"BMP-2に対し親和性をもち、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22及びこれらのフラグメントからなる群から選択される、ペプチド。生体適合性の生分解性ポリマーと、BMP-2に対し親和性をもつ少なくとも1つのペプチドと、を含む、親和性バイオマトリックス。前記親和性ペプチドが、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21及び配列番号22からなる群から選択される、請求項2に記載の親和性バイオマトリックス。前記生体適合性の生分解性ポリマーが天然ポリマーである、請求項2に記載の親和性バイオマトリックス。前記天然ポリマーが、コラーゲン、エラスチン、ケラチン、絹、多糖、GAG及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項4に記載の親和性バイオマトリックス。前記天然ポリマーがコラーゲンである、請求項5に記載の親和性バイオマトリックス。前記天然ポリマーが、皮膚、骨膜、軟骨膜、滑膜、筋膜、腸間膜、骨及び腱からなる群から選択される脱細胞化組織である、請求項6に記載の親和性バイオマトリックス。親和性バイオマトリックスとBMP-2とを含む、制御放出デバイス。前記デバイスが、スポンジ、粒子、注射可能なゲル、注射可能な液体、膜、フィルム、繊維及び繊維系スカフォールドからなる群から選択される形態をしている、請求項8に記載の制御放出デバイス。親和性バイオマトリックスとBMP-2とを含む、キット。したがって、BMP-2に対する制御放出デバイスを製造する方法であって、タンパク質を変性させないないしはタンパク質の活性を不活性化しない方法が必要とされている。タンパク質の局所的持続放出を提供し、ひいては望ましくない異所性の骨形成を防止する、BMP-2に対する制御放出デバイスも所望される。本明細書では、BMP-2に対し親和性を持つペプチドについて述べた。これらの親和性ペプチドは、BMP-2に対し特異的な親和性を有し、親和性バイオマトリックスを調製するのに有用である。親和性バイオマトリックス及びBMP-2から作製されるBMP-2に対する制御放出デバイスも記載される。本明細書では、BMP-2に対し親和性をもつペプチドを説明する。一実施形態では、BMP-2は、ヒト組み換えBMP-2である。BMP-2に対し親和性をもつペプチドは、そのペプチドがBMP-2に対し特異的な結合親和性をもつことを示す。このペプチドは、直鎖であるか又はジスルフィド結合により固定されているかのいずれかであり得る。一実施形態では、BMP-2に対し親和性をもつペプチドは、図1に示す親和性ペプチドのうちのいずれか一つである。別の実施形態では、この親和性ペプチドは、図1に示す親和性ペプチドのうちのいずれか一つのフラグメントであり得る。この親和性ペプチドがBMP-2に対する特異的な親和性をもつ一方、この親和性ペプチドはBMP-2の生理活性に干渉しない。これらの親和性ペプチドは、BMP-2に対する制御放出デバイスの調製において有用である。図1に示すBMP-2に対し親和性をもつペプチドは、米国特許第6472147号に記載のplXファージディスプレイ技術を用いて、同定された。高複雑性ライブラリー当たり109ペプチド配列を有するプライマリーペプチドファージライブラリーを使用することで、BMP-2に対し親和性をもつペプチドを選別した。より具体的には、ビオチン化BMP-2は、ストレプトアビジンコーティングしたELISAプレート上で不動化させ、plXマイナーコートタンパク質上でペプチド配列を提示するファージを導入した。BMP-2に結合しなかったファージは洗い流し、BMP-2に結合したファージを単離し、増幅した。BMP-2に結合した単離ファージは、合計3ラウンドの上記手順に従う選別の第二ラウンド用のインプットに使用された。第三ラウンドの終わりに、BMP-2に結合したファージは、BMP-2への結合に機能するペプチドを決定するために、配列決定された。BMP-2に対し親和性をもつペプチドは、図1に列挙されている。BMP-2に対し親和性をもつペプチドは、親和性バイオマトリックスを調製するのに有用である。親和性バイオマトリックスは、上記のように、BMP-2に対し親和性をもつ少なくとも1つのペプチドを生体適合性生分解性ポリマーに共有結合させることにより調製される。更に、親和性バイオマトリックスは、BMP-2に対する制御放出デバイスとして有用である。代表的な実施形態は、図2に図示される。BMP-2に対する制御放出デバイスは、親和性バイオマトリックス及びBMP-2を含む。親和性バイオマトリックスを調製するために使用される生体適合性生分解性ポリマーは、天然ポリマー、合成ポリマー及びこれらの組み合わせであり得る。生分解性ポリマーは、湿った体内組織にさらされると、容易に分解して小さなセグメントになる。セグメントは、次いで、体内に吸収されるか、又は体内を通過する。より具体的には、生分解されたセグメントは、永続的に追跡されないよう又はセグメントの残留物が体内に保持されないように、体内に吸収されるか又は体内を通過するため、永続的な慢性の異物反応を誘発しない。好適な天然ポリマーとしては、コラーゲン、エラスチン、ケラチン、絹、グルコサミノグリカンGAG、トロンビン、フィブロネクチン、ゼラチン、フィブリン、トロポエラスチン、ポリペプチド、ラミニン、プロテオグリカン、フィブリン糊、フィブリン血餅、多血小板血漿PRP血餅、乏血小板血漿PPP血餅、自己組織化ペプチドハイドロゲル及びアテロコラーゲンなどのタンパク質;デンプン、ペクチン、セルロース、アルキルセルロース例えば、メチルセルロース、アルキルヒドロキシアルキルセルロース例えば、エチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース例えば、ヒドロキシエチルセルロース、硫酸セルロース、カルボキシメチルセルロースの塩、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロースの塩、キチンの塩、カルボキシメチルキチンの塩、ヒアルロン酸の塩、ヒアルロン酸の塩、アルギネート、架橋アルギネートアルギン酸、アルギン酸プロピレングリコール、グリコーゲン、デキストラン、硫酸デキストラン、カードラン、ペクチン、プルラン、キサンタン、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルキトサン、キトサン、ヘパリン、ヘパリン硫酸、ヘパラン、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、カラギーナン、キトサン、デンプン、アミロース、アミロペクチン、ポリ-N-グルコサミン、ポリマンヌロン酸、ポリグルクロン酸、及び誘導体などの多糖;リボ核酸、デオキシリボ核酸などのポリヌクレオチド;並びにこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、天然ポリマーは、コラーゲンである。別の実施形態では、天然ポリマーは、脱細胞化組織から入手され得る。脱細胞化組織は、自己移植組織、同種組織又は異種組織から入手され得る。好適な脱細胞化組織としては、皮膚、骨膜、軟骨膜、滑膜、筋膜、腸間膜、骨、腱及びこれらに類するものが挙げられるが、これらに限定されない。好適な合成ポリマーの例としては、脂肪族ポリエステル、ポリアミノ酸、コポリエーテル-エステル、ポリアルキレンオキサレート、ポリアミド、ポリイミノカーボネート、ポリオルトエステル、ポリオキサエステル、ポリアミドエステル、アミン基含有ポリオキサエステル、ポリ酸無水物、ポリホスファゼン、これらの生体分子及びブレンドが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の目的上、脂肪族ポリエステルとしては、ラクチド乳酸、d-、1-及びメソラクチドを含む、グリコリドグリコール酸を含む、ε-カプロラクトン、p-ジオキサノン1,4-ジオキサン-2-オン、炭酸トリメチレン1,3-ジオキサン-2-オン、炭酸トリメチレンのアルキル誘導体、δ-バレロラクトン、β-ブチロラクトン、γ-ブチロラクトン、ε-デカラクトン、ヒドロキシブチラート繰り返し単位、ヒドロキシバレラ-ト繰り返し単位、1,4-ジオキセパン-2-オンその二量体1,5,8,12-テトラオキサシクロテトラデカン-7,14-ジオンを含む、1,5-ジオキセパン-2-オン、6,6-ジメチル-1,4-ジオキサン-2-オン2,5-ジケトモルホリン、ピバロラクトン、α,α-ジエチルプロピオラクトン、炭酸エチレン、シュウ酸エチレン、3-メチル-1,4-ジオキサン-2,5-ジオン、3,3-ジエチル-1,4-ジオキサン-2,5-ジオン、6,8-ジオキサビシクロオクタン-7-オンのホモポリマー及びコポリマー並びにこれらのポリマーブレンドが挙げられるが、これらに限定されない。好適な脂肪族ポリエステルとしては、ラクチド乳酸、D-、L-及びメソラクチドを含む、グリコリドグリコール酸を含む、ε-カプロラクトン、p-ジオキサノン1,4-ジオキサン-2-オン、炭酸トリメチレン1,3-ジオキサン-2-オン、炭酸トリメチレンのアルキル誘導体、δ-バレロラクトン、β-ブチロラクトン、γ-ブチロラクトン、ε-デカラクトン、ヒドロキシブチラート繰り返し単位、ヒドロキシバレラ-ト繰り返し単位、1,4-ジオキセパン-2-オンその二量体1,5,8,12-テトラオキサシクロテトラデカン-7,14-ジオンを含む、1,5-ジオキセパン-2-オン、6,6-ジメチル-1,4-ジオキサン-2-オンのホモポリマー及びコポリマー並びにこれらのポリマーブレンドが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、生体適合性生分解性ポリマー及びBMP-2に対し親和性をもつペプチドは、好適な反応基と、このポリマーに親和性ペプチドを共有結合させるための対応する官能基と、を有する。この反応基及び官能基は、ポリマー、親和性ペプチド及びこれらの組み合わせの上に存在し得る。好適な反応基としては、アリールアジド、カルボジイミド、ヒドラジン、ヒドロキシメチルホスフィン、イミドエステル、イソシアネート、カルボニル、マレイミド、NHS-エステル、PFP-エステル、チオール、ピリジルジスルフィド及び/又はスルホン酸ビニル並びにこれらに類するものが挙げられるが、これらに限定されない。好適な官能基としては、ヒドロキシル、カルボキシル、アルデヒド、エステル、チオール、アミン、アルケン、アルキン、アルキルハライド、ヒドラジン及び/又はアジド官能基が挙げられるが、これらに限定されない。有機化学又はポリマー化学の業者であれば、親和性ペプチド及びポリマーを上記好適な反応基及び対応する官能基で官能化して、親和性ペプチドをポリマーに共有結合させることができよう。例えば、コラーゲンに示されるリジン残基上のアミン官能基は、単純なカルボジイミド化学物質を用いて、親和性ペプチドのC末端カルボキシル基とカップリングさせることができる。場合により、リンカー配列は、親和性ペプチドがBMP-2に結合する能力を向上させるために、図1に示すペプチドに付加され得る。このリンカー配列は、SGGn又はXXXnであることができ、式中、Xは、セリン、グリシン、アラニン又はトレオニンのいずれかの組み合わせであり得る。一実施形態では、繰り返し単位の数nは、約1~約10である。別の実施形態では、繰り返し単位の数nは、約3~約5である。例えば、親和性バイオマトリックスは、可溶性及び/又は繊維状I型ウシコラーゲンから調製され得る。簡潔には、水に懸濁した、約10mg/mL~約100mg/mLの濃度を有するコラーゲン懸濁液を、成形型に流し込み、次いで凍結乾燥する。熱脱水工程後、1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩EDC/N-ヒドロキシスルホスクシンイミドスルホ-NHSカップリング化学を用いて、親水性ペプチドをコラーゲンに結合させた。この方法で調製されたコラーゲン親和性バイオマトリックスは、多孔質三次元発泡スカフォールドの形状である。この親和性バイオマトリックスは、BMP-2に対する制御放出デバイスとして有用である。BMP-2に対する制御放出デバイスは、親和性バイオマトリックス及びBMP-2を含む。親和性バイオマトリックスに装填され得るBMP-2の量は、生体適合性生分解性ポリマーに結合した親和性ペプチドの量に依存する。生体適合性生分解性ポリマー上に存在する親和性ペプチドの量は、制御放出デバイス中のBMP-2の所望される量以上であり得る。したがって、送達されるBMP-2の1モルに対して少なくとも1モルの親和性ペプチドが存在し得る。当業者であれば、骨修復のために制御放出デバイス中にどれだけの量のBMP-2が所望されるかを判定できるであろう。この制御放出デバイスは、スポンジ、粒子、注射可能ゲル又は液体、膜、フィルム、繊維、繊維系スカフォールド及びこれらに類するものの形状であり得る。一実施形態では、この制御放出デバイスは、注射可能ゲル又は液体の形状であり、ここで、親和性バイオマトリックスは水溶液中にあり、BMP-2を含有する。好適な水溶液の例としては、生理学的緩衝液、生理食塩水、水、緩衝生理食塩水、リン酸緩衝液、ハンクス平衡塩類溶液、PBS、トリス緩衝生理食塩水、Hepes緩衝生理食塩水、及びそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。注射可能なゲル又は液体デバイスを調製するために有用なポリマーは、上記の天然又は合成ポリマーから選択され得る。注射可能な液体又はゲルの場合、親和性バイオマトリックスは、水溶液中に約10mg/mL~約150mg/mLの量で存在し得る。場合により、合成骨無機質もまた、特定の用途のための機械的特性をしつらえるために、BMP-2に対する制御放出デバイスの中に組み込むことができる。例えば、バイオマトリックスの引張り強度を増強するために、生理活性無機物質を組み込むことができ、これには、ヒドロキシアパタイト、フルオロ-ヒドロキシアパタイト及び/又はケイ酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。BMP-2制御放出デバイスは場合によりそこに組み込まれた細胞を有することもできる。好適な細胞タイプとしては、骨細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、幹細胞、多能性細胞、臍帯細胞、間葉系細胞、間葉系幹細胞、骨髄細胞、胚幹細胞、脂肪組織由来前駆細胞、末梢血前駆細胞、成体組織から単離された幹細胞、遺伝子的に形質転換された細胞、及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。BMP-2に対する制御放出デバイスは、BMP-2の無菌親和性バイオマトリックス及び無菌凍結乾燥粉末を含有するキットとして販売され得る。キット内に含有された親和性バイオマトリックス及びBMP-2は、電子ビーム、ガンマ線照射及び無菌調製方法を挙げることができるがこれに限定されない従来の滅菌手順により、滅菌することができる。BMP-2に対する制御放出デバイスは、制御されたやり方で局所的にBMP-2を供給することを可能にする。この制御放出デバイスは、骨修復又は再生が所望される部位に移植又は注射され得る。この局所的供給は、現行の供給方法により引き起こされる過剰な及び/又は異所性の骨形成に関する望ましくない作用を除去するのを助ける。この異所性骨形成の低減は、今度は、これらの移植の失敗率を低め、それゆえに患者のクオリティオブライフを高める。実施例1-ファージディスプレイによるBMP-2親和性ペプチドの選別高複雑性ライブラリー当たり109ペプチド配列を有するプライマリーペプチドファージライブラリーを使用することで、BMP-2に対し親和性をもつペプチドを選別した。より具体的には、ビオチン化BMP-2は、ストレプトアビジンコーティングしたELISAプレート上で不動化させ、plXマイナーコートタンパク質上でペプチド配列を提示するファージを導入した。BMP-2に結合しなかったファージは洗い流し、BMP-2に結合したファージを単離し、増幅した。BMP-2に結合した単離ファージは、合計3ラウンドの上記手順に従う選択の第二ラウンドのためのインプットに使用された。酵素結合免疫吸着アッセイELISAプレートに5マイクログラム/mLのストレプトアビジンのリン酸緩衝生理食塩水PBS溶液を200マイクロリットル毎ウェルで装填し、4°Cで一晩保持した。選別毎に2つのウェルをコーティングした。このストレプトアビジンコーティングしたELISAプレートを次に、96ウェルELISAプレート洗浄機を用いてTween20を含有するトリス緩衝生理食塩水TBSTで三回洗浄し、その後、ビオチン化BMP-2RDSystemsMinneapolis,MN、製品番号355-BM/CFをPBS中5マイクログラム/mLの濃度で装填した。このプレートを室温で30分にわたって維持した。一方、エッペンドルフチューブ1mL容量を、3の脱水ミルクのTBST溶液1mLを用いてブロックしたライブラリー当たり1つ。このエッペンドルフチューブを室温にて30分にわたって混転した。37°Cにて振盪器において、テトラサイクリンを添加した2xYT培地で、二つのMC1061F’GII大腸菌培養を開始した。次にエッペンドルフチューブ中のブロック溶液を廃棄し、ペプチドライブラリー100マイクロリットル及びTBST溶液3ミルク添加300マイクロリットルで置き換えた。この溶液を室温にて1時間にわたって混転した。プライマリーペプチドファージライブラリーをブロッキングしながら、ストレプトアビジンでコーティングされたBMP-2装填ウェルをプレート洗浄機を用いてTBSTで3回洗浄した。次に、このプレートを室温にて1時間にわたってTBST溶液3ミルク250マイクロリットルでブロッキングした。このブロッキング溶液を各ウェルから取り出し、廃棄し、ペプチドファージライブラリー溶液をそれぞれ対応するウェルにウェル当たり200マイクロリットルの容量で導入した。これを1時間にわたって室温に維持した。このライブラリー-ミルク溶液を各ウェルから取り出し、廃棄し、ウェルをTBSTで手により3回洗浄した。200マイクロリットルのmid-logファージMC1061F’GII大腸菌を各ウェルに導入し、37°Cにて30分にわたって培養した。感染した細菌を、テトラサイクリンを添加した2xYT培地50mLにおいて37°Cにて4時間にわたって生育させた。次に、この細菌を遠心分離により分離し、PEG/NaCl溶液を用いてファージを沈殿させた。PEGで沈殿させたファージを第二ラウンドで使用し、上記プロセスを選別プロセスの計三回にわたって繰り返した。第三ラウンドの終わりに、BMP-2に結合したファージは、BMP-2への結合に機能するペプチドを決定するために、配列決定された。MC1061F’GII大腸菌を有する上層寒天中の単プラークのために、ファージ感染した細菌を沈着させた。得られたプラークを使用して、ELISAを用いてBMP-2に結合しているファージを単離した。いったん単一のファージを同定してから、BMP-2に結合したファージを増幅し、PEG沈殿させ、配列解析を行った。BMP-2に対し親和性をもつペプチドは、図1に列挙されている。これらのファージを、実施例2に記載のファージ滴定並びに実施例3に記載の確認及び交差反応性ファージELISAアッセイに使用した。実施例2-BMP-2選別で得たファージの滴定実施例1に記載のBMP-2に結合したファージのPEG沈殿から生じたファージの濃度を判定するために、ファージ滴定を行った。37°Cにて振盪器180~250rpmにおいて2~3時間にわたって、テトラサイクリンを添加した2xYT培地で、大腸菌MC1061F’GIIを生育させた。PEG沈殿原液が1012ファージ/mLを含有しているものと仮定して、96ウェルプレートでファージ滴定を行った。簡潔には、100マイクロリットルの2xYT培地を96ウェルプレートのウェルに導入した。カラム1には、10マイクロリットルの対応するファージ原液を導入した。連続10倍希釈をカラム12までプレートに対して行い、それぞれ1010、109、108、107、106、105、104、103、102、101、100、10-1の濃度のファージを得た。各列は別のファージを含有する。ファージプラーク生育のために、それぞれ対応するファージ希釈系列1.5マイクロリットルをLB/テトラサイクリン/凝固した上層寒天でコーティングしたX-Gal寒天プレート/細菌懸濁液に導入した。プレートを上下逆にして37°Cにて一晩培養した。一晩培養した後、ファージプラークが良好に分離され、計数され得る希釈液を選択した。以下の式を使用して、滴定濃度を計算した:プラーク数66.710滴定数-1×100=ファージ/mL、式中、66.7は各ウェル中のファージの希釈係数であり、希釈数は、ファージプラークが計数され得るまでに行われた希釈の数である。100を乗じることにより、ファージ懸濁液原液中のファージ/mLの数が生じる。計算されたファージ濃度を表1に示す。得られたファージ濃度を使用して、実施例3に記載の確認及び交差反応性ファージELISAアッセイのための希釈を行った。実施例3-確認及び交差反応性ファージELISAアッセイこの実験では、BMP-2に対する、実施例1で同定されたファージの結合を確認する。加えて、ファージがヒト血清アルブミン及びhIgGに結合を呈さないことも試験する。96ウェル黒色ELISAプレートを、PBS中5マイクログラム/mLの濃度のストレプトアビジン列A~D、hIgG列E及びF並びにヒト血清アルブミン列G及びHでコーティングした。プレートを4°Cで一晩インキュベートした。プレートをプレート洗浄機を用いてTBSTで3回洗浄した。列C及びDのストレプトアビジンコーティングされたウェルに、ビオチン化BMP-2RDSystemsMinneapolis,MN、製品番号355-BM/CFの4マイクログラム/mL溶液を100マイクロリットル導入し、30分にわたって室温で静置した。他のウェルすべてに100マイクロリットルのPBSを導入した。これらのプレートを再び、プレート洗浄機を用いてTBSTで3回洗浄した。これらのウェルを次に3の脱水ミルクのTBST懸濁液250マイクロリットルでブロックし、最短でも1時間にわたって室温に静置した。ファージ滴定により判定したファージ濃度を用いて、ファージ原液の希釈を別個の96ウェルプレートで行って、1010、109、108、107、106及び105ファージ/ウェルのファージ濃度を得た。ブロッキンブ後、ELISAプレートをTBSTで3回洗浄し、100マイクロリットルのファージ希釈液を対応するELISAプレートに導入し、最短でも1時間にわたって室温にて静置した。このELISAプレートを再び、プレート洗浄機を用いてTBSTで3回洗浄し、100マイクロリットルのHRPが共役したAnti-M13PhageMabPBS中に1:5000で希釈を各ウェルに導入した。これらのプレートを1時間にわたって室温にて静置し、その後、このプレートをTBSTで3回洗浄した。次に、PODHRP基質を各ウェルに導入した。150のゲインに設定した照度計を用いて、発光を読み取った。図3、図4及び図5中のファージELISAデータは、相対ルミネッセンスを示し、2のN値を有する。図3中のデータは、BMP-2に対する単離ファージの結合を確認する。図4及び図5中のデータは、hIgG及びHSAの両方に結合する配列番号4のペプチドを除いて、hIgG及びHSAのそれぞれについてのファージの交差反応性は最小限であることを示す。実施例4-増幅ルミネッセンス近接ホモジニアスアッセイALPHAALPHAアッセイを用いて、親和性ペプチドに対するBMP-2の濃度依存性結合効率を評価した。3.3マイクログラム/mLのビオチン化BMP-2RDSystemsMinneapolis,MN、製品番号355-BM/CFの希釈原液を2xアッセイ緩衝液PBS、0.01Tween-80、0.05BSAを用い調製した。標準的な自動フルオレニルメチルオキシカルボニルFmoc固相ペプチド合成手順を用いて、配列番号1、配列番号2、配列番号3及び配列番号6を有する化学合成ペプチドを調製した。アッセイ用の各ペプチド溶液を100マイクログラム/mL原液から調製した。この原液をアッセイ緩衝液中に1/2logステップで連続希釈して、100、33.3、11.1、3.70、1.23、0.41、0.14、0.046、0.015、0.0051、0.0017及び0.00056マイクログラム/mLのペプチド濃度を得た。続いて、連続希釈したペプチドを、ビオチン化BMP-2の3.3マイクログラム/mL溶液10マイクロリットルを含有する対応するウェルに添加した。ビオチン化BMP-2についての最終アッセイ試験濃度は、0.825マイクログラム/mLであった。最終ペプチド濃度は、25、8.3、2.8、0.93、0.31、0.10、0.03、0.01、0.003、0.001、0.0003及び0.0001マイクログラム/mLであった。次に、ニッケルNiアクセプター及びストレプトアビジンSAドナービーズPerkinElmerWaltham,MA、製品番号6760619Mをアッセイ緩衝液中に1:100で希釈し、その後、各試験ウェルに20マイクロリットルを添加した。対照には、三種の異なる濃度でBMP-2単独を、並びに、ペプチド無しでSAビーズを、含有させた。プレートをアルミホイルでシールし光から保護し、室温にて卓上振盪器で45分にわたって振盪した。二波長蛍光計PerkinElmerWaltham,MAのEnvision2101MultilabelReaderを用いて、プレートの発光を読み取った。図6のALPHAデータは、ペプチド配列の分子量に基づいてモル濃度を標準化した。図6のデータは、BMP-2に対するペプチドの濃度依存結合を示す。ペプチド配列は、以下のように、BMP-2に対するこれらの濃度依存結合により等級付けされた:配列番号6>配列番号3>配列番号2>配列番号1。実施例5-表面プラズモン共鳴SPR表面プラズモン共鳴測定により、BMP-2に対するペプチド結合親和性を配列番号3及び配列番号6について評価した。CM4シリーズSセンサーチップを用いて、BiacoreS51BiacoreLifeSciencesPiscataway,NJ装置で測定を行った。1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩EDC/N-ヒドロキシスクシンイミドNHSカップリング化学を用いてセンサーチップ上でrhBMP-2RDSystemsMinneapolis,MN、製品番号355-BM/CFを不動化した。BMP-2不動化チップ上に5マイクロモルの濃度でBMP-2親和性ペプチドを流し、屈折率の変化を記録した。データは、BiacoreAnalysisSoftwareBiacoreLifeSciencesPiscataway,NJを用いて、1:1Langmuir結合モデルに適合させた。表2に示すデータは、N値3での平均平衡解離定数である。データは、300~400nMの平均平衡解離定数を示す。実施例6-アルカリホスファターゼ生理活性アッセイこの実験では、マウス骨芽細胞を用い、親和性ペプチドが、BMP-2に結合している細胞表面レセプターと干渉するかどうかを判定した。親和性ペプチド有り及び無しで、BMP-2の存在下、アルカリホスファターゼALP生成をモニターした。継代させた二つのMCHT-1/26細胞マウス骨芽細胞細胞株を前夜に4500細胞/ウェルで96ウェルプレートに接着させた。3種類の希釈率、16、160及び800nMで配列番号6のペプチドを存在させ又は存在させずに、0~1000ng/mLの範囲で連続希釈したBMP-2により、細胞を刺激した。37°Cにて3日にわたって培養した後、細胞を溶解緩衝液250mMのNaCl、25mMのMgCl2及び100mMのトリス、pH=8.0で37°Cにて一晩溶解した。可溶化液の三分の一をp-ニトロフェニルホスフェートでのアルカリホスファターゼアッセイのために使用した。この反応を37°Cで1~2時間にわたって行った。次に、このプレートを405nmの波長にて吸光度プレートリーダーで読み取った。図7は、配列番号6のペプチドがマウス骨芽細胞のALP生成に最小の影響を有することを示す。このことは、配列番号6のペプチドがBMP-2の生理活性に干渉しないことを示す。実施例7-コラーゲンバイオマトリックスフォームの調製80の繊維性I型コラーゲン32mgと20の溶解性I型コラーゲン8mgの40mg/mL水溶液を4°Cにて一晩撹拌した。この懸濁液を次にブレンダー内で3サイクル30秒~1分/サイクルにわたってホモジナイズした。およそ5mLを、5cm×5cmの寸法及び0.5cmの高さを有する成形型に移した。このコラーゲン混合物をスパチュラの平坦な端部により平らにして、コラーゲンの高さ分布の均一性を確保した。次に、このサンプルを脱気し、その後、表3に示すサイクルプロファイルを用いて凍結乾燥したVirtisGardiner,NY。次に、このサンプルを温度制御真空槽を用いて熱脱水した。次に、このコラーゲンバイオマトリックスフォームを生検パンチを用いて6mmディスクに切り、使用可能になるまで乾燥窒素下、室温にて保存した。実施例8-BMP-2に対し親和性をもつペプチドをコラーゲンフォームに結合させることによる、親和性バイオマトリックスの調製ペプチドを結合させるために、実施例7に記載のように調製した6mmコラーゲン発泡ディスクをエッペンドルフチューブ内の1.8mLの40のEtOH/50mMの2-N-モルホリノエタンスルホン酸MESpH5.5の中に配置し、室温にて30分にわたって混転した。このディスクを上記緩衝液から取り出し、0.5mMの配列番号23のBMP-2親和性ペプチド図8Aに示す配列番号6の結合ペプチドを含有する1.8mLの40のEtOH/50mMのMES、pH5.5の中に配置した。標準的な自動フルオレニルメチルオキシカルボニルFmoc固相ペプチド合成手順を用いて、ペプチドを調製した。このディスクを室温にて1時間にわたって混転させておいた。次に、0.5MのEDC原液10マイクロリットル及び0.1Mのスルホ-NHS原液10マイクロリットルどちらも40EtOH/50mMMESpH5.5中をエッペンドルフチューブの中に導入したところ、2.5mMのEDCと0.5mMのスルホ-NHSが生じたペプチド、スルホ-NHS及びEDCについてのモル当量はそれぞれ1:1:5であった。このディスクを室温にて4時間にわたって混転させておいた。次に、このディスクを、10mLの1xPBS中で30分にわたって混転することにより、すすいだ。このすすぎを計三回のすすぎサイクルで繰り返した。最後に、ディスクをPBSから取り出し、真空下にて凍結乾燥機で一晩乾燥させた。三つの対照サンプルもまた上記手順で使用した。1=コラーゲンスポンジ緩衝液、2=コラーゲンスポンジペプチド/緩衝液、及び3=コラーゲンスポンジEDC/NHS/緩衝液。ペプチドを結合させたコラーゲンフォームのミクロ構造をSEMを用いて分析した。代表的な画像を図8Bに示す。この画像は、ペプチド共役コラーゲン発泡体がその多孔質ミクロ構造を保持すること示す。すべてのサンプルに対して、上清を凍結乾燥して乾燥粉末にし、RP-AnalyticalHPLCを用いて分析した。データは、およそ40のBMP-2親和性ペプチド配列番号23が6mmコラーゲンディスクに共有結合していしたことを示す。実施例9-BMP-2定着試験凍結乾燥したrhBMP-2を8.4mLの滅菌水に溶解させ、rhBMP-2の1.5mg/mL懸濁液を得た。荷重試験のために、実施例7及び実施例8で調製した直径6mmの親和性バイオマトリックスを、0.2マイクロメートルの濾過エッペンドルフチューブ内に配置し、100マイクロリットルの0.4mg/mLのrhBMP-2溶液250mMのアルギニン、10mMのヒスチジン、20mMのCaCl2pH6.5緩衝液100マイクロリットルを装填し、室温にて45分にわたって静置した。濾過エッペンドルフチューブ内の親和性バイオマトリックスを3000rpmで5分にわたって遠心処理し、上清を取り出した。生成物挿入における手順に従って、得られた上清の1:100000希釈物を用いて、rhBMP-2イムノアッセイELISARDSystemsMinneapolis,MNDBP200を行った。BMP-2の初期装填濃度から上清中のrhBMP-2の量を減算することにより、rhBMP-2組み込み率を判定した。対照として、親和性ペプチドを含まないEDC/NHS架橋済みコラーゲンの両方の直径6mmディスクを使用した。図9中のデータは、親和性バイオマトリックスは、およそ40重量を装填する架橋済みコラーゲンディスクと比較して、BMP-2全体40マイクログラムのおよそ90重量を装填する。実施例10-コラーゲンディスクからのインビトロBMP-2放出この実験では、模擬的な生理的条件下での親和性バイオマトリックスからのBMP-2のインビトロ制御放出を評価した。この放出実験のために、実施例7及び実施例8に記載の方法により調製されるような親和性バイオマトリックスの直径6mmのディスクを24ウェル細胞培養プレート内に配置した。このスポンジに1.5mg/mLのrhBMP-2溶液を40マイクロリットル装填し、室温にて15分にわたって静置した。実施例8で調製したEDC/NHS架橋済みコラーゲンの直径6mmのディスクを対照として使用した。装填したコラーゲンスポンジを次に、ヒト血清アルブミンHSAを1mg/mLの濃度で添加したPBSを1.5mL含有する24ウェル細胞培養プレートのウェルに移した。対応する時点にて、培地を取り出し、エッペンドルフチューブに移し、-20°Cにて凍結させた。コラーゲンディスクを含有するウェルに、新しい0.1のHSAのPBS溶液を1.5mL補給した。生成物挿入における手順に従って、放出培地の1:1000希釈物を用いて、rhBMP-2イムノアッセイELISARDSystemsMinneapolis,MNDBP200を各時点にて行った。標準曲線を用いることにより、対応するディスクからのrhBMP-2放出の量を判定した。図10中のデータは、親和性バイオマトリックス制御放出デバイスが、36日の時点でおよそ25重量のrhBMP-2の累積放出を有する一方で、EDC/NHS架橋済みコラーゲンスポンジがおよそ90重量を放出することを示す。親和性バイオマトリックス制御放出デバイスからのrhBMP-2の初期の爆発的放出は、EDC/NHS架橋済みコラーゲンスポンジと比較して、有意に低減される。実施例11-変異体ファージELISA配列番号3及び配列番号6の親和性ペプチドにそれぞれ部位特異的突然変異誘発を行って、BMP-2への結合にとって重要であるアミノ酸についての理解を得た。野生型の残基がセリンで置換されるセリンスキャンを行うことにより、配列番号3及び配列番号6の変異体を構築した。図12は、BMP-2に対する特異的な親和性に関し機能するより具体的なアミノ酸配列を同定するために試験された変異体配列を示す。配列番号24~配列番号28は、配列番号3の変異体である。配列番号29~配列番号32は、配列番号6の変異体である。対応するカスタムオリゴヌクレオチドは、IntegratedDNATechnologiesから入手した。標準プロトコルを用いて、これらのオリゴヌクレオチドoligonucletidesをpIX遺伝子の中に挿入した。まず、T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、これらのオリゴヌクレオチドをリン酸化した。次に、このリン酸化オリゴヌクレオチドをssDNAテンプレートにアニーリングした。Kunkel法を用いて、このアニーリングしたDNAを、T4DNAリガーゼ及びT7DNAポリメラーゼを用いて連結した。得られたDNAを、イソプロパノール沈殿を用いて単離し、ゲルを反応の確認にかけた。最後に、電気的な形質転換受容能のある大腸菌を精製DNAで形質転換し、2xYT/Tet/Xgal寒天プレート上に蒔き、一晩増殖させて、単一コロニーを単離した。50mLの2xYT/tet培地中で振盪しながら、形質転換した細胞のアリコートを37°Cで一晩増殖させた。このファージを次に実施例1の手順に従ってPEG沈殿させた。ファージ滴定を行って、実施例2に記載のように、ELISAアッセイのためにファージ濃度を判定した。実施例3の手順に従って、ELISAアッセイを行った。変異体ファージELISAアッセイデータ図11A及び図11Bは、配列番号3のフラグメント及び配列番号6のフラグメントがBMP-2に結合する根拠を示す。より具体的には、配列番号3のフラグメントである配列番号33と、配列番号6のフラグメントである配列番号34とが、BMP-2への結合に重要であり、図12に示されている。実施例12-コラーゲンディスクからのインビトロBMP-2放出この実験では、実施例10に記載のように、しかしながらPBS単独の代わりに熱不活性化ウシ胎児血清FBSを添加したPBSを使用して、模擬的な生理的条件下での親和性バイオマトリックスからのBMP-2のインビトロ制御放出を評価した。この放出実験のために、実施例7及び実施例8に記載の方法により調製されるような親和性バイオマトリックスの直径6mmのディスクを24ウェル細胞培養プレートのウェル内に配置した。このスポンジに1.5mg/mLのrhBMP-2溶液を40マイクロリットル装填し、室温にて15分にわたって静置した。市販のコラーゲンディスクを対照として使用した。装填したコラーゲンスポンジを次に、熱不活性化ウシ胎児血清FBSを添加したPBSを1.5mL含有する24ウェル細胞培養プレートのウェルに移した。対応する時点にて、培地を取り出し、エッペンドルフチューブに移し、-20°Cにて凍結させた。コラーゲンディスクを含有するウェルに、新しい2のFBSのPBS溶液を1.5mL補給した。生成物挿入における手順に従って、放出培地の1:1000希釈物を用いて、rhBMP-2イムノアッセイELISARDSystemsMinneapolis,MNDBP200を各時点にて行った。標準曲線を用いることにより、対応するディスクからのrhBMP-2放出の量を判定した。図13中のデータは、親和性バイオマトリックス制御放出デバイスが、15日の時点でおよそ15重量のrhBMP-2の累積放出を有する一方で、市販のコラーゲンスポンジがおよそ95重量を放出することを示す。親和性バイオマトリックス制御放出デバイスからのrhBMP-2の初期の爆発的放出は、市販のコラーゲンスポンジと比較して、有意に低減される。実施例13-コラーゲンディスクからのインビボBMP-2放出ケージ移植試験システムを使用して、親和性バイオマトリックスからのBMP-2のインビボ放出を評価した。インビボ環境での生理活性剤の制御放出を調査するためにケージ移植システムを用いる例は、PaulaS.LeppertandJosephA.Fix,SubcutaneousTissueCagesforExaminationofSlowReleaseofMaterialsfromLongTermImplants,Biomaterials,Volume11,1990,p.46~49に記載されている。これらの方法を適合させて、親和性バイオマトリックスからのBMP-2のインビボ放出を測定した。このインビボ実験は、実験用動物の取り扱い及び使用を管理するすべての適用され得る規制を遵守した。この実験についての動物福祉は、米国農務省USDA動物福祉法連邦規則9巻パート1、2及び3theUnitedStatesDepartmentofAgriculture’sUSDAAnimalWelfareAct9CFRParts12and3を遵守した。実験動物の管理と使用に関する指針TheGuidefortheCareandUseofLaboratoryAnimalsInstituteofLaboratoryAnimalResources,NationalAcademyPress,Washington,D.C.,1996にも従った。具体的には商品名SPRAGUEDAWLEYHarlanLaboratories,Inc.Indianapolis,IN種のCrl:CDで販売されているアルビノラットの異系交配多目的品種である、7~8週齢のオスのラットをこのインビボ実験に使用した。直接接触床を有するポリボックスに動物を個々に収容した。一日当たりおよそ12時間にわたって蛍光灯を照射した。温度及び湿度をモニターし、毎日記録し、それぞれ64°C~79°C及び30~70の可能な最大限の範囲において維持した。ラットの基礎飼料は、適宜供給される特定のげっ歯類用試料から構成された。自動水システムを介して水道水を適宜供給した。実験デザインの簡潔な説明は、表4に見出すことができる。316ゲージ、46メッシュ0.140mm0.0055インチワイヤ直径ステンレス鋼NewarkWireClothCompanyClifton,NewJerseyを用いて、ケージ移植片長さ=25ミリメートル、直径=10ミリメートルを手で構築した。0.1Mの水酸化ナトリウムを用いてケージ移植片から発熱物質除去し、水で十分に洗浄した。予めドリル切削したポリテトラフルオロエチレンPTFEブロックを用いてチャンバー端部周りのシリコーンエラストマーMED6215、NuSilTechnology,LLCTomsRiver,NJキャップをキャスティングすることにより、ケージ移植片の一端を閉じた。対応するバイオマトリックスを添加した後、カスタムモデルのシリコーンエラストマーストッパーWackerLR3003/40、AlbrightTechnologiesInc.Leominster,MAキャップを使用して、ケージの開いた端部を閉じた。ケージにディスクを装填するのに先立って、キャップ及びケージをオートクレーブ処理した。実施例7の手順に従って無菌条件下でコラーゲンディスクを調製した。次に、電子線照射25kGyを用いて、直径6mmのディスクを滅菌した。実施例8に記載の方法を用いて無菌条件下で親和性バイオマトリックスを調製した。次に、表3に示した凍結乾燥方法を用いて、これらのサンプルを滅菌チャンバで凍結乾燥した。親和性ペプチドを含まない市販のコラーゲンの直径6mmのディスクを対照として使用した。移植に先立って、乾燥したバイオマトリックスをチャンバーの中に配置し、非吸収性縫合糸で適所で縫合した。次に、これらのディスクに、ディスク当たり30マイクログラムの投与量でBMP-2の無菌溶液100マイクロリットルを装填した。吸入麻酔イソフルランを用いて各ラットに麻酔誘引した。眼科用軟膏を目に塗布し、麻酔時間中の組織の乾燥を予防した。各動物に、痛みのためのブプレノルフィン塩酸塩0.05mg/kg、皮下投与及び液体恒常性のための乳酸リンゲル液LRS、1~5mLを投与した。麻酔導入後、真空システムを備えた電気動物クリッパーを用いることにより、体毛を含ませずに、背側頸部領域から背側腰部領域までの動物の手術部位をクリップした。手術部位の周りの領域をクロルヘキシジン二酢酸で洗浄し、アルコールですすぎ、乾燥させ、1濃度のヨウ素のヨードフォル水溶液を塗布した。麻酔にかけた動物を手術台に運び、無菌処理をした領域に滅菌外科用ドレープを適用した。手術中、動物には排気システム下でマスクによりイソフルラン麻酔を維持した。BMP-2を装填したディスクを含有する滅菌ケージ移植片を各ラットの皮下スペースの中に移植した。左胸郭において皮膚切開を行った。鈍器切開により、ラットの背部上に創傷チャンバーを収容するのにちょうど十分な大きさの皮下ポケットを作製した。ケージ移植片を皮下ポケットに配置し、間隙皮下スペースを最小化した。サンプルを含有する端部がシリコーン末端キャップに最も近く、シリコーンストッパーに最も遠く、切開部位に最も近くなるように、ケージ移植片を挿入した。ケージの近位端は、炎症を避けるために、切開ラインから最低1cmの距離で挿入した。このケージ移植片を下に位置する筋肉に非吸収性縫合糸で縫合し、非吸収性縫合糸を用いて切開を閉じた。創傷滲出物を移植後1、3、5及び7日目に採取した。流体採取に先立って、二酸化炭素/酸素及びイソフルランを用いて動物に穏やかに麻酔をかけた。簡潔には、21G針を切開部位から最も遠いシリコーンストッパーの中程に挿入した。ラットを直立位置に保持して、流体が注射器の中に流れるようにした。300マイクロリットルの最終容積が達成されるまで、注射器でゆっくりと吸引した。rhBMP-2イムノアッセイELISAを用いる分析までの間、サンプルを-80°Cで凍結した。実験完了時に、予め装填した二酸化炭素チャンバーに動物を配置し、100二酸化炭素を吸入させることにより安楽死させた。呼吸の視覚的徴候についての観察及び心臓の触診により、安楽死を確認した。図13中のデータは、親和性バイオマトリックス制御放出デバイスが七日間にわたってBMP-2を常に放出することを示す。5日目及び7日目時点で、親和性バイオマトリックスは、対照コラーゲンディスクと比較して、ディスクから放出されるBMP-2に関し統計的な有意差を有する。実施の態様1BMP-2に対し親和性をもち、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22及びこれらのフラグメントからなる群から選択される、ペプチド。2生体適合性の生分解性ポリマーと、BMP-2に対し親和性をもつ少なくとも1つのペプチドと、を含む、親和性バイオマトリックス。3前記親和性ペプチドが、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21及び配列番号22からなる群から選択される、実施態様2に記載の親和性バイオマトリックス。4前記生体適合性の生分解性ポリマーが天然ポリマーである、実施態様2に記載の親和性バイオマトリックス。5前記天然ポリマーが、コラーゲン、エラスチン、ケラチン、絹、多糖、GAG及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、実施態様4に記載の親和性バイオマトリックス。6前記天然ポリマーがコラーゲンである、実施態様5に記載の親和性バイオマトリックス。7前記天然ポリマーが、皮膚、骨膜、軟骨膜、滑膜、筋膜、腸間膜mesenter、骨及び腱からなる群から選択される脱細胞化組織である、実施態様6に記載の親和性バイオマトリックス。8親和性バイオマトリックスとBMP-2とを含む、制御放出デバイス。9前記デバイスが、スポンジ、粒子、注射可能なゲル、注射可能な液体、膜、フィルム、繊維及び繊維系スカフォールドからなる群から選択される形態をしている、実施態様8に記載の制御放出デバイス。10親和性バイオマトリックスとBMP-2とを含む、キット。"