Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
また、光学顕微鏡による結晶成長観察で示したように、金マイクロプレートは初期の形状を保ったまま結晶成長する。金マイクロプレートの(111)面は、他の面に比べて表面自由エネルギーが低いことが知られている $ ^{1,9,10} $ 。このため金結晶成長段階において、BSAは、Fig. 3.17に示すように、金マイクロプレートの(111)面に吸着した状態で存在すると考えられる。そのため、(111)面では結晶の成長が抑制され、二次元的に結晶成長が進行すると推測される（Fig. 3.18）。

Fig. 3.17 金マイクロプレート成長過程の考察 Step 1 : 金イオンの BSA への吸着 Step 2 : BSA 上での金イオンの還元 Step 3 : 金結晶の核生成 Step 4 : 金結晶の成長

Fig. 3.18 金マイクロプレートの(111)面
## ①原子吸光用金標準溶液（HAuCl_{4} in 2M HCl）を用いた場合

原子吸光用金標準溶液とアミノ酸を用いて、金マイクロプレートの調製が可能であるかについて検討した。その結果、5 mM 金イオン溶液に 0.4 M Phe、100 μl/ml ピペリジンを添加し、100℃で6時間加熱することにより、Fig. 3.19(a)のような金マイクロプレートが得られた。この金マイクロプレートはサイズが数十μmと非常に大きく、同時に棒状の金ロッドも生成していた。また、金イオン濃度が1 mMの場合は、Fig. 3.19(b)に示すように、ごくわずかの金プレートや金ロッドが生成したが、生成物の多くは金コロイドの凝集体であった。このように、Pheを用いた場合でも、ピペリジンを添加することにより金マイクロプレートの調製は可能であったが、BSAを用いた場合に比べると、金マイクロプレートの生成量は非常に少なく、サイズのばらつきも大きかった。また、他のアミノ酸（His、Gly、Tyr、Leu、Met、Trp）を用いて、Pheと同様の反応を行っても金マイクロプレートは生成しなかった。Fig. 3.20に示すように、GlyとLeuでは何も観察されず、His、Tyr、Met、Trpでは金コロイドの凝集体が観察された。

ピペリジンの代わりに、アセトン、ジメチルホルムアミド、ベンジルアルコール、ベンズアルデヒド、ジェチルエーテル、ジェチルアミン、エタノールを用いて反応を行った場合、アセトンを用いた場合にのみ、Fig. 3.21 (a) に示すような金マイクロプレートが生成した。しかし、Phe を添加せず、アセトンと原子吸光用金標準液を混合して加熱した場合でも、Fig. 3.21 (b) のような金マイクロプレートが生成した。

Fig. 3.19 Phe と 金 イ オ ン を 混 合 し 、 加 熱 し て 得 ら れ た 溶 液 の 頭 微 鏡 写 真
His

HAuCl_{4}

amino acid

piperidine

Volume

Temp.

Time

5 mM

0.5 M

50 $ \mu $ L

0.5 mL

100 $ ^{\circ} $ C

6 h

Gly

Tyr

Leu

Trp

Met

Fig. 3.20 6種類のアミノ酸と金イオンを混合後、加熱して得られた溶液の顕微鏡写真

20 μm

Fig. 3.21 (a) Phe、アセトンにより調製した金マイクロプレート (b) アセトンにより調製した金マイクロプレート
原子吸光用金標準溶液の代わりに、塩化金を Milli-Q 水に溶かした溶液を用いて金マイクロプレートの調製が可能であるか検討した。塩化金水溶液を用いた場合には、ピペリジンなどの有機溶媒を添加したり、反応温度を100℃まで上昇させたりすると、黒色沈殿が生成した。したがって、ここでは有機溶媒を添加せず、より低温条件下で反応を行った。アミノ酸は、Phe、Gly、Tyr、Leu、Glu、Asn、Met、Argの8種類を用いて、塩化金水溶液5 mM、反応温度60、80℃の条件下で6時間反応させることにより、金マイクロプレートを調製可能であるか検討した。金マイクロプレートが得られた反応条件と生成した金マイクロプレートの顕微鏡写真をFig. 3.22に示す。Fig. 3.22(a)は、Glyを用いて80℃において反応を行った場合で、数μmの少量の金マイクロプレートが生成した。Fig. 3.22(b)は、Leuを用いて80℃で加熱した場合で20 μm程度の金マイクロプレートが生成した。Gluを用いて60℃で加熱した場合においても、極めて少量ではあるがFig. 3.22(c)に示したような金マイクロプレートが観察された。他の条件の場合では金マイクロプレートは生成せず、多くの場合で褐色沈殿が生成するか溶液状態のままであった。

また、塩化金水溶液の濃度が1 mMの場合は、いずれの条件においても金マイクロプレートは生成しなかった。ほとんどの条件において茶褐色もしくは黒色の沈殿が生成したが、いくつかの条件において有色の溶液が得られた。有色溶液が得られた条件及び有色溶液の性質については、次節で述べる。
(a)	反应条件
HAuCl4	5 mM
Gly	0.1 M
Volume	0.5 mL
Temp.	80℃
Time	6 h
(b)	反应条件
HAuCl4	5 mM
Leu	0.1 M
Volume	0.5 mL
Temp.	80℃
Time	6 h
(c)	反应条件
HAuCl4	5 mM
Glu	0.1 M
Volume	0.5 mL
Temp.	60℃
Time	6 h

Fig. 3.22 5 mM 塩化金水溶液を用いた場合に金マイクロプレートが得られた反応条件と生成した金マイクロプレートの顕微鏡写真

塩化金水溶液（$\mathrm{HAuCl_{4}}$）と BSA 混合溶液の加熱による金ナノ粒子の生成

1 mM 塩化金、0.1 M His 混合溶液を $ 80^{\circ} $ C において、30 分加熱すると Fig. 4-30 の左端に示すような紫色溶液が得られた。また、1 mM 塩化金水溶液と 0.1 M His、Arg、Met を混合して 3 時間加熱すると、Fig. 3.23 に順に示した薄紅色、薄青色、黄色の溶液が得られた。これらの溶液が着色したことから、加熱により塩化金が還元されて金ナノ粒子が生成した可能性が考えられる。そこで、それぞれの溶液について、DLS 測定と UV-vis スペクトル測定を行った。

Fig. 3.24 に、DLS 測定の結果を示す。His を用いて $ 80^{\circ} $ C で反応させた場合は、530 nm 付近に単一のピークが得られた。His を用いて $ 60^{\circ} $ C で反応させた場合には、17 nm 付近のピークに加え、5000 nm 付近に
ブロードしたピークが観測された。Arg を用いて 60℃ で反応させた場合は、180nm 付近と 600nm 付近にピークが見られた。また、Met を用いて 60℃ で反応させた場合は 149nm 付近に単一のピークが見られた。

Fig. 3.25 に、UV-vis スペクトルの結果を示す。His を用いて 80℃ で反応させた場合は、金ナノ粒子の SPR に由来すると考えられる 570nm 付近の吸収が観測された。His を用いて 60℃ で反応させた場合にも 520nm 付近にわずかなピークが見られ、この場合も金ナノ粒子の存在が示唆された。Arg と Met の場合は、金ナノ粒子特有のピークは観測されず、発色は別の要因によるものと考えられる。

Fig. 3.23 1 mM 塩化金水溶液とアミノ酸を混合後、加熱して得られた溶液

用いたアミノ酸と反応温度：左から、His 80℃、His 60℃、Arg 60℃、Met 60℃

Fig. 3.24 Fig. 3.23 の 溶液 の DLS
Fig. 3.25 Fig. 3.23 の 溶液 の UV-vis スペクトル

### 3.4 結言

本章では、タンパク質を利用した金マイクロプレートの開発を行い、金イオンと BSA をそれぞれ 1 mM、2 mg/ml になるように混合し、100℃において 3 時間反応させることにより、金イオンが還元され、金マイクロプレートが生成することを明らかにした。このとき得られた金マイクロプレートのサイズは数 $ \mu m $ 、厚さは 70-100 nm であった。金イオン濃度が低くなる程金マイクロプレートの厚みは薄くなり、金イオン濃度が高すぎると金マイクロプレートは生成しなかった。また、BSA 濃度が低すぎると金マイクロプレートは生成せず、BSA 濃度が高くなるとサイズが大きくなり、丸みを帯びた金マイクロプレートが生成した。さらに、金マイクロプレートは極めて低い条件下で生成することが明らかになった。

BSA 以外のタンパク質を用いた場合においても金マイクロプレートは生成したが、タンパク質によって金マイクロプレートよりも金粒子の方が多く生成するものもあった。また、アミノ酸である Phe を用いた場合には、少量のピペリジンまたはアセトンを添加することにより金マイクロプレートを得ることに成功した。

これらの検討結果から、バイオマスを用いた金属イオン吸着実験に
おいても、金やパラジウムあるいは白金イオンの還元が生じている可能性が示唆された。
## 参考文献

1) S. P. Chandran, M. Chaudhary, R. Pasricha, A. Ahmad, M. Sastry, Biotechnol. Prog., 22, 577 (2006).

2) B. Liu, J. Xie, J. Y. Lee, Y. P. Ting, J. P. Chen, J. Phys. Chem. B, 109, 15256 (2005).

3) Y. Shao, Y. Jin, S. Dong, Chem. Commun., 1104 (2004).

4) E. Jette, F. Foote, J. Chem. Phys., 3, 605 (1935).

5) H. C. Chu, C. H. Kuo, M. H. Huang, Inorg. Chem., 45, 808 (2006).

6) X. Sun, S. Dong, E. Wang, Langmuir, 21, 4710 (2005).

7) Z. Li, Z. Liu, J. Zhang, B. Han, J. Du, Y. Gao, T. Jiang, J. Phys. Chem. B, 109, 14445 (2005).

8) J. A. Tossell, Geochem. Cosmochim. Acta, 60, 17 (1996).

9) M. Tsuji, M. Hashimoto, Y. Nishizawa, M. Kubokawa, T. Tsuji, Chem. Eur. J., 11, 440 (2005).

10) C. Kan, X. Zhu, G. Wang, J. Phys. Chem. B, 110, 4651 (2006).
## 第四章 卵殻膜における貴金属イオン吸着現象の機構解明

### 4.1 绪言

第一章でも述べたように貴金属イオンを生体由来材料、バイオマスで回収する技術の確立は多方面において盛んに行われている。当研究室においてもバイオマス、特にタンパク質を多く含有するタンパク質性材料を用いて貴金属イオンを回収する検討を行ってきた。Fig. 4.1に示すように、鶏卵の卵殻膜が貴金属イオンの吸着量、選択性ともに最も優れた能力を有することが分かっている。また卵殻膜を用いることで実際に工業廃液から貴金属イオンを分離回収することも可能であることを既に報告している。(Fig. 4.2) $ ^{1)} $

Fig. 4.1 混合モデル溶液からの吸着量

Fig. 4.2 卵殻膜による実在廃液からの貴金属イオンの吸着
しかしながら、卵殻膜による吸着が可能であることは分かっているが、どのような条件下においてどのように吸着しているかは未だ不明確である。一方で微生物などの生体材料を用いた貴金属イオン回収では貴金属イオンは還元されているという報告もある $ ^{2)} $ 。そこで、本章では貴金属イオンを吸着させた卵殻膜から還元された貴金属微粒子あるいは貴金属イオンの脱着が可能か試み、さらに貴金属イオンを吸着した卵殻膜を透過型電子顕微鏡で観察し、金属微粒子が存在しないか検討した。また貴金属イオンは溶液中で様々な錯体構造を形成して存在する。これまで特定の錯体種のみしか検討されていないことから、錯体種の違いが吸着に及ぼす影響も検討した。

### 4.2 チオ尿素による金イオンの脱着

#### 4.2.1 試薬

吸着させる $ Au^{3+} $ は $ HAuCl_{4} $ を用い、Merck(株)からも購入した 1,000 ppm 原子吸光光度計測定用標準溶液を希釈して用いた。脱着剤として和光純薬工業(株)から購入した試薬特級のチオ尿素を用いた。吸着剤としてキューピー(株)から提供していただいた卵殻膜を用いた。卵殻膜の特徴を以下に示す。

## 卵殼膜

卵殻膜(Fig. 4.3)は卵殻の内側に存在する薄膜のことで、その構造は厚い外膜と薄い内膜から成り、それぞれ網目状になった繊維から構成されている。この卵殻膜は様々な卵加工品の製造過程において大量に発生する。主な成分は約94％を占める水に不溶なタンパク質であり、コラーゲンなどの細胞間基質のようなものであると考えられている。卵殻膜は多くの架橋アミノ酸(プロリン,シスチン)を含有、S-S結合で繊維同士が絡まっている。これまで大量に発生する卵殻膜のほとんどが廃棄処理されてきたが、近年様々な用途開発がすすめられ、生体親和性が良いなどの特性を持つことが明らかとなり、健康補助食，化粧品，ヘアケア製品，衣類などですでに製品化されている。
Fig. 4.3 卵殼膜

#### 4.2.2 実験方法

Au^{3+}が100 ppmとなるように希釈したAu^{3+}溶液10 mlに卵殻膜を100 mg加え、吸着時間を10分,1時間,24時間と変化させて、卵殻膜にAu^{3+}を吸着させた。その後遠心分離し、上澄みを別の容器に分け濃度測定を行い、吸着量を計算した。分離した卵殻膜は純水で3回洗浄したのち、100 mMのチオ尿素水溶液に1時間浸漬し、Au^{3+}を脱着させ濃度分析を行い、吸着量との比から脱着率を算出した。また脱着液の粒径測定を行い、金属微粒子が存在しないか検討した。

濃度分析には誘導結合プラズマ発光分光機(ICP-OES, SPS-3100, エスアイアイ・ナノテクノロジー(株))を用いて定量分析を行った。また粒径測定には動的光散乱計(DLS, ELSZ-2, 大塚電子(株))を用いた。

#### 4.2.3 結果と考察

チオ尿素は金(Ⅲ)イオンを金(Ⅰ)イオンに還元し Fig. 4.4 のような錯体構造を形成して溶液中に分散させることが知られている $ ^{3)} $ 。本実験では卵殻膜に吸着している金元素の脱着が可能か、またどのような状態で吸着しているか検討した。

Fig. 4.4 金イオンとチオ尿素の

チオ尿素による金元素の脱着率を Fig. 4.5 に示す。吸着時間の増加に伴いわずかに脱着率の減少が見られた。しかし吸着に 24 時間吸着させても 80% 以上の金元素が卵殻膜から脱着したことが分かった。
このことからチオ尿素を用いて $ Au^{3+} $ を卵殻膜から脱着できることが分かり、また卵殻膜と金元素の相互作用はチオ尿素と金元素の相互作用にくらべ弱いことが分かった。

Fig. 4.5 チオ尿素による脱着

またチオ尿素により卵殻膜から金属微粒子も脱着できることを期待して DLS にて粒径測定を行ったが、測定は不可能であった。このことからチオ尿素では金属微粒子を脱着することはできないと考えられる。しかし Fig. 4.5 に示した通り、金元素は検出している。チオ尿素では 0 価の金をイオンに酸化しないと考えられるため、金元素は卵殻膜にイオンの状態で吸着していると考えられる。

### 4.3 金属イオンを吸着させた卵殻膜の TEM 観察

#### 4.3.1 試薬

吸着させる金属イオンは$\mathrm{HAuCl_{4}}$，$\mathrm{H_{2}PtCl_{6}}$，$\mathrm{Pd(NO_{3})}$を用い、すべてMerck(株)から購入した標準溶液を希釈して用いた。吸着剤としてキューピー(株)から提供していただいた卵殻膜を用いた。

#### 4.3.2 実験方法

初期金属イオン濃度 200 ppm の溶液 20 ml に卵殻膜を 20 mg 加え 24 時間攪拌を行った後、ろ過分離後、ろ紙上に残った卵殻膜を純水で 3 回洗浄し、30℃で乾燥させた。乾燥した卵殻膜を高分解能透過型電子頭微鏡(HRTEM, JEM-2010, 日本電子(株))を用いて観察した。

#### 4.3.3 結果と考察

Au $ ^{3+} $ , Pd $ ^{2+} $ , Pt $ ^{4+} $ を吸着させた卵殻膜の HRTEM 画像をそれぞれ Fig.
4.6−8 に示す。

Fig. 4.6 卵殻膜によって還元さ

Fig. 4.7 卵殻膜によって還元されたパラジウム

Fig. 4.8 卵殻膜によって還元された白金
観察の結果卵殻膜上に金では10−100 nm程度の、白金とパラジウムでは10 nm程度の金属微粒子が確認された。このことから貴金属イオンは卵殻膜によって還元されているものと考えられる。一方、前項で示した通りAu $ ^{3+} $ はイオンの状態でも吸着していることが分かっている。このことから貴金属イオンは卵殻膜上にイオンと金属、両方の状態で吸着していると考えられる。また前項での吸着時間に伴う脱着率の低下は金属微粒子への還元が時間経過とともに進行しているからと予想される。

### 4.4 金属の錯体種による影響

#### 4.4.1 試薬

本実験では以下の試薬使用し実験を行った。

Table 4.1 実験試薬

試薬名	購入元	等級(規格)	備考
1,000 ppm 金標準溶液	Merck(株)	原子吸光用標準溶液	塩化物錯体
1,000 ppm 白金標準溶液	Merck(株)	原子吸光用標準溶液	塩化物錯体
1,000 ppm パラジウム標準溶液	Merck(株)	原子吸光用標準溶液	硝酸塩
1,000 ppm パラジウム標準溶液	和光純薬工業(株)	原子吸光用標準溶液	塩化物錯体
テトラアンミンパラジウム(Ⅱ)塩化物	和光純薬工業(株)	アンミン錯体
過塩素酸銀一水和物	AlfaAesal(株)
2 M 水酸化ナトリウム水溶液	和光純薬工業(株)	容量分析用
#### 4.4.2 実験方法

用いた錯体種を中心となる金属イオンごとに下記に記す。

## 金

金は2種類の錯体種で検討した。Merck(株)製の標準溶液には塩化物錯体が使用されているので、200 ppmに希釈して用いた。また水酸化物錯体を得るため、1 Mに希釈した水酸化ナトリウム水溶液に標準溶液を加え、Au $ ^{3+} $ が200 ppmとなるように混合して用いた。

## パラジウム

パラジウムは5種類の錯体種で検討した。Merck(株)製と和光純薬工業(株)の標準溶液には硝酸塩と塩化物錯体がそれぞれ使用されているので、200 ppmに希釈して用いた。またまた水酸化物錯体を得るため、1 Mに希釈した水酸化ナトリウム水溶液にMerck(株)製の標準溶液を加え、 $ Pd^{2+} $ が200 ppmとなるように混合して用いた。また過塩素酸塩を得るため、100 ppmに希釈した和光純薬工業(株)製の標準液50 mlに過塩素酸銀一水和物を1.22 g塩化物イオンを銀イオンと接触させることにより塩化銀として沈殿させた。この溶液をろ過により沈殿とろ液に分離しろ液を過塩素酸パラジウム水溶液として実験に用いた。またテトラアンミンパラジウム(Ⅱ)塩化物は $ Pd^{2+} $ が200 ppmとなるよう純水に溶解して実験に用いた。

## 白金

白金は2種類の錯体種で検討した。Merck(株)製の標準溶液には塩化物錯体が使用されているので、200 ppmに希釈して用いた。また水酸化物錯体を得るため、1 Mに希釈した水酸化ナトリウム水溶液に標準溶液を加え、Pt $ ^{3+} $ が200 ppmとなるように混合して用いた。

吸着剤としては卵殻膜を用いた。金属イオン濃度[ppm]が卵殻膜濃度[ppm]に対して1.2倍となるよう卵殻膜の質量と金属イオン溶液の体積を定め、実験を行った。この実験条件では金属イオンが大過剰であると考えられる。24時間攪拌した後ろ過分離し、ろ液をICP-OESもしくは原子吸光光度計(AAS, Z-2310,(株)日立ハイテクノロジーズ)を用いて金属濃度を測定し、吸着量を算出した。

#### 4.4.3 結果と考察

Au $ ^{3+} $ の錯体種による影響を Fig. 4.9 に、溶液の pH と吸着せずに溶
液中に残存していた $ Au^{3+} $ の比(残存率[%])とを Table 4.2 に示す。

Fig. 4.9 金の錯体種の影響

Table 2.2 金溶液の pH と残存率

pH	残存率 [%]
$ [\mathrm{AuCl}_{4}]^{-} $	0.47	92.9
$ [\mathrm{Au}(\mathrm{OH})_{4}]^{-} $	13.8	96.9

検討の結果 $ Au^{3+} $ では錯体種を水酸化物錯体にすると塩化物錯体にくらべ大幅に低下した。溶液中の pH が 13 にまで上昇しているため、一概には言えないが錯体種が大きく影響を及ぼしていると予想される。

パラジウムイオンの錯体種の影響を Fig. 4.10 に、溶液の pH と残存していた $ Pd^{2+} $ の残存率を Table 4.3 に示す。

Fig. 4.10 パラジウムの錯体種の影響
Table 4.4 パラジウム溶液の pH と残存率

pH	残存率 [%]
Pd(NO3)2	0.78	85.1
[PdCl4]2-	0.60	92.8
Pd(ClO4)2-	1.10	91.9
[Pd(OH)4]2-	14.0	91.3
[Pd(NH3)4]2+	8.11	75.2

検討の結果、硝酸塩とアンミン錯体が最も吸着量が高いことが分かった。塩化物錯体と過塩素酸塩，水酸化物錯体ではあまり吸着量に変化はなかった。

白金イオンの錯体種の影響を Fig. 4.11 に、溶液の pH と残存していた Pt^{4+} の残存率を Table 4.4 に示す。

Fig. 4.11 白金の錯体種の影響

Table 4.4 白金溶液の pH と残存率

pH	残存率 [%]
$ [PtCl_{6}]^{2-} $	0.45	92.2
$ [Pt(OH)_{6}]^{2-} $	13.5	91.9

錯体種の組み合わせとしては $ Au^{3+} $ と同様であるが $ Au^{3+} $ 程顕著な変化
は見られなかった。このことから $ Au^{3+} $ と $ Pt^{4+} $ とでは吸着機構に違いがあることが示唆される。

### 4.5 結言

本章ではタンパク質性材料である卵殻膜を用いて貴金属イオン吸着にかかわる因子を検討した。その結果、卵殻膜に対して$\mathrm{Au}^{3+}$はイオンの状態と還元された金属の状態両方で存在していることが分かった。またパラジウムや白金でも同様に還元された金属微粒子を表面上に観察することが出来た。また$\mathrm{Au}^{3+}$と$\mathrm{Pd}^{2+}$ではイオンの錯体種により大きくその吸着性能は変化しており、今後詳細な検討を進める必要があると考えられる。一方$\mathrm{Pt}^{4+}$ではあまり変化が見られなかった。このことから同じ貴金属でも吸着機構に違いがあることが示唆された。
## 参考文献

1. O. E. Piro, E. E. Castellano, R. C. V. Piatti, A. E. Bolzan, A. J. Arvia, Acta Cryst., 58, 252 (2002).

2. A. L. Horwich, J. S. Weissman, Cell, 89, 499(1997).
## 第五章 精製タンパク質における吸着メカニズムの解明

### 5.1 绪言

第四章ではタンパク質性材料である卵殻膜に特化して検討を進めてきたが、卵殻膜は単一のタンパク質から構成されておらず、分子論的な検討は困難である。そこで本章では精製タンパク質を検討対象としてメカニズム解明を目指し、特にタンパク質の糖鎖、および高次構造に注目した。ここでまず、生体における糖鎖と糖鎖を有する糖たんぱく質の役割について述べる。

## 生体における糖鎖

糖鎖とは Fig. 5.1 に示すような単糖がグリコシド結合することにより連なった一群の化合物をさす。糖鎖を構成する糖はアミノ酸やデオキシリボ核酸と違い、反応点が複数あることから、その化合物である糖鎖は複雑で立体的に多様な構造を形成し、DNA, タンパク質に続く生体を構成する第三の鎖と呼ばれる。糖鎖はタンパク質とも結合することができ、アミノ酸のセリンやスレオニンのヒドロキシル基と結合した糖鎖を O-型、アスパラギンのアミンに結合した糖鎖を N-型で結合している糖鎖と称す $ ^{1} $ 。

Fig. 3.1 糖鎖を構成する代表的な担当

A: グルコース, B: マンノース,

C: N-アセチルグルコサミン

## 糖タンパク質

糖タンパク質とは分子中に糖鎖を有するタンパク質である。先にも述べたとおり糖鎖はその複雑で多様な立体構造を有するため、糖タンパク質は糖鎖を利用してわずかに異なる構造を精密に認識させることにより様々な生理現象を司るタンパク質である。糖鎖はその構造中に金属イオンを配位させることができるヒドロキシル基やカルボニル基、自身が酸化されることにより還元することができるアルデヒド
が存在するため金属吸着因子である可能性がある。

またタンパク質の高次構造について説明する。

## タンパク質の高次構造

タンパク質とは約20種類のα-アミノ酸が直列にアミド結合を繰り返すことにより構成される高分子である。しかし、ただアミノ酸が鎖状に連なっている構造(一次構造)では生体特有の機能は発揮されない。タンパク質は分子中で水素結合やS-S結合を形成し折りたたまれ、また複数の分子が会合することにより特有の機能を発揮する。高次構造が崩壊したり、正確に構成されなかったりする場合は機能が発揮されないばかりか、狂牛病やアルツハイマーなどに代表されるフォールディング病を引き起こすことがあると言われている $ ^{2)} $ 。金属イオンを吸着させるときその吸着サイトが立体的に近傍に存在するときより効果的な吸着がおこりうると考えられ、高次構造も金属イオンの吸着因子として考えられる。

以上のようにタンパク質に含まれる糖鎖や、タンパク質の高次構造は金属吸着に関係していると予想される。そこで糖鎖の影響を酵素反応を利用して検討した。また高次構造の影響を変性剤を用いて検討を行った。

### 5.2 糖タンパク質における糖鎖の影響

#### 5.2.1 試薬

モデル糖タンパク質としてシグマアルドリッチジャパン(株)から購入した卵白由来アルブミン(OVA)、和光純薬工業(株)から購入した西洋わさび由来ペルオキシダーゼ(HRP)、ナカライテスク(株)から購入したAspergillus niger由来グルコースオキシダーゼ(GOD)、対照実験として糖鎖を有さないタンパク質である牛血清アルブミン(BSA)を和光純薬工業(株)から購入したものを用いた。また糖鎖をタンパク質から切除するため、ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン(株)から購入したEndo-α-N-acetylgalactosaminidaseを用いた。また緩衝液に用いるため和光純薬工業(株)から購入した試薬特級のリン酸水素2ナトリウムとリン酸2水素ナトリウム、2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol(tris)，塩化ナトリウムと容
量分析用 1 M 塩酸を用いた。吸着させる金属は Merck(株)から購入した金標準液を用いた。

#### 5.2.2 実験方法

まず購入した Endo-α-N-acetylgalactosaminidase 水溶液を pH 7.5 に調製した 20 mM tris-HCl, 50 mM NaCl 水溶液で 1,000,000 倍に希釈する。タンパク質を pH 6.0 に調製した 0.2 M リン酸緩衝液 10 ml に 1.5 mg 程度溶解させた後、1,000,000 倍酵素溶液を 10 μl 加え 37℃ で 16 時間振とうした。その後サンプル液をスペクトラムラボラトリーズ(株)製の分画分子量 10,000 の透析チューブ(Spectra/Por 7 membrane)に移し、純水で一晩透析した。その後透析した溶液をサンプル瓶に移した後 1,000 ppm の金標準液を 5 ml 加えたのち 24 時間攪拌し、日本ミリポア(株)から購入した分画分子量 10,000 の遠心限外ろ過膜(Amicon Ultra)を用いてタンパク質と溶液を分離し、溶液の Au^{3+} 濃度を ICP-OES で測定して吸着量を算出した。

#### 5.2.3 結果と考察

検討の結果を Fig. 5.2 に示す。糖タンパク質である OVA, HRP は酵素反応後、$\mathrm{Au}^{3+}$ の吸着性が低下することが分かった。一方、糖タンパク質である GOD および糖鎖を有さないタンパク質である BSA は吸着性にあまり変化は見られなかった。今回用いた酵素は O-型で結合している糖鎖をタンパク質から切断する酵素である。GOD は O-型ではなく N-型で結合しているため酵素反応が進行せず、糖鎖が切除されなかったため吸着性に変化が表れなかったと考えられる。また BSA は分子中に糖鎖が存在しないため、酵素反応の影響は受けず当然吸着性に変化は表れなかった。以上より OVA と HRP では糖鎖を切除されると $\mathrm{Au}^{3+}$ の吸着性が低下していることから糖鎖も $\mathrm{Au}^{3+}$ 吸着に関与しているものと示唆された。
Fig. 3.2 糖鎖切除による $ Au^{3+} $ の吸着性

### 5.3 タンパク質の高次構造の影響

#### 5.3.1 試薬

モデルタンパク質として和光純薬工業(株)から購入した牛血清アルブミン(BSA)を用いた。また変性剤として和光純薬工業(株)から購入した試薬特級の尿素を用い、還元剤としてサーモフィッシャーサイエンティフィック(株)から購入した固定化 tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) ゲルを用いた。また緩衝液に生化学用 2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol (tris)と容量分析用 1 M 塩酸を用いた。吸着させる金属は Merck(株)から購入した金標準液を用いた。

#### 5.3.2 実験方法

pH 7.5 に調製した 100 mM tris-HCl 緩衝液に尿素を濃度が 8 M となるよう溶解させ、変性液とした。変性液 10 ml に BSA10 mg 溶解させ 1.0 mg/ml の BSA 溶液を作成した。また固定化 TCEP ゲルスラリーは一度等量の純水を加え洗浄したのち遠心分離により上澄みを除去した。BSA 溶液 1 ml に対してスラリー基準で 1 ml の固定化 TCEP ゲルを 3 時間接触させ、BSA を完全変性した。変性後固定化 TCEP ゲルは遠心分離およびろ過により完全に分離した。その後分離液 1 ml に対して 8M 尿素、500 ppm Au^{3+} 溶液を 2.4 ml 加え 24 時間室温で攪拌し、日本ミリポア(株)から購入した分画分子量 10,000 の遠心限外ろ過膜 (Amicon Ultra) により BSA を分離した。ろ液は ICP-OES により濃度分析を行い、吸着量を算出した。対照実験として変性作業を行わなかつ
た BSA でも同様の検討を行った。

#### 5.3.3 結果と考察

実験結果を Fig. 5.3 に示す。検討の結果変性させることにより BSA の $ Au^{3+} $ の吸着性能は低下することがわかった。このことより高次構造によって、吸着サイト同士の微妙な距離感が吸着に影響を及ぼすということが分かった。だが一方で完全に変性を行ってもある程度の吸着がみられている。8 M の尿素水溶液中ではタンパク質はその高次構造は完全に崩壊、直鎖状に存在すると言われる。今回はさらに S-S 結合も還元剤により切断しており、一次構造のみが吸着性に寄与すると考えられる。これにより特定のアミノ酸、もしくはアミノ酸配列が吸着に影響を及ぼすことが示唆された。

Fig. 3.3 タンパク質の変性の影響

### 5.4 結言

本章では精製タンパク質に対して $ Au^{3+} $ 吸着における糖鎖の影響と高次構造の影響を検討した。結果、糖鎖および高次構造はいずれも $ Au^{3+} $ 吸着に寄与しており、今後タンパク質性材料を貴金属吸着剤として用いるときの指針となると考えられる。また一方で高次構造が崩壊しても $ Au^{3+} $ 吸着性能を保持していることからアミノ酸配列にも吸着の因子が存在することが示唆された。
## 参考文献

1) 改定第 3 版 タンパク質実験ノート 下卷, 148, (2004).

2) A. L. Horwich, J. S. Weissman, Cell, 89, 499(1997).
## 第六章 ペプチドマッピング法を利用した吸着サイトの同定を目指した基礎的検討および精製タンパク質への適用

### 6.1 緒言

第五章で述べたとおり、タンパク質において金属イオン吸着には一次構造も関与していると考えられる。アミノ酸配列への金属イオン吸着の検討は多方面で進められている。丸山らは合成ペプチドを表面上に生やした樹脂に対して貴金属イオンを吸着させ、その配列によって吸着量に差異があることを突き止めている $ ^{1} $ 。

Fig. 6.1 N 末端をアセチル化した X-Gly-Leu トリペプチドを表面にはやした樹脂の貴金属イオン吸着

これまでの検討ではペプチドを合成し、検討を進めるボトムアップ型の検討である。そこで本章ではペプチドマッピング法を利用してトップダウン的な手法により精製タンパク質の吸着サイトの同定を試みた。ここでペプチドマッピング法および酵素消化に用いた酵素であるトリプシンについて説明する。

## ペプチドマッピング法

タンパク質の一次構造を決定する方法として用いられる。酵素消化や化学消化によって断片化させたペプチド混合物を分離しその分解特異性を考慮して理論的に考えられる断片との比較からアミノ酸配
列を決定する方法である。かつては高速液体クロマトグラフ(HPLC)などが分離に用いられてきたが近年は質量分析法が発達してきており、多種類のサンプルを短時間で検出できるマトリックス支援レーザー脱離イオン化法-飛行時型質量分析法(MALDI-TOF/MS)も利用されてきている $ ^{2)} $ 。

## トリプシン

膵臓から分泌されるトリプシノーゲンから生成されるタンパク質消化酵素の一種である。C末端側にプロリンが結合していない塩基性アミノ酸(リジンとアルギニン)のC末端側のアミド結合を加水分解することにより消化反応を進行させる $ ^{3)} $ 。膵臓からは、同じくタンパク質消化酵素であるキモトリプシンの誘導体も同時に精製されるため、完全な分離は困難である。よって厳密な基質特異的消化を行うためにキモトリプシンの酵素活性を阻害する必要がある。近年はL-1-tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl ketone (TPCK)によってキモトリプシンを不活性化したトリプシンも販売されており、大いに活用されている。

まず本検討が可能なのか確認するために予備実験としてグリシン(G)とヒスチジン(H)によって GGHGGH という配列に固相合成法で合成したキサペプチドを用いて検討を行った。また実際にトリプシンを用いて牛由来の Ribonuclease A (RNase A)を分解して実験を行った。

### 6.2 合成ヘキサペプチドでの検討

#### 6.2.1 試薬

固相合成用の樹脂としてすでにヒスチジンが表面上に固定化されている H-His(Trt)-Trt(2-Cl)-Resin (His-resin)、アミノ末端が Fmoc により保護されている Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Gly-OH, およびジメチルホルムアミド(DMF), トリフルオロ酢酸(TFA)、O-(1H-Benzotriazol-1-yl)-N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU), 1-Hydroxy-1H-benzotriazole Hydrate (HOBt·H₂O), Triisopropylsilane (TIPS)を渡辺化学より、N,N-diisopropylethylamine (DIEA)を東京化成(株)から、ジクロロメタン(DCM), 試薬一級メタノール, ジエチルエーテルおよびカイザーテストキットを和光純薬工業(株)より購入して用いた。また吸着させる金属イオンとして Merck(株)から購入した金標
準液を用いた。

#### 6.2.2 実験方法

## GGHGGH の合成

今回は固相合成法の一種である Fmoc 法を用いてヘキサペプチドを以下の手順で合成した。

HBTU 3.05 g, DMF 16 ml, HOBt·H₂O 1.25 g を混合し、反応液 A とする。

DIEA 2.75 ml, DMF 14.25 ml を混合し、反応液 B とする。

1. カラムに His-resin を 0.461 g (0.3 mmol 相当) 充填する。

2. DCM 約 5 ml で三回洗浄する。

3. DMF 約 5 ml で三回洗浄する。

4. 3 倍量 Fmoc アミノ酸(G: 0.297 g, H: 0.620 g)をカラムに加える。

5. 反応液 A, 反応液 B を 2.1 ml ずつ加え、1 時間ボルテックスする。

6. 溶液を捨て、重合を確認するためカイザーテストを行う。

このときポジティブであったら2からの作業を繰り返す。

ネガティブであったら次の作業に移る。

7. DCM で三回洗浄する。

8. DMF で三回洗浄する。

9. Fmoc を切り離すため 20% ピペリジン/DMF を 5 ml 加え 1 分ボルテックスする。

10. 溶液を捨て再度 20% ピ ペ リ ジン / DMF を 5 ml 加え 45 分 ボ ル テ ッ ク ス する。

11. 溶液を捨て、DMFで三回洗浄する。

12. 任意の配列を形成するまで 2-11 の作業を繰り返す。

13.メタノールで三回洗浄する。

14.24 時間真空乾燥する。

15. 樹脂から切り離すために TFA 2.8 ml, TIPS 0.1 ml, 純水 0.1 ml 加え 2 時間攪拌する。

16. 溶液を回収し、切り出しきれなかったペプチドを回収するためさらに 0.1 ml の TFA を加え溶液を回収する。この作業を 3 回繰り返す。

17. 回収した溶液に過剰量のジェチルエーテルを加え析出させる。

18.遠心分離し上澄みを廃棄する。

19.16-17 の作業を 4 回繰り返し、完全にペプチドを析出させ、さらに
有機溶媒を除去する。

20.一晩真空乾燥する。

以上の操作より GGHGGH(分子量 520.5)の配列を有するヘキサペプチドを合成した。

合成したヘキサペプチドは逆相高速液体クロマトグラフシステム(RP-HPLC，島津製作所(株))を用いて10×30 mmのODSカラム(Inertsil®ODS-3，ジーエルサイエンス(株))により精製を行った。精製の際に0.1 wt% TFA/水溶液をA液、0.1 wt% TFA/アセトニトリル溶液をB液としてサンプルをA液に1.0 mg/mlとなるよう溶解させHPLCに投入し、Table 6.1にしめすプログラムによりB液のグラジェントをかけ、波長230 nmの吸光度を測定することによりクロマトグラムを得るとともに、サンプルを分取した。

Table 6.1 グラジェントプログラム

時間
[分]	B 液濃度
[vol%]
0	0
5	0
5.01	40
15	80

また、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法-飛行時型質量分析装置(MALDI/TOF-MS, Voyager-DE PRO-FLO, Appliedbiosystems(株))およびプロトン核磁気共鳴装置( $ ^{1} $ H NMR, Unity INOVA-400, Varian(株))を用いて同定を行った。MALDI/TOF-MSの際にはマトリックスとしてα-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸を用い、 $ ^{1} $ H NMRの際の重溶媒としては重水を用いた。

## GGHGGH の Au^{3+} 吸着性能

合成した GGHGGH の $ Au^{3+} $ 吸着性能を検討した。GGHGGH を A 液、もしくは $ Au^{3+} $ 100 ppm/A 液 ( $ Au^{3+} $ : 0.508 μmol/l) に 0.5 mg/ml (GGHGGH: 0.962 μmol/l) となるよう溶解し 5 分以上接触させ、HPLC に投入した。Table 6.1 に示すグラジエントプログラムを用い、ピークを分取したのち、凍結乾燥器にて溶媒を除去し 2 M 塩酸 10 ml に溶解した。この溶
液を原子吸光光度計(AAS)にて Au^{3+} の濃度を測定し GGHGGH が Au^{3+} を吸着するか検討した。

#### 6.2.3 結果と考察

GGHGGH の構造を Fig. 6.2 に示す。

Fig. 6.2 GGHGH の構造

MALDI-TOF/MS のスペクトルを Fig. 6.3 に示す。

Fig. 6.3 MALDI-TOF/MS による同定(negative)

予想される分子量 520.5 にわずかに少ない分子量 519.2 の位置にピークが得られたことから合成に成功したと考えられる。観測された分子量と予想値の差は脱プロトンによって起きたと考えられる。また $ {}^{1} $ H NMR によってもイミダゾール環中のプロトンおよびグリシンの α 位
にあるプロトン由来の特徴的なピークが観測されており合成の成功を支持している(Fig. 6.4)。

Fig. 6.4 $ {}^{1} $ H NMR の結果

合成した GGHGGH および Au^{3+} を吸着させた GGHGGH の HPLC クラマトグラムを Fig. 6.5 に示す。今回は波長 230 nm の光の吸光度を観測することによりクロマトグラムを得た。

HPLC の結果から $ Au^{3+} $ の存在によらず保持時間に変化が起きないことが分かった。またこの保持時間約 9 分の鋭いピークが得られた部分を 5 ml 分取し、凍結乾燥後 AAS によって $ Au^{3+} $ の濃度を測定すると Table 6.2 のようになった。比較対象として保持時間約 7 分も同様に分取して検討した。
Fig. 6.5 A: GGHGHのクロマトグラム,

B: $ Au^{3+} $ を吸着させた GGHGGH のクロマトグラム

Table 6.2 GGHGGH による Au^{3+} 吸着

保持時間	測定 Au $ ^{3+} $ 濃度 [ $ \mu $ mol/l] $ ^{*} $	Au $ ^{3+} $ 物質量 [nmol]
7 分	0.10	1.02
9 分	1.88	18.79

*再溶解させた10ml中の濃度

今回は粗成生物を用いて実験しており正確な GGHGGH の物質量は計算できないが、吸光ピークが得られるフラクションと得られないフラクションで 10 以上 $ Au^{3+} $ の物質量に違いがあることから、GGHGGH が $ Au^{3+} $ を吸着していると考えられ、また HPLC と $ Au^{3+} $ 濃度分析を併用することにより $ Au^{3+} $ が吸着しているペプチドとしていないペプチドを識別することができ、吸着サイトの同定に利用できると考えられる。

### 6.3 精製タンパク質 RNase A で吸着サイトの同定

#### 6.3.1 試薬

実験対象のウシ由来 RNase A はナカライテスク(株)から購入したものを用いた。また酸化反応に用いるために 99% ギ酸をナカライテスク(株)から、脱水メタノール、30% 過酸化水素水を和光純薬工業(株)から購入して用いた。消化反応の際にはサーモフィッシャーサイエンティフィクス(株)から購入した TPCK 処理済みウシ膵臓由来トリプシンを
用い、反応場として試薬特級単酸アンモニウムと容量分析用2M塩酸を用いた。また吸着させる金属イオンとしてMerck(株)から購入した金標準液を用いた。

#### 6.3.2 実験方法

RNase A を消化する為に酸化反応によって分子内 S-S 結合を切断した。タンパク質中の S-S 結合は過ぎ酸酸化によりスルホン化され開裂される。過ぎ酸酸化は Hirs らの手法を参考に行った $ ^{4)} $ 。

1. 2.375 ml の 99% ギ酸に 0.125 ml の 30% 過酸化水素水を加え過ギ酸を生成し、2 時間室温で放置し過ギ酸溶液とした。

2. RNase A 50 mg を ギ酸 1.25 ml，脱水メタノール 0.25 ml の混合液に溶解させた。

3. タンパク質溶液と過ぎ酸溶液を30分間氷冷し、その後混合した。

4. 混合液を2時間30分水冷した後、90 mlの水冷水で希釈し、凍結乾燥した。

5. 乾燥したサンプルを 20 ml の純水に溶解させ再度凍結乾燥することで完全に有機溶媒を除去し酸化 RNase A を得た。

生成した酸化 RNase A は Alonso らの手法を元に以下のような方法でトリプシン消化、および HPLC での分離を行った。

1. 0.1 M 炭酸アンモニウム水溶液および 1 mM 塩酸水溶液を調整する。

2. 1 mg/ml となるようトリプシンを 1 mM 塩酸水溶液に溶解する。

3. 酸化 RNase A 11 mg を 1.6 ml の炭酸アンモニウム水溶液に溶解し、そこに 53.45 μl のトリプシン溶液を加え 37°C で 2 時間振とうした。

4. さらに 53.45 μl のトリプシン溶液を加え 4 時間 37℃ で振とうし、その後凍結乾燥し消化物を得た。

消化物の分離に際して 0.1 wt% TFA/水溶液を A 液、0.1 wt% TFA/アセトニトリル溶液を B 液としてサンプルを A 液に 1.0 mg/ml となるよう溶解させ HPLC に投入し、Table 6.3 にしめすプログラムにより B 液濃度を変化させ、波長 214 nm の吸光度を測定し、分離を行った。
Table 6.3 HPLC グラジェントプログラム

時間 [分]	B 液濃度 [vol%]
0	0
5	0
85	32

## トリプシン消化物の $ Au^{3+} $ 吸着性能

消化物の $ Au^{3+} $ 吸着性能を検討した。トリプシン消化物を A 液、もしくは $ Au^{3+} $ 100 ppm/A 液に 2.0 mg/ml となるよう溶解し 5 分以上接触させた後、HPLC に投入した。Table 6.3 に示す濃度プログラムを用い、ピークを分取したのち、凍結乾燥器にて溶媒を除去し 1 M 塩酸 2 ml に溶解した。この溶液を ICP-OES にて $ Au^{3+} $ の濃度を測定しトリプシン消化物が $ Au^{3+} $ を吸着するか検討した。

#### 6.3.3 結果と考察

RNase A のアミノ酸配列を下に記す $ ^{5)} $ 。

KETAAAK FERQHMDSSTSAA SSSNYCNQMMK SR NLTK DR CKPVNTFVHESLADVQAVCSQK NVACK GQTNCYQSYSTMSITDCR ETGSSK YPNCAYK TTQANK HIIVACEGNPYVPVHFDASV

RNase A は分子中に 4 つの S-S 結合を有するため、変性が難しく消化反応を効率的に進めるためには S-S 結合の開裂が必要である。そのため今回は過ぎ酸酸化法により開裂を行った。

消化物のクロマトグラムを Fig 6.6 に示す。
Fig. 6.6 トリプシン消化物のクロマトグラム

参照した Alonso らの HPLC の結果とは保持時間の変動は見られたがピーク数が同数であったため同様に消化できた考え、Alonso らの検討結果を元にピーク中に含まれるペプチド構造を考えると以下のようになる。

Table 6.4 HPLC のピークとペプチド配列

ピーク番号	ペプチド配列
1	Ser-32-Arg-33
2	Asp-38-Arg-39
3	Glu-86-Lys-91
4	Thr-99-Lys-104
5	Lys-1-Lys-7
6	Asn-62-Lys-66
7	Asn-34-Lys-37
8	Phe-8-Arg-10
9	Gln-11-Lys-31
10	Ser-77-Arg-85
11	Tyr-92-Lys-98
12	Asn-67-Tyr-76
13	Asn-67-Arg-85
14	Cys-40-Lys-61
15	His-105-Val-124
トリプシン消化物に Au^{3+}を吸着させた後のクロマトグラムを Fig.6.7 に示す。

Fig. 6.7 Au $ ^{3+} $ を吸着させたトリプシン消化物のクロマトグラム

GGHGGH における検討同様 $ Au^{3+} $ の存在によらず保持時間に大きな変化が起きなかった。またピークが得られた部分を 5 ml 分取し、ICP-OES によって $ Au^{3+} $ の濃度を測定すると Table 6.5 のようになった。

Table 6.5 トリプシン消化物の Au^{3+} 吸着

ピーク番号	測定 Au^{3+}濃度 [μmol/l]*	Au^{3+}物質量[nmol]	アミノ酸数
1	0.065	0.13	2
2	0.043	0.09	2
3	0.058	0.12	6
4	0.070	0.14	6
5	0.049	0.10	6
6	0.038	0.08	5
7	0.041	0.08	4
8	0.042	0.08	3
9	0.055	0.10	21
10	0.047	0.10	9
11	0.050	0.20	7
12	0.174	0.35	10
13	0.230	0.46	19
14	0.241	0.48	22
15	0.246	0.49	20

*再溶解させた2ml中の濃度
ペプチド鎖長が増えるほど吸着量が上昇している傾向が見られた。また、ペプチド鎖中にCysまたはHisを2つ以上含むペプチドの吸着量が上昇している。しかし単純な結論を得ることは難しく、より詳細な検討が必要であると考えられる。

### 6.4 結言

本章ではペプチドマッピング法を応用した精製タンパク質の吸着サイトの同定を目指した。合成ヘキサペプチドを用いた検討によりHPLCと金属濃度測定法を併用することによりAu^{3+}吸着フラクションの検知が可能であることを示し、また実際に精製タンパク質であるウシ由来RNase Aを用いて吸着サイトの同定を試みた。タンパク質は複雑な因子がそれぞれ関わりあうため、単純に吸着サイトを決定することは困難であったが、本手法を用いて精彩な検討を進めることでタンパク質の吸着サイトの同定が可能であると示唆される。
## 参考文献

1) T. Maruyama, H. Matsushita, Y. Shimada, M. Hnaki, S. Sonokawa, N. Kamiya, M. Goto, Environ. Sci. Technol. 41, 1359 (2007).

2) 細胞工学別冊 実験プロトコールシリーズ タンパク質実験プロトコール ①機能解析編, 202, 秀潤社 (1997).

3) 酵素ハンドブック, 545, 朝倉書店 (1982)

4) C. H. W. Hirs, J. Biol. Chem. 219, 611 (1956).

5) UniProt, http://www.uniprot.org/uniprot/P61824, 2012 年 2 月 27 日 閲覧
# 第七章 タンパク質性材料を用いた貴金属イオン分離回収 システムの実用化に向けての検討

### 7.1 緒言

第一章で述べたとおり、様々な研究が進められているにもかかわらず、バイオマスを用いた貴金属イオン分離回収システムは実用化に至っていない。そこで実用化に向けさらなるバイオマスの探索を行い、より吸着剤として適切なバイマスの発見を目指した。また、バイオマスのハンドリング性向上を目指し、シート上への新規な加工法の開発を行った。

### 7.2 多種類のバイオマスの検討

#### 7.2.1 試薬

吸着させる金属イオンとして Merck(株)から購入した金，パラジウム，白金標準液を用いた。貴金属イオンを希釈する溶液には和光純薬工業(株)から購入した容量分析用1 M 塩酸を用いた。競争吸着実験の際には非金属イオンとして鉄、ニッケル、銅の1,000 ppm原子吸光用標準溶液をMerck(株)から購入し、用いた。また本実験では吸着剤としていずれもタンパク質性材料である11種類のバイオマスを用いた。それぞれ紹介する。

## 卵殼膜

卵殻膜は第二章とおなじものを用いた。

## 羽毛粉末

鳥類から得られる羽毛(Fig. 7.1)はその構造から空気を多く保持することが可能なため保温機能が高く、古来より布団や上着などの防寒用具として用いられてきた。また、その形状や色合いにより装飾品として用いられたり、筆記具などに用いられたりしてきた。しかし、個体数として最も多く飼育されている鶏の羽毛に関しては廃棄されているものもある。
Fig. 7.1 羽毛粉末

## 明太子の皮

明太子の皮(Fig. 7.2)とは産卵前のメスのスケトウダラの腹からとれた「タラコ」を塩漬けにして調味液で味付け熟成したもので、明太子の主な成分は水分とタンパク質である。明太子の皮は明太子の加工過程で大量に産出されるため、近年再利用が模索されている。

Fig. 7.2 凍結乾燥した明太子の皮

## 鶏挽肉

挽肉(Fig. 7.3)とは十分に細かく切断されていたり、すりつぶされていたりするものをさす。食用品として用いられる場合、各種の鳥獣類の肉のうち見た目に難があったり、採取された量がごく微量であったりしたときに混合して挽肉として用いることが多いため非常に食用肉としては安価なものになる。とくに鶏のものは生産量や需要の関係上非常に安く、市販のものでは100 gで100円を切ることがままある。一方で食用品であっても、実際の市場では売り残りや食べ残しなどによって廃棄されていることが多いが、活用方法は堆肥として用いる程度しかないのが現状である。
Fig. 7.3 凍結乾燥した鶏挽肉

## 羊腸

羊腸(Fig. 7.4)とは羊の内臓のうちの腸であり、かつてはスポーツ用品の繊維として用いられていた。現在は工業的にソーセージなどの肉詰め用の袋として用いられている。ソーセージとして内部に各種鳥獣類の挽肉を味付けしたものを詰めるため、腸壁に欠陥や空孔があると食品加工に用いることはできない。そのため欠陥や空孔があるものは活用されないまま廃棄されている。

Fig. 7.4 凍結乾燥した羊腸

## 牛皮

牛皮(Fig. 7.5)は牛の皮革であり、牛皮製品として広く鞄や小物など用いられている。牛皮は一度おおまかにはぎとられたのち、なめし処理を施し、各製品別に厚さを一定にする必要がある。そのため必ず廃棄物として削りぶしが発生し、このような廃棄物の活用方法はいまだ確立されていない。