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## S2-09 マイクロコズムを用いた生態系リスク影響評価システム手法の開発

（５）マイクロコズムを用いた微量汚染化学物質等の低減機能および生態系システムに及ぼす解析評価

横浜国立大学

大学院環境情報研究院

雨宮 隆

<研究協力者>

横浜国立大学

大学院環境情報学府

柴田賢一

平成21～23年度累計予算額：11,215千円

（うち、平成23年度予算額：3,311千円）

予算額は、間接経費を含む。

[要旨] マイクロコズムシステムを用い、微量汚染物質である藍藻由来のミクロシスチン、及び、人為由来の抗生物質（OTC）の生態系リスク影響評価を行った。ミクロシスチンは、生物個体数およびP（生産量）/R（呼吸量）比を用いた結果からいずれもモデル生態系に対してコントロール系と比較して大きな影響を及ぼさないことが分かり、無影響濃度は1 ppm以上であることが明らかとなった。

また、人為由来の微量汚染物質である抗生物質（OTC）については、OTCの無影響濃度（NOEC）は、生物個体数変化及びP（生産量）/R（呼吸量）比を用いた結果からいずれも、0.007 ppm未満であることが確定した。尚、本マイクロコズムにおいてOTCによって生物個体数が大きく減少したのは原生動物（Cyclidium sp.）であり、一方、後生動物のLecane sp.は個体数を増大させる傾向にあった。これは、共通の生物（細菌類）を餌とする食物網を介する間接的な効果であると考えられる。また、OTCは藻類や他の生物に対してはほとんど影響を及ぼすことはなかった。さらに、OTCの添加によって抗生物質耐性菌が出現することも明らかとなった。OTCに対する上記のNOECの値は、米国環境保護庁（EPA）が提示している単一生物種による値（0.11 ppm未満）と比較して1桁以上小さい。

以上の結果より、本マイクロコズムを用いることで、EPA試験では考慮されていない原生動物および後生動物への影響を評価することが可能であり、かつ、生物間相互作用を介してシステム全体に及ぼす影響を評価できることが明らかとなった。

[キーワード] 微量汚染物質、ミクロシスチン、抗生物質、オキシテトラサイクリン、P/R比
### 1. はじめに

湖沼生態系では、富栄養化により異常増殖した藍藻類が産生するミクロシスチンや、人為由来による各種微量化学物質等による汚染が大きな環境問題となっている。富栄養化した湖沼では、毎年、夏季になるとミクロキスティスなどの藍藻類が大量発生し、湖沼生態系の水質や生物相を大きく改変する $ ^{1} $ 。特に、ミクロキスティスなどの藍藻類はミクロシスチンなどの毒素を産生し、これらの毒素は自然由来の微量汚染化学物質としと湖水に存在する。本研究分担者らは、今までに、富栄養化した湖沼生態系におけるミクロキスティスなどの藍藻類の動態に関する数理解析 $ ^{2),3} $ や、生物間相互作用を利用した藍藻類の効率的な低減手法に関する研究 $ ^{4} $ を行ってきた。しかし、藍藻類が産生するミクロシスチンの湖沼生態系一特に微生物生態系一への影響評価はほとんど行われていない。そこで、毒素ミクロシスチンが生物間相互作用と物質循環を通して微生物生態系に及ぼす影響を評価し、微生物生態系における低減機能等を評価することが重要である。

一方、抗生物質の多様や乱用によりMRSAなどの薬剤耐性菌の出現が問題になっており、2010年にはスーパー耐性菌と呼ばれる多剤耐性菌が出現するなど、社会的に大きな問題となっている $ ^{5)} $ 。抗生物質は、医療のみならず畜産・養殖業でも使用されており、特に養殖業では餌に抗生物質を混合して養殖場に投げ込んで与える方法が採用されている。そのため、抗生物質が排泄物として排出されるだけでなく、餌から直接環境中に溶出し、湖沼生態系においても多大な影響を与えている可能性がある。従って、薬剤耐性菌の出現を含め、抗生物質の水圈生態系への影響を総合的に評価する事が重要である。特に、本サブテーマで取り上げた抗生物質OTC（OTC） $ ^{6)} $ は、抗菌スペクトルが広く養殖業をはじめとする水産業で最も一般的に使用されており、耐性菌が野外で確認されている。しかし、OTCの生態系への影響評価はない。そこで本マイクロコズムを用いることで生態系への影響を評価・解析することが重要である。

## 2 ．研究開発目的

本サブテーマにおいては、水域生態系に微量汚染物質として存在する自然由来および人為由来の化学物質が生態系に及ぼす影響を評価することを目的とした。すなわち、自然湖沼生態系に生息する藍藻類が産生する毒性物質であるミクロシスチンおよび人為由来の抗生物質であるOTCを被験物質として、本マイクロコズムを用いて生態系に及ぼす影響を解析・評価することを目的とした。

## 3 ．研究開発方法

## （1） 培養

本マイクロコズムは、TP培地（ポリペプトンおよび各種無機塩類）で培養し、明暗周期＝12H/12H、25℃、2400 luxで培養した。光源にはNational（=Panasonic）FL20SS-W/18を使用した。

## （２）生物個体数の計測

1）藻類、繊毛虫類、輪虫類、貧毛類の各種生物は光学顕微鏡を用いて個体数を計測した。単位は、cells/mlまたはN/mlとした。

2）バクテリアは、サンプルを20秒間超音波処理した後、10倍希釈法により菌数を調整し、生菌数を計測した。PY平板寒天培地上にサンプルを塗布して、25℃で約5日間培養した。30～300 CFU/plateのプレートを選び、3枚計測した。単位はCFU/mlとした。
## （3） 溶存酸素测定

溶存酸素濃度はYSI 58型D0メーターで測定した。D0メーターの電極は5750を、電極のメンブレンは5775スタンダード・メンブレンを用いた。溶存酸素濃度はAM-8000シリーズのデータロガーで記録し、データをPCに転送して解析した。YSI 58型D0メーターの出力電圧に19.99（ppm/V）を乗じ溶存酸素濃度（ppm）に換算した。約10日ごとに電極のメンテナンスを行った。

## （4） 生産量（P）/呼吸量（R）比の算出

呼吸量（R）は暗期（12H）における溶存酸素の減少量を2倍したもの、生産量（P）は明期における溶存酸素の増加量にRの1/2を足したものとした。但し、光合成によって溶存酸素濃度が平衡濃度より濃くなると酸素が培養液から放出され、呼吸によって溶存酸素が平衡濃度より薄くなると酸素が培養液中に溶解するので、酸素の放出・溶解速度を求めて補正した。補正式は、酸素を蒸留水にバブリングし、実験と同じ条件で溶存酸素量の経時変化を測定した。測定結果の近似式を指数関数フィットにより求め、微分して各時間における放出・溶解速度を表す式を求めた。

## （５）微量汚染化学物質ミクロシスチンの添加方法

ミクロシスチンLRはメタノール溶液の状態で培養開始後16日目に添加した。コントロールには同量のメタノールを添加した。ミクロシスチンLR添加後は、添加当日と、2、4、7、14、21日後に生物を測定した。サンプルを孔径0.22μmのフィルタで濾過して、ミクロシスチンLRの濃度をHPLCによって測定した。ミクロシスチンLR添加当日と、2、4、7、14、21日後に測定した。

## （6） 抗生物質OTCの添加方法

OTCは蒸留水に溶解し、孔径0.22μmのフィルタで濾過除菌して、培養開始後16日目に添加した。コントロールには、孔径0.22μmのフィルタで濾過除菌した蒸留水を添加した。添加当日と、2、4、7、14、17、21日後に生物を測定した。

## （7） OTC耐性菌の測定方法

サンプルを20秒間超音波処理した後、10倍希釈法により菌数を調整し、OTC耐性菌数を計測した。PY培地を蒸気圧滅菌した後、50℃まで冷却し、最終濃度が25 mg・L^{-1}となるように濾過除菌したOTC水溶液を加えた。このOTC添加PY平板寒天培地上にサンプルを塗布して、25℃で約1週間培養した。30～300 CFU/plateのプレートを選び、3枚計測した。単位はCFU/mlとした。

## 4 ．結果および考察

## （１）ミクロシスチンの影響評価

## 1 ）生物個体数の変化

ミクロシスチンを加えた2つの系（0.1 mg・L^{-1}ならびに1 mg・L^{-1}）とミクロシスチン無添加のコントロール系において、生物個体数の時間変化にほとんど差は見られなかった。図(5)-1にコントロール、図(5)-2にミクロシスチンを1 mg・L^{-1}加えた系の結果を示す。藻類Chlorella sp.とScenedesmus spp.の個体数は、ミクロシスチン添加後、10^{5} N・mL^{-1}～10^{6} N・mL^{-1}の間で安定して遷移した。また、糸状藻類Tolypothrix sp.は10^{4} N・mL^{-1}～10^{5} N・mL^{-1}の間で安定していた。微小動物に関しては、Cyclidium glaucomaの個体数がミクロシスチン添加後に減少していたが、この挙動はコントロール系でも観察されていたことから本マイクロコズムの自然変動と考えられ、10 N・mL^{-1}～10^{2} N・mL^{-1}で安定していた。また、Philodina sp.とAeolosoma hemprichiについては、
個体数が1 N・mL^{-1}～10 N・mL^{-1}と少ないものの安定して推移した。以上より、ミクロシスチン0.1 mg・L^{-1}及び1 mg・L^{-1}添加では、本マイクロコズムの生物個体数に顕著な変化は認められないことが明らかとなった。

## 2 ）P/R比の変化

図(5)-3にミクロシスチンのP/R比に及ぼす影響を示す。ミクロシスチンを加えた2つの系（0.1 mg・L^{-1}ならびに1 mg・L^{-1}）のP/R比はメタノール480 ppmを加えたコントロール系と比較して大きな変化は見られなかった。但し、コントロール系は何も加えなかった無添加系と比較すると呼吸量が増大する傾向が見られたが、本実験の条件下においては、ミクロシスチンはP/R比に大きな影響を及ぼさないことが明らかとなった。

## 3 ）生態系影響評価

上記の生物個体数変化およびP/R比の変化による結

図(5)-1 コントロール系（メタノール480 ppm）の生物個体数の経日変化

図(5)-2 ミクロシスチン1 mg/Lを加えた系の生物個体数の経日変化
果から、ミクロシスチンの無影響濃度（NOEC）は1 ppm以上であると結論できる。この値は、世界保健機関（WHO）の飲料水中濃度のガイドラインである1 ppbと比較して3桁以上も大きい。以上より、ミクロシスチンはモデル生態系に対して壊滅的な影響を及ぼさないことが明らかとなった。

図(5)-3 ミクロシスチン1 mg/Lを加えた系のP/R比の変化

## （２）OTCの影響評価

## 1 ）耐性菌の出現

本マイクロコズムでは抗生物質であるOTCを加えることで耐性細菌が出現することが分かった。コントロール系をPY培地にて培養した細菌のコロニーの形状は，PY培地に25 ppmとなるようにOTCを添加した培地にて培養した細菌のコロニーの形態とは明らかに異なっていた。一例として，コントロール系のコロニーと7 ppmのOTCを添加した系のコロニーを培養した結果を図(5)-4に示す。前者のコロニーは全体に白っぽく，かつ，コロニーの境界は明瞭ではなかった。一方，後者では形状が大きく異なる2つのコロニーが出現した。1つ目のコロニーは全体的に薄黄色をして

図(5)-4 コントロール系(左)とOTC添加系（右）にて出現したコロニーの形態の違い

おり粘性があり，2つ目のコロニーは白く境界が明瞭な粒状であった。後者のコロニーは，コントロール系をPY培地で培養した系においては出現しなかったことから，これらをOTC耐性細菌と判定した。以下の生物個体数の変化においては，後者のコロニー数を耐性細菌数としてカウントした。2）生物個体数の変化
— 0 ☐— 0.007 ☐— 0.07 ☐— 0.7 ☐— 7

—0—0.007—0.07—0.7—7

—0—0.007—0.07—0.7—7

図5−5 OTC添加による動物の個体数変化

Chlorophyll a

—0—0.007—0.07—0.7—7

Chlorophyll b

—0—0.007—0.07—0.7—7

図(5)-6 OTC添加による藻類（光合成色素量）の変化

本マイクロコズムの生物組成は、OTC添加前は安定していた。OTCを0.007 ppmから7 ppmまで添加した系において添加後14日に渡り、全細菌数およびクロロフィル濃度から評価した藻類の個体数はコントロールと比較して差が見られなかった。また、後生動物であるPhilodina sp.の個体数も藻類と同様に影響を受けなかった。しかし、OTC耐性細菌数、原生動物Cyclidium sp.、後生動物Lecane sp.、Aeolosoma sp.の個体数は後述するようにOTC濃度および経過日数に応じて影響が
見られた。動物、藻類（光合成色素量）、細菌の個体数変化をそれぞれ、図(5)-5、図(5)-6、図

生菌数

芽胞数

OTC耐性細菌数

図5-7 OTC添加による細菌数の変化

(5)-7に示す。

次に、生物の個体数変化を詳しく見るために、OTC添加後14日間に見られた影響を急性影響（2～4日後）、亜急性影響（7日～10日後）、慢性影響（14日後）として整理した（図(5)-8）。影響の有無については、コントロールの個体数の変動幅よりも個体数が増減した場合に影響があったと判定した。

図(5)-8 OTC添加による耐性細菌数の経日変

## (5) -11にそれぞれ、急性影

響、亜急性影響、慢性影響の結果を示す。例えば、急性影響については、Aeolosoma sp.は、7 ppmのOTC添加により個体数が減少していることから、Aeolosoma sp.に対する無影響濃度（NOEC）は7 ppm未満と判定した。また、Cyclidium sp.とLecane sp.は0.007 ppmのOTC添加により個体数に増減が見られたことから、それぞれの生物に対するNOECはいずれも0.007 ppm未満と判定した。尚、OTC添加によってCyclidium sp.の個体数は増加し、一方、Lecane sp.の個体数は減少していた。これは、それぞれの生物が共通の生物（細菌類）を餌としていることら、本マイクロコズムシス
テムにおける競争的な生物間相互作用の現れであると考えられる。また、OTC耐性細菌においては、0.07 ppmのOTC添加により細菌数に増加が見られたことから、OTC耐性細菌に対するNOECは0.07 ppm未満と判定した。このように、亜急性、慢性影響についても同様にNOECを求めることができる。

上記のように判定したOTCの無影響濃度

(NOEC) の急性影響、亜急性影響、慢性影響について表(5)-1に示す。藻類、全細菌、Philodina sp. に対する OTC の影響は小さく、それぞれの生物のNOECは急性影響、亜急性影響、慢性影響の全てにおいて7 ppmより高かった。一方、Cyclidium sp. と Lecane sp. は OTC に対する感受性が高く、これらの生物に対する NOEC は Lecane sp. の亜急性影響 (0.07 ppm 以下) を除き全て 0.007 ppm 満となった。以上より、本マイクロコズムにおいては生物の個体数変化から判定される NOEC は 0.007 ppm 未満であることが明らかとなった。

3）P/R 比の変化

OTC (ppm)

A. hemprichi

OTC (ppm) Lecane

OTC耐性细菌

Cyclidium

図(5)-9 OTC添加による急性影響（2～4日後）

A. hemprichi

図(5)-10 OTC添加による亜急性影響（7～10日後）
OTC添加による生産量(P)と呼吸量(R)の結果を図(5)-12および図(5)-13に示す。それぞれの図において、矢印の根元のプロットはOTC添加日のP/R値を示し、他の3プロットは上記の急性影響、亜急性影響、慢性影響を評価した日におけるP/R値の平均を示す。はじめに、図(5)-12に示すようにOTCを高濃度(7 ppm、0.7 ppm)添加すると、コントロール(0 ppm)と比較して生産量・呼吸量ともに経過日とともに減少したが、特に、呼吸量の減少が

OTC (ppm) A. hemprichi

OTC (ppm) Lecane

OTC耐性細菌

Cyclidium

図(5)-11 OTC添加による慢性影響（14日後）

大きかった。今のところOTCが呼吸量を減少させた理由については明らかではないが、おそらく、OTCが細胞内のリボソームに結合し、代謝活性が低下したためと考えている。次に、図(5)-13に示すようにOTCを低濃度（0.07 ppm、0.007 ppm）添加した場合は、0.07 ppm添加した系において一時的な呼吸量の増加が観察されたが、高濃度添加した系の挙動と同様に生産量、呼吸量ともに減少する傾向を示した。しかし、高濃度添加の系に比べて減少量は少なかった。最も低濃度

表(5)-1 OTC添加によるNOEC値の評価

急性影響	亞急性影響	慢性影響
A.hemprichi	<7
Philodina sp.	>7
Lecane sp.	<0.007	≤ 0.07	<0.007
Cyclidium sp.	<0.007	<0.007	<0.007
クロロフィル a	>7
クロロフィル b	>7
生菌数	>7
OTC耐性細菌数	<0.007	<7	>7

(0.007 ppm) 添加した系においてもコ

ントロールと比較して生産量・呼吸量の減少は有意であり、P/R比の変化から見積もられる本マイクロコズムのNOECは0.007 ppm未満であると判定された。

## 3 ）生態系影響評価：従来法との比較

上記の生物個体数の変化およびP/R比の変化から判定されたNOECを従来法による値と比較した。表(5)-2に米国環境保護局（EPA）のレポートにあるOTCの単一生物種を用いた毒性評価を示す $ ^{7)} $ 。
また、表(5)-3に本マイクロコズムを用いた影響評価結果を示す。生物個体数の変化による評価で

は、本マイクロコズムにおける藻類に対するNOEC（7 ppmより大）は、従来法による値（0.11 ppm未満）と比較して1桁以上大きい。特に、本マイクロコズムにおいては、原生動物（Cyclidium sp.）および後生動物（Lecane sp.）に対するNOECの値が0.007 ppm未満と極めて低い。これらの生物に対してはEPAによる評価は行われていないが、本マイクロコズムで得られたこの値（0.007 ppm未満）はEPAの単一生物種への影響から判定されるNOEC値（0.11 ppm未満）より1桁以上小さい。さらに、本マイクロコズムにおいてP/R比から得られたNOECも0.007 ppm未満であり、OTCに対して感受性の高い系であることが明らかとなった。

以上より、本マイクロコズムから判定されたNOEC値（0.007 ppm未満）はEPAによる値（0.11 ppm未満）よりも十分小さく、これはEPA試験では考慮されていないOTCに対する感受性の高い生物への直接的な影響と、生物

図(5)-12 高濃度OTC添加による生産量と呼吸量の変化

図(5)-13 低濃度OTC添加による生産量と呼吸量の変化

間相互作用を通した間接的な影響が評価されたためであると考えられる。

## （３）まとめ：微量汚染物質の生態系 影響評価

本研究では、自然由来または人為由来の微量汚染物質による水域生態系影響を、生物個体数変化およびP/R比変化から評価・解析した。自然湖沼に生息する藍藻類が産生するミクロシスチンについては、NOECは1 ppm以上

表(5)-2 OTCの単一生物種を用いた毒性評価

单一生物種	EC50(ppm)	NOEC(ppm)
藻類	Pseudokirchneriella subcapitata (Green Algae)	0.11 -0.25	(<0.11)
Pseudokirchneriella subcapitata (Green Algae)	3.9 -4.5	(<3.9)
ミジンロ	Daphnia magna (Water Flea)	17 -30
Daphnia magna (Water Flea)	21 -104
魚類	Oryzias latipes (Medaka)	280
であり湖沼生態系にほとんど影響を及ぼさないことが明らかとなった。また、抗生物質OTCについては、NOECが0.007 ppm未満であり、水域生態系に影響が及ぼされる可能性が示唆された。特に、OTCに感受性の高い原生動物および後生動物への影響が生物間相互作用を通して生態系に広がる可能性が示された。

## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

本研究により、従来法の単一生物種を用いた評価においては見落とされる可能性のある生物間相互作用に起因する生態系への影響評価に有効

であることが示された．特に，本マイクロコズムには原生動物や後生動物が含まれており，それらの生物種の影響が微生物生態系に及ぼす影響を評価することが可能であった．また、従来、生態系リスクは生物種とその個体数の変動に基づく評価が行われていた。しかし、本手法は、生物機能である生産量（P）と呼吸量（R）に基づく生態系リスクの影響評価手法であり、対象とする生態系の個別性に左右されることなく統一的に生態系リスク評価を行うことができる点で、科学的意義は大きい。

EC_{50}(ppm)	NOEC(ppm)
藻類	Chlorella sp.
Scenedesmus sp.
Tolypothrix sp.	>7
原生動物	Cyclidium sp.	<0.007
後生動物	Lecane sp.
Philodina sp.
Aeolosoma sp.	<0.007
>7
<7
<0.007
細菌類	Bacillus cereus
Pseudomonas putida
Acinetobacter sp.
Coryneform bacteria
OTC-resistant bacteria	>7
P/R比による生態系影響評価	<0.007

## （２）環境政策への貢献

本影響評価手法は，実験方法，データの解析方法等が全てマニュアル化されており，国内外において広く利用される可能性を有しており，日本発の新しい生態系リスク評価手法として提言できれば，環境政策への貢献は極めて大きい.

## 6 ．国際共同研究等の状況

特に記載すべき事項はない

### 7. 研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

特に記載すべき事項はない

## （2） 口頭発表（学会等）

1）柴田賢一、雨宮隆、伊藤公紀：第16回バイオアッセイ研究会・日本環境毒性学会合同研究発表会（2010）

「マイクロコズムを用いた呼吸量と生産量によるミクロシスチンLRの生態影響評価」

2) K. Shibata, Y. Ito, T. Amemiya, K. Itoh: JSME, Tsukuba, Japan, 2010.
“Effects of the antibiotic oxytetracycline on a freshwater microcosm”

## （3） 出願特許

特に記載すべき事項はない

## （４）シンポジウム、セミナーの開催（主催のもの）

特に記載すべき事項はない

## （５）マスコミ等への公表・報道等

特に記載すべき事項はない

## （6） その他

特に記載すべき事項はない

### 8 \. 引用文献

1) Sigee, D. C., Freshwater Microbiology, Wiley, 2005, UK.

2) Amemiya, T., Enomoto, T., Rossberg, A. G., Yamamoto, T., Inomori, Y., Itoh, K. 2007, Stability and dynamical behavior in a lake-model and implications for regime shifts in real lakes, Ecological Modelling, 206, 54-62.

3) Serizawa, H., Amemiya, T., Itoh, K. 2009, Patchiness and bistability in the comprehensive cyanobacterial model (CCM), Ecological Modelling, 220, 764-773.

4）雨宮隆、比田井淳、伊藤公紀、アオコの除去方法、特願2009-105196、平成21年4月23日。

5) NORMARK, B. H., NORMARK, S. 2002, Evolution and spread of antibiotic resistance, Journal of Internal Medicine, 252, 91-106.

6）二宮幾代治、動物の抗生物質、養賢堂、213-217（1987）.

7) US EPA, ECOTOX, Aquatic Report, http://cfpub.epa.gov/ecotox/report.cfm?type=short
Development of Ecosystem Risk Impact Assessment Method using Microcosm System

Principal Investigator: Yuhei INAMORI

Institution: Fukushima University

Kanayagawa 1, Fukushima-shi, Fukushima 960-1296 Japan

Tel:+81-24-548-5254 Fax:+81-24-548-5254

E-mail: ina0120@sss.fukushima-u.ac.jp

Cooperated by: Research Institute for Humanity and Nature, Chiba Institute of Technology, Tohoku University, Yokohama National University, National Institute of Radiological Sciences, Natural History Museum and Institute, Chiba, Sagami Women's University

## [Abstract]

Key Words: Microcosm, Ecosystem risk assessment, Dissolved oxygen, Production/respiration ratio, m-NOEC

This research project was conducted with the aim of establishing a risk impact assessment system from the viewpoint of production/respiration (P/R) ratio using a flask microcosm which consisted of several species of bacteria (decomposer), three species of phytoplankton (producer), and four species of zooplankton (consumer), as a model for ecosystem function.

This theme is consisted of five subthemes, that is, 1) Impact risk assessment of chemicals to ecosystem using microcosm system and its standardization (conducted by Fukushima University), 2) Optimization of operating condition for microbiota and stability of microcosm system and its modeling (conducted by Research Institute for Humanity and Nature), 3) Impact risk assessment of metals to ecosystem using microcosm system (conducted by Chiba Institute of Technology), 4) Impact risk assessment of pesticides and organic loading to ecosystem using microcosm system (conducted by Tohoku University) and 5) Impact risk assessment of pollutants to ecosystem using microcosm system (Yokohama National University).

The outcomes can be concluded as follows; 1) m-NOEC (microcosm-NOEC) of AE (polyoxyethrenealkylethel) was determined as $ 2.0 \, mg \cdot L^{-1} $ , and a detailed investigation of gas-liquid equilibrium in microcosm system was conducted to establish the standard assessment method, 2) three species sub-microcosm system indicated a different response against the microcosm system with metal addition loading, and a investigation of safety factor is necessary to estimate toxic data, 3) m-NOEC of Ni (nickel) was determined as under $ 1.0 \, mg \cdot L^{-1} $ , and the gnotobiotic type microcosm system is indicated more suitable for impact risk assessment tool than the stress selected type and/or the naturally derived type microcosm system, 4) m-NOEC of
fenitrothion (sumithione, MEP) was determined as under $ 0.10\ mg\cdotL^{-1} $ , and a different mechanism of toxicity from simazine was suggested, and 5) m-NOEC of OTC (oxytetracycline) was determined as under $ 70\ mg\cdotL^{-1} $ , and the recovery of the system with a mutation of OTC resistant bacteria was observed.

Thus, this P/R ratio method can assess the state of recovery and transfer of an ecosystem by fragmentation, which is not shown by a single species test. This suggests that even when a microcosm receives a structural effect, the functional stability can be maintained by the redundancy of a population or community level.
S2-09-1

(附錄)

環境研究総合推進費（S2-09）

マイクロコズムを用いた生態系リスク影響評価システム手法の開発

生態系リスク評価試験法マニュアル（案）
## 目次

目次.....2

1. はじめに.....4
1.1. 背景.....4
1.2. 目的.....4
1.3. 試験法の概要.....4

2. N-SYSTEM の保守・維持管理.....6
2.1. 器具・装置.....6
2.2. 培養方法.....6

3. 準備.....8
3.1. 器具・装置.....8
3.2. 溶存酸素計の準備.....8
3.2.1. DO 測定時に水流が必要な酸素電極の場合.....8
3.2.2. 電極から光が漏れる DO 計の場合.....9
3.2.3. 溶存酸素計の校正.....9
3.2.4. 酸素の溶解速度を求める.....9
3.3. 繰り返しおよび対照群.....13
3.4. N-SYSTEM の準備.....13

4. 試験の手順.....15
4.1. DO 電極の設置.....15
4.2. 被験物質の準備と添加方法.....15
4.2.1. 被験物質の準備.....15
4.2.2. 被験物質の添加方法.....15
4.3. 試験期間.....15
4.4. 生物量の測定.....16
4.4.1. Philodina sp. 及び Aeolosoma hemprichi の定量.....16
4.4.2. Lecane sp. 及び Cyclidium sp. の定量.....16
4.4.3. Chlorella sp. と、Scenedesmus sp. の定量.....16
4.4.4. Tolypothrix sp. の定量.....16
4.4.5. Chlorophyll a 及び b.....17
4.4.6. Phycocyanin と Phycoerythrin、Allophycocyanin の定量.....17
4.4.7. 細菌 ..... 18
4.5. 呼吸量と総生産量の算出方法 ..... 18
4.5.1. 概要 ..... 18
4.5.2. 呼吸量と総生産量の算出 ..... 19
4.6. エンドポイント ..... 22
4.6.1. 統計処理 ..... 22
### 1. はじめに

#### 1.1. 背景

魚類等の高次捕食者を含んだ水圈生態系は、生産者(藻類)、低次捕食者(微小動物)、分解者(細菌)を主とする微生物生態系を基盤としていることが重要であり、水圈生態系の水質浄化や物質循環には特に微生物生態系が重要な役割を担っている。微生物生態系は、光合成を行う生産者としての藻類、消費者としての微小動物、分解者としての従属栄養細菌類等からなり、窒素、リン、農薬、重金属等の化学物質の負荷による生態系の変動パラメータを考慮することが重要である。

生態系システム評価解析の上では、水圈のモニタリングデータに基づいて構成したマイクロコズム(安定モデル生態系)を用いた微生物群集の動態解析を相補的に活用することが有効・効果的であり、これがマイクロコズムの重要な意義となる。従来より行われてきた単一生物を用いた手法は、生態系機能を含めた生態系リスク評価研究がなされていないのが現状である。マイクロコズムを活用した生態学的研究は、国際化が重視されているのが現状で、OECD試験法の検討においても、生態系システム評価の重要性が指摘されている。

#### 1.2. 目的

本試験法はマイクロコズムを用いた水圏の生態リスク評価を行うことを目的とする。対象とするマイクロコズム(N-system)には、水圏生態系に及ぼす化学物質の影響評価試験のツールとして位置づけられる生産者(藻類)、捕食者(微小動物)、分解者(細菌類)が存在し、単種培養系にはない、微生物間相互作用、物質循環、エネルギーフローなどの生態系機能を含んでいる。

N-system は、分解者として少なくとも 4 種の細菌類 Bacillus cereus、Pseudomonas putida、Acinetobacter sp.、coryneform bacteria、生産者として 2 種の緑藻類 Chlorella sp.、Scenedesmus sp.、1 種の糸状藻類 Tolypothrix sp.、捕食者として 1 種の原生動物繊毛虫類 Cyclidium sp.、2 種の後生動物輪虫類 Lecane sp.、Philodina sp.、1 種の後生動物貧毛類 Aeolosoma hemprichi の組合せからなるマイクロコズムである。定常期の N-system を種として新たな培地に植え継ぐと繰り返し同様な共存系の増殖曲線が得られるという高い安定性と再現性を有するモデル微生物生態系であり、統一規格としてデータを比較解析する上ではきわめて有効なツールである。本試験法は、上記の点に鑑み、生態系機能のモデルとしてのフラスコマイクロコズムである N-system を用いた生態系リスク評価を目的としたものである。

#### 1.3. 試験法の概要

(1) 定常期にある N-system を特定の培地に接種し、定常期に達するまで培養する。
(2) 定常期の N-system に被験物質を添加して試験を開始する。

(3) 添加 2 週間後の生物量と、溶存酸素(DO)濃度変化から算出した呼吸量(R)、生産量(P)、および P/R 比を対照群と比較することで無影響濃度(NOEC)を求める。
### 2.1 ．器具·装置

300 ml 三角フラスコ

シリコセン(松浦製作所、品番6-343-16、型番C-40)

● インキュベーター(温度 25℃・明暗周期=12H/12H・照度 2400 lx(光合成光量子束密度 36 μmol m⁻² s⁻¹)が実現可能なもの)

#### 2.2. 培養方法

N-system の維持培養は必ず無菌的に行うこと。培地は TP 培地 (Table 1) を用いる。培地を調整後、300 ml フラスコに 200 ml ずつ分注してシリコ栓 $ ^{*1} $ をし、オートクレーブ (121℃、15 min) して滅菌する。室温まで冷ました後、30 ml の 2～8 週間培養した N-system をこれに加え、温度 25℃・明暗周期 = 12H/12H・照度 2400 lx (光合成光量子束密度 36 μmol m $ ^{-2} $ s $ ^{-1} $ ) のインキュベーターで培養する。培養開始 1～3 日後は、毎日攪拌し、その後は静置培養する。継代培養は、2 ヶ月に 1 回行う。

2.2.1. Table 1 TP 培地（Taub Polypepton Medium）

A	Polypepton $ ^{*2,3,4} $	2.0 g	/ 100 ml	10.0 ml
B	MgSO $ _{4} $ $ \cdot $ 7H $ _{2} $ O	4.93 g	/ 200 ml	2.0 ml
C	KH $ _{2} $ PO $ _{4} $	2.72 g
NaOH	0.56 g	/ 200 ml	2.0 ml
D	CaCl $ _{2} $ $ \cdot $ 2H $ _{2} $ O	7.35 g	/ 500 ml	40.0 ml
E	NaCl	2.92 g	/ 500 ml	60.0 ml
F	FeSO $ _{4} $ $ \cdot $ 7H $ _{2} $ O	4.98 g
Na $ _{2} $ EDTA	2.72 g	/ 200 ml	0.375 ml
G	H $ _{3} $ BO $ _{4} $	0.930 g
ZnSO $ _{4} $ $ \cdot $ 7H $ _{2} $ O	0.144 g
MnCl $ _{2} $ $ \cdot $ 4H $ _{2} $ O	0.99 g
Na $ _{2} $ MoO $ _{4} $ $ \cdot $ 2H $ _{2} $ O	0.012 g
CuSO $ _{4} $ $ \cdot $ 5H $ _{2} $ O	0.025 g
Co(NO $ _{3} $ ) $ _{2} $ 6H $ _{2} $ O	0.145 g	/500 ml	1.0 ml

蒸留水

$$ TN=14.5mg/l、TP=1.0\quad( 宀 プトン )+3.1\quad(KH_{2}PO_{4})=4.1mg/l、TN\quad/TP=3.54 $$
光源には National（=Panasonic）FL20SS-W/18 を使用する。3 ヶ月ごとにすべての蛍光灯を交換するか、1 ヶ月ごとに照度または光合成光量子束密度を測定して必要に応じて交換する。

*1 株式会社 松浦製作所、品番 6-343-16、型番 C-40、300·500 ml 三角フラスコ用、通気量 2,000～4,500 ml/min。

*2 Polypepton(和光コード(包装):394-00115(500 g)、390-00117(10 kg))を使用する。なお、日本製薬の Polypepton は、「牛乳力ゼインを酵素分解後、精製し、乾燥した灰黄色の粉末である。…(中略)…BD 社製の Trypticase Peptone、Casitone に相当する」(日本製薬製品要覧より)。

*3 Polypepton の添加方法は各人に任せる。e.g. ① その都度粉末で加える。② ペプトン溶液を作って、オートクレーブ(121℃、15 min)して冷蔵保存し、その都度オートクレーブ後に無菌的に加える。ただし、オートクレーブは品質の変化を伴うので、二重滅菌はしない。

*4 窒素含有率 14.5%、リン含有率 1.0%（w/w）。測定方法：①ポリペプトン水溶液を正確に 10ppm 調整。②ペルオキソ二硫酸カリウム分解法で分解。窒素化合物およびリン化合物はすべて $ NO_{3}^{-} $ および $ PO_{4}^{3-} $ に分解される。④ $ NO_{3}^{-} $ を紫外線吸光光度法で、 $ PO_{4}^{3-} $ をモリブデン青吸光光度法で測定した。
### 3. 準備

#### 3.1. 器具·装置

300 ml 三角フラスコ

シリコセン(松浦製作所、品番6-343-16、型番C-40)

● インキュベーター(温度 $ 25^{\circ}C \cdot $ 明暗周期 $ = 12H/12H \cdot $ 照度 $ 2400\ 1x $ (光合成光量子束密度 $ 36\ \mu mol\ m^{-2}\ s^{-1} $ )が実現可能なもの)

• 溶存酸素計(DO計)

● 黒色ゴムチューブ(DO計から光が漏れる場合のみ必要)

● スターラー(DO 計が静水測定可能なら不要)

回転子(DO 計が静水測定可能なら不要)

● 溶存酸素電極用穴あきキャップ(DO計が静水測定可能なら不要)

ビニールチューブ(DO計が静水測定可能なら不要)

円形カバーグラス(DO計が静水測定可能なら不要)

● 断熱材(e.g. シリコンゴムスポンジシート(SR、片面スキン付き)(タイガースポリマー株式会社))および白紙、またはコの字型白色アクリル板(DO計が静水測定可能なら不要)

### 3.2 ．溶存酸素計の準備

##### 3.2.1. DO 測定時に水流が必要な酸素電極の場合

ポーラログラフ式酸素電極など DO の測定に水流が必要な電極を用いる場合は、センサー部に回転子を入れた穴あきキャップをし、センサー付近のみ攪拌して DO を測定する。穴あきキャップの底に円形カバーグラスを敷き、その上に回転子を置くことで、回転子が滑らかに動くことができる。

YSI-5750 に攪拌系を取り付ける方法を Fig. 1 に示した。攪拌系を取り付けた電極を、300 ml 三角

Fig. 1 ①電極、穴あきキャップ、円形カバーグラス、ビニールチューブ、回転子を用意。②ビニールチューブを電極に取り付け、キャップとの間のガスケットとする。③円形カバーグラスと回転子を入れた穴あきキャップを、温度センサーに被さないように電極に取り付ける。
フラスコの底に接触するまで差し込み、ゴムやシリコンのガスケットやクリップなどで固定する。この時、フラスコの口を塞がないこと。

スターラーの上に断熱材と白紙を敷き、スターラーの熱がフラスコに伝わりにくくする。断熱材と白紙の代わりに、コの字型白色アクリル板(厚さ5mmのアクリル板を加工して、下に5mmの隙間ができるようにしたもの)を用いても良い。この上に電極を指したフラスコを載せ、攪拌してDO測定に移る。

##### 3.2.2. 電極から光が漏れる DO 計の場合

ProODO(YSI)などの蛍光式 DO 計は、電極側面から光が漏れるので、黒色ゴムチューブで光を遮断する(Fig. 2)。この電極を、300 ml 三角フラスコの底から 1 cm 程度の深さまで差し込み、ゴムやシリコンのガスケット、あるいはクリップなどで固定する(e.g. テーパージョイント用ケッククリップ KC24)。この時、フラスコの口を塞がないこと。攪拌は必要ない。

Fig. 2 ①センサー部側面から光が漏れる(紫色)。②温度センサーなどに影響がない範囲で黒色ゴムチューブをかぶせて光を遮断する。

##### 3.2.3. 溶存酸素計の校正

210 ml の蒸留水またはミリ Q 水を 300 ml 三角フラスコに入れ、3.2.1 および 3.2.2 の方法で DO 電極を取り付け、DO を 30 分おきに一晩連続測定する。溶存酸素データを取り出し、溶存酸素濃度が安定していることを確認してから、その時の溶存酸素濃度を 100%として校正する。なお、気圧による自動補正機能がある場合には、DO の校正の直前までに気圧の校正を済ませておくこと。

##### 3.2.4. 酸素の溶解速度を求める

酸素が大気中から水中に溶解する速度（$\delta\mathrm{D}$）は、電極やインキュベーター、スターラーの状態、フラスコの口の開き具合などに影響されるため、セット（フラスコ、電極、スターラーなど一式）毎に実験して求め、個別に適用するか、平均を求めて一括して適用する。できれば、試験の直前と直後の2回測定し、DO濃度の平均値を求めてから、以下の方法で$\delta\mathrm{D}$を求めることが望ましい。

## 実験

三角フラスコ(300 ml)に水(蒸留水またはミリ Q 水)を 210 ml 入れ、酸素または窒素で曝気し、溶存酸素濃度を大気との平衡値よりも高く/低くしておく。フラスコの口に息を吹きかけるなどして、フラスコ内の気相の酸素または窒素を空気に置換し、3.2.3と同様に溶存酸素を24～48 h測定する。以下、酸素を
曝気した場合のデータを霊にして δD の求め方を示す。

## 解析方法1 (データ分析ソフトがある場合)

Origin や IGOR Pro などのデータ分析ソフトがある場合、測定データからそのまま近似式を求め、近似式からδ DO を導出する。

例えば、水に酸素を曝気した場合のデータの解析例を Fig. 3 に示す。元データに対して、 $ y=ae^{bt}+c $ の形に近似した。式における a は図中の A1、b は -1/t1、c は y0 に相当する。なお、c の値は既知であり、大気と水の酸素濃度が平衡に達した時の DO 値 8.26 である。実際には実測値に従うこと。

Fig. 3 酸素曝気した後の DO 変化

適切な関数と c 值を選択すれば、 $ R^{2} $ 值は 0.999 以上になるはずである。上記解析結果から、この近似式の各定数の値は、 $ a = A1 = 5.755 $ 、 $ b = -1/t1 = -1/422 $ 、 $ c = y0 = 8.26 $ である。この式を微分すると測定時間における DO の大気中への放出速度が求められる。元の式は、

$$ y=a e^{b t}+c $$

である。これを微分すると、

$$ \frac{dy}{dt}=ab\;e^{bt} $$
となる。時間ではなく、任意の DO における δ DO が知りたいから、 $ \frac{dy}{dt} $ を y の関数として表すように変形すると、

\[\frac{dy}{dt}=ab\;e^{bt}=b\big(ae^{bt}\big)=b\big(ae^{bt}+c-c\big)=b\big(y-c\big)\cdot\cdot\cdot\cdot\

となり、 $ \frac{dy}{dt} $ は y の一次関数として表される。 $ \frac{dy}{dt} = \delta DO $ と、y = DO、b = -1/422、c = 8.26 を代入すると、

$$ \delta DO=-\frac{1}{422}\big(DO-8.26\big) $$

となる。最後に、DO > c の時 δ DO < 0 となり、DO < c の時 δ DO > 0 となることを確認する。なお、このデータは時間の単位が分であるため、δ DO の単位は、mg l⁻¹ min⁻¹ である。

## 解析方法 2 (一般的な表計算ソフトで解析する場合)

Excel などの一般的な表計算ソフトでは、線形近似はできるが、 $ y=ae^{bt}+c $ の形に近似することはできない。そこで、対数を取ることで、線形近似できる形に変換し、aとbを求める。

両辺から c をひくと、

$$ \begin{aligned}&y=a e^{bt}+c\\ &\Leftrightarrow\quad y-c=a e^{bt}\\ \end{aligned} $$

となる。両辺の自然対数を取ると、y>cにおいて、

となり、時間 t の一次関数になる。

$$ \begin{aligned}\Leftrightarrow\quad\ln(y-c)&=\ln ae^{bt}\\&=\ln a+\ln e^{bt}\\&=\ln a+bt\ln e\\&=\ln a+bt\quad\cdots\cdots\cdots\cdots\cdots\cdots\cdots\cdots\cdots\cdots\cdots\cdots\cdots(12)\end{aligned} $$
例として、解析方法1と同じデータからδDOを求める。

元データから、平衡に達した時の DO を読み取ると 8.26 であるから、c = 8.26 である。元データから

Fig. 4 元データから 8.26 を引いた図

#### 8.26 を引くと、Fig.4のようになる。

8.26 をひいたデータ (> 0) について自然対数をとって線形近似すると、Fig. 5 のようになる。しかし、明らかに後半では誤差が大きく、うまく近似できていない。そこで、データ数ができるだけ多く、かつ $ R^{2}>0.999 $ となるように、適用するデータを時間の遅い方から削っていくと、Fig. 6 のようになる。

式(12)と照らし合わせると、b=-0.00239、 $ \ln a=1.74598 $ である。以上から求められたbとcを式(10)に代入すると、

Fig. 5 元データから 8.26 を引き、自然対数をとって線形近似した図
Fig. 6 測定誤差の分を取り除いて線形近似した図

となる。最後に、DO > c の時 δ DO < 0 となり、DO < c の時 δ DO > 0 となることを確認する。なお、このデータは時間の単位が分であるため、δ DO の単位は、mg l $ ^{-1} $ min $ ^{-1} $ である。

$$ 解析方法 1 では b=-\frac{1}{422.28491\pm2.1275}\div-\frac{1}{422}=-0.00237(-0.00236\sim-0.00238) $$

で、解析方法2ではb=-0.00239だった。その差は1％未満であり、解析方法による差はないといえる。

#### 3.3. 繰り返しおよび対照群

NOEC のスクリーニングのためには 1 回で良い。本試験では 3 回の繰り返しを行う。対照群には、試験群と同量の溶媒を添加する。溶媒に水以外の物質を使った場合には、水添加対照群と、溶媒添加対照群の両方をたてる。

#### 3.4. N-system の準備

N-system の培養は無菌的に行う。試験用の培養も維持培養の方法準ずるが、種となるN-system の摂取量は10 mlとする。すなわち以下の通りである。培地はTP培地(Table 1)を用いる。培地を調整後、300 ml フラスコに200 ml ずつ分注してシリコ栓をし、オートクレーブ(121℃、15 min)して滅菌する。室温まで冷ました後、10 ml の2～8 週間培養したN-system をこれに加え、温度25℃・明暗周期=12H/12H・照度2400 lx(光合成光量子束密度36 μmol m⁻² s⁻¹)のインキュベーターで培養する。培養は明期の終了した直後から始める。培養開始1～3日後は、毎日攪拌し、その後は試験開始(DO電極取り付けまたは被験物質添加)まで静置培養する。

生物量や化学分析に使う分析用の N-system と、DO 測定用の N-system は別々に用意する。また、
DO 測定用の N-system は、電極を取り付けるまでは分析用のものと全く同じように培養する。
### 4. 試験の手順

#### 4.1. DO 電極の設置

DO 電極は培養時間 14 日 (336 時間) で設置し、測定を開始する。電極の設置方法は 3.2.1 および 3.2.2 の方法に準ずる。電極は静かに設置し、生物の分布を崩さないようにすること。

電極を設置するときと、設置後は、無菌的に操作を行う必要はない。ただし、電極は、電極に支障が出ない範囲で、できるだけアルコール消毒し、匂いを嗅ぐなどしてアルコールが飛んでいることを十分に確認してから設置すること。

### 4.2 ．被験物質の準備と添加方法

##### 4.2.1. 被験物質の準備

被験物質は、原則的に蒸留水かミリＱ水に溶解する。溶解しにくい場合には、超音波処理で分散させる。他に方法がない時に限り、超音波処理による分散もできないときは、HClやNaOHなどの無機酸・塩基、あるいはDMSOやメタノール、アセトンなどの有機溶媒を用いることができる。しかし、呼吸量への影響が非常に大きいので使用量は最小限にしなくてはならない。

##### 4.2.2. 被験物質の添加方法

被験物質は、培養時間15日(360時間)に添加する。DO測定用のN-systemには、電極とフラスコの隙間からパスツールピペット等のガラス管を差し込み、パスツールピペット内に被験物質の溶液を静かに流して加える。その後、パスツールピペット内を溶液の3倍量の溶媒を流して被験物質が全てN-systemに加えられるようにする。この時、生物の分布を崩さないようにすること。攪拌はしない。この方法が難しい場合には、一旦電極を抜いて被験物質を加えることができる。電極の抜き差し及び被験物質を添加する過程で、DO測定に影響がないように、また生物の分布を崩さないようにすること。

分析用の N-system にはシリコ栓を開けてピペットで静かに加え、生物の分布を崩さないようにすること。攪拌はしない。被験物質と溶媒の量は DO 測定用に揃える。

必ず水を添加した対照群を用意しなければならない。水以外の溶媒を使った場合には、水を添加した対照群とは別に、溶媒を添加した対照群を用意して溶媒の影響を確認しなければならない。

#### 4.3. 試験期間

試験期間は、被験物質を添加した時点から14日(336時間)である。