Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
で、本研究プロジェクトで共通に使われている杉浦マイクロコズムを共通マニュアルに従って培養し、安定に培養できることを検証するとともに、杉浦マイクロコズムに放射線を照射した場合の構造的および機能的安定性への影響を調べた。

また、生態毒性評価試験でマイクロコズムを用いる際は、構成微生物群の複雑さ（例：構成生物種の多様性）が適切である必要がある。すなわち、一般的には、マイクロコズムが複雑になるほど実際の生態系に近づくので、得られる毒性データも正確になると考えられるが、一方で実験の再現性を維持することが困難になり、コストも高くなることが問題視されている。従って、これらの点をバランスよく満たすようにマイクロコズムの最適化を図る必要がある。そこで、系の複雑さと化学物質に対する感受性の関係を調べた。

さらに、マイクロコズムを用いた化学物質等の生態系リスク評価における知見をもとに、本手法を有効な評価手法として広く普及するために、その理論的基盤を確立することが重要な課題となっている。特に、DO変動パターンの計測から毒物の生態系影響を評価する手法の理論的根拠を実験モデルと数理モデルの双方から明らかにすることが課題である。

## 2 ．研究開発目的

## (1) 放射線の生態系への影響評価

まず、構造（個体数）と機能（生産量（P）/呼吸量（R））の関係に着目して、杉浦マイクロコズムの安定性に関して解析を行うことにした。マイクロコズムの安定性を攪乱する因子としては、分解を含む形態変化に伴って生物影響が変化する恐れがある化学物質ではなく、常に一定の生物影響を与えることが可能な放射線の一種であるγ線の外部照射を選択した。放射線は、原子力発電における最も重要なリスク因子である。原子力発電は発電時に二酸化炭素を放出しないため、東京電力福島第一原子力発電所事故以後も地球温暖化対策の重要な柱と位置付けている国も多く、今後国際的には需要の拡大が見込まれている。しかし、生態系の放射線防護に関しては、これまであまり考慮されてこなかった。最近になって国際放射線防護委員会（ICRP）などの国際機関がようやく検討を始め、初步的な防護体系を示したものの¹,²）、生態系を対象にした化学物質規制に比べると取り組みが遅れているのが現状である。そこで、本サブテーマで、マイクロコズムに対する放射線の影響を調べることは、こうした課題にも貢献する意義があると考えられる。

## （２）3者マイクロコズムを用いた評価の有効性

杉浦マイクロコズムよりも単純なマイクロコズムを生態毒性評価試験に用いることの妥当性を化学物質に対する感受性の観点から検証した。そこで、生産者である鞭毛藻Euglena gracilis、消費者である繊毛虫Tetrahymena thermophila、分解者である細菌Escherichia coliの3種類の微生物から構成される3者マイクロコズムを用いた $ ^{3)} $ 。このマイクロコズムは単純であるが、水圈微生物群集の基本的な相互作用を有し $ ^{4)} $ 、細胞数は1年以上にわたって安定に維持される。また、構成微生物種はマイクロコズムと同じ条件で単独培養することが可能である。そこで、3者マイクロコズムとその単独培養系に金属類負荷実験を行い、3者マイクロコズムと単独培養系、単一生物種試験（現在一般的に行われている藻類、ミジンコ、魚類毒性評価試験など）、杉浦マイクロコズムの間で感受性を比較した。
## （３）マイクロコズムによる評価手法の有効性

マイクロコズムを用いた環境影響評価手法を信頼できる技術として確立するには、その手法の理論的裏付けとデータによる検証が必要である。本プロジェクトで行う化学物質等の生態系への影響評価の特徴は、マイクロコズム（モデル生態系）に問題となる化学物質等を投入し、その液相の溶存酸素濃度（D0）の変化を計測し、そのデータからPとRおよび比（P/R）を求め、それらの変化パターンからその影響を評価するものである。この評価における因果過程には、（1）化学物質等による直接/間接効果により生態系構成種の一部或いは全ての個体数に変化が生じる、（2）この個体数変化がD0の変動パターンに変化を生じる、という過程からなる（図(2)-1）。D0変化から化学物質等の生態系影響を推測するうえで、D0変化パターンがいかなる情報を持ち、その変化は何を示しているのかということが明確でなければならない。しかしながら、これまでD0変動、個体数変化、そして物質の毒性との間の因果関係が明確にされておらず、D0変動データから影響評価するという手法の妥当

図(2)-1 化学物質等（毒物）により引き起こされる生態系構成種の個体数変と生産量/呼吸量変化

性についてその理論的基盤の整備が望まれている。そこで、本テーマではこの因果過程を数理モデルとマイクロコズムを用いた実証試験の双方から「化学物質→生態系個体群動態→溶存酸素動態」の間の関係を明らかにし、この手法の有効性を保証する理論的基盤を確立することを目的にした。具体的には以下の3つの課題を検討した。

（1）数理モデルによる DO の変動のメカニズムと予測の理論的基盤を確立する。

（2）3 種及び多種マイクロコズムを用いて、マイクロコズムの構成種の個体数や存在の有無が D0 動態に及ぼす影響を解析し、数理モデルの解析結果を検証する。

（3）2 種系（細菌-藻類）のコンピューター・シミュレーションモデルを用いて、3 段階の毒性の強度（毒性の強さ、或いは量の程度）に対する毒物投与が DO 変動動態に及ぼす影響を解析し、数理モデルの解析結果を検証する。

## 3 ．研究開発方法

## (1) 放射線の生態系への影響評価

杉浦マイクロコズムの安定性に関しては、相模女子大学・杉浦桂教授（当時）よりマイクロコズムの分譲を受けた。本研究プロジェクトの共通マニュアルに従って、マイクロコズムの培養、構成生物種の個体数測定、P/R測定などを行った。杉浦マイクロコズムの安定性に対する放射線の影響については以下の手順で実験を行った。杉浦マイクロコズム6本を、個体数がほぼ一定となる安定期になるまで18日間培養した。その後、マイクロコズム2本ずつを、非照射対照区、γ線10 Gy/dayおよび23 Gy/day照射区として処理した。各処理区において、1本は個体数測定に、別の1本はP/R測定に用いた。培養開始18日目以降、照射区のマイクロコズムは、連続的に $ ^{137}Cs $ γ線を各線量率で外部照射しながら培養した。対照区のマイクロコズムは、照射室内において、鉛
ブロックで $ \gamma $ 線を遮蔽した照射野外の区画で培養した。照射開始後45日間にわたって個体数とDOを測定した。

## （２）3者マイクロコズムを用いた評価の有効性

3者マイクロコズムの化学物質に対する感受性に関しては、安定期にアルミニウム（Al^{3+}；0.27-27 ppm）、マンガン（Mn^{2+}；5.5-550 ppm）、銅（Cu^{2+}；0.064-6.4 ppm）を負荷し、細胞数とP/Rに対する影響を調べた。マンガンと銅については、単独培養系でも負荷実験を行い、細胞数に対する影響を調べた。E. gracilisとE. coli単独培養系については安定期にマンガンおよび銅を添加し、安定期が存在しないT. thermophila単独培養系については培養開始時に添加した。E. gracilisとE. coliの細胞数はコロニー形数法で測定し、T. thermophilaの細胞数は頭微鏡下で直接計数した。P/Rは、本研究プロジェクトの共通マニュアルに従って測定した。

## （３）マイクロコズムによる評価手法の有効性

## （３）－１） 数理モデルによる溶存酸素濃度の変動のメカニズムと予測

自然水系及びマイクロコズムの水相におけるD0の時間変動の機構とこれに関与する変数を明らかにするために，図(2)-2に示すようなモデルを考えた。ここでは、溶存酸素は、消費者及び生産者による消費、外気への拡散により減少し、また生産者による酸素生成及び外気からの溶解により増加する。生理学的時間（すなわちD0(X)変化の1周期）では、個体数は変化しないと仮定し、消費者の量（C）と生産者の量（P）を定数として扱い、大気中酸素濃度Yも定数として扱った。また、個体数変化が生じる生態学的時間では、C, Pは変数(variable)として扱った。ただし、大気中酸素濃度Yは定数として扱った。このモデルに基づきD0の時間変動を記述する以下の微分方程式（1式）をたて、その一般解を求めた。その結果から各パラメータがD0変動にどう関与しているかを解析した。

$$ \begin{aligned}&\frac{dX}{dt}=\left(aY+dP\right)-\left(b+c_{h}C+c_{a}P\right)X\\ &=\alpha-\beta X\\ \end{aligned} $$

$$ \begin{aligned} ここで、\alpha=aY+dP,\quad\beta=b+c_{h}C+c_{a}P.\end{aligned} $$

図(2)-2 溶存酸素（DO）の移動のモデル。Y：大気の酸素濃度；X：液相の酸素濃度（DO）、時間tの関数；C：消費者のバイオマス（個体群密度）；P：生産者のバイオマス（個体群密度）；a：大気から液相への酸素の溶解係数；b：液相から大気への酸素の遊離係数；c：消費者の酸素消費係数；d：生産者の酸素放出係数

## （３）－２）マイクロコズムの構成種の数や存在の有無がDO動態に及ぼす影響

（３）－１）で生産者や消費者の量やその変化がD0波形に及ぼす効果を数理モデルによって解析
したが、この結果を実験系において検証した。検証には、(a)3種系（クロレラ、大腸菌、テトラヒメナ）と(b)多種系（栗原・杉浦マイクロコズム）のマイクロコズムを用いた。具体的には、生物を段階的に投入し、D0波形（特に、山と谷の値）の変化を調べ、生産者及び消費者の存在やその量とD0波形のパターンとの関係を調べ、その結果を検討課題（1）で得られた数学的予測から考察した。

## (a) 3 種系マイクロコズム（“CET マイクロコズム”）

構成種として、薬類（Chlorella vulgaris）、細菌（Escherichia coli）、及び繊毛虫（Tetrahymena thermophila）を用い、番号順に順次接種し、D0 波形（特に、山と谷の値）の変化を調べ、生産者及び消費者の存在やその量との関係を（3）-1）で得られた数学的予測との関係を解析した。培地として、MC 培地（無機塩のみ）を用い、12L/12D, 3000lux（42μmolm^{-2}s^{-1}）の光条件で、30℃で培養を行った。P/R は、本研究プロジェクトの共通マニュアルに従って測定した。

## (b) 多種系マイクロコズム

栗原・杉浦マイクロコズムから分離した以下の4つの生物グループを番号順に日数をおいて順次接種し、D0波形（特に、山と谷の値）の変化を調べ、生産者及び消費者の存在やその量との関係を検討課題(1)で得られた数学的予測と比較し、その検証を行った。(i）細菌（4種）、(ii）藻類（Tolypothrix sp.，Chlorella sp.，Scenedesmus sp.）、(iii）繊毛虫（Cyclidium sp.）、(iv）後生動物（Lecane sp.+Aerosoma hemprichi）

培地として、TP 培地（無機塩＋ペプトン 0.01％含有）を用い、12L/12D, 2400lux の光条件で、25℃で培養を行った。P/R は、本研究プロジェクトの共通マニュアルに従って測定した。

（3）-3）コンピューター・シミュレーションモデルを用いた毒物とDO動態との関係の解析化学物質の投与によるDO波形の変化から、生態系の生産者と消費者の量の変化が推定できることが（3）-1）の解析から明らかになった。これをシミュレーションモデル系で検証するために、解析の容易な2種系（細菌-藻類）のコンピューター・シミュレーションモデルを作成した。これを用いて、毒性（対細菌）の強さ（3段階の強度）とDO変動動態と関係を調べ、DO波形の変化から影響（毒性）の強さを推定できるかを検証した。なお、シミュレーション上では、化学物質の細菌-藻類系への投入は細菌の死亡率を高めることにより行い（化学物質の挙動を記述するモデルは定義されていない）。その毒性効果（死亡率増加）は一定であり消失しないものとした。

## 4 ．結果および考察

## （1） 杉浦マイクロコズムの安定性と放射線影響

## (a) 構造への影響

杉浦マイクロコズムにおける構成生物種の個体数変化を図(2)-3に示した。対照区では、全ての生物種の個体数が、実験期間中ほぼ一定で安定していた。10 Gy/dayでは、細菌の細胞数（コロニー形成単位）が照射開始19日目以降に対照区よりも減少した。他の生物種には影響が見られ
なかった。23 Gy/dayでは、糸状ラン藻Schizothrix sp.の現存量（糸状体の長さ）が28日目以降に対照よりも増加した。細菌の細胞数は4日目以降、ワムシLepadella sp.の個体数は45日目に、それぞれ対照区よりも減少した。他の生物種には影響が見られなかった。

## (b) 機能への影響

マイクロコズムのD0の日変化を図(2)-4に示した。マイクロコズムの培養は12時間明暗周期で行ったが、対照区と照射区ではともに、明期開始直後にD0が急速に上昇して最高値に達し、その後は徐々に低下した。明期が終了して暗期に入ると、D0の低下が促進された。やがて低下速度は鈍るものの、D0低下は継続し、暗期終了時に最低値となった。このようなD0の日変化が実験期間中規則正しく続いた。P/Rの値は、実験期間中、対照区と照射区ともに、ほぼ1で安定しており、明確なγ線の影響は見られなかった（図(2)-5）。

## (c) 安定性

本プロジェクトで作成した共通マニュアルに従ってマイクロコズムを培養したところ、対照区では60日以上にわたって構成生物種の個体数がほぼ一定であり（図(2)-3）、P/Rの値もほぼ1で一定だったので（図(2)-5）、このマニュアルの方法でマイクロコズムを安定に培養できることを構造面および機能面で確認できた。 $ \gamma $ 線の連続照射によってマイクロコズムは、一部の構成生物種の個体数が減少または増加するという構造面への影響を受けたが（図(2)-3）、P/Rを指標とした機能面への影響を受けなかった（図(2)-5）。このメカニズムとしては、個体数が増減しても、それに応じて個体の代謝活性が変化して個体群レベルの代謝活性は影響を受けなかった可能性が考えられる（例えば、個体数が減少した場合は、生き残った個体の代謝活性が上昇）。また、ある生物種の個体数が増減して個体群レベルの代謝活性も変化した場合は、それに応じて同様の生態学的機能を果たしている別の生物種の代謝活性が変化して、群集レベルの代謝活性は影響を受けなかった可能性も考えられる（例えば、ある生物種の個体数が減少し、代謝活性も低下して資源に余剰が出た場合、それを利用して別の生物種の代謝活性が上昇）。いずれのメカニズムにせよ、得られた実験結果は、マイクロコズムが構造的に影響を受ける場合であっても、個体群または群集レベルの冗長性により機能的にはマイクロコズムの安定性が維持される場合があることを示していると考えられる。
黑線：23 Gy/day

図(2)-3 γ線の連続照射が杉浦マイクロコズムの個体数に与える影響

図(2)-4 杉浦マイクロコズムにおける溶存酸素濃度の日変化

照射開始4－14日目の測定結果を示した。

図(2)-5 γ線の連続照射が杉浦マイクロコズムのP/Rに与える影響

薄灰色線：对照 濃灰色線：10 Gy/day

縱軸：溶存酸素濃度（電圧；V）

横軸：DO測定開始後の経過日数

## (d) 水圈微生物生態系に対する放射線のリスク

本研究では10 Gy/dayおよび23 Gy/dayの放射線の影響を調べたが、実際の生態系が、これに相当する線量率で被曝する可能性は極めて低いと考えられる。これまでに深刻な原子力事故が発生したり、高レベル放射性廃棄物の不適切な廃棄が行われてきたが、その大部分の線量率は、本研究の値を下回っている。例えば、1986年に旧ソ連（現ウクライナ）で発生し、史上最悪の原子
力発電所事故といわれたチェルノブイリ原子力発電所事故でも、動物プランクトンと植物プランクトンの線量率は、それぞれ最高で0.009 Gy/dayと0.006 Gy/day程度に過ぎなかった $ ^{5)} $ 。旧ソ連（現ロシア）南ウラルのMayak核複合施設関連では、1957年に発生したKyshtym事故で最高0.1 Gy/day $ ^{6)} $ 、1950-1951年のテチャ川への放射性廃棄物の不適切な投棄で最高0.6 Gy/day $ ^{7)} $ の線量を魚が受けたとされている。また、福島第一原子力発電所事故では高濃度汚染水の直接流入によって近傍の海洋生物への影響が懸念されたが $ ^{8)} $ 、動物プランクトンと植物プランクトンの線量率は、それぞれ最高で1.3 Gy/dayと0.003 Gy/day程度であったと考えられる（2011年3月30日における原発から330 mの海水中濃度I-131 180000 Bq/L、Cs-134 47000 Bq/L、Cs-137 47000 Bq/L $ ^{9)} $ から、現在世界的に最もよく使われている線量計算コードERICA Assessment Tool version June 2011 $ ^{10)} $ を用いて算出）。本研究で調べた線量率を越える唯一の被曝事例は、1951-1952年の南ウラル・カラチャイ湖への放射性廃棄物の不適切な大量投棄によるもので、水生生物の生存を仮定すれば線量率は300-800 Gy/dayに達していたと推定された $ ^{6)} $ 。従って、本研究において、23 Gy/dayでもマイクロコズムのP/Rには影響が見られず（図(2)-5）、一部の構成生物種で個体数変化が見られただけなので（図(2)-3）、原子力施設事故や放射性廃棄物の不適切な廃棄を考慮しても放射線が水圈微生物生態系に深刻な影響を与えるリスクは低いと考えられる。

## (2) 3者マイクロコズムの化学物質に対する感受性

結果の一例として、マンガンが3者マイクロコズムの細胞数およびP/R、単独培養系の細胞数に与える影響を図(2)-6、(2)-7、(2)-8に示した。3者マイクロコズムの細胞数に関しては、5.5 ppmでは、マンガン添加直後にE. coliが一時的に減少した以外、影響は見られなかった（図(2)-6）。27.5 ppmと55 ppmでは、E. gracilisが対照系よりも若干増加し、マンガン添加直後にE. coliが一時的に減少した以外、影響は見られなかった。550 ppmでは、まずE. coliが死滅し、次いでT. thermophilaが死滅したが、E. gracilisは対照系よりも若干増加した。

3者マイクロコズムのP/Rに関しては、5.5−550 ppmで、PとRが濃度依存的に対照系よりも減少し、その減少の程度がRよりもPで大きかったため、P/Rは1よりも小さくなった（図(2)−7）。

単独培養系に関しては、E. gracilisは55 ppmまで明らかな影響が見られなかったが、550 ppmでは細胞数が減少した（図2）-8）。T. thermophilalは、55 ppmまで明らかな影響が見られなかったが、550 ppmでは培養初期に一時的な増殖阻害が見られた。E. coliは、5.5-55 ppmで一時的な細胞数の減少が見られ、550 ppmでは死滅した。

アルミニウムと銅についても同様の結果を得ることができた。これらの結果から、無影響濃度（NOEC）をまとめたものが表(2)-1、(2)-2、(2)-3である。これらの表には、比較のため、現在汎用されている単一生物種試験で求められたNOEC $ ^{11),12} $ とサブテーマ3で取得された杉浦マイクロコズムのNOECも付記した。

3者マイクロコズムと単独培養系の細胞数についてのNOECを個々の生物種に着目して比較すると、マンガン負荷時のE. gracilisや銅負荷時のT. thermophilaのように、両者のNOECが異なる場合があった（表(2)-2、(2)-3）。これは、3者マイクロコズムでは生物間相互作用に起因する間接影響があったためと考えられる。例えば、銅6.4 ppm負荷時に、T. thermophilaは単独培養系では影響を受けなかったが、3者マイクロコズムでは死滅した。これは、3者マイクロコズムでは銅によってE. coliが死滅したためエサ不足となったT. thermophilaが間接的に死滅した。
めと考えられる。このことは、単一生物種試験では生態系影響を完全には評価できず、マイクロコズム試験が必要なことを示唆している。ただ、全体を比較するため、各生物種のNOECのうち最も低いものに着目すると、3者マイクロコズムと単独培養系で差が見られなかった。

図(2)-6 マンガンが3者マイクロコズムの細胞数に与える影響

図(2)-7 マンガンが3者マイクロコズムのP/Rに与える影響
図(2)-8 マンガンが単独培養系の細胞数に与える影響

表(2)-1 アルミニウムのNOEC (ppm)

細胞数	P	R	P/R
E. gracilis	T. thermophila	E. coli	全体
3者マイクロコズム	0.27	0.27	0.27	0.27	<0.27	<0.27	2.7
杉浦マイクロコズム	-	-	-	-	0.3	0.3	0.3

表(2)-2 マンガンのNOEC (ppm)

細胞数または個体数	P	R	P/R
E. gracilis	T. thermophila	E. coli	全体
3者マイクロコズム	>550	55	<5.5	<5.5	<5.5	<5.5	<5.5
単独培養系	55	55	<5.5	<5.5	-	-	-
杉浦マイクロコズム	-	-	-	0.1	0.5	0.1	0.5

表 $ (2) $ -3 銅のNOEC (ppm)

細胞数または個体数	P	R	P/R
E. gracilis	T. thermophila	E. coli	全体
3者マイクロコズム	>6.4	0.64	0.64	0.64	<0.64	<0.64	0.64
単独培養系	>6.4	>6.4	0.64	0.64	-	-	-
単一生物種試験	-	-	-	HC5 $ ^{a} $ : 0.00023点セット $ ^{b} $ : 0.005	-	-	-
杉浦マイクロコズム	-	-	-	-	0.5	0.25	0.5

$ ^{a} $ 単一生物種試験の結果を種感受性分布（SSD）によって解析して推定した、生態系の95%の種が保護される濃度 $ ^{11} $

$ ^{b} $ 藻類、ミジンコ、魚類の各生態毒性評価試験で求められたNOECのうち、最も低い濃度 $ ^{12)} $
3者マイクロコズムと杉浦マイクロコズムの感受性を比較すると、アルミニウム負荷時のP/Rについては3者マイクロコズムの感受性の方が低かったのに対し（表(2)-1）、銅負荷時のP/Rについては両マイクロコズムの感受性は同等であった（表(2)-3）。従って、化学物質の種類によって両者の感受性に差異がある場合と同等な場合の両方があると考えられる。3者マイクロコズムと単一生物種試験の比較に関しては、細胞数または個体数に対する銅の影響に着目すると、3者マイクロコズムの感受性の方が大幅に低かった（表(2)-3）。この原因は、単独培養系についても同様に単一生物種試験より感受性が大幅に低かったことから、生物間相互作用によって3者マイクロコズムで銅の影響が緩和されたためではなく、3者マイクロコズムの構成生物種自体の銅に対する感受性が単一生物種試験の試験生物よりも低かったためと考えられる。

以上より、3者マイクロコズムは生物間相互作用に起因する間接影響を評価できるが、杉浦マイクロコズムや単一生物種試験とは感受性が異なる場合があるため、毒性データを推定するためには適当な安全係数を用いるなどの工夫が必要であることが示唆された。

## （3） マイクロコズムによる評価手法の有効性

## （3） -1） 数理モデルによる溶存酸素濃度の変動のメカニズムと予測

数理モデル（1式「研究開発方法」参照）を解くことにより、溶存酸素（X）の時間変化を予測する以下の式を得た。

$$ X=(X_{0}-\frac{\alpha}{\beta})e^{-\beta t}+\frac{\alpha}{\beta} $$

(2式)

ここで、 $ X_{0} $ はt=0のときのX値。

Xは時間が無限大で $ \alpha/\beta $ に収束する。Xは $ \alpha/\beta $ に収束するが、明期と暗期とでは $ \alpha $ の値が異なるので、明暗の変化のよる溶存酸素濃度の平衡点は以下のように変化する。明期では、

$ \alpha=aY+dP $ ( $ \alpha_{L} $ とする)、暗期では d=0 となるので、 $ \alpha=aY $ ( $ \alpha_{D} $ とする) となる。ただし、酸素消費量は明/暗いずれも同じである

$ \left(\beta=b+c_{h}C+c_{a}P\right) $ 。このように、明暗の切り替えにより平衡点が $ \frac{\alpha_{L}}{\beta} $ と $ \frac{\alpha_{D}}{\beta} $ に変化するので、溶存酸素濃度

度（X）はこの２つの平衡点の間を行き来する（図2-9）。

この波形はDO値の実測データに類似しており、このモデルがDO変動の機構をうまく表していることを示している。ただし、実データでは暗期に入る前にDO値が減少しはじめる結果がでており、これは、CO2が不足することによる光合成低下のためと考えられる（（3）-2）の実験結果参照）。
このDO変化の上限（漸近線 $ X=\frac{\alpha_{L}}{\beta} $ と下限（漸近線 $ X=\frac{\alpha_{D}}{\beta} $ を実際のDO値の極大値（“山”，p）と極小値（“谷”，v）で近似すると、 $ P\cong\frac{\alpha_{L}}{\beta} $ ， $ v\cong\frac{\alpha_{D}}{\beta} $ となる。つ

まり、毒物により溶存酸素濃度の波形の山と谷の値が変化した場合、その変化の方向と程度を知れば、(i) 生産者の活性の低下（ $ \alpha_{L} $ の減少）、(ii) 消費者の活性の低下（ $ \beta $ の減少）、(iii) 両者の活性の低下（ $ \alpha_{L} $ と $ \beta $ の減少）が起こっていることを推定することができる（図(2)-10）。結論として、この方法により、生産者および消費者という生態系の機能的グループ単位での構成要素の量（生産者、消費者、生産者及び生産者の量）とおよび変化をDO波形の解析により定量的に推定

$$ \frac{\alpha_{D}}{\beta} $$

図(2)-10 化学物質（毒物）によるD0波形の山（極大値）と谷（極小値）の値の変化と生態系の生物活性の変化との関係

きることが明らかである。また、図中のベクトルの逆向きは、構成種の活性化を意味する。これは、実験モデルで行う生物添加実験で検証する。活性化現象は、有機物や栄養塩類の導入による場合や外部からの生物の移入の場合もあるだろう。

## （3） -2）マイクロコズムの構成種の数や存在の有無がDO動態に及ぼす影響

## (a) 3 種系マイクロコズム（CET マイクロコズム）

藻類をスタート時、細菌を30日目、繊毛虫を57日目に順次接種し、DO値の変動とP/R比を求めた（図(2)-11）。また、この過程の個体数変化を図(2)-12に示す。DO値の山と谷の値を7日間の時間区間で平均を取り、図(2)-10と同形式で表示したものを図(2)-13に示す。図(2)-13より、時間とともに藻類の活性低下が起こり、細菌添加によってDOの山（極大値）と谷（極小値）が減少し、さらに繊毛虫の添加直後（60～66日）は、山の増加と谷の増加が起こっている。これは、光合成活性の増加と消費者である細菌の減少により系全体の呼吸量が低下したことを示唆している。しかし、その後、山の値が下がり、谷の値がさらに増加していることから、光合成活性の低下と系全体の呼吸量が低下していることが示唆している。
図(2)-11 DO値の変動（紺色）とP/R比（ピンク色）の時間変化（赤線はP/R比＝1を示す）。

図(2)-12 CETマイクロコズムの構成種の個体数変化
図(2)-13　7日間の区間でのD0値の山と谷の平均値の時間推移。図中番号は区間の時間順序

## (b) 多種系マイクロコズム

0日目に細菌、4日目に藻類、17日目に繊毛虫、29日目に後生動物を接種した。細菌接種後、DO値は0まで減少するが、細菌の資源（ペプトン）の枯渇による酸素消費の減少で気相からの溶け込みによってDOが回復した（図(2)-14）。藻類の添加/増加によりDO値が上昇し、明暗の周期に同調してDO値の増減が見られた。その後は、消費者（繊毛虫）の添加によって、DO値の山の減少と谷の減少が見られた。これは、光合成活性の低下と消費活性の増加を示唆している。P/R比は12日あたりには1に収束しそのまま維持された（図(2)-15）。

図(2)-14 多種系マイクロコズムにおけるDO値及び個体数変化

DO 及びP/R計測：n = 3；個体数計測 n = 1、Tolypothrix.spのみ体長合計（mm）で表示
図(2)-15 多種系マイクロコズムにおけるP/R比の変化

（3）-3）コンピューター・シミュレーションモデルを用いた毒物とDO動態との関係の解析

細菌-藻類のシミュレーションモデルを用いた毒性（対細菌）の強さとDO変動動態と関係を解析した。t=0で藻類を、t=3000で細菌を投入し、t=10000で細菌に毒性を示す化学物質を投入した。この毒物投入は、計算上では、細菌の死亡率の増加という方法で実施した。この系のDO値の変化を図(2)-16に示す。t=3000で投入された細菌の増加によってt=4000過ぎまでにDO波形の山と谷がともに減少し安定する。t=10000で毒物の投入により、波形の山と谷は増加に転じるが、その度合いが毒性の強度に依存していることが示されている。以上の結果から、毒物の影響を受ける生物（細菌；消費者）の減少によるDO波形の変化（山と谷の増加）を検出できること、毒物による細菌の減少により、細菌から資源を受けている生産者（藻類）が減少することによってさらにDO波形の変化が生じることも明らかになった。これは、毒物が直接作用しない生物に及ぼす間接効果もDO波形の変化から検出できることを示している。
図(2)-16 細菌-藻類系における DO 変動と毒物投入の影響

## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

本研究により、マイクロコズムが構造的に影響を受ける場合であっても、個体群または群集レベルの冗長性により機能的には系の安定性が維持される場合があることが示唆された。このことは、生態系影響評価の際に、機能面に対する影響を重要視する場合は、現在一般的に測定が行われている構造に関するパラメータ（生物種組成、個体数など）を測定しても適切な評価ができず、機能に関するパラメータを直接測定する必要性を示しており、科学的意義は大きい。また、系の複雑さと化学物質など外的攪乱に対する感受性の関係は生態学や環境毒性学の重要な検討課題であり、3種類の微生物から構成される単純なマイクロコズムを使用して毒性データを推定するためには適当な安全係数を用いるなどの工夫が必要なことを示した本研究の科学的意義は大きい。

理論的側面からは、生態系の生産・消費構造（生産者、消費者、生産者及び生産者の量）および変化を D0 値の極大値と極小値から定量的に評価できることが数理モデルと実験から明らかとなった。さらに、D0 波形の極大値と極小値の変化を解析することにより、毒物が生態系の生産及び消費（呼吸）の量的構造に及ぼす効果とその程度を評価できることが明らかになった。特に、D0 波形の極大値・極小値の変化の方向、程度及び回復までの時間を知ることにより、毒性が生態系の生産・消費構造のどこに作用するかという特性とその強さを評価できることが明らかにされた。これらの結果は、本手法の有効性を理論的に裏打ちし、影響を定量的に評価する手法の基礎を与えるという点でその意義は大きい。
## （２）環境政策への貢献

国際放射生態学連合（IUR）のタスクグループ「環境防護への生態系アプローチ」（代表：Dr. François Bréchignac；IUR会長および国際放射線防護委員会（ICRP）第5委員会委員）に参画し、本研究プロジェクトで得られた知見を最終報告書案に反映させた。例えば、サブテーマ3で得られた杉浦マイクロコズムと単一生物種試験の感受性の比較結果 $ ^{13)} $ や本サブテーマで得られた生物種間相互作用による間接影響の重要性に関する結果（下記誌上発表の「査読あり論文」1）を引用）などを紹介した。この報告書は、放射線防護について各国行政機関が尊重しているICRP勧告や経済協力開発機構原子力機関（OECD/NEA）報告書などの内容に大きな影響を与える可能性が高い。従って、本研究プロジェクトの成果は、将来的には、ICRP勧告などを通して、我が国における環境の放射線防護政策に貢献するものと考えられる。

## 6 ．国際共同研究等の状況

本研究に密接に関連した課題「マイクロコズムを用いた放射線と他の有害因子の生態系影響の比較評価」についてProf. Gennady G. Polikarpov（ウクライナ The A.O. Kovalevsky Institute of Biology of the Southern Seas）と共同研究を実施している。平成21年度（S. FUMA，他7名，Y. INAMORI and G.G. POLIKARPOV: J. Environ. Radioact. 100, 12, 1027-1033 (2009) “Effects of Acute γ-Irradiation on the Aquatic Microbial Microcosm in Comparison with Chemicals”；査読あり）と平成23年度（下記誌上発表の「査読あり論文」2）に、原著論文各1報を共同で発表した。

### 7. 研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

## <論文（査読あり）>

1) S. FUMA, N. ISHII, H. TAKEDA, K. DOI, I. KAWAGUCHI, S. SHIKANO, N. TANAKA and Y. INAMORI: J. Environ. Radioact, 101, 11, 915–922 (2010)

“Effects of Acute Gamma-Irradiation on Community Structure of the Aquatic Microbial Microcosm”

2) S. FUMA, I. KAWAGUCHI, Y. KUBOTA, S. YOSHIDA, Z. KAWABATA and G.G. POLIKARPOV: J. Environ. Radioact, 104, 81-86 (2012)

“Effects of Chronic Gamma-Irradiation on the Aquatic Microbial Microcosm: Equi-Dosimetric Comparison with Effects of Heavy Metals”

<査読付論文に準ずる成果発表>（「持続可能な社会・政策研究分野」の課題のみ記載可。）特に記載すべき事項はない

くその他誌上発表（査読なし）>

特に記載すべき事項はない
## （2） 口頭発表（学会等）

1）府馬正一、川口勇生、久保田善久、吉田聡、川端善一郎：日本放射線影響学会第54回大会(2011)「ガンマ線の連続照射がモデル実験生態系に与える影響：重金属との比較」

2）府馬 正一：日本生態学会第59回大会（2012）

「化学物質と放射線の生態影響の比較」

## （3） 出願特許

特に記載すべき事項はない

## （４）シンポジウム、セミナーの開催（主催のもの）

特に記載すべき事項はない

## （５）マスコミ等への公表・報道等

特に記載すべき事項はない

## (6) その他

特に記載すべき事項はない

### 8 \. 引用文献

1) ICRP: A framework for assessing the impact of ionising radiation on non-human species. ICRP Publication 91, 2003.

2）酒井一夫：ICRP新勧告－新しい放射線防護の考え方と基準 第8回（最終回）環境の放射線防護，日本原子力学会誌，52，748-752，2010.

3) Kawabata, Z. et al.: Synthesis of a species-defined microcosm with protozoa. J. Protozool. Res. 5, 23–26, 1995.

4) Matsui, K. et al.: Direct and indirect interactions for coexistence in a species defined microcosm. Hydrobiologia 435, 109–116, 2000.

5) IAEA: Environmental consequences of the Chernobyl accident and their remediation: twenty years of experience. Report of the Chernobyl Forum Expert Group ‘Environment’, IAEA, Vienna, 2006.

6) Kryshev, I. I., Sazykina, T. G.: Radioecological effects on aquatic organisms in the areas with high levels of radioactive contamination: environmental protection criteria. Radiat. Prot. Dosim. 75, 187–191, 1998.

7) Kryshev, I. I. et al.: Radioecological consequences of radioactive discharges into the Techra River on the Southern Urals. J. Environ. Radioact. 38, 195-209, 1998.

8) Schiermeier, Q.: Radiation release will hit marine life. Nature 472, 145–146, 2011.

9）東京電力：福島第一原子力発電所付近の海水からの放射性物質の検出について（第十一報）別紙4：海水核種分析結果（1 F南放水口付近）13時55分，
http://www.tepco.co.jp/cc/press/betu11_j/images/110331d.pdf, 2011.

10) http://www.erica-tool.com/

11) Versteeg, D.J. et al.: Understanding single-species and model ecosystem sensitivity: data-based comparison. Environ. Toxicol. Chem. 18, 1329–1346, 1999.

12) European Centre for Ecotoxicology and Toxicology of Chemicals (ECETOC): The value of aquatic model ecosystem studies in ecotoxicology. Technical Report No. 73, Brussels, Belgium, 1997.

13) Sugiura, K.: Effects of chemicals and metal ions on microcosms; comparison of community metabolism to single species responses to toxicants. Jpn. J. Environ. Toxicol. 12, 41-53, 2009.
S2-09 マイクロコズムを用いた生態系リスク影響評価システム手法の開発

（3）マイクロコズムを用いた金属類の生態系システムに及ぼす解析評価相模女子大学

栄養科学部健康栄養学科

千葉工業大学

工学部生命環境科学科

栄養科学部健康栄養学科 杉浦 桂（平成21年度）

村上和仁（平成22・23年度）

<研究協力者>

千葉工業大学工学部生命環境科学科 林秀明・島田諒司・三浦あかね・箕浦英樹

平成21～23年度累計予算額 12,512千円（うち、平成23年度予算額3,829千円）

上記の予算額は、間接経費を含む。

[要旨] 金属類の生態リスク影響評価に供するための基礎的知見の集積を目的として、平成21年度の $ Al^{3+} $ 、 $ Cu^{2+} $ 、 $ Zn^{2+} $ 、 $ Cd^{2+} $ 、平成22年度の $ Mn^{2+} $ 、 $ Mg^{2+} $ 、 $ Ca^{2+} $ 、 $ Ni^{2+} $ 、平成23年度の $ Co^{2+} $ の添加（負荷）がマイクロコズム生態系のP/R比の推移に如何なる影響を及ぼすかについて、培養実験および数値シミュレーションの双方から検討をおこなった。呼吸量（R）、生産量（P）、P/Rおよびマイクロコズム構成微生物個体数の経時変化を影響評価項目に選択し、測定結果を基に、金属イオンの実測最大無影響濃度（NOAEC）（マイクロコズム無影響濃度：m-NOEC）を決定し、培養モデルと数理モデルのハイブリッド型リスク影響評価システムの基盤を構築することができた。また、

Naturally derived型、Stress selected型、Gnotobiotic型のタイプの異なるマイクロコズムにおける系の安定性について検討し、標準試験方法としてのマイクロコズムシステムには、完全種構成既知で高い再現性と系の安定性を有するGnotobiotic型マイクロコズムが適していることを明らかにすることができた。

[キーワード] 金属類、P/R比、生産量、呼吸量、m-NOEC、Gnotobiotic型マイクロコズム

### 1. はじめに

金属類の毒性評価は従来よりOECD法等の単一種生物試験によりなされてきた。例えば、HC5法は単一生物種の最大無影響濃度（NOEC）の分布曲線を基に個体数の95％を保護する濃度を予測する方法であり、ECETOC法は藻類、甲殻類、魚類の各NOAECを求め、それらの最小値を1/10倍する方法である。しかしながら、HC5法とECETOC法で求めた予測無影響濃度（PNEC）は、マイクロコズム法・メソコズム法で求めた無毒性濃度（m-NOAEC）と大きな差があることが明らかにされつつあり、生物間相互作用の効果を考慮することが必要不可欠となっている。また、金属類の生態リスクについては十分な知見が得られていないのが現状であり、個々の生物種に対する毒性リスク評価ではなく複雑な生物間相互作用を有する生態系システムに対する生態リスクを評価する上では、生産者・消費者・分解者からなるモデル微生物生態系であるマイクロコズムが有用なツールとなり得
る。

## 2 ．研究開発目的

本研究では、金属類の生態リスク影響評価に供するための基礎的知見の集積を目的として、 $ Al^{3+} $ 、 $ Cu^{2+} $ 、 $ Zn^{2+} $ 、 $ Cd^{2+} $ 、 $ Mn^{2+} $ 、 $ Mg^{2+} $ 、 $ Ca^{2+} $ 、 $ Ni^{2+} $ に加えて、 $ Co^{2+} $ 添加（負荷）がマイクロコズム生態系のP/R比の推移に如何なる影響を及ぼすかについて検討をおこなった。平成23年度は、呼吸量（R）、生産量（P）、生産量／呼吸量（P/R）およびマイクロコズム構成微生物個体数の経時変化を影響評価項目に選択して実験を行い、これらの測定結果を基に、金属イオンの実測最大無影響濃度（NOAEC）（マイクロコズム無影響濃度：m-NOEC）を決定した。また、数理モデル（N88BASICによる杉浦モデル,1996）によるシミュレーション解析により、培養モデル（マイクロコズム）の実験結果を検証し、金属負荷が生態系機能に対して如何なる影響を及ぼすかについて検討した。また、Naturally derived型、Stress selected型、Gnotobiotic型のタイプの異なるマイクロコズムにおける系の安定性について検討した。

## 3 ．研究開発方法

実験方法は「マイクロコズムを用いた生態系リスク影響システム手法の開発 —共通マニュアル（β版ver.2.2）に準じておこなった。

## 4 ．結果および考察

## (1) Mnの生態リスク評価

Mn添加後14日間のP/R比の挙動パターンを対照系（非添加系）と比較して、Mnの生態リスク影響を評価した。

図(3)-1にMn添加がP/R比に及ぼす影響を示した。その結果、添加濃度1.0mg・L^{-1}から徐々にP/R=1のラインから外れ始め、2.0mg・L^{-1}以上では完全に呼吸量（R）過多となり系が崩壊した。経日変化をみてみると、1.0mg・L^{-1}で特に呼吸量に対して影響が生じ、P/R比が減少したが、その後、P/R比=1程度（安定系）に回復した。これより、Mn添加1.0mg・L^{-1}は一時的に毒性を示すが、慢性的な毒性ではないと考えられた。また、Mn添加後14日間の各構成微生物の挙動パターンを対照系と比較して、Mnの生態リスク影響を評価した結果、マイクロコズムを構成する代表的な種の挙動を比較してみると、特に原生動物C.glaucoma

がMn添加1.0mg・L^{-1}で大きな影響を受けていること、すなわち、共存系においても生物種によって影響の大きさが異なることが示された。さらに、Mn添加後14日目（培養開始30日目）における各構成微生物の個体数（N_{30}）を対照系と比較して、Mnの生態リスク影響を評価した。その結果、対照系と添加系における生物個体数の比をとると、対照系に比べて個体数が増加している生物群（微細藻類）と減少している生物群（微小動物）に区分され

図(3)-1 $ Mn^{2+} $ のP/R比に及ぼす影響
ることがわかった。一方、Mn添加後14日間の各構成微生物の現存量（面積個体数密度） $ B_{16-30} $ を対照系と比較して、Mnの生態リスク影響を評価したところ、対照系と添加系における現存量（面積個体数）の比をとると、 $ N_{30} $ と同様に、生物群が二分された。

## (2) Mgの生態リスク評価

Mg添加後14日間のP/R比の挙動パターンを対照系（非添加系）と比較して、Mgの生態リスク影響を評価した。図(3)-2にMg添加がP/R比に及ぼす影響を示した。その結果、添加濃度5.0mg・L^{-1}から徐々にP/R=1のラインから外れ始め、10mg・L^{-1}では完全に呼吸量（R）過多となり系が崩壊した。経日変化をみてみると、Mg添加10mg・L^{-1}で特に呼吸量に対して影響が生じ、P/R比が減少したが、その後、P/R比=1程度（安定系）に回復した。これより、Mg添加10mg・L^{-1}は一時的に毒性を示すが、慢性的な毒性ではないと考えられた。添加後の挙動パターンからの評価では、Mg添加後14日間の各構成微生物の挙動パターンを対照系と比較したところ、マイクロコズムを構成する代表的な種の挙動を比較してみると、特に原生動物C.glaucomaと水生ミミズA.hemprichiがMg添加10mg・1^{-1}で大きな影響を受けていること、すなわち、共存系においても生物種によって影響の大きさが異なることが示された。安定期の個体数（N_{30}）からの評価では、Mg添加後14日目（培養開始30日目）における各構成微生物の個体数を対照

系と比較したところ、対照系と添加系における生物個体数の比をとると、対照系に比べて個体数が増加している生物群（微細藻類・細菌類）と減少している生物群（微小動物）に区分されることがわかった。添加後の現存量（ $ B_{16-30} $ ）からの評価では、Mg添加後14日間の各構成微生物の現存量（面積個体数密度）を対照系と比較したところ、対照系と添加系における現存量（面積個体数）の比をとると、 $ N_{30} $ と同様に、生物群が二分された。

図 $ (3) $ -2 $ Mg^{2+} $ のP/R比に及ぼす影響

Ca添加後14日間のP/R比の挙動パターンを対照系（非添加系）と比較して、Caの生態リスク影響を評価した。図(3)-3にCa添加がP/R比に及ぼす影響を示した。その結果、添加濃度1.0mg·L⁻¹から徐々にP/R=1のラインから外れ始め、5.0mg·L⁻¹以上では完全に呼吸量（R）過多となり系が崩壊する経日変化をみてみると、Ca添加5.0mg·L⁻¹で特に生産量に対して影響が生じ、P/R比が減少した。これより、Ca添加5.0mg/lによりマイクロコ

## (3) Caの生態リスク評価

図3−3 $ Ca^{2+} $ のP/R比に及ぼす影響
ズム生態系は影響を受けることが示された。添加後の挙動パターンからの評価では、Ca添加後14日間の各構成微生物の挙動パターンを対照系と比較したところ、マイクロコズムを構成する代表的な種の挙動を比較してみると、原生動物C. glaucoma、後生動物Lecane sp.、A. hemprichiがCa添加5.0mg・L^{-1}で大きな影響を受けていることがわかる。安定期の個体数（N_{30}）からの評価および添加後の現存量（B_{16-30}）からの評価では、Mg添加系と同様に、対照系と添加系における生物個体数・現存量の比をとると、対照系に比べて個体数が増加している生物群と減少している生物群に区分されたが、生産者である微細藻類でも減少する種（Chlorella sp.、Scenedesmus sp.）が観察された。これは、Ca添加による水中のリンの吸着除去に加えて、pHの急激な上昇による微小動物（特に水生ミミズA. hemprichi）の増殖阻害や白濁による微細藻類の光合成阻害といった影響が生じたものと考えられた。以上より、底質改善材としてのMgとCaは、散布した際に生態系に及ぼす影響が異なり、Caの生態リスクはMgの2倍程度と評価された。

## (4) マイクロコズムにおける各種タイプの安定性・再現性の比較解析

現場の環境下の群集をそのまま維持したNaturally derived型（手賀沼湖水）、自然群集をある条件下で培養しある特定の生物群集に維持発展させたStress selected型（手賀沼湖水）、および完全種構成既知で各種の個体数が単独に計測可能で各種の性質が単独に解析可能なGnotobiotic型（栗原type）のマイクロコズムを用いた。マイクロコズムの培養は、25℃、2,800lux（L/D=12/12hr.）、静置条件とした。Naturally derived型マイクロコズムは手賀沼湖水200mlをそのまま300ml容三角フラスコに、Stress selected型とGnotobiotic型マイクロコズムはポリペプトン濃度を100mg・L^{-1}となるよう調整したTP培地200mlを300ml容三角フラスコに入れ、種を10ml接種して培養を開始した。マイクロコズム内のDO変化を連続測定し、P（生産量）、R（呼吸量）およびP/R比の推移を求めた。また、培養開始後、0、2、4、7、14、16、18、20、23、30日目にマイクロコズム構成微生物の個体数を計測した。

富栄養化湖沼であり、プランクトン量が豊富である手賀沼の湖水を充填したNaturally derived型マイクロココズムにNiを添加して生態リスク影響を評価したところ、対照系（非添加系）の生物相が安定せず、系ごとに構造パラメータである出現生物（=生物相）が異なり、再現性が維持されないことが示された。また、手賀沼の湖水を種としてTP培地で培養したStress selected型マイクロココズムにNiを添加して生態リスク影響を評価したところ、対照系（非添加系）であっても作成した40系中7系しか安定系が構築されず、再現性・安定性のいずれも不十分であった。一方、3種の微細藻類（生産者）、4種の微小動物（消費者）、4種の細菌類（分解者）から構成される完全種構成既知のGnotobiotic型マイクロコズムにNiを添加して、機能パラメータとしてのP/R比の推移から生態リスク影響を評価（図(3)-4）したところ、Ni添加0.1mg・L^{-1}では影響はみられなかったが、1.0mg・L^{-1}ではRが増大してP/R比は<1となった。すなわち、添

図3−4 $ Ni^{2+} $ のP/R比に及ぼす影響