Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
で 312.3g/kg-biomass と最も高くなったが、エタノール収率は稲わらで 121.9 g/kg-biomass と最大となり、変換効率 0.42 と他よりも優れた結果を示した。

本研究では3種類の方法により固定化酵素を作製したが、ここでは紙面の都合上、キトサン担体結合法の結果について述べる。作製した固定化酵素の酵素結合率と相対活性を分析した結果、相対活性5.23IU/mgの活性をもつ酵素を112.3mg/g（結合率72.4%）固定化できたことがわかった。さらにその最適な反応条件を検討した結果、pH5.0、温度50℃と酵素単体と同じとなった。その再利用性について検討した結果、活性は2回目以降で30％近く低下することが示されたが、通常行われる24hの糖化ではグルコース濃度は2回目以降でも初回の80％以上の値を示した。したがって、作製した酵素は工業的には高い再利用性をもつことが明らかとなった。しかし、これらの結果は基質がCMCの場合であり、稲わらで行った場合、稲わらの高い吸着能が原因で酵素が脱落してしまい、非常に低い回収率を示した。

### (3) . 表面処理により作製したバイオマス/生分解性樹脂複合材料の力学特性

まず、稲わらをアドミセル乳化重合により表面処理し、PLAと相溶性の良い高分子膜を被覆した。被覆した高分子膜の材料には、ハンセン溶解度パラメータによる理論的検討とブレンド試料の材料物性および内部構造分析による実験的検討からポリメチルメタクリレート（PMMA）のモノマーであるメタクリル酸メチル（MMA）を選択した。アドミセル乳化重合処理を行った稲わらの表面には高分子の膜が形成されていることがSEM観察により認められた。アドミセル乳化重合によりPMMA被覆表面処理した30wt%稲わら/PLA複合材料の引張強度は、MMA添加量がわずか0.02%(v/v)で60MPa以上となり、未処理の複合材料（約40MPa）よりも大幅に向上した。その破断面および界面構造を分析した結果、稲わら-PLAの高い密着性を観察できたことから、それらの相溶性の改善を明確に認めることができた。次に、無水酢酸によるアセチル化表面処理について検討した。無水酢酸による表面処理では、稲わら表面にエステル結合の形成を示唆する粒が形成される一方で、無水酢酸のモル濃度が高いと稲わらの主成分が加水分解されてしまうことがわかった。このモル濃度と強度の関係を検討した結果、0.001Mと最も薄い濃度で30wt%稲わら/PLA複合材料は最大引張強度（約62MPa）を示し、PLA単体と同等までに回復した。

さらに、リグニンなどの残渣についても無水酢酸を用いて表面処理した。残渣の洗浄および無水酢酸による表面処理の併用により、複合材料の引張強度が向上した。また、その強度の向上は残渣添加量が多いもので高く現れた。さらに、残渣/PLA複合材料の破断面を表面処理前後で比較した結果、表面処理により残渣-PLAの密着性が改善されていることを明確に観察できた。したがって、表面処理による効果を認めることができた。

最後に、実製品の試作として容器・包装材などの成形に用いられるシートを押出成形により作製し、その力学特性などを調べた。結果において、比較的 PLA と性質の近い硬質ポリ塩化ビニルシートの JIS 基準の要求値と比較したところ、十分な強度を得ていた。さらに、製品試作のための二次加工の前段階として、複合材料の力学特性改善の手段とした圧延加工を行う前段階として、その塑性変形について検討し、基礎的知見を得た。結果として、圧延加工による塑性変形は試料内部よりも表面で大きく発生することが示唆された。以上の知見
をもとに二次加工としてホットプレス成形を行うことでスマートフォン梱包用ケースを試作した。その外観は表面処理を行ったもので割れやキズなどはみられないものとなった。しかし、多くの筐体に求められる耐衝撃性や耐熱性、防水性や防塵性の評価は行っていないため、今後の検討が待たれる。

## 環境政策への貢献

(1). バイオエタノール製造後の残渣なども環境に優しい生分解性複合材料に利用されるため、廃棄物の排出を最小限に抑えられる。

(2). バイオマスを利用した生分解性複合材料はグリーンコンポジットと呼ばれ、低コストかつ大規模に工業化生産が可能であるので、プラスチック製の民生用品、容器包装材などに使用すれば、環境に悪い廃棄プラスチックの処理量を減少させることができる。

## 研究成果の実現可能性

本研究では磁性ナノ粒子に固定化された酵素を微粉砕された稲わら粉末に添加して糖化反応を行うと、ゼータ電位の違いなどにより、酵素が稲わら粉末に吸着され、磁性ナノ粒子から脱落してしまい、磁力による繰り返し回収が困難であることがわかった。この問題を解決するために、磁性ナノ粒子に酵素の固定化と吸着による酵素の回収方法および前処理として亜臨界水によるヘミセルロースの加水分解の方法を提案し、低粉砕コスト、低酵素添加量、酵素の回収・再利用可能な高効率の糖化効果が得られる糖化技術の開発を進めている。

一方、生分解性複合材料については実製品の試作に至っており、今後は大容量の表面処理などを検討することで早期の実用化が期待できる。

## 結論

本研究では低コストのバイオエタノール製造および環境に優しい新規生分解性複合材料の民生製品（例えば容器・包装材など）への実用化を目指し、新規生分解性複合材料については製品化の可能性が十分にあるが、上記のようにバイオエタノールの製造に関してはいくつかの課題が発生した。現在、解決策を提案し、研究を進めており、今後も引き続きその検討を行っていき、実用化を図る。
## 本文

### 1. 研究背景と目的

### 1.1 はじめに

現代社会において、化石資源の枯渇化や地球環境問題が益々深刻化している。このため、廃棄物や炭酸ガスの削減による地球温暖化の防止および循環型社会の形成などを狙いとして、化石資源依存型社会から再生可能な資源でカーボンニュートラルの特性をもつバイオマス（biomass）をエネルギーや材料（製品）として用いるバイオマス利用型社会への移行が、世界的に求められている。本国でも、2002年12月27日にバイオマス・ニッポン総合戦略が閣議決定されて以来（2006年3月31日改定）、バイオマスの活用推進に強く取り組む姿勢が示されてきた。この総合戦略では、2010年度を目途とする具体的な目標が設定され、「地球温暖化の防止」、「循環型社会の形成」、「競争力のある新たな戦略的産業の育成」および「農林漁業、農山漁村の活性化」の4つの効果の発現が目指されていたが、数値目標などの関係が明確でなかったことなどから、成果評価が困難となっていた。このため2009年9月12日にバイオマス活用推進基本法（平成21年法律第52号）が施行され、その第20条に基づきバイオマス活用推進基本計画が2010年12月17日に閣議決定された。この基本計画では、全都道府県および600市町村において2020年を目標年とした地域のバイオマス活用推進計画を策定することを掲げており、その基本的方針や国が達成すべき目標、政府が総合的かつ計画的に講ずべき施策などが示されている $ ^{(1)} $ 。このような国の環境政策によるバイオマス活用への強い推進は、全国的な活用取組事例の増加につながっている。それらの事例は、先の総合戦略で目指されていた通り、地球温暖化の防止や循環型社会形成の推進のみならず、農山漁村の衰退が見られる近年、1次産業としての農林漁業と2次・3次産業との融合による地域ビジネスの展開と新たな業態の創出を促すという大きな効果が期待されるからこそ、増え続けているのである。

さて、一般にバイオマスは、家畜排せつ物や食品廃棄物のような「廃棄物系バイオマス」、林地残材や農作物非食用部（稲わら、もみ殻など）のような「未利用バイオマス」、糖質資源（さとうきびやてんさいなど）や油脂資源（なたねなど）のような「資源作物」の3種類に大別できる。このうち、廃棄物系バイオマスと未利用バイオマスは、食料と競合することのない非可食性の資源として活用が期待されており、前述の基本計画においても利用が推進されている。それらのうちの木質系および草本系の（リグノ）セルロース資源は、主成分にセルロース、ヘミセルロース、リグニンをもつため、燃料用エタノールや石油代替化成品原
料、プラスチックなどの素材や複合材料などとして利用できる可能性があり、注目が集まっている。また、それらのほとんどは林地残材や農作物非食用部のような未利用バイオマスであるため、大きな期待が寄せられている。

草本系と木質系は、本国を含むアジア諸国において安定調達を期待できるバイオマスであり、中でも草本系バイオマス（あるいはソフトセルロースと呼ばれる）である稲わらや麦わら、もみ殻は、表1-1のように世界で各々およそ7.3億t/year $ ^{(2)} $ 、3.5億t/year $ ^{(2)} $ 、1.4億t/year $ ^{(3)} $ 発生しており、アジアでの発生量が極めて大きい。

表 1-1 世界の草本系バイオマス発生量 (unit: million ton)

Material	Africa	Asia	Europe	America	Oceania	World	Ref.
Rice straw	20.9	667.6	3.9	37.2	1.7	731.3	(2)
Wheat straw	5.3	145.2	132.6	62.6	8.6	354.3	(2)
Rice husk	-	125.0	-	-	-	137.0	(3)

国内でも草本系（農作物非食用部）はおよそ1,400万t/year発生しており $ ^{(4)} $ 、すき込みを除くと約30%しか利用されていない。前述の基本計画では、それらの全国平均の利用率を2020年までに約45%までにすることとしており $ ^{(1)} $ 、その有効活用の方法や利用技術の確立に関する取組が強く望まれている。このため、米などの農業が盛んな都道府県や市町村への期待は大きい。研究代表者らの機関が位置する秋田県もまた、農林水産省大臣官房統計部が公表している「平成25年度産水陸稲の収穫量」 $ ^{(5)} $ によると全国3位の米の原産地であるため、稲わらなどのソフトセルロース資源が豊富に存在する。秋田県の稲わら賦存量を表1-2 $ ^{(6)} $ に、秋田県3地域区分での賦存量を図1-1に示す。

表1-2 秋田県の稲わら賦存量 $ ^{(6)} $

地域名	H21	H22	H23
鼎 北	124	134	126
鼎 央	226	232	228
鼎 南	216	225	219
計	566	591	573

(風乾重（水分 10~15%）单位：千 t/年)

図 1-1 秋田県 3 地域の稲わら賦存量（平成 21 年）
表 1-2 および図 1-1 のように、(水田の作付面積の変動や水稲の生育状況に左右されるが) 秋田県ではおよそ 60 万 t/year もの稲わらが生産されている。また、土づくり対策の一環として稲わらなどの有機物のすき込みを長年指導してきたため、現在発生している稲わらの 91%がすき込み利用となっている $ ^{(6)} $ 。言い換えれば、秋田県はそれら稲わらなどのエネルギーや材料となる可能性をもつ重要な資源が多く眠っているということである。

この活用の検討として、秋田県では、バイオエタノール推進会議を設置し、「秋田県ソフトセルロース利活用プロジェクト」として平成20年度から平成24年度までの5年間、植物などのバイオマスを原料とするバイオエタノールの実用化について取り組んできた。その一環として社団法人秋田県農業公社を主体として県北地域に位置する大潟村で実施された「稲わらの収集・運搬実証事業」において、収集運搬システムや長期保管方法、収奪による土壌などへの影響などが検討された $ ^{(6)} $ 。研究代表者らはこの事業担当者にヒアリングを行い、事業成果について調査を実施したところ、大潟村内中央地域でのプラント施設の設置や、農家自身が輸送することなどの前提条件が必要であるが、機械購入の補助などを行うことで稲わらの販売単価を7円/kg以上と抑える方法があることがわかった $ ^{(6)} $ 。

以上のように、本国、中でも秋田県では稲わらなどの草本系バイオマス（ソフトセルロース資源）の有効活用に対しての期待が大きく、そのための収集・運搬システム確立のための先行事業なども行われている。したがって、次なる課題として、それらをバイオエタノールや材料などに利用するための要素技術の開発が非常に重要になってきている。

### 1.2 バイオエタノール製造技術の現状

#### 1.2.1 酵素糖化法

バイオエタノールは現在、サトウキビ・シュガービートなどの糖質原料や、米・麦・トウモロコシなどのデンプン質原料から製造されており、食糧と競合するため問題となっている $ ^{(7)} $ 。このため、稲からのような非可食性セルロース資源からの製造が特に注目されている。

エタノールは、一般に糖を発酵させて生産されるが、通常エタノール生産に用いられる酵母である Saccharomyces cerevisiae は、一部の単糖や二糖にしか直接利用できない。セルロースは図 1-2 に示すような構造をもっており、六単糖である グルコースを単一構成成分とする直鎖状の結晶性高分子である $ ^{(8)} $ 。セルロース資源からバイオエタノールを製造するためには、このような高分子である セルロースを構成糖である グルコースまで分解する糖化 (加水分解) 行程が必要となる。この際の糖化方法には、酸糖化法と酵素糖化法の二つがあり $ ^{(8)} $ 、そのう
ちの酸糖化法は、原料を硫酸のような強酸により加水分解することで糖化液を抽出する方法である。この方法には、反応時間が短いことや糖化に利用する硫酸が安価などのメリットがあるが、高温高压下で強酸を用いて行うために安全性に不安があり、糖化後の酸回収や再利用が困難であることや、生成した糖が過剰に分解され、発酵阻害物質を生成してしまうなどのデメリットがある $ ^{(8)} $ 。

図 1-2 セルロースの構造 $ ^{(8)} $

このことから近年、非硫酸系である酵素糖化法が注目されている。しかし、セルロース資源に対して使用されるセルラーゼと呼ばれる複合酵素は、価格が高いという問題がある $ ^{(9)} $ 。デンプン質原料の場合でもこの酵素糖化が行われるが、アミラーゼと呼ばれる安価な酵素により容易に糖化できるため大きな問題とならない。また、稲わらなどのリグノセルロース資源は、セルロースを、ヘミセルロース、リグニンが繊維状に複雑に絡んで強固に取り囲んでいる構造となっているため $ ^{(10)} $ 、糖化酵素を直接加えてもほとんど反応が起こらない。例えば、表1-3に示すように、稲わらは、セルロース32～47%、ヘミセルロース19～27%、リグニン5～24%の組成であり、ヘミセルロースとリグニンの占める割合が高いといわれている。

表1-3 草本系バイオマスの化学組成 (unit: %)

Substrate	Cellulose	Hemicellulose	Lignin	Ref.
Rice straw	32-47	19-27	5-24	(2)
Wheat straw	35-45	20-30	8-15	(2)
Rice husk	22-53	5-23	15-20	(11),(12)

ヘミセルロースは六単糖であるマンノース、五単糖であるキシロースを構成成分とした分岐構造を持つ非晶性高分子であり $ ^{(7)} $ 、加水分解により構成糖にまで分解できる。近年ではキ
シロースからのエタノール発酵も研究されてきている $ ^{(13)} $ 。しかし、芳香族化合物であるリグニンをエタノールに変換する技術については現状では報告がない。このヘミセルロースとリグニンの存在状態ゆえに、セルロース資源の糖化は反応時間が長く、大量の酵素を必要としてしまうという難点がある。特に、大量投入により高騰してしまう酵素コストは、セルロース資源由来のバイオエタノールの製造コストの割合の多くを占めてしまうことから、実用化に大きな障害となっている $ ^{(8)} $ 。草本系は、木質系に比べてリグニンの量が少ないとされているが、高い糖化率を得るためには、リグニン、ヘミセルロースの構造を緩め、セルラーゼがセルロースと接触・反応しやすい状態を作るための(酵素糖化)前処理が必要となる $ ^{(8),(14),(15)} $ 。

また、数十本単位からなるミクロフィブリルを構成して物理的・化学的に安定な状態で存在しているセルロースの構造を緩めることもまた、前処理には重要である。セルロース鎖は分子内で水素結合を形成することでねじれにくい直鎖状の構造を有しており、加えて互いのセルロース鎖間で水素結合することで強固な結晶構造を形成している。この結晶本体がミクロフィブリルであり、その幅は3～5nm程度といわれている $ ^{(14)} $ 。酵素（セルラーゼ）によるセルロースの糖化反応は、長さ1nm以下のグルコース同士間の結合が、タンパク質であるセルラーゼの活性部位によって切断されることであるが、その最初の段階として、セルラーゼはセルロースの本質であるミクロフィブリルへ吸着する必要がある $ ^{(15)} $ 。すなわち、球で換算すると直径5nm程度であるセルラーゼをより効率的にセルロースへ吸着させるためには、前述のようにリグニン、ヘミセルロースの構造を緩めるだけでなく、図1-3のようにセルロースをミクロフィブリル単位で解繊（ミクロフィブリル化）させるほどの前処理が最も理想的というわけである。

図 1-3 酵素糖化において理想的なセルロースの構造 $ ^{(14),(15)} $
#### 1.2.2 酵素糖化前処理としての微粉砕加工

前処理には、希酸やアルカリを用いる方法があるが、過剰分解により発酵阻害物質を生成してしまうため、微粉砕加工 $ ^{(16)} $ や水熱処理 $ ^{(17)} $ に注目が集まっている。特に微粉砕加工は、前処理として有効な手段になり得る。例えば、Inoue らは $ ^{(16)} $ 、ユーカリのボールミルによる微粉砕処理物と加圧熱水処理物の糖化率に対する酵素量の影響を調査し、加圧熱水処理では糖化率が酵素量の低下により急激に低下するのに対し、微粉砕加工であればその低下を抑えることができ、少ない酵素量でも高い糖化率を得られることを報告している。

微粉砕加工の効果としてまず考えられるのは、表面積増大による酵素との接触面積の増加であり、それによる反応効率の向上である。しかし、遠藤らは $ ^{(18)} $ 、木材をボールミルで粉砕したときの粉砕時間と糖化率の関係を調査した結果、粒径が20μm程度から変化しなくなっても、粉砕を続けると糖化率が向上することを明らかにしている。これは、粉砕を続けることでセルロースの結晶化度が低下することが一因であるとしている。小林らは $ ^{(19),(20)} $ 、微粉砕木質バイオマスの粒径や結晶化度などの性状と酵素糖化性との関係を調査し、結晶化度の低下により糖化率が向上することを報告している。また、結晶化度低下の効率を高めるためには含水率を低下させることが重要であることを示唆した $ ^{(20)} $ 。しかし、一方で精製パルプの場合は未粉砕の結晶化度が高い状態においても高い糖化率を得られることから、結晶化度の低下が微粉砕による効果の本質ではないことが指摘されている $ ^{(16)} $ 。遠藤は $ ^{(15)} $ 、固体NMRを用いた緩和時間測定によりセルロース分子の凝集サイズ（ドメインサイズ）を評価し、糖化率が最も高くなった微粉砕木粉粒子（粒径20μm程度）内のドメインサイズが5nm程度となったことを報告した。これはすなわち、見かけ上20μm程度の木粉でも、実際には5nmのドメインから構成されていることを示すものである。また、このドメインサイズがセルロースミクロフィブリルの幅と類似していたことから、粉砕を続けることによりセルロースミクロフィブリルが稠密に集合・配列した構造が崩壊し、酵素が吸着できる表面積が増大した結果、酵素糖化が促進されることを示唆した。

このように、酵素糖化前処理としての微粉砕加工は有効な手段であるが、最も代表的な微粉砕方式であるボールミルは、エネルギー効率が良くないという大きな課題がある $ ^{(21)-26} $ 。粉砕時間を長くすれば酵素糖化性が向上することは明らかであるが、その分コストが増大してしまう。このことから近年、ディスクミル $ ^{(21)} $ やコンバージミル（エネルギー集中型媒体ミル） $ ^{(22)-(24)} $ 、振動ミル $ ^{(25),(26)} $ など、高効率な微粉砕方式や技術、装置開発に関する研究が盛んになっている。微粉砕にかかるコスト削減は、機械工学の進歩により今後もさらなる発展が
期待できるが、燃料用エタノールの実現は容易ではない。一般に酵素糖化前処理はエタノール製造にかかるコストにおいておよそ1/3を占めるといわれているが $ ^{(8)} $ 、酵素糖化コスト自体も1/3~1/2を占めるとされており $ ^{(8)} $ 、さらなる削減が望まれる。

#### 1.2.3 酵素の開発と固定化

酵素糖化に用いられるセルラーゼは単一の酵素ではない。前処理後のバイオマス構造中において、非晶質部のセルロース鎖にランダムに切れ目を入れるエンドグルカナーゼ（EG）、この切れ目からセロビオース単位で鎖を切っていくセロビオヒドラーゼ（CBH）、セロビオースをグルコースまでに分解するβ-グルコシダーゼ（BGL）の3つの成分からなる混合酵素である $ ^{(27)} $ 。これまでセルラーゼは工業的には繊維の処理などで利用されていたため、繊維状をなさないグルコースまでの完全な分解は求められていなかった。このため、BGL活性の低いTrichoderma属の糸状菌（T. reesei）由来のセルラーゼが一般に使用されてきた $ ^{(28)} $ 。しかし、エタノール生産用酵母のS. cerevisiaeではセロビオースを利用できないことから、BGL活性の高いセルラーゼが必要である。

この点を鑑み、米国の DOE（アメリカ合衆国エネルギー省）は、セルロース系原料による生産効率を高める酵素の開発を目指し、2000年から糖化酵素の開発のため Novozymes 社と Genencor 社に 4 年間で合計約 40 億円の委託研究開発資金を提供した $ ^{(29)} $ 。近年、両社は遺伝子組み換え技術により T. ressei に BGL 遺伝子を導入して大量培養し、新しいセルラーゼを開発している（第 1 世代として Celic Ctec - Novozymes 社と Accellerase 1500 - Genencor 社、第 2 世代として Celic Ctec2 - Novozymes 社と Accellerase DUET - Genencor 社） $ ^{(28)} $ 。また、本国でも Yamanobe ら $ ^{(30)} $ により日本の土壌から単離したセルラーゼ生産糸状菌 Acremonium cellulolyticus の研究開発が進められ $ ^{(31)} $ 、現在では Meiji Seika ファルマによりアクレモニウムセルラーゼ（AC）として商業生産に至っている。これらは表 1-4 $ ^{(32)} $ のように BGL 活性が高く、特に、Cellic Ctec2 は非常に高い BGL 活性を有しながらも価格が低く、セルロース系原料用の酵素としての期待が大きい。しかし、未だ実用例は不十分であり、例えば微粉砕のような木粉中にリグニン成分が残存する前処理による影響を評価した報告例はほとんど見られない。また、ヘミセルロースの割合が比較的高いといわれている草本系バイオマスでは、セルロースを取り囲むそれを分解する酵素 $ ^{(33)} $ との併用も評価する必要がある。
表 1-4 市販酵素剤の活性 $ ^{(32)} $

Company	Genencor	Novozymes	Meiji Seika Farma
Enzyme	GC220	Accellerase 1500	Celtic Ctec	Celtic Ctec2	Acremonium cellulase
Protein (Bradford, mg/mL or g)	110	32	90	100	370
FPU (U/mL or g)	160	57	130	150	420
BGL (Cellobiose, U/mL or g)	69	180	1300	4000	1100

酵素開発が進む一方で、酵素を使い捨てにせず回収、再利用する方法として、酵素の固定化にも注目が集まっている $ ^{(35)-(41)} $ 。これは酵素を化学反応的、物理的な手法によって固定化し、生産物と分離することで酵素を繰り返し使用してコストを削減するものである。酵素と生産物の分離だけであれば限外ろ過膜を用いることで可能であるが、酵素は複雑なタンパク質であり、有機溶媒、酸、アルカリや熱などの外的要因によって不可逆的な構造変化を受けると失活してしまう。固定化は酵素に新たな特性を与えることでその欠点を補うことができるものであるため $ ^{(34)} $ 、生産物との分離だけでなく失活の抑制にも有効であると考えられる。また、近年ではナノサイズの磁性粒子と結合させることで磁石により回収する方法も提案されており $ ^{(35),(38),(39)} $ 、セルロース資源の糖化コスト削減への期待は大きくなっている。

一般に酵素の固定化法は、1）担体結合法：水溶性の担体に酵素を結合させる方法、2）架橋法：酵素を2個以上の官能基を有する試薬と反応させて架橋する方法、3）包括法：酵素をゲルの格子の中に包み込むかあるいは半透膜性のポリマーの皮膜で被覆する方法、の3つに大別される $ ^{(37)} $ 。各々の方法にはさらに細かい分類があり $ ^{(37)} $ 、これまで多様な固定化方法が古くから研究され、それぞれの長短所が指摘されてきた。例えば、反応性に富んだアミノ基残基やイオン性のアミノ基残基などと酵素を不溶性の担体に結合させる担体結合法には、単一の酵素だけでなく複数の酵素や微生物菌体および動植物細胞にも同様の手法で固定化できること、固定化操作中に酵素の修飾が起こりにくく自然な状態を保ったまま固定化できるなどの利点がある。しかし共有結合の場合、他のイオン結合や物理的吸着に比べて酵素の
固定化が強いため、酵素の自由な活動が制限され、基質との相互作用が起こりにくくなり、その結果酵素の変性失活がみられるという問題がある。また、樹脂を用いて酵素を取り囲み固定する包括法は、簡便に固定化できる反面、酵素によっては一度担体に保持されたものが再度漏出する場合があるという問題がある。

このように、固定化方法には各々一長一短があるため、その酵素の種類や適用範囲に合わせた適切な手法の選択が必要であるが、磁性粒子と市販セルラーゼ酵素剤を結合し、失活抑制を十分に行うことができる手法を検討した例は未だ見当たらない。また、糖化対象であるセルロース資源の成分は前処理の方法によって異なってくるため、それらを系統的にまとめるためにも、評価例はまだまだ必要である。

### 1.3 生分解性複合材料

#### 1.3.1 プラスチックの現状

プラスチックは、安価で軽量かつその優れた機能性と広範な実用性から需要が大きく、さらなる用途展開への期待もますます高まっている。プラスチックは身のまわりのいたるところに存在しており、天然高分子も含めると「衣・食・住」の全てにおいて見かけないことはない。本国の経済産業省が発表している化学工業統計年報 $ ^{(42)} $ によれば、2012年度の樹脂生産量はおよそ1,054万tであり、その内訳を比率でまとめると、1位がポリエチレンで24.7%、2位がポリプロピレンで22.7%、次いで塩化ビニル樹脂（ポリ塩化ビニル）の12.6%、ポリスチレンの6.6%の順に続いていき、熱可塑性樹脂で88.5%を占めている。ポリエチレンとポリプロピレンで全体の約半分となっているのは、プラスチックの用途の多くが袋やフィルムなどの包装材や容器、シートであるために材料としてそれらが適していることからと考えられる $ ^{(43)} $ 。同じく経済産業省が取りまとめている紙・印刷・プラスチック・ゴム製品統計年報 $ ^{(44)} $ によると、国内生産量約586万t/year（二次加工品などを除外）のプラスチック製品の用途別生産比率は、図1-4 $ ^{(44)} $ に示すようにフィルムおよびシート類で41.1%、容器類で14.8%であり、同じく約半分を占めている。プラスチックの用途は、フィルムなどの他にも発泡製品、建材、日用品および雑貨などと多岐にわたっており、生活必需品やスポーツ用品、電子機器用絶縁材や自動車部品など幅広い分野で使用されている。近年では炭素繊維強化プラスチック（CFRP）の台頭が著しく、ボーイング787のような航空機にも適用され、自動車などの輸送機器への熱可塑性CFRPの展開も期待されている。今や、プラスチックなくして現代社会は成り立たないといっても過言ではない。
図 1-4 プラスチック製品の用途別生産比率 $ ^{(44)} $

しかし、プラスチックは廃棄しても安定でそのまま残ってしまうため、廃棄後の環境負荷が課題となっている。一般社団法人 プラスチック循環利用協会（旧プラスチック処理促進協会）の報告によると $ ^{(45)} $ 、本国では、図1-5のように廃プラスチック総排出量がおよそ1,000万t/year近くにまで上っている。

前述のように、安定性が高いため変化することがないプラスチックは、使用中であればその性質が重宝されてきたが、使用後は逆にその丈夫さや強さが仇となる。プラスチック廃棄物は重量的には目立たないが、実際の廃棄物中での容積は高いため、それらの処理場や埋立地の不足を招いている $ ^{(46)} $ 。環境省など5省が共管の容器包装リサイクル法のような法律の整備によりリサイクルが推進されているが、研究代表者らがリサイクル業社にヒアリングしたところ、回収コストなどの課題があるようである。

図 1-5 プラスチックの生産量と排出量の推移 $ ^{(45)} $
#### 1.3.2 生分解性プラスチックおよびその複合材料

プラスチックの廃棄が問題となっている状況下で、近年注目されているのが生分解性プラスチック（グリーンプラ）である。特に植物などのバイオマス由来のもの（バイオマスプラ）の関心が高い。生分解性プラスチックは使用後に地中に埋めると微生物により\mathrm{CO}_{2}と水に分解されるため、廃棄の問題の解決につながる可能性をもつ。また、植物由来であれば、\mathrm{CO}_{2}と水に分解された後にその植物の光合成に用いられるため、ライフサイクルを通したカーボンニュートラルの考えから環境負荷を少なくすることができる。生分解性プラスチックには、ポリ乳酸（PLA）やポリカプロラクトン（PCL）、ポリビニルアルコール（PVA）やポリブチレンサクシネート（PBS）など様々にあるが、PLAがバイオマス由来であることと比較的高い力学特性をもつために注目されている。PLAはグリーンプラとして包装材や容器などに応用されてきており、さらにはバイオマスプラとして複合機・プリンタの外装部品やなどにも用いられ始めてきている。近年では、環境への影響の大きさから、自動車への適用の期待も大きくなっている $ ^{(47)} $ 。例えば、自動車に適用されているポリプロピレン（PP）をPLAに置き換えると、ライフサイクルでの\mathrm{CO}_{2}排出量を約4割削減できるといわれている。車体重量の約10%利用されている自動車用樹脂材料の全てを植物由来のものに代えるとした場合、1台当り約200kg-\mathrm{CO}_{2}\mathrm{e}、すなわち世界の年間生産台数7千万台にバイオマスプラスチックの普及が進む単純な想定を置くと、年間約1,400万t-\mathrm{CO}_{2}\mathrm{e}の削減につなげることができるようである $ ^{(47)} $ 。しかし、生分解性プラスチック、特にPLAは高価であるため、これまでは外科手術用の縫合糸や骨片接合用スクリューなどの医療材料以外では、広く普及するまでに至っていない。

このため、母材樹脂の割合低下による低コスト化などを狙いとして、生分解性樹脂に植物繊維を添加する生分解性複合材料（グリーンコンポジット）の開発が試みられている $ ^{(48)-(55)} $ 。特に、1.1 節で述べたように、本国（あるいは秋田県）で大量に発生している稲わらのような草本系バイオマスとの複合化は、資源の有効活用の観点からも望ましいと思われる。しかし、植物繊維 - 生分解性プラスチック異相界面の接着性の問題などから、実用化している例はほとんど見当たらない。

### 1.4 研究の目的

ここまで述べてきたように、燃料用バイオエタノール製造では酵素糖化にかかるコストが、
生分解性複合材料は異相界面の難接着性による力学特性の低下が、それらの実用化を妨げている。そこで本研究では、稲わらなどの草本系バイオマスを用いた低コストのバイオエタノール製造技術と新規生分解性複合材料の開発および実用化を目指すことを全体目標として、回収・再利用できる磁性ナノ球状カプセル酵素と酵母、およびバイオマス（リグニンなどの残渣も含む）- 生分解性プラスチックを相溶化させる表面処理（相溶化処理）技術（リグニンなどの残渣も含む）の開発・確立を図ることを目的とする。本研究期間における年度ごとの達成目標を表1-5に示す。本事業ではこの年度ごとの達成目標にそって研究を実施した。本報はその成果をまとめたものである。

表 1-5 研究期間内における達成目標

全体	再生可能な草本系バイオマスからバイオエタノールをより高効率・低コストで製造する技術およびリグニンなどの残渣および草本系バイオマス/生分解性複合材料を作製する技術を確立し、大規模工業化生産への実用化を推進する。
平成23年度	1.粉砕装置の技術改造および最適なバイオマスの粉砕加工条件を確立する。
2.磁性ナノ球状カプセル酵素を創製し、糖化と発酵試験を行い、その有効性を確認する。
3.各種粒度・添加量のバイオマス/生分解性複合材料を作製し、その力学特性と内部構造の関係を明らかにする。
平成24年度	1.酵素の糖化および酵母の発酵に関する最適な条件を検討し、その製造技術を確立する。
2.表面処理の効果および圧延加工による複合材料の力学特性を明らかにする。
平成25年度	1.バイオエタノールの工業化生産への移転に関する問題点を解決する。
2.生分解性複合材料に関する民生用品、包装材などへの応用を検討し、製品を試作する。
## 2 ．研究方法

### 2.1 材料

本研究では、草本系バイオマスとして稲わら、麦わら、もみ殻を用いることとした。平成23年度は中国産の稲わらおよび麦わら（粒度106~300μm、300~1000μm）を、もみ殻は中日本商産製のゴールデンパウダー45Mを用い、主に粉砕機の性能評価に用いた。平成24年度以降は秋田県産の稲わら（図2-1）を購入し、押切にて5～10cmに裁断して粗粉砕に供した。秋田県産の稲わらについては、その後ウイレー式のカッターミル（株）入江商会製、WM-3）により粗粉砕し、試験篩と電磁回転振とう機（ADOLF KUHNER AG 社製、LSR-V-50）を用いて、20～106μm、106～300μm、300～1000μmに分級し、後述の実験に使用した。なお、加熱乾燥式水分計（AND（株）製、MX-50）を用いて105°Cの乾燥条件で試料の含水率を測定したところ、稲わらの含水率は7.3%～10.9%程度であった。

図2-1 購入直後の稲おらの外観

生分解性プラスチックとして、ポリ乳酸（PLA）とポリブチレンサクシネート（PBS）を用いることとした。特にPLAは、バイオマス（植物）由来の生分解性プラスチックであることから、環境に優しい材料としての期待が大きい。PLAにはユニチカ製のTE-4000（脆性グレード）もしくはTE-1070（延性グレード）およびNatureWorksLLC製の標準グレード(Ingeo 3001D）を、PBSは昭和高分子製の1020を用いた。稲わらは、秋田県由利本荘市産のものを用いた。
### 2.2 バイオマスの微粉砕加工とその微粉末の特性評価

#### 2.2.1 微粉碎加工

本研究では、バイオマスの酵素糖化前処理として、共同研究者らが開発した図2-2に示すような構造をもつ省エネルギー型振動ミル「タンデムリングミル $ ^{®} $ 」（中央化工機商事製）を用いて微粉砕を行うこととした。これは、振動ミルをベースに開発されたものであり、粉砕媒体が粉砕容器内壁に沿って転動することで遠心力を作用させた粉砕を行うものである。粉砕筒内部にタンデムリング（インナーパワーリング）が複数枚設置されており、粉砕筒に振動振幅を与えることでこのリングが試料を粉砕する方式となっている。タンデムリングミルでは $ ^{®} $ 、アンバラスウェイトの加振力によってベッドと粉砕筒が振動することで筒内部の媒体が転動する。これにより、対象を短時間で細かく粉砕できるため、大幅にエネルギーを削減できる $ ^{(56)-(58)} $ 。

このタンデムリングミル $ ^{®} $ の小型機により、各バイオマス（稲わら、麦わら、穀殻）を粒径20μm以下まで微細化することを目標とし、振幅7.0mm、振動数1600cpmの条件で30min粉砕加工した。出発原料は粒度106~300μmの粗粉砕試料800gとした。

図 2-2 タンデムリングミル $ ^{®} $ （リング外径：Φ252cm、内径：Φ198cm）
#### 2.2.2 微粉末の性状評価

微粉砕した試料の粒度分布を、レーザー回折・散乱式粒度分析計（日機装株式会社製、MT3300EXII）により測定し，50%平均径を得た。20mlビーカーに試料を適量入れ、界面活性剤および精製水を加えて超音波を10min印加することで分散させた後に装置に投入した。

また、X線回折装置（XRD）（パナリティカル社製、X'Pert Pro）を用いて、微粉末のセルロースの結晶構造を評価した。測定は5～90°走査範囲の範囲で行った。得られた結果から、Segal法に基づき(1)式より2θ=18°、22°のピークの高さから結晶化指数を算出した。

$$ セルロース結晶化度 (\%)=\frac{I_{22}-I_{18}}{I_{22}}\times100 $$

さらに、走査型電子頭微鏡（SEM）（（株）日立ハイテクノロジーズ製、S-4300）により微粉末の微細構造を観察した。観察用試料は、接触面をカーボン両面テープで観察部を傷つけないように固定し、Auコーティングしたものを用いた。

#### 2.2.3 微粉末の酵素糖化性および発酵性の評価

## (1) 酵素糖化実験

セルラーゼ酵素剤としてメイセラーゼおよびアクレモニウムセルラーゼ (Meiji Seika ファルマ製)、GC220（ジェネンコア協和株式会社製）、NS22086（ノボザイム社製）を使用した。

試料 10g と酵素 0.5g と 0.1M 酢酸バッファー（pH5.0）100ml を 250ml 三角フラスコに入れ、オイルバス中で温度を 50℃ に保ちながら攪拌することで酵素糖化を行った。この際、糖化開始時から 24 時間後の糖化溶液を採取し、その遠心分離上澄を、酵素の活性を止めるために 5 分間煮沸し冷凍保存した。次に、これを 100 倍希釈したサンプル溶液 0.1ml、バッファー0.9ml、純水 0.5ml、Schales 試薬 2.0ml を各々分注することで試験溶液を作製した。その後 15 分間煮沸した後室温（23±2℃）に戻し、分光光度計〔日立ハイテクノロジーズ（株）製、U-5100〕により波長 420nm の吸光度を得ることで糖量を測定し、(2)式により糖化率を算定した。ホロセルロースの割合は稲わらおよび麦わらを 0.7^{(2)}、粳殻を 0.5 とした $ ^{(11),(12)} $ 。

$$ 糖化率 (\%)=\frac{t 時間後の糖量 - 初期の糖量 }{ バイオマスの量 \times ホロセルロースの割合 }\times100 $$
## (2) 酵母発酵実験

酵母には、エタノール発酵用酵母 Saccharomyces cerevisiae Fali [AB Mauri 社製] を使用した。糖液 40mg と滅菌状態で培養した酵母 2mg を 500ml 三角フラスコに入れ、バイオシェイカーで温度 28～38°C にて静置させることで発酵させた。酵母植菌後 2～24 時間後で発酵溶液を採取し、その遠心分離上澄液を冷凍保存し、エタノール濃度測定に用いた。

エタノール濃度測定は、F-キットエタノール（Roche Diagnostics GmbH 製）を用いて行った。500 倍希釈したサンプル溶液 0.02ml、エタノール標準液(0.03g/l) 0.02ml、バッファー0.6ml の分量でそれぞれキュベットに分注し、試験溶液を作製した。これを倒置攪拌し、室温で3分間静置させた後に分光光度計で波長 340nm の吸光度を測定した。その後、各キュベットに酵素懸濁液を 0.01ml ずつ加えパラフィルムで蓋をして攪拌させ、室温で 10 分間静置後、再び波長 340nm の吸光度を測定し、エタノール濃度を算定した。

### 2.3 磁性ナノ球状カプセル酵素の作製および性能評価

#### 2.3.1 作製方法

磁性ナノ粒子（$\mathrm{Fe}_{3}\mathrm{O}_{4}$）へのセルラーゼ酵素の固定化はグルタルアルデヒド（GDA）による化学結合により行った。磁性ナノ粒子（$\mathrm{Fe}_{3}\mathrm{O}_{4}$）は化学的共沈法により作製し、酵素は明治製菓ファルマ製のアクレモニウムセルラーゼを用いた。ただし、GDAとの反応の前処理として行った磁性粒子への表面処理については、バイオセンサーなどの分野で研究されているキトサン担体結合法（59）とシリカ被覆法（60）の2種類とし、セルラーゼの固定化に応用した。キトサン担体法は、図2-3（61）のように磁性粒子表面にキトサン担体を結合させ、キトサンとGDAとで縮合反応させる方法である。シリカ被覆法については、テトラエトキシシラン（TEOS）により磁性粒子表面にシリカ被覆を行う方法であり、その後に3-アミノプロピルトリエトキシシラン（APTES）により官能化を行いGDAと反応させる方法（図2-4（62）と、シリカ被覆磁性粒子のシリコーン層を厚くすることで吸着能を高め、吸着とGDAとの反応の両方を利用する方法（図2-5）の2種類について検討した。
(a) 磁性ナノ粒子 - キトサン担体への酵素固定化の模式図

(b) キトサン担体とグルタルアルデヒド(GDA)との縮合反応

図 2-3 磁性ナノ粒子 - キトサン担体との酵素固定化 $ ^{(61)} $
図 2-4 APTES によるシリカ被覆磁性ナノ粒子への酵素固定化 $ ^{(62)} $

図 2-5 シリカへの吸着による酵素固定化

#### 2.3.2 作製した酵素の性能評価

## (1) 特性評価

作製した酵素などの構造を、透過型電子顕微鏡（TEM）（(株)日立ハイテクノロジーズ製、H-8100）、顕微フーリエ変換赤外分光光度計（FT-IR）（日本分光株式会社製、IRT-7000）、および前述のXRDにより分析した。さらに、磁化特性を試料振動型磁力計（VSM）（理研電子株式会社製）により調べた。
## (2) 結合率および相対活性の測定

固定化酵素作製時の溶液中の酵素濃度を、色素結合法の一種であるブラッドフォード法に基づきタンパク質の濃度を分析し、(3)式により固定化前後の酵素濃度から結合率（Loading efficiency）を算定した。標準タンパク質には牛血清アルブミン（BSA）を用いた。

$$ Loading efficiency\left(\%\right)=\left(\left(C_{i}V_{i}-C_{f}V_{f}\right)/C_{i}V_{i}\right)\times100 $$

ここで、式中の $ C_{i} $ は固定化前のタンパク濃度を、 $ V_{i} $ は固定化前の酵素溶液の容積、 $ C_{f} $ 、 $ V_{f} $ は各々の固定化後のものを示している。固定化後の値はろ過後のものを用いた。

次に、カルボキシメチルセルロース（CMC）を基質として相対活性の測定を行った。測定は文献 $ ^{(60),(63)} $ を参考に、IUPACに準拠して行った。活性についてはCMCを基質として酵素加水分解させたときに生成されたグルコース量Wより(4)式を用いて算定した。

$$ Activity of cellulose\ (IU)=1000W/\ (MV) $$

ここで、式中の M、V は各々グルコースの分子量と体積を示し、活性の単位 IU はμmol/mL で定義される。CMC 基質の濃度は pH5.0 の 0.1M 酢酸バッファーに対して 1%(w/v) とし、0.5ml の基質溶液に対して酵素溶液 0.5ml を添加して、50℃ 環境下で 30min 反応させた。

### 2.4 新規生分解性複合材料の作製および性能評価

#### 2.4.1 バイオマスの表面処理

(1) アドミセル乳化重合によるポリマー被覆

アドミセル乳化重合は表面に極薄の高分子膜を重合することで材料表面の改質を行う方法である。アドミセルは“アド(吸着)”と“ミセル”から成る言葉であり、基質表面に吸着させた界面活性剤の濃度を臨界ミセル濃度まで高くしたときに形成される界面活性剤の二重層間でモノマーを重合させる方法である。一般的に、アドミセル重合はアドミセル形成、モノマー吸着、ポリマー形成および外層界面活性剤

図 2-6 アドミセル乳化重合の原理 $ ^{(66)} $
の除去の四つのステップから成る(図2-6) $ ^{(66)} $ 。

まず、イオン交換により基質表面へイオン性界面活性剤が吸着する。このとき両親媒性分子の親水基が基質表面に接触し、一方で長い疎水基は疎水層を形成するために作用する。続いて、他の界面活性剤の疎水鎖が疎水基に吸着していき、界面活性剤の二重層を形成する。この系に有機モノマーを加えると優先的にアドミセル中に吸着するため、ここに開始剤を投入するとアドミセル中で基質表面にポリマー層を形成するための重合反応が起きる。この後、上層の界面活性剤を除去すると、ポリマー膜が露出される。

この処理により、稲わらの表面に生分解性樹脂であるポリ乳酸（PLA）と相溶性の良い高分子を被覆させることができれば、稲わら-樹脂界面の接着性が向上し、力学特性が改善されると思われる。本研究では、材料同士の溶解性の指標であるハンセン溶解度パラメータ $ ^{(67)} $ からPLAと相溶性の高い高分子を検討し、そのモノマーを表面処理に用いることとした。

## (2) 無水酢酸によるアセチル化

図2-7に無水酢酸によるエステル結合の反応式を示す。無水酢酸はカルボン酸無水物の反応性をもつため、稲わらや糖化残渣中のセルロースもしくはリグニンがもつヒドロキシ基と脱水縮合を起こす。このとき、酢酸が生成される一方でセルロースにエステル結合が形成されるアセチル化反応が起こる。PLAはエステル結合によって乳酸が重合した高分子であるため、この表面処理を行うことによってエステル結合を得た稲わらはポリ乳酸に対して親和性が高くなる。よって、より強固に結合あるいは接着して生分解性複合材料の性能を未処理の稲わらを混合した場合よりも向上させることが期待される。

試料 50g を三口フラスコに投入し、モル濃度を 0.005M、0.01M、0.05M、0.1M、0.5M、もしくは 1M になるよう無水酢酸と蒸留水を加え、24 時間攪拌することでアセチル化表面処理を行った。反応中は温度 60℃ となるようオイルバスにて制御した。

図2-7 アセチル化の原理
#### 2.4.2 試験片の作製

## (1) 複合材料の作製

粒度 20～106μm、106～300μm、300～1000μm の稲わらもしくは糖化残渣と樹脂を二軸押出機（テクノベル（株）製、KZX25TW-60MG-NH）で溶融混練した。

二軸押出機における溶融混練は、原料が二本のスクリーの隙間に入り込み、そこでせん断作用を受けることで行われる。混練条件を表2-1に示す。各粒度の稲わら粉末もしくは糖化残渣を樹脂に対して10、20、30wt%添加し、両者のコンパウンドを押し出した。これをペレタイザーにより一定周期で切断することで稲わら/PLA複合材料のコンパウンドペレットを作製した。

表 2-1 混練条件

押出温度	150～180℃
スクリュー回転数	100rpm
コイルフィーダ回転数	18～22rpm

## (2) 試験片の作製

作製したペレットを乾燥機にて、8時間以上乾燥させた後、スクリュー径16mmの射出成形機射出成形機（日精樹脂工業（株）製、NP7-1F）により、図2-8に示す寸法のJIS K 7113基準の1(1/2)号ダンベル型試験片を成形した。そのときの成形条件は、射出温度180~200℃、射出速度17.6mm/s、金型温度40℃とした。

図 2-8 1（1/2）号ダンベル型試験片

#### 2.4.3 物性評価および内部構造観察

## (1) 熱物性、力学特性および内部構造観察

作製した複合材料の熱的特性を熱重量 - 示差熱同時測定装置（TG-DTA）（(株) 島津製作
所製、DTG-60）により調査した。PLAは脆性グレードのTE-4000、もしくはIngeo 3001Dを用いた。また、JIS K 7113基準に従って、万能材料試験機（インストロン(株)製、Series3360）により引張試験を行い、その内部構造および破断面をSEMおよびTEMにより観察した。TEM観察およびその試料作製は、日本電子株式会社（JEOL）に委託して行った。観察には日本電子（株）製のJEM-1010、JEM-200EX、JEM-2100Fを用いた。

## (2) 分解性評価

作製した稲わら/PLA複合材料の分解性を調査するために、秋田県（由利本荘市）にて42ヶ月間の暴露試験および埋設試験を行った。これらの試験には、力学特性の変化が明確になるよう、延性グレードのTE-1070を用いた。試験にはダンベル型試験片を用いた。暴露試験は、試験片を自作のステンレス製ラックに取り付け（図2-9(a)）、JIS7219A法に基づき、仰角を24°に設定して行った。埋設試験は、試験片を深さ5cmの地中に埋めることで行った（図2-9(b)）。各試験片は毎月回収し、洗浄した後に引張試験および顕微鏡観察に供した。顕微鏡観察は、光学顕微鏡（NIKON（株）製、ECLIPSE ME600D）により屋外暴露および埋設試験による試験片表面の変化を調査した。観察は試験片の平行部中央で行った。

(a) 屋外暴露試験

(b) 埋設試験

図 2-9 分解試験の様子

#### 2.4.4 実製品の試作

## (1) 押出シートの作製

実製品の試作として、溶融二軸混練により作製した稲わら/PLA複合材料を用いて、容器や包装材の成形にしばしば用いられるシートを押出成形により作製することとした。まず、前述の二軸押出機に、図2-10のようにシート成形用Tダイと引取ロールを設置した。これ
を用いて表2-2に示す条件で厚さ約1.0mmのシートを押出成形した。

図 2-10 シート成形用 T ダイおよび引取りロール

表2-2 シート成形条件

稲わら添加量[wt%]	10,20,30
予備乾燥	温度[℃]	80
時間[h]	8時間以上
押出条件	温度[℃]	190
回転数[rpm]	100
ダイ温度[℃]	170
引取ロール温度[℃]	50

## (2) 押出シートの性能評価

本研究では、押出シートの性能評価として、まず、JIS K 6734 の硬質ポリ塩化ビニル（PVC）シートの外観検査に準拠して外観検査を行った。次に、同じくJIS K 6734 に準拠して、図2-11のようにシートより押出方向（0°）とそれに垂直な方向（90°）からJIS K 7127 1B(1/2)ダンベル型試験片を打ち抜いた。これを用いて前述の万能材料試験機により引張速度10mm/min、室温23±2°Cの条件で引張試験を行った。さらに試験後の破断面観察をSEMにより観察した。

図 2-11 打ち抜きの模式図
## 3 ．低コストのバイオエタノール製造

### 3.1 タンデムリングミル $ ^{®} $ による粉砕の有効性

#### 3.1.1 微粉末の性状

## (1) 粉砕条件と平均粒径および結晶化指数との関係

図3-1に省エネルギー型振動ミル「タンデムリングミル $ ^{®} $ 」での粉砕における粉砕時間と50%平均粒子径および結晶化指数の関係を示す。出発原料は前述のように106~300μmまで粗粉砕した稲わら粉末である。図より、稲わらはわずか5minで急激に粒径が50μm以下まで低下し、30minで約10μmまで微粉砕されていることがわかる。一方、結晶化指数は粒径ほどではないが10min以上で大きく低下しており、30minでほぼ安定している。一般に、酵素であるセルラーゼは、セルロースの非晶領域に作用するため、10min以降では粒径にほとんど変化はないが、30minではそれよりも糖化率が向上するものと予想される。

図3-1 稲わらの平均粒径と結晶化指数の粉砕時間による変化

## (2) 微細構造

図 3-2(a)にタンデムリングミル $ ^{®} $ での粉砕により得られた稲わら粉末の SEM 写真を示す。ここで比較として、カッターミル粉砕により得られた 20～106μm、106～300μm、300～1000μm の粉末も図の(b)～(d)に示している。また、各々の粒度分布計により測定した平均粒径を図 3-3 に示す。
(a) ~20μm

(b) ~106μm

(c) 106~300μm

(d) 300~1000μm

図 3-2 稲わら粉末の SEM 写真

図 3-3 粒度区分ごとの稲わら粉末の 50% 粒子径

図の3-2(a)および図3-3から、タンデムリングミル $ ^{®} $ で粉砕した稲わら粉末は平均的に20μm以下の粉末になっていることがわかる。また、図3-2の(b)～(d)のカッターミル粉砕後
の粉末では $ 106\mu m $ 以下でも比較的繊維状で粒子先端が切断されている様子が認められるのに対し、タンデムリングミル $ ^{®} $ での粉砕後の粉末（図 3-2(a)）は外皮が崩壊し、四方から衝撃を受けたためと思われる団子状を示している。これは、振動ミルの特徴を如実に現しているものと思われる。また、図はそれらの粉末がさらに小さい粒子の凝集体であることを示唆しており、稲わらの構造を大きく破壊していることが期待できる。前述の平均粒径が 10min 以降で大きな変化がなかったにもかかわらず結晶化度が低下したのは、この凝集が原因と目される。

#### 3.1.2 微粉末の酵素糖化性

## (1) 粒度の影響

本研究ではまず、タンデムリングミル $ ^{®} $ 粉砕の効果の検討として、市販酵素剤である明治製菓ファルマ製のメイセラーゼにより基本酵素糖化性を調べた。図3-4には30minの粉砕加工により20μm以下まで微細化した稲わらの糖化挙動を示す。比較として、カッターミル粉砕により得られた20～106μm、106～300μm、300～1000μmの粉末での結果も示している。

(a) 24h までの糖化挙動

(b) 1h, 24h での糖化率

図 3-4 タンデムリングミル $ ^{®} $ 粉砕された稲わら粉末の酵素糖化性（サンプル数：5個）

図より、カッターミルで粉砕された106μm以下、106～300μm、300～1000μmの粉末は、106μm以下で若干の上昇は見られるが糖化率約20～30%でほとんど変化がないのに対し、タンデムリングミル $ ^{®} $ で粉砕された20μm以下では、70％近くまで向上している。これは、