Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
### c. 個体群レベルの影響評価

コガタシマトビケラ2齢～5齢幼虫に対するクロラントラニリプロールの急性毒性(48h-LC_{50})は、2齢で＞879 μg/L、3齢で＞859 μg/L、4齢で30.3 μg/L（95%信頼区間：23.2～38.6 μg/L）、5齢で22.7（19.2～27.7）μg/Lであった。クロラントラニリプロールは高齢幼虫に対し最も毒性が強く、卵期に対しても毒性影響を及ぼすが、若齢幼虫に対しては毒性がほとんどないという、特異的な変動パターンを有することが判明した。フェニトロチオンおよびイミダクロプリドの卵期における急性毒性を表(2)-13に示した。コガタシマトビケラ卵は、胚発生が進むにつれフェニトロチオンに対する感受性が高くなった。イミダクロプリドは、胚発生初中期の卵には影響を与えなかった。胚発生後期の卵に対して強い毒性を示す傾向は、他の神経系に作用する殺虫剤と一致していた。卵から幼虫期にかけてのフェニトロチオン、イミダクロプリド、クロラントラニリプロールの濃度－反応曲線データを表(2)-14にまとめた。卵期は最も高感受性の発生段階のデータを採用した。蛹期の試験データはないが、安全側にたった影響評価をするため、蛹期は5齢幼虫と同程度の感受性を有していると仮定して、5齢幼虫のデータを代用した。これらの濃度-反応曲線の関数をコガタシマトビケラの室内個体群動態モデルに組み込むことにより、成長に伴う感受性変動と個体群の持つ増殖特性(回復性)を考慮した個体群レベルでの殺虫剤影響評価が可能となる。

表(2)-13 トビケラ卵に対する殺虫剤2剤の急性毒性

殺虫剤	半数致死濃度 ( $ \mu $ g/L)
E1期	E4期	E7期
フェニトロチオン	3471	1281	64.8
イミダクロプリド	>8001	>8001	3.23

表(2)-14 殺虫剤3剤の濃度－反応曲線に関するパラメータ

成長段階	ロジスティック累積分布関数のパラメータ
フェニトロチオン*	イミダクロプリド*	クロラントラニリプロール
μ	σ	μ	σ	μ	σ
卵	1.812	0.102	0.518	0.069	1.943	0.473
1齢	0.959	0.077	0.822	0.048	—	—
2齢	1.108	0.142	1.065	0.056	—	—
3齢	1.142	0.107	1.336	0.108	—	—
4齢	1.283	0.174	1.342	0.083	1.482	0.133
5齢	1.423	0.216	1.579	0.107	1.356	0.077
蛹**	1.423	0.216	1.579	0.107	1.356	0.077

$ ^{*} $ 1齢～5齢幼虫の試験データは引用文献18から入手。**5齢幼虫のデータを代用。

開発した室内個体群動態モデルを用いた影響評価のシナリオは、以下のように設定した。シミュレーション時の初発個体群は同一コホートの卵とした。殺虫剤は48時間の単回曝露とし、個体群の齢組成の違いが個体群の殺虫剤感受性にどのような影響を与えるのかを確認するため、曝露のタイミングをシミュレーション開始から5日目（卵期）、10日目（～1齢期）、15日目（～3齢期）、20日目（～4齢期）の4通りに設定した。個体密度を3段階に設定して各々シミュレーションを行った。すなわち、農薬の影響に脆弱な低密度個体群（初発卵数3,000卵/m²）、農業環境技術研究所で
維持されている室内飼育個体群と同程度の良好な個体群（初発卵数170,000卵/m²）、中間の個体群（初発卵数17,000卵/m²）を設定した。殺虫剤の曝露濃度を様々に変えてシミュレーションを行った結果の一例を図(2)-11に示す。左図は個体数変動を経時的に示したもので、曝露濃度が高くなるにつれ個体数の増加が遅れ、ある濃度以上では個体数が回復せず個体群は持続しなかった。このシミュレーション結果から、対照区の95%の個体数にまで回復するのに要する日数を計算し（個体数が回復しない場合は回復日数を0とする）、曝露濃度に対してプロットすると右図のようになる。曝露濃度が増加するとともに回復日数も増加し、ある濃度以上で回復しないことが明瞭に示された。この濃度を個体群影響閾値濃度と定義し、殺虫剤影響評価における個体群持続性に関する明瞭なエンドポイントとして用いることとした。

図(2)-11 初発卵数170,000卵の個体群にフェニトロチオンを20日目から48時間曝露したときのシミュレーション結果例（左図）と個体群影響閾値濃度（右図）

図(2)-12に各シナリオにおける3剤の個体群影響閾値濃度を示した。個体密度が低いほど作用機作に関係なく殺虫剤の影響を受けやすい傾向がみられた。一方、曝露のタイミングによる個体群閾値濃度の変動は殺虫剤で異なった。卵に低毒性であるフェニトロチオンでは、個体群閾値濃度は個体群の齢組成が高くなるとともに低下した。一方、卵に対し毒性の強いイミダクロプリドでは、齢組成が高くなるとともに閾値濃度は高くなった。卵と高齢幼虫に毒性の強いクロラントラニリプロールでは、低密度個体群の初期および後期に閾値濃度が低かったが、コガタシマトビケラは本剤に対して1齢～3齢期が不感受性であるため、個体密度が増加すると個体群レベルでは影響を受けにくいと解析された。以上の結果は、殺虫剤の作用機作や個体群の齢組成によって個体群の感受性が変動することを示している。
図(2)-12 個体群レベルでの殺虫剤影響評価結果（上段は低密度、中段は中密度、下段は高密度個体群の結果。図中矢印は水溶解度以上でも影響を受けないことを示す。）

本研究で開発したコガタシマトビケラ個体群動態モデルは、定常状態では齢組成が変動しない室内個体群を対象としているが、実環境中のトビケラ個体群は季節により齢組成が変動するため、農薬に対する個体群レベルでの影響の受けやすさは当然変動すると推測される。今後は、季節性を考慮した野外個体群動態モデルを開発し、本影響評価手法の高度化を図る必要がある。

今回得られた個体群影響閾値濃度の最低値と、サブテーマ（3）の個体レベルの急性毒性データのみを用いたSSD解析の結果を比較すると、SSD解析において基準値として用いられるHC_{5}に比べて、個体群閾値濃度は3剤全てで高い値をとった（表(2)-15）。急性毒性データのみで導出されたHC_{5}ではあるが、個体群レベルの観点からも安全側にたった値であることが示唆された。一方、個体群閾値濃度は、20～30％の種が影響を受ける濃度に相当すると算出された。仮に、SSD解析により、河川水の農薬濃度が3割程度の種に急性影響を与えると推定された場合は、トビケラ個体群の存続性にも悪影響を与える可能性があると判定することができる。このように、本研究で開発したコガタシマトビケラの個体群レベルでの影響評価法を活用することにより、個体レベル試験の急性毒性データのみを用いて行われるSSD解析について、個体群レベルの観点から意義付けすることが可能となり、SSD解析手法を用いた生態リスク評価の理論強化に貢献すると期待される。

表(2)-15 個体群閾値濃度とSSD解析結果との比較

フェニトロチオン	イミダクロプリド	クロラントラニリプロール
個体群影響闘值濃度 (μg/L)	8.04	2.8	28.1
1齢幼虫の48h-EC50 (μg/L)	6.23	6.64	>881
SSD解析によるHC5 (μg/L)	1.4	0.51	7.5
個体群閾値濃度における影響を受ける種の割合	29%	16%	24%
## （２）付着藻類を用いた毒性評価

## 1 ）試験候補種の選定と効率的な毒性試験法の開発

8種11株の藻類を対象とし、3,5-DCPを用いた感受性検定の試験条件と結果を表(2)-16に示す。96時間の試験期間において、Anabaena flos-aquae以外の株は96穴マイクロプレート中で16倍以上の増殖を示し、OECDガイドラインの試験の妥当性基準(試験期間に16倍以上の増殖)を満たしていた。萤光プレートリーダーによる測定は、緑藻と珪藻はクロロフィルaの自家蛍光（励起435 nm，蛍光685 nm）を、藍藻はフィコビリンの自家蛍光（励起600 nm，蛍光650 nm）を測定することで、細胞の増殖をモニタリングすることができた。各蛍光強度と顕微鏡で計数した細胞密度は比例関係にあることが確認された。

表(2)-16 3,5-DCP を用いた藻類感受性検定の試験条件と結果

種名	株名	試験時光強度lux	最大增殖速度/day	3,5-DCP EC50Microplatemg/l	3,5-DCP EC50Flaskmg/l
Pseudokirchneriella subcapitata	NIES-35	5000	0.99	2.36
Desmodesmus subspicatus	NIES-797	2000	1.10	2.61	2.10
Mayamaea atoms	NIAES K11-11	2000	0.77	1.58
Nitzschia palea	NIAES PD3	2000	1.21	0.90
Nitzschia palea	NIAES U3-3	2000	0.71	1.11
Nitzschia palea	NIES-487	2000	0.95	1.19
Achnanthidium minutissimum	NIES-71	2000	0.74	0.38
Achnanthidium minutissimum	NIES-414	2000	0.83	0.76	0.96
Navicula pelliculosa	UTEX-B673	2000	0.80	1.04
Pseudanabaena galeata	NIES-512	2000	0.95	0.60	1.00
Anabaena flos-aquae	NIES-73	2000	0.42	3.30

緑藻であるPseudokirchneriella subcapitataとDesmodesmus subspicatusについては、標準物質である3,5-DCPを用いた毒性試験のリングテストが行われており、EC_{50}がそれぞれ平均3.38、6.42 mg/L、標準偏差が1.30、2.38 mg/Lであることが報告されている $ ^{29)} $ 。これより、5～90パーセンタイルの信頼区間はそれぞれ1.24～5.52、2.51～10.3 mg/Lと計算され、本研究の結果もこの範囲内に収まっていた。また、株、培地、および光を同一にした条件下で、マイクロプレートを用いた試験法によるEC_{50}と、フラスコを用いた従来の試験法によるEC_{50}を3株について比較したところ、ほぼ同様の値となった（表(2)-16）。以上の結果から、マイクロプレートを用いた藻類の感受性検定の結果は妥当であると判断された。

感受性検定の結果から、今後農薬を用いた毒性試験に使用する候補種を判定した。緑藻については、湖沼での生息が主要であるものの、河川付着藻類としても生息するDesmodesmusが望ましいと判断された。OECDガイドラインでも推奨種とされ、データの蓄積も比較的豊富である。珪藻については、好清水性種であるAchnanthidium minutissimumのNIES-71株は重金属汚染河川、NIES-414株は非汚染河川から採取されたものである。感受性検定の結果、汚染河川から採取されたNIES-71が感受性は高かった（表(2)-16）。増殖も比較的安定しており試験も容易であるNIES-71株の使用が望ましいと判断された。広適応性種であるNavicula pelliculosaについては、増殖も安定しており試験も容易である。また、OECDガイドライン推奨種であり、データの蓄積も比較的豊富である。さらに、河川での優占度も高く、候補種としてふさわしいと判断される。好汚濁性種であるNitzschia
paleaの3株について、NIAES PD3株は水田、NIAES U3-3株は非汚染河川、NIES-487株は重金属汚染河川から採取されたものである。感受性検定の結果、採取された地点によらず同様のEC_{50}値となった（表(2)-16）。NIAES PD3株とNIAES U3-3株は液体培地での維持が困難であり、前培養までを寒天培地で行う必要があるため、試験操作が煩雑である。従って、Nitzschia paleaについてはNIES-487株の使用が望ましいと判断された。Mayamaea atomusについては珪藻種間で最も感受性が低かったが、河川での優占度が低く、Navicula属に近縁種であるため候補種から除外した。シアノバクテリアについては、Pseudanabaena galeataは維持管理が比較的難しい株であるが、調子の良い状態の株を試験に使用することで安定した試験が可能であった。Anabaena flos-aquaeについてはマイクロプレートでの増殖が非常に悪く、96時間で4～5倍程度しか増殖が認められなかった。感受性もPseudanabaena galeataが高く（表(2)-16）、河川でも優占度が高いため、この種の使用が望ましいと判断された。

以上より、河川付着藻類の試験種として、Desmodesmus subspicatus NIES-797、Nitzschia palea NIES-487、Achnanthidium minutissimum NIES-71、Navicula pelliculosa UTEX-B673、Pseudanabaena galeata NIES-512の5種の使用が適切であると判断した。2012年7月に行った長野県広井川における生物調査結果では、この5属で全藻類個体密度の6割以上をカバーできることが示されている（表(2)-17）。これら5種に対する3,5-DCPのEC $ _{50} $ 値を用いて種の感受性分布解析を行ったところ、試験を行った全8種のEC $ _{50} $ を用いたSSDとほぼ同様の結果が得られた（図(2)-13）。従って、選定した5種の藻類を河川標準種として毒性試験データを蓄積し、SSD解析を行うことで、藻類群集の感受性分布をおおむね代表させることが可能と判断された。

表(2)-17 長野県広井川における付着藻類調査結果（2012年7月調査）

分類群	属名	密度 (cells/cm²)	分類群	属名	密度 (cells/cm²)
珪藻	Achnanthidium	459	綠藻	Ankistrodesmus	279
Amphora	172	Coleochaete	470
Coccoreis	339	Desmodesmus	836
Cymbella	620	Stigeoclonium	295
Cosmarium	77	シアノバクテリア	Lyngbya	221
Diatoma	317	Homoeothrix	38
Frustulia	164	Pseudanabaena	1572
Gomphonema	1312	全合計	17223
Navicula	4748	標準5種合計	10551
Nitzschia	2936	% 標準5種	61%
Melosira	470
Meridion	90
Surirella	372
Synedra	604
Pinnularia	312
Rhoicosphenia	519
図(2)-13 3,5-DCPの種の感受性分布解析結果（同種の複数の株でEC_{50}が得られる場合は、種ごとに幾何平均値としてまとめて解析に使用した）

20種類の除草剤を用いた5種同時毒性試験の結果を表(2)-18に示す。いずれの試験においても、5種すべてにおいてコントロール区で良好な増殖（増殖速度＞0.7 day $ ^{-1} $ ）が認められ、また、6連でのバラつきも小さかった（CV＜7%）。これより、再現性の高い安定した試験法であることが明らかとなった。得られたEC $ _{50} $ 値は種間で大きな差が見られ、特にALS阻害系、PPO阻害系、超長鎖脂肪酸阻害系の除草剤では種間差が大きい傾向が見られた。感受性の順序も作用機作によって異なる傾向を示し、ALS阻害系ではシアノバクテリア、PPO阻害系と超長鎖脂肪酸阻害系では緑藻、4-HPPD阻害系では珪藻が最も高感受性であった。光化学系II阻害系と脂質生成阻害系では、種間差が小さく明確な傾向はみられなかった。

これらの結果を用いて$\mathrm{EC}_{50}$ ベースのSSDを解析し、各除草剤のSSDパラメータ（対数平均と対数標準偏差）を決定した（表(2)-19）。ただし、5種全てで$\mathrm{EC}_{50}$ が水溶解度以上であったシハロホップブチル、フルセトスルフロン、ベンゾビシクロン、オキサジクロメホンは解析対象から除外した。ALS阻害系、PPO阻害系、超長鎖脂肪酸阻害系の除草剤では、感受性の種間差が大きい傾向を反映し、対数標準偏差が大きい傾向が見られた。また、PPO阻害系の除草剤では$\mathrm{HC}_{5}$ の値が非常に低くなる傾向も見られた。さらに、このSSDと標準緑藻の$\mathrm{EC}_{50}$ とを比較した結果を図(2)-14に示す。感受性の分布の中での標準緑藻の位置づけは作用機作ごとに特徴付けられることが明らかとなった。ALS阻害系とPPO阻害系の除草剤では、$\mathrm{HC}_{5}$ が標準緑藻の$\mathrm{EC}_{50}$ よりも10倍程度低い値となった。この場合、標準緑藻1種のみの結果を用いた除草剤の生態リスク評価では、リスクを過小評価してしまう。一方、超長鎖脂肪酸生成阻害系の除草剤では、$\mathrm{HC}_{5}$ が標準緑藻の$\mathrm{EC}_{50}$ よりも10倍以上高い値となった。この場合、標準緑藻1種のみの結果を用いた除草剤の生態リスク評価では、リスクを過大評価してしまう。このように、作用機作によって感受性の高い種が異なるため、標準緑藻1種のみの結果を用いた除草剤の生態リスク評価は適切でないことが示された。このため、リスク評価の際に藻類に適用される不確実性係数（現在は1）の見直しや、SSDの活用などの対応が必要となると考えられた。
表(2)-18 20種類の除草剤の作用機作と5種の付着藻類に対する感受性（μg/L）

除草剤	作用機作a	Pseudanabaena	Desmodesmus	Achnanthidium	Nitzschia	Navicula
シハロホップブチル	A	EC50	>230	>230	>230	>230	>230
EC10	>230	>230	>230	>230	>230
ベンスルフロンメチル	B	EC50	4.1	150	>6000	>6000	>6000
EC10	1.9	18	4200	>6000
シクロスルファムロン	B	EC50	3.1	11	>9700	>9700	>9700
EC10	1.6	1.4	>9700	8800	>9700
ピリミスルファン	B	EC50	150	120	>5400	4400	>5400
EC10	124	52	1600	420	>5400
フルセトスルフロン	B	EC50	>6800	>6800	>6800	>6800	>6800
EC10	>6800	>6800	>6800	>6800	>6800
シメトリン	C1	EC50	23	16	47	86	34
EC10	3.3	5.9	8.2	31	15
ペントキササン	E	EC50	>220	0.084	>220	5.7	59
EC10	>220	0.072	>220	0.24	9.6
ピラクロニル	E	EC50	>5000	0.96	1300	58	1000
EC10	>5000	0.57	66	4.7	57
オキサジアルギル	E	EC50	>1500	0.21	840	56	380
EC10	>8.9	0.18	220	3.2	32
テフリルトリオン	F2	EC50	>100000	>100000	10000	23000	23000
EC10	>100000	>100000	4400	2400	14000
ベンブフェナップ	F2	EC50	>240	>240	130	66	15
EC10	>240	>240	23	52	13
ベンブビシクロン	F2	EC50	>180	>180	>180	>180	>180
EC10	>180	>180	>180	>180	>180
プレチラクロール	K3	EC50	>4000	62	5100	15000	1300
EC10	>4000	5.8	120	1900	200
ブタクロール	K3	EC50	>3600	38	5100	6200	950
EC10	>3600	2.5	200	1100	200
メフェナセット	K3	EC50	>10000	620	>3000	>3200	5800
EC10	>950	34	120	>3200	650
カフェンストロール	K3	EC50	>11000	8.3	8600	5700	9500
EC10	>11000	1.1	380	2200	230
フェントラザミド	K3	EC50	>4100	50	11000	3600	55000
EC10	89	0.35	440	950	200
ベンフレセート	N	EC50	>23000	22000	10000	76000	95000
EC10	>9100	11000	7800	13000	7600
エスプロカルブ	N	EC50	1600	350	>3200	4100	1800
EC10	1300	90	3100	1600	770
オキサジクロメホン	Z	EC50	>500	>500	>500	>500	>500
EC10	>500	>500	>500	>500	>500

$ ^{a} $ A: acetyl CoA carboxylase(ACCase)阻害、B: acetolactate(ALS)生成成阻害, C1: 光化学系II阻害、E: protoporphyrinogen oxidase(PPO)阻害、F2: 4-hydroxyphenyl-pyruvate-dioxygenase(4HPPD)阻害、K3: 超長鎖脂肪酸生成成阻害、N: 脂質生成成阻害、Z: その他
表(2)-19 16種類の除草剤のSSDパラメータ（対数平均、対数標準偏差）とHC5およびHC50

除草剤	作用機作	対数平均	対数標準偏差	HC5 (μg/L)	HC50 (μg/L)
ベンスルフロンメチル	B	7.13	3.44	4.4	1253
シクロスルファムロン	B	6.86	4.20	0.54	952
ピリミスルファン	B	7.45	2.16	49.3	1726
シメトリン	C1	3.55	0.58	12.5	35
ペントキサツン	E	3.22	3.39	0.10	25
ピラクロニル	E	5.52	3.29	1.11	249
オキサジアルギル	E	4.80	3.23	0.39	122
テフリルトリオン	F2	10.76	1.31	5466.2	47293
ベンゾフェナップ	F2	4.87	1.40	13.0	130
プレチラクロール	K3	7.75	2.01	84.3	2310
ブタクロール	K3	7.38	2.04	55.9	1608
メフェナセット	K3	8.65	1.27	705.9	5729
カフェンストロール	K3	7.86	2.94	20.5	2596
フェントラザミド	K3	8.32	2.39	80.6	4106
ベンフレセート	N	10.54	0.88	8950.0	37763
エスプロカルブ	N	7.54	1.00	362.7	1877

図(2)-14 16種類の除草剤の種の感受性分布（〇とそのバーは、SSDの50パーセンタイル値とその信頼区間（5-95パーセンタイル値）、◆は標準緑藻のEC_{50}値を示す）
## 2 ）付着藻類を用いた回復性試験法の開発

付着藻類を用いて、生理状態と一過性の曝露からの回復性との関係を調べた。まず、生理状態の測定法の検討として、珪藻Navicula pelliculosaの生細胞と死細胞を各種密度で調整し、ATP発光、Celltox-Green蛍光、光合成活性を測定した結果を図(2)-15に示す。ATP発光は、正細胞が $ 10^{5} $ cells/mL以上の密度で細胞密度と発光強度が直線関係にあったが、死細胞ではその関係が見られず、全般的に測定ごとのバラツキが大きかった。Celltox-Green蛍光は、死細胞が $ 10^{5} $ cells/mL以上の密度で細胞密度と発光強度が直線関係にあった。なお、生細胞でも直線関係は見られたが、その蛍光強度は死細胞のものと比べて非常に低かった。全般的にATP発光よりも直線性は明確で、測定ごとのバラツキも比較的少なかった。光合成活性としてのクロロフィル蛍光増加量は非常に感度が高く、正細胞が $ 10^{3} $ cells/mL以上の密度で細胞密度と発光強度が直線関係にあった。一方で、死細胞では蛍光の増加は正細胞に比べて非常に低いことから、クロロフィル蛍光増加量を測定することにより、細胞の生理状態を明瞭に表すことができると考えられた。

図(2)-15 付着藻類細胞の正細胞（Live）と死細胞（Dead）の生理状態の把握

参照物質として3,5-ジクロロフェノールを用いた48時間の毒性試験と、その後48時間の回復性試験の結果を図(2)-16に示す。48時間の毒性試験では、曝露濃度の上昇に伴って増殖は抑えられた。
一方、48時間の回復性試験では、曝露濃度の上昇に伴って回復するまでの時間が長くなり、特に1.6および2.3 mg/Lの曝露濃度区では、清浄な培地内でもクロロフィル蛍光の増加が見られるまでに48時間かかった。

この間の細胞の生理状態を調べた結果を図(2)-17に示す。ATP発光とCellTox-Green蛍光は、曝露濃度による有意な差が見られなかった。光合成効率（クロロフィル蛍光増加量／元のクロロフィル蛍光）を計算すると、毒性試験期間中は曝露濃度の上昇に伴い減少し、回復性試験期間中に回復が見られた。また、このときの光合成効率と藻類の増殖速度の間に非常に良い直線関係（ $ R^{2}=0.78 $ , n=54, P<0.001）が得られ（図(2)-18）、光合成効率から藻類の増殖速度を予測できる可能性が示唆された。光合成効率のような、藻類の生理状態を示す指標を用いて、除草剤による回復性の違いなどを調べていくことで、一過性の曝露からの回復までを考慮した生態リスク評価が可能になると考えられた。

図(2)-16 3,5-ジクロロフェノールを用いた毒性試験（左）とその後回復性試験（右）

図(2)-17 毒性試験と回復性試験期間中の光合成効率の推移
図(2)-18 光合成効率と増殖速度の関係

## 3 ）付着藻類を用いた複合毒性試験と複合影響予測のモデル解析

作用機作が同じ除草剤を混合した場合（複合1）と、作用機作が異なる除草剤を混合した場合（複合2）の2組を設定し、それぞれHC_{5}, HC_{10}, HC_{20}, HC_{30}, HC_{40}, HC_{50}に相当する濃度で混合した複合毒性試験を実施した。コントロール区の増殖速度を1とした場合の比増殖速度を図(2)-19に示す。5種の藻類のうち、D. subspicatus（N797株）が両方の組み合わせで最も早く影響を受け、続いてN. pelliculosa（U673株）が影響を受けた。P. galeata（N512株）は、複合1よりも複合2でより大きな影響があった。また、比増殖速度が0.5以下になった場合に、その種は影響を受けたと判断すると（5種のうち1種が影響を受けるたびに「影響を受ける種の割合」が20％ずつ上昇する）、影響を受ける種の割合は図(2)-20のように計算された。得られた結果は、サブテーマ（3）において開発する種の感受性分布（SSD）を用いた複合影響予測モデルの妥当性の検証に活用した。

図(2)-19 複合毒性試験における付着藻類5種の比増殖速度
図(2)-20 複合毒性試験における影響を受ける種の割合

CAモデルとRAモデルを用い、複合影響の予測結果と実際の試験結果の比較を図(2)-21に示す。なお、HC_{30}, HC_{40}, HC_{50}の複合影響については、予測精度が低かったことから解析の対象から除外した。作用機作が同じ場合には、CAモデルの方がRAモデルよりも予測精度が良好であった。一方、作用機作が異なる場合には、RAモデルの方がCAモデルよりも予測精度が良好であった。この結果は既存の知見と一致するものである。

図(2)-21 複合毒性試験結果とモデル予測の比較（誤差は平均値±標準偏差を示す）

CAモデルやRAモデルは、基本的に「複合影響は加算的である」という仮定に基づくモデルである。しかしながら、複合影響では加算的以上の影響をもたらす相乗効果、もしくは互いに毒性を打ち消し合って加算的以下の影響になってしまう拮抗効果も想定される。本研究では、実際の河川水中で想定される低濃度で多種類の農薬による複合影響を評価するため、ファンネル仮説を採用し全てを加算的影響であると仮定した。ファンネル仮説とは、Warne and Hawker（1995） $ ^{30)} $ による
って提唱された複合影響に関する概念である。この仮説では、混合する化学物質の数が少ない場合、加算的モデルによる予測からの解離が大きい（相乗もしくは拮抗する）ケースが多数出てくるが、化学物質の数が増えるに従って、個々の組み合わせで相乗や拮抗効果が起こるが、その組み合わせが多いためにそれらが互いに相殺されて、見かけ上加算的な影響に近づくという考え方である。本研究で想定した低濃度で多種類の農薬による複合影響の場合、ファンネル仮説に従うことが報告されており、前述の複合影響試験結果（HC_{30}, HC_{40}, HC_{50}の高濃度域では、モデルの予測精度が低下する）とも一致した。

単一種に対する複合毒性においては、ファンネル仮説を支持する実験結果がこれまで多数得られている。例えば、Faust et al.（2001） $ ^{31)} $ は、藻類を用いた毒性試験において、18種類のトリアジン系除草剤を阻害率1%に相当する濃度で混合したところ、47%の阻害率が見られた。CAモデルによる予測では44%、RAモデルによる予測では17%であり、作用機作が同じ場合ではCAモデルの有効性が確認されている。さらにFaust et al.（2003） $ ^{32)} $ は、同じく藻類を用いた毒性試験において、16種類の作用機作の異なる薬剤を阻害率1%に相当する濃度で混合したところ、18%の阻害率が見られた。CAモデルによる予測では75%、RAモデルによる予測では15%であり、作用機作が異なる場合ではRAモデルの有効性が確認されている。このように、低濃度で多種類の農薬曝露による影響は、個々の組み合わせでは相乗や拮抗効果が起こっても、全体としてはそれらが相殺されて加算的に見える。しかし、複数の生物種に対する影響を評価する種の感受性分布（SSD）に対し、ファンネル仮説が適用できることを実験的に検証した研究例はこれまでに報告されていない。本件については、サブテーマ（3）で検討を行った。

## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

水生昆虫については、河川に在来する水生昆虫コガタシマトビケラを用いて、初期成長段階別毒性試験法を開発し、成長段階や殺虫剤の作用機作の違いによって感受性が大きく変動することを明らかにした。これらの知見は生態リスク評価の高度化に貢献すると考えられる。また、コガタシマトビケラの生活史パラメータを詳細に解明し、室内個体群動態モデルを開発するとともに、成長に伴う感受性の変動や一時的曝露からの回復性を考慮した個体群レベルでの影響評価法を確立した。これらの成果は、個体レベルから個体群、群集、生態系レベルでの生態リスク評価手法の開発を促進するものであり、その科学的意義は大きい。

付着藻類については、従来法では毒性試験の実施が困難であった河川在来の付着藻類について、96穴マイクロプレートと蛍光プレートリーダーを用いた試験方法に適用しうる試験生物種5種を選定し、5種類の付着藻類に対し同時に実施可能な毒性試験法を開発した。これにより、種の感受性分布の解析に必要とされる毒性データを効率的に蓄積することが可能となった。実際の河川水中で見られる多種多様な農薬の低濃度曝露による複合影響について、既存の知見とおり作用機作の同じ農薬の場合はConcentration-Additive（CA）モデル、作用機作の異なる農薬の場合はResponse Additive（RA）モデルで予測可能であることが明らかとなった。
## （２）環境政策への貢献

## ＜行政が既に活用した成果＞

平成26年2月5日開催の平成25年度水産動植物登録保留基準設定検討会委員等による勉強会において、サブテーマ（2）で開発した水生昆虫コガタシマトビケラの成長段階別毒性試験法および付着藻類の毒性試験法について報告し、現行の評価手法では対応が困難な農薬について、感受性の種間差を適切に反映した評価が可能な手法として提示した。

## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

農薬等化学物質の生物に対する感受性は成長に伴い変動する。本研究で開発した水生昆虫の成長段階別毒性試験法を用いることにより、成長に伴う感受性変動を把握し、既存のテストガイドラインでは急性毒性評価が難しいとされてきた昆虫成長制御剤を含む様々な殺虫剤について、水生昆虫に対する毒性を適切に評価できる。

わが国の河川生態系の一次生産者として優占する付着藻類の代表種5種を選定し、これらの毒性データを効率的に得るための新たな毒性試験法を開発するとともに、詳細をマニュアルにまとめて公開した。現在使用されている標準の藻類種とは異なる感受性が得られるため、本試験法の活用により生態リスクをより適切に評価することができる。

## 6 ．国際共同研究等の状況

特に記載すべき事項はない。

## 7 ．研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

## <論文（査読あり）>

1) T. NAGAI, K. TAYA, H. ANNOH and S. ISHIHARA: Ecotoxicology and Environmental Safety, 94, 37-44 (2013)

“Application of a fluorometric microplate algal toxicity assays for riverine periphytic algal species”

2) T. NAGAI: Human and Ecological Risk Assessment, 20(3), 641-657 (2014)

“Algal population growth model integrated with toxicokinetics for ecological risk assessment under time-varying pesticide exposure”

## くその他誌上発表（査読なし）>

1）岩崎雄一、林岳彦、永井孝志：環境毒性学会誌，16(1)，13-19(2013)

「NOECとLOECにお別れを言うときが来た？」

## （2） 口頭発表（学会等）

1) T. NAGAI, K. TAYA, A. YOKOYAMA and S. ISHIHARA : SETAC Asia/Pacific 2012, Kumamoto, Japan, 2012“

“Development of high-throughput and multi-species algal toxicity assay for probabilistic ecological risk assessment of pesticides”
2) A. YOKOYAMA, T. NAGAI and T. HORIO : SETAC Asia/Pacific 2012, Kumamoto, Japan, 2012 "Acute toxicity of some insecticides to eggs of a net-spinning caddisfly, Cheumatopsyche brevilineata"

3）横山淳史：日本農薬学会第37回大会 (2012)

「河川水生昆虫に対する農薬の影響に関する研究」

4）永井孝志、安納弘親：日本農薬学会第38回大会（2013）

「藻類生長阻害試験の統計解析方法：RExcelで行う非線形回帰分析」

5）永井孝志、多屋清志、依田育子：日本陸水学会第78回大会（2013）

「蛍光マイクロプレートアッセイを用いた各種除草剤に対する河川付着藻類の感受性差の評価」

6) 横山淳史、依田育子：第31回農薬環境科学会（2013）

「水生昆虫コガタシマトビケラの卵に対する殺虫剤の毒性評価－曝露期間と曝露のタイミングによる影響の違いについて－」

## （3） 出願特許

特に記載すべき事項はない。

（４）シンポジウム、セミナーの開催（主催のもの）

特に記載すべき事項はない。

## （５）マスコミ等への公表・報道等

特に記載すべき事項はない。

## (6) その他

永井孝志：「河川付着藻類を用いた農薬の毒性試験マニュアル」を農業環境技術研究所のWEBサイト（http://www.niaes.affrc.go.jp/techdoc/algae/）にて公開（平成26年2月26日）

### 8 \. 引用文献

1) 永井孝志：日本リスク研究学会第21会年次大会講演論文集, 21, 417-421 (2008)

「確率論的アプローチを用いた農薬の生態リスク評価」

2) A. YOKOYAMA, K. OHTSU, T. IWAFUNE, T. NAGAI, S. ISHIHARA, Y. KOBARA, T. HORIO and S. ENDO: Journal of Pesticide Science, 34, 13-20 (2009)

“A useful new insecticide bioassay using first-instar larvae of a net-spinning caddisfly, Cheumatopsyche brevilineata (Trichoptera: Hydropsychidae)”

3) T. IWAFUNE, K. INAO, T. HORIO, N. IWASAKI, A. YOKOYAMA and T. NAGAI: Journal of Pesticide Science, 35, 114-123 (2010)

“Behavior of paddy pesticides and major metabolites in the Sakura River, Ibaraki, Japan”

4) T. NAGAI and A. YOKOYAMA: Journal of Pesticide Science, 37, 233-239 (2012)
“Comparison of ecological risks of insecticides for nursery-box application using species sensitivity distribution”

5) 独立行政法人農業環境技術研究所：「コガタシマトビケラ1齢幼虫を用いた農薬の急性毒性試験法マニュアル」 pp26 (2008)

6) T. H. HUTCHINSON, J. SOLBÉ and P. J. KLOEPPER-SAMS: Chemosphere, 36, 129-142 (1998) "Analysis of the ecotoc aquatic toxicity (EAT) database III — Comparative toxicity of chemical substances to different life stages of aquatic organisms"

8) S. A. COLLYARD, G. T. ANKLEY, R. A. HOKE and T. GOLDENSTEIN: Archives of Environmental Contamination and Toxicology, 26, 110-113 (1984)

“Influence of age on the relative sensitivity of Hyalella azteca to diazinon, alkylphenol ethoxylates, copper, cadmium, and zinc”

9) K. R. PALMQUIST, J. J. JENKINS and P. C. JEPSON: Environmental Toxicology and Chemistry, 27, 1713-1720 (2008)

“Clutch morphology and the timing of exposure impact the susceptibility of aquatic insect eggs to esfenvalerate”

10) K. MIYAKAWA: Kontyu, 41, 413-425 (1973)

“The embryology of the caddisfly Stenopsyche griseipennis Maclachlan (Trichoptera: Stenopsychidae) I. Early stages and changes in external form of embryo”

11）独立行政法人農業環境技術研究所：「コガタシマトビケラの飼育法マニュアル」pp28(2008)

12) J. L. ROBERTSON, R. M. RUSSELL, H. K. PREISLER and N. E. SAVIN eds., Bioassays with Arthropods 2nd ed., CRC Press, (2007)

“Chapter11 Times as a Variable”

13) IRAC MoA Classification Scheme Version7.3

http://www.irac-online.org/irac-moa-classification-version-7-3-now-posted/

14) S. KOBAYASHI: Researches on Population Ecology 10, 40-44 (1968)

“Estimation of the individual number entering each development stage in an insect population”

15) N. J. MILLS: Oecologia, 51, 206-211 (1981)

"The estimation of mean duration from stage frequency data"

16) L. P. LEFKOVITCH: Biometrics, 21, 1-18 (1965)

"The study of population growth in organisms grouped by stages"

17) N. YUSOFF, H. BUDIN and S. ISMAIL: World Academy of Science, Engineering and Technology, 62, 477-482 (2012)

“Simulation of population dynamics of Aedes aegypti using climate dependent model”

18) A. YOKOYAMA, K. OHTSU, T. IWAFUNE, T. NAGAI, S. ISHIHARA, Y. KOBARA, T. HORIO and S. ENDO: Journal of Pesticide Science, 34, 21-26 (2009)

“Sensitivity difference to insecticides of a riverine caddisfly, Cheumatopsyche brevilineata (Trichoptera: Hydropsychidae), depending on the larval stages and strains”
19) 日本植物防疫協会：農薬ハンドブック2011年版

20) J. L. PETERSON, P. C. JEPSON and J. J. JENKINS: Environmental Toxicology and Chemistry, 20, 2205-2214 (2001)

“A test system to evaluate the susceptibility of Oregon, USA, native stream invertebrates to triclopyr and carbaryl”

21) W. G. GOODMAN and N. A. GRANGER: in L. L. GILBERT ed., Insect Development, Morphogenesis, Molting and Metamorphosis, University of North Carolina, USA, 306-394 (2005) "8 The Juvenile Hormones"

22) E. C. ENSLEE and L. M. RIDDIFORD: Roux’s Archives of Developmental Biology, 181, 163-181 (1977)

“Morphological effects of juvenile hormone mimics on embryonic development in the bug, Pyrrhocoris apterus $ ^{*} $ ”

23) N. TATARAZAKO, S. ODA, H. WATANABE, M. MORITA and T. IGUCHI: Chemosphere, 53, 827-833 (2003)

“Juvenile hormone agonists affect the occurrence of male Daphnia”

24) M. MIYAMOTO, H. TANAKA and T. KATAGI: SUMITOMO KAGAKU, 2008-I, 1-18 (2008) "Ecotoxicological risk assessment of pesticides in aquatic ecosystems"

25) S. HAGINO: in H. OHKAWA, H. MIYAGAWA and P. W. LEE, eds., Pesticide Chemistry, WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, p.415 (2007)

“A state of the art of testing methods for endocrine disrupting chemicals in fish and daphnids”

26) K. T. TASSOU and R. SCHULZ: Ecotoxicology and Environmental Safety, 72, 1058-1062 (2009) "Effects of the insect growth regulator pyriproxyfen in a two-generation test with Chironomus riparius"

27) L. D. WILLIS and A. C. HENDRICKS: Journal of the North American Benthological Society, 11, 290-303 (1992)

“Life history, growth, survivorship, and production of Hydropsyche slossonae in Mill Creek, Virginia”

28）八木雅之、笹川満廣：環動昆，4,1-10(1992)「コガタシマトビケラの生活史と群飛行動」

29) ISO: ISO 8692 (2004)

“Water Quality—Freshwater algal growth inhibition test with unicellular green algae”

30) M. S. J WARNE and D. W. HAWKER: Ecotoxicology and Environmental Safety, 31, 23-28 (1995) "The number of components in a mixture determines whether synergistic and antagonistic or additive toxicity predominate: The funnel hypothesis"

31) M. FAUST, R. ALTENBURGER, T. BACKHAUS, H. BLANCK, W. BÖDEKER, P. GRAMATICA, V. HAMER, M. SCHOLZE, M. VIGHI and L. H. GRIMME: Aquatic Toxicology, 56, 13-32 (2001) "Predicting the joint algal toxicity of multicomponent s-triazine mixtures at low-effect concentrations of individual toxicants"

32) M. FAUST, R. ALTENBURGER, T. BACKHAUS, H. BLANCK, W. BÖDEKER, P. GRAMATICA,
V. HAMER, M. SCHOLZE, M. VIGHI and L. H. GRIMME: Aquatic Toxicology, 63, 43-63 (2003) "Joint algal toxicity of 16 dissimilarly acting chemicals is predictable by the concept of independent action"
5C-1102-66

# （３）確率論を導入した農薬の生物多様性影響評価法の開発

（独）農業環境技術研究所

有機化学物質研究領域 永井 孝志

平成23～25年度累計予算額：409千円

（うち、平成25年度予算額：183千円）

予算額は、間接経費を含む。

[要旨]

河川生態系を構成する様々な生物種間の感受性差について、確率論的に解析する種の感受性分布（SSD）を活用し、農薬の生物多様性（種の多様性）に対する影響評価法を開発した。サブテーマ（2）で得られた水生昆虫や付着藻類の毒性データを活用し、SSDの解析を行うとともに、毒性データが少ない場合のSSDを推定する手法を新たに開発した。92剤の除草剤を対象としたSSD解析の結果、SSDの傾き（対数標準偏差値）は除草剤の作用機作ごとに有意な差（P<0.001）が見られた。また、作用機作ごとに標準試験種である緑藻（Pseudokirchneriella subcapitata）の毒性値（EC_{50}値）は、SSDの中央値（対数平均値）と有意な相関関係（P<0.05）が見られたが、SSDの傾きとは有意な関係（P>0.05）がなかった。以上により、除草剤の作用機作ごとに解析した緑藻標準種のEC_{50}値とSSDの中央値との回帰式と、作用機作ごとのSSDの傾きの平均値により、除草剤のSSDが推定できることが示唆された。開発したSSD推定方法を用いて、わが国の水稻用除草剤12種のSSDパラメータ（中央値と傾き）を推定し、文献等により収集した複数の毒性データから解析したSSDパラメータとの比較を行った結果、両者は概ね一致しておりSSD推定手法の有効性が確認された。サブテーマ（4）で必要とされる、複数農薬の曝露による生物多様性への影響評価を可能とするため、累積リスクを考慮したSSD解析手法の改良を行った。既存のConcentration-Additive（CA）モデルとResponse-Additive（RA）モデルを用いた複合影響の予測結果と、サブテーマ（2）で得られた複合影響試験結果の比較を行った結果、作用機作が同じ場合にはCAモデル、作用機作が異なる農薬の場合はRAモデルによる予測精度が良好であった。SSDによる複数の農薬による影響を受ける種の割合（msPAF）の計算においても、CAとRAモデルが適用可能であることが確認された。

[キーワード]

種の感受性分布、作用機作、複合影響、累積リスク

### 1. はじめに

農薬はその作用機作の特殊性により、生物種によって毒性が特徴的に異なるため、種間の感受性差を十分に考慮したリスク評価を行うことが望まれる。しかしながら、環境中に生息する全ての生物種に対する毒性試験を実施し、毒性データを得ることは現実的に不可能である。一方で経験則により、複数の生物種に対する農薬の感受性は対数正規分布に適合することが知られており、図(3)-1のように累積確率分布で表現できる。このように、生物種間の感受性差を統計学的な分布で表現したものが、種の感受性分布（species sensitivity distribution, SSD）である $ ^{1} $ 。SSDはある程
度の毒性データが揃っていれば、図(3)-1のように農薬濃度と影響を受ける種の割合との関係として表現できる。欧米において、SSDは基準値設定の根拠や生態リスク評価を行う際に幅広く用いられている。米国や欧州、オーストラリアなどでは、SSDの5パーセンタイル値に相当する濃度（5％の種が影響を受ける濃度、言い換えれば95％の種が保護される濃度）をHC_{5}（5％ Hazardous Concentration）と表現し、これを無影響濃度とすることで、水生生物保全のための水質基準値の設定根拠として用いている $ ^{2-4} $ 。これは、95％以上の

図(3)-1 種の感受性分布の概念図

種を保護できれば、種の多様性には大きな影響は無い、という仮定に基づいている。図(3)-1縦軸の「影響を受ける種の割合」は、生物多様性（種の多様性）に対する影響度指標と見なすことができ、定量的なリスク評価に適した指標である。わが国で使用される様々な水稲用除草剤についても、SSDを用いてリスクの比較を行った事例がある $ ^{5} $ 。

SSD解析に必要な毒性データの数（種数）は各国のガイドライン等によって異なるが，OECDにおいては5種以上とされている $ ^{6} $ 。しかし、5種以上のデータが得られる農薬は限定されており、多くの農薬ではデータ不足のため、SSDの活用ができないのが実情である。サブテーマ（2）において、わが国の河川に在来する付着藻類5種を選定し、SSD解析に必要なデータを効率的に得ることができる新たな毒性試験法を開発したが、全ての農薬に対し試験を行うのは現実的に困難である。従って、幅広い農薬に対しSSDを用いたリスク評価を行うには、少ないデータからでもSSDを推定できる手法の開発が求められる。また、サブテーマ（4）では、様々な防除体系で使用する複数の農薬による生態リスクを総合的に評価することとなっている。すなわち、SSDを用いて複合影響を考慮した生態リスク（本研究では「累積リスク」と定義する）の評価手法を開発する必要がある。これまでに、de Zwart $ ^{6} $ らがSSDを用いた累積リスク評価法を提案した事例があるが、実験的な検証は未だなされていない。従って、SSDを用いた累積リスクの評価法を実験的に検証することが求められている。

## 2 ．研究開発目的

本研究では、種の感受性分布（SSD）を活用した農薬の生物多様性に対する影響評価法を開発することを目的とした。まず、SSDパラメータ（中央値と傾き）と除草剤の作用機作との関係を明らかにし、少ない毒性データからでもSSDを推定可能な手法を開発した。これにより、SSDによる評価が可能な農薬の範囲を大幅に拡張することが可能となる。また、開発したSSDの推定手法について、推定誤差の確率論な解析を行った。これにより、SSDを用いた生態リスク評価結果の信頼性が確保される。さらに、サブテーマ（4）で必要とされる、複数農薬の曝露による生物多様性への影響評価を可能とするため、既存の複合影響予測モデルによる累積リスクを考慮したSSDの解析手法を開発し、サブテーマ（2）で得られた複合毒性試験の結果を用いて本評価法の有効性を検証した。