Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
# （２）核DNA、シーケンスによる環境DNA手法の確立

神戸大学 源利文

平成25～27年度累計予算額：5,014千円（うち平成27年度：1,014千円）

予算額は、間接経費を含む。

[要旨]

大型生物の環境DNA分析はその手法が初めて報告されてからまだ10年も経ていない新しい技術であるが、めざましい進歩を遂げている。本研究では、これまでミトコンドリアDNAに限定されていた遺伝子マーカーを核DNAに拡げることを試みた。モデルとしてコイを用い、組織等に由来する細胞あたりコピー数の比較を行ったところ、脳、エラ、腸内容物に由来するコイのDNAサンプルいずれにおいても、核rDNAのITS1領域のコピー数がミトコンドリアチトクロームb（CytB）領域のコピー数よりも約20-100倍多いことが明らかになった。その結果と対応するように、環境DNAサンプルにおいてもITS1領域がCytB領域よりも100倍以上多く、環境DNA分析の検出感度の向上に利用可能であることが示された。同時に行ったITS領域のシーケンス情報の取得においては、13魚種についてITS1領域の塩基配列の全部または一部を、12魚種についてITS2領域の塩基配列の全部または一部の配列を得ることができた。また、野外での実践例の少ない環境DNA分析手法の応用可能性を確認するため、野外での環境DNA検出調査も行った。その結果、兵庫県下において30箇所の生息地が知られるのみであったカワバタモロコの生息地を新たに6箇所発見することに成功し、環境DNA分析によって希少種の新規生息地を探索することが可能であることが示された。環境省レッドリストで絶滅危惧Ⅱ類（VU）に指定されているオオサンショウウオを対象とした河川における調査では、桂川水系全域（約1,000km²）におけるオオサンショウウオの分布域を、合計8日間の野外調査で推定することに成功し、調査が困難な希少種の分布域を迅速に把握することができることが明らかになった。また、マルチプレックスPCR法による多種の同時検出にも成功し、調査の一層のコストダウンが可能であるであろうことが示された。これらの成果は広域における希少種や外来種の分布を、これまでの捕獲をともなう調査より低コストで明らかにする手法として有用であり、種々の対象に対して応用が可能である。

[キーワード]

環境DNA、生物モニタリング、魚類、生物量、ため池、河川

### 1. はじめに

生物種の保護・管理をする上で最も基本的な情報として、生物の生息分布や個体数、生物量を知るための新たな手法として、環境DNAによる生物分布モニタリング手法が用いられ始めている。大型生物を対象とした環境DNA手法は近年急速に発展してきたが、いずれの研究もミトコンドリアDNAをターゲットとしている。ミトコンドリアDNAはコピー数が多いために検出上の利点があるが、一方で母系遺伝であることや、種内変異レベルの解像度を有していないことなどの欠点がある。
このため、交雑種の判定や種内の集団遺伝学的な解析には用いることができず、ミトコンドリアDNAを対象としなければならないということが、環境DNA手法を発展させる上でのひとつの束縛となっている。そのため、核DNAを対象とした検出法の開発が必要である。また、環境DNA手法は未だ発展途上であり、野外への適用例が十分ではなく、河川、ため池などの野外水域において希少種の保全に資することを示すための実践的研究も求められている。さらに、これまでの環境DNA手法は一度の解析で一種のデータを得られるにとどまっており、複数種を対象にするためには種の数だけ実験を繰り返す必要があった。生物分布の調査をより簡便にするためには、複数種の同時検出系が必要である。そこで、本研究においては以下の5項目を実施した。

### 2 −1. コイを対象とした核DNAの検出および定量

2−2. 核DNAのシーケンス情報の収集

2−3．環境DNA手法を利用した希少魚種カワバタモロコの検出法の開発および新規生息地の探索

2−4．環境DNA手法を利用したオオサンショウウオ属在来種および外来種の同時検出法の開発および野外適用

2−5. マルチプレックスPCRを用いた野外のため池における在来種と外来種の分布域マピング

## 2 ．研究開発目的

### 2 −1. コイを対象とした核DNAの検出および定量

これまでの大型生物の環境DNA分析ではミトコンドリアDNAが用いられ、核DNAをマーカーとした研究例はほとんどない。ミトコンドリアDNAはコピー数が多いために検出上有利だが、一方で母系遺伝であることや、種内変異レベルの解像度を有していないことなどの欠点がある。また、ミトコンドリアは生物の生理状態などによってその細胞あたりの数が変化することが知られており、環境DNAの量からバイオマスを推定する場合に推定精度に影響する可能性がある。そこで、これまでに環境DNA検出の研究が進んでいるコイ（Cyprinus carpio）をモデルとし、環境DNAサンプルから核DNAを検出・定量する系を開発し、ミトコンドリアをマーカーとした場合と比較することを目的とした。

### 2 -2. 核DNAのシーケンス情報の収集

魚類に関して、核DNAのシーケンス情報はこれまで積極的に収集されてこなかった。特に、本研究で対象とした核rDNAのITS領域の情報はシーケンスデータベース上にもほとんど収録されていない。そこで、琵琶湖淀川水系の魚類を中心に、核rDNAのITS領域のデータを収集することを目的とした。

### 2 −3. 環境DNA手法を利用した希少魚種カワバタモロコの検出法の開発および新規生息地の探索

環境DNA手法は希少種などの探索に有用であると考えられてきたが、実際に野外で希少種の探索に用いられた例はなく、実践例が必要であった。本項目では、環境省レッドリストの絶滅危惧IB類に指定されるコイ科のカワバタモロコ（Hemigrammocypris rasborella）を対象として、野外での分布調査および新規生息地の探索を目的とした。
### 2 -4. 環境DNA手法を利用したオオサンショウウオ属在来種および外来種の同時検出法の開発および野外適用

上述の2-3と同様に、河川における希少種探索の実践例を示すことを目的として、環境省レッドリストで絶滅危惧Ⅱ類（VU）に指定されているオオサンショウウオ（Andrias japonicus）およびそれに近縁な外来種であるチュウゴクオオサンショウウオ（Andrias davidianus）の分布域を明らかにすることを目的とした。

### 2 −5. マルチプレックスPCRを用いた野外のため池における在来種と外来種の分布域マッピング

これまでの環境DNA手法では、主に一回の実験で一種の検出にとどまっていた。複数種を探索する場合には複数回のPCR実験を繰り返す必要があり、手間とコストが必要となる。そこで、複数種の検出をより簡便に低コストで行う手法として、マルチプレックスPCRを用いた複数種の同時検出系の開発を行い、野外のため池における在来種および外来種の分布域調査を実践することを目的とした。

### 3. 研究開発方法

### 2 −1. コイを対象とした核DNAの検出および定量

本項目では、コイを対象として、核DNAを環境DNA手法のマーカーとした検出および定量手法の開発を行った。核DNAのマーカーとしては、核rDNAのITS領域を検出対象の遺伝子とした。rDNAは核内の遺伝子としては例外的に多コピーあるため、検出上の利点があると考えたからである。水槽、野外メソコズム、野外実験池、自然湖沼で採取した環境DNAサンプルを用いて核DNAのコピー数をリアルタイムPCR法によって測定し、ミトコンドリアDNAのコピー数と比較した。また、コイの組織サンプルに由来するDNA（脳組織およびエラの抽出DNAと、環境DNAの供給源として重要と目される腸内容物から抽出したDNA）を対象として、核DNAとミトコンドリアDNAのコピー数を比較した。検出にはコイのITS1領域を特異的に検出するプライマー及びプローブを用い、リアルタイムPCR法によって、それぞれのマーカーのDNAコピー数を測定した。また、核DNAを用いた場合とミトコンドリアDNAを用いた場合のバイオマス推定精度を比較した。

### 2 −2. 核DNAのシーケンス情報の収集

項目2-1の結果から、核rDNAをマーカーとした場合に検出感度が高まることが明らかになったため、その適用対象種を拡大するためにシークエンスデータの整備を行った。琵琶湖淀川水系に生息する在来及び外来の魚種の中から、コイ科の6種とナマズ科の3種に加え、アメリカナマズ科、ドジョウ科、ギギ科、タイワンドジョウ科、カダヤシ科、トゲウオ科、サンフィッシュ科、サケ科、アカザ科からそれぞれ1種を選び、ITS1領域およびITS2領域のシーケンス解析を試みた。また、オオサンショウウオのITS1領域のマスシーケンス解析も行った。

2−3．環境DNA手法を利用した希少魚種カワバタモロコの検出法の開発および新規生息地の探索カワバタモロコの在・不在を調査するためには、種特異的な検出系を作成する必要がある。本
研究ではTaqManプローブ法を用いたリアルタイムPCRによる検出系の確立を行った。カワバタモロコと近縁な種と塩基配列を比べるため、コイ目コイ科に属する近縁種5種のミトコンドリアのチトクロームb（CytB）遺伝子の情報を遺伝子データベースから得た。プライマーおよびプローブはPrimer Express 3.0（Life Technologies社）を用いて、プライマーの3'末端側の5塩基以内の種特異的な塩基数が多くなるようにプライマーを設計した。

設計したカワバタモロコの検出系が正確に機能するかどうかを確認するため、既にカワバタモロコの在・不在が明らかな兵庫県神戸市北区および西区のため池11箇所で、2014年1月に採水調査を行った。ため池の表層水を約2L採水し、ガラスフィルターを用いて吸引濾過をした。ろ過フィルターからDNAを抽出し、設計したリアルタイムPCRによる検出系を用いてカワバタモロコのDNAの有無を確認した。

最後に、2013年10月から2014年1月にかけて、兵庫県下の82箇所のため池で採水調査を行った。採水方法とその後の濾過法、DNA抽出法、リアルタイムPCRによるカワバタモロコの検出法は上述の通りである。

### 2 -4. 環境DNA手法を利用したオオサンショウウオ属在来種および外来種の同時検出法の開発および野外適用

オオサンショウウオおよびチュウゴクオオサンショウウオのミトコンドリアNADH1遺伝子をそれぞれ特異的に検出するプライマー／プローブセットを開発した。それぞれの検出系の特異性を、脱皮殻に由来するDNAおよび京都水族館の飼育水に由来するDNAを用いて確認した。

京都府の桂川水系全域から、2012年9月、12月、2013年3月、6月の4回にわたり4リットルのサンプル水を採取した。採水は、在来種と外来種の交雑が報告されている鴨川流域を含む、京都府の桂川水系37地点で行った。水サンプルからろ過、DNA抽出を行い、リアルタイムPCRによってそれぞれの種の遺伝子の検出実験を行った。

### 2 −5. マルチプレックスPCRを用いた野外のため池における在来種と外来種の分布域マッピング

兵庫県のため池における在来種の代表的なものとして、カワバタモロコ、ミナミメダカ（Oryzias latipes）、ドジョウ（Misgurnus anguillicaudatus）の3種について、マルチプレックスPCRによる同時検出系を作成した。また、国内で在来魚の生息を脅かすサンフィッシュ科の外来魚3種（ブルーギル[Lepomis macrochirus]、オオクチバス[Micropterus salmoides]、コクチバス[Micropterus dolomieu]）について、同様にマルチプレックス検出系を作成した。

兵庫県下のため池合計101地点で177の水サンプルを得た。うち82地点の82サンプルは2-3で述べたサンプルと同一である。これらの水サンプルから環境DNAを抽出し、在来魚および外来魚を対象としたマルチプレックスPCRによって6種の在／不在を明らかにした。

## 4 ．結果及び考察

### 2 −1. コイを対象とした核DNAの検出および定量

環境DNA手法における核DNAマーカー使用の可能性を検討した結果、野外メソコズム実験では核
DNAの分子数がミトコンドリアDNAの分子数に対して160倍程度多く検出された。野外実験池と自然湖沼においては核DNAの分子数がミトコンドリアDNAに比べてそれぞれ300倍、150倍程度多く検出された（図(2)-1）。この結果から、核DNAを環境DNAマーカーとして利用することが可能であることが示され、その感度はミトコンドリアDNAをマーカーとした場合に比べて10倍から100倍程度高いことが示唆された。

(A)

(B)

(C)

図(2)-1. ミトコンドリアチトクロームB遺伝子（CyB）をマーカーとした場合と、核rDNA ITS1領域（ITS1）をマーカーとした場合の各サンプル中における環境DNAコピー数の関係。それぞれ、(A)野外メソコズム、(B)野外実験池、(C)自然湖沼における結果を示す。どのサンプルにおいてもCyBのコピー数とITS1のコピー数は性の相関を示した（実線：タイプII回帰分析、 $ y=156x+3.16\times10^{7} $ 、 $ R^{2}=0.229 $ 、P<0.01[野外メソコズム]； $ y=303x-2.77\times10^{4} $ 、 $ R^{2}=0.977 $ 、P<0.001[野外実験池]； $ y=149x-2.02\times10^{4} $ 、 $ R^{2}=0.972 $ 、P<0.001[自然湖沼]）。点線は
95%信頼区間を示す。

環境DNA手法における核DNAの有用性を確認するためには、核DNAがなぜミトコンドリアDNAより多く検出されるのか、その原因を知る必要がある。そこで、生体内の組織や腸内容物における、チトクロームb遺伝子（CytB）とリボソームRNA遺伝子ITS1領域（ITS1）の細胞あたりコピー数を比較した（図(2)-2）。その結果、ITS1のコピー数は組織間で有意差がない一方で、CytBのコピー数は脳>エラ>腸内容物の順であり、組織間で核DNAのコピー数は変動しないが、ミトコンドリアのコピー数は異なるという知見と整合的であった。また、いずれの組織においてもCytBよりコピー数が多く、脳では約18倍、エラでは約96倍、腸内容物では約76倍であった。環境DNAの放出源として有力な表皮細胞や腸内容物においてITS1が環境水中で観察される150倍程度の量比と近い事から、環境DNAサンプル中にITS1が多く検出される原因は、環境DNAの由来となる体細胞内においてIST1のコピー数が多いことにあると結論できた。

図(2)-2．各組織におけるITS1とCytBの細胞あたりコピー数。いずれの組織においてもITS1がCytBより多かった。また、ITS1は組織間でコピー数に有意な差がなかったが、CytBでは各組織間で有意にコピー数が異なっていた。

最後に、ITS1とCytBのどちらがバイオマス推定精度で優れているのかを比較するために、野外メソコズムおよび野外実験池において行った操作実験で得られたサンプルについて、それぞれのマーカーで推定精度を調べた（図(2)-3）。その結果、どちらの場合も、バイオマスの推定精度はほぼ互角であり、ITS1が有利であるという結果は得られなかった。しかし、上で報告したとおり、検出感度ではITS1が高いため、環境DNAの検出においてもバイオマス推定においてもITS1がマーカーとして有利であると結論できる。
(A)

野外メソコスム

(B)

野外実験池

CytBコピー数(1Lあたり)

ITS1コピー数(1Lあたり)

図(2)-3.（A)野外メソコズムと(B)野外実験池における、CytBとバイオマス、ITS1とバイオマスの関係。どちらの場合も、バイオマスの推定精度はITS1とCytBで同程度であった。

### 2 -2. 核DNAのシーケンス情報の収集

環境DNA手法における新たなマーカーとして期待される核DNAのrDNA領域において、合計18魚種および両生類のオオサンショウウオについてITS1領域とITS2領域のシーケンス解析を試みた。その結果、13魚種についてITS1領域の塩基配列の全部または一部を、12魚種についてITS2領域の塩基配列の全部または一部を得ることができた。これらのシーケンス情報は核DNAを環境DNA解析のマーカーとして用いるための基礎データとなる。それぞれの領域に関して一部の種についてシーケンス解析が不調に終わったが、これは個体内のITS領域におけるシーケンス多型、とくに挿入/欠失を含む多型の存在が原因であると推定された。特に、オオサンショウウオに関しては波形の重なり等によって、通常のサンガー法によるシーケンスではITS領域のシーケンスはまったく読めなかった。

そこで、オオサンショウウオをモデルとして、次世代シーケンサー（MiSeq）を用いたマスシー
ケンシングによって、ITS1領域の個体内多型の情報を得た。1個体に由来するDNAからITS1領域について約2500本のシーケンスを得、類似度の高い（97%以上）シーケンスをクラスタリングした結果、120種類の代表配列を得た。これらの配列の解析の結果、1個体に由来する配列であるにもかかわらず多数の塩基置換や挿入／欠失が存在していた（図(2)-4）。このことから、生物種によってはrDNAに多型が存在するため、環境DNAのマーカーとして用いるには特に挿入／欠失のある部位を避けたプライマー／プローブ設計が重要であることが明らかになった。この解析で得られたシーケンスを元にオオサンショウウオの核DNAの検出系を作成し、野外サンプルに適用する実験を行った結果、既存のミトコンドリアDNAをマーカーとした手法に比べ、野外での検出感度が高かった。

図(2)-4. オオサンショウウオのITS1領域のマスシーケンス解析の結果（一部抜粋）。1個体に由来するシーケンスの中に多数の塩基置換や挿入／欠失が観察された。

### 2 −3. 環境DNA手法を利用した希少魚種カワバタモロコの検出法の開発および新規生息地の探索

カワバタモロコの筋肉に由来するDNAサンプル、およびビオトープの水サンプルに由来する環境DNAサンプルについて、カワバタモロコのDNAの増幅が確認された。

カワバタモロコの在・不在が既知のため池11箇所の水サンプルを解析した結果、分布が確認されている7箇所の池全てからカワバタモロコのDNAを検出し、分布しないと考えられているため池4箇所の水サンプルからはカワバタモロコのDNAは検出されなかった。この結果から、我々の作成した検出系はカワバタモロコの在／不在を正確に判定できるものであることが示唆された。

最後に、兵庫県下のため池82地点で採水を行い、カワバタモロコのDNAを検出する調査を行った結果、7地点のサンプルからカワバタモロコのDNAを検出した。この7地点について、もんどりを用いた捕獲調査を行ったところ、6地点でカワバタモロコが捕獲された。兵庫県下のカワバタモロコ生息地は約30地点といわれており、本調査の結果は環境DNA手法を用いて希少種の生息地を新たに発見することが可能であることを示している。

### 2 -4. 環境DNA手法を利用したオオサンショウウオ属在来種および外来種の同時検出法の開発および野外適用

京都府の桂川水系における在来及び外来オオサンショウウオDNAの検出調査の結果、合計25箇所で在来オオサンショウウオの、9箇所で外来オオサンショウウオ（チュウゴクオオサンショウウオ）のDNAの検出に成功した。両種の検出されたエリアは過去に京都市が行った捕獲調査の結果と良く整合しており、本手法が在来／外来オオサンショウウオに適用可能である事が示された（図(2)-5）。
図(2)-5．桂川水系における在来／外来オオサンショウウオの環境DNA分布と捕獲調査の比較。37地点で調査を行い、25箇所で在来種の、9箇所で外来種のDNAが検出された。河川のバックグラウンドがピンク色で塗られたエリアは京都市の行った捕獲調査によって在来種、外来種および交雑種が生息することが知られているエリアを、青色で塗られたエリアは捕獲調査で在来種のみが生息することが知られているエリアを示す。環境DNA手法による結果は捕獲調査の結果とよく一致した。Fukumoto et al. (2015)のFigure 3を改変¹。

### 2 −5. マルチプレックスPCRを用いた野外のため池における在来種と外来種の分布域マッピング

兵庫県下のため池合計101地点で得た177サンプルについて、外来魚3種（オオクチバス、コクチバス、ブルーギル）と在来魚3種（カワバタモロコ、ミナミメダカ、ドジョウ）の同時検出系でDNA検出を行った。その結果、101地点中23地点でブルーギルのDNAが、33地点でオオクチバスのDNAが、1地点でコクチバスのDNAが、13地点でカワバタモロコのDNAが、24地点でミナミメダカのDNAが、40地点でドジョウのDNAが検出され、それらの結果をもとに分布地図を作成した（図(2)-6）。これらの検出地点から各種についてそれぞれ8-14地点を選択して、実際に生息しているかを捕獲または目視によって確認したところ、75-95%の地点で実際に生息していることが確認され、環境DNAによる外来魚及び在来希少種の生息地検出が有効であることが示された。
図(2)-6. 兵庫県下のため池における外来魚及び在来魚の分布地図。コクチバスは1地点のみで検出されたため、ここにはプロットしていない。野外のため池であっても環境DNA検出によって複数魚種の分布を描くことが可能であることが示された。

## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

本研究で見出された魚類の核DNAを環境サンプルから検出することが可能であることや、核rDNAのITS1領域のコピー数がミトコンドリアのCytB領域のコピー数よりも100倍以上多いことはこれまでに知られていなかった事実である。この結果は、環境DNA分析の感度向上やバイオマス推定精度の向上に役立つと考えられる。

本研究で示された希少種の新規分布域を環境DNAを用いて探索する手法は、概念としては提唱されていたものの、実際にそれに成功した事例はこれまで報告されておらず、科学的に重要な成果である。

環境DNAサンプルから、同属の近縁種のDNAを区別して検出する手法や、マルチプレックスPCRを用いた多種DNAの同時検出系もこれまでに報告がなく、環境DNA分析を実用化する上で重要な成果である。

## （２）環境政策への貢献

## ＜行政が既に活用した成果＞

本研究によるため池や河川での環境DNA検出技術を応用した調査が、環境省中国四国地方環境事務所の「平成27年度希少淡水魚生息域における外来魚等防除のための環境DNA分析技術開発業務」に用いられ、外来魚および希少淡水魚種の環境DNA検出結果が報告された。

## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

環境省レッドリストで絶滅危惧Ⅱ類（VU）に指定されているオオサンショウウオや、特定外来生物であるブルーギル、オオクチバス、コクチバスなどのDNA検出技術は、対象種の検出やバ
イオマス推定等に利用可能であり、希少種の保護事業や、外来種の駆除活動などに直接利用可能である。また、技術の応用によって他の生物種にも利用可能であるので、環境調査等の事業に応用されることが見込まれる。

## 6 ．国際共同研究等の状況

特に記載すべき事項はない。

## 7 ．研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

## <論文（査読あり）>

1) S. FUKUMOTO, A. USHIMARU and T. MINAMOTO (2015) “A basin-scale application of environmental DNA assessment for rare endemic species and closely related exotic species in rivers: a case study of giant salamanders in Japan.” Journal of Applied Ecology 52 (2) 358-365.

2) A. FUJIWARA, S. MATSUHASHI, H. DOI, S. YAMAMOTO, and T. MINAMOTO (2016) "Use of environmental DNA to survey the distribution of an invasive submerged plant in ponds." Freshwater Science in press

## くその他誌上発表（査読なし）>

1）源利文：医学のあゆみ、医歯薬出版，249、12、1264-1269（2014）「環境DNA：エコヘルス研究の新しいツール」

2）岩崎涉・佐藤行人・源利文・山中裕樹・荒木仁志・宮正樹

：実験医学34（1）、103-107（2016）

「環境DNA研究のインパクト」

## （2） 口頭発表（学会等）

1) 福本想、丑丸敦史、源利文：日本陸水学会第78回大会（2013）「環境DNAを用いた在来および外来オオサンショウウオの検出」

2) 源利文：第29回個体群生態学会大会（2013）

「環境DNAを用いた水中生物モニタリングの現状」

3) 源利文：第61回日本生態学会（2014）

「核DNAをマーカーとした環境DNA解析」

4) S. Fukumoto, A. Ushimaru, T. Minamoto: Frontiers in Amphibian Biology: Endangered Species Conservation and Genome Editing, Higashi-Hiroshima, Japan, 2014

"Large-scale environmental DNA assessment for Japanese and Chinese giant salamanders in Katsura River, Japan."
5) 源利文、福岡有紗、高原輝彦、兵庫県立農業高校生物部：日本陸水学会第79回大会（2014）「環境 DNA 手法の希少生物種調査への応用：兵庫県下のため池におけるカワバタモロコの分布調査」

6) T. Minamoto, S. Fukumoto and A. Ushimaru: Joint 2014 Annual Meeting British Ecological Society and Société Française d'Ecologie, Lille, France, (2014)

“A basin-scale application of environmental DNA assessment for rare endemic and exotic giant salamander species in Japan.”

7) 福本想、丑丸敦史、源利文：第62回日本生態学会大会（2015）

「環境DNA分析を用いた希少在来種と近縁外来種の流域スケール調査：京都府桂川のオオサンショウウオを例に」

8) 福岡有紗、丑丸敦史、源利文：第62回日本生態学会大会（2015）「環境DNAとマルチプレックスPCRを用いた複数魚種の同時検出」

9) 藤原綾香、松橋彩衣子、土居秀幸、源利文：第62回日本生態学会大会（2015）「環境DNA手法の新たな展開～沈水植物の検出法の開発～」

10) T. Minamoto, S. Fukumoto and A. Ushimaru: 2015 Society of Wetland Scientist Annual Meeting (2015)

“Environmental DNA assessment of rare endemic species and closely related exotic species: a case study of giant salamanders in Japan”

11）源利文、高原輝彥、北吉匠文、辻汧月、山中裕樹、內井喜美子、土居秀幸

：日本陸水学会第80回大会（2015）

「新たな環境DNAマーカーとしての核DNAの利用」

## （3） 出願特許

特に記載すべき事項はない。

## （４）「国民との科学・技術対話」の実施

1) 源利文：夢・化学21 高校生のための化学講座（浜松）(2013)

「見えない生き物を見つけ出す環境DNA技術」

## （５）マスコミ等への公表・報道等

1) 成果の記者発表（2015年2月5日、於兵庫県教育委員会記者クラブ）

2) サンテレビジョンニュースポート（2015年2月13日、オオサンショウウオの環境DAN解析の成果について5分ほどインタビューを交えて紹介）

3) 朝日新聞（2015年2月14日、全国版、社会面）

4) 読売新聞（2015年2月14日、全国版、社会面）

5) 産経新聞（2015年2月14日、全国版、社会面）

6) 神戸新聞（2015年2月14日、社会面）

7) 日本経済新聞ほか共同通信及び時事通信の配信記事を利用している各紙（2015年2月14日）

8) 朝日新聞（2015年4月23日、大阪版、科学面）
9) NHKニュース7

(2015年5月9日、環境DNA 水を調べて生物を特定する新技術について5分程度の特集)

10）週間エコノミスト（2015年7月21日、サイエンス最前線、p86-87）

## (6) その他

特に記載すべき事項はない。

### 8 \. 引用文献

1) S. FUKUMOTO, A. USHIMARU and T. MINAMOTO (2015)

“A basin-scale application of environmental DNA assessment for rare endemic species and closely related exotic species in rivers: a case study of giant salamanders in Japan.” Journal of Applied Ecology 52 (2) 358-365.
## （３）生物移動分散研究への環境DNAの適用

龍谷大学 山中裕樹

平成25～27年度累計予算額：6,553千円（うち平成27年度：1,814千円）

予算額は、間接経費を含む。

## [要旨]

本研究では環境DNA分析を河川という流水環境での水棲生物の移動分散研究に応用すべく、その研究実施例を提示するとともに、環境DNA分析の分析精度向上に資する関連の基礎研究も含め、研究項目を3つの区分で設定して調査・実験を行った。3-1では水棲生物から環境水中に放出された環境DNAが時間とともに分解してく過程について、アユの飼育水とアユが生息する河川の水を試料として検討した。飼育水と河川水のどちらにおいても20℃の水温では24時間のうちに90-97％が分解してしまうという結果が得られ、環境中での環境DNA分解は相当に早い速度で進行することが示された。また、河川水を用いた実験では分解速度の温度依存性も検討し、同じく24時間で10℃では58％が分解し、30℃ではほぼ100％が分解してしまうことが明らかとなった。3-2では環境DNAの分析精度（特に定量精度）を向上させる目的で水試料の前処理方法の検討を行った。環境DNAは相当に希薄な濃度で存在しているため効率的に回収することが分析をするうえで重要であるが、同時に、分析試料水の繰り返し間でのばらつきを小さくすることも分析精度を向上させるうえで必要である。通常は0.7μmの孔径のグラスファイバーフィルターをもちいて試料水をろ過するが、3μmのメンブレンフィルターでプレ濾過することにより、直接グラスファイバーフィルターでろ過する場合よりも変動係数で12％程度ばらつきを抑えられることが明らかになった。また、試料水を1000Gで遠心分離してから上澄みのみを分析することにより、直接分析した場合に比べて48％程度ばらつきが抑えられることも示された。3-3では2つの大規模な河川（淀川および矢作川）で水棲生物の分布調査を実施した。淀川においてはヌートリアを、矢作川ではアユを調査対象として、流程分布とその時間変化を追うことで移動分散を明らかにすることとした。ヌートリアもアユも河川水中から環境DNAを検出することができ、1年間の調査を実施したアユの例では、春先の海からの遡上、産卵期前の中上流から中下流への産卵親魚の降下、産卵後の減耗といった様子を、環境DNA分析でとらえることが出来た。また、ヌートリアにおいてもアユにおいても、流程分布は調査地点ごとで大きく変動しており、上流から流れてきたDNAがずっと下流まで検出され続けるという結果にはならなかった。このことは、環境DNAが流れにともなって拡散する流水環境では、対象生物の実際の分布と環境DNAの分布が対応付けしにくいのではないかとの懸念が大きくない事を示唆している。本研究では、ブラックボックスが多かった環境DNAの動態について新たな基礎情報を提供すると同時に、流水環境での環境DNA分析による水棲生物の移動分散研究の重要な実施例を提供することができた。河川における生態学的・水産学的な調査研究に環境DNA分析を適用する際の貴重な先行研究例となる。

## [キーワード]

環境DNA、生物モニタリング、アユ、ヌートリア、河川、移動分散、分解
### 1. はじめに

本研究では、流水環境において環境DNA分析による水棲生物の移動分散の追跡を行うという研究実例の提出を主目的とした。また、これに付随する基礎的研究にも取り組んだ。環境DNA分析による水棲生物の分布調査はこれまでにも多く実施されてきた。これは対象生物から環境中に放出されたDNAを手掛かりとして対象生物の在不在を推定するというものであるが、多くの先行研究例は実験池やため池などの止水域で実施されてきた。一方で、水の大きな動きによるDNAの移流拡散が想定される流水環境、すなわち河川においては環境DNA分析が生物の分布とその時間変化をとらえることが出来るかは明らかでない。流水環境においては時間経過とともに起こるDNAの分解を考慮すること、そしてそのわずかな差異をとらえるためにはDNAの分析精度自体の向上も必要となる。本研究ではこれらの課題とその関連課題として次の3つの研究項目を実施した。

3−1 環境DNAの分解と環境要因の効果について

3-2 環境DNAの測定精度向上に向けた試料の前処理について

3-3 流水環境における移動分散研究の実例の提示

## 2 ．研究開発目的

本研究では上記1に掲げた研究項目を実施した。環境DNAは様々な環境要因の効果を受けて時間的に分解することが知られているが、まだまだ未解明な部分が多い。3-1では最も単純な、水槽水中での経時的分解を追い、また、先行研究例が非常に少ない河川水中での分解速度を明らかにすることを主目的とした。また、補足的に紫外線による分解の効果も明らかにした。3-2では環境DNAの測定精度（定量精度）を向上させることを目的として、環境DNAを含む水試料の前処理方法を検討した。環境DNAは裸の分子の状態で環境中に存在しているのではなく、多くが細胞や細胞小器官に含まれた状態で浮遊していると考えられている。これは、採水時に誤って大きな断片を拾ってしまうことによるデータの大きなばらつきを生じさせる原因になる。本研究項目では試料水を目合いの大きいフィルターでプレ濾過をすることでより大きなばらつきを生みうる断片を除外する手法、そして、遠心分離によって大きな断片を除去するという手法を試した。3-3では長野から愛知まで流れる矢作川と、琵琶湖から大阪湾に至る淀川で水棲生物の検出を実際に行い、環境DNA分析による流水環境での研究実例を示すとともに、流水ならではの問題である、「採取した環境DNAは採水地点ではなく他から流れてきたものではないのか？」という疑問に答えるようなデータの解釈方法を検討することを目的とした。

### 3. 研究開発方法

## 3 -1 環境DNAの分解と環境要因の効果について

これまでに実施されてきた研究においても、環境DNA技術を生物の分布の推定に利用しようという試みがなされてきた。しかし、それらの多くは個々の地点で対象種のDNAが有るか無いかを単純に検討したもの、もしくは直接採集等、他の手法によって確認した「種の在不在」との比較から
「環境DNAの有無による種の分布推定」が確からしいかどうかを検討するなど、対象種からの環境水中へのDNA放出に始まる、検出までの一連のプロセスについては完全なブラックボックスのままとなっている。つまり、環境DNAによる種の在不在判定の時空間的な解像度等については全く明らかにされていない。本研究項目では、流水環境である河川において種の移動分散を追跡可能な手法を検討することを目標としている。移動分散という動的な現象を追跡するためにはやはり、手付かずとなっている「環境DNA」の放出から消失までのプロセスを明らかにし、時間的な解像度を詳細に捉えた上でそれを考慮した推定手法を開発せねばならない。本研究では、日本の河川において主要な水産対象種となっているアコ（Plecoglossus altivelis altivelis）を用いて、放出後のDNAがどのような速度で分解するのかについて飼育条件下での基礎的研究を行った。また、環境DNAの野外環境水中での分解については滋賀県の野洲川で採取した水を用いて実験を行った。4Lタンク12本分の採水を行い、実験室に水冷状態で持ち帰ったのち、10℃、20℃、30℃の各温度で48時間インキュベートした。0、1、3、6、12、24、48時間経過ごとに各温度の水を採取して500mLずつ濾過を行い、上述の野外調査と同じ手法でアコの環境DNAの検出・定量を行った。さらに、野外においては大きく効果を持つであろうと推測される紫外線が環境DNAの分解に与える効果を予備的に検討した。

## 3 -2 環境DNAの測定精度向上に向けた試料の前処理について

水中での環境DNAの動態解明のために重要なDNA定量精度の向上に向けた水試料の処理方法についての検討を行った。環境DNAは極薄い濃度で環境水中に含まれており、同じ試料水であっても採水の繰り返しの間で大きくDNA濃度推定値にばらつきが生じることが経験的に知られている。これはしばしばDNA定量精度に看過しがたい大きさの変動を生じさせるため、このバラつきを抑制するための水試料の前処理方法を検討した。まず、実験Ⅰとして、ばらつきの原因と考えられる細胞の大きな塊等のDNAを多く含む断片を除去することで定量精度を向上させる為、採水したサンプルを一旦メッシュサイズが粗いフィルターで濾過し体積が大きい断片を除去するプレ濾過手法を検討した。実験試料は、ガラス水槽(60×30×36(水量 57 L))、水温26℃、明暗周期12時間の条件下で、絶食させた100匹のゼブラフィッシュ(Danio rerio)を飼育した水槽水を用いた。水槽水をボトルに12L採水した。採水した試料を1サンプルにつき300mLを攪拌しながらメッシュサイズ3.0μm(TSTP04700)，10μm(NY1004700)，30μm(NY3004700)，60μm(NY1004700)のナイロンフィルター(MILLIPORE Nylon Net Filters)でそれぞれ濾過し、濾液をGF/Fフィルター(1825-047，GE，Healthcare，Buckinghamshire，UK)で濾過した。各設定、繰り返し数6とした。その後GF/FフィルターからDNA抽出を行ってリアルタイムPCRでDNA濾度の定量を行った。次に、実験Ⅱとして、ばらつきの原因と考えられる細胞の大きな塊等のDNAを多く含む断片を除去することで定量精度を向上させる為、採水したサンプルを遠心分離し、比重の大きいDNAを含む断片を除去する手法を検討した。実験試料は、ガラス水槽(60×30×36cm(水量57L))、水温20℃、明暗周期12時間の条件下で、絶食させた6匹のコイ(Cyprinus carpio)を飼育した水槽水を用いた。水槽水をボトルに800mL採水した。採水したボトルを攪拌し、30mLずつ50mL遠沈管に分注した。遠沈管を4種類の異なる遠心力(1000×g,2000×g,4000×g,8000×g)でぞれぞれ1分間遠心分離した。その後、静かに上清15mLを回収し、エタノール沈殿法によるDNA抽出を行った。各設定、繰り返し数4とした。抽出したDNA試料をリアルタイム採水した。
ムPCRによりDNA濃度の定量を行った。

## 3 -3 流水環境における移動分散研究の実例の提示

空間的な解像度についての知見を得るべく、大阪湾から琵琶湖に至る淀川本流およびその代表的支流である桂川水系で高密度なサンプリングを行い、現在同水系で分布の拡大が懸念されている水辺に済む特定外来生物のヌートリア(Myocastor coypus)の分布推定を実施した。また、このデータを用いて、DNAの有無だけでなく、その量を考慮に入れてより妥当な「在不在」を検討するためのデータ解析方法を提案した。これら2つの方向性（時間、空間）から環境DNA分析による「種の移動分散」把握手法の「感度」について検討し、野外適用への基盤確立を図った。

さらに広範囲、かつ、長期的な調査例を提示すべく、愛知県の矢作川でアユを対象として調査を実施した。長野県に水源を持ち、三河湾に流れ込む当該河川に3-4 k mごとの採水地点を29地点設定して毎月1回、1年間アユの環境DNAの検出・定量を行った。矢作川のアユは豊田市に位置する豊田市矢作川研究所によってアユの遡上量および放流量の把握がなされており、環境DNAで魚の移動を追う本研究にとっては最適な対象地である。毎月の調査では1Lの河川水を採取するとともに水温(℃)、pH、電気伝導度(mS/cm)を測定した。水試料は現場で濾過作業をし、実験室でDNA抽出、そして種特異的プライマーを用いたリアルタイムPCRによる検出・定量を行った。また、陽性反応が得られたPCR産物について、これらのうち濃度が極端に低いと考えられるものは産物のダイレクトシーケンスを実施し、アユ以外の生物種のDNAを誤って増幅した疑陽性ではないことの確認を行った。

## 4 ．結果及び考察

## 3 -1 環境DNAの分解と環境要因の効果について

アユ(湿重量82.9 ± 7.2g)を1個体ずつ水槽(25L)で飼育し、5日間の馴致後アユを取り出した。その後の飼育水中DNAの濃度（コピー数：環境水からの注出DNA溶液1uLあたり）をリアルタイムPCRによる定量測定（分析対象遺伝子領域：チトクロームb）でモニタリングした。結果、DNAの濃度は指数関数的に減少し（図(3)-1）、24時間で90±4.6%程度が分解すると推定された。既存の研究において、ヨーロッパヌマガレイ(Platichthys flesus)とイトヨ（Gasterosteus aculeatus）では、それぞれ約68％と30％のDNAが24時間で分解すると報告されており、これらの値と比較すると、アユから放出されるDNAの分解は格段に速いと考えられる。
図(3)-1．アユを水槽から取り出した後の時間経過に伴う、DNA濃度の減少を示す。取り出し直後から急激に減少し、1日当たり90%程度が分解すると考えられた。

次に、滋賀県野洲川の河川水を用いたアユ環境DNAの分解実験について述べる。10℃、20℃、30℃でそれぞれアユDNAの分解について時間依存性を調べたところ、いずれの温度でも指数関数的な減少を示した（図(3)-2）。経過時間と水温を説明変数として次のモデル式で回帰することができた。

アユDNAcopie数/500mL水 =

$$ 229901.2329*\exp\left(-\left(-0.069755+0.010582* 水温 (^{\circ}C)\right)*\right.\\ \left. 時間 (h)\quad\right) $$

同じくアユを用いた水槽実験では水温を20℃でのみ実施し、結果として24時間で90%の減少率であった。今回の結果では同様の条件で約97%の減少率となり、ほぼ同様の結果が得られた。ただし、今回の実験では水温の効果も明らかになり、それによると水温間で結果に大きな差があった。特に10℃とその他の温度での結果の差が顕著であり、同じく24時間後の減少率をみると10℃では約58%であったのに対し、20℃で約97%、30℃ではほぼ100%であった。この結果に基づいて考えると、特に暖かい季節には地点間でのDNAの流下に伴う解析結果の空間解像度の低下は起こりにくいであろうと言える。過去の研究では流量が早い河川では下流にも上流のDNAと変わらない量のDNAが流れ、流れが遅い河川では急速に沈着、分解が進んで下流へは流達しにくいとの報告がなされている。こうした流量依存性と共に、今回明らかになった水温依存性も考慮してさらなる検討を進める必要がある。ただし、矢作川においては数キロスケールで地点間隔が設定されており、野外調査におけるDNA濃度の流程変化(図(3)-9)をみてもほとんど上流側の影響は考慮しなくても良いだろう。
図(3)-2．河川水中でのアユDNA量の時間経過に伴う変化を示す。3つの温度の間で減少速度に違いがみられ、高温になるほどその速度が速いことが明らかとなった。ただし、いずれの温度においても指数関数的な減少傾向であることに違いはなく、水温と時間を変数とする指数関数式で回帰することができた。数式の詳細は本文を参照のこと。

基礎的知見としてDNAの減少に与える紫外線の効果を確認するため、最もDNAへのダメージが大きいとされるUV-Cの光源（6W×2灯）をコイ（Cyprinus carpio）の肉片から抽出したDNAに照射し、0、1、3、6、12、24時間後のDNAの減少量をリアルタイムPCRによる定量測定（分析対象遺伝子領域：チトクロームb）でモニタリングした。結果として、指数関数的なDNA量の減少が確認され、24時間後には初期量の1％未満に減少した（図(3)-3）。これはもちろん、殺菌目的で使用されるUV-Cを用いたことが原因であり、野外で観察されるUV-AやUV-Bの効果はこれよりも格段に小さいことが推測される。しかしながら、本予備実験によってかなり簡単な指数関数式で紫外線の効果を定式化できる見込みが得られたことで、今後の研究で野外でのUV-AやUV-Bの効果が無視できなくなった場合は、DNAの減少に与えるこれら紫外線のパラメータを比較的簡単な実験で推定できると考えられる。
UV-Cへの暴露時間(h)

図(3)-3. UV-CへのDNA暴露時間と相対的なDNA濃度の関係をしめす。時間経過とともに指数関数的なDNA濃度の低下がみられた。

## 3 -2 環境DNAの測定精度向上に向けた試料の前処理について

実験Ⅰのプレ濾過による方法については、測定されたDNA濃度を多重比較した結果、メッシュサイズ30μmでプレろ過を行ったサンプルのDNA濃度(860±660コピー数/μL)と3.0μmでプレろ過を行ったサンプルのDNA濃度(360±37.0コピー数/μL)の間に有意な差が認められ(TukeyHSD:

$p<0.05)$ 、細かな目合いのフィルターでプレ濾過した試料ほど、測定されたDNA濃度が低くなる傾向がみられた。DNA濃度のばらつきを変動係数として比較した結果、メッシュサイズ3.0μmでプレろ過を行うことで変動係数はプレろ過を行わなかったものより12.7%低減された(図(3)-4)。遠心分離による前処理を検討した実験Ⅱでは、測定されたDNA濃度を多重比較した結果、遠心分離を行わなかったサンプルのDNA濃度(700.±41.0コピー数/2μL)と8000×gで遠心分離行ったサンプルのDNA濃度(250±27.0コピー数/2μL)との間に有意な差が示され(TukeyHSD:p<0.05)、遠心力が大きくなるほど測定されたDNA濃度は低下した。DNA濃度のばらつきを変動係数として比較した結果、遠心分離することで変動係数は低減される傾向が見られ、1000×gの遠心分離を行うことで変動係数は遠心分離を行わなかったものより48.0%低減された(図(3)-5)。
図(3)-4. 各条件のサンプル数(N = 6)、ネガティブコントロールは未検出、変動係数はプレろ過後のGF/Fフィルターでろ過した濾液中のDNA濃度の変動係数を示す。メッシュサイズ3.0μmのナイロンフィルターでプレろ過を行うことで、変動係数はプレろ過を行わなかったものより12.7%低下した。

図(3)-5．各条件のサンプル数(N = 4)、ネガティブコントロールは未検出、変動係数は遠心分離後の上清中の DNA 濃度の変動係数を示す。変動係数は1000 × g の遠心分離を行うことで遠心分離を行わなかったものより48.0%低減された。

## 3 -3 流水環境における移動分散研究の実例の提示

淀川および桂川の水系における多地点調査の結果、51地点中27地点でヌートリアのDNAが検出された（図(3)-6）。平成23年度の河川水辺の国勢調査による同地域でのヌートリア確認状況と比較すると、確認されている地点ではほぼすべて環境DNAで検出できていることが明らかとなった。また、桂川水系では河川水辺の国勢調査で調査されているよりもかなり広範囲に調査を実施したが、その結果として、同水域ではほぼ全域にわたってヌートリアが生息していることが推定された。

図(3)-6. 桂川及び淀川水系におけるヌートリアDNAの分析結果。51地点中27地点でDNAが検出され、
かなり広域的に分布が拡大していることが明らかになった。黒丸の地点が陽性反応のあった地点を示す。

次に、矢作川におけるアユの移動分散についての調査結果について述べる。2014年3月から2015年3月の1年分の試料の分析が終了し、また、PCRで陽性反応が出たものの、格段に濃度が薄いと考えられた試料についてはPCR産物のダイレクトシーケンスによって対象種を適切に検出しているかを確認した。シーケンスの結果はすべてアユのDNAを適切に検出していたことを示していた。以降、周年での河川内のDNA検出結果の季節変化について述べる(図(3)-7参照)。

2014年の3月にはいずれの調査地点からもアユのDNAは検出されなかった。4月に入ると、海からの天然遡上個体と放流種苗に由来すると思われるアユのDNAがそれぞれ下流部と中流部から検出され、季節的な遡上を捉えることができた。5月には上流部でも多く検出されるようになったが、これらの地点には天然遡上アユは達できないため、上流側の漁協による放流種苗に由来すると考えられた。もっとも上流で陽性反応が見られた地点付近では、およそ300 kgの種苗が放流されており、少なくともこの程度の生物量が存在していれば、希釈効果が大きい河川でも検出可能であることが示唆された。6月から8月はアユの成長期であり、河川全域にわたって陽性反応が得られる地点がほとんどを占めた。9月に入ると上流部で陰性となる地点が増加し、アユの産卵に向けた、季節的な降下に起因することが考えられた。10月から12月にかけては陽性反応のある地点はそれほど減少していないものの、繰り返し数4で実施しているPCRの結果を精査する（29地点について繰り返し数4のため、総数で116反応）と、この3ヶ月のうちに陽性反応総数が51、62、21と変化し、12月に急減していた。これは、産卵期の終盤に向かって、アユ親魚の斃死によって生物量が急減していることを示していると考えられる。2015年の1月及び2月には陽性反応が見られる地点の数自体も大きく減った。以上の様な検出結果の季節変化は、よく知られているアユの生活史、即ち、春に河川に遡上し、夏の間河川で藻を食んで成長し、秋以降に産卵して生涯を終えるという生活史を適切にとらえていると考えられる。これにより、流水環境下であっても、季節的な採水調査を広域的に繰り返すことによって生物種の生活史（移動分散、再生産から減耗）を推定するために環境DNA分析が利用できることを実例をもって示すことができた。

3月

4月

5月
図(3)-7. アユの環境DNAの検出・非検出をそれぞれ白丸と赤丸で示す。2014年3月から2015年2月の結果をそれぞれ示している。

流水環境における「DNAの検出・非検出」の空間的解像度を検討するために、新たなデータ解析手法を検討した。上述のヌートリアの検出は定性的な分析であり、PCRで「DNAが増幅したかしなかったか」のみを利用して在不在の判定をしている。しかし、流水環境では上流から下流へのDNAの輸送があるために、上流のある生息域から流下してきたDNAを複数の下流側調査地点で検出してしまう危険性がある。図(3)-8には桂川本流から淀川本流を経て大阪湾にいたる調査地点を左から右へ上流から下流側地点となるよう列举している。縦軸は相対的なDNA濃度を示しており、調査地点間で大きく値が異なることがわかった。図にヌートリアの絵が示してある地点は、その地点よりも上流側でヌートリアのDNA濃度が増加傾向となっている地点であり、このようなDNA濃度の高まりは、近傍にヌートリアが生息している、もしくは生息している小さな支流から河川水が流れ
込んできていることを示すと考えられる。一方で、ヌートリアDNAの濃度が最も高かったeY0007地点（桂川と淀川の合流点）の下流側2地点（eY0006およびeY0005）ではDNA濃度が検出されたものの、上流地点から流れてきたDNAを検出している可能性が否定できない。このような新たな「在不在」の検討方法によって、誤った「生息」判定をしてしまう危険性を減らすことができると考えられる。また、これは対象生物の分布特性や密度および行動範囲にもよると考えられるが、本調査での調査地点間距離を考えると、本水域では環境DNAによる在不在判定が数kmから10数km程度の空間解像度を持つであろうことが推察される。今後は新たな水域においても同様の解析をすすめることにより、対象水域ごとの空間解像度の検討が可能になると思われる。

図(3)-8．桂川本流最上流地点から、淀川合流後大阪湾に至る調査地点での相対的なDNA濃度を示す。

続いて、上述のヌートリアの例と同様にアユについて、上流から下流へ向かっての環境DNAの流下に伴う、下流での誤った検出について検討した。矢作川での調査地点は3-4 kmごとに設定されているが、図(3)-9に示すように、アユのDNA濃度は地点間で大きく変動している。例として5月、7月、9月のDNA濃度（相対値）の下流から上流へ向かっての分布を示しているが、濃度が比較的高い地点であっても、その下流側地点へ向かって長く尾を引くように高いDNA濃度が続くことはあまりないことが分かった。ある地点における高いDNA濃度は、わずかにあると考えられる上流からのDNAの流下のみならず、その地点近傍にDNA放出源であるアユの個体が存在していることで生じていると考えられる。よって、流程に沿って本研究の様に多地点を設定してDNA濃度を比較することで、対象種が実際にいる場所を絞り込むことができると考えられる。矢作川は中流域であれば1秒当たり20トンほどの水量がある大規模な河川であるが、このような水量によって引き起こされるDNAの希釈は、DNAを検出しにくくすることが考えられる。しかしその一方で、空間解像度を高める意味においては個体近傍から離れれば急速にDNA濃度が低下するため、上流から流下してくるDNAを誤って検出するという誤検出の可能性を低下させる効果があると考えられる。以上から、この規模の河川であれば、流水環境であっても少なくとも3-4 kmの空間解像度が見込めることが示せた。
図(3)-9．流程方向の環境DNA濃度（最も濃度の高かった地点yh-008を100％とする）を示す。例として5月、7月、9月の結果を記載している。調査地点の間は3-4km離れている。

図(3)-10にはアユの放流量と遡上量調査から推定された生息量と、各地点でのDNA量を示している。いくつかの地点で見られるように、上流側の隣り合う地点で高いDNA量が観測されていても、下流側では急に濃度が減っている。図(3)-9では単純に環境DNAの濃度の流程分布のみから環境DNAの広がりを考察してそれほど下流方向へ広範囲に流れ下ってはいないであろうとの見解を示した。図(3)-10を見ると、特に上流よりの地点では生息量の多いところで環境DNA濃度も高くなる傾向がみられ、いないところで極端に高くなるという誤検出は起こりにくいであろうと考えられる。この結果は、流水環境中でもある程度の空間解像度は確保された形で環境DNA分析による水棲生物の移動分散調査が実行可能であることを支持するものであると捉えることができる。