Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
試薬である。また、ROS産生量は、細胞培養液のみを作用させた群の値を100％として次式により算出した。ROS production intensity = Fluorescence / cell viability

## （３）黄砂および黄土高原土壌の起災性評価

## 1 ）黄砂·黄土高原土壤

黄砂は、中国・北京市にある中国農業大学屋上に滅菌した黄砂採取装置を設置し、2010年3月24日から3日間採取した黄砂を黄砂1と定義し、2010年3月20日の黄砂を黄砂2と定義して実験に用いた。黄土高原の異なる3地点で採取した土壌を、黄土高原1、2、3と定義し、黄砂発生源土壌試料として実験に用いた。

## 2 ）黄砂および黄土高原土壌の形状観察

黄砂、および黄土高原土壌を走査型電子顕微鏡にて観察した。脱イオン水で0.25 mg/mLに調整した各試料を試料台に滴下し、水分が蒸発するまでホットプレート上で乾燥させた。その後、試料を走査型電子顕微鏡で観察した。

### 3 ）黄砂および黄土高原土壌のRAW264.7細胞に対する細胞傷害性試験

96穴プレートに1.5 × 10^{4} cells/100 μL/wellでRAW264.7細胞を播種し、24時間培養した後、黄砂および黄土高原土壤を加えた。24時間後、25%グルタルアルデヒドにて15分間細胞を固定し、水で3回洗浄後、0.05%メチレンブルー溶液で15分間細胞を染色した。染色した細胞を洗浄した後、0.33N HClにより色素を溶解した。続いて吸光度（655-415 nm）を測定し、メディウムコントロールを100%として細胞生存率を算出した。

## 4 ）黄砂および黄土高原土壤の炎症性サイトカイン誘導

96穴プレートに $ 1.5 \times 10^{4} $ cells/100 μL/wellでRAW264.7細胞を播種し、24時間培養後、黄砂、黄土高原土壤を加えた。24時間後、培養上清中におけるIL-6、TNF-α産生量をELISAで測定した。

## （４）黄砂の炎症惹起メカニズムの基礎的解析

### 1 ）各種阻害剤存在下でのRAW264.7細胞の炎症性サイトカイン産生量の評価

96穴プレートに1.5 × 10^{4} cells/100 μL/wellでRAW264.7細胞を播種し、24時間培養した。その後、ROS阻害剤であるBHA（250 μM）、NADPH oxidase 阻害剤であるDPI（2 μM）、Extracellular Signal-regulated Kinase 1/2（ERK1/2）阻害剤であるU0126（30 μM）、c-jun Nterminal Kinase（JNK）阻害剤であるSP600125（50 μM）またはnuclear factor-kappa B（NF-κB）阻害剤であるSN50（50 μM）を添加した。30分後、各種阻害剤と各粒子（100 μg/mL）を加えた。6時間後、培養上清中のTNF-α濃度をELISAにて測定した。

## （５）黄砂および黄土高原土壌の体内動態と生体影響の基礎的評価

## 1 ）体内動態観察

黄砂および黄土高原土壤の体内移行性を評価するために、BALB/cマウス（6週齢、雌性）
にPBSで希釈した黄砂および黄土高原土壌（30 μg/匹）を経鼻投与した。24時間後に、鼻腔粘膜、肺、脳、肝臓、脾臓を摘出し、およそ1 mm角にカットした後、水冷した2.5%グルタルアルデヒド中で2時間固定した。固定液を廃棄し、冷0.1 Mリン酸緩衝液を加えた後、水冷しながら10分間の洗浄作業を3回繰り返した。その後、冷1%四酸化オスミウム液を加えて水冷しながら1時間振盪し、後固定を行った。続いて、濃度の異なるエタノール中で脱水した後、酸化プロピレンで置換し、Epon-812樹脂で包埋した。作製したサンプルブロックをダイヤモンドナイフで薄切し、およそ60 nmの超薄切片を作製した。この超薄切片を酢酸ウラニルとクエン酸鉛で染色後、透過型電子頭微鏡観察を行った。また、酢酸ウラニルとクエン酸鉛での染色を行わない状態でも超薄切片の観察を行った。

## 2 ）in vivo における起災性試験

黄砂および黄土高原土壌の起災性を評価するため、BALB/cマウスをネンブタールにより麻酔し、PBSで希釈した各濃度の黄砂、および黄砂発生源土壌を経鼻投与した。24時間後、マウスをネンブタールにより麻酔を施し、PBS 1 mLで肺胞内を洗浄し、肺胞洗浄液（BALF）として回収した。BALF内の細胞数はヌクレオカウンターにより計数した。また、肺組織は、ハマトキシリン-エオジン染色で病理学的に解析した。

## 3 ）血液生化学試驗

BALB/cマウス（6週齢、雌性）に PBS で30 μg/匹に調整した黄砂分散液を20 μLずつ経鼻投与した。投与24時間後に、ネンブタール麻酔下で心臓より採血を行った。採血は 5 IU/mL のヘパリン溶液であらかじめ湿らせたシリンジおよび注射針を用いて行った。回収した血液は、1750 × g、15分間の遠心分離により血漿を回収し、血液生化学検査に供した。血漿中のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）、血中尿素窒素（BUN）を比色法にて測定した。ALT 活性は、基質であるL-アラニンのアミノ転位反応によって生じたピルビン酸が、ピルビン酸オキシダーゼと反応することで生じる過酸化水素とジアリールイミダゾールロイコ色素の反応によって生成した青色色素を測定した。BUNは、ウレアーゼの作用によって生成したアンモニアとブロムクレゾールグリーンとの反応によって生じた緑色色素を測定した。

### 4. 結果及び考察

## （１）黄砂モデル粒子であるシリカ粒子の起災性評価

生体が黄砂を吸引した場合、まず肺組織中に多数存在する貪食細胞が黄砂粒子を取り込み、異物排除に働くと考えられている。その過程で、マクロファージなどの貪食細胞は、多くの炎症性サイトカインを産生することで、炎症を誘発し、花粉症や喘息などの免疫疾患を惹起すると考えられる $ ^{5} $ 。そこで本研究では、まずはじめに、黄砂粒子（発生源土壌の黄土粒子を含む）および黄砂の主たる微粒子成分である1μm以上のシリカ粒子を、免疫担当細胞に作用させ、細胞内動態及び免疫賦活化能を評価することで、黄砂の免疫攪乱作用の全貌解明に向けた基礎情報収集を図った。本検討で用いたシリカ粒子は、均一な球状であり非常に分散性に優れていることを既に確認している。まず、粒子径約1μmのシリカ粒子を用い、ヒトマ
クロファージ細胞株THP-1細胞に作用させた際の細胞内動態を透過型電子顕微鏡により観察した。その結果、シリカ粒子はエンドソームもしくは細胞質内に多数取り込まれていることが判明した（図(3)-1）。

Nontreat

シリカ粒子

図(3)-1. シリカ粒子を作用させた細胞の透過型電子顕微鏡像

THP-1細胞にシリカ粒子を6時間作用させ、細胞をTEM観察した。矢印は取り込まれたシリカ粒子を示す。

次に、THP-1細胞にシリカ粒子を作用させた際の、培養上清中の炎症性サイトカインIL-1β産生量を測定することで、シリカ粒子の起炎性を評価した。その結果、シリカ粒子作用群において有意なIL-1β産生が認められ、陽性コントロールとして用いたLPSやATPよりもIL-1βを産生することが示された（図(3)-2）。

図(3)-2. シリカ粒子作用によるIL-1β産生評価.

THP-1細胞にシリカ粒子を24時間作用させ、培養上清中のIL-1β量をELISAで評価した。値は、平均値±標準偏差で示している。**P < 0.01

以上の結果から、シリカ粒子が強い起災性を有することが示された。IL-1βは、炎症反応のトリガーとしてTNFαやIL-6など種々炎症性サイトカインの産生を誘導し、過剰な免疫応答や、さらにはアレルギーや自己免疫疾患の発症などに関与することが報告されている。事実、IL-1βは昨今甚大な健康被害を引き起こしたアスベストへの長期・多量曝露により発現するアスベストーシスの発症要因であることが明らかとされている $ ^{6} $ 。従って、黄砂によるマクロファージからのIL-1β産生が発端となり、種々呼吸器疾患が誘発されることが示唆された。

## （２）黄砂モデル粒子であるシリカ粒子の起災性惹起メカニズムの解明

近年、アスベストや尿酸結晶を始めとした粒子状物質によるIL-1β産生が、the nacht domain, leucine-rich repeat, and pyrin domain containing protein 3（NALP3）インフラマソームと呼ばれ
る分子複合体により制御されていることが報告され始めている $ ^{7)} $ 。NALP3インフラマソーム形成の中心的役割を担うNALP3は、病原体関連分子パターン（pathogen-associated microbial patterns；PAMPs）や、異物認識などにより惹起される“Danger signal”関連分子パターン（danger-associated molecular patterns; DAMPs）に対する細胞内レセプターと考えられている。これらPAMPsやDAMPsを認識したNALP3は重合体を形成し、アダプター分子であるapoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain（ASC）、さらには未成熟なpro-caspase-1をリクルートすることで、NALP3インフラマソームを形成する。この複合体形成がトリガーとなりcaspase-1が活性化し、未成熟なpro-IL-1βは活性型のmature-IL-1βへと変換され、細胞外へと分泌される（図(3)-3）。このように、NALP3インフラマソームは、caspase-1の活性、並びにIL-1β産生を厳重に制御していると考えられている。しかし、その活性化メカニズムには不明な点が数多く残されている。

図(3)-3. 微粒子によるIL-1β活性化メカニズム．NALP3は、アダプター分子であるASC、未成熟なpro-caspase-1をリクルートすることで、NALP3インフラマソームを形成する。この複合体形成によりcaspase-1が活性化し、未成熟なpro-IL-1βは活性型の成熟IL-1βへと変換され、細胞外へと分泌される。

そこで、黄砂による炎症性免疫疾患誘発メカニズムの解明を最終目標に、シリカ粒子のIL-1β産生メカニズムの解明を試みた。粒子状異物によるIL-1β産生は、その貪食過程（エンドサイトーシス）を経ることで誘導されると考えられている。そこで、シリカ粒子によるIL-1β産生がエンドサイトーシス依存的であることを確認する目的で、エンドサイトーシス阻害剤であるcytochalasin D存在下における、シリカ粒子のIL-1β産生誘導能を評価した（図(3)-4）。なおATPは、細胞表面のP2X7受容体に結合し、細胞質内のK⁺を細胞外に流出させることで、エンドサイトーシス非依存的にIL-1β産生を促進することが知られており、コントロールとして用いた。その結果、cytochalasin Dは、ATPによるIL-1β産生にはほとんど影響を与えなかったのに対し、シリカ粒子によるIL-1β産生を有意に抑制した。従って、マクロファージによるエンドサイトーシスが、シリカ粒子によるIL-1β産生の第一のシグナルの一つであることが判明した。

次に、シリカ粒子がpro-IL-1βの発現量、及びcaspase-1の活性化のいずれに作用したのかを、
半定量的RT-PCR、並びにcaspase-1阻害剤を用いることで評価した（図(3)-5）。その結果、pro-IL-1βの発現量は、シリカ粒子作用群、未作用群の両者において、ほとんど差が認められなかった一方で（図(3)-5a）、caspase-1特異的阻害剤であるzYVAD-fmk存在下においては、シリカ粒子によるIL-1β産生がほぼ完全に抑制されることが判明した（図(3)-5b）。なお、シリカ粒子未作用群においてもzYVAD-fmkはIL-1β産生を抑制したが、これはTHP-1細胞で認められる内因性のcaspase-1活性を抑制したものと考えられる。従って、シリカ粒子は、pro-IL-1βのmRNA発現には影響を及ぼさず、caspase-1を活性化することでIL-1β産生を誘導したものと考えられた。

図(3)-4. シリカ粒子によるIL-1β産生誘導におけるエンドサイトーシスの関与. THP-1細胞に、サイトカラシン存在下および非存在下でシリカ粒子を6時間作用させ、培養上清中のIL-1β量をELISAで評価した。値は、平均値±標準偏差で示している。 $ ^{*}P < 0.05 $ 、 $ ^{**}P < 0.01 $

図(3)-5. シリカ粒子作用によるIL-1β産生評価. THP-1細胞にシリカ粒子を24時間作用させ、培養上清中のIL-1β量をELISAで評価した。値は、平均値±標準偏差で示している。 $ ^{**} $ P < 0.01

次に、シリカ粒子によるIL-1β産生が、インフラマソームの形成を介しているのか、その構成分子であるASCの細胞内挙動を指標として検討した（図(3)-6）。青色蛍光タンパク質であるCFPとASCの融合タンパク質（ASC-CFP）を強制発現させたTHP-1細胞を作製し、シリカ粒子を作用した際のASC-CFPの挙動を共焦点レーザー顕微鏡により解析した。その結果、シリカ粒子未作用群においては、ASC由来の青色蛍光は細胞質全体に拡散していたのに対して、シリカ粒子作用群ではASCの凝集を示すドット状の青色蛍光が観察された。以上の結果から、シリカ粒子はインフラマソームを介してIL-β産生を惹起していることが強く示唆された。
図(3)-6. シリカ粒子作用によるNALP3活性化 青色蛍光タンパク質であるCFPとASCの融合タンパク質（ASC-CFP）を強制発現させたTHP-1細胞に、シリカ粒子を作用した際のASC-CFPの挙動を共焦点レーザー顕微鏡により解析した。

近年、活性酸素種（ROS）及びリソソーム内酵素であるカテプシンBが、インフラマソームの活性化因子として作用することが報告されている。そこでまず、代表的なカテプシンB阻害剤であるbafilomycin A₁あるいはCA-074-Me存在下における、シリカ粒子のIL-1β産生誘導能を評価した（図(3)-7a,b）。その結果、いずれの阻害剤もシリカ粒子によるIL-1β産生をほぼ完全に抑制することが判明した。すなわち、カテプシンBがシリカ粒子によるIL-1β産生に必須であることが明らかとなった。そこで、本来エンドソーム、あるいはリソソーム内にのみ存在するカテプシンBが、細胞質に存在するインフラマソームを活性化するメカニズムの解析を試みた。赤色蛍光標識したデキストラン（エンドソームマーカー）とシリカ粒子をTHP-1細胞に共作用させ、デキストランの細胞内動態を共焦点レーザー顕微鏡により評価した（図(3)-7c）。その結果、シリカ粒子未作用群においては、安定なエンドソームを示すドット状の赤色蛍光のみが観察されたのに対し、シリカ粒子作用群においては、細胞質全体にデキストランが拡散している様子が観察された。本結果は、シリカ粒子がエンドソームを破壊したことを強く示唆しており、これにより細胞質へと漏出したカテプシンBが、インフラマソームの形成を誘導したものと考えられた。続いて、シリカ粒子によるIL-1β産生に対するROSの関与を解析した。まず、シリカ粒子作用群におけるROS産生量を評価したところ、シリカ粒子は有意にROS産生を誘導することが判明した（図(3)-8a）。次に、ROS阻害剤であるBHA、DPI存在下における、シリカ粒子のIL-1β産生誘導能を評価したところ、いずれの阻害剤もシリカ粒子によるIL-1β産生をほぼ完全に抑制することが明らかとなった（図(3)-8b）。すなわちシリカ粒子は、カテプシンBの漏出及びROS産生の両者を誘導することでIL-1β産生を惹起することが判明した。そこで、ROSとカテプシンBが1つのシグナル伝達経路を構築している可能性を考え、ROS阻害剤存在下でのエンドソームの細胞内挙動を、先ほどと同様、デキストランを指標として解析した（図(3)-9）。その結果、ROS阻害条件下においては、シリカ粒子作
用群で観察されたデキストランの拡散が、ほぼ完全に抑制されることが判明した。すなわち、シリカ粒子作用時に観察されるエンドソームの破壊が、シリカ粒子の取り込みなどにより誘導されたROS依存的に惹起されることが明らかとなった。

a)

b)

図(3)-7. シリカ粒子によるIL-1β産生誘導におけるカテプシンBの関与

c)

THP-1細胞に、(A) bafilomycin A₁もしくは(B) CA-074-Me存在下および非存在下でシリカ粒子を作用させ、培養上清中のIL-1β量をELISAで評価した。値は、平均値±標準偏差で示している。**P<0.01 (C) 赤色蛍光標識したデキストランとシリカ粒子をTHP-1細胞に共作用させ、デキストランの細胞内動態を共焦点レーザー顕微鏡により評価した。

a)

b)

図(3)-8. シリカ粒子により誘導されるROSのIL-1β産生への関与

（a）THP-1細胞にシリカ粒子を作用させた後、 $ H_{2} $ DCFDAを用いてROS量を測定した。未処理細胞のROS量を100％に設定し、相対値を示した。値は、平均値±標準偏差で示している。THP-1細胞に、（b）ROS阻害剤であるBHAもしくはDPI存在下および非存在下でシリカ粒子を作用させ、培養上清中のIL-1β量をELISAで評価した。値は、平均値±標準偏差で示している。 $ ^{*} $ P<0.05、 $ ^{**} $ P<0.01
図(3)-9.エンドソームの動態評価

ROS阻害条件下において、赤色蛍光標識したデキストランとシリカ粒子をTHP-1細胞に共作用させ、デキストランの細胞内動態を共焦点レーザー顕微鏡により評価した。

以上の結果から、図(3)-10に示す通り、シリカ粒子は細胞にエンドサイトーシスで取り込まれた後、ROSの産生を誘発し、ROSがリソームを破壊することでカテプシンBが細胞質に流出し、インフラマソームの活性化を誘導することが明らかとなった。従って、黄砂によるROS産生を阻害することで、黄砂による免疫疾患誘発を予防できる可能性が示唆された。

図(3)-10. シリカ粒子により誘導されるIL-1β 産生経路の模式図

シリカ粒子はエンドサイトーシスにより取り込まれ、NADPH-oxidaseの活性化、ROS産生、エンドソームの崩壊、cathepsin Bの漏出、インフラマソームの活性化、を介してカスパーゼ1の活性化を誘導する。
## （３）黄砂および黄土高原土壌の起災性評価

次に、黄砂の起災性を評価した。中国・北京市で採取した黄砂と、黄砂発生源の一つである黄土高原で採取した土壤（黄土高原土壤）の起災性を、マクロファージの炎症性サイトカイン産生を指標として評価した。本検討では、2010年3月24日から3日間、中国農業大学屋上で採取した黄砂を黄砂1と定義し、2010年3月20日に同様の方法で採取した黄砂を黄砂2と定義して実験に用いた。さらに、黄砂発生源土壌である黄土高原の異なる3地点から採取した土壤を、黄土高原1、黄土高原2、黄土高原3と定義して実験に用いた。なお、これら黄砂および黄土高原土壌に含まれる細菌菌体外毒素であるリポポリサッカライド（LPS）量は0.04 ng/mg以下であり、起災性を惹起しない含有量であることを確認している。

まず、黄砂および黄土高原土壌の一次粒子径および表面性状を走査型電子顕微鏡で観察した。その結果、いずれの黄砂・黄土高原土壌も、粒子表面は粗く、不揃いな形状の粒子であり、凝集している粒子も存在することが判明した（図(3)-11）。また、いずれの黄砂中にも100μm以上の粒子はほとんど観察されなかったのに対し、全ての黄土高原土壤中には100μm以上の粒子も多数観察された。

次に、黄砂および黄土高原土壌をマウスマクロファージ細胞株であるRaw 264.7細胞に作用させ細胞傷害性を評価した。その結果、いずれの黄砂および黄土高原土壌においても、検討した濃度では細胞傷害性は全く認められなかった（図(3)-12）。さらに、黄砂と黄土高原土壌の起災性を評価した。シリカ粒子の起災性評価においては、IL-1β産生を指標に起災性を評価した一方で、基礎的検討として黄砂粒子をマウスに投与した場合、IL-1βではなく、TNF-αやIL-6などの炎症性サイトカインが産生されることを見出している（data not shown）。そこで本検討では、マウスマクロファージ細胞株RAW264.7細胞に黄砂を添加した後の、培養上清中の炎症性サイトカインTNF-α、IL-6量を指標として起災性を評価した。その結果、黄砂作用群でTNF-α、IL-6産生がコントロール群と比較して有意に増加し、強い免疫活性化能を有するLPS作用群と同程度またはそれ以上の産生が認められた（図(3)-13）。一方で、黄土高原土壤作用群では、TNF-α、IL-6量はコントロール群と同程度であった。以上の結果から、黄砂は黄土高原土壤と比較して、強い起災性を有する可能性が示された。黄砂中に含まれるLPS量は、炎症性サイトカイン産生に影響しない量であることから、黄砂の強い起災性はLPS以外の要因が関与していると考えられた。

次に、サブテーマ(4)において調製した中国・黄土高原の土壌を10 μm以下に分級した土壌試料を黄土高原（10 μm以下）と定義し、実験に用いた。粒子径と起災性の関係を評価するため、黄土高原土壌あるいは黄土高原（10 μm以下）をRAW264.7細胞に作用させ、培養上清中のTNF-α量を評価した。その結果、黄土高原土壌作用群と比較して、黄土高原（10 μm以下）作用群ではTNF-α産生量が有意に増加していた（図(3)-13）。以上の結果から、黄砂によるサイトカイン産生誘導には、黄砂の粒子径が大きく関与しており、小さな粒子ほど強い起災性を有することが示唆された。
図(3)-11. 走査型電子顕微鏡による黄砂及び黄土高原土壌の観察黄砂（a,b）及び黄土高原土壌（c-e）を走査型電子顕微鏡で観察した。スケールバーは、100 μmを示している。

図(3)-12. 黄砂及び黄土高原土壌の細胞傷害性評価

マウスマクロファージ細胞株であるRAW264.7細胞に、黄砂もしくは黄土高原土壌を各濃度（6.25, 25, 100 μg/ml）で添加した後、メチレンブルー法により細胞生存率を算出した。メディウムコントロールを100%とした。結果は、平均値±標準偏差で表記した。

a)

b)

図(3)-13. 黄砂及び黄土高原土壌の起災性評価

マウスマクロファージ細胞株であるRAW264.7細胞に、LPSもしくは黄砂及び黄土高原土壌（最終濃度100 μg/ml）を添加した。24時間後に培養上清を回収し、IL-6（A）とTNF-α（B）量をELISAにより評価した。結果は、平均値±標準偏差で表記した。 $ ^{**} $ P < 0.01、N.D.; 検出限界以下
黄砂には、LPSのみならずβ-グルカンといった菌体成分、輸送過程で付着したアンモニウムイオン、硫酸イオン、硝酸イオンといった化学物質などが付着していることが報告されている。さらに近年、黄砂が塩化カルシウムなどに覆われ、液滴化することによって生体反応性が変化するといった知見も明らかとなりつつある。従って、黄砂と黄土高原土壤の起炎性の違いは、黄砂の粒子径が小さくなることにより表面積が増加し、付着する化学成分の量が多くなることに起因する可能性も考えられる。今後、より詳細に黄砂の物性や付着する成分に着目した評価を進めることで、黄砂の起炎性をより詳細に明らかにできると考えている。

## （４）黄砂の炎症惹起メカニズムの基礎的解析

我々は既に、貪食細胞であるマクロファージが粒子状物質を貪食すると、nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-oxidase（NADPH oxidase）が活性化されることで、ROSが産生され、MAPK経路を活性化することを明らかにしている $ ^{8} $ 。そこで、黄砂の起災性誘発メカニズムを、TNF-α産生誘導メカニズムに焦点を絞り解析した。黄砂による起災性のエンドサイトーシス依存性を、マウスマクロファージ細胞株Raw264.7細胞を用いて評価した。エンドサイトーシス阻害剤であるcytochalasin D存在下で、RAW264.7細胞に黄砂を作用させ、培養上清中のTNF-α量を指標に起災性を評価した（図(3)-14）。その結果、cytochalasin Dは、黄砂によるTNF-α産生を有意に抑制することが判明した。すなわち、マクロファージによるエンドサイトーシスが、黄砂によるTNF-α産生の第一のシグナルの一つであることが判明した。

図(3)-14. 黄砂の炎症惹起におけるエンドサイトーシスの関与

マウスマクロファージ細胞株であるRAW264.7細胞に、エンドサイトーシス存在下で黄砂及び黄土高原土壌を添加した。24時間後に培養上清を回収し、TNF- $ \alpha $ 量をELISAにより評価した。結果は、平均値±標準偏差で表記した。

$ ^{**} $ P < 0.01、N.D.; 検出限界以下

次に、黄砂によるROS産生メカニズムについて検討した。ROSは、NF-κBやMAPKシグナルなど炎症性サイトカイン産生に関連する複数のシグナル応答を活性化することが報告されている。そこでまず、黄砂のマクロファージに対する起災性とROSとの関連を精査するため、黄砂がROS産生に及ぼす影響を評価した。RAW264.7細胞に黄砂および黄土高原土壤を作用させ、ROS産生を評価した。その結果、黄砂や黄土高原（10μm以下）は黄土高原土壤よりも強くROS産生を誘導する傾向が認められた（図(3)-15）。
a)

b)

図(3)-15. 黄砂及び黄土高原土壌のROS産生誘導能評価

RAW264.7細胞をDCFH-DAで30分間処理した。その後、黄砂及び黄土高原土壌（最終濃度100 μg/ml）を添加した。a) 30分、b) 2時間、c) 6時間後に細胞中の蛍光量を指標に、ROS産生を評価した。結果は、平均値±標準偏差で表記した。 $ ^{*}P < 0.05 $ 、 $ ^{**}P < 0.01 $

そこで次に、ROS阻害剤であるBHA存在下でRAW264.7細胞に黄砂および黄土高原（10μm以下）を作用させ、培養上清中のTNF-α量を評価した。その結果、いずれの黄砂および黄土高原（10μm以下）作用群においても、コントロール群と比較して有意なTNF-α産生の上昇が認められたが、ROS阻害剤を作用させることで、コントロール群と同程度までTNF-α産生が抑制された（図(3)-16）。以上の結果から、黄砂による炎症性サイトカインの産生には、ROSなどの酸化ストレス因子の産生が関与していることが示唆された。

図(3)-16. ROS阻害剤存在下における黄砂及び黄土高原土壌の起災性評価. RAW264.7細胞をROS阻害剤であるBHAで30分間処理した。その後、黄砂及び黄土高原土壌を添加した。6時間後に培養上清を回収し、TNF- $ \alpha $ 量をELISAにより評価した。結果は、平均値±標準偏差で表記した。 $ ^{**} $ P < 0.01

次に、黄砂によるROS産生メカニズムについて検討した。ROSは、細胞膜・エンドソーム膜に存在するNADPH oxidaseやミトコンドリアが主な産生源として知られている。そこで、黄砂によるROS産生メカニズムとNADPH oxidaseとの関連を、NADPH oxidase阻害剤であるDPIを用いて評価した。DPI存在下でRAW264.7細胞に黄砂または黄土高原土壤を作用させ、培養上清中のTNF-α量を指標に起災性を評価した。その結果、いずれの黄砂および黄土高原土壤を添加したマクロファージにおいても、TNF-α産生はDPIにより抑制された（図(3)-17）。以上の結果から、黄砂によるROS産生には、NADPH oxidaseが関与していることが示唆された。
図(3)-17. NADPHオキシダーゼ阻害剤存在下における黄砂及び黄土高原土壌の起災性評価. RAW264.7細胞をNADPHオキシダーゼ阻害剤であるDPIで30分間処理した。その後、黄砂及び黄土高原土壌を添加した。6時間後に培養上清を回収し、TNF-α量をELISAにより評価した。結果は、平均値±標準偏差で表記した。N.D.;検出限界以下

MAPKは、細胞が外部からのストレスやサイトカイン刺激を受けると、リン酸化を受けて活性型となり、炎症性サイトカイン産生に関与する転写因子などを活性化するリン酸化酵素である $ ^{8} $ 。そこで次に、黄砂によるマクロファージ活性化にMAPK経路が及ぼす影響を評価した。代表的なMAPKであるJNK、ERKの阻害剤存在下で、RAW264.7細胞に黄砂および黄土高原（10 μm 以下）を作用させ、培養上清中のTNF-α量を評価した。その結果、黄砂、黄土高原（10 μm 以下）によるTNF-α産生は、JNK阻害剤により有意に抑制された（図(3)-18a）。また、ERK阻害剤で処理することによっても、コントロール群と同程度にまでTNF-αの産生が強く抑制された（図(3)-18b）。以上の結果から、黄砂によるTNF-αの産生誘導に、MAPK経路が関与していることが示唆された。以上の結果より、マクロファージに黄砂を作用させることで、ROSが産生し、そのROSの活性化によってMAPK経路が活性化すると考えられる。一方で、MAPK経路が活性化しROSが産生されることも知られていることから、今後、シグナル伝達経路を詳細に検討する必要があると考えている。

a)

b)

図(3)-18. MAPK阻害剤存在下における黄砂及び黄土高原土壤の起災性評価 RAW264.7細胞をJNK阻害剤であるSP600125（a）、ERK阻害剤であるU00126（b）で30分間処理した。その後、黄砂及び黄土高原土壤を添加した。6時間後に培養上清を回収し、TNF- $ \alpha $ 量をELISAにより評価した。結果は、平均値±標準偏差で表記した。 $ ^{*} $ P < 0.05、 $ ^{**} $ P < 0.01、N.D.;検出限界以下
MAPKは、TNF-αの代表的な転写因子として知られるNF-κBをはじめ多くの転写因子を活性化することが知られている。そこで、黄砂の炎症性サイトカイン誘導におけるNF-κBの関与を検討するため、NF-κB阻害剤であるSN50存在下でRAW264.7細胞に黄砂および黄土高原（10μm以下）を作用させ、培養上清中のTNF-α量を評価した。その結果、NF-κB阻害剤を作用させることで、黄砂によるTNF-αの産生が有意に抑制された（図(3)-19）。一方で、NF-κB阻害剤ではTNF-αの産生を完全に抑制できていないことから、黄砂によるTNF-αの産生には、NF-κB以外の転写因子も関与している可能性が考えられた。今後、ROSやMAPKが活性化する転写因子をより詳細に明らかにする必要があると考えられる。

これまでの結果をまとめて考察すると、黄砂によるサイトカイン産生は、貪食細胞による、黄砂のエンドサイトーシス、NADPH oxidase活性化によるROSの産生、MAPKの活性化、NF- $ \kappa $ Bの活性化により誘導されると考えられた。

図(3)-19. NF-κB阻害剤存在下における黄砂及び黄土高原土壤の起災性評価RAW264.7細胞をNF-κB阻害剤であるSN50で30分間処理した。その後、黄砂及び黄土高原土壤を添加した。6時間後に培養上清を回収し、TNF-α量をELISAにより評価した。結果は、平均値±標準偏差で表記した。 $ ^{*}P<0.05 $ 、 $ ^{**}P<0.01 $ 、N.D.; 検出限界以下

## （５）黄砂および黄土高原土壌の体内動態と生体影響の基礎的評価

黄砂に限らず粒子状物質は、吸引曝露した場合、直径1μm以下のものは肺胞にまで到達することが知られている。しかし、黄砂の体内動態に関する情報は世界的にも非常に乏しく、黄砂が体内に侵入するのかどうかといった基礎的な情報さえ不明な点が多い。従って、黄砂が移行する臓器や細胞を明らかとすることは、科学的根拠に基づいた黄砂の安全性情報を提示し、黄砂による生体影響のメカニズム解明に非常に有用な情報であると考えられる。そこで、マウスに黄砂を経鼻投与し、主要臓器への移行性を評価した。

中国・北京市において、一日にヒトが曝露する黄砂の量は約20 mgにも及ぶと考えられている。ヒトの曝露量をマウス1匹に換算すると、一日で約10 μgの黄砂を曝露することになる。そこで、日常的に黄砂を鼻から吸引することを想定し、30 μg/mouseで投与し、黄砂の体内移行性を評価した。黄砂および黄土高原土壌をBALB/cマウスに経鼻投与し、24時間後に肺、脾臓、肝臓、脳、鼻腔粘膜を回収した。回収した各臓器を透過型電子頭微鏡で観察したところ、脾臓、肝臓、脳、鼻腔粘膜に移行した黄砂および黄土高原土壌は認められなかった（図(3)-20b-e, g-j）。一方で肺においては、黄砂、黄土高原土壌投与群ともに粒子の存在が確認された（図(3)-20a, f）。また、黄砂投与群においては、肺胞の上皮細胞内に侵入している粒子も確認された（図(3)-20a）。さらに、黄土高原（10 μm以下）投与群では、黄砂投与群よりも多くの粒
子が肺胞上皮細胞内に侵入していることが観察されるとともに（図20K）、脾臓のリンパ球においても粒子が確認された（図3)-201）。以上の結果から、今後、定量的な検討が必要ではあるものの、黄砂が経鼻投与によって、上皮細胞バリアーを通過し体内に侵入する可能性が示された。また、黄土高原（10μm以下）の結果ではあるが、黄砂は経鼻投与によって体内に吸収され、何らかの経路を通り、各臓器にまで移行する可能性が考えられた。

黄砂が生体内に侵入することが示唆されたことから、黄砂を経鼻投与後に、主要臓器における障害マーカーを指標として生体影響を評価した。黄砂および黄土高原土壌をマウスに経鼻投与し、24時間後、血液を回収し血漿を生化学検査した。その結果、肝障害マーカーであるALTやAST、腎障害マーカーであるBUNはいずれの群においても顕著な変化はなく、臨床的に意義のある異常値は認められなかった（図(3)-21）。次に、黄砂が経鼻投与後に肺組織にまで到達することを鑑み、黄砂を経鼻投与後の肺組織における炎症を評価した。黄砂をマウスに経鼻投与し、経時的に肺胞洗浄液を回収し、肺胞洗浄液中の浸潤細胞数を指標に、肺の炎症度を評価した。その結果、黄砂投与群の浸潤細胞数は、コントロール群と比較して有意に増加した（図(3)-22）。従って、黄砂曝露により、肺組織において、貪食系細胞や好酸球などの炎症性細胞浸潤に伴う強い炎症反応が誘導される可能性が考えられた。今後、浸潤細胞の同定など、黄砂の経鼻投与による影響を精査することで、黄砂特有の起災性を明確にする必要があると考えている。

図(3)-20. 透過型電子顕微鏡による黄砂及び黄土高原土壤の体内動態評価

BALB/cマウスに、30 μg/マウスの黄砂（a-e）、黄土高原土壌（f-j）もしくは黄土高原土壌（10 μm 以下）（k,l）を経鼻投与した。24時間後に、肺（a,f,k）、脾臓（b,g,l）、肝臓（c,h）、脳（d,i）、鼻腔（e,j）を透過型電子顕微鏡で観察した。矢印は粒子を示している。スケールバーは、500 nm（a）、1 μm（f,k,l）、5 μm（b-e,g-j）を示している。
c)

図(3)-21. 黄砂及び黄土高原土壤を経鼻投与したマウスの血液生化学検査BALB/cマウスに、30 μgの黄砂もしくは黄土高原土壤を経鼻投与し、24時間後に心臓より血液を採取した。採取した血液から血漿を回収し、生化学試験を実施した。結果は、平均値±標準偏差で表記した。 $ ^{*} $ P < 0.05

図(3)-22. 黄砂を経鼻投与したマウスの肺における炎症性細胞の浸潤

BALB/cマウスに、30 μg の黄砂またはPBSを経鼻投与し、肺胞洗浄液を回収した。回収した肺胞洗浄液中の細胞数をセルカウンターにより測定した。結果は、平均値±標準偏差で表記した。 $ ^{*} $ P < 0.05
次に、黄砂および黄土高原土壌が肺組織や鼻腔粘膜に与える影響を、病理学的所見を指標に評価した。黄砂および黄土高原土壌をマウスに経鼻投与し、24時間後、肺組織、鼻腔粘膜を摘出した。鼻腔粘膜は、鼻腔の入り口で、鼻毛・汗腺が存在する鼻前庭部、吸気を加湿・加温・洗浄する呼吸部、そして嗅覚器である嗅細胞を含む嗅部の3つに分かれており、本検討では呼吸部と嗅部を検討した。その結果、いずれの群においても、肺組織や鼻腔粘膜の呼吸部上皮では異常所見は認められなかった（図(3)-23a-h）。一方で、黄土高原土壌投与群の嗅上皮では異常は認められなかったのに対し（図(3)-23k）、黄砂投与群の嗅上皮では、嗅細胞の壊死や変性が認められた（図(3)-23j）。この結果は、少なくとも黄砂の曝露が嗅覚器に何らかの損傷を与える可能性を示唆している。今後、検討数を増やすことで、黄砂投与による組織への影響を、より明確に評価するとともに、黄砂が血中に移行した際の体内動態を、黄砂の物性と連��高地に考察したい。

LPS

図(3)-23. 黄砂もしくは黄土高原土壌を経鼻投与したマウスの病理解析. BALB/cマウスに、PBS（a, e, i）もしくは、30 μg の黄砂（b, f, j）、黄土高原土壌（c, g, k）、2 μg のLPS（d, h, l）を経鼻投与し、24時間後に肺（a-d）、呼吸部（e-h）、嗅部（i-l）の組織を回収した。回収した各組織をHE染色した後に、病理組織学的に評価した。スケールバーは、100 μm（a-d）、50 μm（e-l）を示している。
## まとめ

近年、地球温暖化や深刻な砂漠化の進行によって、黄砂の規模（年間の飛来回数や量）が拡大している。それに伴い、人口の多い都市域にも黄砂が到達するようになり、黄砂による健康問題が表面化してきた。これまでの疫学調査から、黄砂は呼吸器疾患を始めとした多くの健康被害を誘発する危険性が指摘されており、今後も黄砂による被害は増加の一途を辿ると考えられている。しかし、黄砂の生体影響に関しての科学的根拠に基づいた情報は乏しく、幾つかの研究機関で小規模な試験のみが実施されているという危機的な状況にある。言わば、科学的なエビデンスのないまま、国際問題にもなりかねない越境課題となりつつあり、感情的反発が高まっている。しかし、古くから春霞等々の季語として、我が国でも歌われ、共存してきたことも事実であり、今こそ、冷静かつ客観的に黄砂問題を見つめ直す必要があろう。そこで本研究ではこのような危機的状況を強く鑑み、中国北京市に浮遊する黄砂と、比較対象として黄土高原土壌を用いて、体内動態や生体への影響を精査した。本結果は、今後のより詳細な検討が必要ではあるが、黄砂が体内に侵入する可能性を示唆し、黄土高原土壌よりも強い起災性を有することを提示した。呼吸時に黄砂を吸引する場合、黄砂が少しずつ生体内へと蓄積し、過剰かつ慢性的な免疫応答を引き起こす可能性が考えられる。過去のアスベストの事例のように、体内に侵入する量はごく僅かであっても、生体内へと蓄積し生体の許容量を超えた時に、初めて予想だにしなかった病態を惹き起こす可能性もある。従って今後、更にヒト健康確保を目指した研究へと発展させるためには、例えば、今回の検討で明らかになった短期投与での体内動態の他に、長期投与による体内動態の検討も急務である。また、黄砂の生体に対する影響は、本検討以外にも、一般毒性や特殊毒性試験など他の評価系や、使う生物の種類や形態など様々な検討項目を体系的に評価し、総合的に判断されるべきである。今後、種々情報を総合することで、将来的には、本研究で得られた成果と、疫学的調査結果を併せて解析することで、黄砂に起因した疾患の発症や悪化のメカニズム解明とその予防・治療への対策へと繋げたいと考えている。

## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

黄砂等の風送ダストによる健康被害は、日本や中国・韓国・台湾といった東アジアのみならず、世界各国でも問題視されている。そのうえ昨今では、中国での急激な大気汚染の拡大や温暖化とも相俟って、大気中SOx・NOx量や花粉抗原が増大していることから、黄砂に付着する有機物の多様化とその増量が懸念されている。本研究において、種々の採取場所由来の黄砂の物性（成分）とその体内動態、さらには免疫毒性の連関解明を図った。特に、黄砂が吸引曝露により体内に侵入し得ることを明らかにし、さらに、免疫毒性の発症メカニズムを明らかにした。本研究成果は、黄砂により誘発される種々免疫疾患の発症・悪化の予防・治療法の開発に向けた基盤情報になり得るものと考えられる。さらに近年、本邦において、ディーゼル粒子や都市大気粉塵による大気汚染も深刻化している。従って、将来的には、本研究で得られた成果と、疫学的調査結果を併せて解析することで、黄砂をはじめとする微粒子に起因した疾患の発症・悪化のメカニズム解明とその予防・治
療への対策、ヒト健康環境の改善に大きく貢献するものと期待される。本研究の成果は、従来までの疫学調査に基づく黄砂の安全性懸念情報に科学的裏付けを付与し、黄砂に起因した疾患の予防・治療に重要な指針を提供するのみならず、地球環境保全に必須の基盤情報を国内外に提示するための基盤情報になり得ると考えられる。

## （２）環境政策への貢献

黄砂は、国境を超える環境問題であることから、国際活動に支障をきたすことなく、ヒト健康への影響を最大限に考慮しつつ、対策を講じることが必要不可欠である。そのためには我が国も、早急に、十分な疫学調査と共に、黄砂の生体影響を科学的に解明せねばならない。本研究の成果は、従来までの疫学調査に基づく黄砂の安全性懸念情報に科学的裏付けを付与し、科学的根拠のない情報による黄砂現象に対する社会不安を取り除くとともに、黄砂アレルギーなどの発症・悪化メカニズムの解明と、その予防・治療に重要な基盤情報を提供することで国民の健康確保に寄与すると考えられる。さらに、科学的根拠に立脚した環境リスクのマネジメントやそのレギュレーションに有用な情報を提供するものと期待される。

## 6 ．国際共同研究等の状況

特に記載すべき事項はない

### 7. 研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

<論文（査読あり）>

T. Morishige, Y. Yoshioka, H. Inakura, A. Tanabe, X. Yao, S. Narimatsu, Y. Monobe, T. Imazawa, S. Tsunoda, Y. Tsutsumi, Y. Mukai, N. Okada, S. Nakagawa: Biomaterials, 31, 26, 6833-6842, 2010 "The effect of surface modification of amorphous silica particles on NLRP3 inflammasome mediated IL-1beta production, ROS production and endosomal rupture"

くその他誌上発表（査読なし）> 特に記載すべき事項はない

## （2） 口頭発表（学会等）

1) Y. Yoshioka, T. Morishige, H. Inakura, S. Tsunoda, Y. Tsutsumi, Y. Mukai, N. Okada and S. Nakagawa: The Asia/Pasific Chapter of Environmental Toxicology and Chemistry 2010 Conference (SETAC), Guangzhou, China, 2010

“Silica particle, major component of Asian dust, induces IL-1β production through NALP3 activation mediated by cathepsin B”

2) K. Higashisaka, Y. Yoshioka, K. Yamashita, Y. Morishita, T. Yoshida, M. Fujimura, K. Nagano, Y. Abe, H. Kamada, N. Itoh, S. Tsunoda, T. Yoshikawa and Y. Tsutsumi: The Asia/Pasific Chapter of Environmental Toxicology and Chemistry 2010 Conference (SETAC), Guangzhou,
China, 2010

“Development of biomarkers for the safety scientific assessment of nanosilica, major component of Asian dust”

3) K. Yamashita, Y. Yoshioka, K. Higashisaka, Y. Morishita, T. Yoshida, M. Fujimura, K. Nagano, Y. Abe, H. Kamada, N. Itoh, S. Tsunoda, T. Yoshikawa and Y. Tsutsumi: The Asia/Pasific Chapter of Environmental Toxicology and Chemistry 2010 Conference (SETAC), Guangzhou, China, 2010

“The safety scientific assessment of reproductive and developmental toxicity of nanosilica, major component of Asian dust”

4) Y. Morishita, Y. Yoshioka K. Yamashita, K. Higashisaka, T. Yoshida, M. Fujimura, K. Nagano, Y. Abe, H. Kamada, N. Itoh, S. Tsunoda, T. Yoshikawa and Y. Tsutsumi: The Asia/Pasific Chapter of Environmental Toxicology and Chemistry 2010 Conference (SETAC), Guangzhou, China, 2010

“Distribution analysis of nanosilica, major component of Asian dust, to the testis for the safety scientific assessment”

5) 藤村真穂、吉岡靖雄、山下浩平、東阪和馬、森下裕貴、潘慧燕、小椋健正、鍋師裕美、吉川友章、伊藤徳夫、馬場貴志、山口進康、那須正夫、堤康央：日本薬学会 第131年会（2011）

“黄砂の健康リスク解析を目指した免疫毒性に関する基礎的評価”

6) 吉岡靖雄, 藤村真穂, 山下浩平, 東阪和馬, 森下裕貴, 潘慧燕, 小椋健正, 長野一也, 阿部康弘, 鎌田春彦, 角田慎一, 鍋師裕美, 馬場貴志, 山口進康, 伊藤徳夫, 吉川友章, 那須正夫, 堤康央: 第38回日本トキシコロジー学会学術年会（2011）

“ヒト健康へのリスク解析に資する黄砂の免疫毒性に関する基礎的評価”

7) Y. Yoshioka, M. Fujimura, K. Yamashita, K. Higashisaka, Y. Morishita, H. Pan, T. Ogura, H. Nabeshi, K. Nagano, Y. Abe, H. Kamada, S. Tsunoda, T. Baba, N. Yamaguchi, M. Nasu, N. Itoh, T. Yoshikawa and Y. Tsutsumi: SETAC North America 32nd Annual Meeting, USA, 2011

“Fundamental assessment for clarification of Relationship between Asian dust and influenza infection-1; Potential immunotoxicity of Asian dust for the future risk-analysis”

8) K. Yamashita, Y. Yoshioka, M. Fujimura, K. Higashisaka, Y. Morishita, H. Pan, T. Ogura, H. Nabeshi, K. Nagano, Y. Abe, H. Kamada, S. Tsunoda, T. Baba, N. Yamaguchi, M. Nasu, N. Itoh, T. Yoshikawa and Y. Tsutsumi: SETAC North America 32nd Annual Meeting, USA, 2011.

“Fundamental assessment for clarification of Relationship between Asian dust and influenza infection-2; Biodistribution and inflammatory effects of Asian dust for the future risk-analysis”

## （3） 出願特許

特に記載すべき事項はない

（4）シンポジウム、セミナーの開催（主催のもの）

特に記載すべき事項はない
## （５）マスコミ等への公表・報道等

特に記載すべき事項はない

## （6） その他

特に記載すべき事項はない

### 8 \. 引用文献

1) A. Echigo et al.: Saline Systems, 20, 1-8, 2005.

“Endospores of halophilic bacteria of the family Bacillaceae isolated from non-saline Japanese soil may be transported by Kosa event (Asian dust storm)”

2) I. Mori, M. Nishikawa, T. Tanimura, H. Quan: Atmos. Environ., 37, 4253-4263, 2003

“Change in size distribution and chemical composition of kosa (Asian dust) aerosol during long-range transport”

4) K.T. Kanatani et al.: Am. J. Respir. Crit. Care Med., 182, 1475-1481, 2010

"Toyama Asian Desert Dust and Asthma Study Team. Desert dust exposure is associated with increased risk of asthma hospitalization in children"

5) Y. Goto et al.: Am. J. Respir. Crit. Care Med., 170, 891-897, 2004

“Particulate matter air pollution stimulates monocyte release from the bone marrow”

7) F. Martinon, A. Mayor and J. Tschopp: Annu. Rev. Immunol., 27, 229-65, 2009 "The inflammasomes: guardians of the body"

8) T. Morishige et al.: Arch. Toxicol., 2012 [Epub ahead of print]

“Suppression of nanosilica particle-induced inflammation by surface modification of the particles”
# （４）黄砂現象の環境および健康への影響評価

大阪大学大学院薬学研究科

那須 正夫

<研究協力者>

大阪大学大学院薬学研究科

一條 知昭

平成21～23年度累計予算額：14,922千円（うち、平成23年度予算額：4,870千円）予算額は、間接経費を含む。

## [要旨]

黄砂現象の環境・健康リスクを考えるにあたっては、地上から舞い上がった土壌粒子の影響を受けることなく黄砂粒子を採取するとともに、黄砂粒子の大きさ、元素組成など粒子としての特徴を把握する必要がある。そこで、本サブテーマでは、黄砂試料の採取方法から検討し、黄砂のより詳細な解析を可能にし、黄砂現象の環境・健康への影響を評価するための基盤的知見を得た。

黄砂中の細菌現存量は、通常の生活環境における大気中の細菌現存量と比較しても、同程度以下であることから、感染症の原因となる可能性は低いと考えられた。しかしながら、これまでの報告以上に多種多様な細菌種が黄砂現象ともに飛来していることから、定着や遺伝子伝播により生態系に影響を及ぼしうると考えられた。一方、微小粒子としての黄砂は、炎症の惹起や生体内への侵入など、生体へ影響を与える可能性があることがわかった。また、日本へ飛来する黄砂粒子は、水分の存在下でより微細な粒子へ分散することから、ヒトの粘膜上でも分散する可能性が示され、細粒子としての黄砂の健康影響を考える必要があることが明らかになった。

[キーワード] 黄砂、環境影響、健康影響、粒度分布、元素組成