Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
最後に、参考として河川底質におけるAnammox活性についても合わせて評価した。#2の水田汚泥と同様にして、Anammox活性が検出され、同様にしてで河川水と底質の界面近傍でAnammox活性が最も高くなる傾向が得られた。Anammox活性に関しては#2の水田土壌よりも圧倒的に小さい結果になった（図20）。

図20 恋瀬川低質サンプルのAnammoxおよび脱窒活性

## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

通常の窒素負荷80 kg-N/haに対して、本研究で用いた飼料イネでは900 kg-N/haまで施肥しても畜産排水を処理可能であることを明らかにした。ただし、高浸透系の場合は地下への硝酸・亜硝酸の流出が懸念されるため、450 kg-N/haで運転することが望ましいことも示せた。窒素収支に基づいた畜産排水処理としての適正な施肥量を示せたことは、今後実フィールドに拡張する際の重要な知見になり得る。また、 $ ^{15} $ Nトレーサーを用いて水の浸透速度の違いにより微生物による脱室活性の違いを定量的に見出したことは学術的にも新規性が高い新たな知見であると考える。温室効果ガスの放出特性の評価より、 $ N_{2}O $ よりも $ CH_{4} $ の温室効果が圧倒的に多く、全体の9割以上を占めることが明らかになった。さらに、 $ N_{2}O $ は水を抜いた好気的条件下で放出量が増大すること、 $ CH_{4} $ は施肥後の嫌気的条件で顕著な放出が確認されたため、水管理（浸透速度）や施肥条件の調整によりこれらの温室効果ガスを削減できる可能性を示せたことは学術的にも意義があると考える。さらに、これらの知見は人工湿地からの温室効果ガス放出の抑制に向けた運転管理の体系化に拡張できるのではないかと考えている。

また、 $ ^{15} $ N トレーサー試験によるAnammox活性検出試験において、畜産排水の液肥を施肥した水田ではAnammox活性が見られなかった一方で、茨城県にある谷津田水田においては高いAnammox活性が検出された。畜産排水には高い窒素化合物が含まれており、窒素の量がAnammox反応を律速にさせる可能性は極めて低い。一方で、畜産排水には窒素化合物と同様に極めて高い有機物が含まれているため、この有機物により脱窒細菌の増殖が大幅に促進された可能性がある。これらの異なるサンプリングサイトから畜産排水を施肥した水田土壌でAnammox細菌を増やす条件を一般化することは困難であるが、畜産排水の有機物を減少させることにより、Anammox活性を高めることが可能になることが十分に考えられる。今回のプロジェクトで用いた畜産排水の液肥は牛
舎からの排水に起因しており、養豚排水よりも有機物濃度が高いことが知られている。したがって、養豚排水のように有機物濃度が低い排水に適用すれば、Anammox活性を利用した窒素除去が十分に行える可能性が考えられる。一方、今回サンプリングサイトとして選択した谷津田水田では、既往の研究と比較しても遜色ない高い活性を示すことが確認できた。この結果より、水田土壌においてAnammox細菌による窒素除去の寄与は最大で30%を超え、これらの細菌を利用できる可能性も示せた。

表7 谷津田水田で検出されたAnammox活性の既往の研究との比較

場所	河口域
(大阪淀川汽水域)	湖沼底質
(茨城県北浦)	水田
(中国)	水田底質
(茨城県谷津田)	河川底質
(茨城県恋瀬川)
Anammox活性
[nmol/ml-sediment/h]	0.29-0.69	2.4-10.4	0.81-3.78	1.42-8.15*	0.10-0.79*
Anammox反応による
N除去の割合 [%]	0.86-1.58	3.5-30.0	4-37	7.8-37.3	0.22-1.95
サンプル箇所	表層0-1,0-2 cm
底質(2か所)	表層2 cm底質
底質11か所	1 m深さ(10 cm
毎)	表層0-4 cm土壤	表層0-4 cm底質
Reference	Amano et al.
(2007) Microbes
Environ. 22:
232-242	Yoshinaga et al.
(2011) Microbes
Environ. 26:
189-197	Zhu et al. (2011)
ISME J. 5:
1905-1912	本研究	本研究

$ ^{*} $ 単位はnmol/g-slurry/h

## （２）環境政策への貢献

## ＜行政が既に活用した成果＞

該当する件は無し。

## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

現在のところ、環境政策への貢献はなされていないが、平成22年度の検討により、畜産排水処理のために約450 kg-N/haの施肥を行う必要があること、温室効果ガスが発生する時期・環境を特定できたことを明らかにした点は、今後の環境政策の一環として水田の適切な維持管理を行うためには大きな意義があると考えている。平成23年度は水位管理による温室効果ガス削減の可能性と土壌細菌群との関わりを評価するため、これらのデータを集積させることで、最終的には環境負荷の低い畜産排水処理のための水田管理方法を提示できるものと考える。

## 6 ．国際共同研究等の状況

特になし。

## 7 ．研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

## <論文（査読あり）>

A. TERADA, S. ZHOU and M. HOSOMI: Clean Technol. Environ. Policy 13, 6, 759-781

“Presence and Detection of Anaerobic Ammonium-Oxidizing (anammox) Bacteria and Appraisal of Anammox Process for High-Strength Nitrogenous Wastewater Treatment: A Review”
## <査読付論文に準ずる成果発表>

特に記載すべき事項はない

くその他誌上発表（査読なし）>

特に記載すべき事項はない

## （2） 口頭発表（学会等）

1）周勝、崎山幸奈、菅原翔、利谷翔平、寺田昭彦、細見正明：第45回日本水環境学会年会（2011）「15Nを用いた畜産排水施用水田の窒素挙動の解明」

2）利谷翔平、周勝、小原裕三、寺田昭彦、細見正明：第45回日本水環境学会年会（2011）「飼料イネ水田による畜産排水処理における温室効果ガス排出」

3）ソドビリゲ、利谷翔平、周勝、寺田昭彦、黒田久雄、細見正明：第47回日本水環境学会年会(2012)

「異なる水環境における.. Anammox反応活性の評価」

## （3） 出願特許

特に記載すべき事項はない

（４）シンポジウム、セミナーの開催（主催のもの）

特に記載すべき事項はない

（５）マスコミ等への公表・報道等

特に記載すべき事項はない

### 8 \. 引用文献

Amano et al. (2007) Microbes Environ. 22: 232-242

Yoshinaga et al. (2011) Microbes Environ. 26: 189-197

Zhu et al. (2011) ISME J. 5: 1905-1912
## (2) 窒素除去に関与する “活性のある” 微生物群の同定と変遷に関する研究

東京農工大学 大学院工学研究院 応用化学部門 細見・寺田研究室

寺田昭彦

周勝

平成22～24年度累計予算額：3,215千円

（うち、平成24年度予算額：959千円）

予算額は、間接経費を含む。

[要旨] 水田はイネ生産ばかりでなく水質浄化など多面的機能を有しており、窒素を高濃度に含む畜産排水を水田に施用して、肥料としての利用と窒素除去の畜産排水処理が同時に達成できる可能性がある。このとき、サブテーマ1で示した水質管理や飼料イネ水田の環境と窒素収支に対応する窒素除去に関与する微生物群の相関を導き出すことができれば、窒素除去を促進可能な微生物を制御することで、窒素除去効率が高く、かつ温室効果ガスの放出が削減できる可能性がある。その中でも、Anammox反応を介する微生物群は温室効果ガスである亜酸化窒素（ $ N_{2}O $ ）を生成しない窒素除去反応経路を有するため、水田土壌のAnammox細菌群の理解とその動態解析は上記の目標を達成するキーとなる微生物と考えられる。また、これに加えメタンを嫌気的に酸化可能な脱室性メタン酸化細菌はもう一つの温室効果ガスであるメタンを亜硝酸の原子状酸素を利用することに窒素除去とメタンの除去が同時可能になる。そこで、水田土壌に棲息するAnammoxを行うとされる細菌群、および脱室をしながらメタン酸化が可能な細菌群の同定を、分子生物学的手法を用いて行った。これまでの手法ではAnammox細菌や脱室性メタン酸化細菌群の検出が困難であるため、新たなPCR条件を開発した。新たなPCR条件を用いることにより、Anammox細菌に比較的近縁な新規のPlanctomycetes群を検出することに成功した。新規の微生物群の発見により、それらの微生物群を特異的に検出できるオリゴヌクレオチドDNAの設計が可能になり、水田土壌中の正確な定量が可能になる。

[キーワード] 畜産排水処理、飼料イネ、生物学的窒素除去、嫌気性アンモニア酸化、脱室性メタン酸化細菌

### 1. はじめに

飼料イネ水田に施肥する窒素はアンモニアを亜硝酸・硝酸に酸化する硝化反応と亜硝酸・硝酸を窒素ガスに還元する従属栄養性の脱窒反応の2つの異なる生物反応を経て無害化される。近年、硝化・脱窒以外の窒素除去経路が明らかになっている。一つは嫌気性アンモニア酸化（Anammox）であり、独立栄養性のAnammox細菌により嫌気条件下でアンモニアと亜硝酸を窒素ガスに変換する。もう一方は、メタン脱窒であり、亜硝酸・硝酸がメタンと反応して窒素ガスに変換される。これらの反応を担う細菌の特徴として、温室効果ガスであるN₂O、CH₄を放出しないため、水田からの温室効果ガスの放出を抑制するメリットを有する。これらの細菌群を飼料イネ水田に保持することが重要であると考えられる。
## 2 ．研究開発目的

サブテーマ1のポット試験により、高窒素負荷においても飼料イネ水田における窒素除去能の高さが証明された。窒素除去のためには、窒素源であるアンモニア態窒素が亜硝酸・硝酸に酸化される必要がある。これまでの酸素に関する窒素収支では通常の硝化・脱窒反応だけではこれまでの結果で得られた窒素分を酸化するには酸素が足りないことが考えられ、近年発見された新しい窒素除去経路であるAnammox反応が起こっている可能性がある。これまでのところ、海底の堆積物、湖沼・河川の底泥等でAnammox反応を担うPlanctomycetes門に属するAnammox細菌の分子生物学的検出は行われているが、水田土壌での検出はこれまでのところ皆無である。そこで、新しい窒素除去経路を担うAnammox細菌の検出をまず試みた。次に、脱窒性メタン酸化を行うことが可能な脱窒性メタン酸化細菌の検出、および定量可能なPCRプライマーの開発を試みた。

### 3. 研究開発方法

## 1 ）DNA抽出

DNAの抽出は抽出キットFast DNA SPIN Kit for Soilを用いて行った。また抽出したDNAはPCR阻害を防ぐため、10倍に希釈して用いた。また、Anammox細菌の分子生物学的検出としてポット試験の土壤0-2 cmと2-20 cmの土壤を採取した。0-2 cm付近ではイネの根が行きとどいており、イネ根圏の土壤である。

## 2 ）ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）

表6にAnammox細菌の検出に用いたプライマーの一覧を示す（表8）。PCRの反応液の組成は各試薬メーカの推奨マニュアルに準拠して行った。

表8 使用したプライマー

プライマ一名	配列(5'-3')	対象	Tm値
Pla46f	GGATTAGGCATGCAAGTC	Planctomycetales	58.0
Amx368f	TTCGCAATGCCCGAAAGG	Anammoxoglobus propionicus以外Anammox	56.0
Brod541f	GAGCACGTAGGTGGGTTTGT	Scalindua	57.0
1037r	CGACAAGGAATTTCGCTAC	universal bacteria(Nested)	59.8
Amx820r	AAAACCCCTCTACTTAGTGCCC	anammoxidans, fulgida, stuttgartiensis	66.0
BS820r	TAATTCCCTCTACTTAGTGCCC	wagneri, sorokinii	60.0
Brod1260r	GGATTCGCTTCACCTCTCGG	Scalindua	59.0
Amx1480r	TACGACTTAGTCCTCCTCAC	All anammox	55.8

## 3 ）使用したプライマーの組み合わせおよびPCRの温度条件

表9-14に使用したプライマーの組み合わせおよびPCRの温度条件を示す。PCRは通常のPCRと、nestedプライマーセットPla46fと1037rを用いてPCRを行い、増幅したPCR産物を用いてPCRを行うnested PCRの双方で行った。

表9 プライマーセットPla46f-1392rのPCR条件（t-RFLP用）

Temperature[ $ ^{\circ} $ C]	time[min:sec]
Step1	Pre-heating	94	05:00
Step2	Denature	95	00:30
Annealing	50	00:30
Elongation	72	01:30
Step3	Final extension	72	10:00
4	$ \infty $
表10 プライマーセット Amx368f-Amx820rのPCR条件（クローニング用）

Temperature[ $ ^{\circ} $ C]	time[min:sec]
Step1	Pre-heating	94	04:00
Step2	Denature	95	00:45
Annealing	58	00:50
Elongation	72	01:00
Step3	Final extension	72	07:00
4	$ \infty $

表11 プライマーセット Amx368f-Amx1480rのPCR条件（クローニング用）

Temperature[ $ ^{\circ} $ C]	time[min:sec]
Step1	Pre-heating	94	04:00
Step2	Denature	94	00:30
Annealing	55	00:30
Elongation	72	01:30
Step3	Final extension	72	07:00
4	$ \infty $

表12 プライマーセット Brod541f-Brod1260rのPCR条件（クローニング）

Temperature[°C]	time[min:sec]
Step1	Pre-heating	95	03:00
Step2	Denaturation	95	00:45	10
touchdown cycles	Annealing	65-60 (-0.5/cycle)	01:00	cycle
Elongation	72	01:00
step3	Denaturation	95	00:45	20
consistent cycles	Annealing	60	01:00	cycle
Elongation	72	01:00
Step4	Final elongation	72	07:00
4	∞

表13 nested PCR第1段階（プライマーセットPla46f-1037r）のPCR条件（クローニング用）

Temperature[ $ ^{\circ} $ C]	time[min:sec]
Step1	Pre-heating	94	04:00
Step2	Denature	95	00:45
Annealing	59	00:50
Elongation	72	03:00
Step3	Final extension	72	07:00
4	$ \infty $

表14 nested PCR第2段階(プライマーセットAmx368f-Amx820r,-BS820r)のPCR条件

Temperature[ $ ^{\circ} $ C]	time[min:sec]
Step1	Pre-heating	95	03:00
Step2	Denaturation	95	00:45
touchdown cycles	Annealing	65-60 (-0.5/cycle)	01:00
Elongation	72	01:00
Step3	Denaturation	95	00:45
consistent cycles	Annealing	60	01:00
Elongation	72	01:00
Step4	Final elongation	72	07:00
4	$ \infty $

## 4 ）t-RFLP（Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism）法によるPlanctomycetes門の変遷

Anammox細菌はPlanctomycetes門に存在する微生物群であり、系統的に他のPlanctomycetes門とは離れた位置に存在している。ただし、Anammox反応を担うAnammox細菌以外でもAnammox反応を
担う可能性が否定できないことも報告があり（Pynaert et al. (2003)）、まずどの微生物群がそれぞれのポットに存在・出現・消失しているのかを確かめるために、Planctomycetes門全体をターゲットとしてt-RFLP法を試みた。表15、表16に使用したプライマーと制限酵素を示す。

表15 t-RFLP法に供試したプライマーセット

primer	specificity	sequence
$ [6FAM]^{*} $ - Pla46f	Planctymcetales	$ [6FAM]GGATTAGGCATGCAAGTC $
1392r	Bacteria	ACGGGCGGTGTGTAC

*[6FAM]-はprimerの5'末端が6FAM蛍光修飾であることを示す

表16 t-RFLPで用いた制限酵素

制限酵素	切断部位
Msp I	C C G G
G G C C
Hha I	G C G C
C G C G

プライマーセット[6FAM]-Pla46f-1392rでサンプルのPCRを行い、PCR産物の精製を精製キットMicroconTM-100（42413/MILLIPORE）を用いて行った。次に、アガロースゲル電気泳動によりPCR精製物が得られているかを確認した。さらに、PCR精製物の制限酵素処理をHhaIとMspIを用いて制限酵素処理を行いT-RF（末端蛍光修飾制限酵素断片）を得た。その後、酵素反応時に混入した塩を除去する為、前段階で得たT-RFのエタノール沈殿を行い、エタノール沈殿後のT-RFとStandard size marker+Hi-Di Formamideの混合液を96wellプレートに15μl/tubeずつ分注した後、95℃,5minでDNAを熱変性させた。最後に、ABI PRISM $ ^{®} $ 3100-Avant Genetic Analyzerでキャピラリー電気泳動を行い、蛍光標識された5'断片長と蛍光強度をGene Scan Softwareで解析した。

## 5 ）16S rRNAのクローンライブラリー解析

t-RFLPにより、これまで知られているAnammox細菌を検出できなかったことから、Anammox細菌を検出できる様々なプライマーセットを用いることにより、それぞれのサンプルの16S rRNA遺伝子に基づいたクローン解析を行い、Anammox細菌の存在を確認することとした。これに合わせ、Anammox反応の代謝経路であるヒドラジンから窒素ガスに変換する際のヒドラジン酸化酵素をコードするヒドラジン酸化遺伝子の検出も試みた。

## 6 ）脱窪性メタン酸化細菌の同定に向けた試み

2011年度の農業環境研究所（つくば）の実験圃場の水田土壌からサンプルを採取した。実験系を表17に、2011年度の現場実験実施状況を表18に示す。土壌サンプリングは、コアサンプラーを用いてDNA抽出用土壌は深さ0～2 cm, 2～4 cm, 4～6 cm, 6～20 cmに分けて採取した。DNA抽出用土壌は、各系3地点から採取し均一化し、ふるいにかけて根などの夾雑物を除いた後、遠心分離で水分を取り除き-20℃で冷凍保存した。

表17 2011年度 実験系

系	窒素負荷 [kg-N/ha]	中干し (2回目追肥後)	間断灌溉 (3回目追肥後)
S100	100	不十分（嫌気的）	落水日数3日
L100	100	十分（好気的）	落水日数6日
S600	600	不十分（嫌気的）	落水日数3日
L600	600	十分（好気的）	落水日数6日
表 18 2011 年度 現場実験スケジュール

日付	水田管理
6/8	移植
7/22	1回目追肥
7月下旬	水管理開始
8/18	2回目追肥
9/12	3回目追肥
9月下旬	落水開始
11/2	収穫

7）飼料イネ水田土壌中のNC10門細菌の同定（従来のプライマーセットによるPCR）

既往の脱室性メタン酸化細菌であるNC10門細菌を対象としたプライマー（8F-1043R（Ettwig et al. (2009) 464, 543-548）を用いたPCRの後、PCR産物のクローニングを行い、PCR増幅産物の16S rRNA系統解析を行った。クローニングにはpGEM-T Easy Vector (Promega)を使用し、シークエンサー。シークエンスの結果から、今回獲得したクローンの16S rRNA遺伝子配列に基づく系統解析を行った。

8）脱窒性メタン酸化細菌を検出する新しいPCRプライマーの設計

7）で得られたクローンライブラリーを抽出し、遺伝子解析ソフトであるARBを用いて、水田土壤中に棲息する脱室性メタン酸化細菌を検出可能な16S rDNAプライマーの設計を行った。また、実際に設計したプライマーのNC10門への選択性を確認するために、設計したPCRプライマーにて水田土壤をPCRにかけ、増幅したPCRをサブクローニングにより、種類を同定した。サンプルのデータを表19に、PCR条件を表20に示す。

表 19 サンプルデータ

サンプリング日	深さ[cm]	窒素負荷[mg-N/ha]
2011/6/8(植栽前)	0-2	50 (基肥)

表 20 PCR 条件

Temperature [ $ ^{\circ} $ C]	Time [min:sec]
Pre-heating	94	02:00
Denature	94	00:30	40 cycle
Annealing	64.5	00:30
Elongation	72	00:20
4	$ \infty $

反心液组成
Master Mix	10 $ \mu $ l
milliQ	4 $ \mu $ l
193F	0.5 $ \mu $ l
616R	0.5 $ \mu $ l
铸型DNA	5.0 $ \mu $ l
全量	20 $ \mu $ l

## 9 ）新規プライマーチェック

平成23年度の検討により、水田土壌から発生するメタンの削減が重要課題であることが明らかになった。メタンをめぐる微生物は図21、表21に示す微生物群を介して行われる。これらの微生物群を正確に定量するために、プライマーのチェックと定量PCR用のポジティブコントロール用の
DNAプラスミドの作成を行った。これにより、サブテーマ3、4の定量PCRの準備を行った。作製したDNAプラスミドはサブテーマ3、4の際に用いた。なお、脱室性メタン酸化細菌に関しては、既存のプライマーセットでは他の細菌も検出してしまい過大評価につながるため、独自でプライマーを設計し、この特異性を評価した。

図21 水田土壌におけるメタンをめぐる微生物群の関係

表21 メタンに関与する微生物群

サンプル名	ターゲットとする遺伝子	プライマーセット
メタン生成古細菌（Methanogen）	mcrA（機能遺伝子）	mlas-mcrA-rev*
メタン酸化細菌（MOB）	pmoA（機能遺伝子）	A189F-Mb661R**
脱室性メタン酸化細菌（DMOB）	16S rRNA遺伝子	193F-661R***

* Steinberg et al. (2008) Appl. Environ. Microbiol. 74: 6663-6671

** Ettwig et al. (2009) Appl. Environ. Microbiol. 75: 3656-3662

*** in this study

平成23年度は、NC10門細菌の16S rRNA系統解析結果およびgene bankのデータベースを基に遺伝子解析ソフトARBを用いてNC10門細菌に特異的な遺伝子配列を抽出、NC10門細菌定量用の新規プライマーセット（表22）作成した。このとき用いたPCRの条件を表24に示す。

表 22 設計した NC10 門細菌定量用プライマー

表 23 PCR 条件（193F-616R）

反应条件	反应液組成
Temperature [°C]	Time [min:sec]	SsoFast™ EvaGreen Supermix (Bio-Rad社)	10 μl
Pre-heating	94	02:00	milliQ water	4 μl
Denature	94	00:30	40	193F
Annealing	64.5	00:30	cycle	616R
Elongation	72	00:20	鋳型DNA
Melt curve step	65-95 0.5℃/0:05	全量	20 μl
4	∞
鋳型DNAには，検量線の精度確認のためにNC10門細菌より獲得したplasmid DNA、いくつかの異なる水田土壌サンプルから抽出したDNAへの適用性確認のために土壌抽出DNA、非特異的增幅の有無の確認のためにChloroflexi門細菌より獲得したplasmid DNAを用いた。反応装置にはCFX96リアルタイムPCRシステム（Bio-Rad 社）を使用した。

## 4 ．結果及び考察

## 1 ）t-RFLPによる微生物生態構造の変遷

高浸透系・窒素負荷 450 kg-N/ha・植栽有りのポットにおけるプライマーPla46f-1392r，制限酵素HhaIのt-RFLPの結果の一例（植栽有り、窒素負荷450 kg-N/ha、高浸透（Run5）・低浸透系（Run6））を図22に示す。各サンプル間でピークパターンに違いがあり、異なる水田環境でイネを生育させた際にPlanctomycetes門の細菌群集構造にも違いが出てくることが分かった。この結果から、窒素負荷量，植栽の有無が水田土壌細菌群に影響を及ぼすことが示唆された。また、それぞれのピークのT-RFの長さから、微生物群の種類を定量することが可能である。もし、既存のAnammox細菌がポットに存在している場合は、222 bpにクロマトグラムのピークが検出されるはずであるが、今回のt-RFLPの結果からはAnammox細菌のピークが検出されなかった。Anammox細菌の存在割合が圧倒的に小さいか、Pla46f-1392rのプライマーセットでは増幅できない新種のAnammox細菌が存在しているかはこの結果からは判別できず、2）のクローニング解析により調査することにした。これらのクロマトグラムを基にして、多次元尺度法による群集構造の変遷を2次元プロットにした（図23）。この結果より、中干しや施肥により群集構造が大きく変わることが示唆された。最終的に到達した2次元プロットの位置は、高浸透・植栽有りの系は窒素負荷に関わらず近くに存在しており、一方で、低浸透および植栽の有無によりその収束する位置に大きな差がみられた。したがって、窒素負荷よりも水の浸透速度（酸素フラックスに影響）および植栽の有無によりPlanctomycetes門の細菌群集構造が大きく影響を受けることが明らかになった。

図22 高浸透系と低浸透系のPlanctomycetes門のt-RFLP解析結果（A: 高浸透系；B: 低浸透系）
図23 多次元尺度法によるPlanctomycetes門に帰属する細菌群集構造の変遷

## 2 ）t-RFLPによる微生物生態構造の変遷

Anammox細菌に特異的なプライマーを用いたPCRを行い、Anammox細菌が存在するかの確認を行った。サンプルは高浸透・植栽有り・窒素負荷450 kg-N/haのものとした。使用したプライマーのPCR結果およびシーケンシングの結果を表24に示す。

表24 PCRおよびクローニングによるAnammox細菌の存在確認

プライマーセット	対象	Reference	PCR	sequencing
Pla46f	Planctomycetales	Neef et al.(1998)	○	0/22
1392r	universal bacteria	Freitag and Prosser (2003)
Amx368f	Anammox globus propionicus	Schmid et al. (2003)	○	0/49
Amx1480r	All anammox	Amano et al. (2007)
Brod541f	Scalindua	Penton et al.(2006)	○	0/15
Brod1260r	Scalindua	Penton et al. (2007)
Ana-hzo1f	hzo gene	Quan et al. (2008)	×	—
Ana-hzo2r	hzo gene	Quan et al. (2008)
hzof1	hzo gene	Li et al. (2010)	×	—
hzor1	hzo gene	Li et al. (2010)

$ ^{*} $ PCR：增幅を確認（○），增幅せず（×）

*sequencing: anammox細菌と同定されたクローン数[コロニー]/シーケンシングを行ったクローン数[コロニー]

## 3 ）Anammox細菌の検出に向けた試み

## ① Pla46f-1392r

Pla46f-1392r PCR産物のシーケンシング結果からPCR産物から得たクローンが系統的にどのようなグループに属するのか調べた。各細菌の門への帰属結果を表25に示す。Pla46f-1392rはPlanctomycetes門を対象としたプライマーであるが他の門に属する細菌DNAも増幅していることが明らかになった。検出されたPlanctomycetes門に属さない微生物群のプライマーとの塩基の相補性にミスマッチはなく、水田に存在するPlanctomycetes門およびAnammox細菌を正しく理解するためには、これまで汎用的に利用されているこのプライマーセットでは不適であることが明らかになった。また、Anammox細菌に近縁なクローンを得ることは出来なった。

表25 Pla46f-1392rのシーケンス結果

phylum	獲得クローン数
Lentisphaerae	1
uncultured OP3	2
Planctomycetes	10
uncultured WS3	6
uncultured	1
Chloroflexi	2
Total	22
## ② AMX368f-AMX1480r

AMX368f-AMX1480r PCR産物のシーケンシング結果から、PCR産物から得たクローンが系統的にどのようなグループに属するのか調べた。解析した49のクローン全てがOP3という分類群に属することがわかった。この結果から使用したAMX368f-AMX1480rはこれまでの報告ではanammox細菌に特異的であると報告されていたが、水田に棲息する多種多様な微生物群のため、OP3のようなanammox、Planctomycetes門以外の細菌DNAを増幅する可能性があることが明らかになった。OP3はPlanctomycetes / Verrucomicrobia / Chlamydiaeのsuperphylum（門と綱や亜綱以下のグループの間に位置する分類群）にあたり、海底底泥、高塩環境の深海、淡水湖、帯水層、メタン生成バイオリアクター、水田土壌などの嫌気的環境で見つかっているとの報告があるが、機能等について不明な部分が多い。得られたクローン（OP3）とプライマーの間に配列違いは無く、クローン同士の相同性が高いことから、PCRで増幅されたのは殆どがOP3であったのではないかと考えられる。

## ③ Brod541f-Brod1260rによる結果

クローン解析の結果、PCR増幅産物はMycobacterium, Actinobacterium（αプロテオバクテリア）等であることがわかった。これらの細菌種はBrod541f-Brod1260rRと2塩基程度の塩基配列の違いがあるが、PCRの条件設定が緩かったことによる非特異的な増幅が起きたものと考えられる。PCR条件の変更を行い、様々な条件で調査したが、クリアな増幅産物を得ることができなかった。

## ④ nested PCRを用いたAnammox細菌検出の試み

これまでの試みでは、1段階のPCRを行ってきたが、これまで既存の報告で他の自然環境で成功例があるプライマーセットが使えなかったため、nested PCRを試みた（Daleら(2009)）。Daleらの条件に加え、新たにアニーリング温度のタッチダウンを行うことを導入し表13、14に示してあるような条件でPCRを行い、ゲル電気泳動を行ったところ、ゲル状の正しい位置に増幅産物が得られた。この増幅産物を切り出し、クローニングを再度行った。クローニングで得られた系統樹を図24に示す。

A

B

図24 nested PCRで増幅された16S rRNA遺伝子の系統樹 (A) 無根系統樹；(B) 有根系統樹 (1st round: Pla46f-1037r; 2nd round: amx368f-amx820r)

得られたクローンは新規な分類（クラスター）を形成した。また、既存のAnammox細菌に近縁な種類は検出されなかった。この3つのクラスターは進化の系統的にこれまでのクローニングで得られ
れたPlanctomycetesとは全く異なるものであり、これまで発見されているAnammoxのクラスターに近い（図24(B)）。未知の種類のAnammox反応を持った細菌と100％断定することはできないが、Anammox反応を担う新規の細菌群である可能性が考えられる。水田のイネ根圏に棲息するPlanctomycetes門に属する窒素除去を担う細菌群はこれまで知られていた既知のAnammox細菌とは異なる種類である可能性が示唆された。

## 4 ）脱窒性メタン酸化細菌の検出に向けた試み

## ① 系統解析

作成した系統樹を図25に示す。図25では今回獲得したクローンでNC10門細菌に分類されたものを太字で示してある。

系統解析により、解析済み全27クローン中5クローンがNC10門細菌に分類されることが確認できた。したがって、定量はこの時点では行っていないものの、脱室性メタン酸化細菌の検出に成功した。これらのクローンはこれまでオランダや日本で報告されている脱室性メタン酸化細菌（NC10門）と97%以上の塩基配列の相同性を示し、同じ種であることが示された。しかし、今回使用したプライマーセット8F-1043Rでは、NC10門細菌に分類されない種類も多く検出されており、残り22クローンはChloroflexi門細菌に属する未培養の細菌などとの相同性が高いという結果であった。in silicoの解析では、これらのクローンのDNA塩基配列は、プライマーと相補性が完全に保たれており、本研究で対象とする水田土壌では従来のプライマーでは不適であることが示唆された。

図 25 NC10 門細菌の系統樹

## ② 新規16S rDNAプライマーの設計

以上の結果から、既往のプライマーでは、飼料イネ水田土壌に棲息するNC10門細菌の定量PCRを行う際に、非特異的増幅による定量の過大評価に繋がる恐れがある。さらに、8F-1043Rでは、塩基長が1000 bpになり、定量PCRに適用するには非常に困難である。そこで、NC10門細菌の16S rRNA系統解析結果およびgene bankのデータベースを基に遺伝子解析ソフトARBを用いてNC10門細菌に特異的な遺伝子配列を抽出、NC10門細菌定量用の新規プライマーセット（表26）作成した。
表 26 設計した NC10 門細菌定量用プライマー

Name	Sequence (5' to 3')
193F	GGRGGAYCAAAGGGGGCGAG
616R	ACGCGGRTCCTCGGTTRAGC

$$ \mathrm{R}=\mathrm{A}/\mathrm{G},\mathrm{Y}=\mathrm{C}/\mathrm{T} $$

この2つのプライマーセットでの塩基の相補性を確認したところ、現在登録されているNC10門細菌の9割以上を検出可能であり、8F-1043RのプライマーセットでサブクローニングしたNC10門に属さない細菌群はin silicoでForwardおよびReverseプライマーにおいて塩基の相補性は3ミスマッチ以上であることから、プライマーとして適している可能性が示唆された。

## ③ 新規16S rDNAプライマーのNC10門への特異性評価

実際に新たに設計したプライマーの特異性を調査するために、193F-616RのプライマーによりPCRを行い、増幅したDNAの電気泳動を行った。このときに、ポジティブコントロールとして、8F-1043Rにより増幅させたクローン（in silicoで新規プライマーとの相補性のミスマッチは0）、ネガティブコントロールとして8F-1043Rにより獲得したNC10門に帰属しないクローン（in silicoで新規プライマーとの相補性のミスマッチは4ミスマッチ）を水田土壌からDNA抽出したサンプルおよび水により評価した。得られた電気泳動の結果を図26に示す。図26に示すように、標準DNAおよび土壌サンプルについては特異的な増幅を確認、またネガティブについては増幅がないことを確認した。また、増幅されたDNAの塩基長は理論値である443 bpでほぼ一致しており、正しい位置にDNAバンドが検出されたといえる。

図 26 PCR 産物（193F-616R）の電気泳動
次に、図26において水田土壌からのDNAサンプルのバンドを切り出し、このDNAをサブクローニングして、塩基配列を同定後、16S rRNA系統解析を行い、系統樹を作製した。サブクローニングで合計40のクローンを獲得して、塩基配列の同定を行った。クローニングにはpGEM-T Easy Vector (Promega)を使用し、Macrogen Japanに解析を委託した。シークエンスの結果から、獲得したクローンの16S rRNA遺伝子配列に基づく系統解析を行った。作成した系統樹を図27に示す。

表 27 サンプルデータ

サンプリング日	深さ[cm]	窒素負荷[mg-N/ha]
2011/9/27(3回目追肥後)	0-2	600 (3回分)

図 27 8F-1043R と 193F-616R PCR 産物の系統樹

解析を行った全40 cloneがNC10門に帰属し（図28）、従来のプライマーセットのような非特異的増幅は見られなかった。また、今回新たに設計したプライマーセットで検出されたNC10門に属する脱室性メタン酸化細菌は8F-1043Rと近縁であり、プライマーの違いによる種レベルでの帰属の相違は見られなかった。以上の結果より、設計したプライマーを用いることにより、特異的に水田土壌に棲息するNC10門細菌を検出することが可能になった。
## ☐ = 水田土壌サンプル

図 28 解析した全 40clone を含む系統樹

また、得られたクローンをポジティブコントロールとして、定量PCRにより検量線を作成した。得られた結果を図29に示す。

図 29 検量線（193F-616R）

以上の結果から、新規プライマーセット193F-616Rが定量PCRに実用可能であることが示された。今後の定量PCRのツールとして、適用していくことが可能で、メタンフラックスとの相関を定量的に議論できる。
## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

水田土壌においてAnammox反応を担うとされる細菌群は水の浸透速度および植栽の有無に対して微生物生態が大きく変動することが明らかになった。一方で、畜産排水の液肥である施肥の負荷の違いはPlanctomycetes門の微生物生態構造に大きな違いを及ぼさなかった。このような操作因子に対する微生物生態構造の変遷を追跡できたことは学術的に大きな成果と考える。

水田土壌は多様性が非常に高く、これまでAnammox細菌を検出可能なプライマーの単純な利用ではAnammox細菌の検出は困難であることが確認された。これは、水田におけるAnammox細菌の同定に関する研究報告が皆無であることに関連している。そこで、Nested PCRを用いて検出手法を改良することにより、上記の問題を克服し、Anammox細菌に近縁なこれまでに知られていないPlanctomycetesを検出することに成功した。これまで検出されていない未知な分類を見出したことは微生物生態学にも新規性を有する成果であると考えている。

さらには、脱室とメタン酸化を同時に行う脱室性メタン酸化細菌の検出および定量用のプライマーを設計およびその特異性の評価を行った。これにより、

## （２）環境政策への貢献

## ＜行政が既に活用した成果＞

該当なし。

## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

現在のところ、環境政策への貢献はなされていないが、新規Planctomycetesの種類を同定したこと、また畜産排水を施肥する水田内の脱室性メタン酸化細菌を定量可能なプライマーを開発できた。これにより、水田土壌中のAnammox反応やメタン酸化を担っていると考えられる細菌群の定量が容易になり、この細菌群の密度に基づいた温室効果ガス放出を削減しつつ畜産排水除去を行える水田管理の方針を見いだせると考えている。

### 6. 国際共同研究等の状況

国際共同研究計画・協力案件：窒素除去に関与する新規微生物群の同定・定量

カウンターパート氏名：Barth F. Smets

所属： Department of Environmental Engineering, Technical University of Denmark

参加・連携状況：現在は微生物定量用のサンプルの提供および意見交換を行っている。今後、新規微生物群の定量等に関するディスカッションを行う予定である。

国際的位置づけ：カウンターパートの所属する大学はヨーロッパ有数の環境工学科を有し、自然環境および排水処理における新規微生物群の利用を行っており、今後の意見交換により、研究の進展が加速することを期待している。

### 7. 研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

## <論文（査読あり）>

1) A. TERADA, S. ZHOU and M. HOSOMI: Clean Technol. Environ. Policy 13, 6, 759-781
“Presence and detection of anaerobic ammonium-oxidizing (anammox) bacteria and appraisal of anammox process for high-strength nitrogenous wastewater treatment: A review”

<査読付論文に準ずる成果発表>

特に記載すべき事項はない

くその他誌上発表（査読なし）>

特に記載すべき事項はない

## （2） 口頭発表（学会等）

1) 寺田昭彦、上村美羽、臼井陽菜子、崎山幸奈、西川恵美、大坂利文、常田聡、周勝、細見正明：第45回日本水環境学会年会（2011）

「畜産排水除去を志向した飼料イネ水田におけるPlanctomycetes門の生態構造解析」

2) 利谷翔平、周勝、小原裕三、寺田昭彦、細見正明：第45回日本水環境学会年会（2011

（3）出願特許

特に記載すべき事項はない

（４）シンポジウム、セミナーの開催（主催のもの）

特に記載すべき事項はない

（５）マスコミ等への公表・報道等

特に記載すべき事項はない

(6) その他

特に記載すべき事項はない

### 8 \. 引用文献

Amano et al. (2007): Microbes Environ. 22: 232-242.

Dale et al. (2009): Environ. Microbiol. 11: 1194-1207.

Freitag and Prosser (2003): Appl. Environ. Microbiol. 69: 1359-1371.

Li et al. (2010): Appl. Microbiol. Biotechnol. 86: 781-790.

Neef et al. (1998): Microbiology-UK 144: 3257-3266.

Penton et al. (2006): Appl. Environ. Microbiol. 72: 6829-6832.

Pynaert et al. (2003): Appl. Environ. Microbiol. 69: 3626-3635.

Quan et al. (2008): Environ. Microbiol. 10: 3130-3139.

Schmid et al. (2003): Syst. Appl. Microbiol. 26: 529-538.
## (3) イネ根圏に棲息する微生物群の空間分布と存在量に関する研究

東京農工大学 大学院工学研究院 応用化学部門 細見・寺田研究室

寺田昭彦

周勝

平成22～24年度累計予算額：7,005千円

（うち、平成24年度予算額：2,403千円）

予算額は、間接経費を含む。

新規Planctomycetes門に属する細菌群および脱窒細菌の定量を定量PCR法にて行った。上部土壤の高浸透系植栽を有する系で、3回目追肥後にPlanctomycete門の細菌数が増加し十倍以上になっていることが確認された。一方、土壤下部では高浸透450 kg-N/ha系を除く全ての系で土壤中のPlanctomycetes門が減少傾向にあった。また、低浸透系は高浸透系と比較して細菌数の減少が大きく、特に植栽のある系においては顕著であった。これらの定量結果から少なくとも高浸透系および田面水に近い作土層において酸素の供給が進み、窒素除去能の向上とAnammox細菌が属するPlanctomycetes門の細菌数の増大の相関関係が見出すことができた。さらに、イネ根圏に付着している微生物群の空間分布を蛍光in situハイブリダイゼーション法を用いて解析したところ、イネ根圏にアンモニアを好気的および嫌気的に酸化するアンモニア酸化細菌およびAnammox細菌が共存していることが明らかになった。

次に、脱室性メタン細菌、メタン酸化細菌とメタン生成古細菌のダイナミクスを実験圃場を用いて検討した。飼料イネの栽培途中における水の引き抜き期間（中干し）を行うことにより、温室効果ガスであるメタンを酸化する細菌群が中干しを行わない実験圃場の系と比較して有意に高い値が得られた。また、新しい水田管理方法である水を引き抜く（落水）を畜産排水の液肥を施肥する前に行い、液肥に含まれる有機物を好気的に分解させて、有機物がメタンに変換されることを抑制させる管理方法を用いると、メタンを生成するメタン生成古細菌の成長を大幅に抑制できることが明らかになった。以上より、水田の水管理は土壌中の微生物群の存在量に大きな影響を及ぼすことを明らかにした。

[キーワード] 畜産排水処理、蛍光in situハイブリダイゼーション法、生物学的窒素除去、嫌気性アンモニア酸化、定量PCR

### 1. はじめに

イネ根圏は大気からの吸収した酸素を根圏生物に供給する場であり、また、有機物を供給することが知られている。そこで、根圏に棲息している微生物群の定量を行うことにより、ポット試験で得られた窒素除去性能、脱室速度との関連を明らかにする。サブテーマ1で植栽した飼料イネポットのイネ根圏に棲息している微生物群、特にPlanctomycetes門の細菌群の定量を行うことによ
り、根圈でどんな反応が起こっているかのヒントを得ることができ、水田および根圈での反応メカニズムの解明につながると考えられる。これにより、Anammox反応を担うPlanctomycetes門と窒素除去の関係性の理解から、これらの細菌群の制御を行うための水田の管理指針を提示できることが期待される。

また、メタン酸化をめぐる微生物群の関係により、水田土壌中のメタン生成量を抑制できる可能性がある。図21に示したようにメタンをめぐる消費者・生産者のポピュレーションを追跡することは水田からのメタン発生を大幅に削減できる可能性がある。

### 2. 研究開発目的

定量PCR法および蛍光in situハイブリダイゼーション法を適用することにより、作土層およびイネ根圏の脱室細菌およびAnammox細菌が帰属するPlanctomycets門および脱室細菌の定量を行い、窒素除去性能との関連を評価した。さらに、イネ根圏の切片を作成し、イネに付着し棲息する微生物群の可視化と空間分布の観察を目指した。また、メタンをめぐる微生物（メタン酸化細菌、脱室性メタン酸化細菌、メタン生成古細菌）の定量を行い、各水田の管理方法の違いがこれらの微生物群のポピュレーションに及ぼす影響を評価した。

### 3. 研究開発方法

## 1 ）リアルタイム定量PCRによる土壤に棲息する微生物群の定量

表4に示すポットの土壌上部2 cmおよび下部2 cm以下から土壌を採取し、それをリアルタイム定量PCRに供試することにより、Anammox細菌が帰属するPlanctomycetes門の細菌群および脱窒細菌群の定量を行った。これまで報告されているAnammox細菌のプライマーセットによるPCRおよびクローニングによる細菌の同定において正確なAnammox細菌の定量ができなかったため、

Anammox細菌を含むPlanctomycetes門を検出することが可能なPla46f-518rのプライマーセットを用いてリアルタイム定量PCRを行い、Anammox細菌を含めたPlanctomycetes門全体の挙動を追跡することとした（表28）。一方、脱室細菌は系統学的に多様であることから、機能遺伝子（亜硝酸還元遺伝子（nirSおよびnirK））の定量を行った。リアルタイム定量PCRで用いた反応条件を表29に示す。検量線はバイオリアクターおよび環境サンプルから採取したAnammoxおよび脱室細菌由来のDNAを用いて行った。

表28 リアルタイム定量PCRに用いたプライマー

プライマー	プライマー標的細菌	プライマーの塩基配列(5'-3')	Reference
Pla46f	Planctomycetes	GGATTAGGCATGCAAGTC	Neef et al. 1998
518r	Bacteria	ATTACCGCGGCTGCTGG	Neef et al. 1998
nirS4Qf	nirS	GT(C/G)AACG(C/T)(C/G)AAGGA(A/G)AC(C/G)GC	Henry et al. 2004
nirS6Qr	nirS	GA(C/G)TTCGG(A/G)TG(C/G)GTCTT(C/G)A(C/T)GAA	Henry et al. 2004
nirK876f	nirK	AT(C/T)GGCGG(A/C/G)CA(C/T)GGCGA	Henry et al. 2004
nirK1040r	nirK	GCCTCGATCAG(A/G)TT(A/G)TGGTT	Henry et al. 2004
表29 PlanctomycetalesプライマーPla46f-518rおよび脱窒遺伝子プライマーのPCR条件

Temperature[ $ ^{\circ} $ C]	time [min:sec]
Step1	Pre-heating	94	5:00	40 Cycle
Denaturation	94	0:30
Step2	Annealing (Planctomycetes)	56	0:30
Annealing (nirS and nirK)	63 ( $ -1^{\circ} $ C/cycle) to 58	1:00
Elongation	72	5:00
Step3	Final extension	72	5:00
Melting curve	94

## 2 ） 蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）法によるイネ根圏の微生物の可視化

実水田（茨城県つくば市の農業環境技術研究所）より得られた根圏をパラホルムアルデヒドにて固定化した。次に、明らかに大きな土の塊を剥がし、イネ根圏をポリビニルアルコールで包埋し、クライオミクロトームにて氷結させた。その後、ミクロトームにより、30 μmの厚みを有する切片を作製した。その後、切片をAmannらの標準プロトコール（Amann et al. (1995)）に従ってハイブリダイゼーションを行い、蛍光顕微鏡または共焦点レーザー顕微鏡を用いてイネ根圏の微生物群の可視化を行った。FISH法で標的とした細菌はアンモニアを好気的に酸化するβ-Proteobacteriaに属するAOBのNitrosomonas属とNitrosospira属、また嫌気的に酸化する嫌気性アンモニア酸化細菌である。

## 3 ）メタンをめぐる微生物群の定量（平成23年度）

## ① 実験系とサンプル

2011年度の農業環境研究所（つくば）の実験圃場の水田土壌からサンプルを採取した。実験系を表30に、2011年度の現場実験実施状況を表31に示す。また、採取したサンプルに関する情報を表32に、水田の水質管理に関する時系列的な情報を図30に示す。

## ② 定量PCR

各微生物の遺伝子コピー数定量はCFX96 リアルタイムPCRシステム（Bio-Rad 社）によるreal time PCRによって行った。用いたプライマーセットを表33に示す。

表30 2011年度 実験系

系	窒素負荷
[kg-N/ha]	中干し
(2回目追肥後)	間断灌溉
(3回目追肥後)
S600	600	不十分（嫌気的）	落水日数3日
L600	600	十分（好気的）	落水日数6日

図30 各処理区における追肥後の灌溉管理とサンプリング（追肥の間隔期間）