相襯顯微技術

生物用相襯顯微鏡相襯顯微技術是一種光學顯微技術，光線在穿過透明的樣品時會產生微小的相位差，而這個相位差可以被轉換為圖象中的振幅或對比度的變化，這樣就可以利用相位差來成像。

光線在穿過非真空介質時，會與介質發生作用從而產生振幅和相位的變化，這種變化與介質的性質相關。振幅的變化通常是由於介質對光的吸收，變化程度與波長也就是光的顏色相關，而介質的厚度、折射率的變化會導致光線相位的改變。人的眼睛僅能測量到達視網膜的光線的能量強度，而很難觀察到相位的改變，普通的光學顯微鏡也無法檢測相位的改變。然而相位的變化通常也會攜帶相當多的資訊，但是在對光線進行測量的時候這部分資訊就全部丟棄了。為了使相位變化的資訊可以被觀察到，就需要將穿過樣品的光線與參考光源相結合，相干的結果可以顯示出樣品的相位結構。

相襯顯微鏡觀察樣品時不需要進行染色，在觀察細胞的時候也就不會對細胞標本產生傷害，因此這種顯微鏡可以用來研究細胞週期。

歷史

相襯顯微技術是二十世紀三十年代弗裡茨・澤爾尼克在研究衍射光柵的時候發明的。在研究中，他認識到與參考光干涉是很有必要的，而為了最大化對比度，需要向參考光中引入相移，這樣可以產生完全的相消干涉。隨後，他認識到相同的技術可以用於光學顯微技術。首先需要在玻璃上精確蝕刻圓環，當將玻璃插入顯微鏡的光路中的時候，就會產生所需要的相移。這個技術稱為相襯技術。

光學顯微鏡觀察的許多物件如原生動物、細菌、精子的尾等等細胞結構在染色以前都是透明的。染色是一個非常困難和耗時的過程，而且有時還會對標本產生傷害。然而，觀察物件的密度和成分不同經常會使光線在穿過它們的時候產生不同的相移，因此他們有時候也被稱為相位物體。使用相襯技術可以使這些結構顯示出來，同時允許對活體標本進行研究。

相襯技術是顯微技術中的一個重大進步，它的發明人澤爾尼克因此榮獲 1953 年的諾貝爾物理學獎。目前，在大多數高階光學顯微鏡中都使用了相襯技術或提供可選的相襯套件，而它也被廣泛應用於為透明標本如活體細胞和小的器官組織提供對比度影像。

原理知識

環形光闌 2. 物平面 3. 相位板 4. 主像平面

目前主要應用的相襯顯微鏡的原理示意圖如右圖所示 ，它的核心是一個位於聚光器的孔徑光闌位置的環形光闌 1 和位於物鏡鏡頭後方的相位板。首先光線從照明用的燈絲內的一點射出，由場透鏡精確的聚焦在聚光器處的環形光闌的開放處。由於這個位置處在聚光器的前焦平面，光線在透過聚光器後將變成平行光。假設這兩束光線在標本平面 2（也就是顯微鏡的載玻片的位置）不發生反射和折射，它們將平行的射入物鏡。由於所有的平行光都會聚焦在後焦平面上，物鏡的後焦平面是聚光器的前焦平面的共軛平面。而實際上，部分光線透過標本以後將會發生反射和折射，而後將在平面 3 處聚焦，因此平面 3 也是物平面的共軛平面。為了完成調整相位的需求，需要在此處新增一塊相位板。相位板的另一個作用是將未被標本影響的光線減弱，用相位對中望遠鏡觀察物鏡後方的相位板，可見減光材料形成的暗環。大多數現代顯微鏡廠商使用真空沉積法制造相位板，把電解質或金屬材料沉積在獨立鏡片上，或者直接加工在物鏡的某片透鏡表面。

在顯微鏡上啟用相襯成像，需要把正確尺寸的環形光闌和相襯物鏡對應起來，因此，相襯光闌和相襯物鏡都標明瞭相應的序號，以 Phx (x 為阿拉伯數字) 標識。例如，準備使用相襯標誌為 Ph2 的 x40 物鏡，必須把 Ph2 相襯光闌裝入聚光鏡。Phx 標識刻在相襯物鏡筒上，而光闌則以轉盤或者滑塊（見左圖）的方式切換。

要使相襯顯微鏡清晰成像，必須將環形光闌和相位板的中心對準。在調整的過程中，使用相位對中望遠鏡暫時取代一個目鏡，透過望遠鏡觀察環形光闌和相位板，然後調節環形光闌的位置，直到二者對齊。

曾經有過一種有趣的相襯設計的變種，在這個設計中，匹配環被一個十字形的傳輸縫代替，而位於物鏡共軛平面的相位環被一個十字形的相位板代替。這個設計的優點是在所有的相位物體的放大過程中只需要一個縫狀光圈，而十字的形狀使得重新對齊中心和旋轉對齊非常容易，因此調整不再需要使用對中望遠鏡了。

一些型號的顯微鏡在出廠前已經預先校準聚光鏡系統，使用者不需要自己進行相襯對中操作。此外，相襯物鏡也可以用於明場觀察，只需將環形相襯光闌移出聚光鏡的光路，切換為明場照明即可。

技術細節

相襯顯微鏡的原理圖中省略了一些細節。首先，聚光環僅僅是一個位於平面 1 中央的小光圈，而相位板也僅僅覆蓋在了平面 3 中央的小光圈上。其次，物鏡、目鏡燈光學系統被極大的簡化了，圖中僅使用了兩個透鏡來代表所有的光學器件。

D 波與 S 波

為了進一步的理解相襯照明的工作原理，我們來研究兩個波陣面（如左圖）。平面 1 處在聚光器的前焦平面上。光線透過小孔 S 射入，透過聚光器射出後形成平行的波陣面。當這些平面波碰到物平面 2 處的位向物體 O 的時候，一些光在穿過標本時被折射。假設標本不會顯著的改變入射光的振幅，而僅僅改變了它們和參考光之間的相位關係，新產生的球面波前在從標本射出後相位將被延遲 90° （λ/4）。注意到現在有兩種型別的波，作為參考光的 S 波和折射光 D 波，它們之間存在這 90° 的相差。物鏡將 D 波在主像平面，也就是圖中的平面 4 的內部聚焦，而 S 波將在其後焦平面，也就是平面 3 上聚焦。相位板 P 現在對 S 波有顯著影響，而大多數的 D 波卻不受影響。在正相襯中，相位板將所有穿過它的光線的振幅衰減約 70-90%，而將相位提前 90°，這樣，由於 S 波和 D 波的相位差達到 180°，將引起相消干涉（180° 的相移來自兩種效果的疊加，S 波被相位板提前了 90°，D 波被相位物體延遲了 90°）。如果沒有相位板，就不會有顯著的相消干涉，這樣就會導致對比度的降低。透過相襯照明的技術，不可見的相位變換現在可以轉變為可見的振幅變化。相消干涉在左圖中可以看到，藍色的波形和橙色的波形分別代表 D 波和 S 波，而他們的和，（D+S）的振幅減小了。

3.1 使用 4F 相關器實現相襯功能

替代 =

從右圖可以看到相襯顯微的工作原理，其中使用了 4F 相關器，實現了相襯功能。在這張示意圖中，放大倍數為 1，因此還不能從真正意義上稱之為顯微鏡。

按照圖中標記的符號，我們假定一個平面波從左方射入而相位傳遞函式的形式為

其中指數上的被稱為傳遞函式的相位。如果相位物體很薄，使得，那麼。

通常的膠片和檢測器都只能響應振幅變化，而不能響應相位變化。但是上面的傳遞函式的振幅變化非常小，因此對比度不夠高。為了最大化對比度，我們需要讓這兩項變成同相，而不是正交，因此 的變化可以直接影響傳遞函式的振幅。我們可以透過有選擇的在其中一項上乘以一個係數 j，以使兩項同相。這個任務可以透過 4F 相關器來實現。我們假定一個平面波射在相關器的輸入平面上，也就是圖中的最左端。相位傳遞函式的傅立葉變換可以在第一個透鏡的後焦平面上產生，其形式為，其中被稱為透鏡的點擴散函式。點擴散函式僅僅是第一個透鏡後焦平面上的一個小點，而相位函式的分佈更大。由於點擴散函式在一個很小的區域上，我們可以將一個很小的能夠產生四分之一相移的物體放在那裡，使產生四分之一相移，而其它部分的相位函式 基本上不會發生變化。

這樣，在焦點的後面，場變成了，而現在兩項都是同相的了。然後我們再將這個場分佈透過第二個透鏡進行傅立葉變換，於是，在最右側的輸出平面上可以得到輸出的場分佈。這時，我們可以忽略兩項共有的係數 j，而相位函式將直接調製振幅，使得影像的對比度增強。

相對於 DIC 技術的優勢與不足

相對於其它對比增強技術，如 DIC，相襯顯微技術不使用偏振光照明，因而可以觀察雙折射介質，如透過塑膠培養瓶或培養皿進行活細胞觀察，這在細胞學研究上特別有用。如和落射熒光技術連用，相襯物鏡可以透過約 70% 的激發光，優於 DIC（相位板仍導致部分激發光衰減），所以相襯往往作為輔助成像功能應用在熒光顯微鏡上。此外，相襯套件的採購價位相對較低，使用調校也較為簡單。

相襯顯微技術存在一些固有的不足。由於必須使用環形光闌，啟用相襯照明時聚光鏡的數值孔徑有所限制，所以相襯成像的軸向解析度較低。另外，標本和背景折射率差異較大的分界處會出現明顯的光暈，導致如細胞膜、細胞器外緣等位置的細節被遮蔽。

影像特點

相襯顯微鏡現實的圖片的特徵是灰色的背景上面可以顯示出明暗的樣品結構。明暗的邊緣表示了樣品光學密度的變化，例如，細胞和水的邊界，這也通常表現為在暗的物體周圍會有明亮的光暈。