Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
が4カ所存在する）と混合することで、4分子を同一分子上につなげ、アスベストに対する結合力が飛躍的に向上したプローブを作製した。この結合力の強化によって、アスベストの蛍光画像がより明瞭に観察できるようになった。しかしながら、細いアスベスト繊維については、蛍光で観察すると見えづらく、蛍光強度を改善する必要があった。そこで、蛍光強度をあげる試みを行なった。これまでは、ストレプトアビジンのみを蛍光標識し

図(1)-16、蛍光分子の標識数の増加による蛍光強度の改善

ており、アスベスト結合タンパク質の方は蛍光標識していなかった。そこで、アスベスト結合タンパク質の方にも蛍光標識を行なう事で、標識量が増加すれば蛍光強度が増加するのではないかと考えた。具体的には、アスベスト結合タンパク質のC末端に存在するシステンに、マレイミド反応基を介して、蛍光色素DyLight488を標識した。この新たに蛍光標識したアスベスト結合タンパク質とストレプトアビジンを混合する事で、蛍光分子の数が増加したプローブを作製した（図(1)-16）。DyLight488で標識する前と、標識した後のプローブを使って、アスベストを蛍光染色し比較を行なった。具体的には、これらのプローブを用いてフィルター上に塗布したアスベスト（アモサイト）を、位相差蛍光顕微鏡法のプロトコールに従って蛍光染色を行ない、位相差顕微鏡と蛍光表顕微鏡で観察した。観察結果を図(1)-16に示す。標識する前と比べ、標識した後の方が、細いアスベスト繊維でも蛍光が明るくなっており観察しやすくなることが分かった。このようにタンパク質に対する蛍光分子の数を調節する事で、蛍光観察するのに十分な蛍光強度を得られる事が分かった。これを最適なバイオプローブとした。

ビオチン化HNSタンパク質の発現には、宿主として大腸菌を一晩培養し、IPTG（終濃度0.5mM）とD-ビオチン（終濃度100μM）を添加後、さらに18℃で21時間培養を行なった。HNSタンパク質の精製はHisTagを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって行った。精製したタンパク質についてポリアクリルアミド電気泳動により精製度を確認したところ95%以上であったので、これを生産方法とした。

## （２）実サンプルを用いた検証（相関顕微鏡を用いた繊維の特異性の検証）

## 1 ）光・電子相関顕微鏡を用いたバイオ蛍光法の特異性の検証

標準サンプルを用いて、特異性を検証した結果、十分な特異性が得られたと考えている。しかし本方法が公定法化されるためには、実際のサンプルではどこまで信頼性があるのか、起こると
すればどのような問題が

起こりえるのかを把握する

必要性がある。すなわち、

蛍光顕微鏡で見えている

繊維が本当にアスベスト

であるのかの確証を得る

必要がある。そのために、

蛍光顕微鏡で観察した視

野と同一の視野を電子顕

微鏡で観察して、エネルギー

一分散形X線分光器(EDX)

で分析して同定する必要

がある。しかし、蛍光顕微

鏡で観察された同じ繊維

を電子顕微鏡で探し出す

のは非常に困難な作業で

ある。さらにアスベスト捕

集に使用するニトロセル

ロースフィルターは繊維

図(1)-17、光電子相関顕微鏡システム。蛍光を示すアスベストの位置を記録し、同じ位置の繊維を電子顕微鏡（SEM）で観察することができる。SEM-EDXで元素分析することでアスベストを確認する事ができる。観察図はアモサイト標準繊維を蛍光顕微鏡で観察した後、電子顕微鏡で同じ繊維を観察した結果である。

で構成されているため、その上にある繊維状物質は、電子顕微鏡の低倍率では背景と区別が付きにくく、広範囲の中から同一の繊維を探し出すことはほぼ不可能に近い。光電子相関顕微鏡は蛍光顕微鏡と電子顕微鏡で試料ステージを共有する特殊な顕微鏡である。蛍光顕微鏡で観察した視野の位置情報を記録し、電子顕微鏡で観察に移した際に、同一の視野に自動で移動してくれる。

そこで、光・電子相関顕微鏡システムをリースにて導入し、蛍光顕微鏡と電子顕微鏡で同一繊維の観察及び分析を行った。まず標準サンプルのアモサイトを捕集したフィルターを、アスペスト蛍光試薬で処理した後、蛍光顕微鏡で観察した。蛍光を放つ繊維の画像及び位置情報の取得を行ない、次に試料台を電子顕微鏡に移した。位置情報を入力することで、同一視野、同一繊維を観察することができた（図(1)-17）。さらに、その繊維をエネルギー分散型X線分光器（EDX）で分析することにより、アモサイトであると同定できた。このように、標準繊維を用いて蛍光顕微鏡と電子顕微鏡で同一繊維の観察及び分析するシステムを確立した。

このシステムを用いて、実際の解体工事のサンプルを用いてプローブの性能を検証した（資料集36-95に掲載）。フィルター34種類を用いて蛍光法を実施し、蛍光を示した繊維340本を電子頭微鏡で観察し、エネルギー分散型X線分析装置（EDX）で分析した。その結果、322本（角閃石262本、クリソタイル60本）がアスベストであることが分かった。すなわち蛍光法によるアスベスト判定における偽陽性率は約5%であることが分かった。

この確度は、迅速法としては、十分であると考えられるが、さらに蛍光を示しながらアスベストではないものを詳細に分析することによって、確度を100％に近づけるための改善方法を探った。分析の結果、アスベスト以外の繊維として、有機繊維6本、鉱物繊維（Mg: Al: Si: Ca = 0.3: 0.4: 1: 0.5）7本、ケイ酸アルミ（Al: Si = 0.7: 1）2本、鉱物繊維（Si）1本、鉱物繊維（Mg: Al: Si: Ca = 0.3: 0.4: 1: 0.5）7本、ケイ酸アルミ（Al: Si = 0.7: 1）2本、鉱物繊維（Si）1本、鉱物繊維（Mg: Al: Si: Ca = 0.3: 0.4: 1: 0.5）7本、ケイ酸アルミ（Al: Si = 0.7: 1）2本、鉱物繊維（Si）1本、鉱物繊維（Mg: Al: Si: Ca = 0.3: 0.4: 1: 0.5）7本、ケイ酸アルミ（Al: Si = 0.7: 1）2本、鉱物繊維（Si）1本、鉱物繊維（Mg: Al: Si: Ca = 0.3: 0.4: 1: 0.5）7本、ケイ酸アルミ（Al: Si = 0.7: 1）2本
Ca = 0.2 : 0.4 : 1 : 0.2)

1本、鉱物繊維（Na:

Mg: Al : Si : K: Ca : Fe = 0.1 : 0.3 : 0.6 : 1 : 0.1 : 0.1 : 0.1）1本、

であることがわかった。有機繊維については、蛍光を呈する励起波長の特性が異なるため、自家蛍光（蛍光プローブが結合して蛍光を持つものではなく、繊維自体が元来蛍光を持つもの）と考えられた。有機繊維の自家蛍光の特徴として、励起・蛍光波長の特性が、アスベストバイオプローブ標識に利用したCy3やCF488A

図(1)-18、波長切り替えによるアスベスト判定。アスベスト結合タンパク質の蛍光の励起波長域は480nm付近であるが、自家蛍光を持つ非アスベストの蛍光は、360nmの短い波長であっても、540nmの長い波長であっても励起され、蛍光が観察される。

と異なる。そこで、この特徴を使えば、有機繊維なのか、アスベスト蛍光プローブが結合したアスベストなのかが判定できると考えられた。具体的には、蛍光タンパク質（CF488Aで修飾したアスベスト結合タンパク質）は、490nm付近に励起波長のシャープな吸収ピークがあるため、360nmや540nmの励起波長では励起されない（蛍光がない）。一方、自家蛍光を持つ有機繊維の場合、360nmや540nmでも励起されて蛍光があるので、見分けられた（図(1)-18）。

また、鉱物繊維についてはアスベストの代替であるロックウール様の組成を示している。ただし、ロックウールやケイ酸アルミについては、プローブは結合しないことが分かっているので、表面が何らかの修飾を受けて、アスベスト結合ペプチドが結合している可能性が考えられる。ロックウールであれば、酸によって溶解するので、捕集フィルターを酸処理することによって、擬陽性が回避できると考えている。

## 2 ）偽陰性の評価

蛍光法によるアスベスト検出の感度については、これまでの研究結果から30ナノメートル幅の微細なクリソタイル繊維が検出できることが分っている。これは最も細いアスベストの単繊維と同等の太さである。このことから、蛍光法では微細なアスベスト繊維も見落とすことはないと考えられる。しかし一方で、様々な夾雑物がある実際の環境測定において、蛍光法がその性能を発揮できるかを確認する必要がある。そこで実際の解体現場やアスベスト除去作業現場において飛散しているものを用いて評価試験を行うために、アスベスト含有吹付け材を試料として使用することとした。また、偽陰性の可能性を直接的に評価するためには、アスベスト繊維の存在と、そ
の同一の繊維について蛍光プローブの反応の有無を確認する必要がある。位相差・蛍光顕微鏡法は、顕微鏡の光路切り換えレバ一で観察モードを位相差／蛍光と切り換えるだけであるので、視野を替えずに同一の繊維を両方の観察法で交互に見ることができる分析方法である。従って、繊維状物質が全てアスベストである場合、位相差モードで観察された繊維の蛍光性の有

試料①	試料②	試料③
使用石綿:アモサイト	使用石綿:クロシドライト	使用石綿:クリソタイル
位相差	蛍光	位相差	蛍光	位相差	蛍光
検出本数(本)	119	115	124	123	122	120
検出本数比(%)	96.6	99.2	98.4

図(1)-19、偽陰性確認試験結果（上）と試料①の同視野における位相差及び蛍光観察像（下）。番号の場所に繊維が確認された。位相差モードで観察された繊維365本のうち、358本が蛍光モードで検出された（偽陰性率1.9%以下）。

無を確認することによって、蛍光法の偽陰性について調べることができる。試料であるアスベスト含有吹付け材は、協力機関である環境調査会社（九電産業株式会社）より入手した。使用した3種類の試料のアスベスト含有率は、X線回折分析装置（XRD）による分析では、それぞれアモサイト12.5%、クロシドライト49.3%、クリソタイル10.6%であった。これらの試料を粉砕後、水分散させメンブレンフィルター上に捕集して試料を作製した。この試料を電子顕微鏡観察及びEDXにより分析した結果、それぞれ繊維20本について、全てアスベストであった。次にこの試料を位相差・蛍光顕微鏡法で分析した結果、365繊維中、358繊維をアスベストと判定することができた（図(1)-19）。実サンプルであるのでアスベスト以外のものが含まれていた可能性もある。従って、現状では偽陰性率が最大でも1.9%であると言える。

## （３）アスベスト迅速計測法の確立

## 1 ）位相差蛍光法によるアスベスト検査

位相差顕微鏡を用いたアスベスト検出法による数値が、長い間疫学的危険度の相関に使われてきたことから、今も基本的に位相差顕微鏡による数値が使われている。バイオ蛍光法は、位相差顕微鏡では検出できない微細なアスベスト繊維も検出できることから、検出されるアスベストの総数は、位相差顕微鏡によって検出される総数よりも多くなることが指摘されていた（“見えすぎ問題”と仮称）。それにより、従来の位相差顕微鏡・電子顕微鏡法によって取得された過去のデータと連続性がないのではないかといった懸念が専門家から指摘された。バイオ蛍光法を広く一般化するために、如何に従来の位相差顕微鏡による計測、電子顕微鏡法による判定の基準を変
えないようにアスベストを計測するかという技術的課題を乗り越える必要があった。

位相差顕微鏡は、蛍光ユニットを追加して、同一視野を位相差モード（透過型）と蛍光モード（落射型）で切り替えながら観察することが可能である。このモードの切り替えは光源と光路の切り替えだけなので、顕微鏡によってはレバー1つで簡単に切り替わる。まず、位相差モードで繊維を計測し、次に蛍光モードに切り替えて、その繊維がアスベストかどうかを判定することで、“見えすぎ問題”が解決できた（図(1)-20）。すなわち、位相差顕微鏡で確認できた繊維のうち、蛍光を持つ繊維をアスベストとして計測するので、従来

(A)

(B)

図(1)-20、位相差・蛍光顕微鏡法によるアスベスト計測。(A)は位相差顕微鏡画像。(B)は(A)の位相差顕微鏡画像と同一視野における蛍光顕微鏡画像を示す。位相差顕微鏡下で観察した繊維状の物質1,3,5において、蛍光顕微鏡下で蛍光タンパク質の結合を確認することができた。一方、位相差顕微鏡下で観察した繊維状の物質2および4においては、蛍光顕微鏡下で蛍光タンパク質の結合を確認することができなかった。この結果、繊維状の物質1,3,5は、アスベストであると判定し、繊維状の物質2および4は、アスベスト以外の繊維と判定できる。

の位相差顕微鏡による計測、

電子顕微鏡法による判定の数値を超えることはない。これにより、位相差顕微鏡の過去のデータとの連続性が担保され、基準が変わるのではないかといった危惧が払拭できた。さらに従来の電子顕微鏡では、位相差顕微鏡で見た繊維と同一の繊維を観察する（探す）ことが事実上不可能である一方で（光・電子相関顕微鏡では可能だが、高価のため一般普及は難しい）、位相差蛍光顕微鏡法は、同一の繊維を容易に確認できることは特筆すべき改良点である。

## 2 ）バイオ蛍光法と公定法（電子顕微鏡法）との相関

現在、『アスベスト・モニタリング・マニュアル 第4.0版』（環境省）による標準的な分析法では、まず位相差顕微鏡によって非アスベストを含む総繊維

図(1)-21、公定法（電子顕微鏡法）と位相差・蛍光法によるアスベスト繊維数濃度測定結果の相関
での繊維数濃度を測定し、1本/L以上の場合に、さらに電子顕微鏡とX線分析装置（EDX）を用い、アスベストの同定を行いながらアスベスト繊維数濃度を測定することとなっている。蛍光顕微鏡法は手順・操作が簡単なため従来法より迅速性に優れる方法である。しかし、得られた測定結果を従来の基準（疫学的データや、環境基準）と照合しながら評価するためには、従来法による測定結果との関係を把握することが必要である。そこで大気捕集フィルター・サンプルを分割し、同一捕集フィルターを両分析方法によって測定することによって、その相関性の検証を行った。実際の解体現場において捕集したサンプル（19サンプル）を用いて、それぞれの方法により計測した結果、相関係数0.87（p<0.01）と高い相関性を示した（図(1)-21）。電子顕微鏡法による測定を行わずとも、同程度の計測が可能な方法であることが確認できた。

## 3 ）測定者の教育、誤差最小化

大気中アスベストの測定は、人が顕微鏡で観察しながら複雑な計測ルールに従って微細な繊維の一本一本を数えるという作業によって行われる。そのため、測定者の習熟度の違いによって測定結果に大きなバラつきが出ることが知られている。蛍光顕微鏡法はコントラストの高い蛍光顕微鏡を用いることによって、判定の容易さと識別性を向上させることが可能な方法である。操作手順自体は簡便であるので特別な訓練は不要であると考えられるが、この方法を普及させるに当たって、初心者から熟練者までがスムーズに計測を実施するために必要な措置や改良点を検討するために、環境省の実施し

図(1)-22、リロケータブルスライドを用いた同一試料の測定結果比較

た「解体現場における迅速な測定方法に関する調査」に参加した。この調査では、リロケータブルスライドを用いることにより、複数の測定者による同一サンプル同一視野での計測結果が比較された。リロケータブルスライドとは、カバーガラスに視野位置を示す番地が印刷されており、一旦顕微鏡ステージから外し異なる顕微鏡装置へ移動させた場合でも、同一の視野を再び観察することが可能なサンプルスライドである。試料は実際の解体現場の大気捕集サンプル3種類を使用した。3機関の3人の測定者がこれらの試料の同一の視野（それぞれにつき50視野）について位相差・蛍光顕微鏡法による計測を行い、その結果を比較した。測定者A及びCによる測定では比較的近い数値を得ることができたが、特に試料①、②において測定者Bのアスベスト計測値が低かった（図(1)-22）。その要因としては、位相差観察においては明るい背景中にある繊維を観察することになるが、蛍光法ではアスベスト繊維以外の背景全体が暗い。そのため位相差／蛍光を切り換えた際に視野全体の光量が大きく変化し、目の順応が追い付かず、蛍光でのアスベスト計測値を下げてしまったことが考えられた。対策の一つには、位相差モードでの光量の調節や慣れによる改善があげられる。さらに、測定者の個人的な視力の差による影響を受けにくいモニター式顕微
鏡を利用することが有効であると考えられた（「流通可能な安価なアスベスト計測システム」の項、参照）。また、現在、日本で使用されている位相差対物レンズは背景が明るく、観察対象物が暗いダークコントラス方式のものであるが、蛍光法の観察像に近いブライトコントラスト（背景が暗く、観察対象物が明るい）の位相差用対物レンズの使用も考えられた。

## 4 ） 蛍光法のための補助具の開発

蛍光法をより簡便で利用しやすい形態にするための補助具を設計し、3Dプリンターにより作製した（図(1)-23）。蛍光法の通常のサンプル処理手順では、サンプリング後にホルダーからフィルターを取り出し、1/4サイズのフィルター片を切り出し、蛍光染色を行った後、スライドガラス上に移して、顕微鏡観察を行う必要があった。これら一連の手順においては、薄く小さなフィルター片をピンセットで扱う作業を伴うため、特に実験環境の整っていない解体現場などで検査を実施する場合、サンプルの落下事故などが発生する可能性が考えられる。

①サンプリングホルダー用キャップ

②顕微鏡観察用支持ディスク・ホルダー

図(1)-23、作製した蛍光法用の補助具（白い造形物）。

られた。そのため、サンプリング後のホルダーに直接、試薬を滴下するためのホルダーキャップを考案した。また同時に、サンプリング時の有効ろ過面積を1/6程度に縮小する設計とし、サンプリング時間の短縮も図った。さらに、サンプリングホルダーに使用されている円形の支持ディスクに乗せたまま、サンプルを顕微鏡の観察ステージにマウントできるパーツを作製した。その結果作業手順を簡略でより安全なものとすることができた。これらを利用することにより、1/6のサンプリング時間（約10-20分）でより簡便にアスベストの迅速検査を実施することが可能となった。

## 5 ）位相差蛍光顕微鏡と顕微鏡用モニター

従来の蛍光顕微鏡は蛍光用励起光源として超高压水銀ランプを使用したものが主流であったが、近年LEDを利用したものも開発されており、消費電力が低くバッテリーによる運用が可能であり、またコンパクトで携帯性が高いことから現場へ持ち込むことも可能である。なかでも位相差/蛍光観察の切り換えがレバー1つで可能なPrimostar（カールツアイス社製）は、位相差/蛍光法を実施する上で非常に適したモデルであると言える。また、顕微鏡用モニターは、目への負担を軽減することが可能であると同時に、顕微鏡観察初心者でも利用することがより容易になる。小型で安価な顕微鏡用モニターシステムとしてDigital Sight DS-Fi2/L3（ニコン社製）がある（図(1)-24）。
このシステムは小型のモニター部にカメラ制御用のソフトが組み込まれており、PCが不要であり、携帯性も高い。また観察、撮影の他、繊維の端点を指定して繊維長を計測するツールも装備されている。PrimostarとDigital Sightの組み合わせを利用して実際のサンプルを観察したところ、蛍光染色したアスベストの観察が可能なことが確認できた。位相差／蛍光法で計測を行う場

図(1)-24、LED型蛍光顕微鏡Primostar i-LEDと顕微鏡用モニターDigital Sight(左)、及びDigital Sightでのアスペスト観察像(右)。長さ計測ボタンを押し、繊維両端をクリックすると長さを計測できる。

合、露光時間やゲインのパラメータをプリセットで設定すれば感度調整を簡単に行うことが可能であった。普及型のモデルとしては安価であることも重要である。従来の高性能な蛍光顕微鏡とCCDカメラのシステムと比較して、半分程度の価格で導入することが可能であり、現実性の高い組み合わせであると考えられた。

## 6 ）携带型小型蓝光顕微鏡

前述のようにLED型顕微鏡は、従来型のものに比べて小型化されているが、さらに、目による観察のための光学系（接眼レンズ及び接眼鏡筒部）を持たず、モニターによる観察を前提とした顕微鏡も存在する。その中には、非常に小型・軽量に作られており、より携帯性の高い機種がある。Lumascope（Etaluma社製）は、顕微鏡単体では重量が2.6kgと非常に軽量な蛍光顕微鏡である（図(1)-25）。Lumascope及び前述のPrimostarを用いて、解体現

図(1)-25、モニター式小型蛍光顕微鏡Lumascope外観（左）とLumascope及びPrimostarによる観察像の比較（左）。小型でも明瞭にアスベストの観察が可能。

場での大気捕集フィルター（13種類）について、蛍光法による計測を行った結果、検出繊維数は
ほぼ変わらず、どちらの顕微鏡を利用しても同等の結果が得られることがわかった。ただし、Lumascopeには位相差観察装置が装備されていないため、蛍光法による計測のみを行うより迅速な測定用のモデルとして利用することを想定している。現場での迅速な測定に際しての利便性を考慮すると、携帯性の高い顕微鏡には大きな利用価値があると考えられる。これにより、利用者の目的に合わせて、位相差／蛍光顕微鏡法用のモデル、蛍光法専用のより小型なモデルの二通りを提供することが可能となった。

## 7 ）バイオ蛍光法の一般大気分析への応用

バイオ蛍光法は、アスベスト解体現場における迅速な計測法としての利用に留まらず、広く一般大気中のアスベスト計測、またプローブを他の物質に対して結合特性を持つものに変更すれば、他の検出対象についても応用可能な技術である。これらへの応用の可能性を検討するために、解体現場以外の一般大気環境として道路交差点脇にてサンプリングを行い、蛍光法によるアスベスト計測を行った。また、PM2.5を捕集したフィルターについても、蛍光顕微鏡による観察及び電子顕微鏡による分析を行った。

交差点サンプルのアスベスト計測については、後述する補助具（「萤光法のための補助具の開発」の項、参照）を用い短時間サンプリングでの計測を試みた。今回の計測では、15分程度の短時間サンプリングで、アスベスト繊維数濃度は検出下限値（0.49本/L）以下という判定を得ることができた。かつてはブレーキライニングなどにアスベストが利用されていたため、交通量の多い道路沿いではアスベストが浮遊している可能性がある。短時間サンプリングと迅速な萤光法を組み合わせることにより、測定点と測定頻度を増やし、全国でより綿密にアスベストの飛散状況をモニターすることが可能となる。

またアスベスト以外の物質に

も広く結合するプローブ

（GGGS3-K8-SA-Cy3）を用いて、PM2.5及び粗粒子を捕集したフィルターに対し光・電子相関顕微鏡による分析を行った。PM2.5を捕集したフィルター上には蛍光試薬と反応する粒子が見られ、EDXで分析したところ鉱物由来の粒子であると判明した。また別のフィルター上には蛍光を示す粒子と共に蛍光を示さない（蛍光試薬が結合しない）粒子がSEMにより観察された。蛍光を示す粒子は先ほど同様鉱物由来のものであったが、蛍光を示さなかった粒子は金属元素を含まない有機物であった（図(1)-26）。つまり、この

図(1)-26、粒子状物質を捕集したフィルターの光・電子相関頭微鏡による観察像及びEDXスペクトル。①の鉱物由来と考えられる粒子については蛍光で観察されたが、②の有機物については蛍光は見られなかった。
プローブを利用した場合、ある種の有機物に対しては反応しない性質があることが分った。このことからプローブの特性をより詳細に検討し設計することにより、例えばPM2.5の中でも特に発癌性や変異原性が指摘されている多環芳香族炭化水素と毒性の低い自然由来の無機物との成分種別によるクラス分けなどに利用できる可能性が示唆された。

## 8 ）アスベストの発光検出技術の検討

課題としては予定していなかったが、もしアスベストが蛍光ではなくて、発光で検出できれば、さらに高感度になる可能性があったので、検討した。また、これまで開発してきた蛍光法は、簡便に検出できるというメリットをもつ反面、自家蛍光を有する物質と区別することが難しかった。自家蛍光は、どの励起波長でも蛍光を発する特徴から、UV励起を使って自家蛍光であるかどうか判定できることがこれまでの研究で分かっている。しかし、この判定では複数の励起波長を使える

Furimazine (-)

Furimazine (+) (発光基質)

図 (1)-27、アーティストの蛍光基質を入れた場合

測定条件: ゲイン: 500, 露光時間: 0.5s

図(1)-27、アスベストの発光検出。発光基質であるFurimazineを入れた場合に、アモサイトが発光した（暗視野）。

光基質が酸化される過程で光が生じ、ルシフェラーゼという酵素がこの反応を触媒している。蛍光は外部から光(励起光)が必要であるが(この励起光が自家蛍光を持つ物質を光らせてしまう)、一方で発光は外部からの光が必要ない(発光基質とルシフェラーゼがあれば発光する)ことから、自家蛍光を持つ物質があっても光らないためバックグラウンドの低い検出法である。近年の技術の発展により、高輝度のルシフェラーゼと高感度CCDカメラを用いることにより、発光を顕微鏡で観察することが可能となってきた。そこで、これらの技術を利用して、アスベストを発光で検出する事を試みた。まず、高輝度ルシフェラーゼとしてNanoLucを使用することにした(このNanoLucは、Furimazineという発光基質と反応して光を生じる。ホタルルシフェラーゼと比較して100～150倍活性が高いことが知られている)。この高輝度ルシフェラーゼNanoLucにアスベスト結合タンパク質を融合したタンパク質(HNS60-90-NanoLuc-AviTag)を作製した。この融合タンパク質を、これまでと同様にストレプトアビジンと結合させて4量体にして結合力を強化したプローブを調製し、アスベストに結合させ、顕微鏡で観察を行なった。観察には、高感度CCDカメラであるEM-CCD(iXON+、ANDOR社製)を使用した(図(1)-27)。発光基質を添加したサンプルでは、アスベストが発光している様子を観察することができた。一方、発光基質を添加しなった場合は、発光は検出されなかったため、検出された発光はNanoLuc由来のものであると確認できた。しかしながら、細いアスベスト繊維については、発光が弱く検出が難しいことが分かった。
## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

バイオ蛍光法は、蛍光で修飾したアスベスト結合タンパク質によって、アスベストを蛍光で可視化する世界で初めての技術である。沢山の種類のタンパク質から無機物質に結合するタンパク質を選択し、蛍光で修飾することでバイオイメージングに応用した。バイオイメージングの世界を無機物質の検出に広げたことは、科学的に大きな意義がある（平成24年度文部科学大臣表彰科学技術賞受賞）。また、本研究開発によって、初めてアスベスト結合領域をペプチドレベルで特定し、特異性と結合性を実際の現場で利用できるレベルまで向上させることができた。実際、現場のサンプルを使って特異性を評価した結果、誤認識率は5%、偽陰性率2%以下でアスベストが問題なく検出できることが実証できた。遺伝子工学、タンパク質工学を駆使して、環境中のアスベスト検査に資するバイオプローブを作成できたことは意義深い。さらに、蛍光顕微鏡で観察できる微細クリソタイルの直径は、30-35nmであることがわかっている。ナノサイズの粒子は、通常の光学顕微鏡では見ることができないくらい小さいが、蛍光でラベルすれば、その存在は可視化できることを実証した。これによりバイオ蛍光法がアスベスト以外にも近年毒性が指摘されているナノ材料の簡便な可視化にも将来応用できる可能性を示したことは科学的に意義が大きい。

## （２）環境政策への貢献

## ＜行政が既に活用した成果＞

バイオ蛍光法によるアスベスト迅速検出法は、環境省アスベストモニタリングマニュアル第4版に記載されている。本研究開発でより信頼性の高いアスベスト迅速計測法が確立できた。

## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

アスベストはこれまでの曝露だけでも今後2030年前後までに約10万人の中皮腫発症を予想する文献も存在する(The New England Journal of Medicine, 353:1591-1603, 2005)。解体現場や瓦礫処理の際のさらなる曝露が重なれば、さらに数十年先までもアスベスト起因性のガン発症の問題を抱えることになる（解体現場のアスベストリスク）。アメリカでは、アスベストは懲罰的損害賠償の対象になるが、日本ではこの賠償はほとんど認められておらず、検査の動機付けにはなっていなかった。そこで2013年6月、石綿飛散防止強化へ向けて法改正が行われ、届け出がなくともアスベスト飛散の恐れがある場合に自治体が立ち入りできる様になった。しかし、現在の大気アスベスト検出の公定法は時間がかかること、提案されている偏光顕微鏡法は複雑な方法であり、且つ微細アスベスト等を見逃してしまう等の問題があり、立ち入り検査の際に利用できる簡易迅速検査法が確立されていなかった。

本方法は、暗視野の中でアスベスト繊維が特異的に光っているために、直ちに微細アスベストも検出できる等の利点がある（推進費の中間評価でS評価）。平成25年10月23日、第10回中央環境審議会石綿飛散防止専門委員会の資料中で、簡便で迅速な蛍光法の普及を期待する旨が記
述されている。

民間の検査会社では、方法論が優れているだけでは技術の普及に至らない。特にアスベストなど社会的な問題が大きい場合には、公的な機関の積極的な評価や自治体・民間への周知が必要となる。

### 6. 国際共同研究等の状況

特に記載すべき事項はない。

## 7 ．研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

## <論文（査読あり）>

1）黒田章夫、石田丈典、西村智基、アレクサンドロフ・マキシム、奥山里美：Journal of Environmental Biotechnology, 11, 17-21 (2011)

「アスベストを検出するための環境バイオテクノロジー」

2) 黒田章夫、石田丈典：光学、41(1)，28-32（2012）

「蛍光顕微鏡を用いた大気中アスベスト検出」

3) T. Ishida, M. Alexandrov, T. Nishimura, K. Minakawa, R. Hirota, K. Sekiguchi, N. Kohyama, and A. Kuroda: Journal of Fluorescence, 22, 1, 357-363 (2012)

“Evaluation of sensitivity of fluorescence-based asbestos detection by correlative microscopy”

4) T. Ishida, M. Alexandrov, T. Nishimura, K. Minakawa, R. Hirota, K. Sekiguchi, N. Kohyama, and A. Kuroda: PLos ONE, 8(9):e76231 (2013)

“Molecular engineering of a fluorescent bioprobe for sensitive and selective detection of amphibole asbestos”

5）黒田章夫、石田丈典、西村智基、Maxym Alexandrov：作業環境、35(1)，57-62(2014)「蛍光顕微鏡法による大気アスベスト検査の有効性検証と位相差蛍光顕微鏡法への応用」

## くその他誌上発表（査読なし）>

1) 黒田章夫、石田丈典: ナノ融合による先進バイオデバイス (シーエムシー出版) 249-257 (2011) 「ナノ分子デザインによるアスベストバイオプローブの作成」

2）黒田章夫、石田丈典、西村智基、Maxym Alexandrov、奥山里美、神山宣彦：日本労働衛生工学会妙録集、34-35（2012）「蛍光顕微鏡法によって実際の大気サンプルのアスベスト繊維を判定した場合の確度の検証」

3）黑田章夫、石田丈典、西村智基、Maxym Alexandrov、市田越子、青木功介、河崎哲男、神山宣彦：日本労働衛生工学会妙録集、62-63（2013）

「蛍光顕微鏡法によるアスベスト検査と自動化ソフトウェアの開発」

4）黑田章夫：日本工業出版「検査技術」18(9)，44-48（2013）
「蛍光タンパク質でアスベストを簡単に検出」

5）黒田章夫：産業と環境、42(6)，81-84（2013）

「現場で簡便に利用できるアスベスト計測技術の開発」

6）黒田章夫、石田丈典、マクシムアレクサンドロフ、西村智基：バイオインダストリー、30(6)，54-61（2013）「バイオ技術によるアスベスト蛍光検出技術の開発」

## （2） 口頭発表（学会等）

1）黒田章夫：環境バイオテクノロジー学会（2011）

「バイオによるアスベスト迅速検出」

2) A. Kuroda, T. Ishida, M. Alexandrov, T. Nishimura: National Environmental Monitoring Conference (2011)

“Detection of Airborne Asbestos by Fluorescent-labeled protein probe and its Application to quick Monitoring”

3) T. Ishida, M. Alexandrov, A. Kuroda: National Environmental Monitoring Conference (2011)

“Fluorescence Microscopy-Based Method for Selective Detection of Asbestos”

4) 黑田章夫、石田丈典、西村智基、神山宣彦：日本労働衛生工学会（2011）

「位相差蛍光顕微鏡法によるアスベスト検査」

5）黑田章夫：新技術説明会（大阪工業会議所），2011年9月11日

「バイオ技術を駆使したアスベストの検出技術」

6）黑田章夫、石田丈典、西村智基、Maxym Alexandrov、奥山里美、神山宣彦：日本労働衛生工学会、2012年11月14日

「蛍光顕微鏡法によって実際の大気サンプルのアスベスト繊維を判定した場合の確度の検証」

7) A. Kuroda, T. Ishida, M. Alexandrov, T. Nishimura: Michael E. Beard Conference, Asbestos Laboratory Issues (ASTM, Florida), Jan. 31, 2013

“Detection of Airborne Asbestos by Fluorescent-labeled protein probe and its Application to quick Monitoring”

8）黒田章夫、石田丈典、西村智基、M. Alexandrov、神山宣彦、関口潔：日環協・環境セミナー，2013年9月27日

「蛍光顕微鏡による大気アスベスト繊維検出法の開発」

9）黑田章夫、石田丈典、西村智基、Maxym Alexandrov、市田越子、青木功介、河崎哲男、神山宣彦：日本労働衛生工学会、2013年11月14日

「蛍光顕微鏡法によるアスベスト検査と自動化ソフトウェアの開発」

## （3） 出願特許

特に記載すべき事項はない。

（４）シンポジウム、セミナー等の開催（主催のもの）
1）「蛍光顕微鏡法によるアスベスト計測」講習会（平成23年10月6日、カールツアイスマイクロスコピー（株）東京本社、対象：アスベスト計測の従事者10名）

2）「アスベストをバイオテクノロジーで観る」講義（平成23年10月28日、広島大学、対象：広島大学附属福山中学校生30名）

3）「蛍光顕微鏡法によるアスベスト計測」講習会（平成23年12月2日、カールツアイスマイクロスコピー（株）東京本社、対象：アスベスト計測の従事者10名）

4）「バイオテクノロジーでアスベストを観る」出前講義（平成23年12月16日、久留米高専専攻科物質工学専攻、対象：5年生及び専攻科学生18名）

5）「蛍光顕微鏡法によるアスベスト計測」講習会（平成24年3月2日、カールツアイスマイクロスコピー（株）大阪支社、対象：アスベスト計測の従事者13名）

6）広島大学公開講座、「バイオでアスベストを検出する」、2012年9月1日、広島大学エクステンションセンター、観客40名

7）広島大学公開講座、「バイオでアスベストを検出する」、2013年8月31日、広島県民文化センター、観客50名

## （５）マスコミ等への公表・報道等

1）中国新聞（2012年4月11日、27面）アスベスト検出技術開発で文部科学大臣表彰、コピーを巻末に添付。

2）毎日新聞（2012年6月21日、広島版、21面）アスベスト検査技術「バイオ蛍光法」従来より検査迅速に、コピーを巻末に添付。

3）中国新聞（2013年4月1日、17面）アスベスト簡単に測定、コピーを巻末に添付。

## (6) その他

黒田章夫、石田丈典、2012年4月9日、平成24年度文部科学大臣表彰科学技術賞（開発部門）、「バイオ蛍光法によるアスベスト検出技術の開発」

### 8 \. 引用文献

特に記載すべき事項はない。
## 資料集

Ⅰ．アスベスト結合バイオプローブの繊維状標準物質との反応性

Ⅱ．解体現場大気サンプルを用いた蛍光バイオプローブによるアスベスト検出例、及び電子顕微鏡による同一繊維の確定分析画像
資料Ⅰ．アスベスト結合バイオプローブの繊維状標準物質との反応性

位相差顕微鏡

クロシドラ

仆

グラス

ウール
資料Ⅱ．解体現場大気サンプルを用いた蛍光バイオプローブによるアスベスト検出例、及び電子顕微鏡による同一繊維の確定分析画像

試料；No.01 解体現場

試料；No.01 解体現場
試料；No.01 解体現場

試料；No.01 解体現場
試料；No. 02 解体現場

試料；No.02 解体現場
試料；No. 03 解体現場

試料；No.03 解体現場
試料；No.03 解体現場

試料；No.03 解体現場
試料；No.04 解体現場

EDXスペクトル

試料；No.04 解体現場

#F012

EDXスペクトル
試料；No. 04 解体現場

試料；No. 05 解体現場

#F014
試料；No. 05 解体現場

試料；No.05 解体現場
試料；No. 05 解体現場

試料；No. 05 解体現場
試料；No.06 解体現場

試料；No. 07 解体現場
試料；No. 07 解体現場

試料；No. 07 解体現場
試料；No. 07 解体現場

試料；No.07 解体現場
試料；No. 08 解体現場

試料；No. 08 解体現場
試料；No. 09 解体現場

試料；No.09 解体現場
試料；No.10 解体現場

試料；No.10 解体現場
試料；No.11 解体現場

試料；No.11 解体現場
試料；No.12 解体現場

試料；No.12 解体現場
試料；No.13 解体現場

試料；No.13 解体現場
試料；No.14 解体現場

試料；No.14 解体現場
試料；No.15 解体現場

試料；No.15 解体現場
試料；No.16 解体現場

SEM像（倍率：1130倍）

試料；No.16 解体現場

SEM像（倍率：1130倍）
試料；No.16 解体現場

蛍光顕微鏡像（対物40倍＋デジタル）

SEM像（倍率：1130倍）

試料；No.17 解体現場

SEM像（倍率：1280倍）

EDXスペクトル
試料；No.17 解体現場

蛍光顕微鏡像（対物40倍＋デジタル）

SEM像（倍率：1280倍）

試料；No.17 解体現場

SEM像（倍率:513倍）

EDXスペクトル
試料；No.18 解体現場

試料；No.18 解体現場
試料；No.18 解体現場

蛍光顕微鏡像（対物40倍＋デジタル）

SEM像（倍率：1230倍）

試料；No.18 解体現場
試料；No.19 解体現場

蛍光顕微鏡像（対物40倍＋デジタル）

SEM像（倍率：1330倍）

試料；No.19 解体現場

SEM像（倍率：1330倍）

EDXスペクトル
試料；No.19 解体現場

SEM像（倍率：1330倍）

試料；No.19 解体現場
試料；No.19 解体現場

試料；No.19 解体現場
試料；No.20 解体現場

試料；No.20 解体現場
試料；No.20 解体現場

蛍光顕微鏡像（対物40倍＋デジタル）

SEM像（倍率：1940倍）

試料；No.20 解体現場

#F072

SEM像（倍率：1040倍）
試料；No.20 解体現場

蛍光顕微鏡像（対物40倍＋デジタル）

SEM像（倍率：1040倍）

試料；No.20 解体現場

SEM像（倍率：1040倍）
試料；No.21 解体現場

SEM像（倍率:918倍）

試料；No.21 解体現場
試料；No.21 解体現場

試料；No.22 解体現場
試料；No.22 解体現場

試料；No.22 解体現場
試料；No.22 解体現場

試料；No.23 解体現場
試料；No.23 解体現場

試料；No.24 解体現場
試料；No.24 解体現場

蛍光顕微鏡像（対物40倍＋デジタル）

SEM像（倍率：1940倍）

試料；No.25 解体現場

SEM像（倍率：1640倍）
試料；No.25 解体現場

蛍光顕微鏡像（対物40倍＋デジタル）

SEM像（倍率:1640倍）

試料；No.25 解体現場

SEM像（倍率：1640倍）
試料；No.25 解体現場

試料；No.26 解体現場
試料；No.26 解体現場

試料；No.26 解体現場
試料；No.27 解体現場

試料；No.27 解体現場
試料；No.27 解体現場

試料；No.28 解体現場
試料；No.28 解体現場

試料；No.28 解体現場
試料；No.28 解体現場

試料；No29 解体現場
試料；No.29 解体現場

蛍光顕微鏡像（対物40倍＋デジタル）

SEM像（倍率：1790倍）

試料；No. 30 解体現場
試料；No. 30 解体現場

試料；No. 30 解体現場
試料；No. 30 解体現場

試料；No. 31 解体現場
試料；No.31 解体現場

SEM像（倍率：1330倍）

試料；No. 32 解体現場
試料；No. 32 解体現場

SEM像（倍率：1450倍）

試料；No.32 解体現場

#F110

SEM像（倍率：880倍）
試料；No. 32 解体現場

SEM像（倍率：880倍）

試料；No.33 解体現場

#F112

SEM像（倍率：1640倍）

EDXスペクトル
試料；No. 33 解体現場

蛍光顕微鏡像（対物40倍＋デジタル）

SEM像（倍率：1640倍）

EDXスペクトル

試料；No. 33 解体現場

#F114

SEM像（倍率：1940倍）
試料；No. 33 解体現場

蛍光顕微鏡像（対物40倍＋デジタル）

SEM像（倍率：1940倍）

試料；No. 33 解体現場

#F116

EDXスペクトル
試料；No.34 解体現場

蛍光顕微鏡像（対物40倍＋デジタル）

SEM像（倍率：1450倍）

試料；No. 34 解体現場

#F118

SEM像（倍率：1510倍）
試料；No. 34 解体現場

蛍光顕微鏡像（対物40倍＋デジタル）

SEM像（倍率：1510倍）
# Development and application of specific bioprobes for rapid asbestos detection to reduce asbestos risk at demolition sites

Principal Investigator: Akio KURODA

Institution: Hiroshima University, Graduate School of Advanced Sciences of Matter

1-3-1 Kagamiyama, Higashi-Hiroshima, Hiroshima

739-8530, JAPAN

Tel: +81-82-424-7758 / Fax: +81-82-424-7047

E-mail: akuroda@hiroshima-u.ac.jp

## [Abstract]

Key Words: Asbestos, Rapid detection, Demolition site, Bioprobe, Fluorescence

Current officially approved method for the detection of asbestos in air relies on a combination of two microscopy techniques. First, phase-contrast microscopy is used to count fibers collected on membrane filters during air sampling. If the calculated fiber load is above 1 fiber/L, each fiber needs to be examined under electron microscope using energy-dispersive X-ray spectroscopy in order to distinguish asbestos from non-asbestos fibers. Since this analysis is time-consuming and requires highly skilled operators as well as bulky equipment, it is not suitable for on-site asbestos testing. An emerging alternative to such techniques is the biofluorescence method, which relies on fluorescently labeled proteins or peptides that can selectively bind to specific inorganic materials, making it possible to visualize and detect these materials under fluorescence microscope. With biofluorescence method, even fibers that are below the resolution of the light microscope could be visualized due to fluorescence light they emit against the dark background. Moreover, the detection is generally quite specific due to highly selective binding of biomolecules to their targets. One of the discovered asbestos-binding proteins, DksA selectively binds to chrysotile asbestos in the serpentine mineral group. HNS is specific to amphibole asbestos, but has a somewhat lower specificity, also binding to aluminium silicate fibers, wollastonite and titanium oxide whiskers. In this study, we determined the amino acid sequence of the HNS protein fragment that is responsible for binding to asbestos, and developed a highly specific asbestos probe by removing other fragments of this protein that contribute to non-specific binding to other non-asbestos inorganic fibers. We also achieved a 260-fold increase in the binding affinity of the probe by multiple display of asbestos-binding fragment on streptavidin. Our tests of the developed probe using various fibers found in the air samples from demolition sites indicated high specificity and sensitivity (less than 5% false positive rate and less than 2% false negative rate).
rate). While the currently approved method that relies on the combination of phase-contrast and electron microscopy generally requires several days to obtain results, the biofluorescence method developed here can provide results within an hour following air sampling. Our research has thus established and verified a rapid, on-site analytical method for asbestos risk management at demolition sites.
資料

# ＥＳＲＩ国際コンファレンス 「日本の高齢化：団塊の世代引退の影響」（概要） $ ^{*} $ ESRI International Conference 2016 “Aging in Japan: The Impact of the Retirement of Japan’s Baby Boomers”

編集 経済社会総合研究所

日 時：平成28年8月2日（火）

場 所：アジア開発銀行研究所大会議室（霞が関ビルディング8階）

急速な高齢化の進展、中でも団塊世代の引退は経済社会に大きな影響を及ぼすものであり、重要な政策課題となっている。当研究所では、団塊世代の引退をはじめとした日本の高齢化に関する課題への対応策について論じるため、国内外の著名なエコノミストを招聘し、国際コンファレンスを開催した。
「経済分析」第192号

ESRI国際コンファレンス「日本の高齢化：団塊の世代引退の影響」

日時：8月2日（火）9:00～18:00

場所：アジア開発銀行研究所大会議室（霞が関ビルディング8階）

9:00 開会挨拶：前川守 経済社会総合研究所長

09:10-10:00 特別セッション 需要と供給：米国と日本から学ぶ
講演者 ジェイソン・ファーマン 米国大統領経済諮問委員会委員長
Q&A

10:00-10:40 セッション 1 団塊の世代引退の経済的影響
(議長：梅渓健児 経済社会総合研究所顧問)
報告者 坪内 浩 総括政策研究官（経済社会総合研究所）
市川恭子 主任研究官（経済社会総合研究所）
Q&A

11:00-12:05 セッション2 団塊の世代が引退し、医療・介護需要が増大することが労働市場に与える影響 (議長：梅渓健児 経済社会総合研究所顧問)
報告者 近藤絢子 東京大学准教授
討論者 オリビア・ミッチェル ペンシルバニア大学教授

13:30-14:35 セッション 3 日本の人口高齢化の家計貯蓄、資産選択に与える影響（議長：アニル・カシャップシカゴ大学教授）
報告者 祝迫得夫 一橋大学教授
討論者 ジェームズ・ポターバ MIT 教授

14:55-16:00 セッション4 日米は高齢化圧力をいかに下げうるか
(議長：アニル・カシャップ シカゴ大学教授)
報告者 クラウディア・ゴルディン ハーバード大学教授
討論者 敦賀貴之 主任研究官（経済社会総合研究所）

16:20-18:00 高齢化に関するパネル・ディスカッション
コーディネータ 梅溪健児 経済社会総合研究所顧問
パネリスト 伊藤元重 学習院大学教授
エドワード・ラジアー スタンフォード大学教授
ジェームズ・ポターバ MIT教授
清家篤 慶應義塾大学塾長、経済社会総合研究所名誉所長

閉会挨拶：前川守 経済社会総合研究所長
特別セッション：需要と供給—アメリカと日本の経験から

報告者：ジェイソン・ファーマン 米国大統領経済諮問委員会委員長

## 【報告】ファーマンCEA委員長

本報告では、世界的な危機からの回復が進む中で、各国経済がどのような軌跡を描いているか、どのような政策対応が可能か、等を探ってみたい。

世界的な金融危機が始まってからほぼ9年が経過し、先進各国では回復が進んでいるが、その状況は国毎にばらついており、未だ需要不足のサインもあちこちに見られる。今日は、最初に、先進各国の回復状況、とりわけ日米欧の財政政策について論じ、その後、生産性及び労働参加という2つの構造問題を論じる。その際、これらの問題が相互に関連し合っている点を指摘する。国々が直面する課題には、人口動態や技術進歩等、共通するものがあるが、いずれも不可避ではなく、何らかの政策対応が可能である。その点で、日米両国は互いの経験や挑戦から学べることは沢山ある。互いの経験から学ぶことで、日米両国は、其々が直面する諸課題を乗り越えられるだろう。

## (経済危機からの回復のばらつき)

先進各国はいずれも逆風（世界金融危機）に見舞われたが、直面した問題は国毎に違っており、また問題への対処も異なっていたことから、回復状況も国毎にまちまちになっている。米国は一人当たりGDPで見て最も回復が進んでいる。日本の回復もそれに続いていたが、足下に減速が見られる。欧州は失われた10年の瀬戸際にある。

米国では、危機対応の初期に実施された大規模な財政拡張や、金融緩和、積極的な金融部門の浄化策等の成果もあり、過去の米国における金融危機からの回復や近時における他国のペースを上回って回復が見られている。日本では一人当たりGDPが世界貿易の縮小の影響で、米国以上に落ち込んだ。また、危機が長期の低成長・低インフレに続いて生じたため、金融的対応には制約があり、積極的な財政拡張が回復を支えた。ただ、2011年の東日本大震災や2014年の消費税率引上げの影響もあり、回復には陰りが見られる。失業率は過去20年の最低水準だが、労働時間は増えておらず、大きな賃金の上昇も見られない。一方、欧州では、危機の際に少なからぬ国々で緊縮財政が採られ、ヨーロッパ中央銀行の利下げのペースも緩やかだった等の事情から、成長が抑制され、失業率も構造的失業率を上回る状態が続いている。

このような回復のバラつきの要因として、総需要に係る政策対応の違いがあり、今日でもその差が大きな役割を果たしている。