Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
題は次の3点である。1. イネの根圏にAnammox細菌および脱室性メタン酸化細菌はどれくらいいる

か？;2. これらの微生物群は水田の窒素除去の寄与にどれだけ貢献しているのか？;3. 水田への畜産排水の施肥量により、これらの微生物群を保持させることが可能か？これらの疑問点を明らかにすべく、以下の検討を行う。

（1）植栽の有無による水田土壌から採取した作土層および根圏の微生物活性に関する研究

作土層もしくは植栽したイネの根圏から得られた土壌による安定性同位体 $ ^{15} $ Nを添加することで窒素収支および脱窒速度を明らかにする。

(2) 窒素除去に関与する“活性のある”微生物群の同定と変遷に関する研究

イネの根圏近傍の微生物群の多様性評価ならびに施肥量に対する微生物群の変遷を追跡し、実際に窒素除去に関与する微生物群の同定を行う。

(3)イネ根圏に棲息する微生物群の空間分布と存在量に関する研究

(2)で同定した微生物を検出できるPCRプライマーを用いて、窒素除去を担う微生物群の定量を行う。また、根圏の微生物の空間分布を確認する。

### 3. 研究開発の方法

## （１）植栽の有無による水田土壌から採取した作土層および根圏の微生物活性に関する研究

ポットを用いて人工液肥の窒素施肥量（100 kg-N/ha, 450 kg-N/ha, 900 kg-N/ha）、植栽（飼料イネ“タカナリ”）の有無や水の浸透速度（1.74 cm/day, 0.42 cm/day）を体系的に評価するために、飼料イネを植栽するポットを用いてそれぞれの窒素除去能力、窒素収支、温室効果ガス（CH4とN2O）放出量評価、さらには $ ^{15} $ Nトレーサーを用いた脱窒速度評価を行った。これにより、飼料イネの畜産排水の除去性能を窒素の収支から評価した。次に、飼料イネ水田土壌の嫌気性アンモニア酸化（Anammox）活性を評価するために各深さごとに区分けした水田土壌を $ ^{15} $ Nトレーサーを用いた。四重極型GC/MSを用いることにより、脱窒およびAnammox活性を分画することで、水田土壌のAnammox活性を評価した。

## (2) 窒素除去に関与する“活性のある”微生物群の同定と変遷に関する研究

窒素除去のためには、窒素源であるアンモニア態窒素が亜硝酸・硝酸に酸化される必要がある。これまでの酸素に関する窒素収支では通常の硝化・脱窒反応だけではこれまでの結果で得られた窒素分を酸化するには酸素が足りないことが考えられ、近年発見された新しい窒素除去経路であるAnammox反応や脱窒性メタン酸化反応が起こっている可能性がある。これまでのところ、海底の堆積物、湖沼・河川の底泥等でAnammox反応を担うPlanctomycetes門に属する細菌（Anammox細菌）や脱窒性メタン酸化を行う細菌の分子生物学的検出は行われているが、これを初めて飼料イネ水田土壌での検出に適用し、系統解析を行った。また、脱窒性メタン酸化細菌に関しては、定量が可能な新規PCRプライマーの開発を行った。

## (3) イネ根圏に棲息する微生物群の空間分布と存在量に関する研究

イネ根圏は大気から吸収した酸素を根圏生物に供給する場であり、また、有機物を供給することが知られている。そこで、根圏に棲息している微生物群の系統を明らかにすることにより、根圏でどんな反応が起こっているかのヒントを得ることができ、水田および根圏での反応メカニズムの解明につながると考えられる。そこで、定量PCR法および蛍光in situハイブリダイゼーション法を適用することにより、作土層およびイネ根圏の脱窒細菌およびAnammox細菌が帰属するPlanctomycets門の定量を行い、窒素除去性能との関連を評価した。また、(2)で開発した脱窒性メタン酸化を担う細菌群の定量に関しては、定量PCR法を用いることによって、

## (4) 水田への施肥量と窒素除去能ならびに微生物の多様性、温室効果ガス放出の評価に関する研究

これまでのポット試験の検討により、水田管理において水を引き抜いてイネの根ぐされを防ぐ中干しによる落水管理がおよぼす温室効果ガス放出の特性について評価した。特に、これまでの研究成果よりメタンの放出量に及ぼす影響とメタンをめぐる微生物群の量に関する評価を行うため、茨城県つくば市にある農業環境技術研究所にある実験圃場において常時湛水管理および中干し管理を実施し、その際の中干しによるメタン削減効果およびメタン生成・消費に関わる土壤微生物群への影響調査を目的とした。この研究成果により、中干しという水田の表面水管理にメタン抑制効果がある可能性が示唆された。また、水田からのメタン発生量のピークは畜産排水の液肥を投入する施肥後に観察されていることから、施肥前に落水を行うことがより効果的なメタン抑制に繋がると考えられる。そこで本実験では実験圃場において施肥前に約2週間程度の落水期間を設ける「施肥前落水」管理を実施し、その際のメタン削減効果およびメタン生成・消費に関わる土壤微生物群への影響とメタン排出量との関係調査を目的とした。

### 4. 結果及び考察

## （1） 植栽の有無による水田土壌から採取した作土層および根圏の微生物活性に関する研究

畜産排水由来の液肥の窒素負荷が450、900 kg-N/haの系は、消失した窒素分が増大していることが確認で
きた。消失した窒素分を生物学的な脱窒とみなしたとすると、植栽ありの窒素負荷450、900

kg-N/haの系では脱窒による窒素除去の割合が高いことが示された（図2）。また、飼料イネの植栽により、高い窒素負荷対しても窒素化合物の地下への浸透を低減することができることが明らかになった。窒素負荷450 kg-N/ha、植栽有りの浸透速度の違いが脱窒速度に及ぼす影響を $ ^{15} $ Nトレーサー法を用いて評価した。最大脱窒速度は高浸透系で1.04 g-N/m²/day、低浸透系で0.31 g-N/m²/dayと高浸透系の方が高く、植栽期間を通して高浸透系の方が低浸透系より高い脱窒速度が得られた。これは高浸透系では土壤中の酸化還元電位（Eh）が酸化的な状態と還元的な状態を繰り返しているために、酸化的状態で起こる硝化反応が促進され、脱窒速度が高くなったと考えられる。一方で、低浸透系では植栽期間を通して土壤Ehは還元的であり、硝化反応が起こりにくかったため、脱窒に必要な硝酸・亜硝酸の生成が少なく、脱窒速度が低くなったと考えられる。脱窒速度の測定結果から、植栽期間を通しての積算脱窒量を求めたところ、高浸透系の脱窒量は17.16 g-N/m²、低浸透系の脱窒量は4.35 g-N/m²であり、高浸透系で低浸透系より約4倍高い値となった。以上より、畜産排水処理を飼料イネ水田で行う場合は、水の浸透速度を高くして酸化的環境を創製することにより、窒素除去能を向上できることが明らかになった。

次に、 $ ^{15} $ Nトレーサー法を応用することにより、Anammoxの活性を評価した。2年間の水田サンプルを採取して評価を行ったところ、畜産排水の液肥を施肥した水田においては、Anammox活性が見られなかった。一方で、茨城県にある谷津田水田においては高いAnammox活性が検出された。畜産排水には高い窒素化合物が含まれており、窒素の量がAnammox反応を律速にさせる可能性は極めて低い。一方で、畜産排水には窒素化合物と同様に極めて高い有機物が含まれているため、この有機物により脱窒細菌の増殖が大幅に促進された可能性がある。これらの異なるサンプリングサイトから畜産排水を施肥した水田土壌でAnammox細菌を増やす条件を一般化することは困難であるが、畜産排水の有機物を減少させることにより、Anammox活性を高めることが可能になることが十分に考えられる。今回のプロジェクトで用いた畜産排水の液肥は牛舎からの排水に起因しており、養豚排水よりも有機物濃度が高いことが知られている。したがって、養豚排水のように有機物濃度が低い排水に適用すれば、Anammox活性を利用した窒素除去が十分に行える可能性が考えられる。一方、今回サンプリングサイトとして選択した谷津田水田では、既往の研究と比較しても遜色ない高い活性を示すことが確認できた。この結果より、水田土壌においてAnammox細菌による窒素除去の寄与は最大で30%を超え、これらの細菌を利用できる可能性も示せた。

図2 各ポットにおける窒素収支のまとめ（A:高浸透（1.74 cm/day）系；B:低浸透（0.42 cm/day）

## (2) 窒素除去に関与する“活性のある”微生物群の同定と変遷に関する研究

これまでのポット試験の結果を鑑み、嫌気性アンモニア酸化を担う微生物群の分子生物学的検出を試みた。これまで排水処理施設や自然界中に棲息しているAnammox細菌を検出するPCR用プライマー（合計5種類を精査）では全く検出されないことが明らかになった。このため、nested PCRを試みた（Dale et al.（2009）Environ. Microbiol. 11(5) 1194-1207）。Daleらの開発した手法を改良し、新たにアニーリング温度のタッチダウンを行うことを試みたところ正しい位置にPCRの増幅産物が得られた。得られたクローンは新規な分類（クラスター）を形成した。また、既存のAnammox細菌に近縁な種類は検出されなかった。この3つのクラスターは進化の系統的にこれまでのクローニングで得られたPlanctomycetesとは全く異なるものであり、水田のイネ根圏に棲息するPlanctomycetes門に属する窒素除去を担う細菌群はこれまで知られていた既知のAnammox細菌とは異なる種類である可能性が示唆された。

次に、近年発見された新規な脱窒性メタン酸化細菌（NC10門細菌）の検出を試みた。既知のPCRのプライマーを用い、検出を試みたところ、脱窒を行いながらメタン酸化が可能な細菌群が畜産排水を施肥する試験水田圃場に棲息することが確認された。しかしながら、このプライマーを用いた場合、NC10門細菌以外の細菌群の検出が非特異的に行われてしまい、NC10門の正確な定量が行えなことが明らかになった。そこで、この菌叢解析により得られた結果からNC10門のみを検出可能な新規プライマー（193f-616r）を設計し、この特異性を評価した。その結果、この193f-616rプライマーは特異性が保たれ、従来のプライマーのようなPCRによる非特異的増幅が抑
制できることが示された。NC10門細菌のみを定量可能であることが示された。このプライマーを以降の検討でNC10門細菌の水田でのダイナミクスを追跡するために利用した。

## (3) イネ根圏に棲息する微生物群の空間分布と存在量に関する研究

（1）における各ポットの2か所（田面水から2、10 cm以深）の土壌から得られた土壌を採取し、定量PCRによりPlanctomycetes門の定量を行った。各ポットにおけるPlanctomycetes門の相対数を図3に示す。上部土壌の高浸透系植栽を有する系で、3回目追肥後に細菌数が増加し十倍以上になっていることが確認された。一方、土壌下部では高浸透450 kg-N/ha系を除く全ての系で土壌中のPlanctomycetes門が減少傾向にあった。また、低浸透系は高浸透系と比較して細菌数の減少が大きく、特に植栽のある系においては顕著であった。微量酸素が存在する高浸透系では硝化が起こりやすく、Anammox細菌を含むPlanctomycetes門が増加したということが考えられる。定量したPlanctomycetesがAnammox反応を担う機能を有していると仮定すると、硝化反応で生成した亜硝酸を反応基質として利用し、菌体の増殖を行ったということの裏付けとなる。これらの定量結果から少なくとも高浸透系および田面水に近い作土層において酸素の供給が進み、窒素除去能の向上とAnammox細菌が属するPlanctomycetes門の菌体数の増大の相関関係が見出すことができた。

次に、(3)(4)における各水田土壌における菌数の変化を評価した。対象としてメタン生成を担うメタン生成古細菌および生成したメタンを酸化するメタン酸化細菌、脱窒性メタン酸化細菌の定量を行い、各水田の水管理方法がこれらの微生物群の量に及ぼす影響を評価した。2011年に実施した実験圃場における水管理の結果より、中干しにより水を引き抜いた系においては、空気に触れることに水田土壌が好気的になり、この酸素利用してメタンを酸化するメタン酸化細菌が落水を行わない系と比較して有意に低い値になることが確認された。一方、メタン生成古細菌に関しては落水の有無に関わらず存在量に有意な差は見いだされなかった。したがって次に、2012年ではメタンおよび亜酸化窒素の生成を抑制するために、施肥前落水および後半低負荷施肥という新しい水管理および液肥の供給方法について検討を行った。この結果より、液肥を施肥する前に落水を行うことによりメタン生成の量は大幅に削減することが可能であったが(詳細は4(4)を参照のこと)、このときにはメタンを酸化するメタン酸化細菌および脱窒性メタン酸化細菌の量に有意な差が見られなかった。一方で、メタン生成古細菌の量に着目すると、施肥前に落水をして液肥に含まれる有機物のメタン生成を抑制した施肥前落水には初期のメタン生成古細菌の量と比較してほとんど増大しなかったものの、通常の中干しを水管理として導入した系はメタン生成古細菌の相対的な増大が見られた(図4)。したがって、新たに導入した施肥前落水を用いることにより、メタン生成古細菌の増殖を抑制することが可能であった。以上より、畜産排水を施肥した水田において土壌を好気的に保つ工程が温室効果ガスを抑えるうえで必須であることが示された。

図3 (A) 土壤上部（2cm）および（B）深部（10cm以深）のPlanctomycetes門の細菌数の相対変化

図4 各飼料イネ水田におけるメタン生成古細菌のダイナミクス
## (4) 水田への施肥量と窒素除去能ならびに微生物の多様性、温室効果ガス放出の評価に関する研究

中干し等の落水管理は土壌中微生物に対し様々な影響を及ぼすことが知られており、メタン生成古細菌の阻害効果やメタン酸化細菌を活性化する効果がこれまでに報告されている。しかし、その効果の程度は水田の管理方法や土壌性質などによって異なるとされている。特に畜産排水処理を目的とした飼料イネ水田管理は、栽培期間中に液肥を高負荷施肥するなど慣行の水田とは異なる土壌条件であると考えられる。そこで本実験では、実験圧場において常時湛水管理および中干し管理を実施し、その際の中干しによるメタン削減効果およびメタン生成・消費に関わる土壌微生物群への影響調査を目的とした。その結果、メタン生成のフラックスは中干しを導入することにより、大幅に削減可能であることが示された（図5）。

次に、前年度の中干しによる温室効果ガス削減効果の検討より明らかになった知見を利用して、畜産排水を施肥した飼料イネ水田における $ CH_{4} $ および $ N_{2}O $ の同時削減を目的とした。削減手法として、水管理では施肥前落水を、施肥方法では後半低負荷施肥を提案した。施肥前落水とは追肥前に落水を行う水管理であり、メタン排出抑制を狙った。落水により土壌中の酸化物を増加させた後に追肥を行うことで、酸化物を利用する微生物とメタン生成古細菌との間で畜産排水中の有機物を巡り競合が起きる。この競合によりメタン排出抑制が期待される。一方、後半低負荷施肥とは栽培の後半に低い窒素負荷での施肥を行う方法であり、 $ N_{2}O $ 排出抑制を目指した（図6）。これらの仮説を検証するために、試験圃場にて実験を行ったところ、栽培期間中の $ CH_{4} $ 排出量に関しては、施肥前落水系は慣行系に比べ前半低負荷系では15%、後半低負荷系では77%の削減ができた（図7）。 $ N_{2}O $ 排出量に関しては、前半低負荷系からは $ N_{2}O $ の排出が確認できたのに対し、後半低負荷系からは $ N_{2}O $ の排出は確認できなかった。これらの温室効果ガスの排出総量を二酸化炭素等量で比較した場合、施肥前落水と後半低負荷を組み合わせた系は慣行系の水田と比べて84%の温室効果ガス削減率を示した（図8）。また、図6で示す水管理による運転（窒素負荷300 kg-N/ha）では、田面水・浸透水でアンモニア・亜硝酸は全く検出されたかった。以上より、ポット試験から得られた現象を把握し、それを水田管理にフィードバックすることにより、安定して畜産管理が可能であり、かつ温室効果ガスを大幅に削減可能であることが示された。

図5 中干しの有無によるメタン生成の推移

Ⅱ.施肥パターン	基肥
[kg-N/ha]	1回目追肥
[kg-N/ha]	2回目追肥
[kg-N/ha]	3回目追肥
[kg-N/ha]	合計負荷量
[kg-N/ha]
①前半低負荷	50	20.5	101	123	294
②後半低負荷	50	82.1	101	30.8	264

図6 新しい水管理法"施肥前落水"と"後半低負荷"を導入した水田管理方法
図7 施肥前落水および前半・後半低負荷による水田管理法がもたらすメタン排出量の評価

図8 施肥前落水および前半・後半低負荷の水田管理法がもたらす温室効果ガス削減効果（CO₂当量）

### 5. 本研究により得られた主な成果

## (1) 科学的意義

ポット試験により、通常の窒素負荷80 kg-N/haの5倍以上の450 kg-N/haで運転可能であることを示せた。 $ ^{15} $ Nトレーサーを用いて水の浸透速度の違いにより微生物による脱窒活性の違いを定量的に見出したこと、これらの細菌群の密度が脱窒活性試験と相関があることを示せたことは、学術的にも新規性が高い新たな知見であると考える。温室効果ガスの放出特性の評価より、亜酸化窒素よりもメタンの温室効果が圧倒的に多く、全体の9割以上を占めることが明らかになった。さらに、亜酸化窒素は好気的条件下で放出量が増大すること、メタンは施肥後の嫌気的条件で顕著な放出が確認されたため、水管理や施肥条件の調整により温室効果ガスを削減できる可能性を示せたことは学術的にも意義がある。水田土壌は多様性が非常に高く、Anammox細菌を検出可能なプライマーの利用では検出が困難であることが確認された。そこで、検出手法を改良することで、上記の問題を克服し、Anammox細菌に近縁な新規なPlanctomycetesを検出することに成功した。残念ながらAnammox反応を見出すことが出来なかったが、Anammox反応が検出された他のサイトのデータより、どのような条件で水田を管理すればAnammox反応を起こすことが可能かの知見を得ることができた。

温室効果ガスであるメタンを抑制可能なメタン酸化細菌の中でも、脱窒を行うことが可能な脱窒性メタン酸化細菌は畜産排水の液肥を施肥した水田土壌に棲息可能であることを明らかにした。また、それらの細菌を特異的に可能な定量プライマーを設計し、その特異性および定量性を明らかにした。これにより脱窒性メタン酸化細菌がメタン酸化細菌と同様に水田土壌に棲息することを定量的に示すことができたことの意義は大きいと考えている。

また、これらの成果から得られた知見より、畜産排水の浄化技術のみならず、水田からの温室効果ガス削減に向けた水管理方法を新たに提案し、温室効果ガスである亜酸化窒素ならびにメタンの大幅な削減が可能になった。この成果は生態工学的・分子生物学的手法を合わせた成果であり、産業排水でも処理が困難とされている
畜産排水を処理し、かつ温室効果ガスの排出も抑制可能な水田の管理方法を提案できた意義は大きいと考えている。

## (2) 環境政策への貢献

## ＜行政が既に活用した成果＞

特に該当すべき事項はない

## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

本申請課題を行うことにより、畜産排水処理のために約450 kg-N/haの施肥を行う必要があること、温室効果ガスが発生する時期・環境を特定できたことを明らかにした点は、今後の環境政策の一環として水田の適切な維持管理を行うためには大きな意義があると考えている。特に、畜産排水は産業排水の中でも高濃度に窒素を含み、水質汚濁防止法に基づく閉鎖性海域に係る窒素・リンの排水基準においてはいまだに暫定基準900 mg-N/Lが設けられており、処理技術の普及が難しい現状である。したがって、水田を核とする排水処理技術が確立できたことの意義は大きいと考えている。一方で、地球温暖化が叫ばれている中、亜酸化窒素やメタンなどの温室効果ガスが多量に水田から排出されていることを鑑みると、現在では排水処理のみならず、温室効果ガスの削減も同時に達成する必要が高まっている。本申請課題で得られた成果の1つである、新しい水管理手法を利用することでより、水田を用いて畜産排水に含まれる窒素化合物を放流基準値以下にまで低下させ、さらに水田からの温室効果ガス削減が可能なWin-Winなシステムを畜産農家に導入してもらえる可能性があると考えている。

6. 研究成果の主な発表状況（別添.作成要領参照）

## (1) 主な誌上発表

## <査読付き論文>

1) A. TERADA, S. ZHOU and M. HOSOMI: Clean Technol. Environ. Policy 13, 6, 759–781 "Presence and Detection of Anaerobic Ammonium-Oxidizing (anammox) Bacteria and Appraisal of Anammox Process for High-Strength Nitrogenous Wastewater Treatment: A Review"

2) S. ZHOU, Y. SAKIYAMA, S. RIYA, X.F. SONG, A. TERADA and M. HOSOMI: Sci. Total Environ. 430, 93–100.

“Assessing Nitrification and Denitrification in a Paddy Soil with Different Water Dynamics and Applied Liquid Cattle Waste Using the N-15 Isotopic Technique”

＜査読付論文に準ずる成果発表＞（「持続可能な社会・政策研究分野」の課題のみ記載可）特に記載すべき事項はない

## (2) 主な口頭発表 (学会等)

1）寺田昭彦、上村美羽、臼井陽菜子、崎山幸奈、西川恵美、大坂利文、常田聡、周勝、細見正明“畜産排水除去を志向した飼料イネ水田におけるPlanctomycetes門の生態構造解析”第45回日本水環境学会年会（2010年3月、北海道大学、札幌）

2) 利谷翔平、周勝、寺田昭彦、細見正明

“飼料イネ水田を利用した温室効果ガス低排出型畜産排水処理の開発”

第14回水環境学会シンポジウム（2011年9月、東北学院大学、宮城）

3) 上村美羽、利谷翔平、周勝、細見正明、寺田昭彦

“畜産排水を施肥した水田におけるメタン放出の挙動とメタン酸化細菌の関係解析”

第46回日本水環境学会年会（2012年3月、東洋大学、東京）

4) M. KAMIMURA, S. RIYA, S. ZHOU, Y. KOBARA, A. TERADA, M. HOSOMI

“Methane flux and abundance of microorganisms responsible for methane production and oxidation in rice paddies applying liquid manure from livestock wastewater with different irrigation strategies”

The 28th Annual Meeting of the Japanese Society of Microbial Ecology(2012年9月、豊橋科学技術大学、愛知)

5) 上村美羽、利谷翔平、周勝、小原裕三、寺田昭彦、細見正明

“畜産排水を施肥した飼料イネ水田のメタン放出挙動とメタンをめぐる微生物群のダイナミクス”

第64回日本生物工学会大会（2012年10月、神戸国際会議場、兵庫）
6) ソドビリゲ、利谷翔平、周勝、寺田昭彦、黒田久雄、細見正明

“異なる水環境における Anammox 反応活性の評価”

第47回日本水環境学会年会（2013年3月、大阪工業大学、大阪）

6）室井友里恵、上村美羽、利谷翔平、周勝、小原裕三、寺田昭彦、細見正明

“畜産排水を施肥した飼料イネ水田におけるCH_{4}およびN_{2}Oの同時削減の試み”

化学工学会第78年会（2013年3月、大阪大学、大阪）

### 7. 研究者略座

課題代表者：寺田 昭彦

早稻田大学大学院理工学研究科博士後期課程修了、博士（工学）、

現在　東京農工大学大学院工学研究院　准教授

## 研究参画者

(1) : 周勝

東京農工大学大学院工学府博士後期課程修了、博士（工学）、当時同大学助教、現在、上海市農業科学院教授

（2）：寺田昭彦（同上）

（3）: 寺田昭彦（同上）

（4）：寺田昭彦（同上）·周勝（同上）
RF-1002 水田のイネ根圏に棲息する脱窒を担う微生物群の同定・定量と窒素除去への寄与の解明

（１）植栽の有無による水田土壌から採取した作土層および根圏の微生物活性に関する研究

東京農工大学 大学院工学研究院 応用化学部門 細見・寺田研究室

寺田昭彦

周勝

平成22～24年度累計予算額：2,376千円

（うち、平成24年度予算額：420千円）

予算額は、間接経費を含む。

[要旨] 水田はイネ生産ばかりでなく水質浄化など多面的機能を有しており、窒素を高濃度に含む畜産排水を水田に施用して、肥料としての利用と窒素除去の畜産排水処理が同時に達成できる可能性がある。このとき、畜産排水由来の液肥の過剰な散布は水質汚濁につながるため、水田内での水質管理、特に窒素に関する物質収支の把握が必要不可欠である。本研究では、亜酸化窒素（ $ N_{2}O $ ）やメタン（ $ CH_{4} $ ）といった温室効果ガスを発生させない窒素代謝経路を持つ微生物群である嫌気性アンモニア酸化（Anammox）細菌およびメタン酸化細菌群を同定し、その浄化能力を最大限に発揮できる条件を明らかにする。ポット試験を通して様々な施肥量（窒素負荷）、水の浸透速度、飼料イネを植栽し、畜産排水を液肥として用いた際の窒素除去性能、温室効果ガス量、窒素除去に関与する微生物群の同定・定量を行った。ポット試験により、水の浸透速度1.74 cm/dayにおいて通常の施肥量の約5倍の窒素負荷450 kg-N/haで運転しても、地下流出を抑え畜産排水が除去できること明らかになった。 $ ^{15} $ Nトレーサー試験により、水田土壌に存在する微生物による脱窒反応を確認し、水の浸透速度が高いほど脱窒活性が高いことが明らかになった。また、温室効果ガスの放出特性の評価より、それぞれのガスが放出される条件を明らかにした。温室効果は $ N_{2}O $ よりも $ CH_{4} $ が圧倒的に多く、全体の9割以上を占めることが明らかになった。次に、 $ ^{15} $ Nトレーサー法を応用することにより、Anammoxの活性を評価した。畜産排水の液肥を施肥した水田においては、Anammox活性が見られなかった。一方で、茨城県にある谷津田水田においては高いAnammox活性が検出された。これらの異なるサンプリングサイトから畜産排水を施肥した水田土壌でAnammox細菌を増やす条件を一般化することは困難であるが、畜産排水の有機物を減少させることにより、Anammox活性を高めることが可能になることが考えられる。

[キーワード] 畜産排水処理、飼料イネ、生物学的窒素除去、温室効果ガス

### 1. はじめに

水田はイネ生産ばかりでなく水質浄化など多面的機能を有しており、窒素を高濃度に含む畜産排水を水田に施用して、肥料としての利用と窒素除去の畜産排水処理が同時に達成できる可能性
がある。このとき、液肥の過剰な散布は水質汚濁につながるため、水田内での水質管理、特に窒素收支の把握が必要である。本研究では、 $ CH_{4} $ や $ N_{2}O $ といった温室効果ガスを発生せずに窒素除去を行えるという新たな窒素代謝経路を持つ微生物群同定し、その浄化能力を最大限に発揮できる条件を明らかにする（図1）。これより、水田施肥管理条件を決定でき、畜産排水の窒素を高効率に低減して、温室効果ガス放出の抑制にもつながることが期待される。

図1 本研究の概略図

## 2 ．研究開発目的

本研究では、畜産排水由来の液肥を施肥している水田に着目し、イネの根圏に存在する窒素循環に関わる微生物群の同定・定量・空間分布の解明を目指し、水田における畜産排水からの窒素除去との関係を明らかにする。窒素はアンモニアを亜硝酸・硝酸に酸化する硝化反応と亜硝酸・硝酸を窒素ガスに還元する従属栄養性の脱窒反応の2つの異なる生物反応を経て無害化される。近年、硝化・脱窒以外の窒素除去経路が明らかになっている。一つは嫌気性アンモニア酸化

（Anammox）であり、独立栄養性のAnammox細菌により嫌気条件下でアンモニアと亜硝酸を窒素ガスに変換する。もう一方は、メタン脱室であり、亜硝酸・硝酸がメタンと反応して窒素ガスに変換される。これらの反応を担う細菌の特徴として、温室効果ガスである $ N_{2}O\cdotCH_{4} $ を放出しないため、水田からの温室効果ガスの放出を抑制するメリットを有する。したがって、畜産排水の処理システムとしての水田の管理上、これらの微生物群の動態の把握は極めて重要である。

サブテーマ1では、様々な窒素施肥量や水の浸透速度を体系的に評価するために、飼料イネを植栽するポットを用いてそれぞれの窒素除去能力、窒素収支、温室効果ガス（CH_{4}とN_{2}O）放出量評価、さらには $ ^{15} $ Nトレーサーを用いた脱窒速度評価を行った。これにより、飼料イネの畜産排水の除去性能を窒素の収支から評価した。また、新たにAnammox活性を明らかにするため $ ^{15} $ Nトレーサー法を用いて水田土壌中のAnammox活性および脱窒活性を定量的に評価した。

### 3. 研究開発方法

（１） 植栽の有無による水田土壌から採取した作土層および根圏の微生物活性に関する研究

## 1 ） 植栽カラム

イネを植栽するカラムは高さ50 cm、直径22.6 cm（表面積400 cm²）の円筒状の塩化ビニル製容器とした。装置の断面図を図2に装置の写真を図3に、装置の寸法を表1に示した。
また、土壌間隙水を採取するために、土壌間隙水採水器（DIK.8393 大起理化社製）のポーラスカップを土壌に深さ5 cmになるように差し込んだ。さらに、酸化還元電位（Eh）を測定するため、Eh計を土壌深さ1 cm、5 cmの位置に差し込んだ。

図2 ポット断面図

図3 植栽後の装置写真

表1 装置の寸法

形状	表面積（cm²）	高さ（cm）
円筒型	(22.6/2)×2×3.14=400	50

本研究では、基肥には化学肥料(ホームラン化成肥料888号, ミズホユーキ有限会社)を、追肥には埼玉県の妻沼有機センターにて生産された液肥を施肥した。液肥の組成を表2に示す。一般的なイネ栽培の窒素負荷量は89 kg-N/haであるが、今回の窒素負荷は平均値に近い値100 kg-N/haとそれよりも高い値450 kg-N/ha、900 kg-N/haの3つを設定した。また、追肥は植栽後、一月の間隔を空け、最高3回行った。追肥の設定は表3に記した。

表2 液肥組成
TOC [mg/l]	3300
NH4+-N [mg/l]	2300
PO43-P [mg/l]	94.7
NO2-N [mg/l]	0
NO3-N [mg/l]	0

表3 施肥设定

全窒素負荷[kg-N/ha]	基肥[kg-N/ha]	追肥①[kg-N/ha]	追肥②[kg-N/ha]	追肥③[kg-N/ha]
100	50	50	0	0
450	50	200	200	0
900	50	250	300	300

## 2 ）飼料イネ

本研究では、短強稲で耐倒伏性が強いタカナリを飼料イネとして用いた。

## 3 ）浸透速度の設定

浸透速度は全国の平均水田浸透速度である1.3 cm/dayより浸透速度が速い高浸透系と遅い低浸透系を模擬した。植栽期間中の平均浸透速度は高浸透系が1.74 cm/day、低浸透系が0.42 cm/dayに設定した。浸透速度は土の充填方法と植栽カラムの下に取り付けたコックによって調節した。高浸透系も低浸透系も5 cmの高さまで直径0.5 cm以下の大きさの砂利を入れ、その上に茨城県農業環境技術研究所の水田で採取した土壌を充填した。充填した土壌の重量は高浸透で平均20 kg、低浸透系で18 kgであった。低浸透系では、20 cm水を含ませて適度にこれた土壌を隙間が少なくなるようにしてつめて、その上に乾燥した土壌を充填した。乾燥した土壌層は10 cmになるよう、水を入
れた際に体積が小さくなることを考えて+3 cmの13 cmを入れた。高浸透系は、砂利の上に30cmの乾燥土壌層になるよう、体積変化を考えて+6 cmの36 cmを充填した。浸透速度の測定は、カラム側面に定規を固定し、水面の変化から計算した。浸透のない系で植栽の有り、無しをそれぞれ作成し、その変化量を差し引くことで蒸発散分、イネによる吸収分を補正した。

## 4 ）サンプリングおよび分析方法

## ① 土壤サンプリング

土壌は、酸化層0-2 cmと2-20 cmに分けて採取した。数箇所土壌を採取し均一化した土壌を分析に用いた。土壌吸着態室素分析および土壌中の全窒素分析に使用する土壌は、採取後に1週間風乾して乳鉢で粒径約1 mm以下に粉砕した。DNA抽出に使用する土壌はリン酸緩衝液に懸濁させ、10000 rpmで遠心分離を行った後、-20°Cで冷凍保存した。

## ② 土壤分析

全窒素分析に用いる土壌は、植栽前と収穫後に採取し、1週間風乾した後乳鉢で粒径約1 mm以下に粉砕した。粉砕した土壌の窒素含有量を有機元素分析計（MICRO CORDER JM10、ジェイサイエンス製）により分析し、土壤中の全窒素量を求めた。土壌に吸着した窒素に関しては、植栽前と収穫後に採取し、1週間風乾した後乳鉢で粒径約1 mm以下に粉砕した。粉砕した土壌は土壌重量に対して10倍量の0.01 M KClを加え1時間振とうした後、0.45 μmメンブレンフィルター

（ADVANTEC）でろ過し、アンモニア態室素（ $ NH_{4}^{+}-N $ ）、亜硝酸態室素（ $ NO_{2}^{-}-N $ ）および硝酸態室素（ $ NO_{3}^{-}-N $ ）の濃度を分析した。アンモニア態室素濃度は陽イオンカラム（IonPac@CS12A，日本ダイオネクス）、亜硝酸・硝酸態室素濃度は陰イオンカラム（IonPac@AS12A，日本ダイオネクス）を装備したイオンクロマトグラフィー（ICS-90、日本ダイオネクス）により測定した。

## ③ 水質分析試料サンプリングおよび分析方法

高浸透系、低浸透系共に、流入水と田面水、深さ5 cmの地点の土壌間隙水、浸透水（流出水）を採取した。土壌間隙水は田植え前に土壌間隙水採水器（DIK.8393 大起理化社製）のポーラスカップを土壌に深さ5 cmになるように鉛直方向に差し込むことで採取した。採取した試料は、0.45 μm メンブレンフィルター（ADVANTEC）でろ過し、各窒素濃度を測定した。測定法は土壌吸着態窒素の際の方法と同様にして行った。

## ④ 植物体のサンプリングおよび分析方法

植栽前および収穫後の飼料イネを、茎、葉、穂、根の部位に分け、80℃で24時間乾燥した。乾燥後、重量を測定し、飼料イネの収量を求めた。飼料イネ中の全窒素量の分析は、乾燥した飼料イネを茎、葉、穂、根の部位に分け、ワンダーブレンダー（大阪ケミカル）により粉砕して均一な状態とし、有機元素分析計（MICRO CORDER JM10、ジェイサイエンス製）により分析した。

## ⑤ 土壤酸化還元電位 (Eh)測定

深さ1、5 cmの位置に差し込まれた土壌Eh測定用のガラス製白金電極（EP.201型、藤原製作所株式会社製）と、ポータブル酸化還元電位計（PRN.41型、藤原製作所株式会社製）により測定した。

## 5 ）ポット試験の実験系

## ① 実験系

本実験では、上記の窒素負荷、浸透速度の違いから条件の異なる計10系の実験系を設定した。系の条件の一覧は表4にまとめた。
表4 ポット試験に供試する実験系

窒素負荷 [kg-N/ha]	植栽あり 高浸透 (1.74 cm/day)	植栽あり 低浸透 (0.42 cm/day)	植栽なし 高浸透 (1.74 cm/day)	植栽なし 低浸透 (0.42 cm/day)
100	Run1	Run2	Run3	Run4
450	Run5 ( $ ^{15} $ N トレーサー)	Run6 ( $ ^{15} $ N トレーサー)	Run7	Run8
900	Run9	Run10	.	.

## ② 生育期間と流入期間

イネの栽培スケジュールを表5に示す。田植えをしてから収穫するまでの生育期間は143日であった。水管理は高浸透では間断灌溉、低浸透では常時湛水とし、週に2回、表面水水位が5 cmになるまで水を入れた。この水管理で高浸透系は約2日で表面水水位が0 cmになるが、低浸透系は湛水状態が維持されることになる。

表5 施肥スケジュール

基肥	6月11日
田植え	6月12日
追肥①	7月13日
中干し	7月27日-8月3日
追肥②	8月12日
追肥③	9月10日
落水	10月16日-
稲刈り	11月2日

## 6 ）Anammox活性调查（平成23年度）

茨城県つくば市にある国立行政法人農業環境技術研究所の実験圃場より、水田土壌を採取した。イネを栽培していない期間である2011年2月および栽培期間中の2011年10月の水田土壌を0-5 cm, 5-10 cm, 10-15 cm, 15-20 cmに分けた。土壌サンプルを酸素に極力触れさせないようにして、バイアルに注入し、それぞれの窒素化合物に $ ^{15} $ Nをラベルさせた基質を投入することにより回分試験を行った。得られた各種窒素ガスの分子量の違いを四重極型GC/MSにて分画することにより、脱室およびAnammox活性を測定した。バイアル試験の流れを図4に示す。

図4 四重極型ガスクロマトグラフィーによる脱窒およびAnammox活性の測定
## 7 ）Anammox活性调查（平成24年度）

平成23年度の検討により、 $ ^{15} $ Nトレーサー法により国立行政法人農業環境技術研究所の実験圃場から採取した水田土壌からAnammox性能を確認することができなかった。そこで、同じ実験圃場による水田サンプルに加え、他の水田土壌および河川土壌を用いることによるAnammox活性の検出を行った。活性の検出には図4の方法を用いた。本研究で用いた環境サンプルを表6に示す。

表6 Anammox活性を測定したサンプル採取箇所

サンプル名	サンプル採取場所	サンプル採取日時
#1	国立行政法人農業環境技術研究所（本申請課題で試験しているサイト）	2012年8月
#2	茨城県北浦付近の水田土壌（谷津田水田）	2012年2月,6月,10月
#3	河川底質（茨城県恋瀬川）	2012年5月

## 4 ．結果・考察

（１） 植栽の有無による水田土壌から採取した作土層および根圏の微生物活性に関する研究

## 1 ）水田土壌の酸化還元電位Eh

Run 5-8のポット土壤における深さ1 cm, 5 cmの酸化還元電位Ehの比較を図5に示す。高浸透系では植栽の有無にかかわらず深さ1 cmの土壤は酸化的であり、表層に酸化層が形成されていることがわかる。低浸透系は常時湛水状態であるため、植栽のある系無い系共に還元的で、時間が経つにつれEhがさらに低くなっていった。また、高浸透で追肥後は、急激にEhの低下が見られた。これは、土壤微生物による液肥中のアンモニア態窒素の酸化に、酸素が使われたためであると考えられる。図5(B)から、高浸透系植栽ありの系は中干以降酸化還元電位Ehが大きく上昇していた。これは、イネの成長によって根から酸素が供給されたためであると考えられる。植栽なし系では二回目追肥後にEh 0 mV付近に上昇した。これは、中干などの影響で土壤に変化があり5 cmまで土壤に酸素が供給されやすくなったためであると考えられた。低浸透系は植栽あり・なし共に常時還元雰囲気を保っていた。以上より、高浸透系は土壤が酸化的で、低浸透系は土壤が還元的で硝化の起こりやすさが異なることが分かった。低浸透系が常に湛水状態で土壤に酸素が供給されにくいのに対し、高浸透系は水位が0 cmの時に空気から土壤に直接空気が供給され、より多くの酸素が土壤に供給されることに起因する。

図5 土壤1 cm (A) および5 cm (B)における酸化還元電位の経日変化
## 2 ） 窒素化合物の举動

植栽期間中の土壤表面水（田面水）、深さ5 cmの土壤間隙水、浸透水（流出水）の無機態窒素濃度変化を図6～11に示す。図6より、追肥後の田面水の $ NH_{4}^{+}-N $ 濃度の減少速度は低浸透系の方が遅く、より長い時間土壤表面に $ NH_{4}^{+}-N $ が滞留していることが確認された。また、図7から追肥後に高浸透系および、1回目追肥後の低浸透田面水の $ NO_{x}^{-}-N $ 濃度が上昇していた。これは、硝化反応が起こったことに起因する。図8より、間隙水の $ NH_{4}^{+}-N $ 濃度は、追肥後に低浸透系のほうが高く検出された。さらに、植栽の無い系では植栽の有る系と比較して $ NH_{4}^{+}-N $ が多く残存しており、その減少も遅かった。高浸透系では $ NH_{4}^{+}-N $ が早く浸透し、酸化的雰囲気であることから、硝化反応が促進されたと考えられる。図9より高浸透、低浸透ともに大きな $ NO_{2}^{-} $ および $ NO_{3}^{-}-N $ 濃度の上昇は見られなかった。図10より、浸透水の $ NH_{4}^{+}-N $ 濃度は高浸透900系（Run9）で3回目以降の施肥で多く検出された。また低浸透系植栽無450 kg-N/haでも $ NH_{4}^{+}-N $ の浸透が見られた。図11より、浸透水の $ NO_{x}^{-}-N $ 濃度は2回目の追肥により植栽無し高浸透450系（Run7）、植栽有り高浸透900系（Run9）および植栽無し低浸透450系（Run8）に検出された。植栽無しの450 kg-N/haに硝酸態窒素の蓄積が見られたことから、イネによる $ NO_{x}^{-}-N $ の吸収もしくはイネ根圏の微生物による窒素除去が考えられた。また、植栽有り900 kg-N/ha（Run9）は窒素負荷が高負荷すぎるため、窒素除去が間に合わない可能性が考えられた。

図6 田面水アンモニア態窒素変化 (左:高浸透系、右:低浸透系)

図7 田面水硝酸態窒素変化（左:高浸透系、右:低浸透系）

図8 5 cm間隙水アンモニア態窒素変化 (左:高浸透系、右:低浸透系)
図9 5 cm間隙水硝酸態窒素変化 (左:高浸透系、右:低浸透系)

図10 浸透水中のアンモニア態窒素変化 (左:高浸透系、右:低浸透系)

図11 浸透水中の硝酸態窒素変化 (左:高浸透系、右:低浸透系)

## 3 ）各ポットにおける窒素収支地下への浸透量評価

植栽期間の実験結果から各ポットからの窒素収支を求めた。地下浸透量は高・低浸透系の平均浸透速度と流出水の無機態窒素濃度から地下へ浸透する窒素量を評価した。飼料イネによる窒素吸収量は、収穫した飼料イネより粉砕後、窒素含有量を分析した。土壌中の吸着態窒素は土壌から塩化カリウムにより窒素成分を溶出させることにより、評価した。表面水中の窒素濃度およびアンモニアガスの揮発量はヘンリーの式より算出した。残りの消失分を生物学的な脱室による寄与として評価した。各ポットの窒素収支を図12に示す。
A

図12 各ポットにおける窒素収支のまとめ（A:高浸透（1.74 cm/day）系；B:低浸透（0.42 cm/day）

窒素負荷100 kg-N/haでは飼料イネの吸収が非常に大きな割合を占め、特に低浸透系では収支が取れなくなってしまった。これは、CHN測定のばらつきの大きさに起因する。これ以降の議論は低浸透100 kg-N/haの系の考察は省くことにした。畜産排水由来の液肥の窒素負荷が増大すると、消失した窒素分が増大する傾向が確認できた。消失した窒素分を生物学的な脱室とみなしたとすると、植栽ありの窒素負荷450 kg-N/ha、900 kg-N/haの系では脱室による窒素除去の割合が高いことが示された。また、飼料イネの植栽により、高い窒素負荷対しても窒素化合物の地下への浸透を低減することができることが明らかになった。ただし、窒素化合物の地下への浸透は窒素負荷増大に伴い増加することが示されたため、900 kg-N/haといった高負荷での畜産排水由来の液肥供給は注意を要することが明らかになった。

## 4 ） $ ^{15} $ N トレーサー法による脱窒速度の実測

脱窒反応の生成物は窒素ガスであり、もともと大気に存在する窒素ガスと区別することが難しい。そこで、自然界の窒素のうち0.366%しかない $ ^{15} $ Nでマーキングした窒素化合物を利用し、脱窒速度、脱窒量の実測を行った。これまで行ってきたRun5（植栽有り、高浸透、窒素負荷450 kg-N/ha）およびRun6（植栽有り、低浸透、窒素負荷450 kg-N/ha）の系にて $ ^{15} $ Nで標識した模擬液肥を作成し、追肥として施肥させた。模擬液肥に用いた試薬は $ ^{15} $ N標識硫酸アンモニウム $ ^{15}(\mathrm{NH}_{4})_{2}\mathrm{SO}_{4} $ (>98 atom% $ ^{15} $ N)、グルコース、リン酸水素ニカリウムである。模擬液肥のpHは水酸化ナトリウム水溶液を加えてpH 8になるように調節した。実験で用いたポットヘ $ ^{15} $ Nで標識した硫酸アンモニウムを含む模擬液肥（ $ NH_{4}^{+}-N=2000\ mg/L $ , TOC=2500 mg/L, $ PO_{4}^{3-}-P=120\ mg/L $ ）を施肥すると、脱窒反応によって放出される窒素ガスは $ ^{15} $ Nを含んだ $ ^{29} $ N $ _{2} $ と $ ^{30} $ N $ _{2} $ が生成する。生成したガスをクローズドチャンバー法により採取して同位体質量分析装置（IRMS）で測定し、 $ ^{15} $ N存在比（ $ ^{29} $ N $ _{2} $ / $ ^{28} $ N $ _{2} $ と $ ^{30} $ N $ _{2} $ / $ ^{28} $ N $ _{2} $ ）の変化から脱窒速度を求めた。図12に $ ^{15} $ Nトレーサー法により測定した植栽期間中の脱窒速度の推移を示す。最大脱窒速度は高浸透系で1.04 g-N/m $ ^{2} $ /day、低浸透系で0.31 g-N/m $ ^{2} $ /dayと高浸透系の方が3.4倍高く、植栽期間を通して高浸透系の方が低浸透系より高い脱窒速度が得られた。これは高浸透系では土壤Ehが酸化的な状態と還元的な状態を繰り返しているために、酸化的状態で起こる硝化反応が促進され、脱窒速度が高くなったと考えられる。一方で、低浸透系では植栽期間を通して土壤Ehは還元的であり、硝化反応が起こりにくかったため脱窒速度が低くなったと考えられる。

また、脱窒速度は高浸透系で基肥後3週間、低浸透系で基肥後4週間に最も高い値を示し、高浸透系、低浸透系ともに基肥の脱窒速度が最も高い結果となった。図13の脱窒速度の測定結果から、
植栽期間を通しての積算脱室量を求めた。高浸透系の脱室量は17.16 g-N/m²、低浸透系の脱室量は4.35 g-N/m²であり、高浸透系で低浸透系より約4倍高い値となった。

図13 高浸透系・低浸透系のポットにおける飼料イネ植栽期間中の脱窒速度の推移

## 5 ）温室効果ガスの放出量評価

クローズドチャンバー法により気相中のガスをシリンジに採取し、温室効果ガス（$\mathrm{CH_{4}}$、$\mathrm{N_{2}O}$）のフラックスを評価した。高浸透および低浸透系における$\mathrm{CH_{4}}$のフラックスの推移を図14に示す。植栽有り100 kg-N/haの負荷の系（Run1およびRun2）では$\mathrm{CH_{4}}$放出のピークはほぼ見られなかったが、植栽有450、900 kg-N/haの系（Run5, Run6, Run9, Run10）では追肥を行った7月13日、8月12日の後に$\mathrm{CH_{4}}$生成フラックスのピークが見られた。これは、追肥の液肥に含まれる有機物により、土壤中の微生物の活性が上がり酸素を消費し、土壤が嫌気的になった際に$\mathrm{CH_{4}}$が生成される可能性を示唆している。各ポットから放出される$\mathrm{N_{2}O}$フラックスの推移を図15に示す。特徴とすべき点として、ポットから水を抜いて乾燥状態にする中干しの期間（7月27日-8月3日）においてどのポットからも$\mathrm{N_{2}O}$のフラックスが大幅に増大する結果が得られた。これは、中干しすることによる土壤中への酸素供給が起こり、硝化の過程により$\mathrm{N_{2}O}$が放出している可能性を示唆するものである。以上より、液肥の供給管理・水管理が$\mathrm{CH_{4}}$、$\mathrm{N_{2}O}$の放出量に大きく寄与していることが明らかになった。

図14 植栽有りの高・低浸透系における $ CH_{4} $ 放出（H：高浸透；L：低浸透、数値は窒素負荷を示す。）

図15 植栽有りの高・低浸透系における $ N_{2}O $ 放出（H：高浸透；L：低浸透、数値は窒素負荷を示す。）
最後に温室効果ガスの放出量を二酸化炭素基準に変換した比較を図16に示す。温室効果係数は$\mathrm{CH}_{4}$が$\mathrm{CO}_{2}$の21倍、$\mathrm{N}_{2}\mathrm{O}$が$\mathrm{CO}_{2}$の310倍としてそれぞれ計算した。高浸透および低浸透に関わらず窒素負荷の増大は温室効果ガスの放出量増大に正の相関がみられた。高浸透系の温室効果ガスの放出量は低浸透系に比べて約40-60%であり、温室効果ガスの削減が期待できることが示された。また、各ポットからの温室効果ガス全量の89-97%が$\mathrm{CH}_{4}$であり、$\mathrm{CH}_{4}$による温室効果が最も顕著であることが明らかになった。

図16 高浸透系と低浸透系における温室効果ガス（CO₂eq）の比較

（H：高浸透；L：低浸透、数值は窒素負荷（kg-N/ha）を示す。）

## 6 ）脱窒およびAnammox活性評価（平成23年度）

どちらの日付およびどの部位においてもAnammox活性は検出されない結果になった。この結果は、脱窒細菌による従属栄養脱窒、もしくは脱室性メタン酸化細菌による脱窒が行われていることを示唆する結果である。また、各系は2検体実験を行っており、再現性はとれている。したがって、本水田土壌においてAnammox細菌によるAnammox活性は非常に低いということが示された。

脱窒活性を図17にまとめた。Aは2011年2月（落水状態）、Bは2011年10月（湛水状態）を示す。落水の場合は、土壌表面は酸素に触れるため、好気的であり、脱窒活性が深層の方が高くなっていることを示唆している。一方で、湛水状態は土壌表面に水がはっているため、土壌表層も嫌気状態が保たれていると考えられる。土壌深部には窒素化合物が枯渇しているため、深層に行くにつれて低い脱窒活性であることが示唆された。

脱室速度 [nmol/g-soil/h]

図17 四重極型ガスクロマトグラフィーによる脱窒活性（A：2011年2月、B:2011年10月）

## 7 ）脱窒およびAnammox活性評価（平成24年度）

平成24年度も昨年度同様に表7に示す#1の水田土壌を上述した活性試験に供したが、Anammox活性は検出されなかった（データ示さず）。この結果は昨年度と変わらず、脱室細菌による従属
栄養的な脱窒、脱窒性メタン酸化細菌による脱窒が行われていることを示唆する結果である。また、各系は2検体実験を行っており、それぞれの測定結果の再現性はとれている。したがって、本申請課題で行っている水田圃場の土壌においてはAnammox細菌によるAnammox活性は非常に低いということが示された。

一方、水田土壌（#2）においては、高いAnammox活性が検出された。図18に各深さおよびAnammox・脱窒反応活性のプロファイルを示す。最も温度が低い2月において、Anammoxおよび脱窒活性が他のサンプリング時と比較して高くなっている点が不可解であるものの、どの底質深さおよび季節によってもAnammoxの活性が検出された。また、Anammox反応は特に田面水表層に近い環境において活性が高く、一方で、脱窒活性は、2月の場合は4-6 cm以降の深さにおいて活性が大きくなること、6月および10月においては水田土壌の深さ方向に対して大きな変化は見られないことが確認された。どの季節および水田深さにおいても、Anammox活性は脱窒活性を上回ることはなかったが、Anammoxの反応の寄与は#1の水田土壌と比較すると明らかに高いことが確認できた。Anammox反応が窒素除去に及ぼす寄与の割合を図19に示す。特に、Anammox反応による窒素除去への寄与は特に水田表層において5%~38%程度であった。このような高いAnammox活性は現場環境のアンモニア・硝酸濃度に依存する。実際に#2の水田は隣接する丘陵地に茶園があることにより、大量の肥料（アンモニア）が亜硝酸・硝酸により水田に流れ込む。これによりAnammox活性が高いことが考えられる。以上の結果より、水田のAnammox活性は水田の管理方法および場所によっても大きく異なることが明らかになった。

図18 谷津田水田土壌（#2）の底質深さ方向でのAnammoxおよび脱窒反応活性

図19 谷津田水田土壤（#2）の底質深さ方向でのAnammox反応の窒素除去の割合(%)