Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
“Fine-scale Spatial Genetic Structure of Ten Dipterocarp Trees in a Bornean Rain Forest”

3) A. ITOH, S. NANAMI, T. HARATA, T. OHKUBO, S. TAN, L. CHONG, S. J. DAVIES and T. YAMAKURA: Biotropica (in press)

“The Effect of Habitat Association and Edaphic Conditions on Tree Mortality during El Niño-Induced Drought in a Bornean Dipterocarp Forest”

くその他誌上発表（査読なし）> 特に記載すべき事項はない

## （2） 口頭発表（学会等）

1) A. Itoh, S. Nanami, T. Yamakura, T. Ohkubo, S. Tan: Annual Meeting of Ecological Society of America, Albuquerque, USA, 2009.

"Interacting effect of habitat and conspecific density on tree mortality in a Bornean rain forest"

2) T. Yamakura, A. Itoh, S. Nanami, S. Mori, T. Ohkubo, S. Tan, L.H. Seng, P.A. Palmiotto, S.J. Davies & P.S. Ashton: Annual Meeting of Ecological Society of America, Albuquerque, USA, 2009 "1/f Noise in spatial patterns of dipterocarp trees in a tropical rainforest, Sarawak, Malaysia"

3) S. Nanami, A. Itoh, S. Tan, B. Diway & T. Yamakura: Annual Meeting of Ecological Society of America, Albuquerque, USA, 2009

"Genetic structure and gene flow in Dryobalanops aromatica, an emergent tree species in a tropical rain forest, Sarawak, Malaysia"

4) 名波哲・伊東明・山倉拓夫・Sylvester Tan・Bibian Diway: 第19回日本熱帯生態学会 年次大会（2009）

「リュウノウジュ個体群におけるサイズクラス間の遺伝構造の差異」

5) 原田剛・名波哲・伊東明・山倉拓夫・Sylvester Tan・Bibian Diway: 第19回日本熱帯 生態学会年次大会（2010）

「ホソバリユウノウジュ個体群の遺伝構造と更新動態」

6) 伊東明・名波哲・山倉拓夫・大久保達弘・S. Tan: 第57回日本生態学会年次大会(2010)「ボルネオ熱帯雨林の実生群集動態－ハビタットと同種密度効果の交互作用－」

7) 原田剛・名波哲・伊東明・山倉拓夫・Bibian Diway・Sylvester Tan: 第57回日本生態学会年次大会（2010）

「マレーシア熱帯雨林におけるフタバガキ科10種の遺伝構造」

8) A. Itoh: International Meeting for Promoting Asia-Pacific Biodiversity Observation Network (AP-BON), Tokyo, Japan, 2010

"Biodiversity Monitoring of Forest Ecosystems by Large-scale Plots: Examples in Malaysia, Thailand and Japan"

9) A. Itoh, S. Tan, S. Nanami, T. Yamakura, T. Ohkubo & C. Lucy: Sarawak Biological Resources Forum 2010, Kuching, Malaysia, 2010

"Long-term study on dynamics of a tropical rain forest with a large-scale plot in Lambir Hills National Park, Sarawak"
10) S. Nanami, T. Harata, S. Tan, B. Diway, A. Itoh, T. Yamakura & L. Chong: Sarawak Biological Resources Forum 2010, Kuching, Malaysia, 2010

"Spatial genetic structure of dipterocarp species in a tropical rain forest, Sarawak, Malaysia"

11）伊東明・名波哲・山倉拓夫・S. Tan・L. Chong：第20回日本熱帯生態学会年次大会(2010)「ランビル熱帯雨林稚樹群集の8年間の動態」

12）名波哲・伊東明・山倉拓夫：第20回日本熱帯生態学会年次大会(2010)

「サラワク州ランビルヒルズ国立公園における一斉開花時のフタバガキ科樹種の開花フェノロジー」

13) A. Itoh: International Workshop "Plant Ecology and Diversity Observation Network and Capacity Building in Indonesia", Sanur, Indonesia, 2010

"Twenty-year experience in establishment and maintenance of a large-scale forest dynamics plot at Lambir Hills National Park in Sarawak, Malaysia"

14) A. Itoh, S. Nanami, T. Yamakura, T. Ohkubo, C. Lucy, T. Tan & HS. Lee: Annual Meeting of Association for Tropical Biology and Conservation, Asia-Pacific Chapter, Sanur, Indonesia, 2010 "Effects of topography on tree mortality resulting from El Niño-induced drought: A study in a Bornean tropical rain forest"

15) S. Nanami, S. Tan, A. Itoh, T. Harata, T. Yamakura, B. Diway & L. Chong Annual Meeting of Association for Tropical Biology and Conservation, Asia-Pacific Chapter, Sanur, Indonesia, 2010 "Spatial distribution patterns of reproduction in dipterocarp trees in a tropical rainforest, Sarawak, Malaysia"

16) T. Harata, S. Nanami, S. Tan, A. Itoh, T. Yamakura, B. Diway & L. Chong Annual Meeting of Association for Tropical Biology and Conservation, Asia-Pacific Chapter, Sanur, Indonesia, 2010 "Spatial genetic structure of ten dipterocarp species in a tropical rainforest, Sarawak, Malaysia"

17）伊東明・原田剛・名波哲・山倉拓夫：第58回日本生態学会年次大会（2011）「フタバガキ科の個体群動態と遺伝的多様性の関係」

18）名波哲・原田剛・松山周平・伊東明・BM. Diway・S. Tan・L. Chong・山倉拓夫:第58回日本生態学会年次大会（2011）

「サラワク州ランビルヒルズ国立公園におけるShorea属樹種の遺伝構造と遺伝子流」

19）原田剛・名波哲・伊東明・山倉拓夫・松山周平・BM. Diway・S. Tan・L. Chong:第58回日本生態学会年次大会（2011）

「フタバガキ科10種個体群の遺伝構造と個体空間分布の関係」

20）伊東明、名波哲、松山周平、宮崎祥子、山倉拓夫、Sylvester Tan、Lucy Chong：第21回日本熱帯生態学会年次大会（2011）

「熱帯雨林樹木10種の死亡に及ぼすハビタットと同種密度の影響の評価と実生を用いた野外実験による検証」

21）山倉拓夫、名波哲、伊東明、Sylvester Tan：第21回日本熱帯生態学会年次大会（2011）「フタバガキ科樹木種子の落下運動」

22) 伊東明：公開シンポジウム「遺伝子から見た熱帯林－消えゆく熱帯雨林は救えるか－」(2001)
「森林伐採は熱帯林の遺伝的多様性を減らすか？ーボルネオ島のフタバガキ樹木の場合ー」

23) 伊東明：日本植物学会近畿支部大会（2011）

「ボルネオ熱帯雨林の樹木群集の生態」（招待講演）

24) T. Harata, S. Nanami, T. Yamakura, A. Itoh, S. Matsuyama, L. Chong, B. M. Diway, S. Tan, O. J. Hard: The 5th East Asian Federation of Ecological Societies International Congress, Shiga, Japan, 2012

"Estimation of seed dispersal from fine-scale spatial genetic structure in the dipterocarp tree populations"

25) A. Itoh, S. Miyazaki, S. Matsuyama, S. Nanami, S. Tan, L. Chong: The 5th East Asian Federation of Ecological Societies International Congress, Shiga, Japan, 2012

"A field experiment on effects of habitat and conspecific density on tropical tree seedlings"

26) A. Itoh, S. Miyazaki, S. Matsuyama, S. Nanami, S. Tan, L. Chong: Annual Meeting of the Association of Tropical Biology and Conservation Asia-Pacific Chapter, Xishuangbanna, China, 2012

"Effects of habitat and conspecific density on tropical tree seedlings: results of a transplantation experiment"

## （3） 出願特許

特に記載すべき事項はない

（４）シンポジウム、セミナーの開催（主催のもの）

特に記載すべき事項はない

（５）マスコミ等への公表・報道等

特に記載すべき事項はない

(6) その他

特に記載すべき事項はない

### 8 \. 引用文献

1) Hardy OJ, X. Vekemans X (2002) SPAGeDi: a versatile computer program to analyze spatial genetic structure at the individual or population levels. Molecular Ecology Notes 2, 618-620.

2) Degen B, Gregourius HR, Scholz F (1996) ECO-GENE, a model for simulation studies on the spatial and temporal dynamics of genetic structures of tree populations Silvae Genetica 45, 5-6.
# （２）生態系劣化評価２－土壌微生物を指標とした評価手法の確立

京都大学・大学院農学研究科 宮下直彦

<研究協力者>

京都大学・大学院農学研究科 岩永廣子

平成21～23年度累計予算額 33,861千円

（うち、平成23年度予算額 10,762千円）

上記の予算額は、間接経費を含む。

[要旨] 森林劣化指標となる微生物や遺伝子を同定するために、マレーシア（サラワク）、インドネシア（ジャワ、スマトラ）、シンガポールの熱帯林と日本の冷温帯林の土壌から抽出した微生物DNAを用いたメタゲノム解析とmRNAを用いたメタトタンスクリプトーム解析を行った。メタゲノム解析では、16SリボソームRNA領域（16S rRNA：細菌対象）とリボソームRNA遺伝子間領域（ITS：菌類対象）の塩基配列を次世代シーケンサRoche 454を用いて、また抽出したDNAのランダムショットガン配列をIllumina GAIを用いて決定した。得られた塩基配列データの群集生態学的解析から、細菌の組成については森林植生や劣化状態に関わらず高次分類階級での優占分類群が共通であることが示された。種レベルでは調査地および採集地点に多くの特異的種が存在した。さらに森林土壌には数千の細菌種が存在するが多くは単独であり、平均2～3個体で存在するという微生物群集生態学の新知見を得た。一方で、細菌の組成・多様性は森林の地理的距離や植生・多様性と明確な関係がなく、森林環境は細菌の組成・多様性を決定する主要因ではないことが示唆された。一方、菌類は高次分類階級での優占分類群は共通するが、細菌より多様性は低く、森林特異性が高いことが判明し、森林劣化評価指標となり得ることが示唆された。ランダムショットガン配列の解析からは、高次分類階級での優占分類群が共通することが確認された。さらに、推測された微生物群集の潜在的機能に調査森林間に大きな違いは見られず、微生物組成が森林間で類似していることに対応している。メタトランスクリプトーム解析では、抽出に成功したサラワクと日本の森林土壌からのmRNAの解析を行った。推定された微生物の組成は、優占分類群が両調査森林でも類似しており、頸在化された代謝機能にも森林間で大きな違いは検出できなかったが、潜在的機能とは異なっていた。

[キーワード] 土壌微生物、次世代シーケンサ、メタゲノム解析、メタトランスクリプトーム解析

### 1. はじめに

土壤微生物（細菌・菌類）は森林の有機物を分解し、物質循環を通して生態系の維持に貢献する。したがって、土壤微生物とその機能（遺伝子群）は森林生態系の健全度や劣化度を評価する指標になると考えられた $ ^{1} $ 。この考えに基づき、土壤微生物に着目した森林劣化評価手法を確立
するために、次世代シーケンサ $ ^{2)} $ ， $ ^{3)} $ により得られた土壌微生物の大規模塩基配列データのメタゲノム解析 $ ^{4)} $ とメタトタンスクリプトーム解析 $ ^{5)} $ を行った。

## 2 ．研究開発目的

過度の伐採、農地開発、焼き畑などの理由による熱帯林の減少は、熱帯林生態系の破壊や生物多様性の消失につながるだけではなく、温暖化に伴う地球全体の気候変動にも大きく影響している。森林劣化評価手法の確立は、熱帯林から始まり地球全体の環境破壊につながる連鎖のカスケードを止めるために必要である。手法が確立できれば、環境政策の運用面（熱帯林保護・保全活動）に貢献できる。具体的には保護・保全対象の熱帯林の劣化の程度を評価し、活動の必要度をランク付でき、保護・保全計画を策定する客観的な根拠となる。保全作業の進捗の程度や保全方法の比較・評価にも利用できる。このような視点に立ち、本研究では熱帯林全体の物質循環に大きな役割を担う土壌微生物に注目し、最新の分子生物学的手法である次世代シーケンサとメタゲノム・メタトタンスクリプトーム解析によって、健全林と劣化林を比較し、森林劣化評価方法の確立を試みた。

## 3 ．研究開発方法

## （１）天然熱帯林と劣化林における土壌細菌組成と多様性

マレーシア・サラワク州のランビルヒルズ国立公園の尾根部と谷部（天然フタバガキ林）、バカム試験地（劣化林：残存林、二次林、火災被害林）と京都府南丹市京都大学芦生演習林（天然冷温帯林）の6森林を調査対象とし、各森林内5地点計30の土壤採集地点の16S rDNA配列データに基づく土壌細菌組成を解析

表(2)-1 土壤探集地

調査森林	採集地ID	森林の特徴
ランビルズ国立公園（尾根部）	LR	自然林
ランビルズ国立公園（谷部）	LV	自然林
バカム試験区(残存林)	BR	残存林
バカム試験区(二次林)	BS	二次林
バカム試験区(火災被害林)	BB	火災被害林
芦生演習林	AS	自然林

した（表(2)-1）。土壌採集は2009年10-12月に実施した。土壌からのDNA抽出には、PowerSoil DNA Isolation kit (MO BIO社)を用いて、土壌10gあたり約10μgのDNAを得ることができた。16S rDNA領域をPCR増幅し、シーケンサFLX454により塩基配列を決定した。塩基配列データを解析し、土壌細菌の多様性を評価した。解析にはRibosomal Database Project (RDP:

http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp)と Quanitative Insights into Microbial Ecology (QIIME: http://www.qiime.org/) のウェブツール群 $ ^{6)} $ を用いた。

## 1 ）高次分類階級における土壌細菌の組成

RDPのClassifierツールによって、各配列を門・綱・目・科レベルで分類群に分類した。各採集地点と調査森林の土壌の細菌組成を構築し、調査森林間の細菌組成の類似性を順位相関によって比較し、また調査森林間の各分類群の頻度の不均一性をカイ2乗検定により比較した。

## 2 ）種レベルでの細菌多様性と細菌数の分布の比較

種多様性の検証のためにクラスター解析を行った $ ^{7)} $ 。クラスター間の遺伝的距離が3%以下のものを一つの種（OTU）として定義した。実験規模の妥当性を判断するために、rarefaction curveを
調査森林レベルで推定した。種多様性の指標であるChao1指数 $ ^{8)} $ と、種均等性指標のShannon指数（H'） $ ^{9)} $ を推定した。あるクラスター内の配列数は細菌種内の細菌（個体）数を反映すると考え、クラスター解析の結果を各採集地点のクラスターの分布に変換し、細菌数の分布を採集地点間と調査森林間で比較した。

## 3 ）細菌種組成の類似度

構築されたクラスターの組成を比較し、採集地点間の全ての組合せについて、種レベルでの細菌組成の類似度であるジャカード指数 $ ^{10)} $ を推定し、UPGMA系統樹を作成した。得られた系統樹に基づき、採集地点と調査森林の関係を解析した。

## （２）土壌細菌組成および多様性の地理的・時間的変異

地理的変異の解析のために、上記6調査森林（ランビルヒルズ国立公園、バカム試験区、芦生）に加え、インドネシア、マレーシア、シンガポールの異なる植生の森林（混交フタバガキ林、二次林、石灰岩林、火災被害林、アカシア植林地、アブラヤシ植林地、冷温帯林、ケランガス林、フタバガキ植林地を含む）及び日本（伊吹山）から土壌を採集し、微生物DNAを抽出した。土壌採集の方法は、各調査森林内において、10採集地点から採集した土壌サンプルをプールする形で行った。地理的変異について計29サンプルの配列データを得た。時間的変異に関しては、合計6森林（ランビルヒルズ国立公園、バカム試験区、芦生）を調査対象とし、2009年12月、2010年8月、2010年10月、2011年4月の4回の土壌採集およびDNA抽出をおこなった（芦生に関しては2010年8月のサンプルなし）。時間的変異について計46サンプルを得た。16S rDNA領域をPCR増幅し、シーケンサFLX454により塩基配列を決定した。解析方法は（1）と同様に、細菌組成、種多様性と組成の類似度の変化を地理的・時間的に比較した。

## （３）天然熱帯林と劣化林における土壌菌類（カビ、キノコ）組成の地理的・時間的変異

細菌16S解析に用いた時間的変異、地理的変異のサンプルのうち、時間的変異については38サンプル（ランビルヒルズ国立公園、バカム試験区、芦生6調査森林の各2地点より3～4回採集分）、地理的変異解析では23サンプルに関して、菌類の群集構造解析を行った。土壌微生物DNAより、菌類の核rRNA ITS領域 $ ^{11} $ をPCR増幅し、次世代シーケンサFLX454によって塩基配列を決定した。塩基配列データを群集生態学的手法を用いて解析することにより、土壌菌類の多様性と組成を明らかにした。解析は（1）と同様に、菌類組成、種多様性と組成の類似度の地理的・時間的変異を調べた。

## 1 ）相同性検索を使った土壤菌類の組成推定と指標菌種の同定

各配列が由来する菌の分類群を推定するため、検索ツールBLASTN $ ^{12)} $ により相同性検索を行った。相同性検索の結果に基づき、MEGANプログラム $ ^{13)} $ を用いて、各分類階級（門～種）で菌類の組成を推定した。組成データに基づき、自然林および劣化林に特異的な菌種を同定した。

## 2 ）種レベルでの菌類多様性と菌類組成

（１）と同様に、クラスター間の遺伝的距離が3％以下のものを一つの種（OTU）として種の多様性を評価した。ITS配列のクラスター構築には、ESPRITプログラム $ ^{14)} $ を使用した。クラスター
の数と配列数に基づき、EstimateSプログラム(http://viceroy.eeb.uconn.edu/EstimateS)を使って、多様性の指標であるChao1指数 $ ^{8)} $ と、Shannon指数（H'） $ ^{9)} $ 、及びサンプル間の菌類組成の類似度を示すジャカード指数 $ ^{10)} $ を推定した。ジャカード指数に基づくUPGMA系統樹により、経時サンプル間および調査森林の関係を解析した。

## （４）ゲノムランダムショットガン配列のメタゲノム解析

6調査森林（ランビルズ国立公園、バカム試験区、芦生）の土壌から土壌微生物DNAを抽出し、ランダムショットガン配列を次世代シーケンサIllumina GAIを用いて決定した。土壌からのDNA抽出には、PowerMax Soil DNA Isolation kit (MO BIO社)を用い、5～10gの土壌から抽出された10□gのDNAを配列決定に使った。各配列が由来する微生物種と遺伝子を推定するため、検索ツールBLASTX $ ^{12)} $ によって相同性検索を行った。相同性検索の結果に基づき、MEGANプログラム $ ^{13)} $ を用いて、各土壌サンプルにおける微生物種と遺伝子機能の組成を推定した。

## （５）メタトランスクリプトーム解析（mRNAランダムショットガン配列解析）

ランビルヒルズ国立公園1カ所（尾根部）、芦生演習林1カ所、シンガポール・ブキティマ国立公園2カ所（天然林、二次林）の合計4カ所から土壌を採集し、100gの土壌から20～30μgの土壌微生物由来Total RNAを抽出した。RNA抽出にはRNA PowerSoil Total RNA Isolation Kit (MO BIO社)を使用した。10□gのTotal RNAをcDNAに逆転写し、Illumina DSN normalization protocolに従って、cDNAライブラリの標準化（リボソームRNAを減らし、mRNAを濃縮する）を行った。標準化されたcDNAライブラリを使って、次世代シーケンサ Illumina HiSeq 2000を用い、RNAランダムショットガン配列を決定した。メタゲノム解析と同様、配列が由来する分類群と遺伝子機能をBLATX $ ^{12)} $ によって推定し、MEGANプログラム $ ^{13)} $ を用いて、土壌微生物群集において発現している機能と、その発現を担う分類群の組成を推定した。

## 4 ．結果及び考察

## （１）天然熱帯林と劣化林における土壌細菌組成および多様性

ランビルヒルズ国立公園、バカム試験地と芦生演習林の解析結果について以下に報告する。1）高次分類階級における土壌細菌の組成

細菌組成を門・綱・目・科の階層で比較した。門ではAcidobacteria, Proteobacteria（上位5門が90％以上を占める、図(2)-1）、綱ではAcidobacteria, Alphaproteobacteria（上位5綱70％以上）、目では、Rhizobiales, Planctomycetales，（上位5目60％

図(2)-1 各調査森林（左6）と各採集地点（右5ずつ）の門の組成
以上）、科ではPlanctomycetaceae,

Chitinophagaceae，（上位5科50％以上）などがどの調査地でも優占分類群であった。共通優占分類群の存在は、分類群の順位相関係数が統計的に有意に正として確認された（図(2)-2）。一方、各分類群の頻度は調査森林と採集地点において4つの分類階層で多くの分類群に有意な不均一性が検出された。

## 2 ）種レベルでの細菌多様性と細菌数の分布の比較

各調査森林のrarefaction curve（図(2)-3）から、解析した配列数が増加しても種数の推定値が定常状態（プラトー）に到達していないことが判明し、土壌微生物の多様性は極めて高く、本研究レベルでは多様性を十分推定できていない可能性が示唆された。採集地点・調査森林当たりの平均クラスター（種）数とChao1指数はサンプルの階層とともに種数推定値が増加し（表(2)-2）、採集地点・森林特

図(2)-2 異なる分類レベルにおける調査森林間の順位相

図(2)-3 各調査森林の rare faction curve

異的な種の存在を意味する。ランビル谷部と芦生で種数が多く推定され、バカム2次林・火災被害林が健全なランビル尾根部・バカム残存林よりも多くの種を維持することは、土壤微生物多様性と森林生態系の違い（熱帯林vs.冷温帯林、自然林vs.劣化林）に明確な関係がないことを示唆す

表(2)-2 クラスター解析による種の多様性と均等性

る。一方、Shannon指数（H'）はサンプルの階層に伴い6.99、8.14、9.66と変化がなく、少数の優先種と大多数の低頻度の種の存在を意味する。種数と個体数の分布の特性を調べた。採集地点では単一種（個体数=1）が全体の60%程を占め（図(2)-4）を相当りの平均個体数は2.82と少ない。最大個体数は数百程であり、高頻度優先種は存在しない。多くの低頻度種の存在が確認され、採集地点・森林に特異的であった。この結果は共通の分布状態であり、森林土壤には数千の細菌種が存在するが多く

群集	配列数	クラスター数	Chao1	H'
1）5探集地点
ランビル尾根	14,070	2,643.8	3,603.13	6.87
ランビル谷	13,115	3,545.4	5,427.02	7.33
バカム残存林	10,951	2,184.0	3,024.27	6.67
バカム2次林	14,002	3,035.4	4,297.08	7.00
バカム火災林	15,758	2,833.8	3,799.97	6.82
芦生	13,833	3,537.8	5,374.46	7.27
平均	13,621	2,963.37	4,254.32	6.99
2）調査森林
ランビル尾根	70,350	9,532	11,714.31	8.01
ランビル谷	65,574	13,149	17,751.58	8.45
バカム残存林	54,755	7,715	9,604.70	7.79
バカム2次林	70,009	11,524	14,769.70	8.17
バカム火災林	78,789	10,889	13,472.66	8.07
芦生	69,165	12,992	18,072.95	8.38
平均	68,107	10,966.83	14,230.98	8.14
3）全体	408,642	53,637	63,309.54	9.66

1）は各5採集地点の平均、2）は調査森林全体の推定値、3）30地点全体クラスター数：それぞれの群集階層のサンプルについて推定した
は単独であり、少個体数（平均2～3個体）の状態で存在するという微生物群集生態学の新知見を得た。

## 3 ）細菌種組成の類似度

推定されたジャカード指数に基づいて、採集地点の関係を示すUPGMA系統樹を作成した（図5）。各森林内の採集地点はクラスターを形成し、森林内の土壌細菌の組成が類似していることを示している。系統樹の末端の長い枝は採集地点の細菌組成の大きな分化を意味し、多数の採集地点特異的な種の存在と対応する。また、芦生とランビル尾根部が隣接することやランビル谷部がバカムの多様な森林とクラスターを作ることから、土壌細菌の組成と地理的距離や森林の生態的状態には関連がないことが判明した。

図(2)-4 調査森林の採集地点における種当りの個体

図(2)-5 土壤細菌組成の類似度（ジャカード指数）

数の2分社壊細菌組成お使び多様性の地理的・時間的変異基づく採集地点間の関係

## 1 ）地理的变異

調査した29森林の全てを考慮した解析は現時点では完了していないため、解析の終わった13調査森林（表3）の結果を報告する。分類群の組成については、前述の調査と同様に、高次の分類群では優占分類群は共通しているが、頻度に不均一性が検出された（図(2)-6）。各調査森林のrarefaction curveが示すように（図(2)-7）、解析配列

表(2)-3 土壤采集地

調査森林	採集地ID	森林の特徴
ランビルズ国立公園（尾根部）	Lrid1	自然林
ランビルズ国立公園（谷部）	Lval2	自然林
バカム試験区(残存林)	Brem3	残存林
バカム試験区(二次林)	B2nd2	二次林
バカム試験区(火災被害林)	Bbur1	火災被害林
芦生演習林	Ash1	自然林
バウ（二次林）	BAU2nd	二次林
バウ（石灰岩林）	BAUlim	自然林
ニア（混交フタバガキ林）	NIAmdf	自然林
ニア（石灰岩林）	NIAlim	自然林
バコウ（混交フタバガキ林）	BKOmdf	自然林
ブキ・ティガプル（フタバガキ林）	BTNmdf	自然林
ブキ・ティガプル（火災被害林）	BTNbur	火災被害林

数が増加しても推定種数が平衡に達しないことから、いずれの調査地においても土壌細菌の多様性が極めて高く、この解析でも多様性のレベルは十分に推定できない可能性がある。調査森林における種多様性（クラスター数とChao1指数）には、森林間に大きなばらつきが検出された（図(2)-8）。
特にChao1指数に関しては、バウ石灰岩林において最も多くの種数

（11,318）が検出され、最小種数が検出されたバコウ混交フタバガキ林

（3,573）と約3倍の違いがあった。また、多様性の推定値である両値には明確な相関が存在せず、クラスター数の推定だけではなく、Chao1指数による補正が必要なことを示唆している。調査集団あたりに検出されたク

ラスター（種）数は2.000～5,000であるが、調査森林全体では25,807と増加する

図(2)-6 各調査森林における門の組成

ることは、やはり調査森林特異的な種が多く存在することを示している。しかし、地域特異的や森林のタイプに特異的なものが存在するわけではない（表(2)-4）。

図(2)-7 各調査森林のrarefaction curve

図(2)-8 各調査森林の種多様性

## 2 ）時間的變化

調査した全ての46サンプルの解析は現在進行中であり、部分的に解析した17サンプルの結果を報告する。分類群の組成の時間的変化について、門レベルでは優占分類群の割合は比較的大きな変化を示さないが、目以下の分類レベ

表(2)-4 調査森林・地域・森林タイプ特異的なクラスター数と割合

forest	# clusters specific %	within %	total	region/type #	clusters specific %	within %	total
Ash	4,231	1,610	0.38	0.06	Sarawak	12,946	0
Lrid1	3,870	937	0.24	0.04	Lambir	7,207	57
Lval2	3,897	1,086	0.28	0.04	Bakam	8,486	10
Brem3	3,026	781	0.26	0.03	Bau	7,154	571
B2nd	3,383	1,053	0.31	0.04	Niah	5,592	54
Bbur1	4,048	1,512	0.37	0.06	Indonesia	6,763	164
BAU2nd	2,858	1,509	0.53	0.06
BAUlim	5,303	2,466	0.47	0.10	フタバガキ	11,275	0
BKOmdf	1,944	348	0.18	0.01	二次林	6,135	28
NIAlim	3,354	1,044	0.31	0.04	火災被害林	7,138	137
NIAmdf	2,428	536	0.22	0.02	石灰岩林	7,518	489
BTNbur	4,113	1,151	0.28	0.04
BTNmdf	4,001	1,032	0.26	0.04
total	25,807	共通	25,807	1
ルでは分類群の頻度に大きな変化が検出された（図には、森林間に大きなばらつきが検出された（図(2)-9）。このことは、比較的気候変動の幅が小さいと思われる熱帯林においても、雨期や乾期などの違いが下位の分類群の組成に影響していることを示唆している。種多様性の時間的変化（図(2)-10については、8月（サラワクでは乾期に対応）に多様性（種・クラスター数）が減少するように見えるが、バカム残存林では大きな変化はなく、この周期性についてはさらなる検証が必要である。クラスターの出現頻度をサラワクの調査森林について調べたところ、3回とも検出されたクラスターはどの調査地においても検出されたクラスターの10%程度であるのに対し、1回だけ検出されたものが60%前後であった。このことは、種多様性が極めて高く、そのうちのごく一部しか検出されていないことを示唆する。また、極めて頻繁に種の絶滅と出現が繰り返されている可能性も示唆されるが、この可能性を検証するために今後配列レベルの進化遺伝学的解析を計画している。地理的変異と時間的変化の関係を調べるために、17サンプル間のジャカード指数を推定し、UPGMA系統樹を作成した（図(2)-11）。バカム残存林2009年12月サンプルがバカム二次林とクラスターを作る一つの例外を除いて、調査森林内の採集時期の違うサンプルは、一つのクラスターを作ることが判明した。このことは、地理的な要因（地理的適応に関する自然選択など）が採集時期の違いによる要因（季節変動に対する適応など）よりも細菌種の組成に大きく影響することを意味するが、系統樹の外側の枝がかなり長いことは、採集時期間の違いも大きいことを示している。

(2)-9 目の組成の時間的変化

図(2)-10 種多様性の時間的変化

Relationship between temporal and spatial changes

図(2)-11 地理的・時間的な細菌種組成の変化
## （３）天然熱帯林と劣化林における土壌菌類（カビ、キノコ）組成の地理的・時間的変異

現在までに終了した2009年と2010年のデータの解析結果について報告する。菌類の分類群組成は細菌のものよりも大きな地理的変異が検出された。門レベルでは優占分類群（BasidiomycotaとAscomycota）が全体の95％を占め、調査森林間で共通しているが、目以下のレベルでは森林間で分類群組成に大きな違いが検出された（図(2)-12）。種レベルでは、各サンプル当たり平均して1,123種の菌類が存在すると推定され、バカム二次林や火災林で種数が低く（817～922種）、熱帯と冷温帯の天然

図(2)-12 菌類（目）の組成

林で多様性が高かった（1200種以上）。菌類の多様性は森林劣化の影響を受けて低くなる傾向が示された。菌類の組成と地上部の植生や気候との間に明確な関連は見られなかったが、フタバガキ林に特異的な菌を11種特定できた。その中には共生菌根菌も含まれ、フタバガキ林の生態系に重要な役割を担うことが示唆された。時間的変化は

地理的変異に比べて、菌類の組成と多様性に関して変動は少なく、菌類が森林環境により大きく影響されることが判明した。地理的変異と時間的変化の関係を調べるために、全サンプル間のジャカード指数を推定し、UPGMA系統樹を作成した（図(2)-13）。採集地点ごとにクラスターを作ることは地理的影響が菌類の組成により大きな影響を与えることと対応する。しかし、注目すべきことは、バカム火災被害林が末端枝の短いクラスターを形成していることや、二次林が全くクラスターを作らないことである。これらの結果は、火災被害後に新しい菌類の侵入が起きたことや攪乱された環境（二次林）への局所的な適応を示唆する。これらの菌類についての結果は、土壤細菌よりも菌類のほうが森林の様々な違いに敏感に適応していることを示唆しており、共

図(2)-13 菌類組成の地理的・時間的变化

生菌根菌などは森林の状態を評価する指標となり得る可能性が高い。大量塩基配列解析による熱帯林の菌類に関する研究は行われておらず、これらの結果は本研究によって初めて明らかにされた新知見である。

## （４）ゲノムランダムショットガン配列のメタゲノム解析

表(2)-1に示した6カ所の調査森林からの各サンプルあたり長さ50bpの塩基配列が800万から
1700万リード得られた。しかし、BLASTXによる相同性検索によって分類群が決定できたのは全体の2.7%から5.1%であり、遺伝子や機能が特定できたものは2.7%～3.5%であった。これらの低い決定率は、ゲノムランダムショットガン配列が遺伝子間領域やイントロンなどの非構造領域の塩基配列を大量に含んでいることが主要な原因であると考えられる。また、検索した（タンパク質）データベースに登録されていない多くの未知のタンパク質を調査した土壌微生物群集が持っている可能性も否定できない。ここで解析できなかった95%以上の配列を今後何らかの形で解析できれば、これまでにない発見ができると考えている。

図(2)-14 細菌の組成（ランダムショットガン（門）

## 1 ）土壤微生物の組成と多様性

分類群を特定できた配列を用いて、それぞれの調査森林の界・門・綱・目・科・属・種の分類レベルにおける微生物組成を構築した。界レベルでは、調査したどの土壌サンプルでも細菌が圧倒的に多く（6サンプルの平均96.7%）、菌類は0.5%以下であった。16S rRNAの解析結果と同様に、優占的細菌はどの土壌でも共通していたが、ランダムショットガン配列の解析では最優占である門はAcidobacteriaではなくProteobacteriaであった（図(2)-14）。この違いは検索に使ったデータベースの違いに由来するものと考えられる。また、どの分類レベルでも分類群頻度の順位相関は統計的に有意に正であり、調査森林間で組成が類似しているが、多くの分類群の頻度に調査森林間で有意な不均一性が検出された。これは、前述のように細菌の組成を決定する森林環境特異的な要因の存在を示唆している。微生物の多様性（分類群の数）を門以下の6分類レベルで推定した（図(2)-15）。ここで、種数はデータベース内に発見できた種の数であり、16S rRNAのクラスター解析によって推定された種数とは異なっている。全般的に調査森林間に多様性レベルの大きな違いは見られないが、芦生の多様性が比較的低かった。しかし、16S rRNAのクラスター解析から得られた結果（ランビルヒル谷部と芦生が比較的高い種多様性を持つ）とは異なっており、ここで用いたデータベースに依存した解析は、データベースに記載されていない未知の微生物が自然界では圧倒的に多数であるため、多様性の比較には適してい

図(2)-15 細菌の多様性（ランダムショットガン）

図(2)-16 細菌群集の潜在的代謝機能
ない可能性が考えられる。

## 2 ）土壤微生物の機能

BLASTX相同性検索に基づき推定された各リードの遺伝子機能を生物学的プロセスに分類し、頻度を調査森林間で比較した（図(2)-16）。微生物組成とは異なり、生物学的プロセスにおいては土壌間でほとんど違いがなかった。これは、微生物組成に関して多少の割合の違いはあるが、優占分類群が共通しているため（図(2)-1、(2)-14）、微生物群集が総体として持つ潜在的な代謝機能がほぼ共通であることは当然期待される結果であった。6カ所の土壌サンプル間で輸送、DNA代謝、オルガネラ編成に関わる遺伝子の頻度に有意な不均一性が検出されたが、森林環境との関連は不明である。

表(2)-5 森林環境の指標となる微生物と遺伝子群

1、指標微生物
特異性	微生物（科）（%）	特徵
地域特異的
Lambir	Pseudonocardiaceae (0.02)	Actinomycetes（放線菌）
Bakam	Methylococcaceae (0.03)	Nutrition methane bacteria
環境特異的
自然林 (Lambir & Brem)	Tricholomataceae (0.04)	Ectomycorrhizal fungi
劣化林 (B2nd & Bbur)	Bacillaceae (0.04)	B. cereus

2、指標遺伝子群
特異性	遺伝子 (%)	機能
地域特異的
Lambir	Trehalose-6-phosphate synthase (0.17)	Trehalose synthesis
Undecaprenyl pyrophosphate synthase (0.17)	Cell wall
Bakam	Superfamily II DNA helicase (0.14)	DNA複製
環境特異的
Bakam 火災被害林	Multidrug transport system (0.71)	防御
Antimicrobial peptide transport system (0.63)	防御

## 3 ）森林環境の指標となる微生物および遺伝子の推定

地域特異的または環境特異的な微生物と遺伝子群を森林環境の指標候補として選抜した（表(2)-5）。これらの微生物は科レベルで推定されているため、具体的な役割などは明らかでない。しかし、これらのうち、ランビルヒルズ国立公園とその尾根部に近い植生であるバカム残存林で環境特異的に観察された担子菌Tricholomataceaeは、塩基配列の相同性から外生菌根菌Laccaria bicolorと推定された。この外生菌根菌は熱帯林樹木と共生すると考えられることから、自然林土壤環境の指標微生物である可能性が高い。また、劣化林（バカム二次林と火災被害林）で検出されたBacillaceae科の細菌は劣化林の評価に使える可能性がある。一方、ランビルヒルズ国立公園で検出されたトレハロース合成や細胞膜形成に関わる遺伝子群やバカム火災被害林で検出された防御に関与する遺伝子群などは、それぞれ自然林と劣化林の評価指標の可能性がある。今後これらの指標微生物や遺伝子群を森林環境評価指標として確立するためには、検出された環境特異的な微生物と遺伝子群について、PCR増幅を利用した森林環境評価のためのマーカーを作成した後、多様な地域・環境由来の土壌DNAサンプルに適用し、PCR増幅の有無や強弱と環境条件との相関
を検証することによってマーカーの妥当性を検討する必要がある。

## （５）メタトランスクリプトーム解析（mRNAのランダムショットガン配列解析）

ランビルヒルズ国立公園尾根部と芦生のサンプルについて配列決定が終了し、平均100bpのRNAショットガン配列をそれぞれ1億1千万個以上得た。現時点では全ての配列の解析は終わっていないため、各サンプル30万個の配列に対して行った解析結果を報告する。BLASTXによる相同性検索を行い、由来する分類群と遺伝子機能を推定した。分類群が推定できた配列の割合は26%で、メタゲノム配列に比べ10倍増加した。これは非翻訳領域が含まれないことと配列長が2倍長くなった結果だと考えられる。一方、機能が推定できた配列の割合は4.1％と、メタゲノムデータと同程度に低く、土壌微生物の多くの遺伝子機能は未知のものであることを示唆した。

## 1 ）土壤微生物分類群の組成

分類群の組成はランビルと芦生で類似しており、門レベルでは、Proteobacteria、Firmicutes、ActinobacteriaのmRNA出現頻度が高く、3門を合わせて約70％を占めた（図(2)-17）。mRNA配列とDNA（ゲノムランダムショットガン）配列（図(2)-14）から推定された分類群の組成は異なり、多く存在している微生物が必ずしも多くの遺伝子を発現しているわけではないことが判明した。例えばAcidobacteriaはメタゲノムでは2番目に多く存在するが（約19%）、mRNA配列では0.8％しか占めず、土壤中に存在するAcidobacteriaの多くは活動停止状態にあることを示唆した。反対に、Asomycota（子囊菌門）はメタゲノムでは1.3％しか占めなかったが、RNA配列では約6％と4番目に多く出現した。これは菌類の活発な代謝をしており、分解者としての貢献が大きいことを示した。また、その他上位分類群にはStreptophyta（ストレプト植物）、Arthropoda（節

図(2)-17 mRNAから見た土壤微生物の組成

足動物）、Chordata（脊索動物）、Chlorophyta（緑藻植物）やCnidaria（刺胞動物）など、上記の16S rRNAやゲノムランダムショットガン配列の解析では検出されなかった細菌や菌類以外の土壤微生物が検出されており、遺伝子発現のレベルで見ると土壌微生物の世界が想像以上に多様であることが判明した。

## 2 ）土壌微生物のメタトランスクリプトーム

発現されている機能でも、機能カテゴリーや発現順位に関してランビルヒルズ尾根部と芦生の間に明確な違いは検出されていない（図(2)-18）。タンパク質代謝関連の遺伝子発現が最も多く、続いて毒性、炭水化物代謝、アミノ酸代謝に関わる遺伝子が多く発現し、合計約50％を占めた。毒性には、抗生物質や接合などに関わる機能が含まれ、土壌微生物群集では細胞間の相互作用が、
一次代謝と同レベルに活性化されていることが明らかになった。DNA代謝やヌクレオチド代謝に関する遺伝子の発現が比較的低レベルであることは、土壌微生物が必ずしも活発な細胞分裂を行っているわけではないことを示唆する。土壌微生物のメタトランスクリプトーム解析の成功例は少なく、本研究によって世界初の知見が得られている。

## 3 ）メタゲノム解析とメタトランスクリプトーム解析の比較

メタゲノム解析とメタトランスクリプトーム解析によって、土壌微生物群集の潜在的な機能と顕在化された機能の違いが明らかになり、優先的な土壌微生物が必ずしも活発に遺伝子発現を行っているわけではないことが判明した。

しかし、データベースに対する相同性検索から同定された分類群や遺伝子からは、本研究の重要なテーマである森林間の違いを見出すことができなかった。両解析では、分類群や遺伝子機能を推定することができなかった配列が多く残っており、未知の分類群や遺伝子に由来するものが多く含まれると推測される。森林状態の指標となる遺伝子および機能を特定するためには、データベースに依存せずに遺伝子機能を推定し比較する解析方法を開発する必要があり、今後の研究の大きな課題である。

図(2)-18 土壤微生物のメタトランスクリプトーム

## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

本研究で行った次世代シーケンサを用いた熱帯林土壌微生物に関するメタゲノム・メタトランスクリプトーム解析は世界的にも初めての試みであった。また、この研究によってこれまでなかった東南アジアの熱帯林土壌微生物の群集構造や生態学に関する情報を得ることができた。具体的には、16S rRNA、rRNA ITS、ゲノムランダムショットガンとmRNAなどを対象とした本研究は、熱帯林土壌微生物群集の組成と代謝機能を様々な情報レベルで明らかにし、熱帯林の多様性研究に土壌微生物群集生態学という新しい分野を開拓できた。一方、本研究は熱帯林の遺伝的・生態的多様性と土壌微生物との関係を解明することを目指したが、土壌微生物の組成や代謝機能と森林環境との明確な関係を発見することはできなかった。しかし、多くのデータの解析は現在も進行中であり、今後新たな発見や成果が得られるものと考えている。本研究によって得られた結果がこれからの研究の重要な基礎となり、熱帯林土壌微生物の群集生態学的研究がより発展するものと考えている。また、本研究を通して、「群集遺伝学」という新しい研究分野の発想を得ることができた。今後群集遺伝学的研究を行うことによって、微生物群集の遺伝学的解析と生態学的解析の融合が進むとも考えている。
## （２）環境政策への貢献

本研究の目的である熱帯林劣化の指標微生物や遺伝子を研究期間内に最終的な特定をすることはできなかった。しかし、森林環境条件の指標候補となりうる微生物や遺伝子・機能を発見することができた。特に菌類は有望であり、それらの指標候補は今後の研究によって、多様な森林環境条件との相関を検証し、森林劣化指標として確立する必要がある。土壤微生物に着目した評価方法を確立できれば、環境政策の運用面、特に熱帯林保護・保全活動に大きな貢献ができると考えられる。具体的には保護・保全対象である熱帯林の劣化の程度を相対的に評価でき、保護・保全の必要度をランク付けすることで、保護・保全計画を策定するための有効かつ客観的な根拠となる。また、この方法は保全作業の進捗の程度や保全方法の比較や評価のためにも利用できると考えられる。

## 6 ．国際共同研究等の状況

カウンターパート氏名・所属・国名

$$ Dr. Ulfah J.Siregar\bullet Bogor Agriculture University\bullet Indonesia $$

Lucy Chong· Sarawak Forest Corporation· Malaysia

Bibian Michael Diway• Sarawak Forest Corporation• Malaysia

John Sabang · Sarawak Forest Corporation · Malaysia

Suliana Charles · Sarawak Forest Corporation · Malaysia

Sylvester Tan · Center for Tropical Forest Science Laboratory · USA

## 参加·連携状況

当研究の遂行にあたって、インドネシア・スマトラ及びジャワとマレーシア・サラワク州における土壌サンプルの採取と土壌微生物DNAの抽出のために、国立公園入園許可、研究許可、DNAの持出し許可の取得、土性検査及び実験施設使用などに関して、上記メンバーの協力を得た。

## 7 ．研究成果の発表状況

## （1） 紙上発表

<論文（査読あり）>

1) N. T. MIYASHITA, H. IWANAGA, S. CHARLES, B. DIWAY, J. SABAN and L. CHONG: PLoS One (in press) (2012)

Pyrosequencing-based analyses of soil bacterial community in five tropical forests in Southeast Asia and one temperate forest in Japan.

## （2） 口頭発表（学会等）

1）岩永廣子、J. Sabang、B. M. Diway、L. Chong、宮下直彦：第20回熱帶生態学会（2010）
「熱帯林土壌微生物のメタゲノム解析による、生態系劣化評価のための指標微生物・指標遺伝子の探索」

2 ) N. T. Miyashita, H. Iwanaga : The $ 3^{rd} $ GEN Network International Seminar: Sustainable Bio-resources for Global Welfare. Bali, Indonesia (2010)

“Metagenomics analysis on soil microorganisms in the South East Asia”

3）岩永廣子、J. Sabang、B. M. Diway、L. Chong、宮下直彦：日本遺伝学会第82回大会（2010）「メタゲノム解析によるマレーシア熱帯雨林と劣化林における土壌微生物の多様性と機能の解明」4）岩永廣子、J. Sabang、B. Diway、L. Chong、宮下直彦：第21回熱帯生態学会（2011）

「メタゲノム解析によるマレーシア天然熱帯林および劣化林における土壌細菌・菌類の組成と多様性の解明」

5）岩永廣子、B. Diway、J. Sabang、L. Chong、宮下直彦：日本微生物生態学会第27回大会(2011)「メタゲノム解析によるマレーシア天然熱帯林と劣化林における土壌細菌・菌類群集の空間的・時間的変動の解明」

## （3） 出願特許

特に記載すべき事項はない。

（４）シンポジウム、セミナーの開催

特に記載すべき事項はない。

（５）マスコミ等への公表・報道等

特に記載すべき事項はない。

## （6） その他

特に記載すべき事項はない。

### 8 \. 引用文献

1) Harris J (2009) Soil microbial communities and restoration ecology: Facilitators or followers? Science 325: 573-574.

2) Mardis ER (2008) The impact of next-generation sequencing technology on genetics. Trends in Genetics 24: 133-141.

3) 菅野純夫、他 10 著者、2009 特集 次世代高速シークエンサーの応用と情報解析. 蛋白質・核酸・酵素 54:1233-1275.

4) Daniel R (2005) The metagenomics of soil. Nature Reviews 3: 470-478.

5) Bailly J et al. (2007) Soil eukaryotic functional diversity, a metatranscriptomic approach. The ISME Journal 1, 632-642.

6) Cole JR et al. (2008) The Ribosomal Database Project: Improved alignments and new tools for rRNA analysis, Nucleic Acids Research 37: D141-D145.

7) Legendre P, Legendre I (1998) Numerical Ecology. Elsevier, New York.