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# 第3章 縮合型リン系難燃剤のバイオアッセイと LC-QTOF-MS による安全性評価

分担研究者：鈴木 剛、滝上 英孝（国立環境研究所 資源循環・廃棄物研究センター）

研究協力者：松神秀徳（国立環境研究所 資源循環・廃棄物研究センター）

### 1. はじめに

プラスチック樹脂や繊維製品中に使用される縮合型リン系難燃剤 $ ^{1-3)} $ は、オリゴマー化やポリマー化等縮合して製造され、分子量が大きくなることからモノマー型リン系難燃剤と比較して揮発等を通じた環境放散性が低くなると考えられている。ハザードの観点においても、縮合型については、分子量が大きくなることで、生物利用能が下がり、毒性発現能も低下していることが期待される。従って縮合体化は、環境上適切な化成品のデザインの在り方と捉えることが出来る。一方で、臭素系難燃剤中の臭素系ダイオキシン類 $ ^{4)} $ や2,4,6-トリブロモフェノール $ ^{5)} $ を例として、構成主体の化成品よりもハザードの強い不純物が含まれることがあり、含有不純物によるリスク性が無視できない場合がある。

縮合型リン系難燃剤は、用途によってPOPsとして規制された臭素系難燃剤（POP-BFRs）の主要な代替物になると考えられている。縮合型リン系難燃剤は、既に一般家庭やオフィスなどの室内環境 $ ^{6,7} $ 、廃電気電子機器リサイクル現場周辺の屋外環境 $ ^{8} $ に遍在している。製剤含有のその他構成成分についても、同様に検出される可能性がある。縮合型リン系難燃剤の構成成分は、重合体とその単量体の混合物であるといわれているが $ ^{9-17} $ 、非意図的生成物等の構成成分はこれまでに調査されていない。また、不純物等を含む製剤のハザードの評価もこれまで実施されていない。

本研究では、リン系代替難燃剤の主流と考えられている縮合型リン系難燃剤のうち、国内外で広く販売されている4種類の製剤を対象として、LC-QTOF-MSによるノンターゲット分析によって製剤構成成分を明らかにし、バイオアッセイによるハザード評価を行なった。また、セミミクロHPLC法を用いて製剤構成成分の溶離時間に応じた分離・分画を行ない、得られた画分についてバイオアッセイ／LC-QTOF-MSを実施して、ハザード関連物質を推定して縮合型リン系難燃剤の安全性やリスク性に関して考察した。

## 2 ．研究方法

## 2 ．1．縮合型リン系難燃剤

本研究では、大八化学工業製から市販されているジェチレングリコールビス[ジ(2-クロロイソプロピル)ホスフェート]（製剤名CR-504L）、1,3-フェニレンビス(ジフェニルホスフェート）（製剤名CR-733S）、ビスフェノールAビス(ジフェニルホスフェート)(製剤名CR-741)、1,3-フェニレンビス[ジ(2,6-ジメチルフェニル)ホスフェート]（製剤名PX-200）の4種類の縮合型リン系難燃剤の製剤を使用した。常温では、CR-504L、CR-733S及びCR-741が液状、PX-200が粉状である。これら難燃剤の主な用途を次に示す $ ^{18} $ 。CR-504Lは、主にポリウレタンフォームに使用されており、自動車用フレームラミネート（自動車の内装等に使用）としても加工され使用されている。CR-733SとCR-741については、各種エンジニアリングプラスチック（耐熱性等特定の機能を強化しているプラスチックの総称）や合成繊維の難燃剤として使用されている。PX-200は、CR-741よりも耐熱性が優れているとされており、また粉状で取り扱いが容易なため、各種エンジニアリングプラスチック、エポキシ樹脂、合成繊維、粘接着剤の難燃剤として幅広く使用されている。
1,3-フェニレン ビス（ジフェニルホスフェート）

1,3-フェニレン ビス [ジ (2,6-ジメチルフェニル) ホスフェート] (製品名: PX-200)

図１ 本研究で対象とした４種類の縮合型リン系難燃剤

## 2 ．2．ノンターゲット分析による製剤構成成分評価

## 2 ．2．1．縮合型リン系難燃剤の調製

縮合型リン系難燃剤を10 mg 秤量後、10 ml のテトラヒドロフラン（THF）に定容した1000 μg/ml の製剤原液を調製した。各製剤原液をTHFで100倍希釈した10 μg/ml の製剤希釈液を調製した。製剤中不純物と想定されるモノマー型リン系難燃剤のリン酸トリス(2-クロロイソプロピル)（TCIPP）、リン酸トリフェニル（TPHP）、リン酸トリス(2,6-ジメチルフェニル）（TDMPP）の同定及び定量には、それぞれ和光純薬工業製、東京化成工業製、林純薬工業製の標準物質を使用した。各標準物質を正確に10 mg 秤量後、10 ml のTHFに定容した1000 μg/ml の標準原液を調製した。各標準原液をTHFで20倍希釈した後（濃度：50 μg/ml）、5水準の濃度（0.01、0.05、0.2、1、及び5 μg/ml）に希釈した標準希釈液を調製した。

##### 2.2.2. LC-QTOF-MS

測定装置には、アジレント・テクノロジー製の Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS システム（LC-QTOF-MS）を使用した。分離カラムには、昭和電工製の KF-402HQ（内径：4.6 mm、長さ：250 mm、ポリスチレンでの排除限界：5000）を使用した。移動相には高速液体クロマトグラフ用 THF（安定剤不含）を使用し、分離カラムの温度は 30℃、移動相の流速は 0.3 ml、サンプルの注入量は 5 μl に設定した。APPI-QTOF-MS のキャピラリー電圧は 3500 V、フラグメンターは 150 V、スキマーは 65 V に設定した。乾燥ガス及び気化ガスの温度は、それぞれ 350℃ 及び 300℃ に設定した。ネブライザーガスの圧力は 50 psi に設定した。コリジョンガスにはアルゴン（>99.9999%）を使用した。精密質量データの取得及び解析には、アジレント・テクノロジー製の MassHunter ソフトウェアを使用した。

## 2 ．2．3．モノマー型リン系難燃剤の同定及び定量

製剤希釈液と標準希釈液を対象として、m/z 100～3200 の質量範囲で MS 測定を行い、製剤中のモノマー型リン系難燃剤を同定した。具体的には、製剤中成分のうち、標準物質で検出された分子量関連イオンの精密質量と保持時間が一致する成分を確認した。標準物質の分子量関連イオンをプリカーサーイオ
ンに設定して m/z 50～1500 の質量範囲で MSMS 測定を行い、標準物質で確認されたプロダクトイオンが一致することを確認した。製剤中モノマー型リン系難燃剤は次の手順で定量した。測定用標準溶液及び測定用製剤溶液について MS 測定で得られた質量データの中からモノマーの標準物質で確認された分子量関連イオンの抽出イオンクロマトグラム（EIC）を±20 ppm の質量範囲で作成した。モノマーのピーク面積を求め、測定用標準溶液の濃度比から絶対検量線法に基づき定量値を求めた。当該測定法では、0.01～5 μg/ml の範囲で作成した標準物質の検量線の相関係数が 0.99 以上であり良好な直線性が確認された。製剤中成分のカラム分離、イオン化、TOF-MS の精密質量分離により、モノマーの正確な定量を干渉するオリゴマーや不純物等は確認されなかった。3 回繰り返し測定で得られた定量値の変動係数 (C. V.) は、0.9～6.6% の範囲であり、安定した定量分析が可能であった。分析工程における汚染は検出下限以下であることが確認された。

## 2 ．2．4．製剤中のその他構成成分の推定

製剤希釈液を対象として、m/z 100～3200 の質量範囲で MS 測定を行い、製剤中構成成分の分子量関連イオンの精密質量に基づいて元素組成を決定した。各成分の分子量関連イオンをプリカーサーイオンに設定して m/z 50～1500 の質量範囲で MSMS 測定を行った。MSMS 測定時に設定したコリジョン電圧値は各成分の開裂に適した値を検討した。各成分のプロダクトイオンの精密質量から開裂経路を解析し、化学構造に基づいて構成成分を推定した。

## 2 ．3．バイオアッセイによるハザード特性評価

## 2 ．3．1．縮合型リン系難燃剤の調製

縮合型リン系難燃剤を 30 mg 秤量後、1 ml の DMSO に定容して製剤原液を調製した。試験時には、製剤原液で活性が確認されたものについて、用量反応データを取得するために段階的な希釈を行なった。本研究では細胞への曝露濃度を 0.1% DMSO とするため、30mg/ml の製剤原液を曝露する場合は細胞への曝露濃度が 30 μg/ml となる。

##### 2.3.2. バイオアッセイ

本研究では、オランダ・BioDetection Systems b.v.で開発された表1に示す核内受容体結合レポーター遺伝子アッセイ（CALUX アッセイ）を用いて、縮合型リン系難燃剤の各種核内受容体の作動性（アゴニスト活性）及び拮抗性（アンタゴニスト活性）を評価した。エンドポイントは、REACH規則（EUの化学品の登録（Registration）・評価（Evaluation）・認可（Authorisation）・制限（Restriction）に関わる規則）で採り上げられている生殖毒性等に着目して、アンドロゲン受容体（AR）、エストロゲン受容体アルファ（ERα）、プロゲステロン受容体（PR）等のアゴニスト及びアンタゴニスト活性を対象とした。AR、ERα及びPRのアゴニスト及びアンタゴニスト活性は、EUで実施された臭素系難燃剤のリスク評価プロジェクト（FIRE: Flame retardants Integrated Risk assessment for Endocrine effects）に採用された実績を有する $ ^{19} $ 。本報告書の4章では、当該バイオアッセイでARアンタゴニスト及びERアゴニストとしてスクリーニングされたリン系難燃剤について、生殖系に関わる動物毒性・行動学的影響を確認しており、生殖毒性スクリーニング手法としての有効性を確認している。

各種核内受容体のアゴニスト及びアンタゴニスト活性は、外来遺伝子であるホタルのルシフェラーゼ遺伝子を安定的に挿入した組み換えヒト骨肉腫(U2OS)細胞を用いるCALUXアッセイを用いて測定した。バイオアッセイは、基本的に既報に準じて実施した $ ^{20)} $ 。概要を以下に示す。U2OS細胞は、培養用培地を用いて、37℃及び5%CO $ _{2} $ の条件で培養した。バイオアッセイを行なう際には、培養フラスコ中のU2OS
細胞を、96well マイクロプレートに 9,000～12,000 cells/well の濃度で播種して、約 24 時間培養した。アゴニスト活性試験では、96well マイクロプレートの各 well から培地を除去した後、DMSO に溶解した各種標準物質溶液と縮合型リン系難燃剤溶液を培養用培地に対して 0.1% DMSO 濃度になるように添加して調製した培地を各 well に添加し、U20S 細胞への曝露を行なった。曝露 24 時間後、誘導されたルシフェラーゼ活性をルミノメーターで測定した。連続的な容量依存応答を示し、アゴニスト標準物質の最高濃度の活性を 100% とした際の相対活性が 5% 以上であった場合にアゴニスト活性有りと判断した。アンタゴニスト活性試験では、96well マイクロプレートの各 well から培地を除去した後、アゴニスト標準物質溶液と縮合型リン系難燃剤溶液を培養用培地に対してそれぞれ 0.1% になるように添加して調製した培地（この場合、0.2% DMSO）を各 well に添加して、U20S 細胞への曝露を行なった。アンタゴニスト活性試験では、次の 3 種類の試験を順に実施して活性の有無を判断した：試験①相対活性 50% を示す濃度（EC50）のアゴニスト標準物質との共曝露試験を行ない、曝露 24 時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。得られた活性が連続的な容量依存応答を示し、アンタゴニスト標準物質の最高濃度の阻害活性を 100% とした際の相対阻害活性が 20% 以上であった場合に、試験②を実施した。試験②アンタゴニスト活性試験①と同様に曝露を行ない、細胞毒性試験を実施した。試験①で示された相対阻害活性が細胞毒性に因らないことを確認した場合に、試験③を実施した。試験③EC50 の 100 倍の濃度のアゴニスト標準物質との共曝露試験を行ない、曝露 24 時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。試験①で観察された阻害が、過剰量のアゴニスト標準物質との共曝露試験（試験③）で回復した（阻害されない）場合に、受容体特異的なアンタゴニスト活性と判断した。

##### 2 \. 3\. 3\. データ解析

本研究では、各種試験を少なくとも n=3 で実施した。アゴニスト活性試験及びアンタゴニスト活性試験で連続的な容量依存応答を示した縮合型リン系難燃剤については、SigmaPlot 13 を用いてシグモイド曲線を描き、EC50 と IC50 (共曝露したアゴニスト標準物質による活性を 50% 阻害する濃度) を算出した。

表 1 本研究で使用したレポーター遺伝子アッセイ

適用手法	対象核内受容体	核内受容体の機能
AR-CALUX アッセイ	アンドロゲン受容体（AR）	男性ホルモン作用
ERα-CALUX アッセイ	エストロゲン受容体α（ERα）	女性ホルモン作用
PR-CALUX アッセイ	プロゲステロン受容体（PR）	妊娠準備・維持作用
PPARγ2-CALUX アッセイ	ペルオキシソーム増殖活性化受容体γ2（PPARγ2）	脂肪細胞の調節、血糖降下作用

## 2 ．4．ハザード関連物質のプロファイリング

縮合型リン系難燃剤には、構成主体のオリゴマー型或いはポリマー型のリン系難燃剤以外にも、合成未反応物や分解生成物と想定される不純物が含まれている。従ってバイオアッセイでは、不純物を含む全ての製剤構成成分のハザードを評価している。本研究では、製剤構成成分から主要なハザード関連物質を推定するために、製剤含有のハザード関連物質のプロファイリングを実施した。THF に溶解した各種縮合型リン系難燃剤（10mg/ml）をセミミクロ HPLC に供して、溶離液を溶離時間に応じて96 ディープウェルプレートに分取した。分離カラムには、昭和電工製の KF-402HQ（内径：4.6 mm、長さ：250 mm、ポリスチレンでの排除限界：5000）を使用した。移動相には、高速液体クロマトグラフ用 THF（安定剤不含）をメンブレンフィルターでろ過したものを要時調製して使用した。分離カラムの温度は、40℃、
移動相の流速は 0.3 ml、サンプルの注入量は 2 μl（20 μg 相当量）とした。分取した溶離液は、3%DMSO/ヘキサン洗浄水を添加後、遠心エバポレータ一で THF を除去した。濃縮後の溶離液についてバイオアッセイを行ない、ハザードを示す溶離液画分を選定した。当該溶離液画分を対象として、先述した 2.2.ノンターゲット分析による製剤構成成分評価を行ない、ハザード関連物質を推定した。

### 3 \. 結果と考察

## 3 ．1．縮合型リン系難燃剤の含有成分

縮合型リン系難燃剤の構成成分は、分子サイズで分離後、APPI条件下で水素付加イオンとなり、TOF-MSで精密質量分離され、ポジティブイオンモードで検出された。ネガティブモードでは検出されなかった。分子量関連イオンの精密質量についてEICを作成した結果、CR-733Sでは6成分、CR-741では6成分、PX-200では4成分、CR-504Lでは9成分が、各製剤の構成成分として確認された。CR-733S及びCR-741では、構成成分の1成分がTPHP標準物質の分子量関連イオンの精密質量及び保持時間と一致した。PX-200では1成分がTDMPPの標準物質と一致し、CR-504LではTCIPPの標準物質と一致した。分子量関連イオンの精密質量の理論値と実測値の誤差は1.57-3.51 ppmの範囲であり、高い質量精度が確認された。さらに、製剤中TPHP、TDMPP、TCIPPと各標準物質のプロダクトイオンが一致することも確認された。

標準希釈液及び製剤希釈液のMS測定データから作成したEICを用いて、製剤中のモノマー型リン系難燃剤（TPHP、TDMPP、TCIPP）のピーク面積を求めて絶対検量線法に基づき定量値を求めた（表2）。CR-733S及びCR-741中TPHPの含有量はそれぞれ2.0%及び1.2%、PX-200中TDMPPの含有量は2.8%であった。CR-733S、CR-741及びPX-200は、オキシ塩化リンと二価のフェノール系化合物、及びフェノール（またはアルキルフェノール）との反応によって製造され $ ^{9-11} $ 、CR-733Sには5%未満のTPHP、CR-741には3%未満のTPHPが含まれると報告されている $ ^{13-17} $ 。CR-504L中TCIPPの含有量は5.7%であった。CR-504Lは、触媒の存在下で、アルキレンオキサイドとオキシ塩化リンとの反応によって製造され、6%未満のTCIPPを含有することが報告されている $ ^{9} $ 。本研究の結果は、既報値の範囲内であった。PX-200中TDMPPの含有量については、本研究が初めての報告となった。

表 2 縮合型リン系難燃剤中のモノマー型リン系難燃剤の含有量

対象製剤	TPHP	TDMPP	TCIPP
濃度(mg/g)	重量%	濃度(mg/g)	重量%	濃度(mg/g)	重量%
平均	標準偏差	平均	平均	標準偏差	平均	平均	標準偏差	平均
CR-733S	20	0.55	2.0	-	-	-	-	-	-
CR-741	12	0.11	1.2	-	-	-	-	-	-
PX-200	-	-	-	28	0.88	2.8	-	-	-
CR-504L	-	-	-	-	-	-	57	3.8	5.7

: 測定していない

MS 測定で検出された CR-733S の 6 成分、CR-741 の 6 成分、PX-200 の 4 成分、CR-504L の 9 成分を対象に MSMS 測定を実施した。各成分のプロダクトイオンの精密質量から元素組成を決定し、開裂経路を解明して化学構造の候補を探索した。CR-733S では、TPHP と二量体から五量体までのオリゴマー、リン酸[(3-
ヒドロキシフェニル) ジフェニル]（HP-DPHP）が含有成分と推定された。CR-741では、TPHPと二量体から四量体までのオリゴマー、リン酸[(4-[2-(4-ヒドロキシフェニル)プロパン-2-イル]フェニル)ジフェニル]（BPA-DPHP）などのBPA-BDPPの類縁物質が含有成分と推定された。PX-200では、TDMPPと二量体と三量体のオリゴマー、リン酸[(3-ヒドロキシフェニル)ジ(2,6-ジメチルフェニル)](HP-2,6-DDMPP)が含有成分と推定された。CR-504Lでは、TCIPPと二量体から五量体までのオリゴマー、TCIPP及びDEG-BDCIPPの類縁物質が含有成分と推定された。

## 3 ．2．縮合型リン系難燃剤のハザード特性

縮合型リン系難燃剤の生殖毒性に関わるハザードを評価した結果、ERαアゴニスト活性、ARアンタゴニスト活性及びPRアンタゴニスト活性が検出された。CR-733S及びCR-504LではERαアゴニスト活性、ARアンタゴニスト活性及びPRアンタゴニスト活性が、CR-741及びPX-200ではERαアゴニスト活性とPRアンタゴニスト活性が示された。縮合型リン系難燃剤のERαアゴニスト活性、ARアンタゴニスト活性及びPRアンタゴニスト活性の容量依存応答を図2、図3及び図4に示す。連続的な容量依存応答から算出したREC5、EC50及びRIC20を表3に示す。

表 3 縮合型リン系難燃剤のアゴニスト活性（REC5、EC50）とアンタゴニスト活性（RIC20）

試験物質	アゴニスト (mg/l)	アンタゴニスト (mg/l)
ERα	AR	PR
REC5	EC50	RIC20	IC50	RIC20	IC50
E2	8.2×10-8	9.7×10-7	—	—	—	—
Flutamide	—	—	2.8×10-2	1.8×10-1	—	—
RU486	—	—	—	—	4.3×10-6	4.1×10-5
CR-733S	1.0	1.1	3.0	3.6	1.0	2.2
CR-741	1.0×10	NC	NE	NC	3.0×10	NC
PX-200	3.0×10-1	1.3	NE	NC	3.0	NC
CR-504L	3.0×10	NC	3.0×10	NC	3.0	1.4×10

NE：最高濃度（30mg/l）で活性なし、NC：計算できない

縮合型リン系難燃剤の構造から推測されるように、CR-733SとCR-741にはTPHPが、PX-200にはTDMPPが、CR-504LにはTCIPPが、それぞれ不純物として数%程度含まれていることを明らかにした。縮合型リン系難燃剤のハザード強度を評価するために、先ずは各縮合型製剤に関連のあるモノマー型リン系難燃剤のハザードと比較考察を行なった。モノマー型リン系難燃剤については、既報においてハザード特性や強度を明らかにしている $ ^{20} $ 。TPHP、TDMPP及びTCIPPのREC5或いはRIC20をモルベースから重量ベースに換えると、ERαアゴニスト活性のREC5はTPHP=0.33mg/l、TDMPP=0.0041mg/l、TCIPP=>3.3mg/l、ARアンタゴニスト活性のRIC20はTPHP=0.98mg/l、TDMPP=0.41mg/l、TCIPP=3.3mg/l、PRアンタゴニスト活性のRIC20はTPHP=0.33mg/l、TDMPP=0.41mg/l、TCIPP=0.98mg/lとなる。これらの評価値を縮合型リン系難燃剤のREC5或いはRIC20と比較すると、いずれの製剤についても、関連するモノマー型リン系難燃剤よりも評価値が高くなっており、ハザード強度が低くなっていることが示された。
縮合型リン系難燃剤の ERα アゴニスト活性については、REC5 に基づく活性強度の順位が PX-200 > CR-733S > CR-741 > CR-504L となり、ポリマー型の CR-504L で最も活性が低かった。試験濃度範囲で得られた容量依存応答に基づくと、CR-733S と PX-200 は、E2（陽性コントロール）と類似の容量依存応答性を示す ERα アゴニストであると考えられた。RIC20 に基づく活性強度の順位は、AR アンタゴニスト活性について CR-733S > CR-504L であり、PR アンタゴニスト活性について CR-733S > PX-200 = CR-504L > CR-741 であった。試験濃度範囲で得られた容量依存応答に基づくと、CR-733S は Flutamide（陽性コントロール）或いは RU486（陽性コントロール）と類似の容量依存応答性を示す AR アンタゴニスト或いは PR アンタゴニストであると考えられた。本研究では、LC-QTOF-MS を用いて各種縮合型リン系難燃剤の含有成分を測定しており、表2に示す通り各製剤に関連するモノマー型リン系難燃剤が数%オーダーで含有されている。従って、これらモノマー型リン系難燃剤の各種活性への寄与を考えることができる。既報 $ ^{20)} $ によると、TPHPと TMDPPが ERα アゴニスト活性と AR アンタゴニスト活性及び PR アンタゴニスト活性を、TCIPPが AR アンタゴニスト活性及び PR アンタゴニスト活性を有しており、縮合型リン系難燃剤で検出されるハザードは、含有モノマー型リン系難燃剤で検出されるハザードと概ねよく一致している。一方で、縮合型リン系難燃剤中のモノマー型リン系難燃剤の含有濃度から想定したハザード強度は、実際に縮合型リン系難燃剤の製剤よりも低い傾向にあり、モノマー型リン系難燃剤以外の含有成分のハザード寄与が想定された。中でも CR-733S については、すべての活性で想定よりも15倍以上強い活性が示された。その他の製剤についても、検出されるエンドポイントの種類や濃度が想定と異なる場合がみられ、モノマー型リン系難燃剤に加え、それ以外の含有成分のハザード寄与が考えられた。モノマー型リン系難燃剤以外の製剤中含有成分についても、先述の通り LC-QTOF-MS で物質数や構造を推定しており、これら関連物質のハザード寄与が想定された。

図2 E2（陽性コントロール）と縮合型リン系難燃剤でみられたERαアゴニスト活性
図 3 Flutamide（陽性コントロール）と縮合型リン系難燃剤でみられた AR アンタゴニスト活性

図 4 RU486（陽性コントロール）と縮合型リン系難燃剤でみられたPRアンタゴニスト活性
#### 3.3. ハザード関連物質のプロファイリング

縮合型リン系難燃剤に数％オーダーで含有されるモノマー型リン系難燃剤のハザード寄与を推定したところ、検出されるハザードの強度や種類が想定と異なる場合があり、その他含有成分のハザード関与が想定された。その他含有成分については、化学物質標準品が存在しないため、縮合型リン系難燃剤中の濃度が測定出来ず、また、各種ハザード強度を評価することが出来ない。そこで本研究では、セミミクロ HPLC 法による製剤構成成分の溶離時間に応じた分離・分画を行ない、得られた画分についてバイオアッセイ／LC-QTOF-MS を実施して、ハザード関連物質を推定した。

縮合型リン系難燃剤で検出された ERα アゴニスト活性、AR アンタゴニスト活性及び PR アゴニスト活性については、既報においても難燃剤やハウスダストで共通して検出されており $ ^{20)} $ 、相互に関連性のあるエンドポイントであることが考えられる。中でも ERα アゴニスト活性は、ハウスダスト $ ^{20)} $ 、室内空気 $ ^{21)} $ 、表層水 $ ^{22)} $ 、環境水中粒子状物質 $ ^{22,23)} $ 、下水処理水 $ ^{22)} $ 、堆積物 $ ^{23-25)} $ 、屋外大気中粒子状物質 $ ^{26)} $ 等の様々な媒体で検出されており、評価重要度の高いハザードと考えられる。そこでここでは、検出されたハザードのうち、ERα アゴニスト活性を対象として、ハザード関連物質のプロファイリングを行なった。はじめに、セミミクロ HPLC を用いて縮合型リン系難燃剤の構成成分を分子サイズに応じて分離して分取した画分について ERα アゴニスト活性試験を実施した。得られた結果を図5に示す。CR-504Lを除く3種の縮合型リン系難燃剤で ERα アゴニスト活性が示された。表3に示している通り、CR-504Lについては、ERα アゴニスト活性が対象製剤中で最も低いため、活性プロファイルが取得できなかったことが考えられた。縮合型リン系難燃剤の ERα アゴニスト活性プロファイルをみると、CR-733Sでは溶離時間7分から7.5分にかけて2つのピークが、CR-741では7分に1つのピークが、PX-200では7分から8分にかけて2つのピークが、それぞれ示されている。実線で示される示差屈折率は、溶離溶媒と分離された構成成分を含む溶液との屈折率の差を示しており、製剤構成成分の相対的含有量の目安となると考えられる。従って、各製剤でみられる最も大きなピークは、構成比の高い縮合型リン系難燃剤由来と考えられた。活性プロファイルと示差屈折率の結果から、CR-733Sについては示差屈折率の最も大きい縮合型リン系難燃剤のピークで ERα アゴニスト活性が示されるものの、いずれの製剤についても縮合型リン系難燃剤そのものが主要なハザード寄与物質ではないと考えられた。リン系難燃剤については、オリゴマー化やポリマー化等縮合型にすることによって、環境放散性が低くなることが良く知られている。これに加えて、本研究の結果から、リン系難燃剤の縮合型化は、分子量が上がることで、生物利用能や毒性発現能も低下することが考えられ、結果としてハザードを低くすることが示唆された。

縮合型リン系難燃剤とモノマー型リン系難燃剤以外の構成成分のハザード寄与を推定するため、ERαアゴニスト活性を示す画分と、活性を示さない前後の画分について、LC-QTOF-MSによるMS測定を行い、分子量関連イオンの精密質量に基づいて元素組成を決定して画分中成分を推定すると共に、そのピーク面積を求めた。各画分中成分のピーク面積と相対活性の関係性から、ハザード関連物質を推定した。CR-733Sでは、対象画分にTPHPの二量体（CR-733Sの構成主体）と三量体、HP-DPHPが検出され、TPHPの二量体（1,3-フェニレンビス（ジフェニルホスフェート）、CR-733Sの構成主体）（図5 Compound A）とHP-DPHP（図5 Compound B）がERアゴニストと推定された。CR-741では、対象画分にビスフェノールAビス（ジフェニルホスフェート）（CR-741の構成主体）とBPA-DPHPが検出され、BPA-DPHP（図5 Compound C）がERαアゴニストと推定された。PX-200では、HP-2,6-DDMPP、TDMPP、TDMPPの二量体（1,3-フェニレンビス[ジ（2,6-ジメチルフェニル）ホスフェート]、PX-200の構成主体）が検出され、HP-2,6-DDMPP（図5 Compound D）とTDMPP（図5 Compound E）がERαアゴニストと推定された。ハザ
ード関連物質については、合成等によって化学物質標準品を入手して、製剤中濃度やハザード強度を調査してそのリスク性を評価する必要がある。中でもFR-733Sに含まれるHP-DPHPについては、検出されたハザード強度と含有濃度を考慮するとERαアゴニスト活性が比較的高いことが想定され、中でも優先して評価すべき物質と想定された。

図 5 縮合型リン系難燃剤の ER アゴニスト活性プロファイル

一：示差屈折率、■：ERアゴニスト活性
## 3 ．4．縮合型リン系難燃剤のハザードに関する見解

本研究では、縮合型リン系難燃剤が構成主体として含まれる製剤で、ERαアゴニスト活性、ARアンタゴニスト活性及びPRアンタゴニスト活性を検出した。その活性強度は、関連性のあるモノマー型リン系難燃剤と比較して低いと考えられた。縮合型リン系難燃剤については、縮合型にすることによって、環境放散性が低くなるだけでなく、生物利用能も低くなり毒性発現能も低下することが推察された。これは、オリゴマーやポリマー化といった縮合体化が環境負荷低減化や安全性確保の観点から、化成品の適切なデザインとなり得ることを示唆する。一方で、縮合型リン系難燃剤中の不純物がハザードに寄与していることが示された。これは、6章の“2.1.2.2,4,6-トリブロモフェノール”で述べるように、製品安全データシート等に記載されていない含有不純物の環境放出や毒性等リスク性が、POP-BFRsの代替難燃剤のひとつ、縮合型リン系難燃剤でも同様にみられることを示している。本研究では、水酸基が導入された化学物質のハザード寄与が想定されており、気相経由だけでなく水相経由の環境放出とそれに伴う毒性等リスク性を考えていく必要がある。縮合体化という化成品デザインについては、構成主体ではなく、その製造プロセスで生じる未反応単量体や水酸化体等の非意図的生成物のリスク性に着目する必要があるかもしれない。また縮合型リン系代替難燃剤については、今後使用量が増えていく可能性が高く、含有製品の使用、廃棄物処理、リサイクル過程の静脈側ライフサイクルにおける未反応単量体や水酸化体を含む分解物等の非意図的生成物の挙動把握とリスク制御が重要な課題と考えられる。

### 4 \. 結論

本研究では、市販されている縮合型リン系難燃剤の4製剤を対象として、バイオアッセイとLC-QTOF-MSを用いて安全性評価を実施した。縮合型リン系難燃剤の構成成分を評価したところ、未反応単量体と考えられるモノマー型リン系難燃剤が数%オーダーで検出され、CR-733S及びCR-741にはTPHPが2.0%及び1.2%、PX-200にはTDMPPが2.8%、CR-504LにはTCIPPが5.7%、それぞれ含まれていた。また、化学物質標準品がないため定量は出来ていないが、モノマー型リン系難燃剤以外にも、CR-733Sには5成分、CR-741の5成分、PX-200の3成分、CR-504Lの8成分の含有成分の存在が明らかとなった。不純物を含む縮合型リン系難燃剤の生殖毒性に関わるハザードを評価した結果、ERαアゴニスト活性、ARアンタゴニスト活性及びPRアンタゴニスト活性が検出された。縮合型リン系難燃剤で検出されるハザードは、含有モノマー型リン系難燃剤で検出されるハザードと概ねよく一致していた。縮合型リン系難燃剤中のモノマー型リン系難燃剤の含有濃度から想定されるハザード強度は、実際に縮合型リン系難燃剤の製剤で検出されるハザードよりも低い傾向であった。セミミクロHPLC法による製剤構成成分の溶離時間に応じた分離・分画を行ない、得られた画分についてバイオアッセイ／LC-QTOF-MSを実施して、検出ハザードのうちERαアゴニスト活性を対象として関連物質を推定した。本研究で対象とした4製剤については、縮合型リン系難燃剤そのものが主要なハザード寄与物質ではないと考えられた。本研究の結果から、リン系難燃剤の縮合型化は、分子量が上がることで、生物利用能や毒性発現能も低下することが考えられ、結果としてハザードを低くすることが示唆された。一方で、縮合型リン系難燃剤が示すERαアゴニスト活性には、同様のハザードを有することが良く知られているモノマー型リン系難燃剤ではなく、水酸基が導入されている関連物質の関与が大きいと推定された。本研究の結果は、縮合体化の化成品デザインとしての有用性と共に、含有される不純物の環境放出や毒性等リスク性の評価の必要性を示した。
### 5 \. 参考文献

1) Daihachi Chemical Industry Co., Ltd. Available on http://www.daihachi-chem.co.jp (accessed Feb. 2015).

2) Pawlowski, K.H.; Schartel, B.: Flame retardancy mechanisms of triphenyl phosphate, resorcinol bis(diphenyl phosphate) and bisphenol A bis(diphenyl phosphate) in polycarbonate/acrylonitrile-butadiene-styrene blends, Polym. Int. 56, 1404-1414 (2007)

3) Despinasse, M.C.; Schartel, B.: Influence of the structure of aryl phosphates on the flame retardance of polycarbonate/acrylonitrile-butadiene-styrene, Polym. Degrad. Stab. 97, 2571-2580 (2012)

4）酒井伸一、滝上英孝: 臭素系ダイオキシン類の発生と制御に関する現状と展望, 環境化学, 23, 129-135 (2013)

5）鈴木 剛、滝上英孝，渡部真文，酒井伸一：臭素系難燃剤に含まれる不純物としての2,4,6-トリブロモフェノールの同定，環境化学，23，123-127（2013）

6) Brandsma, S.H.; Sellstrom, U.; de Wit, C.A.; de Boer, J.; Leonards, P.E.G.: Dust measurements of two organophosphorus flame retardants, resorcinol bis(diphenylphosphate) (RDBPP) and bisphenol A bis(diphenylphosphate) (BPA-BDPP), used as alternatives for BDE-209, Environ. Sci. Technol. 47, 14434-14441 (2013)

7）鈴木剛、鈴木弥生、滝上英孝、吉永淳、高木麻衣、中山祥嗣：エコチル調査パイロット調査におけるハウスダスト中樹脂添加剤等の測定．環境科学会2014年会，講演要旨集，216-217（2014）

8) Matsukami, H.; Tue, N.M.; Suzuki, G.; Someya, M.; Tuyen, L.H.; Viet, P.H.; Takahashi, S.; Tanabe, S.; Takigami, H.: Flame retardant emission from e-waste recycling operation in northern Vietnam: Environmental occurrence of emerging organophosphorus esters used as alternatives for PBDEs. Sci. Total Environ. in press.

9) Daihachi Chemical Industry Co., Ltd. Japan Patent, 259577, (1996)

10) Daihachi Chemical Industry Co., Ltd. Japan Patent, 227632 (1988)

11) Gunkel, L. T.; and Barda, H. J. European Patent Application, 485, 807, FMC Corporation (May 20, 1992)

12) Brady, B. L.; Bright, D. A.; and Schafer, F. M. U. S. Patent, 5, 457, 221, to Akzo Nobel, N. V. (October 10, 1995)

13) Bright, D. A.; Dashevsky, S.; Moy, P. Y.; Williams, B. J.: Resorcinol bis(diphenyl phosphate), a non-halogen flame-retardant additive, J. Vinyl Addit. Technol. 3, 170-174 (1997)

14) Levchik, S. V.; Bright, D. A.; Moy, P.; Dashevsky, S.: New Developments in Fire Retardant Non-Halogen Aromatic Phosphates, J. Vinyl Addit. Technol. 6, 123-128 (2000)

15) Syracuse Research Corporation for the Washington State Department of Health and submitted to Washington State Department of Ecology. Flame Retardant Alternatives (An assessment of potential health and environmental impacts of RDP and BAPP, two phosphate-based alternatives to Deca-BDE for use in electronics) (2006)

16) Pakalin, S.; Cole, T.; Steinkellner, J.; Nicolas, R.; Tissier, C.; Munn, S.; Eisenreich, S. European Report EUR 22693 EN (2007)
17) Rossi, M.; Heine, L. The green screen for safer chemicals: Evaluating flame retardants for TV enclosures; Clean Production Action (2007)

18) 日本難燃剤協会ホームページ：会員各社商品紹介「大八化学工業株式会社」http://www.frcj.jp/company/company08.html

19) Hamers, T., Kamstra, J.H., Sonneveld, E., Murk, A.J., Kester, M.H., Andersson, P.L., Legler, J., Brouwer, A. In vitro profiling of the endocrine-disrupting potency of brominated flame retardants. Toxicol. Sci. 92, 157-173 (2006)

20) Suzuki, G., Tue, N. M., Malarvannan, G., Sudaryanto, A., Takahashi, S., Tanabe, S., Sakai, S.-I., Brouwer, A., Uramaru, N.; Kitamura, S., Takigami, H.: Similarities in the endocrine-disrupting potencies of indoor dust and flame retardants by using osteosarcoma (U20S) cell-based reporter gene assays. Environ. Sci. Technol. 47, 2898–2908 (2013)

21) Kennedy, K., Macova, M., Leusch, F., Bartkow, M. E., Hawker, D. W., Zhao, B., Denison, M. S., Mueller, J. F.: Assessing indoor air exposures using passive sampling with bioanalytical methods for estrogenicity and aryl hydrocarbon receptor activity. Anal. Bioanal. Chem. 394, 1413-1421 (2009)

22) Murk, A. J., Legler, J., van Lipzig, M. M., Meerman, J. H., Belfroid, A. C., Spenkelink, A.: van der Burg, B., Rijs, G. B., Vethaak, D.: Detection of estrogenic potency in wastewater and surface water with three in vitro bioassays. Environ. Toxicol. Chem. 21, 16-23 (2002)

(23) Legler, J., Leonards, P., Spenkelink, A., Murk, A. J.: In vitro biomonitoring in polar extracts of solid phase matrices reveals the presence of unknown compounds with estrogenic activity. Ecotoxicology 12, 239-249 (2003)

(24) Grung, M., Næs, K., Fogelberg, O., Nilsen, A. J., Brack, W., Lübcke-von Varel, U., Thomas, K. V.: Effects-directed analysis of sediments from polluted marine sites in Norway. J. Toxicol. Environ. Health A 74, 439-454 (2011)

(25) Houtman, C. J., Booij, P., Jover, E., Pascual del Rio, D., Swart, K., van Velzen, M., Vreuls, R., Legler, J., Brouwer, A., Lamoree, M. H.: Estrogenic and dioxin-like compounds in sediment from Zierikzee harbour identified with CALUX assay-directed fractionation combined with one and two dimensional gas chromatography analyses. Chemosphere 65, 2244-2252 (2006)

26) van der Linden, S. C., Heringa, M. B., Man, H. Y., Sonneveld, E., Puijker, L. M., Brouwer, A., van der Burg, B.: Detection of multiple hormonal activities in wastewater effluents and surface water, using a panel of steroid receptor CALUX bioassays. Environ. Sci. Technol. 42, 5814–5820 (2008)

## 6 ．研究発表

#### 6 \.1\.誌上発表

1) Matsukami H., Tue N.M., Suzuki G., Someya M., Tuyen L.H., Viet P.H., Takahashi S., Tanabe S., Takigami H.: Flame retardant emission from e-waste recycling operation in northern Vietnam: Environmental occurrence of emerging organophosphorus esters used as alternatives
for PBDEs. Sci. Total Environ. in press.

2) Suzuki G., Tue N.M., Takahashi S., Tanabe S., Sakai S., Takigami H.: Effect-based Hazard Identification of House Dust by In Vitro Assays Detecting Dioxin-like Compounds, Thyroid and Reproductive Toxicants. Curr. Org. Chem. 18, 2231-2239 (2014)

3) Matsukami H., Kose T., Watanabe M., Takigami H. Pilot-scale incineration of wastes with high content of chlorinated and non-halogenated organophosphorus flame retardants used as alternatives for PBDEs. Sci. Total Environ. 493, 672-681 (2014)

4）松神秀徳，戸館侑孝，Sicco H. Brandsma，Pim E.G. Leonards，滝上英孝．：リン酸エステル系難燃剤の定量分析法の開発と国際相互検定研究による検証．環境化学24（2），41-49（2014）

5）鈴木 剛．：臭素化ダイオキシン類のリスク評価：規制管理へ向けたアプローチ．ぶんせき．11，692-693（2013）

#### 6.2. 学会発表

1) Suzuki G., Suzuki Y., Takigami H., Yoshinaga J., Takagi M., Nakayama S.: Flame retardants and other additives in house dust collected from Japan. SETAC Nor America 35th Annual Meeting, Abstracts 259 (2014)

2) Suzuki G., Suzuki Y., Takigami H., Yoshinaga J., Takagi M., Nakayama S.: Flame retardants and other additives in house dust from Japan. 34th International Symposium on Halogenated Persistent Organic Pollutants Abstracts (2014)

3) Matsukami H., Tue N.M., Suzuki G., Someya M., Tuyen L.H., Agusa T., Viet P.H., Takahashi S., Tanabe S., Takigami H.: Emissions of PBDEs and alternative aryl phosphates around e-waste recycling area in the northern part of Vietnam. 34th International Symposium on Halogenated Persistent Organic Pollutants Abstracts (2014)

4) Suzuki Y., Suzuki G., Takigami H., Yoshinaga J., Takagi M., Nakayama S.: Plastic additives in indoor dust from Japanese household. 34th International Symposium on Halogenated Persistent Organic Pollutants Abstracts (2014)

5）松神秀徳，Nguyen Minh Tue，鈴木剛，染矢雅之，宇智田（野田）奈津代，藤森崇，Le Huu Tuyen，阿草哲郎，Pham Hung Viet，高橋真，田辺信介，滝上英孝．：ベトナム北部のE-waste リサイクル施設における難燃剤の環境排出実態調査（第二報）．第23回環境化学討論会，（2014）

6) Matsukami H., Tue N.M., Suzuki G., Someya M., Uchida-Noda N., Fujimori T., Tuyen L.H., Agusa T., Viet P.H., Takahashi S., Tanabe S., Takigami H.: Cumulative Health Risk Assessment of Flame Retardants and Plasticizers in Soils from Vietnamese Informal E-Waste Recycling Site. 1st Southeast Asian Workshop on the Integrated Exposure and Effects Analysis (2014)

7) Matsukami H., Tue N.M., Suzuki G., Someya M., Noda N., Fujimori T., Tuyen L.H., Agusa T., Viet P.H., Takahashi S., Tanabe S., Takigami H.: Emissions of PBDE and non-PBDE flame retardants from primitive E-waste recycling activities in the northern part of Vietnam. 33rd International Symposium on Halogenated Persistent Organic Pollutants (2013)

8) Matsukami H., Kose T., Watanabe M., Takigami H.: Destruction behavior of organophosphorus flame retardants during incineration of solid wastes. 33rd International Symposium on
Halogenated Persistent Organic Pollutants (2013)

9）松神秀徳，Tue Nguyen M.，鈴木剛，染矢雅之，宇智田（野田）奈津代，藤森崇，Tuyen Le H.，阿草哲郎，Pham H. Viet，高橋真，田辺信介，滝上英孝.：ベトナム北部におけるE-wasteリサイクルに伴う難燃剤の環境排出実態調査（第一報）．第22回環境化学討論会（2013）

10) 松神秀徳. リン酸エステル類および塩素化パラフィン類の分析技術に関する研究の紹介. 第 22 回環境化学討論会 (2013)