Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
表 3.13 各破壊株の DOI 非含有液体培地と 6% DOI 含有液体培地の増殖の差が小さい大腸菌株

破壊遺伝子名	DOI 0%の増殖 (%) (WTを100%)	DOI 6%の増殖 (%) (WTを100%)	増殖の差 (DOI0%-6%)	増殖 (当該遺伝子破壊株を100%)
- (WT)	100.00	52.41	47.59	52.41
argO	52.99	48.52	4.47	91.56
aspA	36.21	28.97	7.24	80.01
ycdH	59.07	49.33	9.74	83.51
cyaA	62.63	51.77	10.85	82.67
rffM	51.77	39.91	11.86	77.09
rfaC	90.12	77.93	12.19	86.47
atpA	18.49	6.16	12.33	33.32
ygfZ	45.15	32.82	12.33	72.69
fkpB	80.88	68.24	12.64	84.37
atpH	19.57	5.39	14.18	27.54
ygfY	47.00	32.67	14.33	69.51
yceK	76.68	62.05	14.63	80.92
ybfA	92.74	77.93	14.82	84.02
soxR	79.04	64.04	15.00	81.02
atpB	42.16	26.31	15.85	62.41
ybdJ	87.00	70.76	16.24	81.33
cpdA	95.11	78.78	16.33	82.83
tolB	87.55	71.04	16.51	81.14
ybiM	58.86	42.06	16.80	71.46
ugpQ	81.04	63.80	17.25	78.72

##### 3.2.4.4 1 次スクリーニングで選出した各候補株における 2 次スクリーニング

3.2.4.3 で得られた DOI 耐性 (低感受性) 候補株 $ \Delta argO, \Delta aspA, \Delta ycdH $ の 3 株 及び DOI 感受性候補株 $ \Delta atpH, \Delta atpA, \Delta ackA, \Delta rffC, \Delta gor, \Delta wzxE $ の 6 株について 2 次スクリーニングを実施した。2 次スクリーニングでは、各候補株を DOI 非含有及び 6% DOI 含有 LB 液体培地で培養し、経時的な増殖の変化を測定した結果、DOI 耐性（低感受性）候補株として $ \Delta argO $ 株、DOI 感受性候補株として $ \Delta rffC $ 株、 $ \Delta gor $ 株を見出した (図 3.52)。培養開始 12 時間後、 $ \Delta argO $ 株の DOI 非含有 LB 液体培地における菌体濁度と 6% DOI 含有 LB 液体培地における菌体濁度ほとんど変わらず、 $ \Delta argO $ 株の DOI 非含有 LB 液体培地の生育を 100% とすると 6% DOI 含有 LB 液体培地で 90% を示したことから、DOI 耐性（低感受性）株として選出した (図 3.52(A))。また、①DOI 耐性（低感受性）株は、DOI の発酵生産に活用していくこと、②非常の多くの菌株をスクリーニングしたことから菌株の取り違えが起こる可能性を考慮し、再度、argO 遺伝子破壊株を取得し、DOI 感受性について調べた。その結果、keiocollection の $ \Delta argO $ 株同様の DOI 耐性（低感受性）を示したことから、argO 遺伝子は、DOI 耐性（低感受性）に関連する遺伝子であると同定した。argO はアルギニン排出輸送体をコードする遺伝子であり、その排出輸送体は細胞内のアルギニンのレベルを制御し、塩基性アミノ酸であるアルギニンとリジンの間のバランスを保つのに重要であると考えられている (24)。アルギニン輸送体が DOI の取り込み等の輸送に代用されている可能性が考えられ、DOI 耐性に関与している事項は、アルギニン合成系か、輸送システムかを、他のアルギニン蓄積大腸菌変異株の DOI 耐性能を調べることにより、今後、明らかになると考えられる。
図 3.52 2 次スクリーニング

(A)DOI 耐性（低感受性） 候補株 (B)DOI 感受性候補株

培養開始 12 時間後、ΔrffC 株の 6% DOI 含有 LB 液体培地の菌体濁度は、BW25113 株の DOI 非含有 LB 液体培地の菌体濁度の 17% を示したため (野生株の DOI 非含有 LB 液体培地の増殖を 100% とする)、ΔrffC 株を DOI 感受性株として選出した (図 3.2.52 (B))。また、多数の菌株のスクリーニングで、菌株の取り間違いがなかったことを PCR で確認済みである。rffC は TDP フコサミンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子であり、大肠菌の外膜構成因子 LipidⅢの合成に関与することが知られている (25)。大肠菌の外膜の機能に支障をきたして結果、DOI に対する感受性が上昇したのではないかと推察する。

培養開始 12 時間後、Δgor 株の 6% DOI 含有 LB 液体培地の菌体濁度は、BW25113 株の DOI 非含有 LB 液体培地の菌体濁度の 18% を示したため (野生株の DOI 非含有 LB 液体培地の増殖を 100% とする)、Δgor 株を DOI 感受性株として選出した (図 3.52 (C))。また、多数の菌株のスクリーニングで、菌株の取り間違いがなかったことを PCR で確認済みである。gor はグルタチオン還元酵素をコードする遺伝子である (26)。gor 遺伝子が欠失すると、菌体内の還元型グルタチオン量の減少し、細胞内環境が酸化型になることが予想される。この環境が DOI 感受性を上昇させている可能性が考えられる。

##### 3.2.4.5 酸性条件における大腸菌の生育

本研究で利用している DOI 生産性大肠菌宿主株は GI724 株由来であり、その大肠菌は弱酸性条件の pH 5.0 で生育が可能であった。糖化酵素の反応条件も pH 5.0 であることから、pH 5.0 で生育可能な大肠菌宿主の構築を考慮していたが、潜在的な能力で十分であると判断し、耐酸性大肠菌取得は実施しなかった。
#### 3.2.5 培養工学的 DOI 発酵生産

##### 3.2.5.1 DOI の温度、pH に対する安定性

組換え大腸菌により発酵生産された DOI は培養液中に蓄積する。この DOI を精製する過程において、著しく収率や純度が低下する現象が観察されたことから、各温度、pH 条件下における培地中の DOI の化学的安定性について調べた。

各温度 (温度 4, 20, 35, 50℃) における DOI 安定性に対する pH の影響を調べた結果、4℃ 条件下では、インキュベート初期から後期にかけ、高い DOI 残存率が維持され、アルカリ性条件下の pH 9.0 でも 72 時間で DOI 残存率は約 87% を示した (図 3.2.53 (A))。温度 20℃ の pH 3.0, 5.0 の酸性条件下においてはインキュベート後期にかけて DOI 残存率は約 90% であり、DOI 安定性は高く維持された (図 3.2.53 (B))。しかし、温度 20℃ の pH 7.0, 9.0 の中性、アルカリ性条件下においては DOI 残存率は、それぞれ約 60, 52% を示した。35℃ 条件下では、20℃ 条件下と比較して、どの pH 条件の場合でも DOI 残存率は大きく低下した (図 3.2.53 (C))。温度 35℃ の pH 3.0 の酸性条件下においては 72 時間で DOI 残存率は約 80%、pH 9.0 のアルカリ性条件下においては 72 時間で DOI 残存率は約 18% を示した。大腸菌の至適増殖温度に近い 35℃ において、DOI の不安定性が見られたことから、培養温度の決定には、DOI 安定性を考慮することが必要であると考えられる。50℃ 条件下では、どの pH 条件下においても DOI 残存率は大きく低下し、安定性が 1 番高かった pH 3.0 の酸性条件下においても 72 時間で DOI 残存率は約 30% になった (図 3.2.53 (D))。さらに、pH 9.0 のアルカリ性条件下においては 72 時間で DOI 残存率はほぼ 0% であった。

以上のことから、低温条件下であれば DOI 安定性は高く維持されることが明らかとなり、高温条件下では DOI の分解が促進されるため安定性が低くなると考えられた。また、DOI 生産宿主となる大肠菌の増殖可能温度である 20, 35℃ の温度条件下では、pH が中性及びアルカリ性であると DOI 安定性は非常に低くなることから、DOI 発酵生産はある程度酸性条件下で実施することが必要であると考えられる。
(A) $ 4^{\circ} $ C

(B) $ 20^{\circ} $ C

(C) $ 35^{\circ} $ C

(D) $ 50^{\circ} $ C

pH 3.0 pH 5.0 pH 7.0 pH 9.0

図 3.53 各温度条件下における DOI 安定性に対する pH の影響 (A) $ 4^{\circ} $ C, (B) $ 20^{\circ} $ C, (C) $ 35^{\circ} $ C, (D) $ 50^{\circ} $ C

次に、各 pH (pH 3.0, 5.0, 7.0, 9.0) 条件下における温度に対する DOI 安定性の影響を調べた。pH 3.0 の 4, 20℃ の低温条件下においてはインキュベート後期 (72 時間) まで DOI 残存率は約 90% 以上と高く維持されたが、50℃ の高温条件下においては DOI 残存率は約 30% まで低下した (図 3.54 (A))。pH 5.0 条件下では、pH 3.0 の場合と比較して、4℃ 条件下においては DOI 残存率に差は見られなかったが、20, 35, 50℃ 条件下においてはそれぞれ pH 3.0 の場合と比較して、約 4.2, 22, 17% 低下した (図 3.54 (B))。pH 7.0 条件下では、4℃ 条件においても 72 時間で約 10% 分解した (図 3.54 (C))。また、pH 5.0 条件下の場合と比較して、さらに DOI 残存率の低下が見られた。pH 9.0 条件下では、pH 7.0 条件下の場合と同様な DOI 残存率の低下を示した (図 3.54 (D))。

以上のことから、pH 3.0 の酸性条件であれば、50℃ のような高温条件を除き、DOI の安定性は高く維持されることが明らかとなった。しかし、pH 7.0, 9.0 の中性、アルカリ性条件下では、4℃ のような低温条件を除き、DOI は不安定であることが明らかとなった。DOI はその化学構造上、アルカリ性条件下では異性化反応が起こるため、分解し易いと推測されている (27)。本実験の結果、アルカリ性条件だけでなく、中性条件においても DOI の安定性の低さが顕著に見られたことから、中性条件においても異性化反応が起こっているのではないかと考えられる。したがって、DOI の発酵生産を行う場合には、酸性条件下が適していると考えられる。
(A) pH 3.0

(B) pH 5.0

(C) pH 7.0

(D) pH 9.0

4℃ 20℃ 35℃ 50℃

図 3.54 各 pH 条件下における DOI 安定性に対する温度の影響 (A) pH 3.0, (B) pH 5.0, (C) pH 7.0, (D) pH 9.0

以上のことから、4℃の低温条件下においてもpHが中性側になるにつれて経時的にDOIの残存率は低くなることが分かった。大腸菌の至適増殖温度付近である35℃条件下では、72時間でpH3.0においてはDOI残存率80%、pH5.0においては58%となった。大腸菌の増殖を考慮するとpH5.0付近で培養することが好ましいが、72時間インキュベートするとDOI残存率が58%と低くなるため、DOIの発酵生産において、培養温度を35℃からさらに下げる必要性が考えられる。また、35℃、pH5.0の組み合わせ条件下の48時間インキュベート後のDOI残存率は70%であることから、発酵生産時間をできる限り短縮化する必要性も考えられる。次のDOI生産組換え大腸菌によるDOI高発酵生産条件の検討では、DOIの安定性も考慮し、35℃、pH5.0をベースとして検討を行うことにした。

##### 3.2.5.2 フラスコ培養における最適 DOI 生産条件の検討

バッフルフラスコで温度、pHを詳細に設定して培養を行い、DOI発酵生産に及ぼす温度、pHの影響について調べた。実験温度条件とpHは、上述のDOI安定性への温度及びpHの影響の結果と宿主大腸菌の増殖を考慮して、温度を27,30,33,37℃、pHを5.0,5.5,6.0,6.5,7.0とし、各組み合わせ条件を設定した。また、DOIの基質となるグルコース(Glc)を3%、DOI発酵生産宿主大腸菌の生育炭素源となるマンニトール(Man)を4%として培養を行い、経時的に菌体濁度(OD_{600})、培地中のDOI濃度、Glc濃度及びMan濃度を測定した。また、培養液中のpHを維持するために、12時間おきにpHの調整を行った。
培養温度 27℃ 条件下において、培養液を pH 5.0 に維持する培養は、他の pH (5.5, 6.0, 6.5, 7.0) 条件の場合と比べて DOI 生産大腸菌の増殖が悪かった (図 3.55)。これは生育炭素源である Man の消費速度が遅かったためと考えられ、この増殖速度の遅さが、Glc の消費速度及び DOI の生産速度の低下に繋がったと考えられた。pH 5.0 の条件は、DOI 生産大腸菌の増殖に適さないと考えられる。培養温度 27℃ 条件下の培養では、pH 5.5, 6.0, 6.5, 7.0 条件下において培養 48 時間で約 30 g/L の Glc から約 27 g/L の DOI へ変換され、この時の変換効率はほぼ 100% であった。

培養温度 30℃ 条件下において、培養初期における大腸菌の増殖速度は全ての pH 条件下で同様な増殖速度を示していたが、培養開始 36 時間後あたりから菌体濁度に差が見られ始め、特に、pH 5.0 及び 7.0 の条件下で DOI 生産大腸菌の増殖の低下が見られた (図 3.56)。また、生育炭素源の Man 消費速度の減少と Glc 消費速度の減少に相関が見られた。30℃ 条件下における培養においても、27℃ 条件下における培養と同様に、pH 5.0 では、増殖速度、Man 消費速度、Glc 消費速度、DOI 生産速度が遅く、DOI 生産大腸菌の DOI 生産培養に適さないと考えられた。30℃ 条件下の培養では、pH 5.5, 6.0, 6.5, 7.0 条件下において培養 48 時間で Glc から DOI への変換効率はほぼ 100% であった。しかし、培養 48 時間以降、pH 6.5, 7.0 条件において DOI 量の減少が見られた。これは pH が中性付近の条件であるため、DOI の異性化反応によって分解してしまったのではないかと考えられる。

培養温度 33℃ の pH 5.5, 6.0, 6.5, 7.0 条件下において、培養開始 36 時間後に Glc を全て消費し、DOI の最大生産が見られた (図 3.57)。これは培養温度 27, 30℃ の条件下における培養と比較して、生育炭素源の Man 消費速度が上昇したため、大肠菌の増殖速度も上昇し、培養液中の DOI 生産大肠菌の濃度を上昇させた。生体触媒である DOI 生産大肠菌濃度の上昇が、Glc 消費速度の上昇、さらに DOI 生産速度の上昇を引き起こしたと考えられる。また、pH 5.5, 6.0, 6.5 条件下において、培養開始 36 時間後に Glc を全て消費し、Glc から DOI への変換効率はほぼ 100% を示した。培養温度 33℃ の条件下において、pH 5.0 の条件以外は、培養開始 36 時間以降で DOI 量の減少が見られた。これは培養温度 27, 30℃ の条件のときと比較して、DOI の分解率は大きくなっており、温度による DOI の分解の依存度が大きいと考えられ、また、pH がより中性側の条件の方の分解が速かった。

培養温度 37℃ 条件下において、培養開始 36 時間後に pH 6.0, 6.5, 7.0 条件下で、DOI の最大生産が見られた (図 3.58)。しかし、どの pH 条件下においても Glc から DOI への変換効率は 90% よりも低く、さらに pH 5.0 及び 5.5 の条件下では、DOI の基質となる Glc が消費されないため、DOI の生産性が悪くなっていた。また、DOI 最大生産が見られた培養 36 時間以降で DOI 量の減少が見られ、さらに培地中に Man が残存し、増殖が良好と言い難いことから、37℃ という培養温度条件は、本研究で利用している DOI 生産大腸菌に適していないと考えられた。
(A) $ OD_{600} $

(C) Glc 濃度

(B) DOI 濃度

(D) Man 濃度

図 3.55 GI724Δpzp/btrC 株による DOI 生産への pH の影響 (27℃)

(A) $ OD_{600} $ , (B) DOI 濃度, (C) Glc 濃度, (D) Man 濃度

(C) Glc 濃度

(D) Man 濃度

図 3.57 GI724Δpzp/btrC 株による DOI 生産 への pH の影響 (33℃)

(A) $ OD_{600} $ , (B) DOI 濃度, (C) Glc 濃度, (D) Man 濃

(A) $ OD_{600} $

(B) DOI 濃度

(C) Glc 濃度

(D) Man 濃度

図 3.56 GI724Δpzp/btrC 株による DOI 生産 への pH の影響 (30℃)

(A) $ OD_{600} $ , (B) DOI 濃度, (C) Glc 濃度, (D) Man

(B) DOI 濃度

(C) Glc 濃度

(D) Man 濃度

図 3.58 GI724Δpzp/btrC 株による DOI 生産 への pH の影響 (37℃)

(A) $ OD_{600} $ , (B) DOI 濃度, (C) Glc 濃度, (D) Man 濃度
次に、pH 5.0 条件下において、各温度での培養結果を見ると、Man の消費速度に大きな差が見られた(図 3.59)。33℃ での培養の場合、他の温度より Man の消費速度が速く、短時間で Glc を消費し DOI 高生産性を示した。pH 5.0 の 33℃ 条件下において培養 48 時間で培地中の全 Glc を消費し、Glc から DOI への変換効率はほぼ 100% であった。pH 5.0 条件下では、33℃ の培養温度が適していると考えられる。

pH 5.5 の条件下において、各温度での培養結果を見ると、pH 5.0 のときと同様に培養温度 33℃ のときが、増殖、DOI 生産性、Glc 及び Man の消費が良好であった (図 3.60)。27, 37℃ での培養では、Man の消費が悪く、増殖も他の温度と比べて遅かった。pH 5.5 の 33℃ 条件下において、培養 36 時間後で培地中の全 Glc を消費し、Glc から DOI への変換効率はほぼ 100% を示し、27, 30℃ 条件下においても培養 48 時間後で培地中の全 Glc を消費し、Glc から DOI への変換効率はほぼ 100% を示した。37℃ での培養においては、増殖、DOI 生産性、Glc 及び Man の消費の全てが他の条件 (27, 30, 33℃) と比較して悪く、pH 5.5 の 37℃ 条件下は、本研究で利用している DOI 生産大腸菌に適していないと考えられた。

pH 6.0 条件下において、各温度での培養結果を見ると、33℃ 条件下において培養 36 時間後で、27,30℃ 条件下においては培養 48 時間後で DOI の最大生産を示し、さらに培地中の全 Glc を消費し、Glc から DOI への変換効率はほぼ 100% を示した (図 3.61)。pH 6.0 の 33,37℃ の条件においては、培養 36 時間後以降 DOI の分解が見られた。pH 6.0 の 37℃ 条件における培養では、増殖、DOI 生産性、Glc 及び Man の消費の全てが他の条件 (27,30,33℃) と比較して悪く、pH 6.0 の 37℃ 条件下は、本研究で利用している DOI 生産大腸菌に適していないと考えられた。

pH 6.5 の条件下において、各温度での培養結果を見ると、pH 6.0 の場合と同様に 33℃ 条件下において培養 36 時間後で、27,30℃ 条件下においては培養 48 時間後で DOI の最大生産を示し、さらに培地中の全 Glc を消費し、Glc から DOI への変換効率はほぼ 100% を示した (図 3.62)。しかしながら、各温度の培養で、DOI 最大生産を示した後、培養液中の DOI 量は経時的に減少した。これは pH の影響による DOI の分解が考えられ、pH 6.0 での培養の場合と比較して、さらに分解速度は速かった。すなわち、本研究で利用している DOI 生産大腸菌の DOI 発酵生産には、pH 6.5 条件は適さないと考えられる。

pH 7.0 条件下において、各温度での培養結果を見ると、27℃ 条件下において培養 48 時間後で DOI の最大生産を示し、さらに培地中の全 Glc を消費し、Glc から DOI への変換効率はほぼ 100% を示した (図 3.63)。しかしながら、pH 6.5 の場合と同様に pH 7.0 条件下においても各温度の培養で、DOI 最大生産を示した後、培養液中の DOI 量は経時的に減少し、pH 6.5 での培養の場合と比べ、さらに DOI 分解速度は速かった。すなわち、本研究で利用している DOI 生産大腸菌の DOI 発酵生産には、pH 7.0 条件は適さないと考えられる。
図 3.59 GI724Δpzp/btrC 株による DOI 生産への温度の影響 (pH 5.0)

(A) $ OD_{600} $ , (B) DOI 濃度, (C) Glc 濃度, (D) Man 濃度

図 3.61 GI724Δpzp/btrC 株による DOI 生産への温度の影響 (pH 6.0)

(A) $ OD_{600} $ , (B) DOI 濃度, (C) Glc 濃度, (D) Man 濃度

図 3.60 GI724Δpzp/btrC 株による DOI 生産への温度の影響 (pH 5.5)

(A) $ OD_{600} $ , (B) DOI 濃度, (C) Glc 濃度, (D) Man 濃度

図 3.62 GI724Δpzp/btrC 株による DOI 生産への温度の影響 (pH 6.5)

(A) $ OD_{600} $ , (B) DOI 濃度, (C) Glc 濃度, (D) Man 濃度
(C) Glc 濃度

(D) Man 濃度

図 3.63 GI724Δpzp/btrC 株による DOI 生産への温度の影響 (pH 7.0) (A) OD_{600}, (B) DOI 濃度, (C) Glc 濃度, (D) Man 濃度

温度及び pH の各組み合わせから DOI の生産性を再度検討した。培養開始 36 時間時において、Glc から発酵生産された DOI 生産量は、30℃ の pH 6.0, 6.5 及び、33℃ の pH 5.5, 6.0, 6.5 条件で 26 g/L 以上の DOI を生産した。また、培養開始 36 時間時に全ての Glc を消費し、Glc から DOI への変換効率は 98% 以上と高い値を示した。pH 7.0 条件下では、30, 33℃ の培養において、培養開始 36 時間時に全ての Glc を消費したが、pH 6.0, 6.5 の中性条件下に比べ DOI 生産量は低い。これは、よりアルカリ性側の条件のため培養過程で異性化反応により DOI が分解してしまったためであると考えられる。培養開始 36 時間では、30℃、pH 6.0, 6.5 及び、33℃、pH 5.5, 6.0, 6.5 の条件の中に至適 DOI 生産条件があると考えられる。培養開始 48 時間時においては、27℃ の pH 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 30℃ の pH 5.5, 6.0, 6.5, 7.0 及び、33℃ の pH 5.0, 5.5, 6.0 の条件で 26 g/L 以上の DOI を生産した。また、これらの条件において、培養開始 48 時間時に全ての Glc を消費し、Glc から DOI への変換効率は 98% 以上を示した。しかし、33℃ の条件下では、培養 36 時間から 48 時間の間に DOI の分解が見られ、特に中性付近で分解率が高かった。これは、培養液中に蓄積された DOI が時間の経過とともに、本条件で異性化が進み、分解してしまったためであると考えられる。37℃ の条件下においては、pH 5.0, 5.5, 6.0 の条件で Glc は全て消費しきらず DOI 生産量も他の条件 (27, 30, 33℃) と比べて低かった。pH 6.5, 7.0 条件では、Glc を全て消費したが、DOI 生産量は他の条件 (27, 30, 33℃) と比べて低く、本条件において培養液中に蓄積された DOI の分解が促進されたと考えられる。これらの結果より、3% Glc から培養 36 時間以内に高効率で DOI を生産するためには、温度 30 または 33℃、pH 5.5, 6.0, 6.5 の間に適した条件があり、培養 48 時間以内に高効率で DOI を生産するためには、温度 27, 30, 33℃、pH 5.5, 6.0 の間に適した条件があると考えられる。大腸菌の至適増殖温度に近い 37℃ では、DOI の分解の促進が考えられ、また、pH が中性及びアルカリ性条件下では、異性化反応により DOI の分解が促進されてしまうと考えられる。
したがって、ジャーファーメンターを利用した DOI 生産性の検討では、大肠菌の増殖と培養液中に蓄積された DOI の安定性の維持を考慮した条件である、培養温度 27, 30, 33℃、pH 5.5, 6.0 の条件について検討することとした。

##### 3.2.5.3 廃菌床糖化液からの DOI 発酵生産の試み

表 3.14 キノコ廃菌床糖化処理法とその糖成分

グルコース(%)	キシロース(%)
①生物的前処理⇒アルカリ処理⇒糖化(酢酸/バッファー)	1.90	0.39
②生物的前処理⇒アルカリ処理⇒糖化(MacIlvaine/バッファー)	1.71	0.34
③生物的前処理⇒ハンマークラッシュ処理⇒糖化(酢酸/バッファー)	0.81	0.17
④生物的前処理⇒ハンマークラッシュ処理⇒糖化(MacIlvaine/バッファー)	0.71	0.14

ジャーファーメンターにおける培養工学的な高効率 DOI 発酵生産の検討を実施する前に、実際のキノコ廃菌床由来の糖化液からの DOI 生産性について小スケールで検討を行った。環境低負荷型糖生産システムの開発を担当した長岡科学技術大学から提供されたキノコ廃菌床糖化液の処理方法と糖濃度を以下の表 3.14 に示す。生物的前処理後、化学的なアルカリ処理または物理的なハンマークラッシュ処理を施し、その後、トリコデルマ・リーセイ由来のセルラーゼで糖化を行った。また、組換え大腸菌を利用して、糖化液から DOI を発酵生産させることを考慮し、大腸菌の増殖阻害に関係性の深い酢酸バッファーだけでなく、Macllvaine バッファーの条件においても糖化を行った。グルコースの最終濃度 2%、キシロースの最終濃度 1.5%として DOI の発酵生産実験を行った。得られた糖化液の濃度が薄かったため、糖が足りない場合は試薬のグルコース及びキシロースを投入して補った。また、培地が 100% 糖化液のもの、50% 糖化液のものと糖化液濃度を薄めながら条件検討を行った。DOI 発酵生産の結果、①アルカリ処理→糖化（酢酸バッファー）の糖化液 100% のときのみ、DOI 発酵生産用組換え大腸菌は生育しなかった（図 3.64）。これは、酢酸バッファーと生物的前処理とアルカリ処理の時に抽出された生育阻害物質の効果によるものであると考えられる。それ以外の前処理条件では、DOI 発酵生産用組換え大腸菌は生育可能であった。また、全体的に培地中に持ち込まれる糖化液濃度が薄くなるほど生育が良好になり、コントロールとして培養した試薬培地における大腸菌の生育よりも向上した（図 3.64）。これは各前処理条件において抽出された生育阻害物質が希釈され、その効果が小さくなったこと、さらに糖化液中に含まれる糖以外の成分によると考えられる。組換え大腸菌の DOI 生産性について検討したところ、増殖が良好であるにもかかわらず、培地中の糖化液の割合が多い場合、DOI の生産性がコントロールと比較して、大きく落ち込んでいた。また、キシロースの残量を調べてみると、培地中の糖化液の割合が多いほど多く残存していた（図 3.65）。DOI の原料であるグルコースを細胞内に取り込むためには、キシロースを消費し、ホスホエノールピルビン酸を生産して、大腸菌のグルコース取り込みのメイン系路であるグルース PTS 経路で取り込む必要がある。生育しているにもかかわらず、あまりキシロースが消費されていないことは、培地中の酵母エキス等を利用して、生育し、生育炭素源としてキシロースを利用してないことが考えられる。すなわち、①キシロースの消費経路を強化する、②ホスホエノールピルビン酸に依存しない
①生物的前処理⇒アルカリ処理⇒糖化(酢酸バッファー)

②生物的前処理⇒アルカリ処理⇒糖化(MacIlvaineバッファー)

③生物的前処理⇒ハンマークラッシュ処理⇒糖化(酢酸バッファー)

④生物的前処理⇒ハンマークラッシュ処理⇒糖化(Macllvaineバッファー)

図 3.64 棗菌床糖化液からの DOI 発酵生産検討（宿主大腸菌の生育）

図 3.65 廃菌床糖化液からの DOI 発酵生産検討（DOI 生産と生育炭素源の関係）
グルコースの取り込みを本 DOI 生産菌に導入することで、DOI の生産性が向上すると考えられた。具体的には、キシロースの資化経路の上流に位置する xyl オペロン群の発現強化、GalP, mglBAC, manXYZ のようなグルコース PTS 以外のグルコース取り込み系路の強化、ザイモナス・モビリス由来のグルコース取り込み促進タンパク質 Glf の大腸菌への導入が挙げられる。今後、取り組む非常に大事な課題である。

##### 3.2.5.4 ジャーファーメンター培養における最適 DOI 生産条件の検討

###### 3.2.5.4.1 3% Glc 条件下における最適 DOI 生産条件の検討

フラスコレベルの培養における DOI 発酵生産条件の検討結果を考慮し、ジャーファーメンターを利用した DOI 発酵生産条件の検討を、温度 $ (27, 30, 33^{\circ}\mathrm{C}) $ 、pH $ (5.5, 6.0) $ の条件の組み合わせで実施し、スケールアップを試みた。ジャーファーメンター培養では、攪拌速度 450 rpm、通気量 5 L/min、3% Glc、4% Man の条件に固定し、温度を 27, 30, 33^{\circ}\mathrm{C}、pH を 5.5, 6.0 にそれぞれ設定して検討を行った。

pH 5.5 条件下において、各温度での培養結果を見ると、培養初期（12 時間後）においては、培養温度 27,30℃で同様な増殖速度を示したが、培養中期（24 時間以降）ではそれぞれの温度条件下において大腸菌の増殖に差が見られた（図 3.66）。温度が低い条件ほど、生育炭素源である Man の消費が遅く、増殖速度に差が出たと考えられる。培養温度 27℃ 条件では、培養開始 48 時間時におよそ 18.8 g/L、培養開始 60 時間時におよそ 20.3 g/L の DOI 生産性を示し、その時の Glc 消費量からの DOI への変換効率は、それぞれおよそ 99,92% であった。培養温度 30℃ 条件では、培養開始 48 時間時におよそ 23.3 g/L、培養開始 60 時間時におよそ 24.3 g/L の DOI 生産性を示し、その時の Glc 消費量からの DOI への変換効率は、それぞれおよそ 98,96% であった。培養温度 33℃ 条件では、培養開始 48 時間時にほとんど全ての Glc を消費し、およそ 23.5 g/L の DOI 生産性を示し、Glc から DOI への変換効率はおよそ 92% であった。

pH 6.0 条件下において、各温度での培養結果を見ると、27℃ 条件下において培養 48 時間で、30,33℃ 条件下においては培養 36 時間で Glc から DOI への変換効率はおよそ 99% を示した (図 3.67)。培養 24 時間を見ると、33℃ での培養においては他の温度に比べて、単位時間辺りの DOI 生産速度が速いということが確認できる。培養温度 33℃ の条件では、培養 36 時間後に全ての Glc を消費し DOI へと変換したが、培養 48 時間後では DOI 量は減少した。これは、温度による DOI の分解が考えられるが、より短時間で効率良く DOI を生産するためには、培養温度 33℃ が適していると考えられる。これらの結果より、pH 5.5 条件では、pH 6.0 に比べ、各温度での増殖速度及び DOI 生産速度が遅かった。これは、pH の影響により大腸菌の増殖が悪くなり、培養液中の生体触媒である DOI 生産組換え大腸菌の菌数が少ないため、DOI 生産速度も遅くなったと考えられる。効率良く DOI の生産性を高めるためには、大腸菌の増殖が重要なファクターとなるため、pH 5.5 は本大腸菌宿主には適していないと考えられる。よって、3% Glc 条件下においては、33℃、pH 6.0 条件が最適であると考えられる。
図 3.66 GI724Δpzp/btrC 株による DOI 生産への温度の影響 (pH 5.5, 450rpm, 3% Glc)

(A) $ OD_{600} $ , (B) DOI 濃度, (C) Glc 濃度, (D) Man 濃度

図 3.67 GI724Δpzp/btrC 株による DOI 生産への温度の影響 (pH 6.0, 450rpm, 3% Glc)

(A) $ OD_{600} $ , (B) DOI 濃度, (C) Glc 濃度, (D) Man 濃度

###### 3.2.5.4.2 高濃度 Glc 条件下における DOI 生産性への影響

初発に仕込む Glc の濃度が高ければ DOI の高生産にもつながると考え、初期 Glc 濃度を 5% として培養を行った (図 3.68)。まず、3% Glc 条件下で培養を行った結果を参考にして、pH 6.0、温度 30 または 33℃ の条件で検討した。温度 33℃、pH 6.0 の条件では、培養 48 時間で 5% Glc を全て消費したが、このときの Glc から DOI への変換効率はおよそ 80% であり、分解の可能性が考えられた。特に、培養中期から後期においては、DOI の原料である Glc が消費されているにも関わらず、DOI 生産性の向上は見られなかった。温度 30℃、pH 6.0 条件下においては、培養 48 時間で、Glc がまだ残存しているが、Glc から DOI への変換効率はおよそ 99% を示し、40 g/L の DOI 濃度の培養液の生産が可能となった。すなわち、5% Glc の高濃度 Glc 条件下における培養温度は 30℃ (pH 6.0) が適していると考えられる。

次に、培養温度を $ 30^{\circ}C $ 、初期 Glc 濃度を 6% として培養を行い、3,5% Glc 条件のときと比較した (図 3.69)。5,6% Glc 条件下においては、増殖に差が見られなかったが、DOI 生産性に大きな差が見られた。培養開始 48 時間後で、Glc がまだ残存しているが、5% Glc 条件下においては、Glc から DOI への変換効率はおよそ 99% (40 g/L) を示し、6% Glc 条件下においては、Glc から DOI への変換効率はおよそ 89% (33 g/L) を示した。また、培養開始 60 時間以降では、それぞれの条件において DOI の分解が予想された。また、DOI 生産の生体触媒となる組換え大腸菌の増殖は、初期 Glc 濃度が 5,6% になると培養開始 24 時間以降の増殖が、初期 Glc 濃度が 3% の場合と比較して悪くなる。すなわち、初期糖濃度を抑えることで、増殖を良好にすることができると考えられる。
図 3.68 GI724Δpzp/btrC 株による DOI 生産への温度の影響 (pH 6.0, 450rpm, 5% Glc)

図 3.69 GI724Δpzp/btrC 株による DOI 生産 への Glc 濃度の影響 (30℃, pH 6.0, 450rpm)

$$ \mathrm{OD}_{600}, $$

$$ \mathrm{OD}_{600}, $$

以上より、本条件（30℃、pH 6.0、450 rpm、通気量 5 L/min、2 × YT 培地）のジャーファーメンター培養において DOI を高生産させるためには、初期 Glc 濃度 5% が上限であると考えられる。

###### 3.2.5.4.3 各攪拌速度における DOI 生産性への影響

攪拌速度、通気量による溶存酸素は、微生物の培養に多大な影響を与える。本研究室で所有するジャーファーメンターの最大通気量は、5 L/min であるため、5 L/min で固定した。攪拌速度をそれぞれ 400～600 rpm まで 50 rpm おきに設定して培養を行い、各攪拌速度における DOI 生産性への影響について検討した。

攪拌速度 400 rpm における培養では、培養開始 48 時間時におよそ 28.2 g/L、培養開始 60 時間時におよそ 32 g/L の DOI 生産性を示し、Glc はまだ残存しているがその時の Glc 消費量からの DOI への変換効率は、それぞれおよそ 85,80% であった (図 3.70)。攪拌速度 450 rpm における培養では、培養開始 48 時間時におよそ 40 g/L の最大 DOI 生産性を示しその後 DOI 生産量は上昇しなかったが、その時の Glc 消費量からの DOI への変換効率はおよそ 99% であった。攪拌速度 500 rpm における培養では、培養開始 48 時間時におよそ 35.2 g/L、培養開始 60 時間時におよそ 37 g/L の DOI 生産性を示し、その時の Glc 消費量からの DOI への変換効率は、それぞれおよそ 92,91% であった。攪拌速度 550 rpm における培養では、培養開始 48 時間時におよそ 32.7 g/L、60 時間培養時におよそ 34 g/L の DOI 生産性を示し、その時の Glc 消費量からの DOI への変換効率は、それぞれおよそ 87,84% であった。攪拌速度 600 rpm における培養では、48 時間培養時におよそ 32 g/L の最大 DOI を生産しその後 DOI 量の増加は見られなかったが、その時の Glc 消費量からの DOI への変換効率はおよそ 87% であった。
各攪拌速度における培養 48 時間時の DOI 生産性に注目すると、攪拌速度が速い、つまり酸素供給が高いからといって DOI の生産性に大きく影響するわけではないということが分かった。しかし、攪拌速度が速い培養ほど培養初期において生育炭素源である Man の消費速度が速く、菌体の増殖速度にも影響が出ていると考えられる。また、各攪拌速度における培養 48 時間時の Glc から DOI への変換効率に注目すると、450,500 rpm 条件下において変換効率は、それぞれおよそ 99,92% を示した。

以上の結果より、攪拌速度が速い条件ほど、DOI 生産性及び変換効率は減少してしまうことが分かった。これは、培養液中の溶存酸素濃度が影響し、DOI の分解が促進されている可能性があると考えられる。したがって、ジャーファーメンター培養における最適攪拌速度を 450 rpm とした。

(C) Glc 濃度

(D) Man 濃度

400 450 500 550 600

図 3.70 GI724Δpzp/btrC 株による DOI 生産への攪拌速度の影響(30℃, pH 6.0, 5% Glc) (A) OD_{600}, (B) DOI 濃度, (C) Glc 濃度, (D) Man 濃度

###### 3.2.5.4.4 各生育炭素源における DOI 生産性への影響

本研究で用いている大肠菌株は、生育炭素源としてグルコースを利用することができないため、他の炭素源を生育炭素源として利用しなければならない。現在は、DOI 生産性組換え大肠菌が生育炭素源として良好に資化する Man を用いて DOI の高発酵のための培養を行っているが、他の炭素源であるグリセロール (Gly)、フルクトース (Fru)、キシロース (Xyl) を生育炭素源として利用した場合の DOI 生産性への影響を検討した。

培養初期においては、生育炭素源として Man, Fru を利用した場合の DOI 生産大腸菌の増殖が良く、培養中期では、生育炭素源として Gly を利用した場合の DOI 生産大腸菌の増殖が良かった (図 3.71)。しかしながら、Xyl を生育炭素源として利用した場合は、Man, Gly, Fru の場合と比較して増殖があまり良くなく、本大腸菌宿主では、他の炭素源に比べてカタボライト抑制が強いためであると推察される。DOI 生産性に関しては、Man 及び Gly を利用した発酵生産が培養開始 48 時間時におよそ 40 g/L の最大 DOI 生産性を示した (図 3.71)。その時の Glc 消費量からの DOI への変換効率は、それぞれおよそ
99% であった。生育炭素源として Fru を利用した場合の培養開始 48 時間時の DOI 生産性は、およそ 30 g/L であり、その時の Glc 消費量からの DOI への変換効率はおよそ 98% であった。生育炭素源として Xyl を利用した場合の培養開始 48 時間時の DOI 生産性は、およそ 28.6 g/L であり、その時の Glc 消費量からの DOI への変換効率はおよそ 95% であった。いずれの培養においても、培養 48 時間の時点で消費した Glc からの DOI 生産効率は 95% 以上と高い値を示した。しかし、短時間でより多くの DOI を高生産させるためには、より増殖速度が速く、基質である Glc を速く消費する必要がある。生育炭素源として Fru, Xyl を利用した場合では、大肠菌の増殖と Glc の消費速度が遅いため、DOI 発酵生産のための生育炭素源としては適していないと考えられる。

各生育炭素源における培養 48, 60 時間時の DOI 生産性を比較してみると、どちらの時間においても Man, Gly を生育炭素源として利用した培養の方が DOI 生産性は高いということが分かった。非可食バイオマスの Man 含有量は低いため、Man を DOI 発酵生産を行う組換え大腸菌の生育炭素源として利用することは実用性に乏しいが、廃 Gly のバイオマス利用が様々なところで試みられており、Gly を生育炭素源としての利用は、実用性が高いと考えられる。

(C) Glc 濃度

(D) 各生育炭素源濃度

Man Gly Fru Xyl

図 3.71 GI724Δpzp/btrC 株による DOI 生産への生育炭素源の影響 30℃，pH 6.0, 450 rpm, 5% Glc

(A) $ OD_{600} $ , (B) DOI 濃度, (C) Glc 濃度, (D) 各生育炭素源濃度

###### 3.2.5.4.5 高濃度窒素源培地における DOI 生産性への影響

微生物を培養する上で、窒素源は炭素源に次ぐ栄養源であり、微生物の増殖に必要不可欠である。従来使用していた $ 2 \times YT $ 培地成分の窒素源である Yeast Extract の濃度を 1% から 3% に変更した培地（以下、HNS 培地）で培養を試みることで、大肠菌の増殖と DOI 生産性にどのように影響があるか検討した。また、HNS 培地における攪拌速度、初期 Glc 濃度の検討を行うことで、回分培養での DOI 高発酵生産を目指した。
従来の $ 2 \times YT $ 培地において DOI を高生産した条件である、30℃、pH 6.0、450 rpm、通気量 5 L/min、5% Glc、4% Man の条件では、60 時間培養し、まだ培地中の Glc が残存しているがその際の DOI 生産量はおよそ 40 g/L であった (図 3.72)。窒素源濃度を高くした HNS 培地では、同じ培養条件で 48 時間培養し、ほとんど全ての培地中の Glc 及び Man を消費した。その際の DOI 生産量はおよそ 41.3 g/L であり、このときの Glc から DOI への変換効率はおよそ 93% であった。また、菌体濁度に注目すると、培養初期 (培養開始 12 時間) における大腸菌の増殖速度に差はないが、24 時間以降の培養中期から培養後期にかけて増殖速度に差が見られ始め、培養 48 時間では HNS 培地の菌体濁度は $ 2 \times YT $ 培地のおよそ 2.1 倍になった。菌体濁度の上昇により、 $ 2 \times YT $ 培地と比べ Glc 及び Man の消費速度も上昇し、短時間で DOI の高生産につながったのではないかと考えられる。

図 3.72 GI724Δpzp/btrC 株による DOI 生産への培地成分の影響 30℃, pH 6.0, 450rpm, 5% Glc

(A) $ OD_{600} $ , (B) DOI 濃度, (C) Glc 濃度, (D) Man 濃度

図 3.73 GI724Δpzp/btrC 株による DOI 生産への攪拌速度の影響 30℃, pH 6.0, 5% Glc, HNS medium

(A) $ OD_{600} $ , (B) DOI 濃度, (C) Glc 濃度, (D) Man 濃度

次に、HNS 培地を用いて攪拌速度を 800, 1,000 rpm で培養を行い、450 rpm のときと比較した (図 3.73)。800, 1,000 rpm での培養は、450 rpm での培養に比べ、大腸菌の増殖速度、DOI 生産速度、Glc 及び Man の消費速度が速かった。800, 1,000 rpm における培養では、どちらの条件も培養 36 時間時に培地中の Glc 及び Man を全て消費し、その際の DOI 生産量はそれぞれおよそ 37.7, 41.5 g/L であった。また、このときの Glc から DOI への変換効率はそれぞれおよそ 85, 94% であった。攪拌速度を速くすることで、より好気的に大腸菌が増殖でき、短時間で DOI を高生産することが考えられた。1,000 rpm の培養については、450 rpm での培養より培養時間を 25% 短縮し、高濃度の DOI を生産することに成功した。
次に、HNS 培地を用いて 41.5 g/L/36 h の DOI 生産性を示した、攪拌速度 1,000 rpm の条件で初期 Glc 濃度を 6% として培養を行い、5% Glc 条件のときと比較した (図 3.74)。初期 Glc 濃度 6% での培養では、培養開始 36 時間後で Glc がまだ残存しているが、39.1 g/L の最大 DOI 生産性を示し、その際の Glc から DOI への変換効率はおよそ 78% であった。それぞれの条件で培養 36 時間後に最大 DOI 生産性を示したが、6% Glc 条件では、培養 48 時間後に全ての Glc を消費し、DOI 濃度は 35.6 g/L まで減少した。その際の Glc から DOI への変換効率はおよそ 67% であった。さらに、攪拌速度 1,000 rpm での培養は、800 rpm の培養と比べ生育炭素源である Man の消費が速かった。すなわち、初期 Glc 濃度がある一定以上あること、または生育炭素源の枯渇が、DOI の分解の促進へ繋がった可能性が考えられた。この現象は、攪拌速度を 450 rpm のときも見られた現象である。今後は、高効率 DOI 生産を維持できる回分培養可能な初期 Glc 濃度の検討、生育炭素源の Man 濃度の検討、培養液中に蓄積する DOI の影響等を考慮して、上記した可能性について検討する必要がある。

図 3.74 GI724Δpzp/btrC 株による DOI 生産への Glc 濃度の影響

30℃, pH 6.0, 5% Glc, HNS medium (A) $ OD_{600} $ , (B) DOI 濃度, (C) Glc 濃度, (D) Man 濃度

以上の結果より、高濃度窒素源培地によって従来の培地より大腸菌の増殖速度が上昇し、高密度の大腸菌体が培養液中に存在したことによって Glc から DOI への変換速度が上昇したと考えられる。また、攪拌速度を速くすることで、より短時間で全ての糖を消費し DOI の高生産へとつながった。しかし、初期 Glc 濃度を 6% で行った培養では DOI 生産性が低下したことから、培養条件及び培地成分のさらなる検討が必要であると考えられた。回分培養では、初期 Glc 濃度の至適濃度が決定されつつあることから、今後は、DOI を高生産するために培地中の Glc 濃度をある一定に保ちつつ Glc、Man、培地成分を流加しながら培養を行う、流加培養の必要性もあると考えられた。
###### 3.2.5.4.6 高活性型 DOI 合成酵素を利用した流加培養法による DOI 発酵生産の試み

3.2.1 で取得した高活性型 DOI 合成酵素 W293R を導入した DOI 生産組換え大腸菌を利用して流加培養を試みた。生育炭素源としては、3.2.5.4.4 に示したように、①キシロースの資化性があまり良くなく増殖が遅いこと、②キノコ廃菌床から得られた糖化液はキシロース成分が少ないことから、廃グリセロールがバイオマス原料として注目を沿びているグリセロールを生育炭素源として実験を行った。

(A) OD600

(B) DOI濃度

(C) Glc濃度

(D) Gly濃度

図 3.75 流加培養法による DOI の発酵生産

GI724Δpzp/W293R の高活性型 DOI 合成酵素を導入した株を利用して、本培養培地（3% Yeast extract、0.2% K₂HPO₄、0.2% KH₂PO₄、0.2% (NH₄)₂SO₄、0.2% MgSO₄、0.01% FeSO₄·7H₂O、アンピシリン 100 μg/ml）に、流加培地（250 g Glucose, 250 g Glycerol, 30 g Yeast extract, 470 g H₂O）を 0.3 g/ml で流加し、DOI 発酵生産を行った。培養温度は、DOI の分解を考慮して 28℃ とした。その結果、70.7 g/L/48 h（図 3.2.37 (B) 青線）の DOI 生産性を示した。培養液中に DOI の蓄積のない培養初期のみ、培養温度を大腸菌の生育至適温度に近い 35℃ にあげ、DOI の培地中の蓄積が起こり始めたら、培養温度を 28℃ に下げる温度シフトを試みた結果、35℃ で 8 時間培養後、28℃ に下げたときに、116.0 g/L/60 h（図 3.75 (B) 黒線）の DOI 生産性を示し、100 g/L 以上の実用性の高い生産値が得られた。
### 4. 結論

マイタケ菌のゲノムデータベースを整備し、DNA マイクロアレイによるマイタケ菌の全遺伝子の網羅的発現解析基盤を構築することができた。開発した DNA チップを用いることでマイタケ廃菌床の生物学的前処理因子の特定を行い、リグニンの分解、セルロース、ヘミセルロースの分解様式を解析した。さらに、廃菌床内に分泌する酵素活性の解析から遺伝子発現との相関を調べた。その結果、リグニン分解酵素は713293、180436の2つの、MnPが高発現しており、前処理に関して最重要な酵素であると位置づけた。そして保管期間中に FOLy 遺伝子の発現量が上昇することが明らかとなり、リグニン分解酵素:LOとリグニン分解補助酵素:LDAが協調的にリグニン分解システムを構築していることが確認された。糖質関連酵素(CAZy)に関しては、保管処理中に特異的に高発現していたのはヘミセルロース側鎖分解酵素、ペクチン分解酵素であった。これらの酵素がセルロース微小繊維を束ねる周辺の多糖類を分解するためセルロース微小繊維同士のパッキングが緩まり、糖化の際にセルラーゼが作用しやすくなると考えられた。また、遺伝子発現挙動からマイタケ菌の主要なセルラーゼはEGとAA9であると考えられた。酵素活性の解析結果において保管処理中にCMCase活性が検出できなかったことから保管処理中にEGはセルロースに対して積極的な分解は行っていないことが示唆された。酸化的にセルロースの結晶部分を分解するAA9が発現していたことから、廃菌床中のセルロースにはセルラーゼが作用することができる非晶領域が増加していることが推測された。以上のDNAマイクロアレイ解析、酵素活性解析よりマイタケ菌は廃菌床保管処理中、ヘミセルロース側鎖、ペクチンを炭素源として使用し、積極的にリグニン分解していること、EGとAA9を使用してセルロースの非晶領域を増やしていることが廃菌床前処理をもたらしていると結論付けた。

突然変異育種によるマイタケ菌のバイオマス前処理能力強化株を取得するため、マイタケ菌のリグニン分解能力を指標としたスクリーニング法を開発し、プレートアッセイによる変異株の選抜法を確立した。この方法を駆使して、紫外線照射による変異処理を行ったマイタケ菌株の中から、リグニン分解能力が向上したと考えられる菌株の取得に成功した。

生物学的前処理を施したマイタケ廃菌床の糖化には、セルラーゼへのリグニン分解酵素添加実験よりラッカーゼ活性が糖化率の改善をもたらすことを示した。また、マイタケ菌が廃菌床保管中に生産している酵素の量は極めて少ないと考えられたため、上記の前処理能力強化株の使用もしくはセルロース高分解性糸状菌トリコデルマ・リーセイ（T. reesei）におけるリグニン分解酵素の高発現が必要であることが明らかとなった。リグニン分解能付加T. reeseiの構築はLaccase遺伝子を導入した株で達成することができた。QM9414を親株としてマイタケ菌のLCC31遺伝子を導入した株であるQLCC株およびT. reesei内在性Laccase発現株であるTlacの培養上清中に活性を持ったLaccaseを分泌させることに成功し、Cuを培地中に添加すると培地中のLaccase活性が上昇することを明らかにした。Cu添加の影響を解析したところ本研究においてはラッカーゼ遺伝子を転写レベルで活性化していることが判明した。今後、経時的な遺伝子発現などの詳細に解析をすることでCu添加の影響を明らかにすることができると思われる。MnP遺伝子を導入したT. reeseiは全ての株で遺伝子の転写が確認されたが、明確なMnP酵素活性を示す株を構築することはできなかった。以上のことから本研究のMnP異種宿主発現には転写以降の段階に問題が生じていることが示唆された。廃菌床のリグニンがほぼ存在しない条件（アルカリ処理廃菌床）では、セルラーゼを用いた廃菌床の糖化率は本開発目的である80%に達する。本開発において構築した