Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
チルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)ニアンモニウム(ABTS)を基質としたプレートアッセイ系を組み合わせることで、リグニン分解能力強化株取得に最適なハイスループットスクリーニング系を構築した。

#### 1.2.2 紫外線照射を用いたマイタケ菌への突然変異導入系の確立

変異導入実験においては、いかにして単一の変異導入細胞核に由来する変異体を分離・取得するかが高効率変異導入のポイントとなるため、変異導入細胞の分離法の検討を行った結果、プロトプラスト化が効果的であった。次に分離した細胞を対象に紫外線照射条件の最適化を行い、マイタケ変異導入実験系を確立した。

### 1.3 生物的前处理済み廃菌床に最適な糖化酵素開発

#### 1.3.1 セルラーゼによる廃菌床糖化系へのリグニン分解酵素添加の影響

生物的前処理を施した廃菌床の糖化には、リグニン分解酵素やヘミセルラーゼの添加が効果的であった。また、アルカリ処理にて廃菌床のリグニンを除去したところ、本開発の目標値である80%の糖化率を達成することができた。これは、生物学的前処理ではリグニンの除去が不完全であることを示しており、強力な前処理用酵素の開発が必要であることを示している。前処理関連酵素をバイオマス糖化へ応用するためマイタケ菌リグニン分解酵素をセルラーゼ高生産菌トリコデルマ・リーセイで発現させ、バイオマス前処理および糖化能を持つ株の構築を試みた。その結果リグニン分解酵素遺伝子が組み込まれたT. reesei株の取得に成功した。qRT-PCRによって異種遺伝子が転写されている事を確認したが、リグニン分解活性値が低かったことから転写以降の段階で問題が生じていることが示唆された。培養条件検討の結果、Laccase発現T. reeseiにおいてCu添加が培養上清中のLaccase活性値を増加させることを見い出した。

### 2. 廃菌床糖化溶液からの DOI 発酵高生産組換え大腸菌の開発（新潟薬大）

### 2.1 進化工学的改変による高活性型 DOI 合成酵素の取得・利用

構築した変異型 DOI 合成酵素遺伝子ライブラリーを導入した形質転換体 1107 株について、1 次スクリーニング、2 次スクリーニングを実施し、DOI 生産性向上に関与する部位を 6 カ所 (E23, L143, L214, S230, W293, M346) 同定した。特に DOI 生産性への効果が大きかった W293R について調査した結果、総合的に酵素の能力を示す Kcat/Km 値が、変異型 DOI 合成酵素 W293R の方が野生型 DOI 合成酵素よりも 1.56 倍程度大きな値を示した。次に、DOI 生産性の上昇が大きかった 2 つの変異型 DOI 合成酵素 L214M、W293R、さらには、2 つの単独の変異を組み合わせた L214M/W293R をコードする遺伝子を、グルコース-6-リン酸高蓄積株Δpzp 株に導入して 3 次スクリーニングを行った。Δpzp/L214M 株、Δpzp/W293R 株、Δpzp/L214M/W293R 株の DOI 生産性は、Δpzp/WT 株よりもそれぞれ約 1.1 倍、約 1.2 倍、約 1.3 倍と高くなった。次に in vitro DOI 合成酵素活性測定法を利用して、高 DOI 生産性を示す変異型 DOI 合成酵素の比較検討を行った。野生型 (WT) 及び変異型 DOI 合成酵素 L214M、W293R、L214M/W293R の酵素は、His タグが付加した組換え蛋白質として生産・精製した。in vitro DOI 合成酵素活性測定の結果、WT と比較して、L214M は約 1.3 倍、W293R と L214M/W293R は約 1.5 倍の DOI 合成酵素活性を示した。これらの酵素が有する DOI 合成酵素活性の上昇が、上記した DOI 生産性の上昇に繋がっていることが考えられる。本項目において、高活性型 DOI 合成酵素 L214M、W293R、L214M/W293R の獲得に成功した。
### 2.2 DOI 合成酵素の高安定化

DOI 合成酵素は、ホモ二量体又は、DOI 合成酵素結合蛋白質 BtrC2 とヘテロ二量体を形成することが知られている。二量体を形成することによる DOI 合成酵素活性の安定化を考え、in vitro DOI 合成酵素 assay 系で評価を行った結果、ヘテロ二量体は、高濃度 DOI 存在下における活性の低下をある程度抑えるが、DOI 合成酵素単量体よりも DOI 合成活性が大きく低下することが分かった。すなわち、ヘテロ二量体を利用する DOI 合成システムは、短時間で DOI 発酵生産するためには、不適合であると判断し、組換え大腸菌体内では、DOI 合成酵素のみ多量発現させることとした。

### 2.3 DOI 合成酵素基質グルコース-6-P (G6P) の蓄積速度の強化

グルコースの取り込みに関与する ptsG 蛋白質の抑制因子である Mlc 蛋白質をコードする mlc 遺伝子を破壊した GI724ΔpzpΔmlc 株を作製し、その DOI 合成酵素の基質である G6P の蓄積速度向上、さらには DOI 生産性について検討を行った。その結果、mlc 遺伝子の欠失は、DOI の原料となるグルコース濃度が培地中で高い状態にあっても、ある程度適応することができ、初発のグルコース濃度を高くしたい場合には、GI724ΔpzpΔmlc 株の利用は有効であることが明らかとなった。

### 2.4 DOI 耐性（低感受性）· 耐酸性 DOI 生産宿主の取得・利用

組換え大腸菌による DOI 発酵生産の実用化を考慮すると、5%以上、さらには10%の DOI 含有培養液の生産への必要性が考えられる。しかしながら、本研究で利用している DOI 生産宿主の大腸菌 GI724ΔPZP は、2% DOI を含む培地において、その生育が半分程度阻害され、また、4% DOI を含む培地においては生育が完全に阻害された。培養液中に高濃度の DOI を生産・蓄積させるためには、DOI 耐性株、少なくとも DOI 低感受性株の開発が必要であった。大腸菌の全遺伝子破壊株コレクションを利用し、DOI 耐性・感受性関連遺伝子の探索を行った。大腸菌遺伝子破壊株 (3,823 株) の 6%DOI 含有培地における DOI 感受性試験 (1 次スクリーニング) を実施した。破壊株コレクションの野生株 BW25113 の DOI 非含有培地の増殖を指標 (100%) とし、①6% DOI 含有培地の増殖が 80%以上の株、及び DOI 非含有と 6%DOI 含有培地の増殖差が 10%以下の株を DOI 耐性候補株として 3 株選出し、②6% DOI 含有培地の増殖が 20%以下の株、及び DOI 非含有と 6%DOI 含有培地の増殖差が 90%以上の株を DOI 感受性候補株として 6 株選出した (BW25113 の 6% DOI 含有培地の増殖は 50%) 。各条件で選出した株の 2 次スクリーニングを実施した結果、DOI 耐性候補株として $ \Delta argO $ 株、DOI 感受性候補株として $ \Delta rffC $ 株、 $ \Delta gor $ 株を見出した。また、各遺伝子の機能確認のため、argO 遺伝子欠失株を作製し、評価培養を行ったところ、DOI 耐性を示したことから、argO 遺伝子は、DOI 耐性（低感受性）に関連する遺伝子であると同定した。また、rffC 遺伝子及び gor 遺伝子においても得られた破壊株の遺伝子上を PCR で、該当遺伝子が欠失していることを確認したことから、rffC 遺伝子及び gor 遺伝子は、DOI 感受性に関与する遺伝子であると同定した。

### 2.5 培養工学的 DOI 発酵生産

DOI を生産する大腸菌の生育可能範囲における詳細な DOI 安定性について調べた。温度 4, 20, 35, 50℃, pH 3.0, 5.0, 7.0, 9.0 の条件下で DOI の安定性を評価した結果, 大腸菌の生育温度 (20, 35℃) では, 培養液中の DOI 安定性を考慮すると, pH 5.0 条件付近の DOI 発酵生産が適していると考えられた。次
に，上記結果を考慮し，培養温度（27, 30, 33, 37℃）及びpH（pH 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0）条件を維持しながら，フラスコレベルでDOI生産性を検討した結果，温度27, 30, 33℃，pH 5.5, 6.0条件時のDOI生産性が至適であった（36時間で培地中の3％グルコースを全てDOIに変換）。フラスコ培養の結果を考慮し，ジャーファーメンターで温度，pHだけでなく攪拌速度，通気量なども検討した結果，33℃，pH 6.0, 450 rpm, 5 L/min，生育炭素源マニトール，初期グルコース濃度3％条件が至適DOI生産培養条件であった（効率はフラスコ培養時と同様）。次にジャーファーメンターで初期グルコース濃度を5%まで増加させたときの至適DOI生産培養条件を検討した結果，30℃，pH 6.0, 1000 rpm, 5 L/min，HNS培地，生育炭素源マニトール，初期グルコース濃度5%の条件において、41.5 g/L/36 hを達成し、これまでに我々が報告していた29.5 g/L/60 hのDOI発酵生産効率（DOI生産量、発酵生産時間）を大幅に改善することができた。さらに、流加培養法によりDOI発酵生産を検討した結果、116.0 g/L/60 hのDOI発酵生産効率を達成することができた。

## 環境政策への貢献

### 1. 環境低負荷型糖生産システム

本技術の廃菌床ハイスピード生物的前処理は、これまでの物理的、化学的前処理に対して、設備投資、エネルギーコストから有利であり、小規模な地産地消型のバイオマス利活用プロセスとして非常に有効である。また、リグニン・セルロース・ヘミセルロース同時分解プロセスは、世界屈指のセルラーゼ産生微生物トリコデルマ・リーセイにヘミセルロース、リグニン分解酵素遺伝子を組込み、産生された酵素により、リグニン・セルロース・ヘミセルロース同時分解を行う（図1）。また、酵素により分解されたリグニンを回収すると、エネルギー変換効率が高いリグニンをバイオマスボイラーの燃料としての利用、リグニンを原料とする化成品原料開発の研究へとつながる可能性がある。

原料となるバイオマスには、環境条件による年次変動あるいは季節変動、世界情勢による安定的な確保の問題、さらに食糧自給率の低い日本では食料との競合による問題を解決しなければならない。このような背景を考慮し、本技術の開発原料はキノコ廃菌床をバイオマスとして利用する。廃菌床は、多くのセルロース、ヘミセルロース（約60%）を含み、年間を通じて、新潟県のある会社では、約200t/日以上コンスタントに排出され、さらに運搬収集の必要性がなく、集積されている優秀な非可食

図１ 環境低負荷型糖生産システムの開発

図２ リグニン除去が廃菌床糖化に与える効果7
バイオマスであることから、現在の日本において事業化に結びつけることのできる最有力のバイオマス資源であると考えられる。このキノコ廃菌床を従来の物理的、化学的前処理法と比較して設備投資、排水処理、エネルギーコスト的に有利な生物学的前処理システムを行い、酵素糖化を阻害する難分解性リグニン除去を効率的に行う（図1）。生物学的前処理された廃菌床をリグニン分解酵素で処理し、酵素糖化を行うと従来よりも効率的に投下を行うことができた。さらにアルカリ処理を施して場合で本研究開発の目標値である80%の糖化を達成することができた（図2）。このことからも、廃菌床からの脱リグニンが重要であることが示され、①キノコ（マイタケ菌）の廃菌床における生態解析、②生物的前処理能力を高めたキノコ（マイタケ菌）と③リグニン分解能力を持たせた糸状菌（トリコデルマ）の糖化酵素を組み合わせたオールバイオプロセス開発を目指す本研究の意義は大きいといえる（図3）。

①について、マイタケ菌のゲノム塩基配列を解読し、少なくとも16000の遺伝子が存在することを明らかにした。その情報を元にDNAマイクロアレイチップを開発して生物学的前処理が行われている間の廃菌床中のマイタケの全遺伝子発現状況を解析した。それとともに、廃菌床に含まれるリグニン分解酵素の活性を調査し、前処理に有効なリグニン分解酵素を同定することができた（図4,5）。

② 前処理能力強化菌株の造成

生物的前処理に重要な因子の特定

前処理能力強化マイタケ

③ 廃菌床糖化に最適な糖化酵素開発

図 3 本研究の開発内容

廃菌床保管処理工程の解明を目指したマイクロアレイ解析

図４ 廃菌床の経時的変化

マイクロアレイ解析

図 5 生物学的前处理中の廃菌床における酵素の発現
②では、マイタケ菌の生物学的前処理能力を向上させるために、紫外線照射による変異育種を行った。

前処理能力はリグニン分解能力を反映させていると思われたため、リグニン分解能力を指標としたスクリーニング系を確立した。この手法は、リグニン分解能力を有するキノコ類の改良にも応用できると考えられる（図6）。

③では、①で明らかになったマイタケ菌が廃菌床中で生産しているリグニン分解酵素の遺伝子を糖化酵素生産菌であるトリコデルマ・リーセイに組み込み、糖化酵素とともにリグ

複数の強化候補菌株の取得に成功

マイクロアレイ解析・酵素解析より

リグニン分解酵素遺伝子の発現に成功

図7 リグニン分解能を有する組換えトリコデルマ・リーセイ

ニン分解酵素を生産させる新たな糖化酵素生産菌の構築を行った。また、トリコデルマ・リーセイ自体もリグニン分解酵素を有していたため、同種における高生産化を目指した。その結果、親株のトリコデルマ・リーセイからは検出できないリグニン分解活性を示す菌株の造成に成功した（図7）。本菌はキノコ廃菌床だけでなく、リグニンを多分に含む木材バイオマスを効率的に糖化できる可能性を秘めており、その有用性が期待できる。

### 2. 芳香族化合物前駆体 2-デオキシ-シロ-イノソース(DOI)の発酵生産

2-デオキシ-シロ-イノソース(DOI)は、医薬・農薬、酸化抑制剤や香料等の各種有用化学品の合成のための非常に重要な中間原料である。DOIは、芳香族化合物である2価フェノール(酸化防止剤、タイヤゴム接着剤、美白剤などの化学工業原料)に簡単に変換することができる物質である。本技術は、化学合成が困難であった有用物質DOIを、糖を原料とし、代謝工学的に改変した組換え大腸菌を利用して、低環境負荷

図 8 DOI の有機合成変換
型のバイオプロセスにより生産する技術である。

炭素六員環骨格を持つキラルな化合物である 2-deoxy-scyllo-inosose (DOI) は、医薬・農薬、酸化抑制剤

や香料等の各種有用化学品の合成のための非常に重要な中間原料である。DOIは図8に示すように簡単に2価フェノール（酸化防止剤、タイヤゴム接着剤、美白剤などの化学工業原料）に変換することができる。さらには、擬似糖カルバグルコースにも変換ができ、用途の広い中間原料であるが、化学合成が難しいため、これまで大量に得られなかった。1999年に共同研究先の東京工業大学の柿沼らが見いだしたグルコースを炭素六員環化合物であるDOIに閉環する反応を触媒する酵素（DOI合成酵素、BtrC）の発見に

図9 代謝工学的改変をした組換え大腸菌による DOI の発酵生産

より、大量生産が可能となった。さらに我々は、①高価な誘導物質を必要とせず、培養初期から後期にかけて継続的にプロモーターが働く遺伝子高発現システム開発、②DOIの原材料であるグルコースを大腸菌の生育のためではなく、優先的にDOI合成に利用できるように、糖代謝経路を遺伝子工学的に改変して構築した新規代謝システムの開発（グルコースは大腸菌内に取り込まれるとグルコース-6-リン酸(G6P)に変換された後、3つの経路により利用されるが、これらの経路に関する酵素遺伝子を破壊し、生育させるためにマントール、グリセロール、キシロースなどの単糖を利用させ、G6PをDOI合成酵素のみが利用できるシステム（図9）を行い、ジャーファーメンターを利用して、至適条件下でDOI発酵生産を実施したとき、回分培養で41.5 g/L/36 hを達成した。さらに、流加培養法においては、116.0 g/L/60 hを達成した。本研究で得られたキノコ廃菌床糖化液（グルコース1.90％に対して、キシロース0.39%）は、グルコース含有量が多いが、生育炭素源として考慮していたキシロース含量は低かった。すなわち、DOI発酵生産時に他の生育炭素源が必要になる。本研究で利用したDOI生産組換え大腸菌は、グリセロールの資化性が非常に良く、高DOI生産性が見出されていることから、バイオディーゼル製造工程で生じるグリセロール廃液の活用が考えられる。すなわち、キノコ廃菌床の活用とバイオディーゼル製造工程で生じるグリセロール廃液の活用の二重利活用により、大きく環境負荷低減へ貢献できる技術である。

## 研究成果の実現可能性

キノコ工場から排出される廃菌床は、量の安定的確保、輸送コストが不要、マイタケ菌による生物的前処理など、国内において、バイオマス利活用研究のポテンシャルとして、極めて優位な条件を備えている。また、バイオディーゼル燃料の普及に伴い、その製造時に副生するグリセロール廃液の活用も問題視されている。本技術の環境低負荷型糖生産システムは、これまでの物理的、化学的前処理に対して、
設備投資、エネルギーコストから有利であり、小規模な地産地消型のバイオマス利活用プロセスとして非常に有効であるため、生物学的処理の強化に必要なリグニン分解酵素含むセルラーゼ酵素カクテルをトリコデルマ・リーセイに産生させ、廃菌床の糖化効率を上昇させることにより実現性は高まると考えている。また、本研究で得られた廃菌床糖化液は、DOI発酵生産の原料として利用できたが、DOI発酵生産組換え大腸菌の生育或いは糖の取り込みを阻害した。すなわち、糖化液中に含まれる阻害物質の除去が今後の一つの課題となる。また、得られた糖の濃度も約2%とと低濃度であったため、廃菌床糖化液の膜による濃縮と阻害物質除去の検討により、廃菌床からの高効率DOI発酵生産が可能になると考えている。生育炭素源として利用可能なグリセロール廃液中にも生育阻害物質が混在する可能性があるため、膜濃縮・分離システムの導入が実現性を大きく加速化させると考えている。

## 結論

環境低負荷型糖生産システムの開発において、構築したマイタケ菌ゲノムデータベースおよびそれを活用して開発したマイクロアレイチップを用いることで、マイタケ菌の全遺伝子の網羅的遺伝子発現解析を行うことができるようになり、マイタケ菌の今後の研究開発を行う上での基盤を構築することができた。DNA マイクロアレイ解析および廃菌床の酵素活性の解析よりマイタケ菌は廃菌床保管処理中、ヘミセルロース側鎖、ペクチンを炭素源として使用し、リグニン分解酵素を分泌して積極的にリグニン分解することで廃菌床の前処理効果をもたらしていると結論付けた。

突然変異育種によるマイタケ菌のバイオマス前処理能力強化株を取得するため、マイタケ菌のリグニン分解能力を指標としたスクリーニング法を開発し、プレートアッセイによる変異株の選抜法を確立した。この方法を駆使して、紫外線照射による変異処理を行ったマイタケ菌株の中から、リグニン分解能力が向上したと考えられる菌株の取得に成功した。

廃菌床の効率的な糖化にはさらなるリグニン除去が必要であることが明らかとなり、アルカリ処理によってリグニンを除去した廃菌床を基質とすることで本開発の目的である80%糖化を達成することができた。生物的前処理に必要であると考えられるリグニン分解酵素をトリコデルマ・リーセイに組み込んだところ、数種の酵素の発現に成功した。しかし、その発現量はわずかのものであった。今後、さらなる改良を行うことで、廃菌床の効果的な生物的前処理が可能な酵素標品を生産するトリコデルマ・リーセイ株の開発が期待でき、セルラーゼ酵素カクテルへ添加することで廃菌床糖化効率の改善が期待される。

芳香族化合物前駆体2-デオキシ-シロ-イノソース(DOI)の発酵生産において、①DOI生産性を向上させる高活性型DOI合成酵素L214M、W293R、L214M/W293Rの取得、②培養液中に高濃度のDOIの蓄積を可能とするΔargO株の取得、③回分培養法では、41.5 g/L/36 hのDOI発酵生産効率を示す培養条件の確立、また、流加培養法では、116.0 g/L/60 hのDOI発酵生産効率を示す培養条件を確立した（試薬レベル）。しかしながら、廃菌床糖化液を原料としたDOIの発酵生産では、生育、糖の取り込み阻害が生じ、DOI生産効率が減少した。これらは、廃菌床糖化液中に含まれる夾雑物の影響によると考えられ、上記したリグニン分解能が向上したセルラーゼ酵素カクテルによる廃菌床糖化効率の向上と共に、膜を利用した糖濃縮及び生育・糖取り込み阻害の起因と考えられる夾雑物の除去のステップを導入することにより、廃菌床からのDOIの発酵生産の効率化に繋がると考えられる。また、本研究で開発したDOI生産組換え大腸菌は、グリセロールの資化性が高く、DOIの発酵生産効率が良かったことから、生育のために
利用する炭素源として、廃菌床に少ししか含まれないキシロースの他に、バイオディーゼル製造工程において副生するグリセロール廃液を利活用することにより、より環境負荷低減に貢献する技術へと繋がることが期待できる。
### 1. 研究背景と目的

### 1.1 研究背景

20 世紀に入り石炭や石油等の化石資源を利用した産業は飛躍的に発展し、私達の生活に大きな恩恵をもたらしてきた。プラスチックや洗剤など私達の日常生活において身近な製品の多くは、化石資源を原料、燃料として製造されている。特に石油化学工業により生産されている製品は、原油（ナフサ）を分留し、得られたエチレンやフェノール類などを原料とし、エネルギーを大量消費するプロセス（石油リファイナリー）で生産されている。しかし、従来の化石資源から化学製品を製造する化学工業プロセスでは、有限である化石資源の枯渇とそれに伴う石油価格の高騰、多量の二酸化炭素の排出による地球温暖化、ダイオキシン・環境ホルモンによる環境汚染など、地球的規模の問題が生じている。2013 年 9 月に公表された気候変動に関する政府間パネル (IPCC) の報告によると、世界の温室効果ガスの排出量は、工業化以降人間活動により増加しており、1 年あたりの二酸化炭素の排出量は 2011 年に 1990 年の水準から 54% 増加したとされている (1)。また、2013 年度（平成 25 年度）の我が国の温室効果ガスの総排出量は、13 億 9,500 万 t (CO₂ 換算）であり、前年度の総排出量 (13 億 7,300 万 t）と比べると、1.6% (2,200 万 t）増加したとされる。これは、東日本大震災以降、原子力発電から賄っていたエネルギーを化石燃料に代替したことによる影響と推察される。このように数字的にも非常に緊急性の高い課題であると考えられる。国際的な取り組みとして、2014 年 12 月に開催された COP20 においては、①主に COP21 で議論し、採択するための 2015 年合意文書案を策定すること、②2020 年以降の各国の排出削減目標を提示する際に、どのような情報を提供するかを決めること、③2020 年までの各国の排出削減目標の引き上げについて検討すること、④先進国から途上国への資金支援の見通しを明らかにすることの 4 つの論点について議論された (2)。COP において、先導的な立場にいる日本は、温室効果ガスの排出削減目標を提示すると同時に本格的に始動しなければいけない国際的な位置にいる。すなわち、日

図1.1 石油リファイナリーからバイオリファイナリーへのパラダイムシフト
本にとって低炭素技術の革新の必要性は急務である。そのため、カーボンニュートラルで再生可能なバイオマスを用いた環境低負荷のエネルギー・環境調和型循環産業システムによる物質生産、すなわち微生物を利用したバイオプロセスによる生産システム（バイオリファイナリー）への早期転換を行い、持続可能な低炭素型社会構築が必要である（図1.1）。

このような背景のもと、カーボンニュートラルで、食料と競合のないセルロース系バイオマスを原料とし、石油から合成される化成品、又は代換品への生産システムの開発研究が勢力的に行われており、本研究の研究分担者である小笠原と志田は、これまでに勢力的にセルロース系バイオマスの糖化研究を行ってきている。セルロース系バイオマスは、種類および前処理手法によって基質組成が大きく異なる。そのため、効率的分解には、その組成に最適な酵素種類、成分比率で酵素生産可能な微生物の開発が必要である（図1.2）。

図1.2 セルロース系バイオマスに関する糖化研究

糸状菌トリコデルマ・リーセイは、既存の微生物の中で最もセルロース分解能力の高い微生物として知られており、セルロースを炭素源としてセルラーゼを大量に分泌生産する。その産業上の有用性から世界各国の研究機関でさまざまな変異株が開発され、2006年には野生株のゲノム配列が公開された。小笠原は、セルロース高分解微生物として知られるトリコデルマ・リーセイのプロモーター解析を行い、各セルラーゼを制御するシスおよびトランス因子を明らかにした。最適プロモーターを利用あるいは新規プロモーターを人工的に作り出すことで、最適酵素種類、成分比率で酵素生産可能な菌株の開発に成功し、結晶性セルロース分解能を2.5倍向上させることに成功した（図1.3）。
しかし、この開発は物理的、化学的に処理する従来型の前処理バイオマスを想定して開発した研究である。世界的にみて化学、物理的前処理の設備投資、排水処理、エネルギーコストが問題となっている。特に、バイオマス資源が乏しい日本においては、小規模な地産地消型のプラント建設が必要であるため、前処理技術の簡素化は必須である。小笠原らは、（株）雪国まいたけと共同で廃菌床の糖化研究を進めてきた。その結果、マイタケ収穫後の廃菌床を3ヶ月保管することで、マイタケ菌の菌糸が生育し、廃菌床のリグニン成分を分解することで、その後のセルラーゼによる酵素糖化効率を向上させる「生物的前処理」を見いだしている。しかし、大量の廃菌床を3ヶ月間保管することはスペース、管理の点から、より短期間で処理可能なプロセス開発が実用化には必要である。

図 1.3 プロモーター利用による セルロース分解活性向上

また、本研究の研究代表者の高久と研究分担者の山崎は、これまで勢力的に微生物を利用した糖からの化成品原料の発酵生産の研究を行ってきた。炭素六員環骨格を持つキラルな化合物である2-deoxy-scyllo-inosose（DOI）は、医薬・農薬、酸化抑制剤や香料等の各種有用化学品の合成のための非常に重要な中間原料である。DOIは図1.4に示すように簡単にカテコールやヒドロキノンなどの2価フェノールやヒドロキシヒドロキノン（1,2,4-トリヒドロキシベンゼン）に変換することができる(3,4)。カテコールは神経系医薬品などの原料、食品香料原料、ヘアケア商品などの酸化防止剤などに使用され、年間約4万t（日本国内約3千t）、ハイドロキノンは止血剤、鎮痛剤等の原料、美白剤等の化粧品に使用され、年間約6万t（日本国内約1万t）生産され、世界的に需要の高い物質である。さらには、擬似糖カルバグルコースにも変換ができ、用途の広い中間原料であるが、化学合成が難しいため、これまで大量に得られなかった。東京工業大学の柿沼らは、多数の臨床医学的に重要な化学療法剤である2-デオキシストレプタミン含有アミノグリコシド系抗生物質の生成過程に関与する酵素の1つに、初発の糖質を炭素環化する酵素を発見した（図1.5）。ブチロシン生産菌 Bacillus circulans SANK72073 より精製されたこの酵素は、グルコース-6-リン酸を原料として多段階の反応を触媒し、最終的にDOIを生成した。その後、B. circulansよりそのDOI合成酵素遺伝子（グルコース-6-リン酸をDOIに変換する反応を触媒する酵素をコードするbtrC）がクローニングされ、大肠菌内でその遺伝子を発現、精製することで組換えDOI合成酵素を大量に得ることが可能になった。試験管内で、グルコースをATPの存在下でヘキソキナーゼと組換えDOI合成酵素により炭素環化すべくこれらをワンポットで反応したところ、効率よく直接DOIを合成できたが、非常に高いコストが採算された。高久らは、平成14年度から柿沼らと共同でバイオマス由来のグルコースから工業技術開発の研究を開始した。グルコースを原料とし、DOIの生産条件の検討から始め、DOI合成酵素活性を持つ組換え大腸菌株を作製し、1g/Lの収率でDOIが得られることを確認した。
図 1.4 DOI の有機合成変換

図 1.5 Bacillus circulans における Butirosin B 生成成経路
次に、高価な誘導物質を必要とせず、培養初期から後期にかけて継続的にプロモーターが働く遺伝子高発現システムの開発を行った。栄養増殖期に発現するgapA (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Aをコードする遺伝子) プロモーターと定常期発現プロモーターであるgadA (glutamic acid decarboxylase の∂サブユニットをコードする遺伝子) プロモーターを同時に利用したところ、栄養増殖期から定常期後期まで恒常的に発現可能なシステムの構築に成功した。さらに、gadA 転写活性にネガティブに働くと考えられる領域 (転写開始点から85-166 塩基上流) を欠失させたことにより対数増殖期から定常期まで恒常的に高発現をする改変型gadA プロモーターの開発にも成功し、対数増殖期に高発現するgapA プロモーターと組み合わせた制御下で、DOI合成酵素遺伝子であるbtrCを恒常的に高発現させるベクターを構築した。これにより、人為的な発現誘導を行うこともせずに、常に遺伝子を大腸菌体内で高発現するシステムの構築に成功した(5)。

図 1.6 代謝工学的改変をした組換え DOI 高生産大腸菌

また、DOI 合成酵素の基質である G-6-P は、解糖系のホスホグルコースイソメラーゼ (pgi 遺伝子)、ペントースリン酸経路に向かうグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ (zwf 遺伝子)、多糖生合成経路に向かうホスホグルコムターゼ (pgm 遺伝子) の基質である。すなわち、大肠菌に DOI 合成酵素遺伝子を導入すると、4つの酵素による G-6-P の競合が起こることが予想された。そこで、大肠菌が元来有する3つの G-6-P 代謝経路を、それぞれの経路に相当する遺伝子を破壊することにより遮断し、G-6-P を DOI 合成酵素に優先的に利用させる代謝経路改変は DOI 高生産に繋がると考えた。これらの経路に関する酵素遺伝子を破壊した $ \Delta pgi\Delta zwf\Delta pgm $ 株を作製し、さらに生育させるために、マニトール、グリセロール、キシロースを利用させ、G6P を DOI 合成酵素のみが利用できるシステムを構築した（図 1.6）。フラスコ
培養（30°C, pH6.0）の結果、ほぼ100%の効率でグルコースをDOIに変換し、60時間で29.5 g/Lの発酵生産に成功した(5)。

### 1.2 研究目的

低炭素技術の原料となるバイオマスは、環境条件による年次変動、季節変動、世界情勢問題を克服できる安定供給性を持ち、さらに食糧自給率の低い日本では食料と非競合でなければならない。このような背景を考慮し、本研究では、新潟県の全国2位のキノコ生産量を支える（株）雪国まいたけの廃菌床を地域バイオマスとして利用する。廃菌床は、セルロース、ヘミセルロースを多く含み、年間を通じて230 t/日（13万t/年）一定に排出・集積されているので、今の日本で事業化に直結できる最有力の非可食バイオマスである。この廃菌床を、

①マイタケ菌の生物的前処理能力を最大限強化し、高効率な前処理プロセスを構築する。前処理産物をセルロース高分解微生物トリコデルマ・リーセイの改良・利用で、リグニン、セルロース、ヘミセルロースを同時分解してグルコース、キシロースを生成する。前処理、酵素糖化の全てがバイオプロセスで構築され、従来の物理的、化学的前処理より設備投資、排水処理、エネルギーコスト的に有利な環境低負荷型のオールバイオプロセス糖生産システムを構築する。

図 1.7 低炭素社会構築へ向けた非可食バイオマスからの芳香族化合物前駆体の生産
②得られたグルコースは、代謝工学的に改変された組換え大腸菌によりほぼ100％効率で化学工業原料中間体の2-デオキシ-シロ-イノソース(DOI)に変換し、キシロースはその組換え大腸菌の生育炭素源として利用する。すなわち、セルロース、ヘミセルロース画分から得られた糖は、無駄なく利用される（図1.7）。

本研究は、上記目的を達成するために、大きく2つの研究項目

（1）環境低負荷型糖生産システムの開発（オールバイオプロセス）

## （２） 棄菌床糖化溶液からの DOI 発酵高生産組換え大腸菌の開発

で構成し、実施した。また、本研究は、非可食バイオマスから今まで石油から生産されていた付加価値の高い化成品原料を生産する技術であり、石油リファイナリーからバイオリファイナリーへのパラダイムシフトによる持続型低炭素社会の構築、地球環境問題に貢献することができる。

### 2. 研究方法

2.1 環境低負荷型糖生産システムの開発（オールバイオプロセス）

2.1.1 マイタケ菌のゲノム解析と遺伝子組み換え系の確立

##### 2.1.1.1 使用した菌株と保存方法

本実験ではいずれも株式会社雪国まいたけより提供されたマイタケ菌 Grifola frondosa の菌株を使用した。二核菌糸体 (Dikaryotic strain) は市販品種で食用として栽培されるマイタケ M51 号を使用した。一核菌糸体 (Monokaryotic strain) は M51 株から単離された Gf-M1 株を使用した。マイクロアレイ解析等、菌床を用いた実験には子実体形成能を有する二核菌糸体（M-51 号）を使用した。

菌株は PDA プレート培地上で 25℃、4 週間培養し、4℃で保存した。また、長期間の保存は、コルクボーラー (直径 7 mm) で PDA プレート培地ごと採取した菌糸を 20% グリセロール、0.9% NaCl 中で -80℃ にて保存した。

###### 2.1.1.2 G. frondosa 用培地組成

### G. frondosa 菌床

G. frondosa 菌床は基材として 0.5-2.0 mm に破砕した広葉樹材（ブナ）を使用し、とうもろこしふすまを基材と 9:1 の割合になるように添加し作成されている。この菌床に G. frondosa を植菌し、食用として出荷可能な子実体が形成された状態の菌床を株式会社雪国まいたけより提供された。各菌床は同一時期に作成、植菌されたものを用いた。

### G. frondosa 液体培地 (YMG 培地)

下記の表2.1の組成で培地を調製したのち、オートクレーブにて120℃、20分間殺菌処理して使用した。表2.1 G. frondosa 液体培地組成

試薬名	最終濃度
BactoTM Yeast extract (Difco)	0.4%
Malt extract (Difco)	1.0%
Glucose (ナカライテスク)	0.4%
Potato dextrose agar (PDA)

Bacto™potato dextrose agar (Difco) を終濃度 3.9% になるように純水に溶解し、オートクレーブにて 120℃、20 分間殺菌処理した。その後、クリーンベンチ内で滅菌済みシャーレに注ぎ、完全に固まったことを確認したのち使用した。

###### 2.1.1.3 G. frondosa 廃菌床の保管処理

雪国まいたけより提供された菌床から子実体を取り除き、菌床は通気弁付きポリプロピレン製バッグに移し保管処理を開始した。子実体を取り除いた日を保管0日とし、湿度制御は行わず25℃に設定したインキュベーター内で設定期間まで保管を行った。

###### 2.1.1.4 G. frondosa 廃菌床からの試料調製

酵素抽出、total RNA 抽出は図 2.1 に示したように廃菌床の 3 か所から試料採取した。最外部を Out: O、中間部を Relatively Centre : RC、中心部を Centre : C としてそれぞれ解析した。

① 廃菌床の各場所から 7.5 g の試料を採取し、50 mL のマロン酸 Na 緩衝液（50 mM, pH 4.5）に懸濁した

② 懸濁液を氷水中で一定速度で 15 min 攪拌し、菌床を含む

抽出液はミラクロス（Calbiochem）で濾過したのち、ろ

図2.1 廃菌床からの試料採取場所

液を $ 12,000 \times g $ , $ 15min $ , $ 4^{\circ}C $ で遠心し上清を酵素抽出液として解析に使用した。

##### 2.1.1.5 マイタケ菌からのゲノム DNA 抽出

① G. frondosa 菌糸を YMG 培地で培養し、約 100 mg をマルチビーズショッカー用の 2 mL チューブに採取し、メタルコーンを入れた。

② チューブごと液体窒素で急速凍結した。

③ チューブをマルチビーズショッカー（安井機械）に装着し、1700 回転で 10 秒間破砕処理を行った。

④ チューブを取り出し、破砕された菌体を 500 μL の抽出バッファー (50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM EDTA, 1% SDS) でよく懸濁した。

⑤ 150 μL の PA 溶液 (3M CH₃COOK, 2M CH₃COOH) を加え、よく混ぜたのち 4℃で 14000 rpm、5 min 遠心分離を行った。

⑥ 上清を新たなマイクロチューブに回収し、等量のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（ナカライテスク）を加え、よく混ぜたのち4℃で14000 rpm、5 min遠心分離を行った。

⑦ 上清をあらたなチューブに回収した（中間層がなくなるまで⑥～⑦の操作を繰り返した）。

⑧ 等量のイソプロパノール（ナカライテスク）を加え、よく混ぜたのち4℃で14000 rpm、5 min遠心分離を行った。

⑨ 上清を捨て、70%エタノール（ナカライテスク）を加え、4℃で14000 rpm、5 min 遠心分離を行った。

⑩ 上清を捨て、沈殿を $ 500 \mu L $ の TE バッファーに溶解し $ 5 \mu L $ の RNase 溶液を加えた。
⑪ 37℃で30分保温したのち、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールを500μL加えてよく混ぜたのち4℃で14000rpm、5min遠心分離を行った。

⑫ 上清を新たなチューブに回収した。

⑬ 50 μL の 3M 酢酸ナトリウム溶液、500 μL のイソプロパノールを加えてよく混ぜたのち 4℃で 14000 rpm、5 min 遠心分離を行った。

⑮ 上清を捨て、沈殿を適量の TE バッファーに溶解した。

##### 2.1.1.6 マイタケ菌のゲノム解析

G. frondosa M1 株の染色体 DNA を材料として、次世代シークエンサー (Roche 454 GS FLX titanium) を使用してゲノム配列決定を行った。また、得られた塩基配列データを研究共同機関である（株）雪国またけのデータベースと共にアセンブルした。推定遺伝子領域の予測は、次世代シークエンサープラットフォーム用に開発された複数の解析プログラムを用いて行った。

##### 2.1.1.7 マイタケ菌からの total RNA 抽出および cDNA 合成

RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN) を用い、説明書に従って乳鉢で細かくすり潰した廃菌床サンプルからtotal RNA の抽出を行った。cDNA の合成は、Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche) を用い、付属の説明書に従った。

##### 2.1.1.8 マイタケ菌のカスタムマイクロアレイチップの作成

マイタケ歯 M51 株のゲノム情報を基に、Agilent 社が提供するマイクロアレイデザインソフト eArray を用い、マイタケ全推定遺伝子（約 16000）を搭載したカスタムマイクロアレイをデザインした。プローブ長は 60-mer で 1 遺伝子あたり 2-3 プローブが対応するように計 43,808 プローブを設計しマイクロチップ基板上へ配置した。解析は 1 アレイに対し 1 サンプルをハイブリダイゼーションさせる 1 色法を用いた。2.1.1.7 で得られた RNA からの cDNA および cRNA 合成、マイクロアレイチップへのハイブリダイゼーションは Agilent の説明書に従った。データの解析にはマイクロアレイデータ解析ソフト Gene Spring ver. 12.6 (Agilent Technology) を用いた。

##### 2.1.1.9 定量的 real-time PCR (qRT-PCR)

qRT-PCR には、LightCycler 480 SYBR Green I Master (Roche) および Light Cycler 480 システム (Roche) を用い、その説明書に従って行った。また、各遺伝子に特異的なプライマーは、Tm 値が 60-65℃、増幅産 物 長 さ が 80 - 150 bp になるように 設定 し Primer3 Plus (http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi/) ソフトウェアを用いて設計した。作成したプライマーを表 2.2 に示した。
表 2.2 qRT-PCR に用いたプライマー

GeneSymbol	Gene ID	Primer	Sequence (5'→3')
vpl2-V	713293	qPCR0713293Fw	CACGACGCTATTGGATTCTCTC
qPCR0713293Rv	ATGTTGGCTGGAAAGTTGG
mnp3A	180436	qPCR0180436Fw	CTTCTTCGACACCCAGTTCTTC
qPCR0180436Rv	TCAACTTCGCCTTGGTTTCC
vpl2-L	25314840	qPCR25314840Fw	ACCTCCAGGCGAATTTGTTC
qPCR25314840Rv	TGGCATCGTGGAAAGTAAGG
fio1	431474	qPCR0431474Fw	TTCTGCACACGAACAACACC
qPCR0431474Rv	GGAAACGTCAGGCAAAACAC
vpl2-Mn	1306909	qPCR1306909Fw	CAAGTGGTTCGACGTTCTGG
qPCR1306909Rv	AAACAGCATCGGGGAGAAAC
mnp3B	190517	qPCR0190517Fw	TTGACACCATCACCAGCATC
qPCR0190517Rv	AGCGACCGAGTGAGAAGAAAG
lcc31	713160	qPCR0713160Fw	TTACCCGACAGGCAACAACTC
qPCR0713160Rv	CGCAGGACAAAGACACCAATC
glo	431479	qPCR0431479Fw	CAACTTCTGGGAGGACGTTTG
qPCR0431479Rv	ACAACACCGAACTCTGCAC
cdh1A	20212195	qPCR20212195Fw	TTACCGCGGATGCAAATCTC
qPCR20212195Rv	ATTGCGAGAAACAGCCGAAC
cdh1B	21512770	qPCR21512770Fw	CTGCTCCATCGTCATCTTCATC
qPCR21512770Rv	CATGTCTCGGAAGCAACGAG
act1	24314302	qPCR Gf actin 1Fw	AAGAGCTATGAGTTGCCCGATG
qPCR Gf actin 1Rv	AATGCGGGCTGGAAAAGAG

#### 2.1.2 マイタケ菌の前処理能力強化

##### 2.1.2.1 マイタケ菌糸の培養

① 保存スラント、または平板上の気中菌糸を白金線で少量掻き取り、液体培地に植菌した。

② 2 週間静置培養。培養中は 1 日に 2 回ほどフラスコを振って攪拌し、気中菌糸が発達しないようにした。

③ 滅菌したホモジナイザーで菌糸を粉砕し、菌糸懸液1 mLを50 mLの液体培地に植菌した。

④ 1 週間静置培養。培養中は 1 日に 2 回ほどフラスコを振って攪拌し、気中菌糸が発達しないようにした。

##### 2.1.2.2 プロトプラストの調製

① ミラクロスを用いて培養液を濾過し、菌糸を回収した。

② 菌糸を脱イオン水で数回洗浄した。

③ 菌糸を 0.5 M マンニトールを含むマレイン酸-NaOH 緩衝液で数回洗浄した。

④ 菌糸を滅菌済み試験管に移し、湿重量を測定した。

⑤濾過滅菌しておいたプロトプラスト化酵素液（マレイン酸-NaOH 緩衝液（pH5.6）、0.5M マンニトール、1% セルラーゼオノヅカ RS（ヤクルト）、0.1% Yatalase (TAKARA））を菌糸湿重量 0.1 g に対して 1 mL 添加した。

⑥ $ 20^{\circ}C \sim 30^{\circ}C $ で 2～4 時間振盪した。
⑦ 酵素反応液を一部採取し、血球計算盤でプロトプラスト数を計測。プロトプラスト数が少ない場合は反応時間を延長した。

⑧ ブフナー漏斗型グルスフィルターG2で濾過し、未消化の菌体を除去した。

⑨ ろ液を 3000rpm、4℃、5min の条件で遠心分離した。

⑩ 沈殿したプロトプラストを 0.5 M マンニトール、マレイン酸-NaOH 緩衝液で懸濁した。

⑪ ⑨、⑩をもう一度繰り返し、最終的にプロトプラストを1 mLの緩衝液で懸濁した。

⑫ プロトプラスト懸濁液中のプロトプラスト数を血球計算盤で計測した。

##### 2.1.2.3 UV 照射による変異導入

① $ 5 \times 10^{5} $ 個のプロトプラストに対して紫外線を照射した $ (120 \mu \mathrm{J}, 24 \mathrm{sec}) $ 。

② プロトプラストを 0.5 M マンニトールと 0.1% 硫酸マグネシウムを含む復帰培地に播いた。

③ トップアガーを重層して 1 週間程度培養し、再生したコロニーを単離して PDA プレート培地に植え継いだ。

#### 2.1.3 生物的前处理に最適な糖化酵素開発

##### 2.1.3.1 使用した菌株と保存方法

本研究では遺伝子組み換え実験およびバイオマス糖化実験には世界的標準株である T. reesei QM9414 株およびセルラーゼ高生産変異株である PC-3-7 を使用した。QM9414 株および QM9414 を親株として作成した遺伝子組換え株は、PDA プレート培地で培養して分生子を着生させた。分生子は 10％ グリセロールを含む生理食塩水で懸濁し、胞子懸濁液として -80℃ で保存した。

T. reesei の遺伝子組換え用 DNA 断片を作成するための DNA 増幅用として大腸菌 DH5α を使用した。

##### 2.1.3.2 使用した培地

### T. reesei 用液体培地

下記の表2.3の組成で培地を調製したのち、オートクレーブにて120℃、20分間殺菌処理して使用した。

表 2.3 T. reesei 用液体培地组成

試薬名	最終濃度
炭素源	下記参照*
硫酸アンモニウム (ナカライテスク)	0.14%
リン酸二水素カリウム	0.2%
塩化カルシウム二水和物	0.03%
硫酸マグネシウム七水和物	0.03%
ペプトン (Difco)	0.1%
イーストエキス (Difco)	0.05%
Tween80 (和光純薬)	0.1%
Trace element (下記表2.4 参照)	0.1%
酒石酸緩衝液	50 mM
$ ^{*} $ 炭素源としてそれぞれ 0.3% glucose 又は 1.0% Avicel を用いた。リグニン分解酵素遺伝子形質転換体の培養条件検討には 0.5 mM の FeSO $ _{4} $ 、MnSO $ _{4} $ 、CuSO $ _{4} $ 、CaCl $ _{2} $ 、0.05 %へモグロビン（豚由来）を用いた。

表 2.4 Trace element 組成

試薬名	最終濃度
ホウ酸 (ナカライテスク)	0.006%
七モリブデン酸六アンモニウム四水和物 (和光純薬)	0.026%
塩化鉄 (Ⅲ) (和光純薬)	0.1%
塩化銅五水和物 (和光純薬)	0.4%
塩化マンガン四水和物 (和光純薬)	0.008%
塩化亜鉛 (和光純薬)	0.2%

### T. reesei 用最少培地

下記の表2.5の組成で培地を調製したのち、オートクレーブにて120℃、20分間殺菌処理して使用した。

表 2.5 T. reesei 用最少培地組成

試薬名	最終濃度
炭素源	下記参照 $ ^{*} $
硫酸アンモニウム（ナカライテスク）	0.5%
リン酸二水素カリウム（ナカライテスク）	1.5%
硫酸マグネシウム（ナカライテスク）	0.06%
塩化カルシウム二水和物（ナカライテスク）	0.06%
硫酸鉄七水和物（和光純薬）	0.0005%
硫酸マンガン一水和物（和光純薬）	0.00016%
硫酸亜鉛七水和物（和光純薬）	0.00014%
塩化コバルト（和光純薬）	0.0002%

*プレート培養には上記に炭素源として2% agar および1%の glucose を添加した。

リグニン分解酵素遺伝子組み換え体のスクリーニング用培地は最少寒天培地に0.1% cellobioseを加え、オートクレーブ後、ラッカーゼの呈色基質としてフィルター滅菌した7 mMのタンニン酸を20％になるよう加えた。ペルオキダーゼ発現株はフィルター滅菌した4％レマゾールブリリントブルーR (RBBR)溶液を培地の4％になるように加えた。

###### 2.1.3.3 T. reesei の形質転換

① T. reesei 胞子 $ (1\times10^{7} $ 個 $ を液体培地に植菌し、28℃，220rpm, 20～24 hr. の条件で振盪培養した。

② ミラクロスを敷き詰めたブフナー漏斗で吸引濾過した。

③ 菌糸を滅菌超純水で洗浄後、余分な水分を除いた。

④ Yatalase solution （Yatalase (TAKARA) in A2 buffer（10 mM リン酸ナトリウム緩衝液（pH 5.8）、1.2 M 硫酸マグネシウム（ナカライテスク）））10～30 ml に菌糸を入れた。

⑤ $ 30^{\circ} $ Cで2時間70 rpmで浸透しながら保温した。
⑥ ガラスろ過器 P100 (SIBATA) で吸引ろ過した。

⑦ ろ液と等量の D buffer （100 mM Tris-HCl (pH7.0)、0.6 M ソルビトール（ナカライテスク））を穏やかに重層した。

⑧ $ 4000 \, x \, g $ , $ 15 \, min $ , $ 4^{\circ}C $ で遠心分離し、中間層を新たなチューブに回収した。

⑨ B2 buffer （10 mM Tris-HCl (pH7.5)、1.0 M ソルビトール（ナカライテスク））5～10 ml を添加した。

⑩ 2500rpm, 15min, 4℃で遠心分離し、沈殿となったプロトプラストを B2 buffer で懸濁した。

⑪ ⑨～⑩をもう一度行った。

⑫ 沈殿を C buffer（10 mM Tris-HCl (pH7.5)、10 mM 塩化カルシウム（ナカライテスク）、1.0 M ソルビトール（ナカライテスク））1 mL で懸濁した。

⑬ トーマの血球計数盤を用いてプロトプラスト数を計数し、 $ 5 \times 10^{7} \sim 5 \times 10^{8} $ 個プロトプラスト / 200 μl になるように C buffer で調整するした。

⑭ プロトプラスト懸濁液に DNA 断片（10～20 μg）添加した。

⑮ PEG buffer（10 mM Tris-HCl (pH7.5)、50 mM 塩化カルシウム（ナカライテスク）、25% ポリエチレングリコール 6000（ナカライテスク））を 50 μl 添加し、氷上で 20 min 静置した。

⑯ PEG buffer を 2 ml 添加し、室温で 5 min 静置した。

⑰ C buffer 4mL 添加し、2000 rpm, 15 min, 室温で遠心分離した。

⑱ プロトプラストを C buffer 1 ml で懸濁した。

⑲ 200μl ずつ選択培地にまき、45 ℃で保温したトップアガロース 5ml を重層した。

②28℃で14~21日間培養した。

###### 2.1.3.4 T. reesei にコドン使用頻度を最適化した遺伝子の人工合成

G. frondosa の CDS 情報をかずさ DNA 研究所の Codon Usage Database (http://www.kazusa.or.jp/codon/) 上の Hypocrea jecorina (T. reesei の完全世代) コドン使用頻度に最適化し人工合成した(フナコシ)。人工合成された遺伝子は pUC 系プラスミドに挿入した。

###### 2.1.3.5 T. reesei 形質転換用 DNA 断片の構築

T. reesei 用 G. frondosa リグニン分解酵素発現力セットは当研究室で作成され cbh1 高発現用プラスミド (cbh1 プロモーターおよび 5' 上流領域、cbh1 ターミネーターおよび 3' 下流領域を含みアセトアミド資化性遺伝子 amdS をマーカーとして構築されたプラスミド) を基本構造として用いて構築した (図 2.2)。CBHI (セロビオハイドロラーゼ I) コード遺伝子 cbh1 は T. reesei セルラーゼ遺伝子の中で最も高い発現量を示し、結晶性セルロース (Avicel) を炭素源としてセルラーゼ誘導培養した際にアクチン遺伝子 (act1) 約 100 倍の遺伝子転写量を示す。その転写を支配している cbh1 プロモーターは極めて強力である。

人工合成遺伝子は6×Hisタグ配列が導入遺伝子の終止コド前に付加されるよう設計したプライマーで増幅した。また本実験におけるシグナル配列は各発現遺伝子由来（G. frondosa由来）の配列を用いた。形質転換時は発現力セットをKpnIとEcoRIで消化して切り出した。

また、T. reesei 内在性リグニン分解酵素発現の際は、T. reesei ゲノムから目的遺伝子を In-Fusion Primer を用いて増幅し、増幅産物を cbh1 プライマー発現プラスミドに導入した。T. reesei 内在性リグニン分解