Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
## (2) ダイオキシン類の曝露量と継世代移行量の評価に関する研究

福岡県保健環境研究所 平田輝昭

<研究協力者>

福岡県保健環境研究所 梶原淳睦

福岡県保健環境研究所 堀 就英（平成25年度）

福岡県保健環境研究所 高尾佳子（平成25年度）

福岡県保健環境研究所 櫻井利彦（平成26年度）

平成24(開始年度)～26年度累計予算額：617千円

（うち、平成26年度予算額：207千円）

予算額は、間接経費を含む。

## [要旨]

母体から胎児へのダイオキシン類の移行実態を明らかにするために、平成21年10月～23年3月に九州大学病院で29名の妊産婦(正常出産例19名及び胎児発育遅延例（FGR）10名）の協力を得て生体試料（母体血、母体脂肪、母乳、胎盤、さい帯、さい帯血（さい帯動脈血及びさい帯静脈血）、羊水、胎脂、胎便、新生児尿）の合計217件を採取した。大容量型高速溶媒抽出装置及び大量試料注入装置付き高分解能ガスクロマトグラフ/高分解能質量分析計を用いて、多種類の生体試料中のダイオキシン類を分析する方法を確立し、平成23年度までに母体血、母体脂肪、母乳、胎盤、さい帯、さい帯血（さい帯動脈血及びさい帯静脈血）試料の測定を実施した。今回は羊水、胎脂、胎便、新生児尿試料の合計67件のダイオキシン類濃度測定を行い各検体間の関連を解析した。また、ダイオキシン類の継世代移行量を解析するためカネミ油症患者の母子の血液中ダイオキシン類濃度を比較し解析した。その結果、胎脂試料中のダイオキシン類濃度は、平均8.0 pg-TEQ/g lipid（範囲；2.5～23 pg-TEQ/g lipid）であり、胎便試料中のダイオキシン類濃度は、平均2.8 pg-TEQ/g lipid（範囲；0.34～8.2 pg-TEQ/g lipid）であった。羊水、新生児尿試料についてはダイオキシン類濃度が検出下限以下であった。正常出産15名において、母体血、胎盤組織、胎脂、さい帯血、胎便の順にダイオキシン類濃度が低下する傾向が認められ、母体から胎児側に近い試料ほどダイオキシン類濃度は低くなる傾向が認められた。

[キーワード]

ダイオキシン、胎脂、胎便、羊水、世代移行

### 1. はじめに

ダイオキシン類は難分解性の有害化学物質であり、環境中で長期間にわたり安定して残留することが知られている。近年ゴミ焼却等の発生源の対策が進み、環境基準値を上回る汚染事例はほとんど認められなくなった。一方、環境中に残留する微量ダイオキシン類の持続的摂取によって
健康に影響が及ぶ可能性が指摘されている。高濃度のダイオキシン類曝露による急性毒性と同様に、内分泌かく乱作用に代表される微量ダイオキシン類による長期間曝露のリスクを正確に評価することが重要となっている。

一般人のダイオキシン類の主たる摂取経路は食品である。平均的な食事を介したダイオキシン類の摂取量が、成人に対して直ちに健康被害をもたらす量であるかは、既に一定の評価がなされている。厚生労働省研究班の調査結果によると、マーケットバスケット方式で、求めたダイオキシン類の平均摂取量は、近年ほぼ横ばいで1～2 pg-TEQ/kg体重/日を推移している。この量は、厚生労働省の定める耐容一日摂取量(TDI)の4 pg-TEQ/kg体重/日を下回っている $ ^{1} $ 。ダイオキシン類の主たる摂取源は魚介類であるが、魚介類の摂取量寄与が低下に向かう将来予測はなく、平均的なダイオキシン類曝露量は今後も同程度のレベルで持続するものと考えられる。食事経由のダイオキシン類平均摂取量は、ただちに健康被害をもたらす量に達しておらず、厚生労働省は摂取リスクの高い食品に偏らない、バランスの良い食生活を推奨している $ ^{2} $ 。

環境省が実施した「ダイオキシン類の人への蓄積量調査（2002-2007）」報告書によると、全国の一般市民450名から採取した陰膳食事試料を分析した結果、8名のダイオキシン類摂取量がTDIを超過していた $ ^{3)} $ 。このように、実際的なダイオキシン類摂取量は個人でバラツキの大きいことがわかった。また、国内にダイオキシン類のTDIを超過する高リスクの人々が少なからず存在することが示唆されている。

TDIによって示されるダイオキシン類の健康リスクは一般成人を対象にしており、生体防御機構の未発達な胎児や乳児期におけるリスク、影響等は正確に評価されていない。近年、胎児の発育や発達、さらに小児期から青年期にかけての健康は胎児期における環境要因に影響を受けるという指摘がなされている $ ^{4} $ 。ダイオキシン類の高濃度曝露事例である油症では、母体から胎児へのダイオキシン類の移行が示唆されている $ ^{5} $ 。食事を介したダイオキシン類の持続的な摂取、さらにそれらの体内への蓄積に起因する健康影響の解明が必要である。とりわけ胎児期における母体を介してのダイオキシン類曝露実態と影響を明らかにすることが重要である。

## 2 ．研究開発目的

本分担研究では、母体並びに胎児関連の様々な生体試料を採取し、当該試料中のダイオキシン類濃度測定法を開発し、濃度を明らかにする。ダイオキシン類の母体側から胎児側への移行量やダイオキシン類異性体別の移行の傾向、母体-胎児聞の濃度分布等を把握する。さらに、ダイオキシン類高暴露事例であるカネミ油症患者の母子の血液中ダイオキシン類濃度を比較しダイオキシン類の継世代移行量を解析することを目的とした。

### 3. 研究開発方法

## (1) 試料採取

平成21年10月～23年3月に九州大学病院(福岡市)における出産事例において、インフォームドコンセントを得た妊産婦から母体及び胎児関連試料の採取を行った。試料採取は主に正常出産例、ほかに胎児発育遅延例（FGR）を対象とした。試料の内訳は、母体血、母体脂肪、母乳、胎盤、臍帯、臍帯血(臍帯動脈血（A血）及び臍帯静脈血（V血））、羊水、胎脂、胎便、新生児尿の10種で、あった。このうち今回は、羊水、胎脂、胎便、新生児尿のダイオキシン類濃度を測定し、各
検体間濃度を比較解析した。採取後の試料はガラスまたはテフロンを材質とする清浄な密閉容器に移し、分析を始めるまで凍結保存された。正常出産例19名から158件、FGR例の10名から59件の計217件の生体試料を採取した。妊産婦の平均年齢は正常出産例で31.8才、FGR例で32.3才であった。

## (2) 使用機器

高速溶媒抽出（ASE）にはダイオネクス製の大容量型装置ASE350を使用した。抽出セルは336及び99mLの各容量3種類を用途に応じ使用した。抽出温度は150℃、抽出圧力は1500psiで、あり、抽出溶媒はアセトン/ヘキサン（1:3，v/v）を使用した。ダイオキシン類の異性体分離分析には大量試料注入装置（アイスティサイエンス製LVI-S200）付き高分解能ガスクロマトグラフ/高分解能質量分析計（Agilent7890A/MicromassAutoSpecPremier、HRGC/HRMS）を使用した。キャピラリーカラムは、バリアン製のVF5ms（内径0.25mm，膜厚0.25μm，長さ30m）を使用した。

## (3) 試薬、器材等

アセトン、ヘキサン、トルエン、ジクロメタン、無水硫酸ナトリウムは関東化学製のダイオキシン分析用を使用した。ノナンはWellington Laboratories製を、硝酸銀シリカゲルは和光純薬製のダイオキシン分析用を、濃硫酸は同社製の有害金属測定用をそれぞれ使用した。活性炭（ナカライテスク製）はトルエンで、約30時間還流洗浄し、無水硫酸ナトリウムに対して0.1%(w/w)になるよう混合して用いた。珪藻土粉末（抽出操作用）はInternational Sorbent Technology製のBULK ISOLUTE SORBENT HM-NをASEで洗浄して使用した。同様に硝酸銀シリカゲル、無水硫酸ナトリウム及び珪藻土粉末は、ブランクレベルの低減を目的として、あらかじめASEで溶媒洗浄して使用した。クリーンアップスパイク並びに、シリンジスパイク用の各内部標準溶液はWellington Laboratories製を用い適宜ノナンで希釈して使用した。

ブランクレベルの低減と維持を目的として、各種ガラス製器材（ピペット、フラスコ、スピッツ管等）は、すべて生体試料中ダイオキシン類を分析する専用品として調達し、一般化学分析用と厳重に区別して使用した。

使用するガラス器材は、あらかじめ重クロム酸カリウム・硫酸混液に一夜漫漬したのち、精製水で表面を十分にすすぎ、クリーンボックス内で乾燥させた。母体血、臍帯血の保存容器には50mL容のテフロン製ねじロサンプル管を、上記以外の試料には200mL容のガラス製ねじロ保存瓶をそれぞれ使用した。保存容器は新品を使用し、使用する前に有機溶剂（アセトン、ヘキサン）で繰り返し洗浄し、十分に乾燥させて使用した。

## (4) 分析方法

冷凍保存の生体試料を自然解凍して分析に用いた。ASE・350用の抽出セル(容量33mL)の1ないし2本を用い、胎脂は計0.5～3g、胎便は計0.5～5gを珪藻土粉末に混合してセルに充填し、凍結乾燥機を用いて試料中の水分を除去した。各試料に定量用内部標準(クリーンアップスパイク)として13Cラベル化PCDD/DFs及び13Cラベル化PCBs標準品(ノナン溶液)を正確に添加し、セルキャップを装着して抽出装置に装填し、抽出を行った。羊水、新生児尿は、1～10mlgにクリーンアップスパイクを添加し、抽出溶媒にアセトン/ヘキサン(1:3, v/v)を用いて液-液抽出を行い、抽出液を調製した。得られた抽出液をロータリーエパポレーターで、減圧濃縮し、風袋を量った秤量瓶に移して乾燥させ、脂肪重量を測定した。

脂肪重量を確定後、脂肪を少量のヘキサンで溶解させ、10 mL容のスピッツ管に移し硫酸処理を
行った。ガラス製クロマト管に硝酸銀シリカゲル(0.5g)及び活性炭(0.5g)を各々充填して上下に連結し、カラムの最上端より硫酸層と分離した試料溶液を負荷後、ヘキサン15mLで溶出した。硝酸銀シリカゲルカラムを取り外し、活性炭カラムの上端から10%（v/v）ジクロロメタン/ヘキサンを注ぎ、non-ortho PCBsを除く大部分の PCBsを溶出させた。次いでトルエン25mLを注ぎ入れ、PCDDs、PCDFs及びnon-ortho PCBsを溶出させた。得られたトルエン画分を減圧濃縮してヘキサンに転容し、窒素ガス気流による濃縮を経て1.5mL容の濃縮パイアルに移し、シリンジスパイクを添加して最終検液量を40-50μLとしたものを測定試料とした。調製した測定試料のうち20μLを大量試料注入装置付きHRGC/HRMSに注入し、測定した。得られたSIMクロマトグラムを解析し、2,3,7,8位に置換塩素を持つ4～8塩素化のPCDD/Fs17種類、ダイオキシン様PCBsのnon-ortho PCBs4種の計21種同族体を同定・定量した。

ダイオキシン類濃度（pg/g）の2,3,7,8-TCDD毒性当量（TEQ）への換算には、2,3,7,8-TCDD毒性等価係数（WHO-TEF（2005））を用いた。なお、本報告におけるダイオキシン類の濃度値は特に注釈のない限り、脂肪重量あたりの濃度（lipid weight basis）で表記するものとする。

## （５）カネミ油症患者母子間のダイオキシン類移行の解析

## 調查対象

月森らが行ったアンケート調査 $ ^{5)} $ に応じた、油症患者(母)の回答に基づき、母親と油症発症後に生まれた子の血中ダイオキシン等の濃度を比較検討した。なお、使用したデータは、1986年～2012年の油症一斉検診ダイオキシン類測定結果を使用した、また、2,3,4,7,8-PeCDF濃度(以下、PCDF濃度と略)は、2001～2012年のデータを使用した。

## 解析方法

① 母子間で血液中PCB、PCDF濃度の関連の検討。

PCB、PCDF濃度は、最大値を選択(複数回測定の場合)

ここで、アンケート回答者の内、油症発生後に出産した者で、油症検診時にPCB、PCDFを測定している者は、親34人、子54人であった。母子共に出産後相当の期間が経過しており、出産時の血液検査は行われていないことに留意する必要がある。

② 小児科検診、内科検診を受けたもので、ミルクのみで育てられた子と、母乳又はミルクで育てられた子の群にわけ、検診結果や血液中PCB、PCDF濃度に違いがあるかを検討。

なお、小児科検診ではPCB濃度しか測っていない。また、各データは、一番古い(若い頃に受けた)ものを使用した。

ここで、比較の方法は、同一項目の群間比較とし、量的データの比較においては、2群の比較の場合のt検定（対応なし）で計算した。また、質的データに対しては、2群・二値の場合の、 $ \chi^{2} $ 検定（クラーメルの係数の検定）で計算した。

## 4 ．結果及び考察

(1) 胎脂、胎便、羊水及び新生児尿中のダイオキシン類濃度

16件（正常例15件及びFGR1件）の胎歯試料中のダイオキシン類濃度は、平均8.0pg-TEQ/g lipid（範囲；2.5～23 pg-TEQ/g lipid）であり、18件（正常例15件及びFGR3件）の胎便試料中のダイオキシン類濃度は、平均2.8 pg-TEQ/g lipid（範囲；0.34～8.2 pg-TEQ/g lipid）であった。胎脂は母胎内で胎児の皮膚を保護する役割を果たし、また胎便は胎内で胎児が取り込んだ主に羊水に由
来している。胎脂のダイオキシン類には、母体脂肪組織に含まれるダイオキシン類の組成や濃度が、ほぼそのまま反映されることが分かった。一方、胎便から検出されたダイオキシン類濃度は今回測定した生体試料中で最も低い濃度であった。さらに、羊水、新生児尿試料については液-液抽出による脂肪の抽出を試みたが、検体量(1～10ml)及び脂肪含量が共に少なく脂肪が抽出されず、ダイオキシン類の測定を試みたが検出下限以下であった。

## (2) 母体血、胎脂、胎便等生体試料のダイオキシン類濃度の比較

これまでに得られた生体試料（母体血、母体脂肪、胎盤、さい帯血、胎脂、胎便）中の分析結果より、正常出産例19名のうち14名についてダイオキシン類濃度（Total TEQ）の比較を行ったところ母体血、胎盤、母体脂肪、胎脂、臍帯血、胎便の順に低くなる傾向が認められた。さらにこれら生体試料と母体血のダイオキシン類濃度間に良好な正の相関（ $ r^{2}=0.8322-0.9399 $ ）が認められた（図(2)-1）。
各試料間の濃度相関

図(2)-1
以上のように、母体内でのダイオキシン類の胎児への透過は、胎盤部位で一定の抑制がなされ、胎児へ移行する毒性量は軽減されることが示唆された。比較的毒性が高くTEF値の大きい低塩素化物は胎盤で保持されやすいが、毒性の低い化合物は保持されにくく、胎児側へ移行しやすいことが示された。このことは胎盤組織に存在するAhレセプターへの各化合物の結合性(親和性)の強弱によって説明できると考えられる。

## (3) カネミ油症患者母子間のダイオキシン類移行の解析

上記で解析した母体血、胎脂、胎便に加えて母乳も11件で解析しており、母体血のダイオキシン類濃度間に正の相関（ $ r^{2}=0.5266 $ ）を認めた（図(2)-2）。この結果は出生後も母乳を介して子がダイオキシン類に暴露し続け得ることを意味する。そこで母子間の血液中のダイオキシン類の濃度に関連があるか検討を行った。
母乳中ダイオキシン類濃度

図(2)-2
① 母子間で血液中PCB、PCDF濃度の関連の検討結果

解析の結果、母子の血中PCB濃度の関係は見られなかった。

次に、母と子の血中PCDF濃度を比較したが、PCB濃度と同じく関係は見られなかった。

次に、母親のPCDF濃度区分別に、子のPCB、及びPCDF濃度を調べた。

ここで、血液2,3,4,7,8-pentachlorodibenzofuran (PeCDF)の濃度の異常として以下のとおり区分した。

1) 50pg/g lipids以上:高い濃度

2) 30pg/g lipids以上、50pg/g lipids未満:やや高い濃度

3) 30pg/g lipids未満:通常みられる濃度

この基準で母親を分け、子の濃度を比較した。その結果、母のPCDF濃度が低い方が、子のPCB濃度の平均値が高い傾向を認めた。

次に、母のPCDF濃度と子のPCDF濃度関係を見ると母のPCDF濃度が高い方が、子のPCDF濃度の平均値が高い傾向を認めた。

次に子に与えた栄養別（母乳、ミルク、混合（栄養））に分け、子のPCB濃度及びPCDF濃度を検討した。その結果、栄養別によって子のPCB濃度に差を認めなかった。子のPCDF濃度に関しては、「混合」群、「ミルク」群、「母乳」群の順に子のPCB濃度分布幅が大きくなったが有意差は得られなかった。

最後に母のPCDF濃度群と子のPCDF濃度の関連（子に与えた栄養別）を子に与えた栄養、子の性別と伴に検討した。子の性別別に親のPCDF濃度と子のPCDF濃度の関連を調べると、子が女性の場合、親のPCDF濃度が高いと子のPCDF濃度も高くなる傾向を認めた。さらに子に与えた栄養との関連で見ると、「母乳」の場合で、親のPCDF濃度が高いと、子のPCDF濃度も高くなる傾向を認めた。しかし、今回の調査は「母乳」を摂取した子供たちは、検査までに何年も期間が過ぎていること、今回の調査はあくまでPCDF濃度が高い検体で比較していることに留意する必要がある。残念なことに出産前の母親の血液、出産後の血液、生まれた新生児の血液データは必ずしも採られていない。そのためこの解析はあくまで傾向を見ることに重きを置いているものである。そもそも、栄養別に与えたというアンケートでも「母乳だけ」、「ミルクだけ」の回答は、ある程度信頼性があるかもしれない。しかし、「混合」の場合はどれだけ母乳を与えたか分からないでいる。そこで、次に②の解析を試みた。

## ② 子に与えた栄養別健診結果の比較

小児科検診、内科検診を受けたもので、「ミルクのみ」で育てられた子と、「母乳又は混合(以下母乳群)」で育てられた子の群にわけ、検診結果や血液中PCB、PCDF濃度に違いがあるかを検討した。

ここで、データベースからの抽出は①の解析の1年後であり、抽出にあたり、子たちが一番若いときのデータを選んでいる。また、①の調査後、一部名寄せを行っていること、小児科検診では、PCB濃度しか測っていないことにも注意が必要である。そのため、小児科群と内科検診群に分け解析した。

小児科検診群に関しては、統計的に差が認められるものは、「母親の流・早産」の項目がカイニ乗検定において、p値が0.035であり、Cramerの係数Vが0.592と有意差が認められた。また、「クレチニン」が、t検定でp値0.017、「ALT」が、p値0.0003であり差が認められたが、「PCB濃度」の差は認められなかった。

ここで、小児科検診群では、最初の検診時の年齢が「母乳」群で平均11.0歳、「ミルク」群は、12.2歳であるため与えられた栄養の違いが、その後の食生活による違いが加算され見分けがつかなくなっている可能性がある。

一方、内科検診群では、「関節痛」がカイニ乗検定で、p値0.002、Cramerの係数Vが0.563であり、「月経異常」が、p値0.031、Cramerの係数Vが0.680と差が認められた。また、「PCB濃度」は小児科検診での差が見
られなかったが、内科検診では、p値が0.070と傾向が見て取れた。しかしこの原因はよくわからなかった。さらに、小児科検診ほど明確ではないが「ALT」に関してもp値が0.062と、傾向が見て取れた。一方、ダイオキシン類の差は見られなかった。これも検診時の年齢の平均が「母乳」群で31.4歳で有り、「ミルク」群では、34.1歳と小児科検診時から年月をさらに重ねていることが原因だと考えられる。

## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

各種生体試料中の微量ダイオキシン類を高精度かつ迅速に分析できる手法を確立した。抽出工程に高速溶媒抽出法を採用し、抽出条件を最適化した。本研究で確立した方法を用いれば、安定的に高い抽出効率を得ることができ、分析精度の向上に寄与することとなる。本法を用いた場合の抽出脂肪量(含量%)は従来法とほぼ一致することを確認した。このことは本法と従来法とで得られたデータの相互比較が可能であることを意味する。

確立した試験法を用いて、母体から胎児へのダイオキシン類の移行について実態を明らかにした。各種生体試料からダイオキシン類を同定・定量した結果、ダイオキシン類濃度は過去の分析事例と比較して同等もしくは低くなる傾向が認められ、これは近年の環境汚染レベルの低下が一因と考えられる。また、母体中のダイオキシン類は胎盤部位で胎児側へ透過が抑制されること、母体から胎児への移行性には異性体間で差のあることが明らかとなった。胎盤を介したダイオキシン類の胎児への移行は一定の抑制がなされる（毒性量が軽減される）一方、過去に調査事例が無かった胎脂、胎便の分析データは、主に食事を介して母体に取り込まれたダイオキシン類が、胎児の成育環境や胎児体内に確実に到達していることを裏付けていた。

油症患者の母子間の解析では、散布図で見る限り、母子間の血中PCB濃度やPCDF濃度に関係は見られなかった。また、母親の血中PCDF濃度をランク分けし、子の性別ごとに分類すると、母のPCDF濃度が高いと、子が女性の場合はPCDF濃度が高い傾向が示唆された。

最後に、子を「母乳及び混合」群と「ミルク」群に分け、小児科検診、内科検診で差があるか調べたが、小児科検診では、2群間にPCB濃度の差が出なかった。内科検診では、2群間にPCB濃度の差がある傾向が示唆されたが、PCDF濃度に関しては差が見られなかった。

## （２）環境政策への貢献

## ＜行政が既に活用した成果＞

特に記載すべき事項はない

## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

本調査研究では、種々のヒト生体試料中のダイオキシン類分析に対応するために、分析法の構築・開発を行った。確立した分析方法は、国内外における本分野の研究進展に寄与し、環境政策に役立つ科学データの蓄積が図られることになる。また調査手順の全般(試料採取方法や試料保管方法など)で得られた知見や課題は、今後想定される大規模な調査プロジェクトにおいて、調査手法の設計・立案に役立つと考えられる
## 6 ．国際共同研究等の状況

特に記載すべき事項はない

### 7. 研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

特に記載すべき事項はない

## （2） 口頭発表（学会等）

特に記載すべき事項はない

## （3） 出願特許

特に記載すべき事項はない

## （４）「国民との科学・技術対話」の実施

特に記載すべき事項はない

## （５）マスコミ等への公表・報道等

特に記載すべき事項はない

## (6) その他

特に記載すべき事項はない

### 8 \. 引用文献

1）厚生労働科学研究費補助金食品の安心・安全確保推進研究事業「ダイオキシン類等の有害化学物質による食品汚染実態の把握に関する研究」平成20年度総括・分担報告書.

2）環境省水・大気環境局総務課ダイオキシン対策室、関係省庁共通パンフレット「ダイオキシン類2005」.

3）環境省環境保健部環境リスク評価室「日本人におけるダイオキシン類の蓄積量について一ダイオキシン類の人への蓄積量調査（2002 2007）」報告書

4）環境省「小児の環境保健に関する懇談会小児の環境保健に関する懇談会報告書」平成18年8月.

5) Tsukimori K et al., Maternal exposure to high levels of dioxins in relation to birth weight in women affected by Yusho disease, Environ Int. 38(1):79-86, 2012.
## （3） ダイオキシン類曝露による継世代健康影響の発症機序に関与するゲノム研究

国立大学法人 九州大学

環境発達医学研究センター 研究推進部門ゲノム疫学分野 和氣 徳夫・劉格

医学研究院皮膚科学分野 古江 増隆

病院油症ダイオキシン研究診療センター 内 博史

病院周産期母子医療センター 福嶋 恒太郎

医学研究院 地域医療学講座 浅野間 和夫

〈研究協力者〉京都大学医学系研究科 高尾 知佳

平成24(開始年度)～26年度累計予算額：57,847千円（うち、平成26年度予算額：18,919千円）

予算額は、間接経費を含む。

## [要旨]

AhR-130bpにはC/T SNPが存在する。T/T型ではC/C型と比較し1.75倍のプロモータ活性の亢進が認められる。AhR転写及び蛋白発現もそれぞれ1.7、2倍亢進する。T/T型ではNF1C転写抑制因子の結合サイトが消失するためである。

ダイオキシン類高濃度曝露に伴い出現する健康影響に関与するAhR下流シグナルを明らかにするためヒト絨毛間質細胞を用いTCDD存在下及び非存在下での遺伝子発現変化をC/C型、T/T型細胞別にマイクロアレイ法による解析を行った。マイクロアレイ法によりTCDD応答性発現変化を示したIL24、EDNRB、SERPINB2、FAM43A、TIPRARP及びNPTX1は様々な病態形成に関与することが知られているためReal-time RT-PCRにより発現変化の再確認を行った。

ダイオキシン類高濃度被曝例として油症患者に着目した。2011年油症患者一斉検診時に採血した32例のC/C型及び32例のT/T型油症患者についてIL24血中濃度及び各種ダイオキシン類濃度の測定を行った。遺伝子解析は九州大学倫理審査委員会の了承及び油症患者に対する説明と合意のもとに実施した。IL24血中濃度はT/T型で180.9±43.2pg/m/、C/C型で59.1±15.8pg/mとT/T型で有意に高値であることが示された。PCDD、PCB、PCDF及びTEQ濃度とIL24血中濃度には有意な正の相関は示されなかった。マイクロアレイ法の感度が低いこと及びIL1βがIL24発現調節をしていることからIL1β遺伝子発現をヒト絨毛間質細胞をTCDD処理しReal-time RT PCRにて解析した。T/T型でTCDD応答性IL1β遺伝子発現は有意に亢進していた。しかしC/C型油症患者での血中ダイオキシン類濃度はT/T型に比し高値であったためT/T型油症患者におけるIL1β血中濃度はC/C型と比較し有意な低値を認めた。以上の結果から、血中ダイオキシン類が高濃度ではないダイオキシン類曝露次世代及び次々世代に発生する健康影響はAhR-130bp C/T SNP及びAhR下流のIL1β及びIL24により発症が誘導されることが強く示唆された。

## [キーワード]

ダイオキシン類、AhR-130bp C/T SNP、NF1C、IL1β、IL24、油症
### 1. はじめに

化学物質の胎児期暴露による影響に世界的な関心が高まっている。我が国においても環境省の「子どもの健康と環境に関する全国調査：エコチル調査」が平成22年度に始動し、化学物質曝露等が子どもの健康に与える影響を明らかにする目的でコホート調査をすすめている。一方、高濃度の化学物質に曝露した群において次世代への健康影響を観察することは、化学物質曝露による次世代への健康影響を明らかにするうえで重要な基礎資料となる。

申請者らはpolychlorinated biphenyls(PCBs)およびダイオキシン類の曝露によるカネミ油症患者の治療法開発および発症機序の解明に向けた研究をすすめている（九州大学油症ダイオキシン研究センター）。胎児期に油症に曝露した例では、児の出征体重は母体血中ダイオキシン類濃度の有意に負の相関を示し、この胎児発育抑制効果は男児に特異的であることを明らかにした。また、次世代、次々世代において男児出生率が有意に低いことが分かった。一方、油症患者より出生した児の血中ダイオキシン類濃度は正常健常人と比して有意な差を認めないことから、これら次世代への健康影響の発現は、高濃度のダイオキシン類の母児間移送によるものとは異なる機序が推察される。（図3-1）

申請者たちは、AhRを介する細胞内シグナル伝達機構の個体差が健康影響の出現に関与していると考えた。このため、AhRプロモータ領域に存在するDNA多型に着目した。AhRプロモータ領域を明らかにするため、転写開始点から-237bp、-1417bp、-452bp、-122bp及び-59bpのDNA断片を作成し、ルシフェレースリポーターに組み込み、プロモータ活性を測定した。その結果、転写開始点から-452bpまでのDNA断片にはプロモータ活性が存在するが、転写開始点から-122bpのDNA断片ではその活性が消失した。その結果、AhRプロモータ領域は転写開始点から-452bpであることが判明した。この領域には図3-3に示す様々なDNA多型が存在するが、出現頻度の高い遺伝子型は-59bp領域の1×ggggc、2×ggggc、3×ggggc、4×ggggc、5×ggggc DNA多型及び-130bp領域のC/T SNPであった。このため、-59bp領域の異なるリピート数のDNA多型と-130 C/T SNPを有するDNA断片を作成し、ルシフェレースリポーターに組み込み、プロモータ活性の変化を解析した。その結果、リピート数の変化はプロモータ活性に全く変化を与えず、-130bp C/T SNPがプロモータ活性に大きく影響を与えることが判明した。-130bp T/TはC/C及びC/Tに比較し約1.75倍の活性亢進が観察された。一方、ラットを用いた実験では、PCBなどの化学物質曝露により次世代、次々世代の雄雌出生率の減少をきたし、この機序にはエピジェネティクス変化が関与することが報告されている。これらの成績から、ダイオキシン類曝露による次世代への健康影響の発現機序には、AhRを介する細胞内シグナル伝達機構の個体差(遺伝子多型)やエピジェネティクス変化による遺伝的感受性が関わっていることが推察される。

そこで、本研究では、油症患者を対象としてダイオキシン類曝露における次世代、次々世代の健康影響と遺伝的感受性要因との関連について明らかにすることを目的とする。
## ダイオキシン受容体(Arylhydrocarbon receptor, AHR)を介する細胞内毒性シグナル伝達機構の個体差(遺伝子多型)の破綻の観点から明らかにする必要性。

図 (3)-1

● 血中ダイオキシン類濃度は、児が母親に比べて有意に低く、正常健常人と比して有意な差を認めない。

▶継世代影響の発現は、ダイオキシン類の母児間移送によるものとは異なる機序が推察される。
## 2 ．研究開発目的

本研究では、ダイオキシン類曝露が次世代の健康にどのような影響をいかに及ぼすのかという継世代的な健康影響とその機序を明らかにすることを目的とする。この主旨に沿って、ヒトがダイオキシン類に曝露した事例である油症患者を対象として、油症曝露世代、次世代、次々世代の3世代にわたる健康影響を明らかにする。ついで、これら実態調査により明らかとなった継世代的な健康影響の機序について、血中ダイオキシン類濃度、ダイオキシン受容体(Arylhydrocarbon receptor, AhR)を介する細胞内毒性シグナル伝達機構の個体差をゲノム多様性及びエピジェネティックな遺伝子発現制御の破綻の観点から明らかにする。

## 3 ．研究開発方法

ダイオキシン類はAhRに結合し、ARNTとヘテロダイマーを形成することにより細胞内ヘシグナルを伝達する。これにより下流のCYP1A1などの遺伝子発現を制御する。本研究ではヒトAhRプロモータ領域の一塩基多型(SNP：Single Nucleotide Polymorphism)および転写因子結合サイトの検索を行い、AhRプロモータ領域のSP1及びNF1転写因子の結合解析を行う。次に既存の細胞株を使いダイオキシン存在下、非存在下におけるAhR下流シグナル（CYP1A1など）伝達の活性化解析を行い、ダイオキシン類の細胞シグナル伝達におけるゲノム多様性の関与を証明する。

油症患者血液よりリンパ球を分離しDNAを抽出する。PCRにより標的領域の遺伝子増幅を行う。さらに増幅領域の直接塩基配列の決定及び制限酵素切断多型を用いて、AhRプロモータ領域のSNP遺伝子型決定を行う。健康影響、ダイオキシン類の血中濃度およびAhR遺伝子多型間の比較分析を行いダイオキシン類の細胞内毒性シグナルのゲノム多様性が油症の健康被害に与える影響を明らかにする。

## 4 ．結果及び考察

化学物質の胎児期暴露による影響に世界的な関心が高まっている。我が国においても環境省の「子どもの健康と環境に関する全国調査：エコチル調査」が平成22年度に始動し、化学物質曝露等が子どもの健康に与える影響を明らかにする目的でコホート調査をすすめている。一方、高濃度の化学物質に曝露した群において次世代への健康影響を観察することは、化学物質曝露による次世代への健康影響を明らかにするうえで重要な基礎資料となる。

申請者らはpolychlorinated biphenyls(PCBs)およびダイオキシン類の曝露によるカネミ油症患者の治療法開発および発症機序の解明に向けた研究をすすめている（九州大学油症ダイオキシン研究センター）。胎児期にダイオキシン類に曝露した例では、児の出征体重は母体血中ダイオキシン類濃度の有意に負の相関を示し、この胎児発育抑制効果は男児に特異的であることを明らかにした。また、次世代、次々世代において男児出生率が有意に低いことが分かった。一方、油症患者より出生した児の血中ダイオキシン類濃度は正常健常人と比して有意な差を認めないことから、これら次世代への健康影響の発現は、高濃度のダイオキシン類の母児間移送によるものとは異なる機序が推察される。

ダイオキシン類はAhRを介して様々な機能を示すことが知られている。申請者らはAhR遺伝子内DNA多型がAhR機能に影響を及ぼし継世代的健康影響に関与するのではないかと考えた。
## ① AhR-130bp C/T SNPがプロモータ活性に及ぼす影響について

まずAhRプロモータ領域を決定するため、1精子受精・雄核発生全奇胎DNAを用い、様々なAhRプロモータ欠失変異体を作成し、リシフェラーゼリポータに組み込んだ。1精子受精・雄核発生全奇胎は全ての対立遺伝子間でホモ接合を形成しているためSNP解析に有用である。ルシフェラーゼアツセイの結果、AhRプロモータは転写開始点から-452hpの領域に存在することが判明した。(図3-2)本領域内にはマイナーアリルの頻度が高い2種類のDNA多型が存在した（-59bpのGGGGCリピート数変化、-130bp C/T多型）。全奇胎DNAを用い予想される9種類のハプロタイプの頻度を調べた結果、-130bp C リピート数2（18.0%）、-130bp T リピート数2（24.0%）、-130bp C リピート数3（52.0%）のハプロタイプが日本人には高頻度に出現することが判明した。それぞれのハプロタイプを有するAhRプロモータをルシフェラーゼリポータに組み込み、AhRプロモータ活性を解析した。その結果、-59bp DNA多型に関係なく-130bp C/T SNPのみがプロモータ活性の変化に関与していた。C/C よりT/Tで転写活性が1.75倍亢進していた。（図3-3）
図 (3)-2
全胞状奇胎を用いて…
Table 1. SNP genotype of the AHR upstream region in CHM
Location	SNP	Genotype	n	ratio (%)
-59	rs71010234	1×ggggc	1	2.0
2×ggggc	21	42.0
3×ggggc	26	52.0
4×ggggc	1	2.0
5×ggggc	1	2.0
-67	rs72152648	ggcgggggcg	0	0
-	50	100
-72	rs72286154	gggcgggggcggggcg	0	0
-130	rs10249788	C	50	100
T	38	76.0
-188	rs71010233	G	0	0
-	50	100
-195	rs41446044	G	50	100
C	0	0
-196	rs11330131	G	0	0
-	50	100
-222	rs41351350	G	50	100
A	0	0
-268	rs74739585	T	48	96.0
C	2	4.0

図 (3)-3
5'-ACGGANNNNNTCCAG-3'

AhR遺伝多型によるプロモータ活性の変化

図 (3)-4
AhRプロモータ領域-59bp領域には転写因子SP1が結合する領域が存在し、SP1によりAhR転写が制御されている。一方、-130bp近傍にはNF1転写因子結合サイトが存在する。NF1にはNF1A、NF1B、NF1C及びNF1Xのサブタイプが存在する。NF1C及びNF1Xは転写抑制因子として機能する。AhR-130bp C/Cプロモータでは転写が抑制されることから申請者らはNF1Cに着目し、-130bp C/T SNPによるAhRプロモータ活性の制御機構について解析を進めた。

NF1CによるAhR-130bp C/T領域への特異的結合を証明するため、HeLa細胞(C/C)、TK-nu細胞(T/T)及びHec116細胞(C/T)を用い、NF1C抗体によるクロマチン免疫沈降を行った。図3-5に示す如く、NF1CはHeLa細胞DNAと強く結合し、TYK-nu細胞DNAとの結合は顕著に抑制されていた。Hec-116細胞DNAと結合はHeLa細胞と比較すると減弱していた。この結果、NF1CはAhRプロモーター-130bp Cアリルと効率よく結合することが判明した。さらに図3-5-Cに示す如くNF1CはAhRプロモーター-130bp領域（NF1C結合サイト）中のCアリルに特異的に結合することがクロマチン免疫沈降により確認された。T/T型のTyR-nu細胞と比較しC/C型のHeLa細胞では、NF1Cの結合サイトへの結合が有意に亢進していた。さらに、FlagをタッグしたNF1CをHec116細胞に強制発現し、AhR-130bp C/Tアリルへの結合を解析するとCアリルとの結合がTアリルと比較し、有意に亢進していた。以上から、NF1Cと-130bp領域（NF1C結合サイト）との結合は特異性が存在し、TアリルよりCアリルの方が結合親和性が有意に亢進していることが判明した。
a

Cell lines	rs10249788
HeLa	C/C
TYK-nu	T/T
Hec116	C/T

b

C

d

e

f

図 (3) -5

さらにElectrophoretic mobility shift assayを行った。-130bpCプローブはTプローブに比し複合体形成能が高く、さらにNF1C抗体によりスーパーシフトすることからNF1Cと-130bp領域との特異的結合が証明された。3倍量のcompetitor存在下において、NF1CはTプローブに比し、Cプローブで結合能が亢進していた。さらにHec116細胞（SNP-130bp C/T）を用いてFlag-NF1Cを遺伝子導入した。PCR産物をサブクローニングし、塩基配列を決定した。その結果、複合体に含まれる-130bpDNA領域はTアルよりもCアルの方が有意に高率であった。これらの結果から、-130bpC/C
はT/Tと比較し高率にNF1Cと結合しAhRプロモータ活性が抑制されるが、T/TはNF1C結合親和性が低く、AhRプロモータ活性が有意に抑制されないことが判明した。（図3-6）

Clone number

AHR-130bp NF1C (nuclear factor 1 C) 結合サイト

図 (3)-6
## ② NF1C による AhR 発現抑制の分子機構

NF1Cを強制発現させるためflagをタグした安定型NF1CcDNA変異体をアデノウィルスベクターに組み込み、HEC293細胞に遺伝子導入した。さらにNF1Cノックダウンの為SiRNAを用いた。AhR mRNA及び蛋白発現変化をreal time PCR及びウェスタンブロッド法で解析した。

NF1Cの過剰発現によりAhRプロモータ活性がいかに変化するかを解析する為、-130bpC/C及びT/T遺伝子多型を有するAhRプロモータをルシフェラーゼ・リポータベクターに組み込み、ルシフェラーゼ活性を解析した。NF1Cを過剰発現すると-130bpC/C遺伝子型ではAhRプロモータ活性が有意に抑制されたが、T/T遺伝子型では抑制を認めなかった。同様にNF1CをノックダウンしAhRプロモータ活性の変化を解析した。-130bpC/C遺伝子型ではAhRプロモータ活性の有意な亢進が示され、-130bpT/T遺伝子型では有意な変化は観察されなかった。以上より、SNP-130bpがCアリルの場合、Tアリルの場合より強くNF1Cと結合し、AhR転写活性を負に制御すること、及びSNP-130bpがCアリルの場合、NF1Cの強制発現はAhRプロモータ活性を抑制し、NF1Cの発現抑制はAhRプロモータ活性を有意に上昇させることが判明した。（図3-7）さらに、Flag NF1Cを強制発現したHEK293細胞を用い、NF1C強制発現に伴うAhR発現レベルの変化を解析した。NF1C強制発現によりAhR発現は有意に抑制された。Si RNAを用い、Hec293細胞でのNF1C発現を抑制すると、AhR発現レベルは有意に亢進した。（図3-8）以上からNF1Cは、NF1C結合サイトに特異的に結合し、AhR-130bp Cアリルを特異的にAhR発現を抑制することが明らかになった。
図 (3)−7
図 (3)-8
## ③ -130bp C/T SNPの子宮内膜癌進展への関与

-130bpC/T SNPが子宫内膜癌進展にいかに関与するかを明らかにするため、正常健常人130例及び内膜癌患者121例から血液を採取し、DNAを抽出した。ケース及びコントロール間で-130bp C/T SNPの遺伝子型頻度に有意差は無かった。しかしT/T遺伝子型はC/C及びC/Tに比し、進行癌患者において有意に高頻度に出現した。さらに正常子宫内膜組織と子宮体癌組織での発現を解析すると、子宮体癌組織では、正常子宫内膜に比しAhR発現量が有意に高く、NF1C発現は有意に抑制されていた。（図3-8）AhR高発現、NF1C低発現は未分化子宫内膜癌において顕著であった。（図3-10）

AhR高発現、NF1C低発現が子宮内膜癌の進展にいかに関与するかを解析するためHHUA、HEC6子宮内膜癌細胞及び、ヒト子宮内膜不死化細胞hEMに野生型NF1C及び活性型NF1C(NF1CS)を強制発現した。HHU及びHEC6子宮内膜細胞では、顕著な細胞増殖の抑制が観察されたが、ヒト子宮内膜不死化細胞hEMでは、細胞増殖の抑制を認めなかった。（図3-10,b）次に、浸潤能及び運動能の解析をBoydenchamberを用いて行った。NF1Cを強制発現すると、HHUA、HEC6子宮内膜癌細胞能の浸潤は有意に抑制され、ヒト子宫内膜不死化細胞hEMの浸潤能は抑制されなかった。（図3-10,c）同様にNF1C強制発現によりHHUA及びHEC6子宮内膜癌細胞の運動能は顕著に抑制されるが、ヒト子宫内膜不死化細胞の運動能は抑制をうけなかった。これらのことから、NF1Cは子宫内膜癌細胞特異的に、その増殖、浸潤、運動能を抑制することが明らかとなった。いかなるメカニズムにより、NF1Cによる癌細胞特異的な増殖、浸潤、運動能を抑制するのかを解析した。この目的のため、HHUA及びHEC6子宫内膜癌細胞にNF1Cを強制発現した。NF1C強制発現により、AhR発現は有意に低下し、ビメンチン、SNAIL1などの間葉系マーカーの発現抑制さらにはEカドヘリンなどの上皮系マーカーの高発現が観察された。（図3-10）さらに、SiRNAによりNF1Cノックダウンを行った。NF1Cノックダウンにより、HHUA、HEC6及びhEM細胞でのAhR発現レベルは亢進した。AhR高発現は、AhR SiRNAにより消失した。HHUA、HEC6及びhEM細胞の増殖は、NF1C SiRNAにより亢進し、NF1C SiRNA+、AhR SiRNAにより抑制された。NF1C SiRNAはコントロールSictnと比較し、これらの細胞増殖を亢進した。（図3-11b）NF1C SiRNAは、HHUA、HEC6及びhEM細胞の浸潤能を亢進させ、NF1C SiRNA+、AhR SiRNAは浸潤能の亢進を消去した。同様にHHUA、HEC6及びhEM細胞の運動能についても、NF1C SiRNAは亢進を誘導し、NF1C SiRNA+、AhR SiRNAはその亢進を消去した。（図3-11c-d）さらに、NF1C SiRNAはビメンチン及びSNAIL1などの間葉系マーカーの発現を導き、Eカドヘリンなどの上皮系マーカーの発現を抑制した。NF1C SiRNA+、AhR SiRNAはNF1C SiRNAによるこれらの効果を完全に消去した。（図3-11a）以上の結果から、子宮内膜癌でのAhR高発現、NF1C低発現は癌細胞に上皮一間葉系以降（Epithelial Mesenchymal Transition EMT）を導き、進行癌や、未分化癌への進展に関与すると示唆された。
Table 3. 血液サンプルを用いたAhR-130bpC/TSNP遺伝子頻度
Sample group (n)	T/T	non-T/T	P
Healthy women (130)	12 (9.2 %)	118 (90.8 %)	0.419	0.724
HEC (121)	15 (12.4 %)	106 (87.6 %)
Early stages (89)	7 (7.9 %)	82 (92.1 %)
Advanced stages (32)	8 (25.0 %)	24 (75.0 %)
HEC, human uterine endometrial cancer.
Normal endometrium	HEC	Advanced stage HEC with Talleles

AHRの発現量: 少	中	多
図 (3)-10
a

b

d

図 (3)−11
④ ダイオキシン類高濃度曝露により出現する病態に関与するAhR下流シグナルの解析

下流シグナルの同定に関与する遺伝子群を同定するため、至適TCDD濃度の決定を行った。CYP1A1発現レベルの変化を指標とした。その結果、TCDD10nMでCYP1A1発現の4亢進が観察されたため、以降の解析にはTCDD10nMを用いた（図3-12）

ヒト絨毛間質細胞の培養系を用い、TCDD非存在下におけるSNP-130 C/C及びT/T型におけるAhR mRNA及び蛋白発現レベルを解析した。T/T型ではC/C型と比較し、mRNA発現量が1.7倍、蛋白発現量が2倍高値であった。ARNT発現量は両遺伝子間で変化を認めなかったが、AhR下流に存在し解毒に関与するCYP1A1発現はC/C型に比しT/T型で有意に高値が示された。

ダイオキシン類曝露を原因とする病態形成に関与するAhR下流シグナルを同定するため、マイクロアレイ法による大容量遺伝子発現変化解析を行った。3個体のC/C型純毛間質細胞及び3個体のT/T型細胞を混合し0.1%(V/V) DMSO処理及び10nM TCDD処理を行った。TCDD処理に伴い発現上昇した遺伝子群はC/C型で221個、T/T型で211個存在した。一方、81遺伝子(C/C型)及び233遺伝子(T/T型)は有意に発現抑制した。（図3-13）1.5倍を有意な発現変化の指標とした。TCDD存在下、C/C型及びT/T型の両方で共通に、発現変化した24遺伝子に注目した。そのうち14遺伝子発現はT/T型で、9遺伝子発現はC/C型で亢進していた。（図3-14）マイクロアレイ法よりTCDD応答性発現変化が示された遺伝子群のうち様々な病態形成に関与することが知られているIL24、EDNRB、SERPINB2、FAM43A、TIPRARP、及びNPTX1についてはReal-time RT-PCRによりマイクロアレイ法で示された発現変化の再確認を行った。TCDD処理により、これら6種類の遺伝子mRNAレベルは有意に亢進していることが示された。さらにSERPINB2はT/T型でC/C型と比較し有意に発現の低値を示したが残り5種類の遺伝子mRNAレベルはいずれもT/T型で有意に高値が示された。（図3-15）

TCDDにより、AhR依存性発現亢進、及びC/C型に比較し、T/T型で有意な発現亢進を示すIL24及びIL1βに着目した。IL24及びIL1βは様々な疾患の発症に関与する。このため、ダイオキシン類高濃度被曝例として油症患者に着目した。2011年油症患者一斉検診時に採血し32例のC/C型及び32例のT/T型についてIL24血中濃度及び各種ダイオキシン類濃度の測定を行った。遺伝子解析は九州大学倫理審査委員会の了承及び油症患者に対する説明と合意のもとに実施した。

T/T型32名及びC/C型32名の油症患者背景を表11に示す。油症患者の性差、ダイオキシン類曝露時の年齢、曝露から採血時までのインターバル、曝露からサイトカイン測定までのインターバル、喫煙、魚介類摂取量などについて、C/C型及びT/T型の間で統計学的有意差を認めなかった。

IL24血中濃度はT/T型で180.9±43.2pg/m、C/C型59.1±15.8pg/mとTT型で有意に高値であることが示された。しかしPCDD、PCB、PCDF及びTEQ濃度とIL24血中濃度の間には有意な正の相関は示されなかった。（図3-19）一方、IL1β血中濃度はT/T型で61.5±68.0pg/m、C/C型で171.5±188.9pg/mとC/C型で有意な高値が示された。（図3-17）

マイクロアレイ法の感度が低いこと及びIL1βがIL24発現調節をしていることから、IL1β遺伝子発現とヒト紬毛間質細胞をTCDD処理し、Real-time PCR法にて解析した。TCDD非存在下のIL1β発現はC/C型に比しT/T型で有意に高値であった。さらにT/T型におけるTCDD応答性IL1β遺伝子発現も有意に亢進し、発現増大はT/T型とC/C型の間で有意差を認めなかった。IL1β遺伝子発現がC/C型で有意に高値である原因を明らかにするため、C/C型32例及びT/T型32例の油症患者血中ダイオキシン類濃度を測定した。その結果、Total PCDD濃度はC/C型とT/T型の間で有意差はなく、total PCDF及びtotal TEQはT/T型に比し、C/C型で高値であることが示された。加えて、total coplanar
PCB濃度はT/T型に比しC/C型で有意に高値であった。（図3-18）

以上の結果から、C/C型におけるIL1β血中濃度は、血中ダイオキシン類濃度高値を原因としていると示唆された。T/T型油症患者におけるIL24血中濃度が有意に高値であることから、血中ダイオキシン類が高濃度ではないダイオキシン類曝露次世代及び次々世代に発症する健康影響は、AhR-130bp C/T SNP及びAhR下流のIL24シグナルが発症に関与すると強く示唆された。

IL24には抗腫瘍効果があり、悪性腫瘍の治療への応用が試みられている。このため油症患者218名のAhR遺伝子型を決定した結果、C/C型、C/T型188名、T/T型30名であった。既往歴から悪性腫瘍発症の有無を調べた結果、12/188(C/C型及びC/T型)、0/30(T/T型)であった。統計学的有意差はないが、T/T型に悪性腫瘍の発生が低率である傾向が示された。一方、C/C型32名、T/T型32名の油症患者における炎症性疾患罹患の既往を調査した。症例数が少なく、統計学的有意差を得ることは出来なかったが、花粉症C/C型7/32例（21.9%）、T/T型13/32例（40.6%）、喘息C/C型3/32例（9.4%）T/T型5/32例（15.6%）とT/T型に多発する傾向が認められた。（図3-21）
表(3)-1. 油症患者背景

患者特性	Number(%)	p value $ ^{d} $
CC型	TT型
患者	32	32
性别	0.217
男性	14 (43.8%)	19 (59.4%)
女性	18 (56.4%)	13 (40.6%)
采血时年龄(年)	0.672
40-50	3 (9.4%)	1 (3.1%)
50-60	2 (6.3%)	9 (28.1%)
60-70	9 (28.1%)	4 (12.5%)
70-80	9 (28.1%)	8 (25%)
80-90	9 (28.1%)	10 (31.3%)
曝露からの年数(年)	0.656
0-10	5 (15.6%)	8 (25%)
10-20	5 (15.6%)	3 (9.4%)
20-30	10 (31.3%)	9 (28.1%)
30-45	12 (37.5%)	12 (37.5%)
曝露から採血までの年数(年)	42.3 ± 0.9 $ ^{a} $	42.2 ± 1.3 $ ^{a} $	0.826
曝露からサイトカイ測定までの年数(年)	1.0 ± 0.7 $ ^{a} $	1.3 ± 1.0 $ ^{a} $	0.087
喫煙状況	0.172
喫煙	2 (6.3%)	6 (18.8%)
喫煙なし	23 (71.9%)	21 (65.6%)
その他 $ ^{b} $	7 (21.9%)	5 (15.6%)
魚介類の摂収	0.596
毎日	2 (6.3%)	8 (25%)
3-4回/週	15 (46.9%)	9 (28.1%)
1-2回/週	11 (34.4%)	10 (31.3%)
その他 $ ^{c} $	4 (12.5%)	5 (15.6%)

a 平均值 ± 標準偏差

b 喫煙を止めた患者

c 月に1回又は2回で魚介類を摂収する患者

d スチューデントのt検定
10nM以上のTCDD処理24時間後、細胞内CYP1A1 mRNA発現量が有意に上昇した。

適正なTCDD濃度の確認

細胞内AhRの標的遺伝子であるCYP1A1 mRNA発現量解析(Real-time RT-PCR)

図 (3)-12
# TCDD存在下遺伝子発現解析(発現変動解析)

図 (3)−13
# CC及びTT両遺伝子型でともに発現変化する 遺伝子群(TCDD存在下)の同定

14遺伝子発現はTT型で、9遺伝子発現はCC型で弐進していた。

CC

図 (3)−14
着目する遺伝子発現変動の確認(mRNAレベル)

図 (3)-15

DMSO処理後のIL-24 basal mRNAルベルはCC遺伝子型に比し、TT遺伝子型で有意に高値であった。TCDD処理により、遺伝子IL-24, TIPAPR, FAM43A, SERPINB2, NPTX1, EDNRB, CYP1A1, IL-1βのmRNA発現量が有意に上昇した。NPTX1はTT型で有意に発現低下していた。IL-24, TIPAPR, FAM43A, EDNRB, CYP1A1, IL-1β遺伝子はTT型で有意に発現亢進を認めた。
着目する遺伝子発現変動の確認(タンパク質レベル)

## AhR /IL-24シグナルに着目

TCDD 処理により、IL-24, SERPINB2, CYP1A1の蛋白発現量が有意に上昇した。SERPINB2はT型で有意に発現低下した。IL-24, CYP1A1はT型で有意に発現亢進を認めた。

図 (3)-16
油症患者血清中 IL-24 and IL-1β レベル (ELISA)

図 (3)−17
図 (3)-18
図 (3)−19
悪性腫瘍

なし	あり	計
女	C/C	42	1	43
C/T	39	6	45
no template	1	0	1
T/T	13	0	13
男	C/C	50	4	54
C/T	45	1	46
no template	1	0	1
T/T	17	0	17
総計	208	12	220

図 (3)-20
油症患者皮膚疾患、アレルギー疾患及び炎症の有症率

疾患	CC(n=32)	TT(n=32)	Total(n=64)
患者数	有症率	患者数	有症率	患者数	有症率
皮膚の疾患	皮膚の掻痒	17	53.1%	20	62.5%	37	57.8%
痤疮	9	28.1%	10	31.3%	19	29.7%
湿疹	17	53.1%	17	53.1%	34	53.1%
色素沈着	11	34.4%	11	34.4%	22	34.4%
アルルギー疾患	花粉症	7	21.9%	13	40.6%	20	31.3%
喘息	3	9.4%	5	15.6%	8	12.5%
荨麻疹	14	43.8%	13	40.6%	27	42.2%
炎 症	肺炎	3	9.4%	4	12.5%	7	10.9%
鼻炎	10	31.3%	14	43.8%	24	37.5%
慢性気管支炎	5	15.6%	6	18.8%	11	17.2%
中耳炎	6	18.8%	5	15.6%	11	17.2%