Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
3. “バイオマスリファイナリープロセスの実現はハツ夢になるか？” 河田悦和, 環境技術, 44 巻 1 号 1-2 項

## 招待講演

1. “ハロモナス菌による微好気培養による3-ヒドロキシ酪酸等の生産技術開発に関する研究” 河田悦和, SCE2012 第 32 回キャピラリー電気泳動シンポジウム 主催 (公社) 日本分析化学会 電気泳動分析研究懇談会 2012/11/08

2. “余剰バイオマス資源を用いた 光学活性基幹化学品 3-ヒドロキシ酪酸の生産”河田悦和高機能遺伝子デザイン技術研究組合講演会 主催 高機能遺伝子デザイン技術研究組合 2013/04/12

3. “Efficient secretion of (R)-3-hydroxybutyric acid from Halomonas sp. KM-1 cultured with saccharified Japanese cedar under microaerobic conditions, 河田悦和, You-Xun Jin, 川崎一則, 野尻昌信, 10th Biomass-Asia Workshop タイ王国バンコク 主催者 NASTDA, TISTR, AIST, NEF, 2013/08/05

4. “余剩バイオマス資源を用いた光学活性基幹化学品 3-ヒドロキシ酪酸の生産” 河田悦和, 高分子同友会勉強会 2013/08/26 主催者 高分子学会高分子同友会

## 口頭・ポスター発表

1. “Halomonas sp. KM-1 による好気・微好気条件における 3-ヒドロキシ酪酸の分泌生産” “Efficient secreted production of (R)-3-hydroxybutyric acid under successive aerobic and microaerobic conditions by Halomonas sp. KM-1” 河田悦和, 川崎一則, 茂里康, 第 64 回日本生物工学会大会 口頭発表 主催 日本生物工学会 2012/10/24

2. “ハロモナス菌による微好気培養による3-ヒドロキシ酪酸等の生産技術開発に関する研究” 河田悦和, 第2回健康工学研究部門研究会, 主催産総研健康工学研究部門, 2012/09/15

3. “ハロモナス菌によるバイオプラスチック PHB 生産と GC-MS を用いた代謝分析” JIN YOUXUN, 河田 悦和, 日本農芸化学会 2013 年度大会, 2013/3/26

4. “C5 糖、C6 糖混合物を用いた光学活性基幹化学品 3-ヒドロキシ酪酸の分泌生産” 河田悦和, 第 2 回 JACI/GSC シンポジウム（第 13 回 GSC シンポジウム） 主催 公益 社団法人 新化学技術推進協会, 2013/06/06

5. “スギを用いたハロモナス菌による 3-ヒドロキシ酪酸の分泌生産” 河田 悦和, 川崎 一則, 野尻昌信, 日本生物工学会 2013 年度大会 主催 日本生物工学会, 2013/09/18

6. “ハロモナス菌を用いた木材糖化液からの3-ヒドロキシ酪酸の生産技術開発”河田悦和,川崎一則,野尻昌信 日本農芸化学会 2014 年度大会、2014/03/28

7. “ソーダ・アントラキノン蒸解スギのオンサイト培養酵素を使った酵素糖化” 野尻昌信

他 セルロース学会第 20 回年次大会
8. “ハロモナス菌 KM-1 株のスギ糖化液を用いた 3-ヒドロキシ酪酸の分泌生産” 河田 悦和, 川崎 一則, 野尻昌信, 日本生物工学会 2014 年度大会 主催 日本生物工学会, 2014/09/09

9. “ハロモナス菌による3-ヒドロキシ酪酸の生産技術開発” 河田悦和, CphI 国際医薬品中間体展, 主催者 UBM, 化学工業日報, 2014/04/10

10.“ハロモナス菌 KM-1 株のスギ糖化液を炭素源とした 3-ヒドロキシ酪酸の分泌生産”河田悦和, 川崎一則, 野尻昌信 第 66 回日本生物工学会大会（2014）、2014/09/09

11. “ハロモナス菌を用いた木材糖化液からの 3-ヒドロキシ酪酸の生産の最適化”河田悦和, 野尻昌信, 松下功, 坪田潤 日本農芸化学会 2015 年度大会、2015/03/28

## 「国民との科学・技術対話」の実施

### 1. 産総研関西センター研究講演会

“余剰バイオマス資源を用いた光学活性基幹化学品3-ヒドロキシ酪酸の生産”

主催 産総研関西センター 2013 年 3 月 7 日 参加者 80 名

### 2. 産総研関西センター一般公開

“池田でとれた微生物、バイオ技術でひろがる未来”

主催 産業技術総合研究所 2013 年 8 月 3 日 参加者 40 名
### 6. 知的財産権の取得状況（関連する主な特許の状況）

1. 好塩菌によるポリヒドロキシアルカノエート（PHAs）産生方法及び好塩菌

登録 5164182（H24/12/28） 日本

登録 特 8372611 2013/02/12 米国

登録 602008027526.4（2013/09/11） ドイツ

2.3一ヒドロキシ酪酸又はその塩の産生方法

特願 2011-222685（H23/10/07）日本

PCT/JP2012/075352（H24/10/01）移行中 米国、EPO、マレーシア、タイ

3. 好塩菌による木材糖化液を用いたポリヒドロキシアルカノエート（PHAs）等の産生

方法 登録 5299969（H25/06/28）

4. 好塩菌による乳酸及び／又は酢酸の産生方法 登録 5229904（H25/03/29）

5. ハロモナス菌を用いた 3－ヒドロキシ酪酸の製造方法 特願 2013-233961、2013/11/12

6. ハロモナス菌を用いた 3－ヒドロキシ酪酸の製造方法 特願 2014-030915、2014/02/20

7. ハロモナス菌を用いた 3 ヒドロキシ酪酸の製造方法 特願 2014-105522, H26/05/21

8. ハロモナス菌を用いた3－ヒドロキシ酪酸の製造方法特願 2014-187957, H26/09/16

9. ハロモナス菌を用いた 3 ヒドロキシ酪酸の製造方法 PCT/JP2014/079855, H26/11/11
### 7. 研究概要図

(接式)

K123009ハロモナス菌による木材から3ヒドロキシ酸酸等の生産技術開発に関する研究独立行政法人産業技術総合研究所

## 特長

- 独自木材磁化技術

- 発酵膽害物質が漁減

- 独自間発3-ロキシ酸酸生産ハロモナス益

C5,C6歳の同時利用

発酵膽害物質に強い

優れた3-ロキシ酸酸の生産性、経済性

本研究の課題

・木材赭化

発酵臸害物質の低減

3-ヒロキシ酸酸の製造

発酵胆吉物質への耐性向上

生産性向上

註

3. ロキ酸酸の製造

馴化

培養条件の最適化、大量培養検討
### 8. 英文概要

Title; Development of 3-hydroxybutyric acid Production Technology from Wood using Halomonas

Research Institute; Biomedical Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), Forestry and Forest Products Research Institute (FFPRI)

Principal Investigator; Yoshikazu Kawata

## Abstract:

Japanese cedar ( $ Cryptomeria\ japonica $ ) is a major species in Japanese artificial forests and its utilization is a major concern of forestry management. Halomonas sp. KM-1 was recently isolated and found to grow effectively with saccharified Japanese cedar wood, resulting in intracellular storage of poly- $ (R) $ -3-hydroxybutyric acid (PHB) under aerobic conditions; under microaerobic conditions, extracellular secretion of $ (R) $ -3-hydroxybutyric acid $ ((R) $ -3-HB) led to degradation of intracellular PHB. In this study, we optimized the production of PHB and secretion of $ (R) $ -3-HB using saccharified Japanese cedar in urea fed-batch culture. Intracellular PHB production after 36 h aerobic cultivation was 23.6 g/L; after a shift to microaerobic conditions for 24 h, the concentration of $ (R) $ -3-HB in the medium reached 21.1 g/L. This is the highest level of $ (R) $ -3-HB productivity of a living bacterium reported to date using saccharified wood source. Thus, KM-1 efficiently utilizes saccharified Japanese cedar to produce PHB and secreted $ (R) $ -3-HB, making it a practical candidate for use in the industrial production of $ (R) $ -3-HB.
### 9 \. 参考文献

Gao, H.J., Wu, Q. and Chen, G.Q. (2002) Enhanced production of D-(-)-3-hydroxybutyric acid by recombinant Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett 213, 59-65.

Ikeda, T., Sugimoto, T., Nojiri, M., Magara, K., Hosoya, S. and Shimada, K. (2009) Alkali pre-treatment for producing bioethanol fuel from lignocellulosics part2. Bioethanol production from waste and recycled materials. Japan TAPPI J 63, 581–591.

Ishizaki, A., Tanaka, K., 1991. Production of Poly- $ \beta $ -Hydroxybuturic Acid from Carbon Dioxide by Alcaligenes eutrophus ATCC 17697 cost substrate for ethanol fermentation by Zymomonas mobilis. J. Ferment. Bioeng. 71 (4), 254-257

Lee, S. Y., Lee, Y. and Wang, F. (1999) Chiral compounds from bacterial polyesters: sugars to plastics to fine chemicals. Biotechnol Bioeng 65, 363–368.

Lee, S.Y. and Lee, Y. (2003) Metabolic engineering of Escherichia coli for production of enantiomerically pure $ (R)-(-) $ -hydroxycarboxylic acids. Appl Environ Microbiol 69, 3421-3426.

Liu, Q., Ouyang, S.P., Chung, A., Wu, Q. and Chen G.Q. (2007) Microbial production of R-3-hydroxybutyric acid by recombinant E. coli harboring genes of phbA, phbB, and tesB. Appl Microbiol Biotechnol 76, 811-818.

Matsumoto, K., Okei, T., Honma, I., Ooi, T., Aoki, H. and Taguchi, S. (2013) Efficient $ (R) $ -3-hydroxybutyrate production using acetyl CoA-regenerating pathway catalyzed by coenzyme A transferase. Appl Microbiol Biotechnol 97, 205-210.

Monteil-Rivera, F., Betancourt, A., Van Tra, H., Yezza, A. and Hawari, J. (2007) Use of headspace solid-phase microextraction for the quantification of poly(3-hydroxybutyrate) in microbial cells. J Chromatogr A 1154, 34–41.

Nath, A., Bhat, S., Devle, J. and Desai, A. (2005) Enhanced production of 3-hydroxybutyric acid (3-HB) by in vivo depolymerization of polyhydroxybutyric acid in 3-HB dehydrogenase mutants of Methylobaterium sp. ZP24. Ann Microbiol 55, 107-111.

Quillaguaman, J., Doan-Van, T., Guzman, H., Guzman, D., Martin, J., Everest, A. and Hatti-Kaul, R. (2008) Poly(3-hydroxybutyrate) production by Halomonas boliviensis in fed-batch culture. Appl Microbiol Biotechnol 78, 227–232.

Quillaguaman, J., Guzman, H., Van-Thuoc, D. and Hatti-Kaul, R. (2010) Synthesis and production of polyhydroxyalkanoates by halophiles: current potential and future prospects. Appl Microbiol Biotechnol 85, 1687–1696.

Ren, Q., Ruth, K., Thöny-Meyer, L. and Zinn, M. (2010) Enatomically pure
hydroxycarboxylic acids: current approaches and future perspectives. Appl Microbiol Biotechnol 87, 41–52.

Shiraki, M., Endo, T. and Saito, T. (2006) Fermentative production of $ (R)-(-) $ -3-hydroxybutyrate using 3-hydroxybutyrate dehydrogenase null mutant of Ralstonia eutropha and recombinant Escherichia coli. J Biosci Bioeng 102, 529-534.

Tan, D., Xue, Y.S., Aibaidula and G. Chen, G.Q. (2011) Unsterile and continuous production of polyhydroxybutyrate by Halomonas TD01. Bioresour Technol 102, 8130–8136.

Tokiwa, Y. and Ugwu, C.U. (2007) Biotechnological production of $ (\mathrm{R}) $ -3-hydroxybutyric acid monomer. J Biotechnol 132, 264–272.

Tsugawa, H., Tsujimoto, Y., Arita, M., Bamba, T., Fukusaki, E., 2011. GC/MS based metabolomics: development of a data mining system for metabolite identification by using soft independent modeling of class analogy (SIMCA). BMC Bioinformatics. 12, 131.

Ugwu, C.U., Tokiwa, Y., Aoyagi, H., Uchiyama, H. and Tanaka, H. (2008) UV mutagenesis of Cupriavidus necator for extracellular production of $ (R) $ -3-hydroxybutyric acid. J Appl Microbiol 105, 236-242.

Ugwu, C.U., Tokiwa, Y. and Ichiba, T. (2011) Production of $ (R) $ -3-hydroxybutyric acid by fermentation and bioconversion processes with Azohydromonas lata. Bioresour Technol 102, 6766-6768.

Wang, Y. and Liu, S. (2014) Production of $ (\mathrm{R})-3-\mathrm{hydroxybutyric~acid} $ by $ Burkholderia~cepacia $ from wood extract hydrolysates. AMB Express, 4, 28.

Yin, J., Chen, J.C., Qiong, W. and Chen, G.Q. (2014) Halophiles, coming stars for industrial biotechnology. Biotechnol Adv

http://dx.doi.org/10.1016/j.biotechadv.2014.10.008

Youm, Y.H., Nguyen, K.Y., Grant, R.W., Goldberg, E.L., Bodogai, M. Kim, D., D'Agostino, D., Planavsky, N., Lupfer, C., Kanneganti, T.D., Kang, S., Horvath, T.L., Fahmy, T.M., Crawford, P.A., Biragyn, A., Alnemri, E. and Dixit, V.D. (2015) The ketone metabolite $ \beta $ -hydroxybutyrate blocks NLRP3 inflammasome–mediated inflammatory disease. Nature Medicine 21,263-269

Zhang, L., Xu, J., Zhang, L., Zhang, W., Zhang, Y., 2003. Determination of 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone-labeled carbohydrates by liquid chromatography and micellar electrokinetic chromatography. J. Chromatogr. B. 793, 159–165.
## ラットを用いる急性経口毒性試験

要 約

3-ヒドロキシ酪酸を検体として，ラットを用いる急性経口毒性試験(限度試験)を行った。

試験群には2000 mg/kgの用量の検体を，対照群には溶媒対照として注射用水を雌雄ラットに単回経口投与し，14日間観察を行った。その結果，観察期間中に異常及び死亡例は認められなかった。以上のことから，ラットを用いる単回経口投与において，検体のLD50値は，雌雄ともに

2000 mg/kgを超えるものと考えられた。

依頼者

独立行政法人 産業技術総合研究所

検体

3-ヒドロキシ酪酸

試験期間

2014年08月26日～2014年9月16日

試驗実施施設

一般財団法人日本食品分析センター 千歳研究所

北海道千歳市文京2丁目3番

試驗責任者

一般財団法人日本食品分析センター 千歳研究所

安全性試験部

服部 秀樹
## 1 試験目的

検体について，OECD Guideline for Testing of Chemicals 420(2001)に準拠し，ラットにおける急性経口毒性を調べる。

## 2 檢 体

## 3 -ヒドロキシ酪酸

## 3 試験液の調製

検体に注射用水を加え, 50 ℃に設定した恒温水槽[アズワン株式会社]で加温及び超音波洗浄機[東京超音波技研株式会社]を用いて処理を行い, 100 mg/mL試験液とした。

なお，検体の一部が溶解せず試験液にはわずかに浮遊物が認められたため，浮遊物を避けて分注し，投与に用いた。

## 4 試験動物

4週齢のSlc:Wistar/ST雌雄ラットを日本エスエルシー株式会社から購入し, 約1週間の予備飼育を行って一般状態に異常のないことを確認した後, 試験に使用した。試験動物はプラスチック製ケージに2又は3匹ずつ収容し, 室温20～26℃, 照明時間12時間/日に設定した飼育室において飼育した。飼料[マウス・ラット・ハムスター用ガンマ線照射飼料; CRF-1, オリエンタル酵母工業株式会社]及び飲料水(水道水)は自由に摂取させた。

## 5 試験方法

検体投与用量として2000 mg/kgを投与する試験群及び溶媒対照として注射用水を投与する対照群を設定し，各群につき雌雄それぞれ5匹を用いた。

投与前に約18時間試験動物を絶食させた。体重を測定した後，試験群には試験液，対照群には注射用水をそれぞれ20 mL/kgの投与容量で胃ゾンデを用いて強制単回経口投与した。

観察期間は14日間とし，投与日は頻回，翌日から1日1回の観察を行った。投与後7及び

14日に体重を測定し，t-検定により有意水準5％で群間の比較を行った。観察期間終了時に動物すべてを剖検した。
## 6 試験結果

## 1 ）死亡例

雌雄ともにいずれの投与群においても，観察期間中に死亡例は認められなかった。

## 2 ）一般状態

雌雄ともにいずれの投与群においても，観察期間中に異常は見られなかった。

## 3 ) 体重変化(表-1及び2)

投与後7及び14日の体重測定において，雌雄ともに試験群は対照群と比べ体重値に差は見られなかった。

## 4 ）剖檢所見

観察期間終了時の剖検では，雌雄ともにすべての試験動物に異常は見られなかった。

## 7 考察

検体について、ラットを用いる急性経口毒性試験(限度試験)を実施した。

その結果,観察期間中に異常及び死亡例は認められなかった。以上のことから,ラットを用いる単回経口投与において,検体のLD50値は,雌雄ともに2000 mg/kgを超えるものと考えられた。
表-1 体重变化(雄)

投与群	投与前	投与後(日)
7	14
試験群	139.1±5.6(5)	208.4±4.1(5)	259.5±5.4(5)
対照群	140.7±4.3(5)	208.5±9.8(5)	262.6±11.2(5)

体重は平均値±標準偏差で表した(単位：g)。

括弧内に動物数を示した。

表-2 体重变化(雌)

投与群	投与前	投与後(日)
7	14
試験群	119.1±4.6 (5)	166.2±1.9 (5)	192.0±6.0 (5)
対照群	119.7±3.2 (5)	162.4±9.0 (5)	186.2±11.2 (5)

体重は平均値±標準偏差で表した(単位：g)。

括弧内に動物数を示した。

以上
補遺2 ラットを用いる亜急性経口毒性試験

## 最終報告書

ハロモナス菌乾燥菌体及び3-ヒドロキシ酪酸のラットを用いた

4 週間反覆経口投与毒性試験

試験番号：N-TT140003

報告日：2015年2月6日

試験期間：2014年11月11日~2015年2月28日

試驗実施施設

株式会社ボゾリサーチセンター つくば研究所

〒300-2611 茨城県つくば市大久保8番

試験委託者

独立行政法人産業技術総合研究所

〒563-8577 大阪府池田市緑ヶ丘1-8-31

株式会社ボゾリサーチセンター

〒151-0065 東京都渋谷区大山町36-7
### 1. 目次

1. 目次 -77-

2. 試験実施概要 -80-

2.1 試験番号 -80-

2.2 試験表題 -80-

2.3 試験目的 -80-

2.4 動物の福祉 -80-

2.5 試験委託者 -80-

2.6 試験受託者 -80-

2.7 試験実施施設 -81-

2.8 試験責任者 -81-

2.9 試験担当者 -81-

2.10 試験日程 -81-

2.11 予見することができなかった試験の信頼性に影響を及ぼす疑いのある事態及び試験計画書に従わなかったこと - 81 -

2.12 資料の保存 -82-

2.13 試験責任者の記名・押印 - 82 -

3. 要約 -82 -

4. 試験材料及び方法 - 82 -

4.1 被験物質及び媒体 -82 -

4.1.1 被験物質 1 - 82 -

4.1.2 被験物質 2 - 83 -

4.1.3 媒体 -83

4.2 投与液の調製 - 83 -

4.3 試験動物種及び系統の選択理由 -83 -

4.4 試験動物 -83-

4.5 飼育条件 -84

4.6 飼料、床敷及び飲料水中の混入物質の分析-84-
4.7 動物の識別 - 84 -

4.8 群分け - 84 -

4.9 投与経路、投与期間及び投与回数とそれらの選択理由 - 85 -

4.10 投与方法 - 85 -

4.11 投与量及び群構成 - 85 -

4.12 投与量の設定根拠 - 85 -

4.13 観察及び検査の方法 - 86 -

4.13.1 一般状態の観察 - 86 -

4.13.2 体重測定 - 86 -

4.13.3 摂餌量測定 - 86 -

4.13.4 摂水量測定 - 86 -

4.13.5 尿検査 - 87 -

4.13.6 臨床検査用採血 - 87 -

4.13.7 病理学検査 - 90 -

4.13.7.1 剖検 - 90 -

4.13.7.2 器官重量測定 - 90 -

4.13.7.3 固定/保存 - 90 -

4.13.7.4 病理組織学検査 - 90 -

4.13.7.5 瀕死動物の取扱い - 90 -

4.14 統計解析 - 92 -

5. 試験結果 - 92 -

5.1 死亡動物 - 92 -

5.2 一般状態 - 92 -

5.3 体重 - 93 -

5.4 摂餌量 - 93 -

5.5 尿検査（摂水量を含む） - 93 -

5.6 血液学検査 - 93 -

5.7 血液化学検査 - 94 -

5.8 器官重量 - 94 -
5.9 剖檢 - 94

6. 考察 -95-

## 図

Fig. 1~4 体重

Fig. 5~8 摂餌量

## 表

Table 1-1~1-6 一般状態

Table 2-1~2-4 体重

Table 3-1~3-4 摂餌量

Table 4-1~4-16 尿檢查

Table 5-1~5-16 血液学檢查

Table 6-1~6-12 血液化学検査

Table 7-1~7-8 器官重量（絶対重量）

Table 8-1~8-8 器官重量（相对重量）

Table 9-1 及び 9-2 割検所見

## 付表

Appendix 1-1~1-30 個体別一般状態

Appendix 2-1~2-10 個体別体重

Appendix 3-1~3-10 個体別摂餌量

Appendix 4-1~4-10 個体別尿検査

Appendix 5-1~5-33 個体別血液学検査

Appendix 6-1~6-22 個体別血液化学檢查

Appendix 7-1~7-20 個体別器官重量（絕対重量）

Appendix 8-1~8-20 個体別器官重量（相対重量）

Appendix 9-1 及び 9-2 個体別割検所見
### 2. 試験実施概要

### 2.1 試験番号

N-TT140003

### 2.2 試験表題

ハロモナス菌乾燥菌体及び3-ヒドロキシ酪酸のラットを用いた4週間反復経口投与毒性試験

(A 4-week oral gavage repeated dose toxicity study of the dried cells of Halomonas sp.KM-1 and 3-Hydroxybutyric acid in rats)

### 2.3 試験目的

ハロモナス菌乾燥菌体及び3-ヒドロキシ酪酸をラットに4週間反復経口投与し、明らかな毒性変化を惹起する用量とその変化の内容、及び毒性変化の認められない用量を求める。

### 2.4 動物の福祉

・「動物の愛護及び管理に関する法律」

(昭和48年10月1日法律第105号、最終改正平成24年9月5日法律第79号)

・「実験動物の飼養及び保管並びに苦痛の軽減に関する基準」

(平成25年8月30日環境省告示第84号)

• 「動物実験の適正な実施に向けたガイドライン」

(日本学術会議、平成18年6月1日)

本試験は試験実施施設の動物実験委員会の承認を受けている（承認番号：APS14001）。

### 2.5 試験委託者

独立行政法人産業技術総合研究所

〒563-8577 大阪府池田市緑ヶ丘1-8-31

担当者：河田 悦和

TEL : 072-751-9684 FAX : 072-751-9628

### 2.6 試験受託者

株式会社ボゾリサーチセンター

〒151-0065 東京都渋谷区大山町36-7

TEL : 03-5453-8101 FAX : 03-5453-8109
### 2.7 試験実施施設

株式会社ボゾリサーチセンター つくば研究所

〒300-2611 茨城県つくば市大久保8番

代表 TEL：029-877-2755 FAX：029-865-1798

### 2.8 試験責任者

株式会社ボゾリサーチセンター つくば研究所 安全性・薬理研究部

金光弘幸

ダイヤルイン TEL : 029-877-2770 FAX : 029-865-1798

### 2.9 試験担当者

試験主担当者 : 寺戸康徳

臨床檢查責任者 : 中村大地

病理標本作製主担当者

：野口真紀

病理檢查責任者 ：花見正幸

### 2.10 試験日程

試験開始日 ： 2014 年 11 月 11 日

試験責任者被験物質受領日

:	2014 年 12 月 16 日
動物入荷日	: 2014 年 12 月 12 日
投与開始日	: 2014 年 12 月 19 日
投与終了日	: 2015 年 1 月 15 日
投与終了剖檢日	: 2015 年 1 月 16 日
試験終了日	: 2015 年 2 月 XX 日

### 2.11 予見することができなかった試験の信頼性に影響を及ぼす疑いのある事態及び試験計画書に従わなかったこと

計画剖検時の血液学検査で、動物番号：3102のクエン酸ナトリウム入り容器への血液量（試料3）が十分に得られなかった。その結果、検査項目のPT及びAPTTが測定できなかった。

同群の6例中5例でPT及びAPTTが測定できており、被験物質投与による影響を評価するのに十分な例数の測定がなされていることから、試験評価への影響は無いと判断した。
### 2.12 資料の保存

試験計画書原本（試験計画書変更書を含む）、記録文書、生データ、報告書類（最終報告書の原本を含む）及び標本は株式会社ボゾリサーチセンターつくば研究所の資料保存施設に保存する。なお、その期間は最終報告書提出後5年間とする。期限終了後の保存については、独立行政法人産業技術総合研究所と株式会社ボゾリサーチセンター間で協議し、その処置を決定する。ただし、長期保存に耐えられない生体試料（尿及び血漿）については、試験終了時に廃棄する。

### 2.13 試験責任者の記名・押印

金 光 弘 幸 年 月 日 印

株式会社ボゾリサーチセンター つくば研究所

## 要約

ハロモナス菌乾燥菌体及び3-ヒドロキシ酪酸を注射用水にそれぞれ懸濁及び溶解し、0（媒体）、各被験物質それぞれ1000及び2000 mg/kg/日の投与量で6週齢のCrl:CD(SD)SPFラット（1群雌雄各6匹）に4週間強制経口投与し、その毒性を検討した。

ハロモナス菌乾燥菌体及び3-ヒドロキシ酪酸投与群のすべての動物で、一般状態、体重、摂餌量、血液学検査、血液化学検査及び剤検で投薬起因性の毒性変化は認められなかった。

以上の結果から、本試験におけるハロモナス菌乾燥菌体及び3-ヒドロキシ酪酸の無毒性量（NOAEL）は、雌雄ともに2000 mg/kg/日を上回ると推定された。

## 試験材料及び方法

### 2.14 被験物質及び媒体

#### 2.14.1 被験物質 1

供給者：独立行政法人産業技術総合研究所

名称：ハロモナス菌乾燥菌体

含量 : ほぼ 100%

性状 : 乾燥菌体

保存方法 : 冷凍（冷凍庫内、許容値：-20℃以下、実測値：-38.6~-24.1℃）

保存場所 : つくば研究所 被験物質保存室及び被験物質調製室

返却 : 動物試験終了後の残量はすべて試験委託者に返却した。
#### 2.14.2 被験物質 2

供給者 : 企業より分与

名称 : 3-ヒドロキシ酪酸

含量 : 95%以上

性状 : 淡黄色液体

保存方法 : 冷蔵（冷蔵庫内、許容値：1~10℃、実測値：2.9~5.0℃）

保存場所 : つくば研究所 被験物質保存室及び被験物質調製室

返却 : 動物試験終了後の残量はすべて試験委託者に返却した。

#### 2.14.3 媒体

名称 : 注射用水

规格 : 日本薬局方

メーカー : 株式会社大塚製薬工場

ロット番号 : 4E88N 及び 4G73N

保存方法 : 室温

保存場所 : つくば研究所 媒体調製室

### 2.15 投与液の調製

調製方法：試験1から4日までハロモナス菌乾燥菌体を必要量秤量し、媒体を加え懸濁し、所定濃度とした。試験5日以降は、ハロモナス菌乾燥菌体を必要量秤量し、アルミナ乳鉢を用いて粉砕しつつ媒体を徐々に加えて懸濁させ、所定濃度とした。試験期間を通じて、3-ヒドロキシ酪酸を必要量秤量し、媒体を加え加温後（約50℃）溶解し、所定濃度とした。なお、各投与液ごとに調製した。

調製頻度：用時調製（調製後3時間以内に投与に使用した。）

### 2.16 試験動物種及び系統の選択理由

毒性試験ガイドラインによりげっ歯類を用いた試験が必要とされている。ラットは医薬品などの安全性試験に広く用いられており、この試験に使用される系統のラットは特性がよく知られ、背景資料が豊富であることから選択した。

### 2.17 試験動物

Sprague-Dawley 系 SPF ラット〔Crl:CD(SD)、日本チャールス・リバー（株）、厚木飼育センター〕雌雄各 33 匹を 5 週齢で購入し、4 日間の検疫期間を含む 7 日間の検疫・馴化飼育し、体重増加（検疫初回の体重~群分け時の体重）が順調で一般状態に異常の
みられなかった動物を選び、6週齢で試験に供した。使用動物は雌雄各30匹を用いた。検疫・馴化期間中、体重を3回（投与開始の6、4及び2日前）測定し、一般状態の観察を毎日1回行った。その結果、体重推移及び一般状態に異常はみられなかった。投与開始日の体重範囲は雄で191~216g、雌で138~181gであった。群分け後の予備動物は、試験から除外した（試験1日に、教育・研究用として飼育室から搬出した）。

### 2.18 飼育条件

動物は、温度 $ 22 \pm 3^{\circ}C $ （実測値：21.3~23.1℃）、相対湿度 $ 50 \pm 20\% $ （実測値：48~60%）、換気回数 1 時間当たり 10~20 回、照明 1 日 12 時間 ±15 分（07:00~19:00）の動物飼育室（飼育室番号：D302 号室）に、床敷（7070C、販売業者：株式会社日本医科学動物資材研究所、生産所：Harlan、ロット番号：090914P）を入れたポリカーボネート製ケージ（W $ 280 \times D440 \times H210 mm $ ）で個別飼育し、固形飼料 CR-LPF（放射線滅菌：オリエンタル酵母工業（株）、ロット番号：141022）及び飲料水（つくば市水道水：給水瓶使用）を自由に摂取させて飼育した。

### 2.19 飼料、床敷及び飲料水中の混入物質の分析

飼料、床敷及び飲料水中の混入物質の分析は下記の施設で実施し、その分析報告書を入手した。試験成績に影響のないことを確認したのち、分析報告書の写しを生データとして保存した。

供試飼料についての分析報告書（Eurofins Food and Product Testing K.K、供試全ロット）

供試床敷についての分析報告書（harlan、供試全ロット）

水道法に準拠する水質の分析報告書（株式会社 江東微生物研究所、2014 年 11 月）

### 2.20 動物の識別

動物は、入荷時に小動物用耳標をつけて個体識別を行った。群分け後は、性別及び投与量ごと[対照群、低及び高用量（ハロモナス菌乾燥菌体群）、低及び高用量（3-ヒドロキシ酪酸群）]に4桁の動物番号を付けた。この場合、1000の位は群、100の位は性（0番を雄、1番を雌とした）、10と1の位は個体番号とした。各飼育ケージには用量（群）ごとに色分けし、試験番号、投与経路、投与量、性、動物番号、耳標番号、被験物質名及び割検予定日を明記したケージラベルを揭示した。

### 2.21 群分计

「4.4 試験動物」に示した手順で選択した動物を群分け当日（投与開始2日前）の体重に基づいて、各群の平均体重ができるだけ均等となるように各群を構成した。個体の割付けはコンピュータを用いたブロック配置法及び無作為抽出法の組合せ（ブロック配
置法で必要な群を構成し、試験群及び群内の個体番号を無作為に割当てた）により行った。

### 2.22 投与経路、投与期間及び投与回数とそれらの選択理由

毒性試験ガイドラインに準じ、投与経路は使用適用予定経路である経口投与を選択し、投与期間は4週間とした。投与回数は反復投与試験で一般的に行われている1日1回（7回/週）とした。

### 2.23 投与方法

投与方法は、げっ歯類の経口投与に際して一般的な強制経口投与とした。

投与容量は 10 mL/kg 体重とし、胃ゾンデを用いて強制経口投与した（08:50~12:55）。

対照群には媒体（注射用水）を同様に投与した。個体ごとの投与液量（表示単位：0.1 mL）は最新の体重を基準に算出した。

### 2.24 投与量及び群構成

ハロモナス菌乾燥菌体及び3-ヒドロキシ酪酸を、それぞれ投与量1000及び2000mg/kg/日の2用量とし、対照群を加え5群構成とした。1群当たりの動物を雌雄各6匹とした。群構成表を次に示す。

## 群構成表

被験物質名	試験群	投与量
(mg/kg/日)	濃度
(mg/mL)	投与容量
(mL/kg)	性	動物数	動物番号
対照群	0	0	10	雄
雌	6
6	1001~1006
1101~1106
ハロモナス菌
乾燥菌体	低用量群	1000	100	10	雄
雌	6
6	2001~2006
2101~2106
高用量群	2000	200	10	雄
雌	6
6	3001~3006
3101~3106
3-ヒドロキシ
酪酸	低用量群	1000	100	10	雄
雌	6
6	4001~4006
4101~4106
高用量群	2000	200	10	雄
雌	6
6	5001~5006
5101~5106

### 2.25 投与量の設定根拠

本試験は各被験物質の毒性情報が不明であったため、一般毒性試験における最大投与量2000 mg/kg/日を高用量とし、1000 mg/kg/日を低用量とした。
### 2.26 観察及び検査の方法

投与開始前は入手した全動物について、投与期間中は試験群の動物について次の表に示す観察及び検査を実施した。試験日の起算に関しては下記の通りとした。

試験 1 日 （Study Day 1） ：投与開始日

試験 1 週（Study Week 1） : 試験 1 から試験 7 日

観察及び検査（生前検査）の項目及び実施時期など

項目	実施時期又は頻度
一般状態観察	投与開始前（検疫・馴化期間中）：1回/日投与期間中：投与前、投与直後及び1~3時間後の間（土及び休日は投与前と投与直後）
体重測定	投与開始前（検疫・馴化期間中）：3回（投与開始の6、4及び2日前）投与期間中：試験1、4、7、10、14、17、21、24及び28日（測定当日の投与前）剖検日：剖検のための動物搬出前
摂餌量測定	投与期間中：試験1、4、7、10、14、17、21、24及び28日（測定当日の投与前）
摂水量測定	試験4週（試験26及び27日）の尿検査時
尿検査	試験4週（試験26及び27日）

#### 2.26.1 一般状態の観察

全個体について、体外表、栄養状態、姿勢、行動及び排泄物の異常などの一般状態を観察した。

#### 2.26.2 体重测定

全個体について 07:18~10:52（投与期間中は測定当日の投与前）に測定した。剖検日には相対器官重量算出のため、前日から約16時間絶食させた後の体重を測定した。瀕死期剖検動物については、搬出前に測定した（ただし、データは参考値とし帳票には記載していない）。

#### 2.26.3 摂餌量測定

全個体について 07:53~11:10（投与期間中は測定当日の投与前）に測定した。投与開始日の測定は前日からの1日量を、その後は3から4日ごとに3ないし4日間の累積摂取量を測定し、1匹1日量を算出した。

#### 2.26.4 摄水量测定

尿検査時に、尿検査対象動物について前日からの１日当たりの摂水量を給水瓶を用い
て測定した。

#### 2.26.5 尿検査

試験 4 週の検査当日の投与後、全ての生存例を採尿用のバットを取り付けた金網ケージ（W280×D350×H175 mm）に入れ尿検査を実施した。絶食・自由摂水下で4時間尿を、次いで自由摂食・自由摂水下でその後の20時間尿を採取した。次の表に記載した項目及び方法により検査した。測定用の試料は、遠心分離（設定：室温、約500×g、約5分間）した上で測定に供した。

尿検査の項目、測定法及び使用機器など

検査項目	試料	検査方法	単位
pH	4時間尿	試験紙法 (MultiStix a)	-
タンパク質(protein)	4時間尿	試験紙法 (MultiStix a)	-
ケトン体(Ketone body)	4時間尿	試験紙法 (MultiStix a)	-
グルコース(Glucose)	4時間尿	試験紙法 (MultiStix a)	-
潜血(Occult blood)	4時間尿	試験紙法 (MultiStix a)	-
ビリルビン(Bilirubin)	4時間尿	試験紙法 (MultiStix a)	-
ウロビリノーゲン(Urobilinogen)	4時間尿	試験紙法 (MultiStix a)	E.U./dL
色調(Color)	4時間尿	肉眼検査	-
尿量(Uri.Vol.) Note	4及び20時間尿	目盛り付のスピッツ管又はシリンジを用いて測定	mL
使用機器
a): 尿自動分析装置 Clinitek Advantus™ (Siemens Healthcare Diagnostics)

Note: 4 時間値と 20 時間値を合計し、24 時間尿量を算出した。

#### 2.26.6 臨床検査用採血

剖検日に各群の全ての生存例についてイソフルラン麻酔下で動物（約16～20時間絶食）の腹大動脈から採血を行った。採取用器材、採血量及び試料の種類を次の表に示す。血漿を得るために遠心分離（設定：室温、約2,000×g、約10分間）を行った。

臨床検査用採血、採取用器材及び採血量など

試料注	採取用器材	採血量	試料の種類
1	EDTA-2K入り容器(SB-41:シスメックス株式会社)	約1mL	血液
2	ヘパリンナトリウム入り容器(ベノジエクトⅡヘパリンナトリウム(5mL用):テルモ株式会社)	約4mL	血漿
3	3.2%クエン酸ナトリウム入り容器 (3.2%クエン酸ナトリウム入りニプロ採血管：ニプロ株式会社) (3.2%クエン酸ナトリウム：血液=1:9)	約1.8mL	血漿

注：採血は1→2→3の順に実施した。

## 1 ）血液学検査

試料 1 及び 3 について実施した。また、鏡検による確認に備え試料 1 の一部を用いて May-Grünwald-Giemsa 染色血液塗抹標本を作製した。検査項目及び方法等を次の表に記載した。

血液学検査の項目、測定法及び使用機器など

検査項目	試料	検査方法	単位
赤血球数(RBC)	血液	2角度レーザーフローサイトメトリー法a)	×10^4/μL
ヘモグロビン濃度(HGB)	血液	シアンメトヘモグロビン変法a)	g/dL
ヘマトクリット値(HCT)	血液	赤血球数と平均赤血球容積から算出	%
平均赤血球容積(MCV)	血液	2角度レーザーフローサイトメトリー法a)	fL
平均赤血球ヘモグロビン量(MCH)	血液	ヘモグロビン濃度と赤血球数から算出	pg
平均赤血球ヘモグロビン濃度(MCHC)	血液	ヘモグロビン濃度とヘマトクリット値から算出	g/dL
網状赤血球数(Retic)	血液	RNA染色によるレーザーフローサイトメトリー法a)	×10^9/L
血小板数(PLT)	血液	2角度レーザーフローサイトメトリー法a)	×10^4/μL
白血球数(WBC)	血液	2角度レーザーフローサイトメトリー法a)	×10^2/μL
白血球百分比Note	血液	ぺルオキシダーゼ染色によるフローサイト	%,
メトリー法と2角度レーザーフローサイト	×10^2/μL
メトリー法a)
プロトロンビン時間(PT)	血漿	クロット法b)	S
活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT)	血漿	クロット法b)	S

Note: リンパ球 (LYMP)、好中球 (NEUT)、好酸球 (EOS)、好塩基球 (BASO)、単球 (MONO)、大型非染色性細胞 (LUC)。また、上記の細胞数を白血球数と白血球百分比から算出した。

## 2 ）血液化学検査
試料 2 について実施した。検査項目及び方法等を次の表に記載した。

血液化学検査の項目、測定法及び使用機器など

検査項目	試料	検査方法	単位
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ (AST)	血漿	UV レート法a)	IU/L
アラニンアミノトランスフェラーゼ (ALT)	血漿	UV レート法a)	IU/L
アルカリフォスファターゼ (ALP)	血漿	Bessey-Lowry 法a)	IU/L
γ-グルタミルトランスペプチダーゼ (γ-GTP)	血漿	L-γ-glutamyl-3-carboxy-4-nitroanilide 法a)	IU/L
総コレステロール (T-CHO)	血漿	CEH-COD-POD 法a)	mg/dL
トリグリセライド (TG)	血漿	LPL-GK-GPO-POD 法a)	mg/dL
総ビリルビン (T-BIL)	血漿	ビリルビンオキシダーゼ法a)	mg/dL
グルコース (GLU)	血漿	グルコースデヒドロゲナーゼ法a)	mg/dL
尿素窒素 (BUN)	血漿	ウレアーゼ-LEDH 法a)	mg/dL
クレアチニン (CRNN)	血漿	Creatininase-creatinase-sarcosine oxidase-PPOD 法a)	mg/dL
ナトリウム (Na)	血漿	イオン選択電極法a)	mmol/L
カリウム (K)	血漿	イオン選択電極法a)	mmol/L
クロライド (Cl)	血漿	イオン選択電極法a)	mmol/L
カルシウム (Ca)	血漿	OCPC 法a)	mg/dL
無機リン (P)	血漿	モリブデン酸法a)	mg/dL
総タンパク質 (TP)	血漿	ビュレット法a)	g/dL
アルブミン (ALB)	血漿	BCG 法a)	g/dL
アルブミン・グロブリン比 (A/G)	血漿	総タンパク質とアルブミンから算出	-
使用機器

a): 臨床化学自動分析装置 TBA-120FR (Toshiba Medical Systems)

## 3 ）瀕死動物の取り扱い

瀕死動物（動物番号:5005）については、可能な範囲内で臨床検査を実施したが、クエン酸ナトリウム入り容器への血液量（試料3）が十分に得られなかったため、PT及びAPTTについては測定できなかった。なお、それらすべての成績は統計解析から除外した。
#### 2.26.7 病理学检查

##### 2.26.7.1 剖検

計画剤検動物全例について血液学及び血液化学検査用試料の採血を終えた後、腹腔血管からの放血により安楽殺し、剤検を行い、以降の検査を実施した。

##### 2.26.7.2 器官重量测定

計画剖検動物全例について、次表に示す器官の絶対重量を測定するとともに、絶食後の体重から相対重量（／100 g 体重）を算出した。両側器官は左右別に測定するが、左右の値を合算して評価した。

##### 2.26.7.3 固定/保存

計画剖検動物全例について、眼球、視神経、精巣、精巣上体を除く次表に示す器官・組織を10％リン酸緩衝ホルマリン液で固定し、保存した。眼球及び視神経は3％グルタルアルデヒド・2.5％ホルマリン液にて、精巣及び精巣上体はブアン液にて、それぞれ固定後、10％リン酸緩衝ホルマリン液に移し、保存した。

##### 2.26.7.4 病理組織學檢

計画剖検で被験物質投与に起因すると考えられる変化のみられた器官・組織がみられなかったため、病理組織学検査は実施しなかった。

##### 2.26.7.5 瀕死動物の取扱い

瀕死に陥った動物（動物番号:5005）はイソフルラン麻酔下で開腹し、可能な範囲内で採血して放血致死させた後、速やかに剤検した。瀕死動物の器官重量は測定していない。瀕死動物については、次表に示す対象の器官／組織を10％リン酸緩衝ホルマリン液にて固定し、保存した。瀕死動物の器官・組織については、被験物質投与に起因すると考えられる変化がみられなかったため、病理組織学検査は実施しなかった。

## 固定/保存对象器官/組織

器官/組織	病理学検査
固定／保存	器官重量
大腦	√	√
小腦	√	(脳として測定)
脊髓(胸部)	√
坐骨神経	√*
眼球	√*
視神経	√*
器官/組織	病理学検査
固定／保存	器官重量
ハーダー腺	✓*
下垂体	✓	✓
甲状腺	✓*	✓
上皮小体	✓*	(甲状腺として測定)
副腎	✓*	✓
胸腺	✓	✓
脾臓	✓	✓
顎下リンパ節	✓
腸間膜リンパ節	✓
心臓	✓	✓
胸大動脈	✓
気管	✓
肺(気管支を含む)	✓	✓
舌	✓
食道	✓
胃	✓
十二指腸	✓
空腸	✓
回腸(パイエル板を含む)	✓
盲腸	✓
結腸	✓
直腸	✓
顎下腺	✓*
舌下腺	✓*
肝臓	✓	✓
脾臓	✓
腎臓	✓*	✓
膀胱	✓
精巣/卵巣	✓*/✓*	✓/✓
精巣上体/子宮	✓*/✓*
前立腺/膠	✓/✓
精囊	✓*
乳腺(鼠径部)	✓*
器官/組織	病理学檢查
固定/保存	器官重量
胸骨(骨髓)	✓
大腿骨(骨髓)	✓*
大腿部骨格筋	✓*
皮膚(鼠径部)	✓*
肉眼的異常部位	✓
喉頭	✓
鼻腔**	✓

個体識別部位（耳標裝着耳介）も同様に保存した。

√印の部位を採取、器官重量測定、固定/保存した（瀕死動物の器官重量は測定していない）。

$ ^{*} $ ：両側性臓器は、両方を採取し固定・保存した。

**: 動物番号:5005 の瀕死の原因が鼻腔内にある可能性があったため、鼻腔を脱灰後切り出し、鼻腔内を観察した。

### 2.27 統計解析

計量データ（体重 $ ^{*} $ 、摂餌量、摂水量、尿検査の定量的項目、血液学検査、血液化学検査及び器官重量）について、次の手順に従って検定した。

先ず、Bartlett 法により分散性の検定を行った（有意水準：1%）。分散が等しい場合には Dunnett 法を用いて、非等分散の場合は Steel 法を用いて対照群とハロモナス菌乾燥菌体群、対照群と3-ヒドロキシ酪酸群の間で検定（有意水準：両側 5 及び 1%）を行った。なお、検定には SAS $ ^{®} $ Release 9.1.3（SAS Institute Inc.）を使用した。

*：相対器官重量算出のためのみに測定した剖検日の体重は除外した。

### 3. 試験結果

### 3.1 死亡動物

ハロモナス菌乾燥菌体投与群：

雌雄ともに投与期間を通じて死亡動物はみられなかった。

3-ヒドロキシ酪酸投与群：

2000 mg/kg/日投与群の雄1例（動物番号:5005）が試験20日に瀕死期削検。対照群及び1000 mg/kg/日投与群の雄並びに雌の全例で死亡はみられなかった。

### 3.2 一般状態

成績を Table 1-1~1-6 及び Appendix 1-1~1-30 に示す。

ハロモナス菌乾燥菌体投与群：

雌雄ともに投与期間を通じて、異常はみられなかった。