Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
N12区が最大、2011年はN24が最大であった（表(1)-40）。出穂後45日では有意差は認められなかったが、傾向は出穂後30日と同様であった（表(1)-40）。出穂後60日もほぼ同様の傾向であった（表(1)-40）。

以上の結果をまとめると、施肥量試験の結果、生育、収量共に年次間差異が大きく、とくに初期生育は栽培年次によって大きく異なることが明らかになった。2010年の栽培ではいずれの収穫日においてもN12区がもっとも高い糖収量を示したが、2011年の栽培では再現されず、多肥により収量が増加する傾向が認められた。出穂後（収穫日間）における糖収量、Brix値の増減傾向も2010年と2011年では異なる結果が示され、*特定の傾向をつかむことはできなかった。これらのことから、スイートソルガムの施肥量に対する反応は栽培年次によって変化する事が示唆され、本研究結果のみでは最適な施肥量を定めることはできなかった。このことは、スイートソルガムから安定的に糖生産することの困難さを示しており、

表(1)-38. 施肥量試験区のそれぞれの収穫日におけるBrix値

栽培年	处理区	出穗後30日	出穗後45日	出穗後60日
2010	N0	13.2	±	2.4	ab	13.6	±	1.9	abc	12.6	±	1.4	ab
N6	12.4	±	1.9	ab	11.0	±	2.5	bc	11.8	±	2.0	ab
N12	12.8	±	1.2	ab	16.5	±	1.0	ab	15.3	±	0.3	ab
N24	6.9	±	1.2	b	8.3	±	0.1	c	10.9	±	2.6	b
2011	N0	15.6	±	0.3	a	15.5	±	0.9	ab	14.6	±	1.5	ab
N6	16.2	±	1.1	a	17.1	±	2.4	ab	17.2	±	1.2	ab
N12	15.6	±	0.9	a	17.6	±	0.9	a	18.1	±	0.9	a
N24	15.3	±	1.2	a	17.5	±	0.8	a	17.5	±	0.5	a

施肥量	ns	*	ns
栽培年	**	**	**
施肥量×栽培年	ns	*	ns

同一調査日内で同一アルファベットを含む数値間には5％水準におけるTukey法による有意差はない

$ ^{*} $ 、 $ ^{**} $ はそれぞれ5、1%水準で有意；ns，有意性なし；±標準誤差

表(1)-39. 施肥量試験区のそれぞれの収穫日における地上部生体重量(t ha^{-1})

栽培年	处理区	出穗後30日	出穗後45日	出穗後60日
2010	N0	51.7	±	9.4	ab	44.6	±	13.9	43.9	±	12.7	ab
N6	69.6	±	15.1	ab	62.2	±	19.1	52.1	±	16.6	ab
N12	85.3	±	0.5	a	72.0	±	3.3	74.4	±	3.8	a
N24	74.1	±	3.2	a	73.6	±	4.6	65.2	±	3.4	a
2011	N0	32.9	±	11.1	b	30.6	±	9.1	24.1	±	8.9	b
N6	49.9	±	13.3	ab	53.3	±	18.1	46.0	±	6.9	ab
N12	57.6	±	8.8	ab	52.1	±	7.3	51.6	±	6.7	ab
N24	64.1	±	10.6	ab	58.0	±	9.0	ns	56.2	±	9.6	ab
施肥量	**	*	*
栽培年	**	ns	*
施肥量×栽培年	ns	ns	ns

同一調査日内で同一アルファベットを含む数値間には5％水準におけるTukey法による有意差はない

$ ^{*} $ 、 $ ^{**} $ はそれぞれ5、1%水準で有意；ns，有意性なし；±標準誤差

表(1)-40. 施肥量試験区のそれぞれの収穫日における地上部乾物重量(t ha $ ^{-1} $ )

栽培年	处理区	出穗後30日	出穗後45日	出穗後60日
2010	N0	12.1	±	1.4	b	9.9	±	1.2	11.2	±	2.8	b
N6	14.0	±	2.8	ab	16.3	±	5.8	11.5	±	2.5	b
N12	21.2	±	0.3	a	20.3	±	0.8	20.0	±	1.9	a
N24	14.9	±	1.2	ab	14.7	±	0.7	14.1	±	0.6	ab
2011	N0	10.2	±	3.3	b	9.8	±	3.0	8.3	±	3.2	b
N6	15.1	±	4.0	ab	16.6	±	5.6	14.6	±	1.4	ab
N12	16.4	±	2.1	ab	15.9	±	1.9	15.7	±	1.6	ab
N24	18.1	±	3.1	ab	17.0	±	2.5	ns	16.3	±	1.7	ab
施肥量	**	*	**
栽培年	ns	ns	ns
施肥量×栽培年	ns	ns	ns

同一調査日内で同一アルファベットを含む数値間には5％水準におけるTukey法による有意差はない

$ ^{*} $ 、 $ ^{**} $ はそれぞれ5、1%水準で有意；ns，有意性なし；±標準誤差

との困難さを示しており、さらなる栽培研究を蓄積する必要がある。

## 4 ）無除草栽培の検討

雑草の被度は7月播種で6月播種に比べ低く推移した（図(1)-4）。また、スイートソルガム収穫期の雑草の地上部乾物重は7月播種で少なく、6月播種と7月播種の間で雑草の発生量が異なった
（図(1)-5）。スイートソルガムの糖収量は7月播種で6月播種より多かった（表(1)-41）。6月播種の場合、無除草処理区の1個体あたり糖収量は慣行区の0.2から0.7倍、単位面積あたりでも慣行区の0.6から0.8倍であった（表(1)-41）。一方、7月播種では無除草処理区の40×15区と80×7.5区の1個体あたり糖収量は慣行区の0.7倍であったが、単位面積あたりでは慣行区の1.3倍と慣行区に比べ増加した（表(1)-41）。6月播種では、雑草発生量が多かったことがスイートソルガムの糖収量に影響したが、7月播種では雑草の発生量が少なく、糖収量への影響も小さかったと考えられた。

以上の結果より、無除草条件下でも、栽植密度を高めることで高い糖収量を得られる場合があることが明らかとなった。

図(1)-4. 無除草栽培試験区における雑草被覆率の推移

図(1)-5. スイートソルガム収穫後における雑草の地上部乾物重量、誤差範囲は標準誤差を示す
表(1)-41. 除草の有無および播種密度でのスイートソルガムの諸形質および糖収量の比較

播種日	処理区	稲長（cm）	茎
茎径（mm）	新鮮重（g 本-1）	乾物重（g 本-1）	乾物重（g m-2）	含水率（%）
6月2日	慣行区	272 (100)	21.1 (100) a	604 (100) a	140 (100) a	1165 (100)	78.2 (100) a
80×15区	260 (96)	14.0 (66) b	382 (63) ab	109 (78) ab	909 (78)	71.1 (91) b
40×15区	218 (80)	10.5 (50) bc	163 (27) b	44 (32) bc	735 (63)	70.2 (90) b
80×7.5区	217 (80) ns	8.2 (39) c	147 (24) b	41 (29) c	686 (59) ns	70.2 (90) b
7月15日	慣行区	303 (100)	22.6 (100) a	651 (100) a	118 (100)	987 (100)	80.3 (100) a
80×15区	303 (100)	19.9 (88) b	600 (92) ab	117 (99)	977 (101)	77.5 (97) b
40×15区	281 (93)	17.9 (79) bc	422 (65) b	91 (77)	1513 (102)	78.3 (98) ab
80×7.5区	288 (95) ns	16.4 (73) c	410 (63) b	84 (71) ns	1392 (103) ns	78.8 (98) ab
播種日	処理区	伸長節間数	捺汁液	糖収量
捺汁量（mL 本-1）	Brix值（%）	捺汁効率（%）	(g 本-1)	(g m-2)
6月播種区	慣行区	17 (100) a	283 (100) a	12.4 (100)	47.0 (100) a	34.1 (100) a	254 (100)
80×15区	15 (85) b	169 (60) ab	16.7 (134)	43.8 (93) a	26.4 (77) ab	220 (87)
40×15区	12 (72) bc	69 (24) b	18.3 (148)	36.9 (79) a	12.7 (37) bc	211 (83)
80×7.5区	11 (66) c	55 (19) b	18.1 (146) ns	21.7 (46) b	9.3 (27) c	155 (61) ns
7月播種区	慣行区	18 (100) a	359 (100) a	13.1 (100)	53.1 (100)	46.5 (100) ab	387 (100)
80×15区	17 (95) ab	348 (97) a	13.8 (105)	52.7 (99)	47.7 (103) a	397 (103)
40×15区	16 (91) b	221 (62) b	14.0 (107)	51.6 (97)	31.0 (67) bc	517 (134)
80×7.5区	16 (87) b	218 (61) b	13.6 (104) ns	50.9 (96) ns	29.4 (63) b	489 (126) ns

同一播種日、同一項目内で同一アルファベットを含む数値間には5%水準におけるTukey法による有意差はない。有意差なし

括弧内の数値は慣行区を100としたときの相対値を示す

## （２）高次倍数体の開発

## 1 ）染色体倍加剤と処理ステージの検討

倍加薬剤への浸漬処理がスイートソルガム幼植物体の生存に及ぼす影響を表(1)-42に示した。芽生え期の処理においては、コルヒチン0.1%、24時間処理区および0.01%、120時間処理区で半数致死が得られた。同期のオ倍加薬剤への浸漬処理がス芽生え期の処理においては、数致死が得られた。同期のオリザリン処理においては、0.01%、24時間処理区で約8割の個体、0.01%、120時間処理区で9割以上の個体が枯死した。一方、2～3葉展開期の処理においては、コルヒチン0.1%、120時間処理区で約8割の生存率、コルヒチン0.01%、120時間処理区では、全ての個体が生存していた。同ステージのオリザリン0.01%、24時間処理区では約7割の個体が生存していた。同ステージでは、オリザリン0.001%、120時間処理区において半数致死が得られた。

表(1)-42. 染色体倍加処理がスイートソルガムの生存率に及ぼす影響

倍加処理した生育段階	浸責時間	倍加薬剤	処理濃度(%)	処理個体数	生存個体数	生存率(%)
芽生え期	24	コルセチン	0.1	16	8	50
0.01	18	18	100
オリザリン	0.01	15	2	13.3
0.001	16	9	56.3
蒸留水	17	17	100
120	コルセチン	0.1	17	0	0
0.01	16	7	43.8
オリザリン	0.01	17	1	5.9
0.001	16	3	18.8
蒸留水	17	17	100
2-3葉期	24	コルセチン	0.1	14	11	78.6
0.01	10	10	100
オリザリン	0.01	17	12	70.6
0.001	16	12	75
蒸留水	8	8	100
120	コルセチン	0.1	12	2	16.7
0.01	12	9	75
オリザリン	0.01	15	5	33.3
0.001	15	8	53.3
蒸留水	8	8	100

倍加処理後、屋外のプラスチックポットで生存するすべての個体についてFCMによって倍数性の評価を行ったところ、蒸留水で処理した対照区を含むほとんどの個体において細胞周期における2Cの単独ピーク、または2Cおよび4Cの2ピークが観察された。さらに倍加処理区において、6Cのピークを持つものが2個体得られた。そのうちの1個体は4Cおよび6Cからなる倍数体のピークを示し、
もう1個体は2C、4Cおよび6Cからなる混数体のピークを示した（図(1)-6）。

以上の結果より、本研究によって、スイートソルガムにおいて染色体倍加個体を作出できる可能性が示された。また、これまでに他の単子薬植物でも報告されているように、オリザリンのほうがコルヒチンよりも低濃度、短時間の処理において、致命的な薬害を及ぼすと推察された。2）では染色体倍加効率との関連も含めて最適な染色体倍加条件を決定し、さらなる染色体倍加個体の獲得を目指した。

図(1)-6. フローサイトメトリー（FCM）によるスイートソルガムの核DNA量の推定と倍数性の評価 a, 2倍体；b, 4倍体；c, 混数体の違いを相対的DNA量のピークパターンで判別した

## 2 ）染色体倍加剤への浸漬方法の改良

倍加剤への浸漬方法の改良がスイートソルガム幼植物体の生存および倍加個体の作出におよぼす影響を表(1)-43に示す。1）と同様に処理ステージにかかわらず、コルヒチン濃度の上昇に伴って生存率は低下した。手法別では、従来法に比べ葉を切り詰めることで植物体に傷を与えた改良法ⅠおよびⅡで顕著に生存率が低くなった。しかし、改良法Ⅰで芽生え期に0.01%コルヒチンを処理した区、および改良法Ⅱで2～3葉展開期に0.01%コルヒチンを処理した区でそれぞれ1個体ずつ混数体が得られた（表(1)-43）。倍加効率を1）の結果と比較すると、倍加個体が得られた処理区において生存個体に占める倍加個体の割合が1）では約6%だったのに対して、本改良法では20～33%と大幅に改善された（表(1)-44）。したがって、本改良法の生存率を改善することによって、より多くの倍加個体を効率的に作出できると展望される。
表(1)-43 コルヒチン水溶液への浸漬処理方法がスイートソルガムの生存率と染色体倍加に及ぼす影響

処理ステージ	コルヒチン濃度(%)	処理方法*	処理個体数	生存個体数	生存率(%)	倍加個体数
芽生え期	0.10%	従来法	30	0	0	0
改良法Ⅰ	30	0	0	0
改良法Ⅱ	30	0	0	0
0.01%	従来法	30	17	57	0
改良法Ⅰ	30	4	13	1
改良法Ⅱ	30	6	20	0
2～3葉	0.10%	従来法	20	1	5	0
改良法Ⅰ	20	0	0	0
改良法Ⅱ	20	1	5	0
0.01%	従来法	20	18	90	0
改良法Ⅰ	20	9	45	0
改良法Ⅱ	20	5	25	1

表(1)-44 スイートソルガムの染色体倍加における従来法と改良法の生存率と染色体倍加効率の比較

試験年度	処理時期	処理時間	コルヒチン濃度(%)	処理方法	処理個体数	生存個体数	生存率(%)	測定個体数	倍加個体数	倍加効率(%)
2009	芽生え期	24時間	0.1	従来法	26	16	62	16	1	6.3
2～3葉展開期	120時間	0.01	従来法	22	17	77.3	17	1	5.9
2010	芽生え期	24時間	0.01	改良法Ⅰ	30	4	13.3	3	1	33.3
2～3葉展開期	24時間	0.01	改良法Ⅱ	20	5	25	5	1	20

$ ^{*} $ 従来法，地上部を薬液に浸漬（昨年度の方法）；改良法Ⅰ，地上部の葉を切断後に浸漬；改良法Ⅱ，地上部の葉を切断後に減圧下で浸漬する方法

## 3 ）倍加個体の自殖による増殖

2）で獲得された2個体の混数体のうち1個体は開花まで成長し、自殖種子を得ることにも成功した（図(1)-7）。混数体はヒコバエによる栄養繁殖を行うことによって維持が可能であった。さらに、栄養繁殖世代が開花結実することによって、多くの自殖種子を獲得した。今後、自殖個体を播種の倍数性および諸形質の評価を計画している。

図(1)-7. 混数体の開花によって得られた自殖種子

## （３）共生菌を用いた安定生産技術の開発

1）貧栄養、低温条件での生育促進効果

低温条件においてDSE処理区の地上部バイオマス量は、窒素濃度がN100 mg/Lの処理区および無
窒素処理区で増加した。とくに、NA処理区は10 mg/Lおよび100 mg/L両濃度でバイオマス量が増加した。同様に葉緑素量もすべての処理区において増加した。対照区ではスイートソルガムの葉が展開していないのに対して、P. fortinii処理区では第2葉まで展開し、肉眼でも明らかな葉緑素の蓄積が確認できた（図(1)-8、左が対照区、右がP. fortinii処理区）。また、根部におけるP. fortiniiの定着様式を観察したところ、おもに根の表面を菌糸が覆っていた（図(1)-9、黒色部）。以上をまとめると、低温条件における試験の結果、P. fortiniiを処理したスイートソルガムのバイオマス量は対照区に比べて増加した。さらに、葉緑素量も対照区に比べ明らかに増加した。窒素源は、有機態窒素がバイオマス増加に有効であった。その中でも、NAは通常の作物栽培において実際に使用されており有効であると考える。

図(1)-8. 対照区（左）およびP. fortinii処理個体（右）の外観

図(1)-9. 根部にP. fortiniiが定着している様相（黑色部）

## 2 ）低温条件下における影響解析

土壌を用いた低温条件下の試験で、V. simplexはスイートソルガムのバイオマス量を58.7%増加させた（P<0.05）（図(1)-10）。一方で、D. lagerstroemiaeはスイートソルガムのバイオマス量を8.8%増加させたが、対照区と比較して有意な差は認められなかった。接種25日後のスイートソルガム根部の横断切片を作製して観察したところ、V. simplexは表皮細胞および皮層細胞内にまで菌糸の侵入が確認できたが、D. lagerstroemiaeは表皮細胞のみに留まっていた。また、栽培25
図(1)-10. 栽培25日後のVeronaeopsis simplex処理による宿主植物(スイートソルガム)の外観 左：対照区，右：V. simplex処理区．13℃，25日間，16/8(L/D)の条件で栽培

日後のスイートソルガムにおいて、V. simplex処理は地上部の生育の促進だけでなく、根の分枝など、対照区と比較し明らかな形態的な違いが認められた。一方、D. lagerstroemiae処理は、地上部の生育に差は確認できなかったが、根の分枝が認められた。Tibbett(1998)は、外生菌根菌であるHebeloma spp.が12℃以下の低温条件においてフォスファターゼの生産を増加していることを明らかにし、0℃付近における温度での細胞外フォスファターゼの生産の増加は、低温による酵素活性の損失を補い、冬季の凍土での有機態リンの分解に役立っているかもしれないとしている $ ^{3)} $ 。また、菌根菌は冷涼な土壌で、栄養獲得に順応しており、積極的に無機態窒素の吸収や、酵素の分泌によって活発に栄養を集め、有機態窒素の吸収する能力を持っている $ ^{4)} $ 。このように、低温環境下での植物の栄養獲得に菌類が関係していることが考えられ、DSEにおいても同様にリンや窒素の栄養獲得に関わっていることが推測される。本試験結果からでは、V. simplexがリンや窒素などの栄養吸収に作用していたかどうかは明らかにできなかったが、少なくともバイオマスの増加をもたらす何らかの作用が働いたと推測される。

## 3 ）植物—根部エンドファイト共生系栽培環境における温度の影響

亜熱帯地域の鹿児島県屋久島の森林土壌より分離されたV. simplex Y34は13-37℃において生長が認められ、特に30℃付近の生育が最も良好であった。温帯地域の茨城県阿見町の森林土壌より分離されたH. velutinum 41-Iは13-30℃において生長が認められ、特に30℃付近で最も生育が良好であった。亜寒帯地域のカナダアルバータ州の森林土壌より分離されたP. fortinii BCaPC1は6-23℃において生長が認められ、特に23℃で最も生育が良好であった。次にCd存在下での植物への接種試験結果であるが、13℃ではCd濃度10 ppm及び20 ppmともにP. fortinii接種区において最も高い地上部乾燥重量指数を示し対照区と比較して地上部バイオマスの有意な増加を示した（図(1)-11）。一方、23℃及び30℃では、Cd濃度10 ppm及び20 ppmともにV. simplex接種区において最も高い地上部乾燥重量指数を示し、対照区と比較して地上部バイオマスの有意な増加を示した（図(1)-12）。上述のようにP. fortiniiの生育最適温度は23℃であり、H. velutinum及びV. simplexの生育最適温度は30℃であるとこが明らかになっている。よって、スイートソルガムではDSEの最適接種温度は供試菌株の生育至適温度に対応することが示唆された。対照区とDSE接種区
の宿主植物の生育を比較したとき、乾燥重量だけでなく、草丈、葉の大きさ及び葉数にも顕著な差が観察できた。これは、DSEの接種がリン酸吸収や、有機態窒素吸収に関与していること $ ^{5)} $ 、特に宿主植物の初期生育時の窒素吸収に関与していると報告されていることから利用できる栄養素が対照区に比べ多いことが考えられる。また、V. simplexはIAAを生産することが報告されていることからDSEの接種による生育促進効果は植物ホルモンも関与していることが考えられる。

図(1)-11. 栽培温度13℃でのP. fortinii接種による宿主植物(スイートソルガム)の外観 左：対照区，右：P. fortinii 接種区，栽培条件：Cd濃度10 ppm，21日間，13℃，16/8（L/D）

図(1)-12. 栽培温度23☑でのV.simplex接種による宿主植物(スイートソルガム)の外観 左：対照区，右：V.simplex 接種区，栽培条件：Cd濃度10 ppm，21日間，23，16/8（L/D）

## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

本研究で行なった栽培制御研究は、これまで不明確であった茎の構成要素である伸長節間の数と栽培条件、糖収量との関係を明らかにした。また、バイオアルコール生産のためのスイートソ
ルガム最適品種を明らかにし、効率的生産のための耕種条件を一定程度明らかにした。加えて、省力・低コスト栽培条件確立に向けた、施肥体系、無除草栽培条件についての知見を獲得した。

高次倍数体の開発では、これまで報告のない、スイートソルガムにおける人為的な倍数性操作が可能であることを科学的に実証した。さらにその獲得効率を改善し、混数体を獲得して開花まで育成し、自殖種子を得ることに成功した。したがって、本研究結果は、スイートソルガムで人為的な倍数性操作が可能であることを科学的に立証し、その方法を確立した初めての報告であると考えられる。今後、本研究で開発した染色体倍加手法を活用して、倍数性の操作が糖含量を含むスイートソルガムの諸形質にどのような影響を及ぼすのかを解析することが可能となるなど、科学的な波及効果は大きい。

共生菌を用いた安定生産技術の開発では対象作物であるスイートソルガムに低温耐性を付与する目的で、冷涼環境の亜高山森林で土壌を採取し、DSEを分離し、最適な菌株をスクリーニングすることを試みた。その結果、P. fortiniiが冷涼環境下でもスイートソルガム根に内生的に定着し生育を促進するDSEとして選抜された。さらに選抜試験をすすめることにより、低温条件でスイートソルガムの生育を促進するエンドファイトがV. simplex選抜された。さらにこれらDSEの環境に対する反応を解析した結果、スイートソルガムは、13℃ではP. fortinii、23℃及び30℃ではV. simplexと共生関係を結ぶことでより大きなバイオマス量を獲得することができることが明らかとなった。これにより、北方から南方までの異なる気候条件下での栽培にエンドファイトの利用が可能となった。

## （２）環境政策への貢献

第3サブテーマおよび第2サブテーマの結果と連携して解析した結果、スイートソルガムの多面機能を活用した栽培パッケージモデルの開発が必要であることが明らかになり、地域連携シンポジウム（平成24年3月13日、茨城大学で開催）などで社会的議論を深めた。尚、新聞（たとえば平成23年9月23日日本経済新聞北関東面）、テレビ放映（たとえば平成23年10月21日NHK総合テレビ（全国放送）の「おはよう日本」）などでの報道もあり環境政策に対する市民の理解を深めた。

かすみがうら市では、茨城県の協力のもと、「バイオ燃料の生産・利用の特区」申請の準備を進めている。同市では、バイオ燃料の生産・利用上、最大の課題は種々の法律（アルコール事業法、揮発油等の品質の確保等に関する法律、道路運送車両法、揮発油税法など）であると認識し、これらを特区によってフリーとし、「エネルギーの地産・地消社会」を形成することを目指している。

本研究課題でかねてより指摘していたE3以上のエタノール混入ガソリンの実現は、平成23年度末までにE10まで法律改正される見込みである（各種の環境省資料に記載あり）。

## 6 ．国際共同研究等の状況

特に記載すべき事項はない。

7．研究成果の発表状況 ※【別添】H23研究等報告書作成要領 参照

## （1） 誌上発表
<論文（査読あり）>

1) Ousmane D., Takahashi T., Yonekura A., Nitta Y. and Narisawa K., Microbes and Environments 25, 216-219 (2010)

“A new fungal endophyte, Helminthosporium velutinum, promoting growth of bioalcohol plant, sweet sorghum.”

2) Chohnan S., Nakane M., Habibur R., Nitta Y., Yoshiura T., Ohta H. and Kurusu Y., Journal of Bioscience and Bioengineering 111, 433-436 (2011)

“Fuel ethanol production from sweet sorghum using repeated-batch fermentation”

3) Nitta Y., Ohta H. and Kato T., In Morioka, T., Hanaki, K. and Moriguchi, Y. eds Establishing a resource-circulating society in Asia: Challenges and opportunities, United Nations University Press, Tokyo. 218-234 (2011)

“Regional sustainability-oriented agricultural technology and biomass circulation system development”

<査読付論文に準ずる成果発表> 特に記載すべき事項はない

## くその他誌上発表（査読なし）>

1) Kamiyama, A., Nitta, Y., Homma, T., Umehara, R., Kobayasi, R., Matsuda, T., Nakamura, S., Goto, Y., Inoue, E., Narisawa, K., Kurusu, Y., Ohta, H., Chohnan, S., Miyaguchi, Y., Toyoda, A., Kato, T., Kobayashi, H., Komatsuzaki, M., Sato, T. and Yoshida, K., Tohoku Journal of Crop Science 52, 41-42 (2009)

“Annual Differences of Sugar Production in Effect of Weather Condition on Sugar Yield in Sweet Sorghum (Sorghum bicolor (L.) Moench) Stem”

2) Kamiyama, A., Nitta, Y., Homma, T., Umehara, R., Kobayasi, R., Matsuda, T., Nakamura, S., Goto, Y., Inoue, E., Narisawa, K., Kurusu, Y., Ohta, H., Chohnan, S., Miyaguchi, Y., Toyoda, A., Kato, T., Kobayashi, H., Komatsuzaki, M., Sato, T. and Yoshida, K., Tohoku Journal of Crop Science 52, 39-40 (2009)

“Annual Differences of Sugar Production in Sweet Sorghum (Sorghum bicolor (L.) Moench) Stem”

3）本間貴司・塩津文隆・乃田啓吾・浅木直美・吉田貢士・加藤亮・加藤明・新田洋司：農業および園芸，87，275-284（2012）

「地域の耕作放棄地を利活用した環境保全型バイオ燃料生産」

（2）口頭発表（学会等）

1) Hommaら（他19名）：日本作物学会第228回講演会（2009）

“Effect of Sowing Date and Fertilizer Application on the Elongated Internodes Number and Stem Sugar Content in Sweet Sorghum (Sorghum bicolor (L.) Moench)”

2) 本間ら（他19名）：日本育種学会第116回講演会（2009）

「 糖生産に着目したスイートソルガムにおける生長過程の年次間差異」

3) Kamiyamaら（他19名）：日本作物学会第228回講演会（2009）
“Effect of Sowing Date and Fertilizer Application on Sugar Concentration of Elongated Internodes in Sweet Sorghum (Sorghum bicolor (L.) Moench)”

4）井上ら（他15名）：日本育種学会第116回講演会（2009）

「スイートソルガムにおける染色体倍加条件の検討」

5）米倉茜・成澤才彦：日本微生物生態学会第25回大会（2009）

「根部エンドファイトPhialocephara fortiniiを利用したスイートソルガムの最適な栽培条件の検討」

6）河合由貴・高橋拓也・成澤才彦：日本微生物生態学会第25回大会（2009）

「根部エンドファイトVeronaeopsis simplexを利用した燃料作物によるCd汚染土壤浄化の試み」

7) Homma ら（他15名）：日本作物学会第229回講演会（2010）

“The Damage by the Typhoon No.18 on Above Ground Biomass and Stem Sugar Yield of Sweet Sorghum (Sorghum bicolor (L.) Moench) in 2009”

8）Homma ら（他12名）：27^{th} International Horticultural Congress, Lisbon, Portugal, 2010

“Growth Characteristic and Availability of Sweet Sorghum (Sorghum bicolor (L.) Moench) under Non-irrigated Field Conditions in Ibaraki Prefecture, Japan”

9）Hommaら（他13名）：日本作物学会第230回講演会（2010）

“Variety Choice of Sweet Sorghum (Sorghum bicolor (L.)) as a View of Bio-fuel Crop”

10) Homma ら（他9名）：ASA-CSSA-SSSA 2010 International Annual Meetings, Long Beach, CA, U.S.A., 2010

“Growth Characters of Sweet Sorghum Cultivation for Bio-Ethanol Production in the Southern Region of Ibaraki Prefecture, Japan”

11）本間ら（他8名）：園芸学会平成22年度秋季大会（2010）

「スイートソルガム搾汁残渣の土壌への施用がコマツナの生育におよぼす影響」

12）井上ら（他3名）：日本育種学会第118回講演会（2010）

「スイートソルガムにおける染色体倍加とフローサイトメトリー」

13) Asagi ら（他8名）：ASA-CSSA-SSSA 2010 International Annual Meetings, Long Beach, CA, U.S.A., 2010

“Application Effects of Sweet Sorghum Bagasse on Growth, Yield and N Uptake in Komatsuna”

14) Asagiら（他3名）：日本作物学会関東支部第99回講演会（2010）

“Effects of Differences of Sowing time and Density on Growth of Sweet Sorghum and Weed”

15）Asagiら（他3名）：日本作物学会関東支部第99回講演会（2010）

“Application Effects of Sweet Sorghum Bagasse on Growth and Yield of Sweet Sorghum”

16）Yonekuraら（他3名）：日本微生物生態学会第26回大会（2010）

“Selection and determination of the best system for applying of a root endophyte which promote sweet sorghum growth under low temperature condition”

17）Hommaら（他10名）：日本作物学会第231回講演会（2011）

“Effect of Fertilizer Application Rate on Sugar Yield and Above Ground Biomass of Sweet Sorghum (Sorghum bicolor (L.) Moench)”

18）Hommaら（他10名）：日本作物学会第232会講演会（2011）
“Effect of Fertilizer Application Rate on Growth and Yielding Characters of Sweet Sorghum (Sorghum bicolor (L.) Moench)”

19) Homma ら（他9名）: The 7th ASIAN CROP SCIENCE ASSOCIATION CONFERENCE, Bogor, Indonesia, 2011

"Sweet Sorghum Cultivation for Bio-ethanol Production in the Southern Region of Ibaraki Prefecture, Japan"

20）Asagiら（他9名）：日本作物学会第231回講演会(2011)

“Sweet Sorghum Growth and Soil Nitrogen Distribution Following Bagasse Application”

21) Asagiら（他9名）: The 7th ASIAN CROP SCIENCE ASSOCIATION CONFERENCE, Bogor, Indonesia, 2011

“Plant Growth and Distribution of N Derived from Inorganic Fertilizer Following Sweet Sorghum Bagasse Application”

22）Asagiら（他4名）：日本作物学会関東支部第100回講演会（2011）

“Effects of Sweet Sorghum Bagasse Application and Sowing Time on Growth of Sweet Sorghum and Weed”

23）Asagiら（他4名）：日本作物学会関東支部第100回講演会（2011）

“Effect of Sowing Time and Density in Sweet Sorghum Cultivation on Growth of Sweet Sorghum and Weed”

24）Nittaら（他10名）：日本作物学会第231回講演会（2011）

“Suitable Cultivars for Sweet Sorghum Cultivation as a Bio-fuel Crop for Alcohol Production in the Southern Region of Ibaraki Prefecture”

25）米倉茜、成澤才彥：成23年度日本植物病理学会大会（2011）

「亜熱帯起源の根部エンドファイトVeronaeopsis simplexによるトマト根腐萎涼病に対する抑制効果」

26）河合由貴、成澤才彦：日本微生物生態学会第27回大会（2011）

「根部エンドファイト3種を利用したスイートソルガムによるCd汚染土壌浄化について」

27) Khastiniら（他3名）：日本微生物生態学会第27回大会（2011）

“Change in the community of associated bacteria with Veronaeopsis simplex in the response of high temperature stress”

28）新田ら（他3名）：日本作物学会第233回講演会（2012）「スイートソルガムによる放射性物質の吸収効果」

## （3） 出願特許

特に記載すべき事項はない

## （４）シンポジウム、セミナーの開催（主催のもの）

1）一般公開ワークショップ「首都圏近郊におけるバイオ燃料社会の構築と地域農業イノベーションを目指してー茨城大学バイオ燃料社会プロジェクト（IBOS）の展開ー」（2009年4月24日、
茨城大学インフォメーションセンター、参加者数約100名）

2）バイオ燃料国際シンポジウム「農業イノベーションによるバイオ燃料社会の構築」（2009年12月11日、茨城県立図書館視聴覚ホール、参加者数235名）

3）地域連携シンポジウム「地域と連携したバイオ燃料生産の展望」（2012年3月13日、茨城大学農学部、参加者数約100名）

## （５）マスコミ等への公表・報道等

1）NHK総合テレビ 茨城県域放送「ニュースワイド茨城」で、スイートソルガムの播種風景が放送される。（2009年7月1日）

2）茨城放送「土曜の午後ワイド 恭ノ介のココで語れば」で、茨城大学バイオ燃料社会プロジェクト（IBOS）および茨城大学地球変動適応科学研究機関（ICAS）の紹介。（2009年11月14日）

3）NHK総合テレビ 茨城県域放送「とれたてワイドいばらき」で、バイオ燃料国際シンポジウム（2009年12月11日開催）の案内が生放送される。（2009年12月3日）

4）産経新聞茨城版で、「耕作放棄地からバイオ燃料」記事および国際シンポジウム案内が掲載される。（2009年12月4日）

5）茨城放送「タ刊ほっと」の「ほっとボイス」で、茨城大学バイオ燃料社会プロジェクトおよびバイオ燃料国際シンポジウム（2009年12月11日開催）の案内が生放送される。（2009年12月9日）

6）NHK総合テレビ 茨城県域放送「ニュースワイド茨城」の「インタビューいばらき人」で18時35分から約10分間インタビューされ、生放送される。（2009年12月22日）

7) 読売新聞茨城版で、「バイオ燃料（E10・E3）の走行実証（3月26日）」の記事が紹介される。(2010年3月25日)

8）NHK総合テレビ茨城県域放送の18時台と21時前のニュースで、「バイオ燃料（E10・E3）の走行実証（3月26日）」が放映される。（2010年3月26日）

9）茨城放送「タ刊ほっと」のニュースで、「バイオ燃料（E10・E3）の走行実証（3月26日）」が放送される。（2010年3月26日）

10）水戸経済新聞で、「バイオ燃料（E10・E3）の走行実証（3月26日）」が紹介される。（2010年3月26日）

11）Yahooニュースで、「バイオ燃料（E10・E3）の走行実証（3月26日）」が紹介される。（2010年3月26日）

12) 読売新聞茨城版で、「バイオ燃料（E10・E3）の走行実証（3月26日）」が紹介される。(2010年3月27日)

13) 日本経済新聞茨城版で、「バイオ燃料（E10・E3）の走行実証（3月26日）」が紹介される。(2010年3月27日)

14）茨城新聞で、「バイオ燃料（E10・E3）の走行実証（3月26日）」が紹介される。（2010年3月27日）

15) 東京新聞茨城版で、「バイオ燃料（E10・E3）の走行実証（3月26日）」が紹介される。(2010年4月7日)
16）日本経済新聞茨城版「利根往来」欄で、「茨城大学教授新田洋司氏：製造バイオ燃料、地域で使いたい」が紹介される。（2010年4月9日）

17) NHK総合テレビ（首都圏）「こんにちはいっと6けん」の「わたしの街のイチオシさん」で、バイオ燃料社会プロジェクトが紹介される。(2010年4月15日)

18）NHKサイエンスZERO「つながる生物の謎 土の中の小宇宙」（2010年4月17日）

19）NHK総合テレビ（茨城県域放送）の番組「ニュースワイド茨城」の「フォーカスいばらき」で、バイオ燃料社会プロジェクトが紹介される。（2010年4月22日）

20）日本経済新聞茨城版で、「茨城大バイオ燃料の小型生産装置」が紹介される。（2010年5月7日）

21）日刊工業新聞で、「連携協定－成果はいかに－茨城県・県などバイオ燃料実用間際混合ガソリンの試走成功」欄で紹介される。（2010年6月1日）

22）毎日新聞「地球と暮らす『地産地消に解答求め』」欄で紹介される。（2010年7月5日）

23）MAINICHI RTで、「地球と暮らす『地産地消に解答求め』」でI紹介される。（2010年7月8日）

24）日本経済新聞北関東版の「多士彩々」で、「バイオ燃料『地産地消』目標 スイートソルガム研究先導」が掲載される。（2010年8月13日）

25）NHK総合テレビ（茨城県域放送）の番組「ニュースワイド茨城」の「フォーカスいばらき」で、茨城大学バイオ燃料社会プロジェクトが放送される。（2010年11月4日）

26）NHK総合テレビ（首都圏）「こんにちはいっと6けん」で、茨城大学バイオ燃料社会プロジェクトが紹介される。（2010年11月11日）

27）茨城新聞で、「地域円卓会議in茨城2011」（新田が学識経験者として参加）が紹介される。（2011年2月19日）

28) 日本経済新聞全国面で、茨城大学バイオ燃料社会プロジェクトの活動が紹介される。（2011年3月8日）

29）日本経済新聞北関東面で、「茨城大 小中高生に環境教育 バイオ燃料、成果を紹介」が掲載される。（2011年9月23日）

30）NHK総合テレビ（茨城県域放送）の番組「ニュースワイド茨城」、「茨城県内のニュース」で、茨城大学バイオ燃料社会プロジェクトがスイートソルガムからパルプ化・製紙化が成功した話題が紹介される。（2011年10月14日）

31）NHK総合テレビ（首都圏放送）の番組「首都圏ネットワーク」で、茨城大学バイオ燃料社会プロジェクトがスイートソルガムからパルプ化・製紙化が成功した話題が紹介される。（2011年10月17日）

32）NHK総合テレビ（東北地方放送）の夜のニュース番組で、茨城大学バイオ燃料社会プロジェクトがスイートソルガムからパルプ化・製紙化が成功した話題が紹介される。（2011年10月18日）

33）NHKラジオ第一放送（全国放送）の番組「NHKジャーナル」で、茨城大学バイオ燃料社会プロジェクトがスイートソルガムからパルプ化・製紙化が成功した話題が紹介される。（2011年10月20日）

34）NHK総合テレビ（全国放送）の「おはよう日本」で、茨城大学バイオ燃料社会プロジェクト
がスイートソルガムからパルプ化・製紙化が成功した話題が紹介される。（2011年10月21日）

35）日本経済新聞北関東面で、「イネ科植物から紙開発 茨城大など、数年内に実用化」が掲載される。（2011年11月2日）

36）茨城新聞で、「バイオ燃料の利活用考える 阿見でシンポ」が掲載される。（2012年3月14日）

37) 常陽新聞で、「バイオ燃料の展望を議論 阿見 茨城大がシンポジウム」が掲載される。(2012年3月14日)

## (6) その他

特に記載すべき事項はない

### 8 \. 引用文献

1）成澤才彦（2008）西南暖地におけるDark-septate endophytic fungi(DSE)の採集とその生態解明．微採収報21:1-6

2) Ousmane D, Takahashi T, Yonekura A, Nitta Y and Narisawa K. (2010) A New Fungal Endophyte, Helminthosporium veltinum, Plant Growth of a Bioalcohol Plant, Sweet Sorghum. Microbes Environ 25:216-219

3) Tibbett M. Sanders F. E. and Cairney J. W. G. (1998) The effect of temperature and inorganic phosphorus supply on growth and acid phosphatase production in arctic and temperate strains of ectmycorrhizal $ Hebeloma\ spp. $ in axenic culture. Mycol. Res 102:129-135

4) Tibbet M. and Cairney W. G. (2007) The cooler side of mycorrhizas: their occurrence and functioning at low temperatures. Can. J. Bot. 85:51-62

5) Jumpponen, A. and J. M. Trappe. (1998) Dark-septate root endophytes: a review with special reference to facultative biotrophic symbiosis. New Phytol 140: 295-310.
（２）農地オンサイト型バイオ燃料生産系システムの開発に関する研究

<研究協力者>

茨城大学農学部 Habibur Raman

平成21～23年度累計予算額：31,817千円（うち、平成23年度予算額：9,751千円）

予算額は、間接経費を含む。

## [要旨]

スイートソルガム（糖含量およそ10%）3品種を原料とし、アルコール発酵に適した酵母の選抜および発酵条件の検討を行った結果、3品種の中でFS902品種のみで良好な酵母の生育が確認され、アルコール変換効率は3日間の発酵で糖に対して80%以上であったことから、酵母とスイートソルガムの組合せとしてHitachi株（酵母）およびFS902品種（スイートソルガム）、発酵時間は3日間で発酵温度は30℃が最適発酵条件という結果を得た。さらに、スイートソルガム搾汁液を用いて繰り返し回分発酵（Repeated-batch fermentation）について検討した結果、FS902株の搾汁液を用いて1～10サイクル使用においてHitachi株は10.1%の糖から5.59%～6.13%(v/v)のエタノールを生産し、83.3%～91.4%と極めて高い変換効率を示した。

スイートソルガムの搾りかすの飼料化について検討し、スイートソルガム残渣の繊維を蒸煮・爆砕処理したところ、繊維部分が分解され、粉状のソルガム残渣が回収（収量約60%）可能であった。また、繊維成分を構成しているセルロースやヘミセルロース、リグニン等の定量及び蒸煮条件の検討を行い、反芻家畜の飼料としての利用性を検討した結果、蒸煮時間をなるべく最低限にすることで、リグニンの増加を抑制し粗飼料として有効なセルロース量を増加させる効果があることを明らかにした。また、乳酸菌およびセルラーゼを用いて、サイレージが調製可能であることが判明した。

ブタノールの生産システムの開発を目的とし、スイートソルガム搾汁液を発酵基質としてブタノールを生産する菌株を土壌から2株分離した。両分離株を同定するために、種々の性状鑑別試験を行った結果、グラム陽性の芽胞形成嫌気性細菌のグループに属するClostridium beijerinckiiであった。スイートソルガム搾汁液中で生育してブタノールを生産する細菌SBP1株とSBP2株から、ブタノール馴化培養によるブタノール高生産株の選抜と生産条件の最適化を検討した結果、SBP2株のブタノール馴化培養により2.4%(v/v)のブタノールに耐性を持つ株（SBP2-HB株）を、SBP1株からはブタノール耐性限界濃度2.2%(v/v)の菌株を選抜した。SBP2株の糖からブタノールへの転換率は、0.27であったが、SBP2-HB株では0.78にまで上昇した。また、ブタノール生産条件の最適化を目的としスイートソルガム(FS902)搾汁液濃度の至適化を行った結果、搾汁液を約13倍に希釈して発酵に用いることで、糖から効率的にブタノールを生産できることを見出した。

[キーワード] 原料転換効率、発酵生産技術、残渣処理技術、残渣飼料化技術、ブタノール菌
### 1. はじめに

スイートソルガムは、アフリカ原産のイネ科の作物で、茎にスクロース、グルコース、およびフラクトースを多量に蓄積する。したがって、炭素の供給源としてバイオエタノール生産の候補作物となっている。スイートソルガムの利点は、①生育期間が4～5ヶ月と短いこと、②熱帯だけでなく、より寒冷な地域でも生育可能ということ、そして③食料として利用されていないということである。それゆえ、スイートソルガムから生産されるエタノールは、食料作物の生産や経済に悪影響を及ぼすことなく、再生可能なエネルギーになり得ることが期待される。

スイートソルガムの搾りかすは、糖汁のエタノール発酵原料として利用された後に生じる副産物である。一般的な搾汁装置を用いた場合、スイートソルガムの搾汁率は30～40％とされおり、60～70％の搾りかすが排出されることになる $ ^{1} $ 。残渣であるソルガム搾りかすは、可溶性の成分が減少しているが、反芻家畜のエネルギー源となり得る繊維成分を豊富に含んでいる $ ^{2} $ 。そこで、この搾りかすを飼料として活用できれば、バイオマスと飼料とが密接につながり、畜産業においても有益と考えられる。

バイオ燃料生産を基盤とした持続型地域社会のモデルでは、将来的なバイオ燃料選択における柔軟性や適応性も重要になると考えられる。すなわち、主流となるバイオ燃料が現状のエタノールから次世代のブタノールへ移行することも考慮したモデルの開発である。ブタノールのバイオ燃料としての利点は、エタノールと比べた場合、①水との親和性が低い、②発熱量はエタノールより30％高く、ガソリンとほぼ同じである、③ガソリンやエタノールよりも揮発性が低い、などである。ブタノールの発酵生産はパスツールの時代から知られており、嫌気性芽胞形成細菌であるClostridium acetobutylicumを用いて、広範なブタノール発酵生産の研究が20世紀前半までなされてきた³)。その後、石油化学的プロセスによるブタノール生産が発展し、価格競合の結果、1960年代には発酵生産は劣勢になった。しかし、石油危機以降、バイオ燃料の見直しとともに、また未利用バイオマスの活用という観点も加わりブタノール発酵生産の効率化の研究が進展している。例えば、2000年には、トウモロコシを原料とした場合、高ブタノール生産性株（Clostridium beijerinckii BA101株）の発酵効率データを用いてトウモロコシ価格を$71/tonとした場合、ブタノール価格は$0.55/kgと試算されており⁴)、発酵効率の向上とトウモロコシ価格の変動との関係が議論されている。本研究では、スイートソルガムを用いた分散型バイオ燃料生産システムのなかで、将来的に考えられるバイオブタノールへのシフトに対応できる経済的に良好なサブシステムを構築することをめざす。

## 2 ．研究開発目的

（１）本研究では酵母を利用したスイートソルガムからの効率的で簡便なバイオエタノール生産技術の開発を目的とし、バイオエタノール生産に適した酵母およびスイートソルガムの選抜を検討した。さらに、繰り返し回分発酵（Repeated-batch fermentation）を用いたスイートソルガム搾汁液からの効率的なエタノール生産法を検討した。

（２）搾汁可能となる登熟期を迎えたスイートソルガムの繊維成分はセルロースやヘミセルロースが大部分であるが、さらに固い構造を示し、反芻家畜が分解できないリグニンも多いと考えられる。そこで、本研究では、予めリグニンの構造を脆弱化する必要があると考え、物理的処理の