Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
図(1)-22 北海道の比較対象地域（黄枠：釧路湿原地域南西部、赤枠：釧路湿原）

表 (1)-6 比較対象地域の面積及び発見個体情報

調查地域	面積( $ km^{2} $ )	調查面積( $ km^{2} $ )	個体	つがい	家族
ロシア (2012)	-	662	153	60	29
ロシア (2013)	590	498	82	33	16
釧路渥原地域南西部 (2012)	-	615	215	81	2
釧路渥原 (2012)	210	-	92	45	0

2014年に北海道釧路湿原とロシアの調査範囲において確認された巣及びつがいについて、比較検討を行った。ここでは、巣・つがい間距離、及び湿原(湿地)の面積当たりの巣・つがい密度を比較項目とした。ここで、北海道の釧路湿原の面積は約210km²、ロシアの調査範囲である湿原の面積は約590km²であった。2014年の北海道とロシアの巣間及びつがい間距離と密度を表(1)-7に示した。ロシアの平均最短巣間距離は、北海道の約1.8倍(Mann-Whitney U test, p < 0.01)であった。また、ロシアの平均最短つがい間距離も、北海道の約2.0倍(Mann-Whitney U test, p < 0.01)であった。したがって、北海道釧路湿原の巣及びつがいは、ロシアの調査湿原のそれと比べて明らかに近い距離に他の巣あるいはつがいが存在した。また、密度に関しても、ロシアの調査湿原と比べて北海道釧路湿原では、3倍以上の密度で巣及びつがいが確認された。

表（1）-7 北海道釧路湿原とロシアの調査湿原における巣及びつがい間の距離と密度

N	平均最短距離(m)	最小(m)	最大(m)	密度(/km²)
巣(北海道)	41	1,475	161	3,806	0.20
巣(ロシア)	34	2,619	1,097	4,978	0.06
つがい(北海道)	53	1,194	161	3,432	0.25
つがい(ロシア)	45	2,405	744	6,426	0.08

2013 年のロシア調査時に撮影した画像から、個体を確認した地点の優占植生を分類すると表(1)-8 のようになった。北海道の釧路湿原とは異なり、スゲが多く見られる湿地であるので、個
体が確認された植生もスゲが多くなった。また、調査時期や時間帯のためか、水生昆虫等の餌が豊富であると考えられる水のある場所（開放水域）で索餌している個体も見られた。

表(1)-8 2013年のロシア・ハンカ湖南東岸湿原における個体確認地点の植生分類

優占植生	スゲ	開放水域	ヨシ	その他
地点数	26	12	9	2

## 2 ）衛星追跡送信機による位置追跡調査及び行動圈解析

2012 年 8 月 3 日から 2013 年 6 月 9 日までの取得された位置情報を図(1)-23 に示した。これらの位置情報を基に 100% 最外郭法で行動圏面積を算出すると、表(1)-9 のようになった。また、位置情報から算出した距離は、越冬地への渡りでは 6 日間で 884km、繁殖地への渡りでは 3 日間で 807km であった。

図 (1)-23 PTT 個体の位置情報

行動圈面積の変化から、ヒナの成長過程や繁殖地周辺での行動について推測することができた。また、位置情報から渡りの中継地についても把握することができた。

表(1)-9 PTT を装着した個体の行動圏面積の変化から推測された状況

期間	行動圈面積(km²)	推測状況
2012年8月3日～9月1日	0.60	飛べないヒナ連れ
2012年9月2日～10月7日	5.30	ヒナが飛行可能
2012年10月8日～11月14日	80.34	繁殖テリトリーを離れ、渡りの準備
2012年11月21日～2013年3月13日	42.99	朝鮮半島で越冬中
2013年3月17日～3月25日	2.07	繁殖地の南西約90kmで休息
2013年3月26日～4月26日	58.11	繁殖地周辺で行動
2013年4月27日～6月9日	3.48	繁殖テリトリーを確保
## 3 ）標識鳥の追跡調査

2012年から2014年に環境省の保護増殖事業の一環として行われた標識調査で標識された個体（ヒナ）とその後の追跡調査結果について、表(1)-10,11,12に示した。2013年にメスへの偏りが見られるが、オス・メスの性比はほぼ1対1で、これまでの調査 $ ^{3)} $ と同様の結果になっていた。また、標識されたヒナが翌年の1～2月まで生存する確率は、過去の調査で平均約75%である。2012年は76%とほぼ平均的な生存率であった。2013年は生死不明の個体があるため、生存率は61～89%となり、過去の平均とそれほど大きく異ならない可能性が示唆されていた。その後の生存確認により、生死不明個体の内、少なくとも3羽は生存していたので、78%以上の生存率であったことが判明した。2014年は生死不明の個体があるものの、生存率は86～96%となり、過去の平均よりも高くなった。したがって、この3年間で標識された個体は、生存率に関して、平年と同様かそれ以上の値となり、個体群に悪影響を与える幼鳥死亡率の悪化は見られなかった。今後も同様の調査を継続することにより、毎年の幼鳥死亡率が把握可能となり、繁殖状況悪化等の異常をすぐに察知できることが期待される。また、すでに標識された個体の追跡情報を組み合わせることで、生存率や繁殖率などの個体群動態を考えるうえでより精度の高い情報を集められる。

表(1)-10 2012年の標識調査結果及び追跡調査結果(2013年2月時点)

十勝	釧路	根室	合計
オス	メス	オス	メス	オス	メス
生存	0	3	6	3	1	0	13
死亡	1	1	0	0	0	2	4
合計	1	4	6	3	1	2	17

表(1)-11 2013年の標識調査結果及び追跡調査結果(2014年2月時点)

十勝	釧路	根室	合計
オス	メス	オス	メス	オス	メス
生存	2	0	1	7	1	0	11
死亡	0	0	0	2	0	0	2
不明	3	1	0	1	0	0	5
合計	5	1	1	10	1	0	18

表(1)-12 2014年に標識された個体の追跡調査結果(2015年2月時点)

十勝	釧路	根室	合計
オス	メス	オス	メス	オス	メス
生存	3	5	9	4	2	1	24
死亡	0	0	1	0	0	0	1
不明	0	1	0	1	0	1	3
合計	3	6	10	5	2	2	28

## 4 ）北海道の過去の繁殖状況の GIS データ整備及び営業地点の植生分類

2002 年と 2012 年の営業地点の植生を分類した (図 (1)-24)。植生分類に有意な差は見られなかった (Fisher’s exact test, P=0.07>0.05) が、「牧草地」に分類された巣数が 2002 年と比較し
て2012年には2倍以上に増加した。ただし、この「牧草地」に分類された営業地点の多くは、実際の牧草地ではなく、牧草地に近い湿地状になった場所であった。つまり、植生図の精度や分類上、「牧草地」に巣が存在したことになったためである。しかし、牧草地周辺で営業していることに間違いはなく、繁殖密度の増加や人馴れなどの影響が考えられた。

図(1)-24 2002年と2012年の営業地点植生割合

## 5 ）北海道における営巣適地モデルの作成

初期値の説明変数として、以下の主な植生を選択した。

・営業地点から半径1km の周辺植生で、合計面積割合が0.5%以上の23植生

・主要な繁殖地域である十勝、釧路、根室の3地方の植生で、合計面積割合が3％以上の9植生

・営巣地点の植生で、6巣(全体の0.5%)以上確認された14植生

これにより、重複した植生を除いた、「ヨシクラス」、「ハンノキ群落」、「牧草地」、「エゾイタヤ-シナノキ群落」、「開放水域」等の25植生を初期説明変数とした。

各メッシュのタンチョウの営業に適する確率 $ p(x) $ は式(1)-1で表わされる。

$$ \log\frac{p(x)}{1-p(x)}= 切片 +\sum 各推定值 \times 各 \times ッシュ内植生面積 \cdot\cdot\cdot 式 (1)-1 $$

ここで、推定値とは表(1)-13のEstimateの値である。例えば、ヨシクラスの Model AとBの推定値は、それぞれ4.42、3.11である。

2km メッシュ内の説明変数である植生面積を、GISソフトウェアを使用して算出した。主要な営業地域である十勝、釧路、根室の3地方の営業メッシュ数は、3カ年で合計469であった。ここでは、以下の2種類のモデルを作成した。

• Model A：非営巣メッシュとして、3地方のメッシュをすべて含む

• Model B：非営巣メッシュとして、3地方のメッシュから森林割合が高いメッシュを除く

Model Bにおける「森林割合が高いメッシュ」については、「ヨシクラス」及び「ハンノキ群落」の湿地植生が存在しない、かつ、「落葉針葉樹植林」や「トドマツ植林」等のメッシュ内面積率が90%以上のメッシュとした。これらに基づき一般化線形モデルを作成すると、各植生の項目は表
(1)-13のようになった。

これらのモデルを用いて、北海道全域における各2kmメッシュの営業適応度を式(1)-1から算出すると、図(1)-25のようになった。主要な営業地である十勝、釧路、根室の3地方以外では、近年分散傾向が見られる道北地域に適応度が高いメッシュが存在したほか、道央地域の湿地・原野がある場所にも営業に適応すると推定されるメッシュが存在した。また、Model AとBでは、適応度が高い地域に関して大きな違いは見られなかった。

表 (1)-13 作成した一般化線形モデルの各植生の推定値、標準誤差、有意確率

Vegetation	Model A	Model B
Estimate	Std. Error	Pr(>|z|)	Estimate	Std. Error	Pr(>|z|)
(Intercept)	-1.15	0.25	3.6e-06	-1.40	0.19	4.2e-13
ヨシクラス	4.42	0.53	2e-16	3.11	0.39	1.6e-15
ハンノキ群落	2.91	0.40	3.5e-13	2.77	0.37	9.5e-14
牧草地	0.35	0.10	0.0005	0.31	0.09	0.0003
塩沼地植生	5.47	2.69	0.04	12.80	0.76	0.05
ヤナギ低木群落	1.46	0.70	0.04	2.18	0.30	0.004
ササ草原	-	-	-	0.89	0.41	0.003
ヤマハンノキ群落	1.22	0.48	0.01	0.95	6.60	0.02
エゾイタヤ-シナノキ群落	0.21	0.11	0.06	-	-	-
落葉針葉樹植林	-0.62	0.188	0.0007	-0.28	0.17	0.09
ハンノキ-ヤチダモ群集	-	-	-	1.18	0.63	0.06
下部針広混交林	-0.70	0.28	0.01	-	-	-
エゾマツ-トドマツ群集	-0.59	0.27	0.03	-0.38	0.25	0.13
ヌマガヤオーダー	-	-	-	9.0e+4	1.3e+6	0.94
トドマツ植林	-0.69	0.41	0.09	-	-	-
ササ-ダケカンバ群落	-4.72	4.06	0.24	-19.2	17.3	0.27
エゾマツ-ダケカンバ群落	-100.58	166.09	0.54	-82.0	102.2	0.42

図(1)-25 北海道全域における各2kmメッシュの営業適応度（左：Model A、右：Model B）

## 6 ）个体群存系统性分析

1990–2012年までのデータに基づき算出した齢段階行列を図(1)-26に示した。この齢段階行列より、個体群成長率は1.044となり、過去の分析時 $ ^{1)} $ の1.051より低い値となった。主な要因として、1齢から2齢までの生存率が0.918から0.903に変化し、個体群サイズと幼鳥数から算出した繁殖率が0.157から0.151に低下したことが考えられる。
Age1	Age2	Age3	Age4	Age5	Age6	Age7	Age8	Age9 +
Age1	0	0	0.151	0.151	0.151	0.151	0.151	0.151	0.151
Age2	0.903	0	0	0	0	0	0	0	0
Age3	0	0.895	0	0	0	0	0	0	0
Age4	0	0	0.890	0	0	0	0	0	0
Age5	0	0	0	0.918	0	0	0	0	0
Age6	0	0	0	0	0.937	0	0	0	0
Age7	0	0	0	0	0	0.940	0	0	0
Age8	0	0	0	0	0	0	0.967	0	0
Age9 +	0	0	0	0	0	0	0	0.965	0.933

図（1）-26 1990-2012年までのデータに基づき算出した齢段階行列

ここでは、以下の3つのシナリオ（S.1-3）に基づき、シミュレーションを行った。

S. 1 繁殖地における環境収容力(K)の限界により個体群成長が抑制される。Kは、現在のつがい数の約20～50%増加できると推定し、1,679と2,043とした。また、気候変動等による繁殖率の低下が起こり、100年後の繁殖率(F)が平均して線形的に0.027～0.041減少する。

S. 2 S. 1の条件下で、事故死亡率(S)が約0.07～0.10%/年で増加する。

S. 3 S. 1及びS. 2の条件下で、20～40年に一度の割合で死亡率が0.18～0.36のカタストロフィが発生する。

このとき、各数値の変動幅で、個体数を減少させる影響が高い方をシビア(s)、低い方をマイルド(m)とした。図(1)-27に平均個体群サイズの100年間の変化を示した。

図(1)-27 シミュレーション結果（左：S.1及びS.2、右：S.3）

Kが十分大きい（K=2,043の場合）と、今回想定したカタストロフィが発生しても100年間に絶滅リスクはないが、最もシビアな条件下では絶滅確率が0.6%であった。また、死亡事故率の増加等により生存率が大きく減少しなければ、環境収容力にしたがって個体数は安定すると考えられる。したがって、絶滅リスクや個体数減少リスクを低下させるためには、

・生存率を減少させる死亡事故の抑制

・環境収容力を維持あるいは増加させるための湿地や不凍河川等の生息地保全や再生

・感染症等のカタストロフィの影響を低減させるために過度の集中化を分散により回避といったことが重要である。
## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

## 1 ）シマフクロウについて

シマフクロウは個体数の増加と分布域の拡大が顕著になってきていることが確認された。また一部地域では個体が高密度化してきていることが明らかになった。

今後シマフクロウの個体群を安定的に存続させるには、繁殖成功率とその阻害要因を把握することが重要であるが、本年度研究により、成功率が15－45%（3年間平均26%）と年変動が激しいという実態と、気象要因及び外敵による捕食が確認された。

また、個体の入れ替わりや、寿命、分散距離に関する知見の蓄積が進み、繁殖成功率と合わせて、今後の個体群動態のシミュレーションを行う場合の基礎的情報が得られた。

各生息地の給餌種は地域的に差が大きく、保全上は地域性への留意が必要であることが明らかになった。特に今まで定量的情報のなかった内陸生息地においての餌種が把握できた。

今まで詳細が明らかになっていなかった環境利用について、簡易な方法による野生個体の安全な捕獲とGPSロガー装着を行うことができ、さらに装着個体による精度の高い位置情報が得られたことで、細かな環境利用が明らかになった。さらに、個体の行動から、単独個体の縄張り維持や他個体への偵察行動などを定期的かつ積極的に行っていることが明らかになった。

本研究では個体数の増加が確認されたが、個体の多い地域では高密度化、個体の頻繁な入れ替わりが確認され、その一方で繁殖成功率は必ずしも高くない。これは若い個体の地域外への分散が円滑に進まず滞留している可能性が考えられ、環境整備が危急であることが明らかになった。

## 2 ）タンチョウについて

これまで定量的な比較が困難であった北海道個体群と大陸個体群の繁殖状況に関して、北海道とロシア・ハンカ湖周辺における調査を複数年行ったことにより、定量的な評価が可能となった。これにより、ロシア・ハンカ湖周辺湿原と比較して、北海道の釧路湿原において明らかに高密度で繁殖（営巣）していることが示された。また、PTT 装着個体の位置情報から、繁殖を行っている個体のほぼ周年の行動圏が明らかとなり、繁殖に必要な湿地面積等の環境パラメータを推定するための基礎的な知見を得ることができた。

標識された個体の確認状況から、個体群サイズに大きな影響を与える幼鳥の死亡率悪化は認められなかった。

2002年と2012年の営業地点の植生から、近年、牧草地のような人間の活動圏に近い場所で巣を造るつがいが増加していることが明らかになった。

タンチョウの営巣適地モデルを繁殖テリトリーサイズに近い2×2kmメッシュで作成することで、これまでよりも詳細なポテンシャルマップを図示することが可能となった。また、主な繁殖地である北海道東部以外の地域で、営巣適応度が高い地域は、北海道北部と中央部に存在することが明らかとなった。同時に、適応度の高い地域が限定的であることも示唆された。

新たなデータを追加した個体群存続性分析の結果から、想定したシナリオでは、繁殖地における環境収容力が十分大きい場合には、100年間の絶滅リスクは存在しないが、最もシビアな条件下では絶滅する可能性があることが明らかとなった。特に、生存率に悪影響を与えるような
要因が発生、あるいは増大すると個体群減少リスクが高くなることが示された。

## （２）環境政策への貢献

## ＜行政が既に活用した成果＞

## 1 ）シマフクロウについて

平成27年2月の環境省シマフクロウ保護増殖検討委員会において、本推進費研究の成果報告を行った。シマフクロウの生息地モニタリング結果から、生息数の増加と分布域の拡大が顕著で1980年代半ばからの環境省の地道な「シマフクロウ保護増殖事業」の成果が出ていることを報告する一方で、繁殖率の低さや、個体の分散が円滑に進んでいないことを報告し、分散促進のための環境整備計画の実施が急務であることを提言した。

平成26年11月に林野庁北海道森林管理局では十勝西部署管内で「シマフクロウ生息環境整備計画現地検討会」を行い、人工林の施業方針や河川の魚類環境整備について意見を交換し、本推進費研究で着目された底性魚類の遡上阻害となる小支流のコルゲート管の段差改良工事を提言し、同12月に試験的改良工事が行われ、経過を観察している。従来、魚類の遡上阻害は大規模ダムや砂防ダム、治山ダム等の河川工作物のみが注目されており、ダムへの魚道設置など改良工事は大規模な予算を伴い設置が進んでいない。一方、林道付帯施設のコルゲート管は無数にあり、設置位置や現状など情報が一切整理されていない状態であるが、本改良事業は小規模で実施が比較的容易であるため、今回の改良工事は工法やコストの検討材料ともしている。効果的に実施されれば、今後の各地の魚類環境が大きく改善されるため、シマフクロウのみならず、生物多様性の観点からも非常に重要な作業である。

本推進費研究ではオス単独個体を捕獲しGPSロガーにより行動や環境利用について詳細に情報が集まっていた。そのため北海道地方環境事務所の「野外つがい形成促進事業」において、メスの放鳥によりつがいの成立が予測され、また以後のモニタリングも可能であることから、放鳥対象地として最も適していることを提言し、平成26年10月に飼育下メスの放鳥を実施し、直後につがいが成立され産卵、孵化に至っている。

## 2 ）タンチョウについて

平成24～26年度タンチョウ保護増殖検討会委員として参画し、生息地分散に係わる事業や情報について、本研究成果を基に意見を述べた。また、平成26年3月に公益財団法人北海道環境財団と環境省北海道地方環境事務所が共催したシンポジウムでは、話題提供及びパネルディスカッションの中で本研究成果を紹介した。さらに、河川防災工事や農地改良等の事業者に対し、事業地及びその周辺に生息するタンチョウに関する情報提供を行い、繁殖等に悪影響を及ぼさないように助言した。

## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

## 1 ）シマフクロウについて

本研究において、環境整備の重要性が指摘されたが、今後は関係機関との連携を強化しながら実施する必要がある。本研究の結果を活用することで、そのための基礎的な情報の解析や具体的な事業展開を図ることが可能である。環境省北海道地方環境事務所では、平成25年策定の
環境省北海道地方環境事務所及び林野庁北海道森林管理局の「シマフクロウ生息地拡大に向けた環境整備計画」を具体的に進めるため、本研究結果の生息分布、生息環境、DNA解析、分布拡大シミュレーションなどの成果を参考に、27年度に具体的対象地域や取り組みを策定する作業部会を設置することになっている。

## 2 ）タンチョウについて

北海道と比較して、自然度が高いと考えられるロシア・ハンカ湖東岸におけるタンチョウの繁殖（生息）状況を明らかにすることにより、この地域のタンチョウの繁殖（生息）環境を解析し、北海道におけるそれと比較することで、北海道のタンチョウの繁殖（生息）状況を定量的に評価することができた。これにより、繁殖地における過度の集中の解消や繁殖適地の保全など、タンチョウを分散させるうえで、自然状態での繁殖を考慮する際に指標となる情報を得られた。

衛星追跡送信機を装着した個体の位置情報を基に、繁殖を行っているタンチョウの行動及び行動圏の把握をすることができ、繁殖地と越冬地間の移動のデータは生息地分散や長距離移動に関する基礎的な知見となった。

現在、北海道のタンチョウは北海道東部に集中しており、今後の繁殖地や越冬地の分散を検討するうえで、生息分布状況は最も基礎となる情報である。北海道における最新の繁殖（生息）分布状況を得ることで、この情報を基に、植生や土地利用の環境解析を行い、分散候補地を抽出することが可能となる。実際に、2012年の営業地点データを使用した北海道における2kmメッシュの営業適地マップ（ポテンシャルマップ）を作成したことにより、これまでよりも詳細な営業適応度の高い場所が明らかとなった。この結果は、繁殖地分散に活用することが期待される。また、越冬地分散を考える上で、繁殖地の近くに越冬地を創出することも方策の一つであるので、越冬地の分散にも役立つ成果である。以上の結果は「タンチョウ生息地分散化行動計画」（生息のための諸条件を改善し、繁殖地及び越冬地の分散を図ることにより、給餌に依存しない個体群を絶滅の危機を回避できる規模まで創出し、タンチョウが自然状態で安定的に存在できるような状態になることを最終的に目指しながら、本計画では道内において生息分散が確実に進むことを目標とする）を順応的管理で実施するために有用なデータであり、このようなモニタリング調査の重要性が確認された。

## 6 ．国際共同研究等の状況

国際共同研究計画名

ロシア・ハンカ湖周辺部におけるタンチョウの繁殖（生息）状況

協力案件名

ロシア・ハンカ湖周辺部における航空機を用いたタンチョウの繁殖（生息）状況調査カウンターパート

氏名 Sergey Surmach

所属 Civic Organization “Amur-Ussuri Center for Avian Biodiversity” in Vladostok

国名 ロシア

参加·連携状況
調査時に航空機（ヘリコプター）に同乗し、タンチョウの生息している場所へのナビゲート及び共同調査を行った。また、調査結果に関する補足・参考意見等の助言を得た。

国際的な位置づけ

現在減少が危惧されている大陸個体群のタンチョウ繁殖地であるロシア・ハンカ湖周辺の繁殖（生息）状況を明らかにすることにより、今後のタンチョウ保全の基礎資料となる。

## 7 ．研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

## <論文（査読あり）>

特に記載すべき事項はない

<査読付論文に準ずる成果発表>

特に記載すべき事項はない

くその他誌上発表（査読なし）>

特に記載すべき事項はない

## （2） 口頭発表（学会等）

1）正富欣之、正富宏之、百瀬邦和：日本鳥学会2012年度大会（2012）「北海道に生息するタンチョウの個体群存続性分析（2012年版）」

3）正富欣之、百瀬邦和、正富宏之：日本鳥学会2013年度大会（2013）「ロシア・ハンカ湖南東部の湿原におけるタンチョウの繁殖状況」

4）竹中健：日本鳥学会2013年度大会（2013）

「シマフクロウの繁殖成功率と阻害要因の検討」

5) Y. MASATOMI, K. MOMOSE, H. MASATOMI, S.G. SURMACH and D.V. KORBOV: 26th International Ornithological Congress, Tokyo, Japan, 2014

“The breeding status of Grus japonensis in Kushiro Marsh, Japan, and the southeast marsh around Khanka Lake, Russia”

6) H. MASATOMI and, Y. MASATOMI: 26th International Ornithological Congress, Tokyo, Japan, 2014

“Detection of vegetation types at nest sites of Grus japonensis in eastern Hokkaido, Japan, by using vegetation maps”

7) T. TAKENAKA: 26th International Ornithological Congress, Tokyo, Japan, 2014 26th International Ornithological Congress, Tokyo, Japan, 2014

“Recovery of Blakiston’s fish owl populations – a positive beginning but a long and
challenging road ahead"

8）正富欣之：日本鳥学会2014年度大会（2014）

「近年の北海道におけるタンチョウの営巣環境は変化したか？」

9) T. TAKENAKA: Vth International Wildlife Management Congress, Sapporo, Japan, 2015 "Frontier of Field Research for Conservation of Blakiston's Fish Owl"（アブストラクト提出済み）

10) Y. MASATOMI: Vth International Wildlife Management Congress, Sapporo, Japan, 2015

"Breeding status of red-crowned crane in Hokkaido: Comparison with the Russian Far East"

(アブストラクト提出済み)

## （3） 出願特許

特に記載すべき事項はない

## （４）「国民との科学・技術対話」の実施

1）正富 欣之：シンポジウム “十勝発。ツルと人との新しい関係。～地域とともに考える。タンチョウ分散の取り組み～” 話題提供（2014年3月1日）「タンチョウって、どんな鳥？～生態と個体数について～」

2）百瀬邦和：東邦大学理学部 OB 会（鶴風会）創立70周年総会・記念式典・祝賀会で講演「タンチョウとはどんな鳥でしょう」タンチョウの生態について研究成果を紹介（2014年6月8日）

3）百瀬邦和：信州野鳥の会の創立 30 周年記念会で講演（2014年6月）

4）百瀬邦和：釧路市民学園講座ふるさと講座「第一回タンチョウの魅力～現状と課題～」で講演（2014年10月26日）

5）竹中健：北海道猛禽類研究会第14回勉強会．各地のシマフクロウの餌内容の違い及び環境利用（GPSロガー個体）．（2014年11月10日，主催：北海道猛禽研究会，札幌市）

6）竹中健：シマフクロウトーク & カフェ～北の国のふくろうや北海道の森をゆったり知る時間～（2014年12月13日、レンタルスペースloopolic、東京世田谷区）

7）竹中健：シマフクロウ講演会「シマフクロウ一神の鳥を科学する」．（2015年1月31日，主催：北海道シマフクロウの会，札幌市）

8）市民向けシンポジウム「シマフクロウ・タンチョウを指標とした生物多様性保全 北海道の過去・現在・未来」，2015年2月11日，北海道大学学術交流会館（札幌市）（主催：北海道大学大学院農学研究院・タンチョウ保護研究グループ・北海道大学大学院理学研究院・北海道大学大学院地球環境科学研究院、2015年2月11日、北海道大学学術交流会館、観客約200名）にて講演

## （５）マスコミ等への公表・報道等

1）北海道新聞（平成24年10月21日、道東版、26頁）

2）NHKニュース:ネットワーク北海道（平成24年11月30日）。

3）NHKニュース:おはよう北海道「シマフクロウふえたけれど」（平成24年12月1日、シマフクロウの遺伝子分析成果、生息環境調査結果を含めて8分ほど紹介）。
4）NHKニュース:おはよう日本「シマフクロウに新たな“危機”」（平成24年12月10日、シマフクロウの遺伝子分析成果、生息環境の調査結果を含めて6分ほど紹介）。

5）NHK北海道：「おはよう北海道 特集 知床 シマフクロウの春」（2013年7月19日、推進費研究で得られた給餌生態やクロテンの被害を放映）

6）NHK全国放送：「さわやか自然百景 知床の清流」（2013年7月21日、推進費研究で得られた給餌生態やクロテンの被害を放映）

7）北海道新聞（2014年1月24日、夕刊、13頁、推進費研究で得られたクロテンの被害を特集）

8）STVラジオ「大貫妙子のone fine day」（2014年4月28日、シマフクロウについて紹介）

9）北海道新聞（2014年5月1日、夕刊、1頁、シマフクロウ遺伝的多様性の現状）

10）産経Web（2014年6月10日、

http://photo.sankei.jp.msn.com/kodawari/data/2014/06/11owl/、シマフクロウのひなに

標識 北海道・道央地方で）

11）北海道新聞（2014年10月9日、36頁、シマフクロウ十勝で放鳥へ）

12）毎日新聞（2014年11月26日、北海道版、シマフクロウ生息域拡大へ）

13）森林総合研究所研究最前線．市民参加の鳥類観察記録から広域分布を読み解くことに成功（2014年12月4日、URL:

http://www.ffpri.affrc.go.jp/research/saizensen/2014/20141204-01.html)

14）NHKニュース：おはよう日本（2015年1月8日、シマフクロウの森を守る—北海道—、シマフクロウの生息地改善のための魚類訴状整備について4分ほど紹介）

15）NHK全国放送（平成27年3月10日、地方発ドキュメンタリー「ツルとヒト共に生きる道」）

16）NHKニュース：ほっとニュース北海道（2015年3月25日、シマフクロウ保護に新しい力、サブテーマ1、サブテーマ2、サブテーマ4のシマフクロウ研究を統合した成果を4分ほど紹介）

17）北海道新聞（2015年4月20日、夕刊、「シマフクロウ、タンチョウ道内の生息環境探る」）

18）NHK北海道:ほっとニュース北海道（2015年4月22日、シマフクロウGPSロガ一個体と放鳥個体のつがい化に伴う繁殖経過（孵化の様子）を紹介）

## (6) その他

1）竹中健：北海道国有林の森林環境保護・保全の取り組み報告会 基調講演（2012）「シマフクロウ保護の取り組み」

### 8 \. 引用文献

1) Y. Masatomi, S. Higashi and H. Masatomi: Population Ecology, Vol. 49, PP. 297-304 (2007) "A simple population viability analysis of Tancho (Grus japonensis) in southeastern Hokkaido, Japan"

2) 正富宏之、正富欣之: 専修大学北海道地域総合科学研究センター報告, Vol.6, PP.73-82(2011)「北海道における40年間のタンチョウの航空調査と繁殖番い発見率」

3）正富宏之，正富欣之，佐藤文雄，百瀬邦和：専修大学北海道地域総合科学研究センター報告，Vol.4，PP.69-75(2009)

「北海道のタンチョウ標識個体における性比」
## （2） 遗伭的多樣性と近交弱勢解析

北海道大学大学院理学研究院

增田 隆一・西田 千鶴子

<研究協力者>

北海道大学大学院理学研究院

甲山 哲生・表 溪太・秋山 拓哉

碳野 清香（平成24～25年度）

井田幸子（平成26年度のみ）

平成24～26年度累計予算額：31,757千円（うち、平成26年度予算額：11,169千円）

予算額は、間接経費を含む。

## [要旨]

絶滅が危惧される種において、野外集団の遺伝的多様性を把握することは、その種の保全を考える上で非常に重要である。シマフクロウとタンチョウは、保護活動により、個体数は現在増加傾向にあるものの、過去に大幅な個体数の減少を経験しており、孤立・分断化した集団内での遺伝的多様性の低下と、近親交配による悪影響が懸念されている。本研究では、両種の北海道集団について、過去から現在までの長期にわたる遺伝的多様性の変動と、集団の成立過程を把握することを目的として、ミトコンドリアDNA、マイクロサテライト及び、免疫関連遺伝子（MHC）を遺伝子マーカーとした系統地理学的・集団遺伝学的解析を行った。古い年代の剥製標本を含めたミトコンドリアDNA分析の結果、シマフクロウでは、かつて道内の広域で遺伝的交流があったことが示唆された。しかし、個体数が最も減少した1980年代以降では、遺伝的多様性の減少とともに、地域集団間で遺伝的分化が生じていることが明らかとなった。同様の傾向は、マイクロサテライト及びMHC遺伝子を用いた分析でも観察された。このことから、シマフクロウでは、生息地の減少と分断化に伴う個体数の減少によって地域集団内の遺伝的多様性が減少し、また、地域間での移動が途絶えたことにより集団間の遺伝的分化が進んだことが示唆された。一方、タンチョウでは、いずれの遺伝子マーカーを用いた分析においても、北海道集団内の遺伝的多様性は極めて低く、地域間での遺伝的組成に差はみられないことが明らかとなった。また、剥製標本を用いたミトコンドリアDNA分析の結果、過去100年間で遺伝的組成及び多様性に大きな変動はみられなかった。以上の結果は、現在のタンチョウ北海道集団が極少数個体から回復した経緯を反映していると考えられる。今後、シマフクロウにおいては、地域間の移動を促進させることで、地域集団内の多様性の回復・維持につながると考えられる。また、タンチョウにおいては、感染症の流行等のリスクを分散するためにも積極的に分布拡大を促すことが重要であると考えられる。

## [キーワード]

遺伝的多様性、ボトルネック、ミトコンドリアDNA、マイクロサテライト、主要組織適合遺伝子複合体（MHC）
### 1. はじめに

近代化にともなう人間活動の急激な拡大によって、多くの野生生物が絶滅の危機にさらされている。人間による土地利用・開発は、野生生物にとって生息可能な地域を劇的に減少させるだけでなく、生息地の分断化や生息環境の悪化を招くことにより、野生生物の集団サイズを減少させ、また、分断化された集団間の遺伝子の移動（遺伝子流動）を妨げることで、時として、種の存続を脅かす結果となる。個体数の少ない集団では、しばしば、遺伝的浮動（偶然による対立遺伝子頻度の変化）や近親交配の影響が大きくなることで、遺伝的多様性が低下することがわかっている。遺伝的多様性の低下が集団の存続性に与える負の影響については、多くの理論的及び実証的研究で報告されている $ ^{1} $ 。集団内の遺伝的多様性の消失は、短期的には、個体の生存力や成長率、また繁殖成功率を低下させ、また、長期的には、環境変動に対する適応能力の低下につながると考えられる。一方、個体の持つ遺伝的多様性は病原体に対する抵抗性に重要な役割を担い、集団内での感染症の流行等を防ぐ効果があることが明らかになってきている $ ^{2} $ 。そのため、絶滅が危惧される種において、野外集団の遺伝的多様性を把握することは、その種の保全を考える上で非常に重要である。

野生生物を対象とした集団遺伝学的研究には、ミトコンドリアDNA制御領域の配列情報やマイクロサテライト（ゲノム上に存在する反復配列の多型）といった、遺伝子としての重要な機能は持たず、進化的に中立である考えられる遺伝子マーカーが頻繁に用いられてきた $ ^{3)} $ 。これらの遺伝子マーカーは、対象種の系統関係や、集団の歴史、集団間の遺伝子流動の程度、さらには、個体識別や親子関係を調べる上で非常に有用である。またミトコンドリアDNAについては、核遺伝子と比較して1細胞内に含まれる遺伝子のコピー数が多いため、出土骨や剥製標本といった比較的年代の古いサンプルも解析を行えるという利点もある。一方で、中立的な遺伝子マーカーにおける遺伝的多様性は、必ずしも、集団の持つ環境変動に対する適応能力を反映しているとは限らない。さらに、保全遺伝学でしばしば焦点となる、過去数十年間といったタイムスケールでの集団サイズの変動は、中立的な遺伝子マーカーにおける多様性に影響を与えるには短すぎる場合が多い。そのため、集団の持つ適応的な遺伝的多様性を測るためには、中立的な遺伝子マーカーだけでなく、機能的に重要な遺伝子をマーカーとした分析を行う必要がある。

主要組織適合遺伝子複合体（Major histocompatibility complex, MHC）は脊椎動物の免疫反応に関わる遺伝子領域、あるいは遺伝子群である。MHCには、病原体由来の抗原ペプチドと結合し抗原提示を行う膜タンパク質をコードする遺伝子（MHC class I, II遺伝子）が含まれる。これらの遺伝子は、一般的に他の遺伝子と比べて、集団・個体レベルで非常に高い多様性を示すことが知られている $ ^{4} $ 。MHC遺伝子における高い多様性は、様々な病原体に対する適応であり、自然選択（平衡選択）によって維持されていると考えられている。一方で、過去に集団サイズの大幅な減少（ボトルネック）を経験した集団では、MHC遺伝子においても多様性の低下が観察されることがある $ ^{5} $ 。MHC遺伝子における多様性の低下は、病原体に対する抵抗性を低下させ、集団の絶滅リスクを高めると考えられる。そのため、絶滅危惧種の保全を目的とした、人為的移動・分散や、保護下での繁殖及び野生復帰プログラムにおいては、保全遺伝学的な観点から、ミトコンドリアDNA配列やマイクロサテライトといった、中立的な遺伝子マーカーに加えて、MHC遺伝子における多様性も考慮に入れた計画を立てることが重要である。

シマフクロウ（Bubo blakistoni）及び、タンチョウ（Grus japonensis）は、日本では北海道にの
み分布する大型鳥類であるが、両種ともに、20世紀以降の人間活動による生息地の破壊や分断化によって過去に大幅な個体数の減少を経験している。

シマフクロウは、かつて北海道全域に広く分布していたと考えられるが、北海道南部では1950年代以降、北部では1970年代以降に生息が確認されておらず、現在では主に東部地域に生息するのみである $ ^{6} $ 。個体数は1970年代から1980年代にかけて特に少なくなり、北海道全体で100個体以下となったと推定されている $ ^{7} $ 。1980年代以降の人工給餌や巣箱設置を中心とした保護活動の結果、現在では、約140羽まで個体数が回復したことが野外調査によって観察されている。これまでに我々が行ったマイクロサテライトを用いた研究から、近年のシマフクロウ北海道集団では、遺伝的多様性が低下していること、地域集団が遺伝的に分化していることが示唆されている $ ^{8} $ 。この原因としては過去の個体数の減少に伴うボトルネック効果が考えられるが、それを示すためには集団サイズ減少の前後の集団の遺伝的多様性の比較が必要である。

タンチョウはユーラシア大陸東部に生息する大陸集団と日本の北海道に生息する北海道集団の2つの地理的集団に分かれている⁹)。大陸集団はロシアの東シベリアや、中国北東部などに分布し繁殖地と越冬地間の長距離移動を行うが、北海道集団は渡りをせずに北海道内の限られた地域に周年生息している。タンチョウは、かつて日本全体で多くの個体が観察されたが、19世紀末までに、乱獲や開発などによる生息地減少により個体数が激減し、一時、国内では絶滅したと考えられていた。1920年代に釧路湿原で再発見されたものの、1952年にはわずか33羽しか確認されなかった。その後、給餌や生息地の保全などによる保護活動により個体数は回復傾向にあり、現在では、北海道東部に約1500羽が分布している。ミトコンドリアDNAの制御領域の塩基配列情報を用いた先行研究では、近年の北海道集団からはハプロタイプが2つのみしか確認されず、遺伝的多様性が大陸集団に比べて低いことが示されている¹⁰,¹¹。しかし、タンチョウ北海道集団における、集団レベルでの遺伝的多様性の知見はミトコンドリアDNAの制御領域での解析に留まり、且つ近年の個体を用いた研究しか行われていない。タンチョウの保護を考える上で、複数のマーカーを用いた、さらに詳細な遺伝的情報の蓄積が急務である。

## 2 ．研究開発目的

本研究では、以下の3つを主な目的とした。

（1）シマフクロウとタンチョウの現在の北海道集団について、ミトコンドリアDNA、マイクロサテライト、及び、免疫関連遺伝子（MHC）を遺伝子マーカーとした系統地理学的・集団遺伝学的解析により、遺伝的多様性の程度と地理的な遺伝的構造について把握する。

（２）近年のサンプルより得られたDNAの解析に加えて、全国の博物館等に保管されている剥製標本や出土骨といった古い年代のサンプルのDNAの解析を行うことにより、ボトルネック以前から現在までの長期にわたる遺伝的多様性の変動と集団の成立過程を解明する。

（３）これらのデータに基づき、人為的移動・分散や保護下での繁殖及び野生復帰プログラム等、両種の今後の保全計画への提言を行う。

### 3. 研究開発方法

（１）シマフクロウの遺伝的多様性

1）解析に用いたサンプル及び、DNAの抽出
1963年から2012年にかけて、標識調査の際に採取された血液（主に生後1年以内の幼鳥）、または皮膚組織由来の繊維芽細胞等、合計405個体のサンプルについて、DNeasy Blood & Tissue Kit（Qiagen）を用いてゲノムDNAを抽出した。血液サンプルは抗凝固処理を行った状態、または濾紙に吸着・乾燥させた状態で-20℃で凍結保存し、繊維芽細胞は液体窒素中で凍結保存したものを用いた。また、全国の博物館等に収蔵されていた剥製標本計31個体から得られた羽毛、または、皮膚サンプルからQIAamp DNA Micro Kit DNA（Qiagen）を用いてゲノムDNAを抽出した。外来DNAの混入を避けるために、年代の古いサンプルのDNA抽出は、新鮮なサンプルとは別の実験室において空気清浄化したクリーンベンチ内で行った。各個体は採集地点に基づき、知床、根釧、阿寒、十勝、日高、石狩（現在ではシマフクロウは生息していない）の6つの地域集団に分けて解析を行った。またシマフクロウの世代期間を考慮し、8年毎または16年毎に期間を区切って解析を行った（表(2)-1）。

表(2)-1 シマフクロウ北海道集団のDNAサンプルの採集地点と年代。

年代	探集地域	合計
石狩	日高	大雪	阿寒	根釧	知床
1964年以前	[6]	1 [1]	[3]	[3]	[2]	16
1965-1980	[1]	[2]	3	3	1 [6]	16
1981-1988	[1]	2	3 [1]	7 [1]	4 [3]	22
1989-1996	1	17	12	21 [1]	29	81
1997-2004	25	21	36	44	126
2005-2012	17	29	20	39	70	175
合計	6	22	78	63	108	159	436

括弧無し：血液サンプルまたは培養細胞サンプル、括弧有り：剥製標本。

## 2 ）ミトコンドリアDNA配列を用いた多様性解析

ミトコンドリアDNAは核DNAに比べて進化速度が早く集団内の個体間に生じた遺伝的差異を比較することが可能である。ミトコンドリアDNAは母系遺伝するため、兄弟関係にある個体を除いた116個体の組織あるいは血液サンプルを分析に用いた。また、31個体の剥製標本についても分析に用いた。ミトコンドリアDNA制御領域の部分配列（590bp）の塩基配列を決定した。標的のDNAは表(2)-2のプライマーセットを用いたPCR反応によって増幅した。古いサンプルのDNAはより短い断片（78–148 bp）に分けて増幅を行った。100 bp以下の短い断片については、ダイレクトシーケンスの際に、解析がしやすいようにアクセサリー配列（M13プライマー配列）を付加したプライマーセットを用いてPCR増幅を行った。PCR反応液は全量で20μlとし、その組成はGXL DNA Polymerase (5 units/μl；TaKaRa)を0.2μl、5×Reaction bufferを4.0μl、dNTPを1.6μl、2種のプライマー(10 pmol/μl)を各0.5μl、DNA抽出液を1.0μl、蒸留水を12.2μlとした。この反応液について熱変性（94℃/3分）を1回行い、引き続き、熱変性（94℃/1分）、アニーリング（55～60℃/1分）、DNAの伸長（72℃/1分）を1サイクルとして40サイクル繰り返し、最後に72℃で10分間の伸長反応を行った。PCRにはTaKaRa Thermal Cycler TP-600を用いた。PCR産物は
QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen)を用いて精製し、シーケンス反応の鋳型として用いた。シーケンス反応は、BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit (Life Technologies)を用いて行い、ABI PRISM 3730 DNA Analyzer（Life Technologies）により塩基配列を決定した。

得られた塩基配列のアライメントはMEGA 5.0を用いて行った。ハプロタイプ多様度（h）、ヌクレオチド多様度（ $ \pi $ ）、地域間の遺伝的差異（ $ F_{ST} $ ）はARLEQUIN 3.5.1.2を用いて算出した。また、集団内における遺伝的な階層構造を明らかにするため、ARLEQUINを用いて、Analysis of Molecular Variance（AMOVA）解析を行った。

表(2)-2 ミトコンドリアDNA制御領域増幅用のプライマー

プライマー	塩基配列 (5'-3')	参考文献
L16728	CCAAGGTCTGCGGCTTGAAAAG	8)
Hcontrol-03-kb	TGAAGAGTTATGGTTTAGGTACG	8)
Hcontrol-05-kb	GGGCATTAATGTCATGAAATTAG	This study
Lcontrol-06-kb	TACTAATCCATGCACTAATCCC	This study
Hcontrol-07-kb	GCCATGGATTGGAGTATTAATAG	This study
Lcontrol-08-kb	CAGTTGTACATTAAACCATCTAC	This study
Hcontrol-09-kb	GGCATGGATGTTATATCTTGGTG	This study
Lcontrol-12-kb	GTACTAATCACATACAATTCATG	This study
Lcontrol-14-M13f	GTAAAACGACGGCCAGCCATTAATGTGCTACGTATATAC	This study
Hcontrol-15-M13f	GTAAAACGACGGCCAGATGGGATTAGTGCATGGATTAG	This study
Lcontrol-16-M13f	GTAAAACGACGGCCAGCCTATTCATGACAGAACGACA	This study

下線はM13-forwardプライマー用のアクセサリー部位を示す。

## 3 ）マイクロサテライトを用いた多様性解析

マイクロサテライトは核DNAに存在する数塩基の繰り返し配列であり、高い多型性を示すため、集団遺伝学的研究に用いられている。計407個体について、マイクロサテライト7遺伝子座について遺伝子型を決定した。一方を6-FAM、NED、PET、VICのいずれかの蛍光色素で標識したプライマーセットを用いてPCR反応を行った。PCR反応液は全量で10μlとし、その組成は、rTaq DNA Polymerase（5 U/μl; TaKaRa）を0.1μl、10×Bufferを1.0μl、2mM dNTPsを0.8μl、非修飾及び蛍光標識プライマー（5 pmol/μl）を各0.1μl、DNA抽出液1.0μl、蒸留水を6.9μlとした。この反応液について熱変性（94℃/3分）を1回行い、引き続き、熱変性（94℃/1分）、アニーリング（52℃または60℃/1分）、DNAの伸長（72℃/1分）を1サイクルとして30～35サイクル繰り返し、最後に72℃で10分間伸長反応を行い、PCR産物を得た。PCR産物の分子サイズを、ABI PRISM 3730 DNA Analyzer（Life Technologies）を用いて測定した。サイズマーカーにはGeneScan 600 LIZ Dye Size Standard（Life Technologies）を用いた。得られた波形データを、GENEMAPPER 4.0により解析し、各個体の遺伝子型を決定した。

ハーディー・ワインベルク平衡からの逸脱、連鎖不平衡、ヘテロ接合度の期待値 $ \left(H_{\mathrm{e}}\right) $ 及び観察値 $ \left(H_{\mathrm{o}}\right) $ について、ARLEQUIN3.5を用いて求めた。また、アリル多様度（Allelic richness,
Ar）、及び、均衡係数（ $ F_{IS} $ ）はFSTAT 2.9.3を用いて算出した。過去40年間にわたる、有効集団サイズの変化について、NeEstimeter 2.01を用いて、moment method及びtemporal methodで推定した。ボトルネックの際に見られるヘテロ接合度の期待値と観察値のずれをBOTTLENECK 1.2.0.2を用いて検出した。遺伝的クラスターの数を推定するため遺伝的クラスター数（K）=1-7についてSTRUCTURE 2.3を用いてベイジアンアクラスタリング解析を行った。ヘテロ接合度の観察値（ $ H_{0} $ ）の今後50年間の変動を推定するため、北海道の地域集団が孤立している場合及び集団間で交流のある場合について、BOTTLESIM 2.6.1を用いてシミュレーションを行った。

## 4 ）MHCを用いた多様性解析

MHC遺伝子は、一般的に重複進化によってゲノム中に複数遺伝子座存在するため、従来のシーケンス技法では、大量サンプルの遺伝子型決定（ジェノタイピング）は困難であった。そこで、本研究では、次世代シーケンサーを用いた解析手法を取り入れることで、シマフクロウ北海道集団におけるMHCクラスIIB遺伝子の網羅的ジェノタイピングを行った。

解析に用いるプライマーを開発するため、異なる地域・年代から複数個体のDNAサンプルについて、フクロウ類のMHCクラスIIB遺伝子の保存的な領域に設計されたプライマー $ ^{12)} $ ， $ ^{13)} $ ， $ ^{14)} $ を用いて予備的なPCR増幅を行い、クローニング後、ダイレクトシーケンス法により塩基配列を決定した。得られた配列情報から、シマフクロウのMHCクラスIIB遺伝子のexon2領域に特異的に増幅するプライマー（BublIIb2F:5'-GAGTTCAGYACCTYRAYRG-3';BublIIb2R:5'-CTTTCYTCTSCSTAYYWAGG-3'）を開発した。

1968年から2012年までに北海道各地で集められた200個体のDNAサンプルについて、MHCクラスIIB遺伝子領域の部分配列（203 bp）をPCR増幅した。PCRを行う際には、上記プライマー配列に加えて、次世代シーケンサー用のアダプター配列、及び、個体識別用のタグ配列を組み合わせたフュージョンプライマーを用いた。PCR反応液は全量25μlで、GXL DNA Polymerase (5units/μl；Takara)を0.5μl、5×GXL bufferを5.0μl、dNTPを2.0μl、プライマー（25pmol/μl）を各1.0μl、DNA抽出液を1.0μl、蒸留水を14.5μlとした。この反応液について熱変性（98℃/10秒）、アニーリング（58℃/10秒）、DNAの伸長（68℃/30分）を1サイクルとして28サイクル繰り返した。各サンプルより得られた、PCR産物は、MinElute PCR Purification Kit（Quiagen）で精製後、アガロース電気泳動によりDNA濃度を測定後、等分子量に混合し、次世代シーケンサー（Roche GS FLX+）により、塩基配列決定を行った。解析は、GS FLX Titanium Sequencing Kit XLR70 (Roche)を用い、1/4スケールで行った。

得られたシーケンスデータから、ngs_genotyping 0.9.0 $ ^{15)} $ を用いて、各個体のジェノタイピングを行った。年代・地域間での遺伝的多様性を比較するため、ブートストラップ法によりアリル多様度（Ar）を計算した。また、遺伝子型データに基づいて、個体間のMHC遺伝子型の非類似度（Jaccard distance）を計算し、多次元尺度構成（non-metric multidimensional scaling, NMDS）により各地域集団の遺伝的多様性の程度を比較した。

## （２）タンチョウの遺伝的多様性

## 1 ）解析に用いたサンプル及び、DNAの抽出

2006年から2014年に採集された、バンディング調査時の捕獲個体、傷病保護個体の血液サン