Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
## 2 ）過酸化水素による細胞傷害

## a）過酸化水素による細胞傷害下でのSH-SAW信号計測

本研究で用いたSV40-T2細胞は過酸化水素により細胞-細胞間結合（タイトジャンクション）が損傷を受けることが報告されている $ ^{7)} $ $ ^{8)} $ 。タイトジャンクションとは密着結合とも言われ、細胞膜同士を完全に密着させて上皮細胞同士の間隙を塞ぐ役割を持つ細胞間接着構造である。また、脳の血管上皮細胞などの場合も同様に、血流から脳に有害な物質の進入を防ぐ機構として脳関門があり、タイトジャンクション構造がその役割を果たしていると考えられている $ ^{9)} $ 。また、細胞のApical側とBasal側の極性を維持する役割もある $ ^{10)} $ 。密着結合の劣化は、生体組織の外側と内側を区別する構造が脆弱になったことを意味し、外界からの異物の侵入に対し防御ができなくなることにつながり、生命の危機に至る。この過酸化水素が細胞へ損傷を与える過程とSH-SAWの伝搬特性変化との相関性を調査するために、細胞培養後48hに過酸化水素1 mMを投与しSH-SAWシグナルの測定を行った。

## b）免疫蛍光染色によるSV40-T2細胞におけるタイトジャンクション崩壊の経時的観察

SH-SAWシグナルとタイトジャンクション崩壊の関係を調査する実験を行った。SV40-T2細胞のタイトジャンクションを構成するタンパク質であるZO-1をMolecular Probes™ Alexa Fluor 488、細胞核をSigma™ Hoechst 33258でそれぞれ免疫蛍光染色し、共焦点レーザ頭微鏡で観察した。過酸化水素による密着結合の状態変化とSH-SAW信号との相関性を調べた。

## c）免疫蛍光染色によるSV40-T2細胞のZO-1局在性の観察

続いて、Z軸方向（細胞表層-基底方向）におけるZO·1の局在を観察するため、過酸化水素を投与したものと投与しないものでZO·1を免疫蛍光染色し、共焦点レーザー顕微鏡で観察した。

## 3 ）表面弾性波の測定方法

測定は2章のSH-SAWデバイス評価と同様にネットワークアナライザを用いて行った。測定時のランダムノイズ低減のため、ここでは掃引アベレージングを行った。掃引アベレージングは、

$$ A_{n}=\frac{S_{n}}{F}+\left(1-\frac{1}{F}\right)\times A_{n-1} $$

$$ \cdot\quad\cdot\quad\cdot(3-3) $$

$ A_{n} $ ：測定点のn回目の掃引における掃引アベレージング計算結果

(ベクトル量)

$ S_{n} $ ：測定点のn回目の掃引における測定値（ベクトル量）

F: 掃引アベレージング回数

で計算される。本研究ではアベレージング回数は有効にランダムノイズが低減できることが確認できている10回にて実験を行った。
## 5 ）細胞観察について

図(2)-7 に SV40-T2 細胞の観察に使用した顕微鏡写真を示す。(a)は培養過程と損傷過程の観察に使用した光学顕微鏡(オリンパス社製 BX51M-N33MB)、(b)はタイトジャンクションの観察に使用した共焦点レーザ顕微鏡（オリンパス社製 FV1000）である。

(a)

(b)

図(2)-6. Photographs of microphotographic apparatus.

(a) Optical micro scope. (b) Laser confocal microscope.

## 4 ．結果及び考察

## （１）SH-SAWバイオセンサによるバイオセンシング

## 1 ）過酸化水素による細胞損傷

## a）過酸化水素による細胞損傷下でのSH-SAW信号計測

図(2)-7 に OPEN.ch における細胞損傷過程の測定結果を示す。ここでは、0hの最少挿入損失点における周波数を基準とし、この周波数における変化を調べた。(a)は挿入損失差、(b)は位相差である。コントロールは、過酸化水素を投与していないグループである。OPEN.ch では、細胞を播種・培養する過程で共に増大した挿入損失差、位相差が、過酸化水素の添加によって逆に減少する傾向、即ち、細胞播種前の時点に回帰する傾向を示した。また挿入損失差、位相差は、過酸化水素の添加3hから6hにかけて最も大きな減衰を示した。その後の信号変化は、飽和に達した。変化量として挿入損失差は-1.5dB（減衰変化：$\Delta\alpha/\mathrm{k}\div-690\mathrm{ppm}$)程度、位相差は-13deg（速度変化：$\Delta\mathrm{V}/\mathrm{V}\div-800\mathrm{ppm}$)程度の減少を示した。これは培養過程における挿入損失差1.2dB（減衰変化：$\Delta\alpha/\mathrm{k}\div550\mathrm{ppm}$)程度、位相差10deg（速度変化：$\Delta\mathrm{V}/\mathrm{V}\div620\mathrm{ppm}$)程度の増加に対して変化量が大きいが、損傷過程においては過酸化水素が添加されていることにより、液性が変化したことによると考えられる。SHORT.ch では培養過程と同様にほとんど変化を確認できなかった。
(a)

図(2)-7. Experimental results of $ H_{2}O_{2} $ doping process (OPEN.ch)

Blue plots (●) shows the doping process data, and red plots (■) shows the non-treatment data. 0h indicates the time just after administration of $ 1mM\ H_{2}O_{2} $ .

(a) $ \triangle $ Insertion loss, and (b) Phase shift with time progress.
## 2 ）免疫蛍光染色による細胞損傷の観察

図(2)-8 に過酸化水素投与後、0hから2hごとのSV-40-T2細胞のタイトジャンクションを構成するZO-1タンパクと細胞核を免疫蛍光染色した顕微鏡写真を示す。緑色がZO-1、青色が細胞核である。0hから4hまでの顕微鏡写真ではZO-1の染色は細くなっているが、ZO-1の局在性が崩壊している細胞はほとんど確認されない。それに対して、6hではZO-1の局在性が壊れている細胞が確認でき、4hから6hの間にZO-1の局在性が崩壊すると考えられる。OPEN.chのSH-SAW信号測定結果では、過酸化水素投与後3hから6hにかけて、挿入損失差と位相差が共に最も大きな減衰を示し、ZO-1局在性の崩壊と同調した。ZO-1局在性の崩壊がSH-SAW信号変化に影響を与えたと推測される。

続いて、Z軸方向（細胞表層－基底面方向）におけるZO·1の局在を観察するため、過酸化水素を投与したものと投与しないものそれぞれにZO·1を免疫蛍光染色を施し、共焦点レーザ顕微鏡で観察した。その結果を図(2)·9に示す。AにX·Y平面の画像を示し、BにX·Z、Y·Z平面における顕微鏡画像を示す。図(2)·9（A）によると、コントロール（Non-treatment）と比べ、過酸化水素投与後6hではタイトジャンクションの裏打ちタンパクであるZO·1は崩壊している様子が観察される。この時、細胞の厚さ方向の観察結果が図(2)·9（B）である。コントロールにおいて細胞のApical（表層）側にあったZO·1が過酸化水素投与6h経過後にはBasal（基底）側に移動していることが確認できる。ZO·1の崩壊と移動により、細胞の極性維持機能が失われ、細胞の極性が変化し、結果、SH·SAW信号に対して誘電率変化として影響を与えたと推測される。

Fluorescence imaging

图(2)-8. Microscope photographs of tight junction architecture in SV40-T2 stained with antibody against ZO-1

Tight junction was disruption by $ H_{2}O_{2} $ treatment.
A

B

図(2)-9. Microscope photographs of the tight junction stained with anti-ZO-1 (A) X-Y plane. (B) X-Z plane, and Y-Z plane.

## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

SH-SAWの信号変化と細胞の形態学的変化との関係性を明らかにし、論文に発表した。すでに、アクチンファイバー構造の分解とそれに伴う細胞・細胞間結合（タイトジャンクション）の崩壊が、SH-SAW信号の変調に重大な関与をしていることを、信号変調成分の詳細な解析によって明らかにした。その為のモデル実験として、パツリンや過酸化水素による細胞骨格の分解と細胞・細胞間結合の崩壊実験を行った。今までは、このような細胞内の物性変化を観察する手段がなかった。従来は、外界からの刺激による細胞死や生化学的変化によって生体影響評価を行ってきたが、新たに異なる測定原理に基づき、細胞内物性変化や細胞・細胞間結合力を計測する手段を得たことで、毒性研究や薬理研究に応用されて行くものと考えている。
## （２）環境政策への貢献

## ＜行政が既に活用した成果＞

特に記載すべき事項はない。

## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

環境の複合汚染による生体影響を軽微な段階で留めるためには、環境モニタリングによる汚染初期段階での把握と防止が肝要である。今回新たに開発したSH·SAWデバイスを用いたバイオナノ協調体による汚染物質の計測原理によれば、刺激を受けた検出細胞内に引き起こされる軽微な物性変化や外界から異物の侵入を防げ無くなる細胞・細胞間結合の減衰を検出することによって、生体影響物質の存在を明らかにできる。このSH·SAWバイオナノ協調体を微小流体デバイス（本研究(5)を参照）と組み合わせることによって、より簡便かつ安定に、環境試料中に於ける生体影響物質の存在を検出できるものと考えている。

## 6 ．国際共同研究等の状況

特に記載すべき事項はない。

### 7. 研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

## <論文（査読あり）>

1) H. OTORI, T. HIGASHIYAMA, A. UEHARA, M. AINUMA, Y. KUDO, T. KON, K. MOCHITATE, H. KIKUCHI, Y. FURUYA, Sensors and Actuators A (2012) "Signal change of surface acoustic wave (SAW) by $ H_{2}O_{2} $ damage to SV40-T2 cells cultivated on SH-SAW Sensor" (in press)

くその他誌上発表（査読なし）>

特に記載すべき事項はない。

## （2） 口頭発表（学会等）

上原 篤詞，貝沼 美帆，古屋 泰文，成田 絵里子，今 大健，持立 克身：

第4回バイオ・ナノテクフォーラムシンポジウム講演要旨集，27pp.(2010)

「培養細胞の表面弾性波(SH-SAW)特性変化に着目した環境因子ナノ・バイオセンサ」

2) 上原篤詞，貝沼美帆，古屋泰文，成田絵里子，今大健，持立克身：日本金属学会講演概要，2010年秋季(第147回)大会，p.170(2010)，「培養細胞による表面弾性波(SH-SAW)特性変化に着目した環境因子バイオセンサ」

3) 上原篤詞，古屋泰文，貝沼美帆，今大健，持立克身：

第20回インテリジェント材料/システムシンポジウム講演要旨集，pp.10，(2011)

「培養細胞の表面弾性波(SH-SAW)特性変化に着目した環境因子バイオセンサ」

4) 大鳥秀貴，上原篤詞，貝沼美帆，工藤優佳子，東山拓海，今大健，持立克身，菊池英明，古屋泰文：第21回インテリジェント材料システムシンポジウム（2012）
「表面弾性波(SH-SAW)基板に培養した細胞の損傷による信号変化」

5）東山拓海，大鳥秀貴，貝沼美帆，工藤優佳子，持立克身，菊池英明，古屋泰文：日本機械学会東北学生会第42回卒業研究発表講演会（2012）

「SAW デバイス基板上の SV40-T2 培養細胞の薬液（過酸化水素）損傷に伴う SH-SAW 信号変化」

6) H. Otori, A. Uehara, M. Kainuma, Y. Kudo, T. Higashiyama, T. Kon, K. Mochitate, H. Kikuchi, Y. Furuya: The International Workshop on Piezoelectric Materials and Applications (IWPMA) 2012 (2012),

“Signal Change of Surface Acoustic Wave (SAW) by H $ _{2} $ O $ _{2} $ Damage to SV40-T2 Cells Cultivated on SH-SAW Sensor”

7）東山 拓海，大鳥 秀貴，工藤優佳子，磯野 晶宏，今 大健，持立 克身，菊池 英明，古屋 泰文：第22回インテリジェント材料／システムシンポジウム(2013)

「SH-SAW 電極間に培養した SV40-T2 細胞の薬液損傷モニタリング」

## （3） 出願特許

1) 特許公開2009－002677 表面弾性波デバイスバイオセンサ、平成19年6月19日

（４）シンポジウム、セミナー等の開催（主催のもの）

特に記載すべき事項はない。

## （５）マスコミ等への公表・報道等

特に記載すべき事項はない。

## (6) その他

特に記載すべき事項はない。

### 8 \. 引用文献

1) 池野慎也：“細胞・組織バイオセンシング技術の進展”、BUNSEKI KAGAKU Vol.53、No.3、pp.135-146、2004.

2) T.Nomura, A Saitoh, Y Horikoshi: “Measurement of acoustic properties of liquid using liquid flow SH-SAW sensor system”, Sensors and Actuators B, pp.69-73, 2001.

3) 橋本研也：“弹性表面波(SAW)デバイスシミュレーション技術入門”、株式会社リアライズ社、1997.

4) 吉田武：“改訂 高周波回路設計ノウハウ”、CQ出版、1992.

5) 浅井健吾：“SiO_{2}/Al/LiTaO_{3}構造におけるSAW伝搬特性”、電子情報通信学会総合大会、2002.

6) 独立行政法人国立環境研究所：“バイオナノ協調体による有害化学物質の生体影響の高感度・迅速評価技術の開発”、平成15年度報告書.
7) 独立行政法人国立環境研究所：“人工組織ナノデバイスセンサー複合体を活用した多角的健康影響評価システムの開発に関する研究”、平成23年度報告書.

8) Hideki Otori, Takumi Higashiyama, Atsushi Uehara, Miho Kainuma, Yukako Kudo, Toru Kamimura, Tasuku Kon, Katsumi Mochitate, Hideaki Kikuchi, Yasubumi Furuya, Signal change of surface acoustic wave (SAW) caused by $ H_{2}O_{2} $ damage to SV40-T2 cells cultivated on SH-SAW sensor, Sensors and Actuators A: Physical (in press).

9) Takehiro Nitta, Masaki Hata, Shimpei Gotoh, Yoshiteru Seo, Hiroyuki Sasaki, Nobuo Hashimoto, Mikio Furuse, and Shoichiro Tsukita, Size-selective loosening of the blood-brain barrier in claudin-5-deficient mice, The Journal of Cell Biology, Volume 161, Number 3, May 12, 2003 653–660.

10) J. Miyoshi, Y. Takai, Molecular perspective on tight-junction assembly and epithelial polarity, Advanced Drug Delivery Reviews, 57 (2005), pp. 815–855.

11）小貝崇，谷津田博美，塩川祥子，SH·SAWセンサにおけるSSBWの影響とその補正方法，Proceeding of Symposium on Ultrasonic Electronics, Vol. 28, (2007), pp. 143·144 14·16 November, 2007.

12) 近藤淳，塩川祥子，音響電気相互作用を用いた液相系SH-SAWセンサ，電子情報通信学会論文誌 C-Ⅱ, Vol. J77-C-Ⅱ, No. 8, pp. 338-347.

13) 近藤淳，弹性表面波デバイスを用いた溶液系センサの開発と識別システムへの応用に関する研究，静岡大学大学院電子科学研究科電子応用工学専攻博士論文（1995）[http://hdl.handle.net/10297/6193].

14) K. Mitsakakis, A. Tsortos, J. Kondoh, E. Gizeli: “Parametric study of SH-SAW device response to various types of surface perturbations”, Sensors and Actuators B, pp.408-416, 2009.

15) D. S. Ballantine, et al, Acoustic Wave Sensors Theory, Design, and Physico-Chemical Applications, ACADEMIC PRESS (1997).

16) F. Teston, G. Feuillard, L. Tessier, L. P. Tran Hu Hue, and M. Lethiecq, Analysis of the coupling between shear horizontal plate waves and liquids: Application to the measurement of the shear rigidity modulus of glycerol solutions, J. Appl. Phys., Vol. 87, No. 2, 15 January 2000.
# (3) SAWバイオナノ協調体の開発に関する研究：SH-SAW デバイス上における上皮組織の構築と組織傷害に伴う信号変調の解析

農学生命科学部 分子生命科学科 菊池 英明・工藤 優佳子

理工学部 知能機械工学科 古屋 泰文

平成21～24年度累計予算額：30,540 千円（うち、平成24年度予算額：5,299 千円）

予算額は、弘前大学（(2), (3)章）としての予算額であり、間接経費を含む。

平成20年度はナノテクノロジーを活用した環境技術開発推進事業予算にて実施。

## [要旨]

環境汚染物質による生体影響を検出評価するために、表面弾性波（SH·SAW）デバイス上に上皮組織を構築した。影響評価には、大気汚染物質の代表的標的組織である肺胞上皮から作製した不死化肺胞2型上皮（SV40·T2）細胞を用いた。デバイス上に播種したSV40·T2細胞が、細胞·基質間及び細胞·細胞間結合を形成し、細胞伸展して上皮組織となるに伴って、SH·SAW伝搬波の挿入損出は増大し、到達時間（伝搬速度／位相差）は短縮（増大／増大）した。

次に、SH-SAW バイオナノ協調体を用いて、大気汚染物質による生体影響評価のモデル実験を実施した。試験物質には、酸化的ストレスを与える代表的物質として過酸化水素を選択した。培地への1mM 過酸化水素の添加によって、細胞・細胞間結合の一つである密着結合の構成タンパク質 Zonula occludens（ZO-1）の局在性は、添加3～6時間目（以下、遅延相）に掛けて崩壊し、密着結合の機能を示す Transepithelial Electrical Resistance（TER）も激減した。また、この変化に先立ち添加1時間～3時間目（以下、初期相）には、細胞基底面に集積するアクチン線維の分解が始まり、更に遅延相では密着結合を裏打ちするアクチン線維も崩壊した。SV40-T2細胞の傷害と同調するように、SH-SAW伝搬波の挿入損出は、遅延相に入って減衰した。他方、SH-SAWの位相差（伝搬速度）は、初期相の時点から二相性に低下した。その結果、SV40-T2細胞は剥離していないにも拘わらず、SH-SAWの伝搬波は細胞播種前の状態に回帰した。

以上の結果から、過酸化水素によるSH・SAWの信号変調は、初期相において細胞内部構造形成に関与するアクチン線維が崩壊して位相差が減少し、次いで遅延相に入って密着結合が崩壊して誘電率が変化し、挿入損失の減衰に至ったと推測した。SH・SAW伝搬波の変調を観察することによって、上皮組織の構造的及び機能的傷害が検出できることが示唆された。

## [キーワード]

タイトジャンクション、肺胞上皮細胞、過酸化水素

### 1. はじめに
これまで日本が経験した水銀やカドミウムによる重金属汚染、亜硫酸ガスや窒素酸化物による大気汚染，そして，ダイオキシン等有機塩素化合物による汚染の蔓延，その何れにも共通するのは，被曝量及び生体影響の正確な把握が問題解決にとって必須という点である。環境汚染物質は，単独で健康障害を引き起こすというよりも，複合汚染によることが多く，このような生体影響を検出する計測方法の開発があまりなされてこなかった。

## 2 ．研究開発目的

複合汚染による、ヒトへの環境影響評価を行うことができるように、細胞あるいはそれらの集合体である疑似組織を構築し、その細胞の物性変化を鋭敏に検出するシステムの構築をおこなってきた。具体的には、SH·SAWデバイス上に上皮細胞を生育させ（SH·SAWバイオナノ協調体），検討する汚染化学物質を培養液に混ぜて微小流路を通すことにより細胞に暴露し，細胞の物性変化をSH·SAWのパラメータ変化と関係付けることにより，環境汚染物質の生体影響を検出するシステムの開発を行った。

## 3 ．研究開発方法

## （１）研究の材料と方法

## 1 ）細胞の培養

実験に用いた細胞は，外界との接触に曝される肺胞上皮細胞株 SV40-T2 $ ^{1)} $ を用いた（A. Clement からの提供）。細胞は，37℃の CO $ _{2} $ インキュベーターで 5% fetal bovine serum (FBS) を含んだ Dulbecco's modified Eagle's medium (D'MEM) で培養し，4－5 日間隔で継代を行った。化学物質としては，SV40-T2 細胞は外界からの様々な化合物との接触により活性酸素分子種による障害が報告されていることから、過酸化水素を用いた。

## 2 ）細胞-細胞間結合力と SAW 信号の関係を調べる方法

細胞間接着構造を崩壊させるモデルシステムとして、SV40 ウイルスの Large T 抗原を導入して不死化した肺胞上皮細胞を用いた。環境における大気汚染物質に直接晒される組織として、最初に接触する臓器の上皮細胞であるという理由からである。細胞間接着構造は、外界からの様々な侵襲から個体を防御する重要なバリアとして働いている。環境汚染物質の中には、この細胞間接着機構を破壊する作用をもつ物質が数多く存在している可能がある。細胞間接着を崩壊させる物質のモデルとして、過酸化水素を用いた。細胞間結合力に関与する結合のうち、タイトジャンクションは過酸化水素により破壊されることは報告されているが、その機構は明らかになっていない。そこで、タイトジャンクションの機能的性質を調べることができる、Transepithelial Electrical Resistance（TER）を計測する方法と、FITC-Dextran 粒子の透過性を検出する方法により、単層肺胞上皮細胞のシートに過酸化水素を作用させた後の経時的変化を、SAW 信号の経時的変化と比較する方法を用いた（図(3)-1）。
### a. Transepithelial Electrical Resistance (TER) 测定

12 ウェルプレートにトランスウェル・ポリカーボネート・セルインサート（#665641, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany）を乗せ，1×10^{4}/well の密度で細胞をまき，7－14 日培養した。電気抵抗測定器（Millipore, Millicel-ERS）を用いて，電気抵抗値を測定した^{2}。

### b. FITC-Dextran の透過性測定法

SV40-T2 細胞（P50）を 12 well トランスウェルのインサート（0.4 μm pore, Greiner bio-one）に 1×10^{5}/well の密度でまき、6 日間 D'MEM 培地で培養し、測定日前日にフェノールレッドを含まない D'MEM に培地を交換した。過酸化水素処理後、0, 3, 6, 12, 24, 48 時間後にそれぞれ透過性測定を行った。透過性測定には 4 kDa-FITC (fluorescein isothiocyanate)-Dextran（Sigma Life Science, FD4）を使用した。測定は、フェノールレッドを含まない D'MEM 培地のみであるブランク一連とコントロール、0.5, 1 mM 過酸化水素の各三連で行った。過酸化水素の処理は上面側と基底面側にそれぞれ処理を行った。4 kDa-FITC-Dextran をアピカル側に 20 μl/ml の終濃度になるように加えた。透過性測定は基底面側培地からフェノールレッドを含まない D'MEM を 50 μl 採取し、それらを Fluoroskan Ascent FL-TKS（Labsystems, Helsinki, Finland）を使用して Ex485nm, Em538nm で測定を行った。

図(3)-1. TER 測定法と FITC-Dextran 透過性測定法

図の左側が TER 測定法であり、右側が FITC-Dextran 透過性測定法の概略図である。Inner well の底面には半透膜が張ってあり、単層の上皮細胞を生育させることにより、Outer well と Inner well の間にできたバリア一の状態を、電極を用いて抵抗値を測定する（TER）、あるいは outer well に漏れ出てきた FITC の蛍光値を測定する(FITC-Dextran)。

## 3 ）免疫染色

ZO-1 の局在を観察するため、以下の方法で免疫蛍光顕微鏡観察法を行った $ ^{3} $ 。以降の操作は室温で行った。PBS（-）で SV40-T2 細胞を洗浄後、1% ホルムアルデヒド/PBS（-）で 15 分間細胞を固定した。PBS（-）で洗浄後、0.2% Triton X-100/PBS
(-)で15分間膜の透過性を高めた。PBS(-)で洗浄後、1% BSA/PBS(-)に浸した。カバーガラスを別のディッシュに移し、1% BSA/PBS(-)で1:100に希釈した一次抗体（mouse anti-ZO-1 antibody T8-754、京都大学の月田教授から分与して頂いた）を加え、一時間反応させた。1% BSA/PBS(-)で洗浄後、カバーガラスを別のディッシュに移し、1% BSA/PBS(-)で1:250に希釈した二次抗体（Molecular Probes™ Alexa Fluor 488 rabbit anti-mouse IgG antibody）を加え、室温で30分間、暗所で反応させた。PBS(-)で洗浄後、1.6μg/mlのHoechst 33258で15分間、暗所で反応させた。スライドガラスに50%グリセロールを1-2滴滴下し、カバーガラスを細胞付着面が下になるように設置した。グリセロールをキムワイプで軽く吸い取り、乾いたらマニキュアで周りを固めサンプルを作製した。画像の取得は、共焦点レーザー顕微鏡（FV1000D, Olympus, Tokyo, Japan）によって行った $ ^{2)} $ 。

## 4 ）デバイス表面の擬似マトリックス・コーティング

基本的には、Furuyama らの方法に従った $ ^{4)} $ 。擬似マトリックスとしては、主鎖となるポリエチレンにフェニル基が結合したモノマーと、マレイン酸のカルボキシル基を介して、細胞接着リガンドになる合成ペプチド、または糖鎖を化学結合させた化合物を用いた。フィブロネクチン RGD ペプチド（FIB-1）、ラミニンα1鎖 G4-ペプチド（AG73）を MAST-OH に結合させた各擬似マトリックスを、終濃度 5 μ g/ml になるように無血清培地 D'MEM に加え、LiTaO₃ のチップ上に 200 μ l 載せ、炭酸ガスインキュベータ中 37°C で 2 時間反応させた。実験に用いる細胞を培地にサスペンドし、擬似マトリックスでコートしたチップ上に載せ、炭酸ガスインキュベータ中 37°C で一晩接着させた。余分な細胞を除き、血清を加えた培地を注いでさらに細胞を生育させ、SAW パラメータを計測する実験に用いた。

## 5 ）SH-SAW パラメータの測定

SAW の計測のためのデバイスは、弘前大学理工学部古屋研究室で設計された一方向性浮型電極のタイプとした。SH·SAW の周波数特性は、ネットワークアナライザー（Agilent 社製 E5062A）を用いて測定した。本実験では、バイオセンサーとして SH·SAW 伝搬面に細胞を培養し、細胞層の物性変化による SH·SAW 伝搬特性の変化を検出することが目的であるので、高周波信号が通過する表面成分の伝搬特性における挿入損失（Insertion loss）と位相（Phase shift）について測定を行った。

## 6 ）細胞・細胞及び細胞・基底マトリックスとの結合力と SAW 信号の関係を調べる方法

東京電機大学グループの研究開発で作製された、接着に関与する遺伝子を導入した HEK293 細胞を用いて、細胞・細胞間及び細胞・基質間との結合力を調べるための基礎的な方法の開発を行った。HEK293 細胞に、syndecan を安定発現した 293-recombinant（rSN 細胞）、及び、E-cadherin を cloning した発現ベクターを導
入した E-cadherin recombinant、293/E-cad、rSN/E-cad がそれぞれ作製されている（東京電機大学、田中真人グループ）。これらの細胞を SAW デバイス上に生育させ、SAW のシグナルに及ぼす効果から、どのような細胞間結合力が関わっているかを明らかにする方法である。

## 4 ．結果及び考察

## （１）バイオセンサーの構築

SH·SAW センサ上に擬似マトリックスを構築し、その上に SV40·T2 細胞を接着、生育させたものを固定し、Zonula occludence-1（ZO-1）抗体を用いて免疫染色した結果が図(3)-2である。チップ上に細胞が接着し、上皮細胞としての性質であるタイトジャンクションが形成されている様子がZO-1の細胞間に線状の明瞭な染色像によって示されている。

図(3)-2. SV40-T2 細胞の ZO-1 抗体による免疫染色

## （２）過酸化水素が TER と SH-SAW シグナルに及ぼす効果

以前の我々の実験から、タイトジャンクションを形成した腸上皮細胞に、マイコトキシンであるパツリンを投与するとタイトジャンクションが崩壊し、細胞間隙を通ってイオンが細胞層の間を自由に流通できるようになり、細胞層の間の抵抗値が減少するいわゆる TER の減少を観測していた $ ^{2} $ 。そこで、肺胞上皮細胞である SV40·T2 細胞を、過酸化水素で処理し、経時的に TER を測定した。また、同じ条件で SH·SAW のパラメータを計測した（図(3)·3 及び図(3)·4）。

SH-SAW バイオナノ協調体で、培養上皮細胞がデバイス上に生育していくに従って、表面弾性波の位相と挿入損失の増大が観察された（データは示していない）。位相と挿入損失が十分に上昇した時点で、過酸化水素を添加すると、急激に位相と挿入損失の値は減少した（図(3)-3及び図(3)-4）。
TERと挿入損失の経時変化

図(3)-3. TERと挿入損失の経時変化

TER は過酸化水素濃度を 0.1, 0.5, 1.0 mM の条件について計測しているが、挿入損失（△Insertion loss）は、過酸化水素 1.0 mM の条件で独立に 5 回測定した。

TERと位相シフトの経時変化

図(3)-4. TER と位相シフトの経時変化

TERは過酸化水素濃度を0.1, 0.5, 1.0 mMの条件について計測しているが、挿入損失（△Insertion loss）は、過酸化水素1.0 mMの条件で独立に5回測定した。
しかしながら、挿入損失の減少は過酸化水素処理3時間後から急激に低下し、12時間後には定常状態に落ち着いている。この減少とよく一致して、イオンの透過性増大を示すTERの減少が観察された。この挿入損失の減少は、オープンチャンネルでのみ観察され、ショートチャンネルでは観察されなかった。

一方で、位相変化は図(3)-4に示すように、過酸化水素を投与した直後から減少を始め、12時間まで低下し続けていることが明らかとなった。この位相の減少も、オープンチャンネルでのみ観察され、ショートチャンネルでは観察されなかった。

細胞間間隙の増大によるイオン透過性の上昇は、しばしば分子量の大きな粒子の透過性の上昇を伴うことが知られている。そこで、分子量4 kDaのデキストランにFITCを結合させた粒子が通過する量を、培地の蛍光値を測定することで定量した（図(3)-5）。過酸化水素（0.5 mM, 1 mM）の処理により、下層のチャンバーの培地におけるFITCの蛍光値が、過酸化水素の濃度依存的に増大していることが観測された。12時間より早い時間での測定は行っていないが、細胞間の結合が崩壊していることを示唆する結果であった。

図(3)-5. 酸化水素が FITC-Dextran の透過性に及ぼす効果（SV40-T2 細胞）

これらの観察結果から、過酸化水素の処理により細胞・細胞間結合が崩壊していると共に、細胞内の何らかの物性変化が、SAW信号の変化に対応していることが考えられた。以下、3つの可能性に関して実験を行った。

## 1 ）細胞内アクチン線維の崩壊による物性変化

過酸化水素の処理により、細胞内アクチン線維が崩壊することは、すでに他の細胞において報告されている $ ^{5,6} $ 。そこで、肺胞上皮細胞であるSV40-T2を、カバーガラス上に蒔き、過酸化水素処理を行い、アクチン線維をファロイジンにより染色した。図(3)-6に示すように、細胞の基底面に形成されていたアクチン線維（図(3)-6A）は、過酸化水素添加1時間後には崩壊した（図(3)-6B）。しかし、細胞-細胞間接着部位のアクチン線維は明確に観察されたことから、ZO-1の局在を裏打ちしているアクチンは、その結合部位に留まっていることを示している。これを裏
付けるように、ZO-1 染色の蛍光強度は減少しているものの、密着結合は未だ存在していることを示唆している。しかし、添加6時間後には、細胞・細胞間接着部位のアクチン線維も分解し、密着結合の崩壊によってZO-1の局在性も失われた（図(3)-6D）。

Actin Fiber Nucleus

図(3)-6. SV40-T2細胞のアクチンファイバーとZO-1の変化 (A) 対照、(B) 1mM H₂O₂ 添加1時間後。密着結合(ZO-1)は正常だが、アクチンファイバーの分解は始まっている。(C)、サイトカラシンD添加1時間後。密着結合は崩壊し、アクチンファイバーも分解している。(D)、1mM H₂O₂ 添加6時間後。(C)と同様。

細胞内アクチン線維の減少が、細胞間結合を崩壊させることを示すために、アクチンの重合阻害剤であるサイトカラシンＤを用いて、アクチン線維とタイトジャンクションのZO-1を染色し、共焦点レーザー顕微鏡で観察した。図(3)-6Cに示すように、0.5μMのサイトカラシンＤの処理によりアクチン線維は消失し、タイトジャンクションを構成しているZO-1の染色像は断裂していることを示している。この条件下では、細胞間のイオン透過性を示すTERの値は、サイトカラシンＤ処理後速やかに減少していることが観察された（図(3)-7）。また、この条件下でのSH-SAWの挿入損失と位相の変化を測定すると、いずれもOPENチャンネルにお
図(3)-7. サイトカラシン D 処理による TER の変化

図(3)-8. サイトカラシン D 処理による SH-SAW 挿入損失、位相の変化
さらに、アクチンフィラメントの崩壊と SH-SAW シグナルの位相変化の関係を明らかにするために、アクチンファイバーの脱重合剤であるサイトカラシン D を用いた実験を行った。サイトカラシン D $ 0.5 \mu g/ml $ と $ 1.0 \mu g/ml $ では、細胞内アクチンファイバーは、ほぼ完全に崩壊している。このとき、位相変化はどちらの濃度でも同じレベルにまで減少していることが観察された（図(3)-8 右上）。その一方で、挿入損失はサイトカラシン D の濃度依存性に、シグナルレベルが減少していることが観察された（図(3)-8 左上）。このことは、SH-SAW の位相変化はアクチンファイバーの崩壊と強く関係した現象であり、挿入損失の変化はタイトジャンクションの崩壊と強く関係した現象であることを示唆している。

細胞内物性の変化が、SH-SAWシグナルの変化に及ぼす要因として、物質の粘弾性 $ ^{7} $ 、電気的効果（導電率、誘電率）が報告されている。しかしながら、上記SH-SAWシグナル変化はOPENチャンネルで観察されているが、SHORTチャンネルでは変化がないことから、電気的要因がその変化の主体であることが推定された。

## 2 ）過酸化水素による肺胞上皮細胞損傷に伴う溶媒の導電率の変化

過酸化水素 1 mM は、細胞にとってかなり過酷な条件であり、時間過程に伴って損傷を受け細胞内物質が培地に漏出してくる可能性がある。このことは、SH-SAW 表面の溶媒の導電率が変化する可能性がある。溶媒の導電率の変化も SH-SAW の挿入損失および位相変化に関係していることが報告されている $ ^{8} $ 。そのため、過酸化水素処理後の培地における導電率を計測した。時間経過とともに導電率は変化していることが観察されたが（図(3)-9）、対照実験の細胞チャンバーにおいてもほとんど同様な傾向を示した。このことから、SH-SAW の測定は対照電極と過酸化処理電極の差として計測しているので、導電率の変化は SH-SAW のパラメータ変化には影響を与えないと考えられた。しかしながら、SH-SAW が影響を及ぼす基盤表面付近の導電率に関しては、計測することができないため、導電率の変化による SH-SAW シグナル変動の可能性は残されている。
図(3)-9. 細胞培養液中の導電率の変化

過酸化水素（0.5 mM, 1.0 mM）投与後、6 時間まで経時的に培養液の導電率を測定した。

これらのことは、細胞内の構造タンパク質であるアクチンファイバーが崩壊することによって、細胞内流動性が上昇していることを意味していると考えられる。即ち、細胞内の粘弾性の変化の可能性と、細胞内流動性の上昇による細胞極性の変化である。細胞極性の変化は、SH-SAW基盤上に固定された極性の変化、つまり細胞を含めた基盤の比誘電率の変化をもたらす可能性が考えられる。導電率と、比誘電率の変化によって、SH-SAWの挿入損失及び位相の変化を表わす計算式が導き出されている $ ^{8} $ 。

## 3 ）肺胞上皮細胞のタイトジャンクション崩壊に伴う細胞表面の極性変化

上皮細胞の過酸化水素処理による、比誘電率の変化の可能性を検討するために、MDCKII 細胞に、東北大学生命科学研究科、福田光則教授より分与されたPodokalyxin-Venus発現ベクターを導入し、2日後に過酸化水素処理を2時間行い固定した後、ZO-1抗体で染色して共焦点顕微鏡で観察した。二次抗体は、Alexa Fluor-568共役ヤギ抗マウスIgG抗体を用いた⁹）。通常、上皮性細胞の表面に分布しているポドカリキシンは、タイトジャンクションによって隣り合った細胞が強く接着していることによって細胞表面上の移動を制限されている（図(3)-10黄緑色のドット）。従って、細胞が接着している基底面や細胞側面にはポドカリキシンは分布しておらず、管腔側のみに観察される。しかしながら、過酸化水素処理によって、細胞表面の分子の移動を制限していたタイトジャンクションが崩壊すると、ポドカリキシンは細胞膜の流動性により、管腔側だけではなく基底に近い細胞表面にまで拡散していることが観察される（図(3)-10）。また、赤い蛍光で示されるZO-1のタイトジャンクションが、過酸化水素で崩壊し、シグナルの減衰とともに管腔（上
面側）に留まらず全体に赤く光るようになっている。

膜タンパク質は、膜貫通ドメインを幾つ持っているかによって分類されているが、細胞外ドメインに極性アミノ酸の分布が偏っている場合も考えられる。ポドカリキシンの場合には、シアル酸が付加されているため細胞表面は負に荷電している。従って、タイトジャンクションの崩壊によって細胞表面タンパク質などの分子の自由拡散が可能になれば、上皮細胞として保たれていた細胞極性が変化し、電気的な変化、即ち比誘電率の変化も発生することが考えられる。上記の場合と同様に、SH-SAWの挿入損失及び位相は、比誘電率の変動に伴って変化することが考えられる。

図(3)-10. ポドカリキシンを発現させた MDCKII 細胞の過酸化水素処理

上述のことから、細胞の誘電率の変化が SH-SAW パラメータの変化の大きな要因であることが推定された。しかしながら、現在行っている実験条件や用いている細胞では、SHORT チャンネルでのシグナル変化はほとんど観察されていない（図(3)-8）。このことは、OPEN チャンネルでのみ観察される挿入損失と位相のシグナル変化は、電気的要因によって引き起こされる現象であることが推定される。電気的要因のうち、培地の導電率変化は、対照実験と過酸化水素処理で差が認められないことから、SH-SAW シグナルの変動の要因とはなり難いと考えられる。従って、過酸化水素処理により細胞障害として起こる現象のうち、比較的早い時間に発生する位相変化は、細胞内アクチンフィラメントの崩壊と対応していると考えられる（図(3)-6）。過酸化水素処理から早い時間（0～3時間）では、タイトジャンクションのZO-1とそれを支えるアクチン・バンドルはまだ崩壊していない。従って、細胞間接着性の指標であるTERはまだ減少を始めていない。おそらく、アクチンフィラメントの崩壊によって、この時期の細胞内流動性は上昇していると考えられ、
そのために基盤上の細胞の比誘電率が変化したことが原因と考えられる。

過酸化水素処理後、遅い時期（3～6時間）に起こる挿入損失の減少と一致するTERの減少は、細胞間接着機構のタイトジャンクションの崩壊によるものと考えられる。タイトジャンクションの機能の一つに、細胞表面タンパク質の自由な拡散を防ぐバリアとしての機能がある。従って、タイトジャンクションの崩壊に伴って管腔側／基底面側に局在していたタンパク質が自由拡散を起こし、細胞極性を変化させていると考えられる（図(3)・10）。

## 4 ）細胞・細胞間及び細胞・基底マトリックス間の結合力と SAW 信号の関係を調べる方法の開発

細胞間の接着と、SH-SAW伝搬面への細胞接着の強さが、SH-SAWシグナルの変調に及ぼす機構をより明らかにするために、本研究組織の東京電機大グループによって、接着分子の遺伝子を導入した細胞が作製された。もともと基底面との接着が弱くはがれやすい細胞として、ヒト胎児腎臓上皮細胞であるHEK293細胞を親株として用いた。基底面との接着を強化するために、シンデカンを発現させた細胞株（rSN）、細胞間接着を強化するために、E-カドヘリンを発現させた細胞株（E-cad）、両方を発現させた細胞株（rSN/E-cad）の4種類が準備された。

細胞間結合力に関与するタイトジャンクションの形成が起きているかどうかを明らかにするために、HEK293細胞の4種類の細胞をカバーガラスに生育させ、タイトジャンクションの構成タンパク質であるZO-1（Zonula occludens-1）抗体で免疫染色すると、ほぼ同様のタイトジャンクション特有の局在様式を示す様子が観察された（図(3)-11）。

図(3)-11. HEK293 細胞及びその誘導株におけるタイトジャンクションの形成
しかしながら、HEK293細胞を基盤に生着させたSH・SAWシグナルのデータは不安定で再現性に欠ける結果となった。この原因として、HEK293細胞では、基盤や金メッキとの接着性がこれまでの擬似マトリックスでは安定した接着が得られないことが考えられた。

今後金メッキとの接着性を向上させた条件を検討することにより、再現的で安定した SH-SAW のシグナルのデータを得ることができると考えており、シグナル変調と細胞内物性変化の関係をより明確にしていくことができると考えられる。また、このことは、iPS 細胞由来の様々な細胞を用いて、様々な臓器に及ぼす環境汚染物質のモニタリングに応用していくためには、その細胞の性質に適合した擬似マトリックスの組成を検討していく必要があることを示している。

## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

細胞間タイトジャンクションの状態や、細胞骨格を形成しているアクチンファイバーの状態を、非破壊的にリアルタイムで検出する方法は限られており、SAWデバイスによるシグナル変調を検出することにより達成できることを明らかにしてきた。この手法は、今後、環境科学はもとより、毒性学、医薬品開発など広い分野で活用されることが可能な、新しい検出システムであると考えられる。

## （２）環境政策への貢献

## ＜行政が既に活用した成果＞

特に記載すべき事項はない。

## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

我々のグループは、環境汚染物質により、細胞間のタイトジャンクション及び細胞内のアクチンファイバーが崩壊する状態を、表面弾性波のシグナルの変調から捉えることができることを明らかにした（弘前大学グループ、国立環境研究所グループ）。さらに、SAW基盤上に生育している様々なヒト培養細胞を、微小流路装置に組み込んで長期培養を行うことも完成させている（東京電機大学グループ）。SAWシグナル変調を検出するためのコンパクトな基盤も静岡大学で開発されているので、環境汚染が憂慮される場所に、今後モニタリングポストとして設置することにより、リアルタイムで汚染状況を監視するシステムの構築に活用されることが見込まれる。

## 6 ．国際共同研究等の状況

特に記載すべき事項はない。

### 7. 研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

## <論文（査読あり）>
1) M. ISHIDA, T. ITSUKAICHI, D. KOBAYASHI and H. KIKUCHI: Toxicology 275, 72-78 (2010)

“Alteration of the PKC-$\square$-Vav1 complex and phosphorylation of Vav1 in TCDD-induced apoptosis in the lymphoblastic T cell line, L-MAT.”

2) T. KAWAUCHIYA, R. TAKAHASHI, Y. KUDO, A. TAKAMORI, T. SASAGAWA, K. TAKAHASHI and H. KIKUCHI: Toxicology Letters: 205, 196-202 (2011) "Correlation between the destruction of tight junction by patulin treatment and increase of phosphorylation of ZO-1 in Caco-2 human colon cancer cells."

3) M. EBINA, M. SHIBAZAKI, K. KUDO, S. KASAI, and H. KIKUCHI: Biochim. Biophys. Acta, 1809, 176-183 (2011)

Correlation of Dysfunction of Nonmuscle Myosin IIA with Increased Induction of Cyp1a1 in Hepa-1 cells.

4) S. KASAI, T. ISHIGAKI, R. TAKUMI, T. KAMIMURA, H. KIKICHI, Biochim. Biophys. Acta, General Subjects, 1830, 2509-2516 (2013)

“Beta-catenin signaling induces CYP1A1 expression by disrupting adherens junctions in Caco-2 human colon carcinoma cells.”

5) H. OTORI, T. HIGASHIYAMA, A. UEHARA, M. KAINUMA, Y. KUDO, T. KAMIMURA, T. KON, K. MOCHITATE, H. KIKUCHI, Y. FURUYA, Sensors and Actuators: A, Physical

“Signal Change of Surface Acoustic Wave (SAW) Caused by $ H_{2}O_{2} $ Damage to SV40-T2 Cells Cultivated on SH-SAW Sensor.” (in press)

くその他誌上発表（査読なし）>

1) 菊池英明、持立克身、寒地技術論文・報告集、28, 453-455 (2012) 「医薬品・環境汚染物質検出用バイオセンサ デバイス」

## （2） 口頭発表（学会等）

1) 川内谷知子、高森章子、内匠涼、高橋衡平、菊池英明: 第33回日本分子生物学会年会(2010)「カビ毒パツリンによる大腸癌細胞株Caco-2のタイトジャンクション崩壊機構」

2) 大鳥秀貴，上原篤詞，貝沼美帆，工藤優佳子，東山拓海，今大健，持立克身，菊池英明，古屋泰文：第21回インテリジェント材料システムシンポジウム(2012)

「表面弾性波(SH·SAW)基板に培養した細胞の損傷による信号変化」

3) 東山 拓海, 大島 秀貴, 工藤優佳子, 磯野 晶宏, 今 大健, 持立 克身, 菊池 英明, 古屋 泰文: SH-SAW 電極間に培養した SV40-T2 細胞の薬液損傷モニタリング, 第22回インテリジェント材料/システムシンポジウム（東京）, 2013年1月8日

4) 菊池英明、持立克身、第28回寒地技術シンポジウム(2012)「医薬品・環境汚染物質検出用バイオセンサデバイス」

## （3） 出願特許
特に記載すべき事項はない。

（4）シンポジウム、セミナー等の開催（主催のもの）

特に記載すべき事項はない。

（５）マスコミ等への公表・報道等

特に記載すべき事項はない。

(6) その他

特に記載すべき事項はない。
### 8 \. 引用文献

1) Clement A, Steele MP, Brody JS, Riedel N. SV40T-immortalized lung alveolar epithelial cells display post-transcriptional regulation of proliferation-related genes. Exp Cell Res. (1991) 196, 198-205.

2) Kawauchiya T, Takumi R, Kudo Y, Takamori A, Sasagawa T, Takahashi K, Kikuchi H. Correlation between the destruction of tight junction by patulin treatment and increase of phosphorylation of ZO-1 in Caco-2 human colon cancer cells. Toxicol Lett. (2011) 205, 196-202.

3) Itoh M, Nagafuchi A, Moroi S, Tsukita S. Involvement of ZO-1 in cadherin-based cell adhesion through its direct binding to alpha catenin and actin filaments. J. Cell Biol. (1997) 138, 181-92.

4) Furuyama A, Kimata K, Mochitate K. Assembly of basement membrane in vitro by cooperation between alveolar epithelial cells and pulmonary fibroblasts. Cell Struct Funct. (1997) 22, 603-14.

5) Boardman KC, Aryal AM, Miller WM, Waters CM. Actin re-distribution in response to hydrogen peroxide in airway epithelial cells. J. Cell. Physiol. (2004) 199, 57-66.

6) Chan HL, Chou HC, Duran M, Gruenewald J, Waterfield MD, Ridley A, Timms JF. Major role of epidermal growth factor receptor and Src kinases in promoting oxidative stress-dependent loss of adhesion and apoptosis in epithelial cells. J Biol Chem. (2010) 285, 4307-18.

7) Mitsakakis K, Tsortos A, Kondoh J, Gizeli E, Parametric study of SH-SAW device response to various types of surface perturbations. Sensors and Actuators B: Chemical. (2009) 138, 408–416

8) 近藤 淳，塩川祥子，音響電気相互作用を用いた液相系 SH-SAW センサ．電子情報通信学会論文誌(1994)8,338-347.

9) Yasuda T, Saegusa C, Kamakura S, Sumimoto H, Fukuda M. Rab27 effector Slp2-a transports the apical signaling molecule podocalyxin to the apical surface of MDCK II cells and regulates claudin-2 expression. Mol. Biol. Cell. (2012) 23, 3229-39.