Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
蒸煮・爆砕法を検討した。さらに、蒸煮条件と繊維成分を構成しているセルロースやヘミセルロース、リグニン等の定量を行い、反劭家畜の飼料としての利用性およびサイレージ法を検討した。（3）これまでに知られているブタノール生産微生物は、すべて嫌気性、芽胞形成性のClostridium属に分類される細菌であり、C. acetobutylicum以外では、C. aurantibutylicum、C. beijerinckii、C. tetanomorphumがある $ ^{5-7} $ 。本研究では、スイートソルガム搾汁液中で生育してブタノールを生産する細菌を土壌から分離し、ブタノール馴化培養によるブタノール高生産株の選抜と生産条件の最適化を検討した。

### 3. 研究開発方法

## (1) エタノール生産技術の開発

## 1 ）スイートソルガムと酵母

エタノール発酵にはスイートソルガムの3品種、FS902、FS501、およびKCS105の搾汁液を使用した。前記3品種は茨城大学農学部附属フィールドサイエンス教育研究センターで2009年6月に播種し、2009年12月に収穫し、速やかに搾汁した。搾汁液は使用するまで-20℃で保管し、融解後、遠心（10,000xg）で沈殿物を取り除き、その上清をエタノール発酵に使用した。酵母は、独立行政法人製品評価技術基盤機構から購入したSaccharomyces cerevisiae NBRC 0216および茨城県工業技術センターから分与されたHitachi株の2株を使用した。酵母はYM培地（0.5％ぺトン[Difco]、0.3％酵母エキス[Difco]、1％グルコース[和光純薬工業]、pH7.0）で、30℃、2日間、静置培養し、滅菌した50％グリセロール溶液と等量混合後、使用するまで-80℃で保存した。

## 2 ）酵母によるエタノール発酵

-80℃に保存したS. cerevisiae溶液10μlは1mLのYM培地に植菌し、30℃で2日間、静置培養した。この培養液はFS902、FS501、およびKCS105の搾汁液に植菌し、30℃で静置培養した。培養中、エタノール生成、糖消費、pH変化、および酵母の生育をモニターした。各試験は3連で行った。酵母の生育はA660nmの濁度によって測定した。エタノール生成と糖の消費は以下の条件でHPLCによって分析した：カラム、Shodex Sugar SH1011（8.0x300mm）；溶離液、5mM H₂SO₄；流速、0.6mL/min；カラム温度、25℃；検出、示差屈折計（RI）。HPLCの試料は、培養液を3,600 rpmで4℃、5分間遠心し、得られた上清を5mM H₂SO₄で10倍希釈した後、0.45μmのフィルターで濾過し、調製した。

## 3 ）エタノール収率および糖消費率

エタノール収率（%）は、酵母によるスイートソルガムからのエタノール生産量（% [v/v]）を理論的エタノール生産量（% [v/v]）で除して100を乗算することによって算出した。酵母によるスイートソルガムからのエタノール生産量（% [v/v]）はHPLC分析で得られた数値（% [v/v]）に分析時の希釈倍率を掛け、また理論的エタノール生産量（% [v/v]）は次式から計算した。

理論的エタノール生産量（% $$ v/v $$ ）= $ \left\{\left[スクロース含量\left(\%\left[w/v\right]\right)x360/342\right]+\left[グルコース含量\left(\%\right)\right]+\left[フルクトース含量\left(\%\right)\right]\right\}x\left[92/180\right]x\left[1/0.789\right] $

また、糖消費率は、以下の式で計算した。

糖消費率（%）= $ \left\{\text{発酵後の[スクロース含量(%[w/v])]}+\left[\text{グルコース含量(%]}\right]+\left[\text{フルクトース含量(%)}\right]\right\}/\left\{\text{発酵前の[スクロース含量(%)]}+\left[\text{グルコース含量(%)}\right]+\left[\text{フルクトース含量(%)}\right]\right\} $ x100
## （２）スイートソルガム搾りかすの有効利用に関する検討

## 1 ）スイートソルガム搾りかすの調製方法

スイートソルガム搾りかすは、平成21年11月6日に収穫したスイートソルガム（品種、KCS05）を材料とし、これを刈取り後、穂と葉部を取り除いて茎部だけをロールプレス搾汁機で処理した残渣を用いた。なお、サイレージの調製時には、取り除いた穂および葉を再び加えたものを使用した。サイレージ用添加剤に用いた乳酸菌は、雪印種苗(栄製の乳酸菌（Lactobacillus rhamnosus）パウダーである。また、セルラーゼには、雪印種苗(栄製のセルラーゼ（Acremonium cellulolyticusおよびTrichoderma viride由来）のパウダーを使用した。

## 2 ）スイートソルガム搾りかすの処理方法

蒸煮・爆砕処理は、バッチ式蒸気爆砕装置（日東高压(株)、茨城県つくば市）を用いて、スイートソルガム搾りかすを爆砕した。搾りかすを15mm程度に切断し、そのうち300gを水2Lとともに蒸煮器内に入れ、220℃まで加熱した。所定の温度と時間に達した後、すぐにバルブを開放し、爆砕した。爆砕後の搾りかすを回収し、オーブンで乾燥処理した。サイレージ処理は、市販のポリエチレン製の袋（0.1mm厚さ、30×46cm）を2枚重ねにし、実験用簡易小型プラスチック製バックサイロとして用いた。処理前および処理後の搾りかすは十分に乾燥器(105℃)で乾燥させた後、一般分析を行った。すなわち、水分量は、恒量が得られたアルミ秤量皿に試料を入れ、105℃で2時間処理する加熱減量法で求めた。粗タンパク質はケルダール法により求めた。粗脂肪量は、ジェチルエーテルを用いで連続蒸留させるソクスレー抽出法で求めた。粗繊維は、試料を破砕後、酸およびアルカリによる煮沸・洗浄を行い、水洗い、エタノールおよびジェチルエーテル洗浄した後の風乾物を定量する濾過法で求めた。灰分は、爆砕処理した搾りかすを恒量用るつぼに入れた後、電熱器上で灰化し、600℃のマッフル炉で灰化させる直接灰化法で実施した。可溶性無窒素物（糖質）は、100%から上記の測定項目（%）の和を差し引いた値で求めた。サイレージ抽出液の調製は、細切(5～10mm)試料を適量（乾燥重量として15g）量り取り、これを家庭用電動ミキサー（ファイバーミキサーMX-X58、パナソニック(株）のボトル部に移し、水280mlを加えて破砕し、破砕物をNo.5Aの濾紙（ADVANTEC）で濾過して抽出液を得た。サイレージのpHは、得られた抽出液をpHメーター（HM-5ES、東亜電波工業(株）で測定した。サイロ開封後のサイレージ製品について、pH一官能法 $ ^{8)} $ によってその品質評価を行った。さらに繊維成分を詳細に調べるため、酸性デタージェント繊維(ADF)および中性デタージェント繊維(NDF)をデタージェント法で求め、セルロースおよびヘミセルロース含量を求めた。

## （３）ブタノール生産法の開発

## 1 ）ブタノール生産菌株の分離

分離源は、スイートソルガム栽培畑地土壌とし、採取土壌の7.5g（生重）を少量の滅菌水とともに121ml容バイアル瓶に入れ、80℃、15分間の加熱処理で土壌中の細菌栄養細胞を死滅させた。次に75mlのスイートソルガム搾汁液をバイアル瓶に加えてブチルゴム栓で封じた後、気相を酸素除去した窒素ガスで置換して35℃で培養した（1次培養）。増殖確認後、10倍希釈5連のスイートソルガム搾汁液を含む試験管に接種して嫌気培養し、高次希釈液接種で増殖した培養を選抜した（2次培養）。2次培養から200μlの培養液を採取し、ペプトン-酵母エキス-グルコース平板培地に塗浜接種して35℃で嫌気培養した（BBL社のガスパック法）。生じたコロニーから細菌を分離後、
スイートソルガム搾汁液で嫌気培養して、ブタノール生産性を確認して分離株とした。

## 2 ）分離株の同定とブタノール生産性の分析

分離株の培養液を採取してグラム染色を行って細胞形態を光学顕微鏡で観察した。さらに、標準的なプロトコール $ ^{9)} $ によって16SリボソームRNA遺伝子を解析して系統学的位置を調べた。スイートソルガム搾汁液で培養した際の発酵産物の分析は、スイートソルガム(FS902)搾汁液を蒸留水で1/2、1/3、1/5、1/6、1/10に希釈し、各希釈培養での糖消費量とブタノール生産量をHPLC法で測定した。HPLC法で行った。

## 3 ）ブタノール高生産菌株の選抜方法と生産条件

選抜方法は、種々濃度のブタノールを加えたペプトン-酵母エキス-グルコース(PYG)平板培地に、菌株を塗沫接種して35℃で嫌気培養した（BBL社のガスパック法）。培地に生じたコロニーを懸濁して、さらに高段階濃度（0.2%ステップの濃度上昇）のブタノールを含むPYG寒天培地に接種・培養しコロニーを選別する操作を繰り返した。

### 4. 結果・考察

## （１）エタノール生産技術の開発

## 1 ）スイートソルガム3品種の糖組成および含量

今回使用したスイートソルガム3品種の糖組成および含量を測定し（図(2)-1）、結果を表(2)-1に示した。

(A)

(B)

(C)

図(2)-1. FS901（A）、FS501（B）、およびKCS105（C）の糖組成および含量.

スイートソルガムの糖組成および含量はHPLCを用いて以下の条件で測定された：カラム、Shodex SUGAR SH1011（8.0x300mm）；溶離液、5mM H₂SO₄；流速、0.6ml/min；カラム温度、25℃；検出、示差屈折計（RI）。Ⅰ、sucrose；Ⅱ、glucose；Ⅲ、fructose.

表(2)-1 スイートソルガムFS902、FS501、およびKCS105の糖含量

Sweet sorghums	pH	Sucrose	Glucose	Fructose	Total sugar	Theoretical ethanol yield
%a	%a	%a	%a	%b
FS902	5.47	4.94	2.55	2.61	10.1	6.71
FS501	5.86	4.79	2.10	2.05	8.94	5.95
KCS105	5.59	5.94	1.64	1.79	9.37	6.27

$ ^{a} $ ，% $ (w/v) $ . $ ^{b} $ ，% $ (v/v) $ .
## 2 ）スイートソルガム搾汁液での酵母の生育およびエタノール生成

表(2)-1のように、スイートソルガムの搾汁液中にはスクロース、グルコース、およびフルクトースの3種の糖が含まれている。3品種とも主たる構成成分はスクロースで全糖の約50%を占め、残りをグルコースとフルクトースが半分ずつ分け合っている。全糖としては、FS902が10.1%（w/v）、FS501が8.94%、およびKCS105が9.37%であり、これらがすべてエタノール変換されると理論的にそれぞれ6.71%（v/v）、5.95%、および6.27%が生成される。そこで、まず酵母はこれら3品種の搾汁液で生育可能か、そして搾汁液中の糖は酵母によって効率良くエタノールに変換されるかを試験した。

S. cerevisiae NBRC0216およびHitachi株の前培養液を10mlのスイートソルガムFS902、FS501、およびKCS105の搾汁液に0.1%-植菌（10μl-前培養液）し、30℃で静置培養した。5日後、培養液中の残糖、エタノール生成、酵母の生育、およびpHを解析した結果を表(2)-2に示す。

表(2)-2 スイートソルガム搾汁液での酵母生育およびエタノール生成

Sweet sorghums	Residual sugar content:	Sugar consumption	Ethanol yield	Ethanol yield	Growth	pH
Sucrose	Glucose	Fructose	Total
%a	%a	%a	%a	%	%b	%	A660
FS902	4.94	2.55	2.61	10.1	-	-	-	-	5.47
NBRC0216	NDc	NDc	0.23±0.05	0.23±0.05	97.7±0.5	5.70±0.14	85.0±2.0	3.64±0.58	4.95±0.07
Hitachi	NDc	NDc	0.19±0.13	0.19±0.13	98.1±1.3	5.83±0.05	86.9±0.8	4.58±0.22	5.17±0.19
FS501	4.79	2.10	2.05	8.94	-	-	-	-	5.86
NBRC0216	1.01±0.06	2.69±0.03	3.59±0.05	7.29±0.13	18.4±1.4	1.09±0.08	18.3±1.4	1.21±0.14	5.27±0.00
Hitachi	0.88±0.08	3.03±0.08	3.63±0.12	7.54±0.13	15.7±1.5	0.84±0.06	14.0±1.1	1.03±0.18	5.42±0.02
KCS105	5.94	1.64	1.79	9.37	-	-	-	-	5.59
NBRC0216	0.18±0.01	2.36±0.05	3.56±0.09	6.10±0.10	34.9±1.1	1.92±0.19	30.6±3.1	1.38±0.10	5.16±0.04
Hitachi	0.13±0.03	3.45±0.36	4.11±0.32	7.68±0.14	17.9±1.5	0.97±0.15	15.5±2.4	1.19±0.05	5.30±0.04

$ ^{a} $ , $ \% \left(w/v\right).^{b} $ , $ \% \left(v/v\right).^{c} $ , not detected.

FS902では両酵母とも良好な生育を示し、NBRC0216では5.70±0.14ml、Hitachiでは5.83±0.05mlのエタノールが生成した。これらのエタノール収率はそれぞれ85.0±2.0%、86.9±0.8%と共に85%を超え、糖消費率も97.7±0.5%、98.1±1.3%と高く、効率良くエタノールに変換されているのが分かる。一方、FS501およびKCS105では酵母の生育および糖消費も悪く、エタノール収率も15%前後に留まった。この中で最も良かったNBRC0216とKCS105の組合せですら、糖消費率が34.9±1.1%、エタノール収率が30.6±3.1%であり、FS902と比較するとかなり低い値となった。

以上の結果より、エタノール発酵の原料としてはFS902が最適であり、その時の酵母は今回使用したNBRC0216およびHitachiとも十分使用できることが分かった。FS501およびKCS105で酵母の生育が抑えられる原因は明言できないが、搾汁液中に炭素源として糖は十分にあるので、生育阻害物質の存在によるものと考えられる。
## 3 ）繰り返し回分発酵を用いた酵母によるエタノール発酵

次に上記搾汁液を用いて繰り返し回分発酵によるエタノール生産を検討した。採用した繰り返し回分発酵は、酵母を再利用するため、発酵時間が短くても十分なエタノール生産が期待でき、また、基本的に酵母の生育が伴わないので、前年度に試験して酵母の生育が観察されずにエタノール生産が伴わなかったFS501およびKCS105の搾汁液でも糖からエタノールへの変換が期待できる。そこで、まず酵母の生育を伴いながらエタノール生産が起こるサイクル1の条件を検討した。ここではS. cerevisiae NBRC 0216株およびHitachi株の両株が生育可能なFS902の搾汁液を用い、前培養液から0.01%–、0.05%–、および0.1%–植菌し、30℃で5日間静置培養して、この間のエタノール生成を解析した。その結果を下記図(2)-2に示す。

図(2)-2. 酵母の植菌量がエタノール生産に及ぼす影響.

酵母 S. cerevisiae NBRC 0216株（A - C）およびHitachi株（D - F）の前培養液をスウィートソルガム FS902の搾汁液に0.01% - （A and D），0.05% - （B and E），および0.1% - 植菌（C and F）し，30℃で5日間静置培養した．1日毎に培養液を採取し，エタノール収率（■），糖消費率（●），および生育（○）を解析した（平均 ± 標準偏差，n = 3）。

0.01%-植菌では両株とも生育および糖消費が良くなく、エタノール収率は20%以下であった（A and D）。0.05%-植菌では、両株の生育はかなり改善され、培養3日後NBRC 0216株で濁度が4.82、Hitachi株で7.04に達した（B and E）。これに伴い培養4日後、糖は97%以上消費され、エタノールはそれぞれ5.08%（v/v）および5.49%（v/v）生産された。0.1%-植菌では生育は0.05%-植菌と比べてわずかに良く、エタノール収率はおよそ85%に達した（C and F）。これらの結果から、0.1%-植菌が酵母の生育を伴う繰り返し回分発酵の最初のサイクルには最も適しており、生育およびエタノール生産の観点からはHitachi株の方がわずかに優れているが、両酵母ともエタノール生産に十分適合していることが確認された。加えて、サイクル1で75%以上のエタノール収率を得るには、少なくとも3日の発酵時間が必要であることも分かった。