Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
## （6） チーク造林地

## 1 ）結果

### a. 階層構造

図(3)-15と表(3)-12に調査区T-43のM-w図と、M-w図により分けられた各調査区の階層数と毎木調査の結果をそれぞれ示す。一般にモノカルチャー林分においては階層構造が発達しない単層であるといわれているが、T-43において4層の階層が確認され、最も階層構造が発達していた。T-45、M-43-1、M-43-2、E-29、E-17においては3層、T-58、E-12、G-18においては2層が確認された。T-6においては階層構造が発達せず単層であった。全調査区間の比較において階層数はBA、最大個体重、総個体重、最大DBHのバイオマス量に関係するものと正の相関が見られ、階層が多いほどバイオマス量が多いという結果となった。また、林齢、個体密度、最大樹高との相関は見られなかった。また、樹種特性を考慮し、チーク林分のみにおいて同様の関係を検討したところ、同様の結果が得られた。調査された11林分のうち9林分では、階層構造を構成する樹種は植栽種であり、植栽種以外の樹種の侵入は希であった。M-43-1において第1層は植栽種であるマホガニー、第2層はマホガニーとチーク、第3層はチークによって構成されていた。またG-18においては先駆種のMelaleuca spp.が植栽種とともに第1層に、Anacaldium occidentaleが第2層に侵入しており、上記2つの調査区においては植栽種以外の樹種が侵入し階層を構成していた。

### b. 個体密度と平均個体重の関係

階層毎の平均個体重、密度、BAを算出すると、どの調査区においても上層から下層にかけて各階層の平均個体重とBAは減少し、個体密度は高くなった。

ある個体群の利用できる空間資源の総和は有限であり、個体数の増加は個体あたりに配分される空間資源が減少を意味する。依田らは密度を変えて植栽された同種の個体群において、平均個体重(w)は密度( $ \rho $ )の3/2乗に反比例する（式（3））ことを明らかにし、それを自然間引きの3/2乗則とした（Yoda et al., 1963） $ ^{21)} $ 。

$$ w=A\rho^{B}\quad\cdot\cdot\cdot(3) $$

ここでのA, Bは線分ごとに決まる係数で、Bの値はほぼ1.5の値をとるとされる $ ^{21)} $ 。調查林分の階層間において平均個体重と密度の関係を両対数グラフにプ

表(3)-12 階層構造と毎木調査結

Plot	Layers	Density	DBH	Hinght	BA
[trees/ha]	[cm]	[m]	[m2/ha]
T-43	4	1538	18.5	15.0	58.2
T-6	1	822	13.9	10.9	12.6
T-36	2	611	20.9	15.9	23.1
T-45	3	211	43.6	31.3	32.3
T-58	2	155	50.0	33.5	30.7
M-43-1	3	344	32.7	20.3	42.2
M-43-2	3	1122	21.7	13.5	51.4
E-29	3	361	30.8	24.7	25.6
E-17	3	258	32.5	25.1	29.4
E-12	2	750	16.5	19.1	18.2
G-18	2	1578	14.5	15.6	29.8

図(3)-15 階層構造
ロットし、式（3）によって回帰すると、T-43、T-36、M-43-2、E-29の階層間において自然間引きの3/2乗則に類似した関係がみられた（図(3)-16）。

### c. 遺伝構造解析

サンプリングされた全個体の葉組織からのDNA抽出まで完了し、PCR増幅と遺伝子解析ソフトによる解析が現在進行中である。算出されたヘテロ接合度と近交係数とM-w図によって判別された階層との関係を検討する予定である。T-43において得られた結果を図(3)-17に示す。図(3)-17(A)は階層毎のヘテロ接合度、図(3)-17(B)は階層毎の近交係数の関係である。ヘテロ接合度は階層が上位であるほど高く、下位であるほど低くなった。近交係数は階層が上位であるほど低く、下位であるほど高くなった。

図(3)-16 T43 における個体密度と平均個体重

図(3)-17 T43における個体密度とヘテロ接合度(A)、および個体密度と近交係数(B)との関係

## 2 ）考察

### a. 階層構造

よく発達した天然林において、侵入、定着時期の異なる様々なサイズの個体や、多様な樹種構成によって階層構造が複雑になる。それらは光、温度、湿度などの環境因子に傾度を生じ、様々な生物に対してニッチを提供するため複雑な階層構造ができる。その結果、生態系として膨大な現存量や種多様性を維持していると考えられている。一方、調査された人工林において、階層構造の発達はみられたが、M-43-1、G-18を除いて、階層を構成する樹種は植栽種のみであり、サイズの異なる同種個体よって階層構造が生じていた。同種同齢のモノカルチャー林分においては資源、特に光資源を獲得するための種内競争が起こり、生長がよく適応度の高い個体が上層を優占し、適応度の低い個体を被圧した結果、階層構造が形成された。階層構造は非生物的環境要因に傾度を生じ、ニッチを提供するため、階層構造の発達した人工林において植栽種以外の生物種の生態系への侵入を可能にすると考えられる。人工林における植物種の定着には、植栽種の特徴（散
布型など）や植栽方法、種子源からの距離など様々な要因が影響する $ ^{15} $ 。なぜ調査された人工林においてDBH≥4cmの木本種の定着が希であったのか、本調査からは明らかではない。調査区を設置した人工林の林床では牧草（Pennisctum purpureum）の植栽がおこなわれ、人口過密地域であるジャワ島特有の人為活動も、人工林における植物種の定着に何らかの影響を与えた可能性がある。

最も階層構造が発達したT-43において大径木の伐採痕と植栽後に天然更新したと思われる小径の個体が見られた。チークをはじめ、モノカルチャーに用いられる樹種は耐陰性の低い陽樹が一般的であるが、同調査区においては間伐による林床の光環境の改善が陽樹であるチークの天然更新を可能にさせ、階層構造を複雑にしたのではないかと考えられる。間伐等により人為的に階層構造を複雑に、植栽種の天然更新やあるいは他種の侵入・定着を可能にし、階層構造を複雑にさせることができるのではないかということを示唆している。また熱帯地域特有の高い太陽高度も、陽樹からなる森林の階層構造を発達させる要因ではないかと考えられる。

### b. 個体密度と平均個体重の関係

どの林分においても上層から下層にかけて、各階層の平均個体重とBAは減少し、個体密度は高くなったが、これはつまり上層ほど個体数は少ないが、個体サイズが大きく、下層ほど個体数が多いが個体サイズが小さいということである。大きな個体ほど優占する空間は大きく、個体サイズの増大は密度効果として個体に影響した結果、上層では個体密度が低下し、個体サイズの小さい下層では高い個体密度となったと考えられる。興味深いことに、T-43、T-36、M-43-1、E-29の4つの林分の階層間において自然間引きの3/2乗則の関係がみられた。一般に自然間引きの3/2乗則は、自然間引きの起こっている植栽密度（個体密度）の異なる林分間（個体群間）にみられるが、本研究では人工林における階層間にそれらの法則がみられた。つまり、上記の林分は自然間引きの起こっている異なる個体密度の林分が同所的に存在している、と言い換えることができる。例えば2層からなる人工林は、低密度で個体サイズが大きい個体群（第1層）と、高密度で個体サイズの小さい個体群（第2層）という2つの異なる密度の個体群からなり、階層一つひとつは自己間引きをしている。調査された人工林は同種同齢個体群（コホート）であるから、植栽後の個体サイズの増加に伴い、コホートがサブ個体群（階層）へと分岐し、それが階層構造に発達した。階層構造の発達（サブ個体群への分岐）により個体密度を減らすことで、あるコホートが空間的棲み分けをしていると考えられる。階層数とBAの両者の関係に正の相関がみられたことも、これによって説明できる。

Yamakura $ ^{20} $ やFerozら $ ^{5)} $ はよく発達した天然林における階層間においても自然間引きの3/2乗則が確認されることを明らかにしている。それは自然間引きの3/2乗則がみられた人工林は、天然林と構造的特徴が類似していることを意味している。そのことは森林生態系内の構造的特徴に由来する非生物的環境要因（光や温度などの傾度）が類似し、それらは多様なニッチを他の生物種に提供している可能性があることを示している。しかし、階層構造を構成する種組成は単一で、多樹種から成る天然林とは全く異なっているため、提供されるニッチの多様性は大きく異なっているだろう。今後、単一樹種からなる人工林と天然林の構造的類似は、森林のもつ様々な機能にどのように影響するのかを明らかにし、より詳細な人工林生態系の評価を行うことが必要である。

### c. 遺伝的構造

近親交配の度合いを表す尺度として用いられる近交係数は、適応度が高いと考えられる上位の階層ほど低くなった。またヘテロ接合度は上位階層ほど高くなった。これらの結果上位の個体ほ
ど適応度が高いという可能性を示した。今後は現在進行中の分析をおこない、データ数を増やし検討する予定である。

## 3 ）まとめと成果

本研究により、モノカルチャーの熱帯人工林は植栽種から構成される階層構造をもつことがわかった。いくつかの林分の階層間において自然間引きの3/2乗則がみられた。階層構造の発達は個体密度を減少させ、個体群がサブ個体群として分岐することで空間資源を有効利用し、空間的棲み分けをしていると考えられる。自然間引きの3/2乗則は天然林の階層間においても確認されており、上記の法則がみられる人工林生態系と天然林生態系は構造的に類似していると考えられる。この類似は人工林生態系が多様なニッチを提供していると考えられるが、階層構造を構成する種組成は全く異なっているため、提供されるニッチの多様性は低いだろう。これらの構造的類似は、森林のもつ様々な機能にどのように影響するのかを明らかにし、より詳細な人工林生態系の評価をしてゆくことが必要である。遺伝的構造は、階層構造の上層サブ個体群ほど適応度が高い事を示しており、同種同令の一斉人工林であっても、遺伝的に多様であるならば、少なくとも垂直構造は健全さを維持できることを示唆した。このことは、現実的な熱帯林修復再生方法である人工植栽において、遺伝的多様性の重要さを示している。

## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

## 1 ）熱帯林の遺伝的多様性

フタバガキ科の主要樹種数種についてボルネオ島、マレー半島、スマトラ島での遺伝的多様性の有り様が葉緑体および核DNAレベルで明らかになった。熱帯林は生物多様性が高い地域であると認識されてきたが、遺伝的多様性が同様に高いのかどうかについて詳しいデータがこれまでなかった。本研究により種内の遺伝的多様性の程度は温帯林と同程度であることが分かった。しかし、熱帯林では種多様性が高いことから属などの高次分類群では多様性が高くなることが考えられる。

## 2 ）熱帯林の遺伝構造

フタバガキ科の主要樹種数種について集団の遺伝構造が明らかにされ、その地理的分布を示すことが出来た。集団ごとの遺伝的変異量に基づいて、新しい解析方法（LAMARCなど）を用いることによりクラスター間の遺伝子流動の方向性や集団の拡大、縮小の傾向を示すことができる。これらに基づいて種集団の適応地図を作製し、これに基づいた多様性や遺伝的分化に配慮した造林や森林の保全計画を立てることが出来る。

## （２）環境政策への貢献

東南アジア熱帯雨林のフタバガキ科樹種を中心にした樹木集団の遺伝的多様性及び遺伝構造が明らかになってきた。これによって、遺伝構造を踏まえた保全すべき林分の線引きが可能になり、また見出された変異そのものが種や産地の目印となり、育種にも適用できる遺伝子マーカーとして用いることが出来る。また、地域集団内において繁殖構造がどのように遺伝構造を規制するか
についての図式も明らかにされつつある。これをふまえて熱帯林の集団構造のモデル化を行った。このモデルによれば森林伐採や土地利用による森林の破壊（断片化、孤立化）は長時間の遺伝的変化(多様性の消失や近親交配の増加)を待つまでもなく，遺伝子流動の遮断や適応度の高い林分の消失により，急速に劣化が進むことが予想される。従って適応度の高い林分あるいは多様性の高い林分を見極め、遺伝子資源林として保全することが重要である。本研究の結果はこのような林分を特定する方法と、実質的なデータを提供するものである。また森林の遺伝構造は長時間を経て達成された多種共存の平衡状態の上に成立しており人工的にこれを復元することは難しい。森林修復は、普遍種、固有種、稀少種、絶滅危惧種など種の置かれた状況を判断し、それに応じた保全の方法を見極めたうえで行われる必要がある。すなわち、多様性造林の目的は失われた自然状態の復元ではなく、新しい価値をもった人工的な森林の造成であることもまた理解されるべきである。今後とも、ハビタットの遺伝的背景を考慮した、より適切な森林の保全や造林の方法を開発してゆき、それを広報し、普及に努めたい。

## 6 ．国際共同研究等の状況

本研究は、以下の研究・教育機関との共同研究により実施された。

サラワク州森林公社 Lucy Chong, Bibian Diway

サバ州森林研究センター Eyen Khoo, John Sugau, Joan Pereira

マレーシアプトラ大学 Mohamad Azani Alias, Nik Muhamad Majid

ボゴール農科大学 Iskandar Siregar

インドネシア森林局 Atok Subiakto

シンガポール国立教育研究所 Shawn Lum, Kang Min Ngo, Nik Faizu

シンガポール植物園 Wong Khoon Meng

### 7. 研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

<論文（査読あり）>

1) K. KAMIYA, Y. Y. GAN, S. LUM, M. S. KHOO, S. C. CHUA AND N. FAIZU: Tree Genetics & Genome 7: 297–306 (2011)

“Morphological and molecular evidence of natural hybridization in Shorea (Dipterocarpaceae)”

2) E. S. POESIE, T. SHIMAMURA, S. E. PAGE, I. NINOMIYA, S. H. LIMIN: Tropics, 19, 93-105 (2011)

“Species Composition and Phylogenetic Diversity in a Tropical Peat Swamp Forest, Central Kalimantan, Indonesia”

3) E. S. POESIE, K. HAMAMOTO, K. MOMOSE, T. SHIMAMURA, S. E. PAGE, I. NINOMIYA, S. H. LIMIN: Tropics (in press)

“Fruiting phenology affected by seed preference and fluctuation of seed predator activity in a Tropical Peat Swamp Forest”

4) K. KAMIYA, S. NANAMI, T. KENZO, R. YONEDA, B. DIWAY, L. CHONG, M. A. AZANI, N. M. MAJID, S. K. Y. LUM, K. M. WONG, K. HARADA: Biotropica (in press)
“Demographic history of Shorea curtisii (Dipterocarpaceae) inferred from chloroplast DNA sequence variations”

## くその他誌上発表（査読なし）>

1) 原田光：林木の育種、No.232、pp.47-49（2009）「熱帯林遺伝子研究の推進」

2) 原田光:月刊愛媛ジャーナル大学発産業行シリーズ(研究成果探訪)、5月号、pp.84-85(2010)「熱帯林の遺伝子研究」

3) 上谷浩一：森林科学、第60号、p.39（2010）

「森林樹木の進化プロセスをはかるー遺伝子系統樹からわかること—」

4) 上谷浩一：森林科学、第62号、pp.3-7（2011）

「特集遺伝子から読み解く森林—熱帯アジア産樹木の進化と生物多様性に関するDNA研究」

5) 嶋村鉄也：日本熱帯生態学会ニューズレター、No.086、3-6（2012）「インドネシアにおけるフィールドワーク」

## （2） 口頭発表（学会等）

1) 原田光：第19回日本熱帯生態学会公開シンポジウム 進化の目で見る熱帯：多様性を育むメカニズム（2009）

「ダーウィンと分子進化、熱帯の遺伝的多様性を生むしくみ」

2) 上谷浩一、S.K. Shawn Y. Lum、G.Y. Yuen：第19回日本熱帯生態学会年次大会（2009）uen 「ショレア属種間雑種集団のDNA解析」

3）岸本光樹、原田光：第19回日本熱帯生態学会年次大会（2009）

「葉緑体DNAを用いたDryobalanops属（フタバガキ科）の系統地理学的研究」

4）田中憲蔵、米田令仁、上谷浩一：第19回日本熱帯生態学会年次大会（2009）「シンガポール孤立林におけるフタバガキ科雑種稚樹の葉の特性」

5) 上谷浩一、原田光、名波哲、田中憲蔵、米田令仁、B.Diway、L. Chong、M.A. Alias、N.M.Majid、S. Lum、K.M. Wong：第20回日本熱带生態学会年次大会（2010）

「セラヤ (Shorea curtisii) 地域集団の葉緑体DNA多型」

6）田中憲蔵、市栄智明、上谷浩一：第20回日本熱帯生態学会年次大会（2010）「シンガポール断片化林におけるフタバガキ科雑種苗の光合成特性」

7) K. Kamiya, S. K. Shown, S. K. Y. Lum, K. Harada. The 2010 annual international meeting of the Association for Tropical Biology and Conservation (ATBC), Bali (2010)

"Hybridization in Shorea species and its consequences"

8) K. Harada, K. Kamiya, S. Nanami, K. Tanaka, R. Yoneda, B. Diway, L. Chong, M. A. Alias, N. M. Majid, S. K. Shawn, Y. Lum, K. M. Won: $ 4^{th} $ Rispescia and $ 3^{rd} $ GEN Network International Seminar Sustainable Bio-Resources for Global Welfare (2010)

“Chloroplast DNA polymorphism in the local populations Seraya (Shorea curtisii Dyer)”

9) H.H. Rachmat, I.Z. Iskandar, Supriyanto, K. Kamiya, K. Harada: $ 4^{th} $ Rispescia and $ 3^{rd} $ GEN Network International Seminar Sustainable Bio-Resources for Global Welfare (2010)
“Molecular variation of some endangered species in Indonesia”

10) 岸本光樹、原田光、上谷浩一、荒木智哉、旗谷章子、Lucy CHONG、Bibian DIWAY、Joseph Jawa KENDAWANG、John SUGAW、Eyen KHOO：日本生態学会第58回大会（2011）

「菓緑体 DNA 変異に基づく Dryobalanops 属の系統地理学的研究」

11）田中憲蔵、米田令仁、佐野真琴、上谷浩一、名波哲、Shawn LUM、則近由貴、市栄智明：第122回日本森林学会大会（2011）

「シンガポールの断片化された熱帯林におけるフタバガキ雑種稚樹の分布」

12） 武市泰典、原田光、上谷浩一、B. Diway、L. Chong、J. Kendawang、E. Khoo、J. Sugau、J. Perira：第21回日本熱带生態学会（2011）

「ボルネオにおけるShorea属Pachycarpae節の薬緑体DNAに基づいた系統地理学的研究」

13）上谷浩一、H.H. Rachmat、原田光、名波哲、田中憲蔵、米田令仁、B. Diway、L. Chong、M.A. Aliash、N.M. Majid、S. Lum、K.M. Wong：第21回日本熱帯生態学会（2011）「セラヤ（Shorea curtisii）地域集団の核DNA配列多型」

14）原田光、花田真美、上谷浩一、B. Diway、L. Chong、J.J. Kendawang、E. Khoo、J. Sugau：第21回日本熱带生態学会（2011）

「フタバガキ科リュウノウジュ属6種の核遺伝子を用いた系統解析」

15）田中憲蔵、佐野真琴、米田令仁、上谷浩一、名波哲、S. Lum、則近由貴、市栄智明：第21回日本熱带生態学会（2011）

「シンガポールの断片化熱帯林におけるフタバガキ科雑種稚樹の生育環境」

16) 岸本光樹、原田光、上谷浩一、荒木智哉、旗谷章子、L. Chong、B. Diway、J.J. Kendawang、J. Sugau、J. Perira、E. Khoo：第21回日本熱帯生態学会（2011）

“Phylogeographic study of genus Dryobalanops (Dipterocarpaceae) based on chloroplast DNA variation”

18) 二宮生夫、嶋村鉄也、柳井彰人、B. Suparno：第21回日本熱帯生態学会（2011）

「インドネシア、中部ジャワ、ワナガマ地域における人工林の林分構造」

19) 原田光、上谷浩一、ビビアン・デワイ、ルーシー・チョン、ジョセフジャワ・ケンダワン：第83回日本遺伝学会（2011）

「核遺伝子をもちいたマレーシア熱帯雨林リュウノウジュ属（フタバガキ科）の集団遺伝学的解析」

## （3） 出願特許

特に記載すべき事項はない。

（４）シンポジウム、セミナーの開催（主催のもの）

1) 遺伝子から見た熱帯林—消え行く熱帯林は救えるか？（2011年12月17日、大阪市立大学文化交流センター・ホール、観客40名）
## （５）マスコミ等への公表・報道等

特に記載すべき事項はない。

## （6） その他

特に記載すべき事項はない。

### 8 \. 引用文献

1) Clement M, Posada D, Crandall KA (2000) TCS: A computer program to estimate gene genealogies. Molecular Ecology, 10, 1657-1660.

2) Dupanloup I, Schneider S, Excoffier L (2002) A simulated annealing approach to define the genetic structure of populations. Molecular Ecology 11: 2571-2581.

3) Excoffier L, Smouse PE (2000) Using allele frequencies and geographic subdivision to reconstruct gene trees within a species: Molecular variance parsimony. Genetics. 136: 343-359.

4) FAO(2010) Forest Recourses Assessment 2010

5) Feroz SM, Yoshimura K, Hagihara A (2008) Stand stratification and woody species diversity of a subtropical forest in limestone habitat in the northern part of Okinawa Island. Journal of Plant Research 121:329-337

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22) 長池卓男(2000) 人工林生態系における植物種多様性 日林誌 82:407-416
# （４）遺伝的劣化評価２－種及び地域識別遺伝子マーカー開発と広域集団の解析

独立行政法人森林総合研究所

森林遺伝研究領域 樹木遺伝研究室 津村義彦

<研究協力者>

愛媛大学農学部

原田 光

上谷浩一

平成21～23年度累計予算額：33,623千円

（うち、平成23年度予算額：10,582千円）

予算額は、間接経費を含む。

[要旨] 東南アジアで優占しているフタバガキ科樹木のうち生態的にも林業的にも重要なShorea 属について葉緑体DNAの塩基配列を用いて種識別を行った。その結果、収集した98%の種の識別が可能であることが明らかとなった。東南アジア広域（インドネシア、マレーシア）から広域分布種であるShorea leprosulaの27集団サンプルを収集した。葉緑体で種内多型が見られた5領域の塩基配列を解読し、27のハプロタイプを検出することができた。これらのハプロタイプの分布はカリマンタンとその他（マレー半島とスマトラ島）で大きく異なっていた。またカリマンタン内でもハプロタイプの分布に違いが見られ、東部でより遺伝的多様性が高い傾向があった。またマレー半島とスマトラ島では北部の集団の方が遺伝的多様性が高かった。また $ F_{ST} $ は0.649と高い遺伝的分化を示した。これらの結果から、カリマンタン島とその他を識別することは可能であるが、特定の集団を識別することが現段階では容易でないことが明らかとなった。また核DNAのEST-SSR遺伝子座を用いた解析結果は、薬緑体DNAの結果とよく似ており、カリマンタンとその他が明瞭に遺伝的に分化していたが、その遺伝的分化係数 $ F_{ST} $ は0.0671と低い値を示した。同様に広域分布種であるS. parvifoliaは13集団をスマトラ島、マレー半島、ボルネオ島から収集した。薬緑体DNAの解析結果では25のハプロタイプを検出し、 $ F_{ST} $ は0.499と高い遺伝的分化を示した。またEST-SSR14遺伝子座で解析した結果は $ F_{ST} $ が0.16であった。またボルネオ島とその他が遺伝的に分化していたが、S. leprosulaほど明瞭には分化していなかった。また集団特異的な変異は少なく、個々の集団を識別するほどの遺伝的な違いは見られなかった。これら2種ともボルネオ島とその他で明瞭な遺伝的分化が見られ、一部の集団では遺伝的多様性が高い集団も見られた。

[キーワード] フタバガキ科、種識別、広域分布種、遺伝的多様性、地域分化

### 1. はじめに

種多様性及び遺伝子資源の宝庫であると言われている熱帯林も急速な開発とともに、その森林面積は減少の一途をたどってきた。熱帯林では種多様性の減少にとどまらず、種が長い時間をかけて蓄積してきた遺伝的多様性の消失も引き起こしている可能性がある。現在でも残った森林は
その断片化により、種多様性の減少が起こり生態系としての十分な機能さえもなくしている可能性がある。このような森林生態系は遺伝的な多様性も減少し、容易に衰退するため、健全な森林が失われてしまうことが危惧される。遺伝子資源としても貴重な熱帯林の質の低下をこれ以上引き起こさないためにも、また将来にわたって進化する可能性を含んだ遺伝的多様性を維持するために適切な保全方法が望まれている。

DNAによる種識別や地域識別が可能になれば、材の起源が明らかにできる可能性があり、木材の認証にも役立てることができるようになる。また遺伝的多様性のホットスポットが明らかになることによって、遺伝的多様性の保全策を立てることにも可能である。

## 2 ．研究開発目的

本研究では東南アジア地域で優占している樹種で生態的にも林業的にも重要であるフタバガキ科のうち最も大きなグループであるShorea属を対象に葉緑体DNAを用いた種識別を行う。またShorea属で広域分布種である2種を対象として、東南アジア各国と協力しDNAレベルでの大規模な系統地理学的研究を行ない、DNAによる産地識別の可能性について調査する。またそれぞれの地域の保有する遺伝的な特徴を明らかにし、遺伝的多様性の成立機構を明らかにし、遺伝的多様性の保全の観点から重要な森林を明らかにする。

### 3. 研究開発方法

## （１）種識別のための材料の収集

フタバガキ科のなかでも種数が最も多く生態的にも林業的にも重要なShorea属について、インドネシア及びマレーシアの植物園、樹木園及び天然林からDNA抽出用の薬組織を収集した。収集したサンプルの多くについては標本も作成した。合計で84種、200個体について収集した。

## （２）種識別のための葉緑体 DNA の解析

これまでの研究で種識別が比較的容易な薬緑体 DNA の 4 つの遺伝子間領域（trnL intron, trnL-trnF, trnH-trnK, psbC-trnS）を用いて塩基配列の解読を行った。PCR の条件は 10mMTris-HCl, pH 8.3, 50mM KCl, 1.5mM MgCl₂, 0.1% Triton X-100, 0.01% gelatin, 9.1mM dNTP, 100 pmol プライマー, 0.2μg DNA, 2.5u Taq ポリメラーゼの反応液で 94℃ 5 分後、94℃ 1 分、55-60℃ 1 分、72℃ 2 分で 35 サイクル行い、最後に 72℃ 5 分反応させた。得られた PCR 産物を生成し、シークエンス反応を行って、オートシークエンサー ABI PRISM. 3100 Genetic Analyzer（Applied Biosystems）を用いて塩基配列の解読を行った。

得られた塩基配列データを用いて系統樹を近隣接合法を用いて構築した。この際に外群としてVatica bella, V. oblongifolia, Anisoptera laebis及びCotylelobium lanceolatumを用いた。またその際に材色での分類であるレッドメランティ、イエローメランティ、ホワイトメランティ、バラウが単系統であるかどうかの確認を行った。この分岐結果の信頼性を1000回のプートストラップ解析を行って調査した。これら4つの材色の分類がそれぞれ単系統である場合は、これらを識別する塩基サイトを調べた。また輸入する際に関税率が異なるShorea albidaについても他のShorea属樹種と識別できる塩基を調査した。
## （３）地域識別のための広域分布種の収集

東南アジアのフタバガキ科のなかで広域に分布し、しかも比較的個体密度が多いShorea leprosula及びS. parvifoliaについてインドネシア及びマレーシアの広域から材料の収集を行った。S. leprosulaはマレー半島、ボルネオ島、スマトラ島、ジャワ島で27集団を収集した。S. parvifoliaは同様に4地域で13集団を収集した。

## （４）地域識別のための葉緑体 DNA 解析

薬緑体 DNA の中で地域識別が可能な多型的な領域探索のために 17 の遺伝子間領域のスクリーニングを行った。このスクリーニングには S. leprosula についてはマレー半島の 2 個体とボルネオ島の 2 個体の合計 4 個体を用いて行った。S. parvifolia についても同様に 4 個体を用いてスクリーニングを行った。S. leprosula では薬緑体 DNA で種内多型が見られた 5 領域 (trnD-trnT、petB intron、petL-psbE、psbJ-petA、rps16-trnK) の塩基配列を用いて採取した集団の解析を行った。また S. parvifolia では種内多型が見られた 2 領域 (psbJ-petA、trnQ-rps16) の塩基配列を用いて採取した集団の解析を行った。PCR の条件は 10mM Tris-HCl, pH 8.3, 50mM KCl, 1.5mM MgCl₂, 0.1% Triton X-100, 0.01% gelatin, 9.1mM dNTP, 100 pmol プライマー, 0.2μg DNA, 2.5u Taq ポリメラーゼの反応液で 94℃ 5 分後、94℃ 1 分、55-60℃ 1 分、72℃ 2 分で 35 サイクル行い、最後に 72℃ 5 分反応させた。得られた PCR 産物を生成し、シークエンス反応を行って、オートシークエンサー ABI PRISM. 3100 Genetic Analyzer（Applied Biosystems）を用いて塩基配列の解読を行った。

## （５）地域識別のための核 EST-SSR の開発と集団解析

遺伝解析用のマーカーとしてcDNAライブラリーで得られたExpressed Sequence Tag (EST)配列情報を用いてEST-SSRマーカー40遺伝子座を開発した（Ng et al. 2009, Ohtani et al. 2012）。S. leprosula の24集団を、34遺伝子座のEST-SSRで解析した。またS. parvifoliaについては収集した13集団を14遺伝子座のEST-SSRで解析した。EST-SSR解析は以下のPCR条件で行った。10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂, 0.16 mM 各dNTP, 0.128μM 各プライマー, 12.5ngの鋳型DNAと0.5 unitsのTaqポリメラーゼ。94℃で3分に続いて94℃で45秒, 55-60℃で30秒，の後72℃で45秒を35サイクル行った後、72℃で3分行った。これらはGeneAmp PCR System Model 9600または9700(Perkin-Elmer ABI Co. Ltd)を用いて行った。その後、ハイダイホルムアミド10 μ1とサイズマーカーROX400HD（Applied Biosystems）0.15μlをよく混合した液に、各マイクロサテライト遺伝子座のPCR産物0.5 μ1を加えた。それを95℃で2分熱変性を行った後、氷上で急冷しヒートショックを行った。PCR産物の断片長の決定はオートシークエンサーABI PRISM. 3100 Genetic Analyzer(Applied Biosystems)を用いた。検出されたPCR産物はGene Scan Analysis Ver.3.7（Applied Biosystems）、Genotyper Ver.3.7（Applied Biosystems）により解析を行い、遺伝子型を決定した。

## 4 ．結果及び考察

## （１）種識別のための材料の収集
## （２）種識別のための葉緑体 DNA の解析

Shorea 属の 84 種、200 個体について薬緑体 DNA の 4 領域 ((trnL intron (506bp)、trnL-trnF (441bp)、trnH-trnK (1780bp)、psbC-trnS (1559bp)) の塩基配列を解読した。合計で 4286bp の塩基配列データを得ることができた。これらの塩基情報は日本 DNA データバンク（DDBJ）に登録した。種を識別する多型サイトはイエローメランティの 17 サイトからレッドメランティの 128 サイトの範囲で塩基配列が長くなるほど多型サイトが多くなる傾向があった（表(4)-2）。各材色グループ内での塩基多様度はホワイトメランティで最も高く、イエローメランティが最も低かった（表(4)-3）。このデータでは材の分類で言われている Red Meranti、Yellow Meranti、White Meranti、Balau の 4 つのグループは明瞭に識別が可能であった $ ^{1)} $ ， $ ^{2)} $ 。

表(4)-2 材色の分類ごとの多型サイト数

グループ	trnL	trnL-trnF	trnH-psbA-trnK	psbC-trnS	合計
506 bp	441 bp	1780 bp	1559 bp
ホワイトメランティ	11 (4, 7)	14 (0, 14)	42 (7, 35)	39 (4, 35)	106 (15, 91)
イエローメランティ	3 (2, 1)	4 (1, 3)	5 (3, 2)	5 (4, 1)	17 (10, 7)
バラウ	7 (2, 5)	18 (6, 12)	35 (24, 11)	41 (12, 29)	101 (44, 57)
レッドメランティ	11 (7, 4)	26 (9, 17)	48 (27, 21)	43 (30, 13)	128 (73, 55)

表 4(4)-3 材色グループごとの葉緑体 DNA の 4 領域の塩基多様度

グループ	trnL (S.D.)	trnL-trnF (S.D.)	trnH-psbA-trnK (S.D.)	psbC-trnS (S.D.)
ホワイトメランティ	0.00468 (0.00098)	0.01043 (0.00194)	0.00679 (0.00148)	0.00555 (0.00161)
イエローメランティ	0.00075 (0.00030)	0.00164 (0.00039)	0.00060 (0.00013)	0.00037 (0.00022)
バラウ	0.00176 (0.00050)	0.00674 (0.00097)	0.00282 (0.00050)	0.00418 (0.00048)
レッドメランティ	0.00149 (0.00019)	0.00515 (0.00052)	0.00142 (0.00024)	0.00129 (0.00027)

表 4(4)-3 材色グループを識別する塩基

グループ	trnL (bp)	trnL-trnF (bp)	trnH-psbA-trnK (bp)
190	214	285	296	358	17	52	203	220	245	269	300	92	637	1416	1509	1532	1681
ホワイトメランティ	C	T	T	T	T	G	C	A	C	T	C	C	C	A	C	G	C	T
イエローメランティ	T	G	C	G	T	G	C	G	T	G	G	T	T	G	A	G	A	T
バラウ	C	T	C	T	A	G	T	G	C	T	C	T	T	G	C	T	C	T
レッドメランティ	C	T	C	T	T	A	C	G	C	T	C	T	T	G	C	G	C	C

グループ	psbC-trnS (bp)
74	109	484	526	637	655	709	766	1139	1378	1394	1414	1445	1553
ホワイトメランティ	C	C	C	G	T	G	C	T	A	A	T	A	C	G
イエローメランティ	T	C	C	A	T	T	T	T	A	T	T	A	T	A
バラウ	C	C	T	A	C	T	T	C	A	T	T	G	C	G
レッドメランティ	C	T	T	A	T	T	T	T	T	T	C	A	C	G

またそれらの分岐のブートストラップ値も高い値を示した（図(4)-1）。系統解析の結果、材色での4グループはS. roxburghiiを除いて単系統であることが支持された（図(4)-2）。それらを識別する塩基サイトはホワイトメランティ、イエローメランティ、レッドメランティ、バラウでそれぞれ9、11、6、5の塩基サイトが存在した（表(4)-4）。また4つの材色のグループの分岐はそれぞれ99、61、64のブートストラップ値を示した。それぞれのグループ内で同一の塩基配列を示した種も存在した（図(4)-3）。セクションPachycarpaeに属するS. amplexicaulis、S. pilosa、S. splendidà、S. stenoptera、S. macrophyllaは同一の塩基配列を持っていた。また異なるセクションに属する種が同一の塩基配列をもつものもあった（(i) S. smithiana (MS3), S. slooteni (MW3), S. leprosula
(MP3) and S. fallax (MW1) (ii) S. smithiana (MS1), S. leprosula (MS1), S. fallax (MW1), S. bullata (MW), S. leprosula (MP3), S. platyclados (I), and S. smithiana (MS2).。これらの種は2つのセクション Brachypterae と Mutica に属し、両セクションともレッドメランティであった。多く種の種内で複数の葉緑体ハプロタイプが見られた。いくつかの種は他種と葉緑体ハプロタイプを共有していたが、その中でもレッドメランティに属するものはその関係が複雑であった。しかし、葉緑体ハプロタイプは材の識別グループを越えて共有することはなかった。調査した塩基配列で S. albida と他の Shorea 種を識別する2つの塩基が見つかった（trnH-psbA-trnK の11番目と1225番目の塩基）。種間で同じ塩基配列を持つものも存在し、それらは種間の組み合わせで1.64%存在したが、ほとんどの種は識別可能であった。また種内多型の存在も明らかな複数個体を用いた47種のうち28種で種内多型が確認された。

図(4)-1 Shorea属の葉緑体DNAによる分子系統樹.
この研究では薬緑体 DNA の 4.2kb の塩基配列を解析したが、いくつかの種で同じ塩基配列を共有する種が存在し全ての種を識別するには至らなかった。これら近縁種は同一の塩基配列を持つ場合があるが、さらに薬緑体 DNA のいくつかの領域を調査して確認する必要がある。またある種が雑種起原である場合は、薬緑体 DNA または核 DNA の ITS（Internal transcribed spacer）などの領域を調査する必要がある。得られたデータセットで材色を識別する多くの塩基置換が見つかった。これらを特異的に増幅する例えば対立遺伝子特異的 PCR などを行うことにより、簡便な識別マーカーの開発が可能になる。

図(4)-2 Shorea属のレッドメランティグループの分子系統樹
(c) Balau

(d) White Meranti & other genera

(e) Yellow Meranti

図(4)-3 Shorea属のホワイトメタンティ、イエローメランティ、バラウグループの分子系統樹

## （３）地域識別のための広域分布種の収集

広域分布種である S. leprosula 及び S. parvifolia はスマトラ島、マレー半島、ボルネオ島などに分布している。両種とも低地から丘陵地底部にかけて分布する種である。これらの採取のためにマレー半島、ボルネオ島、スマトラ島を訪問し材料の採取を行った（図(4)-4）。マレー半島では
マレーシア森林研究所の協力の下に5集団から集団サンプルの収集ができた。またスマトラ島ではガジャマダ大学の協力で1地域で2種の集団サンプルを採取することができた。スマトラ島のその他の集団はゲッチンゲン大学の協力で分析することができるようになった。またボルネオ島のほとんどの集団はガジャマダ大学の協力の下に採取ができた。

図(4)-4 広域分布種の2種の採取集団の位置

## （４）地域識別のための葉緑体 DNA を用いた集団解析

マレーシア及びインドネシアの広域に分布する S. leprosula の遺伝的分化を調査した結果、ボルネオ島の集団とそれ以外（マレー半島、スマトラ島）で大きな遺伝的な違いが見られた。薬緑体 DNA の 5 領域（合計 4393bp）を解析した結果、21 のハプロタイプが検出された（図(4)-5、(4)-6）。集団間の遺伝的な違いを表す遺伝子分化係数は $ F_{st} = 0.5851 $ と高い値を示した。

図(4)-5 Shorea leprosula の葉緑体 DNA ハプロタイプネットワーク。
図(4)-6 Shorea leprosula の葉緑体 DNA ハプロタイプの東南アジアでの分布

S. parvifolia については遺伝的分化程度は S. leprosula に似ていたが、遺伝的分化係数は低い値であった。これから S. leprosula については，葉緑体 DNA の多型データで大きな地域の産地識別はある程度可能であることが示された（図(4)-7、(4)-8）。

図(4)-7 Shorea parvifolia の葉緑体 DNA ハプロタイプネットワーク。
図(4)-8 Shorea parvifolia の葉緑体 DNA ハプロタイプのの東南アジアでの分布。

## （５）地域識別のための核 EST-SSR の開発と集団解析

S. leprosula の EST ライブラリーを用いて EST-SSR マーカー40 遺伝子座を開発した。そのうち S. leprosula では 6 遺伝子座はハーディーワインベルグの法則から有意に歪んでいたため、これらを除いて 34 遺伝子座で集団の遺伝的多様性や遺伝構造の解析を行った。集団のヘテロ接合度は 0.370～0.472 の値をとり、アレリックリッチネスは 2.458～3.198 までの値であった。また遺伝的多様性を集団固有な対立遺伝子及び稀な対立遺伝子で調査したところ明瞭な傾向は見られなかった（図(4)-9）。これらの地域的な傾向ではマレー半島やスマトラ島などの西部の集団が、明瞭ではないが遺伝的多様性が高い傾向にあった。

図(4)-9 S.leprosula の集団固有な対立遺伝子及び稀な対立遺伝子頻度
遺伝的多様性の所在を調べたところ、カリマンタン島、スマトラ島、マレー半島などの地域間にあるものが4.38％で、地域内の集団間にあるのが6.09％で、集団内にあるのが89.53％で、約9割の遺伝的変異が集団内にあることが明らかとなった。遺伝子分化係数は低いが $ (F_{st}=0.0671) $ 、ボルネオ島の集団とそれ以外が明瞭に分化していた（図(4)-10、図(4)-11）。

図(4)-10 Shorea leprosula の EST-SSR の遺伝子型データに基づく STRUCTURE 解析結果。ボルネオ島集団とその他（スマトラ島及びマレー半島集団）が遺伝的に明瞭に分化している。

図 (4)-11 Shorea leprosula の EST-SSR の遺伝子型データに基づく集団の系統樹（Neighbor-joining 法）。ボルネオ島集団とその他（スマトラ島及びマレー半島集団）が遺伝的に明瞭に分化している。またスマトラ島とマレー半島も遺伝的な分化が見られる。
S. parvifolia では核の DNA マーカーでは同様にボルネオ島とそれ以外（マレー半島とスマトラ島）が遺伝的に分化していたが、遺伝子分化係数は $ F_{st} = 0.160 $ と葉緑体に比べ低かった（図(4)-12、図(4)-13）。DNA による地域識別は島レベルであると可能であるが、狭い地域を特定するには至らなかった。これは例えば島内の地域間の遺伝的分化があまり高くなかったことが原因であった。核 DNA レベルでは S. leprosula よりも遺伝的分化は高かった。

図(4)-12 Shorea parvifolia の EST-SSR の遺伝子型データに基づく STRUCTURE 解析結果。ボルネオ島集団とその他（スマトラ島及びマレー半島集団）が遺伝的に明瞭に分化している。

図(4)-13 Shorea parvifolia の EST-SSR の遺伝子型データに基づく STRUCTURE 解析の各地域の分布図。ボルネオ島集団とその他（スマトラ島及びマレー半島集団）が遺伝的に明瞭に分化している。