Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
これらの遺伝子の機能解析を実施したところ、相殺影響を受ける遺伝子の多くがミトコンドリア電子伝達系の関連遺伝子（Atp5a1, Atp5d, Atp5k, Atp5o, Blvrb, Cox5b, Cyc1, Mdh1, Ndufa7, Ndufb11, Ndufb4, Ndufb8, Ndufs8, Ndufv2, Nqo2, Uqcrqなど）であることが判明した（図（1）-11）。

ディート (昆虫忌避剤) とペルメトリン (殺虫剤) の複合暴露時にはこれらの遺伝子が相殺影響を受けることから、これらの化学物質を併用することによりミトコンドリアの機能不全が誘発される危険性があることが判明した (検証が必要であるが、この分子挙動は倦怠感などの不定愁訴の原因になる可能性がある)。

図 $ (1)-11 $

a）相殺発現を呈するミトコンドリア電子伝達系遺伝子、

b）相殺発現を呈する候補遺伝子のGO解析

## （５）複合暴露実験３：フタル酸ビス（２-エチルヘキシル）、ビスフェノールＡの複合暴露による遺伝子発現変動

複合暴露実験3の絶対量化発現変動データより、2の方法によって相加(図（1）-12に抜粋)、相乗（図（1）-13）、相殺（図（1）-14）を示す遺伝子を抽出した。
## 図(1)-12 複合暴露実験3 相加遺伝子リスト

曲面: 平均値±Sd

色は最大発現レベルを示す

1000 copies/cell

100 copies/cell

10 copies/cell

1 copies/cell

3次元曲面における相加、相乗、相殺パターン
## 図(1)-13 複合暴露実験3 相乗遺伝子リスト

曲面: 平均値±Sd

色は最大発現レベルを示す

1000 copies/cell

100 copies/cell

10 copies/cell

1 copies/cell

3次元曲面における相加、相乗、相殺パターン
## 図(1)-14 複合暴露実験3 相殺遺伝子リスト

曲面: 平均値±Sd

色は最大発現レベルを示す

1000 copies/cell

100 copies/cell

10 copies/cell

1 copies/cell

3次元曲面における相加、相乗、相殺パターン
Zfp385b	Fam176a	Il6ra	Zdxc	Pex19	Pi4kb	Map3k3	Pln
1457704_at	1424652_at	1452416_at	1433869_at	1442815_at	1439197_at	1426686_at	1450952_at
Mcm5	Acat2	Tlcd1	Vasn	Cenpw	Rdh11	Coro1c	Cys1
1415945_at	1435630_s_at	1452132_at	1455812_x_at	1429156_at	1449209_a_at	1449660_s_at	1419070_at
Fdft1	Rdh11	Fdft1	Hps5	Rpa2	Amz2	Lims1	Pold2
1438322_x_at	1418760_at	1448130_at	1434677_at	1416433_at	1417241_at	1418230_a_at	1448277_at
Thnsl2	Habp4	Cyp51	Dnajb6	Fam98c	Fdx1	1810010H24Rik	Scap
1451455_at	1430869_a_at	1422533_at	1429777_at	1451143_at	1449108_at	1428809_at	1433520_at
Fbxw2	Smad4	Tsc2	Mll1	Aaas	Otud7b	Mvd	Ntan1
1423442_a_at	1422486_a_at	1452105_a_at	1427283_at	1451377_a_at	1429139_at	1448663_s_at	1423538_at
Ptpn2	Cflar	Dnase1l1	Mfsd11	Arid4a	Siva1	Mta1	E330009J07Rik
1438562_a_at	1425686_at	1429173_at	1455487_at	1436191_at	1426323_x_at	1417295_at	1449056_at
Rnf215	Pim2	Thap11	Olfm3	Dap3	Uchl5	Kat2b	Atp8b4
1452756_at	1417216_at	1416428_at	1425898_x_at	1450848_at	1419452_at	1450821_at	1439814_at
2610507l01Rik	Fosb	Siae	Coro7	Pqlc1	Abca9	Osbpl8	Rcbtb2
1431141_at	1422134_at	1416538_at	1428147_at	1426567_a_at	1440879_at	1437069_at	1416390_at
これらの遺伝子の機能解析を実施したところ、相殺影響を受ける遺伝子の多くがコレステロール生成の関連遺伝子（Acat2, Cyp51, Dhcr24, Fdft1, Hmger, Hsd17b7, Ldlr, Mvd, Stard4）であることが判明した（図（1）-15）。これらの分子はコレステロール生成回路の全体に分布しており、強固な抑制効果が予想される。この生成回路への影響は単独暴露の際には観察さ

a)

b)

図（1）-15

a）相殺発現を呈するコレステロール生成遺伝子、b）相殺発現を呈する候補遺伝子のGO解析

れず、このような相殺効果は従来知られていなかったものであり、環境化学物質の規制設定の参考になると共に、ドラッグシードとしての応用も考えられる。
## （６）複合効果を呈する遺伝子のプロモーター解析

複合暴露実験1，2，3の肝において相乗変化もしくは相殺変化を示した遺伝子を対象に、その転写制御において複合暴露に関連する特徴を調査すべく、TRANSFACおよびgeneExplainを用いてプロモーター解析を行った。その結果、特有のもの（該当条件でのみ存在）、共通のもの（該当条件の全候補遺伝子に共通）、および特徴的な転写因子コンビネーション（高頻度で共役するもの）の情報を得た（図（1）-16）。

特有	共通	転写因子コンピホーション
CCI4 x トルエン	相乗	V$P300_01	V$GATA4_Q3, V$NKX25_02, V$PPARG_02, V$HOXA4_Q2, V$DBP_Q6, V$HAND1E47_01, V$PAX2_02, V$GEN_INI3_B	V$AP2ALPHA_01, V$BCL6_Q3, V$BRCA_01, V$DR3_Q4, V$DR4_Q2, V$HNF4ALPHA_Q6, V$PPARG_02, V$YY1_Q5
相殺	V$ZIC3_01, V$IK_Q5	V$DBP_Q6, V$HMGIY_Q6, V$HAND1E47_01	V$COREBINDINGFACTOR_Q6, V$ETF_Q6, V$FOXJ2_02, V$HNF4ALPHA_Q6, V$PPARG_02, V$TAXCREB_01, V$TCF11_01, V$YY1_01
ディート x ペルメトリン	相乗	V$CEBP_Q2_01	V$NKX25_02, V$DBP_Q6, V$PPARG_02, V$HMGIY_Q6, V$PAX8_01	V$CEBPG_Q6, V$CP2_02, V$DR1_Q3, V$FAC1_01, V$HNF3B_01, V$P53_02, V$PAX3_01, V$SREBP_Q3
相殺	V$SREBP_Q6	V$PPARG_02, V$GATA4_Q3, V$PAX2_02, V$SREBP1_01, V$NKX25_02, V$DBP_Q6, V$PAX8_01, V$HOXA4_Q2, V$HAND1E47_01, V$CHOP_01	V$AHRARNT_01, V$CEBPD_Q6, V$CREB_02, V$DR1_Q3, V$HSF2_01, V$PPARG_01, V$SMAD3_Q6, V$YY1_Q6
DEHP x ビスフノールA	相乗	V$GATA_C, V$OCT4_02, V$NF1_Q6_01, V$TBP_Q6, V$POU3F2_02	V$NKX25_02, V$GATA4_Q3, V$PAX8_01, V$PAX6_01, V$HOXA4_Q2, V$GEN_INI3_B, V$DBP_Q6, V$HMGIY_Q6, V$CDPCR3_01, V$GRE_C	V$AP2ALPHA_01, V$COUP_DR1_Q6, V$DR4_Q2, V$HMGIY_Q6, V$HNF4ALPHA_Q6, V$MTF1_Q4, V$OCT1_02, V$WT1_Q6
相殺	V$MYOGNF1_01	V$DBP_Q6	V$AHRHIF_Q6, V$AR_Q2, V$CEBP_Q2_01, V$CREB_Q3, V$DMRT3_01, V$PAX5_02, V$PAX6_Q2, V$VDR_Q3

図 $ (1) $ - 16

現時点では3対の複合暴露実験のみを対象としているため、これらの情報を複合暴露の評価・予測に直接参照するには精度不足であるが、同様の複合暴露実験データを追加して標準データベース化してゆくことで信頼性が向上し、評価・予測判定の基盤情報の1つとなると期待される。

## （7） 複合暴露評価・予測システムのプロトタイプ

Percellomeプロジェクトでは、既に単回暴露毒性についての評価・予測サポートシステムを実用化している。このシステムでは、約100化学物質を対象とした単回暴露実験のトランスクリプトーム解析データを基盤データベースとして利用し、検体による特徴的な遺伝子発現誘導情報を入力して、その毒性を評価・予測する。

本研究の成果を反映して構築されるべき「複合暴露評価・予測システム」は、既存の単回暴露用システムに、複合暴露特有の現象に対応する標準データベースと解析エンジンを結合させた構造になる（図（1）-17）。この複合暴露解析用の追加部分も、単回暴露用システムと原理的に同様のものとなる（参照する標準データベースの内容と、解析エンジンの設定が異なるだけ）ため、基本設計はほぼ終了している。
複合毒性ネットワークモデル

図（1）-17 複合作用評価・予測システムの構成図

複合暴露評価・予測システム用の標準データベース(複合暴露トキシコデータベース)も、収録すべきデータが複合暴露解析に特化しているだけで、データベース構造に特殊な部分は無く、基本構築も終了している。既に測定済みの複合暴露実験データを収録しており、研究的な用途に利用しつつ、システム稼働に必要な追加データに備えて待機している。

## （8） 考察

本研究では、適切な実験設計を採用した3対の複合暴露実験における、網羅的で高精度のトランスクリプトームデータを得た。延べ870万遺伝子のデータであり、複合暴露評価、予測システムを稼働させるには不十分だが、その基本技術を開発し、システムのプロトタイプを構築し始めるには最小限ながら有用な情報となった。

これら3対の複合暴露実験結果を解析した結果、相加的な遺伝子発現挙動を示す遺伝子群が多数存在することが確認された。このことは、微量であっても多数の化学物質に複合暴露した場合、分子レベルではそれらの影響が加算され、ついには顕在化するリスクを示唆するものであり、今後の政策決定において環境中化学物質の量的規制を取り扱う際、留意点となる結果であると考えられた。

単独投与に比べ、複合投与において有意に遺伝子発現が増強（相乗効果）、あるいは減弱（相殺効果）する遺伝子も多数同定されたが、その大半は残念ながら機能未知であり、その意義については今後の研究の進展を待たざるを得ない。しかし上述したとおり、抽出された遺伝子リストの中には疾病や健康障害に関わると報告されている遺伝子（群）が複数含まれていた。

本研究で得られた最も重要な知見は、3対の複合暴露実験結果において、共通して相乗・相殺効果を示す遺伝子は稀であったことである。これは複合効果に関与する分子が固定したものでは無く、化学物質の組合せによって責任遺伝子群が変化することを示唆している。よって、複合暴露影響の有害性情報を迅速に政策決定へ反映させるには、本研究で基本技術を生成した複合効果の分子機序に基づく評価・予測システムの完成が必須である。

なお現時点で、複合暴露評価・予測システムは上述の通り、基本設計を終え構築を開始しているが、その基盤となる標準データベースの情報量が不足している。30対程度の複合暴露実験を追
加すれば必要最低限の情報規模が確保され、システム稼働が可能と推定している。具体的には、使用した6化学物質の組合せを変えた複合暴露実験を実施しつつ、これらとは独立した作用を有する化学物質の新規組合せ（Percellomeデータベースの単回暴露時データを参考にリストアップ済み）による実験を実施し、情報追加することで、可能になる見込みである。

## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

複合暴露は、生活環境、自然環境における生物（人や動植物）に対する化学物質暴露の一般的形態であるが、従来の毒性評価手法では対応が困難なため、新たな有害性評価技術の開発が求められてきた。

本研究により、単一化学物質の分子毒性所見から、複数の化学物質暴露による複合影響の評価・解析、及び複合暴露影響を論理的に予測するインフォマティクス開発のための基盤を確立した。本研究で取得した複合暴露実験データは3対であるが、複合暴露解析に特化した高精度の網羅的トランスクリプトームデータは世界的にも稀であり、国際的なソフトウェアプラットホームGARUDAを介したデータ公開(平成25年度中に開始予定)により、同種の研究活動の推進のみならず、今後の生命科学研究の進歩に伴う基礎医学研究の推進、新規化学物質の設計開発等に対しての貢献が期待される。

## （２）環境政策への貢献

複数の併存する環境化学物質による複合暴露が日常化している状況下、複合暴露影響の評価、予測システムの構築は政策貢献上においても急務であるが、複合暴露問題が現行の毒性学では対応できていない上、本研究で明らかになったように、複合暴露影響に関与する分子が固定していない以上、現実的時間内に技術的に実現可能なアプローチは、トキシコゲノミクスを利用した本研究しかないと考えられる（現行の毒性評価方法では無限の組合せを試験せざるを得ず、現実的な時間内に解を求めることが出来ない）。

本研究で実施した複合暴露実験は3対のみではあるが、複合効果評価基準となる専用標準データベースの構築を開始し、基本的な解析・評価技術を開発した本研究の意義は大きい。

評価システム稼働のための必須条件となる標準データの追加取得は最短3年で実施可能（期間は研究予算に依存する）であり、その結果を加えることにより、複合暴露評価体制が確立し、立案した対応策が適切な提案か否か吟味することが可能になると見込まれる。これにより、人及び環境の安全・保全の質の向上とともに、被害の未然防止の結果としての除染、補償等の経費負担の回避が期待できる。

## ＜行政が既に活用した成果＞

特に記載すべき事項はない

## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

3対の環境化学物質の複合暴露実験により、相乗・相殺挙動をとる遺伝子以外の遺伝子の多く
は相加的な挙動を示すことが判明した。この所見は複合暴露に普遍的なものである可能性が高い。注目すべきは低濃度(無症候用量)において有意な遺伝子発現変動が観察された点、すなわち個々の化学物質が微量であっても多数の化学物質が併存した場合には、相加的な遺伝子発現レベルの上昇により生体影響が顕在化する可能性を示唆していた。このような複数の化学物質に跨がる量的監視は現在、分子標的が唯一であることを前提としたダイオキシン類に限って実施されているが、今後、より多くの環境化学物質について複数の分子標的を考慮しての、同様の管理体制の導入を検討する必要がある。

本研究は、単一化学物質の分子毒性所見から、複数の化学物質の複合暴露影響を論理的に予測するインフォマティクス開発の端緒となるものであり、既に基本技術の開発の大半を終え、残るは稼働に必要な標準データベースの拡充（研究予算規模に依存するが、過去実績では最短3年で実施可能な作業量）のみとした。実用化の暁には、リスク評価・管理業務として、生活環境や自然環境の複合暴露評価体制が確立し、これによる対応策の適正化が見込まれる。これにより、人及び環境の安全・保全の質の向上とともに、被害の未然防止の結果としての除染、補償等の経費負担の回避が期待できる。

## 6 ．国際共同研究等の状況

Percellomeプロジェクトでは、北野宏明博士（特定非営利活動法人システム・バイオロジー研究機構（SBI）会長）が主催し、平成25年度中に一般公開が開始される国際的なライフサイエンス研究用ソフトウェアプラットホーム研究開発計画、Garuda Alliance（www.garuda-alliance.org）に参加し、世界有数規模を誇るPercellomeトキシコゲノミクスデータベースの提供を行うが、その一環として、本研究成果である複合暴露におけるトランスクリプトームデータの提供を予定している。

Garuda Allianceは"Garuda Platform"という共通インターフェイスや一連のソフトウェア提供・管理システムの構築を通じ、ライフサイエンス研究の解析技術・ソフトウェアの集約と、それによる相乗的な研究推進を目的とした、独創的な国際共同研究計画である。計画にはUniversity of Southern California（米）、University of Luxembourg（独）、University of Manchester（英）、University of Monash（豪）、Gwangju Institute of Science and Technology（韓）、東京大学（日）、理化学研究所（日）、慶応大学（日）、沖縄科学技術大学院大学（日）など、世界のアカデミア、バイオ企業が参加しているが、特にインフォマティクス領域に強いメンバーが多く、複合暴露影響の解析のように複雑な解析が必要な問題の解決における共同研究成果が期待できる。

### 7. 研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

<論文（査読あり）>

特に記載すべき事項はない

くその他誌上発表（査読なし）>

特に記載すべき事項はない
## （2） 口頭発表（学会等）

特に記載すべき事項はない

## （3） 出願特許

特に記載すべき事項はない

## （４）シンポジウム、セミナー等の開催（主催のもの）

1）第37回日本トキシコロジー学会 毒性オミクスシンポジウム (平成22年6月16日、沖縄コンベンションセンター、観客150名)

2）第38回日本トキシコロジー学会 毒性オミクスシンポジウム (平成23年7月12日、パシフィコ横浜 会議センター、観客170名)

3）第39回日本毒性学会 毒性オミクスシンポジウム (平成24年7月17日、仙台国際センター、観客150名)

4) 第39回日本毒性学会 子どもの毒性学シンポジウム (平成24年7月17日、仙台国際センター、観客120名)

## （５）マスコミ等への公表・報道等

特に記載すべき事項はない

## (6) その他

特に記載すべき事項はない

### 8 \. 引用文献

1) N. Matsunaga, J. Kanno, C. Hamada and I. Yoshimura: Environmetrics, 20, 1-13 (2009)

“An experimental design for judging synergism on consideration to endocrine disruptor animal experiments.”

2) J Kanno, K. Aisaki, K. Igarashi, N. Nakatsu, A. Ono, Y. Kodama and T. Nagao: BMC Genomics, 7, 64(2006), “Per cell” normalization method for mRNA measurement by quantitative PCR and microarrays.

3) D. R. Laurence & P. N. Bennett: Churchill Livingstone, (1980), “Clinical Pharmacology”

4) Y. Jinm, HP. Kim, E. Ifedigbo, LF. Lau, AM. Choi: Am J Respir Cell Mol Biol, 33, 297-302 (2005), “Cyr61 protects against hyperoxia-induced cell death via Akt pathway in pulmonary epithelial cells.”

5) M. Rumelhard, K. Ramgolam, F. Auger, A.C. Dazy, S. Blanchet, F. Marano and A. Baeza-Sguiban: Toxicology Letters, 168, 155-164 (2007), “Effects of PM2.5 components in the release of amphiregulin by human airway epithelial cells.”
## (2) 複合暴露實驗

中央労働災害防止協会 日本バイオアッセイ研究センター

試験管理部 加納 浩和

平成22～24年度累計予算額：12,003千円（うち、平成24年度予算額：4,001千円）

予算額は、間接経費を含む。

## [要旨]

C57BL/6J系雄マウスに環境化学物質2種を同時に単回強制経口投与し、その毒性を単一での投与と比較することにより、複合暴露影響の質的及び量的な修飾を検証した。具体的には複合暴露実験1で四塩化炭素とトルエン、複合暴露実験2でディートとペルメトリン、複合暴露実験3でフタル酸ビス（2-エチルヘキシル）（＝DEHP）とビスフェノールAの3対を選定し、各単一暴露群、複合暴露群を設け、さらに、各群内に、投与終了後2時間目、4時間目、8時間目及び24時間目の解剖時点を設けた。

観察、検査として、一般状態の観察、体重測定、剖検、臓器重量測定、病理組織学的検査を実施した。いずれの複合暴露実験においても、一般状態の観察を投与直前、投与直後及び各解剖期の解剖直前に実施したが、異常所見はみられなかった。また、体重測定を各解剖時点の解剖直前に実施したが、被験物質投与に関連すると考えられる体重の変動はみられなかった。

剖検、病理組織学的検査及び臓器重量測定でも被験物質投与の影響と考えられるものは認められなかった。

以上のことから、実施した3対の複合暴露実験では、一般状態、体重、剖検、臓器重量及び病理組織学的検査で、単一投与、複合投与とも影響が検出されなかった。これは、本研究の遺伝子発現ネットワークの描出という目的のために設定した、明確な毒性所見が発現しない用量（無症候用量）での検体採取実験が計画通り厳密に遂行されたことを示し、サブテーマ遺伝子発現情報解析で生成したデータの高品質を裏付けるものである。

## [キーワード]

複合暴露、環境化学物質、マウス、無症候用量

### 1. はじめに

複合暴露は、生活環境、自然環境における生物（人や動植物）に対する化学物質暴露の一般的形態であるにもかかわらず、従来の毒性評価手法では対応が困難なため、新たな有害性評価技術の開発が求められている。

従来の毒性評価のための動物実験プロトコルの基本部分を用いて、群構成と投与法を改変すれば、複合暴露実験を行うことは可能である。ただし、これにより得られた検体の評価法に複合影響判定の困難さがある。即ち、従来の病理学的・生化学的・生理学的検査では、複数の要因が作用した結果の総体としての解剖時の最終的な所見が得られることから、その成り立ちを複数の化学物質の影響に分解・合成することが困難である。複合影響の詳細を従来法で行う為には、2つの
物質の比率を変化させるなどの手段が考えられるが、比率ごとに実験を繰り返す必要があり、非現実的であった。

これに対処するためには、毒性の分子機序に基づく評価方法が必要であり、化学物質の単独暴露実験の結果を、合成可能な形式で測定・記録する方法の開発が待たれている。現時点で実用化に最も近い測定・評価技術は、マイクロアレイなど網羅的な遺伝子発現解析技術を用いたトキシコゲノミクスである。その中でも、細胞1個あたりのmRNA発現量を測定し、網羅的な遺伝子発現解析を可能としたPercellome法 $ ^{1)} $ は、測定精度が高い、データ比較が飛躍的に効率化されるという優位性のほかに、延べ270余の実験結果を統合したトキシコゲノミクスデータベースを有していることから、効率的かつ迅速な複合暴露評価技術開発が期待できる。

### 2. 研究開発目的

化学物質の複合暴露評価技術を開発するために、モデルとなる化学物質対を単独もしくは複合暴露し、その毒性を比較することにより、複合暴露影響の質的及び量的な修飾を検証する。またトキシコゲノミクス解析で用いる高品質のRNA用サンプルを高再現性が実証されている厳格な手順により採取し、サブテーマ遺伝子発現情報解析に提供して、複合暴露評価技術の開発のための基礎データ取得を支援する。

### 3. 研究開発方法

モデルとなる対の化学物質について実験動物に複合暴露を行い、動物を解剖して mRNA 測定用等の臓器を採取すると共に、剖検等の検査を行った。

## (1) 動物

動物は、日本チャールス・リバー(株)の C57BL/6J マウス（SPF）の雄を使用した。雄 70 匹を 10 週齢で導入し、2 週間の馴化を実施した。発育順調で一般状態に異常を認めなかった動物から、体重値の中央値に近い 48 匹を選別し、試験に用いた。

## （2） 飼育条件

動物は、全飼育期間を通して以下の環境で飼育した。

温度： $ 23 \pm 2^{\circ}C $

湿度： $ 55 \pm 15\% $

明暗サイクル：12時間点灯(8:00～20:00)/12時間消灯(20:00～8:00)

换気回数 : 15~17 回／時

ケージへの動物の収容方法：単飼

ケージの材質・形状・寸法等 :

ステンレス製2連網ケージ（112(W)×212(D)×120(H) mm／匹）

飼料は、全飼育期間を通して、オリエンタル酵母工業(株)のCRF-1固形飼料（30kGy-γ線照射滅菌飼料）を使用し、固形飼料給餌器により自由摂取させた。

試験に使用した飼料の栄養成分と夾雑物については、オリエンタル酵母工業(株)から分析データを使用ロットごとに入手し、保管した。また、飼料中の夾雑物は本試験計画書に規定した許容
基準と照合して異常のないことを確認し、保管した。

飲水は、全飼育期間を通して、市水（神奈川県秦野市水道局供給）をフィルターろ過した後、紫外線照射して用い、自動給水装置（給水ノズル）により自由摂取させた。

また、試験施設として実施している定期サンプリングにより、飲水サンプルの検査を(財)食品薬品安全センター秦野研究所に依頼して、水道法を参考にして規定した項目について分析し、結果を試験計画書に規定した許容基準と照合して異常のないことを確認し、保管した。

## （３）試験群の構成及び動物数

試験群は下表の計4群とした。動物数は1群当たり3匹、経時的サンプリングを投与終了後4時点（2時間後、4時間後、8時間後、及び24時間後）に実施し、計48匹とした。

化学物質（A）	化学物質（B）
溶媒对照群	—	—
複合暴露群	0.5倍量	0.5倍量
单独暴露群（A）	1倍量	—
单独暴露群（B）	—	1倍量

群分けは、投与前日に行った。供試動物の各群への割り当ては、一般状態及び体重の推移に異常を認めない動物を体重の重い順より各群に1匹ずつ割り当て、二巡目からは各群の動物の体重の合計を比較して、小さい群より順に体重の重い動物を割り当てることにより、群間の体重の偏りを小さくする群分け方法（適正層別方式） $ ^{2)} $ により実施した。

動物の個体識別は、検疫、馴化期間及び観察期間を通してケージに個体識別番号を記したラベルを付すことにより行なった。

## （４）被験物質の特性・同一性、安定性

被験物質の同一性は、赤外吸収スペクトルを赤外分光光度計（(株)島津製作所 FTIR-8200PC）により測定し、文献値 $ ^{3,4)} $ と比較し確認した。

また被験物質の安定性は、使用開始前及び使用終了後に赤外吸収スペクトルを赤外分光光度計（(株)島津製作所 FTIR-8200PC）を用いて測定し、それぞれのデータを比較することにより確認した。

## （５）被験物質の用量

各被験物質の投与用量は、国立医薬品食品衛生研究所・毒性部における、網羅的遺伝子発現変動解析に向けた用量設定実験（単回投与）の際に、一般状態の変化ならびに、投与24時間後の割検時に顕著な所見が認められないという条件の下で設定した。

複合暴露実験1：（A）四塩化炭素、（B）トルエン溶媒コーンオイル
$$ 溶媒 対照群 \quad A=0mg/kg,\quad B=0mg/kg $$

$$ A=3.5mg/kg,\quad B=500mg/kg $$

$$ A=7.0mg/kg,\quad B=0mg/kg $$

$$ A:=0mg/kg,\quad B=1000mg/kg $$

$$ ディート、\quad(B)\quad ペルメトリン $$

$$ A=0mg/kg,\quad B=0mg/kg $$

$$ A=50mg/kg,\quad B=0mg/kg $$

$$ A=100mg/kg,\quad B=0mg/kg $$

$$ A:=0mg/kg,\quad B=100mg/kg $$

$$ A=0mg/kg,\quad B=0mg/kg $$

$$ A=350mg/kg,\quad B=150mg/kg $$

$$ A=700mg/kg,\quad B=0mg/kg $$

$$ A:=0mg/kg,\quad B=300mg/kg $$

## （６）被験物質の調製

用時調整した。なお液中の被験物質の濃度は、ガスクロマトグラフを用いて確認し、設定濃度に対して正確に調製されたことを確認した。

## （7） 投与方法

0.5 mL ガラス製注射筒（(株)トップ）及びマウス用金属ゾンデ（KN-348/マウス経ロゾンデ針 夏目製作所）を用いて、投与液 10 mL/kg を強制経口投与した。なお個体ごとの投与液量は、投与前日の体重を基準に算出した。投与回数は、1 回とし、定められた時刻（10 時 15 分）に対して前後 15 分以内（10 時 00 分～10 時 30 分）に投与を終了し、投与開始・終了時刻を記録した。

## （8） 動物の検査及び臓器の保存

投与後2、4、8、及び24時間目に深麻酔下に脱血後、臓器採取を行った。1匹当たり2分半から3分以内に脱血及び、肝、腎、肺の計3臓器採取を行った。臓器採取に際しては、特にmRNA分解を最小限に抑えるため、RNA保護試薬(RNAlater $ ^{®} $ 、Applied Biosystems社)の肺内注入や肝・腎のRNAlater浸透処理を行った。

## （9） 病理組織学的檢查

病理組織学検査用に採取した腎（通常は右腎を用いるが、剖検で異常が見つかった場合は左腎を対象とする）、肝及び肺について、切り出し、パラフィン包埋を行った。その後、薄切、へマ
トキシリン・エオジン染色を行い、光学顕微鏡で病理組織学的に検査した。

## （１０）倫理面への配慮

本動物実験は、平成18年4月28日付、環境省告示第88号「実験動物の飼育及び保管ならびに苦痛の軽減に関する基準」、平成18年6月1日付け、厚生労働省大臣官房厚生科学課長通知「厚生労働省の所管する実施機関における動物実験等の実施に関する基本方針」及び平成18年11月27日付け、日本バイオアッセイ研究センター制定「動物実験に関する指針」を遵守した。また本試験は日本バイオアッセイ研究センターの動物実験委員会で承認された。

## 4 ．結果及び考察

## （１）被験物質の特性・同一性、安定性

被験物質の同一性は、赤外吸収スペクトルを赤外分光光度計（(株)島津製作所 FTIR-8200PC）により測定し、文献値 $ ^{3,4)} $ と比較し確認した。

また被験物質の安定性は、使用開始前及び使用終了後に赤外吸収スペクトルを赤外分光光度計（(株)島津製作所FTIR-8200PC）により測定し、それぞれのデータを比較することにより確認した。

## （２）複合暴露実験１（四塩化炭素、トルエン）の一般検査及び病理学的検査

いずれの群にも動物の死亡はなく、投与直前、投与直後及び解剖直前とも、一般状態にも異常所見はみられなかった。

各解剖時点の動物について、解剖直前に実施した体重測定では、被験物質投与に関連すると考えられる体重変動はみられなかった。

剖検では、投与2時間後解剖のトルエン単一ばく露群の1匹と投与8時間後解剖の複合ばく露群の1匹の左腎に水腎症が認められた。また、投与8時間後解剖の四塩化炭素単一ばく露群の1匹の左腎に結節が認められた。その他の動物には、特記すべき剖検所見は認められなかった。

臓器重量では、投与2時間後解剖のトルエン単一ばく露群の1匹に、右腎臓の実重量と体重比の高値が認められた。投与8時間後解剖の複合ばく露群の1匹に、左腎臓の実重量と体重比の高値が認められた。その他の動物の肝臓と腎臓の実重量と体重比には、顕著な低値や高値は認められなかった。

病理組織学検査では、投与2時間後解剖のトルエン単一ばく露群の1匹と投与8時間後解剖の複合ばく露群の1匹の左腎に水腎症が認められた。また、投与8時間後解剖の四塩化炭素単一ばく露群の1匹の左腎に癬痕が認められた。その他の動物には、肝を含め特記すべき病理組織学的所見を認めなかった。

腎重量の高値については、検出されたいずれの場合も、水腎症を有していたことから、被験物質投与による影響ではなく、個体差によるものと判断した。

1 匹のマウスにおいて、水腎症が観察されたが、水腎症はこの系統のマウスに自然発生として通常みられる所見であること、当該動物以外には腎に病理組織学的な異常を認めなかったことから、投与による影響ではないと判断した。同様に1 匹のマウスにおいて、結節（病理学検査では
癬痕と認められた）が観察されたが、これもこの系統のマウスに自然発生として通常みられる所見であることから、投与による影響ではないと判断した。

## （３）複合暴露実験２（ディート、ペルメトリン）の一般検査及び病理学的検査

いずれの群にも動物の死亡はなく、投与直前、投与直後及び解剖直前とも、一般状態にも異常所見はみられなかった。

各解剖時点の動物について、解剖直前に実施した体重測定では、被験物質投与に関連すると考えられる体重変動はみられなかった。

剖検では、投与24時間後解剖の複合ばく露群の1匹の左腎に水腎症と長径3 mmの結節が認められた。その他の動物には、特記すべき剖検所見は認められなかった。

臓器重量では、投与４時間後解剖のディート単一ばく露群の１匹に、肝の実重量と体重比の低値、左右腎の実重量と体重比の高値が認められた。その他の動物の肝と腎の実重量と体重比には、頭著な低値や高値は認められなかった。

病理組織学検査において、肝では特記すべき所見は認められなかった。

腎では、投与24時間後解剖の複合ばく露群の1匹の左腎に水腎症と限局性尿細管萎縮（割検で認められた結節の部分）が認められた。その他の動物には特記すべき所見は認められなかった。

肺では、投与2時間後解剖動物のペルメトリン単一ばく露群の1匹に、肺の細気管支上皮に過形成と杯細胞過形成、肺胞領域に肺胞上皮の過形成と扁平上皮化生、及び炎症性細胞浸潤が認められた。その他の動物には、特記すべき所見は認められなかった。

臓器重量の低値もしくは高値については、検出されたいずれの場合も、特定の群のみにみられた変化ではなく、病理組織学的に異常を認めなかったことから、被験物質投与による影響ではなく、個体差によるものと判断した。

1 匹のマウスにおいて、結節を伴う水腎症が観察されたが、水腎症はこの系統のマウスに自然発生として通常みられる所見であること、当該動物以外には腎に病理組織学的な異常を認めなかったことから、投与による影響ではないと判断した。結節（限局性尿細管萎縮）は、水腎症によって萎縮した腎乳頭部に認められたことから、水腎症に伴って発生した偶発病变と考えられた。また1 匹のマウスにおいて肺の細気管支に上皮の過形成と杯細胞過形成、肺胞領域に肺胞上皮の過形成と扁平上皮化生、及び炎症性細胞浸潤が認められたが、これらの変化は一本の細気管支とそれに繋がる肺胞領域だけに限局した変化として認められ、組織奇形と考えられた。

## （４）複合暴露実験３（DEHP、ビスフェノールＡ）の一般検査及び病理学的検査

いずれの群にも動物の死亡はなく、投与直前、投与直後及び解剖直前とも、一般状態にも異常所見はみられなかった。

各解剖時点の動物について、解剖直前に実施した体重測定では、被験物質投与に関連すると考えられる体重変動はみられなかった。

剖検では、投与24時間後解剖のビスフェノールA単一曝露群にて、左腎にのう胞のある個体1匹が認められた。その他の動物には、特記すべき剖検所見は認められなかった。

肝、腎の臓器重量については、投与2時間後解剖の複合ばく露群1匹、DEHP単一ばく露群1匹、
投与4時間後解剖の複合ばく露群1匹、DEHP単一ばく露群1匹、投与8時間後解剖の複合ばく露群1匹、投与24時間後解剖のDEHP単一ばく露群1匹）に、肝の実重量と体重比の低値が認められた。また、これらの動物は、腎の実重量と体重比もやや高値であった。その他、投与24時間後解剖のビスフェノールA単一ばく露群2匹の腎実重量と体重比もやや高値であった。その他の動物の肝と腎の実重量と体重比には、顕著な低値や高値は認められなかった。

病理組織学検査において、肝と肺では、特記すべき所見は認められなかった。

腎では、投与8時間後解剖のDEHP単一ばく露群の1匹の右腎と投与24時間後解剖のビスフェノールA単一ばく露群の1匹の左腎に水腎症が認められた。その他の動物には特記すべき所見は認められなかった。

臓器重量の低値もしくは高値については、検出されたいずれの場合も、特定の群のみにみられた変化ではなく、病理組織学的に異常を認めなかったことから、被験物質投与による影響ではなく、個体差によるものと判断した。

また何匹かのマウスにおいて、水腎症が観察されたが、この系統のマウスに自然発生として通常みられる所見であること、当該動物以外には腎に病理組織学的な異常を認めなかったことから、投与による影響ではないと判断した。

## （5） 判定

以上のことから、本実験で実施した、複合暴露実験においては、いずれの場合も一般状態、体重、剤検、臓器重量及び病理組織学的検査で、計画どおり、単一投与による影響は認められず、また、複合ばく露による影響も検出されなかった。

またサブテーマ遺伝子発現情報解析で測定した遺伝子発現データにおいても、概日リズムの乱れを示す異常は検出されず、Percellome 遺伝子発現解析に適した高品質の mRNA 測定用サンプル採取が成されたことを確認した。

## （6） 考察

本サブテーマの結果は、実施した検査項目上、単一投与、複合投与とも完全な陰性データであり、溶媒対照群との有意差は一切無いが、サブテーマ遺伝子発現情報解析の結果の通り、遺伝子発現レベルでは有意な遺伝子発現変動が観察されている。

もし通常の動物試験のように、本サブテーマで実施した検査項目で検知されるほどの化学物質を投与してしまった場合、そのサンプルを用いた遺伝子発現情報解析では、毒性症状に直接関連する、毒性ネットワークの最下流の遺伝子変動に隠れ、本来、研究すべき上流ネットワークの検出、解析が困難になる。これは今後、遺伝子発現変動測定を含む試験計画を立案する際に留意すべきポイントである。

## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

複合暴露は、生活環境、自然環境における生物（人や動植物）に対する化学物質暴露の一般的形態であるが、従来の毒性評価手法では対応が困難なため、新たな有害性評価技術の開発が
求められてきた。

本研究により、単一化学物質の分子毒性所見から、複数の化学物質暴露による複合影響の評価・解析を可能とする、複合暴露影響を論理的に予測するインフォマティクス開発への道が開かれる。本研究のようなインフォマティクス開発においては、基盤となる生体データの品質は極めて重要である。測定が高感度であるほど、些細な誤差が解析の障害となり、しかも解析の初期のうちはそれが誤差であるとの認識が難しく、最終的な開発段階に至って初めて障害として気付かれることも多い。本研究に於いては、厳密な飼育環境維持(特に照明制御による概日リズムの同調化)の下、mRNA用サンプル採取に最適化された高度な動物実験を実施し、単独投与群（各1）、複合投与群（1）、溶媒対照群（1）の4群(n=3)につき、投与後2、4、8、24時間にて採取した肝、肺、腎の計144サンプルを得た。

これらのサンプルから得られる高精度かつ網羅的なトランスクリプトーム情報は、本研究目的である複合暴露影響の評価・予測技術開発だけでなく、さらに、生命活動の重要な分子機序であるシグナルネットワークの解明等に欠かせないものであり、生命科学研究の進歩に伴う基礎医学研究の推進、新規化学物質の設計開発など、に対する長期的な波及効果は極めて大きい。

（２）環境政策への貢献

＜行政が既に活用した成果＞

特に記載すべき事項はない

＜行政が活用することが見込まれる成果＞

特に記載すべき事項はない

6. 国際共同研究等の状況

特に記載すべき事項はない

### 7. 研究成果の発表状況

（1）誌上発表

<論文（査読あり）>

特に記載すべき事項はない

<査読付論文に準ずる成果発表>

特に記載すべき事項はない

くその他誌上発表（査読なし）>

特に記載すべき事項はない

（2）口頭発表（学会等）

特に記載すべき事項はない
## （3） 出願特許

特に記載すべき事項はない

（4）シンポジウム、セミナーの開催（主催のもの）

特に記載すべき事項はない

## （５）マスコミ等への公表・報道等

特に記載すべき事項はない

## (6) その他

特に記載すべき事項はない

### 8 \. 引用文献

1) J Kanno, K. Aisaki, K. Igarashi, N. Nakatsu, A. Ono, Y. Kodama and T. Nagao: BMC Genomics, 7, 64 (2006)

“Per cell” normalization method for mRNA measurement by quantitative PCR and microarrays.”

2）阿部正信：薬理と治療、14、7285-730（1986）

“長期毒性試験に用いるラット、マウスの体重変化の解析による群分けの適正層別方式の確立。”

3) Bio-Rad Laboratories. 2009.

“4366 Pesticides & Agricultural Chemicals. Bio-Rad’s IR Spectral Database.”

4) FW. McLafferty, ed.: Jone Wiley and Sons. (1994) "Wiley Registry of Mass Spectral Data. 6th ed."
# Molecular Toxicology Study for Risk Assessment of Combined Exposure to Environmental Chemicals

Principal Investigator: Jun KANNO

Institution: National Institute of Health Sciences (NIHS)

Address: 1-18-1 Kamiyoga, Setagawa-ku, Tokyo 158-8501, Japan

TEL: +81-3-3700-9619, FAX: +81-3-3700-9647

E-mail address: kanno@nihs.go.jp

Cooperated by: Japan Bioassay Research Center

## [Abstract]

Key Words: Combined effect, Combined exposure, Percellome Toxicogenomics, Mouse, Synergistic effect

The goal of this research is to develop a molecular-mechanism-based prediction informatics system for prediction of combined effect of more than one chemical simultaneously administered. Percellome Toxicogenomics system is applied to the combined exposure model using mice. Four groups of 12 male C57BL/6 mice each were administered, by single oral gavage, either Chemical A alone, Chemical B alone, half amounts of Chemical A and Chemical B as combined exposure, and vehicle common to both chemicals. Liver, lung and kidney for mRNA analysis by Affymetrix GeneChip Mouse 430 2.0 were sampled at 2, 4, 8, and 24 hours after gavage (n=3 each). GeneChip data was obtained by a Percellome method, i.e. absolute mRNA copy number per one cell (average) for the liver and in one study the liver and lung. The mRNA expression data were plotted onto the 3-dimension surface graph for further analysis. Original software designed to handle the 3-D surface including “RSort” was utilized to automatically extract genes that show significant response out of 45,000 probe sets data generated by the GeneChip, and then, they were assorted by Student’s t-test and Welch-test into “additive”, “synergistic”, and “antagonistic” responses. Three chemical pairs, i.e. carbon tetrachloride (CCl $ _{4} $ ) and toluene (Tol), Deet and Permethrin (Perm), Bis(2-ethylhexyl)phthalate (DEHP) and Bisphenol A (BPA) were selected, due to several reasons including preexisting rich data for single oral gavage study data in the Percellome database.

There were several notable combined effects in the gene responses. The synergistic expression of Cyr61, one of the molecular targets in various models of lung injury and human lung diseases, suggests a potential toxicity of $ CCl_{4} $ and Tol combined
exposure in lung. In this study, another synergistic response among pulmonary fibrosis related genes were observed. Deet and Perm pair induced antagonistic response of mitochondrial electron transport system genes in liver which might relate to wasting syndrome, and DEHP and BPA pair cause hitherto unreported antagonistic suppression of genes related to cholesterol biosynthesis in liver.

Through the promoter analysis it was suggest that there were some specific and/or common transcriptional factor binding sites where identified, suggesting that combined effects are dependent at least in part on transcriptional regulation mechanism.

As a whole, the Percellome approach shows here was considered as a promising direction for the development of predictive systems of combined effects further research, adding a few more chemical pairs should contribute to the maturation of the prediction system.
## C-1007

# 化学物質の複合暴露による健康リスク評価に関する分子毒性学的研究

## 厚生労働省 国立医薬品食品衛生研究所

## 複合暴露による遺伝子発現変動データベース*の構築開始*最終目標である複合暴露影響評価・予測システムの基盤DBとなる。

健康影響評価·予測

## トキシコゲノミクス技術による複合暴露評価手法の確立

RSortと統計パラメータによる候補遺伝子の自動抽出

●PercellomeExplorerによる複合暴露トキシコDB & PercellomeDBの一括参照

●in silico プロモータ解析等による健康影響評価や分子毒性機序解析

## 健康影響に関与する可能性のある遺伝子発現レベルの複合暴露影響の発見

CCl4 × トルエンの複合暴露影響の解析

肺におけるCry61遺伝子の相乗発現

肺における細胞外マトリックス関連遺伝子(amphiregulin等)の相乗発現

ディート x ペルメトリンの複合暴露影響の解析

肝におけるミトコンドリア電子伝達系遺伝子群の相殺発現

DEHP x ビスフェノールAの複合暴露影響の解析

肝におけるコレステロール生成遺伝子群の相殺発現

肝における薬剤耐性トランスポーター遺伝子(Abcc3)の相乗発現

## 複合暴露影響の分子機序解析

- 各々の複合暴露実験の候補遺伝子群において共通する転写因子結合部位の抽出

・各々の複合暴露実験の候補遺伝子群における転写因子コンビネーション解析

→単回複合投与による毒性分子機序の解明
## 政策ごとの予算との対応について(個別表)【東日本大震災復興特別会計】

(所管)復興庁

(会計)東日本大震災復興特別会計

(单位: 千円)

政策評価体系	勘定・組織	項	事項	26年度予算額	27年度予算額	比較増△減額
1.情報通信(ICT政策)	3,877,320	2,226,745	△ 1,650,575
(1)情報通信技術高度利活用の推進	復興庁	生活基盤行政復興政策費	情報通信技術の利活用高度化に必要な経費	3,662,500	1,936,594	△ 1,725,906
(2)情報通信技術利用環境の整備	復興庁	生活基盤行政復興政策費	情報通信技術の利用環境整備に必要な経費	214,820	290,151	75,331
2.国民生活と安心・安全	3,887,924	3,230,955	△ 656,969
(1)消防防災体制の充実強化	復興庁	生活基盤行政復興政策費	消防防災体制等の整備に必要な経費	239,451	334,779	95,328
(2)消防防災体制の充実強化	復興庁	生活基盤行政復興事業費	消防防災体制等の整備に必要な経費	3,648,473	2,896,176	△ 752,297
計	7,765,244	5,457,700	△ 2,307,544

（注）1. 政策評価の対象となる予算及び政策評価の対象外の予算で政策に関連付けられるものを掲記している。

2. 復興庁所管分のうち総務省関係のみ掲記している。

3. 26年度予算額は、当初予算額である。
# 循環型社会形成推進科学研究費補助金 総合研究報告書概要版

1. 研究課題 磁石合金スクラップから希土類元素を抽出・分離する新技術の開発 (K2104, K22041)

2. 国庫補助金精算所要額 20,460,000 円

3. 研究期間 2009 年～2010 年

4. 研究年度 2010 年

5. 研究代表者名 ___ 岡部 徹 (東京大学生産技術研究所)

6. 研究目的

希土類合金磁石は、生産量が急激に増大しており、特に近年は、高性能エアコンやハイブリッド自動車などの駆動用モータの需要増加が大きい。自動車の駆動用モータのように、高温下で動作する機器に使用されるネオジム磁石については、耐熱性と保磁力を向上させるため、資源的に希少なジスプロシウム(Dy)が最大で10mass%程度も添加される。このため今後、ハイブリッド自動車や電気自動車が普及すると、Dyを多量添加したネオジム磁石の需要はさらに増加すると予想されている。しかし近年、中国政府が希土類元素の輸出に対する規制を強化したため、生産量に制約があるDyを中心に希土類元素の価格が高騰し、磁石材料の安定供給に対する不安が高まっている。希土類鉱石の採掘や製錬の際の環境破壊やDyの資源的制約を考えると、製品スクラップからの希土類元素の回収および再利用は重要な課題である。このため申請者は、磁石合金スクラップから効率良く希土類元素を分離・回収する新技術の開発を目的とする基礎的な研究を行う。

### 7. 研究方法

本研究の初年度である平成21年度は、リサイクルプロセスの第一段階である溶融$\mathrm{MgCl}_{2}$を用いた希土類元素抽出工程について、以下の基礎的な実験を行った。プロセスは主に、希土類元素を$\mathrm{MgCl}_{2}$溶融塩中に抽出する工程と、得られた混合塩から希土類の化合物を回収する工程からなる。Fig. 1に溶融$\mathrm{MgCl}_{2}$を抽出媒体として用いた希土類回収プロセスのフローチャートを示す。

Fig. 2 に溶融 $ ZnI_{2} $ を希土類元素の抽出媒体として用いた希土類元素回収プロセスのフローチャートを示す。プロセスは $ MgCl_{2} $ を抽出媒体とした場合と同様に、磁石合金中の希土