垂直顯像 SMI

垂直顯像 SMI 是 1996 年在 SMI 與 SPDM 的基礎上開發出來的，能在奈米等級上最快分析完整的 3D 細胞結構的光學顯微鏡，有效的奈米級光學解析度，在解析 2D 影像能達到 5nm，而在解析 3D 影像能達到 40nm，所以比起以 Abbe 定律所算出來的物理極限 200nm 還要更佳。 恩斯特・阿貝在 1873 年提出理論上光學顯微鏡的解析度限制假說。

垂直顯像 SMI 光學顯微鏡是由海德堡大學光學應用與資訊處理博士所開發出來，集結了定位光學顯微鏡 (光學間距精密顯微鏡 SPDM, Spectral Precision Distance Microscopy) 結構照明裝置 (空間調整照明裝置 SMI, Spatially Modulated Illumination) 的科技。

自從 2008 年 3 月起，許多標準的螢光染劑像是綠色熒光蛋白 (GFP) 與 Alexa 螢光染劑可以應用在 SPDMphymod (可物理修飾螢光團 physically modifiable fluorophores) 定位光學顯微鏡上，這種顯微鏡只有單一雷射波長才有適合的光強度能用在奈米圖解上。

使用 3D 雙重顏色超解析顯微鏡偵測乳癌細胞中的 Her2 與 Her3，使用的標準染劑: Alexa 488, Alexa 568 - LIMON (SPDM +SMI

配置

SMI 是特別的雷射光學照明裝置 (空間調整照明裝置 Spatially Modulated Illumination) 與用 Vertico 反射垂直向的光，使之能夠分析固定住的標本細胞也能分析光學解析度在 10 奈米甚致更少的活細胞 (1 奈米 = 1nm = 1 × 10−9m).

此項科技的特別之處與聚焦科技，例如 4Pi 顯微鏡相比，差在較寬視野能讓整個細胞能在奈米等級的解析度下完整的描繪出來。這種整個細胞的 3D 顯像技術在 20µm × 20µm 的範圍下，只需花 2 分鐘，寬視野的顯像能讓整個物體的照明與針測同時進行。

空間調整照明裝置 (SMI: Spatially Modulated Illumination)

SMI 光學顯微鏡是建立在點擴散函式工程的光學處理技術之上，用以修正顯微鏡的點分散函式 (PSF) 來增加光學解析度，使之能以波長等級來測量螢光物質的距離，分析其他結構引數則能達到奈米等級。

SMI 顯微鏡在海德堡大學已經達到下列成果：每個物件照明的強度都不一樣，與傳統的寬視野螢光顯微鏡不同，而是以兩個相反方向的干涉雷射光來調整空間的精確性，這種空間上的調整波長原理是在 1993 由 Bailey et al 發表。

SMI 可以與其他超解析科技結合，像是與 3D LIMON 或是 LSI - 側向顯像技術而成全內反射。SMI 科技能允許讀出自動螢光基團 (autofluorophore) 分佈在人類眼睛組織的光學影像，這使用了 3 種不同激發波長 (488、568 、647nm) 而能收集自動螢光發出的光譜訊號，這項技術已經應用在人類眼睛組織的黃斑部退化上。

定位顯微鏡 (SPDM: Localization Microscopy)

單一的 YFP 分子在超解析顯微鏡下的圖 / SPDMphymod

SPDM (光學間距精密顯微鏡 Spectral Precision Distance Microscopy)，定位光學顯微鏡的基礎是熒光顯微鏡加上光學處理使得能測量 "光學上分離" 粒子的位置、距離與角度 (例如：分子) 光學顯微鏡的之下。 "光學上分離" 指的是在一定的時間之內的一點上，只有單一粒子或是分子在特定的區域被傳統的光學解析度下 (大概是直徑 200-250nm) 偵測到。當所有的分子在某個區域都含有不同的光學標記就能實現 (例如：不同的顏色或者不同粒子發射的不同激發光)

使用 SPDM 能達到結構的解析且能偵測兩點間空間上的最短距離，位置則由粒子的不同光學特性定位 (拓墣解析)。在合適的條件下，則是依定位的精確度，粒子密度等等決定，"拓墣解析" 則是對應 "頻率偏移調變"。

SPDM 是一種定位顯微鏡能達到有效的光學解析較於傳統的光學解析 (大概 200-250nm) 更佳，能顯出有效點像函式的最大值的一半寬，藉由應用合適的雷射光學精密處理技術，位置與距離小於點分散函式 (傳統上 200-250nm) 的一半寬，且能被偵測目標物與不同的光學訊號精確到奈米等級。 其中一項重要的應用是在基因研究方面 (研究基因組中有功能的部分)，另一項則是研究膜的構造。

定位光學顯微鏡的其中一個里程碑是 1996 年第一次在 3D 奈米等級上定位螢光物質，也因此從理論上與實驗上證明定位的精確度。

SPDMphymod: GFP 快門模式標準螢光染劑 (Standard fluorescent dyes in the blinking mode like GFP)

在過去兩年有分子應用在奈米顯微研究，此分子能射出一樣光譜頻率的光 (但在光學的閃光特性上則不同) 且能像光學間距精密顯微鏡一樣藉由光來調控能否射出光。能藉由結合上千張相同細胞的影像且使用雷射光譜精密測量來記錄定位的影像達到改善光學解析度。應用這種特別的奈米顯微處理技術在過去是非常困難的，因為過去以為只有特殊製造的分子才能使用光來調控能否射出光。

在 2008 年 3 月，的實驗室發現在某種光學 - 物理條件下也可以使用許多標準螢光染劑 GFP、Alexa 染劑與螢光素分子，使用 SPDMphymod (可物理修飾螢光團 physically modifiable fluorophores) 技術，在適合的光強度下，單一雷射則可以顯出奈米級的影像。與其他需要兩條雷射的定位顯微鏡不同，使用特別的光 - 調控 / 光 - 活化螢光分子。

GFP 基因很早就被引進而且表現在許多原核與真核生物中，由於他們發現與開發 GFP ，諾貝爾化學獎在 2008 年頒發給馬丁・查爾菲、下村脩與 錢永健。標準螢光分子除了能應用在 SPMD 上，還能應用在許多其他的領域上像是生物物理學，細胞生物學與醫學等等。

SPDMphymod 科技已經能使用標準螢光染劑：GFP, RFP, YFP, Alexa 488, Alexa 568, Alexa 647, Cy2, Cy3, Atto 488 與螢光素。

奈米等級光學顯微鏡 (LIMON): 3D 超解析顯微鏡

奈米等級光學顯微鏡 (LIMON Light MicrOscopical nanosizing microscopy) 在 2001 年海德堡大學發明，同時結合定位顯微鏡與空間調整照明裝置在 3D 超解析顯微鏡上。

結合 SMI 與 SPDM 使垂直顯像 SMI 能繪出 3D 影像，因此第一次 SMI 計畫與 SPDM 計畫始動。SMI 計畫決定粒子的中心與粒子的在顯微鏡軸的分散方向。然而粒子或分子的中心可以精確到 1-2nm，分散離中心的程度可以被由軸直徑精確到 30-40nm。

隨後，側向粒子或分子則採用 SPDM 來定位且能精確到奈米等級。SPDM 能達到每秒 16 楨與有效的 2D 解析度精確到 10nm ; 大概每 2000 楨能與 SMI 資料結合 (所需時間大約 10 秒) 而產生高解析度的三維影像 (有效的 3D 光學解析度大概在 40-50nm 左右)。而使用快速照相機有些甚至能有較快的速率 (達到每秒數百楨)。而使用合適的染劑能產生較好的 3D 解析影像。

應用 SPDMphymod 結合 SMI (兩者都在 1996 年由克里斯托夫克勒梅的實驗室所發明) 利用 3D 雙重顏色重建 Her2/neu 與 Her3 的排列模式，這些蛋白團能被定位精確到 25nm。

工業上使用超解析顯微鏡

超解析顯微技術既能使用在生醫實驗室還能應用在製藥研究上，在辨識與判斷目標物的價值上特別有用，例如：生物分子裝置 (BBM biomolecular machines) 都是由許多勝任基本功能的體細胞大分子所組成高度奈米結構的複合物，依功能而決定特定的結構，BBM 的其中一個例子是擬核區，它讓兩公尺長的 DNA 折疊在直徑只有幾微米的區域，因此 DNA 才能在細胞中扮演訊息與調控的中心腳色。

藉由使用 LIMON 3D 結合 LIMON 複合物標定，使第一次做 3D 複合物如 BMM 的隱密蛋白質或核酸能顯像且不破壞其結構。直到現今，最大的問題是在詳細分析內部大分子時必須破壞複合物的構造，所以有些利用電腦模型或者以核磁共振方式來模擬複合物的三維結構。