Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
これらの毒性データを得るための毒性試験法については、様々な課題が残されている。

わが国の水域生態リスク評価の対象として重要な河川生態系に注目すると、利用可能な試験生物種や試験法が非常に少ない。特に、河川生態系の生産者として重要な付着藻類については利用可能な試験生物種や試験法が整備されておらず、河川生態系における除草剤の生態リスクを適切に評価するためには、付着藻類の試験生物化と試験法の確立が求められている。一方、水生節足動物については、河川にも生息するヌカエビ、ヨコエビ、ユスリカの農薬テストガイドラインが整備されており、近年では河川生態系の重要な水生昆虫であるコガタシマトビケラ

（Cheumatopsyche brevilineata）の試験生物化に成功し、その有用性の検討やテストガイドライン化に向けた努力が行われている $ ^{2)} $ 。このように水生節足動物では、SSD解析による感受性の種間差を評価する基礎的知見が得られつつある。しかし水生節足動物の中でも特に生態学的に重要な水生昆虫は藻類とは異なり生活史が複雑で、成長段階が分かれた構造化された個体群であることが多く、特定の成長段階にある個体のみを用いた毒性試験では、適切に毒性を評価できない可能性がある。したがって水生昆虫については新たな試験生物の整備よりも、生活史を考慮した毒性試験の高度化が優先的に求められている。

一方、農薬という評価対象化学物質に注目すると、農薬の使用は一年の決まった時期に限られるため、環境中の生物は常に農薬に曝露されているわけではない。より現実に即した農薬の生態影響評価においては、一時的な曝露からの回復性を考慮する必要があるが、OECDテストガイドライン等の従来の毒性試験法では、回復性を適切に評価できない。付着藻類、水生昆虫ともに回復性を評価する毒性試験法の確立が求められている。また複数の農薬が水系に流出した場合、水生生物が複合曝露される可能性がある。特に除草剤では、複数の剤が数 $ μg/L $ のオーダーで同時に河川水中から検出されることがあり $ ^{3} $ 、付着藻類に対する複合影響を評価することが喫緊の課題となっている。

毒性評価における解決すべき課題をまとめると、水生昆虫においては生活史を考慮した毒性評価法を高度化し、一時的曝露からの回復性を評価することができる個体群レベルでの影響評価法を開発することが求められている。一方、付着藻類については新たな試験生物種・試験法を確立し、回復性および複合影響を評価する手法の開発が求められている。

## 2 ．研究開発目的

コガタシマトビケラは試験生物化に成功した数少ない在来の河川棲水生昆虫であり、生態学的にも水産動物の餌震源としても重要な生物の一つである。本研究ではコガタシマトビケラを用いて、水生動物に対する毒性データの少ない殺虫剤の急性毒性データを整備し、コガタシマトビケラの試験生物としての有用性を検討した。より適切なリスク評価手法の確立に向け水生昆虫の毒性評価手法を高度化することを目的として、トビケラの初期成長段階別毒性試験法を開発し、殺虫剤感受性の成長に伴う変動を評価した。また、殺虫剤の一時的曝露からの回復を考慮した個体群レベルでの毒性評価を行うために、コガタシマトビケラの個体群動態モデルを開発した。個体群動態モデルを用いて個体群レベルでの影響評価を実施し、種の感受性分布（SSD）の解析結果と比較することにより、個体レベル試験の急性毒性データのみを用いて行われるSSD解析について、個体群レベルの観点から意義づけを行った。

河川生態系における除草剤の適切な影響評価法の開発に資するため、河川生態系の一次生産者
として重要な付着藻類について、わが国の河川付着藻類群集を代表する5種を試験生物として選定し、至適培養条件等の確立を行うとともに、効率的な毒性試験法を開発した。また、付着藻類の毒性試験による農薬曝露の後に、清浄な培地に移して回復性の評価を行う試験法を開発した。さらに、各種農薬を複数組み合わせた複合毒性試験を実施するとともに、複数農薬の曝露による複合毒性を予測する手法を開発した。

### 3. 研究開発方法

## （１）水生昆虫を用いた毒性評価法の開発

## 1 ）1齢幼虫に対する殺虫剤の毒性評価

コガタシマトビケラ1齢幼虫の感受性データは、古くから上市されている殺虫剤を中心にこれまでに整備され、特に、ネオニコチノイド系およびネライストキシン系殺虫剤に対するトビケラの感受性は、標準試験生物種であるオオミジンコに比べて非常に高いことが報告されている $ ^{2} $ 。これらの殺虫剤については、トビケラ以外の様々な水生生物の毒性データが整備されており、SSD解析手法を用いたリスク評価に活用されている $ ^{4} $ 。一方、上市されて間もない殺虫剤については、トビケラを含めその他の水生節足動物についても毒性データがほとんど整備されていない。そこで、コガタシマトビケラの試験生物種としての有用性を検討し、リスク評価に活用可能な毒性データを整備するために、比較的新しい剤を中心に5剤の殺虫剤（クロラントラニリプロール、エチプロール、スピノサド、メトキシフェノジド、ピリプロキシフェン）を選定し、コガタシマトビケラの1齢幼虫（ふ化24時間以内）を用いた48時間の急性毒性試験を実施した。毒性試験法は「コガタシマトビケラ1齢幼虫を用いた農薬の急性毒性試験法マニュアル」 $ ^{5)} $ に従った。試験結果とミジンコ類の感受性を比較することにより、コガタシマトビケラの有用性の検討を行った。

## 2 ）初期成長段階別毒性試験法の開発

水生生物は初期成長段階ほど化学物質に対する感受性が高い傾向にあると言われている $ ^{6)} $ 。例えば、セスジュスリカ1齢幼虫は4齢幼虫に比べ有機リン系殺虫剤のフェンチオンに数十倍も感受性が高いことが報告されている $ ^{7)} $ 。しかし、ヨコエビの一種Hyalella aztecaでは若齢個体でダイアジノン感受性が低いことが知られており $ ^{8)} $ 、成長に伴う感受性変動は化学物質の種類や生物種により大きく異なる。河川生態系で重要な位置を占める水生昆虫については、成長に伴う感受性変動に関する知見は少ない。特に、卵期は生活史において活発に器官形成（薬剤の作用点形成）が行われる特筆すべき成長段階であるにもかかわらず、卵期における農薬等化学物質の影響を評価した研究例はほとんどない $ ^{9)} $ 。水生昆虫の種類によってはトビケラのように卵期が比較的長く、この時期に化学物質に曝露されると忌避行動をとれずに、その影響を直接受け続ける可能性がある。また、特定の成長段階の個体のみを用いた急性毒性試験の結果に基づいて実施される現行の農薬の生態リスク評価では、成長に伴う感受性の変動が考慮されていないため、リスクを過大もしくは過小評価する可能性がある。水生昆虫の毒性評価を高度化し適切な農薬の生態リスク評価法の確立に資するため、本研究では先ず、コガタシマトビケラを用いた卵期の急性毒性試験法の開発を試みた。

卵期急性毒性試験における曝露期間、曝露のタイミングを決定するにあたり、コガタシマトビケラ卵を産卵用基板から剥離させ、胚発生を光学顕微鏡で観察した。その結果、ヒゲナガカワト
ビケラStenopsyche marmorataの発生過程 $ ^{10} $ と比定することができた。以下に室温20℃におけるコガタシマトビケラ卵の発生過程について概説する（図(2)-1）。産卵1日後（E1期）は胚盤形成期に比定され、胚体は細胞性の羊漿膜で保護されていると考えられる。産卵2日後（E2期）にはコガタシマトビケラ卵は吸水し体積が増大する。産卵2～3日後は胚体が縦に伸長し、付属肢の形成が始まる。

図(2)-1 コガタシマトビケラ卵の発生過程

産卵4日後（E4期）は胚体が横に拡張する前胚反転期に比定される。産卵5日後（E5期）から昆虫胚特有の胚運動である胚反転（トビケラの場合、「姿勢転換」ともいう）が始まるとともに、神経系が発達しはじめる。産卵6日後（E6期）には胚反転が終了するが、胚体を包む羊漿膜はまだ存在する。産卵7日後（E7期）は後胚反転期に比定される。胚体を包んでいた羊漿膜が消失し、二次背器が形成される。この時期には胚体をくねらせるなどの筋肉運動が活発となる。産卵8日（E8期）以降、二次背器は次第に縮小し消失する。背閉鎖が完了し胚体の体壁が完全に閉じた状態となる。卵黄は胚体の消化管内に取り込まれる。産卵9日（E9期）以降、消化管内に取り込まれた卵黄が消費され、胚体の構造はかなり1齢幼虫に近くなる。産卵9日後には体毛が可視化するとともに大顎が赤褐色に色づき、翌日の10日後に一斉にふ化を開始する。ふ化開始の半日ほど前から胚の咽頭が拍動し始めて体内に水分を取り込み、頭部を膨張させる。ふ化時には全身を細かく振るわせ卵歯を卵殻にこすりつけ、卵殻を破ってふ化する。なお産卵用基板から卵塊を剥離させずに胚発生させると、ふ化までの時間が1～2日程度長い傾向が見られた。剥離させた場合は卵の全面から溶存酸素が供給され胚発生が促進されると推測された。

曝露期間の検討では、曝露期間を産卵1日後から各々2、4、6、8日間に設定した。曝露のタイミングの検討では曝露期間を2日間に固定し、異なる発生段階で曝露を行った。試験対象とする発生段階については、化学物質の取り込みに関係すると考えられる羊漿膜の有無や殺虫剤が作用する器官の形成・発達などに注目し、前述の発生過程の特徴からE1、E4、E7期の卵に決定した。E1期は曝露期間中、卵膨張時に試験水を吸収し被験物質の取り込みが増加する可能性がある発生段階である。E4期は曝露期間中に胚反転が起こり、神経系が発達し始める時期である。これらの変化は殺虫剤の取り込みや感受性に影響を及ぼす可能性があると考えられる。E7期は曝露期間中に羊漿膜が消失し、胚体の神経系・筋肉系器官が発達して1齢幼虫に近い体の構造となる。つまり各種殺虫剤の器官（作用点）がほぼ完成する時期であると考えられる。

試験に使用する卵は、農業環境技術研究所で室内継代飼育されているM系統を用いた $ ^{11)} $ 。毎日採卵し、光学顕微鏡で発生段階を確認したのち、実体顕微鏡下でタングステン針を用いて卵塊を5～20卵の断片に裁断して試験に用いた。

処理区ごとにガラス製ビーカーに200 mLの試験水を調整し、これに20個の卵を投入し所定の期
間曝露した。曝露期間中、ロータリーシェーカーで70 rpmの回転速度で試験水を攪拌した。曝露終了後に試験卵を清浄な飼育水200 mLで通水洗浄し、清浄な飼育水（3 mL/穴）を満たしたポリスチレン製24穴プレートに洗浄卵を移してふ化期まで蓄養した。蓄養水は毎日交換した。各処理区のふ化率およびふ化幼虫の48時間後生存率をエンドポイントとし半数致死濃度（LC_{50}）を算出した。対照区のふ化が始まってから7日経過してもふ化しない卵は死亡と判定した。試験水の薬剤濃度は、曝露開始時と終了時にLC/MS/MS分析により確認し、実測濃度をもとにLC_{50}値の計算を行った。各曝露期間のLC_{50}値は、SAS ver.9.3を用いてロジットモデルにより算出した。曝露期間、曝露濃度、死亡率の関係については、式(2.1)のcomplementary log-logモデル $ ^{12)} $ により解析を行った。

$$ 死亡率 P=1-\exp(-\exp(\alpha\times\log_{10}( 曝露期間 )+\beta\times\log_{10}( 曝露濃度 )+\gamma)) $$

ここで、αおよびβは偏回帰係数を、γは切片を表している。

コガタシマトビケラ卵の殺虫剤に対する応答を把握するために、供試薬剤には幅広い作用機作の殺虫剤を選定した（表(2)-1）。曝露期間の検討試験では、神経系に作用するカーバメート系殺虫剤のカルボスルファン、合成ピレスロイド系殺虫剤のエトフェンプロックス、昆虫成長制御剤のブプロフェジンの3剤を用いた。曝露のタイミングに関する試験では上記3剤に加え、昆虫成長制御剤のピリプロキシフェン、テブフェノジド、主に筋肉系に作用するジアミド系殺虫剤のクロラントラニリプロールの計6剤を試験に供した。

表(2)-1 卵期急性毒性試験に供試した殺虫剤の特性

供試薬剤	IRACによる作用機作分類	水溶解度 (mg/L)
カルボスルファン	1A アセチルコリエステラーゼ阻害剤	神経系に作用	3
エトフェンプロックス	3A ナトリウムチャンネルモジュレーター	神経系に作用	0.0225
ピリプロキシフェン	7C 幼若ホルモン類似剤	成長調節	0.367
ブプロフェジン	16 キチン生合成阻害剤タイプI	成長調節	0.387
テブフェノジド	18 脱皮ホルモン受容体アゴニスト	成長調節	0.83
クロラントラニリプロール	28 リアノジン受容体モジュレーター	神経及び筋肉系に作用	1.023

*作用機構の分類は引用文献13に従った。

コガタシマトビケラの1齢幼虫は成長に伴い、ふ化の約8日後より2齢幼虫に、約16日後より3齢幼虫に脱皮することが判明している。従って8日齢、16日齢前後の幼虫を用いた毒性試験法を開発すれば、脱皮期における殺虫剤の影響を評価することが可能である。そこで9日齢および15日齢幼虫を用いた48時間急性毒性試験を検討した。9日齢幼虫（試験開始時1齢幼虫）の試験法は、「コガタシマトビケラ1齢幼虫を用いた農薬の急性毒性試験法マニュアル」 $ ^{5)} $ に従った。15日齢幼虫（試験開始時2齢幼虫）の試験では、試験容器の容量を拡大するとともに、ロータリーシェーカーで試験液を攪拌し、流水環境を再現して毒性試験を実施した。供試薬剤には昆虫成長制御剤のメトキシフェノジドを使用した。

## 3 ）個体群レベルでの影響評価法の開発

前述のように、農薬等化学物質の生物に対する感受性は成長に伴い変動するため、ある一定の成長段階の個体のみで化学物質の影響を評価すると、リスクを過小あるいは過大評価する可能性
がある。より望ましい生態リスク評価では、個体群の持続や生態系の保全を目標とすることから、対象生物の生活史を考慮した適切な成長段階を含む個体群レベルでの影響評価を行う必要がある。河川棲水生昆虫の個体群レベルでの影響評価法を確立するためには、対象生物の生活史パラメータ（各齢期の死亡率、羽化率、産卵率等）を把握し個体群動態モデルを開発する必要がある。しかしながら、害虫に比べると河川棲水生昆虫の生活史パラメータについてはこれまでほとんど研究されていなかった。

本研究では、試験生物化に成功した数少ない河川棲水生昆虫であるコガタシマトビケラの幼虫を用いて成長試験を実施し、生活史パラメータを調査した。ふ化24時間以内の1齢幼虫50個体を飼育水（水深5 cm）の入ったガラス製結晶皿（直径12 cm、高さ8 cm）に投入し、室温20℃の恒温室で飼育を行った。飼育容器には底質としてガラスビーズを入れ、飼育水をスターラーで攪拌した。成長試験は2反復で行い、個体数および齢期を2日ごとに記録した。給餌と水替えは「コガタシマトビケラの飼育法マニュアル」 $ ^{11)} $ に準

じた。得られた成長段階別個体数頻度分布データを基に、各齢期の死亡率 $ ^{14)} $ および平均期間 $ ^{15)} $ を算出した。成虫の性比、産卵率、産卵数、ふ化率については、農業環境技術研究所で維持しているM系統（F37～F40世代）の室内累代飼育記録より算出した。

コガタシマトビケラの生活史を図(2)-2に示す。コガタシマトビケラは卵、幼虫（1齢～5齢）、蛹および成虫の成長段階を持つ完全変態昆虫であり、成虫以外は水中で生活する。

図(2)-2 コガタシマトビケラの生活史

図(2)-3 コガタシマトビケラの生活史の流れ図

Ge～Gp：ステージ間の移行率（時間tからt+1にかけて次ステージに成長する個体の割合）、Pe～Pa：ステージ内の生存率（時間tからt+1にかけて同一ステージ内に留まっている生存個体の割合）、Fa：繁殖率

各成長段階の関係性を流れ図で示すと図(2)-3のようになる。この流れ図を基にレフコビッチ推移行列モデル $ ^{16)} $ を構築し、コガタシマトビケラの室内個体群動態モデルを開発した。レフコビッチ推移行列モデルは齢、ステージ、サイズ等、構造のある個体群を扱うことができ、ネッタイシマカの個体群動態研究などに利用されている $ ^{17)} $ 。図(2)-3に示した行列モデルの各パラメータ（Ge～Gp、Pe～Pa、Fa）は、室内飼育個体群の生活史パラメータより推定した。
ステージ間の移行率 $ (G_{i}) $ およびステージ内の生存率 $ (P_{i}) $ は、式(2.2)および(2.3)により算出した $ ^{17)} $ 。

$$ G_{i}=\frac{s_{i}{}^{d_{i}}(1-s_{i})}{1-s_{i}{}^{d_{i}}} $$

$$ P_{i}=\frac{s_{i}(1-s_{i}^{d i-1})}{1-s_{i}^{d_{i}}} $$

ここで、 $ d_{i} $ は成長ステージiの平均期間、 $ S_{i} $ は成長ステージiの生存率から求めた日生存率を表す。繁殖率 $ (F_{a}) $ は1個体の成虫が1日に産む卵数であり、性比と♀1個体あたりの産卵数から算出した。これらの行列パラメータから、コガタシマトビケラのレフコビッチ推移行列Aは式(2.4)で表される。

$$ \mathrm{A}=\begin{pmatrix}{{{P_{e}}}}&{{{0}}}&{{{0}}}&{{{0}}}&{{{0}}}&{{{0}}}&{{{0}}}&{{{F_{a}}}} \\{{{G_{e}}}}&{{{P_{1}}}}&{{{0}}}&{{{0}}}&{{{0}}}&{{{0}}}&{{{0}}}&{{{0}}} \\{{{0}}}&{{{G_{1}}}}&{{{P_{2}}}}&{{{0}}}&{{{0}}}&{{{0}}}&{{{0}}}&{{{0}}} \\{{{0}}}&{{{0}}}&{{{G_{2}}}}&{{{P_{3}}}}&{{{0}}}&{{{0}}}&{{{0}}}&{{{0}}} \\{{{0}}}&{{{0}}}&{{{0}}}&{{{G_{3}}}}&{{{P_{4}}}}&{{{0}}}&{{{0}}}&{{{0}}} \\{{{0}}}&{{{0}}}&{{{0}}}&{{{0}}}&{{{G_{4}}}}&{{{P_{5}}}}&{{{0}}}&{{{0}}} \\{{{0}}}&{{{0}}}&{{{0}}}&{{{0}}}&{{{0}}}&{{{G_{5}}}}&{{{P_{p}}}}&{{{0}}} \\{{{0}}}&{{{0}}}&{{{0}}}&{{{0}}}&{{{0}}}&{{{0}}}&{{{G_{p}}}}&{{{P_{a}}}}\end{pmatrix} $$

式(2.4)の最大固有値λ、安定齢組成および繁殖価は、数値計算ソフトウェアMatlabで求めた。また各行列パラメータの感度と弾力性を計算した。

式(2.4)は個体数が無限に増大するモデルであるが、実際の室内飼育個体群は環境収容力に制限があるため無制限に個体数が増加することはない。そこで式(2.4)に密度依存性を組み込んだ。トビケラ室内個体群の密度効果はコンテスト型（勝ち残り型）を想定し、幼虫期に作用すると仮定した。コンテスト型として一般的に知られており、式(2.5)で表されるBeverton-Holt関数を適用した。

$$ N_{t+1}=N_{t}\times\lambda\times K/(\lambda\times N_{t}-N_{t}+K) $$

ここで、 $ N_{t} $ は時間tにおける個体数、 $ N_{t+1} $ は時間t+1における個体数、Kは上限値を示す。室内飼育記録の成虫数と、密度依存性を考慮したレフコビッチ推移行列モデルの成虫数がほぼ一致するようにKの値を設定した。コガタシマトビケラの室内飼育では成虫数と産卵数が毎日記録されている。この室内飼育記録の卵数と成虫数の比率をモデルのシミュレーションで得られた卵／成虫比と比較することにより、開発した個体群動態モデルの妥当性を評価した。

有機リン系殺虫剤フェニトロチオン、ネオニコチノイド系殺虫剤イミダクロプリド、ジアミド系殺虫剤クロラントラニリプロールの3剤について、開発した個体群動態モデルによる個体群レベルでの影響評価を行った。1齢～5齢幼虫に対するフェニトロチオンおよびイミダクロプリドの濃度-反応曲線は、Yokoyamaら $ ^{18)} $ の結果を引用した。この2剤の卵期における濃度-反応曲線およびクロラントラニリプロールの2～5齢幼虫に対する濃度-反応曲線は、Yokoyamaら $ ^{18)} $ の方法に準じて48時間急性毒性試験により整備した。得られた濃度-反応曲線の関数を個体群動態モデルに組み込むことにより、任意の殺虫剤濃度で48時間曝露されたときの個体数の変動を計算した。

さらに、個体群レベルでの毒性評価結果とSSD解析結果を比較することにより、個体レベル試験の急性毒性データのみを用いて行われるSSD解析について、個体群レベルの観点から意義付けを行った。
## （２）付着藻類を用いた毒性評価法の開発

## 1 ）試験候補種の選定と効率的な毒性試験法の開発

湖沼では水中に浮遊するプランクトン性藻類が優占するのに対し、流れのある河川では河床の砂や石に付着して生活する付着藻類が優占する。河川生態系においては、川底の石の表面に付着藻類が群体（いわゆる水苔）を形成し、一次生産者としてや、水生昆虫、魚類の餌として重要な生物群となっている。しかしながら、これまでの毒性評価には、主として湖沼で優占する緑藻の毒性データが利用されてきたため、わが国の河川生態系の重要な生産者である付着藻類種に対する毒性データはほとんど整備されていなかった。そこで、複数の付着藻類の試験生物種の選定を行い、生物種による感受性の変動性を明らかにすることが必要となる。しかし、OECDテストガイドラインに代表される従来の毒性試験法では、複数の藻類種に対し多数の試験を行うには多大な労力がかかり、そもそも付着藻類の試験には適さない。そこで、マイクロプレートと蛍光プレートリーダーを用いるハイスループット（時間と経費を節約するための高速な化学物質評価）の試験系を構築し、本試験系に適用可能な付着藻類種を選定した。

候補種の選定根拠として以下の事項を考慮した。①わが国の河川に広く分布している種であり、河川の生物調査でよく観察されること、②幅広い分類群からの種を含むこと（珪藻、緑藻、藍藻など、実際の河川における種数のバランスを考慮する）、③幅広い適応環境から種を選定すること（好清水性種、広適応性種、好汚濁性種など）。これらの条件を満たす候補種として、表(2)-2に掲げる8種11株を用いて検討を行った。

表(2)-2 感受性検定を行った藻類の候補種名と維持管理条件

種名	株名	保存培地	寒天培地での保存	寒天保存の植継期間	液体保存の植継期間	液体植継量ml/15ml	保存時光強度lux	温度℃
Pseudokirchneriella subcapitata	NIES-35	綠藻	C	○	3	28	0.2	1000
Desmodesmus subspicatus	NIES-797	綠藻	C	○	3	28	0.2	1000
Mayamaea atoms	NIAES K11-11	珪藻	CSi	○	1	28	1	1000
Nitzschia palea	NIAES PD3	珪藻	CSi	○	1	×	×	1000
Nitzschia palea	NIAES U3-3	珪藻	CSi	○	1	×	×	1000
Nitzschia palea	NIES-487	珪藻	CSi	○	1	28	1	1000
Achnanthidium minutissimum	NIES-71	珪藻	CSi	○	1	28	1	1000
Achnanthidium minutissimum	NIES-414	珪藻	CSi	○	1	28	1	1000
Navicula pelliculosa	UTEX-B673	珪藻	CSi	○	1	28	1	1000
Pseudanabaena galeata	NIES-512	藍藻	CT	×	×	14	1	500
Anabaena flos-aquae	NIES-73	藍藻	CB	×	×	20	1	1000

候補種として選定した各藻類株の維持保存条件と試験条件を検討した（表(2)-2）。寒天培地での継代保存は、藍藻2株を除いて可能であった。液体培地での継代保存は、珪藻Nitzschia paleaの2株を除いて可能であった。この2株については、前培養も寒天培地で行うこととした。次に、96穴のマイクロプレートによる培養条件と、蛍光プレートリーダーによる藻類の自家蛍光測定の条件を決定し、藻類の毒性試験における標準物質の3,5-ジクロロフェノール（DCP）を用いて感受性検定を行った。以上の結果を踏まえ、試験生物種として以下の5種を選定した。Desmodesmus subspicatus NIES-797、Nitzschia palea NIES-487、Achnanthidium minutissimum NIES-71、Navicula pelliculosa UTEX-B673、Pseudanabaena galeata NIES-512。

選定した5種の試験生物種を用いて、蛍光マイクロプレートアッセイを応用した効率的な毒性試
駿法を開発した。選定種を用いた毒性試験の効率化を図るため、光や温度、培地などの試験条件を可能な限り統一させるための検討を行った。その結果、光強度を3000 lux、温度を22℃、CSi培地を用いるとした条件より、選定5種全てにおいてOECDガイドライン201に記載された試験の妥当性基準（試験期間の増殖率、コントロール試験の再現性、増殖の直線性）を達成可能であることを確認した。このように、統一した条件下で5種同時毒性試験が可能となるため、毒性試験を効率化することが可能となった。

開発した試験法を用いて、表(2)-3に示す20種類の除草剤の毒性試験を行った。96穴マイクロプレートを用いて藻類を培養し、細胞の増殖は蛍光プレートリーダーを用いて測定した。試験期間は4日間とし、期間中の対数増殖期の増殖速度の阻害率をエンドポイントとして、EC $ _{10} $ とEC $ _{50} $ を計算した。被験液の濃度分析はLC-MS/MSを用いて行い、試験期間の最初と最後の濃度の幾何平均値を解析濃度とした。各種除草剤の5種のEC $ _{50} $ 値を対数正規分布に適合させ、種の感受性分布（species sensitivity distribution, SSD）のパラメータである対数平均（ln Mean）と対数標準偏差（ln SD）を決定した。

表(2)-3 毒性試験の対象とした20種類の除草剤の特性

除草剤	CAS No.	作用機作a	水溶解度
(mg/L)	緑藻標準種のEC50
(μg/L)
シハロホップブチル	122008-85-9	A	0.44	>1000
ベンスルフロンメチル	83055-99-6	B	6.7	56.6
シクロスルファムロン	136849-15-5	B	6.5	3.5
ピリミスルファン	221205-90-9	B	89	59
フルセトスルフロン	412928-75-7	B	16.5	>98800
シメトリン	1014-70-6	C1	482	18.9
ペントキサツン	110956-75-7	E	0.216	0.846
ピラクロニル	158353-15-2	E	50.1	5.4
オキサジアルギル	39807-15-3	E	0.37	7.3
テフリルトリオン	473278-76-1	F2	64200	5300
ベンブフェナップ	82692-44-2	F2	0.12	>268
ベンブビシクロン	156963-66-5	F2	0.052	>1000
プレチラクロール	51218-49-6	K3	74	2.92
ブタクロール	23184-66-9	K3	16	3.15
メフェナセット	73250-68-7	K3	5.2	80.1
カフェンストロール	125306-83-4	K3	2.5	2
フェントラザミド	158237-07-1	K3	2.3	6.04
ベンフレセート	68505-69-1	N	261	7300
エスプロカルブ	85785-20-2	N	4.92	66
オキサジクロメホン	153197-14-9	Z	0.15	>11700

$ ^{a} $ A: acetyl CoA carboxylase 阻害、B: acetolactate 生成成阻害、C1: 光化学系Ⅱ阻害、E: protoporphyrinogen oxidase 阻害、F2: 4-hydroxyphenyl-pyruvate-dioxygenase 阻害、K3: 超長鎖脂肪酸生成成阻害、N: 脂質生成成阻害、Z: その他

## 2 ）付着藻類を用いた回復性試験法の開発

前述の毒性試験では、継続的な曝露を受けた場合の影響を評価するものである。しかし、実際の河川水中における農薬の曝露は一過性であるため、一時的に影響を受けてもその後回復すること
とが想定される。これまでの研究事例によれば、藻類の増殖がほぼ抑えられた状態から清浄な培地に移した場合、その回復の早さは除草剤によって異なることが知られている。この理由として、細胞の生理状態に与える影響の違いが関係していることが示唆されている。すなわち、増殖は抑えるが細胞が死んでいない場合には回復が早く、致死性が強い影響の場合には回復が遅くなる。そこで、前述のマイクロプレートを用いた付着藻類の毒性試験法を改良し、藻類細胞の生理状態の把握が可能な回復性試験法を開発することとした。

藻類細胞の生理状態を把握するための、マイクロプレートを用いた測定が可能な技術として、①生細胞数を評価対象とするATP発光の測定、②死細胞数を評価対象とするCellTox-Green蛍光の測定、③光合成活性を評価対象とするDCMU(PSII阻害剤)添加によるクロロフィル蛍光の増加量、の3つを適用することとした。ATPは生細胞数に比例して存在し、ATPとルシフェラーゼの反応による発光を測定することで定量化した。また、細胞死によって体外に放出される微量のDNAと結合することで、緑色の蛍光を発するCellTox-Green蛍光試薬を用いて、死細胞数由来のDNAを定量化した。PSII阻害剤のDCMUを添加した場合にクロロフィル蛍光の増加が見られるが、この増加量は光合成に使用されたエネルギー量とみなせるため、蛍光増加量を光合成活性として定量化した。試験種として珪藻Navicula pelliculosaを用い、その生細胞とグルタルアルデヒド0.1%で1日間処理した死細胞を各種密度で調整した。これらの培養液を用いて、ATP発光、Celltox-Green蛍光、光合成活性を測定した。また、参照物質として3,5-ジクロロフェノールを用い、48時間マイクロプレートで毒性試験を行い、ATP発光、Celltox-Green蛍光、光合成活性を測定した。さらに、48時間曝露させた藻類細胞を清浄な培地に移し、48時間の追加培養を行う回復性試験を実施した。

## 3 ）付着藻類を用いた複合毒性試験と複合影響予測モデルによる解析

個別の除草剤に対する毒性試験を実施する場合と同様に、各種除草剤を5種類組み合わせた複合毒性試験を行った。除草剤の組み合わせとして、作用機作が同じ除草剤を混合した場合と、作用機作が異なる除草剤を混合した場合の2組を設定し、それぞれの除草剤の毒性試験結果から解析したSSDの5,10,20,30,40,50パーセンタイルの濃度（それぞれHC_{5},HC_{10},HC_{20},HC_{30},HC_{40},HC_{50}）で混合した（表(2)-4）。

表(2)-4 複合毒性試験の組み合わせと濃度設定（作用機作の記号は表(2)-3に同じ）

除草剤	作用機作	ln Mean	ln SD	濃度(μg/L)
HC5	HC10	HC20	HC30	HC40	HC50
複合1	プレチラクロール	K3	7.75	2.01	84	175	425	804	1387
複合1	ブタクロール	K3	7.38	2.04	56	117	288	551	959
複合1	メフェナセット	K3	8.65	1.27	706	1121	1963	2939	4150
複合1	カフェンストロール	K3	7.86	2.94	20	60	218	554	1231
複合1	フェントラザミド	K3	8.32	2.39	81	192	550	1173	2241
複合2	プレチラクロール	K3	7.75	2.01	84	175	425	804	1387
複合2	ベンスルフロンメチル	B	7.13	3.44	4.4	15	69	206	524
複合2	ピラクロニル	E	5.61	3.16	1.5	4.8	19	52	122
複合2	エスプロカルブ	N	7.54	1.00	363	521	809	1111	1457
複合2	シメトリン	C1	3.55	0.58	14	17	22	26	30
上記の複合毒性試験で得られた結果を用いて、既存の複合影響予測モデルにより解析を行った。作用機作が同じ農薬を混合した場合の複合影響は、Concentration-Additive（CA）モデルを活用した。CAモデルでは、基本的には毒性値（EC50）で重み付けした農薬濃度を足し算する方法で、Toxic Unit（TU）を次式により計算する。

$$ \mathrm{TU}= 農薬濃度 /\mathrm{ 毒性值 } $$

例えば、作用機作が同じである農薬Aと農薬Bの複合影響は、式(2.7)で表される。

$$ \mathrm{TU_{mixture}=TU_{A}+TU_{B}=[ 農薬 A]\ne C50_{A}+[ 農薬 B]\ne EC50_{B}} $$

毒性値で重み付けした農薬濃度である[農薬A']および[農薬B']は、式(2.8)、(2.9)により求められる。

$$ [ 農薬 A^{\prime}]=TU_{mixture}\times EC50_{A} $$

$$ [ 農薬 B^{\prime}]=TU_{mixture}\times EC50_{B} $$

[農薬A']、[農薬B']の値から濃度反応関係によりそれぞれの農薬の影響率を計算し、次式により複合影響を平均化して計算する。

$$ 影響率 _{mixture}=\left( 影響率 _{A}+ 影響率 _{B}\right)\ \text{／}2 $$

一方、作用機作が異なる農薬を混合した場合の複合影響は、Response Additive（RA）モデルを活用した。RAモデルでは、作用機作が異なる影響は完全に独立に起こると仮定して影響率をかけ算する（相乗効果とは異なる）。例えば、農薬Aと農薬Bの複合影響は、それぞれの農薬の濃度反応関係から個別に影響率を求め、以下の式で計算する。

$$ 影響率 _{mixture}=1-\prod\left(1- 影響率 \right)=1-\left(1- 影響率 _{A}\right)\times\left(1- 影響率 _{B}\right) $$

なお、本研究で活用したCAおよびRAモデルは、これまでに多くの実験的な検証が行われている。本研究では、後述の複合毒性試験（図(2)-19）を用いてCAおよびRAモデルで予測した結果と比較し、既存の複合影響予測モデルを活用することの妥当性について検証を行った。

## 4 ．結果及び考察

## （1） 水生昆虫を用いた毒性評価

## 1 ）1齢幼虫に対する殺虫剤の毒性評価

殺虫剤5剤の情報とコガタシマトビケラ1齢幼虫の毒性試験結果を表(2)-5に示す。トビケラの\mathrm{EC}_{50}值は、\mathrm{LC}/\mathrm{MS}/\mathrm{MS}による実測濃度に基づきロジット法で算出した。試験期間中、対象区および助剤対象区において異常症状は確認されなかった。クロラントラニリプロールおよびメトキシフェノジドは、水溶解度付近の曝露濃度でもトビケラ1齢幼虫に対し急性毒性を示さず（影響個体率0%）、既存の試験生物種であるミジンコ類の方が高感受性であった。メトキシフェノジドと同様の作用機作を持つテブフェノジドについても、トビケラ1齢幼虫に対する毒性は低いことが報告されている $ ^{1} $ 。一方、神経系に作用するエチプロール、スピノサドでは、ミジンコ類に比べてトビケラ1齢幼虫の方が1000倍以上も高感受性であった。なおエチプロールと同じ作用機作を示すフィプ
ロニルについても、同様の傾向を示すことが報告されている。ミジンコおよびトビケラ1齢幼虫に対するピリプロキシフェンの急性毒性は同程度であった。このように、殺虫剤の作用機作によっては、トビケラに対する毒性がミジンコ類と大きく異なることが示唆された。以上の結果から、わが国の河川生態系における殺虫剤感受性の種間差を効率的に把握するうえで、コガタシマトビケラは有用な試験生物であることが示唆された。

表(2)-5 殺虫剤5種のコガタシマトビケラ1齢幼虫対する急性毒性試験結果

供試薬剤	IRACによる作用機構分類	ミジンコEC50μg/L	トビケラEC50μg/L	感受性比 ミジンコ/トビケラ
エチプロール	2B	GABA作動性塩素イオンチャンネル アンタゴニスト	>8330	8.05 >1035
スピノサド	5	ニコチン性アセチルコリン受容体 アロステリックモジュレーター	1480	0.918 1612
ピリプロキシフェン	7C	幼若ホルモン類似剤	75	87.9 0.853
メトキシフェノジド	18	脱皮ホルモン受容体アゴニスト	3710	>7215 <0.514
クロラントラニリプロール	28	リアノジン受容体モジュレーター	11.6	>881 <0.0132

*作用機構の分類は引用文献13に従った。ミジンコのEC_{50}値は引用文献19より入手した。

## 2 ）初期成長段階別毒性試験法の開発

## a．殺虫剤の胚発生への影響

曝露期間中、コガタシマトビケラの卵（胚）が死亡する（胚の透明感がなくなり濁った状態となる）ことはなかった。昆虫成長制御剤のピリプロキシフェンを除き、光学顕微鏡による観察では外見上、殺虫剤処理区の卵はふ化直前の段階（大顎の褐色化、体毛の顕在化）まで胚発生が進んでいた。しかし、最終的には高濃度処理区の未ふ化卵の胚は萎縮・死亡した（図(2)-4A, C, D, H）。ただし、エトフェンプロックスの中濃度処理区では、胚体が咽頭拍動による吸水で膨張した状態でふ化せずに死亡した（図(2)-4B）。このことは、ふ化時の一連の全身運動に神経系が大きく関与しており、エトフェンプロックスの曝露により神経系の働きが阻害されたことにより、ふ化が妨げられた可能性を示唆している。ピリプロキシフェンはE4期の卵に強い毒性影響を示した（後述）。E4期の卵の試験は曝露期間中に胚反転が起こるが、ピリプロキシフェン処理区では胚反転異常となり背閉鎖が完了せず（図(2)-4G）、胚体はねじれ卵黄が変形しその後正常に発生することなく死亡した。殺虫剤処理区ではふ化した個体であっても異常が観察されることがあった。ブプロフェジンの低濃度処理区では対照区と同様正常な個体がふ化したが（図(2)-4E）、高濃度処理区では脚が萎縮し、正常に機能していなかった（図(2)-4F）。筋肉系に作用するクロラントラニリプロールの処理区では脚の運動機能が損なわれていた（図(2)-4I）。
図(2)-4 殺虫剤処理区の未ふ化卵およびふ化個体

A：カルボスルファン87.5μg/L、8日間曝露。

B: エトフェンプロックス0.9μg/L、4日間曝露。

C: エトフェンプロックス24.3μg/L、6日間曝露。

D: ブプロフェジン640μg/L、4日間曝露。

F: ブプロフェジン640μg/L、8日間曝露。

G：ピリプロキシフェン0.81μg/L、2日間曝露。

H: クロラントラニリプロール560μg/L、2日間曝露。

I: クロラントラニリプロール244μg/L、2日間曝露。

## b．ふ化率とふ化個体の生存

テブフェノジドを除く5剤の殺虫剤は、濃度依存的にふ化率が低下した（図(2)-5）。ふ化後48時間正常率（処理卵数に対するふ化個体数）をみると、神経系に作用するカルボスルファンおよびエトフェンプロックスではほぼ100%であったが、ブプロフェジンおよびクロラントラニリプロールでは、高濃度処理区で正常率が低下した。前述のように、ブプロフェジン処理区では脚の外骨格に異常がみられるなど、ふ化はできるものの幼虫の生存には致命的な欠陥が生じることを示唆している。クロラントラニリプロールでは、脚部の筋肉系の機能が低下している可能性があり、これによりふ化個体の生存が低下しているものと推測された。

図(2)-5 殺虫剤5剤の曝露によるふ化率（青線）とふ化個体の48時間後正常率（赤線）
## c．卵の殺虫剤感受性における曝露期間と曝露のタイミングの影響

E1期から2,4,6,8日間曝露し卵に対する殺虫剤の毒性を調べた結果、表(2)-6に示すように、カルボスルファンおよびエトフェンプロックス処理区では、曝露期間が長くなるほど影響が大きかった（2d-LC_{50}は8d-LC_{50}のおよそ90～680倍）。一方、ブプロフェジン処理区では、曝露期間によらず影響の程度はほぼ一定であった（2d-LC_{50}:209 $ \mu $ g/L～8d-LC_{50}:228 $ \mu $ g/L）。Complementary log-logモデルによる曝露期間、曝露濃度および死亡率の回帰結果を図(2)-6に示す。一般的に生物は曝露濃度が一定でも、曝露期間が長くなれば毒性影響をより強く受ける傾向がある。図(2)-6のカルボスルファンおよびエトフェンプロックスにおける死亡率の変動は、カーバメート系殺虫剤に対するカゲロウ科幼虫の応答と同様の傾向を示した $ ^{20)} $ 。一方、ブプロフェジンの死亡率の変動は全く異なる傾向を示した。この要因を考察するため、トビケラ卵の殺虫剤感受性に対する曝露のタイミングによる影響を調査した。神経系に作用するカルボスルファンおよびエトフェンプロックスに対してはE7期の卵が、ブプロフェジンに対してはE1期の卵が最も感受性が高く、これらの2日間曝露による毒性値は8日間曝露の毒性値と同程度（0.3～1倍）であった（表(2)-7）。このことは、トビケラ卵に対する毒性を決定する要因が、曝露期間よりも曝露のタイミングの方が重要であることを示している。

表(2)-6 殺虫剤3剤の曝露期間とトビケラ卵に対する感受性

曝露時間	半数致死濃度 (μg/L)
カルボスルファン	エトフェンプロツクス	ブプロフェジン
2日	>913	5.19	209
4日	162	1.11	209
6日	4.04	0.16	126
8日	1.34	0.056	228

図(2)-6 トビケラ卵における曝露期間、曝露濃度および死亡率の関係（赤線は50％の死亡ライン）
表(2)-7 殺虫剤の曝露のタイミングとトビケラ卵の感受性

殺虫剤	半数致死濃度（μg/L）
E1期	E4期	E7期
カルボスルファン	>913	596	1.31
エトフェンプロックス	5.19	1.19	0.191
ピリプロキシフェン	6.98	0.133	225
ブプロフェジン	209	>426	301
テブフェジド	>2935	>2879	>2879
クロラントラニリプロール	94.5	104	88.2

その他の剤についてみると、ピリプロキシフェンはE4期の卵に対して極めて毒性が強かった。テブフェノジドは、水溶解度よりもはるかに高濃度（3 mg/L）で曝露しても毒性影響は見られなかった。クロラントラニリプロールは、E1, E4, E7期で感受性はほぼ一定であった。このように、薬剤の作用機作により、感受性の高い発生段階は異なることが示唆された。神経系に作用する剤は、神経系器官が完成する、つまり1齢幼虫の体の構造ができあがる胚発生後期においてより強く影響を及ぼすと考えられる。キチン生成を阻害するブプロフェジンは、器官の原基が形成される発生初期に影響が大きいと考えられる。幼若ホルモンは昆虫卵に内在し、胚発生を制御している重要な因子である $ ^{21} $ 。胚発生中の昆虫卵が外部から幼若ホルモンを投与されると、ホルモンバランスが乱され胚発生に異常をきたす。胚反転中のカメムシ卵に幼若ホルモンを作用させると、背閉鎖に失敗し付属肢の形成が不完全になることが報告されている $ ^{22} $ 。これは、幼若ホルモン作用のあるピリプロキシフェンのトビケラ卵への毒性影響と一致している。ミジンコ類に対するピリプロキシフェンの急性毒性はそれほど強くないが、1 μg/L以下の濃度で21日間曝露すると、オオミジンコの繁殖を抑制するとともに、ぷを産仔するようになる $ ^{23} $ 。一方、メソコズム試験では、ピリプロキシフェンが分解すると、ミジンコ個体群は速やかに回復することが報告されており $ ^{24} $ 、ピリプロキシフェンの曝露によって産仔されたぷも生殖能力を有していることから $ ^{25} $ 、ミジンコ類への影響はかなり可塑的であると考えられる。ユスリカ類に対しては2世代影響試験が行われており、3 μg/Lで羽化率等に影響を与えている $ ^{26} $ 。これらの長期間曝露による影響に比べ、ピリプロキシフェンは、トビケラ卵に対してごく低濃度の短期曝露でも致命的な影響を与えることが判明した。テブフェノジドは、トビケラの脱皮ホルモン受容体に対する親和性が低いため、トビケラ卵に毒性影響を示さないと考えられる。クロラントラニリプロールについては、主に筋肉系に作用するとされているが、筋肉は発達していないE1期でも、筋肉の発達しているE7期と同様に毒性を示した。本剤については未だ解明されていない作用点、作用機作が存在する可能性がある。以上のように、殺虫剤の作用機作によって高感受性の発生段階が異なることから、水生昆虫卵の毒性評価では、殺虫剤の作用機作に依存した曝露のタイミング（作用点の形成時期）が重要であると考えられる。曝露期間を2日間に固定し、少なくともE1、E4、E7期の3つの発生段階で試験を行うことにより、効率的かつ適切に卵期の毒性評価を行うことができると考えられる。また、本研究で開発された卵期急性毒性試験は、既存のテストガイドラインでは急性毒性評価が難しいとされてきた昆虫成長制御剤を含め、様々な農薬について水生昆虫に対する毒性を適切に評価できると考えられた。
## d．脱皮期毒性试验

9日齢および15日齢幼虫を用いた毒性試験では、試験中の対照区の生存率は高く（100%）、本試験条件により昆虫成長制御剤の毒性試験が実施可能であると考えられた。表(2)-8に昆虫成長制御剤メトキシフェノジドの毒性試験結果を示す。表中の正常率とは、水流刺激に対し伸身・開脚反応を示す正常な試験個体の割合を指す。メトキシフェノジドは、最高曝露濃度6 mg/Lでも顕著な毒性影響を示さなかった。また、脱皮率についても濃度依存性は見られず、対照区と曝露区の間に差はなかった。9日齢幼虫の6 mg/L曝露試験区では脱皮率が低かったが、未脱皮個体に異常症状は確認されなかった。ベンゾイルヒドラジン骨格を有するメトキシフェノジドは、コガタシマトビケラの脱皮ホルモン受容体との親和性が低く、本種に対し低毒性であると推察された。しかしながら、本種はピリプロキシフェンなどの一部の昆虫成長制御剤に対し感受性が高いことから、本研究で開発した脱皮期を的確に捉えた毒性試験法は、これらの昆虫成長制御剤の毒性影響を適切に評価することができると期待される。

表(2)-8 脱皮期の若齢幼虫を用いたメトキシフェノジドの毒性試験結果

9日齢	15日齢
正常率%	脱皮率%	正常率%	脱皮率%
对照区	100	60	100	70
暴露区(mg/l)
1	100	60	100	90
3	100	50	100	60
6	90	10	100	70

## 3 ）個体群レベルでの影響評価法の開発

## a．コガタシマトビケラの生活史パラメータの解明

コガタシマトビケラ幼虫の成長試験結果を図(2)-7に示す。2齢、3齢、4齢幼虫の個体数は、それぞれ飼育開始16日、26日、40日目にピークに達した。5齢期は期間が長く、また5齢幼虫の生育が

個体によって大きく異なったため、成虫は68日目以降の長い期間にわたって散発的に羽化した。この成長段階別個体数頻度分布データから作成した生命表を表(2)-9に示す。各齢期の死亡率は1～2齢の若齢期で最も高く、3～4齢期では低下したが5齢期で再び上昇した。成虫までの生存率は18.1%であった。このような生存率、各齢期の死亡率の推移は、コガタシマトビケラと同じシマトビケラ科に属すHydropsyche

slossonaeの野外個体群と類似していた $ ^{27)} $ 。

図(2)-7 コガタシマトビケラの成長試験結果（2試験の平均値）
表(2)-9 コガタシマトビケラの生命表（2試験の平均値）

成長段階	各成長段階の個体数 (nx)	各成長段階における死亡数 (dx)	生存率 (lx)	各齢期の死亡率 (qx)
1齢	50.0	31.8	100.0	63.6
2齢	18.2	5.1	36.4	28.5
3齢	13.1	0.6	26.2	5.3
4齢	12.5	0.2	25.0	1.0
5齢	12.3	2.9	24.6	19.9
蛹	9.4	0.4	18.8	3.9
成虫	9.0	9.0	18.0	100.0

H. slossonaeの齢期死亡率は1齢、2齢期でそれぞれ93%、32%と高く、3～4齢期では9～12%に低下するものの、5齢期で44%に上昇した。H. slossonaeの成虫までの最終的な生存率は0.5%ときわめて低いことが報告されている。H. slossonaeの1齢幼虫の高い死亡率は共食いによるものであるが、コガタシマトビケラについては共食いの性質が低く、若齢期に観察された高い死亡率は水質の低下によるものと考えられた。コガタシマトビケラ5齢期に死亡率が増加した原因は餌不足に起因する営業のためのテリトリー争いによるものと推測された。成虫までの生存率がH. slossonaeに比べコガタシマトビケラの方が36倍も高い要因は、室内成長試験の特性として、捕食圧、蛹の寄生虫罹患率等が皆無であったことが挙げられる。このことから、本研究で得られた生活史パラメータは比較的良好な生息環境における値に相当するものと推測された。

累代飼育記録から得られた成虫の性比、産卵率、雌1個体あたりの産卵数、ふ化率を表(2)-10に示す。累代飼育では雌成虫の方が雄成虫よりもやや少なかったが、雌成虫の約8割が産卵し産卵率は高かった。産卵を行った雌成虫の平均産卵数は271個で、コガタシマトビケラ野外個体群の1卵塊当たりの平均卵数272個 $ ^{28)} $ とほぼ一致したことから、累代飼育記録から得られた生活史パラメータは比較的妥当な値であると推測された。ふ化率はややばらつきが大きいものの、9割近い卵がふ化した。この累代飼育記録から得られた生活史パラメータの結果を、前述の成長試験結果に当てはめると、次世代の1齢幼虫は1400個体となり約30倍に増加することとなる。

表(2)-10 累代飼育記録から得られた各種生活史パラメータ

パラメータ	平均	標準偏差
性比( $ \frac{\rho}{\sigma} $ )	0.82	0.06
産卵率(%)	82.3	3.9
産卵数/ $ \rho $	271	13
ふ化率(%)	87.9	25.1

## b．個体群動態モデルの開発

表(2)-11に生活史パラメータから推定した、推移行列モデルのパラメータを示す。行列パラメータから、構築したコガタシマトビケラのレフコビッチ推移行列Aを式(2.12)に、シミュレーション結果を図(2)-8に示した。この行列の最大固有値λ（個体群成長率）は1.039であり、1日に3.9％の割合で無限に個体数が増加していくことを表す。既存の試験生物種であるオオミジンコ（λ=1.35）やユスリカ（λ=1.25）と比較すると、成長率は1桁程度低く、コガタシマトビケラ個体群の回復性は他の試験生物種に比べ遅いことが示唆された。
$$ \mathrm{A}=\begin{pmatrix}{{{0.913}}}&{{{0}}}&{{{0}}}&{{{0}}}&{{{0}}}&{{{0}}}&{{{22.2}}} \\{{{0.076}}}&{{{0.898}}}&{{{0}}}&{{{0}}}&{{{0}}}&{{{0}}}&{{{0}}} \\{{{0}}}&{{{0.037}}}&{{{0.890}}}&{{{0}}}&{{{0}}}&{{{0}}}&{{{0}}} \\{{{0}}}&{{{0}}}&{{{0.079}}}&{{{0.907}}}&{{{0}}}&{{{0}}}&{{{0}}} \\{{{0}}}&{{{0}}}&{{{0}}}&{{{0.088}}}&{{{0.973}}}&{{{0}}}&{{{0}}} \\{{{0}}}&{{{0}}}&{{{0}}}&{{{0}}}&{{{0.026}}}&{{{0.984}}}&{{{0}}} \\{{{0}}}&{{{0}}}&{{{0}}}&{{{0}}}&{{{0}}}&{{{0.012}}}&{{{0.874}}}&{{{0}}} \\{{{0}}}&{{{0}}}&{{{0}}}&{{{0}}}&{{{0}}}&{{{0}}}&{{{0.121}}}&{{{0.962}}}\end{pmatrix} $$

表(2)-11 コガタシマトビケラの推移行列パラメータ

成長段階	各成長段階の平均期間di（日）	日-生存率si	繁殖率Fa（日-產卵数）	ステージ内生存率Pi	ステージ間移行率Gi
卵	12.2	0.989	0	0.913	0.076
1齢	15.1	0.935	0	0.898	0.037
2齢	10.5	0.969	0	0.890	0.079
3齢	11.0	0.995	0	0.907	0.088
4齢	37.7	1.000	0	0.973	0.026
5齢	71.7	0.997	0	0.984	0.012
蛹	8.1	0.995	0	0.874	0.121
成虫	5	0.962	22.222	0.962	0.000

図(2)-8 トビケラ行列モデルによるシミュレーション例

この行列の安定齢組成をみると、卵および1齢幼虫が個体群の8割の個体数を占める主要な成長段階であることがわかる（表(2)-12）。卵を1としたときの各成長段階の1個体あたりの繁殖に対する相対的な重要度を示す繁殖価では、蛹・成虫期が卵よりも200～300倍も高く繁殖に重要な成長段階であることが示された。行列パラメータの感度分析を行った結果を図(2)-9に示した。感度は行列パラメータの変化によって個体群増殖率へがどれだけ変化するかを表す。弾力性は行列パラメータの入に対する相対的寄与率で、行列パラメータの相対的変化あたりの入の相対的変化として表される。これらの値が大きい成長段階は個体群の増殖にとって重要であることを意味する。コガタシマトビケラの場合、4齢、5齢期のステージ間移行率およびステージ内生存率の感度、弾力性が高く、仮にこれらの成長段階に対し強く影響を及ぼすような化学物質に曝露された場合は、個体群の増殖が大きな影響を受ける可能性があることを示唆している。
表(2)-12 トビケラ行列モデルの安定齢組成と繁殖価

成長段階	安定齡組成(u)	繁殖価(v)
卵	0.522	1
1齡	0.281	2
2齡	0.070	6
3齡	0.042	12
4齡	0.055	18
5齡	0.026	46
蛹	0.002	211
成虫	0.003	288

図(2)-9 行列パラメータの感度解析結果

式(2.12)にBeverton-Holt関数を組み込み、上限値K=60000と設定して、シミュレーションを行った結果、卵／成虫比は114と推定され、室内飼育記録の133とよく一致していた（図(2)-10）。室内飼育記録では、飼育設備の不具合により冬季に飼育水温が5℃以上低下するアクシデントがあった。この時期は成虫の羽化数が減少し、産卵行動が抑制され産卵数が10分の1程度まで減少した（図(2)-10上段矢印）。行列モデルによるシミュレーションでこのアクシデントを再現すべく、強制的に産卵数を10分の1まで低下させ、その後の個体数の回復を確認したところ、室内飼育記録とよく一致した。以上の結果から、本研究で開発したコガタシマトビケラの推移行列モデルは、室内個体群の動態を適切に再現できると考えられた。

図(2)-10 室内飼育記録結果（上段）と密度依存性を考慮した行列モデルによるシミュレーション結果（下段）との比較