Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
3 時間泳動した。泳動の終了したゲルを SYBR Gold で 30 分間染色し、蒸留水で 30 分脱色後、撮影装置で撮影した。

## (5) 地下水中微生物からの VOC 分解に関与する遺伝子の検出

検体中に VOC 分解細菌が存在しているか確認するため、表 3.3.7 に示す遺伝子を Conventional-PCR 及び Real Time-PCR で検査した．反応液組成及び反応条件は，各参考文献に従って実施した。

表 3.3.7 標的とした VOC 分解遺伝子と Primer Set

Primer set	target	Reference
ALK1	alkan hydroxylase	alk B	2)
ALK2	alkan hydroxylase	alk M	2)
ALK3	alkan hydroxylase	alk B1	2)
NAH	Naphthalene dioxygenase	nahAc, doxB, ndoC2, pahAc, pahA3, nahA3, nagAc, dntAc, phnAc, narA	3)
TOD	Toluene dioxygenase	todC1	3)
Benzene dioxygenase	bedC1
Chlorobenzene dioxygenase	tcbAa
TOL	Xylene monooxygenase	xylM, ntnM	3)
Subfamily 5 of hydroxylase component of two-component side chain mono-oxygenases
BPH1	Biphenyl dioxygenase	bphA, bphA1, bpdC1	3)
BPH2-4	Biphenyl dioxygenase	3)
RMO	Toluene monooxygenase	tmoF, tbuA1, tbhA, tbmD, bmoA	3)
RDEG	Toluene monooxygenase	3)
PHE	Phenol monooxygenase	dmpN, phhN, poxD, Phenol hydroxylase alpha subunit	3)
TBMD	Subfamily 1 of alfa-subunit of hydroxylase component of multicomponent mono-oxygenases	4)
TMOA	Subfamily 2 of alfa-subunit of hydroxylase component of multicomponent mono-oxygenases	4)
XYLA	Electron transfer component of two-component side chain mono-oxygenases	4)
TODC1	Subfamilies D.1.B, D.1.C, D.2.A, D.2.B, and D.2.C of -subunits of type D iron-sulfur multicomponent aromatic dioxygenases	4)
XYLE	Subfamily 1.2.A of catechol extradiol dioxygenases	4)
XYLE2	Subfamily 1.2.B of catechol extradiol dioxygenases	4)
CDO	Cdo (U01826) of subfamily 1.2.C of catechol extradiol dioxygenases	4)
TBUE	TbuE (U20258) of subfamily 1.2.C of catechol extradiol dioxygenases	4)
TODE	TodE (Y18245), TodE (Y18245), and TobE (AF180147) of subfamily 1.3.B of catechol extradiol di	4)
tceA	reductive dehalogenase	TCE→DCEs, DCEs→VC, VC→Ethylene	5)
vcrA	reductive dehalogenase	DCEs→VC	5)
bvcA	reductive dehalogenase	VC→Ethylene	5)

## 【参考文献】

1) 篠田吉史, 加藤暢夫, 森田直樹, (2000) 16S rRNA 遺伝子解析による細菌の系統分類, 島津評論, 57, 121-132.

2) Kohno, T., Y. Sugimoto, S. Kazunari, et al., (2002) Design of PCR Primers and Gene Probes for General Detection of Alkane-Degrading Bacteria. Microbes Environ., 17, 114-121.

3) Baldwin, B. R., C. H. Nakatsu, and L. Nies. (2003) Detection and Enumeration of Aromatic Oxygenase Genes by Multiplex and Real-Time PCR. Appl. Environ. Microbiol., 69, 3350-3358.
4) 秋山恭子, 紋川亮. (2009) バイオレメディエーションに向けた遺伝子解析による VOC 分解菌のプロファイリング, 都産技研年報, 4, 12-15.

5) Holmes, V. F., J. He, P. K. H. Lee, et al., (2006) Discrimination of Multiple Dehalococcoides Strains in a Trichloroethene Enrichment by Quantification of Their Reductive Dehalogenase Genes. Appl. Environ. Microbiol., 72, 5877-5883.
#### 3.3.3 研究結果及び考察

(1) 地下水中の微生物による汚染物質分解培養試験

(a) 好気性条件での VOC 添加分解培養試験

a1）ベンゼンとトルエン添加分解培養試験

B7-2 地下水での試験結果を図 3.3.4～図 3.3.7 に示す。B7-2 地下水にベンゼン、トルエンを約 5mg/L 加えて好気性条件で培養すると、それらは 48 時間後には分解され、検出下限値 (0.001mg/L) 以下となった。ブランク (BL) はサンプリング操作等による VOC 損失の確認用であるが、試験中は添加した VOC が試料水中に保持されていることが判る。培養 48 時間後の培養液の濁度 (WL=620nm) 測定では、ベンゼンとトルエンを添加したものは微増、添加無しのものは微減を示した。同じ検体での蛍光染色法による菌数測定では培養後の検体で菌数が増加した結果となっており、好気条件の培養及びベンゼン、トルエンの添加でそれらを炭素源とする菌数が増加し、それら増加した菌によりベンゼン、トルエンの分解が進んだと考えられた。菌叢解析の結果から培養により Betaproteobacteria が増加していることが判る。B7-2 地下水にも 4 割程度 Betaproteobacteria が存在していたが、培養後は約 8 割にまで増加していることから、Betaproteobacteria に属する菌がベンゼン、トルエンの分解に関与したと考えられる。

オ-2 地下水を用いた試験の結果を図 3.3.8～図 3.3.11 に示す。オ-2 の地下水では試験開始後、約 36 時間でベンゼン、トルエンの濃度の急激な低下が始まり、約 48 時間後にベンゼン、トルエンが分解され検出下限値以下となった。図 3.3.9 に示した培養中の濁度測定結果では、ベンゼン、トルエンの濃度低下がみられた時間帯に濁度の上昇が確認された。また、培養前と培養 60 時間後の検液の蛍光染色法による全菌数測定の結果からも、VOC を添加した試料では明らかに菌数が増加していることが確認できた。さらに、培養前と培養 60 時間後の菌叢解析を行ったところ、VOC を添加した試料では Gmaproteobacteria が 9 割以上を占める菌叢となっていた。

B7-2 とオ-2 地下水ではベンゼン、トルエンの分解傾向に違いが見られた。B7-2 地下水では、ベンゼン、トルエン濃度は培養開始直後から分解が始まっていると考えられ、オ-2 地下水では培養36 時間までは BL と同様の濃度変化を示していることから、それまではほとんど分解は見られず、36 時間から48 時間の間に分解されている。B7-2 地下水では、ベンゼンは環境基準(0.01mg/L)を超える濃度、また、トルエンは0.07～0.10(mg/L)、キシレンについても0.05～0.09(mg/L)の濃度で検出されていることから、BTX がもともと比較的高濃度で残留しており、それらを資化する細菌が存在していたと考えられる。そのため、培養試験でベンゼン、トルエンを添加した場合でも、菌にとっての環境変化は少なく、定常状態でそれらを分解したものと考えられる。一方、オ-2 地下水では、過去にはベンゼンが環境基準を超えて検出されていたが、現在、環境基準以下の低い濃度で残留しており、トルエン、キシレンも検出下限値以下である。そのことから、ベンゼン、トルエンの添加による環境変化により、それらを資化する細菌が36 時間の誘導期の後、対数増殖期となり急激なベンゼン、トルエンの減少及び菌数の増加が見られたと考えられる。また、クローンライブラリー解析により、B7-2 地下水ではBetaproteobacteria に属するComamonas sp.が分解前後で多い存在割合を示しており、オ-2 地下水では分解後の検体でGammaproteobacteria に属するAcinetobacter sp.が約9 割を占める菌叢となっていることが判った。このことから、
B7-2 では Comamonas sp. が定常的に BTX を分解しており、オ-2 ではベンゼン、トルエンの添加がそれらを資化する Acinetobacter sp. の対数増殖をもたらしたと考えられた。

分解培養試験検体の DGGE 結果を図 3.3.12 （B7-2 地下水での培養試験）と図 3.3.13（オ-2 地下水での培養試験）に示す。B7-2 地下水にベンゼン、トルエンを添加した系では 12 時間から 60 時間まででバンドに変化が見られなかったものの、添加しない系の 48 時間目からバンドパターンに変化が見られた。オ-2 地下水ではベンゼン、トルエンを添加しない系のバンドパターンが 12 時間目から 60 時間目まで大きな変化を示さなかったが、添加した系では 12 時間目のバンドパターンはコントロールのものと似たバンドパターンを示したが、48 時間目にバンドパターンが変化し、60 時間後までそのパターンが維持されていることが判る。今回の培養試験では、B7-2 の地下水からはベンゼン、トルエンが検出されていたが、オ-2 の地下水からはベンゼン、トルエンが検出されていなかった。そのことが DGGE のバンドパターン変化に違いが生じた要因と考えられた。B7-2 の地下水の試験ではベンゼン、トルエンを添加した系で菌叢変化が少なく定常状態を維持し、添加無しの系で、炭素源となるベンゼン、トルエンの供給がなくなり菌叢に僅かであるが、変化が見られた。一方、原水中にベンゼン、トルエンがほとんど存在しなかった、オ-2 の地下水の試験では、添加なしの系では菌叢に変化が見られず、ベンゼン、トルエンを添加した系で 48 時間後に分解菌の対数増殖期への移行により菌叢に大きな変化が見られたと考えられ、クローンライブラリーの菌叢解析、濁度測定及びベンゼン、トルエン濃度測定の実験結果とも一致する結果となった。

また、DGGE 解析だけでは明瞭な結果を得ることは難しいが、DGGE 各バンドの遺伝子配列を明らかにし、多変量解析、系統樹作成などの手法を用いて、さらなる解析を加えることによりクローンライブラリー法と同等の結論が導き出せる可能性も示唆された。
図 3.3.4 ベンゼン、トルエン分解試験での濃度変化

図 3.3.5 ベンゼン、トルエン分解試験の 培養液の濁度変化

図 3.3.6 ベンゼン、トルエン分解試験前後の菌数（蛍光染色法）

図 3.3.7 ベンゼン、トルエン分解試験前後の菌叢(class level)
図 3.3.8 ベンゼン、トルエン分解試験での濃度変化

図 3.3.9 ベンゼン、トルエン分解試験の 培養液の濁度変化

図 3.3.10 ベンゼン、トルエン分解試験前後の菌数（蛍光染色法）

図 3.3.11 ベンゼン、トルエン分解試験前後の菌叢(class level)
図 3.3.12 B7-2 地下水を用いたベンゼン、トルエン分解試験の DGGE 解析

図 3.3.13 オ-2 地下水を用いたベンゼン、トルエン分解試験の DGGE 解析
## a2）ジクロロメタン添加分解培養試験

地下水にジクロロメタンを添加し、菌による分解能を調べたジクロロメタンの濃度変化を図3.3.14に示す。オ-2地下水を用いた試験では4週間培養実施後もジクロロメタンの有意な低減は見られなかったが、B7-2地下水では培養13日から21日の間に分解により、ジクロロメタン濃度の急激な低下が見られた。また、ジクロロメタンの低減が見られた検体に、ジクロロメタンを約10mg/L濃度になるように追加したところ、2日後にはジクロロメタンのピークが見られなくなることからも、菌により分解されたものと考えられる。同じ北側の第2帯水層の上流側地下水から、好気性細菌でジクロロメタンデハロゲナーゼを有することで知られている $ ^{1} $ 、Methylophilus sp.が確認されていることから、その菌により分解されたとも考えられる。現在、菌の単離操作を行っている。

図 3.3.14 ジクロロメタン分解試験での濃度変化

## a3）温度勾配培養によるベンゼン、トルエン添加分解培養試験(B7-2 地下水で実施）

各温度でのベンゼン、トルエンの分解能について確認するため、温度勾配培養試験を実施した。結果を表3.3.8に示す。ベンゼン、トルエンの分解は25℃～36℃の温度範囲で最も速く進むと考えられる。毎月の地下水調査結果から、北側第2帯水層地下水は13℃～23℃、南側第三帯水層地下水は15℃～19℃の温度であり、現場温度条件でベンゼン、トルエンの微生物分解が進む温度条件であることが判る。地下水温が15℃程度以下となる1～3月期の北側第2帯水層では、ベンゼン、トルエンの微生物による分解活性が低下するとも考えられた。
表 3.3.8 ベンゼン、トルエン添加分解培養試験結果表

(ベンゼン添加試験)

サンプルNo.	培養温度(℃)	1	2	3	4	5	8
1	8.4	○	○	○	○	○	○
2	9.6	○	○	○	○	○	○
3	10.7	○	○	○	○	○	×
4	12.5	○	○	○	○	○	×
5	13.7	○	○	○	○	△	×
6	15.0	○	○	○	○	×	×
7	16.7	○	○	×	×	×	×
8	18.0	○	○	○	×	×	×
9	19.5	○	○	×	×	×	×
10	20.9	○	△	×	×	×	×
11	22.6	○	○	×	×	×	×
12	23.9	○	△	×	×	×	×
13	25.3	○	×	×	×	×	×
14	26.7	○	×	×	×	×	×
15	28.2	○	×	×	×	×	×
16	29.6	○	×	×	×	×	×
17	30.9	○	×	×	×	×	×
18	32.7	○	×	×	×	×	×
19	33.9	○	×	×	×	×	×
20	35.5	○	×	×	×	×	×
21	36.9	○	×	×	×	×	×
22	38.7	○	○	△	×	×	×
BL1	40.6	○	○	○	○	○	○
BL2	42.4	○	○	○	○	○	○

(トルエン添加試験)

サンプルNo.	培養温度(℃)	1	2	3	4	5	8
1	8.4	○	○	○	○	○	○
2	9.6	○	○	○	○	○	△
3	10.7	○	○	○	○	○	×
4	12.5	○	○	○	○	△	×
5	13.7	○	○	○	○	×	×
6	15.0	○	○	○	○	×	×
7	16.7	○	○	×	×	×	×
8	18.0	○	○	△	×	×	×
9	19.5	○	×	×	×	×	×
10	20.9	○	×	×	×	×	×
11	22.6	○	○	×	×	×	×
12	23.9	○	△	×	×	×	×
13	25.3	○	×	×	×	×	×
14	26.7	○	×	×	×	×	×
15	28.2	○	×	×	×	×	×
16	29.6	○	×	×	×	×	×
17	30.9	○	×	×	×	×	×
18	32.7	○	×	×	×	×	×
19	33.9	○	×	×	×	×	×
20	35.5	○	×	×	×	×	×
21	36.9	○	×	×	×	×	×
22	38.7	○	○	△	×	×	×
BL1	40.6	○	○	○	○	○	○
BL2	42.4	○	○	○	○	○	○

## (b) 嫌気性条件での VOC 添加分解培養試験

## b1）ベンゼンとトルエン添加分解培養試験

嫌気性条件でベンゼン、トルエンの添加分解培養試験の結果を、それぞれ図3.3.15と図3.3.16に示す。両地下水にベンゼン、トルエンを添加し、嫌気性条件で培養したところ、35日間の培養ではベンゼン、トルエン共に減少しなかった。

図 3.3.15 ベンゼン濃度変化

図 3.3.16 トルエン濃度変化

## b2) ジクロロメタン添加分解培養試験

図 3.3.17 に嫌気性条件でのジクロロメタン添加分解培養試験の結果を示す。

B7-2 及びオ-2 地下水にベンゼンを添加し、嫌気性条件で培養したところ、28 日間の培養ではジクロロメタンは減少しなかった。
図 3.3.17 ジクロロメタン濃度変化

現場周辺地下水の嫌気性条件下ではベンゼン、トルエン、ジクロロメタンはほとんど分解されないと考えられた。しかし、毎月の溶存酸素測定結果から、22-17-2を除く他の地点では好気性条件であることが確認されていることから、広い範囲でベンゼン、トルエンの微生物分解が進んでいるとも考えられた。また、後述の嫌気的VOCの分解遺伝子の探索では、嫌気的条件であるH21-7、22-17-2地点から、嫌気条件下でVOC分解を分解する遺伝子(tceA、vcrA、bvcA)が確認されており、それらの嫌気性状態の地下水中には、トリクロロエチレン及びテトラクロロエチレン類の分解能を有する菌の存在も示唆されている。

## (2) 地下水からの VOC 分解微生物単離試験

表 3.3.9 と表 3.3.10 にそれぞれ B7-2 とオ-2 地下水から単離したベンゼン、トルエン分解菌の同定結果を示す。B7-2 から 7 株、オ-2 から 7 株の菌を分離し、計 14 株の菌種を決定することができた。14 株のうち 7 株が Commonas testostroni と最も多かった。13 株はベンゼン、トルエンとも分解したが Pseudomonas fluorescens はベンゼンのみ分解し、トルエンは分解しなかった。Commonas testostroni は培養試験で分解が見られた後の菌叢解析結果からも優占種となることが確認された。現場地下環境ではこれらの菌によりベンゼン、トルエンの分解が進んでいると考えられた。これら単離した分離株が保有する VOC 分解遺伝子を確認した。その結果を表 3.3.11 に示す。Burkholderia cenocepacia は 7 つの Primer set で増幅産物が確認されたが、Stenotrophomonas acidaminiphila、菌株 2011-57 の C.testostroni は今回使用した 25 の Primer set で全て陰性であった。このことから、分解遺伝子の調査で陰性であっても、ベンゼン、トルエンの分解能を有する菌が存在する可能性があることが判った。VOC 分解試験で分解能を示したものの、概知の分解遺伝子を検出する PCR 検査が陰性となったことから、分解遺伝子の変異、新たな VOC 分解遺伝子等の可能性が考えられた。
表 3.3.9 B7-2 地下水から単離 （63 株中）

菌株No.	ベンゼン分解	トルエン分解	16s RNA遺伝子配列による同定結果
class	order	family	genus	species
2	+	+	Actinomycetales	Corynebacterineae	Nocardiaceae	Rhodococcus	erythropolis
4	+	-	Gammaproteobacteria	Pseudomonadales	Pseudomonadaceae	Pseudomonas	fluorescens
13	+	+	Actinomycetales	Corynebacterineae	Nocardiaceae	Rhodococcus	erythropolis
14	+	+	Betaproteobacteria	Burkholderiales	Burkholderiaceae	Burkholderia	cenoecipacia
37	+	+	Betaproteobacteria	Burkholderiales	Comamonadaceae	Comamonas	testosteroni
38	+	+	Betaproteobacteria	Burkholderiales	Comamonadaceae	Comamonas	testosteroni
58	+	+	Betaproteobacteria	Burkholderiales	Comamonadaceae	Comamonas	testosteroni

表 3.3.10 オ-2 地下水から単離 （40 株中）

菌株No.	ベンゼン分解	トルエン分解	16s RNA遺伝子配列による同定結果
class	order	family	genus	species
11-23	+	+	Betaproteobacteria	Burkholderiales	Comamonadaceae	Comamonas	testosteroni
11-28	+	+	Betaproteobacteria	Burkholderiales	Comamonadaceae	Comamonas	testosteroni
11-30	+	+	Gammaproteobacteria	Pseudomonadales	Pseudomonadaceae	Pseudomonas	nitroreducens
11-45	+	+	Betaproteobacteria	Burkholderiales	Comamonadaceae	Comamonas	testosteroni
11-50	+	+	Gammaproteobacteria	Xanthomonadales	Xanthomonadaceae	Stenotrophomonas	acidaminiphila
11-57	+	+	Betaproteobacteria	Burkholderiales	Comamonadaceae	Comamonas	testosteroni
11-72	+	+	Gammaproteobacteria	Xanthomonadales	Xanthomonadaceae	Stenotrophomonas	maltophilia

表 3.3.11 分離株のベンゼン, トルエン分解能と保有する VOC 分解遺伝子

菌株No.	ベンゼントルエン分解	菌名	NAH	RMO	PHE	TBMD	TMOA	TOL	bphA	XYLA	XYLE1
菌株2	+	+	Rhodococcus erythropolis	+
菌株4	+	Pseudomonas fluorescens	+	+	+
菌株13	+	+	Rhodococcus erythropolis	+
菌株14	+	+	Burkholderia cenocepacia	+	+	+	+	+
菌株37	+	+	Comamonas testosteroni	+	+	+	+
菌株38	+	+	Comamonas testosteroni	+	+	+	+
菌株58	+	+	Comamonas testosteroni	+	+	+
菌株2011-23	+	+	Comamonas testosteroni	+
菌株2011-28	+	+	Comamonas testosteroni	+
菌株2011-30	+	+	Pseudomonas nitroreducens	+
菌株2011-45	+	+	Comamonas testosteroni	+
菌株2011-50	+	+	Stenotrophomonas acidaminiphila
菌株2011-57	+	+	Comamonas testosteroni
菌株2011-72	+	+	Stenotrophomonas maltophilia	+	+
(3) 不法投棄地及び周辺土壤での菌叢調査及び有害物質等含有量調査

菌叢調査を実施した土壤中の菌数測定結果を図3.3.18に示す。

図 3.3.18 土壤中の菌数測定結果

全菌数は遮水壁外の土壌サンプルでは $ 10^{7} \sim 10^{8} $ cells/g、遮水壁内では $ 10^{8} \sim 10^{10} $ cells/g であり、遮水壁内の土壌で高い値を示した。次に、菌叢調査を実施した付近の土壌及び廃棄物層の溶出試験結果を表 3.3.12 に示す。
表 3.3.12 土壌及び廃棄物溶出試験結果

地点名	A	A	B	B	IN	IN	IN	IN	IN	IN
項目	(10m)	(17m)	(10m)	(17m)	4.5m	4.5m	10.5m	14.5m	14.5m	14.5m
①	②	①	①	②	③
トリカロエチン	<0.002	<0.002	<0.002	<0.002	0.59	0.51	<0.002	<0.002	<0.002	<0.002
テラカロエチン	<0.0005	<0.0005	<0.0005	<0.0005	1.1	0.98	0.0008	<0.0005	<0.0005	<0.0005
ジカロメタ	<0.002	<0.002	0.041	<0.002	2.4	4.3	<0.002	<0.002	<0.002	<0.002
四塩化炭素	<0.0002	<0.0002	<0.0002	<0.0002	<0.001	<0.001	<0.0002	<0.0002	<0.0002	<0.0002
1,2-ジカロエチン	<0.0004	<0.0004	0.014	<0.0004	0.60	0.68	<0.0004	<0.0004	<0.0004	<0.0004
1,1-ジカロエチン	<0.002	<0.002	<0.002	<0.002	<0.001	<0.001	<0.002	<0.002	<0.002	<0.002
1,2-ジカロエチン	<0.004	<0.004	<0.004	<0.004	0.046	0.028	<0.004	<0.004	<0.004	<0.004
1,1,1-トリカロエチン	<0.0005	<0.0005	<0.0005	<0.0005	<0.001	<0.001	<0.0005	<0.0005	<0.0005	<0.0005
1,1,2-トリカロエチン	<0.0006	<0.0006	<0.0006	<0.0006	<0.001	<0.001	<0.0006	<0.0006	<0.0006	<0.0006
1,3-ジカロプロペン	<0.0002	<0.0002	<0.0002	<0.0002	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001	<0.0002	<0.0002
ヘンセン	<0.001	<0.001	0.15	<0.001	0.27	0.24	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001
トルエ	0.001	<0.001	14	0.005	26	24	0.018	<0.001	0.001	0.001
1,4-ジオサン	0.015	0.017	0.015	<0.005	0.033	0.19	<0.005	<0.005	0.015	0.015
かドラム及びその化合物	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001	<0.005	<0.005	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001
鉛又はその化合物	<0.0005	<0.0005	0.009	<0.0005	<0.01	<0.01	<0.005	0.008	<0.0005	<0.0005
砒素又はその化合物	0.077	0.009	<0.005	0.010	<0.01	<0.01	<0.005	0.011	0.077	0.077
ホウ素含有量	<0.1	<0.1	3.2	<0.1	2	1	0.2	0.3	0.2	0.4
フッ素含有量	0.4	0.1	2.0	0.2	<1	<1	0.5	1.2	0.5	0.7
pH	8.7	7.6	9.8	7.6	10.4	10.8	8.0	8.3	8.0	8.6
BOD	24	9.2	70	2.6	160	310	8.3	20	19	56
COD	26	9.9	57	2.6	100	220	7.0	26	27	43
EC(μS/cm)	110	81	50	79	660	730	100	400	350	420
備 考	土壤	土壤	土壤	土壤	廃棄物	廃棄物	廃棄物	土壤	土壤	土壤

※数値は pH、EC 以外 mg/L

廃棄物層中の含水比は概ね 10%程度と揚水循環浄化を行っているにもかかわらず低い値を示しており、GL-14.5m 地点の砂礫層から油臭のする浸出水が確認された。その水質分析を行った結果、pH 8.0、ベンゼン濃度 0.054mg/L であった。次に、遮水壁外土壌菌叢の phylum level の解析結果を図 3.3.19 に示す。B(10m)は Firmicutes 優位であるが、A(10m)、A(17m)、B(17m)の土壌では Proteobacteria が優位であった。好気性及び通性嫌気性細菌が主である Proteobacteria が優位であることから、A(10m)、A(17m)、B(17m)は好気的環境にあり、偏性嫌気性の性質を持つ Firmicutes が優位であることから、B(10m)は嫌気的環境にあると考えられた。
Firmicutes が優位となった B(10m)は、土壌溶出試験結果から、高い BOD 值、COD 値を示しており、有機性の污泥を多く含むことが判る。そのため、その地点での分解微生物の活性が上がり、酸素が消費されることにより嫌気状態となっていると考えられた。

図 3.3.19 遮水壁外土壤の phylum level での菌叢解析結果

遮水壁内の土壌及び廃棄物の phylum level の菌叢解析結果を図 3.3.20 に示す。IN(4.5m)②は Firmicutes 優位であるが、10.5m より深い地点の試料についてはどれも Proteobacteria が優位であった。好気性及び通性嫌気性細菌が主である Proteobacteria の存在割合が多いことから、IN(10.5m)①、IN(14.5m)①、IN(14.5m)②、IN(14.5m)③の地点は主として好気的環境にあることが示唆された。溶出試験の結果、IN(4.5m)①と IN(4.5m)②付近の溶出試験値で高い有機物含量が示されていることから、遮水壁外 B(10m)地点と同様に微生物活動の活性化により酸素が消費されていると考えられた。また、好気性培養菌数測定結果が低い値を示していることからも、遮水壁内の 4.5m 付近は嫌気性環境にあると考えられた。IN(4.5m)①及び IN(4.5m)②は pH10 以上であることも菌叢に影響を与えていると考えられる。
図 3.3.20 遮水壁内の土壌及び廃棄物の phylum level での菌叢解析結果

次に、菌叢の class level の解析結果を図 3.3.21 示す。

class level の菌層解析結果から、未だ汚染の残留する遮水壁内の 10.5m より深い地点では Gmaproteobacteria の高い存在割合が確認された。また、それらのサンプルでは Gmaproteobacteria に属する Acinetobacter sp.が 90% を占めていた。一方、遮水壁内上層部土壌の IN(4.5m)①、IN(4.5m)②では Gmaproteobacteria は数%程度の占有率で、多菌種が混在する菌叢を示した。

図 3.3.21 土壤及び廃棄物の class level での菌叢解析結果
表 3.3.13 北侧第 2 带水層地下水水質分析結果(Fe,Mn,F,B,NH_{4}-N,NO_{2}-N,NO_{3}-N,臭気強度)

鉄(溶解性)(mg/L)

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22-11-2	<0.1	—	—	<0.1	—	—	<0.1	—	—	<0.1	—	—
H21-7	1.1	—	—	0.1	—	—	0.8	—	—	0.6	—	—
22-17-2	6.8	—	—	8.1	—	—	15.0	—	—	1.9	—	—
B7-2	0.8	—	—	2.0	—	—	1.9	—	—	0.4	—	—
22-1-2	40.0	—	—	33.0	—	—	0.2	—	—	0.2	—	—
M-2	<0.1	—	—	<0.1	—	—	3.9	—	—	0.1	—	—

2010年11月	2010年12月	2011年1月	2011年2月	2011年3月	2011年4月	2011年5月	2011年6月	2011年7月	2011年8月	2011年9月	2011年10月
22-11-2	0.3	—	—	<0.1	—	—	<0.1	—	—	<0.1	—	—
H21-7	0.2	—	—	0.2	—	—	0.2	—	—	0.2	—	—
22-17-2	1.0	—	—	0.9	—	—	0.8	—	—	1.0	—	—
B7-2	<0.1	—	—	<0.1	—	—	0.1	—	—	<0.1	—	—
22-1-2	2.1	—	—	1.7	—	—	<0.1	—	—	<0.1	—	—
M-2	<0.1	—	—	<0.1	—	—	0.8	—	—	<0.1	—	—

2010年11月	2010年12月	2011年1月	2011年2月	2011年3月	2011年4月	2011年5月	2011年6月	2011年7月	2011年8月	2011年9月	2011年10月
22-11-2	<0.1	—	—	<0.1	—	—	<0.1	—	—	<0.1	—	—
H21-7	0.7	—	—	0.7	—	—	0.7	—	—	0.7	—	—
22-17-2	0.5	—	—	0.6	—	—	0.6	—	—	0.4	—	—
B7-2	0.9	—	—	1.1	—	—	1.1	—	—	1.1	—	—
22-1-2	<0.1	—	—	<0.1	—	—	<0.1	—	—	<0.1	—	—
M-2	<0.1	—	—	<0.1	—	—	<0.1	—	—	<0.1	—	—

2010年11月	2010年12月	2011年1月	2011年2月	2011年3月	2011年4月	2011年5月	2011年6月	2011年7月	2011年8月	2011年9月	2011年10月
22-11-2	0.1	—	—	0.1	—	—	0.1	—	—	<0.05	—	—
H21-7	0.4	—	—	0.4	—	—	0.4	—	—	0.36	—	—
22-17-2	4.5	—	—	5.5	—	—	5.3	—	—	3.5	—	—
B7-2	3.4	—	—	3.6	—	—	3.8	—	—	3.5	—	—
22-1-2	0.1	—	—	0.1	—	—	0.1	—	—	<0.05	—	—
M-2	0.1	—	—	0.1	—	—	0.1	—	—	<0.05	—	—

2010年11月	2010年12月	2011年1月	2011年2月	2011年3月	2011年4月	2011年5月	2011年6月	2011年7月	2011年8月	2011年9月	2011年10月
22-11-2	<0.05	—	—	<0.05	—	—	<0.05	—	—	<0.05	—	—
H21-7	32	—	—	13	—	—	42	—	—	34	—	—
22-17-2	93	—	—	60	—	—	170	—	—	130	—	—
B7-2	68	—	—	27	—	—	94	—	—	76	—	—
22-1-2	<0.05	—	—	0.58	—	—	<0.05	—	—	<0.05	—	—
M-2	<0.05	—	—	<0.05	—	—	<0.05	—	—	<0.05	—	—

2010年11月	2010年12月	2011年1月	2011年2月	2011年3月	2011年4月	2011年5月	2011年6月	2011年7月	2011年8月	2011年9月	2011年10月
22-11-2	<0.05	—	—	<0.05	—	—	<0.05	—	—	<0.05	—	—
H21-7	<0.05	—	—	<0.05	—	—	<0.05	—	—	<0.05	—	—
22-17-2	<0.05	—	—	<0.05	—	—	<0.05	—	—	<0.05	—	—
B7-2	<0.05	—	—	<0.05	—	—	<0.05	—	—	<0.05	—	—
22-1-2	<0.05	—	—	<0.05	—	—	<0.05	—	—	<0.05	—	—
M-2	<0.05	—	—	<0.05	—	—	<0.05	—	—	<0.05	—	—

2010年11月	2010年12月	2011年1月	2011年2月	2011年3月	2011年4月	2011年5月	2011年6月	2011年7月	2011年8月	2011年9月	2011年10月
22-11-2	0.07	—	—	<0.05	—	—	0.55	—	—	0.1	—	—
H21-7	<0.05	—	—	<0.05	—	—	<0.05	—	—	0.28	—	—
22-17-2	<0.05	—	—	<0.05	—	—	3.1	—	—	<0.05	—	—
B7-2	<0.05	—	—	<0.05	—	—	<0.05	—	—	0.06	—	—
22-1-2	<0.05	—	—	<0.05	—	—	0.15	—	—	0.16	—	—
M-2	0.07	—	—	0.06	—	—	<0.05	—	—	0.39	—	—

2010年11月	2010年12月	2011年1月	2011年2月	2011年3月	2011年4月	2011年5月	2011年6月	2011年7月	2011年8月	2011年9月	2011年10月
22-11-2	—	—	—	—	—	—	—	—	—	—	—	—
H21-7	—	—	—	—	—	—	—	—	—	—	—	—
22-17-2	48000	—	—	152000	—	—	240000	—	—	140000	—	—
B7-2	950	—	—	1300	—	—	1100	—	—	750	—	—
22-1-2	—	—	—	—	—	—	—	—	—	—	—	—
M-2	—	—	—	—	—	—	—	—	—	—	—	—
表 3.3.14 南侧第 3 带水層地下水水質分析結果(水温, EC, DO, pH, ORP, 透視度, 色度, 濁度)

2010年11月	2010年12月	2011年1月	2011年2月	2011年3月	2011年4月	2011年5月	2011年6月	2011年7月	2011年8月	2011年9月	2011年10月
12-10	15.0	15.1	15.1	14.9	15.0	15.3	15.3	15.9	15.4	15.4	15.2
才-2	16.2	16.2	15.7	16.2	16.5	17.0	17.7	17.9	18.2	18.0	17.8
A6-2	16.7	16.4	15.5	16.2	16.3	17.1	18.2	19.2	18.6	20.0	19.3
22-3-3	16.5	16.5	16.4	16.4	16.6	16.2	17.2	18.0	17.1	17.0	16.9
B2-2	16.4	16.5	16.4	16.3	16.5	16.7	16.7	17.7	16.8	16.8	16.9
F	15.6	15.8	15.1	15.5	16.0	15.9	16.5	16.7	16.9	17.2	16.9
22-16-3	16.2	16.1	15.8	15.9	16.1	16.7	16.3	16.9	16.5	16.6	16.3
22-16-3	920.0	710.0	110.0	510.0	650.0	350.0	500.0	4.1	57.0	34.0	3.4
表 3.3.14 南侧第 3 带水層地下水水質分析結果( $ NO_{2}-N,NO_{3}-N $ ,臭気強度)

2010年11月	2010年12月	2011年1月	2011年2月	2011年3月	2011年4月	2011年5月	2011年6月	2011年7月	2011年8月	2011年9月	2011年10月
12-10	<0.05	—	—	<0.05	—	—	<0.05	—	—	<0.05	—	—
才-2	<0.05	—	—	<0.05	—	—	<0.05	—	—	<0.05	—	—
A6-2	<0.05	—	—	<0.05	—	—	<0.05	—	—	<0.05	—	—
22-3-3	<0.05	—	—	<0.05	—	—	<0.05	—	—	<0.05	—	—
B2-2	<0.05	—	—	<0.05	—	—	<0.05	—	—	<0.05	—	—
F	<0.05	—	—	<0.05	—	—	<0.05	—	—	<0.05	—	—
22-16-3	<0.05	—	—	<0.05	—	—	<0.05	—	—	<0.05	—	—

2010年11月	2010年12月	2011年1月	2011年2月	2011年3月	2011年4月	2011年5月	2011年6月	2011年7月	2011年8月	2011年9月	2011年10月
12-10	<0.05	—	—	<0.05	—	—	0.06	—	—	<0.05	—	—
才-2	<0.05	—	—	<0.05	—	—	4.50	—	—	0.12	—	—
A6-2	<0.05	—	—	<0.05	—	—	<0.05	—	—	<0.05	—	—
22-3-3	<0.05	—	—	<0.05	—	—	<0.05	—	—	<0.05	—	—
B2-2	0.09	—	—	<0.05	—	—	1.60	—	—	0.71	—	—
F	<0.05	—	—	<0.05	—	—	<0.05	—	—	<0.05	—	—
22-16-3	<0.05	—	—	<0.05	—	—	<0.05	—	—	0.06	—	—

臭気強度 (TON)

2010年11月	2010年12月	2011年1月	2011年2月	2011年3月	2011年4月	2011年5月	2011年6月	2011年7月	2011年8月	2011年9月	2011年10月
12-10	—	—	—	—	—	—	—	—	—	—	—	—
才-2	1600	—	—	1600	—	—	1900	—	—	1958	—	—
A6-2	440	—	—	380	—	—	350	—	—	333	—	—
22-3-3	—	—	—	—	—	—	—	—	—	—	—	—
B2-2	—	—	—	—	—	—	—	—	—	—	—	—
F	—	—	—	—	—	—	—	—	—	—	—	—
22-16-3	—	—	—	—	—	—	—	—	—	—	—	—

水質分析の結果から、北側第2帯水層の22-11-2と南側第3帯水層の12-10では汚染がほとんど見られず、ECが低値であり溶存酸素も存在している。TOCも低い値であることから有機物含有量が少なく、汚染されていない地下水であることが判る。北側第2帯水層の地下水は、溶存酸素が比較的高いことから表層からの浸透量が多く、これまでの調査から地下水流速も比較的速いことが確認されている $ ^{1} $ 。不法投棄地北側のH21-7、22-17-2、B7-2ではEC、TOCが高値を示し、ベンゼン、トルエン、ジクロロメタン汚染の残留が認められる。また、色度、濁度、透視度、臭気強度などの官能試験値も高い値を示すことから、これらの地下水は臭気の強い、濁り水であることが判る。北側調査地点では汚染は22-17-2で極大値を示し、その下流方向末端にあるM-2では、汚染の自然減衰が進んだ状態になっていることが確認できる。

南側第3帯水層は、汚染残留地点であるオ-2、F及びA6-2の地点で高いEC値、TOC値を示し、環境基準程度のベンゼンが検出されているが、ジクロメタンは検出されていない。また、汚染地点から離れるに従い、22-3-3 → B2-2 → 22-16-3の順に12-10に近い分析値になっている。22-16-3ではECが僅かに高値であること以外はほぼ、12-10と同様の水質であった。地下水温は、北側第2帯水層では12.9℃～23.8℃の範囲で、南側第3帯水層では14.9℃～20.0℃の範囲で変動しており、北側第2帯水層の方が外気温の影響を受けやすい環境となっていることが判る。

図3.3.22に蛍光染色法による全菌数測定結果を示す。全菌数は、北側第2帯水層では、汚染残留の見られるH21-7、22-17-2で菌数が多く、水質調査結果で溶存酸素(DO)濃度が低い値であるH21-7、22-17-2では全菌数に対する好気培養菌数割合が低い値を示している。南側第3帯水層では汚染残留の見られるA6-2とFでは高い菌数を示しているが、ほとんど汚染のみられない22-3-3及び22-16-3でも全菌数が高い値を示した。22-3-3と22-16-3では菌叢調査時の水質で高いSS値を示しており、サンプルへの土壌粒子の混入により、検液中の全菌数が高い値を示したと考えられる。
図 3.3.22 地下水菌数测定結果

次に、これらの地下水のクローンライブラリーによる菌叢解析結果(phylum level)を図3.3.23に示す。北側帯水層地下水の菌叢解析結果からH21-7と22-17-2の菌叢はFirmicutesの存在比が他の地点に比べて高い同様の菌叢であることが判る。特に22-17-2地点のAug-11の検体ではProteobacteriaに比べFirmicutesの存在比が高いことから嫌気的環境が優位な状態にあると考えられた。また、22-1-2地点の地下水が豊富な時期（May-11とAug-11）の検体では、電気伝導率(EC)や酸化還元電位(ORP)に他の時期と違いが見られることから、投棄地東側などの周辺地下水の流入により水質に変化が生じ、それに応じて菌叢も変化したものと考えられた。また、汚染が流入する前の22-11-2と、下流のM-2地下水ではよく似た菌叢であることが判った。南側帯水層地下水の菌叢解析結果は汚染残留が低濃度であることを反映し、北側に比べ違いが分かりにくい菌叢であった。しかし、オ-2、A6-2、Fの地点では高い有機物含量からFirmicutesが他地点に比べ高い存在比であり、嫌気的な環境が存在していることが判る。全体的に見ると、12-10→オ-2→A6-2にかけてFirmicutesが増加し22-3-3でそれらが減少している菌叢を示した。B2-2ではFirmicutesが見られず他とは全く違った菌叢を示している。水質試験結果からもB2-2地点は高い溶存酸素(DO)値を示し、菌叢調査と水質調査の両結果から、強い好気的環境であることが判る。これらの結果から、地下水の菌叢は地下環境を反映していることが明らかであることから、
菌叢を調査し、比較することで地下環境の汚染程度について、総合的判断が可能な指標となると考えられる。しかし、地下土壌が混入し懸濁物質濃度(SS)が高い場合には、菌数の増加が見られたことから、それら混入土壌に付着した菌により、菌叢に違いが生ずることも懸念された。観測井周辺の広い地下環境を代表する菌叢を調査するためには、サンプリング時に観測井内土壌の混入に注意が必要である。

サンプル名(北側第2帯水層地下水)

図 3.3.23 地下水菌叢解析結果(phylum level)

図 3.3.24 に genus level で分類した物質循環に関与する細菌の検出割合のグラフを示す $ ^{2)} $ 。北側帯水層では H21-7 でメチル資化性細菌の割合が高く、有機物を分解していると考えられる。

22-1-2(Nov-10)の鉄細菌の割合が高い検体では、水質試験結果でも40mg/Lの高い溶存鉄(d-Fe)濃度を示し、また、M-2地下水の内で最も多い鉄細菌存在割合示す(May-11)の地下水で3.9mg/LとM-2では高いd-Fe濃度が見られている。南側帯水層では、上流の12-10と、水質理化学分析結果から最も自然減衰が進んでいると考えられる22-16-3では、一年を通じて安定した菌叢を示し、汚染残留が見られるオ-2、A6-2、Fでは菌検出割合にばらつきが見られた。地下水水質の変
動により菌叢が変化していると考えられることから、それらの地点では地下水水質が安定しない状況であると考えられた。

サンプル名（北側第2帯水層地下水）

サンプル名(南側第3帯水層地下水)

図 3.3.24 物質循環に関与する細菌の検出割合

図 3.3.25 に species level で確認した VOC 等汚染物質分解が報告されている細菌の検出割合のグラフを示す。クローンライブラリー法による菌叢解析では地下水中に存在する菌の species level まで検出することができるため、それらの菌種名から既知の情報を検索することにより、汚染物質を分解する可能性が高い菌の存在の有無について知ることができる(表 3.3.15)。菌種北側帯水層では H21-7、B7-2 にジクロロメタン分解が報告されている Methylophilus leisingeri の存在が確認され、芳香族類の分解が報告されている Anaerolinea thermophila が H21-7、22-17-2、
A6-2、Fに広く分布していることが確認された。また、今回の試験でベンゼン、トルエンの分解が確認されているComamonas testosteroniがB7-2、オ-2に存在していることも確認できた。図3.3.25から汚染残留が見られる地下水中には、これらVOC、アルカン類、芳香族類を分解することができる菌が多く存在することが判る。また、汚染物質分解試験の結果も併ることにより、問題となる物質の分解に関与している菌を同定することができ、菌叢モニタリングにより分解菌を調べることで、微生物分解が進んでいることを確認することが可能となる。現場の地下水を用いた実験を併せて行い、分解菌及び分解関与菌を、現場地下水からモニタリングする本手法は、微生物分解を確認する最も信頼性の高い方法であると考えられる。

サンプル名（北側第2帯水層地下水）

サンプル名(南側第3帯水層地下水)

図 3.3.25 污染物質分解細菌の検出割合
表 3.3.15 地下水調査で検出された VOC 類分解菌

菌名	分解物	分解能確認等
Novosphingobium aromaticivorans	芳香族類分解	文 献 2)
Novosphingobium subarcticum	芳香族類分解	文 献 3)
Geothrix fermentans	芳香族類分解	文 献 4)
Holophaga foetida	芳香族類分解	文 献 5)
Rhodococcus erythropolis	芳香族類分解	本研究
Anaerolinea thermophila	芳香族類分解	文 献 6)
Sphingomonas sp.	芳香族類分解	文 献 7)
Comamonas testosteroni	芳香族類分解	本研究
Azoarcus anaerobius	芳香族類分解	文 献 8)
Denitratisoma oestradiolicum	芳香族類分解	文 献 9)
Nevskia ramosa	芳香族類分解	文 献 5)
Stenotrophomonas maltophilia	芳香族類分解	本研究
Acidovorax delafieldii	アルカン分解	文 献 10)
Hydrogenophaga taeniospiralis	PCB分解	文 献 11)
Dehalobacter restrictus	脱ハロゲン化	文 献 12)
Desulfitobacterium frappieri	脱ハロゲン化	文 献 13)
Desulfuromonas chloroethenica	脱ハロゲン化	文 献 13)
Methylophilus leisingeri	ジクロメタン分解	文 献 5)
Alkanindiges illinoisensis	アルカン分解	文 献 14)
Hydrocarboniphaga effusa	アルカン分解	文 献 15)

クローンライブラリーによる菌叢解析と現場地下水を利用した汚染物質分解試験により、現場地下環境中で細菌による分解が進むことが判り、また、その分解菌または分解に関与する菌を明らかにすることがでた。明らかになった菌名から、文献調査により、至適温度、至適pH、好気嫌気性条件など多くの情報を得ることができる。得られた情報を基に、現場での地下水水質と菌叢モニタリングの継続により、微生物による浄化が適正に進む地下環境にあるのかを判断をすることが可能であると考えられた。このことから、微生物分解を自然減衰の要因としたMNAの適用の際に重要であり、本研究の目的でもある「①MNA適用の前提条件となる現場地下環境中でのVOC微生物分解の確認」についてはクローンライブラリー法による菌叢解析を利用した方法が有効であると考えられた。

本研究の目的である「②未規制物質も含めた総合的地下環境の安定化指標としての利用」については、菌叢解析結果をグラフ化する方法、物質循環に関与する細菌の割合をグラフ化する方法により、考察を行い地下水状態により菌叢に違いが生じるということは明らかとなり、また、清浄地と汚染地では菌叢が相違していることが確認された。次に、地下水菌叢解析より得たgenus levelの菌叢データで主成分解析を行い、第1主成分と第2主成分が、どの水質データを反映しているのかを確認するため、主成分得点順に水質データを並べ比較を行った。北側帯水層の主成分解析結果を図3.3.26に、対応する第1主成分得点と第2主成分得点の水質データをそれぞれ図3.3.27と図3.3.28に示す。南側帯水層の成分解析結果を図3.3.29に、対応する第1主成分得点と第2主成分得点の水質データをそれぞれ図3.3.30と図3.3.31に示す。