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図14 実験5の植物プランクトン群集についてフローサイトメーターにより測定したサイズ組成の変化 前方散乱(FSC)によるサイズ測定(a)、色素蛍光に基づく植物プランクトンのグルーピング(b)、 "400"、"800"、"1200"ppmにおける2μm以下(c)、2-6μm(d)、6-10μm(e)および10μm以上(f) のサイズ画分における細胞数 2基の培養器で得られた値の平均値と範囲を示す
## 2 ）海洋酸性化実験における $ pCO_{2} $ およびpHの制御

自然微生物群集に対する海洋酸性化の影響を評価するための実験的解析は、今世紀に入り、活発に行われる様になりつつある $ ^{8,9} $ 。しかしながら、その手法は、酸性化の手法（ $ CO_{2} $ の通気、酸の添加）、培養器容量等において、非常に多様である。今後得られる情報を相互に比較し、また政策に反映することを考えると、早期に実験手法の統一を図る必要がある。本研究では、培養液のpHを調整する手法として、実際に海洋における酸性化をもたらす原因である海水中の $ CO_{2} $ 濃度の調整を用いることとした。また、海洋酸性化の影響を海洋物質循環まで含めて解析するためには、有機物濃度等の分析のため、実験期間を通して相当量の試料の採取が必要となる。このため、本研究では、炭酸系の専門家であるサブテーマ（1）のグループの協力を得て、400Lスケールの培養器を用いた実験系の確立を図った。

植物プランクトン群集組成に対する影響を評価する目的で、数L程度の培養系 $ ^{8)} $ が用いられてきている。このような培養液量が少量の場合は、培養液に通気するガス量も少量で良いため、pCO $ _{2} $ およびpHなどの炭酸系を調整、維持することは比較的容易である。一方、より自然状態に近い中規模鎖系（メソコスム）と呼ばれる大型（27m $ ^{3} $ ）の培養系を用いた解析も試みられてきている $ ^{9)} $ 。しかしながら、このシステムでは実験期間を通して、ガスの通気により炭酸系の調整、維持を行うのは現実的では無い。このため、このような大規模な実験系では、海水試料への通気は実験開始前の数日のみ実施し、実験開始後は培養器部の大気部分のみのpCO $ _{2} $ を維持する方法がとられている。このため、実験開始後に大型培養器内の海水のpCO $ _{2} $ およびpHは、開始時に設定した値から、自然の海洋では生じ得ないほどの幅で、大きく変動してしまう（pCO $ _{2} $ の低下、pHの上昇） $ ^{9)} $ 。このため、得られた結果が、酸性化の程度をどの程度反映したものかについて、大きな疑問が残る。

本研究では、実験期間中の $ pCO_{2} $ およびpHを可能な限り一定に保つことを前提にし、また採取試料量を勘案して、培養実験系のスケールを400Lとした。

400Lの海水試料の $ pCO_{2} $ とpHの調整のため、実験開始までに一定時間の気体の通気を行った。実験1では、8時間程度実施し（培養海水容量のほぼ10倍量）、各培養基間で $ pCO_{2} $ およびpHの差は明確であったが、 $ pCO_{2} $ の設定値を下回っていた（図7a）。これは通気量の不足によるものと考えられた。このため、2回目以降の実験では、実験前の通気時間を長くし、最終的には40時間の通気を行った。その結果、実験5では、実験開始時に"400"、"800"および"1200"ppmの設定値にほぼ近い値が得られた。この通気量は海水試料の50倍量に相当し、今後の酸性化実験における通気による炭酸系調整の基準として、「培養海水量の50倍量」を提唱する事が可能である。一方、実験期間中には毎日6時間の通気を実施したが、実験3および5においては、実験中に $ pCO_{2} $ の低下とpHの上昇が認められた。この変化は、培養器中の植物プランクトンの現存量の増大に対応したものであり、光合成による $ CO_{2} $ の消費によるものと考えられる。すなわち、毎日6時間（培養海水量の10倍量）の気体の通気では、植物プランクトンによる $ CO_{2} $ 消費を相殺することは不可能であったことを示す。微生物に対する $ pCO_{2} $ およびpHの変化の影響を評価するためには、これらのパラメータ一は可能な限り不変であることが望ましい。植物プランクトンの光合成の影響を少なくするためには、実験4および5で実施したように、実験開始時の栄養塩の添加量を減少させることなどが有効であろう。

しかしながら、植物プランクトンの現存量が高い沿岸域等では、日中の光合成による $ CO_{2} $ の消費
および夜間の呼吸による$\mathrm{CO}_{2}$の生成により、$\mathrm{pCO}_{2}$および$\mathrm{pH}$が日周的に変化していることが予想される。これを考慮すると、微生物の代謝を反映したある程度の炭酸系の変化は、許容されると考えられる。今後は、自然条件下に近い状況のもとで酸性化の影響を評価する場合や、微生物代謝系に対する$\mathrm{pCO}_{2}$および$\mathrm{pH}$の影響を代謝生理学的に明らかにする場合など、実験系の目的を明確にし、それぞれに妥当な培養条件を設定することが必要であろう。

## 3 ）植物プランクトンの増殖と炭酸系の変化

5回の実験を通して得られた $ pCO_{2} $ とpHとの関係を図15aに示す。両者は良い関係にあり、炭酸系以外のアルカリ度等の条件が、5回の実験を通してほぼ一定であったことを示している。

pCO_{2}は、多くの場合設定値（"400"、"800"および"1200"ppm）に近い値をとったが、設定値から大きく減少する場合が認められ、この際にはpHの増加を伴っていた（図15b）。さらに、pCO_{2}の変化とクロロフィルa濃度との関係を見ると、pCO_{2}の低下がクロロフィルa濃度の高い時に認められていることが明確である。これは、先に述べたように、植物プランクトンの現存量が増加した際に、光合成によるCO_{2}の消費量が増加しpCO_{2}の減少がもたらされていることによる。3種類に設定されたpCO_{2}の培養器それぞれについて、調整値（"400"、"800"および"1200"ppm）からの実測値の減少幅を算出すると、300ppm（設定値400ppm）、500ppm（設定値800ppm）、650ppm（設定値1200ppm）と、pCO_{2}設定値の低い培養器ほど、減少幅が少ない。特に"400"ppm培養器においては、最小値は100ppmを下回る非常に少ないものであった。この結果は、「400"ppm培養器においては、植物プランクトンの現存量が高い場合は、植物プランクトンの光合成が低濃度のCO_{2}により制限を受ける可能性を強く示唆す

図15 5回の実験を通した海水試料の $ pCO_{2} $ とpH(a)、およびクロロフルa濃度(b)との関係

る。一方、“1200”ppmの培養器においては、pCO_{2}の実測値は最小でも550ppmであることから、植物プランクトンの現存量が高い場合も、光合成が低いCO_{2}濃度により制限が生じている可能性は少ない。

海洋における植物プランクトン現存量の制限要因は、通常は栄養塩あるいは鉄等の微量元素と考えられている。沿岸域や湧昇域において、栄養塩および微量元素の有光層への供給量が大きい場合は、高い植物プランクトン現存量が認められる。本実験で得られた結果は、このような海域において、植物プランクトンの光合成が $ CO_{2} $ により律速される可能性を示唆する。一方、海水中の $ pCO_{2} $ が上昇した場合には、「800」および「1200」ppmで認められた様に、このような $ CO_{2} $ 律速は生じにくい。言葉を換えると、栄養塩濃度が豊富で植物プランクトンの現存量、一次生産量が高い海
域では、酸性化による $ pCO_{2} $ の増加は、現存量、一次生産量の更なる増加をもたらす可能性もある。

“400”ppm培養器において $ pCO_{2} $ が最小の100ppm近くまで低下した実験3の4日目において、溶存無機炭素（DIC）濃度は、1750μM存在していた。これは実験開始時の2070μMの85％に相当する値であり、DIC濃度から判断すると、この状況の下では光合成が無機炭素の律速に至っているとは考えにくい。光合成の一般的な炭素固定回路として知られるカルビン-ベンソン回路での炭素固定は、 $ CO_{2} $ のみを基質として固定する。このため、海洋酸性化が植物プランクトンの光合成に与える影響については、全炭酸物質の濃度では無く、本研究の様に、pHによる炭酸系の変化を考慮に入れた評価を行うことが強く望まれる。

本推進費の研究において特筆すべき点の一つは、炭酸系の専門家のサブテーマ（1）のグループと共同で培養実験を実施したことである。培養系の設計から、pCO₂、pHの精密な測定と解析を含め、実験の細部にわたり炭酸系の専門家との協力の下で実験が進められたことは、本研究で成果を上げる上で大きな要因となった。上述した様な課題では、炭酸系の専門家との協力を通して、さらにより有効に研究が進められるものと思われる。

## 4 ）徏藻の増殖への酸性化の影響

本研究で実施した5回の実験で、3回については栄養塩添加後数日以内に珪藻を中心とする植物プランクトンの現存量が増加した。これらの実験は、11月（実験1）、5-6月（実験3）および7-8月（実験5）に実施しているが、何れも好天が続き高い光量子量が得られたことがその原因と考えられる。このような栄養塩の添加に対する珪藻の応答は、同様のメソコスム実験においても一般的に認められているものであり $ ^{10} $ 、栄養塩濃度の高い条件下で高い増殖速度を有することが、珪藻が優占的に増殖する理由と考えられている。

これら珪藻の優占が生じた3回の実験を通して、 $ pCO_{2} $ およびpHの差が珪藻に及ぼす影響は顕著では無く、また、実験によりその方向性が異なっていた。実験1では高 $ pCO_{2} $ 条件下で、やや高いクロロフィルの増加速度が認められ、また、栄養塩の減少速度も"1200"ppmの培養器で高い傾向にあった（図7c、d）。この結果は、自然群集を用いた報告 $ ^{8,9} $ と一致するものである。しかしながら、この結果は、珪藻は細胞内への炭素濃縮機構（CCM）が発達していることから、 $ CO_{2} $ 濃度の増加により光合成は増加しにくい $ ^{11} $ 、とする一般的な認識とは異なっている。

一方、実験5では"1200"ppmの条件下で、光合成生産量が低下する傾向が認められた。本実験では、観測日毎の光合成生産量を、 $ ^{13}C $ トレーサー法により測定した。珪藻が優占種として大きな割合を占めた2、3日目のクロロフィルaあたりの光合成生産速度は、「400」および"800"ppmに比較して少ない傾向にあった（図16）。この結果は、CO $ _{2} $ 濃度の増加が必ずしも光合成速度の増加をもたらさないことを示している。これらは、CO $ _{2} $ の増加が珪藻には阻害的な影響を与えたとする

Yoshimuraらが得た結果と一致している $ ^{12)} $ 。し

図16 実験5の観測日における光合成速度 2基の培養器において得られた値の平均 値と範囲を示す
かしながら、この期間には珪藻以外にも緑藻も比較的高い割合を占めていたことから（図13）、実験3や本実験により認められた緑藻の増殖への酸性化の阻害効果を反映している可能性も考えられる。

珪藻は上述した様に、栄養塩供給量の多い沿岸域や湧昇域で主要な一次生産者である。また、生物ポンプによる有機炭素の下方輸送過程において、重要な役割を果たしているグループである。このため、酸性化に対する珪藻の動向は、海洋の炭素循環や大気CO₂の海洋への吸収量等の変動に関わる可能性が大きい。本研究では、珪藻の酸性化への応答は一定の方向では無く、また、それほど顕著なものでは無かった。今後も情報を積み重ねる必要はあるが、CCMの発達の程度から予測されているように、珪藻への酸性化の影響は限定的なものに留まる可能性が予想される。しかしながら、珪藻の増殖に必要とされる硅酸塩濃度と他の栄養塩濃度との関係などを含めて、今後さらに解析する必要がある。

## 5 ）海洋酸性化のハプト藻Chrysochromulina属への阻害的影響

本研究を通して、石灰質の殻をもたないハプト藻Chrysochromulinaの増殖が酸性化により阻害的

な影響を受ける事が繰り返し確認された。特に、実験2においては、“400”ppmと、pCO₂の増加した“800”および“1200”ppmとの差が頭著に認められた。フローサイトメーターによる粒子の分析結果から、C. sp.に相当する細胞数が、“800”および“1200”ppmにおいて、大きく低下することが見いだされた（図17）。この実験では¹⁵Nトレーサー法による懸濁態有機窒素（PON）の生産量の測定を実施したが、15日目の“800”およ

び"1200"ppm培養器における値は、"400"ppmの値のわずか11-17％に相当するのみであった（図18）。また、実験4および5において

図17 実験2の15日目におけるフローサイトメーターによる植物プランクトン群集の解析 ○内がハプト藻 Chrysochromulina sp.

も、植物色素（図11、13）やフローサイトメーターによる分析結果から、高 $ pCO_{2} $ 、低pH条件下で、C. sp.の増殖の阻害が生じていることが明らかとなっている。

## このため、我々は、単離培養された同属種

（Chrysochromulina sp.）を用いて、実験室での培養実験を通して、pHの影響を評価することを試みた。培養実験で得られた結果の一例を図19に示す。培養開始後3日までは各pH共に大きな差は認められなかったが、4日目以降、細胞数はpHの低下につれて減少する傾向が認められた。培養最終日における細胞数もpH8.2で最大であり、pHが低いほど細胞数も少ない傾向が認められた。この結果は、実験2で認められたpHによる現存量の差ほどは顕

図18 実験2における懸濁態有機窒素（PON）の蓄積生産量の変化
著では無かったが、単離株を用いた実験によっても、酸性化が同属に対して阻害的な影響を及ぼすことが示唆された。

Chrysochromulina sp.への酸性化の阻害的効果がどのような機構によるのかは、現在は明らかになっていない。CO₂濃度の増加は、一般的に光合成速度を増加させることから $ ^{11} $ 、阻害的な影響を与える原因としては、今のところ考えにくい。特に単離培養株を用いた培養実験では、pHを変化させたのみでDIC濃度は変化させていない。これから考えると、pHの低下が何らかの阻害的影響を与えているものと考えられる。pHの変化が植物プランクトンの代謝に及ぼす影響としては、細胞内外のイオンバランスを維持するためのエネルギー消費量の増加 $ ^{13} $ や鉄などの微量元素の存在状態の変化 $ ^{14} $ などが提案されている。今のところ、この原因に関する手がかりは乏しいが、細胞内pHの測定など、培養種を用いた代謝生理化学的な解析を通して、重要な情報が得られるものと期待される。

Chrysochromulina属は沿岸から外洋まで、幅広く分布する植物プランクトングループとして知られている $ ^{15,16} $ 。近年になり、Liuら（2009）は遺伝子解析の結果をもとに、海洋に生息するハプト藻において、同属は中心グループを構成するほどの重要性を有することを報告した $ ^{16} $ 。さらに、植物色素の結果を統合することにより、ハプト藻は富栄養海域から貧栄養海域に至るまで、最も主要な植物プランクトングループであり、ハプト藻、珪藻および原核藻類を合わせたクロロフィルa量の35-50%はハプト藻により占められる事を見いだした（図20）。このLiuらの研究は、海洋生態系において、Chrysochromulina属が重要なグループである事を示している。本研究で得られた様に、同属が海洋酸性化に対して高い感受性を有し、酸性化の進行につれてその現存量を減らす可能性があるならば、一次生産過程を含めた海洋の微生物生態系に大きな変化が生ずることが予想される。

一方、植物プランクトンを指標種として用いて、水質汚染の程度など、水環境を評価する方法が広く用いられてきている。このような環境指標種として生物種を用いる場合には、その分布域が広いことが望ましい。上述した様にChrysochromulina属は、沿岸域から外洋域まで広く分布する事が知られているため、微生物生態系に対する海洋酸性化の影響を評価する際には、非常

図19 Chrysochromulina sp.の単離培養株を用いた各種のpHにおける増殖曲線

図20 海洋におけるハプト藻(A)、珪藻(B)、原核藻類(C)の3グループの、全クロロフィルa濃度に対するそれぞれの寄与 $ ^{16} $
に優れたグループであると考えられる。この際、多くの試料を対象に、光学顕微鏡で本属の細胞数を計測することは時間と労力を要する。しかし、本研究で実施した様にHPLCによる同属の指標色素である19'-ヘキサノイルオキシフコキサンチンの定量や、フローサイトメーターを用いた細胞数の計測は、的確に同属のバイオマスを見積もることを可能にする。今後の海洋酸性化の進行を監視する有力な指標種として提唱できる。

## 6 ）物質循環への影響

海洋の物質循環と気候変動との関係を考察する際に、海洋表層から中・深層の炭素過程は非常に重要である。「生物ポンプ」による表層から中・深層への炭素の鉛直輸送と $ ^{17)} $ 、近年指摘され始めた「微生物炭素ポンプ」による難分解性溶存態有機炭素（R-DOC）の生成 $ ^{18)} $ がその中心的過程と考えられる。

「生物ポンプ」による炭素鉛直輸送についてはセジメントトラップを用いた研究等により、これまで多くの情報が蓄積してきている。一次生産者である植物プランクトンの分類群から考えると、大型の珪藻が優占する場合には、大型動物プランクトンによる捕食を通して、糞粒として比較的多くの有機炭素が中・深層へ輸送される $ ^{19} $ 。一方、2μm以下のピコプランクトンが優占する海域では、微生物食物連鎖の割合も増すことを含め、表層で分解される有機物が多く、相対的に中・深層へ輸送される有機炭素量は少ない $ ^{19} $ 。本研究で得られた結果のみから、酸性化が進んだ際に生物ポンプの効率が上がるか否かについて議論することは時期尚早かもしれないが、CO $ _{2} $ 濃度の上昇が必ずしも珪藻の増殖の促進をもたらさないとすると、海洋酸性化によって、鉛直輸送量は大きく変わらない可能性がある。しかし一方で、本研究の結果から、海洋酸性化は植物プランクトン全体のサイズ組成を変化させる可能性もある。仮に、酸性化が進んだ海域において、2μm以下の以上のナノ、ミクロプランクトンが減少した場合には（図14）、鉛直輸送量は減少することも十分に考えられる。植物プランクトンサイズ組成の変化に関しては、本研究では実験5のみで検討したが、今後、注目すべき課題であると考えられる。

もう一つの炭素隔離過程として最近提唱された「微生物炭素ポンプ」に関連した観測として、本研究では溶存態有機炭素（DOC）の濃度に対する酸性化の影響も評価した。実験1、3および4ではDOC濃度にpCO₂の差による有意な変動は見られなかったが、実験2および5では、pCO₂の低い培養系でDOC濃度が高くなる傾向が認められた。実験5では珪藻、緑藻の増殖が生じた後の6日目からDOCの増加が認められた（図21）。

図21 実験5における溶存態有機炭(DOC)濃度の変化 2基の培養器で得られた値の平均値と範囲を示す
これは、植物プランクトン細胞を構成していた有機炭素が溶存化したものと思われる。また、増加したDOCは、ほぼ1ヶ月間にわたり有意な濃度の変動は認められなかったことから、溶存化したDOCが比較的安定な性質をもつことを示唆している。4日から8日にかけたDOC濃度の増加は、「1200"ppmに比較して"400"および"800"ppmにおいて顕著であり、また実験後半においても"400"ppmにおいて高い濃度が維持された。このような安定なDOCは、「微生物炭素ポンプ」と呼ばれるように、バクテリアの代謝産物が主要な構成分である可能性が高い。ここで認められたDOCの残存量の違いも各pCO₂培養系におけるバクテリアの現存量の違いを反映していることが示唆される $ ^{20)} $ 。より酸性化の進行した培養器でDOC濃度の残存量が少なかったことから、酸性化により「微生物炭素ポンプ」の効率が減少する可能性も考えられる。

このように、気候変動に大きく関与する海洋炭素循環過程に対して、海洋酸性化の影響が及ぶ可能性があることから、今後の酸性化に関する研究を、より生物地球化学的な観点をより重視して進める必要性がある。

## （２）円石藻Emiliania huxleyiの培養株を用いた解析

## 1 ）Emiliania huxleyi の光合成による海洋酸性化の補償

円石藻は光合成の基質として培地中の溶存$\mathrm{CO}_{2}$を消費する。そのような藻類$\left(\mathrm{CO}_{2}\text{user}\right.$と称する）は、光合成の際に吸収した培地中の$\mathrm{CO}_{2}$分子の濃度低下を引き起こす。したがって、その不足を補うため$\mathrm{HCO}_{3}^{-}\rightarrow\mathrm{CO}_{2}+\mathrm{OH}^{-}$の反応が生じ、培地のアルカリ化が引き起こ

図23 様々なpHにおけるEmiliania huxleyi の光合成に対するアルカリ化率 黒色: 光合成 ハッチング: アルカリ化 エラーバーは標準偏差を示す n=3

図22 Emiliania huxleyiにおける光合成とpH変化

されることは既に報告されている（Shiraiwa et al. Plant Cell Physiol. 34: 649-657, 1993）。本研究において、円石藻Emiliania huxleyiを用いた生理学的実験の結果、E. huxleyiには酸性化が進行した場合、それに対抗して周囲の環境のアルカリ化(alkalization)を引き起こす能力を向上させる機能、すなわち、円石藻細胞がpH変化に対する恒常性（補償）機能を有することを初めて明らかにした。

すなわち、光合成によって培地中の溶存 $ CO_{2} $ が消費されるとその不足を補うため

$ HCO_{3}^{-}\rightarrow CO_{2}+OH^{-} $ の反応が進行し、 $ CO_{2} $ 濃度が維持されると同時にpHが上昇する(図22)。同様に、
呼吸によって\mathrm{CO}_{2}が排出されると先ほどと逆の方向に反応が進みpHが低下することになる $ ^{21} $ 。尚、円石藻は石灰化機能を有することが特徴であるが、その反応速度は光合成の反応に比して10-50%であり、それ以上の石灰化反応速度を有する円石藻の報告はこれまでない。また、円石藻の石灰化は細胞内のココリス小胞において進行し、石灰化反応により生産される\mathrm{CO}_{2}分子は直ちに光合成によって吸収・固定される。また、E. huxleyiの石灰化反応は光合成反応の駆動時にのみ進行する。したがって、石灰化反応によって放出される\mathrm{CO}_{2}による酸性化は生じないしくみとなっている。ただし、夜間（暗期）においては、呼吸により放出される\mathrm{CO}_{2}が細胞外へと出され、平衡反応の結果海水の酸性化を引き起こすことは自明である。

円石藻が光合成を行っている場合、pHの上昇速度と光合成活性を我々の作成した装置で同時に測定すると、現行の海水pHに近似のpH8.2条件では両者の比は約1.05になる。しかし、同比は海洋酸性化条件を模したpH7.2条件において1.26の値を示した。対照的にpH9.2においては光合成が殆ど行われず、アルカリ化も観察されなかった。この結果はE. huxleyiが酸性化条件に置かれるとそれに対抗するかのように周囲のpHを上昇させようとする力（補償能力）が強まることを示唆している（図23）。つまり、酸性化に伴って引き起こされるpH上昇速度の増大は、前述した光合成による細胞外の培地中のCO_{2}消費とそれに伴うアルカリ化の増大だけでは説明出来ないことを意味している。この原因については未だに明らかになっていない。しかし、これらの結果は、生物が環境のpHに影響を及ぼす能力を有することを実験的に示した

例として非常に重要な結果である。

## 2 ）海洋酸性化が円石藻Emiliania huxleyi の光合成に与える影響

1）の結果を受けて円石藻 Emiliania huxleyiの光合成の酸性化に対する応答を精査した。NaHCO₃を加え、溶存無機炭素濃度(Dissolved Inorganic Carbon: DIC)を2 mMとして実験を行った所、pH低下に伴う顕著な酸素発生活性の増加が観察され、pH7.2条件では現行の海水のpHに近い8.2に比べて5倍高い活性を示した(図24、2 mM DIC)。この結果はpH低下による炭酸平衡のずれによりCO₂が増加することで光合成活性が上昇したものと考えられる。そこで、NaHCO₃の添加量を増やし、10 mM DICとして測定を行った所、今度はpH7.8にピークを持つ山型のデーターが得られた。ピークであるpH7.8条件の光合成活性はpH8.2の1.5倍であり、pH7.2においても8.2とほぼ同じレベルの活性が観察された(図24、10 mM DIC)。これらの結果は、光合成が酸性化の影響によって上昇することを示している。DIC濃度による違いは2mM DIC条件ではCO₂濃度に対する依存性が顕著に現れているが、10 mM DICではCO₂が十分に存在するため酸性化の影響が表出したものと思われる。次

図24 Emiliania huxleyiにおける光合成の酸性化影響

図25 Emiliania Huxleyiiにおける光化学系活性の酸性化
に光合成の初期過程に当たる光化学系に酸性化が与える影響についても調べた所、光化学系は酸性化の影響をあまり受けないことが明らかになった（図25）。PH7.2～8.2条件において48h培養したE. huxleyi細胞のクロロフィル蛍光を測定すると、光化学系Ⅱの状態を反映するFv/Fm値 $ ^{22)} $ は、pH7.2条件においては、pH8.2と比較して2 mM DICでは20%の減少、CO $ _{2} $ が十分存在する10 mM DICでも10%減少を観察した(図25，実線)。一方、炭酸固定系の活性を反映する(Fm’-F)/Fm $ ^{23)} $ は、2 mM及び10 mM DICともにpH7.2においてpH8.2比で5%の活性減が観察された。しかしながら、pH7.7では、Fv/Fm、(Fm’-F)/Fm共にほとんど減少が見られなかった(図25破線)。この結果は、今世紀末までに予想される0.3程度のpH低下では、E. huxleyiの光化学系にはほとんど影響が無いことを示している。むしろ、2 mM DICの(Fm’-F)/Fm値はpH8.2の場合よりも15%の上昇が認められ、炭酸固定活性が増加していると思われる。

## 3 ）酸性化が円石藻Emiliania huxleyiの石灰化に及ぼす影響

海洋酸性化が E. huxleyi の石灰化に与える影響については全く異なる 2 つの見解が存在する。

Riebessell ら (2000) $ ^{24)} $ は Nature 誌において酸性化によって石灰化の抑制が起こると報告し、

Iglesias-Rodriguez ら (2008) $ ^{25)} $ は酸性化によるココリス体積の増大を 2008 年の Science 誌に発表している。我々はこのような違いがなぜ起こったのかを生理学的手法を用いて解明する為、お互いの実験を再現し詳細な解析を実施した。

まず、両者の違いはその実験法にあった。

Riebessell ら $ {}^{24)} $ は酸添加によって酸性化条件を再現しているのに対し Iglesias-Rodriguez ら $ (2008)^{25)} $ は高

図27 Emiliania huxleyiにおけるCa^{2+}取り込みのHCO_{3}^{-}濃度

図26 酸添加およびCO₂通気実験における E. huxleyiの偏光顕微鏡写真

培養24h後の状態 白く光っているのがココリス

濃度の $ CO_{2} $ を通気することで低 pH の状態を作り出している。

そこでまず、我々は塩酸を添加して pH を 8.2, 7.7, 7.2 に調整した培地による培養実験（酸添加実験）と CO₂ 濃度を 400, 800, 1200 ppm に調整した空気を通気しての実験（CO₂ 実験）を行いそれぞれの再現性を調べた。その結果、酸添加実験では石灰化の抑制が見られ、CO₂ 実験では石灰化の促進が認められたことで、
その再現性が確認できた(図 26)。一見するとどちらも同じく酸性化実験であるが、我々は溶存無機炭素量（DIC）が両者の間で決定的に異なることを見出した。

$ CO_{2} $ が水に溶けると溶存 $ CO_{2} $ 、重炭酸イオン、炭酸イオンのという3種の化学種として存在する。この3者は $ CO_{2}+H_{2}O\LeftrightarrowHCO_{3}^{-}+H^{+}\LeftrightarrowCO_{3}^{2-}+2H^{+} $ という平衡関係にあり、DICとはそれら

(CO₂(aq), HCO₃⁻, CO₃²⁻) の総和に等しい。この平衡が酸添加では右から左、CO₂通気では左から右へと進むことになる。その結果、酸添加実験では増加した CO₂が気相に放出される為 DIC の減少が起こる。計算の結果、酸添加後 24h で pH7.7 条件では 80%、pH7.2 では実に 95% もの溶存無機炭素が失われていることが分かった。一方 CO₂通気による実験では DIC の低下は起こらず実験期間を通じてほぼ一定に保たれていた。炭酸化学種の一つである重炭酸イオンは E. huxleyi における石灰化の基質である 26)。酸添加実験では同基質の欠乏が起こっているものと思われた。そこで、様々は重炭酸イオン濃度下における細胞への 45CaCl₂ 吸収を調べる実験を行った。その結果、酸性化の如何に関わらずカルシウムイオンの取り込みが重炭酸イオンの濃度に依存していることが分かった(図 27)。これらの結果は、Riebessell ら（2000）²⁴)と Iglesias-Rodriguez ら（2008）²⁵)、それぞれの実験結果が違った原因が重炭酸イオン濃度の違いにあったことを明確に示している。それと同時に、現在、懸念されている大気中の CO₂増加による海洋酸性化では、E. huxleyi のココリス形成は影響を受けないことを示唆している。

## 44 ）酸性化が円石藻 Emiliania huxleyiの細胞増殖に及ぼす影響

異なる$\mathrm{CO}_{2}$濃度（400、800、1200 ppm）を通気して炭酸平衡状態を達成した条件下でE. huxleyiの培養を行った結果、$\mathrm{CO}_{2}$濃度が高くなりpHの低下が起こっても増殖速度、ココリス形成能は変化せず、光合成活性は高$\mathrm{CO}_{2}$条件ほど高いレベルを維持した。pH 7.7であっても$\mathrm{CO}_{2}$濃度が高ければ石灰化が阻害されない理由は、石灰化の基質となる$\mathrm{HCO}_{3}^{-}$が十分供給されたためであることを明らかにした。

海洋酸性化予測には今世紀末までに pH が 7.7 程度まで低下すると予測するレポートもある中で、大気中 $ CO_{2} $ 濃度上昇による海洋酸性化は、海洋において大増殖を引き起こす円石藻 E. huxleyi の増殖、光合成、石灰化（ココリス形成）に大きなダメージを与える可能性は少ないことが明らかとなった。

## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

## 1 ）自然群集を用いた実験法の確立

海洋酸性化が海洋微生物群集に与える影響に関する実験的評価法は、まだ確立したとは言えない状況である。本研究では、400Lの大量培養系において、培養液の $ pCO_{2} $ およびpHの調整に必要となる気体の通気量について検討し、実験に用いる海水試料容量の50倍程度が目安となることを明らかにした。

2）酸性化の進行により、ハプト藻Chrysochromulina属など、特定の分類群の増殖が阻害的な影響を受ける事を明らかにした。近年、Chrysochromulina属は、海洋における一次生産者として非常に重要なグループであることが報告された。本研究で得られた結果は、海洋酸性化の進行は、海
洋の微生物群集構造に対して多大な影響を与える可能性を示唆している。

3）海洋微生物が気候変動に影響を与える、炭素の長期貯留過程として重要な「生物ポンプ」および「微生物炭素ポンプ」に対して、海洋酸性化が影響を与える可能性を明らかにできた。前者においては、酸性化に対する植物プランクトングループによる応答の違いを通して、群集のサイズ組成の変化が重要な鍵を握ることが示唆された。また後者については、酸性化によるバクテリア代謝活動の変化が、難分解性溶存態有機物の生成過程の変化を引き起こす可能性がある。

4）我々は本プロジェクトを通じて円石藻Emiliania huxleyiの酸性化に対する応答のメカニズムの解明に注力してきた。海洋酸性化研究は現在までの所、Iglesias-Rodriguezら（2008） $ ^{25)} $ やRiebessellら（2000） $ ^{24)} $ の例でも分かるように現象論に終始しているきらいがある。確かに海洋酸性化の脅威を一般に警告する意味でもこういった研究はとても重要であるが、それだけでは海洋酸性化の真の理解に至ることは難しい。今後、当分野の研究は各生物の酸性化応答メカニズムの研究に軸足を移すことになるだろう、その意味で本研究は非常に大きな意義を持つ。

## （２）環境政策への貢献

1）2011年1月に沖縄で実施されたIPCCの海洋酸性化専門家会議サイドイベントにおいて、本サブテーマにおいて得られた成果について2課題の発表を行い、高い評価を得た。

2）沿岸域から外洋域に一般的に見られるハプト藻Chrysochromulina属、緑藻Tetraselmis属、

Pramimonas属は、海洋酸性化の進行に対する感受性が高く、海洋酸性化の進行と共に減少する可能性が示唆された。このことから、これらの分類群を生物指標種として用いることにより、海洋酸性化の海洋微生物群集に対する影響の程度を評価することが可能となる。これらについて、IPCCの酸性化会議等を通して、成果の広報・普及に努める。

3）本プロジェクトにおいて我々は円石藻Emiliania huxleyiが海洋酸性化という事態に対してどの様に応答するかを明らかにした。この植物プランクトンがもつ光合成による酸性化抑制力を全地球規模で見積もることで、生物学的影響という新たなファクターを海洋酸性化モデルに加えることが出来、それによって酸性化予測の精度向上に大きく貢献できると考えている。

## 6 ．引用文献

1) Caldeira, K. and M. E. Wichett, 2003: Anthropogenic carbon and ocean pH. Nature, 425, 365.

2) Hall-Spencer, J., R. Rodolfo-Metalpa, S. Martin, E. Ransome, M. Fine, S. M. Turner, S. J. Rowley, D. Tedesco and M. C. Buia, 2008: Volcanic carbon dioxide vents show ecosystem effects of ocean acidification. Nature, 454, 96-99

3) Feely, R. A., C. L. Sabine, K. Lee, W. Berelson, J. Kleypas, V. J. Fabry and F. J. Millero, 2004: Impact of anthropogenic $ CO_{2} $ on the $ CaCO_{3} $ system in the oceans. Science, 305, 462-366.

4) Orr, J. C., V. J. Fabry, O. Aumont, L. Bopp, S. C. Doney, R. A. Feely, A. Gnanadesikan, N. Gruber, A. Ishida, F. Joos, R. M. Key, K. Lindsay, E. Maier-Reimer, R. Matear, P. Monfray, A. Mouchet, R. G. Najjar, G. K. Plattner, K. B. Rodgers, C. L. Sabine, J. L. Sarmiento, R. Schlitzer, R. D. Slater, I. J. Totterdell, M. F. Weirig, Y. Yamanaka and A. Yool, 2005: Anthropogenic ocean acidification over the twenty-first century and its impact on calcifying organisms. Nature 437, 681–686.

5) Doney, S. C., V. J. Fabry, R. A. Feely and J. A. Kleypas, 2009: Ocean Acidification: The Other CO $ _{2} $
Problem. Ann. Rev. Mar. Sci., 1, 169-192.

6) Kim, J. M., K. Lee, K. Shin, J. M. Kang, H. W. Lee, M. Kim, P. G. Jang and M. C. Jang, 2006: The effect of seawater $ CO_{2} $ concentration on growth of a natural phytoplankton assemblage in a controlled mesocosm experiment. Limnol. Oceanogr., 51, 1629-1636.

7) Shiraiwa, Y., A. Goyal and N. E. Tolbert, 1993: Alkalization of the medium by unicellular green algae during uptake of dissolved inorganic carbon. Plant Cell Physiol. 34, 649-657.

8) Tortell, P. D., G. R. DiTullio, D. M. Sigman and F. M. M. Morel, 2002: $ CO_{2} $ effects on taxonomic composition and nutrient utilization in an Equatorial Pacific phytoplankton assemblage. Mar. Ecol. Prog. Ser., 236, 37-43.

9) Riebesell, U., K. G. Schulz, R. G. J. Bellerby, M. Botros, P. Fritsche, M. Meyerhofer, C. Neill, G. Nondal, A. Oschlies, J. Wohlers and E. Zollner, 2007: Enhanced biological carbon consumption in a high $ CO_{2} $ ocean. Nature, 450, 545-548.

10) Hama, T., N. Handa, M. Takahashi, F. Whitney and C. S. Wong, 1988: Change in distribution patterns of photosynthetically incorporated C during phytoplankton bloom in controlled experimental ecosystem. J. Exp. Mar. Biol. and Ecol., 120, 39-56.

11) Riebesell, U. 2004: Effects of $ CO_{2} $ Enrichment on Marine Phytoplankton. J. Oceanogr., 60, 719-729.

12) Yoshimura, T., J. Nishioka, K. Suzuki, H. Hattori, H. Kiyosawa, Y. W. Watanabe, 2010: Impacts of elevated $ CO_{2} $ on organic carbon dynamics in nutrient depleted Okhotsk Sea surface waters., J. Exp. Mar. Biol. Ecol., 395, 191-198.

13) Raven J. A. 1985: pH regulation in plants. Science Progress, 69, 495-509.

14) Shi, D., Y. Xu, B. M. Hopkinson, F. M. M. Morel, 2010: Effect of ocean acidification on iron availability to marine phytoplankton. Science, 327, 676-679.

15) Hajdu, S., H. Hoglander, and U. Larsson, 2007: Phytoplankton vertical distributions and composition in Baltic Sea cyanobacterial blooms. Harmful Algae, 6, 189-205.

16) Liu, H., I. Probert, J. Uitz, H. Claustre, S. Aris-Brosou, M. Frada, F. Not and C. Vargas, 2009: Extreme diversity in noncalcifying haptophytes explains a major pigment paradox in open oceans. PANS, 106, 12803-12808.

17) Eppley, R.W., and B. J. Peterson, 1979: Particulate organic matter flux and planktonic new production in the deep ocean, Nature, 282, 677–680.

18) Jiao, N., G. J. Herndl, D. Hansell, R. Benner, G. Kattner, S. Wilhelm, D. L. Kirchman, M. G. Weinbauer, T. Luo, F. Chen and F. Azam, 2010: The microbial carbon pump in the ocean. Nature Rev. Microbiol. 8, 593-599.

19) Legendre, L and J. Le Fevre, 1998: Hydrodynamic sigularities as controls of recycled versus export production in oceans. In: Berger W. H., V. S. Smetacek and G. Wafer (eds.) Production of the Ocean: Present and Past. Wiley & Sons, Chichester.

20) Shimotori, K., Y. Omori, and T. Hama, 2009: Bacterial production of marine humic-like fluorescent dissolved organic matter and its biogeochemical importance. Aquat. Microb. Ecol. 58, 55–66.
21) Fukuda, S., I. Suzuki, T. Hama, and Y. Shiraiwa, 2010: Compensatory Response of the Unicellular-Calcifying Alga Emiliania huxleyi (Coccolithophoridales, Haptophyta) to Ocean Acidification. J. Oceanaogr., 67 (1), 17-25.

22) Demmig, B. and O. Bjorkman, 1987: Comparison of the effect of excessive light on chlorophyll fluorescence (77 K) and photon yield of O, evolution in leaves of higher plants. Planta 171, 171-184.

23) Genty, B., J. M. Briantais and N. R. Baker, 1989: The relationship between the quantum yield of photosynthetic electron transport and quenching of chlorophyll fluorescence. Biochimica et Biophysica Acta 990, 87–92.

24) Riebesell, U., I. Zondervan, B. Rost, P. D. Tortell, R. E. Zeebe, F. M. M. Morel, 2000: Reduced calcification of marine plankton in response to increased atmospheric $ CO_{2} $ . Nature 407, 364–67.

25) Iglesias-Rodriguez, M. D., P. R. Halloran, E. M. Rosalind, R. E. M. Rickaby, I. R. Hall, E. Colmenero-Hidalgo, J. R. Gittins, D. R. H. Green, T. Tyrrell, S. J. Gibbs, P. von Dassow, E. Rehm, E. V. Armbrust and K. P. Boessenkool, 2008: Phytoplankton Calcification in a High- $ CO_{2} $ World. Science 320, 336 – 340.

26) Sekino, K. and Y. Shiraiwa 1994: Accumulation and utilization of dissolved inorganic carbon by a marine unicellular coccolithophorid, $ Emiliania\ huxleyi $ . Plant Cell Physiol. 35, 353-361.

## 7 ．国際共同研究等の状況

実験的な解析により沿岸微生物群集に対する影響を評価するため、日韓共同研究への申請を念頭に、計画を立案中である。昨年11月に濱が韓国Hanyan大学における研究打ち合わせ会議に出席すると共に、海洋酸性化と溶存態有機物に関する講演を行った。また、韓国海洋研究所（KORDI）においても講演、意見交換を実施し、今後の連携に関する打ち合わせを行った。

カウンターパート氏名・所属・国名

Dr. Kan Hon Shin, Hanyan University, Korea

## 8 ．研究成果の発表状況

（1）誌上発表

〈論文（查読あり）〉

1) Fukuda, S., I. Suzuki, T. Hama, and Y. Shiraiwa, 2010: Compensatory Response of the Unicellular-Calcifying Alga Emiliania huxleyi (Coccolithophoridales, Haptophyta) to Ocean Acidification. J. Oceanaogr., 67, 17-25.

〈査読付論文に準ずる成果発表〉

特に記載すべき事項はない。

くその他誌上発表（査読なし）>
特に記載すべき事項はない。

（2）口頭発表（学会等）

1) Fukuda, S., I. Suzuki, T. Hama and Y. Shiraiwa, 2009: PICES 2009 Annual Meeting, Jeju, Korea.

“Control of seawater pH by the cocolithophorid, Emiliania huxleyi (Haptophyceae)”

2) Hama, T., S. Kawashima, Y. Satoh et al., 2009:, PICES 2009 Annual Meeting, Jeju, Korea. "Experimental study on the effect of ocean acidification on microbial structure and bioelemental cycles"

3) 濱 健夫、川島祥子、佐藤雄飛、霜鳥孝一、大森裕子、中山 剛、遠藤寛子、井上勲、安達大輝、長谷川瞬、緑川貴、石井雅男、斉藤秀、笹野大輔，2009：、2009年度日本海洋学会秋季大会

「海洋酸性化が微生物群集構造と生元素循環に及ぼす影響に関する実験的評価 1．実験系および環境要因の変化」

4) 川島祥子、濱健夫、佐藤雄飛、霜鳥孝一、大森裕子、中山剛、遠藤寛子、井上勲、安達大輝、長谷川瞬、緑川貴、石井雅男、斉藤秀、笹野大輔，2009：、2009年度日本海洋学会秋季大会

「海洋酸性化が微生物群集構造と生元素循環に及ぼす影響に関する実験的評価 2．植物プランクトン組成の変化」

5) 佐藤雄飛、濱健夫、川島祥子、霜鳥孝一、大森裕子、中山剛、遠藤寛子、井上勲、安達大輝、長谷川瞬、川貴、石井雅男、斉藤秀、笹野大輔、2009：2009年度日本海洋学会秋季大会

「海洋酸性化が微生物群集構造と生元素循環に及ぼす影響に関する実験的評価 2．生元素の動態」

6) 白岩善博, 2009:」日本植物学会第73回大会「藻類の代謝から見た海洋酸性化

7) 福田真也、鈴木石根、白岩善博, 2009: 日本アイソトープ協会平成21年度オータムスクール

「大気中二酸化炭素濃度上昇による海洋酸性化は円石藻Emiliania huxleyiにどのような影響を与えるか」

8) 福田真也, 2009: 2009: 第1回海洋酸性化勉強会

「海洋酸性化が微生物の群集構造と機能に及ぼす影響」

9) 福田真也・鈴木裕理奈・白岩善博, 2010: 第5回バイオミネラリゼーションワークショップ「円石藻 Emiliania huxleyi は海洋酸性化にどう応答するか」

10）白岩善博, 2010:」第3回海洋酸性化勉強会プログラム,「海洋酸性化と円石藻」