Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
酸に対する感受性を調査する大腸菌株を試験管に入れ、前々培養、前培養後、OD600=0.1になるように前培養液を加え、本培養を30℃の条件下で行った。また、培地の作製には、Mcilvaine buffer 緩衝液を利用し、pH=4.5、5.0、5.5、6.0の培地を作製した。培養開始から0、24、48時間にサンプリングを行い、OD600の測定、pH測定を行った。

#### 2.2.5 培養工学的 DOI 発酵生産

DOI、グルコース、マンニトール、菌体濁度の測定及び定量は、2.2.1.1-2.2.1.3を参照。

##### 2.2.5.1 DOI の pH 及び温度安定性試験

① 1.5 ml チューブに、pH を 3.0, 5.0, 7.0, 9.0 に 調整した McIlvaine buffer が溶媒の 2 × YT 培地をそれぞれ 210 μl ずつ入れた。

② 10％ に調製した DOI 溶液を 90 μl ずつ入れ、最終濃度を 3％ にした。

③ 4,20,35,50℃でそれぞれインキュベートした。

④ 経時的にサンプリングをし、DOI 量を定量し、残存率を計算した。

##### 2.2.5.2 フラスコ培養における DOI 生産培養方法

① 試験管に RMM 培地 3 ml を入れ、抗生物質として Amp (最終濃度 100 μg/ml), Zeo (最終濃度 20 μg/ml), Km (最終濃度 20 μg/ml), Spm (最終濃度 20 μg/ml) を添加した。

② グリセロールストックからミクロスパーテル 1 さじ分植菌した。

③ $ 30^{\circ} $ C, 200 rpm/min で 20 h 振とう培養し、この培養液を前培養液とした。

④ 500 ml バッフルフラスコに 3% Glc, 4% Man を含む 2 × YT 培地 50 ml を入れ、1 N HCl または 1 N NaOH で pH を調整した。

⑤ 抗生物質として Amp (最終濃度 100 μg/ml) を添加した。

⑥ 前培養液を初期 $ OD_{600}=0.1 $ になるように植菌し、各温度、120 rpm で培養した。経時的にサンプリングを行い、pH を調整後、菌体濁度、DOI 生産量及び糖濃度の経時的変化を測定した。

##### 2.2.5.3 ジャーファーメンター培養における DOI 生産培養方法（回分培養）

① 200 ml バッフルフラスコに各生育炭素源を添加した RM 培地 40 ml を入れ、抗生物質として Amp (最終濃度 100 μg/ml), Zeo (最終濃度 20 μg/ml), Km (最終濃度 20 μg/ml), Spm (最終濃度 20 μg/ml) を添加した。

② グリセロールストックからミクロスパーテル 2 さじ分植菌した。

③ $ 30^{\circ}C $ , 130 rpm で $ OD_{600}=3 \sim 3.5 $ になるまで培養し、この培養液を前培養液とした。

④ 3 L ジャーファーメンターに 2×YT または HNS 培地を入れ、オートクレーブ滅菌後、Glc、各生育炭素源を添加し、抗生物質として Amp (最終濃度 100 μg/ml)、消泡剤としてアデカノール (最終濃度 130 nl/ml) を添加した。

⑤ 前培養液を全量投入し、2 N HCl または 14% NH $ _{3} $ で pH 調整後、各温度、各攪拌速度で培養した。

⑥ 経時的にサンプリングを行い、菌体濁度、DOI 生産量及び糖濃度の経時的変化を測定した。
2.2.5.4 ジャーファーメンター培養における DOI 生産培養方法（流加培養）

前培養液は、2.2.5.3 の①～③と同様である。

② 本培養培地（3% Yeast extract、0.2% K₂HPO₄、0.2% KH₂PO₄、0.2% (NH₄)₂SO₄、0.2% MgSO₄、0.01% FeSO₄·7H₂O、アンピシリン 100 μg/ml）に前培養液を投入した。

③ 流加培地（250 g Glucose, 250 g Glycerol, 30 g Yeast extract, 470 g $ H_{2}O $ ）を 0.3 g/min で流加した。

##### 2.2.5.5 Glycerol の定量方法

Glycerol Assay Kit (Megazyme) の手順に従い、測定した。

① サンプルを DW で 100 倍に希釈した。

② 96 穴マイクロプレートに、DW 200 μl、サンプル 10 μl、NADH/ATP/PEP buffer 20 μl、PK/L-LDH 2 μl を入れ、マイクロプレートミキサーで懸濁した。

③ 室温で 4 min 静置した。

④ GK 2 μl を加え、マイクロプレートミキサーで懸濁した。

⑤ 室温で 6 min 静置した。

⑥プレートリーダーを用いて吸光度340 nmで測定した。

##### 2.2.5.6 Fructose の定量方法

D-Fructose/D-Glucose Assay Kit (Megazyme) の手順に従い、測定した。

① サンプルを DW で 100 倍に希釈した。

② 96 穴マイクロプレートに、DW 160 μl、サンプル 3 μl、Reagent 1 40 μl を入れ、マイクロプレートミキサーで懸濁した。

③ 室温で 3 min 静置した。

④ Reagent 220 μl を加え、マイクロプレートミキサーで懸濁した。

⑤ 室温で 5 min 静置した。

⑥ Reagent 3 20 μl を加え、マイクロプレートミキサーで懸濁した。

⑦ 室温で 10 min 静置した。

⑧ プレートリーダーを用いて吸光度 340 nm で測定した。

##### 2.2.5.7 Xylose の定量方法

D-Xylose Assay Kit (Megazyme) の手順に従い、測定した。

① サンプルを DW で 100 倍に希釈した。

② 96 穴マイクロプレートに、DW 200 μl、サンプル 10 μl、Buffer 40 μl、NAD⁺/ATP 40 μl、Hexokinase 2 μl を入れ、マイクロプレートミキサーで懸濁した。

③ 室温で 4 min 静置した。

④ XDH/XMR 5 μl を加え、マイクロプレートミキサーで懸濁した。

⑤ 室温で 6 min 静置した。

⑥ プレートリーダーを用いて吸光度 340 nm で測定した。
### 3. 結果と考察

### 3.1 環境低負荷型糖生産システムの開発 (オールバイオプロセス)

#### 3.1.1 マイタケ菌のゲノム解析と遺伝子組換え系の確立

##### 3.1.1.1 マイタケ菌ドラフトゲノムデータベースの構築

マイタケ菌の菌株改良および高度利用に向けた研究基盤整備の一環として、マイタケ全ゲノム配列の解読を行った。マイタケ菌の全ゲノム配列解読は、研究協力機関の（株）雪国まいたけにおいて先行解析が実施され、同社保有のドラフトゲノムデータベースに対して本研究により得られたゲノム解読データを統合する形でデータ処理行った結果、すでに得られていたものと同様の結果となり、最高精度のドラフトゲノムデータであり、本データベースは一般的な高精度担子菌ゲノムデータベースと同等の情報量を有する高精度データベースであると判断された。今後このデータベースを本研究課題の研究基盤として利用し、各種研究開発を実施することにした。

##### 3.1.1.2 マイタケ用カスタムマイクロアレイチップの開発

項目 3.1.1.1 で構築したマイタケ歯ゲノムデータベースを使用してマイタケ用カスタムマイクロアレイ解析プラットホームの開発を行った。マイクロアレイチップの開発にあたり、推定遺伝子領域情報の抽出、オリゴヌクレオチドプローブの設計を行い、合計 43,803 個の 60-mer オリゴヌクレオチドプローブを搭載した、プローブ搭載率は 100% のマイクロアレイチップを構築した。

##### 3.1.1.3 マイタケ廃菌床保管処理中における DNA マイクロアレイ解析

###### 3.1.1.3.1 バイオマス前処理効果の確認

実際に保管処理を行った廃菌床を T. reesei QM9414 培養上清を用いて糖化実験を行った。糖化率はホ

した。72 h 糖化した結果、保管前の糖化率は 27.7 %であったが 12 週間保管後には 56.4 %まで改善され、実際に廃菌床保管処理によりバイオマス前処理が行われていることを確認した（図 3.1）。

###### 3.1.1.3.2 廃菌床保管処理中における DNA マイクロアレイ解析

子実体収穫後のマイタケ歯床をすぐに通気弁付きポリプロピレン製バッグに移し、30、60、90日間保管した。保管処理なし（保

図 3.1 各保管期間における廃菌床糖化率

管0日）は子実体収穫直後に試料を採取しRNAを抽出した。各保管期間に各採取場所（最外層：O、中間層：RC、中心部：C）の廃菌床から抽出した高純度RNAサンプルを用いDNAマイクロアレイ解析を行った。得られた全遺伝子発現データについて、異なる保管期間条件間の比較を行うために75パーセンタイルシフトノーマライゼーション法を用いて正規化を行い、遺伝子発現のデータ分布をbox-whisker
plot（箱ひげ図）解析により検証した。箱の大きさや中央値の大きなずれがないことからデータの分布がほぼ一様であることを確認した(図3.2)。

図 3.2 正規化した各マイクロアレイデータの box-whisker plot 解析

約 16000 のマイタケ全遺伝子のうちアレイチップのプローブ設計が困難であった遺伝子、発現が検出されなかった遺伝子を除く 15557 遺伝子の発現挙動を階層クラスタリング解析した（図 3.3）。得られたヒートマップは発現強度が低いものほど青色、発現強度が高いものほど赤色で示されている。遺伝子発現挙動は保管前と保管後においてより大きな差が観察されたが各保管期間のサンプル採取箇所(最外層:O、中間部:RC、中心部:C)において目立った挙動の違いは観察されなかった。そのため保管期間ごとの解析には廃菌床の中心であるサンプル採取場所 C のデータを使用して比較することにした。

サンプル採取場所 C の 0 日保管(0C)と 30 日保管の遺伝子発現挙動で 5 倍以上の発現強度差があったものを抽出したところ 576 遺伝子が抽出された。その遺伝子群の階層クラスタリング結果を図 3.4 に示す。その結果、廃菌床の保管処理中に発現挙動が大きく変化する遺伝子群 Cluster A と Cluster B を見出した。Cluster A には 111 遺伝子が含まれ保管処理中に最も高発現していた。Cluster B は 180 遺伝子から成り、保管 0 日で発現していない遺伝子が保管により高い発現を示していた。これらの Cluster A、B に属し各期間において高発現する上位 10 個の遺伝子の推定機能を表 3.1、3.2 に示した。
図3.3 マイクロアレイによる全遺伝子の発現挙動に基づいた階層クラスタリング解析 青→赤になるほど高発現している遺伝子を示す
図 3.4 保管前と 30 日保管後の廃菌床中のマイタケ菌で 5 倍以上発現量が異なる遺伝子の階層クラスタリング解析
赤：リグニン分解酵素 緑：ヘミセルロース、ペクチン分解酵素 青：エステラーゼ

赤：リグニン分解酵素 緑：ヘミセルロース、ペクチン分解酵素 青：エステラーゼ

表3.2 Cluster B に属し各保管期間で発現量が高い上位 10 遺伝子

1	lipase i	short chain dehydrogenase	FOLy LO2 manganese peroxidase
2	CAZy GH29 $ \alpha $ -fucosidase	CAZy CE08 pectin metylesterase	lipase i
3	FOLy LO2 manganese peroxidase	lipase i	CAZy GH29 $ \alpha $ -fucosidase
4	FOLy LO2 manganese peroxidase	FOLy LO2 manganese peroxidase	CAZy CE08 pectin metylesterase
5	CAZy CE08 pectin metylesterase	CAZy GH10 $ \beta $ -1,4-endoxylanase	FOLy LO2 manganese peroxidase
6	CAZy GH27 $ \alpha $ -galactosidase	CAZy GH35 $ \beta $ -galactosidase	CAZy GH27 $ \alpha $ -galactosidase
7	CAZy GH31 $ \alpha $ -xylosidase	CAZy GH29 $ \alpha $ -fucosidase	FOLy LO2 manganese peroxidase
8	CAZy GH35 $ \beta $ -galactosidase	CAZy GH27 $ \alpha $ -galactosidase	CAZy GH31 $ \alpha $ -xylosidase
9	CAZy GH10 beta-1,4-endoxylanase	HYP hydrophobin HGFI	CAZy GH10 $ \beta $ -1,4-endoxylanase
10	endonuclease exonuclease phosphatase	CAZy GH31 $ \alpha $ -xylosidase	twin-arginine translocation pathway signal

表 3.1 Cluster A に属し各保管期間で発現量が高い上位 10 遺伝子

storage time (days)
0	30	60	90
1	AA9 (formerly GH61)	Lectin	Lectin	Lectin
2	mannitol-1-phosphate dehydrogenase	nad-dependent formate dehydrogenase	nad-dependent formate dehydrogenase	nad-dependent formate dehydrogenase
3	AA9 (formerly GH61)	FOLy LO2 versatile peroxidase	FOLy LO2 manganese peroxidase	aspartic peptidase a1
4	nad-dependent formate dehydrogenase	aspartic peptidase a1	FOLy LO2 versatile peroxidase	FOLy LO2 versatile peroxidase
5	uricase (urate oxidase)	FOLy LO2 manganese peroxidase	aspartic peptidase a1	FOLy LO2 manganese peroxidase
6	aspartic peptidase a1	aspartic peptidase a1	aspartic peptidase a1	aspartic peptidase a1
7	serine carboxypeptidase	oxalate decarboxylase	CAZy CE15 4-O-methyl-glucuronoyl methylesterase	hexose transporter
8	udp-glucose dehydrogenase	hexose transporter	oxalate decarboxylase	glutathione s-transferase
9	CAZy GH45 beta-1,4-endoglucanase	aspartic peptidase a1	gpr1 family protein	gpr1 family protein
10	exopolyphosphatase	d-lactonohydrolase-like protein	hexose transporter	CAZy CE15 4-O-methyl-glucuronoyl methylesterase
Cluster B の保管 0 日の遺伝子は発現していなかったので表 3.2 から除外した。表 3.1 に示した Cluster A において保管処理中に共通して高発現している遺伝子には Lectin、nad-dependent formate dehydrogenase (ギ酸デヒドロゲナーゼ) をコードする遺伝子の他にリグニン分解酵素 versatile peroxidase, manganese peroxidase をコードしていた。そのほか、糖質関連酵素(CAZy)の carbohydrate esterase (CE) ファミリーに属する CE15 も 60 日と 90 日において高発現する 10 遺伝子に含まれていた。Cluster B においては lipase 等、脂質分解に関する遺伝子の他、酸化還元酵素、CAZymes、FOLymes が見られた。Cluster B に分類された遺伝子はヘミセスロース側鎖、ペクチンを分解する酵素がほとんどであった。30 日で高発現していた GH35 (β-galactosidase)、GH31 (α-xylosidase etc.)、GH29 (α-fucosidase)、GH27 (α-galactosidase) は保管 60 日では 30-40％ 発現強度が低下し、90 日で再び 30 日と同等またはそれ以上の発現強度を示した。

図 3.4 に示した全 576 遺伝子のうちアノテーション情報が付いていた遺伝子は 194 遺伝ありその内 FOLy または CAZy のアノテーション情報を持つ遺伝子は 64 遺伝子存在した。解析可能な遺伝子のうち 33%が FOLy または CAZy であったことからこれらに絞った発現挙動解析を行った（図 3.5）。中心部の 0 日保管と 30 日保管を比較し 5 倍量以上発現が変動した FOLy と CAZy をコードする遺伝子の階層クラスタリング結果および 0C と 30C における高発現遺伝子 10 個を表 3.3、3.4 に示す。

表 3.3 保管前 0 日において高発現する CAZyme、FOLyme コード遺伝子 高発現順上位 10 遺伝子（30 日 < 5 fold）

Gene ID	Family	0 day storage
Putative activity
1	773582	CAZy AA9	lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs)
2	773570	CAZy AA9	lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs)
3	894661	CAZy GH45	$ \beta $ -1,4-endoglucanase
4	1538882	CAZy GH18	chitinase
5	1428313	CAZy GH18	chitinase
6	1609517	CAZy AA9	lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs)
7	1418216	CAZy GH115	$ \alpha $ -glucuronidase
8	1306928	CAZy CE15	4-O-methyl-glucuronoyl methylesterase
9	20212195	FOLy LO3	cellobiose dehydrogenase
10	1307362	CAZy GH18	chitinase

表 3.4 保管 30 日において高発現する CAZyme、FOLyme コード遺伝子高発現順上位 10 遺伝子（0 日 < 5 fold）

Gene ID	Family	30 day storage
Putative activity
1	713293	FOLy	LO2
2	180436	FOLy	LO2
3	1306928	CAZy	CE15
4	24014124	CAZy	GH03
5	22012983	CAZy	CE16
6	1418216	CAZy	GH115
7	20212064	CAZy	GH95
8	1035723	CAZy	GH28
9	773582	CAZy	AA9
10	24314417	CAZy	GH03
図 3.5 保管前と 30 日保管後の廃菌床中のマイタケ菌で 5 倍以上発現が異なる FOLymes、CAZymes コード遺伝子の階層クラスタリング解析

その結果、保管処理特異的に高発現すると考えられる FOLymes および CAZymes が抽出された。versatile peroxidase および manganese peroxidase をコードする遺伝子は保管処理中常に高発現しており (図 3.5、図 3.6) マイタケの主要リグニン分解酵素であることが示唆された。また、リグニン分解を補助する LDA family に属する酵素の遺伝子もリグニン分解酵素遺伝子同様の発現挙動を示すことが明らかになった (図 3.6)。高発現していた 713293、180436 以外にも複数の MnP の遺伝子発現が確認され、保管期間によって発現挙動が異なっていることが観察された。約半数の FOLymes 遺伝子は保管期間においても転写活性化されておらず、保管処理中のリグニン分解システムでは発現しない酵素の存在が示唆された。

CAZyme について保管処理中に高発現する遺伝子はペクチン分解、ヘミセルロース側鎖分解、リグニンとヘミセルロースのエステル結合を切断する酵素が多く観察された(図3.7)。G. frondosaはT. reeseiの主要なセルラーゼであるcbh1と同じGH7に属する酵素の遺伝子を有しているが全ての期間において発現していなかった(図3.8)。遺伝子発現の観点から、主要なセルラーゼはEGとAA9とであると考えられ、複数のEG、AA9どの期間においても強く発現していた。以上より、T. reeseiの様な協調的なセルラーゼによるセルロース分解を行っていないことが示唆された。
図 3.6 FOLy 遺伝子の発現挙動（LO1:緑字、LO2:赤字）

各酵素が作用する成分 GH10, 11: hemicellulose GH28: pectin GH43, 51: hemicellulose, pectin GH74: xyloglucan

図 3.7 ヘミセルロース、ペクチン分解酵素遺伝子の発現挙動

図 3.8 セルラーゼ(CBH、EG、BGL、LMPO(AA9))の遺伝子発現挙動 (X):キシログルカン特異的
DNA マイクロアレイ解析によってバイオマスの生物的前処理効果に関与が疑われるタンパク質遺伝子の発現を解析したところ、FOLymes、CAZymes 遺伝子以外にも多くの遺伝子が特異的に発現していることが明らかとなった。表 3.1 に示した遺伝子で、保管前と比較し最も発現量が変化した Lectin は生理機能に関しての研究が少なく、Lectin が果たす役割は不明である。Lectin はガラクトースに関連する糖を特異的に認識し結合する糖結合タンパク質である。バイオマス分解への関与も考えられるが、倉橋らはマイタケ栽培中において発現しているレクチン遺伝子が原基(子実体の基礎部分)形成を促す芽だし操作によって発現が強く抑制されることを報告し、Lectin が菌糸伸長に関与することを示唆した(6)。本研究は子実体を取り除いた後の菌床を対象としているが、廃菌床からもう一度子実体を形成させることは可能であり、他の研究者からも報告されている(7)。以上のことから、G. frondosa は再び子実体を形成させようと菌糸を成長させようとしていることが考えられた。また、保管処理中高発現していた遺伝子として、ギ酸デヒドロゲナーゼと保管前には発現していなかったシュウ酸デカルボキシラーゼの発現挙動が検出された(表 3.1)。担子菌類は培地中にシュウ酸などの有機酸を多量に分泌することが知られている。シュウ酸は MnP によって酸化された Mn³⁺のキレーターとなり拡散性の低分子酸化剤としてリグニンのフェノール性ユニットを酸化する。また、シュウ酸と Mn³⁺が反応すると高い還元力を持つギ酸ラジカルを生じ、このギ酸ラジカルが酸素を還元してリグニンを分解しうる反応性の高いスーパーオキシド(O₂・)を発生させリグニン分解を促進していると考えられている。しかし、P. chrysosporium は低濃度のシュウ酸は MnP 活性を促進させるが、高濃度のシュウ酸は MnP 活性を低下させるという報告(8)がされているため、G. frondosa はシュウ酸デカルボキシラーゼの働きにより培地中のシュウ酸の濃度をコントロールすることで Mn³⁺やラジカルの制御を行っている可能性が示唆された。シュウ酸の分解はシュウ酸デカルボキシラーゼとギ酸デヒドロゲナーゼによって二酸化炭素まで分解される。ギ酸デヒドロゲナーゼがギ酸を分解する過程において二酸化炭素を生産するとともに NAD⁺を NADH に還元し電子伝達系に必要なエネルギーを生み出すことから、効率の良いリグニン分解とエネルギー獲得系を有していることが考えられた。表 3.2 で比較的高い発現を示していた lipase i もリグニン分解に関っていることが推察される。MnP は不飽和脂肪酸の存在下で非フェノール性リグニンモデルを分解することが報告されている。リパーゼの活性により遊離脂肪酸が生成され連鎖的に続く脂質酸化で生じるラジカルが MnP によるリグニン分解を補助している可能性がある。LiP 活性を持たない G. frondosa は MnP とこれらのラジカル制御系を駆使して高分子リグニンを分解していると考えられる。また、lipase i と同じく Cluster B に分類され保管処理中に発現量が増加する twin-arginine translocation pathway signal をコードする遺伝子にも興味がもたれた。twin-arginine translocation pathway (tat 経路)は植物やバクテリアなどで見られる分泌経路で通常の general secretion pathway (sec 経路)とは異なる分泌機構を持つ。sec 経路では細胞膜上にある sec 系分泌装置の細い穴をタンパク質がほどけた状態で輸送され、細胞外に分泌されてから立体構造を取るのに対して tat 経路は細胞内で立体構造を取ったタンパク質が立体構造を保持したまま細胞外へと輸送される。細菌であるが Streptomyces ipomoea の Laccase をコードする遺伝子は tat 分泌シグナルを持っていることが報告されており(9)、G. frondosa の複数の MnP および Laccase のシグナル配列に tat シグナル配列特有の連続するアルギニン残基-RR-が存在したため tat シグナル検索システム TatP (http://www.cbs.dtu.dk/services/TatP/)で検索したがいずれの遺伝子からも tat 分泌シグナルは検出されなかった。リグニン分解酵素と tat 経路の関連は見いだせなかったが発現挙動の観点から廃菌床保管処理中には通常と異なるタンパク分泌経路も働いていることが示唆された。表 3.1 の Cluster A で高発現している複数の菌体外 peptidase が見いださ
れた。木質中のタンパク質だけでなく、自身が生産したタンパク質を分解することで窒素源を再利用し、栄養源確保のための酵素を分泌していることが考えられた。木材は炭素に比べて窒素源が非常に限られているため、窒素源の確保は非常に重要である。

#### 3.1.2 マイタケ菌の前処理能力強化

##### 3.1.2.1 マイタケ リグニン分解能力強化株スクリーニング条件の設定

マイタケ菌の生物的前処理能力の強化を行うために、リグニン分解強化菌株の取得を目的とした変異株スクリーニング条件の決定を行い、高浸透圧培養条件下でのプレート培養および2,2'-アゾビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)ニアンモニウム(ABTS)を基質としたプレートアッセイ系を組み合わせることで、リグニン分解能力強化株取得に最適なハイスループットスクリーニング系を構築した。

##### 3.1.2.2 突然変異導入によるマイタケ菌の改良

###### 3.1.2.2.1 紫外線照射を用いたマイタケ菌への突然変異導入系の確立

においては、いかにして単一の変異導入細胞核に由来する変異体を分離・取得するかが高効率変異導入のポイントとなるため、変異導入細胞の分離法の検討を行った結果、プロトプラスト化が効果的であつ

図 3.9 リグニン分解力強化株取得に向けた変異株造成システム

た。次に分離した細胞を対象に紫外線照射条件の最適化を行い、マイタケ変異導入実験系を確立した（図3.9）

3.1.2.2.2 マイタケ リグニン分解能力強化変異株の取得

マイタケ菌のプロトプラストに対して紫外線を照射し、生物的前処理能力としてのリグニン分解活性を強化された変異株の取得を試みた。変異処理後に生育した株について2,2'-アゾビス（3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸）ニアンモニウム（ABTS）を基質としたプレートアッセイ系で評価した。その結果、親株（WT）に対してATBSの分解によって生じる呈色が強化されたと考えられる株の取得に

図3.10 マイタケ菌変異株のプレー トアッセイ
成功した（図3.10）。

###### 3.1.2.2.3 液体培養条件下におけるマイタケ菌の菌体外酵素生産プロファイルの解析

マイタケ菌二核菌糸体および一核菌糸体を様々な培養条件下で培養し、SDS-PAGE 解析に供したところ、二核菌糸体と一核菌糸体間で菌体外タンパク質の生産性および生産パターンに顕著な違いが観察され、特に二核菌糸体が高い菌体外タンパク質生産量を示した（図3.11）。今後、一核菌糸体を基準株として優良菌株を変異造成した後に二核菌糸の再生を行うことで、さらなるリグニン分解能力の強化を行える可能性が示唆された。

Glu: 1% glucose, Avi: 1% Avicel Xyl 1% xylan, GL: 1% glucose+0.01% lignin

#### 3.1.3 生物的前処理済み廃菌床に最適な糖化酵素開発 (新規ハイブリッド培養プロセス)

図 3.11 マイタケ菌の細胞核状態と液体培養条件下での菌体外タンパク質生産性

##### 3.1.3.1 セルラーゼによる廃菌床糖化系へのリグニン分解酵素添加の影響

T. reesei PC-3-7 株の培養上清を用い、保管処理済み廃菌床の糖化実験を行った (図 3.12)。リグニン分解酵素と T. reesei のセルラーゼが相乗的に働くことで糖化率が改善されるかどうかを判断するため、市販のリグニン分解酵素を酵素糖化系へと添加した。その他に、ヘミセルラーゼの添加についてもリグニン分解酵素が糖化に与える効果と比較するために検討を行った (図 3.12)。その結果、セルラーゼのみの control と比較し、Laccase、MnP を添加することで還元糖生成量が増加したため、リグニン分解酵素

図 3.12 セルラーゼによる廃菌床糖化への酵素添加効果

• Control: Trichoderma reesei PC-3-7 · Laccase R: Laccase from Rhus vernicifera

• MnP : MnP from Phanerochaete chrysosporium • Hemicellulase: from Aspergillus niger

を T. reesei で発現させた際に糖化効率の改善が期待された。ヘミセルラーゼ添加と MnP 添加の効果は同程度であり、リグニンやヘミセルロースが保管後においてもセルラーゼのアクセシビティを制限していることが示唆された。

##### 3.1.3.2 廃菌床中に分泌される酵素活性の解析
項目 3.1.1.3 において、廃菌床保管処理中における全遺伝子の発現挙動、特にリグニン分解酵素、糖質加水分解酵素の発現挙動について明らかにした。本項目では、廃菌床保管処理中に分泌されるタンパク質とマイクロアレイの遺伝子発現解析との相関性を評価する為、保管 0、4、8、12 週でサンプリングをして解析した。マイクロアレイ解析と同じサンプリング場所の廃菌床をマロン酸バッファーで抽出し、得られた抽出液のタンパク質量、セルラ

一ざ活性、リグニン分解酵素活性を解析した。解析は各保管期間3つの菌床を用いて行った。保管12週目のみ廃菌床の一つにコンタミネーションが発生したため2検体での解析を行った。

保管0日におけるサンプル採取場所O、RC、Cを比較するとC:中心部が最も分泌タンパク量が多かった。また、歯床中心部において歯床1gあたりG.frondosa分泌タンパクは1.03mg(保管0週)、0.64mg(保管4週)、0.38mg(保管8週)、0.28mg(保管12週)と減少した(図3.13)。この減少パターンは各サンプリング部位で同じであった。セルラーゼ活性は可溶性セルロースを基質としたCMCase活性、キシラナーゼ活性、セロビアーゼ活性の測定を行った(図3.14)。CMCaseおよびキシラナーゼ活性は保管0日で最も高い活性を示したが保管処理により急激に活性が減少し、タンパク質量と同様にCが最も活性が高くRC、Oと外層へとなるにつれ活性が低下した。セロビアーゼ(β-グルコシダーゼ)活性は活性測定の反応時間を長時間反応させたが活性は検出されなかった。リグニン分解酵素は2,6-DMPを基質としてMnP活性およびLaccase活性を測定した(図3.15)。

保管 0 週において MnP、Laccase 活性はそれぞれ C において 0.13U/ g-biomass、0.7 U/g-biomass とわずかしか検出されなかったが保管処理期間中に劇的に活性が上昇した。MnP 活性は保管 4 週に高い活性を示した後、保管 8 週目にはいったん活性が低下、保管 12 週に再

図 3.13 菌床 1g 当たりの分泌タンパク量の経時変化

図 3.14 菌床 1g あたりのセルラーゼ活性 (上) CMCase 活性、(下) Xylanase 活性

び保管4週目と同程度もしくはそれ以上の活性を示した。最も活性が高かった場所はCであり、菌床1gあたりの活性値は保管0週から順に0.13U(0週)、216U(4週)、95U(8週)、229U(12週)であった。Laccase
に関しても保管0週ではわずかな活性しか検出できなかったが保管処理により4週目に最高の活性が観測され保管期間とともに徐々に活性が減少した。最も活性が高かったのはRCであり活性は(1 gの菌床あたり)0.85 U(0週)、36.2 U(4週)、22.4 U(8週)、14.4 U(12週)であった。また、マイクロアレイ解析ではVP、LiPをコードする遺伝子の発現が確認されていたにも関わらず廃菌床酵素抽出にはLiP活性を検出することができなかった。MnP、VP、LiPは同じClass IIペルオキシダーゼでよく似たアミノ酸配列をしているためアノテーション情報が間違っている可能性が考えられた。そこで、LiPとVPの特徴であり、高い酸化還元電位を持つ基質分解に必要な酵素表面の基質結合部位であるTrp残基と、VPとMnPが持つMn結合サイトを確認することでアノテーション情報が正しいかどうか確認した。VP:713293、LiP:25314840のアミノ酸配列をBlast検索し、再解析したところP. chrysosporium LiPのW171の様にVP、LiPに共通で保存されている酵素表面のTyr残基を171残基付近に見出すことができなかった。また、Mn結合サイトが存在し、検索にトップヒットした遺伝子がMnPであったため、ゲ

図 3.15 菌床 1 g あたりのリグニン分解酵素活性（上）MnP 活性、（下）Laccase 活性の経時変化（共に 2,6-DMP を基質として使用）

## ノムのアノテーション情報の推定機能を MnP に改めた。

酵素抽出液の SDS-PAGE によって廃菌床保管処理中におけるマイタケの酵素分泌パターンを解析した (図 3.16)。ゲノムデータから G. frondosa の MnP はどのアイソザイムも約 40 kDa、Laccase (fio1) は約 50-60 kDa の分子量が予想された。LCC31 は G. frondosa 液体培養で最も分泌されている分子量 71 kDa のラッカーゼ Lac1(10) と N 末端配列が一致した。図 3.1.16A の SDS-PAGE の泳動バンドパターンを見ると保管前と 4、8、12 週保管処理したものとで大きな違いが見られた。保管処理中を施したサンプルは保管前と比較し、37-50 kD 付近に複数の強いバンドがみられ、MnP アイソザイムである可能性が示唆された。また、保管前で観察された 25-37 kDa の間のバンドが保管処理中はほとんど観察されなかった。マイクロアレイの解析から糖に吸着する機能を持つタンパク質であるレクチンが発現しており、バイオマスに吸着しているタンパク質の存在が考えられたため、一度酵素を抽出した廃菌床を洗浄し、再び 1 M NaCl を添加したマロン酸バッファーで抽出した。その結果、保管前には 38 kDa 付近に薄くみられていたバンドが保管期間においては明確なバンドとして 38、26、17 kDa 付近に 3 本確認することができ、26 kDa 付近のバンドは NaCl を加えない抽出酵素液の SDS-PAGE の泳動図では確認することができなかった (図 3.16B)。サンプル採取場所 C における 1 M NaCl で抽出した酵素分泌液のタンパク質濃度の経時変化は保管 0 週から 0、0.27、0.20、0.17 mg/g-biomass と保管 4 週目から減少する傾向が観察された。NaCl を加えて抽出した酵素液は、保管 0 週のサンプルでわずかな CMCase 活性を検出することができたが、セルラーゼ活性、
リグニン分解酵素活性は検出されなかった。保管4週目の酵素抽出液のLaccase Zymogramの結果から1つのバンドが確認され、少なくとも1つのLaccaseを廃菌床内に分泌していることが判明した(図3.16C)。

A

図 3.16 廃菌床酵素抽出液の SDS-PAGE

A: 各保管期間の酵素抽出液の SDS-PAGE 銀染色 B: 酵素抽出後の菌床に 1 M NaCl を加えたバッファーで抽出した酵素抽出液の SDS-PAGE 銀染色 C: 保管 4 週目の酵素抽出液の native-PAGE Laccase 活性染色

3.1.3.3 歯菌床保管処理中におけるリグニン分解遺伝子の qRT-PCR 解析

マイクロアレイの解析結果から保管処理中の発現が顕著であったリグニン分解酵素遺伝子を選抜し、各保管期間における発現量を定量して比較するため qRT-PCR 解析を行った。MnP

Gene ID	Annotation
VP	713293	versatile peroxidase
MnP3A	180436	manganese peroxidase
MnP3B	190517	manganese peroxidase
LiP	25314840	lignin peroxidase

図 3.17 保管処理における MnP 遺伝子の相対転写量の経時変化
遺伝子は

Gene

ID713293

(VP) 、

180436

(MnP3A)、

190517

(MnP3B)、

25314840

(LiP) に関して解析した。その結果、マイクロアレイの結果と一致して 713293

Gene ID	Annotation
fio1	431474	multicopper oxidase (Laccase)
LCC31	713160	multicopper redoxase (Laccase)
GLO	431479	glyoxal oxidase-like protein

図 3.18 保管処理における Laccase 遺伝子と LDA 遺伝子の相対転写量の経時変化

(VP)

180436 (MnP)が保管処理中に著しく高く発現していることが明らかとなった。190517 (MnP3B) は act1 比で 0.001-0.02 ほどしか発現していなかったためグラフに載せていない。MnP3B は保管が進むにつれ発現量(act1=1)が 0.00487 (0 週)、0.94 (4 週)、2.57 (8 週)、6.01 (12 週)と上昇していった。

LiP は VP、Mn3A と同様の挙動を示したが 4 週目の 0.7(act1 比)が最高の転写量であった。サンプル採取場所では C で最も発現量が高く RC、O と続き、遺伝子発現挙動は酵素活性の局在と一致する結果となった。各遺伝子とも発現量が最も高かった C のは保管 4 週目であり、ハウスキーピング遺伝子である act1 と比較し VP: 31.1 倍、MnP3A: 109.8 倍、MnP3B: 0.94 倍、LiP: 0.7 倍の発現量を示した (図 3.17)。

Laccase に関してはマイクロアレイ解析で発現が確認された 431474 (fio1)、713160 (LCC31) に関して qRT PCR 解析を行った (図 3.17)。また、リグニン分解酵素と共にバイオマス糖化へ応用するため (第 3 章)、LDA3 に属する glyoxal oxidase-like protein (GLO) に関しても解析した。Laccase に関しては保管処理中における MnP ほどの発現量は検出されず act1 発現量の 1/3 程度であった。Laccase 遺伝子はサンプル採取場所で異なる発現挙動を示した (図 3.18)。fio1 遺伝子は O で最も発現しており内層になるにつれて低い発現量であった。それに対して、LCC31 遺伝子は C で最も発現し外層になるにつれて低い発現であった。保管期間中の遺伝子発量の推移に関しても C と RC において MnP と異なる結果を示した。MnP 遺伝子では保管 4 週目に高い発現量を示した後、保管 8 週目に発現低下が観察されたが Laccase では 8 週目においても大きな発現量の低下は観察されなかった。GLO は保管処理前には発現していなかったが保管処理によりある程度の発現量増加がみられ $ H_{2}O_{2} $ を LO2 のペルオキシダーゼに供給していることが示唆された。

主なセルラーゼの発現解析（図3.8）から G. frondosa の主要なセルラーゼは EG と AA9 であることが示唆された。CBH 遺伝子は保管 0 日において発現していないことから、CMCase で検出した活性は主に EG 活性であったと考えられる。なぜなら EG と同じく保管 0 日で発現していた AA9 は酸化的にセルロー
スを酸化して結晶部位を分解するがセルロースに対する活性をほとんど示さないと言われており、効率的な酸化反応には電子供与体が必要と推測されているためである。保管中にもEG、AA9遺伝子は発現していたが活性が検出できなかったことから保管処理中はAA9が主に働いていたと思われる。このEGとAA9の働きにより菌床のセルロースミクロフィブリルの非晶部分、還元末端を増加させセルラーゼが作用しやすい環境を作り出していると考えられる。AA9はセルロース結晶領域だけでなくヘミセルロース、特にキシログルカン主鎖を分解する(11)ことが報告されているためG.frondosaの木材分解において複数の役割を持っていると思われる。選択的白色腐朽菌Ceriporiopsis suvermisporaにおいてセロビオハイドロラーゼ(CBH)活性を持つがエンドグルカナーゼ(EG)活性より低いことが知られている。G.frondosaの遺伝子発現解析からも同様の傾向が観察され、CBHとEGによる協調的なセルロース分解が行われないためバイオマスとしての廃菌床のセルロース量を大きく減少させなかったとことが推測できる。次に、保管処理中にヘミセルロースおよびペクチン分解酵素が高発現していたことも前処理に大きく関与していることが推測される。図3.1.5で高発現していたGH115（α-1,2 glucronidase）、GH95(α-1,2 fucosidase)はそれぞれグルクロノキシラン側鎖である4-O-メチルグルクロン酸、キシログルカン側鎖であるα-L-fucoseを分解する。さらに図3.1.4に示したCluster Bに分類された遺伝子の多くがヘミセルロース、ペクチン分解酵素であったことから廃菌床保管処理中G.frondosaはペクチンおよびヘミセルロースを分解して炭素源を獲得していることが考えられた。また、保管処理中Xylanase活性が検出できなかったことから保管処理中はXylan主鎖の分解はあまり行われていないことも示唆された。ヘミセルロース側鎖、ペクチン分解酵素活性はCMCase、Xylanaseの活性測定法では検出することができない。よって、CMCase、Xylanase活性が検出できなかったことはヘミセルロースの側鎖を資化している可能性を支持する結果となった。リグニン分解酵素においては180436と713293の2つのMnPが保管処理中、常に高発現していたことからこれらが主要なリグニン分解酵素であることが示唆された。またリグニン分解補助酵素(LDA)もMnPと同様に保管処理中に発現量を増加させた。マイクロアレイ結果からMnPとLDAが協調的に働き効率的なリグニン分解がなされていることが判明した。遺伝子発現解析、酵素解析から保管処理によって、G.frondosaリグニン分解システムが働きだしたと考えられるが保管処理中FOLymes遺伝子は約半数しか発現していなかった。環境に応じて、複数所有するMnP、Laccaseアイソザイムを使い分けていることが示唆された。リグニン分解酵素は廃菌床保管30日と90日で盛んに発現し、60日には発現が低下していることが判明した。保管30日と90日の遺伝子発現挙動の類似性はO、RC、Cのどの部位も同様に観察された。また、この挙動はリグニン分解酵素の活性の局在およびqRT-PCRで見られた挙動と一致している。このことから、30日で積極的にリグニン分解を行い、セルロースやヘミセルロースヘアクセスする経路を確保したため、60日においてはリグニン分解酵素生産を低下させたのではないかと考えられる。または、リグニン分解で生じたラジカルを制御するためにリグニン分解酵素の生産を抑制した可能性もある。廃菌床の3か所（O、RC、C）からサンプリングを行った理由は、廃菌床の外面は堅い菌糸が層を形成しており菌床中心部と遺伝子の発現が異なることが予想されたためである。また、菌床の外層(O)と菌床内部(C)では通気性が異なると思われ、反応に酸素を利用するラッカーゼの活性、転写等に関係すると考えたためである。廃菌床抽出酵素液のラッカーゼ活性測定結果ではRCがCよりも高い活性を示した。解析の結果、リグニン分解酵素の局在やサンプリング場所で発現が異なるLaccase遺伝子が存在していた。最も含水率が高いと推定される廃菌床の中心部:CではLaccase遺伝子の中でLCC31が最も発現量が高かった。Cより外層のRC、OではLCC31ではなく別のLaccase遺伝子fio1が最も高い発現量を示し
た。液体培養で最も発現する G. frondosa の Laccase は LCC31 であり、菌糸周辺の水分量や酸素濃度の環境が Laccase の発現にも関与している可能性が考えられた。

##### 3.1.3.4 マイタケ廃菌床の効果的な糖化法

項目 3.1.2 において保管処理を施したマイタケ 廃菌床にはリグニン分解酵素、糖質加水分解酵素が含まれていることが明らかとなった。そこで、廃菌床からの抽出液を用いて廃菌床の糖化処理の前処理（リグニン除去）を行えば効率的に糖化反応を行うことができると考えられた。保管処理済み廃菌床に対して抽出酵素を用いて処理したのち、洗浄してセルラーゼを投入した。その後 48 時間反応させたあとの糖化率を測定した。その結果、廃菌床を抽出して得られた酵素液による前処理だけでは糖化率の大きな改善に至らなかった（図 3.19）。また、洗浄処理だけでも糖化率の向上がもたらされた。以上のことから保管処理を施した廃菌床にはリグニン分解産物が残留しており、T. reesei のセルラーゼによる糖化反応を阻害している可能性が考えられた。また、廃菌床に含まれている酵素は（マイタケ 菌が生育する上では十分量であるかもしれないが）効率的な糖化を行う上では不十分であることが示唆された。そこで、保管処理済み廃菌床に含まれているリグニンおよびリグニン分解産物を除去するために廃菌床を 0.5 M NaOH で処理して残存リグニンを除去したのち、T. reesei のセルラーゼで糖化試験を行った。その結果、酵素濃度 20 mg/g-廃菌床の条件で 72 時間反応させることによって本研究開発の目標値である 80%

図 3.19 廃菌床抽出酵素液を用いて前処理を行った廃菌床の糖化結果

コントロール：透過処理のみ

洗浄サンプル：前処理時に酵素添加なし

前処理サンプル：廃菌床抽出酵素を用いて前処理

図 3.20 アルカリ処理廃菌床の糖化結果

の糖化率に達することができた(図3.20)。このことから、マイタケ菌のリグニン分解酵素を強化する、もしくは T. reesei においてリグニン分解酵素を大量に生産させるといった手段で効率的な廃菌床の糖化ができると考えられた。

###### 3.1.3.5 T. reesei におけるリグニン分解酵素の発現

項目 3.1.3.1 – 3.1.3.3 において、マイタケ廃菌床保管処理における生物的バイオマス前処理の解析を行いリグニン分解酵素が生物的前処理に大きく関与していることが示唆された。また、廃菌床を効率的に透過するためにはさらに強力なリグニン分解活性が必要であることが示された。そこで、生物的バイオ
マス前処理に関与する G. frondosa リグニン分解酵素をセルラーゼ高生産菌 T. reesei へ組み込み、バイオマス前処理能を付加した菌株の構築を目指した。一般に、リグニン分解酵素の異種宿主発現による大量生産は困難であり、糸状菌を宿主として用いても数百 mg/L の生産しか達成されていない。そのため、発現に対するストレスが比較的少なく抑えられると考えられる T. reesei 自身が持つリグニン分解酵素の同種発現も行った。

###### 3.1.3.6 T. reesei 形質転換体の構築

プロトプラスト-PEG 法を用いて T. reesei QM9414 株の形質転換を行い、アセトアミドを唯一の窒素源とする選択培地で生育可能な多数の形質転換候補株の取得に成功した。候補株は導入した遺伝子が増幅されるプライマーを用いコロニーPCR によって G. frondosa 目的遺伝子の挿入を確認した。その結果得られた計 33 株のリグニン分解酵素遺伝子が導入された T. reesei QM9414 株（表 3.5）を実験に用いた。

表 3.5 導入した遺伝子名と取得した形質転換体数

Name:Gene ID	activity	number of transformant
VP:713293	MnP	2
LiP:252314840	MnP	2
VMn:1306909	MnP	8
MnP3B: 190517	MnP	7
LCC31:713160	Laccase	14

##### 3.1.3.7 異種宿主発現株のスクリーニング

多数の形質転換体が得られたためリグニン分解酵素の指示基質を用いてリグニン分解酵素活性付加株のスクリーニングを行った。ペルオキシダーゼ発現株は合成染料であるレマゾールブリリアントブルーR (RBBR)を0.1%セロビオース含有最小培地に添加し、RBBRを分解によって生じるクリアブーンの観察を行った。また、ラッカーゼ発現株はラッカーゼ活性を示すとタンニン酸が酸化され褐色を呈するバーベンダム反応によるスクリーニングを試みた。しかし、RBBR分解では明確なクリアブーンの形成は見られなかった。バーベンダム反応を用いたスクリーニングにおいても培地の褐色への変化は全く観察されなかった (図3.21)。プレート上における簡易スクリーニングが行えなかったため、各形質転換候補株を1%Avicel培養し、培養上清のリグニン分解酵素活性測定を行った。導入したリグニン分解

図 3.21 形質転換体の候補株スクリーニング 水 QM9414 QVP4 QVP4 培養上清 菌体内抽出液

図 3.22 QVP4 の MnP 活性測定（長時間反応）
酵素遺伝子は cbh1 プロモーター制御下にあるため T. reesei のセルラーゼ誘導基質である Avicel を炭素源として培養し誘導発現させた。その結果、4 種類の MnP 遺伝子を導入した各株（計 19 株）において活性が検出できなかった。しかし、VP を発現させた QVP No.4 株(QVP4)の MnP 活性測定において活性を検出することはできなかったが 3 分間の反応中にわずかに基質の酸化による吸光度増加を示した QVP4 培養上清を活性測定と同じ反応系で数日間反応させたところ弱い呈色を示した。このことから、微弱ながら VP (MnP)を発現していることが示唆された(図 3.22)。

ラッカーゼ発現株について、培養上清を ABTS 含有寒天培地上にスポットし、長時間反応させることで 11 株がラッカーゼ活性を示すことが確認できた（図 3.23）。そこで、ラッカーゼ活性を定量するため培養上清を 1 mL の反応系で活性測定を行った。反応温度はしばしばリグニン分解酵素の活性測定で用いられる 30℃と、セルラーゼによるバイオマス糖化温度である 50℃において活性測定を行った（図 3.24）。その結果 LCC31 発現株 No.3、N0.8 (QLCC3、QLCC8)株が他の株よりも高い活性を示したため解析に用いた。解析した全ての MnP 発現株と Laccase 発現株の酵素活性の有無を表 3.6 および表 3.7 にまとめた。

図 3.23 QLCC 培養上清をスポットした ABTS プレート

図 3.24 QLCC 株形質転換体のラッカーゼ活性
表 3.6 MnP 形質転換体の MnP 活性、発現状況

introduced G. frondosa Gene ID	Strain	ligninolytic enzyme activity	transcription	heterologous recombination*	southern analysis
VP (MnP): 713293	QVP1	×	○	1 copy
QVP4	△	○	○	1 copy
LiP (MnP): 25314840	QLiP16	×	○	-
QLiP17	×	○	-
MnP: 1306909	QVMn1	×	○	-
QVMn2	×	○	-
QVMn3	×	○	-
QVMn4	×	○	○	-
QVMn5	×	○	-
QVMn7	×	○	-
QVMn8	×	○	○	-
QVMn9	×	○	-
MnP: 190517	QMnP3B1	×	○	-
QMnP3B2	×	○	-
QMnP3B3	×	○	-
QMnP3B4	×	○	-
QMnP3B5	×	○	-
QMnP3B6	×	○	-
QMnP3B7	×	○	○	-

$ ^{*} $ qRT-PCR 解析における cbh1 の発現の有無から判断

表 3.7 Laccase 形質転換体の MnP 活性、発現状況

introduced G. frondosa gene ID	Strain	ligninolytic enzyme activity	transcription	heterologous recombination*	southern analysis
Laccase : 713160	QLCC1	○	○	-
QLCC3	○	○	-
QLCC4	○	○	-
QLCC4	○	○	-
QLCC5	×	○	○	-
QLCC6	×	○	○	-
QLCC7	○	○	-
QLCC8	○	○	-
QLCC11	○	○	-
QLCC12	○	○	-
QLCC13	○	○	-
QLCC15	○	○	-
QLCC17	○	○	○	-
QLCC18	○	○	2 copy
QLCC20	×	○	○	-

$ ^{*} $ qRT-PCR 解析における cbh1 の発現の有無から判断