Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
Sustainable Stock-type Society"

13) 長谷川正利，大西暁生，奥岡桂次郎，戸川卓哉，谷川寛樹：土木学会論文集G(環境)，69，6，II_13-II_23（2013）

「持続可能な社会へ向けたCO₂排出量及びマテリアルストック・フローの将来分析一北陸三県の市町村を対象として」

14）田中健介，早川容平，奥岡桂次郎，杉本賢二，谷川寛樹：土木学会論文集G(環境)，69，6，II_15-II_34（2013）

「都道府県における建築物・社会基盤施設の経年マテリアルストック推計に関する研究」

15) Hou, W., H. Tanikawa: Journal of International Review of Civil Engineering, 4, 6 (2013) "The Material Consumption of the Wastewater Treatment Infrastructure in China: An Index Decomposition Analysis"

## <査読付論文に準ずる成果発表>

特に記載すべき事項はない。

## くその他誌上発表（査読なし）>

特に記載すべき事項はない。

## （2） 口頭発表（学会等）

1) Huang, T., F. Shi, H. Tanikawa, O. Higashi, H. Imura: 平成21年度土木学会中部支部研究発表会 (2009)

“Structural change of China’s economic output growth: 1997-2007”

2) 丸山紘史，山下睦，石峰，東修，谷川寛樹，井村秀文：平成21年度土木学会中部支部研究発表会 (2009)

「社会基盤ストックの充実による産業構造の変化の時系列産業連関分析」

3) 山下睦，丸山紘史，石峰，東修，谷川寛樹，井村秀文：平成21年度土木学会中部支部研究発表会 (2009)

「社会インフラストックの充実が社会変貌に及ぼす影響」

4) 前新将，深堀秀敏，大西暁生，東修，谷川寛樹，井村秀文：平成21年度土木学会中部支部研究発表会 (2009)

「都市の物質代謝推計を目指した建築物の平均使用年数の地理的分析—北九州市を対象としたケーススタディー」

5) 河村直幸，平川隆之，長岡耕平，東修，谷川寛樹，井村秀文：平成21年度土木学会中部支部研究発表会 (2009)

「建設資材投入の地域別傾向とCO₂排出量に関する研究」

6) Tanikawa, H., T. Hirakawa, S. Hashimoto, A. Onishi, H. Schandl, H. Imura: 2010 Gordon Conference on Industrial Ecology, New London, U.S. (2010)

“Sustainable urban metabolism scenarios for Japanese cities: A material stock analysis based on a four-dimensional GIS model”
7) Shi, F., H. Tanikawa, T. Hang, X. Tian, H. Imura: ISIE Asia-Pacific Meeting & ISIE MFA-ConAccount Meeting, Tokyo, Japan (2010)

“Study on materials and energy consumption in the Chinese Cement Industry”

8) Shi, F., H. Tanikawa, A. Onishi, T. Huang, H. Imura: The 9th International Conference on EcoBalance, Tokyo, Japan (2010)

“The Regional Analysis of Resource Productivity in China”

9) Huang, T., F. Shi, J. Fei, X. Tian, H. Tanikawa, H. Imura: The 9th International Conference on EcoBalance, Tokyo, Japan (2010)

“Input-output analysis and CO $ _{2} $ emission of construction sector associated with infrastructure development in China”

10) 荒川祐至,早川容平,石峰,谷川寛樹：環境情報科学学会第7回ポスターセッション (2010)

「都道府県における道路ネットワークの形成と産業構造の変化の関連性についての分析」

11）石峰，大西暁生，谷川寛樹，黃韜，森杉雅史，井村秀文：環境科学会2010年会 (2010)「中国の水資源におけるインフラ建設の影響に関する研究」

12) Tanikawa H.,: ISIE Island Industrial Ecology Meeting, Hawaii, U.S. (2011) "Material Stock Analysis of Building and Infrastructure"

13) Shi, F., H. Tanikawa, T. Hang, A. Onishi, X. Tian, H. Imura: 2011 Conference of the International Society for Industrial Ecology, Berkeley, California, USA (2011)

“Resource Productivity and Economic Development in China: A Factor Analysis at the Provincial Level”

14) Shi, F., H. Tanikawa, T. Hang, A. Onishi, H. Imura: The World Congress on Engineering and Technology (CET), Shanghai, China (2011)

“The Regional disparity of Resource Productivity and Economic Development in China”

15）田中健介，奥岡桂次郎，韓驥，白川博章，谷川寛樹：環境情報科学学会第8回ポスターセッション (2011)

「日本全国の橋梁の物質ストックの推計に関する研究」

16) 早川容平，韓驥，谷川寛樹：環境情報科学学会第8回ポスターセッション (2011) 「経年GISデータベースを用いた道路構造物の物質量推計に関する研究」

17) Shi, F., H. Tanikawa, T. Wang: MFA – ConAccount Section Conference 2012, Darmstadt, Germany (2012)

“Material Flow Analysis for Transport Infrastructure and Building Construction in China”

18) Tian, X., M. Chang, H. Tanikawa, H. Imura: MFA – ConAccount Section Conference 2012, Darmstadt, Germany (2012)

“Structural decomposition analysis of the growing $ CO_{2} $ emissions in Shanghai: a regional perspective”

19) Hou, W., H. Liang, J. Han, H. Tanikawa: MFA – ConAccount Section Conference 2012, Darmstadt, Germany (2012)

“Relationship Between Material Consumption And Land Use Change In China Based On Spatial
Information”

20) Tian, X., M. Chang, H. Tanikawa: The 3rd ISIE Asia-Pacific Meeting 2012 (2012) "Carbon Dioxide Emission Cost of Industrialization in China: A Case Study for Beijing"

21) Lwin, C.M., Y. Hayakawa, J. Han, H. Tanikawa, S. Hashimoto: The 10 $ ^{th} $ International Conference on EcoBalance 2012 (2012)

“Evaluation of Resource Efficiency and Prefectural Disparity of Roadway Material Stock and Flow towards a Countrywide Sustainability: A case Study in Japan”

22) Zheng, L., J. Han, K. Sugimoto, H. Tanikawa: 平成24年度土木学会中部支部（2013）

“Spatial Material Stock Analysis Using 4D-GIS: A Case Study in Tiexi District of Shenyang, China”

23）田中健介、奥岡桂次郎、韓驥、谷川寛樹：環境科学会2012年会（2012）「マテリアルストック勘定の視点からの資源生産性評価に対する検討」

24）早川容平、韓驥、白川博章、谷川寛樹：第40回環境システム研究論文発表会（2012）

「統計情報および地理空間情報を用いた建設資材ストック量の推計とその妥当性評価に関する研究-道路構造物におけるケーススタディ-」

25) Fishman, T., H. Tanikawa, H. Schandl: 第40回環境システム研究論文発表会（2012）“Establishment of a Model of Material Stock Saturation in Japan”

26）田中健介、奥岡桂次郎、韓驥、白川博章、谷川寛樹：第40回環境システム研究論文発表会(2012)

「都道府県における建築資材を対象とした投入量と供給量の整合性評価」

27) Lwin, C.M.: A Seminar on Low Carbon Society (2012)

“Evaluation of Net Additions to Stock and Gross Additions to Stock of Infrastructure in Japan with the aid of Material Flow and Stock Analysis”

28） 侯暁馨、梁涵珒、韓驥、谷川寛樹：第26回環境情報科学学術研究論文発表会（2012）

「中国の土地利用変化による建築マテリアル消費に関する研究 - 社会経済分析と地理空間分析を用いて」

29) Fishman, T. and H. Tanikawa: 平成24年度土木学会中部支部（2013) "A Scenario of Construction Material Balance in Japan"

30) 早川容平、杉本賢二、韓驥、白川博章、谷川寛樹：平成24年度土木学会中部支部（2013）「日本全国の社会基盤を対象とした経年ストックGISデータベース構築に関する研究」

31）田中健介、奥岡桂次郎、杉本賢二、韓驥、白川博章、谷川寛樹：平成24年度土木学会中部支部（2013）

「マテリアルストックの充実による地域の産業ごとの生産性変化」

32) 奥山聡俊志，田中健介，鬼頭祐介，奥岡桂次郎，谷川寛樹：平成25年度土木学会関西支部(2013)

「社会基盤の拡充による資源投入に対する生産性への影響評価」

33) H. Tanikawa : 2013 Conference of the International Society for Industrial Ecology, Ulsan, Korea (2013)

“Material Stock Analysis of Urban Infrastructures and Buildings”
34) Tian, X., M. Chang, H. Tanikawa : 2013 Conference of the International Society for Industrial Ecology, Ulsan, Korea (2013)

“Industrial structure change and associated impact on carbon dioxide emissions in China: A regional analysis”

35) Lwin, C. M., S. Hashimoto, H. Tanikawa : 2013 Conference of the International Society for Industrial Ecology, Ulsan, Korea (2013)

“Evaluation of Material Stocks for Infrastructure in Japan : Moving towards a Sustainable Stock-Type Society”

36) Hou, W., X. Tian, H. Tanikawa : 2013 Conference of the International Society for Industrial Ecology, Ulsan, Korea (2013)

“Material stock and dynamic flows associated with wastewater treatment Infrastructure construction in China”

37) 田中健介、奥岡桂次郎、杉本賢二、谷川寛樹：環境科学会2013年会（2013）「低物質社会に向けた資源蓄積量の生産性に関する研究」

38) 奥山聡俊志、奥岡桂次郎、杉本賢二、谷川寛樹：環境科学会2013年会（2013）「社会基盤の拡充による労働生産性への影響評価」

39) 長谷川正利、奥岡桂次郎、大西暁生、杉本賢二、谷川寛樹：環境情報科学学会第10回ポスターセッション (2013)

「建築物と道路の建設・維持管理における資材投入県単位の定量化」

40) 奥山聡俊志、奥岡桂次郎、杉本賢二、谷川寛樹：環境情報科学学会第10回ポスターセッション (2013)

「土砂系資源のマテリアルストック・フロー分析に用いる基盤情報の整備」

41) Maung, K. N., C. M. Lwin, K. Sugimoto, K. Okuoka, H. Tanikawa: ISETS'13 Conference, Nagoya, Japan (2013)

“Evaluation of Material Accumulation on Infrastructure Development and its Implications: An Empirical Case Study in Myanmar”

42) Martihnico-Perez, M. F. G., C. M. Lwin, K. Okuoka, H. Tanikawa : ISETS'13 Conference, Nagoya, Japan (2013)

“Development of Indicators for Economy-Wide Material Flow Accounts (EW-MFA) in the Philippines”

## （3） 出願特許

特に記載すべき事項はない。

## （4） シンポジウム、セミナーの開催（主催のもの）

1) 第2回「アジア太平洋地域における資源生産性の変化」環境システムワークショップ（2009年11月24日、名古屋大学環境総合館1階ホール、参加者約30名）

豪州連邦科学産業研究機構（CSIRO）で物質循環と社会科学を研究するSchandl博士を招き，アジア太平洋地域における資源循環とその資源生産性について議論を行った。
6) IFF・名古屋大学共同ワークショップ「Global Material Stock Collaboration Project」（2014年1月21日、アルペンアドリア大学、参加者約10名）

2) 第1回「北京師範大学-名古屋大学」ワークショップ

（2010年11月4日、名古屋大学環境総合館1階ホール、参加者約40名）

北京師範大学のChen教授と学生を招き、環境研究に関する意見交換会と次世紀に向けた我々の取り組みについて議論を行った。

3) 第2回「低炭素化・低物質化社会に関する研究シンポジウム」

（2010年11月4日、名古屋大学環境総合館1階ホール、参加者約50名）

豪州連邦科学産業研究機構（CSIRO）のSchandl博士と北京師範大学のChen教授を招き，アジア太平洋地域における低炭素化・低物質化について議論を行った。

4) 第2回「北京師範大学-名古屋大学」ワークショップ

（2011年11月25日、北京師範大学、参加者約20名）

第1回に引き続き、環境研究に関する意見交換会と次世紀に向けた我々の取り組みについて議論を行った。

5) 第3回「北京師範大学-名古屋大学」ワークショップ

（2012年9月26日、名古屋大学環境総合館1階ホール、参加者約20名）

第2回に引き続き、環境研究に関する意見交換会と次世紀に向けた我々の取り組みについて議論を行った。

## （５）マスコミ等への公表・報道等

特に記載すべき事項はない。

## (6) その他

特に記載すべき事項はない。

### 8 \. 引用文献

1) 国土交通省：建築統計年報、1966-2010.

2) 総務省統計局：日本統計年鑑、1946-2010.

3) 長岡耕平、谷川寛樹、吉田登、東修、大西暁生、石峰、井村秀文：全国都道府県・政令都市における建設資材ストックの集積・分布傾向に関する研究、環境情報科学論文集、23、83-88、2009.

4) 国土交通省：道路統計年報、1965-2010.

5) 国土交通省：铁道統計年報(民鉄統計年報・私鉄統計年報)、1965-2007.

6) 明野和彦、星野秀和、安藤暁史: 旧版地図を利用した時空間データの試作、国土地理院時報、99、89-102、2002.

7) 稲津亮、谷川寛樹、大西暁生、東修、石峰、井村秀文：複数年の空間情報を用いた都市重量の変化に関する研究—建築物・道路を対象とした和歌山市中心部でのケーススタディー、環
境情報科学論文集、23、89-94、2009.

8) 東岸芳浩、稲津亮、内藤瑞枝、谷川寛樹、橋本征二：都市構造物における経年的資材投入原単位の推計に関する研究、廃棄物学会研究発表会講演論文集、19、147-149、2008.

9) 中国行業標準JTG D40-2002，道路セメントコンクリート路面設計基準

10) 中国行業標準JTG D20-2006，道路設計基準

11) 中国行業標準JTG D50-2006，道路アスファルトコンクリート路面設計基準

12) 中国行業標準JTG/T B06-02-2007 道路工程予算定额（上）

13) 張興強 道路工程 北京交通大学出版社 2010.

14) 中国国家標準GB50090-99 鉄道線路設計規範.

15) TB10001-2005 鉄道路基設定規範.

16) TB10082-2005铁道轨道设计规范.

17) TB 2897-98 铁道碎石道床.

18) GB 50090-2006 铁道線路設定規範.
# Study on Reduction of GHG Emission Associated with Increasing Resource Consumption by Economic Development

Principal Investigator: Yuichi MORIGUCHI

Institution: The University of Tokyo

7-3-1 Hongo, Bunkyo-ku, Tokyo 113-8656, Japan

Tel: +81-3-5841-6237 / Fax: +81-3-5841-8534

E-mail: yuichi@env.t.u-tokyo.ac.jp

Cooperated by: National Institute for Environmental Studies, Ritsumeikan University, Nagoya University, Mizuho Information & Research Institute, Inc.

## Abstract

Keywords: Material flow analysis, Steel, Cement, Paper and paperboard, Mitigation technologies, Critical metals, Dematerialization, 3R(reduce, reuse, and recycle)

This study was undertaken to estimate future resource demand and $ CO_{2} $ emissions from the production of materials according to scenarios of infrastructure development, widespread use of durable goods, and enhanced consumption of consumer products based on economic development in Asian countries, as well as scenarios of popularization of low-carbon technologies in the world. The study estimated future supply and demand of resources and examined the possibility for a low-carbon society and the potential for balanced supply and demand through efficient and cyclic utilization of materials.

We developed material flow and stock models that can estimate demand for carbon-intensive materials such as steel, cement, and paper and paperboard, and $ CO_{2} $ emissions from the production of these materials. These models can be used for examining dematerialization policies such as reduction of product demand and reuse and recycling because they are bottom-up type models that can estimate $ CO_{2} $ emissions from production of materials based on demand for infrastructure, durable goods, and consumer products (stock demand and flow demand). The results obtained show that extension of the lifetime of infrastructure has a significant impact in terms of reducing $ CO_{2} $ emissions from material production.

We also developed system dynamics models that describe the coproduction of multiple metals. This makes it possible to analyze the effects of increased demand for minor metals required for low-carbon technologies on the supply and demand for other metals; namely, system-wide impacts. These models can therefore be used for examining
integrated environmental and resource policies. A case study simulation shows that the current gallium supply will not be able to meet the future demand for gallium required for copper indium gallium selenide (CIGS) solar panels. Recovery of gallium from alumina refinement plants needs to be more than tripled, although the recycling of gallium from solar panels can mitigate that effort.

We estimated energy consumption associated with international trade between 231 countries and regions. The results show that about 64% of global energy consumption induced by Japanese final demand is accounted for by household consumption. This indicates the importance of elucidating and managing energy consumption through the international supply chain of consumer products. Global GHG emission intensities for goods and services, which were estimated based on global energy consumption intensities, are now used as a database for SCOPE 3 estimation in the Green Value Chain Platform administered by the Ministry of the Environment, Japan (http://www.gvc.go.jp/).
## D−0801 非意図的な随伴侵入生物の生態リスク評価と対策に関する研究

（５）輸入動物に随伴するマダニ類の生態リスク評価に関する研究

国立感染症研究所

細菌第一部 第四室 川端寛樹

<研究協力者> 国立感染症研究所 安藤 秀二

国立感染症研究所 高崎 智彦

国立感染症研究所 西條 政幸

国立感染症研究所 高野 愛

国立感染症研究所 黑田 誠

国立感染症研究所 関塚 剛史

国立感染症研究所 椎野 禎一郎

国立感染症研究所 大西 真

国立感染症研究所 渡遼 治雄

大原綜合病院付属研究所 藤田 博己

愛知医科大学 角坂 照貴

山口大学 佐藤 宏

麻布大学 宇根 有美

麻布大学 島田 優一郎

国立環境研究所 五箇 公一

平成20～22年度合計予算額 18,500千円（うち、平成22年度予算額 5,500千円）

予算額は、間接経費を含む

[要旨] これまでに哺乳類等の輸入に随伴した病原体の国内侵入に関して、いくつかの研究がなされている一方、過去7年間で400万頭以上もの輸入実績がある爬虫類とその寄生マダニに関してはほとんど調査がなされていない。そこで2008年度は、爬虫類および寄生マダニを介した病原微生物の国内侵入実態を明らかにすることを目的とし、海外から輸入された爬虫類、およびスリランカの野生爬虫類から外部寄生ダニを採材し病原体検出、分離を行った。これら試験材料からは、新種ボレリア及びBorrelia turcica等のボレリア細菌を検出した。2009年度は国内への侵入・拡散の有無を調べる目的で、国内天然記念物であるセマルハコガメ寄生性のマダニについてサーベイランスを行った。これらマダニからは、輸入爬虫類から見出されたボレリア種と近縁のボレリア種が見出された一方で、海外からの持ち込みを示唆する知見は今のところ得られていない。他方、これらボレリアのマダニ体内動態解析を行い、本種ボレリアと近縁関係にあるヒト病原体回帰熱ボレリアが宿主転換をし、媒介宿主域を拡大させた可能性が明らかとなった。そこで2010年度には媒介宿主域拡大に関与した遺伝子同定のため、B. turcicaのゲノム同定と回帰熱ボレリアとの比較ゲノム解析を試みた。
[キーワード] 国際貿易、侵入種、爬虫類、マダニ、ボレリア、宿主転換

### 1. はじめに

微生物は、自然界での非人為的移動（鳥の渡りなど）によってこれまで拡散し、多様な生態系の中で適合、定着してきたが、20世紀以降、交通手段の発達、物資の輸出入の増大に比例して人為的な微生物移動が、急速に、頻繁になり、また通常は起こりえない遠距離の移動が起るようになってきた。近年では、SARSウイルスの感染者の航空機移動に付随した急速な多国間拡大なども報告される一方で、北米産プレーリードックの輸出に付随した野兎病菌の移動など、愛玩動物などの移動によっても、危険な病原体の移動も認められている。このような公衆衛生の観点から、本邦を含め世界各国で生物の輸入規制強化が図られてきている。加えて、アメリカではマダニ媒介性の感染症の一種、ウシ心水病病原体が爬虫類に寄生したマダニによってアフリカより侵入、定着し、畜産業に打撃を与えた事件がよく知られている(Burridge MJ，2002）。本邦でも、これら爬虫類等を含む野生動物の輸入に随伴した病原体保有マダニの侵入が見出されていることから、早急に、輸入動物随伴性の節足動物がもたらす、公衆衛生上および生態系へ与えるリスクの評価を行う必要がある。

そこで本研究では、本邦ではこれまで全く顧みられなかった、爬虫類等を含む輸入動物随伴性節足動物であるマダニとマダニ媒介性細菌等に焦点をあて、これらの随伴微生物について国内侵入の実態調査を第一に行う。調査で分離された微生物については実験的に生体への感染リスクについて評価を行う。さらに微生物が媒介宿主を拡大させる遺伝学的因子を、分子生物学的手法を用いて明らかにし、公衆衛生上および生態系へ与えるリスク拡大の可能性についても検証する。

### 2. 研究目的

・ペット用に大量輸入されている動物、特に輸入に関する法規制がほとんどない爬虫類に寄生するマダニ類の国内持ち込み実態を明らかにする。

・マダニの分類を行うとともに、それらが媒介する感染症病原体の保有状況を解明する。

・得られた病原体の系統解析を行い、サブテーマ1国立環境研究所と連携してデータベース化をはかるとともに、その病原学的特性を明らかにする。

・外来マダニ類および保有病原体の検出法を開発、マニュアル化を目指す。

・微生物の宿主転換に関する知見を得る。

## 3 ．研究方法

## （１）爬虫類、寄生マダニからのボレリアの検出

## 1 ）輸入爬虫類、寄生マダニからのボレリアの検出

本研究では、トーゴ、ガーナ、スーダン、ザンビア、マダガスタル、ウズベキスタン、スリナム、ロシア、ヨルダンから輸入された爬虫類、およびスリランカの野生爬虫類から外部寄生ダニを採材した（図1、2）。試験した輸入爬虫類（Testudo graeca など計17頭）を安楽殺後、皮膚、全血、心臓、筋肉、および膀胱を無菌的に採取しボレリア培養に使用した。寄生マダニは、解剖可能な成虫、若虫の生個体については実体顕微鏡下で解剖後、中腸組織、唾液腺、およびマダニ体液を含むその他の組織についてボレリアの培養、およびPCR法によるボレリアDNAの検出に使用し
図1．本研究で病原体検索に使用した輸入爬虫類、外部寄生虫種（輸出国別）
図2. ギリシャリクガメに寄生したイボマダニ（宇根有美博士のご厚意による）

解剖不可能な若虫、幼虫、または死個体についてはマダニ全組織からDNA抽出を行いPCR法によるボレリアDNAの検出に使用した。ボレリアの培養にはBSK培地を用い、34℃にて培養を行った。PCRのためのDNA抽出はDNA Tissue kit（キアゲン）をもちい、常法に従ってDNA抽出・精製を行った。PCRおよび増幅DNAの塩基配列決定に使用したプライマーは表1に示した。

表 1. 本研究で用いたボレリアの検出および増幅DNAの塩基配列決定に用いたPCRプライマ一一覧

増幅遺伝子	プライマ一名	塩基配列（5' -3'）	参考文献
Borrelia flaB	BflaPAD	GATCA(G/A)GC(T/A)CAA(C/T)ATAACCA(A/T)ATGCA	Sato et al.
BflaPBU、nest	GCTGAAGAGCTTGAATGCAACC
BflaPCR、nest	TGATCAGTTATCATTCTAATAGCA	1997
BflaPDU	AGATTCAAGTCTGTTTTGGAAAGC
Borrelia 16SrRNA	rrs-F1(3-26)	ATAACGAAGAGTTTGATCCTGGCT	In this study
rrs-F2(682-703)	GGTGTAAGGGTGGAATCTGTTG
rrs-R3(749-768)	TTTCGTGACTCAGCGTCAGT
rrs-R4(1542-1520)	AAAGGAGGTGATCCAGCC(A/G)CACT
Borrelia gyrB	gyrB 3'	GGCTCTTGAAACAATAACAGACATCGC	Schwan et al.
gyrB 5'	GGTTTATGAGTTATGTTGCTAGTAATATTCAAGTGC	2005
gyrB 5'+3	GCTGATGCTGATGTTGATGG
gyrB 5' NIID1	ATGA(A/G)TTATGTTGCTAGTAA(C/T)ATTC
gyrB 5'-1 NIID	GGACTTCATGG(A/T)GTTGG(A/T)ATTC
gyrB 3' NIID1	AG(C/T)GCATT(A/C)TG(C/T)TCAATAAATTCT
gyrB 3' NIID2	TC(C/T)TAAC(C/T)TCATC(C/T)TCTATT	In this study
gyrB 3' NIID3	AAGAA(G/C)T(C/T)CTAAC(C/T)TCATC
gyrB3'-1 NIID	TCAACATTAAGCAT(C/T)TT(A/C/G)CCCCA
gyrB3'-3 NIID	ACC(C/T)CTTGAAAAAGT(C/T)TGTC
Tick mt rrs	mtrrs(1)	CTGCTCAATGATTTTTTAAATTGCTGTGG	Ushijima et al. 2003

## 2 ）国内爬虫類寄生マダニからの病原体分離、検出

2009年度には西表島に棲息するリクガメよりカメキララマダニを採取し、1-1）に示した方法と
同様にボレリアの分離、検出を行った。西表島のリクガメの一部は天然記念物に指定されていることから、これらリクガメからの組織採取は行っていない。また文化庁より天然記念物現状変更許可を受けて調査研究は行われた（図3）。

図３．本研究で病原体検索に用いた西表島産マダニ（Amblyomma geoemydae）.

## （２）ボレリア株の遺伝学的解析

## 1 ）遗伭学的系統解析

得られたDNA配列はMEGA4ソフトウェアを用いた。CLUSTAL-W(Ver. 1.6)により配列を整列後(Open gap penalty=15、Gap extension penalty=6.66)、近隣結合法(NJ法)により系統樹を作成した。Bootstrap試験はKimura-2-parameterによる塩基置換モデルに基づき試行した。

## 2 ）16SrRNA遺伝子 - 23SrRNA遺伝子間の遺伝子構造

16SrRNA遺伝子－23SrRNA遺伝子間の遺伝子構造はライム病ボレリア、回帰熱ボレリアを区別する上で重要である。そこで本研究では、B. turcicaなど本研究で見いだされたボレリアについてこの領域の遺伝子配列をPCRダイレクトシークエンスにより決定し、回帰熱ボレリア、ライム病ボレリアと遺伝子構成について比較した。

## （3） ボレリアのマダニ体内分布

病原体ボレリアがマダニの唾液腺内部へ侵入することが吸血源動物への伝播に必須である。そこで本研究では、共焦点レーザー顕微鏡を用いマダニ唾液腺組織中のボレリアを蛍光免疫染色により検出するとともに、イメージング解析によりボレリアの唾液腺組織内での局在を調べることとした。方法はFisherら(Fisher 2005)に若干の変更を加えボレリア検出を行った。

## （４）病原体感染モデル
## 1 ）爬虫類モデル

ボレリアの爬虫類感染モデルは確立されていない。そこで本研究ではアメリカ国内での繁殖個体、ケゾメリクガメ（Geochelone sulcata、60-150g）を暫定的に感染モデルとして用いた。B. turcica 接種株としてはIST7株、Tick83S株、Tortoise4M1株もしくはTortoise5BL01株、Borrelia sp. GP typeとしてはTortoise13BL01株、Tortoise14H1株、Tortoise14M1株もしくはTortoise19S1株を用いた。これら分離株をBSK培地にて増菌後、1個体当り2×10³-1×10⁶Borrelia細胞を腹腔内に接種した。実験は2匹1群で行い、培地接種群、未接種群を陰性対照として用いた。

## 2 ）マウスモデル

マウス感染実験には回帰熱ボレリア、ライム病ボレリアの実験感染モデルであるC3H/HeNマウス（5週令♀）を用いた。接種株はIST7株、T14H1vir株clone 1、およびBF-17株を用いた。陽性対照としてBorrelia burgdorferi B31 clone 5A4株（感染性株）、陰性対照としてB. burgdorferi B31 clone 5A13株を用いた。B. burgdorferi B31 clone化株はテキサス大学Norris博士より分与を受けた。

## （５）パルスフィールド電気泳動法(PFGE)によるケゾメリクガメからの再分離株解析

PFGEはPeiら(Pei 2008)の方法に従って行った。ゲノムDNA切断には制限酵素BssHIもしくはMluIを用いた。

## （６）爬虫類より見出されるボレリアの特異的検出

上記、（２）２）１６SrRNA遺伝子－２３SrRNA遺伝子間の遺伝子構造解析から見出された爬虫類ボレリア特異的遺伝子を標的としたPCRプライマー（glvA-F:

5' -ATGGTACAAACAATGCAAAAGTTCGGAAGTGC-3', 14-F1: 5' -GGAAACTATAATTGCCCCAA-3' )を作成し、その感度および特異性を調べた。アニーリング温度は、57℃で行った。

## （７）爬虫類から見出されるボレリアのゲノム解析

パルスフィールド電気泳動法により、Borrelia turcica標準株であるIST7株のchromosomal DNAを分取し、物理的に断片化後、HiSeq（Illumina）を用いてde novoシークエンスを行った。得られた配列はcontig作成後、direct sequencingによりgap closingを行った。得られた完全長DNA配列はorf推定後それぞれについてblastPによる相同性検索を行った。またLipoP、TMHMMなどのアルゴリズム解析によりSignal peptidase切断箇所、膜貫通ドメイン数解析をおこなった。

## （８）リケッチア、エーリキア、アナプラズマ等ダニ媒介性細菌の検出

（１）で用いたマダニ材料を用い、Rickettsiae（Rickettsia属、Anaplasma属、Ehrlichia属）のDNA検出を試みた。Rickettsia属細菌の検出は17kDa抗原遺伝子-PCR（Anderson et al，1989），gltA-PCR（Mediannikov et al 2004）、ompA-PCR（Noda et al．1997）を用いた。またAnaplasma属細菌の検出はKimらの方法（Kim et al 2002）に従って行った。Ehrlichia属細菌の検出にはInayoshiらの方法（Inayoshi et al．2004）に準じて行った。

## （9） クリミア・コンゴ出血熱ウイルスの検出
（１）で用いたマダニ材料の内、RNAが回収できた11検体、およびリクガメ血液16検体をクリミア・コンゴ出血熱ウイルスゲノム検出に用いた。検体は、QIAamp Viral RNA Mini kit（QIAGEN）を用いてウイルスRNAを抽出後、Ready-To-Go RT-PCR Beads（GE Healthcare）を用いてRT-PCRを行った。5μlの抽出RNAをtemplateとし、各50pmolのプライマー（CCHF-F2とCCHF-R3）を計50μl（0.5mlチューブ）RT-PCR法を行った。逆転写は42℃30分、95℃5分、PCRの反応条件は35サイクルの（95℃30秒、52℃30秒72℃30秒）、72℃5分である。さらにPuReTaq™ Ready-To-Go PCR beads（GE Healthcare）を用いてnested-PCRを行った。1μlのRT-PCR産物をtemplateとし、各50pmolのプライマー（CCHF-F3とCCHF-R2）を計50μl（0.5mlチューブ）で上と同様の反応条件でPCRを行った。

## （１０）フラビウイルスの検出系作成と輸入検体からのウイルスゲノム検出

フラビウイルスNS5遺伝子内で保存されている領域に新規にprimerを設計し、デング出血熱ウイルス（4株）、日本脳炎ウイルス（2株）、ウェストナイルウイルス（2株）など蚊媒介性ウイルス7種12株、ダニ媒介性ウイルス3種3株を用い、感度を測定した。またこのプライマー(FVX7fおよびFVX12r)を用い、（1）で用いたマダニ材料の内、RNAが回収できた検体についてウイルスゲノム検出を試みた。

## （１１）輸入爬虫類より見出されたトリパノソーマ原虫の同定

ボレリア培地中に見出された輸入ヘビ血液由来トリパノソーマ原虫の同定を試みた。ボレリア細菌培養用のBSK培地4mlに0.1mlのボールパイソン血液を加えて32℃で静置培養していたところ、17日目から上鞭毛体の集合がみられるようになった。これら原虫を集め、定法によりDNAを抽出し、18S～5.8SリボソームRNA遺伝子(rDNA)、およびglycosomal glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 遺伝子(gGAPDH)について塩基配列を検討した。

## 4 ．結果・考察

## （１）輸入爬虫類および寄生マダニにおけるボレリア保菌率

本研究では、試験した17頭の輸入爬虫類のうち12頭でボレリア感染がみいだされた。Testudo属リクガメより分離されたボレリアはBorrelia turcicaと同定された。またGeochelone属リクガメより分離されたボレリアは、B. turcicaと類縁の新種Borrelia(Borrelia sp. GP-type)であった。これらボレリアはリクガメの皮膚組織のみならず血液から高率で分離された。このことはライム病ボレリア、回帰熱ボレリア同様、本ボレリアもリクガメ体内で菌血症を起こしていることを示している（図4）。また本ボレリアは筋肉、膀胱といった結合組織を多く含む部位からも分離されたことから、感染ボレリアはリクガメに全身感染を起こしていること、またライム病ボレリアと同様に、結合組織を含む臓器に何らかの因子を介して定着し、慢性の感染を引き起こしている可能性が考えられた。
図4. 自然感染リクガメの各臓器におけるボレリア分離陽性率

爬虫類寄生マダニとして Amblyomma latum, Amblyomma transversale, Amblyomma sparsum、

Amblyomma dissimile、Amblyomma trimaculatum、およびHyalomma aegyptiumが見いだされた。これらマダニのうち、A. dissimileを除く2属5種では，そのボレリア陽性率は、DNA検出、分離ともに60%以上であった。一方で、母数は少ないが、A. latumのボレリア陽性率は寄生動物種、輸入国などによって異なる可能性が考えられた。このことは動物輸出国、輸入動物種、また感染している微生物種の組み合わせによりその汚染率が異なる可能性を示唆している（図5）。
図5. 爬虫類寄生マダニのボレリアDNA陽性率

上記ボレリア細菌が外来性爬虫類および外来性マダニの侵入にともない国内侵入、定着している可能性が危惧されたことから、2009年度には天然記念物であるセマルハコガメ寄生性のカメキララマダニに焦点を絞り、病原体分離検出を試みた。その結果、西表島産リクガメ寄生のカメキララマダニ228個体中72個体より上記ボレリアに類似のボレリア(Borrelia sp. tAG)が検出された(表2)。

表2. 西表島でリクガメ寄生性マダニの各ステージにおけるBorrelia sp. tAG陽性率

Tick stage	Number of ticks	REP Borrelia (Borrelia sp. tAG) positive ticks $ ^{*1} $ (Prevalence, %)
Larva	124	31 (25)
Nymph	76	30 (39.47)
Male	7	3 (42.86)
Female	21	8 (38.1)
Total	228	72 (31.58)

## （２）ボレリア株の遺伝学的解析

## 1 ）house-keeping遺伝子による検出ボレリアとその系統解析

検出されたボレリアに関して、house-keeping遺伝子である16SrRNA遺伝子、鞭毛抗原遺伝子(flaB)、およびgyrase Bサブユニット遺伝子(gyrB)について塩基配列を決定し、各々の近縁関係を調べた。この結果から、本研究で見いだされた新種爬虫類由来ボレリア（GP-type、BF-type、ST-typeおよびtAG-type）はいずれもB. turcicaと類縁であり、B. turcicaとmonophyleticな一群を形成すること、またライム病群ボレリア、回帰熱ボレリアとは独立した一群であることから（図6および表
3）、我々は新型のボレリア、爬虫類ボレリア(REP Borrelia)の存在を提唱した。

図6. 16SrRNA(A)およびgyrB(B)による代表的な株による系統解析
表3. 16SrRNA、gyrB塩基配列による相同性一覧

A. Similarity matrix; 16SrRNA

B. turcica	Borrelia sp. GP-type	Borrelia sp. BF-type	Borrelia sp. ST-type
IST7	Tortoise14M1	BF-16	Tick98M
REP Borrelia
B. turcica	IST7 (AB473539)
Borrelia sp. GP-type	Tortoise14M1 (AB473533)	99.93%
Borrelia sp. BF-type	BF-16 (AB473538)	98.79%	98.72%
Borrelia sp. ST-type	Tick98M (AB473531)	98.99%	98.93%	99.40%
LD Borrelia
B. burgdorferi	B31 (AE000783)	97.32%	97.25%	96.78%	97.18%
RF Borrelia
B. hermsii	DAH (CP000048)	98.52%	98.59%	97.99%	98.05%

### B. Similarity matrix; gyrB

B. turcica	Borrelia sp. GP-type	Borrelia sp. BF-type	Borrelia sp. ST-type
IST7	Tortoise14M1	BF-16	Tick98M
REP Borrelia
B. turcica	IST7 (AB473535)
Borrelia sp. GP-type	Tortoise14M1 (AB473537)	95.80%
Borrelia sp. BF-type	BF-16 (AB473534)	87.04%	87.10%
Borrelia sp. ST-type	Tick98M (AB473536)	87.36%	87.79%	90.32%
LD Borrelia
B. burgdorferi	B31 (AE000783)	81.22%	81.22%	79.85%	79.89%
RF Borrelia
B. hermsii	DAH (AY597716)	87.16%	87.27%	84.47%	84.46%

## 2 ）16SrRNA遺伝子－23SrRNA遺伝子間の遺伝子構成の解析、およびmRNAの発現

これまで回帰熱ボレリアは16SrRNA遺伝子－23SrRNA遺伝子間領域に、ライム病ボレリアでは見いだされない、外来性因子であると考えられているhypoxanthine-guanine

phosphoribosyltransferase 遺伝子（hpt）、adenylosuccinate synthetase 遺伝子（purA）、および adenylosuccinate lyase 遺伝子（purB）を有していることが知られている。そこで本研究では B. turcica IST7株、および Borrelia sp. BF-typeのBF-16株について本領域の primer walking 法
によるダイレクトシークエンスを行い、その遺伝子構成を調べた。その結果、本ボレリアでは回帰熱の遺伝子構成に加え、新たにmaltose-6'-phosphate glucosidase 遺伝子（glvA）およびphosphotransferase system maltose-specific enzyme IICB component 遺伝子（glvC）の存在を見いだした（図7）。本遺伝子がボレリアにどのようなphenotypeを付与するのかについては不明である。hpt, purABは回帰熱ボレリアにおいてプリン体合成に関与し、結果として高レベルでのボレリア菌血症（10⁸ cells/ml）を引き起こすことが知られている。今回発見されたボレリアについても、爬虫類血液からボレリアが分離されたことから同様の機能を有している可能性が高い。またPCRおよびSouthern hybridization解析により、これら遺伝子群は今回見いだされたREP Borrelia群内で高度に保存されていると考えられた。

図7. 16SrRNA遺伝子 - 23SrRNA遺伝子間の遺伝子構造

## （３）マダニ体内でのボレリアの分布

本研究では共焦点レーザー頭微鏡を用い、唾液腺内に侵入したボレリアの観察を行った。実験に使用した唾液腺組織は、二房存在する唾液腺組織の内、一方でボレリアDNAが検出されたマダニを用いた。他方の唾液腺にてボレリアDNAが検出されたマダニ個体については、唾液腺組織内に侵入しているボレリア像が観察された。一方でボレリアDNAが検出されたマダニ個体では唾液腺組織ではボレリアが観察されなかった。このことは、ボレリアが唾液腺組織内へ侵入し、既に感染のための準備ができていること、すなわち本マダニがこれらボレリアの好適ベクターである可能性が強く示唆された（図8）。すなわち、これらマダニのみの移入によっても本ボレリアが国内侵入しうること、さらには本ボレリアに感受性のある国内棲息動物にこのマダニが吸血することでボレリア感染が引き起こされる可能性を示している。加えて2009年度では、国内で見出されたマダニについて脱皮前後でのボレリアの体内動態についても調べ、本ボレリアが、ライム病ボレリア同様、吸血個体においてのみ、唾液腺内に見出されることを明らかにした（図9）。
図8．マダニ唾液腺内ボレリア。矢印はボレリア（赤）、小三角は唾液腺小胞膜を示す。
図9. 吸血前後におけるマダニ唾液腺内のREP Borrelia（左は脱皮後のマダニ唾液腺、右は吸血後のマダニ唾液腺。赤はボレリアを示す。）

## （４）ボレリア感染実験

## 1 ）ケゾケリクガメを用いた感染実験

使用したボレリア株の内Tortoise14H1株、およびTortoise19S1株が接種リクガメより再分離された。またこれら株をclone化し再接種後、回収されたボレリアと合わせPFGE解析を行った。その結果これら再分離株は、PFGE解析により接種株と同様の制限酵素切断パターンを示したことから、これらボレリア株はケゾケリクガメに感染すること、また感染モデルになる可能性があることが明らかとなった（図10）。

## 2 ）マウス感染実験

ライム病ボレリア感染モデルは関節炎等の再現性が高いC3H/HeN マウスが頻繁に用いられている。また回帰熱ボレリアの菌血症モデルにもC3H/HeN マウスが用いられており、本ボレリアにおいてもC3H/HeN マウス感染モデルが適用できるか否かを評価した。しかしながら感染4週間後にはこれら爬虫類ボレリア接種マウスでは一部で抗体の上昇が確認されたものの、ボレリアは再分離されなかった。また関節炎等の症状も見いだされなかった。近年、吸血宿主へのボレリア感染には補体成分であるH因子結合タンパク質(BbCRASP、erpなど)が必要であり、さらには、これら因子によって動物種特異的な血清耐性が付与される可能性が示されている。本ボレリアについては、今後血清耐性を付与するボレリア遺伝子について検索を行うこと、またそれら遺伝子産物に対する生化学的アプローチがまずは必要であると考えられる。
図10. ケゾメリクガメ感染実験株と再分離株のPFGEによる解析

## （５）ボレリアのvector-switching

これまで、世界には回帰熱の原因となる回帰熱ボレリア群(B. hermsii, B. turicataeなど)とライム病の原因となるB. burgdorferi sensu latoが存在するとされていた。それぞれのボレリア群はOrnithodoros属（ヒメダニ）ダニなどの軟ダニ、硬ダニであるIxodes属マダニによって媒介されること、またそれぞれのボレリアと媒介マダニの間には特異性の高い関係が形成されていること（=vector competence）から、ボレリアは媒介マダニの進化とともに共進化してきたと考えられてきた。このため、発見当初は、本ボレリア群はBorrelia lusitaniae（ライム病群ボレリアの一種。硬ダニによって媒介され、トカゲを感染宿主とする）に近縁のボレリアと推定された。しかしながら、本研究で発見された爬虫類群ボレリアは各種遺伝子の解析からB. lusitaniaeと擬似