Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
Pneumoniae

19) 賀淼、劉博瑩、吉田成一、尾立翠、市瀬孝道：第 132 回薬学会（2012）「成分組成の異なる黄砂の気管支喘息増悪作用の比較」

20）市瀬孝道、賀淼、吉田成一：第132回本薬学会（2012）「黄砂のスギ花粉症増悪作用」

21）市瀬孝道：第11回東海アレルギーフォーラム(2012）「黄砂アレルギーと微生物の役割」

22）市瀬孝道：第17回那須ティーチイング学術集会（2012）「黄砂はアレルギー増悪因子となりうるか？」（招待講演）

23）吉田成一：第24回生殖・発生毒性学東京セミナー（2012）「黄砂による雄性生殖機能の低下」（招待講演）

24）市瀬孝道：兵庫 Allergy Meeting 2012（2012）「黄砂アレルギーと微生物」（招待講演）

25) 市瀬孝道：第128回山口県医師会生涯研修セミナー．平成25年度第1回日本医師会生涯教育講座.2013年．「アレルギー疾患に及ぼす黄砂の微生物学的影響因子の解析」（招待講演）

26）市瀬孝道：大分大学医学部総合内科学第三講座 第3回 Meet The Experts（2013）「アレルギー疾患に及ぼす黄砂の生物学的影響因子の解析」（招待講演）

27) 吉田成一：染色体学会第 63 回年会 市民公開講座（2012）「自動車排ガスや黄砂などの大気汚染物質とマウス精子形成・精子性状の悪化」（招待講演）

28）市瀬孝道：第7回バイオエアロゾルシンポジウム（2013）「黄砂に付着したBjerkadera菌の気管支喘息増悪作用」

29) M. HE: 第7回バイオエアロゾルシンポジウム (2013) 「Comparison of the aggravating effects of Asian sand dusts contained different quantities of β-glucan and lipopolysaccharide on murine lung eosinophilia」

30) 吉田成一、嵐谷奎一、賀淼、市瀬孝道: フォーラム2013: 衛生薬学環境トキシコロジー(2013): 黄砂に付着した有機化合物による雄性生殖機能への影響

31）吉田成一、嵐谷奎一、賀淼、市瀬孝道：第54回大気環境学会年会（2013）「胎仔期黄砂曝露による雄性胎仔および出生仔生殖機能への影響」

32）吉田成一、嵐谷奎一、小林史尚、賀淼、市瀬孝道：第58回日本生殖医学会 学術講演会（2013）「黄砂エアロゾルによる精子形成・精子運動能への影響因子の探索」

33）吉田成一：第32回日本アンドロロジー学会学術大会（2013）「越境大気汚染物質「黄砂」と雄性生殖機能の低下」

34）市瀬孝道、賀淼、吉田成一、吉田安宏、嵐谷奎一：フォーラム2013：衛生薬学環境トキシコロジー（2013）：フォーラム1. 古くて新しいPM2.5問題を考える．「PM2.5を多く含む黄砂と含まない黄砂のアレルギー性気道炎症への影響」

35）市瀬孝道、賀淼、高野裕久：第63回日本アレルギー学会秋季学術大会（2013）．「Toll様レセプターKO喘息モデルマウスを用いた黄砂のアレルギー増悪作用の検討」

36）市瀬孝道、He Miao、吉田成一、嵐谷奎一、高野裕久：第54回大気環境学会年会（2013）「発生源の異なる2つの黄砂の好酸球性気道炎症の増悪作用」

37) M. HE, T. ICHINOSE, S. YOSHIDA, H. TAKANO, M. NISHIKAWA, G. SUN, T. SHIBAMOTO: Respirology. 18. Suppl 4, (2013). Role of atmospheric samples collected from Asian sand dust
storm in allergic airway inflammation and immune tolerance]

38）市瀬孝道：平成25年度地域衛生組織リーダー研修会．第8回環境と健康を考えるつどい

2013年「黄砂と越境大気汚染物質の健康影響」（招待講演）

## （3） 出願特許

特に記載すべき事項はない。

## （４）シンポジウム、セミナー等の開催（主催のもの）

特に記載すべき事項はない。

## （５）マスコミ等への公表・報道等

1) NHK福岡放送「熱烈発信 福岡NOW」（平成25年3月7日（木）18：10～19:00）

2) NHK福岡放送「特報フロンティア」〔本放送〕（平成25年3月8日（金）19：30～19：55）

3) NHK福岡放送「特報フロンティア」〔再放送〕（平成25年3月10日（日）7：45～8:10）

4) 朝日新聞グローブ（平成25年1月6日朝刊，全国版：G-1頁）

5) 東京新聞 くらし「どうするPM2.5対策」(平成25年3月19日朝刊、21項)

## (6) その他

特に記載すべき事項はない。

### 8 \. 引用文献

1) KWON et al.: Effects of the Asian dust events on daily mortality in Seoul, Korea. Environ. Res. 90, 1–5. (2002)

2) CHEN et al.: Effects of Asian dust storm events on daily mortality in Taipei, Taiwan. Environ. Res. 95, 151–155. (2004)

3) YANG et al.: Effects of Asian dust storm events on daily admissions for asthma in Taipei, Taiwan. Inhal Toxicol. 17, 817-821. (2005)

4) YANG,: Effects of Asian dust storm events on daily clinical visits for conjunctivitis in Taipei, Taiwan. J Toxicol Environ Health A. 69, 1673-80. (2006)

5) CHEN & YANG: Effects of Asian dust storm events on daily hospital admissions for cardiovascular disease in Taipei, Taiwan. J Toxicol Environ Health A. 68, 1457-64. (2005)

6) CHANG et al.: Correlation of Asian dust storm events with daily clinic visits for allergic rhinitis in Taipei, Taiwan. J Toxicol Environ Health A. 69, 229-235. (2006)

7) 佐藤達明：黄砂現象時のアレルギー性鼻炎症状の変化.耳鼻臨床.102：831～839.(2009)

8) WATANABE et al.: Correlation between Asian dust storms and worsening asthma in western Japan. Allergology International. (2011)

9) KANATANI et al.: Desert dust exposure is associated with increased risk of asthma hospitalization in children. Am J Respir Crit Care Med. 182(12):1475-1481. (2010)
# （２）黄砂付着微生物の解析とその毒性物質の検出に関する研究

金沢大学

理工研究域自然システム学系 小林 史尚

理工研究域物質化学系 牧 輝弥

環日本海域環境研究センター 柿川 真紀子

医薬保健研究域医学系 東 朋美

〈研究協力者〉

労働安全衛生総合研究所

環境計測管理研究グループ 山田丸

平成23(開始年度)～25年度累計予算額：23,296千円（うち、平成25年度予算額：6,916千円）

予算額は、間接経費を含む。

## [要旨]

近年の黄砂現象の頻発化・大規模化にともない、健康をはじめとする種々の影響評価が注目されているが、黄砂バイオエアロゾルに関する健康影響はいまのところ明らかになっていない。

そこで本研究では、黄砂沈着地域である石川県珠洲市上空のバイオエアロゾルを係留気球や航空機を用いて直接採集し、生物分析結果から人に影響を及ぼす微生物の検索を行った。種々の生物分析法を駆使して、菌種の高度分布から沈着する菌株と通り過ぎる菌株を明らかにした。次に、サブテーマ1と連携し、直接採集した黄砂バイオエアロゾルをサブテーマ（1）に提供し、生体影響とメカニズム解明をサポートした。アレルギ一起因の真菌Bjerkanderaの大気中濃度、原因物質であるβ-グルカン濃度測定、大気中DNA濃度および黄砂イベント前後の種組成変化を測定した。さらに、黄砂イベントASD1(2011年5月2日)およびASD2(2011年5月13日)における大気DNA濃度、細菌種組成、リアルタイムPCRを用いて2つの黄砂イベントDNAライブラリーを作成し、バチルス・スタフィロコッカス遺伝子、セレウス菌毒素セレウリド合成酵素遺伝子（CRS遺伝子）、黄色ブドウ球菌毒素性ショック症候群毒素遺伝子（TSST-1）、O-157（ベロ毒素）遺伝子、および呼吸器系感染症起因菌遺伝子の検出・定量を実施した。ほとんどの毒性遺伝子は検出されなかったが、バチルス・スタフィロコッカス遺伝子に関しては多くの遺伝子が検出・定量された。定点捕集・DNAライブラリーを用いた大気DNA濃度計測、リアルタイムPCRによる毒素遺伝子検出法を提案するとともに、波及効果として、国民の健康阻害防止のために、黄砂付着微生物、黄砂バイオエアロゾル用マスクの開発を実施した。

## [キーワード]

黄砂、バイオエアロゾル、直接採集、生物分析、毒素遺伝子検出
### 1. はじめに

近年の黄砂現象の頻発化・大規模化にともない、ヒトの健康をはじめとする種々の影響評価が注目されている。黄砂の健康影響に関しては、これまでにいくつかの報告があり、発生源を持つ中国では黄砂現象時に呼吸器感染症、心血管疾患、心筋梗塞や脳卒中の発生率が高かったことが新聞等で報道されている $ ^{1} $ 。動物実験等により、黄砂に付着した微生物由来のリボ多糖(LPS)やβ-グルカンなどが影響しているとの報告もある $ ^{2} $ 。著者らは2006年8月に黄砂発生源の敦煌市において係留気球を用いた上空の黄砂粒子の直接採集を行い、その生物分析結果から黄砂粒子に微生物が付着していることを発見した $ ^{3} $ 。その後種々の黄砂バイオエアロブルの研究が行われてきたが $ ^{4,5} $ 、黄砂バイオエアロブルの健康影響についてはまだほとんど明らかになっていない。

## 2 ．研究開発目的

黄砂沈着地域である能登半島石川県珠洲市上空のバイオエアロブルを係留気球や航空機を用いて直接採集し、生物分析から人に影響を及ぼす微生物の検索を行う。また、直接採集サンプルを用いてアレルギーに関係のある微生物由来物質の定量および毒素遺伝子の検出を行う。さらに、サブテーマ（1）と連携し、直接採集した黄砂バイオエアロブルをサブテーマ（1）に提供し、生体影響とメカニズム解明をサポートすることを目的とする。

## 3 ．研究開発方法

## （１）沈着地域能登半島珠洲市における黄砂バイオエアロゾル直接採集・生物分析

黄砂沈着地域における調査は、日本石川県珠洲市（金沢大学里山里海自然学校）において、航空機と係留気球を用いた上空の黄砂バイオエアロゾル直接採集を2011年3月および2012年3月に実施した。航空機は高度約2,900 m（9,500 FT）にて1時間吸引した。係留気球を用いた直接採集については、発生源にて行った方法とほぼ同じく1時間吸引した。これらのサンプル及びこれまでに採集したサンプルの生物分析は、1）分離培養・同定法、2）メタゲノム法、3）耐塩性細菌培養法などを行った。2012年3月1日、石川県珠洲市において航空機（3,000 m）、係留気球（1,000 m）、地上（10 m）の異なる高度で同時サンプリングを実施した。採集方法は、雑菌汚染のないように独自に開発した大気バイオエアロゾルサンプラーを用いて行った。持ち帰ったメンブランフィルターサンプルから直接DNA抽出を行い、16S rDNAクローンライブラリーを用いて細菌種組成を解析した。

## （２）直接採集され分離培養された菌株のサブテーマ（１）への提供および提供菌の大気濃度

大型の黄砂が発生した日に金沢市地上10m（金沢大学自然科学研究棟5階：捕集期間2011年5月1日～7日）において、メンブランフィルター上に黄砂鉱物粒子を含むエアロゾル試料を12時間ごとに捕集した。また，2012年3月上旬に、能登半島珠洲市において、係留気球および航空機を組み合わせ、高度3000mまでの高高度サンプリングを施行した。試料をDAPIで染色した後、蛍光顕微鏡下でエアロゾル粒子を計数した。エアロゾル試料から直接抽出したゲノムDNAを鋳型に16S rRNA遺伝子（16S rDNA）をPCR増幅させ、クローンライブラリーを作成し、細菌種組成を系統分類学的に解析した。
健康影響を検討するために、金沢大学自然科学1号館4階ベランダにて（北緯36度32分、東経136度42分、海拔125 m、地上からの高さ15 m）平成23年3月17日から6月15日まで毎日6時間吸引ポンプと滅菌フィルターを用いて大気バイオエアロゾルを採集した。フィルターサンプルは、黄砂バイオエアロゾルのメタゲノム解析にために開発したDNA抽出法に従い直接DNAを抽出され、大気DNA濃度を測定した。また、アレルギーに悪影響を及ぼすとされる菌体成分のβ-グルカン濃度を測定した。

## （３）黄砂バイオエアロゾルの健康影響評価

また、2011年、2012年と2013年の3年にわたり黄砂の飛来する春季（3月、4月、5月）に金沢市地上約10 m（金沢大学自然科学1号館4階ベランダ）にて日中6時間サンプリングを実施した。採集は、雑菌汚染のないようにあらかじめ滅菌処理されたメンブランフィルターに滅菌フィルターコニットを用いて36 L/minのダイヤグラムポンプなどを用いて吸引した。メンブランフィルターサンプルから直接DNAを抽出し、そのDNAライブラリーから大気DNA濃度測定、リアルタイムPCRを用いた毒素遺伝子検出を行った。

そのDNAをテンプレートとし、リアルタイムPCR法を用いたセレウリド産生性セレウス菌遺伝子(CRS遺伝子)やインフルエンザ菌、クラミジア菌、レジオネラ菌の各種毒素遺伝子の検出を行った。

## （４）波及効果：黄砂バイオエアロゾル対策用マスクの開発

当初計画にはなかったが、黄砂バイオエアロブルの体内への侵入防御策として、マスクの開発も提案、実施されている。黄砂付着微生物に対し抗菌性のあるマスク素材の開発に関しては、2009年能登半島上空3,500 mで直接採集・分離培養同定されたBacillus sp. BASZHN0901 $ ^{5)} $ を用いて種々のフタロシアニン繊維の抗菌性を測定した。

## 4 ．結果及び考察

## （１）沈着地域能登半島珠洲市における黄砂バイオエアロゾル直接採集・生物分析

黄砂バイオエアロブルの直接採集・生物分析は、能登半島珠洲市を中心に、航空機、係留気球等を駆使して直接採集、分析方法としては、1）分離培養・同定、2）メタゲノム、3）耐塩性細菌などを実施した。以下にその生物分析方法を中心に示す。

## 1 ）分離培養・同定

航空機を用いた直接採集と分離培養・同定結果では、(a)2009年11月、(b)2010年3月、(c)2010年5月の3回のサンプリングから、それぞれBacillus sp.、Bacillus sp.、Methylobacterium sp.が単離された。それぞれ高度は(a)3,500 m、(b)2,900 m、(c)3,000 mであり、後方流跡線解析では、(a)ゴビ砂漠方面の西から、(b)ゴビ砂漠方面の西から、(c)シベリヤ方面の北からであった。黄砂現象の可否については、(a)非黄砂、(b)弱い黄砂、(c)ダストは多いが黄砂ではない、という結果であった。以上の結果から、西からの黄砂にはBacillus sp.が多く含まれ、黄砂ではない北からはBacillus sp.ではなくMethylobacterium sp.などが含まれることがわかった。タクラマカン砂漠の砂から
Bacillus sp.が単離されていることから $ ^{1)} $ 、砂漠から舞い上がる黄砂など西からはBacillus菌（枯草菌）が飛来すると考えられる。なお、このBacillus菌には、病原菌であるセレウス菌や炭疽菌なども含まれるため、黄砂とともに健康影響に関連する菌が飛来している可能性がある。他にも、2010年度および2011年度の係留気球・航空機を用いたサンプルから分離培養・同定法によってMethlobacterium sp.やStaphylococcus sp.など21菌株が新たに発見された。

## 2 ）メタゲノム解析

2010年5月の航空機を用いたサンプルのメタゲノム解析ではVariovorax属菌株が54％を占めることがわかった。優占種であるVariovorax sp.の2種は2008年黄砂時の能登上空で検出されたVariovoraxの配列と100％一致した。Methylobacterium sp.など15種の細菌（3種の新種を含む）が検出された。航空機ではなく同日の係留気球を用いた約1,000 mのサンプルからはSphingomonas sp.やBrevibacterium sp.、Ralstnia sp.など17種の細菌（1種の新種を含む）が検出され、SphingomonasとUncultured bacteriumの2種は、2009年非黄砂時の能登半島上空で検出された配列と100％一致した。同じ日でも上空1 kmと3 kmでは浮遊しているバイオエアロゾルの生物種は異なることがわかった。2010年度および2011年度の係留気球・航空機を用いたサンプルからメタゲノム解析によってVariovorax sp.など107菌株が新たに発見された。

## 3 ）耐塭性細菌

航空機や係留気球サンプルの耐塩性細菌として単離されたBacillus subtilisグループのgyrB遺伝子配列を用いた系統学的分類によると黄砂とともにBacillus subtilisが越境輸送された可能性が高いことがわかった。また、Bacillus amyloliquefaciensグループのgyrB遺伝子配列を用いた系統学的分類結果から、珠洲上空には特有の細菌群が存在することがわかった。2010年度および2011年度の係留気球・航空機を用いたサンプルから耐塩性細菌分析によってBacillus sp.など39菌株が新たに発見された。

2012年3月1日に石川県珠洲市において航空機（3,000 m）、係留気球（1,000 m）、地上（10 m）の異なる高度で同時サンプリングを行った。図(2)-1は、それぞれの高度の細菌種組成を示す。航空機（3,000 m）と係留気球(1,000 m)で検出され、地上（10 m）では検出されなかったAlpha proteobacteriaやBacterioidetesは、珠洲市上空を通り過ぎて、沈着しなかった細菌群と考えられる。また、係留気球(1,000 m)と地上（10 m）で検出され、航空機（3,000 m）で検出されなかったActinobacteriaなどは地上が発生源で大気混合層を漂っている細菌群と思われる。航空機（3,000 m）、係留気球(1,000 m)と地上（10 m）のいずれの高度でも検出されたFirmicutesやCyanobacteriaなどは、石川県珠洲市に上昇流はほとんどないので、落下沈着している細菌群の可能性が高い。採集日は、黄砂観測日ではないのでバックグラウンド黄砂と考えられるが、日本を通り過ぎる細菌群や落下沈着する細菌群がわかった。落下沈着する細菌群の中でCyanobacteriaは、いわゆる藍藻とも呼ばれる真正細菌の1群であり、海洋起源と考えられる。黄砂付着微生物として注目される細菌群はFirmicutesであり、これまで黄砂付着微生物としてよく発見されているBacillus subtilisを含む。黄砂付着微生物が通り過ぎ、落下沈着するメカニズムは不明であるが、気象条件や混合状態に大きく影響するものの黄砂付着微生物の種類や性状と大きく関与すると思われる。

黄砂沈着地域上空の係留気球や航空機を用いた直接採集および種々の生物分析結果から、黄砂
には非常に多種多様の微生物、黄砂バイオエアロゾルが含まれることがわかった。

図(2)-1.16S rDNA クローンを用いた細菌種組成の垂直分布

（２）直接採集され分離培養された菌株のサブテーマ（１）への提供および提供菌の大気濃度

2008年5月7日に係留気球を用いて珠洲市において高度400mにて採集されたNorcardiopsis sp. BASZUN0801、Norcardiopsis sp. BASZUN0802、Norcardiopsis sp. BASZUN0803、Norcardiopsis sp. BASZUN0804、およびBjerkandera sp. BASZUP0801、Bjerkandera sp. BASZUP0802など $ ^{4)} $ の菌株を生体影響とメカニズム解明のためにサブテーマ（１）に提供した。

上記Bjerkandera sp.に関して、黄砂時における大気濃度等を実験的に検討した。黄砂発生時に採取した大気エアロゾル粒子を蛍光頭微鏡下で観察したところ、微生物細胞である青色粒子、鉱物粒子と見なせる白色粒子および有機物である黄色粒子が観察された。サブテーマ（1）でアレルギーを顕著に増悪させることが実証された真菌（Bjerkandera）は、黄色に呈する細胞も有し（図(2)-2)）、断片化して大気中に飛散すると考えられる。黄色粒子の粒子濃度は、黄砂が発生すると $ 10^{5} $ particles/m³のオーダーの10倍に増大し、黄砂が続く限り高濃度を維持した（図(2)-3）。

黄砂発生時の細菌種組成の動態を示すクローンライブラリーでは、黄砂発生初期に海洋起源の藍藻が増え、黄砂時期の中盤において大陸に起因する細菌群が検出された（図(2)-4）。黄砂中盤で検出された特定細菌種（Bacillus）は、黄砂発生地（タクラマカン砂漠）および西風が卓越した珠洲上空1000mと3000mで採取した種と遺伝子レベルで100％の一致を示した。また、黄砂発生時には、アレルギーの増悪が懸念されるグラム陰性細菌が、100倍（ $ 10^{7} $ particles/m³）の細胞濃度にまで増え、全細菌数の10％から40％を占めた（図(2)-3）。

今回の結果によると、アレルギーを増悪させる微生物（担子のう菌、グラム陰性細菌）は、黄砂が発生すると10倍から100倍の細胞密度に増大し、2011年5月のように黄砂が長期化すると、その高い濃度を数日間維持する。

2011年3月17日から6月15日まで金沢大学で定点観測した大気DNA濃度を図(2)-5に示す。種々ばらつきがあるものの、黄砂観測日（5月2、3、4、13日および6月4日）前後には大気DNA濃度が増加することがわかった。大気DNA濃度の定量性についてはまだ検討する余地があると思われる。黄砂観測日付近のサンプルからアレルギーを増幅させるといわれている微生物由来のβ-グルカン濃度を測定した結果、黄砂観測日に特異な濃度差がみられなかった。β-グルカンについては
0.4μm以上のエアロブル全てのサンプルを測定したので花粉や比較的大きい粒子に含まれるβ-グルカンが検出されてしまったと考えられる。まだ種々検討する必要があるものの、定点観測における大気DNA濃度およびそのサンプルからのDNA毒素遺伝子検出、β-グルカン濃度の測定が可能であることがわかった。

バイオエアロゾルの蛍光特性

80％がタンパク質分解酵素で分解される。

担子菌（BjerkanderaAdusta）

培養条件によって黄色い細胞が見られる

図(2)-2. Bjerkanderaの顕 微鏡観察

図(2)-3. 黄砂イベント時におけるバイオエアロゾル濃度の変化（顕微鏡観測）
図(2)-4. バイオエアロゾルの種組成変化(2011年5月1日～7日)

図(2)-5. 定点観測による大気DNA濃度
## （３）黄砂バイオエアロゾルの健康影響評価

金沢市地上約10 mにおいて本年度も含め2011年、2012年と2013年の3年にわたり黄砂の飛来する春季（3月、4月、5月）にメンブランフィルターとポンプを用いて、毎日、金沢大学自然研1号館4階にて定点観測・採集を実施した。このサンプルの中で、2011年の黄砂イベントASD1（2011年5月2日）およびASD2（2011年5月13日）のDNAライブラリーサンプルに関して、大気DNA濃度の計測、16S rDNAクローンを用いた細菌種組成解析、およびリアルタイムPCRを用いた各種毒素遺伝子検出を行った。図(2)-6は、黄砂イベントASD-1およびASD-2の大気DNA濃度を示す。この時のDNA抽出法は、経日変化を測定した図(2)-5とは異なり、図(2)-6の方が正確と言える。

ASD-2（2011年5月13日）の大気DNA濃度は、平常時の約8倍であり、ASD-1（2011年5月2日）の約1.5倍であった。黄砂によって多くの細菌が輸送され、黄砂イベントによって飛来する微生物量も異なることがわかった。図(2)-7は、黄砂イベントASD-1およびASD-2における16S rDNAクローンを用いた細菌種組成を示す。大気DNA濃度が低いASD-1は多様性が富み、黄砂イベントによって飛来する際菌種も異なることが分かった。黄砂イベントASD1もASD2もGamma proteobacteriaが優先した。Gamma proteobacteriaには、サルモネラ（腸炎・腸チフス）、ビブリオ（コレラ）、緑膿菌（院内感染や囊胞性線維症患者における肺感染症）など多くの病原菌を含んでいるので、黄砂付着微生物がヒトの健康に影響する可能性があると思われる。そこで、黄砂イベントASD-1およびASD-2のDNAライブラリーサンプルに対し、リアルタイムPCRを用いた毒素遺伝子検出を試みた。衛生指標菌としてバチルス属菌群と黄色ブドウ球菌を含むスタフィロコッカス属菌群および大腸菌やサルモネラ菌を含む腸内細菌群の遺伝子についてリアルタイムPCR検出を行った。図(2)-8は、バチルス属とスタフィロコッカス属遺伝子を用いたリアルタイムPCR検出結果を示す。閾値計算から、黄砂イベントASD-1は1.64×10³ copies/m³、ASD-2は5.29×10³ copies/m³の濃度で衛生指標菌バチルス属およびスタフィロコッカス属菌株を含むことがわかった。腸内細菌群遺伝子は検出されなかった。他にも、食中毒などの原因菌セレウス菌毒素セレウリド合成酵素遺伝子（CRS遺伝子）（図(2)-9）、黄色ブドウ球菌毒素性ショック症候群毒素遺伝子（TSST-1）、O-157（ベロ毒素）遺伝子、および呼吸器系感染症起因菌遺伝子についても検出されなかった。図(2)-8から算出された菌数の健康影響評価

のために、本黄砂イベント時にどれぐらい暴露された時に食品の微生物汚染が起こるか試算を行った。黄砂イベントASD-1およびASD-2の暴露限界時間はそれぞれ1.4hrsと49minとなった。食品微生物汚染として黄砂イベントASD-2は、ASD-1よりも約1.7倍危険な黄砂日であると言える。それぞれの黄砂イベントの健康影響に関する危険性を評価できた。

図(2)-6. 黄砂イベント時の大気DNA濃度
図(2)-7. 黄砂イベント時の16S rDNAクローンを用いた細菌種組成の比較

図(2)-8. 黄砂イベントのリアルタイムPCRを用いたバチルス・スタフィロコッカス遺伝子検出

図(2)-9. 黄砂イベントのリアルタイムPCRを用いたバチルスセレウス(CRS)毒素遺伝子検出
## （４）波及効果：黄砂バイオエアロゾル対策用マスクの開発

これまで得られた知見を応用し、マスク素材の開発を試みた。これまでマスクの素材に関して、土壌菌などを対象に抗菌性などが試験されてきたが、実際に浮遊している黄砂バイオエアロゾルなどで試験する必要がある。そこで、実際の黄砂バイオエアロゾルに有効かどうか実験的に検討した。実験に使用された菌株は航空機を用いて直接された黄砂バイオエアロゾル Bacillus sp. BASZHN0901である。黄砂付着微生物対策用マスクの開発については、JIS L 1902の抗菌性試験方法の使用菌株を本研究で採集・分離培養同定された Bacillus sp. BASZHN0901 を用いて検討した結果、静菌活性値および殺菌活性値のいずれにおいても、コバルト 2 wt% 担持フタロシアニンで効果があった。黄砂付着微生物、黄砂バイオエアロゾル対策用マスクとしては以上の繊維を用いればよいことがわかった。

## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

これまでに健康影響評価が難しかった黄砂バイオエアロゾルに関して、係留気球や航空機を用いた直接採集と多角的な生物分析により、健康影響評価への可能性が導けるとともに、定点観測と大気DNA濃度測定、リアルタイムPCRを用いた毒素遺伝子検出によってこれまでなかった健康影響評価が可能になった。

黄砂時にはアレルギーを増悪するLPSを含むグラム陰性細菌やPGNを含むグラム陽性細菌，担子のう菌などの大気中の微生物濃度が10倍から100倍増加することを明らかにした。これまでよくわかっていなかった黄砂付着微生物の中で、日本上空を通り過ぎるものと落下沈着する細菌種が、航空機・係留気球・地上の高度別同時サンプリングとそのサンプルの細菌種組成解析で明らかになった。これまで簡易かつ精度の高い測定が難しかった黄砂イベント時おける黄砂付着微生物濃度の測定が、定点観測・捕集と直接DNA抽出・DNA測定法から可能になった。大気黄砂付着微生物濃度の指標となる大気DNA濃度は、黄砂イベントの時（ASD-2：2011年5月13日）には平時の約8倍であり、近日の黄砂イベント（ASD-1：2011年5月2日）の約1.5倍と全く異なることがわかった。これまで黄砂イベント時にどのような細菌種がいたか不明であったが、定点捕集DNAライブラリーの細菌種組成解析より明らかになった。さらに、新たに開発したリアルタイムPCRを用いた定点捕集DNAライブラリーからの毒素遺伝子検出法により、黄砂付着微生物として危険な黄砂イベントの程度測定法を提案できた。

## （２）環境政策への貢献

## ＜行政が既に活用した成果＞

特に特記すべき事項はない。

## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

係留気球や航空機を用いた黄砂バイオエアロゾルの直接採集・生物分析結果より黄砂に付着している微生物の健康影響評価が可能になると同時に定点観測からの大気DNA濃度測定、ダイレク
トな毒素遺伝子検出により将来的には大気監視項目の追加など環境政策への貢献の可能性が示された。

本研究での黄砂時の大気中におけるLPSやPGNを含む微生物濃度の増大から，黄砂時のアレルギー増悪の可能性を示唆した。環境省の黄砂問題検討会議における黄砂の危険性の検討において、本研究の成果である黄砂付着微生物の結果より、黄砂付着微生物としての危険性を提示できた。また、本研究の成果である定点捕集・DNAライブラリーを用いた大気DNA濃度計測、リアルタイムPCRによる毒素遺伝子検出法を、全国の気象台における観測に応用することによって、より緻密な黄砂の危険度を国民に情報発信できる。さらに、黄砂付着微生物用マスクの開発により、黄砂粒子のみならず黄砂付着微生物の防止すなわち、国民の健康阻害の防止に役立つと考えられる。

## 6 ．国際共同研究等の状況

本研究の直接的な業務ではないが、関連する業務として、黄砂発生点である中国北西部タクラマカン砂漠東端の敦煌市において毎年係留気球を用いた高高度や地上における黄砂の直接採集および生物分析を実施している。カウンターパートは、中国科学院大気物理研究所 石廣玉教授および陳彬助教である。

### 7. 研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

## <論文（査読あり）>

1) T. MAKI, A. ISHIKAWA, F. KOBAYASHI, M. KAKIKAWA, K. AOKI, T. MATSUNAGA, H. HASEGAWA, Y. IWASAKA: Effects of Asian dust (KOSA) deposition event on bacterial and microalgal communities in the Pacific ocean. Asian Journal of Atmospheric Environment (2011) 5, 157-163.

2) F. KOBAYASHI, S. MOROSAWA, T. MAKI, M. KAKIKAWA, M. YAMADA, Y. TOBO, C.-S. HON, S. MATSUKI, Y. IWASAKA: Atmospheric bioaerosol, Bacillus sp., at an altitude of 3,500 m over the Noto Peninsula: Direct sampling via aircraft. Asian Journal of Atmospheric Environment (2011) 5, 164-171.

3) B. CHEN, F. KOBAYASHI, M. YAMADA, Y-H. KIM, Y. IWASAKA, G-Y. SHI: Identification of cultureable bioaerosols collected over dryland in Northwest China: Observation using a tethered balloon. Asian Journal of Atmospheric Environment (2011), 5, 172-180.

4) 牧輝弥、青木一真、小林史尚、柿川真紀子、松木篤、木野恵太、長谷川浩、岩坂泰信：「立山積雪層に保存される黄砂バイオエアロゾルの集積培養と系統分類学的解析. エアロゾル研究(2011)， 24, 332-340

5) F. KOBAYASHI, T. MAKI, AND Y. NAKAMURA: Biodegradation of phenol in seawater using bacteria isolated from the intestinal contents of marine creatures. International Biodeterioration and Biodegradation (2012), 69, 113-118.

6) T. MAKI, F. KOBAYASHI, M. YAMADA, H. HASEGAWA, Y. IWASAKA: NaCl-amendment assay targeting airborne bacteria in tropospheric bioaerosols transported by westerly wind over Noto Peninsula ansported by westerly wind over Noto Peninsula. Aerobiologia (2013), 9,
341-354.

7) T. MAKI, M. KAKIKAWA, F. KOBAYASHI, M. YAMADA, A. MATSUKI, H. HASEGAWA, Y. IWASAKA: Assessment of composition and origin of airborne bacteria in the free troposphere over Japan. Atmospheric Environment (2013) 74, 73-82.

8) 牧輝弥、福島理英、小林史尚、山田丸、長谷川浩、岩坂泰信：大気中を風送される細菌叢の16S rDNA-クローンライブラリー解析. 分析化学 (2013), 62, 12, 1095-1104.

9) 牧輝弥、原和崇、山田丸、小林史尚、長谷川浩、岩坂泰信：バイオエアロゾルの蛍光顕微鏡観察. エアロゾル研究 (2013), 28, 3, 201-207

10) T. HIGASHI, Y. KAMBAYASHI, N. OHKURA, M. FUJIMURA, S. NAKANISHI, T. YOSHIZAKI, K. SAIJOH, K. HAYAKAWA, F. KOBAYASHI, Y. MICHIGAMI, Y. HITOMI, H. NAKAMURA: Exacerbation of daily cough and allergic symptoms in adult patients with chronic cough by Asian Dust: A hospital-based study in Kanazawa. Atmos. Environ (2014), in press.

## くその他誌上発表（査読なし）>

1) 古本翔吾、牧輝弥、松木篤、原和崇、小林史尚、長谷川浩、岩坂泰信：日本分析化学会第61年会展望とトピックス、p1「氷晶核バイオエアロブルの探索と定量化にむけた蛍光およびラマン顕微鏡観察法の確立」

2) 牧輝弥：ぶんせき(2014)印刷中 「PCR 法を併用した超並列シーケンサーによる環境微生物叢の群集構造解析」

## （2） 口頭発表（学会等）

1) 牧輝弥：黄砂現象の環境・健康影響、微生物および化学物質の長距離移動、総合地球環境学研究所中国環境問題研究拠点、地球研プロジェクト(2011)「黄砂バイオエアロゾルに含まれる細菌種組成」

2) 東朋美：黄砂現象の環境・健康影響、微生物および化学物質の長距離移動、総合地球環境学研究所中国環境問題研究拠点、地球研プロジェクト(2011)「黄砂バイオエアロゾルの健康影響調査」

3) T. MAKI, F. KOBAYASHI, M. KAKIKAWA, M. ATSUSHI, Y. IWASAKA: 2011 International Union of Geodesy and Geophysics General Assembly (IUGG), Melbourne, Australia (2011)「Phylogenetic analysis of long-range transported bacteria isolated from Asian dust (KOSA) bioaerosols」

4) 山田丸、吉田翔太、亀田貴之、小林史尚、諸沢真治、中村香耶、松木篤、築城寿長、檜垣誠吾、岩坂泰信、早川和一：第20回環境化学討論会(2011)「環境中の多環芳香族炭化水素および細菌の除去を目的とした機能性繊維の開発及び評価」

5) 小林史尚、牧輝弥、柿川真紀子、岩坂泰信：第63回日本生物工学会大会(2011)「黄砂バイオエアロゾルの植物生態系に及ぼす影響に関する萌芽的研究」

6) 牧輝弥、小林史尚、柿川真紀子、松木篤、山田丸、岩坂泰信：CIGR（国際農業工学会）国際シンポジウム2011，日本農業工学会第27回シンポジウム・日本学術会議公開シンポジウム(2011）「黄砂バイオエアロゾルに含まれる微生物群種組成の特徴とその食文化への影響」
7) 岩坂泰信、山田丸、小林史尚、牧輝弥、柿川真紀子、東朋美：CIGR（国際農業工学会）国際シンポジウム2011，日本農業工学会第27回シンポジウム・日本学術会議公開シンポジウム(2011）「黄砂とともに長距離輸送する微生物」

8) 小林史尚、岩坂泰信、牧輝弥、柿川真紀子、山田丸、東朋美、長沼毅、松木篤：第5回南極観測シンポジウム(2011)「南極域の風送バイオエアロブル実相調査」

9) F. KOBAYASHI, T. MAKI, M. KAKIKAWA, M. YAMADA, A. MATSUKI, T. NAGANUMA, AND Y. IWASAKA: The 2nd Symposium on Polar Science, Tachikawa, Japan (2011) [The research of atmospheric bioaerosols over Antarctica]

10) T. MAKI, F. KOBAYASHI, AND Y. IWASAKA: The 2nd Symposium on Polar Science, Tachikawa, Japan (2011) [Characteristics of cosmopolitan microbial communities transported by Asian desert dust (KOSA)]

11) T. MAKI, F. KOBAYASHI, M. KAKIKAWA, A. MATSUKI, M. YAMADA, Y. IWASAKA: The annual meeting of Sino-Japan S&T project, Hainan, China (2011) [Japanese fermented food produced by long-range transported bacteria in Asian dust (KOSA) bioaerosols]

12) M. KAKIKAWA, F. KOBAYASHI, T. MAKI, M. YAMADA, A. MATSUKI, Y. IWASAKA: The annual meeting of Sino-Japan S&T project, Hainan, China (2011) [The characteristics of airborne microorganisms in the atmosphere over an Asian dust arrival region, Noto peninsula, 2008-2010]

13）山田丸、福山厚子、陳彬、張代州、小林史尚、牧輝弥、柿川真紀子、松木篤、早川和一、石広玉、岩坂泰信：日本気象学会2011年度秋季大会(2011）「OPCゾンデを用いた黄砂発生源上空の粒子数濃度-粒径分布の鉛直分布観測：2010年9月15日の事例解析と過去の観測結果との比較」

14）山田丸: 第2回金沢大学若手研究者シーズ発表会(2011)「機能性マスク素材繊維の開発研究」

15）小林史尚、牧輝弥、柿川真紀子、山田丸、長沼毅、松木篤、岩坂泰信：第6回大気バイオエアロゾルシンポジウム(2011)「南極域の風送バイオエアロゾル実相調査：気球等を使った先駆的生態系観測の展開」

16）牧輝弥、小林史尚、青木一真、岩坂泰信：第6回大気バイオエアロゾルシンポジウム（2011）「黄砂によって長距離輸送される優占細菌種とその納豆発酵機能の解明」

17）柿川真紀子、小林史尚、牧輝也、山田丸、松木篤、岩坂泰信：第6回大気バイオエアロブルシンポジウム(2011）「非培養法による能登半島上空の生物種同定」

18）山田丸、小林史尚、諸澤真治、吉田翔太、亀田貴之、中村香耶、松木篤、築城寿長、檜垣誠吾、早川和一、岩坂泰信：第6回大気バイオエアロゾルシンポジウム(2011）「環境中の細菌・有害有機化合物除去繊維の開発」

19）松永智樹、牧輝弥、石川輝、青木一真、斎藤佑樹、岩坂泰信：第6回大気バイオエアロブルシンポジウム(2011)「外洋船上実験を利用した黄砂が及ぼす海洋微生物生態系への影響の解明」

20) T. MAKI: Workshop on the persistent toxic substances (PTS) and persistent organic pollutants (POPs) ecological issues in the NOWPAP region (2011) [Phylogenetic analysis of bacterial communities included in free tropospheric bioaerosol over East Asia]

21）東朋美、神林康弘、藤村政樹、大倉徳幸、吉崎智一、中西清香、西條清史、早川和一、人
見嘉哲、小林史尚、道上義正、朝倉大貫、山崎政美、三苫純子、岡田源作、中村裕之：東アジアにおけるエアロゾルの植物・人間系へのインパクト 第2回シンポジウム(2012)「黄砂による健康影響—慢性咳嗽の症状への影響—」

22) F. KOBAYASHI, T. MAKI, M. KAKIKAWA, M. YAMADA, A. MATSUKI, T. NAGANUMA, T. HIGASHI, Y. IWASAKA: 5th International Symposium on the Environment of the Rim-Japan Sea Regions (2012) [The research of atmosphere bioaerosol over Antarctica]

23) T. MAKI, F. KOBAYASHI, M. KAKIKAWA, K. AOKI, A. MATSUKI, M. YAMADA, Y. IWASAKA: 5th International Symposium on the Environment of the Rim-Japan Sea Regions (2012) [Japanese fermented food produced by long-range transported bacteria in Asian dust (KOSA) bioaerosols]

24) M. KAKIKAWA, F. KOBAYASHI, T. MAKI, A. MATSUKI, M. YAMADA, Y. IWASAKA: 5th International Symposium on the Environment of the Rim-Japan Sea Regions (2012) [The characteristics of airborne microorganisms in the atmosphere over an Asian dust arrival region, Noto peninsula]

25）牧輝弥、小林史尚、柿川真紀子、諸澤真治、山田丸、松木篤、岩坂泰信：第3回能登総合シンポジウム(2012)「能登半島上空に風送される大気バイオエアロゾル～西からの旅人と北からの旅人～」

26）柿川真紀子：第3回能登総合シンポジウム(2012）「非培養法で同定した能登上空に浮遊する微生物，2008～2010春季」

27）東朋美、神林康弘、藤村政樹、吉崎智一、早川和一、西條清史、人見嘉哲、小林史尚、道上義正、中村裕之：第82回日本衛生学会総会(2012）「黄砂による慢性咳嗽の症状への影響」

28）牧輝弥：ニコニコ技術部金沢支部会（2012）「そらなっとう発売中；空の微生物を食べよう！」

29) T. MAKI, A. IAHIKAWA, F. KOBAYASHI, M. KAKIKAWA, K. AOKI, A. MATSUKI, H. HASEGAWA, Y. IWASAKA: Asia Oceania Geosciences Society (AOGS) General Assembly (2012)「Effects of Asian dust (KOSA) deposition event on microbial compositions in the Pacific Ocean」

30）松永智樹、牧輝弥、石川輝、齋藤佑樹、堀内周、青木一真、長谷川浩、岩坂泰信：日本分析化学会第61年会（2012）「太平洋に沈着した黄砂鉱物粒子が及ぼす海洋微生物生態系への生化学的影響の解明」

31）齋藤佑樹、牧輝弥、石川輝、松永智樹、青木一真、長谷川浩、岩坂泰信：日本分析化学会第61年会（2012）「黄砂鉱物粒子によって変動する海洋微生物群の核酸クローン解析」

32）牧輝弥、小林史尚、柿川真紀子、松木篤、岩坂泰信：第35回極域気水圏シンポジウム（2012）「能登半島上空へと長距離輸送される大気バイオエアロブル～北極域および中国乾燥地帯～」

33）牧輝弥、青木一真、小林史尚、柿川真紀子、松木篤、岩坂泰信：立山研究会2012，(2012)「黄砂バイオエアロゾルがもたらす発酵食品〜「そらなっとう」から「やまなっとう」に

むけて」

34) T. MAKI, M. KAKIKAWA, F. KOBAYASHI, M. YAMADA, A. MATSUKI, Y. IWASAKA : 第7回 大気バイオエアロブルシンポジウム（2013）「Assessment of composition and origin of airborne
bacteria in the free troposphere over Japan

35）牧輝弥、小林史尚、柿川真紀子、山田丸、松木篤、岩坂泰信：第7回大気バイオエアロブルシンポジウム（2013）「黄砂によって変動する大気バイオエアロブル」

36）牧輝弥、福島里英、小林史尚、岩坂泰信：第6回環日本海域の環境シンポジウム（2013）「黄砂によって変動する大気バイオエアロゾル」

37）牧輝弥、福島里英、小林史尚、岩坂泰信：第24回日本沙漠学会学術大会（2013）「沙漠で生まれる空の微生物」

38）牧輝弥、柿川真紀子、小林史尚、山田丸、長谷川浩、岩坂泰信：第73回分析化学討論会(2013)「能登上空に風送される細菌群の16S rDNAクローンライブラリーを用いた種組成解析」

39）小林史尚、牧輝弥、柿川真紀子、山田丸、松木篤、長沼毅、岩坂泰信：第65回日本生物工学会(2013)「南極域の風送バイオエアロブル実相調査」

40）早川遼、岩田佳奈、熊本洋平、牧輝弥、柿川真紀子、岩坂泰信、小林史尚：第65回日本生物工学会(2013)「黄砂バイオエアロブルの種組成解析と影響評価」

41) T. MAKI, F. KOBAYASHI, M. KAKIKAWA, M. YAMADA, A. MATSUKI, Y. IWASAKA: American Association for Aerosol Research 32nd Annual Conference (2013) [Comparison of airborne bacterial compositions in bioaerosols collected at 3,000m, 1,000m, 10m over Japan]

42）牧輝弥、北田悠、河合賢人、小林史尚、長谷川浩、岩坂泰信：第44回中化連秋季大会（2013）「高度3000mで採取した納豆菌で製造した「そらなっとう」の機能評価」

43）牧輝弥、小林史尚、松木篤、岩坂泰信：第19回大気化学討論会（2013）「大気バイオエアロゾルとして選ばれる細菌種は？」

44）牧輝弥、小林史尚、柿川真紀子、岩坂泰信：日本気象学会2013年度秋季大会（2013）「高高度を風送されるバイオエアロブルの細菌種組成解析」

45）牧輝弥、小林史尚、柿川真紀子、岩坂泰信：第29回日本微生物生態学会（2013）「自由対流圈を風送されるバイオエアロブルの細菌種組成解析」

46）小林史尚、牧輝弥、柿川真紀子、山田丸、松木篤、長沼毅、岩坂泰信：第16回南極エアロブル研究会(2013)「南極の風送バイオエアロブル直接採集-第54次日本南極地域観測隊夏隊公開利用研究同行者実施報告-」

47) F. KOBAYASHI, T. MAKI, M. KAKIKAWA, M. YAMADA, A. MATSUKI, T. NAGANUMA, Y. IWAASAKA: The 4th Symposium on Polar Science (2013)「Direct sampling and bioanalysis of atmospheric bioaerosol on the Antarctic」

48) F. KOBAYASHI, T. MAKI, M. KAKIKAWA, M. YAMADA, A. MATSUKI, T. NAGANUMA, Y. IWAASAKA: The 4th Symposium on Polar Science (2013) [Direct sampling of atmospheric bioaerosol on the Antarctic using a tethered balloon]

49) F. KOBAYASHI, T. MAKI, M. KAKIKAWA, M. YAMADA, A. MATSUKI, T. NAGANUMA, Y. IWAASAKA: The 7th International Workshop on Sand/Duststorms and Associated Dustfall (2013)「Direct sampling of atmospheric bioaerosol using a tethered balloon on the Antarctic」

50) T. MAKI, F. KOBAYASHI, B. CHEN, F. PUSPITASARI, M. KAKIKAWA, A. MATSUKI, G. SHI, H. HASEGAWA, Y. IWASAKA: 7th International Workshop on Sand/Duststorms and Associated Dustfall (2013) 'Diversity and structure dynamics of airborne bacteria (bioaerosols) in Dunhuang