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(4) 環境影響評価細胞の開発：細胞間接着因子E-カドヘリンの発現を強化したヒト細胞培養株の樹立

東京電機大学

理工学部 生命理工学系

田中 真人・小泉 良仁

（独）国立環境研究所

環境健康研究センター

中村 宣篤（研究協力）

平成21～24年度累計予算額：23,676千円（うち、平成24年度予算額：4,071千円）

予算額は、東京電機大学大学（(4)，(5)章）としての予算額であり、間接経費を含む。

平成20年度はナノテクノロジーを活用した環境技術開発推進事業予算にて実施。

## [要旨]

ヒトへの健康影響を評価するバイオナノ協調体のセンサ開発に必要とされる、SH-SAWデバイスへの細胞接着性と細胞-細胞間接着性を強化した細胞株の作成を目的として、ヒトE-カドヘリンcDNAを過剰発現する細胞株の樹立を行った。そのため、E-カドヘリンのcDNAを肝臓のcDNAからクローニングし、発現プラスミド、pCMV-hCDH1を構築した。このプラスミドの配列を精査し、見出された変異部位は、部位特異的変異導入法によって修復した。

安定発現株を得るためには、細胞への遺伝子導入後、プラスミドにコードされた抗生剤耐性遺伝子を使って、細胞を選抜する必要がある。SH-SAWデバイスに播種する影響評価細胞として、培養基質への接着性を高めるためシンデカン遺伝子（rSN細胞）やラミニン・10遺伝子（rLN10細胞）を安定発現株が既に用意されており、幾つかの耐性遺伝子が既に細胞選抜に使われている。本研究では、未選択のピューロマイシン耐性遺伝子有する発現プラスミド（pBApo-CMV Pur）を、安定発現株の選抜に用いた。前記2細胞はHEK293細胞を親細胞とするが、この細胞はE-カドヘリンを発現しているので、導入したE-カドヘリンcDNAと区別できるように、E-カドヘリンのC末端側に6残基のヒスチジンオリゴペプチドを融合したE-カドヘリン発現プラスミドも同時に構築した。

用意した発現プラスミドを、リン酸カルシウム法によってHEK293細胞、rSN細胞、及び、rLN10細胞に遺伝子導入し、ピューロマイシンを培地添加して安定発現細胞株を選抜し、細胞株を樹立した。

## [キーワード]

E-カドヘリン、細胞-細胞間結合、293細胞、hSN細胞、rLN10細胞

### 1. はじめに

環境中には、人類が作り出した多くの化学物質が放出され、さらに多くの物質が新たに製造・使用されていることから、これらの化学物質の安全性を迅速に評価することが重要な課題となっている。化学物質の代表的な生体への影響評価方法として、当核物質で曝露した生体組織や
細胞を採取・破砕し、標的成分を抽出・分離・分析する方法があるが、膨大な時間と多くの高額な装置を必要とする。本プロジェクトでは人工組織ナノバイオ複合体を用いた健康影響評価システムの開発を行い、ヒトの健康に及ぼす環境化学物質の毒性評価システムを構築することを最終目標としている。具体的には、表面弾性波（SH-SAW）センサ上で生体影響を受ける上皮細胞を播種・培養し、細胞の基底面に沿って伝搬するSH-SAWの信号が、環境化学物質によるストレスによって生した組織傷害で、伝搬波の挿入損出や速度・位相の変調を検出することを利用して、影響評価する方法を開発している。このバイオナノ協調体を、持ち運び可能な微小流体チップに組み込めば、実用可能な環境計測センサとして利用できるようになる。先ずは、大気汚染物質によって傷害を受ける肺胞上皮組織由来の不死化肺胞2型上皮（SV40-T2）細胞を用いて、影響評価試験が行われている。

## 2 ．研究開発目的

将来的には、このセンサ上に種々のヒト細胞を使用することによって種々のヒト組織に対する生体影響が計測可能となる。当面はそのモデルとして、ヒトの株化上皮細胞をセンサ上で安定に保持でき、長期培養が可能な遺伝子導入株を樹立する必要がある。既に、細胞外マトリックスと結合するヒトシンデカンを安定発現する細胞株（hSN）、細胞外マトリックス成分であるヒトラミニン-10を安定発現する細胞株（rLN10）を樹立している。hSN細胞、rLN10細胞は、ヒト腎臓由来のHEK293細胞を親細胞として遺伝子導入され確立した細胞株である。本研究では、同種の細胞間接着に関わるヒトE-カドヘリンcDNAを含むプラスミドを、これらの細胞株に遺伝子導入することによって、E-カドヘリンを安定発現する細胞株を作製し、得られた細胞株がSH-SAWバイオナノ協調体に対する搭載細胞として、生体影響計測原理の解明や影響評価細胞として役立つか検討に用いる。

E・カドヘリンは、上皮細胞膜表面で発現する分子量120 kDaの糖タンパク質である。カドヘリンは細胞同士の接着を司っており、カルシウム依存性（calcium-dependent）細胞接着（cell adhesion）タンパク質であることがカドヘリンの名の由来になっている $ ^{1-4} $ ）。カドヘリン結合は同種親和的な結合に分類される。E・カドヘリンは、細胞外に5つのドメインを持ち、先端のドメイン（EC1）が結合部位となる $ ^{5} $ ）。またE・カドヘリンは細胞質内で細胞骨格であるアクチンフィラメントと結合し（図(4)-1） $ ^{6} $ ）、接着結合及びデスモソーム結合を担っている $ ^{7} $ 。なお、細胞外にN末端側が配向し、細胞質内にC末端側が配向する $ ^{5} $ 。結合様式としては、同じ細胞膜状のE・カドヘリン同士が2量体となった後、隣り合う細胞膜上のE・カドヘリン2量体と結合する（図(4)-2） $ ^{5} $ 。

E-カドヘリンは上記のように120 kDaの比較的大きな分子であるので、遺伝子導入の際に用いるE-カドヘリンcDNAには塩基の置換や欠失、付加などが起こりやすいことが予想されたので、遺伝子リソースからの導入ではなく、自ら分子クローニングすることした。計画した安定発現細胞株の想定する性質と名称を図(4)-3に示した。
図(4)-1. E-カドヘリンと細胞骨格との結合

図(4)-2. E-カドヘリン二量体を介した細胞間の結合
図(4)-3. 安定発現株の名称と想定する性質

### 3. 研究開発方法

## （１）Ｅ・カドヘリン発現プラスミドの構築

## 1 ）pCMV-hCDH1 の構築

E-カドヘリンのcDNAはヒト肝臓のcDNAライブラリーを銷型として、PCRクローニングによって得た。用いたプライマーはSP-Ecad、5'-GGCCATGGGCCCTTGGAG-3'およびASP-Ecad、5'-GACTCGAGCTAGTCGTCCTCGCCG-3'であり、PCR反応後、NcoIおよびXhoIで切断し、pCMV-oligoベクターに挿入した。挿入配列全長の塩基配列の結果、メチオニンのコードATGから数えて23番目の塩基がTからCへ、2138番目のTがCへ変異していることが判明したので、部位特異的変異挿入法によって、両者の塩基をCに戻したプラスミドを作製した。それぞれの当該部位を含む制限酵素断片を調製し、元のプラスミドに埋め戻した。再度、全長の配列分析を行って塩基配列を確認した。このプラスミドはサイトメガロウイルスの下流にE-カドヘリンcDNAが結合しているので、上皮系の細胞を含む多くの細胞での一過的発現に用いることができる。哺乳動物細胞での選択マーカーを同一プラスミド上には有していない。

## 2 ）pBApoK2-hEcadおよび pBApoK2-hEcad-MCSの構築

pCMV-hCDH1を鋳型として、PCRプライマーであるSP-Xba1-hCDH1、5'-CCTCTA
GACACCATGGGCCCTTGGAG-3'およびASP-MCS-hCDH1、5'-CCAAGCTTAAACTCGAGAAGATCTGTCGTCCCTCGCCGCC-3'を用いてPCR反応後、XbaIおよびHindIIIで切断してPCR増幅断片を得た。予め、pBApo-CMV PurベクターをPciIおよびXhoIの制限酵素認識配列を切断-埋め戻し法で破壊したベクターをpBApoK2とした。このベクターをXbaIおよびHindIIIで切断して、上記のE-カドヘリンcDNA-MCS断片を挿入した。PCR法による塩基変異を避けるため、pCMV-hCDH1からPstI-PciI断片を単離し、入れ替えを行った。また、pBApoK2-hEcad-MCSのKpnI-XhoI部位にpCMV-hCDH1のKpnI-XhoI断片を挿入することでpBApoK2-hEcadを構築した。このプラスミドはサイトメガロウイルスの下流にE-カドヘリンcDNAが結合しており、同一プラスミド内に哺乳動物細胞での選択マーカー、ピューロマイン耐性遺伝子を有する。マルチクローニング部位（Bgl II, Xho I, Hind III）を供えているので、容易にC末端側にペプチドの挿入が可能である。ただし、余分なペプチド（RSSRV）がつながっているので、pCMV-hCDH1から得たKpn I-Xho I断片をpBApoK2-hEcad-MCSのKpn I、Xho I部位に挿入する手法で、本来の構造のE-カドヘリンをコードするpBApoK2-hEcadも対照として構築した。

## 3 ）pBApoK2-hEcad-MCS（6-His）の構築

標記プラスミドはpBApoK2-hEcad-MCSのマルチクローニング部位、BglII, XhoIに二重鎖合成オリゴヌクレオチドを挿入することで構築した。用いたオリゴヌクレオチドはSP-Bgl2-6His-TAA-noXho1、5'-GATCTCATCATCACCATCACCATTAAG-3'およびASP-Bgl2-6His-TAA-noXho1、5'-TCGACTTAATGGTGATGGTGATGATGA-3'で、徐々に温度を上げることで二重鎖形成を行った。この二重鎖オリゴヌクレオチドを上記の制限酵素部位に挿入した。このプラスミドはE-カドヘリンのC末端側に6残基からなるヒスチジンペプチドを含むので、抗ヒスチジンペプチド抗体を使って検出できる他、ニッケル-キレックスカラムで単離することも可能である。

なお、以上のすべての発現プラスミドは、塩化セシウム密度勾配遠心法によって、超らせん型のものを大量調製し、無菌的に1mM EDTAを含む10mM Tris·HCl, pH7.5 緩衝液に透析して保存した。また、これらのプラスミドのE-カドヘリン・コード領域については塩基配列の決定によってすべて確認済みである。以上のプラスミドが発現するE-カドヘリンの構造の概略を図(4)-4 に示した。

図(4)-4. 各プラスミドで発現するE-カドヘリンの構造
## （２）ヒトＥ・カドヘリンを発現する安定発現株の単離

## 1 ）リン酸カルシウム法による単離方法

E-カドヘリンの安定発現株の取得はリン酸カルシウム法による遺伝子導入法によった。用いた細胞はヒト上皮株細胞293細胞およびその遺伝子導入細胞のhSN細胞、rLN10細胞である。これらの細胞の培養は、T-25フラスコを用い、10%牛胎児血清およびペニシリン、ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で、10%CO₂、37.0℃、飽和水蒸気下の条件で行った。遺伝子導入する前日の夜に、翌朝、細胞の培養密度がフラスコに対して40%～50%までの面積比となるように継代し、細胞の密度が適切であるフラスコを選択し、培地交換（DMEM）後3時間培養を継続した。クリーンベンチ内で、2M CaCl₂ 31μLにDNA（pBApoK2-hCDH1 or pBApoK2-hCDH1-RS6His）を5μg加え、250μLまで滅菌水でフィルアップした。その溶液をあらかじめ用意した2×HBS 250μLに攪拌しながら無菌的に混合し、DNA-リン酸カルシウム複合体の沈澱を生成させた。15分間放置して沈殿を安定化した後、DNA-リン酸カルシウム複合体懸濁液を培養中のT-25フラスコに全量滴下し、4時間培養した。培養後、無血清のDMEMで3回洗浄し、15%-glycerol/HBSを1.5mL滴下し、1分30秒放置した。再度、無血清のDMEMで2回洗浄し、3回目は血清を含むDMEMに交換した。48時間培養後、100mmシャーレ7枚に継代した。翌日、1μg/mLピューロマイシン入りDMEMに培地交換した。5日に1回程度を目安に、ピューロマイシンを含むDMEMで培地交換を行った。ピューロマイシン耐性の細胞コロニーが半径3mm程度に成長するのを確認して、ペニシリンキャップ法でそれぞれのコロニーを単離し、独立に増殖培養を行った。

## 2 ）遺伝子導入株の選抜方法と再クローニング

各遺伝子を導入した細胞は、増殖の過程でE-カドヘリンの発現をウェウスタン・ブロティング法によってスクリーニングした。35mmシャーレにコンフルエントになった時点で試料を採取し、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動を行った後、ニトロセルロース膜に転写し、抗ヒト・E-カドヘリン抗体または抗ヒスチジン抗体によって可視化し、E-カドヘリンを発現している細胞株を選抜した。図(4)-5及び(4)-6にウェウスタン・ブロティング法を行った結果を示した。遺伝子導入によって作製した細胞株で120kDa付近にE-カドヘリンと考えられるバンドを確認した。選抜したクローンの各遺伝子と細胞の組み合わせで、独立に得られた陽性細胞20種ほどの中から高発現と思われる3種の遺伝子導入細胞株を液体窒素温度で保存した。各遺伝子導入株のリストを表(4)-1にまとめた。この中の細胞株のいくつかについては、性質の異なる細胞株の混入が疑われたので、コロニー形成を再び行って、再クローニングを行った。細胞の名称にRを含むものは再クローニングを経たものであることを示す。
### 図(4)-5. 抗His抗体を用いたWB法による遺伝子導入細胞株のヒト・E-カドヘリンの検出

①：分子量マーカー、②：293-Pur+-1、③：hSN細胞、④：rLN10細胞、⑤：負対照、⑥：293C-His-21、⑦：SC-His-11、⑧：SC-His-42、⑨：SC-His-51、⑩：LC-His-61、⑪：LC-His-63、⑫：LC-His-52

図(4)-6. 抗力ドヘリン抗体を用いたWB法による遺伝子導入細胞株の選抜

⑥ : SC-His-11 ⑦ : SC-His-11R2、⑧ : LC-His-63、⑨ : LC-His-63R1
WB法によるE-カドヘリンの発現	PCR法による断片の増幅	E-カドヘリンの染色
293C-51	○	増幅を確認	E-カドヘリンを染色した
293C-54	○	未	未
293C-62	◎	未	未
293C-His-11	◎	増幅を確認	E-カドヘリンを染色した
293C-His-21	○	増幅を確認	E-カドヘリンを染色した
SC-His-11	○	増幅を確認	E-カドヘリンを染色した
SC-His-11R2	◎	未	E-カドヘリンを染色した
SC-His-11R3	◎	未	未
SC-His-42	△	未	未
SC-His-51	△	未	未
LC-His-52	○	増幅を確認	E-カドヘリンを染色した
LC-His-61	○	未	未
LC-His-63	○	未	E-カドヘリンを染色した
LC-His-63R1	◎	未	E-カドヘリンを染色した

表(4)-1. 作製した E-カドヘリン安定発現株

◎：濃いバンドを確認、○：バンドを確認、△：薄いバンドを確認

未：未檢定

## 4 ．結果及び考察

（１）ヒトＥ・カドヘリンを発現する安定発現株の性質

1）ヒトE-カドヘリンの細胞内局在

各遺伝子導入株について、カバーガラス培養後、免疫組織染色を行い、ヒトE-カドヘリンの細胞内局在および細胞骨格ミクロフィラメントの構造への影響を調べた。図(4)-7～(4)-10に示すように、293C-51、293C-His-11、293C-His-21、SC-His-11、SC-His-11R2、LC-His-52、LC-His-63、LC-His-63R1細胞株では、遺伝子導入前の細胞株に比べ、細胞膜付近でのE-カドヘリンの発現・局在が明確に示された。C末端に6残基のヒスチジンペプチドが付加したE-カドヘリンを発現する293C-His-11細胞株と、C末端に6残基のヒスチジンペプチドが付加しないE-カドヘリンを発現する293C-51細胞株はアクチンフィラメントも同時に染色したが、293C-51細胞株でアクチンフィラメントの細胞膜付近での局在がみられた。SC-His-11R2とLC-His-63R1は再クローニングした細胞株である。再クローニング前の細胞株と比較して、強力かつ均一な細胞膜付近でのE-カドヘリンの発現・局在を確認した。E-カドヘリン発現プラスミドであるpBApoK2-hCDH1-RS6His及びpBApoK2-hCDH1の遺伝子導入によって、293細胞が本来合成している量の数倍以上のE-カドヘリンを発現し、なおかつ細胞膜に局在していることが明らかになった。またC末端に6残基のヒスチジンペプチドが付加してもE-カドヘリンは細胞膜に局在することが確かめられた。したがって、6残基のヒスチジンペプチドが付加したE-カドヘリン安定発現株をこれからの研究に利用できると考える。
図(4)-7. E-カドヘリンの細胞内局在(1)

A : 293 细胞、B : 293C-His-21

図(4)-8. E-カドヘリンの細胞内局在(2)

A : hSN 细胞、B : SC-His-11

図(4)-9. E-カドヘリンの細胞内局在(3)

A : rLN10细胞、B : LC-His-52

## 2 ）E-カドヘリンの細胞内局在とミクロフィラメントの構造との相関関係

本研究では、E-カドヘリンとアクチンフィラメントが結合することで表面弾性波がより伝わりやすくなると予想し、E-カドヘリンの安定発現株を作製した。しかし293細胞では少量の内在性E-カドヘリンを発現している。そこで内在性のE-カドヘリンと区別するために、C末
293细胞

293C-51細胞

293C-His-11细胞

図(4)-10. E-カドヘリンとアクチンフィラメントの細胞内局在

4％パラホルムアルデヒドを含むD-PBS(-)で15分間固定した細胞を洗浄し、0.2％トリトンX-100を含むD-PBS(-)で処理した細胞をウサギ抗力ドヘリン抗体で反応し、洗浄後ビオチン標識抗ウサギIgG抗体で処理し、FITC-ストレプトアビジンで可視化した。アクチンフィラメントを染めるために、1μg/mLになるようにローダミンファロイジンを用いた。
端に6残基のヒスチジンペプチドを付加する必要があった。そこで、E-カドヘリンとアクチンフィラメントの結合が6残基のヒスチジンペプチドによって阻害されていないかを調べるために、6残基のヒスチジンペプチドを付加しないヒトE-カドヘリンを安定発現株の作製も行った。293細胞株と293C-His-11細胞株に比べて、293-51細胞株でアクチンフィラメントが細胞膜付近に局在している（図(4)-10）。C末端近傍のドメインはカテニン分子を介してアクチンフィラメントとの相互作用を行っており、6残基のヒスチジンペプチドがアクチンフィラメントとE-カドヘリンの結合に何らかの影響を及ぼす可能性が考えられる。E-カドヘリンとアクチンフィラメントの結合には、β-カテニンとα-カテニンの介在が必要であるが、E-カドヘリンの過剰発現のみで、E-カドヘリンとアクチンフィラメントの結合が誘起されることが示唆された。hSN細胞やrLN10細胞でも6×Hisを付加しないE-カドヘリン安定発現株を作製するべきだと考える。

## 3 ）今後の課題と展望

今回、樹立した様々な細胞株は、環境健康モニターとして、実用研究で試験されることを期待するが、E-カドヘリンは同種の細胞同士の自己集合に関わる分子として機能していることが推測されている。今回、再クローニングの過程で、コロニーごとにE-カドヘリンの発現量が異なっているケースが多々見られた。この性質が、再クローニングを容易にしているものと思われた。実際、再クローニング前の細胞株に比べて再クローニング後の細胞株ではよりE-カドヘリンが均一に局在し強く発現している(図(4)-11、(4)-12)。この性質は今後培養センサに用いる細胞を作製してゆくときにうまく利用できるように思われた。

今回、遺伝子導入したプラスミドが染色体のどの位置に取り込まれて発現しているのかは現状では、解析終了してはいないが、いずれのケースにおいてもサイトメガロウイルスのプロモータの下流にあることは確認済みである。

図(4)-11. 再クローニングすることによるE-カドヘリンの細胞内局在化の変化 A : SC-His-11、B : SC-His-11R2
図12. 再クローニングすることによるE-カドヘリンの細胞内局在化の変化 A : LC-His-63、B : LC-His-63R1

## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

pCMV-hCDH1、pBApoK2-hCDH1、pBApoK2-hCDH1-MCS、pBApoK2-hCDH1-RS6His 計4種類のヒトE-カドヘリン発現プラスミドを得た。これらのプラスミドは、配列が確定しているので、今後も様々な研究利用できる研究資源となった。E-カドヘリンのC末端部分には制限酵素部位が複数設けてあり、いつでも挿入変異が可能となっている。したがって、ヒトE-カドヘリンの接着部位やC末端を改変し、今後の目的に沿ったヒトE-カドヘリン発現プラスミドの構築が容易である。加えてpBApoK2シリーズはピューロマイシン耐性遺伝子をコードしているので、さらなる安定発現株の作製にも応用できる。

強力にヒトE-カドヘリンを安定発現する細胞株の樹立に成功した。現在ほぼ完成の域に達したSAWセンサに実装して、E-カドヘリンの安定発現によって表面弾性波の速度に差異が生じるか検証できると考える。また東京電機大学二井グループが行う微小流体チップ内への実装も同時に検証していきたい。

## （２）環境政策への貢献

バイオナノ協調体による計測の主眼は、従来の抗体や酵素を用いた抗体型や酵素型バイオセンサの様に、単に特定物質の計測を行うのではなく、環境汚染物質や環境化学物質が生体に与える影響を「細胞や組織に対する機能的・構造的变化」として計測できることにある。今回開発した細胞は、バイオナノ協調体の環境影響評価細胞に利用できる。

## ＜行政が既に活用した成果＞

特に記載すべき事項はない。

## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

特に記載すべき事項はない。
## 6 ．国際共同研究等の状況

特に記載すべき事項はない。

### 7. 研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

## <論文（査読あり）>

1) 村原中，脇田晃充，三宅裕，立石昇一朗，平山貴浩，アズラン・アズヒム，村松和明，田中真人，遠藤修，宮崎幸造，松尾洋孝，四ノ宮成祥，守本祐司（2011）「脱細胞化血管スキャフォールドを用いた細胞培養用リングモジュールの開発」生体医工学、49巻3号508-515(2011)

2) Azran, A., Ueno, A., Tanaka, M., Akutagawa, M. and Kinouchi, Y. (2011) "Evaluation of Blood Flow Velocity Envelope in Common Carotid Artery for reference data." Biomedical Signal Processing and Control-Elsevier Journal, 6, 209-215.

くその他誌上発表（査読なし）>

特に記載すべき事項はない。

## （2） 口頭発表（学会等）

1) Kawashima, H., Goto, Y., Saitoh, D., Nemoto, W., Tanaka, M. (2012). Unusual post-translational modification of GFP derivative. 2012 Annual Meeting of the American Society for Cell Biology, held in San Francisco, U.S.A. Dec. 15-19, 2012.

2) 川島 洋明, 後藤 優佳, 林 千慧, 根本 航, 田中 真人(2012). ペプチド性の翻訳後修飾基を介したカルネキシンまたはカルレティキュリンとの複合体形成. Binding ability between a novel peptide modifier on the BraC protein and calnexin or calreticulin. 第85回日本生化学会大会、福岡国際会議場、福岡、2012年12月14日～16日

3) 川島 洋明, 清水 絵里子, 齋藤 大地, 田中 貞人(2012). カルネキシンは N 型糖鎖のないヒト血液凝固第 X 因子と複合体を形成する. Calnexin binds to the human coagulation factor X without N-glycan. 第 85 回日本生化学会大会、福岡国際会議場、福岡、2012 年 12 月 14 日～16 日

4) 川島洋明、木下綾野、石井佐織、渋谷温、山崎太郎、雨宮伸、田中貞人(2012) 遺伝性球状赤血球症の赤血球膜糖タンパク質、バンド3の膜内外の安定性に関する解析、第54回日本小児血液・がん学会学術集会、パシフコ横浜、横浜（2012年11月30日・12月2日）

5) 石井佐織、渋谷温、山崎太郎、雨宮伸、子川和広、木下綾野、川島洋明、田中真人(2012) 共焦点顕微鏡による先天性溶血性貧血の赤血球膜タンパク質、バンド3の膜内配向解析、第115回日本小児科学会学術集会、福岡国際会議場、福岡県、2012年4月20日（金）～22日（日）

6) 渋谷温、川島洋明、山崎太郎、石井佐織、三浦信之、南陸彦、田中真人(2011) 遺伝性球状赤血球症の一家族における赤血球膜糖タンパク質、バンド3の安定性解析。第53回日本小児血液・がん学会学術集会、前橋、群馬、2011年11月25日（金）～27日（日）
7) 小野樹，守本祐司，田中真人，古川克子，牛田多加志，Azran Azhim（2011）脱細胞化した半月板の組織学的解析および生体耐久性の評価に関する研究．生体医学シンポジウム 2011，2-4-3，長野，2011年9月

8) Azhim, A. Yamagami, K. Muramatsu, K. Morimoto, Y. and Tanaka, M. (2011). The Use of Sonication Treatment to Completely Decellularize Blood Arteries: a Pilot Study," Conf. Proc. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 2012, 2468-2471. （查読付き）（33rd Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society (EMBC '11) held in Boston, USA. Aug. 30-Sep. 3 2011)

9) 高橋哲也，アズラン・アズヒム，村松和明，守本祐司，田中真人（2011）ウシ半月板組織の脱細胞化に及ぼす超音波と生物化学的処理の組み合わせ効果。第50回日本生体医工学会，P3-5-1，東京，2011年5月

10）山上和樹，アズラン・アズヒム，高橋哲也，長島良祐，村松和明，守本祐司，田中真人（2011）

超音波照射の効果による豚大動脈の脱細胞化. 第50回日本生体医工学会，P1・1・8, 東京，2011年4月

11）高橋哲也，アズラン アズヒム，山上和樹，長島良祐，村松和明，守本祐司，田中真人（2011）脱細胞化したウシ半月板足場で培養したウサギ半月板細胞の特性評価．第10回日本再生医療学会総会，2P-120,270，新宿，2011年3月

12）川島 洋明，鈴木 もも子，星野 卓哉，菊池 康弘，藤原 恵理，高橋 春菜，田中 真人、N 型糖鎖を含まないヒト血液凝固第 II 因子とレクチン型シャペロンとの結合、第 33 回日本分子生物学会年会・第 83 回日本生化学会大会 合同大会、2010 年 12 月 10 日（金）

13）藤森悠、幡多 徳彦 田中 真人,福井 康裕, 舟久保 昭夫（2010）細胞挙動変化を用いたヒト肝ガン細胞の定量的機能評価に関する研究. 第48回日本人工臓器学会、仙台、2010（平成22）年11月18日（木）～20日（土）

14) Azhim, A., Takahashi, T., Muramatsu, K., Morimoto, Y. and Tanaka, M. (2010). "Decellularization of Meniscal Tissue Using Ultrasound Chemical Process for Tissue-Engineered Scaffold Applications," WCB 2010, IFMBE Proceedings, vol. 31, pp. 915–918, Springer. （查読付き）（In 6 $ ^{th} $ World Congress on Biomechanics held at Singapore, 1-6 August, 2010.）

15) Azhim, A., Narita, Y., Muramatsu, K., Morimoto, Y. and Tanaka, M. (2010). "Decellularization of Living Tissue Using Microwave Chemical Process for Tissue-Engineered Scaffold Applications," WCB 2010, IFMBE Proceedings, vol. 31, pp. 934–937, Springer, 2010. （查読付き）（In 6 $ ^{th} $ World Congress on Biomechanics held at Singapore, 1·6 August 2010.）

## （3） 出願特許

アズラン・アズヒム、田中真人、村松和明、峰崎進、遠藤修（2009）「生体組織の処理方法」特願2009-192608
（４）シンポジウム、セミナー等の開催（主催のもの）

特に記載すべき事項はない。

（５）マスコミ等への公表・報道等

特に記載すべき事項はない。

(6) その他

特に記載すべき事項はない。
### 8 \. 引用文献

1) Takano, A., Tanaka, M. and Futai, N. (2012). On-chip CO $ _{2} $ incubation for pocket-sized microfluidic cell culture. Microfluid. Nanofluidics. 12, 907–915.

2) Furuyama A, and Mochitate K. (2000). Assembly of the exogenous extracellular matrix during basement membrane formation by alveolar epithelial cells in vitro. J. Cell Sci. 113, 859-868.

3) Furuyama A, Hosokawa T, and Mochitate K. (2008). Interleukin-1beta and tumor necrosis factor-alpha have opposite effects on fibroblasts and epithelial cells during basement membrane formation. Matrix Biol., 27, 429-440.

4) Takeichi, M. (1991). Cadherin cell adhesion receptors as a morphogenetic regulator. Science. 251, 1451-1455.

5) Ebnet, K. (2008). Organization of multiprotein complexes at cell–cell junctions Histochem, Cell Biol, 130, 1-20.

6) Smith, A.L., Dohn, M.R., Brown, M.V. and Reynolds, A. B. (2012). Association of Rho-associated protein kinase 1 with E-cadherin complexes is mediated by p120-catenin. Mol. Biol. Cell. 23, 99-110.

7) Haussinger, D., Ahrens, T., Aberle, T., Engel, J., and Grzesiek, S. (2004). Proteolytic E-cadherin activation followed by solution NMR and X-ray crystallography. EMBO J. 23, 1699-1708.

8) Pertz, O., Bozic, D., Koch, A. W., Fauser, C., Brancaccio, A. and Engel, J. (1999). A new crystal structure, $ Ca^{2+} $ dependence and mutational analysis reveal molecular details of E-cadherin homoassociation. EMBO J. 18, 1738-1747.

9) Maniatis, T., Sambrook, J. and Fritsch, E. F. (1982). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY.

10) Kingston, R.E., Chen, C.A., and Okayama, H. (2003). Calcium phosphate transfection. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 20, Unit 20.3. Wiley, Hoboken, NJ.

11) Towbin, H. and Gordon, J. (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 76, 4350-4354.

12) Laemmli, U. K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685.
### 8. 参考资料

A: プラスミドの構築に用いた合成オリゴヌクレオチドの配列

• SP-Ecad : GGCCATGGGCCCTTGGAG

• ASP-Ecad : GACTCGAGCTAGTCGTCCCTCGCCG

• pCMV-F : AATGTCGTACACAACTCC

• S-hEcad475 : CCTCCCATCAGCTGCCCC

• S-hEcad1075 : GCAACAGCTGTGATCAC

• S-hEcad1577 : GGAGAGACACTGCCAAC

• S-hEcad2175 : GCTGCTCTTGCTGTTTC

SV2-R3 : TCAGTTCCATAGGTTGG

• AS-hEcad554 : TGTGCCTTCCTACAGAC

• AS-hEcad1154 : AAGTCCTCGGACACTTC

• AS-hEcad1854 : CCTCCTGGGTGAATTCG

• AS-hEcad2454 : TCCTTTGTCGACCGGTG

• S-hEcad11: GGAGCCGCAGCCTCTCGGCGCTGCTG

• AS-Ecad11: CAGCAGCGCCGAGAGGCTGCGGCTCC

• S-hEcad2122 : CCTGCCATTCTGGGGATTCTTGGAGGAATTCTTG

• AS-Ecad2122 : CAAGAATTCCCTCCAAGAATCCCCAGAATGGCAGG

• SP-Xba1-hCDH1 : CCTCTAGACACCATGGGCCCTTGGAG

• ASP-MCS-hCDH1 : CCAAGCTTAAACTCGAGAAGATCTGTCGTCCCTCGGCCGCC

• SP-Bgl2-6His-TAA-noXho1 : GATCTCATCATCACCATCACCATTAAAG

• ASP-Bgl2-6His-TAA-noXho1 : TCGACTTAATGGTGATGGTGATGATGA

• pBApo-R : CCTTCCGGTATTGTCTCC

## B: pBApoK2-hCDH1の塩基配列

新たに構築したpBApoK2-hCDH1の配列を以下に示す。

【pBApoK2-hCDH1の塩基配列】

GAATTCTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAATGGCCCGCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTGGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGGATCCTCTAGACACCATGGGCCCTTGGAGCCGCAGCCTCTCGGCGCTGCTGCTGCTGCTGCAGGTCTCCTCTTGGCTCTGCCAGGAGCCGGAGC
CCTGCCACCCTGGCTTTGACGCCGAGAGCTACACGTTCACGGTGCCCCCGGCGCCACCTGGAGAGAGGCCGCGTCCTGGGCAGAGTGAATTTTGAAGATTGCACCGGTCGACAAAGGACAGCCTATTTTTCCCTCGACACCCGATTCAAAGTGGGCACAGATGGTGTGATTACAGTCAAAAGGCCTCTACGGTTTCATAACCACAGATCCATTTCTTGGTCTACGCCTGGGACTCCACCTACAGAAAGTTTTCCACCAAAGTCACGCTGAATACAGTGGGGCACCACCACCGCCCCCGCCCCATCAGGCCTCCGTTTCTGGAATCCAAGCAGAATTGCTCACATTTCCCCAACTCCTCTCCTGGCCTCAGAAGACAGAAGAGAGACTGGGTTATTCCTCCCATCAGCTGCCCAGAAAATGAAAAAGGCCCATTCCTAAAACCTGGTTCAGATCAAATCCAACAAAGACAAGAAGGCAAGGTTTTCTACAGCATCACTGGCCAAGGAGCTGACACACCCCCTGTTGGTGTCTTTATTATTGAAAGAGAAACAGGATGGCTGAAGGTGACAGAGCCTCTGGATAGAGAACGCATTGCCACATACACTCTCTTCTCTCACGCTGTGTCATCCAACGGGAATGCAGTTGAGGATCCAATGGAGATTTTGATCACGGTAACCGATCAGAATGACAACAAGCCCGAAATTCACCCAGGAGGTCTTTAAGGGGTCTGTCATGGAA GGTGCTCTTCCAGGAACCTCTGTGATGGAGGTCACAGCCACAGACGCGGACGATGATGTGAACACCTACAATGCCGCCATCGCTTACACCATCCTCAGCCAAGATCCTGAGCTCCCTGACAAAAATATGTTCACCATTAACAGGAACACAGGAGTCATCAGTGTGGTCACCACTGGGCTGGACCGAGAGAGTTTCCCTACGTATACCCTGGTGGTTCAAGCTGCTGACCTTCAAGGTGAGGGGTTAAGCACAACAGCAACAGCTGTGATCACAGTCACTGACACCAACGATAATCCTCCGATCTTCAATCCCACCACGTACAAGGGTCCAGGTGCCTGAGAACGAGGCTAACGTCGTAATCACCACACTGAAAGTGACTGATGCTGATGCCCCCAATACCCCAGCGTGGGAGGCTGTATACACCATATTGAATGATGATGGTGGACAATTTGTCGTCACCACAAATCCAGTGAACAACGATGGCATTTTGAAAACAGCAAAGGGCTTGGATTTTGAGGCCAAGCAGCAGTACATTCTACACGTAGCAGTGACGAATGTGGTACCTTTTGAGGTCTCTCTCACCACCTCCACAGCCACCGTCACCGTGGATGTGCTGGATGTGAATGAAGCCCCCATCTTTGTGCCTCCTGAAAAGAGAGTGGAAGTGTCCGAGGACTTTGGCGTGGGCCAGGAAATCACATCCTACACTGCCCAGGAGCCAGACACATTATGGAACAGAAAATAACATATCGGATTTGGAGAGACACTGCCAACTGGCTGGAGATTAATCCGGACACTGGTGCCATTTCCACTCGGGCTGAGCTGGACAGGGAGGATTTTGAGCACGTGAAGAACAGCACGTACACAGCCCTAATCATAGCTACAGACAATGGTTCTCCAGTTGCTACTGGAACAGGGACACTTCTGCTGATCCTGTCTGATGTGAATGACAACGCCCCCATACCAGAACCTCGAACTATATTCTTCTGTGAGAGGAATCCAAAGCCTCAGGTCATAAACATCATTGATGCAGACCTTCCTCCCAATACATCTCCCTTCACAGCAGAACTAACACACGGGGCGAGTGCCAACTGGACCATTCAGTACAACGACCCAACCCAAGAATCTATCATTTTGAAGCCAAAGATGGCCTTAGAGGTGGGTGACTACAAAATCAATCTCAAGCTCATGGATAACCAGAATAAAGACCAAGTGACCACCTTAGAGGTCAGCGTGTGTGACTGTGAAGGGGCCGCTGGCGTCTGTAGGAAGGCACAGCCTGTCGAAGCAGGATTGCAAATTCCTGCCATTCTGGGGATTCTTGGAGGAATTCTTGCTTTGCTAATTCTGATTCTGCTGCTCTTGCTGTTCTTCGGAGGAGAGCGGTGGTCAAGAGCCCTTACTGCCCCCAGAGGATGACACCCGGGACAACGTTTATTACTATGATGAAGAAGGAGGCGGAGAAGAGGACCAGGACTTTGACTTGAGCCAGCTGCACAGGGGCCTGGACGCTCGGCCTGAAGTGACTCGTAACGACGTTGCACCAACCCTCATGAGTGTCCCCCGGTATCTTCCCCGCCCTGCCAATCCCGATGAAATTGGAAATTTTATTGATGAAAATCTGAAAGCGGCTGATACTGACCCCACAGCCCCGCCTTATGATTCTCTGCTCGTGTTTGACTATGAAGGAAGCGGTTCCGAAGCTGCTAGTCTGAGCTCCCTGAACTCCTCAGAGTCAGACAAAGACCAGGACTATGACTACTTGAACGAATGGGGCAATCGCTTCAAGAAGCTGGCTGACATGTACGGAGGCGGCGAGGACGACTAGCTCGAGTTTAAGCTTGGGGGAGGCTAACTGAAACACGGAAGGAGACAATAC
CGGAAGGAAACCCGCGCTATGACGGCAATAAAAAGACAGAATAAAACGCACGGTGTTGGGTCGTTTGTTCATAAACGCGGGGGTTCGGTCCCAGGGCTGGCACTCTGTCGATACCCCACCGAGACCCCATTGGGGAGCTTGATATCGATAGCTTGGCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGACCGATCGCCCTTCCCAAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTACGCATCTGTGCGGTATTTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTC TAAATACATTCAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAA AAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTC CTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGT GGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTT CCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAG AGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAAGTACTCACCAGTCACAGAAAA GCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACT GCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGG GGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCG TGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACT CTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCT CGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTAT CATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAG GCAACCTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAAC TGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCT AGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCG TCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTT GCAAACAAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTC CGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGG CCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTG CTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCA GCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACT GAGATACCTACAGCGTGAGCATTGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTA TCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTA TCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGG GGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTT TGCTCACATGCATGTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCCAGCAG GCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCC AGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCG
CCCATCCCGCCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCTCGATCGAGGAACTGAAAAACCAGAAAGTTAACTGGTAAGTTTAGTCTTTTTTGTCTTTTATTTTCAGGTCCCGGATCTACCATGACCGAGTACAAGCCCACGGTGCGCCTCGCCACCCGCGACGACGTCCCCGGGCCGTACGCACCCTCGCCGCCGCGTCGCCGACTACCCCGCCACGCGCCACACCGTCGACCCGGACCGCCACATCGAGCGGGTCACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCTCACGCGCGTCGGGCTCGACATCGGCAAGGTGTGGGTCGCGGACGACGGCGCCGCGGTGGCGGTCTGGACCACGCCGGAGAGCGTCGAAGCGGGGGCGGTGTTCGCCGAGATCGGCCCGCGCATGGCCGAGTTGAGCGGTTCCCGGCTGGCCGCGCAGCAACAGATGGAAGGCCTCCTGGCGCCGCACCGGCCCAAGGAGCCGCGTGGTTTCCTGGCCACCGTCGGCGTCTCGCCCGACCACCAGGGCAAGGGTCTGGGCAGCGCCGTCGTGCTCCCCGGAGTGGAGGCGGCCGAGCGGCGCCGGGGTGCCCGCCTTCCTGGAGACCTCCGCGCCCCGCAACCTCCCCTTCTACGAGCGGCTCGGCTTCACCGTCACCGCCGACGTCGAGGTGCCCGAAGGA CCGGCACCTGGTGCATGACCCGCAAGCCCGGTGCCTGAAGATCCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTATGGCTGATTATGATCGAATCGATATC

C: pBApoK2-hCDH1の制限酵素地図

図C. pBApoK2-hCDH1の制限酵素地図