Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
表(3)-9 PBSおよび人工海水中の微生物の不活化速度

不活化速度[ $ Log_{10} $ hour $ ^{-1} $ ]
PBS	人工海水
大肠菌	0.99	2.2
肠球菌	0.58	0.37
MS2	0.03	0.12
大肠菌群	1.18	1.9

図(3)-23 光強度と石英ガラス板の蓋の関係

は大腸菌や大腸菌群と比べ太陽光や塩分に対しての耐性が高いことが示された。MS2においては上記の3種の細菌は全く違う挙動を示した。このことから、太陽光による不活化を考慮する必要がある環境では、ウイルスの指標として細菌を使用することは難しいと考えられる。可視光照射による不活化機構として、細胞内のポルフィリンが細胞内で光増感剤として作用し、光励起によるエネルギー移動によって一重項酸素が発生し、細菌が不活化すると考えられている $ ^{4} $ 。ウイルスは粒子中にポルフィリンを持たないため、MS2はほぼ不活化しなかったと考えられる。

照射光強度について、今回の実験ではウェルプレートに蒸発防止のため石英ガラスの蓋をした。これにより、380nm~430nm の光強度は $ 4.6\ mW/cm^{2} $ から $ 3.0\ mW/cm^{2} $ に約 35% 低下した（図(3)-24）。Maclean ら $ ^{5)} $ は、照射波長域 $ 380nm\sim430nm $ 程度の LED 光源（光強度 $ 10mW/cm^{2} $ ）を用いて不活化実験を行い、その時の不活化速度は大腸菌が $ 0.62\ Log_{10}/hour $ 、腸球菌が $ 0.44\ Log_{10}/hour $ であった。不活化傾向は類似した傾向をとっているがその不活化速度を比較すると今回の実験で得た値は Maclean らの不活化速度の大腸菌は約 1.6 倍、腸球菌は 1.3 倍であった。これは、ポルフィリンが波長 $ 500\ nm\sim700\ nm $ にも吸収帯を持つことが原因であると考えられる。ポルフィリンはソーレー帯と呼ばれる $ 400\ nm\sim500\ nm $ 付近の鋭い吸収帯と、Q 帯と呼ばれる $ 500\ nm\sim700\ nm $ 付近の吸収帯を持つ。今回の実験では Q 帯の光によっても不活化がおきたため、Maclean らの結果より不活化速度が速くなったと考えられる。
今回得られた不活化速度が正しいとすると、河川流下に伴い指標微生物濃度は減少することになる。しかし、一般に河川流下に伴い指標微生物濃度が上昇することが知られており、今回の実験結果と矛盾する。この原因として、天候の変化や川底の石・水深等により太陽光が遮蔽されていること、太陽光による指標微生物の不活化速度よりも環境水中での増殖速度や光回復速度の方が大きいことなどが考えられる。

## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

震災後の段階的復旧において用いられた様々な下水処理方法（暫定的な二次処理や強化された塩素処理等）による衛生学的水質項目の処理効率や放流水質を詳細に解明することができた。衛生学的指標として現在用いられている大肠菌群だけでなく、病原微生物の指標として提案されている様々な微生物（大肠菌、腸球菌、ファージ、ヒトウイルス）を同じ試料から検出することにより、各種糞便汚染指標の病原ウイルスに対する指標性について評価することができた。また、汚染の起源を特定できる糞便汚染指標として開発が進められているバクテロイデスマーカーを下水処理水放流先海域での調査に適用することで、このマーカーが海域において糞便汚染指標としての特徴を有していることが示唆された。さらに、可視光による不活化速度が微生物の種類により大きく異なることから、処理水放流先海域での微生物指標およびウイルスの消長について重要なファクターになる可能性が示された。

## （２）環境政策への貢献

## ＜行政が既に活用した成果＞

特に記載すべき事項はない。

## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

東日本大震災のような下水処理場に大きな被害を与える災害後の下水処理復旧期において、処理水の衛生学的水質は現在大腸菌群数を基準値以下にすることで担保している。しかし、現在注視されている病原微生物であるウイルスや原虫は塩素に対する耐性が高く、大腸菌群数低減のため用いられた塩素処理の強化によって制御することは困難であることから、放流先水域においてこれら病原微生物の濃度が上昇することが懸念される。

塩素処理の強化により、下水処理復旧期においても放流水の指標細菌濃度は放流先水域と同程度に低くなっていた。また細菌はウイルスと比較して太陽光による不活化速度が速く、放流先水域での挙動は大きく異なると予想される。これらの結果より、指標細菌を用いて放流先水域の病原微生物、特にウイルスや原虫の消長を把握するのは困難である。指標細菌に代わる新たな指標としては、今回測定したバクテロイデスの遺伝子マーカーのように、処理水中に比較的高い濃度で存在し、放流先水域で容易に減衰しない特徴を持つ項目を用いるのが望ましい。

これらの成果は、今後水環境学会での発表や委員会等での政策決定者との意見交換を通じ広報・普及に努める
## 6 ．国際共同研究等の状況

特に記載すべき事項はない。

## 7 ．研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

<論文（査読あり）>

特に記載すべき事項はない。

くその他誌上発表（査読なし）>

特に記載すべき事項はない。

## （2） 口頭発表（学会等）

1) 佐竹明日香, 真砂佳史, 大村達夫: 平成24年度土木学会東北支部技術研究発表会（2013）「可視光照射による糞便汚染指標細菌の不活化」

2) 真砂佳史，稲葉愛美：日本水環境学会水中健康微生物研究員会「東日本大震災による下水処理施設の被害からの復旧・復興に向けた取り組み」（2013）「衛生学的観点からの復旧期の下水処理効率の評価」

3) 真砂佳史, 稲葉愛美, 風間しのぶ, 片山浩之, 大村達夫: 第16回水環境学会シンポジウム (2013) 「東日本大震災後の段階的復旧にともなう下水処理効率の回復状況」

4) 真砂佳史，久保田健吾，勝又雅博，佐竹明日香，佐藤紀子，島田祐輔，袖野太士，原田秀樹，大村達夫：第48回水環境学会年会（2014）「人為汚染の有無が大腸菌群の種構成に与える影響」

5) 真砂佳史，稲葉愛美：震災からの復旧に取り組む下水道と放流先の水質状況（2014）「被災浄化センターの復旧に伴う処理効率および放流水質の改善状況」

## （3） 出願特許

特に記載すべき事項はない。

（４）シンポジウム、セミナーの開催（主催のもの）

特に記載すべき事項はない。

（５）マスコミ等への公表・報道等

特に記載すべき事項はない。

## (6) その他

特に記載すべき事項はない。
### 8. 引用文献

1) Stevens et al., (2003) Review of coliforms as microbial indicators of drinking water quality. National Health and Medical Research Council, ISBN: 1864961651

2）厚生労働省，微生物に係る基準の考え方，2002.

3) Kobayashi, A., Sano, D., Taniuchi, A., Ishii, S. and Okabe, S. (2013) Use of a genetically-engineered Escherichia coli strain as a sample process control for quantification of the host-specific bacterial genetic markers. Appl. Microbiol. Biotech, 97(20), 9165-9173.

4) Maclean, M., MacGregor, S. J., Anderson, J. G. and Woolsey, G. (2008) High-intensity narrow-spectrum light inactivation and wavelength sensitivity of Staphylococcus aureus. FEMS Microbiol. Lett., 285(2), 227-232.

5) Maclean, M., MacGregor, S. J., Anderson, J. G. and Woolsey, G. (2009) Inactivation of bacterial pathogens following exposure to light from a 405-nanometer light-emitting diode array. Appl. Environ. Microbiol., 75(7), 1932-1937.
# Effectiveness of Indicator Microorganisms for Water Pollution Caused by Waterborne Pathogens and Evaluation of Disinfection Technology

Principal Investigator: Hiroaki TANAKA

Institution: Kyoto University

1-2 Yumihama, Otsu, Shiga, 520-0811, JAPAN

Tel: +81-77-527-6222 / Fax: +81-77-524-9869

E-mail: htanaka@biwa.eqc.kyoto-u.ac.jp

Cooperated by: The University of Tokyo, Tohoku University

## [Abstract]

Key Words: The Great East Japan Earthquake, Pathogenic virus, Disinfection process, Ecological toxicity, Next generation sequencer, Fecal indicator bacteria, Wastewater treatment plant

The Great East Japan Earthquake followed by the massive tsunami devastated municipal wastewater treatment plants (WWTPs) located along the seashore of the Pacific Ocean. Since then, in the coastal waters, it is thought that higher concentrations of bacteria and viruses were discharged from the damaged WWTPs until their recovery from malfunction. In this study, we investigated 1) the wastewater treatment efficiency and the quality of treated wastewater at four damaged WWTPs in Miyagi prefecture during and after their recovery from the damage; 2) the fate of fecal indicator bacteria and viruses in near-shore seawater receiving discharges from the WWTPs; 3) ecological toxicity of discharged wastewater which was disinfected with higher dose of chlorine; and 4) disinfection efficiency of chlorine and alternative disinfection processes such as UV and ozonation.

We found that bacterial indicators were relatively low and complied with discharge regulation in terms of 3000 cfu/ml of total coliforms. However, higher concentrations of viruses had been discharged from the WWTPs during their recovery period than those after restart of biological treatment, whereas the levels of fecal indicator bacteria were relatively constant. One of the reasons is that during the recovery period chlorination was enhanced to inactivate total coliforms to observe the discharge regulation, which resulted in lower bacterial indicators in the discharge even though reduction in tentative treatment before chlorination was lower in the damaged WWTP. On the contrary, viruses that are resistant to combined chlorine were less effectively removed in the tentative treatment, could survive the enhanced chlorination processes and remained high concentration in the discharge. We also found that the genomes of fecal bacteria and viruses discharged from the WWTPs decreased in the coastal receiving waters along distance from the WWTP.
outlets due to dilution. Correlation analysis showed that bacteriophages better described the fate of human viruses in the coastal waters receiving the WWTP discharge than indicator bacteria.

We also studied characteristics of chlorination, UV irradiation, and ozonation of effluent from insufficient wastewater treatment from the viewpoints of disinfection effects of fecal indicator organisms and ecological toxicities. Chlorination showed efficient disinfection effects on bacterial indicators but little on viral indicators, and high ecological toxicity though dechlorination was able to mitigate the toxicities. UV disinfection was able to reduce both bacterial and viral indicators with increasing UV dose and no significant toxicities were increased. Ozone disinfection showed effective to the viral indicator but less to the bacterial indicators. Aeration and aerobic contact process before disinfection could reduce chlorine and ozone consumption though disinfection efficiency was not improved in terms of CT values of chlorination and ozone consumption. Coagulation and aerobic contact processes can improve UV disinfection effect.
課題名 C−1007 化学物質の複合暴露による健康リスク評価に関する分子毒性学的研究

課題代表者名 菅野純（国立医薬品食品衛生研究所安全性生物試験研究センター 毒性部部長）

研究实施期间 平成22～24年度

累計予算額 59,492 千円（うち 24 年度 15,129 千円）

予算額は、間接経費を含む。

本研究のキーワード（5～10個以下程度）複合暴露影響評価、トキシコゲノミクス、パーセローム、相加相乗性、マウス

## 研究体制

(1) 遺伝子発現情報解析、総括(国立医薬品食品衛生研究所)

(2)複合暴露実験(中央労働災害防止協会)

研究協力機関

なし

## 研究概要

### 1. はじめに(研究背景等)

人や野生動物は、環境中に意図的に散布された、或いは非意図的に分散した複数の化学物質の複合暴露を受けているが、法規制に関わる基準値は単独化合物についてしか検討されていない。その理由として、複合暴露問題が現行の毒性学では扱いきれていないことが挙げられ、そこには、解決を要する2つの問題点が存在している。

第一点は、現在までの毒性学では、化学物質Aの毒性情報と、化学物質Bの毒性情報が在ったとしても、それらが現象論的な情報であることから、A+Bの複合暴露による毒性を予測することが困難であり、A+Bは、新物質Cとして改めて検討し直す必要がある。このため、複合暴露の評価には、化学物質や濃度毎の厖大な組み合わせ数の毒性試験を逐次実施しなければならない状況にあり、現実的に手がつかないのである。

第二点は、複合暴露が起こった際の閾値が、個々の単一化学物質の閾値と同等であるかどうかの科学的検討が成されていないことである。毒性に閾値が有るということは、例えば、体の中に毒性に対抗する中和物質が備わっていて、ある量の毒性物質までは中和するためであると考えることが出来る。現行の法規制では、個々の化学物質の暴露量が閾値以下であれば、複数の化学物質に同時に暴露されても、毒性症状は現れないと仮定している。しかし、実際は中和物質の減少はこの閾値以下の量でも起こるので、個々が閾値以下の量であっても複合して作用した場合、中和物質が枯渇してしまい、毒性症状が現れる可能性がある。

これらの問題点は、毒性学の近代化を目指し我々が進めているパーセローム（Percellome）トキシコゲノミクス法により解決する事が可能である。この手法は、mRNA発現データの精度と定量的な取り扱い性能を格段に向上させたものであり、毒性症状が明らかになる前の段階から、且つ微量暴露の状態から化学物質影響を、網羅性を担保しつつ、高感度・定量的に観察するものである。その為、化学物質A＋BをCとせず、AとBのそれぞれのPercellome情報からA＋Bを科学的に予測することが可能になると期待される。

### 2. 研究開発目的

本研究の目的は、中央環境審議会からも指摘され国民や専門家からの常々の要望の対象となってきているものの、現行の毒性評価法では技術的に対応困難であるところの、環境化学物質の複合暴露により惹起される生体影響を正確かつ迅速に評価する技術の開発である。

そのためには、研究代表者の複合影響判定に関する数理統計学的基礎(Matsunaga et al. Environmetrics (2009), 20:1-13、東京医科歯科大学佐久間昭教授、東京理科大学吉村功教授との交流を経る)と、トキシコ
ゲノミクス、特に時間的・暴露量的に毒性発現の基礎となる定量的なmRNA変動を指標とした生体影響の評価を可能にするパーセローム(Percellome)トキシコゲノミクス手法(Kanno et.al. BMC Genomics (2006), 7:64、特許第4415079号)による分子毒性学的な有害性評価検討手法の应用が現実的かつ効率的であり、単体で暴露した際のPercellomeトキシコゲノミクス(高精度の網羅的遺伝子発現)情報が既に得られている環境化学物質から代表的な3対を選択し、複合暴露した際のPercellomeトキシコゲノミクス情報を得て、開発済みの分子毒性学的な有害性評価検討手法を基盤とした、分子メカニズムに基づく正確かつ迅速な複合暴露影響の安全性評価法の開発を目指す。

また複合影響の予測システム開発及び実用化に必須となる、複合暴露による遺伝子発現データベースを、網羅性と高い定量性を以て構築する。

### 3. 研究開発の方法

## (1) 遺伝子発現情報解析

## 1 ) mRNA 絶対量測定

サブテーマ「複合暴露実験」により採取したmRNA測定用サンプル（マウス肝（一部、肺・腎）、最大3臓器、4投与群（溶媒対照群、各単独投与群、及び複合投与群）、4時点、計16群（一群3匹））について、Affymetrix社GeneChip Mouse Genome 430 2.0 ArrayにPercellome法(Kanno et al. BMC Genomics. 7, 64, 2006 / 特許第4415079号)を適用し、mRNA発現量を細胞1個当たりのコピー数として計測した。具体的にはサンプル破碎液中のDNA含量から細胞数を求め、濃度の異なる複数の外部標準RNA(スパイクRNA)を細胞1個当たり決まった分子数だけその破碎液に添加してから、RNA抽出、マイクロアレイ測定を行う。スパイクRNAの測定値が細胞1個当たり何コピーに由来するかが既知であることを利用し、サンプル中の全てのmRNA測定値を、細胞1個当たりのコピー数に換算した(SCal4.exe使用)。

## 2 ) データ解析

上記のGeneChipにより測定され、Percellome法によって絶対量化された約4万の遺伝子発現情報から、暴露条件(溶媒対照、各化学物質単独もしくは複合)、及び時間、発現量よりなる3次元曲面データを生成

(MFAnalyzer.exe及びCreateSurface.exeを使用)し、主たる遺伝子の発現パターンを評価(MFSurface.exe及びMSV2.exeを使用)しつつ、RSort(特徴的な発現を示す遺伝子をその3次元曲面パターンを用いて自動抽出する独自アルゴリズム)によって、複合暴露影響を受けている可能性のある遺伝子候補を自動抽出した。複合暴露効果判定は、Matsunagaらの報告(Environmetrics 2012009)を参考に、t検定およびWelch検定による単独ばく露群と複合ばく露群との間の有意差検定を適用した。

抽出した遺伝子群については、PercellomeExplorer.exe等を用いてPercellomeデータベースの単独投与時データと網羅的に比較すると共に、IPA(Ingenuity Systems社)によるPathway解析、Genomatix Suite(Genomatix社)、TRANSFAC(BIOBASE社)、GenExplain(GenExplain社)によるプロモーター解析を実施した。

## (2) 複合暴露実験

化学物質の対として、①四塩化炭素(溶剂)とトルエン(溶剂)、②ディート(昆虫忌避剤)とペルメトリン(殺虫剤)、③フタル酸ビス(2-エチルヘキシル)(=DEHP，可塑剤)とビスフェノールA(樹脂原料・可塑剤)の3対について、C57BL/6J系雄マウスに複合暴露を行い、mRNA測定用等の臓器を採取した。

複合暴露実験1:(A)四塩化炭素、(B)トルエン

溶媒 コンオイル

溶媒对照群 A=0mg/kg, B=0mg/kg

複合暴露群 A=3.5mg/kg, B=500mg/kg

单独暴露群（A） A=7.0mg/kg，B=0mg/kg

单独暴露群（B） A: =0 mg/kg, B = 1000 mg/kg

複合暴露実験2：(A) ディート、(B) ペルメトリン

溶媒 コーンオイル

溶媒对照群 A=0mg/kg, B=0mg/kg

複合暴露群 A=50mg/kg, B=0mg/kg

单独暴露群(A) A=100mg/kg, B=0mg/kg

单独暴露群(B) A: =0mg/kg, B =100mg/kg

複合暴露実験3：(A) フタル酸ビス（2-エチルヘキシル）、(B) ビスフェノールA
$$ 溶媒 \quad0.1\%DMSO 添加コーンオイル $$

$$ 溶媒 対照群 \qquad A=0mg/kg,B=0mg/kg $$

$$ 複合暴露群 \qquad A=350mg/kg,B=150mg/kg $$

$$ 单独暴露群 (A)\quad A=700mg/kg,B=0mg/kg $$

$$ 单独暴露群 (B)\quad A\text{:=}0mg/kg,B\text{=}300mg/kg $$

## 1 ) 動物

C57BL/6Jマウス（SPF、チャールス・リバー）、雄、12週齢

## 2 ) 被験物質の調製

コーンオイル（複合暴露実験1，2）もしくは0.1%DMSO添加コーンオイル（複合暴露実験3）を溶媒に用い、用時調整した。なお液中の被験物質の濃度は、ガスクロマトグラフを用いて確認し、設定濃度に対して正確に調製されたことを確認した。

## 3 ) 投与方法

単回強制経口投与。概日リズムが、遺伝子発現値に大きく影響することから、馴化及び実験期間中の12時間明暗サイクルを厳守し、投与とサンプル採取は、定められた時刻に対して前後約20分以内に完了させた。

## 4 )試験群の構成及び動物数

試験群は下表の計4群とした。動物数は1群当たり3匹、経時的サンプリングを投与終了後4時点（2時間後、4時間後、8時間後、及び24時間後）に実施し、計48匹とした。

## 5 )動物の検査及び臓器の保存

投与後2、4、8、及び24時間目に深麻酔下に脱血後、臓器採取を行った。1匹当たり2分半から3分以内に脱血及び、肝、腎、肺の計3臓器採取を行った。臓器採取に際しては、特にmRNA分解を最小限に抑えるため、RNA保護試薬（RNAlater $ ^{®} $ 、Applied Biosystems社）の肺内注入や肝・腎のRNAlater浸透処理を行った。

## 6 )倫理面への配慮

本動物実験は、平成18年4月28日付、環境省告示第88号「実験動物の飼育及び保管ならびに苦痛の軽減に関する基準」、平成18年6月1日付、厚生労働省大臣官房厚生科学課長通知「厚生労働省の所管する実施機関における動物実験等の実施に関する基本方針」及び平成18年11月27日付、日本バイオアッセイ研究センター制定「動物実験に関する指針」を遵守した。また本試験は日本バイオアッセイ研究センターの動物実験委員会で承認された。

### 4. 結果及び考察

## (1) 遺伝子発現情報解析の結果

Percellome標準プロトコルに沿って、サブテーマ(2)「複合暴露実験」で採取したサンプルから低分解・高純度のRNAを抽出し、GeneChip Mouse Genome 430 2.0 Array（Affymetrix）を用いて約4万種のmRNAの経時的発現量変動を細胞1個当たりのコピー数という絶対単位量として測定した。3件の複合暴露実験から延べ870万遺伝子の絶対量化発現変動データを得て、複合暴露評価・予測システムの専用標準データベースの構築を開始した。

複合暴露影響を受ける遺伝子の抽出及び分子機序に関する解析を行い、各複合暴露実験から以下の知見を得た。複合暴露実験1（四塩化炭素xトルエン）では、ヒトの肺疾患でも関連性が報告されているCyr61の相乗発現を肺において検出し、その発現制御ネットワークをプロモーター解析により推定した。また肺の線維化に関連し、PM2.5暴露でも惹起される遺伝子群の相乗発現も検出した。複合暴露実験2では肝においてミトコンドリア電子伝達系の遺伝子群の相殺発現を検出し、ヒトが複合暴露された場合に倦怠感などの不定愁訴に繋がる可能性を見出した。複合暴露実験3においては、肝におけるコレステロール生合成遺伝子群の相殺発現を検出し、従来知られていなかった複合効果を発見した。

さらにこれらの複合暴露実験で相乗変化もしくは相殺変化を示した遺伝子のプロモーター解析から、複合効果の分子機序に関与すると考えられる転写因子結合部位の情報を得た。

以上により分子レベルでの複合作用の検出及び解析技術を生成し、これを基盤として複合影響の評価・予測解析システムの可能性を示した。

## (2) 複合暴露実験の結果

Percellome遺伝子発現解析は毒性の初期応答の分子機序の解明を目的として行うものであり、最終結果としての表現型(毒性症状)の惹起に直接関わる遺伝子変動の混信が起こらない用量設定を行い、実際の動物実
験でも一般状態、体重、剖検、臓器重量及び病理組織学的検査では、いずれの条件でも被験物質投与の影響が検出されなかったことを確認する必要がある。

よって本研究で実施した3対の複合暴露実験では、一般状態の観察を投与直前、投与直後及び各解剖期の解剖直前に実施し、異常所見が見られないことを確認した。また、体重測定を各解剖時点の解剖直前に実施し、被験物質投与に関連すると考えられる体重の変動の無いことを確認した。剖検、病理組織学的検査及び臓器重量測定でも被験物質投与の影響と考えられるものは認められなかった。

また一般状態、体重、臓器重量及び後述の遺伝子発現データにおいても概日リズムの乱れを示す異常は検出されなかった。

以上により、いずれの複合暴露実験においても、Percellome遺伝子発現解析に適した高品質のmRNA測定用サンプル採取が成されたことを確認した。

## (3) 考察

複合暴露実験では複合投与の用量設定が問題になるが、本研究では1980年以前から継続的に進められてきた複合作用に関する議論（佐久間昭、吉村功らとの交流、医薬安全性研究会に於ける議論、Clinical Pharmacology, D.R.Laurence & P.N.Bennett, Churchill Livingstone, 1980など）を考慮し、相加効果を示す評価項目において、化学物質A,Bが等価のとき、加算性が成立することを評価できる実験設計を採用している。すなわち、単独投与で1容量を投与するとき、複合投与では0.5容量ずつ同時投与するモデルである（この設計においてのみ、双方の化学物質が実は同一であったとき、複合投与が同用量となる）。

本研究では、正しく複合効果を評価するための実験設計(図1下段)を採用し3対の複合暴露実験を実施し、網羅的で高精度のトランスクリプトームデータを得た。延べ870万遺伝子のデータであり、複合暴露評価、予測システムを稼働させるには不十分だが、その基本技術を開発し、システムのプロトタイプを構築し始めるには最小限ながら有用な情報となる。

これら3対の複合暴露実験結果を解析した結果、相加的な遺伝子発現挙動を示す遺伝子群が多数存在することが確認された。これは微量であっても多数の化学物質に複合暴露した場合、分子レベルではそれらの影響が加算され、ついには顕在化するリスクを示唆するものであり、今後の政策決定において、環境中化学物質の量的規制を取り扱う際、留意点となる結果であると考えられた。

単独投与に比べ、複合投与において有意に遺伝子発現が増強（相乗効果）、あるいは減弱（相殺効果）する遺伝子も多数同定されたが、その大半は残念ながら機能未知であり、その意義については今後の研究の進展を待たざるを得ない。しかし上述したとおり、抽出された遺伝子リストの中には疾病や健康障害に関わると報告されている遺伝子（群）が複数含まれていた。

本研究で得られた最も重要な知見は、3対の複合暴露実験結果において、共通して相乗・相殺効果を示す遺伝子が稀であったことである。これは複合効果に関与する分子が固定したものでは無く、化学物質の組合せによって責任遺伝子群が変化することを示唆している。よって、複合暴露影響の情報を迅速に政策決定へ反映させるには、本研究で基本技術を生成した複合効果の分子機序に基づく評価・予測システムの完成が必須である。なお現段階で複合暴露評価・予測システムの実用化に不足しているのは、基盤となる標準データベースの情報量である。30対程度の複合暴露実験を追加すれば運用開始可能と推定される（本研究で使用した6化学物質の組合せを変えた複合暴露実験を実施しつつ、これらとは独立した作用を有する化学物質の新規組合せによる実験を実施し、情報追加することで、可能になる見込み）。

### 5. 本研究により得られた主な成果

## (1) 科学的意義

複合暴露は、生活環境、自然環境における生物（人や動植物）に対する化学物質暴露の一般的形態であるが、従来の毒性評価手法では対応が困難なため、新たな有害性評価技術の開

図１ 適切な複合暴露実験設計
発が求められてきた。

本研究により、単一化学物質の分子毒性所見から、複数の化学物質暴露による複合影響の評価・解析、及び複合暴露影響を論理的に予測するインフォマティクス開発のための基盤を確立した。本研究で取得した複合暴露実験データは3対であるが、複合暴露解析に特化した高精度の網羅的トランスクリプトームデータは世界的にも稀であり、国際的なソフトウェアプラットホームGARUDAを介したデータ公開(平成25年度中に開始予定)により、同種の研究活動の推進のみならず、今後の生命科学研究の進歩に伴う基礎医学研究の推進、新規化学物質の設計開発等に対しての貢献が期待される。

## (2) 環境政策への貢献

複数の併存する環境化学物質による複合暴露が日常化している状況下、複合暴露影響の評価、予測システムの構築は政策貢献上においても急務であるが、複合暴露問題が現行の毒性学では対応できていない上、本研究で明らかになったように、複合暴露影響に関与する分子が固定していない以上、現実的時間内に技術的に実現可能なアプローチは、トキシコゲノミクスを利用した本研究しかないと考えられる（現行の毒性評価方法では無限の組合せを試験せざるを得ず、現実的な時間内に解を求めることが出来ない）。

本研究で実施した複合暴露実験は3対のみではあるが、複合効果評価基準となる専用標準データベースの構築を開始し、基本的な解析・評価技術を開発した本研究の意義は大きい。

評価システム稼働のための必須条件となる標準データの追加取得は最短3年で実施可能（期間は研究予算に依存する）であり、その結果を加えることにより、複合暴露評価体制が確立し、立案した対応策が適切な提案か否か吟味することが可能になると見込まれる。これにより、人及び環境の安全・保全の質の向上とともに、被害の未然防止の結果としての除染、補償等の経費負担の回避が期待できる。

## ＜行政が既に活用した成果＞

特に記載すべき事項はない

## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

3対の環境化学物質の複合暴露実験により、相乗・相殺挙動をとる遺伝子以外の遺伝子の多くは相加的な挙動を示すことが判明した。この所見は複合暴露に普遍的なものである可能性が高い。注目すべきは低濃度（無症候用量）において有意な遺伝子発現変動が観察された点、すなわち個々の化学物質が微量であっても多数の化学物質が併存した場合には、相加的な遺伝子発現レベルの上昇により生体影響が顕在化する可能性を示唆していた。このような複数の化学物質に跨がる量的監視は現在、分子標的が唯一であることを前提としたダイオキシン類に限って実施されているが、今後、より多くの環境化学物質について複数の分子標的を考慮しての、同様の管理体制の導入を検討する必要がある。

### 6. 研究成果の主な発表状況

## (1) 主な誌上発表

く査読付き論文>

特に記載すべき事項はない

(2) 主な口頭発表 (学会等)

特に記載すべき事項はない

### 7. 研究者略壓

課題代表者:菅野純

1955年生まれ、東京医科歯科大大学院・医学研究科修了、医学博士、

東京医科歯科大学医学部病理学第二講座助手

米国国立衛生研究所NIH(NIEHS)実験病理部・客員研究員

東京医科歯科大学医学部感染免疫病理学講座講師

国立医薬品食品衛生研究所・安全性生物試験研究センター・毒性部・室長

現在 国立医薬品食品衛生研究所・安全性生物試験研究センター・毒性部・部長

研究参画者

(1): 菅野 純(同上)
## (2) : 加纳 浩和

1962年生まれ、北里大学卒業、産業衛生修了、医学博士、

現在、中央労働災害防止協会・日本バイオアッセイ研究センター・

試驗管理部 経口等試験室・室長 兼 生殖発生試験室・室長
## （1） 遺伝子発現情報解析、総括

国立医薬品食品衛生研究所

安全性生物試験研究センター 毒性部 菅野 純

平成22～24年度累計予算額：47,489千円

（うち、平成24年度予算額：11,128千円）

予算額は、間接経費を含む。

## [要旨]

本研究は、中央環境審議会からも指摘され、国民の関心・不安も高いところの、環境中に於ける化学物質の複合暴露の健康リスクについて、トキシコゲノミクスによる分子毒性学的な有害性評価検討手法により、網羅性と定量性をもって複合影響の分子メカニズムの解明を可能とする基盤を構築するために実施するものである。典型的な環境化学物質の対として、①四塩化炭素(溶剤)とトルエン(溶剤)、②ディート（昆虫忌避剤）とペルメトリン（殺虫剤）、③フタル酸ビス（2-エチルヘキシル）（＝DEHP、可塑剤）とビスフェノールA（樹脂原料・可塑剤）の3対について、マウスにおける複合暴露実験を実施し、GeneChip（Affymetrix社）によって約4万種のmRNAの経時的発現量変動を測定し、独自の特許技術Percellome手法を用いて細胞1個当たりのコピー数という絶対単位量を遺伝子毎に得て、複合暴露影響を受ける遺伝子の抽出及び分子機序に関する解析を行った。

組合せ①では、ヒトの肺疾患でも関連性が報告されているCyr61の相乗発現を肺において検出し、その発現制御ネットワークをプロモーター解析により推定した。またPM2.5暴露でも惹起される肺の線維化に関連する遺伝子群の相乗発現も検出した。

組合せ②では肝においてミトコンドリア電子伝達系の遺伝子群の相殺発現を検出し、ヒトが複合暴露された場合に倦怠感などの不定愁訴に繋がる可能性を見出した。

組合せ③においては、肝におけるコレステロール生成遺伝子群の相殺発現を検出し、従来知られていなかった複合効果を発見した。さらにこれらの複合実験で複合効果を示した遺伝子のプロモーター解析から、特有もしくは共通する転写因子結合部位の情報を得た。以上により分子レベルでの複合作用の検出及び解析技術を生成し、これを基盤とした複合影響の評価・予測解析システム構築のための指針を示した。

## [キーワード]

複合暴露影響評価、トキシコゲノミクス、パーセローム、相加相乗性、マウス
### 1. はじめに

人や野生動物は、環境中に意図的に散布された、或いは非意図的に分散した複数の化学物質の複合暴露を受けているが、法規制に関わる基準値は単独化合物についてしか検討されていない。その理由として、複合暴露問題が現行の毒性学では扱いきれていないことが挙げられ、そこには、解決を要する2つの問題点が存在している。

第一点は、現在までの毒性学では、化学物質Aの毒性情報と、化学物質Bの毒性情報が在ったとしても、それらが現象論的な情報であることから、A+Bの複合暴露による毒性を予測することが実質上困難であり、A+Bは、新物質Cとして改めて検討する必要がある。このため、複合暴露の評価には、厝大な組み合わせの毒性試験を逐次実施しなければならない状況にあり、現実的に手がつかないのである。

第二点は、複合暴露が起こった際の閾値が、個々の単一化学物質の閾値と同等であるかどうかの科学的検討が成されていないことである。毒性に閾値が有るということは、例えば、体の中に毒性に対抗する中和物質が備わっていて、ある量の毒性物質までは中和するためであると考えることが出来る。現行の規制では、個々の化学物質の暴露量が閾値以下であれば、複数の化学物質に同時に暴露されても、毒性症状は現れないと規定していることである。しかし、現実には中和物質が体内から減って行く現象は閾値以下の量でも起こるので、個々が閾値以下の量であっても複合して作用した場合、中和物質が枯渇してしまい、毒性症状が現れる可能性がある。

これらの問題点は、毒性学の近代化を目指し我々が進めているパーセローム（Percellome）トキシコゲノミクス法により解決する事が可能である。この手法は、mRNA発現データの精度と定量的な取り扱い性能を格段に向上させたものであり、毒性症状が明らかになる前の段階から、且つ微量暴露の状態から化学物質影響を、網羅性を担保しつつ、高感度・定量的に観察するものである。その為、化学物質A＋BをCとせず、AとBのそれぞれのPercellome情報からA＋Bを科学的に予測することが可能になると期待される。

## 2 ．研究開発目的

本研究の目的は、国民や専門家からの常々の要望の対象となってきているものの、現行の毒性評価法では技術的に対応困難であるところの、環境化学物質の複合暴露により惹起される生体影響を正確かつ迅速に評価する技術の開発である。

その為には、研究代表者の複合影響判定に関する数理統計学的基礎（文献1および、東京医科歯科大学佐久間昭教授、東京理科大学吉村功教授との交流を経る）と、トキシコゲノミクス、特に時間的・暴露量的に毒性発現の基礎となる定量的なmRNA変動を指標とした生体影響の評価を可能にするパーセローム（Percellome）トキシコゲノミクス手法 $ ^{2)} $ （特許第4415079号）による分子毒性学的な有害性評価検討手法の応用が現実的かつ効率的であり、単体で暴露した際のPercellomeトキシコゲノミクス（高精度の網羅的遺伝子発現）情報が既に得られている環境化学物質から、代表的な3対を選択し、複合暴露した際のPercellomeトキシコゲノミクス情報を得て、開発済みの分子毒性学的な有害性評価検討手法を基盤とした、分子メカニズムに基づく正確かつ迅速な複合暴露影響の安全性評価法の開発を目指す。

また、複合影響の予測システム開発及び実用化に必須となる、複合暴露による遺伝子発現デー
タベースを、網羅性と高い定量性を以て構築する。

### 3. 研究開発方法

## （1） mRNA絶対量測定

サブテーマ「複合暴露実験」により得られたmRNA測定用サンプル（マウス肝（一部、肺・腎）、4投与群（溶媒対照群、各単独投与群、および複合投与群）、投与後2,4,8,24時間の4時点、一群3匹）について、Affymetrix社 GeneChip Mouse Genome 430 2.0 ArrayにPercellome法を適用し、遺伝子毎のmRNA発現量を細胞1個当たりのコピー数として計測した。具体的にはサンプル破碎液中のDNA含量から細胞数を求め、濃度の異なる複数の外部標準RNA（スパイクRNA）を細胞1個当たり決まった分子数だけその破碎液に添加してから、RNA抽出し、マイクロアレイ測定を行う。スパイクRNAの測定値が細胞1個当たり何コピーに由来するかが既知であることを利用し、サンプル中の全てのmRNA測定値を、細胞1個当たりのコピー数に換算した(SCal4.exe使用)。

## （2） データ解析

上記のGeneChipにより測定され、Percellome法によって絶対量化された約4万の遺伝子発現情報から、暴露条件(溶媒対照、各化学物質単独もしくは複合)、および時間、発現量よりなる3次元曲面データを生成（MFAnalyzer.exe及びCreateSurface.exeを使用）し、主たる遺伝子の発現パターンを検討（MFSurface.exe及びMSV2.exeを使用）しつつ、RSort（特徴的な発現を示す遺伝子をその3次元曲面パターンを用いて自動抽出する独自アルゴリズム）によって、複合暴露影響を受けている可能性のある遺伝子候補を自動抽出した（図（1）-1）。

また抽出した候補遺伝子については、Percellomeデータベースの単独投与時データと比較すると共に、同単独投与時データに於いて特徴的な発現パターンを呈する遺伝子（RSortにより自動抽出）について、複合暴露時の発現パターンと比較して、相加性、相乗性、相殺性の判定をはじめ

## とした、複合暴露プロファイルの

詳細解析手法の検討を行った。複合暴露効果判定は、Matsunagaらの報告¹を参考に、t検定およびWelch検定による単独ばく露群と複合ばく露群との間の有意差検定により実施した。

抽出された遺伝子群のパスウェイ解析はIPA（Ingenuity Systems社）を、遺伝子発現制御に関わるプロモーターの解析は、Genomatix Suite(Genomatix社)、TRANSFAC（Biobase社）、GenExplain（GeneExplain社）を用いて行った。

図(1)-1 3次元曲面における相加、相乗、相殺パターン
## 4 ．結果及び考察

（１）複合暴露実験における絶対量化遺伝子発現データの取得、および複合暴露評価・予測システムのための標準データベース

Percellome標準プロトコルに沿って、サブテーマ「複合暴露実験」で採取したサンプルから低分解・高純度のRNAを抽出し、GeneChip Mouse Genome 430 2.0 Arrayを用いて約4万種のmRNAの経時的発現量変動を細胞1個あたりのコピー数という絶対単位量として測定した。標準的なデータ品質検証（ベースラインレベルを含む発現量（mRNAコピー数／細胞）の妥当性評価、トランスクリプトームの全体分布、概日リズム遺伝子等の発現パターンの正規性の確認など）し、不合格のデータは再測定して、以下のデータ解析の実施、および将来の複合暴露評価・予測システムのための標準データベースに収録するに足る品質を有するデータセットを生成した。

本研究で実施した3対の複合暴露実験から、延べ870万遺伝子の絶対量化発現変動データを得て、3次元曲面パターン及びその形状特徴抽出データ等の基本情報を生成し、複合暴露評価・予測システムの専用標準データベースの構築を開始した。

## （2） 複合効果判定

複合暴露実験では複合投与の用量設定が問題になるが、本研究では1980年以前から継続的に進

められてきた複合作用に関する議論（佐久間昭、吉村功らとの交流、医薬安全性研究会に於ける議論、文献1,3など）を考慮し、相加効果を示す評価項目において、化学物質A,Bが等価の時、加算性が成立することを評価できる実験設計を採用している（図（1）－2）。すなわち、単独投与で1容量を投与するとき、複合投与では0.5容量ずつ同時投与するモデルである（この設計においてのみ、双方の化学物質が実は同一であったとき、複合投与が同用量となる）。

図 $ （1）-2 $ 適切な複合暴露実験

有意な変動を示した候補

遺伝子については、単独ばく露群とのt検定およびWelch検定による有意差検定を適用することで、相乗・相殺の自動判定が可能であることを確認した。

より高精度の複合効果（相乗・相殺）判定を行う場合は、単独投与と複合投与の用量を2セットに増やす必要がある $ ^{1)} $ が、本研究では経時的変化の把握を重視し（遺伝子発現制御ネットワーク描出において、遺伝子要素間を結ぶベクトルの方向を決定する重要な要素であるため）、用量は1セットとなっている。このとき、各時点の複合効果判定の検出感度は半減するが、4時点の判定結
果を統合することで感度を回復し、さらにPercellomeプロジェクトで独自開発した解析ソフトウェアの活用により、生物学的にあり得ない発現パターンを排除することでfalse positiveの発生を低減させた。

## （３）複合暴露実験１：四塩化炭素、トルエンの複合暴露による遺伝子発現変動

複合暴露実験1の絶対量化発現変動データより、2の方法によって相加（図（1）-3に抜粋）、相乗（図（1）-4）、相殺（図（1）-5）を示す遺伝子を抽出した。
## 図(1)-3 複合暴露実験1 相加遺伝子リスト

曲面: 平均値±Sd

色は最大発現レベルを示す

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3次元曲面における相加、相乗、相殺パターン
## 図(1)-4 複合暴露実験1 相乗遺伝子リスト

曲面: 平均値±Sd

色は最大発現レベルを示す

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3次元曲面における相加、相乗、相殺パターン
## 図(1)-5 複合暴露実験1 相殺遺伝子リスト

曲面: 平均値±Sd

色は最大発現レベルを示す

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3次元曲面における相加、相乗、相殺パターン
Zc3h12c

1444402 at

Gm1337

1443287 at
Lyve1	Stard7	Lrp11	Rps17	Csnk1a1	---	Bcl2	5230400M06Rik
1429379_at	1445024_at	1433536_at	1438501_at	1430529_at	1460119_at	1440770_at	1432946_at
Fkbp15	Dnaja2	Poldip3	Pygo2	LOC100503470	Syngr1	B230354K17Rik	---
1459735_at	1457233_at	1437837_x_at	1428249_at	1446058_at	1419289_a_at	1424516_at	1458729_at
AA881470	---	Pcdhb11	Nae1	Ttf1	Usp34	Ccr1	8030453O22Rik
1452390_at	1459513_at	1450270_at	1423781_at	1420754_at	1444437_at	1419610_at	1441453_at
Gstm7	---	Scn11a	Cdc26	Ide	Trim27	Dock6	Igdcc4
1425946_at	1444591_at	1420784_at	1423987_at	1441860_x_at	1438376_s_at	1430683_at	1443272_at
Nsun4	Ankrd54	Gm12500	Pmch	2fp511	---	Sdf4	2310022A10Rik
1445570_at	1451182_s_at	1438128_at	1429361_at	1434858_x_at	1449671_at	1426393_a_at	1431712_a_at
Hdlbp	Gh	Slco1a5	Ahcyl2	Tbce	D8Ertd107e	Thrb	LOC106740
1419806_at	1456595_x_at	1449203_at	1452703_at	1428282_at	1445125_at	1422202_at	1435774_at
Adpgk	Stc2	4930442J19Rik	St8sia3	Sptlc3	BB116930	4930435F05Rik	Ntm
1451079_at	1445186_at	1430440_at	1440029_at	1439492_at	1440130_at	1432359_at	1458492_x_at
Hnrnpr	Timm9	1700123I01Rik	Rnf38	1431993_a_at
1438807_at	1428010_at	1453942_at	1431993_a_at
これらの遺伝子の機能解析を実施したところ、ヒトの肺疾患でも関連性が報告 $ ^{4)} $ されているCyr61の相乗発現を肺において検出した。その相乗発現は投与後4時間で特に顕著だが、2～24時間を通じて相乗性を維持していた。同様の相乗発現を呈する遺伝子を抽出

(Jun, Junb, Jund, Fos, Fos11, Dnaja4, Dnajb1, Hspala, Egr1, Ier2, Ier5)し、Genomatix Suiteを用いて、プロモーター解析を行った。相乗発現を呈する候補遺伝子のうちJun, Junb,

また肺の線維化に関連し、PM2.5暴露でも惹起される $ ^{5)} $ 遺伝子群(Areg、Fgfr1、Ccl22)の相乗発現も検出（図（1）-7）し、細胞接着分子や細胞外マトリクス分子

Jund, Fos, Fos11, Egr1は転写因子であり、特にJun, Junb, Jund, Fos, Fos11は複合体を形成し、V$AP1Fに結合する。Cyr61のプロモーター領域にはV$AP1Fは存在せず、V$EGRFがあること、Egr1はV$EGRFに結合し、またそのプロモーター領域にV$AP1Fが見出されたこと、およびそれらの経時的発現パターンから、図（1）-6のようなCyr61の発現制御ネットワークが推定された。

図（1）-6 相乗発現するCyr61の遺伝子発現制御モデル

(Cdh10, Itga5, Cldn4, Sele, mmp19, Cea cam1, Tjp2, Gja1, Tmem125, Tmem183a, La ma5) も同様に相乗的な発現パターンを呈することを明らかにした。これは四塩化炭素とトルエンの複合暴露による

図 $ (1)-7 $

a) PM2.5暴露影響にも関与する $ ^{7)} $ 遺伝子群の相乗発現、b)相乗発現する細胞接着および細胞外マトリクスの関連分子。
肺障害の相乗的増悪を示唆するものであり、土壌汚染や地下水汚染による複合暴露を評価する際、留意すべき知見である。

## （４）複合暴露実験２：ディート、ペルメトリンの複合暴露による遺伝子発現変動

複合暴露実験2の絶対量化発現変動データより、2の方法によって相加（図（1）-8に抜粋）、相乗（図（1）-9）、相殺（図（1）-10）を示す遺伝子を抽出した。
## 図(1)-8 複合暴露実験2 相加遺伝子リスト

曲面: 平均値±Sd

色は最大発現レベルを示す

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3次元曲面における相加、相乗、相殺パターン
## 図(1)-9 複合暴露実験2 相乗遺伝子リスト

曲面: 平均値±Sd

色は最大発現レベルを示す

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10 copies/cell

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3次元曲面における相加、相乗、相殺パターン
## 図(1)-10 複合暴露実験2 相殺遺伝子リスト

曲面: 平均値±Sd

色は最大発現レベルを示す

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3次元曲面における相加、相乗、相殺パターン