Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
を行い Pseudomonas maltophila が最も高い吸着能を示した。さらに Polyacrylamide に固定化された Pseudomonas 細胞による吸着実験は、高い吸着性能を有したまま、繰り返し実験を行うことが可能であった。

当研究室においても近年タンパク質高含有のバイオマスを用いて貴金属イオンの回収を目指す研究を進めてきた。その結果あるバイオマスにおいては高い貴金属吸着性を示すことが分かってきている。

### 1.5 本研究の目的と構成

これまで述べてきたように、生体由来材料を用いた貴金属イオン回収プロセスの研究は多方面から盛んに行われている。しかしながら、その吸着機構は未だに不明な部分が多い。そこで吸着機構の解明を分子論的観点から検討を行った。また未だに実際の工業化に至っていないため、実用化に向けての検討をすすめた。

第二章では、タンパク質に対する貴金属イオンの吸着挙動を調べ、金、白金、パラジウムイオンが各種タンパク質に吸着することを明らかにした。

第三章では、タンパク質の有する貴金属イオン還元能を調べ、貴金属イオン吸着操作における貴金属イオンのナノ粒子化の可能性を示した。

第四章では卵殻膜による吸着メカニズムの解明のため、一度吸着させた貴金属イオンを脱着させその吸着力を検討し、透過型電子顕微鏡によって貴金属イオンを吸着させた卵殻膜の観察を行った。さらに貴金属イオンの状態による影響をみるため、貴金属イオンの錯体構造を変化させてタンパク質高含有材料である卵殻膜へ吸着させる実験を行った。

第五章ではより一般的な吸着メカニズムの解明を目指し糖タンパク質における糖鎖の貴金属イオン吸着への寄与を検討した。具体的に
は酵素反応を用いて糖鎖を除去した糖タンパク質への吸着力の変化を検討した。またタンパク質の高次構造の影響をみるため変性剤を用いてタンパク質を完全に変性させて検討を行った。

第六章ではペプチドマッピング法を利用した吸着サイトの同定を目指し、その基礎的な実験および、精製タンパク質への適用を行った。

第七章ではタンパク質性材料を用いた貴金属イオンの分離回収システムの実用化を目指し、多種類バイオマスを用いて検討し最適な吸着剤を検討した。またハンドリング性の向上を目指し、シート状への加工法を検討した。

第八章では本研究の総括を行い、タンパク質高含有材料を用いた貴金属イオン回収システムの開発の可能性について述べた。
## 参考文献

1) 工業レアメタル, 120, アルム出版社 (2004).

2) 貴金属・レアメタルのリサイクル技術集成, 165, 株式会社エヌ・ティー・エス (2007).

3) B. Rosenberg, L. Van Camp, T. Krigas, Nature, 205, 609 (1965)

4) 化学と工業, 55 (2002).

5) J. E. Bernes, J.D. Edwards, Chem. Ind., 6, 151 (1982).

6) 井上勝利, ケミカルエンジニヤリング, 37, 1001 (1982).

7) 越村英雄，津田充利，南保，“化学工学シンポジウムシリーズ 31”，9 (1992).

8) F. Z. Aamrani, A. Kumar, L. Beyer, J.L. Cortina, A. M. Sastre, Solvemt Extrs. Ion Exch., 16, 1389 (1998).

9) 生体と金属イオン，学会出版センター.

10) J. P. Craig, Jr., A. G. Garrett, H. B. Williams, J. Am. Chem. Soc., 76, 1570 (1954).

11) G. Pneumatitakakis, C. Chassapis, A. Rontoyianni, J. Inorg. Biochem., 49, 83 (1993).

12) J. A. Cuadrado, W. Zhang, W. Hang, V. Majidi, J. Environ. Monit. 2, 355 (2000).

13) M. Wienken, B. Lippert, E. Zangrando, L. Randaccio, Inorg. Chem., 31, 1983 (1992).

14) S. L. Best, T. K. Chattopadhyay, M. I. Djuran, R. A. Palmer, P. J. Shadler, I. Sovágó, K. Varnagy, J. Chem. Soc., Dalton Trans, 15, 2587 (1997).

15) I. E. Burgeson, N. M. Kostic, Inorg. Chem., 30, 4299 (1991).

16) T. N. Parac, G. M. Ullman, N. M. Kostic, J. Am. Chem. Soc., 121, 3127 (1999).

17) T. N. Parac, G. M. Ullman, N. M. Kostic, J. Am. Chem. Soc. 118, 5946 (1996).

18) T. N. Parac, G. M. Ullman, N. M. Kostic, Inorg. Chem. 37, 2141 (1998).

19) N. M. Milovic, N. M. Kostic, J. Am. Chem. Soc., 124, 4759 (2002).

20) L. Zhu, R. Bakhtiar, N. M. Kostic, JBIC, 3, 383 (1998).

21) T. N. Parac, N. M. Kostic, J. Am. Chem. Soc., 118, 51 (1996).

22) L. Zhu, N. M. Kostic, Inorg. Chem. Chim. Acta, 339, 104 (2002).
23) N. M. Milovic, L-M. Dutca, N. M. Kostic, Inorg. Chem., 42, 4036 (2003).

24) N. M. Milovic, N. M. Kostic, J. Am. Chem. Soc., 125, 781 (2003).

25) I. Hamachi, N. Kasagi, S. Kiyonaka, T. Nagase, Y. Mito-oka, S. Shinkai, Chem. Lett., 1, 16 (2001).

26) E. Braun, Y. Eichen, U. Sivan, G. Ben-Yoseph, Nature, 391, 775 (1998).

27) F. Patolsky, Y. Welzmann, O. Lioubashevski, I. Willner, Angew. Chem. Int. Ed., 41, 2323 (2002).

28) C. F. Monson, A. T. Wooley, Nano Lett., 3, 359 (2003).

29) W. E. Ford, O. Harnack, A. Yasuda, I. M. Wessel, Adv. Mater., 13, 1793 (2001).

30) R. Djalali, Y. Chen, H. Matsui, J. Am. Chem. 124, 13660 (2002).

31) P. Mukherjee, A. Ahmad, D. Mandal, S. Senapati, S. R. Sainkar, M. I. Khan, R. Ramani, R. Parischa, P. V. Ajaykumar, M. Alam, M. Sastry, R. Kumar, Angew. Chem. Int. Ed., 40, 3585 (2001).

32) P. Mukherjee, S. Senapati, D. Mandal, A. Ahmad, M. I. Khan, R. Kumar, M. Sastry, ChemBioChem, 3, 461 (2002).

33) P. Mukherjee, A. Ahmad, D. Mandal, S. Senapati, S. R. Sainkar, M. I. Khan, R. Parischa, P. V. Ajaykumar, M. Alam, R. Kumar, M. Sastry, Nano Lett., 1, 515 (2001).

34) A. Ahmad, S. Senapati, M. I. Khan, R. Kumar, M. Sastry, Langmuir, 19, 3550 (2003).

35) P. L. Witkiewicz, C. F. Shaw. Chem. Comm., 21, 1111 (1981).

36) E. Bordignon, L. Cattalini, G. Natile, A. Scatturin, Chem. Comm., 32, 878 (1973).

37) C. F. Shaw, M. P. Cancro, P. L. Witkiewicz, J. E. Eldridge, Inorg. Chem., 19, 3198 (1980).

38) J. Zou, Z. Guo, J. A. Parkinson, Y. Chen, P. J. Sadler, Chem. Commun., 1359 (1999).

39) T. J. Beveridge and S. F. Koval, Appl. Environ. Microbiol., 42, 325 (1981).

40) R. Pardo, M. Herguedas, E. Barrado, M. Vega, Anal. Bioanal. Chem., 376, 26 (2003).

41) W. Ma, J. M. Tobin, Water Research, 37, 3976 (2003).
42) P. Vasudevan, V. Padmavathy, S. C. Dhingra, Bioresour. Technol., 89, 281 (2003).

43) P. F. Li, Z. Y. Mao, X. J. Rao, X. M. Wang, M. Z. Min, L. W. Qiu, Z. L. Liu, Bioresour. Technol., 94, 193 (2004).

44) D. W. Darnall, B. Greene, M. T. Henzi, J. Michael Hosea, R. A. McPherson, Environ. Sci. Technol., 20, 206 (1986).

45) A. P. M. Antunes, G. M. Watkins, J. R. Duncan, Biotech. Lett., 23, 249 (2001).

46) E. Guibal, N. V. Offenberg Sweeney, M. C. Zikan, T. Vincent, J. M. Tobin, Biol. Macromole. 28, 401 (2001).

47) J. R. Lloyd, P. Yong, L. E. Macaskie, Appl. Environ. Microbiol., 64, 4607 (1998).

48) P. Yong, N. A. Rowson, J. P. G. Farr, I. R. Harris, L. E. Macaskie, Environ. Technol., 24, 289 (2003).

49) P. Yong, N. A. Rowson, J. P. G. Farr, I. R. Harris, L. E. Macaskie, Biotechnol. Lett., 24, 205 (2002).

50) P. Yong, N.A Rowson, J. P. G. Farr, I. R. Harris, L. E. Macaskie, J. Chem. Technol. Biotechnol., 77, 593 (2002).

51) I. Vargas, L. E. Macaskie, E. Guibal, J. Chem. Technol. Biotechnol., 79, 49 (2004).

52) A. Nakajima, W. J. Microbiol. Biotechnol., 19, 369 (2003).
## 第二章 タンパク質に対する貴金属イオン吸着

### 2.1 モデルタンパク質に対するレアメタルイオンの吸着実験

## ① タンパク質に対する各種金属イオンの吸着実験

ここではモデルタンパク質に対する各種金属イオンが共存した水溶液を用いた競争吸着について評価した。実験結果は Fig.2.1 に示す。いずれのタンパク質を用いても、比較的に Pd, Au イオンを吸着し、選択的吸着が可能であることが示唆された。共存する卑金属イオンはあまり吸着されなかった。Pd, Au イオンは水溶液中では塩化物錯体を形成し、負の電荷を帯びており、また多くのタンパク質が等電点を pH 5 前後に有するため、正に帯電しているタンパク質表面と静電的な相互作用によって吸着されている可能性も考えられる。しかしながら、同じ白金属イオンでありながら、Pt イオンはあまり吸着されなかった。従って、単に静電的相互作用でタンパク質へ吸着されているのではないことが推察された。

Fig. 2.1 金属イオン混合溶液中での精製タンパク質に対する金属イオンの競争吸着（pH 1，各種金属イオン 10 ppm，各種タンパク質 0.2 g/l）
② 精製タンパク質に対する Pd イオンと Au イオンの飽和吸着量

Pd イオンと Au イオンの精製タンパク質に対する飽和吸着量を調べた。タンパク質に対して金属イオンが過剰な条件下（吸着率が 40% 以下）で検討し、タンパク質 1 分子あたりに吸着された Pd イオンと Au イオン数を Table 2.1 に示す。この結果から、タンパク質 1 分子あたりに多くの Pd イオンと Au イオンが吸着され、タンパク質一分子に多数の吸着サイトが存在することが示唆された。

Table 2.1 タンパク質 1 分子あたりの Au, Pd イオンの吸着量

タンパク質	Lysozyme	BSA	Ovalbumin
Pd イオン吸着量	14±2	65±2	38±3
Au イオン吸着量	3	25±1	15±2

③ Pd, Au, Pt イオン吸着におけるタンパク質濃度依存性

吸着媒体であるタンパク質の貴金属イオン（Au, Pd, Pt）に対する吸着能を評価するためにタンパク質濃度依存性を測定した。実験条件を Table 2.2 に示す。

Fig. 2.2, 2.3, 2.4 に示すように、金イオンおよびパラジウムイオンの吸着においてタンパク質濃度が上昇するにつれ吸着率は増大した。一方、白金イオンについては、金イオンおよびパラジウムイオン同様に、タンパク質濃度の上昇に伴う吸着率の増加が見られたものの、その吸着量は非常にわずかであり、他の2つの金属イオンに比べ吸着されにくいことが明らかとなった。

Table 2.2 実験条件

金属濃度	10 ppm
0.1 M HCl - NaOH 水溶液	pH 4.0
タンパク質濃度	0.05 ~ 2.0 g/l
Fig. 2.2 金イオン吸着におけるタンパク質濃度依存性

Fig. 2.3 パラジウムイオン吸着におけるタンパク質濃度依存性
Fig. 2.4 白金イオン吸着におけるタンパク質濃度依存性

④ Au イオンおよび Pd イオン吸着における pH 依存性

次に、モデルタンパク質による金イオンおよびパラジウムイオンの吸着における pH の影響を評価した。実験条件を Table 3.3 に示す。

金イオンは、吸着率は pH 6.0 以下で 90％以上の値を得た。一方、pH 6.0 以上では吸着率は減少した（Fig. 2.5）。この結果は、金イオンの水溶液中での溶存状態が関与しているものと考えられる。金イオンは、溶液中では塩化物イオンや水酸化物イオンと錯体を形成したアニオン状態で溶解している。そのため、低 pH （等電点以下の pH）ではタンパク質はカチオン状態にあるので、タンパク質と金イオン間の静電相互作用によって吸着されていると推察される。しかしながら、pI 10.7 の Lysozyme と pI 4.6 の BSA, Ovalbumin で吸着挙動に明確な違いが見られなかった。また、Lysozyme と BSA は pH 1.0, 2.0 では吸着率が減少している。つまり、タンパク質による金イオン吸着はタンパク質の帯電状態に依存した単純な静電相互作用によるものだけではないことが示唆された。従って、この結果が得られたもう一つの要因として、pH の変化に伴う金イオンの溶存状態の変化が考えられる。本実験において使用した金イオン水溶液の場合、金イオンは pH 1.0 では $ [AuCl_{4}]^{-} $ の状態で溶解しているが、pH が高くなるにつれ配位子置換が起こり、最終的に pH 6.0 以上ではほとんどが $ [AuOH_{4}]^{-} $ 状態で溶解していると考えられる。この $ [AuOH_{4}]^{-} $ 状態では、配位子
置換が起こりにくいため吸着されないのではないかと推察される。実際、金属酸化物への金イオンの吸着挙動が、pHや塩化物イオン濃度に依存するという結果が報告されており $ ^{1} $ 、溶存種の吸着へ与える影響が示唆されている。

同様の実験をパラジウムイオンでも行った。Fig. 2.6 で示すように、pH が高くなるにつれ、吸着率も増大し、pH 4.0 以上でほぼ 100% 吸着した。pH 8.0 以上ではタンパク質を添加しなくても遠心限外ろ過することでパラジウムイオンがほとんど除去されていまい、測定することができなかった。これは高 pH 領域では、パラジウムイオン同士が結合し、微粒子を形成したためではないかと思われる。パラジウムイオンも金イオンと同様に水溶液中ではアニオン状態で溶解している。そして、低 pH 領域での $ [PdCl_{4}]^{2-} $ が、pH が高くなるにつれ配位子置換が起こり、最終的に $ [PdOH_{4}]^{2-} $ になる。パラジウムイオンは、溶媒抽出や吸着に関する研究が数多くなされて中で、Kondo らは、ジアルキルモノチオリン酸を用いて、種々の塩酸酸性溶液からのパラジウムイオンの抽出を行っている。彼らは水溶液中に存在する 4 種のパラジウム錯体種 $ \left(\mathrm{PdCl}_{4}^{2-}, \mathrm{PdCl}_{3}^{-}, \mathrm{PdCl}_{2}, \mathrm{PdCl}^{+}\right) $ のそれぞれの抽出反応を考慮して抽出速度解析を行い、パラジウム-クロロ錯体の配位子置換反応に対する活性順位が $ \mathrm{PdCl}^{+} > \mathrm{PdCl}_{2} > \mathrm{PdCl}_{3}^{-} > \mathrm{PdCl}_{4}^{2-} $ であり、 $ \mathrm{PdCl}_{4}^{2-} $ は置換不活性のため抽出速度が減少することを報告している $ ^{2)} $ ， $ ^{3)} $ 。本実験において得られた結果は、この報告と合致するものと考えられる。従って、貴金属イオンのタンパク質への吸着において、貴金属イオンの溶存状態は大きく影響することが示唆される。

Table 2.3 実験条件

金属濃度	10 ppm
0.1 M HCl - NaOH 水	pH 1.0 ~ 8.0
溶液
タンパク質濃度	1.0 g/l
Fig. 2.5 金イオン吸着における pH 依存性

Fig. 2.6 パラジウムイオン吸着における pH 依存性

## ⑤Pd イオンと Au イオン吸着における塩濃度の影響

タンパク質による貴金属イオンの吸着における静電的相互作用について検討するため、金イオンおよびパラジウムイオンのLysozymeへの吸着における塩濃度の影響について示した。塩としてNaClとNaCl_{4}Oを選定した。実験条件はTable 3.4に示す。まずNaClについては、NaCl濃度が高くなるにつれ吸着率は減少し、金イオンは57％、パラジウムイオンは18％まで吸着が抑制された（Fig. 2.7左）。吸着が抑えられた要因として、タンパク質
を構成するアミノ酸と金属イオン間の静電相互作用が抑えられたことと塩化物イオン濃度が増加により、金属イオンが置換不活性錯体を形成したことの二つが考えられる。そこで、塩化物イオン濃度を一定にするために塩を$\mathrm{NaCl_{4}O}$に替えて同様の実験を行った。その結果、$\mathrm{NaCl_{4}O}$濃度が増加しても金イオンおよびパラジウムイオンともに吸着率に影響が見られなかった（Fig. 2.7 右）。この結果から、タンパク質による貴金属イオンの吸着は、タンパク質と貴金属イオンが配位結合することにより吸着され、その際の貴金属イオンの溶存種により吸着挙動が大きく変化することが明らかとなった。また、吸着において、タンパク質と貴金属イオン間の静電相互作用はあまり影響しないことも示唆された。

金属濃度	各 10 ppm
0.1 M HCl - NaOH 水溶液	pH 4.0
塩濃度	0.05 ~ 1.0 M
タンパク質濃度	0.2 g/l

Table 2.4 実験条件

Fig. 2.7 金属吸着に及ぼす NaCl 濃度の影響（左）と NaCl₄O 濃度の影響（右）
### 2.2 モデルペプチドによる金イオン吸着サイトの同定

モデルペプチド配列の選定

第1章で述べたとおり、今まで多くの研究が貴金属イオンと His の強い親和性を報告している。また His 残基のイミダブール環の窒素原子が金イオンに配位し、金イオンと G-G-H のトリペプチドが錯体を形成するという報告もある。これより、吸着サイトの同定がしやすいためモデルペプチド配列は Lysozyme（Fig.2.8）中の His 残基を含んだ配列を選定し、この配列を樹脂上に合成して吸着実験を行った。

Fig. 2.8 Lysozyme の 分子構造

KVFGR	CELAA	AMKRH	GLDNY	RGYSL	GNWVC
AAKFE	SNFNT	QATNR	NTDGS	TDYGI	LQINS
DGRTP	GSRNL	CNIPC	SALLS	SDITA	SVNCA
DNGGM	NAWVA	WRNRC	KGTDV	QAWIR	GCRL

Scheme 2.1 Lysozyme のアミノ酸 1 次配列(太字・下線がモデルとして選定した配列)

## N 末端アセチル化トリペプチド樹脂を用いた金イオンの吸着実験

His-Gly-Leu で吸着における His 残基の影響を比較するため、N 末端アミノ酸(X)が異なるトリペプチド X-Gly-Leu を樹脂上に10 種類合成した。しかし、N 末端がアミノ基であるため、N 末端アミノ基に金イオンが吸着することが考えられる。ここで固相合成における側鎖の脱保護操作の前に無水酢酸処理を施し、N 末端のアミノ基をアセチル化することで、Ac-X-Gly-Leu-resin を得た。実験条件を Table 2.5 に示す。
実験結果を Fig. 2.9 に示す。His を含むペプチドが金イオン、パラジウムイオン及び白金イオンに対して強い吸着能を示した。これは、His 残基側鎖にあるイミダゾール環の N 原子が貴金属イオンへの配位し錯体を形成することによるものと考えられる。この結果は、1956 年の金イオンのオブアルブミンへの吸着における Craig らの報告と合致する。一方、他のアミノ酸を含むペプチドについては Lys 残基を含むペプチドが金イオンに対して高い吸着率を示しただけであった。以上より、金、パラジウム及び白金イオンに対して吸着能を有するのは His を含むペプチドで、Lys を含むペプチドは金イオンのみを吸着することが明らかになった。

Table 2.5 実験条件

貴金属イオン濃度	10 ppm
0.1 M NaCl 水溶液	pH 4.0
ペプチド添加量	0.7 μ mol 分

N末端のアミノ酸

Fig. 2.9 N 末端アセチル化トリぺプチド樹脂による金イオンの吸着実験
### 2.3 タンパク質性バイオマスのレアメタルイオン吸着剤としての利用

## ① バイオマスに対する各種金属イオンの競争吸着

吸着実験の結果を Fig. 2.10 に示す。このグラフよりいずれのバイオマスにおいても金属の吸着性能を有することが分かった。いずれのバイオマスに関しても Pd イオンを多く吸着する傾向にあり、その中でも卵殻膜、鶏挽肉、明太子の皮、羽毛粉末、鰹節は Au、Pd、Pt などの貴金属類を吸着し、Cu、Zn などの卑金属類をごくわずかしか吸着しないことから選択的に貴金属を吸着する能力を有していることが予想される。4 種類の中でもとくに卵殻膜は高い吸着量と高い選択性を有していることが分かった。また粗タンパク質量と吸着量や選択性に関連性が見られないことから、タンパク質そのもの量は吸着性能におおきな影響を与えてないことが確認された。

タンパク質含有バイオマス

Fig. 2.10 混合モデル溶液からの競争吸着

## ②単独吸着におけるタンパク質バイオマスの吸着能力の比較

前述の検討では比較的薄い金属イオン濃度かつ金属イオン混合溶液からの選択的吸着を検討したが、ここでは、Pd, Pt, Au イオンそれぞれに対する各種バイオマスの吸着能力を個別に調査した。比較的高濃度で個別の金属イオン水溶液を調製し、バイオマスを添加、24時間後の減少量を測定した。結果を Fig. 2.11 に示す。Pd, Pt, Au イオンを比較した結果、競争吸着と同様単独吸着においても、どのバイオマス
も Au イオンに対して高い吸着能力を示すことがわかった。なかでも卵殻膜が最も高い吸着能力を示し、次に鰹節、鶏挽肉という順で吸着能が高かった。Pd や Pt イオンの吸着能力に関しては、Au イオンの吸着能力と若干違う順序になった。それぞれのバイオマスにおいて含まれるタンパク質成分の違いやタンパク質以外の微量成分の違いのために、金属イオン種間で吸着挙動に差が出たものと思われる。

タンパク質含有バイオマス

Fig. 2.11 Pd, Pt, Au イオン単独吸着におけるバイオマスの吸着能力（バイオマス 0.4 g/l，金属イオン 200ppm、pH～0.6、室温 24 h）

## ③ 金属イオンの飽和吸着量

得られた吸着等温線を Fig. 2.12 に示す。この図よりおおよそではあるが卵殻膜の飽和貴金属イオン吸着量が得ることができ、Au, Pt は約 120 mg-金属/g-卵殻膜、Pd は約 275 mg-金属/g-卵殻膜であることがわかった。

$ x = c_{0} \cdot V / w $ [mg-仕込み金属/g-バイオマス]

Fig. 2.12 卵殻膜の吸着等温線
本項における実験により特定のバイオマスを用いることによって貴金属・レアメタルを選択的に吸着、回収することが可能であることが示唆された。選択性が得られる原因として、混合溶液における吸着量および選択性と粗タンパク質量に相関性が見られないことから単純なタンパク質量だけではなく別の要因が考えられ、序論でも紹介したようにタンパク質の特定のアミノ酸配列による特異的な吸着サイトの存在が予想される。卵殻膜においては卵殻膜内にジスルフィド結合(S-S 結合)が豊富であることが知られている。そのため卵殻膜は高い機械的強度を有し、耐薬品性に優れていると言われている。このS-S結合に用いられる硫黄原子は金属元素、とくに貴金属元素と高い親和性を有する。そのため高い貴金属吸着量、選択性を有するものと考えられる。また貴金属類が還元されやすいことも影響していると考えられる。タンパク質は低pHでは一般に弱い還元剤として作用するため、イオン化傾向が小さく、還元を受けやすい貴金属イオンは還元されタンパク質表面に吸着していることが予想される。一方卑金属イオンはイオン化傾向が高いため、タンパク質の弱い還元能では還元されずイオンとして液中に残存する。そのため貴金属類と卑金属類が分離できるものと考えられる。

卵殻膜の飽和吸着量の導出の試みは今後どれだけ卵殻膜に吸着が可能であるのか、理想状態と実在状態の差異を検討するためにも有用なものである考えられる。吸着等温線の完成にはさらなる試行の必要性がある。しかし、現在一般的に貴金属リサイクルに用いられているイオン交換樹脂の性能が1リットルにつきおおよそ100g程度で金属を回収できると言われるため、卵殻膜を用いる手法は高効率な手法であると考えられる。
### 2.4 タンパク質性バイオマスを用いた実在廃液からのレアメタルの回収

実際の金属精錬液およびメッキ廃液を企業2社から頂き、卵殻膜を用いて精錬液およびメッキ廃液からレアメタルを回収可能かどうか検討した。結果を Tables 2.7, 2.8 にまとめた。まず金属精錬液は、Ag, Pd, Pt, Cu, Pb が含まれている。興味深いことに Pd と Pt の吸着率が選択的に顕著であり、しかも卵殻膜投入量に応じ、吸着率が上昇している。Ag はわずかに吸着し、Cu と Pb はほとんど吸着していない様子がわかる。条件にもよるが、Pd イオン吸着量から概算すると卵殻膜 1 kg でおよそ 140 g 程度のパラジウムが回収可能であり、パラジウム価格にしておよそ 16 万円相当が 1000 円程度のバイオマスで回収可能であることを意味する。この計算は、材料費のみの計算であるため、実際はエネルギーコスト、人件費等をさらに考慮する必要がある。

一方、頂いたメッキ廃液3種はPd, Pt, Auをそれぞれ含有しており、こちらも卵殻膜によりこれら金属イオンが吸着されていることがわかった。メッキ廃液3種は、液性（pH）が大幅に違うものである。このことから、吸着能に差はあるが、広いpH条件下で卵殻膜を用いてPd, Pt, Auの金属イオンを吸着回収可能であることがあきらかになった。

この3種のメッキ廃液中の金属を吸着したバイオマスを濾別、洗浄したのち、600℃で二時間炭化させ、得られた灰を王水にて再溶解させた。得られた溶液中の金属イオンを測定したところ、吸着したPdおよびPdを全て回収することに成功した。Auは吸着したものの30%程度の回収率であった。これは王水による再溶解時間が不足していたためと考えられる。
Table 2.7 頂いた金属精錬液の金属濃度および吸着率

卵殼膜
7.5mg/ml	15mg/ml	30mg/ml	60mg/ml
原液濃度[ppm]	吸着率[%]	吸着率[%]	吸着率[%]	吸着率[%]
Ag	35000	1.7	1.5	4.3	10.0
Pd	4800	25.8	47.6	82.6	99.7
Pt	1500	1.0	4.9	17.0	32.0
Cu	7400	0.4	0.0	0.0	0.0
Pb	450	0.0	0.0	0.0	2.5

$ ^{*} $ 7 M HNO $ _{3} $ を含む。

Table 2.8 頂いたメッキ廃液の金属濃度

対象金属イオン	初濃度(g/l)	吸着率(%)	pH
①	Pt	5.7	85	0.7
②	Pd	100	94	10.3
③	Au	5.3	71	6.2

$ ^{*} $ 300 mg の卵殻膜を 5 ml の溶液に添加
## 参考文献

1) T. Ykoyama, Y. matusukado, A. Uchida, Y. Motomura, K. Watanabe, E. Izawa, J. Coll. Interf. Sci., 233, 112(2001).

2) K. Kondo, H. Nishio, F. Nakashio, J. Chem. Eng. Japan, 22, 269(1989).

3) K. Kondo, J. Oishi, F. Nakashio, J. Chem. Eng. Japan, 23, 365(1990).
## 第三章 タンパク質による金属イオン還元に関する検討

### 3.1 绪言

これまでの検討結果から、タンパク質およびタンパク質バイオマスに多くの金イオン、パラジウムイオン、白金イオンが吸着していることがわかった。また、ペプチドを用いた検討からいくつかのアミノ酸あるいはペプチド配列がこれら金属イオン吸着に重要な役割を果たしていることが判明した。しかしながら、パラジウムや金イオンの吸着量は、タンパク質を構成するアミノ酸残基に比して大幅に多く、アミノ酸やペプチドによる金属イオンのキレートで全てを説明することができない。吸着金属イオンの多さを考えると、これら金属イオンがタンパク質上で還元している可能性が考えられる。そこで本章では、タンパク質によるこれら金属イオンの還元を検討した。

金を例にとると、金イオンを還元し金マイクロあるいはナノプレートを作製する報告例がみられる。この金マイクロプレート調製法の中に、生体分子を利用した例が、数例報告されている。Sastryらは、アロエの抽出物 $ ^{1)} $ 、Leeらは海藻の抽出物 $ ^{2)} $ を用いて金ナノプレートを合成した（Fig.3.1）。また、Dongらは、アミノ酸の一種であるアスパラギン酸を用いてマイクロサイズの金プレートを合成に成功している $ ^{3)} $ 。

そこで本章では、タンパク質を利用して金イオンを還元し、金マイクロプレート調製ができるかどうかの検討を行った。

Fig. 3.1 生体分子を利用して調製された金ナノプレート 左：アロエの抽出物を利用、右：海草の抽出物を利用
### 3.2 実験

## 試薬

原子吸光用金標準溶液（5 mM HAuCl_{4} in 2 M HCl）はメルク株式会社から購入した。塩化金（4 水和物）、ピペリジン、アセトンはキシダ化学株式会社から購入した。ウシ血清アルブミン（BSA）、西洋わさび由来ペルオキシダーゼ（HRP）、アミノ酸は、和光純薬工業株式会社から購入した。カゼイン、リゾチーム、リパーゼ（Candida rugosa 由来、Type VII）、リボヌクレアーゼ A（RNase A）は、シグマ - アルドリッチから購入した。

## 実験操作

## タンパク質を利用した金マイクロプレートの調製

主な金マイクロプレート調製方法を以下に示す。5 mM 原子吸光用金標準液（HAuCl_{4} in 2 M HCl）0.1 ml に、2.5 mg/ml ウシ血清アルブミン（BSA）溶液 0.4 ml を混合し、100℃において 3 時間反応させた（終濃度：金イオン 1 mM、BSA 2 mg/ml）。反応後に、金色光沢を有する結晶の生成が目視により確認された。調製したサンプルを室温まで冷却後、8000 rpm で 60 秒間遠心分離して上澄みを除去した。ここに、1 M NaOH 水溶液を 0.5 ml 添加して数分間攪拌した後、再び遠心分離して上澄みを除去した。この操作は 3 回繰り返し行った。続いて、Milli-Q 水を 0.5 ml 添加して数分間攪拌した後、遠心分離して上澄みを除去した。この操作も 3 回繰り返し行い、BSA が除去された金マイクロプレートを得た。

## 金マイクロプレートのモルフォロジー観察

走査型電子頭微鏡（SEM、SS-550、島津製作所）測定及びエネルギー分散型 X 線（EDX）測定には、Milli-Q 水によく分散させた金マイクロプレートを、カーボンフィルム上に滴下して真空中で 1 晩乾燥させたものを用いた。観察は、加速電圧 15 kV で行った。

原子間力顕微鏡（AFM）測定には、Milli-Q 水によく分散させた金マイクロプレートを、マイカ壁開面上に滴下して真空中で1晩乾燥させたものを用いた。測定はダンピングモードで行った。
X線回折（XRD）測定には、エタノール中によく分散させた金マイクロプレートを、シリカ基板上に数回滴下した後、エタノールを蒸発させたものを用いた。測定は、CuKα線（λ=1.5406Å、40 kV、40 mA）により行った。

## 金マイクロプレートの成長過程の観察

倒立型システム顕微鏡（IX 701、オリンパス）を用いた金マイクロプレートの観察には、5 mM HAuCl_{4} 水溶液に BSA を 20 mg/ml になるよう添加して、よく攪拌したものをスライドガラス上に滴下したものを用いた。

動的光散乱（DLS）測定（ナノゼータサイザー、マルバーン）には、BSA 未洗浄のサンプルを用い、石英セル（光路長 10 mm）中で測定した。

## 金マイクロプレートの光学特性評価

UV-vis-NIR スペクトル（V-570、島津製作所）には、BSA 未洗浄のサンプルを用い、石英セル（光路長 10 mm）中で測定した。また、塩化金水溶液（HAuCl_{4}）を用いて調製した金粒子についても測定した。

蛍光スペクトル測定には、金マイクロプレート調製後冷却したサンプル、BSA 洗浄を行った金マイクロプレートを Milli-Q 水に分散させたサンプル、それぞれの溶液を 0.8 μm フィルター（Millipore）ろ過したサンプルを用いた。また、HAuCl₄ 水溶液を用いて調製した金粒子についても測定した。

## アミノ酸を利用した金マイクロプレートの調製

原子吸光用金標準液（$\mathrm{HAuCl_{4}}$ in 2 M HCl）または塩化金水溶液（$\mathrm{HAuCl_{4}}$）0.5 mLに、アミノ酸を添加した。必要に応じて、少量の有機溶媒の添加や窒素置換を行った。溶液を加熱して反応させた後、光学顕微鏡を用いて観察することにより金マイクロプレートの有無を確認した。
### 3.3 結果及び考察

ウシ血清アルブミン（BSA）により調製した金マイクロプレートの構造特性評価

調製した金マイクロプレートの SEM 写真を Fig. 3.2 に示す。この写真から、三角形や六角形の金マイクロプレートの生成が確認された。金マイクロプレートのサイズは数 $ \mu m $ であり、マイクロサイズの金プレートとしては、比較的サイズのばらつきが少なかった。同時に、100-200 nm のサイズの金粒子も生成している様子が観察された。また、SEM 付属の EDX により金マイクロプレートの分析を行った結果を、Fig. 3.3 に示す。これにより、金のピークが検出されたため、マイクロプレートが確かに金で構成されていることが確認できた。EDX では、金の他に、炭素、窒素、酸素などのピークも検出され、BSA は洗浄操作では完全に除去しきれなかったことが示唆された。

AFM による測定結果を、Fig. 3.4 に示す。これにより、金マイクロプレートの厚さは 70-100 nm 程度であることが明らかになった。厚さは、形状やサイズに依存した傾向は見られなかった。

金マイクロプレートの XRD 測定を行った結果を、Fig. 3.5 に示す。この結果からも、マイクロプレートが確かに金で構成されていることが確認され、面心立方晶系の金結晶の回折パターンが観測された $ ^{4,5)} $ 。(111)面と(200)面のピーク強度比は0.25対0.12、(111)面と(220)面は0.25対0.069であり、参照ファイルと比べると、他の面に対する(111)面のピーク強度が大きかった。このことは、(111)面の多くが測定用基盤表面と平行にキャストされていることを示しており、金マイクロプレートの底面が(111)面であると考えられる $ ^{6,7)} $ 。
Fig. 3.2 金マイクロプレートの SEM 写真

左：1000 倍、右：5000 倍

Fig. 3.3 金マイクロプレートの EDX スペクトル

Fig. 3.4 金マイクロプレートの AFM 像
Fig. 3.5 金マイクロプレートの XRD 回折パターン

## 金マイクロプレート調製における反応条件の検討 ①金イオン濃度の影響

BSA 濃度が 2 mg/ml、金イオン濃度が 0.25、0.5、1、2、3、5 mM になるよう両者を混合したものを、それぞれ 100℃ において 3 時間反応させた。冷却後、BSA 洗浄を行ったサンプルについて SEM 観察を行った。

結果を Fig. 3.6 に示す。金イオン濃度が 0.25、0.5、1、2、3 mM の場合に金プレートの生成が確認された。いずれの場合もプレートのサイズは不均一であり、直径が 10 μm 前後のものが多く見られた。金イオン濃度 0.25-2 mM のサンプルの場合、金イオン濃度が増加するにつれて、金プレートの厚みが増すことが示唆された。金イオン濃度 0.25 mM で調製した金プレートは非常に薄く、X 線が金マイクロプレートを透過して、重なり部分の下にあるプレートが透けて見えるような SEM 写真が得られた。一方で、2 mM の場合では、厚みのある金マイクロプレートが観察された。このことから、金プレートの結晶は底面方向より側面方向に成長しやすいことが示唆される。金イオン濃度が 3 mM の場合では、非常に大きな金プレートが得られ、数十-150 μm サイズのものが多く観察された。この場合は、金イオン量に対する BSA 濃度が少なく、核生成段階に使われる金イオンは限られており、多くの金イオンが結晶成長のために残されているため、大きな結晶が得られたと考えられる。また、金イオン濃度が 5 mM の場合では、金プレートはまったく生成せず、金プレート生成には金イオン濃度
に対して十分な BSA 量が必要であると考えられる。

a

b

c

d

e

f

Fig. 3.6 金イオン濃度が金マイクロプレートの生成に与える影響についての検討

金イオン濃度：a=0.25 mM、b=0.5 mM、c=1 mM、d=2 mM、e=3 mM、f=5 mM、BSA濃度はいずれも2 mg/ml

## ② BSA 濃度の影響

金イオンを 1 mM、BSA を 0.2、1、2、5、10 mg/ml になるよう両者を混合したものを、それぞれ 100℃ において 3 時間反応させた。室温まで冷却後、BSA 洗浄を行ったサンプルについて SEM 観察を行った。結果を Fig. 3.7 に示す。BSA 濃度が 0.2 mg/ml の場合では、金マイク
ロプレートは確認されず、BSA濃度が十分ではないことが示唆された。BSA濃度が1、2、5、10 mg/mlの場合では、いずれの場合も金プレートが確認された。BSA濃度が、1、2 mg/mlの場合では、数μmの金マイクロプレートが観察され、サイズのばらつきが比較的少なかった。BSAの濃度が高くなると、より大きなサイズの金マイクロプレートが観察された。また、BSA濃度が10 mg/mlの場合では、角がとれて丸みを帯びたプレートが多数観察された。したがって、高すぎるBSA濃度は金プレート調製には不適切と言える。

Fig. 3.7 BSA 濃度が金マイクロプレートの生成に与える影響についての検討

BSA 濃度：a=0.2 mg/ml、b=1 mg/ml、c=2 mg/ml、d=5 mg/ml、e=10 mg/ml ※金イオン濃度はいずれも1 mM ※aは、BSA洗浄操作なし
## ③ 反応温度の影響

金イオン濃度 1 mM、BSA 濃度 2 mg/ml になるよう両者を混合したものを、室温、40、60、80、100℃において 3 時間反応させた。これらを室温まで冷却後、SEM 観察を行った。結果を Fig. 3.8 に示す。室温で反応させたものは、反応後の溶液の色が黄色から透明に変化しており、金イオン（3 価）が BSA により還元されたことが示唆された。しかし、目視による金色光沢の結晶の生成は確認できなかった。SEM による観察を行うと、ごくわずかではあるが Fig. 4-3a のような金結晶が観察された。40℃の場合も、目視による観察結果は室温の場合と同様であったが、SEM による観察された金結晶の数が増え、金結晶のサイズも大きかった。60℃以上で反応させたサンプルについては、いずれも目視により金色光沢の金結晶が確認でき、温度が高くなるほど生成量が多くなる様子が観察された。Fig. 3-8 を見ると、60℃の場合はサイズのばらつきが大きく、金粒子の会合体のようなものも多数観察された。80℃の場合も、100℃の場合に比べると金マイクロプレートのサイズのばらつきが大きかった。

(b)

Fig. 3.8 反応温度が金マイクロプレートの生成に与える影響についての検討 反応温度：a=室温、 $ b=40^{\circ}C $ 、 $ c=60^{\circ}C $ 、 $ d=80^{\circ}C $ 、 $ e=100^{\circ}C $ 金イオン濃度はいずれも1 mM、BSA濃度はいずれも2 mg/ml
1 mM 原子吸光用金標準溶液（$\mathrm{HAuCl_{4}}$ in 0.4 M HCl）と 1 mM 塩化金水溶液（$\mathrm{HAuCl_{4}}$）の pH は、それぞれ 0.27 と 3.22 である。この 2 種類の金イオン溶液を用いて、金マイクロプレート調製時の pH 条件について検討した。金イオン濃度 1 mM、BSA 濃度 2 mg/ml になるよう両者を混合した溶液を 100℃において 3 時間加熱した。それぞれの溶液の加熱前と加熱後の写真を、Fig. 3.9 に示す。加熱前は両方の溶液とも、黄色溶液であった。加熱後は、塩化金水溶液を用いた溶液は紫色を呈し、原子吸光用金標準液を用いた溶液は金色光沢の沈殿が生成した。

Fig. 3.10 に、反応後の2種類の溶液について、UV-vis-NIRスペクトルを測定した結果を示す。塩化金水溶液を用いた溶液の場合は、540 nmと595 nmに極大値を持つ吸収が観測され、金ナノ粒子の生成が示唆された。一方、原子吸光用金標準液を用いた溶液の場合は、近赤外領域に金マイクロプレートのSPRに由来する吸収が観測された。

Fig. 3.11 には、塩化金水溶液を用いた溶液について DLS 測定を行った結果を示す。この結果より、塩化金水溶液を用いた場合では、120 nm 程度のサイズの金ナノ粒子が生成したことが示唆された。

これらの結果より、金マイクロプレートは非常に低い pH 条件下において生成し、高い pH 条件下では金粒子が生成することが明らかになった。金イオンは、低 pH 条件下では塩化物イオンが配位した四配位錯体で水中に溶存しており、pH が高くなるにつれ配位子が水酸化物イオンに置換されることが知られている。そのため、pH が低い方が金イオンは還元されにくいと推測され $ ^{8)} $ 、塩化金水溶液を用いた場合に比べて原子吸光標準液を用いた場合の方が、金イオンはゆっくり還元されると考えられる。このことが金の結晶成長に有利に働いたため、原子吸光用金標準液を用いた場合では、金マイクロプレートが生成したと考察した。
Fig. 3.9 100℃、3 時間加熱前後の溶液状態の変化 右：過熱前、左：加熱後

(a) 塩化金水溶液、(b) 原子吸光用金標準液

Fig. 3.10 反応後の溶液の UV-vis-NIR スペクトル

Fig. 3.11 塩化金水溶液を用いた場合の溶液の DLS
BSA の代わりにカゼイン、HRP、リパーゼ、リゾチーム、RNase A を用いて金マイクロプレートの調製を試みた。金イオン濃度 1 mM、タンパク質濃度 2 mg/ml（lysozyme のみ 6 mg/ml）になるよう両者を混合した溶液を 100℃で 3 時間反応させた後、SEM による観察を行った。結果を、Fig. 3.12 に示す。

Fig. 3.12a はカゼインにより調製した金マイクロプレートであり、丸みを帯びた金マイクロプレートが多数観測された。また、金粒子の生成量も多く、反応後の溶液の色は赤色であった。Fig. 3.12b は HRP を用いて調製した金マイクロプレートの SEM 写真である。この場合は、三角形や六角形の金マイクロプレートが多数生成していたが、Fig. 3.12b の右の写真のように金粒子も多数観察された。観察された金マイクロプレートの多くは 10-20 μm 程度のサイズであった。Fig. 3.12c はリパーゼにより調製した金マイクロプレートの写真である。この場合には、少量の金マイクロプレートが観察され、金粒子の生成量の方が多かった。目視による観察結果では、全体としての金構造体（金マイクロプレート、金粒子などを全て含む）の生成量も少なかった。他のタンパク質の場合と比較して大きく異なる点として、リパーゼ溶液と金イオン溶液を混合した溶液は懸濁していることが挙げられ、金マイクロプレートの生成にはタンパク質 - 金イオン複合体が水に溶解することが必要と考えられる。Fig. 3.12d はリゾチームを用いて調製した金マイクロプレートの SEM 写真であり、BSA の場合と同様に、数 μm のサイズの比較的サイズのそろった金マイクロプレートが観察された。Fig. 3.12e は RNase A を用いて調製した金マイクロプレートの写真である。この場合にも、数 μm のサイズの比較的サイズのそろった金マイクロプレートが得られたが、BSA、リゾチームの場合に比べて薄いプレートが観察された。

今回用いた6種類（BSAを含む）の全てのタンパク質を用いて金マイクロプレートの調製が可能であったが、生成する金マイクロプレートの形状及び生成量はタンパク質により異なっていた。100℃において反応させる際にはタンパク質は変性していると考えられるため、タンパク質の立体構造は金マイクロプレート生成に特別な影響を与えないと考えられる。そこで、金マイクロプレート生成量に影響を与える因子としては、上述したタンパク質-金イオン複合体の水への溶解性、タンパク質の種類により金イオン吸着能力の違いなどがあると考察している。また、タ
ンパク質の種類により、最適な濃度条件などが異なると考えられるため、反応条件の最適化を行えば、BSAの場合と同程度のサイズの均一性及び生成量が得られると期待できる。

4.3.3 金マイクロプレート生成遅

Fig. 3.12 タンパク質の種類が金マイクロプレーいての検討

タンパク質：a=カゼイン、b=HRP、c=リパーゼ、金イオン濃度はいずれも1 mM、

タンパク質濃度は 2 mg/ml（リゾチームのみ 6 m
金イオン濃度 1 mM、BSA 濃度 2 mg/ml になるよう両者を混合した溶液を 100℃ に加熱し、10、30、60、120、180 分ごとにサンプリングしたものについて SEM 観察を行った。結果を、Fig. 3.13 に示す。

反応時間が 10 分の場合は、ごくわずかな量の金マイクロプレートが観察された。形状は Fig. 3.13 a に示すように三角形や六角形をしており、サイズは 1-3 μm であった。反応時間 30 分では、観察された金マイクロプレートの数が多くなり、5 μm 以下のサイズの小さな金マイクロプレートが見られた。反応時間 60 分では、金マイクロプレートの生成量が増え、5 μm ほどのサイズの金マイクロプレートが多数観察された。120 分では、60 分で観察された金マイクロプレートに比べて、サイズが大きくなっていた。180 分の場合では、120 分で観察された、金マイクロプレートとあまり変わらないサイズの金マイクロプレートが得られ、金マイクロプレートの成長は 120 分程度で終息することが示唆された。

(b)

Fig. 3.13 反応時間が金マイクロプレートに与える影響 反応時間：a=10 分、b=30 分、c=60 分、d=120 分、e=180 分 金イオン濃度はいずれも1 mM、BSA質濃度はいずれも2 mg/ml
## 光学顕微鏡による観察

金イオン濃度 5 mM、BSA 濃度 20 mg/ml になるよう両者を混合して、よく攪拌したものをスライドガラス上に滴下して、光学顕微鏡を用いて観察した。六角形、三角形のプレートの成長過程を観察した結果を、それぞれ Fig. 3.14、3.15 に示す。金イオンと BSA を混合したときを 0 分として、30 分ごとに観察を続けたところ、2 時間経過したときに金マイクロプレートの核が確認された。その後も観察を続けると、金結晶が徐々に成長して大きくなっていく様子が観察された。結晶成長過程で、金結晶は初めの形状を保ったまま成長しており、金マイクロプレートの形状を決定づけるのは、核形成段階であることが明らかになった。

Fig. 3.14 光学顕微鏡による金マイクロプレートの成長過程の観察
Fig. 3.15 光学顕微鏡による金マイクロプレートの成長過程の観察
## 金マイクロプレート形成初期段階における DLS の変化

金イオン濃度 2 mM、BSA 濃度 2 mg/ml になるよう両者を混合した溶液を 100℃ に加熱し、5、10、15、20、30 分ごとにサンプリングしたものについて DLS 測定を行った。結果を Fig. 3.16 に示す。加熱前（0 分）の場合では 15 nm の位置にピークが観測され、これは BSA-Au 複合体によるピークであると考えられる。加熱後 15 分までは、このピークの粒径が徐々に大きくなり、粒径分布が広がっていった。20 分後のグラフではプロードしたピークが観測され、BSA-Au 複合体に劇的な変化が起こったことが示唆された。このことより、金マイクロプレートの核の大部分が加熱後 15-20 分の間に形成するのではないかと考えられる。また、30 分後には 91、1280 nm にピークが観測され、溶液中に加熱前より大きなサイズの物質が存在することが示された。

Fig. 3.16 金マイクロプレート形成初期段階における DLS の測定
ここでは、これまでの検討により得られた知見及び過去の金マイクロプレートに関する報告例 $ ^{6,7} $ などを基に、金マイクロプレートの生成メカニズムに関する考察を行った。金マイクロプレートの生成過程は、次のように進行すると考察している。金イオンとBSAを混合すると、金イオンがBSAに吸着される（第一段階）。この溶液を加熱することにより、BSAによる金イオンの還元が起こる（第二段階）。その後ある段階で核生成が起こり（第三段階）、続いて結晶が成長して（第四段階）マイクロサイズの金プレートが生成する。考察した金マイクロプレート生成過程をFig.3.24に示す。

反応の第一段階は、BSAと金イオンを混合することによるBSAへの金イオンの吸着である。主な実験条件（BSA濃度：2 mg/ml、金イオン濃度：1 mM）においては、金イオンはBSAに対して33倍モル等量存在する。金イオンはBSA1分子につき約18個吸着することができるため $ ^{8)} $ 、存在する金イオンのうち約半数がBSAに吸着すると考えられる。

この溶液を加熱すると、反応の第二段階である金イオンの還元が起こると考えられる。Fig. 3.17 の UV-vis-NIR スペクトルの結果に示すように、100℃加熱開始から5分後には塩化金溶液に見られる320 nm のピークが消失した。このことから、金イオンの還元は加熱開始から5分以内に起こることが示唆された。また、Fig. 3.13 に示した SEM による観察結果を見ると、加熱開始から10分後には小さな金プレートの生成が確認された。したがって、反応の第三段階と考えられる、核生成は金イオンの還元後即座に起こると考えられる。

さらに加熱を続けると、Fig. 3.16 に示すように 20 分後には劇的な粒径の変化が見られた。また、Fig. 3.17 の UV-vis-NIR スペクトルの結果を見ると、加熱開始から約 30 分で金マイクロプレートの SPR による近赤外領域の吸収が観測された。このことより、加熱開始から約 20 分後には大部分が結晶成長段階に入っており、Fig. 3.13 に示すように 3 時間加熱する間、結晶成長を続けると考えられる。