Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
表 31 2011 年度 現場実験スケジュール

日付	水田管理
6/8	移植
7/22	1回目追肥
7月下旬	水管理開始
8/18	2回目追肥
9/12	3回目追肥
9月下旬	落水開始
11/2	收穫

表 32 サンプルデータ

サンプリング日	深さ[cm]	累積 窒素負荷[kg-N/ha]
2011/6/8
(植栽前)	0-2、6-20	50
2011/7/21
(1回目追肥前)	0-2、6-20	50
2011/8/4
(2回目追肥前)	0-2、6-20	150
2011/9/12
(3回目追肥前)	0-2、6-20	350
2011/9/27
(3回目追肥後)	0-2、6-20	600 (3回分)

表 33 PCR 条件

PCR反应条件

Temperature [ $ ^{\circ} $ C]	Time [min:sec]
Pre-heating	94	02:00
Denature	94	00:30	40 cycle
Annealing	64.5	00:30
Elongation	72	00:20
4	$ \infty $

Master Mix	10 $ \mu $ l
milliQ	4 $ \mu $ l
193F	0.5 $ \mu $ l
616R	0.5 $ \mu $ l
鋳型DNA	5.0 $ \mu $ l
全量	20 $ \mu $ l

## 4 ）圃場実験による畜産排水処理とメタンをめぐる微生物群の定量

## ① 実験系とサンプル

平成23年度に実施した実験圃場における畜産排水処理試験において、常時湛水管理および中干し管理を実施し、その際のメタン削減性能の検討を行ってきた。窒素除去に関してどちらの条件においても大きな差は見られなかったものの、温室効果ガス、特にメタンガスの発生量に大きな違いがみられた。そこで、メタン発生量の違いの影響因子として各水田土壌における微生物群の定量評価を行い、中干しによるメタン生成・消費に関わる土壌微生物群への影響を評価した。

## ② 実験圃場の管理方法

茨城県つくば市にある農業環境技術研究所の圃場にてフィールド実験を実施した。試験圃場は、 $ 40\ m^{2} $ を1つの区画とした。温室効果ガス排出における中干しの影響を調査するために、「常時湛水」「中干し」の2つの実験系を設定した。施肥管理および水管理を含む水田管理スケジュールを表34に示す。全ての試験圃場で追肥は計3回実施した。3回の追肥による窒素負荷を表35に示す。
中干し期間は畜産排水を1回目追肥と2回目追肥の間の7月26日から7月22日の8月17日に設定した。実験期間は飼料イネの栽培期間である6月8日（移植後日数（Days After Transplanting（DAT）0日目）から11月2日までの147日間であった。

表34 飼料イネ水田管理スケジュール

Field management	Date	DAT (days)
基肥	5月26日
代办き	5月26日、6月3日
移植	6月8日	0
1回目追肥（1st LCW）	7月22日	44
中干し開始	7月26日	48
中干し終了	8月17日	70
2回目追肥（2nd LCW）	8月18日	71
3回目追肥（3rd LCW）	9月12日	96
最終落水開始 $ ^{*1} $	8月初旬
収穫	11月2日	147

*1 最終落水期間中、灌漑は行わなかったが、降雨の関係により水位が上昇した。

表35 3回の追肥による窒素負荷（ $ NH_{4}^{+}-N $ ）量

$ NH_{4}^{+}-N $ loading [kg-N ha^{-1}]
Basal	1回目追肥	2回目追肥	3回目追肥	合計
常時濫水	50	53	114	168	385
中干し	50	53	114	168	385

## ③ 测定方法

中干しによるメタン削減効果およびメタン生成・消費に関わる土壌微生物群への影響調査するための調査項目を表36に示す。

表 36 测定項目一覽

サンプル	分析項目	分析方法
ガス	メタンガスフラックス	GC/FID
土壌	土壌吸着体窒素濃度	イオンクロマトグラフィー
有機炭素濃度	TOC
土壌溶存メタン濃度	GC/FID
土壌中微生物遺伝子コピー数	Real time PCR
水	酸化還元電位	酸化還元電位計
表面水水位	自動水位計

## ④ ガスサンプリング

ガス採取は、クローズドチャンバー法により行われた。直径30 cm、高さ30 cmの円筒型アクリル製ベースを飼料イネが1株入るよう、土壌に深さ5 cm程度差し込み、安定のために1時間放置した。その後直径30 cm、高さ100 cmのアクリル製チャンバーをベースにかぶせ、密閉状態とした。
ベースとチャンバーの接続部分にシリコンゴムを敷き、クリップで挟むことで密閉状態を保つようにした。チャンバーにはガス採取のための三方コック、気圧調節用の1 Lテドラーバッグ（東京硝子）、温度計およびチャンバー内部を完全混合にするためのファンが付いている。チャンバーをベースにかぶせて密閉直後（0 min）、10 minおよび20 min後に50 mlシリンジによって内部の気体を採取し、予め真空にしておいた30 mLガスクロバイアル（SVG-30，日電理化硝子製）に注入保存した。ガス採取時，同時に深さ5 cmの土壌に設置した白金電極と。酸化還元電位計（PRN-41型，藤原製作所製）により土壌中の酸化還元電位（Eh）を測定した。

## ⑤ メタンガスフラックス測定

採取したガスサンプルは $ CH_{4} $ 濃度の測定に供した。 $ CH_{4} $ 濃度は水素炎イオン化型検出器付きガスクロマトグラフィー（GC-14B，Shimadzu）、 $ N_{2}O $ 濃度は電子捕捉型検出器付きガスクロマトグラフィー（GC-14A，Shimadzu）により測定した。

$ CH_{4} $ フラックスは，チャンバーの密閉時間における，内部の濃度変化速度から以下の式により計算した。

$$ F=\frac{\triangle C}{\triangle t}\times\frac{V}{V_{_{0}}}\times\frac{T_{_{0}}}{T}\times M\times\frac{1}{A} $$

ここで，F: フラックス $ [g\cdotm^{-2}\cdoth^{-1}] $ ， $ \Delta C/\Delta t $ : チャンバー内濃度変化速度 $ [ppmv\cdoth^{-1}] $ ，V: 密閉体積 $ [m^{3}] $ ， $ V_{0} $ : 標準状態で理想気体1 molが占める体積 $ 0.0224\ m^{3}\cdotmol^{-1} $ ， $ T_{0} $ : 273 [K]，T: チャンバー内温度 [K]，M: モル質量 $ [g\cdotmol^{-1}] $ ，A: チャンバー断面積 $ [m^{2}] $ である。

## ⑥ 土壌サンプリング

土壌サンプリングには2種類の土壌コアサンプラーを土壌の状態によって使い分けた。ライナー採土器（大起理化工業）は直径5.5 cm、深さ20 cmのコアサンプルを採取可能であり、より少量でよい場合は直径2 cm、深さ10 cmのコアサンプラーを用いた。土壌サンプリングは採取位置による偏りを防ぐため、流入水側よりおおよそ2.5、5.0、7.5 cmに位置する3点から毎回ランダムに採取した。

## ⑦ 土壤吸着能窒素 $ \left(NH_{4}^{+}-N,\ NO_{2}^{-}-N,\ NO_{3}^{-}-N\right) $ 濃度，有機炭素濃度（DOC）測定

土壌コアサンプルに含まれる吸着態窒素は、風乾後2.0 mmのふるいにかけて植物残渣等を除いたあとに、KCl溶液により抽出した。抽出液を濾過した後にイオンクロマトグラフィーにて無機態窒素濃度を測定し、単位乾燥土壌当たりに含まれる吸着態窒素量を求めた。また有機炭素濃度は、濾過後KCl抽出液をTOC計（TOC 5000A, Shimadzu）により分析した。

## ⑧ 土壤溶存メタン濃度測定

土壌に溶存しているメタンの抽出操作の一連の流れを図31に示す。50 mlガスクロバイアルにサンプル土壌、 $ N_{2} $ 曝気水20 mlおよび塩化水銀溶液0.3 mlを入れた後、スラリー状になるまで良く振とうした。振とう後は1時間静置し、ヘッドスペースのガスを三方コック付きシリンジで10 ml採取し、真空3 mlバイアルに保存した。保存したガスはGC/FIDでメタン濃度を分析した。
図 31 水田土壌中の温室効果ガス抽出方法

## ⑨ DNA抽出

各実験圃場の2.5、5.0、7.5 cm地点から土壌コアをサンプリングし、0-2、2-4、4-6 cm深さに切断した後、3地点のコアサンプルを完全に混合した状態でDNA抽出まで-20℃にて冷凍保存した。抽出には市販の環境試料用DNA抽出キットExtrap Soil DNA Kit Plus ver.2（日鉄環境エンジニアリング株式会社）を使用した。DNAは滅菌水にて抽出し、使用まで-20℃にて冷凍保存した。

## ⑩ 定量PCR

各微生物の遺伝子コピー数定量はCFX96リアルタイムPCRシステム(Bio-Rad社)によるreal time PCRによって行った。用いたプライマーセットを表37に示す。また各プライマーセットに対する定量PCR反応条件を表38に示す。

表 37 使用したプライマーセット

Target gene	Primer set	Primer sequence (5'-3')
メタン菌	mcrA	mlas	GGGTGGGTMGGDTTCACMCARTA
mcrA-rev	CGTTCABGCGTAGTTVGGRTAGT
メタン酸化細菌	pmoA	A189F	GGNGACTGGGACTTCTGG
Mb661R	CCGGMGCAACGTCYTTACC
NC10門細菌	16S rRNA	193F	GGRGGAYCAAAGGGGGCGAG
616R	ACGCGGRTCCTCGGTTRAGC

$ ^{*} $ M = A/C, D = A/G/T, R = A/G, B = G/C/T, V = A/G/C, N = A/T/G/C, Y = T/C

表 38 PCR 条件

反应条件	反应液组成
Temperature [°C]	Time [min:sec]	SsoFast™ EvaGreen Supermix (Bio-Rad社)	10 μl
Pre-heating	94	05:00	milliQ water	4 μl
Denature	94	00:25	40	193F
Annealing	65 (mlas-mcrA-rev) 65 (A189F-MB661R) 64.5 (193F-616R)	00:30	cycle	616R
Elongation	72	00:45	鋳型DNA	5.0 μl
Melt curve step	65-95 0.5℃/0:05	全量	20 μl
4	∞
## ⑪ 土壤酸化還元電位 (Eh)

予め深さ1 cm，5 cmの位置に挿入した土壌Eh測定用の白金電極（EP.201型，藤原製作所株式会社製）およびポータブル酸化還元電位計（PRN.41型、藤原製作所株式会社製）に接続された比較電極を土壌に挿入することにより定期的に測定した。

## ⑫ 表面水水位

水田表面水の浸透および蒸発散による水位低下を把握するため、飼料イネ移植時に水位計（HIOKI 3635，日置電機）を小区画内のほぼ中央に設置した。また、蒸発散量を把握するために、小区画外に現場土壌を充填し、飼料イネを植栽した箱を設置し、水位計をその中央に設置した。

## 4 ．結果及び考察

## 1 ）リアルタイム定量PCRによる土壌に棲息する微生物群の定量

リアルタイム定量PCRによる各飼料イネ植栽ポットにおけるPlanctomycetes門細菌の相対値を図32に示す。増減の傾向を正確に把握するために、植栽開始の際のPlanctomycetes門の細菌数を1とした。上部土壌の高浸透系植栽を有する系で、3回目追肥後に細菌数が増加し十倍以上になっていることが確認された。一方、土壌下部では高浸透450 kg-N/ha系を除く全ての系で土壌中のPlanctomycetes門が減少傾向にあった。また、低浸透系は高浸透系と比較して細菌数の減少が大きく、特に植栽のある系においては顕著であった。微量酸素が存在する高浸透系では硝化が起こりやすく、nammox細菌を含むPlanctomycetes門が増加したということが考えられる。定量したPlanctomycetesがAnammox反応を担う機能を有していると仮定すると、硝化反応で生成した亜硝酸を反応基質として利用し、菌体の増殖を行ったということの裏付けとなる。これらの定量結果から少なくとも高浸透系および田面水に近い作土層において酸素の供給が進み、窒素除去能の向上とAnammox細菌が属するPlanctomycetes門の菌体数の増大の相関関係が見出すことができた。追肥3回目の後（9月23日）の土壌上部（2 cm）における脱窒に関与する遺伝子を有する細菌（脱窒細菌）とPlanctomycetes門の細菌群の定量結果を図33に示す。高浸透・植栽無しの系は同じ浸透速度で植栽有りの系と比べてどちらの細菌数が少ないことが確認された。これにより、飼料イネを植栽することで、土壌に存在できる脱窒を担う微生物群を高密度に保持できることが明らかになった。具体的には、同じ水の浸透速度、窒素負荷において植栽の有無を比較すると、植栽有りの系ではPlanctomycetes門の細菌数は4.5倍、脱窒細菌数は24倍も存在量が多いことが明らかになった。次に、水の浸透速度の違いにより、高浸透の系がPlanctomycetes門の細菌数は3.3倍、脱窒細菌数は2.1倍多いことが確認された（窒素負荷450 kg-N/haの系）。この結果は図12の $ ^{15} $ Nトレーサー試験で得られた高浸透系の方が最大脱窒速度で3.4倍高い結果（1.04 g-N/m²/day vs. 0.31 g-N/m²/day）に概ね一致する。また、脱窒細菌に対するPlanctomycetes門に属する細菌の割合は5-25%程度であることが明らかになった。植栽の有無、浸透速度、窒素負荷に関してこの割合の傾向は得られなかった。
図32 (A) 土壤上部（2cm）および (B) 深部（10 cm以深）のPlanctomycetes門の細菌数の相対変化

図33 脱窒細菌およびPlanctomycetes門に属する細菌群の存在量の比較

## 2 ） 蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）法によるイネ根圏の微生物の可視化

クライオミクロトームにより作製したイネの切片の光学顕微鏡による断面図を図34に示す。土壌粒子が含まれたサンプルにおいては切片の作製が困難であると考えられてきたが、今回のイネ根圏ではイネ組織の大きな破壊もなく断片の作製ができた。FISH法によるイネ根圏における微生物細胞の検出結果を図35に示す。イネ根圏において微生物群が棲息することが確認された。また、青-紫色で示す好気性アンモニア酸化細菌が比較的イネの根近傍に検出された。イネは大気中から酸素を取り込み、根圏へ供給することが示唆されているため、これらの細菌はイネの根から酸素を獲得し、アンモニアを亜硝酸に変換している可能性が考えられる。Anammox細菌はわずかであるがピンクに検出している部分があり（図35の白丸の部分）、これらの細菌がアンモニア酸化細菌により酸化された亜硝酸を用いて窒素ガスに変換する可能性が考えられる。

図34 実水田のイネ根圏の断面図（左上および右端の大きな。は混入した泡を表す）

図35 FISH法による実水田のイネ根圏に棲息する微生物群の可視化（青-紫：β-プロテオバクテリアに属するアンモニア酸化細菌、ピンク：Anammox細菌、緑：その他の細菌）
## 3 ）実験圃場における脱室性メタン酸化細菌の定量（平成23年度）

サブテーマ2で開発した新規PCRプライマー193f-616rの検量線およびサンプルの融解曲線の結果を図36に示す。

Log Starting Quantity

Temperature, Celsius

図 36 検量線の結果および融解度曲線

融解度曲線は同一融解温度において単一のピークとなり、PCR産物が特異的である、すなわち脱室性メタン酸化細菌由来のDNAが増幅されていることを示した。この定量結果を図37-38に示す。

sampling DATE

図 37 NC10 門に帰属する脱室性メタン酸化細菌の定量結果（灌溉間隔 3 日に 1 回）

図 38 NC10 門に帰属する脱窒性メタン酸化細菌の定量結果（灌溉間隔 6 日に 1 回）

## ① 各土壌深さのNC10門細菌数：

図37-38から、灌溉の頻度を変えた実験系の間で脱室性メタン酸化細菌の大きな違いは見られなかった。また、1回目追肥以降において6-20 cmの土壌深さが深い方で脱室性メタン酸化細菌に帰属するNC10門細菌数が高い結果がみられた。これは、脱室性メタン酸化細菌がメタンを資化するため
め、メタン発生がより顕著に起こると考えられる深層部にアバンダンスが高くなるという可能性が考えられる。各水田土壌深さ方向のメタンフラックスを示したものを図39に示す。CH_{4}濃度分布は深い方でより高い濃度を示しており、また好気/嫌気的環境であることから、より下層でNC10門細菌の活性があることが予想される。

Days after transplanting (day)

図 39 2 回目および 3 回目追肥後における土壤中 CH_{4} 濃度分布 (a: S600; b: L600)

② 水田管理方法による違い：

図40に示すように、土壌中CH_{4}濃度はS系とL系で大きな差が見られたが、NC10門細菌数の違いは1～2倍程度の範囲に収まり、特に大きな違いは見られなかった。

③ NC10門細菌数変動について：

植栽期間を通じ、植栽前からの菌数は最大で約4倍と大きな変動は見られなかった（図40）。水田からのCH_{4}排出挙動に関しては、S600系の方が高い放出速度、また計3回の追肥後では3回目の追肥後の放出速度が最大、などといった違いが見られた（図41）。しかし、今回の結果では、メタン放出速度に見られるような変化・違いは細菌数に関しては確認できなかった。

図40 NC10門に帰属する脱室性メタン酸化細菌の相対値

Days after LCW application

図41 水田からのメタンフラックスの経日変化（LCWは畜産排水由来の液肥を意味している）
4）実験圃場におけるメタンをめぐる微生物群のポピュレーションダイナミクス（平成23年度）常時湛水と中干し系で2回目追肥、3回目追肥をはさんだDAT 70 dayと111 dayの機能遺伝子mcrA、pmoA、NC10（16S rRNA遺伝子）のコピー数を、0-2 cm、2-4 cm、4-6 cm土壌深さごとに比較した結果を図42-44に示す。これらの結果をまとめると、以下のようになる。

・mcrAは水管理に関わらずLCW後に10倍程度減少した。mcrA（メタン生成菌の有する機能遺伝子）は3回の畜産排水（LCW）施肥により、10倍程度減少した。これは畜産排水に含まれるアンモニアが高濃度に入ることに起因する。アンモニアは土壤表層において亜硝酸・硝酸に酸化される。この窒素酸化物を電子受容体として土壤中の脱室細菌が利用することで、脱室が行われる。このときの電子供与体はLCWに含まれる有機物および土壤に存在する有機物であるため、メタン生成古細菌が有機物獲得競合に敗れた結果である可能性が考えられる。

・常時湛水系で pmoA（メタン酸化細菌の有する機能遺伝子）は LCW 後に減少する傾向が見られた。対して中干し系では、LCW 後でも維持あるいは増加する傾向にあった。この様子は 0~2 cm よりも 2~6 cm でより顕著に見られた。中干しは、水を水田から引き抜くことにより、水田土壤を好気的にする。これにより、水田土壤中の酸素濃度が高くなることにより、メタン酸化可能なメタン酸化細菌が増殖したことが考えられる。水田土壤深さ 2-6 cm においてその傾向が顕著に示された一方で、0-2 cm においてその傾向はあまり得られていない。これは畜産排水に含まれる有機物を酸化分解に利用する従属栄養性細菌の増殖が関与しているものと考える。

· NC10門の16S rRNA遺伝子はmcrA、pmoAといった機能遺伝子の量と比較して同程度、あるいはそれ以上のcopy数で存在した。NC10門に帰属する脱室性メタン酸化細菌の量は他のメタンに関与する細菌群と同じオーダーで存在することが初めて明らかになった。これらの細菌群は増殖速度が2週間程度と非常に遅いことが報告されているが、予想を上回る量の脱室性メタン酸化細菌が棲息することが明らかになった。したがって、水田の環境状況を制御することにより、脱室とメタン酸化を同時に達成するこのNC10門細菌のポテンシャルを活かすことが可能になると推察される。

図420-2 cm土壤中の2nd,3rd LCW前後のコピー数変化

(中干し系は48-70日目に水を引き抜いている)
2-4cm 常時濫水

図43 2-4 cm土壤中の2nd, 3rd LCW前後のコピー数変化

(中干し系は48-70日目に水を引き抜いている)

図44 4-6 cm土壤中の2nd, 3rd LCW前後のコピー数変化

(中干し系は48-70日目に水を引き抜いている)

## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

イネ植栽ポットの土壤中のAnammox反応を担うPlanctomycetes門に属する細菌は窒素負荷が高い方がより多く棲息可能であること、さらに土壤上部2 cm付近において密度が高いことを示唆した。土壤中のAnammox反応が起こり得る箇所を絞り込むことが出来たことは学術的に意義がある成果である。また、水の浸透速度もこれらの細菌群の増減に大きな影響を及ぼしており、水の浸透速度の増大が土壤中への酸素の供給を促進しており、土壤中の酸化・還元状態が脱室を行う微生物群の密度の増大に大きく貢献することを示していることも学術的に価値のある成果と言える。

DAT 111 [day]の中干し系では、メタン消費に寄与するメタン酸化細菌（pmoA）や脱室性メタン酸化細菌がメタン生成古細菌よりも有意に多く存在し、常時湛水系に比べメタン削減に有利な微生物叢を形成していたと推察される。すなわち、中干しという操作が、メタンを消費する微生物群の数を増やし、水田の温室効果ガス（メタン）の削減に寄与できる可能性を示唆した。
## （２）環境政策への貢献

＜行政が既に活用した成果＞

該当項目はなし。

## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

サブテーマ3のみの結果では環境政策に対する提言を行うことは困難であるが、今回の特定微生物群の定量手法を平成23年度から実施する圃場における水田土壌サンプルに適用することにより、 $ N_{2}O $ および $ CH_{4} $ 放出量、畜産排水除去特性とリンクさせる。さらに、運転管理条件と窒素除去に関与する微生物群の定量結果より、脱窒に関連する微生物群の制御が低温室効果ガス放出型畜産排水除去システムの構築のカギとなることを示し、一つの有用な畜産排水処理法として普及出来る段階まで研究を進めることができれば、行政に対しての一つのアピールになると考えている。

### 6. 国際共同研究等の状況

特に記載すべき事項はない

### 7. 研究成果の発表状況

（1）誌上発表

<論文（査読あり）>

A. TERADA, S. ZHOU and M. HOSOMI: Clean Technol. Environ. Policy 13, 6, 759-781

“Presence and detection of anaerobic ammonium-oxidizing (anammox) bacteria and appraisal of anammox process for high-strength nitrogenous wastewater treatment: A review”

S. ZHOU, Y. SAKIYAMA, S. RIYA, X.F. SONG, A. TERADA and M. HOSOMI: Sci. Total Environ. 430, 93-100.

“Assessing nitrification and denitrification in a paddy soil with different water dynamics and applied liquid cattle waste using the N-15 isotopic technique”

<査読付論文に準ずる成果発表>

特に記載すべき事項はない

くその他誌上発表（査読なし）>

特に記載すべき事項はない

（2）口頭発表（学会等）

特に記載すべき事項はない

（3）出願特許

特に記載すべき事項はない
（４）シンポジウム、セミナーの開催（主催のもの）

特に記載すべき事項はない

（５）マスコミ等への公表・報道等

特に記載すべき事項はない

(6) その他

特に記載すべき事項はない

### 8. 引用文献

Amann (1995): In Akkermans ADC, van Elsas JD, de Brujin FJ (editors) Molecular Microbial Ecology Manual. Dordrecht (1995): pp 1-15.

Henry et al. (2004): J. Microbiol. Meth. 59: 327-335.

Neef et al. (1998): Microbiology-UK 144: 3257-3266.
(4) 水田への施肥量と窒素除去能ならびに微生物の多様性、温室効果ガス放出の評価に関する研究

東京農工大学 大学院工学研究院 応用化学部門 細見・寺田研究室

寺田昭彦

周勝

平成22～24年度累計予算額：531千円

（うち、平成24年度予算額：219千円）

予算額は、間接経費を含む。

[要旨] 飼料イネ水田において、前半低負荷、後半低負荷、中干しと施肥前落水という異なる施肥管理、水管理を組み合わせた圃場実験を行った結果、中干しよりも施肥前落水の方でメタン抑制効果が高くなる傾向が得られた。またメタン削減が最大となったのは後半低負荷／施肥前落水系で削減率は77%であった。また圃場実験および培養実験から、メタン酸化古細菌（mcrA）は施肥前落水によっては阻害されることが示された。また、メタン酸化古細菌mcrAコピー数はメタンフラックスとの相関性があることから、施肥前落水でメタン生成を担う微生物群の活性を抑制することで、メタンフラックスの削減が期待できる。以上の結果をまとめると、中干しや施肥前落水といった水管理は土壌に酸素を供給することで、メタン生成、消費に関わる微生物群の存在数、比を変化させ、メタン、排出量が削減する効果があることが示された。また、水管理は特にメタン生成古細菌の働きを抑制する効果が高いと考えられる。

[キーワード] 飼料イネ水田、水管理、施肥、閉鎖性水域、底質、DO、貧酸素水塊、貧栄養化

### 1. はじめに

これまでのサブテーマにより、特に畜産排水の処理とともに温室効果ガスの削減も重要であることが検討されてきた。特に、水田土壌の酸化・還元の度合により、畜産排水の液肥に含まれる窒素の除去効率や、亜酸化窒素やメタンなどの温室効果ガスの削減に影響を及ぼすことが明らかになってきている。そこで、これまでの知見を集約することで、畜産排水処理の場である水田の酸化・還元の状況をダイナミックに変化させることにより、窒素除去性能を維持するとともに、温室効果ガスの削減に貢献できるのではないかと考え、茨城県つくば市にある実験圃場を用いることにより、検討を行った。

### 2. 研究開発目的

平成23年度の調査により、中干しによるメタン削減効果の評価および土壌微生物群への影響の結果から、中干しという水田の表面水管理にメタン抑制効果がある可能性が示唆された。水田からのメタン発生ピークは施肥後に観察されており、施肥前に落水を行うことがより効果的なメタン抑制につながると考え、実験圃場において施肥前に約2週間程度の落水期間を設ける「施肥前落
水」管理を実施、その際のメタン削減効果およびメタン生成・消費に関わる土壌微生物群への影響調査を目的とした。

### 3. 研究開発方法

1）新しい水田管理法を考慮した実験系

2012年茨城県の独立行政法人農業環境技術研究所の圃場にてフィールド実験を実施した。これまでの畜産排水処理のための水田管理において、以下の項目が確認されている。

畜産排水の液肥を施肥した水田により窒素除去を 500 kg-N/ha 程度まで行うことが可能

ただし、500 kg-N/ha 以上の負荷で窒素化合物（アンモニア＋硝酸）の水圈環境への流出が顕在化

➢ 温室効果ガスとして水田から排出される温室効果への寄与は窒素負荷 600 kg-N/ha 以下の場合、9 割以上がメタンガス（亜酸化窒素は 10% 以下）

中干しによりメタンガスの放出を抑制可能である。これは土壌が好気性になることにより、嫌気的に形成されるメタンの放出が抑制できるから。

➢ 施肥によりメタンガスの放出

飼料イネの成長が進まなくなる中干し以降は、窒素の取り込み量が少なくなる。

以上の観点から、追肥を行う前に、土壌を好気的にする「施肥前落水」およびイネ栽培の後半部分において畜産排水の施肥量を減少させる「後半低負荷」の2つの検討を行い、温室効果ガスの削減を目指した（図45）。

図45 新しい水田管理方法「施肥前落水」の概要

## 2 ）実験系の設計

試験圃場は、 $ 40\ m^{2} $ を1つの区画とした。温室効果ガス排出における施肥管理および水管理の影響を見るため、「前半低負荷・中干し（慣行の落水）」「前半低負荷・施肥前落水」「後半低負荷・中干し（慣行の落水）」「後半低負荷・施肥前落水」の4つの実験系を設定した。施肥管理および水管理を含む水田管理スケジュールを表39に示す。全ての試験圃場で追肥は計3回実施し、3回の追肥による窒素負荷および溶存有機炭素（DOC）濃度を表40、表41に示す。施肥方法の前半低負荷施肥は、1回目追肥の負荷量を最も低く設定し、2回目追肥、3回目追肥で段階的に負荷を高くして行った。一方で、後半低負荷施肥はその逆の負荷量設定で実施した。水管理である施肥前落水は、1回目追肥前の6月14日から6月28日までの14日間を1回目施肥前落水、2回目追肥前の7月12日から7月25日までの13日間を2回目施肥前落水、3回目追肥前の8月7日から8月22日までの15日間を3回目追肥前落水と、2回目追肥前の8月7日から8月22日までの15日間を3回目追肥前落水とともに、2回目追肥前の8月7日から8月22日までの15日間を3回目追肥前落水とともに、2回目追肥前の8月7日から8月22日までの15日間を3回目追肥前落水とともに、2回目追肥前の8月7日から8月22日までの15日間を3回目追肥前落水とともに、2回目追肥前の8月7日から8月22日までの15日間を3回目追肥前落水とと
回目施肥前落水として実施された。中干し期間は1回目追肥と2回目追肥の間の7月12日から7月22日の10日間に設定した。実験期間は飼料イネの栽培期間である5月23日（移植後日数（Days After Transplanting（DAT））0日目）から10月12日までの142日間であった。

表 39 飼料イネ水田管理スケジュール

環境	DATE	DAT [day]
移植	5月23日	0
1st施肥前落水開始（A5,A7）	6月14日	22
1回目追肥	6月29日	37
中干し(A6,A8)、2nd施肥前落水（A5,A7）開始	7月12日	50
中干し終了（A6,A8）	7月22日	60
2回目追肥	7月26日	64
3rd施肥前落水開始（A5,A7）	8月7日	76
3回目追肥	8月23日	92
最終落水開始	9月6日	106
稲刈り	10月12日	142

表 40 3 回の追肥による窒素負荷量 $ (\mathrm{NH}_{4}^{+}-\mathrm{N} $ ベース)

NH4+-N loading [kg-N ha-1]
1回目追肥	2回目追肥	3回目追肥	合計
前半低负荷系	20.5	101	123	244
後半低负荷系	82.1	101	30.8	214

表 41 3 回の追肥により施肥された溶存有機炭素（DOC）負荷

DOC-C loading [kg-C ha^{-1}]
1回目追肥	2回目追肥	3回目追肥	合計
前半低负荷系	54.2	170	176	400
後半低负荷系	217	170	44.1	430

## 3 ）测定方法

測定項目および測定方法に関してはサブテーマ3の4）の項目と同じ方法で行った。亜酸化窒素のフラックスおよび溶存濃度においてはメタンと同じ方法・解析を用いて評価した。

## 4 ．結果及び考察

## 1 ）土壤Eh

栽培期間中（DAT 0~142 [day]）の深さ1 cm、5 cm、8 cmの土壌Ehの変動を図46に示す。施肥前落水を行った系（A、C）に関しては、落水敢行後に土壌環境が好気的になるため、土壌Ehの上昇が確認された。
図46 栽培期間の深さごとの土壌Eh

(A) 前半低负荷・施肥前落水 (B) 前半低负荷・中干し

(C) 後半低負荷・施肥前落水 (D) 後半低負荷・中干し

## 2 ）飼料イネ水田における窒素化合物の除去性能

栽培期間中（DAT 0~142 [day]）の間隙水（深さ20 cm）における窒素化合物の濃度を図47に示す。どの系においても水田土壌深層部の間隙水の窒素濃度は40日目前後における上昇を除けば未検出レベルであり、現状の畜産排水の施肥の負荷（300 kg-N/ha）であれば、地下水への窒素化合物の浸透による地下水汚染は問題ないことが示唆された。

図47 各実験圃場系における窒素化合物の水質変化

## 3 ）メタン削減効果

前半高負荷施肥の初回施肥後のメタンフラックスを図48、後半低負荷施肥の施肥後のメタンフラックスを図49に示す。また LCW1週間後の土壌溶存メタン濃度の前半低負荷系の結果を図50、後半低負荷系の結果を図51に示す。
これらの結果をまとめると、以下のことが示された。

➢ メタンフラックスの結果（図 48、図 49）から、後半低負荷系では施肥前落水によるメタン削減効果が認められた。しかし、前半低負荷系では施肥前落水の方がメタンフラックスが高い。しかし総排出量では、施肥負荷量によらずメタン削減効果があった。この点に関しては原因の解明が今後必要である。

土壌溶存メタン濃度では、施肥方法に関わらず施肥前落水によるメタン発生抑制効果がみられた。

総排出量では、「後半低負荷系・施肥前落水」が最もメタン排出量削減に有効であることが示された。その排出量は水管理の違いにより（施肥前落水と中干し系）、総量として84%のメタン削減効果が表れた（データ示さず）。これに亜酸化窒素を加え、排出係数（メタンは$\mathrm{CO}_{2}$の25倍、亜酸化窒素は$\mathrm{CO}_{2}$の296倍）を考慮した二酸化炭素等量の排出量を図52に示す。この結果、後半低負荷の施肥管理と施肥前落水の水管理を組み合わせた水田管理方法では、前半低負荷+慣行系（中干しのみ）の系と比較して84%の温室効果ガス削減効果が確認された。この量は、100 kg-N/haの窒素負荷で化学肥料により施肥を行っている一般の水田と同じ温室効果ガス排出量であり、本技術の適用により3倍の窒素負荷で温室効果ガス排出量を1/3に抑えられることを意味している。

図48 施肥後のメタンフラックス（前半低負荷系）

図49 施肥後のメタンフラックス（後半低負荷系）
図50 施肥前落水系と中干し系の土壌溶存メタン濃度の比較（前半低負荷系）

図51 施肥前落水系と中干し系の土壌溶存メタン濃度の比較（後半低負荷系）

図52 5/23(移植)～10/12(稲刈り)までの二酸化炭素換算の温室効果ガス放出量比較

## 3 ）水田土壌微生物の定量

温室効果ガスの大幅削減が見られた後半低負荷系における水田土壌中の微生物定量結果を、図53から図56に示した。各微生物の定量は定量PCRによって行った。

水田土壌表面 5 cm において施肥前落水系では、pmoA 遺伝子と NC10 門の 16S rRNA 遺伝子の コピー数が最大 10 倍程度になった（図 53）。全体を通しても、中干しのみを行った慣行系と比較して 2-3 倍程度の違いがあり、施肥前落水系はこれら 2 つの遺伝子に関して有意に高い値を示した。mcrA 遺伝子の コピー数に大きな違い無いことから、メタン酸化に関与する遺伝子、すなわちメタン酸化細菌数が施肥前落水系において多いことが明らかになった。また、この傾向は脱室性メタン酸化細菌（NC10 コピー数（図 53、図 54）にも有意な差として現れた。
すなわち、水田土壌において、落水を増やすことによりメタンを酸素を使って、もしくは窒素化合物（硝酸・亜硝酸）を利用して酸化を行う細菌群がより多く棲息していること、さらにメタン放出量の総量に相関性があることが示唆された。

土壌 5-10 cm のコピー数に施肥前落水系および中干し系に大きな違いは見られなかった。すなわち、水管理がメタンをめぐる微生物の量に影響を及ぼす範囲は 0-5 cm に限られていることが確認された。

次に、前半低負荷系も含めた各土壌深さにおけるmcrA遺伝子の平均値としてとり、植栽開始時のmcrA遺伝子の相対値を1とした際の相対mcrA遺伝子の経日変化を図57に示す。mcrA遺伝子に関しては、施肥前落水を導入することにより、土壌が好気的になる可能性を鑑みると、好気的な環境がmcrA遺伝子を有するメタン生成古細菌の増殖を抑制した可能性が高い。したがって、施肥前落水という工程を導入することによりメタン生成古細菌の増殖を抑制し、最終的に温室効果ガスであるメタンを抑制することが可能になったと言える。

図530～5 cm土壤中の追肥前後copy数変化（後半低負荷・施肥前落水）

図540～5 cm土壤中の追肥前後copy数変化（後半低負荷・中干し）

図55 5～10 cm土壤中の追肥前後copy数変化（後半低負荷・施肥前落水）
図56 5～10 cm土壤中の追肥前後copy数変化（後半低負荷・中干し）

図57 栽培期間中のメタン生成古細菌の相対数変化

## 4 ）まとめ

これまでの水田管理方法の検討から、新たに「施肥前落水」および「後半低負荷施肥」を実施し、イネ栽培期間において、水管理の変更により温室効果ガス排出量を二酸化炭素当量でを最大84%の削減に成功した。また、窒素負荷300 kg-N/haの畜産排水の液肥の施肥により窒素汚染の懸念が無いことが示された。また、このような水・施肥管理を行った水田土壌には、メタンを酸化する細菌群が有意に多く棲息していること、およびメタンを生成する古細菌の増殖が抑制されていることが確認された。

## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

水管理として「施肥前落水」を行い、水田土壌を好気的にし、施肥条件として「後半低負荷」の施肥を行うことにより、温室効果ガスを最大で84％削減できることを明らかにした。またこのとき、メタンをめぐる微生物群の量に有意差が生じ、特に水管理として施肥前落水を行うことにより、メタンを生成するメタン生成古細菌の増殖を抑制し、メタン生成量の削減に寄与していることを明らかにした。このように、水管理および施肥条件を組み合わせることにより、有
用微生物を制御して飼料イネ水田による畜産排水処理を実施しつつも、温室効果ガス排出の削減に寄与できる可能性を技術的な観点から示したのは初めてのケースである。

## （２）環境政策への貢献

＜行政が既に活用した成果＞

該当なし。

## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

上述した成果として、畜産排水の液肥を我が国の休耕田を含む耕作放棄地40万haに、300 kg-N/haの負荷で施肥し、排水処理を行った際の環境負荷を計算すると、飼料イネ水田においては畜産農家から排出される畜産排水の約50%を水圈環境の水環境汚染のリスクなく処理することが可能になる。また、飼料イネ水田で得られた飼料の総量は濃厚飼料および粗飼料がそれぞれ400万トン生産されると試算され、100%輸入に依存している濃厚飼料の量を1540万TDNトンまで減少することになる。一方、粗飼料はこれにより全く輸入に依存する必要が無くなり、我が国で自給可能になる試算である。その結果、我が国の現在の飼料自給率25%は40%まで上昇することが期待される。また、海外から輸入される際に運搬される船舶の燃料の削減に伴う温室効果ガスの排出も削減可能である。したがって、本技術の適用により、休耕田の有効利用による飼料生産量の増大、畜産排水の浄化を温室効果ガス排出を低減しながら行うことが究極的には可能になると考える。さらには、この技術をアジアモンスーン地域全体に拡張することにより、土地有効利用による食料生産量増大につなげていくことが可能になる。

もちろん、これらの試算は非常にラフな想定に基づくものであり、様々なシナリオを考慮した試算が必要になる。したがって、今後詳細な経済的インパクトを組み合わせることにより、飼料自給率増大につながるような飼料イネ水田をコアとする飼料生産・畜産排水処理システムの実現可能性を評価していきたいと考えている。一方で、研究の面においても複数年の飼料イネ栽培による効果の実証やリンの物質収支なども今後検討していく必要があると言える。

### 6. 国際共同研究等の状況

特に記載すべき事項はない

### 7. 研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

<論文（査読あり）>

特に記載すべき事項はない

<査読付論文に準ずる成果発表>

特に記載すべき事項はない

くその他誌上発表（査読なし）>

特に記載すべき事項はない
（2）口頭発表（学会等）

1) M. Kamimura, S. Riya, S. Zhou, M. Hosomi, A. Terada: The 28th Annual Meeting of the Japanese Society of Microbial Ecology (September 2012)

Methane flux and abundance of microorganisms responsible for methane production and oxidation in rice paddies applying liquid manure from livestock wastewater with different irrigation strategies

2）上村美羽、利谷翔平、周勝、寺田昭彦、細見正明：第64回日本生物工学会大会（2012）「畜産排水を施肥した飼料イネ水田のメタン放出挙動とメタンをめぐる微生物群のダイナミクス」

3）利谷翔平、周勝、小原裕三、寺田昭彦、細見正明：第47回日本水環境学会年会（2013）「空間分布解析による落水後の水田における突発的な亜酸化窒素排出挙動の解明」

4）室井友里恵、上村美羽、利谷翔平、周勝、寺田昭彦、細見正明：化学工学会第78年会（2013）「畜産排水を施肥した飼料イネ水田におけるCH_{4}およびN_{2}Oの同時削減の試み」

## （3） 出願特許

特に記載すべき事項はない

（４）シンポジウム、セミナーの開催（主催のもの）

特に記載すべき事項はない

（５）マスコミ等への公表・報道等

特に記載すべき事項はない

（6）その他

特に記載すべき事項はない

### 8. 引用文献

特に記載すべき事項はない
# Identification and Quantification of Bacterial Groups and their Contribution to Nitrogen Removal at Rice Paddy Field

Principal Investigator: Akihiko TERADA

Institution: Division of Applied Chemistry, Institute of Engineering, Tokyo University of Agriculture and Technology

2-24-16 Naka, Koganei-shi, Tokyo 184-8588

Tel.& Fax: +81-42-388-7069

E-mail: akte@cc.tuat.ac.jp

[Abstract]

Key Words: Livestock Wastewater, Forage Rice Paddy, Biological Nitrogen Removal, Greenhouse Gas Effect, Anaerobic Ammonia Oxidation

A rice paddy field holds multiple functions: not only a site as rice plant production but also as remediation of contaminants, e.g. livestock wastewater. In order to harness a forage rice paddy field for removal of livestock wastewater, the main challenges are twofold. The one is to understand nitrogen mass balance since excessive application of livestock wastewater potentially results in nitrogen-based pollution of the adjacent water bodies. The other is to conduct water management in a rice paddy field by utilizing inhabited bacteria for nitrogen removal, which preferably do not emit greenhouse gases. Hence, the objectives of this study are twofold: first, identification and quantification of anaerobic ammonia oxidizing (anammox) bacteria and denitrifying methane-oxidizing bacteria (DMOB) responsible for nitrogen removal without producing nitrous oxide and methane; second, elucidation of an optimal management condition of a forage rice paddy field by harnessing these bacterial activities. The effects of nitrogen loading based on the amount of livestock wastewater, water infiltration rate and presence/absence of rice paddy plants on nitrogen removal performance, the amount of greenhouse gas emission and microbial community were investigated through pot experiments. $ {}^{15} $ N tracer experiment confirmed that dissipated nitrogen was derived from denitrification and that high denitrification activity correlated with high water infiltration rate. Real time quantitative PCR for denitrifying bacteria and Planctomycetes bacteria (the phylum to which anammox bacteria are affiliated) demonstrated positive correlation between the densities of these bacteria in soil and the denitrifying activity by the $ {}^{15} $ N tracer experiment. Test field experiment with a surface area of 40 m $ ^{2} $ found DMOB affiliated to the NC10 phylum capable of methane oxidation coupling with nitrite reduction to N $ _{2} $ gas. Aerobic condition proliferated methane oxidizing bacteria (MOB) and DMOB, resulting in reduction of methane production. Given this trend, a new water management strategy, termed pre-topdressing water drainage, where water is discharged from a forage rice paddy before addition of liquid manure of livestock wastewater, was proposed. Providing
intentional aerobic condition accelerated heterotrophic bacterial activity, resulting in less chance for methanogens to produce methane. The introduction of the pre-topdressing water drainage dramatically reduced methane emission by 77% compared with the control run applying a conventional water drainage management. Such reduction has correlation with suppression of methanogen. No contamination with nitrogen was observed with this drainage procedure at 300 kg-N/ha. Hence, the proposed control methanogen growth, leading to reduction of greenhouse gas emission with high nitrogen removal from livestock wastewater.
RF-1002 水田のイネ根圏に棲息する脱窒を担う微生物群の同定・定量と窒素除去への寄与の解明

#	微生物反応	電子供与体	電子受容体	反応に微生物群
1	硝化	アンモニア	酸素	アンモニア酸化細菌・古細菌
亜硝酸酸化細菌
2	嫌気性アンモニア酸化(アナモックス)	アンモニア	亜硝酸	嫌気性アンモニア(アナモックス)細菌
3	嫌気性メタン脱室	メタン	硝酸・亜硝酸	嫌気性メタン酸化細菌
4	メタン酸化	メタン	酸素	メタン酸化細菌
5	脱窒	有機炭素	硝酸・亜硝酸	從属性脱窒細菌

窒素除去に寄与

温室効果ガス(メタン・亜酸化窒素)を放出しない
## まとめ

インフラユーザーである民間事業者に対するアンケート調査によれば、民間事業者の意識として、企業活動の生産性向上に関して移動（輸送）時間やコストの削減をインフラに高く期待しているなど $ ^{52} $ 、インフラに対する多様かつ密接な関わりを確認することができた。一方で、インフラを賢く使う取組みの提案については、積極的に参画意思を示す民間事業者は多くなく $ ^{53} $ 、どちらともいえないという回答が多い結果となった。

また、国民（個人）を対象としたモニターアンケートによると、住民参加によるインフラ維持管理については、6割以上の国民が参加してみたいと回答するなど、高い参画意思が伺えた $ ^{注54} $ 。

歴史的に見ると、江戸時代には、町人が自ら橋の整備を行い、それらを利活用することによって経済活動を支えるなどの事例が多く見られた。例えば、大阪の橋の9割は町人によって架橋された「町橋」であり、浪華八百八橋は、商人の経済活動を支え、日々の生活や町の発展を支える重要な役割を担ってきた $ ^{注55} $ 。水路に多く囲まれた大阪において橋は必要なインフラであり、当時の商人がその機能・効果を良く理解し、その機能を最大限活用し、経済活動を支え、商都大阪の発展に寄与してきたものと考えられる。

現代においても、ファナック（株）による栃木県の新工場立地、ダイハツ九州（株）の大分県中津港への新工場の建設・同地域への本社への移転、また、（株）新潟ジャムコの新潟県村上市の企業進出等、道路・港湾等の交通インフラ整備に合わせて、又はその動きを見越して、民間事業者が積極的にその利便性を活かすため、新たに工場等を建設する事例も多数見られるようになっている $ ^{注56} $ 。

上記の事象については、それぞれ時代背景は異なるものの、民間主体がインフラの機能を認識し、インフラを最大限利活用し、その結果、経済活動や企業活動の向上につながっている点で共通が見られる。

このように、インフラ整備によるストック効果に企業が着目し、その効果を最大限活用するようになれば、「企業の生産性向上」につながるものと考えられ、行政としても、インフラ整備によるストック効果の「見える化」・「見せる化」の取組みが重要であろう。

例えば、第2章第1節でも紹介したように、ビッグデータやアンケート等の多様な手法を用いて、ストック効果を可能な限り客観的に把握し、公表すること（「見える化」）や、ストック効果を更に効果的に提供しユーザーと共有（「見せる化」）することにより、インフラユーザーがよりストック効果を実感しやすくなることが期待される。

今後とも、以上のような観点を踏まえて、「賢く投資・賢く使う」取組み、ストック効果「見える化」等、戦略的なインフラ整備に取り組むことにより、「社会のベース」の生産性を向上させ、持続的で力強い成長に貢献していくことが求められる。