Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
### 6. 研究成果の主な発表状況

## (1) 主な誌上発表

## <査読付き論文>

1) T. Ishida, M. Alexandrov, T. Nishimura, K. Minakawa, R. Hirota, K. Sekiguchi, N. Kohyama, and A. Kuroda: Journal of Fluorescence, 22, 1, 357–363 (2012)

“Evaluation of sensitivity of fluorescence-based asbestos detection by correlative microscopy”

2) T. Ishida, M. Alexandrov, T. Nishimura, K. Minakawa, R. Hirota, K. Sekiguchi, N. Kohyama, and A. Kuroda: PLos ONE, 8(9):e76231 (2013)

“Molecular engineering of a fluorescent bioprobe for sensitive and selective detection of amphibole asbestos”

3）黑田章夫、石田丈典、西村智基、Maxym Alexandrov：作業環境、35(1)，57-62(2014)

「蛍光顕微鏡法による大気アスベスト検査の有効性検証と位相差蛍光顕微鏡法への応用」

## (2) 主な口頭発表 (学会等)

1) A. Kuroda, T. Ishida, M. Alexandrov, T. Nishimura: Michael E. Beard Conference, Asbestos Laboratory Issues (ASTM, Florida), Jan. 31, 2013

“Detection of Airborne Asbestos by Fluorescent-labeled protein probe and its Application to quick Monitoring”

2）黒田章夫、石田丈典、西村智基、M. Alexandrov、神山宣彦、関口潔：日環協・環境セミナー，2013年9月27日

「蛍光顕微鏡による大気アスベスト繊維検出法の開発」

### 7. 研究者略壓

課題代表者: 黒田 章夫

大阪大学大学院工学研究科修了、博士（工学）、現在、広島大学大学院先端物質科学研究科教授
5C-1101 解体現場のアスベストリスクに対応する特異的バイオプローブの創成と迅速検出への応用

（１）解体現場のアスベストリスクに対応する特異的バイオプローブの創成と迅速検出への応用

広島大学

大学院先端物質科学研究科分子生命機能科学専攻 黒田 章夫

平成23～25年度累計予算額：97,729千円

（うち、平成25年度予算額：32,089千円）

予算額は、間接経費を含む。

## [要旨]

現在のアスベスト検査の公定法は、最初に位相差顕微鏡により大気中の総繊維濃度を測定し、その濃度が1本/L以上の場合、電子顕微鏡下で繊維の一本一本に電子ビームを照射し、特性X線を分析することでアスベストを判定することになっている。この方法は高度な技能と時間がかかることから、解体現場でのアスベストリスクに対応することはできないとされている。一方、バイオ萤光法とは対象の無機物質に特異的に結合するタンパク質あるいはペプチドを蛍光で修飾し、蛍光顕微鏡下で無機物質を可視化する技術である。バイオ蛍光法では、暗視野の中で繊維が光っているために、光の分解能よりもかなり小さい対象物でも（電子顕微鏡でしか見えなかった様な微細アスベストでも）、その存在が検出できる。また、特異的に光らせるために同時に物質の同定が行なえる。アスベスト結合タンパク質のうち、DksAタンパク質は蛇紋石アスベストであるクリソタイルに特異的である。HNSタンパク質はクロシドライトなど角閃石アスベストに広く結合するものの、アスベスト以外のケイ酸アルミ繊維、ワラストナイト、酸化チタンウイスカー等との交差が見られるという課題が残されていた。本研究では、HNSタンパク質のアスベストの結合に関与する領域を特定し、その他の無機繊維と結合する領域を取り除くことによって、アスベストに特異的なバイオプローブを作成することができた。また、ストレプトアビジンを使った4量体形成により、約260倍アスベストに対する結合力の向上したバイオプローブを開発することができた。このアスベスト特異的バイオプローブと実際の現場サンプルを用いて試験した結果、偽陽性率5%、偽陰性率2%以下でアスベストが検出できることが分かった。現在の電子顕微鏡を使う公定法が数日から約1週間必要であるのに対し、バイオ蛍光法はサンプリング後約1時間でアスベストが検出できる。本研究により、解体現場のアスベストリスクに対応できる迅速アスベスト計測法を確立することができた。

## [キーワード]

アスベスト、迅速検出、解体現場、バイオプローブ、蛍光
### 1. はじめに

日本にはアスベストを含む

建材が約4000万トンあるとさ

れ、今後これらが使われた古い

建物の解体のピークを迎える。

その際、アスベストの飛散を現

場で調べなければ、再び大きな

アスベスト問題を引き起こす

可能性があるとされている。現

状の大気アスベスト検出の方

法としては、大気を濾過した

フィルターを透明化し、位相差顕

微鏡により観察する方法が用

いられている。しかし、この方

法はアスベスト、非アスベスト

繊維の判定は不可能なため、大

解体現場でのアスベストリスク

・2035年頃までは毎年100万トン以上

のアスベスト含有建材が排出

・刻々と変化する現場では現状の検

査方法では対応できない！

・解体現場でのアスベスト飛散をモニ

ターしないとアスベスト問題の再燃

図(1)-1、解体現場でのアスベストリスク

気中の総繊維濃度が1本/L以上の場合、電子頭微鏡による判定を行うことが公定法となっている。しかしながら、電子頭微鏡で観察する場合には前処理等が煩雑である他、繊維一本ずつをエネルギー分散型X線解析装置で分析していくのは、非常に時間と根気のいる作業であり、解体現場でのアスベストリスクには対応できない。もはや日本のアスベスト発生源は、工場から、解体現場などの短期的に移動する現場に変わっており、その状況に対応して新たな検出法が必要となっている。すなわち、時間をかけて検査する定点観測では不十分であり、現場でのアスベスト迅速検出法の確立が急がれている。

### 2. 研究開発目的

研究代表者は細胞内タンパク質ライブラリーの中からアスベストに特異的に結合するタンパク質をスクリーニングし、このタンパク質を蛍光物質で修飾することにより、バイオプローブを作成した。この蛍光プローブを用い、フィルター上のアスベストを蛍光顕微鏡でとらえる方法（バイオ蛍光法）を開発した。染色の操作は簡単で、フィルターに数滴のバイオプローブを垂らすだけで前処理が完結する。このフィルターを蛍光顕微鏡で観察すると、アスベスト繊維が光って見えるため、約30ナノメートル幅の非常に微細なアスベスト繊維が、低倍率でも明瞭に観察できた。アスベストは蛇紋石系のアスベストであるクリソタイルと、他5種類が含まれる角閃石アスベストが存在する。アスベスト結合タンパク質のうち、DksAタンパク質はクリソタイルに特異的で、GatZタンパク質あるいはHNSタンパク質は角閃石系のアスベストに広く結合した。バイオ蛍光法は、位相差顕微鏡レベルの操作性である程度の確度でアスベストと判定できるので、現場での「迅速簡易検出法」として有望視されている（2010年6月改訂の環境省のアスベストモニタリングマニュアル第4版で紹介）。これらのアスベスト結合タンパク質を利用すれば、全種類のアスベストに対応
できるが、残念ながらHNSとGatZがアスベスト以外のケイ酸アルミ繊維、ケイ酸カルシウム（ワラストナイト）、酸化チタンウイスカーとの交差が見られるという課題が残されていた。もしこの点が克服できれば、現場でアスベストと確定できる「迅速検出法」が確立できると考えられた。そこで、HNSとGatZのアスベストの結合に関与する領域を特定し、その他の無機繊維と結合する領域を取り除くことによって、アスベストに対する特異性が向上したバイオプローブを作成することを目的とした。また、実際のサンプルに対して、光・電子相関顕微鏡による蛍光繊維の分析を行うことによって、バイオプローブの特異性を検証することとした。

## 3 ．研究開発方法

## （１）アスベスト特異的バイオプローブの作成

## 1 ）領域を限定したHNSタンパク質（限定HNSタンパク質）の作製

HNSタンパク質の1-59番目までと、60-137番目の領域に分けた限定HNSタンパク質を発現させるために、プライマーの設計し遺伝子の増幅を行った。大腸菌K-12株のゲノムDNAを鋳型として、プライマー（P1、P2）を用いて1-59番目の領域を、プライマー（P3、P4）を用いて60-137番目の領域をコードする遺伝子をPCRにて増幅を行った。PCR反応は、KOD-plus Neo DNAポリメラーゼ（TOYOBO社）を用い、同社のプロトコールに従って行った。増幅した遺伝子をタンパク質発現用プラスミドpET21-b（Novagen社）のNdeI-BamHIサイトに組み、pETHNS1-59とpETHNS60-137を作製した。

ビオチンリガーゼは、特定の15アミノ酸の配列（AviTag）を認識し、その中のリジン残基にビオチンを結合させる。タンパク質発現用ベクターpET21-bにプライマー(P5、P6)を用いてインバースPCRを行うことで、pET21-bのHisTag配列の直前にAviTagの配列を挿入した（pET21b-AviTag）。インバースPCRは、KOD-plus Mutagenesis kit（TOYOBO社）を用い、同社のプロトコールに従って行った。大肠菌K-12株のゲノムDNAを鋳型として、プライマー（P3、P4）を用いて60-137番目の領域を、プライマー（P3、P7）を用いて60-90番目の領域を、プライマー（P4、P8）を用いて91-137番目の領域をコードする遺伝子をPCRにて増幅を行った。増幅した遺伝子を、pET21b-AviTagのNdeI-BamHIサイトに組み込み、

pETHNS60-137-AviTag、

pETHNS60-90-AviTag、

pETHNS91-137-AviTagを作製した。

60-90番目の領域をさらに限定したHNSタンパク質の発現プラスミドの作製はインバースPCRを用いて作製した。具体的には、

pETHNS60-90-AviTagを鋳型にして、プライマー（P9、P10）を用いてpETHNS60-86-AviTagを、プライマー（P11、P12）を用いてpETHNS63-90-AviTagを、プライマー（P12、P13）を用いて

表(1)-1、プライマーの配列

プライマ一番号	配列
P1	GAATTCCATATGATGAGCGAAGCACTTAAAATTC
P2	GGAGGATCCAAACACTGCAGTTTACGAGTGCGC
P3	CATATGCAATATCGCGAAATGCTGATC
P4	GGATCCAAACATTGCTTGATCAGGAAATCG
P5	GCTCAGAAAATCGAATGGCACGAACACCACCACCACCACCACTGAACTA
P6	CTCGAAGATGTCGTTCAGACCGCCACCCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTGTC
P7	GGATCCAAACACGTTCAGCTTTGGTGCC
P8	CATATGGCTCAGCGTCCGGCAAAATATAG
P9	TGTTTGGATCCGAATTCGAGCTCCG
P10	GGTGCCAGATTTAACGGCAGCAAGG
P11	GAAATGCTGATCGCTGACGGTATTG
P12	CATATGTATATCTCCTTCTTAAAG
P13	CTGCTGAATAGCCTTGCTGCCG
P14	AAATCTGGCACCAAAGCTAAACGTTG
pETHNS75-90-AviTagを、プライマー（P12、P14）を用いてpETHNS83-90-AviTagを作製した。これらのプラスミドをビオチンリガーゼを発現する大腸菌BL21（DE3）pBirAcmに導入することによって、目的タンパク質にビオチンを導入した。

限定HNSタンパク質の発現には宿主として、大腸菌Rosetta（DE3）pLysSを用いた。具体的には、pETHNS1-59（または、pETHNS60-137）で形質転換した大腸菌Rosetta（DE3）pLysSをLB培地 $$ 10g/1トリプトン、5g/1酵母エキス、10g/1NaCl $$ で37℃一晩培養し、200mlのLB培地に1%植菌した。600nmにおける濁度（OD600）が0.4～0.7になるまで37℃で培養後、

IPTG $$ Isopropyl- $ \beta $ -D-thiogalactopyranoside（終濃度0.5mM） $$ を添加後、さらに28℃で4時間培養を行った。培養液を遠心分離することで集菌し、菌体ペレットを-80℃で保存した。

ビオチン化HNSタンパク質の発現には、宿主として大腸菌BL21（DE3）pBirAcmを用いた。

pETHNS60-137-AviTag（または、pETHNS60-90-AviTag、pETHNS91-137-AviTag、pETHNS60-86-AviTag、pETHNS63-90-AviTag、pETHNS75-90-AviTag、pETHNS83-90-AviTag）で形質転換した大腸菌BL21（DE3）pBirAcmをLB培地で37℃一晩培養し、200mlのTYH培地[20g/l トリプトン、10g/l 酵母エキス、11g/l HEPES、5g/l NaCl、1g/l 硫酸マグネシウム、0.5% グルコース、水酸化カリウムでpH7.2-7.4に調整]に1%植菌した。OD600が0.7になるまで37℃で培養後、IPTG（終濃度0.5mM）とD-ビオチン（終濃度100μM）を添加後、さらに28℃で4時間培養を行った。培養液を遠心分離することで集菌し、菌体ペレットを-80℃で保存した。

タンパク質の精製の方法は、HNSタンパク質とビオチン化HNSタンパク質ともに、HisTagを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって精製を行った。-80℃で保存しておいた菌体ペレットに、10mlの緩衝液[0.05M Tris-HCl(pH8.3)、0.05M NaCl、10% glycerol]を加えて懸濁し、超音波により破砕した。得られた細胞破砕液をHisTrap FFカラム(GE Healthcare Bioscience社)に供し、C末端にヒスチジンを有するHNSタンパク質、ビオチン化HNSタンパク質を当該カラムに吸着させ、緩衝液[0.05M Tris-HCl(pH8.3)、0.05M NaCl、10% glycerol、0.5Mイミダゾール]で溶出させた。HNS83-90-AviTagタンパク質以外は発現及び精製に成功した。精製したタンパク質についてポリアクリルアミド電気泳動により精製度を確認したところ95%以上であった。

## 2 ）GatZタンパク質の解析

GatZタンパク質のアスベスト結合領域について解析するために、GatZタンパク質をトリプシンによって断片化し、どの領域

GatZタンパク質のアスベスによって断片化し、どの領域

がアスベストに結合するか

解析を行なった。具体的には、

GatZタンパク質にトリプシンを加え、酵素処理を37℃

で一晩行ない断片化した。次に、クロシドライトにGatZト

リプシン消化物を添加して、20分間反応させた後、Wash

液 $$ 25mM Tris-HCl(pH7.5)、300mM NaCl、0.5%Tween20 $$

表(1)-2、プライマーの配列

プライマー番号	配列
P15	AAGCTAGCGCGGATGCGGCGATGGAA
P16	TCGAATTCGCACAGCCGGCACGAACATATTCCT
P17	GCGCTAGCATTGGCACCGAAAGTTCCG
P18	CCGAATTCGCACACACACGTGTTAACGCCTCTG
P19	TTGCTAGCGCACATTCTACCGATTACCA
P20	CTGAATTCGCACAAAAGTGATCGCGGACTAATTC
P21	TGGCTAGCGGTCCCGCATTAACCTTTGC
P22	CCGAATTCGCACAGCGATTTTCAGGGGCGATAAG
で十分に洗浄し、未結合のペプチドを取り除いた。溶出液 $$ 25mM piperidine buffer (pH12) $$ にてクロシドライトに結合しているペプチドを溶離し、得られたペプチドをMALDI-TOFMS（BiflexIV、ブルカー社製）により解析を行なった。

GatZタンパク質のアスベスト結合領域と推定された99-117、168-216、256-275、281-308番目の限定GatZタンパク質を発現させるために、プライマー（表1）を設計してPCR法による遺伝子の増幅を行った。GatZ遺伝子を鋳型として、プライマー（P15、P16）を用いて99-117番目の領域の増幅を行った。また、プライマー（P17、P18）を用いて168-216番目の領域を、プライマー（P19、P20）を用いて256-275番目の領域を、プライマー（P21、P22）を用いて281-308番目の領域の増幅をそれぞれ行った。PCR反応は、KOD-plus Neo DNAポリメラーゼを用い、同社のプロトコールに従って行った。増幅した遺伝子をpET21b-AviTag（Novagen社を改変）のNheI/EcoRIサイトに組み込み、pETGatZ99-117-AviTag、pETGatZ168-216-AviTag、pETGatZ256-275-AviTag、pETGatZ281-308-AviTagを作製した。これらのプラスミドをビオチンリガーゼを発現する大腸菌BL21（DE3）pBirAcmに導入することによって、目的タンパク質にビオチンを導入した。

ビオチン化限定GatZタンパク質の発現と精製は、以下の様に行った。pETGatZ99-117-AviTag（または、pETGatZ168-216-AviTag、pETGatZ256-275-AviTag、pETGatZ281-308-AviTag、pET21b-AviTag）で形質転換した大腸菌BL21（DE3）pBirAcmをLB培地で37℃一晩培養し、200mlのTYH培地に1%植菌した。OD600が0.6になるまで37℃で培養後、IPTG（終濃度0.5mM）とD-biotin（終濃度100μM）を添加後、各発現条件（pETGatZ99-117-AviTagの場合37℃で3時間培養、pETGatZ168-216-AviTagとpET21b-AviTagの場合28℃で3時間培養、pETGatZ256-275-AviTagとpETGatZ281-308-AviTagの場合16℃で18時間培養）で行った。この培養液から得られた菌体を超音波破砕し、ビオチン化HNSタンパク質と同様の緩衝液条件でHisTrap HPカラム（GE Healthcare Bioscience社）を用いたアフィニティークロマトグラフィーに供して、部分精製標品を得た。

## 3 ）タンパク質の蛍光標識

精製した限定HNSタンパク質（HNS1-59、HNS60-137）については、Cy3-Maleimide Reactive Dye（GE Healthcare社）を用いて蛍光標識を行った。標識反応は、同社のプロトコールに従って行ない、精製はHisGravitrapカラム（GE Healthcare社）を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって精製を行った。ビオチン化HNSタンパク質及びビオチン化ペプチドについては、予めCy3蛍光体で修飾されたStreptavidin-Cy3、あるいはCF488Aで修飾されたStreptavidin-CF488A（Biotium社）と混合することによって蛍光標識を行った。0.1M Tris-HCl(pH8.3)緩衝液中で、Streptavidin-Cy3（33.2pmol）に対して20倍量のビオチン化限定HNSタンパク質、あるいはビオチン化限定HNSペプチド（664pmol:HNS60-90-AviTag、HNS91-137-AviTag、HNS60-86-AviTag、HNS63-90-AviTag、HNS75-90-AviTag）、または化学合成したビオチン化ペプチドを添加して1時間静地してビオチン-ストレプトアビジン複合体（HNS60-90-AviTag-Streptavin-Cy3複合体、HNS91-137-AviTag-Streptavin-Cy3複合体、HNS60-86-AviTag-Streptavin-Cy3複合体、HNS63-90-AviTag-Streptavin-Cy3複合体、HNS75-90-AviTag-Streptavin-Cy3複合体）を作製した。

ビオチン化限定GatZタンパク質、及びビオチン化ペプチドについては、予めCy3蛍光体で修飾されたストレプトアビジン（Streptavidin-Cy3）、あるいはCF488Aで修飾されたストレプトアビジン（Streptavidin-CF488A）（Biotium社）と混合することによって蛍光標識を行った。ビオチン
化されているタンパク質、あるいはペプチドは、ストレプトアビジンと自動的、かつ量論的（ストレプトアビジン1分子に4分子のビオチン化タンパク質、あるいはペプチド）に結合する。0.1M Tris-HCl(pH8.3)緩衝液中で、Streptavidin-Cy3（33.2pmol）に対して20倍量のビオチン化限定タンパク質、あるいは化学合成したビオチン化ペプチドを添加し、1時間静置してビオチン-ストレプトアビジン複合体を作製した。

結合力増強型（四量体化）蛍光プローブの作製は次の手順で行った。精製したビオチン化限定HNSタンパク質（HNS60-90）を、予めCy3蛍光体で修飾されたストレプトアビジン（Streptavidin-Cy3）、あるいはCF488Aで修飾されたストレプトアビジン（Streptavidin-CF488A）（Biotium社）と混合した。ビオチン化されているタンパク質は、ストレプトアビジンと自動的、かつ量論的（ストレプトアビジン1分子に4分子のビオチン化タンパク質）に結合する。0.1M Tris-HCl(pH8.3)緩衝液中で、Streptavidin-Cy3（33.2pmol）、あるいはStreptavidin-CF488Aに対して20倍量のビオチン化限定タンパク質を添加し、1時間静置してビオチン-ストレプトアビジン複合体を作製した。これによりビオチン化HNSタンパク質は四量体として蛍光標識された。また蛍光増強のための標識は、複合体形成前の限定HNSタンパク質（HNS60-90）に対して、DyLight488-maleimide（Thermo scientific社）を用いて行った。標識反応は、同社のプロトコールに従って行ない、HisGravitrapカラム（GE Healthcare社）を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって精製を行った。

## 4 ）アスベストへの結合評価

チューブアッセイ法：1.5mlのエッペンチューブに0.5mlのリン酸緩衝液 $$ 0.2M phosphate (pH7.0)、0.3M NaCl、0.5%Tween80 $$ を添加後、25nM限定ビオチン化GatZタンパク質とStreptavidin-Cy3の複合体、もしくはビオチン化T7Tag-AviTagとStreptavidin-Cy3の複合体と、20μgのアモサイト[または20μgのクロシドライト（JAWE331）]を添加し1分間混合させた。アモサイト（またはクロシドライト）をスライドグラスの上にのせ、さらにその上にカバーガラスをのせてプレパラートを作成し、蛍光頭微鏡にて観察を行った。蛍光観察は、チューブアッセイ法の観察方法に準じた。コントロールとして、GatZ-Cy3についても蛍光観察を行った。蛍光頭微鏡（落射蛍光頭微鏡BX-60 オリンパス社製）にて観察を行った。蛍光観察には、U-MNGキューブ（ダイクロイックミラー：DM570、励起フィルター：BP-530-550、吸収フィルター：BA590）を用い、画像の取り込みに頭微鏡デジタルカメラDP-70（オリンパス社製）を使用した。対照としてワラストナイトやその他のJFM標準繊維を用いた。

フィルターアッセイ法：メンブレンフィルター（MCE:ニトロセルロース）に塗布した標準繊維に対して、HNSタンパク質を添加して反応させた後、蛍光顕微鏡を用いて観察を行ない蛍光の有無によりタンパク質が結合しているかどうか評価した。具体的には、アスベスト及びJFM標準繊維を塗布したメンブレンフィルターを吸収紙の上にのせ、洗浄液[0.3Mリン酸緩衝液(pH8.0)、0.3M NaCl、0.5% Triton X-100、1% デオキシコール酸ナトリウム]を1滴滴下し、完全に吸収させた。次にHNSタンパク質（10nM：具体的にはHNS60-90-AviTag-Streptavin-Cy3複合体）を含む結合緩衝液[0.3Mリン酸緩衝液(pH8.0)、0.3M NaCl、0.5% Triton X-100]を2滴滴下し、完全に吸収させアスベストの染色を行った。洗浄液を1滴滴下し、さらに0.05Mのリン酸緩衝液（pH8.0）を4滴滴下して界面活性剤を取り除いた。このように処理を行ったフィルターをスライドグラスにのせ、封
入液をカバーガラスとフィルターの間に挟み込んで、同様に蛍光観察を行った。

遠心法：単量体HNS60-90-AviTag-Cy3、またはHNS60-90-AviTag-Streptavidin-Cy3複合体を、それぞれ45nM～540nMまたは1nM～20nMとなるように0.5mlのリン酸緩衝液中に添加し、さらに50μgのアモサイトを添加して10分間混合した。14,000rpm（約10,000g）で5分間遠心操作を行った後、上清を取り除き未結合のタンパク質を取り除いた。さらに0.5mlのリン酸緩衝液を添加してよく混合し、同様に遠心して上清を取り除く操作（洗浄操作）を合計3回行った。最後に、0.5mlの溶出液 $$ 0.1M Tris-HCl(pH8.0)、1%SDS $$ を加え、95℃、5分間加熱処理を行なうことで、アモサイトに結合している蛍光タンパク質を溶出させた。14,000rpmで10分遠心操作を行った後、溶出された蛍光タンパク質の量を、分光蛍光光度計FP-6500（日本分光社）で測定することにより算出した。各タンパク質濃度におけるアスベストへの結合量から、スキャッチャードプロット解析を行い、解離定数を算出した。

蛍光顕微鏡法によるアスベスト観察：粒子を捕集したメンブレンフィルター（MCE：ニトロセルロース）を吸収紙の上にのせ、洗浄液[0.3Mリン酸緩衝液(pH8.0)、0.3M NaCl、0.5% Triton X-100、1% デオキシコール酸ナトリウム]を1滴滴下し、完全に吸収させた。次に蛍光標識したHNSタンパク質を含む結合緩衝液[0.3Mリン酸緩衝液(pH8.0)、0.3M NaCl、0.5% Triton X-100]を2滴滴下し、完全に吸収させアスベストの染色を行った。洗浄液を1滴滴下し、さらに0.05Mのリン酸緩衝液（pH8.0）を4滴滴下して界面活性剤を取り除いた。このように処理を行ったフィルターをスライドグラスにのせ、封入液をカバーガラスとフィルターの間に挟み込んで、蛍光顕微鏡により観察を行った。

## （２）光・電子相関顕微鏡を用いた同一繊維の観察方法

メンブレンフィルター、また実際の解体現場で採取したサンプルを吸収紙の上に載せ、アスベスト蛍光試薬を用いて処理を行った。基本的にはフィルターアッセイ法に従って行ったが、最後に超純水4滴滴下し、余分な成分を完全に取り除いた。このように処理を行ったメンブレンフィルターを、カーボンテープを貼付けた試料台に固定し、ステージホルダーに装着した。ステージホル

図(1)-2、光・電子相関顕微鏡を用いた同一繊維の観察手順
ダーを蛍光顕微鏡（Axio Imager、カールツアイス社製）にセットし、ステージホルダー上のマーカー3点を登録しステージ・キャリブレーションを行った（図(1)-2）。約50～100視野を蛍光観察して、繊維状の物質が検出された視野についてCCDカメラで撮影を行ない画像および位置情報の取得を行った。USBメモリを使って蛍光顕微鏡で取得した画像及び位置情報を電子顕微鏡システムに入力した。次に、ステージホルダーを電子顕微鏡（SIGMA VP、カールツアイス社製）の試料室に移し、観察位置を蛍光顕微鏡と同期させるために、ステージホルダー上のマーカー3点を再度登録しステージ・キャリブレーションを行った（図(1)-2）。蛍光顕微鏡で観察された繊維状物質が何であるか調べるために、記録した位置情報を入力して、電子顕微鏡の観察視野を移動させた。繊維が確認されたらエネルギー分散型X線分光器（QUANTAX 200、ブルカー社製）にて元素分析を行った。

## （３）バイオ蛍光法によるアスベスト迅速計測法の確立

## 1 ）位相差蛍光顕微鏡法によるアスベスト検査

大気を捕集したメンブランフィルターの捕集面を上に向け、切断したフィルターに洗浄液を1滴滴下し、完全に吸収させた（図(1)-3）。続いて蛍光タンパク質を含む結合緩衝液

図(1)-3、位相差顕微鏡法の前処理手順

### [0.3Mリン酸

緩衝液(pH8.0)、0.3M NaCl、0.5% Triton X-100]を2滴、位置を変えながら滴下し、完全に吸収させた。再び洗浄液を1滴滴下し、続いて調整液を4滴滴下した。捕集面を上にしてスライドガラスに乗せて乾燥させた（80℃のホットプレート上に15分間静置）。捕集面を上にしてアセトン蒸気をあてフィルターを透明化した。カバーガラスに封入液を1滴滴下し、空気が入らないように注意しながら、カバーガラスをフィルター片に被せてサンプルとした（図(1)-3）。サンプルを位相差蛍光顕微鏡にセットして観察した。

## 2 ）公定法（電子顕微鏡法）によるアスベスト検査との比較

電子顕微鏡及びX線分析装置（EDX）によるアスベスト検査は、次の手順により行った。分析試料となるメンブレンフィルターをカッターを用いて切断し、カーボンテープを貼った試料台の上に固定した。イオンスパッタリング装置（JFC-1600、日本電子社製）を用いて、フィルター表面
に白金蒸着を施し、フィールドエミッション式走査型電子頭微鏡（SIGMA VP、カールツアイス社製）により観察を行った。繊維の計数に当たっては、観察倍率1600倍、加速電圧15kVに固定し、モニター画面内に方形枠（観察範囲60μm×45μmに相当）を表示させ、その内側を1視野とした。600視野にわたって観察を行い、繊維が観察された場合には、当該繊維のみの成分を正確に分析するため適宜倍率を10000倍程度まで上げて、EDX（QUANTAX 200、ブルカー社製）により元素分析を行った。繊維計数のルール及び繊維数濃度の算出は、『アスベストモニタリングマニュアル第4版』（環境省）記載の方法で行った。

PM2.5の捕集には、インパクター式分流装置（Impact Sampler、SKC社製）を用いた。PM2.5捕集後は、粗粒子捕集用のフィルターホルダーに付け替え、比較サンプルとして粗粒子を含む浮遊物質も捕集した。いずれのサンプルも大気サンプリング用ポンプ（AIP-105、柴田科学社製）により10L/分の流量で、1時間吸引（計600L）を行った。また補助具を使った迅速測定法用のサンプルについては、大気吸引にミニポンプ（MP-2N、柴田科学社製）を用い、1.8L/分の流量で16分40秒（計30L）吸引を行うことで捕集した。

## 3 ）リロケータブルスライドを利用した複数者間による同一視野観察方法

アスベスト蛍光染色済みのメンブレンフィルター試料をスライドガラスの上に載せ、リロケータブルスライド作製用のカバーガラスを、印字された文字が反転するよう被せ、観察試料とした。位相差蛍光顕微鏡の倍率を400倍(対物x40、接眼x10)とし、アイピースグレーティクルの直径300μmの円をリロケータブルスライドの視野の

## リロケータブル・スライド

視野の場所を特定するために番地が印刷されたカバーガラスを用いることで、同一箇所へのアプローチを確実で容易にした観察用スライド。

同一スライドの同一視野を複数人で計測し、検査結果の整合性を評価

図(1)-4、リロケータブル・スライドによるクロスチェック試験

円に合わせて観察を行った。左上視野A1から観察し、視野毎に結果を視野記録紙に記載しながら順に視野を移動し、50視野（A1～J5）の観察を行った。1機関において観察の終了したサンプルは順次別機関に郵送され、別の測定者が視野枠に従って同一条件で観察を行った（図(1)-4）。

頭微鏡用モニター（Digital Sight、ニコン社製）を、LED型位相差・蛍光顕微鏡（Primostar、カールツアイス社製）に接続し、位相差モード、蛍光モードにおいてそれぞれ最適な観察像が得られるよう露出・ゲインの調整を行い、観察モード設定に登録した。また繊維の長さを計測するための測定ツールのキャリブレーションを行った。位相差・蛍光顕微鏡法観察では、観察するモード（位相差／蛍光）の切り換えに合わせて、登録したプリセットモードを切り換えながらアス
ベストの観察を行った。

また、3 D プリンターによる補助具の作製を行った。3 D CADソフト（Inventor Fusion 2013 R1、Autodesk社製）を用いて設計を行った後、3 D プリンター（Scoovo C170、Open Cube社製）に設計データを入力した。3 D プリンターの制御ソフト上で設計ファイルをプリンター制御用データファイル（Gコードファイル）に変換し、印刷を実行させた。3 D プリンターは、加熱溶解したポリ乳酸フィラメントを積層（積層ピッチ0.1 $ \mu $ m）し、設計物を造形した。

## （４）アスベストの発光検出（アスベスト結合領域を持つ発光酵素の作成と検出）

HNSタンパク質の60-90番目の領域(HNS60-90)と高輝度ルシフェラーゼNanoLucを融合させたタンパク(HNS60-90-NanoLuc-AviTag)の作製を行なった。まず、この融合タンパク質を発現させるプラスミドの作製を行なった。プラスミドpNL1.1[NLuc]（プロメガ社)を鋳型として、プライマー（GGAGTCGACATGGTCTTCACACTCGAAGATTCGとGGAGCGGCCGCCCAGAATGCGTTCGCACAGC）を用いてNanoLucをコードする遺伝子をPCRにて増幅を行った。PCR反応は、KOD-plus Neo DNAポリメラーゼ（TOYOBO社）を用い、同社のプロトコールに従って行った。増幅した遺伝子を、昨年度作製したHNS60-90-AviTagを発現するプラスミドpETHNS60-90-AviTagのSalI-NotIサイトに組み、pETHNS60-90-NanoLuc-AviTagを作製した。

ビオチン化HNSタンパク質の発現には、宿主として大腸菌BL21（DE3）pBirAcmを用いた。

pETHNS60-90-NanoLuc-AviTagで形質転換した大腸菌BL21（DE3）pBirAcmをLB培地で37℃一晩培養し、200mlのTYH培地[20g/l トリプトン、10g/l 酵母エキス、11g/l HEPES、5g/l NaCl、1g/l 硫酸マグネシウム、0.5% グルコース、水酸化カリウムでpH7.2-7.4に調整]に1%植菌した。OD600が0.7になるまで37℃で培養後、IPTG（終濃度0.5mM）とD-ビオチン（終濃度100μM）を添加後、さらに18℃で21時間培養を行なった。培養液を遠心分離することで集菌し、菌体ペレットを-80℃で保存した。タンパク質の精製の方法は、HisTagを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって精製を行った。-80℃で保存しておいた菌体ペレットに、10mlの緩衝液[0.05M Tris-HCl(pH8.3)、0.05M NaCl、10% glycerol]を加えて懸濁し、超音波により破砕した。得られた細胞破砕液をHisTrap FFカラム(GE Healthcare Bioscience社)に供し、C末端にヒスチジンを有する

HNS60-90-NanoLuc-AviTagを当該カラムに吸着させ、緩衝液[0.05M Tris-HCl(pH8.3)、0.05M NaCl、10% glycerol、0.5Mイミダゾール]で溶出させた。精製したタンパク質についてポリアクリルアミド電気泳動により精製度を確認したところ95%以上であった。

アスベストの発光検出は以下の様に行った。1.5mlのエッペンチューブ内で、アスベスト（アモサイト）とHNS60-90-NanoLuc融合タンパク質を反応させた後、頭微鏡を用いて発光の観察を行なった。具体的には、1.5mlのエッペンチューブに0.5mlのリン酸緩衝液[0.3M phosphate (pH8.0)、0.3M NaCl、0.5% Tween80]を添加後、HNS60-90-NanoLuc融合タンパク質（20nM：具体的にはHNS60-90-NanoLuc-AviTag-Streptavidin-Cy3複合体）と、100μgのアモサイト（JAWE231）を添加し10分間混合させた。同じリン酸緩衝液で3回洗浄を行った後、100μlのリン酸緩衝液に再懸濁した。そのアモサイト懸濁液10μlと発光基質溶液10μl[Nano-Glo Luciferase assay Substrate(Furimazine)の5倍希釈液]を混合して、スライドグラスの上にのせ、さらにその上にカバーガラスを載せて封入した。作製したサンプルを頭微鏡（BX-51 オリンパス社製）にて観察し、発光を電子増幅デジタルCCDカメラ(iXON+、ANDOR社製)にて撮影した。
## 4 ．結果及び考察

## （1） アスベスト特異的バイオプローブの創成

1）限定HNSタンパク質によるアスベスト特異的バイオプローブの創成

HNSタンパク質は137アミノ酸からなるタンパク質で、アスベスト以外に、ワラストナイト（ケイ酸カルシウム繊維）、ケイ酸アルミ繊維、酸化チタンウイスカー、炭化ケイ素繊維などの無機繊維と結合する。そこで、HNSのアスベストの結合に関与する領域を特定し、その他の無機繊維と結合する領域を取り除くことによって、アスベストへの結合特異性を向上させた。

図(1)-5、HNSタンパク質の構造（リボンモデル）。HNSタンパク質をN末端領域とC末端領域に分割した。角閃石系アスベストの結合領域は、C末端領域にあることがわかった。

HNSの立体構造からN末端領域とC末端領域の2つの領域に分割可能と予測できた。N末端領域（1-59番目のアミノ酸）とC末端領域（60-137番目のアミノ酸領域）を作る様に遺伝子を設計した。それらを、大肠菌を宿主とする発現ベクターに組み入れ、遺伝子の発現誘導をおこなった（pETHNS1-59、pETHNS60-137）。それぞれの限定HNSタンパク質の精製を行ない、直接蛍光色素(Cy3)で修飾して結合性を調べた。その結果、C末端領域(HNS60-137)が角閃石系アスベストと結合することがわかった（図(1)-5、6）。さらに、HNS60-137は、ケイ酸アルミ繊維や酸化チタンウイスカーには結合し

アモサイト

ワラストナイト

図(1)-6、限定HNSタンパク質の結合評価。蛍光標識した限定HNSタンパク質とアスベストを混合後、位相差顕微鏡（左）と蛍光顕微鏡（右）によって観察した。60-90番目の限定HNSタンパク質はワラストナイトには結合せず、アスベスト（アモサイト）に結合したので、アスベストへの特異性の向上がみられた。
なくなったことから、予想通り、その他の無機繊維と結合する領域を取り除くことによって、アスベストへの結合特異性を向上させることができた。

HNS60-137をさらに限定して、角閃石アスベストに結合する領域を探った。具体的には、60-90番目までと、91-137番目の領域に分けた。得られた限定HNSタンパク質、あるいは限定HNSペプチド（通常分子量5,000以上のものをタンパク質、分子量5,000以下のものをペプチドと呼ぶので、60-90番目までのものはペプチドと呼ぶ）を予め蛍光色素(Cy3)で標識されたストレプトアビジン（Streptavidin-Cy3）と混合した。HNS60-90とHNS91-137は大

図(1)-7、アスベスト結合領域の解析。60-90番目のペプチドの配列を一文字アミノ酸表記で表す。正電荷を持つアミノ酸を赤で、負電荷を持つアミノ酸を青字で示す。疎水性アミノ酸をオレンジで、その他を黒字で示す。アスベスト（アモサイト）への結合性を右欄に示す。下は限定HNSペプチドを発現するプラスミドの構造図。

腸菌内でビオチン化されているため、ストレプトアビジンと自動的、かつ量論的（ストレプトアビジン1分子に4分子のビオチン化タンパク質、あるいはペプチド）に結合する。HNS60-90（60-90番目の限定HNSペプチド）とStreptavidin-Cy3の複合体（HNS60-90-AviTag-Streptavin-Cy3）、及びHNS91-137（91-137番目の限定HNSタンパク質）とStreptavidin-Cy3の複合体

（HNS91-137-AviTag-Streptavin-Cy3）を用いて、角閃石系アスベスト（アモサイト）とワラストナイトに対する結合を調べた（図(1)-6）。その結果、60-90番目の限定HNSペプチドは、角閃石系アスベストと炭化ケイ素繊維には結合するが、ワラストナイトには結合しなくなることが分かった。すなわち、60-90番目までに限定することによって、さらにアスベストへの結合特異性を向上させることができたことになる。

次に60-90番目のペプチドのアスベスト結合領域のさらなる絞り込みを行った。まず、C末端側からの限定を行った。具体的には、87-90番目の4つのアミノ酸を欠失させた

(HNS60-86-AviTag)を作製したところ、角閃石系アスベストへの結合性が消失した（図

HNS60-90-AviTag-Streptavidin-Cy3

HNS60-86-AviTag-Streptavidin-Cy3

HNS63-90-AviTag-Streptavidin-Cy3

HNS75-90-AviTag-Streptavidin-Cy3

図(1)-8、限定HNSタンパク質のアスベスト結合評価。位相差顕微鏡（左）と蛍光顕微鏡（右）によって観察した。
(1)-7、8）。この結果から、角閃石系アスベストへの結合には87-90番目のKAKR（リジンーアラニンーリジンーアルギニン）というペプチドが重要である事がわかった。次にN末端側からの欠失を行った。具体的には、63-90番目、75-90番目、83-90番目に限定したペプチド

HNS75-90-AviTag、

HNS83-90-AviTag) の作製を行った。残念ながら HNS83-90-AviTag に関しては、大肠菌内でのペプチドの発現がみられなかったた

表(1)-3、アスベスト結合特異性

繊維	DksA	HNS	HNS60-90
アス ベスト	クリタイル	結合
クロシドライト	結合	結合
アモサイト	結合	結合
アンソフィライト	結合	結合
トレモライト	結合	結合
アクチノライト	結合	結合
非ア スベスト	グラスウール
ロックウール
微細ガラス繊維
耐火性繊維(RF1)
耐火性繊維(RF2)
ケイ酸アルミニウム繊維	結合
チタン酸カリウム繊維
炭化ケイ素ウイスカー	結合	結合	結合
酸化チタンウイスカー	結合
ワラストナイト	結合

め取得できなかった（大腸菌の中で小さいペプチドは分解され易いので、分解されてしまっていると考えられる）。精製できたHNS63-90-AviTag、HNS75-90-AviTagについて角閃石系アスベストへの結合について調べた。その結果、HNS63-90-AviTag、HNS75-90-AviTag共に角閃石系アスベストへの結合性を有していた（図(1)-7、8）。以上の結果から、角閃石系アスベストへの結合領域は75-90番目の領域に存在することがわかり、さらにKAKRという正電荷に富んだアミノ酸領域が重要であることがわかった。

限定HNS60-90を用いて特異性評価を行った結果、ほぼアスベスト特異的であることが分かった（表(1)-3）。現在のところ、アスベストと炭化ケイウイスカーとの区別は出来ていない。しかし、炭化ケイウイスカーは軍事用の特殊繊維で現場にはほとんど存在しないことから、この交差は無視できると考えられた。従って、DksAとHNS60-90の組み合わせで、十分な特異性が得られたと考えている。

HNSタンパク質の75-90番目からさらにアスベスト結合領域を限定するためには、大腸菌の発現系は使えないので、ペプチドを化学合成することとした。化学合成したペプチドと蛍光色素(Cy3)で標識されたストレプトアビジンを結合させるため、ペプチドのN末端にビオチンを導入した。また、ペプチドを限定してさらに小さくした場合、ペプチドのアスベスト結合領域がストレプトアビジンの立体障害で機能できない可能性が考えられる。

図(1)-9、75-90番目のアスベスト結合領域の解析I。化学合成したペプチドを用いた。
れたので、欠失させる代わりにGGGSリンカー（アスベストには結合しない）で置き換えることで

アスベスト結合領域を絞り込ん

アスベスト結合領域を絞り込ん

だ（図(1)-9）。75～82番目の領

域をGGGSリンカーに置き換えた

ペプチド（GGGSGGGSGGGSKSGTKAKR）

を合成してアスベストへの結合

性を調べたところ、結合力を有し

ていた（図(1)-9）。さらに83～

86番目の領域もGGGSのリンカー

に置き換えたペプチド

（GGGSGGGSGGGSGGGSKAKR）に関しては著しい結合力の低下がみられた（図(1)-9）。以上の結果から、角閃石アスベストの結合には、KAKRだけでは不十分でKSGTKAKR（リジンーセリンーグリシンー

図(1)-10、83-90番目のアスベスト結合領域の解析II。化学合成したペプチドを用いた。

スレオニンーリ ジンーアラニンーリ ジンーアルギニン）というアミノ酸配列が重要であることがわかった。

さらに、アスベスト結合領域であるKSGTKAKRのアミノ酸配列について詳細な解析を行った。リジン（K）とアルギニン（R）は正電荷を有するアミノ酸である。リジンをすべてアルギニンに置換したペプチド（GGGSGGGSGGGSRSGTRARR）についてアスベストへの結合性を調べると、著しい結合力の低下がみられた（図(1)-10）。また、負電荷を有するアミノ酸EをKの近傍に配置したペプチド（GGGSGGGSGGGSKEEKEKR）についてもアスベストへの結合性を調べると、この場合も著しい結合力の低下がみられた（図(1)-10）。しかし、リジンの位置には比較的自由度があった（図(1)-10）。以上の結果から、アスベストの結合には同じ正電荷のアミノ酸でもアルギニンではなくリジンの方が重要であり、負電荷のグルタミン酸はアモサイトへの結合を低下させる効果があることがわかった。

次にペプチドの構造予測ソフト（QUARK）を用い、KSGTKAKRの構造予測を行った（図(1)-11）。その結果、リジンが同一平面上に広がる構造を取り得ることがわかり、アスベストとの結合に関与することが考えられた。

アスベスト結合ペプチド

(GGGSGGGSGGGSKSGTKAKR) を用いて結合特異性を評価した結果、炭化ケイ素ウイスカーを除

図(1)-11、アスベスト結合ペプチド(GGGS) $ _{3} $ KSGTKAKRのモデル。リジンの側鎖をボール形式で示す。正電荷に関わるリジン側鎖の窒素原子を赤く示す。
き、アスベストに特異的であることが分かった。しかし、このペプチドは角閃石アスベストであるアモサイトへの結合力は元のタンパク質と大差ないものの、同じく角閃石アスベストであるクロシドライトへの結合力が減少しており、アスベストプローブとして使いにくいことが分かった。同様にHNS60-90も炭化ケイ素ウイスカーを除き、アスベスト特異的であった（表(1)-3）。またHNS60-90はクロシドライトへの結合力も十分保持されていたので、実際使用するプローブとしては、HNS60-90を利用することとした。現在のところ、アスベストと炭化ケイウイスカーとの区別は出来ていない。しかし、炭化ケイウイスカーは軍事用の特殊繊維で現場にはほとんど存在しないことから、日本の解体現場では事実上無視できると考えられた。一方、DksAは炭化ケイ素ウイスカーにも結合する他は、ほぼクリソタイル特異的である（表(1)-3）。従って、DksAとHNS60-90の組み合わせで、アスベストに対する十分な特異性が得られたと考えている（標準アスベストを用いた場合の蛍光画像を資料集33-35に掲載）。

## 2 ）GatZタンパク質のアスベスト結合領域の解析

GatZタンパク質は、アスベスト以外に、ワラストナイト（ケイ酸カルシウム繊維）、ケイ酸アルミ繊維、炭化ケイ素繊維、微細ガラス繊維などの無機繊維と結合する。そこでGatZについても、HNSと同様に断片化することで、アスベストへの結合特異性を向上させることにした。GatZは420アミノ酸からなるタンパク質で、疎水性の高い領域を親水性の高い領域が取り囲むTIMバレル構造を有しており、疎水性領域を複数含むことから全領域をカバーするよう分割して可溶性発現し、結合評価することは困難だと思われた。そこでまず、MALDI-TOFMS解析によりGatZのアスベスト結合部位を同定し、その中からアスベストとの結合に関

図(1)-12、限定GatZタンパク質。99-117番目のアミノ酸（赤色）、168-216番目のアミノ酸（桃色）、256-275番目のアミノ酸（橙色）、281-308番目のアミノ酸（青色）を発現領域として選定した。

与していると考えられるタンパク質の表面部分に存在する部位について、タンパク質の発現と結合評価を行うことにした。クロシドライトに結合したGatZトリプシン消化ペプチドをMALDI-TOFMSにより解析した結果、GatZのアミノ酸配列の40-65、106-115、162-198、252-308、351-357番目にあたる領域のペプチドであることが分かった。これらの領域は、GatZタンパク質の立体構造上で、図12に示す領域に位置し、全ての結合領域はタンパク質表面上に露出する部位を有していた。また、幾つかの結合領域には、タンパク質内部に位置する疎水性の高い領域（図1）-12水色）が含まれていた。以上のことから本実験では、アスベスト結合領域の可溶性発現とタンパク質安定性を意図して、同定した結合領域からタンパク質表面に露出していない部分を除外し、結合領域を含むヘリックス構造を発現することとし、限定GatZタンパク質（99-117番目のアミノ酸（赤色）、168-216番目のアミノ酸（桃色）、256-275番目のアミノ酸（橙色）、281-308番目のアミノ酸（青色）
を選定して、遺伝子を設計した。なお40-65番目のアミノ酸については、疎水性に富むため可溶性発現が困難と予測されたことから候補から外し、351-357番目の領域は短すぎるためタンパク質発現が困難と予想されたことから候補から外した。

設計した遺伝子を、大腸菌を宿主とする発現ベクターに組み入れ、遺伝子の発現誘導をおこなった（pETGatZ99-117-AviTag、pETGatZ168-216-AviTag、pETGatZ256-275-AviTag、pETGatZ281-308-AviTag）。それぞれのビオチン化限定GatZタンパク質の精製を行ない、得られた部分精製標品（図(1)-13）とStreptavidin-Cy3を反応させ、ビオチン-ストレプトアビジン複合体

図(1)-13、ビオチン化限定GatZタンパク質の精製。 1: GatZ99-117-AviTag、2: GatZ168-216-AviTag、 3: GatZ256-275-AviTag、4: GatZ281-308-AviTag、 5: T7Tag-AviTag、6: 分子量マーカー

(GatZ99-117-AviTag-Streptavin-Cy3複合体、GatZ168-216-AviTag-Streptavin-Cy3複合体、GatZ256-275-AviTag-Streptavin-Cy3複合体、GatZ281-308-AviTag-Streptavin-Cy3複合体、T7Tag-AviTag-Streptavin-Cy3複合体）を調製した。これらの複合体とGatZ-Cy3を用いて、角閃石系アスベストとの結合性を評価した結果、各ビオチン化限定GatZタンパク質は、アスベストに対して結合性を有していたが、その結合性は弱く微細なアスベスト繊維、特にクロシドライトの検出は困難であった（表(1)-4）。

以上の結果から、全長GatZタンパク質のアスベスト結合能は、結合性の弱い複数の限定GatZタンパク質の総和であり、個々の限定GatZタンパク質はアスベスト検出プローブに適さないこと、断片化による特異性の向上が見込めないことがわかった。

表(1)-4、ビオチン化限定GatZタンパク質のアスベスト結合性

プローブ	アモサイト	クロシドライト
T7Tag-AviTag	-	-
GatZ99-117-AviTag-Streptavin-Cy3	+	+/-
GatZ168-216-AviTag-Streptavin-Cy3	+/-	+/-
GatZ256-275-AviTag-Streptavin-Cy3	+/-	+/-
GatZ281-308-AviTag-Streptavin-Cy3	+	+/-
GatZ-Cy3	+	+

## 3 ）アスベストに対する結合

## 力を強化したタンパク質の創成

アスベスト結合タンパク質の結合力を強化させることによって、より明瞭なアスベスト蛍光画像が期待できる。すでに上述した様にストレプトアビジンは、4量体を形成するタンパク質である。従って4分子のビオチン化したタンパク質（ペプチド）がストレプトアビジンを介して繋がることになる（図(1)-14）。ストレプトアビジン複合体は1分子上に4カ所のアスベスト結合部位が存在することにより、分子全体の結合力は単体と比べて向上することが期待できた。そこで、単体で
あるHNS60-90-AviTagを直接Cy3蛍光物質で修飾したものと、4量体であるストレプトアビジン複合体（HNS60-90-AviTag-Streptavidin-Cy3）のアスペストに対する結合を蛍光顕微鏡で観察した。その結果、単体では蛍光

がほとんど見えない濃度条件でも、ストレプトアビジン複合体は非常に明瞭な蛍光画像が得られるようになった(図(1)-14)。

次にその結合力の違いを定量化するために、遠心法とスキャッチャードプロット解析から、単体と4量体であるストレプトアビジン複合体の解離定数を比較した。その結果、単量体であるHNS60-90-AviTag-Cy3の解離定数は260 nMであるのに対し、4量体であるストレプトアビジン複合体

(HNS60-90-AviTag-Streptavidin-Cy3) の解離定数は1.0 nMと強固な結合を示した (図(1)-15)。すなわち、アスベストに対する結合力はペプチドを4量体化させることで約260倍向上した。これは、アスベスト表面とタンパク質の結合が複数箇所で起こることによって解離が起こりにくくなり、結合力が向上したと考えられた。

(A)

(B)

図(1)-14、(A)アスベストに対する結合力を向上させる方法の概念図。(B)単体と4量体の結合力の差を蛍光強度で示した。

アスベストに結合したプローブの濃度 (nM)

アスペストに結合したプローブの濃度 (nM)

図(1)-15、単体と複合体（4量体）の結合力評価。スキャチャードプロットによって解離定数を求めた。傾きは解離定数(Kd)の逆数分の-1となる。

## 4 ）アスベストバイオプローブの蛍光強度の強化と生産方法の確立

アスベスト結合タンパク質にビオチンを付加し、ストレプトアビジン（ビオチンの結合サイト