Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
8) Chao A (1984) Nonparametric estimation of the number of classes in a population. Scand. J. Statist. 11: 265-270.

9) Krebs C (1989) Ecological Methodology. HarperCollins, New York.

10) Chao A et al. (2005) A new statistical approach for assessing similarity of species composition with incidence and abundance data, 2005 Ecology Letters 8: 148-159.

11) White TJ et al. (1990) Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. p315-322. In: PCR protocols: A Guide to Methods and Applications. Academic Press.

12) Altschul SF et al. (1990) Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol. 215:403-410.

14) Sun YJ et al. (2009) ESPRIT: estimating species richness using large collections of 16S rRNA pyrosequences, Nucleic Acids Research 37: e76.

13) Huson DH et al. (2007) MEGAN analysis of metagenomic data, Genome Research 17:377-386.
# （３）遺伝的劣化評価１－地域集団の解析と多様性保全を目指した造林

愛媛大学・農学部 原田 光

二宮 生夫

嶋村 鉄也

<研究協力者>

愛媛大学農学部 上谷 浩一

平成21～23年度累計予算額：49,775千円

（うち、平成23年度予算額：16,053千円）

予算額は、間接経費を含む。

[要旨] フタバガキ科リュウノウジュ属（Dryobalanops）はボルネオ島を中心にマレー半島、スマトラ島に7種が分布している。これについてサバ、サラワク州を中心に37集団436個体分の葉のサンプルを採集し、葉緑体および核遺伝子を用いた集団遺伝学的解析を行った。葉緑体については非コード領域合計1,330bpの配列を決定した。これにより37のハプロタイプを決定した。ネットワーク解析の結果、D. aromaticaとD. beccariiは祖先的なハプロタイプを共有するのに対し、他種ではそれぞれのハプロタイプは種特有のものであり、固有種として分布の限られているものはネットワークの末端に位置する傾向が見られた。同様の結果は核遺伝子を用いた解析でも裏付けられると共に、遺伝的分化に基づくクラスター構造もある程度明らかになった。同様の解析をショレア属パキカルパ節6種（14集団212個体）についても行った。一方、マレー半島およびサバ州、サラワク州に広く分布するShorea curtisiiについて9集団、123個体について、葉緑体DNAおよび核遺伝子を用いた集団遺伝学的解析を行った。葉緑体DNAの変異からは15のハプロタイプが決定され、これを用いたネットワークからマレー半島とボルネオ島で集団が大きく遺伝的に分化していることが示された。核遺伝子の塩基差異はマレー半島の集団平均が0.00921であるのに対し、ボルネオ島集団では0.00175となり、ボルネオ島で変異が減少していることが分かった。LAMARCによる解析の結果、半島部では集団が平衡もしくは増大傾向にあり、ボルネオでは減少していることが分かった。インドネシアでは稀少種であるShorea javanica、Dipterocarpus littoralis、およびモルッカ諸島の固有種Shorea selamica, S. assamica, S. montigenaについて葉緑体、核遺伝子、およびマイクロサテライトマーカーを用いた集団遺伝学的解析を行った。一方、インドネシア・ジャワ島の古いチーク人工林で毎木調査を行い、階層別にマイクロサテライトマーカーを用いて遺伝的多様性を調べた。この結果上層ほど多様性が高く、また仮想の密度の高いところで近親交配の程度が高いことが示された。

[キーワード]

フタバガキ、遺伝的多様性、葉緑体DNA、マイクロサテライト、核遺伝子、ボルネオ、人工林
### 1. はじめに

地球上にはアジア、アフリカ、南アメリカに大きな熱帯雨林が存在し、その炭素蓄積機能から地球環境の調節に大きな役割を担っているとされる。前世紀後半から伐採や農地・プランテーションへの転換などにより世界規模での森林の減少が起こり、これに対して地球温暖化問題と共に、近年生物多様性の価値とその保全についての議論が活発に行われるようになってきた。しかしながら、多様性が維持される仕組みについては未解明であることも多い。本研究では生物多様性の二つのレベル、すなわち生態系の多様性と遺伝子レベルでの多様性がどのような関係性を持つのかについて、島嶼熱帯アジア、特にボルネオ島を中心にフタバガキ科樹木の遺伝的多様性について集団遺伝学的研究を行い、森林劣化がどのようにして起こるのか、その糸口をつかみ、指標化する方法を開発しようとするものである。

## 2 ．研究開発目的

遺伝的変異の調査は、適切な森林生態系管理方策を講じるための科学的知見として非常に重要度の高いものである。本サブテーマの目的は、（1）遺伝的変異に基づく森林劣化の評価手法の開発および、(2)多様性保全のための新しい造林手法の開発である。

## 3 ．研究開発方法

## (1) 对象種

## 1 ）Dryobalanops sp

Dryobalanops（リュウノウジュ）属はフタバガキ科のなかでも例外的に構成する種数が少なく7種が知られるのみである。これらはマレー半島、ボルネオ島およびスマトラ島に分布するが、ボルネオ島のサバ、サラワク州にはすべての種が存在する。このうち、D. aromaticaとD. beccarii、およびD. lanceolataとD. oblongifoliaは混交フタバガキ林に生育し、それぞれ葉の形態が類似するため、形態から分類することはしばしば困難とされる。これらは木材資源として経済的に重要なものであるが、あとの3種（D. rappa, D. fusca, D. keithii）はボルネオ島の固有種で分布が限られ、稀少種となっている。これらについて北ボルネオ（マレーシア・サバ、サラワク州）およびマレー半島を中心にサンプル採集を行い、薬緑体および核遺伝子の変異を調べて分子集団遺伝学的解析を行った。

### a. 葉緑体 DNA の変異に基づく系統解析

マレーシア・サバ、サラワク州を中心に37集団436個体分の葉を採集した（図(3)-1）。これにはD. aromatica 5集団、D. beccarii 13集団、D. lanceolata 7集団、D. oblongifolia 6集団、D. rappa 3集団、D. keithii 1集団、およびD. fusca 1集団が含まれる。これらの葉からCTAB法を用いてDNAを抽出した。これらについてtrnL-trnF, trnH-psbA, psbA-trnKの各スペーサーおよびtrnLイントロンの塩基配列を決定した。得られた配列はATGC (GENETYX, Japan)およびCLUSTAL W $ ^{18} $ を用いてアッセンブルおよびアラインメントを行い、得られた変異に基づいてハプロタイプを決定した。ハプロタイプ間の系統関係はTCS ver. 1.21 $ ^{1)} $ によってネットワークを構築して解析すると共に、DnaSP ver. 5.10 $ ^{12)} $ を用いて各種の集団遺伝学的パラメータ一を算出した。集団間の遺伝的分化はArlequin v3.5.1.2 $ ^{3)} $ に組み込まれたAMOVAを用いて解析した。
図(3)-1 リュウノウジュ属のマレー半島およびボルネオ島におけるサンプリングサイト

### b. 核遺伝子を用いた集団遺伝学的解析

薬緑体DNAは母性遺伝をするため、種子散布によって拡散した系列（lineage）を示すことが出来るが機能をもたない非コード領域を中心に調べているため適応進化的な変異を示すことが出来ない。このため種や集団の適応進化については核遺伝子を用いた解析が必要になる。また、薬緑体DNAより多くの変異が得られるので種の系統関係についてもより詳しく調べることが出来る。倍数性が疑われたD. fuscaを除く6種についてD. aromatica4集団24個体、D. beccarii3集団11個体、D. keithii1集団6個体、D. lanceolata2集団9個体、D. oblongifolia2集団8個体、D. rappa2集団8個体の合計11集団（ボルネオ島9集団、マレー半島2集団）、合計66個体について3つの核遺伝子、GBSSI（デンプン粒結合型スターチシンターゼI）、MetE（メチオニンシンターゼ）、およびSBE2（スターチブランチングエンザイムII）の各部分的塩基配列を決定した。決定した配列の長さはそれぞれ、683bp、981bp、および678bpである。得られた配列はATGC (GENETYX, Japan)によってアッセンブルし、CLASTAL W $ ^{18)} $ をもちいてアラインメントした。結果はBioEdit $ ^{7)} $ によって検証した。各塩基配列の変異を領域毎比較し、突然変異によって生じる塩基置換および挿入欠失を用いてディプロタイプに分けた。さらにDnaSP ver5.10 $ ^{12)} $ を用いてハプロタイプを決定した。

## 2 ）Shorea section Pachycarpae

Shorea属はフタバガキ科の中で最も大きな属であり、Ashtonによれば東南アジア熱帯雨林一帯で196種が知られている。Shorea属Pachycrapae節はボルネオ島に固有であり、低地フタバガキ林に10種が分布している。この研究ではPachycarpae節7種（S. amplexicaulis, S. beccariana, S. macrophylla, S. mecistopteryx, S. pinanga, S. praestans, および S. splendida）について、種間の系統関係と種ごとの遺伝的多様性及び集団間分化の程度を明らかにすることを目的とする。このためマレーシア・サバ、サラワク州各地から、これらの7種について、14集団、212個体の葉のサンプルを採集し、DNAを抽出した。集団の位置および採集した種とその個体数を表(3)-1に示すと共に、その位置を図(3)-2に示した。
表(3)-1 Shorea属Pachycrapae節7種の採集地およびサンプル数

Population	Location	Species*
1	2	3	4	5	6	7	Total
Sabah
Deramakot	5°23'N/117°27'E	-	8	9	10	-	-	-	27
Sarawak
Limbang	4°20'N/115°11'E	-	5	10	-	-	-	-	15
Lambir	4°12'N/114°01'E	-	7	10	-	-	-	-	17
Similajau	3°27'N/113°15'E	-	10	-	-	-	-	-	10
Bukit Tiban	3°27'N/113°26'E	2	-	-	-	10	4	-	16
Mukah	2°30'N/112°18'E	-	4	9	-	6	-	-	19
Sibu	2°00'N/112°00'E	-	10	10	-	-	-	-	20
Kapit	1°55'N/113°04'E	-	-	9	-	-	-	-	9
Sebankoi	1°57'N//111°25'E	-	-	-	-	5	-	6	11
Gunung gading	1°42'N/109°48'E	-	-	5	-	-	-	-	5
Bako	1°43'N/110°28'E	-	10	-	-	-	-	-	10
Kubah	1°35'N/110°09'E	8	10	10	-	-	-	6	34
Semengou	1°23'N/110°17'E	-	10	10	-	-	-	-	20
total	10	74	82	10	21	4	12	213

*Species: 1. S.amplexicaulis, 2. S.beccariana, 3. S. macrophylla,

4. S.mecistopteryx, 5. S.pinanga, 6. S.preastans, 7. S.splendida

図(3)-2 Shorea属Pachycrapae節7種のサンプル採集地。

各個体について、薬緑体DNAの4遺伝子間領域と1遺伝子領域（trnH-psbA-trnKおよびtrnL intron、trnL-trnF spacer）をPCR増幅し、ダイレクト法で塩基配列を決定した。得られた塩基配列はBioEdit $ ^{7)} $ による検証を行ったのち、CLUSTAL W $ ^{18)} $ でアラインメントした。集団遺伝学的な各種のパラメーターはDnaSP v.5.10.01 $ ^{12)} $ で決定した。アラインメントしたデータを基にTCS 1.21 $ ^{1)} $ でハプロタイプネットワークを作成しハプロタイプ間の系統関係を調べた。また複数の集団が得られたS.beccarianaとS.macrophyllaについて集団構造を調べるためSAMOVA $ ^{2)} $ を用いて分散量を最大にす
る集団のグループ分けを行い、これに基づいてArlequin v3.5.1.2 $ ^{3)} $ に組み込まれた分子分散分析(AMOVA)を行った。

## 3 ) Shorea curtisii

Shorea curtisii（現地名セラヤ）は、東南アジアの標高300-800mの丘陵フタバガキ林の優占種である。丘陵フタバガキ林は重要な森林資源であり、マレー半島においてShorea curtisiiは扱伐の対象となっている。この種はマレー半島の丘陵フタバガキ林や海岸性丘陵フタバガキ林に普遍的に分布しているが、ボルネオ島における分布はサラワク州中央部の海岸沿いの砂壌土に限定されている。本研究では、マレー半島から13、そしてボルネオ島から2カ所から集団のサンプルを採集し、DNA分析に供した（図(3)-3）。ボルネオ島では上記の2カ所以外に過去の分布記録のある3カ所での採集を試みたが、開発の進んだこれらの地点ではShorea curtisiiの個体を見つけることができなかった。遺伝的変異の解析には、葉緑体塩基配列、核遺伝子塩基配列、およびマイクロサテライトマーカーを用いた。

マレー半島 13集団

(A)

(B)

ボルネオ 2集団

図(3)-3 Shorea curtisiiの採集地点

## 4 ) Shorea javanica

Shorea javanicaはスマトラ島の南部の数カ所にのみ分布する希少種である。高品質のダマールが採取できるこの種は、古くから植林されているが、現在この種の自然植生はほとんど残っておらず、自生地としてサンプリングできた地点はKubu Perahu (Kp)の1カ所のみである。それ以外の地点は、植林された集団である。ボゴール植物園に植栽されているShorea javanicaは過去にジャワ島内の森林で採集されたものであると考えられており、過去にはジャワ島にも自然集団が存在したことが示唆されるが、その由来ははっきりしない。7地点から合計80個体の成木を採集し、DNA分析に供した（図(3)-4）。遺伝的変異の解析には、薬緑体塩基配列、核遺伝子塩基配列およびマイクロサテライトマーカーを用いた。

## 5 ) Dipterocarpus littoralis

Dipterocarpus littoralisは中央ジャワの南側に位置するヌサカンバンガン島の南西部にのみ分布
する希少種である。この種は、東南アジアの比較的標高の高い森林に広域分布するDipterocarpus retususが中央ジャワの海岸性環境に適応して派生した種であると考えられている。本研究では、西ヌサカンバンガン自然保護区全域からこの種の全成木18個体の葉のサンプルを採集すると同時に、成木の周りに生育する稚樹、合計71個体分のサンプルを採集し、DNA分析に供した（図(3)-5）。遺伝的変異の解析にはマイクロサテライトマーカーを用いた。

図(3)-4 Shorea javanicaの採集地点

図(3)-5 Dipterocarpus littoralisの採集地点

## （2） DNA解析手法

## 1 ）DNA配列の決定と解析

各個体から抽出したゲノムDNAを鋳型にして、薬緑体DNA領域trnH-trnK、trnL-trnF、psbC-trnS、trnS-trnfM）を特異的に増幅するユニバーサルプライマーを用いて、PCR増幅を行った。PCR産物の塩基配列はダイレクトシーケンシング法によって行った。一方、核遺伝子の配列はフタバガキ科の核遺伝子4領域（GapC、GBSSI、Met、PgiC）それぞれを特異的にPCR増幅できるプライマーを用いて決定した。決定した塩基配列は種または種群ごとにまとめ、アライメントを行った後、ハプロタイプネットワークの作成や、遺伝的変異量、遺伝的分化の推定やコアレッセントシミュレーションに用いた。
## 2 ）マイクロサテライト解析

これまでに発表されているフタバガキ科のマイクロサテライトプライマーが本研究の対象種に利用可能であるかをテストした。その結果から、Shorea curtisii、Shorea javanica、Dipterocarpus littoralisの3種について、それぞれ8、7、7のマイクロサテライト遺伝子座を選択し、遺伝的変異の解析に用いた。これらのマイクロサテライト領域は個体ごとにマルチプレックスPCR法を用いて増幅し、DNAシーケンサによってそれらのサイズを決定した。得られたマイクロサテライトデータを用いて、対立遺伝子数やヘテロ接合度などのパラメターを推定し、種間および集団間で遺伝的多様性量を比較した。

## （３）チーク造林地

本研究はインドネシア、ジャワ島中部にある2つの地域で行われた。

## 1 ）ワナガマ演習林（Wanagama I）

ジョグジャカルタ特別州、グヌンキドゥル県にあるガジャマダ大学（Universitas Gadja Mada）のワナガマ演習林（110°30′38″−110°33′03″E、7°53′25″−7°54′52″S）である。年間降水量1900mmで明瞭な乾期と雨期があり、比較的降水量の少ない地域である。年平均気温27.3℃、海拔200−600mである。当演習林は1964年に州政府からガジャマダ大学へ管理が委託され、同大学演習林として設立された。当時ジャワ島では土地の荒廃が深刻な問題となっており、当演習林周辺においても土壌を被覆する植生はなく、激しい雨滴により侵食された土地が広がっていた。現在ではガジャマダ大学の地道な取り組みにより植生が回復し、インドネシアにおける森林造成の成功事例の一つとして知られている。演習林内には熱帯産有用樹種（チーク：Tectona grandis L.f., マホガニー：Swietenia macrophylla King., アカシア：Acacia spp., コーカリ：Eucalyptus spp., コクタン：Diospyros celebica Bakh., ビャクダン：Santalum album L.など）の植栽試験や、産地試験、交配試験、遺伝子保全林分などの様々な林分が造成されている。

## 2 ）林業公社プルフタニ社ケンダル林業ユニット

中部ジャワ州、ケンダル県にある国営プルフタニ社によって管理される林業ユニット（109°43'28"-110°24'35" E and 6°51'22"-7°7'17" S）である。熱帯低地林に含まれるこの地域は年間降水量3500mm、年平均気温27.5℃、海拔は150~200mである。約2万haの林地にてトゥンパンサリというアグロフォレストリーによってチーク造林を行い、60年伐期施業でチーク材を生産している。同社はジャワ島、特に中部と東部においてチーク林業を展開し、ジャワにおける最も一般的な林業形態である。

## 3 ）方法

### a. 每木調查

熱帯産樹種6種からなる11の一斉人工林（モノカルチャー）においておこなわれた（表(3)-2）。0.08～0.25haの調査区を設置し、毎木調査により胸高直径（以下DBHとする）≥4cmの個体を対象にDBH、樹高、樹種を記録した。

### b. 葉のサンプリング

遺伝解析をおこなうためプロット内の全個体より葉組織をサンプリングした。得られたサンプ
ルより DNA を抽出し、PCR 増幅をおこなった。それらを遺伝子解析ソフト（Genemapper 3.0 Applied Biosystems）を用い解析をおこない、ヘテロ接合度と近交係数を算出した。

## 4 ）解析

### a. 階層構造の解析

林分の階層構造を明らかにするためM-w図 $ ^{8)} $ を作成した。各個体の個体重(w)を算出し降順にならべ、n番目に大きな個体の個体重（ $ w_{n} $ ）と最も大きな個体の個体重（ $ w_{max} $ ）からn番目までの個体重の平均（ $ M_{n} $ ）を（1）式によって求め、その関係を両対数ブラフに表した。なお本研究では個体重にD $ ^{2} $ Hを用いた。

表(3)-2 調査区まとめ

$$ M_{_{n}}=\sum_{i=1}^{n}w_{i}/n\cdot\cdot\cdot(1) $$

Plot	Species	Study site	Age	Plot area
Yr	[ha]
T-43	Tectona grandis	①	43	0.08
T-6	Tectona grandis	①	6	0.09
T-36	Tectona grandis	①	36	0.09
T-45	Tectona grandis	②	45	0.09
T-58	Tectona grandis	②	58	0.09
M-43-L	Swietenia macrophylla	①	43	0.25
M-43-S	Swietenia macrophylla	①	43	0.09
E-29	Eucalyptus urophylla	①	29	0.18
E-17	Eucalyptus pellita	①	17	0.24
E-12	Eucalyptus hybrid	①	12	0.12
G-18	Gmelina arborea	①	18	0.09

M-w図はいくつかの線分によって近似することができ（（2）式）、それらの線分は林分を構成する樹木の階層構造と関係する（Hozumi, 1975）。A, Bは線分ごとに決まる係数である。

$$ M=A^{w}+B\qquad\cdot\cdot\cdot(2) $$

以上の解析で確認された階層は上層より第1層、第2層・・・第x層とした。

### b. 個体密度と平均個体重の関係

階層が確認された林分に対し、階層毎の個体密度、平均個体重、胸高断面積合計（以下BAとする）を算出し、それらの階層における密度と個体重の関係を検討した。

## 4 ．結果及び考察

## ( 1 ) Dryobalanops sp

## 1 ）葉緑体 DNA の変異に基づく系統解析

trnL-trnF 378bp, trnH-psbA 240bp, psbA-trnK 304bp およびtrnL 408bpの合計1330bpの塩基配列を決定した。その結果、38箇所の塩基置換と6箇所の挿入／欠失が見つかり、これにより37のハプロタイプが決定できた。これを用いて作成したTCSネットワークを図(3)-5に示した。ここではShorea parvifoliaを外群として用いた。これによりハプロタイプH-5が祖先であることが分かった。D. aromaticaとD. beccariiには14種のハプロタイプが存在するがそのうちH-1, H-7, H-13を共有していた。他種の間では共有されるハプロタイプはなく、それぞれのハプロタイプは種特有のものであった。D. obolongifolia, D. rappa, D. fusca, D. keithiiではそれぞれ、6,3,4,3種のハプロタイプを持ち、単系統的となるグループを形成していた。D. lanceolataではそれぞれ2個と4個からなる二つのハプロタイプ群が場所を隔てて多系統的に存在した。ハプロタイプネットワークからD. aromaticaおよびD. beccariiが祖先的な種であり、これから最初にD. oblongifoliaが分化し、更にD. rappa, D. keithii, D. lanceolataおよびD. fuscaが分化したことが推測できる。ただし、D. fuscaの派生した場所は特定できない。ボルネオ固有種は種分化の末端に位置し、起源の新しい種である
といえる。またハプロタイプの分布はこれらの種の地理的分布と大まかに一致し、リュウノウジュ属の起源となった種（多分はD. aromaticaもしくはD. beccarii）が植生を広げていく過程で種が分化したと考えられる。

図(3)-5 リュウノウジュ属7種のTCSを用いて構築したハプロタイプネットワーク。ドットは仮想的なハプロタイプ、点線は挿入／欠失による関係。

DnaSPで算出した遺伝的変異（塩基多様度）の値を表(3)-3に示す。D. beccarii およびD. lancelota で大きな変異量が見られたのに対し、D. aromaticaの変異量は最も少なかった。 $ F_{ST} $ の値からD. beccarii, D. lancelata, D. oblogifolia で大きな遺伝的分化が生じているのに対し、D. aromaticaおよびD. rappaでは集団間の分化はわずかであることが示された。AMOVA解析によりD. beccarii およびD. oblongifoliaではマレー半島とボルネオ島のあいだで有意な遺伝的分化が起こっており、またD. lanceolataでは北ボルネオと南ボルネオで有意な遺伝的分化が起こっていた。これらの種では地域間の遺伝的分化が大きいため全体的な遺伝的変異量が増加していることが明らかになった。

## 2 ）核遺伝子を用いた集団遺伝学的解析

Dryobalanops属各種、および集団について塩基多様度（$\pi$）$^{14)}$と突然変異率（$\theta$）$^{19)}$、集団間および種間での遺伝子分化係数$F_{\mathrm{ST}}^{9)}$と純塩基置換数$D_{\mathrm{a}}^{14)}$を求め、MEGA4$^{17)}$を用いて$F_{\mathrm{ST}}$と$D_{\mathrm{a}}$の値からNJ法$^{16)}$により系統樹を作成した。図(3)-6に集団ごとの各遺伝子の塩基多様度を示した。集団数の多いD. aromaticaおよびD. beccariiについてみると変異量は集団ごとに大きくばらついていた。
また遺伝子ごとにばらつきのパターンは異なり、遺伝子間で一定の傾向は見られなかった。次に遺伝子ごとの平均の塩基多様度を図(3)-7に示した。D. aromatic、D. beccarii、D. lanceolata、D. oblongifoliaに比べて固有種D. keithii、D. rappaの多様性が小さい傾向がどの遺伝子でも見られた。各遺伝子毎の塩基多様度の平均値はGBSSIで0.00501±0.00210，MetEで0.00346±0.00276，SBE2で0.00614±0.00482となり、遺伝子間で大きな違いはなかった。

表(3)-3 リュウノウジュ属各種の葉緑体DNA変異に基づく遺伝的多様性と遺伝的分化

Species	Population	N	$ \pi $	$ \theta $	$ F_{ST} $
D. aromatica	Limbang	5	0.00000	0.00000
Lambir	20	0.00016	0.00044
Similajau	19	0.00000	0.00000
Lingga	6	0.00000	0.00000
Gunng Panti	23	0.00039	0.00063
All	73	0.00017	0.00080	0.03286
D. beccarii	Deramakot	11	0.00014	0.00027
Similajau	8	0.00039	0.00060
Nyabau	10	0.00000	0.00000
Bukit Tiban	8	0.00058	0.00090
Sg. Asap	3	0.00000	0.00000
Bakun Dam	4	0.00000	0.00000
Murum	7	0.00037	0.00032
Mukah Hill	15	0.00010	0.00024
Batang Ai	23	0.00000	0.00000
Gunng Singgai	10	0.00000	0.00000
Bako	28	0.00000	0.00000
Kubah	9	0.00000	0.00000
Gunng Gading	17	0.00000	0.00000
Gunng Panti	2	0.00078	0.00078
All	155	0.00047	0.00194	0.79490
D. lanceolata	Deramakot	24	0.00012	0.00021
Lambir	18	0.00000	0.00000
Niah	9	0.00017	0.00029
Bakun Dam	6	0.00000	0.00000
Sg. Asap	14	0.00000	0.00000
Murum	6	0.00026	0.00034
Balikpapan	16	0.00018	0.00023
All	93	0.00144	0.00152	0.92690
D. oblongifolia	Nyabau	17	0.00044	0.00046
Mukah Hill	16	0.00031	0.00024

次に図(3)-8に遺伝子領域を非同義サイトとサイレントサイト（同義サイト及び非コード領域）に分けてそれぞれの塩基多様度を求め棒グラフで示した。非同義サイトとサイレントサイトのそれぞれの塩基多様度の比、 $ \pi_{N}/\pi_{S} $ はGBSSI遺伝子で0.9082、MetE遺伝子で0.1405、SBE2遺伝子で0.0410となった。MetEおよびSBE2遺伝子で強い選択的制約が働いているのに対し、GBSSI遺伝子では制約が弱く、この傾向はすべての種で見られた。従ってGBSSI遺伝子はDryobalanops属の種分化の前に偽遺伝子化したことが示唆された。SBE2遺伝子では種間の変異はサイレントサイトのみで起
こっていたので系統間での進化速度に違いは生じないと考えられるので、この遺伝子を用いて系統樹を作成した（図(3)-9）。

図(3)-6 リュウノウジュ属各種の集団毎の塩基多様度

D. aromatica ■ D. beccarii ■ D. keithii ■ D. lanceolata ■ D. oblongifolia ■ D. rappa

図(3)-7 リュウノウジュ属各種の平均塩基多様度

図(3)-8 リュウノウジュ属各種の非同義およびサイレントサイトの塩基多様度
図(3)-9 SBE2遺伝子の集団間 $ D_{a} $ 距離に基づいて作成したNJ系統樹。矢印はUPGMA法によって得られた祖先の位置。D. aromaticについて（P）はマレー半島の集団、(S)はボルネオ島サラワク州の集団を示す。 $ ^{*} $ はボルネオ島固有種。

D. aromaticaおよびD. beccariiが分岐の起点に位置するので、Dryobalanops属の種分化は最初にD. aromaticaとD. beccariiが分化した後、D. aromaticaの系列にD. oblongifoliaが分岐し、さらにD. lanceolataが分化したこと、またD. beccariiの系列として、D. rappaとD. keithiiが分化したことを示している。D. aromaticaについてはマレー半島のものからボルネオ（S）が派生したことを示している。一方、DeramakotのD. beccariiがD. aromaticaのグループに入り込んでいるが、これは種同定の誤りかもしれない。葉緑体DNAの変異、および核遺伝子の変異の解析を通して種の系統関係、集団毎の遺伝的多様性の程度、種による遺伝的多様性の程度などが明らかになった。

### (2) Shorea, sect. Pachycarpae

trnLイントロンについて485bp、trnT-trnLおよびtrnH-psbA-trnKスペーサーについてそれぞれ、366bp、1510bpの長さの配列を決定した。これらの全長は2363bpとなり、これから22の塩基置換および7つの挿入／欠失が見つかった。種ごとの塩基多様度を表(3)-4に示した。

S. beccarianaおよびS. pinangaが他種と比較して大きな変異量を示した。またS. macrophyllaの遺伝的変異はS. beccarianaの1/3程度であった。つぎに薬緑体DNA配列変異を基にハプロタイプネットワークを作成した(図(3)-10)。その結果、ネットワークの中心に位置するハプロタイプはS. beccariana, S. pinanga, S. amplexicaulis, S. splendidaの4種が共有しており、これら4種は互いに近縁であることが示唆された。S. macrophylla, S. mecistopteryx, S. praestansの3種はこれから派生していた。このうちS. macrophyllaとS. praestansはハプロタイプを共有し、たがいに近縁関係にあるといえる。複数
の種で共通のハプロタイプが見つかったことから（1）Pachycarpae節の種分化が比較的最近に起こった結果、共通祖先で見られた遺伝子多型が現存種に未だに保持されている、（2）種間交雑の結果、同じハプロタイプが異種間で共有されていることの可能性が考えられた。現在の所、7種の間での種間交雑を示すデータはなく（1）の可能性が高いと考えられる。SAMOVAによって、S.beccarianaの集団は3、そしてS.macrophyllaは2の遺伝的組成の異なるグループに分けることができた。これに基づいてAMOVA解析を行った。この結果を表(3)-5に示した。

表(3)-4 Shorea属Pachycrapae節7種の塩基多様度

Species	$ S^{\mathrm{a}} $	$ \pi^{\mathrm{b}} $	$ \theta^{\mathrm{c}} $
S.amplexicaulis	1	0.00023±0.00004 $ ^{\mathrm{d}} $	0.00015±0.00015
S.beccariana	15	0.00114±0.00012	0.00127±0.00045
S.macrophylla	10	0.00031±0.00005	0.00088±0.00028
S.mecistopteryx	1	0.00008±0.00006	0.00014±0.00014
S.pinanga	12	0.00111±0.00021	0.00136±0.00590
S.praestans	1	0.00027±0.00008	0.00022±0.00022
S.splendida	0	0	0

$ ^{a} $ number of polymorphic sites (segregating sites)

$ ^{b} $ nucleotide diversity (Nei, 1987)

$ ^{c} $ scaled mutation rate (Watterson, 1975)

$ ^{d} $ standard diviation

図(3)-10 Shorea属Pachycrapae節7種のTCSハプロタイプネットワーク
表(3)-5 AMOVAの結果

S.beccariana
Source of variaton	d.f.	Sum of squares	Variance components	Percentage of variation	F statistics $ ^{a} $
Among regions	2	64.38	2.23346	68.87	$ F_{CT}= $	0.6887 $ ^{*} $
Among populations within reigns	6	26.017	0.4627	14.27	$ F_{SC}= $	0.45831 $ ^{***} $
Within populations	64	35	0.54688	16.86	$ F_{ST}= $	0.83137 $ ^{***} $
total	72	125.397	3.24304	100.0
S.macrophylla
Source of variaton	d.f.	Sum of squares	Variance components	Percentage of variation	F statistics $ ^{a} $
Among regions	1	6.236	0.28802	41.82	$ F_{CT}= $	0.41821 $ ^{ns} $
Among populations within reigns	7	7.662	0.08721	12.66	$ F_{SC}= $	0.21765 $ ^{***} $
Within populations	73	22.883	0.31346	45.52	$ F_{ST}= $	0.54484 $ ^{***} $
total	81	36.781	0.68869	100.0

a***: P-value by permutation test less than 0.001. *: P-value by permutation test less than 0.05. ns: non significant

集団間分化の程度を示す $ F_{ST} $ はS.beccarianaで0.83、S.macrophyllaで0.54であったが、グループ内の集団分化はS.macrophyllaで低かった( $ F_{SC}=0.22 $ )。また、中立性の検定から、S.macrophylla集団では頻度の低い多型サイト数が有意に多いことが示された。このことは、この種が集団サイズの急激な減少と、その後の急速な集団サイズの増加を経験したことを示唆している。以上の結果からS.beccarianaでは歴史的な集団サイズの変動が比較的少なかったため、高い遺伝的変異と高度な集団分化が見られるのに対し、S.macrophyllaではボトルネックによって遺伝的多様性が減少した後、分布域を急速に拡大したため明確な集団分化が見られなかったと考えられる。

## ( 3 ) Shorea curtisii

合計9集団、123個体について、薬緑体trnH-trnKとtrnL-trnFの2領域、合計2.5kbの塩基配列を決定した結果、15の異なるハプロタイプが見つかった。ボルネオ島とマレー半島の集団はそれぞれ頻度の高いハプロタイプを一つずつ持っており（ハプロタイプM1とB1）、これらのハプロタイプの分岐は種分化直後に起こったと考えられた（図(3)-11）。

図(3)-11 Shorea curtisiiの葉緑体ハプロタイプネットワーク。括弧内の数字はハプロタイプの頻度、白抜きの○は集団に固有のハプロタイプである
ハプロタイプM1、M2、B1以外のハプロタイプの頻度は5個体以下と低く、これらは頻度の高いM1またはB1から派生的に生じたことが示された。また、両地域間で共有されるハプロタイプは見つからなかった。マレー半島集団からは、12ハプロタイプが特定されたが、ボルネオ島の2集団で見つかったハプロタイプは3のみであった。塩基多様度はボルネオ島で0.00004であり、マレー半島のもの（0.00010）と比較して半分程度の値を示した。ランビルを含むサラワク州中央部は植生調査の結果から、ボルネオ島の他地域と比較しても種多様性が高いことがわかっている。このことはこの地域が長期間にわたり安定した湿润環境にあり、多くの熱帯樹木が絶滅することなく維持されてきたことを示唆する。このような地域では、他種との競争効果の結果、S. curtisiiが長期間小さい集団サイズによって維持されてきた可能性が考えられる。また、ボルネオ島におけるこの種の分布は、サラワク州北部の海岸沿いの丘陵地で見られる歴史の新しい砂質土壤に限定されており、内陸の丘陵フタバガキ林では見つからない。このようなハビタットの特異性もS. curtisiiの遺伝的変異に影響していると考えられる。また、サブテーマ4で研究された、Shorea属近縁種の葉緑体ハプロタイプを含めて、系統樹を作成した結果、マレー半島とボルネオのハプログループの起源は非常に古く、両グループが分化した後に、他種で見られる多くのハプロタイプが分化したことが明らかになった（図(3)-12）。

図(3)-12 Shorea属葉緑体ハプロタイプの系統樹。太字で示されたShorea curtisiiのマレー半島とボルネオのハプログループが分岐した後に、他種で見られる多くのハプロタイプが派生したことがわかる。

つぎにS. curtisiiの15集団、178個体について、核遺伝子GapC、GBSSI、PgiCの塩基配列を決定し、遺伝的変異量を推定した。塩基多様度は薬緑体DNAに比べ、10倍ほど高く、どの遺伝子座においても多くの異なるハプロタイプが見られた（図(3)-13）。薬緑体DNA配列の結果と同様、ハプロタイプ数はマレー半島で多く、ボルネオ集団からは2～5のハプロタイプしか観察されなかった。また、
ボルネオ集団で見られたハプロタイプ間には多くの塩基置換が蓄積しており、互いに遠縁であることが示された。また、葉緑体の結果と同様、マレー半島とボルネオの間で共有されるハプロタイプは見つからず、両地域集団間の高い遺伝的な分化は核遺伝子データからも示された。

図(3)-13 核遺伝子3領域のハプロタイプネットワーク。大きな〇は高頻度、小さな〇は低頻度のハプロタイプである。黒点は観察されなかった中間的なハプロタイプを示す。白抜きはボルネオ集団で見つかったハプロタイプを示す。

地域集団間（マレー半島-ボルネオ島）、地域内集団間、集団内個体間の差異によって生じている遺伝的変異の割合をAMOVA分析により算出した。その結果、葉緑体、核遺伝子領域ともに、全遺伝的変異の大部分が地域間と集団内個体間に由来し、地域内集団間の遺伝的差異は非常に小さいことが示された（表(3)-6）。また、地域間、地域内集団間、集団間の各階層における遺伝的分化（ $ F_{CT} $ 、 $ F_{SC} $ 、 $ F_{ST} $ ）はpermutation testではいずれも有意であったが、葉緑体DNAの $ F_{SC} $ は有意ではなかった。これらの結果から、遺伝的分化の程度はマレー半島-ボルネオ間で著しく高いが、各地域集団間は遺伝的にほとんど分化していないことが明らかになった。現在、東南アジア熱帯で優占する常緑広葉樹の多くは、氷河期の影響による気温低下と乾燥から逃れたいくつかの小集団が分布を拡げた結果であると考えられている。地域内集団間の低い遺伝的分化と多数の低頻度ハプロタイプの存在は、現在のマレー半島集団が氷河期以降に分布域を急速に拡大した結果であると考えられる。

表(3)-6 葉緑体と核DNA変異の分子分散分析（AMOVA）

Chloroplast	PgiC	GapC	GBSSI
Percentage variation
Among regions (Malay Peninsula - Borneo)	51.11	21.00	57.79	55.18
Among populations within regions	2.50	11.48	2.95	3.40
Within populations	46.38	67.52	39.26	41.42
Fixation indices
$ F_{CT} $ (Among regions)	0.5112 ***	0.2100 **	0.5779 ***	0.5518 ***
$ F_{SC} $ (Among populations within regions)	0.0512 ns	0.1453 ***	0.0699 ***	0.0759 ***
$ F_{ST} $ (Among populations)	0.5362 ***	0.3258 ***	0.6074 ***	0.5858 ***

ns not significant; $ ^{*}P<0.05 $ ; $ ^{**}P<0.01 $ ; $ ^{***}P<0.001 $

核遺伝子の塩基配列データから、プログラムLAMARCを用いて、遺伝的変異量を表す統計量であるθを推定し、集団間で比較した。このθは集団遺伝学において、有効集団サイズ（N）と世代当
図 (3)-14 プログラム LAMARC を用いて推定した、Shorea curtisii 各集団の遺伝的多様性の大きさ (θ) と集団サイズの増加率を示すパラメータ一g の推定値。点がそれぞれの最も推定値、そしてバーは95% 信用区間を示す。

たりの突然変異率（$\mu$）によって定義される（$\theta=4N\mu$）。また、集団サイズの増加率を示すパラメータ一、$g$を推定した（図(3)-14）。

表(3)-7 マイクロサテライトデータから推定されたShorea curtisii各集団の遺伝的変異量

マレー半島	Population	N	A	Ae	Ho	He	F
-kit Larut	7	5.25	4.03	0.70	0.66	-0.07NS
-mut	3	3.38	2.84	0.71	0.56	-0.27NS
-serah	13	6.63	4.08	0.62	0.67	0.07NS
-lau Pangkor	20	5.88	3.39	0.62	0.66	0.12NS
-u Gombak	16	6.38	3.65	0.60	0.63	0.05NS
-njung Tuan	20	6.13	3.72	0.58	0.63	0.09NS
-kit Timah	20	6.88	3.51	0.60	0.62	0.03NS
ポルネオ	Lambir Hills	20	2.88	1.64	0.36	0.36	-0.05NS
Similajau	20	3.50	2.19	0.39	0.40	0.02NS

遺伝的多様性の大きさは集団間で異なっており、ボルネオの2集団の多様性はマレー半島のいずれの集団よりも有意に低かった。θの平均値はマレー半島で0.00921、ボルネオでは0.00175であった。マレー半島集団では、分布の端に位置する海岸性丘陵林の集団（Pulau Pangkor、Beserah、Tanjung Tuan、Bukit Timah、Batam、Bintan）で、その他の内陸集団よりも多様性が低かった。θの平均値はマレー半島の内陸林で0.01159、海岸林では0.00644であった。また、マレー半島の内陸集団の多くはgが0以上を示しており、過去に集団サイズが増加したことが示唆された。マレー半島の海岸沿い集団の多くは、gの推定値が0付近にあり、これらの集団サイズは歴史的に大きく変動していないことが示唆された。これは、海岸に面した丘陵林は分布をさらに拡大することができないことから、森林面積が小さく、また他の森林とも隔離されていることが原因であると考えられる。
一方で、ボルネオの2集団のgはいずれも負であった。このことは、これらの集団が過去にボトルネックを経験した結果、遺伝的変異量が小さくなったことを示唆している。マイクロサテライト8遺伝子座のデータから集団ごとの近交係数（F）を推定したところ、有意な近交係数の上昇はいずれの集団でも見られなかった（表(3)-7）。遺伝的多様性の低かったボルネオ集団でも、近親交配の増加による近交係数の上昇が見られなかったことから、近交弱勢によって近親交配個体の多くが成熟前に死亡し、集団から除去されていることが考えられた。

## ( 4 ) Shorea javanica

Shorea javanicaでは葉緑体遺伝子3領域の変異を調べたが、塩基置換サイトは見つからず単型的であった。また、核遺伝子の3領域、合計2,203塩基対からも塩基置換サイトは6しか見つからなかった（表(3)-8）。核遺伝子領域のサイレント塩基多様度は0.00108-0.00113と推定され、Shorea curtisiiを含む、他のフタバガキ科樹木の変異量の1/5程度しかなかった。また、4集団において近交係数が有意に正の値を示し、これらの集団では高い割合で近親交配が起こっていることが示唆された（表(3)-9）。遺伝的分化の程度はほとんどの集団間で低かったが $ (F_{ST}<0.03) $ 、Ogan Komering Ulu (Oku)集団は他のものとの間に有意な遺伝的分化があった $ (F_{ST}<0.07-0.16) $ 。Oku集団は、スマトラ島西海岸沿いを走るバリサン山脈の東側に位置し、西側に位置する他の集団と隔離されている（図(3)-4）。この結果、これらの集団間では比較的高い遺伝的分化が観察されたと考えられる。前に述べたとおり、良質なダマールが採れるこの種は、その利用価値が高い。しかしながら、唯一残る自然集団であるKubu Perahu (Kp)集団でも、遺伝的変異はほとんど見られなかった。

表(3)-8 Shorea javanicaの塩基配列多様性の程度

Loci	Length (bp)	Population	N	S	Hd	(10-3)	Tajima's D
! s	”s
GapC	751	Pa	32	2	0.571	0.94	0.48	1.557
Gk	32	1	0.514	0.95	0.46	1.634
Kp	30	2	0.662	1.50	0.93	1.235
Be	30	1	0.480	0.89	0.47	1.408
Oku	30	2	0.660	1.56	0.93	1.356
Java	6	1	0.536	1.11	0.81	1.445
Total	160	2	0.581	1.22	0.65	1.223
GBSSI	778	Pa	32	1	0.498	1.02	0.51	1.535
Gk	32	3	0.508	1.25	1.53	-0.422
Kp	30	1	0.508	1.04	0.52	1.578
Be	30	1	0.257	1.06	0.53	1.623
Oku	30	1	0.370	0.76	0.52	0.727
Java	6	1	0.536	1.10	0.79	1.167
Total	160	3	0.509	1.08	1.09	-0.009
PgiC	674	Pa	32	1	0.508	1.16	0.57	1.578
Gk	32	1	0.484	1.10	0.56	1.448
Kp	30	1	0.434	0.99	0.57	1.124
Be	30	1	0.515	1.17	0.56	1.647
Oku	30	1	0.370	0.84	0.57	0.727
Java	6	1	0.536	1.22	0.88	1.167
Total	160	1	0.499	1.13	0.40	1.915
表(3)-9 マイクロサテライトデータから推定されたShorea javanica各集団の遺伝的変異量を示すパラメータ一

Population	N	A	$ A_{e} $	$ H_{o} $	$ H_{e} $	$ F_{IS} $	r	$ F_{IS;IIM} $
Pa	16	2.50	2.00	0.456	0.418	-0.050	-0.012	0.021 (0.025)
Gk	16	2.25	2.05	0.344	0.432	0.234 $ ^{*} $	0.032	0.049 (0.056)
Kp	15	2.50	2.01	0.217	0.423	0.513 $ ^{**} $	0.063 $ ^{\dagger} $	0.086 (0.093)
Be	15	2.50	2.12	0.179	0.476	0.647 $ ^{**} $	0.090 $ ^{\dagger} $	0.118 (0.130)
Oku	15	2.50	2.14	0.183	0.438	0.604 $ ^{**} $	0.088 $ ^{\dagger} $	0.061 (0.086)
Ja	3	2.50	1.83	0.313	0.352	0.250	na	0.080 (0.107)
Total	80	3.00	2.17	0.281	0.477	0.383 $ ^{**} $	0.068	0.077 (0.151)

## ( 5 ) Dipterocarpus littoralis

Dipterocarpus littoralisはヌサカンバンガン島内でも川沿いのみに分布し、成木の分布も非常にまばらである。成木18個体について、7マイクロサテライト遺伝子座の遺伝子型を調べた結果、ヘテロ接合度は0.457、遺伝子座当たりの対立遺伝子数は3.2と推定され、他のフタバガキ科近縁種よりも小さいことがわかった（表(3)-10）。

表(3)-10 Dipterocarpus littoralisのマイクサテライトデータから推定した遺伝的多様性パラメーター

Population	Number samples	Mean number alleles	$ H_{0} $	$ H_{E} $	F
Adults	Saplings	Adults	Saplings	Adults	Saplings	Adults	Saplings	Adults	Saplings
Kali Jati	5	30	2.571	3.857	0.514	0.448	0.449	0.479	-0.180	0.058
Selok Besek	13	41	3.857	4.000	0.473	0.418	0.464	0.456	-0.028	0.025
Average	3.214	3.929	0.493	0.433	0.457	0.468	-0.104	0.042

さらに各遺伝子座およびすべての遺伝子座をこみにした固定係数をもとめた（図(3)-11）。 $ F_{IS} $ は稚樹集団（0.089）で成木集団（0.006）よりも高く、樹齢の増加に伴う近交弱勢が示唆された。成木では2集団間に有意な遺伝的分化は観察されなかったが $ (F_{ST}=0.014, P>0.05) $ 、稚樹集団の分化は有意であった $ (F_{ST}=0.077, P<0.01) $ 。このことから、成木の分布がまばらであるために互いの遺伝子交換が制限された結果、次世代集団の多くが同集団内成木間の交配に由来していることが考えられた。

表(3)-11 Dipterocarpus littoralisのマイクサテライトデータから推定した固定指数

Locus	F_{IS}	F_{IT}	F_{ST}
Adults	Saplings	Adults	Saplings	Adults	Saplings
All loci	0.006 ns	0.089**	0.020 ns	0.159**	0.014 ns	0.077**
DT07	-0.118 ns	-0.036 ns	-0.155 ns	0.000 ns	-0.033 ns	0.035 ns
DT09	-0.111 ns	0.064 ns	-0.026 ns	0.108 ns	0.077 ns	0.047**
DT18	0.019 ns	-0.011 ns	-0.027 ns	-0.004 ns	-0.046 ns	0.007 ns
DT20	-0.050 ns	-0.089 ns	-0.121 ns	-0.064 ns	-0.068 ns	0.022 ns
DT29	0.277 ns	0.170 *	0.330 ns	0.329 **	0.073 ns	0.193 **
DT35	0.213 ns	0.145 ns	0.158 ns	0.209 *	-0.069 ns	0.075 **
DT39	0.290 ns	0.126 *	-0.252 ns	0.160 *	0.030 ns	0.039 *