Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
定された。B. ad の低濃度実験では0.2μgと0.8μg投与量とし、加熱風送黄砂（H-ASD）は0.1mg、アレルギー喘息を誘導するための卵白アルブミン(OVA)は1μgとし、これらの組み合わせによって肺への影響とアレルギー喘息への影響を調べた。各グループは対照群（Control）、B. ad 0.2μg群、B. ad 0.8μg群、H-ASD群、H-ASD + B. ad 0.2μg群、H-ASD + B. ad 0.8μg群の6群、卵白アルブミン（OVA）群、OVA + B. ad 0.2μg群、OVA + B. ad 0.8μg群、OVA + H-ASD群、OVA + H-ASD + B. ad 0.2μg群、OVA + H-ASD + B. ad 0.8μg群の合計12群とした。

B. ad の高濃度実験では2μgと8μg投与量とし、各グループは対照群 (Control)、B. ad 2μg群、B. ad 8μg群、H-ASD群、H-ASD + B. ad 2μg群、H-ASD + B. ad 8μg群の6群、卵白アルブミン (OVA) 群、OVA + B. ad 2μg群、OVA + B. ad 8μg群、OVA + H-ASD群、OVA + H-ASD + B. ad 2μg群、OVA + H-ASD + B. ad 8μg群の合計12群とした。これらを2週間に1回、4回投与して、最終投与の翌日にマウスを屠殺して肺への影響とアレルギー喘息への影響を調べた。炎症の指標としては肺洗浄液中の炎症細胞や炎症性サイトカイン・ケモカイン類を調べた。

## 4 ）発生地の異なる2種類の黄砂の気管支喘息モデルマウスへの影響

黄砂は北九州折尾にて採取した2種類の風送黄砂を用いた。動物は6週齢のICR系雄マウスを用い、実験群は1群16匹として対照群、黄砂1（ASD1：2011年5月1～3日採取）群、黄砂2（ASD2：2011年5月12～14日採取）群、OVA群、OVA + ASD1群、OVA + ASD2群の計6群とした。気管支喘息病態の誘発のためのOVAはマウス1匹あたり1μgとし、黄砂の投与量は0.1mgとして生理食塩水に混濁した。これらの溶液を2週間おきに計4回気管内投与し、最終投与翌日にマウスを屠殺した。8匹のマウスから気管支・肺胞洗浄液（BALF）を採取して、各炎症細胞数とマクロファージ数を測定し、また、BALF中の炎症性サイトカインやケモカインを測定した。残りの8匹のマウスから肺病理標本を作製し、気道上皮の粘液細胞化や気管支粘膜下における好酸球等の炎症細胞を観察した。

5）Toll様レセプターノックアウト（TLRs KO）マウスの骨髓由来マクロファージを用いた黄砂の炎症増悪因子のスクリーニング試験

培養細胞は野生型（WT）BALB/c雄マウス、TLR2 KO、TLR4 KOとMyD88KOマウスの4種類の骨髓由来マクロファージ（BMDM）細胞を用いた。黄砂は2011年5月1～3日にサブテーマ（3）グループによって北九州市折尾で採取した風送黄砂を用いた。培養液にGM-CSF（10 ng/ml）を添加してBMDM細胞を7日間培養後、1 wellあたり3×10^{5} cellになるように細胞を蒔き、前述した黄砂を20μg/ml培養液濃度になるように添加し、24時間後の培養液中のIL-1β、IL-12、MCP-1、IL-6、TNF-αとMIP-1αのタンパク発現量を測定した。

## 6 ）黄砂から抽出した有機化合物質（Tar）のアレルギー喘息増悪作用に関する研究

本実験には2010年11月13～15日の大規模黄砂に採取した黄砂から有機溶媒で抽出した有機化合物（タール成分：Tar）を用いた。動物は6週齢のICR系雄マウスを用いた。実験群は対照群、Tar 0.2μg、Tar 1.0μg、Tar 5μg、加熱黄砂（H-ASD）、H-ASD+Tar 0.2、H-ASD+Tar 1.0、H-ASD+Tar 5μg、OVA (卵白アルブミン)群、OVA+Tar 0.2μg、OVA+Tar 1.0μg、OVA+Tar 5μg、OVA+H-ASD、OVA+H-ASD+Tar 0.2μg、OVA+H-ASD+Tar 1.0μg、OVA+H-ASD+Tar 5μg群の計16群とし、マウスの数は1群14匹とした。OVAの1回当たりの投与量は1μg/body、加熱処理H-ASDは0.1mg/bodyと
した。タール成分の1回投与量は一匹当たり0.2、1.0、5μgとした。これらを0.01%Tweenを含む生理食塩水に懸濁し、1週間間隔で計4回、気管内投与した。全てのマウスは最終投与翌日に心採血にて屠殺した。各群のマウスから気管支・肺胞洗浄液(BALF)を採取し、炎症細胞数と炎症性サイトカイン・ケモカインを測定した。各群のマウスから肺の病理標本を作製し、気道上皮の粘液産生細胞や好酸球等の炎症細胞を観察した。

## 7 ）黄砂から分離した真菌成分のスギ花粉症増悪作用に対する量-反応関係に関する研究

本研究では黄砂から分離したベルカンデラ真菌（B. ad）を用いてスギ花粉症への影響を調べた。各グループは対照群（Control）、B. ad 0.2 μg群、B. ad 2 μg群、H-ASD群、スギ花粉抗原（Cryj1）群、Cryj1+B. ad 0.2 μg群、Cryj1+B. ad 2 μg群、Cryj1+H-ASD群、Cryj1+H-ASD+B. ad 0.2 μg群、Cryj1+H-ASD+B. ad 2 μg群の合計10群とした。B. adの1回点鼻投与量は0.2 μgと2 μg投与量、H-ASDは10 μg投（与量、Cryj1は4 μg投与量とした。これらを2週間に1回、3回点鼻投与して、その2週間後から2日おきに4回、Cryj1のみを投与し、5回目に再びCryj1+黄砂+B. adを点鼻投与した。Cryj1、黄砂、あるいはB. adを投与しない群はこれらの代わりに生理食塩水を点鼻投与した。最終投与の5時間後にマウスを屠殺してスギ花粉症への影響を調べた。炎症の指標としては肺洗浄液中の炎症細胞や炎症性サイトカイン・ケモカイン類と鼻の病理形態学的変化を調べた。

## 8 ）Toll様レセプターノックアウト（TLRs KO）マウスを用いた黄砂のアレルギー喘息増悪作用に関する研究

動物は6週齢のBALB/c系マウスの野生型(WT)、TLR2KO、TLR4KO、MyD88KOの4種の雄マウスを用いた。黄砂はサブテーマ（3）によって2011年5月1～3日に採取した風送黄砂を用いた。1種類のマウス実験群は1群6匹として対照群、黄砂（ASD）群、OVA群、OVA+ASDの計4群の24匹とし、4種のマウスの合計16群（96匹）とした。OVAはマウス1匹あたり1μgとし、黄砂投与量は0.1mgとして生理食塩水に懸濁した。これらの溶液を2週間おきに計4回気管内投与し、最終投与翌日にマウスを屠殺した。6匹のマウスから気管支・肺胞洗浄液（BALF）を採取して、各炎症細胞数とマクロファージ数を測定し、また、BALF中の炎症性サイトカインやケモカインを測定した。肺胞洗浄後のマウスから肺病理標本を作製し、気道上皮の粘液細胞化や気管支粘膜下における好酸球等の炎症細胞を観察した。

9）日本に飛来した黄砂のToll様レセプターノックアウト（TLRs KO）マウスの骨髓由来マクロファージを用いた炎症増悪因子のスクリーニング試験

培養細胞は野生型（WT）C57BL/6雄マウス、TLR2KO、TLR4KO、TLR2/4KO、TLR7/9KOとMyD88KOマウスの6種類の骨髓由来マクロファージ（BMDM）細胞を用いた。黄砂は2011年5月1～3日にサブテーマ（3）のグループによって北九州市折尾で採取した風送黄砂を用いた。培養液にGM-CSF（10 ng/ml）を添加してBMDM細胞を7日間培養後、1 wellあたり3×10^{5} cellになるように細胞を蒔き、前述した黄砂を20μg/ml培養液濃度になるように添加し、12時間後の培養液中のIL-6、IL-12、TNF-α、MCP-1とMIP-1αのタンパク発現量を測定した。

10）スギ花粉症モデルを用いた有機化合物質（Tar）のアレルギー増悪作用に関する研究

本実験には2010年11月13～15日の大規模黄砂に採取した黄砂から有機溶媒で抽出した有機化
合物（タール成分：Tar）を用いた。動物は6週齢のBALB/c系雌マウスを用いた。実験群は①対照（Control）群、②Tar 0.1μg群、③Tar 1.0μg群、④Cryj1（スギ花粉抗原）群、⑤Cryj1 + Tar 0.1μg群、⑥Cryj1 + Tar 1.0μg群、⑦Cryj1 + H-ASD（加熱処理黄砂）群、⑧Cryj1 + H-ASD + Tar 0.1μg群、⑨Cryj1 + H-ASD + Tar 1.0μg群の計9群とし、マウスの数は1群14匹とした。Cryj1の1回当たりの投与量は4μg/body、H-ASDは10μg/bodyとした。タール成分の1回投与量は一匹当たり0.1、1.0μgとした。これらを0.01%Tween 80を含む生理食塩水に懸濁した。これらを2週間に1回、3回点鼻投与して、その2週間後から2日おきに4回のCryj1のみを投与し、5回目に再びCryj1 + H-ASD + Tarを点鼻投与した。Cryj1、黄砂、あるいはTarを投与しない群はこれらの変わりに生理食塩水を点鼻投与した。最終投与の5時間後にマウスを屠殺してスギ花粉症への影響を調べた。炎症の指標としては鼻洗浄液中の炎症細胞や炎症性サイトカイン・ケモカイン類と鼻の病理形態学的変化を調べた。

## 1 1）Toll様レセプターノックアウト（TLRs KO）マウスを用いた黄砂と細菌毒素成分LPSのアレルギー喘息増悪作用に関する研究

動物は6週齢のBALB/c系マウスの野生型（WT）、TLR2欠損（KO）、TLR4KO、MyD88KOの4種類の雄マウスを用いた。黄砂は中国ゴビ砂漠の砂から4μm前後の粒径に精製した黄砂粒子を用いた。1種類のマウス実験群は1群4～5匹として①対照（Control）群、②LPS50ng群、③H-ASD（加熱黄砂）群、④H-ASD+LPS群、⑤OVA群、⑥OVA+LPS50ng群、⑦OVA+H-ASD群、⑧OVA+H-ASD+LPS50ng群の計8群とし、1種類のマウスの総匹数は34匹とした。4種類のマウスの合計は136匹であった。OVAはマウス1匹あたり4μgとし、H-ASD投与量は0.1mg、LPSは50ngとして生理食塩水に懸濁した。これらの溶液を2週間おきに計4回気管内投与し、最終投与翌日にマウスを屠殺した。4～5匹のマウスから気管支・肺胞洗浄液（BALF）を採取して、各炎症細胞数とマクロファージ数を測定し、また、BALF中の炎症性サイトカインやケモカインを測定した。肺胞洗浄後のマウスから肺病理標本を作製し、気道上皮の粘液細胞化や気管支粘膜下における好酸球等の炎症細胞を観察した。屠殺時に心採血後、血清を分離してOVA特異的-IgG1とIgE抗体を測定した。

## 1 2) 黄砂付着レベルの細菌感染毒素成分LPSの肺炎増悪作用と抗原併用曝露によるアレルギー増悪作用に関する研究

本実験では中国ゴビ砂漠の砂から4μm前後の粒径に精製した黄砂粒子を用いた。動物は6週齢のBALB/c系雄マウスを用い、実験群は①対照（Control）群、②LPS1ng群、③LPS10ng群、④加熱黄砂（H-ASD）群、⑤LPS1ng + H-ASD群、⑥LPS10ng + H-ASD群、⑦OVA（卵白アルブミン）群、⑧OVA + LPS1ng群、⑨OVA + LPS10ng群、⑩H-ASD + OVA群、⑪H-ASD + OVA + LPS1ng群、⑫H-ASD + OVA + LPS10ng + H-ASD群の計12群とし、マウスの数は1群14匹とした。OVAの1回当たりの投与量は2μg/body、加熱処理H-ASDは0.1mg/bodyとした。LPSの1回投与量は一匹当たり1ngと10ngとした。これらを生理食塩水に懸濁し、1週間間隔で計4回、経気道曝露した。全てのマウスは最終投与翌日に心採血にて屠殺した。各群のマウスから気管支・肺胞洗浄液（BALF）を採取し、炎症細胞数と炎症性サイトカイン・ケモカインを測定した。各群のマウスから肺の病理標本を作製し、気道上皮の粘液産生細胞や好酸球等の炎症細胞を観察した。屠殺時に心採血後、血清を分離してOVA特異的-IgG1とIgE抗体を測定した。
（２）黄砂エアロゾル及び付着微生物・化学物質による生殖器系への影響とそのメカニズム解明

## 1 ）黄砂イベントの異なる2種類の風送黄砂の雄性生殖機能への影響

6週齢のICR系雄性マウスを用いた。黄砂は1匹当たり0.1mgのASD1あるいはASD2の黄砂を、2週間で4回気管内投与した。最終投与の翌日、心臓採血屠殺後に精巣及び精巣上体を摘出し、組織重量を測定した。右精巣を造精機能測定用に-80℃で保存した。右精巣上体尾部を精子性状解析用とした。

## 2 ）黄砂に付着した微生物の雄性生殖機能への影響

黄砂による影響発生因子を検討するため黄砂付着微生物の一つであるNocardiopsis（微生物群）を用いて雄性生殖器への影響を検討した。Nocardiopsisの投与量は、0.1と1μgとし、黄砂はASD1の加熱処理したものを0.1mgとした。これらを2週間に1回、4回気管内投与し、マウス雄性生殖機能を検討した。

## 3 ）黄砂付着生物成分LPSの雄性生殖機能への影響に関する研究

本実験には黄砂は国立環境研究所より譲渡された中国内の砂漠の砂から精製した粒子経が5μm前後の標準黄砂を用いた。黄砂は360℃30分間加熱し、付着有機物を取り除いた黄砂（H-ASD）を用いた。LPSは市販の大腸菌由来の標準品LPS-EB (0111:B4)用いた。動物は6週齢のICR系雄マウスを用いた。実験群は対照群、LPS-1ng投与群、LPS-10ng群、加熱黄砂（H-ASD）群、H-ASD+LPS-1ng群、H-ASD+LPS-10ng群の計6群とし、マウスの数は1群8-14匹とした。H-ASDの1回当たりの投与量は0.1 mg/bodyとした。LPSの1回投与量は一匹当たり1、10ngとした。これらを生理食塩水に懸濁し、1週間間隔で計4回、気管内投与した。全てのマウスは最終投与翌日に心採血にて屠殺した。各群のマウスから精巣および精巣上体尾部を採取し、一日精子産生能および精子性状解析を行った。また、精巣で発現する遺伝子解析を行った。

上記1）～3）の実験から採取した精巣上体尾部中精子について、精子性状解析装置を使用し精子性状解析を行った。解析項目は、精子運動率、直進運動率、非直進運動率、精子曲線地点移動速度の平均値（VCL）、精子直線地点移動速度の平均値（VSL）、精子進行方向性速度の平均値（VAP）、精子の直線性の平均値（LIN）、直線係数の平均値（STR）、曲線軌道係数の平均値（WOB）、精子頭部の平均振幅値（ALH）、精子頭部が1秒間に振る回数（BCF）である。また、右精巣を1mlのライシスバッファーの中でホモジナイズ後、溶液中の細胞数（精子数）を測定し、DSP（1日に精巣1個あたりで作られる精子数）を算出した。血清中のTestosterone（T）、Estradiol（ $ E_{2} $ ）、LH、FSH濃度をELISAにて測定した。

## 4 ）黄砂から抽出した有機化合物質の雄性生殖機能への影響に関する研究

本実験には2010年11月13～15日の大規模黄砂に採取した黄砂から有機溶媒で抽出した有機化合物（タール成分：Tar）を用いた。動物は6週齢のICR系雄マウスを用いた。実験群は対照群、Tar 0.04 μg群、Tar 0.2 μg群、Tar 1.0 μg、加熱黄砂（H-ASD）、H-ASD+Tar 0.04 μg群、H-ASD+Tar 0.2 μg群、H-ASD+Tar 1.0 μg群の計8群とし、マウスの数は1群14匹とした。加熱黄砂（H-ASD）の1回当たりの投与量は0.1 mg/bodyとした。タール成分の1回投与量は一匹当たり0.04、0.2、1.0 μgとした。
これらを0.01%Tween 80を含む生理食塩水に懸濁し、1週間間隔で計4回、気管内投与した。全てのマウスは最終投与翌日に心採血にて屠殺した。各群のマウスから精巣および精巣上体尾部を採取し、一日精子産生能および精子性状解析を行った。

## 5 ）運動精子に対する黄砂の影響

粒子状物質による運動精子性状の悪化に関し、評価系を確立するために、黄砂を多く含む、中国北京市のビルの換気フィルターに付着した北京降下煤塵 (BP)を使用した。左右精巣上体尾部を採取し、一方を対照群、他方を処理群とし、対照群には精子運動解析用培地 (10% FBS-M199)を添付し、処理群にはBPを含む10% FBS-M199 1mlを添加した。試験は1試験につき5匹のマウスを用いた。処理、10分後より10分間隔で4回、精子性状をコンピュータ画像解析法 (SCA)にて解析した。上記の方法で、粒子状物質による精子性状への影響評価が可能となったため、黄砂、加熱黄砂および黄砂付着タール成分を同様に処理し、精子性状解析を行った。

## 6 ）胎仔期風送黄砂曝露による雄性出生仔マウスの生殖機能への影響

黄砂の胎仔期曝露による出生仔雄性生殖機能への影響を明らかにするために、ICR系妊娠マウスに0.2 mgのASD1黄砂を妊娠7日目及び14日目に気管内投与した。出生仔は対照群とASD群に分け、それぞれ5週齢（5wk対照群、5wk ASD）、10週齢（10wk対照群、10wk ASD群）で雄性生殖機能を検討した。

（３）免疫担当細胞と気管支上皮細胞における黄砂エアロゾル及び付着微生物・化学物質の影響解明

## 1 ）黄砂が気道上皮細胞に及ぼす影響

2011年5月1～3日に採取した無処理の黄砂（ASD1）、2011年5月12～14日に採取した無処理の黄砂（ASD2）、2011年5月1～3日に採取した黄砂を360℃、30分間加熱処理した黄砂（H-ASD1）、以上3種類の黄砂を被検物質とした。正常ヒト気道上皮細胞株BEAS-2B細胞を使用し、無血清培地LHC-9 Mediumを用いて培養した。コラーゲンIコートされたプレートに細胞を播種し、semi-confluentな状態まで培養後、被検物質（0-90 μg/mL）を添加して、4あるいは24時間曝露した。4時間曝露後に、細胞接着分子ICAM-1と粘液関連物質Mucin-1の遺伝子発現をリアルタイムRT-PCR法により検討した。また、24時間曝露後に、細胞活性、IL-6、IL-8、sICAM-1等の液性因子の産生、細胞表面分子ICAM-1の発現を、WST-1を用いた比色法、ELISA法およびフローサイトメトリーにより、それぞれ解析した。

## 2 ）黄砂が免疫担当細胞に及ぼす影響

ASD1、ASD2、H-ASD1を被検物質とした。10週齢の雄性NC/NgaTndCrljマウスを頸椎脱臼にて安楽死させた後、大腿骨および脾細胞を摘出した。大腿骨は、骨髓細胞を摘出し、GM-CSF刺激により分化誘導した骨髓由来樹状細胞（BMDC）に、黄砂（0-90μg/mL）を24時間曝露した。その後、細胞表面分子DEC205の発現をフローサイトメトリーにより解析した。一方、脾細胞は、黄砂（0-90μg/mL）を72時間曝露後、細胞増殖能および細胞表面分子TCRの発現を、Bromodeoxyuridine（BrdU）法およびフローサイトメトリーにより、それぞれ解析した。
## 3 ）黄砂関連生物成分 Bjerkandera が気道上皮細胞と免疫担当細胞に及ぼす影響

Bjerkandera および360℃、30 分間加熱処理した標準黄砂（H-ASD）を被検物質とした。ヒト気道上皮細胞にBjerkandera（0-25 μg/mL）、あるいは、BjerkanderaとH-ASD（50 μg/mL）を24時間曝露した後、細胞活性、IL-6、IL-8、sICAM-1、IL-25、IL-33等の液性因子の産生および細胞表面分子Dectin1の発現を、WST-1を用いた比色法、ELISA法およびフローサイトメトリーによりそれぞれ解析した。別に、10週齢の雄性NC/NgaTndCrlj マウスを頸椎脱臼にて安楽死させた後、大腿骨および脾臓を摘出した。骨髓細胞よりGM-CSF刺激により分化誘導したBMDCは、Bjerkandera、あるいは、Bjerkandera+H-ASDを24時間曝露後、細胞表面分子DEC205、CD86、TLR2、TLR4、Dectin1の発現を解析した。脾細胞は、Bjerkandera、あるいは、Bjerkandera+H-ASDを72時間曝露後、細胞増殖能および細胞表面分子TCRの発現を解析した。

## 4 ．結果及び考察

（１）黄砂エアロゾル及び付着微生物・化学物質による呼吸器・免疫系への影響とそのメカニズム解明

1）黄砂分離微生物の炎症性サイトカイン誘導能を調査するためのスクリーニング試験

サブテーマ（2）の小林らが石川県珠洲市上空で採取した黄砂から分離した微生物の炎症性サイトカイン誘導能を調査するためのスクリーニング試験を、マウスマクロファージを用いて行った。その結果、マウスマクロファージにおける炎症性サイトカイン類（IL-1β、MCP-1、MIP-1α、TNF-α）のmRNA発現は黄砂に付着していた7種類の微生物のうちNo1～No4のNocardiopsis菌体成分が他のBacillus、StreptomycesやBjerkanderaの菌体成分に比較して高く、細胞培養液中のこれらのサイトカインタンパク発現（図(1)-1)-1）も同様に高い発現が見られた。No1～No4のNocardiopsis菌体成分の中で比較するとNo4のNocardiopsis菌体成分のサイトカインmRNA発現やサイトカインタンパク発現が高かった。これらの結果から黄砂附着細菌の中ではNocardiopsis類が黄砂による炎症惹起と関連している可能性が示唆された。また、このNo4のマウスマクロファージ上にあるToll様レセプター（TLRs）を測定した結果、TLR4の発現は低下したが、TLR2の発現を高めた。この結果から、TLR2を介して炎症性サイトカインの発現を高め、肺に炎症を惹起される可能性が示唆された。
図(1)-1)-1.7種の黄砂分離微生物の炎症性サイトカイン誘導能の違い 細胞培養液中の炎症性サイトカインの発現量の変化を示す。 No1～No4.Nocardiosisの4種、No5.Bacillus、No6.Streptomyces、No7.Bjerkandera. DataはM ± SEMで示す。 $ ^{*}p < 0.001 $ vs. Control

2）マウス気管支喘息モデルを用いたアレルギー増悪作用を起こす微生物のスクリーニング試験

マウス気管支喘息モデルを用いて増悪作用を起こす微生物を特定するためのスクリーニング試験を行った。その結果、7種類の微生物のうちBjerkandera (No. 1) 投与群のBALF中の好酸球数がOVA群やOVA+ASD群と比較して著しく増加していた (図(1)-1)-2)。BALF中の好酸球遊走・活性化に関与するTh2型炎症性サイトカインのIL-5やMCP-3 (図(1)-1)-3)も、Bjerkandera投与群で著しく増加していた。また好中球誘導にあずかるKCやTNF-αも増加していた (図(1)-1)-3)。B. ad投与群に続いて好酸球数やこれらの炎症性サイトカインが多く誘導されたものはStreptomyces投与群であった (図(1)-1)-2；図(1)-1)-3)。肺病理組織変化としては、Bjerkandera投与群のマウスでは他の微生物を投与した群に比較して、気道粘膜下への好酸球浸潤や気道上皮の粘液細胞化が著しく悪化していた。Streptomyces投与群にも同様の変化が認められたが軽度であった。以上の結果から、7種類の微生物のなかでも、Bjerkanderaのアレルギー炎症増悪作用が最も強いことが明らかとなった。このことから黄砂に付着しているBjerkanderaのような真菌類が気管支喘息増悪作用に関与しているものと示唆された。
図(1)-1)-2. 気管支喘息モデルマウスにおける7種の微生物の肺洗浄液中の炎症細胞数 No1～No4.Nocardiosis 4種、No5.Bacillus、No6.Streptomyces、No7.Bjerkandera. これらの微生物はOVAとASDと共に気管内に投与した。DataはM±SEMで示す。 a:p<0.05 vs OVA, b:p<0.01 vs OVA, c:p<0.001 vs OVA, d:p<0.05 vs OVA + ASD, e:p<0.01 vs OVA + ASD f:p<0.001 vs OVA + ASD

図(1)-1)-3.7種の微生物の肺洗浄液中のサイトカイン・ケモカイン発現

No1～No4. Nocardiosis 4種, No5. Bacillus, No6. Streptomyces, No7. Bjerkandera. これらの微生物はOVAとASDと共に気管内に投与した。DataはM ± SEMで示す。 $ ^{μ} $ p<0.01 vs. OVA, &p<0.01 vs. OVA+H-ASD, $ ^{§} $ p<0.001 vs. OVA, $ ^{£} $ p<0.001 vs. OVA+H-ASD
## 3 ）Bjerkandera 真菌のアレルギー喘息増悪作用に対する量-反応関係の関する研究

2）の実験によってBjerkandera (B. ad)が肺のアレルギー炎症を高めたことが明らかになったことから、気管支喘息をモデルとしたアレルギー炎症に対するB. adの量-反応関係を調べた。その結果、B. ad 0.2μg単独投与群の肺洗浄液（BALF）中の炎症細胞数は増加しなかったが、0.8μg群では若干の好中球と好酸球に増加が認められ（図(1)-1)-4）、更にこれに熱処理黄砂0.1mgを加えた群ではB. adの投与量に依存して相乗的な増加が認められた（図(1)-1)-4）。これら炎症細胞を誘導活性するサイトカイン類（KC、IL-5、Eotaxin、MPC-3）も相乗的に増加していた。これらの結果はH-ASDがB. ad誘導のアレルギー炎症を増悪させることを示す。

図(1)-1)-4. Bjerkandera、熱処理黄砂、OVAを気管内投与したマウスの肺洗浄液中の炎症細胞数Bjerkandera (B. ad)投与量：0.2 μ g or 0.8 μ g；熱処理黄砂(H-ASD):0.1 mg；OVA:1 μ g. DataはM ± SEで示す。

$ ^{*}p<0.001 $ vs Control; $ ^{**}p<0.01 $ vs Control; $ ^{***}p<0.05 $ vs Control; $ ^{\dagger}p<0.001 $ vs B. ad. 0.2; $ ^{\dagger\dagger}p<0.05 $ vs B. ad. 0.2; $ ^{\ddagger}p<0.001 $ vs B. ad. 0.8; $ ^{\ddagger\ddagger}p<0.01 $ vs B. ad. 0.8; $ ^{\ddagger}p<0.001 $ vs H-ASD; $ ^{\ddagger\ddagger\ddagger}p<0.05 $ vs

H-ASD; $ {}^{p} $ p<0.001 vs OVA; $ {}^{q} $ p<0.01 vs OVA; $ {}^{p} $ p<0.001 vs OVA+H-ASD; $ {}^{q} $ p<0.01 vs OVA+H-ASD; $ {}^{q} $ p<0.05 vs OVA+H-ASD; $ {}^{p} $ p<0.001 vs OVA+B. ad. 0.2;

$ ^{εε} $ p<0.01 vs OVA+B. ad. 0.2; $ ^{λ} $ p<0.001 vs OVA+B. ad. 0.8; $ ^{ν} $ p<0.01 vs OVA+B. ad. 0.2

OVA存在下では、OVA+H-ASD+B. ad 0.2μg群の炎症細胞数はOVA単独群とH-ASD+B. ad 0.2μg群の値の相加的増加を示したが、OVA+H-ASD+B. ad 0.8μg群ではH-ASD+B. ad 0.8μg群と同レベルであった。OVA+H-ASD+B. ad 0.2μg群のBALF中のIL-5とMCP-3はH-ASD+B. ad 0.2μg群と比較し
て著しく増加していたが、OVA+H-ASD+B. ad 0.8μg群のIL-5はH-ASD+B. ad 0.8μg群と同レベルであり、MCP-3は2倍程度高かった。これらの結果はOVAにH-ASDとB. ad 0.2μgが加わるとアレルギー炎症が更に悪化されることを示すが、B. ad量が0.8μgになるとその反応が鈍ることが明らかとなった。血清中のOVA-特異的IgG1抗体産生に対するB. adとH-ASDのアジュバント作用が認められたが、B. ad+H-ASDの添加(OVA+H-ASD+B. ad)によって抗体産生能が更に増強した。

B. ad 2μgと8μgの曝露実験おけるBALF中の炎症細胞数は、B. ad低濃度曝露実験と同じように熱処理黄砂0.1mgを加えるとB. adの投与量に依存して著しい増加が認められた（図(1)-1)-5）。OVA + B. ad 2μgとOVA + B. ad 8μg群のBALF中の炎症細胞数（好中球、好酸球）はOVA、B. ad 2μg、B. ad 8μgの単独投与群に比較して相乗、相加的に増加していた。しかし、3者を加えたOVA + H-ASD + B. ad 2μg群やOVA + H-ASD + B. ad 8μg群ではむしろ低下する傾向を示していた。

図(1)-1)-5. Bjerkandera、熱処理黄砂（H-ASD）、OVAを気管内投与したマウスの肺洗浄液中の炎症細胞数

Bjerkandera (B. ad) 投与量 : 2 μ g or 8 μ g; 熱処理黄砂(H-ASD): 0.1 mg; OVA: 1 μ g. DataはM ± SEで示す。

$ ^{a}p<0.001 $ vs Control; $ ^{b}p<0.01 $ vs Control; $ ^{c}p<0.05 $ vs Control; $ ^{d}p<0.001 $ vs B. ad. $ _{2} $ ; $ ^{e}p<0.01 $ vs B. ad. $ _{2} $ ; $ ^{f}p<0.05 $ vs B. ad. $ _{2} $ ; $ ^{g}p<0.001 $ vs B. ad. $ _{8} $ ; $ ^{h}p<0.05 $ vs B. ad. $ _{8} $ ; $ ^{i}p<0.001 $ vs H-ASD; $ ^{j}p<0.01 $ vs H-ASD; $ ^{k}p<0.001 $ vs H-ASD+B. ad. $ _{2} $ ; $ ^{l}p<0.05 $ vs H-ASD+B. ad. $ _{8} $ ; $ ^{m}p<0.001 $ vs OVA; $ ^{n}p<0.01 $ vs OVA; $ ^{o}p<0.05 $ vs OVA; $ ^{p}p<0.001 $ vs OVA+H-ASD; $ ^{t}p<0.05 $ vs OVA+B. ad. $ _{2} $ ; $ ^{s}p<0.05 $ vs OVA+B. ad. $ _{8} $
一方、BALF中の$\mathrm{TGF}-\beta_{1}$(抗炎症性サイトカイン、修復時の線維芽細胞や平滑筋の增生を誘導)はこの3者を加えた群で著しく増加していた(図(1)-1)-6)。この結果から、3者を加えた2グループのBALF中の炎症細胞数の低下は$\mathrm{TGF}-\beta_{1}$の増加によって起こるものと考えられる。しかし、気管支粘膜下の線維芽細胞の增生による肥厚は$\mathrm{TGF}-\beta_{1}$の増加によって気道のリモデリング(気道の不可逆的修復反応)が進行していると思われる。この3者を加えた気道粘膜下の好酸球・リンパ球浸潤、気道粘膜上皮の粘液細胞増生は特に$\mathrm{OVA}+\mathrm{H}-\mathrm{ASD}+B.ad\;8\mu\mathrm{g}$群(図(1)-1)-7)で著しく、好酸球誘導にあずかるIL-5やMCP-3(図(1)-1)-6)も他のグループよりも著しく増加していた。

これらの結果からOVA抗原と共に、黄砂と比較的濃度の高いB. ad曝露を受けるとBALF中の炎症細胞数は減るものの気道のリモデリングへと進行して行くことが示唆された。血清中のOVA-特異的IgG1抗体産生に関しては低濃度B. adの結果と同様、B. adのアジュバント作用が認められた。

図(1)-1)-6. 肺洗浄液中のTh2サイトカインと好酸球誘導性ケモカインの変化

$$ 2\mu\mathrm{~g~or~}8\mu\mathrm{~g}; $$

$$ Data は M\pm SE で示 $$

$ ^{*} $ p<0.05 vs. Control; $ \dagger $ p<0.05 vs. B. ad 2; $ \ddagger $ p<0.05 vs. B. ad 8; $ \S $ p<0.05 vs. H-ASD; $ \# $ p<0.05 vs. OVA; $ \S $ p<0.05 vs. OVA+H-ASD; $ \& $ p<0.05 vs. OVA+B. ad 8.
図(1)-1)-7. Bjerkandera (B. ad)、加熱黄砂とOVAを投与したマウスの気道の病理組織学的変化(PAS染色)

## 4 ）発生地の異なる2種類の黄砂の気管支喘息モデルマウスへの影響

発生地や輸送経路の異なる2つの風送黄砂について気管支喘息モデルマウスを用いてアレルギーへの影響を調べた。その結果、OVAとASDの併用投与群において、BALF中の好酸球数(図(1)-1)-8は各々の単独投与群と比較して相乗的に増加し、特にOVA＋ASD2群でその増加が著しかった。また、好酸球の活性化に関与する肺洗浄液中のIL-5、MCP-3やEotaxin等も各々の単独投与群と比較して相乗的に増加した(表(1)-1)-1)。しかし、併用投与群間での差はみられなかった。病理学的な観察では、OVAとASDの併用投与群において気管支粘膜下への好酸球浸潤や気道上皮の粘液細胞化がみられ、その変化はOVA＋ASD1群よりもOVA＋ASD2群で著しかった(図(1)-1)-9)。

以上の結果から、両黄砂によって気管支喘息病態は悪化するが、ASD2においてその作用が強いことが明らかになった。ASD1はASD2よりもシリカを多く含むが、ASD2の付着物は大気汚染物質の硫酸塩（ $ SO_{4}^{2-} $ ）や硝酸塩（ $ NO_{3}^{-} $ ）、多環芳香族炭化水素（PAHs）、更にはグラム陰性菌のリポポリサッカライド（LPS）やβ-グルカンをASD1よりも多く含み、粒径もASD1と比較して小さい（PM2.5を多く含む）ことから、これらの成分や粒径の大きさがアレルギー反応の増悪と関連している可能性が示唆された。とくに次の5）の実験結果では、黄砂はTLR4を強く認識していることが明らかとなったことから、そのリガンドである微量のリポサッカライド（LPS）がアレルギーの増悪に関わっている可能性が示唆された。
図(1)-1)-8. イベントの異なる2つの黄砂の肺洗浄液中の炎症細胞の変化

$ ^{*}p < 0.01 $ vs. Control, $ ^{§}p < 0.001 $ vs. OVA, $ ^{¶}p < 0.01 $ vs. OVA, $ ^{i}p < 0.001 $ vs. ASD1, $ ^{‡}p < 0.01 $ vs. ASD1, $ ^{**}p < 0.001 $ vs. ASD2, $ ^{††}p < 0.001 $ vs. OVA+ASD1

表(1)-1)-1.2種類の黄砂の肺洗浄液中のサイトカイン発現の比較

Group *	Animals (n)	Cytokines (pg protein/ml)
IL-1 $ \beta $	IL-4	IL-5	IL-6	IL-12	IL-13	IFN- $ \gamma $
Control	8	ND	3.40 ± 0.29	ND	ND	ND	ND	ND
ASD1	8	33.7 ± 2.55 $ ^{\dagger} $	1.97 ± 1.05	ND	24.9 ± 3.44 $ ^{\S} $	280 ± 34.9 $ ^{\dagger} $	ND	ND
ASD2	8	37.9 ± 6.79 $ ^{\S} $	1.91 ± 0.68	20.8 ± 10.6	33.8 ± 9.19 $ ^{\dagger} $	225 ± 36.3 $ ^{\dagger} $	5.19 ± 2.44	ND
OVA	8	ND	1.17 ± 0.42	6.75 ± 3.49	ND	28.5 ± 16.0	ND	ND
OVA+ASD1	8	39.6 ± 11.0 $ ^{\S} $ $ ^{\ddagger} $	5.01 ± 1.99	163 ± 40.5 $ ^{\dagger} $ I $ ^{\S} $ $ ^{\S} $	32.6 ± 6.25 $ ^{\dagger} $ I	274 ± 50.0 $ ^{\dagger} $ I	36.5 ± 11.1 $ ^{\P} $ $ ^{\dagger\dagger\P} $ $ ^{\S} $	ND
OVA+ASD2	8	43.3 ± 9.79 $ ^{\dagger} $ I	7.11 ± 1.50 $ ^{\S} $ $ ^{\dagger} $ II	160 ± 25.4 $ ^{\dagger} $ I $ ^{\S} $ $ ^{\ddagger} $	19.4 ± 2.78	300 ± 38.8 $ ^{\dagger} $ I	55.1 ± 15.8 $ ^{\dagger} $ I $ ^{\S} $ $ ^{\ddagger\S} $	ND

$ ^{*} $ All values were expressed as mean ± SE. $ \dagger p < 0.001 $ vs. Control, $ \S p < 0.01 $ vs. Control, $ \P p < 0.05 $ vs. Control, $ \S p < 0.001 $ vs. OVA, $ \S p < 0.01 $ vs. OVA, $ \dagger \dagger p < 0.05 $ vs. OVA, $ \S \S p < 0.001 $ vs. ASD1, $ \S \S p < 0.05 $ vs. ASD1, $ \S \S p < 0.001 $ vs. ASD2, $ \S \S p < 0.05 $ vs. ASD2
図(1)-1)-9. イベントが異なる2つの黄砂の肺の病理学的な変化 (PAS染色) ASD単独投与ではADSD1群よりASD2群において気道炎症が強く発現している。 ASDを投与した群ではOVA+ASD1群よりもOVA+ASD2の方が気管支上皮の粘液細胞増生が強い。

## 5 ）Toll様レセプターノックアウト（TLRs KO）マウスの骨髓由来マクロファージを用いた黄砂の炎症増悪因子のスクリーニング試験

黄砂付着微生物由来の炎症起因物質（グラム陰性菌のリポポリサッカライド（LPS）・カビ成分のβ-グルカン）を明らかにする目的で、微生物の分子パターン認識センサーであるToll様レセプター(TLRs)ノックアウト（KO）マウス（TLR2KO、TLR4KO、MyD88KO）3種と野生型(WT)マウスの骨髓由来マクロファージを用いて、培養液中に放出された炎症性サイトカイン量を比較した。その結果、野生型マウス(WT)、TLR2KO、TLT4KO、MyD88KOマウス髄由来マクロファージ（BMDMs）を黄砂で刺激した時の培養液中に放出された炎症性サイトカインのIL-1β、IL-12、MCP-1、IL-6、TNF-α発現はTLR4（LPSの受容体）KOマウスよりTLR2（β-グルカンの受容体）KOマウスで高く、MIP-1αは同レベルであった（図(1)-1)-10）。一方、TLR2やTLR4のアダプター分子MyD88KOマウスではこれらの炎症性サイトカイン発現は見られなかった（図(1)-1)-10）。

以上の結果から、黄砂はTLR2よりもTLR4を強く認識していることが明らかとなり、TLR2のリガンドのβ-グルカン（カビ成分）やペプチドグリカン（グラム陽性菌）よりはTLR4のリガンドであるグラム陰性菌のリポポリサッカライド（LPS）が炎症性サイトカインの発現に関わっている可能性が示唆された。
図(1)-1)-10. 黄砂刺激骨髓细胞由来マクロファージ (BMDMs)の培養液中のサイトカイン発現量

## 6 ）黄砂から抽出した有機化学物質（Tar）のアレルギー喘息増悪作用に関する研究

黄砂に吸着した化石燃焼由来の有機化学物質（タール成分：Tar）のアレルギー喘息増悪作用の量-反応関係を明らかにする目的で、喘息モデルマウスに黄砂と共にTar 1μgと5μgの経気道曝露して、アレルギー炎症への影響を比較検討した。使用したTar中に含まれるPAHs濃度は表(1)-1)-2に示す。

その結果、肺洗浄液中の好中球はOVA + H-ASD群、これにTarを加えたOVA + H-ASD + Tar1μg群とOVA + H-ASD + Tar5μg群は変わらなかったが、好酸球はOVA + H-ASD + Tar1μg群で高い傾向を示し、OVA + H-ASD + Tar5μg群ではむしろ抑制傾向を示した(図(1)-1)-11)。アレルギー炎症を誘導するTh2サイトカインのIL-5やIL-13、好酸球誘導ケモカインのEotxinはOVA + H-ASD + Tar5μg群よりOVA + H-ASD + Tar1μg群で誘導された(図(1)-1)-12)。一方、気道の粘液細胞化や炎症細胞浸潤もOVA + H-ASD + Tar5μg群よりOVA + H-ASD + Tar1μg群で著しかった(図(1)-1)-13)。血中の抗体産生
に関しては、OVA + H-ASD + Tar 1μg群とOVA + H-ASD + Tar 5μg群ではOVA + H-ASD群より高いことからTarにはアジュバント作用があることが示された。

表(1)-1)-2. Tar中のPAHs含有量

Components	Concentration (ng/m^{3})	Concentration of ASD( $ \mu $ g/m^{3})	PAHs( $ \mu $ g/g ASD)	PAHs( $ \mu $ g/g Tar)
BaP	0.17	15.34	10.81	34.59
BkF	0.13	15.34	8.54	27.34
BghiP	0.25	15.34	16.29	52.11
BbF	0.10	15.34	6.49	20.77
BaA	0.29	15.34	18.79	60.14
BeP	0.84	15.34	54.52	174.48
BjF	0.44	15.34	28.80	92.16
Chr	0.26	15.34	17.11	54.76
Coronene	0.31	15.34	20.03	64.09
DaA	0.21	15.34	13.53	43.31
Flu	1.04	15.34	67.95	217.44
Indeno	0.59	15.34	38.20	122.25
Perylene	0.04	15.34	2.85	9.12
Pyr	0.35	15.34	22.84	73.08

BaP: Benzo(a)pyrene, Chr: Chrysene, BkF: Benzo(k)fluoranthene, Coronene,

BghiP: Benzo(ghi)perylene, DaA: Dibenzo(a,h)anthracene,

BbF: Benzo(b)fluoranthene, Flu: Fluoranthene, BaA: Benz(a)anthracene,

IdP: Indeno(1,2,3-cd)pyrene, BeP: Benzo(e)pyren, Perylene,

BjF: Benzo(j)fluoranthene, Pyr: Pyrene
以上の結果より、抗原と黄砂粒子にTar成分の3者が加わった時にアレルギー炎症が増悪されることが明らかとなった。しかし、Tar成分が多い場合（5μg）は、むしろアレルギー炎症が抑制される結果を得た。この結果から、黄砂に含まれている微量の化学物質もアレルギーの増悪に関わっている可能性が示唆された。

図(1)-1)-11. タール成分を投与したマウスの肺洗浄液中の炎症細胞数の変化

\[ All values were expressed as mean\pm SE.\

$$ ^{*}p<0.01vs.Control,^{\S}p<0.001vs.OVA,^{\P}p<0.01vs.OVA,^{\mathrm{I}}p<0.001vs.ASD1, $$

$$ \textcircled{*}_{p}<0.01vs.ASD1,**_{p}<0.001vs.ASD2,^{\dagger\dagger}_{p}<0.001vs.OVA+ASD1 $$
図(1)-1)-12. タール成分を投与したマウスの肺洗浄液中のサイトカイン・ケモカインの変化 All values were expressed as mean ± SE. *p<0.05 vs. control; †p<0.05 vs. Tar 1.0; ‡p<0.05 vs. Tar 5.0; §p<0.05 vs. H-ASD; &p<0.05 vs. H-ASD + Tar 1.0; #p<0.05 vs. H-ASD + Tar 5.0; ‡p<0.05 vs. OVA; ‡p<0.05 vs. OVA + Tar 1.0; γp<0.05 vs. H-ASD + OVA; ‡p<0.05 vs. H-ASD + OVA + Tar 1.0.

図(1)-1)-13. 黄砂と付着タール成分を投与したマウス気道粘膜上皮の粘液細胞增生 OVA + H-ASD + Tar 1 μ g群では気道上皮の著しい粘液細胞增生と気道粘膜下に著しい炎症細胞浸潤が認められる。
$$ All values expressed as mean\pm SE. $$

図(1)-1)-14. Toll様レセプターKOマウスの肺洗浄液中の炎症細胞の変化

$$ ^{a}p<0.05vs.WT Control,^{b}p<0.05vs.WT ASD,^{c}p<0.05vs.WT OVA, $$

$$ \begin{aligned}d_{p}&<0.05vs.WT OVA+ASD;e_{p}<0.05vs.TLR2^{-/-}Control,f_{p}<0.05vs.TLR2^{-/-}ASD,\end{aligned} $$

$$ \begin{aligned}g_{p}&<0.05vs.TLR2^{-/-}OVA,^{\mathrm{h}}p<0.05vs.TLR2^{-/-}OVA+ASD;^{\mathrm{i}}p<0.05vs.TLR4^{-/-}Control,\end{aligned} $$

$$ \mathrm{^{j}_{p}}<0.05vs.TLR4^{-/-}ASD,\mathrm{^{k}_{p}}<0.05vs.TLR4^{-/-}OVA,\mathrm{^{1}_{p}}<0.05vs.TLR4^{-/-}OVA+ASD; $$

$$ \text{m}_{p}<0.05vs.MyD88^{-/-}Control,\text{}\text{}_{p}<0.05vs.MyD88^{-/-}ASD,\text{}\text{}_{p}<0.05vs.MyD88^{-/-}OVA. $$

またTLR2KとTLR4KOマウスはアレルギー炎症（好酸球）を誘導するサイトカイン・ケモカインのIL-5、IL-13、Eotaxon、MCP-3、IL-12、KC(IL-8)に誘導が見られたが、MyD88KOでは殆ど誘導がなかった（図(1)-1)-15）。また野生型(WT)、TLR2KO、TLR4KOマウスでは血中の抗原特異的-IgE、IgG1が産生されているにも関わらず（図(1)-1)-16）、MyD88KOマウスでは全く誘導されなかった。肺の病理学的変化に関して、WT、TLR2KOとTLR4KOマウスの気道は粘液細胞が著しく増加し（図(1)-1)-17）、気管支粘膜下にも著しい好酸球やリンパ球の浸潤（図(1)-1)-18）が見られたが、炎症性サイトカインの誘導が見られなかったMyD88KOマウスは対照群の気道と殆ど変わらなかった（図(1)-1)-18）。これら結果から、黄砂のアレルギー増悪作用にはTLR2、TLR4とこれらのアダプター分子MyD88が非常に重要であること、TLR4のリガンドのLPSと共にTLR2のリガンドのβ-グルカンやペプチドグリカン（PGN）がアレルギーの増悪に関わっている可能性を示唆した（図(1)-1)-19）。更に、この結果から、Alumアジュバントが関わるNalp3 inflammasome系もこの増悪作用に関与していない可能性が示唆された。5）の細胞培養実験でも、黄砂はTLR2とTLR4を認識することは明らかであり、これらのリガンドがアレルギーの増悪に深く関わっていることが示唆された。
図(1)-1)-15. TLRs KOマウスの肺洗浄液中のサイトカインの変化.

All values were expressed as mean ± SE (n = 6),

*p<0.05 vs. WT Control; †p<0.05 vs. WT ASD; ‡p<0.05 vs. WT OVA;

§p<0.05 vs. WT OVA+ASD; ¶p<0.05 vs. TLR2-/-Control; &p<0.05 vs. TLR2-/-ASD;

#p<0.05 vs TLR2-/-OVA; £p<0.05 vs. TLR-/-OVA+ASD; ‡p<0.05 vs. TLR4-/-Control;

‡p<0.05 vs. TLR4-/-ASD; ‡p<0.05 vs. TLR4-/-OVA; ‡p<0.05 vs. TLR4-/-OVA+ASD;

‡p<0.05 vs. MyD88 Control; λp<0.05 vs. MyD88-/-ASD; Ip<0.05 vs. MyD88-/-OVA.

図(1)-1)-16. TLRs KOマウスの血清中の抗原特異的-IgEとIgG1の発現. All values were expressed as mean ± SE (n = 6) $ ^{*}p < 0.05 $ vs. WT OVA+ASD, $ ^{\dagger}p < 0.05 $ vs. TLR2-/- OVA+ASD.
図(1)-1)-17. WT, TLR KO, MyD88 KOマウスに生食, ASD単独, ASD+OVAを投与した気道 ASD+OVA投与したWT, TLR2KO, TLR4KOの気道上皮は著しい粘液細胞(黒矢印) が見れが, MyD88 KO マウスでは認められなかった。青矢印は気道粘膜下の炎症 細胞浸潤を示す。

図(1)-1)-18. OVA+ASDを投与した WT, TLR KO, MyD88KO マウスの気道粘膜下の変 化 (A) WT:OVA+ASD, (B) TLR2KO: OVA+ASD, (C) TLR4KO: OVA+ASD, (D) MyD88KO:OVA+ASD. (D)は気道粘膜下に好酸 球浸潤が見られない. A-D H&E stain.
図(1)-1)-19. Toll様受容体 (TLRs)による各種微生物成分 (LPS、ペプチドグリカン、β-グルカン)の認識
9）日本に飛来した黄砂のToll様レセプターノックアウト（TLRs KO）マウスの骨髓由来マクロファージを用いた炎症増悪因子のスクリーニング試験

日本に飛来した黄砂がどのTLRs（微生物由来の炎症起因物質に反応するセンサー：TLR4はリポポリサッカライド（LPS）；TLR2はβ-グルカンやペプチドグリカン）によって認識されるのかを、C57BL/6の野生型マウス(WT)、とTLR2欠損（KO）マウス、TLR4KOマウス、TLR2,4KOマウス、TLR7,9KOマウスとMyD88KOマウスの骨髓由来マクロファージ（BMDMs）を用いて培養液中に放出された炎症性サイトカイン量を比較した。マクロファージや樹状細胞などの抗原提示細胞の細胞表面や細胞質エンドゾームには病原体分子パターン認識受容体（TLRs）が存在し、様々な微生物（ウイルス、細菌、真菌等）の構成成分を認識し、シグナル伝達を介して炎症性サイトカインを産生すると共に獲得免疫を誘導する。MyD88はTLR3以外のTLRsのアダプター分子として有し、TLR3以外のTLRsシグナル経路により共有されている。TLR2はグラム陽性菌のペプチドグリカン（PG）や真菌のβ-グルカンを認識し、TLR4はグラム陰性菌のLPSを認識し、エンドゾームにあるTLR7やTLR9はウイルスRNAやDNAを認識する。これらのBMDMsを黄砂で刺激すると図(1)-1)-20に示すように、培養液中の炎症性サイトカイン（IL-6、MCP-1、MIP-1α等）発現はMIP-1α、

図(1)-1)-20. TLR KO BMDMsの細胞培養液の炎症性サイトカイン発現

TLRs KOマウスの骨髓由来マクロファージに日本に飛来した黄砂を添加。

12時間後の値 M ± SE.

*p < 0.05 vs. WT ASD, †p < 0.05 vs. TLR2-/- ASD, ‡p < 0.05 vs. TLR4-/- ASD, ‡p < 0.05 vs. TLR2,4-/- ASD, ‡p < 0.05 vs. MyD88-/- ASD.
IL-6、MCP1とTNF-αが示すようにβ-グルカン受容体のTLR2欠損と、LPSの受容体のTLR4が欠損したBMDMsでは野生型(WT)マウスのBMDMsに比べて減少し、β-グルカン+LPS受容体のTLR2,4の両方が欠損したBMDMsでは殆ど発現が見られなかった。またTLR2とTLR4のアダプター分子でもあるMyD88欠損したBMDMsでも発現が誘導されなかった。一方、β-グルカンやLPS受容体が働くことができるWTマウスやTLR7,9KOマウスのBMDMsのサイトカイン発現はそれらよりも高かった。この結果から、黄砂はマクロファージのTLR2やTLR4によって認識され、MyD88を介して炎症性サイトカイン類の発現が誘導されるものと考えられ、それらのリガンドである黄砂に付着したβ-グルカンやLPSがその誘導に係っていることが強く示唆された。

## 10 ）スギ花粉症モデルを用いた有機化合物質（Tar）のアレルギー増悪作用に関する研究

黄砂に付着した化石燃料燃焼由来タール成分のスギ花粉症増悪作用の量-反応関係を明らかにする目的で、スギ花粉とタール成分の低濃度と高濃度をマウスに点鼻曝露して増悪作用を比較した。その結果、抗原投与後20分間観察した鼻の掻痒感としての鼻かき回数は、対照群と比較して、どの群においても統計的に有意差は見られなかったが、Cryj1 + Tar 0.1μg群とCryj1 + H-ASD + Tar 0.1μg群で増加傾向を示した。NCLF（鼻腔洗浄液）中の好酸球数は、Cryj1 + H-ASD + Tar 0.1μg群で最も増加し、好酸球の遊走に関与するNCLF中のEotaxinと鼻の組織中のIL-13発現もこの群で最

図(1)-1)-21. 鼻腔洗浄液中の好酸球数とEotaxinの発現（上段）と鼻組織中のIL-13とIL-5の発現（下段）

$$ \mathbf{M}\pm\mathbf{S E.}\ \mathbf{\Gamma}_{p}^{\dagger}<0.05\ \mathrm{v s}. $$

$$ ^{\S}p<0.001vs. $$

$$ \textcircled{p}p<0.01\qquad\mathrm{v s.~C r y j1} $$

$$ {^\delta p<0.05vs.Tar;^\mathrm{I}p<0.001vs.Tar0.1\mu g;^\dagger\dagger p<0.05vs.Cryj1+Tar0.1\mu g;} $$

$$ ^{**}p<0.05vs.Cryj1+ASD;^{§§}p<0.05vs.Cryj1+H-ASD+Tar1\mu g $$