Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
本件で問題となる液石法の適用を受けるL Pガスの販売について各市場における被告のシェアを示す証拠はないが、簡易ガスを含めL Pガス販売におけるシェアは、東京都においてL Pガス利用世帯の約2.3パーセント、神奈川県において約4.7パーセント、埼玉県において4.9パーセント、千葉県において約5.9パーセントとなっている。千葉県において被告は第3位のシェアを占めているが、千葉県において上位3社のシェアはいずれも5パーセント台であり、上位3社の合計は約17パーセントにすぎず、残りの約83パーセントは中小業者によって占められている。

被告の平成13年度におけるLPガスの直販消費者数は、簡易ガスを含めると全国第3位であり、簡易ガスを除くと全国第6位である。

## LP ガス販売の費用構造

「消費者に対するＬＰガス販売価格のうち、総販売原価はＬＰガスの仕入価格、直接経費（ガスボンベへの充填費、ガスの一般消費者への配送費）及び間接費から構成されている。

ＬＰガスの仕入価格は、輸入業者から直接に仕入れる場合（輸入元売価格）は、1キログラム当たり49円から53円（10立方メートル当たり980円から1060円）であり、この価格は、ガス産出国から日本までの船賃、日本のガス保管基地の運営経費等の販管費、ＬＰガス事業者のガス充填所までのタンクローリーによるガスの運送費及び輸入業者の利益が含まれている。他方で、ＬＰガスの小規模小売店のＬＰガスの仕入価格は、ボンベに充填済みのＬＰガスを卸業者から仕入れることから、10立方メートル当たり1980円から2060円となる。間接経費の総販売原価に占める割合は、小規模小売店においては仕入価格に直接経費を加算した金額を超える程度であるとされている。

「被告の標準価格である10立方メートル当たり4195円（消費税抜き）が原価割れであるかどうかについて検討するに、被告は、被告のLPガス仕入価格は輸入元売価格である1キログラム当たり49円から53円（10立方メートル当たり980円から1060円）であり、直接経費を加えても1キログラム当たり75円（10立方メートル当たり1500円）を超えることはなく、さらに間接経費も小規模小売業者よりも効率的運営が行われていることから、小規模小売業者についての目安である『仕入価格に直接経費を加算した金額を超える程度』を下回ることは明らかであり、結局、総販売原価は3000円を超えることはないと主張しているところであり、本件においては被告の前記標準価格が総販売原価を下回ることを窺わせる証拠はないといわざるを得ない。

「……なお、前記認定したところ及び<証拠略>によれば、原告らの属する中小小売事業者においては、①L Pガスの仕入価格が輸入元売価格ではなく卸価格となることから上記のとおり仕入価格が高額となる傾向にあること、②ガスボンベの配送及び保安調査を外注する場合には経費が増加すること、③原告らの多くはガス配管について無償配管をしており、通常要する費用約10万円を7年から15年かけて償却しているこ
とから、1 か月当たり約 555 円から約 1190 円が上乗せとなっていることなどの点において、被告と比較して高コスト構造となっていることが認められる。」

## 本件価格設定の公正競争阻害性について

「これまでに述べたところによれば、①L P ガス市場自体が平成7年の規制緩和の影響及び都市ガスとの競合などにより価格競争が進展してきていること、②LP ガス市場において新規参入に格段の規制ないし障害があるわけではないこと、③本件で問題となる東京郡、神奈川県、埼玉県、千瘍県においても、多数のL P ガス事業者が存在し、被告の標準価格を下回る価格による販売も行われていること、④被告の上記市場におけるL P ガス販売のシェアは数パーセントにとどまること、⑤被告の標準価格は総販売原価を下回ることを認めるに足りる証拠はないこと、⑥被告の標準価格は新規顧客に対する一般的価格であり既存業者からの切替用に設定されているものではないこと、⑦L P ガス供給契約は小規模導管供給のように設備投資を伴う場合以外は、顧客が比較的自由に解約でき、また現に解約が行なわれていることを指摘することができる。そして、これらによれば、本件における既存顧客と新規顧客との間の販売価格の差はL P ガス市場に競争原理が導入され、全体として安値に移行する過程において、市場の競争状況の違い及び供給コストの差（設備投資の負担等）を反映するものと推認することかでき、本件価格差は本来非効率な業者か自らと同程度に効率的な業者を排除するために能力を超えた価格設定を行っているものとは認められない。

以上によれば、被告の価格設定行為には公正競争阻害性を認めることはできないというべきである。」

##### 4.2.2. 控訴審判決

控訴審では、東京高裁は、一審とほぼ同様の判断を行なって、原告の控訴を棄却した。

## 差別対価の公正競争阻害性

「控訴人らは、差別対価の公正競争阻害性について、差別対価は不当廉売の一類型ではないから、当該売り手が自らと同等あるいはそれ以上に効率的な業者が市場において立ち行かなくなるような価格政策をとっているか否かを基準に判断することは相当でなく、公正競争阻害性の認定に当たって問題となる価格政策は、合理的な理由のない価格差のある二重価格体系と、高い方の価格を維持したまま、拡販のために低い価格を提示し、顧客を奪取しようとする価格政策であり、顧客を奪取される競争事業者の効率性を問題とすることは誤りであり、また、原価割れを必ずしも要件としないと主張する。しかし、同じ商品・役務であっても、その価格は地域性や相手方の諸要素によっても異なりうるから、地域や相手方によって価格が異なること自体が当然に違法となるものではなく、それ故、一般指定3項においても、「不当な」差別対価が禁止されているところである。そして、不公正な取引方法の一として差別対価を禁止する独占禁止法の趣旨は、上記のように価格を通じた業者間の能率競争を確保することにあり、そこで、不当な差
別対価とは、このように価格を通じた能率競争を阻害するものとして、公正競争阻害性が認められる価格をいうと解されるから、不当な差別対価であるかどうかは、当該売り手が自らと同等あるいはそれ以上に効率的な業者（競争事業者）が市場において立ち行かなくなるような価格政策をとっているか否かを基準に判断するのが相当である。そして、ここに競争事業者とは、能率競争に参加している競争単位をいうから、当該売り手が達成可能な利益を生み出すことができる価格に対抗可能な価格を設定することができる効率的な競争単位をいうと解すべきであるので、競争事業者の効率性も当然考慮すべきであり、また、不当な差別対価に当たるかどうかの判断においては、原価割れの有無がその要素になるというべきである。」

## 本件価格設定の公正競争阻害性について

「ＬＰガス市場の一般的状況としては、①ＬＰガス市場自体において平成7年の規制緩和の影響及び都市ガスとの競合などにより価格競争が進行してきていること、②ＬＰガス市場において新規参入につき格段の規制ないし障害があるわけではないこと、③本件で問題となる東京都、神奈川県、埼玉県、千葉県においても多数のＬＰガス事業者が存在し、被控訴人の標準価格を下回る価格による販売も行われていること、④被控訴人の上記市場におけるＬＰガス販売のシェアは数パーセントにとどまること、⑤ＬＰガス供給契約は、小規模導管供給のように設備投資を伴う場合以外は、顧客が比較的自由に解約でき、また現に解約が行われていることを指摘することができる。

そして、被控訴人の価格について検討すると、①被控訴人の標準価格は新規顧客に対する一般的価格であり、既存業者からの切替用に設定されているものではなく、②被控訴人において価格の差が存在するのは、L Pガス供給契約を締結した年月の違い及び消費者のガス消費実態等の諸要素を考慮した結果であるから、価格差が存在することが不合理とはいえず、③低い方の価格が高い方の価格による利益維持確保を前提として設定されているとはいえず、そして、④被控訴人の『新標準価格』や平成15年4月及び平成16年11月の値上げによる価格は総販売原価を下回るとは認められないから、上記のようなL Pガス市場の一般的状況を考慮すると、本件における被控訴人の既存顧客と新規顧客との間の販売価格の差は、L Pガス市場に競争原理が導入され、全体として安値に移行する過程において、市場の競争状況の違い及び供給コストの差（設備投資の負担率）を反映するものと推認することができる。そして、上記のように、不当な差別対価とは、価格を通じた能率競争を阻害するものとして、公正競争阻害性が認められる価格をいい、当該売り手が自らと同等あるいはそれ以上に効率的な業者（競争事業者）が市場において立ち行かなくなるような価格政策をとっているか否かを基準に判断するのが相当であり、その際不当な差別対価に当たるかどうかの判断においては原価割れの有無がその要素になると解されるから、以上のような事実によれば、被控訴人の10立方メートル当たり4404円もしくはこれに準ずる価格が控訴人と同等あるいはそれ以上に効率的な業者（競争事業者）が市場において立ち行かなくなるような価格設定であると認めることはできない」
## 5 ．トーカイ・日本瓦斯事件の経済分析

本節では、本判決で示された事実認定について、経済分析の視点から検討を加えることとする。事実認定で示された内容には、経験的証拠と必ずしも整合的でないものが見られる。事件の結論に影響するか否かはともかくとして、事実認定のあり方に経済分析を活用する余地は大きい。

## 5 ．1．公正競争阻害性の判断基準

「同等に効率的な事業者」という判断基準は、トーカイ・日本瓦斯事件判決によってはじめて明確に打ち立てられた。すなわち、「売り手段階における差別対価が公正競争を阻害するものであるか否かは、結局のところ、当該売り手が自らと同等あるいはそれ以上に効率的な業者が市場において立ち行かなくなるような価格政策を採っているかどうか」ということとされる。ここで示された「同等に効率的な事業者」という基準は欧米でしばしば用いられてきた基準である $ ^{15} $ 。また判決では「市場において価格差が存在することは、業者間の競争が行われていることや市場における需給調整が機能していることの現れ」であると述べられている。この判断は妥当であろう。

また、判決では「公正競争阻害性の認定に当たっては、市場の動向、供給コストの差、当該小売業者の市場における支配力、価格差を設けた主観的意図等を総合的に勘案する」と述べられている。しかし、「総合的」な勘案がどのような構造のもとで行われたか、どのような要素を重視して判断したかといった点は、判決を読む限り必ずしも明らかでない。

経済分析の視点では、「総合的判断」を行うには、その拠って立つ判断枠組みが明確に定義されることが望ましい。まず枠組みとなる理論モデルの構成要素、例えば需要や費用の特徴を明らかにする必要がある。そして競争戦略の手段や戦略的相互依存関係の洞察を行う。その際に動学的効果への考慮が必要となる場合も多い。これら要素を適切に考慮しつつ、どのような理論モデルが現実のデータをより良く説明するかを検討する。これが経済分析における「総合的判断」のあり方である。これによって、実際に行われる違法性の判断基準がよりクリアに理解可能となる。

#### 5.2. 裁判所による事実認定

判決の中で裁判所の認定した事実のうち、経済学的にみて興味深いものは以下の4つである。第1に、事件①の被告であるトーカイの市場シェアは、静岡県で1位であり8.7%であると認定している。また首都圏におけるトーカイのシェアは5.46%以下と認
定している。ここで「以下」とあるのは委託事業者からのシェアを含めるか含めないかの違いを考慮したものである。いずれにせよトーカイのシェアは決して高いとはいえない。また、事件②の被告である日本瓦斯のシェアも、東京都で約2.3%、神奈川県で約4.7%、埼玉県で4.9%、千葉県で5.9%となっている。日本瓦斯のシェアも事件①と同様に非常に低い水準にあるといってよい $ ^{16} $ 。

第2に、判決では「LPガス振興センターの統計によると、LPガス販売業者の一般顧客数は平均952戸であり、専従従業員数は平均7人。これに対して、トーカイでは、ガス集中監視システムの導入、料金の口座振替の促進等により、952戸当たりの顧客についての従業員数は平均2.4人」とある（事件①）。これは原告と被告のコスト差を推し量るうえで、判決文中に示されたきわめて重要な情報である。原告と被告の労働生産性は3倍近く異なっているのである。両者の費用格差も極めて大きいことが示唆されよう。ただし、「総合的」判断を行う際に裁判所がこの事実をどこまで重視したかは不明である。

第3に、「LPガス市場自体が平成9年の液石法改正の影響及び都市ガスとの競合などにより価格競争が進展している」という認定をしている。果たしてこれらの改正によって価格競争が進展したといえるか否かは疑問の余地が大きい。この点は次節で検討したい。

第4に、裁判所は顧客による「自由な解約」が可能であったと認定している。解約・乗り換えが自由にできるか否かは、加入者獲得競争の性格を規定する重要な要素である。そして、この種の競争が行われる際の差別対価や不当廉売をどのように評価すべきか、実は理論的にも実証的にも不明な点が多く残されている $ ^{17} $ 。例えば新聞などで解約を繰り返す人が様々な付加的サービスを享受する一方で、同じ新聞を長年取り続けている人は値下げも付加的なサービスも何も受けないということがよく見られる。

## 5 ．3．液石法とLPガス価格の関係

都市ガス事業や簡易ガス事業にはガス事業法の規制があり価格変更に承認が必要であるがL Pガスは基本的に自由価格である。判決では平成9年（1997年）の液石法改正によって価格競争が進展したと述べている $ ^{18} $ 。しかし、図2に示されるように、実際の小売価格の推移を調べると、液石法改正以降に明らかにLPガス小売価格は上昇して
いる。また、小売業者にとって仕入価格に相当する卸売価格やCIF価格は、図3に見られるように、1997年前後に明確な上昇トレンドは見られない。したがって、1997年前後の小売価格の上昇は、小売市場の競争条件が変化したことによるものと解釈せざるを得ない。

図2 LPガス(プロパン)小売価格推移(10m3当り)

図3 LPガス卸売価格・CIF価格推移（単位トン）

## 5 ．4．LPガスにおける地域市場の画定
LP ガスの小売市場の画定を行う場合には、都市ガスとの競合が問題となる。実は、本事件で問題となった同時期に東京の L P ガス販売量は伸びていた。図 4 は本事件に関連する都道府県の L P ガス販売量の推移を示したものである。先に、価格差別の厚生上の効果を考える場合にはアウトプットが増えているか減っているかは重要なベンチマークとなると指摘した。本裁判が問題とした時期（2000～2002 年）に東京の L P ガス販売量は顕著に増えていた。すなわち、東京とその他の県とは、地域市場の特性が大きく異なっていたことが示唆される。東京では、価格差別の影響は深刻な問題とはならなかったといってよい。ただし、その他地域の販売量は横ばいとなっているので、販売数量のみから何らかの判断を下すことはできない。

## 5 ．5．LPガスにおける「取引適正化」

ＬＰガスの契約条件は、都市ガスと比べるとやや不明確なところが多かった。いわゆる「取引適正化問題」である $ ^{19} $ 。首都圏では特にそれが新規顧客争奪戦の激化という形で表面化してきた。不透明な料金体系や「無償配管」・「無断撤去」などの慣行も多く見られた。これらの不透明な取引慣行を是正するための諸施策も導入されてきた $ ^{20} $ 。

このような加入者獲得競争の実態が、本判決でどこまで考慮されたかは不明である。しかし、加入者獲得競争が過激の度を増せば経済厚生の観点からも問題となり得る。なぜならば、加入者の乗り換えは消費者にもコスト負担を強いるからである。それは社会
## 6 ．比較法的視点からみた差別対価事件判決の意義

#### 6.1. 米国の価格差別規制

以上、具体的事例をもとに、我々は価格差別に関する経済学的合理性について検討してきたが、法と経済学のメッカである米国では、そのような合理性とはいささかかけ離れた規制原理で歴史上進展してきたことは、注目に値する。米国において、価格差別に規制を行なっているのは、クレイトン法の第2条（15U.S.C.§13）である。クレイトン法第2条は、1936年ロビンソン・パットマン法（Robinson-Patman Act）により修正されており、通常、ロビンソン・パットマン法第2条により修正されたクレイトン法第2条を「ロビンソン・パットマン法」と呼んでいる。同条は次の通りである。

「同等同質の商品の異なる需要者間において価格の面で直接又は間接に差別すること」が、当該差別の結果として、①「商業のいずれかの部分において競争を実質的に減殺することになり、若しくは独占を形成するおそれがある」場合、又は、②「かかる差別の利益を与える者若しくはこれを知りつつ受ける者との、若しくはこれらのいずれかの者の顧客との競争を阻害し、破壊し、若しくは妨害するおそれがある」場合には、禁止される（本条a項）。前者が①差別対価を行った事業者の競業者に及ぼす影響を問題とするケース（primary-line case）であり、後者が②当該財・サービスの買手側に及ぼす損害を問題とするケース（secondary-line case）である $ ^{21} $ 。

実は、ロビンソン・パットマン法の制定当時（1936年）、価格差別が経済厚生にどのような影響をもたらすかは、立法者の頭にはなかった。むしろ、価格差別によって悪影響を受ける中小企業の保護にこそ、ロビンソン・パットマン法の関心はあった。特に、当時勃興してきた「チェーンストア」の侵食に対して、街の家族経営的な中小事業者が市場から淘汰されていくことに、議会は関心があった。要するに、価格差別が略奪的かどうかが問題なのではなく、中小企業の顧客あるいは中小企業の事業エリアに対して、「低い価格」で同等の商品サービスを提供し、当該中小企業が損害を蒙ることが、価格差別の主要な悪性だと当時考えられていたのである。このような理解に立つと、①スーパーマーケットによる特定商品（例えば、牛乳）の安値販売、②ガソリンスタンドの安値販売、本件で問題となったような③LPガス業界での新規参入LPガス会社が新規顧客向けの販売価格を既存顧客向けの販売価格より安くすること、は皆、独禁法上介入すべき事態ということになりうる。要するに、立法当時のロビンソン・パットマン法は、消費者厚生を最大化するように設計され解釈されることを念頭に置いた法ではなかった
のである。もちろん、法の目的は多様であり、中小企業の保護という「配分」上の正義に関心を払うこと自体は一般に悪いことではない。しかし、反トラスト（独占禁止）法の目的が、消費者利益の保護にあるとするならば、差別対価規制を使うことで中小企業の保護を図りそれにより消費者価格の高止まりを誘発してしまうことは、消費者利益の保護という反トラスト法の本来の目的と反することになる。このため、ロビンソン・パットマン法は、企業の競争的行為それ自体に萎縮効果を及ぼす可能性があるとして、批判されてきた。このような批判を受けて、おりしも、2007年の4月2日に、反トラスト近代化委員会は、その最終報告書において、ロビンソン・パットマン法について完全に廃止することを勧告している $ ^{22} $ 。

既に述べたように、価格設定者が市場支配力を有していない限り、継続的な価格差別は生じない。しかしながら、ロビンソン・パットマン法は、被告の市場支配力を証明することを求めていない。また、価格差別の「コストによる正当化」の抗弁を非常に狭くしか認めてこなかった。このため、過去の先例では、過剰抑止を生み出してしまったのである。実際、ロビンソン・パットマン法によって価格差別を行なったとして非難されてきた被告企業の多くは、本来経済学的に見て規制されるべき価格差別をしている独占者では全くなかった。すなわち、単に他の競争事業者と競合している顧客向けの価格を低くしているだけの、通常の競争の帰結として、異なった価格をつけているか、あるいは、寡占的市場において同調的行動を破る競争努力のいずれかであった。結果的に生じた差別価格を非難することにより、ロビンソン・パットマン法は効果的に寡占を支えさえしたのである。

ただし、このような裁判所の傾向は $ ^{23} $ 、今ではほとんど払拭されている。すなわち、primary-line case については、Brook最高裁判決（1993年）において $ ^{24} $ 、差別価格が略奪的価格に当たらないような価格にとどまっている場合には、価格差別には「競争上の損害」はないとして、違法ではないと判断している。すなわち、同判決では、コスト割れ要件（短期的な限界費用以下の販売価格（現実的には限界費用を算出することは難しいことから平均可変費用以下の販売価格）であるかどうか）および②「埋め合わせ」要件（価格を引き上げて損失を埋め合わせることができる見込み）を満たさない限り、略奪価格には該当しないとした。これ以後、米国では略奪的価格設定に該当しない価格差別は原則として問題にならないとされている。

これとは対照的に、secondary-line case については、競争に対する影響ではなく、競争者への影響をもとに、判断していた。買い手段階の侵害を競争それ自体が脅威にさらされる場合にのみ認めるとは、secondary-line case については長らく解釈されなかったのである。しかし、このような競争者保護的なロビンソン・パットマン法の解釈と執行は、
批判にさらされて、現在では完全に影を潜めている。

## 6 ．2．日本法との比較

トーカイ・日本瓦斯事件では、前記のように、裁判所は販売価格の差は市場の競争状況及び供給コストの違いを反映するものと推認することができ、本件価格差は本来非効率的な業者が自らと同程度に効率的な業者を排除するために能力を超えた価格設定を行っているものとは認められないとした。市場の動向、供給コストの差、価格差を設けた主観的意図などの各種要因を総合的に勘案するという、先例との整合性を意識した一般的なアプローチをとってはいるものの、「当該売り手が自らと同等あるいはそれ以上に効率的な業者（競争事業者）が市場において立ち行かなくなるような価格政策をとっているか否かを基準に判断するのが相当」であって、「不当な差別対価に当たるかどうかの判断においては、原価割れの有無がその要素になるというべきである」として、かかる効率性の観点から、不当な差別対価の違法性を判断するとしており、これは現在の米国の不当廉売型差別対価規制の立場と軌を一にするものである。

本判決が出るまでは、かつて、第二次北国新聞社事件 $ ^{25} $ において、裁判所は、北国新聞社が石川県を主たる販売圏とする北国新聞とほぼ同一の内容で新たに富山新聞を発行し、両新聞間に50円の価格差(月ぎめで、北国新聞330円、富山新聞280円)をつけたことに対し、費用割れを立証することなく、富山県にある競争紙の排除を図ったことを理由に地域的な差別対価と判断したが、その判断は、我々が既に述べたところに照らせば、疑問であった。富山県に新規参入する価格としては、上記の程度の価格差は、一見合理的であるとも思われるからである。むしろ、この判示は、Brook事件判決が出る前の伝統的なロビンソン・パットマン法の解釈により親和的である。これに対して、トーカイ・日本瓦斯事件では、同等に効率的な競争者の排除という観点で、より経済学的に洗練された視点からの分析が行われているという点で、本件は、従来の先例からは大きな前進というべきである $ ^{26} $ 。
本判決は、これまで先例の少なかった差別対価に関する公正競争阻害性の中身について(完全にではないものの)経済学的にも合理的に説明のつく基準を打ち立てたという意味で、画期的な判決と評することができよう。

## 参考文献

金井貴嗣・川濱昇・泉水文雄編『独占禁止法』(弘文堂・第2版、2005年)

田中寿編著『不公正な取引方法－新一般指定の解説』（商事法務研究会、1982年）

金子晃ほか『新・不公正な取引方法』（青林書院、1983年）

Armstrong, M. (2007) “Recent developments in the economics of price discrimination.” R. Blundell, W. K. Newey and T. Persson eds., Advances in Economics and Econometrics: Theory and Applications: Ninth World Congress, Cambridge University Press.

Borenstein, S. and N. Rose (1994). “Competition and price dispersion in the U.S. airline industry.” Journal of Political Economy 102(4), 653-683.

Fudenberg, D. and J. Tirole (2000). “Customer poaching and brand switching.” Rand Journal of Economics 31, 634-657.

Leslie, P. (2004). “Price discrimination in Broadway theater.” Rand Journal of Economics 35, 520-541.

Posner, R. A. (2001). Antitrust Law, 2nd edition. Chicago: The University of Chicago Press.

Taylor, C. (2003). “Supplier surfing: competition and consumer behavior in subscription markets.” Rand Journal of Economics 34, 223-246.

Verboven, F. (2002). “Quality-based price discrimination and tax incidence: evidence from gasoline and diesel cars.” Rand Journal of Economics 33, 275-297.

## 評釈

トーカイ事件につき、第一審判決の評釈は次の通りである。

村上政博「三光丸本店事件およびトーカイ事件平成16年東京地裁判決とその意義一差止請求訴訟と独占禁止法上のルール形成」ジュリ1278号120頁(2004年)、
伊藤憲二「近時の独占禁止法 24 条に基づく差止請求訴訟判決の検討（2）」公正取引 647 号 48 頁(2004 年)、

植村吉輝「売手段階における差別対価の公正競争阻害性—LPガス販売差別対価差止請求事件」ジュリ1292号164頁(2005年)。

控訴審判決については、村上政博・山田健男『独占禁止法と差止・損害賠償（第2版）』75頁（商事法務、（2005年）に言及がある。

また、日本瓦斯事件につき次のものがある。

〔第一審判決の評釈〕

山本裕子「相手方による差別対価—LPガス販売差別対価差止請求訴訟」平成16年度重判解256頁(2005年)

控訴審判決評釈

植村吉輝「差別対価の判断において原価割れの有無が検討された事例—日本瓦斯差別対価差止請求事件—」阪南論集41巻2号57頁(2005年)。
D-0802 SEA-WP海域における広域沿岸生態系ネットワークと環境負荷評価に基づく保全戦略

（３）SEA-WP海域におけるサンゴ礁海産生物の集団遺伝学的解析

（独）水産総合研究センター瀬戸内海区水産研究所

赤潮環境部有毒プランクトン研究室 長井 敏

<研究協力者>

（独）水産総合研究センター瀬戸内海区水産研究所

安田仁奈（日本学術振興会特別研究員PD、東京工業大学特別研究員）

東京工業大学 大学院情報理工学研究科情報環境学専攻 灘岡研究室

Coralie Taquet（ポスドク研究員、東京工業大学特別研究員）

平成20～22年度合計予算額：35,862千円（うち平成22年度予算額：11,954千円）

予算額は、間接経費を含む。

[要旨] サンゴ礁劣化速度が世界で最も速いSEA-WP海域において、海洋保護区設定の基盤となるreef-connectivityを明らかにするべく、サンゴ礁における代表的な海洋無脊椎動物に関して集団遺伝構造及び系統地理を明らかにした。造礁サンゴの捕食者であるオニヒトデに関してマイクロサテライトを用いた解析を行ったところ、スラウェシ島北部周辺海域は遺伝子流動が強く、2次的大量発生に留意する必要があることが分かった。アオヒトデ類に関して核マイクロサテライトとミトコンドリア両方の分子マーカーで解析したところ、ミトコンドリアでは種判別不能であったが、マイクロサテライトでは種が識別できたと同時に、SEA-WP海域における強い遺伝子流動を検出した。コブヒトデとマンジュウヒトデに関してミトコンドリアの遺伝子を用いたところ、両種ともにSEA-WP海域全般において非常に強い遺伝子流動が検出された。マンジュウヒトデは、オニヒトデと同様にジャカルタ北部においてインド洋側及び太平洋側の両方の遺伝子型が検出されたが、それより東側では、インド洋側の遺伝子型はほとんどみられず、ジャワ海において西から東に向かう遺伝子流動が極めて限られていることが分かった。一方コブヒトデでは、広域的には非常に遺伝的均一性が高いにもかかわらず、局所的に数十キロの地点間で遺伝的に極端に異なる海域も見られた。アオサンゴに関しては、高水温低流速のサンゴ礁内に発達する葉状のものと比較的低水温高流速のサンゴ礁外部に発達する小枝状のアオサンゴの間では遺伝子流動がほとんどなく、それぞれのアオサンゴを別種として保全する必要があることが分かった。ナマコ種のミトコンドリア解析の結果、ニセクロナマコなど広域分散種4種で黒潮海域における強い遺伝子流動が検出され、上流域の保全の重要性が明らかとなったほか、シカクナマコでは遺伝子流動が限られ、無性生殖が卓越していることから、個々の海域特に遺伝的多様性が高く祖先型遺伝子を含む久米島のような集団の保全が重要と考えられた。

[キーワード] reef-connectivity、遺伝的多様性、遺伝子流動、マイクロサテライト、ミトコンドリア
### 1. はじめに

東南アジア-西太平洋海域（The South-East Asia and Western Pacific（SEA-WP）海域）は、太平洋とインド洋の境界に位置する地質学的、生物生態学的、海洋物理学的に複雑な海域であり、浅海生態系における生物多様性の中心地であると言われている。一方で、SEA-WP海域は人口過密によるローカルな、また地球温暖化によるグローバルな環境負荷により生態系の劣化も激しいため、適切な保全策の考案が急務となっている。浅海生態系の保全に際し、現在最も有効とされる海洋保護区を設定するにあたり、サンゴ礁生物の生活史初期における幼生分散によるconnectivityを明らかにすることは不可欠であるが、SEA-WP海域におけるconnectivityの知見は未だ乏しい。

### 2. 研究目的

本研究では、様々な時空間スケールでのサンゴ礁生物の connectivity の実態解明に基づく重要保全海域の同定を通じてサンゴ礁生態系保全に寄与することを目指す。本セクションでは、代表的なサンゴ礁無脊椎動物（造礁サンゴ、ナマコ、ヒトデ）に関し、多型性を示す遺伝子マーカーを開発・使用し、分子系統解析および集団遺伝学的解析によって遺伝子流動を明らかにすることで、SEA-WP 海域を中心とした connectivity の実態解明及び海洋保護区設定の上での指針となる知見を得ることを目的とする。

### 3. 研究方法

## （１）オニヒトデのマイクロサテライトマーカーを用いた集団遺伝学的解析

オニヒトデ Acanthaster planci 個体を、インドネシアの 5 海域 North Jakarta (n = 7)、Derawan (n = 50)、Palu (n = 21)、Manado (n = 11)、Bontang (n = 20) において合計 112 個体を採集した（図 1）。DNA の抽出は Protease K の入った 5% Chelex 溶液で組織を溶解し、95 度で 30 分熱した後、1 X CTAB 溶液を用いた精製を行った。ジェノタイピングは Yasuda ら $ ^{1,2)} $ の方法で実施した。データ解析の際は、すでに発表したインド洋・太平洋のサンプルを加えて行った。Firsher’s exact test は GENEPOP on the web $ ^{3)} $ で行い、pairwise $ F_{ST} $ は ARLEQUIN ver 3.1 $ ^{4)} $ を用いて行った。有意性の検定は、Bonferroni Correction $ ^{5)} $ を実施した。UPGMA 系統樹は、Nei の Da $ ^{6)} $ を用いて POPULATIONS 1.2.30 $ ^{7)} $ で計算した。個体ごとの主成分分析は GENALEX ver 6 $ ^{8)} $ を用いて計算した。

## （２）アオヒトデ・ゴマフヒトデ・ムラサキヒトデの集団遺伝学的解析及び系統地理解析

## 1 ）遺伝子解析用サンプルと DNA 抽出

アオヒトデ Linckia laevigata に関しては、フィリピン (Bolinao, Smul, Negro)、インドネシア (Sekotong)、琉球列島 (沖縄本島・久米島・石垣島・宮古島)、パラオ・トレス海峡 (Dugong Is, Kirkdale)、フィジー (Suva, Dravuni)、オーストラリア (GBR Rib, Western Australia Imperieuse Clerke)、ニューカレドニア、ソロモン島、グアム (Asan)、南アフリカ、タイ (Kata Beach, Puhket) の 23 海域から採集したサンプルを用いて解析した。ゴマフヒトデ Linckia multifora に関しては、インドネシア (Sulawesi)、フィリピン (Bolinao)、グアム、パラオ、フレンチポリネシア、サモア、フィジー、クック島、クリスマス島、ココスキーシング島、紅海 (Sinai) の 11 海域からのサンプル
ルを用いて解析した。さらに、アオヒトデとゴマフヒトデに最も近縁であるムラサキヒトデ Linckia guildingi（セイシェル）をアウトグループとした（図2）。

## 2 ）ミトコンドリア Dloop 領域を用いた遺伝子解析

DNA 抽出は全ての種において、エタノール保存された管足ないし DMSO に溶解した組織の少量を 5% の Chelex 溶液に入れ 97 度で 30 分間熱したものをさらにエタノール精製し、PCR 反応のテンプレート DNA とした。ミトコンドリア Displacement loop (Dloop; DNA 複製時の起点となる領域) 解析に関しては、既存のプライマーである 12Sa:5’ -ACACATCGCCCGTCACTCTC- 3’ と 16Sb:5’ -GACGAGAAGACCCTATCGAGC- 3’ (Williams & Benzie) $ ^{9)} $ を用いて Dloop 領域を含む 16S-rDNA から 12S rRNA 約 1kbp の領域を増幅し、両サイドから配列を決定した後、16S-rDNA 側の Dloop 領域側にプライマーを新規に設定した。（DloopRevSp: 5’ -GGGTTAGCGAGCACCTT-3’） 16sSb と DloopRevSp のプライマーセットを用いて、部分 16S-rDNA 配列及び control region を含む約 600bp の領域を PCR 増幅し、ダイレクトシークエンス法により配列を決定した。ミトコンドリア cytochrome c oxidase 1 (C01) 領域の PCR 増幅に際しては、Arndt ら (1996) $ ^{10)} $ によって開発されたプライマー（C01EF: 5’ -ATAATGATAATGATAGGAGGRTTTGG- 3’）と（C01ER: 5’ -GCTCGTGTRTCTACRTCCAT- 3’）を用いて行った。PCR 組成は、全量で 10 μl の反応系は、5 X Green Buffer を 2 μl、25 mM MgCl₂ を 1 μl、dNTP MIX 2.5mM を 0.5 μl、純水を 5.35 μl、50pM のプライマーセットをそれぞれ 0.1 μl、テンプレート DNA を 1 μl、Go taq (Progema) を 0.05 μl とした。PCR は、熱かい離反応を 94 度 3 分 1 サイクル、伸長反応 94 度 30 秒・50 度 30 秒・72 度 1 分を 37 サイクル、最終ステップを 72 度 5 分間行った。配列決定は Big Dye ver3.1 を用いて行った。配列の決定に際しては、BioEdit を用いて波形データと比較を行い、シークエンスエラーを取り除いた。その後、プライマー領域を含む精度の低い配列をトリムし、合計約 485bp の 310bp の部分 16S-rDNA 配列及び約 175bp の control region を含む領域を解析した。

## 3 ）アオヒトデのマイクロサテライトマーカーの開発

ゲノム DNA は DNeasy Tissue kit (Qiagen) で抽出し、Lian et al. (2006) $ ^{11)} $ の方法に従い、マイクロサテライト領域の単離を行った。簡潔に単離方法を書くと、まず抽出したアオヒトデの全ゲノム DNA を制限酵素で切断した後、得られた DNA 断片の両サイドに既知の配列を付加し、ライブラリーを作成する。ライブラリーの中でマイクロサテライト領域を持つ DNA 断片のみを PCR 法によって増幅させ、プライマーを設計することでマイクロサテライト領域の増幅を可能とした。

## 4 ）アオヒトデ類のマイクロサテライトマーカーによる集団解析

比較的スコアリングが容易でかつすべての海域のサンプルで明りように行うことのできた5遺伝子座(Akiko111, Akiko3b, Hiroko32c, Hiroko40, Hiroko33)のみを用いて行った。PCR反応はMultiplex PCR法を用いシークエンサー3130XL（ABI）を使ってジェノタイピングを行った。1サンプルあたり、キアゲン社のType it master mixを5μl、純水3.4μl、10pMのプライマ一各種を2.1μlずつ入れたものに1μlのテンプレートDNAを加え、95度5分1サイクル、95度30秒・55度30秒・72度30秒を30サイクル、72度30分間行った。スコアリングはソフトウェアGENEMAPPER（ABI）を用いて行った。
## 5 ）各種遺伝学的統計量及び集団分化の検定

ミトコンドリア領域：ハプロタイプ多様度（h）、塩基多様度（ $ \pi $ ）の統計量算出および、標準中立モデル（中立、任意交配、集団サイズの一定性）を帰無仮説とした集団構造や歴史の検定を行うための $ F_{S} $ （Fu 1997） $ ^{12)} $ 算出、mismatch distribution、Rogers検定 $ ^{13)} $ をソフトウェアArlequin 3.11 $ ^{4)} $ を用いて行った。全てのテストは20,000 permutationで行った。遺伝子配列から検出されたハプロタイプ同士の近縁性を視覚的に表すハプロタイプネットワーク（Minimum Spanning Tree）はソフトウェアDNspでハプロタイプを検出したのち、ソフトウェアNETWORKを用いて描いた。また、検出されたハプロタイプの系統関係は、MEGA ver 4を用いて、近隣結合法によって描いた（ブートストラップは1000）。ミトコンドリアDloop領域に関しては、アオヒトデ、ゴマフヒトデそれぞれの集団構造と集団間のconnectivityの統計的有意性を調べるため、Analysis of molecular variance（AMOVA） $ ^{14)} $ とペア集団の $ \varPhi_{ST} $ をArlequin 3.1を用いて算出した。

マイクロサテライト解析：進化的時間スケールでアオヒトデとゴマフヒトデの集団間にどの程度の集団分化が起こっていたのかを調べるためにAMOVAに基づくペア $ F_{ST} $ と $ R_{ST} $ をALEQUIN ver. 311を用いて算出した（20,000 permutations）。遺伝距離の階層構造を視覚化するため、遺伝距離Da） $ ^{6)} $ に基づく系統樹をPOPULATION Software $ ^{7)} $ を用いて近隣接合法によって描いた。さらに、遺伝距離に関して主成分分析をGENEALEX V6 $ ^{8)} $ で行った。

## （３）マンジュウヒトデ及びコブヒトデのミトコンドリアC01遺伝子を用いた系統地理解析

SEA-WP海域において、マンジュウヒトデは15地点から合計273個体、コブヒトデは13地点から合計311個体を、Chelex10%溶液を用いてDNA抽出し解析した(表1,2)。ミトコンドリアcytochrome c oxidase1(CO1)領域のPCR増幅に際して、プライマー(CO1EF:5’-ATAATGATAATGATAGGAGG RTTTGG-3’)と(CO1ER:5’-GCTCGTGTRTCTACRTCCAT-3’) $ ^{10)} $ を用いて行った。コブヒトデに関しては、CO1ER及びCO1ERから増幅される領域の内側に新たにKobuF1:5’-CCGTTCTAAATT AAACTATTCTCTG-3’及びKobuR1:5’-GGCTAGGACTGGGAGTGATAG-3’というプライマーを設計し、PCR及びシークエンス反応を行った。CR組成は、全量で10μlの反応系は、5XGreen Bufferを2μl、25mM MgCl2を1μl、dNTP MIX 2.5mMを0.5μl、純水を5.35μl、50pMのプライマーセットをそれぞれ0.1μl、テンプレートDNAを1μl、Go taq (Progema)を0.05μlとした。PCRは、94度3分1サイクル、94度30秒・45度1分(KobuF1とR1は60度1分)・72度1分を37サイクル、72度5分間行った。配列決定は全てダイレクトシークエンス法により、Big Dye ver3.1を用いて行った。コブヒトデに関しては、今回新たに配列を決定したものに加え共同研究者 $ ^{15)} $ の配列も加え、全合計31地点631配列を解析した(表2)。ハプロタイプ多様度(h)、塩基多様度(π)の統計量算出および、標準中立モデル(中立、任意交配、集団サイズの一定性)を帰無仮説とした集団構造や歴史の検定を行うためのF_{S}(Fu 1997) $ ^{12)} $ 算出、Tajima’s、DをソフトウェアArlequin 3.5.1.2を用いて行った。全てのテストは20,000 permutationで行った。遺伝子配列から検出されたハプロタイプ同士の近縁性を視覚的に表すハプロタイプネットワークはソフトウェアDNspでハプロタイプを検出したのち、ソフトウェアNETWORKを用いて描いた。集団構造の検出に際しては、ソフトウェアDNspでハプロタイプを検出したのち、Analysis of molecular variance (AMOVA) $ ^{14)} $ とペア集団のΦ_{ST}をArlequin 3.5.1.2を用いて算出した。
図1（左図）SEA-WP海域周辺におけるオニヒトデのサンプリングサイト。パイグラフはインド洋の色形態が灰色、太平洋の色形態が白色を表す。

図2（右図）アオヒトデ(黒)・ゴマフヒトデ(白)・ムラサキヒトデ(灰色)のサンプリングサイト

図3 マイクロサテライトによる解析結果。UPGMA法によるオニヒトデ集団の系統樹（数字はブートストラップ）
表1 マンジュウヒトデのサンプルにおける統計値のまとめ．全個体数（Nind）、ハプロタイプ数（Nhaplo）、ハプロタイプ多様度（h）、塩基多様度（ $ \pi $ ）、遺伝距離（Fs） $ ^{12} $ 、Tajima's D $ ^{21,22} $ ．太字で灰色枠の値は有意差あり（P<0.05）

サンプリング地点	国名	略称	N_{ind}	N_{haplo}	$ \pi $	h	F_{S}	Tajima's D
Amami Ohshima	日本	AMM	5	4	0.0077	0.900	0.49	-0.95
Verde Island Passage Anilao	フィリピン	BAT	4	4	0.0041	1.000	-1.41	-0.21
Verde Island Passage Caban	フィリピン	CAB	10	7	0.0030	0.867	-3.35	-1.69
Verde Island Passage Lian	フィリピン	CAL	4	2	0.0008	0.500	0.17	-0.61
Verde Island Passage Maricaban	フィリピン	MAR	6	5	0.0142	0.933	0.68	0.66
Bolinao	フィリピン	BOL	8	3	0.0065	0.464	3.51	-1.81
Bacon	フィリピン	PAC	6	4	0.0022	0.867	-1.16	0.34
Palau	パラオ	PAU	13	10	0.0119	0.949	-1.58	0.41
Manado	インドネシア	BUN	32	16	0.0033	0.883	-10.78	-2.05
Derawan	インドネシア	DER	32	15	0.0054	0.802	-5.15	-1.94
Palu	インドネシア	PAL	29	14	0.0054	0.825	-4.54	-1.75
Bontang	インドネシア	BON	40	23	0.0046	0.915	-17.56	-2.19
Spermonde	インドネシア	SPE	34	21	0.0094	0.939	-7.65	-2.15
Pulau Pari	インドネシア	KES	48	27	0.0300	0.918	-0.97	0.72
Puhket	タイ	THI	2	2	0.0046	1.000	1.10	0.00

表2 コブヒトデのサンプルにおける統計値のまとめ. 全個体数(Nind)、ハプロタイプ数(Nhaplo)、ハプロタイプ多様度（h）、塩基多様度（ $ \pi $ ）、遺伝距離（Fs） $ ^{12)} $ 、Tajima's D $ ^{21,22)} $ . 太字で灰色枠の値は有意差あり（P<0.05）

サンプリング地点	国名	略称	N_{ind}	N_{haplo}	\pi	h	F_{S}	Tajima's D
Amami Ohshima	日本	AMM	8	4	0.014	0.64	-0.79	-1.60
Verde Island Passage Puertogarea	フィリピン	PUE	33	15	0.017	0.77	-11.92	-2.35
Bacon	フィリピン	PAC	11	4	0.012	0.78	-0.49	0.34
Palau	インドネシア	PAU	46	13	0.015	0.71	-8.02	-1.54
Derawan	インドネシア	DER	47	12	0.015	0.71	-6.33	-1.49
Palu	インドネシア	PAL	27	10	0.011	0.65	-7.51	-1.66
Bontang	インドネシア	BON	34	11	0.016	0.79	-5.54	-1.57
Spermonde	インドネシア	SPE	19	10	0.015	0.78	-6.84	-1.60
MAKASSAR_SSULA	インドネシア	sMAKe	15	8	0.018	0.84	-4.00	-1.32
SELAYAR_SSULA	インドネシア	sSELe	15	9	0.029	0.85	-3.44	-1.78
Bali	インドネシア	NUS	16	8	0.022	0.81	-3.00	-1.58
BALI	インドネシア	NUSe	12	4	0.012	0.74	-0.49	0.22
Karimunjawa	インドネシア	KARe	37	14	0.015	0.68	-10.81	-2.05
Komodo	インドネシア	KOM	35	10	0.012	0.61	-6.14	-1.57
SABOLOKECIL_FLORES	インドネシア	fSABe	9	3	0.019	0.64	1.45	0.69
SEBAYUR_FLORES	インドネシア	fSEBe	11	5	0.014	0.62	-1.53	-1.57
Manado	インドネシア	BUN	40	10	0.013	0.72	-4.96	-1.27
MANADO	インドネシア	BUNe	29	9	0.013	0.65	-4.81	-1.93
MISOOL_RA	インドネシア	rMISe	23	7	0.010	0.52	-3.50	-1.85
WAIGEO_RA	インドネシア	rWAIe	7	4	0.013	0.71	-1.22	-1.43
JEFMAN_RA	インドネシア	rJEFe	25	5	0.006	0.36	-2.45	-1.68
GURUABOSO_HALMA	インドネシア	hGURE	20	11	0.019	0.76	-6.98	-2.06
JEREWAI_HALMA	インドネシア	hJERE	17	8	0.017	0.73	-3.69	-1.53
TIDORE_HALMA	インドネシア	hTIDe	3	3	0.022	1.00	-0.69	0.00
TONUU_HALMA	インドネシア	hTONe	12	8	0.019	0.85	-4.64	-1.41
KOLORAI_HALMA	インドネシア	hKOLe	13	7	0.014	0.73	-3.73	-1.59
BIAK_TC	インドネシア	tBIAe	23	9	0.020	0.75	-3.33	-0.88
WINDESI_TC	インドネシア	tWINe	7	4	0.017	0.71	-0.65	-0.32
YAPEN_TC	インドネシア	tYAPe	21	10	0.023	0.86	-4.16	-1.10
NUMFOR	インドネシア	tNUMe	15	6	0.020	0.79	-1.09	-0.97
JAYAPURA	インドネシア	JAYe	1	1	0.000	1.00	N.A.	N.A.
（４）アオサンゴのマイクロサテライトマーカーを用いた集団遺伝学的解析

## 1 ）遺伝子解析用サンプリングと遺伝子型の決定

アオサンゴサンプルの集団遺伝学的解析については、11海域44地点から採集した合計693個体を用いた(表3)。DNA抽出はQiagen社のDNeasy96 Blood & Tissue Kitを用いて行った。遺伝子型の決定はYasuda et al.が開発したマイクロサテライトマーカー $ ^{16)} $ の中から、比較的スコアリングが容易でかつ全海域のサンプルで可能であった8遺伝子座(Saki06, Saki08, Miho04, Miho33, Mayu41, Mayu49, Kumiko02, Emi20)を用いて行った。Miho04とMiho33の間には連鎖不平衡が見られたので、その後の解析はMiho04を除いた7遺伝子座を用いて行った。遺伝子型を決定したもののうち、同一サンプリング地点内で同一遺伝子型をもったクローンを除く異なる遺伝子型をもった個体が6以上あった地点に関して集団解析を行った。それぞれの海域において、ジェネット数Ng(異なる遺伝子型を持った個体数)および集団の中でクローンの占める割合を求めた。遺伝的多様性を明らかにするため、その指標となる対立遺伝子の数Na、有効対立遺伝子Neの数ヘテロ接合度の観測値 $ H_{0} $ と期待値 $ H_{F} $ 、および近親交配の起こっている程度を示す近交係数( $ F_{IS} $ )をGENEALEX V6ソフトウェア $ ^{8)} $ で計算した。

## 2 ）集团遗伭学的解析

さらに、有性生殖による幼生分散の程度を調べるために、無性生殖によるクローンをそれぞれの集団内から抜いた後、N>6であった25集団に関し、近年起きている幼生分散によってどの程度の集団分化が起きているのかを推定するため、遺伝距離の指標となるペア $ F_{ST} $ をソフトウェア GENEALEX V6 $ ^{8)} $ を用いて算出した(9,999 permutations)。これら集団間の遺伝距離における階層構造を視覚化するため、遺伝距離 Da $ ^{6)} $ に基づく近隣結合法による系統樹をソフトウェア POPULATIONS で描いた。また、遺伝的浮動と幼生分散のバランスを調べるために、遺伝的距離と地理的距離をプロットし、ソフトウェア TFPGA を用いて mantel test を実施し、有意性を検定した。一方で遺伝距離に関する主成分分析をソフトウェア GENEALEX V6 $ ^{8)} $ で行い、集団間の遺伝的距離を2次元にプロットした。一方で個体ごとの検定としてクラスタリング解析を行った。ソフトウェア STRUCTURE 3.3.2 $ ^{17)} $ を用いて、仮想的な先祖集団数 K を1から10までをシミュレーションし、最も確からしいクラスター（遺伝的集団）を推定した。

## （５）ナマコ種の16S-RNAを用いた集団遺伝学解析及び分子系統地理解析

熱帯性ナマコの種類および解析個体数については表4に示した。ゲノムDNAは真皮ないし管足組織の少量をProteaseK 10μlとともに200μlの5%のChelex溶液に入れ55度で一晩組織を溶解させたのち、97度で30分間熱したものをさらに1×CTAB法 $ ^{1)} $ で精製したのち、PCR反応のテンプレートDNAとした。PCR組成は、全量で10μlの反応系は、5×Green Bufferを2μl、25mM MgCl₂を1μl、dNTP MIX 2.5mMを0.5μl、純水を5.35μl、50pMのプライマーセット（16Sar 5'-CGCCTGTTATCAAAAACAT-3'及び16Sbr:5'-CTCCGGTTTGAACT CAGATCA-3'） $ ^{18)} $ をそれぞれ0.1μl、テンプレートDNAを1μl、Go taq (Progema)を0.05μlとした。PCRは、94度3分1サイクル、94度30秒・45度1分・72度1分を37サイクル、72度5分間行った。配列決定は全てダイレクトシークエンス法により、Big Dye ver3.1を用いて行った。遺伝子配列から検出されたハプロタイプ同士