Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
その後、黄砂の拡散とともに細菌数は検出限界以下まで低下していることから、黄砂現象とともに細菌が飛来し、その現存量が変化していることが示された。また、2011年5月2日に観測された大規模な黄砂飛来時においても、 $ 7 \times 10^{4} $ cells/m³の細菌が検出されており、黄砂飛来時には大気中の細菌現存量が増加し、最大で $ 10^{4} $ cells/m³であることがわかった（表(1)-1c）。この値は、一般的な土壌と比較しても非常に微量であることがわかった。一方で、従来の培養法ではほとんど細菌が検出できなかったことから（data not shown）、培養に依存しない手法による解析の重要性も明らかになった。

a) 2010年3月～11月

采取地点	采取日	黄砂	采取高度(m)	细菌数(cells/m³)
兵庫県	20 Mar.	+	1,800	< 3 x 10³
南部	21 Mar.	+	1,500	4 x 10³
22 Mar.	+	1,800	< 6 x 10³
26 Mar.	+	1,500	8 x 10³
28 Apr.	+	1,500	5 x 10²
29 Apr.	+	1,500	2 x 10³
22 May	—	1,500	7 x 10³
24 Jun.	—	1,500	5 x 10⁴
23 Jul.	—	1,500	4 x 10⁴
19 Aug.	—	1,800	< 3 x 10³
28 Sep.	—	1,800	2 x 10³
05 Nov.	—	1,800	< 5 x 10²

c) 2011年4月～5月

b) 2010年11月

採取地点	採取日	黃砂	採取高度(m)	細菌数(cells/m³)
兵庫県	11 Nov.	—	1,500	< 3 x 10²
南部	12 Nov.	++	900	1 x 10⁴
13 Nov.	+	750	< 8 x 10²
16 Nov.	—	900	< 2 x 10²
鳥取県	12 Nov.	++	900	4 x 10⁴
北部	13 Nov.	+	750	2 x 10⁴
16 Nov	—	900	< 4 x 10²

採取地点	採取日	黄砂	採取高度 (m)	細菌数 (cells/m³)
10 April	+	900	9 x 10³
02 May	++	900	7 x 10⁴

表(1)-1. 日本上空で採取した黄砂中に存在する細菌の現存量

後述(2)-4)のクローンライブラリの結果をもとに、細菌あたりの16S rRNA遺伝子のコピー数を4コピーとして細菌数を算出した。

以上の結果より、黄砂現象ととともに飛来する細菌の環境・健康への影響を評価する上で不可欠である細菌数に関する定量的な情報を得ることができた。また、黄砂飛来時を中心として非黄砂時も含めて合計23回にわたる測定を行ったこと、さらに、黄砂飛来前から終息までの細菌数の変化を捉えることができ、黄砂現象にともなう大気中の細菌の動態に関する基盤的情報を得ることができた。

## 3 ）PCR-DGGE法による細菌の多様性評価

黄砂に付着した細菌数は前述(2)-2)の結果からも微量であることが明らかである。そこで、前述(1)-2)で最適化したNested PCR法およびPCR-DGGE法を用いて、黄砂とともに飛来する細菌種を推定した。まず、日本上空（鳥取県北部および兵庫県南部の沿岸部：高度1,000-2,000 m）で採取した黄砂試料から直接DNAを抽出し、PCR-DGGE法で解析した結果、黄砂試料中には多様な種の細菌が存在していることがわかった（図(1)-7）。さらに、特徴的なバンド（オレンジで示すバンド）を切り出し、シーケンスを行い、細菌種を推定するとともに、系統解析を行った（図(1)-8）。その結果、黄砂中にはFirmicutes、Bacteroidetes、Alphaproteobacteria、Gammaproteobacteria、Actinobacteria、Cyanobacteriaに属する多様な細菌が存在することが推
定され、黄砂現象にともなって多様な種の細菌が飛来していることを明らかにした。また、これまでに報告のあるFirmicutes、Actinobacteriaといったグラム陽性菌だけでなく、本研究ではBacteroidetes、Alphaproteobacteria、Gammaproteobacteriaなどのグラム陰性菌も検出され、比較的多くの系統学的クラスターが形成されていることが明らかになった。

図(1)-7. 日本上空で採取した黄砂中に存在する細菌のDGGEプロファイルオレンジ色で示すバンドを切りだし、シーケンス解析を行った。

図(1)-8. 日本上空で採取した黄砂中に存在する細菌の系統解析

図(1)-7のオレンジ色で示すバンドを切りだし、シーケンスを行い、系統樹を作成した。黄色が黄砂飛来時、青色が非黄砂時を示す。
## 4 ）クローンライブラリ法による細菌の多様性評価

前述(2)-3)でのPCR-DGGE法による群集構造解析は、Nested PCR法を併用することで、微量な試料からの検出を可能にしている一方で、定量的な結果を得ることができない。一方で、クローンライブラリ法は、定量的な群集構造解析が可能な一方で、多量のDNAが必要となる。

本研究期間においては、大規模な黄砂現象が観測された2010年11月12日および2011年5月2日の試料においてのみ、クローンライブラリ法に十分なDNA量を得ることができたことから、その解析を行った。黄砂試料から直接DNAを抽出し、細菌の16S rRNA遺伝子の全長を標的としてクローンライブラリを作成した。各480クローンの塩基配列を解析した結果、黄砂とともに飛来する細菌は、従来報告されていた以上に系統学的に多様であることを明らかにした（図(1)-9）。また、重篤な病原性が報告されている種の細菌は検出されず、土壌など一般的な環境中での存在が報告されている細菌がほとんどであった。従来の報告では、Bacillus属の細菌が多く検出されており、芽胞を形成することによる環境ストレス耐性に起因すると考えられていた。しかし本研究では、Bacillus属の細菌も多く存在するものの、Actinobacteria、Sphingobacteria、Alphaproteobacteriaが高い割合で存在することがわかった。また、構成比率は少ないものの、GammaproteobacteriaやBetaproteobacteriaなども存在することが明らかになった。さらに、異なる黄砂イベントであっても、構成比率は変わるものの、多様な細菌が存在することが明らかになった。

図(1)-9. 日本上空で採取した黄砂中に存在する細菌の多様性

黄砂試料から直接DNAを抽出し、16S rRNA遺伝子の全長を標的として、各480クローンについて解析した。両日ともに大規模な黄砂現象が観測された。
一方、黄砂試料を標準培地およびR2A培地で培養した場合についても同様に各480クローンについて塩基配列を解析した結果、細菌群集構造は大きく変化し、一部の種の細菌が優占し、さらに培地の種類によっても異なることが明らかになった（図(1)-10）。この結果は、これらの種の細菌が増殖活性をもっていることを示すとともに、培養法のみでは偏った結果を導く可能性があることを示している。

図(1)-10. 培養にともなう細菌群集構造の変化

黄砂試料を液体培地で培養した後、DNAを抽出し、16S rRNA遺伝子の全長を標的として、各480クローンについて解析した。

本サブテーマにより、黄砂粒子は微生物のキャリアーとなることを直接的に証明するとともに、黄砂現象とともに日本へ飛来する細菌の現存量を明らかにした。さらに、その属種についても明らかにするとともに、黄砂現象とともに日本へ飛来する細菌について約2,000クローンのデータベースを構築した（表(1)-2：巻末に記載）。なお、本データベースは公開する予定である。

## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

黄砂やサハラダストなどの風送ダストは地球規模での環境問題となっている。本サブテーマでは、日本上空において直接採取した黄砂粒子上に細菌が付着していること証明するとともに、その現存量に関する情報を得ることができた。また、従来報告されていた以上に多様な種の細菌が飛来しており、増殖活性をもった細菌も飛来していることを明らかにした。今回得られた成果は黄砂現象にともなう地球規模での微生物移動および環境・健康への影響を評価するうえで、基盤的なデータとなる。
また、本サブテーマで検討し、最適化した「微量試料からのDNA増幅法」や「固体表面の細菌の可視化法」は、環境微生物学分野のみならず、微生物検査や品質管理など、環境中の細菌を対象とする様々な分野で応用が可能である。

## （２）環境政策への貢献

地上からの影響を受けることなく日本上空で捕集した黄砂に付着した細菌の現存量およびその属種に関する定量的データは、黄砂そのものの環境・健康への影響を明らかにするうえで必須のデータであり、これらの基盤的データをもとにして、黄砂に対する国際的な議論が可能となる。また、多種多様な細菌が風送ダストにより移動しているという事実は、COP10等で論議されている微生物遺伝子の資源としての妥当性を考えるうえでも重要な知見である。

## 6 ．国際共同研究等の状況

中国農業大学・李品芳教授（中国）に研究協力を依頼し、黄砂発生源地域での試料採取にあたっては同行いただき、コーディネーションならびに現地での情報収集等に協力いただいている。2010年6月には馬場が中国・黄土高原において試料採取を行う際にも同行をいただき、現地での土壤採取を行うとともに、中国における黄砂発生の現状や土地利用、農業形態に関する情報を提供いただいた。また、2011年7月には山口・馬場が中国・ゴビ沙漠で試料採取を行う際にも同行いただくとともに、内蒙古自治区の水利土木局への協力要請などのコーディネーションにも協力いただくなど、密接な関係を築いている。

### 7. 研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

<論文（査読あり）>

1) N. Yamaguchi, A. Sakotani, T. Ichijo, T. Kenzaka, K. Tani, T. Baba and M. Nasu: Biological and Pharmaceutical Bulletin, 35, 1187-1190 (2012)

“Break down of Asian dust particle on wet surface and their possibilities of cause of respiratory health effects”

2) N. Yamaguchi, T. Ichijo, A. Sakotani, T. Baba and M. Nasu: Sci. Rep. (in press) "Global dispersion of bacterial cells on Asian dust"

## くその他誌上発表（依頼原稿）>

1）山口進康、那須正夫：ファルマシア, 46, 659-663 (2010)

「地球を巡る微生物－健康な生活を保証する－」

2） 山口進康：化学療法の領域, 26, 2434-2444 (2010)

「環境微生物検出技術のイノベーション」
## （2） 口頭発表（学会等）

1）馬場貴志、一條知昭、天野翔子、山口進康、那須正夫：フォーラム2009 衛生薬学・環境トキシコロジー(2009)

「黄砂現象にともなう細菌の長距離移動」

2）馬場貴志：第4回大気バイオエアロゾルシンポジウム（2010）「黄砂現象により移動する細菌の現存量」

3) 馬場貴志、一條知昭、天野翔子、山口進康、那須正夫:第83回日本細菌学会総会(2010)「黄砂現象にともなう細菌の長距離移動」

4) 馬場貴志、天野翔子、一條知昭、山口進康、那須正夫:日本薬学会第130年会（2010）「黄砂現象にともなう細菌の長距離移動」

5) T. Baba, T. Ichijo, S. Amano, N. Yamaguchi and M. Nasu: $ 13^{th} $ International Symposium on Microbial Ecology, Seattle, USA, 2010

“Estimation of abundance of bacteria on Asian dust by quantitative PCR”

6) 馬場貴志、一條知昭、更家信、榎木香奈美、山口進康、那須正夫:第26回日本微生物生態学会（2010）

「黄砂現象とともに移動する細菌の多様性」

7) N. Yamaguchi, T. Ichijo, Y. Himezawa, K. Enoki, M. Saraya, T. Baba and M. Nasu: The 4 $ ^{th} $ International Symposium on Environment of Rim of the Japan/East Sea, Jeju-do, Korea, 2010

“Abundance and population structure of bacteria on Asian dust determined by PCR-based approaches”

8) 馬場貴志、姫澤由佳、一條知昭、山口進康、那須正夫：日本薬学会第131年会（2011）「レーザー顕微鏡を用いた黄砂粒子に付着している微生物の可視化」

9) 馬場貴志、更家信、一條知昭、山口進康、那須正夫：日本薬学会第131年会（2011）「黄砂現象に伴って移動する細菌の多様性」

10) 馬場貴志、榎木香奈実、一條知昭、山口進康、那須正夫：日本薬学会第131年会（2011）「増殖活性にもとづいた黄砂現象に伴って移動する細菌の系統解析」

11）馬場貴志、更家信、榎木香奈実、山口進康，那須正夫：第27回日本微生物生態学会（2011）「黄砂現象に伴い移動する細菌の系統解析」

12）馬場貴志、姫澤由佳、一條知昭、山口進康、那須正夫：第61回日本薬学会近畿支部総会・大会（2011）

「黄砂現象とともに飛来する微生物の可視化」

13）馬場貴志、榎木香奈実、更家信、一條知昭、山口進康、那須正夫：第61回日本薬学会近畿支部総会・大会（2011）

「黄砂現象に伴い移動する細菌の多様性」

14）馬場貴志、姫澤由佳、一條知昭、山口進康、那須正夫：フォーラム2011 衛生薬学・環境トキシコロジー（2011）

「黄砂現象とともに飛来する微生物の可視化」
15）山口進康、馬場貴志、榎木香奈実、更家信、一條知昭、那須正夫：フォーラム2011 衛生薬学・環境トキシコロジー（2011）

「黄砂現象に伴い移動する細菌の多様性」

16) N. Yamaguchi, T. Ichijo, A. Sakotani, T. Baba and M. Nasu: 112th American Society for Microbiology General Meeting, San Francisco, USA, 2012

“Global dispersion of bacterial cells on Asian dust”（アブストラクト提出済）

## （3） 出願特許

特に記載すべき事項はない。

## （４）シンポジウム、セミナーの開催（主催のもの）

1) 第4回大気バイオエアロブルシンポジウム（金沢大学との共催）（2010年3月14日、名古屋市ポートビル、参加者約40名）

2) 黄砂現象の環境・健康影響 — 微生物および化学物質の長距離移動—（総合地球環境学研究所、金沢大学との共催）（2011年4月15日、総合地球環境学研究所 セミナー室1・2、参加者約30名）

3) Health and Environment: environmental problem and infection diseases （2012年3月19日、大阪大学特别講義室、参加者約30名）

## （５）マスコミ等への公表・報道等

特に記載すべき事項はない

## (6) その他

1) 第61回日本薬学会近畿支部総会・大会（2011）ポスター賞「黄砂現象とともに飛来する微生物の可視化」

馬場貴志、姫澤由佳、一條知昭、山口進康、那須正夫

2) 112th American Society for Microbiology General Meeting (2012) ハイライトに選出 “Global dispersion of bacterial cells on Asian dust”

N. Yamaguchi, T. Ichijo, A. Sakotani, T. Baba and M. Nasu

### 8 \. 引用文献

1) 長崎県環境保健研究センター資料

http://www.pref.nagasaki.jp/eiken/taiki/kousa.html

2) 西川雅高 他：天気, 38, 221-228, 1991.

「黄砂エアロゾルの降下量分布」

3) 山口進康, 那須正夫: 日本細菌学雑誌, 61, 251-260, 2006.

「蛍光染色による細菌の可視化と迅速・高精度検出」
4) T. Iwamoto et al.: FEMS Microbiol. Ecol., 32, 129-141, 2000.

“Monitoring impact of in situ biostimulation treatment on groundwater bacterial community by DGGE”

5) R.I. Amann, W. Ludwig and K-H. Schleifer: Microbiol. Rev., 143–169, 1995.

“Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation”

6) N. Yamaguchi and M. Nasu: J. Appl. Microbiol., 83, 43–52, 1997.

“Flow cytometric analysis of bacterial respiratory and enzymatic activity in the natural aquatic environment”

7) M. Kawai et al.: J. Appl. Microbiol., 86, 496-504, 1999.

7) M. Kawai et al.: J. Appl. Microbiol., 86, 496-504, 1999.

“Rapid enumeration of physiologically active bacteria in purified water used in the pharmaceutical manufacturing process”

8) T. Baba, R. Matsumoto, N. Yamaguchi and M. Nasu: Microbes Environ., 24, 163-167, 2009.

“Bacterial population dynamics in a reverse-osmosis water purification system determined by fluorescent staining and PCR-denaturing gradient gel electrophoresis”

9) T. Baba, N. Inoue, N. Yamaguchi and Nasu: Microbes Environ.

“Rapid enumeration of active Legionella pneumophila in freshwater environments by the microcolony method combined with direct fluorescent antibody staining” (in press)

10) M. Kawai et al.: Appl. Environ. Microbiol., 68, 699-704, 2002.

“16S ribosomal DNA-based analysis of bacterial diversity in purified water used in pharmaceutical manufacturing processes by PCR and denaturing gradient gel electrophoresis”

11) Y. Nishimura et al.: Microbes Environ., 25, 22-27, 2010.

“Similarity of bacterial community structure between Asian dust and its sources determined by rRNA gene-targeted approaches”
## （２）黄砂付着微生物の遺伝子生態学的解析

大阪大谷大学薬学部 谷 佳津治

<研究協力者>

大阪大谷大学薬学部

見坂 武彦

迫谷 有希子

平成21～23年度累計予算額：2,746千円（うち、平成23年度予算額：863千円）予算額は、間接経費を含む。

## [要旨]

黄砂現象の環境・健康リスクを考える上で、中国から黄砂とともに飛来する細菌の量やその属種を把握しておくことが重要である。しかしながら、タクラマカン沙漠、ゴビ沙漠、黄土高原といった黄砂発生源とされる乾燥地域における細菌群集に関する知見はほとんどない。そこで本サプテーマでは、中国の黄砂発生源に存在する細菌種について、16SリボソームRNA（rRNA）遺伝子を標的としてクローンライブラリを作成し、その系統解析を行った。その結果、乾燥地域であっても、系統学的に多様な細菌が存在することを明らかにした。優占種としては、Actinobacteria、Bacilli、Sphingobacteria、Betaproteobacteriaに属する細菌であり、Gammaproteobacteriaなどヒトと密接なつながりを持つ細菌も存在することがわかった。さらに、中国・北京市へ飛来した黄砂中に存在する細菌も多種多様であったことから、サブテーマ（1）の結果：「日本へ飛来する細菌種の多様性」を裏付けるデータを得ることができた。中国国内においては、日本と比較して黄砂の規模が大きいことから、黄砂現象の環境・生態系への影響はより顕著であると考えられ、日本における黄砂の影響を比較・評価する上で重要な知見を得た。

[キーワード] 黄砂、黄砂発生源、中国・北京、細菌群集構造、系統解析
### 1. はじめに

黄砂は中国やモンゴルの乾燥・半乾燥地域を発生源として、中国国内のみならず、韓国や日本など東アジアの広範な地域へ飛来しており、日本へ到達する総量は年間100万トン以上¹、多い年には200万から300万トンにおよぶとされている²。黄砂現象の環境や生態系、あるいは健康への影響を明らかにするためには、黄砂発生源に存在する細菌種に関する情報が不可欠である。過去の研究において、我々の研究グループは、黄砂発生源の一つである黄土高原の土壌中には、多様な細菌種が存在することを明らかにしている³。また、中国・北京市に飛来した黄砂中の細菌群集構造と発生源土壌の細菌群集構造との比較解析を行っている⁴。しかしながら、その他に、黄砂発生源とされるタクラマカン沙漠、ゴビ沙漠、黄土高原などに存在する微生物に関する知見はほとんどない。黄砂の環境・健康への影響を考える上で、発生源土壌に存在する細菌種に関する情報が必須であり、さらに、黄砂の飛来について、発生源から日本へいたる経路において、その細菌現存量や細菌種に関するデータを蓄積し、黄砂現象を連続的な事象として捉える必要がある。

### 2. 研究開発目的

細菌の長距離移動による環境や健康への影響を明らかにするためには、黄砂発生源に存在する細菌種に関する情報が不可欠であるにもかかわらず、発生源は「沙漠」というイメージが定着しており、非常に特殊な極限環境であるという認識があることから、黄砂現象とともに乾燥耐性などの特徴をもつ種の細菌が飛来すると考えられている $ ^{5)} $ 。しかしながら、発生源における細菌群集については未知な部分が多い。また、黄砂が発生源から日本へいたる経路において、その中間に位置する中国・北京市においては、日本と比較して飛来する黄砂の量、頻度ともに高く、その影響を顕著に受けていると考えられることから、黄砂の環境や生態系、あるいは健康への影響を考察する上で重要な知見となると考えられるが、中国国内で採取した黄砂中の微生物に関する知見も非常に少ない。

そこで、本サブテーマでは、黄砂の健康・環境への影響を評価するための基盤的情報の蓄積を目的として、黄砂発生源であるタクラマカン沙漠、ゴビ沙漠、黄土高原に存在する細菌の16SリボソームRNA（rRNA）遺伝子の配列を決定し、比較検討した。さらに、中国・北京市において、飛来した黄砂粒子を採取し、その細菌現存量や属種、さらに群集構造を明らかにした。

### 3. 研究開発方法

## （１）黄砂発生源土壌における細菌群集構造解析

大阪大学大学院薬学研究科のグループが採取したタクラマカン沙漠、ゴビ沙漠、黄土高原の各土壌から、Nishimuraらの方法 $ ^{4)} $ にしたがって、直接DNAを抽出した。細菌の16S rRNA遺伝子の全長を標的として、各発生源について3地点から150クローン（合計450クローン）のクローンライブラリを作成し、細菌群集構造を解析した。
## （２）北京で採取した黄砂試料中の細菌の現存量測定および多様性解析

中国・北京市にある中国農業大学屋上に滅菌した黄砂採取装置を設置し、2010年3月から5月および2011年3月から5月に連続して毎日試料採取を行った。装置設置から24時間に自然降下した粒子を採取した。50 mg/24時間以上の採取量が得られた試料について、黄砂試料から直接DNAを抽出した。

## 1 ）黄砂中の細菌現存量の測定

黄砂試料からNishimuraらの方法 $ ^{4)} $ にしたがって、直接DNAを抽出した。細菌現存量の測定にあたっては、細菌の16S rRNA遺伝子のV6-V8領域を標的として定量的リアルタイムPCR法により細菌数を測定した。また、DNA抽出時に内部標準として既知量のルシフェラーゼ遺伝子を添加し、DNA抽出後に定量することにより、DNA回収率を算出した。

## 2 ）黄砂中の細菌群集構造解析

大規模な黄砂現象が確認され、黄砂採取量が最も多かった2010年3月20日の黄砂試料について、前述の(1)と同様の方法で150クローンのクローンライブラリを作成し、細菌群集構造を解析した。黄砂試料から直接抽出したDNAについて、サブテーマ(1)で最適化したPCR-DGGE法を用いて解析を行った。得られたDGGEプロファイルから、各試料に特徴的なバンドを切り出し、シーケンスにより塩基配列を決定した。データベースと比較することにより細菌種を推定した。さらに、16S rRNA遺伝子を標的としたT-RFLP（Terminal-Restriction Fragment Length polymorphism）法 $ ^{4)} $ により細菌群集構造解析を行った。標的遺伝子をPCRにより増幅した後、制限酵素Msp Iにより処理し、キャピラリー電気泳動を行い、得られたT-RFLPプロファイルについて比較検討を行った。

## 4 ．結果及び考察

## （１）黄砂発生源土壌における細菌群集構造解析

黄砂発生源であるタクラマカン沙漠、ゴビ沙漠、黄土高原について合計450クローンのクローンライブラリを作成し、細菌群集構造を解析した結果、これらの土壌中には系統学的に多様な細菌が存在することがわかった（図(2)-1）。タクラマカン沙漠では、Actinobacteria、Bacilli、Sphingobacteria、Betaproteobacteriaに属する細菌の構成比率が高かった（図(2)-1a）。ゴビ沙漠においてはタクラマカン沙漠同様、Actinobacteria、Bacilli、Sphingobacteria、Betaproteobacteriaに属する細菌の構成比率が高かった（図(2)-1b）。特に、Betaproteobacteriaの構成比率が高くなっていた。一方、黄土高原においては、Actinobacteria、Sphingobacteria、Betaproteobacteriaに加えて、Gammaproteobacteriaの構成比率が高かった（図(2)-1c）。これらの結果から、乾燥地においても、多様な種の細菌が存在していることが明らかになった。また、特に黄土高原においてGammaproteobacteriaなどヒトや動物由来と考えられる種の細菌の構成比が他の土壤と比較して高くなっていた。これは、黄土高原が大農業地帯 $ ^{7)} $ であり、堆肥等の投入が行われていることが要因の一つであると考えられた。広大な黄砂発生源のうち、各3地点のみの解析であるため、サブテーマ(1)での日本における細菌群集構造と比較検討す
るには限界があるが、日本に飛来する黄砂中の細菌群集構造が多様であることを裏付けるデータを得るとともに、ヒトや動物由来の細菌も飛来する可能性があることを明らかにした。

全長を標的として、各150クローンについて解析した。

## （２）中国・北京市で採取した黄砂試料中の細菌の現存量測定および多様性解析

## 1 ）黄砂試料中の細菌の現存量測定

2010年3月から5月および2011年3月から5月に中国・北京市にある中国農業大学において、ほぼ毎日試料採取を行った。分析を行うにあたっては、信頼できる結果を得ることができる50 mg/24時間以上の採取量が得られた試料について、細菌現存量を測定した（表(2)-1）。その結果、もっとも黄砂採取量が多かった2010年3月20日には、黄砂1 g中に $ 10^{9} $ cellsの細菌が存在していた。一方で、すべての試料において $ 10^{8}-10^{9} $ cell/gの細菌が存在しており、黄砂採取日あるいは採取量と細菌現存量との間に関連性は認められなかった。また、この細菌量は一般的な土壌と比較しても少ないことがわかった。

## 2010 年3月～5月

採取日	黄砂採取量 (mg)	細菌数 (cells/g)
20 Mar.	>5,000	3 $ \times $ 10 $ ^{9} $
21 Mar.	166	6 $ \times $ 10 $ ^{8} $
23 Mar.	203	3 $ \times $ 10 $ ^{9} $
24 Mar.	71	2 $ \times $ 10 $ ^{9} $
27 Mar.	100	2 $ \times $ 10 $ ^{9} $
4 April	55	1 $ \times $ 10 $ ^{9} $
9 April	80	1 $ \times $ 10 $ ^{9} $
10 April	92	4 $ \times $ 10 $ ^{8} $
7 May	65	2 $ \times $ 10 $ ^{8} $
10 May	1,129	3 $ \times $ 10 $ ^{9} $
11 May	70	6 $ \times $ 10 $ ^{8} $

表(2)-1. 中国・北京市で採取した黄砂中に存在する細菌現存量

中国農業大学屋上において、24時間で自然降下した粒子を採取した。後述(2)-2)のクローンライブラリの結果をもとに、細菌あたりの16S rRNA遺伝子のコピー数を4コピーとして細菌数を算出した。
## 2 ）中国・北京市で採取した黄砂の細菌の多様性解析

細菌種の推定にあたっては、細菌の16S rRNA遺伝子を標的としたPCR-DGGE法により分析した。その結果、北京で採取した黄砂中のDGGEプロファイルはすべての試料において類似していることがわかった（図(2)-2）。検出されたバンドのうち、各試料に特徴的あるいは試料間で共通したバンド（オレンジ色で示したバンド）について切り出し、シーケンス解析を行い、細菌種を推定した。その結果、Alphaproteobacteria、Gammaproteobacteria、Deinococcus、Bacteroidetes、Actinobacteriaに属する細菌種が推定された。

Band	Closely related species	Number of matched bases (% similarity)
1a	Methylobacteriaceae bacterium	451/454 (99)
Deinococcus sp.
1b	Kocuria rosea	454/457 (99)
1c	Deinococcus deserti	450/456 (98)
4a	Psychrobacter sp.	457/457 (100)
Pseudoalteromonas sp.
7f	Skermanella sp.	454/458 (99)
9d	Paracoccus sp.	433/433 (100)
11a	Adhaeribacter aquaticus	440/459 (95)
11b	Bacteroidetes bacterium	438/457 (95)
Niastella koreensis
11c	Methylobacteriaceae bacterium	457/459 (99)
Deinococcus sp.
11d	Chelatococcus sp.	448/459 (97)
Rhizobiales genosp.

図(2)-2. 中国・北京市で採取した黄砂中に存在する細菌種の推定

さらに、2010年3月20日には、北京市において大規模な黄砂現象が確認され、採取できた黄砂試料の量も十分あったことから、前述(1)の発生源土壤と同様に、合計150クローンのクローンライブラリを作成し、より詳細に細菌群集構造を解析した。その結果、発生源土壤や日本上空で採取した黄砂中と同様に、多様な種の細菌が存在していることがわかった（図(2)-3）。構成比率の高い細菌種としては、Acidobacteria、Actinobacteria、Bacilli、Sphingobacteria、Alphaproteobacteriaに属する細菌であった。

年次変動や地点間の細菌群集構造の比較解析にあたっては、再現性が高く、過去のデータとの比較が可能なT-RFLP法が有用である。そこで、T-RFLP法を用いて細菌群集構造を比較した結果、試料採取日に関わらず、細菌群集構造は類似していることがわかった（図(2)-4）。特に150 bpおよび275 bp付近にすべての試料に共通するピーク群が検出された。また、275 bpのピークは共通して検出されているものの、その強度は試料によって異なっていた。その一方で、450 bpから500 bp付近には試料に特徴的なピークが検出された。以上の結果より、黄砂試料中の細菌群集構造は類似しているものの、黄砂飛来状況により部分的に変動している可能性があることがわかった。さらに、2010年および2011年においても、そのT-RFLPプロファ
イルは類似していることがわかった。また、日本へ飛来した黄砂中の細菌群集についてもT-RFLP法による解析を試みたが、DNA量が少なく、解析できなかった。

図(2)-3. 中国・北京市で採取した黄砂中に存在する細菌の多様性

中国・北京市において採取した黄砂試料から直接DNAを抽出し、16S rRNA遺伝子の全長を標的として、150クローンについて解析した。

a) 2010年3月～5月

b) 2011年3月～5月

図(2)-4. 中国・北京市で採取した黄砂中の細菌群集構造のT-RFLPプロファイル

中国・北京市において採取した黄砂試料から直接DNAを抽出し、16S rRNA遺伝子を

標的として解析した。
本サブテーマにおいて、黄砂発生源土壌に存在する細菌種を明らかにするとともに、中国・北京市に飛来した黄砂中の細菌現存量および細菌群集構造を明らかにし、中国国内における黄砂現象に関わる約600クローンの細菌データベースを構築した（表(2)-2：巻末に記載、サブテーマ(1)のデータと合わせて公開予定）。発生源土壌および北京に飛来した黄砂中にも多様な種の細菌が存在することが確認できたことから、日本へ飛来する細菌が多様であることが裏付けられた。また黄砂発生源においては、農業が盛んに行われている地域もあり、ヒトや動物由来の細菌が飛来する可能性があることもわかった。さらに、今後、T-RFLP法による解析データを蓄積していくことにより、年次変動を含めてより詳細な解析が可能になると考えられた。

## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

黄砂現象にともなう細菌の移動を考察する上で、黄砂発生源に存在する細菌種に関する情報が必要不可欠である。また、黄砂発生源と日本の間に位置する中国・北京市では、黄砂飛来量が日本に比べて圧倒的に多く、黄砂粒子の環境・健康への影響を考察する上で重要な地点である。本サブテーマでは、黄砂発生源土壌における細菌群集について詳細に明らかにし、乾燥地域において、多様な細菌種が存在していることを明らかにした。また中国・北京市においても、黄砂現象とともに飛来する細菌の現存量およびその群集構造に関する定量的知見を得た。

## （２）環境政策への貢献

黄砂発生源に存在する細菌種を知ることは、黄砂飛来にともなう細菌の長距離移動による環境や健康への影響を評価するうえで有用な知見をとなる。また、黄砂発生源と日本の間に位置し、黄砂飛来量およびその頻度も日本に比べて大きい北京市に飛来した黄砂に付着している微生物に関する情報は、国内に飛来する黄砂の環境や健康への影響を評価するうえで有用な知見となる。また、T-RFLP法のような再現性の高い、統一的な解析方法の必要性を提示することで、黄砂を含めた風送ダストの影響について、国際間での評価を進めるにあたっての基礎データを共有できると考えられる。

## 6 ．国際共同研究等の状況

特に記載すべき事項はない
### 7. 研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

<論文（査読あり）>

1) N. Yamaguchi, A. Sakotani, T. Ichijo, T. Kenzaka, K. Tani, T. Baba and M. Nasu: Biological and Pharmaceutical Bulletin, 35, 1187-1190 (2012)

“Break down of Asian dust particle on wet surface and their possibilities of cause of respiratory health effects”

2) N. Yamaguchi, T. Ichijo, A. Sakotani, T. Baba and M. Nasu: Sci. Rep. (in press) "Global dispersion of bacterial cells on Asian dust"

くその他誌上発表（査読なし）>

特に記載すべき事項はない

## （2） 口頭発表（学会等）

1) 馬場貴志、一條知昭、見坂武彦、山口進康、那須 正夫：第24回日本微生物生態学会（2009）「黄砂現象にともなう細菌の長距離移動」

2) T. Baba, T. Ichijo, M. Saraya, K. Enoki, Y. Himezawa, A. Sakotani, N. Yamaguchi and M. Nasu: 111th IUMS, Sapporo, Japan, 2011

“Long distance movement of bacteria by Asian dust”

3) 馬場貴志、一條知昭、迫谷有希子、山口進康、那須正夫:日本薬学会第132年会（2012）「黄砂現象にともなう細菌の長距離移動」

（3）出願特許

特に記載すべき事項はない

（４）シンポジウム、セミナーの開催（主催のもの）

特に記載すべき事項はない

（５）マスコミ等への公表・報道等

特に記載すべき事項はない

### 8 \. 引用文献

1) 長崎県環境保健研究センター資料

http://www.pref.nagasaki.jp/eiken/taiki/kousa.html

2) 西川雅高 他：天気, 38, 221-228, 1991.

「黄砂エアロゾルの降下量分布」

3) T. Kenzaka et al.: Microbes Environ. 25, 53-57, 2010.

"Soil microbial community structure in an Asian dust source region (Loess Plateau)"
4) Y. Nishimura et al.: Microbes Environ. 25, 22-27, 2010.

“Similarity of Bacterial Community Structure between Asian Dust and Its Sources Determined by rRNA Gene-Targeted Approaches”

6) C.A. Kellogg and D.W. Griffin: Trends Ecol. Evol., 21, 638-644

“Aerobiology and the global transport of desert dust”

7) 李文華 他：環境綜合治理和農業区域協調発展戰略研究，農業生態問題與綜合治理，中國農業出版社 362-363, 2008.

「中国区域農業資源合理配置」
## （３）黄砂の環境毒性学的解析

大阪大学大学院薬学研究科 堤 康央

<研究協力者>

大阪大学大学院薬学研究科

吉岡 靖雄

吉川 友章

平成21～23年度累計予算額：30，837千円（うち、平成23年度予算額：9，553千円）予算額は、間接経費を含む。

## [要旨]

古来より、黄砂は発生源である中国やモンゴルのみならず、日本や中国・韓国・台湾といった東アジアにおいても、毎年のように飛来が確認されており、黄砂による被害は、国境を越えた環境問題となっている。これまでの疫学調査により、黄砂の飛来時には、東アジアを中心とした各国で循環器疾患・呼吸器疾患の罹患率が上昇するといった健康被害が報告されており、炎症性免疫疾患の発症・悪化のリスクファクターの一つとして推定されている。しかし、黄砂による健康被害情報の多くは疫学調査に基づくものであり、黄砂の体内動態や詳細な免疫応答メカニズムなどに基づいた情報は未だに乏しい。黄砂の健康への影響を明らかにするためには、黄砂およびその主成分であるシリカ粒子の①物性解析、②体内・細胞内動態の検討（曝露機会や吸収性、蓄積性といった曝露実態の把握）、③免疫毒性の評価および病態発症・悪化との連関解明が必要不可欠となる。

本サブテーマでは、黄砂およびその成分の吸引曝露後の細胞内取込みや血中への移行性などを精査するとともに、アレルギー誘発への影響を評価することで、安全な健康環境の将来的な確保に資することを目指した。本研究の成果は、従来までの疫学調査に基づく黄砂の安全性懸念情報に科学的裏付けを付与し、黄砂に起因した疾患の予防・治療に重要な指針を提供するのみならず、地球環境保全に必須の基盤情報を国内外に提示するために有用と考えられる。

[キーワード] 黄砂、黄砂発生源土壌、健康影響、免疫毒性、サイトカイン、体内動態
### 1. はじめに

黄砂現象とは、東アジアの沙漠域（ゴビ沙漠、タクラマカン沙漠など）や黄土高原からの土壌粒子が強風により大気中に巻き上げられ、偏西風に乗って輸送されつつ降下する現象である。我が国においても昨今、アレルギー疾患等との関連性で注目されつつあるが、一方で推定ではあるものの、万葉集でも季語（春霞）として頻繁に歌われるなど、なじみ深い。このように、古来より、黄砂は発生源である中国やモンゴルのみならず、日本や中国・韓国・台湾といった東アジアにおいても飛来が確認されており、黄砂による被害は、まさに国境と時間、即ち、時空を超えた環境問題となっている。欧米においても、サハラ砂漠を由来として同様の現象が見られ、黄砂をはじめとする風送ダストに対する関心は世界規模で高まっている。日本では黄砂の飛来が年間を通して確認されており、特に2月から増加し始め、4月にピークを迎える。日本に飛来する黄砂は、サブミクロンサイズ以上の微粒子シリカを主成分とし、リポポリサッカライド（LPS）・β-グルカンなどの菌体成分や空気中の有害化学物質などから構成されており、最近では、細菌までもが黄砂に付着している可能性が示唆されている。このような黄砂現象による被害は、樹木の倒壊、農作物の被害や視界不良による航空機の欠航などといった物理的・経済的被害のみならず、ヒト健康に対する被害も大きな問題となっている。既に疫学調査により、黄砂の飛来時には、東アジアを中心とした各国で循環器疾患・呼吸器疾患の罹患率/死亡率が上昇するといった健康被害が報告されている¹⁾²）。例えば韓国では、黄砂が特に深刻な日の呼吸器疾患死亡率が36.5%、65歳以上の死亡率が2.2%増加したという報告がなされている³）。日本においても、小児喘息の発症と黄砂の飛来の間に強い関連が証明され、黄砂が各種呼吸器疾患の発症やアレルギー疾患と密接に関与していることが強く疑われているなど、吸気暴露により、抗原特異的あるいは非特異的な免疫応答を過剰に惹起し、アレルギー疾患を誘発するものと考えられている⁴）。しかし、黄砂による健康被害情報の多くは疫学調査に基づくものであり、黄砂の体内動態や詳細な免疫応答メカニズムなどに基づいた情報は未だに乏しいのが現状である。例えば、黄砂の体内吸収性など体内動態に関する情報すら世界的にも非常に乏しく、情報が不明瞭な状態のまま、ヒト健康に対する懸念のみが闇雲かつ漠然と高まっている状況である。黄砂は、国境を超える環境問題であることから、国際活動に支障をきたすことなく、ヒト健康への影響を最大限に考慮しつつ、規制を実施することが必要不可欠である。そのためには我が国も、十分な疫学調査と共に、黄砂の生体影響を科学的に解明し、早急にその対策を講じなければならない。

## 2 ．研究開発目的

黄砂のヒト健康への影響を追求するためには、①黄砂およびその成分の物性解析、②黄砂およびその成分の体内・細胞内動態（トキシコキネティクス）の検討（曝露機会や吸収性、蓄積性といった曝露実態の把握）、③免疫毒性の評価と病態発症・悪化との連��高地の、これまでのところ、①・②・③の連閌を詳細に追求した例は殆ど無い。そこで本研究では、黄砂を「微小粒子」として捉え、黄砂およびその主成分であるシリカ粒子の吸引曝露後の細胞内取り込みや血中への移行性などを精査するとともに、アレルギー疾患誘発への影響を評価することで、将来的に、安全な健康環境の確保
に寄与しようとするものである。本研究の成果は、従来までの疫学調査に基づく黄砂の安全性懸念情報に科学的裏付けを付与し、科学的根拠のない情報による黄砂現象に対する社会不安を取り除くとともに、黄砂アレルギーや花粉症などの発症・悪化メカニズムの解明と、その予防・治療に重要な基盤情報を提供することで国民の健康確保に寄与すると考えられる。

### 3. 研究開発方法

## （1） 黄砂モデル粒子であるシリカ粒子の起災性評価

## 1 ）細胞およびシリカ粒子

ヒトマクロファージ細胞株THP-1細胞は、10%ウシ胎仔血清、2 mM L-グルタミン含有RPMI1640を用い、37°C、飽和蒸気圧、5%CO₂条件下で培養した。マウスマクロファージ細胞株RAW264.7細胞は、10%ウシ胎仔血清含有DMEMを用い、37°C、飽和蒸気圧、5%CO₂条件下で培養した。黄砂のモデル粒子として、粒子径1μmの非晶質シリカ粒子を用いた。

## 2 ）透過型電子顕微鏡によるシリカ粒子の細胞内取り込みの確認

Lab-Tek II Chambered Coverglassに1.0 × 10^{5} cells/500 μL/wellでTHP-1細胞を播種した。その後、シリカ粒子を300 μL添加した。6時間後、細胞をRPMI 1640で1回洗浄し、水冷した2.5% グルタルアルデヒド中で2時間固定した。その後、0.1 Mリン酸緩衝液に置換し、水冷しながら10分間の洗浄を3回繰り返した。続いて、1% 四酸化オスミウム液を加えて水冷しながら1時間振盪し、後固定を行った。その後、濃度の異なるエタノール中で脱水した後、酸化プロピレンで置換し、Epon-812樹脂で包埋した。作製したサンプルブロックからダイヤモンドナイフでおよそ60 nmの超薄切片を作製し、酢酸ウラニルとクエン酸鉛での染色後にtransmission electron microscope（TEM）観察を行った。

## 3 ）起炎性評価

THP-1細胞を各プレートに播種した後、0.5 μM Phorbol 12-myristate 13-acetate（PMA）存在下で24時間培養することで、マクロファージ様細胞に分化させた。その後、RPMI 1640で1回洗浄を行うことで、PMAを完全に除去した。以降、本研究において用いたTHP-1細胞は全て同様の処理を施している。96穴プレートに1.5 × 10^{4} cells/100 μL/wellでTHP-1細胞を播種した。その後、10% FBS-RPMI 1640で調製した100 μg/mLのシリカ粒子、ATP（3 mM）あるいはLPS（1.25 μg/mL）を200 μL加えた。12時間後、培養上清中のIL-1β濃度をELISAにより測定した。以降、特に記載のない場合、シリカ粒子・阻害剤などの希釈は全て細胞培養培地にて行っている。また、記載濃度は全て終濃度である。

## （２）黄砂モデル粒子であるシリカ粒子の起災性惹起メカニズムの解明

## 1 ) Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)

6穴プレートに7.0×10^{5} cells/3 mL/wellでTHP-1細胞を播種した。その後、シリカ粒子（100μg/mL）を添加し、3時間培養後、総RNAを定法通りに調製した。DNase I処理の後、5μgの総
RNA、Oligo dT_{20}、SuperScript III Reverse Transcriptaseを使用し、50℃、30分間の逆転写反応により一本鎖cDNAを得た。このcDNAを鋳型として、IL-1β、glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase（GAPDH）に対するプライマーを用い、denaturation:95℃（30 sec）、annealing:60℃（30 sec）、extension:72℃（60 sec）の条件で20サイクルのPCRを行った。PCR産物は2%アガロースゲル中で電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色することで可視化した。

## 2 ）各種阻害剤存在下でのIL-1β産生誘導能評価

96穴プレートに $ 1.5 \times 10^{4} $ cells/100 μL/wellでTHP-1細胞を播種した。その後、cytochalasin D (5 μM)、zYVAD-fmk (10 μM)、bafilomycin A₁ (250 nM)、CA-074-Me (2 μM)、BHA (150 μM) あるいは DPI (60 μM) 存在下で、シリカ粒子 (100 μg/mL)、ATP (3 mM) をそれぞれ200 μL 加えた。6時間後、培養上清中のIL-1β濃度をELISAにて測定した。また、阻害剤を用いる場合、記載濃度において全て30分間の前処理を行っている。なお、cytochalasin Dはアクチン重合阻害によるエンドサイトーシス阻害剤として、zYVAD-fmkはcaspase-1特異的阻害剤として、bafilomycin A₁はカテプシンBの阻害剤として、CA-074-MeはカテプシンB特異的阻害剤として、BHAは活性酸素種（reactive oxygen species; ROS）スカベンジャーとして、DPIはROS産生を司る酵素であるnicotinamide adenin dinucleotide phosphate（NADPH）-oxidaseの阻害剤として作用する。

## 3 ）NALP3 inflammasomeの観察

Lab-Tek II Chambered Coverglassに1.0 × 10^{5} cells/500 μL/wellでTHP-1細胞を播種した。その後、ASC-CFP plasmid（2 μg）-ExGen500（50 μL）の複合体含有培地を添加した後、60時間培養することでASC-CFPタンパク質を十分に発現させた。その後、細胞をRPMI 1640で1回洗浄し、シリカ粒子（100 μg/mL）を加えて4時間培養した。再び細胞を洗浄し、4% paraformaldehyde（PFA）で15分間固定を行った後、Prolong Gold anti-fade reagentで包埋し、共焦点レーザー顕微鏡にて細胞を観察した。

## 4 ）細胞内におけるデキストランの挙動解析

Lab-Tek II Chambered Coverglassに1.0 × 10^{5} cells/500 μL/wellでTHP-1細胞を播種した。その後、10 kDa dextran conjugates Alexa Fluor 594（500 μg/mL）とシリカ粒子（100 μg/mL）の混合液を、BHA（150 μM）存在下、非存在下で300 μL添加した。6時間後、細胞をRPMI 1640で1回洗浄し、4% PFAで15分間固定した。その後、DAPIで核を染色し、共焦点レーザー顕微鏡にて細胞を観察した。

## 5 ）ROS產生量評価

96穴black wellプレートに1.5×10^{4} cells/100 μL/wellでTHP-1細胞を播種した。その後、シリカ粒子（100 μg/mL）を加え、さらに24時間培養した。その後、H_{2}DCFDA（10 μM）を添加し、45分間培養した後、マルチモードプレートリーダーにて蛍光強度(Ex:485nm - Em:530nm)を測定した。なおH_{2}DCFDAは、細胞中のヒドロキシル、ペルオキシルもしくは他の反応性酸素種活性により酸化され、蛍光を発することが知られるROS測定