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# (5) SAWバイオナノ協調体用微小流体システムの設計製作に関する研究

東京電機大学

総合研究所

二井 信行・高野 温

理工学部 生命理工学系

田中 貞人

平成21～24年度累計予算額：23,676千円（うち、平成24年度予算額：4,071千円）予算額は、東京電機大学（（4），（5）章）としての予算額であり、間接経費を含む。平成20年度はナノテクノロジーを活用した環境技術開発推進事業予算にて実施。

## [要旨]

微小流体システムにおいて、ガス透過性隔壁を介して隣接するジャケットリザーバによる CO₂ ガス緩衝作用の下で、細胞培養を可能とするシステム（オンチップ・インキュベーション・システム）を開発した。更に、SH-SAW デバイスによる生体影響評価システム（SH-SAWバイオナノ協調体）とオンチップ・インキュベーション・システムを統合し、その性能評価を行った。その結果、CO₂インキュベータ内での細胞培養を必要とせず、パネルヒータ上での加温のみにて細胞培養を可能にした。この間、外界と隔離され物質移動は無く、滅菌状態は維持された。

この統合された SH-SAW バイオナノ協調体オンチップ・インキュベーション・システム（SH-SAW バイオナノ協調体OCIS）で、(2)及び(3)章と同様に過酸化水素による細胞傷害モデル実験を実施し、細胞-細胞間結合の崩壊に起因する SH-SAW の変調信号を検出した。また、SH-SAW協調体OCIS 内に作成した肺胞上皮組織に対して、低温耐性を試験した。パネルヒータによる加温を停止し、15℃に48時間曝した後、培地交換をせずに37℃に戻した。しかし、細胞は全く正常に接着しており、SH-SAW信号も低温処理以前の状態に速やかに回帰した。SH-SAW協調体OCIS 内の肺胞上皮組織は、この様な低温に対しても十分に耐性を持っており、その後のSH-SAW信号計測に支障は生じないことが示唆された。

## [キーワード]

微小流体、表面弹性波、细胞培養、低温耐性

### 1. はじめに

従来の抗体や酵素を用いた抗体型や酵素型バイオセンサの様に、単に特定物質の計測を行うのではなく、環境汚染物質や環境化学物質が生体に与える影響を「細胞や組織に対する機能的・構造的変化」として計測し、生体影響評価に資する新規バイオセンサとして、「バイオナノ協調体」が本研究の(2)及び(3)章で提唱・検討された。その結果、表面弾性波（SH-SAW）デバイス上に形成した肺胞上皮組織（SH-SAW 肺胞上皮協調体）における細胞-細胞間結合や細胞内部構造に起因して、SH-SAW 伝搬波の挿入損出は増大し、伝搬時間（位相差／伝搬速度）は短縮（増大）することが判明した。

本サブテーマにおいて開発されるべき微小流体システムとしては、

①SH-SAW 肺胞上皮協調体を収納するオンチップ・インキュベーション・システム（OCIS）において
て、播種した肺胞上皮細胞を長期培養し、生体影響評価が可能である。

②オンチップ・インキュベーション・システムがコンパクトかつポータブル化され、外部との電気的接続も簡素化されている。

これらの要件を満たす技術的検討を行うこととした。

[11] Wei Gu et al. PNAS 101, 2004

マイクロ流体チップの材料となるPDMSは，ガス透過性が高い

↓

チップに培地を密封しても，培地の蒸発と培地pHの

変動を抑止できない

↓

マイクロ流体チップで細胞培養する際には，

CO₂インキューベータが必要になる

細胞培養をポータブルにするには，

ガスタンクごと持ち運ばなくてはならない

### 図(5)-1. 微小（マイクロ）流体チップを用いて細胞培養することと細胞培養系自体をポータブル化することとの相違

微小流体チップを用いることにより、細胞数（播種面積）と培地体積を減少させることは可能である。しかし，培地の物理化学的条件を一定にするための雰囲気制御用の機器、具体的には、CO $ _{2} $ インキュベータならびにガスタンクの必要性は変わらない。むしろ、微小流体チップを使ったシステムのほうが、厳密な雰囲気制御を必要とする。これは、主に、培地の表面/体積比の増加と、透明さと低毒性により細胞培養用チップに用いられるポリジメチルシロキサン(PDMS)の高いガス透過性によるものである。

☐ 培地

☐ ウオータージャケット (重曹水溶液)

☐ ガス透過膜 (PDMS)

図(5)-2. PDMS隔膜と重曹水溶液を用いたオンチップ・インキュベーションの原理

重曹水溶液を加熱すると、重炭酸イオンと炭酸の間の平衡移動によりCO₂ガスを発生し、さらに水分の蒸発も促進される。そのため，CO₂ガスと水を透過するPDMSを介して重曹水溶液と培地を接触させると、CO₂と水が緩衝作用を受ける。
まず、SH-SAWバイオナノ協調体をCO₂インキュベータ内で培養する限り、周辺装置のポータブル化は望めない（図(5)-1）。そこで、SH-SAW肺胞上皮協調体を収納する微小流路に隣接する形で、ジャケットリザーバを設置し、その内にCO₂ガス緩衝作用を持つ炭酸水素ナトリウム水溶液を入れ、ガス透過性隔壁を介して、培地中のpHが維持できるOCISを開発した（図(5)-2）。

OCIS を用いてSH-SAW肺胞上皮協調体をポータブル化することには、以下の利点が考えられる。(a)SH-SAW肺胞上皮協調体を作製し、更にOCISに組み込むプロセスを確立すれば、その役割を将来メーカーが担うことで、ユーザーに品質が保証されたSH-SAW肺胞上皮協調体等のOCISパッケージを、安定して提供することができる。

(b)細胞をOCISにパッケージ化することで、細胞を扱うための高度技能スタッフや専用設備を、各々の検査機関が必ずしも保持する必要が無くなる。即ち、バイオナノ協調体を用いた毒性スクリーニング等に対して、導入及びランニングコストの削減に貢献できる。

(c)バイオナノ協調体OCISを用いて得た毒性評価結果は、各々の検査機関を亘って比較検討、データベース化できる。このことが、毒性評価分野に於けるコモディティ化を促進し、一層のコスト削減と環境モニタリング、或いは、膨大な数の環境化学物質の影響評価に貢献できる。

但し、メーカーが製造したSH-SAW肺胞上皮協調体OCISが、ユーザーの元に配送される途中で、パッケージ内の肺胞上皮組織に不可逆的傷害は起きず、培養を再開した際には速やかにSH-SAW信号を回復するか、検討が必要である。

## 2 ．研究開発目的

本研究の目的は、バイオナノ協調体を搭載することが可能で、外部のバルクな系統（配管・光学検出系・電子計測器など）と切り離しが可能な閉鎖系であること。輸送中も滅菌状態で培養細胞を維持でき、容易に検体の導入や評価を可能とする微小流体プラットフォームを開発することである。本研究では、2重リザーバの微小流体チップ単体のみを底部から保温するだけで、CO₂インキュベーションを可能とするOCIS（オンチップ・インキュベーション・システム）を開発し、当該システムを用いた長期細胞培養試験を行い、当該システム内の加湿とCO₂の供給が長期間にわたって正常に行われているかどうかを検証した。次に、SH-SAWデバイスによる生体影響評価システムとOCISを統合し、その性能評価を行った。SH-SAW協調体OCISパッケージをメーカーからエンドユーザへ送付する際に、培養温度を37℃に維持し続け、培地を循環させるための駆動系を作働し続けることは、装備の重量化煩雑化とコスト増大を招く。むしろ、常温かつ培地循環を行わない条件でOCISパッケージを輸送できることが望ましい。そこで、OCISパッケージを常温ないしは低温かつ培地を静置条件においてた際、細胞が生存でき、37℃に復帰後は発送前の状態に回復してSH-SAW計測が継続可能であるかどうかの検証も行った。

## 3 ．研究開発方法

## （１）研究開発の方針

本研究開発の目的に照らし合わせて、以下のように設定した。

a）微小流体環境を滅菌・無毒化したうえで細胞を導入できる。

b）細胞周囲の物理化学的環境を長期間維持できる。

c）細胞の状態および挙動を、当該微小流体システムに組み込んだSAWなどの固体センサで検
出できる。

一般に、以上の要素を両立することを目指すとなると、一般的には、「Lab on a Chip」的指向の集積化的アプローチをとることが多い。しかし、バイオナノ協調体自体が開発途上であることを踏まえて開発のプロセスを迅速に行い、さらに、細胞の維持とセンサのパッケージングのそれぞれに最適かつ無理のない設計を採用するためには、それぞれの技術的要素を独立させて分離した状態で設計できることが望ましいと考えた。よって、本分担研究においては、非集積的アプローチをとった。具体的には、以下の要素からなる微小流体システムの実現を目指した。

a）外部からの変形により、内部の流体を駆動できる微小流路を含むコンパクトな細胞培養系

b）大型機器の力を借りずに、内部の（細胞培養に適した）環境の維持を可能とする方法

c）研究段階の評価にも容易に用いられる単機能の SH-SAW 基板を、b)のチップ内に絶縁的に封止し、さらに当該 SH-SAW の伝搬する面のみを細胞培養表面としてチップ内に提供する手段

以上3点のうち、a)単体については、ポリジメチルシロキサンを主成分とするエラストマー(以下PDMS)のソフトリングラフィを応用し、市販の点字ディスプレイ用の部品で外部から流体駆動が可能な細胞培養システムを開発し、良好な結果を得ている $ ^{1} $ 。そこで、本分担研究においては、b)ならびにc)を、a)に統合できるかたちで新規に開発することとした。さらに、このような機能をもつ微小流体チップの設計時に考慮する点として、細胞や培地等の液体の導入や交換の容易さ、光学的アクセスの容易さ、そして製作の容易さも考慮する必要がある。

## （２）微小流体チップの基本設計

1）マイクロチップ内における培地の物理化学的環境の維持（OCIS）

PDMS ベースの微小流路を適用するとなると、次に、流路内部の物理化学的環境を如何にして維持するか課題を解決する必要がある。PDMS 自体は、水分子と $ CO_{2} $ ガスの透過性が極めて高く、PDMS 流路内に封入された細胞培養用培地は、時間経過と共にその浸透圧と pH が過剰に上昇する。この課題に対し、従来は、外部のシリンジポンプと直結して灌流培養とする、既成の $ CO_{2} $ インキュベータに格納する、培地の組成を調節して緩衝能力を高めるなどの対策が採用されていた。しかし、このいずれも、バイオナノ協調体の搭載という目的には適合しない。そこで、図(5)-2 に示すように、培地は PDMS 流路内に密封された状態で、培地リザーバ及びその PDMS 微小流路を取り囲む形で、外側にもうひとつのリザーバを作り、二重リザーバ構造とする。外側のリザーバには、加温した炭酸水素ナトリウム水溶液（重曹水）を配置し、細胞培養に必要な温度の安定化と $ CO_{2} $ ガスと浸透圧の緩衝化をコンパクトに行うこととした。図(5)-2 に示したように、OCIS の外側リザーバに重曹水を導入することによって、熱、 $ CO_{2} $ 、水分子が PDMS を拡散して培地に供給される。その結果、培地の温度を恒温に保ち、pH と浸透圧の上昇を抑止することができる。
図(5)-3 本サブテーマで開発する細胞長期培養用の閉鎖系微小流体システムの模式図

SH-SAW素子は，その一部（センシング用領域：伝搬面）を細胞培養用表面として露出している。その培養用表面周囲の培地は、外部の点字デバイスで循環させることにより、OCISが完全閉鎖系でありながら、流路内部で培地の温度、pH、浸透圧を緩衝化できる。外側に、炭酸水素ナトリウム水溶液のリザーバ（青）を配置することで、CO_{2}インキュベータによる高湿度、5%CO_{2}ガスの雰囲気が無くとも、培地のpHと浸透圧を正常に保つことができる。

## 2 ）微小流体チップへの SH-SAW 素子の組み込み

平成20年度は、理化学研究所にて行われた研究成果をもとに、GaN HEMT（窒化ガリウム高電子移動度トランジスタ）をバイオナノ協調体中の検出素子として使用することを想定し、GaN HEMT素子の試作ならびに同素子の搭載を想定した微小流体デバイスの設計を行った。平成21年度以降、当該用途の検出素子は、弘前大学により開発されたSH·SAW素子に一本化されたが、GaN HEMTの搭載を想定した微小流体デバイスは、そのままSH·SAW素子にも適用可能であると判断した。そのため、SH·SAW伝搬波の到達時間を測定するための計測系を導入した。基本的には、平成20年度に報告した微小流体システムの概念を変更せず、弘前大学が開発を進めていた細胞培養可能なSH·SAW素子を用いて、微小流体デバイスと統
合可能なパッケージを試作した。更に、作製した SH-SAW デバイスと OCIS との統合パッケージに、弘前大学と同様に不死化肺胞 2 型（SV40-T2）細胞を播種・培養し、SH-SAW の到達時間を測定した。図(5)-2 及び -3 に、OCIS、微小流路からなる培地循環系、そして SH-SAW 素子の 3 者を統合したシステムの模式図を示す。まず、図(5)-3 に示したシステムは、当該システムの外部に設置した点字アクチュエータの各ピンの蠕動運動により、エラストマーからなる流路内の培地に脈流を発生させ、チップ内の培地を循環させられるようにした。同時に、弘前大学にて開発された SH-SAW 基板（LiTaO_{3}単結晶）の伝搬面が、微小流路内の一部（細胞培養領域）に露出して、細胞の播種・培養が可能な状態に配置されなくてはならない。また、播種した細胞が SH-SAW 基板に安定して接着しているか、SH-SAW 信号を計測している期間中も細胞の状態を観察できるように設計する必要がある。そこで、SH-SAW 素子をマウントし、かつ電気配線を担う基板を、透明・平坦で硬さのあるガラス基板をベースしたものにすることで、SH-SAW 素子の他、電気電子要素の実装を容易とした。さらに、その上部に、センサの表面と直結した微小流路の層、点字デバイスによって変形する膜層、細胞培養用培地や OCIS のためのリザーバの構造を、該当する PDMS やその他透明樹脂からなる構造を積層して形成した。

## （３）微小流体チップの実装

1）細胞の長期培養と微小流体細胞培養に対応したチップ

## a) チップの外観と構造

図(5)-2 並びに 図(5)-3 に示した構想に従って、長期細胞培養用微小流体チップを実施期間中に数タイプ試作したが、このうち、最終バージョン(2012年)のチップの外観と構造（組立図）を図(5)-4 に示す。図(5)-4A に示すように、本チップは、ねじ口をもつ円筒状の領域に培地を、その外側のジャケットに重曹水溶液を導入できるようになっている（以降、それぞれ培地リザーバ、ジャケットリザーバと呼ぶ）。円筒部分はポリジメチルシロキサン(PDMS)からなり、培地リザーバとジャケットリザーバとの間で水分・ガスが透過するようになっている。底部は0.45mm厚のカバーガラスであり、倒立頭微鏡による内部（底部）の観察が可能となっている。また、底面をホットプレート等の上に静置して加温するだけで細胞培養に必要な条件を整えることができ、保温時と観察時の取り回しの容易さに貢献している。

## b) 微小流路

図(5)-4 に示すチップの底部にあるガラス基板の上には、PDMS製の流路形状の層（微細加工した凸型より型取りにより転写した凹溝形状。以下、流路層）、そのさらに上に同じくPDMS製の膜(0.15mm厚：以下、膜層)を接合し、流路を形成する。流路は培地循環用につき、培地リザーバに入口と出口をもつ単純なループである。1 チップあたり同一仕様のループが2 系統搭載されている。各ループの中間部に、細胞培養用ウェル（落とし穴）を形成した。これは、流路層に直径1mmの穴を穿孔したものであり、その底部はガラス基板の表面となる。このため、ガラス基板上で細胞を培養することとなる。これは、特に共焦点顕微鏡で細胞を観察するときに有利である。
## c) 点字セルによる培地循環

膜層はそれぞれPDMS製であるため、流路内の水分とガスがPDMS内を拡散することで失われるのを防ぐため、培地の大部分を収める培地リザーバはジャケットリザーバ内に格納してある。しかし、流路層と膜層のすべてをジャケットリザーバ内に囲うと、流路内の培地をポンプする手段がなくなる。そこで、流路層と膜層の一部（写真では右側）をジャケットリザーバ外に露出させ、その個所には図(5)-5Aに示す点字セル（点字ディスプレイの1文字分をなすアクチュエータアレイ）に取り付けられる指板を接着し、流路層のカバーとしてある。培地循環が必要な際には、この指板部分に点字セルを装着することで、大がかりな送液装置を必要とせず、コンパクトに実施できる（図(5)-5B）。
A

Fingerplate for a Braille cell

B

図(5)-4. 細胞長期培養のためのオンチップ・インキュベーション・チップ

A) チップ外観図。培地用リザーバが内側に、ジャケット溶液用リザーバが外側に配置されている。それぞれのリザーバは、ポリジメチルシロキサン(PDMS)製の筒型の壁面で仕切られ、両リザーバ間のガス・水分子の交換を容易としている。リザーバの下面には、2組のマイクロ流路のループを含むPDMS層が配置されている。各流路は入口・出口を有し、それぞれ培地リザーバに連通している。PDMS層の一部はジャケット溶液用リザーバの外側に露出し、点字アクチュエータによるポンプを可能としている。B) 同チップの分解図。このうち、PMPとPMMAの部品、ならびにPDMS筒は射出成形による成形品であり、チップ1個あたりのコストの低下に寄与している。
A

B

### 図(5)-5. 点字ディスプレイ用アクチュエータによるマイクロ流体チップの駆動

A) 点字セル 8 個の直列接続アレイ。各ピン（写真中の白点）が外部からの電気信号により指板面に垂直な方向に上下する。点字 1 文字(2×4 ピン) 8 個からなる部分が 1 個の点字セルであり，それぞれ独立しているため，点字セル単位で切り離して使用することができる。B) 点字セルを装着した長期培養用微小流体チップ。微小流体チップの指板を接着した部分（図(5)-3Aを参照）に点字セル 1 個を装着する。点字セルを専用の制御回路に接続すると，USB ポートを介してパソコンから電源供給と点字ピンの制御が行える。なお、制御回路はマイクロプロセッサを搭載しているため、電源を供給することで，パソコン無しで点字ピンを制御することも可能である。

## （４）微小流体チップの評価

## 1 ）オンチップ・インキュベーションの評価

培地リザーバには、浸透圧測定用に290 mmol/kg標準液、pCO₂（二酸化炭素分圧）測定に10 mM 炭酸水素ナトリウム溶液（pH8.5）、細胞培養用には培地(DMEM+5%FBS)を導入し、ねじロキャップで封止した。ジャケットリザーバには、NaHCO₃とNa₂CO₃の水溶液を導入した。NaHCO₃の濃度は0.8Mに固定し、Na₂CO₃の濃度は20、50、65、75、100mMとした。その後、培地リザーバ内の液体を点字セル(KGS株式会社 SC11)の蠕動パターン(1ステップ/秒)で循環させつつ、チップ底部をホットプレートで37℃に加熱した。培地リザーバ内部の液体の浸透圧とpHの測定は、それぞれ浸透圧計(Wescor 5100C)、pHメータ(堀場製作所F-51)で行った。pHと各種定数（ヘンリ一定数Kₛ、炭酸の第1、2解離定数K₁、K₂）より、pCO₂値を以下の式で算出した。

$$ \begin{aligned}pCO_{2}&=\frac{c_{0}}{K_{H}}\\c_{0}&=\frac{C_{T}}{1+\frac{K_{1}}{10^{-pH}}+\frac{K_{1}K_{2}}{10^{-2pH}}}@\frac{A_{Na}}{\frac{K_{1}}{10^{-pH}}+\frac{K_{1}K_{2}}{10^{-2pH}}}\end{aligned} $$
ただし、 $ c_{0} $ は炭酸の濃度 $ \left(\left[\mathrm{H}_{2}\mathrm{CO}_{3}\right]\right) $ 、 $ C_{T} $ は溶存総炭酸類濃度 $ \left(\left[\mathrm{H}_{2}\mathrm{CO}_{3}\right]+\left[\mathrm{HCO}_{3}^{-}\right]+\left[\mathrm{CO}_{3}^{2-}\right]\right) $ 、 $ A_{Na} $ はナトリウム濃度（この場合、 $ A_{Na}=10\ mM $ となる）、 $ K_{H} $ は気相CO $ _{2} $ のHenry定数、そして $ K_{1} $ と $ K_{2} $ は炭酸の第1、第2解離定数である。

$ K_{H} $ 、 $ K_{1} $ と $ K_{2} $ の値は、温度 T の関数として、以下の式より算出した

$$ \begin{aligned}&-\log K_{1}@-356.3094-0.06091964T+\frac{21834.37}{T}+126.8339\log T-\frac{1684915}{T^{2}},\\&-\log K_{2}@-108.3865-0.03252849T+\frac{5151.79}{T}+38.92561\log T-\frac{563713.9}{T^{2}},\\&\log K_{H}@108.3865+0.01985076T-\frac{6919.53}{T}-40.4515\log T+\frac{669365}{T^{2}}.\\ \end{aligned} $$

細胞培養については、流路をフィブロネクチンでコート後、サル腎臓由来細胞株COS-7の懸濁液をチップ内のウェルに導入し、培地リザーバ内の培地を点字デバイスで循環させつつ、定期的に倒立位相差頭微鏡(ライカ DMIL LED)で観察した。

## 2 ）SH-SAWによる細胞間結合の評価

次に、SH-SAW チップを用いて、細胞単層の細胞間結合の崩壊に伴うSH-SAWの遅延の変化を評価した。評価のためのセットアップを図(5)-6に示す。

まず、ラット由来肺胞2型上皮細胞SV40-T2をチップの培養ウェルに播種した。細胞播種後、透明ホットプレート（37℃）を配置した顕微鏡ステージ上で、コンフルエント状態(およそ48h)まで培養した。その後、過酸化水素(H₂O₂)を培養ウェルに最終濃度1mMで添加した。この間、位相差顕微鏡に取り付けたCCDカメラにて10min間隔でタイムラプス撮影を行った。同時に、バースト正弦波(51.0MHz、-10dBm @50Ω、50cycles)を櫛型電極間に印加し、対向する櫛形電極間電圧の波形をオシロスコープで30min毎に集録した。なお、以上の入力印可と出力波形の集録は、USBと自作の制御用ソフトウェアを介してすべて自動で定時間隔にて行った。

得られた出力波形から、その到達時刻を、出力波形のうち振幅最大のものに注目することで決定した。そして、各時点での出力波の到達時刻と、計測開始時における同・到達時刻との差を遅延時間とした。以上の解析は、グラフ作成ソフトウェアIgor Proの自動化機能にて実装したため、ほぼ自動に近い形で行った。

## 3 ）低温輸送耐性の評価

さらに、チップに細胞を播種後、製造所からエンドユーザに通常の物流経路を介して送付することを想定した、培地循環も、加温もない状態での輸送を模した低温耐性実験を行った。

まず、図(5)-5 に示すチップに細胞を播種し、細胞の接着と単層形成のため、サーモプレートを用いて24時間 チップ底面を37℃に加温した。その後、48時間 同サーモプレートにてチップ底面を15℃に低温保持し、その後、チップ底面を37℃に再び加温した。細胞播種直後よりSAW波形取得を開始し、SH-SAW計測開始直前とSH-SAW計測開始96時間後(4日後)に位相差顕微鏡にて細胞を撮影した。
A

B

図(5)-6. タイムラプス撮影及びSH-SAW計測のセットアップ

A) 全体図。CCDカメラ(QImaging Retiga200R)を搭載した倒立頭微鏡(Leica DMIL LED)にチップを静置し、培養ならびに観察を行う。チップ上のSH-SAW素子は、同軸ケーブルを介してファンクションジェネレータ(Tektronix AFG3521)とオシロスコープ(同DPO3032)に接続する。CCDカメラ、ファンクションジェネレータ、オシロスコープの制御と画像・信号集録は、1台のノートPCにて行う。B) 倒立頭微鏡のステージ部。ステージ上に透明ヒーター(東海ヒット サーモプレート)を搭載し、その上にチップを静置した。これにより、チップ底面を37℃にしつつ底面の細胞を観察できる。チップとファンクションジェネレータならびにオシロスコープ間の接続は、固定ジグでステージ上に固定した端子を介して行う。
## 4 ．結果及び考察

## （１）微小流体チップのインキュベーション能力の評価

## 1 ）浸透压

長期細胞培養用微小流体チップを用いて、浸透圧標準液を15日間のインキュベーションしたときの浸透圧変化を図(5)-7に示す。ジャケットリザーバ内に重炭酸塩/炭酸塩水溶液(0.8M NaHCO₃/65mM Na₂CO₃)を封入してインキュベーションを行った場合（ジャケット有）と、ジャケットリザーバに液体を封入しなかった場合（ジャケット無）で、培地リザーバ内の浸透圧標準液の浸透圧を比較した。ジャケット有は、一般的な細胞培養における浸透圧変化の許容範囲とされる±10mmol/kgにほぼ収まることがわかった。対して、ジャケット無では、浸透圧が約6mmol/kg/dayで上昇した。この結果より、ジャケットリザーバに封入した液体から生じる水分子が、培地リザーバのPDMS筒を透過することで、浸透圧標準液の蒸発を防いだことがわかる。また、ジャケット無しの浸透圧では、10日目以降で浸透圧に誤差が生じやすい傾向が確認された。これは、PDMS筒に含まれた水分の影響と考えられる。浸透圧測定実験は、チップを使い回しまわして行ったため、ジャケット有りの条件で測定に用いた後、洗浄してジャケット無の測定に使用したケースもあった。そのため、PDMS筒が水分を含んだ状態になっていたことが考えられる。すなわち、PDMS筒に含まれた水分が浸透圧の変動に抑制をかけた状態になり、10日目前後で筒に含まれた水分がなくなり、浸透圧が上昇した。

## 2 ） $ pCO_{2} $ （二酸化炭素分压）

続いて、ジャケット液の組成と、培地リザーバ内の$\mathrm{pCO_{2}}$の関係性を評価した。ジャケット液は、0.8M $\mathrm{NaHCO_{3}}$の濃度は固定し、$\mathrm{Na_{2}CO_{3}}$は、濃度を20、50、65、75、100mMの5種類とし、チップ上の$\mathrm{pCO_{2}}$を15日間にわたり測定し、濃度ごとの$\mathrm{pCO_{2}}$の移り変わりを調べた。その結果を図(5)-8に示す。この結果から、0.8M $\mathrm{NaHCO_{3}}$と20·100mM $\mathrm{Na_{2}CO_{3}}$の組み合わせにより、15日間のインキュベーション期間中に、培地リザーバ内の$\mathrm{pCO_{2}}$を3·8%間でコントロールできることがわかった。これは、$\mathrm{Na_{2}CO_{3}}$が$\mathrm{NaHCO_{3}}$を緩衝したためであり、加えた$\mathrm{Na_{2}CO_{3}}$の濃度が大きくなるほど、緩衝能が高くなり$\mathrm{CO_{2}}$ガス発生の反応が穏和になり、チップ上の$\mathrm{pCO_{2}}$が低くなることがわかった。20mM、50mM $\mathrm{Na_{2}CO_{3}}$の場合、$\mathrm{pCO_{2}}$の値は、インキュベーション開始後に急激に上昇し、その後、急落する現象（オーバーシュート）が確認できた。対して、75mM、100mM $\mathrm{Na_{2}CO_{3}}$では、オーバーシュートがなく15日間にわたり比較的安定した$\mathrm{pCO_{2}}$が得られた。$\mathrm{CO_{2}}$ガスの発生が穏和になったためであり、$\mathrm{Na_{2}CO_{3}}$濃度は、単に$\mathrm{pCO_{2}}$の値を決めるだけでなく、長期間にわたり安定した$\mathrm{pCO_{2}}$を得るためにも重要な要素であるといえる。
図(5)-7. オンチップ CO₂ インキュベーションに対応した微小流体チップの底部を 15 日間 37℃ に加温した際の，培地リザーバ内 290 mmol/kg 浸透標準液の浸透圧の変化 ジャケット無しでは、約 6 mmol/kg/day の割合で浸透圧が上昇していくのに対して、ジャケット有りでは、特に 9 日目までは、ほぼ浸透圧の変化が見られなかった。

図(5)-8. オンチップ CO₂ インキュベーションに対応した微小流体チップの底部を 15 日間 37℃ に加温した際の培地リザーバ内の pCO₂ の変化, ならびにジャケット液に添加した Na₂CO₃ の濃度との関係

0.8M NaHCO₃ 水溶液に加える Na₂CO₃ 水溶液の濃度を変えることで、培地リザーバ内の pCO₂ を 3-8% 程度までコントロールできる。加えた Na₂CO₃ の濃度が濃いほど、NaHCO₃ を緩衝するため、オーバーシュートの少ない pCO₂ が安定的に得られる。
## 3 ）保温時の消費エネルギー

本微小流体チップを外気温10℃、内容積70 mm × 70 mm × 30 mmの2mm厚の発泡スチロールに梱包し、底面を37℃に加熱したときの所要仕事率を、有限要素シミュレーションソフトウェア(COMSOL Multiphysics V4.0)を用いて数値的に求めた。モデルの概要とシミュレーション結果（温度プロファイル）を図(5)-9に示す。

具体的には、10℃の静止空気に静置した2cm厚の発泡スチロール(熱伝導率0。04 W/(mK))箱内のチップの底面のみをヒーターで37℃に加熱した際にヒーターから発せられる仕事率として求めた。シミュレーションの結果、ヒーター温度が37℃のときの仕事率は249 mWであった。点字セルの駆動回路の電源電流は実測で50mA @5Vであったため、上記仕様で梱包時に細胞培養を維持するために必要な電力は500 mWと見積もられた。これは、市販のUSB充電バッテリーでも数日以上維持できるレベルの供給電力である。

a

b

図(5)-9 発泡スチロール箱、細胞培養チップ、ヒーターからなる系の熱解析

a）モデルの寸法（正面図と上面図）。チップは、PMMAと水の熱伝導率が近い値であることより、チップの寸法（50 mm × 26 mm × 12 mm）の水の塊であるとした。水塊の下面を一定仕事率の面熱源とした。厚さ0.02 m（2 cm）の発泡スチロール（熱伝導率0.04 [W/(m·K)]）は、面積70 mm × 70 mm × 30 mmで、外面の温度を10℃とした定熱流束境界条件（0.04 / 0.02 = 2.0 [W/(m²·K)]）とした。

b）底面からそれぞれ2 mm, 1cm, 2cm, 3mm上部における表面温度のプロファイルを示すシミュレーション結果。最高温度 37.007 ℃ が, ヒーターの仕事率を 249 mW に設定したときに得られた。

## 4 ）細胞の長期培養

図(5)-10 は、OCIS のウェル（直径1mm）に導入したCOS-7細胞の初期細胞数（播種密度）と増殖率との関係を示す。COS-7細胞の標準的な播種密度( $ 12.5\times10^{3} $ cells/cm $ ^{2} $ )を含む、5.0~17.0
×10^{3} cells/cm^{2}の範囲内において、0.02/h (倍加時間 35 h)程度の増殖率であり、通常のディッシュ等による培養と同様の増殖特性を示すことがわかった。

開発したマイクロ流体チップによる17日間オンチップCO₂インキュベーションでの細胞培養の結果を図(5)-11に示す。細胞の導入後まもなく接着し、1日経過後には細胞の増殖も見られた。細胞は、移動と増殖を繰り返し、5日後には細胞培養ウェルからマイクロ流路に移動する細胞群を観察した（図(5)-11 白破線部）。その後も細胞は増え続け、約1週間でコンフルエントに達してからは、細胞は層を形成するように増えていく挙動が観察できた。加えて、17日経過時に、細胞培養ウェル内の過増殖状態にある細胞をLIVE/DEAD Cytotoxicity Kitを用いて染色（緑：生細胞、赤：死細胞）し、共焦点顕微鏡で蛍光画像取得し、細胞の生死判定を行った。ディッシュを用いた通常の培養では、COS-7細胞は、過増殖状態になると細胞間に接触阻害が生じ、死細胞が増加するが、ウェル内の細胞は、ほとんどが細胞は生存していることが観察された。これは、点字セルによって、流路内を培地が常時強制的に還流し続けることで、細胞に対して常に生理的条件を満たす培地が供給されたためと考えられる。

図(5)-10. チップ内のウェル（直径1mm）に導入したCOS-7細胞の初期細胞数（播種密度）と増殖率（播種後4日間）との関係

縦線は、COS-7細胞の標準的な播種密度を示している。
図(5)-11 微小流体下での COS-7 長期培養の位相差顕微鏡像と、蛍光による生死判定微小流路内の細胞培養ウェルに沈降・接着・増殖した COS-7 細胞は、生存・増殖し（1日目／5日目），細胞塊を形成した（17日目）。この細胞塊の大部分は、生細胞（緑）であることがわかる。

## （２）SH-SAW による細胞のモニタリング能力の評価

## 1 ）細胞の状態とSH-SAW出力波形との関係

図(5)-12A に、SH-SAW ダイの伝搬面（細胞CH）上に播種したSV40-T2細胞の経時変化を示す。0h~24h にかけて、細胞の接着ならびに増殖が認められる。H₂O₂ 添加後、時間経過に伴い細胞間の隙間が広くなっているのが分かる。つまり細胞間の結合が徐々に崩壊していると言える。また、420min では個々の細胞が収縮しているのが確認できる。

また、図(5)・12B に、培養時間経過にしたがうSH・SAW波形の伝搬速度の変化を、測定開始時の値との差で示した。縦軸(SAW delay)は、細胞が接着した伝搬面を通ったSH・SAWの出力波形のある1ピークに注目したときの、当該ピークの時刻と、初期状態におけるそれとの差（シフト量）である。正の値は、当該ピークが初期状態のそれより後に現われることを示しているため、正の値は、細胞の影響で遅延時間が増加していることを示している。図(5)・12B においては、 $ H_{2}O_{2} $ 添加後、遅延時間はほぼ単調に増加した。特に30～120min間と300min～420minにかけて、増加率が高くなった。図(5)・12A においても300minに対し420minでは、細胞が収縮している。この関係からも細胞間結合の破壊や細胞の収縮、剥離により、遅延時間が増加していると考えられる。
A

図(5)-12. SH-SAW伝搬面で培養維持されたSV40-T2細胞の培地に1mM（終濃度）の過酸化水素 $ H_{2}O_{2} $ を添加した後の細胞とSH-SAW遅延時間の変化

A) $ H_{2}O_{2} $ 添後の細胞の位相差頭微鏡写真。各パネルに記載の時刻は、 $ H_{2}O_{2} $ 添加後の経過時刻を示している。B) $ H_{2}O_{2} $ 添加後の SV40-T2 細胞の直下を伝搬した SH-SAW の遅延時間。図中矢印は、A) の各写真パネルに対応している。

## 2 ）細胞とSH-SAW出力の低温輸送に対する耐性

図(5)・13A に、SH・SAW伝搬面でSV40・T2細胞を、37℃ならびに15℃でオンチップ・インキュベーションした際の位相差像を示す。T=0において単層を形成した細胞は、T=96hにおいて、増殖して重層していることが確認された。オンチップ・インキュベーションかつSH・SAW伝搬面上という非典型的な細胞培養条件においても、細胞は2日の常温輸送（低温ストレス）に耐性をもつことが示された。さらに、図(5)・13B に、オンチップ・インキュベーション中
のSH·SAW遅延時間の変化を示す。チップ底面（＝SH·SAW基板）の温度を15℃に冷却すると、SH·SAWの伝搬速度は37℃のそれよりも増大するため、冷却期間中は遅延時間は低減している。しかし、37℃に復帰すると、あたかも15℃の冷却期間がなかったかのようにSH·SAW遅延時間のトレンドは回復している。つまり、SH·SAW基板を搭載したオンチップ・インキュベーション・チップに細胞を播種し、輸送のために一時的温度を低下させても、SH·SAWを使った細胞間結合の評価が、輸送がないときと同様に行えるといえる。

A

B

図(5)-13. SH-SAW伝搬面で培養維持されたSV40-T2細胞とSH-SAW遅延時間の低温における挙動

A) 位相差頭微鏡写真。SV40-T2細胞を播種・培養開始後、細胞進展を待って t=0 とし、SH-SAWの計測を開始した。t=4d は、37℃再加温後24時間後を示す。B) SV40-T2細胞が接着した圧電基板表面に沿って伝搬するSH-SAW伝搬波の到達時間。低温処理の期間中は見かけ上変化したが、37℃に戻すと低温処理前の状態に回復した。
## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

表面弾性波（SH·SAW）素子は、これまで電気信号回路での同調や発信等に使われていた。これらは、いずれも非水系での使用である。この発想を転換し、上皮細胞が平面状に連なることで形成した上皮組織を弾性波で振動させることで、その力学的構造を解析することに使えるのではないかと考え、本プロジェクトは開始された。その為には、①細胞培養培地中での使用に対応した素子や回路の無毒性の絶縁、②発信側櫛形電極における効率的な一方向性SH·SAW伝搬波の受信側に向けた発信、③発生させた表面弾性波が極力エネルギー損失を少なく受信側に到達させる工夫、④表面弾性波の伝搬面と細胞－基質間接着分子との結合を取り持つインターフェースとしての擬似マトリックスの開発等が相まって、SH·SAWセンサは擬似マトリックスを介して接着している上皮組織による信号変調という形で測定できるまでになった。現在は、その安定性と感度を高めることに注力して地道な改良が行われている。

本サブテーマに関しては、SH-SAWバイオナノ協調体が、種々の環境化学物質や環境試料に対する生体影響評価や薬理学的研究に積極的に活用されるためには、周辺の培養装置をコンパクトにパッケージ化する必要があると考え、企画された。即ち、自らSH-SAWデバイスを製作して細胞培養可能にするための専門的知識と技能は、生体影響評価や薬理学的研究分野の研究者には馴染みが薄い。そこで、SH-SAWデバイスを、オンチップ・インキュベーション・システム（OCIS）に統合しSH-SAW肺胞上皮組織協調体OCISとすることで、SH-SAWデバイス上に肺胞上皮細胞を播種・培養した状態で生体影響評価や薬理学的研究分野の研究者に供給可能とすることを目指した。

この SH-SAW協調体OCIS を用いることで、CO₂ インキュベータ等の周辺装置を必要とせず、簡易なパネルヒータの加温のみで、過酸化水素による酸化的ストレスに対する組織傷害を第(2)章及び(3)章と同様に再現し、SH-SAWの信号変調として計測することができた。また、一旦流路内のSH-SAWデバイス上に播種された後は、上皮細胞は長期間安定して生存でき、例えば搬送中で起こるであろう低温曝露に対しても耐性がある。更に、SH-SAW協調体OCIS は、外部のタンク・ポンプや配管を不要とするシステムであり、容易に滅菌状態を維持できるとともに、将来はメーカーで製造しユーザーの元に配送して毒性試験等に供することも可能なように考慮されている。これらの工夫によって、バイオナノ協調体を用いた健康影響評価という計測手法を、より現実的なものに改良できた。

## （２）環境政策への貢献

## ＜行政が既に活用した成果＞

特に記載すべき事項はない。

## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

環境中に溢れている種々の化学物質によって組織や細胞が崩壊する現象は、甚大な公害に依る健康被害を除けば、通常は希有である。寧ろ、極微量の化学物質に暴露され続けることで、上皮組織の細胞－細胞間結合や密着結合が弱められ、結果外界からの異物の侵入リスクが高まる状況の方が、遙かに深刻である。しかしながら、この様な上皮組織としてのintegrityの弱体
化を正確に把握する検出手段が、現時点では無い様に思う。

本プロジェクトは、従来の抗体や酵素を用いた抗体型や酵素型バイオセンサの様に、単に特定物質の計測を行うのではなく、環境汚染物質や環境化学物質が生体に与える影響を「細胞や組織に対する機能的・構造的変化」として計測するための新たなカテゴリーのバイオセンサの確立から出発したが、2期目に入って、現実的な健康影響評価に役立てるように、アッセイ系の改良を行った。即ち、新規バイオセンサ（SH-SAWバイオナノ協調体）を、微小流体デバイスに統合することで、

①SH-SAWバイオナノ協調体の製造者と、アッセイする試験者とが分離できるようにする。

即ち、健康影響評価を行う試験者が、自らバイオナノ協調体を作製する必要性は消失した。

代わって、メーカーが一定の品質管理のもとにバイオナノ協調体を製造して、試験者に安定供給することが可能になった。

②製造者から試験者の元にバイオナノ協調体が支障無く搬送できる為に、搬送中でも滅菌状態の維持、低温に対する耐性を確保することで、試験者の元に配送された後バイオナノ協調体として機能できるように、微小流体デバイスの設計を行った。

③SH-SAWバイオナノ協調体の作製と信号計測には、高度の技能と知識を必要とする。今回、微小流体チップを用いたオンチップ・インキュベーション・システムにパッケージできたことで、基礎的なトレーニングを受けるだけで、取り扱えるように改善できた。

## 6 ．国際共同研究等の状況

特に記載すべき事項はない。

### 7. 研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

<論文（査読あり）>

1) 二井信行，高野温，宮下三佳，田中真人：生体医工学、47，6，529-534（2009）「ポリジメチルシロキサン隔膜を介した水分・ガス交換による微小流体細胞培養デバイスのオンチップCO2インキュベーション」

2) A. TAKANO, M. TANAKA and N. FUTAI : Microfluid. Nanofluid, 12, 6, 907-915 (2012) “On-chip CO $ _{2} $ incubation for pocket-sized microfluidic cell culture.”

## くその他誌上発表（査読なし）>

特に記載すべき事項はない。

## （2） 口頭発表（学会等）

1) 高野温，宮下三佳，田中真人，二井信行：生体医工学シンポジウム2009，千葉（2009）

「ポリジメチルシロキサン隔膜を介した水分・ガス交換による微小流体細胞培養デバイスのオンチップCO2インキュベーション」

2) 高野温，田中真人，二井信行：第22回化学とマイクロ・ナノシステム研究会(22nd CHEMINAS)，名古屋（2010）
「微小流体チップの完全閉空間オンチップインキュベーションの評価」

3) A. TAKANO, M.MYASHITA, M.TANAKA and N. FUTAI: 10th International Symposium on Microchemistry and Microsystems (ISMM 2010), Hong Kong, (2010) "Microfluidic cell culture with simplified on-chip CO $ _{2} $ incubation."

4）滝澤 和也、高野 温、今 大健、上原 篤詞、貝沼 美帆、古屋 泰文、持立 克身、田中 貞人、二井 信行：生体医工学シンポジウム2011（2011）

「表面弾性波素子の微小流体細胞培養チップへのパッケージング」

5) A. TAKANO, T. OGAWA, M. TANAKA and N. FUTAI: 33rd Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society (EMBC '11), Boston, MA, USA (2011) "On-chip Incubation System for Long-term Microfluidic Cell Culture."

6) 高野温，田中貞人，二井信行：日本生体医工学会関東支部若手研究者発表会2011，東京(2011)

「マイクロ流体下での長期細胞培養のためのオンチップCO2インキュベーション」

7) A. TAKANO, K. TAKIZAWA, T. KON, M. TANAKA, Y. FURUYA, N. FUTAI: 1st Progress and Innovation of Smart Materials and Related Technology (PI-SMART2012), Hirosaki, Aomori, 2012

“SAW chip-equipped microfluidic platform for cell-based biosensing.”

8) 二井信行：PI-SMART in 仙台(2012)

「SH-SAW+マイクロ流路の結合型バイオセンサ」

9) 柴田昌宏，相澤典男，高野温，大鳥秀貴，今大健，古屋泰文，持立克身，田中真人，福井康裕，二井信行：生体医工学シンポジウム2012(2012)

「培養細胞単層の粘弾性測定の横波表面弾性波による計測」

10）相澤典男，柴田昌宏，高野温，福井康裕，田中真人,二井信行：生体医工学シンポジウム2012(2012)

「マイクロ流体チップへの細胞播種自動化プロセス」

11) N. FUTAI: $ 5^{th} $ International Conference on Biosensors, Biochips, and Bioelectronic Devices (BIOTRONICS2012), Gwangju, Korea, 2012

“All-in-one Pocket-sized Long-term Cell Culture System Using Braille-based Microfluidics and On-Chip CO $ _{2} $ Incubation.”

12）高野温，柴田昌宏，大鳥秀貴，今大健，古屋泰文，持立克身，福井康裕，田中真人，二井信行：日本生体医工学会関東支部若手研究者発表会2012（2012）

「オンチップCO2インキュベーション下で培養した細胞の表面弾性波による挙動解析」

13) A. TAKANO, S. INOMATA, T. OGAWA, N. FUTAI, M. TANAKA: American Society for Cell Biology (ASCB) 2012 Annual Meeting, San Francisco, CA, USA (2012)

“Applications of the microfluidic cell culture system with on-chip CO $ _{2} $ incubation for cell biology.”

14) A. TAKANO, M. TANAKA, N. FUTAI: 35th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, Osaka, Japan (2013) (accepted)
"Microfluidic cell culture system with on-chip hypoxic conditioning."

## （3） 出願特許

1) 二井信行, 田中真人, 持立克身: マイクロ流体チップ及び細胞の培養方法, 特開2011·206045, 2011. (公開)

## (4) シンポジウム、セミナー等の開催（主催のもの）

特に記載すべき事項はない。

## （５）マスコミ等への公表・報道等

特に記載すべき事項はない。

## (6) その他

1) 生体医学シンポジウム 2009 (2009)における受賞：ベストリサーチアワード

2) 33rd Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society (EMBC ’ 11), Boston, MA, USA (2011)における受賞 : Student Paper Competition Finalist と Philips Young Investigator Award (PYIA) Finalist

3) 二井 信行: 科学技術振興機構(JST) サイエンス・パートナーシップ・プログラム(SPP) 講座型学習活動支援（プランA）講師, (2012)

「マイクロ流体チップを用いた細胞培養実習」

### 8 \. 引用文献
C-0803-91

# Development of Artificial Tissue-Nanodevice Sensor Complex for Versatile Application to Risk Assessment of Health

Principal Investigator: Katsumi MOCHITATE

Institution: Center for Environmental Health Sciences

National Institute for Environmental Studies (NIES)

16-2 Onogawa, Tsukuba, Ibaraki 305-8506, JAPAN

E-mail: mochitat@nies.go.jp

Cooperated by: Hirosaki University and Tokyo Denki University

## [Abstract]

Key Words: Chemical matrix, SH-SAW, Alveolar epithelial cell, On-chip incubation

The risk control of environmental pollutants is fundamental for protection of the public health, and the monitoring for complex exposures by pollutants is essential for the risk assessment of health. However, the traditional monitoring limited to the marked pollutants has not been always enough for surveying the risk, so that we have experienced environmental pollutions in the past. So long as we would persist in assessing the health risk by monitoring the only identified pollutants, we might have to prepare another pollution again by unidentified or unrecognized substances that were unexpectedly or unintendedly produced in or leaked into our environments.

Taking account of the limitation of the traditional monitoring system, a complementary monitoring model is needed that is based on biological effects rather than on chemical or physical detection. The biological tissues that were injured by environmental pollutants might be available for the biological detection of the pollutants, if electric devices could respond to these kinds of injuries.

The first step to develop a novel type of biosensor is to reconstruct an artificial tissue on an electric device and to hold the tissue integrity during the whole period of culture in monitoring. For this purpose we have invented chemical matrices, Pseudomatrices (US Patent No. 8304238) that can work as an interface between a tissue layer and an electric device. By the simple coating of a device with Pseudomatrix the seeded cells can adhere and grow on the device as if they were cultured on plastic culture wares.

The second step is to make a right choice from the candidates of electric devices. A shear horizontal-surface acoustic wave (SH-SAW) device appears to be one of hopeful devices, such as NO sensing by PMP complex and $ H_{2}O_{2} $ sensing by GaAs 2DEG-FET semiconductor. A SH-SAW device has the characteristics that it is able to respond to the electrical permittivity and conductivity as well as mechanical viscosity and density. The