Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
ライトトラップの脇にぶら下げれば光と CO₂ ガスの両方を誘引源として使えるので、両者を併用することが望ましい。

c. 吸引機の種類：誘引された蚊の吸引・捕獲方法には、吸引された虫を捕獲する捕虫かごが回転しているファンの手前にある型とファンの後に網がある型の2種類がある。虫がファンを通過する際に体が傷つけられたり腹部が切断されたりするため、ファンを通過しないで捕虫される型の方が傷みが少なく同定しやすいサンプルが得られる。しかしながら、ファンの手前に捕虫かごが位置するので、吸引力が弱く捕獲される数は少なくなる。

d. 電源：トラップの電源には、交流電源と乾電池の2種類がある。交流電源は誘引力の強い紫外線ランプや強力な吸引機を使えるなどの利点がある反面、設置場所が制限される。乾電池は使用電力が小さいので強力なトラップには使えないが、設置場所を制限されずコンパクトで設置しやすいという利点がある。

e. 設置場所：トラップ採集では設置場所の選定が最も重要である。蚊が誘引されやすく、捕獲されやすい場所を選ぶのが原則である。捕獲結果がもっとも影響されるのは風当たりの強さである。常に風が吹きつける場所は避け、むしろ強い風の当たらない場所がよい。しかし、四方を囲まれた場所はトラップの光りが遮られ遠くまで届かないのでよくない。少なくとも一方が開けた場所に面しており、風当たりの弱い軒先や木の枝などがよい。高さは胸より上、地上から約1.2m～2m。軒先に設置する場合は、屋根から落ちる雫などにも注意する。牛舎や豚舎、鶏舎などの動物舎に近い場所では、採集される種類に偏りが出るのでどちらかといえば好ましくない。動物舎に設置する場合は、これら以外の場所にもトラップを設置するほうがよい。緑の多い公園や植え込みの多い住宅街のように、成虫の潜伏場所がある場所を採集地とするのがよい。ただし、トラップは1晩または1昼夜放置するので盗難やいたずらにも注意する必要がある。

f. 設置時刻：設置する時刻は夜間吸血性の種類を対象にする場合は夕方、昼間吸血性の種類を対象にする場合は早朝というように目的によって異なる。WNVが多くの種類の蚊によって媒介される可能性があることと、調査者の勤務時間を考慮すると、午前中に1kgのドライアイスとともにトラップを設置し、翌日まで24時間設置するのがよいと思われる。採集日の気象条件の違いを考慮して、できれば数日連続して採集するとよい。

g. 設置個数：採集地1ヶ所あたり複数のトラップを設置するのが望ましい。

h. 天候：強い雨あるいは強風（2～3m／秒）の日は避ける。梅雨時の弱い雨程度であればさほど問題はないが、捕集網が雨でぬれる構造のトラップは避ける。

i. 採集された蚊の回収と同定までの保管上の注意： 採集された蚊は同定のために殺すまで、できるだけ痛まないように保管する。網製の捕獲トラップの場合、トラップから回収後、ケージの口を縛ってそのままにしておくと乾燥のために死亡する個体が多くなる。また、生きている個体は布の隙間を歩き回って、体表の鱗や体毛がこすり落とされ同定が困難になる。したがって、できるだけ早く殺して同定に供するか、車で移動するなど同定するまでの間は網製のトラップを保冷ボックスに保管すると、昆虫類の運動性が低下するのでよい。また金属製のケージ（大きさ20cm立方程度）に移して濡らした新聞紙や濡れタオルなどで包んで湿気を保ち、乾燥による死亡とサンプルの損傷を防ぐことも可能であるが、現地での作業は複雑となる。紫外線ランプで甲虫類が一緒に捕獲されている場合は、できるだけ早く不要な虫を取り除き、蚊だけを枠つきのケージに移して損傷を防ぐ。
### j. ライトトラップによる採集結果の例：

ライトトラップで採集される蚊の種類構成は、採集地周辺の環境によって異なる。水田地帯では水田発生性のコガタアカイエカやシナハマダラカの構成割合が高く、都市部ではアカイエカやヒトスジシマカの構成割合が高くなる。

環境が異なる地域におけるライトトラップによる蚊採集数の比較

水田地带	都市部
埼玉県富士見市	富山県黒部市	富山市	神奈川県川崎市	長崎県長崎市
種類	♀	♀	♀	♂	♀	♂	♀
コガタアカイエカ	3,476	1,954	52,436	2	10	19	15
シナハマダラカ	670	0	0	0	0	0	0
アカイエカ	129	91	310	179	247	5	9
ヒトスジシマカ	-	0	0	16	12	10	30
オオクロヤブカ	-	0	0	0	1	26	5
ヤマトヤブカ	-	0	0	0	0	1	5
その他	17	0	0	0	4	0	2
調査年	1999	1999	2001	1999
調査頻度・期間	週1-2回、5月下旬-10月上旬	週1回、6月中旬-9月末	週1回、4月上旬-11月下旬	週1回、4月-11月
浦辺研一他埼玉衛研年報34号	渡辺 護富山衛研年報23号	佐藤英毅川崎市衛研年報37号	津田良夫未発表

(2) 成熟卵保有雌用トラップ（Gravid trap）：イエカ類は産卵場所の選択に際して、水中の化学物質に誘引されることが知られている。この習性を利用して、容器の水面に産卵に来た成虫を吸引機で捕獲するトラップである。このトラップの利点は、産卵にくる雌を対象としているので、少なくとも一回は吸血したことがある雌を捕獲できる点にあり、アルボウイルス等の病原体の検出効率が高い。これに対してライトラップやドライアイストラップでは初めて吸血にくる成虫も捕獲される。初めて吸血にくる成虫が WNV を持っていないのは明らかであるから、WNV の検出のためには吸血経験のある雌のみを採集できる Gravid trap を用いる方がよい。しかし、このトラップで採集できる種類が限られることや、トラップ自体が大きいこと、トラップ設置環境によっては捕集率が低いことなどから、イエカ以外の蚊のモニタリングには不向きかもしれない。

蚊成虫の密度調査法には上述したライトラップ、ドライアイストラップ、成熟卵保有雌トラップ以外に、捕虫網によるすくい取り採集、蚊帳を用いた図（おとり）トラップ、ウインドウトラップ、粘着トラップなどがある。これらの詳細について知りたい場合は、資料8の参考図書を参照されたい。ただし、粘着トラップは下水溝のように立ち入ることの難しい小さな空間を対象にした成虫調査には有効な方法であるので、以下に解説を加える。
## (3) 粘着トラップ

蚊の成虫を捕獲し、発生状況を調査するために使用する器具。蚊専用はないので、ハエ用、ゴキブリ用、飛翔昆虫用の各種製品を使う。

### a. 設置場所

一般家屋では発生源は家屋の周囲、庭にあるので、雨に濡れないように付近の軒下に吊り下げる。ヤブカ類は昼間、イエカ類は夕方から夜間にかけて活動するので、数日間設置し、1日当たりの捕獲数で比較する。ビルの地下水槽や浄化槽のマンホールなど閉鎖された空間では、蓋の内側に粘着トラップ（ $ 10 \times 20 cm $ 程度の粘着面を持つシート）を吊す。

### b. 粘着トラップの種類

①ハエとりリボン

カモ井ハエとりリボン 小売価格：390 円

## ②ゴキブリトラップ

シマダ商事株式会社

サイズ 204×92 (mm)

エイケン株式会社

アース製薬株式会社

小売価格：5 セット 500 円

## ③ミラートラップ

沖縄農業試験場で考案されたミラートラップは、3号缶(直径75mm高さ110mm)にMSハエトリ粘着スプレー（（株）ニッソーグリーン）を吹き付けたもので、庭先の雨がかからない場所に杭を立て、缶を逆さに挿して数か所設置する。

## ④粘着式捕虫機

壁掛け、吊下げ、縦置き、横置きの4通りの設置方法が選べる。飛翔昆虫が好む365mmの光線で虫を誘引し、補虫紙で捕える。

## 小型補虫器（ムシポン）MP-600

FL6 BL 1灯（6W）112×92×296mm 880g AC100V 50/60Hz 電源コード（2m）ロータリー式電源スイッチ補虫紙S-6 1個吊下げ金具 1組メーカー希望小売価格：17,500円

捕虫紙 S-6（5 個入）価格：2800 円
### 1 –2–2. 幼虫調査

幼虫発生源の特定と発生量の評価：我が国で蚊を防除するために殺虫剤を広範囲にわたって散布することは、人体や環境への影響を考えるとかなり難しい。そのため、成虫を対象にした住宅地での殺虫剤散布や幼虫対策のための水田への殺虫剤散布は、緊急時以外は実施が難しい。蚊の発生量を抑えるために通常実施する対策は、中・小規模な幼虫発生源を対象としたものとならざるをえない。

幼虫の発生源は多種多様であり、また同じ場所の水域であっても季節の変化にともなって、水質や生物群集の種類構成も変化するので、常に同じ種類の幼虫が発生しているとは限らない。そこで、成虫調査と平行して、予め指定した地域の幼虫発生源調査を実施する必要がある。幼虫対策のターゲットを知るための調査であるから、どこにどんな種類が発生しているかだけでなく、どれくらい発生しているか（発生数）を評価しておかねばならない。効率よく幼虫対策を行うには、幼虫発生の中心となっている水域（主要発生源）を的確に防除せねばならないからである。

成虫採集結果と幼虫発生状況の対応関係：幼虫発生源調査が正確であれば、成虫採集結果と幼虫発生状況の間にははっきりした対応関係が見られる。成虫の飛翔距離はヤブカの場合数十から数百m、ハマダラカやイエカ類は数kmである。成虫採集場所の周囲1～2kmの範囲内にある発生源を考慮して成虫の採集結果を検討する。多数の成虫が採集されるにもかかわらずその種類の幼虫の発生源が見つからない場合は、幼虫発生源調査が不十分であることを意味している。成虫採集結果との対応関係に注意することで、未発見の幼虫発生場所の有無をある程度推測できる。

（1）一般的定量採集法：幼虫発生量の多少を相互に比較するには、採集単位当たりの幼虫数（生息密度）で表す定量採集を実施する。採集単位には、単位面積、単位体積あるいは単位時間などがある。例えば、水田や池など大きな水域に発生する幼虫の場合、柄杓（直径12～13cm）を用いて、柄杓10杯当たりあるいは20杯当たりの採集幼虫数を用いる。竹の切り株や墓の花立てや古タイヤのように、小さい水域で発生している幼虫すべてを採集することが難しい場合は、小型のカップやサイホンを用いて一定量の水を取り出して50mlあるいは100ml当たりの幼虫数をカウントする方法もある。中程度の大きさであるが水深が浅すぎて柄杓が使えないような場合は、5-10mlのピペットを用いた時間当たり採集数を用いることもある。また、ビン、カン、廃棄された機械のフレームのように発生源の発見が困難な場所では、一定時間一人当たり（例えば20分あるいは30分）で見つけだされる発生場所の数とそれぞれの発生場所における採集数を用いることもある。柄杓採集の杯数やサンプリングする水量、時間当たり採集の単位時間は幼虫の発生密度に応じて変更する必要がある。発生初期には発生密度が低いので、杯数や水量は多く、調査の単位時間も長くする。しかし、発生密度が高く多数の幼虫が採集される場合は、杯数や水量を少なく、調査の単位時間は短くしないと同定などの処理に多くの時間を割かねばならなくなる。

大きな水域（水田や池、排水溝など）で柄杓によって幼虫を採集する場合、水面の浮遊物の周囲や岸辺の壁際、植物の根際などが採集のポイントである。

ある場所の幼虫発生量を把握するには、生息密度だけでなく発生場所の大きさ、あるい
は数も合わせて調べておく。池なら直径何 m ぐらいか、水田であれば縦横何 m ぐらいか、古タイヤや竹の切り株ならばおおよその数がわからないと、その地域から発生する成虫量の多少を評価できない。発生源ごとに調査方法と記録すべき内容を以下にまとめて示した。

発生源	生息密度	発生源の大きさ	地域全体
水田	単位柄杓当たり幼虫数	☐m×☐m	枚数
池	単位柄杓当たり幼虫数	直径☐m	個数
墓の花立て	50ml当たり幼虫数	全体容量☐ml	花立ての総数
人工容器	20分当たり、発見数と一個当たり幼虫数	20分間に調査した面積	調査対象地全体の面積
地表の水溜	ピペットによる10分間当たり幼虫採集数	10分間に調べた面積と水溜まり全体の面積	水溜まりの数

幼虫数の記録法：採集された幼虫の数は正確にカウントして記録するのが原則である。しかし、蚊の種類あるいは状況によって非常に多数の幼虫が発生する場合がある。その場合、柄杓二分の一、あるいは四分の一当たりの個体数をカウントして記録する。また、防除のための事前調査のように、幼虫密度の高い水域を対象として複数箇所で調査する必要がある場合は簡便法として、予め幼虫数をランク分けしておき、ランクを記録するのが実際的である。例えば、0 匹＝一、1～9 匹＝＋、10～99 匹＝++、100 匹以上＝+++のように決めておき、一と＋の数で発生密度を記録する。

発生源のマッピング：調査対象地域にどのような発生源がどれくらいあるかは、都市部や住宅地、農村部などによって大きく異なる。調べた水域が調査地域のどこにあるかを、1／10,000あるいは1／25,000の地図上に記録する。蚊および発生源の種類によって色を変えると、地域全体の発生源の把握が容易になる。幼虫が採集されなくても、水があって幼虫の発生が予想される場所はすべて地図に記録し、複数回の調査を実施して実態を正確に把握しておくのが望ましい。発生源の位置に加えて、成虫採集地点も合わせて地図上に記録しておく。

## (2) 都市部におけるヤブカの発生状況調査：

都市域・住宅地ではヤブカ調査では、独特の定量調査法が提唱されている。ある地域、あるいはある集落のヤブカの発生可能な人工容器（水がめ、ドラム缶、ビン、缶、貯水タンク、花瓶、古タイヤなど）を観察し、下記の結果が得られたとする。

$$ \begin{aligned}& 調査家屋数 &:n 戸 \\& ヤブカの発生が認められた家屋数 &:a 戸 \\& ヤブカが発見された容器数 &:x 個 \\& ヤブカが発見されなかった容器数 &:y 個 \end{aligned} $$

これらの値から、次のような指数が計算される。

$$ ブレト一指数 (Breteau Index)\qquad B=x\nearrow n\times1\ 0\ 0 $$

ハウス指数（House Index） $ H = a \nearrow n \times 100 $

$$ コンテナ指数 (Container Index)\quad C=x\nearrow(x+y)\times100 $$

ブレトー指数は、調査した家の100戸あたり何個の容器にヤブカが発生していたかとい
うことを示す指数である。ハウス指数は、ヤブカ幼虫が発生していた家の割合を示し、その地域にどの程度広くヤブカが分布しているかを知ることができる。しかし、この指数では、家にいくつの発生容器があるのかが考慮されていないので、ヤブカの発生量の指数とはなり難い。コンテナ指数は、発生可能な人工容器の何％が発生源になっているかを示すもので、ヤブカがもしどの家にも同じ程度に発生していれば、その地域の発生状況を把握することは可能である。しかし、ある特定の家に偏って発生するような場合、コンテナ指数は低いが特定の家では問題が生じる。以上、それぞれの指数には一長一短あるが、いずれかを選ぶとすればブレトー指数であろう。

（3）オビトラップ調査法：蚊の産卵場所になるような人工容器（オビトラップ）を設置して、産卵された卵数や発生する幼虫数を調べることによって、その地域の発生状況を評価する方法である。また、検疫所などで新たに侵入する危険性のある蚊の侵入を監視するためにも使われる。ヤブカのように小さい人工容器に発生する種類の調査に使われることが多いが、ビニールシートなどを利用して水溜りを作り、森林内の水溜りに発生する蚊の調査に使われることもある。

a. 設置方法： オビトラップ調査でもっとも注意を要する点は、容器の設置方法である。広い範囲を対象とするときには、周囲の状況に応じていくつかのエリア（住宅地、公園、学校など）に分け、各エリア内に万遍なくトラップを設置する。

b. 設置する高さ：容器は直接地面に置くのが望ましい。多くの場合トラップの設置位置が高くなると、産卵数は少なくなる傾向がある。ただし、場所によっては地面に置くことが難しいことがある。公園のように幼児が遊ぶ場所や、野良猫やカラスがいてトラップを地面に設置するとひっくり返されたり紛失する危険があるところでは、木やフェンスなどを利用して1～1.5 m程度の高さに釘や針金によってトラップを固定する。

c. 周囲の環境： 直射日光が常に当たる場所や、風当たりの強い場所は避ける。茂みの中のようにトラップのまわりが囲まれてしまうような場所もよくない。鉢植えの観葉植物を置くような場所がよい。林に設置する場合は、林の内部よりも周辺部（林縁）がよい。

d. 調査間隔：多くの幼虫は、春なら3～4週間、夏なら1～2週間で成虫まで発育する。トラップを置いたままにする場合、発生した幼虫を羽化するまでに取り除かねばならないので、調査間隔は1週間以内がよい。

e. 容器の種類と大きさ：口径 12～15 cm、深さ 15～20 cm（植木鉢ぐらいの大きさ）、青、緑、茶など暗色のプラスチック容器がよい。木などに固定する場合は小さめ（口径 7～8 cm、深さ 12～13 cm）がよい。上端から約 3 cm の位置に直径 5 mm 程度の穴をひとつ開けて、降雨で増水したときには徐々に水が流れ出るようにしておく。

f. 幼虫の採集と保存：20×30×7cm ほどのバットにトラップの内容物を出し、ピペットで幼虫を拾い出す。幼虫が多数発生している場合は、内容物を茶漉しで集めると便利である。トラップの水は交換せず、水量が少ないときには追加する。落ち葉などが多数入っているときには取り除く。場所によっては虫や小動物の死骸で水質が極端に悪くなることがある。この場合は水を更新する。採集した幼虫はトラップごとに小容器に集めラベルをつける。幼虫で種の同定を行う場合には、小容器に幼虫を集めた後水量を減らし、約70%の濃度になるようにアルコールを加えて保存する。
### 1 −2−3. 蚊の発生源

川や用水路など流れのある水域には幼虫はあまり発生しない。発生源と代表的発生種の例を写真で示す。

古タイヤ（ヒトスジシマカ）

廃棄されたバスタブ、バケツ(アカイエカ、ヒトスジシマカ)

放置されたタライ（アカイエカ、ヒトスジシマカ）

岩のくぼみにできる水溜（ヤマトヤブカ）

樹洞(キンパラナガハシカ、ヤマトヤブカ、ヒトスジシマカ)

廃棄された機械類（ヒトスジシマカ、ヤマトヤブカ）
墓地に多い発生源(石鉢:ヒトスジシマカ)

墓地に多い発生源（水がめ：ヒトスジシマカ、ヤマトヤブカ）

竹の切り株（ヒトスジシマカ、オオクロヤブカ）

汚水溜（オオクロヤブカ、アカイエカ）

水田(シナハマダラカ、コガタアカイエカ)

畑周辺の水溜（アカイエカ）
## 資料 2

## 蚊の成虫および幼虫の同定

我が国には約 130 種類（亜種を含む）の蚊が生息している。ここではこれらすべてを同定することを目的とはしていない。むしろ人家周辺や公園、里山など、一般市民が日常生活で訪れる機会が多く蚊との接触が予想されるような場所を想定し、そこで採集されると思われる 16 種類を選んだ（下表、北海道や沖縄では少し異なる）。人に WNV を橋渡しするのは野鳥と人の両方を吸血する蚊であることを考慮すると、これら 16 種類（亜種を含む）の中で媒介蚊として注意すべき蚊は下表で丸印を付した 11 種類である。この中でアカイエカ・チカイエカ・ネッタイイエカは種類を区別することが困難であるので、ひとまとめにして扱った。これら 3 種の主要発生源は排水溝や污水溜であり、ひとまとめに扱っても幼虫発生源対策を実施する上で問題にはならない。

和 名	一般的な発生状況
1 ○ アカイエカ	都市部で最も普通にみられる。
2 ○ チカイエカ	都市部のビル街に多い。
3 ○ ネッタイイエカ	南日本のみに分布する。
4 ○ ヒトスジシマカ	東北地方の一部および関東以西の平野部に最も普通にみられる。
5 ○ コガタアカイエカ	水田から大量に発生する。
6 ○ ヤマダシマカ	ヒトスジシマカと似た生態的特徴を持つが、発生は少なく分布も限られる。
7 ○ キンイロヤブカ	局地的に多数発生することがある。
8 ○ ヤマトヤブカ	林に普通にみられる。
9 ○ オオクロヤブカ	局地的に多数発生することがある。
10 ○ シナハマダラカ	水田・湿地から多数発生する。
11 ○ セスジヤブカ	局地的に多数発生することがある。
12 カラツイエカ	水田・湿地から発生する。
13 ヨツホシイエカ	南日本のみに分布する。
14 トウゴウヤブカ	海岸にふつうにみられる。
15 アシマダラヌマカ	局地的に多数発生することがある。
16 キンパラナガハシカ	林に普通にみられる。

○WNV 媒介蚊として注意すべき種類

（1）蚊の殺し方：採集された成虫は種類を同定し、各種とも雌雄別の数を調べた後、雌成虫は体内にウイルスを持っているかどうかの検査に用いられる。ウイルス検出のためには、採集された成虫を冷凍庫に数十分間保管して低温で殺すのがよい。冷凍庫が利用できない場合は、クロロフォルムで1～2分間麻酔した後、氷で冷やしたシャーレ上に成虫をおいて同定するのがよい。
1a-1 小あごひげは吻とほぼ同じ長さ→ハマダラカのなかま（シナハマダラカ）

1a-2 小あごひげは吻より短い}\\

→その他の蚊（この検索表では同定不能）

採集した幼虫は小容器に集めた後水量を減らし、約70%の濃度になるようにアルコールを加えて幼虫を殺し、そのまま保存する。

(2) 必要な器具と同定手順：成虫の同定には実体顕微鏡（10～40 倍程度、倍率可変型が望ましい）を用いる。幼虫の同定には実体顕微鏡と光学顕微鏡（最高 400 倍程度）の両方が必要である。採集した成虫は冷凍庫で殺す、あるいはクロロフォルムで麻酔した後、10 匹程度を直径 9cm ほどのシャーレに入れて手早く種類を分けていく。先端の鋭利なピンセットを少なくとも 2 本準備する。感染蚊検査のために、同定した成虫は種類ごとに 1.5 ml のマイクロチューブに入れる。クロロフォルムで麻酔して同定する場合は、マイクロチューブは氷の中に立てておき、麻酔した成虫が動き出さないように低温条件に保つ。各検査での検出感度を考慮して、最大でも 50 匹／チューブとする。

幼虫の同定では、できるだけ大きな幼虫（4令幼虫、体長0.7～1.2cm）を使う。殺した幼虫をスライドグラス上に腹這いに乗せ、頭の向きをそろえて互いがくっつき合わないように注意して横に並べていく。同じ発生源から採集された幼虫は一枚のスライドグラスに乗せるようにすると、サンプルを混同する恐れがない。

### 2 −1. 成虫の同定

観察する部位：成虫の同定では、翅（写真①）、吻②、腹部背面③、胸部背面と側面④、および後脚⑤が示す特徴を観察し、これらの特徴の組み合わせによって種類を決定する。

雌成虫の同定のための検索表：

### 1. 翅の特徴

1a: 白鱗と黒鱗の両方があり、はっきりした白斑がある。----→小あごひげの長さを見る。

小あごひげの長さ
1 b：幅広で非対称型の鱗が交互に並ぶ。------アシマダラヌマカ

1 c : 同じ形状の黒鱗のみ（1c-1）または、 同じ形の白鱗が斑を成さずにまばらに混じる(1c-2)。------→2.吻の特徴へ

### 2. 吻の特徴

2 a ：下方に緩やかに曲がっている。黒色で大型。……→オオクロヤブカ

2 b : 吻は著しく長い。金属光沢を持ち腹面は黄金色。----キンパラナガハシカ

2 c : 吻に白い帯状の斑紋（白带）がある。---→イエカのなかま：3.腹部・脚の特徴へ

２ｄ：吻は真直ぐで白带がない。

→4.胸部背面の特徴へ
3. 腹部・脚の特徴

3 a：腹部横白带は背板の先端につく。翅に白鱗が混じる。------→カラツイエカ

翅に白鱗が混じらない。------→その他の蚊（ここでは同定不能）

3 b：腹部横白带は背板の基部につく。

吻の中央からやや前よりに明瞭な白帯①があり、やや基部よりには白鱗②が散在する。

___→コガタアカイエカ

3 c : 腹部横白带は背板の基部につく。脚にまだら。……→ヨツホシイエカ

3 d：これ以外の特徴を有する。------→その他の蚊（ここでは同定不能）

### 4. 胸部背面の特徴

4 a：背面中央に銀白色の縦条線がある。……→ヒトスジシマカ、ヤマダシマカ
4 b：背面中央に黒ずんだ黄色ないし黄金色の縦条斑がある。------→トウゴウヤブカ、ヤマトヤブカ他

4b-1

小あごひげは黒い。

------→ヤマトヤ

ブカ

4b-2 小あごひげの先

端が白い。

------→トウゴ

ウヤブカ

4 c：胸部背面中央とその両側および肩部に赤褐色縦条斑がある。腹部背板の中央に幅広の白色縦線がある。___→セスジャブカ
4 d：胸部背面に縦条線はない。

4d-1:腹部背面2～7節に逆VないしW字型横白带がある。各ふ節の基部に黄白带がある。------キンイロヤブカ4d-2：腹節基部に明瞭な横白带がある。脚は黒又は褐色、白带はない。------アカイエカ、チカイエカ、ネッタイイエカ
2-2. 幼虫の同定：幼虫の同定には呼吸管、腹部末端節側面の構造、胸部の体毛の形状と長さなどが使われる。

幼虫の体構造を長期に保存し詳しく観察するためにはアルコールで脱水した後、バルサムで封入したスライド標本を作製する必要がある。しかしながら、この処理には時間がかかるので、市販されているスライド標本作成液（ネオシガラール液）あるいはホイヤー液を使用すると、70%アルコールに保存したサンプルからそのままスライド標本を作製でき効率がよい。この方法で作成した標本は数年経過すると色が黒ずんでくるが、短期間であれば十分同定できる。

幼虫の呼吸管を観れば、容易にイエカ類、ヤブカ類、ハマダラカ類の3つに分けることができる。まず、ハマダラカ類の幼虫には呼吸管がない。呼吸管に呼吸管毛が1対しかなければヤブカ類の幼虫である。呼吸管が細長く呼吸管毛が3対以上あればイエカ類の幼虫と考えておおよそ間違いはない。

水域によって発生する幼虫の種類は限られている。そこで、以下の10タイプの水域に発生する幼虫の同定について解説する。

1. 污水溜・下水溝

2. 雨水枡

3. 水田・池

4. 小型人工容器・墓の花立て・古タイヤ　　5. 水がめ　　6. 竹切り株

7. 樹洞

10. 汽水性湿地

7. 樹洞

8. 岩のくぼみ

9. 動物舎の汚水溜
1. 汚水溜・下水溝（アカイエカ・チカイエカ・ネッタイイエカ、オオクロヤブカ、トラフカクイカ）

呼吸管は細長く、呼吸管毛は3対以上ある。

アカイエカ・チカイエカ・ネッタイイエカ

呼吸管の長さは、鞍板の長さより短い。捕食性。トラフカクイカ呼吸管は短く、棘を欠く。側鱗の形状は一様。体を小刻みに震わせて泳ぐ。オオクロヤブカ

2. 雨水枡（アカイエカ・チカイエカ・ネッタイイエカ、ヒトスジシマカ、トラフカクイカ）アカイエカ・チカイエカ・ネッタイイエカ、オオクロヤブカ、トラフカクイカについては、1 污水溜・下水溝を参照。

呼吸管毛は一対。呼吸管棘がある。側鱗は牛角状。

-----ヒトスジシマカ

3. 水田・池（コガタアカイエカ、シナハマダラカ、キンイロヤブカ）

呼吸管は細長く、呼吸管毛は4～5対。

側鱗はしゃもじ形で小さく 20

～40 個がほぼ 3 列に並ぶ。

啓。

啓。

は水面に平行に浮かぶ。

啓。

啓。

啓。

-----シナハマダラカ

呼吸管毛は一対。側鱗は

牛角状で7から11個が

ほぼ2列に並ぶ。

-----キンイロヤブカ

注) 側鱗が棘状で数が少ないのは他のイエカの仲間。
4. 小型人工容器・墓の花立て・古タイヤ（ヒトスジシマカ、ヤマトヤブカ、キンパラナガハシカ、アカイエカ・チカイエカ・ネッタイイエカ、イエカのなかま）

ヒトスジシマカ、アカイエカ・チカイエカ・ネッタイイエカについては1. 汚水溜・下水溝、2. 雨水マスを参照。

呼吸管毛は一対。呼吸管棘の先端数個は通常離れて存在し、呼吸管毛1対は呼吸管棘列内に生える。側鱗の先端は丸く32～93個が斑をなす。

-----→ヤマトヤブカ

胸部・腹部に真直ぐな太い放射状

剛毛を多く生じて毛深い。

-----→キンパラナガハシカ

頭毛 3

呼吸管が細長く、呼吸管毛が3対以上あるイエカ属の幼虫が発生することがある。しかし前胸部の第3毛が第1毛より短い場合は、重要な種類ではない。

5. 水がめ（ヒトスジシマカ、ヤマトヤブカ、イエカのなかま。水質が悪くなるとアカイエカ、ネッタイイエカ、オオクロヤブカが発生する。）

幼虫の同定には、1. 汚水溜・下水溝、2. 雨水マス、4. 小型人工容器を参照。

6. 竹切り株、7. 樹洞（ヒトスジシマカ、ヤマダシマカ、ヤマトヤブカ、オオクロヤブカ、キンパラナガハシカ、イエカのなかま）

幼虫の同定には、1. 汚水溜・下水溝、2. 雨水マス、4. 小型人工容器を参照。

8. 岩の窪み（ヤマトヤブカ、イエカのなかま、海岸にある場合、トウゴウヤブカ）
呼吸管毛は1対。呼吸管前面には明瞭な短横線が認められる。側鱗の先端は太まりヒレ状。

-----トウゴウヤブカ

9. 動物舎の汚水溜（オオクロヤブカ、アカイエカ・チカイエカ・ネッタイイエカ）幼虫の同定には、1. 汚水溜・下水溝、2. 雨水マス、4. 小型人工容器を参照。

### 10. 汽水性湿地（ヨツホシイエカ、セスジャブカ）

頭毛5は5～7分岐、頭毛6は4～6分岐。第1腹節毛7は分岐しない。呼吸管毛は管幅の2倍近い長さのものが4～5対、管幅より短いものが2対。ヨツホシイエカ（南日本のみに分布）腹面刷毛状毛は15房以上、呼吸管毛は一対。呼吸管棘の先端棘は呼吸管基部側45～51％の位置にある。触角毛1は5～12分岐。

-----セスジャブカ
## 資料 3

## 蚊からのウイルス検出法

WNV はフラビウイルス科フラビウイルス属に属されるが、フラビウイルス属の中でも特に日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、マレー渓谷脳炎ウイルス、クンジンウイルスと相同性が高く、抗原的に交叉反応を示す日本脳炎血清型群に分類される。フラビウイルス属のウイルスを蚊から検出する方法としては RT-PCR によるウイルス遺伝子の検出が一般的であるが、近年、ウイルス抗原に特異的に反応するモノクローナル抗体を用いた抗原検査法が WNV に対しても開発され、簡便な検査キット「VecTest $ ^{®} $ 」（Medical Analysis System 社）が市販された。本項ではこの2種検査法を紹介する。

WNV の取り扱いについて、国立感染症研究所の規定では、ウイルスの増殖を行う場合は P3（物理的封じ込めレベル 3）の実験施設内で BSL3（バイオセーフティレベル 3）の取り扱い基準に従い、また、検出のみの場合は P2 の施設で BSL2 の取り扱い基準に従って実施することが規定されているが、本ガイドラインに従って各自治体で検査を行うに当たっては、各自治体で定められた病原体取り扱い基準に従い実施するようにする。

### 3 -1. ウイルス検査を行うべき蚊の種類と検査個体数

米国での調査結果によれば、WNVは30種類以上の蚊から検出されている。わが国に生息する蚊の発生量、吸血嗜好性や人との関わりの密接さなどを考えると、わが国で特に注意を要する種類として、アカイエカ、チカイエカ、ネッタイイエカ、コガタアカイエカ、ヒトスジシマカ、ヤマダシマカ、キンイロヤブカ、ヤマトヤブカ、オオクロヤブカ、シナハマダラカ、セスジャブカの11種類が選ばれるであろう（資料2参照）。これらの種類については、常にウイルス検査を行うようにすべきである。

検査された蚊プール数（50 匹を 1 プールとすることが多い）に対するウイルス陽性プール数の割合は、米国の例では数％から十数％である。従って、約 100 プール（1 プール 50 匹の場合は個体数にして 5000 匹）は調査することが望ましい。蚊の発生消長には明らかな季節変化があるので、発生量が最も多くなる時期（おおよそ 6 月から 9 月）の個体を用いるのが効率的である。発生量が少なくて採集個体数が少ない種類であっても、一ヶ月間の採集個体を集めて、少なくとも一月毎にはウイルス検出を行うようにする。

### 3 –2. 捕集蚊の保存

野外で捕集された蚊は、検査が実施される施設まで搬送され、あるいは一定数の蚊が集まるまでの期間保存されることになるが、WNVの遺伝子がRNAであることから、その間の保存状態によってはRNaseなどの影響を受けることが予想される。また、抗原タンパクの消化などによってウイルスの検出感度が著しく低下することも考えられる。従って、種の同定、雌雄の選別を行った後はできるだけ早く、ウイルス検査用の雌蚊を-80℃（なければ-20℃）に保管する。
### 3 –3. 蚊からの粗抽出液作成

後述（3-6）するが、RT-PCRはVecTestよりも検出感度に優れている。すなわち、VecTestで陽性であれば間違いなく感染蚊が存在すると言えるが、陰性の場合でも感染蚊が存在しないとは言い難い。従って、VecTestで陰性の場合は、その後RT-PCRで確認することが望ましい。VecTest、RT-PCR法のどちらも単独で実施することができるが、同じ蚊プールを用いて両検査法を行うことを想定した場合、まず、リン酸緩衝液（PBS）で蚊を磨碎後遠心して得た上清を粗抽出液として作成しておいた方が便利である。また、蚊虫体を直接検査に用いるよりも判定しやすいきれいな結果が得られる。使用する器具類などは滅菌したものを使う。PBS粗抽出液の作成は以下のとおりである。

雌蚊 50 匹を 1.5 ml マイクロチューブに入れ、約 250 μl の PBS（1% NaCl, 0.025% KCl, 0.143% Na₂HPO₄, 0.025% KH₂PO₄, pH7.2）を加えマイクログラインダーを手動で動かし磨砕する。この際、捕集蚊の中に WNV 感染蚊を含むことが予想されるので内容物が淺れ出ないように慎重に行う。十分に磨砕した後 1,000 回転、約 5 分間遠心し、上清を回収する。回収した上清が 200 μl に満たない場合は、沈殿物に適当量（50～100 μl）の PBS を加え、ボルテックスした後遠心し再度上清を回収する。回収した上清を加えて最終量約 200 μl の粗抽出液とし、その半量 100 μl づつをそれぞれの検出法に用いる。粗抽出液を作成後、すぐに検査に用いない場合、あるいは一つの検査法だけに用い、半量を残す場合は、すみやかに－80℃冷凍庫に保存する。

### 3 –4. VecTest による抗原検出法

VecTest は、近年 WNV 検出に対応して米国で開発された抗原検出キットで、操作が非常に簡単で、検査結果が得られるまでの時間が1時間以内と非常に短いこと、結果の判定が容易であるなどから米国では広く普及している。しかしながら、キットの値段が高価であること、50 匹中に1匹の感染蚊が存在する割合でも陽性判定を得ることは可能であるが、媒介蚊の種によってはウイルスの増殖に差があり、検出可能な濃度まで増えずに反応が弱く出る場合や陰性になる場合もあり、RT-PCRに比べると検出感度はやや劣る短所もある。

### 3 -4-1. VecTest の検査手順

1. 前項（3-3）で作成した $ 100 \mu 1 $ の PBS 粗抽出液に 1 ml の Grinding Solution を加え軽くピペッティングし混和する。

2. 上記混和液 $ 250 \mu l $ を 1.5 ml マイクロチューブに移し、付属のテストストリップをマイクロチューブの中に入れる（液はテストストリップの↓↓の下の線が浸るくらいである）。

3. このまま約 15〜30 分間静置した後、判定を行う。
＜備考＞蚊虫体を直接 VecTest に用いる場合は以下の手順に従う。

1. 付属のプラスチックチューブに雌蚊 50 匹を入れる。

2. 2.5 ml の Grinding Solution を加え銅製のビーズを 4 個入れる。

3. 付属の蓋をしっかり締め、高速で約1分間ボルテックスし、虫体を磨砕する。

<補足 1> ここで雌蚊が 50 匹集まらなければ全体的にスケールダウンしても検出はできる。例えば、20 匹の場合は Grinding Solution を 1 ml にしてもよい。

<補足 2> 蚊の種類によっては比重が軽く液面に浮いてしまい、十分に磨砕できない場合もある。この場合も Grinding Solution の量を少なくすると確実に磨砕できる。50 匹当たり 1 ml でも判定は可能であるが、このような場合を除いては、なるべく用法どおりに実施する事が望ましい。

4. 軽く遠心（5,000回転、5分程度）し、上清250μlを1.5mlマイクロチューブに移し、付属のテストストリップをマイクロチューブの中に入れる。約15～30分間静置した後判定を行う。

<補足3> 遠心せずに上清のみをチューブに移してその後の判定に用いてもよいが、遠心した上清のみを回収した方がよりきれいな結果が得られる。

### 3 -4-2. 結果判定

正しい手順で行えば、15～30分後には上部から約1/3の位置に赤い線が現れる（図1上の矢印）。WNV陽性であればその下に、さらにもう1本赤い線が現れてくる（図1下の矢印）。つまり、検査した蚊プール50匹の中に1匹でもWNV感染蚊がいた場合は赤い線が2本、すべての蚊が陰性であればコントロールの1本だけが現れることになる。テストストリップを液の中に30分以上浸してもバンドが濃くなることはないので、判定は30分程度で終了させる。赤い線が薄くて見えにくい場合はテストストリップを室温で乾燥させてから観察すると見やすくなる。WNVは乾燥すると不活化するが、テストストリップの判定は慎重に行う。

### 3 −5. RT−PCRによるWNV遺伝子（RNA）の検出

(図 1)

ウイルス全般に対して行われる一般的な検出法で非常に感度がよく、プラットを選択するだけでWNV以外のフラビウイルスRNAの検出も可能になることなどからもその汎用性は非常に高い。しかしながら、RNAの抽出からRT-PCRまでの手順は非常に複雑で、使用する試薬類ならびに器具類などは多岐にわたり、それらの取り扱いには熟練を要する。ここで用いるペストル、マイクロチューブ、およびチップ類はRNase freeのディスポーザブルタイプにすることが望ましいが、再利用する場合は通常の2倍念入りに滅菌されたものを使用することを心がける。
### 3 −5−1. 蚊からのウイルス RNA の抽出と精製

ウイルス RNA の抽出に関しては、いくつかのキットが市販されているが（参考資料 1）、ここではその中の High pure viral RNA kit（Roche）を使用した場合の手順を紹介する。ウイルス抽出に関わる試薬類は添付の操作マニュアルに従い、事前に溶解、希釈しておく。

1. 前項（3-3 参照）で得た 100 μ1 の PBS 粗抽出液を 1.5 ml マイクロチューブに入れ、Working solution 200 μ1 を加えピペッティングし混和する。ここでウイルス本体は不活化されるが一連の操作は慎重に行う。

2. 回収チューブの上に乗せたフィルターチューブに $ 300 \mu l $ の上記混和液を注ぐ。

3. 10,000 回転、15 秒間遠心する。

4. フィルターチューブを新しい回収チューブに連結させ、500 μl の Inhibitor removal buffer（Vial.3a）を加え、8,000 回転、1 分間遠心する。

5. フィルターチューブを新しい回収チューブに連結させ、450 μlの Wash buffer を加え、8,000 回転、1 分間遠心する。

6. フィルターチューブを新しい回収チューブに連結させ、再度 450μl の Wash buffer を加え、8,000回転、1分間遠心する。

7. 回収チューブを外し、空のチューブを連結し、12,000回転、10秒の遠心によってサンプル中のアルコールを完全に飛ばす。

8. 回収チューブを捨て、新しい1.5 ml マイクロチューブにフィルターチューブを入れる。

9. $ 50 \mu 1 $ の Elution buffer （Vial.4）を加え、10,000 回転、1 分間遠心する。

10. 得られた精製 RNA はすぐに使用しない場合は $ -80^{\circ}C $ 冷凍庫で保存する。

### 3 −5−2. RT−PCR 用プライマー

エンベロープ（Env）領域と非構造タンパク質（NS3）領域の2種類のプライマーがある。前者はWNV特異的であるが、後者はフラビウイルス全般に反応するもので、検出感度は高いが日本脳炎ウイルスも増幅される。従ってNS3のプライマーによりバンドが得られた場合は、その後の遺伝子解析が必要となる。合成したプライマーは、それぞれ100 pmol/μlになるように希釈し、マイクロチューブなどに小分けしてそれぞれ−20℃に保管し、凍結・融解の回数を減らすことに留意する。

プライマーセット 1 : Env 領域
WNNY514 : Cgg CgC CTT CAT ACA CA
WNNY904 : gCC TTT gAA CAg ACg CCA TA
プライマーセット 2 : NS3 領域
Fla-U5004 : ggA ACD TCM ggH TCN CCH AT
Fla-U5457 : gTg AAR TgD gCY TCR TCC AT

### 3 –5–3. RT-PCR 反应

逆転写反応と PCR 反応をワンステップで行う簡便な RT-PCR キットが市販されているが
(参考資料 2)、ここでは AccessQuick RT-PCR System（Promega）を用いた方法を紹介する。

1. 前項（3-5-1）で精製したウイルス RNA は、逆転写反応・PCR 反応に用いる前に分光光度計によってその RNA 量を測定し、最終濃度 $ 1.0pg/\mu l \sim 1.0\mu g/\mu l $ に調整する。RNA 溶液 $ 1\mu l $ を蒸留水 $ 500\mu l $ に加えた場合の RNA 量は以下の式によって簡単に求められる。

$$ RNA 量 (\mu g/\mu l)=1/25\times OD_{260}\times500 $$

2. 0.2 ml PCR チューブ内で以下の試薬と溶液を混和する (*最終産物量を 25 μl にしたい場合はすべてを半量にしてもよい)。

最終濃度
AccessQuick Master Mix(2×)	25.0 μl	(1.0μM)
プライマー1 (100pmol/μl)	0.5 μl	(1.0μM)
プライマー2 (100pmol/μl)	0.5 μl
RNA テンプレート(1pg-1μg/μl)	1.0 μl
ANV Reverse Transcriptase	22.0 μl	(5U)
Nuclease-Free Water(pH7.0)	25.0 μl
Total	50.0 μl*

### 3. Thermal Cycle Condition

(図 2)

### 3 –5–4. 結果判定

RT-PCR 終了後、反応生成物 5 μl を 2% アガロースゲル電気泳動（100V、約 35 分）を行い、エチジウムブロマイド溶液（10 mg/ml）に 10～20 分染色し、PCR によって増幅された DNA 断片を確認する（図 2）。エチジウムブロマイドは発ガン性物質なので、取り扱う際には使い捨てのビニール製手袋などを着用し、染色容器も専用の容器を用意する。廃液の処
理は水質汚濁防止法に従って執り行われることが義務づけられているので注意する。

### 3 –6. VecTest と RT–PCR の比較

粗抽出液作成以降の必要器材および試薬類、所要時間、検出感度、必要経費などを両者間で比較した。

VecTest®	RT-PCR
必要器材および試薬類1)	検査キットー式ボルテックス2)	RNA抽出キットワンステップRT-PCRキットプライマーセットPCR機電気泳動装置ゲル染色装置写真撮影装置
抽出から結果判定までの時間	約1時間	約24時間
検出可能なウイルスプラーク数	106PFU/ml3)以上	103PFU/ml3)以上
蚊50匹1プールにかかる費用	約2,000円	約1,000円

$ ^{1)} $ PBS 粗抽出液を作成する際に用いる、ペストル、マイクロチューブ、マイクロチップ、遠心機などは両検査法に共通しているのでここでは省略した。

$ ^{2)} $ PBS 粗抽出液を用いる場合は不要になる。

3) 培地上に形成される 1 ml 当たりのウイルスプラーク数。この数字は、1 匹の感染蚊が $ 10^{6} $ 個、 $ 10^{3} $ 個以上のウイルスプラークを持てば、それぞれの検出法で検出されことを示しているが、実際に WNV に感染した（WNV ウイルス血症の）野鳥から蚊が吸血して感染蚊となり得るには、野鳥体内で $ 10^{5} $ PFU/ml 以上のウイルス量であれば十分である。

<参考资料1> 市販されている RNA 抽出キット

High pure viral RNA kit	Roche
SepaGene RV-R	三光純薬株式会社
Sepasol RNA I, Sepasol RNA II	ナカライテスク
ISOGEN-LS	日本ジーン社
TRIzol Reagent, TRIzol LS Reagent	Invitrogen

<参考资料2> 市販されているワンステップRT-PCRキット

AccessQuick RT-PCR	Promega
SuperScript One-Step RT-PCR System	Invitrogen
GeneAmp Gol RNA PCR Kit, GeneAmp EZ-The RNA PCR Kit	Applied Biosystems
## 資料 4

## 殺虫劑感受性試驗法

単一の殺虫剤を長期間使用し続ければ、蚊はいずれ抵抗性を発達させることになる。しかし、防除効果が上がらない原因は必ずしも抵抗性の発達によるものとは限らない。蚊の発生数は生息域のわずかな環境変化によって影響を受けるし、また防除すべき発生源が完全に抑えられていない可能性も考えられる。したがって、薬剤による防除効果が上がらない場合には、安易に薬剤を変えることなく、まずは簡単に殺虫試験を行うことで薬剤の効力を判定することが勧められる。ここでは、殺虫剤原体もしくは製剤を用いた薬剤感受性試験法を紹介する。

### 4 -1. レベル判定による薬剤感受性試験法

## (1) 試験法

診断濃度による浸漬試験

## (2) 供試虫

供試幼虫群の中から目的種を選定し、さらにこの中から3～4齢幼虫を選ぶ。

(3) 手順：

1．腰高シャーレまたはこれに準ずる容器に水200mLを入れる。供試虫（老令幼虫）を20匹ほど入れた容器を必要数用意する。1診断濃度の試験は20匹2区で行い、殺虫剤を加えない対照区を置くことを原則とする（合計8試験区）。

2．供試薬剤と診断濃度（レベル1～3）を決めた後、表1に示した濃度に調製した滴下液（薬剤所定濃度アルコール液又は所定濃度製剤液）を0.8mL加えよく攪拌する。昆虫成長制御剤であるピリプロキシフェンを試験する時は、2週間後の羽化阻止率を観察するため、供試虫の餌としてラット・マウス用固形飼料を5-10mg程度加え、金網蓋をして保存する。これ以外の薬剤は餌を与えず24時間後の致死率を観察する。

3．試験結果から感受性レベルを判定する。

## (4) 判定

レベル 1 の濃度で 95% 以上の致死率が得られる場合は、試験薬剤に対する感受性が高いと判定される。レベル 2 で 50% 以下の致死率しか得られない場合は、供試集団は 10 倍以上の抵抗性を有していると判定され、同じくレベル 3 で 50% 以下の場合は 100 倍以上の高度の抵抗性を発達させていると考えられる（表 1 参照）。
表 1 殺虫剤の感受性試験に用いる薬剤濃度とレベル判定

薬剤抵抗性診断濃度(ppma)
(滴下液の濃度b)
アカイエカ群の診断基準	ヒトスジシマカの診断基準
薬剤名(アカイエカ群の半数致死濃度ppma)	レベル1	レベル2	レベル3	レベル1	レベル2
Fenitrothion(0.007)	0.03(7.5)	0.1(25)	1.0(250)	0.08(20)	0.3(75)
Fenthion(0.002)	0.008(2.0)	0.03(7.5)	0.3(75)	0.03(7.5)	0.1(25)
Temefos(0.0008)	0.003(0.75)	0.01(2.5)	0.1(25)	0.015(3.75)	0.05(12.5)
Permethrin(0.008)	0.03(7.5)	0.1(25)	1.0(250)	0.015(3.75)	0.05(12.5)
Etofenprox(0.01)	0.04(10)	0.15(37.5)	1.5(375)	0.02(5.0)	0.07(17.5)
Pyriproxyfen(0.00005)	0.005(1.25)	0.001(0.25)	0.01(2.5)	0.001(0.25)	0.01(2.5)

$ ^{a} $ ppm は parts per million の略で、溶媒 1 kg 中に殺虫剤原体が 1 mg 溶けている状態をいう。

$ ^{b} $ 水 250 に対し滴下液 1 の割合で希釈液を調製する。

### 4 –2. 製剤を用いた簡易試験法

ここでは、用法・用量に示された濃度に調製した殺虫剤製剤を用いて行う簡易試験法を、フェニトロチオン乳剤を例に紹介する。

## 有機リン系殺虫剤フェニトロチオンの乳剤を用いた殺虫試験の例

(殺虫剤製剤の容器上の表示)

[成分・分量] フェニトロチオン 10%

[用法・用量] 蚊幼虫に対して：発生場所の水量 1 m³ につき、本剤の 20 ml (有効成分 2 ppm*) を適宜水で希釈して散布する。

効力判定は、用法・用量にある濃度（500倍希釈）で行う。この濃度は、100mlの水に乳剤が0.2ml溶けている状態である。0.2mlの乳剤を測りとることは容易ではないので、実際には試験濃度の100倍に調製した殺虫剤（=5倍希釈溶液）を少量準備し、幼虫の入った99mlの水の中に1mlの殺虫剤を加えることで調製するのが便利である。
## (1) 準備するもの

・150 ml 以上のプラスチックコップ

・100 ml が計れる計量カップ

・ガラスピペット（1 ml と 4 ml が測定できるものなら何でも良い）

・割り箸（攪拌用）

・スポイト（蚊を計量カップへ移すための）

・採集した幼虫

・水（水道水でよい）

## (2) 5 倍希釈液の調製

プラスチックコップ中で水4mlと乳剤1mlを混合する。

## (3) 試験の手順

1．上記に従い乳剤の5倍希釈液を調製する。

2．幼虫（10～50 匹）をスポイトなどで吸い採り計量カップに入れ、水で全体量を100 ml*にした後、プラスチックコップに移す。十分な数のボウフラが採集できた場合はこれを2つ準備する（*正確には99 mlであるが、結果に大きく影響しないので、100 mlとして問題ない）。

3．幼虫の入ったプラスチックコップに5倍希釈した乳剤を1ml加え、割り箸などで攪拌する。

4．室温（25℃前後）に置き、24時間後の生存率を観察する。

## (4) 注意点

・殺虫剤の取り扱いは、説明書に従って安全に行う。

・これは、比較的即効性（24 時間以内）のある殺虫剤の効果判定に有効な方法。スミラブ（ピリプロキシフェン）のように蛹の羽化を阻害するような成長制御剤では即効性が認められにくいので、この方法は適さない。作用機構や剤型に応じた試験を行う必要がある。

・野外で採集された蚊の幼虫は、齢期にばらつきがあるが、効力判定に大きな影響を与えるものではないため、そろえる必要はない。

・幼虫の数に余裕がある場合は、用量の10倍（＝50倍希釈液）に調製した殺虫剤液でも同時に試験を行うことで、抵抗性の度合いを把握することが出来る。

## (5) お願い

著しい抵抗性の発達が確認された場合には、国立感染症研究所昆虫医科学部第三室（殺虫殺室・03-5285-1147）にご一報をお願いします。全国的な抵抗性発達の実態把握に役立てるとともに、抵抗性機構の解明を行うことで、その後の防除に役立つ情報を収集したいと考えています。
## 資料 5

## 殺虫剤抵抗性の発達とその対策

殺虫剤を使い始めた当初は使用書にある用法・用量通りに散布して十分な殺虫効果が得られていたのに、同じ殺虫剤を使い続けていると効果が次第になくなる場合がある。そのような場合は殺虫剤抵抗性が発達したことが疑われる。殺虫剤抵抗性は、殺虫剤の透過、活性化、解毒、排出に関わるタンパク質や殺虫剤の作用点分子をコードする遺伝子に生じた突然変異、およびそれらの遺伝子発現を調節する遺伝子に生じた突然変異によりもたらされる遺伝的な現象である。抵抗性遺伝子をもつ個体が殺虫剤散布を施された環境のもとでより多く生き残り、同じ抵抗性遺伝子をもつ子孫の割合が次第に増してゆき、昆虫集団に抵抗性が発達する。高度な抵抗性が発達する場合には、しばしば、異なる遺伝子座に属する複数の抵抗性遺伝子が集団内に蓄積されている。

### 5 −1. 殺虫剤抵抗性の事例

事例1：チカイエカのShinjuku コロニーは1988年東京都新宿区内のビルの地下污水槽Cでの採集に由来する有機りん剤抵抗性コロニーであり、多くの有機りん剤に対して約100倍またはそれを超える抵抗性を示す（表1）。おもな抵抗性要因はカルボキシルエステラーゼの活性増大にある。同時期に同ビルの隔離された殺虫剤を散布していない汚水槽A、散布がもっとも徹底して行われた污水槽C、散布歴が汚水槽Cには及ばない污水槽Bの間で、各有機りん剤に対する抵抗性比を比較したところ、もっとも抵抗性の発達が著しいクロルピリフォス-メチルに対して、汚水槽A,B,Cコロニーの順に、22倍、170倍、690倍であった。

事例 2：成田空港内の空港駅地下汚水槽と滑走路周辺雨水枡でそれぞれ採取したチカイエカとアカイ

表 1. チカイエカの殺虫剤抵抗性

殺虫剤	LC50(ppm)	抵抗性比
感受性系統	Shinjuku コロニー
有機りん剤
フェニトロチオン	0.01	1	100
フェンチオン	0.0067	1.1	160
マラチオン	0.03	10	340
ダイアジノン	0.032	1.2	36
ジクロルボス	0.014	1.3	91
テメフォス	0.0008	0.17	210
クロルピリフォスメチル	0.0083	5.7	690
クロルピリフォスエチル	0.0002	0.028	160
プロペタンフォス	0.017	3.3	190
プロチオフオス	0.058	0.49	8.4
カーバメイト剤
プロポクスル	0.39	0.73	1.8
ピレスロイド剤
ペルメトリン	0.0095	0.14	15
フェノトリン	0.0087	0.28	32

川上 (1989) より 改変。