Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
高い成長速度を示すことが重要であると考えられる。

図(1)-9 大牟田川河口域における PCB のマスバランスの概要

## （２）対象地域におけるPOPs濃度

## 1 ）水試料

総PCB濃度（懸濁態と溶存態の合計値）の平均値は6,800 pg/L（n=19）であり（表(1)-2）、日本全国の沿岸域の濃度 $ ^{10)} $ の平均値と比較して約16倍高かった。懸濁態PCB濃度は850 ± 820 pg/L、溶存態PCB濃度は5,900±13,000 pg/Lであり、溶存態PCB濃度の方が懸濁態よりも高い値を示した。PCB濃度の水平分布は、河川中流のStn23から海域のStn2に向かって懸濁態の表層・底層ならびに溶存態の表層については漸減する傾向にあった。一方、溶存態の表層のPCB濃度については、河口付近のStn8、Stn13で頭著に高い濃度を示した。

総PBDE濃度（懸濁態と溶存態の合計値）は800 pg/L（n=10）であり、日本全国の沿岸域の濃度 $ ^{10)} $ の平均値と比較してほぼ同等であった。懸濁態PBDE濃度は340±710 pg/L、溶存態PBDE濃度は420±690 pg/Lであり、懸濁態と溶存態でPBDE濃度はほぼ同等であった。PBDE濃度の水平分布は、河口のStn13から海域のStn2に向かって漸増する傾向にあった。PBDEの分布は、PCBの分布と大きく異なった。対象地域におけるPCB・PBDEの排出源や懸濁態と溶存態の分配挙動も含めた輸送過程などの違いによって水平分布に差が表れたものと考えられる。

PFOS濃度（溶存態）は $ 2600\pm1500\ pg/L\quad(n=19) $ であり、日本全国の沿岸域の幾何平均値（490 pg/L、n=64） $ ^{11)} $ よりも高い値を示した。

## 2 ）底質試料

PCB濃度は $ 40\pm33\ ng/g\cdotdw\quad(n=4) $ であり、日本全国の沿岸域の濃度 $ ^{10)} $ の平均値と比較してほぼ同等であった（表(1)-2）。PCB濃度の水平分布は、河川中流のStn18から海域のStn2に向かって減少する傾向にあり、水試料の傾向（溶存態表層試料を除く）と一致した。PBDEs濃度は $ 2.8\pm2.4\ ng/g\cdotdw\quad(n=4) $ であり、日本全国の沿岸域の濃度 $ ^{10)} $ の平均値と比較して低い値であった。PBDE濃度の水平分布は、河口のStn13から海域のStn2に向かって漸増する傾向にあった。PBDEの分布は河川のStn18よりも海域のStn2で高い傾向にあり、水試料の傾向と一致した。PFOS濃度は $ 48\pm39\ pg/g\cdotdw\quad(n=3) $ であり、日本全国の沿岸域の濃度 $ ^{11)} $ における平均値よりも低い値であった。
## 3 ）生物试料

総PCB濃度についての各生物の平均値は1500（ハゼクチ）～5400（スズキ）ng/g-lipidであった（表(1)-3）。総PCB濃度はボラ、スズキといった大型の生物で高い値を示した。スズキの筋肉（n=3）は、全国値 $ ^{10)} $ と比較して平均値では低いものの中央値では約2倍高い値を示した。総PBDE濃度は89（ヒイラギ）～140（ハゼクチ、スズキ）ng/g-lipidであった（表(1)-3）。総PCB濃度ではカニ、ヒイラギ、ハゼグチとその他の魚類で濃度差が見られたが、総PBDE濃度では魚種間で大きな差は見られなかった。PFOS濃度についての各生物の平均値は16（フトヘナタリ）～2700（ボラ）ng/g-wet あった（表(1)-3）。環境省の調査 $ ^{11)} $ における魚類中PFOSの幾何平均値（n=64）は0.39 ng/g-wetであり、本研究と同等の値であった。
表(1)-2 水・底質中のPCB・PBDE・PFOS濃度

水 $ ^{a} $
(溶存態+懸濁態)	水 $ ^{b} $
溶存態	水 $ ^{b} $
懸濁態	底質 $ ^{b} $
SS(mg/L)	-	-	157±23
PCB(pg/L)
#3	60	33±60	27±44	1300±1300
#8/#5	340	250±470	91±240	2500±2100
#28	210	180±500	27±16	1200±760
#52/#69	210	180±420	31±24	2100±1800
#70	250	210±520	42±37	490±490
#98/#95	110	100±240	10±6.3	190±190
#118	88	70±180	18±14	1100±950
#153	220	210±530	13±8.6	470±370
#138	150	140±370	10±6.6	410±360
#180	200	190±490	10±8.4	220±140
#194	26	23±57	3.2±6.0	42±18
#209	3.3	0.7±1.8	2.6±3.8	190±190
ΣPCB	6800	5900±13000	850±820	40000±33000
PBDE(pg/L)
#28/#33	19	14±13	5.2±8.4	96±42
#49	4.8	ND	4.8±11	38±30
#47	41	30±37	11±11	74±31
#100	4.2	ND	4.2±11	16±20
#99	0.5	0.5±1.2	9.6±17	91±24
#154	32	27±50	4.9±14	100±120
#153	57	48±81	9.4±22	220±120
#183	75	62±83	13±28	60±120
#209	127	75±200	52±170	130±260
ΣPBDE	800	470±650	330±710	2800±2400
PFOS(pg/L)	-	2600±1500	-	48±39

$ ^{a} $ 平均值、 $ ^{b} $ 平均值±標準偏差
表(1)-3 生物中の PCB・PBDE・PFOS 濃度

フトヘ
ナタリa	ヒイラギa	ハゼクチ	マハゼ	スズキ	ボラ
n	10	5	3	4	7	3
標準体長(mm)b	-	47±6	157±23	115±7.1	310±209	174±4.9
湿重量(g-wet)b	-	2.7±0.9	46±16	20±4	1110±1730	90±3.9
年齢(year)b	-	-	1.3±0.5	0	1.6±1.5	0.7±0.6
脂質含量(% wet
weight)b	0.58	2.4	0.83±0.34	1.17±0.57	4.95±3.37	1.21±0.79
δ15Nb	8.7	11±0.91	11±2.1	10±1.7	13±1.8	7.2±2.3
栄養段階1b	2.0	3.0±0.27	2.8±0.62	2.6±0.51	3.5±0.52	1.8±0.68
PCB(ng/g-lipid)b
#3	2.8	4.8±3.0	0.63±0.58	3.1±1.0	12±1.3	5.6±2.6
#8/#5	14.6	71±58	12±3.7	26±13	140±100	96±66
#28	NDc	53±12	24±8.4	80±18	110±97	81±54
#52/#69	130	190±42	96±30	330±53	350±130	370±300
#70	170	120±29	45±14	190±67	200±120	350±280
#98/#95	42	19±2.5	25±4.9	85±20	68±24	66±45
#118	150	170±46	82±19	150±40	200±110	160±150
#153	140	190±52	90±33	120±70	180±120	130±100
#138	120	130±49	65±24	75±9.9	120±68	100±94
#180	35	40±15	23±17	9.5±11	45±28	39±34
#194	4.1	4.8±1.9	2.7±1.7	3.7±1.9	7.3±6.2	6.8±6.1
#209	8.4	4.4±0.5	2.8±1.4	8.0±4.3	22±19	18±20
ΣPCB	2300	3100±840	1500±490	3800±2000	5400±2300	5000±3900
PBDE
(ng/g-lipid)b
#28/#33	11	26±15	21±13	16±28	27±20	26±14
#49	2.4	1.0±1.1	NDc	6.4±5.7	2.4±4.2	1.5±2.6
#47	6.8	29±33	48±30	55±24	57±39	56±36
#100	1.0	2.8±3.5	4.0±3.0	6.5±1.8	7.3±6.0	4.2±1.8
#99	2.2	4.6±4.5	11±6.5	23±14	4.9±2.9	3.6±2.3
#154	NDc	3.6±1.5	5.0±3.0	6.0±4.9	6.0±4.1	3.0±2.6
#153	6.8	1.0±1.5	2.2±1.9	NDc	4.0±2.0	2.0±2.1
#183	3.3	0.88±0.028	4.4±4.5	0.84±0.7	2.8±4.7	0.57±0.39
#209	74	4.8±6.8	4.2±7.2	NDc	11±13	3.0±3.5
ΣPBDE	128	89±80	140±74	132±71	140±80	120±68
PFOS
(ng/g-lipid)b	16±12	-	2600±2100	1500	970±590	2700±2200

a 混合試料

c 不檢出

$ ^{b} $ 平均 ± 標準偏差
## （３）食物連鎖を通した生物濃縮の解析および食物網蓄積モデルの構築

## 1 ）食物網解析

対象地域において採取した生物のδ^{13}Cは-22.0（ホソイトゴカイ）～-11.5‰（クモヒトデ）の範囲であった。底質は-22.9‰であり、オキシジミやホソイトゴカイが近い値を示した。δ^{15}Nは7.2（オキシジミ、ボラ）～12.8‰（スズキ）の範囲であり、スズキが最も高い値を示した。δ^{15}Nは概して3.4‰上昇するごとに栄養段階が1上昇すると言われているが、対象地域ではオキシジミやボラが下位の消費者であると考えられた。これらの1つ上の栄養段階はマハゼやハゼクチ、最上位はスズキであると考えられた。

胃内容物は、スズキについてはエビ類、カニ類などの甲殻類のほか、ハゼ科などの硬骨魚類が観察された。これらの生物はスズキの下位に位置しており、炭素・窒素安定同位体比の結果を反映していた。また、本調査の結果は、有明海で採捕したスズキの胃内容物を調査結果 $ ^{6)} $ と同様の傾向（アミ類55%、エビ類8%、シャコ類9%、その他甲殻類2%、魚類26%（著者による図からの読み取り値））であった。ボラについては、消化管内に底質が含まれていたが、顕微鏡観察にて珪藻を含むデトリタスが胃内容物として確認された。胃内容物調査に供した個体以外のボラにおいても消化管内には底質が詰まっており、当該調査域においてボラは底質上に存在する珪藻を含むデトリタスを主に食しているものと考えられた。

## 2 ）各生物の栄養段階とPOPsの蓄積の関係

窒素安定同位体比の測定結果に基づき、各生物の栄養段階を推定した。本研究では底生藻食者の巻貝であるフトヘナタリを一次消費者と設定し、他の生物の栄養段階を推定した。各生物の栄養段階と総PCB濃度の関係を図(1)-10に示す。生物中のPCB濃度は栄養段階が上昇するにつれて緩やかに増加し、調査対象地域において総PCBが食物連鎖を通して濃縮されていることが明らかになった。PBDE、PFOSについても同様の傾向が認められた。

図(1)-10 生物の栄養段階と PCB 濃度の関係

TMFは、総PCBは1.52、PCB異性体（n=58）は0.9（#177）～3.28（#9）であった。総PCBのTMFはTwelvemile Creekにおける河川生態系で観察されたTMF $ ^{12)} $ と同等であった。PCB異性体のTMFはNorthwater polynya $ ^{4)} $ 、ハドソン湾 $ ^{13)} $ で観察された値よりも低い値であった。TMFは食物網の構造や食物連鎖長によって変化することが報告されている。Northwater polynya $ ^{4)} $ 、ハドソン湾 $ ^{13)} $ で観察されたTMFは、海鳥や海洋ほ乳類などの高次消費者を含むため食物連鎖長が長いのに対して、
本研究では食物連鎖長が2（巻貝）～3.6（スズキ）と短いこともTMFの算出に影響していると考えられる。PBDEの全異性体の合計値は1.17、値の得られた各異性体（n=7）は0.46（#183）～1.66（#100、#154）であった。また、PFOSのTMFは8を示し、PCBやPBDEよりも高い値であった。この原因の1つとして、PFOSはPCBやPBDEと比較して体内濃度が平衡に達する時間が短いことが考えられる。

PCB異性体のTMFとlog $ K_{ow} $ の関係を図(1)-11に示す。多くの異性体でTMFは1を上回り、食物連鎖を通して生物濃縮されていることが示された。PCB異性体のTMFはlog $ K_{ow} $ が増加するにしたがって減少する傾向がみられた。この結果は、脂溶性の高いPCB異性体ほど食物連鎖を通して濃縮しにくいことを示している。これまでの既報 $ ^{14,15} $ の多くでは脂溶性の高い化学物質のほど食物連鎖を通して濃縮する傾向がみられておるが、本研究の結果は既報の結果と一致しなかった。しかし、バルト海の表層食物連鎖ではlog $ K_{ow} $ とTMFは正の相関を示したのに対し、底層食物連鎖では負の相関を示し $ ^{15} $ ており、TMFは対象とする食物連鎖によって大きく変化するものと考えられた。本研究で対象としている河口域は複数の食物連鎖が混合しており、また移動性の大きい生物も存在する。そのため、特にlog $ K_{ow} $ の大きいPCB異性体については、上位捕食者中のPCB濃度が定常状態に達していない可能性も考えられる。

図(1)-11 PCB 異性体に対する TMF と $ \log K_{OW} $ の関係

☑本研究、☑バルト海 表層食物連鎖 $ ^{15)} $ 、▲バルト海 底層食物連鎖 $ ^{15)} $ 、+中国の淡水 $ ^{14)} $

## 3 ）食物網蓄積モデルを用いた水生生物中のPOPs濃度の予測

食物網解析や文献調査にもとづいて現場の食物網を構築し（図(1)-12）、食物網蓄積モデルにより各生物の体内中POPs濃度を予測した。PCB（#52）、PBDE（#47）の各生物に対するモデル予測値と実測値の比較を図(1)-13(a)、(b)に示す。いずれの生物においても予測値は実測値の1/10～10倍の範囲に収まり、本研究の食物網蓄積モデルの予測精度は比較的高いことが示された。しかし、本研究のモデルは定常状態を仮定しているため、対象水域で定常状態に達していないと考えられる高塩素のPCB異性体については予測値が実測値を上回る傾向にあった。

PFOSの各生物に対するモデル予測値と実測値の比較を図(1)-13(c)に示す。ボラ、マハゼにおいて、予測値は実測値の1/10～10倍の範囲に収まったが、スズキは過大推定（100倍程度）となり、魚種によって予測精度が異なった。この原因の一つとして、モデルの本質的なパラメータである呼吸器官経由および腸管経由のPFOSの取り込み速度定数の報告値が限られている $ ^{16} $ ことが挙げ
られる。水生生物に対するPFOSの室内曝露実験によって、より精度の高い取り込み速度定数を取得することがモデル予測精度の向上に貢献すると考えられる。

図(1)-12 食物網蓄積モデルにおいて適用した対象水域の食物網 図中の数値は餌の構成比を示す。

図(1)-13 PCB（#52）の各生物に対するモデル予測値と実測値の比較 ☐ボラ、◇スズキ、△ハゼクチ、○マハゼ

## （４）対象水域における生態リスク評価

食物網蓄積モデルによる曝露評価・リスク評価は、比較的高い精度で予測が可能であったPCB・BDE47を対象とした。PFOSについては食物網蓄積モデルの予測精度が低く、さらにハザード比による初期評価においてもリスクが低いと判断されたため、食物網蓄積モデルを用いたリスク評価は行わなかった。生態リスクは、食物網蓄積モデルを用いて各生物の曝露評価を行った後、NOECの値と照らし合わせ、その超過確率として表した。当該水域において栄養段階が上位のスズキ、現場での優占種のイトゴカイを代表生物としてリスク評価を行った。

総PCBのNOECについては、文献調査結果をもとにファットヘッドミノーのNOEC 2.2 $ \mu $ g/l $ ^{17)} $ を採用した。体内濃度への変換にあたっては、ファットヘッドミノーに対するAroclor1248の生物濃縮係数（60,000） $ ^{18)} $ を用いた。ファットヘッドミノーのNOEC 2.2 $ \mu $ g/lに生物濃縮係数60000を乗じ、体内中PCB濃度132 $ \mu $ g/g-wwを得た。この体内中PCB濃度（132 $ \mu $ g/g-ww）をNOECとして用いた。BDE47のNOECについては、文献調査結果をもとにファットヘッドミノーの血漿中のチロキシンの減少に対するNOEC 11 $ \mu $ g/g-ww $ ^{19)} $ を用いた。

生態リスク評価の結果を図(1)-14に示す。総PCBについては、曝露評価の結果、スズキの体内濃
度（全身）は概ね $ 10^{4}\sim10^{7} $ pg/g-wetの範囲にあると推定され、NOEC（ $ 1.32\times10^{8} $ pg/g-ww）を超過する割合は全体の0％と推定された。このことから対象水域における総PCBのスズキに対する生態リスクは低いと考えられる。なお、参考までにサブテーマ（2）においてKC-500をメダカに曝露した試験において、体内中の総PCB濃度を推定したところおおよそ $ 10^{9} $ pg/g-wetのオーダーとなり、スズキの曝露評価の最大濃度よりも2桁高い値であった。一方、イトゴカイについて曝露評価を行った結果、体内中の総PCB濃度は $ 10^{3} $ pg/g-wetのオーダーであると推定された。サブテーマ（2）のイトゴカイ曝露実験において遺伝子レベルで発現変動がみられた濃度は1 mg/lであり、この際のイトゴカイの体内濃度は $ 10^{9} $ pg/g-wwのオーダーと推定され、曝露評価の値と $ 10^{6} $ 程度差があることから総PCBのイトゴカイに対するリスクは低いと考えられた。

BDE47については、曝露評価の結果、スズキの体内濃度は概ね10～10⁶ pg/g-wetの範囲にあると推定され、NOEC（1.1×10⁷ pg/g-ww）を超過する割合は全体の0%であると推定された。このことからBDE47のスズキに対する生態リスクは低いと考えられた。なお、サブテーマ（2）においてBDE47をメダカに曝露した試験において、メダカ中のPBDE濃度を推定したところおおよそ10⁹ pg/g-wetのオーダーとなり、スズキの曝露評価の最大濃度よりも3桁高い値であった。一方、イトゴカイについて曝露評価を行った結果、体内中のBDE47濃度は10 pg/g-wetのオーダーであると推定された。サブテーマ（2）のイトゴカイ曝露実験において遺伝子レベルで発現変動がみられた濃度は0.45 mg/lであり、この際のイトゴカイの体内濃度は10⁹ pg/g-wwのオーダーと推定され、曝露評価の値と10⁸程度差があることからBDE47のイトゴカイに対するリスクは低いと考えられた。

今後さらに精緻なリスク評価を行うためには、現場生物を用いた毒性試験法の整備、体内濃度ベースの毒性影響濃度の集積、毒性影響濃度の種間差の補正方法の確立などが求められる。

図(1)-14 PCB、BDE47 のスズキとイトゴカイに対する生態リスク評価の結果

## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

野外調査結果に基づき現場におけるPCBのフラックスを明らかにした。生物を含めたフラックスに関する知見は限られており、POPsの環境動態および生物移行を理解するうえで貴重なデータとなる。また、食物連鎖を通した化学物質の濃縮係数（TMF）は、一般に化学物質の疎水性が強い
物質ほど値が大きくなると考えられていたが、河口域ではこの傾向とは逆の傾向を示すことを明らかにした。さらに、現場の水・底質のPCB・PBDE・PFOS濃度から食物網を通して各種生物中濃度の予測する食物網蓄積モデルを構築し、生物の体内濃度に基づいて生態リスク評価を行う手法を提案した。また、公的な毒性影響試験法の少ない海洋生物について、現場生物のイトゴカイを用いた試験方法を構築した。

## （２）環境政策への貢献

## ＜行政が既に活用した成果＞

特に記載すべき事項はない。

## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

多様な生物に対する化学物質のリスク管理は、化学物質による人の健康や環境への影響の最小化に資する。本研究で用いた食物網蓄積モデルは多様な生物に対する様々な化学物質の曝露評価を可能とし、生物中の体内濃度に基づいた生態リスクを評価することができ、本手法は生態リスク評価の高度化に寄与できる。また、毒性影響試験に関する報告が少なく、知見の集積が求められている海洋生物を対象に、イトゴカイを用いた生態影響試験方法を構築したことにより、幅広い生物種に対する生態影響試験が可能となった。今後の試験方法の標準化・高度化に大きく寄与できる。

## 6 ．国際共同研究等の状況

特に記載すべき事項はない。

### 7. 研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

## <論文（査読あり）>

1) J. Kobayashi, Y. Imuta, T. Komorita, H. Ishibashi, K. Yamada, F. Ishihara, N. Nakashima, J. Sakai, K. Arizona, M. Koga: Chemosphere, 118, 201-206 (2015)

“Trophic-magnification of polychlorinated biphenyls and polybrominated diphenyl ethers in an estuarine food web of the Ariake Sea, Japan”

## くその他誌上発表（査読なし）>

特に記載すべき事項はない。

## （2） 口頭発表（学会等）

1）小森田智大、小林淳、石橋弘志、中島尚哉、石原史隆、伊牟田優希、古賀実、堤裕昭：2012年度日本ベントス学会・日本プランクトン学会合同大会（2012）

「大牟田川河口域における水質・底質の環境要因の空間分布と底生動物群集の関係」

2) T. Komorita, J. Kobayashi, H. Ishibashi, N. Nakajima, H. Ishihara, Y. Imuta, A. Umegura, M. Koga, H.
Tsutsumi: The First Asian Marine Biology Symposium, Phuket, Thailand, 2012

“Spatial distribution of macro zoobenthos community related to the environmental variables surround a mouth of a small river, southern Japan.”

3）小林淳、小森田智大、中島尚哉、石原史隆、伊牟田優希、梅原亮、石橋弘志、有菌幸司、古賀実：第22回環境化学討論会（2013）

「有明海の河口域における残留性有機汚染物質の空間分布と分配」

4）伊牟田優希、小林淳、小森田智大、中島尚哉、石原史隆、梅原亮、石橋弘志、有菌幸司、古賀実：第22回環境化学討論会（2013）

「有明海の河口域に棲息する水生生物への残留性有機汚染物質の蓄積解析」

5）石原史隆、小林淳、小森田智大、中島尚哉、伊牟田優希、梅原亮、石橋弘志、有菌幸司、古賀実：第22回環境化学討論会（2013）

「海産魚類における残留性有機汚染物質の体内分布特性」

6） 小林淳、小森田智大、石橋弘志、有蘭幸司、古賀実：第23回環境化学討論会（2014）「有明海の河口域におけるポリ塩化ビフェニルの食物網蓄積モデルの構築と検証」

7）川中理可、小林淳、石原史隆、櫻井健郎、小森田智大、石橋弘志、有菌幸司、古賀実：第23回環境化学討論会（2014）

「汽水域に棲息する多毛類のポリ塩化ビフェニルの取込み経路と体内動力学」

9）伊牟田優希、小林淳、小森田智大、山田勝雅、石橋弘志、有菌幸司、古賀実：第23回環境化学討論会（2014）

「大牟田川河口域における残留性有機汚染物質の食物連鎖蓄積について」

10）前田佳貴、伊牟田優希、石原史隆、中島尚哉、小林淳、小森田智大、石橋弘志、有菌幸司、古賀実：第23回環境化学討論会（2014）

「有明海河口域における有機フッ素化合物の生物蓄積」

11）小森田智大、小林淳、伊牟田優希、石原史隆、中島尚哉、石橋弘志、堤裕昭：日本海洋学会秋季大会（2014）

「河口域におけるポリ塩化ビフェニル(PCBs)の動態」

## （3） 出願特許

特に記載すべき事項はない。

（４）「国民との科学・技術対話」の実施

特に記載すべき事項はない。

（５）マスコミ等への公表・報道等

特に記載すべき事項はない。
## (6) その他

特に記載すべき事項はない。

### 8 \. 引用文献

1) Yentsch, C.S. and Menzel, D.W.: Deep-Sea Research 10, 221–231 (1963)

“A method for the determination of phytoplankton chlorophyll and phaeophytin by fluorescence”

2) Tsutsumi, H., Fukunaga, S., Fujita, N., Sumida, M.: Marine Ecology Progress Series 63, 157–162 (1990)

"Relationship between growth of Capitella sp. and organic enrichment of the sediment"

3) Post, D.M.: Ecology 83, 703–718 (2002)

“Using stable isotopes to estimate trophic position: models, methods, and assumptions”

4) Fisk, A.T., Hobson, K.A., Norstrom, R.J.: Environ. Sci. Technol. 35, 732–738 (2001)

“Influence of chemicals and biological factors on trophic transfer of persistent organic pollutants in the Northwater Polynya marine food web”

5) Arnot, J.A. and Gobas, F.A.P.C.: Environ Toxicol Chem 23, 2343–2355 (2004) "A food web bioaccumulation model for organic chemicals in aquatic ecosystem"

6) 環境省：有明海・八代海等総合調査評価委員会海域再生対策検討作業小委員会（第2回）

配付資料（2012）

7) 日本魚類学会自然保護委員会編：干潟の海に生きる魚たち 有明海の豊かさと危機、東海大学出版（2009）

8) 大谷壮介、上月康則、仲井薫史、石山哲、村上仁士：海岸工学論文集 53、1056–1060（2006）「干潟の底生微細藻類量の季節変動に及ぼすヤマトオサガニの摂餌圧の影響に関する考察」

9) 高橋一生：日本プランクトン学会報 51、46–72（2004）

「淡水・沿岸域におけるアミ類の摂餌生態（総説）」

10) 環境省：平成21年度版 化学物質と環境（2010）

11) 環境省：平成22年度版 化学物質と環境（2011）

12) Walters, D.M., Fritz, K.M., Johnson, B.R., Lazorchak, J.M.: Environ. Sci. Technol. 42, 2316–2322 (2008)

“Influence of trophic position and spatial location on polychlorinated biphenyl (PCB) bioaccumulation in a stream food web”

13) Kelly, B.C., Ikonomou, M.G., Blair, J.D., Gobas, F.A.P.C.: Sci. Total Environ. 401, 60–72 (2008) "Bioaccumulation behavior of polybrominated diphenyl ethers (PBDEs) in a Canadian Arctic marine food web"

14) Wu, J.P., Luo, X.J., Zhang, Y., Yu, M., Chen, S.J., Mai, B.X., Yang, Z.Y.: Environ. Pollut. 157, 904–909 (2009)

“Biomagnification of polybrominated diphenyl ethers (PBDEs) and polychlorinated biphenyls in a highly contaminated freshwater food web from South China”
15) Nfon, E., Cousins, I.T., Broman, D.: Sci. Total Environ. 397, 190–204 (2008)

“Biomagnification of organic pollutants in benthic and pelagic marine food chains from the Baltic Sea”

16) Sakurai, T., Kobayashi, J., Kinoshita, K., Ito, N., Serizawa, S., Shiraishi, H., Lee, J.H., Horiguchi, T., Maki, H., Mizukawa, K., Imaizumi, Y., Kawai, K., Suzuki, N.: Environmental Toxicology and Chemistry 32, 2009–2017 (2013)

“Transfer kinetics of perfluorooctane sulfonate (PFOS) from water and sediment to a marine benthic fish, marbled sole ( $ Pseudopleuronectes\ yokohamae $ )”

17) DeFoe, D.L., Veith, G.D., Carlson, R.W.: J. Fish Res. Board Can., 35, 997–1002 (1978) "Effects of Aroclor $ ^{®} $ 1248 and 1260 on the Fathead Minnow (Pimephales promelas)"

19) Lema S., C., Dickey, J.T., Schultz, I.R., Swanson, P.: Environmental health perspective 116, 1694–1699 (2008)

“Dietary exposure to 2,2',4,4'-tetrabromodiphenyl ether (PBDE-47) alters thyroid status and thyroid hormone-regulated gene transcription in the pituitary and brain”

18) 環境省：第2回 POPs 対策検討会資料、平成14年3月
# （２）沿岸海洋生物における残留性有機汚染物質の毒性影響の解明とリスク評価に関する研究

尚綱大学短期大学部食物栄養学科

石橋 弘志

平成24～26年度累計予算額：11,621千円

（うち、平成26年度予算額：4,009千円）

予算額は、間接経費を含む。

## [要旨]

残留性有機汚染物質（POPs）であるポリ塩素化ビフェニル（PCBs）、ポリ臭素化ジフェニルエーテル（PBDEs）などの臭素系難燃剤、ペルフルオロオクタンスルホン酸（PFOS）などの有機フッ素化合物は、難分解性・高蓄積性を示すことから生態系への影響が危惧されている。河口域は生物多様性に富み、生物生産が盛んであるが、河川を通して栄養塩とともにPOPsなども流入する。しかしながら、河口域に棲息する水生生物に対するPOPsの毒性影響については不明な点が多く、それらを明らかにすることはPOPsの生態リスク評価の一助となる。本研究では、POPsを曝露した魚類や多毛類を用いて、DNAマイクロアレイによる網羅的遺伝子発現解析を行い、POPsの潜在的毒性影響の予測を試みた。魚類に対しては、KC-500は肝臓炎症、アポトーシス、ガン化に関与し、BDE-47はエストロゲン様作用、PFOSはエストロゲン様作用、発ガン作用などに関与することが示唆された。多毛類に対しては、KC-400はガン化や脂肪合成・脂質代謝系に影響し、BDE-48は発ガン作用、PFOSはアミノ酸取込みや脂質代謝系などに影響することが示唆された。また、両生物種において、POPsの複合曝露（毒性）に対する新規バイオマーカー候補遺伝子の存在が明らかになった。本研究によって魚類や多毛類に対するPOPsの潜在的毒性影響を初めて明らかにした。これらの成果は、今後POPsの生態リスク評価において極めて重要な情報を提示できるだけでなく、生態毒性試験の標準化・高度化にも貢献できるであろう。

## [キーワード]

遺伝子発現、毒性影響、生態リスク、メダカ、イトゴカイ

### 1. はじめに

ポリ塩素化ビフェニル（PCBs）などの残留性有機汚染物質（POPs）は、難分解性・高蓄積性を示すことから生態系への影響が危惧されている。また、これらPOPsを対象として、これまで化学分析による濃度分布や環境動態、生物蓄積、毒性影響などに関する研究が精力的に行われてきた。一方、ポリ臭素化ジフェニルエーテル（PBDEs）などの臭素系難燃剤やペルフルオロオクタンスルホン酸（PFOS）などの有機フッ素化合物は、ストックホルム条約により新規POPsとして指定され、高い学術的・社会的関心を集めている。しかしながら、これら新規POPsの汚染実態や毒性影響に関する知見は極めて乏しいのが現状である。

河口域は生物多様性に富み、生物生産が盛んであるが、河川を通して栄養塩とともにPOPsなどの化学物質も流入する。そのため、河口域に棲息する生物に対する化学物質の適切なリスク評価・管理は急務の課題となっている。特に水生生物は、河口域に流入した化学物質の影響を直接的に
受けると考えられ、生物多様性の保全のためには、化学物質の毒性影響評価やその毒性発現機序に関する研究を推進し、生態リスク評価を行うことが極めて重要である。また、現場生物を用いた生態リスク評価は有用と考えられるが、実際は現場生物の飼育・実験方法などの確立の困難さから、多くの研究ではモデル生物が使用されている。

一般に化学物質の生態影響試験は、水系食物連鎖における生産者として単細胞緑藻類、一次消費者として甲殻類、高次消費者として魚類などが用いられている。これらの試験系では主に生長阻害や遊泳阻害、短期曝露による毒性影響などを評価しているが、これらエンドポイント以外の生物影響については評価が難しいと考えられる。一方、近年の遺伝子解析技術の進展により、DNAマイクロアレイや次世代シーケンサーを用いた網羅的遺伝子解析が様々な生物に対して適用できるようになっており、新規バイオマーカー分子の探索やその機能解析などが進んでいる。しかしながら、新規POPsであるPBDEやPFOSを対象として、網羅的遺伝子発現解析を実施した研究はほとんどなく、新規POPsの毒性影響については不明な点が多い。

### 2. 研究開発目的

サブテーマ（2）では、POPsを曝露した魚類などのモデル生物を用いて、DNAマイクロアレイによる網羅的発現解析を行い、POPs応答遺伝子の探索や機能予測からPOPsの潜在的毒性影響を明らかにする。一方、サブテーマ（1）で得られた現場生物として多毛類に着目し、POPsを曝露した多毛類を用いて、DNAマイクロアレイによる網羅的発現解析を行い、POPs応答遺伝子の探索や機能予測、さらには定量的リアルタイムPCR法の確立・測定も試み、POPsの潜在的毒性影響を明らかにする。

## 3 ．研究開発方法

## （１）メダカを用いたPOPs応答遺伝子の解析と潜在的毒性影響の評価

## 1 ）試験化学物質

試験化学物質としてポリ塩化ビフェニル（Kanechlor-500: KC-500）、テトラブロモジフェニルエーテル類（BDE-47）およびペルフルオロオクタンスルホン酸（PFOS）を用いた。KC-500とBDE-47はAccuStandardから、PFOSは和光純薬工業株式会社からそれぞれ購入した。その他の試薬はすべて特級を用いた。

## 2 ）試験生物

試験生物は、熊本県立大学で継代飼育しているメダカ（Oryzias latipes）を用いた。これらは、水温24±2℃、光周期16時間：8時間（明期：暗期）の飼育条件で、1日2回ブラインシュリンプ孵化幼生（孵化後24時間以内）を飽食量与え、飼育を行った。飼育水には、水道水をフィルター濾過、脱塩素処理を行い、24±2℃に調温したものを用いた。各水槽の飼育水には、エアレーションを設置して十分に酸素を供給した。

## 3 ）曝露試驗

約3ヶ月齢の成魚の雄メダカを用いた。2 L容のガラス水槽に試験液を入れて曝露し、曝露濃度は0.1％ジメチルスルフォキシド含有の溶媒対照群と各化学物質の曝露群（1000 μg/l）を設定した。
これら曝露濃度は、過去の論文等を参考に設定した $ ^{1-4} $ 。各曝露群について10個体を用い、96時間止水式曝露を行った。なお曝露試験中は無給餌とした。曝露試験終了後、肝臓を摘出し、3個体分の肝臓を1サンプル（n=3）としてRNAlater $ ^{®} $ に保存した。これらはtotal RNAの抽出・精製まで-80°Cで保存した。

なお曝露試験中は、行動異常（急沈降の有無、旋回運動の有無、生死確認など）と形態異常（体表の状態、各ヒレの状態、解剖時所見など）の観察も行った。

## 4 ）Total RNAの抽出およびcRNAの合成・蛍光標識

Total RNAはRNeasy $ ^{®} $ Mini Kit（株式会社キアゲン）を用いて抽出した。抽出したtotal RNAは微量紫外可視分光光度計Q5000（株式会社トミー精工）を用いてOD 260および280を測定し、純度と濃度を確認した。また、バイオアナライザー（アジレント社）を用いてRNAの分解を測定した。その後、total RNAはcRNA合成に用いるまで-30℃で保存した。

cRNAは、1 μgのtotal RNAから、Quick Amp Labeling Kit（アジレント社）を使って合成した。cRNA合成時に、それぞれのサンプルを蛍光色素Cy5（GE Healthcare社）によって標識し（Cy5-cRNAサンプル）、DNAマイクロアレイによる遺伝子発現解析に供するまで-30℃で保存した。

## 5 ）DNAマイクロアレイによる網羅的遺伝子発現解析

メダカDNAマイクロアレイEG6000（株式会社エコジェノミクス）を用いた。本アレイは、基礎生物学研究所バイオリソース（http://www.shigen.nig.ac.jp/medaka/）に掲載されている情報の中で完全長cDNAが取得できる6000種のメダカ遺伝子（卵巣、肝臓、脳あるいは胚において発現している遺伝子群；各遺伝子2スポット、合計12000スポット）の配列からオリゴプローブ（35~40 mer）をデザインして搭載したDNAマイクロアレイである。

ハイブリダイゼーションは、2 μgのCy5標識cRNAをハイブリダイゼーション溶液（6x SSPE, 0.05% Tween-20, 20 mM EDTA, 25% formamide, 100 ng/μl salmon sperm DNA, 0.04% SDS）と混合し、45°Cで16時間、5 rpm/minで回転させながら行った。ハイブリダイゼーション終了後、洗浄溶液で洗浄後（45°C；6x SSPE+0.05% Tween-20、室温；3x SSPE+0.05% Tween-20、室温；0.5x SSPE+0.05% Tween-20、室温；2x PBS+0.1% Tween-20、室温；2x PBS）、専用のレーザースキャナー（GenePix 4000B；Axon Instruments, USA）でスポットの蛍光強度を読み取り、専用ソフトMicroarray Imager（Combimatrix Corp., USA）を用いて数値化した。なお、遺伝子のスポット蛍光強度は2スポットの平均値を使用した。

## 6 ）統計解析

数値化されたスポット蛍光強度からバックグラウンドを補正後、内部標準遺伝子ribosomal protein L7 (Zhaobin and Jianying, 2007) を用いて正規化し、解析ソフトarraystat (Imaging Research Inc, USA) で有意 (p < 0.05) に発現変動を示した遺伝子を検出した。さらに発現比が2倍以上、1/2以下の遺伝子について発現変動遺伝子とした。

## （２）イトゴカイを用いたPOPs応答遺伝子の解析と潜在的毒性影響の評価

## 1 ）Total RNAの抽出およびcRNAの合成・蛍光標識
イトゴカイへのPOPs曝露試験終了後、水分を除き、10個体ずつを1つのサンプル $ (n=3) $ としてRNAlater $ ^{®} $ に保存した。これらはtotal RNA抽出まで-30°Cにて保存した。

Total RNAはRNeasy $ ^{®} $ Mini Kit（株式会社キアゲン）を用いて抽出した。抽出したtotal RNAは微量紫外可視分光光度計Q5000（株式会社トミー精工）を用いてOD 260および280を測定し、純度と濃度を確認した。また、2100バイオアナライザー（アジレント社）を用いてRNAの分解および品質を測定した。抽出したtotal RNAは、cRNA合成に用いるまで-30℃で保存した。

cRNAは、1 μgのtotal RNAから、Quick Amp Labeling Kit（アジレント社）を使って合成した。cRNA合成時に、蛍光色素Cy5（アジレント社）によって標識し（Cy5-cRNAサンプル）、DNAマイクロアレイによる遺伝子発現解析に供するまで-30℃で保存した。

## 2 ）DNAマイクロアレイによる網羅的遺伝子発現解析

イトゴカイDNAマイクロアレイ（株式会社エコジェノミクス）を用いて行った。本アレイは、9,223種の遺伝子のオリゴDNAプローブ（35~40 mer）をデザインし、それらをチップに搭載したDNAマイクロアレイである。また、DNAプローブは全てイトゴカイの遺伝子由来であるが、公共のデータベース（NCBI）による相同性検索の結果、イトゴカイにおける遺伝子の機能は未知であるが、DNA配列またはアミノ酸配列が他の生物種で知られている場合、その生物種および遺伝子名を採用している。

ハイブリダイゼーションは、2 μgのCy5標識cRNAをハイブリダイゼーション溶液（6x SSPE, 0.05% Tween-20, 20 mM EDTA, 25% formamide, 100 ng/μl salmon sperm DNA, 0.04% SDS）と混合し、45℃で16時間、5 rpm/minで回転させながら行った。ハイブリダイゼーション終了後、洗浄溶液（45℃; 6x SSPE+0.05% Tween-20、室温; 3x SSPE+0.05% Tween-20、室温; 0.5x SSPE+0.05% Tween-20、室温; 2x PBS+0.1% Tween-20、室温; 2x PBS）で洗浄し、専用のレーザースキャナー（GenePix 4000B; Axon Instruments, USA）でスポットの蛍光強度を読み取り、専用ソフトMicroarray Imager（Combimatrix Corp., USA）を用いて数値化した。

## 3 ）リアルタイムPCRによる遺伝子発現量の測定

1）と同様に抽出したtotal RNAを逆転写し、合成したcDNAを用いてΔΔCt法を用いたリアルタイムPCR（ライフテクノロジーズ）を行った。なお内部標準遺伝子にはribosomal protein L7a-likeを使用した。

## 4 ）統計解析

DNAマイクロアレイでは、数値化された各スポット蛍光強度からバックグラウンドの数値を補正後、内部標準遺伝子ribosomal protein L7a-likeを用いて正規化し、解析ソフトarraystat（Imaging Research Inc, USA）で有意（p < 0.05）に発現変動した遺伝子を抽出した。さらに発現比が2倍以上、1/2以下の遺伝子について発現変動遺伝子とした。

各曝露群の比較では、GraphPad Prism 5（GraphPad Software, Inc.）を用いて統計処理を行い、p<0.05を有意差とみなした。遺伝子発現量は等分散性の検定を行い、等分散性が認められた場合は一元配置分散分析（one way ANOVA）を行った。一元配置分散分析において、有意差が認められた場合には多重検定（Dunnett's post-hoc検定）により有意差を検定した。等分散性が認められない場合
はKruskal-Wallisの順位和検定を行い、有意差が認められた場合にはBonferroni adjustmentをもってMann WhitneyのU検定を行った。

## 4 ．結果および考察

## （１）メダカにおけるPOPsの潜在的毒性影響の解明とリスク評価

## 1 ）KC-500により発現変動した遺伝子群の網羅的探索と潜在的毒性影響の解明

96時間の曝露期間を通じて、行動異常や外観的奇形を呈する個体はみられず、死亡個体も確認されなかった。このことから、今回設定したKC-500の曝露濃度は雄メダカ成魚に対し急性毒性影響を示さないことが示唆された。

そこで、DNAマイクロアレイを用いた遺伝子発現解析を試みたところ、KC-500曝露によって発現が増加した44遺伝子のスクリーニングに成功した。機能が既知の遺伝子群に着目しKC-500の潜在的毒性影響について考察した。

本研究では、ダイオキシン類曝露に対する有用なバイオマーカーとして知られるcytochrome P450 1A（CYP1A）遺伝子の発現が10倍以上増加した。ダイオキシン類の毒性影響は主にAHR（aryl hydrocarbon receptor）シグナル経路を介して引き起こすことが知られている $ ^{5} $ 。AHRはダイオキシン応答受容体とも呼ばれ、ダイオキシン類など環境汚染物質の毒性影響を引き起こすリガンド活性型転写因子である。AHRは通常、細胞内シャペロンタンパク質であるhsp90（heat shock protein 90）や芳香族炭化水素化合物相互作用タンパク質と結合し不活性化した状態で細胞質内に存在しているが、体内にダイオキシン類のようなリガンドが取り込まれるとこれらのリガンドと結合し、核内へ移行、ARNT（aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator）とヘテロ二量体を形成する。

AHR/ARNTへテロダイマーはCYP1AやCYP1Bなどさまざまな標的遺伝子のプロモーター領域にあるダイオキシン応答配列（DRE）に結合し、下流にある遺伝子の転写活性化を行う。これらシグナル経路が関与することにより、致死率の上昇、卵囊浮腫、心囊浮腫、頭部低形成、頭蓋顔面奇形、出血、体軸の催奇形性、成長の遅延などが起こることが報告されている $ ^{6-8} $ 。また本研究では、CYP1A遺伝子だけでなく、hsp遺伝子の発現も変化したことから、KC-500はAHRシグナル経路を介してダイオキシン類と類似の毒性影響を示すことが示唆された。

さらに本研究では、choline kinase α、DNA-damage-inducible transcript 4およびhaptoglobin遺伝子の発現に増加がみられた。リン脂質の生合成に重要な酵素であるcholine kinaseはαとβの2つのアイソザイムが存在する。特にcholine kinase αはガンの増殖、発症および進行に関与することが明らかとなっている。また、DNA-damage-inducible transcript 4はアポトーシスを誘導する遺伝子であることが知られている⁹。さらにヘモグロビンと特異的に結合する糖タンパク質であるhaptoglobinは炎症性疾患に関与する。これらのことから、KC-500は肝臓の炎症、さらにはアポトーシスやガン化に関与することが示唆された。

## 2 ）BDE-47により発現変動した遺伝子群の網羅的探索と潜在的毒性影響の解明

96時間の曝露期間を通じて、行動異常や外観的奇形を呈する個体はみられず、死亡個体も確認されなかった。このことから、今回設定したBDE-47の曝露濃度は雄メダカ成魚に対し急性毒性影響を示さないことが示唆された。

そこで、DNAマイクロアレイを用いた遺伝子発現解析を試みたところ、BDE-47曝露によって発
現が増加した35遺伝子のスクリーニングに成功した。機能が既知の遺伝子群に着目し、BDE-47の潜在的毒性影響について考察した。

BDE-47はKC-500と同様に、ダイオキシン類曝露に対する有用なバイオマーカーとして知られるCYP1A遺伝子の発現を増加した。また、CYP26C1遺伝子の発現も増加しており、これはBDE-47曝露によって発現が増加した35遺伝子のなかで最も高い誘導倍率を示した。これまでのエピゲノム解析により、食道ガン患者におけるCYP26C1遺伝子のDNAメチル化異常が見出されている。しかしながら、魚類における役割・機能は不明である。これらのことから、BDE-47はAHRシグナル経路を介してダイオキシン類と類似の毒性影響を有することが示唆されたが、魚類におけるCYP26C1遺伝子のDNAメチル化異常と毒性影響の関与については今後明らかにする必要がある。

さらに本研究では、choriogenin H、choriogenin H-minorおよびchoriogenin L遺伝子の発現に増加がみられた。Choriogeninは卵膜タンパク前駆体であり、vitellogeninと同様にエストロゲンによって肝臓で合成され、環境エストロゲンに対する有効なバイオマーカーとして知られている $ ^{10,11} $ 。ヒト培養細胞を用いた研究では、BDE-47はエストロゲン受容体αおよびβに対してアゴニスト活性を示し、弱いエストロゲン様作用を有することが示唆されている $ ^{12} $ 。これまで魚類におけるBDE-47のエストロゲン様作用に関する報告はなく、本研究によって初めて雄メダカに対するBDE-47のエストロゲン様作用が明らかとなった。

## 3 ）PFOSにより発現変動した遺伝子群の網羅的探索と潜在的毒性影響の解明

96時間の曝露期間を通じて、行動異常や外観的奇形を呈する個体はみられず、死亡個体も確認されなかった。このことから、今回設定したPFOSの曝露濃度は雄メダカ成魚に対し急性毒性影響を示さないことが示唆された。

そこで、DNAマイクロアレイを用いた遺伝子発現解析を試みたところ、PFOS曝露によって発現が増加した39遺伝子のスクリーニングに成功した。機能が既知の遺伝子群に着目し、PFOSの潜在的毒性影響について考察した。

Vitellogeninは魚類を含め鳥類や両生類などの卵性脊椎動物の繁殖に重要な役割を担っているリンタンパク質の前駆体である。脳下垂体から分泌された生殖腺刺激ホルモンはエストロゲンを合成し、血中のステロイド結合タンパクによって肝臓へ運ばれ、受容体を介して肝臓中でvitellogeninを生成することが知られている $ ^{13} $ 。合成されたvitellogeninは血中に分泌され卵内へ取り込まれ、リポピテリンおよびフォスビチンと呼ばれる卵黄タンパク質になると考えられている。血中

vitellogeninは一般に雌魚の成熟時にmg/mlレベルまで達することが知られているが、雄魚や未成熟魚ではほとんど検出されない。そのため魚類の生殖生理機構を解明することを目的に、vitellogenin遺伝子の発現機構、vitellogeninの卵黄タンパクへの特異的分解過程、卵成長および生殖周期に伴うvitellogeninの変化などに関する研究が行われ、実用面でも雌に特異的に出現する性質を利用して早期雌雄判別法の指標タンパク、卵黄形成のモニタリングなどの分野で利用されていた。しかし近年、雄魚や未成熟魚でもエストロゲン様作用をもつ化学物質に曝露された場合、vitellogeninが誘導されることが報告され、環境エストロゲンの有効なバイオマーカーとなりうることが示唆されている $ ^{13} $ 。本研究では、PFOS曝露によりvitellogenin 3 precursor遺伝子の発現が増加した。また最近の報告では、PFOSを曝露した初期生活段階の海産メダカにおいてvitellogenin遺伝子の発現誘導が明らかにされている $ ^{4} $ 。これらのことから、雄メダカに対するPFOSのエストロゲン様作用が示唆