Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
### 4. 結果及び考察

## (1) メチル水銀の簡易・迅速・高感度な分析システムの開発

## 1 ) 開発分析法のブラッシュアップ

開発法の前処理手順、HPLC測定条件の一つ一つを精査し、特に前処理法をミスがなく容易に実施可能なものに再構築した（表(1)-1参照）。また土壌・底質試料のみではなく、生体試料にも対応できるよう検討を進めた。そして、世界的に最も利用されているメチル水銀測定法であるエチレーション法（エチレーション－GC-AFS、Metropolitan Council）、日本の水銀分析マニュアルに記載されている水銀分析マニュアル法（ジチゾン抽出－GC-ECD法、国立水俣病総合研究センター）とクロスチェックを行った。開発法とエチレーション法の測定値比較結果を図(1)-2に示す。大部分の試料で測定値はよく一致した。しかし、一部の試料でエチレーション法に比べ開発法での測定値が低い試料やその逆の試料が確認された。そこで試料の化学組成から原因究明を進めた。

図(1)-2 開発法とエチレーション法との測定値比較（72試料）

結果として図(1)-3(A)のように試料中の硫黄濃度が高い試料ほど、測定値比(開発法での測定値/エチレーション法での測定値、%)が低いことが確認された。開発法は、メチル水銀と塩化物イオンの弱い錯形成を利用してトルエン相にメチル水銀を移し、そこから比較的強い錯体を形成するEDTAにより水相に逆抽出し、最終的に水銀と強く結合する硫黄部位を有するEmetineCS_{2}配位子により錯体化して測定する。最初の抽出段階で弱い配位子である塩化物イオンを使うため、配位性の夾雑物をマスキングする目的で5 mM Pd^{2+}, 0.1 M Cu^{2+}を含む5 M 塩酸を溶出液として利用している。しかし、水銀と強く結合する硫黄成分の多い試料ではマスキング効果が不足し、メチル水銀が塩化物として抽出できていないと考え、Hg^{2+}をマスキング剤として添加することとした。結果として、これまでの溶出液にさらに0.05 mM (10 mg/L)となるようHg^{2+}加えることで、硫黄濃度が20%を超えるような海底質においても添加回収率が80%以上になり、またエチレーション法で得られた測定結果と近い値が得られた（図(1)-2(B)）。これらの結果、開発法は高い硫黄濃度を持つ試料にも対応できる分析法になったと言える。逆にエチレーション法で測定値が低い試料は、水銀分析マニュアル法との比較や開発法での添加回収実験の結果から、エチレーション法では測定できていない可能性が高いことが確認できた。エチレーション法は世界的に最も多用されているメチル水銀測定法であるが、分析手順の再検討が必要と考えられる。

図(1)-3 硫黄による妨害確認と $ Hg^{2+} $ 添加効果
開発法について、エチレーション法および水銀分析マニュアル法と測定感度、操作の容易さ、測定時間等を比較し評価をおこなった。開発法の最終的な分析手順、エチレーション法および水銀分析マニュアルの手順を表(1)-1に示す。

## <测定感度>

メチル水銀、エチル水銀の標準溶液を用い、開発法のHPLC-CLシステムによる装置検出限界（ $ 2 \times S \times t(n-1, 0.05) $ ）と装置定量限界（ $ S \times 10 $ ）を50ng/Lを7回測定したときの標準偏差（S）から算出した。結果、装置検出限界はそれぞれ5.7 ng/L、6.6 ng/L（絶対量として約1 pg）、装置定量限界（ $ S \times 10 $ ）は15 ng/L、16 ng/Lであった。また検量線の範囲は少なくとも10 μg/Lまで良好な直線が得られた。前処理の必要ない水試料であれば、国の環境基準である0.5 μg/Lの1/10の濃度をEmetineCS₂試薬の添加だけで容易に測定可能である。

鹿児島湾海底質1gに0.5 ng/gとなるよう標準液を添加した試料を9回試料調製し、前処理を行い、開発分析法の検出下限値(MDL)と定量下限値(MQL)を算出したところ、メチル水銀、エチル水銀のMDLはそれぞれ0.07 ng/g、0.08 ng/g、MQLは0.20 ng/g、0.23 ng/gとなった。また検量線範囲は少なくとも250 ngまで良好な直性が得られた。代表的なクロマトグラムを図(1)-4に示す。検量線溶液のクロマトグラム、実試料のクロマトグラムからわかるように、妨害物質等の検出もほとんどなく測定が可能である。

図(1)-4 開発法前処理を実施した検量線溶液及び実試料のクロマトグラム

Peak identification: 1. Methylmercury, 2. Ethylmercury

## 〈前処理〉

前処理の作業ステップ数、振とう等の待機時間を積算したものを表(1)-4に示す。開発法は、振とう、遠心分離等、試薬の添加など簡易な操作かつ作業ステップ数も少ない。24本（検量線溶液4本、試料20本）を1セットとして、前処理にかかる時間は4時間以内である。水銀分析マニュアル法は、開発法と同様に試薬の添加、振とう、遠心分離等の簡易な操作のみであるが、作業ステップ数が開発法に比べ2倍以上と煩雑である。エチレーション法は、作業ステップ数は開発法と同じであるが、有機溶媒の蒸発除去など作業に時間のかかるものが多く、エチル化反応やパージトラップ操作など多数の試料を一度に処理することが困難な操作を含んでいる。

表(1)-2 各分析法の前処理操作

開発法	エチレーション法	水銀マニュアル法
ステップ数	15ステップ	15ステップ	37ステップ
待機時間	66分	237分	63分
待機時間…振とうや遠心分離などの待ち時間
表(1)-1 開発法と既存法（エチレーション法、水銀分析マニュアル法）の測定手順

開発法(HPLC-CL)	エチレーション法(GC-AFS)	水銀分析マニュアル法(GC-ECD)
①Sample (0.1-1.0 g)を遠滅管(50mL)に量り取る
②溶出液 (0.05 mM Hg², 5 mM Pd², 0.1 M Cu²⁺を含む5 M HCl溶液)を20 mL加える
③30分間振とう
④3000rpmで10分間遠心分離	①Sample (0.1-0.5 g)をテロロン製の遠滅管(30mL)に取る
②18% w/v KBr (acidified to 5% w/v with H₂SO₄)溶液を5 mL添加
③1 M CuSO₄溶液 1 mLとジクロロメタン13 gを添加
④1時間静置
⑤1時間振とう
⑥3000rpmで20分間遠心分離	1. Sample (0.1-0.5 g)を遠滅管(50 mL)に量り取る
2. 1 M KOH(エタノール)溶液を10 mL添加
3. 20分間超音波溶出
4. 20分間振とう
5. 1 M HClを10 mL加え弱酸性化
6. N₂ガスを5分間吹き込みH₂Sを除去
7. 20% 塩化ヒドロキシルアミン溶液を2 mL添加
8. 20% EDTA溶液を2 mL添加
9. 0.01% ジチソン(トルエン)溶液を5 mL添加
10. 3分間振とう
11. 3000rpmで3分間遠心分離
12. 水相(固体含む)を吸引除去
13. トルエン相を分取しフロリジルカラムに通し10 mLの遠滅管に受ける
14. 1 M NaOHを3 mL添加(洗浄1回目)
15. 3分間振とう
16. 水相を吸引除去
17. 1 M NaOHを3 mL添加(洗浄2回目)
18. 3分間振とう
19. 1200rpmで3分間遠心分離
20. 水相を吸引除去
⑥トルエン相4 mLを遠滅管(10 mL)に移す
⑦2mM EDTA溶液(40 mM ホウ酸醸電液, pH 9)を0.5 mL加える
⑧30秒振とう
⑨1200 rpmで5分間遠心分離	⑦テロロン製容器(60 mL)に超純水40mLを量り取る
⑧超純水を入れたテロロン製容器にジクロロメタン相(2~3g)を分取して添加
⑨45℃で加温しながらN₂ガスを100 mL/minで吹き込みジクロロメタンを除去(1時間)	21. トルエン相(3 mL)を10 mL遠滅管に移す
22. アルカリ性硫化ナトリウム溶液2 mLを添加
23. 3分間振とう
24. 1200rpmで3分間遠心分離
25. トルエン相を吸引除去
④水相300 μLをオートサンプラー用バイアル(2 mL)に分取
⑧4 μM metineCS₂溶液(アセトニトリル)を300 μL添加
(オートサンプラーの試薬添加機能を利用する場合不必要)	⑧試料溶液(1~40 mL)をガラス製反応容器に分取する
⑧超純水を加え一定体積(100 mL)に調整する
⑨酢酸鑑液 200 μLを加えpHを4~5に調整する
⑨1% NaBE₁を100 μL加え混合
⑨25分間静置(エチル化反応を進める)
⑨Hg-free N₂ガスを12分間吹き込み気化物をTenaxトラップに捕集する	26. 1 M HClを200 μL加え弱酸性化
27. N₂ガスを100 mL/minで5分間吹き込む(H₂Sを除去)
28. Walpole 鑑濫液2mLを加える
29. 0.01% ジチソン(トルエン)溶液を200 μL加える
30. 3分間振とう
31. 1200rpmで3分間遠心分離
32. 水相を吸引除去
33. 1 M NaOHを3 mL加える
34. 3分間振とう
35. 水相を吸引除去
36. 1200rpmで3分間遠心分離
37.1 M HCl数滴加えて弱酸性化
HPLC-CLに200 μL注入(オートサンプラー可)
測定時間 10分/sample(エチル水銀の同時測定を含む)	Tenax捕集管を加熱脱着装置をつGC-(熱分解)-AFSに接続
(Tenax捕集とGC-AFSへの導入を自動化した装置が市販)
測定時間 7分/sample	トルエン相5 μLをGC-ECDに注入(オートサンプラー不可)
測定時間 10分/sample
H. Kodamatani, T. Tomiyasu, J. Chromatogr A, 1228, 155-159, 2013.
H. Kodamatani et al., Anal. Sci., 28(10), 959-965, 2012.	N.S. Bboom, Can. J. Fish Aquat. Sci., 46, 1131-1140, 1989.
N.S. Bboom et al., Fresenius J. Anal. Chem., 358, 371-377, 1997.
L. Liang, M. Horvat, N.S. Bboom, Talanta, 41, 371-379, 1994.	Ministry of the Environment, Japan, MERCURY ANALYSIS MANUAL, May, 2004.
## <测定装置>

開発法はHPLC-CL装置であり市販されているものであるが、Ru錯体試薬の電解供給システムや脱気能力の高い脱ガス装置が別途必要である。エチレーション法、水銀分析マニュアル法は、それぞれガスクロマトグラフィー(GC)-熱分解-原子蛍光検出(AFS)装置、GC-電子捕獲検出(ECD)装置である。エチレーション法のみが水銀を直接検出する測定法で、水銀分析マニュアル法と開発法は、それぞれ塩化物イオン、EmetineCS_{2}を検出することで水銀を測定する間接検出法である。ただし、開発法は非常に選択性の高い検出法であり、試薬や設備を選ばないという点で間接検出がメリットとも言える。また、開発法のみが高速液体クロマトグラフィー(HPLC)ベースであり、高純度の高压ガスが必要で装置を安定させるため常時運転が行われているGC法と比べ装置の導入・維持が容易である。

## <試薬>

開発法ではRu錯体、塩化パラジウムなど比較的高価な試薬が必要である。またEmetineCS₂も合成する必要がある（合成はEmetineと二硫化炭素をアルカリ性で攪拌し、沈殿を回収するのみであり容易）。しかし、これらの試薬は使用量が微量であり、またRu錯体、塩化パラジウムは回収再生も可能である。エチレーション法では、純度の高いエチル化試薬（テトラエチルホウ酸ナトリウム）が必要で、メーカーや純度によっては試薬不純物からメチル水銀の人工生成が起こることが報告されている。また反応性が高いため試薬の取り扱いが非常に難しく、また入手できる環境が限られていることが難点として挙げられる。水銀分析マニュアル法では、比較的入手しやすい試薬のみで実施できるが、抽出試薬であるジチゾンや他試薬溶液の使用前精製が必要になる。よって前処理とは別に溶液調製に相当の時間を要する。

## <器具>

開発法、水銀分析マニュアル法では市販のガラス器具を使用でき、また、振とう器、遠心分離機など一般的な設備で対応可能である。エチレーション法では、ほとんどの操作にテフロン製の器具が求められ、エチレーション反応ーパージトラップ操作のための特殊形状の反応容器、有機溶媒蒸発除去操作のためヒーターと窒素ガスバブリング装置を組み合わせた設備が必要となる。（Tekran社、Canadaにより市販されている。）

## <試料測定能力>

一日当たりの各分析法の試料測定能力（作業人員1名として）は、開発法20試料、エチレーション法12試料、水銀分析マニュアル法10試料である。よって開発法の試料測定能力は他に比べ約2倍となる。開発法ではHPLC測定が市販のオートサンプラーで実施できるため、1日で40試料の処理を行い夜間自動分析することも容易である。一方、エチレーション法、水銀マニュアル法は、前処理に時間がかかるため20試料程度を1日かけて前処理操作を行い翌日に測定を行っている。（水銀分析マニュアル法ではオートサンプラーの使用が不可能、エチレーション法はエチル化とパージトラップ操作を自動化した装置がTekran社より市販されている。）また開発法は、メチル水銀のみならずエチル水銀も同時に分析可能である。（水銀分析マニュアル法、エチレーション法ではエチル水銀の測定は不可能。ただし、エチレーション法のエチル化をプロピル化、フェニル化に代えた手法ではエチル水銀の測定も可能である。）

以上の点を踏まえ、開発法は既存法に比べ少なくとも2倍の試料測定能力を持つ簡易で迅速なものといえる。土壌・底質中のメチル水銀を測定するうえで実用的な測定感度（〜1 gの試料でsub- $ \mu $ g/kgレベルの測定が可能）を持ち、また、既存法がGCベースであるのに対し、開発法はHPLCベースであり、装置の導入のしやすさや維持の面でも優れている。これらのことから、開発法は既存法に劣らない優れた方法と言える。

## 2 ) 試料取扱法の検討

採取した土壌・底質試料は、できるだけ速やかに測定に用いることが理想であるが、多数の試料を採取し分析する環境分析の分野では、測定が完了するまでに数週間から数か月の非常に長い時間を要する。よって、採取した試料をいかに保存しておくかが重要となる。また、土壌・底質試料は水分を含み、不均一なものであるため、採取したままの状態では再現性の良い測定結果を得ることは難しく、測定データの比較も困難である。これらのことから、どのような分析法を利用するにしても、採取した試料の持つ情報を正しく取り出すための保存、乾燥等の処理法の確立が重要となる。総水銀濃度に関しては、試料の処理法が与える影響が検討された報告は数多く存在するが、メチル水銀濃度に関する報告はほとんどない。そこで、採取した試料の乾燥操作や保存状況がメチル水銀濃度に及ぼす影響について検討を進めた。
図(1)-5はインドネシアの水銀汚染地域で採取された水田土壌をできる限り均一に分割後、様々な乾燥方法で処理し、メチル水銀濃度を測定した結果である。総水銀濃度は50 mg/kg程度とほとんど変化がないが、メチル水銀濃度では大きな差が確認され、40℃乾燥を行ったもので、他と比べ約2倍のメチル水銀が検出された。これは微生物活動が活発になる温度で数日間に渡り乾燥を行ったため、メチル水銀の生成反応が進行し、このような結果となったものと考えられた。

図(1)-5 乾燥法の違いによるメチル水銀濃度の変化(水田土壌)

そこで様々な由来の試料を利用し、凍結乾燥したものと40℃乾燥したもので化学成分の比較を行った。メチル水銀以外の化学成分はほとんど差がなく均一な分割ができたものと考えられたが、メチル水銀濃度は特に水分を多く含む底質試料等で大きな変化が確認された（図1）-6）。それぞれの試料は同じサンプリングで採取したものごとに分類しており、凍結乾燥を基準とすると、海底質（水俣湾）や水田土壌（インドネシア共和国産）では40℃乾燥でメチル水銀濃度が上昇し、河川底質（インドネシア共和国産）では大きく低下するなど試料ごとに一定の傾向を示した。共存物質の化学形態変化が分析法に影響を与えている可能性も考え、エチレーション法、水銀分析マニュアル法でも測定したが、同様の測定結果であった。

メチル水銀濃度(凍結乾燥, μg/kg)

図(1)-6 乾燥処理によるメチル水銀の濃度変化

メチル水銀は微生物活動により生成・分解するとされていることから、数日の乾燥期間の間にメチル水銀が生成しうるのか確認実験を行った。大学構内で採取した水銀汚染のない水田土壌に$\mathrm{Hg}^{2+}$を乾燥重量で15 mg/kg程度になるよう添加し、30℃に設定したインキュベーター内で静置した。一定時間経過後、インキュベーターから取り出して冷凍し、凍結乾燥して測定試料とした。また$\mathrm{Hg}^{2+}$を添加後、121℃で30分間滅菌処理した試料も同様に静置した。測定結果を図(1)-7に示す。静置後、1日でメチル水銀の生成が確認され、4日まで上昇し、その後ほぼ一定の濃度となった。この傾向は、添加する水銀濃度を変えても同様であった。一方、滅菌処理した試料では
メチル水銀濃度の上昇は確認されなかった（ブランク試料に比べて高い濃度が検出されたのは、 $ Hg^{2+} $ 添加から滅菌処理が行われるまでに生成されたメチル水銀だと考えられる）。この結果は、乾燥操作の数日の間に微生物活動によってメチル水銀の生成や分解が起こりることを示しているといえる。

図(1)-7 Hg^{2+} 添加によるメチル水銀生成実験

最後に乾燥粉末化した後の試料の保存状態がメチル水銀濃度に与える影響について確認をおこなった。100μg/kg程度の高いメチル水銀濃度を持つ3つの試料を利用し、これら試料を3分割してそれぞれ冷凍（-28℃）、冷蔵（4℃）、40℃の暗所で一定期間保存した後、メチル水銀濃度を測定した。結果を図（1）-8に示す。いずれの試料も40℃乾燥では若干メチル水銀濃度が変化しているような結果となったが、冷凍保存や冷蔵保存では、ほとんど変化は見られなかった。（認証標準物質ERM CC580が4℃保存としているため、4℃保存のERM CC580の測定値を基準として他の測定値を補正した。）よって乾燥粉末化後の試料は、冷暗所に保存することで安定的に利用できると考えられる。

図(1)-8 乾燥粉末化後の保存状態におけるメチル水銀濃度変化

$$ 4^{\circ}C $$

$$ \begin{aligned}&\begin{aligned}\\ & してい \\ &\end{aligned}\\ \end{aligned} $$

これらの実験結果から、試料採取後に微生物活動によりメチル水銀の生成や分解が測定されるレベルで起こることが明らかになった。特に水分を多く含み採取により存在環境（温度や酸素濃度など）が大きく変わる試料は、可能な限り素早く冷凍し、凍結乾燥、粉末化の後、冷暗所で保存するなど、試料採取後に微生物活動を起こさせないように試料を取扱う必要がある。（試料採取後、すぐさま冷凍できるような環境も限られることから、薬品添加による固定化なども検討していく必要がある。）
## 3 ) 水銀汚染を受けた土壤・底質中の有機水銀

本研究をすすめるにあたり測定した土壤・底質の試料数は、288種（乾燥法の違いなどの重複含む）である。水銀の由来としては、火山活動（地熱を含む）、アマルガム法による金精錬活動、水銀鉱山活動、工場排水などで、試料の種類としては、海底質、河川底質、森林土壤、水田土壤などであった。これらの試料の化学組成を湿式分解－還元気化冷原子吸光法による総水銀、蛍光X線分析、元素分析（CNS）、総有機炭素（TOC）測定などにより明らかにして、メチル水銀分析法の開発に利用してきた。また、イトムカ旧水銀鉱山（北海道）、妙高山南地獄谷（新潟）では、土壤・底質試料の採取と同時に水や大気、植物等の採取・分析を進め、環境中に放出された水銀の挙動解明研究も同時に進めた。

測定した土壌・底質試料の主要化学組成をまとめたものを表(1)-3に示す。一般的に還元的環境である底質からメチル水銀が生成し、食物連鎖を通じて大型魚類に蓄積していくとされているが、検討した試料では底質より土壌、特に水銀放出源を近くに持ち、大気輸送で水銀が蓄積したと考えられる森林土壌表層で高いメチル水銀濃度が測定された。水銀汚染の経路やレベル、水銀の存在形態が異なるため単純比較はできないが、総水銀に占めるメチル水銀の割合は、海底質や河川底質では0.1%以下であるのに対し、大気輸送で水銀が蓄積したと考えられる森林土壌では、最大3%に達するものも存在し、乾燥重量で0.4 mg/kgを超えるメチル水銀濃度を持つ土壌も存在した。よって、森林土壌で生成したメチル水銀がどのような挙動を示すのか、今後、解明していく必要があると考えられる。また、水田土壌も全体的に高いメチル水銀濃度を持っており、生成実験の結果からも無機水銀が容易にメチル水銀に変化することが明らかになった。最近、米に含まれるメチル水銀が問題視されており、米のメチル水銀取り込み抑制のためにも水田土壌におけるメチル水銀の生成挙動を明らかにしていく必要がある。

表(1)-3 測定を進めた土壤・底質試料の化学組成(n=288)

最小值	最大值	平均	標準偏差	中央值
総水銀濃度(mg/kg)	0.02	1649.85	67.41	187.62	11.24
メチル水銀濃度(μg/kg)	0.00	444.35	21.39	51.79	4.41
エチル水銀濃度(μg/kg)	0.00	17.40	3.42	3.83	1.94

メチル水銀の存在割合(メチル水銀/総水銀、%)	0.00	3.28	0.16	0.38	0.04
総有機炭素濃度(%)	0.00	54.61	7.25	11.64	2.28
総窒素濃度(%)	0.00	3.08	0.48	0.61	0.23
総炭素濃度(%)	0.09	52.33	8.89	11.71	3.39
総硫黄濃度(%)	0.00	93.52	1.17	7.32	0.08

(蛍光X線分析 as Oxide)
Al2O3(%)	0.41	36.43	15.93	5.94	16.88
SiO2(%)	0.61	80.78	51.74	18.34	57.98
CaO(%)	0.14	73.96	12.12	18.52	2.84
Fe2O3(%)	0.06	21.91	9.13	3.48	9.57
### 5. 本研究により得られた主な成果

## (1) 科学的意義

既存の土壌・底質中メチル水銀分析法と比べ少なくとも2倍の試料測定処理能力を持つ、簡易かつ迅速な測定法を確立した。感度的にもsub- $ \mu $ g/kgレベルの定量（必要試料量1 g以下）が可能で、土壌・底質中のメチル水銀濃度を評価するだけではなく、土壌・底質で生成したメチル水銀の挙動（移動や生体への取込）を追跡するための分析法としても十分な能力を有している。また、採取試料が持つ情報（本来のメチル水銀濃度）を正確に引き出すための採取試料の処理・保存法の検討を進めた。得られた結果は、土壌・底質のメチル水銀を評価するための標準的な処理・保存法の確立に非常に有用なものとなると考えられる。さらに本研究を通し、国内外の様々な要因で水銀濃度が高い地域の土壌・底質試料を収集して測定を進め、森林土壌や水田土壌において高濃度のメチル水銀が存在していることを明らかにした。これらの結果から、土壌・底質中のメチル水銀の存在濃度は、総水銀濃度（水銀汚染レベル）だけに依存せず、土壌の化学組成（特に有機炭素量）や存在環境により大きく異なることを確認した。

## (2) 環境政策への貢献

## ＜行政が既に活用した成果＞

該当なし。

## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

本研究により開発された分析法は、土壌底質中のメチル水銀のモニタリング法、環境動態解明研究に利用できるだけでなく、発展途上国等への技術移転等も容易に実施できるため、水俣条約における発展途上国支援にも貢献できるものとなると考える。また、採取した試料の取り扱いに関する検討結果は、土壌・底質中のメチル水銀を分析していくうえで指針となるものといえる。さらに国内外の試料採取を通して得られた環境中におけるメチル水銀の存在濃度データは、環境政策を立案していくうえで重要な情報となることが期待できる。

### 6. 研究成果の主な発表状況

## (1) 主な誌上発表

<査読付き論文>

該当なし。

## く査読付論文に準ずる成果発表>

該当なし。

## (2) 主な口頭発表 (学会等)

1) 旧水銀鉱山周辺土壤における総水銀およびメチル水銀の分布、児玉谷 仁、前田 千尋、外蘭 寿宗、神崎 亮、富安 卓滋、2014年度日本地球化学会年会、富山大学（2014年9月16－18日）

2) 土壤中メチル水銀の選択的抽出法の確立、児玉谷仁、神崎亮、富安卓滋、第33回溶媒抽出討論、ホテルプラザ神戸（2014年12月11～12日）

3) The influence of sample drying and storage conditions on methylmercury determination in soils and sediments, Hitoshi Kodamatani, Chihiro Maeda, Steven J. Balogh, Yabing H. Nollet, Ryo Kanzaki, Takashi Tomiyasu, ICMGP2015 (2015年6月発表予定、採択済み、韓国).

4) 旧水銀鉱山周辺における水銀分布とその化学形態、重富 あずさ、児玉谷 仁、外菌 寿宗、勝間創太、山崎 仁美、神崎 亮、富安 卓滋、第77回日本分析化学討論会（2014年5月発表予定、受理済み）

5) Emission and behavior of Mercury, from the fumarolic activity of Minamigigokudani, Mt. Myoko, Japan, Hitoshi Kodamatani, Souta Katsuma, Azusa Shigetomi, Toshimune Hokazono, Ryusuke Imura, Ryo Kanzaki, Takashi Tomiyasu, PACIFICHEM2015（2015年12月発表予定、受理済み、米国）

### 7. 研究者略壓

課題代表者:児玉谷仁

神戸大学大学院総合人間科学研究科修了、博士（学術）、現在、国立大学法人鹿児島大学大学院理工学研究科助教
# 5RF-1303 水銀汚染土壌および底質中のメチル水銀の簡易・迅速・高感度な分析システムの開発

（１）水銀汚染土壌および底質中のメチル水銀の簡易・迅速・高感度な分析システムの開発

国立大学法人鹿児島大学

大学院理工学研究科 地球環境科学専攻

児玉谷 仁

平成25～26年度累計予算額：17,791千円

（うち、平成26年度予算額：9,348千円）

予算額は、間接経費を含む。

## [要旨]

水銀汚染を受けた土壌・底質は非常に高濃度（～数千mg/kg）の無機水銀を含み、その一部が微生物活動などによりメチル水銀化する。メチル水銀は水俣病の原因物質として知られ、例え微量であったとしても食物連鎖を通じ生体に高度に蓄積していくため、その評価が必要となる。つまり、土壌・底質中のメチル水銀測定は、非常に高濃度の無機水銀の中から、極微量（数μg/kg）のメチル水銀を測定しなければならない。加えて土壌・底質は地域や環境により化学組成が大きく異なるため、常に同じ分析法で対応できるとは限らない。よって、土壌・底質中のメチル水銀測定は非常に難しいものとして知られ、既存分析法では煩雑な分析操作が必要とされている。

そこで本研究は、様々な要因で水銀濃度が高い地域の土壌・底質を集め、これを利用して様々な土壌・底質試料に対応できる分析法を確立することを目的に研究を進めた。この結果、簡易な前処理と高速液体クロマトグラフィー化学発光検出法による測定により、土壌・底質中に存在するメチル水銀を既存の分析法と比べ簡易かつ迅速に測定できる分析法を確立した。開発法のメチル水銀の検出下限値（MDL）は0.07 ng/g、定量下限値（MQL）は0.20 ng/g（試料1 g使用）であった。さらに、採取した土壌・底質試料の取扱法についても検討を進め、採取試料の乾燥や保存によってもメチル水銀濃度が変動することを確認した。この原因を確認するため、メチル水銀の生成実験を進めた結果、水田土壌などでは微生物活動により数日のうちにメチル水銀が生成することを明らかにした。また、これらの検討のため様々な地域の200試料以上の土壌・底質試料について測定を進めた結果、土壌・底質中のメチル水銀濃度は、無機水銀濃度のみならず、共存する有機物量やその存在環境により大きく異なることを確認した。特に一般的に言われる底質ではなく、森林土壌に高濃度（最高濃度は0.4 mg/kg）のメチル水銀が存在することを確認した。

[キーワード]

メチル水銀、エチル水銀、分析法、土壌、底質
### 1. はじめに

環境中に放出された水銀は、その化学形態を変化させながら国境を越えて拡散する。2013年10月、国際的な水銀規制条約である「水銀に関する水俣条約」が採択され、その発効にむけ環境中に放出された水銀の挙動解明がより一層緒必要とされている $ ^{①} $ 。数ある水銀化学種の中で特に毒性が高く、水俣病の原因物質として知られるメチル水銀は、環境中に放出された無機水銀からも生成し、食物連鎖を通じて濃縮していく。土壌・底質は、このメチル水銀の主生成場とされているが、生成したメチル水銀がどのような経路で生体に濃縮されていくのか詳細には明らかになっていない。また近年、水銀鉱山付近の水田で採取された米にメチル水銀含まれることが報告されており、水銀による土壌汚染とメチル水銀の農作物への取込が新たな問題となりつつある $ ^{②} $ 。これらのことから、土壌・底質中のメチル水銀濃度を簡易・迅速・高感度に評価できる分析法が必要となっている。加えて、水銀汚染が現在進行形で進んでいる発展途上国でも利用できる分析法であることが求められている。

## 2 ．研究開発目的

本研究は、土壌や底質中のメチル水銀の簡易・迅速・高感度な分析法を確立することを目的としている。水銀汚染を受けた土壌・底質は非常に高濃度（～数千mg/kg）の無機水銀を含み、その水銀の一部が、微生物活動等によりメチル水銀化する。つまり、土壌・底質中のメチル水銀測定は、非常に高濃度の無機水銀の中から、極微量（数μg/kg）のメチル水銀を測定しなければならない。よって、その測定は非常に難しいことが知られ、既存分析法では煩雑な分析操作が必要とされている。加えて、土壌・底質の化学組成は地域や環境により大きく異なるため、常に同じ分析法で対応できているとは限らない。また不均一な土壌・底質試料を再現よく測定するためには、乾燥・均一化が必要となるが、この程でも水銀の化学形態変化が起こう。この分析法の問題と、多様な組成を持つ土壌・底質中に存在し、化学形態を容易に変化させる水銀を測定するという困難な作業が状況を複雑化し、土壌・底質中におけるメチル水銀の举動解明を遅らせているといえる。そこで、土壌や底質中のメチル水銀濃度を簡易・迅速・高感度に測定できる分析法を確立することを目的に本研究を計画した。

### 3. 研究開発方法

（１）水銀汚染土壤および底質中のメチル水銀の簡易・迅速・高感度な分析システムの開発

研究代表者らは、これまで煩雑な分析操作を必要としない独自のメチル水銀高感度分析法の開発を進めてきた $ ^{(3-5)} $ 。これまでに確立した土壤底質中のメチル水銀測定手順を下記に示す。

① 土壤・底質試料（～1 g）を 20 mL の 0.1 M Cu^{2+} と 5 mM Pd^{2+} を含む 5 M HCl により 60 分振とうする。この操作により固体試料から水銀種を液相に溶出させる。

② 遠心分離により固液分離した後、液相にトルエンを5 mL加え、再度10分振とうする。これにより、試料溶液中に含まれるアルキル水銀は、塩化物の形でトルエン相に抽出される。一方、大過剰に存在し、メチル水銀測定を妨害する$\mathrm{Hg^{2+}}$は、$\mathrm{HgCl_{4}^{2-}}$のテトラクロロ錯体を形成し、
水相に残る。この結果、アルキル水銀のみを分離することが可能になる。 $ Cu^{2+} $ と $ Pd^{2+} $ は、試料中に存在する配位性の夾雑物をマスキングするために添加されている。

③ トルエン相の一部を別容器に分取し、2 mM EDTA 溶液（20 mM ホウ酸緩衝液、pH 9）により、水銀種を EDTA 錯体として水相に逆抽出する。

④ 水銀の形態別分離・検出には、水銀と強い錯体を形成するエメチン－ジチオカルバミン酸配位子（EmetineCS₂）を利用する。EDTA 錯体となったアルキル水銀にこの配位子を加えて錯形成させる（混合のみで直ちに錯体化する）。

⑤ これを図(1)-2 の高速液体クロマトグラフィー化学発光検出装置（HPLC-CL）に注入する。水銀錯体は、その形態ごとに HPLC 分離され、脂肪族第三アミン構造と強い発光反応を起こすことで知られる Tris(2,2-bipyridine)ruthenium(III)（Ru 錯体）溶液と混合される。EmetineCS₂は脂肪族第三アミン部位を持つため、Ru 錯体を発光させる。この結果、間接的ではあるが水銀量が発光量として測定されることになる。発光試薬である 3 価 Ru 錯体は不安定であるため、安定な 2 価錯体として保存し、オンラインの電解セルにより定電流電解(200 μA)で 3 価として供給する。

この HPLC-CL を用いた測定法の利点は、非常に高い感度と高い選択性を併せ持ち、また測定装置の原理が単純で装置が安価な点にある。この分析法を利用し、既存の分析法（4 種類）と 17 種の土壌・底質試料について測定値のクロスチェックをおこなったところ、一部の試料で測定値に大きな差が確認された。この結果は、各分析法が多種多様な化学組成を有する土壌・底質試料に対応できていないことを示唆していると考えられた。

E: eluent; P₁: pump; AS: Auto-Sampler; C: column; Ru: Ru reagent solution;

$ P_{2} $ : pump; CLD: Chemiluminescence detector; PMT: photomultiplier tube; W: waste; DP: data processor; ECR: electrochemical reactor.

図(1)-1 HPLC-CL 装置概略図

Elunet: 20 mM citrate buffer (pH 3.1)-Acetonitrile (50:50, v/v), 1.5 ml/min; Ru complex solution: 0.25 mM Ru(bpy) $ _{3}^{2+} $ in 0.1 M H $ _{2} $ SO $ _{4} $ , 0.3 ml/min; Column: L-columnODS2 (5 $ \mu $ m, 4.6 x 250 mm) and guard column (10 mm); PMT: -550V; ECR: HX-201, 200 $ \mu $ A.

そこで本研究では、多種多様な化学組成を有する土壌・底質に対応できるように開発分析法をブラッシュアップすることを目的に研究を進めた。この検討に必須となるのが、様々な組成を有する土壌・底質試料である。そこで、これまで採取保存してきた試料に加え、様々な要因で水銀濃度が高い地域の調査を実施する。このとき土壌・底質試料に加え、水や大気、生体等についても調査を進める。この結果、分析法の確立に加え、水銀の環境挙動に関する知見を集積できることになる。また分析法の確立には、均質でメチル水銀濃度が変化せず長期的な土壌・底質試料が必
要となる。しかし、土壌・底質試料は不均一で水分を含み、保存中にメチル水銀濃度が変化する可能性も考えられる。そこで試料の取扱法（乾燥法や保存法）についても検討を進める。試料の取扱法は、試料が持つ情報を正確に引き出すために重要な操作と言え、分析法の確立のみならず環境中のメチル水銀の挙動解明研究を進めていくうえでも非常に重要な知見となる。

## 水银污染源

・河川など水の流れによる運搬・堆積

## 研究内容

既存の分析法に比べ简易で迅速な分析法の確立

・測定操作に伴う水銀の形態変化（メチル水銀の生成や分解）

・試料からメチル水銀を効率よく分離する前処理法の確立・HPLC-化学発光検出法によるメチル水銀測定法の確立

採取試料の取扱法の検討

化学組成の違いに対応できている？

保存や乾燥処理によるメチル水銀濃度変化の確認

様々な要因で水銀濃度が高いフィールドでの調査

・分析法、試料取扱い法確立のための土壤感覚試料採取

・水銀の環境挙動解明のためのデータ蓄積

## 既存分析法の問題点

## 試料前处理の問題

・非常に頻舞な測定操作（多数の試料の測定が困難）

・装置が高価かつ高ランニングコスト（測定環境が制限される）

⇒ より簡易・迅速・高感度な分析法が必要！

## 環境政策への貢献

土壤・底質中のメチル水銀豊度を効率よく知るためのツール提供

⇒ 水銀の環境摯動解明研究を加速化

水銀污染が問題となっている発展途上国への支援

⇒ 分析技術提供（既存法と比べ導入が容易）

## 水龈污染土壤对策

図(1)-2 研究の目的と内容

→ 水銀污染土壤でのメチル水銀生成に関するデータの提供
## 4 ．結果及び考察

## （１）メチル水銀の簡易・迅速・高感度な分析システムの開発

## 1 ）溶出溶液と溶出法について

土壌・底質中のメチル水銀を測定するためには、固体である土壌・底質試料からメチル水銀を溶出させ、さらに大過剰に存在する$\mathrm{Hg}^{2+}$と分離することが必要となる。溶出には、硝酸・塩酸・硫酸などの酸やNaOHなどのアルカリ溶液が用いられており、分離にはハロゲンイオン（主に$\mathrm{Cl}^{-}$、$\mathrm{Br}^{-}$）との錯形成反応を利用した溶媒抽出法が利用されている。現在、開発法では5 M塩酸溶液を溶出液と分離溶液（ハロゲンイオン供給源）として用いている。しかし、試料から効率よくメチル水銀を溶出できる溶液組成と、$\mathrm{Hg}^{2+}$とメチル水銀を分別抽出できる溶液の組成が一致するとは限らない。そこでまずモデル溶出液を利用し、効率よくメチル水銀と$\mathrm{Hg}^{2+}$を分離できる溶液組成の検討を進めた。

水銀種とハロゲンイオンの錯体の安定度定数はCl $ ^{-} $

図(1)-3 各溶出液組成による有機水銀の抽出

(Peak heightが有機水銀の検出量を表している)
図(1)-4 各溶出液組成による $ Hg^{2+} $ の除去

(Peak heightが水銀イオンの検出量を表している)

この結果を基に酸として硫酸、ハロゲン種としてCl⁻、Br⁻を利用し、認証標準物質であるERM CC580（河口底質）の測定を進めた。結果を図(1)-5に示す。開発法で採用している5 M 塩酸を用いたものでしか認証値を得ることができなかった。既存の分析法であるエチレーション法と同様の溶出液組成であっても認証値を得ることができなかったことから、少なくともメチル水銀は試料中から溶出液中に溶出しているが、後の作業ステップに溶出液組成が影響しているものと考えられた。溶液調製も簡易であるので、溶出液は5 M 塩酸を変更せず利用することとした。

図1-(5) 様々な溶出溶液でのメチル水銀測定（ERM CC 580、認証値：75±4 μg/kg）

次に溶出操作として、振とう溶出、超音波溶出、マイクロウェーブ溶出について検討を進めた。結果を図(1)-6に示す。使用した溶出溶液では、いずれの方法も10分以内に認証値を得ることができた。しかし、超音波溶出やマイクロウェーブ溶出では、時間の経過や温度の上昇とともに測定値の低下が確認された。これは過剰の操作により、メチル水銀の分解や測定妨害物質等の溶出が起こったためと考えらえる。土壌・底質の組成は多種多様で、個々に最適な溶出操作時間を設定することは不可能である。振とう溶出であれば、少なくとも過剰な操作時間であったとしてもメ
チル水銀が分解することがなく、また装置的にも最も利用しやすい溶出操作といえる。そこで、振とう溶出30分を採用した。

超音波照射時間(min)

図(1)-6 様々な溶出法によるメチル水銀測定（ERM CC 580認証値75±4 μg/kg）

## 2 ）トルエン抽出とEDTA逆抽出について

開発法では土壌・底質試料からメチル水銀を溶出させた後、遠心分離し、上澄み液のみを別の容器に移し、トルエンによる抽出操作を進めているが、この固液分離操作が不要になれば、より迅速に測定が可能となる。そこで、固液分離操作の必要性について検討を進めた。結果として、固液分離操作なしでも問題なく測定が可能であったが、特に有機物の多い試料でトルエン相の着色が観測された。トルエン相への物質混入は、後の操作を妨害することが予測される。よって、すべての試料で固液分離操作を実施することとした。

次にトルエン抽出後のトルエン相の分取法について検討を行った。有機水銀種を塩化物としてトルエン相に抽出し、このトルエン相を一定量取り出し、EDTA溶液による逆抽出を行うが、EDTAは中性～塩基性でなければ逆抽出剤として機能しない。しかし、トルエン抽出前の溶出液は5 M塩酸という強酸であるため、トルエン分取の際、少量の溶出液が混入しただけでEDTA逆抽出液のpHを低下させてしまう。また溶出液にはEmetineCS₂と錯体を形成し、HPLC測定を妨害するCu²⁺、Pd²⁺、Hg²⁺が高濃度に含まれる。これらのことから、トルエン相分取時の少量の溶出液の混入が測定ミスの原因となってきた。これまではトルエン抽出後、遠心分離し、水相の吸引除去後、再度遠心分離を行ってトルエン相を分離し、ピペットにより水相を吸わないようにトルエン相のみを分取してきた。そのため、このトルエン相を取り出す操作が、最も時間と経験を必要とする作業となっていた。そこで操作ステップは増えるが、水相の除去のため硫酸ナトリウムによる脱水操作を加えた。トルエン抽出後、遠心分離し、水相を吸引除去後、硫酸ナトリウムを適量加え、軽く攪拌して脱水することで、水相を混入させずトルエン相を分取することが可能となった。硫酸ナトリウムの添加は後の操作を妨害することなく利用でき、またこの操作により、エマルジョンを形成するような試料でも、トルエン相を容易に分取することが可能になった（図(1)-7）。
図(1)-7 硫酸ナトリウムによるトルエン相の脱水（上層：トルエン相、下層：水相）

最後にEDTA逆抽出のためのEDTA溶液組成について検討した。2 mM EDTA溶液を用いpHを変更し、逆抽出を確認したところ、pH 6.5－pH 10の範囲でほぼ一定の逆抽出率がえられ、pH 6.5より酸性では逆抽出効率は大きく低下した。よって逆抽出液のpH維持が重要であることから、40 mM ホウ酸緩衝液（pH 9.1）をEDTA溶液の調製溶液として採用した。EDTA逆抽出溶液は、EmetineCS₂で錯体化する際の最終溶液となる。しかし、生成するEmetineCS₂錯体が高い疎水性を持つことから、EDTA逆抽出溶液にEmetineCS₂溶液（アセトニトリル調製）を1:1(v/v)で加え調製していた。つまり、錯体化に伴い試料濃度が1/2に希釈されていた。そこで逆抽出溶液の組成を50％メタノールとして調製することで、EmetineCS₂錯体化に伴う希釈をなくすことを検討した。結果として50％メタノール調製では、標準溶液は問題なく測定可能であったが、トルエン相に着色の見られた試料において、EDTA逆抽出溶液にも着色が確認された。これは逆抽出溶液の疎水性が上昇したため、トルエン相に抽出された疎水性の高い物質が、水相に逆抽出されたと考えられる。疎水性物質の逆抽出溶液への混入は、HPLC測定を妨害することが予測される。よって、試料溶液は希釈されてしまうが、EDTA逆抽出溶液は100％水溶液での調製とした。

## 3 ）EmetineCS₂水銀錯体の安定性について

EmetineCS₂と水銀種の錯形成は、混合後ただちに起こるので、大部分のHPLC用オートサンプラーに標準搭載されている試薬添加機能を使うことで自動化することが可能であった。逆に手作業で調製する場合は、錯体化した後の錯体の安定性が重要となる。EmetineCS₂錯体化したメチル水銀は、冷蔵保存で少なくとも調整後4日間は安定であったが、エチル水銀錯体は徐々に分解していることが確認された（図(1)-8）。よって、試料調製後メチル水銀は安定的に測定可能であるが、長時間にわたる連続測定でエチル水銀を同時定量する場合、標準溶液の測定を行うなどして検量線を補正するか、オートサンプラーの試薬添加機能を使うなどして測定前に錯体化する必要がある。
図(1)-8 EmetineCS₂錯体化したメチル水銀、エチル水銀標準溶液の安定性

## 4 ）HPLC諸条件の再検討

開発法では1試料の測定に15分の測定時間（エチル水銀の測定も含む）が必要となっている。開発法は分離条件が柔軟に変更できる液体クロマトグラフィーベースであるため、測定時間を短縮し、より迅速な測定ができるような分離条件について再検討した。カラムの長さ・粒径等を変化させ最適な分離条件を検討したところ、図(1)-9のように約1/2の時間で測定が達成できる分離条件も確立できた。（研究途中での分離条件の変更は、ピークの誤認等の問題を引き起こす可能性があるため、分離条件はこれまで通りの条件(A)を利用して研究を進めている。）

図(1)-9 A）従来の条件によるクロマトグラム B）再検討した条件によるクロマトグラム

Sample: 0.2 $ \mu $ g/L Methylmercury and Ethylmercury. Peak identification: 1, Methylmercury; 2, Ethylmercury. HPLC Condition: A) Column: L-columnODS2 (5mm, 4.6 x 250 mm); Eluent: 20 mM Citrate buffer (pH 3.1)-Acetonitrile (50:50, v/v); Flow rate: 1.5 ml/min (13.8 MPa). B) Column: L-columnODS2 (5mm, 4.6 x 150 mm); Eluent: 20 mM Citrate buffer (pH 3.1)-Acetonitrile (52:48, v/v); Flow rate: 2.0 ml/min (11.9 MPa).
発光試薬であるRu錯体溶液はHPLC分析の間、常時送液しておく必要がある。Ru錯体は高価であり、できる限り消費量を減らす必要がある。そこでRu錯体溶液の供給法の変更を進めた。これまでは、0.25 mMのRu錯体溶液を用い、定電流電解により発光反応を起こす3価Ru錯体を供給してきた。これを定電圧電解にすることで、これまでの約1/3の濃度である0.1 mMのRu錯体溶液で感度等の低下なく利用できることを確認した。また、EmetineCS₂錯体のHPLC分離に利用する溶離液は50%アセトニトリルが必要であり、これが開発分析法の中で最もコストかかる要因となっていた。分離条件の再検討により、分析時間は約半分となり、アセトニトリル使用量も半減したことになるが、より純度の低い（安価な）アセトニトリルの使用などの検討を進めた。結果、開発法は選択性の高い化学発光検出法なので、高価なHPLCグレード（和光純薬工業、3L、16700円）のアセトニトリルでなくとも特級グレード（和光純薬工業、3L、7700円）で十分に利用可能であった。しかし、異なるメーカー（Sigma-Aldrich）のアセトニトリルでは、ピークのテーリングが起こるなど分離が不十分になる現象が見られた。メーカーごとに異なる不純物の影響であると考えられ、使用するアセトニトリルには注意する必要があることが確認された。最後にこれまで高い脱気性能を持つ脱ガス装置を使用していたため、その影響に気づかなかったが、溶離液、Ru錯体溶液の脱ガスが不十分だと感度が大きく低下することを確認した。化学発光反応に溶存酸素が影響していると考えられる。よって、高感度測定には高い脱気性能を持つ脱ガス装置の導入が不可欠である。

## 5 ）開発法の生体試料への適用について

表層土壌（リター層）は、落葉であり生体試料と言え、また土壌・底質中で生成したメチル水銀が、植物や生体などへ移行していく研究を進めていくうえでも開発法を生体試料に適用できるようにしておく必要がある。そこで開発法の生体試料への適用を検討した。

開発法を魚や貝などの生体試料にそのまま適用したところ、トルエン抽出時にトルエン相の固化や、逆抽出溶液の白濁が確認された。EDTA逆抽出液が白濁した試料は、そのまま測定に使用するとクロマトグラムに多数のピーク（マスキング剤として加えた$\mathrm{Cu^{2+}}$、$\mathrm{Pd^{2+}}$がEDTA逆抽出溶液に混入したためと考えられる）が確認され、メチル水銀のピークがでないなどのトラブルが頻発した。そこで開発法を生体試料測定に安定的に利用するための検討を進めた。土壌・底質と異なり、メチル水銀の認証値を持つ生体試料の認証標準物質は多数あり、魚類等は$\mathrm{mg/kg}$レベルの高濃度のメチル水銀を含むため、メチル水銀溶出後の溶出溶液を適宜希釈することで、白濁等の問題なく測定が可能であることが確認された。しかし、この手法では土壌・底質と同レベルの生体を測定することは不可能である。そこで土壌・底質に含まれるメチル水銀濃度と同レベルのメチル水銀濃度を有する二枚貝の認証標準物質（NIST2974a、NIST2976）を用い検討を進めた。結果として、トルエン抽出前にヘキサン抽出（溶出液にヘキサン10 mLを加え、10分間振とう後3000rpmで5分間遠心分離し、水相を一定量（16 mL）分取）を行い、その後トルエン抽出を行うことで逆抽出溶液が白濁せず測定できることが確認できた（図(1)-9）。この結果、開発法にヘキサン抽出操作を加えることで$\mu\mathrm{g}/\mathrm{kg}$レベルのメチル水銀濃度を持つ生体試料でも測定が可能となった。
図(1)-10 ヘキサン抽出処理の有無によるEDTA逆抽出溶液の状態（上層：トルエン相、下層：EDTA水溶液相）

## 6 ）既存分析法とのクロスチェック

異なる原理・手順を有する分析法で同一試料を測定し測定値を比較することにより、測定値の信頼性を確保できると同時に、それぞれの分析法の手順の効果を検証し、改良を進めていくための情報を得ることができる。そこで世界的に最も利用されているメチル水銀測定法であるエチレーション法（エチレーション－GC-AFS、Metropolitan Council） $ ^{(8)} $ 、日本の水銀分析マニュアルに記載されている水銀分析マニュアル法（ジチゾン抽出－GC-ECD法、国立水俣病総合研究センター） $ ^{(9)} $ とクロスチェックを実施した。

採取保存してきた試料から化学組成が特徴的なもの72種を選び、開発法とエチレーション法の測定値比較を進めた。結果を図(1)-11に示す。大部分の試料で測定値はよく一致した。しかし、一部の試料でエチレーション法に比べ開発法での測定値が低い試料やその逆の試料が確認された。そこでまず開発法で測定値が低い試料について、試料の化学組成から原因究明を進めた。

図(1)-11 開発法とエチレーション法との測定値比較（72試料）
結果として図(1)-12(A)のように試料中の硫黄濃度が高い試料ほど、測定値比（開発法での測定値/エチレーション法での測定値、%）が低いことが確認された。開発法は、メチル水銀と塩化物イオンの弱い錯形成を利用してトルエン相にメチル水銀を移し、そこから比較的強い錯体を形成するEDTAにより水相に逆抽出し、最終的に水銀と強く結合する硫黄部位を有するEmetineCS_{2}配位子により錯体化して測定する。最初の抽出段階で弱い配位子である塩化物イオンを使うため、配位性の夾雑物をマスキングする目的で5 mM Pd^{2+}と0.1 M Cu^{2+}を含む5 M塩酸を溶出液として利用している。よって、水銀と強く結合する硫黄成分の多い試料ではマスキング効果が不足し、メチル水銀が塩化物として抽出できていないと考え、Hg^{2+}をマスキング剤として添加することとした。結果として、溶出液（5 mM Pd^{2+}, 0.1 M Cu^{2+}を含む5 M塩酸）にさらに0.05 mM (10 mg/L)となるようHg^{2+}加えることで、表(1)-1のように硫黄濃度が非常に高い海底質においても添加回収率が80%以上になり、またエチレーション法で得られた測定結果と近い値が得られた（図(1)-12(B)）。これらの結果、開発法は高い硫黄濃度を持つ試料にも対応できる分析法になったと言える。

図(1)-12 硫黄による妨害確認と $ Hg^{2+} $ 添加効果

表(1)-1 高濃度硫黄を含む試料の添加回収実験

試料No	試料名	硫黄濃度(%)	メチル水銀濃度(μg/kg)	s.d. (n=2)	添加回收率(%)
120	河川底質	3.4	0.23	0.04	82
158	海底質(海底熱水噴気地帯)	3.6	0.62	0.03	81
160	海底質(海底熱水噴気地帯)	4.0	0.55	0.03	95
168	海底質(海底熱水噴気地帯)	20.5	5.03	0.20	100
169	海底質(海底熱水噴気地帯)	25.7	3.06	0.11	87
各測定試料1g使用, メチル水銀スパイク量1ng

次に開発法に比べエチレーション法で測定値が極度に低い試料(n=4)について検討を進めた。これらの試料はいずれも同一の河川で採取した試料であったため、可能性として考えられるのは、これらの試料がエチレーション法では測定不能な試料組成を有しているか、開発法でメチル水銀ではない物質をメチル水銀として誤認しているかのどちらかである。そこで、この試料（No.82）を