Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
15）定金香里、市瀬孝道、高野裕久、柳澤利枝、小池英子：第82回日本衛生学会学術総会（2012）

「アトピー性皮膚炎モデルマウスに対するフタル酸ジェチルヘキシル経口曝露の影響」

16）高野裕久:2012年室内環境学会 第1回講演会 (2012)

「室内、室外の環境汚染物質による生活環境病、生活習慣病の増悪とその軽減対策」

17) H. TAKANO: First Malaysian congress of toxicology, Kuala Lumpur, Malaysia, 2012 招待講演 “Environmental pollution and allergic diseases”

18）高野裕久:第62回日本アレルキー学会秋季学術大会（2012）教育講演「環境ストレスとアレルギー」

19）定金香里、市瀬孝道、高野裕久、柳澤利枝、小池英子：第82回日本衛生学会学術総会（2012）

「アトピー性皮膚炎モデルマウスに対するフタル酸ジェチルへキシル経口曝露の影響」

20）伊東恭子：第59回日本病理学会秋期特別総会 A演説（2013）学術研究賞受賞講演「脳形成障害の発生病理解明—遺伝要因と環境要因に着目して」

21）高野裕久:京都府立医科大学公開講座（2013）公開講座

22）高野裕久:愛知学院大学薬学部附属医療生命薬学研究所第1回サイエンスフォーラム（2013）招待講演

「環境汚染物質による生活環境病、生活習慣病の増悪とその軽減対策」

23）定金香里、市瀬孝道、高野裕久、柳澤利枝、小池英子：第83回日本衛生学会学術総会（2013）

「アトピー性皮膚炎モデルマウスに対するフタル酸ジイソノニル経口曝露の影響」

24）定金香里、市瀬孝道、高野裕久、柳澤利枝、小池英子:第44回日本職業・環境アレルギー学会総会・学術大会(2013)

「アトピー性皮膚炎モデルマウスに対するビスフェノールA経口曝露の影響」

25）定金香里、市瀬孝道、高野裕久、柳澤利枝、小池英子：第63回日本アレルギー学会秋季学術大会（2013）

「ベンゾ[a]ピレン低用量経口曝露によるアトピ一性皮膚炎増悪作用」

26）柳澤 利枝、小池 英子、ウィンシュイ ティンティン、高野 裕久：第63回日本アレルギー学会秋季学術大会(2013)

「ビスフェノールAの経気道曝露がアレルギー性気道炎症に及ぼす影響」

27）小池英子：日本薬学会第133年会（2013）

「フタル酸エステル等の生活用品に含有される化学物質が免疫応答に与える影響」

28）丹藤 創、伊東恭子、伏木信次：第55回日本神経病理学会総会学術研究会（2014）

「内分泌攪乱化学物質、ビスフェノールAの青斑核への影響解析」(アブストラクト提出、採択済み)

29）定金香里、高野裕久、柳澤利枝、小池英子、市瀬孝道：第45回日本職業・環境アレルギー学会総会・学術大会（2014）

「アトピー性皮膚炎モデルマウスに対するフタル酸ジイソノニル経母乳曝露の影響」

30）小池英子、柳澤利枝、高野裕久：第41回日本毒性学会学術年会（2014）

「環境化学物質による免疫応答の修飾　ーアレルギーに及ぼす影響機序の解明に向けてー」(アブストラクト提出済み)

### 7. 研究者略壓

課題代表者:伏木 信次

京都府立医科大学大学院修了、博士（医学）、現在、京都府立医科大学副学長・大学院医学研究科教授

研究分担者

サブテーマ1

1)伊東恭子

神戸大学医学部卒業、博士（医学）、現在、京都府立医科大学大学院医学研究科准教授

2) 矢追毅

九州大学大学院薬学研究科修了、修士（薬学）、現在、京都府立医科大学大学院医学研究科助教

サブテーマ2

1）高野裕久

京都府立医科大学医学部卒業、博士（医学）、現在、京都大学大学院教授

2）柳澤利枝
筑波大学大学院修士課程修了、博士(医学)、現在、国立環境研究所主任研究員

3）定金香里

東京大学大学院博士課程単位取得退学、博士(医学)、現在、大分県立看護科学大学助教

4）市瀬孝道

麻布獸医科大学獸医学部卒業、獸医学博士、現在、大分看護科学大學看護學部教授

5) 吉田成一

東京理科大学薬学部卒業、博士（薬学）、現在、大分県立看護科学大学看護学部准教授

6）小池英子

筑波大学大学院博士課程修了、博士(医学)、現在、国立環境研究所主任研究員
## 5 S2-12 環境化学物質による発達期の神経系ならびに免疫系への影響におけるメカニズムの解明

## （１）環境化学物質への曝露による脳形成・発達への影響とそのメカニズムの解明に関する研究

京都府立医科大学
大学院医学研究科	分子病態病理学	伏木 信次
大学院医学研究科	分子病態病理学	伊東 恭子
大学院医学研究科	分子病態病理学	矢追 毅
<研究協力者>
大学院医学研究科	分子病態病理学	丹藤 創
大学院医学研究科	分子病態病理学	荻 寛志（平成24～25年度）
大学院医学研究科	分子病態病理学	及川 優（平成22～24年度）

平成22～25年度累計予算額：79,420千円（うち、平成25年度予算額：16,005千円）

予算額は、間接経費を含む。

## [要旨]

環境化学物質、プラスチック素材として汎用されているビスフェノールA(BPA)は、ヒト血清や尿、羊水、胎盤、母乳から検出され、日常的にヒトはBPAに曝露されている。しかし胎生期から授乳期にかけてのBPA曝露が脳形成・脳機能に及ぼす影響を広く調べた報告はこれまでない。そこで、本サブテーマでは、妊娠期から新生仔期にかけて母マウスへの経口的曝露を介して、経胎盤的ならびに母乳摂取により、仔が低用量BPAに持続曝露される実験系を作製し、多様な手法による解析を行った。その結果、（1）出生後の中枢神経系において、大脳皮質層構築の異常、性的二型核である青斑核における生理的な雌雄差の逆転、行動学的に自閉性・固執性・情動性の制御のかく乱を示唆する所見、脳内神経伝達物質の変動を明らかにし、BPAに対する感受性は、脳の領域によって差異があることを示した。5μg/kg/dayという極低用量曝露によって大脳皮質層構築に異常をきたすこと、ならびに脳内神経伝達物質変動と行動学的異常を関連付けた知見は科学的意義が大きい。（2）分子生物学的解析によって、胎生期・授乳期のBPA曝露によってマウス大脳・血液ゲノムへ新たに刷り込まれたエピゲノム・マークが、非曝露期間（ヒトの離乳期から思春期に相当）を経たあとも維持されていることを初めて見出した。さらにBPA曝露により生じた大脳のエピゲノム・マークにF3世代までの継世代伝達性があることを世界で初めて見出した。本成果は、低用量BPA曝露が脳発達障害の原因になり得ることを示唆するが、環境化学物質曝露の脳への影響評価に際しては複数の脳領域を対象とする解析が必須であることを科学的に提言する。また、脳においてメチル化変動をきたす遺伝子が、全血由来DNAにおいてもメチル化変動をきたすことを示し、曝露影響評価に活用し得るという科学的提言をする。BPAの規制政策の今後の方針に役立てることによって国民の安全・安心の確保に貢献する。エコチル調査を補完する科学的基盤を提供し、エコチル調査においてBPAの曝露影響を評価する検査手法の提案に貢献する。
[キーワード]

ビスフェノールA、脳形成、神経伝達物質、行動異常、エピゲノム

### 1. はじめに

ビスフェノールA（以下、BPA）は、プラスチック素材として人間の生活環境で汎用されているため、ヒト血清や尿、羊水、胎盤、母乳から検出され、ヒトは日常的にBPAに曝露されていることが知られている。近年、発達障害を有する児童の増加と環境化学物質曝露との関連が喧伝されるようになったが、その科学的基盤は依然として不十分であると言わざるを得ない。他方で、胎生期から授乳期にかけてのBPA曝露が脳形成や脳機能に及ぼす影響を広く調べた報告はこれまでなく、その影響の詳細を多角的に明らかにし、その作用メカニズムを解明することが必要である。

われわれは胎仔期BPA曝露が、マウス大脑皮質形成過程における神経細胞の分化・移動、神経回路形成に影響を及ぼすこと $ ^{1,2} $ 、また胎仔期エピゲノムに影響が出現することを報告した $ ^{3)} $ が、その実験系ではBPA投与経路が、より自然に近い経口曝露ではなかった。そこで、妊娠期から授乳期にかけて母マウスへの経口的曝露を介して、経胎盤的ならびに母乳摂取により、仔が低用量BPAに持続的に曝露される実験系を作製し、組織形態学的、神経化学的、行動学的、分子生物学的な手法による多角的解析を行うことが、BPAの規制や影響評価をヒトで行ううえで必要であると考えた。とりわけ大脑皮質以外の脳領域においてBPA曝露の影響が見られるかどうか、エピゲノム変化が生後も維持されるかどうかを解明することが重要と考えた。

## 2 ．研究開発目的

BPAの脳形成・発達への影響を短期的影響から長期的な影響まで網羅的に解明することを目的として、以下の二つを目標とした。

1）胎生期から授乳期のマウスを低用量BPAに曝露したときの影響を、大脳皮質、海馬、中脳等、脳の領域ごとに病理学的・生化学的に解析するとともに、行動への影響とそのメカニズムを明らかにする。2）1）と同様の系を対象に、エピゲノムへの影響を多角的に解明する。リンパ球で影響を検出できるようなバイオマーカーを探索する。

## 3 ．研究開発方法

1）環境化学物質への胎生期・新生仔期曝露による脳形成・発達・成熟および行動への影響とそのメカニズム解明

## a．神経細胞増殖・分化・遊走に関する形態学的解析

妊娠マウス（C57BL/6J）に胎生0日から授乳期である生後の3週間まで連日、経胃管投与によって、0.01%エタノールに溶解したビスフェノールA(BPA)を5μg/kg bw/day, 50μg/kg bw/day, 500μg/kg bw/day投与するモデル系を作製した。Vehicle群（非曝露対照群）には0.01%エタノールを投与した。

胎生11.5日、14.5日、17.5日に5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU, 12.5mg/kg bw)を腹腔内単回投与した。生後3週齢で仔マウス脳を摘出、4％パラホルムアルデヒドで灌流固定後パラフィン包埋切片を作製し、BrdU免疫組織化学と種々の細胞マーカーを用いた免疫組織化学染色を施行、脳
を網羅的に形態学的解析した（図(1)-1)-1）。解析領域は、大脳皮質のほか、海馬、視床、視床下部、線条体、A8, A9, A10ドパミン神経核及び青斑核である。解析個体数はBPA投与群（異なる投与量、計3群）とVehicle群各々に対して、異なるBrdU投与時期(胎生11.5, 14.5, 17.5日)ごとに、n=10(母個体数：n=4-5)とした。

図(1)-1-1. BPA曝露モデルマウス作製のプロトコル

次に、胎生12.5日から14.5日における大脳皮質神経細胞の放射状遊走に関して組織培養系を対象にタイムラプス解析を行った。Oregon-Green BAPTA-1 488 AM蛍光標識と倒立型共焦点レーザー顕微鏡(Eclipse Ti-E, Nikon)を組み合わせたタイムラプス蛍光イメージングの観察系に、ImageJ、Manual Trackingプラグイン、LabVIEWによる解析系を用いて、発生期脳の大脳皮質神経細胞の放射状遊走へのBPA曝露の影響解明を企図した。

BPA曝露モデルマウスから、胎生12.5日目に胎仔脳を摘出し、200μm厚の冠状断組織スライスを作製した(解析個体数：n=10)。冠状断組織スライスの蛍光標識には、Neurobasal培地に10μg/mLのOregon-Greenストック溶液、0.003％のPluronic F-127表面活性剤、1％のN2添加物、L-グルタミン添加剤、ペニシリン-ストレプトマイシン水溶液を添加した蛍光標識用ワーキング溶液を用いた。冠状断組織スライスを蛍光標識用ワーキング溶液に浸漬し、37℃/5% CO₂条件下で1時間培養したのちハンクス緩衝液で洗浄した。

蛍光標識後の冠状断組織スライスをガラスボトムディッシュに移し、コラーゲンゲル内で包埋したのちにディッシュを観察用チャンバーに固定した。観察用チャンバーに固定したディッシュ内の冠状断切片を倒立型共焦点レーザー頭微鏡へ取り付け、37℃/5% CO₂の環境下で観察終了まで培養を続けた。蛍光標識された冠状断組織スライスの画像を、20倍対物レンズ下、488 nm励起光と515±15 nm蛍光フィルタを用いて、観察面と直交する方向（Z方向）に1.85μmの間隔で約30断面、12分毎に24時間にわたり、頭微鏡制御ソフトウェアEZ-C1(Nikon)を用いて取得した。画像を取得時刻毎に、複数枚のZ方向画像から1枚の圧縮画像へと積み重ね、合計121枚の画像に変換した。取得されたタイムラプス蛍光画像における細胞遊走については、画像解析ソフトウェアImageJとプラグ
インソフトウェアManual Trackingを用いて追跡し、記録した。この追跡記録については、遊走する細胞毎にLabVIEW (National Instruments, USA)を用いて解析した。概要を図(1)-1)-2および図(1)-1)-3に示す。

図(1)-1)-2. E12.5の胎仔脳の冠状断組織スライスの作製

取り出した胎仔脳（A，対物レンズ2倍）および冠状断組織スライス（B，スケールバー：500 μm）

図(1)-1)-3. 蛍光標識された冠状断組織スライスのZ方向画像の重ね合わせ 取得時刻毎に複数枚のZ方向画像（A）は1枚の画像（B）として重ね合わされる。 LV, lateral ventricle側脳室: pial surface, 軟膜表面。対物レンズ20倍

## b．青斑核(Locus coeruleus: LC)の発生・分化に関する形態学的解析

a. と同様の投与方法により、胎生期・授乳期にBPA曝露（5 μg/kg bw/day, 50 μg/kg bw/day, 500 μg/kg bw/day）をうけた、あるいはvehicleを投与された仔を用いた。性的二型核のひとつである青斑核(Locus coeruleus: LC)に着目し、胎生12日、14日、胎生18日、生後3週齢、生後8週齢、16週齢のマウスにおいて、チロシン水酸化酵素(Tyrosine hydroxylase: TH)を含有するノルエピネフリン作動性神経細胞をTHの免疫染色を行ったうえ計測した。解析個体数はBPA投与群（異なる投与量、計3群）とVehicle群各々に対して、異なる胎齢・週齢(胎生12日、14日、胎生18日、生
後3週齢、生後8週齢、16週齢)、異なる性別(雌・雄)ごとに、n=10(母個体数：n=4-5)とした。

また、生後8週齢のマウスのLCに関して、THの免疫染色を施した4μm厚の連続組織切片を用いて画像を取得したのち、Photoshop CS5 Extended (Adobe)とImage-Pro Analyzer 7.0.1(Media Cybernetics)を用いて画像処理を行った。画像処理の主な流れは、色補正、画像シーケンス構築、RGBチャネルへ分解したのち青色チャネルのみの取り出し、位置補正、二値化、3次元再構成である(図(1)-1)-4)。そののち、当該核の形状、体積、真球度を測定した。その概要を図(1)-1)-4、図(1)-1)-5に示す。解析個体数はBPA投与群、Vehicle群、異なる性別(雌・雄)ごとに、n=5(母個体数：n=2-3)とした。

### c. 青斑核(Locus coeruleus: LC)の大脳皮質投射形成に関する形態学的解析

a. と同様の投与方法により、胎生期・授乳期にBPAを500 μg/kg bw/dayあるいはvehicleを投与するモデル系に関して、LCのノルエピネフリン作動性神経細胞が投射する大脳皮質：前頭前皮質に着目し、生後3週、8週、16週齢のマウスにおいて、ノルエピネフリントランスポーター(Norepinephrine transporter: NET) 陽性線維密度を計測した。マウス脳は灌流固定後摘出し、40 μm厚の凍結切片を作製し、浮遊法を用いてNETを一次抗体とした免疫蛍光染色を施行し、レーザー頭微鏡でZ-stack画像を取得後、二値化法によりNET陽性線維の密度を画像解析した。解析個体数はBPA投与群、Vehicle群、各週齢(生後3週、8週、16週齢)、異なる性別(雌・雄)ごとに、n=10(母個体数：n=4-5)とした。

D

図(1)-1)-4. 画像処理の流れ

A：オリジナルの画像に色補正をかけた状態、B：青色チャンネルのみ取り出した状態、C：TH陽性部分を二値化したもの、D：オリジナル画像にTH陽性部分をオーバーレイ表示したものである。スケールバー：500 μm.
図(1)-1)-5.3次元再構成結果の例

BPA曝露群のオス3次元再構成結果の例を示す。左上がオリジナルの青色チャネル画像で、左上から順に、矢状断面、矢状断面を傾けたもの、前額断面、水平断面となる。

軸の単位は $ x10^{3} $ μmで、TH陽性領域は、背腹・前後方向に1 mm、左右方向に300 μm程度である。矢状断面像では、三つの頂点を持つ矢じりのような形であることが判明した。

## d．行動学的解析

a. と同様の投与方法により、胎生期・授乳期にBPAを500 μg/kg bw/dayあるいはvehicleを投与された生後11週～15週齢のマウスを対象として、社会行動の評価を行った。IntelliCageでは、自動制御・24時間モニタリングとRFタグでの個体認識により、集団生活環境下での行動実験を実施できる（図(1)-1)-6）。IntelliCageの4隅のコーナーに設けられた水ボトルへのアクセス・飲水という報酬行動を評価することで、マウス個体における嗜好の成立、情動性、自閉性などを抽出することを企図した。プロトコルは、実験開始後2日間はIntelliCageの4コーナーすべてを自由に訪問し、各コーナーに2ヶ所設置された水ボトルにアクセス・飲水が可能な適応期とした。その後、コーナーにある水ボトルにはシャッターが設置され、ノーズポーク（＝鼻でつつく動作）をすることでシャッターが開き飲水が7秒間可能となる条件を設定し、飲水という報酬に対するマウスの集団生活下での各個体の行動を解析した。解析個体数は、BPA群雌(n=8)、BPA投与群雄(n=8)、vehicle群雌(n=16)、vehicle群雄(n=16)とした（図(1)-1)-7）。
図(1)-1)-6. IntelliCageの概観

自動制御・24時間モニタリングとRFタグでの個体認識により、集団生活環境下での行動実験が可能なケージである（左）。4隅に飲水コーナーがあり、ノーズポークによりシャッターが開き水ボトルへのアクセス、飲水が可能になる（右）。
図(1)-1)-7. 行動実験プロトコル

雌は、生後11週から2週間、雄は生後13週から2週間に行動実験を実施した。実験開始後2日間はIntelliCageの4コーナーすべてを自由に訪問し、各コーナーに2ヶ所設置された水ボトルにアクセス・飲水が可能な適応期とした。その後、コーナーにある水ボトルにはシャッターが設置され、ノーズポークをすることでシャッターが開き飲水が7秒間可能となる条件を設定し、飲水という報酬に対するマウスの集団生活下での各個体の行動を解析した。

## e．神経伝達物質の生化学的解析

a. と同様の投与方法により、胎生期・授乳期にBPAを500 μg/kg bw/dayあるいはvehicleを投与された生後13週～16週齢のマウスを対象として、脳内神経伝達物質の定量をHPLC-ECD, LC-MSを用いて行った。速やかにマウス脳を摘出後、大脑皮質前頭前野近傍、基底核、海馬、扁桃核、視床、視床下部、中脳黒質、背側縫線核、青斑核の9領域に正確に分割し、直ちに液体窒素にて凍結し測定時まで冷凍保存した。HPLC-ECD、LC-MSを用いて、各脳領域のドパミン(Dopamine:DA)、ドパミン代謝産物(DOPAC)、セロトニン(5HT)、セロトニン代謝産物(5-HIAA)、ノルエピネフリン(NE)、ガンマアミノ酪酸(GABA)、グルタミン酸(Glu)を測定した。解析個体数は、BPA群雌(n=8)、BPA投与群雄(n=8)、vehicle群雌(n=16)、vehicle群雄(n=16)とした。

## 2 ）環境化学物質への胎生期・新生仔期曝露によるゲノムならびにエピゲノムへの影響とその分子メカニズム解明

## a．動物および核酸の抽出精製：

妊娠全期間を通じてBPAに曝露した母マウス(C57BL/6J)から生まれた仔マウスに、出生直後から3週間、経母乳的にBPAに曝露する群とvehicleのみ投与する対照群(0.01%エタノール)を作製した。BPAは胃内チューブにより投与（500 μg/kg bw/day）した。生後3週齢(P3W)または13
～14週齢(P13-14W)時点で雌雄に分けて、心臓採血による全血採取を行った。そののち直ちに脳を採取し9領域（大脳・海馬・中脳・小脳・基底核・視床・視床下部・扁桃体・脳幹）に取り分けた。全血および脳組織からゲノムDNAを、更にRNAを脳組織からキットを用いて抽出した。なお、遺伝子発現変動とDNAメチル化変動の対応付けは本研究計画の根幹であることから、解析用のゲノムDNAとRNAは、同一の組織溶解液から同時に抽出精製した。

継世代影響解析用マウス家系の作出は以下のように行った。妊娠全期間を通じてBPAに曝露した母マウス(C57BL/6J)（以下F0マウス）から生まれた仔マウス（以下F1マウス）に、出生直後から3週間、経母乳的にBPAに曝露する群とvehicleのみ投与する対照群を作製した。8週齢になったF1マウスの雌雄それぞれを、BPA非曝露マウス（8週齢）と交配し、F2マウスを得た（BPAは非投与）。同様にF3マウス・F4マウスを作出した。F1～F4の各個体（P3W）について、雌雄別に核酸抽出用と交配用の2群に分けた。

## b．遺伝子発現変動の解析：

個体差による影響を考慮して、個体（P3W）ごとのデータを取得した(両群ともに雌n=4、雄n=4)。なお、雌雄差の影響を評価することを考慮して、生まれた同腹仔雌雄1対ずつを妊娠マウス4匹から取得し、蛍光1色標識マイクロアレイ法に用いた。マイクロアレイにはアジレント社のAgilent SurePrint G3 Mouse GE microarray 8x60k (large intervening non-coding RNA probe 搭載)を用いた。

以下のような発現データの解析手順により、個体差を超えて変動する遺伝子候補を抽出した。まず、2元配置分散分析の結果から、変動する遺伝子群の抽出を行う際の要因として、BPA曝露のみならず性別をも考慮すべきかどうかの判定を行った。要因ごとの変動遺伝子の抽出は、多重検定補正済み p-value とFold Change を組み合せたvolcano plot法により行った。また、個体間での総当たり比較による発現変動遺伝子候補の抽出も行った。抽出された変動遺伝子候補の生物学的情報に関する解析は、Cytoscape、PPI network (Genome Network Platform Viewer)、Pathway Studioを用いて検索を行った。

RT-qPCR法を用いた相対的定量により遺伝子発現変動の確認を行った。すなわち、アレイ解析に用いたRNAと同ロットのRNAサンプルからSuperscript VILO cDNA合成キットにより調整したcDNAを鋳型とする定量PCR法を実施し、相対的な発現量比較を行った。PCR反応には、FastStart PCR premix試薬、Batch Primer3によりデザインしたPCRプライマーを使用した。測定は、StepONE plusにより実施した。

## c．網羅的DNAメチル化変動解析：

これまでのわれわれの研究から、BPA曝露によって転写開始点周囲近傍におけるメチル化変動が惹起されると予想されたことから、主としてプロモーターやその周辺領域でのメチル化変動をゲノムワイドに効率的に検出できるMIAMI法により解析した。

解析に用いるDNAは発現解析に用いた同一個体から得ることによって発現解析との対応付けを可能にした。なお、MIAMI法によるメチル化変動アレイ解析を行うにあたっては、常に比較したい2サンプルのDNAを相異なる蛍光で標識しマイクロアレイで同時に検出しなければならないという方法論上の制約がある。しかし予算上、マイクロアレイ法による発現解析で用い
た全個体間で総当たり比較を行うことはできなかったため、解析対象の絞り込みを、まず行った。先の発現変動アレイデータの全有効プローブ値を用いた主成分解析を、Gene Springを用いて行い、その結果から、BPA曝露有無の各群において、はずれ値を示す同腹雌雄ペア1組ずつを除いた。主成分解析の結果をもとに、BPA曝露有無の各群内における統計学的位置関係がよく似た同腹雌雄ペアの対を決め、MIAMI法によるメチル化変動アレイ解析を実施した（両群ともに雌n=3、雄n=3、合計12アレイデータ）。

メチル化変動候補配列のメチル化状態の確認は、メチル化感受性制限酵素を用いた定量PCR法(MS-qPCR)により実施した。ゲノムDNAの制限酵素処理には、MIAMI法と同じMsp I、Hpa IIを用いた。定量PCR法はFastStart PCR premixを使用した。PCRプライマーのデザインには、Batch Primer3を用いた。測定は、StepONE plusにより実施した。

## d．個別遺伝子における1塩基レベルでのメチル化変動解析：

ゲノムDNAをBisulfite処理し、サンプル量の少ない血液DNAについては更に全ゲノムDNA増幅法によりBisulfite処理DNAの増幅を行った。これらDNAを鋳型とするPCR反応を行い、標的配列領域を増幅した。この際使用したプライマーの配列は、メチル化の標的となるCpGを避けるようにMethPrimer（オンラインソフトウェア）を用いて設計した。この反応産物の塩基配列を決定すること（Bisulfite Sequencing 法）により注目配列領域中のCpGメチル化率を調べた。概略、以下のように行った。PCR増幅産物をTAベクターにライゲーションし、大腸菌へ形質転換後、コロニーPCR法で増幅した挿入断片の塩基配列を直接シーケンシング法により決定した。QUMAソフトウェアを用いることで、1サンプルあたり24コロニー分の配列をアラインメントし、標的配列領域中の各CpG配列及び全CpG配列のメチル化度を求め、統計処理を行った。

### e. 統計解析：

QUMA、Graphpad Prism5、R 2.15.2 GUI 1.53 Leopard build 64-bit (6335)を用いて行った。

## 4 ．結果及び考察

1）環境化学物質への胎生期・新生仔期曝露による脳形成・発達・成熟および行動への影響とそのメカニズム解明

## a．神経細胞増殖・分化・遊走に関する形態学的解析

## i．大脳におけるBrdU陽性細胞分布と組織計測学的検索

胎生14.5日にBrdUラベルし、生後3週齢で検索した体性感覚野大脳皮質におけるBrdU免疫染色結果を示した（図(1)-1)-8）。vehicle群では、BrdU陽性細胞が大脳皮質のIV層にほぼ限局して層状に分布するのに対し、BPA投与群(50 μg/kg bw/day, 500 μg/kg bw/day)では雌雄ともに、BrdU陽性細胞が大脳皮質のIV層からVI層に広く分布していた。大脳皮質の各層：I層、II+III層、IV層、V層、VI層に分けて、組織計測学的に陽性細胞数の比率を計測した。胎生14.5日にBrdUラベルした群では、BPA投与群(5 μg/kg bw/day, 50 μg/kg bw/day, 500 μg/kg bw/day)の雌雄ともに、vehicle群に比較し、皮質IV層におけるBrdU陽性細胞分布比率は有意に低く、BPA投与群雌(5
μg/kg bw/day)では皮質V層に分布する細胞比率が有意に高く、BPA投与群雄(5 μg/kg bw/day)では皮質VI層におけるBrdU陽性細胞分布比率が有意に高かった（図(1)-1)-9）。胎生11.5日、17.5日では、BrdU陽性細胞分布に有意差はなかった。

図(1)-1)-8. 胎生14.5日にBrdUラベルされた大脑皮質神経細胞の分布を示す(生後3週齢) Fv: vehicle群雌; F5: BPA 5 μg/kg bw投与群雌; F50: BPA 50 μg/kg bw投与群雌; F500: BPA 500 μg/kg bw投与群雌; Mv: vehicle群雄; M5: BPA 5 μg/kg bw投与群雄; M50: BPA 50 μg/kg bw投与群; M500: BPA 500 μg/kg bw投与群雄
図(1)-1)-9. 胎生14.5日にBrdUラベルされた大脑皮質神経細胞の分布（生後3週齢）

vehicle群では、BrdUにラベルされた神経細胞が大脳皮質のIV層にほぼ限局して層状に分布するのに対し、BPA投与群(5 μg/kg bw, 50 μg/kg bw, 500 μg/kg bw)では、皮質IV層におけるBrdU陽性細胞分布比率は有意に低く、BPA投与群雌(5 μg/kg bw)では、皮質V層の細胞分布比率が、BPA投与群雄(5 μg/kg bw)では、皮質VI層の細胞分布比率が有意に高かった。胎生11.5日、17.5日では有意な差はみられなかった。

$ ^{*} $ : P < 0.05, $ \^{**} $ : P < 0.01. vehicle群との比較
F50

図(1)-1)-10. 海馬におけるBrdU標識細胞の分布：胎生14.5日(E14.5)にBrdUラベルを施行。

CA1 E14 BrdU-labeled

Mv

M50

M500

CA2+3 E14 BrdU-labeled

dentate E14 BrdU-labeled

CA1 E17 BrdU-labeled

CA2+3 E17 BrdU-labeled

dentate E17 BrdU-labeled

図(1)-1)-11. 海馬におけるBrdU標識細胞数（生後3週齢、雄）

胎生14.5日(E14.5)にBrdUラベルした細胞総数、E17.5にBrdUラベルした細胞総数はBPA投与群、vehicle群で有意差はみられなかった。
## ii．海馬におけるBrdU陽性細胞密度

胎生14.5日、17.5日にBrdUラベルした群に関して、CA1、歯状回におけるBrdU陽性細胞総数・密度は、BPA投与群、vehicle群、雌雄で差は見られなかった(図(1)-1)-10，図(1)-1)-11)。

### iii. その他の脳領域

基底核、視床手綱核、視床下部、脳幹、小脳に関して、胎生11.5日、14.5日、17.5日にBrdUラベルされた細胞密度は、BPA投与群、対照群、雌雄で差は見られなかった。

### iv. 大脳皮質神経細胞放射状移動のタイムラプス解析

Oregon-Green蛍光標識を施した冠状断組織スライスの観察により、背側終脳壁の脳室帯外側から辺縁帯における細胞体トランスロケーション（図(1)-1)-12）、ロコモーション（図(1)-1)-13）という放射状遊走様式を示す細胞ならびに接線方向の遊走を示す細胞を分類すすとともに、皮質板深層に定着する神経細胞の放射状遊走を確認できた。

放射状遊走を示す細胞に着目し、vehicle群については89細胞（10胎仔から作製した冠状断組織スライス）、BPA投与群に関しては83細胞（13胎仔から作製した冠状断組織スライス）を対象に解析を行ったところ、細胞の平均遊走速度はBPA投与群の細胞（30.9±1.5μm/h, n=83）においてvehicle群の細胞（29.4±1.5μm/h, n=89）よりやや速かったが、統計学的な有意差は得られなかった(図(1)-1)-14）。次に、遊走細胞の細胞体の軌跡のばらつきの程度を解析した。すなわち、細胞が脳室帯において遊走を開始した地点を開始点、軟膜面近傍において遊走を終了した地点を終了点、開始点と終了点を結んだ直線を基準直線とし、基準直線からの距離を各時点において算出しその標準偏差を求め、ノンパラメトリックt検定を用いて統計解析した。その結果、vehicle群（標準偏差=5.7±0.5, n=89）と比較してBPA投与群（標準偏差=4.1±0.3, n=83）では、細胞体軌跡のばらつきが有意に減少していた(図(1)-1)-15)。
図(1)-1)-12. 細胞体トランスロケーション形態を示す細胞

軟膜との突起の接着を維持し放射状に遊走する細胞がタイムラプス画像において観察される。脳室帯の細胞（矢印）は、放射状突起の先端（矢頭）を軟膜面に接着し、放射状に遊走する。VZ,ventricular zone. スケールバー: 20μm.

図(1)-1)-13. 軟膜面との接着を持たない単極性あるいは多極性突起を有し、ロコモーション形態で放射状遊走する細胞

形態や方向の変化を伴いながら放射状遊走する様子が観察される。VZ, ventricular zone, 脳室帯；Pial surface, 軟膜表面 スケールバー：20μm.
図(1)-1)-14. 放射状遊走する細胞の平均速度

vehicle群; $ 29.4 \pm 1.5 \mu m/h $ . BPA投与群; $ 30.9 \pm \mu m/h $ . エラーバーは標準誤差を示す。

A

B

図(1)-1)-15. 放射状遊走する細胞の細胞体の軌跡のばらつき

（A）各時刻における遊走細胞の基準直線（破線）からのばらつきを表す模式図。軌跡のばらつきは、各時刻において基準直線からの距離の標準偏差として計算した

（B）遊走細胞軌跡の基準直線からの距離の標準偏差。数値が大きいほど基準直線からのばらつきが大きいということを示す。エラーバーは標準誤差を示す。vehicle群とBPA投与群の間の有意差はノンパラメトリックt検定により求めた： $ ^{*} $ : P < 0.05
## b．青斑核(Locus coeruleus: LC)の発生・分化に関する形態学的解析

i．LCにおけるTH陽性神経細胞の計測

胎生12日では、LCにおけるTH陽性神経細胞は同定できなかったが、胎生14日からは、LCの神経細胞にTHのタンパク発現が確認できた。

図(1)-1)-16. LCにおけるTH陽性神経細胞：

ノルアドレナリン作動性神経細胞がTH陽性に染色される。

LCにおけるTH陽性神経細胞総数は、胎生14日、胎生18日では、BPA投与群5 $ \mu g/kg bw/day $ ，50 $ \mu g/kg bw/day $ ，500 $ \mu g/kg bw/day $ とvehicle群間に有意差は得られなかった。生後3週齢では、TH陽性神経細胞数は、BPA投与群500 $ \mu g/kg bw/day $ の雌では、vehicle群の雌に比べて有意に減少していた $ (P<0.05) $ 。生後8週齢では、vehicle群で雌のTH陽性神経細胞数が雄に比し有意に多かった $ (P<0.01) $ 。しかし、BPA投与群500 $ \mu g/kg bw/day $ では、雌のTH陽性神経細胞数がvehicle群雄のレベルまで減少することで、vehicle群雌に比し有意に少なくなった $ (P<0.05) $ 、図(1)-1)-16、図
(1)-1)-17)。一方、BPA投与群50 $ \mu $ g/kg bw/dayの雄では、vehicle群雄に比しTH陽性神经細胞数が有意に増加し、性差が完全に逆転した(P<0.001、図(1)-1)-17)。また、生後16週齢では、vehicle群、BPA投与群500 $ \mu $ g/kg bw/day、雌雄間で明らかな差異はみられなかった。

P16W

図(1)-1)-17. 青斑核のTH陽性神経細胞数経時的変化：

生後3週齢のvehicle群においてTH陽性神経細胞数に雌雄差は認められない。

500 μg/kg bwの雌では、TH陽性神経細胞数が雌のvehicle群に比し有意に少ない。BPA群50 μg/kg bwの雄では、TH陽性神経細胞数が雄のvehicle群に比し有意に多く、BPA曝露による性差の逆転が生じている。

$$ *:P<0.05,**:P<0.01,***:P<0.001. $$

### ii. LCの3次元再構成

LCの連続組織切片を用いたコンピュータによる3次元構成を行い、LCの容積、形状の凹凸を解析した。BPA投与群500 μg/kg bw/day、vehicle、雌雄の結果を示す(図(1)-1)-18)。LC体積はBPA投与群でvehicle群(CNT:control)に比し、雌雄ともにやや大きい傾向を示したが、有意差は得られなかった(図(1)-1)-19左)。核の表面性状を数値化するために、真球度を算出したところ、BPA
500 μg/kg bw/day投与群では雄雌ともにLCの真球度が有意に低く、核の表面性状が不規則な凹凸を示すことが明らかになった(図(1)-1)-19右)。

なお、真球度は(6x体積)/(表面積×相当直径)で計算されるオブジェクト形状に関する値で、真球は1、その他の立体は1未満となる。同じ体積に対し、表面積が大きい、つまりオブジェクトに凹凸があると値が小さくなるという指標である。

BPA 500 $ \mu $ g/kg

図(1)-1)-18. LCの三次元再構成
図(1)-1)-19. LCの体積(左)と真球度(右)

LC体積はBPA投与群(BPA)、vehicle群(CNT)間で有意差は得られなかった。真球度は、BPA投与群では雄雌ともにvehicle群に比し有意に低く、核の表面性状が不規則な凹凸を示した。 $ ^{*} $ : P < 0.05.

### c. 青斑核(Locus coeruleus: LC)の大脳皮質投射形成に関する形態学的解析

生後3週、8週、16週齢におけるNET陽性線維密度、分布形態は、vehicle群、BPA曝露群、雌雄間で有意差はみられなかった(図(1)-1)-20、図(1)-1)-21)。LCにおけるTH陽性ノルエピネフリン作動性神経細胞総数は、生後3週、8週齢では、BPA曝露群の雌でvehicle群の雌に比べて有意に減少(p<0.05)するとともに、BPA曝露群の雄でvehicle群雄に比し有意に増加し、性差が完全に逆転した(p<0.05、図(1)-1)-17)。また、生後16週齢では、vehicle群、BPA曝露群500 μg/kg bw/day、雌雄間で明らかな差異はみられなかった。しかしながら、その主たる投射先である前頭前皮質における投射線維密度には変化がなかった。
図(1)-1)-20. 前頭前皮質におけるNET陽性線維の蛍光免疫染色

P3W, P8W, P16Wにおいて、vehicle群、BPA曝露群、雌雄間でNET陽性線維の分布パターン、密度に差はみられない。Fv: vehicle群雌；F500: BPA 500 μg/kg bw投与群雌；Mv: vehicle群雄；M500: BPA 500 μg/kg bw投与群雄.

図(1)-1)-21. 前頭前皮質におけるNET陽性線維密度

P3W, P8W, P16Wにおいて、vehicle群、BPA群、雌雄間で有意差はない。

## d．行動学的解析

i．解析期間中のコーナー訪問回数(表(1)-1)-1)

コーナー訪問回数は、vehicle群、BPA投与群ともに、夜間帯、しかも報酬の得られない（飲水しない）訪問回数が有意に多かった。

ii．飲水コーナーでの滞在時間
BPA投与群雄では、vehicle群雄に比し、コーナー滞在時間が夜間・昼間ともに有意に長く、報酬の得られない（＝飲水しない）条件でも有意差を示した(図(1)-1)-22)。

### iii. コーナーに対する嗜好性の形成

Preference Biasはマウス一個体のあるコーナーへの嗜好性を数学的に表したものである。

Preference Bias(j) = (C_{1st}(j) + C_{2nd}(j) - C_{3rd}(j) - C_{4th}(j))/2
$ C_{ij} = \text{animal}(j)'s number of corner}(i)\ \text{visits}/\text{animal}(j)'s number of total visits} $

$ C_{1\mathrm{st}}(\mathrm{j}) $ は動物jのコーナー訪問割合のうち最大のものを示す。 $ \mathrm{C}_{2\mathrm{nd}}(\mathrm{j}) $ ， $ \mathrm{C}_{3\mathrm{rd}}(\mathrm{j}) $ ， $ \mathrm{C}_{4\mathrm{th}}(\mathrm{j}) $ はそれぞれ2番目，3番目，4番目のものである。動物jのコーナーiの訪問割合 $ C_{ij} $ は上記で計算される。

Preference varianceは群としての嗜好傾向を数学的に示すものである。

$$ \begin{aligned}{\operatorname{P r e f e r e n c e~V a r i a n c e}(j)=s q r t{\left(\sum_{i=1}^{4}(C_{i j}-C_{i M})^{2}\right)}}\\ \end{aligned} $$

動物jのコーナー訪問割合 $ C_{ij} $ と訪問割合の中央値 $ C_{iM} $ とのコークリッド距離で定義する。中央値 $ C_{iM} $ はコーナーごとに全動物の中央値を計算する。

図(1)-1)-23に示すように、BPA投与群雄では、Preference Biasが有意に高くコーナーに対する嗜好性が形成されたが、他群では嗜好性の形成はみられなかった。

Preference varianceに関しては各群に有意差はみられなかった(図(1)-1)-23)。

### iv. コーナー訪問時の追従性

コーナー訪問において、直前に訪問した一個体に追従するようなタイミングで他個体がコーナーを訪問する性状を「コーナー訪問時の追従性」と定義し、2個体の訪問時間間隔を算出した。BPA投与群雄では、前者にひき続いてコーナーを訪問する性向がみられ、特に報酬行動(＝飲水する)の場合に顕著であった(図(1)-1)-24)。

VisitNocturnal (1 day average)Diurnal (1 day average)TotalWoDWDTotalWoDWDCNT-F170.8 ± 27.7 ****121.8 ± 24.6 ****##49.0 ± 6.4 ****31.2 ± 6.721.6 ± 4.8 ##9.6 ± 2.8BPA-F152.2 ± 56.0 ***101.7 ± 47.9 ***50.5 ± 9.7 ***21.6 ± 8.6 †13.9 ± 5.7 #†7.7 ± 3.2CNT-M143.3 ± 42.0 ****91.7 ± 38.3 ****##51.6 ± 9.2 ****31.0 ± 15.317.9 ± 9.4 #13.1 ± 7.4BPA-M149.0 ± 33.7 ***95.1 ± 31.0 ##53.8 ± 8.5 ***30.2 ± 8.717.7 ± 7.912.5 ± 4.5
図(1)-1)-22. 飲水コーナーでの滞在時間

BPA群雄では、vehicle群雄に比し、コーナー滞在時間が夜間・昼間ともに有意に長く、報酬の得られない条件でも有意差を示した。 $ ^{*} $ : P < 0.05, $ ^{**} $ : P < 0.01.

図(1)-1)-23. コーナーに対する嗜好形成

BPA群雄では、vehicle群雄に比し、コーナーに対する嗜好性が明らかに形成された。一方、雌では両群間に差はみられなかった。***: P < 0.001.
図(1)-1)-24. コーナー訪問時の追従性

BPA群雄では、vehicle群雄に比しinterval（先の動物の訪問との時間間隔）が有意に短く、他個体に追従してコーナーを訪問する表現型がみられた。 $ ^{*} $ : P < 0.05, $ ^{**} $ : P < 0.01.

## e．神経伝達物質の生化学的解析

i．モノアミン（DA、DOPAC、5HT、5-HIAA）定量

DA、DOPAC、5HT、5-HIAAの定量結果を示す(図(1)-1)-25)。

BPA曝露群の雌で、基底核、扁桃核で5HTの増加、視床下部でDA、DOPACの有意な増加、BPA曝露群の雄でDOPAC/DAの比率の増大をみたが、多くは有意な差異を示さなかった。

## ii．NE、GABA、Glu定量

BPA曝露群雌では大脳皮質、基底核、扁桃核、海馬、視床下部、視床、中脳黒質でGABA、Gluの有意な増加、大脳皮質、視床、視床下部でNEの有意な増加をみた(図(1)-1)-25)。BPA曝露群の雄では、扁桃核と海馬でGABAの有意な減少、Gluの有意な増加がみられ、BPA曝露影響に雌雄差のあることが判明した。

### iii. 社会行動と神経伝達物質変動の相関

社会行動結果との相関を統計学的に解析した(図(1)-1)-26, 図(1)-1)-27)。BPA曝露群雌では、昼間の報酬行為を伴わない（飲水しない）コーナー訪問回数が有意に減少していたが、この行動と大脳皮質、視床におけるNEの増加が有意な相関を示した。一方、BPA曝露群雄では、vehicle群雄に比し、コーナー滞在時間が夜間・昼間ともに有意に長く、報酬の得られない条件（＝飲水しない）でも有意差を示しており、コーナーに対する嗜好性が形成された。このコーナー滞在時間の増大と、海馬におけるGABA減少との間に有意な相関関係がみられた。
Female	DA	DOPAC	DOPAC /DA	5-HT	5-HIAA	5-HIAA /5-HT	NE	GABA	Glu
CO	ns	ns	ns	ns	ns	ns	↑↑	↑↑	↑↑
BG	ns	-	-	↑↑	ns	ns	ns	↑↑	↑↑
AMY	ns	ns	ns	↑	ns	ns	ns	↑↑	↑↑
HIP	-	-	-	ns	ns	ns	ns	↑	↑↑
HT	↑↑	↑↑	ns	ns	ns	ns	↑↑	↑↑	↑
TH	ns	ns	↑	ns	ns	ns	↑↑	↑↑	↑↑
DR	-	-	-	ns	ns	ns	ns	ND	ND
SN	ns	ns	ns	ns	ns	ns	ns	↑↑	↑
LC	-	-	-	ns	ns	↑↑	ns	ND	ND
Male	DA	DOPAC	DOPAC /DA	5-HT	5-HIAA	5-HIAA /5-HT	NE	GABA	Glu
CO	ns	ns	ns	ns	↑	↑	↑	ns	↑
BG	ns	-	-	ns	ns	ns	ns	ns	ns
AMY	ns	ns	ns	ns	ns	ns	ns	ns	↑
HIP	-	-	-	ns	ns	ns	ns	↓	ns
HT	ns	↑↑	↑↑	ns	ns	ns	ns	ns	ns
TH	ns	ns	ns	ns	ns	ns	ns	ns	↑↑
DR	-	-	-	ns	ns	ns	ns	ND	ND
SN	ns	ns	ns	ns	ns	ns	ns	ns	ns
LC	-	-	-	ns	ns	ns	ns	ND	ND

図1-1-25. 神経伝達物質定量結果

赤地(↑)はBPA曝露群で有意に増加、青地(↓)はBPA曝露群で有意に減少したものを示す。

CO: 大脳皮質、BG: 基底核、AMY: 膈桃核、HIP: 海馬、HT: 視床下部、TH: 視床、

DR: 背側縫線核、SN: 黑質、LC: 青斑核

DA: ドパミン、DOPAC: ドパミン代謝産物、5-HT: セロトニン、5-HIAA: セロトニン代謝産

物、NE: ノルアドレナリン、GABA: ガンマアミノ酪酸、Glu: グルタミン酸

ND: 検出できず

Wilcoxon rank-sum test (FDR≤10%) ↑および↓: q<0.1, ↑↑: q<0.05, ns: 有意差なし
Spearman's $ \rho $	Num. (Diur.)
WoD
Fv	F500
CO NE	-0.686 $ \dagger $	-0.687
TH NE	-0.729 $ \dagger\dagger $	-0.892 $ \dagger $

図(1)-1)-26. 神経伝達物質定量と行動実験結果の相関

Spearman's rank correlation coefficient

† q≤0.1 Num: 訪問回数、Diur.: 明期、WoD: 飲水行為なし、CO: 大脳皮質、TH: 視床、NE: ノルアドレナリン ● はメスBPA曝露群、 ○ はメスvehicle群

図(1)-1)-27. 神経伝達物質定量と行動実験結果の相関

Spearman's rank correlation coefficient $ \dagger q \leq 0.1 $ Dur.: コーナー滞在時間 Noct: 暗期、WoD: 飲水行為なし、HIP: 海馬、GABA: ガンマ酪酸

▲はオスBPA曝露群、△はオスvehicle群
BPAの胎生期・授乳期曝露による脳形成過程に及ぼす影響を形態学的に検索したところ、大脑皮質形成過程において胎生14.5日に最終分裂直前のDNA合成期にあった（＝胎生14.5日に産生された）神経細胞は、生後3週齢の時点で皮質IV層における分布が非曝露対照群に比し少なくV層あるいはVI層に多く分布するという大脑皮質での分布異常を示した。この大脑皮質神経細胞分布異常には、性差、BPA曝露用量への依存性はなく5μg/kg bw/dayの極低用量でも有意な差異が検出できた。われわれの以前の報告¹や大脑皮質組織培養系を対象とした蛍光イメージング・タイムラプス解析で得られた結果を勘案すると、BPAが神経細胞の遊走過程に促進的に作用したことが基盤にあると考えられるが、当該変化は胎生14.5日に分化した神経芽細胞に限られた変化であり、BPAの大脑皮質形成過程に及ぼす影響には臨界期の存在が示唆される。現在までの解析では、海馬、視床、視床下部、線条体に神経細胞の分化・遊走の異常はみられず、影響は大脑皮質に特異的かつ限定的であった。われわれは既にBPA胎生期曝露による大脑皮質形成過程への影響解析結果を報告しているが¹、マウス系統、投与法、投与量、投与期間を変更しても高い再現性がみられた本所見、すなわち大脑皮質形成過程へのBPA曝露の影響は特筆すべき所見と考える。

次に、性的二型核の一つである青斑核(Locus coeruleus: LC)におけるTyrosine hydroxylase: THを含有するノルアドレナリン作動性神経細胞数の変動に関して検討を行った。胎生期・授乳期におけるBPA曝露は、雌の成熟過程である生後3週から8週齢-ヒトでは思春期に相当すると考えられる時期-において、LCの神経細胞数をvehicle群雄と同レベルまで減少させ、性差の逆転、即ち雌の雄化という現象を惹起することが示された。当該変化が、低用量(50 μg/kg/day)のBPAを妊娠・授乳期間中の母体に経口投与することで引き起こされたことは重要である。生理的には、LCにおけるTH陽性神経細胞数は生後30日で雌雄差はみられないが、生後60日では雌雄差が生じ、雌のTH陽性神経細胞数が雄のそれに比し有意に多くなり、生後120日では雌のTH陽性神経細胞数が減少することにより雌雄差が消失する。さらに、エストロゲン受容体βのノックアウトマウスでは、生後60日にピークに達したTH陽性神経細胞数は、生後週齢とともに生理的に生じる神経細胞減少がわずかにとどまり、野生型に比べ生後240日まで有意に細胞数が多いと報告されている $ ^{4} $ 。LCのノルアドレナリン作動性神経細胞にはエストロゲン受容体βが発現しており、エストロゲン支配性に神経細胞の生存、神経伝達物質の調節などが行われていると想定されている。BPAは弱いエストロゲン作用を有しておりその作用機序の全貌はなお明らかではないものの、一部はエストロゲン受容体を介して影響を及ぼすと考えられている。われわれの実験結果から、胎生期、授乳期におけるBPA投与はLCの神経細胞産生には影響を及ぼさないものの、その後の神経細胞の分化、神経伝達物質の産生機構に影響を及ぼす可能性が示唆された。

さらに、3次元構築モデルを作製してLCの体積・形状を解析したところ、BPA曝露による変化として体積の変動はみられなかったが、LC核の表面性状が不規則な凹凸を示すことが明らかになった。形状の変化の意味するところは現時点で明らかではないが、神経細胞の異常な分布、神経細胞の不規則な脱落、神経突起の分布の多様性などを含め、LC内の部位による構成神経細胞のBPA感受性の差異を反映している可能性がある。

引き続き、性的二型核LCのノルエピネフリン作動性神経細胞が投射する大脳：前頭前皮質の解析を行った。先に記載したように、胎生期・授乳期におけるBPA曝露は、雌の成熟過程である生後3週から8週齢においてLCの神経細胞数がvehicle群雄と同レベルまで減少し、性差の逆転、即ち雌の雄化という現象が生じていることが示唆された。その選択的投射先である前頭前皮質では、