Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
も増加していた (図(1)-1)-21)。

鼻組織中のIL-5もこの群で増加傾向を示した。鼻の病理学的変化として、対照群、Tar 0.1μg群とTar 1μg群では、鼻粘膜下に好酸球や好中球の浸潤は認められなかった（図(1)-1)-22）。これに対し、Cryj1を投与したマウスでは、粘膜下組織や粘膜上皮内に好酸球の浸潤が見られた。その中でも特にCryj1 + H-ASD + Tar 0.1μg群における鼻粘膜下への好酸球浸潤が著しかった（図(1)-1)-22）。しかし、Cryj1 + H-ASD + Tar 0.1μgの鼻粘膜下への好酸球浸潤はCryj1 + H-ASD + Tar 0.1μg群よりも軽度であった。Cryj1を投与したマウスでは、鼻粘膜上皮細胞の增生や上皮細胞の丈が長くなる変化が認められ、特にCryj1 + H-ASD群やCryj1 + H-ASD + Tar 0.1μg群で著しかった（図(1)-1)-22）。さらにPAS染色では、Cryj1 + H-ASD + Tar 0.1μg群における鼻粘膜上皮細胞の肥大が認められ、粘膜下層において浮腫性変化も認められた。また、Cryj1 + H-ASD + Tar 0.1μg群では鼻粘膜上皮細胞に粘液栓も認められた（図(1)-1)-23）。

これらの結果より、 $ Cryj1 + H-ASD + Tar\ 0.1\mu g $ 群のスギ花粉症が強く起こっていたことから、加熱黄砂（H-ASD）に大気汚染物質由来のタール成分が加わるとスギ花粉によるアルギー性鼻炎が増悪されることが明らかとなった。

C

Cont

D

Cryj1

Tar 0.1μg

Cryj1 + Tar 0.1μg

F

Cryj1 + H-ASD

Cryj1 + H-ASD + Tar 0.1μg

図(1)-1)-22. スギ花粉症マウスモデルにおける黄砂と付着タール成分の鼻腔粘膜の変化 C~Fは鼻粘膜下に好酸球浸潤を認める. Cryj1+HASD+0.1μg群では好酸球浸潤が著しい。HE染色
Cont

Tar 0.1μg

Cryj1

Cryj1 + Tar 0.1 $ \mu $ g

Cryj1 + H-ASD

Cryj1 + H-ASD + Tar 0.1μg

図(1)-1)-23. スギ花粉症マウスモデルにおける黄砂と付着タール成分の影響 Cryj1, H-ASDとTar投与群では鼻粘膜上皮細胞の肥大と粘膜下層の浮腫性変化が認められる。PAS染色

## 11 ）Toll様レセプターノックアウト（TLRs KO）マウスを用いた黄砂と細菌毒素成分LPSのアレルギー喘息増悪作用に関する研究

黄砂に付着したLPSのアレルギー炎症増悪メカニズムを明らかにするために、BALB/c系の野生型（WT）とTLR2欠損（KO）、TLR4KO、MyD88KOマウスを用いて、アレルギー喘息モデルにて調べた。その結果、気管支・肺胞洗浄液（BALF）中の好中球数は野生型（WT）とTLR2KOマウスのLPS単独投与群では対照群に比較して有意な増加を示したが、H-ASD + LPS群とOVA + H-ASD + LPS群で著しい増加を示した。しかし、TLR4KOマウスは僅かであり、MyD88KOマウスでは殆ど増加が見られなく、好中球性の炎症は抑えられていた。OVAを投与した群では図(1)-1)-24に示すごとく、WTマウスではOVA + LPS群で好酸球数が増加し、OVA + H-ASD + LPS群では著しい好酸球数の増加が認められた。TLR2KOマウスのOVA + H-ASD + LPS群では好酸球数の増加を示したが、WTマウスのOVA + H-ASD + LPS群に比較して40%低かった。TLR4KOマウスではTLR2KOマウスの1/3程度となり、MyD88KOマウスは、殆ど好酸球誘導は認められなかった（図(1)-1)-24）。リンパ球に関しても好酸球と同様の傾向を示した。

4種類のマウスの鼻洗浄液中の好酸球誘導に係るケモカインのEotaxinや同誘導に係るTh2サイトカインIL-5発現（図(1)-1)-24）も、好酸球数とおおよそ対応していた。しかし、TLR4KOマウスやMyD88KOマウスのOVA+H-ASD群でもWTやTLR2KOマウスほどではないがそれらの発現が認められた。一方、血清中のOVA特異的IgEとIgG1の誘導はIL-5の発現と類似しており（図(1)-1)-25）、OVA+H-ASD群でもWTやTLR2KOマウスほどではないが誘導が見られた。
図(1)-1)-24. WT, TLR2KO, TL4KO, MyD88KOマウスの肺洗浄液中の好酸球数とIL-5の発現 M ± SE. A : 好酸球数 ; B : IL5の発現

肺の病理学的な観察では、WTとTLR2KOマウスのOVA+H-ASD+LPS群では気道上皮の粘液細胞増生や気道粘膜下の好酸球浸潤が顕著にみられたが、TLR4KOマウスではそれよりも弱く、MyD88KOマウスでは軽微、もしくは病態の発現が観察されなかった。

これらの結果から、WTやTLR2KOマウスでは、LPSは（OVA+H-ASDの存在下）TLR4を介してTh2の誘導と抗体産生を高めるが、TLR4KOマウスのOVA+H-ASD+LPS群でも弱いながもTh2への誘導（IL-5、IL-13増加）と抗体産生が見られ、また、MyD88KOマウスでは更に弱い誘導が認められた。TLR4欠損マウスのOVA+H-ASD群を見ると、弱いながらもTh2へのシフトと抗体産生
が見られていることから、TLR4KOマウスのOVA+H-ASD+LPS群のTh2への誘導はLPSの作用というよりは、むしろOVA+H-ASDによるTh2への誘導かも知れない。MyD88KOマウスを見ると、おおよそTh2への誘導が抑えられることから、H-ASDによる細胞障害がデインジャーングナルとなってTLR4やTLR2を介してTh2への誘導を起こしている可能性を示唆した。

図(1)-1)-25. OVAと加熱黄砂とLPSをTLRKOマウスに投与したマウスの血清中の

抗原特異的-IgEの変化.

$ M \pm SE $ . OVA = 4 $ \mu $ g; LPS = 50 ng 投与

$ ^{*}p<0.05 $ vs. control; $ \dagger p<0.05 $ vs. LPS; $ \ddagger p<0.05 $ vs. H-ASD; $ \S p<0.05 $ vs. H-ASD+LPS;

12) 黄砂付着レベルの細菌感染毒素成分LPSの肺炎増悪作用と抗原併用曝露によるアレルギー増悪作用に関する研究

LPSが黄砂のアレルギー増悪因子であることが確証するための再現実験として、滅菌黄砂（360℃30分加熱滅菌黄砂：H-ASD）、LPS+滅菌黄砂+卵白アルブミン（OVA）を気道曝露して、それぞれの増悪作用をマウス喘息モデルにて調べた。気管支・肺胞洗浄液（BALF）中の炎症細胞数に関して、LPS1ngは好中球の誘導を起こさず、LPS10ngでは若干の好中球数の誘導を認めた。H-ASD群も好中球数の増加は認められなかった。しかし、H-ASD+LPS1ng群では対照群比較して好中球の有意な増加を認め、H-ASD+LPS10ng群では著しい増加を認めた。OVA+LPS群や
OVA+H-ASD+LPS群のBALF中の好酸球数はOVA単独群と比較して有意な増加が見られ（図(1)-1)-26）、特にOVA+H-ASD+LPS1ng群で顕著であった。BALF中のサイトカイン類はLPS群ではLPS10ng群においてIL-12の有意な増加を認めたのみで、他のサイトカイン類の誘導は認められなかった。しかし、LPS10ngにH-ASDが加わるとIL-6、IL-12、TNF-αやRANTESが著しく誘導された。一方、OVA+H-ASD+LPS1ng群の好酸球遊走活性にあずかるIL-5やIL-13（図(1)-1)-27)の発現、血清中のOVA特異的IgE抗体産生量は他のOVA投与群と比較すると最も高かった（図(1)-1)-27)。肺の病理学的な観察においてもOVA+H-ASD+LPS1ng群では気道上皮の粘液細胞化や気道粘膜下の好酸球浸潤が顕著にみられた（図(1)-1)-28)。しかし、LPSを増量して投与したOVA+H-ASD+LPS10ng群ではOVA+H-ASD+LPS1ng群に比較すると、好酸球数やサイトカイン発現、抗体産生量はむしろ低下傾向を示した（図(1)-1)-26、27)。また、肺の病態も減じられていた（図(1)-1)-27)。

図(1)-1)-26. 黄砂, OVAとLPSを投与したマウスの肺洗浄液中の炎症細胞の変化

All values were expressed as mean ± SE (n = 8).

*p<0.05 vs. control; †p<0.05 vs. LPS 1; ‡p<0.05 vs. LPS 10; §p<0.05 vs. H-ASD; &p<0.05 vs. H-ASD + LPS 1; #p<0.05 vs. H-ASD + LPS 10; ‡p<0.05 vs. OVA; ‡p<0.05 vs. OVA + LPS 1; ‡p<0.05 vs. OVA + LPS 10; ‡p<0.05 vs. H-ASD + OVA; ‡p<0.05 vs. H-ASD + OVA + LPS 1
図(1)-1)-27. 肺洗浄液中のth2サイトカインIL-5とIL13の変化と血中OVA-特異的IgEとIgG1の変化

$$ ^{*}p<0.05vs.control;^{\dagger}p<0.05vs.LPS1;^{\ddagger}p<0.05vs.LPS10; $$

$$ \S_{p<0.05vs.H-ASD;\text{~\textregistered~}p<0.05vs.H-ASD+LPS1}; $$

$$ ^{\#}p<0.05vs.H-ASD+LPS10;^{\alpha}p<0.05vs.OVA; $$

$$ ⅱ p<0.05vs.OVA+LPS1;^{\beta}p<0.05vs.OVA+LPS10; $$

$$ ^{\gamma}p<0.05vs.H-ASD+OVA;^{\pounds}p<0.05vs.H-ASD+OVA+LPS1. $$

以上の結果より黄砂に付着しているレベルのLPS量は黄砂と共同することで、好中球性の肺炎を著しく悪化し、これに抗原（OVA）が加わることで好酸球性気道炎症（喘息様病態）を著しく悪化し、LPS量が10ngになるとその反応が抑制されることが明らかとなった。
A

図(1)-1)-28. 黄砂、LPSとOVAを経気道曝露したマウスの気管支の病理学的変化

(A)Control; (B) H-ASD + LPS 1 alone; (C) H-ASD + LPS 10; (D) OVA alone;

(E) OVA + LPS 1; (F) OVA + LPS 10; (G) H-ASD + OVA;

(H) H-ASD + OVA + LPS 1; (I) H-ASD + OVA + LPS 10.

(A−I) PAS stain; bar = 50 μm.
（２）黄砂エアロゾル及び付着微生物・化学物質による生殖器系への影響とそのメカニズム解明

１）砂イベントの異なる２種類の風送黄砂の雄性生殖機能への影響

複数の黄砂イベントにおける雄性生殖機能への影響を明らかにすることを目的に、2011年に発生した2つの黄砂イベント時に採取した風送黄砂を成獣に経気道曝露して、精子形成や精子性状、性ホルモン等への影響を比較検討した。その結果、黄砂曝露による造精機能に対する影響を検討したところ、DSPが対照群と比較して、ASD1群で24%減少した(表(1)-2)-1)。ASD2

表(1)-2)-1. 成獣の黄砂曝露による造精機能への影響

群の造精機能に有意な変動は認められなかった。また、精細管の一部空胞化がASD1群で生じ、さらに精細間質水腫がASD1群およびASD2群で認められた（図(1)-2)-1）。これらのことから、ASD1によるDSPの低下は精細管の空胞化が関与する可能性が示唆された。

对照群	ASD1群	ASD2群
DSP( $ \times $ 10 $ ^{6} $ )	12.3 $ \pm $ 4.00	9.4 $ \pm $ 2.10 $ ^{*} $	11.9 $ \pm $ 3.98
DSP/g( $ \times $ 10 $ ^{6} $ )	19.2 $ \pm $ 5.72	16.1 $ \pm $ 4.05	19.6 $ \pm $ 6.11

平均值±标准偏差 $ *: p < 0.05 $

図(1)-2)-1．黄砂曝露による精巣組織への影響

ASD1群において精細管の空胞化、精巣間質の水腫が認められる。

ASD2群において精巣間質の水腫が認められる。

HE染色; bar = 100 $ \mu $ m.

黄砂曝露による精子性状に対する影響を検討したところ、精子運動率が対照群と比較してASD1群で17%減少した(表(1)-2)-2)。一方、ASD2群の精子性状に有意な変動は認められなかった。黄砂曝露による血清ホルモンに対する影響を検討したところ、血清テストステロン濃度

表(1)-2-2. 成獣の黄砂曝露による精子運動率への影響

对照群	ASD1群	ASD2群
n=16	n=16	n=16
Motility	0.62 $ \pm $ 0.11	0.52 $ \pm $ 0.15 $ ^{*} $	0.54 $ \pm $ 0.10
Progressive	0.28 $ \pm $ 0.07	0.24 $ \pm $ 0.09	0.24 $ \pm $ 0.06
Non-Progressive	0.33 $ \pm $ 0.06	0.27 $ \pm $ 0.06 $ ^{**} $	0.30 $ \pm $ 0.05

平均值±标准偏差 $ *: p < 0.05, **: p < 0.01 $
は対照群と比較して ASD1 群で約 3 倍増加した。一方 ASD2 群の血清テストステロン濃度に有意な変動は認められなかった (表(1)-2)-3)。

表(1)-2)-3. 成獣の黄砂曝露による血清ホルモンへの影響

对照群	ASD1群	ASD2群
n=8	n=8	n=8
T (ng/ml)	10.65±7.46	33.05±24.65 $ ^{*} $	8.61±7.89
LH (ng/ml)	1.73±3.34	4.91±4.47	1.32±3.16
FSH (ng/ml)	0.03±0.07	0.00±0.00	0.00±0.00
平均值±横準偏差	$ ^{*} $ : p < 0.05

## 2 ）黄砂に付着した微生物の雄性生殖機能への影響

黄砂に付着した微生物の雄性生殖機能への影響を明らかにすることを目的に、熱処理黄砂と微生物（Nocardiopsis）をマウスに経気道曝露して精子形成や精子性状、性ホルモンへの影響を検討した。その結果、黄砂の影響因子の解明を行うため、ASD1により変動が認められた造精機能について黄砂付着微生物のNocardiopsisを用い検討した結果、DSPが対照群と比較してNocardiopsis群で35%減少した(表(1)-2)-4)。

表(1)-2)-4. 成獣に対する黄砂付着微生物による造精機能への影響

对照群n=14	微生物群n=12
DSP( $ \times $ 10 $ ^{6} $ )	14.9±4.9	9.6±3.9 $ ^{**} $
DSP/g( $ \times $ 10 $ ^{6} $ )	22.9±7.6	16.5±5.9 $ ^{*} $

平均值±标准偏差 $ ^{*} $ : p<0.05 $ \^{**} $ : p<0.01

## 3 ）黄砂付着生物成分LPSの雄性生殖機能への影響に関する研究

黄砂に付着している微生物（グラム陰性桿菌）の構成成分による雄性生殖機能への影響に関する量-反応関係を明らかにする目的で、マウスにLPSを経気道曝露して、造精機能、精子性状への影響を比較検討した。その結果、加熱黄砂(H-ASD)投与あるいはLPS投与により、対照群と比較して精細管障害割合が有意に増加した。特にLPS-100ngを投与したLPS-100ng群およびH-ASD+LPS-100ngでその増加割合が高かった（図(1)-2)-2）。また、造精機能はLPS投与により、濃度依存的に低下した。H-ASDもこれまでの知見通り、造精機能を低下させたが、H-ASDとLPSを併用処
理しても造精機能の低下はH-ASDによる低下効果に対し相乗、相加効果を示すものではなかった。精子性状はLPSにより有意な影響は生じなかった。

図(1)-2)-2. 微生物構成成分LPSおよび加熱黄砂による造精機能への影響

## 4 ）黄砂から抽出した有機化合物質の雄性生殖機能への影響に関する研究

黄砂に吸着した化石燃焼由来の有機化合物（タール成分）の雄性生殖機能への影響に関する量-反応関係を明らかにする目的で、マウスにタール成分の超低濃度～高濃度経気道曝露して、造精機能、精子性状への影響を比較検討した。その結果、精巣一日精子産生能（DSN）はTar0.04μg群、Tar0.2μg群、Tar1μg群、H-ASD+Tar0.04μg群及びH-ASD+Tar0.2μg群で対照群と比較して、それぞれ27.3%、43.2%、21.6%、33.8%、36.7%有意に低下した（p<0.01、p<0.001、p<0.01、p<0.001、p<0.001）(図(1)-2)-3)。それ以外の項目で有意な変動は認められなかった。黄砂付着有機化合物の投与による精子性状に対する影響を検討したところ、精子性状の悪化は認められなかった。以上より、黄砂付着タール成分は、黄砂による造精機能の低下に関与するが、精子性状の悪化には関与しないことが明らかになった。

図(1)-2)-3. 黄砂付着タール成分による造精機能への影響
## 5 ）運動精子に対する黄砂の影響

黄砂が精子性状を悪化させることが昨年度示されたが、その影響は、黄砂が直接精子性状を悪化させるのか、精子形成過程等に影響し間接作用で悪化させるのか明らかにする目的で、マウス精巣上体尾部から運動精子を調整し、黄砂及びタール成分を曝露し、精子性状への影響を検討した。その結果、BP処理により、運動率はBP処理20～40分後においてコントロール群と比較して有意に低下した（図(1)-2)-4）。精子平均移動速度（VCL）も処理20～40分後においてコントロール群と比較して有意に低下した（図(1)-2)-4）。その他、VSL（直線速度）、VAP（進行方向速度）、LIN（直線移動性）の項目においても有意な低下が認められた。

図(1)-2)-4. 北京降下煤塵 (BP) による in vitro 精子性状への影響

以上より、本評価系を用い、黄砂及び構成成分による運動精子に対する精子性状の評価が可能であると考えられた。そこで、本評価系を用い、黄砂、加熱黄砂及び黄砂付着タール成分による精子性状への影響を評価したところ、黄砂処理により運動率などの項目で精子性状の悪化が認められたが、加熱黄砂やタール成分では認められなかった。このことから、黄砂は直接精子性状を悪化させるが、その寄与因子として、黄砂本体やタール成分以外の構成成分であることが示唆された。

## 6 ）胎仔期風送黄砂曝露による雄性出生仔マウスの生殖機能への影響

黄砂の胎仔期曝露による出生仔雄性生殖機能への影響を明らかにするために、ICR系妊娠マウ

スに0.2 mgのASD1黄砂を妊娠7日目及び14日目に気管内投与した。出生仔は対照群とASD群に分け、それぞれ5週齢（5wk対照群、5wk ASD）、10週齢（10wk対照群、10wk ASD群）で雄性生殖機能を検討した。その結果、出産率、出産仔数に有意な変動は認められなかったが（表(1)-2)-5）、出生仔の性比は対照群と比較してASD1群において雄の出生比が0.54から0.40に減少

表(1)-2)-5. 黄砂曝露による出産率・出生仔数・性比への影響

对照群	ASD群
n=16	n=12
出座率	19/20	16/20
出生仔数	277	212
(♂150 ♀127)	(♂91 ♀121)

平均值±標準偏差
した (図(1)-2)-5)。

図(1)-2)-5. 胎仔期黄砂曝露による出生仔性比への影響

妊娠マウスに黄砂を曝露すると出生仔の性比は有意に雄が小さくなった。

$ ^{*} $ : p < 0.05

精巣重量及び精巣上体重量を測定し、黄砂曝露による影響を検討した。精巣重量は5wk対照群と比較して、5wk ASD群の精巣重量が15%減少した。また、精巣上体重量は5wk対照群と比較して、5wk ASD群の精巣上体重量が17%減少した。それ以外の項目では有意な変動は認められなかった。出生仔の造精機能への影響を検討したところ、DSPは10wk対照群と比較して10wk ASD群で31%減少した。それ以外の項目で有意な変動は認められなかった（図(1)-2)-6）。一方、精巣組織像は5wkの出生仔において、精細管の空胞化や10wkの出生仔において、精上皮の離脱などが確認され、造精機能に影響が生じる所見が認められた（図(1)-2)-7）。

精子性状に対する影響を検討したところ、5wk ASD群では、精巣上体尾部中で精子は観察されなかったため、10wk ASD群のみ行った。10wk対照群と比較して10wk ASD群でVSL、LIN、STRがそれぞれ有意に13%、9%、5%低下した。それ以外の項目で有意な変動は認められなかった。

血清ホルモンに対する影響を検討したところ、血清T値、LH値、FSH値に有意な変動は認められなかった。

図(1)-2)-6. 胎仔期黄砂曝露による精巣重量および造精機能への影響
図(1)-2)-7. 胎仔期黄砂曝露による雄性出生仔の精巣組織への影響 ASD1群において精細管の空胞化、精巣間質の水腫が認められる。 また、精上皮の離脱なども認められる。

以上、黄砂は雄性マウスの造精機能の低下や精子性状を悪化させ、雄性生殖機能に悪影響を与えることを見いだした。造精機能の低下は黄砂付着微生物やその構成成分、あるいは黄砂付着有機化合物によっても生じることが明らかになった。しかし、その影響は、黄砂粒子単独でも認められ、今後より詳細な造精機能の低下に寄与する因子の探索・同定が必要である。一方、精子性状への影響に関して、黄砂粒子本体では影響が生じないことから、黄砂に付着している何らかの成分が影響因子と考えられたが、今回検討した微生物由来成分や有機化合物では影響が認められず、今後、確立した精子性状への影響解析のスクリーニング手法を用いて影響因子の解明が必要である。また、黄砂を妊娠マウスに投与し、雄性出生仔に与える影響を評価したところ、黄砂の胎仔期曝露により、雄性出生仔数が低下し、さらに、出生した雄性仔マウスの生殖機能も精巣重量、精巣上体重量の低下、造精機能の低下、精子性状の悪化が認められ、黄砂胎仔期曝露が出生仔雄性生殖機能を低下させることを見いだした。
（３）免疫担当細胞と気管支上皮細胞における黄砂エアロゾル及び付着微生物・化学物質の影響解明

## 1 ）黄砂が気道上皮細胞に及ぼす影響

3種類の黄砂を、それぞれ曝露した後、気道上皮細胞の細胞活性を検討した。何れの黄砂曝露群もコントロール群と比較して、濃度依存的に細胞活性の低下が確認された。一方、同濃度の黄砂間で比較を行うと、30および90 μg/mL曝露群において、ASD2は、ASD1より高い細胞活性を示し、各黄砂イベントにより影響が異なる可能性が示唆された（図(1)-3)-1）。次に、各黄砂を曝露した後、気道上皮細胞のIL-6、IL-8の液性因子産生に及ぼす影響について検討した。ASD1およびASD2を曝露した気道上皮細胞の培養上清中のIL-6およびIL-8量は、曝露濃度依存的に増大した。一方、H-ASD1曝露は、明らかな変化をきたさなかった。また、90 μg/mLにおいて、ASD2曝露によるこれらのサイトカイン産生誘導は、ASD1曝露に比較し、有意に低かった。ASD1と比較し、H-ASD1曝露時のサイトカイン産生は有意に低値を示した（図(1)-3)-2、図(1)-3)-3）。次に、ICAM-1発現量を検討したところ、黄砂曝露後のmRNA量は、ASD1およびASD2の曝露によって、濃度依存的に増

$ ^{*} $ Significantly different from control group (p<0.05)

$ ^{*} $ Significantly different from control group (p<0.05)

図(1)-3)-2. 黄砂の24時間曝露が気道上皮細胞のIL-6産生に及ぼす影響

図(1)-3)-1. 黄砂の24時間曝露が気道上皮細胞の細胞活性に及ぼす影響

$ ^{#} $ Significantly different from the same concentration of ASD1 group $ (p<0.05) $ .

図(1)-3)-3. 黄砂の24時間曝露が気道上皮細胞のIL-8産生に及ぼす影響

$ ^{#} $ Significantly different from the same concentration of ASD1 group $ (p<0.05) $ .

$ ^{*} $ Significantly different from control group (p<0.05)

$ ^{#} $ Significantly different from the same concentration of ASD1 group $ (p<0.05) $ .
大したが、その増加率はASD1の方が有意に大きかった。一方、H-ASD1を曝露した細胞のICAM-1 mRNAには変化は認められなかった（図(1)-3)-4）。細胞表面分子ICAM-1の発現は、ASD1およびASD2の曝露によって、コントロールと比較して、その増加が確認されたが、H-ASD1曝露では、誘導は認められなかった（data not shown）。培養上清中のsICAM-1量は、ASD1及びASD2の90 μg/mL曝露群において、コントロールと比較して発現量が有意に増加した。同濃度の黄砂間を比較すると、90 μg/mL曝露においてH-ASD1がASD1より低値を示した（図(1)-3)-5）。

Mucin-1 mRNA量は、90 μg/mL ASD1曝露群においてコントロールと比較して僅かに増加したが、ASD2およびH-ASD1では有意な変化は認められなかった（data not shown）。

以上より、各黄砂イベントにより、気道上皮細胞が被る影響作用は、異なることが明らかとなった。また、多くの影響指標の変化は、加熱処理により有意な軽減を示したことから、その影響は黄砂に付着した様々な熱易变性の生物学的要因や化学的要因が関与している可能性も示された。一方、IL-6、IL-8、ICAM-1等の炎症性分子は、健康影響をきたす内在メカニズムとして重要な役割を演じていることが示唆されると共に、健康影響のバイオマーカーとしても有用である可能性が示された。

図(1)-3)-4. 黄砂の4時間曝露が気道上皮細胞のICAM-1遺伝子発現に及ぼす影響

$ ^{*} $ Significantly different from control group (p<0.05)

$ ^{#} $ Significantly different from the same concentration of ASD1 group $ (p<0.05) $ .

図(1)-3)-5. 黄砂の24時間曝露が気道上皮細胞のsICAM-1産生に及ぼす影響

$ ^{*} $ Significantly different from control group (p<0.05)

$ ^{#} $ Significantly different from the same concentration of ASD1 group $ (p<0.05) $ .

2）黄砂が免疫担当細胞に及ぼす影響

3 種類の黄砂を、それぞれ曝露した後、BMDC の細胞表面分子 DEC205 の発現について評価した。ASD1 及び ASD2 を曝露した BMDC の DEC205 陽性細胞率は、曝露濃度依存的に増大した。一方、加熱黄砂である H-ASD1 曝露時は、コントロールと比べ、発現量の明らかな変化が認められなかった (図(1)-3)-6)。

3 種類の黄砂を、それぞれ曝露した後、マウス脾細胞の細胞増殖能について検討したところ、ASD1 及び ASD2 を曝露したマウス脾細胞の細胞増殖能は増大した。一方、加熱黄砂である
H-ASD1 曝露時は、コントロールと比べ、細胞増殖能の明らかな変化は認められなかった(図(1)-3)-7)。次に、細胞増殖の認められる細胞種を検討するため、T細胞マーカーTCRの発現を検討したところ、ASD1およびASD2の曝露によってTCR陽性細胞率の増加は認められなかった(data not shown)。従って、T細胞以外の細胞が増殖している可能性が考えられた。

以上より、各黄砂イベントにより、免疫担当細胞が被る影響作用は、異なることが明らかとなった。また、影響指標の変化は、加熱処理により有意な軽減を示したことから、その影響は黄砂に付着した熱易变性の様々な生物学的要因や化学的要因が関与している可能性も示された。一方、DEC205といった異物認識に関与する分子は、健康影響をきたす内在メカニズムとして重要な役割を演じていることが示唆されると共に、健康影響のバイオマーカーとしても有用である可能性が示された。

図(1)-3)-6. 黄砂の24時間曝露がBMDCの細胞表面分子DEC205発現に及ぼす影響

$ ^{*} $ Significantly different from control group (p<0.05)

$ ^{#} $ Significantly different from the same concentration of ASD1 group $ (p<0.05) $ .

図(1)-3)-7. 黄砂の24時間曝露が脾細胞の細胞増殖に及ぼす影響

$ ^{*} $ Significantly different from control group (p<0.05)

$ ^{#} $ Significantly different from the same concentration of ASD1 group $ (p<0.05) $ .

3）黄砂関連生物成分 Bjerkandera が気道上皮細胞と免疫担当細胞に及ぼす影響

気道上皮細胞に、Bjerkandera（Bjer）単独およびBjer+H-ASDを曝露したところ、何れの曝露群においても、コントロールと比較して、細胞活性、液性因子IL-6、IL-8、sICAM-1（IL-25、IL-33は検出限界以下）の産生、細胞表面分子Dectin-1の発現に著しい変化は確認されなかった（data not shown）。

BMDCに、Bjer単独およびBjer + H-ASDを曝露したところ、Bjer単独曝露では、コントロールと比較して、濃度依存的に細胞表面分子DEC205およびCD86陽性細胞率の増加が認められた。同様に、Bjer + H-ASD曝露においても、Bjer単独曝露と同程度のDEC205およびCD86陽性細胞率の増加が確認された（図(1)-3)-8、図(1)-3)-9）。一方、その他の分子に関しては、有意な増加は認められなかった。
脾細胞に、Bjer単独、Bjer + H-ASDを曝露したところ、何れの曝露においても、コントロールと比較して、脾細胞増殖能の増加は認められなかった。また、TCR陽性細胞率の変化も認められなかった（data not shown）。

以上より、黄砂関連生物成分であるBjerは、気道上皮細胞や脾細胞ではなく、免疫応答の開始細胞である、BMDCに影響を及ぼすことが示された。

図(1)-3)-8. BjerkanderaおよびH-ASDの24時間曝露がBMDC細胞の細胞表面分子DEC205発現に及ぼす影響

$ ^{*} $ Significantly different from control group (p<0.05)

図(1)-3)-9. BjerkanderaおよびH-ASDの24時間曝露がBMDC細胞の細胞表面分子CD86発現に及ぼす影響

$ ^{*} $ Significantly different from control group (p<0.05)

$ ^{\dagger} $ p<0.05 versus Bjerkandera-exposed group at the same concentration.
## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

（1）黄砂エアロゾル及び付着微生物・化学物質による呼吸器・免疫系への影響とそのメカニズム解明

1）黄砂付着微生物の中からアレルギーを増悪する真菌（Bjerkandera：Bjer）が見出され、またこの菌種自身がアレルギー炎症を引き起こす抗原となりうることが明らかとなったことは科学的意義が大きい。また、黄砂と抗原存在下で、Bjer真菌の曝露を受けると気道のリモデリング（不可逆的な気道障害）へと進行することか分かった。最近このBjer真菌は真菌関連慢性咳嗽との関連性が報告されており、この真菌と共存する黄砂の役割が注目されていることから、本成果の意義は大きいものと考える。

2）熱処理によって付着有機物を除去した黄砂本体にもアレルギー反応を高める作用があることが明らかとなったことは科学的に意義あるものである。

3）イベントの異なる黄砂はアレルギー反応に違いがあることが分かった。アレルギー増悪作用の違いはシリカが多い黄砂よりも、リポポリサッカライド (LPS)が多い黄砂の方が、増悪作用が強いことが分かったことは科学的に意義あるものである。

4）黄砂バイオエアロゾルの中の真菌Bjerkanderaにスギ花粉症を増悪する作用が見出された。更に黄砂はスギ花粉やこの真菌のアレルギー炎症を悪化することを見出した。黄砂飛来時期にはスギ花粉や真菌関連慢性咳嗽を起こすBjerkandera担子菌も飛散するため、今回の結果は健康問題を考える上では科学的な意義が大きい。

5）黄砂に吸着した有機化合物（タール成分）が気道のアレルギー炎症を増悪することが分かった。しかし、その曝露量が多ければアレルギー炎症に対して抑制的に働くことも明らかとなった。またタール成分には抗体産生（抗原特異的-IgE）を高める作用が有ることも分かったことは科学的意義が大きい。

6）微生物の分子パターンを認識するToll様レセプター（TLRs）ノックアウト（KO）マウスの骨髓由来マクロファージを用いたin vitro実験から、黄砂はTLR2よりもTLR4を介したシグナル伝達経路によって炎症性サイトカイン産生を高めることが分かり、TLR4リガンドであるLPSが炎症惹起に関与していることが分かった。

7）TLR KOマウスのin vivo実験では、黄砂のアレルギー増悪作用にはアダプター分子のMyD88が必修であり、TLR2とTLR4のリガンド（LPS、β-グルカン、ペプチドグリカン）が黄砂の増悪因子として見出されたことは科学的に非常に意義がある。

8）TLR2KO、TLR4KO、TLR2/4KO、TLR7/9KOマウスとMyD88KOマウスの骨髓由来マクロファージを使った実験で、日本に飛来した黄砂は抗原提示細胞（マクロファージ）のTLR4やTLR2に認識されることが分かったことは科学的意義が大きい。

9）黄砂に含まれる微量のタール成分がスギ花粉症のアレルギー性鼻炎を悪化することを見出した。
10）市販のLPSを用いた喘息再現実験で、微量のLPSが抗原（OVA）と滅菌黄砂の存在下、Th2を活性化してアレルギー炎症（アレルギー喘息）を悪化させることを突き止めた。この実験で黄砂に付着した微量のLPSがアレルギー増悪に関わっていることを確証できたことは意義が大きい。

11）TLR2KOとTLR4KOマウスによる市販のLPSを用いた喘息再現実験で、LPSはTLR4を介してTh2への誘導を起こすことを確証した。また、TLR4欠損マウスのOVA+H-ASD+LPS群でもTh2への弱い誘導（IL5発現、IgE抗体産生、好酸球増加）が起きたが、OVA+H-ASD群でも同じレベルで弱いTh2への誘導が起きた。この誘導は、LPSが作用するというよりは、むしろ滅菌黄砂によって起こる細胞障害によるデインジャーシグナル等がTLR2等を介してTh2への誘導を起こしている可能性が考えられ、黄砂のアレルギー増悪作用を今後検討する上では科学的に意義が大きい。

12) LPSが黄砂のアレルギー増悪因子であることが確証できたことから、黄砂エアロゾル中のLPSは疫学研究による増悪因子の指標としても活用できると考える。

（２）黄砂エアロゾル及び付着微生物・化学物質による生殖器系への影響とそのメカニズム解明

１）黄砂イベントことの黄砂の違い（付着物や成分の違い）により、雄性生殖機能に生じる影響が大きく異なること、付着微生物や微生物構成成分（LPS）、黄砂付着有機化合物（Tar）がこれらに寄与している可能性を見いだした。

2）タール成分の量-反応試験で、タール成分が黄砂中に0.04%～0.2%含まれていれば雄性生殖機能の悪化が生じる可能性があることが分かった。しかし、その量が多い場合、雄性生殖機能に影響を与えない、逆U字効果があることも示唆された。

3）運動精子を用いたin vitro実験から、黄砂が直接精子性状を悪化させることを示したが、その原因物質の同定には至っておらず、今後解明が必要である。また、より低濃度の黄砂で検討する必要もある。

4）妊娠マウスに黄砂を曝露すると、雄性出生仔数が低下すること、また、出生した仔マウスの雄性生殖機能も低下することを初めて見いだし、この学術的意義は大きなものである。

（３）免疫担当細胞と気管支上皮細胞における黄砂エアロゾル及び付着微生物・化学物質の影響解明

1）熱易変性の黄砂付着微生物や化学物質の含有量の相違が健康影響の相違に寄与する可能性を、呼吸器系と黄砂の最初の物理化学的接点である気道上皮細胞、樹状細胞や脾臓細胞などの免疫担当細胞を用いた実験研究によって明らかにできた。この結果は黄砂イベントによって健康影響に相違がある可能性を示唆するもので、学術的に価値ある知見である。

2）黄砂と挙動を共にするBjerkandera真菌が健康影響に関与する可能性を、その作用点である細胞・分子レベルで明らかにすることができた。この真菌が黄砂日のバイオマーカー候補として上げられたことは、人の健康影響を考える上で価値ある。
## （２）環境政策への貢献

＜行政が既に活用した成果＞

特に記載すべき事項はない。

## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

（１）黄砂エアロゾル及び付着微生物・化学物質による呼吸器・免疫系への影響とそのメカニズム解明

1) アレルギー喘息や花粉症おける黄砂のアレルギー増悪要因が黄砂に付着した微生物成分（LPS、β-グルカン、ペプチドグリカン）や大気汚染物質由来の有機化学物質（タール）であること、黄砂から有機成分を取り除いたミネラル粒子本体にアレルギー反応を高める作用があることを提示した。これらのエビデンスは、黄砂現象時にアレルギー疾患が悪化するという疫学調査の結果に生物学的妥当性を付与するものであり、行政による黄砂の健康影響や健康被害を見極めるための科学的な根拠資料として役立てることができると考える。

2）黄砂付着微生物のアレルギー増悪メカニズムを解明し、提示することができた。この成果は健康被害の未然防止策・軽減策に関連する環境政策の基礎資料として貢献できると考える。

3）黄砂と挙動を共にするビルカンデラ真菌はアレルギー抗原と増悪因子なりうることを提示することができたことから、国民に黄砂の危険性を警鐘・周知することで、黄砂飛来時の自己防衛に繋げると共に、国民の安全と安心に寄与することがきる。

4）これらの研究成果を多くの科学雑誌に公表することで、健康影響に関する国際的共通理解を形成することができたと考える。今後も多くの成果を公表し黄砂の危険性を警鐘して、国際的な黄砂発生の低減策の取組みに繋げたい。また、本研究の成果は国内や国際的な黄砂問題を解決するための環境政策上の基礎資料として役立てることができると考える。

（２）黄砂エアロゾル及び付着微生物・化学物質による生殖器系への影響とそのメカニズム解明

1）これまで黄砂の健康影響として、呼吸器系、循環器系や免疫系への影響を中心に評価が進んできたが、それ以外に、雄性生殖系に影響を与えることを明らかにした。

2）胎仔期に黄砂曝露を受けると雄性出生仔の生殖機能が悪化することを明らかにした。

3）これらの実験研究の知見をもとに、ヒトにおける健康影響評価を行い、次世代影響を含めた健康被害予防対策や関連する政策の立案等に役立てたい。
（３）免疫担当細胞と気管支上皮細胞における黄砂エアロゾル及び付着微生物・化学物質の影響

1）細胞・分子レベルにおける研究成果から、広域・越境汚染に由来するイベントの異なる黄砂や成分の相違が、健康影響の相違や変動に寄与する可能性を提示した。この成果は、疫学調査結果に生物学的妥当性を付与するものである。

2）この研究においてBjerkandera真菌がヒトの健康影響要因であることを明らかにしたが、今後も免疫担当細胞や気管支上皮細胞を用いて影響要因を絞り込み、明らかにできれば、黄砂に付着した成分の健康影響要因を決定することができ、今後の予防対策の確立等にも役立てることができる。さらに、国内や国際的な黄砂問題を解決するための政策上の基礎資料としても役立つと考える。

### 6. 国際共同研究等の状況

黄砂の健康影響やそのメカニズム、種々の健康問題を解決するには中国側の協力が不可欠である。サブテーマ（1）の研究代表者（市瀬）は中国藩陽市にある中国医科大学公共衛生学院、院長の孫貴范教授と黄砂やPM2.5の健康影響に関する共同研究を進めている。藩陽市でサンプリングした黄砂やPM2.5を日本で分析し、健康への影響も実験研究によって調べており、お互いの協力により中国との関係も極めてよい状況にある。研究代表者の研究室において孫教授の研究室の博士課程（前期課程および後期課程）の学生2名の研究指導にあたった。また、黄砂の健康影響のテーマで中国医科大学博士課程にて博士号を取得したリサーチフェロー1名がサブテーマ（1）の研究分担者として本研究に従事して、その成果を多くの学会や学術誌に発表した。

## 7 ．研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

## <論文（査読あり）>

1) M. HE, T. ICHINOSE, S. YOSHIDA, S. YAMAMOTO, K. INOUE, H. TAKANO, R. YANAGISAWA, M. NISHIKAWA, I. MORI, G. SUN, T. SHIBAMOTO: Asian sand dust enhances murine lung inflammation caused by Klebsiella pneumoniae. Toxicol Appl Pharmacol, 2012. 15, 258(2), 237-247.

2) M. HE, T. ICHINOSE, S. YOSHIDA, H. TAKANO, M. NISHIKAWA, I. MORI, G. SUN, T. SHIBAMOTO: Aggravating effects of Asian sand dust on lung eosinophilia in mice immunized beforehand by ovalbumin. Inhal Toxicol, 2012. 24(11):751-761.

3) S. YOSHIDA, H. TAKANO, M. NISHIKAWA, H. MIAO, T. ICHINOSE: Effects of fetal exposure to urban particulate matter on the immune system of male mouse offspring. Biol Pharm Bull. 2012;35(8):1238-43.

4) 吉田 成一、西川 雅高、押尾 茂、賀 淼、市瀬 孝道：日本で採取した風送黄砂がマウス造精機能および精子運動能に与える影響，大気環境学会誌,2013.48(4),175-180.

5) M. HE, T. ICHINOSE, S. YOSHIDA, H. TAKANO, M. NISHIKAWA, G. SUN, T. SHIBAMOTO:
Induction of immune tolerance and reduction of aggravated lung eosinophilia by co-exposure to Asian sand dust and ovalbumin for 14 weeks in mice. Allergy Asthma Clin Immunol. 2013. 9:19 (3 June).

6) M. HE, T. ICHINOSE, Y. SONG, Y. YOSHIDA, K. ARASHIDANI, S. YOSHIDA, B. LIU, M. NISHIKAWA, H. TAKANO, G. SUN: Effects of two Asian sand dusts transported from the dust source regions of Inner Mongolia and northeast China on murine lung eosinophilia. Toxicol Appl Pharmacol. 2013. Nov 1;272(3):647-655.

7) A. HONDA, Y. MATSUDA, R. MURAYAMA, K. TSUJI, M. NISHIKAWA, E. KOIKE, S. YOSHIDA, T. ICHINOSE, H. TAKANO: Effects of Asian sand dust particles on the respiratory and immune system. J Appl Toxicol, 2014. Mar 34(3):250-257.

8) B. LIU, T. ICHINOSE, M. HE, K. KOBAYASHI, T. MAKI, S. YOSHIDA, K. ARASHIDANI, S. YOSHIDA, M. NISHIKAWA, H. TAKANO, G. SUN. T. SHIBAMOTO: Lung inflammation by fungus, Bjerkandera adusta isolated from Asian sand dust (ASD) aerosol and enhancement of ovalbumin-induced lung eosinophilia by ASD and the fungus in mice. Allergy, Asthma & Clinical Immunology, 2014. Feb 5; 10-10.

9) Y. REN, T. ICHINOSE, M. HE, Y. SONG, Y. YOSHIDA, S. YOUSHIDA, M. NISHIKAWA, H. TAKANO, G. SUN, T. SHIBAMOTO: Enhancement of OVA-induced murine lung eosinophilia by co-exposure to contamination levels of LPS in Asian sand dust and heated dust. Allergy, Asthma & Clinical Immunology 2014, (accepted at May 4) in press.

## くその他誌上発表（査読なし）>

1）市瀬孝道．「黄砂の気道アレルギーに与える影響」 アレルギーの臨床, 2012. 32. 10, 17～21.

2）市瀬孝道．「実験研究による黄砂の毒性評価」医学のあゆみ．2013．247(8)，998～1003．

3）市瀬孝道．「PM2.5とその健康影響」健康教室.2013.753.64-67.

4) 市瀬孝道.「黄砂の呼吸器系への影響.PM2.5と健康」-大気汚染Update.医学のあゆみ.2012.247.8.689-693.

5) 本田晶子、高野裕久.「エアロゾルの健康影響に関する実験的研究, 微小粒子状物質と黄砂による呼吸器系・循環器系への影響」クリーンテクノロジー in press.

6) 本田晶子、高野裕久.「実験研究によるPM2.5の健康影響」大気汚染Update. 医学のあゆみ. 2012. 247. 8. 684-688.

7) 本田晶子、柳澤利枝、小池英子、井上健一郎、高野裕久、「環境化学物質とアレルギー」アレルギーの臨床、2013, 33.8.18-22.

8) 市瀬孝道. 「ヤケイロタケのアレルギー学の基礎研究」 アレルギーの臨床, 2014.(6 月号).

9）市瀬孝道．「4.黄砂アレルギー」呼吸器内科，特集号．2014．印刷中．

## （2） 口頭発表（学会等）

1) M. HE, T. ICHINOSE, S. YOSHIDA, M. NISHIKAWA: 第 52 回大気環境学会年会（2011）. 「Effect of Asian sand dust on expression of cytokine and chemokine induced by Klebsiella pneumoniae
2) 吉田成一、押尾 茂、西川雅高、賀 淼、森育子、市瀬孝道：第 52 回大気環境学会年会（2011）「風送黄砂によるマウス精子性状への影響」

3) 市瀬孝道、高野裕久、井上健一郎、柳沢利枝：第61回日本アレルギー学会秋季学術大会（2011）．「黄砂の肺炎桿菌誘発性肺炎に対する増悪作用」

4) T. ICHINOSE, M. HE: The 42 $ ^{nd} $ Annual meeting of Japanese Society of Occupational and Environmental Allergy. Environmental Air Contaminations Influencing on Airway Allergy - Especially Asian Sand Dust – (2011). 「Asian dusts and allergy」

5) B. LIU, S. YOSHIDA, M. HE, T. ICHINOSE: フォーラム 2011 衛生薬学・環境トキシコロジー（2011）「Effect of microorganisms attached onto yellow dust on inflammatory cytokines and TLRs expression in mouse macrophages」

6) 市瀬孝道：福岡県保険医協会講演会（2011）「黄砂の健康影響」（招待講演）

7) 市瀬孝道：京都府立医科大学公開講座「子どもの健康と化学物質」（2011）「黄砂とアレルギー」（招待講演）

8) 市瀬孝道、賀淼、吉田成一、嵐谷奎一、高野裕久：第53回大気環境学会年会（2012）．「卵白アルブミン誘発性の好酸球性肺炎対する黄砂とビルカンデラ真菌の影響」p179.

9) 吉田成一、賀淼、嵐谷奎一、市瀬孝道：第53回大気環境学会年会（2012）「発生地の異なる黄砂による雄性生殖機能低下に関する比較研究」p177.

10) M. HE, T. ICHINOSE, S. YOSHIDA, M. NISHIKAWA, H. TAKANO: 第53回大気環境学会年会（2012）. 「Effects of long-term exposure to Asian sand dust and ovalbumin on murine lung eosinophilia」 p321.

11）市瀬孝道：第62回日本アレルギー学会秋季学術集会（2012）．シンポジウム2 黄砂のアレルギー疾患への影響．「黄砂の生物学的影響因子の解析」p1319.

12）市瀬孝道：第62回日本アレルギー学会秋季学術集会（2012）．「黄砂粒子と付着微生物によるアレルギー増悪作用」p1147.

13）松田悠吾、本田晶子、村山留美子、辻堅志、西川雅高、小池英子、吉田成一、市瀬孝道、高野裕久：第19回日本免疫毒性学会（2012）「黄砂がヒト気道上皮細胞に及ぼす影響」

14）松田悠吾、本田晶子、村山留美子、辻堅志、西川雅高、小池英子、吉田成一、市瀬孝道、高野裕久：フォーラム 2012 衛生薬学・環境トキシコロジー (2012)「黄砂が呼吸器・免疫系に及ぼす影響」

15) M. HE, T. ICHINOSE, S. YOSHIDA, H. TAKANO, M. NISHIKAWA, G. SUN: American College of Toxicology 33rd Annual Meeting, Orlando, American (2012). 「Effect of Asian sand dust on lung allergic inflammation in mice immunized beforehand by ovalbumin」 p101.

16）吉田成一、賀淼、小林史尚、市瀬孝道：フォーラム2012：衛生薬学・環境トキシコロジー（2012）「黄砂付着微生物による雄性生殖機能への影響」

17）市瀬孝道、賀淼、吉田成一、定金香織、西川雅高、森育子、高野裕久：第52回大気環境学会年会（2011）．「黄砂が卵白アルブミン誘発性の肺の好酸球性炎症に与える影響」

18) M. HE, T. ICHINOSE, S. YOSHIDA, S. YAMAMOTO, K. INOUE, H. TAKANO, R. YANAGISAWA, M. NISHIKAWA, I. MORI, G. SUN, T. SHIBAMOTO: 51th Society of Toxicology (2012) 'Asian Sand Dust Enhances Murine Lung Inflammation Caused by Klebsiella