Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
して当てはまらない。ただし、各集団が別々の遺伝子型を有するため、集団間での移植等はせずに集団の維持を行う必要がある。今回調査地とした全4集団は、集団の中には集団2と集団4のように個体数が少なく、消滅のリスクが高い集団も存在するが、4集団全てにおいて集団内で有性生殖による世代交代が行われていることが確認された。そのため、各集団において実生を介した世代交代に適した環境を作ることで、集団の保持と個体数の増加に努めることが重要である。しかし、遺伝的多様性が無いため、病害や突発的な環境（物理的および生物的）の変化に対する適応度は著しく低いというリスクは避けられない。生育地外における遺伝子保全対策も必要と思われる。

## (3) アオグキイヌワラビ

アオグキイヌワラビにおいて開発したマイクロサテライトマーカーは、15遺伝子座(Avir029、Avir133、Avir193、Avir204、Avir211、Avir214、Avir235、Avir238、Avir249、Avir250、Avir255、Avir273、Avir064、Avir066、Avir155)において、PCR増幅により明瞭なピークパターンが得られ、集団間の対立遺伝子に多型性が認められた(表(3)－5)。

開発した15座のマイクロサテライトマーカーの汎用性を同属種で確かめたところ、タニイヌワラビでは14遺伝子座、ツクシイヌワラビは15遺伝子座、ヤマイヌワラビでは14遺伝子座において良好なピークパターンが得られ、遺伝的多様性の評価が可能になった（表(3)－6）。これまで、アオグキイヌワラビを対象としたアロザイム分析では変異がまったく得られなかったが、マイクロサテライトマーカーでは多くの変異が検出でき、今回開発したマイクロサテライトマーカーの有効性が高いことがわかった。作成したマイクロサテライトマーカーが系統的に遠いヤマイヌワラビにも適用できたことから、メンダ属の多数の種に使用できる有効なマーカーが得られたと考えられる。このうち、Avir193とAvir064の2座は4種とも変異が無かったので、今回の分析には13座を用いた。

開発した13座のマイクロサテライトマーカーを用いて、集団1（5個体）、集団2（34個体）、集団3（59個体）、集団4（5個体）の計103個体を対象に分析した。マイクロサテライト遺伝子座13座における遺伝子座あたりの対立遺伝子数（A）は、アオグキイヌワラビでは1～5で平均2.08、一方、タニイヌワラビでは2～9で平均4.38、ツクシイヌワラビでは1～5で平均3.00、ヤマイヌワラビでは0～8で平均4.67であった（表（3）-7）。アオグキイヌワラビは、解析を行った4種の内、サンプルサイズが最も大きいにもかかわらず、1遺伝子座あたりのアリルの数が最も少なかった。 $ H_{E}=0.21 $ と $ H_{0}=0.21 $ は、他3種から有意に $ (P<0.001\text{と}P<0.05) $ 低く、アオグキイヌワラビの遺伝的多様度が低いことが示唆された。
表(3)−5. アオグキイヌワラビにおいて開発したマイクロサテライトマーカー

Locus	Primer sequence (5'-3')	Repeat	Accession No.
Avir029	F: CCTCTTGAGCCTAGCGATACR: ACACACACACACTCTCTCTCTC	(AC)6(TC)8	AB623256
Avir133	F: GGGAGATTGTACCCAATACTGTR: ACACACACACACTCTCTCTCTC	(AC)6(TC)7	AB623257
Avir193	F: TACAGTAGTCCTAGCAGCCTCAR: ACACACACACACTCTCTCTCTC	(AC)6(TC)8	AB623258
Avir204	F: GTGAAGAATCCATAGGCTCAATR: ACACACACACACTCTCTCTCTC	(AC)6(TC)7	AB623259
Avir211	F: AAGAGATCGATGCTTTATGCTAR: ACACACACACACTCTCTCTCTC	(AC)6(TC)12	AB623260
Avir214	F: CTGTGTGCCTGCTGTTAGTAATR: ACACACACACACTCTCTCTCTC	(AC)6(TC)9	AB623261
Avir235	F: TTCTTGACATAACTTGCAATAAA: ACACACACACACTCTCTCTCTC	(AC)6(TC)7	AB623262
Avir238	F: ATTGTCCACACTAGAGCACTGGAR: ACACACACACACTCTCTCTCTC	(AC)6(TC)7	AB623263
Avir249	F: GCTCTCTCGTTTGATCTGGR: ACACACACACACTCTCTCTCTC	(AC)6(TC)7	AB623264
Avir250	F: CGTGTGGGTTATAAGCTCTTGR: ACACACACACACTCTCTCTCTC	(AC)6(TC)7	AB623265
Avir255	F: CGCTACACCCTTAACTTTGAA: ACACACACACACTCTCTCTCTC	(AC)6(TC)7	AB623266
Avir273	F: AGCTCTTTTAGCTCGCTCR: ACACACACACACTCTCTCTCTC	(AC)6(TC)11	AB623267
Avir064	F: GATCGTATCTACGTTCACCACR: AGAGAGAGAGAGAGAGACACAC	(AG)8(AC)5	AB623268
Avir066	F: CAAAAGATAGTCGTTTAGGTCTTR: AGAGAGAGAGAGAGAGACACAC	(AG)8(AC)6	AB623269
Avir155	F: TGGGAGAAAGTGAGTAAGTGTR: AGAGAGAGAGAGAGAGACACAC	(AG)8(AC)7	AB623270
表(3)–6. アオグキイヌワラビにおいて開発したマイクロサテライトマーカーの近縁種における汎用性

Locus	タニイヌワラビ(n=25)	ツクシイヌワラビ(n=16)	ヤマイヌワラビ(n=21)
Na	$ H_{E} $	Na	$ H_{E} $	Na	$ H_{E} $
Avir029	9	0.73	4	0.52	5	0.58
Avir133	4	0.62	5	0.62	6	0.74
Avir193	1	0	1	0	1	0
Avir204	5	0.6	2	0.49	3	0.52
Avir211	7	0.76	3	0.65	3	0.52
Avir214	3	0.55	3	0.61	2	0.48
Avir235	5	0.69	3	0.66	7	0.78
Avir238	3	0.5	1	0	4	0.54
Avir249	3	0.21	3	0.17	2	0.5
Avir250	3	0.51	3	0.26	6	0.64
Avir255	7	0.71	2	0.49	8	0.77
Avir273	3	0.25	5	0.57	7	0.7
Avir064	1	0	1	0	1	0
Avir066	2	0.56	2	0.49	-*	-*
Avir155	3	0.56	3	0.64	3	0.33
average	3.9	0.48	2.8	0.41	3.8	0.51

$ ^{*} $ は PCR 反応によって増幅しなかったことを示す.

表(3)−7. マイクロサテライトマーカー13 遺伝子座に基づくアオグキイヌワラビと近縁種の遺伝的多様性

N	A	$ H_{E} $	$ H_{O} $	C	PD	$ H' $
アオグキイヌワラビ	103	2.08	0.21	0.34	28	0.27	2.44
集団1	5	1.38	0.18	0.35	3	0.60	1.37
集団2	34	2.38	0.2	0.38	9	0.26	1.61
集団3	59	1.85	0.2	0.33	19	0.32	2.49
集団4	5	1.38	0.19	0.38	1	0.20	0
タニイヌワラビ	25	4.38	0.56	0.69	19	0.76	3.94
ツクシイヌワラビ	16	3	0.47	0.74	11	0.69	3.25
ヤマイヌワラビ	21	4.67	0.59	0.76	20	0.95	4.3

個体が保有する対立遺伝子の組み合わせ(MLAC: multi locus allele combination)は、現存するアオグキイヌワラビ全体で28種類(C=MLAC数)、MLACが異なる割合(PD=C/個体数)は0.27だった(表(3)-7)。各集団では、集団1がC=3、PD=0.6、集団2がC=9、PD=0.26、集団3がC=19、PD=0.32、集団4がC=1、PD=0.2だった。集団3が最も変異に富み、集団4は全く変異が無かった。タニイヌワラビでは、C=19、PD=0.76、ツクシイヌワラビでは、C=11、PD=0.69、ヤマイヌワラビでは、C=20、PD=0.95であり、アオグキイヌワラビが最も変異が少なかった。アオグキイヌワラビにおいては、同一のMLACが頻繁に見られ、このMLACを遺伝子型番号1とした。遺伝子番号1と分析された個体は、集団1で3個体(60%)、集団2で25
個体（74%）、集団3で36個体（62%）、集団4で5個体（100%）、全体で69個体（67%）であった。また遺伝子番号1以外で2個体以上確認されたMLACは4種であり、他の23種のMLACは各1個体ずつであった。

図(3)-9.アオグキイヌワラビ集団における優占する遺伝子型(遺伝子型1)の個体が各集団に占める割合.Nは分析個体数を示し、円グラフ青色および数値が遺伝子型1を示した個体が占める割合を示す.

集団間の遺伝的分化の程度を示す $ F_{ST} $ 及び $ R_{ST} $ の値は、集団1と集団4の間以外は低く、遺伝的分化はほぼ生じていないことが示された(表(3)－8)。集団1と集団4で値が大きくなったのは、双方の集団サイズが小さいためと思われる。個体数が多い集団2と集団3の間では、 $ F_{ST} $ が0.00、 $ R_{ST} $ が0.01であり、特に小さい値を示しているのは、両者が近接した2集団であり、遺伝子流動が他の集団間に比べて頻繁であるためと考えられる。

表(3)-8. アオグキイヌワラビ集団間の遺伝的分化( $ R_{ST} $ 上右、 $ F_{ST} $ 下左)

集团1	集团2	集团3	集团4
集团1 (n = 5)	---	0.04	0.04	0.11
集团2 (n = 34)	0.017	---	0.01	0.02
集团3 (n = 59)	0.017	0.00	---	0.02
集团4 (n = 5)	0.051	0.01	0.01	---

MLACの遺伝子番号1の胞子体(集団2、No.16)から得た60個の胞子を解析したうちで、27個の胞子において明瞭なフラグメントサイズが検出された(表(3)－9)。検出されたフラグメントサイズは、胞子体で検出されたものに一致したので、胞子一粒から抽出した微量のDNAサンプルでも、信頼に足る解析結果が得られ
れたと考えられる。今回のマイクロサテライトマーカー解析では、2個の対立遺伝子が検出された遺伝子座(Avir133, Avir214, Avir250, Avir255)を分析した。

表(3)−9 アオグキイヌワラビの胞子の分析

遺伝子座
Avir133	Avir214	Avir250	Avir255
親胞子体	158 / 197	94 / 100	231 / 249	157 / 177
胞子 01	158
胞子 02	158
胞子 03	158
胞子 04	197
胞子 05	158 / 197
胞子 06	100
胞子 07	94
胞子 08	94
胞子 09	100
胞子 10	94
胞子 11	94 / 100
胞子 12	94 / 100
胞子 13	249
胞子 14	231
胞子 15	249
胞子 16	249
胞子 17	231 / 249
胞子 18	231
胞子 19	177
胞子 20	157 / 177

本種は四倍体なので、対立遺伝子は実際には4個あり、例えばAvir133であれば、158と197の対立遺伝子は158/158/197/197、158/197/197/197、158/158/158/197として存在していることが想定される。胞子が全て2個の対立遺伝子158/197であれば、異質倍数体起源の四倍体で、染色体対合が限定され親の対立遺伝子が分離しない固定異質接合体 $ ^{10} $ であり、胞子に1個の対立遺伝子のみが検出されるなら、染色体対合がランダムに起こり、親の対立遺伝子が分離したことになる。胞子のジェノタイピングを行った結果、4座(Avir133, Avir214, Avir250, Avir255)すべてにおいて1個の対立遺伝子のみが検出される胞子が認められた(表(3)－9)。これらのことから、アオグキイヌワラビは固定異質接合をしていないことが判明した。有性生殖で世代を更新する際に、胞子の遺伝子型を構成する対立遺伝子の組み合わせは、1つに限られていないことが明らかになった。

今回調査地とした4集団のうち、集団1と集団4は個体数が極端に少なく、消滅のリスクが高い集団である。集団1は公園内の川沿いの集団で、10年前には50個体程度確認できたが、その後台風等による川の氾濫やがけ崩れで、生育地が消滅し個体数が激減した。特定の遺伝子型(MLACの遺伝子番号27と28)もあるので、個体数を増やすよう保全が求められる。集団4は宮崎県で再発見された集団であり、周囲の鹿の食害がひどく、現地での保全は困難である。遺伝子型は最も頻度の高い遺伝子型番号1のみであるので、少なくとも1個体を移植して保護すれば復元は可能となる。集団2と3は個体数も多く、遺伝的変異に富んでい
る。特に集団3には固有な遺伝子型も多い。現状をできるだけ維持できるような保全対策が必要である。

本種の保全に際しては、集団間で遺伝的分化がほとんどないので、28パターンの遺伝子型を維持できるよう、個体識別をもとに管理する必要がある。その中で、MLACの2,4,7,9（以上集団2）と、10,11,14（以上集団3）は、アオグキイヌワラビの全ての対立遺伝子を有しているので、現地での保護及び胞子等による保全対策が望まれる。

## (4) タイワンアリサンイヌワラビ

タイワンアリサンイヌワラビの解析には、アオグキイヌワラビで開発した15座のマイクロサテライトマーカーを用いた(表(3)－5)。このうち、12遺伝子座はPCRにより良好な増幅結果が得られた。1集団全25個を対象に12遺伝子座で分析した結果、タイワンアリサンイヌワラビは全て同じ遺伝子型で、Avir029、Avir214、Avir235、Avir238、Avir255、Avir155の6遺伝子座では、2個の対立遺伝子がヘテロに固定され、変異は見られなかった(表(3)－10)。個体番号5番から胞子を採集し、前菓体を育てAvir255以外の5遺伝子座での分離を分析した結果、前菓体は全て親と同一の遺伝子型であり、本四倍体は分離の起こらない固定ヘテロ接合体だった。

表(3)－10. マイクロサテライト6遺伝子座に基づくタイワンアリサンイヌワラビの全個体の遺伝子型

個体ID	Avir029	Avir214	Avir235	Avir238	Avir255	Avir155
1	159/175	91/98	83/109	172/190	163/177	184/186
2	159/175	91/98	83/109	172/190	163/177	184/186
3	159/175	91/98	83/109	172/190	163/177	184/186
全てのサンプルで同一の遺伝子型
25	159/175	91/98	83/109	172/190	163/177	184/186

タイワンアリサンイヌワラビの同じ集団を対象に2002年に行われたアロザイム多型分析 $ ^{27)} $ では、21個体が分析され、解析できた7遺伝子座のうち、6遺伝子座がヘテロであり、そのうち1遺伝子座は変異に富み4対立遺伝子が見いだされている。今回の結果は、アロザイム多型分析よりも多型検出能が高いマイクロサテライトマーカーで変異が検出されず、前回の結果と矛盾した。可能性の一つとして、アロザイム多型分析が10年前のサンプリングであり、現地は人為的な影響やシカの食害はないもののたびたび川が氾濫し、攪乱が生じ、集団の遺伝的多様性が失われてしまったことがあげられる。今回の調査では、遺伝解析が終わった段階で、葉が枯れており、アロザイム多型分析用の生葉を得ることはできなかったので、過去、10年間の遺伝的多様性の変化を明らかにするためには、同一個体でアロザイムとマイクロサテライト両者を分析する必要が残された。

タイワンアリサンイヌワラビは、四倍体で遺伝的に固定(固定異質接合体)していた。現在の個体からは、胞子での分離が無いため、どのような受精様式をとっても集団に変異は生じない。同じメシダ属四倍体でも胞子で分離したアオグキイヌワラビとは遺伝的性質が異なっていた。

タイワンアリサンイヌワラビは、現在確実に確認できるのは1集団のみであり、生育域全体の保全が必要
である。また胞子囊群を着けてない若齢個体が多いので、今後成長するにつれ自己間引き等で個体数が減少する可能性がある。本集団では遺伝的多様性が全く無いため、病害や突発的な環境（物理的および生物的）の変化に対する適応度は著しく低いというリスクは避けられない。生育地外における遺伝子保全対策も必要と思われる。

## (5) キュウシュウイノデ

キュウシュウイノデにおいて開発したマイクロサテライトマーカーは、6遺伝子座(Polk012、Polk023、Polk024、Polk030、Polk031、Polk093)において、PCR増幅により明瞭なピークパターンが得られた。これらの6遺伝子座は、他のイノデ属種において多様な対立遺伝子が検出できたので、6遺伝子座のマイクロサテライトマーカー全てを用いて分析を行った。得られた6マーカーは、同属で系統的にも近縁なコモチイノデ、ナンピイノデ、サカゲイノデにおいても適用可能だった。

集団1の55個体と栽培株2集団2個体の計57個体の分析結果を表(3)－11に示した。その結果、6遺伝子座全てがホモ接合体で、変異がまったく検出されなかった。キュウシュウイノデは無融合生殖二倍体であり、胞子で増殖してもクローン増殖となる。少なくとも3集団の全個体は同一のクローンであった。

表(3)−11. マイクロサテライト6遺伝子座に基づくキュウシュウイノデの全個体の遺伝子型

個体ID	Polk012	Polk023	遺伝子座
Polk024	Polk030	Polk031	Polk093
1	87/87	121/121	198/198	111/111	154/154	194/194
2	87/87	121/121	198/198	111/111	154/154	194/194
3	87/87	121/121	198/198	111/111	154/154	194/194
全てのサンプルで同一の遺伝子型
55	87/87	121/121	198/198	111/111	154/154	194/194
栽培1	87/87	121/121	198/198	111/111	154/154	194/194
栽培2	87/87	121/121	198/198	111/111	154/154	194/194

キュウシュウイノデは、現在、生育が確認できているのは1集団のみであり、生育域全体の保全が必要である。本集団周辺では現在シカの食害は観察されず、個体は旺盛に生育し、大株が多く安定した生育地である。ただし、シカが生育する地域の集団はことごとく絶滅してしまったので、シカの防御を考慮に入れて集団を保持する必要がある。また、本種の栽培は容易なため、植物園等への分散など、生育地外における遺伝子保全対策も必要である。

### 5. 本研究により得られた成果

## (1) 科学的意義

シダ植物においてマイクロサテライトマーカーを用いた解析はこれまで世界的に見ても、限られた数の報告がなされているだけである。また、すでに開発されているものも二倍体有性生殖種のみを対象としており、
シダ類の多様な生殖様式をカバーするものではない。

本プロジェクトでは、これまでの3年間で二倍体有性生殖種2種（カナワラビ属Arachniodesとイワデンダ属Diplazium）、四倍体有性生殖種（メシダ属Athyrium）、二倍体無融合生殖種（イノデ属Polysthichum）のシダ植物に対してマイクロサテライトマーカーを開発した。このうちメシダ属以外のマイクロサテライトマーカーは、世界でも初めて開発されたものである。また、イワデンダ属以外のマーカーは同属植物に汎用可能であり、多くの絶滅危惧種を含むメシダ属やカナワラビ属にも応用可能となり、シダ植物の集団遺伝学的研究の発展への大きな貢献となった。

二倍体有性生殖種シビカナワラビは、分布が限定するにもかかわらず、著しい遺伝的変異が有り、現存する4集団は遺伝的に分化していることが明らかとなった。二倍体有性生殖種フクレギシダは、4集団において全個体が遺伝的に全く同じ完全ホモ個体であること、集団間では遺伝的に異なることが分かり、シダ植物特有の自配自家受精による集団形成の重要性が初めて明らかとなった。四倍体有性生殖種アオグキイヌワラビは、遺伝的に変異は少ないものの28遺伝子型が検出できた。供試した普通種であるメシダ属3種は、高い遺伝的変異を示した。一方、同じく四倍体有性生殖種タイワンアリサンイヌワラビは、遺伝的に全て同一で固定異質接合体だった。

四倍体種に関しては、通常遺伝的変異は少ないものと、これまで考えられてきたが、マイクロサテライトマーカーを用いた解析によって、多くの遺伝的変異が生じていることが明らかとなった。また、アオグキイヌワラビは同質倍数体起源の、タイワンアリサンイヌワラビは異質倍数体起源の可能性があり、シダ植物に多く見られる四倍体種の保持する遺伝的多様性の実態について、新たな知見をもたらした。二倍体無融合生殖種キュウシュウイノデは、遺伝子座全てが同一のホモ接合体で、変異がまったく検出されず、全て同一クローンであった。

全個体ジェノタイピングを行うことで、保全生態学ではこれまで取り上げられることの少なかったシダ植物に関する新たな情報が得られた。

## (2) 環境政策への貢献

今回調査した5種は、全て平成22年度からの環境省のRDB調査対象種である。今回得られた結果から、個体数と遺伝的多様性の動態についてモニタリングが可能となり、より正確な保全管理が可能となった。高宮は環境省の「平成24年度第3次絶滅のおそれのある野生生物の選定・評価検討会」「植物I分科会」検討委員であるため、委員会で今回の成果を提示し、次期環境省レッドデータブックの編集に貢献する予定である。

今回の調査対象種は、福岡県・佐賀県・熊本県・宮崎県・鹿児島県でも県のレッドデータ(リスト)に含まれており、各県の自然保護課に情報提供し、保全対策に協力する予定である。また、保全対策を含め、成果の広報・普及に努める予定である。

### 6. 国際共同研究等の状況

現在、特に記載すべき事項はない。

### 7. 研究成果の発表状況
## (1) 誌上発表

<論文(査読あり)>

1) A. IZUNO, M. TAKAMIYA, S. KANEKO and Y. ISAGI: American Journal of Botany, 98, e339-341 (2011)

“Microsatellite loci in an endangered fern species Athyrium viridescentipes (Woodsiaceae) and cross-species amplification”

2) A. IZUNO, M. TAKAMIYA, S. KANEKO and Y. ISAGI: Journal of Plant Research, (2012)

“Genetic variation and structure of the endangered Lady Fern Athyrium viridescentipes based on ubiquitous genotyping.” (in press)

3) 井鷺裕司、兼子伸吾、水谷未耶、加藤慶子、伊津野彩子、高宮正之、志賀隆、增本育子、大竹邦明:DNA多型 (2012)

「全個体遺伝子型解析による絶滅危惧植物の保全」(印刷中)

## くその他誌上発表(査読なし)>

特に記載すべき事項はない。

## (2) 口頭発表 (学会等)

1) 橋本美幸、寺田 (西田) 泰子、藤井紀行、高宮正之：第73回日本植物学会大会 (2009) 「ホソバイヌワラビ (広義) の種内分類群に関する研究」

2) 吉岡あゆみ、兼子伸吾、井鷺裕司、藤井紀行、高宮正之：第74回日本植物学会大会 (2010)「マイクロサテライトマーカーを用いた絶滅危惧シダ植物の遺伝的特徴の解明」

3) 高宮正之：第58回日本生態学会大会（2011）

「様々な繁殖様式をもつシダ植物におけるユビキタスジェノタイピング」

4) 伊津野彩子、高宮正之、兼子伸吾、井鷺裕司：第58回日本生態学会大会（2011）

「有性生殖をする絶滅危惧植物アオグキイヌワラビの遺伝構造—複数生育地にまたがる遺伝的固定」

5) 吉岡あゆみ、伊津野彩子、兼子伸吾、井鷺裕司、藤井紀行、高宮正之：第75回日本植物学会大会(2011)

「マイクロサテライトマーカーを用いた絶滅危惧シダ植物の解析」

6) A. IZUNO, M TAKAMIYA, S. KANEKO, Y. ISAGI, 18th International Botanical Congress, Melbourne, Australia, (2011)

“Conservation of a critically endangered tetraploid fern species Athyrium viridescentipes based on the ubiquitous genotyping approach.”

7）井鷺裕司、兼子伸吾、水谷未耶、加藤慶子、高宮正之、伊津野彩子、志賀隆、増本育子、大竹邦明：第20回日本DNA多型学会（2011）

「全個体遺伝子型解析による絶滅危惧植物の保全」

## (3) 出願特許
特に記載すべき事項はない。

## (4) シンポジウム、セミナーの開催(主催のもの)

1）ユビキタスジェノタイピングと数理モデルングによる絶滅危惧植物保全 (2011年3月10日 札幌コンベンションセンター参加者110名)

## (5) マスコミ等への公表・報道等

特に記載すべき事項はない。

## (6) その他

1）第13回 日本DNA多型学会優秀研究賞（全個体遺伝子型解析による絶滅危惧植物の保全，井鷺裕司，兼子伸吾，水谷未耶，加藤慶子，高宮正之，伊津野彩子，志賀隆，増本育子，大竹邦明）

### 8. 引用文献

1) 岩槻邦男：多様性からみた生物学、裳華房、(2002)

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(4) 全個体ジェノタイピングおよび位置情報に基づく絶滅危惧植物個体群の持続可能性評価に関する研究

北海道大学大学院地球環境科学研究院 佐竹暁子

<研究協力者>

高知大学大学院総合人間自然科学研究科 加藤元海

平成21～23年度累計予算額 9,069千円

(平成23年度予算額 2,196千円)

予算額は、間接経費を含む。

[要旨] 絶滅危惧種の個体レベルの生育場所と遺伝子型の情報を基にして、絶滅危惧植物個体群の持続可能性を予測する数理モデルの開発を行なった。数理モデルでは、実生、非繁殖成体、繁殖成体の3つの齢構成を考慮し、親個体の遺伝子型情報に基づく血縁度に応じた近交弱勢を仮定し、個体群存続可能性解析(PVA)を行なった。近交弱勢の影響に関しては、血縁度と近交弱勢の関係に複数の関数を仮定して解析を行なった。本プロジェクトにおいて開発した数理モデルは、花粉親になる確率と種子の定着確率を距離の関数として表現可能なものであり、ジェノタイピング情報をともなった個体群であれば、様々なタイプの絶滅危惧種に応用できるものとした。数理モデルの解析から、一般的な傾向として、近交弱勢が強いほど100年後の絶滅確率が高まり、また絶滅までの時間が短いことが明らかになった。本年度の解析で想定した絶滅危惧種では、全個体数が100個体と少ないことから、時間とともに交雑を行なう個体間の血縁度が高くなり、それにともなって集団全体におけるヘテロ接合度も時間とともに低下することが明らかになった。花粉が近距離にしか散布されない場合には、ヘテロ接合体の割合が低下し、絶滅確率が上昇することが示された。一方で、長距離花粉散布が行なわれると、絶滅確率は減少することが明らかになった。このことは、わずかな頻度でも長距離花粉散布が行なわれ、離れた個体群間で遺伝子流動があることが、絶滅確率の減少および生物多様性喪失の阻止に有効に働くことを意味している。

本プロジェクトで取得されたシモツケコウホネに関する遺伝／位置情報データを用いて、将来の変化を予測した結果、最も個体数の多い個体群が消失すると100年後に集団が生存する確率が6割も低下することが明らかになった。また、7個体しか残存していない個体群も、集団の生存確率の維持に貢献していることがわかった。しかし、対象種の生活史パラメーター値に結果は大きく依存するため、遺伝情報に加えて生存率や繁殖率などの基本的な生活史パラメーターに関する情報の取得が急がれる。

[キーワード] 血縁度、持続可能性、ヘテロ接合度、近交弱勢、絶滅確率

### 1. はじめに

これまで、絶滅の可能性のある動物や植物を対象に、個体群の絶滅確率や将来の個体群サイズを推定するために、個体群存続可能性解析が行われてきた。従来用いられてきた個体群存続性解析は、個
体の遺伝子型情報および個体が分布する位置情報を取り入れていないため、予測性に限界があった。しかし、本プロジェクトにおいて、対象種の全個体ジェノタイピングを行うことで、これまで欠けていた遺伝子型や位置情報に関わるデータを入手することが可能になる。絶滅危惧種には生活史、遺伝構造、履歴等に関して様々なタイプが認められる。従って、そのような多様な絶滅危惧種に対して適切な保全策を構築するためには、全個体についての遺伝子型・位置情報を総合的に活用することで、新しい個体群存続性解析の方法を確立することが必要である。

### 2. 研究目的

本研究では、個体レベルの詳細な位置情報と遺伝子型情報を活用することで、詳細な交配様式を表現した数理モデルを開発し、生物多様性の持続可能性や脆弱性を理論的に検討することを目的としている。まず、実生、成熟非繁殖、成熟繁殖、という3つの状態からなるステージ構造モデルをベースにして、繁殖個体から生産される種子の生存率が親個体の血縁度によって決定されると仮定した数理モデルを開発する。血縁度の推定には、ジェノタイピング情報を活用し、血縁度と種子の生存率の関係に関しては、線形減少関数、指数的減少関数、そして階段型減少関数の3通りの関数を比較する。

次に、当モデルのパフォーマンスを調べるために、本プロジェクトで得られた、絶滅危惧種全個体の位置情報と遺伝子型情報を基にして、持続可能性解析を行い、将来の絶滅確率、将来残存する個体数、血縁度の推移を予測する。さらに、実生、成熟非繁殖、成熟繁殖、という3つの状態からなるステージ構造モデルに、花粉散布と種子散布の空間距離依存性を導入することでモデルの改良を行う。

最後に、当プロジェクトで得られたジェノタイピングデータを活用し、複数種の絶滅危惧種の個体群存続性解析を行い、適切な保全管理に関する提言を行う。

### 3. 研究方法

## (1) ステージ構造モデルの開発

数理モデルでは、3つの齢構成（実生seedling stage、非繁殖成体non-fertile adult stage、繁殖成体fertile adult stage）を考慮し、それぞれのステージ間で図（4）-1に示すような遷移が生じると仮定した。

ここで、 $ s_{1} $ ， $ s_{2} $ ， $ s_{3} $ はそれぞれ実生、成熟・非開花、成熟・開花状態の生存率を意味している。また、 $ \alpha_{1} $ ， $ \alpha_{2} $ ， $ \alpha_{3} $ は実生から成熟・開花状態への一年あたりの遷移率、成熟・非開花状態から成熟・開花状態への遷移率、そして成熟・開花状態が翌年もその状態を維持する確率に対応している。

繁殖個体どうしの交雑の際には花粉と胚珠を提供する親個体の遺伝子型情報を基に血縁度を求め、血縁度に応じた近交弱勢を仮定して個体群存続可能性解析を行なった。血縁度と近交弱勢の関係は1)線形減少関数、2)指数的減少関数、3)階段型減少関数の3つを仮定して解析を行なった(図(4)－2)。
$$ \left(\mathbf{0}\leq\boldsymbol{\varphi}\leq\mathbf{1},\right. $$

図(4)－1. 数理モデル化した齢構成. S: 実生 (Seedling stage), N: 非繁殖成体 (Non-fertile adult stage), F: 繁殖成体 (Fertile adult).

$$ X_{\mathrm{out}} $$

## 距離に無関係な(分集団外との)交配

図(4)－2. メタポピュレーションモデルの概要. 確率 $ 1 - X_{out} $ で胚珠(雌株)と花粉親(雄株)との距離に応じた受粉率が起こり、確率 $ X_{out} $ で距離に関係ない交配が行なわれる。確率 $ X_{out} $ が大きいほど、分集団間の交配が高頻度となる。
2 個体間の血縁度は、Lynch and Ritland $ ^{1)} $ を参考にして、以下のように遺伝子情報から推定を行なった。血縁度を r とすると、

$$ r=\frac{1}{W}\sum_{}^{loci}w\hat{r} $$

で表される。ただし、 $ \sum_{loci}^{loci} $ は全ての遺伝子座に関して足し合わせることを表す。ここで、

$$ W=\sum^{\mathrm{l o c i}}w, $$

$$ w=\frac{(1+\delta_{ij})(p_{i}+p_{j})-4p_{i}p_{j}}{2p_{i}p_{j}}, $$

$$ \hat{r}=\frac{p_{i}(\delta_{jk}+\delta_{jl})+p_{j}(\delta_{ik}+\delta_{il})-4p_{i}p_{j}}{(1+\delta_{ij})(p_{i}+p_{j})-4p_{i}p_{j}} $$

ただし、$p_{i}$ はある遺伝子座における遺伝子型 $i$ の頻度を表し $(j, k, l)$ についても同様）、$\delta_{ij}$ はクロネッカーのデルタ $(i=j$ の場合は $\delta_{ij}=1, i\neq j$ の場合は $\delta_{ij}=0)$ を表す。

## (2) 空間動態をとりいれる: 花粉散布と種子散布

(1) において説明したモデルは、花粉散布や種子散布が距離に依存せず行われると仮定していたが、それに空間動態を考慮して、花粉親になる確率と種子の定着確率を距離の関数として表現可能なモデルを開発した。数キロメートルのスケールといった比較的短い距離の花粉散布については、距離とともに散布率が指数関数的に減少すると考えた。また、強風の際には数十キロメートルのスケールという長距離にわたり分散されることが報告されている。そのため今年度は、確率1-Xoutで短距離の分散が起こり、確率Xoutで距離に依存しない分散が生じると仮定したメタポピュレーションモデルへと改良を行なった(図(4)-3)。種子散布については、距離とともに分散率が指数関数的に減少すると仮定し、コンピューターシミュレーションを行なった。

植物の生活史が、絶滅確率にどのように影響するかをコンピューターシミュレーションによって検討した。検討した生活史は、1) 発芽から1年以内に成熟し、開花後には枯死する1年草；成熟まで1年以上必要で、開花後も枯死せず繰り返し繁殖する多回繁殖型多年草のうち、2) 毎年開花を行なう多年草毎年開花と、3) 毎年は開花しない多年草隔年開花、の3つの生活史を対象に絶滅率を比較した。
$$ X_{\mathrm{out}} $$

## 距離に無関係な(分集団外との)交配

図(4)−3. メタポピュレーションモデルの概要. 確率 $ 1 - X_{out} $ で胚珠 (雌株) と花粉親 (雄株) との距離に応じた受粉率が起こり、確率 $ X_{out} $ で距離に関係ない交配が行なわれる。確率 $ X_{out} $ が大きいほど、分集団間の交配が高頻度となる。

## (3) 小笠原諸島に生息する絶滅危惧種のムニンフトモモの個体群持続存続性解析

この3ステージモデルを用いてまず、残存個体数が100程度の小笠原諸島に生息する絶滅危惧種のムニンフトモモを対象に、持続存続性解析を行った。生存率、各状態間の遷移率、花序数などのパラメータ一値については、Kirchner et al. $ ^{2)} $ を参考にした。

花粉の受粉に関しては、受粉率は2個体間の距離に依存するとした。つまり、受粉率は距離の減少関数として、具体的には次式で与えた。

$$ D_{\mathrm{p}}=e^{-a x} $$

ただし、 $ D_{p} $ は受粉率 $ (0 \leq D_{p} \leq 1) $ 、a は受粉パラメータ、x は 2 個体間の距離 (m) を表す。シミュレーションでは、受粉率が 0.5 となる半飽和距離を 50 m とした（つまり、 $ a = \log_{e} 0.5 / 50 $ として与えられる）。

種子の分散に関しては、分散距離 $ x \sim \frac{1}{2} $ の分散確率は距離の減少関数とした。具体的には次式で与えた。

$$ D_{s}=e^{-bx} $$

ただし、 $ D_{s} $ は分散確率 $ (0 \leq D_{s} \leq 1) $ 、b は分散パラメーター、x は分散距離 (m) を表す。シミュレーションでは、分散確率が 0.5 となる半飽和距離を 5 m とした（つまり、 $ b = \log_{e} 0.5 / 5 $ として与えられる，具体例を図 (4) ☐ -4 に示す）。
## 種子分散距離による空間的分散の一例

$$ X_{\mathrm{o u t}}=\mathbf{0.1} $$

● 印 初期個体(105個体)

×印 100年後(68個体残存)

図(4)－4. 種子分散距離による空間分布パターンの変化. 種子分散距離が5mと100mの場合を比較した. Dpは受粉率、Dsは分散確率を示す.

## (4) 絶滅危惧種ヤチシャジンの個体群持続存続性解析

ヤチシャジンAdenophora palustris（キキョウ科）は、湿原に生育する多年生草本で、絶滅危惧IA類に指定されており、全1,009個体が6つの分集団を構成している。本プロジェクトで取得されたヤチシャジンに関する遺伝子型／位置情報データを用いて、現在の個体群の遺伝的多様性、個体数、絶滅可能性がどのように変化するかを予測した。特に、複数の分集団のうち、どれが個体群存続性維持に大きな貢献をしているかを検討することは、個体群管理の上で大変重要な課題である。そこで、一つずつ分集団を仮想的に消滅させた際、個体群存続性がどのように変化するかコンピューターシミュレーションによって検討した。なお近交弱勢は強く、分集団間での交流は頻繁に生じる、そして花粉分散の半減距離は50mであると仮定した上で、解析を進めた。

## (5) 絶滅危惧種シモツケコウホネの個体群持続存続性解析

シモツケコウホネNuphar submersa（スイレン科）は、農業用水路等に生育する栃木県固有の絶滅危惧水生植物である。環境省レッドリストでは絶滅危惧IA類に指定されており、全277個体が3つの分集団をなしている。(4)のヤチシャジンと同様に、本プロジェクトで取得されたシモツケコウホネに関する遺伝子型／位置情報データを用いて、個体群持続存続性解析を行った。
### 4. 結果及び考察

（1）小笠原諸島に生育する絶滅危惧種のムニンフトモモの持続存続性解析

数理モデルの解析から、一般的な傾向として、近交弱勢が強いほど100年後の絶滅確率が高まり、また絶滅までの時間が短縮されることが明らかになった(図(4)－5)。

A Prob of extinction (InbDep: linear)

B Prob of extinction (InbDep: Exp)

C Prob of extinction (Step)

図4－(5). 3種類の減少関数に基づく100年後の絶滅確率. 線形減少関数(A), 指数的減少関数(B), 階段型減少関数(C).

特に、近交弱勢の強さが0.5を上回ると絶滅率の上昇が顕著になった。3つの関数間で結果を比較した
結果、絶滅率に関してはどの関数も同様な予測をもたらすことが示された。全個体数が100個体と少ない絶滅危惧種に関しては、時間とともに交配を行なう体間の血縁度が高くなり、それにともなって集団全体におけるヘテロ接合度も時間とともに低下することが明らかになった。以上の結果は、遺伝的多様性の低下による血縁度の上昇が、絶滅率の上昇に多大な寄与を与えることを示唆している。

花粉が近距離にしか散布されない場合には(非メタポピュレーションモデル)、ヘテロ接合体の割合が低下し、絶滅確率が上昇することが示された。

一方で、長距離花粉散布が行なわれると(メタポピュレーションモデル)、絶滅確率は減少することが明らかになった(図(4)－6)。このことは、わずかな頻度でも長距離花粉散布が行なわれ、離れた個体群間で遺伝子流動があることが、絶滅確率の減少および生物多様性喪失の阻止に有効に働くことを意味している。

図(4)-6. 近交弱勢の強さ(横軸)と100年後の絶滅確率(縦軸)

また、近交弱性が中程度の場合に各生活史間で違い多年草毎年開花 < ⊗多年草隔年開花、という順番に絶滅率が上昇した(図(4)－7)。このことは、開花機会の少ない多年草隔年開花という生活史を持つ植物は、毎年開花する植物より脆弱であることを示唆している。
図(4)－7. 近交弱勢の強さ(横軸)と100年後の絶滅確率(縦軸)との関係に、3つの異なる植物の生活史が与える影響

## (2) 絶滅危惧種ヤチシャジンの個体群持続存続性解析

生存率などのデモグラフィックパラメータ値が不明であるため、様々な値を用いて個体群存続確率を推定した(図(4)−8)。

ヤチシャジンにおける個体群存続確率

開花後の栄養成長率(S3)

図(4)－8. ヤチシャジンにおける個体群存続確率の推定値. 実生から非繁殖個体への遷移率と開花後の栄養成長率に応じた変化を示す.
実生から非繁殖成体までの生存率 $ (S_{1}) $ と繁殖後のクローン成長率 $ (S_{3}) $ を変化させ100年後の生存確率を予測したところ、生存率、クローン成長率の増加に伴い全ての分集団が絶滅する状態から全ての分集団が生存する状態への推移が見られた。

どの分集団が消失する叱最も生存率が低下するかを検討するためには、これらのデモグラフィックパラメータ値に依存した解析を行う必要がある。そこで、 $ (s_{1}, s_{3}) = (0.8, 0.3) $ ， $ (0.3, 0.7) $ という全ての分集団が絶滅する状態から全ての分集団が生存する状態への推移が生じる境界に位置するパラメーターセットに絞って検討した。

ヤチシャジンは全1,009個体が6分集団を構成しているが、どの分集団が消失すると最も生存率が低下するかを検討したところ、最も個体数の多いSera2個体群の消失によって約1割 $ \left(\left(s_{1},s_{3}\right)=(0.8,0.3)\right. $ の場合 $ ) $ から3割 $ \left(\left(s_{1},s_{3}\right)=(0.3,0.7)\right. $ の場合 $ ) $ ほど生存率が低下することが示された。一方で、残り5つの分集団の消滅は、個体群存続確率の変化に全く影響を与えないという予想が得られた。血縁度の経時変化を予測したところ、分集団の消滅がない場合においても、100後には20%の血縁度の上昇が予測された（図（4）－9）。

血縁度の時間変化

図(4)－9. ヤチシャジン個体群における血縁度の時間変化. controlは分集団の消滅が生じない状況を指す.

各遺伝子座における対立遺伝子頻度の100年後の変化を予測したところ、Sera2の消失によって極端に対立遺伝子の多様性が低下することが明らかになった(図(4)－10)。これらの結果は、Sera2分集団の重要性を示唆している。