Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
## (2) 環境政策への貢献

## ＜行政が既に活用した成果＞

特に記載すべき事項はない。

## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

これまで、1,4-ジオキサンに汚染に対して、高エネルギー消費・高コストとなるオゾンと紫外線による促進酸化法（AOP）を除いて净化法が存在せず、特に様々な夾雑物質を含み、処理すべき量も膨大な土壌／地下水汚染については非常に困難であった。本研究において、系統学的にも分解様式的にも多様な1,4-ジオキサン分解菌のライブラリを構築することができ、さらに、1,4-ジオキサン汚染環境のオンサイトリアクターあるいはバイオオーグメンテーションによる浄化に有望な数株の1,4-ジオキサン分解菌を提示することができた。特に、D17株については、他の汚染物質が共存する場合でも1,4-ジオキサン分解活性を維持できることが確認され、様々な特性をもつサイトにおける1,4-ジオキサン汚染の浄化に活用することができると考えられる。実際に、青森・岩手県境不法投棄現場に設置した実証設備は、1,4-ジオキサン汚染地下水を用いた試験において高い性能を発揮しており、1,4-ジオキサンによる土壌／地下水汚染の浄化の現実的な対策となりると期待される。我々の調査だけでも国内において公表されている1,4-ジオキサンによる地下水汚染現場は4ヶ所あり、潜在的にはさらに多くの汚染現場が存在する可能性がある。本研究により現実的な汚染対策技術が開発されれば、公表されている汚染現場の浄化への貢献のみならず、新たな汚染現場の発見と浄化の促進にも貢献できるものと期待される。我々は、学会発表などの学術的な公表のみならず、新聞報道などによる一般向けの情報発信も積極的に行うことで成果の普及に努めており、国内外で発生している1,4-ジオキサン汚染問題の解決と、汚染に伴う健康被害の未然防止に貢献することを目指している。

### 6. 研究成果の主な発表状況

## (1) 主な誌上発表

## <査読付き論文>

1) K. SEI, M. OYAMA, T. KAKINOKI, D. INOUE and M. IKE: J. Water Environ. Technol., 11, 1, 11–19 (2013)

“Isolation and characterization of tetrahydrofuran-degrading bacteria for 1,4-dioxane-containing wastewater treatment by co-metabolic degradation”.

2) K. SEI, K. MIYAGAKI, T. KAKINOKI, K. FUKUGASAKO, D. INOUE and M. IKE: Biodegradation, 24, 5, 665–674 (2013)

“Isolation and characterization of bacterial strains that have high ability to degrade 1,4-dioxane as a sole carbon and energy source”.

## (2) 主な口頭発表 (学会等)

1) K. SEI, M. OYAMA, T. KAKINOKI, D. INOUE and M. IKE: Water and Environment Technology Conference 2012 (WET2012), Tokyo, Japan (2012)

“Isolation and characterization of tetrahydrofuran-degrading bacteria for 1,4-dioxane-containing wastewater treatment by co-metabolic degradation”

2）福ヶ迫久仁衛、池道彦、清和成、井坂和一：日本水処理生物学会第49回大会（2012）「包括固定化分解菌を用いた低濃度1,4-ジオキサンの処理」

3）成田尚宣、福ヶ迫久仁衛、黒田真史、山本哲史、斎藤祐示、池道彦：第65回日本生物工学会大会(2013)

「Pseudonocardia dioxanivorans D17による1,4-ジオキサン汚染地下水の浄化に関する検討」

4）山本哲史、斎藤祐二、池道彦、清和成、井上大介：第16回日本水環境学会シンポジウム(2013)「1,4-ジオキサン汚染地下水の生物浄化に関する研究」

5) K. SAWADA, D. INOUE, T. TSUNODA, M. MORITA, M. IKE, and K. SEI: Water and Environment Technology Conference 2014 (WET2014), Tokyo, Japan (2014)

“Evaluation of the 1,4-dioxane biodegradation potential of Pseudonocardia spp. and Rhodococcus spp.”

6) M. KURODA, K. FUKUGASAKO, T. NARITA, and M. IKE: IWA World Water Congress & Exhibition 2014, Lisbon, Portugal (2014)

“Development of bioreactor using for treatment of 1,4-dioxane-polluted groundwater”
7) K. SAWADA, D. INOUE, T. TSUNODA, Y. AOKI, M. KURODA, M. IKE, and K. SEI: $ 9^{th} $ IWA International Symposium on Waste Management Problems in Agro-Industries (AGRO'2014), Kochi, Japan (2014)

“Identification of 1,4-dioxane degradation genes of Pseudonocardia sp. D17 by microarray expression analysis”

8) 井上大介、角田翼、関雅仁、澤田和子、森田雅恵、池道彦、清和成: 第51回環境工学研究フォーラム (2014)

「Pseudonocardia属細菌およびRhodococcus属細菌の1,4-ジオキサン分解ポテンシャルの評価」

9) 山本哲史，斎藤祐二，井上大介，清和成，黒田真史，池道彦：第51回環境工学研究フォーラム（2014）

「1,4-ジオキサン汚染地下水の生物処理技術」

### 7. 研究者略壓

## 課題代表者: 池道彦

大阪大学大学院工学研究科修了、博士（工学）、現在、大阪大学大学院工学研究科教授

## 研究分担者

1) 清 和成

大阪大学大学院工学研究科修了、博士（工学）、現在、北里大学医療衛生学部教授

## 2 ）井上 大介

大阪大学大学院工学研究科修了、博士（工学）、現在、北里大学医療衛生学部准教授

## 3 ) 斎藤祐二

東京工業大学大学院工学研究科修了、博士（工学）、現在、大成建設株式会社技術センター建築技術研究所次長

## 4 ) 山本 哲史

大阪大学大学院工学研究科修了、工学修士、現在、大成建設株式会社技術センター建築技術研究所主任
# 5B-1201 1,4-ジオキサン汚染地下水の生物浄化可能性の評価診断ツールの開発と浄化戦略の実証

## (1) 1,4-ジオキサン分解菌の分解活性化因子の特定と浄化戦略の策定

国立大学法人大阪大学

池道彦

<研究協力者>

国立大学法人大阪大学 黒田 真史

平成24～26年度累計予算額：45,064千円

（うち、平成26年度予算額：13,851千円）

予算額は、間接経費を含む。

## [要旨]

1,4-ジオキサンは、各種工業で汎用される化学物質である一方で、水環境への残留性の高さから各地で汚染が問題となっている。本プロジェクトは、現実的な浄化技術が存在しない1,4-ジオキサンによる地下水汚染に対して、1,4-ジオキサン分解菌を用いた生物浄化技術を確立するとともに、1,4-ジオキサン汚染現場の浄化戦略の策定に有用な浄化促進手法を診断するツールを開発することで、包括的な1,4-ジオキサン浄化技術パッケージを提案することを目的としており、特に本課題では、様々な1,4-ジオキサン分解菌の特徴付け、及びそれを基にした1,4-ジオキサン汚染地下水の各種バイオレメディエーション技術の開発を行った。

ドラフトゲノム解析により各分解菌の遺伝学的特徴付けを行ったところ、我々が保有する1,4-ジオキサン分解菌であるPseudonocardia sp. D17株及びT5株は、既報の分解菌の持つ1,4-ジオキサン分解酵素遺伝子であるthmA遺伝子と相同性の高い遺伝子を持つ一方で、D6株、D11株、及びT1株はthmA遺伝子とは配列が異なる1,4-ジオキサン分解酵素遺伝子を持つことが示唆された。構成型1,4-ジオキサン分解菌であるPseudonocardia sp. D17株を用いて構築したバイオリアクターは、様々な窒素・リン濃度の模擬汚染地下水、及び実際の汚染現場より採取した地下水に対して高い浄化性能を示し、極めて実現性の高い浄化技術であることが示された。また、模擬汚染地下水を用いた土壌カラムリアクターにPseudonocardia sp. D17株を添加したところ1,4-ジオキサンは速やかに分解されたことから、Pseudonocardia sp. D17株を用いたバイオオーグメンテーション技術は、有望な浄化技術オプションであることが示唆された。一方、実際の1,4-ジオキサン汚染土壤／地下水試料によるバイオスティミュレーション試験では、40日間の試験期間中に土着微生物による1,4-ジオキサンの分解は認められなかったことから、実現のためには1,4-ジオキサン分解菌の活性化物質のさらなる探索が必要であるものと考えられた。

## [キーワード]

1,4-ジオキサン、1,4-ジオキサン分解菌、バイオレメディエーション、ゲノム解析
### 1. はじめに

1,4-ジオキサンは各種化学・医薬品工業、繊維工業等で汎用されており、PRTR届出データによると日本では年間約60 tが公共用水域に排出されている。また、ポリエチレンテレフタラートや界面活性剤製造時の副生成物として非意図的にも排出されている。1,4-ジオキサンは水に任意に混和するが、揮発性、固相への吸着性、光分解性、加水分解性、生分解性がいずれも低く、環境中へ放出されると長期間水環境中に残留しやすい。一方、1,4-ジオキサンは急性、慢性毒性を有する上、発がん性を有する可能性も指摘されており、水環境中での高い残存性から人体への悪影響が懸念されている。

そのため、WHOにより1,4-ジオキサンに係る飲料水水質ガイドライン（2003年：0.05 mg/L）が、日本でも水道水質基準（2004年：0.05 mg/L）、水環境基準（2009年：0.05 mg/L）、排水基準（2012年：0.5 mg/L）が定められている。しかし、現実には1,4-ジオキサンは各地の河川水や地下水から数十〜数百μg/Lの濃度で検出されており、埋め立て処分場周辺の地下水からは数mg/Lでの検出も報告されている。これらの汚染環境の浄化は喫緊の課題であるが、現状では1,4-ジオキサンは、高エネルギー消費・高コストとなるオゾンと紫外線による促進酸化法（AOP）以外では十分に処理できないことが明らかとなっており、広範囲に渡る土壌や地下水汚染の浄化には現実的な方法はない。

## 2 ．研究開発目的

我々は1,4-ジオキサンの生物分解に関する研究を実施し、多様な環境試料から1,4-ジオキサン分解菌の分離に成功してきた。また、その活用により、低コストの1,4-ジオキサン含有排水処理が可能であることも示してきた。このことから、汚染環境の浄化についても、土着の1,4-ジオキサン分解菌、あるいは我々が単離した高性能の分解菌を活用したバイオスティミュレーション、バイオオーグメンテーション、オンサイト浄化等の技術を確立することは可能であると考えている。一方で、汚染環境における分解菌の存在やその分解能力の情報を収集、診断し、汚染環境の状態に合わせた最も適切な浄化対策技術を選択する必要がある。そこで、1,4-ジオキサン分解菌を用いた1,4-ジオキサン汚染環境の浄化技術を確立するとともに、1,4-ジオキサン汚染現場の浄化戦略の策定に有用な、浄化促進手法を診断するツールを開発することで、包括的な1,4-ジオキサン浄化技術パッケージを提案することを本プロジェクトの目的とした。サブテーマ（1）においては特に、我々が単離した1,4-ジオキサン分解菌について生理学的・遺伝学的特徴付けを行うとともに、それを基にして1,4-ジオキサン汚染地下水のバイオリアクター処理、バイオオーグメンテーション処理、及びバイオスティミュレーション処理の各技術を開発することを主眼を置いた。

### 3. 研究開発方法

## （１）１,４-ジオキサン分解菌の生理学的特徴付け

1,4-ジオキサン分解菌の生理学的特徴付けは全て文献 $ ^{1)} $ に基づいて行った。16S rRNA遺伝子はプライマー27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）及び1392R（5'-ACGGGCGGTGTGTACA-3'）を用いてPCR法により増幅し、塩基配列の決定は北海道システム・サイエンス株式会社に委託した。
## （２）１,４-ジオキサン分解菌の遺伝学的特徴付け

ドラフトゲノム配列情報の取得は北海道システム・サイエンス株式会社に委託した。ゲノム中の遺伝子推定はRAST（http://rast.nmpdr.org/）を用いて行った。また、遺伝子機能解析はNCBI blastx（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）を用いて行った。各酵素のマルチプルアラインメントと系統解析はClustalWプログラムを用いて行い、NJplotプログラムを用いて系統樹を描画した。

## （３）１,４-ジオキサン分解活性化因子の検討

MGY培地（4 g/L Yeast Extract、10 g/L Malt Extract、4 g/L Glucose、pH 7.3）で培養したD6株及びPseudonocardia sp. D17株菌体を回収し、500 mg/Lの1,4-ジオキサンを含む無機塩培地F（1 g/L $ K_{2}HPO_{4} $ 、1 g/L $ (\mathrm{NH}_{4})_{2}\mathrm{SO}_{4} $ 、50 mg/L NaCl、200 mg/L $ MgSO_{4}\cdot7H_{2}O $ 、10 mg/L $ FeCl_{3} $ 、50 mg/L $ CaCl_{2} $ 、pH7.5）、または同培地に5 g/Lの各種添加物（Glycerol、Ethylene glycol、Glucose、Ethanol、Corn Steep Liquor (CSL)、Casamino acid）をそれぞれ添加したものに菌体を懸濁した。28℃で好気的に培養し、培養液中の1,4-ジオキサン濃度を経時的に測定した。

## （４）バイオリアクターを用いたモデル汚染地下水の浄化試験

本実験に用いた実験装置を図(1)-1に示す。このリアクターは、1250 mL容の完全混合式リアクター（working volume = 1000 mL）であり、ウォータージャケットにより水温を28±1℃に調整した。塩酸（2 mol/L）及び水酸化ナトリウム（1-2 mol/L）をpHコントローラー（TDP-51，東興化学研究所）を用いて添加することでpH7.5を維持した。また、エアポンプにより0.6–2.0 L/minの範囲で曝気し、DO値が4 mg/L以上となるように保つとともに、攪拌を行った。ポリエチレングリコールゲル担体に包括固定化したPseudonocardia sp. D17株を充填率が約13％となるように加えた（リアクターA）。同様のリアクターに固定化したPseudonocardia sp. D17株を加えない実験系を対照とした（リアクターB）。

無機塩培地 F の組成を基準として窒素及びリン濃度を様々に調整し、10 mg/L の 1,4-ジオキサンを添加したものを模擬汚染地下水として用いた。これを、水理学的滞留時間（HRT）が 2～12 h となるように連続的にリアクターに流入させた。各 Phase における運転条件を表(1)-1 に示す。オーバーフローより網構造のセパレーターにより固定化担体を分離し、これを処理水とした。

原水及び各槽内の1,4-ジオキサン濃度、溶解性有機炭素濃度（DOC）を経日的に測定した。また、固定化担体に含まれるPseudonocardia sp. D17株生菌数を適宜測定した。
図(1)-1 バイオリアクター模式図

表(1)-1 バイオリクターの各Phaseにおける運転条件

Phase	期間(day)	HRT(h)	窒素濃度(mg-N/L)	リン濃度(mg-P/L)
I	0-32	12	212	172
II	32-43	12	53	43
III	43-54	6	53	43
IV	54-70	4	53	43
V	70-76	3	53	43
VI	76-85	2	53	43
VII	85-93	6	53	43
VIII	93-98	6	1.25	43
XI	98-103	6	0.25	43
X	103-111	6	0.125	43
XI	111-117	6	0.025	43
XII	117-134	6	0.0125	43
XIII	134-139	6	1.25	43
XIV	139-147	6	1.25	1
XV	147-153	6	1.25	0.1
XVI	153-158	6	1.25	0.01
## （５）バイオリアクターを用いた実汚染地下水の浄化試験

2013年4月30日に青森・岩手県境不法投棄現場において1,4-ジオキサン汚染地下水を採取した。この実汚染地下水は、水処理設備の原水槽から採取されたものであり、不法投棄現場内全域の井戸から揚水された地下水が合流したものである。この実汚染地下水について、（4）と同様のバイオリアクターを用いて処理を試みた（リアクターA）。同様のリアクターに固定化したPseudonocardia sp. D17株を加えない実験系を対照とした（リアクターB）。運転開始後0-7日目（Phase R-I）及び7-14日目（Phase R-II）にはそれぞれ表(1)-2に組成を示す1,4-ジオキサン添加無機塩培地及び模擬汚染地下水を、またPhase R-III（14-19日目）には表(1)-3に組成を示す実汚染地下水に10 mg/Lの1,4-ジオキサンを添加し、リアクターに連続的に供給した。Phase R-I～R-IIIを通じて、HRTは6 hに設定した。水温28±1℃、pH7.5、DO 4 mg/L以上となるように制御した。原水及び各槽内の1,4-ジオキサン濃度及びDOCを経日的に測定した。また、固定化担体に含まれるPseudonocardia sp. D17株生菌数を適宜測定した。

表(1)-2 無機塩培地（Phase R-I）及び模擬汚染地下水（Phase R-II）の組成

項目	無機塩培地(Phase R-I)	模擬污染地下水(Phase R-II)
K2HPO4(NH4)2SO4	250 mg/L	0.692 mg/L
250 mg/L	21.8 mg/L
MgSO4·7H2O	50 mg/L	50 mg/L
FeCl3	2.5 mg/L	2.5 mg/L
CaCl2	12.5 mg/L	12.5 mg/L
NaCl	12.5 mg/L	12.5 mg/L
1,4-dioxane	10 mg/L	10 mg/L

表(1)-3 実汚染地下水（Phase R-III）の水質

項目	実汚染地下水 (Phase R-III)
pH	7.85
1,4-ジオキサン	186 μ/L
BOD	4.1 mg/L
COD	26 mg/L
SS	24 mg/L
硝酸態窒素	4.80 mg/L
亜硝酸態窒素	0.25 mg/L
アンモニア態窒素	5.95 mg/L
全窒素	18.5 mg/L
リン酸態リン	0.35 mg/L
## （６）実汚染土壌－地下水抽出液を用いたラボスケールのバイオオーグメンテーション試験

単一炭素源として500 mg/Lの1,4-ジオキサンを添加した無機塩平板培地F上に形成したPseudonocardia sp. D17株のコロニー1白金耳を、MGY培地に植菌し、7日間の回転振盪培養（120 rpm, 28℃）を行った。遠心分離（21,900×g, 8 min, 4℃）によって集菌した後、生理食塩水（0.85%）で2回洗浄し、Pseudonocardia sp. D17株濃縮液（2.5 mg-TSS/mL）を調製した。1 Lの実汚染地下水に実汚染土壊を100 g加え、よく攪拌した後、孔径10.0 μmのメンブレンフィルター（Isopore TCTP, Merck Millipore）を用いてろ過し、固形物を取り除くことで、実汚染土壊－地下水抽出液を調製した。この実汚染土壊－地下水抽出液に表(1)-4の条件で1,4-ジオキサン、添加物（(NH₄)₂SO₄、K₂HPO₄、及びコーンスティープリカー（CSL））、及びPseudonocardia sp. D17株濃縮液（1 mL）を添加し、50 mLずつ100 mL容スクリューバイアル瓶に分注した。1,4-ジオキサンおよび各添加物の濃度は表(1)-5に示した。これらの実験系を28℃で静置し、1,4-ジオキサン濃度を経日的に測定した。

表(1)-4 実汚染土壤－地下水抽出液における Pseudonocardia sp. D17 株

バイオオーグメンテーション試験の実験系

系1	実汚染土壤－地下水抽出液 + 1,4-ジオキサン
系2	実汚染土壤－地下水抽出液 + 1,4-ジオキサン	+ D17
系3	実汚染土壤－地下水抽出液 + 1,4-ジオキサン + (NH4)2SO4 + K2HPO4	+ D17
系4	実汚染土壤－地下水抽出液 + 1,4-ジオキサン + (NH4)2SO4 + K2HPO4 + CSL	+ D17

表(1)-5 添加した1,4-ジオキサンおよび栄養源の濃度

物質名	濃度
1,4-ジオキサン	25 mg/L
$ (\mathrm{NH}_{4})_{2}\mathrm{SO}_{4} $	12.8 mg/L
$ K_{2}HPO_{4} $	0.77 mg/L
CSL	100 mg/L
THF	100 mg/L

## （7） 模擬汚染土壌－地下水カラムを用いたバイオオーグメンテーション試験

汚染土壌－地下水系を想定して構築したカラムを用いて1,4-ジオキサン汚染の浄化を試みた。MGY培地で培養したD17株菌体を回収し、1/4無機塩培地F(250 mg/L K₂HPO₄、250 mg/L (NH₄)₂SO₄、12.5 mg/L NaCl、50 mg/L MgSO₄・7H₂O、2.5 mg/L FeCl₃、12.5 mg/L CaCl₂、pH7.5）で2回洗浄したものを種菌とした。1,000 mL容のカラム（working volume = 600 mL）にガラスウールで栓をし、豊浦標準砂を表(1)-6で示す条件で充填した。ここに種菌を加え、土壌表面を直径10 cmのグラス繊維ろ紙で覆い、100 mg/Lの1,4-ジオキサンを含む1/4無機塩培地Fを0.3 L加えて、0.3 L/dayの速度で循環させた（試験系）。構築したリアクターの模式図を図(1)-2に示す。同様のリアクターに種菌を加えない実験系を対照系とした。試験は全て、28℃に保温して行った。ガスクロマトグラフを用いて循環液の1,4-ジオキサン濃度を経日的に測定した。
表(1)-6 土壤充填条件

豊浦標準砂	1.0 kg
吸水量	0.25-0.26 kg
空隙	20 mL
空隙率	3.0%

図(1)-2 土壌カラムリアクター模式図

## （８）土着微生物によるバイオスティミレーション試験

（6）に示したバイオオーグメンテーション試験と同様に調整した実汚染土壌－地下水抽出液を用いて、土着微生物によるバイオスティミレーション試験を行った。また、実汚染土壌－地下水抽出液を孔径0.2μmのメンブレンフィルター（DISMIC-25CS, ADVANTEC）で濾過することで、含まれる土着微生物を除去し、1,4-ジオキサンを添加したものを対照系とした。実験条件を表(1)-7に示す。各添加物の濃度は表(1)-5の通りである。ガスクロマトグラフを用いて培養液中の1,4-ジオキサン濃度を経日的に測定した。

表(1)-7 汚染土壤－地下水抽出液におけるバイオスティミュレーション試験の実験系

系1	污染土壤－地下水抽出液（濾過滅菌）+1,4-ジオキサン
系2	污染土壤－地下水抽出液 +1,4-ジオキサン
系3	污染土壤－地下水抽出液 +1,4-ジオキサン + (NH4)2SO4 + K2HPO4
系4	污染土壤－地下水抽出液 +1,4-ジオキサン + (NH4)2SO4 + K2HPO4 + CSL
系5	污染土壤－地下水抽出液 +1,4-ジオキサン + (NH4)2SO4 + K2HPO4 + THF
## （9） 1,4-ジオキサン濃度及びDOC濃度測定方法

各実験系より採取した1.5 mLのサンプルに、2 mol/Lの塩酸を10 μL添加し、孔径0.45 μmのセルロースアセテート製のメンブレンフィルター（DISMIC, ADVANTEC）により濾過して、1.5 mL容のエッペンドルフチューブ中にて4℃の暗所で保存した。この保存したサンプルを、ガスクロマトグラフにより分析し、1,4-ジオキサンの濃度を測定した。分析条件を表(1)-8に示す。

同様に保存したサンプルのうち流入水及び試験系のDOC濃度を、TOC計(TOC-V_{CSH}, Shimadzu)を用いてNPOC測定法により測定した。

## （１０）固定化担体中のD17株の生菌数の測定方法

試験系より固定化担体を4個採取し、生理食塩水（0.85%）を5 mL添加してホモジナイザー（IWAKI）によりホモジナイズした後、超音波処理（VCX-130；49.4 W, 20 kHz, 30 s）を施した。得られた分散液を生理食塩水（0.85%）により希釈して、1,4-ジオキサン（500 mg/L）を含む無機塩平板培地Fへと塗布して希釈平板法により生菌数を計数した。

表(1)-8 ガスクロマトグラフ分析条件

システム構成	GC-2014 (Shimadzu)
GC Solution ver 2.4 (Shimadzu)
AOC-20i+s
検出器	水素炎イオン化検出器 (FID)
カラム	ガラス製、3.2 φ ×2.1m (Shimadzu)
充填剤	Gaskuropack54 (GL-Science)
サンプル注入量	5 μm
キャリアガス	高純度窒素 (>99.999%)
キャリアガス線速度	67 mL/min.
水素ガス圧力	60 kPa
酸素ガス圧力	50 kPa
カラム槽温度	200°C (一定)
注入口温度	200°C
検出器温度	230°C
信号レンジ	10^{-1}
溶媒	H_{2}O
## 4 ．結果及び考察

## （１）１,４-ジオキサン分解菌の生理学的特徴付け

これまでの研究において単離した1,4-ジオキサン分解菌の生理学的特徴と16S rRNA遺伝子配列解析を元にした同定結果、及び1,4-ジオキサン分解特性を調べ、表(1)-9にまとめた。D1株を除く5株全てがActinobacteria綱に分類されるものであり、環境中においてActinobacteria綱細菌は1,4-ジオキサン分解に大きな役割を果たしている可能性が推測された。また、1,4-ジオキサン分解様式として、1,4-ジオキサンの存在によって分解活性が誘導される株（誘導型：D1、D6）、1,4-ジオキサンの存在に関わらず分解活性を持つ株（構成型：D11、D17）、テトラヒドロフランの存在によって1,4-ジオキサンの分解活性が誘導される株（共代謝型：T1、T5）の3種が存在することが明らかとなり、現場に存在する菌株の特性に合わせて、その分解能力を引き出す方策を決定すべきことが示唆された。

## （２）１,４-ジオキサン分解菌の遺伝学的特徴付け

D6、D11、D17、T1、T5の各株について、ドラフトゲノム解析が完了しそれぞれ7.4 Mbp、8.6 Mbp、7.3 Mbp、6.0 Mbp、6.2 Mbpの総塩基配列が得られた。各株ともに総解析塩基／予想ゲノムサイズで定義される冗長度は100を超えており、精度の高い配列データが得られたものと考えられた。D6株及びD17株については、ORF予測とアノテーション解析を行い、マイクロアレイプローブ設計に供した。

続いて、各1,4-ジオキサン分解菌のドラフトゲノム情報から、1,4-ジオキサン分解酵素遺伝子を探索した。Pseudonocardia sp. ENV478において、テトラヒドロフランとの共代謝による1,4-ジオキサン分解にthm遺伝子群が関わることが示唆されている $ ^{2)} $ 。そこで、ENV478株のthm遺伝子群と相同性の高い領域を各分解菌のゲノム情報より探索したところ、Pseudonocardia sp. D17及びRhodococcus sp. T5において、thm遺伝子群と高い相同性を持つ遺伝子群が見出された。両者はほぼ同様のものであるため、一例としてD17株の同領域の遺伝子配置（図(1)-3）とその相同性検索結果（表(1)-10）を示す。これらの遺伝子のほとんどは、ENV478株のもののみならず、同じく1,4-ジオキサン分解菌として知られるP. dioxanivorans CB1190の遺伝子群 $ ^{3)} $ とも高い相同性を示しており、1,4-ジオキサン分解に関わる遺伝子であることが強く推測された。

表(1)-9 各種1,4-ジオキサン分解細菌の生理学的特徴と同定結果

D1	D6	D11	D17	T1	T5
形態	棹状	棹状	棹状	棹状	棹状	棹状
コロニーの色	白色	白色	白色	白色	赤色	赤色
グラム染色	陰性	陽性	陽性	陽性	陽性	陽性
運動性	無	無	無	無	無	無
OFテスト	陰性	陰性	陰性	陰性	陰性	陰性
カタラーゼ活性	陽性	陽性	陽性	陽性	陽性	陽性
オキシダーゼ活性	陰性	陰性	陰性	陰性	陰性	陰性
16S rRNA遺伝子塩基配列に基づく系統学的解析	Afipia	Mycobacterium	Mycobacterium	Pseudonocardia	Rhodococcus	Rhodococcus
sp.	sp.	sp.	sp.	sp.	sp.
1,4-ジオキサン分解様式	誘導型	誘導型	構成型	構成型	共代謝型	共代謝型
Mycobacterium sp. D6、Mycobacterium sp. D11、及びRhodococcus sp. T1については、上述の方法によりthm遺伝子群を見出すことはできなかった。そこで、thm遺伝子群が、soluble di-iron monooxygenase（SDIMO）ファミリー $ ^{4)} $ に属していることに着目し、SDIMOファミリーの代表的な酵素の一つであるメタン酸化酵素soluble methane monooxygenase（sMMO）遺伝子群 $ ^{5)} $ と相同性の高い領域を、各分解菌のゲノムからRASTを用いて探索した。その結果、D6株、D11株、T1株よりそれぞれ一つずつsMMOをコードするmmo遺伝子群が見出され、またD17株からは上述のthm遺伝子群の他に、もう一つmmo遺伝子群を持つことが明らかとなった。また、D11株からはさらに、sMMOとは異なり膜結合型であるparticulate methane monooxygenase（pMMO）をコードするpmo遺伝子群も見出された。これらの遺伝子群のうち、αサブユニットをコードするthmA、mmoX、pmoA、及びメタン酸化菌であるMethylococcus capsulatusの持つmmoXの塩基配列の系統解析を行った（図(1)-4）。D17株、T5株、P. dioxanivorans CB1190、及びPseudonocardia sp. ENV478のthmA遺伝子は互いに相同性が高く、一つのグループを形成していることが示された。D6株とT1株のmmoXは相同性が高く、また、D17株のmmoXとも比較的近縁であり、これらがthmAとは異なるグループを形成していた。D11株のmmoXは他の1,4-ジオキサン分解菌とは異なり、メタン酸化菌のmmoXに比較的似ていたが、相同性は高くなく、特異な遺伝子であることが示唆された。また、D11株の持つpmoAは他のいずれの遺伝子とも異なっていた。

以上より、1,4-ジオキサン分解菌群の持つ1,4-ジオキサン分解遺伝子候補であるthm、mmo、pmoを見出すことができ、また、各伝子群の多様性とグルーピングが示唆されたものと言える。

図(1)-3 Pseudonocardia sp. D17におけるthm遺伝子群を含む領域の遺伝子配置各ORFは表(1)-10と対応している
表(1)-10 Pseudonocardia sp. D17におけるthm遺伝子群を含む領域の遺伝子相同性検索結果

Gene	start	end	Putative function of gene product	origin	%identity
orf1	15814	15452	hypothetical protein	Pseudonocardia sp. ENV478	99%
orf2	15296	13797	Betaine-aldehyde dehydrogenase	Pseudonocardia dioxanivorans CB1190	100%
orf3	13645	12011	alpha-subunit of multicomponent tetrahydrofuran monooxygenase	Pseudonocardia sp. K1	99%
orf4	11884	10799	Ferredoxin--NAD(+) reductase	Pseudonocardia dioxanivorans CB1190	100%
orf5	10765	9728	methane/phenol/toluene hydroxylase	Pseudonocardia dioxanivorans CB1190	99%
orf6	9725	9375	ThmC, tetrahydrofuran monooxygenase coupling protein	Rhodococcus sp. YYL	100%
orf7	9310	9170	Hypothetical protein	Pseudonocardia sp. K1	86%
orf8	9121	8459	Hypothetical protein	Pseudonocardia dioxanivorans CB1190	99%
orf9	8202	6766	Aldehyde dehydrogenase	Pseudonocardia dioxanivorans CB1190	99%

図(1)-4 thmA、mmoX、及びpmoAの塩基配列の系統解析
## （３）１,４-ジオキサン分解活性化因子の検討

誘導型1,4-ジオキサン分解菌であるMycobacterium sp. D6株について、種々の添加物による1,4-ジオキサン分解活性の向上を試みた（図(1)-5）。グリセロール、エチレングリコール、及びエタノールについては、1,4-ジオキサン分解の活性化は見られず、また、1,4-ジオキサンのみを含む場合と比較して菌体の増殖も抑制された。一方、グルコース及びCSLについては、1,4-ジオキサンのみの場合と比較して1,4-ジオキサン分解が良好に進行し、また、菌体の増殖が活発となった。特にCSLを添加した場合に菌体増殖が顕著であった。CSLには微生物にとって利用しやすい有機性窒素源であるアミノ酸が豊富に含まれており、これを利用することで1,4-ジオキサンの資化に伴って効率的にMycobacterium sp. D6株の菌体合成が行われるためと考えられた。

また、構成型の1,4-ジオキサン分解菌であるPseudonocardia sp. D17株についても同様に、種々の添加物による1,4-ジオキサン分解活性の向上を試みた（図(1)-6）。エチレングリコール及びエタノールについては、1,4-ジオキサンのみを含む場合と比較して1,4-ジオキサン分解及び菌体の増殖がともに抑制された。一方、グリセロール、グルコース、カザミノ酸については、1,4-ジオキサンのみを含む場合と比較して増殖が促進され、また、1,4-ジオキサン分解も促進された。CSLついては、顕著に増殖を促進したものの、明確な分解促進は生じなかった。これらのうち、グリセロール及びグルコースはPseudonocardia sp. D17株の炭素源となったものと考えられた一方、カザミノ酸及びCSLによる増殖促進はその他の添加物と比較して極めて顕著であり、Mycobacterium sp. D6株の場合と同じく、含まれるアミノ酸類がPseudonocardia sp. D17株の菌体合成を補助したものと考えられた。また、CSLが菌体増殖を促進したにも関わらず1,4-ジオキサン分解を促進したかったことから、CSLに含まれる何らかの成分が1,4-ジオキサン分解酵素遺伝子の発現を抑制した可能性があり、さらなる検討を要するものと考えられる。

以上より、グルコースやグリセロールといった利用しやすい炭素源、あるいはCSLやカザミノ酸といった有機性アミノ酸類は1,4-ジオキサン分解菌の増殖を促進し、結果として1,4-ジオキサンの分解が促進されることが明らかとなった。これは、バイオリアクター処理やバイオオーグメンテーションに用いる1,4-ジオキサン分解菌の菌体を確保するための培養の効率化に寄与する知見であると言える。一方、これらの基質は1,4-ジオキサン分解菌以外の様々な微生物の資化し得るため、原位置浄化効率の向上を狙った実際の汚染環境への直接投入には必ずしも有効でないとも考えられることから、1,4-ジオキサン分解菌のみを特異的に増殖させる、あるいは1,4-ジオキサン分解菌の分解活性を特異的に向上させる基質の探索がさらに必要であるものと言える。
B

図(1)-5 D6株の1,4-ジオキサン分解と菌体増殖の添加物による促進

A

B

図(1)-6 Pseudonocardia sp. D17株の1,4-ジオキサン分解と菌体増殖の添加物による促進
## （４）バイオリアクターを用いたモデル汚染地下水の浄化試験

固定化したPseudonocardia sp. D17株を用いてバイオリアクターを構築し、10 mg/Lの1,4-ジオキサンを含むモデル汚染地下水の処理を試みた（図(1)-7）。

運転開始から3日目において、リアクターAでの1,4-ジオキサン濃度は0.5 mg/L以下となり、対照系であるリアクターBと比較して明確な1,4-ジオキサンの除去が行われた。11日目において処理性能の悪化が確認されたが、曝気量を0.6 L/minから1.0 L/minへと上げると処理性能が回復した（Phase I）。32日目には流入水の窒素及びリン濃度を減少させたが、1,4-ジオキサンの処理性能は保たれ、またアンモニア態窒素の流入が減少したことにより硝化反応が抑えられDO値の回復が確認された（Phase II）。HRTを12時間から段階的に短くしていったところ、HRTが6時間、4時間及び3時間において、試験系の1,4-ジオキサン濃度は定量限界（0.05 mg/L）に近い濃度に保たれた（Phase III-V）。一方、HRTが2時間において、リアクターAにおける1,4-ジオキサン処理性能は悪化し、1,4-ジオキサンは約5.8 mg/L残存した（Phase VI）。その後、HRTを6時間として負荷を落とすと1,4-ジオキサン処理性能は回復した（Phase VII）。

試験系のDOC濃度は、HRTが12時間において、安定時には0.5 mg-C/L以下まで除去可能であり、中間代謝物が蓄積していないことが示唆された（Phase II）。HRTを段階的に短くしていったところ、DOC除去性能はHRTが4時間において不安定となった（Phase IV）。しかし、HRTを3時間とするとDOC除去性能は回復した（Phase V）。理由として、HRTを短くすることで1,4-ジオキサンの

図(1)-7 D17株を用いたバイオリアクターによる1,4-ジオキサン分解（Phase I～VII）
容積負荷量を上げた際に、処理速度が追いつかず分解過程で生じる中間代謝物が蓄積したが、その後、Pseudonocardia sp. D17株はこの負荷に対して適応することができたためと考えられた。

続いて、流入水中に含まれるアンモニア態窒素またはリン酸態リンの濃度を段階的に減少させていった時の流入水、リアクターA及びリアクターBの1,4-ジオキサン及びDOC濃度の経時変化を図(1)-8に示す（Phase VIII-XVI）。

模擬汚染水中に含まれるアンモニア態窒素の濃度を1.25 mg/Lから0.0125 mg/Lまで段階的に減少させた時、リアクターAでは明確な1,4-ジオキサンの除去が行われた（Phase VIII–XII）。また、リアクターAにおけるDOC濃度は、2 mg-C/L以下であり、比較的安定してDOCを低濃度まで除去できていた。つまり、中間代謝物の蓄積は見られなかったものと言える。

固定化担体中の Pseudonocardia sp. D17 株の生菌数について、Phase VIII 開始時には $ 3.1 \times 10^{7} $ cfu/mL-gel であったが、Phase XII の後には $ 3.9 \times 10^{6} $ cfu/mL-gel と減少していたことから、添加するアンモニア態窒素の制限により Pseudonocardia sp. D17 株の細胞合成が制限されたものと考えられた。

続いて、Phase XIII–XVI において、流入水中に含まれるリン酸態リンの濃度を 43 mg/L から 0.01 mg/L まで段階的に減少させた。この時、いずれのリン酸態リン濃度であっても、リアクターAでは明確な1,4-ジオキサンの除去が行われた。DOC濃度は1 mg-C/L以下に保たれ、中間代謝物の蓄積も見られなかったものと言える。また、147日目及び154日目における固定化担体中の生菌

図(1)-8 D17株を用いたバイオリアクターによる1,4-ジオキサン分解（Phase VIII～XVI）
数は $ 6.3 \times 10^{6} $ cfu/mL-gel 及び $ 1.2 \times 10^{7} $ cfu/mL-gel であり、Phase XII 後の 134 日目における $ 3.9 \times 10^{6} $ cfu/mL-gel と比較して増加していたことから、リン酸態リン濃度 0.01–43 mg/L の範囲で Pseudonocardia sp. D17 株の細胞合成は制限されなかったものと考えられた。

以上より、本課題において構築したPseudonocardia sp. D17株を用いた1,4-ジオキサン汚染地下水浄化バイオリアクターは高速で大量の汚染水を処理可能であり、また、非常に低濃度の窒素・リンにも対応できることが明らかとなった。以上より、バイオリアクターによる1,4-ジオキサン除去技術の基礎を確立できたものと考えられる。

## （５）バイオリアクターを用いた実済染地下水の浄化試験

固定化Pseudonocardia sp. D17株を用いて構築したバイオリアクターを用いて、10 mg/Lの1,4-ジオキサンを添加した実汚染地下水の処理を試みた（図(1)-9）。10 mg/Lの1,4-ジオキサンと、53 mg/Lの窒素、45 mg/Lのリンを含む模擬汚染地下水を流入させることでリアクターの立ち上げを行ったところ（Phase R-I:7-14日目）、運転開始から1日目において、試験系での1,4-ジオキサン濃度は検出限界以下となり、対照系と比較して明確な1,4-ジオキサンの除去が行われた。その後、模擬汚染地下水（Phase R-II:7-14日目）および実汚染地下水（Phase R-III:14-18日目）へと切り替えた後も、1,4-ジオキサン濃度は検出限界以下に保たれた。DOC濃度は、試験系において模擬汚染地下水に切り替わったPhase R-IIにおいて一時的な上昇が確認されたが、その後は安定し、汚染地下水を用いたPhase R-IIIでは、流入水や対照系に比べて低い値を示した。以上より、構築したバイオリアクターは、実証試験を行う岩手・青森県境不法投棄現場の地下水に対しても高い性能を発揮するものと考えられた。

図(1)-9 バイオリアクターを用いた実汚染地下水の浄化試験（Phase R-I-R-III）
## （６）実汚染土壤－地下水抽出液を用いたラボスケールのバイオオーグメンテーション試験

土着微生物を含む実汚染土壌－地下水抽出液を用いて、1,4-ジオキサン汚染地下水の浄化に対するPseudonocardia sp. D17株のバイオオーグメンテーションの適用可能性を検討した。試験結果を図(1)-10に示す。Pseudonocardia sp. D17株を添加した系2～4では、分解速度に差があるものの、すべて検出限界以下まで分解されたことから、Pseudonocardia sp. D17株は実汚染土壌－地下水系においても有効に働くことが示唆された。また、いずれの系においても、土着微生物が存在する場合に1,4-ジオキサンの分解速度がわずかに低下した。この原因として、土着微生物の生育により窒素・リン・酸素などが消費され、Pseudonocardia sp. D17株の働きが律速された可能性が考えられる。系2と、系3、系4を比較した場合、無機態の窒素・リンやPseudonocardia sp. D17株の増殖を促進することが示唆されているCSLを添加したことによる1,4-ジオキサンの分解促進は観察されなかったが、これは、本実験系では無機態の窒素・リンやCSLに含まれる有機態窒素などの栄養源ではなく、酸素が1,4-ジオキサンの分解を制限する要因であるためと推測された。

以上の結果から、Pseudonocardia sp. D17株によるバイオオーグメンテーション法は1,4-ジオキサンを検出限界以下まで分解できる有効な浄化法であることが示唆された。特に、栄養源を追加することなく浄化を行えることは、栄養源による土壌・地下水の二次汚染のリスクがないことから、本法の利点であると言える。

図(1)-10 実汚染土壌－地下水系抽出液を用いたバイオオーグメンテーション試験

$$ \mathcal{N}+\mathbf{N},\mathbf{P}+\mathbf{D}17 $$

$$ \begin{aligned}\mathcal{N}+N,P+CSL+D1\end{aligned} $$
## （7） 模擬汚染土壌－地下水カラムを用いたオーグメンテーション試験

Pseudonocardia sp. D17株を用いたバイオオーグメンテーション法の有効性をスケールアップした実験系で確認するため、模擬汚染土壌－地下水カラムを用いて試験を行った。結果を図(1)-11に示す。Pseudonocardia sp. D17株を添加した試験系では、1,4-ジオキサン濃度は約5日で検出限界以下にまで減少した。対照系においても1,4-ジオキサン濃度の緩やかな減少が確認されたが、これは揮発によるものと考えられた。従って、本実験系においてPseudonocardia sp. D17株は有効に働き、模擬汚染土壌－地下水系に含まれる1,4-ジオキサンを浄化できたものと考えられる。今回のラボスケールの試験系では1,4-ジオキサンの分解が良好に進行したが、実際の汚染現場に適用する際には、酸素の供給不足により1,4-ジオキサン分解の阻害が生じる可能性があると推測されるため、エアスパージング法等との組み合わせなど、適切な酸素供給方法の検討が、実用化に向けての課題であると考えられる。

図(1)-11 模擬汚染土壌－地下水カラムを用いたオーグメンテーション試験
## （8） 土着微生物によるバイオスティミュレーション試験

実汚染土壌および地下水中に含まれる土着微生物を活用したバイオスティミュレーション法による1,4-ジオキサン浄化の可能性を検討するために、実汚染土壌および地下水の抽出液を調製し、1,4-ジオキサンの分解を試みた。結果を図(1)-12に示す。無機態窒素とリンを添加した系3において若干の1,4-ジオキサン分解が見られたが、その他の実験系では、40日間の試験期間中に土着微生物による1,4-ジオキサンの顕著な分解は確認されなかった。後述のサブテーマ（2）における汚染地下水からの1,4-ジオキサン分解菌集積や汚染土壤からのSDIMO保有菌集積からも示唆される通り、一定数の1,4-ジオキサン分解菌が環境中に存在しており、促進因子の添加などの特定の操作により活性化される可能性があるものであると言えるが、環境中の1,4-ジオキサン分解菌の特性は未だ不明な点が多く、工学的利用に向けた課題は多いと言わざるを得ない。今後は、それらを単離し分解特性に関する知見を集積することで、1,4-ジオキサン分解菌の合理的な活性化方法を明らかにする必要があると考えられる。

図(1)-12 土着微生物によるバイオスティミュレーション試験

系1：污染土壤－地下水抽出液（滤过减菌）+1,4-ジオキサン，系2：污染土壤－地下水抽出液+1,4-ジオキサン，系3：污染土壤－地下水抽出液+1,4-ジオキサン+ $ (\mathrm{NH}_{4})_{2}\mathrm{SO}_{4}+ $

$ K_{2}HPO_{4} $ ，系4：污染土壤－地下水抽出液 +1,4-ジオキサン + $ (\mathrm{NH}_{4})_{2}\mathrm{SO}_{4} + \mathrm{K}_{2}\mathrm{HPO}_{4} + \mathrm{CSL} $

系5 污染土壤－地下水抽出液 +1,4-ジオキサン + $ \mathrm{(NH_{4})_{2}SO_{4}} $ + $ K_{2}HPO_{4} $ + THF
## （9） 汚染サイトの特性に応じた浄化戦略の選択フローの作成

本研究課題で検討してきたバイオリアクター処理、バイオオーグメンテーション、バイオステイミュレーションの三種の浄化技術を、汚染サイトの科学的特性に応じて選択するためのフローを、図(1)-13のように提案できる。サブテーマ（2）で後述するように、ジェチレングリコールの（DEG）添加により1,4-ジオキサン分解菌を含むSDIMO保有菌を汚染サイト環境試料から特異的に集積することができる。この試験により、SDIMO保有菌が増殖され、環境試料中の1,4-ジオキサンが有意に分解されるようであれば、汚染サイトにジェチレングリコール添加によるバイオステイミュレーション法を適用し得るものと判断できる。また、SDIMO保有菌の増殖と、環境試料中の1,4-ジオキサン分解がみられない場合、汚染サイトには土着の1,4-ジオキサン分解微生物が存在しないものと判断されるため、外部で培養した1,4-ジオキサン分解菌の利用が必要であると判断される。

1,4-ジオキサン分解菌が汚染サイト環境で利用できるかを確認するためには、汚染サイト環境試料を用いたラボスケールのバイオオーグメンテーション試験を予め行うことが望ましい。試験において、環境試料中の共存物質やサイトの環境条件の影響を受けず、添加した1,4-ジオキサン分解菌により浄化が達成されるようであれば、汚染サイトにバイオオーグメンテーション法を適用し得るものと判断できる。また、何らかの原因により添加した1,4-ジオキサン分解菌が働かない場合、バイオオーグメンテーション法によるin situ処理は難しいものと判断される。

揚水した汚染地下水をバイオリアクターによって処理する場合、自由にプロセスを構成することが可能であり、1,4-ジオキサン分解菌の能力を最大限に発揮させるための環境条件を整えることも、阻害的に働く共存物質を事前に処理して除くことも可能である。実際にサブテーマ（3）においてバイオリアクター処理を達成していることからも、その適用性は非常に広いと言え、汚染サイトの科学的特性に依らずに選択し得る浄化オプションであると言える。他方、浄化技術の選択のためには、汚染サイトの科学的特性のみならず、確保されている予算や工期といった事業特性も非常に重要な要素であり、これらを総合的に検討しなければならないと言える。

図(1)-13 汚染サイトの特性に応じた浄化戦略の選択フロー
## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

これまで1,4-ジオキサン分解菌の報告はわずかであったが、本研究において誘導型分解菌が2菌株、構成型分解菌が2菌株、共代謝型分解菌が2菌株の特徴付けが完了した。特にD1株、D6株、D11株、Pseudonocardia sp. D17株の4菌株については、これまでの報告において最も優れた1,4-ジオキサン分解菌であったCB1190株 $ ^{6)} $ を上回る能力を持ち、汚染地下水の浄化への適用が有望であることが明らかとなった。また、Pseudonocardia sp. D17株を用いて構築したバイオリアクターは模擬汚染地下水に対して優れた浄化性能を発揮し、10 mg/Lという高濃度の1,4-ジオキサン汚染水を環境基準値以下である0.05 mg/L以下にまで浄化することが可能であった。これは、これまで経済的に困難であった1,4-ジオキサンによる地下水の広範な汚染の浄化の可能性を開くものであると言える。また、1,4-ジオキサン分解菌を用いたバイオオーグメンテーション法による地下水浄化の試みとして、これまでに2例が報告されているが $ ^{7),8)} $ 、この両者において1,4-ジオキサンの分解には1～4ヶ月の時間を要した。一方、本研究では、模擬汚染地下水中の約10 ppmの1,4-ジオキサンを5日間で検出限界以下にまで分解することに成功しており、初期濃度や実験系の違いのため単純には比較できないものの、我々が開発したPseudonocardia sp. D17株を用いたバイオオーグメンテーションシステムは、これまでの報告と比較して高い性能を持つものであると言える。

## （２）環境政策への貢献

## ＜行政が既に活用した成果＞

特に記載すべき事項はない。

## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

これまで、1,4-ジオキサンによる汚染は高エネルギー消費・高コストとなるオゾンと紫外線による促進酸化法（AOP）を除いて净化法が存在せず、特に様々な夾雑物質を含み、処理すべき量も膨大な土壌／地下水汚染については非常に困難であった。本研究により、系統学的にも分解様式的にも多様な1,4-ジオキサン分解菌のライブラリを構築することができ、さらに、1,4-ジオキサン汚染環境のオンサイトリアクターあるいはバイオオーグメンテーションによる净化に有望な数株の1,4-ジオキサン分解菌を提示することができた。また、1,4-ジオキサン分解菌を活性化する因子や、共存汚染物質が1,4-ジオキサン分解に及ぼす影響の一部も明らかにすることができた。今後もこれらの知見集積を進めていくことにより、様々な特性をもつ1,4-ジオキサン汚染環境の浄化に対応できる浄化オプションを整備することができると考えられる。

さらに、上記の知見を基に構築したPseudonocardia sp. D17株を用いたバイオリアクターは、様々な窒素・リン濃度の模擬汚染地下水や実汚染地下水を用いた試験において高い1,4-ジオキサン分解性能を発揮しており、1,4-ジオキサンによる地下水汚染の浄化の現実的な対策となりうると期待される。我々の調査だけでも国内において公表されている1,4-ジオキサンによる地下水汚染現場は4ヶ所あり、潜在的にはさらに多くの汚染現場が存在する可能性がある。本研究により現実的な汚染対策技術が開発されれば、公表されている汚染現場の浄化への貢献のみならず、新たな汚染現場の発見と浄化の促進にも貢献できるものと期待される。我々は、学会発表などの学術的な公表のみならず、新聞報道などによる一般向けの情報発信も積極的に行うことで成果の普及に努めて