Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
おり、国内外で発生している1,4-ジオキサン汚染問題の解決と、汚染に伴う健康被害の未然防止に貢献することを目指している。

## 6 ．国際共同研究等の状況

特に記載すべき事項はない。

## 7 ．研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

## <論文（査読あり）>

1) K. SEI, M. OYAMA, T. KAKINOKI, D. INOUE and M. IKE: J. Water Environ. Technol., 11, 1, 11–19 (2013)

“Isolation and characterization of tetrahydrofuran-degrading bacteria for 1,4-dioxane-containing wastewater treatment by co-metabolic degradation”.

2) K. SEI, K. MIYAGAKI, T. KAKINOKI, K. FUKUGASAKO, D. INOUE and M. IKE: Biodegradation, 24, 5, 665–674 (2013)

“Isolation and characterization of bacterial strains that have high ability to degrade 1,4-dioxane as a sole carbon and energy source”.

## <査読付論文に準ずる成果発表>

特に記載すべき事項はない。

## くその他誌上発表（査読なし）>

1) （株）オフィス東和編：排水污水処理技術集成 Vol.2、エヌ・ティー・エス社、95-101 (2013)

「第2編 処理技術研究の最前線 第1章 生物処理技術 第2節 1,4-ジオキサン分解菌を用いた

汚染水の生物処理・浄化技術の可能性（執筆担当：清和成、池道彦）」

2) 山本哲史，斎藤祐二，井上大介，清和成，黒田真史，池道彦:環境浄化技術、13(5),15-19(2014)「1,4-ジオキサン汚染地下水の生物浄化技術」

## （2） 口頭発表（学会等）

1) K. SEI, M. OYAMA, T. KAKINOKI, D. INOUE and M. IKE: Water and Environment Technology Conference 2012 (WET2012), Tokyo, Japan (2012)

“Isolation and characterization of tetrahydrofuran-degrading bacteria for 1,4-dioxane-containing wastewater treatment by co-metabolic degradation”

2）福ヶ迫久仁衛、池道彦、清和成、井坂和一：日本水処理生物学会第49回大会（2012）「包括固定化分解菌を用いた低濃度1,4-ジオキサンの処理」

3) 成田尚宣、福ヶ迫久仁衛、黒田真史、山本哲史、斎藤祐示、池道彦：第65回日本生物工学会大会（2013）

「Pseudonocardia dioxanivorans D17による1,4-ジオキサン汚染地下水の浄化に関する検討」
4) 山本哲史、斎藤祐二、池道彦、清和成、井上大介: 第16回日本水環境学会シンポジウム (2013) 「1,4-ジオキサン汚染地下水の生物浄化に関する研究」

5) K. SAWADA, D. INOUE, T. TSUNODA, M. MORITA, M. IKE, and K. SEI: Water and Environment Technology Conference 2014 (WET2014), Tokyo, Japan (2014)

“Evaluation of the 1,4-dioxane biodegradation potential of Pseudonocardia spp. and Rhodococcus spp.”

6) M. KURODA, K. FUKUGASAKO, T. NARITA, and M. IKE : IWA World Water Congress & Exhibition 2014, Lisbon, Portugal (2014)

“Development of bioreactor using for treatment of 1,4-dioxane-polluted groundwater”

7) K. SAWADA, D. INOUE, T. TSUNODA, Y. AOKI, M. KURODA, M. IKE, and K. SEI : $ 9^{th} $ IWA International Symposium on Waste Management Problems in Agro-Industries (AGRO’2014), Kochi, Japan (2014)

“Identification of 1,4-dioxane degradation genes of Pseudonocardia sp. D17 by microarray expression analysis”

8) 井上大介、角田翼、関雅仁、澤田和子、森田雅恵、池道彦、清和成：第51回環境工学研究フォーラム（2014）

「Pseudonocardia属細菌およびRhodococcus属細菌の1,4-ジオキサン分解ポテンシャルの評価」

9) 山本哲史, 斎藤祐二, 井上大介, 清和成, 黒田真史, 池道彦: 第51回環境工学研究フォーラム (2014)

「1,4-ジオキサン汚染地下水の生物処理技術」

## （3） 出願特許

1) 1,4-ジオキサン分解菌の培養方法に関する特許を出願中

## （４）「国民との科学・技術対話」の実施

1）第60回青森・岩手県境不法投棄現場の原状回復対策協議会（主催：岩手県、2014年3月15日、二戸地区合同庁舎大会議室、一般傍聴者15名）にて実証試験の中間報告

2) 2014地球環境保護 土壌・地下水浄化技術展（東京ビッグサイト西ホール、平成26年10月15-17日、参加者18,877人）にて研究内容の展示・紹介

## （５）マスコミ等への公表・報道等

1）岩手日報（2013年5月26日）「県境産廃不法投棄 土壤浄化の進行を確認」

2) デーリー東北（2013年5月26日）「県境産廃 N 地区順調に汚染浄化」

3) 大成建設ホームページ プレスリリース（2013年5月26日）「コストを大幅減、1,4-ジオキサンの生物浄化技術実証試験へ」

4) 日経産業新聞（2013年7月11日）「汚染水浄化コスト1/10 大成建設など 岩手・青森県境で実証」
5）日刊建設産業新聞（2013年7月12日）「分解菌で1,4-ジオキサン净化 CO_{2}とコスト大幅減」

6) 建設通信新聞（2013年7月18日）「ジオキサン汚染の生物浄化技術 効果確認 ランニングコスト AOPの1/10」

7) フジサンケイビジネスアイ（2013年7月22日）「生物浄化技術の実証試験」

8) 月刊建築技術（2013年10月号、株式会社建築技術）「1,4-ジオキサンの生物浄化技術実証試験へ」

9) 建設通信（2014年10月16日、朝刊、3頁）「大成建設バイオ浄化を加速 迅速、安価に無害化」

10) 環境新聞（2014年10月21日、5頁）「1,4-ジオキサン 排水処理にも光明」

## (6) その他

1) WET Excellent Paper Award (K. SEI, M. OYAMA, T. KAKINOKI, D. INOUE and M. IKE: Isolation and characterization of tetrahydrofuran-degrading bacteria for 1,4-dioxane-containing wastewater treatment by co-metabolic degradation, 2012年6月30日, Japan Society on Water Environment)

2）日本水処理生物学会第49回大会ベストプレゼンテーション賞（福ヶ迫久仁衛、池道彦、清和成、井坂和一：包括固定化分解菌を用いた低濃度1,4-ジオキサンの処理,2012年11月25日，日本水処理生物学会）

### 8 \. 引用文献

1) S.T. COWAN and K.J. STEEL: (1974) Cowan and Steel's Manual for the Identification of Medical Bacteria, 2nd edition, Cambridge University Press.

2) H. MASUDA, K. McCLAY, R.J. STEFFAN, G.J. ZYLSTRA: J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 22, 312–316 (2012) “Biodegradation of Tetrahydrofuran and 1,4-Dioxane by Soluble Diiron Monooxygenase in Pseudonocardia sp. Strain ENV478”

3) C.M. SALES, S. MAHENDRA, A. GROSTERN, R.E. PARALES, L.A. GOODWIN, T. WOYKE, M. NOLAN, A. LAPIDUS, O. CHERTKOV, G. OVCHINNIKOVA, A. SCZYRBA, L. ALVAREZ-COHEN: J Bacteriol. 193, 4549–4550 (2011) “Genome Sequence of the 1,4-Dioxane-Degrading Pseudonocardia dioxanivorans Strain CB1190”

4) J.G. LEAHY, P.J. BATCHELOR, S.M. MORCOMB: FEMS Microbiol. Rev. 27, 449–479 (2003) "Evolution of the Soluble Diiron Monooxygenases"

5) H. DALTON: Phil. Trans. R. Soc. B 360, 1207–1222 (2005) “The natural and unnatural history of methane-oxidizing bacteria”

6) R.E. PARALES, J.E. ADAMUS, N. WHITE, H.D. MAY: Appl. Environ. Microbiol. 60, 4527–4530 (1994) “Degradation of 1,4-dioxane by an Actinomycete in Pure Culture”

7) S.L. KELLEY, E.W. AITCHISON, M. DESHPANDE, J.L. SCHROOR, P.J.J. ALVAREZ: Water Res. 35, 3791–3800 (2001) “Biodegradation of 1,4-dioxane in Planted and Unplanted Soil: Effect of Bioaugmentation with Amycolata sp. CB1190”

8) M. LI, S. FIORENZA, J.R. CHATHAM, S. MAHENDRA, P.J. ALVAREZ: Water Res. 44, 2894–2900 (2010) “1,4-Dioxane Biodegradation at Low Temperatures in Arctic Groundwater Samples”
# （２）１,４-ジオキサン汚染サイトの生物浄化可能性評価診断ツールの開発

学校法人北里研究所北里大学

清 和成・井上 大介

平成24～26年度累計予算額：38,369千円（うち、平成26年度予算額：12,999千円）

予算額は、間接経費を含む。

## [要旨]

1,4-ジオキサンは、水環境中における残留性と毒性から、水環境中の重要な汚染化学物質と認識され、近年に各種の基準が定められたが、1,4-ジオキサンによる水環境汚染は既に生じており、その汚染の浄化が喫緊の課題となっている。他方、近年になり、環境中に1,4-ジオキサン分解菌が存在することが明らかにされ、その分解菌を活用することにより、浄化効果と経済性の両面に優れる1,4-ジオキサン汚染浄化技術を開発することが可能であることが見出された。そこで本研究では、1,4-ジオキサン汚染地下水の生物学的浄化（バイオレメディエーション）技術の開発を目指し、汚染現場に適した浄化技術の選択に資する診断ツールを開発することを目的として、各種の検討を実施した。これまでに分離された1,4-ジオキサン分解菌（資化菌および共代謝菌）の多くがPseudonocardia属とRhodococcus属に属していることから、両属から25種を選抜し、1,4-ジオキサンの資化能およびテトラヒドロフラン（THF）を一次基質とした共代謝能を調査した結果、①1,4-ジオキサン資化能は両属に共通の特性ではなく、限られた種または株の特性であること、②Pseudonocardia属の多くの種がTHF分解能を保有しており、その一部は1,4-ジオキサンの共代謝分解も可能であること、③Rhodococcus属では、THF分解能も一部の種あるいは株に特異的な特性であることが明らかになった。また、化学工場敷地内の土壌・水、ならびに1,4-ジオキサン汚染地下水から新規1,4-ジオキサン分解菌の分離を試みた結果、前者から系統分類学的に多様な分解菌が分離され、また、後者からは分解菌を分離することはできなかったものの、分解菌を集積できることが明らかになった。また、既に分解特性が明らかされている構成型1,4-ジオキサン資化菌Pseudonocardia sp. D17株を対象としたマイクロアレイ発現解析の結果、thm遺伝子群が1,4-ジオキサンの初発酸化に関与することが明らかになった。これらの成果を踏まえ、thm遺伝子が含まれるsoluble di-iron monooxygenase遺伝子を標的としたPCRシステムを、環境中の1,4-ジオキサン分解菌を網羅的に検出し、1,4-ジオキサン生分解ポテンシャルを把握するためのツールとして提案するとともに、1,4-ジオキサン汚染地下水の浄化実証試験に使用するPseudonocardia sp. D17株をモニタリングするための定量モニタリングツール（real-time PCR法）を開発した。さらに、これらのモニタリングツールの有用性について検討した結果、両ツールの有用性が検証され、分解菌数と浄化の成否との関係を示すことができた。

## [キーワード]

1,4-ジオキサン、生物学的浄化（バイオレメディエーション）、1,4-ジオキサン分解菌、資化、共代謝、マイクロアレイ発現解析、定量的モニタリングツール
### 1. はじめに

1,4-ジオキサンは、セルロース、エステル及びエーテル類に適した合成有機溶剂であり、各種化学工業や医薬品製造業、繊維工業等において汎用されている。また、我々が日常的に使用する界面活性剤（特にアルキルエーテルサルフェート）やポリエチレンテレフタレートの製造時にも不可避的に副生成する。1,4-ジオキサンは、水に任意に混和し、揮発性、固体への吸着性、光分解性、加水分解性、生分解性がいずれも低い物性を有するため、水環境中での残留性が極めて高い。さらに、急性毒性、慢性毒性を有し、発がん性を有する可能性も指摘されており、水環境中における高い残存性から環境汚染に伴う人体への悪影響が懸念されている。

そのため、世界保健機関により1,4-ジオキサンに係る飲料水水質ガイドライン（50 μg/L）が2003年に定められ、国内においても、2004年に水道水質基準（基準値：50 μg/L）、2009年に水質環境基準（50 μg/L）、2012年に排水基準（500 μg/L）が定められた。しかし、埋立処分場浸出水の汚染（数mg/L）や河川水・地下水における基準値超過事例（数十～数百μg/L）、産業廃棄物不法投棄現場における高濃度地下水汚染（最大で数十mg/L）が報告されており、国内外の水環境中において1,4-ジオキサン汚染の発生が明らかにされている。このため、1,4-ジオキサン汚染環境の浄化は喫緊の課題であるが、1,4-ジオキサンは極めて安定な物質であり、現状の浄化技術の中では、紫外線やオゾン、過酸化水素を組み合わせた促進酸化法（AOP）が唯一有効であるとされてきた。しかし、AOPは高エネルギー消費・高コストであるため、広範囲にわたる土壌や地下水に対する汚染浄化には不向きである上、実際の汚染環境中で想定される共存物質の存在下では1,4-ジオキサンの除去効率が低下するため $ ^{1)} $ 、費用対効果はさらに低くなる。このため、浄化効果と経済性の両面から1,4-ジオキサン汚染に有効な浄化技術は存在しない。

他方、我々は、これまでの検討から、一般的には生物難分解性（化審法に基づく好気的生分解による14日間のBOD分解率0%）と言われている1,4-ジオキサンを分解できる微生物が多様な環境中に存在していることが明らかにし³）、また、その分解菌の活用により、低コストの1,4-ジオキサン含有廃水処理が可能であることを示してきた。このため、1,4-ジオキサン汚染環境においても、分解菌の活用による低コストでの浄化が可能であると考えられた。しかし、生物学的浄化（バイオレメディエーション）技術を適用するにあたっては、汚染現場における分解菌の存在状況などを踏まえ、各汚染現場に適した浄化戦略を選択することが必要である。また、浄化過程においても、分解菌の挙動を把握し、状況に応じて浄化促進策を講じる必要性もある。

## 2 ．研究開発目的

上記の背景から、本研究開発事業においては、1,4-ジオキサン分解菌を活用することにより、1,4-ジオキサン汚染地下水を低コストで環境基準値以下まで浄化するための一連の技術群の開発と実証を全体目標とした。この目標を達成するため、本サブテーマにおいては、汚染現場に適したバイオレメディエーション技術の選択に資する診断ツールを開発することを目的とし、以下の5つの検討課題に取り組んだ。

検討1) 既存1,4-ジオキサン分解菌の近縁種の1,4-ジオキサン分解能の評価

検討2）土壌等より分離した新規1,4-ジオキサン分解菌の特徴づけ

検討3) マイクロアレイ発現解析に基づく、既存1,4-ジオキサン分解菌の分解関与遺伝子群の特定検討4) 1,4-ジオキサン分解菌の定量的モニタリングツールの開発
検討5) 分解菌挙動と浄化性能を予測するための数値モデルの構築と、開発したモニタリングツールの有用性検証

## 3 ．研究開発方法

## 1 ）既存1,4-ジオキサン分解菌の近縁種の1,4-ジオキサン分解能の評価

我々がこれまでに分離してきた1,4-ジオキサン分解菌、ならびに他の研究グループによってこれまでに報告されている1,4-ジオキサン分解菌を整理したところ、1,4-ジオキサンを資化分解するものと、テトラヒドロフラン（THF）等を一次基質に利用して共代謝分解するものが存在していた（表(2)-1）。また、既知の分解菌の系統分類学的位置に着目すると、特にPseudonocardia属とRhodococcus属に分類されるものが多いことが明らかになった。そこで、1,4-ジオキサン分解能がPseudonocardia属およびRhodococcus属に共通の特性であるのか、あるいは一部の種またはグループに特異的な特性であるのかを明らかにするため、両属に分類される細菌株の1,4-ジオキサン分解能を調査した。なお、1,4-ジオキサンは資化および共代謝によって分解することが知られていることから、本研究では資化およびTHFを一次基質とした共代謝による分解について検討することにした。

表(2)-1 これまでに報告された1,4-ジオキサン分解菌と分解機構

分解機構	菌株	文献
資化	Afipia sp. D1	4)
Mycobacterium sp. PH-06	5)
Pseudonocardia benzenivorans B5	6)
Pseudonocardia dioxanivorans CB1190	7)
Mycobacterium sp. D6	4)
Mycobacterium sp. D11	4)
Pseudonocardia sp. D17	4)
Rhodococcus ruber 219	8)
共代謝(THF)	Flavobacterium sp.	9)
Pseudonocardia sp. ENV478	10)
Pseudonocardia tetrahydrofuranoxydans K1	11)
Rhodococcus ruber T1	12)
Rhodococcus ruber T5	12)
共代謝(メタン)	Methylosinus trichosporium OB3b	11)
共代謝(プロパン)	Mycobacterium vaccae JOB5	11)
共代謝(トルエン)	Burkholderia cepacia G4	11)
Pseudomonas mendocina KR1	11)
Pseudonocardia tetrahydrofuranoxydans K1	11)
Ralstonia picketii PKO1	11)
Rhodococcus sp. RR1	11)
不明	Pseudonocardia antarctica DVS 5a1	13)
まず、Pseudonocardia属およびRhodococcus属から代表菌株を選定するため、Pseudonocardia属の40種、Rhodococcus属の45種を対象とした16S rRNA遺伝子配列に基づく系統解析を行った。Pseudonocardia属の系統樹を図(2)-1、Rhodococcus属の系統樹を図(2)-2に示す。図(2)-1、図(2)-2の結果に基づき、Pseudonocardia属から13種、Rhodococcus属から12種を代表種として選定し(表(2)-2)、種ごとの基準株の1,4-ジオキサン分解能を調査することにした。なお、使用する各基準株は（独）理化学研究所バイオリソースセンターより購入した。

分解試験に使用する各供試菌株は、表(2)-2に示す温度において、MGY培地中で十分量まで培養した後、遠心分離（8,500×g,4℃,5分）によって菌体を回収し、滅菌生理食塩水で2回洗浄した。この菌体を、$\mathrm{OD}_{600}$（600 nmにおける濁度）が1.0になるように、20 mlの無機塩培地（pH 7.0）⁷を含む50 ml容バイアル瓶に植種した。ここに、資化試験の場合には20 mg/Lあるいは100 mg/Lの1,4-ジオキサン、共代謝試験の場合には20 mg/Lの1,4-ジオキサンと50 mg/LのTHF（一次基質）を添加した。また、供試菌株を植種しないコントロール系も作成した。各バイアル瓶は、28℃、120 rpmで回転振盪培養することにより、分解試験を実施した。なお、分解試験期間は14日間とした。試験期間中は、培養液の一部を経時的に採取し、遠心分離（20,000×g,4℃,5分）を行った後、上清を孔径0.45 μmのセルロースアセテートフィルターでろ過し、GC-FID（GC：GC2014（島津製作所）、カラム：ガラスカラム（3.2 mm φ ×2.1 m）、充填剤：Gaskuropack 54、キャリアガス：N₂（55 ml/分）、カラム・注入口温度：200℃、検出器温度：230℃）を用いて1,4-ジオキサン及びTHFの残存濃度を測定した。

また、供試菌株のうち、1,4-ジオキサン資化能、1,4-ジオキサン共代謝能、あるいはTHF分解能を有することが確認された菌株を対象として、既往研究において1,4-ジオキサン分解に関与することが報告されているsoluble di-iron monooxygenase（SDIMO）のα-subunitをコードする遺伝子（以下、SDIMO遺伝子と称する）のPCR検出を実施した。PCR検出には、Colemanら $ ^{14)} $ が開発したPCRプライマーを用いた。また、増幅産物は、シーケンス解析を行い、既知のSDIMO遺伝子との相同性を調査した。

さらに、1,4-ジオキサン資化能を有することが明らかになったR. aetherivorans JCM 14343を対象として、分解酵素誘導物質の調査を行った。R. aetherivorans JCM 14343をMGY培地中で十分量まで培養し、遠心分離により菌体を回収し、滅菌生理食塩水で2回洗浄した後、500 mg/Lの1,4-ジオキサン、THF、エチレングリコール、ジェチレングリコール、トリエチレングリコール、グリオキシル酸、またはグルコースを含む無機塩培地に植種して1日間培養した。その菌体を回収・洗浄した後、20 mg/Lの1,4-ジオキサンを添加した20 mlの無機塩培地を含む50 ml容バイアル瓶に植種し、分解試験を実施した。
図(2)-1 Pseudonocardia属の系統樹（赤枠が選定した代表種）
図(2)-2 Rhodococcus 属の系統樹（赤枠が選定した代表種）
表(2)-2 1,4-ジオキサン分解能の評価に用いた Pseudonocardia 属、Rhodococcus 属の基準菌

属	試験菌株	培養温度（℃）
Pseudonocardia	Pseudonocardia acaciae JCM16707	37
Pseudonocardia ammonioxydans JCM12462	28
Pseudonocardia asaccharolytica JCM10410	28
Pseudonocardia autotrophica JCM4348	28
Pseudonocardia carboxydivorans JCM14827	28
Pseudonocardia chloroethenivorans JCM12679	28
Pseudonocardia dioxanivorans JCM13855	28
Pseudonocardia halophobica JCM9421	28
Pseudonocardia hydrocarbonoxydans JCM3392	28
Pseudonocardia petrolephila JCM3378	28
Pseudonocardia sulfidoxydans JCM10411	28
Pseudonocardia thermophile JCM3095	37
Pseudonocardia yunnanensis JCM9330	28
Rhodococcus	Rhodococcus aetherivorans JCM14343	28
Rhodococcus chlorophenolicus JCM7439	28
Rhodococcus corallines JCM3199	28
Rhodococcus corynebacterioides JCM3376	28
Rhodococcus equi JCM1311	28
Rhodococcus erythropolis JCM3201	28
Rhodococcus gordoniae JCM12658	28
Rhodococcus opacus JCM9703	28
Rhodococcus pyridinivorans JCM10940	28
Rhodococcus rhodochrous JCM3202	28
Rhodococcus ruber JCM3205	28
Rhodococcus zopfii JCM9919	28

## 2 ）土壤等より分離した新規1,4-ジオキサン分解菌の特徴づけ

国内の某化学工場の敷地内より採取した土壌と水を植種源として用い、1,4-ジオキサン分解菌の集積培養を試みた。その結果、集積培養系から10種類の菌株が分離された。そこで、これら10株に対して、生理学的特徴づけと16S rRNA遺伝子配列に基づく系統分類学的特徴づけを行うとともに、1,4-ジオキサン（50 mg/L）を単一炭素源として添加した無機塩培地における増殖の可否に基づいて1,4-ジオキサン分解（資化）能を判定した。さらに、1,4-ジオキサン分解能を有することが確認された菌株を対象として、tryptic case soy broth（TSB）培地中における増殖に対するpHの影響の調査、1,4-ジオキサンを単一炭素源として添加した無機塩培地を用いた1,4-ジオキサン濃度の増殖に対する影響の調査を行った。なお、増殖は、菌体濁度（OD_{600}）を経時的に測定することによって評価した。

他方、1,4-ジオキサン汚染サイトの地下水試料を植種源として用いた1,4-ジオキサン分解菌の集積培養も試みた。1,4-ジオキサンを含む無機塩培地に地下水試料中の懸濁物質を植種した後、20℃、
120 rpmで回転振盪培養し、1,4-ジオキサン濃度を継時的に測定した。有意な1,4-ジオキサン分解が確認された後、1,4-ジオキサンの再添加、あるいは新たな無機塩培地への懸濁物質（遠心分離によって回収）の植え継ぎを繰り返すことにより、1,4-ジオキサン分解菌の集積を行った。なお、培養の途中段階において、培養温度を20℃から28℃に変更して温度上昇が集積系内の微生物群による1,4-ジオキサン分解に及ぼす影響を検討した。そして、安定した1,4-ジオキサン分解が確認された後、1,4-ジオキサンを含む無機塩寒天培地に集積系の一部を塗抹した。寒天培地上に出現したコロニーは、1,4-ジオキサンを含む無機塩液体培地で培養し、増殖が観察されたものを再度1,4-ジオキサンを含む無機塩寒天培地に塗抹することで純化を試みた。他方、集積系内における1,4-ジオキサン分解菌の存在を遺伝子レベルで確認するため、上述したColemanら $ ^{14)} $ が開発したプライマーを用い、SDIMO遺伝子のPCR検出を行った。

## 3 ）マイクロアレイ発現解析に基づく、既存1,4-ジオキサン分解菌の分解関与遺伝子群の特定

我々が既に保有している1,4-ジオキサン分解菌（資化菌）のうち、誘導型の資化菌であるMycobacterium sp. D6株と構成型の資化菌であるPseudonocardia sp. D17株を代表菌株として用い、マイクロアレイ発現解析によって、1,4-ジオキサン分解時における遺伝子発現プロファイルを調査し、その結果に基づき、1,4-ジオキサン分解に関与する遺伝子群の特定を試みた。

まず、マイクロアレイ発現解析に使用するMycobacterium sp. D6株とPseudonocardia sp. D17株について、サブテーマ（1）において解読されたドラフトゲノムデータに基づき、マイクロアレイ上に搭載するDNAプローブの配列を決定し、全ゲノムを対象としたマイクロアレイを作製した。なお、マイクロアレイの作製には、アジレント・テクノロジー社のeArrayシステムを用い、1枚のスライドで8サンプルの解析が可能なフォーマットを用いることとした。

次に、RNA抽出からマイクロアレイデータの処理までのマイクロアレイ発現解析の各工程について検討し、解析方法を最適化した。

マイクロアレイ発現解析を行うための分解試験は、以下の二通り（マイクロアレイ発現解析 $ ^{①} $ 、 $ ^{②} $ ）で実施した。

マイクロアレイ発現解析①においては、500 mg/Lの1,4-ジオキサンを添加した無機塩培地にPseudonocardia sp. D17株のコロニーを植種し、28℃、120 rpmで回転振盪培養を行った。培養期間中は、培養液中の1,4-ジオキサン濃度を経時的に測定し、有意な分解が観察された時点で新たな無機塩培地（1,4-ジオキサン濃度：500 mg/L）に植え継ぎ、その培養液を用いてマイクロアレイ発現解析を実施した。マイクロアレイ発現解析の結果、シグナルノイズ（S/N）比が150以上となったプローブ（遺伝子）を強発現遺伝子と定義し、データ解析に用いることとした。

マイクロアレイ発現解析②においては、グルコースを単一炭素源として添加した無機塩培地でPseudonocardia sp. D17株を培養した後、100 mg/Lの1,4-ジオキサンあるいはエチレングリコールを含む無機塩培地にOD_{600}が0.8になるように植種し、28℃、120 rpmで回転振盪培養を行った。培養期間中は、1,4-ジオキサン濃度あるいはエチレングリコール濃度を経時的に測定し、それらの経時変化を明らかにするとともに、0時間、21時間、および51時間（1,4-ジオキサン添加系のみ）にマイクロアレイ発現解析に用いる試料を採取した。
## 4 ）1,4-ジオキサン分解菌の定量的モニタリングツールの開発

1,4-ジオキサン分解菌のモニタリングツールを開発するための基礎的知見を得るため、1,4-ジオキサン分解菌を含む特定の系統範囲を特異的に検出するPCRシステム、1,4-ジオキサン分解関与遺伝子群、およびそれらの遺伝子群をターゲットにしたPCRシステムについて、既往研究を調査した。

また、サブテーマ（3）の浄化実証試験において1,4-ジオキサン分解菌Pseudonocardia sp. D17株の挙動をモニタリングするため、同株を特異的に定量検出できるreal-time PCRシステムの開発を行った。サブテーマ（1）で取得したPseudonocardia sp. D17株のドラフトゲノムデータ、ならびに本サブテーマの検討3)の成果を元にして、real-time PCRシステムの標的とする候補配列を選定し、Primer3プログラム $ ^{15)16} $ を用いてreal-time PCRプライマー候補を抽出した。次に、Primer-Blastプログラム $ ^{17)} $ を用いて、プライマー候補の配列とGenBank登録配列との相同性を検索し、特異性が高いことが明らかになったプライマーを抽出した。ここで抽出された特異性の高いプライマーを対象として、D17株のゲノムDNAを用いた検出感度の評価を行い、高感度検出が可能なプライマーについて、real-time PCR反応条件の最適化を行った。real-time PCR法に使用するスタンダードは以下の手順で作製した。まず、シカジーニアスDNA抽出試薬ST（関東化学）を用い、Pseudonocardia sp. D17株のゲノムDNAを抽出した。このゲノムDNAから、開発したプライマーを用いて標的遺伝子の部分配列を増幅し、NucleoSpin PCR and Gel Clean-up（タカラバイオ）を用いて精製した。その後、DynaExpress TA PCR Cloning Kit (pTAC-1) with Jet Competent Cell（バイオダイナミクス研究所）を用いたTAクローニングに供し、PCR産物が挿入されたプラスミドを保有するクローンを選抜して培養し、FastGene Plasmid Mini Kit（日本ジェネティクス）を用いてプラスミドを抽出したものをスタンダードとした。調製したスタンダードは、real-time PCRに供し、増幅効率と検量線の $ r^{2} $ 値を求めた。

## 5 ）分解菌挙動と浄化性能を予測するための数値モデルの構築と、開発したモニタリングツールの有用性検証

検討4)で開発したPseudonocardia sp. D17株の定量モニタリングツールの有用性を明らかにするため、既知濃度のPseudonocardia sp. D17株の培養液からゲノムDNAを抽出し、開発手法による定量を実施した。その定量結果を他の手法で求めたPseudonocardia sp. D17株の濃度と比較し、両者の関係を調べた。また、開発した定量手法をサブテーマ（3）の浄化実証試験に適用し、汚染地下水浄化過程におけるPseudonocardia sp. D17の挙動解析を行った。そのモニタリング結果に基づき、1,4-ジオキサン汚染の浄化に必要な1,4-ジオキサン分解菌数を推定した。

他方、検討4)で実施した文献調査ならびに他のサブテーマにおける検討の結果から、①ジエチレングリコールが1,4-ジオキサン分解菌の増殖や分解酵素誘導に関与していること、および②SDIMO遺伝子が1,4-ジオキサン微生物分解ポテンシャルを知るためのバイオマーカーとして利用できる可能性が示された。そこで、環境試料中にジエチレングリコールを添加して1,4-ジオキサン分解菌の集積を試み、SDIMO遺伝子を標的としてその集積効果を把握することが可能かを検証した。具体的には、300 ml容三角フラスコに90 mlの無機塩培地と10 gの1,4-ジオキサン汚染土壌を加え、ここにジエチレングリコールを20 g/Lになるように添加して、28℃、120 rpmで回転振盪培養を行った。0日および6日後に5.0 mlを採取し、ISOIL for beads beating（ニッポン・ジーン）を用いて土壤中のDNAを抽出し、MagExtractor -PCR & Gel Clean up-（東洋紡）を用いて精製した。このDNAサ
ンプルに対して、Colemanら $ ^{14)} $ が開発したプライマーを用いたSDIMO遺伝子のPCR検出を行った後、アガロースゲル電気泳動に供し、SYBR Green I染色と紫外線照射によってPCR増副産物の確認を行った。

## 4 ．結果及び考察

## 1 ）既存1,4-ジオキサン分解菌の近縁種の1,4-ジオキサン分解能の評価

実験に供したPseudonocardia属13種およびRhodococcus属12種の代表菌株における1,4-ジオキサン分解能の評価結果を表(2)-3に整理している。25種の内、P. dioxyanivorans JCM 13855 $ ^{T} $ 株とR. aetherivorans JCM 14343 $ ^{T} $ 株の2菌株においてのみ、1,4-ジオキサンの資化が観察された（図(2)-3(A)）。このうち、P. dioxyanivorans JCM 13855 $ ^{T} $ 株（=P. dioxyanivorans CB1190株）は元々1,4-ジオキサン資化菌として分離された菌株である $ ^{7)} $ 。他方、R. aetherivorans JCM 14343 $ ^{T} $ 株は、メチルtert-ブチルエーテルを分解することが知られているが $ ^{18)} $ ，1,4-ジオキサン分解能についてはこれまでに報告がなく、本研究で初めて確認された。同種での1,4-ジオキサン分解についても報告例はない。また、これら2種に加えて、P. acaciae JCM 16707 $ ^{T} $ 株およびP. asaccharolytica JCM 10410 $ ^{T} $ 株においては、THFと1,4-ジオキサンを同時に添加した場合に、THF分解に続く1,4-ジオキサンの分解が観察された（図(2)-3(B)）。このことから、これら2種は、THFを一次基質に利用して1,4-ジオキサンを共代謝分解できることが明らかになった。一方、他のPseudonocardia属の8種（P. autotrophica JCM 4348 $ ^{T} $ 株、P. carvoxydivorans JCM 14827 $ ^{T} $ 株、P. halophobica JCM 9421 $ ^{T} $ 株、P. hydrocarbonoxydans JCM 3392 $ ^{T} $ 株、P. petroleophila JCM 3378 $ ^{T} $ 株、P. sulfidoxydans JCM 10411 $ ^{T} $ 株、P. thermophila JCM 3095 $ ^{T} $ 株、P. yunnanensis JCM 9330 $ ^{T} $ 株）においては、THF分解は観察されたものの、試験期間（14日間）内に1,4-ジオキサンの分解は確認されなかった（図(2)-3(C)）。以上の結果から、以下のことが示唆された：

① 1,4-ジオキサン資化能は Pseudonocardia 属、Rhodococcus 属に共通の特性ではなく、限られた種または株の特性である。

② Pseudonocardia 属の多くの種が THF 分解能を保有しており、その一部は 1,4-ジオキサンの共代謝分解も可能である。

③ Rhodococcus 属では、THF 分解能も一部の種あるいは株に特異的な特性である。
表(2)-3 Pseudonocardia属およびRhodococcus属の代表菌株を用いた

1,4-ジオキサン資化試験およびTHFを一次基質とした共代謝試験の結果

供試菌株	資化試驗a	共代謝試驗b
THF	1,4-ジオキサン
P. acaciae JCM 16707T	-	++	++
P. ammonioxydans JCM 12462T	-	-	-
P. asaccharolytica JCM 10410T	-	+(19%)	+(55%)
P. autotrophica JCM 4348T	-	+(25%)	-
P. carboxydivorans JCM 14827T	-	+(55%)	-
P. chloroethenivorans JCM 12679T	-	-	-
P. dioxanivorans JCM 13855T	+	++++	++++
P. halophobica JCM 9421T	-	+(2%)	-
P. hydrocarbonoxydans JCM 3392T	-	+(50%)	-
P. petroleophila JCM 3378T	-	+(23%)	-
P. sulfidoxydans JCM 10411T	-	+(8%)	-
P. thermophila JCM 3095T	-	+(33%)	-
P. yunnanensis JCM 9330T	-	+(59%)	-
R. aetherivorans JCM 14343T	+	++++	++++
R. chlorophenolicus JCM 7439T	-	-	-
R. corallinus JCM 3199T	-	-	-
R. corynebacterioides JCM 3376T	-	-	-
R. equi JCM 1311T	-	-	-
R. erythropolis JCM 3201T	-	-	-
R. gordoniae JCM 12658T	-	-	-
R. opacus JCM 9703T	-	-	-
R. pyridinivorans JCM 10940T	-	-	-
R. rhodochrous JCM 3202T	-	-	-
R. ruber JCM 3205T	-	-	-
R. zopfii JCM 9919T	-	-	-

$ ^{a} $ −, 14日以内に分解されず; +, 14日以内に分解.

$ ^{b} $ −, 14日以内に分解されず; +, 分解されたが14日後に一部残存 (14日後の残存率); ++, 14日以内に残存率0%; +++, 7日以内に残存率0%; ++++, 3日以内に残存率0%.
(A)

(B)

(C)

1,4-ジオキサン(試験系)

× 1,4-ジオキサン(コントロール系)

THF(試験系)

× THF(コントロール系)

図(2)-3 1,4-ジオキサンを資化する菌（A）、THFを一次基質として1,4-ジオキサンを共代謝する菌（B）、THFは分解するが1,4-ジオキサンは共代謝しない菌（C）における分解举動の代表例 A : P. aetherivorans JCM 14343^{T}, B : P. acaciae JCM 16707^{T}, C : P. halophobica JCM 9421^{T}

次に、1,4-ジオキサン分解能あるいはTHF分解能が確認された12種について、SDIMO遺伝子のPCR検出を試みた。その結果、全ての種においてPCR産物が得られた。そこで、PCR産物のシーケンス解析を行い、GenBankに登録されたSDIMO遺伝子との比較を行った。本研究で解析した菌株および既知のSDIMO遺伝子の系統解析の結果を図(2)-4に示す。P. dioxanivorans JCM 13855 $ ^{T} $ 株のSDIMO遺伝子は、既に解読されている同株の該当配列に一致し、1,4-ジオキサン・THFモノオキシゲナーゼ遺伝子に分類された。他方、本研究において新たに1,4-ジオキサン資化能が確認されたR. aetherivorans JCM 14343 $ ^{T} $ 株、1,4-ジオキサン共代謝能を有する2種、ならびにTHF分解能を有する種の内6種のSDIMO遺伝子は、プロパン・メタンモノオキシゲナーゼ遺伝子に分類された。また、THF分解能を有するP. halophobica JCM 9421 $ ^{T} $ 株およびP. carboxydivorans JCM 14827 $ ^{T} $ 株のSDIMO遺伝子はどちらのグループとも相同性が低いことが明らかになった。
図(2)-4 本研究でTHF・1,4-ジオキサン分解能を有することが明らかになった12種の菌株のSDIMO遺伝子配列と既知のSDIMO遺伝子配列の系統分類学的関係
## 2 ）土壤等より分離した新規1,4-ジオキサン分解菌の特徴づけ

化学工場敷地内の土壌・水を植種源とする集積培養系から分離された10菌株の系統分類学的特徴づけ、および1,4-ジオキサン分解（資化）能判定の結果を表(2)-4に整理した。10菌株のうち、A2株、A3株、A4株、A6株、B1株、B2株、B3株、B6株の8菌株が1,4-ジオキサン資化能を有することが確認された。これら8菌株は、グラム陽性のArthrobacter属（A4株）、Microbacterium属（A2株、B1株）、Mycobacterium属（B6株）、Rhodococcus属（B2株、B3株）、およびグラム陰性のBosea属（A3株）に分類され（A6株はグラム陽性菌であるが、16S rRNA遺伝子配列に基づく系統学的解析は終了していない）、系統学的に非常に多様であった。特に、Arthrobacter属、Microbacterium属、およびBosea属については、これまでに1,4-ジオキサン分解菌の報告はなく、本研究が初めての発見である。

1,4-ジオキサン資化能を有することが確認された8菌株の増殖に対するpH、1,4-ジオキサン濃度の影響について検討した。TSB培地を用いてpHの影響について評価した結果、ほとんどの菌株がpH5～9で生育可能であることが確認され、B6株はpH6、A4株、B1株、B2株はpH7、A2株、A3株、A6株、B3株はpH8において比増殖速度が最大値を示した（表(2)-4）。また、無機塩培地を用いて1,4-ジオキサン濃度の影響について検討した結果、いずれの菌株においても、100 mg/Lまでの濃度では増殖可能であることが明らかになった。

表(2)-4 化学工場敷地内の土壌・水新たに分離した10菌株の生理学的・系統分類学的特徴および1,4-ジオキサン分解（資化）能

菌株	16S rRNA 遺伝子配列に基づく近縁種	1,4-ジオキサン分解能（50 mg/L）	増殖可能pH域（最適pH）
A2	Microbacterium arabinogalactanolyticum (98.4%)	+	4～10 (8)
A3	Bosea thiooxidans (97.6%)	+	5～9 (8)
A4	Arthrobacter boritolerans (98.8%)	+	4～10 (7)
A5	Microbacterium nematophilum (97.6%)	-	試験せず
A6	-	+	4～10 (8)
B1	Microbacterium nematophilum (96.8%)	+	4～10 (7)
B2	Rhodococcus wratislaviensis (98.0%)	+	6～9 (7)
B3	Rhodococcus artherivorans (99.2%)	+	5～10 (8)
B6	Mycobacterium mucogenicum、Mycobacterium phocaicum、Mycobacterium ratisbonense (97.9%)	+	5～10 (6)
C1	Pseudomonas acephalitica (98.4%)	-	試験せず
他方、1,4-ジオキサン汚染サイトより採取した地下水試料中の懸濁物質を用いて1,4-ジオキサンの分解を試みた結果、有意な分解が観察されたことから、1,4-ジオキサン分解菌の集積を実施した。その結果、約1年後には、図(2)-5に示すように、かなり高い分解能を有する集積系を構築することができた。また、約18ヶ月経過以降の集積系における1,4-ジオキサン分解挙動を図(2)-6に示しているが、培養温度を20℃に設定していた時点では分解速度は11.5-15.5 mg/L/日であったのに対し、28℃に変更して培養を継続した結果、分解速度は24 mg/L/日程度まで上昇することが観察された。そこで、1,4-ジオキサン分解菌が十分量まで集積されたと考えられたため、集積系からの1,4-ジオキサン分解菌の分離を試みた。その結果、寒天培地上に複数のコロニーが出現したため、純化を進めたが、分解能を示す単一のコロニーを取得することが困難であった。そのため、集積系に1,4-ジオキサン分解菌が本当に集積されているかを確認するため、植種源と集積系からDNAを抽出し、他の検討から1,4-ジオキサン分解に関与することが示唆されたSDIMO遺伝子のPCR検出を試みた。その結果、SDIMO遺伝子は、植種源では検出下限値付近の少数しか存在しなかったが、集積系においては常に検出されたことから、1,4-ジオキサン分解菌が集積されたことが確認された（図(2)-7）。それにも関わらず1,4-ジオキサン分解菌を分離することができなかったのは、集積系内に存在（優占）する1,4-ジオキサン分解菌がアミノ酸やビタミン等の何らかの栄養を要求する、または他の微生物と共生条件下でのみ生育し得る菌であり、純粹培養が困難な菌であるか、あるいは近年多くの報告例がある人工培地での培養が困難な菌であるものと考えられた。

図(2)-5 汚染地下水より構築した集積系による1,4-ジオキサン分解（約1年後）
図(2)-6 汚染地下水より構築した集積系による1,4-ジオキサン分解（約18ヶ月後以降）

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 M

図(2)-7 既存1,4-ジオキサン分解菌および集積系におけるSDIMO遺伝子のPCR検出結果 レーンM, 100 bp DNAラダー ; レーン1, Afipia sp. D1株 ; レーン2, Mycobacterium sp. D6株 ; レーン3, Mycobacterium sp. D11株 ; レーン4, Pseudonocardia sp. D17株 ; レーン5, Rhodococcus ruber T1株 ; レーン6, Rhodococcus ruber T5株 ; レーン7-8, 地下水試料 ; レーン9-10, 集積系 ; レーン11, 陰性コントロール（DNAなし）. 矢印はSDIMO遺伝子の増幅産物の位置を示す
3）マイクロアレイ発現解析に基づく、既存1,4-ジオキサン分解菌の分解関与遺伝子群の特定

サブテーマ（1）で取得した既存1,4-ジオキサン分解菌 Mycobacterium sp. D6株および Pseudonocardia sp. D17株のドラフトゲノムデータからオープンリーディングフレーム（ORF）を予測し、BLAST検索（BLASTP）によってアノテーションが付いたORFを抽出し、アジレント・テクノロジー社のeArrayシステムを用いて、DNAプローブの設計を行った。その結果、D6株では8211配列、D17株では7571配列のプローブを設計することができた。そこで、同社の8x15Kフォーマット（スライド1枚で8サンプルを解析可能）を用い、実験に用いるカスタムDNAアレイを作製した。

次に、解析方法の最適化を試みた結果、表(2)-5の手順により、良好な解析が可能であることが確認されたため、本手順によりマイクロアレイ発現解析を行うことに決定した。

最適化した解析方法を用いて、マイクロアレイ発現解析①を実施した。本検討では、Pseudonocardia sp. D17株を用いた1,4-ジオキサン分解試験の結果、1,4-ジオキサン濃度が6日後に約40%低下し、7日後に約60%低下した。そこで、7日後の培養液の一部を1,4-ジオキサンを添加した新たな無機塩培地に植え継ぎ、その培養液を用いてマイクロアレイ発現解析を実施することとした。その結果、マイクロアレイに搭載された7511プローブの内、285プローブのS/N比が150以上となり、強発現したものと判定された。この285プローブの中で175プローブがblastp検索により機能推定されたため、それらの元になった175遺伝子を対象として1,4-ジオキサン分解メカニズムの推定を試みた。既に報告されている誘導型1,4-ジオキサン資化菌P. dioxanivorans CB1190株の全ゲノム解析および1,4-ジオキサン分解関与遺伝子群推定の結果と比較したところ、175遺伝子の内の152遺伝子がP. dioxanivorans CB1190株にも共通して存在しており、さらに、表(2)-6に示している19遺伝子がP. dioxanivorans CB1190株による1,4-ジオキサン分解においても強発現することが明らかにされている $ ^{19} $ 。P. dioxanivorans CB1190株では、thm遺伝子群が1,4-ジオキサンから2-ヒドロキシ-1,4-ジオキサンおよび2-ヒドロキシエトキシアセトアルデヒドへの初発酸化反応を担っていることが報告されているが $ ^{19} $ 、表(2)-6に示した19遺伝子にもthm遺伝子群が複数含まれていた。

表(2)-5 最適化されたマイクロアレイ発現解析方法

工程	使用キット・装置・条件
① 全 RNA 抽出、DNA の除去	RNAspin Miniキット（GEヘルスケア）
② rRNA の除去	RiboMinus Transcriptome Isolation Kit（Bacteria）
（Life Technologies）
③ Poly A の付加	E. coli Poly (A) polymerase（New England BioLabs）
④ Cy3 ラベル化 cRNA の合成	Low Input Quick Amp Labeling Kit（Agilent）
⑤ ラベル化 cRNA の精製	RNeasy Mini Kit（Qiagen）
⑥ ハイブリダイゼーション	65℃、16時間、暗所
⑦ アレイスライド洗浄	Gene Expression Wash Buffer（Agilent）
⑧ スキヤン・数値化	GenePix 4000B（フィルジェン）、スキヤン感度：PMT580