Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
Pseudonocardia sp. D17株のゲノム上にはthmA遺伝子（コードする酵素：soluble di-iron monooxygenase alpha subunit）が2つ、thmD遺伝子（コードする酵素：feredoxin-NAD(+) reductase）が7つ、thmB遺伝子（コードする酵素：methane/phenol/toluene hydroxylase）が4つ、thmC遺伝子（コードする酵素：monooxygenase component MmoB/DmpM）が4つ存在しており、ゲノム上での位置を見てみると、それらの中でクラスターを形成しているものが2組存在していた（thmADBC；プローブID：0861～0864および6260～6263）。これらの中で、プローブID：0861～0864が全て強発現していることが観察されたため、それらに該当するthmクラスターが1,4-ジオキサン分解時に強発現していることが示唆された。すなわち、Pseudonocardia sp. D17株においても、既に報告されている誘導型1,4-ジオキサン分解菌P. dioxanivorans CB1190株と同様に、thmクラスターが1,4-ジオキサンの初発酸化に関与していることが示唆された。他方、P. dioxanivorans CB1190株は誘導型の1,4-ジオキサン資化菌であるのに対して、我々が保有するPseudonocardia sp. D17株は構成型の1,4-ジオキサン資化菌であり、分解様式が異なっている。そこで、両菌株における遺伝子発現の相違点について調査を行った。その結果、P. dioxanivorans CB1190株では、thm遺伝子群の近傍に存在し、GntRファミリーの転写調節因子をコードすると推定される遺伝子がthm遺伝子群と同程度発現しているのに対して、Pseudonocardia sp. D17株においては同遺伝子のS/N比は僅か（2.875）であり、thm遺伝子群に比べて発現量が非常に小さいことが観察された。また、Pseudonocardia sp. D17株のゲノム解析結果から、この遺伝子の上流に別の制御因子をコードすることが推定される遺伝子（carR）も存在していた。これらのことから、詳細については更なる検討が必要であるものの、制御因子における差異がP. dioxanivorans CB1190株とPseudonocardia sp. D17株での分解様式の差異につながっている可能性が考えられた。

1,4-ジオキサン分解過程におけるPseudonocardia sp. D17株の遺伝子発現状況について更なる知見を得るため、マイクロアレイ発現解析②を実施した。その結果、グルコースで前培養したPseudonocardia sp. D17株は、1,4-ジオキサンおよびエチレングリコールに対して、図(2)-8の分解挙動を示した。そこで、0時間（1,4-ジオキサン曝露前）、21時間後（1,4-ジオキサンを約50%、エチレングリコールを約10%分解した時点）、51時間後（1,4-ジオキサンを90%分解した時点）の培養液からRNAを抽出し、マイクロアレイ発現解析を行った。マイクロアレイ発現解析①において1,4-ジオキサン分解に関与することが明らかになったthmクラスターに着目して、発現量の時間変化および基質の違いによる発現量の差異を調べることにした。なお、マイクロアレイ発現解析①ではプローブID：0861～0864のみが強発現することが観察されたが、ここでは、プローブID：0861～0864と6260～6263の両方について調査することにした。マイクロアレイ発現解析の結果を図(2)-9に示す。わずかに例外は含まれているものの、全ての調査遺伝子において、分解基質の種類（1,4-ジオキサン／エチレングリコール）や1,4-ジオキサンへの曝露の有無、1,4-ジオキサン分解状況に関係なく、発現量は類似していた。この結果はPseudonocardia sp. D17株による1,4-ジオキサン分解が構成的に生じていることを示すものと考えられた。すなわち、本発現解析の結果から、Pseudonocardia sp. D17株が構成型1,4-ジオキサン分解菌であることが遺伝子発現レベルで確認することができた。
表(2)-6 マイクロアレイ発現解析①におけるPseudonocardia sp. D17株による1,4-ジオキサン分解時に強発現したプローブ（遺伝子）

プローブID	シグナルノイズ比	推定タンパク質	遺伝子名
0368	2214	Transglycosylase associated protein
6516	1672	Short-chain dehydrogenase/reductase SDR
2755	682	Transcription factor WhiB
0820	504	NLP/P60 protein
5968	498	IstB domain-containing protein ATP-binding protein
7537	468	Nitrilotriacetate monooxygenase FMN-dependent oxidoreductase
0864	372	Monooxygenase component MmoB/DmpM	thmC
0863	286	Methane/phenol/toluene hydroxylase	thmB
5884	276	Ferredoxin--NAD(+) reductase	thmD
0859	218	Ethyl tert-butyl ether degradation EthD
4108	212	Amidase
0860	194	Betaine-aldehyde dehydrogenase
0862	186	Ferredoxin--NAD(+) reductase	thmD
0861	184	Soluble di-iron monooxygenase alpha subunit	thmA
7547	178	Regulatory protein ArsR
5815	168	D-lactate dehydrogenase
5650	156	Short-chain dehydrogenase/reductase SDR
2857	152	Hydroxyacid-oxoacid transhydrogenase
6262	152	Methane/phenol/toluene hydroxylase	thmB
図(2)-8 グルコースで前培養したPseudonocardia sp. D17株による1,4-ジオキサンおよびエチレングリコールの分解挙動

図(2)-9 マイクロアレイ発現解析②における、Pseudonocardia sp. D17株による1,4-ジオキサンおよびエチレングリコールの分解前および分解中のthm遺伝子群の発現状況
## 4 ）1,4-ジオキサン分解菌の定量的モニタリングツールの開発

1,4-ジオキサン分解菌のモニタリングツール（real-time PCR法）を開発するため、まず初めに文献調査により関連情報の収集を行った。特定の系統分類に属する細菌群のみを特異的に検出するPCRシステムとして、Pseudonocardia属の16S rRNA遺伝子を特異的に検出するものが存在したが $ ^{20} $ 、検討1)の結果から、1,4-ジオキサン分解能はPseudonocardia属細菌に共通する性質ではないことが明らかになったことから、同PCRシステムは1,4-ジオキサン分解菌のモニタリングツールには利用できないものと判断された。そこで、1,4-ジオキサンの分解に関与する遺伝子群を検出するPCRシステムについて調査を行った。検討3)のマイクアレイ発現解析の結果から、1,4-ジオキサンの分解にはSDIMO遺伝子が関与していることが明らかになったため、SDIMO遺伝子に対するPCRシステムを調査したところ、SDIMO遺伝子に含まれる可溶性メタン／プロパン／トルエン等のモノオキシゲナーゼ遺伝子を標的とするもの $ ^{21} $ と、より幅広いSDIMO遺伝子まで検出可能なもの $ ^{14)} $ が存在することが明らかになった。環境中の1,4-ジオキサン生分解ポテンシャルや1,4-ジオキサン分解菌の多様性のモニタリングを行うためには、関連する遺伝子を網羅的に検出することが望ましい。そこで、Colemanらが開発した幅広いSDIMO遺伝子を網羅的に検出できるPCRシステム（SDIMO遺伝子網羅的検出システム） $ ^{14)} $ が、環境中の1,4-ジオキサン分解菌および1,4-ジオキサン生分解ポテンシャルのモニタリングツールとして有用であると考えられた。

他方、サブテーマ（3）の浄化実証試験において使用するPseudonocardia sp. D17株の挙動を特異的かつ定量的に解析するためのモニタリングツールの開発を試みた。検討3)のマイクロアレイ発現解析の結果から、Pseudonocardia sp. D17株による1,4-ジオキサンの初発酸化反応にはthm遺伝子群（thmADBC）が関与していることが示唆されており、また、1,4-ジオキサン分解メカニズムが詳細に調査されているP. dioxanivorans CB1190株において、グリオキシル酸分解経路が1,4-ジオキサン分解の下流反応を担っていることが報告されている $ ^{19} $ 。そこで、thm遺伝子群およびグリオキシル酸分解関与遺伝子群を対象として定量モニタリングツール（real-time PCRシステム）を開発することとした。

Pseudonocardia sp. D17株のドラフトゲノムデータからthm遺伝子群およびグリオキシル酸分解関与遺伝子群の塩基配列を特定し、研究開発方法に記した手順に従って各候補遺伝子配列を検出対象としたreal-time PCRプライマーの設計して、特異性の検証ならびに検出感度に関する実験的検討を行った結果、表(2)-7に示しているmonooxygenase component MmoB/DmpMをコードすると推定されるthmC遺伝子を検出対象としたPCRプライマーがPseudonocardia sp. D17株を最も特異的かつ高感度に検出可能であることが明らかになった。ただし、Primer-Blast検索の結果から、ここで開発したPCRプライマーにおいても、Pseudonocardia sp. D17株に加えて、THF分解菌であるPseudonocardia sp. ENV478株、Rhodococcus sp. YYL株、Pseudonocardia sp. K1株、1,4-ジオキサン分解菌であるP. dioxanivorans CB1190株のthm遺伝子を同時に検出する可能性が明らかになった。このため、環境試料への適用においては、バックグラウンドでのPCR増幅が起こらないことを事前に確認しておく必要があると考えられた。
表(2)-7 Pseudonocardia sp. D17株の定量モニタリングのためのreal-time PCRシステム

標的遺伝子	thmC遺伝子（NODE_28_length_17400_cov_346.055328_154[9758 - 9375]（reverse sense））
フォワードプライマ一配列	5'-TGATTATGTGGGGCTGGTTATG-3'
リバースプライマ一配列	5'-CGAGGAAAGTTGTGTTCGTGATG-3'
増幅断片長	107 bp
Real-time PCR反応条件	95℃ 1分×1サイクル{95℃ 30秒、62℃ 30秒、72℃ 30秒}×32サイクル融解曲線作成 60-95℃

また、開発したPCRプライマーを用いたreal-time PCRの条件について実験的検討を行った結果、表(2)-7に示す条件において、最も特異的かつ高感度に定量化能であることが明らかになった。そこで、real-time PCRによる定量解析に使用するスタンダード（Pseudonocardia sp. D17株ゲノムから得られたPCR増幅産物をプラスミドpTAC-1に挿入したもの）を調製し、増幅効率等について検討した。その結果、増幅効率は94.6%～104.7%、検量線のダイナミックレンジは6オーダー、相関係数 $ r^{2} $ は0.994～0.999であり（n=4）、定量モニタリングツールとして十分な性能を有すると判断された。そこで、サブテーマ（3）で実施する浄化実証試験におけるPseudonocardia sp. D17株の举動解析には、ここで開発したPCRプライマーとスタンダードを用いたreal-time PCRを使用することとした。

## 5 ）分解菌挙動と浄化性能を予測するための数値モデルの構築と、開発したモニタリングツールの有用性検証

1,4-ジオキサン分解菌を網羅的に検出するためのモニタリングツールとして選出したSDIMO遺伝子網羅的検出システム $ ^{14)} $ の有用性について検証した。他のサブテーマにおいて、ジェチレングリコールが1,4-ジオキサン分解菌の選択的増殖に有効である可能性が示された。そこで、1,4-ジオキサン汚染サイトより土壌試料（調査サイトでは1,4-ジオキサン汚染の自然浄化はほぼ生じていないことから、1,4-ジオキサン分解に関与するSDIMO遺伝子を保有する微生物はわずかしか存在しないと想定される）を採取し、ジェチレングリコールを添加した無機塩培地中で土壌を培養して、その培養による1,4-ジオキサン分解菌の増殖を上記のSDIMO遺伝子網羅的検出システムによって評価することができるかを調査した。7種類の土壌試料における培養開始時および6日間培養後のSDIMO遺伝子の検出結果を図(2)-10に示す。培養開始時でもSDIMO遺伝子に由来する420 bpのPCR増幅産物が検出されたが、一部の試料を除いてバンド輝度が非常に低かった。他方、ジェチレングリコールを添加して6日間培養した結果、全ての土壌試料において培養開始時よりもバンド輝度が高くなることが観察された。以上の結果から、予想通り、調査した土壌試料中にはSDIMO遺伝子保有菌はごく僅かしか存在していないが、ジェチレングリコールを用いた培養により、ごく僅かなSDIMO遺伝子保有菌が増殖することが確認され、本研究で用いたSDIMO遺伝子網羅的検出システムは、1,4-ジオキサン分解菌のモニタリングツールとして有用であることが示された。そこで、汚染土壌中に存在するSDIMO遺伝子の多様性を把握するため、ジェチレングリコールで培養していない元の土壌試料中のSDIMO遺伝子を次世代シーケンス解析に供した結果、各試料から約54000
〜78000程度の配列を取得することができた。

他方、上記の検討4)において開発したPseudonocardia sp. D17株の定量モニタリング手法（real-time PCR法）の有用性を明らかにするため、同手法による定量値と、濁度（OD_{600}測定値）およびアクリジンオレンジを用いた直接計数法による定量値との関係について調査した。その結果、real-time PCR法による定量値は、濁度の測定結果および直接計数法による定量値のいずれに対しても高い相関を有することが明らかになり（図(2)-11）、定量モニタリング手法として有用であることが示唆された。real-time PCR法による定量値は直接計数法の定量値よりも1オーダー低くなったが、これはDNA抽出効率等による影響であると考えられた。しかし、現在使用しているDNAテンプレート調製法は事前検討において最もDNA抽出効率の高い方法であることから、real-time PCR法の定量値の向上は容易ではないと判断された。このため、real-time PCR法による定量値と図(2)-11(B)に示されている相関関係を基にして菌体濃度に換算する方法が現実的であると考えられた。これを踏まえてサブテーマ（3）において実施した浄化実証試験における浄化の成否とPseudonocardia sp. D17株の菌体濃度との関係について検討した結果、バイオリアクターを用いた処理の場合、10^{5} cells/mlオーダーでも浄化は可能であるが、より安定した浄化を達成するためには10^{6} cells/ml以上の必要であるものと推察された。

図(2)-10 ジェチレングリコールを用いた培養前後における

7種類の土壌試料中のSDIMO遺伝子の検出結果

レーンM, 100 bp DNA ladder ; レーンP, 陽性コントロール (Pseudonocardia sp. D17株) ; N, 陰性コントロール (DNAなし) ; 前, 培養前 ; 後, 培養6日後
(A)

(B)

図(2)-11 異なる手法を用いた Pseudonocardia sp. D17 株の定量結果の相関関係 A，濁度と real-time PCR 定量値の関係；B，直接計数と real-time PCR 定量値の関係
## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

1,4-ジオキサン生分解に関する既往研究では、環境試料より1,4-ジオキサン分解菌（資化菌および共代謝菌）が分離され、その分離特性等の特徴づけが行われてきた。本研究でも、複数の環境試料から新規1,4-ジオキサン分解菌の探索を試み、分解菌ライブラリを拡充するとともに、系統分類学的に多様な細菌が1,4-ジオキサンを分解できる可能性を示した。また、これまでに分離された1,4-ジオキサン分解菌が多く含まれている系統分類に着目して、Pseudonocardia属およびRhodococcus属に分類される細菌の1,4-ジオキサン分解（資化、共代謝）能を網羅的に調査し、両属の1,4-ジオキサン分解（資化、共代謝）能について新規の知見を得ることができた。

他方、1,4-ジオキサンの生分解機構の分子レベルでの解明は、世界でもごく僅かな分解菌でしか試みられてこなかったが、本研究により、構成型1,4-ジオキサン資化菌Pseudonocardia sp. D17株による1,4-ジオキサンの初発酸化にthmクラスターが関与することを強く示唆する結果が得られ、同菌株による1,4-ジオキサン分解機構の解明に向けて重要な知見を得ることができた。また、この知見を利用して、Pseudonocardia sp. D17株のthmC遺伝子を標的とするreal-time PCRシステムをデザインし、浄化実証試験における同菌株の举動を特異的かつ高感度に定量モニタリングするツールを開発することができた。これまでの知見から、本定量モニタリングツールに使用したthmC遺伝子は1,4-ジオキサン分解菌が一般的に保持しているものと考えられるため、使用するPCRプライマ一配列の微調整や反応条件の変更等により、Pseudonocardia sp. D17株以外の1,4-ジオキサン分解菌の検出にも応用することも可能である。

さらに、thm遺伝子を含むSDIMO遺伝子を標的としたPCRシステムにより、環境中の1,4-ジオキサン分解ポテンシャルをある程度評価可能であることを明らかにし、汚染現場に応じたバイオレメディエーション技術の選択に資する診断ツールの開発のある程度達成することができた。

以上のことから、本研究では、今後のバイオレメディエーション技術の開発ならびに実施において大いに貢献する1,4-ジオキサン分解菌モニタリング技術の基盤が構築できたものと言える。

## （２）環境政策への貢献

## ＜行政が既に活用した成果＞

特に記載すべき事項はない。

## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

本研究により、系統分類学的にも分解様式的にも多様な1,4-ジオキサン分解菌のライブラリを構築することができた。また、汚染現場の1,4-ジオキサン生分解性ポテンシャルの評価、ならびに浄化過程における分解菌の挙動把握に必要となるモニタリングツールを整備することができた。これらの成果と、他のサブテーマで得られた成果を併せて、多様な汚染現場に対応可能な、低コストで環境基準値を達成できる1,4-ジオキサン汚染対策技術パッケージを整備することができた。本汚染対策技術パッケージは、国内で既に発生している、あるいは今後発見される1,4-ジオキサン汚染環境の迅速かつ適切な浄化を強力に支援するものであり、1,4-ジオキサン汚染問題にかかる環境政策に大いに貢献し得ると考えられる。
なお、本研究の成果を1,4-ジオキサン汚染問題の解決に速やかにつなげていくため、本研究により得られた成果の学術雑誌への論文の公表、国内および海外の学会における発表、ならびに報道等を活用した一般向けの発表を積極的に進め、広く情報発信に努めてきた。今後も、得られた研究成果の早期公表によって、成果の広報と普及に努めていく予定である。

## 6 ．国際共同研究等の状況

特に記載すべき事項はない。

## 7 ．研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

## <論文（查読あり）>

1) K. SEI, M. OYAMA, T. KAKINOKI, D. INOUE and M. IKE: J. Water Environ. Technol., 11, 1, 11-19 (2013)

“Isolation and characterization of tetrahydrofuran-degrading bacteria for 1,4-dioxane-containing wastewater treatment by co-metabolic degradation”

## <査読付論文に準ずる成果発表>

特に記載すべき事項はない。

## くその他誌上発表（査読なし）>

1) （株）オフィス東和編：排水污水处理技術集成 Vol.2、エヌ・ティー・エス社、95-101 (2013) 「第2編 処理技術研究の最前線 第1章 生物処理技術 第2節 1,4-ジオキサン分解菌を用いた汚染水の生物処理・浄化技術の可能性（執筆担当：清和成、池道彦）」

2) 山本哲史，斎藤祐二，井上大介，清和成，黒田真史，池道彦:環境浄化技術、13(5),15-19(2014)「1,4-ジオキサン汚染地下水の生物浄化技術」

## （2） 口頭発表（学会等）

1) K. SEI, M. OYAMA, T. KAKINOKI, D. INOUE and M. IKE: Water and Environment Technology Conference 2012 (WET2012), Tokyo, Japan (2012)

“Isolation and characterization of tetrahydrofuran-degrading bacteria for 1,4-dioxane-containing wastewater treatment by co-metabolic degradation”

2) 福ヶ迫久仁衛、池道彦、清和成、井坂和一：日本水処理生物学会第49回大会（2012）「包括固定化分解菌を用いた低濃度1,4-ジオキサンの処理」
3) 山本哲史、斎藤祐二、池道彦、清和成、井上大介: 第16回日本水環境学会シンポジウム (2013) 「1,4-ジオキサン汚染地下水の生物浄化に関する研究」

4) K. SAWADA, D. INOUE, T. TSUNODA, M. MORITA, M. IKE, and K. SEI: Water and Environment Technology Conference 2014 (WET2014), Tokyo, Japan (2014)

“Evaluation of the 1,4-dioxane biodegradation potential of Pseudonocardia spp. and Rhodococcus spp.”

5) K. SAWADA, D. INOUE, T. TSUNODA, Y. AOKI, M. KURODA, M. IKE, and K. SEI: $ 9^{th} $ IWA International Symposium on Waste Management Problems in Agro-Industries (AGRO'2014), Kochi, Japan (2014)

“Identification of 1,4-dioxane degradation genes of Pseudonocardia sp. D17 by microarray expression analysis”

6) 井上大介、角田翼、関雅仁、澤田和子、森田雅恵、池道彦、清和成：第51回環境工学研究フォーラム（2014）

「Pseudonocardia属細菌およびRhodococcus属細菌の1,4-ジオキサン分解ポテンシャルの評価」

8) 山本哲史，斎藤祐二，井上大介，清和成，黒田真史，池道彦：第51回環境工学研究フォーラム (2014)

「1,4-ジオキサン汚染地下水の生物処理技術」

## （3） 出願特許

1) 1,4-ジオキサン分解菌の培養方法に関する特許を出願中

## （４）「国民との科学・技術対話」の実施

1) 第60回青森・岩手県境不法投棄現場の原状回復対策協議会（主催：岩手県、2014年3月15日、二戸地区合同庁舎大会議室、一般傍聴者15名）にて実証試験の中間報告

2) 2014地球環境保護 土壌・地下水浄化技術展（東京ビッグサイト西ホール、平成26年10月15-17日、参加者18,877人）にて研究内容の展示・紹介

## （５）マスコミ等への公表・報道等

1）岩手日報（2013年5月26日）「県境産廃不法投棄土壌浄化の進行を確認」

2) デーリー東北（2013年5月26日）「県境産廃 N 地区順調に汚染浄化」

3) 大成建設ホームページ プレスリリース（2013年5月26日）「コストを大幅減、1,4-ジオキサンの生物浄化技術実証試験へ」

4) 日経産業新聞（2013年7月11日）「汚染水浄化コスト1/10 大成建設など 岩手・青森県境で実証」

5）日刊建設産業新聞（2013年7月12日）「分解菌で1,4-ジオキサン净化 CO₂とコスト大幅減」

6) 建設通信新聞（2013年7月18日）「ジオキサン汚染の生物浄化技術 効果確認 ランニングコスト AOPの1/10」

7) フジサンケイビジネスアイ（2013年7月22日）「生物浄化技術の実証試験」
8) 月刊建築技術（2013年10月号、株式会社建築技術）「1,4-ジオキサンの生物浄化技術実証試験ヘ」

9) 建設通信（2014年10月16日、朝刊、3頁）「大成建設バイオ浄化を加速 迅速、安価に無害化」

10) 環境新聞（2014年10月21日、5頁）「1,4-ジオキサン 排水処理にも光明」

## (6) その他

1) WET Excellent Paper Award (K. SEI, M. OYAMA, T. KAKINOKI, D. INOUE and M. IKE: Isolation and characterization of tetrahydrofuran-degrading bacteria for 1,4-dioxane-containing wastewater treatment by co-metabolic degradation, 2012年6月30日, Japan Society on Water Environment)

2）日本水処理生物学会第49回大会ベストプレゼンテーション賞（福ヶ迫久仁衛、池道彦、清和成、井坂和一：包括固定化分解菌を用いた低濃度1,4-ジオキサンの処理,2012年11月25日，日本水処理生物学会）

3）日本水環境学会 平成25年 論文奨励賞（廣瀬賞）（清和成：Isolation and characterization of tetrahydrofuran-degrading bacteria for 1,4-dioxane-containing wastewater treatment by co-metabolic degradation, 2014年6月10日，日本水環境学会）

### 8 \. 引用文献

1) C.D. ADAMS, P.A. SCANLAN, N.D. SECRIST: Environ. Sci. Technol. 28, 11, 1812-1818 (1994)

“Oxidation and biodegradability enhancement of 1,4-dioxane using hydrogen peroxide and ozone”

2) K. KOSAKA, H. YAMADA, S. MATSUI, K. SHISHIDA: Water Sci. Technol. 42, 7-8, 353-361 (2000) “The effects of the co-existing compounds on the decomposition of micropollutants using the ozone/hydrogen peroxide process”

3) K. SEI, T. KAKINOKI, D. INOUE, S. SODA, M. FUJITA, M. IKE: Biodegradation, 21, 4, 585-591 (2010) "Evaluation of the biodegradation potential of 1,4-dioxane in river, soil and activated sludge samples"

4) K. SEI, K. MIYAGAKI, T. KAKINOKI, K. FUKUGASAKO, D. INOUE, M. IKE: Biodegradation, 24, 5, 665-674 (2013) "Isolation and characterization of bacterial strains that have high ability to degrade 1,4-dioxane as a sole carbon and energy source"

5) Y.-M. KIM, J.-R. JEON, K. MURUGESAN, E.-J. KIM, Y.-S. CHANG: Biodegradation, 20, 4, 511-519 (2009) “Biodegradation of 1,4-dioxane and transformation of related cyclic compounds by a newly isolated Mycobacterium sp. PH-06”

6) P. KÄMPFER, R.M. KROPPENSTEDT: Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 54, 3, 749-751 (2004) "Pseudonocardia benzenivorans sp. nov."

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8) D. BERNHARDT, H. DIEKMANN: Appl. Microbiol. Biotechnol., 36, 1, 120-123 (1991) “Degradation of dioxane, tetrahydrofuran and other cyclic ethers by an environmental Rhodococcus strain”

9) B. SUN, K. KO, J.A. RAMSAY: Biodegradation, 22, 3, 651-659 (2011) “Biodegradation of 1,4-dioxane by a Flavobacterium”
10) S. VAINBERG, K. McCLAY, H. MASUDA, D. ROOT, C. CONDEE, G.J. ZYLSTRA, R.J. STEFFAN: Appl. Environ. Microbiol., 72, 8, 5218-5224 (2006) “Biodegradation of ether pollutants by Pseudonocardia sp. strain ENV478”

11) S. MAHENDRA, L. ALVAREZ-COHEN: Environ. Sci. Technol., 40, 17, 5435-5442 (2006) "Kinetics of 1,4-dioxane biodegradation by monooxygenase-expressing bacteria"

12) K. SEI, M. OYAMA, T. KAKINOKI, D. INOUE, M. IKE: J. Water Environ. Technol., 11, 1, 11-19 (2013) "Isolation and characterization of tetrahydrofuran-degrading bacteria for 1,4-dioxane-containing wastewater treatment by co-metabolic degradation"

13) M. LI, S. FIORENZA, J.R. CHATHAM, S. MAHENDRA, P.J.J. ALVAREZ: Water Res., 44, 9, 2894-2900 (2010) “1,4-dioxane biodegradation at low temperatures in Arctic groundwater samples”

14) N.V. COLEMAN, N.B. BUI, A.J. HOLMES: Environ. Microbiol. 8, 7, 1228-1239 (2006) “Soluble di-iron monooxygenase gene diversity in soils, sediments and ethene enrichments”

15) T. KORESSAAR, M. REMM: Bioinformatics, 23, 10, 1289-1291 (2007) “Enhancements and modifications of primer design program Primer3”

16) A. UNTERGASSER, I. CUTCUTACHE, T. KORESSAAR, J. YE, B.C. FAIRCLOTH, M. REMM, S.G. ROZEN: Nucleic Acids Res. 40, 15, e115 (2012) “Primer3 - new capabilities and interfaces”

17) J. YE, G. COULOURIS, I. ZARETSKAYA, I. CUTCUTACHE, S. ROZEN, T.L. MADDEN: BMC Bioinformatics, 13, 134 (2012) “Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction”

18) M. GOODFELLOW, A.L. JONES, L.A. MALDONADO, J. SALANITRO: Syst. Appl. Microbiol. 27, 1, 61-65 (2004) "Rhodococcus aetherivorans sp. nov., a new species that contains methyl t-butyl ether-degrading actinomycetes"

19) A. GROSTERN, C.M. SALES, W.Q. ZHUANG, O. ERBILGIN, L. ALVAREZ-COHEN: Appl. Environ. Microbiol., 78, 9, 3298-3308 (2012) “Glyoxylate metabolism is a key feature of the metabolic degradation of 1,4-dioxane by Pseudonocardia dioxanivorans strain CB1190”

20) R. MORÓN, I. GONZÁLEZ, O. GENILLOUD: Int. J. Syst. Bacteriol., 49, 1, 149-162 (1999) “New genus-specific primers for the PCR identification of members of the genera Pseudonocardia and Saccharopolyspora”

21) Y.-H. KIM, K.-H. ENGESSER, S.-J. KIM: Environ. Microbiol., 9, 6, 1497-1510 (2007) "Physiological, numerical and molecular characterization of alkyl ether-utilizing rhodococci"
# （３）１,４-ジオキサン汚染サイトにおける１,４-ジオキサン浄化実証試験

大成建設株式会社技術センター

斎藤 佑二・山本 哲史

平成24～26年度累計予算額：32,168千円（うち、平成26年度予算額：13,610千円）

予算額は、間接経費を含む。

## [要旨]

1,4-ジオキサンによる地下水汚染は、我が国だけでなく諸外国においても報告されている。これらの汚染には、1,4-ジオキサンだけでなく、重金属や揮発性有機化合物等による複合汚染を引き起こしている事例が多く見受けられる。本研究で用いるPseudonocardia sp. D17は、これらの複合汚染の環境下においても1,4-ジオキサンを分解できる能力を有していることが明らかとなった。そこで、Pseudonocardia sp. D17を用いた生物浄化技術実証試験を岩手・青森県境不法投棄現場にて実施した結果、実汚染地下水を環境基準値（0.05mg/L）未満まで浄化できることが明らかとなった。

一方で、1,4-ジオキサン分解菌を用いた地下水浄化では、安定的な処理を実施するために分解菌の菌体量を保持することが重要である。特に、立ち上げ初期においては、他の微生物も存在する環境下おいて1,4-ジオキサン分解菌を優先化させる必要がある。そこで、Pseudonocardia sp. D17の培養に適した炭素源としてジェチレングリコールを選定し、開放系での培養手法を確立した。この培養手法を用いることにより、地下水揚水処理に必要な1,4-ジオキサン分解菌の菌体を容易に作成できるだけでなく、他の微生物の共存下でもジェチレングリコールを添加することで、特異的にPseudonocardia sp. D17を優先化することが可能である。

以上の検討より、Pseudonocardia sp. D17を用いた地下水揚水処理の性能を確認でき、1,4-ジオキサン汚染地下水の新たな浄化手法の可能性を示した。また、ジェチレングリコールを用いた培養手法は、Pseudonocardia sp. D17だけでなく、自然環境中に存在している1,4-ジオキサン分解菌を活性化、増殖できる可能性がある。そのため、バイオオーグメンテーションやバイオスティミュレーションといった原位置浄化への適用が期待できる。

## [キーワード]

複合地下水污染、不法投棄現場、促進酸化法、生物淨化、優先化

### 1. はじめに

大阪大学が保有する Pseudonocardia sp. D17 は、1,4-ジオキサン分解酵素を常時生産している構成型資化菌である。構成型資化菌は、極低濃度の 1,4-ジオキサンも分解可能であると考えられており、環境基準値未満までの浄化が期待できる。そこで、本研究では、Pseudonocardia sp. D17 を用いた生物浄化技術に関する検討を実施した。

## 2 ．研究開発目的

本研究では、Pseudonocardia sp. D17を用いた地下水揚水処理技術の確立を目的として研究を実施した。具体的には、国内外にける1,4-ジオキサン汚染サイトの文献調査を実施することで、汚染
サイトの特徴を整理した。さらに、それらの汚染サイトの特徴を踏まえ、浄化技術の確立に向けた課題を抽出し、実験的な検討を行った。さらに、実浄染サイトにて生物浄化実証装置を設置し、その性能を評価した。

### 3. 研究開発方法

## （１）１,４-ジオキサン汚染サイトの調査

## 1 ）国内外における1,4-ジオキサン汚染

文献及び公開されている資料等を基に国内外の1,4-ジオキサン汚染について整理した。

## 2 ）実地下水を用いた生物浄化の可能性検討

国内の某汚染サイトにおける1,4-ジオキサン汚染地下水を用いて、生物净化の可能性の評価を実験的に行った。試験では、汚染サイトにて採水した地下水に栄養塩類を加えてpH7.3に調整した後、Pseudonocardia sp. D17の植菌液をOD $ _{600} $ が0.03になるように添加して、28℃にて回転振盪(120 rpm)を行った。サンプリングは適宜行い、溶液中の1,4-ジオキサン濃度をヘッドスペースGC/MSにて測定した。尚、栄養塩類の組成は、無機塩培地Fに準じたが、濃度はその値の1/4とした。

## 3 ）生物浄化実証試験に向けた基礎的情報の取得

1,4-ジオキサンの生物分解において影響を及ぼす可能性のある因子について整理し、フラスコ試験にて実験的に確認した。

## a）共存する汚染物質が1,4-ジオキサン分解に及ぼす影響

重金属などの汚染物質が1,4-ジオキサンの分解に及ぼす影響を調査することを目的として試験を行った。汚染物質には、ヒ素、ホウ素、フッ素、及び鉛を選定し、供試試薬としてヒ酸カリウム、ホウ酸、フッ化ナトリウム及び硝酸鉛を用いた。試験では、1,4-ジオキサン濃度を50 mg/Lとした100 mL無機塩培地Fに所定濃度の汚染物質を添加した後、Pseudonocardia sp. D17の植菌液をOD_{600}が0.03になるように加え、28℃にて回転振盪(120 rpm)を行った。適宜サンプリングを行い、溶液中の1,4-ジオキサン濃度を測定した。

## b) 模擬汚染地下水を用いた1,4-ジオキサン分解試験

実環境から採水した汚染地下水に栄養塩類を加えてpH7.3に調整した後、1,4-ジオキサンを添加して模擬汚染地下水(1,4-ジオキサン濃度：10 mg/L)を作成した。ここでの栄養塩類の組成は無機塩培地Fに準じたが、濃度はその値の1/4とした。作成した模擬汚染地下水100 mLにPseudonocardia sp. D17の植菌液をOD_{600}が0.03になるように加えて、28℃にて回転振盪(120 rpm)を行った。適宜サンプリングを行い、溶液中の1,4-ジオキサン濃度を測定した。

## （２）生物浄化実証試験に関する検討

### 1 ）実汚染地下水へのPseudonocardia sp. D17の適用評価

岩手・青森県境不法投棄現場内の実汚染地下水を用いて、Pseudonocardia sp. D17による分解試験を行った。試験では、水処理施設の原水槽より採取した地下水に栄養塩類を加えてpH7.3に調整した後、Pseudonocardia sp. D17の植菌液をOD_{600}が0.03になるように添加して、28℃にて回転振盪
(120 rpm)を行った。サンプリングは適宜行い、溶液中の1,4-ジオキサン濃度を測定した。尚、栄養塩類の組成は、無機塩培地Fに準じたが、濃度はその値の1/4とした。

## 2 ）生物净化美证試驗

## a）生物浄化実証装置について

岩手・青森県境不法投棄現場の水処理施設建屋内に図(3)-1に示したフローの実証設備を設置し、試験を行った。既設の原水槽へ揚水した地下水は、一旦原水タンクで貯留された後、生物浄化槽へ送液される。生物浄化槽では、Pseudonocardia sp. D17によって1,4-ジオキサンの分解がなされた後、膜分離ユニットによって地下水のみを処理水タンクに移送し、一時貯留タンクにて貯留される。貯留された処理水中の1,4-ジオキサン濃度が環境基準値未満(<0.05 mg/L)を達成できた場合、水処理施設に処理槽を移送する一方で、環境基準値以上であった場合は、原水タンクに返送し、再度、原水として用いた。また、Pseudonocardia sp. D17の漏えい対策として次亜塩素酸ナトリウムによる殺菌処理設備を設けている。生物浄化実証装置の外観を図(3)-2に、実証設備主なコニットを図(3)-3に示した。以上の一連の実証装置を用いて実証試験を実施した。

図(3)-1 生物净化実証試験におけるフロー図
図(3)-2 生物净化実証装置の外観

净化槽(液量：300L)

原水・処理水タンク

ポンプ類及び膜ユニット

図(3)-3 実証設備の主なユニット
## b）スケールアップが浄化性能に及ぼす影響

450L容量の浄化槽に200 kgの地下水及びPseudonocardia sp. D17の植菌液を加え(菌体濃度：26 mg/L)、0.1 vvmにて曝気を行った。その後、1,4-ジオキサン、硫酸アンモニウム及びリン酸水素ニカリウムの混合溶液(C:N:P=10:2:0.1)を所定量添加し、水温を25℃に維持した。この時、膜コニットにて処理した地下水は、図(3)-4に示すように浄化槽の上に設置したポリタンクに貯留後、浄化槽に返送される(バッチ処理)。試験期間中には、定期的に膜コニット透過後の処理水を採取し、1,4-ジオキサン濃度を分析した。

一方、上記の実証スケールの浄化試験の比較として、ラボスケールにて同様の試験を実施した。試験では、1 L容量のバイオリアクターに0.65 Lの地下水及びPseudonocardia sp. D17の植菌液を加え(菌体濃度：24 mg/L)、0.15 vvmにて曝気を行った。その後、1,4-ジオキサン、硫酸アンモニウム及びリン酸水素ニカリウムの混合溶液(C:N:P=10:2:0.1)を所定量添加し、水温を25℃に維持した。サンプリングは適宜行い、地下水の1,4-ジオキサン濃度を分析した。

## c）立ち上げ方法の検討

1,4-ジオキサンを炭素源として浄化槽の立上げ方法の検討を行った。試験では、前述のバッチ処理での運転を行い、1,4-ジオキサン、硫酸アンモニウム及びリン酸水素ニカリウムの混合溶液(C:N:P=10:2:0.5)を所定量添加した。試験期間中には、混合溶液の添加を合計6回行い、処理水中の1,4-ジオキサン濃度及び全有機炭素濃度をモニタリングするとともに、浄化槽内の菌体濃度を測定した。

図(3)-4 バッチ処理の模式図
## d）連続処理での浄化性能の調査

連続試験では、c）立上げ方法の検討の後に生物槽ヘ100 kgの地下水を加えた後、連続的に地下水を流入させるとともに、膜ユニットより処理水を引き抜いた(図(3)-5)。また、運転期間中は、曝気量を0.07 vvmとし、滞留時間及び水温を変化させて処理を行った。サンプリングは適宜行い、原水及び処理水の1,4-ジオキサン濃度をモニタリングした。尚、栄養塩類としてはリン酸水素ニカリウム溶液を用いて、净化槽内のリン酸濃度を0.05 mg/Lになるように維持した。

## e）長期連続運転における浄化性能の調査

450 L容量の浄化槽に200 kgの実地下水及びPseudonocardia sp. D17の植菌液を加え(菌体濃度：86 mg/L)、実汚染地下水(表(3)-1)を連続的に流入させた。運転は、表(3)-2に示した条件で行い、処理前後の1,4-ジオキサン濃度をモニタリングするとともに、サブテーマ（2）で開発した遺伝子解析手法を用いて浄化槽内のPseudonocardia sp. D17の菌体濃度を測定した。実験期間中には、事前に培養したPseudonocardia sp. D17の植菌液を適宜添加した。なお、添加した植菌液は、以下の手順でラボにて作成した。

10 L容量のバイオリアクターに5 g/LのCSLを含んだ無機塩培地を7.5 L添加し、オートクレーブ処理を行った。その後、1,4-ジオキサン濃度がおよそ3000 mg/Lになるように1,4-ジオキサンを加え、あらかじめ培養した500 mLの培養液（MGY培地、2週間培養）を添加し、28℃にて培養を行った。系内は、pH7.0±0.2にて制御され、2.5 L/minにてエアレーションをしている。適宜、溶液中の1,4-ジオキサン濃度をモニタリングし、1,4-ジオキサン濃度が50 mg/L未満になった場合には、およそ3000 mg/Lの濃度になるように1,4-ジオキサンを添加した。培養は約14日間行い、遠心分離により集菌・洗浄したものを植菌液とした。

図(3)-5 連続処理の模式図
表(3)-1 実地下水の水質(単位 : mg/L)

項目	数值
1,4-ジオキサン濃度	0.06～0.66 $ ^{*} $
無機窒素濃度	9.4～13.2
リン酸	0.28～0.34
全有機炭素濃度	7.7～9.8

$ ^{*} $ 試薬の1,4-ジオキサンを人為的に添加した期間有り

表(3)-2 運転条件

項目	数值
水温	25±0.3℃
pH	7.3±0.2
ばっ気量	20 L/min
滞留時間	12～18時間

### （３）Pseudonocardia sp. D17の培養方法の検討

## 1 ）培養に用いる炭素源の検討

500 mg/Lの1,4-ジオキサンを含むCGY培地(カントン：5 g/L、グリセリン：5 g/L、Yeast Extract；1 g/L)を用いて10日間28℃にて回転振盪培養(120 rpm)を行った。培養後、遠心分離機にて集菌・洗浄し、菌体を生理食塩水と混合したものを植菌液とした。

300 mL容量のバッフル付の三角フラスコに無機塩培地F(K₂HPO₄:1 g/L、(NH₄)₂SO₄:1 g/L、NaCl:50 mg/L、MgSO₄·7H₂O:200 mg/L、FeCl₃:10 mg/L、CaCl₂:50 mg/L、pH:7.3)を100 mL加え、オートクレーブで滅菌した。その後、1 g/Lになるようにエチレングリコール、ジェチレングリコールもしくはトリエチレングリコールを添加した後、植菌液を加えて28℃にて回転振盪培養(120 rpm)を9日間行った。培養終了後に吸引濾過にて菌体を万物として回収し、105℃で一晩乾燥した後、菌体重量を測定し菌体濃度(mg-dry cell/L)を求めた。培養9日目の菌体濃度から初期菌体濃度を差し引いた☑菌体濃度により、菌体の増殖性を評価した。

### 2 ）ジェチレングリコール濃度がPseudonocardia sp. D17の増殖に及ぼす影響

300 mL容量のバッフル付の三角フラスコに、1～30 g/Lのジェチレングリコールを含む無機塩培地Fを100 mL加え、事前にMGY培地で培養したPseudonocardia sp. D17を植菌して(初期菌体濃度：111 mg-dry cell/L、28℃にて7日間、回転振盪培養(120 rpm)を行った(n=2)。培養終了後、吸引濾過にて菌体を万物として回収し、1)と同様の手順にて菌体濃度(mg-dry cell/L)を求めた。培養7日目の菌体濃度から初期菌体濃度を差し引いた☑菌体濃度により、菌体の増殖性を評価した。なお、比較として、ジェチレングリコールの代わりにエチレングリコールを用いた試験も同様の手順で行った。
## 3 ）ジェチレングリコールを用いた培養方法における1,4-ジオキサン分解活性

1,4-ジオキサンを含む実地下水(pH:7.38、1,4-ジオキサン濃度：0.16 mg/L、リン酸イオン濃度：0.08 mg/L、全室素(TN)濃度：36.5 mg/L、全有機炭素(TOC)濃度：11 mg/L、化学的酸素要量(COD):33 mg/L)に硫酸アンモニウム及びリン酸水素ニカリウムをそれぞれ1 g/Lになるように添加した後、ジェチレングリコールを20 g/Lになるように加えて培養液を作成した。この培養液650 mLを1 L容量のリアクターに加え、事前に作成したPseudonocardia sp. D17の植菌液を添加し(初期菌体濃度：157 mg-dry cell/L)、28℃にて6日間培養した。培養中は、pH7.0に制御しながら、0.65 L/minのエアレーションを行った。また、植菌液には、MGY培地を用いて培養(28℃、14日間)したPseudonocardia sp. D17を無機塩培地に所定の菌体濃度になるように作成したものを用いた。培養期間中には24時間毎にサンプリングを行い、1,4-ジオキサン分解活性の測定試験に供した。一方、比較として、ジェチレングリコールの代わりにグルコースを用いて培養した実験系も同様に行った。

1,4-ジオキサン分解活性の測定試験では、100 mL容量のバッフル付の三角フラスコに、100 mg/Lの1,4-ジオキサンを含む無機塩培地19 mLと、サンプリングした培養液1 mLを加え、28℃にて回転振盪培養(120 rpm)を24時間行った。その後、溶液中の1,4-ジオキサン濃度をヘッドスペースGC/MSにて測定した。また、培養液を添加しないブランク系も同様の手順にて試験を実施し、次の式にて、1,4-ジオキサンの分解活性を求めた。

$$ 1,4- ジオキサン分解活性 \ (mg-1,4-Dioxane\ /mL- 培養液 )\ =\ \ (C_{0}-C_{24})\times20\ mL/1000\ mL $$

$ C_{0} $ (mg/L): 培養液を添加していないブランク系を24時間回転振盪培養した後の1,4-ジオキサン濃度

$ C_{24} $ (mg/L): 培養液を添加した系を24時間回転振盪培養した後の1,4-ジオキサン濃度

### 4 ）10 Lスケールでのジェチレングリコールを用いたPseudonocardia sp. D17の培養

1,4-ジオキサンを含む実地下水に硫酸アンモニウム及びリン酸水素ニカリウムをそれぞれ1 g/Lになるように添加した後、10 g/Lになるようにジェチレングリコールを加えて培養液を作成した。この培養液8 Lを10 L容量のリアクターに加え、事前に培養・作成したPseudonocardia sp. D17の植菌液を添加して(菌体濃度43.2 mg-dry cell/L)、4 L/minにてエアレーションを行いながら、28℃にて9日間培養した。また、培養4日目に、5 g/Lになるようにコーンスティープリカーを添加した。なお、培養期間中は、系内を200 rpmにて攪拌し、pH7.0±0.2に制御した。培養開始してから1、2、3、4、5、7及び9日目に培養液のサンプリングを行い、3)の方法に準じて1,4-ジオキサン分解活性を測定するとともに、ジェチレングリコール濃度をHPLCにて測定した。また、培養開始直後と、培養開始してから4日目と9日目には、150 mLの培養液をサンプリングし、メスシリンダーにて正確に100 mL秤取った後、吸引濾過にて菌体をすべて回収・洗浄し、105℃で一晩乾燥した。なお、4日目のサンプリングは、コーンスティープリカーを添加する直前に行った。その後、乾燥重量を測定し、菌体濃度として算出した。