Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
Blastを利用して、AhyとHco内の宿主・共生藻の遺伝子を同定し、さらに、同定できた宿主と共生藻のコンティグGC含有量(GC%)を調べた。次に、現場海水温の季節的上昇に伴う発現変動遺伝子を同定するため、アセンブルされたコンティグとリードを用いて、発現変動解析を行った。さらに、この解析結果から、上昇減少する遺伝子がどのような遺伝子種であるかを明らかにするため、Gene ontology (GO)を用いたenrichment解析を行った。

図(2)-6 クシハダミドリインとアオサンゴの採集地点 4ヶ月間における水温変化

## 4 ．結果及び考察

## (1) 石西礁湖内外における島嶼からの陸源負荷が生物多様性に及ぼす影響評価のためのメタゲノム解析 1) 石西礁湖4定点における周年調査（月1回）

基本的に月1回の定期的なモニタリング調査を実施し、2014年6月から2016年1月下旬まで海水サンプリングを行い、メタゲノム解析のサンプルを採集した。これら全てのサンプルからDNA抽出を行い、冷凍庫に保存した。現在、メタゲノム解析を実施中であり、本報告書に結果を加えることができなかった。

## 2 ) 石西礁湖周辺海域における広域多点調査

2013年の広域多点調査の結果において、生のOTU（Operational Taxonomic Units）数は、6月の調査で、131－677の範囲、8、9月の調査では177－881の範囲にあった。1サンプルあたりの取得配列数の多少によるOTU数への影響を補正するため、全サンプルの中で最小の取得配列数に合わせてOTU数を再計算したところ、OTU数は、6月の調査で、72－226の範囲、8、9月の調査では71－407の範囲に算出された。5回の広域多点調査から、地点毎のOTU数を比較すると、St.02、07、31で多く、逆にSt.32、13、10、5、26で少ない傾向が認められ、一元配置分散分析の結果でも有意な差が見られたことから（ $ F(17,64)=2.25,p<0.05 $ ）、地点によりプランクトン出現種多様性に差があることが判明した。特にSt.02で多く、St.13やSt.32で少ない結果となった。類似度指数から見た生物多様性の地点間の差異については、狭い海域ながら、栄養塩分布や海流、地形構造等の要因により、プランクトンの多様性に差異が生じていた（図(2)-7）。平稳時における地点間のプランクトン生物多様性と台風通過後のパターンとはそれなりに類似しており、石西礁湖の北部と南部で生物多様性（種組成）が異なることを示唆する結果が得られた。一方、NMDSプロット解析の結果を見ると、6月17、18日の両日のサンプルは、広範囲かつ混在してプロットされる傾向にあった。一方、台風通過後の21日のサンプルは、図右下に比較的集中的にプロットされ、台風通過による海水の擾乱により出現プランクトンの組成が変化かつ均一になったことを示唆する結果を得た
（図(2)-8、左図）。8月27日、9月5日のNMDSプロットの結果は、一見、台風通過の影響はないように見えるが、台風通過前後でプロットの位置が大きく異なっている点と異なっていない点があることから、台風による擾乱の影響は少なからずあったことが示唆された（図(2)-8、右図）。

河川水由来のケイ酸塩を利用して増殖する珪藻は、陸源負荷の起源を推定するのに、最も良い生物群であるため、各サンプルにおける単位配列数あたりの珪藻の配列数を調べると、6月17、18、21日では、いずれも石垣島南部海域の地点で多く（図(2)-9）、8月27日も石垣島南部で多く、9月5日では石垣島北部海域で多く（図(2)-10）、以上の結果から、陸源負荷の起源が石垣島周辺、とりわけ南部海域にあることが強く示唆された。石垣島南部に位置する石垣市は、近年の観光地化等により、おそらく高濃度の窒素、リンを含む生活排水や工業用排水が河川水に入り、それが南部沿岸域に流入し、石西礁湖周辺海域の富栄養化に寄与している可能性の高いことが示された。

図(2)-7 2013年における広域多点調査のうちメタゲノム解析による類似度指数を用いた解析結果各調査日におけるクラスタリングデンドログラム（左図）と各クラスタリンググループごとの水平的な分布（右図）を示す。
図(2)-8 NMDSプロット解析の結果．左図は6月の調査結果を示し、右図は8、9月の調査結果を示す．6月17日，赤色の丸；18日，紫色の丸；21日，うす緑色の丸．8月27日，赤色の丸；9月5日，うす緑色の丸．

珪藻配列数/全配列数

図(2)-9 2013年6月、石西礁湖周辺海域の広域多点調査における珪藻の分布量．6月調査時においてメタゲノム解析より得られたNGSデータのうち、珪藻配列数/総配列数の大小を5段階に分けて、地図上にプロットした．石垣島南部海域で珪藻の出現量が多いことを示しており、陸源負荷の起源が石垣島南部にあることを示す．
図(2)-10 2013年8月、石西礁湖周辺海域の広域多点調査における珪藻の分布量．8月下旬および9月上旬の調査時においてメタゲノム解析より得られたNGSデータのうち、珪藻配列数/総配列数の大小を5段階に分けて、地図上にプロットした．8月の調査時も6月と同様に石垣島南部海域で珪藻の出現量が多く、9月は石垣島北部で高い値を示しており、陸源負荷の起源が石垣島周辺にあることを示す．

図(2)-11 2014年6月、石西礁湖周辺海域の広域多点調査における珪の分布量．6月調査時においてメタゲノム解析より得られたNGSデータのうち、珪藻配列数/総配列数の大小を5段階に分けて、地図上にプロットした．石垣島南部海域で珪藻の出現量が多いことを示しており、陸源負荷の起源が石垣島南部にあることを示唆する．

2014年は、6月7、13日の2回の広域多点調査を実施し、プランクトンのメタゲノム解析を行った。生のOTU数は、6月の調査で、190－697の範囲にあった。1サンプルあたりの取得配列数の多少によるOTU数への影響を補正するため、全サンプルの中で最小の取得配列数に合わせてOTU数を再計算したところ、OTU数は、6月の調査で、118－293の範囲に算出された。検出された生物群を見ると、渦鞭毛藻、動物プランクトン（カイアシ類）、珪藻、原生動物の配列数およびOTUで70－80％を占めていた。河川水由来のケイ酸塩を利用して増殖する珪藻は、陸源負荷の起源を推定するのに、最も良い生物群であるため、各サンプルにおける単位配列数あたりの珪藻の配列数を調べると、6月7、13日では、いずれも石垣島南部海域の地点で多く（図(2)-11）、昨年度の同時期の
調査とほぼ同様な結果が得られた。以上の結果から、陸源負荷の起源が石垣島周辺、とりわけ南部海域にあることが強く示唆された。

2015年の広域多点調査は19地点において、6月25日に1回のみ実施した。プランクトンメタゲノム解析結果において、OTU数は70−422（260.5±81.6，平均±標準偏差）の範囲にあった。昨年や一昨年と同様、石垣島南部、石西礁湖内側、西表島～ヨナラ水道付近と水平的に幾つかのグループに区分することができた。狭い海域ながら、栄養塩分布や海流、地形構造等の要因により、プランクトンの多様性に差異が生じていることが示唆された（図(2)-12）。今回のメタゲノム解析による生物調査では、>1μmと0.2-1μmの各サイズ画分で検出された生物多様性を比較してみたところ、>1μmのサイズ画分から、941OTUが検出され、0.2-1μmの画分から、780OTUが検出され、613個のOTUは、共通して検出された（図(2)-13）。0.2-1μm画分だけから検出された167OTUsについてピコプランクトンを解析したところ、そのほとんどはいわゆる環境DNAで、渦鞭毛藻等が死滅した細胞からDNA断片が捕集されたものであり、それ以外では、小型のハプト藻・クリプト藻が3種程度、検出された。以上から、少なくとも今回の調査においては、0.2-1.0μmサイズのメタゲノム解析の結果は、さほど重要な情報を含んでいないと考えられた。

2015年、6月に石西礁湖内の2地点において、3時間毎に連続調査を実施した。OTU数は、183－355（278.1 ± 50.2，平均 ± 標準偏差）の範囲にあった。2地点各9サンプルにおけるスーパーグループの配列数から見た出現頻度を見ると、渦鞭毛藻に代表されるAlveolataと動物プランクトンが属するOpisthokonta、および珪藻に代表されるStramenopilesで90％以上占められた。時間経過とともに、動物プランクトンの割合が最多である時間帯と、渦鞭毛藻が最多の時間帯が認められた。地点間で大きく異なるパターンを示し、一定していなかった（図(2)-14）。この原因としては、大きな潮汐による攪拌が考えられた。また、通常、渦鞭毛藻は日周鉛直移動を示し、午前6時から午後3時頃までは、光合成のため表層付近に集積する傾向にあり、両地点において、夜中に底層付近まで沈降し、表層（0-5 m）に渦鞭毛藻が少なくなる現象は観察することができた。

図(2)-12 2015年における広域多点調査のうちメタゲノム解析による類似度指数を用いた解析結果クラスタリングデンドログラム（左図）と各クラスタリンググループ毎の水平的な分布（右図）を示す.
図(2)-13 広域多点調査のうちプランクトンメタゲノム解析結果を示す。>1.0μmと0.2-1.0μmのサイズ画分から検出されたOTUの類似性を示す.

図(2)-14 24時間連続調査のうちメタゲノム解析の結果（左図：SS11，右図：SS17）。

図(2)-15 3年間に取得した海水3Lに出現した生物のメタゲノム解析データにおける各サンプルあたりのNGS取得配列数とOTU数のXYプロット.
図(2)-16　3年間に取得した海水3Lに出現した生物のメタゲノム解析データにおけるスーパーグループレベルの出現割合（n = 136）。左図，OTU数で比較；右図，NGS数で比較。

地点名

図(2)-17 各サンプルあたりの平均OTU数（n=136）。図(2)-15に示した通り、OTU数は取得したNGS配列数によって影響を受けるため、最少のNGS配列数に合わせて、NGS配列をランダムに抽出することで補正し、OTU数を計算。図中の赤線は、全地点の平均OTU数を示し、図右上の数字は、平均±標準偏差を示す。

OTU数は通常、取得した配列数に依存するので、各サンプルにおける生OTU数と取得NGS数（エラー除去後）の関係について、3年間合計136個の海水のメタゲノム解析データをXYプロットで示したところ、右上がりの指数曲線に近似した（図(2)-15）。スピアマン検定の結果、相関係数は有
意と判定され、つまり、取得配列数が多いほどOTU数も多くなることが示された。しかし、20,000配列前後に曲線は横に傾き、石西礁湖周辺海域の海水3L中に出現するプランクトンは、約20,000配列読めば、だいたい網羅的に検出（400-650 OTUs）できることを示すことができた。石垣島周辺海域に出現する生物群をスーパーグループレベルで取り纏めたところ、1位は渦鞭毛藻や繊毛虫を代表とするAlveolataで、2位は、動物プランクトンやベントスを代表とするOpisthokontaで、3位は珪藻を代表とするStramenopilesであった（図(2)-16）。基本的に、広島湾等の富栄養化した日本の内湾域の組成と大きな相違はなく、生物多様性に富んだ海域であることが判明した。ただし、富栄養化した内湾域の場合、8μmのポアサイズのろ紙で500mLの海水をろ過するだけでも目詰まりを起こすことがあるが、石西礁湖の場合、3Lの海水を1μmのポアサイズのろ紙で直接、ろ過しても目詰まりすることはなかったことから、富栄養化の影響はあるものの、まだ、微細藻類の出現密度は、基本的に低いと言える。

1サンプルあたりの取得配列数の多少によるOTU数への影響を補正するため、全サンプルの中で最小の取得配列数に合わせてOTU数を再計算したところ（n = 136）、各地点の平均OTU数は、100.0-248.8の範囲にあり、最大8回の広域多点調査の結果から、地点毎のOTU数を比較すると、St.02、07、31、つまり石垣島の南部と北部で多く、逆にSt.13、15、16、18、石垣島西部とヨナラ水道付近で少ない傾向が認められ、地点によりプランクトン出現種多様性に差があることが判明した（図(2)-17）。

## 3 ) オニヒトデ幼生の胃内容物調査

人工的に作出したオニヒトデ幼生（生後、7日目）に、餌料藻類として知られる緑藻のDonariella sp.と珪藻のChaetoceros calcitransを餌として与えたところ、12時間後には、胃にこれらの餌生物が充満していた（図(2)-18）。同様に、石垣島北部の天然海水からネットで捕集したプランクトンを餌として与えて12時間後に観察したところ、小型の微細藻類を捕食しているのを確認することができた。幼生約500個体からDNAを抽出し、18SrRNA遺伝子の一部の領域を増幅し、メタゲノム解析を実施、餌生物の特定を行ったところ、OTU数の割合として、渦鞭毛藻36%、珪藻36%、動物プランクトン24%、繊毛虫10%、クリプト藻・ハプト藻10%、原生動物9%を検出することに成功した（図(2)-19）。オニヒトデ幼生の口のサイズは、20μm程度で、動物プランクトンを直接捕食できるはずがなく、以上の結果から、オニヒトデ幼生は、微細藻類のみならず、デトライタス等の生物由来の分解産物も食している可能性が示唆された。

## (2) サンゴ礁レジリエンス過程の観察のためのサンゴ着底坂のメタゲノム解析

着定板1枚から0.8−9.2（2.8±2.0，平均±標準偏差）gの付着物が回収され（図(2)-20）、地点や採集時期により大きく異なった。0.5gの付着物からDNAを抽出0.2−6.2（3.3±1.6）μgのDNAが抽出された。付着物量とDNA量の間に、明瞭な関係は見られなかった（図(2)-21）。メタゲノム解析の結果、OTU数は、190−697の範囲にあった。1サンプルあたりの取得配列数の多少によるOTU数への影響を補正するため、全サンプルの中で最小の取得配列数に合わせてOTU数を再計算したところ、OTU数は、98−278の範囲で算出された。配列数が多かった上位10位は、3種を除いて海藻類であり、着底板には多くの海藻が付着していた（図(2)-22）。また、類似度指数によるNMDSプロット解析の結果、着底板を回収した時期（季節）でサンプルが近隣にプロットされ、サンプルが近隣にプロットされ、サンプルが近隣にプロットされ、サンプルが近隣にプロットされ、サンプルが近隣にプロットされ、サンプルが近隣にプロットされ、
ル間の出現種の特性が似る傾向にあり、今回の解析結果のみから、付着生物群の特徴について、地点間の差異を検出するのは困難であった。しかし、ほぼ同時期に採集した海水中のプランクトンメタゲノム解析から得られた出現種種組成とは大きく異なること、また、着底板の付着生物群の特徴が、着底板間でかなり異なることから、今後、データを蓄積することにより、着底板上の生物群の特徴と、稚サンゴの生残と成長の関係が明らかになることが期待される。

図(2)-18 人工的に作出したオニヒトデ幼生の光学顕微鏡写真. A & B, 緑藻Donariella sp.を餌として与えた。C & D, 珪藻Chaetoceros calcitransを餌として与えた。E～H, 天然の微細藻類を餌として与えた。A, C, E, Gは通常光下にて撮影、B, D, E, Fは蛍光下にて撮影し、微細藻類由来のクロロフィルの自家蛍光が赤く光っていることを示す。
図(2)-20 サンゴ着底板上に付着した付着物（生物および泥）。上，最も付着物が少なかったサンプル（左は表で右は裏）；下，最も付着物が多かったサンプル（左は表で右は裏）

図(2)-21 各サンプルにおけるサンゴ着底板1枚当たりの質重量およびDNA抽出量.
図(2)-22 石西礁湖周辺海域におけるサンゴ着底板のメタゲノム解析の結果．配列数が多かった上位10位の生物を右図にて示す．6，9，10以外は全て海藻であった．

## (3) 石西礁湖に同所的に存在するサンゴの遺伝子発現解析

得られたリードは、クシハダミドリインからtotal 9.0 Gbp, 177Mリード、アオサンゴからはtotal 9.8Gbp, 191Mリードであった。得られたリードを種ごとにアセンブルを行ったが(表(2)-2)、50 bp single endリードを使用しているため、平均コンティグ長が1 kbp以下でN50の値も低いため、アセンブルが十分でない可能性が考えられた。クシハダミドリインとアオサンゴの全contig数に対する同定された宿主遺伝子の割合はそれぞれ、27%, 14%とアオサンゴの同定された割合が低い結果となった(表(2)-3)。しかし、両種の同定された共生藻遺伝子の割合は、56%, 73%であった。アオサンゴの遺伝子同定では、優先的に共生藻の遺伝子が宿主遺伝子よりも多く得られた。アオサンゴのcontig数は、クシハダミドリインと比べると2万の差があった。これは、ショートリードを元とするアセンブルが起因と考えられた。同定された遺伝子の相同性を見てみると、クシハダミドリインは、同族のココビミドリインの遺伝子に対して高い相同性を持つcontigの割合が、G.ventalinaをデータベースにする場合より多い事がわかった(図(2)-23)。逆に、アオサンゴでは同じ亜綱のG.ventalinaをデータベースに利用した方が、ココビミドリインの遺伝子に対するよりも、高い相同性を持つcontigが多い結果になった。クシハダミドリインとアオサンゴの共生藻では、ゲノムが解読済みのS.minutum (clade B)よりも、clade Cに属する褐虫藻のデータベースを利用した方が、相同性の高いcontigの割合が多い事が分かった。さらに、褐虫藻の遺伝子型を決めるゲノムのITS領域を、得られたcontigの中から検索すると、クシハダミドリインとアオサンゴの褐虫藻は、clade Cの遺伝子型であるITS領域を持つ事が明らかになった。クシハダミドリインからは、20,241ORFs、アオサンゴからは6,209ORFsが検出された。これらORFが検出された遺伝子の中で、互いに相同性があった物が6,031遺伝子であった(図(2)-24)。共生藻では、26,742の遺伝子が相同でさらに、非常に高い相同性を示した(図(2)-25,26)。今年度の研究では、シーケンスに関して予定通りとはならなかったが、亜種の異なるサンゴから同じ遺伝子型の褐虫藻が得られ、遺伝子の相同性も高い事が明らかになった。

2014年度に行われたシーケンスでは、リードのクオリティーが悪く、後の解析に支障が出る事が明らかになった。2015年度では、水産総合研究センターに新たに導入されたNextSeq500を用い
て、再度シーケンスを行った。使用したサンプル月の現場水温は、それぞれ27.6℃と31.1℃であった。AhyとHcoから得られたリード数は、それぞれ212M, 67Mリードであった(表(2)-4)。得られたコンティグ数は、Ahyが349,351、Hcoが209,065であった。それぞれのN50値は、1kを超えていたため、よくアセンブルされていると判断した。AhyとHcoの全contig数に対する同定された宿主遺伝子の割合はそれぞれ、22%, 18%とHcoの同定された割合が低い結果となった（図(2)-27）。一方、両種の同定された共生藻遺伝子の割合は、27%, 37%であった。Hcoの遺伝子同定では、優先的に共生藻の遺伝子が宿主遺伝子よりも多く得られた。全コンティグのGC含有量(GC %)について調べると、2つのピークを持つ分布が得られた（図(2)-28）。共生藻コンティグのGC%は、Ahyで53%、Hcoで54%であった。S. minutumのゲノム配列中のGC含有率は51%を占めることが報告されている $ ^{11} $ 。従って、共生藻由来のシーケンスをうまく分離できていることが示唆された。公共データベースのUniref90とBlastを用いた相同検索の結果は、Ahyが30%、Hcoが35%であった（図(2)-27）。発現変動解析では、温度上昇に伴って上昇する宿主と共生藻の遺伝子数は、Ahyで4,567と1,820、Hcoで1,322と1,112、逆に温度上昇に伴って減少する宿主と共生藻の遺伝子数は、Ahyで3,483と2,577、Hcoで1,345と1000であった（図(2)-29）。Gene ontologyを用いたenrichment解析では、Ahy宿主で減少する遺伝子群は、DNA複製に関連する遺伝子群、Ahy共生藻で上昇する遺伝子群は、光合成に関連する遺伝子群であった。Hcoの宿主で減少する遺伝子群は、ヘム合成に関連する遺伝子群であり、Hco共生藻で上昇する遺伝子群は、アポトーシスに関連する遺伝子群であった。今後、詳細な解析を行うことで、熱ストレスの回避メカニズムも明らかにできると期待している。また、ストレスに応答して発現する遺伝子を特定できれば、環境下での個体のストレス評価も可能になると考えている。

表(2)-2 Trinity de novo assemblerによるアセンブル結果

A. hyacinthus	H. coerulea
Number of contigs	82,833	63,955
Total bases	33,251,518	24,887,315
Longest contig length	11,664	5,082
Shortest contig length	201	201
Average length	401.4	389.1
N50	419	403
N90	228	226

表(2)-3 宿主，共生藻遺伝子の相同検索結果

A. hyacinthus	H. coerulea
Chidaria	Acropora digitifera genome	20,063 (10,781)	3,323 (2,299)
Gorgonia ventalina transcriptome	2,503 (2,027)	5,473 (3,817)
Symbiodinium spp.	Symbiodinium minutum genome	4,532 (3,423)	4,605 (3,423)
Symbiodinium spp. Clade C1 transcriptome	42,105 (20,732)	41,909 (20,754)
No hit	13,630	8,645

Contig number (Unique gene number)
図(2)-23 宿主，共生藻遺伝子の相同性の割合

図(2)-24 宿主遺伝子間の相同数

図(2)-25 共生藻遺伝子間の相同数
図(2)-26 共生藻遺伝子間の相同性

表(2)-4 2種のシーケンス・アセンブル結果

Acropora hyacinthus	Heliopora coerulea
Total bases	64 Gb	20 Gb
Total reads	212 M	67 M
Number of contigs	349,351	209,065
Total bases (bp)	336,909,425	222,366,075
Longest contig length (bp)	26,095	27,757
Shortest contig length (bp)	201	201
Average length (bp)	964	1,064
N50 (bp)	1,632	1,802
N90 (bp)	373	418
図(2)-27 全コンティグに対する宿主、共生藻コンティグの割合とUniref90に相同のあったコンティグの割合

図(2)-28 全コンティグ、宿主コンティグ、共生藻コンティグのGC含有率
図(2)-29 発現変動遺伝子の検出数

青い線より上，温度上昇で発現が減少した遺伝子；青い線より下，温度上昇で発現が上昇した遺伝子；赤プロット，変動遺伝子 (FDR; q < 0.05)

## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

石西礁湖周辺海域における広域多点調査の一環として、プランクトンメタゲノム解析を実施した。各サンプルにおけるOTU (Operational Taxonomic Units) 数と取得した次世代シーケンス (NGS) 数の関係を合計136個のメタゲノム解析データについて検討したところ、海水3L中に出現するプランクトンは、約20,000配列読めば、おおよそ網羅的に検出（400-650 OTUs）できることを明らかにした。石西礁湖周辺海域において、最大8回の広域多点調査によるメタゲノム解析の結果から、地点間の生物多様性を比較したところ、各地点の平均OTU数は、100.0-248.8の範囲にあり、石垣島の南部と北部で多く、逆に石垣島西部とヨナラ水道付近で少ない傾向が認められ、地点によりプランクトン出現種多様性に差があることが判明した。また、陸源負荷の影響評価のため、河川由来のケイ酸塩を利用して増殖する珪藻に着目して解析したところ、複数の調査で、石垣島の南部を中心に高頻度の分布が見られたことから、特に降雨時の陸源負荷の起源が、主に石垣島南部にあることを明らかにした。

サンゴ着底版のメタゲノム解析を行った結果、OTU数は、98－278の範囲で算出された。配列数が多かった上位10位は、3種を除いて海藻類であり、着底板には多くの海藻が付着していたことが判明した。今後、稚サンゴの成長率・生残率の低い地点と高い地点から回収した着底版のメタゲノム解析を精力的に行うことで、生物叢の違いを明らかにできる可能性がある。

オニヒトデ幼生を人工的に大量作出し、これに天然のプランクトンを餌として与え、胃内容物
のメタゲノム解析を行うことで、餌生物を特定できる方法を、世界で初めて開発した。約500個体について解析を行ったところ、OTU数の割合として、渦鞭毛藻36%、珪藻36%、動物プランクトン24%、繊毛虫10%、クリプト藻・ハプト藻10%、原生動物9%を検出することに成功し、オニヒトデ幼生は、微細藻類を中心にデトライタスを捕食している可能性のあることが示された。本法により、栄養塩仮説が正しいかどうかの検証が可能になり、重要な餌生物の特定に貢献できると考えている。

## （２）環境政策への貢献

## ＜行政が既に活用した成果＞

特に記載すべき事項はない。

## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

石西礁湖周辺海域における広域多点調査によるプランクトンメタゲノム解析の結果により、当該周辺海域におけるプランクトン出現種の組成や、生物多様性の程度が明らかとなり、また、陸源負荷の影響評価のため、河川由来のケイ酸塩を利用して増殖する珪藻に着目して解析したところ、石垣島の南部を中心に高頻度の分布が見られたことから、陸源負荷の起源が、主に石垣島南部にあることを示すことができた。これにより、今後、河川水由来の陸源負荷をどの様に軽減していくか、行政サイドと連携を深めていくデータを提示することができた。

## 6 ．国際共同研究等の状況

特に記載すべき事項はない。

## 7 ．研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

<論文（査読あり）>

特に記載すべき事項はない。

## <査読付論文に準ずる成果発表>

1) 長井 敏・田遼晶史・本郷悠貴．石西礁湖周辺海域における陸源負荷の影響評価 メタゲノミクスによる推定．水産総合研究センター 研究の動き 第12号．(2014年11月)

2) 長井 敏・田遼晶史・本郷悠貴．石西礁湖周辺海域における陸源負荷の影響評価 メタゲノミクスによる推定．平成26年中央ブロック推進会議成果情報（2014年12月）

## くその他誌上発表（査読なし）>

特に記載すべき事項はない。

## （2） 口頭発表（学会等）

1) 本郷悠貴, 安田仁奈, 田遙晶史, 長井敏: NGS現場の会（つくば国際会議場）「現場の温度変化に呼応して発現・抑制するサンゴの遺伝子探索」
## （3） 出願特許

特に記載すべき事項はない。

（４）「国民との科学・技術対話」の実施

特に記載すべき事項はない。

（５）マスコミ等への公表・報道等

特に記載すべき事項はない。

（6）その他

特に記載すべき事項はない。

### 8. 引用文献

1) 長井敏・飛田晃介・漆崎慎吾・田遙晶史ほか. メタゲノミクスによるプランクトンモニタリングの実践（植物プランクトンを中心に）. 日本プランクトン学会報 62: 65-72 (2015).

2) Tanabe AS, Nagai S, Hida H, Yasuike M, Fujiwara A, Nakamura Y, Takano Y, Katakura S. Comparative study of the validity of three regions of 18S-rRNA gene for massively parallel sequencing-based monitoring of the planktonic eukaryote community. Molecular Ecology Resources. doi:10.1111/1755-0998.12459 (2015).

3) Nagai S, Hida K, Urushizaki S, Onitsuka G, Yasuike M, Nakamura U, Fujiwara A, Tajimi S, Kimoto K, Kobayashi T, Gojobori T, Ototake M. Influences of diurnal sampling bias on fixed-point monitoring of plankton biodiversity determined using a massively parallel sequencing-based technique. Gene 576: 667–675 (2016).

4) Nagai S, Hida K, Urusizaki S, Takano Y, Hongo Y, Kameda T, Abe K. Massively parallel sequencing-based survey of eukaryotic community structures in Hiroshima Bay and Ishigaki Island. Gene 576: 681–689 (2016).

5) 長井敏・野口大毅・阿部和雄. メタゲノム解析による海洋低次生態系の多様性比較. DNA多型, Vol.19: 129-133 (2011).

6) Okaji K, Ayukai T, Lucas JS. Selective feeding by larvae of the crown- of thorns starfish, Acanthaster planci (L.). Coral Reefs 16: 47-50 (1997).

7) Uthicke S, Logan M, Liddy M, Francis D, Hardy N, Lamare M. Climate change as an unexpected co-factor promoting coral eating seastar (Acanthaster planci) outbreaks. Scientific reports 5: 8420, DOI: 10.1038/srep08402

8) Grabherr, M.G., et al., Full-length transcriptome assembly from RNA-Seq data without a reference genome. Nat Biotechnol. 29(7): p. 644-52 (2011).

9) Shinzato, C., et al., Using the Acropora digitifera genome to understand coral responses to environmental change. Nature. 476(7360): p. 320-323 (2011).

10) Putnam, N.H., et al., Sea anemone genome reveals ancestral eumetazoan gene repertoire and genomic organization. Science 317(5834): p. 86-94 (2007).

11) Shoguchi, E., et al., Draft assembly of the Symbiodinium minutum nuclear genome reveals dinoflagellate gene structure. Curr Biol. 23(15): p. 1399-408 (2013).

12) Keeling, P.J., et al., The Marine Microbial Eukaryote Transcriptome Sequencing Project (MMETSP): illuminating the functional diversity of eukaryotic life in the oceans through transcriptome sequencing. PLoS Biol. 12(6): p. e1001889 (2014).
# （３）石西礁湖を中心としたサンゴ礁生物のreef-scape connectivityの解明

国立大学法人宮崎大学

安田仁奈

平成25～27年度累計予算額：23,134千円（うち平成27年度：7,500千円）

予算額は、間接経費を含む。

## [要旨]

本研究では、サンゴ礁生物の幼生分散によるreef-scape connectivityを明らかにし、海洋保護区の配置に重要となる知見を得ることおよびオニヒトデ大量発生の早期予測と大量発生メカニズムの解明を目的とした。石西礁湖周辺海域で造礁サンゴ類(ハナヤサイサンゴ類、ミドリイシ類、アオサンゴ類)合計2103群体について遺伝子解析を行い、まず野外の形態観察ではわからない隠ペい種の分布を明らかにし、隠ペい種の分布を決める環境要因を統計モデルにより明らかにした。各種について集団遺伝解析を行い、石西礁湖内における各種のconnectivityを空間遺伝構造から推定した。さらに種間で共通している石西礁湖ないにおける遺伝構造から、ひとつの独立した海域として保全した方がよい空間を保全管理ユニットとして同定した。さらに、最も強い遺伝構造をもつアオサンゴを用いて、親群体および1世代での加入を評価するための着底実験による各群体の起源推定を行い、重要海域を絞り込んで既存の保護区と対照させた。石西礁湖の南北ではconnectivityが限られていること、ヨナラ水道の小浜島側の海域や、黒島と新城島の間の離れ礁は他の海域への幼生供給を行う重要海域であることを同定した。西表島周辺の集団間は集団の孤立性が高い一方、石垣島の南西の海域は相対的にconnectivityが強く、重要な供給源としての役割を果たしているため、この海域の陸源負荷の軽減が重要であると考えられた。

一方、サンゴ捕食者オニヒトデに関しては、形態では判別できないオニヒトデ幼生を遺伝子により判別する技術の確立し、2013年には石西礁湖において様々な生物の再生産の場として重要なヨナラ水道周辺で世界初めてのオニヒトデ幼生の高密度集団を発見した。この結果から、高密度幼生は大量発生の引き金になると示唆され、これらを形成する0.25μg/L以下にクロロフィルa濃度を抑える必要があることがわかった。同時に、石西礁湖では台風が高密度幼生を外洋に分散させるため、大量発生を抑える影響がある可能性が示唆された。

## [キーワード]

集団遺伝解析、幼生分散、connectivity、造礁サンゴ、オニヒトデ

### 1. はじめに

サンゴ礁生態系は高い生物多様性を誇る生態系であるが、近年オニヒトデの大量発生や、高水温による白化などにより世界中で激減する傾向にある。日本で最大のサンゴ礁海域を誇る石西礁湖においても同じ傾向にあり、慢性化したオニヒトデの大量発生およびローカルなストレスにより回復の兆しが見られない状況にある。サンゴ礁生物は、親が固着性でほとんど動かないものにおいても、生活史の初期に浮遊幼生期を持ち親とは離れた場所に着定する。そのため、生態系の基盤となっている造礁サンゴが安定して加入できるように、幼生分散が主に起きている範囲を同
定し、特に幼生を他の海域へ供給しているソース海域を中心に保全していくことが重要である。一方オニヒトデに関しても、2週間から6,7週間の浮遊幼生期を持っており、この時期の減耗ないし高い生存率が大量発生に深くかかわっていると指摘されているものの、野外での挙動が全く分かっていない状態である。そのため、石西礁湖周辺海域において、大きな2つの課題として①造礁サンゴが効率的に加入し、保全できるための重要海域の選定および②オニヒトデ大量発生の機構や早期モニタリングができるシステムを整え、できるだけ早くオニヒトデ大量発生を抑えることが重要である。加えて、造礁サンゴにおいては、野外において形態で種を識別することが困難であり、これまでの形態識別では、真に生殖隔離が起きている「種」を間違って同定してしまっている可能性がある。そこで、本研究では、遺伝子解析を用いて、まず、造礁サンゴについては互いに交雑している種の境界を集団遺伝学的に明らかにすることを試みた。アオサンゴにおいては、遺伝的に異なる集団が本当に保全上別々に扱うべき別種であるのかを確認するため、また、サブテーマ1の数値シミュレーションによって幼生分散を推定する際の初期値となる産卵期を明らかにするために、生殖細胞の観察も行った。造礁サンゴにおける隠ペい種は、野外において形態では判別が困難なものの、類縁種がどのような環境を好んですみわけをしているのかを明らかにすることで、環境要因からどちらの種が多く分布しているか予測できるようになる。そのため、サブテーマ1で収集した環境データを用いて、類縁種間における分布の割合を説明する環境因子を統計モデルにより推定した。さらに、長い時間スケールにおいて、石西礁湖ないで様々な生活史を持つ造礁サンゴの集団間でどの程度connectivityが起こっているのかを明らかにするために、高度型分子マーカーを用いて集団遺伝解析を行った。また、長い時間スケールにおけるconnectivity推定に加え、着定板を海水中に設置し、着底した幼生の遺伝子型からソースとなっている集団を決定することにより、1世代で起きている幼生分散の範囲も推定した。

一方、オニヒトデの大量発生に関しては、まず石西礁湖内で遺伝構造を持っているかどうかを確認したうえで、過去60年間失敗に終わっていた野外幼生採集によるオニヒトデ幼生の野外分布を明らかにすることを試みた。オニヒトデ幼生は他のヒトデ幼生やナマコ幼生などに形態が酷似しているため、オニヒトデ幼生を種判別できる遺伝子マーカーを確立させることが重要となる。そこで、まず、サンゴ礁の他のヒトデとオニヒトデの遺伝子配列を比較してオニヒトデと同定できる領域を探し、その領域に遺伝子マーカーを作成した。その後、全サブテーマが協力して物理データと一緒に採集した海水プランクトンサンプルを顕微鏡下でソーティングし、オニヒトデ幼生の同定を行った。これらのデータと野外のクロロフィルa濃度を比較することで、野外オニヒトデ幼生の分布特性を明らかにし、オニヒトデ幼生のエサ環境を把握することを試みた。

## 2 ．研究開発目的

本研究では以下の3つを明らかにすることを目的とした。

（１）石西礁湖に幅広く分布する造礁サンゴ普通種の隠ぺい種とその分布の解明による正しい生物多様性評価方法の確立と、野外調査において形態では区別できない種の環境要因からの分布推定を可能にすること。

（２）石西礁湖周辺海域において、生活史の異なる様々な種において集団間のconnectivityを明らかにし、長い時間スケールでの造礁サンゴが個体群を維持している空間範囲（保全管理に最適なユニット）を同定する。さらに、着底板を使った稚サンゴの遺伝子型を同定することにより、１世
代で起こっている加入の範囲が長い時間スケールで起きている幼生分散の推定と一致するかどうかを確認する。

（３）野外オニヒトデ幼生を同定する遺伝解析方法を確立し、それを用いて石西礁湖の広域調査を行い、野外におけるオニヒトデ幼生の分布特性から大量発生との関連を推定する。さらにオニヒトデ幼生のエサとなるクロロフィルaの濃度分布と比較し、オニヒトデ幼生の石西礁湖におけるエサ環境を明らかにする。

## 3 ．研究開発方法

## （１）集団遺伝解析用の研究試料の採集

サンゴ礁生物において成体は固着性であっても生活史の初期にはプランクトン幼生期間をすごし、幼生分散を行うものが多くいる。またサンゴ礁は複雑な地形・環境を擁するため、物理的な幼生分散が可能な範囲であっても生息できる着底場所は限られる。そのため、複雑な地形を細かく捉えた上での詳細なサンプリングによる集団間のconnectivityを明らかにすることが海洋保護区などの重点海域を明らかにするために必要である。既存の海中公園の配置に関する科学的な評価および新たな海洋保護区を設定するにあたって、分散能力や生活史戦略の異なる生物を複数種調べてその効果を検証する必要がある。そこで本研究では、サンゴ礁生態系の基盤となる生物として、造礁性のサンゴを3種類（アオサンゴHeliopora spp.・クシハダミドリイシAcropora spp.・ハナヤサイサンゴPocillopora spp.）および、サンゴ捕食者として生態系の保全に重要となるオニヒトデを対象種とした。クシハダミドリイシとハナヤサイサンゴはともにサンゴ礁生態系、特に本研究の対象海域である石西礁湖において普通種として幅広く分布している。両種ともに、白化やオニヒトデの大量発生など大きなかく乱があったときにいち早く加入と成長が起こり、サンゴ礁の回復に寄与する種である。一方アオサンゴは、高水温白化やオニヒトデによる被食を受けにくく、生息域も他の造礁サンゴが比較的少ない場所に繁茂する。クシハダミドリイシの仲間は放精放卵型の生殖生態をもち、水中で受精を行う。クシハダミドリイシの幼生は1週間程度から、長くて50日弱の浮遊幼生期間をもつ。アオサンゴは保育型の生殖生態をもち、1年に一度雌雄異体のコロニーのうち、雄によって放精されると、雌の体内で受精が起こる。雌はしばらく発生した幼生を保育したのちに幼生を海水中へ放出する。幼生は70%程度が数時間以内着定するが、最大で2週間程度の浮遊幼生期間を持つ。ハナヤサイサンゴ類においては、形態による種判別が一部困難ため、産卵様式の情報が十分に整理されていないものの、イボハダハナヤサイP. verrucosaは主に放卵放精型で生殖していることが知られるが、フィリピンで一度だけ保育型の幼生放出が目撃されている。チリメンハナヤサイP. meandrinaも放精放卵ともに報告されている。ヘラジカハナヤサイP. eydouxiは、放精放卵のみが報告されている。P. damicornisは基本的に保育型であるが、西オーストラリアや東太平洋などの一部の海域では放精放卵しているところが目撃されている。

本研究では、石西礁湖およびその周辺海域を中心とした海域においてサンゴ礁生物（オニヒトデ・アオサンゴ類・クシハダミドリイン類・ハナヤサイサンゴ類）の採集を行った。サンゴの採集と個々のサンゴや環境要因に関する記録は、サンプル名・サンプル No・時間・種・色・群体の大きさ・周辺の種・水深・温度・緯度/経度・地質・周辺の種・形状の項目を防水ノートに記載した。
集団遺伝解析用のサンゴサンプリングは極力3種類が同所的に分布する場所で採集を行った。オニヒトデに関しては、大量発生がすでに収束傾向にあったため、2014年にヨナラ水道とタギドングチの2地点においてそれぞれ30個体のサンプルを採集した。

## （２）アオサンゴ類の種境界と connectivity の推定

アオサンゴの遺伝子による種の同定（遺伝子および生殖時期による生殖隔離の確認）と集団遺伝解析、共生褐虫藻の多様性の解析、着定板を用いた1世代における加入の検証

## 1 ）アオサンゴの種同定（遺伝子解析）

アオサンゴは、高度多型遺伝子マーカーである核のマイクロサテライト解析により、黒潮海域に2つの遺伝的に異なる遺伝タイプ(HC-AおよびHC-B)が含まれていることが明らかとなっている $ ^{1} $ 。しかし、これは多検体を取り扱う集団遺伝解析を行わない限り、個々の個体のタイプの推定が難しい。そこで、単一の遺伝子座の配列でもタイプを判別することが可能であるかどうかを調べるため、本研究では、マイクロサテライトマーカーの解析をまず行い、その後別の遺伝子領域も加えて解析した。さらに、これら遺伝子で示されている“隠ペい種”が、本当に生態学的にも異なっており、保全する上で、別々に扱うべきであるかどうかを確認するため、また数値シミュレーションや幼生の加入実験に必要な知見を得るために、野外での観察および年間を通じた生殖細胞の観察を行った。

集団遺伝解析では、親群体を用いた遺伝子流動解析による幼生分散の推定とともに、1世代で加入した幼生がどこからきたものかを同定することにより、1世代でどの程度の範囲から加入が起こっているかを明らかにした。

## 2 ）アオサンゴ2種のマイクロサテライト解析によるタイプ決定（ベイズ法によるクラスタリング解析）

アオサンゴ2種の判別を行うため、ソフトウェアStructure ver2.3.4 $ ^{2)} $ を用いて、GeneAlexで作成したstructureファイルを開き、ベイズ法によるクラスタリング解析で個体ごとのアサイメントを行った。Burninは100000、MCMCは500000に設定し、事前情報として地理情報を入れないAdmixtureモデルと事前情報として地理情報を入れるLOCPRlORモデル $ ^{3)} $ を使用した。地理情報のないAdmixtureモデルでは仮想的な祖先集団数であるK値を1~5、地理情報を入れるLOCPRlORモデルでは石西礁湖とそれ以外にわけ、K値を1~5に仮定し、それぞれ10回異なるランダムシード反復して結果の安定性を調べた。

## 3 ）マイクロサテライト以外の ITS2・ミトコンドリア遺伝子による確認

しばしば動物の種判別に用いられる核のITS2と呼ばれる領域およびミトコンドリアの部分領域でも遺伝的な違いが検出できるかを確認した。ITS2はアオサンゴが属する八放サンゴ類でよく用いられるプライマー5.8S-436および28S-663 $ ^{4)} $ を用いた。ミトコンドリア領域は、GenBankに登録されているアオサンゴのミトコンドリア領域の配列を基に、多型性が大きいと考えられる配列を増幅できるようなプライマーを新規に作成した(HC-NDF-50, AAATGAGTCAAGTACCTATGCAG, HC-MutR,CCCCATAACTTCAATTCTAGC)。PCR法を用いて上記の領域を増幅し、キャピラリーシークエンサーを用いたダイレクトシークエンス法によって配列を決定した(Yasuda et al. 2015を参照)。決定した配列は、ソフトウェアBioEdit ver7、GENETIX ver11、MEGA6を用いてアライメントおよびエディットを行った。遺伝子配列の遺伝的多様性（ハプロタイプ多様性および塩基多
様度）は DNAsp ver5 によって算出した。ITS2 に関しては、当該領域の遺伝子領域の進化を明らかにするため、ソフトウェア Network を用いてハプロタイプネットワーク図を作成した。

4）アオサンゴ2タイプの分布と環境相関(サブテーマ1と共同):

各地点におけるアオサンゴ2タイプが生息する割合と環境因子の間の相関を調べ、reef-scape環境の何が分布を決めているのかを明らかにした。物理環境データはサブテーマ1が収集したものを使用し、遺伝子データと環境相関の一般化線形モデル（GLM）とAICモデル選択による解析によるテストはサブテーマ1の向が行った。誤差分布を二項分布と仮定すると過分散になったため、ベータ二項分布を仮定した。環境変数間の相関を考慮し、相関の高い変数は一方を排除した（多重共線性の排除）。

考えられる環境変数を全て考慮したグローバルモデルは：

同じ地点でサンプリングされたアオサンゴ類のうちHCAの割合～水深＋表層水温＋表層塩分濃度＋表層塩分濃度の標準偏差＋表層クロロフィルルa濃度＋表層濁度とした。

5）アオサンゴの種における生態学的な違いの検出（野外調査および生殖細胞の観察）：

生殖細胞観察用の採集は，沖縄県の石垣島と西表島の間にある石西礁湖周辺の3地点（ヨナラ水道（Yn）、ターヤーグチ（Ty）、ケングチ（Kn））でスクーバダイビングにより行った。2014年6月から2015年8月までの約一年間にわたり約1ヶ月から2ヶ月に1度の頻度で採集を行い、ヨナラ水道では合計249群体（A147群体、B102群体）、合計4群体（A0群体、B3群体、AとBの中間タイプ1群体）、ターヤーグチでは合計23群体（A15群体、B2群体、AとBの中間タイプ6群体）を採集した（表(3)-1）。標本は、AタイプおよびBタイプがそれぞれ最低6群体以上となるようにランダムに群体を選んで採集した。採集時には、幼生保育行動ないし幼生放出を行っているか否かも記録するとともに、個々の群体の形態写真や位置情報を毎回記録した。標本採集時のダメージに起因する生殖行動の変化を考慮し、同一群体からの複数回の採集は出来るだけ避けた。標本はサンゴの先端から3-10cm程度を採取した。組織観察用の標本は10％海水ホルマリン溶液に保存するとともに、遺伝子解析用に0.5-1cm程度を99.5％エタノールに保存した。さらに、マイクロサテライト遺伝子による解析で2タイプが両方いる場所および片方ずつのタイプしかいない場所に水温計ロガーTidbitを設置して2タイプの生息域の水温環境を調べた。
表(3)-1 生殖時期推定のための各タイプにおける標本採集・観察数

地点名
縫度・駆度	年	月	日	測沙	N	A	B	A and B
鍛錫数
(組縫切片数)	Q	卵母組胞	Q	縫量	鍛錫数	Q	卵母組胞	Q	縫量	鍛錫数
(組縫切片数)	Q	卵母組胞	Q	縫量
ヨナラ水道 (Yn)	2014	6	5	小潮	26	10(5)	4	19	3	12	10(10)	4	12	0	0	0(0)	0	0	0	0	0
24°21°16'N, 123°57'16"E	7	13	大潮	28	13(6)	0	0	0	0	15(3)	3	0	4	8	0(0)	0	0	0	0	0
17	中潮	14	14(3)	1	5	0	0	0(0)	0	0	0	0	0(0)	0	0	0	0	0
21	長潮	21	9(7)	0	0	0	0	12(0)	2	10	1	4	0(0)	0	0	0	0	0
25	大潮	12	6(0)	1	2	0	0	6(2)	1	1	0	0	0(0)	0	0	0	0	0
28	大潮	20	9(1)	1	5	0	0	11(3)	0	0	0	0	0(0)	0	0	0	0	0
8	29	中潮	27	14(8)	2	11	0	0	13(3)	0	0	0	0	0(0)	0	0	0	0	0
10	29	中潮	20	12(7)	4	14	0	0	8(0)	3	13	0	0	0(0)	0	0	0	0	0
2015	1	13	小潮	15	12(0)	6	27	0	0	3(3)	0	0	0	0	0(0)	0	0	0	0	0
2	16	中潮	18	12(0)	5	21	0	0	6(3)	2	10	0	0	0(0)	0	0	0	0	0
3	14	小潮	18	12(0)	5	18	4	16	6(3)	3	12	0	0	0(0)	0	0	0	0	0
7	24.25	小潮	18	12(7)	4	20	0	0	6(0)	0	0	0	0	0(0)	0	0	0	0	0
8	18.19	中潮	12	6(0)	0	0	0	0	6(0)	0	0	0	0	0(0)	0	0	0	0	0
小計	249	147(44)	33	142	7	28	102(30)	18	58	5	0	0(0)	0	0	0	0	0
ケンダチ (Kn)	2014	6	12	大潮	4	0(0)	0	0	0	0	3(2)	0	0	2	8	1(0)	0	0	0	0	0
24°13°22'N, 124°14'7"E	小計	4	0(0)	0	0	0	0	3(2)	0	0	2	8	1(0)	0	0	0	0	0
ターヤーグチ (Ty)	2015	7	24.25	小潮	10	5(0)	0	0	0	0	1(0)	1	1	0	0	4(0)	0	0	0	0	0
24°16'5"N, 123°49'50"E	August	18.19	中潮	13	10(0)	0	0	0	0	1(0)	0	0	0	0	2(0)	0	0	0	0	0
小計	23	15(0)	0	0	0	0	1(0)	1	1	0	0	0	6(0)	0	0	0	0	0

## 6 ）アオサンゴの集団遺伝解析：

## a DNA抽出とジェノタイピング

アオサンゴのDNA抽出は熱アルカリ法を用いた。マイクロサテライト遺伝子座はsaki06、saki08、miho04、miho30、miho33、mayu09、mayu41、mayu49、emi20 $ ^{5)} $ の9種類を用いて、それぞれPCRを行うことにより、目的の領域を増幅した。PCRカクテルは1サンプルあたり3.86μLのddH2O、各0.035μLの蛍光プライマーとそれに対応した非蛍光プライマー、5μLのno color GOTaq Master Mix、1μLの抽出したDNA溶液で合計10μLとした。設定条件はdenature 94℃で3分を1サイクル、denature 94℃で30秒・annealing 60℃で30秒・extension 72℃で20秒を35サイクル、final extension 72℃で5分を1サイクルとした。プライマーにSaki06を用いる場合のみannealingは50℃に設定した。1％のアガロースゲルを作成し、電気泳動により増幅とサイズを確認した。増幅が確認できたら、ddH2Oでそれぞれ200倍に希釈した。100サンプルあたりLIZ600を20μLとHiDiを1000μLとして混ぜ合わせたHiDi with LIZ溶液を10μLに対して、200倍に希釈したPCR産物を1μL加えたジェノタイピング用サンプルを作成した。作成したサンプルは神奈川県の水産総合センター中央水産研究所に輸送し、ABi3730での解析を行った。ジェノタイピングソフトウェアであるGeneMapper ver4.1(ABi)を用いて、中央水産研究所のABi3730(ABi)で解析をして帰ってきたデータのジェノタイピングを行った。GeneMapperでは、増幅に用いたマーカーの蛍光の色と検出される領域を設定したパネルを作成し解析を行った。そして、それぞれのマーカーでアレル(対立遺伝子)を決定するビンを作成し、再び解析を行うことで遺伝子型を決定した。この段階でバンドパターンが不明瞭ないし、明らかな連鎖不均衡がみられたmiho30、miho33、mayu9、mayu49は解析から除いた。

## b 遺伝分化係数 $ F_{ST} $ による遺伝構造の算出

石西礁湖周辺海域におけるアオサンゴ2タイプの遺伝構造を調べるため、AMOVA(Analysis of Molecular Variance)によってサンプル全体の遺伝的分化係数である全FSTとペア集団間の遺伝的分化の程度をみるpairwise $ F_{ST} $ を求めた。AMOVAは集団間の分化の大きさを計算し、遺伝分化係数のP値によって有意に大きいか検定できる手法である。地理的ないし生物学的に共通する意味のありそうな集団同士を複数まとめてグループ化し、グループ間の分化を調べることも可能である。ま