斑馬魚

斑馬魚（又名印度斑馬魚、黑斑馬魚、藍斑馬魚、斑馬、藍條魚、花條魚、印度魚），是一種熱帶淡水魚，為輻鰭魚綱鯉形目鯉科的其中一種。原生於喜馬拉雅地區，是一種受歡迎的觀賞性魚類。同時，其在科研領域也是一種重要的有脊椎模式生物，尤其是在生物體再生能力的研究方面，並且有多種基因編輯後的轉基因人工培育種。斑馬魚在被重新被劃歸為鿕屬（Danio）之前，曾被歸類為短鿕屬（Brachydanio），因而在科研文獻中被長期稱為 Brachydanio rerio，而非如今的 Danio rerio。

分佈

斑馬魚原生於喜馬拉雅地區東南部的溪流中，見於孟加拉、印度、巴基斯坦、緬甸、尼泊爾等國。本種類出現在東印度的恆河流域，常棲息於溪流、運河、水溝、池塘、緩流或靜滯水體（如稻田等）。斑馬魚是美國、日本、斯里蘭卡、菲律賓、模里西斯等地的外來物種，可能是被故意放生或是從養魚場逃離而引入野外環境中。

特徵

體色為銀色或金色，側面覆蓋著五條橫紋，這些橫紋從頭部延伸至尾鰭的後端，臀鰭和尾鰭上同樣也有這種條紋，這些條紋與斑馬條紋觀感有同處，因而得名。背部呈淺橄欖黃；外形側看為紡錘狀，身形扁而修細，口向前。雄性為魚雷狀，體一般長於雌性，金色條紋間有藍色條紋，色偏紅；雌性腹部更大，偏白，條帶呈銀色，成年雌性可於臀鰭起點前側觀察到小的生殖乳突。斑馬魚可以長到長達 6.4 釐米，但通常不會長於 4 釐米。其壽命為 2～3 年左右，理想條件下可以超過 5 年。

生態

本魚棲息在溪流、溝渠或靜止的水中，每 2 至 3 天可產卵一次，每次可產約 200 顆以上的卵，屬雜食性，以昆蟲、小型甲殼類等為食。性情溫和，喜群遊，通常數尾成一群。無家庭觀念。

生殖發育

斑馬魚的發育分為 6 個階段：卵裂期，囊胚期，原腸胚期、分裂期、成形期和孵化期。

斑馬魚的平均傳代時間（generation time）為 3 個月。雄性斑馬魚需要在場等待排卵和產卵發生，隨後雌性斑馬魚在每個卵塊（clutch）中能夠間隔 2～3 天產下幾百枚卵。卵排出後，胚胎髮育開始；如若沒有精子，生長又在前幾個細胞分裂後停止。受精卵幾乎立刻變得透明，這一特性使得斑馬魚極大地方便了科研人員，使其適合科學研究。

斑馬魚的胚胎髮育身份迅速，受精 36 小時內先期物質就分化出了所有的器官：胚胎最早見於卵黃中，這時卵黃頂端出現一個巨大的細胞（見右側，如 0h 時圖）；隨後，這個細胞一分為二（見 0.75h 時圖）；再之後，細胞持續性分裂，直至形成上千個小細胞（見 3.25h 時圖）；大量的細胞隨後遷移出卵黃的邊緣（見 8h 時圖），再隨之開始形成一頭一尾（見 16h 時圖），尾生長並從卵細胞中分離出來（見 24h 時圖）；胚胎消耗作為養料來源的卵黃並逐漸成熟，卵黃逐漸收縮（見 72h 時圖）。過若干月後，成年斑馬魚進入生殖成熟期（見右圖底端圖）。

科研人員為促進斑馬魚產卵，往往在放置小水箱中放置，模擬河流的岸邊。小水箱內建隔板，隔離雌雄；並下有柵格，防止成魚吞食魚卵。適時開啟隔板，供其交配產卵；因其晝夜節律，斑馬魚早上產卵為佳，故早上開啟為好，開啟時抬高水箱底柵格，減小魚的活動範圍，方便其交配；可在水箱底部發現卵，透明者為受精卵。科研人員可以透過此方式在 10 分鐘內收集大量魚卵。雄性斑馬魚會對雌性身上諸如 “好的斑紋” 之類的顯著標記更有反應，然而在集體中，雄性會和其能找到的雌性交配。在交配中吸引雌性的機制尚不清楚。交配環境中有植物，甚至是塑膠植物，也會大大地促進產卵。

品種分類

5.1 轉基因品種

斑馬魚是研究發育生物學的新興模式動物。斑馬魚由於具有飼育容易、胚胎透明、體外受精、突變種多、遺傳學工具成熟等諸多優點，近年來已成為研究脊椎動物發育與人類遺傳疾病的新興模式生物。與其他脊椎動物相較下，斑馬魚最大的優點就是具有多達 6,000 多種的遺傳突變種，這些突變種的建立大致上是利用 X 射線、N - 乙基 - N - 亞硝基脲或反轉錄病毒的感染造成基因組的突變，之後再經由多次的子代篩選所得。這些突變種的表徵包含如胚層分化，器官發育，生理調適與行為表現等多方面，所以可提供研究人員極佳的正向遺傳學材料來進行發育機制上的研究。另外在斑馬魚系統中也開發出阻斷基因功能的工具 - 嗎啉基，可快速以逆向遺傳學手法來驗證基因的功能。所以正向遺傳學與逆向遺傳學的巧妙利用，可以正確推匯出斑馬魚遺傳發育途徑，也是目前斑馬魚成為研究人類疾病新興模式生物的主要原因。

從 2003 年後期起，表達綠色、紅色、黃色熒光蛋白的轉基因品種斑馬魚在美國上市。表達熒光蛋白的斑馬魚也被商家稱為 “螢光魚”。別的培養品種包括 “golden”、“sandy”、“longfin”、“leopard” 等。其中 leopard 品種，之前被稱為 Danio frankei，是一種由於色素變異產生的帶點狀色彩的斑馬魚品種。的普通斑馬魚品種與 leopard 品種、長鰭次種都已透過育種篩選獲得並被用於水族魚類交易。（Xanthochromism 是一種有關紅色素被黃色素替代的帶有特殊黃色。）

5.2 野生品種

（ZFIN）提供了最新的目前已知野生型（wild-type, 簡稱 WT）斑馬魚資訊。

AB (AB)
AB/C32 (AB/C32)
AB/TL (AB/TL)
AB/Tuebingen (AB/TU)
C32 (C32)
Cologne (KOLN)
Darjeeling (DAR)
Ekkwill (EKW)
HK/AB (HK/AB)
HK/Sing (HK/SING)
Hong Kong (HK)
India (IND)
Indonesia (INDO)
Nadia (NA)
RIKEN WT (RW)
Singapore (SING)
SJA (SJA)
SJD (SJD)
SJD/C32 (SJD/C32)
Tuebingen (TU)
Tupfel long fin (TL)
Tupfel long fin nacre (TLN)
WIK (WIK)
WIK/AB (WIK/AB)

5.3 雜交品種

不同鿕屬品種之間的雜交品種可能仍具有生殖能力，例如 D. rerio（斑馬魚）與 D. nigrofasciatus 的雜交品種。

養殖要求

6.1 水族養殖

為相當受歡迎的觀賞魚，飼養時以寬約 60 公分的水族箱為宜。

斑馬魚適應性強，易於新手養殖，因其性格活潑、繁殖迅速、較為美觀、價格便宜、易於獲得而受歡迎。斑馬魚能 6 只以上成群遊動，並且可以與水族箱中其它品種魚類有互動，但它們易於感染、、微孢子蟲病、分枝桿菌病等疾病。成年斑馬魚會食魚卵，保護魚卵要透過將生殖區域隔離開來。

斑馬魚也常被用來產生轉基因品種，也是熒光魚的第一代品種。

6.2 餵食情況

斑馬魚屬雜食性魚類，主要食用浮游動物、浮游植物、昆蟲、昆蟲幼體等，但在食物條件不理想的情況下也會食用別的食物，例如蠕蟲、甲殼類動物等。

在實驗室中，斑馬魚苗通常用草履蟲餵養，待其成長到一定大小後則餵食豐年蝦，成年的斑馬魚則是吃一般的魚飼料。

科研特性

斑馬魚的色素細胞為科學家廣泛研究的物件，此處表現出對背景的偽裝。

圖下方展示的是斑馬魚色素突變，突變種由插入基因產生。上方為野生型，與之對比。變異種不能很好地合成黑色素，故其黑素細胞缺乏黑色素。

斑馬魚是一種常見且常用的科研模式生物，被用於研究脊椎動物的發育以及基因功能。由美國分子生物學家及他在俄勒岡大學的同事在 1970、80 年代首先在實驗室中使用作模式生物。George Streisinger 所進行的斑馬魚克隆實驗形成了最早一批成功的脊椎動物克隆體之一。 斑馬魚在科研領域的重要性在成功的大規模先導性中被凸顯，這一實驗常被稱為 Tübingen/Boston 篩查（the Tübingen/Boston screens）。該品種魚目前已有特有的線上資料庫，包括遺傳學資料庫、基因組學資料庫、發育資訊資料庫、 (Zebrafish Information Network，簡稱 ZFIN)。斑馬魚國際資源中心（The Zebrafish International Resource Center，簡稱 ZIRC）儲存了斑馬魚的遺傳學資訊，並由 29,250 對等位基因的資訊對研究領域釋出。斑馬魚也是少數幾種被送上太空的魚類之一。

使用斑馬魚進行的研究已經在發育生物學、腫瘤學、毒理學、生殖醫學、畸形學、遺傳學、神經科學、環境科學、幹細胞、再生醫學和進化理論等領域取得進展。

7.1 作為模式生物的特性

作為模式生物，斑馬魚在科研領域具有許多優勢。其基因組已經被全部測序，並被充分了解，其發育行為容易理解、易於觀察、便於測驗。其胚胎髮育迅速，胚胎相對較大、突出而且透明，還可以在母體外發育。此外，科研人員可以獲得已經被研究成型的、帶有特定特徵的變異種。

其它的好處包括：在早期發育階段，斑馬魚胚胎大小幾乎不變，便於染色之類的簡單技術操作；其發育階段中兩個細胞組成的胚胎可以融合成一個細胞，從而獲得純合子胚胎；斑馬魚與人類和哺乳類模型在毒理測試方面顯著相近，並且展現出類似於哺乳動物睡眠行為的晝夜節律。然而，斑馬魚不是一個完全理想的實驗模型，其在別的科研領域也有不適用之處，例如其不存在標準的飲食，又比如在一些有關人類疾病的基因方面，斑馬魚和哺乳類存在微小但很重大的差異。

7.2 再生能力

斑馬魚在幼魚階段能夠再生其鰭、皮膚、心臟、體側線的毛細胞以及大腦。在 2011 年，廣告宣傳以公佈其將這項能力應用於人體的企劃，以期籌措 5,000 萬英鎊。

斑馬魚也被發現可在創傷後再生感光細胞與視網膜神經。目前研究顯示，這是由 (Muller glia) 的去分化與增殖介導的。研究人員不斷截斷背上以及腹面上的尾鰭，並且分析其再生以觀測其突變。已經發現，在截肢部位出現，使得斑馬魚的細胞重新活躍為可再生的類似於幹細胞的狀態。2012 年，澳洲科學家釋出的一項研究表明，斑馬魚使用一種被稱為成纖維細胞生長因子的特異的蛋白質以確保其脊髓可以痊癒而無。科學家們首次繪製出斑馬魚神經細胞的詳細圖譜。該圖譜揭示了這些特殊魚類如何能夠徹底修復被截斷的脊髓，這可能為人類脊髓損傷的治療策略提供重要線索。此外，斑馬魚後側體側線的毛細胞被發現可以在創傷後或者發育中斷後再生。對其再生期間基因表達的研究使得若干重要的訊號通路得以被識別出來，例如 Wnt 訊號通路和成纖維細胞生長因子等。

研究包括神經退行性疾病、行動失調、精神疾病、耳聾等在內的神經系統疾病時，研究人員使用斑馬魚來理解遺傳學缺陷如何引起人腦、脊椎、感應器功能上的異常。科研人員也透過此途徑深入瞭解人體錯綜複雜的肌肉與骨骼疾病，例如肌肉萎縮症等。斑馬魚研究的另一焦點在於理解刺蝟訊號通路（一種生物訊號）如何影響細胞生長乃至引起一系列的癌症。

7.3 遺傳特性

7.3.1 基因表達

由於斑馬魚的生命週期較短、可控性強，故常被用作遺傳學研究的模型動物。基因敲落和用反義嗎啉基進行修改 RNA 剪接是常用的反向遺傳學技術。人工合成的高分子嗎啉基寡核苷酸 (MO) 包含與 DNA、RNA 相同的核苷；透過與互補序列結合，他們可以減少特定基因的表達或者阻礙其它 RNA 上進行的過程。嗎啉基寡核苷酸 (MO) 可以在 32 細胞階段後注入胚胎內的某個細胞，使得這一細胞所分裂出的細胞都出現在某個基因上的表達減弱；不過，大分子可以任意透膜通行早期胚胎（小於 32 細胞）中的細胞中，進行擴散。使用嗎啉基的指南描述了合理控制策略。嗎啉基常以 500pL 劑量直接透過顯微注射注入 1～2 細胞階段的斑馬魚胚胎中，使之可以與多數細胞融合。

斑馬魚基因敲除的難點在於：基因組在完成輻鰭魚和肉鰭魚的分化之後的基因複製中，由於同源基因互補，同源基因中其中之一很難不被表達。儘管斑馬魚的基因組很複雜，市面上還是不少有供研究基因表達譜以分析基因表達的國際化的商業平臺的，並且還推薦使用技術的規範。

7.3.2 基因組測序

維康桑格研究所在 2001 年啟動斑馬魚基因組測序專案。蒂賓根參考樣品系的基因組序列可以在美國國家生物技術資訊中心 (NCBI) 的 斑馬魚基因組 上獲得。斑馬魚參考基因組被注是 Ensembl 專案 的一部分，由（Genome Reference Consortium）所維護。

2009 年，印度德里的（Institute of Genomics and Integrative Biology）宣佈了一種野生品系斑馬魚的基因組測序，其包含大約 17 億對鹼基。野生型斑馬魚的基因組測序差異倍數為 39。與參照基因組的比較分析發現了超過 500 萬單核酸突變和超過 160 萬插入或剪下突變。共 1.4GB 超過 26,000 個蛋白質編碼基因的斑馬魚參照基因組序列由 Kerstin Howe 等人於 2013 年釋出。

7.3.3 線粒體 DNA

在 2001 年 10 月，美國奧克拉荷馬大學研究人員公開了斑馬魚的完整線粒體 DNA 序列。這一序列包含 16,596 個鹼基對，與其它魚類差別不超過 100 個鹼基對，僅僅比金魚 (雙名法：Carassius auratus) 的長 18 個鹼基對，比 (雙名法：Cyprinus carpio) 的長 21 個鹼基對。其線粒體基因含量與基因順序與常見的脊椎動物線粒體 DNA 相同，包含 13 種蛋白質編碼基因和 1 個包含重鏈複製起點的非編碼控制區。其中間發現有，共 5 個的 1 組 tRNA 基因和類似脊椎動物輕鏈複製起點的序列。因為從鹼基對變化的角度很難得出有關適應性的結論，所以很難得出進化上的結論。

7.3.4 色素基因

1999 年，nacre 變異在斑馬魚體內的哺乳類同源基因 MITF 傳輸因子中被識別出來。人體的變異會導致眼部缺陷和色素缺失，這一症狀是瓦登伯革氏症候群的一種。2005 年 12 月，對 golden 品系的研究認為一種被稱為的溶質載體蛋白編碼基因導致了其不同尋常的體色，這種蛋白似乎在黑色素形成過程中是必要的，並且透過馬琳代（Morpholino）敲除，其這一功能被確認。隨後，與人體基因在實驗中被識別出來：一個單鹼基對差異被發現能夠大大影響膚色，使得淺膚色的歐洲裔人種與黑膚色的非裔人種被區分開來，但這一實驗並未對人做實驗，而是採用了比較基因組學這一新領域的研究方法。帶有 nacre 突變的斑馬魚與帶 roy orbison (roy) 突變的斑馬魚交配可以得到沒有黑素細胞和虹細胞的斑馬魚，這些得到的斑馬魚在成年期也是透明的，一律有著帶顏色的眼睛和半透明的皮膚。

7.3.5 轉基因

轉基因是一種研究斑馬魚基因的功能的常見手段。透過使用 Tol2 轉位子體系的方法，構建轉基因品種斑馬魚尤其容易。

7.3.6 透明體色

2008 年，美國波士頓兒童醫院的研究人員開發了一種新的斑馬魚品系 Casper。這種品系的成魚體色透明。這能夠方便對細胞活動、迴圈系統遠端轉移等現象的細緻觀察。由於人和斑馬魚有許多基因功能是相同的 Casper 品種被寄予加深人類對如白血病等癌症在內的人類疾病研究的厚望。在 2013 年 1 月，日本科學家轉基因透明斑馬魚品系得到可以在高強度腦活動時放出可見發光的品系，使得斑馬魚對外界刺激的反應可以被記錄精確到特定的大腦發光區域。

7.3.7 環境監測

2007 年 1 月，復旦大學研究人員修改了斑馬魚的基因，使得其能夠用於探測水體中的雌激素汙染，這一汙染被認為與男性不育有關。研究人員克隆了對雌激素敏感的基因，將之注入斑馬魚的受精卵中，得到的轉基因魚會在感知汙染時變綠。

7.3.8 RNA 剪接

2015 年，美國布朗大學的研究人員發現，10% 的斑馬魚基因並不依賴於蛋白質來啟動 RNA 剪接。這些基因在每個內含子的尾端有著 AC 和 TG 鹼基對的重複序列。在 3' 剪接位置 (3' splicing site，簡稱 3'ss) 上，腺嘌呤（A）和胞嘧啶（C）交替重複 ；在 5' 剪接位置 (5' splicing site，簡稱 5'ss) 上，互補的胸腺嘧啶（T）和鳥嘌呤（G）同樣交替重複。研究人員發現，斑馬魚對 U2AF2 蛋白的依賴比人類更小，而這一蛋白對 RNA 剪接的發生是必需的。這種在內含子周圍重複鹼基對以改變 RNA 核酸二級結構的模式在真骨類中曾發現過，但在四足類中未曾發現過。這表明四足類中的某一進化可能導致了人類與斑馬魚在對 U2AF2 依賴程度的差異。

7.4 近交衰退

近親交配後，幼魚會顯現近交衰退的不良後果。近交衰退主要由有害隱性基因的表達產生的。對於斑馬魚而言，在較為緊張的環境（例如人為因素造成的緊張）中，近交衰退被認為會更加嚴重。由化學藥劑克黴唑（一種咪唑類抗真菌類藥物，用於農業、獸醫、醫療）誘導的斑馬魚環境壓力感受會加劇近親繁殖在關鍵生育特性上的影響。胚胎有效率在近親雜交的魚中大大減小，並且雄魚產生後代有減少趨勢。

醫學研究方向

8.1 癌症

斑馬魚被用來生產包括黑色素瘤、白血病、胰腺癌和肝細胞癌等癌症研究時使用的轉基因模型。表達突變的 BRAF 或 NRAS 癌基因的斑馬魚模型在置於缺乏腫瘤抑制蛋白（p53）的背景下會得上黑色素瘤。在組織學上，這些腫瘤高度類似於人類疾病，是可移植入人體的，並且展現了大範圍的基因組變化。BRAF 基因黑色素瘤模型魚被用來作兩種篩選的平臺，這一方法公佈於 2011 年 3 月的《自然》上。在另外一項研究中，這一模型被用來理解人類黑色素瘤中擴增和過表達的基因的功能作用。SETDB1 基因能在斑馬魚體內顯著地加速腫瘤生成，從而顯示了其作為致癌基因的性質。這一點尤為重要，因為目前已知 SETDB1 參與了表觀遺傳調控，而表觀遺傳調控越發地被認為是腫瘤細胞生物學的核心。

在別的研究中，研究人員使用化學篩查，來針對起源神經脊細胞中的遺傳程式進行靶向治療。這項研究顯示，一種叫做來氟米特（leflunomide）的的小分子抑制 DHODH 蛋白可以阻止神經脊幹細胞的發育，透過干涉能夠避免這一發育最終所導致的黑色素瘤的發生。因為這一過程會針對性識別黑色素瘤而非其它單一的遺傳變異，來氟米特可能在人類黑色素瘤治療方面有所利用價值。

8.2 心血管疾病

在心血管研究領域，斑馬魚被用來模擬凝血、血管新生、心臟衰竭和先天性心臟病。

8.3 免疫系統

研究急性炎症中，研究人員已經建立了炎症研究的斑馬魚模型以及相關處理機制，使得研究人員能對炎症的遺傳控制機制進行細化研究，並且有可能以此識別有潛力的新藥物。

斑馬魚在研究脊椎動物的固有免疫方面是廣泛使用的模式生物（固有免疫能夠在受精後 28～30 小時內進行吞噬作用，吞噬作用是免疫反應的重要一環）。與之對比，適應性免疫（也稱特異性免疫、獲得性免疫、後天性免疫）在受精後至少四周才能在功能上達到成熟狀態。

8.4 傳染病

由於人類和斑馬魚的免疫系統保守性較強、相對一致性高，許多人類傳染病可以在斑馬魚上模擬。斑馬魚透明的早期胚胎被用於深入研究活體成像和分析宿主和病原體之間的互動。科學家已經建立了用於模擬一大批細菌、病毒、寄生蟲類病原體的斑馬魚模型，例如用於結核病研究的斑馬魚模型已經為分支桿菌的致病機制研究提供了深入研究的平臺。此外，也已經發展出使用斑馬魚感染模型進行高通量微抗生素藥物篩查的自動化技術。

8.5 修復視網膜損傷

斑馬魚的另一顯著特徵在於其擁有四種視錐細胞，除人體內擁有的紅色、綠色、藍色敏感視錐細胞外，擁有紫外線敏感細胞。斑馬魚因此可以看見非常廣的色譜。故斑馬魚也被用於研究視網膜的發育，尤其是視錐細胞如何在視網膜中形成鑲嵌方面。斑馬魚和一些真骨類魚類以其視網膜上高度精密的視錐細胞鑲嵌排列備受科學家關注。

這一對斑馬魚視網膜特性的研究也已經延展至人類的視網膜醫學研究。2007 年，倫敦大學學院的研究人員培養出一種成年斑馬魚幹細胞，這些幹細胞在斑馬魚和哺乳動物的眼睛中被發現，且最終會發育成視網膜神經。這些細胞可以注射進入眼部，用於治療損壞視網膜神經的疾病，此類疾病涵蓋大部分眼疾，包括黃斑部退化、青光眼、糖尿病相關失明等。研究人員研究了人眼中的 Müller 細胞，其研究物件年齡從 18 個月大到 91 歲。研究中，科研人員能夠將這些細胞培養為所有種類的視網膜神經細胞。研究團隊在實驗室可以輕鬆地培育這些細胞，並且還將培育出的幹細胞移植進入大鼠視網膜中對周圍的神經進行觀察，研究人員稱這些幹細胞試圖以與在人體內相同的方式發育。

8.6 藥物研發

如同在許多進行中的研究專案所演示的那樣，斑馬魚模型使得研究者不僅能夠識別除引發人類疾病的基因，也可以用來在藥物開發專案中開發新的治療藥劑。斑馬魚胚胎是一種快速、價效比高且可靠的致畸檢驗模型。使用斑馬魚進行藥物篩查可以識別具有生物學療效的新的化合物種類，或者發現已知藥物的新用途。例如一種常用的抑制劑（瑞舒伐他汀）透過斑馬魚試驗發現可以抑制前列腺癌的生長。迄今為止，已經進行過 65 項小分子篩查，其中至少一項已經進行臨床試驗。在這些篩查中，許多技術難度仍待解決，例如：藥物吸收率在不同組織或者器官是不同的，這一不同導致藥物的實際有效濃度（即其對特定部位的暴露量）無法從其水溶液濃度推算；個體動物之間的天然差異等。但對於理解藥效而言，藥物的暴露產生了藥效，因此瞭解藥物在體內的暴露量是至關重要的。同時，將斑馬魚身上的實驗結果解讀為對人類等高等脊椎動物有效的結果需要在知悉藥物濃度和藥效之間的關係基礎上，這一基礎可由藥物代謝動力學和藥物效應動力學方面分析產生。迄今，只有對於對乙醯氨基酚的斑馬魚幼體模型已經建立了上述所言的人體和藥物相互作用的模型。但在斑馬魚身上進行藥理學分析前景仍是廣闊的。

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