Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
## （３）黄砂の環境毒性学的解析

黄砂を「微小粒子」としての観点から捉え、黄砂およびモデル粒子の吸引暴露後の鼻腔粘膜や気管、肺等における細胞内取り込みや、血中への移行性などを精査した。さらに、黄砂粒子による炎症惹起機構についても研究を進めた。

## （４）黄砂現象の環境および健康への影響評価

効率的かつ高精度な黄砂サンプリング法を確立し、飛来する黄砂粒子の特徴を明らかにするとともに、サブテーマ(1)および(2)において得られた黄砂現象にともなう微生物の移動量や属種に関する定量的な情報とサブテーマ(3)で得られた生体への影響、また生体内での動態に関する情報を総合し、黄砂現象の環境、生態系、そして健康への影響について考察した。

### 3. 研究開発の方法

## （１）黄砂付着微生物の微生物生態学的解析

## 1 ）黄砂粒子上の微生物の定量のための分子微生物生態学的方法の最適化

黄砂粒子が微生物のキャリアーとなることを直接的に証明するために、黄砂粒子上に付着した微生物を可視化するためのバイオイメージング法について検討した。さらに、黄砂とともに飛来する細菌の現存量およびその群集構造を明らかにするために、微量な試料からの細菌分析法を検討した。

## 2 ）日本上空で採取した黄砂試料中の微生物の可視化、細菌の現存量測定および多様性解析

2010年3月から11月および2011年4月から5月の黄砂飛来時を中心に、日本上空（鳥取県北部および兵庫県南部の沿岸部：高度1,000－2,000 m）で採取した黄砂（合計23試料）について、黄砂粒子上に付着した微生物を直接可視化するとともに、マイクロコロニー法を応用し、増殖活性についても評価した。また、細菌の16S rRNA遺伝子を標的として、定量的リアルタイムPCR法により細菌現存量を測定するとともに、PCR-DGGE（PCR-Denaturing gradient gel electrophoresis）法を用いて、その細菌群集構造を明らかにした。さらに、大規模な黄砂現象が観測された2010年11月12日、2011年5月2日の黄砂について、クローンライブラリを作成し（合計2,000クローン）、細菌群集構造を明らかにした。

## （２）黄砂付着微生物の遺伝子生態学的解析

## 1 ）黄砂発生源土壤における細菌群集構造解析

黄砂発生源であるタクラマカン沙漠、ゴビ沙漠、黄土高原の土壌中に存在する細菌について、細菌の16S rRNA遺伝子を標的としてクローンライブラリを作成し（合計450クローン）、その細菌群集構造を明らかにした。

## 2 ）北京で採取した黄砂中の細菌の現存量測定および多様性解析

中国・北京市（中国農業大学）において、2010年3月から5月、2011年3月から5月に連続して毎日試料採取を行い、自然降下した粒子を採取した。50 mg/24時間以上の採取量が得られた試料について、細菌の16S rRNA遺伝子を標的として、定量的リアルタイムPCR法により細菌現存量を測定した。また、上述(2)-1)と同様にクローンライブラリを作成し（合計150クローン）、細菌群集構造を明らかにした。また、T-RFLP（Terminal-Restriction Fragment Length polymorphism）法を用いて、細菌群集構造の経時的な比較解析を行った。

## （３）黄砂の環境毒性学的解析

## 1 ）黄砂モデル粒子であるシリカ粒子の起災性評価および炎症惹起メカニズムの解明

黄砂モデル粒子として、シリカ粒子（粒径1 μm）を用い、その起炎性を評価した。ヒトマクロファージ細胞株THP-1細胞にシリカ粒子を添加し、透過型電子顕微鏡により細胞内への移行を観察した。また、各種阻害剤存在下でのIL-1β産生能を指標として、炎症惹起メカニズムについて検討した。

## 2 ）黄砂および黄土高原土壌粒子の起災性評価および炎症惹起メカニズムの解析

中国・北京市（中国農業大学）で採取した黄砂および黄砂発生源の一つである黄土高原で採取した土壤を用い、黄砂粒子の起災性を評価した。黄砂および発生源土壌をマウスマクロファージ細胞株Raw264.7細胞に添加し、炎症性サイトカイン（TNF-αおよびIL-6）産生能を指標として、黄砂粒子の起災性を評価するとともに、その炎症惹起メカニズムについて検討した。

## 3 ）黄砂および黄土高原土壌粒子の体内動態と生体影響評価

上述の(3)-2で用いた黄砂および黄土高原土壌を、BALB/cマウスに経鼻投与し、肺組織、鼻腔粘
膜に与える影響について、病理所見を指標に評価した。また、鼻腔粘膜、肺、脳、肝臓、脾臓を摘出し、透過型電子顕微鏡で観察し、粒子の体内動態について明らかにした。また、主要臓器における障害マーカーを指標として、生体影響を評価した。

## （４）黄砂現象の環境および健康への影響評価

## 1 ）日本上空における黄砂の採取法の最適化

小型航空機を用いた日本上空での黄砂採取方法を最適化するとともに、粒子径・元素組成などの黄砂粒子の特徴を明らかにするために、走査型電子顕微鏡を用いた粒度分布測定法および元素組成分析法を開発・最適化した。

## 2 ）日本へ飛来した黄砂粒子の粒度分布測定および元素組成分析

日本上空（鳥取県北部および兵庫県南部の沿岸部：高度1,000－2,000 m）において、2010年3月から11月および2011年4月から5月の黄砂飛来時を中心に、合計23回の試料採取を行った。採取した黄砂について、上述(4)-1)で開発した方法を用い、粒度分布を測定した。さらに、粒径が0.5－1μmおよび1－5μmの粒子画分について、SEM-EDXを用いて各100粒子の元素組成を測定した。

## 3 ）黄砂現象の環境・健康への影響評価

黄砂現象の環境・健康への影響を評価するために、サハラダストやオーストラリアンダストを含む風送ダストに関する文献調査を行った。さらに、一般的な大気中の微生物に関する情報収集を行うとともに、大阪大学大学院薬学研究科屋上において、黄砂飛来時および非黄砂時の大気中の細菌現存量を測定した。

本サブテーマにおける結果とサブテーマ(1)から(3)で得られた結果を総合し、「微生物のキャリアーとしての黄砂」と「微小粒子としての黄砂」の両面から、黄砂現象の環境・健康への影響について考察した。

## 4 ．結果及び考察

## （１）黄砂付着微生物の微生物生態学的解析

## 1 ）黄砂粒子上の微生物の定量のための分子微生物生態学的方法の最適化

黄砂粒子上の微生物を可視化するために、蛍光染色法を最適化するとともに、共焦点レーザー顕微鏡を用いた顕微分光法により、蛍光波長にもとづいた微生物と粒子の識別を可能にし、黄砂粒子上の微生物のバイオイメージング法として確立した。また、細菌の16S rRNA遺伝子を標的とした遺伝子増幅法を検討し、その検出感度を100倍以上向上させ、微量試料における細菌分析法として確立した。

## 2 ）日本上空で採取した黄砂試料中の微生物の可視化、細菌の現存量測定および多様性解析

大規模な黄砂現象が観測された2010年11月12日、2011年5月2日に日本上空（鳥取県北部の沿岸部：高度約1,000 m）で採取した黄砂について、バイオイメージングにより黄砂粒子上に微生物が付着していることを確認した（図(1)-1）。また、粒子の粒径が大きいほど微生物が付着している割合が高く、特に直径5 μm以上の粒子においてその傾向が顕著であることがわかった。さらに、マイクロコロニー法により、黄砂粒子上の微生物が増殖活性をもっていることを明らかにした。

また、黄砂試料から直接DNAを抽出し、定量的リアルタイムPCR法により細菌現存量を測定した結果、黄砂飛来時の大気1 m³あたりの細菌数は、最大時で約10⁴ cellsであり、黄砂現象の終息とともにその現存量は10² cells/m³以下に減少した。以上の結果より、黄砂現象とともに細菌が移動していることを明らかにした。

さらに、黄砂現象とともに飛来する細菌種について、16S rRNA遺伝子を標的としてクローンライブラリを作成し（合計960クローン）、細菌群集構造解析を行った結果、優占種としてActinobacteria、Bacilli、Sphingobacteria、Alphaprotebacterial属する細菌が検出され、これまで報告されていた以上に多様な種の細菌が黄砂現象とともに飛来していることを明らかにした（図1）-2）。また、黄砂中の細菌を液体培地で培養後、同様にクローンライブラリを作成し（合計960クローン）、細菌群集構造を解析した結果、Bacilli、Sphingobacterial属する細菌が優占しており、これらの細菌種が増殖活性を有していることがわかった。
図(1)-1. バイオイメージングによる 黄砂粒子上の微生物の可視化

左：黄砂粒子に付着している微生物

右：黄砂粒子上で増殖し、マイクロコ

ロニーを形成した微生物

本サブテーマにより、黄砂粒子は微生物のキャリアーとなることを直接的に証明するとともに、黄砂現象にともなって日本へ飛来する細菌現存量を明らかにした。さらに、その属種についても明らかにするとともに、黄砂現象とともに日本へ飛来する約2,000クローンの細菌データベースを構築した。なお、本データベースは公開する予定である。

## （２）黄砂付着微生物の遺伝子生態学的解析

## 1 ）黄砂発生源土壤における細菌群集構造解析

黄砂発生源であるタクラマカン沙漠、ゴビ沙漠、黄土高原について合計450クローンのクローンライブラリを作成し、細菌群集構造を解析した結果、これらの土壌中には多様な種の細菌が存在することを明らかにした（図(2)-1）。タクラマカン沙漠では、Actinobacteria、Bacilli、Sphingobacteria、Betaproteobacteriaに属する細菌の構成比率が高く、ゴビ沙漠においてもタクラマカン沙漠同様、Actinobacteria、Bacilli、Sphingobacteria、Betaproteobacteriaに属する細菌の構成比率が高かった。一方、黄土高原においては、Actinobacteria、Sphingobacteria、Betaproteobacteriaに加えて、Gammaproteobacteriaの構成比率が高かった。また、特に黄土高原においてGammaproteobacteriaなどヒトや動物由来と考えられている細菌種の構成比が高くなっていたことは、黄土高原が大農業地帯であり、堆肥等の投入が行われていることが要因の一つであると考えられた。以上の結果から、乾燥地である黄砂発生源においても、多様な種の細菌が存在していることを明らかにした。

図(2)-1. 黄砂発生源土壤中に存在する細菌の多様性
## 2 ）北京で採取した黄砂中の細菌の現存量測定および多様性解析

中国・北京市（中国農業大学）において、採取した黄砂について、細菌の16S rRNA遺伝子を標的として、定量的リアルタイムPCR法により細菌現存量を測定した結果、黄砂1 g あたりの細菌数は、 $ 10^{8}-10^{9} $ cellsであり、黄砂の規模と細菌現存量との間に関連性は認められなかった。また、T-RFLP 法を用いて細菌群集構造を比較した結果においても、試料採取日に関わらず、細菌群集構造は類似していることがわかった。

さらに、中国・北京市において大規模な黄砂現象が確認された2010年3月20日には、採取できた黄砂試料の量も十分であったことから、合計150クローンのクローンライブラリを作成し、より詳細に細菌群集構造を解析した。その結果、発生源土壌や、日本と同様に多様な細菌種が存在しており、Acidobacteria、Actinobacteria、Bacilli、Sphingobacteria、Alphaproteobacterial属する細菌が優占種であることを明らかにした。

本サブテーマにより、黄砂発生源土壌および中国・北京市に飛来した黄砂中には、多様な種の細菌が存在していることを明らかにし、日本へ飛来する細菌種が多様であることを裏付けるデータを得た。また黄砂発生源においては、農業が盛んに行われている地域もあり、ヒトや動物由来の細菌が飛来する可能性があることも明らかになった。

## （３）黄砂の環境毒性学的解析

1）黄砂モデル粒子であるシリカ粒子の起災性評価および炎症惹起メカニズムの解明

黄砂モデル粒子である粒子径1 μmのシリカ粒子とヒトマクロファージ細胞を反応させた結果、シリカ粒子がエンドソームもしくは細胞質内に多数取り込まれていることがわかった。また、シリカ粒子が強い起災性を有することを示した。さらに、その炎症惹起メカニズムについて検討した結果、シリカ粒子は細胞にエンドサイトーシスで取り込まれた後、活性酸素の産生を誘発し、活性酸素がリソソームを破壊することでカテプシンBが細胞質に流出し、インフラマソームの活性化を誘導することが明らかになった。

## 2 ）黄砂および黄土高原土壌粒子の起災性評価および炎症惹起メカニズムの解析

黄砂および黄砂発生源土壌をマウスマクロファージ細胞株に作用させ、炎症性サイトカイン産生を指標に起炎性を評価した結果、黄砂作用群では、陽性コントロールとして用いたリポポリサッカライド（LPS）作用群と同程度のTNF-αおよびIL-6産生が認められ、黄砂は強い起炎性を示すことが明らかとなった（図(3)-1）。また、黄砂発生源土壌作用群でのTNF-α、IL-6産生量は黄砂作用群と比較して有意に低かったことから、黄砂は黄砂発生源土壌よりも起炎性が強いことが示された。そこで、種々の阻害剤を用い、黄砂の炎症惹起メカニズムを検討した結果、黄砂はマウスマクロファージ細胞株に取り込まれた後、活性酸素産生を誘発し、MAPKを活性化することで炎症性サイトカインを産生誘導することが明らかになった。

図(3)-1. 黄砂粒子による 炎症性サイトカインの誘導

## 3 ）黄砂および黄土高原土壌粒子の体内動態と生体影響評価

黄砂および黄砂発生源土壌を生体マウスに経鼻投与し、粒子の体内動態を評価したところ、黄砂投与群においてのみ、肺胞上皮細胞内に粒子が観察され、上皮細胞を通過して体内に移行する可能性が示された（図(3)-2）。さらに、肺組織における炎症を評価した結果、黄砂の暴露により、肺組織において、貪食系細胞や好酸球などの炎症性細胞浸潤に伴う強い炎症反応が誘導される可能性が考えられた。

また、病理学的解析により、投与局所である鼻腔の嗅上皮細胞において、黄砂投与群で壊死・変性が認められたことから、黄砂曝露が嗅覚器に損傷を与える可能性が示された（図3）-2）。
肺組織のTEM観察像

嗅部上皮細胞の病理所見

図 (3)−2. 生体マウスへの黄砂暴露による黄砂粒子の体内動態および病理所見

本サブテーマにより、黄砂が体内に侵入する可能性があることを示した。さらに、黄砂粒子は黄土高原土壌よりも強い起災性を有することを明らかにするとともに、その炎症惹起メカニズムの一部を明らかにし、「微小粒子としての黄砂」の健康への影響を評価するための基礎的知見を得た。

## （４）黄砂現象の環境および健康への影響評価

1）日本上空における黄砂の採取法の最適化

日本上空（鳥取県北部および兵庫県南部の沿岸部：高度1,000－2,000 m）において、解析に十分量の黄砂粒子を採取するために、独自に黄砂捕集装置を開発し、短時間で大量の黄砂捕集を可能にした（湿式ビーズ法）。さらに、粘着シートを用いた乾燥状態での黄砂採取法を確立した（乾式粘着シート法）。また、微量な試料においても粒度分布測定を可能とするため、走査型電子顕微鏡画像を用いた独自の画像解析プログラム（PaSDAS：Particle Size Distribution Analysis Software）を開発した。

## 2 ）日本へ飛来した黄砂粒子の粒度分布測定および元素組成分分析

日本上空において、2010年3月から11月および2011年4月から5月に合計23回の試料採取を行った。

採取した黄砂粒子の粒度分布を測定した結果、黄砂飛来時においても1μm以下の粒子画分が全体の60－80％を占め、非常に粒径の小さい粒子が飛来していることが明らかになった。その一方で、大規模な黄砂現象が確認された2010年11月および2011年5月に鳥取県北部の沿岸部（高度約1,000 m）で採取した黄砂粒子では、1μm以下の粒子画分が最も多く存在する点は変わらないものの、粒径2－5μmの粒子画分の割合が増加していたことから、大規模な黄砂観測時には粒径の大きい粒子も飛来している可能性が示された。またSEM-EDXによる元素組成分析の結果、黄砂飛来時にはケイ素（Si）あるいはアルミニウム（Al）の割合が高い粒子が多く、これらの粒子は土壌由来の粒子であることが推定された（図(4)-1）。

a) 乾式粘着シート法

b) 湿式ビーズ法

図(4)-1. 水分の存在下による黄砂粒子の分散と元素組成の変化

一方、乾式粘着シート法で採集した黄砂粒子を分析した結果、日本に飛来する黄砂中には細かな粒子以外に、粒子同士が結合した凝集体が存在することが明らかになった（図(4)-1）。また、湿式ビーズ法で採取した試料に比べ、ケイ素を多く含む粒子の割合が低く、アルミニウムあるいはカルシウム（Ca）が表面の主成分である粒子が存在した。特にカルシウムは、湿式ビーズ法による試料では、ほとんど認められなかったことから、黄砂粒子の表面に可溶性のカルシウムが付着し、このカルシウムを含む塩により凝集体を形成していたものと考えられる。以上の結果より、黄砂粒子は水分の存在下において、より微細な粒子に分散する可能性があることが明らかになった。これは、黄砂粒子がヒト等の粘膜上においてより微細な粒子に分散する可能性があることを示しており、黄砂粒子の生体影響を明らかにする上で重要な知見である。
## 3 ）黄砂の環境・健康への影響評価

黄砂の環境・健康への影響を評価するために、過去5年間の報告を中心に情報収集を行った。その結果、風送ダストに関する論文数は1000件以上あるにも関わらず、微生物に関する報告は約20件と報告数が非常に少なく、社会的関心が高いにも関わらず未知な部分が多いことがわかった。また、微生物の検出法としては培養法が中心であり、検出された微生物数も少なく、風送ダストの環境や健康への影響を評価するために必要な定量的データはほとんどないことがわかった。また、ヒトが生活する一般的な環境の大気中におけるダスト濃度や細菌数に関するデータについてもほとんど報告がなかった。

そこで、ヒトが生活する環境における大気中の細菌現存量について測定を行った結果、その値は環境によって大きく異なるものの、 $ 10^{2}-10^{4} $ cells/m $ ^{3} $ であることがわかった。サブテーマ(1)の黄砂中の細菌現存量と比較すると、黄砂中に存在する細菌量は通常の大気環境中と同程度以下であることが明らかになった。

本サブテーマおよびサブテーマ(1)から(3)により得られた「微生物のキャリアーとしての黄砂」と「微小粒子としての黄砂」の基盤的知見を総合し、黄砂現象の環境・健康への影響を考察した。

微生物の面から健康へのリスクを考えた場合、黄砂とともに飛来する細菌の現存量は大規模な黄砂飛来時でも1 m³あたり約10⁴ cellsであり、我々の生活する一般的な環境の大気中の細菌現存量と比較しても同程度以下であること、加えて検出された細菌種についても土壌や河川など幅広い環境中に生息する一般的な細菌種が大部分であり、深刻な感染症等の起因菌は検出されていないことから、黄砂とともに飛来する細菌による感染症の発生等のリスクは低いと考えられた。その一方で、黄砂は数百万から数千万年にわたって飛来しており、地球学的な時間スケールでは膨大な量の細菌が地球上を移動していると考えられる。またその属種についても多種多様であることから、飛来地での定着や遺伝子伝播を通じて、今後も地球上の微生物生態系に影響を与える可能性が考えられる。

一方で粒子としての黄砂は、炎症を惹起するとともに、生体内に侵入し、細胞障害を起こす可能性が示され、さらに細かい粒子ほど起炎性が強くなることが明らかになった。黄砂粒子がヒトの粘膜上でさらに微細な粒子に分散する可能性も示されたことから、粒子としての黄砂は生体に影響を与える可能性があると考えられた。

## 5 ．本研究により得られた主な成果

## （1） 科学的意義

黄砂等の風送ダストによる健康被害は、日本や中国・韓国・台湾といった東アジアにおいて、社会的に関心を集めている。さらに、近年の急激な大気汚染・温暖化に伴い、予期せぬ成分や微生物が付着した黄砂の飛来による生体に及ぼすリスク上昇が懸念されている。

本研究により得られた黄砂現象とともに移動する細菌の量、属種に関する定量的なデータは、黄砂現象の健康影響を評価する上で不可欠な基盤的知見となるだけでなく、これまで考えられていた以上に多様な細菌が地球上を移動していることを明らかにしたことから、地球規模での生態系あるいは環境に与える影響を考える上でも重要な知見である。

また、微小粒子としての黄砂の生体影響という観点から、トキシコキネティクスなどを有効活用し、黄砂の物性（成分）とその体内動態、さらには免疫毒性の評価を行った。今後、本研究で得られた成果と、疫学的調査結果を併せて解析することで、黄砂をはじめとする微粒子に起因した疾患の発症・悪化のメカニズム解明が期待される。

## （２）環境政策への貢献

本研究では、黄砂とともに飛来する細菌の現存量および多様性、ならびに黄砂粒子の生体影響に関する基盤的知見を得た。これらの成果を学術的に公表するとともに、種々のメディアを通じて一般社会に紹介し、成果の広報・普及に努めることにより、科学的根拠のない情報によって生じる黄砂現象に対する過度の社会不安を取り除き、科学的データに立脚した環境リスクのマネジメントやリスク・コミュニケーション等の政策に貢献できる。
### 6. 研究成果の主な発表状況

## （１）主な誌上発表（2012年3月末現在）

## く査読付き論文>

1) T. Morishige, Y. Yoshioka, H. Inakura, A. Tanabe, X. Yao, S. Narimatsu, Y. Monobe, T. Imazawa, S. Tsunoda, Y. Tsutsumi, Y. Mukai, N. Okada and S. Nakagawa: Biomaterials, 31, 6833–6842 (2010)

“The effect of surface modification of amorphous silica particles on NLRP3 inflammasome mediated IL-1beta production, ROS production and endosomal rupture”

2) N. Yamaguchi, A. Sakotani, T. Ichijo, T. Kenzaka, K. Tani, T. Baba and M. Nasu: Biol. Pharm. Bull., 35, 1187–1190 (2012)

“Break down of Asian dust particle on wet surface and their possibilities of cause of respiratory health effects”

3) N. Yamaguchi, T. Ichijo, A. Sakotani, T. Baba and M. Nasu: Sci. Rep. (in press)

“Global dispersion of bacterial cells on Asian dust”

## くその他誌上発表（依頼原稿）>

1）山口進康、那須正夫：ファルマシア，46，659-663（2010）

「地球を巡る微生物──健康な生活を保証する──」

2）那須正夫：化学療法の領域，26，2372-2375（2010）.

「環境の変化と微生物生態系（総論）」

3）山口進康：化学療法の領域，26，2434-2444（2010）.

「環境微生物検出技術のイノベーション」

## （２）主な口頭発表（学会等）

## <国内発表>

1）馬場貴志、一條知昭、天野翔子、山口進康、那須正夫：フォーラム 2009 衛生薬学・環境トキシコロジー (2009)

「黄砂現象にともなう細菌の長距離移動」

2）馬場貴志、一條知昭、見坂武彦、山口進康、那須正夫：第24回日本微生物生態学会（2009）

「黄砂現象にともなう細菌の長距離移動」

3）那須正夫：第4回大気バイオエアロゾルシンポジウム（2010）

「黄砂飛来にともなう微生物およびその遺伝子の移動に関する環境微生物学的研究」

4）馬場貴志：第4回大気バイオエアロゾルシンポジウム（2010）

「黄砂現象により移動する細菌の現存量」

5）馬場貴志、一條知昭、天野翔子、山口進康、那須正夫：第83回日本細菌学会総会(2010)

「黄砂現象にともなう細菌の長距離移動」

6）一條知昭、姬澤由佳、馬場貴志、那須正夫：日本薬学会第130年会（2010）

「黄砂粒子の粒度分布測定を目指した画像解析プログラムの開発」

7）馬場貴志、天野翔子、一條知昭、山口進康、那須正夫：日本薬学会第130年会（2010）

「黄砂現象にともなう細菌の長距離移動」

8）一條知昭、馬場貴志、姫澤由佳、山口進康、那須正夫：第26回日本微生物生態学会（2010）「黄砂現象とともに移動する細菌の現存量」

9）馬場貴志、一條知昭、更家信、榎木香奈美、山口進康、那須正夫：第26回日本微生物生態学会（2010）

「黄砂現象とともに移動する細菌の多様性」

10) 馬場貴志、姬澤由佳、一條知昭、山口進康、那須正夫：日本薬学会第 131 年会（2011）

「レーザー顕微鏡を用いた黄砂粒子に付着している微生物の可視化」

11) 馬場貴志、更家信、一條知昭、山口進康、那須正夫：日本薬学会第 131 年会（2011）

「黄砂現象に伴って移動する細菌の多様性」

12) 馬場貴志、榎木香奈実、一條知昭、山口進康、那須正夫：日本薬学会第 131 年会（2011）

「増殖活性にもとづいた黄砂現象に伴って移動する細菌の系統解析」

13) 藤村真穂、吉岡靖雄、山下浩平、東阪和馬、森下裕貴、潘慧燕、小椋健正、鍋師裕美、吉川友章、伊藤徳夫、馬場貴志、山口進康、那須正夫、堤康央：日本薬学会第131年会（2011）

「黄砂の健康リスク解析を目指した免疫毒性に関する基礎的評価」
14) 吉岡靖雄、藤村真穂、山下浩平、東阪和馬、森下裕貴、潘慧燕、小椋健正、長野一也、阿部康弘、鎌田春彦、角田慎一、鍋師裕美、馬場貴志、山口進康、伊藤徳夫、吉川友章、那須正夫、堤康央：第38回日本トキシコロジー学会学術年会（2011）

「ヒト健康へのリスク解析に資する黄砂の免疫毒性に関する基礎的評価」

15) 一條知昭、馬場貴志、姬澤由佳、山口進康、那須正夫：第27回日本微生物生態学会（2011）「黄砂現象による細菌の長距離移動」

16) 馬場貴志、更家信、榎木香奈実、山口進康、那須正夫：第 27 回日本微生物生態学会（2011）「黄砂現象に伴い移動する細菌の系統解析」

17) 一條知昭、馬場貴志、姫澤由佳、更家信、榎木香奈実、山口進康、那須正夫：第6回大気バイオエアロゾルシンポジウム（2011）

「黄砂とともに飛来する細菌の現存量と多様性」

18) 馬場貴志、姫澤由佳、一條知昭、山口進康、那須正夫：第 61 回日本薬学会近畿支部総会・大会（2011）「黄砂現象とともに飛来する微生物の可視化」

19) 馬場貴志、榎木香奈実、更家信、一條知昭、山口進康、那須正夫：第61回日本薬学会近畿支部総会・大会（2011）

「黄砂現象に伴い移動する細菌の多様性」

20) 馬場貴志、姫澤由佳、一條知昭、山口進康、那須正夫：フォーラム 2011 衛生薬学・環境トキシコロジー（2011）

「黄砂現象とともに飛来する微生物の可視化」

21) 山口進康、馬場貴志、榎木香奈実、更家信、一條知昭、那須正夫：フォーラム 2011 衛生薬学・環境トキシコロジー（2011）

「黄砂現象に伴い移動する細菌の多様性」

22) 馬場貴志、一條知昭、山口進康、那須正夫：第 85 回日本細菌学会総会（2012）

「黄砂現象にともなう細菌の長距離移動」

23) 馬場貴志、一條知昭、迫谷有希子、山口進康、那須正夫: 日本薬学会第 132 年会（2012）「黄砂現象にともなう細菌の長距離移動

## <国際発表>

1) T. Baba, T. Ichijo, S. Amano, N. Yamaguchi and M. Nasu: $ 13^{th} $ International Symposium on Microbial Ecology, Seattle, USA, 2010

“Estimation of abundance of bacteria on Asian dust by quantitative PCR”

2) Y. Yoshioka, T. Morishige, H. Inakura, S. Tsunoda, Y. Tsutsumi, Y. Mukai, N. Okada and S. Nakagawa: The Asia/Pasific Chapter of Environmental Toxicology and Chemistry 2010 Conference (SETAC), Guangzhou, China, 2010

“Silica particle, major component of Asian dust, induces IL-1β production through NALP3 activation mediated by cathepsin B”

3) K. Higashisaka, Y. Yoshioka, K. Yamashita, Y. Morishita, T. Yoshida, M. Fujimura, K. Nagano, Y. Abe, H. Kamada, N. Itoh, S. Tsunoda, T. Yoshikawa and Y. Tsutsumi: The Asia/Pasific Chapter of Environmental Toxicology and Chemistry 2010 Conference (SETAC), Guangzhou, China, 2010

“Development of biomarkers for the safety scientific assessment of nanosilica, major component of Asian dust”

4) K. Yamashita, Y. Yoshioka, K. Higashisaka, Y. Morishita, T. Yoshida, M. Fujimura, K. Nagano, Y. Abe, H. Kamada, N. Itoh, S. Tsunoda, T. Yoshikawa and Y. Tsutsumi: The Asia/Pasific Chapter of Environmental Toxicology and Chemistry 2010 Conference (SETAC), Guangzhou, China, 2010

“The safety scientific assessment of reproductive and developmental toxicity of nanosilica, major component of Asian dust”

5) Y. Morishita, Y. Yoshioka K. Yamashita, K. Higashisaka, T. Yoshida, M. Fujimura, K. Nagano, Y. Abe, H. Kamada, N. Itoh, S. Tsunoda, T. Yoshikawa and Y. Tsutsumi: The Asia/Pasific Chapter of Environmental Toxicology and Chemistry 2010 Conference (SETAC), Guangzhou, China, 2010

“Distribution analysis of nanosilica, major component of Asian dust, to the testis for
the safety scientific assessment"

6) N. Yamaguchi, T. Ichijo, Y. Himezawa, K. Enoki, M. Saraya, T. Baba and M. Nasu: The 4 $ ^{th} $ International Symposium on Environment of Rim of the Japan/East Sea, Jeju-do, Korea, 2010 “Abundance and population structure of bacteria on Asian dust determined by PCR-based approaches”

7) T. Baba, T. Ichijo, M. Saraya, K. Enoki, Y. Himezawa, N. Yamaguchi and M. Nasu: 111th American Society for Microbiology General Meeting, New Orleans, USA, 2011

“Long distance movement of bacteria by Asian dust”

8) T. Baba, T. Ichijo, M. Saraya, K. Enoki, Y. Himezawa, A. Sakotani, N. Yamaguchi and M. Nasu: 111th IUMS, Sapporo, Japan, 2011

“Long distance movement of bacteria by Asian dust”

9) Y. Yoshioka, M. Fujimura, K. Yamashita, K. Higashisaka, Y. Morishita, H. Pan, T. Ogura, H. Nabashi, K. Nagano, Y. Abe, H. Kamada, S. Tsunoda, T. Baba, N. Yamaguchi, M. Nasu, N. Itoh, T. Yoshikawa and Y. Tsutsumi: SETAC North America 32nd Annual Meeting, USA, 2011 "Fundamental assessment for clarification of relationship between Asian dust and influenza infection-1; Potential immunotoxicity of Asian dust for the future risk-analysis"

10) K. Yamashita, Y. Yoshioka, M. Fujimura, K. Higashisaka, Y. Morishita, H. Pan, T. Ogura, H. Nabashi, K. Nagano, Y. Abe, H. Kamada, S. Tsunoda, T. Baba, N. Yamaguchi, M. Nasu, N. Itoh, T. Yoshikawa and Y. Tsutsumi: SETAC North America 32nd Annual Meeting, USA, 2011 "Fundamental assessment for clarification of relationship between Asian dust and influenza infection-2; Biodistribution and inflammatory effects of Asian dust for the future risk-analysis"

11) N. Yamaguchi, T. Ichijo, A. Sakotani, T. Baba and M. Nasu: 112th American Society for Microbiology General Meeting, San Francisco, USA, 2012

“Global dispersion of bacterial cells on Asian dust “（アブストラクト提出済）

12) M. Nasu: 2012 International Bioaerosol Symposium, Seoul, Korea, 2012

“Global dispersion of bacterial cells with Asian dust “（招待講演）

### 7. 研究者略歴

課題代表者：那須正夫

1950年生まれ、大阪大学大学院医学研究科博士課程修了、医学博士、現在、大阪大学大学院薬学研究科教授

## 研究参画者

（1）1）：山口進康

1968年生まれ、大阪大学大学院薬学研究科修了、博士（薬学）、現在、大阪大学大学院薬学研究科准教授

2）：馬場貴志

1974年生まれ、鳥取大学大学院農学研究科修了、博士（農学）、現在、大阪大学大学院薬学研究科助教

## （2） : 谷佳津治

1962年生まれ、大阪大学大学院薬学研究科修了、博士（薬学）、現在、大阪大谷大学薬学部教授

## （3） : 堤康央

1969年生まれ、大阪大学大学院薬学研究科修了、博士（薬学）、現在、大阪大学大学院薬学研究科教授

## （4） ：那須正夫（課題代表者）
## （１）黄砂付着微生物の微生物生態学的解析

大阪大学大学院薬学研究科

山口進康

馬場 貴志

平成21～23年度累計予算額：36，047千円

（うち、平成23年度予算額：9,986千円）予算額は、間接経費を含む。

[要旨] 黄砂現象の環境・健康リスクを考える上で、黄砂粒子に付着して飛来する細菌の量やその属種を明らかにすることが重要である。しかしながら、日本上空で採取できる黄砂の量は限られているため、より微量の試料からも信頼性の高い結果を得るための方法が必須である。そこでまず、これまでの分子微生物生態学的方法の開発における様々な実績をもとに、微量な黄砂試料での細菌現存量の測定および多様性の解析を可能にした。

次に、日本上空（鳥取県北部および兵庫県南部の沿岸部：高度1,000-2,000 m）で採取した黄砂粒子上の微生物を可視化することにより、黄砂粒子が微生物のキャリアーとなり、黄砂現象とともに微生物が長距離移動していることを直接的に証明した。また、増殖活性をもつ微生物も黄砂とともに飛来していることを明らかにした。さらに、定量的リアルタイムPCR法により細菌現存量を測定し、黄砂飛来時の大気中には $ 10^{4} $ cells/m $ ^{3} $ の細菌が存在することを明らかにした。また16S rRNA遺伝子を標的として、黄砂とともに飛来する細菌について約2,000クローンのライブラリを作成し、これまで考えられていた以上に系統学的に多様な細菌種が黄砂現象とともに日本へ飛来していることを明らかにした。

[キーワード] 黄砂、バイオイメージング、細菌現存量、多様性、クローンライブラリ
### 1. はじめに

日本には毎年おもに3月から5月にかけて中国大陸から黄砂が飛来し、その総量は年間100万トン以上 $ ^{1)} $ 、多い年には200万から300万トンにおよぶとされている $ ^{2)} $ 。黄砂は中国やモンゴルの乾燥・半乾燥地域を発生源とする土壌粒子であることから、発生源地域に存在する微生物が黄砂粒子に付着し、長距離移動している可能性が考えられ、黄砂に多量の微生物が存在する場合、飛来先の環境や生態系、あるいは我々の健康に影響を与えるものと推察される。しかしながら、黄砂を微生物のキャリア一として捉える研究は、環境中の微生物を高精度に検出・解析するための手法的制約から限られている。

そこで本サブテーマでは、これまでに環境中の微生物動態を精度よく解析するために開発・応用してきた「培養に依存しない分子微生物生態学的手法」 $ ^{3),4)} $ を用い、「微生物のキャリアーとしての黄砂」の観点から詳細に検討を行った。

### 2. 研究開発目的

黄砂現象の環境、生態系あるいは健康への影響を評価するためには、黄砂現象による微生物の移動を直接的に証明するとともに、その現存量や属種に関する定量的データが必要不可欠である。

細菌の検出法として広く用いられている培養法は感度が高い方法であるが、環境中に生息するほとんどの細菌は、通常の培養条件下では増殖困難であることから $ ^{5)} $ 、細菌群集全体を対象とする場合は定量性が低い点が課題となる。したがって、黄砂を微生物のキャリア一として捉え、その環境・健康影響を明らかにするためには、このような方法論的制約を解決するための新たな方法が必要となる。

そこで本サブテーマにおいては、これまでに開発・応用してきた蛍光染色法 $ ^{7,8} $ を発展させ、黄砂飛来時に日本上空で採取した黄砂粒子に付着した微生物をシングルセルレベルで可視化し、黄砂現象にともなう微生物の移動を直接的に証明した。さらに、遺伝子を標的とした分子微生物生態学的手法を、黄砂など微量試料においても信頼性の高いデータを得るために最適化し、日本に飛来する黄砂中の細菌現存量および細菌群集構造を明らかにした。

## 3 ．研究開発方法

（1）黄砂粒子上の微生物の定量のための分子微生物生態学的手法の最適化

1）黄砂粒子に付着した細菌の可視化

サブテーマ(4)において調製した中国・黄土高原の土壌を10 μm以下に分級した土壌試料に大腸菌を添加し、蛍光染色した後、レーザー顕微鏡を用いた顕微分光により、粒子および細菌由来の蛍光波長のパターンを分析した。また、得られた蛍光波長および強度に関する基礎データをもとに、バイオイメージング法として最適化した。

## 2 ）微量試料からの細菌DNA増幅法

黄砂発生源である中国・黄土高原の土壌より細菌のDNAを抽出し、16S リボソームRNA
（rRNA）遺伝子を標的とした定量的リアルタイムPCR法によりコピー数を測定した。抽出DNAの濃度が $ 10^{6}-10^{2} $ copies/μlとなるように段階希釈したものを試料とし、全ゲノム増幅法およびNested PCR法による遺伝子増幅とその定量限界を検討した。全ゲノム増幅にはillustra GenomiPhi DNA Amplification Kit（GE healthcare）を用いた。Nested PCRでは、細菌の16S rRNA遺伝子を標的として、まずそのほぼ全長をPCRにより増幅した。それぞれのDNA増幅産物に対して、16S rRNA遺伝子のV6-V8領域を標的としたPCRを行い、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（DGGE: denaturing gradient gel electrophoresis）法 $ ^{4)} $ で解析し、微量試料からのDNA増幅法として確立した。

## （２）日本上空で採取した黄砂中の微生物の可視化、細菌現存量の測定および多様性評価

日本上空（鳥取県北部および兵庫県南部の沿岸部：高度1,000−2,000m）において、第一航空株式会社の協力のもと、黄砂を採取した。2010年3月から11月および2011年4月から5月の黄砂飛来時を中心に、合計23回の試料採取を行った。

## 1 ）黄砂現象とともに日本へ飛来した黄砂粒子上の微生物の可視化

黄砂粒子をポリカーボネートフィルター上に捕集し、パラホルムアルデヒドで処理した後、洗浄、脱水を行い、蛍光染色した。共焦点レーザー顕微鏡を用い、(1)-1)で決定した条件下で観察した。さらに、黄砂粒子上の微生物の増殖活性の有無を明らかにするため、マイクロコロニー法 $ ^{9} $ の最適化を行った。試料をポリカーボネートフィルター上に捕集したのち、フィルターを標準寒天培地、1/100標準寒天培地、0.05% Yeast extract寒天培地、R2A寒天培地上に静置し、25℃で培養した。上述と同様の方法で蛍光染色し、(1)-1)で決定した条件下で観察した。

## 2 ）黄砂現象とともに日本へ飛来した細菌の現存量測定

黄砂試料から、Kawaiらの方法 $ ^{10)} $ にしたがって、直接DNAを抽出した。細菌現存量の測定にあたっては、細菌の16S rRNA遺伝子のV6-V8領域を標的として、定量的リアルタイムPCR法により細菌数を測定した $ ^{11)} $ 。また、DNA抽出時に内部標準として既知量のルシフェラーゼ遺伝子を添加し、DNA抽出後に定量することにより、DNA回収率を算出した。

## 3 ）PCR-DGGE法による細菌の多様性評価

細菌の多様性評価にあたっては、前述の(2)-2)にしたがって、黄砂試料から直接DNAを抽出した。(1)-2)で決定した細菌DNA増幅法により遺伝子増幅を行った後、細菌の16S rRNA遺伝子のV6-V8領域を標的としたDGGE法による分析を行った。DGGEゲルから主要なバンドを切り出し、シーケンス解析を行った。DNA Data Bank of Japan (DDBJ; http://www.ddbj.nig.ac.jp)のデータベースの既知配列から相同性の高いものを検索し、細菌種を推定した。さらに、多重アライメントを行い、近隣結合法により系統樹を作成した。

## 4 ）クローンライブラリ法による細菌の多様性評価

大規模な黄砂現象が確認された2010年11月12日および2011年5月2日に日本上空（鳥取県北部の沿岸部：高度1,000−2,000m）で採取した黄砂について、細菌の16S rRNA遺伝子の全長を
標的としたクローンライブラリを作成し、細菌群集構造を解析した。さらに、増殖活性をもつ細菌種についても明らかにするために、採取した黄砂粒子を2種の液体培地（標準培地、R2A培地）に接種した後、25℃で振とう培養し、培地からDNAを抽出し、上述と同様の方法でクローンライブラリを作成し、細菌群集構造を解析した。

## 4 ．結果及び考察

（1）黄砂粒子上の微生物の定量のための分子微生物生態学的方法の最適化

## 1 ）黄砂粒子に付着した微生物の可視化

黄砂が微生物のキャリアーとなることを直接証明するためには、黄砂粒子に付着した微生物を可視化する必要がある。そこでレーザー顕微鏡を用いた新たなバイオイメージング法の検討を行った。日本上空で採取した黄砂粒子は5 μm以下であることから、大きさで微生物と粒子を区別することが困難であり、また黄砂粒子は自家蛍光を発するため、通常の蛍光染色法のみでの検出は困難であった。そこで、微生物由来の蛍光波長と黄砂粒子由来の自家蛍光波長を詳細に解析した（図(1)-1）。核酸結合性染色剤で染色し、最適波長のレーザー光で励起した結果、UV励起光下では蛍光強度が強いものの、粒子と微生物の蛍光波長域が重なっており、区別は困難であった（図(1)-1a）。赤色励起光下では赤外域に蛍光波長をもつため目視はできないが、粒子の蛍光強度が弱く、細菌のみを検出可能であった（図(1)-1c）。一方、青色励起光下では、大腸菌は520 nm付近にピークがあるのに対し、粒子は550 nm以降になだらかなピークをもつことがわかった（図(1)-1b）。これらの結果より、染色剤の選択と顕微分光の最適化を行うことにより、粒子上に付着した微生物を蛍光波長の違いから粒子と区別できる可能性があることがわかった。

図(1)-1. 萤光染色した大腸菌および黄砂発生源土壌粒子の蛍光顕微鏡画像および蛍光波長a) UV励起光、b) 青色励起光、c) 赤色励起光
この結果をもとに、土壌粒子に大腸菌を添加した試料を用いて、レーザー頭微鏡を用いた頭微分光法による細菌の可視化のための条件を決定した。各波長域の蛍光を検出することにより、微生物、粒子それぞれの蛍光画像を取得し、さらにその画像を合成することにより、粒子に付着した細菌を可視化できることがわかった（図(1)-2b）。さらに、試料を乾熱滅菌処理することにより、微生物由来の蛍光のみが消失していることから（図(1)-2b）、黄砂粒子上の微生物の新たなバイオイメージング法として確立した。

a) 蛍光顕微鏡画像

b) レーザー顕微鏡画像

図(1)-2. 蛍光顕微鏡およびレーザー顕微鏡による黄砂発生源の土壌粒子に添加した大腸菌の検出
## 2 ）微量試料からの細菌DNA増幅法

微量試料における細菌群集構造解析を行うために、全ゲノム増幅およびNested PCR法を検討し、DGGE法により評価した（図(1)-3）。その結果、通常のSingle PCRでは、 $ 10^{4} $ copies/μlまでバンドを確認できた（図(1)-3a）。全ゲノム増幅では $ 10^{3} $ copies/μl以下ではそのバンドパターンは大きく異なり、 $ 10^{4} $ copies/μlが再現性をもった結果を得られる限界であった（図(1)-3b）。一方、Nested PCR法では $ 10^{2} $ copies/μlまでcontrolと類似したバンドパターンが確認でき、さらに、 $ 10^{1} $ copies/μl以下の濃度においても、パターンは異なるもののバンドが確認できた（図(1)-3c）。したがって、Nested PCR法を用いることにより、 $ 10^{2} $ copies/μlまで検出限界を下げることを可能にした。また、 $ 10^{1} $ copies/μlの濃度であってもバンドが確認できることから、そのバンドを切り出し、シーケンス解析を行うことにより、試料中に存在した細菌種を推定することが可能となる。また、本手法を用いるにあたっては、PCRの際に使用する酵素由来の細菌DNAが増幅することがあるため、8-methoxypsoralenを使用し、その増幅を抑制することが重要であることもわかった。

過去の我々の研究から、黄砂試料から抽出した細菌DNA濃度は $ 10^{3}-10^{4} $ copies/μlと推定されることから、本手法を用いることで、信頼性の高い結果を得ることができると考えられた。また、細菌群集構造解析において、DGGE法はそのバンドパターンを同一ゲル間でしか比較できないものの、特徴的なバンドを切りだしてシーケンスを行うことにより、その属種を推定できるという利点があるため、その検出感度を向上できた意義は大きい。

図(1)-3.16S rRNA遺伝子を標的とした各遺伝子増幅法の検討

a）通常の解析方法、b）全ゲノム増幅法、c) Nested PCR法。

$ 10^{6} $ copies/ $ \mu $ lのDNAを通常の方法で解析した結果をControlとし、DGGE解析のバンドパターンにより増幅効率を評価した。
（２）日本上空で採取した黄砂粒子上の微生物の可視化、細菌現存量の測定および多様性評価

１）黄砂現象とともに日本へ飛来した黄砂粒子上の微生物の可視化

大規模な黄砂現象が確認された2010年11月12日および5月2日に日本上空（鳥取県北部の沿岸部：高度1,000－2,000m）で採取した黄砂粒子に付着した微生物について、(1)-1)で開発した手法を用いて可視化を行った結果、黄砂粒子上に微生物が付着していることが確認できた（図(1)-4）。地上からの影響を極力さけ、上空において採取した黄砂粒子上の微生物を可視化したことにより、黄砂現象にともなって微生物が日本へ飛来していることを直接的に証明した。

a) 2010年11月12日

b) 2011年5月2日

図(1)-4. 日本上空で採取した黄砂粒子に付着した微生物の可視化

a)、b) の両日ともに大規模な黄砂現象が確認された。

また、約2,000－8,000個の黄砂粒子を観察した結果、微生物が付着している粒子は粒径5－10μmの比較的大きな粒子であり、一つの粒子に複数の微生物が付着していることがわかった。さらに、黄砂粒子の粒度分布と粒子径ごとの微生物数を図(1)-5に示した。大規模な黄砂現象が確認された2010年11月12日には、粒子径の大きな粒子が比較的多く、付着していた微生物も粒子径が大きな粒子ほど増加し、粒径5μm以上の粒子で特に多い傾向があった。

図(1)-5. 黄砂粒子の粒度分布と各粒子画分の黄砂粒子に付着していた微生物数

黄砂粒子上の微生物数は、レーザー頭微鏡を用いて200視野（2,000－8,000粒子）を観察し、微生物数を計数するとともに、微生物が付着していた粒子径を測定し、算出した。
さらに、マイクロコロニー法により、微生物が黄砂粒子上で増殖することを確認した（図(1)-6）。このことは、黄砂粒子に付着した微生物が増殖活性をもっていることを示すものであり、黄砂現象とともに「生きている」状態で微生物が飛来していることを明らかにした。

a) 2010年11月12日

b) 2011年5月2日

図(1)-6. 日本上空で採取した黄砂粒子上で増殖し、マイクロコロニーを形成した微生物

黄砂粒子をフィルター上に捕集し、寒天培地上で培養した後、レーザー顕微鏡を用いて観察した。

以上の結果より、黄砂粒子は微生物のキャリアーとなり、微生物が黄砂現象とともに日本へ飛来していること、また増殖活性をもつ微生物も飛来していることを直接的に証明した。

## 2 ）黄砂現象とともに日本へ飛来した細菌の現存量測定

前述の(2)-1)ように、黄砂粒子上の微生物を可視化することにより、黄砂現象とともに微生物が飛来していることが明らかになった。飛来する微生物の環境や健康への影響を明らかにするためには、その細菌現存量に関する定量的データが必要となる。そこで、細菌の16S rRNA 遺伝子を標的とした定量的リアルタイムPCR法により細菌現存量を測定した。

2010年3月から2010年11月においては、兵庫県南部の沿岸部（高度1,000−2,000m）において試料採取を行った（表(1)-1a）。黄砂飛来が観測された2010年3月21日に $ 4 \times 10^{3} $ cells/m $ ^{3} $ が検出されたのをはじめ、黄砂観測時には約 $ 10^{3} $ cells/m $ ^{3} $ の細菌が存在することがわかった。また、非黄砂時期である6月から9月においても、大気中には $ 10^{2}-10^{4} $ cells/m $ ^{3} $ の細菌が存在することが明らかになった。

一方、2010年11月には、本研究期間において最大規模の黄砂現象が確認されたことから、これまでの兵庫県南部の海上に加え、鳥取県北部の海上においても試料採取を行った。さらに、黄砂飛来前の11日から、黄砂飛来時の12日、徐々に拡散していく13日、降雨により完全に黄砂現象が終息した16日まで連続的に試料採取を行った。11月12日の日本上空における大気中の細菌現存量は $ 10^{4} $ cells/m $ ^{3} $ であり、これまでで最も多い細菌が検出された（表(1)-1b）。