Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
2011.

12) 持立克身，粂昭苑，曾勤，小高真希，白木伸明，樋口裕一郎，永野麗子：日本結合組織学会・マトリックス研究会合同シンポジウム2“再生医療・臓器再生・人工臓器とマトリックス工学”(2011)「基底膜構造体を培養基質に用いた幹細胞の分化と機能発現」

13) 大鳥秀貴, 上原篤詞, 貝沼美帆, 工藤優佳子, 東山拓海, 今大健, 持立克身, 菊池英明, 古屋泰文: 第21回インテリジェント材料システムシンポジウム(2012)

「表面弾性波(SH-SAW)基板に培養した細胞の損傷による信号変化」

14）東山拓海，大鳥秀貴，貝沼美帆，工藤優佳子，持立克身，菊池英明，古屋泰文：日本機械学会東北学生会第42回卒業研究発表講演会（2012）

「SAW デバイス基板上の SV40-T2 培養細胞の薬液（過酸化水素）損傷に伴う SI

15) H. Otori, A. Uehara, M. Kainuma, Y. Kudo, T. Higashiyama, T. Kon, K. Mochitate, H. Kikuchi, Y. Furuya: The International Workshop on Piezoelectric Materials and Applications (IWPMA) 2012 (2012) “Signal Change of Surface Acoustic Wave (SAW) by H $ _{2} $ O $ _{2} $ Damage to SV40-T2 Cells Cultivated on SH-SAW Sensor”

16) A. TAKANO, K. TAKIZAWA, T. KON, M. TANAKA, Y. FURUYA, N. FUTAI: 1st Progress and Innovation of Smart Materials and Related Technology (PI-SMART2012), Hirosaki, Aomori, 2012

“SAW chip-equipped microfluidic platform for cell-based biosensing.”

17) 二井信行: PI-SMART in 仙台(2012)

「SH-SAW+マイクロ流路の結合型バイオセンサ」

18）柴田昌宏，相澤典男，高野温，大鳥秀貴，今大健，古屋泰文，持立克身，田中真人，福井康裕，二井信行：生体医工学シンポジウム2012(2012)

「培養細胞単層の粘弾性測定の横波表面弾性波による計測」

19）相澤典男，柴田昌宏，高野温，福井康裕，田中真人，二井信行：生体医工学シンポジウム2012(2012)

「マイクロ流体チップへの細胞播種自動化プロセス」

20) N. FUTAI: $ 5^{th} $ International Conference on Biosensors, Biochips, and Bioelectronic Devices (BIOTRONICS2012), Gwangju, Korea, 2012

“All-in-one Pocket-sized Long-term Cell Culture System Using Braille-based Microfluidics and On-Chip CO $ _{2} $ Incubation.”

21）高野温，柴田昌宏，大鳥秀貴，今大健，古屋泰文，持立克身，福井康裕，田中真人，二井信行：日本生体医工学会関東支部若手研究者発表会2012(2012)

「オンチップCO2インキュベーション下で培養した細胞の表面弾性波による挙動解析」

22) A. TAKANO, S. INOMATA, T. OGAWA, N. FUTAI, M. TANAKA: American Society for Cell Biology (ASCB) 2012 Annual Meeting, San Francisco, CA, USA (2012)

“Applications of the microfluidic cell culture system with on-chip CO $ _{2} $ incubation for cell biology.”

23) 東山 拓海，大鳥 秀貴，工藤優佳子，磯野 晶宏，今 大健，持立 克身，菊池 英明，古屋 泰文：第 22 回 インテリジェント材料／システムシンポジウム (2013)

「SH-SAW 電極間に培養した SV40-T2 細胞の薬液損傷モニタリング」

24) A. TAKANO, M. TANAKA, N. FUTAI: 35th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, Osaka, Japan (2013) (accepted) "Microfluidic cell culture system with on-chip hypoxic conditioning."

### 7. 研究者略历

課題代表者: 持立 克身

独立行政法人国立環境研究所環境健康研究センター、フェロー

(1): 持立 克身（同上）

(2): 古屋 泰文

弘前大学大学院理工学研究科 教授

(3): 菊地 英明
弘前大学農学生命科学部 教授

(4): 田中 真人

東京電機大学理工学部 教授

(5): 二井 信行

東京電機大学総合研究所 助教
C-0803 人工組織ナノデバイスセンサー複合体を活用した多角的健康影響評価システムの開発に関する研究

(1) 人工組織ナノデバイスセンサー複合体を活用した多角的健康影響評価システムの開発に関する研究

（独）国立環境研究所 環境健康研究センター 持立 克身・中村 宣篤・戸勤

大篭 敬子・佐藤 薫

環境計測研究センター 中村 みなみ

平成21～24年度累計予算額：39,235千円（うち、平成24年度：6,830千円）

予算額は、間接経費を含む。

平成20年度はナノテクノロジーを活用した環境技術開発推進事業予算にて実施。

## [要旨]

表面弾性波（SH-SAW）伝搬面で細胞培養を実施するために、表面改質を検討した。生物由来の細胞接着蛋白は、コラーゲンやフィブリン等のマトリックス蛋白に吸着固定されることで、細胞に対する接着リガンドを提示するように分子進化して来た。しかし、SH-SAW 伝搬面はコラーゲンやフィブリンとは異なるので、本来備わった性質で安定吸着することが難しい。そこで、a）生物由来の細胞接着蛋白に代わって、化学合成（擬似）マトリックスを考案した。擬似マトリックスは、複数個の疎水性側鎖Rと基質との疎水結合によって、基質への安定した吸着を可能とする。b）擬似マトリックスの側鎖に結合する細胞接着リガンドには、インテグリン接着受容体に対しては、RGD配列を持つFIB·1ペプチドを用いた。シンデカン（syndecan）接着受容体に対しては、ラミニンペプチドを用いた。

影響評価細胞としては、SV40-large T 抗原で不死化したラット肺胞2型上皮（SV40-T2）細胞を用いて、SH-SAW チップ上に標的上皮組織を形成した（SH-SAW バイオナノ協調体）。更に、ヒトＥＳ細胞から分化誘導することで、影響評価細胞を得ることが出来ないか検討した。Feeder細胞の混入による信号への摂動が懸念されることから、自主開発した基底膜構造体形成技術を用いてヒトラミニン-511の基底膜基質を作製し、feeder細胞は用いない分化培養方法について検討した。環境汚染物質に対する感受性が高い組織の一つである神経や血管内皮への分化誘導を検討した。

SH-SAW 信号が、伝搬面上に形成した上皮組織によってどの様な機構で変調を受けるか解析するため、東京電機大学と共同で、細胞・基質間結合や細胞・細胞間結合を変えた、種々の HEK293 recombinants を試作して、バイオナノ協調体の作製に供した。

## [キーワード]

疎水化、擬似マトリックス、SV40-T2 細胞、細胞接着、基底膜基質
### 1. はじめに

環境中には多くの化学物質が存在し、また、多くの化学物質が新たに製造・使用されようとしていることから、化学物質の安全性、あるいは、医薬品等の副作用を迅速に評価することは最重要課題のひとつである。代表的な化学物質の影響評価手法には、曝露を受けた組織や細胞を採取・破砕し、その後、標的成分を抽出・分離・分析する方法がある。しかしこれには、結果を得るまでに労力と時間が掛かり、侵襲的であり、暴露装置や分析装置等、多種類の大がかりで高額な周辺装置が必要となる。他方、バイオアッセイ法には、化学発光法を用いて特定遺伝子の発現や代謝全般への影響で評価をする方法、あるいはミジンコ等の微生物の行動観察、微生物の発光酵素の減衰から毒性を評価する方法等が開発され、前者に比べればいずれも安価で成果を上げているが、影響評価が限定的である欠点はぬぐえない。現時点では、より高い確度をもって判定するには、動物実験に頼らざるを得ない。動物実験は高い信頼性を持つ一方で、有意な結論を得るには、個体差や定量性に十分に留意する必要がある。最近では、倫理面から動物実験はできるだけ少なくしようとする動きが、国際的には加速されつつある。このような社会情勢と測定技術が抱える問題点を考慮し、平成15・19年度に「バイオナノ協調体による有害化学物質の生体影響の高感度・迅速評価技術の開発」プロジェクトが開始された。

## 2 ．研究開発目的

“バイオナノ協調体”とは、新規素材上に自在に人工組織を形成するバイオテクノロジーと、ナノテクノロジーを活用したセンサー技術を融合させた、従来の範疇には属さない新規バイオセンサーで、人工組織から発信されるシグナルを直下のセンサー媒体が直接感応できるように、インターフェースの役割を担う化学合成（擬似）マトリックスによって両者が一体化した“人工組織－ナノデバイスセンサー複合体”である。

我々の体は、多く種類の臓器から構成されている。それぞれの臓器は、外界に接している上皮組織、循環器系の一員である血管内皮組織、及び両者間を充当する形で存在する間充緯等から構成されている。外界に接している上皮組織は、有害化学物質や微生物等の異物の侵入に常に曝されている。他方、血管内皮組織は、侵入した異物が体内に拡散する過程で集積する組織であり、上皮組織とは違った形で異物の影響に曝されている。上皮組織としての最小単位は上皮細胞と基盤となる基底膜構造体から、血管内皮組織としての最小単位は血管内皮細胞と基盤となる基底膜構造体から構成されており、さらにその下部には線維芽細胞や平滑筋細胞等から成る間充緯が存在する。

本研究では、上皮組織や血管内皮組織と同等の機能を有し、外部刺激に対する細胞応答信号を発信できる人工組織を、機能協調を可能にする擬似マトリックスを介して、非侵襲的に、連続して、高感度に検出できるナノ構造体上に構築した"バイオナノ協調体"を創製する。このバイオナノ協調体を用いて、動物実験系を一部代替し、既存・新規化学物質の安全性評価、並びに医薬品としての副作用を、迅速・高効率に実現する手法の確立をめざす。

### 3. 研究開発方法

（１）SAWチップ上での細胞培養に関わる幾つかの課題

1）SH-SAW 伝搬面の改質
## a）化学合成（擬似）マトリックスコートによる細胞接着性の確保

センサーとして用いる電子デバイス表面は、生体組織とは異なるので、常套手段である生物由来の細胞外マトリックス（コラーゲンやフィプロネクチン等）を用いても、細胞外マトリックスのコートが不安定で、その結果細胞の接着は安定しない。そこで、ポリエチレンポリマーを主鎖とし、側鎖に疎水性基（R=phenyl, OCnH2n+1）と無水マレイン酸を持つ、化学合成（擬似）マトリックスを合成した。疎水性基Rは、それぞれの電子デバイスに適した疎水性基を選択することで、電子デバイスと安定な疎水結合を形成でき、無水マレイン酸は、種々の細胞接着リガンドである合成ペプチドと共有結合できる。この擬似マトリックスをインターフェースに用いることで、細胞は電子デバイス上で安定した細胞接着が可能になる。図(1)-1に、擬似マトリックスの構造を示した（特許No.4555773, US Patent No. 8304238）。

擬似マトリックスによる細胞接着性の試験には、SV40-large T 抗原で不死化したラット肺胞2型上皮（SV40-T2）細胞を用いた。先ず、SV40-T2細胞を、FBSを含まないDMEM培地に6.0x10^{5} cells/mlの濃度に懸濁し、擬似マトリックスをコートした96穴培養皿に、各々100μl播種した。1日間CO_{2}インキュベータ内で培養した後、メタノール100μlで固定し、0.4%クリスタルバイオレット50μlで染色、595nmの吸光度を測定した。

図(1)-1. 化学合成（擬似）マトリックスの構造
擬似マトリックスをコートした SH-SAW 伝搬面上に於ける上皮細胞の形態は、長期培養によってどの様に変化するか、位相差顕微鏡及び電子顕微鏡を用いて観察した。電子顕微鏡による観察に際しては、SAWチップ上で培養した細胞を定法に従って2.5％グルタルアルデヒドで固定し、走査型電子顕微鏡（SEM）及び透過型電子顕微鏡（TEM）観察のために、試料をプロセスした。

## （２）多角的毒性検査に適した影響評価細胞の種類を拡充する方法

バイオナノ協調体に用いる影響評価細胞は、幾つかの要件を満たす必要がある。

①センサーの特性に合致する。

②正常细胞である。癌细胞由来ではない。

③遺伝的形質が安定している。

センサーの特質に依存して、計測される細胞や組織の状態に対する認識は変わって来る。今回用いたSH-SAWセンサーに於いては、センサー表面を伝搬する表面弾性波が、播種した細胞の基底面を含む近傍の誘電率及び粘弾性の状態を反映して変調を受ける。この特性を計測結果に感度良く反映させるには、播種した細胞がSH-SAW伝搬面に、極近距離で強く接着している必要がある。この目的を達成するため擬似マトリックスには、インテグリン接着受容体に呼応したRGD配列ペプチド、及び、シンデカン接着受容体に呼応したラミニンα鎖G4領域接着ペプチドを用意した（図(1)-1）。もう一方で、シンデカン接着受容体を介した細胞接着の安定を図るため、HEK293細胞に上皮細胞のシンデカン遺伝子を強制発現させたrSN細胞を作製した。更に東京電機大学と共同で、細胞-細胞間結合形成に必須なE-カドヘリンも同時に強制発現させたrSN/Ecad細胞を作製し、これらの細胞を弘前大学の共同研究者に提供した。

## （３）ヒトＥＳ細胞から影響評価細胞を調製する方法

これまで大気汚染物質の毒性評価に用いて来たラット肺胞2型上皮（SV40-T2）細胞や（2）で作製した細胞は、適度の増殖性能を持ち、調製が比較的簡単であり、SH-SAWバイオナノ協調体の測定原理を解析するには好都合である。しかし、生体影響評価に用いる細胞としては、別の観点から新たな細胞を準備しておく必要がある。SV40-T2細胞、或いは、HEK293系列の細胞は癌細胞ではなく、意図的に不死化した細胞ではあるが、正常組織から採取した初代培養細胞の方が、生体影響評価という観点からはより適切であろう。但し、初代細胞の調製は煩雑であり、継代数も限られる。特にヒトの細胞を用いる場合は、ロット毎に遺伝的形質が変動する不確定性もある。これらの点を勘案し、ヒトES細胞を分化誘導することで、目的の成熟した標的細胞を得ることが出来るか検討した。

これまでは、種々の feeder 細胞との共培養で hES 細胞から分化誘導するのが常套手段であったが、feeder 細胞の混入により毒性評価の閾値が変動する可能性もあるので、feeder 細胞を用いない分化誘導を検討する必要がある。そこで、rLN-10 細胞から作製したヒトラミニン-511 の基底膜基質（hLN10-sBM）を用い、feeder 細胞は用いない分化培養方法について検討した（図(1)-2）。この培養基質を用いることで、マウス／ヒトES 細胞から膵島β細胞や肝実質細胞へ分化誘導できることが、既に熊本大学・発生医学研究所との共同研究で確立
している $ ^{1-3} $ ）。本研究では、環境汚染物質に対して感受性が高い組織の一つである神経や血管内皮を選択し、hES細胞からの分化誘導について検討した。

図(1)-2. 基底膜基質上でのhES細胞由来前駆細胞の培養

具体的には、hES 細胞から神経や血管内皮細胞にまで分化誘導させ、そこから目的の細胞を単離するのは、多大な労力と時間が掛かるので効率が悪い。そこで、市販されているhES H9株由来神経前駆細胞や血管内皮前駆細胞（メルクミリポア，SCR055及びSCR221）を購入し、これらの前駆細胞からhLN10-sBM基質上で成熟誘導させる方法を検討した。

## 4 ．結果及び考察

## （１）SAWチップ上での細胞培養

1）SH-SAW 伝搬面の改質：化学合成（擬似）マトリックスコートによる細胞接着

マウス・ラミニンのα鎖G4領域に存在する細胞接着領域は、細胞表面のシンデカン接着受容体に結合し、受容体の一部であるヘパラン硫酸と類似の構造を持つヘパリンによって、結合阻害をうける。このことを利用し、α1鎖からα5鎖までの全てのα鎖（α1－α5鎖）G4領域の代表的な接着ペプチドを合成し、MASTまたはMMACポリマー（R=phenyl, OCH₃）と反応させ、その細胞接着性能を、ラット不死化肺胞2型上皮（SV40-T2）細胞を用いて検討した。培養溶液には、遊離の接着ペプチドを共存させるか（図(1)-3）、もしくは固相化した接着ペプチドに1mg/mlヘパリン処理を行い（図(1)-4）、結合阻害の有無も検討した。
図(1)-3. 固相化したラミニンα鎖G4領域ペプチド及びRGDペプチドに対する肺胞上皮細胞の接着及び同一の遊離ペプチドによる接着阻害

図(1)-4. 固相化したラミニンα鎖G4領域ペプチド及びRGDペプチドに対するヘパリン処理による肺胞上皮細胞の接着阻害

対照には、フィブロネクチン（FN）をコートした。何れのペプチドもFNと同程度の細胞接着能を示したが、□で囲んだペプチドは、遊離ペプチドやヘパリンによる接着阻害が明確
に認められ、これらのペプチドをSH-SAW伝搬面に対する細胞接着の為のリガンドに用いることにした。インテグリン接着受容体に対するRGDペプチドとして、FIB-1も併せて検討した。

## 2 ）SAWチップ上での長期細胞培養に於ける細胞形態

表面改質したLiTaOx のSAWチップ上に、SN&Ecad 細胞を播種し、約1週間培養した。培養後、定法により細胞を2.5％グルタルアルデヒドで固定、走査型電子顕微鏡で細胞-細胞間結合を観察した（図(1)-5）。

293

SN&Ecad 細胞は、正常に密着結合を形成しているのが観察された。また、syndecan-2 遺伝子のみ遺伝子導入した SN細胞も、上面に起伏があるが、ほぼ正常な密着結合を形成していた。しかし、親株の293細胞は、細胞-細胞間結合が不完全で、細胞同士が重層している個所や、内部に通ずる空洞も観察された。

図(1)-5. LiTaOx SAW チップ上に播種した 上皮細胞の密着結合. 培養期間は約1週間。 Bar : 10 μm。

SN&Ecad細胞を2週間培養すると、細胞・細胞間結合の個所に、内部に通じる空洞が僅かだが出現するようになった（図(1)-6A）。また、透過型電子顕微鏡による観察では、プラスチック培養皿での培養と同様、細胞が重層もしくは擬重層を呈した。親細胞の293細胞由来だと推測される（図(1)-6B）。

A

図(1)-6. LiTaOx SAW チップ上に播種したSN&Ecad 細胞の走査型（A）及び透過型（B）電子顕微鏡写真 培養期間は2週間。
位相差顕微鏡による観察では、培養期間が2週間に達する辺りから、所々細胞がドーム形成により脱落しては周囲の細胞が伸展移動して覆われた個所が認められるようになった（図(1)-7）。

以上のことから、

①擬似マトリックスをコートすることは、細胞-基質間結合のみならず、細胞-細胞間結合にも重要である。

②SAWチップ上における上皮細胞の培養期間は、現時点では2週間が最長と推測される。

図(1)-7. LiTaOx SAW チップ上に播種したSN&Ecad 細胞の位相差顕微鏡写真 培養条件は、図(1)-6 と同じ。○印で囲んだ個所では、局所的な細胞の脱落後に細胞伸展が起こったことを伺わせる。

（２）多角的毒性検査に適した影響評価細胞の種類を拡充する方法 東京電機大学の報告に記載。

## （３）ヒトＥＳ細胞からの影響評価細胞の調製

1）ヒトラミニン-511 の基底膜基質の作製

これまでは、先ず culture insert のプラスチック性多孔性薄膜上に I 型コラーゲン線維基質を作製した。次に、その I 型コラーゲン線維を MAST-oligoGlcNAc でコートした上に、ヒトラミニン-511 を遺伝子導入した HEK293 recombinant（rLN-10 細胞）を播種することで、ラミニン-511 の基底膜構造体を形成した。最後に、形成された基底膜構造体は温存し、rLN-10 細胞のみを除去することにより、基底膜基質（rLN10-sBM）を調製した $ ^{1,3} $ （図(1)-8）。
図(1)-8 rLN10細胞を用いて作製した rLN-511 sBM $ ^{1)} $

rLN10細胞の基底面直下に基底膜緻密板が形成され、細胞の除去によって基底膜が露出する。基底膜には、構成成分のラミニンやⅣ型コラーゲンの集積が認められる。左図において、上図は細胞を剥離する前、下図は細胞剥離後のTEM。↑は基底膜緻密板、△はanchoringfilaments。右下図は、細胞剥離後の基底膜表面のSEM。基底膜構造体の穴から、下部のコラーゲン線維が覗き見える。免疫蛍光染色像（右上中）において、緑色はラミニンやⅣ型コラーゲン蛋白の集積個所を示す。赤は核染色。

しかしながら、この方法はルーティンの継代培養には向いていない。また、分化誘導を掛けて多量の成熟細胞を調製するにも適さない。そこで、rLN10-sBMの調製方法を簡素化した。先ず、I型コラーゲン線維基質作製の工程を省き、培養ウェルや培養フラスコに直接MAST-oligoGlcNAcコートした後、rLN-10細胞を播種して、基底膜基質（rLN10-p.sBM）を作製した。このrLN10-p.sBM基質上で、hES由来の前駆細胞を播種・培養した（図(1)-2）。

従来の考えに従えば、hES細胞を培養して影響評価細胞に分化誘導するのが穏当である。しかし、この分化誘導には、一般に長期間の培養を必要とする点、目的の細胞以外の細胞にも分化が起こる点、目的の成熟細胞を単離する際に細胞傷害を起こす恐れや細胞数の損出、異なる細胞の混入等を勘案すると、影響評価細胞を調製する方法としては著しく効率が悪い。そこで、市販のhES由来前駆細胞を雛形として、前駆細胞として継代・増殖させることが出来るか、また、必要に応じ成熟細胞に誘導できるか検討した。その結果、神経前駆細胞については、図(1)-2の方法で継代培養でき、BDNF（Brain-derived neurotrophic factor）の添加によって、安定した神経分化が実現した（図(1)-9）。しかし、血管内皮前駆細胞につい
図(1)-9 hLN-511基底膜基質上での神経前駆細胞の継代培養と神経分化

図(1)-10 hLN-511基底膜基質上での血管内皮前駆細胞の継代培養

ては、他の細胞外マトリックスを用いた場合よりも、細胞の形態も比較的整っていたが、HPAEC (Human Pulmonary Arterial Endothelial Cell)、HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cell)、LMVE (Lung MmicroVascular Endothelial Cell) の様には、分化誘導できなかった（図(1)-10）。血管内皮細胞は、環境影響評価細胞として重要であり、ラミニン-511の基底膜基質（rLN10-p.sBM）に代わって、血管内皮組織の直下に存在する基底膜成分であるラミニン-411等の基底膜基質を開発し、成熟した内皮細胞への分化誘導に向けて更に検討を進める必要がある。

## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

a）電子素子上での細胞培養
従来、培養細胞による in vitro 毒性試験は、プラスチック培養皿内で培養された細胞に試験物質を投与し、生化学的、形態学的影響を解析して、試験物質の毒性を評価するのが常套手段であった。今回、絶縁処理を施した表面弾性波（SH-SAW）素子上での細胞培養が可能になったことで、細胞が被る生体影響を直接 SH-SAW 素子の特性を活かして計測することが可能になった。

本研究で開発したのは、従来の抗体や酵素を用いた抗体型や酵素型バイオセンサの様に、単に特定物質の計測を行うのではなく、環境汚染物質や環境化学物質による生体影響を「細胞や組織に対する機能的・構造的変化」として計測する、新しい概念に基づくバイオセンサである。

## b）電子素子の表面改質

電子素子上で細胞培養を可能にする新規手段が提示された。培養細胞を電子素子表面に細胞接着させるためのインターフェースとなる化学合成（擬似）マトリックスの発明である。擬似マトリックスは、SH-SAW伝搬面の表面構造に適合した疎水性側鎖Rを選択することで、LiTaOx伝搬面に安定結合した。この表面改質によって、SH-SAWの伝搬面で安定した細胞接着が可能になった。

## （２）環境政策への貢献

## ＜行政が既に活用した成果＞

特に記載すべき事項はない。

## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

特定物資をモニターするのではなく、細胞や組織に対する機能的・構造的变化を計測できるバイオナノ協調体を用いることで、これまで本格的な健康影響評価が手つかずだった環境化学物質について、相互に比較が可能な形で毒性試験が可能になる。その結果を元に、毒性をランク付けし、監視対象の絞り込みと重点化に貢献できる。

## 6 ．国際共同研究等の状況

特に記載すべき事項はない。

### 7. 研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

## <論文（査読あり）>

1) H. OTORI, T. HIGASHIYAMA, A. UEHARA, M. KAINUMA, Y. KUDO, T. KAMIMURA, T. KON, K. MOCHITATE, H. KIKUCHI, Y. FURUYA, Sensors and Actuators: A, Physical

“Signal Change of Surface Acoustic Wave (SAW) Caused by $ H_{2}O_{2} $ Damage to SV40-T2 Cells Cultivated on SH-SAW Sensor.” (in press)

2) N. SHIRAKI, T. YAMAZOE, Z. QIN, K. OHGOMORI, K. MOCHITATE, K. KUME, and S. KUME. PLoS One 6(8):e24228 (2011) Efficient Differentiation of
Embryonic Stem Cells into Hepatic Cells in vitro Using a Feeder-Free Basement Membrane Substratum.

3) Y. HIGUCHI, N. SHIRAKI, K. YAMANE, Z. QIN, K. MOCHITATE, K. ARAKI, T. SENOKUCHI, K. YAMAGATA, M. HARA, K. KUME and S. KUME. Synthesized Basement Membranes Direct the Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Pancreatic Lineages. J. Cell Sci. 123: 2733-2742 (2010)

くその他誌上発表（査読なし）>

1) 永野麗子，細川剛，古山昭子，持立克身：基底膜構造体を培養基質に人工組織の構築，移植，vol.43，10-16（2008）

2) 細川剛，永野麗子，持立克身：再構成基底膜構造体sBM基質－精緻な人工組織構築を可能にする培養基質－,進み続ける細胞移植治療の実際(上巻),遺伝子医学MOOK別冊,211-217(2008)

3) 岩田博夫監修:再生医療製品の許認可と素子工学の新しい試み、シーエムシー出版、109-117(2012)「基底膜基質を用いた組織構築と化学合成マトリックスによる簡素化（執筆担当：持立克身，古屋昭子，白木伸明）」

## （2） 口頭発表（学会等）

1）上原篤詞，貝沼美帆，古屋泰文，成田絵里子，今大健，持立克身：第4回バイオ・ナノテクフォーラムシンポジウム講演要旨集，27pp.(2010)「培養細胞の表面弾性波(SH·SAW)特性変化に着目した環境因子ナノ・バイオセンサ」

2) 上原篤詞，貝沼美帆，古屋泰文，成田絵里子，今大健，持立克身：

日本金属学会講演概要，2010年秋季(第147回)大会，p.170(2010)，

「培養細胞による表面弾性波(SH-SAW)特性変化に着目した環境因子バイオセンサ」

3) 上原篤詞，古屋泰文，貝沼美帆，今大健，持立克身：

第 20 回インテリジェント材料/システムシンポジウム講演要旨集，pp. 10, (2011)

「培養細胞の表面弾性波(SH-SAW)特性変化に着目した環境因子バイオセンサ」

4) M. Kotaka, Z. Qin, N. Shiraki, K. Umeda, K. Kume, S. Kume, and K. Mochitate. Functional hepatic tissue reconstruction with primary hepatocytes on synthesized basement membrane substratum and its application to ES cell differentiation to hepatocytes. KEY Forum in Developmental Biology and Regenerative Medicine, Global COE and IMEG. Sep 8–9, 2011.

5）持立克身，粂昭苑，曾勤，小高真希，白木伸明，樋口裕一郎，永野麗子：日本結合組織学会・マトリックス研究会合同シンポジウム2“再生医療・臓器再生・人工臓器とマトリックス工学”（2011）「基底膜構造体を培養基質に用いた幹細胞の分化と機能発現」

6）柴田昌宏，相澤典男，高野温，大鳥秀貴，今大健，古屋泰文，持立克身，田中真人，福井康裕，二井信行：生体医工学シンポジウム2012(2012)

「培養細胞単層の粘弾性測定の横波表面弾性波による計測」

7) 大鳥秀貴，上原篤詞，貝沼美帆，工藤優佳子，東山拓海，今大健，持立克身，菊池英明，古屋泰文：第21回インテリジェント材料システムシンポジウム（2012）
「表面弾性波(SH-SAW)基板に培養した細胞の損傷による信号変化」

8) 高野温，柴田昌宏，大鳥秀貴，今大健，古屋泰文，持立克身，福井康裕，田中真人，二井信行：日本生体医工学会関東支部若手研究者発表会 2012 (2012)

「オンチップ CO₂ インキュベーション下で培養した細胞の表面弾性波による挙動解析」

9) 東山拓海，大鳥秀貴，貝沼美帆，工藤優佳子，持立克身，菊池英明，古屋泰文：日本機械学会東北学生会第42回卒業研究発表講演会（2012）

「SAW デバイス基板上の SV40-T2 培養細胞の薬液（過酸化水素）損傷に伴う SH-SAW 信号変化」

10) H. Otori, A. Uehara, M. Kainuma, Y. Kudo, T. Higashiyama, T. Kon, K. Mochitate, H. Kikuchi, Y. Furuya: The International Workshop on Piezoelectric Materials and Applications (IWPMA) 2012 (2012),

“Signal Change of Surface Acoustic Wave (SAW) by H $ _{2} $ O $ _{2} $ Damage to SV40-T2 Cells Cultivated on SH-SAW Sensor”

11）東山 拓海， 大鳥 秀貴， 工藤優佳子， 磯野 晶宏， 今 大健， 持立 克身， 菊池 英明， 古屋 泰文：第 22 回インテリジェント材料／システムシンポジウム (2013)

「SH-SAW 電極間に培養した SV40-T2 細胞の薬液損傷モニタリング」

## （３）出願及び成立特許

1) Katsumi MOCHTATE: Cell culture medium and immobilized preparation of cell adhesion protein or peptide. US Patent No. 8304238 (特許查定, 2012年11月6日)

2) Katsumi MOCHTATE: Method of preparing basement membrane. EU Patent No. 1437147（特許査定，2012年6月27日）

3) Katsumi MOCHTATE: Method of preparing basement membrane, method of constructing basement membrane specimen, reconstituted artificial tissue using the basement membrane specimen and process for producing the same. US Patent No. 7,972,852 (特許查定，2011年7月05日)

4) Katsumi MOCHTATE: Method of preparing basement membrane, method of constructing basement membrane specimen, reconstituted artificial tissue using the basement membrane specimen and process for producing the same. US Patent No. 7906332 (特許查定, 2011年3月15日)

5) Katsumi MOCHTATE: Method of preparing basement membrane, method of constructing basement membrane specimen, reconstituted artificial tissue using the basement membrane specimen and process for producing the same. US Patent No. 7399634（特許查定，2008年7月15日）

6) 持立克身：細胞培養基質および細胞接着蛋白質またはペプチドの固相化標品．特許No.4555753（特許査定，2010年7月23）

7) 持立克身：基底膜標品の作製方法．特許4214287（2008年11月14日）

8) 二井信行・田中真人・持立克身：マイクロ流体チップ及び細胞の培養方法．特許公開 2011-206045（2011年10月20日）
9) 持立克身・古屋泰文・細川直裕・林芳幸・三枝康孝・今大健：表面弹性波デバイスバイオセンサ．特許公開2009-002677（2009年1月8日）

## （４）シンポジウム、セミナー等の開催（主催のもの）

特に記載すべき事項はない。

## （５）マスコミ等への公表・報道等

1）持立克身、他弘前大学理工学部，東京電機大学生命工学科．人工組織ナノデバイスセンサー複合体を活用した多角的健康影響評価システムの開発．ナノテクノロジー2012展，2月15・17日，1212．東京

## (6) その他

特に記載すべき事項はない。

### 8 \. 引用文献

1) N. Shiraki, T. Yamazoe, Z. Qin, K. Ohgomori, K. Mochitate, K. Kume, and S. Kume. PLoS One 6(8):e24228 (2011) Efficient Differentiation of Embryonic Stem Cells into Hepatic Cells in vitro Using a Feeder-Free Basement Membrane Substratum.

2) Y. Higuchi, N. Shiraki, K. Yamane, Z. Qin, K. Mochitate, K. Araki, T. Senokuchi, K. Yamagata, M. Hara, K. Kume and S. Kume. Synthesized Basement Membranes Direct the Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Pancreatic Lineages. J. Cell Sci. 123: 2733-2742 (2010)

3) 岩田博夫監修:再生医療製品の許認可と素子工学の新しい試み、シーエムシー出版、109-117(2012)「基底膜基質を用いた組織構築と化学合成マトリックスによる簡素化（執筆担当：持立克身，古屋昭子，白木伸明）」

4) 鈴木喜晴，野水基義：ラミニンアイソフォームの活性部位の多様性と相同性．生化学 73：1215-1220 (2001)
# (2) SAWバイオナノ協調体の開発に関する研究：細胞培養用SH-SAWデバイスの開発

弘前大学

大学院理工学研究科 古屋 泰文・大鳥 秀貴

（株）リバーエレテック 今 大建（研究協力）

平成21～24年度累計予算額：30,540 千円（うち、平成24年度予算額：5,299 千円）予算額は、弘前大学（2），（3）章）としての予算額であり、間接経費を含む。平成20年度はナノテクノロジーを活用した環境技術開発推進事業予算にて実施。

## [要旨]

細胞の集合体である生体組織が外部から受ける種々の刺激（化学的・物理的刺激）に対して生ずる初期反応を、電子素子の特性を活かして直接捕捉することで、複合した環境汚染物質等による生体影響を短時間で評価する方法の開発を目指した。本研究では、細胞培養液中でも伝搬中のエネルギー減衰が少ない水平せん断型表面弾性波（SH-SAW：Shear Horizontal Surface Acoustic Wave）に着目し、培養細胞とSH-SAWチップの一体化（SH-SAWバイオナノ協調体）を図ることで、測定のリアルタイム化を実現した。

(1) バイオセンサとして最適なSAWセンサの基本設計に、開放型浮き電極を採用することで、シングル電極の場合と比べ、ノイズ成分（リップル）の低減化に成功した。

(2) バイオセンサとしてのSH-SAWの計測原理を解析した。SH-SAWの伝搬面上で直接培養する細胞としては、大気汚染物質の代表的標的組織である肺胞上皮として、ラット不死化肺胞2型上皮（SV40-T2）細胞を選択した。

(3) 大気汚染物質による酸化的ストレスを試験評価するために、過酸化水素をモデル化合物に選択し、培養SV40-T2細胞における密着結合の崩壊が、SH-SAW信号に及ぼす影響を計測した。主に誘電率を検出するOPENチャンネル(.ch)では、密着結合に局在するZO-1蛋白の局在性喪失と平行して、SH-SAWの挿入損失差と位相差が減少した。他方、主に機械的影響を検出するSHORT.chでは変化がなかった。これらの結果から、過酸化水素による密着結合の崩壊とそれから派生する細胞内変化によって、細胞内及び近傍の誘電率が変化し、OPEN.chのSH-SAW信号変化に至ったと推測している。

## [キーワード]

SH-SAW、誘電率、SV40-T2、密着結合、過酸化水素

### 1. はじめに

産業技術の急激な発展による環境汚染や公害は、人体を危険に曝し、技術の進歩による新たな問題が今後も発生することが予測されており、このような問題を防止する技術が必要とされている。しかし、環境中に存在する多種多様な生体への有害物質の安全性や、新たな医薬品の効果を評価する現存の方法では高額な装置が必要であり、評価時間もかかる。また、信頼性の高い評価方法として動物実験があるが、動物の個体差などにより複数回行う必要があり、倫理
面の問題も軽視できない。そのため、これらの方法に取って代わる、より簡便で安価な評価方法の開発が急務となっている。

近年、細胞・組織レベルの機能を計測するバイオセンシング技術が発展して来ている。細胞は生命活動の最小単位で、細胞の集合体である組織は細胞の高度機能発現のための構造であり、生体が外部から受ける種々の刺激（化学的・物理的刺激）に対して最初の反応をする。この初期反応を捉えることができれば、種々の刺激が生体へ与える影響や効能を短時間で評価する方法へと発展させることができる。即ち、従来型の抗体や酵素を用いた抗体型／酵素型バイオセンサのように、単に特定物質の計量を行うのではなく、医療医薬品、化学物質、環境汚染物質が生体に与える影響を「細胞や組織に対する機能的・構造的变化」として計測する次世代バイオセンサ（バイオナノ協調体）の構築が可能となる¹）。このバイオセンシング技術では、細胞が発信する信号をその場で計測するために、デバイス上で細胞・組織を培養するなど、培養系と検出系の一体化によるモニタリング技術が求められる。

本研究では、表面弾性波（SAW：Surface Acoustic Wave）に着目した。SAWは表面にエネルギーが集中しているため表面性状により伝搬特性が変化する。特に水平せん断型表面弾性波（SH-SAW：Shear Horizontal SAW）は水溶液中でもエネルギーの減衰が少ないため、細胞培養液中でのセンシングが可能である。このため、SH-SAW伝搬面に細胞を培養し、細胞の存在状態に起因するSH-SAW伝搬特性の変化を捉えることができれば、複合した環境有害因子が細胞・組織に与える影響をリアルタイムに検出できるバイオセンサとなり得る。現在、超音波を用いた生物診断・評価は広く検診などに利用されており、細胞に対して無害と考えられており、バイオセンサへの適用にはさしたる問題を抱えていない。本研究では、SH-SAWを用いたバイオナノ協調体開発の一環として、SH-SAWデバイスの設計・性能評価、及び、SH-SAW伝搬面に細胞を培養し、細胞の存在状態に起因するSAW信号の変化について解析した。

### 2. 研究開発目的

本研究では、SH-SAWを用いたバイオセンシングを提案する。図(2)-1にSH-SAWを用いたバイオセンサの概念図を示す。SH-SAW伝搬面上に細胞を培養し、種々の刺激に対する細胞の応答によりSH-SAW伝搬特性が変化する。

提案するバイオセンサの特徴を列挙すると以下のようになる。

①細胞を直接SH-SAW伝搬面上に培養できるため、培養系と検出系を一体化でき、リアルタイムな検出が可能となる。

②特定物質の定量によるバイオセンシングとは異なる。複合した有害因子が細胞・組織の機能や構造に与える影響を、SH・SAW伝搬波の特性変化として計測する。

③SH-SAWは、エネルギーが伝搬媒質表面に集中している。このため、細胞-細胞間結合の崩壊やSH-SAWセンサと細胞との接着面における接着力の変化を、SH-SAWの信号変化として計測できる可能性が高い。

④小型で安価である。

このSH-SAWバイオセンサの実現のため、SH-SAWデバイス設計と性能評価を行った。また、SH-SAW伝搬面に細胞を直接培養し、培養細胞の状態変化がSH-SAWデバイス信号に与える影響について調べた。特に、SH-SAW伝搬経路上にSV40-T2（ラット不死化肺胞2型上皮）細胞を
培養することによる、更には過酸化水素によるSV40-T2細胞の傷害とSH-SAW伝搬特性の変化との相関性に関して比較検討した。

図(2)-1. SH-SAWバイオセンサの概略図

### 3. 研究開発方法

## （１）SH-SAWデバイスの開発

## 1 ）圧電基板の選定

本研究ではデバイスが培養液中にある状態で測定を行う。そのため、培養液中でSH-SAWが伝搬することが条件となり、液中でも減衰が少ないSH-SAWを励振する圧電基板に限られる。そこで、液相センサなどの研究に多く用いられているLiTaO_{3}に着目した $ ^{2)} $ 。表(2)-1にSH-SAWを励振するLiTaO_{3} 36°Y-XカットとLiTaO_{3} 42°Y-Xカットの基本特性を示す $ ^{3)} $ 。

LiTaO_{3}では、42°Y-Xカットのほうが36°Y-Xカットに比べて電気機械結合係数が大きく伝搬損失が少ない。このため、LiTaO_{3} 42°Y-Xカットを用いた。
LiTaO_{3}
36°Y cut	42°Y cut
Propagation direction	X	X
Electromechanical coupling coefficient [%]	5.0	7.6
Temperature coefficient of delay [ppm/℃]	-28～-32	-40
Velocity of SAW [m/s]	4160	4022

表(2)-1. Characteristics of LiTaO_{3} substrate (36°Y cut and 42°Y cut)

## 2 ）IDTの設計

## a) IDTの構造

IDTの特性を決定する要因として、1周期当たりのIDTの構造が挙げられる。SAWデバイスに用いられるIDTの設計で、最も基礎的なIDTの構造はシングル電極と呼ばれる。この構造では、電極の両側に等しい大きさのSAWを励振する双方向性を持っているため、エネルギーの一部しか受信できず挿入損失が大きくなることや、送受間IDTの反射により生じるTTE (Triple Transit Echo) によってリップルが生じる $ ^{3} $ 。この解決策としてSAWに方向性を持たせる一方向性IDT (Unidirectional IDT) を利用することが考えられる。一方向性IDTには様々な種類があるが、作製可能であるIDTの幅やIDT間距離、作製工程を考慮し、開放型浮き電極を正・負励振電極間の中心からずらした位置に配置することで方向性を得るOFEUDT (Open Floating Electrode type Unidirectional Transducer) を作製し、シングル電極との周波数特性の比較を行った。図(2)-2（a）にシングル電極構造、(b)にOFEUDT 電極構造の概略図を示す。両電極とも波長を80 μmとして中心周波数を50 MHzに設計した。

(a)

(b)

図(2)-2. Schematic of IDT structure. (a) Single design. (b) OFEUDT design
## b) IDTの電極対数

IDTの特性を決定するもう一つの要因として電極対数が挙げられる。IDTの正負2電極を電極対と呼び、IDT電極指数を数える時の単位として利用される。IDTの電極対数はSAWフィルタの帯域幅に関係する。以下に関係式を示す。

$$ 2f_{0}/n= 带域幅 \quad\text{⋯⋯(3-1)} $$

$$ f_{0}：中心周 \quad 波数 \qquad n：電極対数 $$

この式より電極対数が多くなると帯域幅が狭くなり、狭帯域フィルタとなる。狭帯域であることはセンサとして鋭い共振を有するため、広帯域のセンサより大きな変化量を得られる。しかし、電極対数を多くするとTTEの影響が大きくなりリップルが増加すると考えられる。そのため、OFEUDTの対数5、15、25の3種類を作製し比較を行った。

## 3 ）SH-SAWデバイスの作製

図(2)-3 に今回作製したSH-SAWデバイスの写真を示す。膜厚はクロム接着層100ÅとAu 1000Åの計1100Åとし，（株）リバーエレテックにてフォトリングラフィ工程により作製した。すべての測定において、SH-SAWデバイスの端面は、SH-SAWの反射を低減するために削っている。

SH-SAW伝搬面には物理的な変化と電気的な変化を検出するOPEN.chとAuの薄膜により短絡させて物理的な変化のみを検出するSHORT.chを作製した。

図(2)-3. Photograph of SH-SAW device
## 4 ）測定回路基板の設計

回路には測定機器であるネットワークアナライザとのインピーダンスマッチング（50Ω）を行うためにマイクロストリップラインを用いた。マイクロストリップラインの特性インピーダンス $ Z_{0} $ は以下の式で与えられる $ ^{4} $ 。

$$ Z_{0}=\frac{377}{\sqrt{\varepsilon}\bigg(\frac{w}{h}+2\bigg)} $$

$ \cdot \cdot \cdot (3-2) $

ε：誘電体層の比誘電率 w：ライン幅 h：誘電体層の厚さ

この式より、今回用いたFR-4ガラスエポキシ基板（サンハヤト社製 NZ-G33KR）は比誘電率4.6、誘電体層の厚さ1.6 mmであるため、マイクロストリップライン幅を2.7 mmで作製した。この基板にSH-SAWデバイスを接着し、デバイスの電極とマイクロストリップラインを導電性ペースト（藤倉化成 ドータイトD-550）で接続した。

## 5 ）ネットワークアナライザ

SH-SAWの周波数特性は、ネットワークアナライザ（Agilent社製E5062A）を用いて測定した。ネットワークアナライザは測定物の高周波信号に対する伝送特性や反射特性などの電気的特性を解析する機器である。ネットワークアナライザではSパラメータ（Scattering parameter）で高周波ネットワークを特性化する。高周波におけるデバイスポートの電圧や電流測定では、電流計や電圧計を接続した場合、プローブ自体に無視できないほどのインピーダンスがあるため非常に困難であるが、Sパラメータを用いた場合では負荷を接続する必要がない。2ポートデバイスには4つのSパラメータがあり、Sの後の最初の番号は高周波信号が出るポートで、2番目の番号は高周波信号が入るポートを表している。このSH-SAWデバイスは、バイオセンサとしてSH-SAW伝搬面に細胞を培養し、その変化によるSH-SAW伝搬特性の変化を検知することが目的である。そのため、SH-SAWデバイスは高周波信号が通過する伝送特性（S_{21}）における挿入損失と位相について測定を行った。

## （２）SH-SAWデバイスの性能評価

## 1 ）SH-SAWセンサの作製

図(2)-4 に作製したSH-SAWセンサの写真を示す。SH-SAWセンサにはSH-SAWデバイスを2つ搭載し、片方のデバイスを細胞の変化を測定するSensor.chとし、もう片方のデバイスを温度や質量の変化を測定するReference.chとした。この両デバイスの差を取ることで温度と質量の変化を補正した。測定回路にはSH-SAWデバイス評価と同様のものを用いた。細胞培養の際、培養液を保持するためにアクリルで40×30×12mmのプールを作製した。SH-SAW伝搬面以外にPDMS（ポリジメチルシロキサン）をコートし絶縁処理を施した。PDMSの固化条件は70℃で2hとした。
(a)

(b)

図(2)-4. SH-SAW biosensor

(a) Schematic illustration. (b) Photograph.

## 2 ）SH-SAWセンサの基礎特性評価方法

SH-SAWデバイスのIDT上に形成したSiO₂膜の膜厚や形状の条件により挿入損失が30dB以上もの増加を引き起こすと報告されている⁵）。このようにSH-SAWデバイスのIDT上に物質を形成する場合、SH-SAWの周波数特性の劣化に気を付けなければならない。SH-SAWセンサの作製では、(2)-2）節の通り、SH-SAWセンサにPDMSで絶縁処理を施している。この処理は、SH-SAWデバイス伝搬部以外であるがIDT上にも行うため、この処理によるSH-SAWセンサの特性への影響について評価した。また、センサは、SH-SAW伝搬部に直接細胞を培養するため、プールが培養液で満たされる。そのため、液中でSH-SAWが実際にセンサとして必要な信号を検知可能であるかを調べた。基礎実験として純水、グリセリン水溶液、イソプロピルアルコール（IPA）水溶液を用い、SH-SAW伝搬表面の性状変化によるSH-SAWデバイスの信号変化を調べた。さらに、温度特性も調査した。測定は2章のSH-SAWデバイス評価と同様にネットワークアナライザを用いて行った。

## （３）SH-SAWバイオセンサによるバイオセンシング

## 1 ）計測システムのセットアップ

SH-SAWデバイス信号は温度変化の影響を受けやすいため、計測環境の温度変動を最小限にした計測システムを構築することが重要である。細胞培養環境である炭酸ガス培養器(CO_{2}インキュベータ)は温度：37℃、CO_{2}濃度：5％に保たれている。そのため、CO_{2}インキュベー
タ内にセンサを設置することで温度一定条件下で実験が遂行できると考えた。図(2)-5 にセットアップを示す。CO₂インキュベータ内に設置されたSH-SAWバイオセンサはSMA-RF ケーブルにより計測器であるネットワークアナライザに接続されている。なお、ケーブルはエチルアルコールにより滅菌消毒を行い、コンタミネーションが起こらないようにした。CO₂インキュベータ背面にある孔からケーブルを外に出し、シリコン栓やエポキシ系樹脂などで隙間をふさぎCO₂が外に漏れないようにした。これにより、細胞を培養している過程においてセンサの温度が変動しない状態での計測が可能となった。
(a)

(b)

図(2)-5. Experimental setup of cells cultivated on SH-SAW biosensor

(a) Schematic illustration.

(b) Photographs of $ CO_{2} $ incubator, Network analyzer, and SH-SAW biosensors were connected to Network analyzer via SMA-RF cable.