Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
者や技術者が、簡便に生物分布のモニタリングに利用できる、環境DNA技術を確立することである。

図1 本研究プロジェクトの組織図

## 3 ．研究開発の方法

## （１）定量PCRによる環境DNA手法の開発（広島大学）

1-1 デジタルPCRとリアルタイムPCRを用いた環境DNA量からのコイの個体数推定

野外実験水槽を12基用いて、コイの個体数（0-85匹）を変えてコイの飼育実験を行った。水槽水から環境DNAを抽出し、環境DNA量については、リアルタイムPCR法とデジタルPCRの両手法を用いて解析を行い、これら2手法にて定量された環境DNA量と飼育実験の個体数と比較した。

## 1 -2 生物量のモニタリングにおける環境DNA技術の有用性の検証

オオクチバス（Micropterus salmoides）とブルーギル（Lepomis macrochirus）の外来魚2種を対象にして、2012年7-8月にかけて兵庫県明石市周辺のため池50面において調査を行った。環境DNA手法では、各池の沖と岸の表層から採取した水サンプル各1Lに含まれる各魚種に特異的なDNAの濃度を定量PCR法によって測定し、外来魚2種の生息状況（採捕調査結果）との比較を試みた。

1−3 Cycleave PCR法による在来種とその同種内外来遺伝子型の検出

コイについて、日本在薬型および外来型の遺伝子それぞれについて、SNP部分をRNAとする

DNA-RNA-DNAプローブを設計し、これら2種のプローブを異なる蛍光物質で標識した。このCycleave

PCR法によって、2種のDNA比が正しく定量できるかどうかを確認するため、在来および外来遺伝子型

由来のDNAを異なる比率で混合したDNA溶液（DNA比スタンダード）を鋳型としてリアルタイムPCRを行

ない、DNA比（外来DNAコピー数／在来DNAコピー数）とΔC_{T}値（C_{T}在来プローブ-C_{T}外来プローブ）の検量線を

作成した。次に、在来遺伝子型と外来遺伝子型を異なるバイオマス比で飼育する水槽実験を行なった。

飼育水から抽出した環境DNAをCycleave PCR法に供し、定量されたDNA比からバイオマス比を正しく推

定できるかを確認した。
## （２）核DNA、シーケンスによる環境DNA手法の確立 （神戸大学）

### 2 −1. コイを対象とした核DNAの検出および定量

コイを対象として、核DNAを環境DNA手法のマーカーとした検出および定量手法の開発を行った。水槽、野外メソコズム、野外実験池、自然湖沼で採取した環境DNAサンプルを用いて核DNAのコピー数をリアルタイムPCR法によって測定し、ミトコンドリアDNAのコピー数と比較した。

### 2 −2. 核DNAのシーケンス情報の収集

項目2-1の結果から、核rDNAをマーカーとした場合に検出感度が高まることが明らかになったため、その適用対象種を拡大するためにシークエンスデータの整備を行った。琵琶湖淀川水系に生息する在来及び外来の魚種について、ITS1領域およびITS2領域のシークエンス解析を試みた。また、次世代シークエンサーによるオオサンショウウオのITS1領域のマスシークエンス解析も行った。

### 2 −3. 環境DNA手法を利用した希少魚種カワバタモロコの検出法の開発および新規生息地の探索

既にカワバタモロコの在・不在が明らかな兵庫県のため池で、採水調査を行った。ため池の表層水を約2L採水し、ガラスフィルターを用いて吸引濾過をした。ろ過フィルターからDNAを抽出し、設計したリアルタイムPCRによる検出系を用いてカワバタモロコのDNAの有無を確認した。

### 2 -4. 環境DNA手法を利用したオオサンショウウオ属在来種および外来種の同時検出法の開発および野外適用

オオサンショウウオおよびチュウゴクオオサンショウウオのミトコンドリアNADH1遺伝子をそれぞれ特異的に検出するプライマー／プローブセットを開発した。京都府の桂川水系全域から、2012年9月、12月、2013年3月、6月の4回にわたり4Lのサンプル水を採取した。採水は、在来種と外来種の交雑が報告されている鴨川流域を含む、京都府の桂川水系37地点で行った。水サンプルからろ過、DNA抽出を行い、リアルタイムPCRによってそれぞれの種の遺伝子の検出実験を行った。

### 2 −5. マルチプレックスPCRを用いた野外のため池における在来種と外来種の分布域マッピング

兵庫県のため池における在来種の代表的なものとして、カワバタモロコ、ミナミメダカ（Oryzias latipes）、ドジョウ（Misgurnus anguillicaudatus）の3種について、マルチプレックスPCRによる同時検出系を作成した。また、国内で在来魚の生息を脅かすサンフィッシュ科の外来魚3種（ブルーギル[Lepomis macrochirus]、オオクチバス[Micropterus salmoides]、コクチバス[Micropterus dolomieu]）について、同様にマルチプレックス検出系を作成した。兵庫県下のため池合計101地点で177の水サンプルを得た。うち82地点の82サンプルは2-3で述べたサンプルと同一である。これらの水サンプルから環境DNAを抽出し、在来魚および外来魚を対象としたマルチプレックスPCRによって6種の在／不在を明らかにした。

## （３）生物移動分散研究への環境DNAの適用（龍谷大学）

## 3 −1 環境DNAの分解と環境要因の効果について

アユ（Plecoglossus altivelis altivelis）を用いて、放出後のDNAがどのような速度で分解するのかについて飼育条件下での基礎的研究を行った。また、環境DNAの野外環境水中での分解については滋賀県の野洲川で採取した水を用いて実験を行った。4Lタンク12本分の採水を行い、実験室に氷冷状態で持ち帰ったのち、10℃、20℃、30℃の各温度で48時間インキュベートした。0、1、3、6、12、24、48時間経過ごとに各温度の水を採取して500mLずつ濾過を行い、上述の野外調査と同じ手法でアユの環境DNAの検出・定量を行った。

## 3 -2 環境DNAの測定精度向上に向けた試料の前処理について

環境DNAは極薄い濃度で環境水中に含まれており、同じ試料水であっても採水の繰り返しの間で大きくDNA濃度推定値にばらつきが生じることが経験的に知られている。これはしばしばDNA定量精度に看過しがたい大きさの変動を生じさせるため、このバラつきを抑制するための水試料の前処理方法を検
討した。まず、実験Ⅰとして、ばらつきの原因と考えられる細胞の大きな塊等の DNA を多く含む断片を除去することで定量精度を向上させる為、採水したサンプルを一旦メッシュサイズが粗いフィルターで濾過し体積が大きい断片を除去するプレ濾過手法を検討した。次に、実験Ⅱとして、ばらつきの原因と考えられる細胞の大きな塊等の DNA を多く含む断片を除去することで定量精度を向上させる為、採水したサンプルを遠心分離し、比重の大きい DNA を含む断片を遠心分離による除去する手法を検討した。

## 3 -3 流水環境における移動分散研究の実例の提示

大阪湾から琵琶湖に至る淀川本流およびその代表的支流である桂川水系で高密度なサンプリングを行い、外来哺乳類、ヌートリア（Myocastor coypus）の分布推定を実施した。さらに、愛知県の矢作川でアユを対象として調査を実施した。当該河川に3-4 kmごとの採水地点を29地点設定して毎月1回、11年間アユの環境DNAの検出・定量を行った。

## （４）外来種・希少種調査への環境DNAの適用（兵庫県立大学）

## 4 -1 ため池における生物量定量：池干し調査と環境DNAの比較

池干しが行われるため池において、コイと特定外来種であるブルーギルを対象に、環境DNA分析と生物の採捕調査を行い、両データの関係について検証を行った。さらに、池の体積なども分析時に考慮した。池干し調査は、姫路市・明石市・加古川市のため池8面にて、2014年9月から12月にかけて行った。対象生物はコイとブルーギルの2種とし、池干し前に環境DNA採集を、池干し直後に生物の採捕調査を行った。環境DNAの採集は、池干しの約1週間前に実施した。ため池の沖帯3地点と岸帯3地点の計6地点からそれぞれ1L採水し、環境DNAを抽出し、リアルタイムPCRにてDNA量を定量した。

## 4 −2 環境DNAを用いた流水環境における生物量推定法の開発

水槽3基（6,000 L）にアユ（P/ecoglossus altivelis）1尾、3尾、9尾を投入し、各尾数に応じて水中に放出されたアユのDNA量を調べた。実験中、各水槽から水1Lずつを採取した。次に、採取した水をろ過してフィルターにトラップされたDNAの抽出・精製を行い、アユ特異的なDNAを増幅・定量するプライマー・プローブを用いて、リアルタイムPCRによりDNA量を測定した。これによって、アユのバイオマス（mg/L）と環境中のDNA量（コピー数/L）との関係を解析した。

## 4 −3 環境DNA手法を用いた水生植物の分布推定法の開発

野外調査において、従来の目視による分布調査か環境DNA手法のどちらがクロモの検出力が高いかを比較した。調査は、東広島市内のため池21か所（クロモ分布情報あり：5か所、なし：16か所）にて行った。各ため池から1Lを採水し、フィルター濾過によってDNAを抽出した。それらからクロモDNAが検出されるかをリアルタイムPCRにより確認した。

水中の環境DNA量によって、そこに生育する水草の生物量を推定することができるかを明らかにするために、室内の制御環境下において水槽実験を行った。実験対象生物はクロモとオオカナダモの2種を扱った。それぞれの種について、生物量を3条件(1cm、4cm、4cm×2本)にわけて水2L中で10日間生育した。各条件につき6反復行った。各種投入後数日にわたりに15mlずつ採水した。それらをエタノール沈殿し、環境DNAを抽出し定量した。

### 4. 結果及び考察

## （１）定量PCRによる環境DNA手法の開発（広島大学）

## 1 −1 デジタルPCR、リアルタイムPCRを用いたコイの個体数・バイオマス推定

採水したサンプルにおいて、リアルタイムPCRとデジタルPCRを用いてコイの環境DNA量を定量した。その結果、まずはデジタルPCRとリアルタイムPCRではほぼ同じような値が測定されることがわかった。しかし、測定誤差についてCV値を用いて比較すると、リアルタイムPCRでは、デジタルPCRに比較して、DNAのコピー数が少ない時に、デジタルPCRよりもばらつきが大きくなることが明らかとなり、デジタルPCRの測定制度が高いことがわかったリアルタイムPCRとデジタルPCRを用いて定量したコイの環境DNA量と、コイの個体数を比較したところ、有意な強い関係性が見られることが明らかとなった。また、
デジタルPCRではDNAコピー数が少ない時にも、回帰の直線上に値が分布しており、リアルタイムPCRよりも高精度で個体数・生物量推定が可能であることが示唆された。

## 1 -2 生物量のモニタリングにおける環境DNA技術の有用性の検証

オオクチバスでは、目視調査によって池50面のうち2面で生息が確認され、環境DNA手法では11面でオオクチバスのDNAが検出された（DNA検出率100%）。ブルーギルでは、目視調査によって50面のうち5面で生息が確認され、環境DNA手法では23面でブルーギルのDNAが検出された。さらに、目視調査によって生息確認した5面すべてでDNAも検出された（100%）。両魚種の環境中のDNA濃度は、採捕調査による努力当たりの漁獲量（catch-per-unit effort、CPUE）と、正の相関関係をもつ傾向がみられた。

## 1 −3 Cycleave PCR法による在来種とその同種内外来遺伝子型の検出

在来遺伝子型と外来遺伝子型を持つコイを異なるバイオマス比で飼育した6つの水槽水から得られた環境DNA試料中のDNA比をCycleave PCRによって定量した。6水槽について、環境DNA試料より定量された外来DNAの割合と、実際に測定した外来遺伝子型のバイオマスの割合には傾きがほぼ1の強い正の相関が検出された。したがって、本研究で開発したCycleave PCRを用いた環境DNA手法を用いれば、外来遺伝子型のバイオマス割合、つまり外来遺伝子型の侵入レベルを推定できることが示唆された。そこで、西日本の23地点の水域に本手法を適用し、コイ地域個体群における外来遺伝子型の侵入レベルの推定を行った。17水域において外来／在来DNA比の定量値が得られ、その結果、西日本において大きく外来遺伝子型の侵入が進んでいることが明らかとなった。

## （２）核DNA、シーケンスによる環境DNA手法の確立 （神戸大学）

### 2 −1. コイを対象とした核DNAの検出および定量

環境DNA手法における核DNAマーカー使用の可能性を検討した結果、野外メソコズム実験では核DNAの分子数がミトコンドリアDNAの分子数に対して160倍程度多く検出された。野外実験池と自然湖沼においては核DNAの分子数がミトコンドリアDNAに比べてそれぞれ300倍、150倍程度多く検出された。この結果から、核DNAを環境DNAマーカーとして利用することが可能であることが示され、その感度はミトコンドリアDNAをマーカーとした場合に比べて10倍から100倍程度高いことが示唆された。

### 2 −2. 核DNAのシーケンス情報の収集

オオサンショウウオをモデルとして、次世代シーケンサー（MiSeq）を用いたマスシーケンシングによって、ITS1領域の個体内多型の情報を得た。1個体に由来するDNAからITS1領域について約2500本のシーケンスを得、類似度の高い（97％以上）シーケンスをクラスタリングした結果、120種類の代表配列を得た。これらの配列の解析の結果、1個体に由来する配列であるにもかかわらず多数の塩基置換や挿入／欠失が存在していた。このことから、生物種によってはrDNAに多型が存在するため、環境DNAのマーカーとして用いるには特に挿入／欠失のある部位を避けたプライマー／プローブ設計が重要であることが明らかになった。

### 2 −3. 環境DNA手法を利用した希少魚種カワバタモロコの検出法の開発および新規生息地の探索

兵庫県下のため池82地点で採水を行い、カワバタモロコのDNAを検出する調査を行った結果、7地点のサンプルからカワバタモロコのDNAを検出した。この7地点について、もんどりを用いた捕獲調査を行ったところ、6地点でカワバタモロコが捕獲された。兵庫県下のカワバタモロコ生息地は約30地点といわれており、本調査の結果は環境DNA手法を用いて希少種の生息地を新たに発見することが可能であることを示している。

### 2 -4. 環境DNA手法を利用したオオサンショウウオ属在来種および外来種の同時検出法の開発および野外適用

京都府の桂川水系における在来及び外来オオサンショウウオDNAの検出調査の結果、合計25箇所で在来オオサンショウウオの、9箇所で外来オオサンショウウオ（チュウゴクオオサンショウウオ）のDNAの検出に成功した。両種の検出されたエリアは過去に京都市が行った捕獲調査の結果と良く整合しており、本手法が在来／外来オオサンショウウオに適用可能である事が示された。

2−5. マルチプレックスPCRを用いた野外のため池における在来種と外来種の分布域マッピング
兵庫県下のため池合計101地点で得た177サンプルについて、外来魚3種（オオクチバス、コクチバス、ブルーギル）と在来魚3種（カワバタモロコ、ミナミメダカ、ドジョウ）の同時検出系でDNA検出を行った。その結果、101地点中23地点でブルーギルのDNAが、33地点でオオクチバスのDNAが、1地点でコクチバスのDNAが、13地点でカワバタモロコのDNAが、24地点でミナミメダカのDNAが、40地点でドジョウのDNAが検出され、環境DNAによる外来魚及び在来希少種の生息地検出が有効であることが示された。

## （３）生物移動分散研究への環境DNAの適用（龍谷大学）

## 3 -1 環境DNAの分解と環境要因の効果について

DNAの濃度は指数関数的に減少し、24時間で90±4.6%程度が分解すると推定された。既存の研究において、ヨーロッパヌマガレイ（Platichthys flesus）とイトヨ（Gasterosteus aculeatus）では、それぞれ約68％と30％のDNAが24時間で分解すると報告されており、これらの値と比較すると、アユから放出されるDNAの分解は格段に速いと考えられる。

## 3 -2 環境DNAの測定精度向上に向けた試料の前処理について

実験Ⅰのプレ濾過による方法については、測定されたDNA濾度を多重比較した結果、メッシュサイズ30μmでプレろ過を行ったサンプルのDNA濾度(860±660コピー数/μL)と3.0μmでプレろ過を行ったサンプルのDNA濾度(360±37.0コピー数/μL)の間に有意な差が認められ、細かな目合いのフィルターでプレ濾過した試料ほど、測定されたDNA濾度が低くなる傾向がみられた。

遠心分離による前処理を検討した実験Ⅱでは、測定されたDNA濃度を多重比較した結果、遠心分離を行わなかったサンプルのDNA濃度（700.±41.0コピー数/2μL）と8000×gで遠心分離行ったサンプルのDNA濃度（250±27.0コピー数/2μL）との間に有意な差が示され、遠心力が大きくなるほど測定されたDNA濃度は低下した。

## 3 -3 流水環境における移動分散研究の実例の提示

淀川および桂川の水系における多地点調査の結果、51地点中27地点でヌートリアのDNAが検出された。平成23年度の河川水辺の国勢調査による同地域でのヌートリア確認状況と比較すると、確認されている地点ではほぼすべて環境DNAで検出できていることが明らかとなった。

矢作川におけるアユの移動分散について、環境DNAの検出によりこれまでよく知られているアユの生活史、即ち、春に河川に遡上し、夏の間河川で藻を食んで成長し、秋以降に産卵して生涯を終えるという生活史を適切にとらえていると考えられる。これにより、流水環境下であっても、季節的な採水調査を広域的に繰り返すことによって生物種の生活史（移動分散、再生産から減耗）を推定するために環境DNA分析が利用できることを示された。

## （４）外来種・希少種調査への環境DNAの適用（兵庫県立大学）

## 4 -1 ため池における生物量定量：池干し調査

ため池から採取した水サンプルのDNA量と、池干しによる採捕調査から得られたコイ、ブルーギルの生物量を比較した結果、コイでは、環境DNA量が生物量を比較的反映する結果となった。一方ブルーギルでは、生物量が異なっていても環境DNA量はほぼ一定の値を示し、環境DNA量と生物量の間に関係性はみられなかった。

## 4 -2 環境DNAを用いた流水環境における生物量推定法の開発

水槽実験の結果、環境中のアユのDNA量から生物量を推定するモデル式の開発に成功した。次に、このモデル式を用いて、野外調査時に採取した水サンプル中のDNA濃度からアユの生物量を推定したその結果、野外で採取した水サンプルから推定されたアユの推定生物量は2980kgになり、放流時よりも約13.5倍に増加していることが示唆された。

## 4 −3 環境DNA手法を用いた水生植物の分布推定法の開発

野外調査の結果、目視によってクロモの分布が確認できたのは2か所（分布情報あり）のみであった。一方で、環境DNA手法では、目視で確認できた2か所に加え、3か所（分布情報あり：2か所、なし：1か所）からクロモDNAが検出された。このことから、環境DNA手法は水生植物においても検出力が高く有力な
分布推定法となりうることが示唆された。

オオカナダモにおいては、生物量が多くなるほど環境DNA量も増加する傾向が検出された一方で、クロモにおいては生物量が少ない条件下でも個体によっては環境DNA量が増加した。今回の実験ではクロモはオオカナダモよりも生物量自体が小さいため、生物量が小さい条件下では環境DNA量との関係性が見えにくくなったことが考えられる

## 5 ．本研究により得られた主な成果

## （1） 科学的意義

本研究開発により得られた成果の重要な科学的意義として、以下の４点が挙げられる。

1）生物分布調査への環境DNA手法の適用：本研究で示された、外来種の生物分布や希少種の新規分布域について環境DNAを用いて探索する手法は、概念としては提唱されていたものの、実際にそれに成功した事例はこれまでほとんど報告されておらず、科学的に重要な成果である。さらに、環境DNAサンプルから、同属の近縁種のDNAを区別して検出する手法や、マルチプレックスPCRを用いた多種DNAの同時検出系もこれまでに報告がなく、環境DNA分析を実用化する上で重要な成果である。特に矢作川でのアユの移動分散調査では、毎月一回の調査と付随する分析をほぼ2名の調査者で実施でき、非常に省力化できることが示唆された。生物の移動分散調査は多くの研究で非常に基礎的かつ労力のかかるパートである。対象種のDNAを現場から採取するという環境DNA分析は、労力が小さく、かつ、明確な科学的根拠をもった結果が得られる手法である。実際の野外調査での実行性を示した本研究は実務的調査研究への橋渡しとして意義が大きい。

2) 環境DNAからの生物量推定：これまでに実験生態系を用いた高原らや他の研究で明らかになった、環境DNAと魚のバイオマスや個体数の関係について、比較的面積が大きく、自然環境に近いため池全体でもある程度定量できること、さらには河川などの流水系でも推計できる可能性が示された。

3）環境DNAによる遺伝型の判別：同種内外来種などの種内の遺伝子型間の違いを環境DNAから判別し、その割合を定量できる可能性が示された。

4）核DNAによる環境DNA手法の開発：本研究で見出された魚類の核DNAを環境サンプルから検出することが可能であることや、核rDNAのITS1領域のコピー数がミトコンドリアのCytB領域のコピー数よりも100倍以上多いことはこれまでに知られていなかった事実である。この結果は、環境DNA分析の感度向上やバイオマス推定精度の向上に役立つと考えられる。

## （２）環境政策への貢献

これら本研究開発により得られた環境DNA技術については、すでに様々な省庁や自治体、環境コンサルタント会社から問い合わせを受けており、すでにいくつかとは共同で研究や実地での応用を開始している。また、本研究開発のゴールであった日本語によるマニュアル化については日本生態学会雑誌の特集号にて環境DNA手法に関する詳細な総説が出版される（受理済）。

## ＜行政が既に活用した成果＞

本研究によるため池や河川での環境DNA検出技術を応用した調査が、環境省中国四国地方環境事務所の「平成27年度希少淡水魚生息域における外来魚等防除のための環境DNA分析技術開発業務」に用いられ、外来魚および希少淡水魚種の環境DNA検出結果が報告された。さらに、河川やダム湖の生物群集の把握のために、すでに国土交通省の外郭団体であるダム水源地整備センターにおいて、同環境DNA技術を利用した評価方法の検討のために、同センター設置の氾濫原研究会において検討のための調査・実験を依頼されている。

## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

環境DNA分析は現場での作業が水をくむだけであるというその省力化された特性があり、今後は水産資源の管理（放流効果の検証等）や外来種の侵入検知、希少種の探索等に有効活用が期待できる。DNAという物証を持って結果を出せるため、これらの課題にかかわる行政判断が求められる場面で活用されることが期待できる。さらに、環境省レッドリストで絶滅危惧Ⅱ類(VU)に指定されているオサンショウウオや、特定外来生物であるブルーギル、オオクチバス、コクチバスなどのDNA検出技
術は、対象種の検出やバイオマス推定等に利用可能であり、希少種の保護事業や、外来種の駆除活動などに直接利用可能である。また、技術の応用によって他の生物種にも利用可能であるので、環境調査等の事業に応用されることが見込まれる。さらに判別が難しい同種内外来種などの遺伝型が異なる種や集団についても適用可能であり、新たな生物分布調査方法として非常に有効であると見込まれる。

### 6. 研究成果の主な発表状況

## （１）主な誌上発表

## く査読付き論文>

1) T. TAKAHARA, T. MINAMOTO and H. DOI (2015) “Effects of sample processing on the detection rate of environmental DNA from the Common Carp (Cyprinus carpio).” Biological Conservations 183, 64–69

2) H. DOI, K. UCHII, T. TAKAHARA, S. MATSUHASHI, H. YAMANAKA, T. MINAMOTO (2015) "Use of droplet digital PCR for estimation of fish abundance and biomass in environmental DNA surveys" PLOS ONE 10:e0122763

3) S. FUKUMOTO, A. USHIMARU and T. MINAMOTO (2015)

“A basin-scale application of environmental DNA assessment for rare endemic species and closely related exotic species in rivers: a case study of giant salamanders in Japan.” Journal of Applied Ecology 52 (2) 358–365.

4) H. DOI, T. TAKAHARA, T. MINAMOTO, S. MATSUHASHI, K. UCHII, and H. YAMANAKA (2015) "Droplet digital polymerase chain reaction (PCR) outperforms real-time PCR in the detection of environmental DNA from an invasive fish species." Environmental Science & Technology 49:5601-5608.

5) H. YAMANAKA, and T. MINAMOTO (2016) "The use of environmental DNA of fishes as an efficient method of determining habitat connectivity." Ecological Indicators 62, 147–153.

6) K. Uchii, H. Doi, and T. Minamoto (2016) A novel environmental DNA approach to quantify the cryptic invasion of non-native genotypes. Molecular Ecology Resources 16:415–422.

## く査読付論文に準ずる成果発表>

1）高原輝彦、源利文、土居秀幸（2014）：身近な水の環境科学（測定編）－調査・実習から環境教育まで－、朝倉書店「水を調べるだけで生き物がわかる！～環境中のDNAを利用した生物分布モニタリング法～」

## （２）主な口頭発表（学会等）

1) T. Takahara, T. Minamoto, H. Doi: 26th International Congress for Conservation Biology, Baltimore, USA, 2013 “Using environmental DNA to estimate the distributions and biomass of fish”

4）土居秀幸、高原輝彦、源利文：第61回日本生態学会（2014）「環境DNAとフェノロジー：現状と未来」

5) H. Doi, T. Takahara, T. Minamoto: Evolutionary Community Ecology symposium, Kyoto, Japan, (2014) “Community ecology using environmental DNA “

6) T. Minamoto, S. Fukumoto and A. Ushimaru: Joint 2014 Annual Meeting British Ecological Society and Société Française d'Ecologie, Lille, France, (2014) “A basin-scale application of environmental DNA assessment for rare endemic and exotic giant salamander species in Japan.”

7) H. Yamanaka, T. Minamoto: Joint 2014 Annual Meeting – British Ecological Society and Societe Française d'Ecologie, Lille, (2014) “Assessment of the effect of artificial obstructions
on fish migration in a river using environmental DNA."

### 7. 研究者略壓

## 課題代表者：土居秀幸

東北大学大学院生命科学研究科博士後期課程修了博士（生命科学），愛媛大学農学部 日本学術振興会特別研究員（PD），University of Washington 客員研究員，Carl-von-Ossietzky University Oldenburg 日本学術振興会海外特別研究員，広島大学サステナブル・ディベロップメント実践研究センターテニュアトラック講師，兵庫県立大学大学院シミュレーション学研究科准教授

## 研究分担者

## 1 ）源利文

京都大学大学院理学研究科博士後期課程修了、博士（理学）、京都大学生態学研究センター講師（研究機関研究員）、産業技術総合研究所特別研究員、総合地球環境学研究所プロジェクト上級研究員、現在、神戸大学大学院人間発達環境学研究科特命助教

## 2 ）山中裕樹

京都大学大学院理学研究科修了、博士（理学）、総合地球環境学研究所研究員，龍谷大学理工学部助手，現在、龍谷大学理工学部 講師

## 3 ）片野泉

奈良女子大学大学院人間文化研究科修了、博士（理学）、奈良女子大学共生科学研究センター研究員，土木研究所自然共生研究センター専門研究員，Carl-von-Ossietzky University

Oldenburg Post-doc，兵庫県立大学環境人間学部准教授，現在、奈良女子大学理学部准教授
## (1) 定量PCRによる環境DNA手法の開発

広島大学 土居秀幸

平成25～27年度累計予算額：12,815千円（うち平成27年度：0千円）

予算額は、間接経費を含む。

## [要旨]

本研究では、平成25、26年度において、環境DNAによる生物分布モニタリング手法を開発すべく、特に環境DNAの濃度から生物量を推定する手法の開発、外来種の分布や生物量の推定、さらには、新しい手法であるCycleave PCR法による在来種とその同種内外来遺伝子型の検出を行った。1-1として、デジタルPCRとリアルタイムPCRを用いた環境DNA量からのコイの個体数推定をおこなった。12基のメソコズムを用いて、水中の環境DNA量とコイの個体数・生物量の関係について検討し、両者には明瞭な正の関係があり、環境DNA量から生物量や個体数を予測できること、さらに新しい分析手法であるデジタルPCRでは、特に低濃度でさらに精度よく推定できることがわかった。1-2として、環境DNA手法と古典的な採捕調査とを50個のため池で比較し、特にオオクチバス

（Micropterus salmoides）については、採捕調査で明らかとなった生物量明瞭な関係があることがわかった。1-3として遺伝的に非常に近縁である同種内外来遺伝子型の侵入を迅速に把握するための環境DNA手法の開発を行った。まず、DNA上の一塩基多型に基づいて在来遺伝子型と外来遺伝子型を判別し、さらに両者のDNAの存在比を決定する定量PCR手法を確立した。次に、水槽実験において、環境DNAより定量した外来／在来DNA比から外来／在来遺伝子型のバイオマス比を高精度に推定できることを確認した。さらに、本手法を野外へ適用し、自然水域における外来遺伝子型の侵入レベルを短期間のうちに広範に推定することに成功した。

[キーワード]

環境DNA、生物モニタリング、魚類、生物量、ため池、河川

### 1. はじめに

生物種の保護・管理をする上で最も基本的かつ重要な情報は、生物の生息分布や個体数、生物量である。分布や個体数推定には、様々な手法や分布予測モデルが提案されてきており、近年になってもその議論が終息することはない。従来の研究では、生物の生息場所や生息量を知るためには、目視で数える、採集を行う、網を仕掛けるなど、多大な労力と時間をかけて調査を行う必要があった。これらの調査方法は、信頼性が低いことや調査対象を広げられないなどの多くの問題点が挙げられていた。よって、生物の分布や生物量などを迅速かつ広域で推定できる新たな手法を開発する必要がある。その問題を解決する手法として本研究では、環境DNAによる生物分布モニタリング手法を提案する。環境DNAによるモニタリング手法では、水に含まれる生物由来のミト
コンドリアDNAから生物の種を判別し、さらにその量を定量PCRにより定量することによって、生物分布や生物量を推定する。その際、より高精度での推定を実現するためには、どのような環境要因が環境DNAの定量に影響するかについても明らかにする必要がある。そのために以下の3つの研究を進めた。

1-1 デジタルPCRとリアルタイムPCRを用いた環境DNA量からのコイの個体数推定

1-2 生物量のモニタリングにおける環境DNA技術の有用性の検証

1−3 Cycleave PCR法による在来種とその同種内外来遺伝子型の定量的検出法の開発

## 2 ．研究開発目的

## 1 -1 デジタルPCRとリアルタイムPCRを用いた環境DNA量からのコイの個体数推定

デジタルPCRとリアルタイムPCRを用いた環境DNA量から魚の個体数を推定する手法を開発するために、メソコズムによる操作実験を行った。3－85個体のコイを飼育して（表(1)-1）、その水から環境DNAを取り出して解析することで、水中の環境DNA量とコイの個体数の関係について検討した。本実験ではコイを対象にして飼育実験を行った。

## 1 -2 生物量のモニタリングにおける環境DNA技術の有用性の検証

環境DNA手法と古典的な調査法（目視や採捕調査）における生物モニタリング法としての有用性を比較・検証するため、オオクチバス（Micropterus salmoides）とブルーギル（Lepomis macrochirus）の外来魚2種を対象にして、2012年7-8月にかけて兵庫県明石市周辺のため池50面において調査を行った。

## 1 -3 Cycleave PCR法による在来種とその同種内外来遺伝子型の検出

同種内の遺伝的に異なる外来集団（同種内外来遺伝子型）は、見た目で在来種と区別がつかないため、その検出に大きな困難を要するだけでなく、在来種との交雑によって遺伝子浸透を引き起こす可能性が高く、生物多様性保全における重大リスクとなっている。在来種と遺伝的に非常に近い同種内外来遺伝子型の特異的検出には、種内の小さな変異を判別できる高感度な手法が必要となる。そこで本研究では、最も豊富に存在する遺伝変異であり、変異の最小単位である一塩基多型（SNP）に基づいて、在来遺伝子型と外来遺伝子型のDNAの存在比を決定する定量PCR法を確立するとともに、その定量PCR法を利用し、外来遺伝子型の侵入規模を迅速に推定する環境DNA手法を開発することを目的とした。

### 3. 研究開発方法

## 1 -1 デジタルPCRとリアルタイムPCRを用いた環境DNA量からのコイの個体数推定

コイを用いた飼育実験は、広島大学理学部に設置されている野外実験水槽を12基用いて行った。各水槽（約450L）に実験7日前に水道水を入れ、実験開始まで汲み置きした。また1基の水槽はコイを入れず（0匹）、コントロール区とした。採水は、コイを入れる前（コントロール、0日）、1日目、2日目、3日目に採水した。また、途中で死亡した個体については体重を測定して、実験水
槽から取り除いた。

エタノール沈殿による抽出：水槽中央部において、1.5ml の 3M sodium acetate を入れておいた 50ml 遠沈管に 15ml 1 の水をピペットで採水した。採水後すぐに 33ml absolute ethanol を入れたあと、-20℃ にて冷凍保存した。その後、高速冷却遠心機（条件：10,000g、1時間、4℃）で遠心した後、その上澄みをQiagen DNeasy Blood and Tissue Kit を用いて、抽出・精製した。

環境DNA量については、リアルタイムPCR（StepOne、Life technologies）とデジタルPCR（QX-100、Bio-Rad、広島大学霞キャンパスに設置）の両手法を用いて解析を行った。コイのプライマープローブについては、リアルタイムPCR、デジタルPCR共に同じものを用いて分析を行った（F、5'-GGTGGGTTCTCAGTAGACAATGC-3'；R、5'-GGCGGCAATAACAAATGGTAGT-3'、TaqMan probe（5'-FAM-CACTAACACGATTCTTCGCATTCCACTTCC-TAMRA-3'）。これら 2 手法にて定量された環境DNA量と飼育実験の個体数と比較した。

表(1)-1 コイ飼育実験に用いた個体数

Tank	Individuals per pond
1	0
2	3
3	4
4	5
5	7
6	9
7	11
8	17
9	25
10	38
11	56
12	85

## 1 -2 生物量のモニタリングにおける環境DNA技術の有用性の検証

オオクチバス（Micropterus salmoides）とブルーギル（Lepomis macrochirus）の外来魚2種を対象にして、2012年7-8月にかけて兵庫県明石市周辺のため池50面において調査を行った。環境DNA手法では、各池の沖と岸の表層から採取した水サンプル各1Lに含まれる各魚種に特異的なDNA（ミトコンドリアDNAのシトクロムb遺伝子の一部）の濃度を定量PCR法によって測定し、外来魚2種の生息状況（在・不在および生物量）の評価を試みた。目視調査は、水サンプル採集の際に、対象魚種が確認できるかどうかによって在・不在を判定した。採捕調査は、熟練の研究者2名が投網とタモ網を用いて、すべての池において面積辺りの努力量が等しくなるように行い、生息状況を評価した。

## 1 −3 Cycleave PCR法による在来種とその同種内外来遺伝子型の検出

在来種とその同種内外来遺伝子型のモデルとして、日本列島在来のコイ（Cyprinus carpio）と、それとは数百万年前に分岐し、現在は人為導入により日本全国の湖沼・河川に広く分布するユー
ラシア大陸系統のコイを用いた。まず、既知のコイのミトコンドリアDNAのD-loop領域の全ハプロタイプの塩基配列情報から、在来遺伝子型と外来遺伝子型間の一塩基多型（SNP）を探索した。在来および外来遺伝子型それぞれについて、SNP部分をRNAとするDNA-RNA-DNAプローブを設計し、これら2種のプローブを異なる蛍光物質で標識した（表(1)-2参照）。プローブ配列を含む領域を増幅する在来および外来遺伝子型に共通のプライマーセットとプローブ2種を同時に用い、RNA分解酵素Hを含んだリアルタイムPCRを行なった（Cycleave PCR法）。図(1)-1に示すように、プローブ配列とターゲット配列が完全にマッチすれば、RNA分解酵素によりDNA-RNAハイブリッドのRNA部分が切断され、プローブの蛍光が発せられる。

Cycleave PCR法によって、2種のDNA比が正しく定量できるかどうかを確認するため、在来および外来遺伝子型由来のDNAを異なる比率で混合したDNA溶液（DNA比スタンダード）を銷型としてリアルタイムPCRを行ない、DNA比（外来DNAコピー数／在来DNAコピー数）とΔC_{T}値（C_{T}在来プローブ－C_{T}外来プローブ）の検量線を作成した。次に、在来遺伝子型と外来遺伝子型を異なるバイオマス比（在来／外来＝0.1、0.2、0.7、1.7、4.0、9.8）で飼育する水槽実験を行なった。飼育水から抽出した環境DNAをCycleave PCR法に供し、定量されたDNA比からバイオマス比を正しく推定できるかを確認した。

表 (1) -2

塩基配列（5'→3'）
F-プライマー	TCCACCCTCGGATAAT
R-プライマー	ACTATGTAAGGATAAGTTGAACTA
在来遺伝子型プローブ	GAGATGCCAGA-(HEX標識)	※下線部はSNPかつRNA
外来遺伝子型プローブ	GAAATGCCAGA-(FAM標識)	※下線部はSNPかつRNA

図(1)-1 Cycleave PCR法の原理

## 4 ．結果及び考察

## 1 -1 デジタルPCR、リアルタイムPCRを用いたコイの個体数・バイオマス推定

実験1、2、3日目に採水したサンプルにおいて、リアルタイムPCRとデジタルPCRを用いてコイの環境DNA量を定量した。その結果、まずはデジタルPCRとリアルタイムPCRではほぼ同じような値が測定されることがわかった（ $ R^{2}=0.961 $ 、p<0.0001）。しかし、測定誤差についてCV値を用い
て比較すると、リアルタイムPCR（qPCR）では、デジタルPCR（ddPCR、digital droplet PCR）に比較して、DNAのコピー数が少ない時に、デジタルPCRよりもばらつきが大きくなることが明らかとなり、デジタルPCRの測定精度が高いことがわかった（図(1)-2）。

リアルタイムPCRとデジタルPCRを用いて定量したコイの環境DNA量と、コイの個体数を比較したところ、有意な強い関係性が見られることが明らかとなった（図（1）-3）。また、その関係性の強さを示すR²値はリアルタイム、デジタルPCRそれぞれ0.868と0.874であり、有意な差異は見られなかった。

コイの環境DNA量とコイの生物量を比較したところ、有意な強い関係性が見られることが明らかとなった（図(1)-4）。また、その関係性の強さを示す $ R^{2} $ 値はリアルタイム、デジタルPCRそれぞれ0.783と0.886であり、有意にデジタルPCRにおいて関係性が強いことがわかった。さらに、個体数・生物量との比較において、デジタルPCRではDNAコピー数が少ない時にも、Type II回帰の直線上に値が分布しており、リアルタイムPCRよりも高精度で個体数・生物量推定が可能であることが示唆された。

図(1)-2. リアルタイムPCR（qPCR）、デジタルPCR（ddPCR、digital droplet PCR）におけるコイの環境DNA（eDNA）量とそのデータのばらつきの関係。赤線は一般線形モデル（GLM）から得られた線形回帰を示し、点線は±95%信頼区間を示す。上部四角中のグラフは、中央値とばらつきを示す。中央値が黒線、四角枠が±25%四分位、バーが±1.5x四分位、白丸がはずれ点をそれぞれ示す。
図(1)-3. コイの環境DNA(eDNA)量と各水槽でのコイ個体数の関係。赤線はType II回帰から得られた線形回帰を示し、点線は±95%信頼区間を示す。黒、赤、緑丸はそれぞれ測定1、2、3日目のデータを示す。

図(1)-4. コイの環境DNA(eDNA)量と各水槽でコイ生物量の関係。赤線はType II回帰から得られた線形回帰を示し、点線は±95%信頼区間を示す。黒、赤、緑丸はそれぞれ測定1、2、3日目のデータを示す。
## 1 -2 生物量のモニタリングにおける環境DNA技術の有用性の検証

オオクチバスでは、目視調査によって池50面のうち2面で生息が確認され、環境DNA手法では11面でオオクチバスのDNAが検出された（図（1）-5）。さらに、目視調査によって生息確認した2面でDNAも検出された（DNA検出率100%）。ブルーギルでは、目視調査によって50面のうち5面で生息が確認され、環境DNA手法では23面でブルーギルのDNAが検出された。さらに、目視調査によって生息確認した5面すべてでDNAも検出された（100%）。一方、オオクチバスのDNAは、採捕調査による生息確認済みの11面のうち8面でのみDNAが検出され（DNA検出率73%）、ブルーギルのDNAは、採捕調査による生息確認済み18面のうち14面でのみDNAが検出された（78%）。

両魚種の環境中のDNA濃度は、採捕調査による努力当たりの漁獲量（catch-per-unit effort、CPUE）と、正の相関関係をもつ傾向がみられたが、統計的に有意ではなかった（オオクチバス、 $ R^{2}=0.37 $ 、p=0.11；ブルーギル、 $ R^{2}=0.03 $ 、p=0.59）（図(1)-6）。しかしながら、オオクチバスの場合、環境中のDNA濃度の外れ値を除外したとき（1,333コピー、図(1)-6 左）、統計的に有意な正の相関関係を示すことがわかった（ $ R^{2}=0.93 $ 、p<0.001）。

これらの結果から、環境DNA手法は、魚種の違いに関係なく、それらの在・不在をある程度正確に予測できることがわかった。さらに、環境DNA濃度は、とくにオオクチバスの場合、採捕調査よりも正確にバイオマスを推定できることが示唆された。今後は、各魚種の生息密度や池の大きさ、水質（PCR阻害物質の有無等）などとDNA濃度との関係を明らかすることで、環境DNAを用いた生物量のモニタリング手法の更なる精度向上が期待できる。

図(1)-5．左図はオオクチバス、右図はブルーギルのため池50面における調査結果を示す。赤丸は対象種のDNAが検出された池、白丸は検出されなかった池を示す。黒い太線で囲まれた池は各魚種が目視確認された池、ポンチ絵は各魚種が採捕調査によって捕獲された池を示す。
Log_{10} [採捕調査による努力当たりの漁獲量 (g)]

図(1)-6. 各魚種の環境中のDNA濃度（eDNA）と採捕調査による努力当たりの漁獲量（catch-per-unit effort、CPUE）との関係を示す（オオクチバス、 $ R^{2}=0.37 $ 、p=0.11；ブルーギル、 $ R^{2}=0.03 $ 、p=0.59）。

## 1 −3 Cycleave PCR法による在来種とその同種内外来遺伝子型の検出

鋳型DNA量が150、1000、20000（コピー／反応）のどの場合も、Cycleave PCR法により得られたDNA比と$\Delta C_{\mathrm{T}}$の検量線は、外来／在来DNA比が0.07から15の範囲で直線性を示すと同時に、異なる鋳型DNA量の間でも検量線はほぼ同一であった（図(1)-7）¹）。つまり、Cycleave PCR法は、鋳型DNA量に関わらず、在来または外来遺伝子型どちらかのDNAが約6%以上存在すれば、DNA比を正確に定量できることが分かった。次に、在来遺伝子型と外来遺伝子型を持つコイを異なるバイオマス比で飼育した6つの水槽水から得られた環境DNA試料中のDNA比をCycleave PCRによって定量した。6水槽について、環境DNA試料より定量された外来DNAの割合と、実際に測定した外来遺伝子型のバイオマスの割合の関係を図(1)-8に示す。両者の間には傾きがほぼ1の強い正の相関が検出された。つまり、外来DNAの割合は外来遺伝子型バイオマスの割合と1：1の関係を持っていた。したがって、本研究で開発したCycleave PCRを用いた環境DNA手法を用いれば、外来遺伝子型のバイオマス割合、つまり外来遺伝子型の侵入レベルを推定できることが示唆された。そこで、西日本の23地点の水域に本手法を適用し、コイ地域個体群における外来遺伝子型の侵入レベルの推定を行った。17水域において外来／在来DNA比の定量値が得られ、その結果、西日本において大きく外来遺伝子型の侵入が進んでいることが明らかとなった（図(1)-9）。
Ln DNA比(外来DNAコピー数／在来DNAコピー数)

図(1)-7. Cycleave PCRより得られたDNA比と $ \Delta C_{T} $ の検量線

図(1)-8. バイオマスの割合とDNAの割合の関係
図(1)-9. 西日本の河川および貯水池において推定された在来および外来遺伝子型の割合。円グラフ中の数字は外来遺伝子型の割合（%）。

## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

本研究開発により得られた成果の重要な科学的意義として、以下の2点が挙げられる。まず、1)これまでに実験生態系を用いた高原ら $ ^{1)} $ や他の研究で明らかになった、環境DNAと魚のバイオマスや個体数の関係について、比較的面積が大きく、自然環境に近いため池全体でもある程度定量できること、さらには河川などの流水系でも推計できる可能性が示された。2)同種内外来種などの種内の遺伝子型間の違いを環境DNAから判別し、その割合を定量できる可能性が示された。

## （２）環境政策への貢献

これら本研究開発により得られた環境DNA技術については、すでに様々な省庁や自治体、環境コンサルタント会社から問い合わせを受けており、すでにいくつかとは共同で研究や実地での応用を開始している。また、本研究開発のゴールであったマニュアル化については日本生態学会雑誌の特集号にて環境DNA手法に関する詳細な総説が出版される予定である（受理決定）。さらに、アドバイザリーボード会合において、PO、アドバイザーと意見交換を行い、今後環境政策に活かすためにどのように研究に取り組んでいけばよいか、アドバイスを頂いた。今後、環境省においても環境DNAを使った外来種モニタリングなどを検討したく、今後の本委託業務の成果を期待しているとの感想を得た。

## ＜行政が既に活用した成果＞

河川やダム湖の生物群集の把握のために、すでに国土交通省の外郭団体であるダム水源地整備センターにおいて、同環境DNA技術を利用した評価方法の検討のために、同センター設置の氾濫原研究会において検討のための調査・実験を依頼されている。
## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

水域生態系に生息する、魚類をはじめとした様々な種類について、環境DNAによりその生息場所や生息量を評価できることから、迅速かつ簡便な生息分布調査やモニタリングのために利用されることが見込まれる。さらに判別が難しい同種内外来種などの遺伝型が異なる種や集団についても適用可能であり、新たな生物分布調査方法として非常に有効であると見込まれる。

## 6 ．国際共同研究等の状況

特に記載すべき事項はない。

## 7 ．研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

## <論文（査読あり）>

1) T. TAKAHARA, T. MINAMOTO and H. DOI (2015) “Effects of sample processing on the detection rate of environmental DNA from the Common Carp (Cyprinus carpio).” Biological Conservations 183, 64-69

2) H. DOI, K. UCHII, T. TAKAHARA, S. MATSUHASHI, H. YAMANAKA, T. MINAMOTO (2015) "Use of droplet digital PCR for estimation of fish abundance and biomass in environmental DNA surveys" PLOS ONE 10:e0122763

3) H. DOI, T. TAKAHARA, T. MINAMOTO, S. MATSUHASHI, K. UCHII, and H. YAMANAKA (2015) "Droplet digital polymerase chain reaction (PCR) outperforms real-time PCR in the detection of environmental DNA from an invasive fish species." Environmental Science & Technology 49:5601-5608.

## <査読付論文に準ずる成果発表>

1）高原輝彦、源利文、土居秀幸（2014）：身近な水の環境科学（測定編）－調査・実習から環境教育まで－、朝倉書店「水を調べるだけで生き物がわかる！～環境中のDNAを利用した生物分布モニタリング法～」

## くその他誌上発表（査読なし）>

特に記載すべき事項はない。

## （2） 口頭発表（学会等）

1）高原輝彦、源利文、土居秀幸、満尾世志人、角田裕志、木塚俊和、高村典子：「ため池の生物多様性の保全」にかかる研究成果報告会～兵庫県東・北播磨のため池に棲む生きものと人との関わり～（2013）「水を調べるだけで魚がわかる!?」

2) T. Takahara, T. Minamoto, H. Doi:26th International Congress for Conservation Biology, Baltimore, USA, 2013 "Using environmental DNA to estimate the distributions and
biomass of fish"

3）内井喜美子、土居秀幸、源利文、山中裕樹：日本陸水学会第78回大会（2013）「環境DNAを利用した同種内外来種の迅速把握」

4）高原輝彥、源利文、土居秀幸、木塚俊和、満尾世志人、角田裕志、高村典子：第61回日本生態学会（2014）「オオクチバス等の外来魚モニタリングにおける環境DNA技術の有用性の検証－調査手法の違いによる結果の比較を通して—」

5）内井喜美子、土居秀幸、源利文、山中裕樹：第61回日本生態学会（2014）「同種内外来種の侵入規模の迅速把握」

6）土居秀幸、高原輝彦、源利文：第61回日本生態学会（2014）「環境DNAとフェノロジー：現状と未来」

7) H. Doi, T. Takahara, T. Minamoto: Evolutionary Community Ecology symposium, Kyoto, Japan, (2014) “Community ecology using environmental DNA”

## （3） 出願特許

特に記載すべき事項はない。

## （４）「国民との科学・技術対話」の実施

1）高原輝彦：サイエンス・カフェひょうご in 加古川（2014）

「水を調べて生きものを調査する～環境中のDNAを利用した生物のモニタリング法～」

## （５）マスコミ等への公表・報道等

1）朝日新聞（2015年4月30日、大阪版、科学面）

## (6) その他

1）第16回日本陸水学会吉村賞（土居秀幸受賞2014年9月13日）

### 8 \. 引用文献

1) K. Uchii, H. Doi, and T. Minamoto (2016) A novel environmental DNA approach to quantify the cryptic invasion of non-native genotypes. Molecular Ecology Resources 16:415-422.