Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
の生態学的地位（niche）を有しながらも、その由来はB. lusitaniaeとは全く異なることが明らかになった。爬虫類ボレリアを加えた系統解析では、①爬虫類ボレリアと回帰熱ボレリアは祖先を共通にするボレリアであること、また②マダニの18SrRNA遺伝子配列をもとにした系統解析と比較し、これら爬虫類ボレリアが存在することで既存のボレリアとマダニの共進化モデルに不整合性が生じると考えられた。本研究でみいだされた爬虫類ボレリアの発見（2008年度）、ならびに2009年度研究で明らかとなった、マダニ体内でのREP Borreliaのマダニ体内動態解析から、共進化モデルの不整合性は回帰熱ボレリアの祖先が遺伝子水平伝播などにより何らかの外来性因子を獲得した結果、vector-switchingを起こしてvector域を広げてきた可能性により説明が可能であると考えられた。このことは、節足動物媒介性感染症の伝播システムを理解する上で極めて重要な発見であり、またボレリアの分布拡大戦略として、vector-switchingが有効であったことを示唆している（図11）。

図11. 本研究から示されたボレリアの進化とvector switching（概略図）。LD Borreliaはライム病ボレリア、REP Borreliaは爬虫類ボレリア、hTBRF BorreliaはBorrelia miyamotoi等の回帰熱群ボレリアの一部で硬ダニによって媒介される一群、RF Borreliaは回帰熱ボレリアを示す。）

## (6) REP Borreliaの特異的検出系の確立

16SrRNA遺伝子－23SrRNA遺伝子間の遺伝子構成の解析をもとに、2009年度にはREP Borrelia 特異的遺伝子であるglvCを標的としたPCR法を新たに開発し、その感度、特異性を調べた。その結果、本PCRはREP Borreliaでは100%の感度を示すこと、またライム病ボレリア3株、回帰熱ボレリア2株では増幅産物が見られないことから、その特異性は極めて高いことが示された(Takano et al. manuscript in preparation)。

## （7） 爬虫類から見出されるボレリアのゲノム解析

Borrelia turica基準株であるIST7株は954,496 bp、GC含量29.6%、推定orf数は884であった(表4)。
またゲノム全体を1kb毎に区切りそれぞれの領域での他種ボレリアゲノムとの相同性を示した(図12)。

表4. 本研究で決定されたB. turcicaゲノム（chromosomal DNA）

B. turcica	B. duttonii	B. reccurentis	B. burgdorferi	B. garinii	B. afzelii
Chromosome size (bp)	954, 496	931, 674	930, 981	910, 725	904, 246	905, 394
Chromosome GC %	29.6	27.6	27.5	28.6	28.3	28.3
Chromosome ORF number	884	820 (2)	800 (20)	851 (7)	832 (8)	856 (6)
Ribosomal RNAs	3	3	3	6	5	5
Transfer RNAs	34	32	32	18	31	33

図12. B. turcica IST7株と B. duttonii Ly株（上段）および B. burgdorferi B31株（下段）とのゲノム全体における相同性

これらorfはlipoPプログラムによりその局在が推定され、特にマダニや宿主動物体内での生存に深く関与すると考えられるシグナルペプチダーゼ切断部位が存在すると推定されたorfは82、膜貫通ドメインを有するタンパク質は113と推定された。このうちB. turcicalに特異的orfは44であり、シグナルペプチダーゼ-I切断部位が存在すると推定されたorfは2、膜貫通ドメインを有することが推定されたorfは5、細胞質に存在するタンパク質をコードすると推定されたorfは37であった（表5）。-112-このうち18orfは多属細菌に類似配列が見出される一方、細菌には見出されないorfも16存在した。これらはウイルス等に由来する可能性が考えられた。またB. turcicalとの比較ゲノム解析により、節足動物へ全身感染する回帰熱群ボレリアに特異的であるorfが4見出された。これらorfの内、BDU_0357はLipoPアルゴリズムにより膜タンパク質であることが推定された。本orfの機能は未知であるが、回帰熱群ボレリアに特異的であることから、この遺伝子が上記形質付与に関与している可能性が考えられた。

表5. LipoP 1.0解析によるタンパク質の局在推定（2011年3月31日現在）
全orf	B. turcica特異的orf
Cytoplasmic	689	37
SPaseI-cleaved proteins	51	2
Lipoproteins (SPaseII-cleaved proteins)	31	0
Transmembrane proteins	113	5
Total	884	44

（８）リケッチア、エーリキア、アナプラズマ等ダニ媒介性細菌の検出

試験に供した76検体中33検体からリケッチア遺伝子がまた6検体からエーリキア遺伝子が検出された（表6）。各種リケッチア遺伝子（ompA, gltA）についても系統解析を行うことにより様々なリケッチア種をこれらのダニ類が保有していることが示された。結果の1例を図13に示した。特にアフリカより輸入されたリクガメ寄生のAmblyomma sparsum等からヒト病原性リケッチアであるR. africae近縁種が見出された。またエーリキア属細菌のgroEL遺伝子配列に基づく系統解析から、本研究で見出されたエーリキア属細菌はヒト病原体であるEhrlichia chaffeensisである可能性が強く示唆された（図14）。

表6. 本研究で見出された輸入爬虫類寄生マダニにおけるリケッチア、エーリキア細菌保菌率

Country	Host species	Tick species	Rickettsia	Ehrlichia
Africa
Republic of Ghana	Python regius	Amblyomma latum	0/4	0/4
Amblyomma transversale	15/17	0/17
Republic of Madagascar	Phelsuma dubia	Amblyomma latum	1/1	0/1
Republic of the Sudan	Geochelone pardalis babcocki	Amblyomma sparsum	0/2	0/2
Republic of Togo	Python regius	Amblyomma latum	0/3	0/3
Republic of Zambia	Geochelone pardalis babcocki	Amblyomma sparsum	7/17	4/17
South America
Republic of Suriname	Iguana iguana	Amblyomma dissimile	0/3	0/3
Central Asia
Republic of Uzbekistan	Testudo horsfieldii	Hyalomma aegyptium	1/1	0/1
Russian Federation	Testudo horsfieldii	Hyalomma aegyptium	0/2	0/2
Near and Middle East
Hashemite Kingdom of Jordan	Testudo graeca	Hyalomma aegyptium	1/11	2/11
South Asia
Democratic Socialist Republic of Sri Lanka	Boiga forsteni	Amblyomma trimaculatum	8/15	0/15
Total	33/76	6/76
(43.4%)	(7.9%)
図13. 本研究で見出されたリケッチア属細菌の gltA 遺伝子配列に基づく系統解析

図14. 本研究で見出されたエーリキア属細菌の $ groEL $ 遺伝子配列に基づく系統解析

（9）クリミア・コンゴ出血熱ウイルスおよびフラビウイルスの検出系作成と輸入検体からのウイルスゲノム検出

フラビウイルスNS5遺伝子保存領域を増幅するプライマー(FVX7fおよびFVX12r)を用い、その感度および検出限界を調べた。フラビウイルス10種15株を用いた範囲では、感度は100％であり、かつ検出限界は5PFUであった。この方法を用い輸入爬虫類寄生性マダニからのウイルスゲノム検出を
試みたがいずれも検出限界以下であった。また同様にクリミア・コンゴ出血熱ウイルスゲノム検出も検出限界以下であった。

## （１０）輸入爬虫類より見出されたトリパノソーマ原虫（図15）

18S rDNAの後半1,445塩基配列を、データバンクに登録されるT. varani (AJ005279、AJ223572)と比較すると、4塩基を除いて一致し、99.7%の相同性であった。gGAPDHの900塩基配列については、T. varani (AJ620261)と2塩基を除いて一致し98.7%の相同性であった。今回のヘビ感染例について、宿主血液中のトリパノソーマの形態学的観察は実施できていないが、18S rDNAおよびgGAPDHの高い相同性から、T. varaniの感染が強く示唆された。ガーナ産クロクビコブラ (Naja nigricollis)からT. voltariae Macfie, 1919の記載もあり、爬虫類寄生種の異同性について遺伝学的な再確認が望まれる。

A

B

図15．本研究で輸入爬虫類より検出されたトリパノソーマ属原虫（共同研究者佐藤宏博士のご厚意による）。

財務省統計によれば、輸入爬虫類数は年間30万頭以上であり、ボレリアをはじめいくつかの病
原体の侵入が危惧される。本研究では、佐藤、宇根らと共同で、ガーナより輸入されたヘビの一種、ボールパイソン全血よりトリパノソーマ原虫を見いだした。これは、ヘビ全血が混入したボレリア培地で生育が見られたが、ボレリア培地単独では、原虫の増殖は見られなかった。分離されたトリパノソーマは、18S rDNA、gGAPDH遺伝子の塩基配列、形態同定から、Trypanosoma varani Wenyon、1908であると考えられた。本トリパノソーマ国内侵入が確認されたのは、おそらく初めてのことであるが、国内生態系への浸潤、定着、また病原性などについては今後の検討課題であると考えられる。また研究参画者の安藤は、Rickettsia、Ehrlichia、Anaplasma属細菌のDNA検出法を確立させるとともに、本試験に供したマダニからリケッチアの一種Rickettsia africaeに近縁のリケッチアDNAを検出している(Ando S et al. manuscript in preparation)。R. africaeはAfrican poxの起因菌であることから、今後、人体へのリスク評価などを進める必要がある。さらには新たな環境下、vector-switchingにより媒介動物種が変化することで、吸血動物への未知のダメージが生じる可能性（固有の生態系中の貴重な生物資源が失われてしまう可能性など）もあり得ることから、本研究による輸入爬虫類に関するモニタリングを継続することで、公衆衛生学的、生態学的リスク評価を進める一方で、このvector-switchingのメカニズム解明を進める必要があると考えられた。

## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

輸入爬虫類および寄生マダニから新型ボレリアが発見され、REP Borreliaとして世界に初めて提唱した。寄生マダニ体内のボレリア動態を詳細に分析した結果、本ボレリアがマダニの吸血時にマダニ唾液腺へ移行することから、その伝播動態はライム病ボレリアと同様であることが明らかとなった。さらにボレリアと宿主マダニ類のDNA系統解析を行った結果、ボレリアの進化過程において、回帰熱ボレリアがvector-switchingにより新たな媒介宿主に適応したことが示された。これは既存のvector-competenceの破綻がおこることで、節足動物媒介性感染症が突如として、あらたな地域で定着、流行する可能性を示唆しており、科学的にそのメカニズムを解明することは公衆衛生上、予防医学上、また生態学的も極めて重要な意義が有ると思われた。

## （２）地球環境政策への貢献

現在法的措置が一切ない輸入爬虫類の病原体モニタリングの重要性を提起した。国としての病原体侵入防御システムである検疫体制の必要性を示すとともに、輸入規制に関する科学的エビデンスを提供した。また、検疫のための特異的検出システムも開発した。

## 6 ．引用文献

1) Anderson BE, & Tzianabos T (1989). Comparative sequence analysis of a genus-common rickettsial antigen gene. J Bacteriol 171: 5199-5201.

2) Ando, S. et al. Manuscript in preparation.

3) Burridge MJ, Simmons LA, Peter TF, & Mahan SM (2002). Increasing risks of introduction of heartwater onto the American mainland associated with animal movements. Ann NY Acad
Sci 969: 269–274.

4) Fisher MA, Grimm D, Henion AK, Elias AF, Stewart PE, & Rosa PA, Gherardini FC (2005). Borrelia burgdorferi sigma54 is required for mammalian infection and vector transmission but not for tick colonization. Proc Natl Acad Sci U S A 102: 5162-5167.

5) Inayoshi M, Naitou H, Kawamori F, Masuzawa T, & Ohashi N (2004). Characterization of Ehrlichia species from Ixodes ovatus ticks at the foot of Mt. Fuji, Japan. Microbiol Immunol 48:737-745.

6) Kim HY, Mott J, Zhi N, Tajima T, & Rikihisa Y (2002). Cytokine gene expression by peripheral blood leukocytes in horses experimentally infected with Anaplasma phagocytophila. Clin Diagn Lab Immunol 9:1079-1084.

7) Mediannikov OY, Sidelnikov Y, Ivanov L, Mokretsova E, Fournier PE, Tarasevich I, & Raoult D (2004). Acute tick-borne rickettsiosis caused by Rickettsia heilongjiangensis in Russian Far East. Emerg Infect Dis. 10: 810-817.

8) Noda H, Munderloh UG, & Kurtti TJ (1997). Endosymbionts of ticks and their relationship to Wolbachia spp. and tick-borne pathogens of humans and animals. Appl Environ Microbiol. 63: 3926-3932.

9) Pei Y, Terajima J, Saito Y, Suzuki R, Takai N, Izumiya H, Morita-Ishihara T, Ohnishi M, Miura M, Iyoda S, Mitobe J, Wang B, & Watanabe H (2008). Molecular characterization of enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 isolates dispersed across Japan by pulsed-field gel electrophoresis and multiple-locus variable-number tandem repeat analysis. Jpn J Infect Dis 61: 58-64.

10) Sato Y, Konishi T, Hashimoto Y, Takahashi H, Nakaya K, Fukunaga M, & Nakao M (1997). Rapid diagnosis of lyme disease: Flagellin gene-based nested polymerase chain reaction for identification of causative Borrelia species. Int J Infect Dis 2: 64-73.

11) Schwan TG, Raffel SJ, Schrumpf ME, Policastro PF, Rawlings JA, Lane RS, Breitschwerdt EB, & Porcella SF (2005). Phylogenetic analysis of the spirochetes Borrelia parkeri and Borrelia turicatae and the potential for tick-borne relapsing fever in Florida. J Clin Microbiol 43: 3851-3859.

12) Takano, A. et al. Manuscript in preparation.

13) Ushijima Y, Oliver JH Jr, Keirans JE, Tsurumi M, Kawabata H, Watanabe H, & Fukunaga M. (2003) Mitochondrial sequence variation in Carios capensis (Neumann), a parasite of seabirds, collected on Torishima Island in Japan. J Parasitol 89: 196-198.

7．国際共同研究等の状況

特に記載すべき事項はない。

8．研究成果の発表状況

（1）誌上発表

<論文（査読あり）>
1) Sato H, Takano A, Kawabata H, Une Y, Watanabe H, & Mukhtar MM (2009). Trypanosoma cf. varani in an imported ball pythone (Python regnus) from Ghana. Journal of Parasitology 95:1029-1033. (PMID: 20050011, DOI: 10.1645/GE-1816.1)

2) Takano A, Muto M, Sakata A, Ogasawara Y, Ando S, Hanaoka N, Tsurumi M, Sato F, Nakamura N, Fujita H, Watanabe H, & Kawabata H (2009). Relapsing fever spirochete in seabird tick, Japan. Emerging Infectious Diseases 15: 1528-1530.

3) Takano A, Goka K, Une Y, Shimada Y, Fujita H, Shino T, Watanabe H, & Kawabata H (2010). Isolation and characterization of a novel Borrelia group of tick-borne borreliae from imported reptiles and their associated ticks. Environmental Microbiology 12: 134-146.

## くその他誌上発表（査読なし）>

1) 川端寛樹（2008） ボレリア・ブルク ドルフェリ 抗体. Medical Technology 別冊 「新・臨床検査項辞典」 医歯薬出版. pp664-665.

2) 川端寛樹（2009） ボレリア感染症．今日の治療指針．医学書院．pp142-143.

3) 高野 愛，渡邊治雄，川端寛樹（2009）生活と環境．地球温暖化とダニ媒介性感染症．日本環境衛生センター．54(4)，22-27.

## （2） 口頭発表（学会）

1) Kawabata H, Takano A, Watanabe H. : 4th International Infection Control Conference of Theodore Bilharz Research Institute (2008) “Lyme disease and other tick-borne infectious diseases.”

2) Takano A, Kawabata H, Watanabe H, Shino T, Goka K, Une Y, Fujita H. : International Symposium on Mite & Whitefly (2008) “The reptile associated ticks and Borrelia from imported Reptiles.”

3) 川端寛樹，高野愛，渡邊治雄：第63回日本衛生動物学会西日本支部大会（教育講演）（2008）「実験室内に病原体の姿を探る」

4) 安藤秀二，坂田明子，宇根有美，五箇公一，藤田博己，花岡希，高野愛，川端寛樹，岸本寿男．輸入爬虫類が病原体を持ち込むリスクに関する考察．（2008）第26回日本クラミジア研究会・第15回リケッチア研究会合同学術集会．2008年11月．岐阜．

5)高野 愛，川端寛樹，渡邊治雄，藤田博己，椎野貞一郎，五箇公一，宇根有美：第53回日本応用動物昆虫学会大会（2009）「爬虫類から見出された新規ボレリア：ボレリア-媒介節足動物間のcoevolutionに関する新見解」

6) 高野 愛，藤田博己，角坂照貴，今内覚，田島朋子，武藤麻紀，小笠原由美子，川端寛樹，渡邊治雄：第148回日本獣医学会学術集会（2009）「国内産爬虫類寄生性マダニから見いだされたボレリアとそのマダニ体内での動態」

7)高野 愛，藤田博己，角坂照貴，今内覚，田島朋子，五箇公一，宇根有美，川端寛樹，渡邊治雄：第149回日本獣医学会学術集会（2010）「爬虫類および爬虫類寄生マダニより発見された新群のボレリアとその性状解析」

8) 高野 愛，川端寛樹，武藤麻紀，藤田博己，渡邊治雄：第 83 回日本細菌学会総会（2010）「国
内産爬虫類寄生性マダニから見いだされたボレリアとそのマダニ体内での動態」

9) 高野 愛，川端寛樹，藤田博己，角坂照貴，今内覚，田島朋子，渡邊治雄，大西真：第56回日本衛生動物学会北日本支部大会（2010）「ボレリア属細菌のマダニ体内動態と進化に関する研究」

10) Takano A, Goka K, Une Y, Fujita H, Shiino T, Watanabe H, Ohnishi M, Kawabata H.: 12th International Conference on Lyme borreliosis and other tick-borne diseases (2010) "Isolation and characterization of a novel Borrelia group of tick-borne borreliae from imported reptiles and their associated ticks."

11)高野 愛，関塚剛史，黒田誠，大西真，川端寛樹：第63回日本衛生動物学会大会（2011）「マダニ媒介性の新型ボレリア Borrelia turcica の比較ゲノム解析」

（3）出願特許

特に記載すべき事項はない。

（４）シンポジウム、セミナーの開催（主催のもの）

特に記載すべき事項はない。

（５）マスコミ等への公表・報道等

特に記載すべき事項はない。

（6）その他

特に記載すべき事項はない。
平成 25 年度

# 環境研究総合推進費補助金 研究事業 総合研究報告書

# エタノール発酵糸状菌を活用した製紙廃棄物からの 効率的バイオエタノール製造法の開発 (3K122017)

平成 26 年 3 月

国立大学法人 富山大学 星野一宏
補助事業名 環境研究総合推進費補助金研究事業（平成24年度～平成25年度）

所管 ___ 環境省

国庫補助金 32,776,000 円（複数年度の総計）

研究課題名 エタノール発酵糸状菌を活用した製紙廃棄物からのバイオエタノール製造法の開発

研究期間 平成24年6月8日～平成25年3月31日

研究代表者名 星野 一宏（国立大学法人 富山大学）

研究分担者 高野 真希（国立大学法人 富山大学）
## 目次

総合研究報告書概要 …… 1

本文

1．研究背景と目的 …… 10
1.1 研究背景 …… 10
1.2 未利用バイオマス資材によるエタノール発酵研究の現状と課題 …… 12
1.3 研究の目的 …… 16
2．研究方法 …… 21
2.1 実験材料 …… 21
2.2 ペーパースラッジの前処理 …… 25
2.3 ペーパースラッジの成分評価 …… 28
2.4 セルラーゼを用いたペーパースラッジの加水分解 …… 30
2.5 エタノール発酵糸状菌のスクリーニング …… 32
2.6 同時糖化発酵プロセスによるペーパースラッジからのエタノール生産 …… 32
2.7 培養液中のセルラーゼ活性 …… 34
3．結果と考察 …… 35
3.1 ペーパースラッジの成分分析 …… 35
3.2 ペーパースラッジの前処理法の確立 …… 40
3.3 ペーパースラッジの加水分解の最適化 …… 46
3.4 エタノール発酵糸状菌の検索および同時糖化発酵プロセス …… 56
4．結論 …… 70
5．参考文献 …… 73
6．研究発表 …… 79
論文発表

学会等発表

7．知的財産権の取得状況 …… 82
研究概要図 …… 83
英文概要 …… 84
環境研究総合推進費補助金 研究事業 総合研究報告書概要

研究課題名：エタノール発酵糸状菌を活用した製紙廃棄物からの効率的

バイエタノール製造法の開発

番号 : 3K122017

国庫補助金清算所要額：32,776,000 円（複数年度の総計）

研究期間：平成24年6月8日～平成26年3月31日

研究代表者名：___ 星野 一宏（国立大学法人 富山大学）

研究分担者：___ 高野 真希（国立大学法人 富山大学）

## 目的

日本国内において、製紙製造工程で年間550万トンのペーパースラッジ(Paper

Sludge, 以下 PS と略称する）が発生している。その大半は中間処理として焼却

より処理されており、これが CO₂ 発生の源となっている。この削減を目指しつ

つ PS からバイオエタノールの生産を達成させるために、PS の前処理法を確立

するとともに、PS に対して耐性を有する新規なエタノール発酵糸状菌と PS 中

の繊維質を効率よく加水分解できるように最適化した酵素カクテル剤と組み合
わせた同時糖化発酵プロセス（Simultaneous Saccharification Fermentation, 以下 SSF プロセスと略称する）を確立し、1 トンの湿潤最終 PS から 50 kg のエタノールを生産させること（エタノール濃度 10 - 30 g/L の生産）を目標とする。

## 研究方法

本研究に使用した PS は、主に富山県高岡市の中越パルプ工業（株）能町事業所と二塚事業所の廃水処理装置から排出され、燃焼処理を行う前の PS（以下、最終 PS と略称する）と、能町事業所の抄紙機より排出された PS 残渣（以下、抄紙テールと略称する）を主に使用した。また、各 PS の加水分解には、安価で入手が容易な 14 種類の市販セルラーゼ剤を使用した。さらに、最終 PS が微生物の生育にとって過酷な状態であることから、最終 PS 中で生育が可能で、かつ効率的なエタノール生産を達成できるエタノール発酵糸状菌を、本研究室で保存している接合菌 Mucor 属およびその近縁種ライブラリー84 株からスクリーニングした。

さらに、高温耐性変異株は、選択したエタノール発酵糸状菌の分生子に対してカーボンイオンビームを照射し、40℃で生育する菌株を得た。両 PS の成分分析は、水分含量、カルソンーリグニン、酸可溶性ーリグニン、繊維成分（セルロースおよびヘミセルロース）、灰分含量をセルロース系バイオマスの成分分析法 $ ^{1)} $ に準じて求めた。また、無機成分の分析は、灰中の無機成分は蛍光 X 線分析（スペクトリス、PW2404）により行った。

最終 PS の前処理は、水洗浄法、酸処理法、アルカリ法、アルカリ－酸処理法により実施した。これら処理 PS の加水分解は、各種セルラーゼ剤を用いて、pH 5.5 に調整した反応液 $ \left(\mathrm{(NH_4)_2SO_4}\quad7.5\ \mathrm{g/L},\quad\mathrm{KH_2PO_4}\quad3.5\ \mathrm{g/L},\quad\mathrm{CaCl_2}\cdot2\mathrm{H_2O}\right. $ 1.0 g/L、 $ MgSO_4\cdot7H_2O $ 0.75 g/L、Yeast extract 5.0 g/L）中で行った。基質濃
度は 50 - 100 g-dry/L とし、反応体積は 25 mL、28℃のインキュベーター（高崎科学器機、TB-C-50RS）内で 120 rpm の振盪反応により実施した。さらに、PS を効率良く加水分解させるためにセルラーゼ剤の配合比の最適は、14 種類の市販の酵素剤を用いて試料である最終 PS を加水分解させ、生成した発酵糖より、加水分解活性を求める。加水分解の結果が望ましい酵素剤を 3 種類選択した後、実験計画法（DOE）を用いて応答曲面法（RSM） $ ^{2)} $ を実施し、配合比の最適化を実施した。さらに、SSF プロセスによる PS からのエタノール生産は、100 mL の培養瓶（培養体積 25 mL）に、各種処理 PS 濃度が 50 - 100 g-dry/L となるよう入れ、さらに、最適化した酵素カクテル剤とエタノール発酵糸状菌を植菌することにより行った。培養は、28℃、120 rpm の振盪条件で 96-144 時間行った。、酵素による加水分解反応およびエタノール発酵における培地中のエタノールおよび糖質濃度は液体クロマトグラフィー（島津製作所、LC-10 System）を用いて分析した。

## 結果と考察

PS らエタノールを効率良く製造するためには、その成分を詳細に分析することが必要である。そこで、中越パルプ工業（株）の2事業所より排出された最終PSと抄紙テールについて成分分析を実施した。初めに、最終生成物がエタノールであることから、PS中の繊維質（セルロースおよびヘミセルロース）の含量を中心に分析に行った。最終PSの繊維質含量は乾燥物基準で14-18％がセルロース、7-10％がヘミセルロースであり、抄紙テール中の繊維質含量は約47-48％がセルロース、約17-18％がヘミセルロースであったことから、いずれもエタノールを生産させるためのバイオマス源として有望な資源であることがわかった。さらに、最終PSからエタノールを生産する際、酵素反応への阻害や発酵
阻害を引き起こすと考えられる無機成分（炭酸カルシウムなど）と繊維質以外の有機成分（界面活性剤、脱墨剤など）を除去する方法として、アルカリ－酸処理法を開発した。本処理により、最終PS中の無機成分を未処理の状態から約52%にまで除去することができ、特に、カルシウム含量は未処理の場合の約30%から3%にまで減少させることができた。

次に、PS からエタノールへの発酵プロセスは、PS 中に含まれる繊維質からグルコースおよびキシロースなどの発酵糖を生成する糖化段階と、生成した発酵糖を発酵微生物によりエタノールへ変換する発酵段階の組合せにより進行する。この逐次反応において、前者の糖化段階が律速であり、この反応性の向上が生成エタノール量を左右する。すなわち、この加水分解を効率化し、使用酵素量を削減させることが実用化へ一つの鍵となっている。そこで、市販のセルラーゼ剤を組み合わせた酵素カクテル剤の最適化を試みた。各種前処理を行ったPS に対して14種類の市販セルラーゼ剤を用いて加水分解を行い、生成した還元糖より最適と考えられる酵素剤を3種類選択した。次に、PS 加水分解において選択した3種類の酵素剤の配合条件をDOEを用いて決定し、この実験計画に従い加水分解反応を行い生成した発酵糖量を求めた。生成発酵糖量の結果を元にRSM³を実施し、酵素配合比に対して得ることが可能な発酵糖量を予測した。その結果、抄紙テールの場合、Cellulase T:Cellulase Onozuka 3S:Accelleraseの混合比を、0.310:0.348:0.342とした加水分解において、最大の発酵糖が生産できると予測できた。さらに、アルカリ－酸処理最終PSの場合、Accellerase:Pectinase:Meicelaseの混合比が、1.907:0.710:0.384とした加水分解反応において、生成発酵糖量を最大にすることができると予測できた。

そこで、最適化した酵素カクテル剤を用いて、80 g-dry/L の抄紙テールに対して 120 時間の加水分解反応を行った結果、グルコースは 41.4 g/L、キシロースは
3.3 g/L、セルトリオースは 2.8 g/L、セロビオース 6.7 g/L と利用可能な可溶糖として合計 54.1 g/L 生成させることができた。同様に、最適な酵素カクテル剤を用いて 50 g/L の最終 PS を用いて加水分解反応を行った結果、反応 96 時間目にグルコース 12.3 g/L、1.2 g/L キシロース、1.0 g/L セロビオースと利用可能な可溶糖を合計 14.5 g/L 生成させることができた。

次に、最適な PS からエタノールを生産させるために、本研究室の接合菌 Mucor ライブラリーから PS に対してエタノール発酵に優れた菌株のスクリーニングを実施した。その結果、Mucor circinelloides NBRC 4563 株を見出した。そこで、使払紙テールおよびアルカリ－酸処理最終 PS に対して最適化した酵素カクテル剤と本菌株を組み合わせた SSF プロセスにより、それぞれの培養 96 時間で 21.3 g/L および 30.2 g/L のエタノールを得ることができた。このアルカリ－酸処理 PS を基質とした SSF プロセスにより、湿潤最終 PS 1 トン（処理 PS 257.6 kg）から 54.9 kg のエタノールが生産できることが示された。さらに、本研究開発で見出したエタノール発酵糸状菌 M.circinelloides NBRC 4563 の機能向上を図り、エタノールの生産性を向上させるために、イオンビーム変異 $ ^{4)} $ を実施し 40℃でエタノール発酵が可能な耐熱性エタノール発酵株の取得に成功した。本菌株を用いて 100 g-dry/L の抄紙テールの SSF プロセスを行った結果、培養 96 時間で 32.5 g/L のエタノールを生産できることができた。さらに、100 g-dry/L のアルカリ－酸処理最終 PS の SSF プロセスにより、培養 96 時間で 32.5 g/L のエタノールを生産することができた。

## 環境政策への貢献

近年、地球温暖化対策、原油の高騰化、電力供給の安定化等の国家的問題を解決するための一つの方策として、未利用再生可能バイオマス資源を開拓し、
その利用法を開発することが急務となっている。特に、我が国のような貧資源国では、新規エネルギーの開発は国家的な課題である。地球環境の保全と資源循環型社会の実現のためには、食品廃棄物、家畜排せつ物、廃木材、工業廃棄物などの再生産可能でカーボンニュートラルのバイオマス廃棄物の有効利用が不可欠である。特に、平成18年3月に閣議決定された「バイオマス・ニッポン総合戦略」や平成17年4月に閣議決定された「京都議定書目標達成計画、また、平成21年6月に成立した「バイオマス活用推進基本法」に基づき、未利用バイオマスのエネルギー化、化学原料化、発酵原料などへ活用するための技術開発が大いに注目されている。この中で、日本国内において、紙を製造する過程で年間550万トンのPSと呼ばれる製紙汚泥が発生する。このPSの処理は、多大なエネルギーの消費と共に、多量の炭酸ガス、発生、悪臭の発生、排水の悪化など、環境を多大に害していることが古くより指摘されてきた。また、その改善方法の確立もまた国家的な問題である。本研究課題は、産業廃棄物であるPSを未利用バイオマス資源として活用し、次世代型の発酵技術であるSSFプロセスへ適応させることにより、備蓄可能なエネルギーを生産させると共に、産業廃棄物の削減と化石燃料の使用量の抑制を実現せしめようとする新規な取り組みであり、環境政策への貢献は大きい。本研究の根幹となる技術は、従来の発酵微生物では成し遂げられなかった多種多様なバイオマスの成分であるアミロース、セルロース、ヘミセルロース、キチンなど多糖類を構成する糖質を発酵できるエタノール発酵糸状菌によるSSFプロセスであり、オンリーワンの技術である。この菌株の耐熱発酵、セルラーゼ高分泌などさらに高機能化を図ることで、PSのみならず農産廃棄物、生活廃棄物、工業廃棄物などに対して有効かつ簡便に利用でき、最終的に多種多様な原料からバイオエタノールを生産できる環境改善型システムの構築できると期待される。本研究開発は、これら
複合的な環境問題を解決する方策を提案しており、「国家規模」で開発すべきである。

## 研究成果の実現可能性

我が国における草本系及び木質系バイオマスからのエタノール生産は、経済産業省を中心に2020－2030年を目指し開発が進んでいる。本研究は、ソフトバイオマスと同等あるいはそれ以上の資源 $ ^{5,6)} $ であるPSを使用している点で、実用化は可能と考えられる。現在、本研究開発で開発したPSの前処理法（アルカリ－酸処理法）を適応し、さらに、高温発酵糸状菌を活用し、PSからバイオエタノールを製造するため、某製紙工場内でベンチスケールの実証試験装置を設置し、実証試験を実施する計画が産学間で進んでいる。現状、唯一の問題点は採算性である。セルラーゼ剤は高価であり、その使用量の削減が必要である。本研究開発では達成できないが、エタノール発酵糸状菌の高度機能化、特に、セルラーゼの飛躍的な分泌株の開発を進めている。このようなエタノール発酵糸状菌が開発できれば、酵素剤を添加しない糖化発酵同時進行（CBP）プロセスを構築でき、PSからのエタノール生産のみならず、リグノセルロースからのエタノールが実用化されるであろう。

## 結論

製紙製造から発生する廃棄物の削減および有効利用を目的として、PSを原料としたバイオエタノール生産技術の開発を検討した。このPSの成分分析を行った結果、優れたバイオマス資源であることが判明した。そこで、最終PSの前処理法としてアルカリ－酸処理法を開発するとともに、本処理PSを効率良く加水分解させるためのDOEを用いた酵素カクテル剤の調製法を確立した。さらに、
最終 PS からエタノールを生産させるための菌株として M.circinelloides NBRC 4563 株を見出した。この菌株と酵素カクテル剤を組み合わせた SSF プロセスにより、50 g/L の処理 PS から培養 96 時間で 21.3 g/L のエタノールを得ることができた。また、本プロセスを 40℃で SSF プロセスができるエタノール発酵変異株を構築し、活用することで処理 PS からのエタノール生産量を 23.5 g/L へ向上できた。

## 參考論文

1) 担子菌を用いた脱リグニン処理法の開発による農産廃棄物の利用法の拡大に関する研究(K1818, K1931)、谷口正之、星野一宏、酒井謙二、平成19年度廃棄物処理等科学研究総合研究報告書, 環境省, p.150 (2008).

2) Simultaneous saccharification and ethanol fermentation of oxalic acid pretreated corncob assessed with response surface methodology, J. W. Lee, R. C. Rodrigues, T. W. Jeffries, Bioresour Technol., 100, 6307-6311 (2009).

3) Optimization of enzymatic hydrolysis of pretreated rice straw and ethanol production., A. Singh, N. R. Bishnoi, Appl. Microbiol. Biotechnol., 93, 1785-93 (2012).

4) A new approach for improving cordycepin productivity in surface liquid culture of Cordyceps militaris using high-energy ion beam irradiation, S. K. Das, M. Masuda, M. Hatashita, A. Sakurai, M. Sakakibara, Lett. Appl. Microbiol., 47, 534-538 (2008).

5) Bioconversion of paper sludge to biofuel by simultaneous saccharification and fermentation using a cellulase of paper sludge origin and thermotolerant Saccharomyces cerevisiae TJ14, J. Prasetyo, K. Naruse, T. Kato, C. Boonchird, S. Harashima, E.Y. Park, Biotechnol. Biofuels., 4, 35-48 (2011).
6) Efficient production of cellulase in the culture of Acremonium cellulolyticus using untreated waste paper sludge, J. Prasetyo, J. Zhu, T. Kato, E. Y. Park, Biotechnol. Prog., 27, 104-110 (2011).

## 知的財産権の取得状況

1) 製紙廃棄物からのエタノール製造方法、星野一宏、高野真希、特願 2013-200843.

2) 糸状菌を用いる木質系バイオマスからのエタノール製造方法、星野一宏、高野真希、特願 2013-202539.

## 研究概要図

Fig. エタノール発酵糸状菌を活用した同時糖化発酵プロセスによる ペーパースラッジからのバイオエタノール生産プロセスのフロー
### 1. 研究背景と目的

### 1.1 研究背景

我が国の紙・パルプ産業は、年間2,774万トンの紙・板紙を製造する巨大製造業である $ ^{1} $ 。また、化学工業、鉄鋼業に続く、我が国製造業の第4位を占めるエネルギー多消費型産業 $ ^{2)} $ でもある(Fig.1)。さらには、同産業は大量の産業廃棄物排出事業でもある。それゆえ、1980年代より廃棄物を原料とするサーマルリサクルを行い化石燃料使用量の削減などの省エネルギー化の努力を進めて来た(Fig.2)。一方、CO $ _{2} $ の大量排出産業でもある紙・パルプ産業は、国内排出量の4.2％に当たる年間2,282万トン-CO $ _{2}^{3)} $ を排出しているが、1997年の京都議定書の温暖化抑策を受けて発生抑制の努力をしている $ ^{4)} $ 。

Fig.1 製造業業種別エネルギー消費

Fig.2 製紙事業所の環境対策 王子ホールディングス HP より

近年、地球温暖化対策、化石燃料の高騰化、さらには、東日本大震災による原子力発電所事故の影響も有り、カーボンニュートラルな未利用バイオマス資源を開拓し、その利用法を構築することが急務となってきた。特に、我が国のような貧資源国では、新規エネルギー資源の開発は国家的な課題である。地球環境の保全と資源循環型社会の実現のためには、食品廃棄物、家畜排せつ物、廃木材などの再生可能でカーボンニュートラルなバイオマス廃棄物の有効利用が不可欠である。さらに最近、これらの廃棄物の適正処理と資源化を促進する
法律 $ ^{5-8)} $ が次々と施行されていることもあり、これらの物質をエネルギー資源、化学原料、発酵原料等として活用するための技術開発が大いに注目されている。

現在、日本国内では、紙を製造する過程で年間550万トンのPSと呼ばれる産業廃棄物、すなわち製紙汚泥が発生している（Fig.3）。製紙事業所では、この産業廃棄物の減容化と

Fig.3 ペーパースラッジ

サーマルリサイクルを目的として主に焼却処理を実施している。しかし、排出される PS が 50%以上の水分を含んでいるため焼却処理時に多大な化石燃料を必要としている。したかって現状では PS の有効な利用方法はほとんど無く、焼却した後、灰の一部をセメント原料として再利用し、残りの大半は埋め立てられている。また、この際に PS の燃焼により発生する二酸化炭素は、わが国の CO₂ 排出の一要因である (Fig.4)。

経済産業省は2005-2009年まで「エネルギー使用合理化ペーパースラッジ有効利用技術開発」プロジェクト $ ^{9)} $ を実施し、その有効利用技術の開発を推進している。現在、PS灰は主にセメント原料 $ ^{10)} $ として再利用されているが、セメントの国内需要減少もあり、PS灰の新規用途の開発が不可欠となっている。そのため土壌改良材製造技術の開発を行うとともに、高温で自燃させ熱エネルギーを回収し、得られたPS焼却灰を板紙の内填材に再利用する技術開発 $ ^{11)} $ 、さらには、ガス化してエネルギー源として活用する技術開発 $ ^{12)} $ が行われきた。すなわち、紙・パルプ産業においては、化石燃料の消費量を削減しCO $ _{2} $ の発生量を削減すること、ならびに産業廃棄物の排出量を削減することが重大な課題となっており、これら問題を早急に解決することが求められている。
Fig.4 製紙事業所におけるペーパースラッジ等廃棄物処理フロー

### 1.2 未利用バイオマス資材によるエタノール発酵研究の現状と課題

近年、原油の高騰化とともに、未利用なバイオマス資源を開拓し、その利用法を開発することが急務となってきた。特に、我が国のような貧資源国では、新規エネルギー資源の開発は国家的な課題である。このような観点から、我が国ではバイオマス・ニッポン $ ^{13)} $ を旗印に官民を挙げてバイオマス資源の開発およびその有効な変換技術の開発が進められている。中でもカーボンニュートラルなエネルギーの利用が高まっている。その一つとして、ガソリンの一部をエタノールに置き換えたバイオ燃料が普及し始めている。そのため世界のエタノール生産量は年々増加し、2010年には200億ガロン $ ^{14)} $ を超えた。エタノールの
主な生産国はブラジルと米国であり、世界の全生産量の8割以上を占める。現在、エタノールの主な原料は豊富な糖質を含むトウモロコシやサトウキビであるため、これらを広大な土地で生産してきた米国やブラジルが必然的にエタノール生産大国となった。しかしながらトウモロコシなどは本来食糧として生産されるものであり、エタノールの原料として使用することで競合が起こり、これらの資源作物の価格高騰という新たな問題も発生している。一方、我が国はバイオエタノール製造に関する制度の施行や製造設備の開発が極めて遅れている。欧米諸国のように資源作物を豊富に生産することもできず、これら農産物からのバイオエタノール生産は食糧自給率の低い日本では不可能に近い。農林水産省のバイオマス・ニッポン総合戦略では2030年度までに原油換算で58億リットルの生産を目標 $ ^{15)} $ としているが、2007年度以降いくつかの企業が日本各地で大規模プラントによるエタノール生産を開始 $ ^{16,17)} $ したものの、目標に達するため原料として使用するのは規格外穀物や多収穫穀物に限られており、量的には甚だ不十分である。さらに、未利用バイオマスである稲わら、もみ殻、刈草、廃木材、間伐材などからのエタノール生産は残念ながらほとんど実用化に至っていないのが実状である。また、ソフトバイオマスとほぼ同様の繊維質を有するPSからのエタノール生産に関する基礎研究は $ ^{18,19)} $ は若干行われているが、実用化を目指した研究開発は検討されていない。

このような背景から、PS から省エネルギー的にバイオエタノールを製造する

技術開発が進められようとしている。我々は、1980年代後半から現在まで穏和

な条件でバイオマス資源をエネルギー資源へ変換することが可能な発酵技術の

研究を手がけ、省エネルギー的にエネルギー資源であるバイオエタノール 20-25)

やプラスチックの原材料である乳酸 $ ^{26)} $ の生産技術の開発を行ってきた。

現在、ブラジルやアメリカなどで行われているエタノールの製造は、トウモ
ロコシやサトウキビから得られた6炭糖を主成分とする糖液に対して酵母（S. cerevisiae）を用いて発酵させる方法である。トウモロコシやサトウキビは、生産が容易で加工がしやすく、豊富な糖が得られる。また酵母は高濃度の糖存在下で優れた成長能力を持ち、エタノール生産収率も高い。しかし食料を燃料に替えるという倫理観の問題に始まり、食料としての供給の減少などの重大な問題を抱えている。このような背景から、未利用なバイオマス資源である農産廃棄物（稲わら、もみ殻など） $ ^{27,28} $ 、林産廃棄物（間伐材、廃木材） $ ^{29,30} $ や産業廃棄物（PSなど） $ ^{31,32} $ からエタノールを高収率で得る研究が進められている。

PS は、高水分含量であり、バイオマス成分である糖質（セルロースとヘミセルロース）を含み、さらに、リグニンおよび無機分を多量に含んでいる。この成分中の糖質を有効利用するためには、5 炭糖および6 炭糖をともに効率よくエタノールへ変換することが望まれる。しかし、S. cerevisiae は 5 炭糖を資化できるものの発酵性を有しないことから、古くは、キシロース発酵酵母である Candida sheatae や Pichia stipites $ ^{33)} $ を用いたセルロース系バイオマスの加水分解物のエタノール発酵が検討されている。さらに、近年、キシロース代謝酵素遺伝子を組換えた S. cerevisiae $ ^{34)} $ 、Z. palmaes $ ^{35)} $ や RITE による組換えコリネ菌 $ ^{36)} $ の開発などが国家プロジェクトの一環として行われている。しかし、これらエタノール発酵微生物を用いて 5 炭糖の代表であるキシロースからエタノール発酵を行う場合、培養が難しい、副生成物が生成する、エタノール耐性が低い、発酵阻害物質により強く発酵が阻害されるなど多くの問題を抱えている。さらに、組換え微生物を用いた場合には、高いエタノール生産性を達成できるものの、組換え菌を使用する際の安全性の問題や倫理的問題を解決していく必要がある。これらのことから、我々は、2008 年より従来エタノール微生物として考えられていなかった糸状菌の探索を行い、全く新しいキシロース発酵糸状菌を発見す
ると共に、この微生物を用いたソフトバイオマス(特に、稲わら、刈り芝)からのバイオエタノール製造システムの開発 $ ^{37-39} $ を行ってきた（Fig.5）。

Fig. 5 エタノール発酵糸状菌と加水分解酵素を組み合わせた同時糖化発酵による稲わら糖からのバイオエタノールの製造の概略

以上の研究開発により、接合菌 M.javanicas に属する特異的な株が、好気条件下でグルコース発酵効率（発酵微生物が消費した単糖をすべてエタノールへ変換した場合を100%とした値であり、理論上1 mol の炭素源から2 mol のエタノールが生成する。S.cerevisiae を用いたグルコース培養の場合、最適培養条件で85%程度、また、キシロースの場合、発酵効率は0%である）90%、またキシロース発酵効率28%を示し、最大エタノール生産量はいずれも約70 g/Lであることを明らかにした。さらに、このエタノール発酵糸状菌の他の発酵微生物との最大の素意は、糸状菌自身がバイオマス加水分解酵素を分泌する点にある。この分泌量を向上できれば、発酵糖を得るために使用する酵素添加量を軽減させ
ることが可能となる。そこで、選択したエタノール発酵糸状菌の加水分解酵素分泌生産の可能性を検討した結果、選択したエタノール発酵糸状菌は、セルロースおよびヘミセルロースを加水分解する endo-β-Glucanase、Cellobiohydrolase、β-Glucosidase、Xylanase、β-Xylosidase などを分泌することが判明した。

さらに、ソフトバイオマスからのエタノール生産において、微細化等の前処理を行った後、酵素加水分解により発酵糖を生産した。本糸状菌が分泌する酵素量は、その際に添加する酵素量の5-20%であった。この事実から本糸状菌を用いた場合、エタノール発酵に必要なエネルギー量を若干軽減させる効果があることがわかった。稲わらを基質とした場合、低コストでエタノールを生産させるためには、糖化反応と発酵を一つの発酵槽で行う次世代型のエタノール発酵システム、SSFプロセスが有望である。そこで、稲わらを原料として最適化した市販の酵素剤を組み合わせたSSFプロセスを行った結果、最大発酵収率85%でエタノールをできることを実証した。

### 1.3 研究目的

PS からのバイオ燃料であるエタノール生産に関する研究は、国際的には極めて少なく、Cellulase と S. cerevisiae を組み合わせた SSF プロセス $ {}^{40)} $ 、Cellulase とキシロース代謝遺伝子を組換えた E. coli による SSF プロセス $ {}^{41)} $ 、さらに、Cellulase と耐熱性 S. cerevisiae を組み合わせた SSF プロセス $ {}^{42)} $ の例があるので、天然のエタノール発酵微生物を用いて、PS 中の糖質をすべて活用しエタノールを効率よく生産させようとする試みは皆無である。

我々が開発するエタノール発酵糸状菌を用いた PS からのエタノール製造技術は、PS の加水分解において、高温高压の装置は必要とせず、また、Cellulase 等