Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
NET陽性線維の分布・密度には3週、8週、16週齢いずれの年齢においても、BPA曝露群、vehicle群での有意差はみられなかった。この結果から、BPA曝露により有意に減少したLCのノルエピネフリン作動性神経細胞が大脳皮質以外の領域に投射する細胞であった可能性、あるいは神経細胞軸索終末での分枝数の増減がフィードバック機構により惹起された可能性などが考えられる。

集団行動解析バッテリーであるIntelliCageを用いた行動実験では、BPA曝露マウスの社会行動の異常を抽出できたと考える。報酬とは無関係に社会集団から離れたコーナーに長時間滞在する傾向、嗜好性の形成、追従性の増加など、その変動はBPA投与群雄に顕著にみられた。背景病態に関しては議論のあるところであるが、自閉性、固執性、情動性などが関与している可能性がある。ヒトにおけるいかなる病態のモデルとなり得るかに関しては今後さらに解析を進めることが必要であるが、発達障害モデルとして理解することも可能である。

他方、脳の機能的変動を明らかにする一つのアプローチとして、脳内神経伝達物質の変動をHPLC-ECD, LC-MSを用いて測定したところ、BPA曝露の生物影響に性差のあることが立証できたと考える。興味深いことは、IntelliCageを用いた行動実験によりBPA曝露群雄に顕著にみられた行動、即ち報酬とは無関係に社会集団から離れたコーナーに長時間滞在する傾向や嗜好性の形成が、海馬におけるGABAの減少と相関していたことである。背景病態には議論のあるところであるが、海馬-中隔-中脳腹側被蓋野を結ぶ報酬系のかく乱がその病態背景として考えられる。

一方、LCのノルエピネフリン作動性神経細胞にBPA曝露の影響・雌雄の差異が消失する16週齢において、BPA曝露群雌の大脳皮質でNE量が有意に増加していたことは、LCの神経細胞数とは関係なく、ノルエピネフリン作動性神経細胞の機能亢進状態が基盤にあることを示唆する。その意味するものはなお不明であるが、BPAへの胎生期・授乳期曝露により生理的にみられるLCのノルエピネフリン作動性神経細胞数の消長を喪失したことが、その後の神経細胞活動に何らかの変動をもたらした可能性を想定し、今後さらなる検証を進めることが求められる。

以上のように、胎生期から新生仔期にかけての低用量BPA曝露が脳形成過程に及ぼす影響の一部を解明し得たので、環境政策立案に資する科学的根拠となることを期待する。

2）環境化学物質への胎生期・新生仔期曝露によるゲノムならびにエピゲノムへの影響とその分子メカニズム解明

## a．発現変動遺伝子候補の抽出

得られたアレイデータのうち、少なくとも1サンプルで、有効なシグナルを示した31323アレイプローブを対象にデータ解析を進めた。まず、2元配置分散分析の結果から、投与条件のみが変動要因であること、すなわちBPA曝露により変動する遺伝子群は性別-BPA曝露の交互作用を受けないということが判明した。

そこで、各群の発現量（性別を無視した個体間平均値）をもとにvolcano plot法により変動遺伝子を抽出した。「多重検定補正済み p-value < 0.05 かつ Fold Change > 2」という一般的な基準で抽出される遺伝子はなく、多重検定補正済み p-value < 0.05 での最大変動幅はFold Change < 1.5 となった。遺伝子発現変動は胎仔脳に比べ予想外に小さいことがわかった。次に検定の閾値と同時にFold Changeの閾値を設定し直し、「多重検定補正済み p-value < 0.2 かつ Fold Change > 1.2」というかなり緩やかな条件で遺伝子の抽出を行ったところ、51プローブ存在した（BPA曝
露でUPが29、BPA曝露でDOWNが22；表(1)-2)-1にかかげた遺伝子群については、直接的な蛋白-蛋白間相互作用を示すものや共通の直接結合蛋白（変動遺伝子としては抽出されなかった）を有するものが少なからず含まれていた（図(1)-2)-1）。しかし、予想に反して、これらの変動は全て2倍に満たないものであった。これは、変動の有無に関する個体差が少なからず認められたことが大きく寄与したためと考えられた。これらの遺伝子について実施したRT-定量PCR法による変動確認においても、BPA曝露群としてのFold Changeは1.5に満たないものであることが確認されたことから，候補遺伝子とはならないと考えられた。

通常一般に変動遺伝子として見なされるよりもかなり緩やかな条件で抽出されたこれらの遺伝子が、真にBPA曝露に対する応答の結果なのかどうかの判断は難しい。しかし、ここまでに行った発現変動ランキングに基づく抽出手法の方法論的制約としては、繰り返し実験の少ない統計検定、多重検定の補正、ノイズの影響などを原因とする、重要遺伝子の抽出漏れの可能性が指摘されてきた。さらに個々の遺伝子だけではパスウェイへの影響がわからないという欠点もある。

そこで、GSEA(Gene Set Enrichment Analysis)法による遺伝子抽出に着手した。これは、例えば、10倍変動した1遺伝子に比べ、1.2倍変動した、同一のパスウェイ上にある10遺伝子のほうが重要では無いかという観点にたった解析手法であり、ある生物学的情報に関連する遺伝子がまとまって、わずかでも変動している場合に有効と考えられている。そこで、先に抽出された遺伝子群について、どのような関連性が濃縮されるかを検討した。その結果、Human Phenotypeとして

Abnormality of the alveolar ridges $ (p = 0.012471) $ , PathwayとしてGenes involved in Neuro transmitter Receptor Binding And Downstream Transmission In The Postsynaptic Cell $ (p = 0.005627) $ , Genes involved in Transmission across Chemical Synapses Cell $ (p = 0.030958) $ , Genes involved in

Trafficking of GluR2-containing AMPA receptors (p = 0.094107) といったカテゴリーがヒットした。そこで、これらのカテゴリーに含まれる遺伝子が複数同時に動いているかどうかをBPA曝露群の個体ごとにみたところ、必ずしもそのような結果にはなっていなかった。このことから、GSEA法によっても、ある生物学的情報に関連する発現変動遺伝子群を必ずしもうまく抽出できなかったと判断した。

以上の結果から、各群の発現量の個体間平均値を利用する手法とは異なるアプローチによって、発現アレイデータから遺伝子抽出を行うことが必要であると判断した。

## b．MIAMI法によるDNAメチル化変動遺伝子候補の抽出

方法の項で述べたように、個体間総当たりでの比較を実施できない制約があったため、発現アレイの情報をもとに解析対象個体の絞り込みを行った。BPA曝露群とvehicle投与群それぞれにおいて同腹仔の関係にある雌雄4対(8匹)、合計雌雄8対16匹を発現解析では用いた。これらの個体を、有効なシグナルを示した31323プローブ全てのシグナル値を用いたクラスタリング解析の結果、同腹仔同士の発現状態が非常に似ていることが判った。そこで、全8対の同腹仔ペア間で主成分解析による比較を行った。その結果、vehicle投与群、BPA投与群それぞれにおいて、1対ずつのはずれペアが検出された(図(1)-2)-2)。そこで、まず、これら雌雄2対4匹を解析対象から外した。

そのうえで、各群内の3ペアの位置関係がよく類似していることに着目し、図(1)-2)-2において両端矢印で示した比較対間でBPA曝露有無のメチル化解析を行うことにした。さらに、メチル
化の性差による影響を見るため、同腹仔の雌雄間での比較をvehicle投与群、BPA曝露群それぞれにおいて行うことにした。このようにして決められた比較すべき2個体間において、蛋白をコードする遺伝子上のDNAメチル化をMIAMI法にて検索した。

表(1)-2)-1. 変動遺伝子候補リスト

Gene Name	Entrez ID
Fgfbp1	14181
Glp2r	93896
Slc10a7	76775
Gm10753	100038731
Tmem45a	56277
Cd48	12506
Gypc	71683
Gm5068	277069
4930423D22Rik	74634
Crh	12918
Ss18	268996
Tbx15	21384
Iqsec3	243621
Gm4461	100043474
Cldn 5	12741
1700027A07Rik	69996
Nsf	18195
Gm7276	639653
Evc 2	68525
Pfch 1	269437
Sfmbt1	54650
Rpl	19041
Rbm27	225432
Sh2d2a	27371
Fli 1	14247
Spag5	54141
Smago	207818
Gm9174	668450
Akap1l	219181
Gnb4	14696
Gm5396	385454
Lrp6	16974
C03003GA07Rik	654818
Fitm2	226859
Plob 1	18795
Nav1	215690
Acin1	56215
A830005F24Rik	442803
Mex3b	106797
Kremen1	84035
9530062K07Rik	78739
Cd276	102657
6430548M08Rik	234797
Gm4514	100043553
Srpx	51795
Srgap3	259302
74930475L05Rik	75818
Fbxo15	50764
Ap2b1	71770
図(1)-2)-1．抽出された蛋白-蛋白間相互作用の例

図(1)-2-2. 異なる同腹仔ペア間での発現傾向の主成分解析結果

その結果、DNA中の「CCGG」配列を認識するメチル化感受性制限酵素Hpa II認識部位34カ所においてメチル化の違いが見出された。しかし、その多くは特定の個体において見出されたものであった。このうち、15カ所はpromoter領域に、残り19カ所は転写開始点の10kb以内の下流で、かつ、ストップコードンより上流に位置していた。これら34カ所のうち、26カ所はBPA曝露群の雄のみで、2カ所は雌のみでメチル化の亢進を示した。2カ所は性差による影響のみを受けてい
た。残り4カ所はBPA曝露群もしくはvehicle投与群内の雌雄差のみを示した。前述の遺伝子発現マイクロアレイ法の結果と同様、HpaⅡ認識部位に着目したメチル化変動解析の結果からは、個体差の影響が予想外に大きいことが明らかとなった。

遺伝子発現マイクロアレイ法による発現変動遺伝子候補とオーバーラップした遺伝子は特定の1匹において、3カ所（遺伝子）検出された。それら検出されたHpaⅡ認識部位について、そのメチル化状態をMS-PCR法により定量した。アレイで比較した個体間に差は認められたが、2元配置分散分析の結果からは、性別やBPA曝露の有無による有意な群間差は得られなかった。またメチル化度と発現レベルの間に相関も得られなかった。

以上の結果から、MIAMI法を用いて有意なBPA曝露応答性メチル化変動部位を抽出することは困難であると判断した。

### c. 発現変動遺伝子候補の抽出

「 a．発現変動遺伝子候補の抽出」で述べた発現アレイデータからの遺伝子抽出作業を行うなかで、遺伝子発現レベルが同一群内でも個体差がみられる傾向にあることに気がついていた。そこで、必ずしも一般的な手法とはされていないけれども、個体間比較を総当たりで行う次のような2通りの抽出法を実施した：i）同一性間の比較によるBPA応答性変動遺伝子の抽出、ii）同一薬剤処理条件の同腹異性間差次的発現を示す遺伝子群から、片方の処理条件群にのみ現れる遺伝子の抽出。このとき、差のある発現量の基準として発現変化量2倍以上を設定した。これらの作業をすべての個体の組み合わせで行い、遺伝子ごとに抽出回数をカウントした。カウント数の多い上位の遺伝子のうち、各遺伝子領域にDNAメチルA化の標的となるCpGに富む配列領域（CpG island；以下CGI）が少なくとも1つ存在する遺伝子に着目し、RT-qPCR法により発現変動を確認した。その結果、i）の方針により3つのBPA応答性発現変動遺伝子A、B、Gnasを得ることができた。Gnas遺伝座からは4つのalternative promoterから異なるmRNAが転写されるが、NespおよびGnasxlにおいてBPA応答性発現変動を見出した(図(1)-2)-3)。
図(1)-2)-3. 大脳におけるBPA応答性発現変動

## d．大脳（P3W）における候補遺伝子領域のDNAメチル化変動の解析

発現アレイやMIAMI法の解析に用いた個体のゲノムDNAを用いて、3つの候補遺伝子(A, B, Gnas)領域それぞれのCGIを対象にBisulfite Sequencing法にて一塩基レベルでのCpGメチル化状態を解析した。NespおよびGnasxlの各転写開始点周囲にCGIが存在する。これらの領域中で検索したCpGにおいてBPA応答性メチル化変動は見いだされなかった。A・B両遺伝子はゲノム上の狭小な領域に隣り合って位置しており、それぞれの遺伝子内に2つずつのCGIを、さらに遺伝子間に2つのCGIを持つ(図(1)-2)-4A)。これらのCGIとA遺伝子転写開始点上流(0.5kb内)の複数のCpGについて調べた。その結果、P3Wの大脳において、AのCGI1領域中に存在する23カ所のCpGのうち8番目のCpG(以下、CpG_8)のみがBPA曝露依存性のメチル化状態変動を示すことを見いだ
A) AおよびB遺伝子のゲノム構造．エクソンを白抜きボックス，CGI，組織特異的エンハンサー領域(TSE)，Bisulfite Sequencing法で解析した領域をそれぞれ線で示す．B, C) 円グラフによって、大脳(B)および血液(C)由来 DNAにおけるA遺伝子CGI1領域中の各CpG部位（全23カ所）でのメチル化度（%；黒）を示す．Fisher's exact test によりBPA曝露群とvehicle投与群の間で有意差がある部位にはアステリスクを付した。*：significant at P<0.05、**：significant at P<0.01

した。この変動は性差に依存しておらず(図(1)-2)-4B)、かつmRNA発現変動との間に強い逆相関を示す唯一の部位であった(図(1)-2)-5A)。そこで、CpG_8を含むAのCGI領域に候補を絞り以後の解析を行った。

A

B

C

図(1)-2)-4. A遺伝子CGI1領域におけるBPA曝露応答性メチル化変動

## e．離乳直後のP3Wおよび離乳後にはBPA曝露を受けていないP13-14Wのマウス大脳におけるCpG_8のメチル化変動を解析

大脳におけるA遺伝子CpG_8のメチル化変動の解析を、離乳直後の個体（P3W）について解析
個体数を拡大して実施した。さらに、離乳後はBPA曝露を受けていないP13-14Wのマウスも対象として解析した。大脳皮質におけるCpG_8のメチル化変動を解析した個体数は以下のとおりである：非曝露群25匹(P3W $ _{6} $ ,♀6; P13-14W $ _{9} $ ,♀4)、曝露群28匹(P3W $ _{6} $ ,♀6; P13-14W $ _{8} $ ,♀8)。2way-ANOVAの結果、BPA曝露歴のみがメチル化度の変動要因とされ、週齢・性別による違いはなかった(図(1)-2)-5B)。離乳後にはBPA曝露を受けていないP13-14Wのマウス大脳においても低メチル化傾向が維持されていたことから、大脳におけるCpG_8のメチル化度(%)を指標とするBPA曝露履歴の判定が可能ではないかと考えた。

BPA曝露履歴の判定指標とするためには基準となるCpG_8のメチル化度(%）のカットオフ値を求める必要がある。そこで、図(1)-2)-5BのデータをもとにROC曲線を作成し（図(1)-2)-5C）、Youkin's index法により最適カットオフ値を求めた。その結果、「CpG_8におけるメチル化度が18.50%以下であれば曝露歴有り」と判定したとき、その感度（真陽性率）・1-特異度(偽陽性率)は各々89.29％、12.00％となりROC曲線下面積（AUC）は87.14%であった。これは既報 $ ^{5} $ の腫瘍関連遺伝子エピゲノムマーカーと遜色ない感度と特異性を示すものであり、BPA曝露履歴の判定において高い予測能・診断能を持つ指標となることが期待された。

## f．全血由来DNAにおけるA遺伝子のメチル化変動

大脑皮質における変動と高い相関をもって検出されるBPA応答性DNAメチル化変動が全血由来DNAにおいても存在するならば、個体のみならず脳へのBPA曝露履歴を評価する良い代理マーカーとなり、ヒトの疫学調査への応用が期待される。そこで、まずBPA非曝露・曝露両群のマウス(P13-14W)の全血由来DNAを用いて、CpG_8を含むA遺伝子CGI1のメチル化変動をBisulfite Sequencing法で調べた。その結果(図(1)-2)-4C)、離乳後にはBPA曝露を受けていないP13-14Wのマウスにあって複数のCpG部位においてBPA応答性DNAメチル化変動が惹起されていること、大脑とは異なるプロファイルを示すこと、そのプロファイルには性差があることが判明した。しかし、大脑のように単一CpG部位のメチル化変動に着目した指標ではBPA曝露履歴を判別することができなかった。ところが、全血由来DNAでは複数のCpG部位におけるメチル化変動の共起性に着目し、そのパターンを指標にすればBPA曝露履歴を判別しうることを見出した。すなわち、雄では2つのCpGが共に脱メチル化したパターンが、雌では雄とは異なるCpGが共に脱メチル化したパターンが生じる頻度がBPA非曝露群において有意に高い割合を示すことを見出した(図(1)-2)-6A)。

すなわち、雌雄別個に、$\mathrm{CpG\_8}$を含むA遺伝子CGI1領域におけるメチル化プロファイルに着目すれば、全血由来DNAを用いたBPA曝露履歴の判定が可能になると期待された。そこで、さらに個体数を増やしてプロファイルを比較した結果、雄のみで投与群間差が再び検出された。図(1)-2)-6Bに示すように，A遺伝子CGI1中の3および5番目のCpG脱メチル化の共起性頻度が、BPA曝露群においてF1世代の雄において顕著に低下していた。この結果から、cut-off値を設けることで、P3WおよびP13-14Wの雄においては、全血由来DNAを用いたBPA曝露履歴判定が可能であることが期待された。ROC曲線(図(1)-2)-6C)から最適カットオフ値を求めた。ROC曲線下面積(AUC)は86.83%であり、「2つのCpGが共に脱メチル化したパターンの出現率が62.25%以下であれば曝露歴有り」と判定したときの感度（真陽性率）、1-特異度(偽陽性率)は、各々78.57%、12.50%となった。
さらに、雄の同一個体における判定結果から両組織の指標を組み合わせて判定を行った場合には。ROC曲線下面積（AUC）は96.49%，感度（真陽性率）、1-特異度(偽陽性率)は各々90.91%、0.00％となり、より高い判別能を持つ指標となることがわかった。
A

A

B

B

C

C

図(1)-2)-5.(左図)

A) アレイ解析に用いたマウスの大脳におけるA mRNA発現レベルとCpG_8のメチル化度(%)との間の相関直線と95%信頼区間（点線）

B) P3WおよびP13-14Wの大脳DNAにおけるA遺伝子CpG_8のメチル化度(%)

C) そのROC曲線解析

図(1)-2)-6.(右図)

A) P13-14Wの大脳DNAにおける性特異的脱メチル化共起パターンの出現頻度

B) P3WおよびP13-14の大脳DNAにおける同上の共起パターンの出現頻度

C) 雄のROC曲線解析
これまでの研究結果をまとめると(表(1)-2)-2)、①大脳皮質 DNA、全血 DNA において見出されたそれぞれの BPA 応答性エピゲノムマーカー（CpG メチル化変動）は、腫瘍関連遺伝子エピゲノムマーカーと遜色ない感度と特異性を示した。②A 遺伝子の CGI 1 において見出した CpG メチル化変動部位は、脳組織を用いた BPA 曝露履歴の判定に応用可能な良いエピゲノムマーカーとなることが期待される。この配列部位はヒトでも保存された配列でありマウス・ヒトにおいて SNPs は今のところ見つかっていないことから、ヒト大脳組織を用いた BPA 曝露履歴判定マーカーの候補となる可能性がある。③雄マウスに限れば、全血 DNA は検出感度こそ劣るものの脳組織に代わって曝露履歴を判定するための代替試料になりうることが示唆された。

表(1)-2-2 母体を介した BPA 曝露履歴判別能の組織間での比較

Tissue (sex)	AUC	Cut-off value (%)	Sensitivity (%) [95% CI]	Specificity (%) [95% CI]	PPV (%)	NPV (%)
Estimate [95% CI]	P-value
Cerebral Cortex (male + female)	0.8714 [0.7632 to 0.9796]	<0.0001	< 18.50	89.29 [71.77 to 97.73]	88.00 [68.78 to 97.45]	89.29	88.00
Blood (male)	0.8683 [0.7343 to 1.0020]	0.0006	< 62.25	78.57 [49.20 to 95.34]	87.50 [61.65 to 98.45]	84.62	82.35
Cerebral Cortex + Blood (male)	0.9649 [-]	[-]	[-]	90.91 [-]	100.00 [-]	100.00	92.31

AUC: area under curve; CI: confidence interval; PPV: positive predictive value; NPV: negative predictive value. Cerebral cortex: Vehicle $ (n = 25) $ ; BPA500 $ (n = 28) $ , Blood: Vehicle $ (n = 16) $ ; BPA500 $ (n = 14) $ , Cerebral Cortex + Blood (male): Vehicle $ (n = 12) $ ; BPA500 $ (n = 11) $ .

以上の結果を受けて更にBPA応答性エピゲノム・マークの特性を明らかにするために、大脳においてこのエピゲノム・マークが世代を超えて伝達・維持されるかどうかについて検討を加えた。

## g．大脳においてA遺伝子に刷り込まれたBPA応答性エピゲノム・マークの継世代維持の解析

まず，BPA曝露によって新たにF1マウス大脳皮質ゲノムに刷り込まれたエピゲノム・マークの伝達とそれを担う生殖細胞系列を明らかにするためにマウス家系を作出した。5匹のF0マウス(妊娠母体)から得られた家系および解析に用いた個体を図(1)-2)-7に示す。

BPA投与はF0妊娠マウスのみに行った。F1世代は胎仔個体として、F2世代はF1胎仔の生殖細胞系列として直接曝露を受けており、F3世代が最初の非曝露世代となる。このF3世代の脑において、F1世代の脑で見出されたA遺伝子CGI1中の8番目のCpG(以下、CpG_8)の低メチル化傾向が示されていれば、脑におけるBPA応答性エピゲノム・マークが継世代的に維持されていると考えられる。

さらに、雌雄いずれかの生殖細胞依存的に継世代伝達がなされる可能性も考慮すると、F3世代に至るまでに全4通りの伝達経路がある(図(1)-2)-8)。全経路での世代間伝達の知見を得るために図(1)-2)-6で示されたマウス個体(P3W)の大脳を対象としてCpG_8のメチル化解析を行った。
図(1)-2)-7. 継世代影響解析用のマウス家系.
図(1)-2)-8. 雌雄いずれかの生殖細胞依存的に継世代伝達がなされる際にF3世代に至る伝達経路。*を付したゾ우は交配用非曝露マウス、その他は曝露マウスの系統、()内はF3の解析雌雄ペア数を示す。

マウス大脑皮質DNAをもとにBisulfite Sequencing法によりA遺伝子CpG_8のメチル化度を評価した場合、F1世代に相当する前述の解析個体群では雌雄差無くメチル化度は18.5%（カットオフ値）未満まで低下する(図(1)-2)-9, BPA500)。この結果は、今回の作出家系で解析されたF1世代においても同様に再現された(図(1)-2)-9, F1)。さらに、この低メチル化傾向は、F2世代のみならずF3世代の個体においても維持されていた(図(1)-2)-9, F2およびF3)。すなわち、解析個体の雌雄や生殖細胞系列の雌雄の組み合わせの違いによる全4通りの伝達経路に依存せず、直接曝露を受けていない最初の世代の大脑皮質細胞に伝えられたことを示唆する結果であった。

一方これまでに明らかにしてきたように血液DNAにおいては、A遺伝子CGI1中の3および5番目のCpG脱メチル化の共起性頻度が、BPA曝露群においてF1世代の雄において顕著に低下する

（62.25％未満）。そこで、F3世代(P3W)およびその親個体(P16W)の全血DNAを調べたところ、このような脱メチル化共起性頻度の低下は認められなかった。すなわち、大脳とは異なり全血DNAではBPA応答性エピゲノム・マークが継世代性に維持されないことが明らかとなった。

最近、「エピゲノムの継世代伝達」について、「表現型情報がDNA塩基配列以外の因子（エピジェネティックな分子機構）によって世代を超えて伝達される遺伝現象」と定義されることに一定のコンセンサスが得られるようになってきた。その一例として、抗アンドロゲン作用をもつVinclozolin (VCZ)の継世代影響を調べたSkinnerらによる報告 $ ^{6)} $ がある。F0妊娠マウスに限ったVCZ投与によってF2、F3世代にも生殖能力低下や発病率増加等といった表現型の継世代性が認められた。その際、遺伝子プロモーター領域のDNAメチル化プロファイルの世代を超えた変動も認められたことから、遺伝情報を次世代へ伝える生殖細胞においてエピジェネティックな変化が生じたことによる影響と考えられた。
図(1)-2)-9. P3Wの大脳皮質DNAにおけるA遺伝子CpG_8メチル化度(%) $ の $ /継世代伝達. 非曝露群個体(vehicle)とBPA曝露群F1個体(BPA500)、および家系F1-F3個体群(F1, F2, F3)におけるメチル化度(Mean ± SD). One-way ANOVAおよびBonferroni/Dunn post-hoc test. ***P < 0.001.

本研究によってわれわれは、胎生期・授乳期のBPA曝露によって大脳皮質ゲノムへ雌雄差なく刷り込まれたエピゲノム・マークが、非曝露期間(ヒトの離乳～思春期に相当)を経たあとも維持され、雌雄どちらの生殖細胞系列を介しても次世代の大脳皮質ゲノムへと受け継がれることを初めて明らかにした。このことは、体細胞系列において新たに刷り込まれたエピゲノム・マーク即ちエピゲノム情報の変化が未知のメカニズムによって生殖細胞系列を介して次世代に伝達されること、さらにエピゲノム情報によって次世代へ伝えられる脳への化学物質曝露影響が存在する可能性をも示している。

本研究のBPA曝露モデルにおいては世代を超えて伝達される表現型やエピゲノム・マークと表現型との連��高地に関するには至らなかった。しかし中枢神経系を含む体細胞への影響が次世代にも及ぶような分子機構の解明は化学物質の毒性や作用メカニズムを研究するうえで新たな重要課題になりえるものと考えられる。環境化学物質の脳機能に与える影響に対する評価や対策の立案には、「エピゲノムの継世代伝達性」への考慮も今後、必要となるであろう。

一方、脳と同等の的中率で曝露履歴を判定できた雄(F1)由来血液DNAのエピゲノム・マークには継世代性が無かった。このことは血液DNAを試料とする化学物質曝露履歴マーカーの開発可能性を示すものである。今後、性差に依存しないこのようなマーカーが開発されれば、疫学データのより詳細な解析に資するものと期待される。
## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

## 1 ）：環境化学物質への胎生期・新生仔期曝露による脳形成・発達・成熟および行動への影響とそのメカニズム解明

マウスにおいて、胎生期・授乳期における低用量BPA曝露（母体への経口投与と母乳による曝露）が、出生後の中枢神経系において、形態学的ならびに機能的な変化を引き起こすことを示した。その変化は、大脑皮質層構築の異常、性的二型核における生理的な雌雄差の逆転、行動学的に自閉性・固執性・情動性の制御のかく乱を示唆する所見、脳内神経伝達物質の変動であった。BPAに対する感受性は、脳の領域によって差異があることを世界で初めて示した。

## 2 ）：環境化学物質への胎生期・新生仔期曝露によるゲノムならびにエピゲノムへの影響とその分子メカニズム解明

胎生・授乳期のBPA曝露によって、マウス大脳ならびに血液ゲノムへ新たに刷り込まれたエピゲノム・マークが、非曝露期間（ヒトの離乳期～思春期に相当する時期）を経たあとも維持されていることを初めて見出した。BPA曝露により生じたエピゲノム・マークに継世代伝達性があることを世界で初めて見出した。このことはエピゲノム情報によって次世代へ伝えられる脳への化学物質曝露影響が存在する可能性を示している。

全体を通しての科学的意義のまとめ：BPAの曝露影響に関しては、脳の領域による感受性ならびに作用メカニズムに差異があることを示し、環境化学物質曝露の脳への影響評価に際しては複数の脳領域を対象とする解析が必須であることを科学的に提言するに至った。また脳においてBPA曝露によるメチル化変動をきたす遺伝子が、全血由来DNAにおいてもメチル化変動を示すことを明らかにし、曝露履歴評価に活用し得るという科学的提言をするに至った。

## （２）環境政策への貢献

## ＜行政が既に活用した成果＞

特に記載すべき事項はない。

## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

## 1 ）環境化学物質への胎生期・新生仔期曝露による脳形成・発達・成熟および行動への影響とそのメカニズム解明

マウスにおいて、胎生期から新生仔期にかけての低用量BPA曝露（母体への経口投与と母乳による曝露が、脳発達障害の原因になり得ることを示した。

## 2 ）環境化学物質への胎生期・新生仔期曝露によるゲノムならびにエピゲノムへの影響とその分子メカニズム解明

環境化学物資の脳機能に与える影響に対する評価や対策の立案にあたっては、「エピゲノムの継世代伝達性」への考慮も今後必要となることを示した。

継世代性がない雄由来血液DNAのエピゲノム・マークは、脳と同等の中率で曝露履歴を判定できたことから、血液DNAを試料とする化学物質曝露履歴マーカーの開発可能性が示された。今
後このようなマーカーが開発されれば、疫学データのより詳細な解析に資するものと期待される。

全体を通し、これまでも、また、今後も、

（1）論文発表、学会発表、あるいは、市民を対象とした講演会やメディア等を通じ、成果の広報・普及に努める。

（2）上記により、BPA曝露の脳形成・発達への影響に関する情報を広く提供し、国民の安全・安心の確保と経済的損失の縮小に貢献する。

（3）BPAに関する規制政策の今後の方針、方向性の決定に役立てる。

(4) 現在進行中のエコチル調査を補完し、疫学的観察事項に対し生物学的妥当性を付与すること、エコチル調査において脳発達障害との関連を優先的に調査すべき対象物質を提案すること、さらに曝露履歴マーカーの開発に対する提言に貢献する。

## 6 ．国際共同研究等の状況

特に記載すべき事項はない。

### 7. 研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

## <論文（査読あり）>

1) 伊東恭子：日本小児科学会雑誌, 116, 10-19 (2012) 「脳形成・発達と環境化学物質」

2) H. OGI, K. ITOH and S. FUSHIKI: Brain Behav. 3, 223-228 (2013)

“Social behavior is perturbed in mice after exposure to bisphenol A: a novel assessment employing an IntelliCage.”

3) S, TANDO, K. ITOH, T. YAOI, H. OGI, S. GOTO, M. MORI and S. FUSHIKI: Neuropathology (2014), doi:10.1111/neup.12137[Epub ahead of print]

“Bisphenol A exposure disrupts the development of the locus coeruleus-noradrenergic system in mice.”

## くその他誌上発表（査読なし）>

1）伊東恭子、伏木信次：小児科臨床, 66, 1461-1467 (2013)

「4）環境化学物質と脳形成障害」

## （2） 口頭発表（学会等）

1) 伊東恭子：第52回日本神経病理学会総会学術研究会（2011）招待講演

シンポジウム「脳形成障害とオミックス」にて「環境化学物質の胎生期曝露と脳形成障害」

2) 丹藤 創、伊東恭子、森脇三造、韓 龍哲、安田竜有二、伏木信次：第52回日本神経病理学会総会学術研究会 (2011)

「ビスフェノールAが脳形成過程へ及ぼす影響の形態学的解析」

3) 森脇三造、伊東恭子、中村惠子、外崎円、丹藤創、伏木信次：第52回日本神経病理学会総会学術研究会 (2011)
「ビスフェノールAがマウス大脳皮質神経細胞遊走に及ぼす影響の解明：タイムラプス蛍光イメージングを用いて」

4) 伏木信次：京都府立図書館・京都府立医科大学附属図書館連携事業府民講演会 (2011) 「子どもの脳を守る—環境化学物質はどのような影響を及ぼすか—」

5) 伏木信次：京都府立医科大学公開講座 (2011)

「環境中の化学物質と脳発達」

6) 伏木信次、矢追毅、伊東恭子：第39回日本毒性学会学術年会（2012）招待講演

シンポジウム「エピジェネティクスから捉えた毒作用発現」にて「環境化学物質ビスフェノールAと脳形成・発達」

7) 伏木信次：福井大学 大学院セミナー (2012) 招待講演「環境化学物質への胎生期曝露と脳の形成・発達」

8) 伊東恭子: 平成23年度京都府立医科大学健康セミナー「保育サポーター養成・支援講座」(2012)「子どもの脳と化学物質—環境化学物質はどのような影響を及ぼすか」

9) 伏木信次：京都府立医科大学公開講座 (2013)

「子どもの脳と環境要因」

10) 伊東恭子：第59回日本病理学会秋期特別総会 A演説 (2013) 受賞講演「脳形成障害の発生病理解明—遺伝要因と環境要因に着目して」

11）丹藤創、伊東恭子、伏木信次：第55回日本神経病理学会総会学術研究会 (2014)

「内分泌攪乱化学物質、ビスフェノールAの青斑核への影響解析」（アブストラクト提出、採択済み）

## （3） 出願特許

特に記載すべき事項はない。

（４）シンポジウム、セミナー等の開催（主催のもの）

1）京都府立医科大学公開講座「子どもの健康と化学物質」

（2011年12月18日、京都府立医科大学附属図書館ホール、観客30名）

2）京都府立医科大学公開講座「環境化学物質と健康」（2013年3月20日、京都府立医科大学図書館ホール、観客50名）

（５）マスコミ等への公表・報道等

特に記載すべき事項はない。

## （6） その他

1) 伊東恭子：日本病理学会学術研究賞 受賞、2013年11月22日

「脳形成障害の発生病理解明—遺伝要因と環境要因に着目して」
### 8. 引用文献

1) Nakamura K, Itoh K, Sugimoto T, Fushiki S. (2007) Prenatal exposure to bisphenol A affects adult murine neocortical structure. Neurosci. Lett. 420: 100-105.

2) Nakamura K, Itoh K, Yaoi T, Fujiwara Y, Sugimoto T, Fushiki S. (2006) Murine neocortical histogenesis is perturbed by prenatal exposure to low doses of bisphenol A. J. Neurosci. Res. 84:1197-1205.

3) Yaoi T, Itoh K, Nakamura K, Ogi H, Fujiwara Y, Fushiki S. (2008) Genome-wide analysis of epigenomic alterations in fetal mouse forebrain after exposure to low doses of bisphenol A. Biochem. Biophys. Res. Commun. 376: 563-567.

4) Pendergast JS, Tuesta LM, Bethea JR. (2008) Oestrogen receptor beta contributes to the transient sex difference in tyrosine hydroxylase expression in the mouse locus coeruleus. J. Neuroendocrinol. 20:1155-1164.

5) Hua D, Hu Y, Wu YY, Cheng ZH, Yu J, et al. (2011) Quantitative methylation analysis of multiple genes using methylation-sensitive restriction enzyme-based quantitative PCR for the detection of hepatocellular carcinoma. Exp. Mol. Pathol. 91:455–460. doi: 10.1016/j.yexmp.2011.05.001

6) Chang HS, Anway MD, Rekow SS, Skinner MK. (2006) Transgenerational epigenetic imprinting of the male germline by endocrine disruptor exposure during gonadal sex determination. Endocrinology 147: 5524-41.
# （２）環境化学物質によるアレルギー疾患増悪メカニズムの解明とスクリーニング手法の開発

京都大学 工学研究科 高野裕久

（独）国立環境研究所 環境健康研究センター 柳澤利枝・小池英子

大分県立看護科学大学 看護学部 市瀬孝道・吉田成一・定金香里

平成22～25年度累計予算額：79,419千円（うち、平成25年度予算額：16,006千円）

予算額は、間接経費を含む。

## [要旨]

環境化学物質によるアレルギー増悪影響の評価やメカニズム解明は不十分であり、影響を簡易にスクリーニングできる評価系も確立されていない。本サブテーマでは、(1) ベンヂピレン(BaP)、ビスフェノールA（BPA）の低用量、経気道曝露が、若齢期のアレルギー性喘息を増悪することとそのメカニズム、次世代影響と性差がある可能性を示し、(2) フタル酸ジイソノニル（DINP）、BPA、BaPの低用量、経口曝露が若齢期のアトピ一性皮膚炎を増悪することとそのメカニズム、次世代影響と性差がある可能性も指摘した。（3）BaP、フタル酸ジエチルヘキシル（DEHP）の低用量曝露が、若齢期のアレルギー性鼻炎を増悪することとそのメカニズムを明らかにし、(4) BaP、DEHP、DINP、BPAのin vitroおよびin vivo曝露が、樹状細胞等の免疫担当細胞の構成・機能に影響を及ぼすこと、物質共通、および、特異的な変動因子が存在することを明らかにし、バイオマーカー同定と影響メカニズムの解明に役立てた。以上、（1）一般環境でも想定されるような少量の化学物質曝露がアレルギー疾患を増悪しうること、（2）その発現メカニズム、（3）物質そのもののみならず、曝露経路や病变の主座の相違によって影響は異なること、（4）経口的あるいは病变局所的な低用量曝露の影響を評価することが重要であることを示し、「環境化学物質のアレルギー増悪影響の評価には、簡易in vitro評価系でスクリーニングされた対象物質について、複数のアレルギー疾患モデルを用い、実社会で想定される曝露経路と曝露量（少量曝露）、小児期曝露、次世代影響を念頭に、評価・解析を行うことが重要である。」ことを科学的に提言した。本成果を、国民の安全・安心の確保に役立て、増悪影響評価系・システムの確立・普及により、アレルギー疾患患者に対する新たな対策の提案や化学物質規制対策への提言、影響の未然防止に貢献する。エコチル調査を補完し、小児アレルギー増加との関連を優先的に調査すべき対象物質を提案すると共に、疫学的観察事項に生物学的妥当性を付与する。

## [キーワード]

環境化学物質、アトピ一性皮膚炎、アレルギ一性喘息、アレルギ一性鼻炎、評価手法

### 1. はじめに

近年、アトピ一性皮膚炎、気管支喘息、花粉症等のアトピ一・アレルギー疾患が小児・若年者
を中心に急増している。アレルギー急増の主因は環境要因の急変と考えられ、衛生環境、食環境、住環境の変化とともに、環境汚染の関与が指摘されてきた。われわれは、ディーゼル排ガス微粒子(DEP)がアレルギー性喘息を増悪することを明らかにし、疫学的既報に実験的論拠を与えた。その後、DEPに含まれる脂溶性化学物質（群）、プラスチック可塑剤であるDEHP等の環境化学物質の腹腔内曝露が、アレルギー性喘息やアトピー性皮膚炎を増悪することも報告した。特に、DEHPは、少量曝露や若齢期曝露、乳児期曝露によってもアトピー性皮膚炎増悪影響を発揮した。しかし、莫大な数にのぼる環境化学物質によるアレルギー増悪影響の評価やメカニズムの解明は未だに不十分であり、環境化学物質のアレルギー増悪影響を簡易・迅速・高感度にスクリーニングできる評価系も確立されていない。このため、フタル酸エステル類、ベンゾピレン(BaP)、ビスフェノールA（BPA）をはじめとする環境化学物質のアレルギー増悪影響の評価とメカニズム解明、及び、影響を簡易・迅速・高感度にスクリーニングできる評価系の確立が必要であり、小児・若年者のアレルギー疾患への対策として重要である。

## 2 ．研究開発目的

フタル酸エステル類(DEHP、フタル酸ジイソノニル：DINP)、BaP、BPAのアレルギー増悪影響の評価とメカニズム解明、及び、環境化学物質の増悪影響を簡易にスクリーニングできる評価系の確立を目的とし、以下を目標とした。

（1）アレルギー性喘息・鼻炎、アトピー性皮膚炎モデルを用い、フタル酸エステル類、BPA、BaPがアレルギー疾患に及ぼす影響を広く評価し、増悪メカニズムを明らかにする。（2）一部、母乳を介した次世代影響も検討する。（3）in vitroでも増悪メカニズムの解明を図る一方、種々の環境化学物質のアレルギー増悪影響を簡易にスクリーニングできる評価系を開発する。

## 3 ．研究開発方法

## 1 ）環境化学物質によるアレルギー性喘息増悪メカニズムの解明

アレルギー性喘息マウスモデルは、C3H/HeJマウス(雄、6週齢)に対し、卵白アルブミン(OVA)1μg/animalを、隔週で計4回、経気道曝露することにより作製した。OVAはリン酸緩衝生理食塩水(PBS；pH7.4)に懸濁し、投与量は全量で100μL/回とした。OVAと化学物質の投与が重なる時は同時投与した。

H22年度は、BaPを選択した。実験群は1群25-28匹として、1) Vehicle群、2) OVA、3) OVA+BaP 0.05 pmol/animal/wk、4) OVA+BaP 1 nmol/animal/wk、5) OVA+BaP 20 nmol/animal/wkの5群に分けた。BaPは、100％ジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解した後、PBSで適宜希釈し、OVA初回投与時より、週1回、計7回、経気道曝露した(DMSOの終濃度は0.01%)。Vehicle群は、0.01％DMSOを含むPBSを投与した。

H23年度は、DEHPを選択した。実験群は、1群13-17匹として、1) Vehicle群、2) OVA、3) OVA+DEHP 0.02 nmol/animal/wk、4) OVA+DEHP 0.4 nmol/animal/wk、5) OVA+DEHP 8 nmol/animal/wkの5群に分けた。DEHPは、100% DMSOに溶解した後、PBSで適宜希釈し、OVA初回投与時より、週1回、計7回、経気道曝露した(DMSOの終濃度は0.1%)。Vehicle群は、0.1% DMSOを含むPBSを投与した。
H24年度は、DINPを選択した。実験群は、1群15-19匹として、1) Vehicle群、2) OVA、3) OVA+DINP 0.02 nmol/animal/wk、4) OVA+DINP 0.4 nmol/animal/wk、5) OVA+DINP 8 nmol/animal/wkの5群に分けた。DINPは、100% DMSOに溶解した後、PBSで適宜希釈し、OVA初回投与時より、週1回、計7回、経気道曝露した(DMSOの終濃度は0.1%)。Vehicle群は、0.1% DMSOを含むPBSを投与した。

H25年度は、BPAを選択した。実験群は、1群12-13匹として、1) Vehicle群、2) OVA、3) OVA+BPA 0.0625 nmol/animal/wk、4) OVA+BPA 1.25 nmol/animal/wk、5) OVA+BPA 25 nmol/animal/wkの5群に分けた。BPAは、99.5% エタノールに溶解した後、PBSで適宜希釈し、OVA初回投与時より、週1回、計7回、経気道曝露した(エタノールの終濃度は0.001%)。Vehicle群は、0.001% エタノールを含むPBSを投与した。

BaPの乳児期曝露実験は、妊娠14-15日齢のC3H/HeJマウスを導入し、1群11-17匹として、出産直後に産仔調整を行い(5匹/腹)、1) Vehicle群、2) BaP 0.25 pmol/animal/wk、3) BaP 5 pmol/animal/wk、4) BaP 100 pmol/animal/wkの4群に分けた。BaPはオリーブオイルに懸濁し、適宜希釈した。Vehicle群にはオリーブオイルを投与した。出産1日目から週1回、計3回(Day 1, 8, 15)、母獣に対して経口の投与した。仔獣は、3週齢で離乳し、前述の4群に対して6週齢よりOVA(1 μg/animal)、あるいはVehicle(PBS)を隔週で計4回気管内投与した。

各実験において、最終投与24時間後の気管支肺胞洗浄液(BAL)中の細胞数、肺における炎症性因子の発現（IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、IL-12、IFN- $ \gamma $ 、MCP-1、RANTES、eotaxin、MCP-3）、血中OVA特異的抗体量（OVA-IgE、OVA-IgG $ _{1} $ 、OVA-IgG $ _{2a} $ ）を測定した。また、肺の病理組織学的変化は、気管支、および血管周囲への炎症細胞浸潤はハマトキシリン・エオジン染色(HE染色)、気道上皮の粘液産生細胞の增生はPeriodic acid-Schiff染色(PAS染色)を用いて評価した。

## 2 ）環境化学物質によるアトピ性皮膚炎増悪メカニズムの解明

若齢期曝露の影響を調べる実験では、アトピー素因を有するNC/Nga系マウス(SPF、オス、7週齢)を、1物質の検討につき、60匹用いた。これを表(2)-2-1に示すような5群に分けた。各々、1)溶媒のみを投与した群、2)ダニ抗原感作（Dp）群、3)Dp+環境化学物質1/400 NOAEL投与群、4)Dp+環境化学物質1/20 NOAEL投与群、5)Dp+環境化学物質NOAEL投与群を設定した。各環境化学物質をオリーブ油に溶解し、3)～5)群に、週1回、計4回、経口的に曝露した（図(2)-2)-1）。アトピー性皮膚炎を誘発するアレルゲンにはヤケヒヨウヒダニ抽出物(Dp)を用い、マウス耳介背側に注射し炎症を発症させた。一方、母乳を介した乳児期DINP曝露の影響を調べる実験では、NC/Nga系妊娠マウス（SPF）を4つの群に分け（n=14/群）、出産0日目、7日目、14日目に、溶媒またはDINPを投与した（図(2)-2)-2）。投与量は、若齢期曝露と同様、1/400 NOAEL、1/20 NOAEL、NOAELの3用量とした。仔獣を生後4日目に5匹/腹となるよう調製した後、3週間の授乳期間を経て母獣から分離、7週齢時の仔獣に対し、アトピー性皮膚炎への影響評価を開始した。溶媒を投与した母獣から産まれた仔をさらに2群に分け、一方の群には溶媒を皮下投与し（非アトピー性皮膚炎誘発群；Saline(+vehicle)群）、もう一方およびDINP経母乳曝露された仔の群には、Dpを皮下投与し、アトピー性皮膚炎を発症させた。表(2)-2)-1に各群名を記す。

いずれの実験においても、誘発期間中に症状を経時的に観察、スコア化した（n=12/群）。また、屠殺時に採取した血液中の総IgE濃度、抗原特異的IgG $ _{1} $ 抗体価を、ELISAを用いて測定した（n=12/群）。また、屠殺時に採取した耳介組織中の炎症関連タンパク量もELISAを用いて測定した（n=6/群）。
群）。皮下組織中の病理的変化を調べるため、ハマトキシリン・エオジン（HE）染色およびトルイジンブルー（TB）染色を施した耳介組織標本を用いて炎症細胞数を測定した（n=6/群）。なお、各化学物質のNOAELは、齧歯類に化学物質混合飼料を中・長期的に与えたときの病理的変化に基づき決定された値で、DEHPが19 mg/kg/day、DINPは15 mg/kg/day、BPAは5 mg/kg/day、BaPは0.21 mg/kg/dayである。

表(2)-2)-1．化学物質によるアトピ一性皮膚炎影響評価における実験群

若齡期曝露実験	乳児期曝露実験
DEHP	DINP	BPA	B[a]P	DINP
1)	Saline+vehicle	Saline+vehicle	Saline+vehicle	Saline+vehicle	Saline(+vehicle)
2)	Dp+vehicle	Dp+vehicle	Dp+vehicle	Dp+vehicle	Dp(+vehicle)
3)	Dp+DEHP 8.3	Dp+DINP 6.6	Dp+BPA 2.19	Dp+B[a]P 0.09	Dp(+DINP 0.0375)
4)	Dp+DEHP 166.3	Dp+DINP 131.3	Dp+BPA 43.75	Dp+B[a]P 1.84	Dp(+DINP 0.75)
5)	Dp+DEHP 3,325	Dp+DINP 2,625	Dp+BPA 875	Dp+B[a]P 36.75	Dp(+DINP 15)

若齢期曝露実験では、マウスの体重を25 g、投与間隔を7日おきとし、各化学物質の1/400 NOAEL、1/20 NOAEL、NOAELを換算した値をマウスへの1回投与量とした。3)～5)群の数値は、1回投与量を表している。乳児期曝露実験ではvehicleを投与した母獣から産まれた非アトピ一性皮膚炎誘発群を1)群、アトピ一性皮膚炎誘発群を2)群、DINPを投与した母獣から産まれたアトピ一性皮膚炎誘発群を3)～5)群とした。母獣へのDINP投与は7日おきとし、投与時には体重を量り、3)群には0.0375 mg/kg/day、4)群には0.75 mg/kg/day、5)群には15 mg/kg/dayに相当する量を各母獣に経口的に投与した。

図 $ （2）-2 $ -1．若齢期曝露実験の投与スケジュール
図 $ （2）-2 $ -2. 乳児期曝露実験の投与スケジュール

## 3 ）環境化学物質によるアレルギー性鼻炎増悪メカニズムの解明

まず、マクロファージ株を用い、炎症性サイトカイン遺伝子発現おけるBPAとDEHPの影響を評価した。マウス由来マクロファージ様細胞株（RAW264.7）を用いた。RAW264.7細胞を $ 10\times10^{4} $ cells/mlの濃度に調整し、細胞懸濁液を1枚当たり4ml播種後、37℃、5%CO_{2}インキュベーターで培養した。対照群以外の細胞にOVA処理を行い、OVA濃度は100μg/ml、処理時間は24時間とした。24時間後、所定濃度に調整した化学物質（BPA：0.5、5、50mM、DEHP：15、150mM）を処理し、24時間後に細胞を回収した。化学物質未処理群（対照群、OVA処理群）には同量のPBS（-）を処理し、24時間後に同様に細胞を回収した。各群、4枚ずつ作成した。回収した細胞から定法に従い、総RNAを回収、DNase処理を行った後、逆転写反応を行い、cDNAを合成した。作成したcDNAを用い、発現遺伝子の定量解析をABI PRISM $ ^{®} $ 7000 Sequence Detection Systemにて行った。解析した遺伝子は、IL-1β、IL-6、MCP-1、MIP-1α、TNF、KCである。

次いで、スギ花粉抗原を用いたアレルギー性鼻炎マウスモデルにおいてBPAの影響を評価した。BALB/c雌マウス（6週齢）を1群12匹として、対照（生理食塩水投与）群、Crij1-4μg投与群、Crij1-4μg+BPA0.1mg投与群、Crij1-4μg+BPA1mg投与群の計4群とした。初期感作として、水酸化アルミニウム1.5mg+Crij1の5μgを頸部皮下に投与し、その後、PBSで調整したCrij1溶液を3週間間隔で2回点鼻した。Crij1の1回投与量は、マウス1匹あたり4μgとし、左右の鼻に2μgずつ点鼻した。その後、99.5%アルコールに溶解したBPAをオリーブ油で0.1 mg/200μl或いは1 mg/200μlになるように調整し、これらを1週間に1回、計3回腹腔内投与した。対照群とCrij1-4μgのみを投与した群はBPAの代わりにオリーブ油を3回腹腔内投与した。その1日後からCrij1-4μgを毎日連続して5回点鼻投与した。全てのマウスは最終点鼻投与5時間後に、深麻酔下で心採血によって屠殺し、6匹のマウスは咽頭部より生理食塩水を注入して鼻腔洗浄を行い、鼻腔洗浄液中の炎症細胞数や炎症性サイトカイン類を測定した。残り6匹のマウスは鼻の組織標本を作成しで形態学的な観察を行った。

一方、卵白アルブミンを用いアレルギー性鼻炎マウスモデルにおいて低用量BPAの影響を評価した。BALB/c雌マウス（6週齢）を1群14匹として、対照（生理食塩水点鼻投与）群、BPA1（0.02μg）