Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
以上、本課題全体で得られた成果を統合し、随伴侵入生物の体サイズや生態的特性に応じた迅速な検疫手法、侵入・定着状況のモニタリング手法、および効率的防除手法の開発を行う。また、侵入生物データベースの収録データについて、侵入経路・分布情報の規格化と検索機能の公開により、身近に進行しつつある問題としての随伴侵入生物の実態を様々な角度から提示し、広く一般に普及啓発すると同時に政策的対応の必要性を環境省にも提示する。

## 3 ．研究方法

アルゼンチンアリについては、侵入個体群のサンプル収集を国内外において行い、ミトコンドリアDNA変異に基づく系統解析を行うとともに、貿易統計データ分析により侵入経路・分布拡大プロセスの解明を試みた。また神戸港で側所的に生息する複数のスーパーコロニーを対象として、分布境界線の年変動の実態および繁殖虫の季節消長を野外調査によって明らかにした。

また、敵対性試験により、敵対性行動の時間的動態について調査した。プラスチックシャーレに異なるコロニーのワーカーを1匹ずつ入れ、5分間敵対行動の有無および強度を観察した。試験区は1区6反復行った。

次にコロニー内およびコロニー間の時空間的遺伝構造を解明するためにソフトウェア

STRUCTUREを用いてマイクロサテライトDNA対立遺伝子頻度に基づくAssignment解析を行った $ ^{13)} $

14) 15)

以上の試験によりスーパーコロニー間の敵対性レベルと遺伝構造の時空間的動態を明らかにし、スーパーコロニー間での遺伝子流動の可能性の検討を行った。

さらに防除薬剤フィプロニルが在来アリ類および地表徘徊性節足動物に与える影響を解析した。室内毒性試験により、在来アリ類とアルゼンチンアリの半数致死濃度LC50値を求めた。次に国立環境研の敷地において、フィプロニル粒剤を防除事業での施用量（0.5g/10m²）設置し、10 m²以内の地表徘徊性昆虫類の個体群動態をピットホールトラップ法により推定した。

国内外における外来アリ研究機関との連携により防除ネットワークを構築するとともに、1年に1回研究集会を開催し、情報の共有化を図った。得られた成果を公表することによって、外来生物リスク管理の普及啓発を行った。

カワヒバリガイについては、国内侵入地域のすべて水系から1地点当たり平均10個体のサンプリングを行い、これをひとつの地域個体群とみなし、国内26地域個体群から計264個体を収集した。これらの地域個体群はさらに上位集団として利根川下流域、利根川上流域、天竜川、矢作川、木曽三川、琵琶湖淀川水系の6つの地方に区分される（表1）。そして国内個体群の起源を探るため、原産国の中国、韓国より4地点、日本と同じ侵入先である、台湾、アルゼンチンの各1地点の合計90個体分のDNA試料を実験に用いた。

次にDDBJに登録されているイガイ科のCOI領域の塩基配列情報をもとに2組のプライマーセットを開発した。それらのプライマーを用いたダイレクトシーケンス法により、277個体のすべてのCOI領域約1203bpの塩基配列を解読した。まず、各地域個体群内の遺伝的多様性の程度を概観するために、遺伝子多様度、塩基多様度を計算した。次にハプロタイプ間の類縁関係を見るために、得られたデータとDDBJに登録されているイガイ科の近縁種3種の塩基配列データを用いて最節約法、
近隣接合法による系統樹を作成した。

日本産の26地域個体群を先に述べた6つの地方に分けて、AMOVA（Analysis of molecular variance）を行い、国内の侵入個体群に見られる遺伝的分化に地理的構造が見られるのか検討した。さらに27個体群間の類縁関係を推定するために、各地域個体群間の純塩基置換率(DA) $ ^{16)} $ を計算し、近隣結合法により樹状図を作成した。また地域個体群間のPairwise Fstを計算し、遺伝的分化程度の検討を行い、exact test $ ^{17)} $ を用いて、どの組み合わせでハプロタイプ頻度に有意差が見られるのかを検討した。

カエルツボカビ菌については、国立環境研究所が中核となって、サブテーマ4の課題代表である麻布大学と連携して、国内の獣医師、動物園・水族館・博物館、全国都道府県自治体および環境省の間で研究情報ネットワークを構築し、サンプル採集を実施した。情報発信・交流の場として、国立環境研究所HPの侵入生物データベース（http://www.nies.go.jp/biodiversity/invasive/）においてカエルツボカビ情報ページを掲載し、情報のアップデートを行った。さらにオーストラリア、アメリカ、韓国の研究者と情報交流を図り、海外サンプルの採集を図った。

カエルツボカビ菌の採集については既に全世界で報告され、推奨されている、両生類の皮膚を綿棒で拭って、体表の微生物を採集するというスワブサンプル法を採用した。11店舗で飼育販売されていた265個体（在来種3種、外来種15種）、12展示施設（動物園、水族館、博物館）で飼育されていた294個体（在来種17種、外来種58種）、および北海道から南西諸島にいたる964地点の野生個体5,565個体（在来種47種、外来種2種）についてスワブサンプルを採集した。さらに、パナマから73個体、オーストラリアから252個体、USAから54個体の野生両生類スワブサンプルを採集した。

得られたスワブサンプルは、Goka et al (2001) $ ^{18)} $ の方法に準じて、Lysis BufferによりDNAを抽出し、Goka et al. (2009) $ ^{19)} $ に準じてNested-PCR法によりカエルツボカビITS-DNA領域（約300塩基）を増幅して、感染の有無を判定するとともに、得られたPCR産物の塩基配列を解析してカエルツボカビ菌のDNA変異を調査した。Nested-PCR法とは、ITS1およびITS2領域を挟む18S領域および28S領域という保存性の高い領域にプライマーを設計して、ITS全体のDNA断片をPCR増幅した上で、この第1PCR産物をテンプレートとして、Annis et al (2004) $ ^{20)} $ が開発したカエルツボカビITS-DNA特異的プライマーBd1aおよびBd2aによって第2PCRを実施して、目的産物(ITS-DNA 300bp)を増幅するという方法である（図1）。この方法によって、野外の夾雑物が大量に混入したスワブサンプルにわずかに含まれるカエルツボカビ菌のDNAを効率よく、高い純度で大量に得ることができる。得られたDNA情報に基づき、最節約法による系統樹を作成した。

日本国内で発見されたカエルツボカビの毒性および両生類の感受性を調べるために、日本国内で感染が認められた在来種のシリケンイモリと、南米原産のベルツノガエルあるいは在来種ヌマガエルを仕切付きプラスチックケース内で同居飼育し、カエルツボカビの感染実験を実施した（図2）。

また、日本国内のカエルツボカビの発生動態を調べるために、在来種であるシリケンイモリと外来種のウシガエルについて、野外集団の感染率の推移を継続的に調査して感染率の季節変動を調べた。

最後に、本研究と既存研究で報告されている感染確認地点の位置情報（計245地点）を用いて、
気温と降水量データに基づき、GIS解析により世界のカエルツボカビリスクマップを作成した。

図1. Nested-PCR法の原理

1回目のPCRで確実に合成できるよう、保存性の高い18Sおよび28Sの末端領域を含むフラグメントを合成する。このとき、カエルツボカビ以外の様々な菌類のDNAも増幅される。次に、この合成DNAをテンプレートとして、カエルツボカビのITS領域に特異的なプライマーを用いてPCR反応させるとカエルツボカビのDNAフラグメントのみが大量に増幅される。

図2. 感染シリケンイモリから無菌ベルツノガエルへのカエルツボカビ水平感染実験

4. 結果・考察

アルゼンチンアリ
国内外25地点220個体の遺伝解析を行った結果、アルゼンチンアリ侵入個体群は、ヨーロッパおよび北米、オーストラリア、ニュージーランド、日本において単一の遺伝子型を持つ巨大スーパーコロニーを形成していることが明らかになった（図3）。一方、異なる遺伝子型を持つ小規模スーパーコロニーがヨーロッパ、アメリカ、日本に局所分布していた。また、日本にはこれまでのところ5遺伝子型が検出されたことから、日本は侵入地の中でもっとも遺伝的多様性が高く、国際貿易港において多くの物資の移送が行われており、アルゼンチンアリもまた急速に、そして大量に持ち込まれていることが示された。

さらに港湾統計データに基づく分析の結果、アリ類の運搬率が高い $ ^{21} $ 農水産品の最大輸入相手国がアメリカであることから、日本のアルゼンチンアリ侵入個体群はアメリカから持ち込まれた可能性が高いと推定された。アルゼンチンアリの発見年代の推移 $ ^{22} $ をみると、19世紀におもに大西洋を囲んで欧米諸国に、20世紀以降になって環太平洋諸国に分布を拡大している。このことは、19世紀まではヨーロッパを中心とした物資や人の移送が行われており、20世紀になるとアメリカやアジアを中心とした物資や人の移送へと世界貿易構造の変化と連動していると考えられる（図4）。

神戸港において女王およびオスの季節消長を調べた結果、全てのスーパーコロニーで繁殖虫が5月から7月下旬にかけて出現しており、時間的生殖隔離は認められなかった。また、敵対性試験を行った結果、ワーカー同士に比べワーカーのオスに対する敵対性レベルが低く、オスが負傷や死亡する頻度も低かった。このことから、行動学的にはスーパーコロニー間でオスを介した遺伝子流動が起きている可能性が示唆された（図5）。一方、ワーカー同士の敵対性レベルの季節変動を調べた結果、世界中に広く分布するスーパーコロニーの敵対性レベルの変動パターンが他のスーパーコロニーに同調する傾向がみられた（図6）。このことから、コロニー融合の可能性が示唆された。

マイクロサテライト遺伝子座の対立遺伝子頻度に基づく集団遺伝解析を行った結果、隣接するスーパーコロニーは遺伝的に独立しており、遺伝子流動は低頻度でしかおきていないことが明らかになった（図7）。これらの結果から、アルゼンチンアリは安定した環境下では短期間でスーパーコロニーの個体群構造が変化しないと推測される。

以上のことから、日本は他の侵入地に比べ遺伝的多様性が高く、ごく短期間で複数回の侵入がおきていることが示唆された。また、他の侵入地ではみられない遺伝子型を持つ個体群が検出されたことから、原産地から直接侵入した可能性も示された。研究成果をふまえると、アルゼンチンアリの防除スケジュールは、繁殖虫が出現する5月前の防除が効果的であり、防除ユニットとしては単一のスーパーコロニーが分布する地域では、侵入地全体の最適薬量を散布、一方複数のスーパーコロニーが分布する地域では、各スーパーコロニー単位での最適薬量を散布する必要があると考えられる。
図3．アルゼンチンアリのミトコンドリアDNAにおける最節約系統樹（サンプルHは、Vogel et al. (2010)の塩基配列情報、★は原産地を示す）
図4. アルゼンチンアリの分布と20世紀前後の世界経済構造の変化

△は原産地、〇は侵入地を示す。上図における航路は、1831年から1836年にかけてチャールズ・ダーウィンが乗船したビーグル号の航路を示している。
図5. アルゼンチンアリ神戸個体群におけるスーパーコロニー間の敵対性レベル

図6 ワーカー間の敵対性レベルの季節変動

各スーパーコロニーから任意に採集したワーカーを6ペア、5分間観察を行った得点の最大値の平均値を示す。

図7 マイクロサテライト7遺伝子座を用いたSTRUCTURE解析（K=3）

また防除剤生態リスク評価では、室内毒性試験によりフィプロニルは在来アリ類と比較してアルゼンチンアリに対して非常に高い殺虫活性を有することが示され（図8）、同所的に生息する在来アリ類に対する影響を相対的に低く抑えることができると考えられた。また、ベイト式薬剤を用いた野外実験からは薬剤設置1週間後に処理区の地表徘徊性節足動物の群集構造が無処理区と比較して有意に変化したが、4週間後には処理区と無処理区の間で群集構造に有意な差は認められなくなった。このことから薬剤による地表徘徊性昆虫類に対する影響は短期間であり、周辺環境からの地表徘徊性節足動物の再移入が開始されるものと予測された。以上の結果から、防除剤の
有効利用による低リスクでの防除手法の確立が可能と考えられた。

図8. 在来アリ類・アルゼンチンアリに対する防除剤フィプロニルの室内毒性試験

以上の研究成果を公表し、情報の共有化を図るために、国内のアルゼンチンアリ防除事業関係者を参集して、「アルゼンチンアリ研究会」を発足した。参加団体は、国立環境研究所、東京大学、香川大学、岡山大学、自然環境研究センター、アース製薬株式会社、フマキラー株式会社、および環境省自然環境局外来種対策室である。2008年12月19日に東京大学にて第1回、2010年1月25日に国立環境研究所にて第2回、2011年1月18日に香川大学にて第3回の研究集会を開催し、情報交換と防除戦略に関する議論を行った。これらの研究成果と議論をふまえて、2011年度より開始する環境研究総合推進費課題D-1101「外来動物の根絶を目指した総合的防除手法の開発」（課題代表：五箇公一）にて、防除手法の開発研究を実践することとなった。

## カワヒバリガイ

国内26地点の264個体と韓国、中国と、日本と同じく侵入地の台湾、アルゼンチンの合計6地点より90標本を得て遺伝解析を行った。その結果、合計33個のハプロタイプが検出された（表1）。

まず、日本国内に限ると、日本に見られる20個のハプロタイプのうち、1つ（H2）は大塩湖を除く残りの5地方に共通して見られ、13個（H1，3-12，14-16）は関東地域集団のみにのみ見られるハプロタイプであった（表1、図9）。残りの5つのハプロタイプ（H13，17-20）は関東地域集団（利根川下流域）には全く見られず、琵琶湖淀川水系、木曽三川、矢作川、天竜川、利根川上流域（大塩湖）の各地方に共通してみられた（表1、図9）。

次に原産地の中国の12ハプロタイプのうち4個のハプロタイプ（H2，4，10，16）が日本にも見
られ、そのうち2つ（H2，4）は中国、韓国、日本に共通で、他の1つ(H16)は中国、日本とアルゼンチンに共通だった（表1、図9）。H2は日本、中国、韓国、台湾、アルゼンチンのいずれにも見られるハプロタイプで日本でも全国的に見られるハプロタイプだったが、H4，10、16の2つは国内では関東地域集団（利根川下流域）にのみ見られた（表1、図9）。

分子系統解析の結果、関東地域集団（利根川下流域）と中国に見られる9ハプロタイプ（H1-8, 33）の単系統性が強く支持されたほかは、ハプロタイプの類縁性と、地理的分布パターンに明瞭な関係は認められなかった（図10）。

個体群間の純塩基置換率（DA）を計算し、近隣接合法により個体群間の類縁関係を調査した結果、関東平野部の侵入個体群は今回調査した中国、韓国の個体群を起源の一部とする可能性が示された（図11）。一方で、関西、中部、東海、関東内陸部に広域分布する集団の起源は別であることが示唆された。日本とアルゼンチンの個体群は遺伝的組成が大きく異なり、起源が異なる可能性が示唆された（表1、図9）。台湾のハプロタイプ（H2，16）はいずれも関東地域集団（利根川下流域）にも見られ類縁性が示唆された。

カワヒバリガイは主に輸入シジミ類などに付着して海外から侵入しているとされ、実態調査が必要とされる。今後の分布拡大を防止するためには、利水施設の建設計画段階での影響評価、水産物の検疫強化が不可欠だと考えられる。

表1．本研究で調査したカワヒバリガイの地域集団名、個体群番号、個体群名、サンプル数、ハプロタイプ数、ハプロタイプの頻度.

サンプル数	ハブロタイプ数	H01	H02	H03	H04	H05	H06	H07	H08	H09	H10	H11	H12	H13	H14	H15	H16	H17	H18	H19	H20	H21	H22	H23	H24	H25	H26	H27	H28	H29	H30	H31	H32	H33
関東地域集团
1:霞ヶ浦	10	5	2	2	1	1	4
2:黒部川-1	13	7	1	5	2	1	1	1	2
3:黒部川-2	10	7	1	2	1	1	1	2	2
4:利根川-1	10	5	1	4	1	3	1
5:利根川-2	10	5	2	4	2	1	1
6:利根川-3	10	3	4	5	1
7:長門川	10	3	6	3	1
8:前川	9	3	3	4	2
9:返田機場	9	3	1	4	4
10:鹿島用水	10	5	5	1	1	2	1
11:江戸川	10	4	5	2	2	1
12:小貝川-1	10	5	2	4	1	2	1
13:小貝川-2	9	5	3	3	1	1	1
大塩湖地域集团
14:大塩湖-1	19	3	11	3	5
15:大塩湖-2	10	4	1	5	1	3
矢作川地域集团	3	5	2
16:矢作川	11	4	1
天竜川地域集团	1	2	3	1
17:天竜川	10	5	3	1	2	3	1
木曽三川地域集团	3	4	1
18:長良川	9	4	1
19:掛斐川	11	4	2	1	5	3
琵琶湖-淀川地域集团	3	1	4
20:琵琶湖今浜	9	4	1	6	3	1
21:浜大津	10	3	1	2
22:瀬田川	10	4	2	5	4	2
23:宇治川	6	2	2	3	1
24:淀川-1	10	4	4	2	1	5
25:淀川-2	9	4	1	2	1	5
26:木津川	10	2	9	1
中国
27:崇明島	21	9	1	11	3	1	1	1	1	1	1
28:上海	12	4	1	7	1	2	1
29:太湖	7	2	5	2
韓国
30:Paldang Dam	16	2	2	14
台湾
31:Shueili River	21	2	20
アルゼンチン
32:La plata River	13	5	5	1	4	1	2
図9. 標本の採集地点と各地域個体群のハプロタイプ頻度。

白色：国内では利根川下流域地方にのみ見られるハプロタイプ；黑色：利根川上流域（大塩湖）、天竜川、矢作川、木曽三川、琵琶湖淀川水系の5地方に共通して見られるハプロタイプ；薄い灰色：全国的に分布するハプロタイプ；濃い灰色：アルゼンチンのサンプルのみで見られたハプロタイプ。円の大きさは標本数を示す。

図10．国内外のカワヒバリガイ見つかった33ハプロタイプの系統関係と同じく特定外来生物に指定される同属2種の遺伝的関係
図11. 純塩基置換率（DA）に基づく地域個体群間の近隣結合樹。

## カエルツボカビ

サブテーマ4の課題代表の麻布大学と共同で、日本全国の獣医師、社団法人日本動物園水族館協会、博物館、自治体、および環境省自然環境局との情報ネットワークを構築し、検査体制を構築した（図12）。さらに、韓国ソウル大学、オーストラリア・グリフィス大学、オーストラリアCSIRO、アメリカ・リー大学、Arkansas Game & Fish Commissionと共同研究体制を構築し、各国のサンプル採集ルートを確保した。

得られた両生類スワブサンプルをNested-PCR法により分析した結果、カエルツボカビITS-DNA領域において塩基配列に変異が認められ、ハプロタイプが50タイプ検出された。それぞれのハプロタイプに検出された順にアルファベットA～Zでコードし、途中よりアルファベットではコードが足りなくなったので、Zよりあとに検出されたハプロタイプについてはBd27～Bd50と標記した。各ハプロタイプはすべてホモ接合体で、ヘテロ接合体は検出されなかった。ハプロタイプ間の変異の特徴は、特にITS1領域における塩基の挿入・欠失による塩基長の変異が生じていることであった（ハプロタイプの塩基配列情報の一部は投稿中未公開データのためここでは示さない）。
図12. 全国カエルツボカビ検査体制の構築

ペットショップで販売されている両生類265個体を検査した結果、58個体に感染が認められた（感染率22%）（表2）。種によって感染率に差があり、特に感染率が高い種は南米原産種で、北米産ウシガエルRana castabeianaおよびアフリカ原産アフリカツメガエルXenopus laevisという実験用個体も感染率が高かった。ウシガエルをのぞき、感染個体におけるカエルツボカビのハプロタイプはAタイプもしくはCタイプがほとんどであった。ウシガエルのみ、非常に多様なタイプのカエルツボカビが検出された。

展示施設における両生類294個体を検査した結果では、12個体の感染が認められた（感染率4%）（図13）。感染が認められたのはわずかな種で、アフリカ原産のバナナガエルAfrixalus fornasinii sp.、メキシコ原産のウーパールーパーAmbystoma sp.、在来種のヤマアカガエルRana ornativentris、オオサンショウウオAndrias japonicus、野生化外来種のウシガエルRana catesbeianaから検出された。検出されたカエルツボカビのタイプは、A、B、E、F、J、K、およびMなど変異に富んでいた。

野生個体については5,565個体のうち159個体で感染が確認された（感染率3%）。感染が認められたのは、在来種8種（オオサンショウウオA. japonicus，シリケンイモリCynops ensicauda，ヌマガエルFejervarya limnocharis，アマガエルHyla japonica，トノサマガエルRana nigromaculata，ツチガエルRana rugosa、ハナサキガエルRana (Eburana) narina、リュウキュウカジカガエルBuergeria japonica）、および外来種2種（ウシガエルR. catesbeiana およびアフリカツメガエルX. laevis）のみであった。その他の在来種39種については、感染は認められなかった。日本固有種オオサンショウウオから高い確率で特異的なカエルツボカビ（B、J、K）が検出された（感染率37%）。また
沖縄固有種シリケンイモリは64％という高い感染率を示した。その他の感染在来種については、感染率は1％未満の極めて低い値を示した。外来種ウシガエルとアフリカツメガエルの感染率は、約20％と比較的高かった。最も多様なカエルツボカビに感染していたのはシリケンイモリで、28タイプ保有していた（図14）。

パナマから採集した73個体、オーストラリアから採集した252個体、およびUSAから採集した54個体の野生両生類については、それぞれ19個体、94個体および21個体から感染が確認された。検出されたカエルツボカビのハプロタイプはいずれも90％以上がAタイプで、残りはわずか数タイプのA近似型のみであった。アメリカ原産ウシガエルは、アメリカ本国内では感染率が0であった。

得られたカエルツボカビITS-DNA塩基配列情報に、既に海外で報告されている情報を加えて、最節約法により、ハプロタイプ系統樹を構築した結果、日本で発見されたカエルツボカビ（50タイプ）は海外で発見されているもの（17タイプ）よりも遺伝的多様性が圧倒的に高く、海外産カエルツボカビは日本の系統から派生したものと推定された（図15）。

表2 両生類のペットショップ販売個体におけるカエルツボカビ感染状況とカエルツボカビ ITS-DNAハプロタイプの分布

Species	Origin	Prevalence	Fungus haplotypes (number of infected amphibians)
Ambystoma mavortium	USA	0/2
Ambystoma mexicanum	Mexico	0/13
Bombina orientalis	Demographic People's republic of Korea	0/2
Breviceps adspersus	South Africa	0/2
Bufo japonicus formosus	Japan	0/3
Dendrobates auratus	Panama	0/1
Dendrobates leucomelas	Brazil	0/1
Ceratophrys cornuta	Suriname	2/3	A (1), C (1)
Ceratophrys cranwelli	Argentine	0/8
Ceratophrys ornata	Argentine, Brazil	32/89	A (22), C (10)
Cynops ensicauda	0/1
Cynops pyrrhogaster	0/1
Lepidobatrachus laevis	Argentine	1/4	A (1)
Litoria caerulea	Papua New Guinea	0/3
Phyllomedusa sauvagii	Argentine	0/3
Rana catesbeiana	Japan (Naturalized alien species)	17/17	D (1), E (4), F (5), G (2), L (1), N (1), P (1), S (1), T (1)
Rhacophorus maximus	Thailand	0/1
Xenopus laevis	South Africa	26/128	A (1), C (23), L (1), V (1)
Total	78/282	A (25), C (34), D (1), E (4), F (5), P (1), S (1), T (1), V (1)
### Aquarium. 2

Afrixalus fornasinii sp. 1/1: M (1)

Agalychnis callidryas 0/3

Agalychnis moreletii 0/1

Ambystoma mculatum 0/1

Ambystoma sp. 1/1: A (1)

Ambystoma tigrinum 0/1

Bombina orientalis 0/1

Brachytarsophrys carinensis 0/2

Bufo japonicus formosus 0/2

Bufo punctatus 0/1

Bufo viridis sp. 0/1

Ceratophrys cranwellii 0/4

Ceratophrys ornata 0/1

Chiromantes xerampelina 0/1

Cynops ensicauda 0/1

Cynops pyrrhogaster 0/1

Dendrobates auratus 0/1

Dendrobates azureus 0/1

Dendrobates leucomelas 0/1

Dyscophus guineti 0/1

Glyphoglossus molossus 0/2

H. alboguttatus 0/1

Hyla cinerea 0/1

Hyla geographica 0/1

Hyla gratiosa 0/1

Kaloula pulchra 0/1

Kassina maculata sp. 0/2

Leptopelis vermiculatus 0/4

Limnodynastes salmini 0/2

Litoria caerulea x L. infrafrenata 0/2

Mantella pulchra 0/2

Megophrys nasuta 0/1

Melanophryniscuc stelzneri 0/1

Microhyla ornata 0/1

Pedostibes hosii 0/1

Phyllomedusa bicolor 0/1

Phyllomedusa hypochondrialis 0/2

Phyllomedusa sauvagii 0/1

Pipa pipa 0/2

Polypedates leucomystax sp. 0/1

Rana catesbeiana 0/1

Rana japonica 0/2

Rana ornativentris 1/3: E (1)

Rana porosa porosa x 0/1

Ranitomeya ventrimaculata 0/4

Rhacophorus arboreus 0/3

Rhacophorus prominanus sp. 0/1

Rhacophorus schlegelii 0/1

Rhacophorus viridis amamiensis 0/3

Scaphiopus couchii 0/1

Silurana toropicalis 0/1

Siren sp. 0/1

Spea hammondi 0/1

Uperoleia sp. 0/1

Xenopus laevis 0/1

Aquarium. 6

Ambystoma sp. 0/1

Buergeria buergeri 0/3

Buergeria japonica 0/2

Ceratophrys cranwelli 0/1

Cynops ensicauda 0/10

Cynops pyrrhogaster 0/2

Fejervarya limnocharis 0/3

Litoria caerulea 0/1

Microhyla ornata 0/1

Polypedates leucomystax leucomystax 0/2

Pyxicephalus adspersus 0/1

Rana narina 0/1

Rana okinawana 0/1

Rana supranarina 0/4

Rhacophorus viridis viridis 0/2

図13. 展示施設におけるカエルツボカビ感染率およびカエルツボカビDNAハプロタイプの分布
図14a 野生両生類個体におけるカエルツボカビ感染率およびカエルツボカビDNAハプロタイプの分布（本土）
図14b 野生両生類個体におけるカエルツボカビ感染率およびカエルツボカビDNAハプロタイプの分布（南西諸島）
図15. カエルツボカビITS-DNAハプロタイプの最節約系統樹

大きいフォントで記されているOTUが日本国内で発見されたハプロタイプを示し、小さいフォントで記されているのがこれまでに海外で報告されているハプロタイプを示す。

次に在来種シリケンイモリの感染個体もしくは非感染個体と南米原産ベルツノガエルの同居飼育実験を行った結果、10日以内に100%（7/7）感染していることがNested-PCR検査によって示された（図16）。140日間の飼育期間を通して、ベルツノガエルの感染率の低下は認められず、感染は継続していた。さらにベルツノガエル感染個体は非感染個体と比較して成長率が有意に低下していた（図17）。同様の実験を在来種ヌマガエルへの感染で実施した結果、感染は認められたが発症はしなかった。このことから、日本のカエルツボカビは海外の両生類に対して有害であるが、日本の両生類は抵抗性を有しており、発症しないことが示唆された。

さらに野外集団の感染率の季節変動を調査した。その結果、神奈川県のウシガエルの感染率には季節変動が見られ、冬季から春季（3月）に感染率が上がり（感染率：最大66%）、夏季（8－10月）には感染個体は見られなくなった（図18）。一方で在来種のシリケンイモリの感染率には明瞭な季節性は見られず1年を通して0-52%の間で推移した（図18）。シリケンイモリの感染率には生息環境の違いが感染率に影響するようで、水中に生息していた個体の感染率（14-63%）は陸上に生息していた個体の感染率（0－27.3%）に比べてほぼすべての季節で高かった。ウシガエルとシリケンイモリに見られる感染率の年変動の違いには、カエルツボカビの生理的な特性と生息地の水温の年変動の違いが影響している可能性がある。これまでの先行研究からカエルツボカビ
は低温を好むが高温に弱いことが知られている $ ^{23)} $ （Kriger and Hero，2007）。また今回調査したウシガエルの生息地の水温は冬季は7℃近くまで低下するが夏季は22℃を超える。一方でシリケンイモリの生息地は沖縄の湧水池付近で一年を通して水温が15から20℃の範囲内で安定していた。おそらくウシガエルの生息地では冬季にカエルツボカビが爆発的に増殖し夏季には激減するのに対し、シリケンイモリの生息地では一年を通してカエルツボカビが安定して増殖しているものと考えられる。

最後にカエルツボカビの全世界リスクマップを作成した結果、日本以外でリスクが高かったオーストラリア、中南北米等の地域は、両生類が減少しているものの原因不明とされているそれらの地域 $ ^{24} $ と一致した（図19）。これはカエルツボカビが生息地の減少や過剰採取と並ぶ世界的な両生類減少の要因であることの傍証となった。

図16. シリケンイモリからベルツノガエルへのカエルツボカビ水平感染実験におけるPCR検査結果ベルツノガエルは全て、実験前は無菌状態であった。非感染のシリケンイモリと同居した区（Control区）では試験7区全てにおいて、10日後になってもベルツノガエルからはカエルツボカビのITS-DNA（300bp）は検出されていない。一方、感染シリケンイモリと同居した区では試験7区全てにおいて、ベルツノガエルからもカエルツボカビITS-DNAが明確に検出された。
図17 カエルツボカビに感染したベルツノガエル試験個体群と非感染のベルツノガエル試験個体群の成長直線（体長ベース）
図18. 神奈川県産のウシガエル幼生（上）および沖縄県産のシリケンイモリ（下）の感染率と水温の年変動

ウシガエルの感染率には明瞭な季節変動が見られ、水温の低下する冬期に感染率が上昇し、夏季には感染率の低下が見られる。一方、シリケンイモリの感染率には季節変動が見られない。湧水の水温が15－20℃とカエルツボカビの好む温度が年中保たれているためか、一年を通してカエルツボカビの感染が見られる。
図19. カエルツボカビのリスクマップ

リスクは0～1で表し、1に近づくほどカエルツボカビの生息に適しているため感染リスクが高い地域を示す。

以上の結果から、日本国内には、野生個体および室内飼育個体を含めて、カエルツボカビ菌の感染が認められ、しかもその遺伝的多様性が海外と比較して圧倒的に高いことが示された。しかも、オオサンショウウオという日本固有種に特異的なカエルツボカビ菌が感染していたことから、かなり古くからカエルツボカビ菌が日本国内には生息していたことが示唆される。ちなみに、オオサンショウウオのスワブサンプルから検出されたDNAが、本当にカエルツボカビ菌由来であるか確かめるために、我々は皮膚組織の病理検査も実施し、カエルツボカビ菌特有の形態を確認している。さらに、国内に所蔵されているオオサンショウウオ標本の病理検査も実施した結果、1902年という古いサンプルからもカエルツボカビ菌形態を確認している。これは、従来の、カエルツボカビ発祥の自然宿主とされるアフリカツメガエルの最古感染標本（1938年）よりもさらに30年以上古くに遡る、世界最古のカエルツボカビ標本ということになる。その他のハプロタイプについてはスワブサンプルしかないため形態精査は行っていないが、リボソームRNA18S領域および28S領域もNested-PCRにより増幅し、それらの配列がDNAデータベースに登録されているカエルツボカビ菌DNA（ハーバード大・マサチューセッツ工科大によるカエルツボカビ菌全ゲノム解析プロジェクトデータhttp://www.broad.mit.edu）と100%のホモロジーを示すことを確認している。国内で感染している在来種については、オオサンショウウオやシリケンイモリなど高感染率の種も含めて、一切、健康上には異常は認められなかった。逆に、野外で発見された異常死亡個体からは一切カエルツボカビ菌は検出されていない。このことは在来両生類がカエルツボカビ菌に対して抵抗性を有しており、両生類と菌の間に長い共進化をへて（片利）共生関係が生まれていることを示唆する。

一方、カエルツボカビの被害が世界でも最も著しい、中米パナマおよびオーストラリア東海岸では野生個体における感染率は日本に比べて高く、またカエルツボカビ菌の遺伝的多様性は極めて低かった。このことは、カエルツボカビ菌の起源は日本を含むアジアにあり、そこから世界各地に飛び火的に分布拡大して、猛威をふるっている、という、「カエルツボカビ・アジア起源説」
という新しい仮説が立てられる（図20）。日本国内ではウシガエルが最も多様なカエルツボカビ菌に感染していたが、これは北米原産のウシガエルは当初無菌状態で輸入され、アジアで養殖・野生化を繰り返す中で、日本国内にcrypticに生息している様々なカエルツボカビ菌が宿主転換した結果でないかと類推される。実際に野外における感染率をみると、同所的に生息する在来種よりもかなり高く、二次的感染が示唆される。

図20. カエルツボカビのアジア起源説概念図。ITS-DNA領域の塩基配列情報から、これまでに日本に多様性の中心があるという結果が出ている。

ペット用の両生類は海外から日本に輸入されるケースがほとんどであると考えられがちであるが、実際には、生きたオオサンショウウオを国外の博物館などに展示用に大量に輸出するケースがある。またウシガエルもかつては日本および中国で大量に養殖して、他国に販売していた時代がある。従って、カエルツボカビ菌がアジアから世界に拡散するルートも十分に想定される。いずれにしても、カエルツボカビという菌自体が発見されて間もなく、生物学的情報が不足している中では、全てが推測の域を出ず、日本、アジア、そして世界のカエルを取り巻く情勢は極めて混沌としている。今後、カエルツボカビの分布拡大プロセスについては、従来のアフリカツメガエル起源説を見直して、世界中のカエルツボカビ菌の遺伝学的・生態学的特性を調査し、詳細に解析する必要がある。

そもそも、アフリカツメガエルが起源だとしても、アジアのカエルが起源だとしても、どちらのカエルも人為的に移送される先は実験室内や展示施設や個人の家の中など人為的環境エリアと考えられる。では、カエルツボカビは、なぜそのような人為環境から中南米の奥地に侵入を果たしたのか？それは、やはり「人」が運んだとしか考えられない。中南米では林産資源としてのみならず、エコツーリズムなど観光資源として熱帯林地域を活用する動きが活発になっており、近年、様々な国から多くの人間が訪れて、熱帯林の奥地まで足を踏み入れている。これまで人間世
界から隔絶されてひっそりと生きてきた両生類の生息空間に人が足を踏み入れたことによって、下界からカエルツボカビ菌が持ち込まれ、免疫のない両生類の間でこの菌は瞬く間に広がったのではないか。一方、アジア地域では、水田環境も含めてもともとカエルと人が接触する場面が多く、この地域に生息するカエルたちは、常に人為攪乱の脅威にさらされながら、生きてきたため、カエルツボカビに対しても既に抵抗性を獲得しており、大きな被害は生じないのかも知れない。人との付き合いの浅いカエルたちが、今、人が持ち込んだ病原体によって危機にさらされているというのが、カエルツボカビ大流行の経緯と推測される。

では、日本の両生類は、カエルツボカビ菌によって害を被ることはないと断言できるであろうか？サブテーマ4課題代表の麻布大の調査によれば、輸入カエルから分離されたカエルツボカビ菌株（Cタイプ）を用いた室内感染実験において在来種の一部に感染と発症の事例があることが詳細報告にも記されている。海外から持ち込まれるカエルツボカビ菌の中には日本には生息していないタイプが含まれているかも知れず、その場合は、共進化を経ていない新型病原菌として日本の在来両生類に対して強毒性を示す可能性がある。また、パナマにおけるカエルツボカビ症の感染爆発にはバナナプランテーションなどの土地開発が密接に関係していることが統計的に示されており $ ^{25} $ 、農薬などの環境攪乱要因あるいは生理攪乱要因が両生類の免疫機能を低下させ、感染症の感染爆発を引き起こすことも想定される。つまり、常在菌として生息する菌も環境が変化することにより、有害な菌に変貌する恐れがある。今後、環境要因とカエルツボカビ症発症の関係について詳細に調査を進め、グローバル・リスクマップに反映させ、より確度の高いリスク管理に結びつける必要がある。

カエルツボカビの問題を通して得られる最大の教訓は、生物移送がもたらす新興感染症の感染爆発のリスクである。カエルツボカビ症は両生類固有の病気であるが、寄生生物問題の本質がそこにはっきりと示されている。いかなる寄生生物にも、長きにわたる共進化を経て、共生関係に至った自然宿主が存在し、宿主-寄生生物間の共進化が両者の多様性を育んできたと考えられる。恐らく、カエルツボカビにも付き合いの長い自然宿主となる両生類が存在し、カエルツボカビはその両生類の生息域でのみ生息していたのではないか。しかし、人間がその宿主両生類とともにこの菌を全く異なる環境に移送したことから、カエルツボカビはそれまで全く出会ったことのない、免疫のない両生類に対して重大な被害を及ぼすに至ったというシナリオが想定される。

そして、宿主-寄生生物間の共生関係の攪乱は、実は、われわれ人間にとって脅威となる新興感染症の流行にも密接に結びついている。例えばHIVやSARSなどの突発出現ウィルス（Emerging virus）と呼ばれる新興感染症病原体はいずれも自然宿主（キクガシラコウモリやチンパンジー等）に対しては無害であり、自然宿主と共生関係にある。しかし、近年の人間による生態系攪乱が、ウィルス-自然宿主間の共生関係を崩壊させ、人間自身がウィルスと接触する機会が増大したことで、様々な新興感染症が多発しているのではないかと考えられている $ ^{26} $ $ ^{27} $ $ ^{28} $ 。問題なのは病原体自身ではなく、その共生関係を攪乱している人間活動にある。自然環境が破壊され、宿主生物が移送されることにより、寄生生物はその生息場所を失い、宿主転換を図り、人間を含む生態系に対して重大な被害を及ぼさざるを得なくなっている。自然共生という言葉が唱われて久しいが、寄生生物との共生をはかり、人間の安全で健康な生活を守るためにも、寄生生物の進化的重要単位ESUを守るという視点も必要だと考えられる。
以上、アルゼンチンアリ（外来アリ）、カワヒバリガイ（外来淡水生物）、およびカエルツボカビ（外来寄生生物）の研究成果については、国立環境研究所侵入生物データベースに反映させ、一般への最新情報の公開と普及啓発に活用した。本研究課題を通して、非意図的な随伴侵入生物は、人為輸送ルートの開拓および環境改変によって、その侵入ルートおよび分布拡大プロセスが大きく影響を受けることが予測され、生態学的調査にとどまらず、社会的・経済的背景にも注目してデータを収集し、総合的リスク評価を図ることが重要と考えられる。

また、特に、生態系を守る立場にある我々生態学者は、国内外で自分の「生息地」以外のフィールドに出掛けて調査する機会が多いが、生態系を守るという目的のためにも自分の体に付着する「目に見えない異物」に十分な注意を払う必要があることも示された。

## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

アルゼンチンアリ、カワヒバリガイ、およびカエルツボカビという分類群の異なる非意図的随伴侵入生物を対象として、その遺伝的変異を詳細に解析するとともに、貿易や水路開発など人為的環境改変要因との関係を検討して、侵入ルートおよび分布拡大プロセスのシナリオ構築が行われた。

## （２）地球環境政策への貢献

アルゼンチンアリおよびカワヒバリガイの研究成果は、生物多様性条約事務局CBD発行の科学論文特集BIODIVERSITYにおいて、日本の侵入生物トピックのReview論文として2009年に度掲載された。アルゼンチンアリ研究ネットワークを通じて、2008年度に環境省中国四国地方環境事務所が実施している防除事業に対して、2009年度には環境省中部地方環境事務所が実施している防除事業に対して防除手法およびそのリスク評価について提案を行った。カエルツボカビについての成果は、2009年度にMolecular Ecologyに、2010年度にOIE国際獣疫事務局会誌に掲載され、国際的に大きな反響を呼んだ。さらにこの問題を通じて、生態学と獣医学のインターフェースが構築され、課題代表の五箇は獣医学関係の研究集会においても招待講演を行った。また、2010年10月名古屋で開催されたCBD-COP10においても成果発表を行い、2011年2月スイス・ジュネーブで開催されたCBD外来種専門家会合にも招聘された。IUCN国際自然保護連合主催のAmphibian Arc Project 両生類箱船計画の策定にも専門家として招聘され貢献した。カワヒバリガイの分布拡大プロセスの解明は、国土交通省が建設を進めている霞ヶ浦導水事業に対して侵入生物（特定外来生物）の分布拡大リスクを提示するとともに、その防除対策について具体的提言につながる。カエルツボカビの侵入ルート・分布拡大プロセスに関する研究成果は、国際的な両生類減少の要因解析に貢献するとともに、「生物多様性と感染症pandemic」という概念に実証例を提供する。

### 6 \. 引用文献

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