Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
酵素においても各遺伝子のシグナル配列を使用し、終止コド前に6×His tagが付加されるようにプライマーを設計した。形質転換時は発現力セットをXbaIとEcoRIで消化して切り出した（図2.3）。プラスミド構築に使用したプライマー配列を表2.6、2.7、2.8に示す。

表 2.6 cbh1 vector inverse PCR 用プライマー

プライマ一名	配列 (5'→3')
cbh1 vector prom	GATGCGCAGTCCGCGGTTGACTATTG
cbh1 vector term	ACTAGTGCTCCGTGGCGAAAGCCT

図 2.2 T. reesei 用 G. frondosa リグニン分解酵素発現力セットの構築

表 2.7 G. frondosa リグニン分解酵素発現用ベクター構築用プライマー

遺伝子名	プライマ一名	配列 (5'→3')
vpl2-V	vpl2-V-Fw-Sig-new	ATGTCCTTCAAGTCCATCTTCGC
vpl2-V-Fw-new	GTCCCATCCCCCAGAG
vpl2-V-Rv-His-new	TTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGAGAAGGGGGTACTGGGGCA
vpl2-V-Rv-new	TTAAGAAGGGGGTACTGGGGCA
MnP3-A	MnP3-A-Fw-Sig-new	ATGGCGTTCAAGACCCTCG
MnP3-A-Fw-new	GCGCTTATCCGACGGGT
MnP3-A-Rv-His-new	TTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGGCGGCGCTACGG
遺伝子名	プライマ一名	配列 (5'→3')
MnP3-A-Rv-new	TTAGGCGGCGCTACGG
vpl2-L	vpl2-L-Fw-Sig	ATGTCCTTCAAGGCCATCTTCG
vpl2-L-Fw	GCTCCGTCGCGGCTG
vpl2-L-Rv-His	TTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGAGATGGAGGGACTGGGGCGAC
vpl2-L-Rv	TTAAGATGGAGGGACTGGGGC
fio1	fio1-Fw-Sig	ATGAGCGGTTCTATTTCGAGCTCC
fio1-Rv-His	TTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGTGGGGCGCTACACTGGT
fio1-Rv	TATGGGGCGCTACACTGGT
vpl2-Mn	vpl2-Mn-Fw-Sig	ATGAGCTTCAAGGCCATCTTTGC
vpl2-Mn-Fw	GCCCCTTCCCGCCAAGT
vpl2-Mn-Rv-His	TTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGTGACGGTGGCACGG
vpl2-Mn-Rv	TATGACGGTGGCACGGG
MnP3-B	MnP3-B-Fw-Sig	ATGAGTTTCAAAGCACTAGCTTCGC
MnP3-B-Fw	GCACTCACTCGCCGAGTTG
MnP3-B-Rv-His	TTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGCTGGGGGGAACC
MnP3-B-Rv	TTAGCTGGGGGGAACC
LCC31	LCC31-Fw-Sig	ATGGCGAACTTCCCTACACTTTCC
LCC31-Fw	GGCATCGGACCCGTAACG
LCC31-Rv-His	TTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGATCAGAAGGTCGAGGG
LCC31-Rv	TTAGTGATCAGAAGGTCGAGGG
GLO	GLO-Fw-Sig	ATGCACTTTCCAAAGATTCTCGCA
GLO-Fw	TCTCCTCCATGTAATTCATCGCG
GLO-Rv-His	TTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGAGGCCCAAGATCTCGGAGA
GLO-Rv	TTAGAGGCCCAAGATCTCGGAGA
CDH1-A	CDH1-A-Fw-Sig	ATGCTCGTATGTATTCGACGGGAG
CDH1-A-Fw	CAGTCCGGGAGTATCTACACTGA
CDH1-A-Rv-His	CTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGGGGCCCCCGGC
CDH1-A-Rv	CTAGGGGCCCCCGGC
CDH1-B	CDH1-B-Fw-Sig	ATGCGCATTCCGCGTTTGC
CDH1-B-Fw	CAGAGCAACTCACCCTACTGC
CDH1-B-Rv-His	TTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGATGTAGGCGAGGTGAACGC
CDH1-B-Rv	TTAGATGTAGGCGAGGTGAACGC
表 2.8 T. reesei 内在性リグニン分解酵素発現プラスミド構築に使用したプライマー

アノテーション	protein ID	プライマ一名	配列 (5'→3')
Laccase	54239(TAA)	Lac54239Fw_IF	CGCGGACTGCGCATCATGGCGCGGTTGTATGTG
Lac54239Rv_IF	CCACGGAGCACTAGTTTACAAGCCCATATCCAGAT
Lac54239Rv His	GTGGTGGTGGTGGTGGTGCAAGCCCATATCCAGATACTTTTG
124079(TAG)	Lac124079Fw_IF	CGCGGACTGCGCATCATGAGTCGTTTTGCGTGGGT
Lac124079Rv_IF	CCACGGAGCACTAGTCTAAGAACAACAGATTTGGTGTTA CG
Lac124079Rv His	GTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGAGAACAACAGATTTGGTGTTA CGTG
102820(TGA)	Lac102820Fw_IF	CGCGGACTGCGCATCATGAACAGCTTCACGCGGC
Lac102820Rv_IF	CCACGGAGCACTAGTTCAGCTTCTCAGAGCTGCAGCT
Lac102820Rv His	GTGGTGGTGGTGGTGGTGGCTTCTCAGAGCTGCAGCTCC
GLO	124282(TGA)	124282Fw_IF	CGCGGACTGCGCATCATGAAGCCCTCTCCGGTGGC
124282Rv_IF	CCACGGAGCACTAGTTCAAACACCGGGAGTCGTAAAGCC
124282Rv His	GTGGTGGTGGTGGTGGTGAACACCGGGAGTCGTAAAGCC
GO	22915(TGA)	22915Fw_IF	CGCGGACTGCGCATCATGGTACCTTCAAGGAGAATCCTC G
22915Rv_IF	CCACGGAGCACTAGTTCACAAACCACTGCGATCGCC
22915Rv His	GTGGTGGTGGTGGTGGTGCAAACCACTGCGATCGCCAA
cbh1vector 終止コドン導入	cbh1_ter_inv_TAA	TAAACTAGTGCTCCGTGGCGAAAGC
cbh1_ter_inv_TG A	TGAACTAGTGCTCCGTGGCGAAAGC
cbh1_ter_inv_TAG	TAGACTAGTGCTCCGTGGCGAAAGC
図 2.3 T. reesei 内在性リグニン分解酵素発現力セットの構築

(cbh1terminater は In-Fusion の相同配列を示すため異なる色で示した)

##### 2.1.3.6 DNA のシークエンシング

シークエンシング反応用 DTCS Kit (BECKMAN)およびマルチキャピラリーDNA 解析システム CEQ2000TMXL DNA Analysis System (BECKMAN)を用いて行った。また、使用したシーケンシングプライマーは、seq-cbh1U2 (5'-GCACTGAACAGGCAAAAGATTGAGTTG-3'), seq-cbh1dr (5'-GTCATGATACGGGCTCACCAAGA-3')である。

###### 2.1.3.7 T. reesei からのゲノム DNA 抽出

項目 2.1.1.5 マイタケ菌からのゲノム DNA の抽出と同様の方法で行った。

##### 2.1.3.8 サザン解析

AlkPhos direct Labelling and CDP-star Detection System (GE Healthcare) を用いて、その取扱い説明書に従って行った。

###### 2.1.3.9 T. reesei からの RNA 抽出

① 各条件で回収した菌糸 50 mg を液体窒素で凍結しマイクロチューブに入れた。
② $ 700 \mu L $ の水飽和フェノールを添加した。

③ $ 700 \mu L $ の TES を添加した。

④ ジルコニアビーズを 500 mg 添加した。

⑤ $ 65^{\circ} $ Cで15分間激しく振盪した。

⑥ 氷上で 2 分間静置した。

⑦ 15000 rpm、10 min、4℃で遠心分離した。

⑧ 上清 200 μL を新しいチューブに回収し、TRISOL LS を 750 μL 添加した。

⑨ 激しく攪拌し、室温で 5 分静置した。

⑩ 200 μL のクロロホルムを添加した。

⑪ よく 混ぜたのち、15000 rpm、5 min、4℃で遠心分離した。

⑫ 上清 $ 600 \mu L $ を新しいチューブに回収し、 $ 360 \mu L $ のエタノールを添加した。

⑬ RNA spin Mini（GE ヘルスケア）のシリカカラムにて精製した。

###### 2.1.3.10 T. reesei RNA からの cDNA 合成および qRT-PCR

cDNA 合成は、Transcriptional First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche) を用い、付属の説明書に従った。qRT-PCR は、LightCycler 480 SYBR Green I Master (Roche) および Light Cycler 480 システムを用いて行った。また、各遺伝子增幅用のプライマーは以下の表 2.9 に示した。

表 2.9 T. reesei qRT-PCR 用プライマー

遺伝子名	プライマ一名	配列(5'→3')
Vpl2-V	qPCR Vpl2-V Fw	AGACGAACTTTCCGCCAAC
qPCR Vpl2-V Rv	CTGGATCAAGTCGCCAAAAG
Vpl2-L	qPCR Vpl2-L Fw	CGAACTTTCACGCCAACATC
qPCR Vpl2-L Rv	TGAAGTCCCCAAATGACACC
Vpl2-Mn	qPCR Vpl2-Mn Fw	TCGCGGAAATCGAGACTAAC
qPCR Vpl2-Mn Rv	ACCGGCAAACTGGATGAAG
MnP3B	qPCR MnP3B Fw	AACCAAGCCAGCTCCAATC
qPCR MnP3B Rv	CACTTCAGAGCAATCCACCATC
LCC31	qPCR LCC31 Fw	GCACAATGCTCAAGACAACG
qPCR LCC31 Rv	AACAAAAGCAGGTCCGTCAG
54239	qPCR 54239 Fw	TCTACGGCCCCATTTTCATC
qPCR 54239 Rv	ATCATGGCAGCAACATCGAG
cbh1	qPCR cbh1 Fw	CTTGGCAACGAGTTCTCTT
qPCR cbh1 Rv	TGTTGGTGGGATACTTGCT
cbh2	qPCR cbh2 Fw	CGTCAATTGTCGTGGAA
qPCR cbh2 Rv	ACTGAGCATTGGCACACTT
egl1	qPCR egl1 Fw	CGGCTACAAAAGCTACTACG
遺伝子名	プライマ一名	配列 (5'→3')
qPCR egl1 Rv	CTGGTACTTGCGGGTGAT
xyn1	qPCR xyn1 Fw	GGTTGACGACTGGATCT
qPCR xyn1 Rv	GGTTGTCCTCCATGATGTAG
act1	qPCR act1 Fw	AATACCGCGCTCACGTCTTC
qPCR act1 Rv	TCGTCTCGTTGCTGGATCTC

##### 2.1.3.11 蔭菌床糖化実験

5％ バイオマス(90 日保管廃菌床)、5 mg セルラーゼ/g-バイオマス、50 mM 酢酸緩衝液(pH 5.0)を 2 mL の反応系、50℃で反応させ 24 時間と 48 時間でサンプリングを行った。セルラーゼは PC-3-7 培養上清を用いた。

糖化反応におけるセルラーゼへの添加効果を解析するために市販の各種酵素を 2.5 mg/g-バイオマスで添加した。使用した酵素は Rhus vernicifera 由来 Loccase、Phanerochaete chrysosporium 由来 manganese peroxidase、Aspergillus niger 由来 Hemicellulase（いずれも sigma）を用いた。

##### 2.1.3.12 Laccase プレート活性測定

0.1 % ABTS (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid))、1 % p-ヒドロキシ安息香酸、1% Agarose、50 mM 酢酸緩衝液 (pH 5.0) を含んだ寒天培地上に培養上清をスポットし、Laccase 活性によって観察される緑色の呈色を観察した。

##### 2.1.3.13 タンパク質定量方法

Quick Start $ ^{™} $ Bradford Protein Assay Kit (BIO-RAD)を用いて説明書に従って行った。検量線はBovine Gamma Globulin (BGG)を基準として作成し、試料のタンパク質濃度を算出した。

##### 2.1.3.14 SDS-PAGE

Molecular Cloning 4^{th} edition（Green MR and Sambrook J, 2012）に従い行った。銀染色は銀染色 MS キット(Wako)を用いプロトコールに従った。

##### 2.1.3.15 CMCase 活性测定

50 mM 酢酸バッファー（pH 5.0）に融解した 1% carboxymethyl cellulose (CMC) を基質として 50℃ で反応を行い、生成した還元糖を Somogyi-Nelson 法により測定した。反応 1 分間に 1 μmol の還元末端を遊離する酵素量を 1 U とした。

##### 2.1.3.16 Somogyi-Nelson 法による還元糖の定量

① CMC 分解反応液 500 μL に Somogyi 液 $ ^{*} $ を 500 μL 加え、よく混ぜたのち 15 分間煮沸した。

② 氷上で 5 分以上冷却した。

③ 500 μL の Nelson 液**を加え、よく 混ぜたのち 1 mL の 純水を添加した。

④ 3000 rpm、25℃、10分間遠心分離した。
⑤ 上清の波長 520 nm を測定した。

⑥ D-グルコースを還元糖のスタンダードとして作製した検量線より生成還元糖量を算出した。

## $ ^{*} $ Somogyi 液 I

① 無水硫酸ナトリウム 144 g を熱水 400 mL に溶解

② 酒石酸ナトリウムカリウム四水和物 12 g、炭酸ナトリウム 24 g、炭酸水素ナトリウム 16 g を 400 mL 以下の熱水に溶解

③ ①と②を混合し、800 mL にメスアップ

$ ^{*} $ Somogyi 液Ⅱ

①無水硫酸ナトリウム 36 g、硫酸銅五水和物 4 g を熱水に溶解し、200 mL にメスアップした。

*Somogyi 液 I と II を 4：1 で混合して Somogyi 液とした。

## **Nelson 液

① 熱水に七モリブデン酸六アンモニウム四水和物 50 g を溶解した。

② 50℃まで放冷した。

③ 硫酸 42 mL 添加した。

④ 40℃まで放冷した。

⑤ 予め 50 mL の純水に溶解しておいた 6 g ヒ酸水素ナトリウムを全量添加した。

⑥ 遮光瓶で保存した。

##### 2.1.3.17 Xylanase 活性测定

xylan 基質溶液は beechwood (ブナ)由来 xylan を 3%(w/v)になるように量り取り適当量の水を加え、沸騰水中で 3 分間保温しながら攪拌し可能な限り溶解させた。その後水でメスアップし、遠心して得られた上清を 3% xylan 溶液として用いた。

反応は 50 mM 酢酸緩衝液(pH 5.0)、50℃で行った。反応停止には反応系の 1/10 量の NaOH を加え生成したキシロースは DNS 法によって測定した。反応 1 分間に 1 μmol のキシロースを遊離する酵素量を 1 U とした。

##### 2.1.3.18 DNS 法による還元糖の定量

① Xylan 分解液 200 μL に DNS 液 $ ^{*} $ を 400 μL 添加し、氷上に静置した。

② 室温に戻した。

③ 5 分煮沸した。

④ 純水を 1.8 mL 添加した。

⑤ 室温で 10 分静置した。

⑥ 波長 540 nm を測定した。

⑦ D-グルコースを還元糖のスタンダードとして作製した検量線より生成還元糖量を算出した。

$ ^{*} $ DNS 液
0.5 M NaOH 240 mL にジニトロサリチル酸 1.5 g、酒石酸ナトリウムカリウム 4 水和物 90 g を溶解し、300 mL にメスアップした。

##### 2.1.3.19 Cellobiase 活性测定

cellobiase 活性測定は 100 mM 酢酸バッファー(pH 5.0) 中で 20 mM cellobiose を基質として 50℃ で反応させ、生成グルコース量を Glucose C II Kit (Wako) を用いて測定した。D-グルコースをスタンダードとして作製した検量線より生成グルコース量を算出した。反応 1 分間に 1 μmol の cellobiose を加水分解する酵素量を 1 U とした。

##### 2.1.3.20 Laccase 活性测定

Laccase や他のリグニン分解酵素は温度調節機能付き分光光度計 日立 U-2000 を使用して酵素によって酸化された基質の吸光度上昇を測定することで算出した。反応液はキュベット内で混合し、そのまま反応させ吸光度の上昇を計測した。Laccase 活性は 2,6-dimethoxyphenol (2,6-DMP) または ABTS(2-2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid) を基質として用いた。

###### 2.1.3.20.1 2,6-DMP を用いた方法

① 0.5 mL 酵素抽出液、0.5 mL 50 mM マロン酸 Na バッファー(pH 4.5)をキュベット内で混合した。

② $ 60^{\circ} $ Cで5 min 保温した。

③ 0.5 mL 3 mM 2,6-DMP 添加した。

④ $ 60^{\circ} $ C 15 min 470 nm の吸光度を測定した。

⑤ 吸光度增加から吸光度増加から酸化された基質量を計算し活性を算出した。

反応 1 分間で 1 μmol の 2,6-DMP 酸化に必要な酵素量を 1 U とした。

$$ \mathrm{U}/\mathrm{L} = (\Delta\mathrm{A}_{470} \times V \times 10^{6}) / (\varepsilon \times \min \times E) $$

ε: モル吸光計数 $ (\mathbf{M}^{-1} \cdot \mathbf{c}\mathbf{m}^{-1}) $ V : 反応系の総量 (L) E : 酵素液量 (L)

min: 反応時間 (min)

###### 2.1.3.20.2 ABTS を用いた方法

① 850 μL 50 mM 酢酸バッファー (pH4.5)、100 μL 10mM ABTS をキュベット内で混合した。

② $ 60^{\circ} $ Cで5 min 保温した。

③ $ 50 \mu L $ 酵素液添加した。

④ $ 60^{\circ} $ C 1 min 420 nm の吸光度を測定した。

⑤吸光度增加から酸化された基質量を計算し活性を算出した。

1 分間の反応で 1 μmol の ABTS 酸化に必要な酵素量を 1 U とした。

$$ \mathrm{U}/\mathrm{L}=(\Delta\mathrm{A}_{420}\times V\times10^{6})/(\varepsilon\times min\times E) $$

V: 反応系の総量 (L) E: 酵素液量 (L) min: 反応時間 (min)

菌床抽出酵素液以外のラッカーゼ活性はより鋭敏な呈色試薬である ABTS を基質として用いた。

##### 2.1.3.21 MnP 活性测定
① 0.5 mL 酵素液、0.25 mL 6 mM MnSO_{4} キュベット内で混合した。

② $ 60^{\circ} $ C 5 min 保温した。

③ 3 mM 2,6-DMP を 0.5 mL 添加した。

④ $ 1.2\ mM\ H_{2}O_{2} $ を $ 0.25\ mL $ 添加（反応開始）した。

⑤ $ 60^{\circ} $ C 1 min 470 nm 吸光度を測定した。

⑥ 吸光度增加から酸化された基質量を計算し活性を算出した。

菌床抽出酵素液の場合ラッカーゼと同一基質を使用しているためラッカーゼによる吸光度上昇を差し引いて MnP 活性を求めた。菌床抽出酵素液以外は活性に応じて反応時間を延ばし、1 分当たりの吸光度上昇を算出した。

$$ \mathrm{U}/\mathrm{L}=(\Delta\mathrm{A}_{470}\times V\times10^{6})/(\varepsilon\times min\times E) $$

ε: モル吸光計数 $ \left(M^{-1} \cdot cm^{-1}\right) $ V：反応系の総量 (L) E: 酵素液量 (L)

min: 反応時間 (min)

ΔA_{470}:ラッカーゼ活性測定で求めた吸光度の上昇をMnPによる測定値から差し引いた

##### 2.1.3.22 LiP 活性测定

lignin peroxidase 活性は終濃度が 16 mM のベラトリルアルコール、50 mM 酒石酸 Na バッファー(pH3.0)、0.4 mM $ H_{2}O_{2} $ および試料からなる総量 1.5 mL の反応系で 37℃ で 310 nm における吸光度増加を測定し、生成物のベラトリルアルデヒドのモル吸光係数 $ 9,3000 M^{-1} \cdot cm^{-1} $ を用いて酵素活性を算出した。

### 2.2 棗菌床糖化溶液からの DOI 発酵高生産組換え大腸菌の開発

2.2.1 進化工学的改変による高活性型 DOI 合成酵素の取得・利用

2.2.1.1 DOI の定量

###### 2.2.1.1.1 DOI のオキシム化

DOI は紫外可視検出が困難であり、水溶液中ではハイドロ型とケト型の 2 つのフォームをとることから、ケト型を ortho-4- Nitrobenzylhydroxylamine Hydrochloride 溶液(以下、NBHA)(TCI-ACE)で誘導化後、HPLC で分離し、紫外可視検出を行う。フラスコ培養では 40 mg/ml、ジャーファーメンター培養では 55 mg/ml の NBHA 溶液を調製して使用した。

① 1.5 ml チューブに、DW 90 μl、HPLC 用 Methanol (Wako) 100 μl、培養上清 10 μl、NBHA 20 μl を入れボルテックスし、スピンダウンした。

② $ 60^{\circ} $ C で 1 h オキシム化反応した。

③ 室温で 5 min 静置し、ボルテックスしてスピンダウンした。

④ 55℃ の条件下で、減圧濃縮遠心機 (EYELA Centrifugal Evaporator CVE-3100) によりサンプルを乾固した。

###### 2.2.1.1.2 HPLC による DOI 量の測定

使用機器

オートサンプラ SIL-20AHT (SHIMADZU)

$$ オンライン脱気ユニット \qquad D6U-20A_{3}(SHIMADZU) $$
UV-VIS 送出器 SPD-20A (SHIMADZU)

送液コニット LC-20AD (SHIMADZU)

カラムオーブン CTO-20A (SHIMADZU)

超音波洗净器 AU-25C (Aiwa)

使用カラム Kinetex 2.6u XB-C18 100A (Phenomenex)

## 测定条件

溶離液 15% Methanol 水溶液

流速 0.7 ml/min

オーブン温度 40℃

波長 262 nm

① 乾固させたサンプルに HPLC 用 Methanol 200 μl を加え、超音波でサンプルを溶解した。

② 超音波洗净器でサンプルを 5 min 脱気処理した。

③ 15,000 rpm (Max) で 2 min 遠心した。

④ 上清を $ 2\mu l $ 、HPLC にインジェクトした。

##### 2.2.1.2 Glucose の定量方法

D-Glucose (GOPOD) Assay Kit (Megazyme) の手順に従い、測定した。

① サンプルを DW で 100 倍に希釈した。

② 1.5 ml チューブに、GOPOD 375 μl、DW 15 μl、サンプル 10 μl を入れ懸濁し、スピンダウンした。

③ $ 45^{\circ}C $ で 20 min インキュベートした。

④ 常温になるまで静置し、再度懸濁してスピンダウンした。

⑤ 96 穴マイクロプレート (CORNING) に 300 μl 入れ、プレートリーダー (TECAN) を用いて吸光度 510 nm で測定した。

##### 2.2.1.3 Mannitol の定量方法

D-Mannitol/L-Arabitol Assay Kit (Megazyme) の手順に従い、測定した。

① サンプルを DW で 100 倍に希釈した。

② 96 穴マイクロプレートに、DW 200 μl、サンプル 10 μl、Buffer 10 μl、NAD⁺ 10 μl を入れ、マイクロプレートミキサー（SCINICS）で懸濁した。

③ 室温で 2 min 静置した。

④ ManDH 2 μl を加え、マイクロプレートミキサーで懸濁した。

⑤ 室温で 5 min 静置した。

⑥ プレートリーダーを用いて吸光度 340 nm で測定した。

##### 2.2.1.4 OD の測定方法
サンプルを 10 倍〜200 倍まで状況にあわせて希釈し、菌体濁度を分光光度計 Ultrospec 6300 pro (Amersham Biosciences) を用いて OD600 を測定した。希釈は DW で行った。

##### 2.2.1.5 大腸菌のエレクトロポレーション法による形質転換

###### 2.2.1.5.1 エレクトロポレーション用コンピテントセルの作製

① 500 ml バッフルフラスコに LB 培地 50 ml を入れ、抗生物質として Zeocin (最終濃度 20 μg/ml), Kanamycin (最終濃度 20 μg/ml), Streptomycin (最終濃度 20 μg/ml) を添加した。

② 大腸菌を植菌し、37℃, 120 rpm で 18 h 培養した。

③ 新しい 500 ml バッフルフラスコに LB 培地 50 ml を入れ、初期 $ OD_{600}=0.1 $ になるように植菌し、37℃, 120 rpm で $ OD_{600}=0.6 $ 辺りになるまで 3 h 程培養した。

④ クリーンベンチであらかじめ冷やしておいた 50 ml チューブに移し、2,000 g、15 min 遠心した。

⑤ ice cold DW 50 ml で 3 回、2,000 g、15 min 遠心し、洗浄した。

⑥ ice cold 10% Gly 50 ml で 2 回、2,000 G、15 min 遠心し、洗浄した。

⑦ 最後の遠心後、上清をきれいに捨て $ 200 \mu l $ の 10% Gly で懸濁した。

⑧ 20 μl ずつ 1.5 ml チューブに分注し、-80℃ で保存した。

###### 2.2.1.5.2 エレクトロポレーションによる形質転換

## 使用機器

Gene Palser Xcell (BIO-RAD)

1 mm Cuvette (BIO-RAD)

エレクトロポレーションの条件

Voltage 1,800 V

Capacitance 25 $ \mu $ F

Resistance 200 $ \Omega $

① エレクトロポレーション用コンピテントセル 20 μl にプラスミド 1 μl を加え軽くピペッティングした。

② あらかじめ冷やしておいたキュベットに全量移し、氷中で 5 min インキュベートした。

③ Gene Palser Xcell のポッドにキュベットを入れ、電気パルスを与えたら、すかさず LB 培地 980 μl 入れ、37℃ で 45 min インキュベートした。

④ 最終濃度が 2,000 倍になるように希釈し、LB/Amp (100 μg/ml) プレートに 100 μl プレーティングし、30℃ で 24 h 静置培養した。

##### 2.2.1.6 大腸菌の塩化カルシウム法による形質転換

2.2.1.6.1 ケミカルコンピテントセルの作製

① グリセロールストックされた GI724 Δpzp 株を LB 培地 5 ml に植菌し、37℃で一晩振蕩培養した。

② 一晩振蕩培養した前培養液を SOB 培地 200 ml (500 ml 羽根付きフラスコ)に OD600 が 0.1 になるよ
うに植菌し、 $ 16^{\circ} $ Cで培養した。

③ OD600 が 0.3-0.7 になった時点で回収、フラスコを氷上で 15 min 冷却した。

④ 冷却した培養液を 50 ml チューブ 4 本へ移し、2,000 G で 5min 遠心後、上清をのぞき TB (OD600=0.3 なら 3 ml、0.5 なら 4 ml、0.7 なら 5 ml) を加え、緩やかに懸濁した。

⑤ 4 本のチューブを 1 本にまとめ、2,000 G で 5 min 遠心、上清を除いた後、TB(OD600=0.3 なら 3 ml、0.5～0.7 なら 4 ml)を加え緩やかに懸濁した。

⑥ Dimethyl Sulfoxide (DMSO) (Wako)を7%になるように加え、氷上で10 min 放置した。冷却した1.5 ml チューブに100 μl ずつ分注し、-80℃で保存した。

###### 2.2.1.6.2 ケミカルコンピテントセルへの形質転換

① 氷上で融解させたケミカルコンピテントセル(GI724 Δpzp 株) 100 μl に Plasmid を 0.2 μl 加えた。

② 軽くピペッティングし、氷中で10 min静置した。

③ $ 42^{\circ}C $ で 1 min ヒートショックを行い、すぐに氷中に戻し、2 min 放置した。

④ SOB 培地を 900 μl 加え、37℃で 45 min 振とう培養した。

⑤ RM プレート(2% Casamino Acids (DIFCO), 1 mM MgCl₂, M9 Salts (15% Na₂HPO₄·12H₂O (Wako), 3% KH₂PO₄ (Wako), 1% NH₄Cl (Wako), 0.5% NaCl (Wako)), Ampicilim 100 μg/ml、Kanamycin 20 μg/ml、Streptomycin 20 μg/ml、Zeocin 20 μg/ml) に滅菌蒸留水 (DW) で 10 倍希釈した培養液を 100 μl 塗布し 30℃ で 24 h 静置培養した。

##### 2.2.1.7 変異遺伝子ライブラリーの構築

① P_{L} プロモーターを取り除いた pLEX plasmid (Invitrogen) に gadA プロモーターを結合させたプラスミド（ $ \Delta P_{L}/pLEX $ ）を作製した。

② 野生型 DOI 合成酵素（btrC）遺伝子をテンプレートとして、 $ Mn^{2+} $ 存在下で PCR を行い、野生型 DOI 合成酵素（btrC）遺伝子にランダムに変異を導入した。ランダム変異導入条件は、0.25mM $ Mn^{2+} $ または 0.5mM $ Mn^{2+} $ 存在下で PCR を行った。

$$ \begin{aligned}&10\times PCR buffer(70mM MgCl_{2},500mM KCl,100mM Tris-HCl(pH8.3))\\&10\times dNTPs(2mM dGTP,2mM dATP,10mM dCTP,10mM dTTP)EX taq polymerase(TAKARA)\\&PCR 条件 :94℃2m30s,(94℃20s,50℃25s,72℃1m10s)\times30,72℃3m\\ \end{aligned} $$

③ 得られた PCR 反応物をフェノール/クロロホルムで処理し、遠心後、上清をエタノール沈殿して、DNA 画分を回収した。

④ $ \Delta P_{L}/pLEX $ と DNA 断片を結合させ、ケミカルコンピテントセルへ形質転換し、変異株ライブラリーを構築した。

##### 2.2.1.8 1 次スクリーニング

① 変異型 DOI 合成酵素遺伝子ライブラリーをグルコース-6-リン酸高蓄積株
GI724Δpgi* [F,λ^{-},lacI^{q},lacPL8,ampC::PtrpcI,mcrA,mcrB,INV(rnnD-rnnE),Δpgi::Km^{r}] 株にエレクトロポレーション法で形質転換した。

② 得られたクローンをディープウェルプレート 96well 丸底で、30℃で 24 時間振とうし、前培養を行った。

③ 前培養液を培地の入ったディープウェルプレート 96well 丸底に植菌し、30℃で 15 時間振とうし、本培養を行った。培養後、培養上清を回収し、DOI の生産性を検証した。

##### 2.2.1.9 2 次スクリーニング

① 1 次スクリーニングの結果得られた候補株を、試験管で前培養を行った。

② 本培養は、初期濁度が OD600=0.1 になるように三角フラスコに植菌後、30℃で培養し、培養開始後 0, 12, 24, 36 時間の菌体濁度、グルコース濃度、DOI 濃度の測定を行った。

##### 2.2.1.10 3 次スクリーニング

① 氷上で融解させたケミカルコンピテントセル (GI724 Δpzp [F,λ^{-}lacI^{q},lacPL8,ampC::PtrpcI,mcrA,mcrB,INV(rnnD-rnnE),Δpgi::Km^{r},Δzwf::Zeor^{r},Δpgm::Spm^{r}]株) 100 μl に 2 次スクリーニングより得られた候補株の有する Plasmid を 0.2 μl 加えた。

② 軽くピペッティングし、氷中で10 min静置。

③ 42℃で1 min ヒートショックを行い、すぐに氷中に戻し、2 min 放置した。

④ SOB 培地を 900 μl 加え、37℃で 45 min 振蕩培養した。

⑤ RM プレート (Amp 100 μg/ml、KM 20 μg/ml、SM 20 μg/ml、Zeo 20 μg/ml) に滅菌蒸留水 (DW) で 10 倍希釈した培養液を 100 μl 塗布し 30℃ で 24 h 静置培養した。

⑥ 試験管に RMM (Amp 100 μg/ml、KM 20 μg/ml、SM 20 μg/ml、Zeo 20 μg/ml) 3 ml を分注し、滅菌済みの爪楊枝で培養プレートからシングルコロニーをつつき、植菌した。

⑦ $ 30^{\circ} $ Cで24 h、170 rpmで振蕩培養した。

⑧ 500 ml のバッフルフラスコに 2×YT 培地 (3 次スクリーニング用) を 48 ml 分注した。

⑨ 前培養液の菌体濁度を測定し、本培培地に加える菌体量が OD600=0.1 となるよう計算した培養液量を 1.5 ml チューブに分注し、2,000 G で 5 min 遠心した。

⑩ 遠心後に上清を取り除き、バッフルフラスコに分注した本培培地で懸濁し培地に加えた。

⑪ 30℃、120 rpm で回転振盪培養し、OD600 が 0.5 付近になった時点で 50% Glucose を 2 ml （最終濃度 2%）加え、この時間を 0 h として 12 h ごとにサンプリングした。

##### 2.2.1.11 His-Tag 組換え蛋白質の生産・精製

① 試験管に LB/Amp 培地 (200 μg/ml) 3 ml を分注し、プレートからシングルコロニーを爪楊枝でつつき植菌、37℃で 12 h-14 h 振盪培養した。

② 培養液を初期 OD600=0.1 になるように計算し、バッフルフラスコに分注した 50 ml LB/Amp 培地に直接植菌した。

③ 37℃で回転振蕩培養し、OD600=0.5-0.6になった時点で1 M IPTGを25 μl（最終濃度0.5 mM）添加し、さらに4 h培養した。
④ 培養液を 50 ml チューブに移し、4,000 g で 5 min 遠心した。

※ここからはすべて氷中で操作した。

⑤ 上清を捨て、Lysis Buffer (50 mM Phosphate Buffer (pH7.7), 300 mM NaCl, 0.2 mM $ CoCl_{2} \cdot 6H_{2}O $ ) を 10 ml 加え Vortex し、4,000 g で 5 min 遠心した。

⑥ 上清を捨て、Lysis Buffer を 10 ml 加え Vortex した後、超音波ホモジナイザー(EYELA VC-750)で菌体破砕した。

## $ ^{*} $ 破碎条件

Amplitude : 30%

Timer : 30 sec

Pulser : ON 1 sec OFF 1 sec

⑦ 10,000 G で 10 min 遠心し、上清を 15 ml チューブに移した。

⑧ Ni-NTA Agarose (QIAGEN)を1サンプルにつき50μl量（Lysis Bufferで洗浄前の原液換算量）加え、水中に寝かせ、2h緩やかにshakingした。

⑨ 1,000 g で 1 min 遠心し、アスピレーターを用いて 1 ml 程度まで上清を除いた。

⑩ 沈殿した Ni-NTA Agarose と上清を懸濁し、1.5 ml チューブに移した。

⑪ 1,000 g で 1 min 遠心し、上清を捨て Wash Buffer (50 mM Phosphate Buffer (pH7.7), 30 mM Imidazole (nacalai tesque), 0.2 mM CoCl₂ · 6H₂O) を 800 μl 加えた。

⑫ 軽くピペッティングし、1,000 G で 1 min 遠心した。

⑬ 上清を綺麗に取り除き、Elution Buffer (50 mM Phosphate Buffer (pH7.7), 200 mM Imidazole (nacalai tesque), 0.2 mM $ CoCl_{2} \cdot 6H_{2}O $ ) を 400 μl 加えた。

⑭ 軽く混和し、5 min 放置した。

⑮ 10,000 g で 2 min 遠心後、上清を新しい 1.5 ml チューブへ移した。

##### 2.2.1.12 in vitro DOI 合成酵素活性测定

① 氷中で、BtrC 酵素反応液を以下の系で調整した。

反応系

G6P Buffer (100 mM Phosphate Buffer (pH7.7), 0.4 mM CoCl_{2} · 6H_{2}O) 10 $ \mu $ l

G6P Solution (0.25, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 10, 20 mM) 10 $ \mu $ l

50 mM β-NAD $ ^{+} $ 10 μl

精製 BtrC 酵素 X $ \mu $ l (10 $ \mu $ g)

Elution Buffer (2.2.1.11 記載) 70-X $ \mu $ l

計

100 μl

② 調整したサンプルを $ 46^{\circ} $ C で 5 min 反応させ、素早く氷中に戻した。

③ 1.5 ml チューブへ滅菌蒸留水(DW) 50 μl、BtrC 酵素反応液 50 μl、Methanol (HPLC grade) (Wako) 100 μl、NBHA (10 mg/ml) 20 μl を入れ Vortex した。

④ 60℃でオキシム化反応を1 h行い、減圧濃縮遠心機 (EYELA Centrifugal Evaporator CVE-3100)により
乾固させた。

⑤ 乾固させたサンプルに Methanol を 200 μl 加え、超音波破碎により溶解させた。

⑥ 15,000 rpm で 3 min 遠心後、上清 120 μl をバイアルに移し、HPLC により DOI を定量し、DOI 合成酵素活性、また Lineweaver-Burk plot で Km、Kcat を算出した。

#### 2.2.2 DOI 合成酵素の高安定化

##### 2.2.2.1 組換え蛋白質の生産・精製

① btrC 蛋白質、btrC2 蛋白質生産用プラスミドを大腸菌 DH5α に形質転換した。

② 以下、2.2.1.11 His-Tag 組換え蛋白質の生産・精製を参照。

##### 2.2.2.2 in vitro DOI 合成酵素活性测定

2.2.1.12 in vitro DOI 合成酵素活性测定を参照。

#### 2.2.3 DOI 合成酵素基質グルコース-6-P (G6P) の蓄積速度の強化

DOI、グルコース、マンニトール、菌体濁度の測定及び定量は、2.2.1.1-2.2.1.3を参照。

##### 2.2.3.1 グルコース-6-リン酸測定

① 培養液を OD600=1.4 になるように DW で希釈し、1 ml を 1.5 ml チューブへ移した。

② Max で 2 min 遠心して上清を捨てた。

③ DW で wash し、Max で 2 min 遠心した(3 回繰り返した)。

④ Pellet に DW100 μl を入れた。

⑤ チューブを氷上に移し、 $ 5M\ HClO_{4} $ を $ 50\ \mu l $ 入れ懸濁した。

⑥ 2.5M K₂CO₃を100μl入れ懸濁した。

⑦ Max で 10 min 冷却遠心を行い、上清を assay に用いた。

⑧ Assay を行うため、上清 80 μl と G6P 測定 buffer (0.15M ニトリロトリエタノールアミン塩酸塩 buffer(pH.7.6), 100mM KCl, 10mM MgSO₄, 2mM NADP) 160 μl を混合した。

⑨ 0.15 mg/ml グルコース-6-リン酸脱水素酵素を 10 μl 入れ、37℃で 20 min 反応させた。

⑩ Ultrospec 6300 pro UV/Visible Spectrophotometer (Amerham Biosciences) で OD 450 nm を測定した。

##### 2.2.3.2 DOI 生產試驗培養

① 試験管に RMM 培地 3 ml を入れ、グリセロールストックから植菌した。30℃で 24 h 培養し、これを前培養とした。

② 2×YT 培地 50ml (500ml バッフル) に OD600=0.1 になるよう計算し、必要な前培養液量を 1.5 ml チューブに移した。

③ 2,000 g で 10 min 遠心した後、上清を除去して 2×YT 培地 50 ml に植菌した。

④ 植菌した培養液から 1.2 ml 採取する。これを 0 h のサンプルとし、72 h まで 12 h ごとにサンプリングを行った。

⑤ 菌体測定はそれぞれの時間でサンプルを採取した後すぐに行った。
⑥ G6P 測定用とウェスタン用サンプルの調整のため、培養液 1.2 ml から新しい 1.5 ml チューブに 500 μl を移した。

⑦ 残り 700 μl を菌体測定終了後に採取したサンプルを 15,000 rpm で 5 min 遠心した。

⑧ DOI 測定用に上清 400 μl を別のチューブへ移し、1N HCl で pH を 3 前後になるように加え、4℃ で保存する。マンニトール測定用に上清 200 μl を別のチューブへ移し、-20℃ で冷凍保存した。

#### 2.2.4 DOI 低感受性・耐酸性 DOI 生産宿主の取得・利用

##### 2.2.4.1 DOI の精製

① DOI 含有培養上清液をフィルターペーパーで吸引濾過した。

② 陽イオン交換カラム (アンバーライト 200CT、オルガノ株式会社)、陰イオン交換カラム (アンバーライト IRA96SB、オルガノ株式会社) を繋げ、吸引濾過をした DOI 含有培養上清を通液させ、分画し、DOI 含有フラクションを回収した。

③ DOI 含有フラクションはウォーターバスを $ 40^{\circ} $ C に設定したロータリーエバポレーターを使用し 200 mL 程度になるまで減圧蒸留を行った。

④ 濃縮したフラクションを-20℃で凍結させ、凍結乾燥機を使用して水分が完全に無くなるまで濃縮を行った。

⑤ 濃縮 DOI の重量に対し 1.2 倍量の methanol (以下 MeOH と略す) を加え、濃縮 DOI を溶解させた。

⑥ ウォーターバスを $ 70^{\circ} $ C 程度に設定し、DOI/MeOH 溶液を加温しながら MeOH の 7 倍量の ethanol (以下 EtOH と略す) を 7 mL/min で添加しながら攪拌を行った。

⑦ EtOH を添加後、攪拌しながら 1 日常温で放冷し、DOI の結晶化を行った。

⑧ 粗結晶 DOI をフィルターペーパーで吸引濾過した。

⑨ 粗結晶 DOI を凍結乾燥機 (-40℃、19.4 Pa) で 24 h 凍結乾燥させた。

⑩ 結晶 DOI の純度測定を行った (HPLC による DOI の定量)。

##### 2.2.4.2 大腸菌の対数増殖期における DOI による増殖阻害の検討

① BW25113 株 (Keio collection の野生株) のフリーズストックからミクロスパーテルを用いて LB 固体培地に植菌し、30℃ で一晩、静置培養を行った。

② LB 液体培地 1 mL が入った試験管に前日植菌したプレートから BW25113 株を爪楊枝で植菌し、30℃で 120 rpm、24 h 振盪培養（往復振とう培養機照射式 TA-100L、高崎科学器械株式会社）を行った（前培養）。

③ 前培養液を 10 倍希釈し、分光光度計 (UV/Visible Spectrophotometer Ultrospec 6300、Amersham Biosciences) を用いて濁度 OD600 を測定した。

④ LB 液体培地及び LB/0-6% DOI 含有液体培地 1 mL が入った試験管に前培養液を初期 OD600=0.1 になるように添加し、30℃ で 120 rpm、8 h 振盪培養を行った。

⑤ 培養開始から 8 h まで 1 h 毎に分光光度計を用いて濁度 OD600 を測定し、培養 3 h-7 h の比増殖速度を算出した。

## 《比増殖速度の算出方法》

比增殖速度の公式： $ \mu=\ln\left(\mathrm{X}/\mathrm{X}_{0}\right)/\mathrm{t}-\mathrm{t}_{0} $
$ \mu= $ 比增殖速度、X=细胞濃度、t=時間

DOI 非含有培地において培養開始 3 h の菌体濁度が 1.21、7 h の菌体濁度が 4.66 であった時の比増殖速度は、約 $ 0.34 \left[ \mu = \ln \left( \frac{4.66}{1.21} \right) / 7 - 3 = 0.337 \ldots \right] $ となる。

##### 2.2.4.3 DOI 及び糖濃度、浸透压による増殖阻害の関係性の検討

① BW25113 株をフリーズストックから LB 固体培地にミクロスパーテルを用いて植菌し、30℃で一晩、静置培養を行った。

② LB 液体培地 1 mL が入った深型 96 穴プレート (2.0 ml Pre-Sterlized 96 Square Well Deep Well Plate、Axygen) に前日に植菌したプレートから BW25113 株のシングルコロニーを爪楊枝で植菌した後、CO $ _{2} $ 透過性シール (greiner bio-one、型番：67051) で蓋をし、30℃ で 1,600 rpm、24 h 振盪培養 (invitroshaker Mix-EVR、TAITEC) を行った (前培養)。

③ 前培養液を 10 倍希釈し、マイクロプレートリーダー (infinite M200、TECAN) を用いて OD600 の測定を行った。

④ LB/0-6% DOI 含有液体培地、LB/0-6% Glc 含有液体培地、LB/0-12.7% スクロース含有液体培地 1 ml が入った試験管に前培養液を初期 OD600=0.1 になるように添加し、30℃ で 120 rpm、24 h 振盪培養を行った。

⑤ 培養開始から 24 h 後にマイクロプレートリーダーを用いて OD600 の測定を行った。

《スクロース濃度の計算例》

浸透压の公式： $ \pi=CRT $

C=容量モル濃度、R=気体定数、T=絶対温度

DOI の分子量は 162、スクロースの分子量は 342 である。 $ \pi $ は C に比例するので、DOI 6% 溶液と同じ浸透圧を有するスクロース溶液は、12.7% $ (342 \times 6 / 162 = 12.66\ldots) $ となる。

##### 2.2.4.4 DOI が大腸菌に与える増殖阻害作用の検討

大腸菌の対数増殖期における DOI による増殖阻害の検討 (2.2.4.3) の①～③まで同様の方法で行った。

④ LB 液体培地及び LB/0-6% DOI 含有液体培地 1 ml が入った試験管に前培養液を初期 OD600=0.1 になるように添加し、30℃ で 120 rpm、48 h 振盪培養を行った。

⑤ 培養開始から 48 h まで 12 h 毎に滅菌済みの 1.5 ml チューブに 10 μl、無菌の 1.5 ml チューブに 40 μl のサンプリングを行い、10 μl の培養液で分光光度計を用いて濁度 OD600 を測定した。

⑥ 40 ☐1 の培養液を OD600=1.0 になるよう調製した後、 $ 10^{6} $ 倍まで 10 倍ずつ希釈を行った。

⑦ 細胞懸濁液一種につき LB 固体培地 3 枚に 100 μl ずつプレーティングし、30℃、15 h 静置培養を行った。

⑧ 生育したコロニーを計測し、生菌率を求めた。

##### 2.2.4.5 DOI 耐性及び DOI 感受性関連候補遺伝子のスクリーニングシステムの構築

① BW25113 株をフリーズストックから LB 固体培地にミクロスパーテルを用いて植菌し、30℃で一晩、静置培養を行った。

② LB 液体培地 1 ml が入った深型 96 穴プレートに前日に植菌したプレートから BW25113 株のシング
ルコロニーを爪楊枝で植菌した後、 $ CO_{2} $ 透過性シールで蓋をし、30℃で1,600 rpm、24 h振盪培養を行った（前培養）。

③ 前培養液を 10 倍希釈し、マイクロプレートリーダーを用いて OD600 の測定を行った。

④ LB/0-6% DOI 含有液体培地 1 ml が入った試験管に前培養液を初期 OD600=0.1 になるように添加し、30℃ で 120 rpm、24 h 振盪培養を行った。

⑤ 培養開始から 24 h まで 6 h 毎にマイクロプレートリーダーを用いて OD600 の測定を行った。

##### 2.2.4.6 Keio collection を利用した DOI 耐性及び DOI 感受性関連候補遺伝子の 1 次スクリーニング

① BW25113 株 (Keio collection の野生株) のフリーズストックからミクロスパーテルを用いて LB 固体培地に植菌をし、30℃ で一晩、静置培養を行った。

② Keio collection のフリーズストックから 96 ピンプレート (stem) を用いて LB/Km (20 μg/ml) 固体培地に植菌をし、30℃ で一晩、静置培養を行った。

③ LB 液体培地 1 ml が入った深型 96 穴プレートに前日に植菌したプレートから BW25113 株及び破壊株を爪楊枝で植菌をした後、CO₂ 透過性シールで蓋をし、30℃ で 1,600 rpm、24 h 振盪培養を行った (前培養)。

④ 前培養液を10倍希釈し、マイクロプレートリーダーを用いて濁度OD600を測定した。

⑤ LB 液体培地又は LB/6% DOI 含有液体培地 1 ml が入った試験管に前培養液を初期 OD600=0.1 になるように添加し、30℃ で 120 rpm、12 h 振盪培養を行った。

⑥ 培養開始から 12 h 後にマイクロプレートリーダーを用いて濁度 OD600 を測定した。LB/DOI 0% 培地における野生型株の生育に対し LB/DOI 6% 培地での生育が 80% 以上の生育を示した株を DOI 耐性とし、LB/DOI 0% 培地における野生型株の生育に対し LB/DOI 6% 培地での生育が 20% 以下の生育を示した株を DOI 感受性とした。

##### 2.2.4.7 1 次スクリーニングで選抜した DOI 耐性及び DOI 感受性関連候補遺伝子欠失株の 2 次スクリーニング

① BW25113 株及び 1 次スクリーニングで選出した破壊株のフリーズストックからミクロスパーテルを用いて、BW25113 株は LB 固体培地に、1 次スクリーニングで選出した候補株（10 株）及び rffC とオペロンを形成している遺伝子の欠失株（11 株）は LB/Km（20 μg/ml）固体培地に、植菌して 30℃ で一晩、静置培養を行った。

② LB 液体培地 1 ml が入った深型 96 穴プレートに前日植菌したプレートから BW25113 株及び破壊株を爪楊枝で植菌をした後、CO₂ 透過性シールで蓋をし、30℃ で 1,600 rpm、24 h 振盪培養を行った（前培養）。

③ 前培養液を 10 倍希釈し、分光光度計を用いて濁度 OD600 を測定した。

④ LB 液体培地及び LB/6% DOI 含有液体培地 1 ml が入った試験管に前培養液を初期 OD600=0.1 になるように添加し、30℃ で 120 rpm、24 h 振盪培養を行った。

⑤ 培養開始から 24 h まで 6 h 毎に分光光度計を用いて濁度 OD600 を測定した。

##### 2.2.4.8 酸感受性試験培養