Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
表 $ (2)-2-7 $ DINP乳仔期経母乳曝露における影響の性差

Saline (+vehicle)
Male	Female
Dp-IgG1	93.0	$ \pm $ 6.1	46.0	$ \pm $ 5.9	***
IL-13	171.0	$ \pm $ 26.4	68.5	$ \pm $ 21.6	*

Dp (+DINP 0.0375)
Male	Female
Score	3837.7	$ \pm $ 604.7	34677.5	$ \pm $ 10685.5	*
Dp-IgG $ _{1} $	3837.7	$ \pm $ 604.7	34677.5	$ \pm $ 10685.5	*
EOS	231.5	$ \pm $ 34.5	472.1	$ \pm $ 91.3	*
MC	10.1	$ \pm $ 1.5	36.5	$ \pm $ 2.3	***
Severe	7.0	$ \pm $ 0.9	27.7	$ \pm $ 2.3	***
Mild	2.2	$ \pm $ 0.4	6.9	$ \pm $ 1.3	*

Dp (+vehicle)
Male	Female
Total IgE	39.4	$ \pm $ 11.7	120.4	$ \pm $ 19.4	**
IL-33	63840.7	$ \pm $ 7939.3	90635.8	$ \pm $ 7059.8	*
Eotaxin	198.1	$ \pm $ 44.9	342.7	$ \pm $ 22.8	*

Dp (+DINP 0.75)
Male	Female
Dp-IgG $ _{1} $	2677.1	$ \pm $ 279.2	8356.1	$ \pm $ 1513.6	**
IL-33	58050.3	$ \pm $ 5225.9	77067.6	$ \pm $ 5740.3	*

Dp (+DINP 15)
Male	Female
Dp-IgG $ _{1} $	4158.7	$ \pm $ 808.2	9511.6	$ \pm $ 1643.0	**
IL-13	419.2	$ \pm $ 41.7	687.3	$ \pm $ 90.5	*
MCP-3	401.6	$ \pm $ 49.8	207.8	$ \pm $ 63.1	*

Data are the means ± SEM. Score; clinical score. EOS; the number of the eosinophils. MC; the total number of the mast cells. Severe; the number of the severely degranulated mast cells. Mild; the number of the mildly degranulated mast cells. *p < 0.05, **p < 0.01, and ***p < 0.001.

## 3 ）環境化学物質によるアレルギー性鼻炎増悪メカニズムの解明

細胞培養実験を図(2)-3-1に示した。OVA処理により、IL-1βおよびIL-6 mRNA発現量が増加した。OVAと化学物質を併用処理した群では、OVA単独処理群と比較して、mRNA発現に有意な変動は認められなかった。また、MCP-1 mRNA発現はOVA処理により、対照群と比較して約8.5倍に増加した。化学物質（BPA、DEHP）を併用処理すると、BPAではすべての濃度において、MCP-1 mRNA発現はOVA処理群と比較して有意な発現変動は認められなかった。しかし、DEHP 150μM併用処理群ではOVA単独処理群と比較すると約1.5倍（対照群と比較すると約13倍）の有意な発現誘導が認められた。さらに、MIP-1α mRNA発現量はOVA処理により、対照群と比較して約1.7倍に増加した。化学物質の併用処理により全ての併用処理群で発現量の増加が認められ、特にBPA 0.5、5μM併用処理群、DEHP 150μM処理群では有意な発現誘導が認められた（それぞれOVA単独処理群と比較して、約1.9倍、2.0倍、1.9倍）。

一方、TNF mRNA発現量はOVA処理により、対照群と比較して約2.1倍増加したが、化学物質の併用により、有意差は認められなかったが、その発現誘導が抑制される傾向をしめした。また、KC mRNAは対照群では発現しておらず、OVA処理により、発現誘導が認められるものの、その発現は弱く、また、化学物質の併用処理によっても大きな発現変動は認められなかった。

以上の結果より、in vitro実験ではOVAの存在下において、炎症性サイトカイン（IL-1β、IL-6、MIP-1α）mRNA発現に対するBPAの発現誘導が認められたため、BPAはアレルギー反応を増強する可能性を示唆した。
Crij1を用いたアレルギー性鼻炎マウスモデルにおけるBPAの影響評価については、Crij1単独投与群の体重は対照群に比較して低下傾向を示し、Crij1+BPA0.1mg群の体重はCrij1単独投与群よりも更に低下しており、対照群と比較すると有意(P<0.05)に低下していた。Crij1+BPA1mg群の体重はCrij1単独投与群よりも低下していたが、対照群との比較では有意差を示さなかった。

Crij1単独投与群の鼻洗浄液（NCLF）中の総細胞数（p<0.001）、好中球数(p<0.001)及び好酸級数(p<0.01)は対照群に比較して有意に増加していた(図(2)-3)-2)。Crij1+BPA0.1mg群の総細胞数（p<0.05）と好酸級数(p<0.05)は対照群に比較して有意に増加していたが、Crij1単独投与群に比較すると総細胞数や炎症細胞数は減少傾向を示していた（図(2)-3)-2）。Crij1+BPA1mg群の総細胞数（p<0.05）と好酸級数(p<0.01)は対照群との比較では有意に増加していた。しかし、Crij1単独投与群と比較すると好中球数は有意（p<0.05）に減少し、更にリンパ球もCrij1+BPA0.1mg群に比較して有意（p<0.05）に減少していた（図(2)-3)-2）。

Crij1単独投与群ではIL-5とINF-γには殆ど発現が認められなかったが、IL-1β、IL-6やIL-13に発現が認められた。またケモカイン類では好酸球の遊走、活性化に関連したEotaxinやMPC-3には発現が認められなかったが、好中球に関連したKCに発現が認められた。またMCP1、MIP-1αやTNF-αにも弱いながら発現が認められた。Crij1+BPA0.1mg群とCrij1+BPA1mg群のNCLF中のサイトカインやケモカイン発現はNALF中の炎症細胞数の変化と類似していた（表(2)-3)-1）。サイトカインのIL-1βとIL-6はBPAの投与量に依存して低下する傾向をしていた。またケモカイン類のKCやMIP-1αにもBPAの投与量に依存して低下する傾向が見られた（表(2)-3)-2）。一方、鼻の組織学的観察では、対照群の鼻粘膜下に好酸球等の炎症細胞の浸潤はほとんど認められなかったが、Crij1を投与したマウスでは、粘膜下組織や粘膜上皮内に好酸球の著しい浸潤が見られた。しかし、BPA投与群（0.1mgと1mg）では鼻粘膜下への好酸球浸潤がCrij1を投与よりも減弱していた。

以上の結果より、AlumとCrij1初期感作によるスギ花粉症誘発モデルではBPAの投与は鼻洗浄液中の炎症細胞数やサイカイン・ケモカインの発現を低下させ、アレルギー性鼻炎の病態を軽減させた。Alum+Crij1感作系では、BPAはむしろアレルギー反応を抑制する方向に作用することが明らかとなった。

OVAを用いたアレルギー性鼻炎マウスモデルにおける低用量BPAの影響評価については、BPA単独投与群の鼻洗浄液（NCLF）中の総細胞数は図(2)-3)-3に示すように増加が認められなかった。OVA単独群では総細胞数が増加したが、OVA+BPA群では総細胞数の増加は認められず、むしろBPAを添加することによって低下傾向を示した（図(2)-3)-3）。またOVA+BPA群のNCLF中の炎症性サイトカインIL-6, EotaxinやKCはOVA単独群と変わらなかった。鼻の病理学的観察でもOVA+BPA群の鼻粘膜下の好酸球性炎症はではOVA単独群に比較して低減していた。一方、血清中のOVA特異的-IgE抗体は検出されなかった。OVA特異的-IgG1抗体産生はBPAの0.02μgと0.2μg群で濃度依存的に増加したが、2μgでは0.2μgよりも低下する傾向を示した（図(2)-3)-4）。Ex vivo実験において、BPAの2μg群ではConAやLPS刺激による脾細胞の増殖反応が高められた（図(2)-3)-5）。一方、OVA添加群ではConAやLPS刺激によってBPA濃度依存的に増殖反応が低下する傾向を示した。以上の結果から、総細胞増加が見られないことから、低用量のBPAはアレルギー炎症を高める作用がないことが示唆された。しかし、OVA特異的-IgG1抗体産生がBPAの低用量で濃度依存的に増加したことから、IgG1産生に対してはアジュユバント作用があることが示された。Ex vivo実験でのConAやLPS刺激における2μg BPA群の脾細胞増殖反応の増加やOVA+ BPA群における増
殖反応の低下は、2次刺激によって脾細胞が何らかの影響（リンパ球の活性化、アポトーシスや老化の促進）を受けている可能性が推察された。

OVAを用いたアレルギー性鼻炎マウスモデルによるDEHPの影響評価については、DEHP添加群の鼻洗浄液中の好中球数は投与量に依存して増加傾向を示し、DEHPの投与量の最も多い3.2μg投与群では対照群と比較して有意な増加を示した（図(2)-3)-6）。アレルギー炎症指標の好酸球数はDEHP投与によって増加傾向を示し、0.16μg投与群では対照群と比較して有意な増加を示した。しかしOVA群との間に有意差はなかった。鼻洗浄液中のサイトカイン/ケモカイン（表(2)-3)-3）のうちIL-6, Eotaxin, KCがOVA投与によって増加傾向を示し、OVA+DEHP投与群（0.008μg, 0.16μg, 3.2μg）ではIL-13, EotaxinとKCが対照群に比較して有意に増加し、IL-13はOVA単独群と比較しても有意に増加していた。

鼻組織ではOVA投与によってIL-1β, IL-5, IL-6, IL-13, Eotaxin, KC, MCP-1, MCP-3やMIP-1αに増加傾向が認められたものの有意差を示すには至らなかった（データ示さず）。OVA+DEHP投与群のうち対照群との間に有意差を示したものはDEHP（0.008μg）投与群のIL-6とKCであったが、OVA群との有意差は示さなかった。鼻粘膜の病理組織変化として、OVA単独投与群では鼻粘膜上皮細胞の增生と丈の延長、粘膜下組織には好酸球の浸潤が認められた（図(2)-3)-7）。OVA+DEHP（0.0004μg, 0.008μg, 0.16μg, 3.2μg）投与群では総じてこれらの変化がOVA単独群より強く見られ、特に3.2μg投与群では粘膜下組織への好酸球の浸潤が強い傾向にあった（図(2)-3)-7F）。粘液細胞の增生はOVAやOVA+DEHP投与によって若干増加が認められるが著しい変化ではかった。以上の結果から、DEHPは環境中で曝露される低濃度レベルであっても炎症性サイトカイン発現を高めてアレルギー性鼻炎を悪化させる可能性が示唆された。

OVAを用いたアレルギー性鼻炎マウスモデルにおける低用量ベンツ(a)ピレン（BaP）の影響評価については、BaP0.1μg群とBaP10μg群の鼻洗浄液中の炎症細胞数は対照群と変わらなかった（図(2)-3)-8）。OVA群では好中球数と好酸球数が増加し、対照群との間に有意差を示しアレルギー性鼻炎が惹起していることが示唆された。OVA+BaP0.1μg群ではOVA群よりもそれらの炎症細胞数は低下する傾向を示したが、OVA+BaP10μg群では総細胞数、好中球数やリンパ球数が増加する加傾向を示した。一方、OVA群の鼻洗浄液中のサイトカイン/ケモカインのIL-6とKCは対照群と比較すると増加傾向を示し（図(2)-3)-9）、OVA+BaP0.1μg群とOVA+BaP10μg群では量-依存的に増加し、対照群との間に有意差を示した。またOVA+BaP10μg群のIL-6はOVA群との間でも有意差を示した。OVA群のEotaxinは対照群と比較して有意に増加したが、OVA+BaP0.1μg群はOVA群と変わらず、OVA+BaP10μg群ではむしろ低下する傾向を示した。Th2サイトカインのIL-13は検出限界に近い値でOVAやBaP投与による影響は認められなかった。鼻組織の病理的な観察でも、OVA+BaP10μg群ではOVA群に比較して鼻粘膜の浮腫性変化と鼻粘膜下への好酸球浸潤が強いことが確認された。一方、OVA群の血清中のOVA-特異的IgG1とIgE抗体は対照群よりも有意に増加したが、併用群ではBaPを加えたことによる影響は認められなかった。

以上の結果から、少なくともBaP10μg群ではアレルギー性鼻が亢進していることが示唆されたが、IgEやIgG1抗体産生に関してはBaPの腹腔内投与による影響は無いもと考えられた。
図(2)-3)-1. RAW264.7細胞を用いた炎症性サイトカイン遺伝子スクリーニング系におけるビスフェノールA (BPA) とフタル酸ジエチルヘキシル (DEHP) の影響
図(2)-3)-2. BPAを投与したマウスの鼻洗浄液中の炎症細胞の変化

値は平均値± SEM. $ ^{*} $ p < 0.001 vs. Control; $ ^{\dagger} $ p < 0.01 vs. Control;

$ ^{\ddagger} $ p < 0.05 vs. Control ; $ ^{\S} $ p < 0.05 vs. Crij1; $ ^{\P} $ p < 0.01 vs. Crij1 + BPA $ _{0.1} $

表(2)-3)-1 BPAを投与したスギ花粉症モデルマウスの鼻洗浄液中のサイトカイン発現

Group	Animals(n)	Cytokines (pg protein/total NCLF)
IL-1 $ \beta $	IL-5	IL-6	IL-13	IFN- $ \gamma $
Control	6	0.60±0.38	0	33.4±14.9	0.39±0.37	0
Crij 1	6	197±53.5 $ ^{*} $	0.73±0.58	248±29.5 $ ^{*} $	2.70±1.70	0
Crij 1 + BPA $ _{0.1mg} $	6	77.5±7.39 $ ^{\dagger} $	0.90±0.90	260±30.0 $ ^{*} $	0.30±0.30	0
Crij 1 + BPA $ _{1mg} $	6	56±13.1 $ ^{\dagger} $	0	142±37.9 $ ^{\S} $	0	0

値は平均値±SEM示す。

* p < 0.001 versus Control ; † p < 0.01 versus Crij 1 ; ‡ p < 0.05 versus Crij 1 ; § p < 0.05 versus Crij 1 + BPA_{0.1}
表(2)-3)-2. BPAを投与したスギ花粉症モデルマウスの鼻洗浄液中のケモカイン発現

Group	Animals(n)	Chemokines (pg protein/total NCLF)
Eotaxin	KC	MCP-1	MCP-3	MIP-1 $ \alpha $	TNF- $ \alpha $
Control	6	0	16.6±5.22	3.68±0.11	0	0	8.72±1.48
Crij 1	6	0	252±19.5	4.01±0.22	0	8.68±6.67 $ ^{*} $	11.4±1.63
Crij 1 + BPA $ _{0.1} $ mg	6	0	205±16.0	4.03±0.20	0	5.79±0.96	13.3±1.68
Crij 1 + BPA $ _{1} $ mg	6	0	126±23.4 $ ^{\dagger} $	4.02±0.17	0	3.99±1.50	7.51±0.47 $ ^{\dagger} $

値は平均値±SEM示す。

$ ^{*} $ p < 0.05 versus Crij 1 ; $ \dagger $ p < 0.05 versus Crij 1+BPA $ _{0.1} $

図 (2)-3)-3.(左図)

鼻洗净液中の総細胞数の変化値は平均値±SEで示す.

図 (2)-3)-4.(右図)

$$ \mathsf{p}<0.05\ \mathsf{v s} $$

血清中の抗原特異的-IgG1産生量値は平均値±SEで示す.
図2-3-5. 脾臓リンパ球の増殖反応

値は平均値±SEで示す.

図(2)-3)-6. 卵白アルブミン(OVA)とDEHPを点鼻投与したマウスの 鼻洗浄液中の炎症細胞の変化

値は平均値±SEで示す. $ ^{*} $ p < 0.05 vs. Control.
表(2)-3)-3. 鼻洗浄液中の炎症性サイトカイン・ケモカインの変化

Group $ * $	Animals	Cytokines and chemokines (pg protein/ml)
(n)	IL-1 $ \beta $	IL-5	IL-6	IL-13	IL-33	Eotaxin	KC	MCP-1
Control	8	ND	ND	36.3 ± 6.95	ND	ND	2.58 ± 0.82	22.9 ± 2.60	ND
OVA	8	ND	ND	96.8 ± 30.2	ND	ND	12.7 ± 3.19	39.1 ± 2.46	ND
OVA + DEHP $ _{1} $	8	ND	ND	63.8 ± 16.3	ND	ND	7.44 ± 2.73	36.4 ± 4.39	ND
OVA + DEHP $ _{2} $	8	ND	ND	128 ± 42.6	5.15 ± 0.43 $ ^{\S\P} $	ND	9.78 ± 3.19	44.9 ± 4.12 $ ^{\dagger} $	ND
OVA + DEHP $ _{3} $	8	ND	ND	113 ± 41.6	5.31 ± 0.52 $ ^{\S\P} $	ND	11.9 ± 2.45	48.4 ± 8.07 $ ^{\ddagger} $	ND
OVA + DEHP $ _{4} $	8	ND	ND	90.3 ± 22.8	5.09 ± 0.40 $ ^{\S\P} $	ND	20.5 ± 3.30 $ ^{\ddagger} $	42.7 ± 4.58	ND

*Control: saline; OVA: OVA (50μg); OVA+DEHP1: OVA (50μg) + DEHP (0.0004μg); OVA+DEHP2: OVA (50μg) + DEHP (0.008μg); OVA+DEHP3: OVA (50μg) + DEHP (0.16μg); OVA+DEHP4: OVA (50μg) + DEHP (3.2μg). *All values were expressed as mean ± SE. †p < 0.05 vs. Control; ‡p < 0.01 vs. Control; §p < 0.001 vs. Control; ¶p < 0.001 vs. OVA.

C

对照群

OVA群

OVA+DEHP 0.008 $ \mu $ g群

OVA+DEHP 0.0004 $ \mu $ g群

OVA+DEHP 0.16 $ \mu $ g群

OVA+DEHP 3.2 $ \mu $ g群

図(2)-3)-7. OVA+DEHPを点鼻投与したマウスの鼻粘膜下の好酸球浸潤 鼻粘膜下への著しい好酸球浸潤を示す（F）。HE 染色
図(2)-3)-8. 鼻洗浄液中の炎症細胞の変化. データは $ M \pm SE $ (n=8) で示す. * p < 0.05 vs. Control, † p < 0.05 vs. BaP0.1, † p < 0.05 vs. BaP10, ¶ p < 0.01 vs. OVA+BaP0.1.

図(2)-3-9 鼻洗浄液中のサイカイン，ケモカインの変化

$$ ^{*}p<0.05vs.control;^{\dagger}p<0.05vs.BaP0.1;^{\ddagger}p<0.05vs.BaP10; $$

$$ ^{\S}p<0.05vs.OVA;^{\&}p<0.05vs.OVA+BaP0.1 $$
## 4 ）環境化学物質のアレルギー性疾患増悪影響に対するスクリーニング手法の開発

本研究では、平成22年度にDEHPとDINPを対象として、平成23年度にはBaPとBPAを対象として、in vitro曝露が樹状細胞の遺伝子発現に及ぼす影響について検討した。平成24年度には、DEHPとDINPを対象とし、in vitro曝露による樹状細胞サブセットの変化とアレルギー性喘息モデルマウスを用いた若齢期曝露が免疫担当細胞の構成や機能に及ぼす影響について検討した。最終年度の平成25年には、BaPとBPAを対象として平成24年度と同様の検討を行い、加えて、BaPの乳児期曝露が免疫担当細胞の構成や機能に及ぼす影響についても検討した。

まず、環境化学物質のin vitro曝露が樹状細胞に及ぼす影響については、BMDCの包括的遺伝子発現解析においては、DEHPおよびDINP、BaPの曝露により、BMDCのサイトカインやサイトカイン受容体、シグナル伝達系因子、細胞外基質、細胞分化・増殖やアポトーシスに関連する因子などの遺伝子の発現が増加することを明らかにし、共通して変動する遺伝子の存在も見出した。これらの環境化学物質は、先行研究において、BMDCの活性化を示す細胞表面分子の発現を増加することも確認している。一方、BPAの曝露による遺伝子発現の変動は非常に少なく、6時間曝露による顕著な遺伝子発現の変動は、FOS遺伝子の発現増加のみであった。24時間曝露においては、いくつかの防御系因子の遺伝子発現増加が観察されたが、IL1RAP [IL-1 receptor accessory protein]やIL13RA 1 [IL13 receptor, alpha 1]、CD69等の免疫応答に関わる遺伝子の発現低下も観察された。BPAは、BMDCの活性化を示す細胞表面分子の発現への影響も少なかったことから、抗原提示細胞への直接的な修飾作用は弱い可能性が示唆された。これらの結果を、表(2)-4)-1にまとめた。

代表例として、BaPの結果について述べる。BaP曝露により発現が変動した遺伝子数は24時間よりも6時間の曝露の方が多く、サイトカインやサイトカイン受容体、転写因子、リン酸化・脱リン酸化酵素、細胞外基質、細胞分化・増殖やアポトーシス、ストレス応答に関連する因子等の遺伝子の変動が観察された。中には、6時間と24時間両方で発現増加が観察された遺伝子（CD93、CCL7[chemokine (C-C motif) ligand 7]、CCL12、CXCL10[chemokine (C-X-C motif) ligand 10]、IIGP1[interferon inducible GTPase 1]、IFIT1,2,3[interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1,2,3]、IFIH1[interferon induced with helicase C domain 1]、IRF7[interferon regulatory factor 7]、RSAD2[radical S-adenosyl methionine domain containing 2、CYP1B1[cytochrome P450, family 1, subfamily B, polypeptide 1]等）もあった。また、BaP曝露とDEHPまたはDINP曝露に共通して発現増加した遺伝子（IL6やIL12RB1[IL-12 receptor, beta 1]、IL13RA1[IL-13 receptor, alpha 1]、CXCL10[C-X-C motif chemokine 10], CCR2[chemokine (C-C motif) receptor-like 2], TLR7[toll-like receptor 7]、SERPINB2[serine (or cysteine) peptidase inhibitor, clade B, member 2]、MMP14[matrix metallopeptidase-14]、RSAD2等）も観察された。

BaPの6、24時間曝露とDEHPの6時間曝露で増加を示したRSAD2は、感染防御などに重要な役割を果たす抗ウィルスタンパクであり、樹状細胞サブセットのpDCにおいてTLR7/9の刺激によりIRF7依存的に強く発現誘導され、I型インターフェロンの産生を誘導することが知られている。加えて、RSAD2と関連性のあるCXCL10（IP-10, interferon gamma inducible protein 10としても知られている）やIFIT1、IRF7等もまた、BaP曝露で遺伝子発現が増加することが明らかとなった。また、IL-12RB1、TLR7、SERPINB2遺伝子は、BaPとDEHP、DINPいずれの6時間曝露においても発現増加が観察された。一方、BaPの6時間曝露では、Th2応答の調節に関わるIDO1[indoleamine 2,3-dioxygenase 1]やCCR2、早期活性化マーカー分子のCD69、抗原提示に関わる補助刺激分子の
CD86遺伝子等の発現増加に加え、喫煙との関連が示唆されているセルサイクルに重要な転写因子のBBX [bobby sox homolog] 遺伝子の発現増加といった特徴的な変化も観察された。タバコ煙にはBaPが含まれていることから、喫煙とBBXの関連性にはBaPが寄与している可能性も示唆された。さらに、フタル酸エステルと同様にBaPは、BMDCの活性化を示す細胞表面分子の発現等をタンパクレベルでも増加することも確認している。

以上より、フタル酸エステルとBaPは、樹状細胞を刺激し、免疫・炎症反応や防御機構等に関わる因子を修飾すること、加えて特徴的な遺伝子変動の存在も示された。BMDCの包括的遺伝子発現解析の結果は、表(2)-4-1に示した。

包括的遺伝子発現解析の結果から、pDCに関連する因子の変動が認められたことから、環境化学物質が樹状細胞サブセット（pDCおよびcDC）に及ぼす影響について解析を進めた。これまでに、アレルギー性喘息において、pDC（CD11c+PDCA-1+）は抗炎症作用を、cDC（CD11c+PDCA-1-）は炎症亢進作用を示すことが報告されている4）。解析の結果、GM-CSFとFlt3Lで分化誘導したBMDCに対しては、BaP曝露によりpDCが増加しcDCが減少したが（図(2)-4)-1a）、DEHPとDINP、BPA曝露による影響は観察されなかった。GM-CSFで分化誘導したBMDCに対しては、BaP曝露によりpDCが増加しcDCが減少、DEHP曝露によりpDCが増加、BPA曝露によりpDCが低下したが、DINP曝露による影響は認められなかった。一方、GM-CSFによるBMDCの分化誘導過程に及ぼす影響（すなわち樹状細胞の前駆細胞に及ぼす影響）においては、BaP曝露によりcDCが減少したが（図(2)-4)-1b）、DEHP（図(2)-4)-1c）およびDINP（図(2)-4)-1d）、BPA（図(2)-4)-1e）曝露により、cDCの有意な増加が観察された。

以上の結果より、培養条件による影響の差異もあるが、フタル酸エステルとBPAは、樹状細胞の前駆細胞に作用してcDCの分化を促進する可能性があり、BaPは、pDCを促進し、cDCを抑制する可能性が示唆された。

一方、環境化学物質がアレルギー性喘息モデルマウスの免疫担当細胞に及ぼす影響について検討した。

## 【BaPの若齢期曝露における解析】

LNCの総細胞数は、Vehicle群に対してOVA群で有意に増加し、OVA+BaP群でさらに増加する傾向であった（図(2)-4)-2a）。LNCの細胞増殖能は、用量依存性はなかったが、OVA群に対し、OVA+BaP群で増加する傾向がみられた。また、OVA群に対し、OVA+BaP中用量および高用量群で、LNC中のMHC class II⁺CD86⁺細胞（活性化抗原提示細胞）の割合の有意な増加および細胞数の増加傾向が認められたことから、抗原提示細胞を活性化する可能性が示唆された。DCサブセットに大きな変化はなかったが、cDCの割合は、OVA群に対してOVA+BaP群でむしろ減少する傾向であり、pDCおよびcDCの細胞数は、いずれも増加する傾向であった。BaPは、樹状細胞以外の抗原提示細胞を活性化する可能性があるが、in vitroの結果も含め、樹状細胞に対しては、pDCを促進してアレルギー反応を抑制する方向に作用している可能性も示唆された。

## 【フタル酸エステルの若齢期曝露における解析】

LNCの総細胞数は、OVA群に対し、OVA+DEHP群で減少傾向、OVA+DINP群で増加傾向であった（図(2)-4)-2b,c）。また、OVA群に対し、OVA+DINP高用量群で、LNC中のMHC class II⁺CD86⁺細胞（図(2)-4)-2d）やcDC（図(2)-4)-2e）の割合の有意な増加、LNCの細胞増殖（図(2)-4)-2f）、IL-4、IL-5産生の増加傾向が観察された。一方、DEHPは、樹状細胞の活性化を抑制する可能性が示唆さ
れた。フタル酸エステルにおいては、骨髓細胞に及ぼす影響についても検討した。その結果、総骨髓細胞数は、OVA+DINP群で増加する傾向であったが、有意な変化は認められなかった。一方、この骨髓細胞からGM-CSFで分化誘導したBMDCは、OVA群でpDCの割合が有意に増加したが、その増加はDEHPまたはDINPの曝露を加えることで低下する傾向であった。また、一部の曝露条件で、cDCが増加した。さらに、Flt3Lで分化誘導したBMDCにおいては、OVA群での変化は認めらなかったが、OVA+DINP高用量群は、pDCの割合を低下したが、MHC class II+細胞の割合およびMDCとIL-12p40産生を増加する傾向が観察された。以上の結果から、喘息モデルマウスにおけるDEHPの樹状細胞への影響は総じて軽微であったが、DINPは、in vitroの結果も含め、樹状細胞の前駆細胞に作用して活性化cDCの増加あるいは局所リンパ節への移行を促している可能性が示唆された。

## 【BPAの若齢期曝露における解析】

LNCの総細胞数は、Vehicle群に対し、BPA中用量とBPA高用量、OVA、OVA+BPA高用量群で増加傾向、OVA+BPA低用量および中用量群では有意に増加した。また、OVA+BPA中用量群は、OVA群に対しても有意な増加を認めた（図(2)-4)-3a）。さらに、OVA群に対し、OVA+BPA低用量および中用量群では、活性化抗原提示細胞やcDC、T細胞（TCR⁺細胞）の数が増加する傾向であったが、OVA+BPA高用量群では有意に低下した。OVA再刺激下における培養後のLNCの細胞増殖は、OVA群に対し、OVA+BPA低用量群でのみ増加傾向がみられた。また、OVA群に対し、特にOVA+BPA低用量群でIFN-γ、IL-4（図(2)-4)-3b）、IL-5（図(2)-4)-3c）、SDF-1αの産生が有意に増加または増加する傾向が観察された。OVA+BPA群で観察されたLNCの総細胞数や活性化抗原提示細胞数、サイトカイン産生の増加は、肺局所での炎症病態と並行する結果であった。

## 【BaPの乳児期曝露における解析】

雄のLNCの総細胞数は、Vehicle群に対し、BaP中用量とBaP高用量群で増加傾向、OVAとOVA+BaP群で有意な増加を認めた。また、OVA群に対し、OVA+BaP低用量群で有意な増加を示した（図(2)-4-4a）。細胞表面分子の解析では、Vehicle群に対しBaP高用量群で、OVA群に対しOVA+BaP低用量および中用量群で、活性化抗原提示細胞、活性化T細胞（TCR $ ^{+} $ CD28 $ ^{+} $ 細胞）の数が増加または増加する傾向がみられた。OVA再刺激下で45時間培養したLNCは、細胞増殖に顕著な変化は認められなかったが（図(2)-4)-4c）、OVA群に対し、OVA+BaP低用量および中用量群でIL-4産生が増加する傾向であった（図(2)-4)-4b）。

雌のLNCの総細胞数は、Vehicle群に対し、OVAとOVA+BaP群で有意な増加を認め、OVA群に対し、OVA+BaP群で増加傾向を示した（図(2)-4)-4d）。また、細胞生存率が、Vehicle群に対し、OVA+BaP高用量群で有意に低下した。細胞表面分子の解析では、Vehicle群に対しBaP高用量群で、OVA群に対しOVA+BaP群で、cDCサブセットや活性化抗原提示細胞、T細胞の数が増加または増加する傾向がみられた。Vehicle群に対してBaP高用量群では、活性化T細胞も有意に増加した。OVA再刺激下で45時間培養したLNCは、OVA群に対し、OVA+BaP中用量群で、IFN-γとIL-4（図(2)-4)-4e）、IL-5産生の増加傾向および細胞増殖（図(2)-4)-4f）の有意な増加を認めた。

BaPの乳児期曝露の影響には、性差の存在も示唆されたが、雌雄ともに、肺局所での炎症反応に並行して、OVA+BaP群でLNCの総細胞数、活性化抗原提示細胞数、サイトカイン産生の増加が観察された。

以上の結果を、表(2)-4)-2、(2)-4)-3にまとめた。総じて、本研究で観察された環境化学物質の若齢期曝露および乳児期曝露による免疫担当細胞への影響は、肺局所での炎症病態と並行する結果
であり、環境化学物質が所属リンパ節における樹状細胞等の抗原提示細胞の活性化を促すことでTh2反応を亢進し、喘息病態の悪化に寄与している可能性が示された。また、in vitroおよびin vivo曝露の研究成果から見出された抗原提示細胞の活性化マーカー分子は、in vitroスクリーニングにも有用であると考えられる。

表(2)-4)-1. 環境化学物質のin vitro曝露がBMDCの遺伝子発現に及ぼす影響

(In vitro exposure)	BaP	DEHP	DINP	BPA
BMDC
- Gene expression
- Gene numbers	6 h (117), 24 h (26)	6 h (25), 24 h (15)	6 h (53), 24 h (27)	6 h (1), 24 h (49)
(AVE > 2.0-fold)
(AVE < 0.5-fold)	6 h (115), 24 h (5)	6 h (51), 24 h (32)	6 h (111), 24 h (48)	6 h (0), 24 h (3)
- Common change (Up-regulation)	Immune/inflammatory regulators; Cell defense-related factors
e.g. IL-6, IL-6R, IL-12, IL-12R, IL-13R, CXCL10, CCR2, MMP-14, RSAD2, TLR7/9, IFIT1/2/3, IRF7	FOS
- Specific change (Up-regulation)	e.g. BBX, IDO1, IGTP, IIGP1, IFIH1, IFIT1,2,3, IRF7, GM14446, MPA2I	e.g. AI607873, IL-7, TRIP13, PPOX, ATG12	-

(a).

(b).

(c).

(d).

(e).

図(2)-4)-1 環境化学物質のin vitro曝露によるBMDCサブセットの変化
(a). GM-CSFとFlt3Lで分化誘導後、BaP (0.1-10 μM) に24時間曝露したBMDCサブセット (pDC, CD11c⁺PDCA-1⁺; cDC, CD11c⁺PDCA-1⁻)、(b-e). 環境化学物質 (BaP: 0.1, 1 μM; DEHP, DINP, BPA: 1, 10 μM) とGM-CSFの存在下で6日間の培養により分化誘導したBMDCサブセット。

Data are the means ± SEM of triplicate culture. $ * $ ; p<0.05, $ ** $ ; p<0.01 vs. Control.

(a).

(b).

(c).

(d).

(e).

(f).

図(2)-4)-2 BaPおよびフタル酸エステルの若齢期曝露によるアレルギー性喘息モデルマウスの免疫担当細胞の変化

(a-c). LNCの総細胞数、(d). LNC中の活性化抗原提示細胞（MHC class II⁺CD86⁺細胞）の割合、(e). LNC中の樹状細胞サブセット（pDC: CD11c⁺PDCA-1⁺; cDC; CD11c⁺PDCA-1⁻）の割合、(f). OVAの再刺激有無で3日間（67時間）培養したLNCの細胞増殖。

BaP: 0.05, 1, 20 pmol/body/week; DEHP, DINP: 0.02, 8 nmol/body/week. Data are the means $ \pm $ SEM of 4-8 animals per group. $ * $ ; p<0.05 vs. Vehicle group, $ \# $ ; p<0.05, $ \#\# $ ; p<0.01 vs. OVA group.
(a).

(b).

(c).

図(2)-4)-3 BPAの若齢期曝露によるアレルギー性喘息モデルマウスの免疫担当細胞の変化 (a). LNCの総細胞数、(b, c). OVAの再刺激有無で3日間（66時間）培養したLNCのサイトカイン産生。 BPA: 0.0625, 1.25, 25 nmol/body/week. Data are the means ± SEM of 4-8 animals per group. **; p<0.01 vs. Vehicle group, #; p<0.05, ##; p<0.01 vs. OVA group.

(a).

(c).

(d).

(e)

(f).

図(2)-4-4 BaPの乳児期曝露によるアレルギー性喘息モデルマウスの免疫担当細胞の変化 (a, d). LNCの総細胞数、(b, e). OVAの再刺激有無で2日間（45時間）培養したLNCのIL-4産生、(c, f). OVAの再刺激有無で2日間（45時間）培養したLNCの細胞増殖。

BaP: 0.25, 5, 100 pmol/body/week, M: male, F: female. Data are the means $ \pm $ SEM of 4-8 animals per group. $ * $ ; p<0.01 vs. Vehicle group, $ \# $ ; p<0.05, $ \#\# $ ; p<0.01 vs. OVA group.
表(2)-4)-2. 環境化学物質の若齢期曝露が喘息モデルマウスの免疫担当細胞に及ぼす影響

(In vivo exposure)
Allergic asthma model	Exposure in childhood
BaP	DEHP	DINP	BPA
Bone marrow cells	-
- Numbers	↘	↗
- BMDC by GM-CSF	-	pDC (%)↘	pDC (%)↘
- BMDC by Flt3L	→	MHC II+(%)↗,
pDC (%)↘
MDC, IL-12 production↗
Mediastinal LNC
- Numbers	↗	↘	↗	↑
- Proliferation	↗	-	↗	↗
- Phenotypes
(% of positive cells)	MHC II+CD86+↑,
cDC↘	→	MHC II+CD86+↑,
pDC↗, cDC↑	MHC II+CD86+↗,
CD11c+↗, cDC↗
(positive cell numbers)	MHC II+CD86+↗,
pDC, cDC↗	MHC II+CD86+↓,
pDC, cDC↘	MHC II+CD86+↑,
pDC↗, cDC↗	MHC II+CD86+↗,
CD11c+↗
- Cytokine production	-	-	IL-4, IL-5 ↗	IL-4, IL-5, SDF-1α ↑,
IFN-γ↗

↑ 増加、↓減少、↑増加傾向、↓減少傾向、→変化なし、-未検討

表(2)-4)-3. BaPの乳児期曝露が喘息モデルマウスの免疫担当細胞に及ぼす影響

(In vivo exposure) Allergic asthma model	Exposure in infancy
BaP
Mediastinal LNC	M	F
- Numbers	↑	↗
- Proliferation	→	↑
- Phenotypes
(% of positive cells)	CD11c+↓, cDC↓	MHC II+CD86+↗, CD11c+↗, cDC↗
(positive cell numbers)	MHC II+CD86+↗, CD11c+↘, cDC↘	MHC II+CD86+↗, CD11c+↑, cDC↑
- Cytokine production	IL-4, IL-5↗	IL-4, IL-5, IFN-γ↗

↑ 増加、↓減少、↑増加傾向、↓減少傾向、→変化なし
## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

## 1 ）環境化学物質によるアレルギー性喘息増悪メカニズムの解明

BaPおよびBPAの若齢期における低用量経気道曝露は、アレルギー性喘息を増悪すること、またそのメカニズムの一部を初めて明らかにした。DEHPおよびDINPは、アレルギー性喘息に対する影響は軽微である可能性を示した。BaPの乳児期曝露による仔のアレルギー性喘息への影響は顕著ではないものの、次世代影響が存在し、性差がある可能性も初めて指摘した。

## 2 ）環境化学物質によるアトピ一性皮膚炎増悪メカニズムの解明

DINP、BPA、BaPの若齢期における低用量経口曝露およびDINPの母乳を介した乳児期曝露が、アトピ一性皮膚炎を増悪することとそのメカニズムを初めて明らかにした。また、次世代影響と性差の存在も初めて指摘した。

## 3 ）環境化学物質によるアレルギー性鼻炎増悪メカニズムの解明

低用量のBPA曝露は炎症性分子の発現をin vitroで、OVA特異的抗体産生をin vivoで高め、アレルギー反応を増強する可能性があることを指摘した。DEHPの低用量経鼻曝露が、アレルギー性鼻炎を増悪することとそのメカニズムを初めて明らかにした。低用量のBaP曝露がアレルギー性鼻炎を悪化させることも示した。

## 4 ）環境化学物質のアレルギー性疾患増悪影響に対するスクリーニング手法の開発

BaP、DEHP、DINP、BPAを対象とし、in vitroおよびin vivo曝露による免疫担当細胞への影響を解析した結果、樹状細胞の炎症関連因子の発現増加やサブセットの変化、喘息モデルマウスにおける免疫担当細胞の構成・機能の変化が存在し、環境化学物質によるアレルギー増悪メカニズムにおいて重要であることを初めて示すことができた。また、in vitroスクリーニング(簡易評価系)に有用な分子や変化を確認した。

全体を通し、(1)一般環境でもその存在が想定されるような少量の環境化学物質の曝露が種々のアレルギー疾患を増悪しうること、（2）その発現メカニズム、（3）物質そのもののみならず、その曝露経路や病变の主座の相違によっても環境化学物質の増悪影響は異なること、（4）経口的、あるいは、リアルワールドで存在する病变局所的な低用量曝露の影響を評価することが重要であることを初めて示し、「環境化学物質のアレルギー疾患増悪影響の評価にあたっては、in vitro簡易評価系によりスクリーニングされた対象物質について、複数のアレルギー疾患モデルを用い、リアルワールドで想定される曝露経路と曝露量（少量曝露）、小児期曝露、次世代影響存在の可能性を念頭に置き、評価・解析を行うことが重要である。」ことを科学的に提言するに至った。

## （２）環境政策への貢献

## ＜行政が既に活用した成果＞

特に記載すべき事項はない。

## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

## 1 ）環境化学物質によるアレルギー性喘息増悪メカニズムの解明

BaPおよびBPAの小児期における少量経気道曝露が、アレルギー性喘息の増悪因子であることを
示した。また、BaPの少量曝露時の次世代影響（特に男児）も検討すべき事案であることを提案できた。

## 2 ）環境化学物質によるアトピ一性皮膚炎増悪メカニズムの解明

DINP、BPA、BaPの小児期における少量経口曝露、授乳によるDINP曝露が、アトピ一性皮膚炎の増悪因子であることを示した。また、少量曝露時の次世代影響（特に女児）も検討すべき事案であることを提案できた。

## 3 ）環境化学物質によるアレルギー性鼻炎増悪メカニズムの解明

BaP、DEHPの小児期における少量曝露が、アレルギー性鼻炎の増悪因子であることを示した。

## 4 ）環境化学物質のアレルギー性疾患増悪影響に対するスクリーニング手法の開発

これまでの成果から見出されたアレルギー増悪影響を反映するバイオマーカーを利用したスクリーニング(簡易影響評価)系により、多種の物質の影響評価およびアレルギーを増悪しうる環境化学物質の探索が容易となり、化学物質規制対策への提言、影響の未然防止に貢献できる。

全体を通し、これまでも、また、今後も、

（1）論文発表、学会発表、あるいは、市民を対象とした講演会やメディア等を通じ、成果の広報・普及に努める。

（2）上記により、アレルギー増悪因子に関する情報を広く提供し、国民の安全・安心の確保と経済的損失の縮小に貢献する。

(3) 今回の検討対象物質や可塑剤に関する規制政策の今後の方針、方向性の決定に役立てる。

（4）アレルギー増悪影響の簡易in vitro影響評価系を確立・普及し、アレルギー疾患を増悪しうる環境化学物質の探索を容易にする。また、複数のアレルギー疾患モデルを用いたin vivoにおける評価系をあわせた影響評価システムを構築し、増悪因子の特定に役立てる。ひいては、アレルギー疾患患者に対する新たな対策の提案や化学物質規制対策への提言、影響の未然防止に貢献する。

（5）現在進行中のエコチル調査を補完し、疫学的観察事項に対し生物学的妥当性を付与すること、エコチル調査において小児アレルギー増加との関連を優先的に調査すべき対象物質を提案することに貢献する。なお、実際に、関連の調査では、既に、フタル酸エステル類とアレルギーの関係が疫学的に検討されつつある。

## 6 ．国際共同研究等の状況

特に記載すべき事項はない。

## 7 ．研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

## <論文（査読あり）>

1) TT. WIN-SHWE, R. YANAGISAWA, E. KOIKE, H. NITTA and H. TAKANO: J Appl Toxicol, 33, 1070-1078 (2013)

“Expression levels of neuroimmune biomarkers in hypothalamus of allergic mice after phthalate exposure.”
2) M. HE, K. INOUE, S. YOSHIDA, M. TANAKA, H. TAKANO, G. SUN and T. ICHINOSE: Immunopharmacol Immunotoxicol, 35, 3, 390-395 (2013)

“Effects of airway exposure to di-(2-ethylhexyl) phthalate on allergic rhinitis”

3) K. SADAKANE, T. ICHINOSE, H. TAKANO, R. YANAGISAWA and E. KOIKE: Immunopharmacol Immunotoxicol, 36, 1, 61-69 (2014)

“Effects of oral administration of di-(2-ethylhexyl) and diisononyl phthalates on atopic dermatitis in NC/Nga mice”

4) 定金香里、市瀬孝道、高野裕久、柳澤利枝、小池英子：日本職業・環境アレルギー学会誌（印刷中）

「アトピ一性皮膚炎モデルマウスに対するビスフェノールA経口曝露の影響」

## くその他誌上発表（査読なし）>

1）高野裕久、小池英子、柳澤利枝：チャイルドヘルス、15、850-854（2012）「環境化学物質とアレルギー疾患」

2）柳澤利枝：国立環境研究所ニュース、32，4，3-5（2013）

「大気汚染物質を含む環境汚染物質が免疫・アレルギーに及ぼす影響とその作用機構の解明」

3) 本田晶子、柳澤利枝、小池英子、井上健一郎、高野裕久：アレルギーの臨床、33、8、18-22 (2013) 「環境化学物質とアレルギー」

4) 高野裕久：アレルギー、62、548-554，(2013)

「環境ストレスとアレルギー」

3）高野裕久：環境衛生工学研究、（印刷中）

「環境汚染による生活環境病、生活習慣病の増悪・増加」

6）本田晶子、上田佳代、高野裕久：日本予防医学会雑誌、（印刷中）「環境汚染物質とアレルギー」

## （2） 口頭発表（学会等）

1）高野裕久：第15回ラテックスアレルギー研究会(2010)

「化学物質とアレルギー」

2）柳澤利枝、小池英子、高野裕久：第61回日本アレルギー学会秋季学術大会（2011）「ベンゾ[a]ピレン（BaP）の経気道曝露がアレルギー性気道炎症モデルに与える影響」

3）市瀬孝道、賀 淼、吉田成一：フォーラム2011 衛生薬学・環境トキシコロジー（2011）「化学物質が花粉症に与える影響」

4) E. KOIKE, R. YANAGISAWA and H. TAKANO: The 6th International Congress of Asian Society of Toxicology, Sendai, Japan, 2012

“Immunological effects of phthalates and other chemicals in consumer products”

5) 柳澤 利枝、小池 英子、ウィンシュイ ティンティン、市瀬 孝道、高野 裕久：第19回日本免疫毒性学会学術大会（2012）

「フタル酸エステル類の経気道曝露がアレルギー性喘息に及ぼす影響」
4）ウインシュイ ティンティン、柳澤利枝、小池英子、新田裕史、高野裕久：第19回日本免疫毒性学会学術大会(2012)

「アレルギー喘息モデルマウスにおけるフタル酸エステル類曝露が神経・免疫バイオマーカーの発現に及ぼす影響」

5）定金香里、市瀬孝道、高野裕久、柳澤利枝、小池英子：第82回日本衛生学会学術総会（2012）「アトピ一性皮膚炎モデルマウスに対するフタル酸ジエチルヘキシル経口曝露の影響」

8）高野裕久：2012年室内環境学会第1回講演会（2012）

「室内、室外の環境汚染物質による生活環境病、生活習慣病の増悪とその軽減対策」

9) H. TAKANO: First Malaysian congress of toxicology, Kuala Lumpur, Malaysia, 2012 招待講演 “Environmental pollution and allergic diseases”

10）高野裕久：第62回日本アレルキー学会秋季学術大会（2012） 教育講演「環境ストレスとアレルギー」

11）高野裕久：京都府立医科大学公開講座（2013）公開講座

環境要因と健康

12）高野裕久：愛知学院大学薬学部附属医療生命薬学研究所第1回サイエンスフォーラム（2013）招待講演

「環境汚染物質による生活環境病、生活習慣病の増悪とその軽減対策」

13）定金香里、市瀬孝道、高野裕久、柳澤利枝、小池英子：第82回日本衛生学会学術総会（2012）「アトピ一性皮膚炎モデルマウスに対するフタル酸ジェチルヘキシル経口曝露の影響」

14）定金香里、市瀬孝道、高野裕久、柳澤利枝、小池英子：第83回日本衛生学会学術総会（2013）

「アトピ一性皮膚炎モデルマウスに対するフタル酸ジイソノニル経口曝露の影響」

15）定金香里、市瀬孝道、高野裕久、柳澤利枝、小池英子：第44回日本職業・環境アレルギー学

会総会・学術大会（2013）「アトピ一性皮膚炎モデルマウスに対するビスフェノールA経口曝露の影響」

16）定金香里、市瀬孝道、高野裕久、柳澤利枝、小池英子：第63回日本アレルギー学会秋季学術大会（2013）

「ベンゾ [a] ピレン低用量経口曝露によるアトピ一性皮膚炎増悪作用」

17）柳澤 利枝、小池 英子、ウィンシュイ ティンティン、高野 裕久：第63回日本アレルギー学会秋季学術大会（2013）

「ビスフェノールAの経気道曝露がアレルギー性気道炎症に及ぼす影響」

18）小池英子：日本薬学会第133年会（2013）

「フタル酸エステル等の生活用品に含有される化学物質が免疫応答に与える影響」

19）定金香里、高野裕久、柳澤利枝、小池英子、市瀬孝道：第45回日本職業・環境アレルギー学会総会・学術大会（2014）

「アトピー性皮膚炎モデルマウスに対するフタル酸ジイソノニル経母乳曝露の影響」

「環境化学物質による免疫応答の修飾　ーアレルギーに及ぼす影響機序の解明に向けてー」（アブストラクト提出済み）
## （3） 出願特許

特に記載すべき事項はない。

（４）シンポジウム、セミナーの開催（主催のもの）

特に記載すべき事項はない。

## （５）マスコミ等への公表・報道等

1）日刊工業新聞（2013年6月18日、全国版、23頁、「花粉症などアレルギー性疾患 骨髓由来細胞使い簡易判定 京大など新手法」）

(6) その他

特に記載すべき事項はない。

### 8 \. 引用文献

特に記載すべき事項はない。