Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
###### 3.1.3.8 異種リグニン分解酵素遺伝子を形質転換した T. reesei 株のサザン解析

MnP 発現株では QVP1 とわずかながら活性が見られた QVP4 株を解析した(図 3.25)。Laccase 発現株では最も高い活性を示した QLCC18 株を解析した(図 3.26)。

QVP 株において Nsi I 消化の際、非相同組み換え株で見られる 3.9 kb のバンドが見られた QV1 は相同組み換え体であり、予想と異なるハイブリダイゼーションパターンであった QVP4 は非相同組み換え体であることが分かった。検出されたバンドの数からそれぞれ、導入遺伝子が 1 コピー導入されていることを確認した。

図 3.25 VP が cbh1 と相同組換えした場合の制限酵素地図（上）とサザン解析の結果（下）

Laccase を発現させた QLCC18 は Xmn I で消化した際、相同組み換え体で観察されるはずの 6.8 kb より低い位置にバンドが見られた(図 3.26)。しかし、培養上清の SDS-PAGE では CBH I のバンドを欠失していたことから相同組み換え体であると予想していた。そのため、導入した発現力セットの全長ではなく、上流領域約 1 kb が抜け落ちた状態で遺伝子組み換えが起こったと考えられる。ハイブリダイズしたバンドの数から 2 コピーの導入遺伝子が組み込まれたことを確認した。

以降の培養条件検討など詳細な解析はサザン解析を行った株で行った。
図 3.26 LCC31 が cbh1 と相同組換えした場合の制限酵素地図（上）とサザン解析の結果（下）

###### 3.1.3.9 G. frondosa リグニン分解酵素発現株の qRT-PCR 解析

QLCC 以外の株は明確な酵素活性を示さなかったため、転写レベルで G. frondosa リグニン分解酵素遺伝子が発現しているのかどうか確認した。1% Avicel 培養 3 日目の菌体から RNA を抽出し、導入した G. frondosa リグニン分解酵素遺伝子と主要なセルラーゼ遺伝子を対象とした qRT-PCR 解析を行った。その結果、酵素活性が検出できなかった株を含め、全ての形質転換体で転写が確認された(図 3.27)。解析した 33 の発現株のうち cbh1 の発現を示さなかった株（相同組み換え体）は 25 株、cbh1、導入遺伝子両方を発現していた株（非相同組み換え体）は 8 株であった。非相同組み換え体である QVMn4、QVMn8 においては他の QVMn 株よりも導入遺伝子の転写量が低く、cbh1 の転写も wild 株で見られる発現量よりも低かった(図 3.27D)。QLCC5,QLCC20 株においては導入遺伝子の転写が相同組み換え株と比較し低い値であった(図 3.27F)。
図 3.27 T. reesei に導入した G. frondosa リグニン分解酵素遺伝子の qRT-PCR 解析結果 A: QM9414 B: VP 発現株 C: LiP 発現株 D: VM n 発現株 E: MnP3B 発現株 F: LCC 発現株

####### 3.1.3.10 G. frondosa リグニン分解酵素発現 T. reesei 培養条件の検討

リグニン分解酵素の異種発現ではしばしば LiP、VP、MnP の補因子であるへムを培地中に添加すると、リグニン分解酵素生産量が上昇することが知られている。本実験においては構造安定化を行う Ca などの関連因子を培地に添加し培養を行った。ラッカーゼに関しては補因子である Cu を培地に添加した。ペルオキダーゼ発現株として、わずかに MnP 活性を示した QVP4 を使用した。ラッカーゼ発現株としては他の発現株と比較し高い活性を示した相同組み換え株 QLCC18 を使用した。非相同組み換え株 QVP4 に関して 1% Avicel 培地を基本として FeSO₄、MnSO₄、CaCl₂、ヘモグロビン(豚由来)を別々に添加し 5 日間の培養後、活性測定を行った。活性測定結果は 30℃、50℃において反応させたが 3 分間の測定時間中に活性は検出できなかった。SDS-PAGE においても親株との大きな違いは観察されなかった(図 3.28)。VP が
菌体外に分泌されず、菌体内に蓄積されている可能性を考慮し、菌体内 MnP 活性測定を行ったが培養上清と同様に活性は検出できなかった。

ラッカーゼ発現株 QLCC18 に関して $ CuSO_{4} $ 添加した Avicel 培地で培養を行った。その培養上清の Laccase 活性測定結果を図 3.29 に示す。0.5 mM $ CuSO_{4} $ を添加した培地において明らかな活性の上昇が見られた。一般に Laccase は高い温度安定性を示すため、形質転換体が G. frondosa 本来の立体構造と同様な Laccase を生産しているか確認するため 70℃ にて活性測定を行い、安定した反応が起こっていることを観察した。測定結果は、Cu 添加なしでは 50℃ で 21.0 U/L、70℃ で 37.4 U/L であったが Cu 添加した培地ではそれぞれの温度で 81.3 U/L、121.2 U/L であった。銅を添加し

図 3.28 ペルオキシダーゼ関連物質を添加した QVP4 の 1% Avicel 培養上清の SDS-PAGE

non: 1 % Avicel, Mn supp:1 % Avicel + 0.5 mM MnSO_{4}, Fe supp: 1 % Avicel + 0.5 mM FeSO_{4}, Hem supp: 1 % Avicel + 0.05 % Hemoglobin, Ca supp: 1 % Avicel + 0.5 mM CaCl_{2}

たことにより活性は50℃で3.88倍に上昇した。培地へのCu添加に関わらず70℃でも安定した酵素反応を続け、高い活性を示したことからLaccaseの構造は不完全な状態ではなく、正しい立体構造で分泌されていることが示唆された。

また、Laccase 活性測定の 1 mL の系に培地と同じ濃度になるよう $ CuSO_{4} $ を添加したが活性の上昇は確認されなかった(data not shown)。このことから添加した Cu が反応に直接関与していないことが明らかとなった。他の株でも再現性を取るために別の LCC31 発現株である QLCC3 株においても培養を行い、培地に $ CuSO_{4} $ を添加するとラッカーゼ活性が上昇することを確認した。

なぜ培地への Cu 添加がラ

図 3.29 QLCC18 の培養上清ラッカーゼ活性測定 Cu sup.: 0.5 mM CuSO_{4} を培地に添加
ツカーゼ生産に影響するのかを明らかにする為、転写段階における影響を qRT-PCR で解析した。親株である QM9414 において 1% Avicel 培地への $ CuSO_{4} $ を添加した場合、cbh1 転写量及び他のセルラーゼ遺伝子（cbh1 と egl1）の転写量は $ CuSO_{4} $ を添加していない時と比べて若干低下した(図 3.30)。

図 3.30 0.5 mM $ CuSO_{4} $ 添加培地におけるセルラーゼ遺伝子の転写量

転写レベルではなく、分泌系などに Cu が何らかの影響を及ぼしている可能性から CMCase、Xylanase の酵素活性測定を行った(図 3.31)。Cu 添加培養では Cu を添加しなかった 1% Avicel 培養と比較し CMCase 活性の低下が観察された。親株で Cu 添加の効果が cbh1 転写を活性化しなかったにも関わらず、cbh1 プロモーター制御下にあるはずの LCC18 株の LCC31 遺伝子の転写量は増加した(図 3.32)。Cu 添加なしの培養では act1 比で 12.8 倍の転写量であったが Cu 添加によって 16.8 倍の転写量に増加した。

図 3.31 0.5 mM CuSO_{4} 添加培地におけるセルラーゼ活性への影響 Cu supp. 0.5 mM CuSO_{4} を培地に添加
図 3.32 $ CuSO_{4} $ 添加による QLCC18 株の遺伝子転写への影響

Cu supp. 0.5 mM $ CuSO_{4} $ 培地に添加

###### 3.1.3.11 T. reesei 内在性リグニン分解酵素の同種発現

T. reesei ゲノム中には表3.8に示されるリグニン分解遺伝子が存在している。しかし、これらの酵素遺伝子は種々の糖を炭素源とした培養のDNAマイクロアレイ解析結果からセルラーゼ生産条件でもほとんどの遺伝子が発現していないことが判明している(図3.33)。そこで、G. frondosa由来リグニン分解酵素の異種宿主発現よりもプロテアーゼによる分解や分泌のストレスが比較的低いと予想される同種発現によってリグニン分解能付加株の構築を試みた。表3.8で示したT. reesei内在性のFOLy遺伝子の

表 3.8 T. reesei ゲノム中のリグニン分解遺伝子

Gene ID	FOLy family	Annotation	Signal seq
122948	LO1	Candidate laccase	-
54239	LO1	Related to laccase	+
124079	LO1	Related to laccase	+
102820	LO1	Related to laccase	+
121098	LO1	Related to laccase	+
73016	LDA1	Related to aryl-alcohol oxidase	-
70910	LDA1	Related to aryl-alcohol oxidase	+
80764	LDA1	Related to aryl-alcohol oxidase	-
120008	LDA1	Related to aryl-alcohol oxidase	+
124282	LDA3	Candidate copper radical oxidase	+
22915	LDA6	Related to glucose oxidase	+
61066	LDA6	Related to glucose oxidase	+

配列をシグナル配列予測サイト Signal P（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）を用いて分泌シグナル配列を検索し直したところ Gene ID 121098（related to laccase）は分泌シグナルではなくアンカー配列であったため同種発現候補から除外した。同様に aryl alcohol oxidase 遺伝子も signal P では分泌シグナルが検出されなかったため発現候補から除外した。2つある LDA6 について 61066 は発現が確認できなかったため、わずかに発現していた 22915 を選抜した。
図 3.33 T. reesei 内在性 FOLy,mes コード遺伝子の各種炭素源培養におけるマイクロアレイ解析結果

##### 3.1.3.12 FOly 遺伝子高発現株の構築

G. frondosa 由来リグニン分解酵素異種宿主発現と同様に T. reesei でセルラーゼ遺伝子の中で最も強力な誘導性プロモーターである cbh1 プロモーターを用い T. reesei FOLy 遺伝子同種発現用プラスミドを構築した。構築した全てのプラスミドを QM9414 へと導入した。

G. frondosa 異種発現と同様にアセトアミドを唯一の窒素源とする選択培地で生育する複数の株を選抜し、導入遺伝子が増幅されるようにコロニーPCRを行った。その結果54239 (laccase)、124079 (laccase)、22915 (glucose oxidase)が組み込まれ、

れた株の取得に成功した。102820 (laccase)、124282 (glyoxial)

oxidase)においては形質転換候補株の構築には成功しているが本研究では解析するには至っていない。得られた 54239 (laccase)、

図 3.34 ABTS 含有寒天プレートにおけるラッカーゼ活性確認試験
124079 (laccase)導入株を 1% Avicel を炭素源として培養し、ABTS 含有寒天プレートで長時間反応させ Laccase 活性の確認を行った (図 3.34)。その結果、複数の株で活性が検出された。次に Laccase 活性を定量するため 1 mL 系で活性測定を行った (図 3.35)。その結果、54239-No.8 株で最も高い 35.5 U/L の活性が得られた。この株を Tlac1-8 株と名付け、後の解析に用いた。124079 に関しては液体での活性測定および ABTS 含有寒天プレート上で活性を検出することはできなかった。

図 3.35 54239 発現株培養上清のラッカーゼ活性

###### 3.1.3.13 T. reesei 内在性リグニン分解酵素発現株のサザン解析

Laccase 活性測定で他の発現株と比較し、高い Laccase 活性を示した Tlac1-8 株（54239 発現 N0.8 株）、Tlac1-3 株（54239 発現 N0.3 株）をサザン解析した(図 3.36)。

Tlac 株用ハイブリダイゼーションプローブは 54239 遺伝子に相補的であり、Xho I 消化した際、親株の内在性の 54239 遺伝子は 6.6 kb にバンドが見られる。Tlac1-8、1-3 株でこのバンドが確認されたため 54239 と発現力セットの相同組み換えは起こっていなかった。Tlac1-3 株のハイブリダイゼーションパターンは予想していた相同組み換え体のパターンと一致したため 1 コピー相同組み換え体であることが明らかになった。Tlac 1-8 株は cbh1 相同組み換えのハイブリダイゼーションパターンと一致しなかったため、非相同組み換え体であることが示唆された。ハイブリダイズしたバンドの数から 2 コピーの遺伝子が導入されていることが分かった。
図 3.36 54239 (Tlac)が cbh1 と相組み換えした場合の制限酵素マップ(上)と親株における制限酵素マップ（中央）とサザン解析結果

##### 3.1.3.14 Tlac1-8 株の培養条件検討

G. frondosa ラッカーゼ異種発現株 QLCC8 および QLCC3 において 1% Avicel 培養に 0.5 mM CuSO_{4} を添加した際、活性の上昇が見られたことから Tlac1-8 培養においても同様に添加を行った。1% Avicel 培地に Cu 添加なし、0.05 mM CuSO_{4} 添加、0.5 mM CuSO_{4} を添加して培養を行った。その活性測定結果を図 3.37 に示す。その結果、どの培養条件でも最も高い測定温度の 70℃ で最大の活性を示した。Tlac1-8 に 1% Avicel、0.05 mM CuSO_{4} 添加、0.5 mM CuSO_{4} 添加した培養で最大の活性はそれぞれ 56.4 U/L、115.0 U/L、141.7 U/L であった。本添加効果実験では CuSO_{4} の添加は 0.05 mM よりも 0.5 mM 添加の方がラッカーゼ生産に効果的であった。
図 3.37 培地への $ CuSO_{4} $ 添加による Tlac1-8 株の Laccase 活性への影響

また、Cu 添加が 54239 遺伝子の転写に影響を及ぼすかどうか明らかにするため、同培養条件下で得られた RNA を qRT-PCR によって解析した(図 3.38)。その結果、54239 遺伝子の転写量が act1 比で 10.6 倍(添加なし)から 14.2 倍(Cu 添加)に増加していることが明らかになった。cbh1 転写量は Cu 添加なしでは act1 比で 3.2 倍であったが Cu 添加では 4.5 倍まで上昇した。

図 3.38 培地への 0.5 mM $ CuSO_{4} $ 添加による Tlac1-8 株 54239 遺伝子の転写への影響 Cu supp. 0.5 mM $ CuSO_{4} $ を培地に添加

本研究におけるリグニン分解酵素の発現は1Lの培地中に50-60gものタンパク質を生産する糸状菌T. reeseiを宿主として、さらにT. reeseiにおいて最も高い発現量を誇るcbh1プロモーターを使用したにもかかわらず結果としてわずかなリグニン分解酵素活性を示す株しか得ることができなかった。本研究で
行った qRT-PCR 解析によって T. reesei に導入した G. frondosa リグニン分解遺伝子の転写までは問題なく行われていることが明らかとなった。そのため、今回の異種宿主発現における問題点は転写以降の段階にあると考えられ、以下の様な原因が考えられる。①プロテアーゼによる分解②補因子がアポ酵素に正しく組み込まれていない③翻訳されたタンパク質の不完全な折り畳み

まず原因①に関しては、以前の Aspergillus niger を宿主として P. chrysosporium MnP の異種宿主発現を行った報告(12)ではデンプンによって発現が強く誘導されるグルコアミラーゼ遺伝子のプロモーター glaA プロモーターを使用し、宿主には複数のプロテアーゼを欠損させた A. niger を用いて 100 mg/L の異種 MnP 生産を達成した。また、プロテアーゼ破壊をしていない Aspergillus oryzae を宿主としてデンプンやマルトースで誘導される TAKA amylase A (amyB) のプロモーターの支配下で発現させた P. chrysosporium の MnP 異種宿主発現の報告(13)では生産量が 5 mg/L ほどで前述の A. niger の 1/20 量よりも少なかった。このことからリグニン分解酵素の異種発現においてプロテアーゼによる影響も高活性を得られなかった原因の一つであることが示唆された。T. reesei においても主要な菌体外プロテアーゼ遺伝子（spw）を破壊した株で異種 EG を発現した際、spw 非欠損株と比較して組み換え EG の生産量が改善されたため(14)、宿主のプロテアーゼ破壊は異種宿主発現に一定の効果を上げることができると考えられる。

原因②に関して、リグニン分解酵素が補因子として金属イオンを用いていることが異種における発現を妨げている可能性がある。MnP などのペルオキシダーゼはヘムを活性中心に持ちLaccaseはCuを活性中心に持っている。MnPの大腸菌、酵母、糸状菌における異種宿主発現においてしばしば培地にヘモグロビンやヘミンなど、ヘム関連物質が添加される。前述のA. nigerにおけるMnP異種宿主発現株でもヘモグロビンを加えずに培養すると5-10 mgしかMnPを生産しない。このヘム添加によって得られるヘルオキシダーゼの活性は飛躍的に上昇するが、どのようにタンパク質発現に関与しているのか詳細な研究、報告はされていない。おそらく、ヘムが細胞内に取り込まれ、翻訳されたヘルオキシダーゼの折り畳みの段階に関わることが予想される。このような背景から、VP(MnP):713293を発現させたQPV4株においてヘモグロビンやFeを培地に添加して培養を行ったが、MnP活性を検出することはできなかった。T. reeseiは優れたタンパク質分泌能を持つことから不完全なタンパクが速やかに分解される可能性はあるが、ヘモグロビン添加によってVP生産が改善されなかった理由は不明である。T. reeseiにおいてTrametes sp.のLaccaseを発現させた例では、Cuを培地に添加した培養で形質転換体は培養上清中に3620 U/Lものラッカーゼ活性を示すが、Cuを添加せず培養したところ活性は検出されなかった(15)。Larrondoらも同様にCu添加によるAniger、Anidulansを宿主として異種発現させたLaccase活性の上昇を報告している(16)。この報告において、Cu添加の影響をノーザン解析およびウェスタン解析のバンド強度から考察しており、転写、翻訳レベルにおいてCuが関与しないと結論付け、アポ酵素へ組み込むCuの量が不足しているためCu添加が効果的であることを示唆した。しかし、本実験においては異種発現株QLCC18、同種発現株Tlac1-8の両株において培地へのCu添加によるLaccase遺伝子の転写量が上昇した。Cu添加によるcbh1への影響は親株QM9414では発現量の減少が見られたがTlac1-8株では上昇したことからCuはcbh1に何らかの影響を与える可能性が示唆されたが、本研究からは転写を活性化するのか抑制するのかは判断できない。酵素活性測定時の反応系にCuを添加してもLaccase活性の上昇は見られないことから、Cuが培養時に何らかの働きをしていると考えられる。本実験における異種リグニン分解酵素はT. reesei cbh1プロモーター制御下にあるため、Cuに関連するプロモーター配列があるか検討した。担子菌のLaccase遺伝子のプロモーター配列にはMRE(Metal response element)が存在することが知られている。
MRE のコンセンサス配列- TGCRCNC-は cbh1 プロモーターの TATA box 付近には見られず TATA-box より 2.2 kb 上流に存在したが、プロモーター領域から離れすぎているため転写には関与しないと考えられた。本実験では 1% Avicel 培養 3 日目の菌体を回収して qRT-PCR 解析を行った。しかし Cu 添加が培養前期から転写に影響しているかどうか遺伝子転写量を経時的に観察する必要がある。Cu が Loccase の折り畳みに関与する報告があるが、本研究の結果からは Cu 添加によって導入遺伝子が転写レベルで転写活性化されている可能性も示唆された。今後、Avicel 培養初期における菌体を用いた qRT-PCR、ペルオキシダーゼ発現株のヘモグロビン添加による遺伝子発現の影響を調べることで補因子添加による影響が明らかになると考えられる。過去の報告から MnP、VP、LiP などのペルオキシダーゼの異種宿主発現で酵素をより多く分泌させるには培地中へのヘモグロビンなどポルフィリンに関係した物質の添加が非常に効果的である(12, 13, 17)。今後、担子菌のリグニン分解ペルオキシダーゼを大量発現させ工業利用するには大量のヘモグロビン添加は困難であり、宿主ヘムの生成系の強化が有効な手段となるかもしれない。しかし、Fe は過酸化物と反応しフリーラジカルを生じることから生体内に過剰に存在すると有毒であるため、微生物は生体内の Fe 濃度を厳密に制御している。これらの理由から、工業利用のために T. reesei によってリグニン分解ペルオキダーゼをセルラーゼと同レベルで分泌させるには様々な菌株改良が必要とされることが予想される。

原因③に関しては、小胞体に正しい折り畳みがされない異常たんぱく質が蓄積すると UPR(unfolded protein response)によって foldase による折り畳みや ERAD(ER-associated degradation)と呼ばれる異常たんぱく質の速やかな小胞関連分解が行われることが知られており、cbh1 プロモーターを使用したことにより過剰の異常タンパク質が生産された可能性が考えられる。発現したタンパクのフォールディングや分泌系が追い付かず結果として活性を持ったリグニン分解酵素をほとんど分泌しなかったことが想定される。QLCC 株で qRT-PCR 解析により非相同組み換え体と判断された4株中3株は長時間反応させても Laddress 活性を検出することができなかった。この結果は、CBHI 分泌が優先され、導入した Laddress の分泌と両立できていないことが推測される。QLCC に関して Laddress 活性を示した株は全て cbh1 との相同組み換え体であった。CBHI を欠損させると理論的には分泌経路の約 60％が解放されることから考察すると分泌ストレスも異種タンパクの生産に大きな影響を及ぼしていると考えられる(18)。また、qRT-PCR 解析より、非相同組み換え体において遺伝子転写のタイトレーションが起きていることが示唆された。Trametes sp. の Laddress を T. reesei で発現させた Zhang らは cbh1 プロモーターのタイトレーションを防ぐため、また glucose 培養においても異種タンパクを発現させるため A. nidulans 由来の構成的に発現するグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター(gpd promoter)を使用した。その結果得られた Laddress 活性は本研究において最高の活性を示した Tlac1-8 よりも 25.5 倍も高い活性であった。しかし、Laddress の異種宿主発現という目標はクリアすることができた。

本研究では、T. reesei の cbh1 と比較し 1/4 ほどの発現量である egl1 プロモーターの使用も予定していたが、プラスミドの構築には至らず cbh1 プロモーターとの比較をすることができなかった。egl1 プロモーターであれば転写のタイトレーションや分泌ストレスを軽減できた可能性も考えられる。また、宿主の選択も異種タンパク発現において考慮するべき点である。現在、世界中で研究されている T. reesei Rut-C30 株は wild type である QM6a を親株として繰り返し突然変異導入をすることで造成されたセルラーゼ高生産変異株である。この Rut-C30 株は小胞輸送、小胞ソーティング、ゴルジ関連小胞 ATPase など分泌に関わる酵素をコードする遺伝子が変異もしくは欠損していることが明らかとなっている(19)。これらの遺伝
子の変異もしくは欠損がセルラーゼ高生産に寄与し、タンパク質の分泌ストレスに対応していることが考えられるため、日本におけるセルラーゼ高生産変異株PC-3-7株などを宿主として用いることも有効かもしれない。結果において述べなかったが、PC-3-7にG. frondosaのVPを形質転換したPCV1（非相同組み換え体）は0.7 U/LのMnP活性を示した。MnP遺伝子を導入したQM9414形質転換体は19株中1株わずかに活性を示すのみであった。しかし、PCV1では明らかなMnP活性を認めることができ、異種宿主発現のホストとしてQM9414より優れている可能性が示唆された。シグナル配列に関しては、100mg/Lの異種リグニン分解酵素の生産に成功していたプロテアーゼ欠損A. nigerでP. chrysosporiumのMnPシグナル配列を使用しており担子菌シグナル配列が子囊菌においても十分機能していることが示された。QLCC株は菌体外にLaccaseを生産したため本実験においても担子菌（G. frondosa）由来のシグナル配列が子囊菌（T. reesei）で機能することが明らかになった。

### 3.2 棗菌床糖化溶液からの DOI 発酵高生産組換え大腸菌の開発

#### 3.2.1 進化工学的改変による高活性型 DOI 合成酵素の取得・利用

図 3.39, 3.40 に示すように 1 次、2 次スクリーニング系を構築した。1107 株を 1 次スクリーニングした結果、野生型よりも DOI 生産性が上昇した 24 株の候補株を得た。続いて、2 次スクリーニングを行った結果、6 株 (S230G/W293R, E200A/D202E, A143G, M346T, L214M, E23D) の候補株を得た。また、DOI 高生産性に関与する部位を特定するために、二重に変異が導入されたクローンについては、一重の変異クローン (S230G, E200A, D202E) を構築し、DOI 生産性の評価を行った。その結果、DOI 生産性向上に関与する部位を 6 カ所 (E23, L143, L214, S230, W293, M346) 同定することができた（図 3.41）。

図 3.39 高活性型 DOI 合成酵素遺伝子取得の 1 次スクリーニング
図 3.40 高活性型 DOI 合成酵素遺伝子取得の 2 次スクリーニング

図 3.41 変異型 DOI 合成酵素の DOI 生産性比較（培養 36 時間）

DOI 合成酵素の N 末端側に存在する E23 は、NAD⁺結合に関与することで知られるロスマンフォールドドメイン上にあるので、これらの部位への変異は、DOI 合成の反応に必須である NAD⁺結合能に影響をきたしたと考えられる。また、活性部位に近い L143, L214, S230 の変異は、基質認識や変換の活性に影響を与え、ゲート付近にある M346 の変異は、基質の結合に影響を与えると推測される。W293 の部位は、ゲート、活性中心からも遠く、ロスマンフォールドドメイン上にもない。この部位の変異の DOI 生産性への効果は非常に大きかったことも重なり、非常に興味深い部位である（図 3.42）。そこで野生型 DOI 合成酵素と変異型 DOI 合成酵素 W293R の酵素特性を Km, Kcat を測定し、比較検討した結果（表 3.9）、基質親和性を示す Km 値は、変異型 DOI 合成酵素 W293R の方が野生型 DOI 合成酵素よりも 1.1 倍程度大きい値を示したが、ほとんど変わらないことが明らかとなった。しかしながら、酵素の代謝回転能を示す Kcat 値は、変異型 DOI 合成酵素 W293R の方が野生型 DOI 合成酵素よりも 1.41 倍程度大きい値を示し、
代謝回転能が高いことが示され、総合的に酵素の能力を示す Kcat/Km 値は、変異型 DOI 合成酵素 W293R の方が野生型 DOI 合成酵素よりも 1.56 倍程度大きな値を示し、W293R の変異は、酵素の代謝回転に大きな影響をきたしていることが推測された。

図 3.42 DOI 生産性に影響を与える DOI 合成酵素の変異部位

表 3.9 野生型 DOI 合成酵素と変異型 DOI 合成酵素の特性の比較

Km (M)	Kcat (sec-1)	Kcat/Km(M-1s-1)
野生型	1.1 x 10-3	0.36	327
变異型 W293R	1.0 x 10-3	0.51	510

次に DOI 生産性の上昇が大きかった 2 つの変異型 DOI 合成酵素 L214M、W293R、さらには、2 つの単独の変異を組み合わせた L214M/W293R をコードする遺伝子を、グルコース-6-リン酸高蓄積株 $ \Delta pzp $ 株に導入して 3 次スクリーニングを行った。2 次スクリーニングまでは、培地中のグルコースを DOI 発酵生産の原料及び生育の炭素源として利用するグルコース-6-リン酸蓄積株 $ \Delta pgi $ 株を宿主として利用していた。すなわち、グルコース-6-リン酸 (G6P) がペントースリン酸経路の酵素と DOI 合成酵素の競合により利用される状態で有り、より高活性型の DOI 合成酵素獲得が期待されるスクリーニングであった。3 次スクリーニングでは、DOI 生産宿主としての実績があり、生育炭素源としてはマンニトールを利用し、培地中に存在するグルコースを全て DOI の発酵生産に利用できるように代謝工学的に改変された $ \Delta pzp $ 株を利用した。これは、グルコースの生育への利用と切り離し、獲得された変異型 DOI 合成酵素の DOI 生産性のみへの寄与を評価するスクリーニングステップである。3 次スクリーニングの結果、菌体濁度の上昇とマンニトールの消費に相関が見られ、生育炭素源としてマンニトールを利用して、増殖していると考え
られた。また、これはΔpzp株は、グルコースをG6Pへと変換した後にそのまま細胞内に蓄積し、生育に利用することが不可能な代謝工学的に改変された株であることからも確認された。Δpzp/野生型(WT)株、Δpzp/L214M株、Δpzp/W293R株、Δpzp/L214M/W293R株間の菌体濁度の上昇とマニトールの消費速度を比較した時、大きな違いは見られなかったが、Glucose消費及びDOI生産の速度を比較した時、Δpzp/WT株よりも他の3つの変異型DOI合成酵素遺伝子導入株のグルコース及びDOI生産速度は上昇していた(図3.43)。また、生育の上昇がほぼ止まり、生育炭素源である培地中のマニトールが枯渇する培養開始24時間に注目すると、Δpzp/L214M株、Δpzp/W293R株、Δpzp/L214M/W293R株のDOI生産性が(図3.43)、Δpzp/WT株よりもそれぞれ約1.1倍、約1.2倍、約1.3倍と高くなっており、またこれらのDOI生産性上昇と同様に、グルコースの消費量も上昇していた(図3.43)。このときのそれぞれの菌株内のDOI合成酵素量をウェスタン解析で定量したところほぼ同一であったことから、変異型DOI合成酵素遺伝子導入株は、細胞内のG6Pを効率よくDOIへ変換しているため、野生型DOI合成酵素遺伝子導入株と比較して、培地中のグルコースを速く取り込み、G6Pに変換し、DOIの発酵生産をしていると考えられる。大腸菌のGlucoseの取り込みは、細胞内のG6Pの蓄積によってGlucoseの取り込みが抑制されるglucose PTSに制御されている。DOI合成酵素活性が高い変異型酵素は、野生型DOI合成酵素に比べて、細胞内に蓄積するG6Pを効率よく利用していくため、細胞内に蓄積するG6P量が少なくなり、効率よくグルコースも

(C)

(D)

WT L214M W293R L214M/W293R pLEX Vector

図 3.43 変異型 DOI 合成酵素の DOI 生産性への影響（3 次スクリーニング）
取り込むことが推測される。また、WT よりも高 DOI 生産性を示した L214M と W293R を組み合わせた L214M/W293R の利用は、さらなる高 DOI 生産性を示し、相加或いは相乗的な DOI 生産性の効果が見られた。

次に in vitro DOI 合成酵素活性測定法を利用して、高 DOI 生産性を示す変異型 DOI 合成酵素の比較検討を行った。野生型（WT）及び変異型 DOI 合成酵素 L214M、W293R、L214M/W293R の酵素は、His タグが付加した組換え蛋白質として生産・精製した。in vitro DOI 合成酵素活性測定の結果、WT と比較して、L214M は約 1.3 倍、W293R と L214M/W293R は約 1.5 倍の DOI 合成酵素活性を示した（図 3.44）。これらの酵素が有する DOI 合成酵素活性の上昇が、図 3.43 に記載した DOI 生産性の上昇に繋がっていることが考えられる。

図 3.44 変異型 DOI 合成酵素の in vitro DOI 合成酵素活性の比較

DOI 合成酵素について結晶構造がすでに報告されており、ホモダイマ一構造を有することが明らかになっている (20)。また、DOI 合成酵素は N 末端ドメインと C 末端ドメインに分けることができ、前者は $ NAD^{+} $ 結合ドメインとして知られるロスマンフォールドドメイン、後者はデヒドロキナ酸合成酵素に類似したドメインである。また、DOI 合成酵素の活性部位で重要なアミノ酸残基として、Arg119, Asp135, Lys141, Asp151, Glu183, Lys186, Lys225, Glu235, Glu243, His246, His250, His262 が知られている。青色で示したアミノ酸残基は基質と相互作用するもの、桃色で示したアミノ酸残基はコバルトイオンと相互作用するもの、黄色で示したアミノ酸残基は基質由来のリン酸基と相互作用を示すものである（図 3.45）。本研究で取得された DOI の高生産性を示したアミノ酸残基は赤色 (L214M) と緑色 (W293R) で示してある。L214M は、①基質 G6P と相互作用するアミノ酸残基 Lys225 と同じヘリック上に位置すること、②立体構造上 G6P と相互作用するアミノ酸残基 Asp135 やコバルトイオンと相互作用する Glu183、His262 の近傍に位置すること、さらに L214M が G6P 側に配位しているアミノ酸残基であることから、214M 番目のアミノ酸残基の置換（L⇒M）は DOI 合成酵素と基質 G6P の相互作用に影響をきたしていると考えられる。また、これは、L214M に関する速度論的解析結果より、Km 値が WT と比較して小さくなり、G6P との親和性が WT よりも上昇していたことからも示唆される。W293 は、外側に位置するアミノ酸残基である。293M 番目のアミノ酸残基の置換（W⇒R）は、速度論的な解析の結果、代謝回転速度及び基質に対する親和性
共に向上させる効果を示したが、どのようにこの塩基性アミノ酸残基への置換が影響を与えたか、立体構造の情報からのみでは、推測が非常に困難である。今後、モデルング等による解析技術の適用が必要であると考えられる。

図 3.45 DOI 合成酵素の立体構造と変異部位

#### 3.2.2 DOI 合成酵素の高安定化

図3.46に示すように、DOI合成酵素は、高濃度のDOI存在下において活性が低下することがin vitro DOI合成酵素assayの結果明らかとなった。DOI合成酵素は、ホモ二量体又は、DOI合成酵素結合蛋白質BtrC2とヘテロ二量体を形成することが知られている。二量体を形成することによるDOI合成酵素活性の安定化を考え、in vitro DOI合成酵素assay系で評価を行った結果、ヘテロ二量体は、高濃度DOI存在下における活性の低下をある程度抑えるが、DOI合成酵素単量体よりもDOI合成活性が大きく低下することが

図 3.46 高濃度 DOI 存在下における DOI 合成酵素及び DOI 合成酵素複合体の活性
分かった（図 3.46）。すなわち、ヘテロ二量体を利用する DOI 合成システムは、短時間で DOI 発酵生産するためには、不適合であると判断し、この項目の開発をここで終了することとした。

#### 3.2.3 DOI 合成酵素基質グルコース-6-P(G6P)の蓄積速度の強化

DOI 合成酵素の基質である G6P をできる限り速く、多量に大腸菌体内に蓄積させることができれば、高活性型 DOI 合成酵素の利用価値も高まり、短時間における DOI の高生産につながると考えられる。G6P を基質として利用する遺伝子を全て破壊した GI724Δpzp 株とさらにグルコースの取り込みに関与する ptsG 蛋白質の抑制因子である Mlc 蛋白質をコードする mlc 遺伝子を破壊した GI724ΔpzpΔmlc 株の細胞内 G6P 濃度の測定を行った。その結果、GI724ΔpzpΔmlc 株の細胞内 G6P 濃度は、GI724Δpzp 株よりも 2-3 倍高い濃度であった (図 3.47 (A))。すなわち、DOI 合成を行う宿主として優れていると考えられた。上記両株に DOI 合成酵素遺伝子を導入し、DOI の原料であるグルコース 3%、生育炭素源であるマンニトール 4% の条件下で DOI の発酵生産性試験を行った結果、DOI 生産性に違いは見られなかった (図 3.47 (B))。

グルコース濃度を 3% から 4.5% に変更した時、GI724ΔpzpΔmlc/btrC (DOI 合成酵素遺伝子導入) 株の DOI 生産性は、GI724Δpzp/btrC 株よりも向上したが、3% グルコースの場合と培養液中の DOI 濃度が変わらなかった (図 3.48)。培養液中の グルコース濃度に着目すると、GI724ΔpzpΔmlc/btrC 株及び GI724Δpzp/btrC 株を利用した DOI 発酵生産試験において、どちらの株も培養液中にグルコースを残存させていた。培養 48 時間目の グルコース消費量と DOI 生産量を考慮して DOI 変換率を算出すると約 99% であり、変換効率に関しては問題がないため、双方の株の グルコースの消費量の差が、DOI 生産量の差として検出されたと考えられる。すなわち、mlc 遺伝子の欠失は、培地中の グルコース濃度が高い状態にある程度適応可能とすることできると考えられる。

(A)

図 3.47 mfc 遺伝子欠失の DOI 生産への影響

(A) 大腸菌細胞内の G6P 濃度, (B) GI724Δpzp /btrC 株と GI724ΔpzpΔmlc/btrC 株の DOI 生産性
(A)

(B)

図 3.48 mlc 遺伝子欠失の高濃度グルコース存在下における DOI 生産性への影響 (A) 生育 (B) DOI 生産量 (C) グルコース消費量

#### 3.2.4 DOI 耐性（低感受性）·耐酸性 DOI 生産宿主の取得・利用

##### 3.2.4.1 DOI の大腸菌への増殖阻害効果

組換え大腸菌による DOI 発酵生産の実用化を考慮すると、5%以上、さらには10%の DOI 含有培養液の生産への必要性が考えられる。しかしながら、本研究で利用している DOI 生産宿主の大腸菌 GI724ΔPZP は、2% DOI を含む培地において、その生育が半分程度阻害され、また、4% DOI を含む培地においては生育が完全に阻害された (図 3.49)。培養液中に高濃度の DOI を生産・蓄積させるためには、DOI 耐性株、少なくとも DOI 低感受性株（以後、DOI 耐性（低感受性）と記載する）の開発が必要であると考えられる。大腸菌の DOI に対する感受性は、図 3.49 のように株ごとに異なる。また、DOI 発酵生産培養時には、DOI 原料のグルコースと生育炭素源の 2 種類の糖存在下における培養を実施するため、カタボライト抑制効果の程度が、DOI 生産性に影響を与えることも考えられ、実際に、各々の大腸菌株により、利用しやすい生育炭素源の種類が異なることも明らかになっている (21)。さらに、バイオマス由来糖化液に含まれる様々な生育阻害物質への適応程度も大腸菌株ごとに異なることが予想される。以上のことから、①利用するバイオマス糖化液の種類、②利用する生育炭素源の種類などにより、DOI 生産宿主とするのに最適な大腸菌株が異なると考えられる。現在の DOI 生産宿主大腸菌株に自然又は人為的に突然変異を導入して DOI 耐性（低感受性）変異株を取得する方法は、変異株の取得に要する労力は小さいが、変異部位の特定が困難である。自然又は人為的突然変異導入法に対し、大腸菌単一遺伝子破壊株ライブラリーである Keio collection （22）を利用し、スクリーニングにより DOI 耐性（低感受性）変異株を取得する方法は、変異株の取得に要する労力は大きいが、変異部位の特定が容易である。先に記した①、②より、DOI 生産に最適な宿主大腸菌が決定されていない現状を考えると大腸菌の DOI に対する耐性及び感受性に関与する遺伝子を同定し、各々の場面に最適な大腸菌株に適応させていくことが有効であると考
えた。そこで、Keio collection を利用し、各々の菌株における培養液中の DOI 濃度が DOI 生産性に与える影響を調べ、DOI 耐性及び感受性に関与する遺伝子を同定・解析し、DOI 耐性大腸菌株の開発を目的とした。

図 3.49 DOI 生産宿主大肠菌の DOI 感受性

図 3.49 に示すように、DOI 含有 LB 液体培地において、BW25113 株の増殖は DOI 濃度依存的に阻害された。高糖濃度の条件下では、高浸透圧及び代謝阻害が生じ、増殖が困難になることが知られている $ ^{(23)} $ 。DOI 存在下培養における大腸菌の増殖阻害が、DOI 特異的な増殖阻害か、高糖濃度による代謝阻害及び高浸透圧により生じた増殖阻害であるかについて検討を行った。

まず、大肠菌の DOI の代謝阻害の影響について考えた。これまでに大肠菌、DOI を単一炭素源として増殖に利用できないことが本研究において確認されている。また、DOI 含有 LB 培地で大肠菌を培養したとき、培養液中の DOI 濃度はほとんど変わらないことが明らかとなっており、DOI は細胞内に取り込まれないと考えられる。すなわち、グルコースのような資化可能な糖が高濃度に存在下すると代謝阻害を引き起こし、増殖が阻害されるが、細胞内に取り込まれる可能性が低い DOI においては、代謝阻害の結果により引き起こされる増殖阻害ではないと考えられ、本現象は DOI 特異的もしくは DOI 由来の物質特異的な増殖阻害の可能性が高いと考えられた（図 3.50 (B)）。

次に、浸透圧による大腸菌の増殖への影響を調べるために、各 DOI 濃度 $ (0, 1, 2, 4, 6\%) $ の LB 液体培地と同じ浸透圧になるように、スクロース含有 LB 液体培地 $ (0, 2.1, 4.2, 8.4, 12.7\%) $ を用いて BW25113 株を培養した。この浸透圧による増殖への影響を検討するにあたり、大腸菌 BW25113 株が資化することができないスクロースを利用した。スクロース含有 LB 液体培地における大腸菌の生育は、スクロースを含まない培地における増殖よりも良好であった（図 3.50(C)）。0% スクロース含有 LB 液体培地における増殖に対し、12.7% スクロース含有 LB 液体培地の増殖は約 21% 上昇した。以上の結果から、培地中に DOI が含まれることにより生じる大腸菌の増殖阻害は、浸透圧によるものでないと考えられる。
図 3.50 DOI の大腸菌への増殖阻害様式の検討

(A) 高濃度 DOI 存在下における大腸菌の増殖阻害効果、(B) 高糖濃度存在下における大腸菌の増殖阻害効果、(C) 高浸透圧条件下における大腸菌の増殖阻害効果

次に DOI が大腸菌の増殖に与える阻害作用が増殖抑制効果あるいは殺菌効果であるかを検討するために、DOI 含有 LB 液体培地における大腸菌の生菌率を調査した。図 3.51 及び表 3.10 に示すように、DOI 非含有 LB 液体培地における大腸菌の培養開始 12 時間以降の定常期、死滅期において、その生菌率は低下する。そこで、生菌率が高い 12 時間後の対数増殖期における生菌率に注目して、検討を行った結果、DOI 濃度依存的に生菌率の低下が見られた。すなわち、DOI は大腸菌に対して殺菌効果を有することが明らかとなった。

図 3.51 DOI 存在下における大腸菌の増殖曲線
表 3.10 DOI 含有 LB 液体培地を用いた培養における生菌率

培養時間(h)	生菌率(%)
DOI 0%	DOI 1%	DOI 2%	DOI 4%	DOI 6%
12	100	93	75	66	60
24	84	74	72	58	45
36	58	28	23	21	8
48	22	22	22	18	8

##### 3.2.4.2 DOI 耐性・感受性関連遺伝子取得のための1次スクリーニング系の確立

3.2.4.1 により、DOI 特異的な増殖阻害が考えられた。その増殖阻害に関連する遺伝子を見出し、DOI の増殖阻害機構を明らかにすることで、DOI 耐性大腸菌変異株の獲得に繋がると考えた。そこで、大腸菌の全遺伝子破壊株コレクション (Keio collection) を用いて、DOI 耐性・感受性関連遺伝子の探索を行うこととし、DOI 耐性・感受性関連遺伝子取得のスクリーニング系の構築を試みた。

適切に DOI 感受性を評価できるタイミングを決定するために、Keio collection の野生株である BW25113 株を使用して DOI 含有 LB 液体培地 (0, 1, 2, 4, 6%) における大腸菌の経時的な増殖を調べた結果、DOI 濃度依存的に大腸菌の増殖は阻害され、培養開始から 6 時間後から観測された。①遺伝子の欠失により誘導期が長くなる変異株の DOI 耐性及び感受性の評価には、培養開始 6 時間のポイントでは困難であると考えられること、②培養開始 12 時間では、調査したすべての DOI 濃度存在下における BW25113 株の増殖は定常期に入り安定したこと、③培養開始 18 時間では、0% DOI 培地において、菌体濃度が減少し始めたことから、培養開始 12 時間において DOI 耐性及び感受性を評価することが適切であると考えた。また、スクリーニング培地中の DOI の濃度は、大腸菌の増殖が完全に阻害される濃度が望ましいとも考えられるが、スクリーニングのために準備する DOI の精製に時間を要することから、増殖阻害率が 50% を超える 6% とともに。また、BW25113 株の至適培養温度範囲は 30-37℃ であり、培地中の DOI の安定性を維持する観点から 30℃ とした。以上から、DOI 耐性・感受性関連遺伝子の取得のための 1 次スクリーニング条件（培養温度：30℃、培地：6% DOI 含有 LB 液体培地、DOI 耐性・感受性評価培養時間：12 時間）を決定した。

##### 3.2.4.3 Keio collection を利用した DOI 耐性・感受性関連遺伝子取得へ向けた 1 次スクリーニング

Keio collection を利用した DOI 耐性及び DOI 感受性に関与する候補遺伝子の取得を目的として研究を行った。3.2.4.2 で決定したスクリーニング条件 (30°C、DOI 6%、12 h) で Keio collection 3,823 株の 1 次スクリーニングを行った。Keio collection の野生株である BW25113 株の DOI 非含有 LB 液体培地における増殖を指標 (100%) として、6% DOI 含有 LB 液体培地における増殖が 80% 以上を示した遺伝子破壊株を DOI 耐性（低感受性）候補株とし、6% DOI 含有 LB 液体培地における増殖が 20% 以下を示した遺伝子破壊株を DOI 感受性候補株とした。1 次スクリーニングの結果、DOI 感受性候補株のみ 6 株選出できた（表 3.11 及び表 3.12）。また、遺伝子の欠失が起因となり、DOI 非含有 LB 液体培地における増殖が速く、或いは遅くなったため、DOI 耐性（低感受性）候補株あるいは DOI 感受性候補株と選出されること、逆にされないことが予想される。そこで、DOI 非含有 LB 液体培地の増殖と 6% DOI 含有 LB 液体培地の増殖の差が 10% 以下の株を DOI 耐性（低感受性）候補株に加えた（表 3.13）。
表 3.11 6% DOI 含有液体培地において増殖が速い大腸菌株

破壊遺伝子名	DOI 0%の増殖(%) (WTを100%)	DOI 6%の増殖(%) (WTを100%)	増殖の差 (DOI0%-6%)	増殖 (当該遺伝子破壊株を100%)
- (WT)	100.00	52.41	47.59	52.41
malG	115.10	79.04	36.06	68.67
cpdA	95.11	78.78	16.33	82.83
rfaC	90.12	77.93	12.19	86.47
ybfA	92.74	77.93	14.82	84.02
maeB	95.74	77.37	18.38	80.81
ansA	111.56	77.20	34.36	69.20
eutI	107.86	76.73	31.13	71.14
yjiP	99.72	76.31	23.41	76.53
dcrB	97.20	76.02	21.18	78.21
ymgH	94.25	75.98	18.27	80.62
yccK	94.36	75.22	19.13	79.72
yicL	136.56	74.51	62.06	54.56
mdoH	123.75	73.59	50.16	59.46
ydjL	92.47	73.23	19.24	79.19
parC	96.95	73.23	23.72	75.53
gudD	96.84	72.80	24.04	75.17
tyrB	99.99	72.39	27.60	72.40
panD	124.14	72.11	52.04	58.08
yjjQ	123.07	71.66	51.40	58.23

表 3.12 6% DOI 含有液体培地において増殖が遅い大腸菌株

破壊遺伝子名	DOI 0%の増殖(%) (WTを100%)	DOI 6%の増殖(%) (WTを100%)	増殖の差 (DOI0%-6%)	増殖 (当該遺伝子破壊株を100%)
- (WT)	100.00	52.41	47.59	52.41
atpH	19.57	5.39	14.18	27.54
atpA	18.49	6.16	12.33	33.32
ackA	58.55	12.02	46.53	20.53
rffC	98.89	12.60	86.29	12.74
gor	96.28	17.66	78.62	18.34
wzxE	61.94	17.72	44.22	28.61
ypfI	108.01	20.03	87.98	18.54
hflD	83.68	20.17	63.51	24.11
cyoA	79.46	20.24	59.22	25.47
cysH	93.69	20.32	73.37	21.69
wcaF	69.77	20.33	49.44	29.14
yhfK	100.76	20.37	80.39	20.22
gntY	86.34	20.92	65.42	24.23
rfbA	77.45	20.93	56.52	27.02
gloA	76.16	21.54	54.63	28.28
atoD	81.81	21.67	60.13	26.49
dadA	76.55	21.89	54.66	28.60
ytfA	81.57	22.28	59.30	27.31
ybfL	76.94	22.45	54.49	29.18
speB	96.14	22.60	73.54	23.51