Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
Laccase 発現 T. reesei に関してもその生産性の向上、さらなるリグニン分解能力の付与によって同様の効果が期待でき、セルラーゼ酵素カクテルへ添加することでバイオマス糖化効率の改善が期待される。

糖からの DOI 発酵生産に関する研究では、

① 変異型 DOI 合成酵素ライブラリーより、DOI 生産性を向上させる高活性型 DOI 合成酵素 L214M、W293R、L214M/W293R の取得に成功した。

② 培養液中に高濃度の DOI を生産・蓄積させるためには、DOI 耐性株、少なくとも DOI 低感受性株の開発が必要であったことから、大肠菌の全遺伝子破壊株コレクション(3,823 株)を利用し、DOI 耐性・感受性関連遺伝子の探索を行い、DOI 耐性候補株として $ \Delta argO $ 株、DOI 感受性候補株として $ \Delta rffC $ 株、 $ \Delta gor $ 株を見出した。

③ DOI 安定性について調べ、低温、酸性条件下で安定であることを明らかにし、その性質を考慮して、組換え大腸菌による至適 DOI 発酵生産条件の検討を行い、フラスコレベルでは、温度 27,30,33℃, pH 5.5, 6.0 条件下が至適 DOI 生産条件であること乱した。また、ジャーファーメンター回分培養では、30℃, pH 6.0, 1000 rpm, 5 L/min, HNS 培地, 生育炭素源マンニトール, 初期グルコース濃度 5% の条件において、41.5 g/L/36 h を達成し、これまでに我々が報告していた 29.5 g/L/60 h の DOI 発酵生産効率 (DOI 生産量、発酵生産時間) を大幅に改善することができた。さらに、流加培養法、培養温度シフト、高活性型 DOI 合成酵素の利用により、116.0 g/L/60 h の DOI 発酵生産効率を達成し、100 g/L 以上の実用性の高い生産値が得られた。

上記のように試薬を利用した DOI 発酵生産は高効率化を達成できたが、廃菌床糖化液を原料とした DOI の発酵生産では、生育、糖の取り込み阻害が生じ、DOI 生産効率が減少した。これらは、廃菌床糖化液中に含まれる夾雑物の影響によると考えられ、環境低負荷型糖生産システムの開発（オールバイオプロセス）で記載したリグニン分解能が向上したセルラーゼ酵素カクテルによる廃菌床糖化効率の向上と共に、膜を利用した糖濃縮及び生育・糖取り込み阻害の起因と考えられる夾雑物の除去のステップを導入することにより、廃菌床からの DOI の発酵生産の効率化に繋がると考えられる。また、本研究で開発した DOI 生産組換え大腸菌は、グリセロールの資化性が高く、DOI の発酵生産効率が良かったことから、生育のために利用する炭素源として、廃菌床に少ししか含まれないキシロースの他に、バイオディーゼル製造工程において副生するグリセロール廃液を利活用することにより、より環境負荷低減に貢献する技術へと繋がることが期待できる。

### 5. 参考文献

1) Working Group I Technical Support Unit. 「Climate Change 2013 The Physical Science Basis Summary for Policymakers」. IPCC. October 2013

2）国連気候変動枠組条約第20回締約国会議(COP20) 京都議定書第10回締約国会議(CMP10)等の概要と評価、環境省、2014年12月14日

3) Kakinuma K, Nango E, Kudo F, Matsushima Y, Eguchi T, An expeditious chemo-enzymatic route from glucose to catechol by the use of 2-deoxy-scyllo-inosose synthase, (2000), Tetrahedron Letters, 41, 1935–1938

4) Hansen CA, Frost JW, Deoxygenation of polyhydroxybenzenes: an alternative strategy for the benzene-free synthesis of aromatic chemicals, (2002) J Am Chem Soc., 124, 5926-7
cellulase hyperproduction by the fungus Trichoderma reesei using massively parallel DNA sequencing, (2009), Proc Natl Acad Sci U S A.;10, 16151-16156

20) Nango E, Kumasaka T, Hirayama T, Tanaka N, Eguchi T, Structure of 2-deoxy-scyllo-inosose synthase, a key enzyme in the biosynthesis of 2-deoxystreptamine-containing aminoglycoside antibiotics, in complex with a mechanism-based inhibitor and NAD+, (2008), Proteins, 70, 517-27

21) 高久洋暁、脇坂直樹、高木正道、組換え大腸菌によるバイオマスからの芳香族化合物前駆体2-deoxy-scyllo-inosose (DOI)の高効率発酵生産、(2010)、酵素工学ニュース 63, 23-28

22) Baba T, Ara T, Hasegawa M, Takai Y, Okumura Y, Baba M, Datsenko KA, Tomita M, Wanner BL, Mori H, Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection, (2006), 2, 2006.0008

23) 波多野裕美、武部聡、東慶直、Tanticharonia sakaeratensis の高濃度グルコース耐性・代謝に関するプロテオーム解析、(2011)、Mem. Faculty. B. O. S. T. Kinki University, 28, 95-108

(24) Nandineni MR, Gowrishankar J, Evidence for an arginine exporter encoded by yggA (argO) that is regulated by the LysR-type transcriptional regulator ArgP in Escherichia coli, (2004), J Bacteriol. 186, 3539-46.

(25) Leonardi R, Roach PL, Thiamine biosynthesis in Escherichia coli: in vitro reconstitution of the thiazole synthase activity, (2004), J Biol Chem, 279, 17054-62

26) Davis NK, Greer S, Jones-Mortimer MC, Perham RN, Isolation and mapping of glutathione reductase-negative mutants of Escherichia coli K12, (1982), J Gen Microbiol, 128, 1631-4.

27) 高久洋暁、宮崎達雄、脇坂直樹、鯨坂勝美、高木正道、グリーンバイオケミストリーの最前線 第7章工業的スケールでの製造を目指した 2-deoxy-scyllo-inosose の微生物生産・精製法の開発、(2010)、シーエムシー出版、114-123

### 6. 研究発表

## 論文発表

① 小笠原 渉, 志田 洋介, 「セルラーゼ高生産糸状菌 Trichoderma reesei 日本型系統菌株の開発」, 「バイオマス分解関連酵素研究の最前線」, 株式会社 シーエムシー出版, p216-223(2012)

② 小笠原 渉, 志田 洋介, 「糸状菌 Trichoderma reesei におけるセルラーゼ・ヘミセルラーゼ遺伝子発現機構」, 「バイオマス分解関連酵素研究の最前線」, 株式会社 シーエムシー出版, p20-26(2012)

③ 小笠原 渋, 志田 洋介, 比較ゲノム解析によるセルロース分解微生物「トリコデルマ・リーセイ」日本型系統樹進化の謎の解明とさらなる進化, 化学と生物, 50(8):592-599 (2012)

## 学会発表

① 高久洋暁「組換え大腸菌によるバイオマスからの芳香族化合物前駆体の高効率発酵生産」バイオマス利活用技術に関する討論会、大阪市立大学バイオマス検討会、化学工学会バイオ部会関西・東海地区交流会、大阪市立大学、2012年12月21日

② 小笠原渉「比較ゲノム解析によるセルロース形バイオマス分解微生物の進化と生物戦略の探求」農学におけるバイオマス利用研究フォーラムグループ平成24年度バイオマス利用研究特論Ⅰ、2012年10月26日
③ 小笠原渉「日本型トリコデルマ・リーセイ系統樹進化の謎とさらなる進化」JBA アルコール・バイオマス研究会講演会、東京大学大学院、2013年2月8日

④ 小笠原渉「比較ゲノム解析を基にしたトリコデルマ・リーセイ日本型系統樹のセルラーゼ高生産化の解明と転写制御工学を用いた新たな系統樹進化」日本農芸化学会 2013 年度大会、東北大学、2013 年 3 月 27 日

⑤ 荒学士、脇坂直樹、山崎晴丈、高木正道、高久洋暁「酵母 Pichia pastoris による糖からの芳香族化合物前駆体の高発酵生産」日本生物工学会、神戸、2012 年 10 月 24 日

⑥ 岩澤裕喜、脇坂直樹、山崎晴丈、高木正道、高久洋暁「高活性型2-deoxy-scyllo-inosose (DOI)合成酵素W293Rの改変」日本農芸化学会関東支部2012年度大会、新潟、2012年10月27日

⑦ 竹田美春、佐藤拓、山崎晴丈、高木正道、高久洋暁「高活性型2-deoxy-scyllo-inosose合成酵素の取得」日本農芸化学会関東支部2012年度大会、新潟、2012年10月27日

⑧ 荒学士、脇坂直樹、山崎晴丈、高木正道、高久洋暁「酵母 Pichia pastoris による糖からの芳香族化合物前駆体の高発酵生産」日本農芸化学会関東支部 2012 年度大会、新潟、2012 年 10 月 27 日

⑨ 齊藤耕平、宮内大樹、中村明靖、志田洋介、小笠原渉、高橋優信、山口隆司、若山樹、今田美郎「きのこ廃菌床を対象としたエネルギー回収プロセスの評価」第46回日本水環境学会年会、東京、2012年3月14日

⑩ 齋藤耕平、中村明靖、幡本将史、志田洋介、若山樹、今田美郎、小笠原渉、山口隆司「セルロース系バイオマスを対象とした資源回収プロセスの開発」第42回石油・石油化学討論会、秋田、2012年10月11日

① 岡部陽平、齊藤耕平、中村明靖、志田洋介、小笠原渉、幡本将史、山口隆司、若山樹、今田美郎「きのこ廃菌床を対象とした資源・エネルギー回収プロセスに及ぼす前処理の影響」第30回土木学会関東支部新潟会研究調査発表会、新潟、2012年10月30日

⑫ 志田洋介, Juliano de Oliveira Porciuncula, 新田美貴子, 山口香織、平川英樹, 森一樹, 久原哲, 小笠原涉「セルラーゼ高生産糸状菌 Trichoderma reesei 変異株系統樹の比較ゲノム解析」第7回日本ゲノム微生物学会、滋賀、2013年3月8日

⑬ 小笠原 渉, 志田 洋介, 森 一樹, 久原 哲「比較ゲノム解析を基にしたトリコデルマ・リーセイ日本型系統樹のセルラーゼ高生産化の解明と転写制御工学を用いた新たな系統樹進化」日本農芸化学会 2013 年度大会、宮城、2013 年 3 月 27 日

⑭ Keigo Kojima, Takanori Furukawa, Yosuke Shida, Wataru Ogasawara “Analysis of Lignin Degradation System of Maitake Mushroom (Grifola Frondosa) for Bioconversion of Waste Mushroom Bed to Valuable Chemicals.” The 2nd International GIGAKU Conference in Nagaoka, Niigata, 22th Jun, 2013

⑮ 小島慧吾、古川隆紀、志田洋介、倉橋敦、下田隆史、西堀耕三、山崎晴丈、高久洋暁、小笠原渉「バイオプロセスによる脱リグニン処理を目指したマイタケ廃菌床保管処理中における網羅的遺伝子発現応答解析」生物工学会、広島、2013年9月18日

⑯ 志田洋介「糸状菌 Trichoderma reesei における糖質加水分解酵素遺伝子群の発現制御」第 28 回セルラーゼ研究会、千葉、2014 年 7 月 11 日

⑰ 小笠原渉「セルラーゼ・ヘミセルラーゼ遺伝子発現応答 総論」第 28 回セルラーゼ研究会、千葉、2014 年 7 月 11 日
⑱ Keigo Kojima, Yosuke Shida, Pham Tuan Anh, To Kim Anh, Wataru Ogasawara, “Ligninolytic Enzymes Production Profiling of Phomopsis sp. N7.2 and Its Applications” The 3rd International GIGAKU Conference in Nagaoka, Niigata, 21th Jun, 2014

## ※「国民との科学・技術対話」の実施

1) 「長岡発！低炭素社会実現のための戦略」，平成24年度まちなか大学講座, 長岡（新潟）, 2012年9月15日．約30名

2）「微生物の力を借りた「モノ造り」」、長岡高専 アドバンスコース、2012年11月17日．約40名

3) 「微生物の力を借りた「モノ造り」」、「微生物による糖からの芳香族化合物前駆体の発酵生産」朱鷺メッセバイオマス&エネルギーExpo in 新潟、2012年12月3日．約300名

4）「微生物の力を借りた「モノ造り」」、小山高専 技術科学フロンティア概論、2012年12月17日．約40名

5）「微生物の力を借りた「モノ造り」～バイオマス利活用～」，高度技術者研修，長岡（新潟），2013年2月5日．約30名

6）「日本型トリコデルマ・リーセイ系統樹進化の謎とさらなる進化」JBA アルコール・バイオマス研究会講演会、東京,2013年2月8日．約40名

7）「地球防衛軍（微生物）の未知なるちから」、大学体験講義、2013年7月22日、新潟県立新発田高等学校、24名

8）「地球防衛軍（微生物）の未知なるちから」、高大連携事業特別講義、2013年7月25日、新潟県立柏崎翔洋中等教育学校、46名

9）「人類を支える小さな微生物の大きなちから」、出張講義、2014年6月18日、新潟市立万代高等学校、40名

10）「地域資源を活用した高付加価値生産物の開発」、SSH フェスティバル、2014年11月29日、長野県立飯山北高等学校、150名

11）「糸状菌 Trichoderma reesei のセルラーゼ誘導発現メカニズム」糸状菌分子生物学学会若手の会、仙台、2014年11月14日、50名

### 7. 知的財産権の取得状況

特になし
研究概要図 微生物を利用した地域バイオマスキノコ廃菌床からの化学工業原料生産システムの開発
To enhance the DOI productivity, we attempted 1) improvement in the function of DOI synthase, 2) molecular breeding of DOI producing recombinant E. coli, 3) improvement of DOI productivity by fermentation technological method.

In the screening for DOI synthase mutants with high activity, we obtained three mutants (L214M, W293R, L214M/W293R). These mutants have the DOI synthase with high activity, which enhances the DOI productivity. These mutant enzymes may contribute to enhance the DOI productivity because of shortening the culture time and acceleration of DOI production.

To conduct a practical application of DOI (DOI productivity; 100 g/L and over), DOI-resistant E. coli mutant is required for the high DOI accumulation in culture medium because of the sensitivity of E. coli against DOI. The Keio mutant collection (3,823 mutant strains) was screened for DOI-resistant and -sensitive strains in the 6% DOI containing medium. We obtained $ \Delta argO $ as the DOI-resistant mutant strain and $ \Delta rffC $ , $ \Delta gor $ as the DOI-sensitive candidate mutant strain. The DOI-resistant mutant strain, $ \Delta argO $ , may contribute to accumulate the high concentration of DOI in the culture medium, which leads to enhance the DOI productivity.

To improve the DOI productivity by the control of temperature, pH, aeration and agitation in a jar fermentor, we firstly examined the effects of temperature (0, 20, 35, 50°C) and pH (3.0, 5.0, 7.0, 9.0) on the DOI stability. DOI is stable under low temperature and acidic conditions. Next, Considering the growth temperature conditions of DOI producing recombinant E. coli and the chemical property of DOI, the examination of optimal condition of DOI productivity should perform on the basis of this condition (35°C, pH 5.0). We investigated the effects of temperature (27, 30, 33, 37°C) and pH (5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0) on the DOI productivity of DOI producing recombinant E. coli using 500 ml buffled flasks. We were able to obtain DOI at 27 g/L under the optimum conditions (30 or 33°C, pH 6.0, almost 100% yield). Finally, we examined the DOI productivity by the control of temperature, pH, aeration and agitation in a jar fermentor. We determined the optimal batch culture condition (temperature, 30°C; pH, 6.0; agitation speed, 1,000 rpm; aeration, 5 L/min; growth carbon, mannitol; initial glucose concentration, 5%) and fed-batch culture condition [temperature, 35°C to 28°C; pH, 6.0; agitation speed, 450 rpm; aeration, 10 L/min; feeding medium (250 g Glucose, 250 g Glycerol, 30 g Yeast extract, 470 g H₂O), 0.3 g/min]. Those condition cultures indicate 41.5 g/L/36 h and 116.0 g/L/60 h of DOI productivity, respectively. Especially, fed-batch culture method may be an important contribution because the DOI productivity is over 100 g/L.

In this study, we had problems, which concentrate taeget sugars and remove the growth inhibitor against host E. coli $ \Delta $ pzp for DOI production. Our future research will be focused on the membrane separation technologies, which remove fermentation inhibitors and concentrate effeininly target sugars.
# A-0804 海洋酸性化が石灰化生物に与える影響の実験的研究

（1） $ CO_{2} $ 増加が沿岸底生生物と生態系に及ぼす影響に関する研究

京都大学フィールド科学教育研究センター瀬戸臨海実験所 白山 義久

深見 裕伸

(研究期間中に宮崎大学農学部海洋生物環境学科に異動)

<研究協力者>

京都大学フィールド科学教育研究センター瀬戸臨海実験所 諏訪 僚太

独立行政法人水産総合研究センター西海区水産研究所 鈴木 豪

平成20～22年度 合計予算額 21,300千円（うち、平成22年度予算額 7,500千円）

予算額は、間接経費を含む。

[要旨] 大気中の二酸化炭素（$\mathrm{CO}_{2}$）分圧を削減することが地球温暖化対策として重要であることは論をまたない。$\mathrm{CO}_{2}$が海に溶け込むことで起こる海洋酸性化は、骨格に炭酸カルシウムをもついわゆる石灰化生物にとって特に深刻であると予想されるが、その影響を正しく把握するためには、精密に将来の海水中の$\mathrm{CO}_{2}$分圧を模擬することが可能な実験システムを用いて、石灰化生物を様々な環境下にて飼育し、その影響を明らかにする必要がある。本研究では、海洋酸性化の生物影響を調べることを目的として、将来の海洋表層の$\mathrm{CO}_{2}$分圧を精密に再現できる高精度$\mathrm{CO}_{2}$溶解システムを開発し、$\mathrm{CO}_{2}$分圧の日周変化や海水温上昇、低$\mathrm{CO}_{2}$分圧域を考慮した実験を石灰化生物であるウニ類と造礁サンゴ類を対象として行った。日周及び季節変化を考慮した高$\mathrm{CO}_{2}$分圧環境下で飼育したムラサキウニAnthocidaris crassispinae幼個体の成長は14ヶ月程経過した時点から成長が対象区に比較し低下する長期曝露の影響がみられた。また、$\mathrm{CO}_{2}$分圧の日周変化そのものがバフンウニHemicentrotus pulcherrimusの幼生の体サイズに及ぼす影響を調査した結果、明確な影響は検出されなかった。一方、$\mathrm{CO}_{2}$分圧の日周変化がクシハダミドリイシAcropora hyacinthus幼個体に及ぼす影響を調査したところ日周変化しない高$\mathrm{CO}_{2}$分圧条件よりも骨格重量が低下することが分かった。また、同属のコユビミドリイシA.digitiferra幼個体について海洋酸性化と高海水温の影響を調べた結果、共作用はみられず高海水温条件下においては$\mathrm{CO}_{2}$分圧に関係無く骨格乾重量が増加することが分かった。さらに、産業革命以前の低レベル$\mathrm{CO}_{2}$分圧がバフンウニとムラサキウニ幼生及びコユビミドリイシ幼個体に及ぼす影響を調べた結果、共に成長が増大することが分かり、このことは200年以上前の人間活動が活発になる産業革命以前の海洋環境においては海洋生物の成長がより早かった可能性を示唆する。本実験システムで得られた海洋酸性化の影響を多様な条件下にて調べた結果は、将来の海洋生物への影響をより正確に予測するための材料となる。

[キーワード] 海洋酸性化、 $ CO_{2} $ 、高精度 $ CO_{2} $ 溶解システム、石灰化生物、飼育実験

### 1. はじめに

大気中の二酸化炭素（$\mathrm{CO}_{2}$）濃度を削減することが地球温暖化対策として重要であることは論をまたない。しかし大気中に排出される$\mathrm{CO}_{2}$の削減の必要性は、別の地球環境問題からも極めて重要
である。それが大気 $ CO_{2} $ 濃度の上昇に伴う海洋表層の海水酸性化である（IPCC 2006 $ ^{1} $ ）；Kleypas et al. 2006 $ ^{2} $ ）。海洋酸性化は骨格に炭酸カルシウムをもついわゆる石灰化生物にとって特に深刻であると予想される(Orr et al. 2005 $ ^{3} $ )が、その影響を正しく把握するためには、精密に $ CO_{2} $ 分圧を制御できる実験システムを用いる必要がある。

従来から行われてきた生物への影響査定実験は、コンスタントに現在よりも高いCO₂分圧に調整した空気を実験水槽に供給し、それによって高CO₂分圧でpHが低下した一定条件に海洋生物を暴露することによってその影響を調べてきた(e.g. Shirayama and Thornton 2005⁴)；Michaelidis et al. 2005⁵）。しかしながら、CO₂分圧を一定に高めた実験のみでは海洋酸性化の生物への影響を正しく評価できているとはいえない。なぜならば、例えば実際の海洋ではCO₂分圧は一定ではなく、昼間は植物プランクトンなどが活発に光合成を行い、海水中のCO₂を消費して有機物を生産するため、CO₂分圧は減少し、一方夜間には、植物プランクトンを含めてすべての生物が有機物を分解しCO₂を放出するため、海水中のCO₂分圧は上昇する。CO₂分圧は、日周以外に年変動もすることが分かってきており、たとえば京大瀬戸臨海実験所で観測した結果では、冬季には海水のCO₂分圧は大気中のCO₂の分圧に近いが、夏季には現在の大気CO₂分圧よりは高いCO₂分圧になる（サブテーマ5報告参照）。これは高温条件で海水あるいは海底に存在する有機物が微生物によって盛んに分解されるため、CO₂分圧が高まるためと考えられる。

また、今後は海洋酸性化の進行と共に海水温が上昇することも予測されている（IPCC 2006 $ ^{1} $ ）ので、海洋生物は将来、海洋酸性化のみではなく高海水温と両方の影響を受ける可能性がある。さらには、大気中CO $ _{2} $ 分圧は人間活動が活発になった産業革命以降（約200年前）から増加を始めているため、産業革命以前のCO $ _{2} $ 分圧は現在よりも低く、現在の海は海洋生物にとって既に海洋酸性化状態にある可能性もある。このような状況を勘案すると、これまでのようにCO $ _{2} $ 分圧を一定に高めた実験系のみではなく、日周変化や海水温上昇、そして低CO $ _{2} $ 分圧の条件が生物へ及ぼす影響をも個別に評価して行くことで、将来の海洋酸性化の海洋生態系に対するインパクトを正しく予測することができるといえる。

## 2 ．研究目的

このような現状を背景に、将来の海洋表層の$\mathrm{CO}_{2}$分圧を精密に制御できる飼育システムを用いて、$\mathrm{CO}_{2}$分圧の日周変化や海洋酸性化と水温上昇の共作用、そして低$\mathrm{CO}_{2}$分圧といった様々な環境条件が石灰化生物へ及ぼす影響を評価することを研究目的とする。そのために、石灰化生物の中でも大気中の$\mathrm{CO}_{2}$分圧の変化を最も受けやすいと考えられる浅海域に生息する水産重要種及び岩礁帯の生態系重要種であるウニ類（ムラサキウニAnthocidaris crassispina及びバフンウニHemicentrotus pulcherrimus）や、サンゴ礁における生態系重要種である造礁サンゴ類（コユビミドリイシAcropora digitifera及びクシハダミドリインAcropora hyacinthus）を材料として、上記のような酸性化条件の影響の把握を行う。

### 3. 研究方法

（１）ウニ類への海洋酸性化の影響評価

1）酸性化条件への長期曝露がムラサキウニに与える影響の評価実験

a. 実験システムの作成
上記のように将来の海洋表層の$\mathrm{CO}_{2}$分圧を、日周変化および年周変化をも考慮して再現することを意図した飼育システム（以下、初期システムという）を作成した（図1）。初期システムでは、まず京都大学フィールド科学教育研究センター瀬戸臨海実験所付属白浜水族館（以下水族館）で周辺海域からくみあげて水槽に供給している海水中の$\mathrm{CO}_{2}$分圧を測定する。その結果に基づき、脱$\mathrm{CO}_{2}$空気（ソーダライムで除去）に測定値と同じ分圧になるよう$\mathrm{CO}_{2}$ガスを添加しコントロール区水槽を曝気する仕組みとした。一方、同様のガス添加システムで供給空気の$\mathrm{CO}_{2}$分圧をコントロール区より500 ppm高くして実験区の水槽を曝気する仕組みとした。

## b．初期システムの実証試験

初期システムが所期の性能を有することを確認するため、2008年11月に、1時間ごとに、水族館の取水口周辺の原海水、原海水をタンクに一旦貯留した後に飼育海水として供給されている海水、その海水に含まれる$\mathrm{CO}_{2}$の分圧を測定した上でガス調整システムによる海水と同じ分圧の$\mathrm{CO}_{2}$を含む空気を曝気している水槽（コントロール区）の海水、同じガス調整システムを用いてコントロール区よりも$\mathrm{CO}_{2}$分圧を500 ppm高めた空気を曝気している水槽（実験区）の海水、それぞれの全炭酸濃度（DIC）およびアルカリ度（TA）を測定し、システムの性能を確認した。

図１将来の$\mathrm{CO}_{2}$環境を模擬することを意図した初期の実験装置（初期システム）

### c. ムラサキウニの長期飼育実験

ムラサキウニの幼稚体を用いて、初期システムを用いた長期飼育実験を実施した。各水槽にムラサキウニの幼稚体50個体をいれ、毎日ワカメを飽食条件で与えて飼育した。実験に用いた個体の体重を3週間ごとに測定した。このデータから各個体の相対成長を計算し、その結果から、高分圧のCO_{2}がムラサキウニの幼若個体の成長に与える影響を評価した。

## 2）日周CO $ _{2} $ 分圧変動を加味した酸性化条件がバフンウニ幼生に与える影響の評価実験 a．実験システム

初期システムでの経験を踏まえて、本プロジェクトの参画機関が共通に用いる海水のCO $ _{2} $ 分圧条件を精密に再現できる実験装置（AICAL装置、図2）では、電子制御された流量制御装置によって
て純粋な$\mathrm{CO}_{2}$ガスと大気から$\mathrm{CO}_{2}$を取り除いたガス（希釈ガス）を調合することで、任意の$\mathrm{CO}_{2}$分圧のガス（調整ガス）を作成することが出来る。作成された調整ガスは、実験所周辺海域より汲み上げた海水で満たされたU字型の円筒状プラスチック（吸収筒）の底部から放出され、海水に添加される。本システムは連続的に海水が流れる流水式である。1つの吸収筒で$\mathrm{CO}_{2}$分圧が調整された海水を毎分約300 ml供給することができ、作成された海水の$\mathrm{CO}_{2}$分圧は連続的に計測される。本システムは時間毎に$\mathrm{CO}_{2}$分圧が変化するプログラムも作成することも可能である。

b．バフンウニ幼生の日周 $ CO_{2} $ 分圧変動を加味した酸性

## 化条件への曝露実験

CO_{2}濃度調整システム

図２　海水の$\mathrm{CO}_{2}$分圧を精密に制御できる$\mathrm{CO}_{2}$溶解システム（AICAL装置）の模式図

浅海域でのCO₂分圧の日周変化は平均値±200 ppm程度である（Kitada et al. 2006 $ ^{6} $ ）。このことから上記システムを用い、400 ppm（コントロール）、400±200 ppm（コントロールに日周変動を加えたもの）、800 ppm（酸性化条件）、800±200 ppm（酸性化条件に日周変動を加味したもの）となる実験条件を作成（図3）した。バフンウニの受精卵（10個/ml）をメッシュを貼ったプラスチックカップ（200 ml、各条件4本）にいれ、3日間各条件への暴露を行った。暴露後に幼生を回収し、その全長、後腕長、ボディー長（図8A）を光学顕微鏡下にて撮影した写真から、画像解析ソフトウェア ImageJ 1.38 program (National Institutes of Health, Bethesda, MD)を用いて計測し、CO₂分圧が日周変動する酸性化条件がバフンウニの幼生の形態形成に与える影響を評価した。

## 3 ）低レベルCO $ _{2} $ 分圧がムラサキウニとバフンウニの初期発生に与える影響の評価実験

精密$\mathrm{CO}_{2}$溶解システムを用いて、ウニ類2種（ムラサキウニとバフンウニ）の受精卵を、自然界の現在の$\mathrm{CO}_{2}$分圧よりも低い産業革命前レベルの$\mathrm{CO}_{2}$分圧条件に曝露し、その初期発生に与える影響を調べるための飼育実験を行った。曝露$\mathrm{CO}_{2}$分圧条件はバフンウニにおいては230と430（コント
図３　日周変動を考慮して作成したCO₂分圧条件

ロール）ppmの計2条件、ムラサキウニにおいては300、400（コントロール）、500、600 ppmの計4条件とした。それぞれのウニ種の幼生を各条件に3日間曝露した後に骨格サイズ（全長、後腕長、ボディ長）の計測を行い、バフンウニについては受精後の卵300個を105分間各条件に曝露した後に10％ホルマリン海水によって固定して卵割数の測定も行った。

## （２）造礁サンゴ類への海洋酸性化の影響評価

1）日周$\mathrm{CO}_{2}$分圧変動を加味した酸性化条件がクシハダミドリイシ幼個体に与える影響の評価実験

白浜周辺に生息する温帯性造礁サンゴ類のクシハダミドリイシの配偶子より得た幼個体を、精密$\mathrm{CO}_{2}$溶解システムを用いて自然海の日周$\mathrm{CO}_{2}$分圧変動を加味した$\mathrm{CO}_{2}$分圧条件に曝露し、その初期成長に与える影響を調べるための実験を行った。曝露$\mathrm{CO}_{2}$分圧条件は475（コントロール）、605、800、1000 ppmの固定$\mathrm{CO}_{2}$分圧条件及び600 ppmと1000 ppmを12時間毎に行き来する日周変動条件の計5条件、曝露期間は28日間とし、実験後に顕微鏡下にて撮影した写真から画像解析ソフトウェア ImageJ 1.38 program (National Institutes of Health, Bethesda, MD)を用いて骨格表面積（投影面積）を計測した。

## 2 ）酸性化条件と高水温の複合条件がコユビミドリシ幼個体に与える影響の評価実験

精密CO₂溶解システムを用い、ココビミドリイシの幼個体への高CO₂分圧と高水温の複合条件の暴露実験を実施した。幼個体はプラスチックプレート上に着底させた生後7日の個体を用い、実験条件は400 ppm + 27℃（コントロール）、400 ppm + 31℃、1000 ppm + 27℃、1000 ppm + 31℃とした。幼個体が付着したプラスチックプレート（各条件約60個体）を実験水槽（12 L）に入れ10日間、各条件への暴露を行った。暴露後に幼個体は回収され、軟組織をウォータージェットにより取り除いた後に乾燥させた。乾燥させたサンプルは超精密天秤（Thermo Cahn、C-35 microbalance）により重量を計測し、高CO₂分圧と高水温の複合条件がサンゴ幼個体に与える影響を評価した。
## 3 ）低レベルCO₂分圧がコユビミドリイシに与える影響の評価実験

精密CO_{2}溶解システムを用い、ココビミドリイシの幼個体を低CO_{2}分圧条件に暴露し、その影響を評価した。幼個体は上記と同様の方法でプラスチックプレート上に付着させたものを用いて10日間の暴露を行った後に骨格重量を計測した。実験条件は400 ppm（コントロール）と250 ppm（低CO_{2}分圧）を用いた。

## 4 ．結果・考察

## （１）ウニ類への海洋酸性化の影響評価

1）酸性化条件への長期曝露がムラサキウニに与える影響の評価実験

## a．飼育システムの検証

水族館で蛇口から供給している海水（本実験システムにおいて、対照区の$\mathrm{CO}_{2}$分圧として参照している海水）は、一度取水口から海水タンクに貯留し、時間を経て蛇口から排出されるため、貯

$$ に CO_{2} $$

能性がある。この可能性を検証するために実際の現場海水と水族館の蛇口から供給されている海水を採取しその$\mathrm{CO}_{2}$分圧を測定した（図4A）。その結果、現場の海水では、$\mathrm{CO}_{2}$分圧は現在の大気の$\mathrm{CO}_{2}$分圧に近い値を中心として変動しており、最小値が275ppm、最大値が440ppmであった。また最大値は夜明け前の午前5時に得られ最小値は午後3時に得られた。この結果は、現場海水の$\mathrm{CO}_{2}$分圧は、現場の植物プランクトンによる光合成活性と、現場に生息する微生物をはじめとする生物群集の呼吸活性とに大きく影響されており、光合成による$\mathrm{CO}_{2}$の消費がピークを迎える時間に$\mathrm{CO}_{2}$分圧が最小になり、光合成のない夜間の$\mathrm{CO}_{2}$の累積的な発生がピークを迎える午前5時ごろに最大値となったものと解釈することができる。

一方、水族館の蛇口からの供給海水は、現場のCO₂分圧よりも100-300 ppmほど高い値で推移した（図4A）。したがって水族館

(A)

(B)

図4（A）取水口（現場）と水族館蛇口から供給される海水中の$\mathrm{CO}_{2}$分圧の日周変化（◆:水族館蛇口 ■:現場取水口）。（B）取水口のある場所の水位の変化。
の供給海水を用いて飼育されている動物たちはすでに将来の$\mathrm{CO}_{2}$分圧に近い高$\mathrm{CO}_{2}$環境で飼育をされているということができる。この原因は海水の貯留槽に取水口からくみ上げた海水が一時的にためられており、貯留槽の中で有機物の分解が起こっているためと解釈される。供給海水の日周変化は午前8時にピークに達した。もし一定の速度で貯留槽の海水が取水口からの供給と蛇口からの排出を継続している場合は周辺の気温がもっとも高くなる午後2時ごろに$\mathrm{CO}_{2}$分圧が最大になるはずである。その結果はむしろこの測定をしたときの潮位の変化に大きく影響されているも

(A)

のと考えられる（図4B）。すなわち、この日潮位がもっとも低くなった午前3時の前後数時間の間、貯留槽には取水口から新鮮な海水が供給されず、貯留槽内での有機物の分解による$\mathrm{CO}_{2}$分圧の増加のみが進行した。潮位が十分に回復した午前7時以降は取水口から新鮮で$\mathrm{CO}_{2}$分圧が低い海水が貯留槽内に供給されるようになったため、$\mathrm{CO}_{2}$分圧が低下に転じたと思われる。実際13時前後にあったもう一つの干潮では、水位があまり下がらなかったため、水族館の蛇口から供給される海水の$\mathrm{CO}_{2}$分圧には大きな変化が見られなかった。

## b．初期システムの実証試験

次に、初期システムにおける水槽内の環境変化を追跡した結果、コントロール区においては、供給空気の$\mathrm{CO}_{2}$分圧に比べて実際の水槽内の$\mathrm{CO}_{2}$分圧が常に200ppm程度高いことが明らかになった（図5A）。この結果は、水槽内で飼育している動物や微生物などによってコンスタントに呼吸による$\mathrm{CO}_{2}$の発生が起こっており、その発生量が換水（およそ毎時2％）による新鮮海水の供給と低$\mathrm{CO}_{2}$分圧空気の曝気では十分に解消されないことを示

(B)

図5 コントロール区（A）と、+500 ppmの条件に制御することを目指している実験区（B）の水槽内のCO₂分圧の日周変化。■：供給している調整した空気のCO₂分圧 ◆：実際の水槽内の海水のCO₂分圧。コントロール区では、供給している空気のCO₂分圧よりも常に200 ppm程度高いCO₂分圧レベルに、実際の水槽の環境がなっているが、+500 ppm実験区の水槽海水のCO₂分圧は供給している空気のCO₂分圧とよく一致している。
している。しかし供給している空気の $ CO_{2} $ の変動パターンと水槽内の $ CO_{2} $ 分圧の変動パターンは比較的よく一致しており、本水槽システムが目指している $ CO_{2} $ 分圧の日周変化を水槽中で再現するという目的にはおおむね達していた。

コントロールに対して+500 ppmになるように調整した空気で曝気している実験区の水槽内の$\mathrm{CO}_{2}$分圧は供給している空気の$\mathrm{CO}_{2}$分圧とよく一致していた（図5B）。この結果は、$\mathrm{CO}_{2}$分圧を水槽内で上昇させることは曝気によって達成することができるが、水槽内の$\mathrm{CO}_{2}$分圧を低下させることは水槽内に直接調整した空気を供給するだけでは困難であることを示唆している。これは、単位$\mathrm{pCO}_{2}$変化をもたらすのに必要な全炭酸量の変化と関係しており、同じ原海水の$\mathrm{pCO}_{2}$から曝気で$\mathrm{pCO}_{2}$を変化させるときに$\mathrm{pCO}_{2}$を高める方が小さい全炭酸変化でよいが、低める場合はより大きな全炭酸変化を必要とする。また、飼育水槽は有機物分解による$\mathrm{CO}_{2}$分圧増加の要因もあり、これらの複合的な効果で+500 ppm区は曝気空気と近い$\mathrm{CO}_{2}$分圧になり、コントロール区は曝気空気の$\mathrm{CO}_{2}$分圧にまで下がらなかったものと解釈することができよう。

これらの結果から、初期システムでは、現在の海洋の$\mathrm{CO}_{2}$の日周変化をおおむね模擬しながら、およそ+300 ppm前後の条件の水槽（コントロール区）とおよそ+600 ppm前後の条件の水槽（実験区）で実験を継続していたと考えている。コントロール区と実験区との間には、およそ300 ppmの$\mathrm{CO}_{2}$分圧の定常的な差があり、また日周変化は現場のパターンをよく再現しているものとなっていると評価することができる。

コントロール区の$\mathrm{CO}_{2}$分圧を正確に制御して現在の現場の分圧と同じレベルに下げるためには、十分な気液比をもった$\mathrm{CO}_{2}$吸収機構を使うことが必要とわかった。この長期飼育水槽実験では、本プロジェクトで開発した向流型の吸収塔をその後追加した。できるだけ高い換水率で$\mathrm{CO}_{2}$分圧を制御した海水を水槽内に供給し、よりよい実験水槽内$\mathrm{CO}_{2}$環境制御とするよう改善し、実験を継続している。

図6 ムラサキウニの相対成長。■：コントロール区 ◆：実験区。実験開始後14か月の間はほとんど差がみられないが、その後相対成長は実験区の方がコントロール区より低い傾向が次第に顕著になってきている。
### c. ムラサキウニの長期飼育実験

上記のような条件で長期間飼育したムラサキウニの幼稚体の成長を追跡した結果、実験の初期段階では、コントロール区と実験区の動物の間で、成長にはほとんど差がなかったにもかかわらず、実験を開始してから14か月程度を経過した段階で、両者の間には差が生じ始め、20か月を経過した段階まで徐々にその差が広がりつつある（図6）。

従来の止水条件で小型水槽（30 L）を用いて得られた実験結果（Shirayama and Thornton, 2005 $ ^{4} $ ）：図7）に比べて、大型水槽(200 L)を用い継続的な換水を行った今回の実験では、高CO $ _{2} $ の影響が顕著になるまでの時間が大幅に長くなっていた。この結果は従来の実験システムでは、CO $ _{2} $ 分圧の微妙な制御が十分できておらず、実験区のCO $ _{2} $ 分圧は供給している空気のCO $ _{2} $ 分圧よりも高くなっているため、影響を過大評価していた可能性が高いことを示唆している。実際、本システムにおいてさえも、コントロール区の海水のCO $ _{2} $ 分圧は、供給している空気のCO $ _{2} $ 分圧よりも高くなっており、低分圧の制御を精密に行うことが、将来の海洋酸性化の影響評価には重要となる。

図7 小型水槽止水条件で得られた、高CO₂分圧条件でのツマジロナガウニの成長に対する影響（Shirayama and Thornton, 2005⁴）より）。この実験の場合、16週（3か月）から、コントロール区と実験区との間で成長率に差がみられるようになってきた。一方、白山が2003年から2005年にかけて実施した一定分圧の大型水槽実験（白山ら、未発表）では、今回の実験と同程度の換水を常時行った。そのためか、影響は実験開始から500日程度を経過して顕著になり、日周変動を加味した今回の実験とよく似た結果となっている。したがって日周変化を加味したことが結果にはあまり大きな影響を与えていないかもしれないが、その実験では、700日近くになって顕著な影響が観察されており、今回の実験後もさらに継続して推移を見守る必要があると考えた。そこで、低分圧側の制御をより精密に行うために、本節以降の実験ではプロジェクトで開発した向流式のCO₂溶解システム（図2）を用いた。
A

D

図8 A：計測したバフンウニ幼生の形態部位。B-D：日周変動する$\mathrm{CO}_{2}$分圧条件と高$\mathrm{CO}_{2}$分圧条件に3日間曝したバフンウニ幼生の各形態部位のサイズ（平均値±標準誤差、サンプル数$n=4$）。

## 2 ）日周CO₂分圧変動を加味した酸性化条件がバフンウニ幼生に与える影響の評価実験

CO $ _{2} $ 分圧が一日の中で変動する条件（400±200 ppm、800±200 ppm、図3）で培養したバフンウニの幼生は、CO $ _{2} $ 分圧が一定な条件に曝したものに比べてその形態に差は認められなかった（Bonferroni、各p＞0.05、図8 B－D）。幼生の全長とボディ長には各条件間に差はみられなかった（Bonferroni、各p＞0.05）が、後腕の長さにおいてCO $ _{2} $ 分圧を高めた2条件800 ppmと800±200 ppmではコントロールよりも長さがそれぞれ12.0％と6.20％有意に短くなっていることが分かった（Bonferroni、各p＜0.05、図8）。

バフンウニ幼生の体サイズは\mathrm{CO}_{2}分圧の上昇に伴い減少することが報告されており（Kurihara and Shirayama 2004 $ ^{7} $ ））、これは今回得られた高\mathrm{CO}_{2}分圧実験区における後腕長サイズの低下を示す結果（図8C）と一致する。この結果と、後述する低\mathrm{CO}_{2}分圧域におけるバフンウニ幼生サイズの増大を考慮すると、日周変動する\mathrm{CO}_{2}分圧条件下において、形態サイズの低\mathrm{CO}_{2}分圧時間域における増大と、高\mathrm{CO}_{2}分圧時間域における減少が同条件下にて起こっているために見かけ上の変化が現れなかった可能性が示唆される。今後は、\mathrm{CO}_{2}分圧レベルやその変動パターンが異なる条件について同様の実験を実施することで、\mathrm{CO}_{2}分圧の日周変化とウニ幼生の形態形成の関係をより詳細に調べていく必要がある。

3）低レベルCO $ _{2} $ 分圧がムラサキウニとバフンウニの初期発生に与える影響の評価実験

低レベルCO $ _{2} $ 分圧条件に105分間曝したバフンウニの受精卵約300個の卵割数を計測した結果、未
卵割卵から8細胞期までの胚が観察されたものの、2条件間の各細胞期の割合に有意差は検出されなかった（U-test、each p > 0.05、図9）。

各$\mathrm{CO}_{2}$分压条件に3日間曝したバフンウニのウニ幼生の骨格サイズは全長、後腕長、ボディ長の全てにおいて230ppm条件の方が430ppm条件より有意に長かった（全長：NestedANOVA、$F_{1,159}=38.1$、後腕長：$F_{1,159}=13.9$、ボディ長：$F_{1,159}=21.5$、each$p<0.001$、図10）。一方、各$\mathrm{CO}_{2}$分压条件に3日間曝した後のムラサキウニのウニ幼生の骨格サイズは、全長と後腕長において、300ppmに曝した幼生の方が500と600ppmに曝したものよりもサイズが有意に長くなった（NestedANOVA,

図9 低CO₂分圧条件に105分間曝したバフンウニ受精卵の初期発生における各細胞期の胚の割合（平均値±標準、サンプル数 n=4）

図10 低CO₂分圧条件に3日間曝したバフンウニ幼生の各形態部位のサイズ（平均値±標準誤差、サンプル数n=4）
C

$ CO_{2} $ 分压(ppm)

図11 低CO₂分圧条件に3日間曝したムラサキウニ幼生の各形態部位のサイズ（平均値±標準誤差、サンプル数 n=4）

post hoc Tukey-Kramer HSD test、each p < 0.05、図11A－B）。また、ムラサキウニのウニ幼生の全長は600 ppm条件において400 ppm条件よりも有意に短くなった（Nested ANOVA、post hoc Tukey-Kramer HSD test、p < 0.05、図11C）。本研究において実験に用いたウニ類の幼生サイズが産業革命前のCO₂分圧レベルの条件下において、現在や近未来に予測されているCO₂分圧条件に曝した幼生よりも大きくなることが明らかとなった。このことは、将来予想される海洋酸性化の石灰化生物への影響は現在において既に起こっている可能性を示唆するものである。

## （２）造礁サンゴ類への海洋酸性化の影響評価

1）日周$\mathrm{CO}_{2}$分圧変動を加味した酸性化条件がクシハダミドリイシ幼個体に与える影響の評価実験実験後に計測した各条件の幼個体の骨格表面積は475 ppmにおいては$1.05\pm0.03\ \mathrm{mm}^{2}$、605 ppmは$0.98\pm0.03\ \mathrm{mm}^{2}$、800 ppmは$0.96\pm0.02\ \mathrm{mm}^{2}$、1000 ppmは$0.90\pm0.05\ \mathrm{mm}^{2}$となり、$\mathrm{CO}_{2}$分圧値との強い相関を示した$(y=-0.03\times10^{-2}x+1.152,\ \mathrm{R}^{2}=0.9316,\ p<0.05$、図12）。また、日周変動条件
（600と1000 ppmの12時間サイクル）においては $ 0.90\pm0.02\ mm^{2} $ となり、この回帰直線よりも低い値となった。本研究は $ CO_{2} $ 分圧が日周変動する自然条件を模した実験条件を人工的に作成することでその影響を調べたものである。その結果、600 ppmと1000 ppmに12時間毎に曝露されたクシハダミドリイシ幼個体の骨格表面積は一定の $ CO_{2} $ 分圧条件に曝したものよりも表面積サイズが小さくなるというマイナス影響がより大きくなる可能性があることが明らかとなった。このことは、海洋酸性化の海洋生物への影響評価をより正確に行うためには、本実験における $ CO_{2} $ 分圧の日周変動を加味した条件のような、より自然条件に近い実験条件を用いる必要があるといえる。

## 2 ）酸性化条件と高水温の複合条件がコユビミドリシ幼個体に与える影響の評価実験

高CO $ _{2} $ 分圧に曝した条件では骨格重量の低下がみられた（2-way ANOVA、p < 0.001、図13）。また、高水温による骨格重量の低下促進はみられず、むしろ高水温による骨格重量の有意な増加傾向がみられた（2-way ANOVA、p < 0.01、図13）。

図12 日周$\mathrm{CO}_{2}$分圧変動を加味した酸性化条件がクシハダミドリイシ幼個体に与える影響。10日間各条件に曝露した幼個体の投影面積、黒四角（■）：475 ppmから1000 ppmの固定$\mathrm{CO}_{2}$分圧条件、白丸（○）：600 ppmと1000 ppmの12時間変動サイクル条件（平均値±標準誤差、サンプル数 n=4）。回帰直線と回帰式は475 ppmから1000 ppmの$\mathrm{CO}_{2}$分圧条件に曝露した幼個体の投影面積より算出。日周変動を加味した酸性化条件に曝した幼個体の投影面積はこの回帰式の下に位置しているのが分かる。