Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
29) AM. ZAMA and M. UZUMCU: Front Neuroendocrinol 31, 4, 420-439 (2010)

“Epigenetic effects of endocrine-disrupting chemicals on female reproduction: an ovarian perspective”

30) T. MATSUEDA, T. IIDA, H. HIRAKAWA, K. FUKAMACHI, H. TOKIWA and J. NAGAYAMA: Fukuoka Igaku Zasshi 84, 5, 263-272 (1993)

“Concentration of PCDDs, PCDFs and coplanar PCBs in breast milk of Yusho patients and normal subjects”

### 7. 国際共同研究等の状況

特に記載すべき事項はない

### 8. 研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

## <論文（査読あり）>

1) K. TSUKIMORI, H. UCHI, C. MITOMA, F. YASUKAWA, K. FUKUSHIMA, T. TODAKA, J. KAJIWARA, T. YOSHIMURA, T. HIRATA, N. WAKE and M. FURUE: Chemosphere, 84, 7, 928–35 (2011)

“Comparison of the concentrations of polychlorinated biphenyls and dioxins in mothers affected by the Yusho incident and their children”

2) K. TSUKIMORI, H. UCHI, C. MITOMA, F. YASUKAWA, T. CHIBA, T. TODAKA, J. KAJIWARA, T. YOSHIMURA, T. HIRATA, K. FUKUSHIMA, N. WAKE and M. FURUE: Environ Int, 38, 1, 79–86 (2012)

3) K. TSUKIMORI, F. YASUKAWA, H. UCHI, M. FURUE and S. MOROKUMA: Epidemiology, 23, 72, 349–350 (2012)

“Sex ratio in two generations of the Yusho Cohort”

4) K. FUKUSHIMA, K. TSUKIMORI, D. LI, T. TAKAO, S. MOROKUMA, K. KATO, H. SEKI, S. TAKEDA, S. MATSUMURA and N. WAKE: Hum Exp Toxicol, (2012)

“Effect of transient TCDD exposure on immortalized human trophoblast-derived cell lines.” (in press)

5) K. TSUKIMORI, S. MOROKUMA, T. HORI, K. TAKAHASHI, T. HIRATA, Y. OTERA, K. FUKUSHIMA, T. KAWAMOTO and N. WAKE: J Obstet Gynaecol Res, (2012)

“Characterization of placental transfer of polychlorinated dibenzo-p-dioxins, dibenzofurans and polychlorinated biphenyls in normal pregnancy”
くその他誌上発表（査読なし）>

1) K. TAKAHASHI, T. HORI, D. YASUTAKE, S. MOROKUMA, Y. OTERA, K. FUKUSHIMA, T. YAMAMOTO, J. KAJIWARA, T. KAWAMOTO, T. HIRATA, K. TSUKIMORI, and M. FURUE: Organohalogen Compd, 73, 645–648 (2011)

“Determination of Dioxins in Umbilical Cord Blood Samples Using Accelerated Solvent Extraction”

2) T. HORI, K. TAKAHASHI, D. YASUTAKE, S. MOROKUMA, Y. OTERA, T. TODAKA, T. YAMAMOTO, H. HIRAKAWA, J. KAJIWARA, T. KAWAMOTO, T. HIRATA, and K. TSUKIMORI: Organohalogen Compd, 73, 1600–1603 (2011)

“Concentrations of Dioxins in Sets of Placental Tissue, Maternal Blood and Umbilical Cord Blood Samples Collected from Japanese Pregnant Women”

## （2） 口頭発表（学会等）

1) Koji TAKAHASHI, Tsuguhide HORI, Daisuke YASUTAKE, Seiichi MOROKUMA, Yuka OTERA, Kotaro FUKUSHIMA, Takamitsu YAMAMOTO, Jumbuka KAJIWARA, Toshihiro KAWAMOTO, Teruaki HIRATA, Kiyomi TSUKIMORI, and Masutaka FURUE: 31st International Symposium on Halogenated Persistent Organic Pollutants - Dioxin 2011, Brussels, Belgium, 2011

“Determination of Dioxins in Umbilical Cord Blood Samples Using Accelerated Solvent Extraction”

2) Tsuguhide HORI, Koji TAKAHASHI, Daisuke YASUTAKE, Seiichi MOROKUMA, Yuka OTERA, Takashi TODAKA, Takamitsu YAMAMOTO, Hironori HIRAKAWA, Jumbuku KAJIWARA, Toshihiro KAWAMOTO, Teruaki HIRATA, and Kiyomi TSUKIMORI: 31st International Symposium on Halogenated Persistent Organic Pollutants - Dioxin 2011, Brussels, Belgium, 2011

“Concentrations of Dioxins in Sets of Placental Tissue, Maternal Blood and Umbilical Cord Blood Samples Collected from Japanese Pregnant Women”

## 3 ）堀　就英、高橋浩司、諸隈誠一、川本俊弘、平田輝昭、月森清巳：環境ホルモン学会第14回研究発表会（2011）

「高速溶媒抽出法を用いた妊産婦血液、臍帯血及び胎盤組織試料のダイオキシン類分析」

4）諸隈誠一、大寺由佳、福嶋恒太郎、藤田恭之、湯元康夫、穴見愛、月森清巳、和氣徳夫：第63回日本産科婦人科学会学術講演会（2011）

「ダイオキシン類の母体から胎児への移行に関する検討」
C-0903 妊娠におけるダイオキシン摂取が胎児健康に及ぼす影響のリスク評価に関する研究

(3) 「ダイオキシン類の胎盤毒性に関する基礎的研究」

九州大学医学研究院生殖病熊生理学 教授 和氣 徳夫

九州大学病院総合周産期母子医療センター 講師 福嶋恒太郎

順天堂大学産婦人科 准教授 加藤 聖子

<研究協力者>

九州大学大学院医学研究院生殖病態生理学 浅野間和夫

九州大学大学院医学研究院生殖病態生理学 高尾 知佳

九州大学大学院医学研究院生殖病態生理学 李 丹

平成21～23年度累計予算額：1，866千円（うち平成23年度：1，040千円）

予算額は、間接経費を含む。
## [要旨]

本課題では、ヒト胎盤を構成する絨毛細胞に対する、2,3,7,8-テトラクロロジベンゾ-1,4-ジオキシン(TCDD)をはじめとするダイオキシンの直接的影響とその機構を細胞生物学的に明らかにすることを目的とした。ヒト不死化絨毛細胞株を用いてTCDD曝露による細胞生物学的影響を細胞増殖能、細胞浸潤能について検討した。その結果、48時間までの暴露では、細胞の増殖、浸潤、アポトーシスにはTCDDは影響を与えないことがわかった。しかしながら、絨毛幹細胞においては、TCDDは増殖・維持には抑制的に作用すること、エストロゲンの存否により与えうる作用が異なる可能性があることが示唆された

また、TCDDのレセプターであるアリル炭化水素受容体（AhR）のプロモータ領域について、胞状奇胎検体を用いて検討したところ、4種類の一塩基変異がみられること、そのうちの1種類は転写活性が高いことがわかった。

これらの結果から、絨毛細胞に対するTCDDの効果は単純な細胞毒性ではなく他の液性因子の効果を修飾するような作用として表現される可能性や、転写領域の一塩基変異などによるレセプターの発現量の差が表現型に関与している可能性があることを示唆するものと考えられ、今後妊娠中のダイオキシン感受性の個体差について検討を加える必要があることが示された。

[キーワード] 絨毛細胞、aryl hydrocarbon 受容体、ダイオキシン、遺伝子多型

### 1. はじめに

妊娠中の低レベルのダイオキシン暴露は低出生体重児の増加と関連するとの報告がある $ ^{1-4} $ 。低出生体重児は、発達の遅れや学習障害 $ ^{5} $ 、将来の高血圧 $ ^{6} $ や心血管疾患 $ ^{7,8} $ の危険性を増すとされている。つまり妊娠中のダイオキシン暴露が児に及ぼす影響を明らかにする中で、出生体重に影響を及ぼすメカニズムを決定することは重要である。

2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin（TCDD）の作用は、アリル炭化水素受容体（AhR）を介して表現される。AhRは、シトクロムP450（CYP）酵素の誘導を調節する。これらのCYP酵素の誘導は最終的に活性酸素種（Reactive oxygen species, ROS）の発生を惹起する。そして、このROSによりDNAの損傷 $ ^{9} $ がもたらされる。動物モデルでは、低酸素と相まって、TCDDへの子宮内暴露はトロフォブラストのアポトーシスと、子宮内胎児死亡の増加を起こすことが知られている。低酸素への反応はhypoxia-inducible factor（HIF）を介して行われるが、この経路とAhRによって媒介される経路の間のクロストークがこのプロセス $ ^{10} $ で重要な役割を演じる。HIF1Aは、また、絨毛外栄養膜細胞（EVT）分化 $ ^{11-16} $ の調節で、鍵となる役割を演じている。従って、TCDD暴露は、ROSの増加により胎盤形成に必須なEVT機能に直接影響を及ぼし、結果的に胎盤の機能障害を通して胎児発育制限を引き起こすことが考えられる。しかし、TCDDがヒトEVT $ ^{9,10} $ の生物学的性質に影響を及ぼすというエビデンスはほとんどない。AHRは環境汚染物質のような生体異物に応答して遺伝子転写を調節する $ ^{17-18} $ 。AHRは哺乳類の組織に幅広く発現しており、TCDD, benzo[a]pyrene (BaP)そして3-methylcholanthrene (3MC)のようなダイオキシン類の受容体として知られているリガンド活性転写因子である $ ^{19-21} $ 。ダイオキシンはAhRに結合し、エストロゲン作用あるいは抗エストロゲン作用などの内分泌かく乱物質としての性質を示すことが報告されているが、その効果は細胞によって多様である $ ^{22,23} $ 。核内受容体ERとの相互作用も報告されているが、まだ一定の見解は得られ
ていない。また、AhRシグナルは外因性リガンド非依存的に増殖、分化、細胞周期停止やアポトーシスのような生理的影響にも関与する $ ^{22,23} $ 。AhRを介するシグナル伝達経路についてはいくつかの報告があり、活性型AhRは肝細胞癌発生や胃癌腫瘍形成を誘導する事が報告されている $ ^{24} $ 。一方でAhR経路が抗増殖的に機能すると示している研究もある $ ^{25,26} $ 。しかしAhRの病理学的意義はまだ議論の余地はあるが、AhRの発現上昇は様々なヒト癌種、例えば肺癌、乳癌、膵臓で報告されている $ ^{27,29,30} $ 。これらの報告に対して、正常細胞でAhR上昇メカニズムを解明しようとする研究はほとんどない。最近、AhR遺伝子のSNPと癌リスクまたは癌発生間における関連性について肺癌や乳癌で報告された $ ^{31-36} $ 。これらの研究は発癌や癌発生におけるAhR上昇メカニズムにはいくつかのSNPsが関与することを示唆する。癌患者で見つかっている多型の中でいくつかのSNPsはAhRの上昇に応答している $ ^{37-40} $ 。しかしながらAhR発現メカニズムにおけるAhR多型の影響を研究する報告はない。

## 2 ．研究開発目的

本サブテーマでは、TCDDがヒトEVTの生物学的性質に与える影響を明らかにすることを目的として、TCDD暴露時のEVTの細胞増殖、浸潤、Tube-like formationならびに分化に関わるタンパク質の発現の評価およびエストロゲンの影響を検討するとともにサイドポピュレーション（SP）細胞を分離・培養し、ダイオキシンの絨毛幹細胞への影響を解析した。さらにヒトAhRのプロモータ領域SNPsによるAhR転写制御への影響を明らかにする事を目的としAhRプロモータ領域を同定し、プロモータ上のSNPを探索し、遺伝子多型による、ダイオキシンへの感受性が変化しうるかどうかを検討した。

### 3. 研究開発方法

## (1) TCDD が ヒトEVT に与える生物学の影響についての検討

## 1 ）细胞培養

TCL1細胞は、選択的帝王切開の時に絨毛膜から分離された細胞から不死化され樹立された。HTR-8/Svneoは第一三半期のトロフォブラストから不死化され樹立された $ ^{15,16} $ 。TCL1、HTR-8/Svneoとも10%の胎仔血清（fetal calf serum，FCS，Gibco Invitrogen）を加えたRPMI1640（Nipro, Tokyo, Japan）培地または調整培地で、37°C、5%CO $ _{2} $ 条件で培養した。

## 2 ）WST細胞增殖試験

細胞増殖は、コールターカウンターを用いた計測ないしWST-分析で評価した。WST細胞増殖試験は、メーカーのプロトコルに従って市販のキット（WST-1細胞増殖分析システム(Takara, Shiga, Japan)）を使用した。5x10³個のTCL1細胞は96穴マイクロプレートに播種し、24時間TCDD/DMSOに暴露した後、WST試薬を加え2時間培養し、450nmでの吸収度をマイクロプレートリーダーを用いて計測した。

## 3 )アポトーシスの検出

アポトーシスはTUNEL法（a terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated digoxigenin uridine triphosphate (dUTP) nick-end labeling (TUNEL)）により、メーカーのプロトコルに従って市販のキット（TUNEL Label Mix；Roche Diagnostics, Tokyo Japan）を用いて行った。顕微鏡BZ-8100(KEYENCE, Tokyo, Japan)を用いて（拡大×40-x400）、写真を撮影し、アポトーシス細胞の数は、TUNELに対して陽性の細胞の数を計測した。ひとつの実験に少なくとも3
フィールド計測を行った。

## 4 ) 細胞浸潤試驗

TCL1細胞の浸潤能は、ボイデンチェンバー（BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ）を用い、メーカーのプロトコルに従って評価した。それぞれの濃度のTCDD暴露の後、無血清培地を用いて懸濁したTCL1の懸濁液0.5ml、 $ 2 \times 10^{5} $ 細胞/ウェルの濃度でボイデンチェンバーの上室に加え、下室は10%胎仔血清を添加したRPMI培地を加え37°Cで24時間培養し、上質側の細胞を綿棒で拭い除去した後に細胞を固定し染色した(Diff-Quick Stain Set, Dade Behring, Inc., Newark, DE)。フィルタをNikon Eclipse TS100 (Nikon, Tokyo, Japan)で鏡検し計測した。

## 5 )細胞スクラッチ試験

24ウエルプレートにTCL1細胞を播種し、単層でコンフルエントになるまで培養した後に200のμLピペットを用いて中央部を掻爬した。6、12時間後に、BZ-8100顕微鏡(KEYENCE, Tokyo, Japan)にて写真を撮影し、視野内の空白部をNIHイメージで計測し定量化した。

## 6 ) Tube-like formation 試驗

Growth factor-reduced Matrigel (BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ)を24ウェルプレートに加え（300μL）、37°Cで1時間重合させた。それぞれの濃度のTCDDと2時間暴露し、無血清培地を用いて懸濁したTCL1の懸濁液0.5ml、2×10^{5}細胞/ウェルの濃度でマトリゲル上に加え、Olympus IX71 microscope (Olympus, Tokyo, Japan)を用いて、経時的に鏡検し撮影した。connected capillary bridge (15)を計測し定量化した。ひとつの実験に少なくとも3フィールドは計測を行った。

## ウェスタンブロット法

7) 細胞を62.5mM Tris-HCl (pH 6.8)，100mM dithiothreitol，2%(w/v) sodium dodecyl sulfate (SDS)，and 10% glycerolを含む溶解バッファで溶解し細胞タンパクを抽出、pre-stained molecular weight marker (BioRad Laboratories, Hercules, CA) と共にSDSゲル電気泳動を行い、イモビロン-P (ミリポア、ベッドフォード、MA) に転写した。immunoblotting system (GE Healthcare Japan, Tokyo, Japan) を用いて解析した。

## （２）TCDDが絨毛幹細胞に与える生物学の影響とエストロゲンの関与についての検討

1) HTR SVneo細胞におけるAhR, ER、ARNTの発現をWestern blotで解析した。

2) HTR SVneo細胞をphenol-red free DMEM+10%chacoal-treated FCSで培養し、 $ 10^{-12}\sim10^{-8} $ Mのestradiol(E2)ならびに $ 10^{-12}\sim10^{-8} $ MのTCDDを培養液中に添加し4日目までの生細胞数を測定した。HTR SVneo細胞にプロモーター領域にエストロゲン反応配列を含むルシフェラーゼベクターを形質導入し、 $ 10^{-12}\sim10^{-8} $ Mのestradiol(E2)ならびに $ 10^{-12}\sim10^{-8} $ MのTCDDを含むphenol-red free DMEM+10%chacoal-treated FCSで培養し、3日目のルシフェラーゼ活性を測定した。

3）絨毛細胞株HTR SVneo細胞をHeochst33342で染色後、FACS Vantageを用いて幹細胞分画を多く含んだSP細胞と分化細胞を多く含む分画のnon-SP細胞を分取し、培養した。

それぞれの細胞からRNAを抽出し、SP細胞で発現が亢進している遺伝子をマイクロアレイでスクリーニングしリアルタイムPCRで同定した。同時にAhRの発現も解析した。

4）E2存在下の条件（DMEM+10%FCS）とE2-低下の条件（phenol-red free DMEM+10%chacoal-treated FCS）でSP細胞とNSP細胞を培養し、TCDD添加による細胞増殖能を解析した。phenol-red free DMEM+10%chacoal-treated FCSで培養したHTR SVneo親細胞にTCDDを添加し、SP細胞出現率を比較した。
(3)AhR発現メカニズムにおけるAhR多型の影響についての検討

## 1 ) 细胞培養

HeLa、TYL-nu、HEC-116そしてHEK293T細胞は10％胎仔血清を加えたDMEM（NACALAI TESQUE, INC., Kyoto, Japan）で培養で37℃、5%CO₂条件で培養した。

## 2 )組織サンプル

全胞状奇胎（CHM）50検体はJSOG分類に従いCHMと診断されたものを用いた。母親由来のものが含まれていない父親由来のものだけで構成されている事を確認する為、17のマイクロサテライト座のジェノタイピングを行い、すべて同一であることを確認し実験に用いた。CHM組織採取にあたり、日本人男性パートナー及び日本人女性ドナー共にインフォームドコンセントの元、同意を得ている。正常子宮内膜は子宫筋腫や子宮内膜症などの理由で子宫摘出を受ける任意の20人より同意を得て採取した。これらは九州大学倫理員会承認の元に行われた研究の一環で採取された検体である。これらの検体よりRNAとゲノムDNAはAllPrep DNA/RNA Mini Kit (Qiagen, Hliden, Germany)を用いて抽出した。

## 3 ) 血液サンプル

血液サンプルは福岡市東区に住む49歳から76歳まで計7132人の中より任意に130検体を選択した。これらのサンプルは九州大学倫理員会承認の元に行われたコホート研究の一環で採取された検体である。遺伝学的研究の為、同意の元健康な正常女性より採取した。

## 4 ) シークエンス解析

CHM検体を用いてヒトAhR転写開始点（TSS）より上流740bpをPCRし、EXO-SAP後ABI PRISM BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems, California, USA）を用いてシークエンスを行った。

## 5 ) 一過性トランスフェクション及びルシフェラーゼ解析

ヒト AHR-TSS より -2376 bp, -1417 bp, -452 bp and -122 bp 上流を PCR し、pGL-2 Luciferase basic vector に組み込んだ。各 $ 1 \mu g $ ルシフェラーゼレポーターと pcDNA3.1-His-LacZ を HeLa 細胞 ( $ 3 \times 10^{5} $ 細胞数) に Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) を用いてトランスフェクションした。

## 6 ) 蛋白質抽出及びウェスタンブロット

蛋白抽出はice-cold lysis buffer (20 mM Tris-HCl [pH 8.0], 1% TritonX-100, 10% glycerol, 137 mM NaCl, 1.5M MgCl₂, 1 nM EGTA, 50 mM NaF, 1 mM Na₂VO₄, 1mM PMSF, 1 μg/ml leupeptin, 10 μg/ml aprotinin)を用いて抽出した。15μgの蛋白質を10%SDS-PAGEで泳動し、PVDF膜に転写した後5%nonfat dry milkでブロッキングした。一次抗体はNF1 (H-300) (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA), GAPDH (FL-335) (Santa Cruz Biotechnology) and NF1C (abcam, Cambridge, UK)を用いて行った。二次抗体はhorseradish peroxidase-linked anti-rabbit antibodies (Promega Madison, WI.USA) or anti-mouse antibodies (Promega)を用いた。検出にはenhanced chemiluminescence system (Chemi-Lumi One L, Nacalai Tesque)を用いて検出した。

## 7 ) ChIP解析

ChIP解析は報告されている方法で行った（19）。細胞を0.4%ホルムアミドで固定及びクロスリン
クし0.125Mグリシンで中和した。1 μg mouse control IgG and 40 μl Protein A/G agarose beads (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA)でプレクリアし、免疫沈降に用いる抗体は2 μg of anti-NF1C (abcam, ab89516) or Histone H3 (Millipore, Billeria, MA, USA)抗体を用いた。その後洗浄プロテインK処理後、PCRを行う。プライマーは

follows: pAHR-NBS forward, 5' -GTCCTACGTCATCACGTGCC-3';

pAHR-NBS reverse, 5' -TCCTGCTTGCCCCCGCCCAT-3;

pAHR-unrelated forward, 5' -AACTGAAAGGTGGCTTACTG-3';

pAHR-unrelated reverse, 5' -CAAGGAAGTAGATGGACATC-3' を用いた。

## 4 ．結果及び考察

(1) TCDD が ヒトEVT に 与 える 生物学 的 影響 につ いて の 検 討

1) HTR-8/SV40, TCL1 細 胞 に お け る AhR 発 現

A)

B)

C)

図(3)-1 -1 : TCDDがヒト絨毛細胞株増殖能に与える影響

HTR-8/SV40とTCL1細胞が機能的なTCDD受容体を発現しているかどうかを確認するために、AhRと
CYP1A1（図(3)-1）-1A）についてウェスタンブロット法を行った。両方の細胞とも、AhRタンパク質を発現していた。さらに1nMのTCDDを加えて培養したところ、CYP1Aタンパク質がAhRとともに誘導された。

## 2 ）TCDDは、HTR-8/SV40およびTCL1細胞の細胞増殖、アポトーシスに影響を及ぼさない

TCDDのEVTの細胞増殖に対する効果を調べるために、細胞増殖曲線を計測した。0.1、1、10nMのTCDD存在、非存在下にTCL、HTR細胞（図(3)-1)-1B）の細胞数を24、48時間後に計測した。0、0.1、1、10nmのTCDDによるインキュベーションの後の相対細胞数はHTR-8/SV40細胞では、24時間では2.17±0.19、2.25±0.38、2.14±0.11または2.20±0.11で、48時間では、3.55±0.41、3.85±0.23、3.80±0.15、4.14±0.26細胞であった。（図(3)-1)-1A左）。TCL細胞では0、0.1、1、10nmのTCDDによるインキュベーションの後の相対細胞数は、24時間では1.76±0.15、1.68±0.21、1.73±0.09または1.79±0.11、48時間では、2.88±0.33、3.23±0.30、3.09±0.12、3.36±0.26であった。（図(3)-1)-1B）

WST細胞増殖試験では、TCL1細胞（図(3)-1）-1C）の0.1、1、10nmのTCDD24時間暴露後の吸光度値は、対照に比し、1.08±0.01、1.08±0.02倍、HTR細胞では同じく1.47±0.13と0.98±0.08倍であった。TUNEL法を用いて評価した0、0.1、1または10nMのTCDD24時間暴露後の、TCL1とHTR-8/SV40細胞のアポトーシス細胞の割合はTCDDの濃度で差はなかった

## 3 ）TCDDは、HTR-8/SV40、TCL1細胞の浸潤、運動能に影響を与えない

TCDDのTCL1とHTR-Neoの細胞浸潤能に対する効果を調べるために、ボイデンチェンバー法を行った。0.1、1または10nmのTCDDで24時間培養後の浸潤細胞数はHTR細胞では、40.7±4.0, 42.0±6.1, 39.7±8.5, or 42.0±4.6、TCL1細胞では、48.7±5.5, 46.7±6.1, 48.7±4.5, or 47.3±6.5であった。

次いでスクラッチ法でHTR-8/SV40とTCL1細胞の運動能へのTCDDの影響を評価した。0、0.1、1または10nMのTCDD12時間暴露後の相対的な無細胞領域の広さはHTR細胞（図(3)-1)-2）では0.11±0.08,0.13±0.10,0.18±0.07 and 0.16±0.02倍、TCL細胞では（図(3)-1)-2）と0.08±0.06,0.17±0.09,0.10±0.02 and 0.12±0.07倍でTCDD暴露による用量依存的な影響は見られなかった。
A)

図(3)-1)-2: TCDDがヒト絨毛細胞株浸潤能に与える影響

4）TCDDは、TCL1でチューブ-構造活動に影響を及ぼさない

マトリゲル上でTCL1細胞は血管内皮細胞に特異的な形質であるTube-like formationを呈する（図(3)-1）-3）。0.11、10nMのTCDD存在、非存在下に8時間培養したTCL1細胞におけるcapillary networks（矢印）の数は、14.7±2.5、14.0±4.6、15.7±3.5または14.3±3.1であった。

5）TCDDは、EVT分化に関連したタンパク質の表現度に影響を及ぼさない

次いで、TCDDがTCL1細胞の分化と関連していることが知られているHIF1A、VEGF、ITGA1、A6、AVB3のタンパク発現に与える影響を調べるためにウェスタンブロット解析を行った。0.11または10nMのTCDDへの24または48時間暴露では、タンパク発現には差はみられなかった（図(3)-1）-4）
A)

B)

図 $ (3)-1 $ -3

図(3)-1)-4:TCDDがヒト絨毛細胞株分化関連マーカー発現に与える影響
(2) TCDD が ヒトEVT に 与 える 生物学 的 影響 へ の エ スト ロ ゲ ン の 関 与 につ いて の 検 討

1) エ スト ロ ゲ ン 、 TCDD の 絨 毛 細 胞 増 殖 能 へ の 影 響

HTR SVneo細胞におけるAhR, ER, ARNTの発現をWestern blotで確認した（図(3)-2)-1）。10^{-12}～10^{-8} Mのestradiol(E2)添加は無添加群にくらべ、HTR SVneo細胞の増殖能に変化はなかった。TCDD添加は10^{-10}～10^{-8} Mでは細胞増殖に変化はなかったが、10^{-8} Mの高濃度では抑制した（図(3)-2)-2）。

図 $ (3)-2 $ -1

E2

図(3)-2-2:エストロゲン、TCDDの絨毛細胞増殖能への影響
2) エストロゲン、TCDDの絨毛細胞におけるエストロゲンレセプター転写能への影響

10^{-8} Mのestradiol(E2)添加と10^{-10} MのTCDD添加群は無添加群に比べ有意にHTR SVneo細胞におけるエストロゲンレセプター転写能を亢進させた（図(3)-2）-3）。

## Luciferase assay

E2

TCDD

図(3)-2)-3:エストロゲン、TCDDの絨毛細胞におけるエストロゲンレセプター転写能への影響

## 3 ）絨毛SP細胞の分離

DMEM with 10% serumで培養したHTRSVneo細胞を解析したところ、SP細胞をみとめた(図(3)-2)-4)。このSP分画はVerapamil処理で消失した。今回分離したHTR SVneo-SP細胞とNSP細胞を用いてマイクロアレイ解析を施行したところ、SP細胞においてNSP細胞に比べ代表的なstemness geneであるALDH3とSOX2の発現亢進がみとめられたことよりSP細胞は幹細胞を多く含む分画であることが示された。

これらの遺伝子の発現をリアルタイム P C R で確認したところ、ALDH3は58倍、SOX2は2.24倍の発現亢進をみとめた（図(3)-2）-4）。

## 4 ）絨毛SP細胞におけるAhRの発現増加とシグナル解析

マイクロアレイ解析ではAhRも発現がNSP細胞に比べSP細胞で亢進しており、同様にリアルタイムPCRで確認したところ約2倍の発現亢進がみとめられた（図(3)-2）-5）。
## HTR SV neo細胞におけるSP細胞の存在

Verapamil

図(3)-2)-4)：絨毛SP細胞の分離

(DMEM with 10% serum培养条件下)
AhR

図(3)-2)-5：絨毛SP細胞におけるAhRの発現

## 5 ）TCDDの絨毛SP細胞とNSP細胞増殖能に対する効果

DMEM with 10% serum培養条件下では、TCDD添加により、SP細胞は増殖が抑制、NSP細胞は増殖が促進される傾向がみられたが、有意差は出なかった（図(3)-2）-6）。DMEM phenolred free with 10% chacoal treated serum(E2低下条件の培地)培養条下でも同様に、TCDD添加により、SP細胞は増殖が抑制、NSP細胞は増殖が促進され $ 10^{-9} $ Mでは有意差がみられた（図(3)-2）-7）。

図(3)-2 -6 : TCDDの絨毛SP細胞とNSP細胞増殖能に対する効果1
図(3)-2 -7 : TCDDの絨毛SP細胞とNSP細胞増殖能に対する効果2

## 6 ）TCDDのSP細胞出現率への影響

DMEM phenolred free with 10% chacoal treated serum条件下で培養したHTRSVneo親細胞を用いて、SP細胞の比率を解析したところ、 $ 10^{-9} $ M TCDDはHTRSVneo親細胞のSP細胞の出現率を低下させた（図(3)-2）-8）。

図(3)-2 -8 : TCDDのSP細胞出現率への影響
(3)AhR発現メカニズムにおけるAHR多型の影響についての検討

1）ヒトAhRプロモータの同定

ヒトAhRのプロモータを決定する為、AhR上流-1から-2376bpまでの各コンストラクト（pAhR-2376, pAhR-1417, pAhR-452とpAhR-122）をルシフェラーゼベクターに組み込み、HeLa細胞を用いてルシフェラーゼレポーター解析を行った。pAhR-2376からpAhR-452のレポーター活性は類似していた。それに対してpAhR-122ではより低い活性を示した。しかし、その活性もプロモータを含まないコントロールレポーターに比べて1000倍も高い活性を示した。（図(3)-3）-1）

B

図(3)-3-1: ヒトAhRプロモータの同定

## 2 ）ヒトAhRプロモータ上のSNPの探索

Fig1AでヒトAhRプロモータ領域を決定したので、我々は日本人集団の中でこの領域のSNPsを調べた。50人の日本人全胞状奇胎（CHM）検体と健常女性130人の血液検体を用いた。AhR上流-1から-452bpまでの間でNCBIのdbSNPで報告されているSNPsは9個あり、50人のCHM検体の中で、そのうちSNP rs10249788（-130，C>T）とrs71010234（-59，ggggcggggc，also described as 2×ggggc）が見つかった（表(3)-3）-1）。

SNP rs10249788 (-130, C>T) は C:T=76.0%:24.0% の頻度で、SNP rs71010234 はほとんどが 3×ggggc（54.0%）、2×ggggc（42.0%）であった。これら 2 つの SNPs は TSS から -130 と -59bp に位置していた。

ハプロタイプとは同一染色体上で統計学的に遺伝的に連鎖している多型の組み合わせの事を示す。ある一定の範囲について少数の対立遺伝子を同定する事により他の多型座位を決める事が出来、これらの情報により癌などの疾病の遺伝的要因を調べるのに有用である。そこでハプロタイプを決めるため、SNP rs10249788とrs71010234のコンビネーションパターンを調べた。94％が3つ
のパターンに分けられた；(C, 2×ggggc; T, 2×ggggc; C, 3×ggggc)（表(3)-3）-2）。

表(3)-3)-1) CHMにおけるAhR上流部位のSNP遺伝子型

SNP局在	遺伝子型	n	割合(%)
-59	rs71010234	1×ggggc	1	2.0
2×ggggc	21	42.0
3×ggggc	26	54.0
4×ggggc	1	2.0
5×ggggc	1	2.0
-67	rs72152648	ggcggggcg	0	0
-	50	100
-72	rs72286154	gggcggggcggggcg	0	0
-	50	100
-130	rs10249788	C	38	76.0
T	12	24.0
-188	rs71010233	G	0	0
-	50	100
-195	rs41446044	G	50	100
C	0	0
-196	rs11330131	G	0	0
-	50	100
-222	rs41351350	G	50	100
A	0	0
-268	rs74739585	T	48	96.0
C	2	4.0

表(3)-3)-2. CHM由来AHRプロモータにおけるSNPsのコンビネーション

rs10249788	rs71010234	n	ratio (%)
C	3×ggggc	26	52.0
T	2×ggggc	12	24.0
C	2×ggggc	9	18.0
C	1×ggggc	1	2.0
C	4×ggggc	1	2.0
C	5×ggggc	1	2.0
AHR転写上のこれらの多型パターンの評価を行うため、この3つのパターンを含むルシフェラーゼレポーターを作成し、プロモータ活性の比較を行った。C, 2×ggggcとC, 3×ggggcの間ではプロモータ活性に違いは見られなかったが、C, 2×ggggcに比べてT, 2×ggggcでは1.75±0.37倍高いAHRプロモータ活性が認められた（図(3)-3）-1B:**, p<0.01）。このデータはSNP rs10249788の多型で活性が変化している事が示唆された。次に130人の健常人血液検体を用いてCHM検体と同様のSNPs解析を行った。SNP rs10249788の遺伝子型頻度を表(3)-3)-3に示した。この値はHardy-Weinberg equilibriumに一致している(p=0.751)。SNP rs10249788のCとTアレルの頻度は67.3%と32.7%であった。CHM検体及び血液検体でCアレルがドミナントであり、統計学的有意差は認められなかった（表(3)-3）-1, 3:p=0.478）。

表(3)-3-3. 血液サンプル由来の rs10249788 遺伝子型頻度

Samples group (n)	C/C	C/T	T/T
Healthy women (130)	57 (43.9 %)	61 (46.9 %)	12 (9.2 %)
HEC (107)	49 (46.2 %)	44 (41.5 %)	13 (12.3 %)
Early stages (87)	41 (47.1 %)	39 (44.8 %)	7 (8.1 %)
Advanced stages (20)	8 (40.0 %)	6 (30.0 %)	6 (30.0 %)

## 4 ）SNP rs10249788はAHRプロモータ活性に影響した

遺伝子制御部位上のSNPsは転写因子のDNA結合部位を欠失させるあるいは生じることにより転写に影響する事が報告されている。我々はSNP rs10249788により影響を受ける転写因子の探索をデータベースALIBABA2.1を用いて行った。これより我々はSNP rs10249788により影響を受ける転写因子結合部位としてNF1結合部位に注目した。NF1は以下の下線部で構成されるパリンドロームに結合する：5' -TTGG(C/A)(N) $ _{5} $ (G/T)CCAA-3 $ ^{20,21} $ 。AhRプロモータ上の候補となるNF1結合部位は5' -A(C/T)GGAATGGAATCCAG-3であり、標準のコンセンサス配列とは一部異なるが、p53制御部位上のNF1C結合部位に類似していた $ ^{22} $ 。NF1CはNF1ファミリーに属し、腫瘍サプレッサーとして働くことが知られている $ ^{22,23} $ 。

## 5 ）SNP rs10249788はAHRプロモータへのNF1C結合に影響した

NF1が特異的にSNP rs10249788に結合するか否かを調べるため、SNP rs10249788部位のC/CまたはT/Tを持つ細胞株HeLa細胞とTYK-nu細胞株におけるNF1の蛋白質発現をウェスタンブロット法で調べた。両細胞は同等量のNF1蛋白質を発現した（図(3)-3）-2A, B）。クロマチン免疫沈降（ChIP）解析はSNP rs10249788のCまたはTにおけるNF1の結合、特にNF1Cの結合力を評価する為に抗NF1C抗体を用いて両細胞間で行った。HeLa細胞及びTYK-nu細胞共にSNP rs10249788を含む部位でNF1Cの結合が認められた（図(3)-3）-2C, D）。リアルタイムPCRによりHeLa細胞（C/C）ではTYK-nu細胞
(T/T) に比べ1.47±0.77倍強く AHR制御部位と NF1C間の結合が認められた（図(3)-3）-2D:*,p<0.05）。次にSNP rs10249788部位にC/Tアレルを持つHec116細胞株を用いて実験を行った。Hec116細胞はNF1Cの発現が弱いことから、Flagタグを付けた全長NF1Cが組み込まれた発現ベクターを用いてHec116細胞に遺伝子導入を行った（図(3)-3）-2E）。その細胞溶解物は抗NF1C抗体で免疫沈降し、沈澱してきたDNAを増幅しサブクローニングした後、SNP rs10249788を含む部位のシークエンス解析を行った。各20コロニーを各5回の独立した実験でそれぞれ任意に選択し解析した結果、SNP rs10249788の塩基配列は17.4±4.4コロニーがC、3.2±1.1コロニーがTであった（Fig.(3)-3）-2F）。このデータはNF1Cが結合の為にTよりCを選択する事を裏付けた。

A

Cell lines	rs10249788
HeLa	C/C
TYK-nu	T/T
Hec116	C/T

B

C

E

F

図(3)-3-2:SNP rs10249788のAHRプロモータへのNF1C結合に対する影響
## 考察

TCDDは直接のみならず、胎盤の形成障害や、内分泌機能への間接的な影響など、様々なメカニズムによって胎児の発育に影響を及ぼしていると考えられる。暴露期間によっても、TCDDは影響を生じるかもしれないが、少なくとも、今回の我々の研究では短期TCDD暴露は、EVTの細胞増殖や浸潤、分化機能に対して影響がなかった

TCDDが絨毛細胞機能に与える影響についての研究は少なく、未だ結論はでていない $ ^{41-44} $ 。JAR細胞ではTCDDは用量依存的にアポトーシスを誘導する。一方絨毛がん由来のJEG-3細胞ではTCDD、PCDD/PCDFのいずれもDNA損傷やアポトーシスを起こさないと報告されている。加えて、絨毛の一次培養では、妊娠時期によってもTCDDの影響は異なるとの報告もある。しかしながらアポトーシスを誘導するTCDD濃度には報告により大きな際があることも加味すれば、TCDD暴露で起こる初期流産は内分泌環境の破綻による胎盤機能不全と胚への循環不全とによっておこる可能性があると考えられる。

今回の研究において、ヒトへの暴露濃度としては比較的高濃度である0.1-10nmのTCDD $ ^{41-45)} $ は、EVT由来培養細胞の増殖や、機能的分化またはタンパク質発現に影響を及ぼさなかった。これは油症研究におけるダイオキシン暴露妊婦の追跡調査において、胎児の発育制限と流産が増加していた一方、絨毛細胞障害によって発症が増加する妊娠高血压症候群 $ ^{45-47)} $ の発生率が変化していなかったことと合致する所見であった。

ラットにおいてはTCDDとHxDDDは、insulin-like growth factor I（IGF-I）のシグナル伝達阻害により胎仔の成長が妨げられることがしられている $ ^{48} $ 。TCDDとPCDD/PCDF暴露は、同様にトロフォブラスト由来細胞であるJEG-3細胞のhCG分泌を阻害することが報告されている $ ^{41} $ 。今回の結果は、胎児の発育に対するTCDDの影響は絨毛細胞の機能障害ではなく、内分泌機能など、他の経路を介する可能性を指示するものと考えられる。

HTR-Svneo細胞にはSP細胞が存在し、複数のstemnessに関与する遺伝子群の発現亢進がみとめられること、ダイオキシンレセプターAhRのmRNAはNSP細胞に比べ、SP細胞で発現が増加していること、TCDDは濃度依存性にSP細胞に対して増殖抑制、NSP細胞に対しては増殖促進効果を持つ傾向があり、特にE2非存在下でその効果は優位であること、TCDDはSP細胞（特にpure stem cells）を減少させることを示した。以上より、TCDDは絨毛幹細胞の増殖・維持には抑制的に作用することが示唆された。最近、乳癌幹細胞の増殖がAhR agonistにより抑制されること、AhR antagonistがヒト血液幹細胞の増殖を抑制すること $ ^{49} $ 、AhRの活性化はMCF細胞において、乳癌幹細胞の特性のひとつであるmammosphereの形成を抑制すること $ ^{50} $ などが報告されている。また、我々の結果では、分化細胞であるNSP細胞の増殖は促進していた。白血病幹細胞においても、AhRの活性化がレチノイン酸で誘導される分化を促進するという報告があり $ ^{51} $ 、分化細胞に対しては、促進的に作用する可能性がある。

ダイオキシン類を含む生体異物化合物による暴露は動物やヒトヘ様々な毒性及び発癌性応答をもたらす。AhRは標的遺伝子を活性化する為、暴露により結合したダイオキシン類により活性化され核内へと移行すると考えられている。転写を活性化する従来の機能に加え、AhR細胞増殖、分化、細胞周期停止やアポトーシスにも関与する $ ^{24} $ 。本課題ではヒトAhRのプロモータ領域SNPsによるAhR転写制御への影響を明らかにする事を目的とした。

我々はAhR-TSS上流-452bp間のプロモータ上にSNP rs71010234（2×ggggc）とrs10249788（C>T）
をみつけ、rs71010234はAhRの転写活性を制御する特徴なSNPではない事を明らかにした。しかしSNP rs10249788ではCに比べTで高いAhRプロモータ活性を示す事が明らかとなった。この活性の違う理由には転写因子が結合することが予想され、結果としてSNP rs10249788部位に1つのNF1結合部位を見出した。癌細胞におけるAhR転写制御の研究に繋げるため、我々はNF1Cに注目した。NF1Cは腫瘍サプレッサーとして知られているNF1ファミリーの転写因子である $ ^{41,42} $ 。AhRプロモータ上のNF1結合部位はp53制御部位上のNF1C結合部位と類似していた $ ^{41} $ 。また、すでに報告されているAhRプロモータの特徴として、基本的なTATA-boxを欠損し、転写因子Sp1の結合部位を含むGC-boxが存在する事が分かっている $ ^{52} $ 。AhRプロモータ上のSp1の結合はAhRの発現を上昇させる事が報告されている $ ^{53} $ 。一方、NF1ファミリーメンバーのNF1XはSp1と相互作用し、プロモータのSp1結合を拮抗する事でPDGF-Aの転写を抑制することが報告されている $ ^{54} $ 。AhRプロモータ上のNF1結合部位の隣接部にもGC-boxが存在する。これらの背景よりNF1CはAhRプロモータ上のSp1の結合を拮抗する事によってAhRの転写を抑制すると考えられる。SNP rs10249788部位への結合はTアレルに比べCアレルで強く結合する事も明らかとなった。これらのことからAhRプロモータ上のSNP rs10249788によりAhRの転写が制御されている可能性が考えられる。

## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

EVT由来細胞株を用いた検討では、その増殖、浸潤は、一般的な血中濃度を大きく超える濃度のTCDD曝露でも明らかな変化をしめさなかった。一方、TCDDのレセプターであるAhRのプロモーター領域について、胞状奇胎検体を用いて検討したところ、4種類の一塩基変異がみられること、そのうちの1種類は転写活性が高いことがわかった。これらの結果から、TCDDのヒト絨毛細胞への影響は単純な毒性ではなく、他の液性因子の効果を修飾するような作用を示しているような可能性、あるいは個々の個体での、レセプター発現やSNPsによる差が表現型の発現に大きく影響する可能性を示唆するものと考えられた。

## （２）環境政策への貢献

SNPsと個体におけるTCDDの感受性の関連について明らかとなれば、TCDDの影響を受けやすい高感受性の個体への暴露防止策などあらたな対策がとれるものと思われる。

## 6 ．国際共同研究等の状況

特に記載すべき事項はない

### 7. 研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

<論文（査読あり）>

Fukushima K, Tsukimori K, Li D, Takao T, Morokuma S, Kato K, Seki H, Takeda S, Matsumura S, Wake N. Hum Exp Toxicol, (2012)

“Effect of transient TCDD exposure on immortalized human trophoblast-derived cell lines.”
くその他誌上発表（査読なし）>

特に記載すべき事項はない

## （2） 口頭発表（学会等）

特に記載すべき事項はない

## （3） 出願特許

特に記載すべき事項はない

## （４）シンポジウム、セミナーの開催（主催のもの）

特に記載すべき事項はない

## （５）マスコミ等への公表・報道等

特に記載すべき事項はない

### 8 \. 引用文献

1. Hertz-Picciotto I, Charles MJ, James RA, Keller JA, Willman E, Teplin S. Epidemiology 16, 648-656 (2005)

“In utero polychlorinated biphenyl exposures in relation to fetal and early childhood growth”

2. Konishi K, Sasaki S, Kato S, Ban S, Washino N, Kajiwara J Environ Res 109, 906–913 (2009) "Prenatal exposure to PCDDs/PCDFs and dioxin-like PCBs in relation to birth weight"

3. Sagiv SK, Tolbert PE, Altshul LM, Korrick SA: Epidemiology 18, 120–129 (2007)

5. Weindrich D, Jennen-Steinmetz C, Laucht M, Schmidt MH. Dev Med Child Neurol 45, 463-469 (2003)

“Late sequelae of low birthweight: mediators of poor school performance at 11 years”

6. Law CM, Shiell AW, Newsome CA, Syddall HE, Shinebourne EA, Fayers PM: Circulation 105, 1088-1092 (2003)

“Fetal, infant, and childhood growth and adult blood pressure: a longitudinal study from birth to 22 years of age”

7. Barker DJ.: Trends Endocrinol Metab 13, 364–368 (2002)