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【3J122004】浄水発生土（天日ケーキ）の園芸資材へのリサイクル技術に開する研究（H24～H25；累計交付額 84.907 千円）

仲原 龍吾（岡山市水道局）

### 1. 研究開発目的

水道事業において、河川の表流水を浄水処理して飲料水を製造する事業体においては浄水処理を行う浄水場で河川の濁質に由来する汚泥が発生する。汚泥を固液分離により脱水し、浄水発生土を生成する方法としては脱水機による機械的なケーキ生成（以下、脱水ケーキ）と天日乾燥床による太陽光蒸発によるケーキ生成（以下、天日ケーキ）が主流である。

脱水ケーキは、均一形状で種子混入も少ないため農業利用を行う中間処理施設への産業廃棄物処分においても処分価格が安価で有価物販売も可能である。一方、天日ケーキは、農業利用においても処分価格が高価となる。その理由として天日ケーキは形状が大きく、不均一であり、リサイクル製品の保管性低下を引き起こす含水率も高いことが挙げられる。また、屋外での長時間にわたる天日による固液分離を行うプロセスから雑草種子などの不純物の混入や微生物（カビ）発生の確率が高いことも理由の一つである。

岡山市水道局では、処分コストを抑制するため処分価格が高価な天日ケーキ処分（500t/年）を自己保有最終処分場へ処分してきた。しかし、自己保有最終処分場の残存容量も少なくなくなったこと及びリサイクル率を向上させる環境的な方針により、平成22年度から中間処理施設への高価な産業廃棄物処分に切り替えた。これにより運搬処分費が約600万円/年から約1,000万円/年へ上昇した。

本事業目的は、天日ケーキの運搬処分費を削減する販売を行うために技術的課題である形状の不均一、種子発芽可能性、カビ発生に対して破砕と乾燥処理によるリサイクル製品化プラントを効率性及び環境性を踏まえて開発することである。また、もう1つの目的は、天日ケーキリサイクル製品販売のチャンネルを開発し、販売のチャンネルが機能しない時のリスク分散も考慮して現状の市民販売及び処分の2つのチャンネルにリサイクル製品販売のチャンネルを加えた3つのチャンネルを持つビジネスモデルの構築とビジネスモデルの効率的運用手法を開発することである。

## 2 ．本研究により得られた主な成果

## (1) 技術的貢献度

①木質ペレットバーナ乾燥装置

乾燥システムに環境影響（CO₂排出量）が少ない木質ペレットを燃料とした制御性の良いバーナ乾燥装置を開発した。

②リサイクル製品化プラント自動運転装置

開発実験により得られたデータを分析し、原料毎の含水率及び処理量を設定すれば、
種子発芽抑制効果のあるリサイクル製品を自動運転で製造する運転装置を開発できた。

③浄水発生土の処理計画システム及び手順

リスク分散及び効率的運用のために市民販売、産業廃棄物処分及びリサイクル製品の企業への販売の3つのチャンネルを最適に運用する手法を開発した。

## (2) 得られた成果の実用化

平成26年度から開発したリサイクル製品化プラントにより天日ケーキを対象として袋詰めのリサイクル製品を製造し、構築したビジネスモデルにより運用を開始する。天日ケーキの年間発生量である500tのリサイクル製品化処理を実施する予定である。

## (3) 社会への貢献の見込み

水道事業を運営する自治体では、岡山市同様に浄水発生土の製品化による販売が課題である都市が多い。今後、開発した技術普及とリサイクル製品の販売促進を目的として共同で特許取得（特許出願）した企業と協力協定を結び技術普及プロモーションと販売促進プロモーションを実施していく予定である。

### 3. 委員の指摘及び提言概要

技術的には既存の技術であり、驚きはないが、リサイクルした製品について性状等の検討を行っており、他都市の天日乾燥ケーキへの応用も可能である。ただ、園芸資材へのリサイクルだけでなく、別の技術への活用も視野に入れることが事業化を図る上で必要だったのではないか。また、事業化の課題や経済性などを明らかにし、国の補助金などを当てにせず健全な事業として育てることを提案すべき。

### 4. 評点

総合評点：B
政策評価調書（個別票1）

【政策ごとの予算額等】

政策名	安定的で効率的な国家公務員共済制度等の構築及び管理
評価方式	総合・実績事業	政策目標の達成度合い	目標達成	番号	⑮政策目標9-1
25年度	26年度	27年度	28年度	29年度概算要求額
予算の状況	当初予算(千円)	67,250,077	70,397,559	74,351,954	70,481,812	65,369,800

補正予算(千円)	△121,769	△103,395	△82,494	-

線越し等(千円)	-	-	-

計(千円)	67,128,308	70,294,164	74,269,460

執行額(千円)	67,128,308	70,237,732	73,852,291

政策評価結果の概算要求への反映状況	平成27年度政策評価結果を踏まえ、安定的で効率的な国家公務員共済制度等の管理・運営のために必要な経費の確保に努めるべく予算要求を行った。
## 政策評価調書（個別票2）

政策名	安定的で効率的な国家公務員共済制度等の構築及び管理	番号	⑮政策目標9-1	(千円)
予算科目	予算額	政策評価結果の反映による見直し額(削減額)合計
整理番号	会計	組織/勘定	項	事項	28年度当初予算額	29年度概算要求額
対応表においてとなっているもの	●	1	一般	財務本省	国家公務員共済組合連合会等助成費	国家公務員共済組合連合会等補助等に必要な経費	7,202,055	6,837,125	-
●	2	一般	財務本省	国家公務員共済組合連合会等助成費	日本郵政共済組合等補助に必要な経費	117,713	118,071	-
●	3	一般	財務本省	国家公務員共済組合連合会等助成費	日本郵政共済組合等負担金に必要な経費	63,162,044	58,414,604	-
●	4
小計	70,481,812	65,369,800	-
対応表においてとなっているもの	●	1
●	2
●	3
●	4
小計
対応表においてとなっているもの	○	1	<	>	>
○	2	<	>	>
○	3	<	>	>
○	4	<	>	>
小計
対応表においてとなっているもの	●	1	<	>	>
●	2	<	>	>
●	3	<	>	>
●	4	<	>	>
小計
合計	70,481,812	65,369,800	-
## 政策評価調書（個別票3）

【見直しの内訳・具体的な反映内容】

政策名	安定的で効率的な国家公務員共済制度等の構築及び管理	番号	⑤政策目標9-1	(千円)
事務事業名	整理番号	予算額	政策評価結果の反映による見直し額(削減額)	政策評価結果の概算要求への反映内容
28年度当初予算額	29年度概算要求額	増△減額

該 当 な し
○ 政策目標 9－1：安定的で効率的な国家公務員共済制度等の構築及び管理

目標設定の考え方	国家公務員共済組合制度は、国家公務員及びその遺族の生活の安定と福祉の向上に寄与するとともに国家公務員の職務の能率的運営に資することを目的とする社会保险制度です。
これを踏まえ、安定的で効率的な国家公務員共済組合制度の構築及び管理を行っていくことが重要であると認識しています。その際、「社会保障制度改革推進法」（平成24年法律第64号）等に沿って取り組む社会保障制度改革及び諸外国との社会保障協定に適切に対応すること、福祉事業を含む全ての事業について、適正な運営を確保することが重要であると考えています。

上記の「政策目標」を達成するための「施策」
政9-1-1：被用者年金一元化後の年金制度の適正な運営を含む社会保障制度改革への対応
政9-1-2：諸外国との社会保障協定への対応
政9-1-3：国家公務員共済組合連合会等の適正な運営の確保

施策	政9-1-2:諸外国との社会保障協定への対応
定性的な測定指標	平成28年度目標	目標の設定の根拠
[主要]政9-1-2-B-1:諸外国との社会保障協定への対応	社会保障協定締結に向けて、関係省庁と連携を図り、適切な対応を行います。	国際的な人的交流の活発化に伴う日本と諸外国の社会保障制度の二重適用の問題や、年金受給資格の問題を解決すべく、日本と諸外国との間で社会保障協定の締結を推進するためです。

施策	政9-1-3: 国家公務員共済連合会等の適正な運営の確保
定性的な測定指標	平成28年度目標	目標の設定の根拠
[主要]
政9-1-3-B-1: 国家公務員共済組合連合会等の適正な業務運営を確保します。	国家公務員共済組合連合会等の適正な業務運営を確保します。	国家公務員共済年金の支給等の実務を担う国家公務員共済組合連合会等の適正な業務運営を確保することにより、安定的で効率的な国家公務員共済組合制度等の管理・運営に努めるためです。
政策目標に係る予算額	平成25年度	26年度	27年度	28年度当初	平成28年度行政事業レビュー番号
(項)国家公務員共済組合連合会等助成費	67,128,308 千円	70,294,164 千円	74,269,460 千円	70,481,812 千円	0053

（注）「政策目標に係る予算額」の表中には、政策目標9－1に係る予算額を記載しています。

担当部局名	主計局（給与共済課）	政策評価実施予定時期	平成29年6月
様式2

(所得の種類) 1. 営業 2. 農業 3. その他の事業 4. 不動産 5. 利子・配当 6. 給与 7. 公的年金等 8. 譲渡 9. 山林 10. その他 11. 不詳

# 国民健康保険実態調査〔世帯票〕

〔平成 24 年度〕

都道府県名	保険者名

都道府県番号	保険者番号・区番号	群別	抽出番号	擬制世帯であるか	市町村民税	軽減世帯	世帯主職業区分	主たる所得者職業区分	平成23年度保険料(税)(医療給付費分)	平成23年度保険料(税)(後期高齢者支援金分)	平成23年度保険料(税)(介護納付金分)	短期被保険者証等交付状況	保険料(税)賦課経過措置
保険者番号	調定額	収納額	調定額	収納額	調定額	収納額
1 2擬否	1 2課税非課税	1 2 3短期証資格証明書交付なし

医療給付費等分	平 成 24 年度 保 險 料 (税) 賦 課 状 況	固定資産税額 (土地・家屋) (平成24年度)
保 險 料 (税) 算 定 額
所 得 割 額	資 産 割 額	均 等 割 額	平 等 割 額	計
一 般 被 保 險 者 分	|	|	|	|	|	|	|	|	|	|	|	|	|	|	|	|	|	|	|	|	|	|	|	|	|	|	|	|	|	|	|	|	|	|	|	|
退 職 被 保 險 者 等 分	|	|	|	|	|	|	|	|	|	|	|	|	|	|	|	|	|	|	|	|	|	|	|	|	|	|	|	|	|	|	|	|	|	|	|	|
計

後期高齢者支援金分	平 成 24 年度保險料(税) 賦課状況
保險料(税)算定額
所得割額	資産割額	均等割額	平等割額	計
一般被保險者分	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月
退職被保險者等分	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月
計

介護納付金分	平 成 24 年度保險料(税) 賦課状況
保險料(税)算定額
所得割額	資産割額	均等割額	平等割額	計
一般被保險者分	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月
退職被保險者等分	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月	月
計

被保険者区分	世帯主との続柄	性別	生 年 月	所得の有無	所得の種類	総所得金額山林所得金額	イ雑損失の繰越控除額	分離譲渡所得金額(特別控除後の金額)

(注) (軽滅世帯) 1. 非軽滅 2. 2割軽滅 3. 3割軽滅 4. 4割軽滅 5. 5割軽滅(8を除く) 6. 6割軽滅 7. 7割軽滅 8. 5割軽滅(国保法施行令第29条の7第5項第5号イ又は地方税法施行令第56条の89第2項第4号イによる)

(職業区分) 1. 農林水産業 2. その他の自営業 3. 被用者 4. その他 5. 無職 6. 不詳

(保険料(税)賦課経過措置) 1. 経過措置非該当 2. 旧国保被保険者合算軽減 3. 平等割半額 4. 旧国保被保険者合算軽減かつ平等割半額 5. 被扶養者であった者に対する緩和措置 6. その他

(短期被保険者証等交付状況) 1. 短期証 2. 資格証明書 3. 交付なし

(所得の有無) 1. 有 2. 無 3. 不詳 4. 有(特例対象被保険者等の給与所得有)
# 第3節 | 人手の過不足感の状況

## ● 特に非製造業で人手不足が進行しており、全体的にバブル期に次ぐ不足感

続いて、企業側の労働需要について詳細にみるために、まずは企業における人手の過不足感の状況について確認していく。

まず、人手の過不足感について概観する。第1-(2)-8図では、人手の過不足感を表す指標として、日本銀行「全国企業短期経済観測調査」（短観）の雇用人員判断D.I.²の推移を示している。ここでは、雇用人員判断D.I.がプラスであることは、人手が過剰と考えている企業の割合の方が高く、マイナスであることは、人手が不足していると考えている企業の割合の方が高いことを示している。

今回の景気回復局面における人手不足の状況を把握するため、長期の雇用人員判断 D.I. の推移をみてみると、人手不足感は 2010 年以降強まり続けている中で、直近の 2017 年 1～3 月の雇用人員判断 D.I. は全産業・製造業・非製造業いずれも前年より低下しており、1992 年 1～3 月期以来 25 年ぶりの人手不足感となっていることが分かる。

#### 第1-(2)-8図 雇用人員判断 D.I. の推移

○ 産業別に雇用人員判断 D.I. をみると、全産業、製造業、非製造業はいずれも不足感が高まっており、特に非製造業の不足感が高くなっている。

(「過剰」「不足」・%ポイント)

資料出所 日本銀行「全国企業短期経済観測調査」をもとに厚生労働省労働政策担当参事官室にて作成（注）グラフのシャド一部分は景気後退期。
## ●引き続き「正社員等」において不足感が強まっている

次に、第1-(2)-9図により、厚生労働省「労働経済動向調査」の雇用形態別 $ ^{3} $ にみた労働者の過不足判断D.I.の推移をみていく。なお、ここでは、先述の日本銀行「全国企業短期経済観測調査」とは逆に、労働者の過不足判断D.I.がプラスであることは、人手が不足していると考えている企業の割合の方が高く、マイナスであることは、人手が過剰であると考えている企業の割合が高いことを示していることに注意が必要である。全体的に人手不足感が強まっている中で、「派遣労働者」と比較して「常用労働者」の不足感が高まっている。

次に、「常用労働者」のなかでどの雇用形態で不足感が強まっているかをみていくと、「正社員等」が「臨時」より不足感が強い傾向が継続している中で、2015年1～3月期で「正社員等」の不足感が「パートタイム」を超して以降、9期連続で「正社員等」の不足感が「パートタイム」の不足感を上回っており、「正社員等」において深刻な人手不足の状況にあることが分かる。

## 第1-(2)-9図

### 雇用形態別にみた労働者過不足判断 D.I

○ 雇用形態別にみると、臨時と比較して正社員・パートタイムが不足と感じる事業所が増加している中で、2015年2月調査以降では正社員等の不足感がパートタイムを上回っている。

(「不足」「過剰」・％ポイント)

(年·月)

資料出所 厚生労働省「労働経済動向調査」をもとに厚生労働省労働政策担当参事官室にて作成

（注）1）「常用労働者」とは、期間を定めずに、又は1か月を超える期間を定めて雇われている者、日々又は1か月以内の期間を定めて雇われている者で、前2か月にそれぞれ18日以上雇われた者のいずれかに該当する者をいい、「正社員等」「臨時」「パートタイム」を含み、「派遣労働者」は含まない。

2）「正社員等」とは、雇用期間を定めないで雇用されている者又は1年以上の期間の雇用契約を結んで雇用されている者をいい、「パートタイム」は除く。

3）「臨時」とは、1か月以上1年未満の期間を定めて雇用されている者及び期間を限って季節的に働いている者をいい、「パートタイム」は除く。

4）「パートタイム」とは、1日の所定労働時間又は1週間の所定労働日数が当該事業所の正社員のそれより短い者をいう。
## 正社員等では「建設業」「製造業」、パートでは「宿泊業、飲食サービス業」で不足感が強まっており、「医療、福祉」は特に正社員等で不足感が強い

最後に、雇用形態別に産業別の状況をみていこう。第1-(2)-10図では、正社員等とパートタイムの主要産業における労働者の過不足判断D.I.の推移を示している。雇用形態間で比較すると、パートタイムでは「宿泊業，飲食サービス業」「卸売業，小売業」で不足感が高くなっている一方で、正社員等ではあらゆる産業で不足感が強まり続けている。また、2016年1～3月期以降の最近の動きをみると、パートタイムでは「宿泊業，飲食サービス業」で強まっており、正社員等では、「医療，福祉」「運輸業，郵便業」「建設業」で不足感が高く、特に「医療，福祉」については、2015年1～3月期に不足感がパートタイムを上回って以降、増加傾向で推移している。

### 第1-(2)-10図 産業別にみた労働者過不足判断 D.I

○ 産業別に足下の過不足状況をみると、正社員では医療，福祉や建設業、パートタイムでは宿泊業，飲食サービス業の不足感が強まっている。

資料出所 厚生労働省「労働経済動向調査」をもとに厚生労働省労働政策担当参事官室にて作成

(注) 1）「正社員等」とは、雇用期間を定めないで雇用されている者又は1年以上の期間の雇用契約を結んで雇用されている者をいい、「パートタイム」は除く。

2）「パートタイム」とは、1日の所定労働時間又は1週間の所定労働日数が当該事業所の正社員のそれより短い者をいう。
入札・契約調書

1	請負契約年月日	平成25年 4月19日
2	請負業者名	有限会社 サンコーグリーン産業
3	請負業者の住所	栃木県塩谷郡高根沢町宝積寺2384-12
4	工事件名	御料牧場内園地管理工事
5	工事場所	栃木県塩谷郡高根沢町大字上高根沢(御料牧場内)
6	工事種別	造園工事
7	工事概要	芝生地管理工・草地管理工
8	工期(自)	平成25年 4月20日
9	工期(至)	平成25年11月29日
(税込み)	(税抜き)	落札率
10	予定価格	非公表円	非公表円	—%
入札金額	6,489,000円	6,180,000円
11	入札結果	下表のとおり
順(入札者)	第1入札金額(円)	第2入札金額(円)	第3入札金額(円)	第4入札金額(円)	第5入札金額(円)
1	有限会社 サンコーグリーン産業	6,180,000
2	福田土木造園 株式会社	6,900,000
3	株式会社 河内緑化	7,000,000
4	株式会社 磯造園土木	7,940,000
5	合資会社 栃南造園	12,800,000
6	清原開拓造園 株式会社	16,970,000
## 入札・契約調書

1	請負契約年月日	平成25年 7月 8日
2	請負業者名	株式会社 河内緑化
3	請負業者の住所	栃木県宇都宮市下岡本町3764-8
4	工事件名	御料牧場内樹木管理ほか工事
5	工事場所	栃木県塩谷郡高根沢町大字上高根沢(御料牧場内)
6	工事種別	造園工事
7	工事概要	マツ手入工・生垣寄植刈込工・薬剤散布工
8	工期(自)	平成25年7月 9日
9	工期(至)	平成26年3月20日
(税込み)	(税抜き)	落札率
10	予定価格	非公表円	非公表円	— %
入札金額	3,003,000円	2,860,000円
11	入札結果	下表のとおり
順(入札者)	第1入札金額(円)	第2入札金額(円)	第3入札金額(円)	第4入札金額(円)	第5入札金額(円)
1株式会社 河内緑化	2,860,000
2福田土木造園 株式会社	3,700,000
3株式会社 磯造園土木	3,970,000
4鷺野谷造園代表鈴木孝	事前辞退
課題名 5RFc-1201 簡単な試料前処理のみで実施できるダイオキシン土壤汚染バイオアッセイキットの開発

課題代表者名 川西優喜 （大阪府立大学大学院理学系研究科 分子細胞遺伝学研究室 助教）

研究实施期间 平成24～25年度

累計予算額 11,202千円（うち25年度5,457千円）

予算額は、間接経費を含む。

本研究のキーダイオキシン、バイオアッセイ、酵母、土壌汚染、簡易検出ワード

研究体制

(1)簡単な試料前処理のみで実施できるダイオキシン土壌汚染バイオアッセイキットの開発(大阪府立大学)

【注意】

本報告書は一般に公開されるため、特許出願および論文公開の関係上、本文および図について一部情報を伏せて執筆しました。

## 研究概要

### 1. はじめに(研究背景等)

現在ダイオキシン類を定量するには、公定法では高分解能ガスクロマトグラフ/質量分析計(HRGC/HRMS)を用いた機器分析法、準公定法として抗体法(ELISA)や動物細胞株を使用した生物検定がある。しかしこれらはいずれも土壌からのダイオキシン類の抽出・精製といった試料前処理過程に約10日を要し、分析終了までに2週間程度必要である。また分析には専門の施設・設備を要し、特にHRGC/HRMSは極めて高額のため分析コスト削減のネックである（図1）。土壌汚染対策法の改正など今般の社会情勢は、今後ますます土壌汚染の調査・対策件数の増大を予想させる。しかしその調査・対策は高額な費用と多くの時間が必要なことが多く、企業にとって無視できない負担である。従って本提案の社会的・経済的意義は大きい。またこの高負担が合理的な土壌汚染リスク管理の大きな制約となっている。そこで本提案の低コストなダイオキシン汚染土壌検出法は、安全・確実な土壌汚染対策に貢献する。これにより土壌汚染による健康リスクを低減できる。

分析コスト・時間の削減に貢献

図1 研究の背景と概要

### 2. 研究開発目的

そこで本提案では低コスト・省時間の分析法として、ダイオキシン汚染を、簡単な試料前処理のみで1日で結果判定できる簡便・迅速・低コストのスクリーニングキットを開発する。

提案者らはすでにダイオキシン受容体ジーンバッテリーを利用したダイオキシン類を検出するレポーター酵母を開発、バイオアッセイキットとして上市（96回分析用、4万8千円）している（図2）。本
提案では、まず新規に簡便な試料前処理法を開発する。この前処理の簡易化に伴い、抽出度の低下および妨害物質の混入が予想される。これを補償するため酵母の高感度化、すなわち細胞壁破壊（プロトプラスト化）、細胞膜壁関連遺伝子破壊による改変を行う。様々な土壌試料を測定し、ダイオキシン検出1次スクリーニング系として十分な性能を持つか確認する。最後に試料前処理とバイオアッセイを同梱したキットを試作する。

本提案の開発要素の一つは、酵母のプロトプラスト化・細胞膜壁関連蛋白質遺伝子改变による高感度化である。この改良はダイオキシン検出酵母の他、提案者らがすでに作出している多くの微量汚染物質検出のバイオアッセイ酵母にも施すことができ、科学的・技術的に発展性に富む要素である。

図2 先行研究で開発したバイオアッセイ酵母

### 3. 研究開発の方法

## （１）簡単な試料前処理のみで実施できるダイオキシン土壤汚染バイオアッセイキットの開発

申請者らの開発したヒトダイオキシン受容体遺伝子全長を導入したバイオアッセイ酵母の改良から始めた。この酵母はダイオキシン類が酵母内のヒトダイオキシン受容体に結合し、活性化すると発色する。

酵母には分厚い細胞壁があり、細胞内への被検剤の浸透を阻む。また細胞膜にはタンパク質Bが存在し、細胞内の被検剤を排出する。そこで、細胞壁の透過性を向上させ、被検剤の排出は抑制することで細胞内の被検剤濃度が上昇し、結果的に検出感度が向上することを企図し、細胞壁を構成するタンパク質A遺伝子1,2と、タンパク質B遺伝子5,10をCre/LoxP法により単一、二重、三重に破壊した遺伝子破壊型酵母を作製した。そしてこれら酵母株を宿主にアッセイ系を構築した。

一方、酵母細胞壁には、タンパク質Aのほかグルカンも多く含まれている。そこでZymolyaseでグルカンを溶解、酵母をプロトプラスト化した。このプロトプラスト処理により細胞壁はさらに脆弱化、被検剤の浸透性が一層高まると期待した。

最後に、アッセイ酵母の性能向上に伴い土壌試料の前処理法、すなわち抽出とクリーンナップをかなり簡素化しても、ダイオキシン類を検出できると予想した。そこで、あらかじめ3塩化ダイオキシンを添加した土壌から、超音波振とう器を用いてヘキサン抽出、市販の使い捨て多層カラムと活性炭カラムを用いてダイオキシン類をクリーンナップし、高感度化酵母で検出を試みた。

### 4. 結果及び考察

## （１）簡単な試料前処理のみで実施できるダイオキシン土壤汚染バイオアッセイキットの開発

予想通り $ \beta-NF $ 100 nM のときの応答を比較すると、タンパク質 A 1 タンパク質 B 5 二重破壊株とタンパク質 A 1 タンパク質 A 2 タンパク質 B 5 三重破壊株は、野生株に比べ、10 倍以上の応答性向上を示した。検出限界濃度も改善し、5～100 倍の感度向上が見られた。これら 2 株のプロトプラストを作製した。プロトプラストをアッセイに用いることで細胞増殖が不必要と思われたため、プロトプラスト用にアッセイプロトコルも改変・最適化した。その結果、従来法に比べアッセイ時間を 15 時間短縮ができた。各種多環芳香族に対する応答性を確認したところ、プロトプラストでもアッセイ可能であり、検出限界濃度が 2～10 倍改善することがわかった。

次いで土壌試料の簡易前処理法を開発した。前処理には、土壌からのダイオキシン類の抽出・濃縮と、不純物質の除去・クリーンナップの2つの目的がある。クリーンナップ性能は、カラム処理前には三塩化ダイオキシン以外の多環芳香族にもアッセイ酵母は応答していたのが、カラムを通すことで多環芳香族は除去され、三塩化ダイオキシン添加土壌のみ酵母アッセイで陽性となった。

次に抽出性能、すなわちダイオキシン類回収率は約70%であった。バイオアッセイの検量線を用いて検出限界を計算したところ、0.061[ng/g]であった。この値は、環境基準が1,000[pgTEQ/g]、調査指標
が250 [pg-TEQ/g]であることを考えると、十分使い物になる性能といえる。

最後に、公定法による測定データのある実際の汚染土壌を簡易前処理、アッセイした。分析化学会頒布の土壌認証標準物質、すなわち焼却炉ちかくの汚染森林土壌を簡易前処理しアッセイしたところ1gの土壌でも陽性判定できた。酵母アッセイの検量線からTEQを求めたところ、23,000[pg/g]であった。これは公定法で算出した値111[pg/g]の約200倍にあたり、かなり過大に評価することがわかった。これは土壌試料が多種類のダイオキシン異性体を含んでいるためで、アッセイ酵母が、TEF・毒性係数の低い異性体にも応答して、過大な評価につながったと考えている。しかし様々なダイオキシン異性体を含む試料を陽性と判定することはむしろ一次スクリーニング法としては望ましいとも考えられ、当初の目的通り機器分析の事前スクリーニングとして有用な方法であると結論する。

### 5. 本研究により得られた主な成果

## (1) 科学的意義

現在ダイオキシン類の汚染は、ソックスレー抽出、硫酸クリーンナップ、多層シリカゲルカラムやアルミナカラムによるクロマトグラフィーを経てGC/MSで定量する公定法で調べられている。専用施設・機器を備えた検査機関への委託分析が主流であり、費用は高額で、分析結果の受領までには相応の日数を要する。

従って、本研究開発による酵母の高感度化は、簡便な前処理方と合わせて高校理科室程度の施設を持つ事業所で安価に簡便に迅速に、土壌のダイオキシン汚染の有無の判定に貢献する。企業は本研究で開発するキットを汚染の一次スクリーニングに用い、陽性判定される土壌試料だけを公定法による分析にまわせばよい。そうすることで、これまで負担していたコストと時間を大幅に削減できる。

## (2) 環境政策への貢献

## ＜行政が既に活用した成果＞

特に記載すべき事項はない

## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

平成24年度環境研究総合推進費募集要項が述べているように、今後ますます土壌汚染対策法、ダイオキシン類特別措置法に基づく汚染調査が増大する。安全確実な土壌汚染対策と健康リスク低減のため、低コストの土壌汚染調査法の開発が求められている。

現在、土壌のダイオキシン類汚染は、HRGC/HRMSを用いた公定法、ELISAや動物細胞株を使用した生物検定による簡易法で調べられている。これらはいずれも専用の施設・分析機器を備えた検査機関（公的機関・民間の分析サービス会社）が実施している。また、試料の前処理には長時間のソックスレー抽出や、硫酸によるクリーンナップ、多層シリカゲルカラムやアルミナカラムによるクロマトグラフィーが必要である。委託費用は高額で、分析結果の受領までには相応の日数を要する。

高校理科室程度の施設を持つ事業所で安価に簡便に迅速に、土壌のダイオキシン汚染有無を判定できる本課題は特に中小企業にとって福音となる。このバイオアッセイキットは、まさにこの行政ニーズを満たす解決策の決定打である。

### 6. 研究成果の主な発表状況

## (1) 主な誌上発表

く査読付き論文>

特に記載すべき事項はない

## (2) 主な口頭発表 (学会等)

1）ミネラルコルチコイド受容体 (MR) 発現酵母の高感度化，原島小夜子，川西優喜，八木孝司，変異機構研究会・第25回夏の学校，2012年6月30-7月1日，小牧市

2）男性ホルモン受容体（AR）・黄体ホルモン受容体（PR）の発現酵母の高感度化と有用性の評価，又野真実，原島小夜子，川西優喜，八木孝司，変異機構研究会・第25回夏の学校，2012年6月30-7月1日，小牧市
3）レチノイン酸受容体・レチノイドX受容体発現レポーターアッセイ酵母株の樹立，芳川智哉，椎崎一宏，川西優喜，八木孝司，変異機構研究会・第25回夏の学校，2012年6月30-7月1日，小牧市

4）アフリカツメガエルの甲状腺ホルモン受容体（TR）αレポーターアッセイ酵母株の樹立，松井聡子，原島小夜子，川西優喜，八木孝司，変異機構研究会・第25回夏の学校，2012年6月30-7月1日，小牧市

5）酵母レポータージーンアッセイを用いた有機フッ素化合物の核内受容体リガンド活性の評価，吉田仁，永吉晴奈，川西優喜，原島小夜子，椎崎一宏，八木孝司，松田知成，高木総吉，安達史恵，柿本健作，山口貴弘，小西良昌，第21回環境化学討論会，松山，2012年7月

6）酵母レポーターージーンアッセイを用いた紫外線吸収剤の核内受容体リガンド活性の評価，永吉晴奈，吉田仁，川西優喜，原島小夜子，椎崎一宏，八木孝司，松田知成，高木総吉，安達史恵，柿本健作，山口貴弘，小西良昌，第21回環境化学討論会，松山，2012年7月

7) Detection of environmental pollutants as human receptor agonists in estuarine sediments of Taiwan using various reporter gene assays, Chien-Hsiun Chen, Ton-Cun Liu, Masanobu Kawanishi, Pei-Hsin Chou, SETAC Asia Pacific 2012 Meeting, Kumamoto, Japan, 2012年9月

8) Evaluation of estrogenic, androgenic, and antiandrogenic activities in Taiwanese rivers using yeast bioassays and liquid chromatography-tandem mass spectrometry, Tsung-Ya Tsai, Yi-Lin Lia, Masanobu Kawanishi, Pei-Hsin Chou, SETAC Asia Pacific 2012 Meeting, Kumamoto, Japan, 2012年9月

9）性ホルモン受容体発現酵母の高感度化と環境試料のリガンド活性評価，又野真実，原島小夜子，川西優喜，八木孝司，第18回バイオアッセイ研究会・日本環境毒性学会合同研究発表会，2012年9月23日-24日，熊本市

10）アフリカツメガエルの甲状腺ホルモン受容体レポーターアッセイ酵母株樹立と有用性評価，松井聡子，原島小夜子，川西優喜，八木孝司，第18回バイオアッセイ研究会・日本環境毒性学会合同研究発表会，2012年9月23日-24日，熊本市

11）レポーターアッセイ用ミネラルコルチコイド受容体(MR)発現酵母の改良と有用性評価，原島小夜子，柿内康司，川西優喜，八木孝司，第18回バイオアッセイ研究会・日本環境毒性学会合同研究発表会，2012年9月23日-24日，熊本市

12）ヒト副腎皮質ホルモン受容体発現酵母によるレポーターアッセイの改良と有用性評価，原島小夜子，柿内康司，川西優喜，八木孝司，日本環境変異原学会第41回大会，静岡，2012年11月

13）アフリカツメガエル甲状腺ホルモン受容体発現レポーターアッセイ酵母株樹立と有用性評価，松井聡子，原島小夜子，川西優喜，八木孝司，日本環境変異原学会第41回大会，静岡，2012年11月

14）ヒト性ホルモン受容体（ERα/β，PR，AR）発現酵母の高感度化と有用性の評価，又野真実，原島小夜子，川西優喜，八木孝司，日本環境変異原学会第41回大会，静岡，2012年11月

15）レチノイン酸受容体・レチノイドX受容体発現酵母の樹立と内分泌攪乱物質および河川水のアッセイ，芳川智哉，椎崎一宏，川西優喜，八木孝司，日本環境変異原学会第41回大会，静岡，2012年11月

16）酵母レポーターアッセイによる府大池の水と底泥の内分泌かく乱活性の検出，松浦麻衣、又野真実、原島小夜子、川西優喜、中谷直樹、八木孝司，大阪府立大学第8回キャンパスビオトープ研究会，2013年4月23日，堺市

17）キイロショウジョウバエのエクジソン受容体のリガンドを検出するレポーターアッセイ酵母株の樹立，松浦麻衣，原島小夜子，川西優喜，中川好秋，八木孝司，変異機構研究会・第26回夏の学校，2013年6月22-23日，尾張一宮市

18）昆虫の脱皮ホルモン受容体リガンドを検出するレポーターアッセイ酵母の樹立，松浦麻衣，原島小夜子，川西優喜，中川好秋，八木孝司，日本農芸化学会関西支部例会第80回講演会，2013年7月6日，堺市

19）昆虫脱皮木ルモン受容体発現レポーターアッセイ酵母株の樹立と有用性評価，松浦麻衣，原島小夜子，川西優喜，中川好秋，八木孝司，第19回日本環境毒性学会研究発表会，2013年9月7-8日，東京20）カエルの甲状腺ホルモン受容体発現レポーターアッセイ酵母によるリガンド活性物質の検出，松井聡子，原島小夜子，川西優喜，八木孝司，第19回日本環境毒性学会研究発表会，2013年9月7-8日，東京

21）高感度化レポーターアッセイ酵母を用いたステロイドホルモン受容体リガンド検出システムの有用性評価～各種人工合成化学物質のステロイドホルモン様活性の検出～，原島小夜子，又野真実，柿内康司，川西優喜，八木孝司，第19回日本環境毒性学会研究発表会，2013年9月7-8日，東京
22）キイロショウジョウバエのエクジソン受容体リガンド活性を検出するレポーターアッセイ酵母株の樹立と有用性評価，松浦麻衣，原島小夜子，川西優喜，中川好秋，八木孝司，第36回日本分子生物学会年会，神戸，2013年12月

23）カエルの甲状腺ホルモン受容体発現レポーターアッセイ酵母株樹立と有用性評価，松井聡子，原島小夜子，川西優喜，八木孝司，第36回日本分子生物学会年会，神戸，2013年12月

24）酵母レポーターアッセイ法に基づくステロイドホルモン受容体リガンド検出システムの確立・改良と有用性評価，原島小夜子，又野真実，柿内康司，川西優喜，八木孝司，第36回日本分子生物学会年会，神戸，2013年12月

### 7. 研究者略壓

課題代表者: 川西 優喜

京都大学工学部卒業、博士(工学)、現在、大阪府立大学大学院理学系研究科准教授

研究分担者

なし
5RFc-1201 簡単な試料前処理のみで実施できるダイオキシン土壌汚染バイオアッセイキットの開発

大阪府立大学

大学院理学系研究科 分子细胞遗传学研究室 川西優喜

研究協力者 原島小夜子、森健太郎

平成24～25年度累計予算額：11,202千円

（うち、平成25年度予算額：5,457千円）

予算額は、間接経費を含む。

## 特許出願および論文公開の関係上、本文および図について一部情報を伏せて執筆しました。

## [要旨]

低コスト・省時間の分析法として、ダイオキシン汚染を、簡単な試料前処理のみで1日で結果判定できる簡便・迅速・低コストのスクリーニングキットを開発した。ダイオキシン受容体AhRを発現するレポーターアッセイ酵母の高感度化および改変プロトコルを用いたアッセイ短時間化を行い、簡易カラムによる前処理と組み合わせることで、迅速・簡便なダイオキシン類検出系を開発した。

野生型アッセイ酵母株に比べ、タンパク質A遺伝子1,2、タンパク質B遺伝子5,10を単一，二重，三重に破壊した遺伝子破壊型アッセイ酵母ではリガンドの与える最大活性は2.1～12.6倍に上昇、検出限界濃度は～1/100に向上した。遺伝子破壊型酵母株の中で特に高感度化の見られた2株YSA172（タンパク質A1Δタンパク質B5Δ），YSA222（タンパク質A1Δタンパク質A2Δタンパク質B5Δ）をプロトプラストにし、アッセイプロトコルを改変することで、リガンドの検出限界濃度は1/100に向上した。またアッセイプロトコル改変によりアッセイ時間を40時間から25時間に短縮した。

さらに本アッセイ酵母と、簡易ハキサン抽出、市販の使い捨てカラムを用いた簡易精製を組み合わせることで、土壌中のダイオキシン類を検出できた。0.061[ng/g土壌]のTriCDDを検出でき、環境基準1,000[pg/g土壌]以上のダイオキシン類を検出するには0.061gの土壌で十分であることがわかった。複数のダイオキシン類を含む土壌を用いた場合、毒性当量は過大に評価した。疑陽性率が高いと予想されるものの、土壌汚染の1次スクリーニングの優れたツールとして利用できる。

## [キーワード]

ダイオキシン、バイオアッセイ、酵母、土壌汚染
### 1. はじめに

現在ダイオキシン類を定量するには、公定法では高分解能ガスクロマトグラフ/質量分析計(HRGC/HRMS)を用いた機器分析法、準公定法として抗体法(ELISA)や動物細胞株を使用した生物検

類の抽出・精製といった試料前処理過程に約10日を要し、分析終了までに2週間程度必要である。また分析には専門の施設・設備を要し、特にHRGC/HRMSは極めて高額のため分析コスト削減のネックである（図(1)-1）。土壤汚染対策法の改正など今般の社会情勢は、今後ますます土壤汚染の調査・対策件数の増大を予想させる。

しかしその調査・対策は高額な費用と多くの時間が必要なることが多く、企業にとって無視できない負担である。従って本提案の社会的・経済的意義は大きい。またこの高負担が合理的な土壤汚染リスク管理の大きな制約となっている。そこで本提案の低コストなダイオキシン汚染土壤検出法は、安全・確実な土壤汚染対策に貢献する。これにより土壤汚染による健康リスクを低減できる。

図(1)-1 研究の背景と概要

## 2 ．研究開発目的

そこで本提案では低コスト・省時間の分析法として、ダイオキシン汚染を、簡単な試料前処理のみで1日で結果判定できる簡便・迅速・低コストのスクリーニングキットを開発する。

提案者らはすでにダイオキシン受容体ジーンバッテリーを利用したダイオキシン類を検出するレポーター酵母を開発、バイオアッセイキットとして上市（96回分析用、4万8千円）している（図(1)-2）。本提案では、まず新規に簡便な試料前処理法を開発する。この前処理の簡易化に伴い、抽出度の低下および妨害物質の混入が予想される。これを補償するため酵母の高感度化、すなわち細胞壁破壊（プロトプラスト化）、細胞膜・壁遺伝子

破壊による改変を行う。様々な土壌試料を測定し、ダイオキシン検出1次スクリーニング系として十分な性能を持つか確認する。最後に試料前処理とバイオアッセイを同梱したキットを試作する。

本提案の開発要素の一つは、酵母のプロトプラスト化・細胞膜・壁遺伝子改変による高感度化である。この改良はダイオキシン検出酵母の他、提案者らがすでに作出している多くの微量汚染物質検出のバイオアッセイ酵母にも施すことができ、科学的・技術的に発展性に富む要素である。

図(1)-2 先行研究で開発したバイオアッセイ酵母
## 3 ．研究開発方法

## (1) 遺伝子破壊株の作製

【使用した試薬・培地、実験機器】

試薬類は特に断りがない限り全て研究用、特級を用いた。

Glucose Medium (total volume 1L)

Dropout powder* 1.3 g

Glucose（ナカライテスク株式会社、京都）20 g

Yeast Nitrogen Base w/o Amino acid and Ammonium Sulfate (Difco, USA) 1.7 g
$ (NH_{4})_{2}SO_{4} $ （シグマアルドリッチジャパン株式会社、東京）5.0 g

5M NaOH（ナカライテスク株式会社、京都）500 μl

D₂W 900 ml

*Dropout powder（標記のない試薬は全てナカライテスク株式会社製）

Adenine (hemisulfate salt) 2.5 g

L-Arginine (HCl) 1.2 g

L-Aspartic acid 6.0 g

L-Glutamic acid (monosodium salt) 6.0 g

L-Histidine 1.2 g

L-Lysine (mono-HCl) 1.8 g

L-Methionine 1.2 g

L-Phenylalanine 3.0 g

L-Serine 22.5 g

L-Threonine 12.0 g

L-Tyrosine 1.8 g

L-Valine 9.0 g

L-Tryptophan（シグマアルドリッチジャパン株式会社、東京）1.2 g

L-Leucine 3.6 g

Uracil（シグマアルドリッチジャパン株式会社、東京）1.2 g

必要に応じてL-Tryptophan, L-Leucine, Uracil, L-Phenylalanine, L-Tyrosineを取り除いたものを用いた。Medium類は糖類のみ別に調製し、オートクレーブによる滅菌後、混和した。また、糖類とは別に調製したMedium類をComplete Mediumとした。

## 作製した選択培地

野生株酵母用

2% Glucose Medium (total volume 1 L)
Complete Medium (Trp-, Ura-) 900 ml
20% Glucose (ナカライテスク株式会社、京都) 100 ml
2% Galactose Medium (total volume 1 L)
Complete Medium (Trp-, Ura-) 900 ml
20% Galactose (ナカライテスク株式会社、京都) 100 ml