Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
群; BPA2 (0.2μg) 群; BPA3 (2μg) 群; 卵白アルブミン OVA (60μg) 単独投与群; OVA + BPA1 (0.02μg) 群; OVA + BPA2 (0.2μg) 群: OVA + BPA3 (2μg) 群の8群に分けた。これらの混合液を2週間おきに4回点鼻投与し、その後、対照群以外はOVA (60μg) を2日間隔で3回点鼻投与し、BPA添加群では最終投与時に再び上記のOVA+BPAの混合液を点鼻投与した（OVAは計8回、BPAは計5回投与）。最終点鼻投与5時間後に8匹のマウスを屠殺し鼻洗浄液を回収し、炎症細胞数と炎症性サイトカイン・ケモカインを測定し、残りの6匹のマウスからは鼻の病理標本を作成した。屠殺時に心採血した血液は血清分離後、OVA-特異的IgG1とIgE測定に用いた。また鼻の掻痒感の指標として鼻かき回数を最終投与15分間測定した。

培養細胞実験として、前記に示す8群のマウスの脾臓から脾細胞を取り出し、脾臓細胞（リンパ球）の増殖反応を調べた。取り出した脾細胞は1週間培養後、 $ 2 \times 10^{5}/well/200 \mu l $ になるように調整してから、ConAとLPSにて刺激し、72時間後の脾細胞数をCell Viability Assay法にて測定した。

次いで、卵白アルブミンを用いたアレルギー性鼻炎マウスモデルにおいてDEHPの影響も評価した。BALB/c雌マウス（6週齢）を1群14匹として、対照（生理食塩水点鼻投与）群、卵白アルブミンOVA（50μg）群；OVA+DEHP1群：OVA（50μg）+DEHP（0.0004μg）投与；OVA+DEHP2群：OVA（50μg）+DEHP（0.008μg）投与；OVA+DEHP3群：OVA（50μg）+DEHP（0.16μg）投与；OVA+DEHP4群：OVA（50μg）+DEHP（3.2μg）投与、の6群に分け、これらの混合液を2週間おきに4回点鼻投与した。その後、対照群以外はOVA（50μg）を2日間隔で3回点鼻投与し、DEHP添加群では最終投与時に再び上記のOVA+DEHPの混合液を点鼻投与した（OVAは計8回、DEHPは計4回投与）。最終点鼻投与5時間後に8匹のマウスを屠殺し鼻洗浄液を回収し、炎症細胞数と炎症性サイトカイン・ケモカインを測定した。また洗浄後の鼻粘膜組織の炎症性サイトカイン・ケモカインも測定した。残りの6匹のマウスからは鼻の病理標本を作成した。

加えて、卵白アルブミン用いたアレルギー性鼻炎マウスモデルにおいて低用量BaPの影響も評価した。BALB/c雌マウス（6週齢）を1群14匹として、①対照（生理食塩水点鼻投与）群、②BaP 0.1μg群；③BaP 10μg群；④卵白アルブミン（OVA：80μg）群；⑤OVA（80μg）+BaP 0.1μg群；⑥OVA（80μg）+BaP 10μg投与の6群に分けた。OVAは生理食塩水に溶解し40μg/8μl溶液を調整した。BaPはオリーブオイルに溶解し、0.1μg/0.1mlと10μg/0.1ml溶液に調整した。OVA + BaP群ではBaPの0.1μgもしくは10μgを、2週間おきに4回腹腔内投与し、OVAはBaPの腹腔内投与5時間後に左右の鼻腔に8μlずつ4回点鼻投与した。その後、2日おきに4回、OVA溶液を8μlずつ左右に点鼻投与した。なお、対照群にはBaP溶液の代わりにオリーブオイルの0.1mlを2週間間隔で4回とOVAの代わりに8μlの生理食塩水を8回点鼻投与した。またOVA群ではBaP溶液の代わりに2週間おきに4回オリーブオイルを腹腔内投与し、またBaP 0.1μg群とBaP 10μg群ではOVAの代わりに生理食塩水を計8回点鼻投与した。最終点鼻投与5時間後にマウスを屠殺し、各群8匹のマウスから鼻洗浄液を回収し、炎症細胞数と炎症性サイトカイン・ケモカインを測定した。残りの6匹のマウスからは鼻の病理標本を作成した。また血清中のOVA-特異的IgEとIgG1抗体を測定した。

## 4 ）環境化学物質のアレルギー性疾患増悪影響に対するスクリーニング手法の開発

環境化学物質のin vitro曝露が樹状細胞に及ぼす影響を検討した。環境化学物質は、BaPおよびDEHP、DINP、BPAは、ジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解した後、RPMI-1640培地に10％非働化ウシ胎児血清（FBS）、100 U/ml ペニシリン、100 μg/ml ストレプトマイシン、50 μM 2-メル
カプトエタノールを添加したR10培地で希釈して使用した。曝露時のDMSOの最終濃度は0.1％となるように調製した。動物は、アトピー素因をもつNC/NgaTndCrlj雄性マウス（13週齢、26-28g）を使用し、大腿骨より骨髓細胞を採取した。骨髓細胞は、溶血処理した後、遠心洗浄し、R10培地に懸濁した。生細胞数は、トリパンブルー色素排除法により求めた。骨髓細胞（4×10^{5} cells/ml）は、20 ng/mlリコンビナントマウス顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）を含むR10培地に懸濁し、10 mlの骨髓細胞懸濁液をφ100 mmカルチャーディッシュ中で培養した。培養の間は、3日目に等量の培地を加え、6日目に半量の培地を新しい培地と交換し、8日目に浮遊細胞と弱い接着細胞を骨髓由来樹状細胞（BMDC）として回収した。生

遺伝子発現の解析では、BMDC（ $ 1\times10^{6} $ cells/ml）は、GM-CSF（10 ng/ml）の存在下で、10 μMの環境化学物質またはvehicle（0.1% DMSO）に6、24時間曝露した。実験は、N=2で行った。曝露後の細胞は、PBSで遠心（4℃, 400×g, 5 min）洗浄した。RNeasy Mini（QIAGEN）のプロトコールに従い、細胞（ $ 7\times10^{6} $ cells/sample）は、lysis buffer 600 μl/sampleを加えて懸濁し、ペレットペッスルを用いて氷上で1分間ホモジネートした後、total RNAを抽出した。total RNAサンプルからのcDNA合成、cRNA増幅は、Affymetrix社の推奨プロトコールに従って行い、遺伝子発現の変動は、Affymetrix Mouse Genome 430 2.0 Arrayを用いて解析した。蛍光強度を補正した後、曝露群の遺伝子の発現率（曝露群のシグナルレベル/vehicleのシグナルレベル）を用いてデータ解析し、曝露群の発現率が1.5倍以上に増加あるいは0.65倍以下に低下した遺伝子を抽出した。

BMDCサブセットの解析においては、骨髓細胞をGM-CSF（20 ng/ml）またはGM-CSF（5 ng/ml）とFlt3リガンド（Flt3L, 200 ng/ml）を含む培地で8日間培養することによりBMDCを分化誘導した。この、BMDC（1×10⁶ cells/ml）は、GM-CSF（10 ng/ml）またはGM-CSF（5 ng/ml）とFlt3リガンド（Flt3L, 200 ng/ml）の存在下で、環境化学物質（0.1-100 μM）およびvehicle（0.1% DMSO）に24時間曝露した。また、環境化学物質が樹状細胞の前駆細胞に及ぼす影響として、BMDCの分化誘導過程に対する影響を検討するため、骨髓細胞（4×10⁵ cells/ml）をGM-CSF（10 ng/ml）と環境化学物質（0.1-10 μM）の存在下で6日間培養した。培養終了後、形質細胞様樹状細胞（plasmacytoid DC, pDC: CD11c⁺PDCA-1⁺）および従来型樹状細胞（conventional DC, cDC: CD11c⁺PDCA-1⁻）のサブセットマーカーの発現等について検討した。細胞表面分子（CD11c, PDCA-1）の発現とサイトカイン（TARC, MDC, IL-12p40, IFN-α）の産生は、それぞれフローサイトメトリーとELISA法を用いて測定した。

一方、サブテーマ(2)-1のアレルギー性喘息モデルマウスにおいて、免疫担当細胞に関する検討も加えた。同サブサブテーマと同様のアレルギー性喘息モデルマウスを用いて、同実験条件で環境化学物質（BaP, DEHP, DINP, BPA）の若齢期曝露およびBaPの乳児期曝露を実施し、免疫担当細胞の構成や機能に及ぼす影響を評価した。当該モデルマウスの所属リンパ節である縦隔リンパ節の細胞（LNC）を採取し、細胞表面分子（抗原提示細胞マーカー: MHC class II, CD86; 樹状細胞マーカー: CD11c, PDCA-1; T細胞マーカー: TCR, CD4, CD8, CD28）の発現を検討した。さらに、抗原である卵白アルブミン（OVA, 100 μg/ml）の再刺激有無の条件下で、LNC（1×10⁶ cells/ml）を2日または3日間培養した後、サイトカイン（IFN-γ、IL-4、IL-5、SDF-1α等）の産生や細胞増殖を検討した。また、一部の実験においては、骨髓細胞を採取し、GM-CSFまたはFlt3Lの刺激下でBMDCを誘導し、細胞表面分子（抗原提示細胞マーカー: MHC class II, CD86; 樹状細胞マーカー: CD11c, PDCA-1）の発現とサイトカイン（TARC, MDC, IL-12p40, IFN-α）の産生を検討した。細胞の調製、
培養方法は、先述の通りであり、細胞表面分子およびサイトカイン産生、細胞増殖は、それぞれフローサイトメトリーおよびELISA法、BrdU incorporation assayを用いて測定した。

## 4 ．結果及び考察

## 1 ）環境化学物質によるアレルギー性喘息増悪メカニズムの解明

OVA感作により、Vehicle群に比し、気管支肺胞洗浄液(BAL)中の好中球、好酸球、および単球の細胞数が有意に増加し(図(2)-1)-1)、肺におけるIL-4, IL-5, IL-10, IL-13, IL-33, MCP-2, RANTES, eotaxinのタンパク発現も顕著に上昇した(表(2)-1-1, 表(2)-1-2)。OVA感作時におけるBaPの経気道曝露により、OVA+BaP 20 pmol/animal/wk群で、OVA群に比し好酸球数が有意に増加した。病理組織学的検討では、OVA感作による気管支、および血管周囲への炎症細胞の集積(図(2)-1)-2)や、気管支上皮の粘液産生細胞の増生(データ非表示)が、BaPの経気道曝露により亢進し、OVA+BaP 20 pmol/animal/wk群で最も顕著であった。また、OVA+BaP 20 pmol/animal/wk群において、OVA群に比し、IL-5, IL-10, IL-13, IL-33, eotaxin, OVA特異的IgG_{1}(図(2)-1)-3)産生も有意な上昇を示した。

OVA感作時におけるDEHPの経気道曝露により、好中球、好酸球、単球の細胞数がOVA単独に比してDEHP用量依存的に増加傾向を認めたが、有意な変化ではなかった(図(2)-1)-4)。また、病理組織学的検討では、OVA感作による気管支、および血管への炎症細胞浸潤(図(2)-1)-5)や、気管支上皮の粘液産生細胞の増生(データ未表示)が観察されたが、DEHP曝露による明確な影響は認められなかった。肺におけるIL-5、IL-13、eotaxin(表(2)-1)-3)、および血中OVA特異的IgG1、IgG2a(図(2)-1)-6)においても、DEHP曝露による増加傾向は認めたが有意な変化ではなかった。OVA特異的IgE産生は、DEHP曝露による影響を認めなかった。

OVA感作時におけるDINPの経気道曝露により、BAL中の好中球、好酸球の細胞数がOVA単独に比してDINP用量依存的に増加傾向を認め、リンパ球数は、OVA+DINP 8 nmol/animal/wk群で有意な増加を示した(図(2)-1)-7)。また、病理組織学的検討では、OVA感作による気管支、および血管周囲への炎症細胞浸潤(図(2)-1)-8や、気管支上皮の粘液産生細胞の増生(データ未表示)が観察されたが、DINP曝露による明確な影響は認められなかった。肺におけるIL-5、IL-13、eotaxin(表(2)-1)-4)、および血中OVA特異的IgE、IgG₁産生(図(2)-1)-9においても、DINP曝露による増加傾向は認めたが有意な差ではなかった。

OVA感作時におけるBPAの経気道曝露により、BAL中の好酸球、好中球、リンパ球、マクロファージの細胞数がOVA単独に比して増加し、この増加は低用量、中用量曝露群でより顕著であった(図2-(1)-10)。病理組織学的検討では、OVA存在下におけるBPA曝露で気管支、および血管周囲への炎症細胞の集積(図(2)-1)-11)や、粘液産生細胞の増生(データ未表示)を認め、中用量群で最も顕著であった。加えて、肺におけるIL-13、IL-33、RANTES、およびKCのタンパク発現(表(2)-1-5,表(2)-1)-6)は、特に低用量、中用量曝露群で有意な上昇を認めた。血中OVA特異的IgE、IgG₁、IgG₂a抗体産生(図(2)-1)-12)は、いずれもBPA曝露で上昇傾向を認めたが、曝露用量による影響は認めず、OVA群に対する有意な変化はなかった。

BaPの乳児期曝露により、OVA感作した雄の仔獣において、BaP 0.25 pmol/animal/wk群でBAL中の好酸球、リンパ球が増加傾向を認めたが(図(2)-1)-13(a))、有意な変化ではなかった。また、気管支、および血管周囲への炎症細胞の集積、気管支上皮の粘液産生細胞の増生(データ未表示)も同様であ
った。肺におけるIL-5, IL-13, MCP-1, eotaxin, RANTESの発現(表(2)-1)-7)、血中OVA特異的$\mathrm{IgG}_{1}$, $\mathrm{IgG}_{2\mathrm{a}}$の産生(図(2)-1)-14(a-c))も、BaPの乳児期曝露により増加傾向を認めたが有意な変化ではなかった。OVA感作した雌の仔獣では、BaP 0.25 pmol/animal/wk群で好中球、リンパ球が、BaP 1 pmol/animal/wk群で好酸球が増加傾向を認めたが(図(2)-1)-13(b))、有意な変化ではなかった。また、気管支、および血管周囲への炎症細胞の集積、気管支上皮の粘液産生細胞の増生も同様であった(データ未表示)。肺におけるIL-33, IFN-γのタンパク発現(表(2)-1)-8)、OVA特異的$\mathrm{IgG}_{1}$, $\mathrm{IgG}_{2\mathrm{a}}$の産生は、BaP 0.25、あるいはBaP 1 pmol/animal/wk群で増悪傾向を認めた(図(2)-1)-14(d-f))。一方、BaPの乳児期曝露のみでは、雌雄の仔獣ともに気道炎症への影響は認めなかった。

以上の結果より、BaP、あるいはBPAの若齢期における経気道曝露は、アレルギー性喘息を増悪する可能性が示唆され、その作用機序として、環境化学物質曝露によるTh2反応の亢進が寄与していることが考えられた。また、BPA曝露では、ヒトが環境中で曝露され得る濃度で影響が認められたことから、低用量曝露による影響評価が重要であると考えられた。一方、フタル酸エステル類として選択した、DEHP、およびDINP曝露は、アレルギー性喘息に及ぼす影響は軽微であると考えられた。また、BaPの乳児期曝露は、雌雄の仔獣いずれにおいてもアレルギー性喘息へ及ぼす影響は軽微と考えられたが、その存在が示唆され、曝露用量に対する反応性には性差がある可能性も示された。

図(2)-1)-1. BaPの経気道曝露による気管支肺胞洗浄液中の細胞数の変化

$ ^{*} $ ; p<0.05 vs. Vehicle group, $ ^{**} $ ; p<0.01 vs. Vehicle group. Data are the mean $ \pm $ SE of 15-16 animals per group.
OVA+BaP 20 pmol/animal/wk

図(2)-1)-2. BaPの経気道曝露による肺の病理組織学的変化(HE染色)

(a) Vehicle group, (b) OVA group, (c) OVA+BaP 20 pmol/animal/wk group. (N=5)

表(2)-1)-1. BaPの経気道曝露による肺におけるサイトカインのタンパク発現変化

Group	N	pg in total lung supernatants
Th1 cytokines	Th2 cytokines
IFN- $ \gamma $	IL-12	IL-4	IL-5	IL-10	IL-13	IL-33
Vehicle	16	5116 ± 298	1074 ± 40.2	15.9 ± 2.35	29.2 ± 1.64	23.2 ± 1.50	3.53 ± 0.67	7847 ± 332
OVA	15	5194 ± 403	1201 ± 44.9	31.7 ± 6.51	208 ± 39.1 $ ^{**} $	27.8 ± 1.67	156 ± 28.4 $ ^{**} $	15606 ± 1743 $ ^{**} $
OVA+BaP 0.05 pmol/animal/wk	15	4840 ± 330	1152 ± 35.3	35.0 ± 6.85 $ ^{*} $	244 ± 45.1 $ ^{**} $	33.3 ± 2.51 $ ^{**} $	227 ± 46.0 $ ^{**} $	25017 ± 4364 $ ^{**} $
OVA+BaP 1 pmol/animal/wk	16	5415 ± 277	1182 ± 33.1	30.4 ± 3.87 $ ^{**} $	304 ± 39.9 $ ^{**} $	33.3 ± 1.46 $ ^{**} $	220 ± 28.8 $ ^{**} $	26390 ± 2963 $ ^{**} $
OVA+BaP 20 pmol/animal/wk	16	4488 ± 320	1098 ± 32.3	37.1 ± 4.07 $ ^{**} $	357 ± 41.5 $ ^{**} $ $ ^{\#} $	37.7 ± 2.41 $ ^{**} $ $ ^{\#\#} $	299 ± 29.7 $ ^{**} $ $ ^{\#\#} $	31649 ± 2996 $ ^{**} $ $ ^{\#\#} $

表(2)-1)-2. BaPの経気道曝露による肺におけるケモカインのタンパク発現変化

Group	N	pg in total lung supernatants
MCP-3	RANTES	eotaxin
Vehicle	16	132 $ \pm $ 8.24	123 $ \pm $ 7.56	74.8 $ \pm $ 3.89
OVA	15	254 $ \pm $ 24.0 $ ^{**} $	222 $ \pm $ 22.8 $ ^{**} $	586 $ \pm $ 113 $ ^{**} $
OVA+BaP 0.05 pmol/animal/wk	15	253 $ \pm $ 24.6 $ ^{**} $	245 $ \pm $ 27.2 $ ^{**} $	651 $ \pm $ 120 $ ^{**} $
OVA+BaP 1 pmol/animal/wk	16	273 $ \pm $ 18.0 $ ^{**} $	230 $ \pm $ 19.9 $ ^{**} $	795 $ \pm $ 101 $ ^{**} $ $ \# $
OVA+BaP 20 pmol/animal/wk	16	296 $ \pm $ 23.3 $ ^{**} $	267 $ \pm $ 23.4 $ ^{**} $	951 $ \pm $ 89.9 $ ^{**} $ $ \# $

Data are the means $ \pm $ SEM of 15-16 animals per group. **; p<0.01 vs. Vehicle group, #; p<0.05 vs. OVA group.
図(2)-1)-3. BaPの経気道曝露による血中抗原特異的抗体産生の変化

(a) OVA-IgE, (b) OVA- $ IgG_{1} $ , (c) OVA- $ IgG_{2a} $ . Data are the means ± SEM of 25-28 animals per group. $ * $ ; p<0.01 vs. Vehicle group, $ \# $ ; p<0.05 vs. OVA group.

図(2)-1)-4. DEHPの経気道曝露による気管支肺胞洗浄液中の細胞数の変化

$ ^{**} $ ; p<0.01 vs. Vehicle group. Data are the mean $ \pm $ SE of 9-13 animals per group.
図(2)-1)-5. DEHPの経気道曝露による肺の病理組織学的変化(HE染色)

(a) Vehicle group, (b) OVA group, (c) OVA+DEHP 8 nmol/animal/wk group. (N=4)

表(2)-1)-3. DEHPの経気道曝露による肺におけるサイトカインおよびケモカインのタンパク発現変化

Group	N	pg in total lung supernatants
IL-4	IL-5	IL-13	IFN- $ \gamma $	RANTES	eotaxin
Vehicle	14	0	3.08 ± 0.48	1.44 ± 0.70	1342 ± 76.1	117 ± 15.7	71.3 ± 6.41
OVA	13	0.83 ± 0.83	108 ± 29.8 $ ^{**} $	111 ± 27.3 $ ^{**} $	1395 ± 81.9	138 ± 10.0	316 ± 75.6 $ ^{**} $
OVA+DEHP 0.02 nmol/animal/wk	11	0.10 ± 0.10	135 ± 37.1 $ ^{**} $	158 ± 40.9 $ ^{**} $	1505 ± 48.5	144 ± 14.5	350 ± 89.2 $ ^{*} $
OVA+DEHP 0.4 nmol/animal/wk	13	0.82 ± 0.72	176 ± 34.7 $ ^{**} $	186 ± 35.3 $ ^{**} $	1430 ± 69.0	159 ± 11.4	440 ± 94.5 $ ^{**} $
OVA+DEHP 0.8 nmol/animal/wk	13	2.08 ± 1.21	190 ± 36.6 $ ^{**} $	182 ± 36.1 $ ^{**} $	1490 ± 69.4	134 ± 13.4	440 ± 84.3 $ ^{**} $

$ ^{*} $ ; p<0.05 vs. Vehicle group, $ ^{**} $ ; p<0.01 vs. Vehicle group. Data are the mean $ \pm $ SE of 9-13 animals per group.

図(2)-1)-6. DEHPの経気道曝露による血中抗原特異的抗体産生の変化

(a) OVA-IgE, (b) OVA- $ IgG_{1} $ , (c) OVA- $ IgG_{2a} $ . $ * $ ; p<0.01 vs. Vehicle group. Data are the mean $ \pm $ SE of 9-13 animals per group
図(2)-1)-7. DINPの経気道曝露による気管支肺胞洗浄液中の細胞数の変化**; p<0.01 vs. Vehicle group. Data are the mean ± SE of 11-14 animals per group.

図(2)-1)-8. DINPの経気道曝露による肺の病理組織学的変化(HE染色)

(a) Vehicle group, (b) OVA group, (c) OVA+DINP 8 nmol/animal/wk group. (N=4-5)
表(2)-1)-4. DINPの経気道曝露による肺におけるサイトカインおよびケモカインのタンパク発現変化

Group	N	pg in total lung supernatants
IL-4	IL-5	IL-13	IFN- $ \gamma $	RANTES	eotaxin
Vehicle	11	30.8 ± 56.5	4.01 ± 0.41	0.00	710 ± 42.8	117 ± 12.1	68.4 ± 4.65
OVA	13	56.5 ± 8.70	84.1 ± 24.7 $ ^{**} $	106 ± 35.0 $ ^{**} $	883 ± 71.8	125 ± 13.6	284 ± 83.8 $ ^{**} $
OVA+DINP 0.02 nmol/animal/wk	14	57.7 ± 7.79	109 ± 23.3 $ ^{**} $	151 ± 35.0 $ ^{**} $	814 ± 50.0	147 ± 9.97	320 ± 67.3 $ ^{**} $
OVA+DINP 0.4 nmol/animal/wk	14	50.3 ± 6.71	135 ± 30.9 $ ^{**} $	180 ± 45.0 $ ^{**} $	834 ± 52.0	155 ± 17.7	336 ± 71.9 $ ^{**} $
OVA+DINP 0.8 nmol/animal/wk	13	48.0 ± 13.4 $ ^{*} $	132 ± 33.4 $ ^{**} $	155 ± 45.8 $ ^{**} $	923 ± 51.5 $ ^{*} $	156 ± 18.5	344 ± 72.9 $ ^{**} $

Data are the mean $ \pm $ SE of 11-14 animals per group. $ * $ ; p<0.05 vs. Vehicle group, $ ** $ ; p<0.01 vs. Vehicle group.

図(2)-1)-9. DINPの経気道曝露による血中抗原特異的抗体産生の変化

(a) OVA-IgE, (b) OVA-IgG $ _{1} $ , (c) OVA-IgG $ _{2a} $ . Data are the means ± SEM of 11-14 animals per group. *; p<0.05 vs. Vehicle group, **; p<0.01 vs. Vehicle group.
図(2)-1)-10. BPAの経気道曝露による気管支肺胞洗浄液中の細胞数の変化 *; p<0.05 vs. Vehicle group, **; p<0.01 vs. Vehicle group, #; p<0.05 vs. OVA group.

OVA+BPA 1.25 nmol/animal/wk

図(2)-1)-11. BPAの経気道曝露による肺の病理組織学的変化(HE染色)

(a) Vehicle group, (b) OVA group, (c) OVA+BPA 1.25 nmol/animal/wk group. (N=4-5)

表(2)-1)-5. BPAの経気道曝露による肺におけるサイトカインのタンパク発現変化

Group	N	pg in total lung supernatants
Th2 cytokine	Th1 cytokine
IL-4	IL-5	IL-10	IL-13	IL-33	IFN- $ \gamma $	IL-12
Vehicle	8	25.8 ± 2.91	7.94 ± 0.44	11.0 ± 2.06	0.69 ± 0.69	4481 ± 333	592 ± 30.0	2152 ± 99.5
OVA	7	34.8 ± 2.70	78.1 ± 16.8 $ ^{**} $	17.4 ± 1.34	67.4 ± 15.0 $ ^{**} $	7214 ± 668 $ ^{*} $	754 ± 26.6 $ ^{**} $	2378 ± 53.8
OVA+BPA 0.0625 nmol/animal/wk	8	49.0 ± 7.13 $ ^{*} $	267 ± 80.2 $ ^{**} $	22.3 ± 2.19 $ ^{*} $	218 ± 65.6 $ ^{*} $	13451 ± 1974 $ ^{**} $	923 ± 46.3 $ ^{**} $ $ # $	2110 ± 48.7 $ ^{\#} $
OVA+BPA 1.25 nmol/animal/wk	7	45.4 ± 7.83	264 ± 86.2 $ ^{**} $	24.8 ± 3.50 $ ^{**} $	202 ± 55.6 $ ^{**} $ $ # $	14305 ± 2056 $ ^{**} $ $ # $	764 ± 46.8 $ ^{**} $	2049 ± 57.1 $ ^{##} $
OVA+BPA 25 nmol/animal/wk	7	66.2 ± 22.4	188 ± 62.6 $ ^{**} $	22.7 ± 3.44 $ ^{*} $	163 ± 54.4 $ ^{*} $	10516 ± 1702 $ ^{**} $	729 ± 38.8 $ ^{*} $	2019 ± 94.2 $ ^{##} $

Data are the mean $ \pm $ SE of 7-8 animals per group. $ * $ ; p<0.05 vs. Vehicle group, $ ** $ ; p<0.01 vs. Vehicle group, $ \# $ ; p<0.05 vs. OVA group, $ \#\# $ ; p<0.01 vs. OVA group.
表(2)-1)-6. BPAの経気道曝露による肺におけるケモカインのタンパク発現変化

Group	N	pg in total lung supernatants
MIP-1α	KC	MCP-1	eotaxin	MCP-3	RANTES
Vehicle	8	7.63 ± 2.86	0.00 ± 0.00	26.7 ± 2.86	36.5 ± 4.93	120 ± 5.54	52.1 ± 5.64
OVA	7	7.48 ± 3.31	2.50 ± 2.50	65.0 ± 6.54 $ ^{**} $	173 ± 30.7 $ ^{**} $	146 ± 13.8	66.9 ± 6.66
OVA+BPA 0.0625 nmol/animal/wk	8	29.3 ± 7.53	40.0 ± 14.2 $ ^{*} $	133 ± 32.5 $ ^{**} $	363 ± 94.7	222 ± 35.6 $ ^{*} $	135 ± 17.7 $ ^{**,\#} $
OVA+BPA 1.25 nmol/animal/wk	7	39.3 ± 15.4	72.0 ± 38.0 $ ^{*,\#} $	194 ± 87.0 $ ^{*} $	407 ± 123 $ ^{**} $	272 ± 68.9 $ ^{*} $	189 ± 47.3 $ ^{*,\#\#} $
OVA+BPA 25 nmol/animal/wk	7	31.6 ± 6.32	77.1 ± 35.4 $ ^{*,\#} $	133 ± 30.6 $ ^{*} $	355 ± 118	188 ± 62.6	95.0 ± 12.1 $ ^{*} $

図(2)-1)-12. BPAの経気道曝露による血中抗原特異的抗体産生の変化

(a) OVA-IgE, (b) OVA-IgG $ _{1} $ , (c) OVA-IgG $ _{2a} $ . Data are the means ± SEM of 7-8 animals per group. $ * $ ; p<0.05 vs. Vehicle group, $ ** $ ; p<0.01 vs. Vehicle group.
図(2)-1)-13. BaPの乳児期曝露による血中抗原特異的抗体産生の変化

(a) 雄(M), (b) 雌(F) Data are the means ± SEM of 4-8 animals per group. $ * $ ; p<0.05 vs. Vehicle group, $ ** $ ; p<0.01 vs. Vehicle group.
表(2)-1)-7. BaPの乳児期曝露による肺におけるサイトカインおよびケモカインのタンパク発現変化(雄)

Group	N	pg in total lung supernatants
IL-4	IL-5	IL-13	IL-33	IFN- $ \gamma $	IL-12	MCP-1	eotaxin	RANTES
Vehicle	7	91.3 ± 8.56	3.95 ± 0.33	0.35 ± 0.33	5377 ± 180	1665 ± 44.3	182 ± 8.68	1.18 ± 0.60	40.0 ± 2.45	97.8 ± 9.70
BaP 0.25 pmol/animal/wk	5	98.0 ± 15.3	3.45 ± 0.43	4.25 ± 0.75	5620 ± 565	1822 ± 102	171 ± 9.83	11.2 ± 4.44	47.0 ± 1.38	101 ± 15.4
BaP 5 pmol/animal/wk	4	65.0 ± 6.08	3.66 ± 1.15	4.33 ± 0.75	5252 ± 239	1730 ± 74.9	167 ± 9.57	4.58 ± 2.89	39.4 ± 3.74	102 ± 13.0
BaP 100 pmol/animal/wk	4	68.8 ± 2.87	2.26 ± 0.10	0.96 ± 0.90	5206 ± 124	1430 ± 62.1	170 ± 11.0	1.81 ± 1.11	45.7 ± 4.53	89.8 ± 10.8
OVA	8	77.0 ± 9.40	175 ± 17.7**	340 ± 49.4**	13225 ± 151**	1664 ± 64.9	128 ± 14.2	148 ± 29.6**	575 ± 83.3**	139 ± 10.4*
OVA+BaP 0.25 pmol/animal/wk	8	63.8 ± 15.5	319 ± 62.9**	394 ± 71.0**	15902 ± 1659**	1739 ± 117	169 ± 20.1	198 ± 36.4**	823 ± 158**	204 ± 35.2*
OVA+BaP 5 pmol/animal/wk	8	63.7 ± 8.58	211 ± 49.4**	263 ± 57.5**	11902 ± 1468**	1660 ± 88.1	122 ± 7.99**	120 ± 29.1**	544 ± 119**	183 ± 20.3*
OVA+BaP 100 pmol/animal/wk	8	64.0 ± 3.76	190 ± 35.6**	270 ± 51.0**	15354 ± 1422**	1746 ± 35.0	161 ± 19.7	113 ± 23.0**	540 ± 110**	246 ± 30.0**

Data are the means $ \pm $ SEM of 4-8 animals per group. $ * $ ; p<0.05 vs. Vehicle group, $ ** $ ; p<0.01 vs. Vehicle group.

表(2)-1)-8. BaPの乳児期曝露による肺におけるサイトカインおよびケモカインのタンパク発現変化(雌)

Group	N	pg in total lung supernatants
IL-4	IL-5	IL-13	IL-33	IFN- $ \gamma $	IL-12	MCP-1	eotaxin	RANTES
Vehicle	7	48.4 ± 6.89	11.0 ± 0.27	0.00 ± 0.00	5369 ± 406	1954 ± 92.0	193 ± 12.4	0.60 ± 0.50	42.3 ± 4.37	117 ± 20.0
BaP 0.25 pmol/animal/wk	5	63.7 ± 14.9	11.0 ± 0.35	0.23 ± 0.23	4720 ± 295	1875 ± 76.3	217 ± 5.15	1.40 ± 0.98	37.4 ± 2.99	121 ± 13.2
BaP 5 pmol/animal/wk	4	35.2 ± 7.63	10.4 ± 0.31	0.08 ± 0.08	6492 ± 1530	2143 ± 128	230 ± 13.2	3.68 ± 1.56	39.9 ± 2.16	110 ± 10.8
BaP 100 pmol/animal/wk	4	57.3 ± 8.12	11.6 ± 0.34	0.00 ± 0.00	4885 ± 335	1519 ± 101 $ ^{*} $	226 ± 14.9	3.93 ± 1.87	54.4 ± 4.30	157 ± 19.4
OVA	8	67.7 ± 6.10	372 ± 71.7 $ ^{**} $	332 ± 56.8 $ ^{**} $	23218 ± 2249 $ ^{**} $	2025 ± 101	304 ± 21.2 $ ^{**} $	221 ± 38.1 $ ^{**} $	658 ± 107 $ ^{**} $	311 ± 32.4 $ ^{**} $
OVA+BaP 0.25 pmol/animal/wk	8	56.6 ± 5.71 $ ^{*} $	553 ± 83.6 $ ^{**} $	447 ± 55.4 $ ^{**} $	29794 ± 3143 $ ^{**} $	2019 ± 72.1	337 ± 16.8 $ ^{**} $	254 ± 24.0 $ ^{**} $	712 ± 59.6 $ ^{**} $	265 ± 18.5 $ ^{*} $
OVA+BaP 5 pmol/animal/wk	8	49.6 ± 6.60	492 ± 30.6 $ ^{**} $	396 ± 29.8 $ ^{**} $	33850 ± 2300 $ ^{**} $ ,\#	2329 ± 104 $ ^{*} $ ,\#	347 ± 26.0 $ ^{**} $	268 ± 20.8 $ ^{**} $	725 ± 52.0 $ ^{**} $	361 ± 29.9 $ ^{**} $
OVA+BaP 100 pmol/animal/wk	8	68.8 ± 7.12	479 ± 36.3 $ ^{**} $	414 ± 20.0 $ ^{**} $	29191 ± 2329 $ ^{**} $	2172 ± 86.5	311 ± 21.5 $ ^{**} $	224 ± 32.6 $ ^{**} $	828 ± 72.7 $ ^{**} $	360 ± 48.5 $ ^{**} $

Data are the means $ \pm $ SEM of 4-8 animals per group. $ * $ ; p<0.05 vs. Vehicle group, $ ** $ ; p<0.01 vs. Vehicle group. $ \# $ ; p<0.05 vs. OVA group.
M

図(2)-1)-14. BaPの乳児期曝露による血中抗原特異的抗体産生の変化

(a),(d) OVA-IgE, (b),(e) OVA-IgG $ _{1} $ , (c),(f) OVA-IgG $ _{2a} $ . (a-c) 雄, (d-f) 雌. Data are the means ± SEM of 4-8 animals per group. **; p<0.01 vs. Vehicle group.

## 2 ）環境化学物質によるアトピ性皮膚炎増悪メカニズムの解明

若齢期（7週齢）のアトピ一性皮膚炎モデルマウス、NC/Nga（SPFグレード、雄）に対し、NOAEL以下のDEHP、DINP、BPA、B[a]Pを経口的に曝露し、症状・病態への影響を検討した。

Dpをマウス耳介皮下に繰り返し、投与することにより乾燥、紅斑、浮腫、かひやびらんの形成などアトピ一性皮膚炎様症状が耳介背側の表皮に発症した。DEHPの経口曝露では、これら症状の増悪は認められなかった（図(2)-2)-3）。しかし、皮下組織中のマスト細胞や好酸球の浸潤がDEHPを曝露した群の方が増加する傾向が見られ、最も高用量の3,325 μgを投与した群（Dp+DEHP 3,325）では、好酸球数の増加に有意差が認められた（図(2)-2)-4）。また、即時型アレルギーを誘発するTh2系サイトカインのひとつ、IL-13でDEHP経口曝露群は、産生が増加する傾向に有り、中用量の166.3 μgを投与した群（Dp+DEHP 166.3）で有意な差が認められた（表(2)-2)-2）。抗体の産生には、DEHP経口曝露の影響はみられない、あるいは減少を示した（表(2)-2)-2）。

DINPの経口曝露では、低用量（6.6μg）、中用量（131.3μg）を投与したマウスでアトピ一性皮膚炎様症状が増悪する傾向がみられた（図(2)-2)-5）。また低・中用量DINP曝露群では、組織中MIP-1α量、血中IgE抗体量も増加する傾向がみられた（表(2)-2)-3）。さらに両群の皮下組織中炎症細胞浸潤が有意に亢進していた（図(2)-2)-6）。高用量群では組織中のeotaxin産生量の増加傾向がみられたが、症状や炎症細胞浸潤には影響が見られなかった。

BPAの経口曝露では、低用量（2.19 μg）を投与したマウスでアトピ一性皮膚炎様症状が増悪す
る傾向がみられた（図(2)-2)-7）。また、皮下組織中の好酸球浸潤も有意に亢進していた（図(2)-2)-8）。皮下組織中のIL-18、IL-13、MIP-1αもやや産生量が増していた（表(2)-2)-4）。一方、中用量・高用量のBPA曝露では、症状・病態ともに影響が見られなかった。

BaPの経口曝露では、低用量（0.09μg）、次いで高用量（36.75μg）を投与したマウスでアトピ一性皮膚炎様症状が増悪する傾向がみられたが、中用量（1.84μg）曝露では影響がみられなかった（図(2)-2)-9）。また、皮下組織中のマスト細胞数（図(2)-2)-10）やMIP-1α、IL-1β量、血中総IgE抗体量（表(2)-2)-5）も皮膚症状の結果と併行していた。

以上、NOAEL以下のDEHP、DINP、BPA、BaPを若齢期アトピ一性皮膚炎モデルマウスに経口曝露した結果、各化学物質が皮膚症状に与える影響は総じて弱いものであった。しかし、統計的に有意ではないものの、DINP、BPA、BaPでは、皮膚症状スコアが、非曝露群に比べ高い傾向を示していた。特にDINPの曝露は、好酸球やマスト細胞の活性を亢進する結果が得られた。また、いずれの物質も、高用量よりもむしろ低用量で増悪する傾向がみられた。皮膚症状の増悪に関連する因子としては、これら化学物質が炎症局所の炎症細胞浸潤を活性化し、症状を増悪していることが考えられた。概して即時型アレルギーの発症関連因子である抗体やTh2系のサイトカイン（IL-4、IL-5、IL-13）の産生の亢進は、認められないか弱いものであったが、炎症細胞遊走因子であるMIP-1αが関与することが示唆された。BaPの曝露ではIL-1ファミリーの関与も示された。

若齢期経口曝露実験で検討した4種類の化学物質の中から、最も炎症の増悪を惹起したDINPを用いて、経母乳曝露によるアトピ一性皮膚炎増悪作用を検討した。乳児期に母乳を介しDINP曝露した仔に対し、7週齢でアトピ一性皮膚炎を発症させたところ、オスではアトピ一性皮膚炎様症状に変化がみられなかったが、最も低用量（0.0375 mg/kg/day）のDINPを投与された母獣から産まれたメスでは増悪傾向が見られた（図(2)-2)-11）。同群では皮下組織中の炎症細胞浸潤と（図(2)-2)-12）、血中抗原特異的IgG₁抗体産生（表(2)-2)-6）が顕著に亢進していた。一方、組織中のサイトカイン類の産生への影響は弱かった。また、中用量曝露群のメス、オスともにマスト細胞の浸潤、活性化、メスのDINP経母乳曝露全群で抗原特異的IgG₁抗体産生の有意な増加が認められた（図(2)-2)-12、13、表(2)-2)-6）。以上の結果から、母親が経口的にDINPに曝露されたとき、母乳を介して、仔のアトピ一性皮膚炎様症状や病態を増悪する可能性が示された。また、その傾向は、若齢期曝露と同様、低用量曝露において顕著であることも示された。仔への影響には性差が存在し、メスの方がより増悪する傾向が認められた（表(2)-2)-7）。
図(2)-2)-3 DEHPを経口曝露した若齢期マウスの皮膚症状スコア Data are the means ± SEM of 12 animals per group.

図(2)-2-4 DEHPを経口曝露した若齢期マウスの皮下組織中炎症細胞数

Data are the means ± SEM of 6 animals per group. Total; total mast cells. Severe; severely degranulated mast cells. Mild; mildly degranulated mast cells. Not; non-degranulated mast cells. *p < 0.05 vs. Dp+vehicle group.
表(2)-2-2. DEHP経口曝露におけるサイトカイン・抗体産生量

IL-13	MIP-1 $ \alpha $	total IgE	Dp-IgG $ _{1} $
(pg/mg total ear protein)	(ng/ml)	(titer)
Saline+vehicle	11.46	$ \pm $ 1.46	**	0.75	$ \pm $ 0.75	*	55.47	$ \pm $ 24.01	**	225.60	$ \pm $ 15.99	**
Dp+vehicle	35.60	$ \pm $ 2.44	294.49	$ \pm $ 51.76	351.21	$ \pm $ 56.89	674.76	$ \pm $ 64.85
Dp+DEHP 8.3	43.91	$ \pm $ 5.47	402.53	$ \pm $ 95.53	234.11	$ \pm $ 45.83	365.29	$ \pm $ 51.37	**
Dp+DEHP 166.3	58.22	$ \pm $ 3.61	**	424.76	$ \pm $ 82.96	358.55	$ \pm $ 68.98	495.82	$ \pm $ 87.39
Dp+DEHP 3,325	47.45	$ \pm $ 4.76	251.67	$ \pm $ 72.46	209.59	$ \pm $ 29.04	452.97	$ \pm $ 60.38

Data are the means ± SEM of 6 animals per group (IL-13 and MIP-1α) or 12 animals per group (total IgE and Dp-IgG₁). Dp-IgG₁ means Dp-specific IgG₁.

* p < 0.05, and ** p < 0.01 vs. Dp+vehicle group.

図(2)-2)-5 DINPを経口曝露した若齢期マウスの皮膚症状スコア Data are the means ± SEM of 12 animals per group.
表(2)-2)-3. DINP経口曝露におけるサイトカイン・抗体産生量

MIP-1 $ \alpha $	eotaxin	total IgE
(pg/mg total ear protein)	(ng/ml)
Saline+vehicle	0.00	$ \pm $ 0.00	*	1.37	$ \pm $ 1.14	309.87	$ \pm $ 37.45	**
Dp+vehicle	74.81	$ \pm $ 20.14	16.07	$ \pm $ 1.48	1093.33	$ \pm $ 160.42
Dp+DINP 6.6	101.59	$ \pm $ 21.00	20.18	$ \pm $ 4.68	1219.70	$ \pm $ 126.47
Dp+DINP 131.3	100.12	$ \pm $ 24.09	19.18	$ \pm $ 3.03	1302.35	$ \pm $ 67.32
Dp+DINP 2,625	64.07	$ \pm $ 17.07	34.22	$ \pm $ 6.81	*	1035.72	$ \pm $ 105.44

Data are the means ± SEM of 6 animals per group (MIP-1α and eotaxin) or 12 animals per group (total IgE). * p < 0.05, and ** p < 0.01 vs. Dp+vehicle group.

図(2)-2-6 DINPを経口曝露した若齢期マウスの皮下組織中炎症細胞数

Data are the means $ \pm $ SEM of 6 animals per group. Total; total mast cells. Severe; severely degranulated mast cells. Mild; mildly degranulated mast cells. Not; non-degranulated mast cells. *p < 0.05 vs. Dp+vehicle group.
図(2)-2)-7 BPAを経口曝露した若齢期マウスの皮膚症状スコア Data are the means ± SEM of 12 animals per group.

図(2)-2)-8 BPAを経口曝露した若齢期マウスの皮下組織中好酸球数 Data are the means ± SEM of 6 animals per group * p < 0.05 vs. Dp+vehicle group.
表(2)-2)-4. BPA経口曝露におけるサイトカイン産生量

IL-18	IL-13	MIP-1 $ \alpha $
(pg/mg total ear protein)
Saline+vehicle	1235.09	$ \pm $ 177.19	10.67	$ \pm $ 2.37	*	11.69	$ \pm $ 2.40	*
Dp+vehicle	1301.83	$ \pm $ 150.56	33.24	$ \pm $ 1.40	199.58	$ \pm $ 41.04
Dp+BPA 2.19	1756.80	$ \pm $ 323.65	46.31	$ \pm $ 5.67	291.49	$ \pm $ 26.05
Dp+BPA 43.75	1604.26	$ \pm $ 137.09	39.15	$ \pm $ 4.96	211.22	$ \pm $ 32.60
Dp+BPA 875	1276.26	$ \pm $ 281.55	48.73	$ \pm $ 5.69	309.50	$ \pm $ 93.81

Data are the means $ \pm $ SEM of 6 animals per group.

* p < 0.05 vs. Dp+vehicle group.

図(2)-2)-9 BaPを経口曝露した若齢期マウスの皮膚症状スコア Data are the means ± SEM of 12 animals per group.
図(2)-2)-10 BaPを経口曝露した若齢期マウスの皮下組織中マスト細胞数 Data are the means ± SEM of 6 animals per group * p < 0.05 vs. Dp+vehicle group.

表(2)-2)-5. BaP経口曝露におけるサイトカイン・抗体産生量

MIP-1 $ \alpha $	IL-1 $ \beta $	total IgE
(pg/mg total ear protein)	(ng/ml)
Saline+vehicle	3.29	$ \pm $ 0.32	*	30.58	$ \pm $ 3.15	*	345.39	$ \pm $ 96.63	**
Dp+vehicle	75.84	$ \pm $ 12.49	130.37	$ \pm $ 37.02	1931.05	$ \pm $ 368.29
Dp+BaP 0.09	109.65	$ \pm $ 33.21	257.83	$ \pm $ 106.03	2391.66	$ \pm $ 569.15
Dp+BaP 1.84	76.29	$ \pm $ 25.76	193.14	$ \pm $ 82.10	1561.13	$ \pm $ 188.13
Dp+BaP 36.75	117.38	$ \pm $ 28.07	254.65	$ \pm $ 84.41	1936.79	$ \pm $ 280.56

Data are the means ± SEM of 6 animals per group (MIP-1α and eotaxin) or 12 animals per group (total IgE).

* p < 0.05 vs. Dp+vehicle group.
[F]

Days

図(2)-2)-11 DINPを乳仔期に経母乳曝露したマウスの皮膚症状スコア

Data are the means $ \pm $ SEM of 12 animals per group. [M]; male, [F]; female.

図(2)-2-12 DINPを乳仔期に経母乳曝露したメスマウスの皮下組織中炎症細胞数

Data are the means $ \pm $ SEM of 6 animals per group. Total; total mast cells. Severe; severely degranulated mast cells. Mild; mildly degranulated mast cells. Not; non-degranulated mast cells.
表(2)-2)-6. DINP乳仔期経母乳曝露における抗原特異的IgG $ _{1} $ 抗体産生量

Male	Female
(titer)
Saline (+vehicle)	92.97	$ \pm $ 6.14	**	45.95	$ \pm $ 5.94	**
Dp (+vehicle)	3603.70	$ \pm $ 330.83	3036.09	$ \pm $ 449.75
Dp (+DINP 0.0375)	3837.66	$ \pm $ 604.71	34677.49	$ \pm $ 10685.50	**
Dp (+DINP 0.75)	2677.10	$ \pm $ 279.19	8356.12	$ \pm $ 1513.63	**
Dp (+DINP 15)	4158.65	$ \pm $ 808.21	9511.56	$ \pm $ 1642.97	**

Data are the means $ \pm $ SEM of 12 animals per group.

** p < 0.01 vs. Dp(+vehicle) group.

$$ \triangle\mathrm{Saline}(+\mathrm{vehicle}) $$

$$ \blacksquare Dp(+DINP0.0375)\quad\blacksquare Dp(+DINP0.75) $$

$$ \triangle Dp(+DINP15) $$

* p < 0.05, ** p < 0.01, and *** p < 0.001 vs. Dp (+vehicle) group.

図(2)-2)-13 DINPを乳仔期に経母乳曝露したオスマウスの皮下組織中マスト細胞数 Data are the means ± SEM of 6 animals per group