Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
の窒素源として硫安 $ (\mathrm{NH}_{4})_{2}\mathrm{SO}_{4} $ を使用している。この中に硫酸イオンを含んでいるため最終PS中のCaイオンと反応し石膏が生成することが懸念される。そこで、培地成分中の窒素源として $ (\mathrm{NH}_{2})_{2}\mathrm{CO} $ 、 $ NH_{4}Cl $ 、 $ HN_{4}NO_{3} $ 、 $ KNO_{3} $ 、および $ NH_{4}H_{2}PO_{4} $ を使用した。最適酵素カクテル剤を用いて50 g-dry/Lの最終PSとなるように窒素源の異なる培地中で96時間の加水分解反応を行った。窒素源として $ NH_{4}H_{2}PO_{4} $ を使用した時、加水分解反応は良好に進行し、反応96時間目に理論収量に匹敵するグルコース18.6 g/Lを得ることができた。さらにキシロースの生成量も向上させることを明らかにした。

次に第2の対策として、最終PSの前処理として、3.2節で開発したアルカリ酸処理法を開発した。Fig.32は、アルカリ－塩酸処理PSを加水分解した時の生成した発酵糖濃度の変化を示す。セルラーゼカクテル剤は、RSMを用いて計算した最適な酵素混合比Accellerase:Meicelase:Pectinase=1.393:0.943:0.664を用いた。50 g-dry/Lのアルカリ－塩酸処理PSを用いて、エタノール発酵を想定し、pH 5.5に調整した培地中で加水分解反応した実施した。アルカリ－酸処理PSの懸濁液は、緩衝作用が無く、容易にpH調整が可能であった。また、窒素源として、石膏の生成を防ぐためにNH4H2PO4を用いた。この加水分解反応96時間で、35.4 g/Lのグルコースを、5.6 g/Lのキシロースを得ることができた。この値は、アルカリ－塩酸処理PS中の繊維質が、80.8%が加水分解できたことを意味する。

以上の結果より、反応溶液中の成分である硫安をリン酸水素アンモニウムNH₄H₂PO₄へ変更する戦略1)では、最終PSから生成する発酵糖量を1.5倍向上させることができた。一方、最終PS中のCa塩を除去するアルカリ－酸処理法、戦略2)は、単独のセルラーゼ剤を用いて未処理の最終PSを加水分解したときに得られたグルコース濃度が120時間で3-4 g/Lであったことと比較して約10倍、
Fig.32 酵素カクテル剤を用いたアルカリ-酸処理 ペーパースラッジの加水反応

また、酵素カクテル剤を用いた最終 PS の加水分解において得られた発酵糖量を2.9倍向上させることができた。すなわち、戦略2)で行った最終 PS からのCa塩の除去は、最終 PS からセルラーゼにより発酵糖を得るためには必ず実施しなければならない前処理であることがわかった。本事業で開発したアルカリ－酸処理法により、最終 PS に含まれている繊維質から80%以上の収率で発酵糖を得ることができたことは、最終 PS をエタノールなどへ変換させるための第一段階を克服できたと考えられる。

### 3.4 エタノール発酵糸状菌の検索および同時糖化発酵プロセス

#### 3.4.1 ペーパースラッジからエタノールのためのエタノール発酵糸状菌

我々が新規に発見したエタノール発酵糸状菌 Mucor 属は、ソフトバイオマスであり稲わらからのエタノール生産菌として構築した菌株である。特に、Mucor
javanicus 株 51,52)は、好気条件下でグルコースからの効率的なエタノール発酵のみならず、通常の醸造製造に使用されている酵母 Saccharomyces cerevisiae やテキストの製造に用いられている発酵微生物 Zyomonas mobilis 53)では発酵が不可能なキシロースを高収率で発酵することができる。さらに、糸状菌であることからアミラーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼなどを分泌する特徴を有する高性能な発酵微生物である。そこで、PS からエタノールが製造できのるか、稲わらからのエタノール生産の結果を元に検証した。初めに、80 g-dry/L 抄紙テールを基質として、3.3 節で最適化したセルラーゼカクテル剤と M.javanicus 株を組み合わせた SSF プロセスを実施した (Fig.33)。その結果、培養初期より酵素による加水分解が進むと共に、エタノールが生産され始め、培養 120 時間目に 30.2 g/L のエタノールを得ることができた。このときのエタ

Fig.33 酵素カクテル剤とエタノール発酵糸状菌 Mucor javanicus を用いた同時糖化発酵によるエタノール生産
ノール発酵効率は86.3%、また、培養時間および培養体積当たりのエタノール生産量で示されるエタノール生産性は、0.25 g/L/hと極めて優れたエタノール生産能を示した。一方、最終PSからのエタノール生産に関しての能力は、全くの未知数である。3.1節で分析したように、最終PSの繊維質以外にもその他有機物質と填料成分である無機成分を大量に含む。また3.2節で示したように各種前処理方法により調製したPSに対して、それぞれ最適なセルラーゼカクテル剤が存在し、その種類および混合比により生成する発酵糖が異なる。さらに、我々のエタノール発酵糸状菌が一般の酵母と比較して、環境に対する耐性が強い $ ^{54)} $ ことが判明しているが、PSや前処理に使用した薬剤が、エタノール発酵糸状菌の生育阻害やエタノール発酵阻害物質を含む可能性は否めない。そこで、これらの問題を解決するために、本研究室の接合菌MucorライブラリーからPSの発酵に優れた菌株を新規にスクリーニングした（Fig.34）。調査したMucor属の菌種および近縁種合計84株である。50 g/Lの未処理の最終PSを基質として、発酵培地を調製した。培養液のpHは、HClを用いて強制的に5.5に調整した（発酵糸状菌にとって極めて劣悪な環境である）。その培地にセルラーゼ剤Acellulreaseを6.9 PFU/g-PSとなるように添加し、さらに保存スラントから各種菌株を植菌し、SSFプロセスを開始した。培養は嫌気条件下で28℃とし120 rpmの振盪で120時間行った。また、同時に、醸造用酵母S.cerevisiae Kyokai 7を用いて同様なSSFプロセスを行ったが、菌体の増殖は確認できず、さらにエタノールの生産も認められなかった。なお、Mucor属を用いた培養では、セルラーゼの反応により生成したグルコースとキシロースの培養液中の残存量と、エタノール発酵糸状菌により生成したエタノール量を比較した。その結果、エタノール生成量が高い菌株は、最終PSに対して耐性を有し、さらに、エタノール生産に対して阻害を受けていないことがわかった。その結果、Mucor circinelloides
Mucor属ライブラリーとセルラーゼ剤を組み合せた 最終ペーパースラッジの同時糖化発酵

Fig.34
f. griseo-cyanus NBRC 4563、Mucor circinelloides f. circinelloides NBRC 4572、Mucor circinelloides f. circinelloides NBRC 5382、Mucor circinelloides f. circinelloides NBRC 30470、Mucor circinelloides f. janssenii NBRC 6746、Mucor ambiguus NBRC 8092、Mucor recurvus NBRC 8093、および Mucor fragilis NBRC 9402 が 5 – 6 g/L のエタノールを生産できることが示された。これらの菌株の中で、特に、Mucor circinelloides f. griseo-cyanus NBRC 4563 株は、約 6.0 g/L のエタノール生産ができる優れた株であることが判明した。このときの培養条件は、最適化を行っていない培養環境であるにもかかわらず発酵効率は約 84% に達した。そこで以下の研究では、M. circinelloides NBRC 4563 を使用した。

#### 3.4.2 エタノール発酵糸状菌を用いた同時糖化発酵プロセスによるペーパースラッジからのエタノールの生産

100 g-dry/L の抄紙テールを基質として、3.3 節において確立した最適化した酵素カクテル剤と、M.circinelloides NBRC 4563（Fig.35）を組み合わせた SSF プロセスを実施した。SSF プロセスの概略を Fig.36 に示す。Fig.37 に示すこの培養結果から酵素反応により生成した発酵糖は急激に減少し、それと反対にエタノールは急激に生成され、培養 36 時間目には 20 g/L に達した。その後、徐々にエタノール生成量は増加し、培養 120 時間目に 30.0 g/L のエタノールに達した。このときの発酵収率は 93%、エタノール生産性は、0.25 g/L/h である。バイオマスからのエタノール生産においては、得られたエタノール濃度が 30 g/L 以上になることが、蒸留によるエネルギーコスト面の実用化の鍵となっている。この値をクリアーできたことは、発酵に関して実用化への第一歩になると考えられる。さらに、抄紙機から排出される抄紙テールの場合、湿潤抄紙テール 1 トン（81%水分含量）から約 57 kg（71.3 L）のエタノールを生成できることが示された。
Fig.35 エタノール発酵糸状菌 Mucor circinelliides NBRC 4563

Fig.36 エタノール発酵糸状菌と酵素カクテル剤により 同時糖化発酵プロセス
Fig.37 酵素カクテル剤とエタノール発酵糸状菌 M.circinelloides NBRC 4563 を用いた同時糖化発酵によるエタノール生産

この値は、本研究開発の目標値 50 kg をクリアーする有益な結果である。そこで、次に不純物質として有機物質および無機物質を含む最終 PS からのエタノール製造へ適応した。3.2 節において実施した各種処理により調製した PS に対して、抄紙テールの実験条件と同様にして SSF プロセスを実施した。Fig.38 は、未処理の最終 PS を基質として SSF プロセスを行った培養の結果である。基質濃度は 100 g-dry/L とした。未処理の PS の場合、培養 12 時間目まで酵素反応によりグルコースが生成し、その後減少した。一方、培養 12 時間目からエタノールは生産され始め、培養 72 時間目にエタノール 8.9 g/L に達した。この結果から、Mucor circinelliides NBRC 4563 株と最適化したセルラーゼカクテル剤を用いた SSF プロセスにより、未処理の最終 PS から直接エタノールが生成できることを実証した。しかし、この成果は、発酵効率 60% と高いものの、生産性は 0.111 g/L/h
と低く、実用化にはほど遠いことが示された。そこで、水洗浄法による前処理を行った PS を基質として同様に SSF プロセスを実施した。水洗浄法により、無機成分が若干低下するとともに繊維質含量は僅かに向上した。その結果、エタノールの生成速度は速くなったが、エタノールは培養 48 時間で未処理のものと同じ濃度（8.9 g/L）にしか達しなかった。このときの生産性は、0.172 g/L/h となり、未処理 PS を用いた SSF プロセスを実施したときの生産性を 1.55 倍へ向上させることができた。しかし、この処理法はエタノール生産量が少ないことが欠点である。

そこで、次に最終 PS 中の無機成分、特に Ca 塩を除去するために塩酸処理を行った PS を基質として、SSF プロセスを実施した。本前処理では最終 PS 中の無機成分、特に Ca 塩の除去が顕著であり、処理 PS 中の繊維質含量は 50% を上回った。培養 12 時間目まで酵素反応により グルコースが生成し、その後菌体の

Fig.38 酵素カクテル剤とエタノール発酵糸状菌 M.circinelloides NBRC 4563 を用いた未処理最終ペーパースラッジの同時糖化発酵
増殖とともに消費された。一方、エタノールは徐々に生産され、培養72時間目に17.8 g/Lまで生産されたこのときの発酵効率は69%、エタノール生産性は、0.242 g/L/hに達し、PSの前処理による無機成分の除去の効果が顕著であることが判明した。この培養の結果からPSに吸着している無機成分の除去は、セルラーゼ剤による加水分解の促進、さらに、エタノール発酵糸状菌の発酵効率の改善できることがわかった。

最後に、今回の研究開発で開発したアルカリ－酸処理により調製した最終PSのSSFプロセスの結果をFig.39に示した。本処理法により、PS中の繊維質に吸着している有機成分や無機成分を可能な限り除去することができる。この処理PSを用いてSSFプロセスを実施した結果、培養72時間目で、21.3 g/Lのエタノールを生産できた。このときの発酵効率は67％と、塩酸を用いた酸処理と比較してほぼ同等の値である。しかし、エタノール生産性は、0.295 g/L/hと未処理の最終PSを基質としたSSFプロセスの生産性を2.7倍向上できた。

Fig.39 酵素カクテル剤とエタノール発酵糸状菌 M.circinelloides NBRC 4563 を用いたアルカリ-酸処理ペーパースラッジの同時糖化発
このエタノール生産性は、無機成分をほとんど含まず、繊維質が豊富な抄紙テールからのエタノール生産濃度を上回る優れた値である。

湿润最終 PS 1 トン（54%水分含量）の乾燥物に対してにアルカリ－酸処理を実施した場合、無機成分の除去により処理 PS の乾燥物重量は初期の 56% に減少する。このとき得られる乾燥処理 PS の重量は $ (1,000 \times (1 - 0.54) \times 0.56 = 257.6 \, \text{kg}) $ である。この内、本処理により繊維質含量は 59.3% であるから、152.8 kg の繊維質が回収される。Fig.39 に示したように 100 g-dry/L アルカリ－酸処理 PS を基質として SSF を実施した結果、21.3 g/L のエタノールが生産できた。この結果は、処理 PS 257.6 kg-dry から $ (21.3 \, \text{g/L} \times 257.6 \, \text{kg-dty} \div 100 \, \text{g/L}) = 54.9 \, \text{kg} $ のエタノールが生産できたことを示す。この値は、本開発の設定値であるエタノール濃度 10 から 30 g/L に入り、さらに、湿润最終 PS 1 トンからエタノール生産量 50 kg を上回る。

#### 3.4.3 高温発酵型エタノール発酵糸状菌の開発

3.4.1. 項において PS からのエタノール生産に適したエタノール発酵糸状菌として M.circinelloides NBRC 4563 株を見出した。さらに、本菌株と最適化したセルラーゼカクテル剤を組み合わせた SSF プロセスにより、アルカリ－酸処理最終 PS からエタノールを効率良く生産できることが判明した。しかし、一般のセルラーゼ剤の至適温度は 40 - 50℃ であるが、一般のエタノール発酵微生物の増殖温度やエタノール発酵温度は 30℃ 前後であり、本菌株の最適培養培養温度も同様である。すなわち、SSF プロセスにおいて酵素加水分解の至適温度と微生物の最適発酵温度が異なるため、SSF プロセスは発酵微生物の至適培養温度で実施しなければならない。一般のエタノール発酵微生物でも 40℃ でエタノール発酵が実施できる株は、Kluyvermyces marxianus DMKU3-1042 $ ^{55)} $ など限られている。
現在、バイオマスからのバイオエタノール製造において、バイオマスの殺菌を必要とせず、さらに、SSFプロセスの際の加水分解速度を向上させるために、耐熱性菌株の開発が行われているが、未だに優れた菌株は見出されていない。また、本研究開発で得られたM.circinelloides NBRC 4563株は、36℃での発酵は可能だが、40℃では生育することすらできない。しかし、このような菌株に対して一般の変異法を用いても、耐熱性を有する変異株を得ることは極めて難しい。高温で発酵可能な菌株を得るためには、高温状態で菌体が増殖でき、さらにエタノール発酵に係わる酵素群の高温発現および活性化を可能とする広範囲な変異誘導が必要である。我々は、以前Mucor javanicus高キシロース発酵株を得た方法に準じて2.1.4項に示すオンビーム変異法によるM.circinelloides NBRC 4563株耐熱化を試みた。そこで、M.circinelloides NBRC 4563株に対してカーボンイオンビーム変異を実施し、40℃以上で生育できる菌株を3株得ることに成功した。Fig.40は、40℃寒天培地上での増殖の様子を示す写真である。40℃の寒天培地上でWild株は増殖できなかったが、変異株A（40℃増殖株）、B（44℃増殖株）、およびC（48℃増殖株）はすべて良好に増殖していることがわかる。

初めに、3種の変異株A、B、C株の28℃におけるグルコースおよびキシロースの発酵能を検討した。

さらに、Wild 株と Mutant A 株を用いて 50 g/L グルコースを 28、36、40℃で培養した結果を示す（Fig.41）。Wild 株は 40℃で増殖することができなかったが、Mutant A 株はすべての培養温度下で培養 24 時間に 22-23 g/L のエタノールを生産可能あった。すなわち、今回開発した Mucor circinelloides NBRC 4653 株の Mutant は、世界で初めて構築された 40℃以上発酵糸状菌である。現在、2 回目のイオンビーム変異を実施し、液体培地中 50℃以上で発酵可能な菌株の取得に成功している。
$$ 40^{\circ}C) $$

Fig.40 イオンビーム変異誘導により構築したエタノール発酵糸状菌 M.circinelloides NBRC 4563 変異株の 40℃での増殖

Fig.41 Wild 株およびMutant A 株を用いたグルコースのエタノール発酵(28, 36, 40℃)
この新規に構築した菌株を用いて、抄紙テールのSSFプロセスを実施した(Fig.42)。40℃の培養温度の場合、培養96時間目に32.4 g/Lのエタノールを生産することができた。この値は、Wild株を用いて28℃で同時発酵を実施した培養120時間目のエタノール濃度（30.2 g/L）と比較してさらに向上し、生産速度も速まることがわかった。次に、アルカリ－酸処理最終PSに対して40℃でSSFプロセスを実施した。Fig.43は、40℃でSSFプロセスを行った結果を表す。培養96時間目で23.1 g/Lのエタノールを生産でき、エタノール濃度および生産速度とも向上することがわかった。すなわち、SSFプロセスを40℃で実施できるエタノール発酵糸状菌を構築できたことから、本SSFプロセスは、PSの酵素加水分解反応および発酵素速度を向上できることが明らかとなった。

Fig.42 Mutant A 株を用いた 40℃での抄紙テールの同時糖化発酵
今回開発した高温発酵型エタノール発酵糸状菌は、PS のみならず、未利用のリグノセルロース物質からバイオエタノールを製造するための新規生体触媒としての応用が期待される。

Fig.43 Mutant A 株を用いた 40℃でのアルカリ－酸処理 PS の同時糖化発酵
### 4. 結論

本研究では、製紙製造業界において多くの問題を引き起こしている製紙廃棄物の削減および有効利用を目的として、主な廃棄物であるペーパースラッジ(PS)を原料として備蓄可能なバイオエタノールをさせるための新規な発酵技術の開発を行った。この開発を進めるために、下記の4サブテーマを実施し、

① PS の成分分析

② PS の前処理の確立

③ PS の加水分解物の最適化

④ エタノール発酵糸状菌を利活用した PS からのバイオエタノール生産以下の結論を得た。

① 製紙事業所から発生する最終 PS の繊維質含量は乾燥物基準で 14 - 18% がセルロース、約 7 - 10 がヘミセルロースであり、また、抄紙テール中の繊維質含量は約 47 - 48% がセルロース、約 17 - 18% がヘミセルロースであることがわかった。これらの結果から、PS はエタノールを生産させるためのバイオマス源として有望な資源であることがわかった。

② 最終 PS からエタノールを生産する際、酵素反応への阻害やび発酵阻害を引き起こすと考えられる無機成分（炭酸カルシウムなど）と繊維質以外の有機成分（界面活性剤、脱墨剤など）を除去する方法として、アルカリ－酸処理法を開発した。処理法により、最終 PS 中の無機成分を未処理の状態から約 52%にまで除去することができ、特に、カルシウム含量は未処理の場合の約 30%から 3%にまで減少させることができた。

③ 最終 PS および抄紙テールを効率良く加水分解させるために、各種酵素活
性を複合的に有す市販のセルラーゼ剤を組み合わせた酵素カクテル剤を調製することが必要である。そこで、実験計画法（DOE）を用いて決定し、その実験計画に従い加水分解実験を実施し、各配合比で加水分解を行ったとき生成した発酵糖量を求めた。得られた分析結果に対して応答曲面法（RSM）を実施し最適な酵素配合比を決定した。その結果、抄紙テールの場合、Cellulase T : Cellulase Onozuka 3S : Accellerase の混合比を、0.310 : 0.348 : 0.342 とした、また、アルカリ－酸処理最終PSの場合、Accellerase : Pectinase : Meicelase の比が、1.907 : 0.710 : 0.384 の時、生成発酵糖量を最大にすることができること予測できた。そこで、最適化した酵素カクテル剤を用いて、80 g/L の抄紙テールに対して120 時間の加水分解反応を行った結果、生成したグルコースは41.4 g/L、キシロースは3.3 g/L、セロトリオースは2.8 g/L、セロビオース6.7 g/Lと利用可能な可溶糖として合計54.1 g/L生成させることができた。同様に、最適な酵素カクテル剤を用いて50 g/Lの最終PSを用いて加水分解反応を行った結果、反応96 時間目に38.0 g/LのGlucoseを生成できた。

④ PS からエタノールを生産させるために、接合菌 Mucor ライブラリーから PS に対してエタノール発酵に優れた菌株のスクリーニングを実施した結果、Mucor circinelloides NBRC 4563 株を見出した。アルカリ－酸処理最終 PS に対して最適化した酵素カクテル剤と、M.circinelloides NBRC 4563 を組み合わせた SSF プロセスにより、50 g/L のアルカリ－酸処理 PS から培養 96 時間で 21.3 g/L のエタノールを生産できた。このアルカリ－酸処理 PS を基質とした SSF プロセスにより、湿潤最終 PS 1 トン (処理 PS 257.6 kg) から 54.9 kg のエタノールが生産できることが示された。

さらに、本研究でサブテーマに挙げていなかったが、本研究で見出したエタ
ノール発酵糸状菌 M.circinelloides NBRC4563 の機能向上を図り、エタノールの生産性を向上させるために、イオンビーム変異法を実施し $ 40^{\circ} $ C でエタノール発酵が可能な高温発酵株の構築を行い、有益な変異株を 3 株得た。本菌株を用いてアルカリ－酸処理最終 PS の SSF プロセスを行った結果、培養 96 時間で 23.6 g/L のエタノールを生産できることを実証した。
### 5. 参考文献

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(https://www.ecologyexpress.jp/content/trend/20120629trend.html).

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29) Ethanol production from Eucalyptus plantation thinnings, S. McIntosh, T. Vancouver, J. Palmer, M. Spain, Bioresour Technol., 110, 264-272 (2012).

30) Ethanol production from residual wood chips of cellulose industry: acid pretreatment investigation, hemicellulosic hydrolysate fermentation, and remaining solid fraction fermentation by SSF process., N. L. Silva, G. J. Betancur, M. P. Vasquez, E. B. Gomes, N. Pereira Jr., Appl. Biochem. Biotechnol., 163, 928-936 (2011).

31) Bioconversion of kraft paper mill sludges to ethanol by SSF and SSCF. L. Kang, W. Wang, Y. Y. Lee, Appl. Biochem. Biotechnol., 161, 53-66 (2010).

32) Ethanol production of semi-simultaneous saccharification and fermentation from mixture of cotton gin waste and recycled paper sludge, J. Shen, F. A. Agblevor, Biopro. Biosys.t Eng., 34, 33-43 (2011).

33) Effects of lignocellulose degradation products on ethanol fermentations of glucose and xylose by Saccharomyces cerevisiae, Zymomonas mobilis, Pichia stipitis, and Candida shehatae, J. P. Delgenes, R. Moletta, J. M. Navarro, Enzyme Microb. Technol., 19(3), 220-225 (1996).

34) Improved ethanol production by a xylose-fermenting recombinant yeast strain constructed through a modified genome shuffling method, W. Zhang, A. Geng,
Biotechnol. Biofuel., 5, 46-56 (2012).

35) Genetic engineering of Zymobacter palmae for production of ethanol from xylose, H. Yanase, D. Sato, K. Yamamoto, S. Matsuda, S. Yamamoto, K. Okamoto, Appl. Environ. Microbiol., 73 (8), 2592-2599 (2007).

36) Metabolic engineering of corynebacterium glutamicum for fuel ethanol production under oxygen-deprivation conditions, M. Inui, H. Kawaguchi, S. Murakami, A. A. Vertès, H. Yukawa, Microbiol. Biotechnol., 8, 243–254 (2004).

37) 新規エタノール発酵糸状菌を活用した稲わら等からの同時糖化発酵システムの開発、星野一宏, 米田英伸, 平成21年度バイオマスエネルキー等高効率転換技術開発(先導、要素)成果報告会, 予稿集, NEDO, p.292-293 (2009).

38) 新規エタノール発酵糸状菌を活用した稲わら等からの同時糖化発酵システムの開発、星野一宏，米田英伸，平成22年度バイオマスエネルキー関連事業成果報告会、燃料化およびリファイナリー技術開発，予稿集，NEDO，p.81-89(2011).

39) 新規エタノール発酵糸状菌を活用した稲わら等からの同時糖化発酵システムの開発、星野一宏，米田英伸，平成24年度 NEDI 新エネルギー成果報告会，バイオマスエネルギー利用技術の実用化に向けて，予稿集，NEDO, p.127-140 (2012).

40) Bioconversion of kraft paper mill sludges to ethanol by SSF and SSCF, L. Kang, W. Wang W, Y. Y. Lee, Appl. Biochem. Biotechnol., 161(1-8), 53-66 (2010).

41) Conversion of paper sludge to ethanol. I: impact of feeding frequency and mixing energy characterization, Z. Fan, L. R. Lynd, Biopro. Biosyst. Eng., 30, 27-34 (2007).

42) Bioconversion of paper sludge to biofuel by simultaneous saccharification and fermentation using a cellulase of paper sludge origin and thermotolerant Saccharomyces cerevisiae TJ14, J. Prasetyo, K. Naruse, T. Kato, C. Boonchird, S. Harashima, E.Y.Park, Biotechnol. Biofuel., 29(4), 35-41 (2011).

43) Consolidated bioprocessing of highly concentrated Jerusalem artichoke tubers for simultaneous saccharification and ethanol fermentation, L.Guo, J.Zhang, F.Hu, D.Dy Ryu, J.Bao., Biotechnol. Bioeng., 110(10), 2606-2615 (2013).

44) Endowing non-cellulolytic microorganisms with cellulolytic activity aiming for
consolidated bioprocessing, R. Yamada, T. Hasunuma, A. Kondo, Biotechnol Adv., 31(6), 754-63 (2013).

45) 遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律（平成15年6月18日法律第九十七号）.

46) Production of cordycepin by a repeated batch culture of a Cordyceps militaris mutant obtained by proton beam irradiation, M. Masuda, S. K. Das, S. Fujihara, M. Hatashita, A. Sakurai, J. Biosci. Bioeng., 111(1), 55-60 (2010).

47) Enzyme-aided alkaline extraction of oligosaccharides and polymeric xylan from hardwood kraft pulp, T. K. Hakala, T. Liitiä, A. Suurnäkki, Carbohydr. Polym., 93, 102-108 (2013).

48) 古紙スラッジのリサイクル、内山智幸、蓑鳩裕典、松嶋景一郎、尾谷賢、鈴木善人、野田良巳、北海道立工業試験場報告、No.298, 125-132 (1999).

49) Dynamics of water-soluble carbon substances and microbial populations during the composting of de-inking paper sludge., M. H. Charest, H. Antoun, C. J. Beauchamp, Bioresour Technol., 91(1), 53-67 (2004).

50) 担子菌を用いた脱リグニン処理法の開発による農産廃棄物の利用法の拡大に関する研究(K1818,K1931), 谷口正之, 星野一宏, 酒井謙二、平成19年度廃棄物処理等科学研究総合研究報告書, 環境省, p.150 (2008).

51) Production of biofuel from waste lignocellulosic biomass materials based on energy saving viewpoint, M. Takano, K. Hoshino, Adv. Mater. Dev. Perform., 6, 715–720 (2012).

52) Direct ethanol production from rice straw by coculture with two high-performing fungi, M. Takano, K. Hoshino, Front. Chem. Sci. Eng., 6, 139–145 (2012).

53) Fuel ethanol production from lignocellulose: a challenge for metabolic engineering and process integration, J. L. Zaldivar, J. Nielsen, L. Olsson, Appl. Microbiol. Biotechnol., 56(1-2), 17-34 (2001).

54) 製紙廃棄物からのエタノール製造方法、星野一宏、高野真希、特願 2013-200843 (2013).

55) High-temperature ethanol fermentation and transformation with linear DNA in the thermotolerant yeast Kluyveromyces marxianus DMKU3-1042, S. Nonklang, B. M.
Abdel-Banat, K. Cha-aim, N. Moonjai, H. Hoshida, S. Limtong, M. Yamada, R. Akada, Appl. Environ. Microbiol., 74(24), 7514-7521 (2008).
## 6 ．研究発表

### 6.1 論文発表及び学会発表

1) Direct bioethanol production from paper sludge by consolidated bioprocessing with new fusion cell of Mucor sp. K. Hoshino, M. Takano, 15th International Biotechnology Symposium and Exhibition (ISB2012), Daegu, Republic of Korea, September 16-21 (2012).

2) Bioethanol production from paper sludge using high-performing fungus, M. Takano, K. Hoshino, 15th International Biotechnology Symposium and Exhibition (ISB2012), Daegu, Republic of Korea, September 16-21 (2012).

3) Ethanol production from raw paper sludge by SSF with cellulases cocktail and ethanol-producing fungi, M. Takano, Y. Seto, K. Hoshino, 3rd International Cellulose Conference, Sapporo, Japan, October 10-12 (2012).

4) Mucor javanicus を用いた糖化発酵同時進行による未利用繊維残渣からのエタノール生産、高野真希、星野一宏、第 64 回日本生物工学大会, p.140, 神戸国際会議場、4Bp24、10/26 (2012).

5) エタノール発酵糸状菌を用いた同時糖化発酵によるペーパースラッジからのバイオエタノール生産、瀬戸裕介、高野真希、星野一宏、第64回日本生物工学大会、神戸国際会議場、4Ip01、10/26(2012).

6) 接合菌を用いた製紙廃棄物からの効率的エタノール生産, 高野真希、星野一宏、第76回化学工学会年会、大阪大学豊中キャンパス、J102、3/17(2013).

7) 糸状菌を用いたペーパースラッジ類からのバイオエタノールおよび乳酸の生産、瀬戸裕介、高野真希、星野一宏、東北大学川内北キャンパス、2C12p09、3/25 (2013).
8) エタノール発酵接合菌を用いたペーパースラッジからの直接バイオエタノール生産高野真希、星野一宏、東北大学川内北キャンパス、2C12p09、3/26 (2013).

9) 接合菌 Rhizopus oryzae と Cellulase を組み合わせた同時糖化発酵によるペーパースラッジからのエタノール及び乳酸の生産、瀬戸裕介、高野真希、星野一宏、セルロース学会第 20 回年次大会、京都大学宇治キャンパス、P086、7/18 (2013).

10) Rhizopus oryzae と Cellulase を組み合わせた同時糖化発酵によるペーパースラッジからの選択的な Ethanol および Lactate の生産、瀬戸裕介、高野真希、星野一宏、第 65 回日本生物工学大会、広島国際会議場、1P-202、9/18 (2013).

11) Mucor 属接合菌を用いた製紙廃棄物からの効率的エタノール生産、高野真希、星野一宏、第 65 回日本生物工学大会、広島国際会議場、2P-145、9/19 (2013).

12) Absidia 属糸状菌の酵母化およびエタノール生産への応用、飯田貴大、高野真希、星野一宏、第65回日本生物工学大会、広島国際会議場、3P-188、9/20、(2013).

13) Development of thermotolerant ethanol-producing fungus for bioethanol production from lignocellulose, K. Hoshino, M. Takano, M. Hatashita, Asian Congress on Biotechnology 2013 (ACB2013), New Delhi (India), PC02, 12/17 (2013).

14) Development of efficient ethanol production from paper sludge by ethanol-producing Mucor sp. M. Takano, K. Hoshino, Asian Congress on Biotechnology 2013 (ACB2013), New Delhi (India), PC3, 12/17 (2013).

15) Selective production of ethanol or lactate from paper sludge by SSF with Rhizopus oryzae, Y.Seto, M. Takano, K. Hoshino, Asian Congress on Biotechnology 2013 (ACB2013), New Delhi (India), PC5, 12/17 (2013).
16) Construction of yeast-like Abisidia sp. and its application on ethanol production, T. Iida, M. Takano, K. Hoshino, Asian Congress on Biotechnology 2013 (ACB2013), New Delhi (India), PC7, 12/17 (2013).

17) エタノール発酵接合菌を用いたアルカリ－酸処理ペーパースラッジからの効率的バイオエタノール生産、高野真希、星野一宏、日本農芸化学会2014年度大会、第65回日本生物工学大会、明治大学生田キャンパス、3A01a13、3/29(2014).
### 7. 知的財産権の取得状況

1) 製紙廃棄物からのエタノール製造方法、星野一宏、高野真希、特願 2013-200843.

2) 糸状菌を用いる木質系バイオマスからのエタノール製造方法、星野一宏、高野真希、特願 2013-202539.
### 9. 英文概要

# Development of Efficient Bioethanol Process from Paper Manufacture Waste by Using Ethanol-producing Fungi

エタノール発酵糸状菌を活用した製紙廃棄物からの効率的バイオエタノール製造法の開発

Kazuhiro Hoshino, Graduate School of Science and Engineering, University of Toyama, 3190 Gofuku, Toyama 930-8555, Japan

星野一宏、富山大学大学院 理工学研究部、930-8555 富山市五福 3190

Maki Takano, Graduate School of Science and Engineering, University of Toyama, 3190 Gofuku, Toyama 930-8555, Japan

高野真希、富山大学大学院 理工学研究部、930-8555 富山市五福 3190

## Abstract :

To achieve the production of bioethanol from paper sludge aiming at this reduction, the preprocessing method of paper sludge (PS) was investigated. In addition, the simultaneous saccharification fermentation (SSF) process combined with the optimized cellulase cocktail for saccharification of fiber in paper sludge and a new ethanol-producing fungus that has the resistance for raw PS was achieved. In particular, the alkaline-acid treatment method as a pretreatment method of removing organic components other than the mineral was first developed based on componential analysis of raw and pretmented PS. Next, the method for decision of the best mix ration of cellulase reagents for saccharification of PS was achieved by using Response