"ヒト被験体において、該被験体の眼における内因性11-シス-レチナールの欠乏の影響を、内因性11-シス-レチナールの代わりになることにより軽減させるための組成物であって、該組成物は、9-シス-レチナールまたは11-シス-レチナールを含み、該9-シス-レチナールまたは11-シス-レチナールは、該ヒト被験体の眼における内因性11-シス-レチナールの代わりになり、該組成物は、該ヒト被験体に投与されることを特徴とする、組成物。ヒト被験体において、該被験体の眼における内因性11-シス-レチナールの欠乏の影響を、内因性11-シス-レチナールの代わりになることにより軽減させるための組成物であって、該組成物は、9-シス-レチナールまたは11-シス-レチナールのうちのいずれかの誘導体である合成レチノイドを含み、該誘導体は、内因性レチノイドを含まない調製されたウシ網膜色素上皮RPEミクロソームにおいて、レシチン:レチノールアシルトランスフェラーゼLRATアッセイにおいてインビトロにおいて9-シス-レチニルエステルまたは11-シス-レチニルエステルへと変換され得、該組成物は、該ヒト被験体に投与されることを特徴とする、組成物。ヒト被験体において、該被験体の眼における内因性11-シス-レチナールの欠乏の影響を、内因性11-シス-レチナールの代わりになることにより軽減させるための組成物であって、該組成物は、ヒト被験体の眼において機能性オプシン/レチノイド複合体を生じる合成レチノイドを含み、該合成レチノイドは、式I~式XIIIのうちの1つにより示される構造を有し、必要に応じて、該合成レチノイドは9-シス-レチナールでも11-シス-レチナールでもない、組成物。加齢ヒト被験体における夜間視力またはコントラスト感度の喪失を処置または予防するための組成物であって、該組成物は、有効量の合成レチノイドを含み、該合成レチノイドは、i式I~式XIIIのうちの1つに記載の合成レチノイドであるか、またはii9-シス-レチナールまたは11-シス-レチナールの誘導体であり、該誘導体は、内因性レチノイドを含まない調製されたウシ網膜色素上皮RPEミクロソームにおいて、レシチン:レチノールアシルトランスフェラーゼLRATアッセイにおいてインビトロにおいて9-シス-レチニルエステルまたは11-シス-レチニルエステルへと変換され得、該組成物は、該ヒト被験体に投与されることを特徴とする、組成物。請求項4に記載の組成物であって、該組成物は、前記被験体への予防的投与のために製剤されたか、または前記ヒト被験体は少なくとも45歳である、組成物。前記ヒト被験体が低下した視力を有する、請求項1または2または3に記載の組成物。請求項1または2または3または6に記載の組成物であって、前記内因性11-シス-レチナールの代わりになることは、内因性11-シス-レチナールの欠乏に起因する前記ヒト被験体の眼における光受容体機能の喪失を軽減させる、組成物。請求項1~7のうちのいずれか1項に記載の組成物であって、前記ヒト被験体への経口投与用または前記ヒト被験体の眼への局所投与用に製剤された、組成物。請求項1~8のうちのいずれか1項に記載の組成物であって、前記ヒト被験体は、レーバー先天性黒内症、白点状網膜炎、先天性停在性夜盲、白点眼底または加齢性黄斑変性を有する、組成物。前記被験体はレーバー先天性黒内症を有する、請求項9に記載の組成物。前記経口投与は、約1.0mg~約1000mgの前記レチナールまたは合成レチノイドの経口投与である、請求項8に記載の組成物。前記局所投与は、点眼剤、眼内注射または眼周囲注射による投与である、請求項8に記載の組成物。前記ヒト被験体は、RPE65遺伝子変異またはレシチン:レチノールアシルトランスフェラーゼLRAT遺伝子変異を有する、請求項1または2または3に記載の組成物。前記欠乏はRPE65遺伝子欠損に起因するものではない、請求項1~13のうちのいずれか1項に記載の組成物。眼科用組成物または経口投与形態であって、式I~式XIIIのうちのいずれか1つによって示される構造を有する合成レチノイドを含み、該合成レチノイドは、9-シス-レチナールでも11-シス-レチナールでもない、組成物。薬学的に受容可能なビヒクルをさらに含む、請求項1~15のうちのいずれか1項に記載の組成物。本明細書に記載される発明。現在のところ、レチノイド欠乏のための治療法はほとんどない。抗酸化性ビタミンと亜鉛とを組み合わせる一方法は、低い回復効果をもたらすに過ぎない。そこで、光受容体機能を回復または安定化し、不十分な内因性レチノイドレベルの影響を改善する組成物および方法が必要である。発明の簡単な概要本発明は脊椎動物視覚系の光受容体機能を回復または安定化する方法を提供する。合成レチノイドをヒトまたは非ヒト脊椎動物に投与して光受容体機能を回復または安定化し、および/またはレチノイドレベル不足の影響を改善することができる。一局面において、脊椎動物の眼の光受容体機能を回復する方法が提供される。一般にこの方法は、眼に内因性欠乏症を有する脊椎動物に有効量の合成レチノイドを薬学的に受容可能なビヒクルと共に投与する工程を包含する。合成レチノイドは脊椎動物の眼のオプシンに結合し、機能性オプシン/合成レチノイド複合体を形成する。合成レチノイドは例えば式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XIIまたはXIIIの合成レチノイドでよい。ある実施形態において、合成レチノイドは9-シス-レチナールである。この合成レチノイドは点眼、眼内注射または眼周囲注射などによって眼に局所投与することができる。合成レチノイドを脊椎動物に経口投与することもできる。また別の局面において、脊椎動物の眼の内因性レチノイドの需要をへらす方法も提供される。一般にこの方法は薬学的に受容され得るビヒクル中の合成レチノイドを眼に投与する工程を包含し、その際合成レチノイドは脊椎動物の眼の中でオプシンと結合し、機能性オプシン/合成レチノイド複合体を形成する。合成レチノイドは例えば式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XIIまたはXIIIの合成レチノイドでよい。ある種の実施形態において、合成レチノイドは9-シス-レチナールである。欠乏している内因性レチノイドは例えば11-シス-レチナールであり得る。また別の局面において、脊椎動物の眼の光受容体機能の喪失を改善する方法が提供される。その方法は一般に、薬学的に受容可能なビヒクル中の有効量の合成レチノイドを脊椎動物の眼に予防的に投与する工程を包含する。この合成物は、オプシン蛋白に結合して機能性オプシン/合成レチノイド複合体を形成する。合成レチノイドは例えば経口投与または局所投与することができる。合成レチノイドは例えば式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XIIまたはXIIIの合成レチノイドでよい。ある実施形態において、合成レチノイドは9-シス-レチナールである。その他の局面において、視力低下を起こした、または視力低下の発生リスクのある被験体のための処置を選択する方法が提供される。その方法は一般的にその被験体が標準的被験体に比較して内因性レチノイドレベルの低下を示すかどうかを確認し、その被験体に薬学的に受容可能なビヒクル中の有効量の合成レチノイドを投与する工程を包含する。合成レチノイドは被験体の眼の中でオプシンに結合する。被験体は例えばレーバー先天性黒内症、白点状網膜炎、先天性停在性夜盲、白点眼底または加齢性黄斑変性を有するヒトであり得る。ある実施形態において、欠乏している内因性レチノイドは11-シス-レチナールである。合成レチノイドは、脊椎動物の眼に局所投与するなど、経口的または局所的に脊椎動物に投与できる。合成レチノイドは例えば式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XIIまたはXIIIの合成レチノイドでよい。ある実施形態において、合成レチノイドは9-シス-レチナールである。もう一つの局面において、薬学的に受容可能なビヒクル中の合成レチノイドを含む眼科用組成物が提供される。合成レチノイドは例えば式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XIIまたはXIIIの合成レチノイドでよい。ある実施形態において、合成レチノイドは9-シス-レチナールである。眼科用組成物は例えば点眼剤、眼内注射溶液または眼周囲注射溶液でよい。その他の関連する局面において、薬学的に受容可能なビヒクル中のオプシン結合合成レチノイドを含む経口投与形態が提供される。この合成レチノイドは例えば式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XIIまたはXIIIの合成レチノイドでよい。ある実施形態において、上記合成レチノイドは9-シス-レチナールである。また別の局面において、脊椎動物のレーバー先天性黒内障を処置する方法が提供される。この方法は一般に被験体に、薬学的に受容可能なビヒクル中の有効量の合成レチノイドを投与する工程を包含する。合成レチノイドは脊椎動物の眼の中でオプシンに結合し、機能性オプシン/合成レチノイド複合体を形成する。合成レチノイドは例えば式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XIIまたはXIIIの合成レチノイドでよい。その他の実施形態においては、合成レチノイドが9-シスレチナールでないという条件で、その合成レチノイドは例えば式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XIIまたはXIIIの合成レチノイドでよい。その他の実施形態においては、合成レチノイドは9-シス-レチナールである。合成レチノイドは例えば眼に局所投与できる。ある実施形態において、合成レチノイドは点眼、眼内注射、眼周囲注射などによって局所投与できる。合成レチノイドは被験体に経口投与することもできる。また別の局面において、脊椎動物被験体の白点状網膜炎RetinitisPunctataAlbescens、先天性停在性夜盲CongenitalStationaryNightBlindnessまたは白点眼底FundusAlbipunctatusを処置する方法を提供する。一般的にその方法は被験体に薬学的に受容可能なビヒクル中の有効量の合成レチノイドを投与する工程を包含する。合成レチノイドは脊椎動物の眼においてオプシンに結合し、機能性オプシン/合成レチノイド複合体を形成する。その合成レチノイドは例えば式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XIIまたはXIIIの合成レチノイドでよい。ある実施形態において、合成レチノイドは9-シス-レチナールである。合成レチノイドは例えば眼に局所投与できる。合成レチノイドは例えば点眼、眼内注射または眼周囲注射によって局所投与できる。合成レチノイドを被験体に経口投与することもできる。もう一つの局面において、脊椎動物被験体の加齢性黄斑変性を処置する方法が提供される。その方法は一般にその被験体に薬学的に受容可能なビヒクル中の有効量の合成レチノイドを投与する工程を包含する。合成レチノイドは脊椎動物の眼においてオプシンに結合し、機能性オプシン/合成レチノイド複合体を形成する。例えば合成レチノイドはその眼のなかの遊離オプシンに結合することができる。合成レチノイドは例えば式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XIIまたはXIIIの合成レチノイドでよい。幾つかの実施形態において、合成レチノイドは9-シス-レチナールである。その合成レチノイドは例えば眼に局所適投与され得る。その合成レチノイドは例えば点眼、眼内注射または眼周囲注射によって局所投与できる。その合成レチノイドは上記被験体に経口投与することもできる。もう一つの局面において、加齢脊椎動物被験体における夜間視力またはコントラスト感度の喪失を処置または予防する方法が提供される。その方法は一般に、薬学的に受容可能なビヒクル中の有効量の合成レチノイドを上記被験体に投与する工程を包含する。合成レチノイドは上記脊椎動物の眼においてオプシンに結合し、オプシン/合成レチノイド複合体を形成する。例えば合成レチノイドは眼のなかの遊離オプシンに結合することができる。上記合成レチノイドは例えば式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XIIまたはXIIIの合成レチノイドでよい。ある実施形態において、合成レチノイドは9-シス-レチナールである。上記合成レチノイドは例えば眼に局所投与され得る。局所投与の適切な方法は例えば点眼剤、眼内注射または眼周囲注射などを含む。合成レチノイドは被験体に経口投与することもできる。ある実施形態において、合成レチノイドは被験体に予防的に投与される。例えば、本発明は以下の項目を提供する。項目1脊椎動物の眼の光受容体機能を回復させる方法であって、内因性異常を有する脊椎動物に薬学的に受容可能なビヒクル中の有効量の合成レチノイドを投与する工程を包含し、ここで、該合成レチノイドは、該脊椎動物の眼の中のオプシンに結合し、機能性オプシン/合成レチノイド複合体を形成する、方法。項目2前記合成レチノイドが、9-シス-レチナールである、項目1に記載の方法。項目3前記合成レチノイドが、式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XIIまたはXIIIの合成レチノイドを含む、項目1に記載の方法。項目4前記内因性レチノイド異常が、加齢性黄斑変性、レーバー先天性黒内障、白点状網膜炎、先天性停在性夜盲または白点眼底に関連する、項目1に記載の方法。項目5前記合成レチノイドが、前記眼に局所投与される、項目1に記載の方法。項目6前記合成レチノイドが、点眼、眼内注射または眼周囲注射によって局所投与される、項目5に記載の方法。項目7前記合成レチノイドが、前記脊椎動物に経口投与される、項目1に記載の方法。項目8脊椎動物の眼における、内因性レチノイドに対する要求をへらす方法であって、以下:該眼に、薬学的に受容可能なビヒクル中の合成レチノイドを投与する工程であって、ここで、該合成レチノイドは該脊椎動物の眼のオプシンに結合し、機能性オプシン/合成レチノイド複合体を形成する、工程、を包含する、方法。項目9前記合成レチノイドが、式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XIIまたはXIIIの合成レチノイドを含む、項目8に記載の方法。項目10前記合成レチノイドが、9-シス-レチナールである、項目8に記載の方法。項目11前記内因性レチノイドが、11-シス-レチナールである、項目8に記載の方法。項目12脊椎動物の眼の光受容体機能の喪失を回復させる方法であって、以下:薬学的に受容可能なビヒクル中の有効量の合成レチノイドを該脊椎動物の眼に予防的に投与する工程であって、ここで、該合成レチノイドがオプシン蛋白に結合して、機能性オプシン/合成レチノイド複合体を形成する、工程、を包含する、方法。項目13前記合成レチノイドが、前記眼を備える脊椎動物に経口投与される、項目12に記載の方法。項目14前記合成レチノイドが、前記脊椎動物の眼に局所投与される、項目12に記載の方法。項目15前記合成レチノイドが、式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XIIまたはXIIIの合成レチノイドを含む、項目12に記載の方法。項目16前記合成レチノイドが、9-シス-レチナールである、項目12に記載の方法。項目17低下した視力を有する被験体のための処置を選択する方法であって、以下:該被験体が、標準被験体と比較した場合に内因性レチノイドレベルの欠乏を示しているか否かを決定する工程;および、薬学的に受容可能なビヒクル中の有効量の合成レチノイドを該被験体に投与する工程であって、ここで、該合成レチノイドは、該被験体の眼のオプシンに結合する、工程、を包含する、方法。項目18前記被験体が、レーバー先天性黒内障、白点状網膜症、先天性定常的夜盲、白点眼底または加齢性黄斑変性を有する、項目17に記載の方法。項目19前記内因性レチノイドが、11-シス-レチナールである、項目17に記載の方法。項目20前記眼を備える前記脊椎動物に合成レチノイドが経口投与される、項目17に記載の方法。項目21前記合成レチノイドが、前記脊椎動物の眼に局所投与される、項目17に記載の方法。項目22前記合成レチノイドが式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XIIまたはXIIIの合成レチノイドを含む、項目17に記載の方法。項目23前記合成レチノイドが、9-シス-レチナールである、項目17に記載の方法。項目24薬学的に受容可能なビヒクル中の合成レチノイドを含む、眼科用組成物。項目25前記合成レチノイドが、式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XIIまたはXIIIの合成レチノイドを含む、項目24に記載の組成物。項目26前記合成レチノイドが、9-シス-レチナールである、項目24に記載の組成物。項目27前記眼科用組成物が、点眼剤、眼内注射溶液または眼周囲注射溶液を含む、項目24に記載の組成物。項目28薬学的に受容可能なビヒクル中にオプシン結合性合成レチノイドを含む、経口投与形態。項目29前記オプシン結合性合成レチノイドが、式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XIIまたはXIIIの合成レチノイドを含む、項目28に記載の組成物。項目30前記合成レチノイドが、9-シス-レチナールである、項目28に記載の組成物。項目31脊椎動物被験体のレーバー先天性黒内障を処置する方法であって、以下:薬学的に受容可能なビヒクル中の有効量の合成レチノイドを該被験体に投与する工程であって、ここで、該合成レチノイドは、該脊椎動物の眼のオプシンに結合し、機能性オプシン/合成レチノイド複合体を形成する、工程、を包含する、方法。項目32前記合成レチノイドが、式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XIIまたはXIIIの合成レチノイドを含む、項目31に記載の方法。項目33前記合成レチノイドが、9-シス-レチナールである、項目31に記載の方法。項目34前記合成レチナールが、前記眼に局所投与される、項目31に記載の方法。項目35前記合成レチノイドが、点眼、眼内注射または眼周囲注射によって局所投与される、項目34に記載の方法。項目36前記合成レチノイドが、前記被験体に経口投与される、項目31に記載の方法。項目37脊椎動物被験体の白点状網膜炎、先天性停在性夜盲または白点眼底を処置する方法であって、以下:、薬学的に受容可能なビヒクル中の有効量の合成レチノイドを該被験体に投与する工程であって、ここで、該合成レチノイドは、該脊椎動物の眼のオプシンに結合し、機能性オプシン/合成レチノイド複合体を形成する、工程、を包含する、方法。項目38前記合成レチノイドが、式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XIIまたはXIIIの合成レチノイドを含む、項目37に記載の方法。項目39前記合成レチノイドが、9-シス-レチナールである、項目37に記載の方法。項目40前記合成レチノイドが、前記眼に局所投与される、項目37に記載の方法。項目41前記合成レチノイドが、点眼、眼内注射または眼周囲注射によって局所投与される、項目40に記載の方法。項目42前記合成レチノイドが、前記被験体に経口投与される、項目37に記載の方法。項目43脊椎動物被験体の加齢性黄斑変性を処置する方法であって、以下:薬学的に受容可能なビヒクル中の有効量の合成レチノイドを該被験体に投与する工程であって、ここで、該合成レチノイドは該脊椎動物の眼のオプシンに結合し、オプシン/合成レチノイド複合体を形成する、工程、を包含する、方法。項目44前記合成レチノイドが、前記眼の遊離オプシンに結合する、項目43に記載の方法。項目45前記合成レチノイドが、式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XIIまたはXIIIの合成レチノイドを含む、項目43に記載の方法。項目46前記合成レチノイドが、9-シス-レチナールである、項目43に記載の方法。項目47前記合成レチノイドが、前記眼に局所投与される、項目43に記載の方法。項目48前記合成レチノイドが、点眼、眼内注射または眼周囲注射によって局所投与される、項目47に記載の方法。項目49前記合成レチノイドが、前記被験体に経口投与される、項目43に記載の方法。項目50加齢脊椎動物被験体における夜間視力またはコントラスト感度の喪失を処置または予防する方法であって、以下:薬学的に受容可能なビヒクル中の有効量の合成レチノイドを該被験体に投与する工程であって、ここで、該合成レチノイドは該脊椎動物の眼のオプシンに結合し、オプシン/合成レチノイド複合体を形成する、工程、を包含する、方法。項目51前記合成レチノイドが、前記眼の遊離オプシンに結合する、項目50に記載の方法。項目52前記合成レチノイドが、式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XIIまたはXIIIの合成レチノイドを含む、項目50に記載の方法。項目53前記合成レチノイドが、9-シス-レチナールである、項目50に記載の方法。項目54前記合成レチノイドが、前記眼に局所投与される、項目50に記載の方法。項目55前記合成レチノイドが、点眼、眼内注射または眼周囲注射によって局所投与される、項目54に記載の方法。項目56前記合成レチノイドが、前記被験体に経口投与される、項目50に記載の方法。項目57前記合成レチノイドが、前記被験体に予防的に投与される、項目50に記載の方法。項目58前記被験体がヒトである、項目50に記載の方法。発明の詳細な説明本発明は脊椎動物の視覚系における光受容体機能を回復または安定化する方法を提供する。合成レチノイド類を投与して光受容体機能を回復または安定化し、および/またはレチノイドレベル不足の影響を改善することができる。例えば合成レチノイドを11-シス-レチノイド代替物および/またはオプシンアゴニストとして作用させることによって、光受容体機能を回復または安定化することができる。合成レチノイドは脊椎動物視覚系に対するレチノイド不足の影響を改善することもできる。合成レチノイドを脊椎動物に予防的または治療的に投与することができる。適切な脊椎動物としては例えばヒトおよび非ヒト脊椎動物が含まれる。適切な非ヒト脊椎動物としてはイヌ、ネコ、ウマおよびその他の家畜が含まれる。合成レチノイド類は11-シス-レチナールまたは9-シス-レチナールから誘導されるレチナール類であり、または9-シス-レチナールである。幾つかの実施形態において、合成レチノイドは合成シス-レチノイドである。その他の実施形態において、合成レチノイドは、これら合成レチノイドが9-シス-レチナールでない場合は、11-シス-レチナールか9-シス-レチナールの誘導体である。また別の実施形態において、合成レチノイドはビタミンAではない。幾つかの実施形態において、合成レチノイドは例えば内因性レチノイドのレベル度を補充するレチノイド代替物であり得る。その他の実施形態において、合成レチノイドはオプシンに結合し、オプシンアゴニストとして機能し得る。ここに使用する用語アゴニストとはオプシンに結合し、オプシン/合成レチノイド複合体の光反応能力を助長する合成レチノイドをいう。合成レチノイドはオプシンアゴニストとして内因性レチノイドの需要をへらすことができる。合成レチノイドはオプシンに結合し、機能性オプシン/合成レチノイド複合体を形成するというやり方でオプシンに機能例えば光受容を回復させることもできる。その際オプシン/合成レチノイド複合体は杆体また錐体膜の部分にある光子に反応することができる。合成レチノイドは例えば次のような11-シス-レチナール誘導体または9-シス-レチナール誘導体を含む;非環式化合物;ポリエチレン鎖長が改変されたレチナール類、例えばトリエン-またはテトラエン-レチナールなど;アルキル、ハロゲンまたはヘテロ原子置換ポリエン鎖などの置換ポリエン鎖を有するレチナール類;トランス-またはシス-固定されたポリエチレン鎖のような修飾ポリエン鎖を有するレチナール類、またはアレンまたはアルキレン修飾を有するレチナール類;および複素環、複素芳香環または置換シクロアルカンまたはシクロアルケン環などの環修飾を有するレチナール類。幾つかの実施形態において、合成レチノイドは下記の式Iであらわされるレチナールであり得る:上記式中、RおよびR1は線状、iso-、sec-、tert-、およびその他の枝分かれアルキル基ならびに置換アルキル基、置換枝分かれアルキル、ヒドロキシル、ヒドロアルキル、アミン、アミドなどから独立的に選択され得る。RおよびR1は独立的に低級アルキルでよい;これは、1-6炭素原子を有する直鎖または枝分かれアルキル、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、tert-ブチル、ペンチル、ヘキシルなどを意味する。適切な置換アルキルおよび置換枝分かれアルキルとしては、例えば酸素、ヒドロキシル、窒素アミド、アミンハロゲン、ヘテロ原子またはその他の基で置換されたアルキル類、枝分かれアルキル類およびシクロアルキル類が含まれる。適切なヘテロ原子としては例えば硫黄、珪素、およびフルオロまたはブロモ置換基がある。その他の実施形態において、RまたはR1は例えばヘキサン、シクロヘキサン、ベンゼンならびに置換シクロアルキルなどのシクロアルキルでよい。適切な置換シクロアルキルとしては例えば酸素、ヒドロキシ、窒素、アミド、アミン、ハロゲン、ヘテロ原子またはその他の基で置換されたシクロアルキル類が挙げられる。適切なヘテロ原子としては例えば硫黄、珪素、およびフルオロ-またはブロモ-置換基が挙げられる。合成レチノイドは下記の式IIの改変されたポリエン鎖長を有する11-シス-レチナールまたは9-シス-レチナールでもよい:ポリエン鎖長は1、2、または3つのアルキル、アルケンまたはアルキレン基によって伸長できる。式IIにより、各nおよびn1は、nとn1との合計が少なくとも1であるという条件で、1、2、または3つのアルキル、アルケンまたはアルキレン基から独立的に選択できる。合成レチノイドは下記の式IIIの置換ポリエン鎖を有する11-シス-レチナールまたは9-シス-レチナールの誘導体でもよい:R1ないしR9の各々は水素、アルキル、枝分かれアルキル、シクロアルキル、ハロゲン、ヘテロ原子などから独立的に選択され得る。適切なアルキルとしては例えばメチル、エチル、プロピル、置換アルキル例えばヒドロキシル、ヒドロアルキル、アミン、アミドを有するアルキルなどが挙げられる。適切な枝分かれアルキルは例えばイソプロピル、イソブチル、置換枝分かれアルキルなどであり得る。適切なシクロアルキルとして例えばシクロヘキサン、シクロヘプタンおよびその他の環状アルカン類、ならびに置換環状アルカン類、例えば置換シクロヘキサンまたは置換シクロヘプタンなどが挙げられ得る。適切なハロゲンとしては例えば臭素、塩素、フッ素などが挙げられる。適切なヘテロ原子としては例えば硫黄、珪素およびフルオロ-またはブロモ-置換基が挙げられる。適切な置換アルキル、適切な枝分かれアルキルおよび置換シクロアルキルとしては例えば酸素、ヒドロキシル、窒素、アミド、アミン、ハロゲン、ヘテロ原子またはその他の基で置換されたアルキル類、枝分かれアルキル類およびシクロアルキル類が挙げられる。典型的実施形態において、合成レチノイドは9-エチル-11-シス-レチナール、7-メチル-11-シス-レチナール、13-デスメチル-11-シス-レチナール、11-シス-10-F-レチナール、11-シス-10-Cl-レチナール、11-シス-10-メチル-レチナール、11-シス-10-エチル-レチナール、9-シス-10-F-レチナール、9-シス-10-Cl-レチナール、9-シス-10-メチル-レチナール、9-シス-10-エチル-レチナール、11-シス-12-F-レチナール、11-シス-12-Cl-レチナール、11-シス-12-メチル-レチナール、11-シス-10-エチル-レチナール、9-シス-12-F-レチナール、9-シス-12-Cl-レチナール、9-シス-12-メチル-レチナール、11-シス-14-F-レチナール、11-シス-14-メチル-レチナール、11-シス-14-エチル-レチナール、9-シス-14-F-レチナール、9-シス-14-メチル-レチナール、9-シス-14-エチル-レチナールなどである。合成レチノイドはその他に修飾された環状構造を有する11-シス-レチナールまたは9-シス-レチナールの誘導体でもよい。適切な例は、例えば、下記の式IV、VおよびVIそれぞれであらわされる、環修飾を含む誘導体、芳香族同族体およびヘテロ芳香族同族体を含む。適用される場合、R1ないしR5の各々またはR6は、水素、アルキル、置換アルキル、ヒドロキシル、ヒドロアルキル、アミン、アミド、ハロゲン、ヘテロ原子などから独立的に選択され得る。適切なアルキルとしては例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチルなどが挙げられる。適切なハロゲンとしては例えば臭素、塩素、フッ素などが含まれる。適切なヘテロ原子は例えば硫黄、珪素または窒素などである。式VIにおいて、Xは例えば硫黄、珪素、窒素、フルオロ-またはブロモ置換基でよい。合成レチノイドはその他に、修飾ポリエン鎖を有する11-シス-レチナールまたは9-シス-レチナールの誘導体でよい。適切な誘導体としては例えば、ポリエン鎖にトランス/シス-固定構造、6s-固定同族体、ならびに修飾アレン、アルケン、アルキンまたはアルキレン基を有するものが含まれる。一実施形態において、誘導体は下記の式VIIの11-cis-固定同族体である:Rは例えば水素、メチルまたはその他の低級アルカンまたは枝分かれアルカンであり得る。nは0ないし4であり得る。m1は1、2または3である。特定の実施形態において、合成レチノイドは下記の式VIIIの11-シス-固定同族体である:nは1ないし4でよい。幾つかの典型的実施形態において、合成レチノイドは9,11,13-トリ-シス-7-環レチナール、11,13-ジ-シス-7-環レチナール、11-シス-7-環レチナールまたは9,11-ジ-シス-7-環レチナールである。また別の例において、合成レチノイドは式IXの6s-固定同族体である。R1およびR2は水素、メチルおよびその他の低級アルキルおよび置換低級アルキルから独立的に選択することができる。R3は指示されたいずれかの位置のアルケン基から独立的に選択できる。その他の実施形態において、合成レチノイドは例えば式X-XIIに示されるような9-シス-環縮合誘導体でよい。また別の実施形態において、合成レチノイドは下記の式XIIIであらわされる。R1ないしR15の各々は水素、アルキル、枝分かれアルキル、ハロゲン、ヒドロキシル、ヒドロアルキル、アミン、アミド、ヘテロ原子などから独立的に選択され得る。適切なアルキルとしては例えばメチル、エチル、プロピル、置換アルキルヒドロキシル、ヒドロアルキル、アミン、アミドを有するアルキルなどが挙げられる。適切な枝分かれアルキルは例えばイソプロピル、イソブチル、置換枝分かれアルキルなどでよい。適切なハロゲンとしては例えば臭素、塩素、フッ素などが挙げられる。適切なヘテロ原子は例えば硫黄、珪素、およびフルオロ-またはブロモ置換基が挙げられる。適切な置換アルキルおよび置換枝分かれアルキルとしては例えば酸素、ヒドロキシル、窒素、アミド、アミン、ハロゲン、ヘテロ原子またはその他の基で置換されたアルキル類および枝分かれアルキル類が含まれる。nおよびn1の各々は、nとn1との合計が少なくとも1であるという条件で、1、2、または3つのアルキル、アルケンまたはアルキレン基から独立的に選択され得る。その他に、R11-R12および/またはR13-R14は環状炭素環にアルケン基を含むことができる。ある実施形態において、R5およびR7は一緒になって、例えば式VII、VIII、X、XIおよびXIIに示されるような、例えば5、6、7または8員環のシクロアルキルまたは置換シクロアルキルなどのシクロアルキルを形成することができる。その他の実施形態において、合成レチノイドは9-シス-レチナールでもよい。この代わりに11-シス-レチナールを使用することができる。合成レチノイドの製法は例えば下記の文献に開示されている:Anal.Biochem.272:232-421999;Angew.Chem.36:2089-931997;Biochemistry14:3933-411975;Biochemistry21:384-931982;Biochemistry28:2732-391989;Biochemistry33:408-161994;Biochemistry35:6257-621996;BioorganicChemistry27:372-821999:Biophys.Chem.56:31-391995;Biophys.J.56:1259-651989;Biophys.J.83:3460-692002;Chemistry7:4198-2042001;ChemistryEurope5:1172-751999;FEBS158:11983;J.AmericanChem.Soc.104:3214-161982;J.Am.Chem.Soc.108:6077-781986;J.Am.Chem.Soc.109:61631987;J.Am.Chem.Soc.112:7779-821990;J.Am.Chem.Soc.119:5758-591997;J.Am.Chem.Soc.121-5803-041999;J.Am.Chem.Soc.123:10024-292001;J.AmericanChem.Soc.124:7294-3022002;J.Biol.Chem.276:26148-532001;J.Biol.Chem.277:42315-242004;J.Chem.Soc.-PerkinT.1:1773-771997;J.Chem.Soc.-PerkinT.1:2430-392001;J.Org.Chem.49:649-521984;J.Org.Chem.58:3533-371993;J.PhysicalChemistryB102:2787-8061998;Lipids8:558-65;Photochem.Photobiol.13:259-831986;Photochem.Photobiol.44:803-071986;Photochem.Photobiol.54:969-761991;Photochem.Photobiol.60:64-681994;Photochem.Photobiol.65:1047-551991;Photochem.Photobiol.70:111-152002;Photochem.Photobiol.76:606-6152002;Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:9412-161991;Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:4072-761993;Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:13442-471997;およびProc.R.Soc.Lond.SeriesB,Biol.Sci.2331270:55-761988これらの開示は参考として本明細書に組み込まれる。オプシン蛋白については、例えばオプシン蛋白を発現する発現系によって合成レチノイドを確認できる。適切な動物モデルとしては例えばRPE65-/-マウスが含まれる下記参照。適切な非ヒト動物モデルはその他にラット、マウス、霊長類の系を含む。このような動物モデルは例えば、染色体内の、オプシンをコードする核酸と、突然変異オプシンをコードする外因性核酸との相同組換えを促進することによって作製され得る。一局面において、相同組換えは次のように行われる;胚幹ES細胞を相同組換えが起きるようにオプシン遺伝子を含むベクターで形質転換し、その後そのES細胞を胚盤胞に注入し、その胚盤胞をフォスターマザーに移植すると、その後キメラ動物が誕生するCapecchi,Science244:1288-921989。このキメラ動物を繁殖させ、その他のトランスジェニック動物を生成することができる。適切な発現系としては例えばインビトロまたはインビボ系が挙げられ得る。適切なインビトロ系には例えば組み合わせ転写-翻訳系が含まれる。適切なインビボ系には例えばオプシン蛋白を発現する細胞が含まれる。例えば脊椎動物の視覚系の細胞をインビトロ培養のために適合させることができ、或いはオプシン蛋白を発現する組換え細胞系を使用できる。これら細胞系はオプシン蛋白を発現する一般的に安定な細胞系である。合成レチノイドを細胞培養培地に加えて適当な期間培養した細胞によってオプシン/ロドプシンを産生することができる。オプシンおよび/またはロドプシンは分離できる例えばイムノアフィニティによって。分離した蛋白サンプルを試験し、形成された色素の量および最大吸収を確認することができる。核酸を脊椎動物に導入する方法は例えばSambrooketal.MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPressColdSpringHarbor,NewYork,2001に開示されている。オプシン蛋白を発現する組換え細胞系は例えば、オプシン蛋白をコードする発現構成物を適切な細胞系に導入することによって作製され得る。発現構成物は一般的には、オプシン蛋白をコードする核酸に操作可能に結合したプロモータおよび任意に終止シグナルを含む。オプシンをコードする核酸は例えば、データベースゲノムまたはcDNAライブラリーなどからの情報の使用によって、ポリメラーゼ連鎖反応法によって、またはその他の方法によって得ることができる。例えばオプシンをコードする核酸はハイブリダイゼーションによって得ることができる。一般的にはSambrooketal.上記を参照されたい。特殊な実施形態において、オプシンをコードする核酸は低、中程度または高度のストリンジェンシー条件下でハイブリダイゼーションによって得ることができる。ある実施形態において、オプシンをコードする核酸は高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で得られ得る。制限するものではないが、例として、高ストリンジェンシー条件を用いる操作法は次のようである:DNAを含むフィルタのプレハイブリダイゼーションを、6×SSC、50mMトリス-HClpH7.5、1mMEDTA、0.02PVP、0.02フィコール、0.02BSA、および500μg/ml変性サケ精子DNAからなる緩衝液中で65°Cで8時間ないし一晩行う。フィルタを、100μg/ml変性サーモン精子DNAおよび5-20×106cpmの32P標識プローブを含むプレハイブリダイゼーション混合液中で65°Cで48時間ハイブリダイズする。フィルタの洗浄を2×SSC、0.01PVP、0.01フィコール、および0.01BSAを含む溶液中で65°Cで1時間行う。続いて0.1×SSC中で50°Cにて45分間の洗浄を行い、その後オートラジオグラフィーを行う。使用できる高ストリンジェンシーのその他の条件は当業者には公知である。一般的にSambrooketal.上記を参照されたい。発現構成物は任意に1つ以上の複製起点および/または選択可能マーカーを含むことができる例:抗生物質耐性遺伝子。適切な選択可能マーカーは、例えばアンピシリン、テトラサイクリン、ネオマイシン、G418などに対する耐性を与えるものなどを含む。適切な細胞系は例えば、HEK293細胞、T-RExTM-293細胞、CHO細胞およびその他の細胞または細胞系を含む。ロドプシンオプシンおよび合成レチノイドを含むのUV-可視スペクトルをモニターし、合成レチノイドがオプシン蛋白とシッフ塩基を形成したかどうかを決定し得る。例えば酸変性、精製蛋白を分析し、約440nmの最大吸収が存在するかどうかを決定し、合成レチノイドがオプシン蛋白と共にシッフ塩基を形成するという証拠を与えることができる。その他の実施形態において、ヒドロキシルアミン処理し、そのシッフ塩基が外部環境から隔離されることを確認することができる下記。適切な合成レチノイドはロドプシンの分子モデル化によって選択することもできる。ロドプシン結晶構造の座標は蛋白質データバンク1HZXTelleretal.Biochemistry40:776-722001から入手できる。ある実施形態において、ロドプシンの構造に与えるアミノ酸置換の影響、およびオプシンと11-シス-レチナール、または合成レチノイドとの接触に与えるアミノ酸置換の影響は分子モデル化によって決定できる。例証的実施形態において、蛋白質データバンク1HZXTelleretal.Biochemistry40:776-722001からのロドプシン結晶構造のための座標を使用してコンピューターモデルを作成する。例えばInsightIIInsightIIrelease2000,Accelrys,Unc.,SanDiego,CAを使用して水素原子の付加および最適化を行うことができる。結晶水を除去し、細胞外領域における接近可能の隙間に水分子を導入することができる。一般的に水の添加前には最小化は行われない。水層例えば厚さ5Åを使用して、ロドプシンの細胞外部分、ならびに極性燐脂質ヘッドと接触している残基を被覆することができる。水分子の全ては、ロドプシンの細胞外半分と同様に、レチナールと共に自由に動くことができる。水のキャップがロドプシンの細胞質部分に置かれない場合は、分子のこの部分を凍結してそのモデルの分解を防ぐことができる。ある実施形態において、水キャップはロドプシンの細胞外部分に置かれる燐脂質の極性ヘッドと接触する膜に埋め込まれた部分と共に。水およびロドプシンの細胞外部分を動けるようにすることができ、その動きは任意の適切な頻度でモデル化される。例えばそのモデル化ロドプシンの動きは100ps刺激でモデル化され得る。合成レチノイドを適切な条件下で、オプシン蛋白/合成レチノイド複合体を形成するのに十分な時間、オプシン蛋白と接触させることができる。オプシン/合成レチノイド複合体の安定性は、本明細書に記載の、または当業者に公知の方法によって測定できる。それが安定性の増加を示すときにはオプシン/合成レチノイド複合体中のオプシンは安定する例えば、合成レチノイドに結合した場合、遊離オプシンすなわちレチノイドに結合していないに比較して、半減期は増加し、ヒドロキシルアミンに対する感受性はより低くなり、アグレソーム蓄積はより少なくなる、など。合成レチノイドはインビトロまたはインビボでオプシン蛋白と接触することができる。例えば、オプシン蛋白をインビトロ翻訳系において合成し例えば小麦胚芽または網状赤血球溶解物の発現系、合成レチノイドをその発現系に加える。その他の実施形態において、オプシン蛋白を生体外でオプシン蛋白と接触させ、その複合体を脊椎動物の眼に投与することができる。合成レチノイドをレチノイド欠乏例えば11-シス-レチナールの欠乏、遊離オプシンの過剰、全トランス-レチナールの再循環におけるレチノイド老廃物下記を参照または中間物質の過剰などを示す脊椎動物の眼に投与することができる。脊椎動物の眼は野生型オプシン蛋白を含むのが普通である。脊椎動物の眼の内因性レチノイドレベルおよびそのようなレチノイド類の不足を決定する方法は、例えば米国暫定特許出願第60/538,051号2004年2月12日出願に開示されているこの開示は参考として本明細書に組み込まれる。脊椎動物の眼の内因性レチノイドレベルおよびこのようなレチノイド類の不足を決定する他の方法としては、被験体からのサンプル中のレチノイドの高圧液体クロマトグラフィーHPLC分析などが挙げられる。例えば、レチノイドレベルまたはレチノイドレベルの欠乏は被験体からの血液サンプルから決定できる。典型的実施形態において、血液サンプルは被験体から得られ、サンプル中のレチノイドの型およびレベルは分離され、標準相高圧液体クロマトグラフィーHPLC例えばHP1100HPLCおよびベックマン、ウルトラスフェア-Si、4.6mm×250mmカラムで、10酢酸エチル/90ヘキサンを用い、流速1.4ml/min.によって分析することができる。これらレチノイドは例えばダイオード-アレー検出器およびHPChemstationA.03.03ソフトウェアによる325nmでの検出により検出できる。レチノイドの欠乏は例えばサンプル中のレチノイドのプロフィールを正常被験体からのサンプルと比較することによって決定できる。ここに使用する、例えば11-シス-レチナールなどの内因性レチノイドのレベルの喪失、欠乏または消耗とは、同種の脊椎動物の健康な眼に見いだされるレベルより低い内因性レチノイドレベルをいう。合成レチノイドは内因性レチノイドの需要をへらすことができる。本明細書に使用する予防的なおよび予防的には合成レチノイドを投与されない匹敵する脊椎動物視覚系と比較して、脊椎動物視覚系の悪化または悪化の進行を阻止するために合成レチノイドを投与することを意味する。用語回復するは脊椎動物の視覚系の光受容体機能が、合成レチノイドを投与されない匹敵する脊椎動物視覚系に比較して長期的に例えば数週間または数カ月にわたって測定して改善することをいう。用語安定化するは、合成レチノイドを投与されない匹敵する脊椎動物視覚系と比較して脊椎動物視覚系の付加的分解が最小になることをいう。一局面において、脊椎動物の眼はレーバー先天性黒内障LCAを有することが特徴である。この疾患は出生時またはその後間もなくの小児を冒す非常に稀な小児疾患である。それは眼の杆体も錐体も両方冒す。例えばRP65およびLRAT蛋白をコードする遺伝子の幾つかの突然変異がLCAに関係している。両遺伝子の突然変異により、人は11-シス-レチナールを十分量作ることができなくなる。その結果、11-シス-レチナールは全くまたは少量しか存在しない。RP65欠陥患者では、レチニルエステルがRPEに形成される。LRAT欠陥患者はエステル類を作ることができず、したがって過剰のレチノイドを分泌する。LCAの場合、合成シスレチノイドを使用して、存在しない、または枯渇した11-シス-レチナールを補充することができる。また別の局面において、脊椎動物の眼は白点状網膜炎を有することが特徴である。この疾患は杆体中の11-シス-レチナールの不足を示す色素性網膜炎の一つの型である。合成シス-レチノイドを使用して、存在しないまたは枯渇した11-シスレチナールを補充することができる。また別の局面において、脊椎動物の眼は先天性停在性夜盲CSNBまたは白点眼底を有することが特徴である。この疾患群は夜盲という症状を示すが、色素性網膜炎の場合のような進行性視力低下はない。CSNBの幾つかの型は11-シス-レチナールの再循環の遅れによる。白点眼底は最近までCSNBの特殊な症例と考えられていた。すなわち網膜の外観が異常で、網膜に小さい白点が無数にあらわれる。最近これも、色素性網膜炎に比べて進行は遥かに遅いとはいえ、やはり進行性疾患であることが示された。これは11-シス-レチナールの循環の遅れに導く遺伝子欠陥によって起きる。こうして、合成レチノイドを投与し、レチノイド補充によって光受容体機能を回復することができる。また別の局面において、脊椎動物の眼は加齢性黄斑変性AMDを有することが特徴である。種々の実施形態において、AMDはウェット型かドライ型である。AMDにおいては、疾患後期の合併症が新生血管を網膜下に増殖させるか、または網膜萎縮をおこすかどちらかによって視力喪失が起きる。特定の理論によって縛られるものではないが、光受容体からの老廃物の過剰生産がRPEに過負荷をかけるのかも知れない。これはオプシンに結合するために使用できる11-シス-レチナールの欠乏による。遊離オプシンは安定な化合物ではなく、光が与えられなくても視カスケードの生化学反応の開始を自発的に起こすことができる。脊椎動物の眼に合成レチノイドを投与すると、11-シス-レチナールの欠乏およびオプシンの自発的誤開始を抑制することができる。ある実施形態において、合成レチノイドの投与は老廃物の生成を低減しおよび/またはドルーゼ腔形成を減少させ、視力喪失例えば脈絡膜血管新生および/または脈絡網膜萎縮などを軽減し、または遅らせることができる。また別の局面において、合成レチノイドは中高年者に投与される。本明細書に使用する中高年者被験体とは一般的に最低45、または最低50、または最低60または最低65歳の人である。被験体は、低下した夜間視力および/または低下したコントラスト感度をもつことを特徴とする加齢眼を有する。過剰の未結合オプシンは視覚伝達系をランダムに励起する。これはその系にノイズを作り出し、その結果、よく見るためにより多い光およびより多いコントラストが必要になる。これらの遊離オプシン分子を合成レチノイドで抑制すると、自発的誤開始が減少し、シグナル対ノイズ比は高まり、それによって夜間視力およびコントラスト感度は改善する。合成レチノイドはヒトまたはその他の非ヒト脊椎動物に投与できる。合成レチノイドは任意の適切な手段、例えば経口又は局所的投与によって眼に供給することができる。局所的投与の仕方としては点眼、眼内注射または眼周囲注射などが挙げられ得る。眼周囲注射は一般的には合成レチノイドを結膜または腱眼を覆っている線維組織に注射することを含む。眼内注射は一般的には合成レチノイドを硝子体に注射することを含む。幾つかの実施形態において、投与は非侵襲的で、点眼または経口投与型によって行われる。合成レチノイドは薬学的に受容可能なビヒクルならびに当業者にとって日常的な方法を用いて投与するように処方できる。ビヒクルは合成レチノイドの溶解度によって選択される。適切な眼科的組成物は点眼や注射などによって眼に局所的に投与するものを含む。点眼の場合は、処方物は任意に、例えば、塩化ナトリウム、濃グリセリンなどの等張化剤;燐酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなどの緩衝剤;ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートポリソルベート80ともいう、ポリオキシステアレート40、ポリオキシエチレン水素化ヒマシ油などの界面活性剤;クエン酸ナトリウム、エデンテートナトリウムなどの安定剤;塩化ベンザルコニウム、パラベン類などの保存料;およびその他の諸成分を含むこともできる。保存料は例えば約0.001ないし約1.0重量/容量のレベルで用いられる。処方物のpHは、通常、眼科的処方に容認できる範囲内、例えば約pH4ないし8の範囲内である。注射の場合、合成レチノイドは、注射用リポソーム溶液などの形で、注射用食塩溶液として提供できる。眼内および眼周囲注射は当業者には知られており、例えばOphthalmicSurgery:PrinciplesofPractice,Ed.,G.L.Spaeth,W.B.SandersCo.,Phyladelphia,Pa.,U.S.A.,p.85-871990など多くの出版物に記載されている。適切な経口投与型には例えば硬または軟ゼラチン、メチルセルロースまたは消化管で溶解し易いその他の適切な材料からなる、錠剤、丸薬、サチェット、またはカプセルが含まれる。適切な無毒性固体賦形薬を使用することができ、それらには例えば医薬品級のマンニット、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどがある。例えばRemingtonPharmaceuticalSciences,17Ed,Gennaroed.,MackPublishingCo.,Easton,Pennsylvania1985を参照されたい。合成レチノイドの投与量は被験体の臨床的状態、症状および年齢、投与型などに応じて適切に選択できる。点眼の場合、合成レチノイドは単回量として約0.01mgから、約0.1mgから、または約1mgから、約25mgまで、約50mgまで、または約90mgまで投与できる。点眼剤は必要に応じて1日に1回以上投与することができる。注射の場合、適切な量は例えば約0.0001mg、約0.001mg、約0.01mg、または約0.1mgから約10mgまで、約25mgまで、約50mgまでまたは約90mgまでの合成レチノイドを週に1ないし4回投与できる。その他の実施形態において、約1.0ないし約30mgの合成レチノイドを週に1ないし3回投与できる。経口投与量は一般的に約1.0ないし約1000mgを1日1ないし4回以上投与できる。経口投与の典型的投与量は約10mgから約250mgを1日1ないし3回の範囲である。下記の実施例は単に本発明の種々の局面の説明に過ぎず、本発明を制限するものではない。実施例1:視プロセスは11-シス-レチナールの全トランスーレチナールへの光異性化によって開始する。持続的視力を得るためには11-シス-発色団が全トランス-レチナールから再生しなければならない。これには主要な網膜色素上皮蛋白であるRPE65が必要である。RPE65遺伝子の破壊は網膜色素上皮における全トランス-レチニルエステルの大量蓄積、11-シス-レチナールの欠乏、したがってロドプシンの欠乏、および究極的には失明を起こす。Rpe65-/-マウスにおいて、9-シス-レチナールの経口投与はイソロドプシン杆体の光色素を生成し、エレクトロレチノグラムにおいて光感受性を回復することが以前報告されたVanHooseretal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:8623-282000。この研究において、9-シス-レチナール投与による早期介入は、レチナールエステル蓄積を著しく減少し、処置後6カ月より長く、杆体網膜機能を維持した。単一細胞の記録において、杆体の光感受性は再生したイソロドプシン量の関数であることが示された;多量は正常な感受性および動態を有する杆体反応を回復した。未処置Rpe65-/-マウスでは残留杆体機能の著しい低下が認められた。この杆体機能は、レチノイド分析によって示されるように、網膜における全トランス-レチナールの光変換による11-シス-レチナールの生産が低効率であるためらしい。これらの研究は、薬学的介入により、暗所で飼育されたRpe65-/-マウスの視機能の長期持続的保持が引き起こされ、遺伝的早発性盲目および網膜変性の一群であるRPE65遺伝子の突然変異による、レーバー先天性黒内障と診断されたヒトの視力を回復させる有用な治療法が得られることを示す。序論レーバー先天性黒内障LCAは、出生時からの盲目または重度視覚障害を起こす一群の疾患である。全ては杆体および錐体両方の機能異常、微弱な記録不能のエレクトロレチノグラムERG、および眼振を示す。彼らは早発性網膜萎縮を起こし、時が経つにつれて網膜の色素性変化、したがって黒内障を伴い得る。LCAは種々の異なる細胞機能を破壊する少なくとも5つの異なる遺伝子の欠陥によって起きる。全LCA症例の約12において、網膜色素上皮細胞RPEの65-kDa蛋白RPE65遺伝子が無能力である。RPE65はRPE細胞において顕著に発現し、そこでレチノイドサイクルに重要な役割を演ずる。これは光受容体およびRPE細胞の両方を含む、密接に関連し合う一組の事象である。視物質の発色団11-シス-レチナールの光異性化は全トランス-レチナールを生成する。それは光受容体において還元され、RPEに運搬され、再び11-シス-レチナールに変換され、その後光受容体に戻され、元の視物質を再生する。レチノイドプロセッシングにおけるRPE65の正確な機能は知られていない。Rpe65のための遺伝子を除去したRpe65-/-遺伝子工学的マウスは、網膜の形態、機能および生化学に変化を示し、それはヒトLCA患者に見られる変化に酷似している。Rpe65-/-マウスでは杆体および錐体両方の機能はひどく破壊され、ERGは非常に弱まる。全トランス-レチニルエステルがRPE細胞に脂質様滴となって劇的過剰に蓄積し、網膜の変性もある。このため、Rpe65-/-マウスはLCAの細胞レベルおよび分子レベルでの起源および結果を洞察する機会を与え、種々の治療法を試験する手段をも与える。本研究はRpe65-/-マウスに起きる生化学および機能の変化の周到な研究の結果を記載し、9-シス-レチナールの供給によってこの疾患の進行を止め、機能的効果を逆転させ得る方法を示すものである。目標は:1この疾患の進行に対するおよび光受容体機能に対する9-シス-レチナール処置の有益な効果を調べること;2単一細胞電気生理学およびERG記録を用いて、9-シス-レチナール処置が網膜の杆体機能および光駆動シグナルに影響を与える仕方を評価すること;および3LCA患者にもRpe65-/-マウスにも存続する低レベルの残留視力の生化学的基礎を研究することである。9-シス-レチナールをRpe65-/-マウスに投与すると、杆体の光色素が生成し、暗所で6カ月よりも長く持続した。9-シス-レチナールによる早期介入は正常な杆体生理機能を回復させ、RPEにおけるエステル蓄積を著しく減少させる。だが、ERGによって測定される網膜機能は一部分改善するに過ぎない。これらの研究は、薬理学的介入は暗所に維持されたRpe65-/-マウスの視機能の長期持続的保持を生じ、LCA患者の視力の回復のための有用な治療であることを証明するものである。材料および方法動物:動物試験の全ては、ワシントン大学動物保護委員会によって承認され、米国獣医学会安楽死委員会の勧告にしたがう手順を使用した。動物は完全な暗所で飼育され、全操作は全てコダックNo.1セーフライトフィルタ透過率、>560nmを用いて、暗赤色光のもとで行われた。一般的に全研究に齢2-3カ月のマウスが使用された。RPE65欠乏マウスはDr.M.RedmondNEI、ナショナルインスチチュートオブヘルスNationalInstituteofHealthから入手し、既述Redmondetal.,Nat.Genet.20:344-511998;Redmondetal.,MethodsEnzymol.316:705-242000のように遺伝子型を決定した。網膜G蛋白共役受容体-欠乏マウスを生成し、既述Chenetal.,Nat.Genet.28:256-602001のように遺伝子型を決定した。一重Rpe65-/-マウスと一重Rgr-/-マウスとを遺伝的に均質になるまで交雑育種させることによって、二重ノックアウトマウスRpe65-/-Rgr-/-を作成した。レチノイドおよび視物質の分析:全ての手順は既述VanHooseretal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:8623-282000;Jangetal.,J.Biol.Chem.276:32456-652001;Palczewskietal.,Biochemistry38:12012-191999のように暗赤色光のもとで行われた。既述の方法に加えて、レチノイド分析が、ダイオードアレー検出器およびHPChemstationA.07.01ソフトウエアを備えたHP1100シリーズ高圧液体クロマトグラフィーHPLC上で行われ、それらの特異な保持時間および最大吸収によって、レチノイド異性体を同定することができた。標準相カラムベックマンウルトラスフェアBeckmanUltrasphereSi5μ、4.6×250mmを用い、ヘキサン中0.5酢酸エチルv/vのアイソクラチック溶媒系で15分間、その後ヘキサン中4酢酸エチルで60分間、流速1.4ml/分、20°C合計75分で操作し、325nmで検出した結果、11-シス-、13-シス-および全トランス-レチニルエステルを分離できた。それに加えて、解剖マウス眼の分析、レチノイド類の誘導体化および分離に関する研究操作の全ては既に詳細に記載されている。VanHooseretal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:8623-282000。ロドプシンおよびイソ-ロドプシンの測定を既述のように行ったPalczewskietal.,Biochemistry38:12012-191999。一般的にはアッセイごとに2つのマウス眼を使用し、アッセイを3ないし6回繰り返した。データはS.E.M.と共に示される。光および電子顕微鏡検査:前部および硝子体を除去することによってアイキャップを作成した。それらの眼はPND1-28において週単位で氷上に集められた。薄い切片1.0μmをリチャードソン青色溶液1で染色し、光顕微鏡検査を行った。超薄切片0.05μmを酢酸ウラニル/クエン酸鉛で染色し、電子顕微鏡検査を行った。マウスRPEミクロソームの調製:頸部転位またはCO2による窒息の直後に、新鮮なマウス眼を摘出した。前部、硝子体および網膜を顕微解剖鏡下で注意深く除去した。代表的には、各調製につき30-40の眼を切開した。12の切開アイキャップを、1μMロイペプチンおよび1mMジチオスレイトールを含む10mMMOPS、pH7.0、400μl中に入れ、20分間激しく撹拌するという方法でRPE細胞を分離した。それらのアイキャップを細いブラシでしずかにブラッシングし、さらにRPE細胞を除去した。細胞懸濁液を取り出し、MOPS緩衝液をさらに400μl部分加え、アイキャップを再び20分間振盪した。細胞懸濁液を合一し、ガラス-ガラス-ホモジナイゼーションを行った。ホモジネートを10,000×gで10分間遠心分離し、その後上清を275,000×gで1時間遠心分離した。そのペレットをMOPS緩衝液200μlにおいて再構成し、再びガラス-ガラス-ホモジナイゼーションにかけた。総蛋白濃度典型的には0.5-1mg/mlをブラッドフォード法によって測定した。例えばBradford,Anal.Biochem.72:248-541976を参照されたい。マウスRPEミクロソームを使用した全トランス-レチノールの11-シス-レチノールへの異性化:11-シス-レチノールへの異性化を決定するために使用するアッセイは以前McBeeetal.,Biochemistry39:11370-702000報告されたものである。手短に述べると、20μlのウシ血清アルブミン最終濃度1、125μlの50mM1,3-ビス[トリスヒドロキシメチル-メチルアミノ]プロパン、pH7.5、10μlのATP最終濃度1mM、25μMアポ組換え体CRALBP、40μlのRPEミクロソーム一般には総蛋白25-50μg、および0.5μlの4mM全トランス-レチノールジメチルホルムアミド中。上記反応物を37°Cで2時間インキュベートした。300μlのMeOHを使用して反応を停止し、レチノイド類を200μlのヘキサンで抽出した。混合物を2分間激しく振盪し、その後14,000rpmで4分間遠心分離し、相分離した。上の有機層を取り、100μl部分を分離し、HPChemstationソフトウエアバージョンA.07.01を備え付けたHP1100HPLCを使用して分析したベックマンウルトラスフェアSi、4.6mm×250mm、ヘキサン中10酢酸エチルを使用、流速1.4ml/分。プロ-S-[4-3H]NADHおよびプロ-S-[4-3H]NADPHの調製:プロ-S-[4-3H]NADHおよびプロ-S-[4-3H]NADPHの合成は既述Jangetal.,J.Biol.Chem.276:32456-652001;Jangetal.,J.Biol.Chem.275:28128-382000のように、L-グルタミン脱水素酵素、NADP、およびL-[2,3-3H]グルタミン酸パーキンエルマーライフサイエンシス社PerkinElmerLifeSciencesで行われた。RDHアッセイ:これらのアッセイはNADHの存在下または不在下でジヌクレオチド基質として11-シス-レチナールおよびプロ-S-[4-3H]NADPHを用い、[15-3H]レチノールの生成レチナールの還元をモニターすることによって行われた例えばMcBeeetal.,Prog.Retin.EyeRes.20:469-5292001を参照されたい。経口的胃管栄養法による投与:経口的胃管栄養法による投与は既述VanHooseretal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:8623-282000のように行われた。レチノイド類の静脈内投与:化学物質類は別途記載がない限り、シグマ/アルドリッヒ社Sigma/Aldrichから購入した。溶液Aは、ラクテート加リンゲル溶液バクスター社Baxter1mlに懸濁した10mgの9-シス-レチナール、75mgのクレモフォアEL、1mgのα-トコフェロール、および0.6mgの安息香酸を含んでいた。この混合物を10分間渦巻き状に撹拌し、20,000×gで10分間遠心分離し、9-シス-レチナール濃度7.7mMを分光光学的に測定した。溶液Bは、ラクテート加リンゲル溶液バクスター1ml中に懸濁した13mgの9-シス-レチナール、50mgのクレモフォアEL、10mgのジパルミトイルホスファチジルコリン、および40mgの2-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリンを含んでいた。この混合物を10分間渦巻き状に撹拌し、20,000×gで10分間遠心分離し、9-シス-レチナール濃度10mMを分光光度法で測定した。溶液AおよびB一般には100μlは27ゲージ針および拘束管を備え付けた1ml注射器を用いてマウス外側尾静脈内に送達された。単一細胞の記録:マウスを出生時から暗所で飼育し、頸部転位によって殺し、眼を取り出した。網膜を分離し、氷上でHEPES緩衝エイムス溶液10mMHEPES。pHをNaOHで7.4に調節中で12時間まで保存した。単離杆体は、溶液の160μl滴中で細い針で網膜の小片大体1mm2を切り裂くという方法で得た。その滴を、赤外ビデオ視聴システムを備えた倒立顕微鏡ニコンエクリプスNikonEclipseの台上の記録室に注入し、37°Cに温めた炭酸水素塩緩衝エイムス溶液5CO2、95O2で平衡化した際、pH7.4を2-3ml/分で連続的に注いだ。全切開は赤外-可視画像変換器を備えた解剖顕微鏡を用いて赤外線照明下で行われた。単離した杆体を、直径1.2-1.5μmの開口を有する、熱で磨いたシラン化硼珪酸電極に吸引によって引きつけた。その電極はHEPES緩衝エイムス溶液で満たされていた。浴および吸引電極への電気的接続はカロメル半電池に接触したNaCl充満-寒天架橋によって行った。浴電圧はアクティブクランプ回路によって接地されていたBayloretal.,J.Physiol.354:203-231984。吸引電極によって集められた膜電流をアキソパッチAxopatch200Aパッチクランプ増幅器アキソンインスツルメント社AxonInstruments,FosterCity,CAによって増幅し、30Hz3dBポイントで8極ベッセル低周波フィルタを通し、1kHzでディジタル化した。470、570および640nmに最大出力を有する発光ダイオードからの光を三叉ファイバーオプチックを使用して合一し、顕微鏡コンデンサーの代わりに水浸レンズを用いて標本上に焦点を合わせた。光刺激は三次元的に均質であり、記録された細胞上に中心をもつ直径0.57mmの円形領域を照らした。光の強度を上記標本で測定し、ロドプシンの吸収スペクトルおよび測定した発光ダイオードスペクトルを使用して等価的500-nm光子杆体感度に関して最大に変換した。マウスのエレクトロレチノグラム:マウスは出生時から暗所で飼育し、麻酔しケタジェクト/キシラジェクト、65mg/kg腹腔内、トロピカミド1で瞳孔を拡大した。コンタクトレンズ電極を1滴のメチルセルロースと共に眼の中に置き、接地電極を耳の中に置いた。ERGを記録し、ユニバーサル試験および電気生理学的装置3000UTASE-3000LKCテクノロジー社LKCTechnologiesInc.、Gaithersburg、MDで分析した。マウスをガンツフィールドチェンバGanzfieldchamberに入れ、1つの眼のフリッカーを記録した。フリッカー刺激は固定周波数10Hzである範囲の強度0.00040-41cds/m2を有した。免疫細胞学:Rpe65マウスを5群に分けた:Rpe65-/-、9-シス-レチナールを胃管栄養法によって投与し、暗所に維持したRpe65-/-;9-シス-レチナールを胃管栄養法によって投与し、フラッシュに曝露し、暗所に15分間保持したRpe-/-;暗所に保持したRpe/;およびフラッシュに曝露し、暗所に15分間保持したRpe/。フラッシュ研究では、暗順応したマウスは2cmの距離からフラッシュサンパクSunpak433D、1msに曝露された。網膜を0.13M燐酸ナトリウムpH7.4中4パラホルムアルデヒド中、4°Cで15分間固定し、その組織を0.13M燐酸ナトリウムpH7.4中5、10または15スクロースに30分間ずつ移し、同じ緩衝液中20スクロース中、4°Cで一晩保存した。組織をその後最適切断温度凍結包埋合成物に移し、10μmの切片を作製した。凍結切片を、1:10に希釈したマウスモノクローナル抗燐酸化RhA11-82P抗体中で4°Cで一晩インキュベートした。トリトンX-1000.1を全ての燐酸緩衝食塩溶液に加え、抗体を透過し易くした。対照は、インキュベーション緩衝液から一次抗体を削除することによって処理した。一次抗体中でのインキュベーション後、切片を燐酸緩衝食塩液ですすぎ、その後インドカルボシアニンCy3-結合ヤギ抗マウスIgGと共に1:200インキュベートした。切片を燐酸緩衝食塩液ですすぎ、グリセロール中5n-プロピルガレートにおいて載せ、カバースリップをかぶせた。結果9-シス-レチナールによる早期処置はRpe65-/-マウスの油様構造を除去する;ROSとRPEとの間の界面異常である光受容体の喪失に加えて、Rpe65-/-マウスのRPE細胞は多数の脂質様小滴を含んでいた。若い動物では、Rpe65-/-マウスからのRPEの固定電子顕微鏡切片に空の小胞が認められたが、対照には認められなかった。加齢につれて>PND21、それらには光回折物質が充満した。それらの物質は電子顕微鏡切片作製中保持された。この考察はRpe65-/-マウスにおける全トランス-レチニルエステルの過剰蓄積に関連する図1A、白丸。Rpe65-/-マウスより低レベルであったとはいえ、レチニルエステルは加齢につれて、Rpe65/マウスにも蓄積した。PND21までに、眼1つにレチニルエステル約800pmolが蓄積していた。これに対しRpe65/マウスでは約40pmolであった。Rpe65/マウスにおいては、ロドプシンレベルは、最初はレチニルエステル量の数倍を超えていた。PND7マウスを9-シス-レチナール10mg/mlの0.25mgの投与量で1日おきに、齢30日になるまで処置した場合、エステル蓄積の劇的変化が観察された図1B。年齢の増加、および1週間1回の投与1.25mgの継続で、全トランス-レチニルエステル量はRpe65/マウスと同様に増加したが、エステル類の全体的量はイソロドプシンの同時増加と共に伴って著しく抑制された図1C、左パネル。ひとたび沈着すると、齢1カ月より後に処置を開始しても、RPEに蓄積したエステル類は除去されなかった図1C、右パネル。若い動物または若い成動物を9-シス-レチナール処置した場合、RPEとROSとの界面の接触は改善し図1D、パネルd、f、h、空胞は本研究の数カ月間にわたって一部分だけが詰まっているようにみえた図1D、パネルcおよびe。これらの観察は、再生色素の形成がエステル類の蓄積を著しく緩徐にするが、眼に蓄積した全トランス-レチニルエステルの完全除去は促進されないことを示唆する。9-シス-レチナール処置の長期効果:マウスを9-シス-レチナールで処置すると、光色素レベルの長期持続的増加および全トランス-レチニルエステルの蓄積の減少が起きた。Rpe65-/-マウス齢1カ月を9-シス-レチナールで1回2.5mg処置し、その後12時間明/暗サイクル、または24時間暗所いずれかに37日間保持した。いずれの条件下でも顕著なレチナール減少は認められなかった図2A。これらの結果は、9-シス-レチナールの単回投与が通常の実験室的条件下でこれらの動物のイソ-ロドプシンを維持することを示唆する。研究のもう一つの組において、ロドプシンまたはイソ-ロドプシンレベルを齢6カ月のRpe65-/-マウスで測定した図2B。これらの動物では、イソ-ロドプシンレベルは3群のRpe65-/-マウスで匹敵していた:PND30および34に9-シス-レチナールで2回処置したマウス1回の投与量2.5mg、PND30および120の2回処置したマウス、およびPND30およびPND150の2回処置したマウス。Rpe65-/-におけるイソ-ロドプシンの50減少図2、BとAとを比較は、齢の関数としての、Rpe65/におけるロドプシンの同様な減少と一致する。エステルレベルは50減少し未処置動物と比較して、9-シス-レチナールの投与頻度および投与量には影響されなかった。ロドプシンまたはイソ-ロドプシンは未処置-暗順応Rpe65-/-マウスには検出されなかった。9-シス-レチナールは9-シス-レチノールに還元され、眼および肝臓に9-シス-レチニルエステルの形で貯蔵され得る。必要なときに9-シス-レチノールがレチニルヒドロラーゼによって遊離される。眼および肝臓における9-シス-レチノイドの貯蔵庫の大きさを調べるために、1群のマウスを9-シス-レチナール2.5mgで処置し、48時間後に1時間間隔で複数回フラッシュに曝露した;1回のフラッシュはロドプシンの約30-35を退色させた。イソ-ロドプシンおよび9-シス-レチニルエステルは3回より多くの強力なフラッシュ後に有意に減少した。肝臓およびRPEのレチニルエステルは24時間間隔の5回のフラッシュ後に完全に枯渇した。ロドプシン含有ROSディスクの連続的流出および再合成は視物質の長期保存に影響を与えない。そのため、9-シス-レチナールは大部分、食作用を受けたイソ-ロドプシンから新たに生成したオプシン分子へと長期間にわたって再循環されるようである。9-シス-レチナール処置の生理的影響:Rpe65-/-マウスの9-シス-レチナール処置は網膜機能の長期改善ももたらした。9-シス-レチナール処置の長期生理的影響を、Rpe65/およびRpe65-/-マウスにおける種々強度の単回フラッシュ反応およびフリッカーERG測定から決定した。これまでの研究は、経口9-シス-レチナール投与の48時間後にERG感度が一部分回復することを示した。この部分的回復はPND30に1回処置したRpe65-/-マウスで12週より長く持続した。Rpe65/マウスにおけるフリッカーERGは、0.015cds/m2の光レベルではピーク振幅254.9±41.5μV、7.5cds/m2ではピーク振幅95.1±8.9μVに達した図2C、左パネル。これらのデータは、それぞれ、杆体および錐体の優勢なERG応答に似ている。処置をしないRpe65-/-マウスでは、フリッカーERGは7.5cds/m2の光レベルで有意に小さいピーク振幅、76.0±12.0μVに達した図2C、右パネル。2.5mgの9-シス-レチナールで1回処置した後8週間目には、フリッカーERGは0.059cds/m2で137.3±24.4μVのピーク振幅に、13cds/m2では40.0±7.1μVのピーク振幅に達した図2C、右パネル。これらのピークはRpe65/マウスにおけるよりも小さく、より高い光レベルで発生した;しかし、処置Rpe65-/-マウスの反応は未処置マウスのそれに比べて2.1対数単位だけより敏感で、より大きい振幅を有した。このように、9-シス-レチナールの投与はERGの長期間の部分的回復をもたらした。9-シス-レチナール処置は、構成性オプシンの燐酸化を排除した:Rpe65マウスの酵素プロセスをさらに考察するため、関連酵素活性の数種の直接的測定を行った。オプシンはあるシグナリング能力を有することが一般に認められている。燐酸化オプシンに対するモノクローナル抗体を使用してRpe65マウスからの網膜切片を免疫標識化すると、この活性をうまく評価することができるが、9-シス-レチナール処置はこの活性を阻害することが予想される。Rpe65/マウスおよびRpe65-/-マウスからの網膜を一定の暗所で固定した。Rpe65/マウスのROSは標識化を示さず、未処置Rpe65-/-マウスからのROSは燐酸化オプシンに対するモノクローナル抗体によって標識化された。この標識化は9-シス-レチナール処置をしたRpe65-/-マウスPND30に1回胃管栄養法によって投与し、その処置の48時間後に分析したでは完全に阻止された。この9-シス-処置はオプシンの燐酸化を正常杆体におけるそれらと同等レベルまで減少させた。単回フラッシュの15分後に暗所で固定したROSは9-シス-レチナールで処置したRpe65/マウスおよびRpe65-/-マウス両方において、免疫標識を示した。これらのデータは、オプシンがRpe65-/-マウスにおいて構成的に燐酸化されることを示唆する。これらの研究は、全トランス-レチノールの11-シス-レチノールへの変換および構成性オプシン燐酸化に特異的欠陥があるが、11-シス-レチノールから11-シス-レチナールへの酸化には欠陥はないことを示した。構成性オプシン燐酸化はLCAの病因における重要な要素であり得る。イソメラーゼ活性を直接測定するために、新規の手順を使用してRpe65マウスからRPEミクロソームを分離した。Rpe65/マウスからのRPEミクロソームを用いた対照試験において、RPEミクロソームおよびCRALBPが存在する場合にのみ、外部から加えた全トランス-レチノールから11-シス-レチノールが生成した。CRALBPを削除した場合、ならびにRPEミクロソームまたはCRALBPが熱で変性した場合には11-シス-レチノールは存在しなかった。11-シス-レチノールはRpe65-/-マウスからのRPEミクロソームには検出されなかった。11-シス-レチノール脱水素酵素11-シス-RDHはRPE65蛋白との複合体として精製されたので、11-シス-レチノールの酸化をRpe65マウスからのRPEミクロソーム中で研究した。NADPHおよびNADHをジヌクレオチド補因子として用い、Rpe65/マウスおよびRpe65-/-マウスに強い活性が検出された。NADPH依存性活性とNADH依存性活性とを区別するために、脱水素酵素活性の試験を非放射性NADHおよび[3H]NADPHの存在下で行った。このような条件において、NADPH依存性脱水素酵素活性だけが容易に検出され得る。Rpe65/とRpe65-/-との差は些細であった;なぜならばこの活性は、11-シス-Rdh/マウスによって決定したところ、正常なレチノイド流のために必要な活性に比べて遥かに高いからであるJangetal.,J.Biol.Chem.276:32456-652001。これらのデータは、Rpe65-/-マウスからのRPEミクロソームが高いNADPH依存性およびNADH依存性脱水素酵素活性を含むことを示唆する。Rpe65マウスのRPEにおける11-シス-RDHの免疫学的局在に差は認められなかったことを付け加える。9-シス-レチナール処置は正常杆体機能を回復する:ERGは主として二極性反応を反映するから、9-シス-レチナールが完全回復を提供できないということは、光受容体の残留性欠陥または杆体から二極性細胞へのシグナル伝達における問題に帰せられ得る。9-シスレチナール処置が正常な光受容体機能を回復できるかどうかを決定するために、吸引電極を用いてRpe65/マウスおよび未処置および処置Rpe65-/-マウスPND30に1回胃管栄養法によって投与し、その処置の48時間後に分析したからの単一杆体の反応を記録した。循環暗電流の光誘起性変化を、0、0.25、1.25、または2.5mgの9-シス-レチナールを胃管栄養法によって投与した試験に先立って1日1回、連続2日間Rpe65/マウスまたはRpe65-/-マウスからの単一杆体の外側部分から記録した。レチノイド分析は、2.5mg投与量の9-シス-レチナールで300±25pmolのイソ-ロドプシン/眼が形成され、1.25mg投与量では109.8pmolのイソ-ロドプシン/眼、0.25mg量では85.6±6.2pmol/眼が形成されることを明らかにした。9-シス-レチナール投与量とイソ-ロドプシン濃度との非直線性関係は肝臓およびその他の組織における蓄積を反映するものと考えられる。表に記載された全ての杆体型は光反応を支持し、光反応はフラッシュ強度の増加につれて増加し、光が全てのcGMPチャンネルを閉鎖し、細胞の光感受性暗電流を完全に抑制するのに十分な明るさになったときに最大飽和振幅に達する。各型の杆体から出る反応群は、飽和反応の振幅が9-シス-レチナールの用量の増加と共に増加することを示す。各群の杆体の平均暗電流と9-シス-レチナール用量との間の関係をプロットする。補充的9-シス-レチナールを受けなかったRpe65-/-杆体における光感受性暗電流は2.1±0.3pAで、9-シス-レチナール0.25mgを受けたRpe65-/-杆体3.6±0.9pAとは有意差はなかった。マウスに2.5mgの9-シス-レチナールを与えたとき、杆体暗電流は発色団の投与量が多くなるにつれて増加し、Rpe65/マウスと本質的に同じ数値に達した。Rpe65-/-フラッシュ反応のその他の2特性、反応動力学および光感受性、は補充的9-シス-レチナールの量と共に変化した。動力学的差を説明するために平均の薄暗いフラッシュ反応細胞内直線範囲を各杆体型で測定した。5種類のセットの杆体からの平均反応を同じピーク振幅に目盛り、比較した。2.5mgの9-シス-レチナールで処置したマウスからのRpe65/およびRpe65-/-杆体で記録した反応は本質的に同じ反応速度を有する。直線範囲の反応を重ね合わせると、2種類の杆体型のディムフラッシュ反応は同じ時間対ピークおよび回復時間を有することが示される。1.25または0.25mgの9-シス-レチナールを胃管栄養法によって投与したRpe65-/-マウスからの杆体で記録された反応も実質的に同じで、同様な時間対ピークおよび回復時間を示した;両方共Rpe65/のそれらより実質的に速い。補充的9-シス-レチナールを受けなかったRpe65-/-マウスからの杆体反応の薄暗いフラッシュ反応速度は中間であった;それらはRpe65/よりは速かったが1.25または0.25mgの9-シス-レチナールで処置したマウスからの杆体よりは遅かった。Rpe65/杆体と、Rpe65-/-マウスからの杆体との光感受性の差を図3に示す。この図は、5種類の試験条件の各々についてRpe65/および、2.5、1.25、0.25または0mgの9-シス-レチナールを投与したRpe65-/-マウス刺激反応曲線をプロットしたものである。フラッシュ強度の半飽和はRpe65/杆体において最も低く約30フォトン/μm2、2.5、1.25、および0.25mgの9-シス-レチナールを投与したマウスからの杆体ではそれぞれ6倍、66倍および131倍増加した。9-シス-レチナールを受けなかったマウスからの杆体の光感受性は最小量0.25mgを受けたマウスからの杆体と同じであった。9-シス-レチナール処置をしない場合、光異性化によって11-シス-レチナールがRpe65-/-マウスに生成する:光に全くさらされなかったRpe65-/-マウスはレチノイドの従来の顕微分析では検出レベル以下の11-シス-レチナールオキシムと同定されたを有する。しかし、これらのマウスはERG研究および単一細胞記録では強い照明に反応する。明るい光への曝露によって11-シス-レチナールが生成するかどうかを確認するために、2つの眼の代わりに4または8つの眼を使用してレチノイド分析を行った。Rpe65-/-では、暗順応動物に目立った量の11-シス-レチナールは検出されなかった。より多い眼を分析に用いると、一般的クロマトグラムに0.2pmol未満/眼の11-シス-レチナールオキシムが検出された。全トランス-レチナール4.2±1.1pmol/眼、n=8が存在し、強いフラッシュがこのアルデヒドを2.1±0.6pmol/眼の11-シス-レチナールに変換した。レチノイド類が真の標準の保持時間によって同定され、クロマトグラフィー試験中にそれらのUVスペクトルを測定した。次に、光異性化がフォトイソメラーゼ網膜G蛋白共役受容体蛋白の作用に起因するかどうかを確認することが重要であった。二重ノックアウトRpe65-/-Rgr-/-マウスを作成し、レチノイド分析を行った。遊離全トランス-レチナールの顕著な減少が観察されたが2.2±0.2pmol/眼、光フラッシュが同様のフラクション約50を11-シス-レチナールに光変換した。RPEまたは網膜にこれらのレチナールが存在するかどうかを確認するために、網膜およびRPEを分離し、個々に分析した8つの眼を使用したことに注意。大多数の全トランス-レチナールが網膜で観察されたのに対し、11-シス-レチナールはほとんどがRPEに存在した。退色は全トランス-レチナールを11-シス-レチナールこれも網膜に存在したに変換した。11-シス-レチナールがひとたび形成されると、そのレベルは暗所では15、30、または120分後に変化しない。Rpe65-/-Rgr-/-マウスのERG分析はRpe65-/-マウスから得た反応と比べて定性的には差がなかった図2C、右パネル。それと共にこれらの結果は、退色前の動物には、11-シス-レチナールを生成し、ロドプシンを再生するレチナール光異性化経路があることを示す。9-シス-レチナールの種々の送達法:重要な点はイソロドプシンを再生するだけでなく、シスレチノイド類の貯蔵庫も形成するという目的で、9-シス-レチノイド類の種々の送達法を比較することであった。二方法を試験した:胃管栄養法による投与既述されているVanHooseretal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:8623-282000および静脈注射。静脈注射はレチノイドを送達する効率的方法であり、シス-レチノイド類のアルデヒドおよびアルコール型またはそれらの異性体組成物11-シス-対9-シス-間に重要な差はなかった。9-シス-レチナールの静脈注射は、シクロデキストリンと共に供給した際もこれを伴わずに供給した際も、イソロドプシンを生成した。レチナールは血中から速やかに除去されたが、シクロデキストリンの存在下ではより長時間循環中で安定であり得たt1/2=12時間対23時間。シクロデキストリンの添加は、肝臓またはRPEへの9-シス-レチニルエステル類の蓄積もより高める。これは循環時間の延長によるものと考えられる。血流からの9-シス-レチナールの速やかな排泄により、イソ-Rhを十分再生するためには静脈注射を複数回行うことが必要になる。これは胃管栄養法の場合にはあてはまらない。なぜならば胃管栄養法の場合はレチナールが血流中に48時間よりも長く存在し続けるからである。胃管栄養法による投与および静脈注射は共に、Rpe65-/-マウスにイソロドプシンを効果的に生成した。両方法の利点および欠点は考察の部下記に記載される。考察RPE65の役割およびLCA:LCAの動物モデルであるRpe65-/-マウスを病的状態に導く事象の因果的連鎖は確立されていないとはいえ、その主な欠陥はレチノイドサイクルの中断であると考えられる。このサイクルは、RPEにおいて全トランス-レチナールが11-シス-レチナールへと酵素的に変換されることおよび光受容体細胞へとそれが戻ることによって視物質を再生させる。RPEと光受容体との間の正常なレチノイド流の破壊が、RPEにおけるレチナールエステル類の過剰蓄積を説明し得る。さらに、ロドプシン再生の失敗は杆体および錐体の光感受性の低下を説明し得る。11-シス-レチナールの欠如は光受容体中の遊離オプシンも増加させる。高レベルの遊離オプシンは連続的光曝露の影響に似た光変換カスケードの実質的活性化をもたらす。こうして高まった活性は、ROS層の厚さの減少および光受容体の変性を起こし得る。これらは連続的光にさらされた動物にも起こる効果である。この一連の事象は遊離オプシンの燐酸化によってさらに悪化するかも知れない。これは網膜変性に導くことが他の諸研究において証明されている。9-シス-レチナールによるRpe65-/-マウスの早期処置は全トランス-レチナールの蓄積を阻止し、RPEプロセスとROSとの間の付着接触を改善し、オプシンの脱燐酸化に導き、網膜変性のさらなる進行を防止した。これらの観察は、RPEにおけるエステル蓄積および光受容体における高レベル活性オプシンの存在がRpe65-/-マウスの網膜変性の主因であり得ることを示唆する。回復した杆体機能:Rpe65-/-マウスからの杆体の光感受性は9-シス-レチナールの食事性補充によって用量依存的に回復した。最大用量は正常な感受性および反応速度を示す杆体反応を支持した。より少用量の9-シス-レチナールによる処置は、感度は低下しているが、より速い反応速度を有する杆体反応を生成した。この反応は野生型杆体における定常的バックグラウンド照明下で起きる感受性および反応速度の変化によく似ている。より少量の9-シス-レチナールを投与したマウスから記録される杆体反応の光感受性の変化は2因子の組み合わせによって説明できる。感受性低下の一つの原因は、視物質の量およびその量子効率の両方の低下によって起きる杆体の有効収集面積の減少であった;イソ-ロドプシンの量子効率はロドプシンのそれの約3分の1である。感受性のその他の減少は、遊離オプシンによる変換カスケードの定常的活性化によって説明できる;これは野生型杆体における定常的バックグラウンド照明によって起きるものに匹敵する効果をもたらす。9-シス-レチナールで処置しなかったRpe65-/-マウスからの杆体も強く減感された光反応を生成した。未処置Rpe65-/-マウスに残留する杆体反応が存在するということは、LCAの小児において光反応が低下はしたが存在するという以前の報告と一致する。これらの結果から、それらの条件下では強い光のフラッシュによる光反応の生成は十中、八、九、網膜における全トランス-レチナールの光変換による11-シス-レチナールの生成によることが判明する。全トランス-レチナールが遊離しているか、オプシンに結合共有結合または非共有結合しているかどうかは議論の余地がある。発色団とオプシンとがあらかじめ結合していれば、その後、短い10ms光フラッシュの時間内に十分に速くそれが光異性化され、変換がトリガーされて、光感受性11-シス-レチナール複合体すなわちロドプシンが形成される。Rpe65マウスの杆体における光変換:処置Rpe65マウスおよび未処置Rpe65マウスからの光感受性杆体の変化は、それだけで作用する2.5mgの9-シス-レチナールまたは等価的バックグラウンドによる減感と共に作用する杆体の有効収集面積の減少遊離オプシンによる変換カスケードの定常的活性化が低レベルであるために帰することができる。有効収集面積ECAは、杆体の幾何学的収集面積A、色素の量子効率QE、および色素密度αに依存する。上記式中、1は経路の長さである。9-シス-レチナールを使用して生成する色素はイソ-ロドプシンであり、それはRhの量子効率の約1/30.22対0.67である。生化学的測定値は、2.5mgの9-シス-レチナールを胃管栄養法により投与したマウスでは色素の全てがイソ-ロドプシンであり遊離オプシンなし±10、Rpe65/杆体中のロドプシン量の約57であるすなわち300pMイソ-ロドプシン対525pMロドプシン。量子効率および軸方向の色素密度の減少は、9-シス-レチナールを2.5mg与えたマウスから得られる杆体の有効収集面積の約5倍の減少を起こすと予想される。これは、Rpe65p/の杆体と比較して、9-シス-レチナールを2.5mg与えたRpe65-/-マウスから得られる杆体のフラッシュ強度の半飽和の6倍の増加と一致する。9-シス-レチナール1.25および0.25mgで処置したマウスからの杆体において、イソ-ロドプシンの軸方向密度はRpe65p/杆体におけるロドプシン量の、それぞれ21および16であった。上と同じ理由によって、これらの変化は、Rpe65p/と比較してフラッシュ強度の半飽和を14.5-および19倍増加すると予想される。これは観察された感受性の変化を説明するには不十分である;1.25および0.25mgの9-シス-レチナールを胃管栄養法により投与したマウスからの杆体はその後それぞれ4.5倍および6.8倍減感される。付加的減感は、暗光のように作用してカスケードの定常的活性化をおこす等価なバックグラウンドに帰することができる。Rpe65p/杆体に関する独立的諸研究において、バックグラウンド照明によるフラッシュ感受性の変化はウエーバー-フェヒナーWeber-Fechner関係式によって説明された:上記式中、Sfは定常光におけるフラッシュ感度、Sは暗所におけるフラッシュ感度、Ibはバックグラウンド光強度、そしてIはフラッシュ感度をその暗数値の半分だけ減少させるバックグラウンド強度108光子/μm2/sである。したがって、378および648光子/μm2/sのバックグラウンド強度はフラッシュ感度の4.5および7倍の変化を起こすことが期待される。有効収集面積0.5μm2および積分時間0.3秒では、これらのバックグラウンド強度はRpe65p/杆体の等価的活性化、57および97Rh/sに相当する。処置Rpe65-/-杆体において、残留遊離オプシンの等価なバックグラウンドを、遊離オプシン濃度の生化学的測定値と生理学的減感推定値との組み合わせによって決定した。Rpe65p/杆体のRh分子数は約2×107すなわち、0.02pl中3mMロドプシンと推定される。Rpe65-/-マウスからの杆体における生化学的測定値から、処置後48時間目にはそれらがRpe65p/より約40少ない色素を作ることが示される。従って、2.5mgの9-シス-レチナールを胃管栄養法により投与したRpe65-/-マウスからの杆体中のイソ-ロドプシン分子数は約1.2×107である。より少ない用量の9-シス-レチナールは、イソ-ロドプシンを形成するために使用できる色素を全ては再生せず、そこは遊離オプシンのプールとなる。レチノイド分析により、1.25および0.25mgの9-シス-レチナールを胃管栄養法により投与したRpe65-/-マウスからの杆体中の遊離オプシン量は使用できる色素すなわち7.5-8.6×106分子の総量の63および72であることが示唆される。この量の遊離オプシンで、57および97Rh/sを退色させる定常光によって起きるRpe65/杆体の減感に匹敵する減感をRpe65-/-マウスからの杆体に起こすためには、約1×105オプシンがそのカスケードならびに1Rhを活性化しなければならない1.3-0.9×105オプシン:Rh。この数値は遊離オプシン:Rhの活性化比のこれまでの推定値すなわち106:1と広く一致する。図3の挿入図は、バックグラウンド明順応およびフラッシュ反応を同様な量だけ減感した等価な遊離オプシンバックグラウンドによる順応が、薄暗いフラッシュ反応速度に対して同様な効果を有することを示す。これは、順応がバックグラウンド光によるものであれ、暗順応と関連する等価なバックグラウンドによるものであれ、薄暗いフラッシュ反応の反応速度における順応変化は同様であることを示したこれまでの研究とも概ね一致する。未処置Rpe65-/-マウスから記録される高度に減感された杆体反応は、処置マウスの杆体に見られるような反応速度の促進を示さなかった。この相違についてはいくつかの説明が可能である。一つの可能性は、遊離オプシンの活性が未処置Rpe65-/-マウスからの杆体では処置マウスのそれより低いことである。これは、おそらく、未処置杆体ではオプシンの燐酸化があるためと考えられる。この説明は、少用量の9-シス-レチナールによる処置が、残っている遊離オプシンの大部分または全てを多分脱燐酸化によってより高い活性状態に変えることを必要とする。もう一つの可能性は、未処置マウスでは光色素の活性化および脱活性化が変化することである。例えば、光変換によって作りだされる光色素が正常ロドプシンと一致するということは明らかでない;例えばオプシンがまだ燐酸化されているかも知れない。9-シス-レチナール処置後の正常杆体機能の完全またはほぼ完全な回復は、エレクトロレチノグラムの感度の部分的回復と対照的であった。エレクトロレチノグラムは主として二極性細胞の活性を反映するので、この差は、杆体における反応が杆体-二極性シナプスを経て正しく伝達されないことを示す。Rpe65-/-マウスでは、視シグナルの欠乏のためにこのシナプスが正しく生成しないことが考えられる。出生時から連続的9-シス-レチナール処置を行うとこの問題の改善に役立つかも知れない。9-シス-レチナール処置の利点および欠点:レチナールは次の二方法の一つまたは組み合わせによって効果的に眼に送達され得る:胃管栄養法による投与および静脈注射。最も効果的な送達系は胃管栄養法である。それは1-2日以内に視物質を回復し、肝臓およびRPEミクロソーム内の9-シス-レチニルエステルの蓄積をも起こす。それは非常に再現性のある方法である。48時間にわたって血中レチノイドの一過性上昇があり、その後正常レベルに戻る。唯一の目立った欠点は、レチノイドの多くが貯蔵されるよりむしろ分泌され、そのためその他の送達法より多量を必要とすることである。静脈注射もレチノイドを眼に送達する効果的方法であるが、この方法はレチノイドが腎臓によって血流から速やかに排泄されるという欠点を有する。これはレチナールをシクロデキストリンネットに閉じ込めることによってある程度防ぐことができる。十分に再生するためには多数回または多用量を注射しなければならないが、これは局所的感染と関連する潜在的問題を生ずる。循環する全トランス-レチノイドの量を減らすために、肝臓カルボキルエステラーゼを阻害して、全トランス-レチナールの血流への放出を阻止することが有用かも知れない。このような阻害剤は、それらが強力であれば、非常に有毒である。なぜならばそれらはヒドロラーゼ活性を必要とするその他のプロセスを阻害するからである。ビタミンK1およびEのような一般的なおよび弱い阻害剤はある程度有効であるが、血流中のシス-レチノイドレベルを高めるにはより特異的阻害剤が必要である。眼内注射は同様な症例に選択できることを付け加えておく。肝臓およびRPEにはシス-レチノイドの大きい貯蔵庫はない。これは十中、八、九、遊離レチナールまたはレチノールが全トランス異性体に非酵素的に変換するためである。しかし、哺乳動物の視力の効率はすぐれており、シス-レチノイド治療を念頭に置いて考慮する価値がある。例えば、哺乳動物の網膜は約108の光受容体を含む。もしも各光受容体が平均1-2×103フォトン/sを量子効率0.65または9-シス-レチナールでは0.3で吸収するならば、11-シス-レチナールの1日必要量は1μg未満に過ぎず、この量はたとえレチノイドの大部分が肝臓に保持され、または分泌されるとしても、食事性補充によって容易に供給できる量である。ビタミンAの推奨摂取量は男性で0.8mg/日、女性で0.7mg/日であり、3mg/日という安全性の上限は、データ不足のため、推定値に過ぎない。複数回の胃管栄養法による投与は眼のレチニルエステル量を増やさない。これに対して、早期介入は全トランス-レチニルエステルの蓄積を顕著に低減する図1。これは網膜疾患のシス-レチノイド治療の成功する必要条件の一つであり得る。RPEにおける全トランス-レチニルエステルのレベルは介入の時期によってあらかじめ決まる。もしも治療が出生後非常に早期に開始されるならば、エステルは野生型マウスにおけるように、年齢と共に徐々に増加するに過ぎない。その処置は眼からエステルを除去はしないが、エステルの蓄積を阻止する。考えられる一つの説明は、オプシンが再生しないというシグナルを網膜が送り、これが血液循環からのレチノール捕獲をおこし、レチニルエステルとしてRPEに貯えるというものである。レチニルエステルが11-シス-レチナールに変換できない場合、オプシンシグナルがオンになり、これら二つの要因が最後にはエステル蓄積に導く。このような連絡のメカニズムは分子レベルでは知られていない。つまり、この研究は、9-シス-レチナールの投与が杆体光色素および杆体網膜機能を6カ月間よりも長く回復し、早期介入がエステル蓄積を著しく低減することを証明するものである。Rpe65-/-マウスのオプシンはRpe65-/-マウスの杆体において構成的に燐酸化される。視物質のこの改変はLCAの病理生理学に関係し得る;幸いなことに、9-シス-レチナール処置後、オプシンは脱燐酸化される。Rpe65-/-マウスの11-シス-レチナールのソースは網膜に存在する全トランス-レチナールの光異性化から生じ、二重Rpe65-/-Rgr-/-ノックアウトマウスに示されるように、網膜G蛋白共役受容体のフォトイソメラーゼに加えて、その他の作用機序がこのプロセスに関係するという証拠も提供されている。単一細胞の記録を使用する電子生理学的データは、11-シス-レチナールが現場で杆体外側部分に形成されることを示唆する。これらの研究はLCAの病因に関する分子レベルでの情報を提供し、薬理的介入が暗所で飼育されたRpe65-/-マウスの視機能の長期保存をもたらすことを証明している。実施例2光変換はロドプシンRh発色団11-シス-レチニリデンの、全トランス-レチニリデンへの光異性化によって開始する。ここで、異なる環サイズを有するレチナール同族体で再生したロドプシンこれはC11=C12二重結合の周りの異性化を阻止するを使用して、このG-蛋白共役受容体の活性化メカニズムを研究した。11-シス-7-環-ロドプシンはインビボでもインビトロでもG-蛋白を活性化しないし、その他の二重結合に沿って異性化しない;これはそれがオプシンの結合部位にきっちりとフィットしていることを示唆する。これに対して、退色11-シス-6-環-ロドプシンはインビボで、および低pH、インビトロで光変換を軽度に活性化する。これらの結果は、より硬い6位固定6-lockedレチナール異性体ではその他の二重結合に沿った異性化によって、および11-シス-6-環-ロドプシンではpHを低くすることによって鍵となる残基のフォトン化によって部分的活性化が起きることを明らかにする。完全な活性化は得られない、なぜならば異性化はロドプシンのコンホメーション再配列の完全な1組を誘発しないからである。6-および7-環-束縛-レチノイドに関するこれらの結果はロドプシン活性化への新しい洞察を与え、固定されたレチナール類、特に11-シス-7-環-レチナールの利用を示す。脊椎動物の網膜光受容体細胞において、視物質発色団の異性化、11-シス-レチナールの全トランス-レチナールへの異性化が、総合的に光変換カスケードと称される1組の反応をトリガーする。光変換事象は活性化ロドプシンRhによって開始し、究極的にはニューロンのシグナリングに導く典型的G-蛋白カスケードに沿って進行する。ロドプシン発色団の光異性化によって生成する触媒的活性な中間体であるメタロドプシンIIまたはMetaII、Rhは、オプシンのLys296に脱プロトン化したシッフ塩基を介して共有結合した全トランス-レチナールを含む。それに続いて、MetaIIは再プロトン化を受け、光分解した発色団は加水分解され、オプシンから遊離する。光異性化した発色団によるロドプシン活性化の正確なメカニズムは知られていない。ロドプシンの光退色プロセスは、レチナールが11-シス-二重結合の周囲で異性化できないようにする余分の環をC10とC13との間に含むレチナール同族体を使用して研究された。C9-C11の動きが制限されている人工的視物質は正常な光分解中間体を形成する。これはロドプシンの活性化にC11=C12結合異性化が重要であることを示唆する。より最近になって、光異性化後、発色団のβ-イオノン環がMetaIIに移行中に新しい位置に動くことが報告されたBorhametal.,Science288:2209-122000。Jangetal.J.Biol.Chem.276:26148-532001は、6-環-束縛レチナール異性体および基底状態のロドプシンの結晶構造を使用して、この移動が制限される場合に残留活性だけが認められることを示した。固定されたレチナール同族体を用いてビタミンA-欠落ラットにおけるインビボ視伝達も研究された。これらの動物はロドプシンの正常補体の約半分を有した。固定されたレチナールの注射は光受容体に同族体色素を出現させたが、ラット眼から記録されたエレクトロレチノグラフィーb-波の応答には顕著な影響を与えなかった。野生型ロドプシンからの妨害のため、結果を十分に説明することができなかった。光受容体において光でトリガーされる諸事象は二細胞系、すなわち光受容体細胞及び網膜色素上皮細胞RPEを含む再生反応と相互に綿密に関係する。フォトンの吸収によって生ずるあらゆる光異性化はロドプシンの再生によって、新たに合成された11-シス-レチナールと釣り合う。Rhから遊離した光異性化生成物、全トランス-レチナールは光受容体において全トランス-レチノールに還元され、その後、RPEにおいて視サイクルまたはレチノイドサイクルと呼ばれる酵素的過程において11-シス-レチナールに戻るMcBeeetal.,Prog.Retin.EyeRes.20:469-5292001。レチノイドサイクルの数種の成分が確認されているが、主な酵素的および化学的変換はよくわかっていない。レチノイドサイクルに含まれる蛋白の一つはRPE65である。これは分子量65kDaを有する高度に発現される膜結合型RPE蛋白である。この蛋白は11-シス-レチノール脱水素酵素11-シス-RDHと複合体を形成するようにみえる。RPE65の機能は知られていないが、レチノイドプロセッシングと関係すると考えられている。95より多くのRPE65を除去する高濃度塩で洗ったRPEミクロソームはまだ大部分の異性化活性を保有していた。しかし予想外に、Rpe65-/-マウスはRPE中に全トランス-レチニルエステルを脂質様滴の形で過剰蓄積していた。その後のレチノイド分析では、エステルまたはアルコール型のいずれの11-シス-生成物も検出されなかった。Rpe65-/-マウスのエレクトロレチノグラムERG測定は、杆体および錐体機能がひどく衰退していることを明らかにした。少量の11-シス-レチナールが光受容体細胞において現場で光化学的反応によって生成する。シス-レチノイドによる早期介入がレチニルエステル蓄積を著しく減らすことが証明された実施例1を参照。この動物モデルは、11-シス-レチナールとは異なる、光活性化プロセスを受けた合成レチナール同族体で再生したロドプシンのインビボ特性を野生型ロドプシンからの妨害なしに研究するのに非常に有用である。本研究において、環-束縛11-シス-レチナール異性体で再生され、C11-C12二重結合周囲の異性化を阻止するC10とC13との間の3-炭素架橋を含むロドプシンは、インビボでもインビトロでも顕著な異性化および活性化を受けない。これに対して、11-シス-6-環-ロドプシンの退色2-炭素架橋はその他の二重結合に沿って異性化を起こし、低pHでロドプシンの活性種を生成する;それはFTIR分光光度分析によって証明されたように、インビボおよびインビトロの両方において光変換事象をトリガーする。これらの結果はロドプシン活性化への新たな洞察をもたらすものであり、同時に、6-および7-環-束縛レチノイドが網膜病変のレチノイド治療において有用であることを示すものである。方法および材料11-シス-7-環-レチナールの合成:11-シス-7-環-レチナールを公表された手順によって合成したAkitaetal.,J.Am.Chem.Soc.102:6372-63761980;Fujimotoetal.,Chirality14:340-462002:Caldwelletal.,J.Org.Chem.58:3533-371993。異性体1-4化合物1-4としても記載されているの同定には図4Aを参照されたい。11-シス-7-環-レチナールで再生されたロドプシンの光異性化:杆体外側部分、オプシンの調製、レチナールによるロドプシン再生、およびコンカナバリンA-セファローズ4Bカラム上でのロドプシンの精製を既述Jangetal.,J.Biol.Chem.276:26148-532001のように行った。11-シス-レチナールおよび11-シス-7-環-レチナール類で再生したロドプシンの燐酸化:再生したロドプシン2mg/mlを、5mMMgCl2、0.5mM[32P]ATP約35,000ないし約50,000cpm/nmolおよび精製ロドプシンキナーゼ約5μgの蛋白を含む100mM燐酸ナトリウム緩衝液、pH7.2、100μlに混合し、既述Palczewskietal.,J.Biol.Chem.266:12949551991のようにアッセイを行った。試験は3回行われた。11-シス-7-環-レチナール異性体を用いるRDHのHPLC活性アッセイ:11-シス-RDHレチノール脱水素酵素および光受容体全トランス-レチナールー特異的RDHprRDHまたは全トランス-RDHの活性を、[15-3H]レチノール異性体の生成レチナール異性体の還元をモニターすることによって分析試験したJangetal.,J.Biol.Chem.275:21128-382000。反応混合物100μlはMES最終的濃度、66mM、pH5.5、1mMDTT、精製11-シス-RDH-His60.31μgのためのプロ-S-[4-3H]NADH16μMJangetal.,J.Biol.Chem.275:21128-382000またはprRDHのためのプロ-S-[4-3H]NADPH12μMSf9細胞に発現され、20mMBTP、1mMジチオスレイトール、1μMロイペプチンに細胞ペレット/緩衝液比1:49で懸濁された、および反応を開始するために最後に添加される2μlの11-シス-7-環-レチナール異性体120μMサブストレートストックを含んでいた。反応液を33°Cで10-20分間インキュベートした。レシチン:レチノールアシルトランスフェラーゼLRATアッセイ:新鮮ウシ眼をシェンクパッキング社SchenkPackingCo.,Inc.Stanwood,WAから入手した。ウシRPEミクロソームの調製は既に記載されたStecheretal.,J.Biol.Chem.274:8577-851999。このミクロソームを10mMMOPS、1μMロイペプチン、および1mMジチオスレイトールに再懸濁した。その際光熱量計によって測定して総蛋白濃度が約5mg/mlになるようにしたBradford,Anal.Biochem.72:248-541976。部分を80°Cで保存し、調製1カ月以内に使用した。内因性レチノイドを破壊するために、RPEミクロソームの部分、200μl、を石英キュベットに入れ、クロマトUVE-トランスイルミネータTM-15型、UVP社を用いて0°Cで5分間照射した。全研究は暗赤色光の条件下で行われた。全トランス-レチノール、11-シス-レチノール、および11-シス-7-環レチノールは、分光光度分析によって測定して1mM濃度になるようにジメチルホルムアミドに溶解した。130μlの10mMBTP、pH7.4、20μlの10ウシ血清アルブミン、および10μlの10mMATP10mMBTP1,3-ビス[トリスヒドロキシメチル-メチルアミノ]プロパン、pH7.4、中を含む1.5mlのポリプロピレンチューブに、20μlのUV処理ウシRPEミクロソーム約100μgの総蛋白を加えた。その後11-シス-7-環-レチノールの1mMジメチルホルムアミド溶液2μlをその混合物に加え、指定された時間、37°Cでインキュベートした。300μlのMeOHおよび300μlのヘキサンの添加によって反応を停止した。レチノイドを抽出するために、渦撹拌器上で5分間激しく撹拌し、14,000rpmで4分間遠心分離し、ヘキサン層と水層とを分離した。ヘキサン抽出物100μlを標準相HPLC4酢酸エチル/ヘキサンによって分析した。研究は2回ずつ行った。レチノイドの量は標準化された。LRAT阻害アッセイ:アッセイは上記のように行われたが、11-シス-7-環-レチノールと共に37°Cで15分間プレインキュベーションした後、全トランス-レチノールまたは11-シス-レチノールの1mM溶液2μlを加え、反応液をさらに10分間インキュベートした。対照として、11-シス-7-環-レチノールを加えずに、反応液をジメチルホルムアミド2μlと共にプレインキュベートした。FTIR分光光度測定:オプシン膜24μMSachsetal.,J.Biol.Chem.275:6189-942000をBTP緩衝液1mMMgCl2および130mMNaClを含む20mMBTP、pH7.5中で、240μMの11-シス-レチナールと共に、または11-シス-6-環-または11-シス-7-環-レチナール異性体類いずれかの混合物と共に一晩インキュベートした。膜懸濁液を100,000×gで25分間遠心分離し、BTP緩衝液に再懸濁すると2.2mMロドプシンが得られた500nmの吸収から。トランスデューシンの高親和性同族体Gt-340-350で測定するために、8mMVLEDLKSCGLF配列番号:1を使用した。H2O/D2O交換のためにペレットをジューテリウム化緩衝液に3回再懸濁した。緩衝溶液を除去し、ペレットを2つのBaF2窓と、3μmポリテトラフルオロエチレンガスケットとを有する30-mm直径の温度制御-トランスミッションセルに移した。ブルーカBrukerifs66-Vスペクトロメータを用いてスペクトルを記録したBartletal.,FEBSLett.473:259-642000。全てのサンプルで、MetaIIからロドプシンを差し引いた差スペクトルを作成した。動力学的光散乱:光散乱の変化を既述Hecketal.,MethodsEnzymol.315:329472000のように測定した。測定は300μl容積を有する10mm-パスキュベットで、等張性緩衝液20mMBTP、130mMNaCl、および1mMMgCl2、pH6.4図6に説明されている中で、22°C、A/D変換器ニコレット400、マジソン、WIを用い、ドエルタイム5-msで行われた。膜懸濁液を含むサンプル3μMロドプシンを精製Gt0.8μMおよび1mMGTPで再構成した。適切なニュートラル濃度フィルタによって減衰させた緑色500±20nmフラッシュによるロドプシンのフラッシュ光分解によって反応をトリガーした。フラッシュ強度は、退色し、光励起ロドプシンのモル分率Rh/Rhとしてあらわされるロドプシンの量によって、測光的に定量された。動物:全ての動物試験はワシントン大学動物ケア委員会によって承認され、米国獣医学会安楽死委員会の勧告にしたがった手順を使用した。全動物は完全な暗所に置かれ、全ての操作はコダックNo.1安全光フィルタ透過>560nmを用いて暗赤色光のもとで行われた。一般的に、齢2-3カ月のマウスを全ての試験に使用した。RPE65-欠乏マウスはM.Redmondナショナルアイインスチチュート、ナショナルインスチチュートオブヘルス、Bethesda,MDから入手し、既述Redmondetal.,Nat.Genet.20:344-511998;Redmondetal.,MethodsEnzymol.316:705-242000のように遺伝子型を決定した。レチノイドおよび視物質の分析:全ての手順は既述VanHooseretal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:8623282000;Jang.etal.,J.Biol.Chem.276:32456652001;Palczewskietal.,Biochemistry38:12012-191999のように暗赤色光のもとで行われた。ERG:マウスを麻酔するために、100mMNaClを含む10mM燐酸緩衝液、pH7.2、で希釈した6mg/mlケタミンおよび0.44mg/mlキシラジンの15μl/g体重を腹腔内注射した。1トロピカミドで瞳孔を拡大した。コンタクトレンズ電極をメチルセルロースの1滴と共に眼の上に置き、接地電極照合電極を耳の中に置いた。ERGをユニバーサル試験および電気生理学的装置3000ユニバーサルテスティングアンドエレクトロフィジオロジックシステム3000universaltestingandelectrophysiologicsystem3000UTASE-3000LKCテクノロジー社LKCTechnologies,Inc.で記録した。マウスをガンツフィールドチェンバに入れ、フラッシュ刺激に対する反応を両眼から同時に得た。フラッシュ刺激は強度範囲0.00020-41candelas/m2を有し、白色光フラッシュ持続時間は10msであった。2回から4回の記録を10秒よりも長い間隔で行った。全条件における各点の記録には一般的に4-8匹の動物を使用した。全てのERG測定は麻酔後10-40分以内に行われた。イムノサイトケミストリー:切片の作成、および抗燐酸化ロドプシン抗体、A1182PP.Hargraveからの贈り物を用いる免疫標識を既述のように行ったVanHooseretal.,J.Biol.Chem.277:19173-822002。モデリング:ウシロドプシンのためのコーディネートは蛋白データバンクから得た1HZX。水素原子の付加および全ての最適化はInsightIIでInsightIIrelease2000、AccelrysInc,Sandiego,CA既述のように行われたJang.etal.,J.Biol.Chem.276:26148-532001。結果11-シス-7-環-レチナールの合成およびロドプシンの活性部位のモデリング:7員環を組み込んだ11-シス-固定-レチナール同族体の全体的合成が最近報告されたFujimotoetal.,Chirality14:340-462002。この方法は11-シス-7-環-レチナールを合成する変法で行われた。化合物は4種類の異性体の混合物として製造された。これらの異性体は標準相HPLCによってよく分離され、前に方法および材料の部分上記に記載されたものと一致するUV-可視および1HNMRスペクトルを有するCaldwelletal.,J.Org.Chem.58:3533-371993;Akitoetal.,J.Am.Chem.Soc.102:6370-721980。異性体3,11-シス-7-環-レチナールのコンホメーションは11-シス-レチナールと高度に重なる。全ての異性体はロドプシンのX線構造を使用する分子モデリングPalczewskietal.,Science289:739-452000;Telleretal.,Biochemistry40:7761-722001およびエネルギー最小化アルゴリズムによって示されるように、ロドプシンの結合部位にフィットする。異性化、還元およびエステル化に対する11-シス-7-固定-ロドプシンの感受性:11-シス-7-環-レチナールは6-環-異性体に比べて熱による異性化にはより安定である。溶液中でこれらの7-環-レチノイドを退色させると、最少量の異性体が9,11,13-トリシス-レチナール1である異性体混合物が生成する図4A。これらの異性体で再生したロドプシンをコンカナバリンAカラムクロマトグラフィーを使用して精製した図4B。オプシンに結合した際、11-シス-7-環-レチナール異性体3が異性化に対して最も安定であるようにみえる図4C、他方、11,13-ジシス-異性体2は暗所においてさえ容易に異性体3に変換し、オプシンがこの異性化を促進することが示唆される。全体的に、7-環-含有レチノイドは6-環-含有レチナールに比較して全ての条件においてより安定で、より低い程度に相互変換を受けるようにみえる。トリ-シス異性体1を除いて、それらは11-シス-RDHのためには貧弱な基質である。それらは異なる異性体間の区別なしにprRDHによって利用される。これらのデータはまたしても6-環-レチノイドのデータとは異なる。最良の基質に対する両方の脱水素酵素の活性は天然レチナールの約10分の1に過ぎず、これらの基質が視覚系に内生する脱水素酵素によってあまり利用されないことを示唆する。これらのレチノイドはLRATにとっても貧弱な基質であり、一部だけがエステル化され得るに過ぎない図5。全トランス-レチノールまたは11-シス-レチノールが基質として存在する際に分析試験すると、11-シス-7-環-レチナール類は効果のないLRATインヒビタである。11-シス-7-環-ロドプシンのインビトロ活性:11-シス-7-環-レチナールで再生したロドプシンにおける光誘発性形質転換を評価するために、FTIR分光測定法を用い、オプシンの異なる領域に特異的なスペクトルの変化をモニターした。光活性化すると、異性体1および4で再生したロドプシンは野生型ロドプシンに比較して差スペクトルにわずかな変化をもたらしたが、異性体2および3は不活性であった。11-シス-結合は固定されているため、これらの変化は固定されたC11=C12二重結合を除いたその他の二重結合の周囲の異性化を反映する。これらのスペクトルの全てはpH非感受性であった。FTIRによると、退色で発色団はその幾何学構造を変化しつつあるが、発色団の移動はロドプシンの水素結合にもカルボン酸のプロトン化状態にも顕著な変化を起こさないことが明らかである。スペクトルデータと一致し、Gt活性化のモニターとしての光散乱変化は、非常に低いが測定可能のpH非依存性活性を与えた。6-および7-環-異性体によるロドプシンのインビボ再生:インビボ研究のためにレチノイド同族体で再生されるロドプシンを生成するために、Rpe65マウスをレドモンドRedmondらの方法24によって作成した。これらのマウスは11-シス-レチナールの実質的量を産生することができないVanHooseretal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:8623-282000。Rpe65/マウスのロドプシンは光感受性の発色団を有する。しかし、Rpe65-/-マウスを使用してインビボで11-シス-7-固定-レチナールで再生したロドプシンは、光不感性ロドプシンを生成した。これは1SDSの添加によって差スペクトルにおいて検出することができた。レチノイド分析は、予想される量の視物質の存在を明らかにした。7-環異性体類の混合物の注射が唯一の異性体生成物11-シス-7-環-レチナール、異性体3を与えたとはいえ、6-環-含有レチナールの混合物は、これまでの研究Jang.etal.,J.Biol.Chem.276:26148-532001から予想され得るように3種類の異性体を生成した。これらの結果は、11-シス-レチナールの構造に酷似した11-シス-7-環-レチナールで、オプシンがインビボで容易かつ優先的に再生されることを示唆する。インビボにおける11-シス-7-環-ロドプシンの活性の欠如:アッセイの感度を高めるため、およびインビボで7-固定-異性体で再生するロドプシンの特性を評価するために、Rpe65-/-マウスを異性体3で処置した。活性a-およびb-波はMe2SOのみで処置したサンプルに比べてこの処置による影響を受けなかった。これに対して、陽性対照において9-シス-レチナールは、強度の低い光であっても処置マウスの感受性を有意に高めた。さらに、11-シス-7-環-ロドプシンは精製ロドプシンキナーゼを使用するインビトロ燐酸化アッセイにおいて不活性であった。つまり、これらの結果は、7-環-レチナールは、全ての試験条件においてほとんど不活性であるロドプシンを生成することを示す。この知見はインビボおよびインビトロにおける異なる感度を有する相補的方法、例えばFTIR、ERG、Gt活性化、および燐酸化などを検出アッセイとして使用することによって確認された。11-シス-6-環-Rhはインビボおよびインビトロにおいて活性である:驚いたことに、6-環-含有レチナールでインビボ再生したロドプシンは、より強い退色において活性である。a-およびb-波はMe2SO対照と比べて明らかに高まった。この結果は、以前に測定したロドプシンの低活性と一致するBhattacharayaetal.,J.Biol.Chem.267:6763-691992;Ridgeetal.,J.Biol.Chem.267:6770-751992;Jang.etal.,276:26148-532001。ロドプシンおよび固定同族体を有する色素の相対的活性は次のようである。6-固定同族体で再生したロドプシンを含む膜では、野生型ロドプシンに匹敵するGt活性化速度を誘発するためには1350倍強度の活性化光フラッシュが必要である。FTIRスペクトルに見られるpH依存性と一致し、この活性は酸性pHでは上昇する。これは天然ロドプシンの周知のpH/速度プロフィールpH7.4における活性がpH6.4に比べて高いとは対照的である。その上、この結果の作用機序関係考察下記を参照されたいと並んで、これらのデータは固定された同族体の活性が単に内因性11-シス-レチナールの痕跡量に起因するという考え方を排除することができる。さらに、6-固定同族体で再生したロドプシンの活性はヒドロキシルアミンに感受性を有し、光活性化光生成物が天然Rhと同様な開いたコンホメーションを有することを示している。インビボでの知見と一致して、11-シス-6-環-ロドプシンの活性は7-固定色素の活性より著しく高い。FTIRスペクトルは、11-シス-6-環-ロドプシンの基礎状態の蛋白-発色団相互作用が退色サンプルとは異なることを示す。pH7.5では1206cm-1のバンドによって示される発色団-蛋白相互作用の変化は、蛋白の顕著な変化には導かれず、残留活性だけが検出され得た14。しかし、pH4.5では、同じ変化が水素結合の再配向および二次構造の変化に導き、Gt-340-350-由来のペプチドに結合できるMetaII様生成物を形成した。この知見は、pHがオプシンの構造変化を誘発し、それが発色団と結合部位の蛋白環境との相互作用を可能にすることを示唆する。この変化のためのpKaは5.4であり、MetaII様構造は、11-シス-レチナールで再生したMetaIIに匹敵する半値幅時間で崩壊する。Glu113のプロトン化に帰せられるRho/MetaII差スペクトルにおける1713cm-1のバンドはpH4.5で11-シス-6-環-異性体で再生するMetaII様生成物においては1708cm-1にシフトするようにみえる。1713cm-1のMetaIIバンドとは対照的に、サンプルをD2Oで処理した際にこのバンドは顕著にはシフトしないが、結合の形がわずかに変化した。興味深いことに、このバンドは11-シス-6-環-異性体で再生したロドプシンのE113Q突然変異体のMetaII様光生成物にも認められる。考察本研究の結果から、異なる、ただし関連する2つの論題、すなわちロドプシンの活性化メカニズムおよびレチノイド同族体のインビボ利用、に関する結論が導かれる。ロドプシンの活性化:レチノイド同族体の研究から得られた新しい教訓:本研究は活性化プロセスに関する新しい重要な情報を明らかにした。明らかに異なる3種類の発色団-蛋白相互作用が11-シス-7-環-および11-シス-6-環-含有レチナールおよび11-シス-レチナールで見いだされた。111-シス-7-環-異性体で再生したロドプシンは野生型活性の0.1を有するに過ぎない;これは感度の高いERGおよびFTIR研究のいずれにおいても不活性である。この低活性は存在する遊離オプシンが少量である結果であり得、遊離オプシン:Rhの推定活性化比率、すなわち106:1と一致し得る。こうして11-シス-7-環-レチナールはオプシン結合ポケットによって安定化され、安定な11-シス-環-ロドプシンを形成するようにみえる。9,11-ジシスおよび9,11,13-トリシスが退色すると最も安定な異性体である異性体3に変換し、Gt活性化の欠如と一致するFTIRスペクトルを生成する。2これに対して、11-シス-6-環-レチナールのC9=C10およびC13=C14二重結合に沿って起こり得る移動は、ロドプシンの活性化におけるトリガーバリヤを十分に克服する。この活性はインビボにおいて、およびヌクレオチド取り込みおよび燐酸化アッセイを使用するこれまでの測定に比べて進歩した光散乱アッセイにおいて、明らかに検出できる。この活性状態はヒドロキシルアミンに対する感受性、FTIRスペクトルの形、およびGtペプチドとの相互作用においてMetaIIに似ている。しかし11-シス-6-環-Rhの退色はpH依存性のGt活性化に導き、一方MetaIIはpHの広範囲にわたる広い高活性を有する。この結果は、C9-C10およびC13-C14に沿った異性化がロドプシンの発色団周囲を十分に弛緩させ、発色団-遊離オプシンで認められたような活性化が可能になることを示唆する。しかしロドプシンの活性化は鍵となる残基の正しい強制プロトン化では達成されない。完全な活性化が起きるのは、全トランス-レチニリデンが最も伸展したコンホメーションをとり、発色団のβ-イオノン環がその蛋白環境に作用し得る場合だけである。活性化メカニズムはまだ明らかでないとはいえ、もう一つの驚くべき考察との深い関係、すなわちFTIRスペクトルが活性種を示す一方、対イオンGlu113のプロトン化および塩架橋破壊を示すスペクトルモチーフのスペクトル特性が変化するということが推測される。pH依存性活性の最も明快な説明は、Hが、部分的に光で活性化され、野生型ロドプシンの光活性化中に発生する状態に類似する仕方で、レチナール結合部位に適合するというものである。もう一つの矛盾しない説明は、6-環-レチナールの制限された光化学が、重要な残基類Glu113を含むのプロトン化および活性コンホメーションオプシン/オプシン平衡に類似しているの形成を最後には可能にするような仕方で、それら6-環-レチナールの逆アゴニスト様特性を一部分除去するのに十分である、というものである。3天然MetaIIでは、エネルギー量は、中性pHにおいても塩基性pH値においてさえも受容体を活性コンホメーションにすることができる程十分大きい。11-シス-6-環-Rhの光誘発性活性種の見かけpKaは5.4で、1pH単位だけより低く、遊離Glu残基のpKaから約1.5kcal離れる。その一方、MetaIIのプロトン化種は6.7のpKaを有する。天然ロドプシンおよび11-シス-6-環-レチナール再生-ロドプシンにおいて観察された活性種のある残基を、天然pKaより高いpHにおいてプロトン化するにはエネルギーが必要である。結論として、天然または6-固定-レチナールのロドプシン結合ポケットにおけるレチナール異性化は、Gtとのカップリングを可能にするような蛋白のコンホメーション変化を起こすようである。興味深いことに、この特性は特異的であり、しかも非常に類似している6-環-および7-環-含有レチナールを区別する。この相違はおそらく、活性部位における両レチナールのコンホメーション、環によって与えられる固定性、および6-環-含有レチナールの容易な異性化に起因する。レーバー先天性黒内障における6-および7-環-含有同族体の使用:RPE65遺伝子の突然変異が確認されているのは、レーバー先天性黒内障LCAと診断された患者Leber,Arch.Ophthalmol.Paris15:1-251869;Marlhenseral.,Nat.Genet.17:194-971997、および常染色体劣性小児期発生性重症網膜ジストロフィー患者Guetal.,Nat.Genet.17:194-971997、および常染色体劣性色素性網膜炎患者Morimuraetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:3088-931998である。LCAの特徴は、先天性盲目、または貧弱な中心視力、軽度の眼底変化、ほとんど存在しないエレクトロレチノグラムシグナル、眼振、乳頭反応の低下、時には光恐怖症Schappert-Kimmijseretal.,Ophthalmologica137:420-221949、場合によっては網膜の色素性変性、杆体光受容体の欠如、錐体のレムナント、RPEにおける色素の凝集、および網脈絡膜接着の欠如Leber,Arch.Ophthalmol.Paris15:1-251869;Krolletal.,Arch.Ophthalmol.71:683-6901964である。LCAの遺伝的異常は、種々の生理学的経路からの遺伝子に関連しCremersetal.,Hum.Mol.Genet.11:1169-762002、RPE65遺伝子の突然変異が全てのLCA症例の約12を占めるThompsonetal.,Invest.Ophthal.Vis.Sci.41:4293-992000。LCAを治療するための数種類の治療アプローチが提案されている。これらの方法としては、RPE移植、遺伝子代替治療、および薬理的介入が挙げられる。今日まで、動物における遺伝的変性の大部分の実験的治療介入は変性の進行を遅らせることを目的にしている。RPE65遺伝子の突然変異によって起きるレチノイドサイクルのブロックは、有望なことに、9-シス-レチナールの経口添加、およびそれによるイソ-ロドプシンの形成によって薬理的に克服されるらしい。シス-レチノイド投与後48時間以内に杆体光色素が形成され、杆体の生理的状態は劇的に改善され、RPE65が存在しない場合薬理的介入が視力を回復する可能性が示された。視機能の回復に関する9-シス-レチナール介入の効果に関するこの長期研究は、この考え方をさらに支持するものである。これまでの実施例は説明のためのものであり、本願発明の範囲を制限するものではない。本発明のその他の変形は当業者には容易に理解されるものであり、添付の請求項に包含される。全ての公報、特許、特許出願およびここに記載されるその他の参考文献は参考として本明細書に組み込まれる。配列表"