Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
表 21 転嫁カルテルを実施した団体の転嫁状況

(单位：名)

団体数 (割合)
転嫁できている	157 (89.2%)
転嫁拒否は受けていないが転嫁状況は把握していない	11 ( 6.3%)
一部は転嫁できていない	8 ( 4.6%)
合計	176 ( 100%)

また，平成28年3月末までに表示カルテルを実施した139団体に対して，実際に届出の内容に沿った表示となっているかについて確認したところ，128団体（92.1%）で，「届出どおりの表示が実施されている」と回答しており，表示カルテルがおおむね実効性をもって実施されているものと考えられる。

表 22 表示カルテルを実施した団体の実施状況

(单位：名)

団体数(割合)
届出どおりの表示が実施されている	128 (92.1%)
把握していない	11 (7.9%)
合計	139 (100%)

以上のことから，消費税の転嫁及び表示の方法の決定に係る共同行為に関する特別措置は，取引上の立場が弱い事業者が消費税の転嫁をしやすい環境を整えたという点で，効果的に実施されたものと評価できる。

## (3) 効率性

届出者の事務負担を軽減するため，届出様式や届出の記載例等についてウェブサイトに掲載し，本局及び各地方事務所等のいずれでも届出を受け付けることとし，転嫁カルテル及び表示カルテルを同時に届出する場合は，届出書の添付書類についても一部を省略可能にした。

平成 28 年 3 月までに転嫁カルテル又は表示カルテル届出を行った全ての団体（208 団体）に対して，届出手続についての評価を確認したところ，「問題なし」と回答した団体が 194 団体（93.3%）と大部分を占めており，届出手続の事務負担の軽減策はおおむね評価されているものと考えられる。

以上のことから，本件取組は，届出者の負担を極力軽減しながら，消費税の転嫁をしやすい環境を整えることができた点で，効率的であったと評価できる。
コーナーの内容充実，説明会等における周知などを通じて，同コーナーへのアクセス件数を増やすための取組を行うこととする。

また，次回の消費税率引上げの際に軽減税率制度が導入されることが予定されているため，軽減税率制度が導入された場合の消費税転嫁対策特別措置法の考え方についてガイドライン等で明確化する。

## (2) 消費税転嫁対策特別措置法に係る説明会及び講師派遣

次回の消費税率引上げに際して，今後も全国各地で説明会を開催し，要望に応じて積極的に講師を派遣する。特に，転嫁拒否行為の未然防止の観点から，違反行為の多い業界を対象にした説明会を開催する。

また，講師派遣については，公正取引委員会のウェブサイトで講師派遣の案内についてのページを充実させるとともに，中小企業団体等の事業者団体からの講師派遣依頼に広く対応し，公正取引委員会の職員を講師として派遣していく旨を積極的に呼びかけていくこととする。

加えて，消費税転嫁対策特別措置法への理解度や説明会への満足度をより向上させるため，参加者の理解度レベルを確認し，レベルに応じた説明をするなど，より参加者のニーズに沿った説明会にする。

## 2 転嫁拒否行為に対する迅速かつ厳正な対処のための取組

次回の消費税率引上げの際も，「買いたたき」をはじめとする転嫁拒否行為の発生が懸念されるところ，消費税の円滑かつ適正な転嫁を確保することを目的として，書面調査等による積極的な情報収集並びに転嫁拒否行為に対する調査及び勧告・指導等について，これまでの取組を継続し，引き続き，転嫁拒否行為に対する迅速かつ適正な対処のための取組を推進する。

## 3 消費税の転嫁及び表示の方法の決定に係る共同行為に関する特別措置

公正取引委員会のウェブサイトに掲載している「届出に関するよくある質問」や届出の記載例等を必要に応じて見直すなど，届出者の事務負担軽減に引き続き配慮する。

## 第6 第三者の知見の活用

政策評価委員会における各委員の主な意見は以下のとおりである。

☐ 転嫁拒否行為に関する端緒の9割以上が書面調査によるものであり，申告によるものは1割も満たないのは，消費税転嫁対策特別措置法に関する広報活動が不十分だからか。

田中委員

（取引上立場の弱い事業者は転嫁拒否行為を受けたとしても，今後の取引への影響を考慮して自らその事実を申し出にくい場合があることから，書面調査が端緒源となることが多いと考えている旨回答した。）
○ 表7の書面調査の発送件数について，中小企業，小規模事業者等の件数が平成26年度から平成27年度にかけて減少しているのはなぜか。 （平成26年度に書面調査を発送した際に，未達となった発送先について，平成27年度の調査の発送先から除外したためである旨回答した。）	若林委員
○ 消費税転嫁対策特別措置法に係る説明会の参加者の理解度について，当該説明会受講前の理解度もアンケートして受講後と比較して評価する方法も行ってはどうか。 （意見を踏まえ，今後説明会の実施方法について検討することとしたい旨回答した。）	小西委員

## 第7 評価を行う過程において使用した資料

平成27年度における消費税転嫁対策の取組について（平成28年6月2日公表）

・公正取引委員会主催説明会の参加者に対するアンケート
課題名 5C-1155 黄砂エアロゾル及び付着微生物・化学物質の生体影響とそのメカニズム解明に関する研究

課題代表者名 市瀬 孝道 （大分県立看護科学大学 看護学部 人間科学講座 生体反応学研究室 教授）

研究实施期间 平成23～25年度

累計予算額 115,612千円（うち25年度34,322千円）

予算額は、間接経費を含む。

本研究のキーワード 黄砂、アレルギー疾患、雄性生殖器、免疫担当細胞、気管支上皮細胞、バイオエアロゾル、生物分析、毒素遺伝子検出、多環芳香族炭化水素、免疫細胞毒性反応

## 研究体制

(1) 黄砂エアロゾル及び付着微生物・化学物質による呼吸器系・生殖器系・免疫系への影響とそのメカニズム解明（大分県立看護科学大学、（独）国立環境研究所、京都大学）

(2) 黄砂付着微生物の解析とその毒性物質の検出に関する研究 (金沢大学)

(3) 黄砂エアロゾルに含まれる化学物質の計測とその細胞毒性に関する研究（産業医科大学）

<研究協力機関>

（独）労働安全衛生総合研究所、東京理科大学環境安全センター、中国医科大学

## 研究概要

### 1. はじめに(研究背景等)

黄砂は古来より春の風物詩として空が黄色に霞む自然現象として認識されていた。しかし、温暖化や中国内陸部の土壌の荒廃によって砂漠化が進むにつれてその発生回数が増加すると共に大規模化し、以前では九州や西日本で多く見られた黄砂現象が近年では北日本や北海道までも見られるようになった。中国はもとより日本や韓国でも、大規模黄砂による交通機関や精密機器等の産業、牧畜、農業生産への被害が発生している他、中国由来の大気汚染物質が加わった汚れた黄砂による健康被害も報告され、現在、黄砂は東アジア一帯の国境をまたぐ環境問題となっている。

近隣諸国の疫学調査では、黄砂現象時に呼吸器系感染症、心血管疾患、心筋梗塞や脳卒中の増加、気管支喘息、アレルギー性鼻炎や結膜炎等による来院患者数の増加等が報告されている。日本へ飛来する黄砂は、濃度は低いが粒子が細かく、また、黄砂の飛来時期とスギやヒノキの花粉の飛散時期が重なること、更に、小児等の気管支喘息が増加していることから、アレルギー疾患への影響に社会的な関心が向けられている。事実、黄砂現象時に花粉症や気管支喘息の症状や病態に悪化が見られること、小児喘息における入院リスクが上昇することが学術論文に報告され、行政的な対応が迫られている。

### 2. 研究開発目的

本プロジェクト研究では、黄砂エアロゾル及び分離微生物や化学物質を用い、細胞毒性、呼吸器系、免疫・アレルギー系への影響、雄性生殖器系等への影響を評価し、黄砂エアロゾルによる種々の生体影響を生物学的・化学的・物理的側面から多角的に解析して、その発生メカニズムを解明することを目的とする。

（１）サブテーマ１

サブサブテーマ1)の呼吸器系においては①黄砂分離微生物の炎症性サイトカイン誘導能を抗原提示細胞によって調査すること、②イベントの異なる黄砂のアレルギー喘息への影響を評価すること、③黄砂に付着している微生物成分（LPS、真菌）や化学物質（タール成分）のアレルギー喘息や花粉症への影響を評価すること、④アレルギー喘息等の増悪メカニズムを、病原体分子パターン認識受容体（Toll様レセプター：TLRs）ノックアウトマウスを用いて解明することを目的とした。
サブサブテーマ2)の生殖器系では①複数のイベント時の黄砂による雄性生殖機能への影響を評価すること、②黄砂粒子本体あるいは黄砂に付着する黄砂構成成分による影響を評価することにより、影響規程因子の絞り込みを行うこと、③胎任期黄砂曝露による雄性出生仔の生殖機能への影響を解明することを目的とした。

サブサブテーマ3)の免疫担当細胞と気管支上皮細胞の評価系では①複数のイベント時の黄砂を気道上皮細胞や免疫応答を担う免疫担当細胞に曝露し、健康影響の異同を評価すること、②黄砂に付着する熱易变性の生物学的要因や化学的要因の役割を評価すること、③黄砂関連生物成分である真菌の影響を評価することにより、影響規定要因の絞り込みと影響発現メカニズム解明を図ることを目的とした。

## (2) サブテーマ2

上空のバイオエアロゾルを直接採集し、生物分析から人に影響を及ぼす微生物の検索を行うこと、直接採集サンプルを用いてアレルギーに関係のある微生物由来物質の定量および毒素遺伝子の検出を行うこと、サブテーマ1と連携し、直接採集した黄砂バイオエアロゾルをサブテーマ1に提供し、微生物の生体影響とメカニズム解明をサポートすることを研究開発目的とした。

## (3) サブテーマ3

中国大陸から飛来する黄砂エアロゾルの化学的・物理的性状を究明するために、黄砂の元素成分、イオン類、多環芳香族炭化水素（PAHs）、ニトロ多環芳香族炭化水素(nitro-PAHs)等の分析、微生物成分、粒径分布や形態観察を行い、ヒトへの健康影響のリスク評価を行う有用な指標の探索をおこなう。また、黄砂エアロゾル及び抽出化学成分（タール）の免疫担当細胞に対する毒性試験によって影響評価を行うことを目的とした。

### 3. 研究開発の方法

(1) 黄砂エアロゾル及び付着微生物・化学物質による呼吸器系・生殖器系・免疫系への影響とそのメカニズム解明

(1)−1)黄砂エアロゾル及び付着微生物・化学物質による呼吸器・免疫系への影響とそのメカニズム解明

① サブテーマ2の小林らが石川県珠洲市上空で採取した黄砂から分離した微生物の炎症性サイトカイン誘導能を調査するためのスクリーニング試験を、マウスマクロファージを用いて行った。② マウス気管支喘息モデルを用いて増悪作用を起こす微生物を特定するためのスクリーニング試験を行った。③ Bjerkandera（Bjer）真菌が肺のアレルギー炎症を高めたことが明らかになったことから、気管支喘息をモデルとしたアレルギー炎症に対するBjerの量-反応関係を調べた。④ 発生地や輸送経路の異なる2つの風送黄砂について気管支喘息モデルマウスを用いてアレルギーへの影響を調べた。⑤ 黄砂付着微生物由来の炎症起因物質を明らかにする目的で、微生物の分子パターン認識センサーであるToll様レセプター(TLRs)の欠損マウスの骨髓由来マクロファージを用いて、培養液中に放出された炎症性サイトカイン量を比較した。⑥ 黄砂に吸着した有機化学物質（Tar）のアレルギー喘息増悪作用の量-反応関係について喘息モデルマウスを用いて調べた。⑦ Bjer真菌と黄砂のスギ花粉症に対する増悪作用の量-反応関係を調べた。⑧ 黄砂のアレルギー炎症増悪作用の起因物質を明らかにする目的で、Toll様レセプター(TLRs)欠損マウスを用いて、喘息モデルにてアレルギー増悪作用を比較した。⑨ 日本に飛来した黄砂がどのTLRsによって認識されるのかを、C57BL/6の野生型マウス(WT)、とTLR2欠損（KO）、TLR4KO、TLR2/4KO、TLR7/9KOとMyD88KOマウスの骨髓由来マクロファージ（BMDMs）を用いて培養液中に放出された炎症性サイトカイン量を比較した。⑩ 黄砂に付着した化石燃料燃焼由来タール成分のスギ花粉症増悪作用の量-反応関係を、マウスを用いて調べた。⑪ 黄砂に付着したLPSのアレルギー炎症増悪作用メカニズムを明らかにするために、BALB/c系の野生型（WT）とTLR2KO、TLR4KO、MyD88KOマウスを用いてアレルギー喘息モデルにて調べた。⑫ LPSが黄砂のアレルギー増悪因子であることが確証するための再現実験として、市販のLPSと滅菌黄砂を用いてマウスの喘息モデルにて調べた。

## (1) -2)黄砂エアロゾル及び付着微生物・化学物質による生殖器系への影響とそのメカニズム解明

① 黄砂による雄性生殖機能への影響：2011年に発生した2つの黄砂イベント時に採取した風送黄砂(ASD1およびASD2)を用いた。雄性マウスに黄砂を気管内曝露し、造精機能解析や精子性状解析、血中ホルモン濃度測定などを行った。② 黄砂の構成成分による雄性生殖機能への影響：雄性マウスに黄砂の各種構成因子を気管内投与した。加熱処理し、付着物質を除去した黄砂粒子（加熱黄砂）、黄砂付着微生物、微生物構成成分（LPS）および黄砂付着有機化合物（Tar）を用いた。影響評価は造精機能、精子性状解析などである。③ 胎仔期黄砂曝露による雄性出生仔生殖機能への影響：妊娠マウ
スに黄砂 (ASD1)の気管内投与を行い、出生した雄性仔マウスの生殖機能を評価した。評価項目は、造精機能、精子性状解析などである。

## (1) -3)免疫担当細胞と気管支上皮細胞における黄砂エアロゾル及び付着微生物・化学物質の影響解明

① 黄砂が気道上皮細胞に及ぼす影響：2011/5/1～3に採取した無処理の黄砂（ASD1）、5/12～14に採取した無処理の黄砂（ASD2）、5/1～3に採取した黄砂を360℃、30分間加熱処理した黄砂（H-ASD1）を被検物質とした。ヒト気道上皮細胞に被検物質を24時間曝露した後、細胞活性とIL-6、IL-8の産生を解析した。② 黄砂が免疫担当細胞に及ぼす影響：10週齢の雄性NC/NgaTndCrljマウスを安楽死させた後、大腿骨および脾細胞を摘出した。大腿骨は、骨髓細胞を摘出し、GM-CSF刺激により分化誘導した骨髓由来樹状細胞（BMDC）に、黄砂を24時間曝露した後、細胞表面分子DEC205の発現を解析した。一方、脾細胞は、黄砂を72時間曝露後、細胞増殖能を解析した。③ 黄砂関連生物成分Bjerkandera（Bjer）が気道上皮細胞と免疫担当細胞に及ぼす影響：Bjerおよび360℃、30分間加熱処理した標準黄砂（H-ASD）を被検物質とした。ヒト気道上皮細胞にBjer、あるいは、BjerとH-ASDを24時間曝露した後、細胞活性、IL-6、IL-8の産生を解析した。別に、分化誘導したBMDCは、Bjer、あるいは、Bjer+H-ASDを24時間曝露後、細胞表面分子DEC205の発現を解析した。脾細胞は、Bjer、あるいは、Bjer+H-ASDを72時間曝露後、細胞増殖能を解析した。

## (2) 黄砂付着微生物の解析とその毒性物質の検出に関する研究

上空のバイオエアロゾルサンプリングは、係留気球や航空機を用いて能登半島珠洲市上空で行った。定点観測は、2011年、2012年と2013年の3年にわたり黄砂の飛来する春季（3月、4月、5月）に金沢市において実施した。毒素遺伝子の検出は、定点観測のDNAライブラリーから種々の毒素遺伝子をプローブとしたリアルタイムPCRを用いて行った。

## (3) 黄砂エアロゾルに含まれる化学物質の計測とその細胞毒性に関する研究

黄砂イベント時における風送黄砂の捕集は、産業医科大学（北九州市八幡西区折尾）で3月中旬～5月の黄砂飛来時期に行った。捕集装置は分粒特性を有するHi-volume及びLow-volume air samplerを用いた。捕集用フィルターはテフロンフィルターと石英フィルターを用いた。4段階のフィルターで得られた粒子状物質は生物特性、化学的及び物理的性状の検索に用いた。黄砂は主に2011年5月1日～3日と5月12日～14日の黄砂イベント時に捕集した黄砂を分析した。前者の黄砂日の黄砂をASD1，後者の黄砂日のものをASD2とした。黄砂粒子を含む全粉じん濃度、黄砂粒子の金属成分、付着するイオン類、また有機化学物質の多環芳香族炭化水素（PAHs）とニトロ多環芳香族炭化水素（nitro-PAHs）を測定した。PAHsは高速液体クロマトグラフ法、ニトロ多環芳香族炭nitro-PAHsはGC/MS/MS法を用いて計測した。また、粒子の形態は走査型電子顕微鏡、元素分析はICP-AESを用いて行った。

一方、捕集された黄砂の細胞毒性評価は、黄砂曝露マウスのリンパ組織の細胞群を回収し、細胞活性化能を増殖活性により測定し、また細胞死のイベントが起きる際に役割を持つNF-κBに着目し、その変化をウェスタンブロット法により評価した。

### 4. 結果及び考察

(1)黄砂エアロゾル及び付着微生物・化学物質による呼吸器系・生殖器系・免疫系への影響とそのメカニズム解明

(1)−1)黄砂エアロゾル及び付着微生物・化学物質による呼吸器・免疫系への影響とそのメカニズム解明

1) 黄砂付着微生物の中からアレルギーを増悪する真菌 (Bjerkandera: Bjer) が見出され、またこの菌種自身がアレルギー炎症を引き起こす抗原となりることが明らかとなった。また、黄砂と抗原存在下で、Bjer真菌の曝露を受けると気道のリモデリング (不可逆的な気道障害) へと進行することか分かった。

2) 熱処理によって付着有機物を除去した黄砂本体にもアレルギー反応を高める作用があることが明らかとなった。

3) イベントの異なる黄砂はアレルギー反応に違いがあることが分かった。アレルギー増悪作用の違いはシリカ( $ SiO_{2} $ )が多い黄砂よりも、リポポリサッカライド(LPS)が多い黄砂の方が、増悪作用が強いことが分かった。

4) 黄砂バイオエアロゾルの中の真菌 Bjerl スギ花粉症を増悪する作用が見出された。更に黄砂はスギ花粉やこの真菌のアレルギー炎症を悪化することを見出した。

5) 黄砂に吸着した有機化合物（タール成分）が気道のアレルギー炎症を増悪することが分かった。しかし、その曝露量が多ければアレルギー炎症に対して抑制的に働くことも明らかとなった。またタール成分には抗体産生（抗原特異的-IgE）を高める作用が有ることも分かった。
6) 微生物の分子パターンを認識するTolI様レセプター(TLRs)欠損(KO)マウスの骨髓由来マクロファージを用いたin vitro実験から、黄砂はTLR2よりもTLR4を介したシグナル伝達経路によって炎症性サイトカイン産生を高めることが分かり、TLR4リガンドであるLPSが炎症惹起に関与していることが分かった。

7) TLR KOマウスのin vivo実験では、黄砂のアレルギー増悪作用にはアダプター分子のMyD88が必修であり、TLR2とTLR4のリガンド(LPS、β-グルカン、ペプチドグリカン)が黄砂の増悪因子として見出された。

8) TLR2欠損 (KO), TLR4KO, TLR2/4KO, TLR7/9KO マウスと MyD88KO マウスの骨髓由来マクロファージを使った実験で、日本に飛来した黄砂は抗原提示細胞（マクロファージ）の TLR4 や TLR2 に認識されることが分かった。

9) 黄砂に含まれる微量のタール成分がスギ花粉症のアレルギー性鼻炎を悪化することを見出した。

10) TLR2KOと4KOマウスによる市販のLPSを用いた喘息再現実験で、LPSはTLR4を介してTh2への誘導を起こすことを確証した。また、TLR4欠損マウスのOVA+H-ASD+LPS群でもTh2への弱い誘導（IL-5発現、IgE抗体産生、好酸球増加）が起きたが、OVA+H-ASD群でも同じレベルで弱いTh2への誘導が起きた。この誘導は、LPSが作用するというよりは、むしろ滅菌黄砂によって起こる細胞障害によるデインジャーシグナル等がTLR2等を介してTh2への誘導を起こしている可能性が示唆された。

11) 市販のLPSを用いた喘息再現実験で、微量のLPSが抗原(OVA)と滅菌黄砂の存在下、Th2を活性化してアレルギー炎症（アレルギー喘息）を悪化させることを突き止め、微量のLPSがアレルギー増悪に関わっていることを確証した。

(1)-2)黄砂エアロゾル及び付着微生物・化学物質による生殖器系への影響とそのメカニズム解明

1) 造精機能を検討したところ、ASD1でコントロール群と比較して、低下が認められたが、ASD2では認められず、黄砂発生源により、造精機能への影響が異なることが示唆された。また、精子性状の一項目である精子運動率や血中テストステロン濃度もASD1でのみ有意な変動が認められ、ASD2はコントロールと同程度であった。

2) 加熱黄砂は造精機能を低下させ、また、黄砂付着微生物（Nocardiopsis）、微生物由来成分（LPS）および黄砂付着有機化合物（Tar）も造精機能を低下させた。しかし、LPS、Tarによる造精機能の低下は加熱黄砂の共存下では認められず、黄砂による造精機能の低下にLPSやTarの寄与は小さいと考えられた。

3) 妊娠マウスにASD1黄砂を気管内投与し、雄性出生仔への影響を評価したところ、出生仔の性比が小さくなり、出生した雄性仔マウス数が少なくなった。胎任期に黄砂曝露を受けた雄性仔マウスは造精機能の低下や精細管障害などが観察され、生殖機能の低下を認めた。

(1)−3)免疫担当細胞と気管支上皮細胞における黄砂エアロゾル及び付着微生物・化学物質の影響解明

1) 気道上皮細胞の細胞活性を検討したところ、何れの黄砂曝露群もコントロール群と比較して、濃度依存的に細胞活性の低下が確認された。一方、同濃度の黄砂間で比較を行うと、30および90μg/mL曝露群において、ASD2は、ASD1より高い細胞活性を示した。ASD1およびASD2を曝露した気道上皮細胞の培養上清中のIL-6およびIL-8量は、曝露濃度依存的に増大した。一方、H-ASD1曝露は、明らかな変化をきたさなかった。また、90μg/mLにおいて、ASD2曝露によるこれらのサイトカイン産生誘導は、ASD1曝露に比較し、有意に低かった。ASD1と比較し、H-ASD1曝露時のサイトカイン産生は有意に低値を示した。

2) ASD1及びASD2を曝露したBMDCのDEC205陽性細胞率は、曝露濃度依存的に増大した。一方、加熱黄砂であるH-ASD1曝露時は、コントロールと比べ、発現量の明らかな変化が認められなかった。同様に、ASD1及びASD2を曝露したマウス脾細胞の細胞増殖能は増大した。一方、加熱黄砂であるH-ASD1曝露時は、コントロールと比べ、細胞増殖能の明らかな変化は認められなかった。

3) 気道上皮細胞に、Bjer単独およびBjer+H-ASDを曝露したところ、何れの曝露群においても、コントロールと比較して、細胞活性、IL-6、IL-8の産生に著しい変化は確認されなかった。BMDCに、Bjer単独およびBjer+H-ASDを曝露したところ、Bjer単独曝露では、コントロールと比較して、濃度依存的にDEC205の増加が認められた。同様に、Bjer+H-ASD曝露においても、Bjer単独曝露と同程度のDEC205陽性細胞率の増加が確認された。一方、脾細胞では、何れの曝露においても、コントロールと比較して、脾細胞増殖能の増加は認められなかった。以上より、気道上皮細胞が被る影響作用は、黄砂イベントによって異なることが明らかとなった。また、気道上皮細胞や免疫担当細胞に関する多くの影響指標の変化は、加熱処理により有意な軽減を示したことから、影響作用は黄砂に付着した様々な熱易変性の生物学的要因や化学的要因が関与していることが示された。さらに、黄砂関連生物成分であるBjerは、気道上皮細胞や脾細胞ではなく、免疫応答の開始細胞である、BMDCに影響を及ぼすことも示された。

（２）黄砂付着微生物の解析とその毒性物質の検出に関する研究
1) 石川県珠洲市上空のバイオエアロゾルを係留気球や航空機を用いて直接採集し、種々の生物分析法を駆使して、菌種の高度分布から沈着する菌株と通り過ぎる菌株を明らかにした。

2) サブテーマ1と連携し、直接採集した黄砂バイオエアロゾルをサブテーマ1に提供し、生体影響とメカニズム解明をサポートした。アレルギ一起因の真菌ビルカンデラ(Bjrukandera)の大気中濃度、原因物質であるβ-グルカン濃度測定、大気中DNA濃度および黄砂イベント前後の種組成変化を測定した。

3) 黄砂イベントASD1(2011年5月2日)およびASD2(2011年5月13日)における大気DNA濃度、細菌種組成、リアルタイムPCRを用いて2つの黄砂イベントDNAライブラリーを作成し、バチルス・スタフィロコッカス遺伝子、セレウス菌毒素セレウリド合成酵素遺伝子（CRS遺伝子）、黄色ブドウ球菌毒素性ショック症候群毒素遺伝子（TSST-1）、O-157（ベロ毒素）遺伝子、および呼吸器系感染症起因菌遺伝子の検出・定量を実施した。ほとんどの毒性遺伝子は検出されなかったが、バチルス・スタフィロコッカス遺伝子に関しては多くの遺伝子が検出・定量された。

4) 2011年の5月初旬の黄砂イベント時にはアレルギー喘息の増悪因子となりうるリポポリサッカライド(LPS)を菌体成分にもつグラム陰性菌やペプチドグリカンを菌体成分にもつグラム陽性菌が大気中に著しく増加することが明らかとなった。更に真菌関連慢性咳嗽を起こすBjer真菌も黄砂日に増加し、黄砂と挙動を共にすることを明らかにした。

## （３）黄砂エアロゾルに含まれる化学物質の計測とその細胞毒性に関する研究

1）2011年5月1日～3日（ASD1）と5月12日～14日(ASD2)の黄砂を分析した。ASD2は2μm付近の細かな粒子の含有量が多い。ASD2の黄砂はASD1の黄砂に比較して大気汚染物質由来の硝酸イオン（NO_{3}^{-}）や硫酸イオン（SO_{4}^{2-}）量が多く、海塩由来と思われるNa^{+}やCl^{-}イオンもかなり多く混入していた。また微生物由来のLPSやβ-グルカンの微生物由来の毒素成分量もASD2の方が多かった。その分、ASD2の方がASD1よりも黄砂粒子の主成分である二酸化ケイ素（SiO_{2}）や三酸化アルミ（Al_{2}O_{3}）等のミネラル含有量が少なかった。また主要多環芳香族炭化水素（PAHs）含有量についてもASD1よりもASD2の方が多かった。

2）黄砂日に採取した全粉じん濃度は、黄砂日以外の全粉じん濃度に比べて明らかに高濃度を認めた。また、黄砂の粒径は0.88μm以上で、不定形であり、微粒子には認められなかった。X線回折法で黄砂特有のSi、Mg、Ca、Fe、Naが認められた。PAHsとnitro-PAHsは粒径1.1μm以下の微粒子に90％以上が含有し、黄砂粒子の含有は少ない事が認められた。

3）黄砂の免疫系における細胞毒性に関す研究では、黄砂曝露した脾臓細胞はマイトジェン（LPS等の刺激）に対する相対反応が低かった。しかし、無刺激の状態では黄砂投与による若干の細胞の増殖活性化が認められた。その現象は単回黄砂投与の脾臓細胞でも観察された。これらの結果は、黄砂投与後の体内イベントが、肺と脾臓では異なったタイミングで起こっていることを示唆している。また、それは細胞内分子で、様々な細胞内イベントに関与する転写因子NF-κBの動向と同じであった。

### 5. 本研究により得られた主な成果

## (1) 科学的意義

(1)黄砂エアロゾル及び付着微生物・化学物質による呼吸器系・生殖器系・免疫系への影響とそのメカニズム解明

(1)−1)黄砂エアロゾル及び付着微生物・化学物質による呼吸器・免疫系への影響とそのメカニズム解明

イベントが異なる2つの黄砂を比較するとシリカの多い黄砂よりもPM2.5や微生物成分（LPS、β-グルカン）の多い黄砂の方がアレルギー炎症を増悪することが明らかになり、黄砂イベントによって健康影響が異なる可能性を示したことは科学的に意義が大きい。黄砂エアロゾルに含まれる真菌（Bjerkandera）がアレルギー炎症を誘導し、黄砂と共同してアレルギー喘息や花粉症を増悪することを突きとめた。黄砂と挙動をともにするBjerkandera担子菌は真菌関連慢性咳嗽との関連が示唆されていることから、今回の結果は健康問題を考える上では科学的な意義が大きい。また、黄砂に付着している化石燃料燃焼由来のタール（Tar）成分がアレルギー喘息や鼻炎を悪化する因子であることを突きとめ、微生物以外の有機化学物質もアレルギーの増悪に関わっていることを明らかにしたことは科学的意義が大きい。飛来黄砂は抗原提示細胞の病原体分子パターン認識受容体（TLRs）のTLR2とTLR4によって認識され、黄砂のアレルギー増悪作用はTLRのアダプター分子MyD88を介して起こり、TLR2とTLR4のリガンドであるLPSやβ-グルカンが増悪因子である可能性を示した。この黄砂のアレルギー増悪メカニズムを解明できたことは一連の研究の中では最も価値ある科学的な知見である。また、市販のLPSを用いた再現実験からも黄砂に含まれる微量レベルのLPSがアレルギー喘息を増悪することを確認できたことは科学的価値が高い。この一連の実験の中で、付着物を除いた黄砂粒
子本体にもアレルギー反応を高める作用があることを見出したことも価値ある科学的知見である。

## (1) -2)黄砂エアロゾル及び付着微生物・化学物質による生殖器系への影響とそのメカニズム解明

イベントの異なる黄砂は雄性生殖機能への影響に相違があること、影響因子として黄砂粒子本体や、各種構成成分が関与することを明らかにした。さらに、妊娠期に黄砂に曝露されると、雄の出生率を低下させると共に雄の生殖機能を低下させることを科学的明らかにしたことは、次世代を考える上で意義が大きい知見である。

## (1) -3)免疫担当細胞と気管支上皮細胞における黄砂エアロゾル及び付着微生物・化学物質の影響解明

熱易変性の黄砂付着微生物や化学物質の含有量の相違が健康影響の相違に寄与する可能性を、呼吸器系と黄砂の最初の物理化学的接点である気道上皮細胞、樹状細胞や脾臓細胞などの免疫担当細胞を用いた実験研究によって明らかにできた。この結果は、黄砂イベントによって健康影響に相違がある可能性を示唆するもので、学術的に価値ある知見である。また、黄砂と挙動を共にするBjerkandera真菌が健康影響に関与する可能性を、その作用点である細胞・分子レベルで明らかにすることができた。この真菌が黄砂日のバイオマーカー候補として上げられたことは、人の健康影響を考える上で価値ある。

## (2) 黄砂付着微生物の解析とその毒性物質の検出に関する研究

健康影響評価が難しかった黄砂バイオエアロゾルに関して、係留気球や航空機を用いた直接採集と多角的生物分析により、黄砂日には微生物種や微生物数が増大し、黄砂イベントによって微生物数が異なること、また、アレルギーに影響するLPSをもつグラム陰性菌やペプチドグリカンを持つグラム陽性菌、β-グルカンを持つBjerkandera真菌が大気中に著しく増加することを証明することができた。この成果は、定点観測、大気DNA濃度測定やリアルタイムPCRを用いた毒素遺伝子検出によって、これまでの大気中の微生物解析になかった健康影響評価が可能になったことを意味し、人の健康影響を考える上で学術的に価値ある。

## (3) 黄砂エアロゾルに含まれる化学物質の計測とその細胞毒性に関する研究

黄砂イベントごとに黄砂に吸着した有機化学物質（PAHs）濃度に違いがあり、また、これらが黄砂日に大気中に著しく増加することから、PAHsがヒトへの健康影響評価を行う有用な指標となりうることを提示した。また、黄砂が体内のリンパ組織に対し影響を及ぼすことが示唆され、特に末梢血リンパ球のNF-κB活性をヒトの影響評価指標として活用できるエビデンスは学術的に価値あるものである。

## (2) 環境政策への貢献

＜行政が既に活用した成果＞

特に記載すべき事項はない。

## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

（１）黄砂エアロゾル及び付着微生物・化学物質による呼吸器系・生殖器系・免疫系への影響とそのメカニズム解明

（１）－１）黄砂エアロゾル及び付着微生物・化学物質による呼吸器・免疫系への影響とそのメカニズム解明

1）アレルギー喘息や花粉症における黄砂のアレルギー増悪要因が黄砂に付着した微生物成分（LPS、β-グルカン、ペプチドグリカン）や大気汚染物質由来の有機化学物質であること、黄砂から有機成分を取り除いた黄砂粒子本体にアレルギー反応を高める作用があることを提示した。これらのエビデンスは、黄砂現象時にアレルギー疾患が悪化するという疫学調査の結果に生物学的妥当性を付与するものであり、行政による黄砂の健康影響や健康被害を見極めるための科学的な根拠資料として役立てることができると考える。

2）黄砂付着微生物のアレルギー増悪メカニズムを解明し、提示することができた。この成果は健康被害の未然防止策・軽減策に関連する環境政策の基礎資料として貢献できると考える。

3）黄砂と挙動を共にするビルカンデラ真菌はアレルギー抗原と増悪因子なりることを提示することができたことから、国民に黄砂の危険性を警鐘・周知することで、黄砂飛来時の自己防衛に繋げると共に、国民の安全と安心に寄与することがきる。

4）これらの研究成果を多くの科学雑誌に講評したことで、健康影響に関する国際的共通理解を形成することができたと考える。今後も多くの成果を公表し黄砂の危険性を警鐘して、国際的な黄砂発
生の低減策の取組みに繋げたい。また、本研究の成果は国内や国際的な黄砂問題を解決すための環境政策上の基礎資料として役立てることができると考える。

（１）-２）黄砂エアロゾル及び付着微生物・化学物質による生殖器系への影響とそのメカニズム解明１）これまで黄砂の健康影響として、呼吸器系、循環器系や免疫系への影響を中心に評価が進んできたが、それ以外に、雄性生殖系に影響を与えることを明らかにした。

2）胎仔期に黄砂曝露を受けると雄性出生仔の生殖機能が低下することを明らかにした。

3）これらの実験研究の知見をもとに、ヒトにおける健康影響評価を行い、次世代影響を含めた健康被害予防対策や関連する政策の立案等に役立てたい。

（１）-３）免疫担当細胞と気管支上皮細胞における黄砂エアロゾル及び付着微生物・化学物質の影響１）細胞・分子レベルにおける研究成果から、イベントの異なる黄砂や成分の相違が、健康影響の相違や変動に寄与する可能性を提示した。この成果は、分子・細胞レベルから疫学調査結果に生物学的妥当性を付与するものである。

2）この研究においてBjerkandera真菌がヒトの健康影響要因であることを明らかにしたが、今後も免疫担当細胞や気管支上皮細胞を用いて影響要因を絞り込み、明らかにできれば、黄砂に付着した成分の健康影響要因を決定することができ、今後の予防対策の確立等にも役立てることができる。さらに、国内や国際的な黄砂問題を解決するための政策上の基礎資料としても役立つと考える。

## （２）黄砂付着微生物の解析とその毒性物質の検出に関する研究

1）黄砂日には微生物種や微生物数が大気中に増大し、黄砂イベントごとにこれらが異なること、また、アレルギー増悪に関わるLPSを菌体成分にもつグラム陰性菌やペプチドグリカンを持つグラム陽性菌、慢性咳嗽に関わるBjerkandera真菌が大気中に著しく増加することを見出した。これらの微生物が黄砂と挙動を共にすることはアレルギー疾患にとっては不利益な問題であり、黄砂付着菌や黄砂の発生を抑えるなどの健康被害予防対策が必要である。

2）今後、中国大陸から運ばれて来る種々多様な微生物や人畜の健康に影響をおよぼす微生物を解析・毒素遺伝子を検出することが出来れば、黄砂付着微生物による健康被害を予測・防止することができ、行政ニーズに答えることができると考えられる。我々は黄砂に付着した微生物の侵入を防ぐための黄砂付着微生物用マスクを開発した。

## （３）黄砂エアロゾルに含まれる化学物質の計測とその細胞毒性に関する研究

1）黄砂イベントによって黄砂の物理学的、化学的、生物学的な性状に違いがあること、特にアレルギー増悪や発がん性がある多環芳香族炭化水素類のPAHsやnitro-PAHsが吸着していること、これらが黄砂日に大気中に著しく増加することから、黄砂日には行政による注意喚起や個人レベルでの予防対策が必要と考えられる。

2）免疫毒性の面からは、末梢血リンパ球のNF-κBなどの分子レベルの指標を測定することで黄砂曝露のリスク評価ができる可能性が考えられ、このパラメータ一値が環境行政や政策に活用できるかも知れない。

## 全体としては、

1. 黄砂の健康影響の科学的知見を行政や国民に提示することができた。

2. 本成果は疫学調査結果に対する生物学的な妥当性を証明するものであり、行政による健康影響の見極めの基礎資料となるものである。

3. 黄砂の増悪因子や増悪メカニズムの一部が解明できたことは、健康被害の未然防止策・軽減策に関連する環境政策、SPM濃度上昇時の注意喚起や行動指針などの基礎資料として貢献できると考える。

4. 国際的な黄砂問題を解決するための日中韓三力国環境大臣会合や三力国黄砂局長会合等の基礎資料として役立てることができると考えられる。

### 6. 研究成果の主な発表状況

## (1) 主な誌上発表

<査読付き論文>

1) T. MAKI, A. ISHIKAWA, F. KOBAYASHI, M. KAKIKAWA, K. AOKI, T. MATSUNAGA, H. HASEGAWA,
Bjerkandera adusta isolated from Asian sand dust (ASD) aerosol and enhancement of ovalbumin-induced lung eosinophilia by ASD and the fungus in mice. Allergy, Asthma & Clinical Immunology, 2014. Feb 5;10(1):10. doi:10.1186/1710-1492-10-10.

19) Y. REN, T. ICHINOSE, M. HE, Y. SONG, Y. YOSHIDA, S. YOUSHIDA, M. NISHIKAWA, H. TAKANO, G. SUN, T. SHIBA MOTO: Enhancement of OVA-induced murine lung eosinophilia by co-exposure to contamination levels of LPS in Asian sand dust and heated dust. Allergy, Asthma & Clinical Immunology 2014, (accepted at May 4) in press.

## (2) 主な口頭発表 (学会等)

1) M. HE, T. ICHINOSE, S. YOSHIDA, M. NISHIKAWA: 第 52 回大気環境学会年会 (2011). 「Effect of Asian sand dust on expression of cytokine and chemokine induced by Klebsiella pneumoniae in mouse macrophage」

2) T. MAKI, F. KOBAYASHI, M. KAKIKAWA, M. ATSUSHI, Y. IWASAKA: 2011 International Union of Geodesy and Geophysics General Assembly (IUGG), Melbourne, Australia (2011) [Phylogenetic analysis of long-range transported bacteria isolated from Asian dust (KOSA) bioaerosols]

3) 吉田成一、押尾茂、西川雅孝、賀淼、森育子、市瀬孝道：第52回大気環境学会年会（2011）「風送黄砂によるマウス精子性状への影響」

4) 市瀬孝道、高野裕久、井上健一郎、柳沢利枝：第61回日本アレルギー学会秋季学術大会(2011).「黄砂の肺炎桿菌誘発性肺炎に対する増悪作用」

5) T. ICHINOSE, M. HE: The 42 $ ^{nd} $ Annual meeting of Japanese Society of Occupational and Environmental Allergy. Environmental Air Contaminations Influencing on Airway Allergy - Especially Asian Sand Dust – (2011). [Asian dusts and allergy]

6) B. LIU, S. YOSHIDA, M. HE, T. ICHINOSE: フォーラム 2011 衛生薬学・環境トキシコロジー(2011)「Effect of microorganisms attached onto yellow dust on inflammatory cytokines and TLRs expression in mouse macrophages」

7) 吉田成一、賀淼、嵐谷奎一、市瀬孝道:第53回大気環境学会年会(2012)「発生地の異なる黄砂による雄性生殖機能低下に関する比較研究」

8) M. HE, T. ICHINOSE, S. YOSHIDA, M. NISHIKAWA, H. TAKANO: 第53回大気環境学会年会(2012)「Effects of long-term exposure to Asian sand dust and ovalbumin on murine lung eosinophilia」

9) M. HE, T. ICHINOSE, S. YOSHIDA, H. TAKANO, M. NISHIKAWA, G. Sun: American College of Toxicology 33rd Annual Meeting, Orlando, American (2012). [Effect of Asian sand dust on lung allergic inflammation in mice immunized beforehand by ovalbumin]

10) 吉田成一、賀淼、小林史尚、市瀬孝道: フォーラム 2012: 衛生薬学・環境トキシコロジー(2012)「黄砂付着微生物による雄性生殖機能への影響」

11）賀淼、劉博瑩、吉田成一、尾立翠、市瀬孝道：第132回薬学会（2012）「成分組成の異なる黄砂の気管支喘息増悪作用の比較」

12) 松田悠吾、本田晶子、村山留美子、辻堅志、西川雅高、小池英子、吉田成一、市瀬孝道、高野裕久：第19回日本免疫毒性学会（2012）「黄砂がヒト気道上皮細胞に及ぼす影響」

13) 嵐谷奎一、山根裕一、原愁花里、秋山幸雄、楢崎幸範、市瀬孝道: 第53回大気環境学会(2012)「最近の北九州地域の多環芳香族炭化水素濃度の特徴」

14) Y. SONG, T. ICHINOSE, T. KANAZAWA, Y. YOSHIDA: 15th International congress of Immunology. Milan, Italy, Aug (2013) [Intratracheally administration of Asian sand dust activates NF- $ \kappa $ B in immune cells.

15) Y. SONG, T. ICHINOSE, K. MORITA, T. NAKANISHI, T. KANAZAWA, Y. YOSHIDA: 第 36 回日本免疫学会 (2013)「TLR4 is involved in Asian sand dust-induced peripheral inflammation」

16）吉田成一、嵐谷奎一、賀淼、市瀬孝道：フォーラム2013：衛生薬学環境トキシコロジー（2013）：黄砂に付着した有機化合物による雄性生殖機能への影響

17）吉田成一、嵐谷奎一、賀淼、市瀬孝道：第54回大気環境学会年会（2013）「胎仔期黄砂曝露による雄性胎仔および出生仔生殖機能への影響」

18）市瀬孝道、賀淼、高野裕久：第63回日本アレルギー学会秋季学術大会（2013）.「Toll様レセプターKO喘息モデルマウスを用いた黄砂のアレルギー増悪作用の検討」

19) 牧輝弥、小林史尚、柿川真紀子、岩坂泰信: 第29回日本微生物生態学会 (2013)「自由対流圈を風送されるバイオエアロゾルの細菌種組成解析」
20) T. MAKI, F. KOBAYASHI, B. CHEN, F. PUSPITASARI, M. KAKIKAWA, A. MATSUKI, G. SHI, H. HASEGAWA, Y. IWASAKA: 7th International Workshop on Sand/Duststorms and Associated Dustfall (2013)「Diversity and structure dynamics of airborne bacteria (bioaerosols) in Dunhuang City during a dust event」

21）山田丸、中村香耶、亀田貴之、小林史尚、松木篤、築城寿長、檜垣誠吾、早川和一、岩坂泰信：第30回エアロゾル科学・技術研究討論会（2013）「黄砂用マスクの開発と評価」

22) M. HE, T. ICHINOSE, S. YOSHIDA, H. TAKANO, M. NISHIKAWA, G. SUN, T. SHIBAMOTO: Respirology. 18. Suppl 4, (2013). [Role of atmospheric samples collected from Asian sand dust storm in allergic airway inflammation and immune tolerance]

### 7. 研究者略壓

課題代表者:市瀬孝道

麻布獸医科大学獸医学部卒業、獸医学博士、現在、大分県立看護科学大学看護学部教授

研究分担者：

（1）-1）市瀬孝道（同上）

（1）-2）吉田成一

東京理科大学薬学部卒業、博士（薬学）、現在、大分県立看護科学大学准教授

（1）-3）高野裕久

京都府立医科大学医学部卒業、博士（医学）、現在、京都大学教授

(2) 小林 史尚

金沢大学工学部卒業、博士（工学）、現在、金沢大学准教授

(3) 吉田 安宏

広島大学大学院医学研究科修了、博士（医学）、現在、産業医科大学准教授
## 5 C-1155 黄砂エアロゾル及び付着微生物・化学物質の生体影響とそのメカニズム解明に関する研究

（１）黄砂エアロゾル及び付着微生物・化学物質による呼吸器系・生殖器系・免疫系への影響とそのメカニズム解明

大分県立看護科学大学 看護学部 市瀬孝道・吉田成一・定金香里

京都大学 工学研究科 都市環境工学専攻 高野裕久

（独）国立環境研究所 環境健康研究センター 小池英子

＜研究協力者＞

中国医科大学 公共衛生学院 賀 ミョウ

京都大学 工学研究科 都市環境工学専攻 本田 晶子

東京理科大学 環境安全センター 西川 雅高

平成23～25年度累計予算額：83,994千円

（うち、平成25年度予算額：24,936千円）

予算額は、間接経費を含む。

[要旨]

呼吸器系への影響としては、イベントが異なる2つの黄砂を比較するとシリカの多い黄砂よりもPM2.5や微生物成分（LPS、β-グルカン）の多い黄砂の方がアレルギー炎症を増悪することを明らかにした。黄砂エアロゾルに含まれる真菌（Bjerkandera）がアレルギー炎症を誘導し、黄砂と共同してアレルギー喘息や花粉症を増悪することを突きとめた。黄砂に付着している化石燃料燃焼由来のタール（Tar）成分がアレルギー喘息や鼻炎を悪化する因子であることを突きとめた。飛来黄砂は抗原提示細胞の病原体分子パターン認識受容体（TLRs）のTLR2とTLR4によって認識され、アレルギー増悪作用はTLRのアダプター分子MyD88を介して起こる。またTLR2とTLR4のリガンドであるLPSやβ-グルカンが増悪因子である可能性を示した。市販のLPSを用いた再現実験から、黄砂に含まれるレベルの微量のLPSがアレルギー喘息を増悪することを確認した。また付着物を除いた黄砂本体にもアレルギー反応を高める作用があることを見出した。

生殖器系への影響としては、黄砂は雄マウスの造精機能を低下させ、精巣組織障害や精子性状を変化させる等の雄性生殖機能に影響を及ぼしていることを明らかにした。これらの影響は黄砂粒子本体のほか黄砂に付着した微生物成分や有機化合物が関与していることを突きとめた。また、妊娠マウスに黄砂曝露すると雄性出生仔数が低下し、雄性造精機能も低下することを突きとめた。

免疫系への影響としては、黄砂イベントにより、気道上皮細胞、抗原提示細胞、脾細胞等の免疫担当細胞が被る催炎症性作用や免疫応答活性化作用などの影響が異なること、その影響には黄砂に付着した熱易変性物質が関与している可能性が示された。さらに、黄砂エアロブルに含まれるBjerkanderalは免疫応答開始細胞の抗原提示細胞に影響を及ぼすが、気道上皮細胞や脾細胞には影響しないことが示された。Bjerkanderalを含む熱易変性成分が、気管支喘息などの呼吸器・免疫疾患の増加や悪化に関与する可能性を示唆した。
## [キーワード]

黄砂、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、雄性生殖器、免疫担当細胞、気管支上皮細胞

### 1. はじめに

黄砂は古来より春の風物詩として空が黄色に霞む自然現象として認識されていた。しかし、温暖化や中国内陸部の土壌の荒廃によって砂漠化が進むにつれてその発生回数が増加すると共に大規模化し、以前では九州や西日本で多く見られた黄砂現象が近年では北日本や北海道までも見られるようになった。中国はもとより日本や韓国でも、大規模黄砂による交通機関や精密機器等の産業、牧畜、農業生産への被害が発生している他、中国由来の大気汚染物質が加わった汚れた黄砂による健康被害も報告され、現在、黄砂は東アジア一帯の国境をまたぐ環境問題となっている。

近隣諸国の疫学調査では、黄砂現象時に呼吸器系感染症、心血管疾患、心筋梗塞や脳卒中の増加、気管支喘息、アレルギー性鼻炎や結膜炎等による来院患者数の増加等が報告されている $ ^{1} $ ~ $ ^{6} $ 。日本へ飛来する黄砂は、濃度は低いが粒子が細かく、また、黄砂の飛来時期とスギやヒノキの花粉の飛散時期が重なること、更に、小児等の気管支喘息が増加していることから、アレルギー疾患への影響に社会的な関心が向けられている。事実、黄砂現象時に花粉症 $ ^{7} $ や気管支喘息 $ ^{8} $ の症状や病態に悪化が見られること、小児喘息における入院リスクが上昇することが学術論文に報告 $ ^{9} $ され、行政的な対応が迫られている。

そこで、本プロジェクト研究のサブテーマ（1）では、黄砂エアロブル及び付着微生物・化学物質による呼吸器系・生殖器系・免疫系への影響とそのメカニズムを解明することを目的とし、アレルギー喘息やスギ花粉症モデルマウスを用いて黄砂本体、黄砂付着微生物成分や有機化学物質（タール成分）のアレルギーへの影響とその発生メカニズムを調べた。またこれらの雄性生殖器への影響、更に免疫担当細胞（樹状細胞・リンパ球）や気管支上皮細胞へのこれらの影響を調べた。

本研究成果が黄砂問題を解決するための基礎資料となり、黄砂の健康被害の未然防止や軽減策に関連する環境政策に役に立てることを期待する。

## 2 ．研究開発目的

（１）黄砂エアロゾル及び付着微生物・化学物質による呼吸器・免疫系への影響とそのメカニズム解明

本研究では、①黄砂分離微生物の炎症性サイトカイン誘導能を抗原提示細胞によって調査すること、②イベントの異なる黄砂のアレルギー喘息への影響を評価すること、③黄砂に付着している微生物成分（LPS、真菌）や化学物質（タール成分）のアレルギー喘息や花粉症への影響を評価すること、④アレルギー喘息等の増悪メカニズムを、病原体分子パターン認識受容体（Toll様レセプター：TLRs）ノックアウトマウスを用いて解明することを目的とした。

（２）黄砂エアロゾル及び付着微生物・化学物質による生殖器系への影響とそのメカニズム解明

本研究では、①複数のイベント時の黄砂による雄性生殖機能への影響を評価すること、②黄砂粒子本体あるいは黄砂に付着する黄砂構成成分による影響を評価することにより、影響規程因子
の絞り込みを行うこと、③胎仔期黄砂曝露による雄性出生仔の生殖機能への影響を解明することを目的とした。

## （３）免疫担当細胞と気管支上皮細胞における黄砂エアロゾル及び付着微生物・化学物質の影響解明

本研究では、①複数のイベント時の黄砂を、呼吸器系と黄砂の最初の物理化学的接点である気道上皮細胞や免疫応答を担う免疫担当細胞に曝露し、健康影響の異同を評価すること、②黄砂に付着する熱易变性の生物学的要因や化学的要因の役割を評価すること、③黄砂関連生物成分である真菌の影響を評価することにより、影響規定要因の絞り込みと影響発現メカニズム解明を図ることを目的とした。

### 3. 研究開発方法

（1）黄砂エアロゾル及び付着微生物・化学物質による呼吸器・免疫系への影響とそのメカニズム解明

## 1 ）黄砂分離微生物の炎症性サイトカイン誘導能を調査するためのスクリーニング試験

培養細胞はマウスマクロファージ様株細胞(RAW264.7)を用いた。使用微生物は小林らが石川県珠洲市上空で採取した黄砂に付着していた7種類の微生物（Nocardiopsisの4種、Bacillus、Streptomyces、Bjerkandera）を用いた。培地から分離したこれらの微生物を1%ホルマリンにて1時間不活化した。その後、LPSフリーの蒸留水を加えてソニケーターにて粉砕後、12,000回転にて遠心し、この過程を3回繰り返して蒸留にて水洗浄した菌体成分を得た。先ずRAW264.7細胞（4×10^{5} cell）を24時間培養後、前述した黄砂付着微生物7種の菌体を30μg/ml培養液濃度になるように添加し、24時間後のRAW264.7細胞におけるIL-1、MIP-1α、MCP-1、TNF-αのmRNA発現と培養液中のこれらのタンパク発現を測定した。

## 2 ）マウス気管支喘息モデルを用いたアレルギー増悪作用を起こす微生物のスクリーニング試験

本実験には1）で用いた7種の微生物を用いた。本実験では、サブテーマ（3）で採取した風送黄砂を付着有機化合物や微生物などを除去するために360℃、30分間処理した加熱黄砂（H-ASD）を用いた。動物は6週齢のICR系雄マウスを用いた。実験群はOVA（卵白アルブミン）群、OVA+ASD群、OVA+ASD+No.1～4（Nocardiopsiの4種）群、OVA+ASD+No.5（Bacillus）群、OVA+ASD+No.6（Streptomyces）群、OVA+ASD+No.7（Bjerkandera）群の計9群とし、使用したマウスの数は1群1匹～5匹とした。OVAの1回当たりの投与量は1μg/body、ASDは0.1mg/bodyとした。各不活化微生物の1回投与量は一匹当たり5μgとした。これらを生理食塩水に懸濁し、1週間間隔で計4回、気管内投与した。全てのマウスは最終投与翌日に心採血にて屠殺した。各群のマウスから気管支・肺胞洗浄液（BALF）を採取し、炎症細胞数と炎症性サイトカイン・ケモカインを測定した。各群のマウスから肺の病理標本を作製し、気道上皮の粘液産生細胞や好酸球等の炎症細胞を観察した。

## 3 ）Bjerkandera 真菌のアレルギー喘息増悪作用に対する量-反応関係の関する研究

(1)-2の実験によってアレルギー増悪作用を起こす微生物がBjerkandera (B. ad)であることが特