以下の1から3の特徴を有する誘導多能性幹細胞:1生殖細胞および内部細胞塊以外の体細胞由来である、2胚、生殖細胞および胚性幹ES細胞を利用せず製造される、および3内在性のOct34およびNanogを発現している。前記体細胞がヒト細胞である、請求項1に記載の誘導多能性幹細胞。前記ヒト体細胞が疾患患者由来の体細胞である、請求項2に記載の誘導多能性幹細胞。前記胚、生殖細胞および胚性幹ES細胞を利用せず製造されることが、Oct34、Klf4、およびSox2を含む単離された遺伝子を体細胞に導入することである、請求項1~3のいずれか1項に記載の誘導多能性幹細胞。前記胚、生殖細胞および胚性幹ES細胞を利用せず製造されることが、Oct34、Klf4、cMycおよびSox2を含む単離された遺伝子を体細胞に導入することである、請求項1~4のいずれか1項に記載の誘導多能性幹細胞。請求項1~5のいずれか1項に記載の誘導多能性幹細胞を分化誘導する工程を含む、体細胞の製造方法。前記誘導多能性幹細胞を分化誘導して製造された体細胞が、心筋細胞、インスリン産生細胞、神経細胞、血球細胞または肝細胞である、請求項6に記載の方法。請求項1~5のいずれか1項に記載の誘導多能性幹細胞、または該誘導多能性幹細胞を分化誘導して製造された体細胞と被験物質を接触させる工程を含む被験物質の有効性または毒性の評価方法。請求項1~5のいずれか1項に記載の誘導多能性幹細胞を分化誘導して製造された体細胞を有効成分として含有する、幹細胞移植療法のための剤。誘導多能性幹細胞が、幹細胞移植療法を施す対象患者に対して実質的に拒絶反応を生じさせない体細胞由来である、請求項9記載の剤。誘導多能性幹細胞が、幹細胞移植療法を施す対象患者の体細胞由来である、請求項9または10記載の剤。前記幹細胞移植療法が、心不全、インスリン依存性糖尿病、パーキンソン病または脊髄損傷を対象とする、請求項9~11のいずれか1項に記載の剤。本発明の課題は核初期化因子を提供することにある。より具体的には、本発明の課題は、卵子、胚、生殖細胞や胚性幹細胞を利用せずに分化細胞の初期化を誘導し、ES細胞と同様な多能性や増殖能を有する誘導多能性幹細胞を簡便かつ再現性よく樹立することにある。さらなる本発明の課題は、誘導多能性幹細胞の用途を提供することである。本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行い、国際公開WO200580598に記載された核初期化因子のスクリーニング方法を用いて核初期化因子の同定を試みた。その結果、核初期化に関連する遺伝子として24種類の候補遺伝子を見出し、それらのうち3種類の遺伝子が核初期化に必須の遺伝子であることを確認した。本発明は上記の知見を基にして完成されたものである。すなわち、本発明により、体細胞の核初期化因子であって、下記の3種類の遺伝子:Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、及びMycファミリー遺伝子の各遺伝子産物を含む因子が提供される。この発明の好ましい態様によれば、下記の3種の遺伝子:Oct34、Klf4、及びcMycの各遺伝子産物を含む上記の因子が提供される。また、別の好ましい態様によれば、下記の遺伝子:Soxファミリー遺伝子の遺伝子産物をさらに含む上記の因子も提供され、より好ましい態様としてSox2の遺伝子産物を含む上記の因子が提供される。さらに別の好ましい態様によれば、Mycファミリー遺伝子の遺伝子産物とともに、あるいはMycファミリー遺伝子の遺伝子産物に換えてサイトカインを含む上記の因子が提供され、より好ましい態様としてサイトカインがbasicfibroblastgrowthfactor及び/又はStemCellFactorである上記の因子が提供される。特に好ましい態様によれば、Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、Mycファミリー遺伝子、及びSoxファミリー遺伝子の各遺伝子産物に加えて、TERT遺伝子の遺伝子産物を含む体細胞の核初期化因子、並びにOctファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、Mycファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、及びTERT遺伝子の各遺伝子産物に加えて、下記の遺伝子:SV40LargeTantigen、HPV16E6、HPV16E7、及びBmilからなる群から選ばれる1種以上の遺伝子の遺伝子産物を含む因子が提供される。これらの因子に加えて、下記の群:Fbx15、Nanog、ERas、ECAT152、Tcl1、及びβcateninからなる群から選ばれる1種以上の遺伝子の遺伝子産物をさらに含む上記の因子が提供される。また、上記発明の別の好ましい態様によれば、下記の群:ECAT1、Esg1、Dnmt3L、ECAT8、Gdf3、Sox15、ECAT151、Fthl17、Sall4、Rex1、UTF1、Stella、Stat3、及びGrb2からなる群から選ばれる1種以上の遺伝子の遺伝子産物をさらに含む上記の因子も提供される。別の観点からは、本発明により、体細胞の核初期化により誘導多能性幹細胞を製造する方法であって、体細胞に上記の核初期化因子を接触させる工程を含む方法が提供される。この発明の好ましい態様によれば、体細胞の培養物中に上記の核初期化因子を添加する工程を含む上記の方法;体細胞に上記の核初期化因子をコードする遺伝子を導入する工程を含む上記の方法;上記の核初期化因子をコードする遺伝子を少なくとも1種以上含む組換えベクターを用いて体細胞に該遺伝子を導入する工程を含む上記の方法;及び体細胞として患者から採取した体細胞を用いる上記の方法が提供される。さらに別の観点からは、本発明により、上記の方法により得られた誘導多能性幹細胞が提供される。また、上記の誘導多能性幹細胞から分化誘導された体細胞も本発明により提供される。さらに本発明により、幹細胞療法であって、患者から分離採取した体細胞を用いて上記の方法により得られた誘導多能性幹細胞を分化誘導して得られる体細胞を該患者に移植する工程を含む療法が提供される。さらに本発明により、上記の方法により得られた誘導多能性幹細胞を分化誘導して得られる各種細胞を用いて、化合物、薬剤、毒物などの生理作用や毒性を評価する方法が提供される。また、本発明により、細胞の分化能及び/又は増殖能を改善する方法であって、細胞に対して上記の核初期化因子を接触させる工程を含む方法、並びに上記方法により得られた細胞及び上記方法により得られた細胞から分化誘導された体細胞が提供される。本発明により提供された核初期化因子を用いることにより、胚、生殖細胞やES細胞を利用せずに簡便かつ再現性よく分化細胞核の初期化を誘導することができ、ES細胞と同様の分化及び多能性や増殖能を有する未分化細胞である誘導多能性幹細胞を樹立することができる。例えば、本発明の核初期化因子を用いて患者自身の体細胞から高い増殖能及び分化多能性を有する誘導多能性幹細胞を作製することができ、この細胞を分化させることにより得られる細胞例えば心筋細胞、インスリン産生細胞、又は神経細胞などは、心不全、インスリン依存性糖尿病、パーキンソン病や脊髄損傷など多用な疾患に対する幹細胞移植療法に利用することができ、ヒト胚を用いる倫理的問題や移植後の拒絶反応を回避できるので極めて有用である。また誘導多能性幹細胞を分化させてできる各種細胞例えば心筋細胞、肝細胞などは化合物、薬剤、毒物などの薬効や毒性を評価するためのシステムとして極めて有用である。本発明の核初期化因子は、下記の3種類の遺伝子:Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、及びMycファミリー遺伝子の各遺伝子産物を含むことを特徴としており、好ましい態様では、上記の3種の遺伝子に加えてSoxファミリー遺伝子の遺伝子産物を含むことを特徴としている。本発明の核初期化因子を確認する手段としては、例えば、国際公開WO200580598に記載された核初期化因子のスクリーニング方法を利用することができる。上記刊行物の全ての開示を参照により本明細書の開示に含める。当業者は上記刊行物を参照することにより核初期化因子をスクリーニングし、本発明の初期化因子の存在及び作用を確認することができる。例えば、初期化現象を容易に観察する実験系としてFbx15遺伝子座にβgeoベータガラクトシダーゼとネオマイシン耐性遺伝子の融合遺伝子をノックインしたマウスを利用することができる。その詳細を本明細書の実施例に示した。マウスFbx15遺伝子はES細胞や初期胚などの分化多能性細胞において特異的に発現する遺伝子である。マウスFbx15遺伝子にβgeoをノックインし、Fbx15の機能を欠失したホモ変異マウスでは、通常、分化多能性や発生を含めて異常な表現型は観察されない。このマウスにおいては、βgeoがFbx15遺伝子のエンハンサーやプロモーターにより発現制御されており、分化した体細胞ではβgeoは発現せず、G418に感受性を示す。一方、βgeoをノックインしたホモ変異ES細胞は極めて高濃度12mgml以上のG418に耐性を示す。この現象を利用し、体細胞の初期化を可視化する実験系を構築することができる。上記実験系を利用して、まずβgeoをノックインしたホモ変異マウスの胎児受精後135日から線維芽細胞Fbx15βgeoβgeoのMEFを単離することができる。MEFはFbx15遺伝子を発現しないため、βgeoも発現せず、G418に感受性を示す。ところが、このMEFと遺伝子操作を加えていないES細胞やはりG418に感受性を示すを融合させると、MEFの核が初期化する結果、βgeoが発現してG418耐性となる。従って、この実験系を利用することにより、初期化現象をG418耐性に置き換えて可視化できる。上記の実験系を用いて核初期化因子を選択することができる。核初期化因子に関連する遺伝子の候補として、ES細胞で特異的な発現を示す遺伝子及びES細胞の分化多能性維持における重要な役割が示唆される遺伝子を複数選択し、それらの候補遺伝子が単独で、あるいは適宜組み合わせることにより核初期を惹起するか否かを確認することができる。例えば、選択された1次候補遺伝子を全て組み合わせることにより分化細胞をES細胞に近い状態に初期化誘導できることを確認した後、その組み合わせのなかから1個ずつの遺伝子を除いた組み合わせを用意して同様の作用を確認し、その遺伝子が存在しない場合に初期化誘導能が減弱し、あるいは初期化誘導能が失われる2次候補遺伝子を選択することができる。そのようにして選択された2次候補遺伝子について同様のステップを繰り返すことにより、必須の核初期化遺伝子の組み合わせを選択することができ、Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、及びMycファミリー遺伝子の3種の遺伝子の遺伝子産物の組み合わせが核初期化因子として作用することを確認することができ、さらにこれらの3種類の遺伝子の遺伝子産物に加えてSoxファミリー遺伝子の遺伝子産物を組み合わせが核初期化因子として極めて優れた性質を有することを確認することができる。核初期化因子の選択方法の具体例は本明細書の実施例に具体的に示されており、当業者は上記の一般的説明及び実施例の具体的説明を参照することにより、これら3種の遺伝子の組み合わせが体細胞の初期化を誘導すること、及びこれら3種の遺伝子産物の組み合わせが核初期化に必須であることを容易に確認することができる。本発明により提供される核初期化因子は、少なくともOctファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、及びMycファミリー遺伝子の遺伝子産物の組合せを含み、例えばOct34、Klf4、及びcMycの3種の遺伝子の遺伝子産物の組み合わせを含む。Octファミリー遺伝子としては、例えば、Oct34、Oct1A、及びOct6などを挙げることができる。Oct34はPOUファミリーに属する転写因子であり、未分化マーカーとして報告されている。また、Oct34は多能性維持に関与しているとの報告もあるJNicholsetalCell95pp379911998。Klfファミリー遺伝子としては、Klf1、Klf2、Klf4、及びKlf5などを挙げることができる。Klf4Kruppellikefactor4は腫瘍抑制因子として報告されているAMGhalebetalCellRes15pp9262005。Mycファミリー遺伝子としては、cMyc、NMyc、及びLMycなどを挙げることができる。cMycは細胞の分化及び増殖に関与する転写制御因子でありSAdhikaryMEilersNatRevMolCellBiol6pp635452005、多能性維持に関与しているとの報告があるPCartwrightetalDevelopment132pp885962005。Oct34、Klf4、及びcMyc以外の各ファミリー遺伝子のNCBIアセッション番号は以下のとおりである。これらの遺伝子はいずれもヒトを含む哺乳類動物において共通して存在する遺伝子であり、本発明において上記遺伝子産物を利用するためには、任意の哺乳類動物由来例えばマウス、ラット、ウシ、ヒツジ、ウマ、サルなどの哺乳類動物由来の遺伝子を用いることが可能である。また、野生型の遺伝子産物のほか、数個例えば1~10個、好ましくは1~6個、より好ましくは1~4個、さらに好ましくは1~3個、特に好ましくは1又は2個のアミノ酸が置換、挿入、及び/又は欠失した変異遺伝子産物であって、野生型の遺伝子産物と同様の機能を有する遺伝子産物も利用可能である。例えば、cMycの遺伝子産物としては野生型のほか安定型などを用いてもよい。他の遺伝子産物についても同様である。本発明の核初期化因子は、上記の3種の遺伝子産物のほか、他の遺伝子産物を含むことができる。そのような遺伝子産物として、Soxファミリー遺伝子の遺伝子産物を挙げることができる。Soxファミリー遺伝子としては、例えば、Sox1、Sox3、Sox7、Sox15、Sox17、及びSox18、好ましくはSox2を挙げることができる。少なくともOctファミリー遺伝子例えばOct34、Klfファミリー遺伝子例えばKlf4、Mycファミリー遺伝子例えばcMyc、及びSoxファミリー遺伝子例えばSox2の4種の遺伝子の遺伝子産物の組み合わせを含む核初期化因子は初期化の効率の観点から本発明の好ましい態様であり、特に万能性の獲得のためにSoxファミリー遺伝子の遺伝子産物を組み合わせることが好ましい場合がある。Sox2は初期発生過程で発現し、転写因子をコードする遺伝子であるAAAvilionetalGenesDev17pp126402003。Sox2以外のSoxファミリー遺伝子のNCBIアセッション番号は以下のとおりである。また、Mycファミリー遺伝子の遺伝子産物はサイトカインで置き換えることができる場合がある。サイトカインとしては、例えば、SCF又はbFGFなどが好ましいが、これらに限定されることはない。さらに好ましい態様として、上記の3種類の遺伝子産物、好ましくは上記の4種類の遺伝子産物に加えて、細胞の不死化を誘導する因子をあげることができる。たとえば、TERT遺伝子の遺伝子産物を含む因子と、下記の遺伝子:SV40LargeTantigen、HPV16E6、HPV16E7、及びBmilからなる群から選ばれる1種以上の遺伝子の遺伝子産物を含む因子を、組み合わせることを挙げることができる。TERTはDNA複製時における染色体末端テロメア構造維持のために必須であり、ヒトでは幹細胞や腫瘍細胞では発現するが、多くの体細胞においては発現が認められないIHorikawaetalProcNatlAcadSciUSA102pp184374422005。SV40LargeTantigen、HPV16E6、HPV16E7、またはBmilは、LargeTantigenと組み合わせることにより、ヒト体細胞の不死化をもたらすことが報告されているSAkimovetalStemCells23pp142314332005PSalmonetalMolTher2pp4044142000。これらの因子は、特にヒト細胞からiPS細胞を誘導する場合において極めて有用である。TERTおよびBmi1遺伝子のNCBIアセッション番号は以下のとおりである。さらに、下記の群:Fbx15、Nanog、ERas、ECAT152、Tcl1、及びβcateninからなる群から選ばれる遺伝子のうちの1種又は2種以上の遺伝子産物を組み合わせてもよい。初期化の効率の観点から特に好ましい態様として、Fbx15、Nanog、ERas、ECAT152、Tcl1、及びβcateninの遺伝子産物を上記4種類の遺伝子産物と組み合わせた合計10種類の遺伝子産物を含む核初期化因子を挙げることができる。Fbx15YTokuzawaetalMolCellBiol23pp26997082003、NanogKMitsuietalCell113pp631422003、ERasKTakahashiKMitsuiSYamanakaNature423pp54152003、及びECAT152ABortvinetalDevelopment130pp1673802003はES細胞特異的発現遺伝子であり、Tcl1はAktの活性化に関与しておりABortvinetalDevelopment130pp1673802003、βcateninはWntシグナル伝達経路の重要な構成因子であり、多能性維持に関与しているとの報告もあるNSatoetalNatMed10pp55632004。さらに、本発明の核初期化因子は、例えば、下記の群:ECAT1、Esg1、Dnmt3L、ECAT8、Gdf3、Sox15、ECAT151、Fthl17、Sall4、Rex1、UTF1、Stella、Stat3、及びGrb2からなる群から選ばれる1種以上の遺伝子の遺伝子産物を含んでいてもよい。ECAT1、Esg1、ECAT8、Gdf3、及びECAT151はES細胞特異的発現遺伝子でありKMitsuietalCell113pp631422003、Dnmt3LはDNAメチル化酵素関連因子であり、Sox15は初期発生過程で発現し転写因子をコードする一群の遺伝子であるMMaruyamaetalJBiolChem280pp2437192005。Fthl17はFerritinheavypolypeptidelike17をコードしておりAcolLoriotTBoonCDeSmetIntJCancer105pp37162003、Sall4は胚性幹細胞で高発現するZnフィンガータンパク質をコードしておりJKohlhaseetalCytogenetGenomeRes98pp27472002、Rex1はOct34の下流にある転写因子をコードしているEBenShushanJRThompsonLJGudasYBergmanMolCellBiol18pp1866781998。UTF1はOct34の下流に位置する転写補助因子であり、これを抑制するとES細胞の増殖を抑制するとの報告があるAOkudaetalEMBOJ17pp2019321998。Stat3は細胞増殖分化のシグナル因子であり、Stat3の活性化によりLIFが働き、多能性維持に重要な役割を果たしているHNiwaTBurdonIChambersASmithGenesDev12pp2048601998。Grb2は細胞膜に存在するさまざまな成長因子受容体とRasMAPKカスケードとの間を仲介するタンパク質をコードしているAMChengetalCell95pp7938031998。もっとも、本発明の核初期化因子に含むことができる遺伝子産物は上記に具体的に説明した遺伝子の遺伝子産物に限定されることはない。本発明の核初期化因子には、核初期化因子として機能することができる他の遺伝子産物のほか、分化、発生、又は増殖などに関係する因子あるいはその他の生理活性を有する因子を1又は2以上含むことができ、そのような態様も本発明の範囲に包含されることは言うまでもない。核初期化因子として機能することができる他の遺伝子産物は、例えば、Oct34、Klf4、及びcMycの3種の遺伝子のうち1種又は2種のみを発現させた体細胞を用い、この細胞に対して核初期化を誘導することができる遺伝子産物をスクリーニングすることによって特定することができる。本発明により、新たな核初期化因子のスクリーニング方法として上記のスクリーニング方法も提供される。また、本発明の核初期化因子に含まれる遺伝子産物は、例えば上記遺伝子から産生されるタンパク質自体のほか、該タンパク質とその他のタンパク質又はペプチドなどとの融合遺伝子産物の形態であってもよい。例えば、緑色蛍光タンパク質との融合タンパク質やヒスチジンタグなどのペプチドとの融合遺伝子産物を用いることもできる。また、HIVウイルスに由来するTATペプチドとの融合タンパク質を調製して用いることにより、細胞膜からの核初期化因子の細胞内取り込みを促進させることができ、遺伝子導入などの煩雑な操作を回避して、融合タンパク質を培地に添加するだけで初期化を誘導することが可能になる。このような融合遺伝子産物の調製方法は当業者によく知られているので、当業者は目的に応じて適宜の融合遺伝子産物を容易に設計して調製することが可能である。本発明の核初期化因子を用いて体細胞の核を初期化して誘導多能性幹細胞を得ることができる。本明細書において誘導多能性幹細胞とはES細胞に近い性質を有する細胞のことであり、より具体的には、未分化細胞であって多能性及び増殖能を有する細胞を包含するが、この用語をいかなる意味においても限定的に解釈してはならず、最も広義に解釈する必要がある。核初期化因子を用いて誘導多能性幹細胞を調製する方法については国際公開WO200580598に説明されており上記公報においてはES様細胞という用語が用いられている、誘導多能性幹細胞の分離手段についても具体的に説明されている。従って、当業者は上記刊行物を参照することにより、本発明の核初期化因子を用いて誘導多能性幹細胞を容易に調製することが可能である。本発明の核初期化因子を用いて体細胞から誘導多能性幹細胞を調製する方法は特に限定されず、体細胞及び誘導多能性幹細胞が増殖可能な環境において核初期化因子が体細胞と接触可能であれば、いかなる方法を採用してもよい。例えば、本発明の核初期化因子に含まれる遺伝子産物を培地中に添加してもよく、あるいは本発明の核初期化因子を発現可能な遺伝子を含むベクターを用いて該遺伝子を体細胞に導入するなどの手段を採用してもよい。このようなベクターを用いる場合には、ベクターに2種以上の遺伝子を組み込んでそれぞれの遺伝子産物を体細胞において同時に発現させてもよい。初期化すべき体細胞において本発明の核初期化因子に含まれる遺伝子産物の1種又は2種以上がすでに発現されている場合には、本発明の核初期化因子から該遺伝子産物を除くこともできるが、このような態様も本発明の範囲に包含されることは言うまでもない。本発明の核初期化因子を用いて誘導多能性幹細胞を調製するにあたり、初期化すべき体細胞の種類は特に限定されず、任意の体細胞を利用することができる。例えば、胎児期の体細胞のほか、成熟した体細胞を用いてもよい。誘導多能性幹細胞を疾病の治療に用いる場合には、患者から分離した体細胞を用いることが望ましく、例えば、疾病に関与する体細胞や疾病治療に関与する体細胞などを用いることができる。本発明の方法により培地中に出現した誘導多能性幹細胞を選択する方法も特に限定されず、例えば、マーカー遺伝子として薬剤耐性遺伝子などを用いて薬剤耐性を指標として誘導多能性幹細胞を分離するなどの周知の手段を適宜採用できる。ES細胞の未分化性及び多能性を維持可能な培地又はその性質を維持することができない培地は当業界で種々知られており、適宜の培地を組み合わせて用いることにより、誘導多能性幹細胞を効率よく分離することができる。分離された誘導多能性幹細胞の分化能及び増殖能はES細胞について汎用されている確認手段を利用することにより当業者が容易に確認可能である。本発明の方法により調製される誘導多能性幹細胞の用途は特に限定されず、ES細胞を利用して行われているあらゆる試験研究やES細胞を用いた疾病の治療などに使用することができる。例えば、本発明の方法により得られた誘導多能性幹細胞をレチノイン酸、EGFなどの増殖因子、又はグルココルチコイドなどで処理することにより、所望の分化細胞例えば神経細胞、心筋細胞、血球細胞などを誘導することができ、そのようにして得られた分化細胞を患者に戻すことにより自家細胞移植による幹細胞療法を達成することができる。もっとも、本発明の誘導多能性幹細胞の用途は上記の特定の態様に限定されることはない。以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。例1:初期化因子の選択初期化因子を同定するためには初期化現象を容易に観察する実験系が必要である。実験系としてFbx15遺伝子座にβgeoベータガラクトシダーゼとネオマイシン耐性遺伝子の融合遺伝子をノックインしたマウスを利用した。マウスFbx15遺伝子はES細胞や初期胚といった分化多能性細胞において特異的に発現する遺伝子である。しかしマウスFbx15遺伝子にβgeoをノックインし、Fbx15の機能を欠失したホモ変異マウスにおいては、分化多能性や発生を含めて異常な表現型は観察されなかった。このマウスにおいては、βgeoがFbx15遺伝子のエンハンサーやプロモーターにより発現制御される。すなわち、分化した体細胞ではβgeoは発現せず、G418に感受性を示す。一方、βgeoをノックインしたホモ変異ES細胞は極めて高濃度12mgml以上のG418に耐性を示す。この現象を利用し、体細胞の初期化を可視化する実験系を構築した。上記実験系において、まずβgeoをノックインしたホモ変異マウスの胎児受精後135日から線維芽細胞Fbx15βgeoβgeoのMEFを単離した。MEFはFbx15遺伝子を発現しないため、βgeoも発現せず、G418に感受性を示す。一方、このMEFと遺伝子操作を加えていないES細胞やはりG418に感受性を示すを融合させると、MEFの核が初期化する結果、βgeoが発現してG418耐性となる。すなわち、この実験系により初期化現象をG418耐性に置き換えて可視化できる国際公開WO200580598。上記実験系を用いて初期化因子の探索を行ない図1、初期化因子の候補としてES細胞で特異的な発現を示す遺伝子、及びES細胞の分化多能性維持における重要な役割が示唆される遺伝子を合計24種類選択した。これらの遺伝子を下記の表4及び表5に示す。なお21のβcatenin及び22のcMycに関しては活性型の変異体cateninS33YcMycT58Aを用いた。これらの遺伝子のcDNAをレトロウイルスベクターpMXgwにGatewayテクノロジーにより挿入した。まず24遺伝子を一つずつFbx15βgeoβgeoのMEFに感染させ、その後、ES細胞培養条件でG418選択を行った。しかしG418耐性コロニーは一つも得られなかった。次に、全24遺伝子のレトロウイルスを同時にFbx15βgeoβgeoのMEFに感染させた。ES細胞培養条件でG418選択を行ったところ、複数の薬剤耐性コロニーが得られた。これらのコロニーを単離し培養を継続した。これらの細胞は長期間にわたって培養が可能であり、またES細胞に類似した形態を示すことが分かった図2。図中、iPS細胞は誘導多能性幹細胞ES様細胞、ESlike細胞、ESL細胞とも呼ぶ、ESは胚性幹細胞を示し、MEFは分化細胞胎児線維芽細胞を示す。マーカー遺伝子の発現をRTPCRにより検討したが、Nanog、Oct34などの未分化マーカーが発現していた図3。Nanogの発現はES細胞に近いが、Oct34の発現はES細胞より低いことがわかった。また、DNAメチル化状態をバイサルファイトシークエンス法で確認したが、Nanog遺伝子やFbx15遺伝子はMEFにおいて高メチル化状態にあるが、iPS細胞においては脱メチル化されていることがわかった図4。インプリンティング遺伝子であるIGF2遺伝子はMEFとiPS細胞の両者で約50がメチル化されていた。Fbx15βgeoβgeoのMEFを採取した受精後135日の始原生殖細胞においてはインプリンティング記憶が消去されIGF2遺伝子はほぼ完全に脱メチル化されていることが知られているので、iPS細胞はFbx15βgeoβgeoのMEFに混入していた始原生殖細胞に由来するものではないと結論された。以上の結果より、24種類の因子の組み合わせにより、分化細胞MEFをES細胞に近い状態に初期化誘導できることが示された。次に、24種類の遺伝子の全てが初期化のために必要であるか否かを検討した。1遺伝子ずつ除外した23遺伝子をFbx15βgeoβgeoのMEFに感染させた。その結果、10遺伝子については、それを除外した時に、コロニーの形成が阻害されることがわかった図5:遺伝子の番号は表4に示した遺伝子の番号に対応しており、3、4、5、11、14、15、18、20、21、及び22の10種類の遺伝子である。これらの10遺伝子を同時にFbx15βgeoβgeoのMEFに感染させたところ、24遺伝子を同時に感染させた場合に比して有意に効率よくG418耐性コロニーが得られた。さらに、この10遺伝子から1遺伝子ずつ除外した9遺伝子をFbx15βgeoβgeoのMEFに感染させた。その結果、4種の遺伝子14、15、20、又は22をそれぞれ除外した場合にはG418耐性のiPS細胞コロニーが形成されないことがわかった図6。従って、10遺伝子のうち、これら4種の遺伝子が初期化誘導にとって特に重要な役割を果たすことが示唆された。例2:4種類の遺伝子群の組合せによる初期化誘導10種類の遺伝子群のなかで特に重要性が示唆された4遺伝子により体細胞の初期化の誘導が可能であるか否かを検討した。Fbx15遺伝子にβgeoをノックインしたMEF細胞に上記10種類の遺伝子の組み合わせ、上記4種類の遺伝子の組み合わせ、上記4種類のうち3種類のみの遺伝子の組み合わせ、及び上記4種類のうち2種類のみの遺伝子の組み合わせを用いて、これらの遺伝子群をレトロウイルスにより体細胞に導入した。その結果、4種類の遺伝子を導入した場合には160個のG418耐性コロニーが得られた。この結果は、10種類の遺伝子を導入した場合の結果179コロニーとほぼ同数であったが、4遺伝子導入の場合には10遺伝子導入の場合に比べてコロニーが小さかった。また、これらのコロニーを継代培養した場合、iPS細胞の形態を示したコロニーは10遺伝子導入の場合に12クローン中9クローンであったのに対して、4遺伝子導入の場合には12クローン中7クローンと若干少ない傾向にあった。4遺伝子としては、マウス由来のもの、ヒト由来のもの、どちらでもほぼ同じ数のiPS細胞が得られた。上記4遺伝子の中から選択された3遺伝子を導入した場合、ある組合せ14、15及び20では36個の扁平なコロニーが得られたが、継代培養してもiPS細胞は観察されなかった。別の組合せ14、20、及び22では54個の小さいコロニーが得られた。これらのうち、比較的大きいコロニーを6つ継代培養したところ、6クローンのすべてでES細胞に類似した細胞が得られた。しかしながら、ES細胞に比べると細胞同士や培養シャーレへの接着が弱いと思われた。また細胞増殖の速度も4遺伝子を導入した場合に比べて遅かった。また4遺伝子中の3遺伝子の他の2通りの組み合わせではそれぞれ1つずつコロニーが形成されたが、継代培養しても細胞の増殖は認められなかった。4遺伝子のなかから選択された2遺伝子の組み合わせ6通りでは、いずれの場合にもG418耐性コロニーが1つも形成されなかった。以上の結果を図7に示す。また、図10にはES細胞マーカー遺伝子の発現をRTPCRで確認した結果を示した。方法の詳細は以下のとおりである。Fbx15βgeoβgeoのMEFに3遺伝子Oct34、Klf4及びcMyc、Sox2minusと表記、4遺伝子3遺伝子にSox2を加えたもの、4ECATと表記、10遺伝子4遺伝子に表4の3、4、5、11、18、21を加えたもの、10ECATと表記を導入し樹立したiPS細胞、Fbx15遺伝子にβgeoをノックインした成体マウスの尾部皮膚より樹立した線維芽細胞に10遺伝子を導入して樹立したiPS細胞10ECATSkinfibroblastと表記、マウスES細胞及び遺伝子導入していないMEF細胞よりTotalRNAを精製し、DNaseI処理によりゲノムDNAの混入を除去した。逆転写反応によりFirststrandcDNAを作成し、PCRによりES細胞マーカー遺伝子の発現を検討した。なおOct34、Nanog、ERasに関しては導入したレトロウイルスからではなく、内在性遺伝子からの転写産物のみを増幅するプライマーを用いてPCRを行った。プライマー配列を表6に示す。この図に示された結果から、3遺伝子を導入した場合、ERasやFgf4は効率よく発現誘導されるが、多能性維持に必須の因子であるOct34とNanogの誘導は起こらないか、おこっても非常に弱いことがわかった。一方、4遺伝子を導入した場合、Oct34とNanogが比較的強く誘導されているクローンが調べた4クローン中で1クローン7が存在した。さらに10遺伝子を導入した場合は、調べた5クローン中、3クローンにおいて、Oct34とNanogの強い誘導が認められた。これらの結果から、初期化のためには少なくとも3遺伝子の組合せ14、20、及び22が必須であり、それらの3種の遺伝子を含む4遺伝子群及び10遺伝子群では遺伝子の数を増やすにつれて初期化の効率が上昇することが明らかとなった。例3:初期化した細胞の多分化能の解析樹立したiPS細胞の分化多能性を評価するため、24因子、10因子、および4因子で樹立されたiPS細胞をヌードマウスの皮下に移植した。その結果、ES細胞と同様の大きさの腫瘍が全例で形成された。組織学的に見ると腫瘍は複数の種類の細胞から構成されており、軟骨組織、神経組織、筋肉組織、脂肪組織、および腸管様組織図8が認められたことから、iPS細胞の多能性が証明された。一方、3因子で樹立した細胞をヌードマウスに移植すると腫瘍は形成されたが、組織学的には未分化細胞からのみ形成されていた。したがって、分化多能性の誘導のためには、Soxファミリーが必須であることがわかった。例4:成体マウスの尾部に由来する線維芽細胞の初期化マウス胎児線維芽細胞MEFで同定した4因子をFbx15遺伝子にβgeoをノックインし、さらに全身で緑色蛍光蛋白質GFPを発現する成体マウスの尾部に由来する線維芽細胞に導入した。その後、フィーダー細胞上でES細胞培養条件と同様の条件で培養してG418による選択を行った。薬剤選択開始後約2週間で複数のiPS細胞コロニーが得られた。これらの細胞をヌードマウスの皮下に移植すると三胚葉系の様々な組織からなる奇形腫を形成した。また成体皮膚線維芽細胞に由来するiPS細胞を胚盤胞に移植し、偽妊娠マウスの子宮に移植したところ、受精後13.5日目の胚において、全身でGFP陽性細胞の分布しているものが認められた。これはiPS細胞が多能性を有しており、マウス胚発生に寄与できることを示している。この結果は、同定した因子群が胎児期の体細胞だけではなく成熟したマウスの体細胞に対しても初期化を誘導する能力のあることを示している。成体皮膚由来の細胞で初期化誘導できることは実用上極めて重要である。例5iPS細胞樹立におけるサイトカインの影響を検討した。フィーダー細胞STO細胞に塩基性線維芽細胞増殖因子bFGF又は幹細胞因子SCFの発現ベクターpMXレトロウイルスベクターを導入し、これらのサイトカインを恒常的に発現する細胞を樹立した。Fbx15βgeoβgeoマウス由来MEF50万個/100mmディッシュをこれらのSTO細胞上で培養し、4因子を導入後G418による選択を行ったところ、通常のSTO細胞上で培養した時と比べて、コロニー形成数がbFGF図11、SCFdatanotshownを産生するSTO細胞上では20倍以上上昇した。またcMyc以外の3因子を導入しても通常のSTO細胞上ではiPS細胞コロニーは生成されなかったが、bFGF図11、SCFdatanotshownを産生するSTO細胞上では、コロニーの形成が認められた。これらの結果から、サイトカインの刺激により、MEFからのiPS細胞の樹立効率が上昇すること、及びcMycに換えてサイトカインを用いることにより核初期化が可能になることが明らかとなった。例6Oct34、Klf4、cMyc、及びSox2遺伝子にはすべてファミリー遺伝子表1及び2が存在する。そこで4遺伝子に換えてファミリー遺伝子によってもiPS細胞が樹立できるかを検討した。表7に2回の実験の結果を合わせたものを示す。Soxファミリーについては、Sox1はG418耐性コロニー数及びiPS細胞樹立効率とともにSox2と同程度であった。Sox3はG418耐性コロニー数はSox2の10分の1程度であったが、ひろったコロニーからのiPS細胞樹立効率はSox2よりむしろ高かった。Sox15はG418耐性コロニー数及びiPS細胞樹立効率とともにSox2より低かった。Sox17はG418耐性コロニーはSox2と同程度であったが、iPS細胞樹立効率は低かった。Klfファミリーについては、Klf2はKlf4より少ないG418耐性コロニーが生じたが、iPS細胞の樹立効率は同程度であった。Mycファミリーについては、まず野生型のcMycがT58A変異体とG418耐性コロニー数、iPS細胞樹立効率の両者において同程度であることを確認した。さらにNMyc及びLMycともに野生型は、ともにcMycとG418耐性コロニー数、iPS細胞樹立効率の両者において同程度であった。例7Fbx15βgeo以外のレポーターでiPS細胞が樹立できるかを検討した。まずNanog遺伝子を中央部に含む大腸菌人工染色体BACを単離し、大腸菌内の組み換えにより、GFP遺伝子及びピューロマイシン耐性遺伝子をノックインした図12A。ついで同改変BACをES細胞に導入し、未分化状態特異的にGFP陽性となることを確認したdatanotshown。ついで同ES細胞のマウス胚盤胞に移植することによりキメラマウスを経てトランスジェニックマウスを作出した。このマウスにおいてはGFP陽性細胞は胚盤胞の内部細胞塊や受精後13.5日胚の生殖腺において特異的に認められた図12B。受精後13.5日胚DBA、129及びC57BL6マウスの雑種から生殖腺を除去し、MEFを単離した。フローサイトメトリーにより、単離したMEFはGFP陰性であることを確認した図13。このMEFに4因子をレトロウイルスで導入し、ピューロマイシンによる選択を行ったところ、複数の耐性コロニーが得られた。その中の約10~20のみがGFP陽性であった。GFP陽性コロニーを継代培養するとES細胞に類似した形態図14や増殖図15を示した。また遺伝子発現を見るとFbx15βgeoβgeoのMEFからG418選択により単離したiPS細胞より、さらにES細胞に近い発現パターンであることがわかった図16。この細胞をヌードマウスに移植すると奇形腫が形成されたことからiPS細胞であることが確認された図17。さらにNanogGFP選択によるiPS細胞をC57BL6マウスの胚盤胞に移植することによりキメラマウスが誕生した図18。さらにこのキメラマウス同士を交配させることによりジャームライントランスミッションが確認された図19。このNanogGFP選択により樹立されたよりES細胞に近いiPS細胞においては、レトロウイルスからの4因子の発現はほぼ完全にサイレンシングを受けており、内在性のOct34やSox2により自己複製が維持されていることが示唆された。例810cmコンフルエントのiPS細胞を、トリプシン処理し、ES細胞用培地に懸濁したSTO細胞は懸濁後10~20分ゼラチンコートしたディッシュに接着させることによって除去した。2×106の細胞を、HEMA2hydroxyethylmethacrylateでコーティングした大腸菌培養用ディッシュで4日間浮遊培養し、EmbryoidbodyEBを形成させた。EB形成4日目に、EBを全量10cm組織培養用ディッシュに移しES細胞用培地で24時間培養して接着させた。24時間後にITSfibronectin含有培地に交換した。7日間培養し2日毎に培地交換を行う、nestin陽性細胞を選択した無血清下で培養すると、他の系譜の細胞がある程度死んでいくday512。次にA2B5陽性細胞の誘導を行った。7日後にトリプシン処理して細胞をばらばらにし、残存するEBは除去した。1×105個の細胞をpolyLornithinefibronectinがコーティングされている24ウェルプレートに撒き、N2bFGF含有培地で四日間培養した。四日後にN2bFGFEGF含有培地へ交換し、四日間培養した。四日後にN2bFGFPDGF含有培地に交換して、四日間培養した。この期間に細胞が増えすぎてコンフルエントになった場合は随時継代し、1~2×105個の細胞を撒いた。継代時期によって数は変更する。四日後にN2T3培地に交換して、7日間培養しし、2日毎に培地交換を行った。day31に固定し、免疫染色した。その結果、iPS細胞から、βIIIチュブリン陽性の神経細胞、O4陽性のオリゴデンドロサイト、GFAP陽性のアストロサイトへの分化が確認された図20。例9Fbx15βgeoノックインマウス以外の任意のマウス体細胞からiPS細胞を樹立するために、薬剤選択を用いない樹立方法を開発した。10cmディッシュSTOフィーダー細胞上にマウス胎児線維芽細胞MEFを、これまでより少数1万、5万又は10万個培養し、レトロウイルスによりコントロールDNA又は4因子を導入した。ES細胞培地にて2週間培養G418選択無し行ったところ、コントロールDNAを導入したディッシュではコロニー形成が認められなかったが、4因子を導入したディッシュにおいては形質転換したと思われる扁平なコロニー加えて、複数のコンパクトなコロニーが形成された図21。これらから24コロニーをピックアップし培養を続けたところ、ES細胞様の形態が認められた。その遺伝子発現をRTPCRにて検討したところ、7クローンにおいてES細胞マーカーであるEsg1の発現が認められた。またクローン4においてはNanog、ERas、GDF3、Oct34、Sox2などの多くのES細胞マーカーの誘導が認められたことからiPS細胞であると考えられた図22。以上の結果より、iPS細胞樹立にはFbx15βgeoノックインなどを用いた薬剤選択は必須でなく、任意のマウス由来体細胞からiPS細胞を樹立できることが示された。本技術により疾患モデルマウスの体細胞からもiPS細胞が樹立できる可能性が示された。例10iPS細胞を誘導する細胞として、線維芽細胞以外の細胞である、肝細胞及び胃粘膜細胞を検討した。Fbx15βgeoβgeoマウスの肝臓から肝細胞を還流により単離した。この肝細胞に4因子をレトロウイルスで投与し、G418による選択を行ったところ複数のiPS細胞コロニーが得られた。DNAマイクロアレーによる遺伝子発現パターン解析の結果、肝臓由来のiPS細胞は皮膚線維芽細胞や胎児線維芽細胞由来のiPS細胞より、さらにES細胞に類似していることが明らかとなった。胃粘膜細胞からも、肝細胞からと同様にiPS細胞が得られた。例11PD98059はMAPキナーゼの阻害薬であり、多くの分化細胞においては増殖を抑制するが、ES細胞においては、未分化状態維持と増殖を促進することが知られている。そこでiPS細胞樹立におけるPD98059の効果を検討した。NanogEGFPIRESPuroの選択マーカーをもつマウスから樹立したMEFに4因子をレトロウイルスで投与し、ピューロマイシンによる選択を行った。PD98059を投与しない場合、得られたiPS細胞コロニーの中で、GFP陽性の割合は8であった。一方、PD98059最終濃度25μMをレトロウイルス感染の翌日から持続的に投与した群では、得られたコロニーの45がGFP陽性であった。これはPD98059がGFP陽性の、よりES細胞に近いiPS細胞の増殖を促進するが、GFP陰性のiPS細胞や、分化細胞の増殖は抑制するためであると考えられた。このことからPD98059は、よりES細胞に近いiPS細胞の樹立や、薬剤選択を用いないiPS細胞の樹立に利用できることが示された。例12胎児由来のHumandermalfibroblastにマウスエコトロピックウイルスレセプターであるsolutecarrierfamily7Slc7a1、NCBIアクセッション番号NM007513をレンチウイルスで発現させた細胞に、マウスOct34遺伝子プロモーター下流に赤色蛍光蛋白質遺伝子を、およびPGKプロモーター下流にハイグロマイシン耐性遺伝子を組み込んだプラスミドをヌクレオフェクションで導入した。ハイグロマイシンによる選択を行い、安定発現株を樹立した。800000個の細胞をマイトマイシン処理したSTO細胞の上にまき、翌日レトロウイルスによりOct34Sox2Klf4cMycいずれもヒト由来を導入した。3週間後に得られたコロニー図23左を24個拾い、STO細胞を播種した24wellplateに移して培養した。2週間後に増えてきた1クローンをSTO細胞を播種した6wellplateに継代して培養した結果、ES細胞に形態上において類似した細胞が得られ図23右、iPS細胞であることが示唆された。培地は常にマウスES細胞用培地を用いた。例13ヒト成体皮膚線維芽細胞adultHDFにレンチウイルスでSlc7a1マウスレトロウイルス受容体を導入した細胞を800000個のフィーダー細胞マイトマイシン処理STO細胞上にまき、以下の組み合わせでレトロウイルスにより遺伝子を導入した。1Oct34Sox2Klf4cMycTERTSV40LargeTantigen2Oct34Sox2Klf4cMycTERTHPV16E63.Oct34Sox2Klf4cMycTERTHPV16E74Oct34Sox2Klf4cMycTERTHPV16E6HPV16E75Oct34Sox2Klf4cMycTERTBmi1Oct34Sox2Klf4cMycTERTはヒト由来、Bmi1はマウス由来マウスES細胞の培養条件下で、薬剤選択無しで培養を続けたところ、1の組み合わせで因子を導入したディッシュにおいて、ウイルス感染8日後において、iPS細胞と思われるコロニーが出現した図24。他の組み合わせ2から5においても、1の組み合わせの場合ほどは明瞭ではないが、iPS細胞様のコロニーが出現した。4因子のみを導入しても、全くコロニーは出現しなかった。