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Fig.6 エタノール発酵糸状菌を用いた PS からの同時糖化発酵プロセスによるエタノール生産

Fig.7 エタノール発酵糸状菌を用いた PS からの糖化発酵同時進行プロセスによるエタノール生産

の添加量を軽減できる。さらに、セルロースの加水分解物であるグルコースの発酵のみならず、従来、天然のエタノール発酵微生物 S. cerevisiae では発酵が不可能であったヘミセルロース加水分解物であるキシロースを効率よく発酵できる省エネルギー型のシステムである (Fig.6)。一方、省エネルギー型の発酵システムとして、現在、神戸大学の近藤グループが精力的に取り組んでいる数種の Cellulase を細胞表層に提示できるように遺伝子組換えを行った酵母によりセルロースから直接エタノールを生産させる糖化発酵同時進行 (CBP) プロセス 43,44) がある (Fig.7)。これは一つの微生物により Cellulase の細胞表層での発現、セル
ロースの加水分解、さらにエタノール発酵へ行おうとする画期的な変換プロセスであり、次世代型の発酵技術として期待されている。しかし、この技術は遺伝子組換え技術を用いており、我が国ではカルタヘナ法 $ ^{*1} $ に基づく「遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律」 $ ^{45)} $ の適応を受けることから生産現場での利用は難しく、また培養環境により発酵が阻害されると云った問題点が指摘されている。一方、このプロセスの観点から本報告書で提案する野生のエタノール発酵糸状菌は、Fig.7のように容易に糖化発酵同時進行CBPプロセスを達成できる可能性を秘めていることから、将来に向けて検討していく必要があろう。

紙・パルプ産業において、多くの問題を生じさせている製紙廃棄物の有効利用を目的として、PSから備蓄可能なバイオ燃料製造法を開発する。具体的には、我々がこれまで開発してきたエタノール発酵糸状菌およびソフトバイオマスからエタノールを生産させるための培養技術を活用し、PS中の繊維質を効率よく加水分解できる酵素カクテル剤と新規なエタノール発酵糸状菌を組み合わせたSSFプロセスを開発し、効率よくPSからエタノールを生産させるために、下記の4テーマについて実施する。

## ① PS の成分分析

製紙工場から排出される PS 中の糖質、有機成分、無機成分などを詳細に分析し、PS 発生源の相違による成分分布を明らかにする。

## ② PS の前処理法の確立

PS 中の糖質成分および無機成分を踏まえて、最適な PS 前処理法を開発する。

③ PS の加水分解の最適化
統計学的手法（実験計画法、DOE）を用いて PS から発酵糖を効率よく生産するための最適酵素カクテル剤の開発を行う。

④ エタノール発酵糸状菌を利活用した PS からのバイオエタノール生産

酵素カクテル剤とエタノール発酵糸状菌を組み合わせた SSF プロセスにより、PS からエタノールを直接高収率で生産させることを検討するとともに、省エネルギー的観点から本プロセスの有用性を実証する。さらに、無機成分の回収・リサイクル法を検討する。

Fig.8 エタノール発酵糸状菌を用いた糖化発酵同時進行プロセスによる PS からのエタノール生産

これらのテーマを実施することにより最終的に、湿润最終PS 1トンから50kgのエタノールを生産させること（エタノール濃度10-30g/L）を目標とする。さらに、PS中の繊維質を効率良く抽出するための前処理、繊維質を効率良く加水分解させるための酵素カクテル剤、エタノール発酵糸状菌の機能向上を目指
した耐熱化を検討する。PS 前処理工程から分離される無機成分を分析し、製紙製造プロセスへ再利用する方法を検討する。
### 2. 研究方法

### 2.1 実験材料

#### 2.1.1 ペーパースラッジ (PS)

本研究では、富山県高岡市の中越パルブ工業（株）より分譲してもらった PS を使用した。それぞれの PS 名称と由来を下記に示す。

最終 PS （能町）：能町事業所排出の最終 PS （Fig.9）

最終 PS （二塚）：二塚事業所排出の最終 PS

抄紙テール : 能町事業所の抄紙機より排出された PS (Fig.10)

中越パルプ工業（株）は、木質パルプおよび古紙などから再生紙の製造を主に行い、年間4.5万トンの廃棄物を排出している。その内、約4.0万トンの最終PSが焼却処分され、その内5千トンが埋め立て等に最終処分されている。同製紙事業所より分譲してもらったすべてのPSは腐敗が速いことから、分析および試験に使用するまで、ビニール袋に入れ-30℃の冷凍庫内で保存した。また、使用する際には、PSが入ったビニール袋を水洗することにより自然解凍させ使用した。

Fig.9 最終 PS（能町）

Fig.10 抄紙テール

#### 2.1.2 セルラーゼ剤

PS の加水分解のための使用した市販のセルラーゼ剤は、下記の 14 種類である。
これらは食品加工用および胃腸薬として利用する消化剤およびソフトバイオマス加水分解用に開発された酵素剤である。使用した酵素剤は、Meiselase（明治製菓）、Cellulase T、Cellulase A、Hemicellulase、Pectinase（天野エンザイム）、Cellulase Y-NG、Cellulase Onozuka 3S、Cellulase Onozuka R-10（ヤクルト薬品工業）、Sumyzyme AC、Sumyzyme X、Sumyzyme SNX（新日本化学工業）、Cellulase from Trichoderma ATCC 26921、Novozyme 188（SIGMA）、Accellerase 1500（GENRNCOR）、Vecelex（合同酒精）である。

#### 2.1.3 エタノール発酵糸状菌

エタノール発酵糸状菌は、我々が発見した Mucor 属接合菌（Fig.11）を元に最終 PS に耐性のある菌株をスクリーニングするために、以下に示す 84 株の菌株を NBRC（独立行政法人 製品評価技術基盤機構）より分譲いただいた。

Mucor circinelloides fsp. circinelloides

Mucor dormorphosporus

Mucor circinelloides van tieghem fsp.

griseo-cyan

Mucor javanicus

Mucor plumbeus

Mucor racemosus fsp. racemosus

Fig.11 M.javanicus

Mucor genevensis

Mucor hiemalis fsp. hiemalis

Mucor circinelloides fsp. janssenii

Mucor rouxianus

Mucor circinelloides van tieghem fsp. circinelloid

Mucor mucedo

Mucor subtilissiformis
Mucor bacilliformis

Mucor fragilis

Mucor ambiguus

Mucor racemosus fsp. sphaerosporus

Mucor petrinsularis

Mucor hiemalis fsp. silvaticus

Mucor hiemalis wehmer fsp. silvaticus

Mucor albo-ater

Mucor oblongisporus

Mucor plasmaticus

Mucor odoratus

Mucor recurvus

Mucor inaequisporus

Mucor bacilliformis

Mucor tuberculisporus

Mucor oblongiellipticus

Mucor hiemalis fsp. luteus

Mucor abundans

Mucor hiemalis fsp. Corticolus

Mucor guilliermondii

Mucor hiemalis Wehmer fsp. hiemalis

Mucor hiemalis Wehmer fsp. luteus

Mucor piriformis

Mucor flavus

Mucor saturninus

Mucor strictus

Rhizomucor pusillus

Rhizomucor miehei
#### 2.1.4 イオンビーム変異による高温耐性エタノール発酵糸状菌の構築

PS からエタノールを製造するために選択した Mucor 属糸状菌の実用化を目指して、耐熱性菌株の取得のために、イオンビーム変異法を実施した。イオンビーム変異の方法を以下に示す。ペトリディッシュ（培養体積 12 mL）に、Potato Dextrose Agar （PDA） 39 g/L の寒天培地を調製し、滅菌後、冷却保存しておいた選択した Mucor 属糸状菌スラントから植菌した。培養は、28℃に設定したインキュベーター内で約 3 日間暗所静置することにより行った。得られた培養プレートから菌糸をはぎ取り、100 mL の滅菌生理食塩水に懸濁させた。この懸濁液を、滅菌したミキサー内で 30 秒間破砕した。この菌懸濁液を、OptiCell （Thermofisher Scintific Lab.）に 6 mL 入れ凍結した。このサンプルを(公財)若狭湾エネルギー研究センター（Fig.12）に送り、シンクロトロン装置（Fig.13）でプロトンイオンビームを 3,000 Gy 強度で照射（2 秒間隔で 0.2 Gy 照射、総照射時間 500 分）し変異誘導を行った（簡単な手順を Fig.14 に示した） $ ^{46)} $ 。照射サンプルを PDA ペトリディシュ上に播種し、40℃のインキュベーター内で生育した菌株コローニーを回収することにより、3 株変異体を得た。

Fig.12 若狭湾エネルギー 研究センター

Fig.13 シンクロトロン装置
Fig.14 Mucor 属糸状菌分生子に対するイオンビーム照射およびスクリーニング手順

### 2.2 ペーパースラッジの前処理

#### 2.2.1 ペーパースラッジの酸処理

最終 PS 中の繊維質から酵素反応により発酵糖を得るためには、PS 中の無機成（填料、凝集剤の大半）や有機性成分（インク、界面活性剤、廃水処理装置内の微生物叢）を除去する前処理を回はすることが必要である。特に、製紙製造工程において炭酸カルシウム（CaCO₃）、カオリン（Al₄Si₄O₁₀(OH)₈）、やタルク（Mg₃Si₄O₁₀(OH)₂）が填料として添加されており、最終 PS 中にも填料由来の無機成分が含まれている。特に、PS 中に大量に含まれる CaCO₃ の除去は、CaCO₃ + 2HCl → CaCl₂ + CO₂ + H₂O の反応式にしたがい、PS 懸濁液の pH を酸性にすることにより溶出することができる。そこで、最終 PS の前処理として、塩酸を用いた酸処理法を実施した。具体的な酸処理法の手順を以下に記す。400 g-dry の最終 PS 懸濁液に対して 1 M HCl 水溶液を 1 L 注ぎ、室温で攪拌しながら一昼夜浸漬した。その後、PS 懸濁液をサラシに取り絞った後、水洗いを数回行った。
絞り液の pH が中性になるまで十分に水洗いし、サラシ内の固形物を回収した。前処理されたスラッジを 90℃ に設定した乾燥器内で乾燥した。その後、破砕機（ASONE, NH-34S）を用いて、200 - 500 μm の分画スクリーンを通過したサンプルを回収し実験に供した。Fig.15 は簡単に前処理の手順と処理前後の PS の写真を示す。

Fig.15 最終ペーパースラッジの酸よる前処理

#### 2.2.2 ペーパースラッジのアルカリ－酸処理

最終 PS 中の繊維質以外の有機物質（界面活性剤、インクなど）および、無機成分（填料成分、凝集剤）をともに除去するために、最終 PS に対してアルカリ処理を行った後、2.2.1 節に示した方法にしたがって酸処理を行った。

具体的には、400 g-dry の最終 PS を 1 L の 1M NaOH 水溶液に一昼夜浸漬した後、サラシを用いて固形分 (アルカリ処理 PS) を絞り、NaOH 水溶液を除去した。この回収した固形分に対して 1 L の 1 M 酸水溶液中に一昼夜浸漬した。使用
した酸水溶液は、主に塩酸を使用した。その後、固形分（アルカリ－酸処理 PS）をサラシに取り、絞った後、水洗いを十分行った。各処理 PS の懸濁液の pH が中性になったら、90℃に設定した乾燥器内で乾燥した。その後、2.2.1 節に示した方法にしたがってサンプルを調製した。Fig16 はアルカリ－酸処理の手順と PS の写真を示す。

Fig.16 最終 PS のアルカリ－酸よる前処理
#### 2.3. ペーパースラッジのの成分評価

#### 2.3.1 ペーパースラッジの水分含量

PS の水分含量は、水分計（MOC-120H, 島津製作所）を用いた赤外線加熱乾燥質量測定法により測定した。水分計で PS の重量を正確に測定した後、赤外線加熱により乾燥させる。重量の変化が無くなった時の重量を測定する、PS と乾燥 PS の重量差より、PS の水分含量を求めた。

#### 2.3.2 ペーパースラッジの成分分析

製紙製造工程から発生する PS は、木材パルプや古紙パルプの微細な繊維質、填料、漂白剤、凝集剤、廃水処理施設内の曝気槽内の生物叢など多様な有機物と無機物質を含んでいる $ ^{48,49} $ 。PS からエタノールを生産する場合、パルプ由来の有機成分（セルロース、ヘミセルロースや、パルプ中に含まれるフェニルプロパン化合物の重合物であるリグニン）含量を把握することは重要である。特に、多糖類であるセルロースおよびヘミセルロースは、発酵糖の原料となる。一方、PS 中に存在する無機物は、エタノール生産の原料にはならないが、繊維質から発酵糖を生産する際の酵素反応への影響、エタノール発酵糸状菌による発酵糖からのエタノール生産への影響が懸念される。また、PS から填料の原料となる無機物質を回収できれば、将来、製紙製造工程への再利用も期待できる。以上のことから、実製紙事業所から発生している PS 中の有機成分および無機成分を分析し、各成分の有効利用を検討する必要である。そこで、PS 中のパルプ由来の有機物の分析 $ ^{50)} $ は、稲わらや木材中などのリグノセルロース分析法を用いて分析を行った。この分析により、PS 中のセルロース、ヘミセルロース、およびリグニン（Klason lignin と Acid-soluble Lignin）の含量を求めた。さらに、PS を直接灰化法により得た無機物質の成分は、イオンクロマトグラフィー法および蛍光 X 線法により求めた。

##### 2.3.2.1 Klason lignin の定量

PS の各部位に含まれている有機成分（糖質）、Lignin、無機成分（灰分）を定
量するため以下の分析を行った。まず、PS 試料 0.3 g を 30 mL 容のビーカーにとり、氷上（2℃）で冷やしながら 4.5 mL の 72% H₂SO₄ を加え、ガラス棒で磨砕した後、15℃で 3 時間攪拌し、多糖成分の溶解と加水分解を行った。その混合液を 300 mL 容の三角フラスコに移し、さらに 171 mL の蒸留水を加えてオートクレーブ（121℃、30 min）を行い、希釈溶解液中で硫酸エステルグループやセロデキストリンを加水分解した。冷却後、加水分解液を濾過（ADVANTEC Co., ガラス繊維濾紙 GA-200）して不溶性の成分を得た。この不溶性の乾燥重量を測定することにより、Klason lignin 含量を求めた。

##### 2.3.2.2 Acid-soluble lignin の定量

Klason lignin を定量する際に得られた濾液の 205 nm の波長における吸光度を、3 % H₂SO₄ を対照液として分光光度計を用いて測定し、次式を用いて酸可溶性 lignin（Acid-soluble lignin）含量を算出した。

酸可溶性 lignin 含量 $ (\%) = \mathrm{D} \times \mathrm{A} \times \mathrm{V} / (\mathrm{d} \times \mathrm{a} \times \mathrm{W}) $

ただし、D：希釈倍率（-）、A：吸光度（-）、V：濾液の液量(L)、d：光路長(1 cm)、a：Lignin吸光係数(94.5 L/g/cm)、W：サンプルの乾燥重量(g)である。

##### 2.3.2.3 ペーパースラッジ中のセルロースおよびヘミセルロース含量

Klason lignin を定量する際に得られた濾液を pH 7.0 に調整し、濾液中のグルコースおよびその他の糖質濃度を Glucose-CII テストおよびフェノール硫酸法によって測定した。このとき Glucose-CII テストより得られたグルコース量は、PS 中のセルロース量を示す。また、フェノール硫酸法により得られ全糖量より、このグルコース量を引くことにより、ヘミセルロース量を求めた。このヘミセルロースは主に Xylose の重合物 Xylan である $ ^{46)} $ 。

##### 2.3.2.4 ペーパースラッジ中の灰含量（直接灰化法）

2 事業所の最終 PS（能町および二塚）および抄紙テール（スクリーン）や各種処理最終 PS のサンプルを 90℃ で 24 時間乾燥させた。その後、各試料を 3.0 g
ずつるつぼに量りとり、電気炉（ASONE：小型プログラム電気炉 MMF-1）を用いて $ 500^{\circ} $ C で 2 時間加熱灰化し、残渣を灰分とした。酸素供給量は 100 mL/min とした。

##### 2.3.2.5 ペーパースラッジ中の無機分析

灰化処理済のサンプル中の陽イオン成分を調べるためにイオンクロマトグラフィー法により分析した。PFA 容器に灰化試料を $ 50 \pm 2 $ mg ずつ量り取り、濃硝酸 20 mL、過塩素酸（60%）0.3 mL、6 N 塩酸 0.15 mL の溶液を 4.0 mL 加えた。次に、この容器を SHF 試料分解容器に入れ、電子レンジ（200 W、10 分間）で熱分解させた。分解後の溶液を使用したクロマト用試料とした。HPLC システムは LC-10ADvp（島津製作所、LC-10 System）であり、陽イオン分離カラムとして、TSKgel IC-Cation I/II HR（東ソー）を用いて電気伝導度検出器（島津製作所、CDD-10）により検出した。また、PS の前処理において、PS に残留している無機成分を定量するために、波長分散型蛍光 X 線装置（XRF）（スペクトリス、PW2404R）による元素分析を行った。初めに、各種 PS を電気炉を用いて $ 500^{\circ} $ C で 2 時間処理し灰化した。その後、XRF 装置により分析し、灰分に含まれる元素およびその含量比を解析した。

### 2.4 セルラーゼを用いたペーパースラッジの加水分解

#### 2.4.1 PS からの発酵糖の生産

PS 中に存在している有機成分は、前処理の有無にかかわらずその大半がセルロースを主成分とする繊維である。特に、抄紙工程において抄紙にできなかった成分や古紙から繊維分とインクなどをフローターで除去する際に、回収できなかった短い繊維分である。これら繊維成分は、主にセルロースおよびヘミセルロースであり、微生物の発酵により物質変換を行う際には、発酵糖の原料となる。すなわち、PS から効率良く発酵糖を簡便かつ効率よく生成することが、有用物質を生産する上での重要な検討事項である。
そこで、国内で入手可能な食品製造用セルラーゼ剤を用いて、各種 PS の加水分解反応を行った。PS からのエタノール製造を想定し、pH を 5.5 に調整した反応溶液 $ ((NH_{4})_{2}SO_{4} $ 7.5 g/L, $ KH_{2}PO_{4} $ 3.5 g/L, $ CaCl_{2}\cdot2H_{2}O $ 1.0 g/L, $ MgSO_{4}\cdot7H_{2}O $ 0.75 g/L, Yeast extract 5.0 g/L) 中に濃度 50 - 100 g-dry/L となるように PS を加え、全量を 25 mL にしてインキュベーター内で 28℃、120 rpm の振盪条件で加水分解を行った。反応容器から PS 懸濁液を遠沈管に回収した後、煮沸により酵素を失活させた。その後、遠心分離処理を行い、その上静を分析サンプルとした。酵素濃度は主に 3 g-protein/L で行った。生成したグルコース、キシロースなどの糖質は、示差屈性計（島津製作所、RID-10）を備えた高速液体クロマトグラフィー（島津製作所、LC-10 System）を用いて分析した。使用したカラムは IcSep WAI Wine Analysis Column（Transgenomics Co.）を使用した。キャリアには 1.25 mM の $ H_{2}SO_{4} $ を用い流速 0.6 mL/min で HPLC へ供給した。

#### 2.4.2 PS 加水分解のための酵素剤の最適化

市販のセルラーゼ剤は、各種活性を有していることから、単一の酵素剤では、加水分解能力が乏しく、複数の市販酵素剤を混合したカクテル剤の開発が必要である。しかし、現在まで酵素カクテル剤の最適な調製方法がないことから、本研究では統計学的手法を活用し配合比に関して最適化を行った。具体的には、市販のセルラーゼ剤を単独で用いて各種酵素活性を得る。次にそれらの酵素剤を用いて、PSを加水分解し生成した発酵糖より加水分解活性を求める。このときに、加水分解に望ましい酵素剤を3種類選択する。次に、実験計画法（DOE）ソフトであるDesign Expert®（Stat-Ease, Inc.）を用いて応答曲面法（RSM）解析を行い、最適配合比を求めた。最適なセルラーゼ酵素剤を用いたPSの加水分解試験は、2.4.1節に記述した方法に準じて行った。
### 2.5 エタノール発酵糸状菌のスクリーニング

最終PSに対して耐性を有しSSFプロセスを行うためのエタノール発酵糸状菌を選択するために、84株のMucor属接合菌のスクリーニングを行った。具体的には、前培養は、ペトリディッシュ（培養体積12mL）に、39g/Lの濃度でPDA寒天培地を調製し、滅菌後、冷却保存しておいたスラントから植菌することにより行った。28℃に設定したインキュベーター内で約3日間の暗所静置培養を行った。本培養で使用した培地組成は、 $ (\mathrm{NH}_{4})_{2}\mathrm{SO}_{4} $ 7.5g/L、 $ KH_{2}PO_{4} $ 3.5g/L、 $ MgSO_{4}\cdot7H_{2}O $ 0.75g/L、 $ CaCl_{2}\cdot2H_{2}O $ 1.0g/L、Yeast extract 5g/L、Chloramphenicol 50mg/Lであり、最終PS濃度が50g-dry/Lとなるように添加した。さらに、培地のpHは1HClを用いて5.5に調製した。その発酵用培地にセルラーゼ剤Acellulreaseを6.9PFU/g-PSとなるように添加し、さらに前培養したPDA寒天培地からから菌糸を植菌し、SSFプロセスを開始した。培養は嫌気条件下で28℃とし120rpmの振盪で120時間行った。培養終了後、培養液中の生成エタノール濃度を比較することにより、エタノール発酵微生物を選択した。

### 2.6 同時糖化発酵プロセスによる PS からのエタノール生産

選択したエタノール発酵糸状菌を用いた発酵能の検討およびSSFプロセスによるエタノールの生産は以下のように行った。まず組成（Glucose 20 g/L、(NH₄)₂SO₄ 7.5 g/L、Yeast extract 5.0 g/L、KH₂PO₄ 3.5 g/L、CaCl₂・2H₂O 1.0 g/L、MgSO₄・7H₂O 0.75 g/L、寒天 15 g/L）の培地をpH 5.5に調整した。次に調製した寒天培地を121℃で15分間オートクレーブを行い、ペトリディッシュに12 mL加えて寒天培地とし、スラントにて4℃保存しておいた菌体を寒天培地上に植菌した。その後、28℃に設定したインキュベーター内で4日間静置培養を行った。本培養は、次のように行った。まず、1.25 - 2.5 gの最終PS、抄紙テール、あるいは処理最終PSを入れた100 mL容の三角フラスコに、上記の培地を25 mLとなるように添加し、オートクレーブを行った。その後、クリーンベンチ内で、フィルター滅菌を行った酵素剤あるいは最適化した酵素カクテル剤をタンパク質濃度として3 g-protein/Lとなるように培地中に添加した。そこへ前培養してい
たエタノール発酵糸状菌の寒天プレートを100 mLの生理食塩水に懸濁させ、滅菌したミキサー内で破砕した。この懸濁液を三角フラスコ内へ1.0 mL添加し、培養を開始した。培養は、28℃に設定したインキュベーター内で120 rpmで振盪することにより行った。エタノール糸状菌とセルラーゼ剤を組み合わせたSSFを行った際の概略をFig.17に表す。

Fig.17 エタノール発酵糸状菌とセルラーゼ剤を組み合わせた SSF プロセス

酵素反応により生成した生成したグルコース、キシロースなどの糖質や発酵により生じたエタノール、副生成物である酢酸、グリセリンなどは、示差屈性計を備えた高速液体クロマトグラフィー（島津製作所、LC-10 System）を用いて分析した。使用した分析カラムは IcSep WAI Wine Analysis Column (Transgenomics Co.) である。

### 2.7 培養液中のセルラーゼ活性

Mucor 属およびその近縁種の糸状菌は、各種セルラーゼを分泌生産することができる。特に、PS 中のセルロース成分を加水分解させ、効率良く発酵糖を生産させるためには、endo-β-Glucanase, Cellobiohydrolase, および β-Glucosidase の分
泌が必須である。さらに、これら菌株から多くのセルラーゼが分泌できれば、SSFプロセスにおいて酵素剤の添加は不要となり、エタノール製造に係わるコストの削減につながる。そこで、糸状菌の培養経過に伴うセルラーゼの分泌を検討した。β-GlucosidaseおよびCellobiohydrolaseの酵素活性は、それぞれ4-Nitrophenylβ-D-glucopyranosideおよび4-Nitrophenylβ-D-cellobiosideを基質とし、28℃の振盪反応で生じたNitrophenol量より求めた。また、endo-β-Glucanase活性は、酵素反応によりAzo-CM Cellulose（Megazyme Co.）から生じたAzo色素量を元に求めた。
### 3. 結果と考察

#### 3.1. ベーパースラッジの成分分析

最終ペーパースラッジ（最終 PS）は、製紙製造事業所おいて、木質パルプから繊維質を抽出する際の、蒸解工程・漂白工程等から排出される廃棄物、古紙をパルプに再生する際にインキは填料などを繊維分から取り除く際に使用する各種薬剤と填料成分などの無機物質、抄紙工程において抄紙機から漏れ出した低分子の繊維分（抄紙テー

ル）、および、工場全体から排出される廃水処理施設の生物叢や沈降分離により使用される凝集剤（ポリ鉄、PACなど）など多種多様な成分を含んでいる。これらのことから、最終 PS の成分は、その事業所が製造する紙製品の種類により大きく異なっていると予想される。本研究開発で使用する PS は産業用紙、新聞紙用紙などを主に製造する事業所から発生している。該当事業所において発生する最終 PS は、スクリープレスによる脱水後、廃棄物焼却炉（2002年

Fig.18 最終ペーパースラッジ焼却炉

Fig.19 最終ペーパースラッジ炭化装置
稼動，焼却量 10.3 トン/h）で焼却、減容化されている。この時発生する熱を回収し、工場内で有効なエネルギーとして活用している。実際の製紙事業所におけ最終るPS燃焼現場をFig.18に示した。また、Fig.19は最終PSの炭化装置の現場写真である。しかしながら、最終PSの燃焼処理には水分含量が多いことから補助燃料として、湿潤最終PS 1 トン当たり約27 Lの重油を必要する。それゆえ、PSの成分を明確に把握することが求められる。そこで、事業所の各製紙製造工程から発生しているPS（最終PS、抄紙テール）の成分分析を行った。最終生成物がエタノールであることから、初めに、各PSの発酵原料となるセルロースおよびヘミセルロース成分の含量を中心に分析に行った。Fig.20は各PSサンプルの水分含量を示す。能町事業所と二塚事業所の最終PSの水分含量は約54-55%、また、能町工場の抄紙テール（スクリーンおよびクリーナー）の水分含量は81-91%とかなり高いことがわかった。Fig.21は各種PSの成分を示す。Fig.21に示したように能町事業所の最終PSの繊維質含量（セルロースとヘミセルロースの和）は乾燥物基準で28%、また、二塚事業所の場合、21%であることがわかる。また、木質パルブ由来のリグニン（LigninとAcid-soluble ligninの和）は、能町事業所の場合9%、二塚事業所では18%と、事業所の製造する紙製品、古紙パルプと木質パルプの配合比などにより、PS中の成分比が異なっていることがわかった。しかし、最終PSの乾燥物に占める無機成分は約60%であることがわかった。一方、抄紙機からの廃水でクリーナーとスクリーンから回収される抄紙テールは、事業所内の廃水が集まる最終PSとは異なり、抄紙製造機から排出されるPSのため、繊維質の割合が高く、クリーナーおよびスクリーンで回収された抄紙テールの含量が64-66%と高く、また、無機成分をほとんど含まないとがわかった。これらの結果から、製紙事業所により最終PS中の有機成分の割合が異なること、最終PS中には約60%無機成分を含んでいること、さらに
Fig.20 ペーパースラッジの水分含量

Fig.21 各ペーパースラッジの成分分析
抄紙テールは繊維質含量が高く発酵基質として適していることがわかった。実際の事業所内で抄紙テールは、この純度の高いセルロース繊維は、事業所内の廃水と混ざり、最終的に最終 PS として、焼却炉で燃焼処理されている。現在、サンプル提供事業所では、0.3%程度の抄紙テールが継続的に1日当たり900トン程度発生していることから、この物質の有効利用が強く求められている（抄紙テールのエタノール発酵の検討は後で述べる）。

Fig.21 の PS 成分分析の結果から、エタノールの生産の可能性を検討する。一般のエタノール発酵微生物を用いたエタノール発酵の場合、グルコースなどの単糖から得られるエタノールの理論収量は、微生物の増殖のため炭素源の消費を無視すると51.1％となる。繊維質含量の低い最終PS（55%水分含量、21-28%の繊維分）からエタノールを生産した場合、湿潤最終PS1トンから(450 kg×0.21～0.28×0.511＝）48.3-64.4 kg-ethanolが生産できる可能性があることがわかる。湿潤最終PS（能町）100 kgを基質として1 m³の発酵槽でエタノール生産させた場合、発酵効率100％と仮定すると理論上46 kg-dry/L×0.28×0.511=6.58 g/Lのエタノールが生産できることがわかる。一方、この抄紙テール(スクリーン)の場合、湿潤抄紙テール（スクリーン）1トンから（190 kg×0.66×0.511＝）64.1 kg-ethanolが生産できると試算できる。最終PSと同様に100 kgのテールを基質として1 m³の発酵槽でエタノール生産させた場合、理論上19 kg-dry/L×0.66×0.511=6.40 g/Lのエタノールが生産できることがわかる。

以上の結果から、PS 中に含まれている繊維質は、極めて有用なバイオマス資源であり、効率良く発酵糖を得る方法が確立できれば、良好なエタノール発酵の原料になると考えられる。さらに、現在、各製紙事業所で実施されている最終PSの焼却処理に取って変わることのできる新規な処理法になると期待される。しかし現時点では、PS 中の繊維質を効率良く回収する方法が確立することが難
しいこと。廃棄物の減容化およびエネルギーの回収の点を考えると燃焼による方法もやむを得ないだろう。最終 PS からの繊維質の分離回収と回収した繊維分を効率良く有用物質へ変換できるかが鍵となる。

次に、最終 PS および抄紙テール（スクリーンおよびクリーナー）の無機成分はイオンクロマトグラフィーを用いて分析した。Fig.21 の分析結果から最終 PS 中の無機成分の含量は、約 60% とかなり高含量であり、抄紙テールも、0 - 8% の無機成分を含んでいることがわかる。

そこで、無機成分中の成分を把握するために最終 PS と抄紙テールを水分計を用いて乾燥させ、その後、硝酸水溶液中で電磁波により PS 中の有機質を分解し分解し、無機物を無機イオンとして溶出させた。その後、電気伝導度計を備えたイオンクロマトにより主要な陽イオンを分析した。乾燥 PS グラム当たりの陽イオン含量の結果を Fig.22 に示す。

Fig.22 各種ペーパースラッジ焼却灰中の無機成分
2 事業所の最終 PS（能町および二塚）および抄紙テールの結果を示す。いずれの PS にも、主に Na、K、Mg、Ca イオンが含まれ、特に Na イオンと Ca イオンが多量に含まれていることがわかる。Na イオンは、木質バルブを蒸解させ繊維質を得る工程で使用した水酸化ナトリウム（NaOH）と硫酸ナトリウム（Na₂SO₄）に由来し、PS 中の有機物や無機物に結合していると考えられる。Ca イオンは、紙を抄造するときに使用される炭酸カルシウム（CaCO₃）などに由来し、Mg イオンは、填料として使用されるタルクに由来すると考えられる。

これらの物質は、PS 中の繊維質から発酵糖を得る加水分解プロセスや、発酵糖からエタノールを生産する発酵プロセスに影響を与える可能性があるため、抄紙工程や製紙事業所の排水処理工程でこれら物質を除去することが望ましいと考えられる。しかし、このような観点でPSの前処理法を検討した報告は無い。

### 3.2 ペーパースラッジの前処理技術の確立

これらの結果を踏まえ、PS の前処理法について詳細に検討した。最終 PS は、パルプの蒸解や再生紙からのセルロースの繊維回収でアルカリ処理が行われている。それ故、一般の最終 PS の懸濁液は pH 8.0 - 9.0 の弱アルカリ性を示す。この最終 PS 中に含まれる繊維分を原料としてエタノールへの物質変換を行う場合、加水分解酵素による発酵糖の生成およびその後の発酵プロセスが必要である。しかし、繊維質から発酵糖を得るためのセルラーゼは、通常至適 pH は 4.0 - 5.5 である。さらに、また、エタノール発酵微生物である酵母などは、至適発酵 pH は 4.0 - 5.0 である。したがって、通常の逐次的な糖化・発酵プロセスにおいて、最終 PS を原料とした場合、加水分解反応は起こらず、さらに発酵微生物は死滅してしまう。そこで、塩酸などの酸により反応液や培養液の pH を弱酸性に低下させる必要があるが、PS 懸濁液は含有成分のために緩衝作用が強く、容易に pH
を低下させることはできない。

そこで、最終 PS 中の繊維質以外の有機成分や無機成分を除去し、効率良く酵素剤により加水分解による可溶糖の生産などを行うための最適な前処理法の確立を目指した。具体的には、2.3 節にしたがってパルプ由来のセルロース、ヘミセルロースおよびリグニンと、填料由来の無機成分について検討した。

初めに、最終 PS の前処理として最も簡便な水による洗浄法を検討した。最終 PS をサラシの中に入れ、一昼夜、水に浸漬し水を流しながら洗浄した。その後、洗浄物を乾燥し各種分析を行った。水洗浄処理 PS は、最終 PS と比較して見た目にはほとんど変化は認められなかった。水洗浄処理处理 PS 乾燥物の成分分析を行った結果を Fig.23 に示す。

Fig.23 水洗净処理ペーパースラッジの成分含量
最終 PS の水洗い処理により、無機成分は 47.8 から 39.2%へ減少でき、セルロースは 17.7%から 24.4%、また、ヘミセルロース 11.3%から 13.9%と向上させることができた。すなわち、最終 PS の水洗浄により繊維質に吸着していた無機成分を溶出し、発酵糖の原料であるセルロースとヘミセルロースを 29.0%から 38.3%へ向上させることができた。また、PS 中の糖質以外の有機成分含量（界面活性剤など）はほとんど変化していないことから、これら成分は水洗いでは除去できないことも判明した。また、水洗浄処理 PS についてセルラーゼを用いた加水分解を実施したが、未処理の最終 PS と同等量の発酵糖しか得ることはできなかった。

そこで、最終 PS 中に含まれる無機成分の除去や繊維質以外の有機成分の除去に着目した各種処理法を検討した。Fig. 24 は、最終 PS および酸処理、アルカリ処理、およびアルカリ－酸処理を行った成分分析の結果である。初めに最終 PS 中に含まれる無機成分の除去に着目した酸処理法を検討した。特最終 PS 中に多量に存在する無機成分、特に Ca 塩の除去を試みた。最終 PS 懸濁液が緩衝作用を示す原因は、填料中の $ CaCO_{3} $ が原因であると考えられる。このことから、最終 PS から Ca 塩の除去することにより PS 懸濁液の pH 調整も容易になり、エタノール生産を行う際の酵素反応および発酵効率を向上できると期待できる。一般に Ca 塩は塩化物にすることで水に溶解することから、最終 PS 懸濁液に塩酸を加える酸処理法を検討した。2.2 節に示した方法で最終 PS 懸濁液に酸処理を施し一昼夜浸漬した。塩酸を加えると PS 中の $ CaCO_{3} $ が溶解し、 $ CO_{2} $ ガスが発生した。調製した酸処理 PS の成分を分析した結果を Fig.23 の 2 列目の棒グラフに示した。

酸処理後の PS の成分は、セルロース 36.3%、ヘミセルロース 18.6%、他の有機成分 17.3%、無機成分 27.8% に変化した。この塩酸処理によって、無機成分
はかなり減少し、反対にセルロースとヘミセルロースは増加した。その結果発酵糖含量が約32.6%から54.9%に増加し、PS中の繊維質含量を高めることができた。以上の結果から最終PSの前処理として、塩酸を用いた酸処理が有効であり、無機成分の除去と繊維成分含量の向上を達成できることがわかった。しかし、塩酸処理では繊維成分に吸着している有機成分（界面活性剤など）の除去は、十分にできない（残留割合:16.3%）ことも判明した。付着有機成分が、エタノール製造へどのように影響するかは、SSFプロセスのところで説明する。

Fig.24 各種処理ペーパースラッジの成分成分
次に、最終 PS 中に含まれる繊維質以外のアルカリ溶解性の有機物質の除去に着目したアルカリ処理法を行った（Fig.24, 右から2列目の棒グラフ）。アルカリ酸処理後の PS の成分は、セルロース 41.0%、ヘミセルロース 17.2%、他の有機成分 7.5%、無機成分 34.5%に変化した。アルカリ処理により、未処理の最終 PS 中のセルロース含量を向上させることができ、さらに、繊維質以外の有機物質量を大幅に軽減できることがわかった。しかし、処理 PS 中の無機成分を大幅に軽減することはできなかった。

そこで、繊維質以外の有機化合物と無機成分を最終 PS からする 2 段階の処理法「アルカリ－酸処理」を検討した。アルカリ－酸処理を行った最終 PS は、未処理の最終 PS と比較して見た目は黒くなった。さらに、Fig.25 は最終 PS の SEM 写真とアルカリ－酸処理最終 PS の SEM 写真である。写真から明らかなように最終 PS 中の繊維質は多くの物質を吸着しているが、アルカリ－酸処理 PS ではほとんど吸着していないことがわかった。

Fig.25 最終ペーパースラッジとアルカリ-酸処理 ペーパースラッジの SEM 写真
Fig.24（右1列目の棒グラフ）に示したアルカリ－酸処理の成分分析の結果から、無機成分は未処理の41％から22.5％にまで減少できた。これとは逆にエタノール発酵の原料となるPS中の繊維質（セルロースおよびヘミセルロース含量）を、未処理の32.6％からアルカリ－酸処理後59.3％にまで向上できることがわかった。さらに、糖質以外の有機成分は、未処理の26.3％からアルカリ－酸処理PSの17.1％まで軽減できた。

以上の結果より、アルカリ－酸処理法が最終 PS の前処理に有効な方法であることがわかった。また、処理 PS 中の無機成分を検討することで各処理 PS 法により除去できた物質を決定することができる。さらに、アルカリおよび酸処理後の洗浄液の分析結果から、有益な化合物を回収・再利用する可能性を見出すことができる。そこで、各種前処理後の PS 灰化物に存在する元素比を蛍光 X 線分析により求めた（Fig.26）。未処理の PS 中の無機成分の総量和 100％として示した。PS 中の無機成分は、塩酸処理、アルカリ処理、およびアルカリ－酸処理処理と減少し、アルカリ－酸処理において約 52％にまで除去することができた。特に、Ca の変化が顕著で、アルカリ－酸処理の場合、最終 PS の Ca 含量約 30％から 3％にまで減少させることができた。また、PS に存在する A（主に、カオリン由来）も最終 PS 含量約 32％から 13％にまで低減できたが、Si、Mg（主に、タルク由来）、Na（パルプ蒸解 NaOH 由来）に関しては、いずれの処理法も除去効果は低いことがわかった。

以上の結果より、製紙製造から発生する最終 PS は、多種多様な有機・無機成分を多く含むため、この中から繊維質を取り出すこと極めて難しい。本研究で開発したアルカリ－酸処理法は、アルカリ条件下で繊維質などに吸着している界面活性剤などの有機成分を除去でき、次の塩酸処理により、繊維質に吸着している Ca 塩を粗除去できる優れた前処理法である。アルカリ－酸処理法で使用
するアルカリおよび酸は、製紙製造事業所では、日常的に多量に使用している薬剤であり、入手も容易であるため実用化に向けても有利である。また、アルカリ－酸処理の酸処理工程において、高濃度のCa塩を含む廃液が回収でき、さらには製紙製造事業所にはCO₂発生源が多く存在していることから、この廃液から墳料として再利用できるCaCO₃を回収するプロセスを構築することは容易であると考えられる。

Fig.26 XRF 解析による各種処理ペーパースラッジ 灰中の無機成分含量

### 3.3 ペーパースラッジの加水分解の最適化

PS から効率よくエタノールを得るためには、PS 中に含まれる繊維質（セルロースおよびヘミセルロース）からグルコースおよびキシロースなどの発酵糖
を生成する糖化段階と、生成した発酵糖を発酵微生物によりエタノールへ変換する発酵段階の組合せ検討することが重要である。この逐次反応においては、一般に前者の繊維質の加水分解反応が律速であり、この反応の向上が生成エタノール量を左右する。一方、加水分解の触媒は、高価な酵素剤が必須であり、リグノセルロースからエタノールを製造させる際、この使用量を削減させることが実用化へ一つの鍵となっている。

Fig.27 は PS 中に含まれる繊維質が、セルラーゼにより加水分解される発酵糖であるグルコースおよびキシロースが生成されるメカニズムを示す。PS 中のの繊維質は、主鎖であるセルロースの束の横に、ヘミセルロースであるキシロースからなるペントースの糖鎖からなる。特に、セルロースの束は、強固な結

Fig.27 ペーパースラッジ中の繊維質の各種酵素による 加水分解のメカニズム
晶構造を有しており、これがセルロースの加水分解の妨げとなっている。この結晶性のセルロースは、Cellobiohydrolase（CBH）により、セルロースの末端から加水分解されるとともに、β-Gluconase（EGB）の作用により、ランダムに切断を受ける。また、キシロースからなる側鎖は、Xylanaseの作用により、ランダムに切断される。このようにしてセルロースおよびヘミセルロースは低分子化される。グルコース2分子からなるセルビオースは、最終的にはβ-Glucosidaseの作用により、発酵糖であるグルコースへ加水分解される。また、キシロース2分子からなるキシロビオースは、β-Xylosidaseの作用により非発酵糖であるキシロースへ変換される（キシロースは通常の発酵微生物である酵母などでは発酵できない）。我々が開発している糸状菌は、キシロースの発酵も可能である。繊維質の加水分解は、上記で述べたようにCBH、EGB、β-Glucosidase、Xylosidase、およびβ-Xylosidaseの作用による。迅速なセルロースの加水分解を達成させるためには各加水分解酵素の最適な成分比の最適化が必要になる。市販のセルラーゼ剤は、これらの酵素の複合剤であり、必ずしもPS中の繊維質を加水分解するために最適化されてはいない。

また PS は、パルプ蒸解工程や再生紙からの繊維質の蒸溶にアルカリ処理を施していることから、セルロース結晶構造の大半が既に壊されており、さらに、パルプ中のリグニンの大半を黒液という形で除去しているため優れた基質になると想定できる。しかし、3.1 節に示したように最終 PS は、繊維質以外の有機成分と填料成分である無機成分を多く含むことから、セルラーゼにより PS を直接加水分解することは難しいと考えられる。

そこで、PS 中の繊維質から発酵糖を得るためのセルラーゼ剤について検討した。初めに繊維質含量が多い抄紙テール（スクリーン）を基質として 6 時間の加水分解を行い、14 種類の市販セルラーゼ剤の生成還元糖量を比較した (Fig.27、
右上図)。市販のセルラーゼ剤は CBH、EGB、β-Glucosidase Xylobiose、およびβ-Xylosidase を含む混合物で有り、薬剤中の配合比や各酵素の比活性により、生成する還元糖量は異なる。加水分解反応の結果、基質乾燥重量当たり 0.05 から 0.35 g/g の還元糖が生成し、セルラーゼ剤によりその分解能は大きく異なることが判明した。特に、Meicellase (A)、Cellulase T “Amano” (B)、Cellulase Onozuka 3S (E)、Cellulase from Trichoderma viride (L)、Accellerase (N) の還元糖生成量が高いことがわかる。これら酵素剤の中で、セルロースをランダムにセロビオースにまで加水分解する endo-β-Glucoanase 活性が高く、非発酵性セルビオースから発酵糖グルコースを得るための β-Glucosidase 活性が高い 3 種類の酵素剤 B、E、および N を選択した。そこで、この 3 種類の市販の酵素剤を個々に用いて、

セルラーゼ剂
A	Meicelase
B	Cellulase T
C	Cellulase A
D	Cellulase Y-NG
E	Cellulase Onozuka 3S
F	Sumizyme AC
G	Sumizyme X
H	Sumizyme SNX
I	Pectinase G
J	Hemicellulase
K	Novozyme 188
L	Cellulase from Trichoderma viride
M	Vecelex
N	Accellerase 1500

Fig.27 市販のセルラーゼ剤による抄紙テールの加水分解と応答曲面法による酵素混合比の最適化
80 g/L の抄紙テールに対して 120 時間の加水分解反応を行った。使用した酵素剤の酵素タンパク質濃度は 1.0 g-protein/L とした。この酵素濃度は、一般のセルロース系バイオマスを酵素加水分解する際に用いる酵素濃度（15～30 PFU/g-Substrate）よりかなり低く 3.8～7.1 PFU/g であった。Cellulase T 、Cellulase Onozuka 3S、および Accellerase を使用した場合、反応 120 時間で生成したグルコース濃度はそれぞれ 28.1 、 44.6 、 31.6 g/L 、 また、キシロース濃度はそれぞれ 2.5 、 3.1 、 0.1g/L となり、酵素剤により発酵糖の生成量が大きく異なることがわかった。

そこで、これら市販の酵素剤を組み合わせた酵素カクテル剤を作成し、PSから発酵糖を最大限に生成させるための酵素混合比を検討した。具体的には、今回のように抄紙テールの加水分解に必要な酵素活性（特に、EGBおよび $ \beta $ -Glucosidase）を有する酵素剤を3種類選択した。次に、実験計画法（Design of Experiments, DOE）ソフトであるDesign Expert $ ^{\circledR} $ 8を用いて、酵素混合比につて実験計画を立てた。その計画にしたがって抄紙テールの加水分解実験を実施し、各配合比で加水分解を行ったときの結果を分析した。得られた分析結果に対して応答曲面法（Response Surface Methodology, RSM）を実施し配合比の最適化を実施した。実際に、実験計画法にしたがって先の3種類の酵素剤を用いて抄紙テールの加水分解反応を48時間行った。Fig.27（右下図）は実験計画法で設定された反応条件で加水分解反応を行い生成した発酵糖量（グルコース量＋キシロース量）を基に応答曲面を行い三次元で示した結果である。この結果から、Cellulase T:Cellulase Onozuka 3S:Accelleraseの混合比を、0.310：0.348：0.342としたときに、最大の発酵糖が得られると予測できた。そこで、この混合比で調製した酵素カクテル剤を用いて、80 g/Lの抄紙テールに対して120時間の加水分解反応を行った。このときの酵素量は、4.7
PFU/g-Substrate である。反応 120 時間で生成した発酵糖はグルコース 41.4 g/L、キシロース 3.32 g/L、セロトリオース 2.79 g/L、セロビオース 6.71 g/L となり、利用可能な可溶糖として合計 54.1 g/L を生成させることが示された (Fig.28)。

Fig.28 酵素カクテル剤を用いた抄紙テールの加水分解

この結果から、RSMは抄紙テールから少量のセルラーゼ剤を用いて効率よく発酵糖を得るために酵素混合比を決定するための有望な手法になることがわかった。さらに、本最適化法は、SSFプロセスによるセルロース系バイオマスからのエタノール生産において、加水分解速度の改善や使用酵素の削減などへ応用できると期待される。

そこで、次に RSM を活用した最終 PS の加水分解について酵素カクテル剤の最適化を試みた。基質濃度は、50 g-dry/L となるように調製した。本研究開発で使用した最終 PS は、先に述べたように水に懸濁すると pH 8.0 - 9.0 を示す。
そこで、1 M 塩酸を添加し懸濁液の pH を 5.0 程度まで下げた最終 PS を基質として 120 時間の加水分解反応を実施した。使用した市販のセルラーゼ剤は 13 種類で、加水分解時の濃度はすべて 1.0 g·protein/L とした。

Fig.29 は、各市販のセルラーゼ剤を用いて最終 PS を加水分解を行った時のグルコース、キシロース、およびセロビオース濃度の変化を示す。反応終了後生成したグルコース濃度は、Meicelase と Accellerase が高く約 4.0 g/L であった。また、キシロースの生成濃度は、いずれの酵素も低く、最大でも 0.5 g/L であった。さらに、セロビオース濃度は、Pectinase を使用した際反応液中に確認できなかったことから、β-Glucosiase の活性を有していることがわかった。

Fig.29 市販のセルラーゼによる最終ペーパースラッジの加水分解
以上の結果から、最終 PS の加水分解のためのセルラーゼ剤としてグルコース生成濃度と β-Glucosidase 活性の高い、Meicelase、Accellerase、および Pectinase を選択した。次に、3 種類の酵素剤混合比を DOE により 14 条件の混合比で調製した酵素ブレンド剤を用いて最終 PS の加水分解反応を 96 時間行い、生成した発酵糖（グルコース + キシロース）を元に RSM を用いて解析した（Fig.30）。その結果、Accellerase : Pectinase G : Meicelase の比が、1.907 : 0.710 : 0.384 の時、生成する発酵糖量を最大できることがわかった。そこで、この結果を元に調製した最適酵素カクテル剤を用いて 50 g-dry/L の最終 PS を用いて 96 時間の加水分解反応を行った（Fig.31）。その結果、加水分解反応は 48 時間目頃までス

Fig.30 最終ペーパースラッジの加水分解のための酵素剤の最適化適化
Fig.31 酵素カクテル剤を用いた未処理最終ペーパースラッジの加水分解

ムーズに進行し、その後、反応は緩やかになり反応96時間目に12.3 g/Lのグルコースを得ることができた。一方、キシロースの生成量は培養48時間以降1.2 g/Lとほぼ停止しすることがわかった。

これは、3.1 節で示したように最終 PS 中に含まれている Ca 塩と、反応液中に含まれている硫安 $ \mathrm{NH_4(SO_4)_2} $ が反応し、不溶性の $ \mathrm{Ca_2SO_4} $ （石膏）が生成したことが一因と考えられる。このような難分解性の物質が絡み合った繊維質を酵素反応により加水分解させることは難しく、さらに、石膏にセルラーゼが吸着し失活する可能性も否定できない。

そこで、先ず初めに、反応溶液成分を変更することによる石膏の生成抑制について検討した。SSFプロセスによるPSからのエタノール生産を想定し、酵素カクテル剤によるPS加水分解に反応液として培地成分を使用する。通常培地中