Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
プル、死亡個体の筋肉・腎臓等の組織サンプルより、DNeasy Blood & Tissue Kit（Qiagen）を用いてゲノムDNAの抽出を行った。血液は抗凝固処理、または濾紙吸着後に乾燥させたものを-20度で凍結保存し、組織は用いるまで-20度で99%エタノール内に保存した。このうち、出生地が明らかである生後1年以内のヒナ及び幼鳥より得られた合計153個体（十勝：46個体、釧路：84個体、根室：20個体、網走：3個体）のDNAサンプルを解析に用いた。これに加えて、全国の博物館や研究組織等、合計10機関で保存されていた1878-2001年に捕獲された計18個体の剥製標本の羽軸サンプルから、QIAamp DNA Micro Kit（Qiagen）を用いてDNAを抽出した。外来DNAの混入を避けるために、剥製標本のDNA抽出は近年のサンプルとは異なる実験室のクリーンベンチ内で行う等十分注意した。

## 2 ）ミトコンドリアDNA配列を用いた多様性解析

タンチョウのミトコンドリアDNAにおける多様性解析には、これまでに、制御領域の塩基配列情報が用いられてきた $ ^{10)} $ 。しかし、本研究の過程で、タンチョウのミトコンドリアDNAにおいて、制御領域を含む周辺領域で遺伝子重複が生じていることが明らかとなった。そこで、Nested PCR法を用いて、遺伝子重複を含む領域約5.2 kbの塩基配列決定を行った。その結果、先行研究で多様性解析に用いられた領域は、重複した制御領域（CR1, CR2）のうち、後半部分にあたるCR2であることがわかった。今までにCR2から検出されたハプロタイプの分類はCR2の5'末端側の440-bpの配列からが可能であることが示されているため $ ^{11)} $ 、この領域を特異的に増幅するPCRプライマーを新たに開発した。

近年のサンプルは440bpを含む約2kbをPCRにて増幅し、ダイレクトシーケンス法により塩基配列を決定した。PCR組成は全量20μlの反応系でGXL DNA Polymerase (5 units/μl; Takara)を0.3μl、5×Reaction bufferを4.0μl、dNTPを1.6μl、プライマーセットをそれぞれ(20 pmol/μl)0.3μl、DNA抽出液を1.0μl、蒸留水を12.5μlとした。この反応液について熱変性（98℃/10秒）、アニーリング（60℃/5秒）、DNAの伸長（68℃/2分）を1サイクルとして25サイクル繰り返した。PCR産物はQIAquick PCR Purification Kit（Qiagen）で精製し塩基配列の鋳型として用いた。配列決定はBig Dye ver 3.1とDNAシーケンサー（ABI3130）を用いて決定した。得られた塩基配列情報に基づいて、北海道集団内における各ミトコンドリアDNAハプロタイプの出現頻度を調べた。

剥製標本から抽出したDNAは分断化している可能性が考えられるため、制御領域を重なる短い2つの領域（286bp、381bp）に分けて塩基配列を決定し、近年のサンプルとの比較を行った。塩基配列のアライメントはMEGA 5.0を用いて行い、塩基配列から検出されたハプロタイプについて採集地域別に出現頻度を調べた。

## 3 ）マイクロサテライトを用いた多様性解析

153個体について先行研究で開発されたマイクロサテライト9遺伝子座（Gj-M8、Gj-M11a、Gj-M13、Gj-M15、Gj-M34 $ ^{16} $ ）；Gj4066、Gj1303、Gpa33、Gpa34 $ ^{17)} $ ）の遺伝子型を決定した。一方を6-FAM、NED、PET、VICのいずれかで標識したプライマーセットを用いてPCR反応を行い、PCR産物の分子サイズをABI 3730 automated sequencerを用いて測定した。PCR反応液は全量で5μlとし、その組成は2×Multiplex PCR Master Mix (Qiagen)を2.5μl、蒸留水を1.0μl、primer mix（1pmol/μl、各非修飾及び蛍光標識プライマー3-4組を混合したもの）を0.5μl、DNA抽出液1.0μl
とした。この反応液について熱変性（95℃/15分）を1回行い、引き続き、熱変性（94℃/30秒）、アニーリング（60℃/90秒）、DNAの伸長（72℃/90秒）を1サイクルとして30サイクル繰り返し、最後に72℃で10分間伸長反応を行い、PCR産物を得た。サイズマーカーとしてはGS600 LIZ（Life Technologies）を用い、GENEMAPPER 4.0で解析を行った。

各個体の遺伝子型データを元に、遺伝的な集団構造を明らかにするために、仮定分集団数（K）=1-5について、STRUCTURE 2.3.4を用いたベイジアンクラスタリング解析を行った。また、集団内の遺伝的多様性はマイクロサテライト9遺伝子座のヘテロ接合度期待値及び観察値の平均値をARLEQUIN 3.5.1.3、アリル多様度（Ar）と地域間の遺伝的差異（ $ F_{ST} $ ）をFSTAT 2.9.3を用いて算出した。

## 4 ）MHCを用いた多様性解析

タンチョウ北海道集団におけるMHCクラスIA、及び、クラスIIB遺伝子の多様性を明らかにすることを目的として、153個体を用いて解析を行った。まず、これらの遺伝子領域に特異的なプライマーの開発を行った。MHCクラスIA遺伝子については、データベース（GenBank）上で公開されている近縁種のカナダヅルの塩基配列情報と、その他鳥類の配列情報に基づいて、保存性の高い領域にプライマーを設計した。そのプライマーを用いて、タンチョウの北海道集団の複数個体について、予備的なPCR増幅を行い、クローニング後、ダイレクトシーケンス法により塩基配列を決定した。得られた配列情報から、タンチョウのクラスIA遺伝子のexon3領域に特異的なプライマーを開発した。

MHCクラスIIB遺伝子は、これまでにツル科の鳥類では塩基配列が報告されていないため、鳥類に共通のMHCクラスIIB遺伝子領域のプライマー $ ^{18)} $ を用いて、タンチョウを含むツル科12種、及び、ツル目の近縁3種について、MHCクラスIIB遺伝子のexon1からexon4領域の部分配列をPCR増幅した。PCR増幅断片はクローニングを行い、ダイレクトシーケンス法により塩基配列を決定した。得られた塩基配列の多型情報に基づいて、ツル科鳥類のMHCクラスIIB遺伝子領域の保存性の高い部位に、新たなプライマーを設計した。クラスIA遺伝子と同様に、タンチョウの北海道集団の複数個体について、予備的な解析を行い、タンチョウのMHCクラスIIB遺伝子のexon2領域に特異的なプライマーを開発した。

上記のプライマーを用いて、次世代シーケンサー（Roche GS FLX+）により、タンチョウ北海道集団の153個体について、MHCクラスIA、及び、クラスIIB遺伝子座の網羅的な遺伝子型決定を行った。そのデータに基づき、各地域集団におけるMHCの多様性の程度について検討した。

## 4 ．結果及び考察

## （１）シマフクロウの遺伝的多様性

## 1 ）ミトコンドリアDNA配列を用いた多様性解析

計150個体のミトコンドリアDNAコントロール領域の部分配列から5つのハプロタイプが識別された（BFH01-BFH05）。5つのうちBFH05は1964年以前にのみ見られ、それ以降では見られなかった。3つのハプロタイプ（BFH01、BFH03、BFH04）は1964年以前には北海道に広く分布していた（図(2)-1）。期間1965－1980年、1981－1996年にも各ハプロタイプは複数の地域で確認されていたが、期間1997－2012年ではほとんどのハプロタイプが各地域集団に固定してお
り、構成が大きく偏っていた（図(2)-1）。AMOVAによる解析の結果、期間1964年以前、1965–1980年では地域間で有意な遺伝的差異は検出されなかったのに対して、1981－1996年、1997－2012年では非常に高い遺伝的分化が見られた（表(2)-3）。ハプロタイプ多様度と塩基多様度はともに、北海道全体では有意な変化は見られなかったが、各地域では80年代以降に、急激な減少が観察された（表(2)-3）。

図(2)-1 シマフクロウ北海道集団におけるミトコンドリアDNAハプロタイプの年代別分布

表(2)-3 ミトコンドリアDNA・マイクロサテライト分析による遺伝的多様性及び遺伝的分化度

年代	ミトロンドリア DNA	マイクロサテライト
N	FST	hall	hlocal	πall	πlocal	N	FST	Ar	Ho	He	FIS
1964 年以前	19	0.05	0.68	0.59	0.0074	0.0066	-	-	-	-	-	-
1965-1980	16	-0.150	0.78	0.70	0.0085	0.0075	8	-0.07	3.7	0.59	0.58	-0.02
1981-1988	16	0.31*	0.65	0.38	0.0067	0.0058	17	0.06*	3.5	0.53	0.56	0.05
1989-1996	28	0.55*	0.71	0.38	0.0070	0.0035	81	0.19*	3.3	0.52	0.55	0.05
1997-2004	31	0.49*	0.65	0.39	0.0063	0.0036	126	0.16*	3.2	0.47	0.54	0.13
2005-2012	40	0.60*	0.59	0.28	0.0065	0.0028	175	0.13*	3.3	0.51	0.53	0.05
N：解析サンプル数、 $ F_{ST} $ ：地域集団間の遺伝的分化度、 $ h_{all} $ 、 $ h_{local} $ ：北海道全体及び地域集団でのハプロタイプ多様度、 $ \pi_{all} $ 、 $ \pi_{local} $ ：北海道全体及び地域集団での塩基多様度、Ar：アリル多様度、 $ H_{o} $ ：ヘテロ接合度観察値、 $ H_{e} $ ：ヘテロ接合度期待値、 $ F_{IS} $ ：近交係数、 $ ^{*} $ ：有意な $ F_{ST} $ 値（P<0.05）。

## 2 ）マイクロサテライトを用いた多様性解析

2006年から2014年にかけて採集された407個体について、マイクロサテライト7遺伝子座のほぼすべて（99.6%）で遺伝子型の決定に成功した。古い剥製標本からの分析は成功しなかった。北海道集団を単一の集団とみなして解析を行った結果、解析に用いた7遺伝子座中、1981–1996年で5遺伝子座において、また、1997–2012年で6遺伝子座でハーディー・ワインベルク平衡からの逸脱がみられた。一方、各地域集団についての解析では逸脱を示したのは7遺伝子座中0–2遺伝子座であった。遺伝子座間の連鎖不平衡は0–14通りの組み合わせで検出されたが、地域集団によって連鎖不平衡となる遺伝子座の組み合わせは異なっていた。図(2)–2はmoment method及びtemporal methodにより推定された各年代の有効集団サイズを示しており、いずれの手法でも同様に1980年代が最も低く（10–20個体）であり、それ以降は徐々に回復傾向であることが明らかとなった。また、1965–1980年では、推定誤差が大きいものの最も高い有効集団サイズが観察された。

図(2)-2 シマフクロウ北海道集団における有効集団サイズの変化 ●: Moment method、○: temporal method。

STRUCTURE解析の結果、遺伝的クラスターの数（K）=4の場合の尤度が最も高く、この4つのクラスターは、現在の地域集団とほぼ一致した。AMOVAによる解析の結果、1980年以前では地域間で遺伝的差異は検出されなかったが、それ以降の解析期間では有意に高い遺伝的分
化が見られた。1981–1996年ではほとんどの個体はその生息地域に特有の遺伝的クラスターに分配されたが、1980年以前や1997–2012年では、一部の個体が他の生息地に特有のクラスターに分配された（図(2)-3）。アリル多様度は北海道全体で有意な減少が見られた（表(2)-3）。北海道全体ではヘテロ接合度観察値は期待値に比べてより急速な減少を示した（表(2)-3）が、一部の地域集団（阿寒、根釧、大雪）ではヘテロ接合度観察値が期待値よりも有意に高い値を示した。近交係数は有意な増加を示した。更に、今後50年間のヘテロ接合度観察値のシミュレーションの結果、北海道の地域集団が孤立している場合には56.2%まで減少し、一方、集団間で個体の移動（遺伝子流動）がある場合には、減少率は86.5%まで緩和されることが予測された。

図(2)-3 STRUCTURE解析による各個体の4つの遺伝的クラスターへの分配確率 1*：1980年以前、2*：1981–1996年、3*：1997–2012年

## 3 ）MHCを用いた多様性解析

1968年から2012年までに北海道各地で集められた200個体のDNAサンプルを用いて、次世代シーケンサーを用いてMHCクラスIIB遺伝子exon2領域（203 bp）の網羅的解析を行った。その結果、174個体から信頼性の高いデータが得られ、北海道集団全体で19種類のユニークな配列（対立遺伝子）が検出された。1個体から最大16種類の対立遺伝子が確認されたことから、シマフクロウのゲノムには少なくとも8つのMHCクラスIIB遺伝子座が存在することが示唆された。これは、これまでに他のフクロウで報告されている遺伝子座数（1-4遺伝子座 $ ^{13)} $ ）と比較して遥かに多く、近年の遺伝子重複によって生じたと考えられる。一方で、他の鳥種では1遺伝子座から100種類以上の対立遺伝子が見つかることも少なくないことから $ ^{19),20)} $ 、シマフクロウの集団レベルでのMHC遺伝子における多様性（最低8遺伝子座、19対立遺伝子）は極めて低い水準にあることが明らかとなった。

シマフクロウの地域集団間ではMHC遺伝子における多様性に顕著な差がみられ、最も個体数が多い知床集団では、各年代を通して高いアリル多様性が観察された（表(2)-4）。これに対して、他の地域個体群のアリル多様性はこれよりも低く、特に、阿寒や根釧集団では、1993年以降に生まれた個体から検出された対立遺伝子数は11、あるいは12種類のみであった（表(2)-4）。図(2)-4は、個体間のMHCの遺伝子型の非類似度に基づいて、各個体の遺伝子型の類縁関係を二次元平面上にプロットしたものである。知床集団では、様々な遺伝子型が見られるのに対し、阿寒や根釧では集団内の個体のMHC遺伝子型がほぼ均一であることが示唆された（図(2)-4）。また、阿寒・根釧集団の古い年代のサンプルからは、現在、これらの集団ではみられない対立
遺伝子も確認された（図(2)-5）。以上より、北海道のシマフクロウにおいては、過去の個体数の大幅な減少に伴い、集団内の多様性が低下したと考えられる。

表(2)-4 シマフクロウ北海道集団におけるMHCクラスIIB対立遺伝子数及びアル多様度

年代	地域	N	$ K_{individ.} $	$ K_{pop} $	Ar
1963-1992	知床	11	12	16	14.99
根釧	15	11	14	11.71
阿寒	7	11	16	13.63
大雪	4	11	16	14.42
1993-2002	知床	29	12	18	14.96
根釧	11	11	11	11.00
阿寒	6	11	12	11.79
大雪	11	12	15	13.77
2003-2012	知床	29	12	19	15.93
根釧	12	11	11	11.00
阿寒	9	10	12	11.18
大雪	18	12	16	14.28
日高	12	13	17	15.90

N：個体数、 $ K_{individ.} $ ：個体あたりの対立遺伝子数の中央値、 $ K_{pop.} $ ：集団全体で検出された対立遺伝子数、Ar：アリル多様度。

図(2)-4 1993年以降に捕獲されたシマフクロウのMHCクラスIIB遺伝子型の類縁関係
図(2)-5 シマフクロウ北海道集団におけるMHCクラスIIB対立遺伝子の地域・年代別頻度分布

## 4 ）シマフクロウ北海道集団における遺伝的多様性及び地理的遺伝的構造の推移

マイクロサテライトマーカーを用いた我々の先行研究⁸では、北海道のシマフクロウは地域集団間で遺伝的に分化していることが示されたが、この分化が本来のものなのか、近年の個体数の減少に伴って生じたのかどうかについては明らかではなかった。本研究では、古い年代の剥製標本等も含む、より多くのサンプルを用いて分析を行った結果、ミトコンドリアDNAハプロタイプの多くは1964年以前には北海道に広く分布していたが、それ以降の期間では、地域間でハプロタイプの頻度に偏りが見られ、1997年以降では、各地域集団で1つか2つのハプロタイプしか観察されなかった（図(2)-1）。ミトコンドリアDNAとマイクロサテライトのいずれにおいても、1980年以前では地域間で有意な遺伝的差異は検出されなかったのに対して、その後の期間では非常に高い遺伝的分化が見られた（表(2)-3）。同様に、MHC遺伝子を用いた解析でも地域集団間で遺伝的多様性に顕著な差が見られた（図(2)-4）。これらの結果は、1980年以前には北海道の広い地域で遺伝子流動が存在したこと、その後、ハプロタイプ頻度やアリル頻度の大きな変化が各地域で生じたことを示唆する。生息地の分断化と孤立が、地域間の遺伝的構成の差異を短期間で拡大させたと考えられる。北海道集団を単一の集団として扱った際に見られたハーディー・ワインベルク平衡からの逸脱は、実際には複数の分集団を内包していたことによるワーランド効果と呼ばれる減少だと考えられる。連鎖不平衡が検出されたマーカーの組み合わせは一定でなかったことから、遺伝子座の連鎖ではなく繁殖ペアの偏りが要因とする方が妥当だと思われる。1980年以降の地域集団で検出された高いヘテロ接合度は集団サイズが近年急激に減少したことを示す。これらの結果はいずれも1980年前後に集団の分断化と縮小が起こったことを支持する。野外調査でもこの時期にシマフクロウの個体数が最も小さくなったと推測されている⁷)。さらにマイクロサテライト解析による有効集団サイズの推定値もこの時期に最
小となった（図(2)-2）。したがって、北海道のシマフクロウ集団は1980年前後にボトルネックを経験したと考えられる。おそらく、この時期活発に行われた住宅や道路、ダムなどの建設が、生息地の分断化や減少をもたらしたことがボトルネックの原因となったと思われる。

STRUCTURE解析の結果識別された4つの遺伝的クラスターは地理的区分とほぼ一致した（図(2)-3）。日高と阿寒の地域の個体は同じクラスターに分配されたが、この2地域間の $ F_{ST} $ は有意に高い値をとった。よって2地域で交流があるのではなく、日高集団のサンプルサイズが小さいことにより解析の中で独立したクラスターと認識されなかった可能性がある。

STRUCTURE解析から1981–1996年の大雪、阿寒、根釧地域の集団は遺伝的に非常に均質であることが示された。1997–2012年には、一部の個体が採取地とは別の地域に特有なクラスターに分配された。これは地域間の遺伝子流動を示しており、特に大雪地域で顕著だった。実際に野外調査で阿寒及び知床から大雪地域に移動し（1990年及び2002年）、繁殖を行っている個体が観察されている。1981年から2012年にかけて大雪地域で遺伝的多様性が増加していること、有意なハーディー・ワインベルク平衡からの逸脱が見られたことは、これらの個体の移動によって生じたのかもしれない。シマフクロウのように世代期間が長く集団サイズが小さい場合、わずかな数の個体の移動が集団構造や遺伝的多様性に大きな影響を与えると考えられる。

一般的にボトルネックを経験した集団では遺伝的多様性が低下することが知られている。多くの希少鳥類について行われた研究では、特に100-150個体以下のボトルネックを経験した集団では近親交配や遺伝的多様性の低下により、孵化率が低下することが報告されている $ ^{21} $ 。ボトルネック期間の前後での遺伝的多様性の変化はいくつかの鳥類の種で研究されている。例として、20世紀前半にボトルネックを経験した絶滅危惧種ズグロモズモドキ（Vireo atricapilla）についてのマイクロサテライトを用いた研究では、遺伝的多様性の低下及びボトルネック前後の集団間での遺伝的差異が生じたことが明らかとなっている $ ^{22} $ 。また、生息地の消失と分断化によって個体数を91%減らしたウイスコンシン州のソウゲンライチョウ（Tympanuchus cupido）についての研究では、50年間でマイクロサテライトとミトコンドリアDNAの多様性が大きく低下したことが示されている $ ^{23} $ 。しかし一部の研究ではボトルネックを経験しても遺伝的多様性の変化が見られなかったことが報告されている。例として、ヨーロッパのオジロワシ（Haliaeetus albicilla）は20世紀に劇的に個体数が減少したが、高い遺伝的多様性が保たれていた $ ^{24} $ 。この結果については、この種の世代期間が長いことが影響している可能性が指摘されている。また、集団が小さいパッチ状に分断されたイベリアカタシロワシ（Aquila adalberti）についての研究では、ミトコンドリアDNAの多様性は低下していたものの核遺伝子の多様性は保たれていることがマイクロサテライト分析により示されている $ ^{25} $ 。

北海道のシマフクロウも集団の分断化と近年のボトルネックを経験したことが本研究で明らかになった。長い世代期間をもつ種では核遺伝子の低下が生じにくいことが示唆されているが、本研究では長い世代期間をもつシマフクロウで核遺伝子においても多様性の低下が検出された（表(2)-3）。この結果は北海道のシマフクロウの有効集団サイズが極めて小さくなったことを示唆する。また、マイクロサテライト分析の結果は北海道のシマフクロウ集団が地域ごとに分断化されており近親交配が生じていることを支持した。

近親交配は、しばしば出生体重や生存率、繁殖力、感染症などへの抵抗力に影響するとされている $ ^{26} $ 。種の保全のためには、生態的な要因だけでなく遺伝的な要因についても考慮する必
要がある。本研究はシマフクロウの遺伝的多様性が集団の分断化により近年減少したこと、わずかな個体の移動であっても多様性の回復に有効であることを明らかにした。シミュレーションでも今後、地域集団間で交流がある場合には多様性の低下が抑えられることが示されている。したがって、シマフクロウの長期的な保全のためには、孤立した地域間の移動を促進することが有効であると考えられる。

## （２）タンチョウの遺伝的多様性

## 1 ）ミトコンドリアDNA配列を用いた多様性解析

2006年から2014年に採集された153個体について、ミトコンドリアDNAのCR2領域の塩基配列を決定した結果、北海道集団には3種類のハプロタイプ（Gj1, Gj2, Gj13）が存在することが明らかとなった。このうち、Gj1及びGj2は、先行研究で報告されていたものであるが、Gj13は本研究で新たに発見されたハプロタイプである。先行研究において、大陸由来の個体から、これまでに北海道集団とは異なる10週類のハプロタイプ（Gj3-12）が報告されている $ ^{10,27} $ 。このことから、タンチョウ北海道集団のミトコンドリアDNAにおける遺伝的多様性は非常に低いと考えられる。

また、解析に用いた全153個体のうち、89.5％の個体のミトコンドリアDNAハプロタイプはGj2であり、98.0％がGj1、0.7%（1個体のみ）がGj13であった（図(2)-6）。このように、ハプロタイプ数が少なく、また、特定のハプロタイプに頻度が大きく偏っているという遺伝的組成は、現在のタンチョウの北海道集団が、極少数の個体から回復した経緯を反映していると考えられる。

図(2)-6 タンチョウ北海道集団におけるミトコンドリアDNAハプロタイプの頻度
1878–2001年に作製された剥製標本18個体について、ミトコンドリアDNAのCR2領域の塩基配列を決定した結果、近年のサンプルと同様に、多くの個体がGj2（14/18個体）あるいは、Gj1（2/18個体）であった（表(2)-5）。また、1997年に作製された1個体の標本からGj13が検出された。さらに、1930年前後に作製された剥製標本から、これまで大陸由来の個体でのみ報告されていたタイプであるGj8が検出された。しかし、この個体については、採集地点に曖昧な点があり、大陸由来である可能性も否定できない。

以上より、現在のタンチョウ北海道集団では、ミトコンドリアDNAにおける多様性は低く、また、過去約100年間において集団内の遺伝的組成及び多様性に大きな変化がないことが示唆された。これらの結果は、過去の個体数の大幅な減少により、ボトルネックを経験したためであると考えられる。これを検証するためには、ボトルネック以前と考えられるより古い年代のサンプル（出土骨等）を用いた解析を行う必要がある。

表(2)-5 タンチョウ剥製標本の作製年、採集地域及び、ミトコンドリア DNA ハプロタイプ

作製年代	採集地域	ハプロタイプ
1878	千歳	2
1927	釧路	2
1926-36	十勝	8
1960	釧路	2
1971	釧路	2
1983	-	2
1983	-	2
1983	-	1
1983	-	2
1986	釧路	2
1987	野付	2
1987	根室	2
1988	阿寒	2
1991	釧路	2
1992	阿寒	2
1997	-	1
1997	上川	13
2001	釧路	2

採集地域不明はハイフン（−）で示し、ハプロタイプはGj1の場合「1」と表記。

## 2 ）マイクロサテライトを用いた多様性解析

解析に用いた全153個体について、マイクロサテライト9遺伝子座すべての遺伝子型を決定することができた。STRUCTUREを用いたベイジアンクラスタリング解析の結果、遺伝的クラス
ターの数はK=1で最も高い尤度が得られ、北海道集団の全ての個体は一つの遺伝的クラスターにまとまることが示唆された。図(2)-7は、K=2の場合のSTRUCTURE解析の結果を示し、この場合も、すべての個体が一つのクラスターに分配された。

図(2)-7 STRUCTURE解析による各個体の2つのクラスターへの分配確率

表(2)-6 マイクロサテライトによる遺伝的多様性

遺伝子座	十勝 (n=46)	釧路 (n=84)	根室・網走(n=23)
Na	Ar	He	Ho	Na	Ar	He	Ho	Na	Ar	He	Ho
Gj-M8	3	2.87	0.45	0.49	3	2.73	0.42	0.42	3	3	0.27	0.13
Gj-11a	5	4.49	0.68	0.72	6	4.96	0.65	0.63	4	4	0.62	0.61
Gj-M13	4	3.49	0.64	0.75	5	3.55	0.66	0.61	3	3	0.67	0.57
Gj-M15	6	5.38	0.63	0.83	6	5.27	0.56	0.65	4	4	0.45	0.57
Gj-M34	3	3.00	0.56	0.23	3	3.00	0.57	0.39	3	3	0.60	0.17
Gj4066	6	4.97	0.71	0.77	8	5.79	0.68	0.72	6	6	0.66	0.74
Gj1303	2	2.00	0.44	0.47	2	2.00	0.34	0.33	2	2	0.48	0.57
Gpa33	6	5.48	0.66	0.60	9	6.29	0.66	0.69	4	4	0.50	0.57
Gpa34	5	4.36	0.53	0.38	7	5.33	0.65	0.57	5	5	0.69	0.61
平均	4.44	3.95	0.59	0.58	5.44	4.54	0.58	0.56	3.78	3.67	0.55	0.50
標準偏差	1.51	1.78	0.10	0.20	2.40	2.25	0.12	0.14	1.20	1.53	0.14	0.21

n：解析サンプル数、Na：アリル数、Ar：アリル多様度、He：ヘテロ接合度期待値、Ho：ヘテロ接合度観察値。

各地域に特有な対立遺伝子は個体レベルでわずかしか存在せず、アリル多様度やヘテロ接合度でも地域間で大きな差異はみられなかった（表(2)-6）。また、集団化の分化の程度を示す $ F_{ST} $ の値は、いずれの地域集団間の比較においても極めて低く、有意な値を示さなかった（表(2)-7）。これらの結果から、タンチョウ北海道集団においては、地理的な遺伝的構造はなく、画一的な遺伝的組成を有することがわかった。この理由として、過去の個体数減少にもない遺伝的多様性を消失し、少数の祖先から集団が回復したことによるボトルネック効果が示唆され、また、野外調査から推測される個体数の推移もこれを支持する。今後、タンチョウの大陸集団において
て、同じプライマーを用いた研究を行うことで対立遺伝子の共有の有無や、遺伝的多様度の比較、また、集団間の遺伝的分化の程度の調べることが可能である。大陸集団と北海道集団の比較はタンチョウの過去の集団の遺伝的な背景の解明するうえで重要であろう。

表(2)-7 北海道内の地域間における遺伝的分化度 $ (F_{\mathrm{ST}}) $

十勝	釧路	根室・網走
十勝	0.05009	0.10979
釧路	0.00546	0.24136
根室・網走	0.00782	0.0036

対角線の下が $ F_{ST} $ 値、上がP値を示す。 $ F_{ST} $ 値は0から1の値をとり、集団間の遺伝的分化が大きいほど値は1に近づき、小さいほど値は0に近づく。

## 3 ）MHCを用いた多様性解析

次世代シーケンサーを用いた解析によって、解析に用いた153個体のうち、MHCクラスIA遺伝子については151個体、また、MHCクラスIIB遺伝子については全153個体で、高い精度で遺伝子型を決定することができた。

北海道集団全体で、MHCクラスIA遺伝子においては15種類の対立遺伝子が検出され、また、クラスIIB遺伝子においては6種類の対立遺伝子が検出された。1個体あたりの対立遺伝子数は、MHCクラスIA遺伝子で4–11種類、MHCクラスIIB遺伝子で2–4種類であった。このことから、タンチョウのゲノム中には、6遺伝子座以上のMHCクラスIA遺伝子、また、2遺伝子座のMHCクラスIIB遺伝子が存在することが示唆される。一般的な鳥類の野外集団においては、1遺伝子座から数百種類以上の対立遺伝子がみつかることも少なくないことから $ ^{19),20} $ 、これと比較して、タンチョウの北海道集団におけるMHCの多様性は非常に低いと考えられる。

図(2)-8は、3つの地域（釧路、根室、十勝）別に、MHCクラスIA、及び、クラスIIB遺伝子の各対立遺伝子の頻度を示したものである。いずれの遺伝子においても、地域間で対立遺伝子頻度に大きな差はみられなかったことから、タンチョウ北海道集団では、MHC遺伝子においても、遺伝的組成が均質化していることが明らかとなった。このことから、タンチョウ北海道集団では病原体に対する感受性が低下していることが示唆される。現在のタンチョウ北海道集団は、分布域が道東部の狭い範囲に限られている上に、高密度で生息しているため、高病原性の感染症等が発生した場合の集団の絶滅リスクが高いと考えられる。そのため、タンチョウの今後の保全活動においては、MHC遺伝子の多様性も考慮に入れた計画の策定が重要である。
(a) 釧路

(b) 十勝

(c) 根室・網走

(f) 根室·網走

MHCクラスIA対立遺伝子

MHCクラスIIB対立遺伝子

図(2)-8 タンチョウ北海道集団における、MHCクラスIA（a−c）及び、MHCクラスIIB遺伝子（d−f）の対立遺伝子の地域別頻度分布。

## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

本研究開発により、シマフクロウ及びタンチョウの北海道集団について、現在から過去約100年間にわたる遺伝的組成・多様性の変遷を把握することができた。また、最新のシーケンス手法を取り入れた解析により、機能的に重要な遺伝子である、MHC遺伝子の多様性を集団レベルで解明することができた。本研究で新たに開発したプライマーは、他のフクロウ科、あるいは、ツル科鳥類にも応用可能であるため、本研究で用いたその他の解析手法は、他の希少野生動物の保全遺伝学的研究に応用されることが期待される。

## （２）環境政策への貢献

## ＜行政が既に活用した成果＞

本研究によって蓄積されたシマフクロウ北海道集団における遺伝的多様性に関する情報に基づいて、環境省の「シマフクロウ放鳥手順策定ワーキンググループ」において本研究成果の中間発表を行い、従来から重要視されてはいたものの議論する材料がなかった個体の人為的移動やつがい化の計画について、遺伝的要素の具体的な検討材料を提供し、放鳥手順策定の修正補完に重要な役割を果たした。
## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

シマフクロウ、および、タンチョウの今後の保全活動では、遺伝的多様性を考慮した人為的な移入・分散、および、飼育個体の野生復帰の実施が重要になると考えられる。本研究の成果は、これらを実施する上での、遺伝的要素の具体的な検討材料を提供するものであり、移動・分散計画の策定に貢献できる。

シマフクロウについては、地域間の遺伝的交流を促進することにより、集団内の遺伝的多様性が回復することが期待される。現時点では、比較的遺伝的多様性が高く個体数が多い知床集団をソースとして他の集団への人為的移動・分散を行うことが多様性向上・維持のために有効であるのではないかと思われる。また、今後、地域間がつながるような森林の発達を促し、地域の分断化をなくすような対策が必要と考えられる。

タンチョウについては、現時点では、集団の分布域が狭い範囲に限られている上に、高密度で生息しているため、感染症等が発生した場合のリスクが大きいと考えられる。よって、まず、繁殖地や越冬地の分散化を図ることが重要であり、人為的な個体の移動を行う際には、供給源となる個体の地域性を考慮する必要はないと考えられる。

生息域外での種保存のために各飼育個体の遺伝的特徴を把握することが重要であり、本研究で開発された遺伝的多様性分析法及び個体識別法を適用することができる。さらに、飼育下で繁殖に参加させる個体を選定する際の生物学的指標は、本研究で得られた自然集団の遺伝的多様性データに基づいて検討していく必要がある。

## 6 ．国際共同研究等の状況

以下の国際共同研究計画を進めている。

計画名：沿海地方におけるシマフクロウ・タンチョウの多様性に関する共同研究

カウンターパート：セルゲイ・スルマチ研究員、ロシア科学アカデミー生物土壌研究所、ロシア

参加・連携状況：平成24年12月に増田、甲山、表がウラジオストックにあるロシア科学アカデミー生物土壌研究所を訪問し、スルマチ研究員と研究打ち合わせを行うとともに、土壌生物研究所、ロシア極東大学博物館等において鳥類標本の調査を行った。また、北海道大学大学院理学研究院とロシア科学アカデミー生物土壌研究所間の研究協力に関する協定を締結した。現在、ロシア産サンプルのDNA分析を北海道大学で行うため、サンプルの輸送手続きを進めている。

国際的位置づけ：シマフクロウ及びタンチョウは世界でも極東地域にのみ生息する大型鳥類であり、その多様性に関する研究はこれまで行われておらず、本研究は新しい知見をもたらすものと期待できる。
## 7 ．研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

## <論文（査読あり）>

1) K. OMOTE, C. NISHIDA, M.H. DICK and R. MASUDA: Mol. Phylogenet. Evol., 66, 889-897 (2013)

“Limited phylogenetic distribution of a long tandem-repeat cluster in the mitochondrial control region in Bubo (Aves, Strigidae) and cluster variation in Blakiston’s fish owl (Bubo blakistoni)”

2) T. I. KOHYAMA, K. OMOTE, C. NISHIDA, T. TAKENAKA, K. SAITO, S. FUJIMOTO, R. MASUDA: Zoological Lett., 1, 13 (2015)

“Spatial and Temporal Variation at Major Histocompatibility Complex Class IIB Genes in the Endangered Blakistion’s Fish Owl.”

3) K. OMOTE, C. NISHIDA, T. TAKENAKA, K. SAITO, R. SHIMAMURA, S. FUJIMOTO, T. SATO, R. MASUDA: Zoological Lett., 1, 16 (2015)

“Recent Fragmentation of the Endangered Blakiston’s Fish Owl (Bubo blakistoni) Population on Hokkaido Island, Northern Japan, Revealed by Mitochondrial DNA and Microsatellite Analyses.”

## <査読付論文に準ずる成果発表>

特に記載すべき事項はない。

## くその他誌上発表（査読なし）>

特に記載すべき事項はない。

## （2） 口頭発表（学会等）

1) 表渓太、西田千鶴子、Matthew Dick、増田隆一：日本動物学会北海道支部第57回大会（2012）「シマフクロウの系統的位置およびミトコンドリアDNAコントロール領域における巨大な反復配列の進化」

2）表渓太，西田千鶴子，竹中健，齋藤慶輔，志村良治，増田隆一：日本鳥学会2012年度大会(2013)

「絶滅危惧種シマフクロウにおける遺伝的多様性および集団構造の変遷」

3）秋山拓哉，甲山哲生，西田千鶴子，大沼学，百瀬邦和，志村良治，増田隆一：日本動物学会北海道支部第58回大会（2013）

「マイクロサテライト解析によるタンチョウ北海道集団の遺伝的多様性」

4）甲山哲生，表渓太，西田千鶴子，竹中健，増田隆一：日本動物学会北海道支部第58回大会(2013)

「次世代シーケンサーによるシマフクロウMHCのジェノタイピング」

5）表渓太，西田千鶴子，竹中健，齋藤慶輔，志村良治，藤本智，佐藤孝雄，増田隆一：日本鳥学2013年度大会（2013）

「集団遺伝学的解析によるシマフクロウ個体群の歴史的変遷」

6) 表溪太，西田千鶴子，竹中健，齋藤慶輔，志村良治，藤本智，佐藤孝雄，増田隆一：
日本動物学会第84回岡山大会（2013）

「mtDNA分析によるシマフクロウの集団構造変遷の解明」

7) 甲山哲生，表渓太，西田千鶴子，竹中健，増田隆一：日本動物学会第84回岡山大会（2013）「パイロシーケンシング法を用いた絶滅危惧種シマフクロウの主要組織適合遺伝子複合体（MHC）の多様性解析」

8) 甲山哲生、秋山拓哉、表渓太、西田千鶴子、竹中健、大沼学、百瀬邦和、増田隆一：日本生態学会第61回大会(2014)

「シマフクロウのタンチョンチョンにおける主要組織適合遺伝子複合体(MHC)の多様性評価」

「シマフクロウとタンチョウにおける主要組織適合遺伝子複合体(MHC)の多様性評価」

9）秋山拓哉，甲山哲生，大沼学，百瀬邦和，増田隆一：日本動物学会北海道支部第59回大会(2014)

「タンチョウ剥製標本のミトコンドリアDNA解析」

10）秋山拓哉，甲山哲生，西田千鶴子，大沼学，百瀬邦和，増田隆一：日本動物学会第85回仙台大会（2014）

「タンチョウにおけるミトコンドリアDNAの遺伝的多様性と重複」

11）甲山哲生，秋山拓哉，西田千鶴子，大沼学，百瀬邦和，増田隆一：日本動物学会第85回仙台大会（2014）

「ツル目におけるMHC class IIB遺伝子の多型と進化」

12) R. MASUDA : Vth International Wildlife Management Congress, Sapporo, Japan, 2015

“Historical changes of genetic diversity in the Blakiston's fish owl and red-crowned crane populations on Hokkaido”（アブストラクト提出済み）

13) K. OMOTE : Vth International Wildlife Management Congress, Sapporo, Japan, 2015

“Fragmentation of the endangered Blakiston’s fish owl (Bubo blakistoni) population on Hokkaido revealed by genetic analyses on museum samples” (アブストラクト提出済み)

14) T. AKIYAMA : Vth International Wildlife Management Congress, Sapporo, Japan, 2015

“Population Genetic Analyses of Microsatellites and Major Histocompatibility Complex (MHC) Genes in the Endangered Red-crowned Crane on Hokkaido, Japan” (アブストラクト提出済み)

## （3） 出願特許

特に記載すべき事項はない。

## （４）「国民との科学・技術対話」の実施

1) 市民向けシンポジウム「最新技術による動物の進化と歴史の探求」（主催：公益社団法人日本動物学会北海道支部、2013年5月25日、北海道大学総合博物館、観客64名）にて講演

2）市民向けシンポジウム「シマフクロウ・タンチョウを指標とした生物多様性保全：北海道の過去・現在・未来」，2015年2月11日，北海道大学学術交流会館（札幌市）（主催：北海道大学大学院農学研究院・タンチョウ保護研究グループ・北海道大学大学院理学研究院・北海道大学大学院地球環境科学研究院、2015年2月11日、北海道大学学術交流会館、観客約200名）にて講演
## （５）マスコミ等への公表・報道等

1）NHK土曜プラス「シマフクロウふえたけれど」（平成24年12月1日、シマフクロウの遺伝子分析成果を含めて8分ほど紹介）

2）北海道新聞（2014年5月1日、夕刊、半頁、「シマフクロウ 薄れる多様性」）

3）NHKニュース：ほっとニュース北海道（2015年3月25日、シマフクロウ保護に新しい力、サブテーマ1、サブテーマ2、サブテーマ4のシマフクロウ研究を統合した成果を4分ほど紹介）

4）北海道新聞（2015年4月20日、夕刊、「シマフクロウ、タンチョウ道内の生息環境探る」）

## (6) その他

特に記載すべき事項はない。

### 8 \. 引用文献

1) R. FRANKHAM, J. D. BALLOU, D. A. BRISCOE: Introduction to Conservation Genetics. Cambridge University Press, Cambridge, UK (2010)

2) D. SPIELMAN, B. W. BROOK, D. A. BRISCOE, R. FRANKHAM: Conserv. Genet., 5, 439–448, (2004)

“Does Inbreeding and Loss of Genetic Diversity Decrease Disease Resistance?”

3) J. C. AVISE: Phylogeography. Harvard University Press, Cambridge, MA, USA (2000)

4) J. KLEIN: Natural History of the Major Histocompatibility Complex. John Wiley & Sons, New York, NY, USA (1986)

5) J. RADWAN, A. BIEDRZYCKA, W. BABIK: Biol. Conserv., 143, 537–544 (2010) "Does Reduced MHC Diversity Decrease Viability of Vertebrate Populations?"

6) Y. HAYASHI: J. Yamashina. Inst. Ornithol. 31, 45–61 (1999)

“Past and Present Distribution of Blakiston’s Fish Owl (Ketupa blakistoni) in Hokkaido, Japan

Based Upon Museum Specimens –”

7) T. TAKENAKA: Doctoral dissertation, Hokkaido University, Sapporo, Japan (1998)

“Distribution, Habitat Environments, and Reasons for Reduction of the Endangered Blakiston’s Fish Owl in Hokkaido, Japan.”

8) K. OMOTE, C. NISHIDA, T. TAKENAKA, R. MASUDA: Zoolog. Sci., 29, 299–304 (2012) "Temporal Changes of Genetic Population Structure and Diversity in the Endangered Blakiston's Fish Owl (Bubo blakistoni) on Hokkaido Island, Japan, revealed by microsatellite analysis."

9) C. D. MEINE, G. W. ARCHIBALD (Eds.): The Cranes: Status Survey and Conservation Action Plan. IUCN. Gland, Switzerland and Cambridge, UK (1996)

10) O. HASEGAWA, S. TAKADA, M. C. YOSHIDA, S. ABE: Zoolog. Sci., 16, 4, 685-692 (1999) "Variation of Mitochondrial Control Region Sequences in Three Crane Species, the Red-Crowned Crane Grus japonensis, the Common Crane G. grus and the Hooded Crane G. monacha"

11) Y. MIURA, A. SHIOMI, J. SHIRAISHI, K. MAKITA, M. ASAKAWA, T. KITAZAWA, H. TERAOKA: J. Vet. Med. Sci., 75, 43–47 (2013)

“Large-Scale Survey of Mitochondrial D-loop of the Red-crowned Crane Grus japonensis in
Hokkaido, Japan by Convenient Genotyping Method.

“Isolation and Characterization of Major Histocompatibility Complex (MHC) Class II B Genes in the Barn Owl (Aves: Tyto alba).”

13) R. BURRI, H. N. HIRZEL, N. SALAMIN, A. ROULIN, L. FUMAGALLI: Mol. Biol. Evol., 25, 1180–1191 (2008)

"Evolutionary Patterns of MHC Class II B in Owls and Their Implications for the Understanding of Avian MHC Evolution."

14) M. ALCAIDE, S. V. EDWARDS, L. CADAHÍA, J. J. NEGRO: Conserv. Genet., 10, 1349–1355 (2008)

“MHC Class I Genes of Birds pf Prey: Isolation, Polymorphism And Diversifying Selection.”

15) S. A. PAVEY, M. SEVELLEC, W. ADAM, E. NORMANDEAU, F. C. LAMAZE, P.-A. GAGNAIRE, M. FILTEAU, F. O. HEBERT, H. MAAROUFI, L. BERNATCHEZ: Mol. Ecol., 22, 3833–3849 (2013)

16) H. ZOU, H. DONG, W. KONG, J. MA, J. LIU: Anim. Sci. J., 81, 519-522 (2010) "Characterization of 18 Polymorphic Microsatellite Loci in the Red-crowned Crane (Grus japonensis), an Endangered Bird."

17) O. HASEGAWA, Y. ISHIBASHI, S. ABE: Mol. Ecol., 9, 1677-1678 (2000)

“Isolation and Characterization of Microsatellite Loci in the Red-crowned Crane Grus japonensis.”

18) R. BURRI, M. PROMEROVÁ, J. GOEBEL, L. FUMAGALLI: Mol. Ecol. Resour., 14, 778–788 (2014)

“PCR-based Isolation of Multigene Families: Lessons From the Avian MHC Class IIIB.”

19) M. ALCAIDE, S. V. EDWARDS, J. J. NEGRO, D. SERRANO, J. L. TELLA: Mol. Ecol., 17, 2652–2665 (2008)

“Extensive Polymorphism and Geographical Variation at a Positively Selected MHC Class II B Gene of the Lesser Kestrel (Falco naumanni).”

20) M. ALCAIDE, J. MUÑOZ, J. MARTÍNEZ-de la PUENTE, R. SORIGUER, J. FIGUEROLA: Ecol. Evol., 4, 688–698 (2014).

“Extraordinary MHC Class II B Diversity in a Non-passerine, Wild Bird: the Eurasian Coot Fulica atra (Aves: Rallidae).”

21) S. HEBER, J. V. BRISKIE: Conserv. Biol., 24, 1674–1678 (2010)

“Population Bottlenecks and Increased Hatching Failure in Endangered Birds.”

22) G. ATHRE, K. R. BARR, R. F. LANCE, P. L. LENBERG: Evol. Appl., 5, 540–552 (2012) "Birds in Space and Time: Genetic Changes Accompanying Anthropogenic Habitat Fragmentation in the Endangered Black-capped Vireo (Vireo atricapilla)."

23) J. A. JOHNSON, M. R. BELLINGER, J. E. TOEPFER, P. DUNN: Mol. Ecol., 13, 2617-2630
(2004)

“Temporal Changes in Allele Frequencies and Low Effective Population Size in Greater Prairie-chickens.”

“Bottleneck But Long-lived: High Genetic Diversity Retained in White-tailed Eagles upon Recovery from Population Decline.”

25) B. C. MARTINEZ, J. A. GODOY, J. J. NEGRO: Mol. Ecol., 16, 477–486 (2007)

“Population Fragmentation Leads to Spatial and Temporal Genetic Structure in the Endangered Spanish Imperial Eagle.”

26) L. F. KELLER, D. M. WALLER: Trends Ecol. Evol. 17, 230–241 (2002) "Inbreeding Effects in Wild Populations."

27) Y. MIURA, J. SHIRAISHI, A. SHIOMI, T. KITAZAWA, T. HIRAGA, F. MATSUMOTO, H. MASATOMI: J. Vet. Med. Sci., 75, 1241 (2013)

“Origin of Three Red-crowned cranes Grus japonensis Found in Northeast Honshu and West Hokkaido, Japan, from 2008 to 2012.”