Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
植物園等において絶滅危惧植物の生育域外保全を行う際に、各個体に遺伝子型のタグを付け、それに基づいて適切に維持・管理することは、域外保全活動において先進的かつ有益な取り組みであるといえる。日本に現存するスズカケソウについては、ユニークな対立遺伝子を持つすべてのクローンを、その遺伝子型とともに広島市植物公園で生育域外保全するという段階まで持ち込むことができたことは、大きな成果の一つとしてあげることができる。

更に、スズカケソウ以外の絶滅危惧植物に関しても、域外保全が行われている、あるいは検討されている分類群について、現存する全個体について遺伝子型タグを付加したうえで個体管理することがほぼ可能となった。各個体の遺伝子型に基づいて種内の遺伝的多様性を保全する枠組みを実証したこと、そして、その基礎となる全残存個体の遺伝子型情報を、比較的短期間かつ低コストで複数の絶滅危惧植物について同時に整備できることを示したことは、絶滅危惧種の適切な域外保全を実行する上で、本プロジェクトの重要な成果といえる。

## (2) 環境政策への貢献

今回得られた成果は、全個体ジェノタイピングに基づく絶滅危惧植物の盗掘防止と適正管理に関するモデルケースを提供するものである。全個体ジェノタイピングが終了した絶滅危惧種については、残存するすべての個体に遺伝的にタグを付けたことになるので、市場に流通している個体の由来を正確に特定でき、絶滅危惧種の違法な採取や販売を検知可能である。また、園芸的価値が高く、盗掘被害を受けやすい希少植物について、全個体についてジェノタイピングが終了していること、違法な採取によって市場に流通している個体の由来を特定できることを広く周知することによって、盗掘防止への強い圧力になることが期待できる。さらに、そのような絶滅危惧植物を、認定業者等が合法的に販売する場合にも、特定の遺伝子型を有する個体を販売することにより、販売されている個体が正規のルートを経たものであることを簡単に証明できるようになる。全個体ジェノタイピングに基づくこれらの対策の総合的な実施により、絶滅危惧植物の盗掘防止と有効利用について、より厳密かつ積極的な制度が構築できると考えられる。

各絶滅危惧植物が生育する地域の自治体や市民団体に今回の研究成果を報告し、適切な保全方針の提案を行った。スズカケソウについては、つるぎ町教育委員会およびつるぎ町内の小学校に今回の研究成果を伝え、生育地における保全活動や環境教育に活用している。静岡県湖西市に生育するトキワマンサクについては、生育地の保護と地域の活性化を目的とした市民団体(トキワマンサク里作り推進会)と湖西市教育委員会に今回の研究成果を伝え、今後の保全指針に活用してもらう予定である。また、熊本県荒尾市教育委員会と地権者は、現在トキワマンサク生育地の管理方法について検討していることから、今回の研究成果を保全活動に活用する予定である。シモツケコウホネについては、絶滅のおそれのある野生動植物の種の保存に関する法律に基づく「国内希少野生動植物種」として指定される予定である。さらに生育地の保護を目的とした市民団体(シモツケコウホネと里を守る会)と栃木県上都賀農業振興事務所に、今後の保全活動に生かせるように、クローン数やその分布様式などに関する研究成果を伝えた。ガシャモクについてはこれまで自生地における調査研究や保全活動を主導してきた北九州市立自然史・歴史博物館やガシャモクの保護を目的とした市民団体(ガシャモク再生の会)、生育地外保全を行っている小学校などの関係者に今回の研究成果を伝え、より適切な自生地の保全方針や生育地外保全について共に検討する予定である。キバナスゲユリについては、環境省と国営沖縄記念公園熱帯・亜熱帯緑化植物園が実施している「キバナスゲユリ生息域外保全モデル事業」において本プロジェクトの遺伝解析結果が活用される予定である。
### 6. 国際共同研究等の状況

「特に記載すべき事項はない」

### 7. 研究成果の発表状況

## (1) 誌上発表

## <論文(査読あり)>

1) I. MASUMOTO, S. KANEKO, K. OHTAKE, and Y. ISAGI: Conservation Genetics Resources 3, 163-165 (2012)

“Development of microsatellite markers for Adenophora palustris (Campanulaceae), a critically endangered wetland plant species in Japan”

2) M. YOKOGAWA, T. SHIGA, S. KANEKO and Y. ISAGI: Conservation Genetics Resources, (2012) "Development of nuclear microsatellite markers for the critically endangered freshwater macrophyte, Nuphar submersa (Nymphaeaceae), and cross-species amplification in six additional Nuphar taxa" (in press)

3) C. FUKADA, S. KANEKO, M. YOKOGAWA, and Y. ISAGI: Conservation Genetics Resources, 4, 495-497 (2012)

“Development of ten microsatellite markers for Arisaema minus (Araceae), a vulnerable Japanese herb species”

4) N. NAKAHAMA, S. KANEKO, A. HAYANO, Y. ISAGI, M. INOUE—MURAYAMA and T. TOMINAGA: Conservation Genetics Resources, (2012)

“Development of microsatellite markers for the endangered grassland species Vincetoxicum pycnostelma (Apocynaceae), using next generation sequencing technology.” (in press)

5）津村義彦、陶山佳久編：森の分子生態学第二版、p137-158、文一総合出版、(2012)「第4章 絶滅危惧種の分子保全遺伝学 (執筆担当:井鷺裕司)」

6）井鷺裕司、兼子伸吾、水谷未耶、加藤慶子、伊津野彩子、高宮正之、志賀隆、増本育子、大竹邦明：DNA多型 20,148-152 (2012)

「全個体遺伝子型解析による絶滅危惧植物の保全」

## くその他誌上発表(査読なし)>

1）志賀隆、横川昌史、兼子伸吾、井鷺裕司:Nature Study, 58,2-4 (2012)「全個体遺伝子型解析で絶滅危惧種を護る:シモツケコウホネを例にして」

2）井手雄二、尹丸信弘编：森林遗伭育種学、文泳堂出版、(2012)

「集団内の遺伝的動態 (執筆担当:井鷺裕司)」(印刷中)

## (2) 口頭発表 (学会等)

1) S. KANEKO, F. NOBUSHIMA and Y. ISAGI: East Asian Plant Diversity and Conservation 2 $ ^{nd} $
2) 水谷未耶、兼子伸吾、井鷺裕司: 第57回日本生態学会東京大会(2010)

「日本に生育する絶滅危惧種トキワマンサクの全野生個体解析による多様性評価」

3) 兼子伸吾、大庭俊司、井鷺裕司: 第57回日本生態学会東京大会(2010)「絶滅危惧植物センリゴマの全残存集団を対象とした網羅的遺伝解析」

4) 大竹邦暁、兼子伸吾、増本育子、井鷺裕司: 第57回日本生態学会東京大会(2010)「ユビキタスジェノタイピングによる絶滅危惧植物ヤチシャジンの保全」

5) 志賀隆、杉田勇治、横川昌史、兼子伸吾、井鷺裕司: 第9回日本植物分類学会愛知大会(2010)「水生植物ナガレコウホネ(スイレン科)の形態変異と遺伝的変異」

6) 志賀隆、横川昌史、兼子伸吾、井鷺裕司: 日本植物学会第74回春日井大会 (2010)

「遺伝子解析から見いだされたコウホネ属の絶滅危惧種～見逃されてきた絶滅危惧種とその保全」

7) 井鷺裕司、兼子伸吾、加藤慶子、水谷未耶、増本育子、大竹邦暁:第58回日本生態学会札幌大会(2011)

「二次的自然下に生育する絶滅危惧植物保全のためのユビキタスジェノタイピング」

8) 志賀隆、横川昌史、兼子伸吾、井鷺裕司: 第58回日本生態学会札幌大会(2011)

「地域固有絶滅危惧種シモツケコウホネを守る: ユビキタスジェノタイピングから見えてきたこと」

9) 畑中佑紀、尾関雅章、平尾章、井鷺裕司: 第58回日本生態学会札幌大会(2011)

「AFLPとマイクロサテライト多型解析による絶滅危惧種タデスミレの残存個体群評価

10) 兼子伸吾、西川恵子、井鷺裕司ほか7名: 第58回日本生態学会札幌大会(2011)「全個体ジェノタイピングによる絶滅危惧植物ガシャモクの遺伝的多様性解析」

11) 深田ちひろ、小林禧樹、兼子伸吾、井鷺裕司、丑丸敦史: 第58回日本生態学会札幌大会(2011)「全個体ジェノタイピングによるハリママムシグサの遺伝的構造」

12) T. SHIGA, M. YOKOGAWA, S. KANEKO and Y. ISAGI: East Asian Botany, International Symposium, Tsukuba, Japan, (2011)

“Assessing genetic and genotypic diversities of Nuphar submersa, a critically endangered macrophyte, and its conservation implications”

14) Y. ISAGI, S. KANEKO, K. KATO, A IZUNO, M. MIZUTANI, T. SHIGA, I. MASUMOTO and K. OHTAKE: 18th International Botanical Congress, Melbourne, Australia, (2011)

“Conservation of critically endangered plant species based on information obtained by the ubiquitous genotyping.”

15) S. KANEKO, T. ABE, Y. ISAGI: 18th International Botanical Congress, Melbourne, Australia, (2011)

“Conservation of a critically endangered shrub species Stachyurus macrocarpus var. prunifolius
(Stachyuraceae) based on the ubiquitous genotyping approach."

16) K. KATO, S. KANEKO, Y. ISAGI: 18th International Botanical Congress, Melbourne, Australia, (2011)

“Conservation of a critically endangered perennial species, Veronicastrum villosulum (Plantaginaceae) by ubiquitous genotyping.”

17) 井鷺裕司、兼子伸吾、水谷未耶、加藤慶子、高宮正之、伊津野彩子、志賀隆、増本育子、大竹邦明:日本多型学会 第20回学術集会(2011)

「全個体遺伝子型解析による絶滅危惧植物の保全」

18) S. KANEKO, Y. MATSUKI, X. Y. QIU and Y. ISAGI: The 5th EAFES International Congress, Otsu, Japan, (2012)

“Single clone remaining of Rehmannia japonica, critically endangered plant species in Japan, as revealed by exhaustive genotyping of all remnant populations.”

19) K. KATO, S. KANEKO and Y. ISAGI: The 5th EAFES International Congress, Otsu, Japan, (2012) "Conservation genetics of the endangered clonal herb, Veronicastrum villosulum (Plantaginaceae): analysis of all wild and cultivated populations with microsatellite markers."

20) 内海知子、横川昌史、高宮正之、井鷺裕司: 第59回日本生態学会大津大会(2012)

「マイクロサテライト遺伝マーカーによるウスコキクチナシグサ(絶滅危惧IA類)の極めて低い遺伝的多様性」

21）深田ちひろ、兼子伸吾、横川昌史、井鷺裕司、小林禧樹、丑丸敦史:第59回日本生態学会大津大会(2012)

「絶滅危惧種ハリママムシグサの保全遺伝学」

## (3) 出願特許

特に記載すべき事項はない。

(4)シンポジウム、セミナーの開催(主催のもの)

1）シモツケコウホネを知る・守る (2010年9月23日 栃木県立博物館講堂 参加者126名)

2) ユビキタスジェノタイピングと数理モデルングによる絶滅危惧植物保全 (2011年3月10日 札幌コンベンションセンター 参加者10名)

3) 広島市植物園シンポジウム「ふるさとの自然を守ろう～生物多様性を考える～」(平成23年11月23日、広島市植物園展示資料館、観客50名)

## (5) マスコミ等への公表・報道等

1) 毎日新聞「シモツケコウホネ遺伝子解析 45個体に認識 宇都宮でシンポ 保存へ条例化検討を」(2010年9月24日)

2) 下野新聞「シモツケコウホネ守ろう 生物多様性の意義訴え 宇都宮でシンポ」(2010年9月24日)
3) 徳島新聞「スズカケソウ絶滅回避へ光 自生地と別遺伝子型 京大調査 太田小栽培4株で確認」(2010年10月19日)

4) 徳島新聞「新型遺伝子のスズカケソウ 京大グループ解析へ つるぎ栽培の太田小が提供」(2010年10月21日)

5) 朝日新聞「群落保全 遺伝子型カギ 多様性の維持 適応力高める」(2011年9月25日)

## (6) その他

1) 水谷未耶：「日本に生育する絶滅危惧種トキワマンサクの全野生個体解析による多様性評価」、第57回日本生態学会東京大会ポスター賞 保全分野 優秀賞

2）第13回 日本DNA多型学会優秀研究賞（全個体遺伝子型解析による絶滅危惧植物の保全、井鷺裕司、兼子伸吾、水谷未耶、加藤慶子、高宮正之、伊津野彩子、志賀隆、増本育子、大竹邦明）

### 8. 引用文献

1) C. LIAN and T. HOGETSU: Molecular Ecology Notes, 2, 212-213 (2002)

“Development of microsatellite markers in black locust (Robinia pseudoacacia) using a dual-suppression-PCR technique.”

3) J. K. PRITCHARD, M. STEPHENS and P. DONNELLY: Genetics, 115, 945–959 (2000) "Inference of population structure using multilocus genotype data."

4) D. FALUSH, M. STEPHENS and J. K. PRITCHARD: Genetics, 164, 1567–1587 (2003)

“Inference of population structure using multilocus genotype data: linked loci and correlated allele frequencies.”

5) M. HUBISZ, D. FALUSH, M. STEPHENS and J. K. PRITCHARD: Molecular Ecology Resources, 9, 1322–1332 (2009)

“Inferring weak population structure with the assistance of sample group information.”

7) T. YAMAZAKI: The Journal of Japanese Botany, 36, 351–352 (1961) "Meeting with Rehmannia japonica Makino."

9) Z. XIA, Y-Z. WANG and J. F. SMITH: American Journal of Botany, 96, 519–530 (2009)

“Familial placement and relations of Rehmannia and Triaenophora (Scrophulariaceae s.l.) inferred from five gene regions.”
10) T. SHIGA, J. ISHII, Y. ISAGI and Y. KADONO: Acta Phytotaxonomica et Geobotanica, 57, 113–122 (2006)

“Nuphar submersa (Nymphaeaceae), a new species from central Japan.”

11) M. YOKOGAWA, T. SHIGA, S. KANEKO and Y. ISAGI: Conservation Genetics Resources, (2012) "Development of nuclear microsatellite markers for the critically endangered freshwater macrophyte, Nuphar submersa (Nymphaeaceae), and cross-species amplification in six additional Nuphar taxa" (in press)

12) N. J. OUBORG, W. P. GOODALL-COPESTAKE, P. SAUMITOU-LAPRADE, I. BONNIN and J. T. EPPLEN: Molecular Ecology, 9, 497–498 (2000)

“Novel polymorphic microsatellite loci isolated from the yellow waterlily, Nuphar lutea.”

12) T. MAKINO: Botanical Magazine Tokyo 24:137–147 (1910) "Observations on the flora of Japan."

13) T. SHIGA and Y. KADONO: Acta Phytotaxonomica et Geobotanica, 55, 107–117 (2004) "Morphological variation and classification of Nuphar with special reference to the populations in central to western Japan."

14) C. FUKADA, S. KANEKO, M. YOKOGAWA, T. KOBAYASHI, A. USHIMARU and Y. ISAGI: Conservation Genetics Resources (2012)

“Development of ten microsatellite markers for Arisaema minus (Araceae), a vulnerable herb species in Japan.” (in press)
## (2) 地史的環境変動と近年の温暖化リスク下にある高山における絶滅危惧植物保全に関する研究

東北大学大学院農学研究科	陶山 佳久
<研究協力者>
新潟大学農学部	阿部 晴恵
東北大学農学部	小笠原 玄記
東北大学大学院生命科学研究科	牧 雅之
東北大学大学院生命科学研究科	堀江 佐知子
京都大学大学院農学研究科	横川 昌史
山梨県森林総合研究所	長池 卓男
屋久島生物多様性協議会	手塚 賢至
屋久島生物多様性協議会	荒田 洋一
屋久島生物多様性協議会	斎藤 俊浩
屋久島生物多様性協議会	手塚 田津子
屋久島生物多様性協議会	布施 健吾
北海学園大学工学部	佐藤 謙
北海道立総合研究機構環境科学研究センター	西川 洋子

平成21～22年度累計予算額:28,456千円

(うち、平成22年度予算額:9,535千円)

予算額は、間接経費を含む。

[要旨]高山における絶滅危惧植物保全に関する研究を行う本サブテーマでは、計6種を対象に研究を行った。このうち5種について、DNAマーカーの開発、分布調査、DNA抽出用試料採取、遺伝的解析を行った。他1種については1集団の全個体の分布調査およびDNA抽出試料の採取を行った。

ゴヨウザンヨウラクについては、300に満たない開花株しか存在しないことが認識され、その保全価値があらためて認められた。一方で、遺伝的データからは近年における明確な個体群サイズ縮小の証拠は検出されず、更新状況にも大きな問題は観察されなかった。従って、具体的な保全策としては、まずは現地保全を適切に遂行することが有効だと考えられた。ヤクシマリンドウについては、1,000に満たない株数しか現存しないことが明らかになり、山域間の遺伝的分化も認められたため、すべての分布域における保全の重要性を認めることができる。具体的な保全策として、本研究で行われた現存全個体の位置・写真・DNA記録が存在するという宣言による、盗掘抑止が考えられる。ヒダカソウについては、現状としてすでに生育保護区の設定や立入り制限等の保全対策が講じられているにも関わらず、個体群動態調査からも集団遺伝学的にも著しい個体数の減少傾向が認められた。個体群間は遺伝的に隔離している傾向があるとともに、ほぼ絶滅状態にある個体群も認められることから、全生育地を対象としたさらなる積極的な保全対策が必要であると考えられる。
キリギシソウとキバナノアツモリソウについては、現在当該地域の保全のために実施されている入山規制開始以降は個体群の著しい縮小傾向は認められず、対策に一定の効果が認められた。従って、今後も入山規制を継続し、保全効果を維持することが望まれる。キタダケソウについては、すでに特定国内希少野生動植物種に指定されて保全対策が施されているため、今後も適切な保全対策が継続されることが望まれる。

[キーワード]高山植物、地球温暖化リスク、遺伝的多様性、絶滅危惧種

### 1. はじめに

現在の日本列島の高標高域において島状に存在する高山帯には、氷河期の遺存種などが分布する興味深い生物相が維持されている。また、現在の冷涼な高山環境に適応して生存している種が多いと考えられるため、現在懸念されている温暖化の影響を最も受けやすい生態系のひとつであると考えられる。地球温暖化への危惧を背景として1988年に設立された「気候変動に関する政府間パネル(IPCC)」の報告書においても、地球温暖化に対して脆弱性が高い地域として高山地域が挙げられている。

また高山植物の多くは、人為としての盗掘や踏圧、シカなどによる食害の影響などを受け、気候変動以外の要因によっても絶滅リスクの高いグループである。さらに高山植物は、過去の氷河期-間氷期サイクルの影響を受けて、個体群の分布パターンやサイズに関する様々な変化を経ているため、過去の分布履歴が現在の遺伝的構造に大きく影響していると考えられる。このことは、現在の分布パターンからは認識困難な遺伝的多様性・空間的遺伝構造が存在する可能性が高いと考えられるだけでなく、今後に生じるかもしれない集団サイズや分布パターンの変化によって深刻な遺伝的劣化を受ける可能性があると考えられる。

これらの点から、高山植物の分布の現状と遺伝的状況を明らかにし、適切な保全策を講ずることの意義は大きい。

### 2. 研究開発目的

本研究では、高山に分布する絶滅危惧植物を対象に、個体群動態に大きな影響力を持つと考えられる遺伝的特徴を把握し、適切な保全対策の構築に寄与することを目的とする。そこで、温暖化や盗掘の影響が大きいと考えられる高山植物を対象に、生育位置、繁殖状況を現地調査して正確な分布全容を把握するとともに、遺伝的解析用のサンプルを採集する。また、対象種の遺伝的解析用にマイクロサテライトDNAマーカーを開発して、採取した個体の遺伝子型を決定し、集団遺伝学的な解析を行う。これらのデータをもとにして、遺伝的多様性や対立遺伝子頻度に関する現状把握、遺伝的特徴の評価、集団の遺伝的構造から判断した個体群間の遺伝的違いの把握など、保全活動計画策定に対して有効な情報を提供することを目的とする。

### 3. 研究開発方法

解析は、岩手県の五葉山のみに分布するゴヨウザンヨウラク(ツツジ科:絶滅危惧IA類)、屋久島の高標高域のみに分布するヤクシマリンドウ（リンドウ科:絶滅危惧IB類）、キタダケソウ属の3種として、北海道のアポイ岳周辺のみに分布するヒダカソウ(キンポウゲ科:絶滅危惧IA類)、北海道の軽山のみに分布するキリギシソウ(キンポウゲ科:絶滅危惧IA類)、南アルプスの北岳のみに分布するキタダケソウ(キンポウ
ゲ科: 絶滅危惧 □類)を、そして北海道の崋山・音別および本州中部以北の限られた地域に分布するキバナノアツモリソウ(絶滅危惧IB類)の合計6種を対象とした。

## (1) ゴョウザンヨウラク

ゴヨウザンヨウラク Menziesia goyozanensis（ツツジ科ヨウラクツツジ属）は高さ1～1.3mの落葉低木で、1962年に新種記載されたツツジ科の植物で、岩手県の五葉山のみに分布が知られている（図(2)-1）。環境省レッドリストでは絶滅危惧IA類に指定されており、2002年の報告 $ ^{1} $ によれば、「100 × 10m以下のきわめて限られた範囲に約60個体が生育する」と記載されている。

本研究においてすべての開花株の位置情報をGPSで記録し、サイズ(自然高・地際直径)と開花数の測定およびDNA抽出用サンプルの採取を行った。さらに、比較対象として同所的に生育する近縁種コヨウラクツジについても、ゴヨウザンヨウラクの生育範囲内ですべての株のサンプル採取を行った。さらに同属の近縁種であるガクウラジロヨウラクを加え、3種間での遺伝的比較を行った。遺伝マーカーとして、Taniらのプロトコル²)によりマイクロサテライトマーカーを開発し、遺伝的解析を行った。

図(2)−1. ゴヨウザンヨウラクの花(左)と開花個体の枝(右)

## (2) ヤクシマリンドウ

ヤクシマリンドウ Gentiana yakushimensis (リンドウ科リンドウ属)は、鹿児島県屋久島の高標高域における花崗岩上の割れ目に生育する多年生草本で、環境省レッドリストでは絶滅危惧IB類に指定されている（図(2)-2）。本種は屋久島の山岳山頂部にのみ分布することから、地球温暖化に際してより標高の高い場所に移動することができず、温暖化による絶滅が懸念される。また盗掘による個体数の減少も危惧されている。

本研究では、分布地における全個体の分布情報を、GPSおよび目視による位置記録、写真記録によってとりまとめ、繁殖状況調査（開花株数・結実株数・分枝数）およびDNA解析のためのサンプリングを行った。

マイクロサテライトマーカーは、採取したヤクシマリンドウのサンプルを材料として、Taniらのプロトコル $ ^{2)} $ により開発した。また、近縁種であるGentiana crassicaulisですでに開発されているマイクロサテライトマーカー $ ^{3)} $ 及びエゾリンドウGentiana trifloraで開発されたマーカー（西原ら、未発表）について、ヤクシマリンドウへの適用可能性を確認して使用した。
図(2)−2. ヤクシマリンドウの開花株(左)と分布調査地における調査風景(右)

## (3) ヒダカソウ

ヒダカソウ Callianthemum miyabeanum (キンポウゲ科キタダケソウ属) は北海道様似町アポイ岳周辺のカンラン岩・蛇紋岩地帯のみに生育する固有種であり、環境省レッドリストでは絶滅危惧IA類に指定されている (図(2)−3)。本種はアポイ岳の代表的高山植物として注目度が高いだけでなく、サハリンに生育するカラフトミヤマイチゲと、後述するキリギシソウ (絶滅危惧IA類)、およびキタダケソウ (絶滅危惧□類) 等の近縁希少種があり、これらとの種間比較が可能である点で研究対象種としての利点がある。

本種については、全ての開花株の位置情報把握とサンプリングをアポイ岳とその近隣の吉田山、幌満岳の分布域で行った。また、株ごとに分枝数、花茎数のカウントも行った。また、狭い範囲内でのクローン構造を明らかにするために、6カ所の1m×1mモニタリングプロットにおいて、全株の位置情報記録およびサンプリングを行った。

遺伝マーカーについては、採取したヒダカソウのDNAサンプルを使用し、Taniらのプロトコル $ ^{2)} $ によりマイクロサテライトマーカーを開発し、遺伝的解析を行った。

図(2)-3. ヒダカソウの花(左)とヒダカソウ分布地であるアポイ岳(右)
## (4) キリギシソウ

キリギシソウCallianthemum kirigishiense（キンポウダ科キタダケソウ属）は、北海道芦別市塀山のみに分布する多年草で(図(2)-4)、環境省レッドリストでは絶滅危惧IA類に指定されている。分布調査は、北海道環境科学研究センターの資料に基づいて、全開花株と6つのモニタリング区内の全株の位置情報記録を行い、DNA分析用に株ごとのサンプリングを、他対象種と同様の方法で行った。

遺伝マーカーの開発は、前述したヒダカソウのサンプルを対象に、Taniらのプロトコル $ ^{2)} $ によりマイクロサテライト部位の濃縮を行い、ヒダカソウと同属である本種においても利用できるマーカーを選抜し、遺伝的解析を行った。

図(2)-4. キリギシソウの株(左:写真中央)とキリギシソウの分布地である崄山の景観

## (5) キタダケソウ

キタダケソウCallianthemum hondoense(キンポウゲ科キタダケソウ属)は、南アルプスの北岳のみに分布する高山植物で(図(2)−5)、特定国内希少野生動植物種に指定された絶滅危惧植物(□類)である。本研究では、本研究で対象とした同属のヒダカソウおよびキリギシソウの比較対象種として位置づけ、集団遺伝学的に比較可能なサンプルの採取を行い、ヒダカソウを対象として開発したマイクロサテライトマーカーのうちで本種でも利用可能なものを選抜し、集団遺伝学的解析を行った。

図(2)-5. キタダケソウの株(左)とキタダケソウの分布地である北岳の景観(右)
## (6) キバナノアツモリソウ

キバナノアツモリソウCypripedium yatabeanum (ラン科アツモリソウ属) は落葉性の地生ランであり (図(2)−6)、環境省レッドリストでは絶滅危惧IB類に指定されている。本研究では、本種の北海道におけるすべての生育地である崄山の個体群および、音別町の海岸沿いに生育する約1,000株の個体群を解析対象とした。調査は、崄山の全株の位置情報把握及び株ごとのサンプリングを他対象種と同様の方法で行った。また音別町の個体群においては、約50株についてランダムサンプリングを行った。

Taniらのプロトコル $ ^{2)} $ によりマイクロサテライトマーカー開発を行うとともに、同属で開発された既存のマーカーの利用可能性を検討した。

図(2)–6. キバナノアツモリソウの花(左)とキバナノアツモリソウ分布調査風景(右)

### 4. 結果及び考察

## (1) ゴョウザンヨウラク

岩手県の五葉山における分布地において全開花株の分布調査を行い、数ヘクタールの範囲内に241株が分布していることを確認し、それらの位置とサイズを記録した。また、生育状況調査によって明らかになった開花株の平均樹高（自然高）は96.2cm、平均地際直径は14.5mm、開花数（2009年）の平均値は51花、平均結果率は49%であった（図（2）－7）。

平均:96.2cm

平均:14.5mm

平均:51花

図(2)−7. ゴヨウザンヨウラク開花株の樹高、開花数、結果率の頻度分布。
本研究において新たに開発した16座のマイクロサテライトマーカーは(表(2)-1) $ ^{3)} $ 、個体識別や遺伝的多様性、空間的遺伝構造等の解析に十分に使用できる多型性を示した。開発したマイクロサテライトマーカーのうち11座を用いてジェネット識別、遺伝的多様性、空間的遺伝構造等の解析を241株のサンプルを対象に行った。

表 $ (2) $ -1. ゴヨウザンヨウラクにおいて開発したマイクロサテライトマーカー

遺伝子座	プライマー塩基配列(5'-3')	繰り返し配列	Accession No.
Mg15	F: TCTCGAGGTGGGTGGTCTCT	(TC)15	AB597166
R: AGCAGTGATGTTGGCAGTAATG
Mg17	F: ACTCCCAACTTTCTCTCTAGCC	(CT)4CC(CT)15	AB597167
R: CGGGTGGAATGATCTGGTTGAG
Mg26	F: TTCTCCAGCTGCGCACCA	(CT)9	AB597168
R: GAAAGCACAAGCCGAGCAAC
Mg59	F: AACTTTCCACTTCGACGTTTTC	(TC)5CC(TC)14C(TC)	AB597169
R: TCAGCACCCGATCCAT
Mg125	F: CCGCAAATCGATTAATCT	(CA)4CTCG(CA)2TG(CA)6	AB597170
R: ACAAATGGCGTCTTACCT
Mg140	F: GTACCTTGGTTTTTACGG	(CT)8AGAT(CT)3...	AB597171
R: GTTTCCATTAACGAGGTG	(CT)2CC(CT)3CA(CT)9
Mg142	F: CATGGGAGGGAGAGTACAAT	(GA)3GG(GA)15	AB597172
R: AGTACACTCAGTGGGTCCAA
Mg205	F: CCAAATAGCTAGACCACC	(GA)8	AB597173
R: AGGAGGAAATTCGTAGATTA
Mg213	F: CCAAAACCTTTCGCTACA	(TC)8...(TC)5...(TC)10	AB597174
R: ATTTCAAGCTAAGTTACCTCAAA
Mg214	F: GGCAGCCCTGCAATAAG	(GA)6GG(GA)13	AB597175
R: TAGGACGCTTCAGTTCCC
Mg218	F: GGCTTCTTCGCTTCTATCCT	(TC)18	AB597176
R: CCTCCTGCTCACGATTAGTCC
Mg220	F: ATTTTAAGGAGCGGAGTT	(GT)9	AB597177
R: AGTTCTATTACCTAGTCGCTTTG
Mg223	F: GCTACAAACCCACTCAAGTAA	(GA)13	AB597178
R: TTTCTGGAAATCTCGC
Mg240	F: TGAGGAAGGGAAAAACAGATCG	(TC)16...(TC)7	AB597179
R: CCCAGCAATGAATCCCAATAC
Mg247	F: CGTGTCAATTATGCCTAAACA	(GT)9(GA)18	AB597179
R: CTACCACTGTGCCAATCC
Mg286	F: AGGGGAGTTAGGGTTTGG	(GA)23	AB597180
R: CGGGCATTCGCTAGTAT
遺伝解析の結果、ゴヨウザンヨウラクの全開花株241株は、遺伝的には192クローンによって構成されていることがわかった（図(2)-7）。同一クローンに属するラメットは数メートル程度以内の近距離に分布していた。また、個体間の遺伝的な距離 $ ^{4} $ と空間的な距離の関係を解析した結果、50m以下の近距離に近縁な個体が生育する空間的遺伝構造が検出された（図(2)-8）。

図(2)−7. 岩手県五葉山におけるゴョウザンヨウラクの開花株の分布位置とクローンの分布、および同所的に分布するコヨウラクツツジの開花株の分布位置

図(2)−8. ゴヨウザンヨウラク個体ペア間の遺伝的な近さと空間的距離との関係

また、開発したマーカーのうち12座は近縁種のコヨウラクツツジについても遺伝的解析に使用できる多型性を示した。さらに、別の近縁種であるガクウラジロヨウラクについても7座が利用可能であったため、これら7座のマーカーを用いて集団遺伝学的な種間比較を行った。その結果、遺伝的多様性のレベルを示す尺度
である、検出されたアリル数(k)、アレリックリッチネス(A)、ヘテロ接合度の観察値( $ H_{0} $ )、ヘテロ接合度の期待値( $ H_{E} $ )のいずれにおいても、ゴヨウザンヨウラクは近縁種であるコヨウラクツツジおよびガクウラジロヨウラクよりも低い値を示した(表(2)-2)。

表(2)−2. ゴヨウザンヨウラクとその近縁種であるコヨウラクツツジおよびガクウラジロヨウラクとの遺伝的多様性比較

遺伝子座	N	K	RS	HO	HE	FIS
ゴヨウザンヨウラク
Mg26	189	6	3.95	0.333	0.323	-0.031
Mg59	190	18	14.41	0.895	0.87	-0.028
Mg140	192	3	2.23	0.354	0.434	0.185
Mg218	192	17	13.41	0.891	0.872	-0.021
Mg233	192	8	6.65	0.719	0.804	0.106
Mg240	187	8	6.13	0.348	0.553	0.372
Mg247	183	23	18.53	0.803	0.9	0.108
平均	189.3	11.9	9.33	0.62	0.679	0.087
ゴヨウラクツツジ
Mg26	49	23	22.48	0.816	0.939	0.132
Mg59	49	14	13.42	0.612	0.72	0.151
Mg140	49	6	5.83	0.327	0.552	0.411
Mg218	49	11	10.91	0.592	0.745	0.207
Mg233	49	16	15.98	0.878	0.921	0.048
Mg240	49	22	21.79	0.813	0.936	0.133
Mg247	49	23	22.64	0.837	0.937	0.108
平均	48.9	16.4	16.15	0.696	0.821	0.15
ガクウラジロヨウラク
Mg26	50	18	17.66	0.86	0.905	0.051
Mg59	50	15	14.79	0.88	0.914	0.038
Mg140	49	17	16.48	0.653	0.69	0.055
Mg218	50	13	12	0.76	0.814	0.067
Mg233	50	10	9.96	0.76	0.829	0.084
Mg240	50	20	19.36	0.66	0.916	0.282
Mg247	49	23	22.56	0.898	0.943	0.048
平均	49.7	16.57	16.12	0.782	0.859	0.1

N: 分析個体数、k: 対立遺伝子数、 $ R_{S} $ : アレリックリッチネス、 $ H_{0} $ : ヘテロ接合度の観察値、 $ H_{E} $ : ヘテロ接合度の期待値、 $ F_{IS} $ : 近交係数

特に、ほぼ同所的に同様の集団サイズで分布するコヨウラクツツジは比較対象として条件がほぼ同一と言えるため、ゴヨウザンヨウラクが比較的低いレベルの遺伝的多様性を保持している可能性が高いと考えられる。一方、近交係数 $ (F_{IS}) $ についてはゴヨウザンヨウラクで特に高い傾向は認められなかった。
また、ゴヨウザンヨウラクの系統的な位置づけを明らかにするために、7座のマイクロサテライトマーカーの遺伝子頻度を元にした3種間の遺伝距離 $ (D_{A}) $ によって3種の遺伝的関係を近隣結合法によって図化した。また、同様にストラクチャー解析 $ ^{5)} $ ， $ ^{6)} $ および主座標分析によって種間関係を解析した(図(2)-9)。その結果、いずれの解析によってもゴヨウザンヨウラクと他種とは遺伝的に明瞭に異なることが示され、系統的にもゴヨウザンヨウラクの保全価値が確認された。

a)

b)

c)

図(2)−9. ゴヨウザンヨウラクとその近縁種であるコヨウラクツツジおよびガクウラジロヨウラクとの遺伝的関係を示すNJ法による分岐図(a)、ストラクチャー解析図(K=2の場合)(b)（それぞれの縦バーが1個体を表し、色分けされた部分の割合が、それぞれ異なる遺伝的組成に由来すると推定されることを意味する）、および主座標分析図(c)（一つの点が1個体を示し、近い位置にプロットされるほど遺伝的に似通っていることを示す）。

さらに、ボトルネック解析によって、集団サイズの急激な減少があったのかを集団遺伝学的に解析 $ ^{7} $ したが、近縁種と比較して明確な強いボトルネックを受けた事は検出されなかった。

生育地においては多くの種子生産および幼稚樹の更新が観察され、個体群が危機的な衰退過程にある兆候は認められなかった。

以上の遺伝的な解析による成果と、個体群の良好な生育状況を勘案して総合的に考察すると、まず本種
が300に満たない開花株（開花個体数では200に満たない）しか存在しない希少種であることが、本プロジェクトの網羅的解析によって明確に認識され、その保全価値があらためて認められた。一方で、本種の分布域において、ボトルネックが発生した証拠は集団遺伝学的には検出されず、更新状況にも明確な問題は認められなかった。これらのことから、本種の具体的な保全策としては、まずは現地保全を適切に遂行することが有効である。ただし、その分布範囲はきわめて限られているため、分布地において山地崩壊などの大規模な自然災害があれば、個体群の存続に深刻な事態を招く危険性も想定され、現地外保存を行うことも考慮に入れる必要がある。また、開花個体のクローン数は188に過ぎないうえ、遺伝的多様性が近縁種と比較して低いことから、近交弱勢などによる個体群の遺伝的劣化については注意が必要である。

## (2) ヤクシマリンドウ

本研究での分布調査で、鹿児島県屋久島の永田岳周辺に226株、宮之浦岳から翁岳に至る山域に470株、さらに安房岳から黒味岳に至る山域に252株の分布を確認し、全分布域に948株が生育していることを確認した(図(2)-10)。

図(2)−10. 屋久島におけるヤクシマリンドウの分布域および分布数概略図(保全目的のため、詳細な位置は省略した模式図を示す)

これらの植物個体は、すべてその位置をGPSによって記録し、写真撮影するとともに、採取可能な株についてDNA分析用に微量サンプルを採取した。また、分枝数、開花の有無等の生育状況についても記録し
た。2010年に調査を行った宮之浦岳から翁岳に至る山域の全696個体のうち、開花個体は48%であり、そのうち9%の個体で結実が認められた(図(2)-11)。これらの調査により、本種の生育実態の全体像が初めて明らかになった。

開花調查(計696株)

結実調査(228株)

図(2)−11. 屋久島におけるヤクシマリンドウの開花率と結実率

遺伝的解析は、本研究で開発した4座のマイクロサテライトマーカーと8座の一塩基多型(SNP)領域、同属のGentiana crassicaulisで開発されたマイクロサテライトマーカー $ ^{7)} $ 、西原ら（未発表）により開発されたエゾリンドウのマイクロサテライトマーカーのうち16座について、本研究で利用可能な多型性があるか調査した。その結果、13座で解析が可能であることがわかり、さらにそのうち6座のマイクロサテライトマーカーに多型が認められた(表(2)-3)。

これらのマーカーを用いて、永田岳周辺から採集した211サンプル及び宮之浦岳周辺から採集した97サンプルを対象として遺伝的解析を行った。また近縁普通種との比較のため、宮城県大崎市において採取したエゾリンドウ9個体についても、同様に遺伝的解析を行った。ある種で開発されたマイクロサテライトマーカーを他種に適応して遺伝的多様性を比較する場合には、マーカーの種特異性が影響するため注意が必要だが、ヤクシマリンドウで得られた遺伝的多様性の指標であるヘテロ接合度の観察値 $ (H_{0}) $ は0.059、ヘテロ接合度の期待値 $ (H_{\mathrm{E}}) $ は0.082で、いずれもエゾリンドウで得られた値（0.368および0.444）よりも明らかに低い値を示した。

また、ヤクシマリンドウの種内の集団間比較では、遺伝的多様性の指標であるヘテロ接合度の期待値 $ (H_{\mathrm{E}}) $ は、永田岳で0.11、宮之浦岳周辺で0.18、アレリックリッチネス $ (R_{\mathrm{S}}) $ は永田岳で1.6、宮之浦岳周辺で2.0であり、普通種であるエゾリンドウ9株のヘテロ接合度の期待値やアレリックリッチネスと比較して、明らかに低い値を示した(表(2)-4)。永田岳と宮之浦岳周辺の峰間の遺伝的分化程度 $ (F_{\mathrm{st}}) $ は0.275であり、やや高い遺伝的分化が認められた。
表(2)−3. ヤクシマリンドウとその近縁種エゾリンドウにおけるマイクロサテライトマーカーの変異性

遺伝子座	N	k	HO	HE
ヤクシマリンドウ
Gtm_10	152	1	0.000	0.000
Gtm_81	144	1	0.000	0.000
Gtm_84	133	2	0.008	0.008
Gtm_86	145	1	0.000	0.000
Gtm_94	148	2	0.034	0.166
Gcr_128	148	1	0.000	0.000
Gcr_169	139	3	0.115	0.391
Gyaku_002	151	1	0.000	0.000
Gyaku_003	153	1	0.000	0.000
Gcr_197	151	1	0.000	0.000
Gcr_59	177	2	0.006	0.028
Gcr_79	176	5	0.534	0.404
Gcr_138	171	5	0.070	0.069
平均	153	2	0.059	0.082
エヅリンドウ
Gtm_10	9	6	0.889	0.850
Gtm_81	9	6	0.778	0.758
Gtm_84	9	3	0.333	0.392
Gtm_86	9	3	0.111	0.216
Gtm_94	9	7	0.667	0.843
Gcr_128	9	1	0.000	0.000
Gcr_169	4	4	0.250	0.750
Gyaku_002	9	2	0.444	0.366
Gyaku_003	9	1	0.000	0.000
Gcr_197	9	4	0.222	0.542
Gcr_59	-	-	-	-
Gcr_79	8	2	0.500	0.400
Gcr_138	9	3	0.222	0.216
平均	9	3.5	0.368	0.444

Nは分析個体数、kは対立遺伝子数、 $ H_{0} $ はヘテロ接合度の観察値、 $ H_{E} $ はヘテロ接合度の期待値
表(2)−4. マイクロサテライトマーカー6 座を用いたヤクシマリンドウおよびエゾリンドウの遺伝的多様性

種名(集団)	N	G	G/N	A	R_{S}	H_{E}
ヤクシマリンドウ(永田岳)	211	14	0.07	2.3	1.6	0.11
ヤクシマリンドウ(宮之浦岳周辺)	97	6	0.06	2.7	2	0.18
エゾリンドウ	9	9	1	3.3	3.2	0.39

N:解析個体数, G:クローン数, A:遺伝子座あたりの平均対立遺伝子数, $ R_{S} $ : アレリックリッチネス, $ H_{E} $ : ヘテロ接合度の期待値

以上の成果から、ヤクシマリンドウがわずか1,000に満たない株数しか現存しない絶滅危惧種であることが明らかになった。また、山域間で明瞭な遺伝的分化があることから、すべての個体群における保全の重要性を認めることができる。保全策としては、盗掘抑止を第一に考慮に入れなければならないが、本研究で網羅的に行われた全植物個体の位置・写真・DNA記録と照合すれば、万が一盗掘株が流通した場合にその由来の特定が可能であるという事実を一般に周知することにより、盗掘の抑制効果が期待できる。現段階では、このような対策には法的な拘束力は無いが、法生物学的な応用として前向きな検討が必要だろう。

## (3) ヒダカソウ

これまでに分布が確認されている北海道アポイ岳周辺の5つの生育地（保全上の理由により、詳細な場所を伏せて生育地A～Eと標記する）において、2010年に全開花株の分布調査・サンプリングを行った。その結果、生育地Aでは開花株を確認できず、そのほかの生育地においてもごくわずかな開花株数しか観察されなかった（図(2)-12、保全上の理由によりここでは実数を伏せる）。

※A-E は北海道環境科学研究センターのモニタリングプロット名に基づく

図(2)−12. ヒダカソウの生育地における2005年と2010年の開花株数の比較(保全上の理由により縦軸の実数を伏せる)
これまでに継続して行われて来た個体群動態調査の結果を用いて近年の個体数変化を見てみると、全生育地における開花株は、2005年から2010年の間に、約15%にまで減少し、急激な減少傾向にあることが明らかになった。このような減少をもたらした直接的な原因は不明であるが、花粉制限、乾燥化、ハイマツの侵入など、いくつかの生育環境の変化が指摘されている $ ^{8} $ 。

本研究で17座のマイクロサテライトマーカーを開発し、そのうち多型性のある15座を有効なマーカーとして集団遺伝学的解析を行った(表(2)−5)。有効であった15座のマーカーは、他の近縁種(後述するキリギシソウおよびキタダケソウ)においても良好なPCR増幅が見られ利用可能であった。

表(2)−5. ヒダカソウにおけるマイクロサテライト 15 遺伝子座の変異性

遺伝子座	N	K	$ H_{E} $	$ H' $
Cm_004	24	5	0.574	1.061
Cm_005	24	8	0.729	1.55
Cm_011	24	16	0.803	2.074
Cm_012	24	12	0.782	1.881
Cm_013	24	11	0.734	1.727
Cm_014	24	12	0.842	2.099
Cm_016	24	15	0.876	2.341
Cm_017	24	10	0.743	1.705
Cm_018	24	14	0.815	2.093
Cm_020	24	19	0.906	2.707
Cm_023	24	8	0.714	1.53
Cm_032	24	9	0.701	1.519
Cm_035	24	16	0.897	2.465
Cm_050	24	22	0.907	2.733
Cm_052	24	13	0.821	2.041
Average	24	12.67	0.789	1.968

N: 分析個体数, k: 対立遺伝子数、HE: ヘテロ接合度の期待値、H': Shannon–Weiner diversity index

開発したマイクロサテライトマーカーのうち多型性が高く、情報量の多い5座のマーカーを用いて遺伝的多様性と分集団間の分化に関する詳細な解析を行った。その結果、いずれの分集団(個体群)においても高い遺伝的多様性が検出され(表(2)−6)、分集団間の遺伝的分化も比較的高いレベル(遺伝子分化係数： $ G_{ST}=0.16 $ )であることがわかった。また、個体群内に設置された $ 1m\times1m $ の全株調査方形区を対象として解析したジェネット(遺伝的に同一な個体：クローン)識別の結果では、ごく近傍ではクローン成長による株の形成が検出され、1つのジェネットは最大11ラメットによって構成されていることがわかった(表(2)−7)。また、近年に急激な集団サイズの減少があったのかを集団遺伝学的に検出する解析 $ ^{7} $ を試みたところ(ボトルネック解析)、近縁種と比較しても強いボトルネックを受けている可能性が示唆された。
表(2)−6. マイクロサテライト 5 遺伝子座の遺伝子型をもとにしたヒダカソウ個体群の遺伝的多様性(保全上の理由で、集団名は記号で標記する)

集团	N	RS	HE	FIS
1	17	6.25	0.72	-0.04
2	55	6.40	0.66	-0.01
3	41	11.30	0.86	-0.03
4	98	8.20	0.79	0.10

Nは分析個体数、Kは対立遺伝子数、 $ R_{S} $ はアレリックリッチネス、 $ H_{0} $ はヘテロ接合度の観察値、 $ H_{E} $ はヘテロ接合度の期待値、 $ F_{IS} $ は近交係数

表(2)−7. ヒダカソウの各個体群における $ 1m \times 1m $ 方形区内の株数およびクローン数 (保全上の理由で、集団名は記号で標記する)

方形区	N	G	N/G
Y-E	17	12	1.4
A-D	47	18	2.6
H/H-B	22	4	5.5
H/H-C	20	12	1.7
H-C	72	34	2.1
H-D	24	12	2.0
平均	33.7	15.3	2.6

N: 分析個体数, G: クローン数

以上の成果と、昨年までに得られた個体群の明らかな縮小傾向から総合的に考察すると、絶滅危惧植物としてのヒダカソウ保全の緊急度は極めて高いと考えられる。つまり、現状としてすでに生育保護区の設定や立入り制限等の保全対策が講じられているにも関わらず、開花株数が著しく減少していることを重視する必要がある。個体群間では遺伝的に隔離している傾向があるとともに、個体群によってはほぼ絶滅状態にある場所が認められることを考慮すると、全生育地を対象としたさらなる積極的な保全対策が必要と考えられる。現状を考えると、現地の保全だけでは本種の保全にとって手遅れになる可能性が十分にあるため、現地外保全や積極的な復元・再生事業等も必要である。

## (4) キリギシソウ

北海道芦別市嵯山における5つのモニタリング区内（A～Fプロット：合計約112m²）において全株の分布調査・サンプリングを行った（生育地情報は北海道環境科学研究センターの資料に基づく）。2010年度の調査により、確認された全株のうち、7分の1が開花株であると認められた（ここでは保全上の理由により実数を伏せる）。2000年から行われているモニタリングデータと比較すると、株数、開花株数ともに横ばいかやや減少傾向であった。また、Dプロットは2006年にがけ崩れのため生育地が崩壊したものの、2010年には株数が回復したことが確認された。