Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
された。

さらに本研究では、KC-500曝露によって発現が増加したcholine kinase α遺伝子やBDE-47曝露によって発現が増加したCYP26C1遺伝子の発現がPFOS曝露によっても同様に増加した。これらの遺伝子は前述の通り、ガンの増殖、発症および進行やDNAメチル化異常などに関与する可能性がある。ニジマスを用いた研究では、PFOAの発ガン促進作用が報告されていることから $ ^{14} $ 、雄メダカに対するPFOSの発ガン作用が示唆された。

## 4 ）POPs曝露により発現が増加した遺伝子群のオントロジー解析

遺伝子オントロジー（gene ontology: GO）で定義された用語はGOタームと呼ばれ、すべての用語が3つの概念のカテゴリーに分類されている。すなわち、生物学的プロセス（biological process）、細胞の構成要素（cellular component）および分子機能（molecular function）である。そこで本研究では、生物学的プロセスについてGO解析を試み、各POPsがどのような遺伝子機能に影響するか解析した。

KC-500曝露では、transport, signal transduction, cell development/differentiation, cell junction, proteolysisの順に発現増加した遺伝子数が多く（図(2)-1）、KC-500はこれらの遺伝子機能に影響することが示唆された。またBDE-47曝露では、transport, cell development/differentiation, endocrine/reproduction, signal transductionの順に発現増加した遺伝子数が多く（図(2)-1）、BDE-47はこれらの遺伝子機能に影響することが示唆された。さらにPFOS曝露では、metabolism, cell development/differentiation, regulation of transcriptionの順に発現増加した遺伝子数が多く（図(2)-1）、PFOSはこれらの遺伝子機能に影響することが示唆された。これらのことから、各POPsによって影響を受ける遺伝子の機能は多岐に渡ること、またPOPsの種類によって特異的に遺伝子機能に影響することが明らかとなった。今後これらの遺伝子群についてパスウェイ解析などを試み、毒性発現機序のネットワークなどを明らかにする必要がある。
図(2)-1 POPs曝露により発現が増加した遺伝子群のオントロジー解析

## 5 ）POPs曝露により発現変動した遺伝子群の比較

各POPs曝露によって発現変動した遺伝子群について、ピアソンの相関係数を用いて物質間で比較したところ、KC-500とBDE-47（R=0.4510，図(2)-2-A）、KC-500とPFOS（R=0.3785，図(2)-2-B）、BDE-47とPFOS（R=0.3788，図(2)-2-C）の間で統計学的に有意な正の相関関係が認められた（p＜0.0001）が認められた。また、階層的クラスター解析により比較を試みたところ、BDE-47とPFOSは同じクラスターに分類された（図(2)-2-D）。これらのことから、BDE-47とPFOSによる潜在的毒性影響は一部と類似すると考えられた。しかしながら、今回発現変動した遺伝子群についてパスウェイ解析などを試み、毒性発現機序のネットワークなどを明らかにする必要がある。
D

図(2)-2 POPs曝露による遺伝子発現解析

(A-C) ピアソンの相関係数. 各遺伝子の $ \log_{2} $ 変換した発現変動倍率を用いてPOPs間で比較した. (D) 階層的クラスター解析. 統計学的に有意な発現変動を示した遺伝子を用いてPOPs間で比較した. 赤色は発現誘導、緑色は発現抑制、黒色は変動なし.

## 6 ）POPs曝露に対する新たなバイオマーカー候補遺伝子の探索

以上の結果から、各POPsを曝露したメダカ肝臓中において発現が増加した遺伝子群のスクリーニングに成功した。また、これら変動遺伝子群とこれまでに報告されている毒性学的知見の関連を精査し、各POPsの潜在的毒性影響を示唆した。しかしながら、実環境中においてこれらPOPsは複合して存在しており、これらの水生生物に対する複合影響を評価することは極めて重要な課題
である。そこで、各POPs曝露によって共通して発現増加した遺伝子群を抽出し、それらの複合汚染に対する新規バイオマーカー候補遺伝子としての可能性を考察した。

図(2)-3 POPs曝露により共通して発現が増加した遺伝子群

本研究では、各POPs曝露により共通して4つの遺伝子（choline kinase α、thyrotropin releasing hormone receptor 2（trhr2）、emx1 transcription factorおよびneurolysin（metallopeptidase M3 family））の発現が増加した（なおPFOS曝露によって発現増加したthyrotropin releasing hormone receptor 2（trhr2）およびemx1 transcription factor遺伝子については統計学的な有意差は認められなかったが、それぞれ1.9倍以上増加していたため発現増加遺伝子とみなした）（図(2)-3）。これらのことから、これらの遺伝子はPOPsの複合曝露に対する新規バイオマーカー候補遺伝子であることが示唆された。また、これら4遺伝子のうち、本研究ではcholine kinase αに着目した。本遺伝子の発現は、KC-500曝露により4.6倍、BDE-47曝露により2.7倍、PFOS曝露により3.3倍増加し、各POPs曝露によって高い誘導倍率を示した。Choline kinase αはαとβの2つのアイソザイムが存在する。細胞内に取り込まれたコリンはcholine kinaseによってリン酸化されホスホコリンとなり、細胞膜の構成要素ホルファチジルコリンの合成経路へと組み込まれる。これまでの研究によると、choline kinaseはガンの増殖、発症および進行に関与することが提案されている。例えば、乳ガン、肺ガン、大肠ガン、前立腺ガン、膀胱ガンなどのガンのなかにcholine kinase、特にα型が過剰発現されるものがあることが知られている。本研究ではcholine kinase α遺伝子以外に、各POPs曝露によってガン化に関与する遺伝子群の発現も増加しており、これらを総合して考えるとcholine kinase αは今回供試したPOPsの複合曝露に対する新規バイオマーカー候補として特に注目すべき遺伝子であることが示唆された。

## （２）イトゴカイにおけるPOPsの潜在的毒性影響の解明とリスク評価

## 1 ）POPsの急性毒性影響

これまでイトゴカイではKC-400、BDE-47あるいはPFOSの急性毒性影響は明らかにされていない。そこで、イトゴカイに対する各POPsの急性毒性影響を明らかにするため、72時間の止水式曝露による急性毒性試験を実施した。

KC-400曝露は、0.001、0.01および0.1 mg/lの試験区において急性毒性は示さず、これらの試験区の生存率は100%であった（図(2)-3-A）。また、1 mg/lの試験区では1個体のみ死亡が確認され、生
存率は96.7%であった（図(2)-3-A）。今回、溶媒対照区（S.C.）と全ての曝露区の間に統計学的な有意差は認められなかった。

BDE-47曝露は、0.001、0.01および0.1 mg/lの試験区において急性毒性は示さず、これらの試験区の生存率は100%であった（図(2)-4-B）。また、0.45 mg/lの試験区では1個体のみ死亡が確認され、生存率は96.7%であった（図(2)-4-B）。しかし、0.1および0.45 mg/lの試験区では、軽度の遊泳阻害を呈する個体が確認された。今回、溶媒対照区（S.C.）と全ての曝露区の間に統計学的な有意差は認められなかった。

PFOS曝露は、0.1、1および10 mg/lの試験区において急性毒性は示さず、これらの試験区の生存率は100%であった（図(2)-4-C）。また、100 mg/lの試験区では8個体の死亡が確認され、生存率は73.3%であった（図(2)-4-C）。今回、溶媒対照区（S.C.）と全ての曝露区の間に統計学的な有意差は認められなかった。

以上のことから、100 mg/lのPFOSを曝露した試験区を除き、KC-400、BDE-47あるいはPFOSは今回の曝露条件で明瞭な急性毒性を示さないことが示唆された。

図(2)-4 イトゴカイに対するPOPsの急性毒性影響

各濃度に調整したKC-400（A）、BDE-47（B）あるいはPFOS（C）を72時間止水式曝露し、曝露終了後の生存率（%）を算出した。急性毒性試験は各試験区10個体×3連（合計30個体）で実施し、生存率は平均値±標準偏差で示した。S.C.は溶媒対照区（DMSO）。

## 2 ）POPs曝露により発現変動した遺伝子群の網羅的探索

1 mg/lのKC-400、0.45 mg/lのBDE-47および10 mg/lのPFOSを72時間曝露したイトゴカイでは明瞭な急性毒性影響は確認されなかった。そこで、これらの試験区のイトゴカイ試料について、DNAマイクロアレイによる網羅的遺伝子発現解析を試みた。

今回用いたDNAマイクロアレイチップに搭載された9223遺伝子のうち、KC-400、BDE-47およびPFOS曝露によってそれぞれ210、313および31遺伝子の発現が変化し、これらPOPsによって発現変動する遺伝子群のスクリーニングに成功した。KC-400（210遺伝子/9223遺伝子=2.3%）あるいはBDE-47（3.4%）曝露によって変動した遺伝子の割合は、PFOS（0.34%）曝露と比較してそれぞれ6.8倍あるいは10倍高かった。今回用いたKC-400（1 mg/l）およびBDE-47（0.45 mg/l）の曝露濃度は、PFOS（10 mg/l）と比較して10倍程度低いにもかかわらず、KC-400およびBDE-47はPFOSと比較してより多数の遺伝子の発現に影響すると考えられた。

これら発現変動した遺伝子のうち、発現が増加した遺伝子数は、KC-400で210、BDE-47で295、
PFOSで26であった（図(2)-5-A）。一方、発現が抑制した遺伝子数は、KC-400で0、BDE-47で18、PFOSで5であり（図(2)-5-B）、発現増加した遺伝子数と比較すると極めて少なかった。これらのことから、本研究では、特に発現増加した遺伝子群について考察することとした。

(A)

(B)

図(2)-5 POPs曝露により発現増加（A）あるいは抑制した（B）遺伝子数とそれらで共通して発現変動した遺伝子数

## 3 ）KC-400により発現変動した遺伝子群の網羅的探索と潜在的毒性影響の解明

DNAマイクロアレイの結果、KC-400応答遺伝子群の探索に成功した。そこで本研究では、イトゴカイの各遺伝子に特異的なプライマー対を設計し、PCR条件等を最適化することによって、ΔΔCt法を用いたリアルタイムPCRによる遺伝子発現定量系を構築した。この定量系を用いて、KC-400を3日間曝露したイトゴカイについて各遺伝子発現量を測定した。

Tensinは細胞質のリンタンパク質で、アクチンフィラメントに結合し、接着斑として機能する $ ^{15} $ 。1 mg/LのKC-400曝露群では有意に増加したことから（図(2)-6-A）、KC-400は細胞の構造形成に影響すると考えられた。DnaJはシャペロンタンパク質であり、熱ショックタンパク質（Hsp）と相互作用し、ガンに関与することが知られている $ ^{16} $ 。1 mg/LのKC-400曝露群では有意に増加した（図(2)-6-B）。また大腸ガンとの関連が指摘されているUBA domain-containing protein遺伝子の発現は1 mg/L以外のKC-400曝露群で有意に抑制された（図(2)-6-C）。これらのことから、KC-400の発ガンへの関与が示唆された。

Insulin degrading enzymeはインスリン分解酵素である。これまで血糖値やアミロイドβ脳内蓄積によるアルツハイマ一病との関連が報告されている。1 mg/LのKC-400曝露群では有意に増加した（図(2)-6-D）。全てのKC-400曝露群において、26S proteasome regulatory subunit rpn2遺伝子発現に影響はみられなかった（図(2)-6-E）。脂肪細胞の分化に関わるグリセロール-3-リン酸脱水素酵素(glycerol-3-phosphate dehydrogenase)や脂肪酸合成酵素(fatty acid synthase)の遺伝子発現は、1 mg/LのKC-400曝露群で有意に増加した（図(2)-6-F, G）。また、脂質代謝関連遺伝子cytochrome P450(CYP)4A11のホモログであるCYP XL-301-like遺伝子の発現は1 mg/LのKC-400曝露群で有意に増加した（図(2)-6-H）。これらのことから、KC-400は脂肪合成・脂質代謝系に影響すると考えられた。
(A)

(D)

(F)

(G)

(H)

Nominal concentration (mg/L)

図(2)-6 リアルタイムPCRによるKC-400応答遺伝子群の発現解析

## 4 ）BDE-47により発現変動した遺伝子群の網羅的探索と潜在的毒性影響の解明

DNAマイクロアレイの結果、BDE-47応答遺伝子群の探索に成功した。そこで本研究では、イトゴカイの各遺伝子に特異的なプライマー対を設計し、PCR条件等を最適化することによって、ΔΔCt法を用いたリアルタイムPCRによる遺伝子発現定量系を構築した。この定量系を用いて、BDE-47を3日間曝露したイトゴカイについて各遺伝子発現量を測定した。

mRNAのプロセッシングに関与するheterogeneous nuclear ribonucleoprotein Q（図(2)-7-A）、カルシウムセンサーとして知られるdouble C2-like domains, β-like（図(2)-7-B）、筋繊維形成に関与するfibrillin 3-like遺伝子（図(2)-7-C）の発現は、0.45 mg/LのBDE-47曝露によって有意に増加した。また、アポトーシス誘導に関与するcaspase-8-like遺伝子の発現も0.45 mg/LのBDE-47曝露によって有意に増加した（図(2)-7-D）。今回、遺伝子発現量の定量は実施しなかったが、DNAマイクロアレイでは、ガン化に関与するras and EF-hand domain-containing protein homolog isoform 1やras-related protein Rab-11A-like遺伝子の発現も増加しており、GO解析の結果と併せて考えると、BDE-47の潜在的毒性影響は極めて多岐に渡り、ガン化への関与も示唆された。なお本研究では、aldehyde dehydrogenase family 1 member L2, mitochondrial-likeやCYP XL-301-like遺伝子のリアルタイムPCR系を構築・測定したが、全てのBDE-47曝露群において、これら遺伝子群の発現に影響はみられなかった(data not shown)。
Nominal concentration (mg/L)

図(2)-7 リアルタイムPCRによるBDE-47応答遺伝子群の発現解析

## 5 ）PFOSにより発現変動した遺伝子群の網羅的探索と潜在的毒性影響の解明

DNAマイクロアレイの結果、PFOS応答遺伝子群の探索に成功した。そこで本研究では、イトゴカイの各遺伝子に特異的なプライマー対を設計し、PCR条件等を最適化することによって、ΔΔCt法を用いたリアルタイムPCRによる遺伝子発現定量系を構築した。この定量系を用いて、PFOSを3日間曝露したイトゴカイについて各遺伝子発現量を測定した。

10 mg/LのPFOS曝露によってアセトアルデヒド脱水素酵素の一種であるaldehyde dehydrogenase family 1 member L2遺伝子の発現が増加した（図(2)-8-A）。ユビキチン/プロテアソーム経路に関与するUBX domain-containing protein（図(2)-8-B）、アミノ酸トランスポーター関連excitatory amino acid transporter（図(2)-8-C）、アミノ酸の取り込みに関与するvitamin k-dependent γ-carboxylase（図(2)-8-D）、脂質代謝関連CYP XL-301-like（図(2)-8-E）、色素沈着関連garnet遺伝子（図(2)-8-F）の発現は、0.1, 1, 100 mg/LのPFOS曝露で抑制された。これら遺伝子群の関与したPFOSの潜在的毒性影響が示唆されたが、これら遺伝子群の発現抑制の生理学的意義等の解明は今後の検討課題であろう。
(A)

(C)

(D)

(E)

(F)

図(2)-8 リアルタイムPCRによるPFOS応答遺伝子群の発現解析

以上のことから、各POPsによって影響を受けた遺伝子群が明らかとなった。さらに本研究において発現増加した遺伝子のうち、KC-400とBDE-47曝露で共通して発現が増加したのは8遺伝子であった（図(2)-5-A）。言い換えると、8遺伝子以外の遺伝子の種類はKC-400とBDE-47でそれぞれ異なっていた。また、PFOS曝露で発現増加した26遺伝子のうち、BDE-47と共通して発現増加したのは25遺伝子であった（図(2)-5-A）。KC-400とPFOS曝露において共通して発現が増加した遺伝子は今回確認されなかった（図(2)-5-A）。これらのことから、PFOS曝露による潜在的毒性影響はBDE-47でも引き起こされる可能性があったが、一方でBDE-47あるいはKC-400特有の潜在的毒性影響も示唆され、本研究で用いたPOPsによる潜在的毒性影響は極めて多岐に渡ると考えられた。

## 6 ）POPs曝露により発現が増加した遺伝子群のオントロジー解析

本研究では、公共データベースを用いて、今回発現増加した遺伝子群のGOアノテーション情報を作成し、GOを用いて遺伝子群の機能予測を試みた。

Biological Process（生物学的プロセス）に関与するGO解析を試みたところ（図(2)-9）、3物質ともに、タンパク質フォールディング（protein folding）に影響した。また、KC-400とBDE-47は、タンパク質のリン酸化（protein phosphorylation）や分解（proteolysis）などの遺伝子機能にも影響した。さらに、KC-400とBDE-47は、タンパク質機能以外の遺伝子機能にも影響し、KC-400とBDE-47による潜在的毒性影響は多岐に渡ると考えられた。

Cellular Component（細胞の構成要素）に関与するGO解析を試みたところ（図2)-10）、3物質ともに、細胞膜（membrane）に影響し、KC-400とBDE-47は、細胞質（cytoplasm）などの遺伝子機能にも影響した。さらに、BDE-47は上述以外の遺伝子機能（核nucleus，細胞骨格cytoskeleton，ミオシン複合体myosin complexなど）にも影響し、BDE-47による潜在的毒性影響は多岐に渡ると考え
## られた。

Molecular Function（分子機能）に関与するGO解析を試みたところ（図(2)-11）、3物質ともに、タンパク質結合（protein binding）に影響し、KC-400とBDE-47は、ヌクレオチド（nucleotide binding）やDNA結合（DNA binding）、触媒（catalytic activity）やタンパク質キナーゼ活性（protein kinase activity）などの遺伝子機能にも影響した。さらに、BDE-47は上述以外の遺伝子機能（核酸結合nucleic acid activity, GTPase activityなど）にも影響し、BDE-47による潜在的毒性影響は多岐に渡ると考えられた。

図(2)-9 POPs曝露により発現が増加した遺伝子群のオントロジー解析：Biological Process

図(2)-10 POPs曝露により発現が増加した遺伝子群のオントロジー解析：Cellular Component
図(2)-11 POPs曝露により発現が増加した遺伝子群のオントロジー解析：Molecular Function

## 7 ）POPs曝露により発現変動した遺伝子群の比較

各POPs曝露によって発現変動した遺伝子群について、ピアソンの相関係数を用いて物質間で比較したところ、KC-400とBDE-47（r=-0.0027）、KC-400とPFOS（r=-0.0053）で明瞭な関係は認められなかった（図(2)-12-AおよびB）。しかしながら、BDE-47とPFOSの比較では、統計学的に有意な正の相関関係（r=0.6121、p<0.0001）が認められた（図(2)-12-C）。また、階層的クラスター解析により比較を試みたところ、BDE-47とPFOSは同じクラスターに分類された（図(2)-12-D）。図(2)-5で示したように、PFOS曝露で発現増加した遺伝子の多くはBDE-47と共通したこと、また今回のピアソンの相関係数および階層的クラスター解析の結果を伏せて考えると、PFOSによる潜在的毒性影響は、BDE-47による影響の一部と類似すると考えられた。しかしながら、今回発現変動した遺伝子群についてパスウェイ解析などを試み、毒性発現機序のネットワークなどを明らかにする必要がある。
(D)

図(2)-12 POPs曝露による遺伝子発現解析

(A-C) ピアソンの相関係数. 各遺伝子の $ \log_{2} $ 変換した発現変動倍率を用いてPOPs間で比較した. (D) 階層的クラスター解析. 統計学的に有意な発現変動を示した遺伝子を用いてPOPs間で比較した. 赤色は発現誘導、緑色は発現抑制、黒色は変動なし.

## 8 ）POPs曝露に対する新たなバイオマーカー候補遺伝子の探索

以上の結果から、各POPsを曝露したイトゴカイにおいて発現変動を示した遺伝子群のスクリーニングに成功した。また、これら変動遺伝子群とこれまでに報告されている毒性学的知見の関連を精査し、各POPsの潜在的毒性影響を示唆した。しかしながら、実環境中においてこれらPOPsは複合して存在するため、これらPOPsの水生生物に対する複合影響を評価することは極めて重要な課題である。そこで、各POPs曝露によって共通して発現増加した遺伝子群を抽出し、それらの複合汚染に対する新規バイオマーカー候補遺伝子としての可能性を考察した。

本研究では、各POPs曝露によって共通して2つの遺伝子（guanine-nucleotide-exchange-factorとpresenilin 1-1）の発現が増加した（図(2)-5-A）。このうち、guanine-nucleotide-exchange-factorはguanosine triphosphate（GTP）に結合するためにguanosine dephosphate（GDP）の放出を制御することによってGTPaseを活性化することが知られている $ ^{17} $ 。また、ガン化との関連も示唆されている。さらに、ヒトのアルツハイマ一病の原因遺伝子として知られているpresenilin 1-1 $ ^{18} $ については、リアルタイムPCRによる測定法を確立し、遺伝子発現に及ぼす濃度依存的影響を調査した（図(2)-13）。Presenilin 1-1遺伝子の発現量は、1 mg/LのKC-400、0.45 mg/LのBDE-47曝露によって有意に増加し、0.1, 1, 100 mg/LのPFOS曝露によって有意に抑制された。PCBsはアルツハイマ一病との関連も指摘されている。これらのことから、guanine-nucleotide-exchange-factorとpresenilin 1-1は今回実施した3種類のPOPs複合曝露に対する新規バイオマーカー候補として特に注目すべき遺伝子であること
が示唆された。しかしながら、本研究で対象としたイトゴカイでは、これらの遺伝子配列は明らかになっているものの、実際の機能については解析がなされていない。今後、イトゴカイにおけるこれら遺伝子群の機能や毒性学的意義を明らかにするとともに、長期曝露試験などによって遺伝子発現の経時的変化を確認し、POPs複合汚染に対する新規バイオマーカー候補遺伝子としての可能性を精査する必要がある。

Nominal concentration (mg/L)

図(2)-13 リアルタイムPCRによるPOPs応答遺伝子presenilin 1-1の発現解析

## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

ストックホルム条約に新たに登録されたポリ臭素化ジフェニルエーテル類や有機フッ素化合物を対象として、水生生物に対する毒性影響を遺伝子レベルで調査した研究は極めて少ない。本研究では、メダカおよびイトゴカイのDNAマイクロアレイを用いて網羅的遺伝子発現解析を試み、遺伝子レベルからPOPsの潜在的毒性影響を明らかにした。特に、本研究によって初めてイトゴカイにおけるPOPs応答遺伝子が明らかとなった。また、POPsの複合曝露（毒性）に対する新規バイオマーカー候補遺伝子が両生物種において明らかになった。これら遺伝子の今後のさらなる機能解析によって、生態毒性試験の標準化・高度化に大きく寄与できるとともに、本研究成果は、POPsの生態リスク評価において極めて重要な情報を提示できる。

## （２）環境政策への貢献

## ＜行政が既に活用した成果＞

特に記載すべき事項はない。

## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

POPsによる底質汚染のモデルとして、現場生物イトゴカイを用いた評価系を構築した。これらは新たな生態影響評価試験の標準化・高度化に大きく寄与できる。また、DNAマイクロアレイ解析による遺伝子レベルでの毒性影響評価により、環境基準の設定や生態系保全および生物資源の利活用を促進する一助になりえる点からも環境政策に資する。さらに世界をリードする学術情報
を発信するだけでなく、POPsに関するストックホルム条約などに関連した国際社会のニーズや生態系保全・生物多様性保全を考慮した化学物質の安全性評価・利用指針の構築に資することが期待され、今後の環境政策に大きく貢献できる。

## 6 ．国際共同研究等の状況

特に記載すべき事項はない。

### 7. 研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

<論文（査読あり）>

特に記載すべき事項はない。

くその他誌上発表（査読なし）>

特に記載すべき事項はない。

## （2） 口頭発表（学会等）

H. Ishibashi, M. Uchida, M. Hirano, J. Kobayashi, T. Komorita, H. Nakamura, Y. Kagami, T. Kusano, Y. Ishibashi, K. Arizona: 7th International Conference on Marine Pollution and Ecotoxicology, Hong Kong, 2013

“Transcriptomic analysis of the liver of Japanese medaka (Oryzias latipes) exposed to Kanechlor-500, BDE47 or PFOS.”

## （3） 出願特許

特に記載すべき事項はない。

## （４）「国民との科学・技術対話」の実施

特に記載すべき事項はない。

（５）マスコミ等への公表・報道等

特に記載すべき事項はない。

(6) その他

特に記載すべき事項はない。

### 8 \. 引用文献
“Changes in gene expression profile of medaka with acute toxicity of Arochlor 1260, a polychlorinated biphenyl mixture”

4) Fang, C., Wu, X., Huang, Q., Liao, Y., Liu, L., Qiu, L., Shen, H., Dong, S.: Aquat. Toxicol. 106–107, 9–19 (2012)

“PFOS elicits transcriptional responses of the ER, AHR and PPAR pathways in Oryzias melastigma in a stage-specific manner”

5) Mimura, J., Fujii-Kuriyama, Y.: Biochim. Biophys. Acta. 1619(3), 263–268 (2003) "Functional role of AhR in the expression of toxic effects by TCDD"

6) Guiney, P.D., Walker, M.K., Spitsbergen, J.M., Peterson, R.E.: Toxicol. Appl. Pharmacol. 168(1), 1–14 (2000)

“Hemodynamic dysfunction and cytochrome P4501A mRNA expression induced by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin during embryonic stages of lake trout development”

7) Henry, T.R., Spitsbergen, J.M., Hornung, M.W., Abnet, C.C., Peterson, R.E.: Toxicol. Appl. Pharmacol. 142, 56–68 (1997)

“Early life stage toxicity of 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin in zebrafish (Danio rerio)”

8) Antkiewicz, D.S., Burns, C.G., Carney, S.A., Peterson, R.E., Hideman, W.: Toxicol. Sci. 84, 368–377 (2005)

"Heart malformation is an early response to TCDD in embryonic zebrafish"

9) Knowles, L.M., Yang, C., Osterman, A., Smith, J.W.: J. Biol. Chem. 283(46), 31378–31384 (2008)

“Inhibition of fatty-acid synthase induces caspase-8-mediated tumor cell apoptosis by up-regulating DDIT4”

10) Chen, X., Li, V.W., Yu, R.M., Cheng, S.H.: Ecotoxicol. Environ. Saf. 71, 200–208 (2008)

“Choriogenin mRNA as a sensitive molecular biomarker for estrogenic chemicals in developing brackish medaka (Oryzias melastigma)”

11) Yu, R.M., Wong, M.M., Kong, R.Y., Wu, R.S., Cheng, S.H.: Aquat. Toxicol. 77, 348–358 (2006) "Induction of hepatic choriogenin mRNA expression in male marine medaka: a highly sensitive biomarker for environmental estrogens"

12) Kojima, H., Takeuchi, S., Uramaru, N., Sugihara, K., Yoshida, T., Kitamura, S.: Environ. Health Perspect. 117(8), 1210–1218 (2009)

“Nuclear hormone receptor activity of polybrominated diphenyl ethers and their hydroxylated and methoxylated metabolites in transactivation assays using Chinese hamster ovary cells”

13) Sumpter, J.P., Jobling, S.: Environ. Health Perspect. 103, 173–178 (1995)
“Vitellogenesis as a biomarker for estrogenic contamination of the aquatic environment”

14) Tilton, S.C., Orner, G.A., Benninghoff, A.D., Carpenter, H.M., Hendricks, J.D., Pereira, C.B., Williams, D.E.: Environ. Health Perspect. 116(8), 1047–1055 (2008)

“Genomic profiling reveals an alternate mechanism for hepatic tumor promotion by perfluorooctanoic acid in rainbow trout”

15) Lo, S.H.: Int. J. Biochem. Cell Biol. 36(1), 31–34 (2004) "Tensin"

16) Ohtsuka, K., Hata, M.: Cell Stress Chaperones 5(2), 98–112 (2000)

“Mammalian HSP40/DNAJ homologs: cloning of novel cDNAs and a proposal for their classification and nomenclature”

17) Cherfils, J., Zeghouf, M.: Physiol. Rev. 93(1), 269–309 (2013) "Regulation of small GTPases by GEFs, GAPs, and GDIs"

18) Russo, C., Schettini, G., Saido, T.C., Hulette, C., Lippa, C., Lannfelt, L., Ghetti, B., Gambetti, P., Tabaton, M., Teller, J.K.: Nature 405(6786), 531–532 (2000)

“Presenilin-1 mutations in Alzheimer's disease”
# Quantitative Evaluation of the Impact of Persistent Organic Pollutants on an Estuarine Ecosystem

Principal Investigator: Jun KOBAYASHI

Institution: Prefectural University of Kumamoto

3-1-100 Tsukide, Kumamoto City, Kumamoto 862-8502,

JAPAN

Tel: +81-96-321-6710/ Fax: +81-96-321-6710

E-mail: jkobayashi@pu-kumamoto.ac.jp

Cooperated by: Shokei University Junior College

## [Abstract]

Key Words: Persistent organic pollutants, Ecological risk, Food web bioaccumulation model, Exposure assessment, Flux, Gene expression, Toxicity effect, DNA microarray

Persistent organic pollutants (POPs) such as polychlorinated biphenyls (PCBs) are highly persistent and have strong bioaccumulation potentials and may adversely affect the ecosystem. Polybrominated diphenyl ethers (PBDEs) and perfluorooctanesulfonic acid (PFOS) have, in recent years, been classified as POPs by the Stockholm Convention on POPs, and they have therefore attracted a great deal of attention from researchers and social concerns. However, little information is available on the concentrations of these new POPs in environmental media and the toxic effects they may cause and ecological risks they pose.

Estuaries contain abundant nutrients, and a range of organisms live in them. However, harmful chemicals such as POPs flow into estuaries along with nutrients. Therefore, it is necessary to appropriately assess the risks posed by POPs to organisms living in estuaries. In subtheme (1), the risks posed by POPs to organisms living in an estuary on the Ariake Sea were assessed using field survey data and a model simulation. The PCB flux from the river water to Capitella sp. was estimated from field survey data. Trophic magnification factors (TMFs) for PCBs, PBDEs, and PFOS were determined using stable nitrogen isotope data obtained for living aquatic organisms. We developed a food web bioaccumulation model to assess the exposure of organisms to POPs. An ecological risk assessment was performed using information on the toxic effects of POPs, including the results of the DNA microarray studies performed under subtheme (2). The results suggested that only low levels of ecological risk are posed by total-PCBs and BDE47.

In subtheme (2), tests were performed to determine the toxicities of PCBs, PBDEs, and PFOS to fish and polychaeta. Comprehensive gene expression analysis using a DNA
microarray was then performed for the organisms, and an attempt was made to predict the potential toxic effects of the POPs. The toxicity test results for the fish suggested that KC-500 causes liver inflammation, apoptosis, and cancer, BDE-47 causes estrogenic effects, and PFOS is carcinogenic and has estrogenic effects. The toxicity test results for the polychaeta suggested that KC-400 affects carcinogenic processes, lipid synthesis, and lipid metabolism, BDE-47 affects carcinogenic processes, and PFOS affects amino acid uptake and lipid metabolism. A new biomarker candidate gene for the exposure of fish and polychaeta to mixtures of these three POPs was found. The results will be extremely important for use in ecological risk assessments and will contribute to the standardization and advancement of ecological toxicity tests.
## （３）森林減少・劣化による花粉媒介・生物制御サービスの広域変動予測手法の開発

国立研究開発法人森林総合研究所
森林昆虫研究領域	岡部貴美子
森林昆虫研究領域	昆虫生態研究室	滝 久智
森林植生研究領域	正木 隆・佐藤 保
〈研究協力者〉
徳島大学	山下 聡
京都大学	市岡 隆朗
神戸大学	前藤 薰
国立研究開発法人 国立環境研究所	五箇 公一
国立研究開発法人 森林総合研究所	長谷川 泰洋

平成23～27年度累計予算額：97,231千円（うち平成27年度：17,754千円）

予算額は、間接経費を含む。

## [要旨]

森林生態系においては、送粉サービスや生物制御サービスが森林劣化による生物多様性の変化の影響を強く受けることが懸念されている。また分解サービスは物質循環、炭素排出、リサイクルなどにおいて重要視されてきた。そこで森林劣化の観点からこれらの定量化を試みた結果、日本のローカルな送粉サービスにおいては、送粉昆虫の多様性とソバの結実率との間に正の相関が検出され、また人工林との明確な関連はないが、天然林や自然植生が正の効果を持つことが明らかとなった。一方昆虫による生物制御サービスについては、ローカルなスケールではおそらくミクロな景観および種の多様性により、明瞭な関係は抽出されなかった。分解サービスについては樹種によって差異はあるものの、ブナ枯死木において木材分解菌の多様性が分解サービスの指標となる可能性が示唆された。これらの定量化に基づき、ローカルな送粉、生物制御、分解サービスの予測マップを作成した。また国スケールではサービス供給能力(例:送粉効率)、移動性等を考慮し、送粉サービスではニホンミツバチの遺伝的多様性、生物制御サービスでは捕食性天敵の種多様性を指標とし、これらと景観および気象等の非生物的要因との関係を解析して全国的な生態系サービス予測マップを作成した。マレーシア・ボルネオ島においては、生物制御サービス、分解サービスについて森林劣化との関係を定量化し、東南アジアにおけるローカルなサービス予測マップを作成した。これらのことから生態系サービス予測手法について、1．東アジアの温帯雨林地域で生物相が類似する地域では類似の手法を適用可能である、2．気候帯と生物相が大きく異なる地域では、主要なサービス供給生物を明らかにし、定量化する必要がある、3．基盤情報として植生図(土地利用図)を整備する必要がある、4．将来予測においては適切なシナリオの開発が必要であることを整理した。またREDD+における生物多様性の指標として、人為かく乱や森林タイプなどを提案した。
[キーワード]

送粉サービス、生物制御サービス、分解サービス、森林劣化、REDD+

### 1. はじめに

生物多様性条約（CBD）の第10回会議（COP10）では「生物多様性概況第3版（GB03）」の分析を受けて、2010年以降の戦略目標（愛知目標）が採択された。この議論の中ではさまざまなステークホルダーによる具体的な行動を促すため、生態系サービスの評価などが強調されている。また「生物多様性と生態系サービスの経済学（TEEB）」の最終報告書が提出されたことにより、革新的資金メカニズムなどの議論も進んでおり、そのためにも生態系サービスの定量化を進める必要がある。森林生態系に関しては、温暖化緩和策としての「森林の減少・劣化の防止による温室効果ガスの排出削減（REDDおよびREDD+）」とのコベネフィットが期待され、その導入に欠かせない評価やモニタリング手法が望まれている。さらに、「生物多様性と生態系サービスに関する政府間科学政策プラットフォーム」（IPBES）の設置が決まり、生物多様性や生態系サービスの現状と予測や評価に関する科学的知見がCBDの中で果たす役割が重要視されている。

このような国際的な状況の下、わが国の森林分野では大規模長期生態学研究のネットワーク（JaLTER）等により長期的な森林動態の研究が進捗しているが、生態系機能の評価は端緒についたところであり、人間社会への恩恵としての生態系サービスについては未評価の部分が大きい。今後生態系サービスには生物多様性保全のインセンティブとして、さらには安全安心な社会の構築のための基盤情報として、期待が高まると予想される。加えて政府間地球観測作業部会（GEO）による全球地球観測システム（GEOSS）のなかで、生物多様性観測に関する地球規模のネットワーク（GEO BON）がスタートし、日本国内の観測ネットワークとしてJBON、アジア太平洋地域にAP BONが設立されたことから、東～東南アジアに共通の生態系サービス評価のためのプロトコルが望まれている。これらのことから本研究では、国際的に共通課題である森林減少や劣化と生態系サービスの変動との関係を日本および東南アジアの研究サイトにおいて解明し、ローカルと国・地方レベルという異なるスケールにおける適切な生態系管理手法開発に資する。

## 2 ．研究開発目的

森林の減少と劣化が昆虫を中心とした動物による花粉媒介と生物制御サービスにおよぼす影響を解明し、森林景観データを用いて、森林に由来する送粉者と天敵による生態系サービスの地理的・時間的変動をアジア全域について予測する手法を開発する。

### 3. 研究開発方法

森林減少・劣化による花粉媒介・生物制御サービスの広域変動予測手法の開発のために、1）モデルサイトにおける森林景観と生態系サービスを供給する生物との関係の解明、2）送粉者・天敵昆虫のデータベース構築、3）森林劣化と生態系サービスの量的関係の解明およびこれらに基づく日本および東アジアの生態系サービスローカル予測マップの作成と、日本の国レベルの同マップ作成、4）生態系サービスの変動予測手法の開発を行った。生態系サービスの予測マップ作成は、モデルサイトまたは全国に調査地点を設置し、生態系サービスを供給する生物種または生物群の多様性と景観(特に森林劣化)との関係を定量化し、これを外挿して求める範囲で地図化
した（手法の概要は図3-1参照）。

図(3)-1 生態系サービス予測マップ作成手法の概念図. 全国レベルで予測する場合は、10km四方のグリッドをなるべく網羅するように調査を行い、景観、気象要因等の要因と生物多様性または生態系サービスとの関係を定量化する。適宜、グリッドの代わりに行政単位などを利用する。

1）日本国内で森林景観と送粉サービスの関係を定量化するために、茨城県常陸太田市に17地点のモデルサイト（ソバ圃場）を設定した（図(3)-4参照）。モデルサイトで一定時間内にソバの花に訪花する昆虫を採集し、それらの種と個体数を調べた。その中で最も機能が高いと考えられる送粉昆虫を抽出し、森林景観との関係を解析した。また生物制御サービスを定量化するために同サイトにマレーズトラップ（図(3)-4参照）を設置し、ワタアブラムシ（Aphis gossypii）と天敵昆虫（テントウムシおよびクサカゲロウ）を採集し、小型昆虫（害虫および天敵）と周辺の景観との関係を解析した。さらに茨城県北茨城市と高萩市の森林地帯に集合フェロモントラップを設置してチャバネアオカメムシ（Plautia stali；害虫）を採集し、森林景観と森林からのディスサービスである害虫供給との関係を予測した。同時に天敵も採集し、景観との関係を考察した。分解サービスに関しては、同様に茨城県北部の異なる森林タイプ・林齢の森林から得たサルノコシカケ類の多様性を解析した。また老齢林内で異なる分解度のブナ属およびコナラ属の枯死木から木材腐朽菌のDNAを採集し、菌類の多様性と分解速度との関係を解析した。

東南アジアではマレーシア・クチン市の郊外にモデルサイトを設定し(図(3)-2)、隣接する原生林とアカシア林(二次林)の5本のライン上にマレーゼトラップを設置して天敵昆虫を採集、同定した。この野外調査にもとづき、森林劣化との定量的関係を解析した。またマレーシア・ビンツル市のアカシア林、天然林には分解サービス調査のモデルサイトを設定し、木片の分解速度を指標とする分解サービスの定量化を行った。さらに東南アジア地域の分解サービスの予測を行う準備として、タイ（アカシア林3、天然林2）、ベトナム(アカシア林2、天然林2)、マレーシアボルネオ島サラワク、サバ（どちらもアカシア林4、天然林2）での多孔菌類の調査を元に、森林タイプと多孔菌の多様性または種組成の一般化について検討した。
A

B

C

図(3)-2 東南アジアのモデルサイトと調査. A: マレーシア (ボルネオ島) の調査地点、B: 上クチン市の森林景観、下調査方法(マレーズトラップ)、C: 上ビンツル市の森林景観、下調査方法(木片の分解調査.

これらの研究結果と既存の出版物(主に科学論文)をレビューし、森林劣化と生態系サービスの関係を定量的に予測した。またREDD+のスキームにおいて生態系サービス保全のための森林減少・劣化対策の手法を取りまとめた。さらにREDD+におけるセーフガードの生物多様性および生態系サービス保全のモニタリングと評価に資するために、アジア地域で有効と考えられる基準と指標を整理した。

2）既存の採集情報や文献情報を元に、国内及びアジアの送粉及び天敵サービスを中心とするデータベース構築を行った。

3）日本のローカルスケールではハナバチ類による送粉サービスを定量化するために茨城県常陸太田市に17地点のモデルサイト（ソバ圃場）を設定した（図3）-4参照）。モデルサイトで一定時間内にソバの花に訪花する昆虫を採集し、それらの種と個体数を調べた。また同サイトでソバの結実量を調べ、送粉サービスの定量化を行ったこの評価をもとに、送粉サービスマップのプロトコルを作成した。またローカルな分解サービスを予測するために、木材腐朽菌をサービス供給生物とし、分解速度を指標として定量化を行い、分解サービス予測マップのプロトコルを作成した。

国スケールの生態系サービスを予測するために、①送粉能力が高い、②営巣場所として森林に依存する傾向がある、③軒探索のための移動能力が高いことから在来ミツバチのニホンミツバチ（Apis cerana）を対象送粉生物として、北海道と南西諸島を除く全国135箇所で花または巣から採集を行い、遺伝的多様性を指標として送粉サービス供給ポテンシャルの予測を行った。遺伝的多様性に関しては採集個体の対立遺伝子数とヘテロ接合度を調べた。また送粉サービスの利用状
況を全国レベルで予測するため、農林水産省の作物統計を用いて、昆虫によって受粉する虫媒作物の県単位の耕作地面積を調べた。

国スケールの生物制御サービスを予測するために、①害虫捕食能力が高い、②営業場所として森林に依存する傾向がある、③移動能力が高いことから、カリバチのうちスズメバチ類を対象捕食性昆虫とし、南西諸島を除く全国132地点に誘引トラップ（オレンジジュースと蒸留酒の混合による一般的なスズメバチトラップ）を設置して採集を行い、種の多様性を指標として生物制御サービス供給ポテンシャルの予測を行った。

アジアのローカルスケール（マレーシア・クチン市郊外）における生物制御サービスの定量化にもとづき、サブテーマ4によって作成された現地の植生図を利用して、予測マップを作成した。アジアのローカルスケールの分解サービスマップ作成のためには、マレーシアサラワク州ビンツル市郊外の天然林（5林分）、アカシア林（人工林、15林分）に木片を設置して分解速度を調べ、分解サービスの定量化を行い、景観との関係を解析した。結果にもとづき、サブテーマ4に作成された現地の植生図を利用して、予測マップを作成した。

本研究による日本における生態系サービス予測マッププロトコルから、東アジアにおける生態系サービス予測手法について考察した。また同様に熱帯アジアにおける生物多様性に強い影響を受ける生態系サービスの調査、定量化手法について整理した。

4）茨城県北茨城市北部の10 km 四方のサイトの土地利用図にもとづき、1）と3）から20年後の植生変化を予測して、分解サービス変動予測マップを作成した。

図(3)-3 シナリオアプローチのフレームワーク(Pereira et al. 2010より改変).

長期的な生物多様性および生態系の変動予測にはシナリオが必要であることから、既存の研究をレビューし、トレンド分析を行った(図(3)-3)。生態系サービスの長期的な変動の予測を行うためにどのようなシナリオが適切かを明らかにするため、web of scienceに「生物多様性」「生態