Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
City during a dust event

51）山田丸、中村香耶、亀田貴之、小林史尚、松木篤、築城寿長、檜垣誠吾、早川和一、岩坂泰信：第30回エアロゾル科学・技術研究討論会（2013）「黄砂用マスクの開発と評価」

52）小林史尚、牧輝弥、柿川真紀子、山田丸、松木篤、長沼毅、岩坂泰信：第8回大気バイオエアロブルシンポジウム（2014）「南極域における大気バイオエアロブル直接採集」

53) T. MAKI, F. KOBAYASHI, B. CHEN, F. PUSPITASARI, M. KAKIKAWA, A. MATSUKI, G. SHI, H. HASEGAWA, Y. IWASAKA: $ 8^{th} $ Atmospheric Bioaerosol Symposium (2014) [Bacterial structures in atmosphere and sand dunes of Taklamakan Desert]

54）東朋美、中村裕之：第5回サクラン研究会年次大会 第12回北陸先端科学技術大学院大学高資源循環ポリマーセンターシンポジウム (2014)「黄砂の健康影響と予防法としてのサクランの活用」

## （3） 出願特許

1) 山田丸、亀田貴之、早川和一、岩坂泰信、小林史尚、松木篤、築城寿長、檜垣誠吾：金沢大学・ダイワボウノイ株式会社；特願2011－155806、平成23年7月14日「砂塵飛来有害物質及び微生物除去剤、砂塵飛来有害物質及び微生物除去セルロース繊維及び繊維構造物」

## （４）シンポジウム、セミナー等の開催（主催のもの）

1) 第29回レーザセンシングシンポジウム：2011年9月8日-9日、石川県七尾市、約120名、実行委員(幹事)牧輝弥、実行委員(会計)小林史尚、実行委員柿川真紀子、山田丸など

2) 第6回大気バイオエアロゾルシンポジウム：2011年12月9日-10日、東京都立川市、約80名、実行委員(幹事)山田丸、実行委員小林史尚、牧輝弥、柿川真紀子、東朋美など

3) 第5回環日本海域の環境シンポジウム(5th International Symposium on the Environment of the Rim-Japan Sea Regions)：2012年2月3日-4日、石川県金沢市、約70名、実行委員小林史尚、牧輝弥、柿川真紀子、東朋美など

4) 第3回能登総合シンポジウム:2012年3月16日-17日、石川県珠洲市、約50名、実行委員 小林史尚、牧輝弥、柿川真紀子など

5) 第7回大気バイオエアロゾルシンポジウム：2013年1月31日－2月1日、滋賀県彦根市、約70名、実行委員(幹事)牧輝弥、実行委員小林史尚、山田丸、柿川真紀子、東朋美など

6) 第6回環日本海域の環境シンポジウム：2013年3月2日－3月3日、石川県金沢市、約50名、実行委員牧輝弥、柿川真紀子、東朋美など

7) 第8回大気バイオエアロゾルシンポジウム：2014年1月21日～22日、大阪市、約70名、実行委員(幹事)牧輝弥、実行委員小林史尚、山田丸、柿川真紀子、東朋美など

## （５）マスコミ等への公表・報道等

1) 北國新聞（2012年3月1日、石川県版、28頁）「上空3千メートルの細菌で納豆」

2) 北國新聞（2012年3月4日、一面）「黄砂の細菌 繊維で除去」

3) NHKワールドTV科学技術情報番組「Science View」（平成25年1月18日、大気バイオエアロゾルの顕微鏡観察の成果について5分間ほど紹介）
4) TOKYO FMエフエムラジオ番組「フロンティアーズ 明日への挑戦」(平成24年12月1日、大気バイオエアロブル研究のこれまでの成果について30分間ほど紹介)

5) NHKニュース おはよう日本（NHK総合）（平成24年11月5日、大気バイオエアロゾルの観測調査の成果について10分間ほど紹介）

6) テレビ朝日「モーニングバード」（平成24年8月23日、大気バイオエアロブルの観測調査の成果について10分間ほど紹介）

7) ニコニコ生放送（平成24年7月22日、大気バイオエアロゾルの観測調査の成果について10分間ほど紹介：20分間生放送、1万人が閲覧）

8) 朝日新聞グローブ（平成25年1月6日朝刊、全国版：G-1頁）

9) 每日新聞（平成25年1月7日朝刊、地方版石川、21頁）

10）朝日新聞（平成24年10月19日朝刊、地方版石川、27頁）

11）中日新聞（平成24年9月13日朝刊、全国版総合、3頁）

12) AFPBBNews : Agence France-Presse(フランス通信社)（平成24年9月5日、国際）

13）読売新聞（平成24年8月27日朝刊、地方版地域、29頁）

14）日本経済新聞：共同通信社（平成24年8月16日夕刊、全国版社会、14頁）

15）毎日新聞（Yahooニュース）（平成24年8月17日朝刊、全国版社会、25頁）

16) テレビ朝日「やじうまテレビ！」（2013年4月2日、黄砂付着微生物の納豆菌を使用した雲チェンバー実験について紹介）

17) 北陸朝日放送[ニュース]週刊 J チャンネル（2013年4月5日、ヘリコプターを使って高高度の黄砂付着微生物を採取する大気観測調査について紹介）

18) NHK「マサカメTV」（2013年4月13日、黄砂付着微生物の大気観測風景ともども、「そらなっとう」を15分間ほど紹介）

19) 日経サイエンス（平成25年5月号、40頁-47頁）

20）朝日新聞（2013年5月17日、朝刊全国版教育、24頁）

21）BS朝日「ボクらの地球」（2013年5月24日、立山の積雪に含まれる微生物で作成した納豆と積雪を利用した黄砂付着微生物について5分ほど紹介）

22）北陸朝日放送[ニュース]週刊 J チャンネル（2013年6月14日、黄砂付着微生物研究に取り組む牧輝弥について密着取材を行い、25分間ほど紹介）

23）每日新聞（2013年7月1日、朝刊地方版石川、22頁）

24）北國新聞（2013年7月2日、朝刊かなざわ、28頁）

25）北國新聞（2013年7月3日、朝刊社会1、29頁）

26）北國新聞（2013年7月7日、朝刊地方社会、19頁）

27）朝日新聞（2013年7月5日、夕刊全国版、1頁）

28）北陸朝日放送[ニュース]週刊 J チャンネル（2014年1月29日、大気バイオエアロゾルシンポジウム紹介）

## (6) その他

特に記載すべき事項はない。
### 8. 引用文献

1) 岩坂泰信等：「黄砂」古今書店，ISBN978-4-7722-3125-1(2009)

2) T. ICHINOSE et al.: Pulmonary toxicity induced by intratracheal instillation of Asian yellow dust (Kosa) in mice. Environmental Toxicology and Pharmacology, 20, 48-56 (2005)

3) 小林史尚等：黄砂発生源におけるバイオエアロゾル拡散に関する研究. エアロゾル研究, 22, 218-227 (2007)

4) 小林史尚等：能登半島珠洲市上空における黄砂バイオエアロゾルの直接採集および分離培養・同定. エアロゾル研究、25, 23-28 (2010)

5) F. KOBAYASHI et al.: Atmospheric bioaerosol, Bacillus sp., at an altitude of 3,500 m over the Noto Peninsula: direct sampling via aircraft. Asian Journal of Atmospheric Environment, 5, 164-171 (2011)
## （３）黄砂エアロゾルに含まれる化学物質の計測とその細胞毒性に関する研究

産業医科大学

医学部

吉田 安宏

嵐谷 奎一

産業生態科学研究所

上野 晋

平成23(開始年度)～25年度累計予算額：8,322千円（うち、平成25年度予算額：2,470千円）

予算額は、間接経費を含む。

## [要旨]

黄砂粒子の化学的・物理的検索は、Andersen Hi-volume air samplerを用いて、黄砂粒子を捕集した。黄砂粒子を含む全粉じん濃度、黄砂粒子に付着する化学物質の多環芳香族炭化水素（PAHs）とニトロ多環芳香族炭化水素（nitro-PAHs）に注目し、高速液体クロマトグラフを用いて測定した。また、黄砂粒子の粒径と元素組成について、走査型電子顕微鏡により検索した。その結果、黄砂飛来時の全粉じん濃度は、それ以外の全粉じん濃度に比べて明らかに高濃度を認めた。また、黄砂粒子の粒径は0.88μm以上で、不定形であり、微粒子には認められなかった。X線回折法で黄砂特有のSi、Mg、Ca、Fe、Naが認められた。PAHsとnitro-PAHsは粒径1.1μm以下の微粒子に90%以上が含有し、黄砂粒子の含有は少ない事が認められた。捕集された黄砂の細胞への影響を毒性、言い換えれば細胞動態および細胞内イベントの解析により、評価した。方法は黄砂を頻回投与した曝露モデルマウスを作成し、そのマウスの細胞、特にリンパ組織の細胞群を回収し解析した。細胞への影響は、細胞の活性化能を増殖活性により、また細胞死のイベントが起きる際に役割を持つ分子に着目し、その変化をウェスタンブロット法により評価した。黄砂に曝露した群から採取した脾臓細胞はマイトジェンに対する相対反応が低かった。しかしながら、無刺激の状態では黄砂による若干の活性化が認められた。その現象は単回黄砂投与の脾臓細胞でも観察された。これらの結果は、黄砂投与後のイベントが、肺と脾臓では異なったタイミングで起こっていることを示唆している。またそれは細胞内分子で、様々な細胞内イベントに関与する転写因子NF-κBの動向と同じであった。

風送黄砂に付着している成分の情報提供ができ、それらをもとに毒性などの生体影響を調査する筋道を整える準備ができた。今後は得られた知見を発展させ、リスク評価パラメータ一値などの策定などにも応用できるのではと考えている。

## [キーワード]

黄砂、有機化学物質、多環芳香族炭化水素、免疫細胞毒性反応、転写因子NF- $ \kappa $ B
### 1. はじめに

黄砂は、中国大陸内陸部砂漠地帯や黄土地帯の土壌が大気攪乱によって数千メートルの高さまで巻き上げられて拡散し、その黄砂粒子は、中国の都市部や工業地帯を通過する中で、化石燃焼由来のガス状成分や有害成分を吸着して、日本に飛来して来る。この黄砂飛来により、呼吸器疾患やアレルギーなどの健康影響が危惧されるため、飛来する黄砂粒子による健康影響を評価する事が重要である。そこで中国大陸から飛来する黄砂エアロブルの化学的・物理的性状の究明、細胞培養試験などによるそれらの毒性評価を行う。黄砂飛来時期を主にして、年間を通して粒子の捕集を実施する。黄砂は、元素成分、イオン類、多環芳香族炭化水素（PAHs）やニトロ多環芳香族炭化水素(nitro-PAHs)等の分析、これらに加えて微生物成分の分析と、粒径分布や形態観察を行う。また、黄砂エアロブル及び抽出化学成分の免疫担当細胞に対する毒性試験を行う。

## 2 ．研究開発目的

本研究では中国大陸から飛来する黄砂エアロブルの化学的・物理的性状を究明し、ヒトへの健康影響のリスク評価を行う有用な指標の探索をおこなう。また、それらの細胞毒性評価を行うことを主たる目的としている。細胞毒性は特に曝露モデルマウスのリンパ組織から調製した細胞内イベントを解析することで評価する。その際、曝露する物質の性質を変えながら、曝露評価を進めた。また、詳細な細胞内イベントの解析を行う目的で、レポーター細胞（HEK-TLR2-NF-kB細胞）株を用いた評価方法も行った。

## 3 ．研究開発方法

## （1） 黄砂エアロゾルの化学的・物理的性状の解明

黄砂イベント時における風送黄砂の捕集は、産業医科大学（北九州市八幡西区折尾）で3月中旬～5月の黄砂飛来時期に行った。捕集装置は分粒特性を有するHi-volume及びLow-volume air samplerを用いた。捕集用フィルターはテフロンフィルターと石英フィルターを用いた。4段階のフィルターで得られた粒子状物質は生物特性、化学的及び物理的性状の検索に用いた。黄砂は主に2011年5月1日～3日と5月12日～14日の黄砂イベント時に捕集した黄砂を分析した。前者の黄砂日の黄砂をASD1、後者の黄砂日のものをASD2とした。黄砂粒子を含む全粉じん濃度、黄砂粒子の金属成分、付着するイオン類、また有機化学物質の多環芳香族炭化水素（PAHs）とニトロ多環芳香族炭化水素（nitro-PAHs）を測定した。金属類はプラズマ原子発光分析器（ICP-AES, 61E Trace and ICP-750, Thermo Jarrell-Ash, MA）によって測定した。PAHs分析は、超音波抽出→濃縮→高速液体クロマトグラフで分離し、強い発瘧性のあるBenzo(a)pyreneを含む14種を定量した。nitro-PAHsはGC/MS/MSで、3-nitrofluoranthene、1-nitropyreneを測定した。黄砂粒子の形態検索は、走査型電子頭微鏡、元素分析は、X線-回析法によって行った。微生物成分のLPSとβ-グルカンは生化学工業のLPS and β-グルカンアッセイキットを用いて測定した。

一方、捕集された黄砂の細胞毒性評価は、黄砂曝露マウスのリンパ組織の細胞群を回収し、細胞活性化能を増殖活性により測定し、また細胞死のイベントが起きる際に役割を持つNF-kBに着目し、その変化をウェスタンブロット法により評価した。
## （2） 毒性评估

## 1 ）黄砂のマウスへの気管内投与

実験動物には雄性ICRマウスを用い、黄砂（ASD）の曝露は4回気管内投与により行った。黄砂を加熱処理し、付着物を取り除いた黄砂（hASD）も準備し投与を行った。本実験はサブテーマ（1）のマウスを共用して行った。最終投与24時間後に、麻酔下にてマウスを屠殺し、脾臓を採取した。亜急性の反応を見るためのモデルマウスを作成し、黄砂1回気管内投与後、1日、3日で脾臓を採取した。また、有機化学物質の例としてTar 1μg、Tar 5μgを用いて、同様に気管内投与を行い、化学物質曝露モデルマウスを準備した。

## 2 ）細胞表面マーカーおよび脾臓細胞増殖反応、サイトカイン産生の解析

細胞表面マーカーは蛍光色素をラベルしたモノクローナル抗体で染色後、FACSを用いてCD3、CD19、CD11b、CD80、CD86、MHC class IIについて解析した。またマイトジェン（細胞分裂誘起物質）であるLPS、ConA刺激に対する脾臓細胞の増殖反応は、96ウェルプレートに2 x 10^{5}/well でまき、培養72時間後にプロメガのCell viability assay systemを用いて評価した。サイトカイン産生はELISA法により、IL-2、TNF- $ \alpha $ 、IL-6の産生を測定した。

## 3 ）細胞内イベントの解析

細胞の生存に関与する因子 (p62、LC3-II、PARP)の発現量あるいは活性化は特異的抗体を用いたウェスタンブロット法により解析した。簡単に以下に方法を記す。マウスから採取した脾臓を細胞溶解緩衝液 (RIPA)中に入れ、細胞溶解液を調製した。脾臓細胞の場合、Tris-Ammonium液で赤血球を壊した後、調製した。その溶解液のタンパク量を、プロテインアッセイキット (Bio-Rad)で測定し、各サンプル10μgの細胞溶解液を準備した。それらをサンプル緩衝液とともに、3分間煮沸し、ready-madeゲル (ATTO)にアプライした。電気泳動 (20mA、80分)終了後、ゲルをニトロセルロースメンブランにウェット式トランスファー (200mA、70分)を行い、ウェスタンブロット用のメンブランを得た。そのメンブランを1%BSA含有PBS-Tween緩衝液でブロッキングしたのち、それぞれに特異的な1次抗体 (p62、LC-3、PARP、p-p65 (NF-κBの構成成分の一つである分子)、β-actin)を用いて2時間反応させた。PBS-Tween緩衝液で洗浄後、HRP標識2次抗体で1時間反応させた。洗浄後、ペルオキシダーゼに対する基質を加え、化学発光をCCDカメラで撮影した。得られたウェスタンブロットの結果をImageJにてタンパク量を解析・数値化した。またハウスキーピング分子のβ-actinによりそれぞれのバンドのdensityを標準化し、グラフ化した。

## 4 ）レポーター細胞を用いた黄砂付着物による免疫担当細胞への影響評価

NF-kBレポーター細胞（HEK-TLR2-NF-kB細胞）を用いて、加熱黄砂（hASD）もしくは、2011年5月に飛来したイベントの異なる2種の黄砂（ASD1、ASD2）を添加して、12時間後の転写因子NF-kB活性を調べた。
## 4 ．結果及び考察

（1）黄砂エアロゾルの化学的・物理的性状の解明

1）イベントが異なる2つの黄砂の成分分析と大気中のPAHs濃度

a 黄砂イベント時に採取した2種類の黄砂の粒子径と成分比較

ハイボリュームアンダーセンサンプラーで捕集したASD1（2011年5月1～3日採取黄砂）とASD2（2011年5月12～14日採取黄砂）の粒径別重量（%）分布を図(3)-1に示した。図中にフィルターのカット値を示す。図に示すようにASD2は2 mm付近の細かな粒子の含有量が多い。次

図(3)-1. 黄砂の粒径別重量 (\%) 分布

表(3)-1. ASD1とASD2黄砂のアニオン・カチオン、ミネラル成分と微生物由来の毒素成分量

にアニオン・カチオン、ミネラル成分と微生物由来の成分含量を表(3)-1に示した。ASD2の黄砂はASD1の黄砂に比較して大気汚染物質由来の硝酸イオン（NO_{3}^{-}）や硫酸イオン（SO_{4}^{2-}）量が多く、海塩由来と思われるNa^{+}やCl^{-}イオンもかなり多く混入していた。またLPSやβ-グルカンの微生物由来の毒素成分量もASD2の方が多かった。その分、ASD2の方がASD1よりも黄砂粒子の主成分である二酸化ケイ素（SiO_{2}）や三酸化アルミ(Al_{2}O_{3})等のミネラル含有量が少なかった。また主要多環芳香族炭化水素（PAHs）含有量についても表(3)-2に示すごとくASD1よりもASD2の方が多かった。フィルター別では図(3)-1に示す④カット値（0.91～1.7μm）フィルターの粉じんのPAHs量が高く、BghiP（Benzo(ghi)perylene）やChrysene量が多かった（データ示さず）。

成分	含有量(μg/mg)
ASD1(5/1-3)	ASD2(5/12-14)
Cl-	11	54
NO3-	13	50
SO42-	9.2	16
NH4+	0.96	0.023
Na+	72	35
Ca2+	14	23
Mg2+	1.5	5.2
SiO2	710	510
Al2O3	130	94
Fe2O3	54	43
CaO	25	14
CaCO3	35	58
MgO	30	27
TiO2	6	4.2
LPS(ng/mg)	0.061	0.214
β-Glucan(ng/mg)	0.355	28.16
表(3)-2.2種の黄砂の主要多環芳香族炭化水素(PAHs)濃度

測定日	PAHs濃度(ng/g,粉じん)濃度
BaP	BkF	BghiP	BbF	Indeno	Chrysene
ASD1	439	296	569	170	377	734
ASD2	660	455	672	350	552	1122

(注)粒径0.9μm以上の黄砂粉じん中のPAHs濃度表示BaP:Benzo(a)pyrene,BkF:Benzo(k)fluoranthene,BghiP:Benzo(ghi)perylene,BbF:Benzo(b)fluoranthene,Indeno:Indeno(1,2,3-cd)pyrene.ASD1:2011年5月1～3日採取黄砂;ASD2:2011年5月12～14日採取黄砂

## b 2つの黄砂イベント時の大気中のPAHs濃度

2011年5月1～3日採取黄砂と2011年5月12～14日採取黄砂の大気中のPAHsの代表的なBaP、BkFとBghPの大気中濃度を（図(3)-2）に示した。5月上旬の黄砂日と中旬前期の黄砂日には明らかに大気中のこれらのPAHsに増加が見られた。BaPはアレルギー反応を増悪すること、強力な発がん作用があること、BkFとBghPにも発がん作用や発がん促進作用があることから、黄砂日にこれらのPAHs濃度が大気中に著しく増加することは人の健康を考える上でも重要な問題である。黄砂のアレルギーの増悪作用はこのようなPAHsの大気中の増加に原因するかも知れない。

図(3)-2.2011年4月末～5月 大気中のPAHs濃度の日変動（折尾）

## 2 ）2012-2013の大気中の粉じん濃度

2013年3月中頃から5月にかけ、ほぼ連日の粉じん濃度 (図(3)-3)と2012年3月から2013年11月までの月中頃の3日間の平均粉じん濃度 (図(3)-4)を測定した。図(3)-3に示すように3月19日黄砂飛
来時は224μg/m^{3} と最大の値を得た。図(3)-4に示すように、月別平均濃度は夏季に最も低く、春から冬季に高値で、特に黄砂の影響を受けた春の5月が高い値であった。

図(3)-3. 粉塵濃度の推移

図(3)-4. 全粉塵濃度の月別濃度推移 (2012年4月～2013年11月)
大気中の浮遊粒子状物質の粒経特性は、図(3)-5に示すように、黄砂飛来時は2.5～10μmの粒経が最も濃度が高く、非黄砂飛来時は2.5μm以下の微小粒子濃度が高く、明らかに黄砂飛来時には粗大粒子が多い事が認められた。2013年3月～5月の期間で黄砂、煙霧飛来時の粉じん濃度の比較を行った。その結果、明らかに黄砂飛来時の粉じん濃度は煙霧や非黄砂・煙霧飛来時に比べ有意に高値であった（図(3)-6）。

黄砂飛来時

2012年3月24日

非黄砂飛来時 2012年5月15日

図(3)-5. 浮遊粒子状物質の粒径分布

図(3)-6. 黄砂、煙霧、その他非飛来時の平均粉じん濃度比較（2013年3月～5月）
## 3 ）2013年3月－5月の大気中粉じん濃度とPAHs濃度

2013年4月から5月にかけて連日と2012年4月～2013年11月の約1年間の中頃3日間の大気中のPAHs濃度を測定した。図(3)-7に示すように2013年4月から5月にかけてのPAHs濃度も粉じん濃度の変動と同様に日間変動が認められ、黄砂、煙露飛来時にそれ以外の日時に比べて高い濃度傾向が認められた。しかし黄砂・煙霧の影響を受けていない5月13日にPAHs濃度が極めて高い濃度が認められた。濃度の増加要因について後方流跡線解析を用いて汚染の起源を検討した。図(3)-8に示すように、この日は、モンゴル・ゴビ砂漠付近から発生した気塊が、北京などの工業地帯の化石燃料の燃焼により発生した高濃度のPAHsを含み、九州地方に到達した影響と考えられる。

図(3)-7. 大気中の粉じん濃度(上段)と代表的なPAHs濃度の日間変動(下段)
NOAA HYSPLIT MODEL Backward trajectory ending at 0000 UTC 12 May 13 CDC1 Meteorological Data

図(3)-8.2013年5月13日の後方流跡線解析

図(3)-9に示すように2012年4月～2013年11月のPAHsの月別濃度は粉じん濃度と同様に夏季に極めて低値、冬から春季にかけて高値であり、明らかに冬～春季節は大陸で暖房等に用いられる化石燃料の使用量が増加するためと考えられる。

2013年3月8～9日のPAHsおよびnitro-PAHs濃度の分粒特性を求めた。PAHs濃度は粒形1.1μm以上の粒子にほとんど認められず、1.1μm以下の微粒子に90％以上が含有していた（図(3)-10）。

また、nitro-PAHs濃度はPAHsと同様に0.88μm以下の微粒子にほぼ100％が含有していることが認められた。なお、nitro-PAHs濃度はPAHs濃度に比べ1/10以下であった（図(3)-11）。
図(3)-9. 多環芳香族炭化水素の経日変化 $ (ng/m^{3}) $ 2012年12月～2013年11月

各段の代表PAHs濃度(ng/m³)

粒径(μg)

図(3)-10. 各段の代表的なPAHs濃度2013年3月8～3月9日
図 (3)-11. 各段の代表的な Nitro-PAHs濃度 2013年3月 8～3月9日

飛来する黄砂粒子にPAHsが含有しているかどうかについて、2009年3月13日に富山県立山・室堂平(2,450m)から採取した黄砂粒子のPAHs濃度を測定した（図(3)-12）。3種のPAHs濃度は50～200ng/gであり、黄砂発生源のモンゴルで採取した、黄砂粒子にはPAHsはほとんど含有していなかった。従って、日本に飛来する黄砂には中国の工場地帯で発生した汚染物質が含有されていることが示唆された。

図(3)-12. 黄砂付着PAHs濃度比較

## 4 ）黄砂粒子の形態及び元素特性

黄砂粒子の形態及び元素特性Andersen Hi-vorume air samplerで粒子を捕集し、走査型電子顕微鏡を用い形態及び元素特性を調べた。その結果、0.88μm以上の各段のすべてから黄砂粒子が認められた。2段目（2.6～5.6μm）の粒子中の黄砂の電子顕微鏡像は不型形で（図(3)-13）、黄マーク）、X線回析スペクトルにより黄砂特有のSi、Mg、Al、Ca、Fe、Naが認められた（図(3)-14）。
Mapping

MAG: 3000x HV: 15kV WD: 7.7mm

図(3)-13. 電子顕微鏡写真（2段:2.6～5.6 $ \mu $ m）

図(3)-14. クロマトグラム（2段目 2.6～5.6 μm）
## （2） 毒性评估

## 1 ）脾臟細胞重量

黄砂 (0.2 mg、0.02 mg/マウス) を4回気管内投与後、マウスの脾臓を取り出し、重量を測定した。図(3)-15に示すように黄砂の影響は統計学的な有意差は観察されなかった。またマウスの体重も黄砂の影響は認められなかった (data not shown)。黄砂 (0.2 mg、0.02 mg/マウス) を1回気管内投与後、1日、3日目に脾臓を取り出し、重量を測定したが、劇的な変化は認められなかった (data not shown)。

図(3)-15. 脾臓重量

## 2 ）細胞表面マーカーおよび脾臓細胞増殖反応の解析

4回黄砂投与後、細胞種の識別として用いられる細胞表面マーカーであるCD3(T細胞マーカー)、CD19(B細胞マーカー)およびCD11b(マクロファージや顆粒球のマーカー)について解析した。図(3)-16に示すように、全てのマーカーにおいて劇的な変化は認められなかった。また、抗原提示

図(3)-16. 細胞表面抗原の発現

APC活性化マーカー
細胞の活性化マーカーであるCD80、CD86、MHC class II についても劇的な変化は認められなかった。

黄砂4回投与後、マウスより取り出した脾臓細胞をマイトジェン (LPS 1 μg/ml、ConA 5 μg/ml) で刺激し、その増殖能を測定した結果を、相対活性で表したものが、図(3)-17である。黄砂に曝露した群から採取した脾臓細胞は対照群のマウスから採取した脾臓細胞に比べ、マイトジェンに

図(3)-17. 脾臓細胞の増殖反応

対する反応が低かった。しかしながら、無刺激の状態では黄砂による若干の活性化が認められた。

黄砂投与後1日での気管支・肺胞洗浄液（BALF）中炎症性サイトカイン（TNF- $ \alpha $ ）の産生が対照群と比べ著しく増加した。しかしながら、黄砂投与後3日目では対照群と共に、BALF中TNF- $ \alpha $ の産生は認められなかった（data not shown）。黄砂投与後3日目に採取した脾臓細胞は対照群に比べ、マイトジェン（ConA、LPS）に対する反応が高かった（図(3)-18）。また、黄砂投与後3日目の脾臓細胞では無刺激の状態でもATPレベルが高値であった。これらの結果は、黄砂投与後のイベントが、肺と脾臓では異なったタイミングで起こっていることを示唆している。

図(3)-18. マイトジェンに対する脾臓細胞の反応

加えて、その脾臓細胞のサイトカイン産生（IL-2、TNF- $ \alpha $ 、IL-6）は、対照群と比べ有意に高かった（図(3)-19）。一方、黄砂投与後1日目の脾臓細胞ではマイトジェンにより誘導されるサイトカイン産生は対照群と有意な差は認められなかった。これらのことからも、脾臓では肺とは違った時間経過で影響が及ぼされることが推察された。

上記の結果を踏まえ、黄砂に付着している物質の影響に関して調べた。黄砂付着物質の代表と
図(3)-19. 脾臓細胞からのサイトカイン産生

してTarを用い、マウスに4回投与法で黄砂の曝露を行った。マウス脾臓より調製した脾臓細胞をマイトジェン（細胞分裂誘起物質：LPS 1μg/ml、ConA 5μg/ml）で刺激し、その増殖能を測定した結果を表したものが、図(3)-20である。この図は各群12匹の平均を示している。Tarに曝露した群から採取した脾臓細胞は、対照群のマウスから採取した脾臓細胞に比べ、マイトジェンに対する反応が高かった。このことは、黄砂に吸着している化学物質が免疫細胞の反応を修飾（細胞分裂を誘起促進）する作用があることを示唆している。また、無刺激の状態でもその細胞活性化を示唆するデータが認められた。

一方、焼いた黄砂との共刺激ではマイトジェンに対する反応を抑制した。これらのことから、黄砂付着成分による免疫細胞への修飾作用が、共刺激、或いはその環境により双方向性の作用を

図(3)-20. 黄砂および付着物質投与後の脾臓細胞の増殖反応
示すことが示唆された。興味深いデータとして、焼いた黄砂自体は、免疫反応を惹起する可能性があることを示唆するデータが得られた点である。これは、後述する黄砂の細胞活性化機構には、粒子それ自身が関与していることを示唆しているデータと解釈している。

## 3 ）細胞内イベントの解析

前項目において、細胞の増殖に何らかの影響が見られたので、細胞に影響があった場合の最終的な形状である細胞死の観点から、細胞内イベントの解析を行った。マウスから採取した脾臓細胞の細胞溶解液を用い、細胞内イベントをウェスタンブロットにより解析した。図(3)-21が実際のウェスタンブロットの写真で、マウス3匹の結果を載せている。Ctが対照群で、ASDが黄砂曝露群である。図(3)-22がそれぞれのバンドの濃さをImageJソフトで解析し、β-actinで標準化後の、平均と標準偏差をグラフ化（マウス8匹）したものである。p62とLC3IIは、細胞死のタイプの一つであるオートファジーの特徴的なマーカーである。またPARPはアポトーシスの際、活性化されるcaspase3により切断される分子である。つまり、Cleaved-PARPはアポトーシスの間接的なマーカーと言える。図から読み取れるように、黄砂曝露群の脾臓細胞では、これらのマーカーが発現あるいは活性化しており、何らかの細胞死の形態が細胞内で現れているものと推測できる。

図(3)-21. ウェスタンブロットによる蛋白発現解析

図(3)-22. タンパク発現量の数値化

次に免疫担当細胞の亜急性活性化機構の解明として、細胞内イベントに着目し、その影響評価として転写因子であるNF-kBに焦点を当てた。転写因子NF-kBの構成成分で細胞生存に重要であ
り、その活性化を司っているp65のリン酸化をウェスタンブロット法により評価した。黄砂を1回気管内投与したマウスから調製した脾臓細胞を細胞溶解液に懸濁し、試料とした。

黄砂投与後3日目に採取した脾臓細胞では対照群と比べて、リン酸化p65が亢進していた（図(3)-23）。図(3)-15で観察された脾臓への影響は、特に細胞内分子への影響まで及んでおり、その結果として炎症反応が惹起されていると考えられた。このように、脾臓では若干、肺の炎症時期とは異なったタイムポイントで炎症反応が起こっていることがわかった（図(3)-24）。

day 3

図(3)-23. NF-kBのリン酸化の解析

Preparation of bronchoalveolar lavage fluids (BALFs):

図(3)-24. 肺における急性炎症
## 4 ）レポーター細胞を用いた黄砂付着物による免疫担当細胞への影響評価

遺伝子工学と分子生物学的手法を組み合わせると、細胞株を非常に魅力的なレポーターに作り上げることができる。ここでは通常、よくトランスフェクションなどで使われるHEK293細胞（ヒト腎臓ガン細胞株）に転写因子であるNF-kBの結合サイトを組み込み、レポーター細胞を構築したものを、解析細胞（図(3)-25）として用いた。

図(3)-25. NF-kB レポーター一株の構造

NF-kBレポーター細胞を用いた解析から、黄砂付着有機化学物質が転写因子NF-kBを活性化することが認められた(図(3)-26)。焼いた黄砂自身によるレポーター活性は非常に弱いものであったことから、黄砂付着化学物質自体がNF-kBの活性を誘導していることが示唆された。NF-kBと細胞死は密接に関連しており、詳細解明は今後の更なる検討課題である。図(3)-26はNF-kBの相対活性を示している。
図(3)-26. NF-kB レポーターアッセイの

相対活性

### 5. 本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

黄砂イベントによって黄砂に吸着した有機化学物質（PAHs）濃度、形態や元素特性に違いがあり、これらがヒトへの健康影響のリスク評価を行うにあたり、非常に有用な指標となりうることを提示した。また、大陸から飛来する黄砂やPM2.5に吸着した有害化学物質（PAHs、nitro-PAHs）の特徴が明らかになった。特に、黄砂が中国にどの地域を通過し、またどの高度かにより、黄砂粒子、PM2.5に吸着しているPAHs、nitro-PAHs濃度に差がある事が認められた、これらの大気粉じんの形態や元素特性も明らかになった。全粉じんおよびPAHs濃度は明らかに大陸からの汚染物質の影響を受けていることが認められた。ヒトへの健康影響のリスク評価を行うにあたり、得られた知見は非常に有用な指標となりうるため、科学的に大変意義あるものである。

黄砂の免疫毒性の研究では、2次リンパ組織に対する黄砂エアロブルの影響は現在までほとんど解析されておらず、今回の結果から黄砂が体内のリンパ組織に対して影響を及ぼすことが示唆された。以上より、風送黄砂に付着している成分の情報の一部がわかり、それらをもとに毒性などの生体影響を鑑みる筋道を整える準備ができた。

## （２）環境政策への貢献

## ＜行政が既に活用した成果＞

特に記載すべき事項はない。

## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

黄砂イベントによって黄砂の物理学的、化学的、生物学的な性状に違いがあり、これらの性状が健康影響、特に化学物質がアレルギーの増悪因子となりうることから、黄砂中のこれらの性状
は、行政による健康影響の見極めとその予防対策に役立てられることができると考えられる。また、PAHsやnitro-PAHsが比較的多く吸着した黄砂は生体影響が強いことから、黄砂飛来時には行政による注意喚起や個人レベルでの予防対策が必要と考えられる。

毒性評価研究では、本成果を更に発展させ応用することで、黄砂のヒト曝露度合いを分子レベルで表現出来る可能性が考えられる。例えば、末梢血リンパ球のNF-kBなどの分子レベルの指標を測定することで黄砂曝露のリスク評価ができる可能性が考えられ、パラメータ一値が環境行政や政策に活用できるかも知れない。

## 6 ．国際共同研究等の状況

特に記載すべき事項はない。

## 7 ．研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

## <論文（査読あり）>

1) Y. SONG, T. ICHINOSE, K. MORITA, T. NAKANISHI, T. KANAZAWA AND Y. YOSHIDA: Asian sand dust causes subacute peripheral immune modification with NF- $ \kappa $ B activation. Environ Toxicol. 2013 Dec 5. doi:10.1002/tox.21931.

## くその他誌上発表（査読なし）>

特に記載すべき事項はない

## （2） 口頭発表（学会等）

1) 宋媛、市瀬孝道、吉田安宏：第34回日本分子生物学会（2011）「Intratracheal administration of Asian sand dust induces autophagic and apoptotic phenomena in splenocytes」

2) 嵐谷奎一、山根裕一、原愁花里、秋山幸雄、楢崎幸範、市瀬孝道：第53回大気環境学会(2012)「最近の北九州地域の多環芳香族炭化水素濃度の特徴」

3) 嵐谷奎一、原愁花里、山根裕一、秋山幸雄、檜崎幸範、市瀬孝道：第53回大気環境学会(2012)「最近の北九州地域の黄砂・煙霧飛来時の汚染物質濃度の特徴」

4) 中村志歩、嵐谷奎一、亀田貴之、鳥羽陽、早川和一：第53回大気環境学会(2012)「多環芳香族炭化水素の光分解速度に元づく越境汚染指標の検討」

5) Y. YOSHIDA, Y. SONG, T. ICHINOSE: 99th American association of Immunology annual meeting, Boston, MA, USA, 2012 「Particle such as an Asian sand dust activate autophagic and apoptosis key molecules in CD11b positive cells」

6) Y. SONG, Y. YOSHIDA, T. NAKANISHI: 第41回日本免疫学会総会 (2012) 「Asian sand dust induces autophagic and apoptotic event in peripheral lymphoid organ」

7) Y. SONG, T. ICHINOSE, T. KANAZAWA, Y. YOSHIDA: 100th American association of Immunology annual meeting. Honolulu, HI, USA, 2013 [Asian sand dust induces autophagic markers and activates NF- $ \kappa $ B in immune cells]

8) Y. SONG, T. ICHINOSE, T. KANAZAWA, Y. YOSHIDA: 15th International congress of
Immunology, Milan, Italy, 2013 [Intratracheally administration of Asian sand dust activates NF- $ \kappa $ B in immune cells.]

9) Y. SONG, T. ICHINOSE, K. MORITA, T. NAKANISHI, T. KANAZAWA, Y. YOSHIDA: 第42回日本免疫学会総会 (2013) 「TLR4 is involved in Asian sand dust-induced peripheral inflammation」

## （3） 出願特許

特に記載すべき事項はない。

（４）シンポジウム、セミナー等の開催（主催のもの）

特に記載すべき事項はない。

（５）マスコミ等への公表・報道等

特に記載すべき事項はない。

(6) その他

特に記載すべき事項はない。

### 8 \. 引用文献

特に記載すべき事項はない。
# Studies on Biological Effects and Clarification of the Mechanisms of Asian Dust Aerosol, Attached Microorganisms and Chemical Substances

Principal Investigator: Takamichi ICHINOSE

Institution: Department of Health Sciences, Oita University of Nursing and Health Sciences, Oita, Japan

Cooperated by:

Environmental Health Division, Department of Environmental Engineering, Graduate School of Engineering, Kyoto University, 615-8530, Kyoto, Japan.

Environmental Chemistry Division, National Institute for Environmental Studies, 305-8506, Ibaraki, Japan,

College of Science and Engineering, Kanazawa University, 920-1192, Ishikawa, Japan.

Department of Immunology and Parasitology, School of Medicine, University of Occupational and Environmental Health, Japan, 807-8555, Fukuoka, Japan.

## [Abstract]

Key Words: Asian sand dust, Allergic diseases, Airway epithelial cells, Immune cells, Splenocytes, Male reproductive function, Kosa bioaerosol

Asian sand dust (ASD) contains various air pollutants (heavy metals, $ SO_{4}^{2-} $ , $ NO_{3}^{-} $ , polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs)) and biological agents (spores, fungi, bacteria). Therefore, the aggravating effects and mechanism of microbial elements and chemical products on allergic diseases (asthma and allergic rhinitis) were investigated. Subtheme 1 presented that ASD-bound LPS, lipoproteins, $ \beta $ -glucan, Bjercandera fungus and chemical substances (Tar) may be strong candidates for the aggravating substances in ASD. Moreover, Toll like receptor (TLR) 2 and TLR4 may play an important role in disease enhancement by ASD and that MyD88 is the significant key adapter molecule in the downstream signaling pathway for Th2 generation. ASD also affected airway epithelial cells and immune cells such as bone marrow-derived dendritic cells (BMDC) and splenocytes. The difference in ASD events and heat-sensitive components contained with ASD contribute to the health effects, especially Bjerkandera activates BMDC. On the other hand, the effects of ASD and fetal ASD exposure on reproductive function in male mice and male mice offspring were investigated. ASD reduced daily sperm production (DSP) and induced seminiferous tubules damage in male mice. Moreover, fetal ASD
exposure reduced DSP in male offspring. In subtheme 2, the direct sampling and bioanalysis over Suzu city in Noto Peninsula using a tethered balloon and an airplane were conducted in order to reveal the health effect of Kosa bioaerosol. Subtheme 2 presented gram-positive and gram-negative bacteria, and Bjerkandera adusta fungus were increased in the atmosphere during dust storm events. In subtheme 3, two kinds of ASD collected using a high-volume air sampler from the atmosphere at Kitakyushu, Fukuoka on 1–3 May, 2011 (ASD1) and 12-14 May, 2011 (ASD2), after dust storm events. ASD2 had higher levels of PAHs, LPS, and $ \beta $ -glucan, compared with ASD1, but SiO2 was rich in ASD1 than ASD2. The effects of ASD on splenocytes were investigated. The western blotting demonstrated that nuclear factor $ k_{B} $ (NF- $ k_{B} $ ) was activated in splenocytes. These novel findings may serve as a warning about the ill effects of airborne desert dust on the human respiratory system.
平成 23 年度 環境研究総合推進費補助金 研究事業

総合研究報告書

# 廃棄物発生抑制行動を推進する心理要因の構造化と

市民協働プログラムの実践

(K2141, K22056, K2352)

平成24年5月

東京大学 先端科学技術研究センター

栗栖 聖
補助事業名	環境研究総合推進費補助金 研究事業
所管	環境省
研究課題名	廃棄物発生抑制行動を推進する心理要因の構造化と市民協働プログラムの実践
研究番号	K2141, K22056, K2352
国庫補助金精算所要額（円）	43,882,000
研究期間（西暦）	2009-2011
研究代表者名	栗栖聖（東京大学）
研究分担者名	広瀬幸雄（名古屋大学, 2009～2010；関西大学, 2011）、花木啓祐（東京大学）、荒巻俊也（東洋大学, 2009～2010）、中谷隼（東京大学）
0. 本研究の目的と全体像 ..... 7
1. 大規模アンケートによる環境配慮行動理解 ..... 9
1.1. 研究目的 ..... 9
1.2. 方法 ..... 9
1.2.1. 調査の概要 ..... 9
1.2.2. クラスター分析による行動の類型化 ..... 11
1.3. 結果と考察 ..... 11
1.3.1. クラスター分析による類型化と実施度 ..... 11
2. 廃棄物削減に対する詳細分析 ..... 20
2.1. 廃棄物削減行動への個人属性影響評価 ..... 20
2.1.1. 方法 ..... 20
2.1.1.1. 調査の概要 ..... 20
2.1.1.2. 調査票の内容 ..... 20
2.1.2. 結果と考察 ..... 20
2.1.2.1. 行動実施度の地域間比較 ..... 20
2.1.2.2. 個人属性との関係 ..... 21
2.2. 心理因子の影響モデル評価 ..... 28
2.2.1. はじめに ..... 28
2.2.1.1. 研究背景 ..... 28
2.2.1.2. 目的 ..... 28
2.2.2. 廃棄物発生抑制行動の仮説モデルの検討 ..... 30
2.2.2.1. 環境配慮行動における合理的行動理論と計画的行動理論 ..... 30
2.2.2.2. 廃棄物発生抑制行動の仮説モデルと規定因 ..... 32
2.2.3. 廃棄物発生抑制行動の検討 ..... 33
2.2.3.1. 調査の概要 ..... 33
2.2.3.2. 単純集計 ..... 34
2.2.4. 対象とする行動 ..... 35
2.2.4.1. 行動の実行度 ..... 36
2.2.4.2. 行動間の関連 ..... 37
2.2.4.3. 行動間の選定 ..... 38
2.2.5. マイバッグ持参行動に関する調査結果 ..... 38
2.2.5.1. 調査概要 ..... 39
(1) 3 都市のレジ袋削減に関する取り組み.....39
2.2.5.2. 対象 3 都市における比較分析.....42
(2) 各要因の平均値の比較.....45
2.2.5.3. マイバッグ持参行動規定因の検討.....47
2.2.5.4. まとめ.....55
2.2.6. 詰替え用容器の再使用行動に関する調査結果.....56
2.2.6.1. 調査概要.....56
2.2.6.2. 対象 3 都市における比較分析.....57
2.2.6.3. 詰め替え用容器の再使用行動の規定因の検討.....61
2.2.6.4. まとめ.....69
2.2.7. 総合考察.....70
2.2.7.1. マイバッグ持参行動と規定因に関する考察.....70
2.2.7.2. 詰め替え用容器の再使用行動と規定因に関する考察.....73
2.2.7.3. 本研究の意義と課題.....75
2.3. LCA による廃棄物抑制行動の環境負荷評価（中谷・花木 G）.....79
2.3.1. 評価対象および評価方法.....79
2.3.2. ケーススタディ①～⑤.....80
2.3.2.1. ケーススタディ①：買物袋に関するシナリオ.....80
2.3.2.2. ケーススタディ②：飲料容器に関するシナリオ.....83
2.3.2.3. ケーススタディ③：洗剤容器に関するシナリオ.....87
2.3.2.4. ケーススタディ④：食器に関するシナリオ.....90
2.3.2.5. ケーススタディ⑤：ご飯に関するシナリオ.....93
2.3.3. 環境負荷の評価結果の分析.....96
3. 市民への情報提供法の検討.....102
3.1. 情報内容の検討.....102
3.1.1. 研究目的.....102
3.1.2. 有効情報の抽出.....102
3.1.2.1. 既往研究に基づく提供情報内容の検討.....102
3.1.2.2. 対象行動および提供情報の内容.....103
3.1.2.3. 調査方法.....105
3.1.3. 結果と考察.....105
3.1.4. フリーペーパーを用いた情報提供実験.....115
3.1.4.1. フリーペーパー会社の選出.....115
3.1.4.2. 実験方法.....115
3.1.4.3. 実験結果.....117
3.1.5. まとめ ..... 117
3.2. 行動促進に向けたソーシャルネットワーキングシステムの利用可能性検討 ..... 118
3.2.1. 研究経緯と概要 ..... 118
3.2.2. 方法 ..... 119
3.2.2.1. 実験概要 ..... 119
3.2.2.2. 実験対象者の選定 ..... 120
3.2.2.3. コミュニティ作成 ..... 120
3.2.2.4. 実験の実施方法 ..... 123
3.2.2.5. 実験後アンケート ..... 124
3.2.3. 実験結果 ..... 125
3.2.3.1. 書き込み数 ..... 125
3.2.3.2. 書き込みに対する同調行動 ..... 128
3.2.3.3. コミュニティ強度の比較 ..... 130
3.2.3.4. 実験後アンケート ..... 132
4. 市民協働プログラムの実施 ..... 135
4.1. LCA 情報の利用プログラム ..... 135
4.1.1. 目的 ..... 135
4.1.2. 実施概要 ..... 135
4.1.2.1. 市民講座のプログラム内容 ..... 135
4.1.2.2. 市民講座の実施 ..... 136
4.1.3. 実施の結果 ..... 139
4.1.3.1. 練馬区における結果 ..... 139
4.1.3.2. 目黒区における結果 ..... 143
4.1.4. 考察 ..... 145
4.1.4.1. 全国での現状把握調査との関連性 ..... 145
4.1.4.2. 今後の課題 ..... 147
4.2. 名古屋における 2R 行動促進市民協働プログラム ..... 148
4.2.1. プログラムの目的 ..... 148
4.2.2. プログラムの内容 ..... 150
4.2.2.1. 実施日時・場所 ..... 150
4.2.2.2. 参加者 ..... 150
4.2.2.3. 会場の机などの配置 ..... 151
4.2.2.4. 当日の進行 ..... 151
4.2.3. 事前・当日・事後アンケートの方法 ..... 155
4.2.3.1. 対象者 ..... 155
4.2.3.2. 手続き ..... 156
4.2.3.3. アンケートの構成 ..... 156
4.2.4. アンケートの結果 ..... 158
4.2.4.1. 衣類のリユースに関する態度のプログラム前後の比較 ..... 158
4.2.4.2. プログラム後のリユース・リサイクル行動の実行 ..... 160
4.2.4.3. リユース行動についての認知・行動評価と行動の関連の相関分析 ..... 166
4.2.4.4. プログラム内容などについての家族友人とのコミュニケーションとプログラム後の実行とのクロス集計 ..... 169
4.2.5. まとめ ..... 172
5. 研究成果の発表 ..... 176
5.1. 学術雑誌論文 ..... 176
5.2. 口頭発表 ..... 176
5.3. ポスター発表 ..... 177
5.4. シンポジウム ..... 177
O. 本研究の目的と全体像