Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
本研究で得られたデータでは広域分布種であるS. leprosulaとS. parvifoliaはボルネオ島とその他の地域（スマトラ島とマレー半島）で明瞭に遺伝的に分化していた。産地識別はこの大きな地域では可能であることが示された。これは東南アジア地域が長期的な気候変動の結果、氷河期に陸続きとなり大きな大陸（スンダ大陸）となり、暖かくなった間氷期にまた隔離されるということを繰り返してきた結果、植物も氷期に異動していたことが考えられるが、少なくも最終氷期の頃には東南アジアは陸続きになっていたが、この2種はほとんど異動していないことを示している。またボルネオ島とその他の地域の遺伝的な違いは、葉緑体DNAの突然変異から推定すると数十万年以上前に形成された遺伝構造であると考えられる。

本研究結果から、これら遺伝的に異なる2つの地域はそれぞれ別に保全すべきで、S. leprosulaではマレー半島の北部やボルネオ島東部にユニークな葉緑体DNAハプロタイプが見られる。またS. parvifoliaではスマトラ島東部にユニークなハプロタイプが見られる。これらの地域は優先的な保全が必要である可能性がある。

## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

東南アジアの広域分布種であるS. leprosula及びS. parvifoliaの薬緑体DNAの解析結果で高い集団間分化がみられ、また核DNAのEST-SSRの解析結果でも遺伝的分化度は高くはないが、明瞭な遺伝構造が検出された。これら情報がS. leprosulaとS. parvifoliaの遺伝子資源としてのどの地域が重要であるかを明らかにでき、現在のフタバガキ科林の成り立ちに関する基礎的なデータが得られたことに大きな科学的意義がある。

## （２）環境政策への貢献

東南アジアの遺伝的多様性のあり方が明らかになってきており、今後の保全に向けての政策立案の資料として活用が期待される。本研究の結果は、これまで熱帯域の多様性保全機能やその成り立ちを、遺伝学的手法を用いて評価するための手法を確立した点において重要な成果をもたらした。様々な関係機関を通じ、成果の広報・普及に努める。

## 6 ．国際共同研究等の状況

この研究はすべてマレーシア森林研究所（FRIM）、ガジャマダ大学（UGM）及びゲッチンゲン大学（GU）との共同研究により行なわれた。

カウンターパート：Lee Soon Leong (FRIM), Kevin K. S. Ng (FRIM), Norwati Muhammad (FRIM), Mohamad Na'iem (UGM), Sapto Indrioko (UGM), Reiner Finkeldey (GU)

### 7. 研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

<論文（査読あり）>

1) K. K. S. NG, S. L. LEE, Y. TSUMURA, S. UENO, C. H. NG, C. T. LEE: Molecular Ecology Resources 9: 393-398(2009)
“EST-SSRs isolated from Shorea leprosula and their transferability to 36 species within the Dipterocarpaceae.”

NA'IEM, S. INDORIKO, K. K. S. NG, N. MUHAMMAD, and S. L. LEE: Journal of Plant Research 124:35–48 (2011)

“Molecular database for classifying Shorea species (Dipterocarpaceae) and techniques for checking the legitimacy of timber and wood products.”

3) M. OHTANI, S. UENO, N. TANI, L. S. LEE, Y. TSUMIRA: Conservation Genetics Resources (in press)

“Twenty-four additional microsatellite markers derived from the expressed sequence tags of an endangered tropical tree Shorea leprosula (Dipterocarpaceae).”

4) N. TANI, Y. TSUMURA, K. FUKASAWA, T. KADO, Y. TAGUCHI, S. L. LEE, C. T. LEE, N.

MUHAMMAD, K. NIIYAMA, T. OTANI, T. YAGIHASHI, A. B. RIPIN, A. R. KASSIM: Journal of Ecology (in press)

“Male fecundity and pollen dispersal in hill dipterocarps: significance of mass synchronized flowering and implications for conservation.”

5) S. MASUDA, N. TANI, M. OHTANI, Y. TSUMURA: Conservation Genetics Resources 2: 109-111 (2010)

“Characterization of 12 microsatellite loci for important tropical tree species Shorea maxwelliana and S. laevis (Dipterocarpaceae).”

## くその他誌上発表（査読なし）>

1) Tsumura, Y.: R. Wickneswari & C. Cannon (eds) Managing the Future of Southeast Asia's Valuable Tropical Rainforests: A Practitioner's Guide to Forest Genetics, pp57-68, Springer (2011)

“Gene Flow, Mating Systems, and Inbreeding Depression in Natural Populations of Tropical Trees.”

## （2） 口頭発表（学会等）

1) Tsumura, Y., M. Ohtani, N. Tani, S. Ueno, S. L. Lee, K. K. S. Ng, N. Muhammad, B. Diway, R. Finkeldey, E. Khoo, K. Kamiya, K. Harada, S. Indrioko, and M. Na'iem (2010) Plylogeographical study of wide-distributed tree species, Shorea leprosula, in Southeast Asia. International Symposium on Forestry and Forest Products 2010, October 5-7, Kuara Lumpur.

2) Tsumura, Y. (2011) Species and population identification of Shorea using molecular markers.

FRIM/JIRCAS Ecology and Genetics of dipterocarps, -its role in sustainable forest management, January 25-26, Genting Highland.

## （3） 出願特許

「特に記載すべき事項はない」
## （４）シンポジウム、セミナーの開催（主催のもの）

「特に記載すべき事項はない」

## （５）マスコミ等への公表・報道等

「特に記載すべき事項はない」

## (6) その他

「特に記載すべき事項はない」

### 8 \. 引用文献

1) Ashton PS (1982) Flora Malesiana. Series I-Spermatophyta. Flowering Plants Vol.9, part 2, Dipterocarpaceae. Martinun Nijhoff Publishers, The Netherlands.

2) Symington CF (1943) Malayan Forest Records No.16. Foresters' Manual of Dipterocarps. (Reprinted with plates and historical introduction, University of Malaya Press, Kuala Lumpur.
## （５）遺伝的劣化評価３－希少種および絶滅危惧種の解析(フタバガキの遺伝的変異)

$$ 九州大学 大学院 \quad 理学研究院 \quad 生物科学部門 $$

Alfred E. Szmidt

猪股伸幸（平成21-22年度）

<研究協力者>

$$ \begin{aligned}& 九州大学 大学院 \quad 理学研究院 \quad 生物科学部門 \quad 手島康介 \\& 九州大学 大学院 \quad 理学研究院 \quad システム生命科学府 \quad( 博士課程 )\quad 生命理学 \quad Wei Lun Ng\end{aligned} $$

平成21～23年度累計予算額：27,368千円

（うち、平成23年度予算額：8,131千円）

予算額は、間接経費を含む。

熱帯林の減少に伴う森林劣化の評価を行うために普遍種と希少種の遺伝的多様性を比較することを目的とする。本サブテーマでは、(1) Pinus krempfii（希少種）とPinus yunnanensis（普遍種）、(2) Shorea balangeran（希少種）とShorea leprosula（普遍種）、および(3) Myoporum bontioides（絶滅危惧種）の3グループを対象にして集団遺伝学的研究をすすめた。(1) Pinus 属の解析では10核遺伝子領域、11葉緑体SSR、14ミトコンドリア遺伝子領域の解析を行った。総じて希少種の遺伝的変異量は普遍種と比較して非常に低いという結果が得られた。(2) Shorea 属を用いた研究ではcDNAライブラリの構築を行った。159核遺伝子領域のPCRプライマーを設計し、増幅を確認した。また、普遍種であるShorea parvifoliaの遺伝的変異の解析を行い、その結果を論文にまとめている。(3) 絶滅危惧種であるMyoporum bontioidesを用いた研究では、日本のサンプルに加え、中国のサンプルを加えて解析を続けている。この種からは、ほとんど変異が観察されなかった。

## [キーワード] 希少種、絶滅危惧種、遺伝的多様性、SSR多型、塩基配列多型

### 1. はじめに

希少種や絶滅危惧種を保全し再生に導くためにはその森林の状態を正確に把握しなければならない。遺伝的変異の解析はそのための方法の一つを提供する。本サブテーマでは以下の3グループの樹木種を対象とし、希少種とそれに近縁な普遍種の遺伝的変異の集団遺伝学的解析を行った。

## （1） Pinus krempfii（希少種）と Pinus yunnanensis（普遍種）

Pinus krempfii（希少種）は1921年にベトナム南部山岳地帯で発見された針葉樹であり、高さ30-35mに達し、胸高直径は150-200cm以上になる高木である。Pinus krempfiiはマツ属の中で最も南に分布するというだけでなく、対称な平たい葉（幅約12mm、長さ約100mm）を持つという点においても特徴のある種である。特徴ある平たい針葉、放射仮道管の欠如、その他材の特徴などからマツ属の中でも独特の存在である。Pinus krempfiiは絶滅が危惧されている状態であり、その分布もカインホア（Khanh Hoa）およびラムドン（Lam Dong）の2省に限られている $ ^{10} $ 。他のマツ属の
種とは異なり純林を形成しない。標高1000から2000mの広葉および針葉の熱帯モンスーン林に混在し、小規模な群落または孤立する。自然状態におけるPinus krempfii林再生の頻度は非常に低いと言われている。生物学的および経済学的重要性にも関わらず、Pinus krempfii集団の遺伝的要請に関する情報は存在しない。種の遺伝的変異に関する情報は、この独特な種の保全および再生の方法を検討するためには不可欠である。

Pinus yunnanensis（普遍種）は中国南西部の雲貴高原に分布する。P. krempfii や他の熱帯性マツ科樹木（P. kesiya、P. merkusii）と異なり、山の斜面に広大な純林を形成する。20cmにも達する長いとげを持つことを除くと、形態的・組織的に典型的なマツ科の特徴を有する。

## （2） Shorea balangeran（希少種）とShorea leprosula（普遍種）

フタバガキ科のShorea属は東南アジアの熱帯雨林の林冠を構成する種である。およそ190種が存在し、南アジアと東南アジアのみに分布している。Shorea leprosula（普遍種）はマレー半島、スマトラ島、ボルネオ島の低地の熱帯雨林において林冠を構成する。Shorea balangeran（希少種）はインドネシアの湿地帯にのみ分布する。その分布域は人間の活動や山火事により減少している。

## (3) Myoporum bontioides (希少種)

Myoporum bontioides（ハマジンチョウ）は沿岸部に生育する常緑低木である。塩環境・岩礁に適応しているが塩環境以外でも生育する。種子は海流により散布される。九州・沖縄地方を含む日本南部から中国南部、台湾、ベトナムの熱帯域まで分布している。日本では環境省により絶滅危惧種に指定されている。日本において分布が限られている理由としては、この種の生育環境や気候が限られていることや近年の沿岸開発の影響などが挙げられる。この種は上記(1)(2)の2グループと異なり、対照とするのに適当な普遍種が存在しない。しかし、分布の中心である東南アジアの熱帯林の集団と日本集団とを比較することで、希少集団と普遍集団の遺伝的組成の比較を行うことが可能である。

## 2 ．研究開発目的

本サブテーマは、

(1) 希少種（絶滅危惧種）と普遍種が保有する遺伝的変異の量とパターンを明らかにすること

(2) 希少および絶滅危惧種が絶滅するリスクを遺伝的多様性データに基づいて推定すること

(3) 希少および絶滅危惧種の保全・管理・再生に向けた遺伝的データの利用を提案することを目的として研究を行う。

### 3. 研究開発方法

## （1） Pinus krempfii（希少種）と Pinus yunnanensis（普遍種）

本研究の中心的課題はP. krempfiiの遺伝的変異量を求めて、分集団間の分化を明らかにすることである。この目的のもと、我々は6自然集団からとられたサンプルの、合計10カ所の各遺伝子座、合計約9kbの領域の遺伝的変異について調査を行った。加えて、薬緑体マイクロサテライト(cpSSR)7遺伝子座およびミトコンドリアの遺伝子座（mtDNA）14カ所の配列も決定した。とくに分集団内の遺伝的変異の量を求め、分集団間の遺伝的分化の程度を明らかにし、この種における保全・管
理・再生を行うためのガイドラインを提唱することを目的として研究を進めた。

ベトナムの6カ所の自然林から採取されたP. krempfii 57個体の葉を用いた。サンプル地点は以下の通りである: Long Lnh (Da Chay 89A、Da Chay 90A, Da Chay 91A)、Cong Troi (Cong Troi 102、Cong Troi 103)、Tuong Da Nhim (Bidoup)。それぞれの集団の中からランダムに個体を選んだ。DNA抽出までのサンプルの保存にはシリカゲルを用いた。DNAは乾燥葉から改良されたCTAB法を用いて抽出された $ ^{8)} $ 。TaKaRa ExTag Polymerase（宝酒造）を用いてPCRを行った。PCRプロトコールはタッチダウンPCRとアニーリング温度を一定にしたPCRの2通りの方法を用いた。泳動の結果バンドが複数観察されたものに関してはゲルから切り出して精製を行った。ABI PRISM Big Dye Terminator v 3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems)を用いてシークエンス反応を行い、CleanSEQ (Agencourt Bioscience Corporation)を用いて精製した後、3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems)で配列の解析を行った。断片長に多型があったもの、ヘテロ接合体、増幅がうまくいかなかったものに関してはpGEM-T(Easy) Vector Systems (Promega)を用いてクローニングを行った後に解析した。いくつかの遺伝子座(4CL, TPP1, SOS27, IFG8612)ではダイレクトシークエンスの結果に基づきネストしたプライマーを設計して解析を行った。それぞれのサンプルの配列はATGC ver. 6 (Genetyx)を用いて補正し、アセンブルを行った。ClustalX $ ^{12)} $ を用いてアラインメントを行った後、BioEdit 7.0.5.2 $ ^{5)} $ を用いてマニュアルで修正をおこなった。領域内の遺伝的多様性はハプロタイプ多様度(Hd $ ^{9)} $ 、塩基多様度(π $ ^{9} $ , θ $ ^{13)} $ )を用いて測った。解析にはDnaSP ver. 5.10.01 $ ^{7)} $ を用いた。集団間の遺伝的分化はAMOVA $ ^{3)} $ を用いて行った。集団間の分化の程度はF $ _{ST}^{14)} $ を用いて測った。F $ _{ST} $ は遺伝的分散のうち、集団間の違いに起因する部分の割合を意味している。この統計量の検定は10,000回繰り返して行ったシミュレーションの結果を用いて行った。これら一連の解析にはArlequin v. 3.5.1.2 $ ^{2)} $ を用いた。

## （2） Shorea balangeran（希少種）とShorea leprosula（普遍種）

これら2種の多型解析は核遺伝子座を遺伝子マーカーとするが、その開発にあたり、EST解析と配列データベースをもとにしたプライマーの設計を行った。EST解析を行なうため、インドネシアで採集した2種の苗木と筑波植物園で栽培されているS. leprosulaの枝を採集し、RNA抽出を行った。抽出したRNAを用いて希少種と普遍種両方のcDNAライブラリを構築した。得られたライブラリに基づき、シロイヌナズナで保存されている領域の配列を参考にして、両種で共通して増幅するプライマーを設計した。最終的に159領域の核遺伝子領域のプライマーをデザインすることができた。

Shorea leprosula および Shorea balangeran の両種においてボルネオ島の2カ所でサンプリングを行った。それぞれの地点において15個体からサンプルを収集した。さらにDramagaの人工林からもサンプリングを行った。基本的に各個体から1-3枚の葉を取り、シリカゲルで乾燥させた。おおよそのサンプリング地点は図(5)-1に示す通りである。

乾燥させた薬からCTAB法を用いてゲノムDNAを抽出した。TaKaRa ExTag Polymeraseを用いて設計した核遺伝子マーカーのPCRを行った。吸光度を測定してPCR反応産物の濃度を定量し、サンプルごとにすべての反応産物等量混ぜ合わせた。サンプルごとにMIDタグをライゲートした後、Roche 454 sequencing system (Roche)を用いて配列の解析を行った。得られた配列データを解析して、塩基多様度（θ、π）の推定およびTajima's D $ ^{11} $ の値を推定した。さらに上記2種に加え、普遍種で
図(5)-1. 本研究で用いたShorea leprosulaおよびShorea balangeranのサンプリング地点

## (3) Myoporum bontioides（絶滅危惧種）

絶滅危惧マングローブ様灌木であるMyoporum bontioidesにおいて日本の8集団と中国1集団からサンプルを収集した。M. bontioidesの合計20カ所のマイクロサテライト（SSR）マーカーの両端にプライマーを設計し、確認を行った。まず、M. bontioidesのゲノムDNAを4カッター制限酵素(Sau3AI)で切断し、アダプターを接続した。ビオチン修飾した2塩基SSR（(AC) $ _{15} $ および(AG) $ _{15} $ ）を用いてSSRマーカーを含む配列をキャプチャーした。300の候補クローンの配列決定を行い、その中から最終的に29カ所のSSRマーカーを選抜しプライマーを設計した。実際のサンプルで確認を行ったところ、10マーカーは設計通り増幅し、マーカーとして用いることができることが確認された。残りのマーカーは増幅効率が悪いか、ゲノム中の複数の箇所を増幅することがわかったため使用しなかった。ジェノタイピングはABI3100シークエンサーを用いて行い、GeneMapper v4.0を用いて解析を行った。解析を行ったすべての集団サンプルにおいて10 SSR 遺伝子座のデータを収集した。さらに、葉緑体DNAの5カ所を増幅するプライマーを設計し、配列を解析した。

## 4 ．結果及び考察

## （1） Pinus krempfii（希少種）と Pinus yunnanensis（普遍種）

本研究はP. krempfiiの遺伝的変異について調べた初めての研究である。本研究以前にはプライマーを設計するために必要な配列情報も存在しなかった。本研究では、他のマツ科の種の配列情報を用いてP. krempfiiのプライマーを設計し、10コーディング領域、合計およそ9kbの解析を行った。ハプロタイプ多様度および塩基多様度を表(5)-1に示す。10遺伝子座のうち、最もハプロタイプ数が多かったのはCFX遺伝子座でその数は23であった。最も少なかったのはTPP1遺伝子座で3ハプロ
タイプであった。塩基多様度は0.0000から0.0059の間にあり、Bidoupに集団からとられたサンプルがすべての遺伝子座において最も高い塩基多様度を示した。遺伝子座ごとにみてみるとGSTG2遺伝子座が最も多様性が高く、4CL、Rav2およびTPP1をはじめとする7遺伝子座においてはほとんど多様性が観察されなかった。同義座位、非同義座位および非同義+非コード領域の変異量についても表(5)-1に示してある。概して非コード領域の変異量はほとんどの遺伝子座において非常に小さかった。

表(5)-1 核遺伝子座の遺伝的変異 (4CL, CFX, GSTG1)

Locus	Populations	n	S	h	Hd	Pi(n)	Theta (θw)	Pi(n)	Theta (θw)	Pi(n)	Theta (θw)	Pi(n)	Theta (θw)	Tajima's D test
Synonymus	Synonymous	Nonsynonymous	Nonsynonymous	Silent	Silent	Total	Total
4CL	Da Chay 90A	26	5	4	0.3450	0.0022	0.0051	0.0001	0.0004	0.0009	0.0022	0.0005	0.0012	-1.7092 $ {}^{ns} $
(1089 bp) $ {}^{a} $	Da Chay 91B	24	4	5	0.4070	0.0021	0.0040	0.0001	0.0004	0.0009	0.0017	0.0005	0.0010	-1.4566 $ {}^{ns} $
Da Chay 89A	18	0	1	0.0000	0.0000	0.0000	0.0000	0.0000	0.0000	0.0000	0.0000	0.0000	-
Cong Troi 102	6	0	1	0.0000	0.0000	0.0000	0.0000	0.0000	0.0000	0.0000	0.0000	0.0000	-
Cong Troi 103	20	1	2	0.1890	0.0000	0.0000	0.0003	0.0005	0.0000	0.0000	0.0002	0.0003	-0.5915 $ {}^{ns} $
Bidoup	20	2	3	0.4160	0.0021	0.0027	0.0000	0.0000	0.0009	0.0018	0.0004	0.0005	-0.5278 $ {}^{ns} $
Total	114	7	7	0.2760	0.0013	0.0037	0.0001	0.0009	0.0006	0.0016	0.0003	0.0012	-1.7031 $ {}^{ns} $
CFX	Da Chay 90A	26	13	11	0.8740	0.0000	0.0000	0.0000	0.0000	0.0045	0.0039	0.0037	0.0031	0.7132 $ {}^{ns} $
(1102 bp)	Da Chay 91B	24	9	7	0.8260	0.0000	0.0000	0.0000	0.0000	0.0030	0.0026	0.0025	0.0022	0.4573 $ {}^{ns} $
Da Chay 89A	18	9	6	0.6860	0.0000	0.0000	0.0000	0.0000	0.0036	0.0028	0.0030	0.0024	0.9175 $ {}^{ns} $
Cong Troi 102	6	3	3	0.8000	0.0000	0.0000	0.0000	0.0000	0.0017	0.0014	0.0014	0.0012	1.1241 $ {}^{ns} $
Cong Troi 103	20	11	12	0.9210	0.0061	0.0051	0.0000	0.0000	0.0030	0.0034	0.0025	0.0028	-0.3438 $ {}^{ns} $
Bidoup	20	10	9	0.8580	0.0000	0.0000	0.0000	0.0000	0.0045	0.0031	0.0038	0.0026	1.6614 $ {}^{ns} $
Total	114	16	23	0.8960	0.0012	0.0034	0.0000	0.0000	0.0039	0.0033	0.0033	0.0027	0.5462 $ {}^{ns} $
GSTG1	Da Chay 90A	26	3	3	0.3940	0.0024	0.0023	0.0009	0.0012	0.0007	0.0007	0.0008	0.0010	-0.3026 $ {}^{ns} $
(815 bp)	Da Chay 91B	24	14	6	0.4760	0.0069	0.0097	0.0002	0.0006	0.0059	0.0007	0.0029	0.0048	-1.4032 $ {}^{ns} $
Da Chay 89A	18	3	3	0.2160	0.0009	0.0025	0.0002	0.0006	0.0059	0.0005	0.0004	0.0011	-1.7130 $ {}^{ns} $
Cong Troi 102	6	2	3	0.6000	0.0053	0.0077	0.0012	0.0010	0.0015	0.0023	0.0014	0.0011	-0.7093 $ {}^{ns} $
Cong Troi 103	20	3	3	0.5320	0.0033	0.0024	0.0008	0.0006	0.0014	0.0014	0.0012	0.0010	0.4211 $ {}^{ns} $
Bidoup	20	3	4	0.2840	0.0017	0.0025	0.0002	0.0006	0.0007	0.0015	0.0005	0.0010	-1.4401 $ {}^{ns} $
Total	114	19	12	0.4010	0.0034	0.0100	0.0006	0.0013	0.0020	0.0085	0.0012	0.0044	-2.0903 $ {}^{ns} $
表(5)-1 核遺伝子座の遺伝的変異(TPS4)

Locus	Populations	n	S	h	Hd	Pi(n)	Theta ( $ \theta $ )	Pi(n)	Theta ( $ \theta $ )	Pi(n)	Theta ( $ \theta $ )	Pi(n)	Theta ( $ \theta $ )	Tajima's D test
Synonymus	Synonymous	Nonsynonymous	Nonsynonymous	Silent	Silent	Total	Total
TPS4	Da Chay 90A	26	2	3	0.2180	0.0006	0.0021	0.0004	0.0006	0.0006	0.0022	0.0004	0.0010	-1.2234 $ {}^{ns} $
(520 bp)	Da Chay 91B	24	3	4	0.5330	0.0031	0.0044	0.0006	0.0007	0.0031	0.0044	0.0017	0.0015	-0.6322 $ {}^{ns} $
Da Chay 89A	18	1	2	0.2090	0.0000	0.0000	0.0005	0.0007	0.0000	0.0000	0.0004	0.0006	-0.5290 $ {}^{ns} $
Cong Troi 102	6	2	3	0.6000	0.0027	0.0036	0.0008	0.0011	0.0027	0.0036	0.0013	0.0017	-1.1320 $ {}^{ns} $
Cong Troi 103	20	1	2	0.2680	0.0000	0.0000	0.0002	0.0007	0.0000	0.0000	0.0005	0.0005	-0.0861 $ {}^{ns} $
Bidoup	20	1	2	0.1000	0.0000	0.0000	0.0002	0.0007	0.0000	0.0000	0.0002	0.0005	-1.1644 $ {}^{ns} $
Total	114	3	4	0.2950	0.0010	0.0031	0.0005	0.0005	0.0010	0.0031	0.0006	0.0011	-0.7913 $ {}^{ns} $

集団間分化について AMOVA を用いて解析した結果を表(5)-2 に示す。CFX, GSTG1 およびGSTH2 の3 遺伝子座において有為な集団分化が検出された。4CL や IFG1934, TPP1、TPS4 などの遺伝子座においてはどの集団の組み合わせでも有為な分化は検出されなかった。他方で CFX and GSTH2 遺伝子座では Cong Troi 102、Cong Troi 103、Bidoup などの集団を含む組み合わせで有為な分化が検出された。他の集団間の比較では、ほとんど分化が検出されないか $ (F_{ST} \sim 0) $ 、負の $ F_{ST} $ が検出された。負の値はサンプルサイズが少なすぎたか、集団の分化が非常に小さいことに起因するものであろう。特に Da Chay の集団間で集団間分化は小さかった。このことはこれらの集団が同じ地方（Long Lanh）に由来し、数キロしか離れていないという事実からも理解できる。

表(5)-2 Results of AMOVA analysis

Loci	Fst	p-value
4CL	0.01890	0.12805 $ \pm $ 0.01156
CFX	0.08521 $ ^{*} $	0.00000 $ \pm $ 0.00000
GSTG1	0.03940 $ ^{*} $	0.03030 $ \pm $ 0.00487
GSTH2	0.04316 $ ^{*} $	0.02346 $ \pm $ 0.00390
IFG1934	0.00243	0.39589 $ \pm $ 0.01173
IFG8612	0.01238	0.28837 $ \pm $ 0.01570
RAV2	0.02566	0.17204 $ \pm $ 0.01196
SOS27	-0.00157	0.44379 $ \pm $ 0.01423
TPP1	-0.01925	0.90714 $ \pm $ 0.00806
TPS4	0.00535	0.34707 $ \pm $ 0.01232

それぞれの遺伝子座におけるTajima's D $ ^{11} $ の値を調べた（表(5)-1）。GSTGI遺伝子座において有為な負の値が検出された。SOS27遺伝子座ではDa Chay 89AとDa Chay 91BおよびBidoup集団において有為な負の値が検出された。集団サイズの減少や集団の分断は絶滅の危機に瀕している種に共通している現象であり、適応度の現象につながるとみられている。集団サイズの減少や集団の分断がもたらす悪影響の一つは遺伝的多様性の減少である。遺伝的浮動により、特に低頻度のアリルが集団から失われ、長期的にみると種全体の遺伝的変異量が低下する。集団サイズの減少および集団の分断化によってホモ接合体が増え、適応度の低下や致死を招くという別の側面もある。
このような近交弱性は動物でも植物でもよく知られている $ ^{14)} $ 。これらの両要因が結果的に絶滅の危機に追いやるものと考えられている $ ^{14)} $ 。

本研究の結果は、少なくとのこれらの要因がP. krempfiiの自然集団において現実に働いていることを示唆するものであった。P. krempfiiのハプロタイプ多様度は、アジアに広く分布している他のマツ科の3種（P. tabuliformis, P. densata, P. yunnanensis）と比べると凡そ50%低い値である。すなわちP. krempfiiの遺伝子座あたりのアリル数は他のマツと比べて非常に少ないことを意味している。塩基多様度を比較してみてもP. krempfiiの多様性は他の3種よりも非常に低い（図(5)-1）。P. krempfiiのミトコンドリアDNAには変異が見つからず、対して他の3種のミトコンドリアにはかなりの量の塩基多型が報告されている（Wang, unpublished data）。これらの結果はP. krempfiiの遺伝的変異量が低いということをサポートしている。薬緑体マイクロサテライトの解析からはP. krempfiiが最近に集団サイズの拡大あるいは変異の固定を経験したことを示唆する結果が得られた。現在の集団サイズが限られていることからこの結果は集団の拡大ではなく、長い間の遺伝的浮動の効果によって多型が失われた結果ではないかと考えられる。さらにP. krempfiiの種子サンプルを収集し、自殖率の推定も試みた。しかしほとんどすべての種子の中身が空であったため、推定はできなかった。マツは自家不和合であることが知られており、空の種子は自殖を意味する $ ^{6} $ 。よって前述の遺伝的浮動による多様性の消失だけでなく、P. krempfiiは自殖による適応度低下の状態にもあるということができる。以上のように、遺伝的情報に基づく研究から、P. krempfiiは遺伝的劣化が著しく緊急に保護しなければならない状態にあることが明らかになった。さらに空の種子が多いということから再生には困難が伴うことが予想される。

赤: P. krempfii (Pk), 黄: P. yunnanensis (Py), 緑: P. tabuliformis (Pt), 紫: P. densata (Pd)

図(5)-2. P. krempfii と近縁3種の塩基多様度 ( $ \pi $ )

AMOVA解析では3つの遺伝子座(CFX, GSTG1, GSTH2)において有為な集団の分化が確認された。しかし、2集団間の組み合わせで $ F_{ST} $ の値を調べたところ、10遺伝子座中5遺伝子座で集団の分化がみられた。最も分化が大きかった集団の組み合わせはCong TroiとBidoupであった。葉緑体マイク
ロサテライトを用いた研究でも同様の結果が得られた。それぞれの集団は比較的近傍に位置しているにもかかわらず、分化が進んでいることが明らかになった。P. krempfii は他のマツ科の種と異なり純林を構成せず、他の樹種に混ざって小規模に群落を形成または孤立する。このことは種子や花粉の散布が限られることを意味している。さらに散布能力が限られていることから集団間分化が進行することを表している。この点はP. krempfii の保護を考える上で重要なポイントである。各分集団においては遺伝的多様性が失われる傾向にあっても、種全体でみてみると多様性が維持される可能性があることを意味するからである。集団間の分化は集団サイズが小さいことから遺伝的浮動の影響であると考えることができる。しかし本研究では調べた遺伝マーカーの数が限られているため、自然選択の影響も排除できない。ゲノムの他の領域を調べてみる必要があるであろう。もし自然選択が集団間の分化に寄与していれば、各分集団特異的な適応をしていることを意味する。仮にそうであれば、種の保全を考える際に各分集団から集められた種子を混ぜ合わせて用いることは避けるべきであり、その地に適応した種子を用いるべきである。

## (2) Shorea balangeran（希少種）と Shorea leprosula（普遍種）

Shoreaを対象とした遺伝学的研究は行われているが、少数の遺伝子座を用いた研究がほとんどを占めており、ゲノムレベルでの研究はほとんど存在しない。ゲノムレベルの遺伝的変異データは、集団の構造や動態を推定するためには不可欠である。本研究ではまずゲノムレベルの解析を行うために必要となるライブラリの構築を行った。Shorea balangeranとShorea leprosulaそれぞれからRNAを抽出し、次世代シーケンサーRoche FLX 454を用いてcDNAライブラリの構築を行った。その結果、Shorea balangeran (S.bal)からは6169配列、Shorea leprosula (S.lep)からは7520配列を得た。得られた配列のうちそれぞれ2682配列、2904配列について機能を推定することができた(S.balの結果について図(5)-3に示す)。

図(5)-3 S.balから得られた転写産物の機能分布(生物学的プロセス)

また、遺伝マーカーを構築するため、これらの配列のうち両種に共通して存在しかつ機能を推定することのできた438配列をもとにして、PCRプライマーの設計を行った。159遺伝子座についてプ
ライマーデザインを完了し、両種においてその増幅を確認した。159遺伝子座からさらに96遺伝子座に絞り込み、PCRを行って増幅した後、次世代シーケンサRoche FLX 454を用いて配列の解析を行った。遺伝的変異を求めたところ、遺伝子座ごとに変異量のばらつきが非常に大きかった。この解析結果が実際の変異量を正確に反映しているものなのか、あるいはデータ処理上の見かけのものなのか、現時点では両方の可能性を排除できない。今後さらに詳細にデータ解析を進めていく必要がある。

Shorea balangeran（希少種）と Shorea leprosula（普遍種）に加え、7集団からサンプルされたShorea parviflia（普遍種）78個体について5核遺伝子座の遺伝的変異パターンの解析を行い、ボルネオ島とスマトラ島-マレー半島との間に遺伝的な分化が存在することを確認した。シミュレーションから分集団の分岐がおよそ300,000年前であると推定された。この結果は論文にまとめ投稿し、受理された。

## (3) Myoporum bontioides（絶滅危惧種）

10カ所の核SSRマーカーを用いた研究では、遺伝的変異を検出することができなかった。同様に、5カ所の薬緑体遺伝子領域においても、1サンプル1遺伝子座 (trnL-trnF領域)を除き、変異を検出することができなかった。この結果から、以下のように考察することができる。

本来SSRマーカーは変異率が高く、遺伝的変異を多く含んでいると考えられている。にもかかわらず、我々の研究では10カ所のSSR遺伝子座において変異を検出することができなかった。我々が設計したSSRマーカーはゲノム中からランダムに選んだものであり、従ってもし実際に集団が変異を保有しているのであれば、10遺伝子座すべてで変異を観察できないということは考えられない。他方で、本研究で用いたSSRのリピート数が小さくまたSSRの突然変異率はリピート数と正の相関があるという説もあるため、今回用いたSSRマーカーに多型が少なかっただけであるという可能性は排除できない。今後、さらにリピート数の多い領域を用いて解析することでこの点については明らかにすることができるであろう。さらに葉緑体上の5カ所の非コード領域の配列を決定した。非コード領域はコード領域に比べて突然変異率が高いため多型を多く保持しており、多くの研究において集団レベルで遺伝的変異を比較するときに用いられている。しかしながら、SSRの場合と同様にただ1個体において一つの塩基置換が見つかっただけであった。

SSRの結果とあわせて考えると、この結果はM. bontioidesの九州地方の集団と少なくとも一部の中国の集団において遺伝的変異が存在しないという結論を導くことができる。この結論に対して、いくつかの要因を考えることができる。まず、M. bontioidesはお互いに枝や根が絡み合っている灌木である。従って個体の判別が容易ではなく、同一個体が複数回サンプルされる可能性を考えることができる。しかしながら我々のサンプルは異なる茂み、異なる島など異なる地点からとられている。よって同一個体からのサンプルが混ざっているという要因だけでは今回の結果を説明することはできない。第二の要因としては、日本のM. bontioidesは分布の端に位置するという事実がある。さらに、人為的な影響により生息域の急激な現象にさらされたという点も挙げることができる。

我々の研究において明らかにされた遺伝的変異が非常に少ないという事実は、現在および将来のM. bontioides集団の適応度に対し悪影響を与えることが考えられ、結果として絶滅のリスクを高めることが考えられる。本研究の結果は2010年3月にマレーシアのクアラルンプールにおいて開催
された国際会議 “Sustainable Utilisation and Conservation of Forests in the Genomics Era” において発表した。

## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

これまで絶滅の危機に瀕している生物の遺伝学的研究は限られていた。あるとしても絶滅危惧種のみを対象にした研究が主であった。近縁関係にある希少種・普遍種について、平行して集団遺伝学的解析を行なった研究例はこれまでに無い。系統関係が近くかつ異なる状態にある二種の遺伝的変異をセットで調べることで、熱帯樹木種の絶滅の遺伝的要因について新たな知見をもたらすことができた。

## （２）環境政策への貢献

遺伝的変異をマーカーとして希少種および絶滅危惧種の保全・維持を行うためには、その種が本来持つべき遺伝的多様性の量やパターンを正当に評価する必要がある。本サブテーマの目的は熱帯樹木種の遺伝的多様性のいわば標準状態を明らかにし、絶滅リスクを査定するために必要な客観的知見を提供するものである。本研究のような遺伝学的研究は熱帯林の状態の正当な評価や保全方針の立案に貢献できると考えている。環境政策や保全ガイドラインの作成に反映されるよう、さらなる発展的研究の推進や成果の普及に勤める。

## 6 ．国際共同研究等の状況

本研究は、以下の研究・教育機関との共同研究により実施された。

Dr. Iskandar Siregar, Department of Silviculture, Faculty of Forestry, Bogor Agricultural University, Indonesia

Dr. Phi-Hong Hai, Research Center for Forest Tree Improvement, Forest Science Institute of Vietnam, Vietnam

Dr. Suchitra Changtragoon, Royal Forest Department, Thailand

Dr. Xiao-Ru Wang, Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, China

Dr. B. Nagarajan, Institute of Forest Genetics and Tree Breeding, Coimbatore, India

Dr. Marjan Khalili Mahani, Umea University, Sweden

## 7 ．研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

<論文（査読あり）>

1) H. IWANAGA, K. M. TESHIMA, I. A. KHATAB, N. INOMATA, R. FINKELDEY, I. Z. SIREGAR,

U. J. SIREGAR, and A. E. SZMIDT: Ecology and Evolution, in press (2012)

“Population structure and demographic history of a tropical lowland rainforest tree species Shorea parvifolia (Dipterocarpaceae) from Southeastern Asia”
くその他誌上発表（査読なし）>

特に記載すべき事項はない

（2）口頭発表（学会等）

1) Alfred Szmidt: IUFRO Kuala Lumpur (2010)

"Genetic diversity of a mangrove-like species, Myoporum bontioides"

2) Wei Lun Ng, Nobuyuki Inomata, Makoto Yoko-o, Mutsunori Tokeshi, Alfred E. Szmidt: Sustainable Utilisation and Conservation of Forests in the Genomics Era (2010)

“Genetic diversity of a mangrove-like species, Myoporum bontioides”

3) Alfred Szmidt: Workshop for initiating a global genetic diversity assessment (2012) "Genetic diversity loss of tropical trees in Asia"

## （3） 出願特許

特に記載すべき事項はない

（４）シンポジウム、セミナーの開催（主催のもの）

特に記載すべき事項はない

（５）マスコミ等への公表・報道等

特に記載すべき事項はない

(6) その他

特に記載すべき事項はない

### 8 \. 引用文献

1) DeSalle R (2005) Conservation genetics - Genetics at the brink of extinction. Heredity, 94, 386-387.

2) Excoffier L, Lischer H (2010) Arlequin suite ver 3.5: a new series of programs to perform population genetics analyses under Linux and Windows. Molecular Ecology Resources, 10, 564-567.

3) Excoffier L, Smouse PE, Quattro JM (1992) Analysis of molecular variance inferred from metric distances among DNA haplotypes - application to human mitochondrial DNA restriction data. Genetics, 131, 479-491.

4) Frankham R (2005) Genetics and extinction. Biological Conservation, 126, 131-140.

5) Hall TA (1999) BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series, 41, 95-98.

6) Kärkkainen K, Koski V, Savolainen O (1996) Geographical variation in the inbreeding depression of Scots pine. Evolution, 50, 111-119.
7) Librado P, Rozas J (2009) DnaSP v5: A software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data. Bioinformatics, 25, 1451-1452.

8) Murray MG, Thompson WF (1980) Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic Acids Research, 8, 4321-4325.

9) Nei M (1987) Molecular evolutionary genetics. Columbia University Press, New York.

10) Nguyen HN (1993) Two-flat-needle pine endemic to Vietnam. Forestry Review, 32, 10-11.

11) Tajima F (1989) Statistical method for testing the neutral mutation hypothesis by DNA polymorphism. Genetics, 123, 585-595.

12) Thompson JD, Gibson TJ, Plewniak F, Higgins DG (1997) The ClustalX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research, 24, 4876-4882.

13) Watterson G (1975) On the number of segregating sites in genetical models without recombination. Theoretical Population Biology, 7, 256-276.

14) Wright S (1951) The genetical structure of populations. Annals of Eugenics, 15, 323-354.
## （６）遺伝的劣化評価３－希少種および絶滅危惧種の解析（マングローブの遺伝的変異）

福岡女子大学 人間環境学部 小泉 修 美濃部純子

国際文理学部 猪股伸幸 （平成23年度）

平成21～23年度累計予算額：25,927千円

（うち、平成23年度予算額：6,542千円）

予算額は、間接経費を含む。

[要旨] マダガスカル全域から、マングローブ樹種のうち、オヒルギ、マヤプシキ、ヒルギダマシの生態的状態の記録とサンプル（葉）を採集した。オーストラリアの東北部の数地域からオヒルギ、マヤプシキ、ヒルギダマシの生態観察とサンプル採集を行なった。西表島の数地点にて、オヒルギ、ヒルギダマシ、マヤプシキ、ヒルギモドキの生態観察とサンプルの採集を行った。これらのサンプルからDNAを抽出し、核遺伝子および葉緑体DNAの変異解析を行った。この結果、熱帯地方全体を考えると、核遺伝子および葉緑体DNAによっても、それなりに遺伝的多様性が見られた。しかし、遺伝子タイプは、5地域に明確に区別でき、各地域内の遺伝的変異は非常に低く、分化していることが判明した。更に、マングローブ樹種3種について広域な分布域内の12地点でサンプル採集を行い、DNAを抽出した。葉緑体と核遺伝子数個について種内変異を解析した。オヒルギについては、各地域内の遺伝的変異は非常に低く、海域ごとに分けられる5地域グループ間のハプロタイプの遺伝的分化は大きかった。ヒルギダマシとマヤプシキについては、オヒルギよりさらに遺伝的変異が低い傾向が見られた。マングローブ林構成種に特徴的な大きな遺伝的分化と低い地域内変異は、今後のマングローブ林の保存・再生を考える際に十分に考慮されるべき特徴と思われる。上記の暫定的な結論を更に検証するために、最終年度ではマングローブ3種について分布域全域をカバーする広域集団について遺伝的多様性と集団構造について解析した。得られた結果にもとづいて遺伝的に劣化していると思われる種や地域集団を明らかにし、絶滅のリスクを検討した。また、絶滅危惧集団を保全するための植林ガイドラインを作成した。

[キーワード] マングローブ、葉緑体DNA、核遺伝子、遺伝子種内変異、遺伝子多様度

### 1. はじめに

熱帯から亜熱帯地域の河口汽水域に形成されるマングローブ林はCO₂吸収源として地球温暖化防止に役立っており、豊かな生態系をつくるのにも重要な働きをしている。しかし、FAO（国連食糧農業機構）によると、過去25年間（1980-2005）に世界のマングローブ林の20％が失われており、とくにアジア・太平洋地域での減少が著しいとされる。従って地域によっては、普通種であったものが希少種や絶滅危惧種化している可能性がある。マングローブ林の消失を防止するためには、減少しつつある集団の適応力（生存力）が低下しているのかどうかを調べることが重要である。そこで本研究では、マングローブ樹種について、遺伝的変異量と遺伝的集団構造を解析した。