Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
Production of the Bioplastic, poly(3-hydroxybutyrate), by Halomonas Strains

Culture medium	DCW (mg/ml)	PHB (%) in DCW
Halomonas sp. KM-1	Marine Broth with 3% Glycerol	0.67 ± 0.31	24.8 ± 5.0
H. campisalis ATCC 700597 $ ^{1} $	Marine Broth with 3% Glycerol	0.60 ± 0.09	23.5 ± 1.3
H. meridiana NBRC 15608 $ ^{T} $	Marine Broth with 3% Glycerol	0.80 ± 0.15	5.0 ± 2.0
H. pantelleriensis ATCC 700273 $ ^{T} $	Marine Broth with 3% Glycerol	0.40 ± 0.21	22.6 ± 6.0
H. halomophilia NBRC 15537 $ ^{T} $	Marine Broth with 3% Glycerol	0.41 ± 0.09	0.0 ± 0.0
H. aquamarina NBRC 101894 $ ^{T} $	Marine Broth with 3% Glycerol	0.32 ± 0.08	12.3 ± 2.0
H. cupida NBRC 100987	Marine Broth with 3% Glycerol	1.07 ± 0.21	15.4 ± 2.3
H. cupida NBRC 102219 $ ^{T} $	Marine Broth with 3% Glycerol	0.86 ± 0.25	2.2 ± 1.0
H. elongata NBRC 15536 $ ^{T} $	Marine Broth with 3% Glycerol	0.44 ± 0.20	2.5 ± 1.2
H. halodenitrificans NBRC 14912 $ ^{T} $	Marine Broth with 3% Glycerol	0.30 ± 0.12	2.2 ± 1.5
H. halophila NBRC 102604 $ ^{T} $	Marine Broth with 3% Glycerol	0.68 ± 0.15	12.8 ± 2.0
H. pacifica NBRC 101900	Marine Broth with 3% Glycerol	0.50 ± 0.25	18.0 ± 3.2
H. pacifica NBRC 102220 $ ^{T} $	Marine Broth with 3% Glycerol	0.70 ± 0.32	25.1 ± 6.0
H. variabilis NBRC 102410 $ ^{T} $	Marine Broth with 3% Glycerol	0.70 ± 0.18	5.3 ± 2.0
H. venusta NBRC 102221 $ ^{T} $	Marine Broth with 3% Glycerol	0.98 ± 0.15	10.5 ± 1.8
Halomonas sp. KM-1	SOT with 3% Glycerol	1.85 ± 0.06	34.2 ± 1.9
H. campisalis ATCC 700597 $ ^{T} $	SOT with 3% Glycerol	1.58 ± 0.08	24.4 ± 0.4
H. meridiana NBRC 15608 $ ^{T} $	SOT with 3% Glycerol	1.40 ± 0.08	25.0 ± 1.6
H. pantelleriensis ATCC 700273 $ ^{T} $	SOT with 3% Glycerol	0.79 ± 0.05	22.5 ± 1.7

All of the observations were repeated thrice. Values indicated are means $ \pm $ standard deviation.

表 5 各種細菌の異なる炭素源によるバッチ培養による PHB 生産

Comparison of PHA yields achieved in batch systems (shake flasks and fermentors)

Organism	Carbon source	PHA content (wt.%)	CDW (g l $ ^{-1} $ )	PHA concentration (g l $ ^{-1} $ )	Volumetric productivity (g l $ ^{-1} $ h $ ^{-1} $ )	Reference
Halomonas sp. KM-1	Glucose	79.3	51.1	40.5	1.67	This work
Glycerol	80.2	50.5	40.5	1.04
Waste Glycerol	60.0	24.8	14.9	0.58
Halomonas boliviensis	Sucrose	54.0	14.0	7.7	0.40	Quillaguamán et al. 2007
Alcaligenes latus	Sucrose	83.0	14.0	11.5	0.39	Wang and Lee 1997
Azotobacter vinelandii a	Glucose	74.0	10.0	7.5	0.30	Page 1992
Escherichia coli a	Glucose	80.8	8.9	7.2	0.15	Lee et al. 1994
Wautersia eutropha	H $ _{2} $ /CO $ _{2} $	76.0	17.0	13.0	0.18	Heinzle and Lafferty 1980
Wautersia eutropha a	Glucose	54.0	9.4	5.1	0.11	Doi et al. 1988
Haloferax mediterranei	Starch	67.0	9.7	6.5	-	Lillo and Rodriguez-Valera 1990; Rodriguez-Valera and Lillo 1993
表 6 KM-1 株の半回分培養による PHB 生産の向上

バイオプラスチックPHB生産量の比較

Organism	Carbon source	PHB content (wt.%)	CDW (g l $ ^{-1} $ )	PHB concentration (g l $ ^{-1} $ )	Volumetric productivity (g l $ ^{-1} $ h $ ^{-1} $ )	Reference
Halomonas sp. KM-1	Glucose	79.3	51.1	40.5	0.48	バッチ培養
Glucose	88.7	96.4	89.3	1.06	半回分
Halomonas boliviensis	Sucrose	54.0	14.0	7.7	0.40	Quillaguamán et al. 2007
Alcaligenes latus	Sucrose	83.0	14.0	11.5	0.39	Wang and Lee 1997
Azotobacter vinelandii a	Glucose	74.0	10.0	7.5	0.30	Page 1992
Escherichia coli a	Glucose	80.8	8.9	7.2	0.15	Lee et al. 1994
Wautersia eutropha	H $ _{2} $ /CO $ _{2} $	76.0	17.0	13.0	0.18	Heinzle and Lafferty 1980
Wautersia eutropha a	Glucose	54.0	9.4	5.1	0.11	Doi et al. 1988
Haloferax mediterranei	Starch	67.0	9.7	6.5	-	Lillo and Rodriguez-Valera 1990

3．3 ハロモナス KM-1 株によるバイオプラスチック PHB、3-ヒドロキシ酪酸の生産

好気培養(200rpm)で36時間まで培養した後、給気条件を変更(100rpm、50rpm、0rpm)して、菌体濃度(濁度)およびゲノム DNA の溶出量を測定した(図2)。好気培養では、菌体濃度の上昇が認められるが、50rpm、0rpm では菌体濃度が減少した。そこで、培地に溶出したゲノム DNA の濃度をリアルタイム PCR 法で測定した結果、0rpm ではゲノム DNA の溶出が見られたが、50rpm ではほとんどゲノム DNA の溶出は見られず、溶菌はなかった。さらに、好気条件(コントロール)と、好気条件で48時間まで培養した後、微好気条件(50pm)へ移行したものについて、菌体重量、PHB 生産量、3-ヒドロキシ酪酸生産量、残存する炭素源(グリセロール)、さらに電子顕微鏡の撮影を実施した(図3，4)。微好気条件に変更した場合、好気条件で蓄積した PHB を分解し、ほぼ定量的に3-ヒドロキシ酪酸を分泌すること認められ、電子顕微鏡による観察からも蓄積した PHB が分解し
ている様子が認められた。

図２ 好気条件変更によるハロモナス KM-1 株の OD 変化と DNA 溶出量

図３　好気、微好気条件による３－ヒドロキシ酪酸の生産
好気、微好気培養での3-ヒドロキシ酪酸分泌生産

図４ 好気微好気条件による３－ヒドロキシ酪酸の生産観察

3．4 C₆糖、C₅糖を用いたハロモナスKM-1株によるバイオプラスチックPHBの生産

木材の構成糖の5-30%をC₅糖が占めることから、C₆糖(グルコース)とC₅糖(キシロース、アラビノース)を用いて、バイオプラスチックPHBの生産量を検討した。SOT改培地に、グルコース10%、グルコース9%+キシロース1%、グルコース9%+アラビノース1%、グルコース7%+キシロース2%+アラビノース1%を、それぞれ加え、乾燥菌体重量、PHB生産量、培地中の糖濃度をそれぞれ測定した(図5，6)。乾燥菌体重量、PHB生産量ともにグルコースだけものとグルコースとC₅糖が混合されたものの間にほとんど差はなく、36時間の培養で乾燥菌体重量が約40 g/L、PHB生産量が29-30g/Lであった。培地中のC₆糖グルコースとC₅糖キシロース、アラビノースの培養液中の残存量を調べたところ、C₅糖とC₆糖の間に、ハロモナス菌による消費速度の差は認められず、低濃度のC₅糖の方が先に消費されていた。
## C6糖、C5糖混合好気培養による菌体重量、PHB生産

C6糖、C5糖の利用にほぼ差はない。

図 5 C6 糖、C5 糖混合好気培養による菌体重量、PHB 生産

ハロモナス菌のC6糖、C5糖の利用について

図6 ハロモナス KM-1 株による C6 糖、C5 糖の利用について
3．5 スギ木材糖化液を用いたハロモナス KM-1 株による 3-ヒドロキシ酪酸の生産

森林総合研究所にて調整されたスギ木材糖化液を用い、これに SOT 改培地の組成塩を加えて、ハロモナス KM-1 株による 3-ヒドロキシ酪酸の生産を調べた。木材糖化液の糖組成は、95.9 g/L D-glucose, 8.3 g/L D-mannose, 0.3 g/L D-galactose, 5.3 g/L D-xylose, 0.2 g/L L-arabinose であったため、コントロール実験としてグルコース 10% (100 g/L) 含む SOT 改培地を用いた。好気条件の場合、木材糖化液を用いた培養では、24 時間後、36 時間後それぞれ、菌体重量 22.3 g/L, 26.3 g/L、PHB 生産量 8.4 g/L、13.0 g/L が得られた。一方、コントロールの 10% グルコースの場合は、24 時間後、36 時間後それぞれ、菌体重量 28.5 g/L、37.2 g/L、PHB 生産量 17.6 g/L、26.9 g/L が得られた。好気条件の際には、培地中に 3-ヒドロキシ酪酸は検出されなかった。好気培養 24 時間後、微好気培養に移行して 18 時間目には、木材糖化液の場合、菌体重量 15.2 g/L、PHB 生産量 0.6 g/L (菌体内)、3-ヒドロキシ酪酸生産量 8.0 g/L (培養液)が得られた (図 7)。一方、コントロールの 10% グルコースの場合は、菌体重量 16.7 g/L、PHB 生産量 6.1 g/L (菌体内)、3-ヒドロキシ酪酸生産量 12.1 g/L (培養液)が得られた。好気、微好気培養におけるハロモナス菌の状況を、電子顕微鏡で観察した (図 8, 9)
スギ糖化液による3-HB生産

図7 スギ糖化液による3-ヒドロキシ酪酸の生産

木材糖化液100%

乾燥菌体重量 27.8 g/L

PHBの割合 46.0 %

滅菌なし、好気培養 42 h培養

図８ スギ糖化液を用いた PHB、3HB 生産の電子顕微鏡観察
# Halomonas sp.KM-1によるPHB・3HB生産状況

木材糖化液100%

乾燥菌体重量 13.7 g/L

PHBの割合 5.9 %

滅菌なし、好気培養 24 h培養後、→ 做好気培養18h

図9 スギ糖化液を用いた PHB、3HB 生産の電子顕微鏡観察

## 3 ．6 GC-MS 装置を用いたハロモナス KM-1 株のメタボローム解析

Halomonas sp. KM-1 株を用い、グルコース 5%, 10% を炭素源に SOT 改培地で培養し、経時的にサンプリングして、菌体内、培養液それぞれの代謝物の組成、傾向を GC-MS 装置を用いて分析した（図 10）。菌体内は、53 種類、培地には 35 種類化合物が検出された（表 7、8）。特徴的なこととしては、菌体内に培養定常期においてのみ、3-ヒドロキシ酪酸が検出された（図 11）。さらに、対数増殖期と定常期において検出された化合物を主成分分析した結果、3-ヒドロキシ酪酸が多いグループと、コハク酸が多いグループに分けられた（図 12）。また、PHB 産生の多いハロモナス菌と、少ないハロモナス菌について、それぞれ定常期の菌体内の分析を行い、主成分分析を行った結果、PHB の多い菌と、少ない菌がそれぞれ異なる主成分を持つグループとして分けることができた
図１０　ハロモナス菌のメタボローム解析の概略

表 7 KM-1 株細胞中の代謝物の GC-MS による分析

### Halomonas sp. KM-1 cell metabolic using GC/MS

The number of identified fluctuating compounds

ID	Compound Name	ID	Compound Name	ID	Compound Name	ID	Compound Name
1	PyruvateO-Chalactoic acid	13	N-Acetyl-Valine	23	Launch acid	41	Mannose
2	Lactic acid	16	Thymine	29	Ribose	42	Galactose
3	Chal情	17	Alanine	30	Arabidopsis	43	Glucose-1-D-galactose
4	Valine	18	Citramalic acid	31	N-Acetyl-Glutamate	44	Adonine
5	3-Hydroxy-Butyric acid	19	Malic acid	32	Threonine	45	Glucose
6	N-Carybic acid	20	Nissimic acid	33	Glutamine	46	Gluconic acid
7	Isolucine	21	Pyrogluconic acid	34	2-Dodecyl-glucose	47	Glucose
8	Proline	22	Cytosine	35	2-Aminopimelic acid	48	Coflavin alcohol
9	Glycine	23	Ethincine
10	Succinic acid	24	Phosphoenolpyruvic acid	36	Citric acid	49	Cystic acid
11	Glycine acid	25	Glutamic acid	37	Tegalactose-1	50	Tryptophan
12	Uncell	26	Phenylalanine	38	Dimethylbromide	51	Diolic acid
13	Parenic acid	27	Ammonate	39	Parenic	52	Cysteine-Cysteine
14	Sennic	40	Parenic-2	53	Practose-6-Phosphate
KM-1 culture medium metabolic using GC/MS The number of identified fluctuating compounds

ID	Compound Name	ID	Compound Name	ID	Compound Name
1	2-Hydroxypyridine	19	Nicotinamide	28	Glucose
2	Pyruvate-CH₂-pyridic acid	18	5-amin-2-hydroxypyridine	28	Glucose and
3	N-Butylamine	17	Ketoglutaric acid	30	Mannitol
4	Oxalate	18	Phosphoryl-pyuvic acid	31	Glucose-1,4-lactone
5	Ketovaline	19	Malic acid	32	Galactosamine
6	3-Hydroxy-S-butyric acid	20	Glutamic acid	33	Glucose
7	Ketostilobutine	21	Phenylalanine	34	Comifany alcohol
8	3-Hydroxy-isovaleric acid	22	Hydroxybenzoic acid	35	Mavancin
9	Valine	23	Ribulose
10	Succinic acid	24	Glutathione Oxidase
11	Glycolic acid	25	Prostate
12	Phenyl pyruvate	26	Mannose
13	Fumaric acid	27	Galactose
14	Glutamic anhydride

Typical chromatogram (TIC) of KM-1 cell extracts in different culture conditions

図11 KM-1 株細胞中の代謝物の GC-MS によるクロマトグラフ
図 1 2 KM-1 株細胞中の代謝物の GC-MS による PCA 分析

Principal component analysis (PCA) of 15 different Halomonas strains

図13 ハロモナス菌株細胞中の代謝物のGC-MSによるPCA分析
## 3 ．7 CE-MS 装置を用いたハロモナス KM-1 株のメタボローム解析

Halomonas sp. KM-1 株を用い、グルコース 10% を炭素源に SOT 改培地で好気条件から微好気条件へ培養条件を変更し、対数増殖期、定常期、微好気培養に移行して 18 時間目、それぞれの菌体内、培地の組成物、傾向を CE-MS 装置を用いて分析した。サンプリング数が少ないので定性的な分析しかできていないが、ヒートマップによる分析では、明らかにそれぞれの代謝物の組成に違いが見られた(図 14)。

図１４ CE-MS 分析による KM-1 株代謝物のヒートマップ

#### 3.8 Halomonas sp. KM-1 株のゲノム解析

従来より Halomonas sp. KM-1 株のゲノム解析を行ってきたが、完全シークエンスをめざし、デジタルバイオロジー社 PacBio RS II シークエンサーを用い解析を行った結果、リード数塩基数 Polymerase Reads 87,985 626,210,428 bp, Subreads 114,036 624,957,170 bp のシークエンスを得、アセンブルにより、完全シークエンスを得た。以下の表 9 に結果を示す。本シークエンスを解析ソフト CRITICA、Glimmer2、
tRNAScan-SE、BLASTIN および BLASTP により解析した結果、表 10 に示す結果を得た。CRITICA、Glimmer2 それぞれの解析ソフトにより同定された遺伝子の機能分類を、図 15，16 に示す。

表 9 解析対象ゲノム配列情報項目

総コンティグ数	1
全コンティグの総塩基数	5,091,463bp
GC含量	64.08%
参照ゲノム配列	Halomonas elongata DSM 2581 chromosome, complete genome
参照ゲノム配列アクセッション番号	NC_014532
参照ゲノム配列塩基数	4,061,296 bp

表10 アノテーション解析結果

項目	使用ソフト	解析対象、クエリ	解析結果
遺伝子の領域予測	CRITICA	100bp以上のコテイグ	予測CDS数:4,333
Glimmer2	100bp以上のコテイグ	予測CDS数:5,309
遺伝子予測結果のマージ	CRITICA、glimmer2遺伝子予測結果	CRITICA,glimmer2一致:2,633CRITICAのみ:1,685,glimmer2のみ:2,660マージ後:6,978
tRNA予測	tRNAScan-SE	全コンティグ	tRNA領域:66カ所anti codon:37種類アミノ酸種類:20種類
rRNA予測	BLASTIN	全コンティグ	rRNA領域:1コンティグ5S:1コンティグ16S:1コンティグ23S:1コンティグ
アノテーション1	BLASTP	CRITICA予測CDS	アノテーションのついたCDS:4236
BLASTP	glimmer2予測CDS	アノテーションのついたCDS:4871
アノテーション2	BLASTP	CRITICA予測CDS	アノテーションのついたCDS:4308
BLASTP	glimmer2予測CDS	アノテーションのついたCDS:4980
図１５ CRITICA 解析ソフトにより同定された遺伝子の機能分類

図 1 6 Glimmer2 解析ソフトにより同定された遺伝子の機能分類
## 3 ．9 ハロモナス菌によるバイオプラスチックPHB、3-ヒドロキシ酪酸の生産性向上について

好気条件で60時間まで培養した後、微好気条件(50pm)へ移行したものについて、菌体重量、PHB生産量、3-ヒドロキシ酪酸生産量、残存する炭素源、さらに電子顕微鏡の撮影を実施した。窒素添加の有無、回数により、好気条件で蓄積したPHBを、微好気条件で分解、3-ヒドロキシ酪酸の分泌量が変化するを確認した。特にPHB合成、分解に窒素添加が必要なことをはじめて明らかにした。さらに、初発濃度20%のグルコースを用いた場合、40g/L以上の3-ヒドキシ酪酸の分泌が行えることを確認した(図17,18,19)。さらに、同時期のPHB合成酵素PhaC、PHB分解酵素PhaZそれぞれの発現量を、16SリボゾームRNAの発現量と比較して確認したところ、合成酵素では窒素添加を行うことで、合成酵素の発現量が3から4倍程度多くなった(図20)。また、好気微好気条件では、微好気条件にすると発現量が少なくなる傾向が見られた。一方、分解酵素の場合は、36時間目の場合、窒素添加無添加で、ほぼ差はなく、一方、微好気条件に誘導すると、窒素無添加は発現量が少なくなる傾向を示すのに対し、窒素添加あり微好気条件では、倍以上分解酵素の発現が見られた。結果、電子顕微鏡に見られるPHB顆粒が著しく小さくなる減少は、合成酵素と分解酵素の発現量のバランスが、合成優位から分解優位に変わることで起こったものと推定された(図20)。同時に、菌体内の代謝物の変化について、GC-MSで分析した結果、Ketovaline,Glucosamine-6-phosphate,Alanine,Ornithineなどいくつかの化合物が3-ヒドロキシ酪酸と同様の増加を示したのに対し、Adenineは逆の傾向を示した。今後これらの代謝物の変化を元に、新たな化合物の生産に向けた検討を実施していく(表11、図21)。
窒素添加・無添加、好気・微好気条件によるハロモナス菌の反応

図１７ 窒素添加・無添加、好気・微好気条件によるハロモナス菌の反応

異なる代謝条件での電子顕微鏡観察

図１８ 異なる代謝条件での電子顕微鏡観察（窒素添加なし）
異なる代謝条件での電子顕微鏡観察

好気培養60時間

図１９ 異なる代謝条件での電子顕微鏡観察（窒素添加あり）

窒素添加・無添加、好気・微好気条件によるハロモナス菌の反応 PHB合成phaC・分解酵素phaZのRNA量

図２０ 窒素添加・無添加、好気、微好気条件によるハロモナス菌の反応 PHB合成酵素 phaC、分解酵素 phaZ の RNA 発現量
## メタボローム解析による各種代謝物の変化 1

Metabolite	RT	Intensity of the total ion intensity standard limited by internal standard Rbitol, n = 3

## メタボローム解析による各種代謝物の変化 2

図２１　メタボローム解析による各種代謝物の変化２
## 3 ．10 スギ木材糖化液を用いたハロモナス KM-1 株による 3-ヒドロキシ酪酸の生産性向上

スギ木材糖化液を用い、ハロモナス KM-1 株による 3-ヒドロキシ酪酸の生産を調べた。グルコースもしくはスギ糖化液の糖濃度を 12% に調整した。窒素源として、等量の尿素もしくは硝酸ナトリウムを用いて培養した。尿素の場合は、硝酸ナトリウムの場合と比べ、グルコース、木材糖化液を用いたいずれの場合も、20% 以上 PHB の蓄積量が向上し、全炭素窒素分析装置でも同様の結果を確認した。好気条件の場合、木材糖化液を用いた培養では、グルコースを用いた場合と比較し、半分程度の PHB の蓄積量であったが、グルコースの場合、蓄積した PHB の 35% 前後の PHB 顆粒が菌体内に残存するのに対し、木材糖化液の場合は蓄積した PHB のほとんどが分解され、21 g/L 以上の 3-ヒドロキシ酪酸が分泌されることが判明した。(図 22，表 12)

図２２ スギ糖化液での各種窒素源の有効性
3-ヒドロキシ酪酸生産量の比較

Organism	Carbon source	Procedure	(R)-3-HB (g/l)	Reference
Halomonas sp. KM-1	Glycerol	microaerobic condition	15.2	Kawata et al. (2012)
Wild strain
Glucose	40.0	Kawata et al. (2014)
スギ糖化液	21.1	In submission
Methylobaterium sp. ZP24	lactose	in vivo PHA depolymerization	1.8	Nath et al. (2005)
mutant
Escherichia coli	glucose	recombinant	12	Gao et al. (2002)
(phAB, ptb, buk)
Escherichia coli	glucose	recombinant	9.9	Lee et al. (2003)
(phaCAB, phaZ)
Escherichia coli	glucose	recombinant	7.3	Shiraki et al. (2006)
(phaCAB, phaZ)
Escherichia coli	glucose	recombinant	12.2	Liu et al. (2007)
(phAB, tesB)
Methylobacterium rhodesianum MB 126	methanol	mutant	2.8	Hölscher et al. (2010)
(3HB dehydrogenase null, lipoic acid synthase null)
Ralstonia eutropha	fructose	mutant	3.1	Shiraki et al. (2006)
(3HB dehydrogenase null)
Azohydromonas lata	glucose	mutant (UV)	6.5	Ugwu et al. (2011)
Burkholderia cepacia	Wood extract hydrosate	Wild strain	16.8	Wang et al. (2014)

## 3 ．11 PHB 顆粒蓄積と 3-HB 放出の過程における菌体の電子顕微鏡による解析

好気的培養（震盪 200rpm 条件詳細）の過程における菌体の形態の時間変化（4 条件：好気 12 時間、18 時間、24 時間、36 時間）と、その好気的条件から微好気的条件（震盪 50rpm 条件詳細）に移した場合（好気 24 時間+微好気 24 時間、および好気 36 時間+微好気 24 時間）の形態の様子を、超薄切片電子顕微鏡法によって観察した(図 2 3)。好気的培養の初期（12 時間）においては、桿菌の形状の菌体内に径が 100nm 以下の小型顆粒が観察された。培養時間の経過とともに 200-500nm 程度に成長した顆粒が観察されるようになり（18 時間、24 時間）、これら顆粒によって内から押し出されるように菌体の外形は膨張した。好気的培養 36 時間においては細胞内部に大型顆粒（500nm 前後）が密に充填された状態となり、菌体の外形は楕円にまで変形した。好気的培養 24 時間、あるいは 36 時間の後に微好気的培養に移して 24 時間を経た菌体では、顆粒のサ
イズが縮小し、微好気条件移行の前には詰まっていた顆粒と顆粒の間隔が広がり、細胞質の空間が回復した。

図２３ PHB顆粒蓄積と３-HB放出の過程の電子顕微鏡解析

電子線トモグラフィー解析においても、好気的培養時（3 条件：好気 12 時間、18 時間、36 時間）と、好気的条件から微好気的条件に移した場合（好気 24 時間+微好気 24 時間）の観察を行い、菌体の形態を三次元像として把握することに成功した(図 24、25)。菌体内に顆粒が密に充填された状態において、顆粒同士がどのような空間的配置をとるかを明らかにすることが可能となり、また好気的培養初期には細長い桿菌であった形状が回転楕円体状に膨張していることを三次元像から明確に評価することが可能となった。
図 2 4 KM-1 株菌体の三次元再構成像

## ハロモナス菌の電子顕微鏡立体解析

好気培養

乾燥菌体重量 52.1 g/L

PHB の割合 88.2 %

好気＋微好気培養

乾燥菌体重量 10.9 g/L

PHB の割合 22.9 %

図２５　ハロモナス KM-1 株の電子顕微鏡立体解析

電子線トモグラフィー解析においても、好気的培養時（3 条件：好気 12 時間、18 時間、36 時間）と、好気的条件から微好気的条件に移した場合（好気 24 時間+微好気 24 時間）の観察を行い、菌体の形態を三次元像として把握することに成功した。菌体内に顆粒が密に充填された状態において、顆粒同士がどのような空間的配置をとるかを明ら
かにすることが可能となり、また好気的培養初期には細長い桿菌であった形状が回転楕

円体状に膨張していることを三次元像から明確に評価することが可能となった。結果、

超薄切片電子顕微鏡法と電子線トモグラフィー法による解析から明らかになった段階

的な好気・微好気的条件の培養における菌体内顆粒の成長と縮小は、細胞乾燥重量と

PHB 含量の測定によって把握される増大・減少とよく一致しており、PHB 顆粒蓄積と

3-HB 放出の過程を形態的に評価したデータとして活用ができる。この一連の実験にお

いては、「好気 24 時間+微好気 24 時間」の培養と「好気 36 時間+微好気 24 時間」の培

養を比較すると、後者の方がピーク時の PHB 蓄積が前者より多いことが測定されてい

るにもかかわらず、続く微好気 24 時間での PHB 量減少の程度は前者の方が大きく、

3-HB 放出の効率としては有利である。このような PHB 蓄積・3-HB 放出の効率の様子

は、電子顕微鏡観察から明解な形で評価ができる。好気24時間よりも好気36時間の方

が PHB 顆粒が大型に成長していることも画像化されたし、「好気 36 時間+微好気 24 時

間」の培養後に大型顆粒の多くがまだ菌体内に残留している様子も画像化された。

## 3 ．12 ラットによる乾燥菌体、3-ヒドロキシ酪酸の経口毒性試験

3-ヒドロキシ酪酸の急性毒性試験の場合には、

・観察期間中に異常及び死亡例は認められなかった。

・一般状態 雌雄ともにいずれの投与群においても，観察期間中に異常は見られなかった。

・体重変化 投与後7及び14日の体重測定において，雌雄ともに試験群は対照群と比べ体重値に差は見られなかった。

・剖検所見 観察期間終了時の剖検では，雌雄ともにすべての試験動物に異常は見られなかった。

以上の結果から、以上のことから、ラットを用いる単回経口投与において、検体の
LD50 値は，雌雄ともに 2000 mg/kg を超えるものと考えられた。結果の詳細を、補遺 1 に示した。

ハロモナス菌乾燥菌体、3-ヒドロキシ酪酸の亜急性毒性試験の場合には、以下の性状が見受けられた。

ハロモナス菌乾燥菌体投与群：被験物質投与による影響はみられなかった。

なお、2000 mg/kg/日投与群の雄1例と雌1例で、それぞれ前胃の白色隆起巣と腺胃の暗赤色巣がみられたが、発現頻度及び病理学的性状から偶発所見と判断した。

3-ヒドロキシ酪酸投与群：被験物質投与による影響はみられなかった。

なお、1000 mg/kg/日投与群の雄1例で空腸の憩室がみられたが、用量相関性がみられず、病理学的性状から偶発所見と判断した。

2000 mg/kg/日投与群の雄の瀕死動物1例（動物番号：5005）で、低栄養状態、皮膚の蒼白化、鼻腔粘膜の肥厚による内腔の狭窄、ガス貯留による胃及び腸の拡張、腺胃の暗赤色巣、胸腺及び脾臓の小型化がみられた。

ハロモナス菌乾燥菌体では、投与期間を通じて死亡動物はみられなかった。

雌雄すべての投与群で一般状態、体重及び摂餌量に異常はみられなかった。

尿検査で 2000 mg/kg/日投与群の雌の尿量で有意な低値がみられたが、血液化学検査で腎臓パラメータ、腎臓の器官重量及び割検で腎臓に異常が認められていないことから、偶発的な変動と判断した。2000 mg/kg/日投与群の雄と雌の血液化学検査で、それぞれ無機リンと総コレステロールの有意な低値が認められたが、軽微な低値であり、腎臓及び肝臓の器官重量並びに割検で腎臓及び肝臓に異常が認められていないことから、偶発的な変動と判断した。2000 mg/kg/日投与群の雄の胸腺で絶対及び相対重量の有意な高値が認められたが、血液学検査でリンパ球及び割検で胸腺に異常がみられていなことから、偶発的な変動と判断した。
3-ヒドロキシ酪酸では、2000 mg/kg/日投与群の雄1例で試験20日に削噴、自発運動の減少、呼吸数の減少及び皮膚の蒼白化並びに腹部膨満がみられ、瀕死期剖検した。剖検では低栄養状態、皮膚の蒼白化、鼻腔粘膜の肥厚による内腔の狭窄、ガス貯留による胃及び腸の拡張、腺胃の暗赤色巣、胸腺及び脾臓の小型化がみられ、鼻腔粘膜の肥厚による内腔の狭窄より生じた胃及び腸の拡張による横隔膜の圧迫が瀕死の原因と考えられた。なお、同瀕死動物のこれらの所見は、病理学的性状から投薬起因性の毒性変化では無いと判断した。

生存動物の一般状態、体重及び摂餌量に異常はみられなかった。

尿検査で 2000 mg/kg/日投与群の雄の pH で低値傾向、タンパク質陽性例及びケトン体陽性例の増加、1000 mg/kg/日以上の投与群の雌で pH の低値傾向、タンパク質陽性例の増加及び尿量の有意な低値がみられたが、腎臓の器官重量及び割検で腎臓に異常が認められていないことから、偶発的な変動と判断した。

血液化学検査では、2000 mg/kg/日投与群の雄でグルコース、ナトリウム及び無機リンの有意な低値、2000 mg/kg/日投与群の雌で総タンパク質及びアルブミンの有意な低値がみられたが、軽微な低値であり、腎臓及び肝臓の器官重量並びに剖検で腎臓及び肝臓に異常が認められていないことから、偶発的な変動と判断した。

以上の結果から、本試験におけるハロモナス菌乾燥菌体及び3-ヒドロキシ酪酸の無毒性量（NOAEL）は、雌雄ともに2000 mg/kg/日を上回る(無毒性と判断)と推定された。結果の詳細を、補遺2に示した。
### 4. 結論

## 4 ．1 ハロモナス菌の培養、PHB 生産性について

我々が取得した Halomonas sp. KM-1 株と、NBRC (Chiba, Japan) 13 株、ATCC 2 株のハロモナス菌の生育を比較した結果、Halomonas sp. KM-1 株は、カルチャーコレクションの他のハロモナス菌と比較し、バイオプラスチック PHB の生産量が多いことが確認された。特に、限られた 5 種類のハロモナス菌しか生育しない栄養塩と炭素源からなる安価な SOT 培地や SOT 改培地においても、顕著な PHB 蓄積量を示した。これらの高い PHB の蓄積量、安価な、滅菌を必要としない培地組成は、商業培養を行う上で優位点である。さらに、実用化の際には未精製の炭素源が使用されることが予想されるため、今回試みた炭素源としてスギ糖化液やバイオディーゼル廃グリセロールを用いること、特にスギ糖化液の場合は、そのものに直接栄養塩を添加した培地でも生育可能であることは、今後の商業応用の可能性を示している。現状では、スギ糖化液の価格が、対グルコースなどの市販糖と比べて高く、十分な商業化のインセンティブをもたらしているとは言い難いのが状況である(図 2 6)。しかしながら、将来社会状況の変化と共に、循環型社会形成の雰囲気醸成が行われば、十分商業化できるレベルに達していると自負している。

同時に KM-1 株の PHB 蓄積時の代謝分析、KM-1 株と他のハロモナス菌との PHB 生産量の違いと代謝物の主成分分析は、今後より PHB の蓄積量、炭素源からの転換効率、次なる生産物のターゲットを検討する上で重要な示唆を与えるものと思われる。
## スギ糖化プロセスの特徴

1. ソーダ蒸解法は、すべての木質系バイオマスの脱リグニンに利用可能。

2. 黒液は、エネルギー利用の実績があり、糖製造時のエネルギーは完全自給可、さらに余剩エネルギーも得られる。苛性ソーダは回収し、再利用するため、廃棄物も少ない。

3. スギチップ1tから378kg(C6糖:357kg、C5糖:21kg)の糖を回収できる。（実証プラント実績）

4. スギパルプの酸素漂白処理により、糖化酵素使用量を大幅削減、結果糖価格を1kg当たり125円と試算。余剰リグニン成分の有効利用により、さらなるコスト低減が期待される。

図２６ スギ糖化プロセスの特徴

4．2 ハロモナス KM-1 株によるバイオプラスチック PHB、3-ヒドロキシ酪酸の生産ハロモナス KM-1 株による3-ヒドロキシ酪酸の生産の生産については、好気培養(200rpm)で蓄積したPHBを、給気条件を変更(50rpm)しただけで、ハロモナス菌が溶菌することなく、著量の3-ヒドロキシ酪酸が、PHBから分解され、分泌している(図4、27)。代謝物の変化については、GC-MSやCE-MSで分析しており、ヒートマップの分析からも、好気培養から微好気培養へと培養の様子が変わり、代謝物が変化していることが明らかになった。給気条件を変化し、代謝を変更させ、著量の中間体を分泌させる手法は、公益財団法人地球環境産業技術研究機構(RITE)のグループが、コリネバクテリウム属の菌体で検討しているものが著名だが、今後ハロモナス菌が、培養時に雑菌の混入が少なく、安価な培地で生育できる特性を生かし、3-ヒドロキシ酪酸以外の生産にも有益な知見が得られることが期待され、α-ケトグルタル酸など一部の代謝物については既に特許出願を行っている。
図２７ ハロモナス菌の主要代謝物の蓄積経路

## 4 ．3 電子顕微鏡による観察

好気的条件と微好気的条件において杉の木質糖化液で培養した際の、KM-1細胞の形態変化を電子顕微鏡によって観察した。最初の好気培養では、PHBの蓄積として直径0.15～0.45μmほどの細胞内顆粒が細胞一個あたり6～14個観察された。微好気培養の観察のためには、震盪200rpmで24時間の培養をしてから震盪50rpmで5時間の培養をして、化学固定を行った。好気条件とは対照的に細胞内顆粒の個数は0～5個に減少し、顆粒の大きさも直径0.05～0.5μm程に小さくなった。電顕観察に用いた菌体のPHB含量は、好気条件で8.4g/Lであり、微好気条件で0.6g/Lであった。電顕で観察された細胞内顆粒の個数とサイズの減少は、震盪を200rpmから50rpmに変えたときの細胞乾燥重量とPHB含量の減少とよく一致する。

前の報告で、グリセロールによる好気的条件での培養を行った際には細胞内顆粒の直径は約0.3～0.7μmであった。今回、杉の木質糖化液による24時間培養でPHB産生レ
ベルが $ 8.8 \, g/L $ であったのに対して、純粋なグリセロールによる $ 48 \, \text{時間培養では PHB 産生レベルは } 21.3 \, \text{g/L} $ であった。この違いは主として細胞内に蓄積された PHB 含量の違いの結果であり、そう考えれば電顕で観察された形態の違いも説明がつく。

電顕観察に用いた試料については、さらに、含まれる細胞数をコロニー形成で確認した。好気条件と微好機条件での生細胞個数は、それぞれ $ 6.2 \times 10^{10}/mL $ 、および $ 6.0 \times 10^{10}/mL $ であり、微好気条件において KM-1 細胞の生存能力に損傷がないことが確認され、今後商業培養が検討される過程において、十分な優位性をもっていると結論できる。

## 4 ．4 ハロモナス KM-1 株による木材糖化液の利用、バイオプラスチック PHB、3-ヒドロキシ酪酸の生産

木材の構成糖の5-30%をC5糖が占め、現在さかんに検討される非可食バイオマスからのバイオエタノール生産においても、リグノセルロースに含まれるC5糖の有効利用が経済性を成立させる上で不可避の課題である。工業的に利用されている微生物の多くは、C5糖を利用することができず、C6糖のみが利用されC5糖のキシロース、アラビノースなどは培地中に残っていたのが実際である。また、限られたC5糖を利用できる菌体でも、C6糖が優先して代謝される特性(Glucose catabolite repression 異種代謝抑制)から、グルコースが優先的に消費され、その後C5糖が利用されることが報告されている(図28)。ハロモナス菌KM-1株は、C6糖存在下でも、C5糖をC6糖とほぼ同じスピードで代謝し、PHBの生産量も変化ないことから、工業的な利用において極めて有利である。また、この異種代謝抑制がないことは、学術的な観点から、遺伝子代謝制御の解除のメカニズムについても極めて注目される菌体である。
## 微生物のC6糖、C5糖の利用パターン

図２８ 各種微生物のＣ６糖、Ｃ５糖の利用パターン

## 4 ．5 ハロモナス KM-1 株による木材糖化液の利用、バイオプラスチック PHB、3-ヒドロキシ酪酸の生産

本研究では、ハロモナス菌で日本のバイオマス資源として有望なスギを利用し、実際にバイオプラスチック PHB 及び3-ヒドロキシ酪酸を生産した。バイオリファイナリーの構築は世界的な課題であり、実際の木材糖化液そのものを用いて、菌体を培養し、化成品を生産できたことは極めて有意義なことといえる。今後、試薬のグルコース、キシロース、アラビノースと比べて劣る PHB、3-ヒドロキシ酪酸の生産性をどのように向上させるかが課題である。この点については、糖濃度 11%のスギ糖化液を持ちいて、培養した結果、スギ糖化液中の糖は 36 時間目にすべて消費され、3-ヒドロキシ酪酸を、糖等量あたりグルコースに匹敵する 20%程度の転換効率、分泌量 21.1 g/L、生産効率 0.35 g·L⁻¹·h⁻¹ でスギ糖化液から生産することが可能となり、現在のところスギ糖化液は有効に PHB へと転換され、転換された PHB のほとんどは分解され、3-ヒドロキシ酪酸とし
て分泌されるといえる(図4，表12)。生産濃度、速度のさらなる向上については、糖の濃縮が初期検討したが、濃縮にかかるエネルギー消費が大きく、培養後に菌体濃縮して、3-ヒドロキシ酪酸を分泌生産することを試みた。通常は、濃縮に伴う、分解抑制などが起こることが懸念されたが、培養60時間の時点で、2倍、4倍に濃縮して、微好気条件に移行した場合、それに比例して分泌される3-ヒドロキシ酪酸の生産量、濃度が上昇することが判明し、最大250 g/Lの分泌溶液を回収することができ、十分事業性のあるものと判断した(図29)。

PHB蓄積後の濃縮プロセスの適応

- より高濃度の3HB溶液を得るために-

·PHB蓄積後に遠心濃縮、微好気転換、pHをコントロール

→ PHB蓄積後の菌体は容易に沈殿

→ 原料糖の濃縮プロセスを不要に

→ 最大 250 g/L以上の3HB生産濃度達成！

図２９ PHB 蓄積後の、３HB 分泌プロセスの改良

一般に、化学反応プロセスと比較すると、微生物による発酵生産プロセスは、高い原料価格、水の精製のコスト、低い基質濃度、生産物濃度など実用化を妨げる多くの課題を抱えている。特に、他の微生物のコンタミネーションを防ぐために、滅菌プロセスが必要であり、連続的な培養が難しく、これらが一層のコスト上昇に関わっている。近年、これらの課題を解決する可能性のある手段として、ハロモナス菌を含む好塩菌の優位性
が認識されている。好塩菌は、高塩濃度で生育すること、そのため培地を滅菌せずとも、コンタミネーションの懸念なく、連続培養が可能であること、幅広い温度領域で生育できること、高い基質濃度にも耐性であること、また、一部の好塩菌はpHで生育すること等、低コスト化に適した特徴がある(Yin et al. 2014)。特に、我々が使用したHalomonas sp. KM-1は、至適pHが9.4程度と高く、今回のプロジェクトの実験にあたっても、種菌の培養時以外は、滅菌操作を行わずに実験を実施した。基質濃度も、グルコースの場合30%程度の濃度まで生育可能であり、それに伴って生産物の濃度も向上させることが可能である。

一方、3-ヒドロキシ酪酸の生産の経済性の試算では(図30)、3-ヒドロキシ酪酸1kgあたり、1,000円程度での生産の可能性が示された。今後より詳細な試算検討が必要なもの、企業における数十Lスケールの、精製糖を用いた培養により、事業化に向けた課題が判明しつつある。事業化にあたっては、まずは市販価格の高い医療用原料や健康食品などとしての利用を検討していくことが妥当と判断する。

3-ヒドロキシ酪酸の機能については、脳幹、胎盤を通り、ヒトのエネルギー源として利用され、また、がん細胞には利用できないことはは従来知られていたが、最近、3-ヒドロキシ酪酸が、炎症を引き起こすタンパク質の一部「NLRP3」の発現を直接抑えることにより炎症性の病気、例えば、2型糖尿病、アルツハイマー病、アテローム性動脈硬化などの発生を抑制する可能性が、マウスを用いた実験で明らかになった(Youm et al.,2015)(図31、32)。

また、今回のプロジェクトの中で、ラットを用いた亜急性毒性試験を実施した。ハロモナス菌乾燥菌体及び3-ヒドロキシ酪酸の無毒性量（NOAEL）は、雌雄ともに2000 mg/kg/日を上回る、すなわち無毒性と判断された。このことは、3-ヒドロキシ酪酸が、安全な化合物であることと共に、それを生産するハロモナス菌も生産プロセスとして安全であると判断された。今後、ハロモナス菌を用いて、3-ヒドロキシ酪酸以外の化合物の生産
を検討するホワイトバイオプロセス、バイオマスリファイナリーの確立にあたって、今回のプロジェクト検討の中で判明した種々の結果は、早急な事業化に向けて、有意な可能性を示したものと思われる。プロジェクト発足当時は、バレル100ドル程度であった原油の価格が、現在は50ドル程度と、バイオマスリファイナリーの事業化、特にエネルギーへの応用へは厳しい状況が生じている。日本国内においては、未だ遺伝子組換え手法を用いた生物の社会寛容度は低く、バイオマスリファイナリーの生産はバイオプラスチックなどごく限られた検討がなされているに過ぎない。それゆえ、今後の事業化検討においては、まずは遺伝子組換え体でないこと、バイオセーフティレベル1(ヒトあるいは動物に病気を起こす可能性の低い微生物)であることのメリットを生かし、野生株を用いた培養プロセスの調整のみでの事業化に向けた展開について検討する(図33、34)。

PHB, 3-HB生産の経済性について

試算根拠 パイオマスプラスチックの開発・利用普及に関する调查 日本有機資源協会

図 30 PHB、3HB 生産の経済性について
図 3 1 PHB、3-ヒドロキシ酪酸とは

図323-ヒドロキシ酪酸の人に対する効果
## 参考 企業との検討

3-ヒドロキシ酪酸の生産技術に関し、

企業と共同で、大スケール培養、精製等のプロセスの検討を実施。

図33 企業との検討

## 独自菌株ハロモナス菌の利点

・未精製の余剰バイオマス(木材糖化液、バイオディーゼル廃グリセロール)を利用可能

·木材糖化液に含まれるC6糖グルコースに加え、C5糖キロース、アラビナスを同時に利用可能

·中程度の高塩濃度(海水利用可能)、高アルカリ環境に生育するので、雑菌増殖なく、多量のエネルギーを要する培地の滅菌が不要

·好気的条件で乾燥菌体重量の約80%のバイオブラスチックPHBを菌体内に蓄積、微好気条件に変更後、光学活性基幹化学品(R)-3-ヒドロキシ酸酸を分泌

図 3 4 独自菌体ハロモナス菌の利点
### 5. 研究発表

論文発表 (査読あり)

1. “Efficient production and secretion of $ (\mathrm{R}) $ -3-hydroxybutyric acid from living Halomonas sp. KM-1 under successive aerobic and microaerobic conditions” Y. Kawata, K. Kawasaki, S. Shigeri APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, 96 卷 4 号 913～920 页 2012/11/01

2. “Taxonomic characterization and metabolic analysis of the Halomonas sp. KM-1, a highly bioplastic poly(3-hydroxybutyrate)-producing bacterium” Y. Kawata, L-H Shi, K. Kawasaki, S. Shigeri JOURNAL OF BIOSCIENCE AND BIOENGINEERING, 113 卷 4 号 456～460 页 2012/04/01

3. “Draft Genome Sequence of the Halomonas sp. KM-1, a Moderately Halophilic Bacterium that Produces the Bioplastic, Poly(3-hydroxybutyrate)” Y. Kawata, K. Kawasaki, S. Shigeri, JOURNAL OF BACTERIOLOGY, 194 卷 10 号 2738~2739 页, 2012/04/01

4. “Metabolomics-based component profiling of Halomonas sp. KM-1 during different growth phases in poly(3-hydroxybutyrate) production” You-Xun Jin, Lian-Hua Shi, Yoshikazu Kawata BIORESOURCE TECHNOLOGY 2013, 140 卷, 73～79

5. “Efficient secretion of (R)-3-hydroxybutyric acid from Halomonas sp. KM-1 cultured with saccharified Japanese cedar under microaerobic conditions” Y. Kawata, Y-X Jin, M. Nojiri, BIORESOURCE TECHNOLOGY 2013, 140 卷 443～445

6. "Efficient secretion of (R)-3-hydroxybutyric acid from Halomonas sp. KM-1 by nitrate fed-batch cultivation with glucose under microaerobic conditions", Y. Kawata, H. Ando, I. Matsushita, J. Tsubota, BIORESOURCE TECHNOLOGY, 2014, 156卷, 443~445

7. “Analysis of optimal conditions for poly-(R)-3-hydroxybutyric acid and (R)-3-hydroxybutyric acid production by Halomonas sp. KM-1 cells under nitrate fed-batch cultivation with glucose” Y. Kawata, in submission

8. “Optimal (R)-3-hydroxybutyric acid secretion from Halomonas sp. KM-1 cells cultured with saccharified Japanese cedar via urea fed-batch cultivation” Y. Kawata, M. Nojiri, I. Matsushita, J. Tsubota, in submission

## 論文発表(査読なし)

1. “光学活性基幹化学品を余剰バイオマスから製造する技術” 河田悦和, ケミカルエンジニヤリング, 57 巻 12 号 901～907 頁 2012/12/01 化学工業社

2. “好塩菌ハロモナスの工業利用” 河田悦和, 生物工学会誌, 90 巻 9 号 594 頁 2012/09/01