Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
表 10 本製造法と現行法によるバイオディーゼル1L 当たりの減価償却費の比較

樹脂触媒法	均相塩基触媒法
東北大	京都市	装置A	装置B	装置C
減価償却費（円/L）	654	62.5 (21.0)	22.9	12.5	23.4
装置コスト	5,230,000	750,000,000	11,000,000	6,000,000	11,250,000
製造量	3 L	5,000 L	200 L	200 L	200 L
運転時間	24 h	1 日	6 h	5 h	12 h

のスケールアップを行うことで大きく改善される。共同研究者が行っている他の研究で日生産量50 Lの全自動の連続製造装置を開発しており、この知見に基づくと、日生産量2,000 Lの本連続製造装置が1億円で製作可能といわれている。この条件で減価償却費を再計算すると、18.8円となり、均相塩基触媒法での値と同程度となる。また、現行の均相塩基触媒法の京都市の場合、前述の式(11)で算出すると62.5円/Lとなったが、資料での報告値は21円/Lであり、試算方法の違いによるものと考えられる。

最後に、ビタミン E 類の回収による利益コストを試算する。本製造装置による遊離脂肪酸からバイオディーゼルへの転化率は 100 %であるため、1 L のバイオディーゼルを製造するために必要な遊離脂肪酸残渣油量は、密度の違いに基づき 0.83 kg となる。前述の図 20 に基づき、この残渣油には 0.1 wt% のビタミン E 類が含まれ、そのうちトコトリエノール類の割合は 61 %であることから、ビタミン E 類量は $ 8.3 \times 10^{-4} $ kg、トコトリエノール類量は $ 5.1 \times 10^{-4} $ kg となる。また、トコトリエノールの価格は、食用米油製造会社からの情報では、10 %品で 2 万円/kg、60 %品で 15 万円/kg、95 %品で 30 万円/kg といわれている。本回収法では、樹脂に吸着したビタミン E 類がエタノール溶液の形で脱離され、ほぼ 100 %回収される。そのため、残渣油のビタミン E 組成を維持したまま回収されるとすれば、エタノール除去後にトコトリエノール 60 %品が得られると考えられる。この場合、1 L のバイオディーゼルを製造する際に、副生されるビタミン E 類の利益コストは 76 円、10 %品が得られるとしても利益コストは 10 円となる。現在、ビタミン E 類の回収に関する基礎データを取得した段階であるため、この利益コストは目安に過ぎないが、バイオディーゼル製造の経済性を大きく向上させることは間違いない。

### 4. 結論

実際に食用米油製造会社で発生した米ぬか由来の遊離脂肪酸残渣油を原料とし、研究代表者ら独自のイオン交換樹脂法を用いてJIS規格を満たす高品質バイオディーゼル燃料を連続製造できるベンチスケールの装置を作製、その生産性が最大となる装置運転条件を明らかにした。得られた燃料は、僅かに残留するメタノールを蒸留除去するだけで、JIS規格21項目を全て満たす高品質品
となることを外部専門機関により証明された。また、本研究成果に基づく燃料製造のランニングコストは約33円／L（薬剤11円、樹脂2円、樹脂再生（廃棄物処理）8円、光熱12円）と推算され、京都市の均相アルカリ触媒法によるコスト約55円／Lから40％削減、本研究開始前の本法コスト96円／Lから65％削減された。また、原料残渣油は約0.1wt%のビタミンE類を含み、このような低濃度のビタミンE類も陰イオン交換樹脂の吸着能により選択的に回収できること、より高い抗酸化活性を持つトコトリエノール含有量に応じてバイオディーゼル1L当たり10~76円の利益を生じる可能性があることも明らかになった。この利益コストが燃料製造プロセスコストに反映されれば、更なる競争優位性が得られると確信される。
### 5. 参考文献

1) M.J.Haas, S.Bloomer, K.M.Scott, “Simple, high-efficiency synthesis of fatty acid methyl esters from soapstock”, J.Am.Oil Chem.Soc., 77, 373-379 (2000)

2) O.M.I.Nwafor, “Emission characteristics of diesel engine operating on rapeseed methyl ester”, Renewable Energy, 29, 119–129 (2004)

3) J.P.Szybist, S.R.Kirby, A.L.Boehman, “NOx Emissions of alternative diesel fuels: a comparative analysis of biodiesel and FT diesel”, Energy Fuels, 19, 1484–1492 (2005).

4) G.Knothe, C.A.Sharp, T.W.Ryan, “Exhaust emissions of biodiesel, petrodiesel, neat methyl esters, and alkanes in a new technology engine”, Energy Fuels, 20, 403–408 (2006)

5) M. Lapuerta, J. Fernandez, J. R. Agudelo, “Diesel particulate emissions from used cooking oil biodiesel”, Bioresour. Technol., 84, 773-780 (2007)

6) Y.C. Sharma, B. Singh, S.N. Upadhyay, “Advancements in development and characterization of biodiesel: A review”, Fuel, 87, 2355-2373 (2008)

7) N.N.A.N.Yusuf, S.K.Kamarudin, Z.Yaakub, “Overview on the current trends in biodiesel production”, Energ. Convers. Manag., 52, 2741-2751 (2011)

8) E.M. Shahid, Y. Jamal, “Production of biodiesel: A technical review”, Renew. Sustain. Energy Rev., 15, 4732-4745 (2011)

9) http://www.oil.or.jp/kiso/seisan0301.html

10) http://www.oil.or.jp/kiso/seisan0201.html

11) JIS K2390, “自動車燃料-混合用脂肪酸メチルエステル(FAME)”, 日本規格協会(株)(2008)

12) Y.Watanabe, P.Pinsirodom, T.Nagao, “Conversion of acid oil by-produced in vegetable oil refining to biodiesel fuel by immobilized Candida antarctica lipase”, J. Mol. Catal. B:Enzym., 44, 99-105 (2007)

13) N.Akgun, A.Yaprakcl, C.Candemir, “Esterification of olive acid oil in supercritical methanol”, J.Lipid Sci. Technol., 112, 593-599 (2010)

14) K.Bunyakiat, S.Makmee, R.Sawangkeaw, S.Ngamprasertsith, “Continuous production of biodiesel from via transesterification from vegetable oils in supercritical methanol process”, Fuel, 86, 442-447 (2007)
15) B.S.Souza, D.M.M.Pinho, E.C.Leopoldino, “Selective partial biodiesel hydrogenation using highly active supported palladium nanoparticles in imidazolium-based ionic liquid”, Appl. Catal. A: Gen., 433, 109-114 (2012)

16) M.J. Hass, P.J. Michalski, S. Runyon, “Production of FAME from Acid Oil, a By-product of Vegetable Oil Refining”, J. Am. Oil Chem. Soc., 80, 97-101 (2003)

17) Z.-M. Wang, J.-S. Lee, J.-Y. Park, “Novel biodiesel production technology from soybean soapstock”, J. Chem. Eng., 24, 1027-1030 (2007)

18) P.-J.Shiu, S.Gunawan, W.-H.Hsieh, “Biodiesel production from rice bran by a two step in-situ process”, Bioresour. Technol., 101, 984-989 (2010)

19) Y.Li, X.Zhang, L.Sun, “Fatty acid methyl esters from soapstocks with potential use as biodiesel”, Energy Convers. Manage., 51, 2307-2311 (2010)

20) B.Peng-Lim, S.Ganesan, G.P.Maniam, “Sequential conversion of high free fatty acid oils into biodiesel using a new catalyst system”, Energy., 46, 132-139 (2012)

21) J.M.Marchetti, V.U.Miguel, A.F.Errazu, “Techno-economic study of different alternatives for biodiesel production”, Fuel Process. Technol., 89, 740-748 (2008)

22) N.Ozbay, N.Oktar, N.A.Tapan, “Esterification of free fatty acids in waste cooking oils (WCO): Role of ion-exchange resins”, Fuel, 87, 1789-1798 (2008)

(23) B.M.E.Russbueldt, W.F.Hoelderich, “New sulfonic acid ion-exchange resins for the pre-esterification of different oils and fats with high content of free fatty acids”, Applied Catalysis A: General., 362, 47-57 (2009)

24) Y. Liu, L. Wang, “Biodiesel synthesis combining pre-esterification with alkali catalyzed process from rapeseed oil deodorizer distillate”, Fuel Processing Technology, 90, 857-862 (2009)

25) 今井晋平, “イオン交換樹脂吸着法による米ぬか油からのビタミンEの回収”, 東北大学学士論文 (2010)

26) N. Shibasaki-Kitakawa, H. Honda, H. Kuribayashi, T. Toda, T. Fukumura, T. Yonemoto, “Biodiesel production using anionic ion-exchange resin as heterogeneous catalyst”, Bioresource Technology, 98, 416-421 (2007)

27) 米本, 北川, 戸田, 「脂肪酸エステルの製造方法」, 特許第 4198663 号 (2008.10.10)

28) 北川, 米本, 千田, 宮沢, 仲川, 木村, 「油脂からのトコトリエノールとバイオディーゼル燃料の同時生産方法」, 特開2009-190989 (2009.8.27公開)
29) N. Shibasaki-Kitakawa, T. Tsuji, M. Kubo, T. Yonemoto, “Biodiesel Production from Waste Cooking Oil Using Anion-exchange Resin as Both Catalyst and Adsorbent”, Bioenergy Research, 4, 2011, 287-293 (2011)

30) T.Eitsuka, K.Nakagawa, T.Miyazawa, “Down-regulation of telomerase activity in DLD-1 human colorectal adenocarcinoma cells by tocotrienol”, Biochem. Biophys. Res. Commun., 348, 170-175 (2006)

31) 京都市南部クリーンセンター管理課燃料化施設係「京都市における廃食用油燃料化事業の概要と施設紹介」配布資料 (2012)
### 6. 研究発表

### 6.1 論文発表

1) 北川尚美, 米本年邦, イオン交換樹脂触媒を用いた新規なバイオディーゼル燃料製造技術の開発, 化学工学, Vol.74, No.4, 2010, 164-167

2) N.Shibasaki-Kitakawa, T.Tsuji, K.Chida, M.Kubo, T.Yonemoto, Simple Continuous Production Process of Biodiesel Fuel from Oil with High Content of Free Fatty Acid Using Ion-exchange Resin Catalysts, Energy & Fuels, Vol.24, No.6, 2010, 3634-3638

3) H.Hermansyah, A.Wijanarko, M.Kubo, N.Shibasaki-Kitakawa, T.Yonemoto, Rigorous Kinetic Model Considering Positional Specificity of Lipase for Enzymatic Stepwise Hydrolysis of Triolein in Biphasic Oil-water System, Bioprocess and Biosystems Engineering, Vol.33, No.7, 2010, 787-796

4) N. Shibasaki-Kitakawa, T. Tsuji, M. Kubo, T. Yonemoto, Biodiesel Production from Waste Cooking Oil Using Anion-exchange Resin as Both Catalyst and Adsorbent, Bioenergy Research, Vol.4, No.4, 2011, 287-293

5) 北川尚美，高品質バイオ燃料と高機能生理活性物質を同時製造可能な環境配慮型反応分離技術の開発，化学工学，Vol.76，No.4，2012，207-208

6) N.Shibasaki-Kitakawa, M.Murakami, M.Kubo, T.Yonemoto, A Kinetic Model Describing Antioxidation and Prooxidation of $ \beta $ -Carotene in the Presence of $ \alpha $ -Tocopherol and Ascorbic Acid, Journal of the American Oil Chemists' Society, Vol.89, No.5, 2012, 815-824

7）北川尚美，イオン交換樹脂触媒を用いた高品質バイオディーゼル燃料製造技術，(財)京都高度技術研究所産学連携事業部バイオマス利用研究会平成23年度活動報告「バイオマス利用研究No.13」，2012,52-58

### 6.2 招待講演

1) N. Shibasaki-Kitakawa, T. Yonemoto, Continuous Production of High Quality Biodiesel from Vegetable Oils with High Fatty Acid Content Using Ion-exchange Resin Catalysts, The 12th International Conference on QiR, 2011年7月6日, Sanur Paradise Hotel (Bali, Indonesia)

2）北川尚美，イオン交換樹脂触媒を用いた高品質バイオディーゼル燃料製造技術，NPO 法人近畿バイオインダストリ振興会議第 18 回バイオマス研究会, 2011 年 7 月 15 日，大阪科学技術センター (大阪)
3）北川尚美，イオン交換樹脂触媒を用いた高品質バイオディーゼル燃料製造技術，(財)京都高度技術研究所産学連携事業部第64回バイオマス利用研究会,2011年9月29日，京都高度技術研究所(京都)

### 6.3 学会等発表

1) N.Shibasaki-Kitakawa, T.Tsuji, M.Kubo, T.Yonemoto, Production of High Quality Biodiesel Fuel From Waste Cooking Oil Using Anion-exchange Resin Catalyst, 2010 AIChE Annual Meeting, 2010年11月9日, Salt Palace Convention Center (Salt Lake City, UT, USA)

2) 金川恵一,久保正樹,北川尚美,米本年邦,副生物の除去工程を必要としない高品質バイオディーゼル燃料合成法,化学工学会第76年会,2011年3月24日,東京農工大学(東京)

3) N.Shibasaki-Kitakawa, Y.Kimura, M.Murakami, M.Kubo, T.Yonemoto, Kinetic Analysis for Water-soluble Free Radical Induced Oxidation of Liposomal Cholesterol with/without Lipid-soluble Antioxidants, Asian Congress on Biotechnology, 2011 年 5 月 12 日, Shanghai Everbright Convention & Exhibition Center（上海，中国）

4) N.Shibasaki-Kitakawa, T.Yonemoto, Production Process of High Quality Biodiesel Using Ion-exchange Resin Catalysts without Upstream and Downstream Processing, The World Conference on Oilseed Processing, Fats & Oils Processing, Biofuels & Applications, 2011年6月22日, Hilton Izmir (Izmir, Turkey)

5) 井原亨, 北川尚美, 中島一紀, 米本年邦, 遊離脂肪酸滝油を原料としたバイオディーゼル燃料合成, 化学工学会第 43 回秋季大会, 2011 年 9 月 16 日, 名古屋工業大学（名古屋）

6) 鮭川祐子, 中島一紀, 北川尚美, 米本年邦, リポソーム内包コレステロールの酸化反応速度に及ぼす構成リン脂質の影響, 化学工学会第 43 回秋季大会, 2011 年 9 月 15 日, 名古屋工業大学 (名古屋)

7) N. Shibasaki-Kitakawa, K. Kanagawa, K. Nakashima, T. Yonemoto, High Quality Biodiesel Fuel Production from Crude Jatropha Oil without Upstream and Downstream Processing, 2011 AIChE Annual Meeting, 2011年10月18日, Minneapolis Convention Center (Minneapolis, MN, USA)

8) 北川尚美, 米本年邦, 廃棄バイオマスを原料とした高品質バイオディーゼル燃料製造技術の開発, INCHEM TOKYO 産学官マッチングフォーラム, 2011 年 11 月 16 日, 東京ビッグサイト (東京)

9) 北川尚美, 米本年邦, 廃棄脂肪酸油を原料とした高品質バイオディーゼル燃料製造法, 東北大学イノベーションフェア, 2012 年 3 月 15 日, 東京国際フォーラム (東京)

10) 金川恵一, 中島一紀, 北川尚美, 米本年邦, イオン交換樹脂を触媒・吸着剤とした高品質バイ
オディーゼル燃料合成法, 化学工学会第 77 年会, 2012 年 3 月 16 日, 工学院大学(東京)

11) Y.Sukegawa, Y.Kimura, K.Nakashima, N.Shibasaki-Kitakawa, T.Yonemoto, Kinetic Analysis for Water-soluble Free Radical Induced Oxidation of Biomembrane Lipids, $ 103^{rd} $ AOCS Annual Meeting & Expo, 2012年4月30日, Long Beach Convention Center (Long Beach, CA, USA)

12) N. Shibasaki-Kitakawa, T. Ihara, K. Nakashima, T. Yonemoto, High Quality Biodiesel Production from Waste Acid Oil Using Ion-exchange Resins as Catalysts and Adsorbents, 103^{rd} AOCS Annual Meeting & Expo, 2012年4月30日, Long Beach Convention Center (Long Beach, CA, USA)

13) N. Shibasaki-Kitakawa, T. Yonemoto, A New Biodiesel Production Process Using Ion-exchange Resins as Catalysts and Adsorbents, ACHEMA (International Powder and Nanotechnology Forum 2012), 2012年9月19日, Exhibition grounds of Messe Frankfurt GmbH (Frankfurt, Germany)

14) N. Shibasaki-Kitakawa, K. Kanagawa, K. Nakashima, T. Yonemoto, Simple Production Process of High Quality Biodiesel and Glycerin from Jatropha Oil Using Cation-and Anion-exchange Resins, World Congress on Oleo Science (WCOS 2012) & 29th ISF Congress, 2012年10月1日，アルカス SASEBO(佐世保)

15) 中島一紀, 佐藤拓海, 北川尚美, 米本年邦, セルロースの酵素分解における超音波前処理の効果, 第64回日本生物工学会大会, 2012年10月26日, 神戸国際会議場(神戸)

16) 北川尚美, 米本年邦, イオン交換樹脂を触媒としたバイオディーゼル燃料の連続製造技術, 東北大学イノベーションフェア, 2013 年 1 月 17 日, 仙台国際センター (仙台)

17) 井原亨, 北川尚美, 中島一紀, 米本年邦, 廃棄脂肪酸油からの高品質バイオディーゼル連続合成プロセスの開発, 化学工学会第 78 年会, 2013 年 3 月 18 日, 大阪大学(大阪)

18) 鮭川祐子, 北川尚美, 中島一紀, 米本年邦, 生体膜系におけるリン脂質とコレステロールの共酸化速度論, 化学工学会第78年会, 2013年3月18日, 大阪大学(大阪)
### 7. 知的財産権の取得状況

1) 名称: 脂肪酸エステルの製造方法およびバイオディーゼル燃料

発明者:(東北大)北川尚美・米本年邦・井原亨・(三菱化学)高柳弘昭

権利者:(株)東北テクノアーチ、三菱化学(株)

種類:特願

番号: 特願 2012-021989

出願年月日:平成24年2月3日
概要：食用油製造工程で排出し大半が焼却処理されている遊離脂肪酸残渣油を新規バイオマス資源と捉え、独自のイオン交換樹脂法により高品質バイオ燃料に連続変換すると共に、油中の高付加価值物質を回収することで経済性向上を図る。

K2401 食用油製造工程で排出する遊離脂肪酸残渣油を原料とした 高品質バイオディーゼル燃料の連続製造技術の開発

- バイオ燃料と機能性物質を同時製造可能な技術は他になし

- 食糧生産に伴う廃棄物を利用するため真に食との銃合なし

- 環境配慮型で採算性のある革新的な燃料製造プロセスが確立

- 本プロセスをパーム残渣油(1200万トン)にも適用可能
## 英文概要

研究課題名

Development of Continuous Production Technology of High-quality Biodiesel Fuel using by-produced Acid Oil in Edible Oil Processing

研究代表者名及び所属

Toshikuni Yonemoto, Tohoku University

Naomi Shibasaki-Kitakawa, Tohoku University

Toshiyuki Kimura, National Agriculture and Food Research Organization, Tohoku Agricultural Research Center

## 要旨

Acid oil dumped during the edible oil processing and consisting of about 95wt% of free fatty acids and 5wt% of triglycerides, is used as a cheaper feedstock for biodiesel production. Vitamin E is expected to be recovered from the feedstock, which is helpful for decreasing the production cost of biodiesel. The novel bench-scale apparatus, in which expanded-bed reactors packed with cation- and anion-exchange resins were connected in series, was constructed. The continuous biodiesel production from rice bran acid oil was performed. The results led to the following conclusions:

(1) The rice bran acid oil contained vitamin E, tocotrienol and tocopherol, at about 1 wt% and the above anion-exchange resin selectivity adsorbed vitamin E from the oils.

(2) The effluent from the apparatus fully met the biodiesel standards of Japan (JIS K2390) without any downstream purification processes except for removing methanol.

(3) The running cost for biodiesel production by this system was estimated to be 33 yen/L-biodiesel compared with 55 yen/L-biodiesel reported by Kyoto City using conventional homogeneous alkali catalyst. The profit for recovery of Vitamin E was estimated to be 10-70 yen/L-biodiesel.

キーワード

Acid oil, Continuous production, High quality biodiesel, Ion-exchange resin, Vitamin E
【4RFd−1202】在来マルハナバチによる環境調和型ポリネーション様式の確立に関する研究（H24～H26；累計予算額11,210千円）

高橋 純一（京都産業大学）

### 1. 研究实施体制

(1) 有用在来種の室内増殖方法の確立と遺伝子解析に関する研究（京都産業大学）

(2)育種モデルの確立に関する研究（大阪府立大学）

### 2. 研究開発目的

在来マルハナバチは、現在実用化されているセイヨウオオマルハナバチと比べて、累代飼育に関連する技術の未確立であることや個体間の変異が大きいため形質の安定化が不十分である。例えば、①室内での女王蜂の交尾成功率の低さ、②女王蜂の産卵能力に起因するコロニー間での個体数(働き蜂)の変異が大きい、③累代飼育個体の休眠期間中の高い死亡率、④累代飼育個体（F1以降）の低い営業成功率、⑤野生種（1世代目）の病原微生物の高い浸潤率等のため繁殖成功率が低く、野生世代は飼育することができても、次世代や次々世代と世代を重ねるごとに飼育可能数が減少し、長期に安定的に系統を維持できない。⑥また、飼育下でのコロニーの大きさ（働き蜂の数）が、セイヨウオオマルハナバチほど安定していない。コロニー大きさが小さい巣をハウスに導入した場合、働き蜂の訪花活動が低く、十分な授粉効果が得られない。これらの問題を解決できなければ、実用化が困難であると考えられる。

そこで本研究では、トマトの授粉用生物資材として利用できる在来マルハナバチの開発について、現在問題となっている安定生産の阻害要因であるコロニーの営業成功率と交尾率の向上に加えて、コロニーサイズを大きくする選抜育種技術を確立する必要がある。確立した技術をもとにトマトハウスでの授粉試験から授粉能力の高い系統を作出する。累代飼育およびトマト生産に適した形質を改良する事で、このエゾオオマルハナバチを実用化することができると考えている。

今回の申請課題では、在来種による基盤技術の確立により、環境に配慮した授粉様式の確立の過程で在来マルハナバチの実用化が求められており、その実現により外来種の完全規制による生物多様性の保全が実現するための基礎研究となるようにする。

### 3. 本研究により得られた主な成果

## (1) 科学的意義

これまで飼育及び授粉試験が困難であった北海道産在来マルハナバチの中から候補種の選抜を行い、エゾオオマルハナバチにおいて累代飼育方法を確立した。さらにサブテーマ(2)で開発したBLUP育種モデルを使った方法により、DNA情報をもとに選抜育種を行い、コロニーサイズの大型の（産卵能力の高い）系統が選抜可能であることを実証した。BLUPによるDNA育種は、昆虫でも初めての成功結果である。さらに実践試験として、増殖したエゾオオマルハナバチを利用してトマトハウス内での訪花行動調査を行い、授粉能力があることを初めて確認した。またセイヨウオオマルハナバチとの比較試験でも同等の能力があることを初めて確認することができた。今回の研究成果により、代替種として在来種をBLUPモデルによる育種でコロニーサイズの大型化を行えば、実用化が可能であることを初めて実験的に示すことができた。

エゾオオマルハナバチの実用化後を想定した遺伝子汚染リスク評価を行った。仮にエゾオオマルハナバチが実用化され、一部の個体が野生個体と交配した場合であっても地域個体群の遺伝子構造に大きな影響にはならないことが示唆される結果を得た。

## (2) 環境政策への貢献（研究者による記載）

＜行政が既に活用した成果＞
2014年3月に一般財団法人自然環境研究センターで開催されたマルハナバチ利用方針検討会で本研究成果である北海道在来マルハナバチ種の実用化までの予定計画を提示し、外来生物法におけるセイヨウオオマルハナバチの取扱いに関する政策判定に貢献した。当会には、オブザーバーとして環境省および農水省も参加して議論が行われた。

また、2014年11月には、北海道庁農政部、ホクレン農業協同組合連合会、JA北海道が参加し、北海道庁で開催されたエゾオオマルハナバチの実用化に向けた検討会において、本研究成果のエゾオオマルハナバチの実用化に関する研究成果を提示し、特定外来種セイヨウオオマルハナバチの利用規制と在来種への転換を進めるための準備体制の策定に貢献した。

＜行政が活用することが見込まれる成果＞

エゾオオマルハナバチがトマト授粉に利用できることが今回初めて科学的データをもとに示すことができた。この結果により、北海道庁農政局では、エゾオオマルハナバチ利用普及検討会の協議会（仮称）を設立し、特定外来種であるセイヨウオオマルハナバチの完全規制とエゾオオマルハナバチの普及に向けた生産現場との連携体制をJA、ホクレン、生産者団体の関係機関と調整を行うための準備協議会の設立準備を進めることに活用されることが見込まれる。

### 4. 委員の指摘及び提言概要

在来生態系に与える影響が大きく問題となっていたセイヨウオオマルハナバチに替えてエゾオオマルハナバチを育種・利用する技術開発研究であり、実用化の隘路を正しく理解し、課題が設定され、十分実用化の見通しのある研究成果を得ている。さらに、実用化した場合に想定される野生個体群に対する影響も評価している。少なくとも北海道に関しては、十分実用化の見通しのある研究になっており、外来種問題を解決できる可能性を十分もった成果である。早い実用化が期待されるが、育種モデルの具体的な提案、有効性の検証が必要である。（なお、成果に対してやや論文が少ない感がある。今後積極的に国際的にも発信してほしい。）

### 5. 評点

総合評点：A
（２）メタゲノム解析による生物多様性の把握とサンゴ礁レジリエンス過程の観察

国立研究開発法人水産総合研究センター 長井敏

国立研究開発法人水産総合研究センター 田遷晶史・本郷悠貴（平成26-27年度のみ）

平成25～27年度累計予算額：29,434千円（うち平成27年度：9,478千円）

予算額は、間接経費を含む。

[要旨]

石西礁湖周辺海域における生物多様性の程度を把握するため、プランクトンメタゲノム解析を実施した。3年間に取得した合計136個のメタゲノム解析データにおいて、OTU（Operational Taxonomic Units）数と取得した次世代シーケンス（NGS）数の関係を解析したところ、右上がりの指数曲線に近似し（P<0.05）、海水3L中に出現するプランクトンは、約20,000配列読めば、だいたい網羅的に検出（400-650 OTUs）できることが判明した。最大8回の広域多点調査によるメタゲノム解析の結果から、地点間の生物多様性を比較したところ、各地点の平均OTU数は、100.0-248.8の範囲にあり、石垣島の南部と北部で多く、逆に石垣島西部とヨナラ水道付近で少ない傾向が認められ、地点によりプランクトン出現種多様性に差があることが判明した。また、陸源負荷の影響評価のため、河川由来のケイ酸塩を利用して増殖する珪藻に着目して解析したところ、複数の調査で、石垣島の南部を中心に高頻度の分布が見られたことから、特に降雨時の陸源負荷の起源が、主に石垣島南部にあることを明らかにした。

サンゴ着底板のメタゲノム解析を行った結果、OTU数は、98－278の範囲で算出された。配列数が多かった上位10位は、3種を除いて海藻類であり、着底板には多くの海藻が付着していたことが判明した。

オニヒトデ幼生を人工的に大量作出し、これに天然のプランクトンを餌として与え、胃内容物のメタゲノム解析を行うことで、餌生物を特定できる方法を、世界で初めて開発した。約500個体について解析を行ったところ、OTU数の割合として、渦鞭毛藻36%、珪藻36%、動物プランクトン24%、繊毛虫10%、クリプト藻・ハプト藻10%、原生動物9%を検出することに成功し、オニヒトデ幼生は、微細藻類を中心にデトライタスを捕食している可能性のあることが示された。

## [キーワード]

メタゲノム解析、OTUs（Operational Taxonomic Units）、類似度指数、珪藻、渦鞭毛藻

### 1. はじめに

最近の研究で藻類は、およそ11の植物門から構成されており、細胞の形態、薬緑体の組成と構造、鞭毛装置の構造・機能、生活環、遺伝子配列などが、分類の基準となっている。比較的大型の植物プランクトンでは、遺伝子情報は充実してきたが、採集地点等の詳細な情報が登録されておらず、10ミクロンより小型の超微細種の情報になると、何種類いるのか未だに不明である。沿岸域に普遍的に出現する珪藻で20,000種、渦鞭毛藻で2,000種、ハプト藻で2,000種、クリプト
藻・ユーグレナ藻で共に800種、藍藻で2,000種程度は存在すると見積もられている。特に小型の海産珪藻、ハプト藻、クリプト藻、ユーグレナ藻では未記載種が多く、その遺伝子情報の蓄積は極めて乏しい状況にあると言える。動物プランクトン・無脊椎動物群は植物プランクトン同様、極めて多様な動物群を含み、分布域、生活史などの生態も多様性に富んでおり、原生動物を除いた種で7,000種、このうちカイアシ類で2,000種類、原生動物2,700種存在すると言われている（日本産生物種数調査）。実際には、その数倍の種数の存在が推定されている。動物プランクトンに特化したデータベースとしてCensus of Marine Zooplankton (CMrarZ http://www.cmarz.org/)が知られており、形態と遺伝情報の総合化を目指した取り組みが行われている。

各都道府県市の海洋研究機関が1970年代前半から、環境モニタリングを実施しており、動植物プランクトンのデータは蓄積されてきたが、優占種の情報がほとんどであり、レア種や微細な植物プランクトンの情報はほとんどない。次世代型と呼ばれるシーケンサーは、従来型シーケンサーの千倍～数万倍の性能を発揮する。シーケンス革命の到来により、メタゲノムから“ペタゲノム”という言葉が使われる時代になり、従来の形態情報を重視していたモニタリングのスタイルに加え、大量に得られるゲノム情報をフル活用した革新的なスタイルも導入していく必要がある。当研究グループでは、既に、高精度でメタゲノム解析をすることができるプログラムを完成させ、それを用いてメタゲノム解析を実施しており、多数の原著論文として発信されつつある $ ^{1)} $ 、 $ ^{2)} $ 、 $ ^{3)} $ 、 $ ^{4)} $ 。試しに、2009年に広島湾および沖縄県石垣島の2ヶ所からそれぞれ5回ずつ海水をサンプリングし、次世代シーケンサーを用いて、動植物プランクトンの出現種について遺伝子解析（5万リード、500bpのPCR産物）したところ、各海域から、広島湾、石垣島サンプルから、それぞれ645個、791個のOTUが検出され、99個が両海域から検出され546個が広島湾のみで、692個が石垣島のみで検出された。両海域では出現種が相当異なることが既に明らかにされている。加えて、広島湾サンプルではプランクトン群集の明瞭な季節的出現特性が検出されたが、石垣島ではそれが見られない。以上のように、従来の研究手法だと、1個の海水サンプルからは、20、30種しか出現種を記載できなかったことに対して、メタゲノム解析を行うと、数百種のレベルで出現種の把握と時系列的なモニタリングが可能である $ ^{1)} $ 。

石西礁湖周辺海域において、環境生物モニタリングは実施されてはいるが、メタゲノム解析による微細藻類の網羅解析とモニタリングは実施されていない。農業、牧畜、観光など、周辺海域の富栄養化が進行する要素が多くなっている現状において、周辺海域の富栄養化の把握や陸源負荷起源の特定、オニヒトデの大量発生における「栄養塩仮説」の検証などを行うために、植物プランクトン出現種の組成や生物多様性の程度、他海域との差異、周辺海域内における地点間の差異に関する情報を、メタゲノム解析によるモニタリングで蓄積することは緊急を要する重要な研究課題である。

## 2 ．研究開発目的

石西礁湖内外における島嶼からの陸源負荷が生物多様性・分布密度・種組成に及ぼす影響をメタゲノム解析により明らかにする。次いで、サンゴの深刻な食害種であるオニヒトデ幼生の胃内容物をメタゲノム解析の手法で検出し、餌生物特定を行う。また、サンゴの着底板を設置し、サンゴ幼生の着底後の初期減耗に影響する要因を明らかにする。さらに、環境ストレスがもたらす生体影響を総合的に評価するの一環として、高水温における生体応答に着目し、石西礁湖に同
所的に存在するサンゴの遺伝子発現解析を行い、現場海水温の季節的上昇に伴う発現遺伝子を比較し、高水温時に応答して発現する遺伝子の同定を目的とする。

### 3. 研究開発方法

## (1) 石西礁湖内外における島嶼からの陸源負荷が生物多様性に及ぼす影響評価のためのメタゲノム解析 1) 石西礁湖4定点における周年調査(月1回):

石西礁湖周辺海域に出現するプランクトンの基本的な生物多様性・出現種やその季節性の把握のため、石西礁湖の4地点（図は省略）において、環境調査を実施、5 mのホースを鉛直に降ろして鉛直採水し、海水1~3L中に出現したプランクトンのメタゲノム解析を実施した。方法は、長井ほか $ ^{1,5)} $ に従い、次世代シーケンス（NGS）データを取得し、種同定を行う。サンプリングは、サブテーマ4により実施した。メタゲノム解析の概略としては、海水中に含まれる動植物プランクトンをろ過法によりフィルター（1μmのヌクレポアフィルター）上に捕集し、ろ紙をアルミホイルに包んだ後、凍結保存した。DNA抽出については、ろ紙の半分を切断、それを1.5mLのプラスチックチューブに入れ、5% Chelexバッファー150μLを添加した。DNA抽出効率を上げるため、ハンディ式ホモジナイザーを用いてろ紙ごと、30－60秒間、ホモジナイズを行った。これに、5% Chelexバッファー350μLを追加し、97℃で20分間加熱後、ろ紙を除去し、DNA抽出を完了した。Roche454 FLX Titanium systemを用いて、メタゲノム解析のためのNGSを取得するため、ユニバーサープライマー18S-rDNAを用いてPCR増幅を行った。サンプル毎に異なるタグ付けしたプライマーでPCR増幅を行うので、PCR増幅産物を精製後、PCR産物のDNA濃度を測定し、等量になるよう混合した。その後、NGSを行うためのライブラリー調整を行い、NGSを得た（図(2)-1）。

図(2)-1 メタゲノム解析フロー図
図(2)-2 次世代シーケンスデータの解析プラットフォームの概略図

図(2)-3 広域多点調査地点図（メタゲノム解析用海水サンプル最終地点＋オニヒトデ幼生採集地点）．6月17、18、21日に調査を実施
図(2)-4 広域多点調査地点図（メタゲノム解析用海水サンプル採集地点）。8月27日、9月5日に調査を実施

次世代型シーケンサーは、一度に大量の配列を取得することが可能だが、同時に大量のエラー配列も発生する。このため、バイオインフォマティクス技術を駆使したエラー除去や種同定の技術が必要となるが、使用するプログラムも研究者により統一が取れていない状況にある $ ^{1} $ 、 $ ^{3} $ 、 $ ^{4} $ 、 $ ^{5} $ 。このため、シーケンスエラー除去、キメラ配列除去を行うプログラムを完成させ、本解析にはそのプログラムを用いた（図(2)-2）。

## 2 ) 石西礁湖周辺海域における広域多点調査

陸源負荷によるプランクトン多様性の影響評価、あるいは陸源負荷の起源を明らかにするため、広域多点調査（基本的に、毎年6、8月に実施、16地点）を行い、海水中に出現するプランクトンのメタゲノム解析を実施した。2013年は6月17、18、21日（台風の通過後）の3回（16地点、図(2)-3）と8月27日、9月5日（台風の通過後）の2回調査（18地点、図(2)-4）を実施した。2014年は6月7、13日の2回のサンプリング調査を実施した。2015年は、6月25日に19地点で広域多点調査（1回）、6月22、23日に2地点において24時間連続調査した。いずれも、5 mのホースを用いて鉛直採水し、海水3 L中に出現するプランクトンのメタゲノム解析を実施した。海水サンプリングは他のサブテーマと連携して実施した。

## 3 )オニヒトデ幼生の胃内容物調査

昨年度までの研究において、オニヒトデの大量発生機構解明のため、幼生の分布調査と餌生物の特定を目的としたネットサンプリングによる調査を実施し、オニヒトデ幼生をマイクロピペットで分取し、DNA抽出、種判別プライマーで種同定後、オニヒトデ幼生と判定されたDNAサンプルについて、さらに微細藻類検出用の薬緑体ユニバーサルプライマーを用いてPCR増幅を試みるという研究計画を検討してきたが、予想以上に、天然のネットサンプルのエタノール固定標本からオニヒトデ幼生を見出すのは困難であった。また、仮にオニヒトデ幼生であると同定できても、
身体の回りに複数の植物プランクトンが絡みついていたり、突き刺さっていたりするので、餌生物の特定をするのは、困難であると判断した。このため、本年度は、親個体から採卵誘発して、幼生を人為的に大量に作出し、ネットで濃縮した天然プランクトンを餌として与え、胃内容物をメタゲノム解析により同定する手法の確立を試みた。

図(2)-5 オニヒトデ幼生飼育実験に用いた精巣、卵巣および受精卵の写真左上，卵巣；左下，精巣；右，受精卵をそれぞれ示す。

石西礁湖から採集してきた複数の成熟オス個体およびメス個体を水槽に飼育しておき、まずはメス3個体から卵巣を取り出し、10-25房/L海水として、これに10⁻⁵Mの濃度となるよう1-methyladenineを添加し、1時間後に、浮遊した成熟卵を回収した⁶,⁷)。400卵/mLの密度で1Lの海水に懸濁させ、これに成熟した精巣液を10 μL添加し、20-60分間放置した（図(2)-5）。その後、受精卵を数回、清浄海水で洗浄し、400卵/mLの密度となるように清浄海水で希釈し、1L容の容器、複数個に懸濁して、温度29℃に設定した水槽に浮かべて飼育を開始した。飼育海水は、24時間毎に交換した。これまでの報告で、オニヒトデ幼生は、自分の胃の口径より小さい微細藻類を捕食することが知られおり⁶）、飼育3目に緑藻Donariella sp.および珪藻Chaetoceros calcitransを5,000 cells/mLの初期密度で添加して、幼生がこれらの微細藻類を捕食するかどうか、24時間後に蛍光頭微鏡下で観察を行った。また、飼育5日後、サブテーマ(4)のリーダーである鈴木豪研究員の所属する西海区水産研究所亜熱帯研究センターの地先の天然海域で、プランクトンネットにより採集したプランクトンを餌として与え、24時間後、蛍光頭微鏡観察を行った。胃の内部に赤い自家蛍光を発する微細藻類の存在を確認したので、幼生を篩で濃縮洗浄し、約1,000個体を99.5%エタノール保存した。次に、幼生の胃内容物のメタゲノム解析を行うため、メタゲノムこれを25個体ずつ、洗浄しながらマイクロピペットで集め、DNA抽出を行った。DNA抽出後、ユニバーサルプライマーを用いてPCR増幅を行い、増幅産物が認められたので、メタゲノム解析を行った。

(2) サンゴ礁レジリエンス過程の観察のためのサンゴ着底板のメタゲノム解析: サンゴの白化後のレジ
リエンス過程を観察するため、サンゴ幼生の着底後の成長、初期減耗に影響する要因解明を目的としたサンゴ着底板に付着する生物のメタゲノム解析を実施すべく、2013年度に4回（6、7、10、11月）、複数の地点に設置した着底板を約10枚ずつ回収し（合計29サンプル、表(2)-1）、着底板に付着した生物を金属のスクレーパーを用いてそぎ落とし、50 mLの遠沈管に入れ、凍結保存した。

表(2)-1 サンゴ着底板の設置および回収情報

番号	基盤
設置日	基盤
回收日	場所詳細	サンゴ情報
1	3月15日	6月3日	石垣島浦底湾・魚礁・水深2m	3年前まで枝状のミドリイン属サンゴの優占地帯であったが、2年前にオニヒトデによってほぼ全滅。
2	3月15日	6月5日	嘉弥間島北・水深3m	石西礁湖の北側、いわゆる「北礁」。サンゴは、様々な種類が高被度に分布。この水深はミドリインが一番多い。
3	3月15日	//	嘉弥間島北・水深6m	この水深では、ミドリインと他のサンゴが半々くらい。
4	3月15日	//	嘉弥間島北・水深10m	この水深では、ミドリイン以外のサンゴが多くなる。
5	3月15日	//	サクラグチ（石垣港南側）・水深3m	港からの航路出口に近い。1998年の白化以降は、ソフトコーラルが優占して、造礁サンゴの回復はまばら。
6	3月15日	//	サクラグチ（石垣港南側）・水深7～8m	この水深（6～15m）は、特にソフトコーラルが多い。
7	4月15日	7月8日	小浜東の礁湖内東寄り（D1）・水深3m	生サンゴほとんどなし。太枝の死サンゴ原型留める。
8	4月15日	//	小浜東の礁湖内中央（D2）・水深4m	生サンゴほとんどなし。砂地にハマサンゴの根が点在
9	4月15日	//	嘉弥間島南西側（D3）・水深3m	水路わきのパッチリーフ。この2、3年でミドリインが増えてきた。
10	4月15日	//	小浜東の礁湖内西寄り（D4）・水深2～3m	生サンゴほとんどなし。枝は原型留めず散乱。基質は海藻に覆われている。
11	4月15日	//	小浜東の礁湖南端（内側・H2）・水深3m	生サンゴほとんどなし。太枝の死サンゴ原型留める。
12	4月15日	//	小浜東の礁湖南東端（H1）・水深6m	枝状ミドリインがまばらに分布。
13	4月15日	//	小浜東の礁湖南端（外側・H3）・水深4.5m	生サンゴわずかに残る。太枝の死サンゴ原型留める。スズメダイモドキの縄張りあり
14	4月15日	//	黒島北側のパッチリーフ（H4）・水深7m	枝状ミドリインが高被度に分布。
15	6月5日	//	嘉弥間島北・水深3m	上記のKN3と同じ場所。
16	6月5日	//	嘉弥間島北・水深6m	上記のKN6と同じ場所。
17	6月5日	//	嘉弥間島北・水深10m	上記のKN10と同じ場所。
18	6月5日	//	サクラグチ（石垣港南側）・水深3m	上記のSA3と同じ場所
19	6月5日	//	サクラグチ（石垣港南側）・水深7～8m	上記のSA6と同じ場所
20	7月10日	10月9日	石垣島浦底湾アウトリーフ・水深2m	3年前までサンゴ高被度。2年前のオニヒトデで全滅。かつてはテーブル状ミドリインが優占。
21	7月10日	//	石垣島浦底湾アウトリーフ・水深5m	かつては枝状ミドリインが優占。
22	7月10日	//	石垣島浦底湾アウトリーフ・水深10m	かつては枝状ミドリインとその他のサンゴが半々。
23	7月8日	11月6日	小浜東の礁湖内東寄り（D1）・水深3m	上記の石西Aと同じ場所。
24	7月8日	//	小浜東の礁湖内西寄り（D4）・水深2～3m	上記の石西Dと同じ場所。
25	7月8日	//	黒島北側のパッチリーフ（H4）・水深7m	上記の石西Hと同じ場所。
26	7月8日	//	嘉弥間島北・水深3m	上記のKN3と同じ場所。
27	7月8日	//	嘉弥間島北・水深6m	上記のKN6と同じ場所。
28	7月8日	//	嘉弥間島北・水深10m	上記のKN10と同じ場所。
29	7月8日	//	サクラグチ（石垣港南側）・水深3m	上記のSA3と同じ場所
30	7月8日	//	サクラグチ（石垣港南側）・水深7～8m	上記のSA6と同じ場所

(3)石西礁湖に同所的に存在するサンゴの遺伝子発現解析:六放サンゴ亜種のクシハダミドリイシと八放サンゴ亜種のアオサンゴの遺伝子発現解析を行った。クシハダミドリイシは熱に弱い種、アオサンゴは熱に強い種として既に報告がある事から、これらの種を対象にし、現場海水温の季節的上昇に伴う発現遺伝子を比較し、高水温時に応答して発現する遺伝子の同定を試みた。

石西礁湖内に2つの定点(24.258E,124.129N; 24.258E,124.130N)を設け、現場に水温計を設置した。5月～9月までの5ヶ月間のうち計8回、クシハダミドリイシとアオサンゴのサンプリングを実施し、各個体の遺伝子発現の解析を行った。5月～9月までの5ヶ月間のうち計8回、クシハダミドリイシとアオサンゴのサンプリングを実施し、最終サンプリング時に、水温計の回収を行った。水温計のデータを解析し（図(2)-6）、サンプリング間で温度変化のある時点4点を選択して、サンゴ個体よりtotal RNAを抽出した。サンプルは、5月と8月に採取されたクシハダミドリイシ（Acropora hyacinthus; Ahy）とアオサンゴ（Heliopora coerulea; Hco）を使用した。サンゴ個体よりtotal RNAを抽出した。BioanalyzerによるRNAのクオリティ一を確認後、Illumina TruSeq RNA sample prep kitにて計12のcDNAライブラリーを作成した(2時点×2種×3個体)。作成したcDNA LibraryはIllumina社のNextSeq500を用いて、150bpのペアエンドシーケンスを行った。得られた全リードからアダプターと低クオリティ一の除去を行い、Trinity de novo assembler $ ^{8)} $ によって種ごとにアセンブルした。各種のコンティグには、サンゴと共生藻の両者が混在している状態であるため、両者を分ける必要がある。沖縄科学技術大学院大学が解読した六放サンゴ亜綱のコユビミドリイン（Acropora digitifera）、イソギンチャク(Nematostella vectensis)、褐虫藻（Symbiodinium minutum）のゲノム情報 $ ^{9), 10), 11) $ と、公共データベースに既存の褐虫藻(クレードA, C1, C15, D1a)の発現遺伝子情報 $ ^{12)} $ と