"COL1A1の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸dsRNAであって、前記dsRNAがセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖が、配列番号53のヌクレオチド配列と3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含み、かつ前記アンチセンス鎖が、配列番号54の対応するアンチセンスヌクレオチド配列と3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む、前記dsRNA。COL1A1の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸dsRNAであって、前記dsRNAがセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、COL1A1RNA転写物と相補的な領域を含み、かつ、表3または表6に列挙されたアンチセンス配列のうちの1つと3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む、前記dsRNA。TFGβの発現を阻害するための二本鎖リボ核酸dsRNAであって、前記dsRNAがセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖が、配列番号69のヌクレオチド配列と3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含み、かつ前記アンチセンス鎖が、配列番号70の対応するアンチセンスヌクレオチド配列と3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む、前記dsRNA。TFGβの発現を阻害するための二本鎖リボ核酸dsRNAであって、前記dsRNAがセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖が、配列番号91のヌクレオチド配列と3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含み、かつ前記アンチセンス鎖が、配列番号92の対応するアンチセンスヌクレオチド配列と3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む、前記dsRNA。TGFβの発現を阻害するための二本鎖リボ核酸dsRNAであって、前記dsRNAがセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、TGFβRNA転写物と相補的な領域を含み、かつ、表4または表7に列挙されたアンチセンス配列のうちの1つと3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む、前記dsRNA。SMAD2/3の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸dsRNAであって、前記dsRNAがセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖が、配列番号140のヌクレオチド配列と3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含み、かつ前記アンチセンス鎖が、配列番号141の対応するアンチセンスヌクレオチド配列と3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む、前記dsRNA。SMAD2/3の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸dsRNAであって、前記dsRNAがセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、SMAD2/3RNA転写物と相補的な領域を含み、かつ、表5に列挙されたアンチセンス配列のうちの1つと3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む、前記dsRNA。少なくとも1個の修飾ヌクレオチドを含む、請求項1~7のいずれか1項に記載のdsRNA。前記修飾ヌクレオチドの少なくとも1つが、2-O-メチル修飾ヌクレオチド、5-チオリン酸エステル基含有ヌクレオチド、コレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に結合した末端ヌクレオチド、2-デオキシ-2-フルオロ修飾ヌクレオチド、2-デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、2-アミノ修飾ヌクレオチド、2-アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミダートおよび非天然塩基含有ヌクレオチドからなる群より選択される、請求項8に記載のdsRNA。前記相補領域が少なくとも17ヌクレオチド長である、請求項2、5、および7のいずれか1項に記載のdsRNA。前記相補領域が19~21ヌクレオチド長である、請求項2、5、および7のいずれか1項に記載のdsRNA。それぞれの鎖が30ヌクレオチド以下の長さである、請求項1~11のいずれか1項に記載のdsRNA。少なくとも一方の鎖が、少なくとも1ヌクレオチドの3オーバーハングを含む、請求項1~12のいずれか1項に記載のdsRNA。リガンドをさらに含む、請求項1~13のいずれか1項に記載のdsRNA。前記リガンドが前記dsRNAの前記センス鎖の3末端と複合体化されている、請求項14に記載のdsRNA。前記相補領域が表3または表6のアンチセンス配列のうちの1つからなる、請求項2に記載のdsRNA。表3または表6から選択されるセンス鎖配列からなるセンス鎖と、表3または表6から選択されるアンチセンス配列からなるアンチセンス鎖とを含む、請求項2に記載のdsRNA。前記相補領域が表4または表7のアンチセンス配列の1つからなる、請求項5に記載のdsRNA。表4または表7から選択されるセンス鎖配列からなるセンス鎖と、表4または表7から選択されるアンチセンス配列からなるアンチセンス鎖とを含む、請求項5に記載のdsRNA。前記相補領域が表5のアンチセンス配列の1つからなる、請求項7に記載のdsRNA。表5から選択されるセンス鎖配列からなるセンス鎖と、表5から選択されるアンチセンス配列からなるアンチセンス鎖とを含む、請求項7に記載のdsRNA。請求項1~7のいずれか1項に記載のdsRNAを含有する、細胞。請求項1または2に記載のdsRNAを含む、COL1A1遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物。請求項3、4または5に記載のdsRNAを含む、TGFβ遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物。請求項6または7に記載のdsRNAを含む、SMAD2/3遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物。脂質製剤をさらに含む、請求項23~25のいずれか1項に記載の医薬組成物。前記脂質製剤がSNALPまたはXTC製剤である、請求項26に記載の医薬組成物。細胞内のCOL1A1発現を阻害する方法であって、a.請求項1~7のいずれか1項に記載のdsRNAを前記細胞に導入する工程、および、b.工程aで作製された細胞を、COL1A1遺伝子のmRNA転写物が分解されるのに十分な時間にわたり維持し、それによって前記細胞内のCOL1A1遺伝子の発現を阻害する工程を含む、前記方法。前記細胞が肝星細胞である、請求項28に記載の方法。COL1A1発現が少なくとも30阻害される、請求項28または29に記載の方法。肝線維症を治療する方法であって、そのような治療を必要とするヒトに、治療上有効量の請求項1~7のいずれか1項に記載のdsRNAまたは請求項30~34のいずれか1項に記載の医薬組成物を投与する工程を含む、前記方法。前記対象の体重に対して0.01mg/kg~5mg/kgの濃度で前記dsRNAが投与される、請求項40に記載の方法。肝線維症の治療に使用するための、請求項1~7のいずれか1項に記載のdsRNAまたは請求項23~27のいずれか1項に記載の医薬組成物。dsRNAの少なくとも一方の鎖をコードするベクターであって、前記dsRNAが、COL1A1をコードするmRNAの少なくとも一部と相補的な領域を含み、30塩基対以下の長さであり、かつ切断のために前記mRNAを標的とする、前記ベクター。dsRNAの少なくとも一方の鎖をコードするベクターであって、前記dsRNAが、TGFβをコードするmRNAの少なくとも一部と相補的な領域を含み、30塩基対以下の長さであり、かつ切断のために前記mRNAを標的とする、前記ベクター。dsRNAの少なくとも一方の鎖をコードするベクターであって、前記dsRNAが、SMAD2/3をコードするmRNAの少なくとも一部と相補的な領域を含み、30塩基対以下の長さであり、かつ切断のために前記mRNAを標的とする、前記ベクター。前記相補領域が19~21ヌクレオチド長である、請求項34~36のいずれか1項に記載のベクター。請求項34~37のいずれか1項に記載のベクターを含む、細胞。肝線維症を特徴とする慢性肝疾患を治療する方法であって、そのような治療を必要とするヒトに、治療上有効量の請求項1~7のいずれか1項に記載のdsRNAまたは請求項23~27のいずれか1項に記載の医薬組成物を投与する工程を含む、前記方法。肝線維症を特徴とする慢性肝疾患の治療に使用するための、請求項1~7のいずれか1項に記載のdsRNAまたは請求項23~27のいずれか1項に記載の医薬組成物。本発明の詳細な説明本明細書において記載される態様および実施形態は、これに限定されないが、慢性肝疾患に関係がある肝線維症を含む肝疾患および肝線維症の治療および/または予防のための組成物と方法に関連する。その実施形態は、肝臓の損傷中に過剰に産生され、そして、線維症の原因となる細胞外マトリックスECM物質のうちの少なくとも1つが減少する可能性がある場合、肝臓の線維症が、予防されなくても、少なくとも低減する可能性があるという前提を利用している。本明細書において記載される組成物と方法は、関連するECM遺伝子とまた線維形成のプロセス中に肝星細胞HSCの活性化に関与するシグナル伝達分子、例えばTGF-βおよびSMAD2/3の遺伝子発現のRNA干渉に基づく。二本鎖RNA分子dsRNAがRNA干渉RNAiとして知られるよく保存された調節機構で遺伝子発現を妨げることが示されている。国際公開第WO99/32619号Fireらは、エレガンス線虫Caenorhabditiselegansで遺伝子の発現を阻害するために少なくとも25ヌクレオチド長のdsRNAを使用することを開示した。植物例えば、Waterhouseらの国際公開第WO99/53050号、およびHeifetzらの国際公開第WO99/61631号を参照のこと、ショウジョウバエ例えば、YangDetalCurrBiol1011911200を参照のこと、および哺乳類Limmerの国際公開第WO00/44895号、およびKreutzerらの独国特許第10100586.5号を参照のことを含む他の生物でもdsRNAは標的RNAを分解することが示されている。この天然の機構は、今では遺伝子の異常な、または、望まれない調節を原因とする疾患を治療するための新しい種類の医薬の開発の焦点となっている。慢性肝疾患症状の間に肝臓での線維症の原因となる1つのそのようなECM成分はコラーゲン1A1COL1A1である。本発明者らは、本明細書において記載されるように、インビボでのHSCへのsiRNAの脂質ナノ粒子LNP介在性送達が、四塩化炭素CCl4誘発性マウス肝臓傷害モデルのHSCにおけるCOL1A1発現をかなり低減させたことを示す図2~3。CCl4処理の後に、カチオン性脂質C12-200PNAS20101071864を含むLNP中に製剤されたsiRNAを静脈内注射により投与した。HSC特異的な標的であるCOL1A1の発現のサイレンシングにより、HSCへの効果的なsiRNA送達が実証された。COL1A1ノックダウンはおよそ0.1mg/kgのIC50を有すると共に用量依存的であった図4~5。本発明者らは、さらに驚くべきことに、複数回6回の肝臓損傷を39日の期間にわたって受けた慢性肝疾患のマウスモデルにおいて、本明細書において記載されるCOL1A1siRNA製剤を用いてCOL1A1発現の効果的で著しい減少が達成されることもできることを示した図13。線維形成のプロセス中にHSCの活性化に関与するシグナル伝達分子には、TGF-βとSMAD2/3が含まれるがこれらに限定されない。TGF-βとSMAD2/3を特異的に標的とするsiRNAのLNP介在性送達がTGF-βとSMAD2/3のインビトロでの発現を著しく低減させることを本発明者らは示す図9~10。肝臓でSMAD2/3を特異的に標的とするsiRNAのLNP介在性送達が、四塩化炭素CCl4誘発性マウス肝臓傷害モデルでのSMAD2/3とCOL1A1の発現を著しく低減させることを本発明者らはさらに示す図11~12。線維症は、慢性肝疾患を含む多くの慢性器官不全疾患に共通の病理上の特色である。傷害の後にネクローシス死細胞が、マトリックス産生細胞を刺激するサイトカインのようなメディエーターを分泌する炎症細胞の反応を誘起する。基本的に、損傷を受けた肝臓細胞は物質例えば、コラーゲン類を細胞外のマトリックスに分泌するHSCを活性化する。ECMでの不適切なコラーゲンの沈着が線維症の特徴であり、それは発病過程の後期で生じる。線維症を止めることで肝臓の機能を安定化することができ、移植までの時間を延期し、または生存期間の延長をもたらす。線維症の生物学は非常によく理解されている。HSCは肝線維症の発病において中心的な役割を果たし、慢性肝疾患において静止した状態のHSCから線維形成性筋線維芽細胞に分化転換する。それはTGF-β駆動型プロセスであり、SMAD2とSMAD3がTGFβシグナル伝達の中間物として機能する。TGF-βは直接的に、および、間接的に作用するが、それはこのプロセスの重要なメディエーターである。肝線維症の治療および/または予防の1つの方法は、HSCの増殖を抑制すること、および/または、HSCのアポトーシスを促進することである。別の方法は、HSCがコラーゲンのようなECM成分を産生し、肝臓細胞のECMに分泌して線維性の塊を形成することを阻害することである。COL1A1は、通常、肝臓に非常に低いレベルで存在するが、肝臓への損傷の後に活性化されたHSCによって発現が上昇し、そして、産生される。COL1A1、TGFβ、SMAD2およびSMAD3などのTGFβシグナル伝達中間物ならびにCOL1A1の過剰発現に寄与するその他のタンパク質/因子の発現をRNAiで阻害することが、病因に無関係に肝線維症の治療に妥当であり得る。したがって、本明細書において記載される態様および実施形態は、細胞または哺乳類においてCOL1A1遺伝子、TGFβ遺伝子および/またはSMAD2/3遺伝子の発現を阻害するための、COL1A1遺伝子、TGFβ遺伝子および/またはSMAD2/3遺伝子をそれぞれ標的とするiRNAとそれらを用いる方法を含む。COL1A1遺伝子、TGFβ遺伝子および/またはSMAD2/3遺伝子の発現を阻害することにより肝線維症を治療および/または予防するための組成物および方法もまた本明細書において提供される。iRNAはRNA干渉RNAiとして知られるプロセスによるmRNAの配列特異的な分解を目的とする。前記態様の1つの実施形態では、COL1A1の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸dsRNAであって、前記dsRNAがセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖が、配列番号53のヌクレオチド配列と3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含み、かつ前記アンチセンス鎖が、配列番号54のヌクレオチド配列と3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む前記二本鎖リボ核酸dsRNAが、本明細書において提供される。前記態様の別の実施形態では、TGFβの発現を阻害するためのdsRNAであって、前記dsRNAがセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖が、配列番号69のヌクレオチド配列と3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含み、かつ前記アンチセンス鎖が、配列番号70のヌクレオチド配列と3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む前記dsRNAが、本明細書において提供される。前記態様の別の実施形態では、TGFβの発現を阻害するためのdsRNAであって、前記dsRNAがセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖が、配列番号91のヌクレオチド配列と3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含み、かつ前記アンチセンス鎖が、配列番号92のヌクレオチド配列と3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む前記dsRNAが、本明細書において提供される。前記態様の別の実施形態では、SMAD2/3の発現を阻害するためのdsRNAであって、前記dsRNAがセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖が、配列番号140のヌクレオチド配列と3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含み、かつ前記アンチセンス鎖が、配列番号141のヌクレオチド配列と3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む前記dsRNAが、本明細書において提供される。本明細書に記載される態様のいくつかの実施形態では、前記iRNAは、配列番号5341100-b1Dと配列番号5441101-b1DのRNA配列ペアAD-21349-b1、配列番号6942861と配列番号7042862のRNA配列ペアAD-22138、配列番号9142883と配列番号9242884のRNA配列ペアAD-22149および/または配列番号14040322-b1と配列番号14140323-b1のRNA配列ペアAD-20916-b1を含むdsRNAである。いくつかの実施形態では、前記iRNAの配列は、表3~7に見出される配列識別子によって特定される配列を含む。表3~7はセンス鎖と対応するアンチセンス鎖の配列識別子配列番号を含む。表3の各列配列番号1~配列番号62は、本明細書において記載される組成物と方法で用いられるCOL1A1を標的とする2つの別々のiRNA、すなわち、センス鎖配列番号1~配列番号62のうちの奇数番号の配列識別子と対応するアンチセンス鎖配列番号1~配列番号62のうちの偶数番号の配列識別子の2つの別々のペアを特定する。同様に、表4の各列配列番号63~配列番号130は、本明細書において記載される組成物と方法で用いられるTGF-βを標的とする2つの別々のiRNA、すなわち、センス鎖配列番号63~配列番号130のうちの奇数番号の配列識別子と対応するアンチセンス鎖配列番号63~配列番号130のうちの偶数番号の配列識別子の2つの別々のペアを特定する。表5の各列配列番号132~配列番号167は、本明細書において記載される組成物と方法で用いられるSMAD2/3を標的とする2つの別々のiRNA、すなわち、センス鎖配列番号132~配列番号167のうちの奇数番号の配列識別子と対応するアンチセンス鎖配列番号132~配列番号167のうちの偶数番号の配列識別子の2つの別々のペアを特定する。表6の各列配列番号185~配列番号2792は、本明細書において記載される組成物と方法で用いられるCOL1A1を標的とする2つの別々のiRNA、すなわち、センス鎖配列番号185~配列番号2792のうちの奇数番号の配列識別子と対応するアンチセンス鎖配列番号185~配列番号2792のうちの偶数番号の配列識別子の2つの別々のペアを特定する。表7の各列配列番号2793~配列番号2860は、本明細書において記載される組成物と方法で用いられるSMAD2/3を標的とする2つの別々のiRNA、すなわち、センス鎖配列番号2793~配列番号2860のうちの奇数番号の配列識別子と対応するアンチセンス鎖配列番号2793~配列番号2860のうちの偶数番号の配列識別子の2つの別々のペアを特定する。したがって、いくつかの実施形態では、iRNAは表3~7に記載され、そして、本明細書において提供される配列識別子配列番号によって特定されるようなRNA配列ペアセンス鎖と対応するアンチセンス鎖の二重鎖またはセンス鎖と対応するアンチセンス鎖を含むdsRNAである。本明細書において取り上げられる組成物のiRNAは、30ヌクレオチド以下の長さの、すなわち、15~30ヌクレオチドの長さの、一般的には19~24ヌクレオチドの長さの領域であって、COL1A1遺伝子、TGFβ遺伝子および/またはSMAD2/3遺伝子のmRNA転写物の少なくとも一部と実質的に相補的である領域を有するRNA鎖アンチセンス鎖を含む。これらのiRNAの使用により、肝臓でのCOL1A1の発現または過剰発現に関係する線維形成のプロセスに関連があるとされる遺伝子のmRNAを標的とした分解が可能になる。特に非常に低用量のCOL1A1、TGFβおよび/またはSMAD2/3のiRNAが特異的に、および、効率的にRNAiを仲介することができ、それぞれ、COL1A1遺伝子、TGFβ遺伝子および/またはSMAD2/3遺伝子の発現を著しく阻害することになる。細胞ベースの試験およびインビボモデル系を用いて、本発明者らは、COL1A1、TGFβおよび/またはSMAD2/3を標的とするiRNAが特異的に、および、効率的にRNAiを仲介することができ、各遺伝子の発現を著しく阻害することになることを示している。本発明者らはまた驚くことに、反復性肝臓傷害または慢性肝臓傷害の条件でのCOL1A1発現の著しい低減を仲介するために、COL1A1を標的とするiRNAを用いることができることを発見している。また、本発明者らは、間接的にCOL1A1の発現を阻害することになるSMAD2/3の発現の阻害をSMAD2/3のRNAiが仲介することを示す。したがって、これらのiRNAを含む方法と組成物は、直接的な、または、間接的なCOL1A1生産の下方調節による肝疾患および/または肝線維症の治療および/または予防に有用である。以下の詳細な説明は、COL1A1遺伝子、TGFβ遺伝子および/またはSMAD2/3遺伝子の発現を阻害するためのiRNAを含む組成物の製造法および使用法ならびにCOL1A1の発現または過剰発現を原因とする肝線維症を特徴とする肝疾患を治療および/または予防し、可能であれば反転させる組成物および方法を開示する。本明細書において取り上げられる組成物の実施形態はまた、30ヌクレオチド以下の長さであり、一般的には19~24ヌクレオチドの長さであり、COL1A1遺伝子、TGFβ遺伝子またはSMAD2/3遺伝子のRNA転写物の少なくとも一部と実質的に相補的な領域を有するアンチセンス鎖を持つiRNAを含む。本明細書において取り上げられる医薬組成物の実施形態は、30ヌクレオチド以下の長さであり、一般的には19~24ヌクレオチドの長さであり、COL1A1遺伝子、TGFβ遺伝子および/またはSMAD2/3遺伝子のRNA転写物の少なくとも一部と実質的に相補的な領域を有するアンチセンス鎖を持つiRNAを薬学的に許容可能な担体と共に含む。したがって、いくつかの態様において、COL1A1iRNA、TGFβiRNAおよび/またはSMAD2/3iRNAおよび薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物、COL1A1遺伝子、TGFβ遺伝子、SMAD2遺伝子および/またはSMAD3遺伝子の発現を阻害する前記組成物の使用方法、ならびにCOL1A1遺伝子の過剰発現を原因とする肝線維症を治療および/または予防し、可能であれば反転させるために前記医薬組成物を使用する方法が本発明において取り上げられる。1つの実施形態では、前記医薬組成物は1つより多いiRNAタイプ、すなわち、1つより多い遺伝子標的を標的とするiRNAを含む。例えば、前記医薬組成物はCOL1A1iRNAとTGFβiRNAの組合せ、COL1A1iRNAとSMAD2/3iRNAの組合せ、またはCOL1A1iRNA、TGFβiRNAおよびSMAD2/3iRNAの組合せを含む。1つの実施形態では、ビタミンA結合リポソームを用いて前記iRNAを送達する。肝臓中のHSCは循環系からビタミンAを取り込み、そして、それを貯蔵する。ビタミンA結合リポソームは、iRNAがビタミンA捕捉性HSCを特異的に標的とするように機能する。1つの実施形態では、本明細書において記載されるiRNAの送達用の前記脂質ナノ粒子LNP製剤は、LNPカプセル化iRNAがビタミンA捕捉性HSCを標的とするようにビタミンAと結合させられる。いくつかの実施形態では、本明細書において記載される前記医薬組成物および/または治療法は、コラーゲン特異的シャペロンであるヒートショックプロテイン47HSP47を標的とする追加のiRNAをさらに含む。Sato,Y.ら2008NatureBiotechnology26431442は、siRNA含有ビタミンA結合リポソームによるHSP47の発現阻害が、致死量のジメチルニトロソアミンで処理されたラットにおいてほぼ完全に肝線維症を解決し、そして、生存期間を延長させることを示した。I.定義便宜上、本明細書、実施例および添付の請求項で使用されるある用語および言い回しの意味が以下に提供される。本明細書の他の部分での用語の使用法とこの節で提供されるその定義の間に明らかな食い違いがある場合、この節での定義が勝るものとする。本明細書において用いられる場合、用語慢性肝疾患または慢性肝疾患状態は、肝臓が長期間にわたって反復性損傷および/または傷害を受け、結果として線維症および硬変に至る肝臓実質の進行性の破壊と再生のプロセスに入っている病気を意味する。慢性肝疾患は、これらに限定されないが、ウイルス性の原因例えば、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、サイトメガロウイルスCMV、エプスタインバールウイルスEBV、毒性物質および/または薬品の反復使用例えば、アルコール性肝疾患、アミオダロン、メトトレキサート、ニトロフラントイン、代謝性/遺伝性の原因/症状例えば、非アルコール性脂肪肝疾患、血色素症、ウィルソン病および自己免疫疾患例えば、自己免疫性慢性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎を含む様々な病因のうちのどんなものの結果としても生じることができ、または、どんなものとも関係がある。肝疾患または肝疾患状態は、本明細書において用いられる場合、その状態が少なくとも1か月間持続する、または、継続するとき、慢性であるとみられるが、いくつかの好ましい実施形態では、慢性を12週間以上の期間として定義することができる例えば、対象の残りの生存期間など。本明細書において用いられる場合、用語線維症は、器官または組織の通常の成分として、というよりはむしろ修復性プロセスまたは反応性プロセスとしての線維性組織の形成を意味する。線維症は、任意の特定の組織での線維芽細胞の蓄積と正常な沈着を超過するコラーゲンの沈着を特徴とする。線維症は、炎症、刺激状態または傷治癒の結果として生じる。本明細書において用いられる場合、線維芽細胞の蓄積およびコラーゲンの沈着と同じ意味で用語線維症を用いる。線維芽細胞は結合組織の細胞であり、全身の結合組織に分散している。線維芽細胞は、I型および/またはIII型コラーゲンを含有する軟質ECMを分泌する。組織に対する傷害への反応で、近くの線維芽細胞がその傷に移動し、増殖し、そして、大量のコラーゲン性細胞外マトリックスを産生する。コラーゲンは、細胞外マトリックスおよび結合組織、軟骨および骨の主な成分であるグリシンとプロリンに富む線維性タンパク質である。コラーゲン分子は、α鎖と呼ばれる鎖の3重らせん構造であり、ロープ様のらせん状に互いに巻き付けられている。コラーゲンにはいくつかの形態または型が存在し、これらのうちで最も一般的なI型は皮膚、腱および骨に見られ、そしてIII型は皮膚、血管および内臓器官に見られる。本明細書において用いられる場合、用語線維形成のプロセスは、線維形成中の線維性組織の一時的、および、進行性の沈着を意味する。本明細書において用いられる場合、用語肝線維症は、肝臓に存在する、および/または、肝臓に生じる線維症を意味する。用語肝線維症hepaticfibrosisおよび肝線維症liverfibrosisは互換的に用いられる。本明細書において用いられる場合、用語硬変は、肝臓が機能性肝臓細胞の喪失を経た肝線維症の後期を意味する。正常な肝臓組織が線維性組織と置換され、その結果、正常な肝臓構造が広範囲に変形する。密集した線維組織が取り巻く再生結節が主な特徴である。線維症瘢痕組織の異常増殖が肝臓の本来の機能を抑制する。硬変は通常、非可逆的であると考えられる。G、C、A、TおよびUは各々一般的にそれぞれグアニン、シトシン、アデニン、チミジンおよびウラシルを塩基として含有するヌクレオチドを表す。しかしながら、用語リボヌクレオチドまたはヌクレオチドはまた、以下にさらに詳細を記すように、修飾ヌクレオチドまたは代用置換部分surrogatereplacementmoietyを意味し得ることが理解されるであろう。当業者は、そのような置換部分を担持するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対形成特性を実質的に変えることなく、グアニン、シトシン、アデニンおよびウラシルを他の部分と置換できることに気付くであろう。例えば、これに限定されないが、その塩基としてイノシンを含むヌクレオチドは、アデニン、シトシンまたはウラシルを含有するヌクレオチドと塩基対形成することができる。それ故に、ウラシル、グアニンまたはアデニンを含有するヌクレオチドは、本明細書において取り上げられるdsRNAのヌクレオチド配列において、例えば、イノシンを含有するヌクレオチドと置換されることができる。別の例では、オリゴヌクレオチド内のどの位置にあるアデニンおよびシトシンもそれぞれグアニンおよびウラシルと置換して標的mRNAとG-Uウォッブル塩基対を形成することができる。そのような置換部分を含有する配列は本明細書において記載される組成物および方法に適切である。本明細書において用いられる場合、用語iRNAは、その用語が本明細書において定義されるようにRNAを含み、そして、RNA転写物のRNA誘導サイレンシング複合体RISC経路による標的切断に介在する因子を意味する。1つの実施形態では、本明細書に記載されるようなiRNAは細胞内でのCOL1A1遺伝子、TGFβ遺伝子またはSMAD2/3遺伝子の発現を阻害する。本明細書において用いられる場合、標的配列は、第1次転写産物のRNAプロセッシングによる産物であるメッセンジャーmRNAを含む、COL1A1遺伝子、TGFβ遺伝子、SMAD2遺伝子またはSMAD3遺伝子の転写中に形成されたmRNA分子のヌクレオチド配列の連続部分を意味する。その配列の標的部分は少なくとも、その部分での、または、その近くでのiRNA指向性切断の基質として働くために十分な長さであろう。例えば、標的配列は一般的に長さが9~36ヌクレオチドまで、例えば、15~30ヌクレオチドであり、その間の部分範囲を含むであろう。非限定的な例として、標的配列は15~30ヌクレオチド、15~26ヌクレオチド、15~23ヌクレオチド、15~22ヌクレオチド、15~21ヌクレオチド、15~20ヌクレオチド、15~19ヌクレオチド、15~18ヌクレオチド、15~17ヌクレオチド、18~30ヌクレオチド、18~26ヌクレオチド、18~23ヌクレオチド、18~22ヌクレオチド、18~21ヌクレオチド、18~20ヌクレオチド、19~30ヌクレオチド、19~26ヌクレオチド、19~23ヌクレオチド、19~22ヌクレオチド、19~21ヌクレオチド、19~20ヌクレオチド、20~30ヌクレオチド、20~26ヌクレオチド、20~25ヌクレオチド、20~24ヌクレオチド、20~23ヌクレオチド、20~22ヌクレオチド、20~21ヌクレオチド、21~30ヌクレオチド、21~26ヌクレオチド、21~25ヌクレオチド、21~24ヌクレオチド、21~23ヌクレオチドまたは21~22ヌクレオチドまでであり得る。本明細書において用いられる場合、用語配列を含む鎖は、標準ヌクレオチド命名法を用いて言及される配列により記載されるヌクレオチド鎖を含むオリゴヌクレオチドを意味する。本明細書において用いられる場合、他に指示されない限り、用語相補的であるは、第2ヌクレオチド配列に対する関係で第1ヌクレオチド配列について記述するために用いられるとき、当業者によって理解されるように、第1ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが一定の条件で第2ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとハイブリダイズして二重鎖構造を形成する能力に当てはまる。そのような条件は、例えば、ストリンジェントな条件である可能性があり、そこでストリンジェントな条件は、400mMNaCl、40mMPIPESpH6.4、1mMEDTA、50oCまたは70°Cで12~16時間とそれに続く洗浄を含み得る。生物内で遭遇し得るような生理学的に妥当な条件などの他の条件を適用することができる。当業者は、ハイブリダイズしたヌクレオチドの最終的な適用に合わせて、2つの配列の相補性を試験するために最も適切な一組の条件を決定することができるであろう。iRNA内の相補的配列、例えば、本明細書に記載されるようなdsRNA内の相補的配列は、第1ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの第2ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドへの一方または両方のヌクレオチド配列の全長にわたる塩基対形成を含む。そのような配列は、本明細書において互いに対して完全に相補的であると言及されることができる。しかしながら、本明細書において第1配列が第2配列に対して実質的に相補的であると言及される場合、その2つの配列は完全に相補的であり得る、または、それらの配列の最終的な適用、例えば、RISC経路による遺伝子発現の阻害に最も妥当な条件でハイブリダイズする能力を保持しながら、30塩基対bpまでの二重鎖にハイブリダイゼーションすると、それらは1つ以上だが、一般的には5つ以下、4つ以下、3つ以下または2つ以下のミスマッチ塩基対を形成することができる。しかしながら、2つのオリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーションして、1つ以上の一本鎖オーバーハングを形成するように設計されている場合、そのようなオーバーハングは、相補性の判定の点でミスマッチとみなされないものとする。例えば、21ヌクレオチドの長さの1つのオリゴヌクレオチドと23ヌクレオチドの長さの別のオリゴヌクレオチドを含むdsRNAであって、長い方のオリゴヌクレオチドが短い方のオリゴヌクレオチドと完全に相補的である21ヌクレオチドの配列を含むdsRNAを本明細書において記載される目的にとって完全に相補的であるとさらに言及することができる。相補的配列は、本明細書において使用される場合、非天然ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドのハイブリダイズする能力についての上記の要件が満たされている限り、非ワトソン‐クリック塩基対ならびに/または非天然ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドから形成される塩基対を含むことができ、または、それらから完全に形成されることができる。そのような非ワトソン‐クリック塩基対には、G:Uウォッブル塩基対合またはフーグスティーン型塩基対合が含まれるがこれらに限定されない。本明細書では、用語相補的である、完全に相補的であるおよび実質的に相補的であるを、それらが使用されている文脈から理解されるように、dsRNAのセンス鎖とアンチセンス鎖の間、または、iRNA薬剤のアンチセンス鎖と標的配列の間の塩基マッチングに関して使用することができる。本明細書において用いられる場合、mRNAの少なくとも一部と実質的に相補的であるポリヌクレオチドは、目的のmRNA例えば、COL1A1をコードするmRNAの連続部分に実質的に相補的であるポリヌクレオチドを意味する。例えば、ポリヌクレオチドは、その配列がCOL1A1をコードするmRNAの非中断部分と実質的に相補的である場合、COL1A1mRNAの少なくとも一部に相補的である。用語二本鎖RNAまたはdsRNAは、本明細書において用いられる場合、標的RNAに対してセンス方向とアンチセンス方向を有すると言及すされるであろう2本の逆平行であり実質的に相補的である核酸鎖を含むハイブリダイズした二重鎖領域を持つRNA分子またはRNA分子複合体を包含するiRNAを意味する。その二重鎖領域は、RISC経路を通した所望の標的RNAの特異的分解を可能にする任意の長さの二重鎖領域であり得るが、それは、典型的には、9塩基対から36塩基対bp、例えば、15~30bpの長さの範囲にあるであろう。9bpと36bpの間の二重鎖を考慮すると、その二重鎖は、この範囲での任意の長さ、例えば、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35または36であることができ、そして、その範囲の中の任意の部分範囲、これらに限定されないが、15~30bp、15~26bp、15~23bp、15~22bp、15~21bp、15~20bp、15~19bp、15~18bp、15~17bp、18~30bp、18~26bp、18~23bp、18~22bp、18~21bp、18~20bp、19~30bp、19~26bp、19~23bp、19~22bp、19~21bp、19~20bp、20~30bp、20~26bp、20~25bp、20~24bp、20~23bp、20~22bp、20~21bp、21~30bp、21~26bp、21~25bp、21~24bp、21~23bpまたは21~22bpの間の部分範囲内の任意の長さであることができる。Dicerおよび類似の酵素によるプロセッシングによって細胞中に生成されたdsRNAは一般に19~22bpの長さである。dsDNAの二重鎖領域の一方の鎖は、標的RNAの領域と実質的に相補的な配列を含む。その二重鎖構造を形成する2本の鎖は、少なくとも1つの自己相補領域を有する1つのRNA分子に由来する可能性があり、または、2つ以上の別々のRNA分子から形成される可能性がある。前記二重鎖領域が1つの分子の2本の鎖から形成される場合、その分子は、二重鎖構造を形成する一方の鎖の3末端とそれの他方の鎖の5末端の間が本明細書においてヘアピンループと称されるヌクレオチドの一本鎖によって分けられた二重鎖領域を持つ可能性がある。そのヘアピンループは少なくとも1個の未対合のヌクレオチドを含むことができ、いくつかの実施形態では、そのヘアピンループは少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも20個、少なくとも23個またはそれ以上の未対合のヌクレオチドを含むことができる。dsRNAの2つの実質的に相補的である鎖が別々のRNA分子からなる場合、それらの分子は必ずというわけではないが、共有結合で結合することができる。前記の2本の鎖がヘアピンループ以外の手段により共有結合で結合される場合、その結合構造はリンカーと称される。上記のようなdsRNAを指すために、用語siRNAもまた本明細書において用いられる。用語RNA分子またはリボ核酸分子は、自然で発現される、または、自然に見いだされるRNA分子だけでなく、本明細書に記載されるような、または、当技術分野において公知であるような1個以上のリボヌクレオチド/リボヌクレオシド類似体または誘導体を含むRNAの類似体および誘導体を包含するということを当業者は認識するであろう。厳密に言うと、リボヌクレオシドはヌクレオシド塩基とリボース糖を含み、そして、リボヌクレオチドは1つ、2つ、または3つのリン酸部分を有するリボヌクレオシドである。しかしながら、用語リボヌクレオシドとリボヌクレオチドは、本明細書において用いられる場合、同義であるとみなされ得る。ヌクレオ塩基構造またはリボース‐リン酸骨格構造において、例えば、以下で本明細書に記載されるように、RNAを修飾することができる。しかしながら、リボヌクレオシド類似体または誘導体を含む分子は二重鎖を形成する能力を保持しなければならない。非限定的な例として、RNA分子は、2-O-メチル修飾ヌクレオシド、5チオリン酸エステル基を含むヌクレオシド、コレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に結合した末端ヌクレオチド、ロックドヌクレオシド、脱塩基ヌクレオシド、2-デオキシ-2-フルオロ修飾ヌクレオシド、2-アミノ-修飾ヌクレオシド、2-アルキル修飾ヌクレオシド、モルホリノヌクレオシド、ホスホラミデートまたは非天然塩基含有ヌクレオシドまたはそれらの任意の組合せが含まれるがこれらに限定されない少なくとも1個の修飾リボヌクレオシドを含むこともできる。あるいは、RNA分子は、dsRNA分子の全長まで少なくとも2個の修飾リボヌクレオシド、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも15個、少なくとも20個またはそれ以上の修飾リボヌクレオシドを含むことができる。RNA分子中のそのような複数の修飾リボヌクレオシドの各々について修飾が同じである必要はない。1つの実施形態では、本明細書において記載される方法および組成物で使用することが考えられる修飾RNAは、要求される二重鎖構造を形成する能力を持ち、RISC経路による標的RNAの特異的分解を可能にする、または、仲介するペプチド核酸PNAである。1つの態様では、修飾リボヌクレオシドはデオキシリボヌクレオシドを含む。そのような例では、iRNA薬剤は、例えば、デオキシヌクレオシドオーバーハング、またはdsRNAの二本鎖部分内の1個以上のデオキシヌクレオシドを含む1個以上のデオキシヌクレオシドを含むことができる。しかしながら、どんな場合にも二本鎖DNA分子は用語iRNAによって包含されないことは自明である。1つの態様では、RNA干渉薬剤は、標的RNAの切断を指向するために標的RNA配列と相互作用する一本鎖RNAを含む。理論にとらわれたくないが、植物および無脊椎動物細胞に導入された長鎖二本鎖RNAは、Dicerとして知られるIII型エンドヌクレアーゼによってsiRNAに分解される。III型リボヌクレアーゼ様酵素であるDicerは、2塩基の3オーバーハングを特徴とする19~23塩基対の短干渉RNAにdsRNAを加工するNature409363。siRNAは次にRNA誘導サイレンシング複合体RISCに組み込まれ、そこで1つ以上のヘリケースがsiRNA二重鎖を巻き戻し、相補的なアンチセンス鎖が標的認識を先導することを可能にするCell107309。適切な標的mRNAに結合すると、RISC中の1つ以上のエンドヌクレアーゼが標的を切断してサイレンシングを誘導するGenesDev15188。したがって、1つの態様において、本発明は、標的遺伝子のサイレンシングをもたらすRISC複合体の形成を促進する一本鎖RNAに関連する。本明細書において用いられる場合、用語ヌクレオチドオーバーハングは、iRNAの二重鎖構造、例えば、dsRNAからはみ出る少なくとも1個の未対合のヌクレオチドを意味する。例えば、dsRNAの一方の鎖の3末端が他方の鎖の5末端を超えて伸びている、またはその逆のとき、ヌクレオチドオーバーハングが存在する。dsRNAは少なくとも1ヌクレオチドのオーバーハングを含むことができ、あるいは、そのオーバーハングは少なくとも2ヌクレオチド、少なくとも3ヌクレオチド、少なくとも4ヌクレオチド、少なくとも5ヌクレオチドまたはそれ以上を含むことができる。ヌクレオチドオーバーハングは、デオキシヌクレオチド/デオキシヌクレオシドを含むヌクレオチド/ヌクレオシド類似体を含むことができ、または、それらからなることができる。前記オーバーハングは、センス鎖上、アンチセンス鎖上、または、それらの任意の組合せであり得る。また、オーバーハングのヌクレオチドは、dsRNAのアンチセンス鎖かセンス鎖のどちらかの5末端、3末端または両端に存在することができる。1つの実施形態では、dsRNAのアンチセンス鎖は、3末端および/または5末端に1~10ヌクレオチドのオーバーハングを持つ。1つの実施形態では、dsRNAのセンス鎖は、3末端および/または5末端に1~10ヌクレオチドのオーバーハングを持つ。別の実施形態では、オーバーハング中の1個以上のヌクレオチドがヌクレオシドチオリン酸と置換される。用語平滑のまたは平滑末端のは、dsRNAに関して本明細書において用いられる場合、dsRNAの所望の末端に未対合のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体が存在しないこと、すなわち、ヌクレオチドオーバーハングが存在しないことを意味する。dsRNAの一端または両端が平滑であり得る。dsRNAの両端が平滑である場合、そのdsRNAは平滑末端型であると言われる。明確にすると、平滑末端型dsRNAは、両端が平滑である、すなわち、その分子のどちらの末端にもヌクレオチドオーバーハングが存在しないdsRNAである。そのような分子は、最も多くの場合、その全長にわたって二本鎖であるであろう。用語アンチセンス鎖またはガイド鎖は、標的配列に実質的に相補的な領域を含むiRNA、例えば、dsRNAの鎖を意味する。本明細書において用いられる場合、用語相補領域は、本明細書において定義されるような配列、例えば標的配列と実質的に相補的なアンチセンス鎖の領域を意味する。相補領域が標的配列と完全には相補的ではない場合、その分子の内部領域または末端領域にミスマッチが存在し得る。一般に、大半の許容されるミスマッチは末端領域、例えば、5末端および/または3末端の5、4、3または2ヌクレオチド内に存在する。用語センス鎖またはパッセンジャー鎖は、本明細書において用いられる場合、その用語が本明細書において定義されるようにアンチセンス鎖の領域と実質的に相補的である領域を含むiRNAの鎖を意味する。本明細書において用いられる場合、1つの実施形態では、用語SNALPは、安定核酸脂質粒子を意味する。SNALPは、iRNAまたはiRNAが転写されるプラスミドのような核酸を含む低減した水性内部をコートする脂質小胞を意味する。SNALPは、例えば、米国特許出願公開第20060240093号、第20070135372号、および国際公開第WO2009082817号に記載される。SNALP製剤の例は本明細書のどこかに記載される。細胞に導入するは、iRNAに言及する際、当業者によって理解されるように、細胞への取り込みもしくは吸収を促進すること、またはもたらすことを意味する。iRNAの吸収または取り込みは、独力の拡散性プロセスまたは能動的細胞性プロセスを通して、または、補助薬剤または装置によって起こり得る。この用語の意味はインビトロの細胞に限定されない。iRNAを生物の部分である細胞に導入することもできる。そのような例では、細胞への導入は生物への送達を含むであろう。例えば、インビボ送達のために、iRNAを組織部位に注入する、または、全身投与することができる。インビボ送達は、米国特許第5,032,401号および米国特許第5,607,677号、および米国出願公開第2005/0281781号に記載されるもののようなβグルカン送達システムによるものでもあり得る。これによりそれらの文献の全体を参照して組み入れる。細胞へのインビトロ導入は、電気穿孔法およびリポフェクションなどの当技術分野において公知の方法を含む。さらなる方法は本明細書において以下に記載される、または、当技術分野において公知である。本明細書において用いられる場合、~の発現を阻害するという句は、本明細書に記載されるようなiRNA組成物で処理された細胞でのCOL1A1遺伝子、TGFβ遺伝子またはSMAD2/3遺伝子の発現の、未処理の細胞でのCOL1A1、TGFβまたはSMAD2/3の発現と比較した少なくとも部分的な低減を意味する。用語サイレンスする、~の発現を阻害する、~の発現を下方調節する、~の発現を抑制するなどは、それらがCOL1A1遺伝子、TGFβ遺伝子および/またはSMAD2/3遺伝子について言及する限りにおいて、COL1A1遺伝子、TGFβ遺伝子および/またはSMAD2/3遺伝子の発現の少なくとも部分的な阻害であって、COL1A1遺伝子、TGFβ遺伝子および/またはSMAD2/3遺伝子を転写し、そして、COL1A1遺伝子、TGFβ遺伝子および/またはSMAD2/3遺伝子の発現が阻害されるように処理されている第1細胞もしくは細胞群から単離され得る、または、そのような細胞もしくは細胞群で検出され得るCOL1A1mRNA、TGFβmRNAおよび/またはSMAD2/3mRNAの、第1細胞もしくは細胞群と実質的に同一であるがそのように処理されていない第2細胞もしくは細胞群対照細胞と比較して低減した量によってそれぞれ明らかとなるような阻害を本明細書において意味する。阻害の程度は通常、次式で表される:。あるいは、COL1A1遺伝子、TGFβ遺伝子またはSMAD2/3遺伝子の発現と機能的に関連しているパラメータ、例えば、COL1A1遺伝子、TGFβ遺伝子またはSMAD2/3遺伝子によりそれぞれコードされるタンパク質の量の、またはサイトカイン生産の喪失もしくは減少などの一定の表現型を示す細胞の数の低下という表現で阻害の程度が表され得る。原則としては、恒常的に、または、ゲノム工学的にのどちらかでCOL1A1、TGFβおよび/またはSMAD2/3を発現する任意の細胞において、そして、任意の適切な測定法によりCOL1A1遺伝子、TGFβ遺伝子および/またはSMAD2/3遺伝子のサイレンシングが判定されることができる。しかしながら、所与のiRNAがCOL1A1遺伝子、TGFβ遺伝子および/またはSMAD2/3遺伝子の発現をある程度阻害するかどうか、および、それによって所与のiRNAが本発明に包含されるかどうか決定するために基準が必要なとき、以下の実施例で提供される測定法がそのような基準として機能するものとする。例えば、ある例では、COL1A1遺伝子、TGFβ遺伝子および/またはSMAD2/3遺伝子の発現は本明細書において取り上げられるiRNAの投与によって少なくとも約10、15、20、25、30、35、40、45または50抑制される。いくつかの実施形態では、COL1A1遺伝子、TGFβ遺伝子および/またはSMAD2/3遺伝子は本明細書において取り上げられるiRNAの投与によって少なくとも約60、70または80抑制される。いくつかの実施形態では、COL1A1遺伝子、TGFβ遺伝子および/またはSMAD2/3遺伝子は本明細書に記載されるようなiRNAの投与によって少なくとも約85、90、95、98、99または以上抑制される。COL1A1、TGFβおよび/またはSMAD2/3の発現に関連して本明細書において用いられる場合、用語治療する、治療などは、COL1A1の過剰発現が介在する肝線維症の除去または緩和を意味する。いくつかの実施形態では、用語治療する、治療などは、肝線維症に関係する少なくとも1つの症状を除去すること、もしくは緩和すること、または、線維形成のプロセスを遅延させること、もしくは反転させることを意味する。肝機能または肝線維症バイオマーカーまたは肝線維症症状に関連して、低減するは、そのようなレベルの統計的に有意な減少を意味する。その減少は、例えば、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40またはそれ以上の減少である可能性があり、そして好ましくは、肝臓不全、慢性肝疾患、肝線維症または硬変が無い個人について正常な範囲内であるとして許容されるレベルまで下がっている。本明細書において用いられる場合、治療上有効量および予防上有効量という句は、COL1A1の過剰発現が介在する肝線維症の治療、予防または管理における治療上の利益をもたらす量を意味する。治療上有効な特定の量は通常の医療従事者によって容易に決定されることができ、そして、それは例えば、患者の病歴および年齢、肝疾患または肝線維症の病期、ならびにCOL1A1の過剰発現を間接的に阻害する他の薬剤ならびに慢性肝臓傷害および線維症に至る遠因を治療する他の薬剤の投与などの当技術分野において公知の因子に依存して変化する可能性がある。本明細書において用いられる場合、医薬組成物は薬学的有効量のiRNAと薬学的に許容可能な担体を含む。本明細書において用いられる場合、薬学的有効量、治療上有効量または単に有効量は、意図した薬学的な、治療上の、または予防上の結果をもたらすのに有効なiRNAのその量に当てはまる。例えば、ある疾病または疾患に関係する測定可能なパラメータが少なくとも10減少するとき所与の臨床治療が有効であると考えられている場合、その疾病または疾患の治療用の薬品の治療上有効量は、そのパラメータで少なくとも10の減少をもたらすために必要な量である。例えば、治療上有効量のCOL1A1遺伝子を標的とするiRNAはCOL1A1タンパク質のレベルを少なくとも10減少することができる。用語薬学的に許容可能な担体は治療薬の投与用の担体を意味する。そのような担体には、生理食塩水、緩衝生理食塩水、ブドウ糖、水、グリセロール、エタノールおよびそれらの組合せが含まれるがこれらに限定されない。その用語は細胞培養培地を特に排除している。経口投与される薬品について、薬学的に許容可能な担体には、不活性希釈剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、甘味剤、着香剤、着色剤および保存剤などの薬学的に許容可能な賦形剤が含まれるがこれらに限定されない。適切な不活性希釈剤には炭酸ナトリウムおよび炭酸カルシウム、リン酸ナトリウムおよびリン酸カルシウム、および乳糖が含まれるが、一方、コーンスターチおよびアルギン酸は適切な崩壊剤である。結合剤はデンプンおよびゼラチンを含むことができるが、一方、滑沢剤は、存在する場合、一般的には、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクであろう。所望により、胃腸管での吸収を遅らせるために錠剤をモノステアリン酸グリセリルなどの物質でコートすることができる。薬品の製剤に含まれる薬剤は本明細書において以下に記載される。本明細書において用いられる場合、線維症を予防する医薬は、統計標本において、未処理対照試料と比較して処理試料で線維症の発生を低減させ、または、未処理対照試料と比較してその疾患または病気の1つ以上の症状の発生を遅らせる、または、重症度を低減させる組成物である。感染は、本明細書において用いられる場合、宿主内で複製する外来生物または外来因子の宿主における存在に起因し得る疾患または病気を意味する。感染は、典型的には感染性生物または因子による正常な粘膜性隔壁または他の組織の隔壁への侵入を含む。感染症を有する対象は、その対象の体内に存在する客観的に測定可能な感染生成物または因子を有する対象である。本明細書において用いられる場合、対象は哺乳類、例えば、イヌ、ウマ、ネコおよび他の非ヒト霊長類である。好ましい実施形態では、対象はヒトである。本明細書において用いられる場合、XXが数である用語LNPXXは、本明細書においてAFXXとも称される。例えば、LNP09はAF09とも称され、そして、LNP12はAF12としても知られ、そのようにも称される。本明細書において用いられる場合、用語含んでいるcomprisingまたは含むcomprisesは、本発明に必須であって、さらに、必須にせよ、必須でないにせよ非特定の要素を包含しやすい組成物、方法およびそれらのそれぞれの成分に関して用いられる。本明細書において用いられる場合、用語~から基本的になるは、所与の実施形態に必要な要素に当てはまる。その用語により、本発明のその実施形態の基本的、および、新規の、または、機能上の特徴に実質的に影響しない要素が存在することが可能になる。用語~からなるは、実施形態のその記述に列挙されていないどんな要素をも排除する、本明細書に記載されるような組成物、方法およびその個々の要素に当てはまる。II.二本鎖リボ核酸dsRNACOL1A1遺伝子、TGFβ遺伝子および/またはSMAD2/3遺伝子の発現を阻害するiRNA薬剤が本明細書において記載される。1つの実施形態では、そのiRNA薬剤は細胞または哺乳類、例えば肝線維症を特徴とする肝疾患を有するヒトにおいてCOL1A1遺伝子、TGFβ遺伝子および/またはSMAD2/3遺伝子の発現をそれぞれ阻害するための二本鎖リボ核酸dsRNA分子であって、COL1A1遺伝子、TGFβ遺伝子またはSMAD2/3遺伝子の発現で形成されるmRNAの少なくとも一部と相補的な相補領域を有するアンチセンス鎖を含むdsRNAであって、そして、その相補領域は30ヌクレオチド以下の長さであり、一般的に19~24ヌクレオチドの長さであるdsRNAであって、COL1A1遺伝子、TGFβ遺伝子またはSMAD2/3遺伝子をそれぞれ発現している細胞と接触すると、COL1A1遺伝子、TGFβ遺伝子および/またはSMAD2/3遺伝子の発現をそれぞれ、例えば、PCRまたは分枝状DNAbDNAベースの方法で測定すると、または、ウェスタンブロットなどのタンパク質ベースの方法で測定すると少なくとも10阻害するdsRNAを含む。bDNAまたはTaqMan測定法などによりCOL1A1mRNAレベルを測定することで、または、例えば、ウェスタンブロッティングまたは流動細胞分析技術を用いた免疫蛍光分析などによりタンパク質レベルを測定することでCOS細胞、HeLa細胞、一次肝細胞、HepG2細胞、一次培養HSCなどの培養細胞での、または、対象由来の生物学的試料でのCOL1A1遺伝子の発現を分析することができる。dsRNAは、そのdsRNAが使用されるであろう条件でハイブリダイズして二重鎖構造を形成するほど相補的な2本のRNA鎖を含む。dsRNAの一方の鎖アンチセンス鎖は、標的配列に実質的に相補的であり、一般的に完全に相補的な相補領域を含む。その標的配列は、COL1A1遺伝子、TGFβ遺伝子またはSMAD2/3遺伝子の発現中に形成されたmRNAの配列に由来することができる。他方の鎖センス鎖はアンチセンス鎖と、その2本の鎖が適切な条件で混合されるとハイブリダイズして二重鎖構造を形成するように、相補的な領域を含む。一般的に、その二重鎖構造は15塩基対と30塩基対の間の長さを含み、より一般的には18塩基対と25塩基対の間の長さを含み、さらにより一般的には19塩基対と24塩基対の間の長さを含み、および最も一般的には19塩基対と21塩基対の間の長さを含む。同様に、前記標的配列に対しての相補領域は15ヌクレオチドと30ヌクレオチドの間の長さを含み、より一般的には18ヌクレオチドと25ヌクレオチドの間の長さを含み、さらにより一般的には19ヌクレオチドと24ヌクレオチドの間の長さを含み、および最も一般的には19ヌクレオチドと21ヌクレオチドの間の長さを含む。いくつかの実施形態では、前記dsRNAは15ヌクレオチドと20ヌクレオチドの間の長さを含み、別の実施形態では、前記dsRNAは25ヌクレオチドと30ヌクレオチドの間の長さを含む。当業者が認識するように、切断の標的とされるRNAの標的領域は、大変頻繁により大きいRNA分子の部分であり、頻繁にはmRNA分子の部分であるであろう。妥当である場合、mRNA標的の一部は、RNAi指向性切断すなわち、RISC経路を通じた切断の基質であるために十分な長さのmRNA標的の連続配列である。9bpほどの二重鎖を有するdsRNAは、いくつかの状況では、RNAi指向性RNA切断に介在することができる。最も頻繁には、標的は少なくとも15ヌクレオチドの長さ、好ましくは15~30ヌクレオチドの長さであるであろう。当業者はまた、前記二重鎖領域、例えば9~36bpの、例えば、15~30bpの二重鎖領域はdsRNAの主な機能部分であることも理解するであろう。したがって、1つの実施形態では、所望のRNAを切断のために標的とする、例えば15~30bpの機能性二重鎖に加工される限り、30bp以上の二重鎖領域を持つRNA分子またはRNA分子複合体はdsRNAである。したがって、当業者は、1つの実施形態では、それで、miRNAはdsRNAであることを認識するであろう。別の実施形態では、dsRNAは天然のmiRNAではない。別の実施形態では、COL1A1、TGFβおよび/またはSMAD2/3の発現を標的とするのに有用なiRNA薬剤はより大きいdsRNAの切断により目的の細胞で生成されることはない。本明細書に記載されるようなdsRNAは1つ以上の一本鎖ヌクレオチドオーバーハングをさらに含むことができる。そのdsRNAを、以下でさらに論じるような当技術分野において公知の標準的な方法、例えば、Biosearch、AppliedBiosystems,Incから市販されているような自動化DNA合成機を使用して合成することができる。1つの実施形態では、COL1A1遺伝子はヒトCOL1A1遺伝子である。別の実施形態では、COL1A1遺伝子はマウスまたはラットのCOL1A1遺伝子である。1つの実施形態では、iRNAはヒトならびに/またはマウスおよびラットのCOL1A1配列と交差反応する。特定の実施形態では、第1配列は表3と表6由来のセンス配列を含むdsRNAのセンス鎖であり、第2配列は表3と表6の対応するアンチセンス配列からなる群より選択される。表3と表6に提供される標的配列中のどこかを標的とする別のdsRNA薬剤をその標的配列と隣接するCOL1A1配列を用いて容易に決定することができる。1つの実施形態では、TGFβ遺伝子はヒトTGFβ遺伝子である。別の実施形態では、TGFβ遺伝子はマウスまたはラットのTGFβ遺伝子である。特定の実施形態では、第1配列は表4と表7由来のセンス配列を含むdsRNAのセンス鎖であり、第2配列は表4と表7の対応するアンチセンス配列からなる群より選択される。表4と表7に提供される標的配列のどこかを標的とする別のdsRNA薬剤をその標的配列と隣接するTGFβ配列を用いて容易に決定することができる。1つの実施形態では、iRNAはヒトならびに/またはマウスおよびラットのTGFβ配列と交差反応する。1つの実施形態では、SMAD2/3遺伝子はヒトSMAD2/3遺伝子である。別の実施形態では、SMAD2/3遺伝子はマウスまたはラットのSMAD2/3遺伝子である。特定の実施形態では、第1配列は表5由来のセンス配列を含むdsRNAのセンス鎖であり、第2配列は表5の対応するアンチセンス配列からなる群より選択される。表5に提供される標的配列のどこかを標的とする別のdsRNA薬剤をその標的配列と隣接するSMAD2/3配列を用いて容易に決定することができる。1つの実施形態では、iRNAはヒトならびに/またはマウスおよびラットのSMAD2/3配列と交差反応する。1つの態様では、dsRNAは少なくとも2つのヌクレオチド配列、すなわち、センス配列およびアンチセンス配列を含み、それによってセンス鎖は表3~7に提供される配列からなる群より選択され、そのセンス鎖の対応するアンチセンス鎖は表3~7より選択されるであろう。この態様では、2つの配列の一方はその2つの配列の他方と相補的であり、その配列の一方がCOL1A1、TGFβおよび/またはSMAD2/3遺伝子の発現で生成されたmRNA配列と実質的に相補的である。したがってこの態様では、dsRNAは、1つのオリゴヌクレオチドが表3~7中のセンス鎖として記載され、第2のオリゴヌクレオチドが表3~7由来のセンス鎖の対応するアンチセンス鎖として記載される2つのオリゴヌクレオチドを含むであろう。本明細書のどこかに記載され、そして、当技術分野において公知であるように、dsRNAの補的な配列は、別々のオリゴヌクレオチド上にあるのではなく1つの核酸分子の自己相補領域として含まれることもできる。当業者は、20塩基対と23塩基対の間の、しかし具体的には21塩基対の二重鎖構造を有するdsRNAがRNA干渉の誘導に特に効果的なものとして認められていることをよく知っている。しかしながら、他の人達は、より短い、または、より長いRNA二重鎖構造が同様に効果的であり得ることを見つけている。上記の実施形態では、表3~7に提供される配列識別子で特定されるオリゴヌクレオチド配列の特質から、本明細書において記載されるdsRNAは最小で21ntの長さを持つ少なくとも1本の鎖を含むことができる。一端または両端でほんのわずかのヌクレオチドを欠く表3~7の配列のうちの1つを有するより短い二重鎖が上記のdsRNAと比較して同様に効果的であり得ることを合理的に予想することができる。それ故に、表3~7の配列のうちの1つに由来する、少なくとも15、16、17、18、19、20またはそれ以上の連続したヌクレオチドの部分配列を有するdsRNAであって、COL1A1遺伝子、TGFβ遺伝子および/またはSMAD2/3遺伝子の発現を5、10、15、20、25または30阻害以下まで阻害するそれらの能力が完全配列を含むdsRNAと異なるdsRNAが本発明に従って考えられる。さらに、表3~7に提供されるRNAは、RISC介在性切断を受けやすいCOL1A1転写物、TGFβ転写物および/またはSMAD2/3転写物中の部位を同定する。したがって、本発明は、そのような配列の1つの内部に標的を定めるiRNAをさらに取り上げる。本明細書において用いられる場合、iRNAがRNA転写物の特定の部位内のどこにおいてもその転写物の切断を促進する場合、そのiRNAはその特定の部位内に標的を定めると言われる。そのようなiRNAは、それぞれCOL1A1遺伝子、TGFβ遺伝子および/またはSMAD2/3遺伝子の中の選択された配列に隣接する領域から抽出された追加のヌクレオチド配列に結合した、表3~7に提供される配列の1つに由来する少なくとも15個の連続したヌクレオチドを全般的に含むであろう。標的配列は一般的には15~30ヌクレオチドの長さであるが、この範囲にある特定の配列の、任意の所与の標的RNAの切断を指向することについての適合性には様々な違いがある。本明細書において提示される様々なソフトウェアパッケージおよびガイドラインが任意の所与の遺伝子標的に最適な標的配列を同定するためのガイダンスを提供するが、標的配列として機能し得るサイズ範囲にある配列を同定するために所与のサイズ非限定的な例として、21ヌクレオチドのウィンドウまたはマスクが標的RNA配列上に字義通りに、または、例えば、インシリコを含む比ゆ的に設置される経験則による方法もとることができる。配列ウィンドウを最初の標的配列の位置の1ヌクレオチド上流に、または、下流に漸次動かすことにより、次に可能性がある標的配列を同定することができ、ついに選択された任意の所与の標的サイズについて可能な配列の完全なセットが特定される。最適に機能する配列を同定するためのこのプロセスにより、同定された配列の組織的な合成および本明細書に記載されるような、または、当技術分野において公知であるような測定法を用いる試験と組み合わされて、iRNA薬剤に標的とされると、標的遺伝子の発現の最も好ましい阻害を仲介するRNA配列が同定されることが可能となる。したがって、例えば、表3~7中の配列識別子により特定される配列は効果的な標的配列を表すが、同等の、または、さらに好ましい阻害特性を有する配列を同定するために、所与の配列の1ヌクレオチド上流または下流に漸次ウィンドウを歩かせることにより阻害効果のさらなる最適化を達成できると考えられる。また、例えば、表3~7中の配列識別子によって特定される任意の配列について、組織的にヌクレオチドを付加するか除去するかのどちらかによってより長い、または、より短い配列を生成し、そして、それらの配列および標的RNAの位置からその上流または下流により長い、または、より短いサイズのウィンドウを歩かせることにより生成した配列を試験することによりさらなる最適化が達成され得るであろうと考えられる。また、この方法を新しい候補標的を作成することに結び付け、当技術分野において公知であるような、または、本明細書に記載されるような阻害測定法でそれらの標的配列に基づきiRNAの有効性を試験することにより、阻害効率がさらに改善することになり得る。さらになお、そのような最適化された配列を、その分子を発現阻害剤としてさらに最適化するために例えば、血清中安定性または循環半減期の増加、熱安定性の増加、経膜送達の向上、特定の場所または細胞種へのターゲティング、サイレンシング経路の酵素との相互作用の増加、エンドソームからの放出の増加など、例えば、本明細書に記載されるような、または、当技術分野において公知であるような修飾ヌクレオチドの導入、オーバーハングの付加またはオーバーハングの変更、または、当技術分野において公知であるような、および/もしくは、本明細書で論じられるようなその他の修飾により調整することができる。本明細書に記載されるようなiRNAは標的配列に対する1つ以上のミスマッチを含有することができる。1つの実施形態では、本明細書に記載されるようなiRNAは3つ以下のミスマッチを含有する。iRNAのアンチセンス鎖が標的配列に対するミスマッチを含有する場合、相補領域の中央にミスマッチ区域が位置しないことが好ましい。iRNAのアンチセンス鎖が標的配列に対するミスマッチを含有する場合、相補領域の5末端または3末端のどちらかから最後の5ヌクレオチド以内にミスマッチが制限されることが好ましい。例えば、COL1A1遺伝子、TGFβ遺伝子および/またはSMAD2/3遺伝子の領域に相補的な23ヌクレオチドiRNA薬剤のRNA鎖について、そのRNA鎖は一般的に中央の13ヌクレオチド内にどんなミスマッチをも含有しない。標的配列に対するミスマッチを含有するiRNAがCOL1A1遺伝子、TGFβ遺伝子および/またはSMAD2/3遺伝子のそれぞれの発現阻害に効果的であるかどうか判定するために、本明細書において記載される方法、または当技術分野において公知の方法を用いることができる。COL1A1遺伝子、TGFβ遺伝子および/またはSMAD2/3遺伝子の発現阻害におけるミスマッチを有するiRNAの有効性を考慮することは、特にCOL1A1遺伝子、TGFβ遺伝子および/またはSMAD2/3遺伝子の中の特定の相補領域が集団内で多型性の配列変化を有すると知られている場合、重要である。1つの実施形態では、dsRNAの少なくとも一端は、1~4ヌクレオチドの、一般的には1または2ヌクレオチドの一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを有する。少なくとも1つのヌクレオチドオーバーハングを有するdsRNAは、その平滑末端型の相対物と比較して予想外に優れた阻害特性を持つ。さらに別の実施形態では、iRNAのRNAは、例えば、dsRNAは、安定性またはその他の有益な特質を向上するために化学的に修飾される。本発明において取り上げられる核酸は、CurrentprotocolsinnucleicacidchemistryBeaucageSLetalJohnWileySonsIncNewYorkNYUSAに記載されるもののような当技術分野においてよく確立されている方法によって合成および/または修飾されることがでる。この文献をこれにより参照して本明細書に組み入れる。修飾には、例えば、a末端修飾、例えば、5末端修飾リン酸化、複合体化、逆結合など、3末端修飾複合体化、DNAヌクレオチド、逆結合など、b塩基修飾、例えば、安定化塩基、不安定化塩基、または広範囲のレパートリーの相手と塩基対合する塩基との置換、塩基の除去脱塩基ヌクレオチドまたは複合体化塩基、c糖修飾例えば、2位または4位でのまたは糖の置換、ならびにdホスホジエステル結合の修飾または置換を含む骨格修飾が含まれる。本明細書において記載される実施形態において有用なRNA化合物の具体例には、修飾された骨格を含む、または、天然のヌクレオシド間結合を含まないRNAが含まれるがこれらに限定されない。修飾された骨格を有するRNAには、中でも、骨格中にリン原子を有さないものが含まれる。本明細書の目的のために、そして、当技術分野においてときどき参照されるように、ヌクレオシド間骨格にリン原子を有さない修飾RNAはオリゴヌクレオシドであると考えることもできる。特定の実施形態では、修飾RNAはヌクレオシド間骨格にリン原子を有するであろう。修飾RNA骨格には、例えば、チオリン酸エステル、キラルチオリン酸エステル、ジチオリン酸エステル、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、3-アルキレンホスホン酸エステルおよびキラルホスホン酸エステルを含むメチルホスホン酸エステルおよび他のアルキルホスホン酸エステル、ホスフィン酸エステル、3-アミノアミド亜リン酸エステルおよびアミノアルキルアミド亜リン酸エステルを含むアミド亜リン酸エステル、チオノアミド亜リン酸エステル、チオノアルキルホスホン酸エステル、チオノアルキルホスホトリエステル、および通常の3-5結合を有するボラノリン酸エステル、これらの2-5結合類似体、およびヌクレオシド単位の隣接対が3-5から5-3に、または、2-5から5-2に結合している逆極性を有するものが含まれる。様々な塩、混合塩、および遊離酸形態もまた含まれる。上記のリン原子含有結合の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第3,687,808号、第4,469,863号、第4,476,301号、第5,023,243号、第5,177,195号、第5,188,897号、第5,264,423号、第5,276,019号、第5,278,302号、第5,286,717号、第5,321,131号、第5,399,676号、第5,405,939号、第5,453,496号、第5,455,233号、第5,466,677号、第5,476,925号、第5,519,126号、第5,536,821号、第5,541,316号、第5,550,111号、第5,563,253号、第5,571,799号、第5,587,361号、第5,625,050号、第6,028,188号、第6,124,445号、第6,160,109号、第6,169,170号、第6,172,209号、第6,239,265号、第6,277,603号、第6,326,199号、第6,346,614号、第6,444,423号、第6,531,590号、第6,534,639号、第6,608,035号、第6,683,167号、第6,858,715号、第6,867,294号、第6,878,805号、第7,015,315号、第7,041,816号、第7,273,933号、第7,321,029号および米国再発行特許第39464号が含まれるがこれらに限定されず、それらの文献の各々を参照して本明細書に組み入れる。その中にリン原子を含まない修飾RNA骨格は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または1つ以上の短鎖ヘテロ原子性もしくは複素環式ヌクレオシド間結合により形成される骨格を有する。これらには、部分的にはヌクレオシドの糖部分から形成されるモルホリノ結合、シロキサン骨格、スルフィド、スルフオキシドおよびスルホン骨格、ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファミン酸エステル骨格、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格、スルホン酸エステルおよびスルホンアミド骨格、アミド骨格ならびに混合N、O、SおよびCH2構成要素部分を有する他のものを持つものが含まれる。上記のオリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第5,034,506号、第5,166,315号、第5,185,444号、第5,214,134号、第5,216,141号、第5,235,033号、第5,64,562号、第5,264,564号、第5,405,938号、第5,434,257号、第5,466,677号、第5,470,967号、第5,489,677号、第5,541,307号、第5,561,225号、第5,596,086号、第5,602,240号、第5,608,046号、第5,610,289号、第5,618,704号、第5,623,070号、第5,663,312号、第5,633,360号、第5,677,437号および第5,677,439号が含まれるがこれらに限定されず、それらの文献の各々を参照して本明細書に組み入れる。他の実施形態では、適切なRNA模倣物をiRNAに使用することが考えられており、そのiRNAではヌクレオチド単位の糖とヌクレオシド間結合の両方、すなわち、骨格が新しい基によって置換される。適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために塩基単位が維持される。1つのそのようなオリゴマー化合物であって、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているRNA模倣物はペプチド核酸PNAと称される。PNA化合物では、RNAの糖骨格がアミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格で置換される。ヌクレオ塩基は維持され、そして、その骨格のアミド部分のアザ窒素原子と直接的に、または、間接的に結合する。PNA化合物の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第5,539,082号、第5,714,331号および第5,719,262号が含まれるがこれらに限定されず、それらの文献の各々を参照して本明細書に組み入れる。PNA化合物についてのさらなる教示を、例えば、NielsenetalScience199125414971500中に見出すことができる。本発明において取り上げられるいくつかの実施形態は、チオリン酸エステル骨格を有するRNAおよびヘテロ原子骨格を有するオリゴヌクレオシド、および特に先に参照した米国特許第5,489,677号の-CH2-NH-CH2-、[メチレンメチルイミノまたはMMI骨格として知られる]-CH2-NCH3-O-CH2-、-CH2-O-NCH3-CH2-、-CH2-NCH3-NCH3-CH2-および-NCH3-CH2-CH2-[式中、本来のホスホジエステル骨格は-O-P-O-CH2-として表される]、および先に参照した米国特許第5,602,240号のアミド骨格を含む。いくつかの実施形態では、本明細書において取り上げられるRNAは、先に参照した米国特許第5,034,506号のモルホリノ骨格構造を有する。修飾RNAはまた、1つ以上の置換糖部分を含有することもできる。iRNA、例えば、本明細書において取り上げられるdsRNAは2位に次のOH基、F基、O-アルキル基、S-アルキル基もしくはN-アルキル基、O-アルケニル基、S-アルケニル基もしくはN-アルケニル基、O-アルキニル基、S-アルキニル基もしくはN-アルキニル基、またはO-アルキル-O-アルキル基のうちの1つを含むことができ、アルキル基、アルケニル基およびアルキニル基は炭素数1~10の置換もしくは非置換アルキル基または炭素数2~10の置換もしくは非置換アルケニル基または置換もしくは非置換アルキニル基であり得る。例示的で適切な修飾には、O[CH2nO]mCH3、OCH2.nOCH3、OCH2nNH2、OCH2nCH3、OCH2nONH2OCH2nON[CH2nCH3]2が含まれ、式中、nとmは1から約10である。他の実施形態では、dsRNAは2位に次のうちの1つを含む:炭素数1~10の低級アルキル基、置換低級アルキル基、アルカリル基、アラルキル基、O-アルカリル基またはO-アラルキル基、SH基、SCH3基、OCN基、Cl基、Br基、CN基、CF3基、OCF3基、SOCH3基、SO2CH3基、ONO2基、NO2基、N3基、NH2基、ヘテロシクロアルキル基、ヘテロシクロアルカリル基、アミノアルキルアミノ基、ポリアルキルアミノ基、置換シリル基、RNA切断基、レポーター基、挿入物質、iRNAの薬物動態特性を向上するための基、またはiRNAの薬力学的特性を向上するための基、および類似の特性を有する他の置換物。いくつかの実施形態では、その修飾には、2メトキシエトキシ基2-O-CH2CH2OCH基3、2-O-2-メトキシエチル基または2-MOE基としても知られるMartinetalHelvChimActa199578486504、すなわち、アルコキシ-アルコキシ基が含まれる。別の例示的な修飾は2-ジメチルアミノオキシエトキシ基、すなわち、2-DMAOE基としても知られ、本明細書において以下の実施例に記載されるOCH22ONCH32基であり、2-O-ジメチルアミノエトキシエチルエトキシエチル基または2-DMAEOE基としてまた当技術分野において公知である2-ジメチルアミノエトキシエトキシ基、すなわち、本明細書において以下の実施例にもまた記載される2-O-CH2-O-CH2-NCH22基である。その他の修飾には、2-メトキシ基2-OCH3、2-アミノプロポキシ基2-OCH2CH2CH2NH2および2-フルオロ基2-Fが含まれる。iRNAのRNAのその他の位置に、特に3末端ヌクレオチドの糖の3位、または2-5結合dsRNA中に、および5末端ヌクレオチドの5位に類似の修飾がなされることもできる。iRNAは、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分のような糖模倣物を有することもできる。そのような修飾糖構造の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第4,981,957号、第5,118,800号、第5,319,080号、第5,359,044号、第5,393,878号、第5,446,137号、第5,466,786号、第5,514,785号、第5,519,134号、第5,567,811号、第5,576,427号、第5,591,722号、第5,597,909号、第5,610,300号、第5,627,053号、第5,639,873号、第5,646,265号、第5,658,873号、第5,670,633号および第5,700,920号が含まれるがこれらに限定されず、それらのうちのあるものが本願によって共通して認知され、それらの文献の各々を参照して本明細書に組み入れる。iRNAは、当技術分野においては単純に塩基としばしば称されるヌクレオ塩基の修飾または置換を含むこともできる。本明細書において用いられる場合、未修飾のまたは天然のヌクレオ塩基はプリン塩基のアデニンAとグアニンG、ならびにピリミジン塩基のチミンT、シトシンCおよびウラシルUを含む。修飾ヌクレオ塩基には、5-メチルシトシン5-me-C、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの6-メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの2-プロピルおよび他のアルキル誘導体、2‐チオウラシル、2-チオチミンおよび2‐チオシトシン、5-ハロウラシルおよび5-ハロシトシン、5-プロピルウラシルおよび5-プロピルシトシン、6-アゾウラシル、6-アゾシトシンおよび6-アゾチミン、5-ウラシルシュードウラシル、4‐チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオールアルキル、8-ヒドロキシルおよび他の8-置換アデニンおよびグアニン、5-ハロ、特に5-ブロモ、5-トリフルオロメチルおよび他の5-置換ウラシルおよびシトシン、7‐メチルグアニンおよび7-メチルアデニン、8-アザグアニンおよび8-アザアデニン、7-デアザグアニンおよび7-ダアザアデニンおよび3-デアザグアニンおよび3-デアザアデニンなどの合成ヌクレオ塩基および天然ヌクレオ塩基が含まれる。さらなるヌクレオ塩基には、米国特許第3,687,808号に開示されるもの、ModifiedNucleosidesinBiochemistryBiotechnologyandMedicineHerdewijnPedWileyVCH2008において開示されるもの、TheConciseEncyclopediaOfPolymerScienceAndEngineeringpages858859KroschwitzJLedJohnWileySons1990において開示されるもの、EnglischetalAngewandteChemieInternationalEdition199130613によって開示されるもの、およびSanghviYSChapter15dsRNAResearchandApplicationspages289302CrookeSTandLebleuBEdCRCPress1993によって開示されるものが含まれる。これらのヌクレオ塩基のうちのあるものは、本発明において取り上げられるオリゴマー化合物の結合親和性を増加させることに特に有用である。これらは5-置換ピリミジン類、6-アザピリミジン類ならびに2-アミノプロピルアデニン、5-プロピニルウラシルおよび5-プロピニルシトシンを含むN-2、N-6およびO-6置換プリン類を含む。5-メチルシトシン置換が核酸二重鎖の安定性を0.6~1.2°C増加させることが示されておりNucleicAcidsResearch33439447、MookORetalMolCancTher6833843、GrunwellerAetalNucleicAcidsResearch3131853193。ロックド核酸ヌクレオチドの調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第6,268,490号、第6,670,461号、第6,794,499号、第6,998,484号、第7,053,207号、第7,084,125号および第7,399,845号が含まれるがこれらに限定されず、それらの文献の各々を参照してその全体を本明細書に組み入れる。本発明において取り上げられるiRNAのRNAの別の修飾は、iRNAの活性、細胞分布または細胞取込を向上させる1つ以上のリガンド、部分または複合物のRNAへの化学的結合を含む。そのような部分には、コレステロール部分LetsingeretalProcNatlAcidSciUSA19898665536556、コール酸ManoharanetalBiorgMedChemLet1994410531060、例えば、ベリル-S-トリチルチオールなどのチオエーテルManoharanetalAnnNYAcadSci1992660306309、ManoharanetalBiorgMedChemLet1993327652770、チオコレステロールOberhauseretalNuclAcidsRes199220533538、例えば、ドデカンジオール残基またはウンデシル残基などの脂肪族鎖SaisonBehmoarasetalEMBOJ19911011111118、KabanovetalFEBSLett1990259327330、SvinarchuketalBiochimie1993754954、例えば、ジ-ヘキサデシル-rac-グリセロールまたは1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-ホスホン酸トリエチルアンモニウムなどのリン脂質ManoharanetalTetrahedronLett19953636513654、SheaetalNuclAcidsRes19901837773783、ポリアミン鎖またはポリエチレングリコール鎖ManoharanetalNucleosidesNucleotides199514969973、またはアダマンタン酢酸ManoharanetalTetrahedronLett19953636513654、パルミチル部分MishraetalBiochimBiophysActa19951264229237、またはオクタデシルアミン部分もしくはヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステロール部分CrookeetalJPharmacolExpTher1996277923937などの脂質部分が含まれるがこれらに限定されない。1つの実施形態では、リガンドが、それが組み込まれるiRNA薬剤の分布、ターゲティングまたは持続時間を変化させる。好ましい実施形態では、リガンドが選択された標的、例えば、分子、細胞または細胞種、細胞区画もしくは器官区画、組織、器官または身体の領域などの区画への、例えば、そのようなリガンドを欠く種と比較して向上した親和性をもたらす。好ましいリガンドは二重鎖核酸の二重鎖対合に関与しないであろう。リガンドには、タンパク質例えば、ヒト血清アルブミンHSA、低密度リポプロテインLDLまたはグロブリン、炭水化物例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリンまたはヒアルロン酸、または脂質などの天然物質が含まれ得る。リガンドはまた組換え分子または、合成ポリアミノ酸などの合成高分子のような合成分子であり得る。ポリアミノ酸の例には、ポリリシンPLL、ポリLアスパラギン酸、ポリL-グルタミン酸、スチレン-マレイン酸無水物共重合体、ポリL-ラクチド-グリコリード共重合体、ジビニルエーテル-マレイン酸無水物共重合体、N-2-ヒドロキシプロピルメタクリルアミド共重合体HMPA、ポリエチレングリコールPEG、ポリビニルアルコールPVA、ポリウレタン、ポリ2-エチルアクリル酸、N-イソプロピルアクリルアミドポリマーまたはポリホスファゼンであるポリアミノ酸が含まれる。ポリアミンの例には、ポリエチレンイミン、ポリリシンPLL、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、シュードペプチド-ポリアミン、ペプチド模倣性ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの4級塩またはαラセンペプチドが含まれる。リガンドはまた、ターゲティング基、例えば、細胞または組織ターゲティング薬剤、例えば、レクチン、糖タンパク質、脂質またはタンパク質、例えば、腎臓細胞などの特定の細胞種に結合する抗体を含むことができる。ターゲティング基はチロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタントタンパク質A、ムチン炭水化物、多価乳糖、多価ガラクトース、N-アセチル-ガラクトサミン、N-アセチル-グルコサミン多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホン酸エステル、ポリグルタメート、ポリアスパルテート、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸、ビタミンB12、ビタミンA、ビオチンまたはRGDペプチドまたはRGDペプチド模倣物であり得る。リガンドの他の例には、色素、インターカレート剤例えば、アクリジン、架橋剤例えば、ソラーレン、マイトマイシンC、ポルフィリンTPPC4、テキサフィリン、サフィリン、多環式芳香族炭化水素例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン、人工エンドヌクレアーゼ例えば、EDTA、親油性分子、例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、1-ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、1,3-ビス-Oヘキサデシルグリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、1,3-プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、O3-オレオイルリトコール酸、O3-オレオイルコレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジンおよびペプチド複合物例えば、アンテナペディアペプチド、Tatペプチド、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、PEG例えば、PEG-40K、MPEG、[MPEG]2、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン例えば、ビオチン、輸送/吸収促進剤例えば、アスピリン、ビタミンE、葉酸、合成リボヌクレアーゼ例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン-イミダゾール複合物、テトラアザマクロサイクルのEu3複合体、ジニトロフェニル、HRPまたはAPが含まれる。リガンドはタンパク質、例えば、糖タンパク質、またはペプチド、例えば、共リガンドに特異的な親和性を有する分子、または抗体、例えば、肝星細胞のような特定の細胞種に結合する抗体であり得る。リガンドにはまた、ホルモンおよびホルモン受容体が含まれ得る。それらにはまた、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補因子、多価乳糖、多価ガラクトース、N-アセチル-ガラクトサミン、N-アセチル-グルコサミン多価マンノース、または多価フコースなどの非ペプチド種も含まれ得る。リガンドは、例えば、リポポリサッカリド、p38MAPキナーゼの活性化因子またはTGFβ受容体であり得る。リガンドは、例えば、細胞の細胞骨格を破壊することにより、例えば、細胞の微小管、マイクロフィラメントおよび/または中間径フィラメントを破壊することにより細胞へのiRNA薬剤の取り込みを増加させることができる薬品などの物質であり得る。その薬品は、例えば、タクソン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノリド、ラトランクリンA、ファロイジン、スウィンホリドA、インダノシンまたはミオセルビンであり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるようなiRNAに結合するリガンドは薬物動態PK修飾因子として作用する。本明細書において用いられる場合、PK修飾因子は、薬物動態修飾因子を意味する。PK修飾因子には、脂質親和体、胆汁酸、ステロイド、リン脂質類似体、ペプチド、タンパク質結合剤、PEG、ビタミンなどが含まれる。例示的なPK修飾因子には、コレステロール、脂肪酸、コール酸、リトコール酸、ジアルキルグリセリド、ジアシルグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、ナプロキセン、イブプロフェン、ビタミンE、ビオチンなどが含まれるがこれらに限定されない。多数のチオリン酸エステル結合を含むオリゴヌクレオチドもまた血清タンパク質に結合することが知られており、したがって、短いオリゴヌクレオチド、例えば、骨格中に複数のチオリン酸エステル結合を含む約5塩基、10塩基、15塩基または20塩基のオリゴヌクレオチドがまたリガンドとして例えばPK修飾因子リガンドとして本発明に従う。さらに、血清成分例えば、血清タンパク質に結合するアプタマーもまた、本明細書において記載される実施形態でのPK修飾リガンドとしての使用に適切である。脂質複合体1つの実施形態では、リガンドまたは複合物は脂質または脂質ベースの分子である。そのような脂質または脂質ベースの分子は、好ましくは、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミンHSAに結合する。HSA結合リガンドが複合体の標的組織、例えば、身体の非腎臓標的組織への分布を可能とする。例えば、標的組織は肝臓の実質細胞を含む肝臓であり得る。HSAに結合できる他の分子もまたリガンドとして使用することができる。例えば、ネプロキシンまたはスピリンを使用することができる。脂質または脂質ベースのリガンドは、a複合体の分解への耐性を増大することができ、b標的細胞または細胞膜へのターゲティングまたは輸送を向上することができ、および/またはc血清タンパク質、例えば、HASへの結合を調節するために用いられ得る。調節する、例えば、複合体の標的組織への結合を制御するために脂質ベースのリガンドを使用することができる。例えば、HSAに強力に結合する脂質または脂質ベースのリガンドほど腎臓にターゲットされる可能性が少なく、したがって、身体から除去される可能性が少なくなるであろう。複合体が腎臓を標的とするためにHSAにあまり強力に結合しない脂質または脂質ベースのリガンドを使用することができる。好ましい実施形態では、前記脂質ベースのリガンドはHSAに結合する。複合体が、好ましくは、非腎臓組織に分布されるように、それが十分な親和性でHSAに結合することが好ましい。しかしながら、HSAリガンド間結合が反転されることができないほど親和性が強くないことが好ましい。別の好ましい実施形態では、複合体が、好ましくは、腎臓に分布するように、前記脂質ベースのリガンドはHSAに弱く結合するか、全く結合しない。腎臓細胞にターゲットする他の部分もまた、脂質ベースのリガンドの代わりに、または、それに加えて使用することができる。別の態様では、前記リガンドは部分、例えば、増殖細胞などの標的細胞によって取り込まれるビタミンである。これらは、例えば、悪性または非悪性タイプの、例えば癌細胞の望まない細胞増殖を特徴とする疾患の治療に特に有用である。ビタミンの例には、ビタミンA、EおよびKが含まれる。ビタミンの他の例には、ビタミンB、例えば、葉酸、B12、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサールまたは肝臓中のHSCのような標的細胞によって取り込まれる他のビタミンもしくは栄養物が含まれる。HSAおよび低密度リポプロテインLDLもまた含まれる。細胞透過性ペプチドおよび薬剤別の態様では、前記リガンドは細胞透過性薬剤であり、好ましくはらせん状細胞透過性薬剤である。好ましくは、その薬剤は両親媒性である。例示的な薬剤は、TATまたはアンテナペディアなどのペプチドである。前記薬剤がペプチドである場合、それは修飾されている可能性があり、ペプチジル模倣物、逆転異性体、非ペプチドまたは偽ペプチド結合、およびD-アミノ酸の使用を含む。前記らせん状薬剤は好ましくはαらせん状薬剤であり、それは好ましくは親油性相および疎油性相を持つ。前記リガンドはペプチドまたはペプチド模倣物であり得る。ペプチド模倣物オリゴペプチド模倣物とも称されるは天然ペプチドに類似する明確な三次元構造に折り畳まれることができる分子である。ペプチドおよびペプチド模倣物のiRNA薬剤への結合が、細胞認識および吸収の向上などによりiRNAの薬物動態分布に影響する可能性がある。前記ペプチドまたはペプチド模倣物部分は約5~50アミノ酸、例えば、約5、10、15、20、25、30、35、40、45または50アミノ酸の長さであり得る。ペプチドまたはペプチド模倣物は、例えば、細胞透過性ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチドまたは例えば、主として、チロシン、トリプトファンまたはフェニルアラニンからなる疎水性ペプチドでありうる。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、拘束ペプチドまたは架橋ペプチドであり得る。別の変形例では、前記ペプチド部分は疎水性膜移行配列MTSを含むことができる。例示的な疎水性MTS含有ペプチドはAAVALLPAVLLALLAP配列番号168のアミノ酸配列を有するRFGFである。疎水性MTSを含有するRFGF類似体例えば、アミノ酸配列AALLPVLLAAP配列番号169はまたターゲティング部分でもあり得る。前記ペプチド部分は細胞膜を越えてペプチド、オリゴヌクレオチドおよびタンパク質を含む大極性分子を運ぶことができる送達ペプチドであり得る。例えば、HIVのTatタンパク質由来の配列GRKKRRQRRRPPQ配列番号170およびショウジョウバエのアンテナペディアタンパク質由来の配列RQIKIWFQNRRMKWKK配列番号171が送達ペプチドとして機能することができることが明らかになっている。ファージディスプレイライブラリーまたは1ビーズ-1化合物OBOCコンビナトリアルライブラリーから同定されたペプチドのように、ペプチドまたはペプチド模倣物はDNAのランダム配列によりコードされることができる。細胞ターゲティング用途のために組み込まれたモノマー単位を介してdsRNA薬剤に繋がれるペプチドまたはペプチド模倣物は、アルギニン-グリシン-アスパラギン酸RGD-ペプチドまたはRGD模倣物である。ペプチド部分は約5アミノ酸から約40アミノ酸までの範囲の長さであり得る。ペプチド部分は、例えば、安定性を増大させるために、または、立体構造特性を方向付けるために構造上の修飾を有することができる。以下に記載される構造上の修飾のいずれも利用することができる。内皮腫瘍細胞または乳腺癌腫瘍細胞などの腫瘍細胞を標的とするためにRGDペプチド部分を使用することができる。RGDペプチドは、肺、腎臓、脾臓または肝臓を含む他の様々な組織の腫瘍へのdsRNA薬剤のターゲティングを容易にすることができる。好ましくは、RGDペプチドは腎臓へのiRNA薬剤のターゲティングを容易にするであろう。前記RGDペプチドは線状または環状であることができ、修飾、例えば、グリコシル化またはメチル化されて特定の組織へのターゲティングを容易にすることができる。例えば、グリコシル化RGDペプチドは、αvβ3を発現する腫瘍細胞へiRNA薬剤を送達することができる。増殖細胞に濃縮されるマーカーを標的にするペプチドを使用することができ、例えば、RGD含有ペプチドおよびペプチド模倣物は、癌細胞、特にαvβ3インテグリンを提示する細胞を標的とすることができる。したがって、RGDペプチド、RGD含有環状ペプチド、D-アミノ酸を含むRGDペプチドならびに合成RGD模倣物を使用することができるであろう。RGDに加えて、αvβ3インテグリンリガンドを標的とする他の部分を使用することができる。一般的に、細胞増殖と血管新生を制御するために、そのようなリガンドを使用することができる。細胞透過性ペプチドは、細胞、例えば、細菌細胞もしくは真菌細胞などの微生物細胞またはヒト細胞などの哺乳類細胞を透過することができる。微生物細胞透過性ペプチドは、例えば、αらせん状線状ペプチド例えば、LL-37またはセロピンP1、ジスルフィド結合含有ペプチド例えば、α-ディフェンシン、β-ディフェンシンまたはバクテネシン、または、ただ1つのもしくは2つの優勢なアミノ酸を含有するペプチド例えば、PR-39またはインドリシジンであり得る。細胞透過性ペプチドはまた核移行シグナルNLSを含むこともできる。例えば、細胞透過性ペプチドは、HIV-1のgp41とSV40ラージT抗原のNLSの融合ペプチドドメインに由来するMPGSimeonietalNuclAcidsRes31271727242003などの二連両親媒性ペプチドであり得る。炭水化物複合物いくつかの実施形態では、本明細書において記載されるiRNAオリゴヌクレオチドは炭水化物複合物をさらに含む。炭水化物複合物は、本明細書に記載されるように、核酸のインビボ送達に好都合であり、ならびに組成物はインビボでの治療上の使用に適切である。本明細書において用いられる場合、炭水化物は、少なくとも6炭素原子を各炭素原子に結合する酸素、窒素もしくはイオウ原子とともに有する1つ以上の線状、分枝状または環状であり得る単糖単位からなる炭水化物それ自体か少なくとも6炭素原子を各炭素原子に結合する酸素、窒素もしくはイオウ原子とともに有する1つ以上の線状、分枝状または環状であり得る単糖単位からなる炭水化物部分をその一部として持つ化合物のどちらかである化合物を意味する。代表的な炭水化物には、糖単糖、二糖、三糖および約4~9単糖単位を含有するオリゴ糖ならびにデンプン、グリコーゲン、セルロースおよびポリサッカリドガムなどのポリサッカリドが含まれる。具体的な単糖には炭素数5の糖および上記のこのましくは炭素数5~8の糖が含まれ、二糖および三糖には好ましくは炭素数5~8の単糖単位を有する糖が含まれる。1つの実施形態では、前記炭水化物複合物は、からなる群、すなわち、式II~式XXIIより選択される。本明細書において記載される実施形態で使用される別の代表的な炭水化物複合物には、XかYの一方がオリゴヌクレオチドであり、他方は水素である、が含まれるがこれに限定されない。いくつかの実施形態では、前記炭水化物複合物は、これらに限定されないが、PK修飾因子、エンドソーム分解性リガンドおよび細胞透過性ペプチドなどの他のリガンドをさらに含む。リンカーいくつかの実施形態では、切断可能または切断不可能であり得る様々なリンカーを用いて本明細書において記載される複合物をiRNAオリゴヌクレオチドに結合することができる。用語リンカーまたは結合基は、化合物の2つの部分を結合する有機部分を意味する。リンカーは、典型的には、直接結合または酸素もしくはイオウなどの原子、NR8、CO、CONH、SO、SO2、SO2NHなどの単位または、これらに限定されないが、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換アルケニル、置換もしくは非置換アルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘテロシクリルアルキニル、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘテロアリールであって、式中、O、S、SO、SO2、NR8、CO、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換ヘテロアリール、置換もしくは非置換複素環が1つ以上のメチレンの中に挿入されるか1つ以上のメチレンがO、S、SO、SO2、NR8、CO、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換ヘテロアリール、置換もしくは非置換複素環で終わりになるものなどの原子鎖を含み、式中、R8は水素、アシル、脂肪族または置換脂肪族である。1つの実施形態では、前記リンカーは1~24原子の間であり、好ましくは4~24原子の間であり、好ましくは6~18原子の間であり、より好ましくは8~18原子の間であり、最も好ましくは8~16原子の間である。切断可能な結合基は、細胞外では十分に安定だが、標的細胞に入ると切断されて、そのリンカーが一つにまとめている2つの部分を放出する。好ましい実施形態では、対象の血液中または例えば、血液または血清中に見られる条件を模倣するために、または、代表するために選択され得る第2基準条件よりも標的細胞中または例えば、細胞内条件を模倣するために、または、代表するために選択され得る第1条件で前記の切断可能な結合基が少なくとも10倍以上、好ましくは少なくとも100倍速く切断される。切断可能な結合基は切断因子、例えば、pH、酸化還元電位または分解性分子の存在に敏感である。一般的に、切断因子は血清または血液中よりも細胞内に広く存在し、または高いレベルもしくは活性で見つかる。そのような分解性因子の例には、例えば、細胞中に存在し、酸化還元で切断可能な結合基を還元により分解することができる酸化還元酵素またはメルカプタンなどの還元剤を含む酸化還元剤であって特定の基質のために選択される、または、基質特異性が無い酸化還元剤、エステラーゼ、酸性環境を作り出すことができる、例えば、pHが5以下になるエンドソームまたは薬剤、一般的な酸、基質特異的であり得るペプチダーゼおよびホスファターゼとして作用することにより酸で切断可能な結合基を加水分解または分解することができる酵素が含まれる。ジスルフィド結合などの切断可能な結合基はpHに敏感であり得る。ヒト血清のpHは7.4であり、一方、平均細胞内pHはわずかに低く、約7.1~7.3の範囲である。エンドソームはより酸性のpHを持ち、5.5~6.0の範囲であり、リソソームは約5.0のさらにより酸性のpHを持つ。いくつかのリンカーは好ましいpHで切断される切断可能な結合基を持ち、それによってリガンドからカチオン性脂質を細胞内で放出し、または細胞の所望の区画に放出するであろう。リンカーは、特定の酵素により切断される切断可能な結合基を含むことができる。リンカーに組み込まれる切断可能な結合基の種類は、標的とされる細胞に依ることができる。例えば、エステル基を含むリンカーを介してカチオン性脂質に肝臓ターゲティングリガンドを連結することができる。肝臓細胞はエステラーゼに富み、したがってそのリンカーはエステラーゼに富んでいない細胞種よりも肝臓細胞でより効率的に切断されるであろう。エステラーゼに富む他の細胞種は肺、腎皮質および精巣の細胞を含む。肝臓細胞および滑膜細胞などのペプチダーゼに富む細胞種を標的とするとき、ペプチド結合を含むリンカーを使用することができる。一般的に、切断可能な結合基候補の適合性を、分解性因子または条件のその結合基候補を切断する能力を試験することで評価することができる。血液中での、または、他の非標的組織と接触するときの切断可能な結合基候補の切断耐性能力をまた試験することも望ましいであろう。したがって、第1条件が標的細胞での切断を示すために選択され、第2条件が他の組織または生物学的液体、例えば、血液もしくは血清での切断を示すために選択される場合、第1条件と第2条件の間での切断に対する相対的感受性を測定することができる。無細胞系、細胞、培養細胞、培養器官もしくは組織、または動物の全身でその評価を行うことができる。無細胞条件または培養条件で最初の評価を行い、動物の全身でのさらなる評価により確認を行うことが有益であり得る。好ましい実施形態では、有用な候補化合物は、血液または血清または、細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロ条件と比較して、細胞中でまたは、細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロ条件で少なくとも2、4、10または100倍速く切断される。酸化還元で切断可能な結合基切断可能な結合基の1つの分類は、還元または酸化されて切断される酸化還元で切断可能な結合基である。還元により切断可能な結合基の例は、ジスルフィド結合基-S-S-である。切断可能な結合基候補が適切な還元により切断可能な結合基であるかどうか決定するために、または、例えば、特定のiRNA部分および特定のターゲティング剤との使用に適切であるかどうか決定するために、本明細書において記載される方法に頼ることができる。例えば、標的細胞などの細胞で観察されるであろう切断速度を模倣する当技術分野において公知の試薬を使用して、ジチオスレイトールDTT、または他の還元剤と保温することにより候補を評価することができる。血液または血清の条件を模倣するように選択されている条件で候補を評価することもできる。好ましい実施形態では、血液では候補化合物が多くとも10切断される。好ましい実施形態では、有用な候補化合物は、血液または、細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロ条件と比較して、細胞中でまたは、細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロ条件で少なくとも2、4、10または100倍速く分解される。候補化合物の切断速度を、細胞内媒体を模倣するように選択された条件での標準的な酵素反応速度測定法を用いて決定することができ、そして、細胞外媒体を模倣するように選択された条件と比較することができる。リン酸エステルベースの切断可能な結合基リン酸エステルベースの切断可能な結合基は、リン酸エステル基を分解する、または、加水分解する因子により切断される。細胞中でリン酸エステル基を切断する因子の例は細胞中のホスファターゼなどの酵素である。リン酸エステルベースの結合基の例は、-O-POORk-O-、-O-PSORk-O-、-O-PSSRk-O-、-S-POORk-O-、-O-POORk-S-、-S-POORk-S-、-O-PSORk-S-、-S-PSORk-O-、-O-PORk-O-、-O-PSRk-O-、-S-PORk-O-、-S-PSRk-O-、-S-PORk-S-、-O-PSRk-S-である。好ましい実施形態は、-O-POOH-O-、-O-PSOH-O-、-O-PSSH-O-、-S-POOH-O-、-O-POOH-S-、-S-POOH-S-、-O-PSOH-S-、-S-PSOH-O-、-O-POH-O-、-O-PSH-O-、-S-POH-O-、-S-PSH-O-、-S-POH-S-、-O-PSH-S-である。好ましい実施形態は-O-POOH-O-である。上記のものと類似する方法を用いて、これらの候補を評価することができる。酸で切断可能な結合基酸で切断可能な結合基は、酸性条件で切断される結合基である。好ましい実施形態では、酸で切断可能な結合基は、約6.5以下例えば、約6.0、5.5、5.0またはそれ以下のpHを持つ酸性環境中で、または、一般的な酸として作用することができる酵素のような因子により切断される。細胞中では、エンドソームおよびリソソームなどの特定の低pHオルガネラが酸で切断可能な結合基に切断環境を提供することができる。酸で切断可能な結合基の例には、ヒドラゾン、エステルおよびアミノ酸のエステルが含まれるがこれらに限定されない。酸切断基は、一般式-C=NN-、COOまたは-OCOを有することができる。好ましい実施形態は、前記エステルアルコキシ基の酸素に結合する炭素がアリール基であるとき、ジメチルペンチル基またはt-ブチル基などの置換アルキル基または第3級アルキル基である。上記のものと類似する方法を用いて、これらの候補を評価することができる。エステルベースの結合基エステルベースの切断可能な結合基は、細胞中のエステラーゼおよびアミダーゼなどの酵素により切断される。エステルベースの切断可能な結合基の例には、アルキレン基、アルケニレン基およびアルキニレン基のエステルが含まれるがこれらに限定されない。エステルの切断可能な結合基は、一般式-COO-または-OCO-を有する。上記のものと類似する方法を用いて、これらの候補を評価することができる。ペプチドベースの結合基ペプチドベースの切断可能な結合基は、細胞中のペプチダーゼおよびプロテアーゼなどの酵素により切断される。ペプチドベースの切断可能な結合基は、オリゴペプチド例えば、ジペプチド、トリペプチドなどおよびポリペプチドを産生するためにアミノ酸間で形成されるペプチド結合である。ペプチドベースの切断可能基はアミド基-CONH-を含まない。アミド基は任意のアルキレン、アルケニレンまたはアルキネレンの間で形成され得る。ペプチド結合は、ペプチドおよびタンパク質を産生するためにアミノ酸間で形成される特別な種類のアミド結合である。ペプチドベースの切断基は、一般的に、ペプチドおよびタンパク質を産生するアミノ酸間で形成されるペプチド結合すなわち、アミド結合に限定され、アミド官能基全体を含んでいるわけではない。ペプチドベースの切断可能な結合基は、一般式NHCHRACONHCHRBCO-配列番号876を有し、式中、RAとRBは2つの隣接するアミノ酸のR基である。上記のものと類似する方法を用いて、これらの候補を評価することができる。リンカーを有する代表的な炭水化物複合物には、XかYの一方がオリゴヌクレオチドであり、他方は水素である、が含まれるがこれらに限定されない。RNA複合体の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第4,828,979号、第4,948,882号、第5,218,105号、第5,525,465号、第5,541,313号、第5,545,730号、第5,552,538号、第5,578,717号、第5,580,731号、第5,591,584号、第5,109,124号、第5,118,802号、第5,138,045号、第5,414,077号、第5,486,603号、第5,512,439号、第5,578,718号、第5,608,046号、第4,587,044号、第4,605,735号、第4,667,025号、第4,762,779号、第4,789,737号、第4,824,941号、第4,835,263号、第4,876,335号、第4,904,582号、第4,958,013号、第5,082,830号、第5,112,963号、第5,214,136号、第5,082,830号、第5,112,963号、第5,214,136号、第5,245,022号、第5,254,469号、第5,258,506号、第5,262,536号、第5,272,250号、第5,292,873号、第5,317,098号、第5,371,241号、第5,391,723号、第5,416,203号、第5,451,463号、第5,510,475号、第5,512,667号、第5,514,785号、第5,565,552号、第5,567,810号、第5,574,142号、第5,585,481号、第5,587,371号、第5,595,726号、第5,597,696号、第5,599,923号、第5,599,928号および第5,688,941号、第6,294,664号、第6,320,017号、第6,576,752号、第6,783,931号、第6,900,297号、第7,037,646号が含まれるがこれらに限定されず、それらの文献の各々を参照して本明細書に組み入れる。所与の化合物中の全ての位置が均一に修飾される必要はなく、そして、実際には、前述の修飾のうちの1つよりも多くのものが1つの化合物中に、またはiRNA内のたった1つのヌクレオシドに組み込まれ得る。本発明はまた、キメラ化合物であるiRNA化合物を含む。キメラiRNA化合物またはキメラ体は、本発明との関連では、iRNA化合物、好ましくはdsRNAであり、それは、それぞれが少なくとも1つのモノマー単位、すなわち、dsRNA化合物の場合ヌクレオチドからなる2つ以上の化学的に別個の領域を含む。これらのiRNAは、ヌクレアーゼ分解に対する向上した耐性、向上した細胞取込および/または標的核酸への向上した結合親和性をそのiRNAにもたらすように修飾されている少なくとも1つの領域を含有することが典型的である。前記iRNAのその他の領域は、RNA:DNAまたはRNA:RNAハイブリッドを切断することができる酵素の基質として機能することができる。例として、RNaseHは、RNA:DNA二重鎖のRNA鎖を切断する細胞性エンドヌクレアーゼである。したがって、RNaseHの活性化によりRNA標的が切断され、それにより遺伝子発現のiRNA阻害の効率を大いに向上する。結果として、キメラdsRNAを使用すると、同じ標的領域にハイブリダイズするチオリン酸エステル結合型デオキシdsRNAと比較して、より短いiRNAで匹敵できる結果をしばしば得ることができる。当技術分野において公知のゲル電気泳動および必要に応じて関連する核酸ハイブリダイゼーション技術によりRNA標的の切断を日常的に検出することができる。ある例では、非リガンド基によりiRNAのRNAを修飾することができる。多数の非リガンド分子がiRNAの活性、細胞分布または細胞取込を向上させるためにiRNAと複合体化されており、そして、そのような複合体化を実施するための方法が科学文献において利用可能である。そのような非リガンド部分には、コレステロールKuboTetalBiochemBiophysResComm20073655461、LetsingeretalProcNatlAcadSciUSA1989866553、コール酸ManoharanetalBioorgMedChemLett199441053、チオエーテル、例えば、ヘキシル-S-トリチルチオールManoharanetalAnnNYAcadSci1992660306、ManoharanetalBioorgMedChemLet199332765、チオコレステロールOberhauseretalNuclAcidsRes199220533、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール残基もしくはウンデシル残基SaisonBehmoarasetalEMBOJ199110111、KabanovetalFEBSLett1990259327、SvinarchuketalBiochimie19937549、リン脂質、例えば、ジ-ヘキサデシル-rac-グリセロールもしくは1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-H-ホスホン酸トリエチルアンモニウムManoharanetalTetrahedronLett1995363651、SheaetalNuclAcidsRes1990183777、ポリアミン鎖もしくはポリエチレングリコール鎖ManoharanetalNucleosidesNucleotides199514969、またはアダマンタン酢酸ManoharanetalTetrahedronLett1995363651、パルミチル部分MishraetalBiochimBiophysActa19951264229、またはオクタデシルアミン部分もしくはヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステロール部分CrookeetalJPharmacolExpTher1996277923などの脂質部分が含まれている。そのようなRNA複合体の調製を教示する代表的な米国特許は先に記載されている。典型的な複合体化プロトコルは配列の1つ以上の位置にアミノリンカーを担持するRNAの合成を含む。次に、適切なカップリング試薬または活性化試薬を使用して、複合体化される分子とそのアミノ基を反応させる。溶液相において、固形支持体になお結合しているRNAを用いるかRNAを切断した後に複合体化反応を実行することができる。典型的には、RNA複合体のHPLCによる精製により、純粋な複合体がもたらされる。iRNAの送達多数の異なる方法で、それを必要とする対象へのiRNAの送達を達成することができる。iRNA、例えば、dsRNAを含む組成物を対象に投与することにより、インビボ送達を直接的に実行することができる。あるいは、iRNAをコードしそのiRNAの発現を指向する1つ以上のベクターを投与することにより、送達を間接的に実行することができる。これらの変形例を以下でさらに論じる。直接的な送達一般的に、核酸分子の任意の送達方法をiRNAとの使用のために適合させることができる例えば、AkhtarSandJulianRL1992TrendsCellBiol2139144および国際公開第WO94/02595号を参照のこと。それら文献の全体を参照して本明細書に組み入れる。しかしながら、分子をインビボでうまく送達するために考慮する重要な3つの因子が存在する:a送達される分子の生物学的安定性、2非特異的効果の予防、および3標的組織での送達された分子の蓄積。例えば、組織非限定的な例としては腫瘍への直接注入もしくは移植などの局所投与により、または、製剤を局所的に投与することにより、iRNAの非特異的効果を最小化することができる。治療部位への局所投与が薬剤の局所濃度を最大化し、別の方法ではその薬剤により害を受ける可能性がある全身組織、または、その薬剤を分解することができる全身組織への薬剤の曝露を限定し、そして、より少ない総投与量のiRNA分子が投与されることを可能とする。いくつかの研究で、iRNAが局所的に投与されるときの遺伝子産物の成功したノックダウンが示されている。例えば、カニクイザルでの硝子体内注入TolentinoMJetalRetina24132138とマウスでの網膜下注入ReichSJetalMolVis9210216によるVEGFdsRNAの眼内送達が両方とも加齢黄斑変性の実験モデルにおける血管新生を妨げることが示された。さらに、マウスでのdsRNAの直接腫瘍内注入が腫瘍体積を減少させPilleJetalMolTher11267274、そして、腫瘍担持マウスの生存時間を延長することができるKimWJetalMolTher14343350、LiSetalMolTher15515523。RNA干渉は、直接注入によるCNSへの局所送達について成功を示しておりDornGetalNucleicAcids32e49、TanPHetalGeneTher125966、MakimuraHetalBMCNeurosci318、ShishkinaGTetalNeuroscience129521528、ThakkerERetalProcNatlAcadSciUSA1011727017275、AkaneyaYetalJNeurophysiol93594602、鼻腔内投与による肺への局所送達について成功を示しているHowardKAetalMolTher14476484、ZhangXetalJBiolChem2791067710684、BitkoVetalNatMed115055。疾患の治療用にiRNAを全身投与するために、RNAを修飾することができ、または、代わりに薬物送達システムを用いて送達することができる。両方の方法が、インビボでのエンドヌクレアーゼおよびエクソヌクレアーゼによるdsRNAの急速な分解を防ぐように作用する。RNAまたは医薬担体の修飾もiRNA組成物の標的組織へのターゲティングを可能にすることができ、そして、望まないオフターゲット効果を避けることができる。コレステロールなどの親油性基への化学的複合体化によりiRNA分子を修飾し、細胞取込を向上させ、そして分解を防ぐことができる。例えば、親油性コレステロール部分と複合体化されたApoB指向性iRNAをマウスに全身注入し、肝臓と空腸の両方でapoBmRNAをノックダウンすることとなったSoutschekJetalNature432173178。アプタマーへのiRNAの複合体化が前立腺癌のマウスモデルでの腫瘍増殖を抑制し、そして、腫瘍退縮に介在することが示されているMcNamaraJOetalNatBiotechnol2410051015。他の実施形態では、ナノ粒子、デンドリマー、ポリマー、リポソームまたはカチオン性送達システムなどの薬物送達システムを使用してiRNAを送達することができる。正に荷電したカチオン性送達システムは負に荷電したiRNA分子の結合を促進し、そしてまた、負に荷電した細胞膜での相互作用を増強して細胞によるiRNAの効率的な取込を可能とする。カチオン性脂質、デンドリマーまたはポリマーはiRNAと結合させられることができるか、iRNAを包むベシクルまたはミセルを形成するように導入されることができるかのどちらかである例えば、KimSHetalJournalofControlledRelease129107116を参照のこと。ベシクルまたはミセルの形成が全身投与される時のiRNAの分解をさらに防ぐ。カチオン性iRNA複合体の作製法および投与法は十分に当業者の能力の範囲内である例えば、SorensenDRetalJMolBiol327761766、VermaUNetalClinCancerRes912911300、ArnoldASetalJHypertens25197205を参照のこと。それらの文献の全体を参照して本明細書に組み入れる。。iRNAの全身送達に有用な薬物送達システムのいくつかの非限定的な例には、DOTAPSorensenDRetal上記、VermaUNetal上記、オリゴフェクタミン、固形核酸脂質粒子ZimmermannTSetalNature441111114、カルジオリピンChienPYetalCancerGeneTher12321328、PalAetalIntJOncol2610871091、ポリエチレンイミンBonnetMEetalPharmRes印刷前の8月16日付電子出版、AignerAJBiomedBiotechnol71659、アルギニン-グリシン-アスパラギン酸RGDペプチドLiuSMolPharm3472487、およびポリアミドアミンTomaliaDAetalBiochemSocTrans356167、YooHetalPharmRes1617991804が含まれる。いくつかの実施形態では、iRNAは全身投与のためにシクロデキストリンと複合体を形成する。iRNAとシクロデキストリンの投与方法と医薬組成物は米国特許第7,427,605号に見つけることができ、その文献の全体を参照して本明細書に組み入れる。ベクターにコードされるdsRNA別の態様では、DNAベクターまたはRNAベクターに挿入された転写単位からCOL1A1遺伝子、TGFβ遺伝子および/またはSMAD2/3遺伝子を標的とするiRNAを発現することができる例えば、CoutureAetalTIG199612510、SkillernAetal国際公開第WO00/22113号、Conrad国際公開第WO00/22114号およびConrad米国特許第6,054,299号を参照のこと。発現は、使用された特定のコンストラクトおよび標的組織または細胞種に応じて一時的でも数時間から数週間の単位持続性でも数週間から数か月またはそれ以上あり得る。組み込み型ベクターまたは非組み込み型ベクターでありうる線状コンストラクト、環状プラスミドまたはウイルスベクターとしてこれらの導入遺伝子を導入することができる。染色体外プラスミドとして遺伝されることを可能にするように、導入遺伝子を構築することもできるGassmannetalProcNatlAcadSciUSA1995921292。発現ベクター上のプロモーターからiRNAの1つの鎖または個々の鎖を転写することができる。2つの別々の鎖が、例えば、dsRNAを生成するように発現されることになっている場合、2つの別々の発現ベクターを例えば、形質移入または感染により標的細胞に共導入することができる。あるいは、dsRNAの各々個々の鎖が、同じ発現プラスミドに局在している複数のプロモーターによって転写されることができる。1つの実施形態では、dsRNAがステムループ構造を持つようにリンカーポリヌクレオチド配列により連結される逆方向反復ポリヌクレオチドとしてdsRNAが発現される。iRNA発現ベクターは一般的にDNAプラスミドまたはウイルスベクターである。本明細書に記載されるようなiRNAの発現用組換えコンストラクトを作製するために、真核細胞に適合性がある発現ベクター、好ましくは脊椎動物細胞に適合性がある発現ベクターを使用することができる。真核細胞発現ベクターは当技術分野において周知であり、多数の商業上の供給元から入手可能である。典型的には、そのようなベクターは、所望の核酸断片の挿入に便利な制限部位を含んで提供される。iRNA発現ベクターの送達は、例えば、静脈内投与または筋肉内投与による、患者から生体外に移植された標的細胞に投与して、その後、患者に再導入することによる、または、所望の標的細胞への導入を可能にする他のあらゆる手段による全身性の送達であり得る。カチオン性脂質担体例えば、オリゴフェクタミンまたは非カチオン性脂質ベース担体例えば、トランジット-TKO商標との複合体として標的細胞にiRNA発現プラスミドを形質移入することができる。本発明は、標的RNAの様々な領域を標的とするiRNA介在性ノックダウンのために1週間以上の期間にわたり、複数回、脂質形質移入することも考えている。様々な公知の方法を用いて、ベクターの宿主への成功する導入をモニターすることができる。例えば、一時的な形質移入を、グリーンフルオレッセントプロテインGFPなどの蛍光マーカーのようなレポーターを用いて示すことができる。特定の環境因子例えば、抗生物質および薬品への耐性、例えば、ハイグロマイシンB耐性を形質移入細胞にもたらすマーカーを用いて生体外での細胞の安定的な形質移入を確実にすることができる。本明細書において記載される方法および組成物とともに利用することができるウイルスベクターシステムには、aアデノウイルスベクター、bレンチウイルスベクター、モロニーマウス白血病ウィルスなどを含むがこれらに限定されないレトロウイルスベクター、cアデノ随伴ウイルスベクター、d単純ヘルペスウイルスベクター、eSV40ベクター、fポリオーマウイルスベクター、gパピローマウイルスベクター、hピコルナウイルスベクター、iオルソポックスなどのポックスウイルスベクター、例えば、ワクシニアウイルスベクターまたは鳥ポックス、例えば、カナリアポックスもしくは家禽ポックス、およびjヘルパー依存性または新世代アデノウイルスが含まれるがこれらに限定されない。複製欠損ウイルスもまた好都合であり得る。様々なベクターが細胞のゲノムに組み込まれる、または、組み込まれないであろう。コンストラクトは、必要に応じて、形質移入のためのウイルス性配列を含むことができる。あるいは、EPVベクターおよびEBVベクターなどのエピソームによる複製が可能であるベクターにコンストラクトを組み込むことができる。iRNAの組換え発現用のコンストラクトは、標的細胞におけるiRNAの発現を確実なものとするために、一般的に調節性配列、例えば、プロモーター、エンハンサーなどを必要とするであろう。ベクターとコンストラクトについて考慮する他の態様は以下でさらに論じられる。iRNAの送達に有用なベクターは、所望の標的細胞または組織でのiRNAの発現に十分な調節性配列プロモーター、エンハンサーなどを含むであろう。恒常性発現または制御性/誘導性発現のどちらかをもたらすように調節性配列を選択することができる。例えば、ある生理学的調節因子、例えば、循環グルコースレベルまたはホルモンに感受性である誘導性調節性配列を用いることによりを参照のこと。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムの正確なパッケージと宿主細胞DNAへの組み込みに必要な構成要素を含有している。核酸の患者への送達を促進する1つ以上のベクターにiRNAをコードする核酸配列をクローンする。レトロウイルスベクターについてのさらなる詳細は、例えば、BoesenetalBiotherapy6291302に見出すことができ、その文献は造血性幹細胞を化学療法に対してより耐性とするためにその幹細胞にmdr1遺伝子を送達するレトロウイルスベクターの使用について記載している。遺伝子治療でのレトロウイルスベクターの使用を説明する他の文献は、ClowesetalJClinInvest93644651、KiemetalBlood8314671473、SalmonsandGunzbergHumanGeneTherapy4129141およびGrossmanandWilsonCurrOpininGeneticsandDevel3110114である。使用が考えられているレンチウイルスベクターには、例えば、米国特許第6,143,520号、第5,665,557号および第5,981,276号に記載されるHIVベースのベクターが含まれており、それらの文献を参照して本明細書に組み入れる。iRNAの送達での使用にアデノウイルスも考えられている。アデノウイルスは、例えば、気道上皮への遺伝子の送達に特に魅力的な媒体である。アデノウイルスは自然界では気道上皮に感染し、そこでそれらは軽い病気を引き起こす。アデノウイルスベースの送達システムの他の標的は肝臓、中枢神経系、内皮細胞および筋肉である。アデノウイルスは非増殖細胞に感染できる利点がある。KozarskyandWilsonCurrentOpinioninGeneticsandDevelopment3499503、RosenfeldetalCell68143155、MastrangelietalJClinInvest91225234、国際公開第WO94/12649号、およびWangetalGeneTherapy2775783NatBiotech2010061010に記載される。アデノ随伴ウイルスAAVベクターの使用も考えられているJVirol6130963101FisherKJetalJVirol70520532、SamulskiRetalJVirol6338223826、米国特許第5,252,479号、米国特許第5,139,941号、国際特許出願第WO94/13788号、および国際特許出願第WO93/24641号に記載され、それらの文献の全開示を参照して本明細書に組み入れる。別の好ましいウイルスベクターは、ワクシニアウイルスなどのポックスウイルス、例えば、アンカラ修飾ウイルスMVAまたはNYVACなどの弱毒化ワクシニア、家禽ポックスまたはカナリアポックスなどの鳥ポックスである。必要に応じて、他のウイルス由来のエンベロープタンパク質もしくは他の表面抗原でベクターをシュードタイプすることにより、または、異なるウイルスのキャプシドタンパク質と置換することにより、ウイルスベクターの指向性を改変することができる。例えば、レンチウイルスベクターを水疱性口内炎ウイルスVSV、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、モコラウイルスなどに由来する表面タンパク質でシュードタイプすることができる。異なるキャプシドタンパク質血清型を発現するようにベクターを改変することにより、AAVベクターが異なる細胞を標的とするようにさせることができる。例えば、RabinowitzJEetalJVirol76791801を参照のこと。その文献の全開示を参照して本明細書に組み入れる。ベクターの医薬製剤は、許容可能な希釈剤中にベクターを含むことができ、または、遺伝子送達用媒体が包埋されている遅放性マトリックスを含むことができる。あるいは、完全な遺伝子送達ベクター、例えば、レトロウイルスベクターを組換え細胞からそのままの形状で産生することができる場合、その医薬製剤は、その遺伝子送達システムを産生する1つ以上の細胞を含むことができる。III.iRNA含有医薬組成物1つの実施形態では、iRNAと薬学的に許容可能な担体を含有する医薬組成物が本明細書において提供される。iRNA含有医薬組成物はCOL1A1遺伝子の過剰発現に関連する肝線維症の治療に有用である。送達モードに基づいてそのような医薬組成物を製剤する。一例は、静脈内IV送達などの非経口送達による全身性投与用に製剤される組成物である。別の例は、例えば連続ポンプ点滴での脳への点滴などによる脳柔組織への直接送達用に製剤される組成物である。本明細書において取り上げられる医薬組成物は、COL1A1遺伝子、TGFβ遺伝子および/またはSMAD2/3遺伝子の発現を阻害するのに十分な投与量で投与される。一般的に、iRNAの適切な用量は、1日に受容者の体重1キログラムあたり0.01~200.0ミリグラムの範囲にあり、概して、1日に体重1キログラムあたり1~50mgの範囲にあるであろう。例えば、1回の投与あたり0.05mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg、40mg/kgまたは50mg/kgの用量でdsRNAを投与することができる。1日に1回前記医薬組成物を投与することができ、または、1日を通して適切な投与間隔で2、3またはそれ以上の分割用量としてiRNAを投与することができ、または、制御放出製剤により連続点滴もしくは連続送達を用いて前記iRNAを投与することさえできる。その場合、各分割用量に含まれるiRNAは、総1日投与量を達成するように対応して少なくなければならない。数日にわたる送達のために、例えば、数日の期間にわたってiRNAの持続性放出をもたらす従来の持続性放出製剤を用いて単位投与量を調合することもできる。持続性放出製剤は当技術分野において周知であり、例えば、本発明の薬剤について用いることができるであろう特定の部位への薬剤の送達に特に有用である。この実施形態では、前記単位投与量は1日用量の対応する倍数を含む。その後の用量が3日以下、4日以下もしくは5日以下の投与間隔で、または、1週間以下、2週間以下、3週間以下もしくは4週間以下の投与間隔で投与されるほど、単一用量のCOL1A1、TGFβおよび/またはSMAD2/3のレベルへの効果が長期にわたることができる。当業者は、対象を効果的に治療するために必要とされる投与量とタイミングが、その対象の疾病または疾患の重症度、以前の治療、一般的な健康状態および/または年齢、ならびに他の存在する疾病を含むがこれらに限定されない一定の要因によって影響されることを認識するであろう。さらに、治療上有効量の組成物を用いる対象の治療には、一回の治療または一連の治療が含まれる可能性がある。本明細書のどこかに記載されるように、従来の方法論を用いて、または、適切な動物モデルを使用するインビボ試験に基づいて、本発明に包含される個々のiRNAの効果的な投与量およびインビボ半減期を推定することができる。様々な原因の肝線維症の研究用に、例えば、四塩化炭素CCl4処理マウス、ジアメチルニトロサミン処理マウスおよびチオアセタミド処理マウスのような多数のマウスモデルが利用可能である。iRNAのインビボ試験ならびに治療上有効量の決定にそのようなモデルを使用することができる。本発明はまた、本発明において取り上げられるiRNA化合物を含む医薬組成物と製剤を包含する。局所処置が望ましいのか、または、全身処置が望ましいのかに応じて、および、治療される領域に応じて多数の方法で本発明の医薬組成物を投与することができる。投与は、局所例えば、経皮パッチによる投与、例えば、噴霧器によるものを含む、粉剤もしくはエアロゾル剤の吸入もしくは吹送による肺性投与、気管支内投与、鼻腔内投与、表皮性および経皮性投与、経口投与または非経口投与であり得る。非経口投与には、静脈内注射もしくは点滴、動脈内注射もしくは点滴、皮下注射もしくは点滴、腹腔内注射もしくは点滴、または筋肉内注射もしくは点滴、例えば、移植した装置による真皮下投与、または、例えば、実質内投与、髄腔内投与もしくは脳室内投与による頭蓋内投与が含まれる。肝臓例えば、肝臓のHSCなどの特定の組織を標的とするように、iRNAを送達することができる。局所投与用の医薬組成物と製剤には、経皮パッチ、軟膏、外用水薬、クリーム剤、ゲル剤、滴剤、座剤、スプレー剤、液剤および粉剤が含まれ得る。従来の医薬担体、水性基剤、粉体基剤、または油性基剤、増粘剤などが必要である、または、望ましい可能性がある。コーティング付きコンドーム、グローブなども有用である可能性がある。適切な局所投与用製剤には、本発明において取り上げられるiRNAが脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤および界面活性剤などの局所送達剤と混合されているものが含まれる。適切な脂質とリポソームには、中性例えば、ジオレオイルホスファチジルDOPEエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンDMPC、ジステアロリホスファチジルコリン、陰性例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロールDMPGおよびカチオン性例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピルDOTAPおよびジオレオイルホスファチジルエタノールアミンDOTMAが含まれる。本発明において取り上げられるiRNAはリポソーム内にカプセル化されることができ、または、リポソーム、特にカチオン性リポソームとの複合体を形成することができる。あるいは、iRNAは脂質、特にカチオン性脂質との複合体になることができる。適切な脂肪酸とエステルには、アラキドン酸、オレイン酸、エイコン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸エステル、トリカプリン酸エステル、モノオレイン、ジラウリン、1-モノカプリン酸グリセリル、1-ドデシルアザシクロヘプタン-2-オン、アシルカルニチン、アシルコリンまたはC1-20アルキルエステル例えば、イソプロピルミリステートIPM、モノグリセリド、ジグリセリドまたはそれらの薬学的に許容可能な塩が含まれるがこれらに限定されない。局所投与用製剤については米国特許第6,747,014号に詳細が記載され、その文献を参照して本明細書に組み入れる。リポソーム性製剤薬品の製剤に研究され、そして、使用されてきている、多くの組織化界面活性剤構造体がマイクロエマルジョンの他に存在する。これらには、モノレイヤー、ミセル、バイレイヤーおよびベシクルが含まれる。リポソームなどのベシクルは、薬物送達の観点からそれらが提供するそれらの特異性と作用期間のために、関心を非常に引きつけている。本発明で用いられる場合、用語リポソームは球状の1つのバイレイヤーまたは複数のバイレイヤーに整えられた両親媒性脂質からなるベシクルを意味する。リポソームは、親油性物質と水性内部から形成される膜を有する単層または多重膜のベシクルである。水性部分は送達される組成物を含む。カチオン性リポソームは、細胞壁と融合することができるという利点を持っている。非カチオン性リポソームは同程度に効率よく細胞壁と融合することはできないが、インビボでマクロファージによって取り込まれる。哺乳類の無傷な皮膚を通過するために、脂質小胞は、適切な経皮勾配の影響下で、各々50nm未満の直径を有する一連の微細な孔を通過していかなくてはならない。したがって、とても変形しやすく、そのような微細な孔を通過していくことができるリポソームを使用することが好ましい。リポソームのさらなる利点には、天然リン脂質から得られるリポソームは生物適合性であり、および、生分解性である、リポソームは広範囲の水溶性薬品および脂質溶解性薬品を取り込むことができる、リポソームはその内部区画中にカプセル化された薬品を代謝と分解から守ることができることが挙げられるRosoffinPharmaceuticalDosageFormsLiebermanRiegerandBanker1988MarcelDekkerIncNewYorkNYvolume1p245。リポソーム製剤の調製における重要な考慮事項は、脂質表面電荷、ベシクルのサイズおよびリポソームの水性内部の容積である。リポソームは、有効成分の作用部位への転移と送達に有用である。リポソーム膜は生物学的膜に構造的に類似しているので、組織にリポソームが適用されると、そのリポソームは細胞膜と融合し始め、リポソームと細胞の融合が進むにつれ、活性薬剤が作用することができるその細胞へリポソームの内容物が移される。リポソーム性製剤は、多くの薬品の送達モードとして、精力的な研究の中心であり続けている。局所投与について、リポソームは他の製剤に勝って、いくつかの利点を提供するという証拠が増えてきている。そのような利点には、投与された薬品の全身性高吸収に関連する副作用の低減、投与された薬品の所望の標的での蓄積の増加、および、親水性および疎水性の両方の広範囲の薬品を皮膚に投与する能力が挙げられる。高分子量DNAを含む薬剤を皮膚に送達するリポソームの能力が、いくつかの報告により詳述されている。鎮痛剤、抗体、ホルモンおよび高分子量DNAを含む化合物が皮膚に投与されてきている。適用の大半は、表皮上部のターゲティングという結果になっている。リポソームは2つの広範な分類に分けられる。カチオン性リポソームは、負に荷電したDNA分子と相互作用して安定的な複合体を形成する正に荷電したリポソームである。正に荷電したDNA/リポソーム複合体は負に荷電した細胞表面に結合し、そして、エンドソームの内部に取り入れられる。エンドソーム内の酸性pHのため、リポソームが破裂し、その内容物をその細胞の細胞質に放出するWangetalBiochemBiophysResCommun1987147980985。pH感受性の、または、負に荷電したリポソームは、DNAと複合体化するというよりもむしろDNAを封入する。DNAとその脂質は同じように帯電しているので、複合体形成よりもむしろ反発が起こる。にもかかわらず、これらのリポソームの水性内部に封入されるDNAもある。培養中の細胞単層にチミジンキナーゼ遺伝子をコードするDNAを送達するためにpH感受性リポソームを用いている。その外来性遺伝子の発現がその標的細胞で検出されたZhouetalJournalofControlledRelease199219269274。1つの主要な種類のリポソーム性組成物には、天然ホスファチジルコリン以外のリン脂質が含まれる。例えば、ジミリストイルホスファチジルコリンDMPCまたはジパルミトイルホスファチジルコリンDPPCから中性のリポソーム組成物を形成することができる。アニオン性リポソーム組成物は一般的にジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成され、一方、アニオン性融合性リポソームは主にジオレオイルホスファチジルエタノールアミンDOPEから形成される。別の種類のリポソーム性組成物は、例えば、大豆PCおよび卵PCなどのホスファチジルコリンPCから形成される。別の種類はリン脂質および/またはホスファチジルコリンおよび/またはコレステロールの混合物から形成される。いくつかの研究によりリポソーム性薬品製剤の皮膚への局所性送達が評価されている。インターフェロン含有リポソームのモルモットの皮膚への適用により、ヘルペスによる皮膚のただれが減少する結果になったが、他の手段による例えば、液剤としての、または、乳剤としてのインターフェロンの送達は効果的ではなかったWeineretalJournalofDrugTargeting19922405410。また、その他の研究によって、水性システムを用いるインターフェロンの投与に対するリポソーム性製剤の一部として投与されたインターフェロンの有効性が試験され、そして、水性投与よりもリポソーム性製剤が優れていると結論されたduPlessisetalAntiviralResearch199218259265。非イオン性リポソームシステム、特に非イオン性界面活性剤とコレステロールを含むシステムも、薬品の皮膚への送達でのそれらの利便性を判定するために検討されている。シクロスポリン-Aをマウスの皮膚の真皮に送達するために、Novasome商標Iジラウリン酸グリセリル/コレステロール/ポリオキシエチレン-10-ステアリルエーテルおよびNovasome商標IIジステアリン酸グリセリル/コレステロール/ポリオキシエチレン-10-ステアリルエーテルを含む非イオン性リポソーム性製剤を使用した。そのような非イオン性リポソームシステムは皮膚の様々な層へのサイクロスポリンAの送置の促進に効果的であることが結果により示されたHuetalSTPPharmaSci19944466。リポソームはまた立体安定化リポソームを含み、その用語は、本明細書において用いられる場合、リポソームに組み入れられると、そのような特別な脂質を欠くリポソームと比較して循環存続期間を向上することになる1つ以上の特別な脂質を含むリポソームを意味する。立体安定化リポソームの例は、リポソームのベシクル形成脂質部分の一部がAモノシアロガングリオシドGM1などの1つ以上の糖脂質を含む、または、BポリエチレングリコールPEG部分などの1つ以上の親水性高分子で誘導体化されているものである。任意の特定の理論に縛られることを望むものではないが、少なくともガングリオシド、スフィンゴミエリンまたはPEG誘導体化脂質を含有する立体安定化リポソームについては、これらの立体安定化リポソームの循環半減期の向上は細網内皮系RESの細胞への取り込みの減少に起因することが当技術分野において考えられているAllenetalFEBSLetters198722342WuetalCancerResearch1993533765。1つ以上の糖脂質を含む様々なリポソームが当技術分野において公知である。PapahadjopoulosらAnnNYAcadSci198750764は、リポソームの血液半減期を向上させるモノシアロガングリオシドGM1、硫酸ガラクトセレブロシドおよびホスファチジルイノシトールの能力を報告した。これらの発見はGabizonらによってProcNatlAcadSciUSA1988856949に詳しく説明された。両方ともAllenらに属する米国特許第4,837,028号および国際公開第WO88/04924号は、1スフィンゴミエリンおよび2ガングリオシドGM1または硫酸ガラクトセレブロシドエステルを含むリポソームを開示する。米国特許第5,543,152号Webbらは、スフィンゴミエリンを含むリポソームを開示する。1,2-sn-ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームは国際公開第WO97/13499号に開示されるLimら。1つ以上の親水性高分子で誘導体化された脂質を含む多数のリポソームおよびそれらの調製方法は当技術分野において公知である。SunamotoらBullChemSocJpn1980532778は、PEG部分を含有する非イオン性界面活性剤2C1215Gを含むリポソームについて説明した。IllumらFEBSLett198416779は、ポリスチレン粒子の高分子性グリコールでの親水性コーティングが血液半減期を非常に向上させることを特に言及した。ポリアルキレングリコール例えば、PEGのカルボキシル基の結合により修飾された合成リン脂質がSearsにより記載されている米国特許第4,426,330号および第4,534,899号。KlibanovらFEBSLett1990268235は、PEGまたはPEGステアレートで誘導体化されたホスファチジルエタノールアミンPEを含むリポソームが血液循環半減期を非常に増加させることを説明した。BlumeらBiochimicaetBiophysicaActa1990102991は、そのような観察を他のPEG-誘導体化リン脂質、例えば、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンDSPEとPEGの組合せから形成されるDSPE-PEGに拡張した。その外部表面に共有結合で結合したPEG部分を有するリポソームが欧州特許第EP0445131B1号およびFisherに属する国際公開第WO90/04384号に記載されている。1~20モルパーセントのPEG誘導体化PEを含有するリポソーム組成物およびその使用方法は、Woodleら米国特許第5,013,556号および第5,356,633号とMartinら米国特許第5,213,804号および欧州特許第EP0496813B1号によって説明されている。多数の他の脂質-高分子複合体を含むリポソームは国際公開第WO91/05545号および米国特許第5,225,212号両方ともMartinらに属するおよび国際公開第WO94/20073号Zalipskyらに開示されている。PEG修飾セラミド脂質を含むリポソームは国際公開第WO96/10391号Choiらに記載されている。米国特許第5,540,935号Miyazakiらおよび米国特許第5,556,948号Tagawaらは、その表面で機能部分によりさらに誘導体化され得るPEG含有リポソームについて記載する。多数の核酸を含むリポソームが当技術分野において公知である。Thierryらに属する国際公開第WO96/40062号は、リポソーム中に高分子量の核酸をカプセル化する方法を開示する。Tagawaらに属する米国特許第5,264,221号はタンパク質結合リポソームを開示し、そのようなリポソームの内容物はdsRNAを含むことができると強く主張する。Rahmanらに属する米国特許第5,665,710号は、リポソーム中にオリゴデオキシヌクレオチドをカプセル化するある方法について記載している。Loveらに属する国際公開第WO97/04787号は、raf遺伝子を標的とするdsRNAを含むリポソームを開示する。トランスファーソームはさらに別の種類のリポソームであり、そして、薬物送達用媒体の魅力的な候補である非常に変形しやすい脂質凝集物である。トランスファーソームは、非常に変形しやすいのでそれ自体よりも小さい孔を容易に通り抜けることが可能な脂質液滴と説明され得る。トランスファーソームはそれが使用される環境に適応することができ、例えば、それらは自己最適化性であり皮膚の孔の形状に適応する、自己修復性であり、断片化することなくそれらの標的に到着することが多く、そして、多くの場合、自己負荷性である。トランスファーソームを作製するために表面エッジ活性化剤、たいていは界面活性剤を標準的なリポソーム性組成物に添加することができる。トランスファーソームは、血清アルブミンを皮膚に送達するために使用されてきている。血清アルブミンのトランスファーソーム介在性送達は血清アルブミン含有液剤の皮下注入と同程度に効果的であることが示されている。マイクロエマルジョンを含む乳剤およびリポソームなどの製剤での広範な応用が界面活性剤に認められる。天然および合成の多種多様な界面活性剤の特性を分類し、そして、等級づけする最も一般的な方法は、親水性/親油性バランスHLBの使用によるものである。親水性基ヘッドとしても知られるの性質が、製剤に使用される様々な界面活性剤を分類するための最も有用な手段を提供するRiegerinPharmaceuticalDosageFormsMarcelDekkerIncNewYorkNY1988p285。界面活性剤分子がイオン化されていない場合、それは非イオン性界面活性剤として分類される。医薬品および化粧品での広範な応用が非イオン性界面活性剤に認められ、そして、非イオン性界面活性剤は広範なpH値にわたって使用することができる。一般的に、それらのHLB値はその構造に応じて2から約18までの範囲である。非イオン性界面活性剤には、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、ショ糖エステルおよびエトキシル化エステルなどの非イオン性エステルが含まれる。脂肪族アルコールエトキシレート、プロポキシル化アルコールおよびエトキシル化/プロポキシル化ブロックポリマーなどの非イオン性アルカノールアミドおよびエーテルもまたこの種類に含まれる。ポリオキシエチレン系界面活性剤は非イオン性界面活性剤類の中で最も普及しているメンバーである。界面活性剤分子が水に溶解または分散しているとき負電荷を持つ場合、その界面活性剤は陰イオン性と分類される。陰イオン性界面活性剤には、石鹸などのカルボキシレート、アシルラクチレート、アミノ酸のアシルアミド、アルキル硫酸エステルおよびエトキシル化アルキル硫酸エステルなどの硫酸エステル、アルキルベンゼンスルホネート、アシルイセチオネート、アシルタウレートおよびスルホサクシネートなどのスルホネート、ならびにホスフェートが含まれる。陰イオン性界面活性剤類の最も重要なメンバーはアルキル硫酸エステルと石鹸である。界面活性剤分子が水に溶解または分散しているとき正電荷を持つ場合、その界面活性剤は陽イオン性と分類される。陽イオン性界面活性剤には、第4級アンモニウム塩およびエトキシル化アミンが含まれる。第4級アンモニウム塩はこの種類で最も使用されるメンバーである。界面活性剤分子が正電荷か負電荷のどちらかを持つ能力を有する場合、その界面活性剤は両性と分類される。両性界面活性剤には、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、N-アルキルベタインおよびホスファチドが含まれる。薬品、製剤および乳剤中での界面活性剤の使用が概説されているRiegerinPharmaceuticalDosageFormsMarcelDekkerIncNewYorkNY1988p285。核酸脂質粒子1つの実施形態では、例えば、SPLP、pSPLP、SNALPまたは他の核酸脂質粒子を形成する脂質製剤中に本発明において取り上げられるCOL1A1、TGFβおよびSMAD2/3のdsRNAを完全にカプセル化する。本明細書において用いられる場合、用語SNALPは、SPLPを含む安定な核酸脂質粒子を意味する。本明細書において用いられる場合、用語SPLPは、脂質小胞内にカプセル化されたプラスミドDNAを含む核酸脂質粒子を意味する。SNALPおよびSPLPは典型的にはカチオン性脂質、非カチオン性脂質、および粒子の凝集を防ぐ脂質例えば、PEG-脂質複合体を含む。SNALPおよびSPLPは静脈内i.v.注入後の循環存続期間の延長を示し、そして、遠位部分例えば、投与部位から物理的に離れている部位に蓄積するので、それらは全身性適用に極めて有用である。SPLPには、国際公開第WO00/03683号に記載されるカプセル化濃縮化剤-核酸複合体を含むpSPLPが包含される。本発明の粒子は典型的には約50nm~約150nm、より典型的には約60nm~約130nm、より典型的には約70nm~約110nm、最も典型的には約70nm~約90nmの平均直径を有し、そして、実質的に非毒性である。さらに、核酸は、本発明の核酸脂質粒子中に存在するとき、水性溶液中でヌクレアーゼによる分解に対して耐性である。核酸脂質粒子およびその調製方法は、例えば、米国特許第5,976,567号、第5,981,501号、第6,534,484号、第6,586,410号、第6,815,432号、および国際公開第WO96/40964号に開示される。1つの実施形態では、脂質対薬品比質量/質量比例えば、脂質対dsRNA比は約1:1から約50:1まで、約1:1から約25:1まで、約3:1から約15:1まで、約4:1から約10:1まで、約5:1から約9:1まで、または約6:1~約9:1の範囲にあるであろう。前記カチオン性脂質は、例えば、N,N-ジオレイル-N,N-ジメチルアンモニウムクロリドDODAC、N,N-ジステアリル-N,N-ジメチルアンモニウムブロミドDDAB、N-I-2,3-ジオレオイルオキシプロピル-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリドDOTAP、N-I-2,3-ジオレイルオキシプロピル-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリドDOTMA、N,N-ジメチル-2,3-ジオレイルオキシプロピルアミンDODMA、1,2-ジリノレイルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパンDLinDMA、1,2-ジリノレニルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパンDLenDMA、1,2-ジリノレイルカルバモイルオキシ-3-ジメチルアミノプロパンDLin-C-DAP、1,2-ジリノレイオキシ-3-ジメチルアミノアセトキシプロパンDLin-DAC、1,2-ジリノレイオキシ-3-モルホリノプロパンDLin-MA、1,2-ジリノレオイル-3-ジメチルアミノプロパンDLinDAP、1,2-ジリノレイルチオ-3-ジメチルアミノプロパンDLin-S-DMA、1-リノレオイル-2-リノレイルオキシ-3-ジメチルアミノプロパンDLin-2-DMAP、1,2-ジリノレイルオキシ-3-トリメチルアミノプロパンクロリド塩DLin-TMA.Cl、1,2-ジリノレオイル-3-トリメチルアミノプロパンクロリド塩DLin-TAP.Cl、1,2-ジリノレイルオキシ-3-N-メチルピペラジノプロパンDLin-MPZ、または3-N,N-ジリノレイルアミノ-1,2-プロパンジオールDLinAP、3-N,N-ジオレイルアミノ-1,2-プロパンジオDOAP、1,2-ジリノレイルオキソ-3-2-N,N-ジメチルアミノエトキシプロパンDLin-EG-DMA、1,2-ジリノレニルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパンDLinDMA、2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノメチル-[1,3]-ジオキソランDLin-K-DMA、またはそれらの類似体、3aR,5s,6aS-N,N-ジメチル-2,2-ジ9Z,12Z-オクタデカ-9,12-ジエニルテトラヒドロ-3aH-シクロペンタ[d][1,3]ジオキソール-5-アミンALN100、6Z,9Z,28Z,31Z-ヘプタトリアコンタ-6,9,28,31-テトラエン-19-イル4-ジメチルアミノブタノエートMC3、1,1-2-4-2-2-ビス2-ヒドロキシドデシルアミノエチル2-ヒドロキシドデシルアミノエチルピペラジン-1-イルエチルアザンジイルジドデカン-2-オールTechG1、またはそれらの混合物であり得る。前記カチオン性脂質は、粒子中に存在する全脂質の約20molから約50molまで、または、約40molを構成することができる。別の実施形態では、脂質-siRNAナノ粒子を調製するために化合物2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノエチル-[1,3]-ジオキソランを使用することができる。2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノエチル-[1,3]-ジオキソランの合成は、2008年10月23日に提出された米国仮特許出願第61/107,998号に記載され、その文献を参照して本明細書に組み入れる。1つの実施形態では、前記脂質-siRNA粒子は、63.0±20nmの粒子サイズと0.027のsiRNA/脂質比で2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノエチル-[1,3]-ジオキソランを40、DSPCを10、コレステロールを40、PEG-C-DOMGを10モルパーセント含む。前記非カチオン性脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリンDSPC、ジオレオイルホスファチジルコリンDOPC、ジパルミトイルホスファチジルコリンDPPC、ジオレオイルホスファチジルグリセロールDOPG、ジパルミトイルホスファチジルグリセロールDPPG、ジオレオイル-ホスファチジルエタノールアミンDOPE、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリンPOPC、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミンPOPE、ジオレオイル-ホスファチジルエタノールアミン4-N-マレイミドメチル-シクロヘキサン-l-カルボキシレートDOPE-mal、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンDPPE、ジミリストイルホスホエタノールアミンDMPE、ジステアロイル-ホスファチジル-エタノールアミンDSPE、16-O-モノメチルPE、16-O-ジメチルPE、18-1トランスPE、1ステアロイル-2-オレオイル-ホスファチジエタノールアミンSOPE、コレステロールまたはそれらの混合物を含むがこれらに限定されないアニオン性脂質または中性脂質であり得る。前記非カチオン性脂質は、粒子中に存在する全脂質の約5molから約90molまで、約10mol、またはコレステロールが含まれている場合は約58molであり得る。粒子の凝集を抑制する複合体化脂質は、例えば、これらに限定されないが、PEG-ジアシルグリセロールDAG、PEG-ジアルキルオキシプロピルDAA、PEG-リン脂質、PEG-セラミドCer、またはそれらの混合物を含むポリエチレングリコールPEG-脂質であり得る。PEG-DAA複合体は、例えば、PEG-ジラウリルオキシプロピルCi2、PEG-ジミリスチルオキシプロピルCi4、PEG-ジパルミチルオキシプロピルCi6またはPEG-ジステアリルオキシプロピルC]8であり得る。粒子の凝集を抑制する複合体化脂質は、粒子中に存在する全脂質の0molから約20molまで、または、約2molであり得る。いくつかの実施形態では、前記核酸脂質粒子は、例えば、粒子中に存在する全脂質の約10mol~約60molまたは約48molの比率でコレステロールをさらに含む。LNP011つの実施形態では、脂質dsRNAナノ粒子すなわち、LNP01粒子を調製するために脂質様物質ND984HClMW14872008年3月26日に提出された米国特許出願第12/056,230号を参照のこと。その文献を参照して本明細書に組み入れる。、コレステロールSigma-AldrichおよびPEG-セラミドC16AvantiPolarLipidsを使用することができる。エタノール中の各々の原液を次のように調製することができる:ND98,133mg/ml、コレステロール,25mg/ml、PEG-セラミドC16,100mg/ml。次にND98、コレステロールおよびPEG-セラミドC16原液を例えば42:48:10のモル比で混合することができる。混合された脂質溶液を例えば、pH5の酢酸ナトリウム中のdsRNA水性溶液と、最終エタノール濃度が約35~45であり、そして、最終酢酸ナトリウム濃度が約100~300mMであるように混合することができる。脂質-dsRNAナノ粒子は典型的には混合すると自然に形成する。所望の粒子サイズ分布に応じて、その結果のナノ粒子混合物を、例えばLipexExtruderNorthernLipids,Incなどのサーモバレル型押出成形機を使用することにより例えば、100nmカットオフ性のポリカーボネート膜から押し出すことができる。いくつかの場合では押出工程を省略することができる。エタノールの除去およびそれと同時の緩衝液交換を、例えば、透析濾過または接線流濾過により達成することができる。緩衝液を約pH7、例えば、約pH6.9、約pH7.0、約pH7.1、約pH7.2、約pH7.3または約pH7.4のリン酸緩衝生理食塩水PBSと交換することができる。LNP01製剤は、例えば、国際公開第WO2008/042973号に記載され、これによりその文献を参照して組み入れる。脂質-dsRNA製剤のさらなる例は次の通りである。DSPC:ジステアロイルホスファチジルコリンDPPC:ジパルミトイルホスファチジルコリンPEG-DMG:PEG-ジジミリストイルグリセロールC14-PEGまたはPEG-C14平均分子量2,000のPEGPEG-DSG:PEG-ジスチリルグリセロールC18-PEGまたはPEG-C18平均分子量2,000のPEGPEG-cDMA:PEG-カルバモイル-1,2-ジミリスチルオキシプロピルアミン平均分子量2,000のPEGSNALP1,2-ジリノレニルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパンDLinDMA含有製剤は2009年4月15日に提出された国際公開第WO2009/127060号に記載され、これによりその文献を参照して組み入れる。XTC含有製剤は、例えば、2009年1月29日に提出された米国仮特許出願第61/148,366号、2009年3月2日に提出された米国仮特許出願第61/156,851号、2009年6月10日に提出された米国仮特許出願第号、2009年7月24日に提出された米国仮特許出願第61/228,373号、2009年9月3日に提出された米国仮特許出願第61/239,686号、および2010年1月29日に提出された国際出願第PCT/US2010/022614号に記載され、これによりそれらの文献を参照して組み入れる。MC3含有製剤は、例えば、2009年9月22日に提出された米国仮特許出願第61/244,834号、2009年6月10日に提出された米国仮特許出願第61/185,800号、および2010年6月10日に提出された国際出願第PCT/US10/28224号に記載され、これによりそれらの文献を参照して組み入れる。ALNY-100含有製剤は、例えば、2009年11月10日に提出された国際出願第PCT/US09/63933号に記載され、これによりその文献を参照して組み入れる。C12-200含有製剤は、2009年5月5日に提出された米国仮特許出願第61/175,770号および2010年5月5日に提出された国際出願第PCT/US10/33777号に記載され、これによりそれらの文献を参照して組み入れる。カチオン性脂質の合成本発明の核酸脂質粒子で使用される化合物のいずれも、例えばカチオン性脂質などは実施例においてより詳細に記載される方法を含む公知の有機合成技術により調製されることができる。他に指示されない限り、全ての置換基は以下に定義される通りである。アルキル基は、1から24個の炭素原子を含む直鎖状または分枝状、非環状または環状の飽和脂肪族炭化水素を意味する。代表的な飽和直鎖アルキル基にはメチル基、エチル基、n-プロピル基、n-ブチル基、n-ペンチル基、n-ヘキシル基などが含まれ、一方、飽和分枝状アルキル基にはイソプロピル基、sec-ブチル基、イソブチル基、tert-ブチル基、イソペンチル基などが含まれる。代表的な飽和環状アルキル基にはシクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基などが含まれ、一方、不飽和環状アルキルにはシクロペンテニル基およびシクロヘキセニル基などが含まれる。アルケニル基は、隣接する炭素原子の間に少なくとも1つの二重結合を含有する先に定義したようなアルキル基を意味する。アルケニル基はcis異性体とtrans異性体の両方を含む。代表的な直鎖アルケニル基および分枝状アルケニル基にはエチレニル基、プロピレニル基、1-ブテニル基、2-ブテニル基、イソブチレニル基、1-ペンテニル基、2-ペンテニル基、3-メチル-1-ブテニル基,2-メチル-2-ブテニル基、2,3-ジメチル-2-ブテニル基などが含まれる。アルキニル基は、隣接する炭素原子の間に少なくとも1つの三重結合をさらに含有する先に定義したような任意のアルキル基またはアルケニル基を意味する。代表的な直鎖アルキニル基および分枝状アルキニル基にはアセチレニル基、プロピニル基、1-ブチニル基、2-ブチニル基、1-ペンチニル基、2-ペンチニル基、3-メチル-1ブチニル基などが含まれる。アシル基は、結合部位の炭素が以下に定義するようにオキソ基で置換されている任意のアルキル基、アルケニル基またはアルキニル基を意味する。例えば、-C=Oアルキル基、-C=Oアルケニル基および-C=Oアルキニル基がアシル基である。複素環基は、飽和、不飽和または芳香族のどれかであり、そして、窒素、酸素およびイオウから独立して選択される1個からまたは2個のヘテロ原子を含む5~7員の単環式複素環、または7~10員の二環式複素環であって、前記窒素およびイオウヘテロ原子が所望により酸化されている可能性があり、そして、前記窒素ヘテロ原子が所望により4級化されているものを意味し、上記複素環のいずれかがベンゼン環に融合している二環式リングを含む。任意のヘテロ原子または炭素原子を介して前記複素環基を結合することができる。複素環基には以下に定義するようなヘテロアリール基が含まれる。複素環基には、モルホルニル基、ピロリジノニル基、ピロリジニル基、ピペリジニル基、ピペリズィニル基、ヒダントイニル基、バレロラクタミル基、オキシラニル基、オキセタニル基、テトラヒドロフラニル基、テトラヒドロピラニル基、テトラヒドロピリジニル基、テトラヒドロピリミジル基、テトラヒドロチオフェニル基、テトラヒドロチオピラニル基、テトラヒドロピリミジニル基、テトラヒドロチオフェニル基、テトラヒドロチオピラニル基などが含まれる。用語置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアルケニル基、置換されていてもよいアルキニル基、置換されていてもよいアシル基および置換されていてもよい複素環基は、置換されると、少なくとも1個の水素原子が置換基で置換されることを意味する。オキソ置換基=Oの場合、2個の水素原子が置換される。この点では、置換基には、オキソ基、ハロゲン、複素環基、-CN、-ORX、-NRXRY、-NRXC=ORY、-C=ORX、-C=OORX、-C=ONRXRY、-SOnRXおよび-SOnNRXRYが含まれ、式中、nは0、1または2であり、RXとRYは同じであるか異なり、そして独立して水素、アルキル基または複素環基であり、そして前記アルキル置換基および複素環置換基の各々がオキソ基、ハロゲン、-OH、-CN、アルキル基、-ORX、複素環基、-NRXRY、-NRXC=ORY、-C=ORX、-C=OORX、-C=ONRXRY、-SOnRXおよび-SOnNRXRYのうちの1つ以上でさらに置換され得る。ハロゲンはフルオロ基、クロロ基、ブロモ基およびヨード基を意味する。いくつかの実施形態では、本発明の方法は保護基の使用を必要とする可能性がある。保護基方法論は当業者に周知である例えば、ProtectiveGroupsinOrganicSynthesisGreenTWetalWileyInterscienceNewYorkCity1999を参照のこと。簡単に述べると、本発明の範囲内の保護基は、機能基の望まない反応性を低減する、または、除去する任意の基である。ある反応中に機能基にその活性を隠すために保護基を付加することができ、次に元の機能基を表に出すために保護基を除去することができる。いくつかの実施形態では、アルコール保護基が使用される。アルコール保護基は、アルコール機能基の望まない反応性を低減させる、または、除去する任意の基である。当技術分野において周知の技術を用いて保護基を付加し、そして、除去することができる。式Aの合成いくつかの実施形態では、式Aであって、式中、R1とR2は独立してアルキル基、アルケニル基またはアルキニル基であり、各々が置換されていてもよく、そしてR3とR4は独立して低級アルキル基であるか所望により結合させられて置換複素環を形成するものであるカチオン性脂質を使用して本発明の核酸脂質粒子を製剤する。いくつかの実施形態では、前記カチオン性脂質はXTC2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノエチル-[1,3]-ジオキソランである。一般的に、他に指示されない限り全ての置換基が先に定義したとおりである次の反応計画1または2により上記の式Aの脂質が作製され得る。計画1計画1に従って、R1とR2は独立してアルキル基、アルケニル基またはアルキニル基であり、各々が置換されていてもよく、そしてR3とR4は独立して低級アルキル基であるか所望により結合させられて置換複素環を形成する脂質Aを調製することができる。ケトン1および臭化物2は購入可能であり、または、当業者に公知の方法に従ってそれらを調製することができる。1と2の反応がケタール3を産生する。ケタール3のアミン4での処理が式Aの脂質を産生する。Xがハロゲンイオン、水酸化物イオン、リン酸イオン、硫酸イオンなどから選択される陰イオン性対イオンである式5の有機塩を用いて式Aの脂質を対応するアンモニウム塩に変換することができる。計画2あるいは、計画2に従って、ケトン1出発物質を調製することができる。グリニャール試薬6とシアン化物7は購入可能であり、または、当業者に公知の方法に従ってそれらを調製することができる。6と7の反応がケトン1を産生する。式Aの対応する脂質へのケトン1の変換は計画1において説明される通りである。MC3の合成DLin-M-C3-DMAすなわち、6Z,9Z,28Z,31Z-ヘプタトリアコンタ-6,9,28,31-テトラエン-19-イル4-ジメチルアミノブタノエートの調製は次の通りであった。ジクロロメタン5mL中の6Z,9Z,28Z,31Z-ヘプタトリアコンタ-6,9,28,31-テトラエン-19-オール0.53g、4-N,N-ジメチルアミノ酪酸塩酸塩0.51g、4-N,N-ジメチルアミノピリジン0.61gおよび1-エチル-3-3-ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩0.53gの溶液を室温で一晩撹拌した。前記溶液を希塩酸で洗浄し、次に希炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。有機画分を無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、そして、ロータリーエバポレーターで溶媒を除去した。1~5メタノール/ジクロロメタン溶出濃度勾配を用いてシリカゲルカラム20gに残留物を通した。精製産物を含む画分を混合し、そして、溶媒を除去し、無色の油分0.54gが産生した。ALNY-100の合成次の計画3を用いてケタール519[ALNY-100]の合成が実行された。515の合成2つ口丸底フラスコRBF1L内の200mlの無水THF中のLiAlH43.74g,0.09852molの撹拌懸濁液に70mLのTHF中の51410g,0.04926molの溶液を0°C窒素雰囲気下でゆっくりと加えた。添加を完了した後に、反応混合物を室温まで温め、次に、加熱して4時間還流した。反応の進行はTLCによりモニターした。反応の完了の後TLCによる、混合物を0°Cまでに冷却し、そして、飽和Na2SO4溶液を注意深く加えて反応の抑制を行った。反応混合物を室温で4時間撹拌し、そして、濾過した。残留物をTHFでよく洗浄した。濾過液と洗液を混合し、そして、400mLのジオキサンと26mLの濃塩酸で希釈し、そして、室温で20分間撹拌した。真空下で揮発性成分を取り除いて515の塩酸塩を白色の固形物として供給した。収量:7.12g1HNMRδ934568374266260250245516の合成250mLの2つ口RBF内の100mLの乾燥DCM中の化合物515の撹拌溶液に、トリエチルアミン37.2mL,0.2669molを加え、そして、窒素雰囲気下で0°Cまで冷却した。50mLの乾燥DCM中のN-ベンジルオキシ-カルボニルオキシ-スクシンイミド20g,0.08007molをゆっくりと添加した後に反応混合物が室温まで温まるにまかせた。反応の完了の後2~3時間、TLCによる、混合物を1NのHCl溶液1x100mLと飽和NaHCO3溶液1x50mLで続けて洗浄した。次に有機層を無水Na2SO4上で乾燥し、そして、溶媒を蒸発乾燥させて粗製物質が生じ、シリカゲルカラムクロマトグラフィーでそれを精製して粘着性の塊として516を得た。収量:11g89。1HNMRδ736727569512496274260230225LCMSMH2323517Aおよび517Bの合成シクロペンテン5165g,0.02164molを500mLの1つ口RBF内の220mLのアセトンと水10:1の溶液に溶解し、そして、N-メチルモルホリン-N-オキシド7.6g,0.06492molと続けて4.2mLのtert-ブタノール中のOsO4の7.6溶液0.275g,0.00108molを室温でそれに添加した。反応の完了後約3h、固形のNa2SO3を添加して混合物の反応を抑制し、そして、その結果生じる混合物を室温で1.5時間撹拌した。DCM300mLで反応混合物を希釈し、そして、水2x100mLと続けて飽和NaHCO31x50mL溶液、水1x30mLそして最後に塩水1x50mLで洗浄した。有機相をNa2SO4上で乾燥し、そして、真空で溶媒を除去した。粗物質のシリカゲルカラムクロマトグラフィー精製によりジアステレオマーの混合物が供給され、それらは分取HPLCにより分離された。収量:-6g粗物質517Aのピーク1白色の固形物513g1HNMRδ739731504478473448447394393271172167LCMSMH2663MNH42835presentHPLC9786立体化学はX線により確認された。518の合成化合物505の合成について記載されるものと類似の方法を用いて化合物5181.2g,41が無色の油分として得られた。1HNMRδ735733730727537527512475458457278274206200196191162148137125087HPLC9865化合物519の合成の一般的方法ヘキサン15mL中の化合物5181等量の溶液をTHF中のLAHの氷冷溶液1M,2等量に滴下して加えた。添加を完了した後に混合物を40°Cで0.5時間にわたって加熱し、次に氷浴で再度冷却した。混合物を飽和Na2SO4水溶液で注意深く加水分解し、次にセライトに通して濾過し、そして油分に還元した。カラムクロマトグラフィーにより純粋な5191.3g,68がもたらされ、それを無色の油分として得た。13CNMR□1302130112791123793644447383354315299297296295293272256245233226141エレクトロスプレーMSC44H80NO2の分子量、計算値:654.6、実測値:654.6.標準的な方法か押出しが無い方法のどちらかにより調製された製剤は同じ方法で特徴づけられ得る。例えば、製剤は典型的には目視検査により特徴づけられる。それらは、凝集物または沈殿物が無いやや白っぽい半透明の溶液であるであろう。脂質-ナノ粒子の粒子サイズと粒子サイズ分布は、例えば、MalvernZetasizerNanoZSMalvern、米国を用いる光散乱により測定され得る。粒子は約20~300nm、例えば、40~100nmのサイズであるであろう。粒子サイズ分布は単峰式であるであろう。製剤中の全dsRNA濃度ならびに封入画分が色素排除試験法を用いて推定される。製剤化dsRNAの試料を製剤崩壊界面活性剤、例えば、0.5トリトン-X100の存在下、または、非存在下でリボグリーンMolecularProbesなどのRNA結合色素と保温することができる。界面活性剤を含有する試料からのシグナルにより検量線と比較して製剤中の全dsRNAを測定することができる。全dsRNA含量から界面活性剤の非存在下でのシグナルにより測定される遊離のdsRNA含量を引き算することで封入画分が決定される。封入dsRNAのパーセントは典型的には>85である。SNALP製剤では、粒子サイズは少なくとも30nm、少なくとも40nm、少なくとも50nm、少なくとも60nm、少なくとも70nm、少なくとも80nm、少なくとも90nm、少なくとも100nm、少なくとも110nmおよび少なくとも120nmである。適切な範囲は典型的には少なくとも約50nm~少なくとも約110nm、少なくとも約60nm~少なくとも約100nm、または少なくとも約80nm~少なくとも約90nmである。経口投与用組成物および製剤には粉剤または顆粒剤、微粒子剤、ナノ粒子剤、水または非水性媒体中の懸濁剤または液剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、サシェ、錠剤またはミニ錠剤が含まれる。増粘剤、着香剤、希釈剤、乳化剤、分散補助剤または結合剤が望ましい可能性がある。いくつかの実施形態では、経口製剤は、1つ以上の浸透促進界面活性剤とキレート剤と共に本発明において取り上げられるdsRNAを投与するものである。適切な界面活性剤には脂肪酸および/またはそれらのエステルもしくは塩、胆汁酸および/またはその塩が含まれる。適切な胆汁酸/塩には、ケノデオキシコール酸CDCAおよびウルソデオキシケノデオキシコール酸UDCA、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸、グリコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロ-24,25-ジヒドロ-フシジン酸ナトリウムおよびムグリコジヒドロフシジン酸ナトリウムが含まれる。適切な脂肪酸には、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチル酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、1-モノカプリン酸グリセリル、1-ドデシルアザシクロヘプタン-2-オン、アシルカルニチン、アシルコリンまたはモノグリセリド、ジグリセリドまたはそれらの薬学的に許容可能な塩例えば、ナトリウム塩が含まれる。いくつかの実施形態では、浸透促進剤の組合せ、例えば、胆汁酸/塩と組合せて脂肪酸/塩を用いる。1つの例示的な組合せはラウリン酸のナトリウム塩、カプリン酸およびUDCAである。さらなる浸透促進剤にはポリオキシエチレン-9-ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン-20-セチルエーテルが含まれる。スプレー乾燥粒子を含む顆粒形態で本発明において取り上げられるdsRNAsを経口送達することができ、または、ミクロもしくはナノ粒子を形成するように複合化されて経口送達することができる。dsRNA複合体化剤には、ポリ-アミノ酸、ポリイミン、ポリアクリレート、ポリアルキルアクリレート、ポリオキセタン、ポリアルキルシアノアクリレート、カチオン化ゼラチン、カチオン化アルブミン、カチオン化デンプン、カチオン化アクリレート、カチオン化ポリエチレングリコールPEGおよびカチオン化デンプン、ポリアルキルシアノアクリレート、DEAE誘導体化ポリイミン、DEAE誘導体化ポルラン、DEAE誘導体化セルロースおよびDEAE誘導体化デンプンが含まれる。適切な複合体化剤には、キトサン、N-トリメチルキトサン、ポリ-L-リシン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノメチルエチレンPTDAE、ポリアミノスチレン例えば、p-アミノ、ポリメチルシアノアクリレート、ポリエチルシアノアクリレート、ポリブチルシアノアクリレート、ポリイソブチルシアノアクリレート、ポリイソヘキシルシナオアクリレート、DEAE-メタクリレート、DEAE-ヘキシルアクリレート、DEAE-アクリルアミド、DEAE-アルブミンおよびDEAE-デキストラン、ポリメチルアクリレート、ポリヘキシルアクリレート、ポリD、L-乳酸、ポリDL-乳酸-グリコール酸共重合体PLGA、アルジネートおよびポリエチレングリコールPEGが含まれる。dsRNAの経口製剤とそれらの調製は米国特許第6,887,906号、米国特許出願公開第20030027780号、および米国特許第6,747,014号に詳細が記載され、それらの文献の各々を参照して本明細書に組み入れる。非経口投与、実質内脳への投与、髄腔内投与、脳室内投与または肝臓内投与のための組成物と製剤は、緩衝液、希釈剤、ならびに、これらに限定されないが、浸透促進剤、担体化合物および他の薬学的に許容可能な担体または賦形剤などの他の適切な添加剤を含むことも可能である無菌水性溶液を含むことができる。本発明の医薬組成物は、液剤、乳剤およびリポソーム含有製剤を含むがこれらに限定されない。これらの組成物は、既製液体、自己乳化固形物および自己乳化半固形物を含むがこれらに限定されない様々な構成要素から作製され得る。肝臓癌腫などの肝臓疾患を治療するとき肝臓を標的とする製剤が特に好ましい。単位剤形で都合よく提供され得る本発明の医薬製剤は、製薬産業において周知の従来の技術に従って調製され得る。そのような技術は有効成分を医薬担体または賦形剤と混合させる工程を含む。一般的に、有効成分を液体担体または細分化固形担体またはその両方と均一かつ十分に混合し、次に必要に応じて産物を成形することにより前記製剤が調製される。本発明の組成物は、これらに限定されないが、錠剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、液体シロップ剤、軟質ゲル剤、座剤および浣腸剤などの多くのあり得る剤形のいずれかに製剤され得る。本発明の組成物は、水性媒体、非水性媒体または混合媒体中の懸濁剤として製剤され得る。水性懸濁剤は、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールおよび/またはデキストランを含む懸濁剤の粘度を増加させる物質をさらに含有することができる。前記懸濁剤は安定化剤を含有することもできる。その他の製剤乳剤本発明の組成物は乳剤として調製および製剤され得る。典型的には乳剤は、通常、直径が0.1μmを超える液滴の形状で1つの液体が別の液体に分散する不均一系である例えば、AnselsPharmaceuticalDosageFormsandDrugDeliverySystemsAllenLVPopovichNGandAnselHC2004LippincottWilliamsWilkinsNewYorkNY、IdsoninPharmaceuticalDosageFormsLiebermanRiegerandBanker1988MarcelDekkerIncNewYorkNYvolume1p199、RosoffinPharmaceuticalDosageFormsLiebermanRiegerandBanker1988MarcelDekkerIncNewYorkNYVolume1p245、BlockinPharmaceuticalDosageFormsLiebermanRiegerandBanker1988MarcelDekkerIncNewYorkNYvolume2p335、HiguchietalinRemingtonsPharmaceuticalSciencesMackPublishingCoEastonPa1985p301を参照のこと。乳剤は、多くの場合、緊密に混合され、そして、互いに分散した2つの非混和性液体を含む二相系である。一般的に、乳剤は油中水型w/oか水中油型o/wのどちらかであり得る。水相が小さい液滴に細かく分割され、大容量の油相中に分散されるとき、その結果生じる組成物は油中水型w/o乳剤と呼ばれる。あるいは、油相が小さい液滴に細かく分割され、大容量の水相中に分散されるとき、その結果生じる組成物は水中油型o/w乳剤と呼ばれる。乳剤は分散層に加えてその他の成分、および、水相、油相またはそれ自体別の相に存在し得る活性薬物を含有することができる。乳化剤、安定化剤、色素および抗酸化剤などの医薬賦形剤も必要に応じて乳剤中に存在し得る。医薬乳剤はまた、例えば、油中水中油型o/w/o乳剤および水中油中水型w/o/w乳剤の場合のように、2つよりも多い相からなる多重乳剤でもあり得る。そのような複合型製剤は、単純な二相型乳剤が提供しないいくらかの利点を多くの場合提供する。o/w乳剤の個々の油滴が小さい水滴を取り囲む多重乳剤は、w/o/w乳剤を構成する。同様に、油の連続相中で安定化された水の小球の中に取り囲まれた油滴の系はo/w/o乳剤を提供する。乳剤は、熱力学的安定性がほとんどないこと、または、全くないことを特徴とする。多くの場合、乳剤の分散相または不連続相は外相または連続相によく分散され、そして、乳化剤または製剤の粘度によりこの形態で維持される。乳剤のどちらかの相は、乳剤様の軟膏ベースおよびクリーム剤の場合のように、半固形物または固形物であり得る。乳剤を安定化する他の手段は、乳剤のどちらかの相に取り込まれ得る乳化剤の使用を必要とする。乳化剤は、合成界面活性剤、天然乳化剤、吸収基剤、および細分散化固形物の4つの区分に大きく分類され得る例えば、AnselsPharmaceuticalDosageFormsandDrugDeliverySystemsAllenLVPopovichNGandAnselHC2004LippincottWilliamsWilkinsNewYorkNYIdsoninPharmaceuticalDosageFormsLiebermanRiegerandBanker1988MarcelDekkerIncNewYorkNYvolume1p199を参照のこと。表面活性剤としても知られる合成界面活性剤は、乳剤の製剤に広範な応用性を見出しており、そして、文献中に概説されている例えば、AnselsPharmaceuticalDosageFormsandDrugDeliverySystemsAllenLVPopovichNGandAnselHC2004LippincottWilliamsWilkinsNewYorkNYRiegerinPharmaceuticalDosageFormsLiebermanRiegerandBanker1988MarcelDekkerIncNewYorkNYvolume1p285IdsoninPharmaceuticalDosageFormsLiebermanRiegerandBankerMarcelDekkerIncNewYorkNY1988volume1p199を参照のこと。界面活性剤は典型的には両親媒性であり、そして、親水性部分および疎水性部分を含む。界面活性剤の疎水性に対する親水性の割合は親水性/親油性バランスHLBと名付けられており、そして、製剤の調製において界面活性剤を分類し、そして、選択するのに有用な手段である。界面活性剤は、親水性基の性状に基づいて様々な種類、非イオン性、陰イオン性、カチオン性および両性に分類され得る例えば、AnselsPharmaceuticalDosageFormsandDrugDeliverySystemsAllenLVPopovichNGandAnselHC2004LippincottWilliamsWilkinsNewYorkNY、RiegerinPharmaceuticalDosageFormsLiebermanRiegerandBanker1988MarcelDekkerIncNewYorkNYvolume1p285を参照のこと。乳液製剤に用いられる天然乳化剤には、ラノリン、蜜蝋、ホスファチド、レシチンおよびアラビアゴムが含まれる。吸収基剤は、無水ラノリンおよび親水性ワセリンのように、親水性を有するので、水を吸収してw/o乳剤を形成し、しかしそれでも、その半固形物の硬度を保持する。細分化された固形物もまた、特に界面活性剤と組み合わせて、および、粘性調合物中において良好な乳化剤として使用されている。これらには、重金属水酸化物などの極性無機固形物、ベントナイト、アタパルファイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、コロイド状ケイ酸ナトリウムおよびコロイド状計算アルミニウムマグネシウムのような非膨潤粘土、顔料ならびに炭素またはトリステアリン酸グリセリルなどの非極性固形物が含まれる。多様な非乳化材料も乳液製剤に含まれ、そして、乳剤の特性に寄与する。これらには、脂肪、油、ワックス、脂肪酸、脂肪族アルコール、脂肪エステル、保湿剤、親水性コロイド、保存剤および抗酸化剤が含まれるBlockinPharmaceuticalDosageFormsLiebermanRiegerandBanker1988MarcelDekkerIncNewYorkNYvolume1p335、IdsoninPharmaceuticalDosageFormsLiebermanRiegerandBanker1988MarcelDekkerIncNewYorkNYvolume1p199。親水性コロイドまたはヒドロコロイドには、ポリサッカリド例えば、アラビアゴム、寒天、アルギン酸、カラギナン、グアーガム、カラヤガムおよびトラガカント、セルロース誘導体例えば、カルボキシメチルセルロースおよびカルボキシプロピルセルロースおよび合成高分子例えば、カルボマー、セルロースエーテルおよびカルボキシビニル高分子などの天然ガム類および合成高分子が含まれる。これらは水中で分散し、または、膨潤し、分散相の液滴の周囲に強力な界面薄膜を形成することにより、そして、外相の粘度を増大させることにより乳剤を安定化させるコロイド溶液を形成する。乳剤は多くの場合、微生物の増殖を容易に援助できる炭水化物、タンパク質、ステロールおよびホスファチドなどの多数の成分を含有するため、これらの製剤は多くの場合、保存剤を組み入れる。乳液製剤に含まれる一般的に使用される保存剤には、メチルパラベン、プロピルパラベン、第4級アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、p-ヒドロキシ安息香酸のエステルおよびホウ酸が含まれる。製剤の劣化を防ぐために抗酸化剤もまた通常乳液製剤に添加される。使用される抗酸化剤は、トコフェロール、アルキルガレート、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンなどのフリーラジカル捕捉剤、またはアスコルビン酸およびメタ重亜硫酸ナトリウムなどの還元剤、ならびにクエン酸、酒石酸およびレシチンなどの抗酸化剤協力剤であり得る。皮膚科的経路、経口経路および非経口経路による乳液製剤の適用ならびにそれらの製造方法は文献に概説されている例えば、AnselsPharmaceuticalDosageFormsandDrugDeliverySystemsAllenLVPopovichNGandAnselHC2004LippincottWilliamsWilkinsNewYorkNY、IdsoninPharmaceuticalDosageFormsLiebermanRiegerandBanker1988MarcelDekkerIncNewYorkNYvolume1p199を参照のこと。製剤の容易性ならびに吸収および生物学的利用能の観点からの有効性のため経口送達用の乳液製剤は非常に広範に用いられてきている例えば、AnselsPharmaceuticalDosageFormsandDrugDeliverySystemsAllenLVPopovichNGandAnselHC2004LippincottWilliamsWilkinsNewYorkNYRosoffinPharmaceuticalDosageFormsLiebermanRiegerandBanker1988MarcelDekkerIncNewYorkNYvolume1p245、IdsoninPharmaceuticalDosageFormsLiebermanRiegerandBanker1988MarcelDekkerIncNewYorkNYvolume1p199を参照のこと。鉱油ベースの下剤、油溶性ビタミンおよび高脂質栄養調製品は、o/w乳剤として通常経口投与される物質のうちに含まれる。本発明の1つの実施形態では、iRNAと核酸の組成物はマイクロエマルジョンとして製剤される。マイクロエマルジョンは、単一の光学的に等方性であり、熱力学的に安定な溶液である水、油または両親媒性の系として定義され得る例えば、AnselsPharmaceuticalDosageFormsandDrugDeliverySystemsAllenLVPopovichNGandAnselHC2004LippincottWilliamsWilkinsNewYorkNY、RosoffinPharmaceuticalDosageFormsLiebermanRiegerandBanker1988MarcelDekkerIncNewYorkNYvolume1p245を参照のこと。典型的にはマイクロエマルジョンは、まず、油を界面活性剤水溶液に分散し、次に、概して中間鎖長アルコールである十分な量の第四の成分を加えて透明な系を形成することにより調製される系である。したがって、マイクロエマルジョンはまた、表面活性分子の界面薄膜により安定化される2つの非混和性溶液の熱力学的に安定で光学等方的に透明な分散物として説明されているLeungandShahinControlledReleaseofDrugsPolymersandAggregateSystemsRosoffMEd1989VCHPublishersNewYorkpages185215。マイクロエマルジョンは通常、油、水、界面活性剤、共界面活性剤および電解質を含む3~5種の成分の組合せにより調製される。マイクロエマルジョンが油中水型w/oまたは水中油型o/wであるかは、使用する油と界面活性剤の特性、および、界面活性剤分子の極性頭部および炭化水素尾部の構造および幾何学的充填状態に依存するSchottinRemingtonsPharmaceuticalSciencesMackPublishingCoEastonPa1985p271。相ダイアグラムを用いる現象論的方法は広く研究されており、そして、マイクロエマルジョンの製剤方法についての包括的な知識を当業者に提供しているNewYorkNY、RosoffinPharmaceuticalDosageFormsLiebermanRiegerandBanker1988MarcelDekkerIncNewYorkNYvolume1p245、BlockinPharmaceuticalDosageFormsLiebermanRiegerandBanker1988MarcelDekkerIncNewYorkNYvolume1p335を参照のこと。従来の乳剤と比較して、マイクロエマルジョンは自然に形成される熱力学的に安定な液滴の製剤の中で非水溶性薬品を可溶化するという利点をもたらす。マイクロエマルジョンの調製に使用される界面活性剤には、これらに限定されないが、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Brij96、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、テトラグリセロールモノラウレートML310、テトラグリセロールモノオレエートMO310、ヘキサグリセロールモノオレエートPO310、ヘキサグリセロールペンタオレエートPO500、デカグリセロールモノカプレートMCA750、デカグリセロールモノオレエートMO750、デカグリセロールセキオレエートSO750、デカグリセロールデカオレエートDAO750がそれらのみか共界面活性剤と組み合わせて含まれる。共界面活性剤は、通常、エタノール、1-プロパノールおよび1-ブタノールなどの短鎖アルコールであるが、界面活性剤薄膜を貫通し、結果として界面活性剤分子の間に生成したボイドスペースのために乱れた薄膜を形成することにより界面流動性を高めるように働く。しかしながら、共界面活性剤を使用することなくマイクロエマルジョンを調製することが可能であり、そして、非アルコール含有自己乳化性マイクロエマルジョン系は当技術分野において公知である。水相は典型的には水、薬品の水溶液、グリセロール、PEG300、PEG400、ポリグリセロール、プロピレングリコールおよびエチレングリコールの誘導体であり得るが、これらに限定されない。油相には、Captex300、Captex355、CapmulMCM、脂肪酸エステル、炭素数8~12の中間鎖モノ、ジ、およびトリ-グリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪族アルコール、ポリグリコール化グリセリド、炭素数8~10の飽和ポリグリコール化グリセリド、植物性油ならびにシリコン油などの物質が含まれ得るが、これらに限定されない。マイクロエマルジョンは薬品の可溶化と薬品の吸収の向上の観点から特に興味深い。脂質ベースのマイクロエマルジョンo/wとw/oの両方が、ペプチドを含む薬品の経口生物学的利用能を向上すると主張されている例えば、米国特許第6,191,105号、第7,063,860号、第7,070,802号、第7,157,099号、ConstantinidesetalPharmaceuticalResearch19941113851390、RitschelMethFindExpClinPharmacol199313205を参照のこと。マイクロエマルジョンは、薬品可溶化の向上、酵素的加水分解からの薬品の保護、薄膜流動性と透過性の界面活性剤誘導変化による薬品吸収の向上の可能性、調製の容易性、固形剤形よりも優れた経口投与の容易性、臨床的有効性の向上および毒性の減少という利点をもたらす例えば、米国特許第6,191,105号、第7,063,860号、第7,070,802号、第7,157,099号、ConstantinidesetalPharmaceuticalResearch1994111385、HoetalJPharmSci199685138143を参照のこと。多くの場合、マイクロエマルジョンは、それらの成分が外界温度で集まると、自然に形成することができる。これは、熱不安定性薬品、ペプチド、またはiRNAを製剤するときに特に有利であり得る。マイクロエマルジョンはまた、美容用途および医薬用途の両方で活性成分の経皮送達に有効である。本発明のマイクロエマルジョン組成物および製剤は、胃腸管からのiRNAと核酸の全身性吸収の増大を促進し、ならびに、iRNAと核酸の局所細胞性取込を向上することが期待される。本発明のマイクロエマルジョンはまた、製剤の特性を改善し、そして、本発明のiRNAと核酸の吸収を向上させるために、ソルビタンモノステアレートGrill3、ラブラソールおよび浸透促進剤などのその他の成分および添加剤を含むことができる。本発明のマイクロエマルジョンに使用される浸透促進剤は、界面活性剤、脂肪酸、胆汁塩、キレート剤、および非キレート非界面活性剤からなる5つの大きい区分の1つに属するように分類され得るLeeetalCriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems1991p92。これらの区分の各々は先に論じられている。浸透促進剤1つの実施形態では、本発明は、動物の皮膚への核酸、特にiRNAの効率的な送達をもたらすために様々な浸透促進剤を用いる。大半の薬品が溶液中にイオン化形態と非イオン化形態の両方の形態で存在する。しかしながら、通常、脂質可溶性薬品または親油性薬品だけが容易に細胞膜を通過する。通過される予定の膜が浸透促進剤で処理された場合、非親油性薬品でさえ細胞膜を通過することが明らかになっている。非親油性薬品の細胞膜を越えた拡散の補助に加えて、浸透促進剤はまた親油性薬品の透過性を向上する。浸透促進剤は、5つの大きい区分、すなわち、界面活性剤、脂肪酸、胆汁塩、キレート剤、および非キレート非界面活性剤の1つに属するように分類され得る例えば、MalmstenMSurfactantsandpolymersindrugdeliveryInformaHealthCareNewYorkNY2002、LeeetalCriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems1991p92を参照のこと。浸透促進剤の上述した分類の各々は以下でさらに詳細に論じられている。界面活性剤:本発明との関連では、界面活性剤または、表面活性剤は、水性溶液に溶解すると、その溶液の表面張力を、または、その水性溶液と別の液体との間の界面間張力を低減させ、結果として、粘膜によるiRNAの吸収を増大させることになる化学的実体である。胆汁塩と脂肪酸に加えて、これらの浸透促進剤には、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン-9-ラウリルエーテルおよびポリオキシエチレン-20-セチルエーテル例えば、MalmstenMSurfactantsandpolymersindrugdeliveryInformaHealthCareNewYorkNY2002、LeeetalCriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems1991p92を参照のこと、および、FC-43などのパーフルオロ化合物乳剤が含まれる。TakahashietalJPharmPharmacol198840252。脂肪酸:浸透促進剤として作用する様々な脂肪酸とその誘導体には、例えば、オレイン酸、ラウリル酸、カプリン酸n-デカノイン酸、ミリスチル酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン1-モノオレオイル-rac-グリセロール、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール1-モノカプレート、1-ドデシルアザシクロヘプタン-2-オン、アシルカルニチン、アシルコリン、それらの炭素数1~20のアルキル例えば、メチル、イソプロピルおよびt-ブチルエステル、およびそれらのモノ-およびジ-グリセリドすなわち、オレエート、ラウレート、カプレート、ミリスチレート、パルミテート、ステアレート、リノレエートなどが含まれる例えば、TouitouEetalEnhancementinDrugDeliveryCRCPressDanversMA2006、LeeetalCriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems1991p92、MuranishiCriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems19907133ElHaririetalJPharmPharmacol199244651654を参照のこと。胆汁塩胆汁の生理学的役割には、脂質および脂溶性ビタミンの分散および吸収の促進が含まれる例えば、MalmstenMSurfactantsandpolymersindrugdeliveryInformaHealthCareNewYorkNY2002、BruntonChapter38inGoodmanGilmansThePharmacologicalBasisofTherapeutics9thEdHardmanetalEdsMcGrawHillNewYork1996pp934935を参照のこと。様々な天然胆汁塩およびそれらの合成誘導体が浸透促進剤として作用する。したがって、用語胆汁塩には、胆汁の天然成分のいずれもが、ならびに、それらの合成誘導体のいずれもが含まれる。適切な胆汁塩には、例えば、コール酸または、その薬学的に許容可能なナトリウム塩、コール酸ナトリウム、デヒドロコール酸デヒドロコール酸ナトリウム、デオキシコール酸デオキシコール酸ナトリウム、グルコール酸グルコール酸ナトリウム、グリコール酸グリココール酸ナトリウム、グリコデオキシコール酸グリコデオキシコール酸ナトリウム、タウロコール酸タウロコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸タウロデオキシコール酸ナトリウム、ケノデオキシコール酸ケノデオキシコール酸ナトリウム、ウルソデオキシコール酸UDCA、タウロ-24,25-ジヒドロ-フシジン酸ナトリウムSTDHF、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウムおよびポリオキシエチレン-9-ラウリルエーテルPOEが含まれる例えば、MalmstenMSurfactantsandpolymersindrugdeliveryInformaHealthCareNewYorkNY2002、LeeetalCriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems1991page92、SwinyardChapter39InRemingtonsPharmaceuticalSciences18thEdGennaroedMackPublishingCoEastonPa1990pages782783、MuranishiCriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems19907133、YamamotoetalJPharmExpTher199226325、YamashitaetalJPharmSci199079579583を参照のこと。キレート剤本発明との関連で使用されるようなキレート剤は、溶液から金属イオンをそれと錯体を形成することにより除去し、結果として、粘膜によるiRNAの吸収を増大させることになる化合物として定義され得る。本発明における浸透促進剤としてのその使用に関して、大半の特徴が明らかになったDNAヌクレアーゼは触媒作用に二価の金属イオンを必要とし、したがって、キレート剤により阻害されるので、キレート剤はDNase阻害剤として働きもするという追加の利点を追加するJarrettJChromatogr1993618315339。適切なキレート剤には、エチレンジアミンテトラ酢酸二ナトリウムEDTA、クエン酸、サリチレート例えば、サリチル酸ナトリウム、5-メトキシサリチレートおよびホモバニレート、コラーゲンのN-アシル誘導体、ラウレス-9およびβ‐ジケトンエナミンのN-アミノアシル誘導体が含まれるが、これらに限定されない例えば、KatdareAetalExcipientdevelopmentforpharmaceuticalbiotechnologyanddrugdeliveryCRCPressDanversMA2006、LeeetalCriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems1991page92、MuranishiCriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems19907133BuuretalJControlRel1990144351を参照のこと。非キレート非界面活性剤本明細書において用いられる場合、非キレート非界面活性剤浸透促進化合物は、キレート剤または界面活性剤として示される活性は有意ではないが、にもかかわらず消化管粘膜を通してiRNAの吸収を増大させる化合物として定義され得る例えば、MuranishiCriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems19907133を参照のこと。この種類の浸透促進剤には、例えば、不飽和環状尿素、1-アルキル-アルカノン誘導および1-アルケニルアザシクロ-アルカノン誘導体25742578、至適標準の肝臓生検の実行を必要とせずに肝線維症の病期と等級を決定するために、慢性肝疾患を有する200人の患者の20を超える非侵襲性パラメータを測定し、そして、非侵襲性パラメータのレベルにより判定されるような炎症活性をこれらの患者に由来する継続的な肝臓生検の線維症と関係づけようと試みた。病理学的な診断では、ステージ1とステージ2は、軽い線維症を示し、ステージ3とステージ4は重症の線維症を示した。Lun-GenLuらは、肝線維症と炎症活性の間に緊密な相関が存在することを発見した。AST、GGT、アルブミン、アルブミン/グロブリン、ALP、AFP、ヒアルロン酸、N-末端プロコラーゲンIIIPIIINP、IV型コラーゲンColIV、メタロプロテイナーゼ-1TIMP-1の組織インヒビター、α-2-マクログロブリン、ナチュラルキラー細胞NK、ドップラー超音波検査、CTおよび/またはMR画像検査のいくつかのパラメータの全てで炎症活性の程度と関連があった。GGT、アルブミン、アルブミン/グロブリン、ALP、AFP、ヒアルロン酸、ColIV、TIMP-1、α-2-マクログロブリン、トランスフォーミング増殖因子-β1TGFb1、NK、ドップラー超音波検査、CTおよび/またはMR画像検査のいくつかのパラメータの全てで線維症の病期分類と関連があった。炎症と初期の線維症でTGFβとTIMP-1のレベルがさらに著しく増加することが明らかになった。このことは、それらが肝臓の炎症と線維症の変化を反映する可能性があることを示している。GGT、アルブミン、アルブミン/グロブリン、ALP、AFP、HA、7S-IVおよびα2-MAには肝線維症と正の相関があった。この研究では、有意な診断値を持つことが知られているPIIINP、ラミニン、トランスフェリンおよびアポプロテインA1は確かめられなかった。肝疾患とその結果の肝線維症の治療には、肝臓での炎症と刺激状態の主な原因を治療すること、および炎症を制御することが含まれるがこれらに限定されない表2を参照のこと。本明細書において記載されるdsRNA介在性方法に加えて、治療はまた、次のうちの1つ/それ以上を含むことができる。抗ウイルス薬剤―肝疾患または肝線維症がB型肝炎またはC型肝炎により引き起こされるとき、注射可能な抗ウイルス薬インターフェロンαにより肝臓の炎症を止めることができる。さらに、B型肝炎では、ラミブジンまたはアデフォビルなどの経口抗ウイルス薬を使用することが可能であり、一方、C型肝炎では、リバビリンを使用することができる。コルチコステロイド類―自己免疫疾患を原因とする慢性肝疾患を治療するためにコルチコステロイド類を使用することができる。しかしながら、炎症が抑制されるときでも、肝臓の瘢痕形成が続き得る可能性がある。ある薬品の中断―ある薬品によって慢性肝炎が引き起こされるとき、それらの薬品を中断することは通常どのような症状をも取り除く。アルコールの中断―これはアルコール誘導性慢性肝疾患での回復に必須であるが、それはまたC型肝炎および肝臓の他の慢性疾患でも非常に当を得ている。他の治療法の例には、表2に開示されるものが含まれる。さらに、肝線維症の治療、予防および/または管理のために、Qingganカプセル、イチョウ葉、Ruangan、サルビア、ミシマサイコおよび白シャクヤクなどの伝統的な漢方薬を前記治療法および組成物と組み合わせて用いることができる。VI.COL1A1遺伝子、TGFβ遺伝子および/またはSMAD2/3遺伝子の発現阻害法1つの態様では、細胞内のCOL1A1の発現を阻害する方法であって、a前記細胞内のCOL1A1遺伝子、TGFβ遺伝子またはSMAD2/3遺伝子を標的とするdsRNAを前記細胞に導入する工程、およびb工程aで作製された細胞を、COL1A1遺伝子、TGFβ遺伝子またはSMAD2/3遺伝子それぞれのmRNA転写物が分解されるのに十分な時間にわたり維持する工程を含む方法が、本明細書において提供される。dsRNAがTGFβ遺伝子および/またはSMAD2/3の遺伝子の発現を標的とする実施形態では、細胞を刺激してCOL1A1を過剰発現させるTGFβからのシグナル伝達を低減することにより、その細胞でのCOL1A1遺伝子の発現が間接的に阻害される。その阻害はCOL1A1遺伝子のmRNA転写物の分解によるものではない。遺伝子発現の減少は当技術分野において公知のどんな方法によっても、および、本明細書において記載される方法、例えば、定量RT-PCRによって評価され得る。1つの実施形態では、細胞は哺乳類細胞であり、好ましくはヒト細胞である。別の実施形態では、細胞は哺乳類肝臓細胞である。好ましい実施形態では、細胞はHSCである。1つの実施形態では、細胞に1つより多いdsRNAが導入される。1つの実施形態では、COL1A1遺伝子、TGFβ遺伝子および/またはSMAD2/3遺伝子を標的とするdsRNAが細胞に導入される、すなわち、dsRNAの組合せが細胞に導入され、そして、1つより多い遺伝子が標的とされる。例えば、COL1A1iRNAとTGFβiRNAの組合せ、COL1A1iRNAとSMAD2/3iRNAの組合せ、またはCOL1A1iRNA、TGFβiRNAおよびSMAD2/3iRNAの組合せ。1つの実施形態では、dsRNAが、好ましくは、リポソーム中の、例えば、当技術分野において公知のおよび/または本明細書において記載されるLNP製剤化リポソーム中のdsRNAが細胞に導入される。1つの実施形態では、HSCなどの特異的な細胞を標的とするためにLNPが製剤される。例えば、LNPカプセル化dsRNAがビタミンA捕捉性HSCを標的とするように、LNP製剤化リポソームをビタミンAと結合させることができる。1つの実施形態では、COL1A1の発現が少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、または100までも阻害される。TGFβ遺伝子および/またはSMAD2/3遺伝子の発現もまたdsRNAによって阻害される実施形態では、COL1A1の発現の減少に加えて、それらのそれぞれの発現は少なくとも30阻害される。1つの態様では、哺乳類のCOL1A1遺伝子の発現を阻害する方法であって、a前記哺乳類の細胞内のCOL1A1遺伝子、TGFβ遺伝子またはSMAD2/3遺伝子を標的とするdsRNAを含む組成物を前記哺乳類に投与する工程、およびb工程aの哺乳類を、COL1A1遺伝子、TGFβ遺伝子またはSMAD2/3遺伝子それぞれのmRNA転写物が分解されるのに十分な時間にわたり維持し、それによって前記細胞内のCOL1A1遺伝子の発現を阻害する工程を含む方法が本明細書において提供される。dsRNAがTGFβ遺伝子および/またはSMAD2/3遺伝子の発現を標的とする実施形態では、細胞を刺激してCOL1A1を過剰発現させるTGFβからのシグナル伝達を低減させることにより、細胞でのCOL1A1の発現が間接的に阻害される。その阻害はCOL1A1遺伝子のmRNA転写物の分解によるものではない。遺伝子発現の減少は当技術分野において公知のどんな方法によっても、および、本明細書において記載される方法、例えば、定量RT-PCRによって評価され得る。1つの実施形態では、吸引肝臓生検試料は、標的遺伝子の発現の減少をモニターするための組織材料として働く。1つの実施形態では、前記方法は、例えば、長期間、例えば、2、3、4日またはそれ以上、例えば、1週間、2週間、3週間、4週間またはそれ以上の間、標的COL1A1遺伝子の発現が減少するように本明細書において取り上げられる組成物を哺乳類に投与する工程を含む。好ましくは、本明細書において取り上げられる方法および組成物に有用なiRNAは標的COL1A1遺伝子、TGFβ遺伝子、またはSMAD2/3遺伝子の一次、またはプロセッシングを受けたRNAを特異的に標的とする。iRNAを用いてこれらの遺伝子の発現を阻害するための組成物および方法を、本明細書のどこかに記載されているように調製し、および、実行することができる。本明細書に記載される態様のいくつかの実施形態では、1つより多いiRNAが哺乳類に投与され、そして、哺乳類中で1つより多い遺伝子が標的とされるように、本明細書において取り上げられる方法および組成物は1つより多いiRNAを含む。例えば、COL1A1iRNAとTGFβiRNAの組合せ、COL1A1iRNAとSMAD2/3iRNAの組合せ、またはCOL1A1iRNA、TGFβiRNAおよびSMAD2/3iRNAの組合せ。したがって、本明細書において記載される態様のいくつかの実施形態では、本明細書において記載される方法および組成物は、COL1A1遺伝子およびTGFβ遺伝子を標的とするiRNAを含む。これらの方法では、COL1A1遺伝子およびTGFβ遺伝子の両方の発現が阻害される。別の実施形態では、本明細書において記載される方法および組成物は、COL1A1遺伝子およびSMAD2/3遺伝子を標的とするiRNAを含む。これらの方法では、COL1A1遺伝子およびSMAD2/3遺伝子の両方の発現が阻害される。さらに別の実施形態では、本明細書において記載される方法および組成物は、COL1A1遺伝子、TGFβ遺伝子およびSMAD2/3遺伝子を標的とするiRNAを含む。これらの方法では、COL1A1遺伝子、SMAD2/3遺伝子およびTGFβ遺伝子の全て3つの発現が阻害される。本明細書において記載される態様の1つの実施形態では、前記方法は、治療される予定の哺乳類のCOL1A1遺伝子、TGFβ遺伝子またはSMAD2/3遺伝子のRNA転写物の少なくとも一部と相補的なヌクレオチド配列を含むiRNAを含有する組成物を投与する工程を含む。治療される予定の生物がヒトなどの哺乳類であるとき、経口経路、腹腔内経路、または、頭蓋内投与例えば、脳室内投与、実質内投与および髄腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、経気道エアロゾル投与、経鼻投与、経直腸投与、および局所バッカル投与および舌下投与を含む投与を含む非経口経路を包含するがこれらに限定されない当技術分野において公知のどんな手段によっても前記組成物を投与することができる。ある実施形態では、静脈内点滴または注入により前記組成物が投与される。VII.COL1A1遺伝子の過剰発現を特徴とする肝疾患および肝線維症の治療法本発明の態様および実施形態は、特に、COL1A1遺伝子の発現を標的とするiRNAとCOL1A1介在性肝線維症の治療用の少なくとも1つのiRNAを含有する組成物の使用に関連する。本発明の実施形態はまた、COL1A1遺伝子の発現を促進する伝達経路中の分子、例えば、TFGβおよびSMAD2/3を標的とするiRNAの使用に関連する。例えば、COL1A1遺伝子を標的とするiRNAを含有する組成物を肝線維症の治療および/もしくは予防のために使用し、または、TGFβ遺伝子および/もしくはSMAD2/3遺伝子を標的とするiRNAを含有する組成物を肝線維症の治療および/もしくは予防のために使用する。1つの実施形態では、そのような治療を必要とする対象で肝線維症を治療する、および/または、予防する方法であって、治療上有効量のCOL1A1遺伝子、TGFβ遺伝子またはSMAD2/3遺伝子を標的とするiRNAをその対象に投与する工程を含む方法が本明細書において提供される。1つの実施形態では、肝線維症を治療する、および/または、予防する方法は、a哺乳類の細胞内のCOL1A1遺伝子、TGFβ遺伝子またはSMAD2/3遺伝子を標的とするiRNAを含む組成物を対象に投与する工程、およびb工程aの対象を、COL1A1遺伝子、TGFβ遺伝子またはSMAD2/3遺伝子それぞれのmRNA転写物が分解されるのに十分な時間にわたり維持し、それによって前記細胞内のCOL1A1遺伝子の発現を阻害する、または、低減させる工程を含む。iRNAがTGFβ遺伝子および/またはSMAD2/3遺伝子の発現を標的とする実施形態では、細胞を刺激してCOL1A1を過剰発現させるTGFβからのシグナル伝達を低減させることにより、細胞でのCOL1A1の発現を間接的に減少させる。COL1A1の発現の減少はCOL1A1遺伝子のmRNA転写物の分解によるものではない。遺伝子発現の減少は当技術分野において公知のどんな方法によっても、および、本明細書において記載される方法、例えば、定量RT-PCRによって評価され得る。1つの実施形態では、吸引肝臓生検試料は、標的遺伝子の発現の減少をモニターするための組織材料として働く。1つの実施形態では、肝線維症は、ウイルスまたは他の感染症、自己免疫疾患、胆管閉塞、代謝性疾患、過度の飲酒、原発性胆汁性肝硬変、NASH、化学物質への曝露または癌の結果である。他の実施形態では、肝線維症は本明細書において記載される他の示されたことの結果である。1つの実施形態では、1つより多いdsRNAが対象に投与され、そして、その結果として、1つより多い遺伝子が標的とされる。例えば、COL1A1iRNAとTGFβiRNAの組合せ、COL1A1iRNAとSMAD2/3iRNAの組合せ、またはCOL1A1iRNA、TGFβiRNAおよびSMAD2/3iRNAの組合せ。1つの実施形態では、本明細書において記載される肝線維症を治療する、および/または、予防する方法はCOL1A1遺伝子およびTGFβ遺伝子を標的とするiRNAを含む。この実施形態では、COL1A1遺伝子とTGFβ遺伝子の両方の発現が阻害される。別の実施形態では、本明細書において記載される肝線維症を治療する、および/または、予防する方法はCOL1A1遺伝子およびSMAD2/3遺伝子を標的とするiRNAを含む。この実施形態では、COL1A1遺伝子とSMAD2/3遺伝子の両方の発現が阻害される。さらに別の実施形態では、本明細書において記載される肝線維症を治療する、および/または、予防する方法はCOL1A1遺伝子、TGFβ遺伝子およびSMAD2/3遺伝子を標的とするiRNAを含む。この実施形態では、COL1A1遺伝子、SMAD2/3遺伝子およびTGFβ遺伝子の全て3つの発現が阻害される。1つの実施形態では、COL1A1遺伝子、TGFβ遺伝子およびSMAD2/3遺伝子を標的とするiRNAが投与される。1つの実施形態では、対象の体重に対して0.01mg/kg~5mg/kgの濃度でiRNAが投与される。1つの実施形態では、前記方法は、例えば、慢性肝疾患または肝線維症の治療および/または予防のために、他の医薬および/または他の治療法と組み合わせて、例えば、公知の医薬および/または公知の治療法、例えば、慢性肝疾患または肝線維症の遠因の治療に現在用いられているものと共にiRNAまたはその医薬組成物を用いることにさらに関連する。例えば、生物学的化学療法および放射線治療などの1つ以上のその他の抗肝癌治療と併せてiRNAまたはその医薬組成物を投与することもできる。したがって、治療には、例えば、化学療法例えば、クロラムブチル、プレドニゾン、プレドニゾロン、ビンクリスチン、シタラビン、クロファラビン、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、デシタビン、MDR1阻害剤、リツキシマブ、インターフェロン-α、アントラサイクリン系薬品ダウノルビシンまたはイダルビシンなど、L-アスパラギナーゼ、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ブレオマイシン、フルダラビン、エトポシド、ペントスタチンまたはクラドリビン、骨髄移植、幹細胞移植、抗代謝物薬品メトトレキサートおよび6‐メルカプトプリンまたはそれらの任意の組合せが含まれ得る。化学療法は癌細胞を破壊することができる薬品を用いる癌の治療である。現在の使用法では、用語化学療法は、標的型治療法と対照的に、急速に分裂する細胞に全般的に影響する細胞毒性薬品を通常意味する。化学療法薬品は可能な様々な方法で細胞分裂を妨害し、例えば、DNAの複製または新しく形成された染色体の分配を妨害する。正常な細胞は全般的にDNA損傷を修復できるが、多くの癌細胞がDNA損傷を修復できないことからある程度の特異性が生じる可能性があるが、化学療法の大半の種類は全ての急速に分裂する細胞を標的とし、そして、癌細胞に特異的ではない。大半の化学療法計画は組合せて施される。例示的な化学療法剤には、5-FU増強剤、9-AC、AG2037、AG3340、アグリカナーゼ阻害剤、アミノグルテチミド、アムサクリンm-AMSA、アスパラギナーゼ、アザシチジン、バチマスタットBB94、BAY12-9566、BCH-4556、ビス-ナフタルイミド、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスタインCarmustaineポリフェプロザン、cdk4/cdk2阻害剤、クロラムブシル、CI-994、シスプラチン、クラドリビン、CS-682、シタラビンHCl、D2163、Dアクチノマイシン、ダウノルビシンHCl、DepoCyt、デキシフォサミドDexifosamide、ドセタキセル、ドラスタインDolastain、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、DX8951f、E7070、EGFR、エピルビシン、エリスロポエチン、エストラムスチンリン酸ナトリウム、エトポシドVP16-213、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、FK317、フラボピリドール、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル5-FU、フルタミド、フラジリンFragyline、ゲムシタビン、ヘキサメチルメラミンHMM、ヒドロキシウレアヒドロキシカルバミド、イホスファミド、インターフェロンα-2a、インターフェロンα-2b、インターロイキン-2、イリノテカン、ISI641、クレスチン、レモナールDP2202、ロイプロリド酢酸LHRH放出因子類似体、レバミゾール、LiGLAγ-リノレン酸リチウム、ロジンシーズ、ロメテキソールLometexol、ロムスチンCCNU、マリミスタットMarimistat、メクロレタミンHClナイトロジェンマスタード、メゲストロール酢酸、メグラミンMeglamineGLA、メルカプトプリン、メスナ、ミトグアゾンメチル-GAG、メチルグリオキサールビス-グアニルヒドラゾン、MGBG、ミトタンo.p-DDD、ミトキサントロン、ミトキサントロンHCl、MMI270、MMP、MTA/LY231514、オクトレオチド、ODN698、OK-432、経口プラチナ、経口タキソイド、パクリタキセルTAXOL.RTM.、PARP阻害剤、PD183805、ペントスタチン2デオキシコホルマイシン、PKC412、プリカマイシン、プロカルバジンHCl、PSC833、ラリトレキセドRalitrexed、RASファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、RASガン遺伝子阻害剤、セムスチンメチル-CCNU、ストレプトゾシン、スラミン、クエン酸タモキシフェン、タキサン類似体、テモゾロミド、テニポシドVM-26、チオグアニン、チオテパ、トポテカン、チロシンキナーゼ、UFTテガフール/ウラシル、バルルビシン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンデシン、VX-710、VX-853、YM116、ZD0101、ZD0473/Anormed、ZD1839、ZD9331が含まれるが、これらに限定されない。肝線維症の治療または肝線維症の緩和の有効性は、例えば、肝線維症マーカーα-2-マクログロブリンa-MA、トランスフェリン、アポリポプロテインA1、ヒアルロン酸HA、ラミニン、N-末端プロコラーゲンIIIPIIINP、7SコラーゲンIV7S-IV、全ビリルビン、間接ビリルビン、アラニンアミノトランスフェラーゼALT、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼAST、AST/ALT、g-グルタミルトランスペプチダーゼGGT、アルカリホスファターゼALP、アルブミン、アルブミン/グロブリン、血液尿素窒素BUN、クレアチニンCr、トリグリセリド、コレステロール、高密度リポプロテインおよび低密度リポプロテインの定期的なモニターおよび肝臓吸引生検により評価され得る。治療の前初期測定値、および、その後、治療計画中後期測定値に肝線維症マーカーを測定することができ、および/または、肝臓吸引生検を実行することができる。後期測定値の初期測定値との比較により、医師にその治療が有効であるかどうかの指標が提供される。そのようなパラメータのうちのいずれか1つ、または、パラメータの任意の組合せを測定することにより治療または予防の有効性をモニターすることは、十分に当業者の能力の範囲内である。COL1A1を標的とするiRNAまたはその医薬組成物の投与との関連では、肝線維症症状に対して効果的であるとは、臨床的に適切な方法での投与が患者のうちの少なくとも統計的に有意な部分に、症状の改善、回復、疾患の負荷の減少、腫瘍体積または腫瘍細胞数の減少、寿命の延長、生活の質の改善などの有益な効果、または、肝線維症および関連する病因の治療に詳しい医師によって良いものとして一般に認められる他の効果をもたらすということを指す。肝線維症状態の1つ以上のパラメータマーカーに統計的に有意な改善が存在するとき、または、そうでなければ予期されるであろう症状の悪化または発生が起こらなかったことにより、治療効果または予防効果は明白である。例として、測定可能な疾患パラメータでの少なくとも10の望ましい変化、および好ましくは少なくとも20、30、40、50またはそれ以上の望ましい変化が有効な治療の指標であり得る。例えば、血清中の肝臓酵素活性のレベルの低下または血清アルブミンの増加がアルブミンを合成する肝臓の能力の改善を示す。当技術分野において公知であるような肝線維症の実験動物モデル、例えば、本明細書において記載されるマウスモデルを用いて所与のiRNA薬品またはその薬品の製剤の有効性を判定することもできる。実験動物モデルを用いるとき、マーカー、症状、または組織学的に検討される細胞外コラーゲンに統計的に有意な低減が観察されると、治療の有効性が証明される。ウイルスと寄生生物による感染症が炎症と肝線維症の原因となる可能性がある。いくつかの例は、ヘパドナウイルス科A型およびB型肝炎ウイルス、D型肝炎ウイルス、E型肝炎ウイルスおよび未分類のウイルス例えば、海綿状脳症の病因因子、B型肝炎ウイルスの不完全付随体であると考えられているデルタ肝炎の因子、非A型非B型肝炎の因子経腸的に伝播する=クラス1、非経口的に伝播する=クラス2すなわち、C型肝炎、ノルウォークウイルスおよび関連ウイルス、ならびにアストロウイルスである。例示的な寄生生物には、赤痢アメーバEntamoebahistolytica、マラリア原虫Plasmodium属の種熱帯熱マラリア原虫Plasmodiumfalciparum、四日熱マラリア原虫P.malariae、卵形マラリア原虫P.ovale、三日熱マラリア原虫P.vivax、線虫トリヒナTrichinellaspiralis、吸虫肝臓ジストマClonorchissinensis、マンソン住血吸虫Schistosomamansoni、ビルハルツ住血吸虫S.haematobiumおよび日本住血吸虫S.japonicumおよびそれらの任意の組合せが含まれるがこれらに限定されない。他の実施形態では、抗ウイルス医薬または抗ウイルス薬剤と組み合わせてCOL1A1、TGFβおよび/またはSMAD2/3を標的とするiRNAの投与が実行される。本明細書において記載される方法に有用な抗ウイルス薬剤の例には、免疫グロブリン、アマンタジン、インターフェロン、ヌクレオシド類似体およびプロテアーゼ阻害剤が含まれるがこれらに限定されない。抗ウイルス薬剤の具体的な例には、アセマンナン、アシクロビル、アシクロビルナトリウム、アデフォビル、アロブジン、アルビルセプトスドトックス、塩酸アマンタジン、アラノチン、アリルドン、メシル酸アテビルジン、アブリジン、シドフォビル、シパムフィリン、塩酸シタラビン、メシル酸デラビルジン、デスシクロビル、ジダノシン、ジソキサリル、エドクスジン、エンビラデン、エンビロキシム、ファムシクロビル、塩酸ファモチン、フィアシタビン、フィアルリジン、ホサリラート、ホスカメットナトリウム、ホスホネットナトリウム、ガンシクロビル、ガンシクロビルナトリウム、イドキシウリジン、ケトキサール、ラミブジン、ロブカビル、塩酸メモチン、メチサゾン、ネビラピン、ペンシクロビル、ピロダビル、リバビリン、塩酸リマンタジン、メシル酸サクイナビル、塩酸ソマンタジン、ソリブジン、スタトロン、スタブジン、塩酸チロロン、トリフルリジン、塩酸バラシクロビル、ビダラビン、リン酸ビダラビン、リン酸ビダラビンナトリウム、ビロキシム、ザルシタビン、ジドブジンおよびジンビロキシムが含まれるが、これらに限定されない。さらなる実施形態では、COL1A、TGFβおよび/またはSMAD2/3を標的とするiRNAの投与が抗寄生生物医薬または抗寄生生物薬剤と組み合わせて施される。抗寄生生物医薬は、感染性生物を殺すかその成長または機能を抑制する薬剤を意味する。殺寄生生物剤とも称される抗寄生生物医薬の本明細書において記載される方法に有用な例には、アルベンダゾール、アムホテリシンB、ベンズニダゾール、ビチオノール、塩酸クロロキン、リン酸クロロキン、クリンダマイシン、デヒドロエメチン、ジエチルカルバマジン、ジロキサニドフロエート、ドキシサイクリン、エフロミチンeflomithine、フラゾリダオンfurazolidaone、グルココルチコイド類、ハロファントリン、ヨードキノール、イベルメクチン、メベンダゾール、メフロキン、アンチモン酸メグルミン、メラルソプロール、メトリフォネート、メトロニダゾール、ニクロサミド、ニフルチモクス、オキサムニキン、パロモマイシン、イセチオン酸ペンタミジン、ピペラジン、プランジカンテル、リン酸プリマキン、プログアニル、パモ酸ピランテル、ピリメタンミン-スルホンアミド、ピリメタンミン-スルファドキシン、キナクリンHCl、硫酸キニン、グルコン酸キニジン、スピラマイシン、スチボグルコン酸ナトリウムグルコン酸ナトリウムアンチモン、スラミン、テトラサイクリン、チアベンダゾール、チミダゾールtimidazole、トリメトプリム-スルファメトキサゾールおよびトリパルサミドが含まれるが、これらに限定されず、これらのうちのいくつかは単体で使用される、または、他と組み合わせて使用される。同じ組成物中にiRNAと追加の治療薬を組み合わせて、例えば、非経口的に投与することができ、または、追加の治療薬を別個の組成物の部分として、もしくは、本明細書において記載される別の方法により投与することができる。1つの実施形態では、肝疾患または肝線維症の遠因、例えば、ウイルスまたは他の感染症、自己免疫疾患、胆管閉塞、代謝性疾患、過度の飲酒、原発性胆汁性肝硬変、NASH、化学物質への曝露および肝臓癌を治療すると知られている薬剤などの非iRNA治療薬と共にiRNAを投与する。非iRNA治療薬のいくつかの例が表2に示されている。別の実施形態では、本明細書において記載される特徴とされるiRNA、例えば、COL1A1、TGFβおよび/またはSMAD2/3を標的とするdsRNAは抗C型肝炎ウイルス薬剤などの非iRNA治療薬と共に投与される。例えば、C型肝炎ウイルスの感染症の治療のためにインターフェロンαと共に本明細書において取り上げられるiRNAを投与することができる。1つの実施形態では、iRNAはCOL1A1iRNAであり、そして、肝臓で細胞外にコラーゲンを過剰に沈着させることになる伝達経路に関与する第2の遺伝子を標的とする第2のiRNAと組み合わせてそのiRNAを投与する。例えば、その第2の遺伝子はTGFβ、SMAD2またはSMAD3をコードする遺伝子であり得る。1つの実施形態では、iRNAはCOL1A1iRNA、TGFβiRNAまたはSMAD2/3iRNAであり、活性化HSCにより産生されるプロコラーゲンの成熟に関与する第2の遺伝子であるコラーゲン特異的シャペロンのHSP47を標的とする第2のiRNAと組み合わせてそのiRNAを投与する。患者に0.01mg/kg、0.05mg/kg、0.1mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg、1.5mg/kg、2.0mg/kgまたは2.5mg/kgのdsRNAなどの治療用量のiRNAを投与することができる。ある期間の時間、例えば、5分、10分、15分、20分または25分の期間にわたってiRNAを静脈内点滴により投与することができる。例えば、定期的に、例えば1か月、2か月、3か月、4か月またはそれ以上の間に隔週ですなわち、二週間ごとに投与を繰り返す。最初の治療計画の後、より低い頻度で治療をほどこすことができる。例えば、3か月の間に隔週で投与した後に、6か月間、または、1年間またはそれ以上の間、1か月に1回投与を繰り返すことができる。iRNAの投与により、COL1A1のレベルが、例えば、患者の細胞、組織、例えば、肝臓組織または他の区画において少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80または少なくとも90またはそれ以上減少することができる。完全用量のiRNAを投与する前に、輸液反応を起こす用量の5用量などのより少ない用量を患者に投与し、アレルギー反応などの悪性効果、または、脂質レベルもしくは血圧の上昇について患者をモニターすることができる。別の例では、サイトカイン例えば、TNF-αまたはIFN-αレベルの上昇などの望まない免疫刺激性効果について患者をモニターすることができる。COL1A1の発現への阻害的効果のため、本発明による組成物またはそれより調製された医薬組成物は、不可逆的な肝臓損傷が防がれ得るという点で、生活の質を向上させることができ、そして、生存時間を延長させることができる。他に定義されていない限り、本明細書において使用されている全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により共通して理解されるものと同じ意味を持つ。本発明において取り上げられるiRNAと方法の実施または試験に、本明細書において記載されるものと類似または同等の方法および材料を用いることができるが、適切な方法と材料が以下に記載される。本明細書において言及される全ての特許公開、特許申請、特許、および他の参照文献の全体を参照して本明細書に組み入れる。矛盾がある場合は、定義を含み本明細書が優先する。さらに、材料、方法および実施例は例示だけを目的とし、限定を意図するものではない。実施例1:干渉RNAiRNA合成試薬の供給元本明細書において試薬の供給元が具体的に教示されていない場合、分子生物学での適用に標準的な品質/純度の分子生物学用試薬の任意の供給会社からそのような試薬を得ることができる。オリゴヌクレオチド合成申請者らは、本明細書において記載されるiRNA分子を生成するためにいくつかの異なる方法を用いている。本実施例は、使用している1つの方法を記述するものである。当業者は、本明細書において記載されるようなiRNAを調製するために当技術分野において公知の任意の方法を用いることができる。AKTAオリゴパイロットシンセサイザー上でオリゴヌクレオチドを合成する。市販されている多孔質ガラスcontrolledporeglass固形支持体dT-CPG、500Å、PrimeSynthesisおよび標準的な保護基を有するRNAホスホラミダイトである5-O-ジメトキシトリチルN6-ベンゾイル-2-t-ブチルジメチルシリル-アデノシン-3-O-N,N-ジイソプロピル-2-シアノエチルホスホラミダイト、5-O-ジメトキシトリチル-N4-アセチル-2-t-ブチルジメチルシリル-シチジン-3-O-N,N-ジイソプロピル-2-シアノエチルホスホラミダイト、5-O-ジメトキシトリチル-N2--イソブトリル-2-t-ブチルジメチルシリル-グアノシン-3-O-N,N-ジイソプロピル-2-シアノエチルホスホラミダイトおよび5-O-ジメトキシトリチル-2-t-ブチルジメチルシリル-ウリジン-3-O-N,N-ジイソプロピル-2-シアノエチルホスホラミダイトPierceNucleicAcidsTechnologiesと共にオリゴヌクレオチド合成のために使用した。Promegaから2-Fホスホラミダイト、5-O-ジメトキシトリチル-N4-アセチル-2-フルオロ-シチジン-3-O-N,N-ジイソプロピル-2-シアノエチル-ホスホラミダイトおよび5-O-ジメトキシトリチル-2-フルオロ-ウリジン-3-O-N,N-ジイソプロピル-2-シアノエチル-ホスホラミダイトを購入している。グアノシンを除く全てのホスホラミダイトをアセトニトリルCH3CN中に0.2Mの濃度で使用し、10THF/ANC体積/体積中に0.2Mの濃度でグアノシンを使用する。16分のカップリング/リサイクル時間を用いる。活性化剤は5-エチルチオテトラゾール0.75M、AmericanInternationalChemicalsであり、PO-酸化にはヨウ素/水/ピリジンを使用し、PS-酸化には2,6-ルチジン/ACN1:1体積/体積中のPADS2を使用する。3-リガンド複合体化鎖を、対応するリガンドを含有する固形支持体を使用して合成する。例えば、ヒドロキシプロリノール-コレステロールホスホラミダイトから配列中へのコレステロール単位の導入を実行する。6-アミノヘキサン酸エステル結合を介してコレステロールをtrans-4-ヒドロキシプロリノールに連結してヒドロキシプロリノール-コレステロール部分を得る。5末端をCy-3およびCy-5.5蛍光団で標識したiRNAを、BiosearchTechnologies社より購入する対応するQuasar-570Cy-3ホスホラミダイトから合成する。保護化リガンド-ホスホラミダイト構成単位を適切に使用することにより5末端および/または内部位置へのリガンドの複合体化を達成する。5-エチルチオ-1H-テトラゾール活性化剤の存在下での固形支持体結合オリゴヌクレオチドへの無水CH3CN中の0.1Mホスホラミダイト溶液の15分に延長したカップリング。1で報告されるような標準的なヨウ素‐水法を用いて、または、tert-ブチルヒドロペルオキシド/アセトニトリル/水10:87:3での処理によりヌクレオチド間亜リン酸エステルのリン酸エステルへの酸化を行い、10分の酸化待機時間がオリゴヌクレオチドを複合体化する。DDTTAMChemicalsより購入、PADSおよび/またはBeaucage試薬などのイオウ転移試薬を用いることにより亜リン酸エステルをチオリン酸エステルへ酸化してチオリン酸エステルを導入する。コレステロールホスホラミダイトを自作で合成し、ジクロロメタン中に0.1Mの濃度で使用する。コレステロールホスホラミダイト用のカップリング時間は16分である。脱保護Iヌクレオ塩基脱保護合成の完了後、100mLのガラスボトルVWRに前記支持体を移す。80mLのエタノールアンモニア混合液[アンモニア:エタノール3:1]を55°Cで6.5時間用いて塩基とリン酸エステル基を同時脱保護することにより、オリゴヌクレオチドを支持体から切り離す。ボトルを氷上で一時的に冷却し、次に前記エタノールアンモニア混合液を濾過して新しい250mLのボトルに移す。1部40mLのエタノール/水1:1体積/体積で2回、前記多孔質ガラスCPGを洗浄する。前記混合液の体積を次にロータリーエバポレーターにより約30mLに減少させる。次に、前記混合液をドライアイス上で凍結し、真空乾燥機を用いて真空で乾燥させる。脱保護II2-TBDMS基の除去26mLのトリエチルアミン、トリエチルアミン三フッ化水素酸塩TEA3HFまたはピリジン-HFおよびDMSO3:4:6に前記乾燥残留物を再懸濁し、2位のtert-ブチルジメチルシリルTBDMS基を取り除くために60°Cで90分間加熱する。次に、50mLの20mM酢酸ナトリウムを用いて反応を抑制し、pHを6.5に調整する。精製までオリゴヌクレオチドを冷凍庫に貯蔵する。分析精製の前に高速液体クロマトグラフィーHPLCによりオリゴヌクレオチドを分析する。緩衝液とカラムの選択は、配列および/または複合体化されたリガンドの性質に依る。HPLC精製逆相分取HPLCによりリガンド複合体化オリゴヌクレオチドを精製する。自分で充填したTSKゲルカラムでの陰イオン交換HPLCにより複合体化しなかったオリゴヌクレオチドを精製する。緩衝液は、10CH3CN中の20mMリン酸ナトリウムpH8.5緩衝液Aと10CH3CN、1MNaBr中の20mMリン酸ナトリウムpH8.5である。全長のオリゴヌクレオチドを含む画分をプールし、脱塩し、そして、凍結乾燥する。およそ0.15の分光密度ODの脱塩化オリゴヌクレオチドを150μLまで水に希釈し、次に、CGEおよびLC/MS分析のための特別なバイアルにピペットで分注する。次に化合物をLC-ESMSとCGEにより分析する。iRNA調製iRNAの一般的な調製には、1xPBS中で等モル量のセンス鎖とアンチセンス鎖を95°Cで5分間加熱し、そして、室温までゆっくりと冷やす。二重鎖が完全体であることをHPLC分析により確認する。標準的な命名法を用いて核酸配列を以下に表記し、表1の略語を特に以下に表す。表1核酸配列表記に用いられるヌクレオチドモノマーの略語。オリゴヌクレオチド内にこれらのモノマーが存在するとき、それらは相互に5-3ホスホジエステル結合により結合していると理解されるであろう。実施例2:COL1A1、TGFβ、SMAD2/3siRNAの設計および合成転写物ヒトコラーゲン1A1分子COL1A1、ヒトトランスフォーミング増殖因子β1TGFβ、SMADファミリーメンバー2および3をコードする遺伝子、ならびにマウスMusmusculusおよびラットRattusnorvegicus由来のオルソロガスな配列を標的とするsiRNAを特定するためにオリゴヌクレオチドの設計を行った。その設計の過程でヒトCOL1A1mRNANM_000088.3配列番号172、マウスCOL1A1mRNANM_007742.3配列番号173、ヒトTGFβmRNANM_000660.4配列番号174、マウスTGFβmRNANM_011577.1配列番号175、4つのヒトSMAD3mRNANM_001145102.1配列番号180、NM_001145103.1配列番号181、NM_001145104.1配列番号182、およびNM_005902.3配列番号183、マウスSMAD3mRNANM_016769.4配列番号184を用い、3つのヒトSMAD2mRNAはNM_001003652.2配列番号176、NM_001135937.1配列番号177、およびNM_005901.4配列番号178であり、ならびにマウスSMAD2mRNAはNM_010754.4である。NCBIRefseqコレクションから全ての配列を得た。2セットのオリゴを設計した。ヒトCOL1A1に100同一であるがマウスまたはラットでは100未満同一であるヒト特異的オリゴセット、および、ヒト、非ヒト霊長類、マウスのCOL1A1転写物および両方のラットCOL1A1転写物に100同一である第2siRNAセット。マウスSMAD2NM_010754とマウスSMAD3NM_016769に対して100の同一性を有するオリゴのセットを設計した。TGFβについては、ヒト配列とマウス配列に対して100の同一性を有するオリゴのセットを設計した。siRNAの設計と特異性予測19塩基長のオリゴセットの特異性を各配列から予測した。COL1A1、TGFβおよびSMAD2/3のsiRNAを、それらそれぞれのヒト、またはマウスおよびラットのNCBIRefseqセット内でNM_recordおよびXM_recordとして定義されるトランスクリプトームに対するFASTAアルゴリズムを用いる包括的な検索に使用した。次に、アラインメントをパースし、そして、siRNAと任意の潜在的なオフターゲット転写物の間のミスマッチの位置と数に基づいてスコアを生成するためにofftargetFasta.pyという名称のPythonスクリプトを使用した。siRNAのシード領域での、その分子の5末端から2~9の位置での差異を強調するために、オフターゲットスコアに荷重がかけてある。次のようにオフターゲットスコアを計算する。オリゴと転写物の間のミスマッチにペナルティーが与えられる。オリゴの位置2~9中のシード領域での1つのミスマッチに2.8のペナルティーが与えられ、推定上の切断部位10および11でのミスマッチに1.2のペナルティーが与えられ、および、他の全てのミスマッチに1のペナルティーが与えられる。次に、ミスマッチペナルティーを合計して各オリゴ‐転写物対についてのオフターゲットスコアを計算する。次に、全てのオリゴ‐転写物対由来の最小のオフターゲットスコアを決定し、そして、その後のオリゴの分別に用いる。計算されたスコアに従って、特異性でsiRNAの両鎖を分類した。3より高いスコアは非常に特異的であるとみなされ、3に等しいスコアは特異的であるとみなされ、そして、2.2と2.8の間のスコアは適度に特異的であるとみなされる。どのオリゴを合成するか選択するときに、我々はアンチセンス鎖のオフターゲットスコアによって高いものから低いものまで分類し、そして、最も良いオフターゲットスコアが最も低いオリゴ対を選んだ。COL1A1、TGFβおよびSMAD2/3のRNA配列の合成MerMade192シンセサイザーでCOL1A1、TGFβおよびSMAD2/3のiRNA配列を1μmolの規模で合成した。以下に詳述するように、配列表中の全ての配列についてエンドライト化学を適用した。●センス鎖中の全てのピリミジン類シトシンおよびウリジンが2-O-メチル塩基2O-メチルCおよび2-O-メチルUを含んだ。●アンチセンス鎖では、リボAヌクレオシドに5位の方向に隣接するピリミジン類はそれらに対応する2-O-メチルヌクレオシドで置き換えられた。●センス配列およびアンチセンス配列の両方の3末端に2塩基のdTsdT伸長部が導入された。●MerMade192合成ソフトウェアでのローディングに適合するように配列ファイルをテキストファイルに変換した。合成、切断および脱保護ホスホラミダイト化学を用いる固形物支持型オリゴヌクレオチド合成をCOL1A1、TGFβおよびSMAD2/3のRNA配列の合成に用いた。96ウェルプレート中で上記の配列の合成を1umの規模で実行した。0.1Mの濃度で前記アミダイト溶液を調製し、そして、アセトニトリル中に0.6Mの濃度のエチルチオテトラゾールを活性化剤として用いた。第1工程でメチルアミンを用い、そして、第2工程でフッ化物試薬を用いて合成した配列を96ウェルプレート中で切断し、そして、脱保護化した。アセトン:エタノール80:20混合液を用いて粗製の配列を沈殿させ、そして、0.02Mの酢酸ナトリウム緩衝液中に沈殿物を再懸濁した。各配列の試料をLC-MSで分析して同一性を確認し、紫外線で分析して定量し、そして、選択した試料セットをイオン交換IEXクロマトグラフィーにより分析して純度を測定した。精製および脱塩Source15Qカラムを使用するAKTAエクスプローラー精製システムでCOL1A1、TGFβおよびSMAD2/3のRNA配列を精製した。精製中にカラム温度を65°Cに維持した。96ウェル1.8mLのディープウェルプレートにおいて試料注入および回収を実行した。全長の配列に相当する1つのピークを溶離液中に回収した。AKTAピューリファイアーを使用してSephadexG25カラムで精製された配列を脱塩した。脱塩したCOL1A1配列、TGFβ配列およびSMAD2/3配列をA260での紫外線測定により濃度およびイオン交換HPLCにより純度について分析した。次に、一本鎖をアニーリングさせた。実施例3:NIH3T3細胞でのCOL1A1siRNAのインビトロスクリーニング細胞培養および形質移入トリプシン処理によりプレートから剥がす前に、5のCO2濃度の大気中、37°C、10FBSを添加したDMEMINVITROGEN商標でNIH3T3細胞を集密近くまで増殖させた。96ウェルプレートに1ウェルあたり10μlのOpti-MEMと0.2μlのリポフェクタミンRNAiMaxINVITROGEN商標、Carlsbad、カリフォルニア州、カタログ番号13778-150と共に1ウェルあたり5μlのsiRNA二重鎖に5μlのOpti-MEMを加えてリバーストランスフェクションを実行し、室温で15分間保温した。前記形質移入ミックスに細胞を加え、そして、RNA精製の前に24時間培養した。複数のCOL1A1二重鎖の各々を用いる単一用量スクリーンについて、10nMの最終二重鎖濃度で実験を実行した。10nMの単一用量スクリーンで強いサイレンシングを示す10個の二重鎖のサブセットを、段階希釈を用いて10nMから10fMまでの濃度範囲にわたって試験して、それらのIC50を決定した。選択したAD21349配列番号53および配列番号54は65pMのIC50を有する。試験されたsiRNAはげっ歯類、非ヒト霊長類NHPおよびヒトと交差反応した図1を参照のこと。MagMAX-96全RNA単離キットAppliedBiosystem、ForerCity、カリフォルニア州、製品番号:AM1830を用いる全RNA単離細胞を回収し、そして、140μlの溶解/結合溶液中に溶解し、次にEppendorfのサーモミキサーを用いて850rpmで1分間混合したその過程を通して混合速度は同じであった。20マイクロリッターの磁気ビーズおよび溶解/結合促進混合液を細胞溶解物に加え、そして、5分間混合した。磁気スタンドを使用して磁気ビーズを捕捉し、そして、ビーズをかき乱すことなく上清を除去した。上清を除去した後に磁気ビーズをイソプロパノールを添加した洗浄溶液1で洗浄し、そして、1分間混合した。再びビーズを捕捉し、そして、上清を除去した。次に、ビーズを150μlのエタノールを添加した洗浄溶液2で洗浄し、捕捉し、そして、上清を除去した。次に50μlのDNase混合液MagMaxターボDNase緩衝液およびTurboDNaseをビーズに加え、そして、それらを10~15分間混合した。混合した後に100μlのRNA再結合溶液を加え、そして、3分間混合した。上清を除去し、そして、磁気ビーズを150μlの洗浄溶液2で再び洗浄し、そして、1分間混合し、そして、上清を完全に除去した。磁気ビーズを2分間混合して乾燥させた後にRNAを50μlの水に溶出した。ABI高能力cDNA逆転写キットAppliedBiosystems、FosterCity、カリフォルニア州、カタログ番号4368813を使用するcDNA合成一反応当たり2μlの10×緩衝液、0.8μlの25×dNTP混合物、2μlのランダムプライマー、1μlの逆転写酵素、1μlのRNase阻害剤および3.2μlの水のマスターミックスを10μlの全RNAに加えた。MJResearchまたはBio-RadC-1000もしくはS-1000サーマルサイクラーHercules、カリフォルニア州を使用して次の工程でcDNAを生成した:25°C10分、37°C120分、85°C5秒、4°Cで保持。リアルタイムPCRLightCycler480用384ウェルプレートRoche、カタログ番号0472974001に1ウェルあたり合計で10μlの中に0.5μlのGAPDH用TaqManプローブAppliedBiosystems、カタログ番号4326317E、0.5μlのCOL1A1、TGFβまたはSMAD2/3用TaqManプローブおよび5μlのRocheProbesMasterMixRoche、カタログ番号04887301001を含むマスターミックスに2μlのcDNAを加えた。LightCycler480リアルタイムPCRマシーンRocheでリアルタイムPCRを行った。少なくとも2回の独立した形質移入で各二重鎖を試験した。各形質移入をqPCRで2回試験した。ΔΔCt方法を用いてリアルタイムデータを解析した。GAPDHの発現に対して各試料を正規化し、そして、非ターゲティング二重鎖のAD-1955で形質移入された細胞に対してノックダウンを評価した。XLfitソフトウェア中の4パラメータフィットモデルを用いてIC50を明らかにした。図1に示されるように、NIH-3T3細胞中での単一用量のコラーゲン1A1siRNAの効果をインビトロで検討した。siRNAAD-21349配列番号53および配列番号54はCOL1A1mRNAの産生について約65pMのIC50を有する。実施例4:四塩化炭素CCl4誘導マウス肝線維症モデル一般的に、肝臓傷害は多くの要因、例えば、四塩化炭素CCl4、ジアメチルニトロザミンおよびチオアセトアミドなどの毒性化学物質、例えば、異種血清に対するインビボでの免疫反応および住血吸虫やウイルスなどの病原体に起因する損傷、胆管線維症に至る総胆管の結紮、ならびに過度の飲酒により引き起こされ得る。エタノール飼料で飼育されたヒヒおよびラットのツカモト/フレンチモデルがアルコール性肝臓傷害動物モデルの例である。本明細書における実験マウスモデルの使用は、化学物質CCl4で肝臓傷害が誘導されるものである。このマウスモデルはよく研究されている肝線維症の化学誘導モデルである。CCl4処理マウスで観察される肝臓の病理変化には、血清アラニンアミノトランスフェラーゼ活性の上昇と共にネクローシス、炎症および線維症が含まれる。いくつかのマイクロアレイでの研究により、肝臓での長期の線維性変化とよく相関するプロコラーゲンタイプ1AJiangYetal2004ToxicolSci79404410などの肝臓線維形成に関与する遺伝子のCCl4誘導性上方調節が示された。第1日と第8日にミネラルオイルMO中に1.75ml/kgの濃度のCCl4を用いてBalb/c動物に経口強制投与が施された。CCl4の最初の投与から24時間後に血清中肝臓酵素レベルを測定した。第10日または第11日に前記動物を殺処理し、シリウスレッドで肝臓の組織像を染色して細胞外コラーゲンのレベルを測定した。CCl4の初回投与の24以内に2つの肝機能バイオマーカー酵素であるアラニントランスアミナーゼALTおよびアスパラギン酸トランスアミナーゼASTが上昇したように、コラーゲンの発現レベルが著しく上昇した。同様に、CCl4処理マウスの肝臓は、対照ミネラルオイル処理動物と比較して、シリウスレッド染色による細胞外コラーゲンの染色の増大を示した。実施例5:CCl4マウスモデルでのCOL1A1siRNAのインビボ試験CCl4マウスモデルでのCOL1A1ノックダウン用siCOL1A1のAF09およびAF12ベースの送達を評価するために、第1日および第8日に経口強制投与により2回1.75ml/kgの最終用量でCCl4を用いてBalb/c動物に肝臓傷害を誘導した。対照動物にはミネラルオイルだけが与えられた。その後、第9日にAF09およびAF12製剤化siRNAを前記マウスに静脈内注入し、次に、第11日のsiRNA注入後約40時間で前記マウスを殺処理した。使用した対照siRNAはsiLUCAD1955であった。siCOL1A1AD21349配列番号53および配列番号54とsiLUCAD1955の両方の投与量は3mg/kgであった。Taqman-定量PCRを用いて肝臓でのCOL1A1およびGAPDHのmRNAレベルを分析した。1条件1群あたり合計で10~15匹の動物を用いた。COL1A1mRNAのレベルをGAPDHmRNAレベルのそれに対して正規化した。図2はCCl4/siRNA処理計画を示し、そして、図3は得られた結果を要約する。AF09およびAF12製剤化siCOL1A1AD21349配列番号53および配列番号54の両方が、対照siLUCsiRNAと比較してCCl4処理マウスでCOL1A1mRNAレベルのレベルを著しく減少させた。さらに、3mg/KgではAF12-21349配列番号53および配列番号54を用いるCOL1A1ノックダウンがAF09-21349よりも優れていた。CCl4処理マウスモデルでのAF12ベースの送達によるsiCOL1A1の用量反応を評価するために、第1日および第8日に経口強制投与により2回1.75ml/kgの最終用量でCCl4を用いてBalb/c動物に肝臓傷害を誘導した。対照動物にはミネラルオイルだけが与えられた。第9日にAF12製剤化siRNAを様々な投与量で前記マウスに静脈内注入し、次に、第11日のsiRNA注入後約40時間で前記マウスを殺処理した。使用した対照siRNAはAF12_LUCAD1955であった。AF12_COL1A1AD21349配列番号53および配列番号54とsiLUCAD1955の両方の投与量は、0.1mg/kgから3mg/kgまでの範囲であった。Taqman-定量PCRを用いて肝臓でのCOL1A1およびGAPDHのmRNAレベルを分析した。1投与量1群あたり合計で10匹の動物を用い、ミネラルオイル対照群に5匹の動物を用いた。COL1A1mRNAのレベルをGAPDHmRNAレベルのそれに対して正規化した。図4はCCl4/siRNA処理計画での用量反応を示し、そして、図5は得られた結果を要約する。3mg/kg、1mg/kgおよび0.5mg/kgの投与量でのAF12_COL1A1AD21349配列番号53および配列番号54製剤が、対照siLUCsiRNAと比較してCCl4処理マウスでCOL1A1mRNAレベルのレベルを著しく減少させた。AF12-AD21349配列番号53および配列番号54を用いるCOL1A1ノックダウンについて、ED50は約0.1mg/kgであった。データはAF12_Lucに対して正規化された。マウスモデルでのsiCOL1A1のAF11ベースの送達を評価するために、第1日および第7日に経口強制投与により2回1.75ml/kgの最終用量でCCl4を用いてBalb/c動物に肝臓傷害を誘導した。対照動物にはミネラルオイルだけが与えられた。第8日にAF11製剤化siRNAを様々な投与量で前記マウスに静脈内注入し、次に、第10日のsiRNA注入後約40時間で前記マウスを殺処理した。使用した対照siRNAはsiLUCAD1955であった。COL1A1AD21349配列番号53および配列番号54とsiLUCAD1955の両方の投与量は3mg/kgであった。Taqman-定量PCRを用いて肝臓でのCOL1A1およびGAPDHのmRNAレベルを分析した。1投与量1群あたり合計で10匹の動物を用い、ミネラルオイル対照群に5匹の動物を用いた。COL1A1mRNAのレベルをGAPDHmRNAレベルのそれに対して正規化した。図6はCCl4/AF11-siRNA処理計画を示し、そして、図7は得られた結果を要約する。3mg/kgの投与量でのAF11_COL1A1AD21349配列番号53および配列番号54製剤が、対照siLUCsiRNAと比較してCCl4処理マウスでCOL1A1mRNAレベルのレベルを著しく減少させた。AF11-AD21349製剤を用いておよそ65のCOL1A1mRNAノックダウンが達成された。データはAF12_Lucに対して正規化された。肝星細胞HSCは肝線維症中の異常なマトリックス沈着の主要な原因である。これらの細胞は、慢性肝疾患の両方で静止した状態のHSCから活性化された線維形成性筋線維芽細胞への分化転換を経る。その分化転換は、細胞増殖、平滑筋αアクチンα-SMAの発現を有する形態変化および細胞外マトリックスタンパク質、原線維性コルゲンの沈着を特徴とするFriedmanetal1992Hepatology15234243Friedman2000JBiolChem27522472250。UemuraM.ら2005MolBiolCell1642144224は、一次ラットHSCでのSMAD3の過剰発現と一次ラットHSCのTGFβでの処理が接着斑とαSMA組織を増加させることを示した。このことは、TGFβが、SMAD3を介してシグナルを伝達して、活性化HSCまたは筋線維芽細胞の形態学的な、および機能上の成熟に重要な役割を果たしていることを示している。AFベースのすなわち、AF09、AF11、AF12ベースの製剤送達方法がCCl4処理マウス中の活性化HSCまたは筋線維芽細胞にsiRNAをまさに送達したことを確認するために、活性化HSCで過剰発現されてもいるα-SMAのノックダウンを、AF09_ACTA2を使用して判定した。α-SMAは活性化筋線維芽細胞および血管平滑筋細胞に存在するが肝細胞には存在しないので、α-SMAを標的として選択した。図8は、CCl4処理マウスの肝臓細胞でのACTA2の発現ノックダウンを示した。このデータにより、CCl4処理マウス中のHSCへのAF09-ACTA2の送達が確認された。実施例6:NIH3T3細胞でのTGFβsiRNAのインビトロスクリーニングNIH3T3細胞を増殖させ、培養し、そして、用いたsiRNAがトランスフォーミング増殖因子β1TGFβ遺伝子を標的としたこと以外は実施例3に記載されるようにsiRNAで処理した。複数のTGFβ二重鎖の各々を用いる単一用量スクリーンについて、10nMの最終二重鎖濃度で実験を実行した図9。10nMの単一用量スクリーンで強いサイレンシングを示す10個の二重鎖のサブセットを、段階希釈を用いて10nMから10fMまでの濃度範囲にわたって試験して、それらのIC50を決定した。選択したsiRNAであるAD22149配列番号91および配列番号92およびAD22138配列番号69および配列番号70はTGFβのmRNAにそれぞれ約20pMおよび約70pMのIC50を有する。試験されたsiRNAはげっ歯類、NHPおよびヒトと交差反応した。実施例7:NIH3T3細胞でのSMAD2siRNAのインビトロスクリーニングNIH3T3細胞を増殖させ、培養し、そして、用いたsiRNAがSMADファミリーメンバー2および3SMAD2およびSMAD3遺伝子を標的としたこと以外は実施例3に記載されるようにsiRNAで処理した。複数のSMAD2/3二重鎖の各々を用いる単一用量スクリーンについて、10nMの最終二重鎖濃度で実験を実行した図10。10nMの単一用量スクリーンで強いサイレンシングを示す10個の二重鎖のサブセットを、段階希釈を用いて10nMから10fMまでの濃度範囲にわたって試験して、それらのIC50を決定した。選択したsiRNAであるAD-20916配列番号140および配列番号141はSMAD2のmRNAに約75pMのIC50を有する。実施例8:CCl4マウスモデルでのSMAD2siRNAのインビボ試験SMADは線維症発生でのTGFβシグナル伝達に関与しているので、SMADの発現をノックダウンすると肝臓傷害マウスモデルでのCOL1A1の発現が影響を受けるかどうか検討した。CCl4マウスモデルでのSMAD2ノックダウン用siSMAD2AD-20916配列番号140および配列番号141のLNPベースの送達を評価するために、第0日に経口強制投与により2回1.75ml/kgの用量でCCl4を用いてBalb/c動物に肝臓傷害を誘導した。対照動物にはミネラルオイルだけが与えられた。第2日にLNP製剤化siRNAを前記マウスに静脈内注入し、次に、CCl4誘導後第4日に前記マウスを殺処理した。対照siRNAはsiLUCAD1955であった。siSMAD2/3AD-20916配列番号140および配列番号141とsiLUCAD1955の両方の投与量は3mg/kgであった。Taqman-定量PCRを用いて肝臓でのSMAD2およびGAPDHのmRNAレベルを分析した。1条件1群あたり合計で10匹の動物を用いた。SMAD2mRNAのレベルをGAPDHmRNAレベルのそれに対して正規化した。図11は得られた結果を要約する。siSMAD2/3AD-20916配列番号140および配列番号141は対照siLUCsiRNAと比較してCCl4処理マウスでSMAD2/3mRNAレベルのレベルを著しく減少させた。SMAD2発現の減少はおよそ80であった。CCl4マウスモデルでのSMAD2ノックダウン用siSMAD2AD-20916配列番号140および配列番号141のLNPベースの送達とCOL1A1の発現へのその効果を評価するために、第0日に経口強制投与により2回1.75ml/kgの用量でCCl4を用いてBalb/c動物に肝臓傷害を誘導した。対照動物にはミネラルオイルだけが与えられた。第2日にLNP製剤化siRNAを前記マウスに静脈内注入し、次に、CCl4誘導後第4日に前記マウスを殺処理した。対照siRNAはsiLUCAD1955であった。siSMAD2/3AD-20916配列番号140および配列番号141とsiLUCAD1955の両方の投与量は3mg/kgであった。Taqman-定量PCRを用いて肝臓でのSMAD2、COL1A1およびGAPDHのmRNAレベルを分析した。1条件1群あたり合計で10匹の動物を用いた。SMAD2mRNAのレベルをGAPDHmRNAレベルのそれに対して正規化した。図12は得られた結果を要約する。siSMAD2AD-20916のLNPベースの送達を用いるSMAD2のノックダウンにより、CCl4処理マウスでのCOL1A1の発現が減少した。LucsiRNA注入動物に対して、その減少は約50~60であった。実施例9:慢性肝疾患のマウスモデルでのCOL1A1siRNA性阻害のインビボでの実証肝臓に対する反復性損傷により慢性肝疾患が引き起こされ、その結果、最終的には肝線維症および硬変になる肝臓破壊および肝臓退縮の進行性のプロセスに入る。肝臓に対するそのような反復性損傷の条件でCOL1A1の効果的な阻害が仲介され得るかどうか、および、そのような状況でそのような処理が線維症の低減に効果的であるかどうか評価するために、複数回の損傷を含む慢性肝臓傷害のマウスモデルを確立し、そして、COL1A1のノックダウン用のCOL1A1に対するsiRNAの反復投与の効果を測定した。この慢性肝臓傷害のマウスモデルでは、第1日、第8日、第15日、第22日、第29日および第36日に経口強制投与により1.75ml/kgの最終用量でCCl4を用いてBalb/c動物に肝臓傷害を誘導した。これらの同じ日に対照動物にはミネラルオイルだけが与えられた。第23日、第27日、第30日、第33日および第37日にAF09およびAF12製剤化COL1A1siRNAを前記マウスに静脈注入し、次に、最後のsiRNA注入後の約40~48時間で、すなわち、第39日で前記マウスを殺処理した。使用した対照siRNAはsiLUCAD1955であった。siCOL1A1AD21349配列番号53および配列番号54とsiLUCAD1955の両方の投与量は1mg/kgであった。Taqman-定量PCRを用いて肝臓でのCOL1A1およびGAPDHのmRNAレベルを分析した。1条件1群あたり合計で10匹の動物を用いた。COL1A1mRNAのレベルをGAPDHmRNAレベルのそれに対して正規化した。図13は得られた結果を要約する。驚くことに、siCOL1A1AD21349配列番号53および配列番号54のC12ベースの送達を用いるCOL1A1のノックダウンにより、39日の期間にわたって複数回の肝臓損傷6回を受けたマウスでCOL1A1の発現が著しく、および、予期せず減少した。LucsiRNA注入動物に対して、その減少は約95であった。実施例10:慢性肝疾患のマウスモデルCCl4モデル、TAAモデルおよび胆管結紮モデルでのCOL1A1siRNA性阻害のインビボでの実証CCl4モデルでは、肝臓損傷が中心静脈周辺領域のみへ非常に集中することになり、したがって、CCl4モデルは肝臓の中心静脈周辺領域への肝臓損傷の良いモデルである。TAAモデルでは、一様な肝臓損傷すなわち、中心静脈周辺性および門脈周囲性肝臓損傷となる。TAAモデルはCCl4モデルよりも時間がかかり、したがって、TAAモデルはヒト集団に発生する肝臓傷害をより厳密に模倣していると考えられる。胆管の結紮またはカニューレ挿入が胆管結紮モデルに介在する。このモデルは胆管周辺領域をもたらし、そして、このモデルはヒトでの胆管線維症の良いモデルである。他の2つのモデルと対照的に、胆管結紮モデルでは、結果として継続性および進行性傷害、すなわち慢性肝疾患になる。図16は、胆管結紮マウスモデルでのsiCOL1A1AD21349配列番号53および配列番号54のAF12ベースの送達を用いるCOL1A1ノックダウンの実験計画および効果を示す。図17は胆管結紮動物での相対的なCol1a1発現を示す。図18は、胆管結紮マウスモデルでのsiCOL1A1AD21349配列番号53および配列番号54を用いるCOL1A1ノックダウンの効果を示す。図19は、肝臓傷害のTAAマウスモデルでのsiCOL1A1AD21349配列番号53および配列番号54を用いるCOL1A1ノックダウンの実験計画および効果を示す。表2治療することにより線維形成が低減することができる基礎疾患の例表3COL1A1siRNA二重鎖表4TGF-βsiRNA二重鎖表5SMAD2/3siRNA二重鎖表6マウスCol1a1転写物NM_007742.3配列番号173と交差反応するヒトCOL1A1転写物NM_000088.3配列番号172に基づいて設計されたヒトCOL1A1iRNA配列表7トランスフォーミング増殖因子βiRNA配列表8一般的に用いられる肝線維症の病期分類スコアBattsKPLudwigJChronichepatitisAnupdateonterminologyandreportingAmJSurgPathol199519140917DesmetVJGerberMHoofnagleJHMannsMScheuerPJClassificationofchronichepatitisdiagnosisgradingandstagingHepatology199419151320IshakKBaptistaABianchiLCalleaFDeGrooteJGudatFetalHistologicalgradingandstagingofchronichepatitisJHepatol1995226969KnodellRGIshakKGBlackWCChenTSCraigRKaplowitzNKiernanTWWollmanJFormulationandapplicationofanumericalscoringsystemforassessinghistologicalactivityinasymptomaticchronicactivehepatitisHepatology198114315SchirmacherPFleigWEDienesHPZGastroenterol20044217585表9肝臓の一般的なマーカー"