Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
## 研究方法

### 1. 菌体の培養、PHB 生産の比較方法

Halomonas sp. KM-1 株と NBRC または、ATCC より購入したハロモナス菌間の生育を、栄養塩のみの SOT 培地とトリプトンなどを含む培地で比較した。

さらに、KM-1 株による PHB 生産の検討には、栄養塩のみからなる SOT 改培地を用い、適宜炭素源を添加した。また、窒素添加を行う場合には、24 時間目以降 12 時間おきに 2.5 g/L 相当の硝酸ナトリウム、または 0.875 g/L 相当の尿素を適宜追加した。木材糖化液には、SOT 改の組成と同じ塩加え、使用した。試験管通気培養の場合には、20ml 容の試験管に 5mL の培養液を入れ、33℃、135rpm 往復振とう、3 日間培養した。フラスコ・好気培養、微好気培養の場合には、200ml 容のヒダ付きフラスコに 20 mL の培地を入れ、33℃、200 rpm 回転振とうで好気培養を行った。適宜、微好気培養へ移行する場合には、回転数を 50 rpm に減じた。ファーメンターによる培養の場合は、DO20%で 60 時間程度培養し PHB を蓄積した後、DO0.5%以下(空気供給を停止)として培養し、3-ヒドロキシ酪酸を分泌させた。

### 2. バイオプラスチック PHB、3-ヒドロキシ酪酸の分析

バイオプラスチック PHB は、Ishizaki and Tanaka (1991) 及び Monteil-Rivera et al. (2007) の手法に従い、ガスクロマトグラフィーにより分析した。3-ヒドロキシ酪酸は、培養液を遠心分離して上清のみ分離、10 倍に水にて希釈して、これを示唆屈折角の検出器を備えた HPLC にて分析した。使用したカラムは、BIORAD 社アミネックス HPX-87H カラムを用い、溶離液 0.008N 硫酸、流速 0.6mL/min、カラム温度 35℃ にて分析したところ、おおよそ 8.7 分にグルコース、13.3 分に 3-ヒドロキシ酪酸がそれぞれ溶出した。

### 3. 電子顕微鏡観察

段階的な好気・微好気的条件で培養した場合の KM-1 株の微小形態の変化を、超薄切片電子頭微鏡法と電子線トモグラフィー法によって解析した。
電顕用超薄切片試料の作製と透過電子顕微鏡による観察は、常法に従って行った。

### 4. 木材糖化液の作成

木材糖化液の原料としてスギおよび広葉樹（ユーカリ・アカシア混合）からの糖化液を作成した。スギ糖化液の原料は、森林総合研究所の北秋田木質バイオエタノール製造実証施設でスギチップをソーダ・アントラキノン蒸解したスギパルプを次亜塩素酸ナトリウム、あるいはオゾンで漂白したものを用いた。広葉樹糖化液の原料は、製紙会社から提供して頂いた広葉樹クラフトパルプ（漂白済み）を用いた。パルプは、水で懸濁後、クエン酸でpH調整、滅菌し、糖化酵素を添加し、50℃で133時間回転攪拌して糖化し、濃縮した(Ikeda et al. 2009)。

## 結果と考察

## 結果

### 1 \. 木材糖化液の性状、組成について

木材糖化液は、褐色の液体で得られた。リグニンは検出できない程度に除去されていた。また、発酵を阻害する糖の変性物（ヒドロキシメチルフルフラール）なども検出できなかった。糖組成については、HPLC（Shodex SP0810 カラム）により分析した平均的な糖組成を表1に示す。

表 1 木材糖化液组成

Glucose	Manose	Xylose	C6 糖/C5 糖
スギ	89.4%	6.3%	4.2%	95.7/4.2
広葉樹(アカシア、ユーカリ)	84.3%	0.0%	15.7%	84.3/15.7

スギを原料とする場合は、グルコースのほかにマンノースとキシロースを含み、五炭糖は4.2%、広葉樹を原料とする場合は、グルコースとキシロースで構成され、五炭糖は15.7%
であった。糖化時間が短いものでは、セロビオースを数%含むものもあった。

スギを原料とした場合の1試料のマスバランス分析した結果、木材チップ1000kgから378kgの糖が生産できる計算となった。ここで糖製造時のロス分としてパルプ71kgとしたのは、糖化後の残渣除去時のロス分を計上してある。黒液は製造時に熱エネルギーと電気に使用するが、黒液の38%は余剰となるので、マテリアル利用などにも活用できる。

2．ハロモナス菌の培養、PHB生産性について

KM-1 株と、NBRC13 株、ATCC 2 株のハロモナス菌の生育を比較した。SOT 培地は、栄養塩と炭素源からなり NBRC306 培地、Marine Broth 培地は、栄養塩に加えてトリプトンや酵母エキスなどを含む。SOT 培地では、KM-1 株も含め 5 株のみが成育した。NBRC306 培地、Marine Broth 培地では、高塩濃度を生育に要求する H. subglaciescola NBRC 14766 $ ^{T} $ のぞき 14 種類のハロモナス菌が生育した。

SOT 培地で生育できる 4 種の菌株について、炭素源として 3% グリセロールを加え、試験管培養し、菌体重量、PHB の生産量を測定した。いずれも、22%以上の PHB の蓄積が得られ、特に KM-1 株は、34%以上の PHB を蓄積した。KM-1 株は、試薬のグルコース、グリセロールを用いた場合、PHB を乾燥菌体あたり 80%以上、培養液あたり 40g/L 以上の蓄積し、他のハロモナス菌はもとより、商業培養が検討されている菌株と比べても遜色ない生産性を示した。

3．ハロモナス KM-1 株によるバイオプラスチック PHB、3-ヒドロキシ酪酸の生産

好気条件で60時間まで培養した後、微好気条件(50 rpm)へ移行したものについて、菌体重量、PHB生産量、3-ヒドロキシ酪酸の生産量、残存する炭素源、さらに電子顕微鏡の撮影を実施した。窒素添加の有無、回数により、好気条件で蓄積したPHBを、微好気条件で分解、3-ヒドロキシ酪酸の分泌量が変化するを確認した。特に従来はPHB合成、分解に窒素が必要なことをはじめて明らかにした。さらに、初発濃度20%のグルコースを用いた場合、40 g/L以上の3-ヒドキシ酪酸の分泌が行えることを確認した。(図1)
## 好気、微好気培養での3-ヒドロキシ酪酸分泌生産

図１　好気、微好気条件での３-ヒドロキシ酪酸分泌生産

## 4 ．スギ木材糖化液を用いたハロモナス KM-1 株による 3-ヒドロキシ酪酸の生産

スギ木材糖化液を用い、ハロモナス KM-1 株による 3-ヒドロキシ酪酸の生産を調べた。好気条件の場合、木材糖化液を用い、硝酸ナトリウムを窒素源とした培養では、グルコースを用いた場合と比較し、半分程度の PHB の蓄積量を得た。特徴的なこととしては、グルコースの場合、蓄積した PHB の 35%前後の PHB 顆粒が菌体内に残存するのに対し、木材糖化液の場合は蓄積した PHB のほとんどが分解された。木材糖化液を用いて、窒素源を、硝酸ナトリウム、尿素、塩化アンモニウムで比較したところ、尿素の場合,硝酸ナトリウムの 1.4 倍程度の菌体重量、PHB 蓄積量が得られた。塩化アンモニウムの場合は生育が見られなかった(図 2)。この培養時には、木材糖化液中の糖は 36 時間目にすべて消費された。一方、微好気条件として、PHB を分解する過程では、微好気条件移行 12 時間前に窒素添加を行うことが、PHB の分解の促進に重要であることが判明し、その結果、3-ヒドロキシ
酪酸を、糖等量あたりグルコースに匹敵する20%程度の転換効率、分泌量21.1 g/L、生産効率0.35 g·L⁻¹·h⁻¹でスギ糖化液から生産することが可能となった。(図2) この条件により、木材糖化液に含まれる糖は、すべて消費され、主にPHBに転換された。転換されたPHBのほとんどは分解され、3-ヒドロキシ酪酸として分泌された。

図２ スギ糖化液での尿素の有効性

## 考察

木材の構成糖の5-30%をC5糖が占め、非可食バイオマスからのバイオエタノール生産においても、リグノセルロースに含まれるC5糖の有効利用が経済性を成立させる上で不可避の課題である。工業的に利用されている微生物の多くは、C5糖を利用することができず、C6糖のみが利用される。また、限られたC5糖を利用できる菌体でも、C6糖が優先して代謝される特性から、グルコースが優先的に消費され、その後C5糖が利用されることが報告されている。本ハロモナス菌は、C6糖存在下でもC5糖をC6糖とほぼ同じスピードで代
謝し、PHB の生産量も変化がない。このことは、工業的、学術的にも注目される。

本研究では、日本のバイオマス資源として有望なスギを利用し、実際にバイオプラスチック PHB 及び3-ヒドロキシ酪酸をハロモナス菌で生産した。バイオリファイナリーの構築は世界的な課題であり、実際の木材糖化液そのものを用いて、菌体を培養し、化成品を生産できたことは極めて有意義なことといえる。特に3-ヒドロキシ酪酸は、総培養時間60時間で21.1 g/Lを達成した（表2）。スギ糖化液中のほとんどの糖は36時間目には消費され、PHBへと転換されており、これは全炭素窒素分析装置でも確認された。現状ではこれ以上の生産量、生産性の向上は見込み難く、商業的な生産の目標値である生産量100 g/L、生産速度1.0 g/L・hは困難であった、そこで、PHB蓄積後の菌体を濃縮し、これから3-ヒドロキシ酪酸を分泌生産することを試みたところ、濃縮倍率に応じ、最大250g/Lの3-ヒドロキシ酪酸を分泌生産することに成功し、工業的な生産指標を達成した（図3）。

表2 3-ヒドロキシ酪酸の生産量の比較

3-ヒドロキシ酪酸生産量の比較

Organism	Carbon source	Procedure	(R)-3-HB (g/l)	Reference
Halomonas sp. KM-1	Glycerol	microaerobic condition Wild strain	15.2	本研究
Glucose	40.3
X-S-糖化液	21.1
Methylobaterium sp. ZP24	lactose	in vivo PHA depolymerization mutant	1.8	Nath et al. (2005)
Escherichia coli	glucose	recombinant (phbAB, ptb, buk)	12	Gao et al. (2002)
Escherichia coli	glucose	recombinant (phaCAB, phaZ)	9.9	Lee et al. (2003)
Escherichia coli	glucose	recombinant (phaCAB, phaZ)	7.3	Shiraki et al. (2006)
Escherichia coli	glucose	recombinant (phbAB, tesB)	12.2	Liu et al. (2007)
Methylobacterium rhodesianum MB 126	methanol	mutant (3HB dehydrogenase null, lipoic acid synthase null)	2.8	Hölscher et al. (2010)
Ralstonia eutropha	fructose	mutant (3HB dehydrogenase null)	3.1	Shiraki et al. (2006)
Azohydromonas lata	glucose	mutant (UV)	6.5	Ugwu et al. (2011)
Burkholderia cepacia	Wood extract hydrosate	Wild strain	16.8	Wang et al. (2014)
PHB蓄積後に遠心濃縮、微好気転換

→ PHB蓄積後の菌体は容易に沈殿

→ 原料糖の濃縮プロセスを不要に

→ 最大 250 g/L以上の3HB生産濃度達成！

図 3 PHB 蓄積後の濃縮、3-ヒドロキシ酪酸の分泌

## 環境政策への貢献

環境研究総合推進費・第7研究分科会・循環型社会形成・次世代廃棄物処理技術に示す循環型社会形成の推進及び廃棄物に係る問題解決に資する研究を実施するために、当研究では以下の課題の解決を目指す。

### 1. 森林資源の保護、育成

2. エネルギー以外への余剰バイオマス資源の有効活用、化石燃料資源の使用抑制

3. 循環型社会の促進のためのバイオプロセス・インフラの整備以下、それぞれの内容を簡潔に述べる。
### 1. 森林資源の保護、育成

日本では、国土の約26%、1000万haが人工林であり、花粉症に悩まされる人も多いスギが、過半を占める。多く人工林が間伐作業を必要とするが、木材価格の低下ゆえ、間伐作業のコストをまかないきれないのが現状である。2012年末、国の再生可能エネルギー政策の中で、未利用木材燃焼発電が、33.6円/kWに設定された。これは、木材チップ価格37,330円/ton（発電効率0.2の場合）、56,000円/ton（発電効率0.3の場合）に相当する。バイオエタノール生産の場合、現在の目標価格125円/kg（100円/L）、将来は50円/kg（40円/L）を目指しているが、現状では木材チップの原料価格だけで、バイオエタノールを目標価格の相当割合を占める。それゆえ、より高付加価値で、年間数千トン以上の生産スケールが期待される化学品の製造が求められている。そこで我々は、バイオプラスチックのモノマーである3-ヒドロキシ酪酸に注目した。関連する企業の想定により、本品の価格を1kgあたり約1000円、バイオプラスチック・ポリヒドロキシアルカネートの市場規模を30万トン以上と想定した。森林総合研究所プラントによる検討では、スギチップ1トンから368kgの糖を生産可能であった。スギ人工林のバイオマス年間生産量は1.9トン/haであるため、年間699kg/haの糖が生産できる。ハロモナス菌を含め微生物がバイオプラスチックを生産する糖収率が約20%なので、理論上は年間1haあたり140kgのバイオプラスチック、3-ヒドロキシ酪酸が生産でき、日本の人工林の約22%を使用すれば、年間30万トン程度のバイオプラスチックの生産可能であるため、経済性、市場規模ともに有望である。

### 2. エネルギー以外への余剰バイオマス資源の有効活用、化石燃料資源の使用抑制

現在日本に輸入される石油資源の約20％が、エネルギー以外の用途、主に化成品原料として利用されている。上記の推定では、人工林から年間1900万トンのバイオマスが生産される。現在取り組まれているバイオエタノール製造の場合には、第一段階と
して木材を粉砕し、その後これを酵素や酸で糖化し、微生物発酵によるエタノール生産が行われている。一方で、シェールガスなど非在来型の安価なエネルギー源が市場に供給されつつある現在では、木材からバイオエタノールより高価で、より高付加価値、かつ大量消費される材料、中間原料の生産が求められる。

木材の糖化液には、糖化プロセスに由来するフラン類やフルフラール類、酢酸など多くの微生物の増殖を抑制する物質が含まれており、通常の微生物でこれらの木材糖化液を利用する際には、これらの夾雑物の除去が課題である。

我々は、バイオマスの有効利用の観点から、木材糖化液の利用を検討した。通常の木材糖化液に含まれる濃度のフラン類やフルフラール類、酢酸を通常の培地に添加し、ハロモナス菌を培養した結果、ほとんど生育抑制が認められなかった。そこで、実際にいくつかの日本の人工林の代表種であるスギの糖化液に、直接栄養塩を加えて、培養し、バイオプラスチックPHB、3-ヒドロキシ酪酸の生産を確認した。純粋なグルコースに比べて80%程度の生育、50%程度のPHB、3-ヒドロキシ酪酸の生産が確認できた。将来、石油由来の脂肪族ポリエステルに替わるべく、生産性の向上をめざし、森林総合研究所と検討を進めた。

### 3. 循環型社会形成を促進するためのバイオプロセス・インフラの整備

日本に輸入される石油資源の約20%（約4000万KL）が、エネルギー以外の用途、主に化成品原料として利用されている。今後、これらを生成可能資源で生産することを考えた場合、この石油量に匹敵する量の確保が必要である。現在、日本で再生可能・バイオマス資源として検討されているものには、バイオディーゼルの原料である廃食用油、植物本体・リグノセルロースである農業残渣、木材などがあげられる。日本の食用油の総生産量が230万トン、うち廃食用油回収量45万トンと推定され(2006年環境省資料)、前述の、日本の人工林から年間1900万トンのバイオマスが生産されることか
ら、これらのバイオマス資源を用いて、化成品原料の半分程度を賄うことは可能である。しかしながら、これらのバイオマス資源は、そのままでは利用が難しく、リグノセルロースの場合、前段階の糖化プロセスを経て、ようやく化学プロセスやバイオプロセスの原料となるが、微生物の成育を阻害する夾雑物が生じる。

我々のハロモナス菌の場合、これらの糖化リグノセルロース(木材糖化液)、さらにバイオディーゼル廃グリセロールを、これらに含まれる夾雑物の影響を、ほとんど受けず利用可能である。さらに、リグノセルロースの5-30％を占めるキシロース、アラビノースなどのC5糖を直接利用可能である。塩を含み高アルカリ環境で生育するため、他の雑菌の混入も認めないため、現在検討している3-ヒドロキシ酪酸以外の化成品原料を製造するためのバイオプロセス・インフラとしてきわめて有望なものとして期待され、今後、適切な知財の確保に努めながら研究を進展させる。

## 研究成果の実現可能性

3-ヒドロキシ酪酸の機能については、脳幹、胎盤を通り、ヒトのエネルギー源として利用され、また、がん細胞には利用できないことはは従来知られていたが、最近、3-ヒドロキシ酪酸が、炎症を引き起こすタンパク質の一部「NLRP3」の発現を直接抑えることにより炎症性の病気、例えば、2型糖尿病、アルツハイマー病、アテローム性動脈硬化などの発生を抑制する可能性が、マウスを用いた実験で明らかになった(Youm et al., 2015)。それゆえ用途は、バイオプラスチックの合成原料のみならず、安全な生体のエネルギー物質として輸液や目薬の原料、また抗生物質の合成出発物質などとしての利用できる。10年以内の実用化を目指し、当初は販売価格の高い医薬品原料としての利用を目指す。その後、木材糖化プロセスも含め製造プロセスを改良し、微生物では合成が難しい超高分子、異種分子とのコポリマーなど、新たな物性を持ったポリマーを、現在の微生物ポリエステルの価格(1000円/kg)を目標に製造する。将来は、工業製造に適
したハロモナス菌の優位な点を生かして、他の化学基幹品の製造のインフラとして活用することも視野に入れ検討する。

## 結論

木材から3-ヒドロキシ酪酸(3-HB)の生産技術について、3-HBの生産性、メカニズム等について検討を行った。ハロモナス菌は、木材に含まれるキシロースなどC5糖の利用可能であり、培地の滅菌が不要で、安価な人工培地で生育が早いなど種々の商業的な培養に適した特性を持っている。3-ヒドロキシ酪酸の生産効率についても、十分商業的に成立するレベルに達しており、今後、糖化プロセスのコスト低減、培養プロセスのさらなる改善を経て、企業と共同で、早期の実用化が可能か検討を継続する。
### 1. 研究背景と目的

国内外で、非可食バイオマスからバイオエタノールの生産が進められている。非可食バ

イオマスの多くを占めるリグノセルロースは、グルコースなどのC6糖と、キシロース、ア

ラビノースなどの C5 糖からなり、通常のエタノール発酵酵母は C5 糖を利用できないため、

C5 糖の利活用が課題となっている。一方、日本では化成品製造を目的として、約 21% の石

油を消費しており、非在来型の石油、天然ガスの商業生産がはじまりつつあるが、早晚、

化石資源の石油から再生可能資源への転換が求められている。我々は、環境省・循環型社

会形成推進科学研究費補助金「ハロモナス菌を用いた BDF 廃グリセロール利活用によるバ

イオプラスチック PHA 生産」(平成 20～22 年)において、独自のハロモナス菌を、バイオ

ディーゼル廃グリセロールを炭素源に、好気条件下培養して、バイオプラスチック PHA

を生産することを成功した。さらに、プロジェクト終了後、PHAを生産、蓄積する好気条

件から、培養条件を微好気培養に変更するだけで、ハロモナス菌が蓄積したPHAを分解し、

そのモノマーである3-ヒドロキシ酪酸を培地に分泌することを見いだした。

本ハロモナス菌は、中程度高塩濃度、pH9-10の培地で良好に生育するため、雑菌の増殖

を認めず、培地の滅菌操作の必要がない。今後、未精製の炭素源を利用できること、省エ

ネルギーなプロセスであること、光学活性化合物が生産できること等の優位性を生かし、

スギ間伐材などの非可食の余剰バイオマス資源から3-ヒドロキシ酪酸などの化成品中間体

を生産する基礎技術を確立し、将来は、企業での事業化を通じて、持続可能社会実現に向

けた環境政策へ貢献する。具体的には、我々の発見した独自菌株ハロモナス KM-1 株を用

い、木材から3-ヒドロキシ酪酸等を生産する基礎技術を確立するため、商業的な生産の目

標値である生産量 $ 100 \, g/L $ 、生産速度 $ 1.0 \, g/L \cdot h $ の達成を目的に研究を実施した。
## 2 ．研究方法

我々の発見した独自菌株ハロモナス KM-1 株を用い、木材から 3-ヒドロキシ酪酸等を生産する基礎技術を確立するため、分泌量の向上、培養阻害物質への一層の耐性の向上をはかる。本年度は、商業的な生産の指標生産量 100 g/L、生産速度 1.0 g/L・h の達成を目的に研究を実施した。本目的を解決するため、以下の実験を実施した。

## 2 ．1 木材糖化液の調製

木材糖化液は、スギおよび広葉樹（ユーカリ・アカシア混合）パルプを原料として作成した。スギ糖化液の原料パルプは、森林総合研究所の北秋田木質バイオエタノール製造実証施設でスギチップをソーダ・アントラキノン蒸解したスギパルプを次亜塩素酸ナトリウム、あるいはオゾンで漂白したものを用いた。広葉樹糖化液の原料パルプは、製紙会社から提供された広葉樹クラフトパルプ（漂白済み）を用いた。

ソーダ・アントラキノン蒸解は1,4-dihydro-9,10-dihydroxyantraacene disodium saltを0.1%含む3.8%水酸化ナトリウム液に液量の20%のスギチップ（乾燥物換算）を混合し、パンディア式蒸解釜で168℃、2時間行った。黒液をプレス機で除去後、水洗し、スギパルプとした。

次亜塩素酸ナトリウム漂白は、スギパルプ（乾燥物換算）に対して活性塩素が3%量の次亜塩素酸ソーダを加えて18時間漂白し、再度水洗後、脱水して得た。オゾン漂白は、パルプ濃度10%とし、NaOHを対パルプ10%添加し、O₂ガス6 kg/cm²、90℃、60分処理を2回実施した後、リン酸でpH2.55にした後、常温でパルプに対し2%のオゾンで処理して作成した。

酵素糖化は3Lのバッフル付三角フラスコにパルプ固形分濃度3%から18%になるように投入し、イオン交換水で懸濁し、全量1Lとした。これをクエン酸でpH調整(pH5.0)後、滅菌し、糖化酵素としてGC220 (Genencoa) 5～8 FPU/g-pulpとNovozyme188 (Novo) 5
～10unit/g-pulp を 0.2μm フィルターで無菌ろ過して添加し、50℃で 40～336 時間回転攪拌して作成した。糖化液はオートクレーブで失活後、遠心分離で残渣を除き、必要に応じてロータリーエバポレータで濃縮した。

パルプ濃度 5% までは糖化率は 95% 以上となったが、パルプ濃度 10% では、糖化率 90% となり、パルプ濃度 18% では、糖化率 80% 程度に低下した。また、パルプ濃度の増加に伴って糖化時間を長くしなければ糖化率 80% に到達しなかった(Ikeda et al. 2009)。

## 2 ．2 菌体の培養（回分培養、半回分培養）

我々が取得した Halomonas sp. KM-1 株は、International Patent Organism Depositary, NITE に FERM BP-10995 として寄託した。他の、実験に使用したハロモナス菌は、NBRC (Chiba, Japan) または、ATCC culture collections (Virginia, USA) より購入した。菌株間の生育を、下記の 4 種の培地を用い比較した。

[1] SOT medium (pH 9.0、国立環境研究所 HP 参照)に、1%のグルコースを加えたもの

[2] SOT medium (pH 9.0) に、3%のグリセロールを加えたもの

[3] NBRC 306 medium (pH 7.0) NBRC のハロモナス菌の推奨培地 （ポリペプトン、酵母エキス含む）

[4] Marine Broth 培地 (pH 7.6) (Difco, USA) (ポリペプトン、酵母エキス含む)

[5] Marine Broth 培地 (pH 7.6) (Difco, USA) に、3% グリセロールを添加したもの。

さらに、Halomonas sp. KM-1 株による PHB 生産の検討の場合には、SOT medium を改変した以下の組成の培地 “SOT 改” を用い、これを基準とし、適宜炭素源を添加し、検討した。

また、木材糖化液を利用する際には、SOT 改の組成となる塩を、木材糖化液に溶解して使用した。微好気条件に移行する前に、窒素添加を行う場合は、2.5g/L 相当の硝酸ナトリウムまたは 0.875 g/L 相当の尿素を、微好気条件移行 12 時間前に添加した。
木材糖化液は、森林総合研究所が、森林整備効率化支援機械開発事業（林野庁）で建設した実証プラント(北秋田市)で、スギチップより生産されたもの使用した。

## SOT 改

$$ 12.6\ g/L\quad NaHCO_{3} $$

$$ 2.86mg/L\quad H_{3}BO_{3} $$

$$ 5.3\ g/L\quad Na_{2}CO_{3} $$

$$ 1.81mg/L\quad MnSO_{4}\cdot7H_{2}O $$

$$ 2.0\ g/L\quad K_{2}HPO_{4} $$

$$ 0.222mg/L\quad ZnSO_{4} $$

$$ 12.5\ g/L\quad NaNO_{3} $$

$$ 0.079mg/L\quad CuSO_{4}\cdot5H_{2}O $$

$$ K_{2}SO_{4} $$

$$ 0.39mg/L\quad Na_{2}MoO_{4}\cdot2H_{2}O $$

$$ 1.0\ g/L\quad NaCl $$

$$ 0.049mg/L\quad Co(NO_{3})_{2}\cdot6H_{2}O $$

$$ 0.2\ g/L\quad MgSO_{4} $$

$$ 0.04\ g/L\quad CaCl_{2} $$

$$ 0.01\ g/L\quad FeSO_{4}\cdot7H_{2}O $$

$$ 0.08\ g/L\quad Na_{2}EDTA\cdot2H_{2}O\quad pH\ 9.4 $$

## 試験管・好気培養

20ml 容の試験管に 5mL の培養液を入れ、33℃、135rpm 往復振とう、3 日間培養した。

フラスコ・好気培養、微好気培養

200ml 容のヒダ付きフラスコに 20mL の培地を入れ、33℃、200rpm 回転振とうで好気培養を行った。適宜、微好気培養へ移行する場合には、回転数を 50rpm に減じた。給気条件を検討する場合には、回転数を 100rpm、0rpm(静置)に変え実施した。

各試験は、3 回実施した。

## 添加する窒素の検討

窒素添加を行う場合には、12時間ごとに硝酸ナトリウムを、2.5g/L相当添加した。さ
らに、硝酸ナトリウムに加えて、尿素を用いた検討も実施した。尿素の場合は、2等量の窒素を含むため1／2モル相当を添加した。

## 2 ．3 ファーメンターによる培養試験

ファーメンターによる培養試験は、バイオット社微生物培養装置 BMZ-P を用いて行った。通常 1 L 容の培養槽に、400 mL の培地を添加し、滅菌せずに培養した。24 時間までは、DO30%、それ以降は 10% 程度に維持し、微好気培養の場合には、空気供給を停止し、攪拌のみを 200rpm で維持した。

## 2 ．4 バイオプラスチック PHB、3-ヒドロキシ酪酸の分析

バイオプラスチック PHB 及び 3-ヒドロキシ酪酸は、Ishizaki and Tanaka (1991) 及び Monteil-Rivera et al. (2007) の手法に従い、ガスクロマトグラフィーにより分析した。概略は以下の通りである。培養菌体サンプルは、基本的には 12 時間おきに 0.25 mL を採取し、必要に応じ、6 時間おきに採取し、20,400 g で 3 分遠心分離し、蒸留水を加え、懸濁、遠心、上清の除去を 2 回繰り返した。このサンプルを遠心乾燥機で 3 時間乾燥した。これを秤量後、メチルエステル化反応を行い、ガスクロマトグラフィー分析に供した。

3-ヒドロキシ酪酸の分析は、ガスクロマトグラフィーと液体クロマトグラフィーを用いて分析した。ガスクロマトグラフィーの場合、50 μL の培養上清液を、遠心乾燥機で 1 時間乾燥し、メチルエステル化反応を行い、同じくガスクロマトグラフィー分析に供し分析した（Ishizaki and Tanaka (1991) 及び Monteil-Rivera et al. (2007)）液体クロマトグラフィーの場合、培養液を遠心分離して上清のみ採取し、40 μL 程度を 10 倍に水にて希釈し、これを示唆屈折角の検出器を備えた HPLC（島津製作所製 示差屈折計検出器 RID-10A 型、または UV-VIS 検出器 SPD-20A システムコントローラ CBM-20ALite(JP)、送液ポンプ LC-20ADXR、7725I インジェクターASSY、カラムオー
ブン CTO-20A、ワークステーション LABSOL SINGLE LC)にて分析した。分析カラムは、BIORAD 社アミネックス HPX-87H カラムを用い、溶離液 0.008N 硫酸、流速 0.6mL/min、カラム温度 35℃にて分析したところ、おおよそ 7.9 分にクエン酸、8.7 分にグルコース、9.3 分にピルビン酸、12.1 分に乳酸、13.3 分に3-ヒドロキシ酸、14.9 分に酢酸がそれぞれ溶出した。

## 2 ．5 培地中の糖、有機酸の分析

糖組成は、キャピラリー電気泳動もしくは液体クロマトグラフィーを用いて分析した。キャピラリー電気泳動の場合、従来の手法(Zhang et al., 2003)に従い、1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolon (Wako, Osaka, Japan)を用いて、糖を修飾し、糖試薬(D-glucose、D-xylose、L-arabinose (Wako)を標準物質として分析した。液体クロマトグラフィーの場合、上記、3-ヒドロキシ酸の場合と同じく分析した。

## 2 ．6 全炭素窒素分析装置による培地上清の分析

培養液を遠心分離して上清のみ採取し、 $ 40\mu L $ 程度を10倍～100倍に水にて希釈し、これを、全窒素分析装置のついた全有機炭素計(島津製作所製TOC-LCSN)にて分析した。標準液の調整、キャリアガス圧力、電気炉温度等は標準の設定を用いた。

## 2 ．7 化学固定法による電子顕微鏡観察

電顕用超薄切片試料の作製と透過電子顕微鏡による観察は、常法に従って行った。東海電子顕微鏡株式会社の分析サービスを利用した場合のプロトコールは次のとおりである。細胞の化学固定（前固定）のために、室温において菌体を含む培養液に同体積の固定液（4％パラホルムアルデヒドと4％グルタルアルデヒドを含む0.1Mリン酸緩衝液、pH7.4）を加えた後、4℃での遠心によって菌体を沈降させ、別の固定液（2％グルタルアルデヒドと4％グルタルアルデヒドを含む0.1Mリン酸緩衝液、pH7.4）を加えた後、4℃での遠心によって菌体を沈降させ、別の固定液（2％グルタルアルデヒドと4％グルタルアルデヒドを含む0.1Mリン酸緩衝液、pH7.4）を加えた。
ルデヒドを含む0.1Mリン酸緩衝液、pH7.4）を加えて懸濁し4℃にて一夜固定処理を行った。次に、グルタルアルデヒドを除去するため、0.1Mリン酸緩衝液による洗浄（遠心操作）を3回行い、2%四酸化オスミウムを含む0.1Mリン酸緩衝液での処理（4℃、3時間）によって後固定を行った。試料の脱水を、エタノール水溶液の上昇系列（50%、70%、90%、100%）を通すことによって行い、試料をプロピレンオキサイド（PO）、POと樹脂（クエトール812、日新EM）の70:30混合液、そして100%樹脂の順番に移して樹脂浸透をさせた。樹脂重合は、60℃にて48時間の処理で行った。試料が包埋された樹脂ブロックをウルトラミクロトーム上でダイヤモンドナイフによって切り出し、得られた切片に2%酢酸ウランによる染色と鉛染色を施した。超薄切片を載せた電顕用グリッドを、透過電子顕微鏡（日本電子JEM-1200EX、加速電圧80kV）によって観察した。産業技術総合研究所において実施する場合には、以下の手法に従った。段階的な好気・微好気的条件で培養した場合のKM-1株の微小形態の変化を、超薄切片電子顕微鏡法と電子線トモグラフィー法によって解析した。

電顕用超薄切片試料の作製と透過電子顕微鏡による観察は、常法に従って行った。細胞を二重化学固定（グルタルアルデヒドと四酸化オスミウム）で処理した後、エポン樹脂に包埋した。2%酢酸ウラニルによるブロック染色を施した樹脂ブロックをウルトラミクロトーム上でダイヤモンドナイフによって約70nmの厚さで切り出し、得られた切片に.5%鉛染色による染色を施した。超薄切片を載せた電顕用グリッドを、透過電子顕微鏡（日立H-7600、加速電圧80kV）によって観察した。

電子線トモグラフィーによる菌体の三次元像の再構築のためには、上の方法で作製した樹脂ブロックから約600～1000nmの厚さの準超薄切片を切り出して観察に用いた。このように厚い試料では菌体が切り取られることなく一個の菌体全体が保存される可能性があるが、その厚さを通常の透過電子顕微鏡で撮像することは困難である。しかし、より透過性に優れた高角度環状暗視野走査透過型電子顕微鏡法（HAADF-STEM）では、
数百 nm の試料厚でも観察が可能になる。透過電子頭微鏡（FEI、TecnaiG2F20、加速電圧 120kV）の HAADF-STEM モードにおいて、KM-1 株の準超薄切片試料を ±60 度程度の試料傾斜角度内で 1 度ずつ回転させながら連続画像を取得した後、ソフトウェア Inspect3D（FEI）および Avizo5（MCS）を用いて三次元再構築計算と可視化処理を行った。

## 2 ．8 ゲノムDNAの調整

通常のゲノム DNA は、TaKaRa バイオ社の NucleoSpin $ ^{®} $ Tissue を用いて精製した。次世代シークエンサーに供したゲノム DNA は、TaKaRa バイオ社の NucleoBond AXG 20 を用いて精製した。

### 2.9 ゲノム解析

ゲノム DNA の濃度は、リアルタイム PCR 装置を用い測定した。50 μL の上清サンプルを脱塩のためにエタノール沈殿し、乾燥後、50 μL 蒸留水に溶解した。ハロモナス菌特異的な 16S rRNA シークエンス(DNA Data Bank of Japan, Japan) から、forward 832f プライマー (5'-TGGGTCCTTCGCGGACTTT-3') と、reverse 1016r プライマー (5'-CGTCTCCGAAGGGTTCGCAGG-3') を作成した。それぞれのプライマーは、大肠菌では、それぞれ 832-850、995-1016(E.coli 番号) の位置に相当する。

リアルタイム PCR 反応では、 $ 1 \mu L $ の上清サンプル溶液を、 $ 10 \mu L $ of $ 2 \times $ SYBR Green Realtime PCR Master Mix-Plus (Toyobo, Japan) および各 12 pmol の 832f と 1016r のプライマーと混合し、ミリ Q 水を加え $ 20 \mu L $ とした。ハロモナス菌のゲノム DNA をコントロールに、StepOne real-time PCR 装置 (Applied Biosystems, USA) を用いて通常のプロトコール (15 秒 $ 95^{\circ}C $ 、1 分 $ 60^{\circ}C $ で 40 サイクル) を行い、その後、熱変性ステップで、乖離カーブにより、増幅の特異性を確認した。
ゲノム遺伝子の解析は、各種検討を行った結果、次世代シークエンサーPacBio RS II

を用い、物理的に断片化した長鎖 DNA からライブラリーを作製して、1 分子リアルタイ

ム（Single Molecule Real-Time; SMRT）DNA シーケンスにより実施した。

## 2 ．10 ハロモナス菌遺伝子の情報解析(原核遺伝子予測)

シーケンスで得られたリードをシーケンサー付属のソフトウェア SMRT Analysis1

(RS_HGAP_Assembly.2) を用いて de novo アセンブルを行った。このゲノムドラフト

配列に対して、遺伝子予測解析（遺伝子領域予測およびアノテーション、コンティグの

整列化）を行った。

## 2 ．11 全RNAの調整

通常のゲノム DNA は、TaKaRa バイオ社の NucleoSpin $ ^{\circledR} $ RNA を用いて精製した。

トランスクリプトーム分析に供する場合は、Illumina 社の Ribo-Zero rRNA Removal Kit

(Bacteria)を用いて、リボゾーム RNA を除去し、分析に供した。

## 2 ．12 mRNA定量による遺伝子発現量の分析（リアルタイム PCR）

遺伝子の発現量は、ゲノム DNA から推定した遺伝子配列を元に、PHB 合成遺伝子

(PhaC)、PHB 分解遺伝子(PhaZ)、コントロールとして 16S リボゾーム RNA のそれぞれ

の RNA の発現量、cDNA をテンプレートにして、リアルタイム PCR 装置を用いて増幅

して測定した。それぞれの遺伝子のプライマーは、PHB合成遺伝子(PhaC) forward

(phaC-F: 5' -AACTTCGTCACCACCAACCC-3') および reverse (phaC-R: 5'

-GTTCTCGTAAACCACGTAGCC-3′), PHB 分解遗伝子(PhaZ) forward (phaZ-F: 5′

-ACAGTGGTCTCAACGAGTGG-3′) and reverse (phaZ-R:5′

-TGCTCATCAGTGCCTTGAC-3′)および、16S rRNA は、forward 832f プライマー
(5'-TGGGTCCCTTCGCGGACTTT-3') と、reverse 1016r プライマー(5'-CGTCTCCGAAGGGTTCGCAGG-3')を用いた。リアルタイム PCR 反応では、1μL の全 RNA サンプル溶液を、10μL of RNA-direct SYBR Green Real-time PCR Master Mix (TOYOBO 社)および各 12 pmol の各プライマーを混合し、ミリ Q 水を加え 20μL とした。ハロモナス菌のゲノム DNA をコントロールに、StepOne real-time PCR 装置 (Applied Biosystems, USA) を用いて通常のプロトコール (15 秒 95°C、15 秒 55°C、45 秒 74°C で 45 サイクル)を行い、その後、熱変性ステップで、乖離カーブにより、増幅の特異性を確認した。それぞれの発現量を 16S リボゾーム RNA の発現量で標準化して比較した。

## 2 ．13 mRNA定量による遺伝子発現量の分析（トランスクリプトーム解析）

上記手法で、精製したmRNAの品質検定を実施した後、TruSeq Standard mRNA Sample Preparation Guide Rev. E(イルミナ社)に従い、TruSeq Standard mRNA LT Sample Prep Kit(イルミナ社)を用いて、ライブラリーの作成を行った。すなわち、mRNA解析検体を断片化し、ランダムプライマーを用いて一本鎖cDNAを合成し、これを鋳型としてdUTPを取り込ませた二本鎖cDNAを合成し、磁気ビーズ法でサイズ選抜を行った。これにindex付きアダプターを付加し、dUTPを含む鎖を選択的に増幅しない位ポリメラーゼによりPCR増幅し、得られたPCR産物を精製して、シークエンスライブラリーとした。これをAgilent2100Bioanalyzerにて分析し、適切な鎖長分布を示したので、HiSeq2000を用いてシークエンス解析を行った。これによって得られたリード配列から、ERANGE3.2を用いて、個々の遺伝子の発現量と新規発現候補領域を決定し、それぞれを比較して、注目している遺伝子の発現量を確認した。
2．14 ガスクロマトグラフィー質量分析装置を用いたメタボローム解析

ガスクロマトグラフィー質量分析装置(GC-MS)を用いたメタボローム解析は、以下の手

法で実施した。培養液を $ 500 \mu L $ 採取し、速やかに氷上にて 30 秒冷却する。その後、 $ 4^{\circ}C $ 、

20,400 g で 3 分遠心分離し、上清と菌体を分離する。菌体に、氷冷した蒸留水 1.0 mL を

加え、懸濁、遠心、上清の除去を２回繰り返した。これに、-30℃のメタノールを1.0 mL

加え、懸濁、さらに-30℃のクロロホルム 1.0 mL と氷上で冷却した蒸留水 1.0 mL を加え、

4℃、20,400 g で 10 分遠心分離した。上層 1.5 mL をバイヤルに移し、濃縮乾燥機でメタ

ノール分を除去し、さらに、凍結乾燥を行った。乾燥したサンプルに、20 mg/mL

methoxyamine hydrochloride (Sigma-Aldrich)のピリジン溶液 50 μL を加え、30℃で 90

分間オキシム化反応を行った。さらに、1% trimethylchlorosilaneを含む

N-methyl-N-trifluoroacetamide (MSTFA) (Thermo, USA)を100 μL加え、37℃で30分

TMS 化反応を行った。

反応後のサンプルを、GCMS-QP2010 Ultra system (Shimadzu)にて分析した。分析条

件は、fused silica capillary column (CP-SIL 8 CB low bleed/MS, 30 m × 0.25 mm i.d.,

film thickness, 0.25 μm; Technologies, USA)を用い、front inlet 温度 230°C、ヘリウム

ガス流速 1.0 mL/min、injector split ratio 1:25、injection volume 1.0 μL、solvent delay

4 分で行った。Injector および source 温度は、それぞれ $ 250^{\circ} $ C、 $ 200^{\circ} $ C に設定した。

カラム温度は、 $ 80^{\circ} $ C で 2 分保持した後、 $ 15^{\circ} $ C/分で、 $ 330^{\circ} $ C まで昇温し、その後、6

分間保持 $ 330^{\circ} $ C で保持した。質量分析装置は、electron impact ionization mode で 70 eV

で測定した。データは、full scan mode で、m/z 85 から 500、scan time 0.05 秒 で測定

した(Tsugawa et al., 2011)。

取得したデータは、ピーク分析の前に、MetAlign software にてノイズ除去を行った。カ

ラムや TMS 化試薬に由来するピークはすべて除去した。定量分析のために、21 種類の化

合物について標準品を用いて分析した。内部標準 ribitol を用いて、それぞれの化合物を定
量した。

## 2 ．15 キャピラリー電気泳動質量分析装置装置を用いたメタボローム解析

キャピラリー電気泳動質量分析装置装置(CE-MS)を用いた代謝物の解析は以下の手法で行った。GC-MSの分析手法と同じく、菌体の回収、洗浄を行った。その後、速やかに、メタノール1.6 ml、クロロホルム1.6 ml、さらに蒸留水0.64mlを加え、20,400 gで5分遠心分離を行い、上清を回収、乾固させ、再度蒸留水に溶解して、菌体サンプルとした。培地のサンプルの場合は、培地上清を限外ろ過し、培地サンプルとした。

キャピラリー電気泳動 TOF-MS 分析は、Agilent 社 CE-TOF MS system（Agilent Technologies）の装置で、fused silica capillary column (80 cm x 50 μm i.d.) を用いて、陽イオンモード、陰イオンモードで分析した。

## 2 ．16 ラットによる乾燥菌体、3-ヒドロキシ酪酸の経口毒性試験

ラットによるハロモナス菌乾燥菌体、3-ヒドロキシ酪酸の経口毒性試験は、3-ヒドロキシ酪酸の急性毒性試験と、ハロモナス菌乾燥菌体、3-ヒドロキシ酪酸の亜急性毒性試験をそれぞれ実施した。3-ヒドロキシ酪酸の急性毒性試験の場合には、各群につき雌雄それぞれ5匹を用い、投与前に約18時間試験動物を絶食させた。体重を測定した後，試験群には2000mg/kgの用量の検体を，対照群には注射用水をそれぞれ20mL/kgの投与容量で胃ゾンデを用いて強制単回経口投与した。観察期間は14日間とし，投与日は頻回，翌日から1日1回の観察を行った。投与後7及び14日に体重を測定し，t-検定により有意水準5％で群間の比較を行った。観察期間終了時に動物すべてを剖検した。ハロモナス菌乾燥菌体、3-ヒドロキシ酪酸の亜急性毒性試験の場合には、ハロモナス菌乾燥菌体及び3-ヒドロキシ酪酸を注射用水にそれぞれ懸濁及び溶解し、0（媒体）、各被験物質それぞれ1000及び2000mg/kg/日の投与量で計5群、6週齢のCrl:CD(SD)SPFラット（1群雌雄各6匹）に、投与容量10mL/kg体重とし、4週間胃ゾンデを用いて強制経口投与し、その毒性を検討した。
## 3 ．研究結果と考察

## 3 ．1 木材糖化液の性状、組成について

木材糖化液は、褐色の液体で得られた。リグニンは検出できない程度に除去されていた。また、発酵を阻害する糖の変性物（ヒドロキシメチルフルフラール）なども検出できなかった。糖組成については、HPLC（Shodex SP0810 カラム）により分析した平均的な糖組成を表1に示す。

表 1 木材糖化液組成

Glucose	Manose	Xylose	C6 糖/C5 糖
スギ	89.4%	6.3%	4.2%	95.7/4.2
広葉樹(アカシア、ユーカリ)	84.3%	0.0%	15.7%	84.3/15.7

スギを原料とする場合は、グルコースのほかにマンノースとキシロースを含み、五炭糖は4.2%、広葉樹を原料とする場合は、グルコースとキシロースで構成され、五炭糖は15.7%であった。糖化時間が短いものでは、セロビオースを数%含むものもあった。

スギを原料とした場合の1試料のマスバランスを図1に示す。木材チップ1000kgから378kgの糖が生産できる計算となった。ここで糖製造時のロス分としてパルプ71kgとしたのは、糖化後の残渣除去時のロス分を計上してある。黒液は製造時に熱エネルギーと電気に使用するが、黒液の38%は余剰となるので、マテリアル利用などにも活用できる。
図１ スギを原料とした場合の試料のマスバランス

## 3 ．2 ハロモナス菌の培養、PHB生産性について

我々が取得した Halomonas sp. KM-1 株と、NBRC 13 株、ATCC 2 株のハロモナス菌の生育を比較した(表 2)。SOT 培地は、栄養塩と炭素源からなり、NBRC306 培地、Marine Broth 培地は、栄養塩に加えてトリプトンや酵母エキスなどを含む。SOT 培地
では、KM-1 株も含め 5 株のみが成育した。NBRC306 培地、Marine Broth 培地では、高塩濃度を生育に要求する H. subglaciescola NBRC 14766 $ ^{T} $ のぞき 14 種類のハロモナス菌が生育した。まず、市販されている Marine Broth 培地を用いて、試験管培養にて 33℃、3 日間培養して、それぞれの菌体重量、バイオプラスチック PHB の生産量を測定した(表 3)。菌体重量に差はあるものの、いずれも PHB の生産は認められなかった。そこで、Marine Broth 培地に 3% グリセロールを炭素源として加え、菌体重量、バイオプラスチック PHB の生産量を測定した(表 3)。結果、15 種類のうち 8 種類が 10% 以上の PHB の蓄積を認め、KM-1 株を含む 4 株は 20% 以上の PHB を蓄積した。さらに、SOT 培地での生育が芳しくない H. halomophilia NBRC 15537 $ ^{T} $ をのぞいた 4 種類の SOT 培地で生育できる菌株について、炭素源として 3% グリセロールを加え、試験管培養にて 33℃、3 日間培養して、同じく菌体重量、バイオプラスチック PHB の生産量を測定した(表 4)。いずれも、22% 以上の PHB の蓄積が得られ、特に KM-1 株は、34% 以上の PHB を蓄積した。さらに、KM-1 株について、SOT 改培地を用い、フラスコ培養にて、菌体重量、バイオプラスチック PHB の生産量を測定し、文献の報告値と比較した(表 5、6)。KM-1 株は、試薬のグルコース、グリセロールを用いた場合、PHB を乾燥菌体あたり 80% 以上、培養液あたり 40g/L 以上の蓄積し、他のハロモナス菌はもとより、商業培養が検討されている菌株と比べても遜色ない生産性を示した。さらに、バイオディーゼル廃グリセロールを直接培地に混入した場合でも 15g/L 程度の生産性を示した(表 5)。
Observation of the Growth of Halomonas Strains in Different Media

Culture media	SOT with 1% Glucose	SOT with 3% Glycerol	NBRC306	Marine Broth
Halomonas sp.KM-1	+	+	+	+
H. campisalis ATCC 700597 $ ^{T} $	+	+	+	+
H. meridiana NBRC 15608 $ ^{T} $	+	+	+	+
H. pantelleriensis ATCC 700273 $ ^{T} $	+	+	+	+
H. halomophilia NBRC 15537 $ ^{T} $	±	±	+	+
H. aquamarina NBRC 101894 $ ^{T} $	-	-	+	+
H. cupida NBRC 100987	-	-	+	+
H. cupida NBRC 102219 $ ^{T} $	-	-	+	+
H. elongata NBRC 15536 $ ^{T} $	-	-	+	+
H. halodenitrificans NBRC 14912 $ ^{T} $	-	-	+	+
H. halophila NBRC 102604 $ ^{T} $	-	-	+	+
H. pacifica NBRC 101900	-	-	+	+
H. pacifica NBRC 102220 $ ^{T} $	-	-	+	+
H. variabilis NBRC 102410 $ ^{T} $	-	-	+	+
H. venusta NBRC 102221 $ ^{T} $	-	-	+	+
H. subglaciescola NBRC 14766 $ ^{T} $	-	-	-	-

Bacterial growth was indicated by mark as negative (-), positive (+), and weakly positive (+/-). All of the observations were repeated at least twice.

表 3 各種ハロモナス菌のマリンブロス培地による生育、PHB 生産量

Production of the Bioplastic, poly(3-hydroxybutyrate), by Halomonas Strains 1

Culture medium	DCW (mg/ml)	PHB (%) in DCW
Halomonas sp. KM-1	Marine Broth	0.72 ± 0.09	0.0 ± 0.0
H. campisalis ATCC 700597 $ ^{T} $	Marine Broth	0.68 ± 0.12	0.0 ± 0.0
H. meridiana NBRC 15608 $ ^{T} $	Marine Broth	0.82 ± 0.05	0.0 ± 0.0
H. pantelleriensis ATCC 700273 $ ^{T} $	Marine Broth	0.37 ± 0.01	0.0 ± 0.0
H. halomophilia NBRC 15537 $ ^{T} $	Marine Broth	0.34 ± 0.08	0.0 ± 0.0
H. aquamarina NBRC 101894 $ ^{T} $	Marine Broth	0.28 ± 0.07	0.0 ± 0.0
H. cupida NBRC 100987	Marine Broth	1.03 ± 0.06	0.0 ± 0.0
H. cupida NBRC 102219 $ ^{T} $	Marine Broth	0.79 ± 0.10	0.0 ± 0.0
H. elongata NBRC 15536 $ ^{T} $	Marine Broth	0.42 ± 0.08	0.0 ± 0.0
H. halodenitrificans NBRC 14912 $ ^{T} $	Marine Broth	0.25 ± 0.10	0.0 ± 0.0
H. halophila NBRC 102604 $ ^{T} $	Marine Broth	0.61 ± 0.04	0.0 ± 0.0
H. pacifica NBRC 101900	Marine Broth	0.44 ± 0.16	0.0 ± 0.0
H. pacifica NBRC 102220 $ ^{T} $	Marine Broth	0.64 ± 0.05	0.0 ± 0.0
H. variabilis NBRC 102410 $ ^{T} $	Marine Broth	0.77 ± 0.10	0.0 ± 0.0
H. venusta NBRC 102221 $ ^{T} $	Marine Broth	1.03 ± 0.08	0.0 ± 0.0

All of the observations were repeated thrice. Values indicated are means $ \pm $ standard deviation.