長鏈非編碼核糖核酸

長鏈非編碼核糖核酸（long non-coding RNAs，簡稱為 lncRNA）指的是長於 200 核苷酸的不編碼蛋白質的轉錄物（Perkel 2013）。該有些武斷的界定將長鏈非編碼核糖核酸與較小的調控核糖核酸區分開來，後者如微核糖核酸（miRNAs）、小干擾核糖核酸（siRNAs）、Piwi 互作核糖核酸類（piRNAs）、小核仁核糖核酸（snoRNAs）及其它短核糖核酸（Ma 2013）。

長鏈非編碼核糖核酸的丰度

近年研究顯示人類基因組中的轉錄只有五分之一與蛋白編碼基因有關（Kapranov 2007），這說明至少有較編碼核糖核酸序列四倍多的長鏈非編碼核糖核酸。而像 FANTOM（哺乳動物 cDNA 功能註釋）等的大規模互補脫氧核糖核酸（cDNA）測序計劃揭示了轉錄的複雜性（Carninci 2005）。FANTOM3 計劃從約一萬個不同的基因座中鑑定出了約三萬五千條非編碼轉錄物它們有著與 mRNA 類類似的特徵，包括 5' 端有帽、受到剪接及多聚腺苷酸化，但只有很小的開放閱讀框（ORF）或根本沒有（Carninci 2005）。然而長鏈非編碼 RNA 的丰度是意料之外的，其數目代表的是保守估計的最低值，因為這種方法忽略了許多單獨的轉錄物及非多腺苷酸化的轉錄物（瓦片陣列資料顯示出 40% 以上的轉錄物是非多腺苷酸化的）（Cheng 2005）。儘管如此，在這些 cDNA 文庫中明確鑑定非編碼 RNA 類仍是充滿挑戰的，因為該方法無法區分非編碼轉錄物及蛋白編碼轉錄物。

長鏈非編碼核糖核酸的基因組組織

目前將哺乳動物基因組的全景描繪為：長段的基因間空間將多個轉錄 “焦點” 分割開（Carninci 2005）。然而長鏈非編碼核糖核酸正位於這些基因間區段中並由此轉錄出來，其中大多數是與其它轉錄物之間呈錯綜複雜的正義或反義重疊，這些轉錄物往往包括了蛋白編碼基因（Kapranov 2007）。在正義或反義鏈上的多個不同的編碼或非編碼轉錄物共享這些轉錄焦點中的基因組序列（Birney 2007），使得這些重疊的亞型之間產生複雜的層次結構。例如，8961 個 cDNA 中的 3012 個曾被 FANTOM2 計劃註釋為編碼序列中的一段截短序列，但後來又重新被指定為蛋白編碼 cDNA 中的新非編碼 RNA 變異體（Carninci 2005）。儘管編碼 RNA 及非編碼 RNA 的交錯排列具備一定的丰度和保守性，並可能意味著它們兩者之間具有某些生物學關聯性，但仍無法對這些複雜的焦點結構進行簡單的評價。

GENCODE 共同體已綜合性整理及分析了一些人類長鏈非編碼 RNA 的註釋及它們的基因組結構、修飾、細胞定位及組織表達譜（Derrien 2012）。他們的分析結果說明人類長鏈非編碼 RNA 易形成具有兩個外顯子的轉錄物（Derrien 2012）。

長鏈非編碼核糖核酸的保守性

如微核糖核酸及小核仁核糖核酸等的眾多小型核糖核酸都顯現出了跨多物種的保守性（Bentwich 2005）。與之相反，大多數長鏈非編碼核糖核酸則保守性不強，這一點常被引用為其不具備功能的證據（Brosius 2005；Struhl 2007）。然而，如 Air 及 Xist 等經過詳細研究的長鏈非編碼 RNA，它們的保守性也很差（Nesterova 2001），這意味著非編碼 RNA 類可能受到不同的選擇壓力（Pang 2006）。mRNA 必須保守密碼子的正常用法並防止單個長 ORF 中出現移碼突變，然而對長鏈非編碼 RNA 的選擇壓力可能只會令其保守其中的較短區域，這些較短區域對於結構或序列特異性相互作用較為關鍵。因此，我們可見選擇壓力只會作用於長鏈非編碼 RNA 轉錄物的小塊區域。仍然要看到：儘管長鏈非編碼 RNA 總體來說保守性較低，但仍可見許多長鏈非編碼 RNA 具有較強的保守元件。例如，高度保守的 phastCons 元件中有 19% 存在於已知的內含子中，而其它 32% 存在於未註釋的區域之中（Siepel 2005）。此外，人類長鏈非編碼 RNA 中的具有代表性的一類長鏈非編碼 RNA 在鹼基取代和插入 / 缺失速率方面顯現出較小但顯著的降低，這一現象指示了淨化選擇壓力使得轉錄物的完整性得到保守，這在序列、啟動子及剪接三種水平上體現出來（Ponjavic 2007）。

非編碼核糖核酸的保守性差可能是近期且快速的適應性選擇的結果。例如，非編碼核糖核酸較蛋白編碼基因可能對進化壓力可塑性更強，如 Xist 或 Air 等的許多世系特異性非編碼 RNA 的存在可以證明這一點（Pang 2006）。相對於黑猩猩基因組來說人類基因組中經受近期進化改變的保守區域確實主要存在於非編碼區域，其中很多已有詳盡描述（Pollard 2006；Pollard 2006）。其中包括一條名為 HAR1F 的非編碼 RNA，該基因在人類中經歷了快速的進化變化，且特異性地在人類新皮質的卡哈爾 - 雷濟厄斯氏細胞中特異性表達（Pollard 2006）。現有報道稱許多功能已確定的 RNA 進化速率也很快（Pang 2006；Smith 2004），這可能由於這些序列受到結構 - 功能約束時表現得更靈活，我們可以期待在這些序列中發現新的進化方式。人類基因組中有數千條序列的一級序列保守性較差，但有證據顯示它們 RNA 二級結構卻存在著保守性（Torarinsson 2006；Torarinsson 2008），這支援了上述論點。

長鏈非編碼核糖核酸的功能

cDNA 文庫的大規模測序及更先進的基於下一代測序的轉錄組測序表明哺乳動物中長鏈非編碼核糖核酸的數量大約是幾萬條。然而，雖然越來越多的證據提示大多數長鏈非編碼核糖核酸具有功能（Mercer 2009；Dinger 2009），但相對只有一小部分已被證明有生物學重大意義。截至 2012 年十二月，約有 127 條長鏈非編碼 RNA 在 LncRNAdb（一個描述長鏈非編碼 RNA 的文獻資料庫）中有功能註釋（Amral 2011）。

4.1 長鏈非編碼 RNA 類在基因轉錄調控中的作用

4.1.1 長鏈非編碼 RNA 類在基因特異性轉錄中的作用

RNA 轉錄在真核生物中是一個受到嚴密調控的過程。非編碼 RNA 可以靶向該程序的多個方面，包括靶向轉錄啟用因子或轉錄抑制因子、如 RNA 聚合酶（RNAP）Ⅱ 等轉錄反應中的各組分、甚至是 DNA 雙螺旋結構，以達到調控基因轉錄及表達的目的（Goodrich 2006）。非編碼 RNA 將這些機制結合在一起可以組成為一個包括轉錄因子在內的調控網路，可以精細地調控複雜真核生物的基因表達。

非編碼 RNA 透過多種不同的機制調節轉錄因子的功能，包括充當共調控因子的角色、修飾轉錄因子的活性或是調控共調控因子的活性。例如，非編碼 RNA Evf-2 作為同源異形框轉錄因子 Dlx2 的共啟用因子，Dlx2 在前腦發育及神經發生中起到重要作用（Feng 2006；Panganiban 2002）。Evf-2 轉錄自位於 Dlx5 與 Dlx6 基因之間的超保守元件，音蝟因子在前腦發育過程中誘導該長鏈的轉錄（Feng 2006）。Evf-2 接著將 Dlx2 轉錄因子招募到同一個超保守元件處，Dlx2 在此處誘導 Dlx5 的表達。哺乳動物基因組中存在其它一些可轉錄且執行增強子功能的超級保守或高度保守元件，這提示 Evf-2 可作為範例闡述脊椎動物生長過程中以複雜表達的形式嚴密調控重要發育基因的普遍機制（Pennacchio 2006；Visel 2008）。近期研究也確實發現與之類似的其它非編碼超保守元件的轉錄及表達在人類白血病中出現異常，且促進結腸癌細胞的凋亡，這提示了它們涉及到腫瘤形成（Calin 2007）。

區域性的非編碼 RNA 類可以招募轉錄機制對附近蛋白編碼基因的轉錄加以調控。TLS（translocated in liposarcoma）是一種結合 RNA 的蛋白，它結合到 CREB 結合蛋白和組蛋白乙醯基轉移酶 p300 上並抑制這兩者在靶基因週期蛋白 D1 上的活性，從而起到抑制後者的作用。作為 DNA 受損訊號的響應，長鏈非編碼 RNA 以低水平表達出來並拴在週期蛋白 D1 基因的 5' 調控區域上，這指導了 TLS 招募到週期蛋白 D1 啟動子上（Wang 2008）。除此之外，這些區域性的非編碼 RNA 作為配體調控 TLS 的活性。從更廣泛的層面上說，這一機制使得細胞可以利用 RNA 結合蛋白（它們組成了哺乳動物蛋白質組中的最龐大的種類之一）並在轉錄程式控制中整合它們的功能。

在 X 染色體失活的情況下一些基因仍可以轉錄，近期對逃避染色體失活控制的染色體區域進行研究，發現其中表達的長鏈非編碼 RNA 可能介導了這一過程（Reinius 2010）。

4.1.2 長鏈非編碼 RNA 調控基礎轉錄機器

非編碼 RNA 還可以靶向通用轉錄因子，後者是 RNAPⅡ 轉錄所有基因所必需的（Goodrich 2006）。這些通用因子包括了起始複合體中組裝在啟動子上或涉及轉錄延伸的部件。轉錄自二氫葉酸還原酶（DHFR）基因上游次要啟動子的一條非編碼 RNA 進入 DHFR 主要啟動子，形成穩定的 RNA-DNA 三股螺旋以阻止轉錄輔因子 TFⅡB 結合到其上（Martianov 2007）。已知真核染色體上存在著數千個三股螺旋（Lee 1987），這一調控基因表達的新機制可能事實上代表這些三股螺旋在控制啟動子上起到的廣泛作用。U1 非編碼 RNA 透過結合到 TFⅡH 上並刺激其對 RNAPⅡ 的 C - 端以實現誘導轉錄起始（Kwek 2002）。相反，非編碼 RNA 7SK 可透過下列方式起到抑制轉錄延伸的作用：7SK 首先與 HEXIM1/2 結合，形成抑制性複合物，該複合物阻止 PTEFb 通用轉錄因子去磷酸化 RNAPⅡ 的 C - 端結構域（Kwek 2002；Yang 2001；Yik 2003），當細胞處於應激狀況下可以抑制全域性延伸。這些例子中的機制可以繞開單個啟動子上特異性的調控模式，介導起始及延伸轉錄機器工作水平發生直接改變，提供了迅速影響基因表達全域性改變的方法。

現也證明非編碼重複序列有著介導全域性調控的能力。人類的短散在核內（SINE）Alu 元件及小鼠中同源的 B1 和 B2 元件是基因組中丰度最高的可移動性元件，分別組成了人類和小鼠基因組的約 10% 和約 6%（Lander 2001；Waterston 2002）。在如熱休克等環境應激情況下這些元件被 RNAPⅢ 轉錄為非編碼 RNA（Liu 1995），後者接下來會以高親和度的方式與 RNAPⅡ 結合並阻止其形成為有活性的前起始複合物（Allen 2004；Espinoza 2004；Espinoza 2007；Mariner & Walters 2008）。這使得在響應應激的情況下可以大範圍並迅速抑制基因的表達（Allen 2004；Mariner & Walters 2008）。

對 Alu 元件的 RNA 轉錄物中的功能序列進行分析後，發現其亦有類似於蛋白質轉錄因子中結構域的模組化結構（Shamovsky 2008）。Alu 元件 RNA 包括兩個 “臂”，每個臂都可以結合到一個 RNAPⅡ 分子上；體外實驗表明該 RNA 還具有兩個調控結構域，起到抑制 RNAPⅡ 轉錄活性的作用（Mariner 2008）。

4.2 長鏈非編碼 RNA 類在基因轉錄後調控中的作用

除了在轉錄水平上調控，ncRNAs 也在轉錄後水平調控 mRNA 加工的不同方面。與小調控 RNAs，例如微小 RNAs 和小核仁 RNAs，類似，ncRNAs 的功能包括與目標 mRNA 進行互補鹼基配對。互補 ncRNA 和 mRNA 形成的 RNA 雙鏈可能為需要結合反式作用因子的 mRNA 募集關鍵因子，可能影響轉錄後水平基因表達的每一步，包括前體 mRNA 加工，剪接，運輸，翻譯以及降解。

4.3 長鏈非編碼 RNA 類在表觀遺傳調控中的作用

包括組蛋白和 DNA 甲基化、組蛋白乙醯化和 SUMO 化等在內的表觀遺傳修飾影響了染色體生物學的眾多方面，主要包括透過對廣大染色質區域進行重塑從而調控大量基因（Kiefer 2007；Mikkelsen 2007）。一段時間以來，RNA 作為染色質的有機組成部分已被人知曉（Nickerson 1989；Rodriguez-Campos 2007），但現在我們才開始認識到 RNA 在涉及到染色質修飾通路上的意義（Chen 2008；Rinn 2007；Sanchez-Elsner 2006）。

果蠅屬中的長鏈非編碼 RNA 類透過將三胸蛋白 Ash1 募集到同源異形調控元件並指導其發揮染色質修飾作用的方式誘導同源異形基因 Ubx 的表達（Sanchez-Elsner 2006）。後來發現哺乳動物中也存在著相似的調控模式：認為強大的表觀遺傳機制奠定了胚胎同源異形基因家族的表達譜，而同源異形基因家族是貫穿整個人體發育過程中持續發揮作用的重要因子（Mazo 2007；Rinn 2007）。人類同源異形基因家族確實與數百個非編碼 RNA 之間有著相關性，這些非編碼 RNA 在人體發育的時空軸上按順序表達，這些非編碼 RNA 也定義染色質各區域中組蛋白甲基化程度的差異以及 RNA 聚合酶可進入染色質的程度（Rinn 2007）。其中一條名為 HOTAIR 的轉錄自 HOXC 基因座的非編碼 RNA 透過改變組蛋白三甲基化狀態從而使 HOXD 基因座中長約 40kb 的區域發生轉錄沉默。目前認為 HOTAIR 執行的作用機制是：多梳染色質重塑複合物具有操縱細胞表觀遺傳狀態的功能，而 HOTAIR 以反式調控的方式指導該功能的發揮並繼而影響基因的表達。多梳複合物中的成員包括 SUZ12、EZH2 和 EED 等，它們具有 RNA 結合結構域並可能結合 HOTAIR 及其它類似的非編碼 RNA 類（Denisenko 1998；Katayama 2005）。該例子極好地描繪出了這樣一個更廣泛的主題：非編碼 RNA 類招募一系列染色質修飾蛋白到特定基因組基因座上併發揮功能，這更加突出了目前所繪製基因組圖譜的複雜性（Mikkelsen 2007）。發育時期中調控基因表達的染色質修飾有著區域化的模式，大量長鏈非編碼與蛋白編碼基因的聯絡確實幫助塑造了這種模式。例如，大多數蛋白編碼基因都具有配對的反義基因，許多抑癌基因在癌症中常受到沉默，一些反義基因使用表觀遺傳機制使這些抑癌基因沉默（Yu 2008）。近期研究發現：在白血病中 p15 基因和一條反義非編碼 RNA 的表達此消彼長（Yu 2008）。經過詳細分析發現：p15 的反義非編碼 RNA（CDKN2BAS）可透過一種未知機制誘導 p15 的異染色質和 DNA 甲基化狀態發生改變，因而調控了 p15 基因的表達（Yu 2008）。因此，相關的反義非編碼 RNA 類表達發生異常可能繼而沉默了抑癌基因，從而走向癌症發生。

4.3.1 基因印記

最近非編碼 RNA 指導的染色質修飾主題最初是從基因組印記的現象中引出的，基因組印記是僅從母系或父系染色體兩者中的一個表達出等位基因的現象。一般來說，印記基因是呈簇狀排列於染色體上，這提示：印記的機制是作用於區域性的染色質區域上而不是針對單個基因。這些基因簇常常與長鏈非編碼 RNA 相關：長鏈非編碼 RNA 的表達量與在相同等位上相連鎖的蛋白編碼基因受到抑制的程度呈正相關（Pauler 2007）。詳細分析確實顯示出非編碼 RNA Kcnqot1 和 Igf2r/Air 在指導基因印記上發揮著重要作用（Braidotti 2004）。