"ゲノムDNAにおける特定領域にDNAメチル化異常を特異的に導入することにより、人為的にエピジェネティック異常を誘発させることができる培養細胞又はヒト以外のモデル動物。エピジェネティック機構に関連する疾患又は異常を人為的に誘発させることができる病態モデル動物である、請求項1記載のヒト以外のモデル動物。DNAメチル化異常がDNAメチル化又は脱メチル化の阻害である、請求項1又は2記載の培養細胞又はヒト以外のモデル動物。特定領域が疾患の発症原因遺伝子若しくは発症に関連するエピジェネティック異常を起こす領域、又は、それらの候補領域である、請求項1~3のいずれか一項に記載の培養細胞又はヒト以外のモデル動物。特定領域がTDMRである、請求項1~4のいずれか一項に記載の培養細胞又はヒト以外のモデル動物。トランスジェニック動物である、請求項1~5のいずれか一項に記載のヒト以外のモデル動物。請求項1~6に記載の培養細胞又はヒト以外のモデル動物の製造方法であって、TDMRの一部又は全体を含む領域の塩基配列に相当する塩基配列からなるRNA、又は、TDMRの近傍領域を含む領域の塩基配列に相当する塩基配列からなるRNAの発現を負に制御することによって、ゲノムDNAにおける特定領域にDNAメチル化異常が特異的に導入することからなる、前記方法。RNA干渉RNAiによりRNAの発現が負に制御されている、請求項7記載の方法。短鎖ヘアピンRNAshRNAの転写により生じる短鎖干渉性RNAsiRNAの作用によりRNAiが行われる、請求項8記載の方法。請求項1~6に記載の培養細胞又はヒト以外のモデル動物の製造方法であって、TDMRの一部又は全体を含む領域の塩基配列に相当する塩基配列からなるRNA、又は、TDMRの近傍領域を含む領域の塩基配列に相当する塩基配列からなるRNAに対する短鎖干渉性RNAsiRNAを生じるshRNAの発現用ビークルにより培養細胞又はヒト以外の動物を形質転換することからなる、前記方法。請求項1~6に記載の培養細胞若しくはモデル動物、又は、請求項7~10記載の方法で作製された培養細胞若しくはモデル動物を利用する、エピジェネティック機構に関連する疾患又は異常に有効な医薬品のスクリーニング方法。しかし疾患エピゲノムデータベースを基にして得た、ゲノム領域を標的とした医薬品の開発において、患者組織を採取してその組織のDNAメチル化状況を調べることは、患者にとって多大なる負担を強いることになる。故に、適切なモデル細胞又はモデル動物が必要となる。しかしながら、従来の変異遺伝子導入トランスジェニックにより作成されたモデル動物や、遺伝子欠損ノックアウトにより作成されたモデル動物ではこのようなゲノムワイドエピゲノムアソシエーションスタディに適したものではない。本発明は上記の課題を解決することを目的とし、特定の領域、特に、疾患発症原因遺伝子又は発症に関連するエピジェネティック異常を起こす領域に、人為的にエピジェネティックなメチル化異常を誘発できるモデル培養細胞又は病態モデル動物の作製法等を提供する。本発明者は、上記課題を解決すべく、正常な発生に必要な遺伝子であるSall4遺伝子の転写制御域をモデルとして鋭意検討を行い、エピジェネティック異常を起こす領域に、人為的にエピジェネティックなメチル化異常を誘発させることによって、発生異常を誘発するモデル動物を産出することに成功した。即ち、本発明は以下に示す各態様に係るものである。1ゲノムDNAの特定領域にDNAメチル化異常を特異的に導入することにより、人為的にエピジェネティック異常を誘発させることができる培養細胞又はヒト以外のモデル動物。2エピジェネティック機構に関連する疾患又は異常を人為的に誘発させることができる病態モデル動物である、態様1記載のヒト以外のモデル動物。3DNAメチル化異常がDNAメチル化又は脱メチル化の阻害である、態様1又は2記載の培養細胞又はヒト以外のモデル動物。4特定領域が疾患の発症原因遺伝子若しくは発症に関連するエピジェネティック異常を起こす領域、又は、それらの候補領域である、態様1~3のいずれか一項に記載の培養細胞又はヒト以外のモデル動物。5特定領域がTDMRである、態様1~4のいずれか一項に記載の培養細胞又はヒト以外のモデル動物。6トランスジェニック動物である、態様1~5のいずれか一項に記載のヒト以外のモデル動物。7態様1~6に記載の培養細胞又はヒト以外のモデル動物の製造方法であって、TDMRの一部又は全体を含む領域の塩基配列に相当する塩基配列からなるRNA、又は、TDMRの近傍領域を含む領域の塩基配列に相当する塩基配列からなるRNAの発現を負に制御することによって、ゲノムDNAにおける特定領域にDNAメチル化異常が特異的に導入することからなる、前記方法。8RNA干渉RNAiによりRNAの発現が負に制御されている、態様7記載の方法。9短鎖ヘアピンRNAshRNAの転写により生じる短鎖干渉性RNAsiRNAの作用によりRNAiが行われる、態様8記載の方法。10態様1~6に記載の培養細胞又はヒト以外のモデル動物の製造方法であって、TDMRの一部又は全体を含む領域の塩基配列に相当する塩基配列からなるRNA、又は、TDMRの近傍領域を含む領域の塩基配列に相当する塩基配列からなるRNAに対する短鎖干渉性RNAsiRNAを生じるshRNAの発現用ビークルにより培養細胞又はヒト以外の動物を形質転換することからなる、前記方法。11態様1~6に記載の培養細胞若しくはモデル動物、又は、態様7~10記載の方法で作製された培養細胞若しくはモデル動物を利用する、エピジェネティック機構に関連する疾患又は異常に有効な医薬品のスクリーニング方法。本願発明方法により人為的に作製されたモデル動物等は、DNAのメチル化プロフィールが改変されていることによって、後天的かつ不可逆的に、エピジェネティック異常によりエピジェネティック機構に関連する疾患を人為的に誘発することができる。その結果、本発明方法で作成した病態モデル動物等は、そのDNAメチル化状況を元に戻すことにより根本的な治療モデルとして用いることができる。更に、本発明のモデル動物等はエピジェネティック異常を改善したり、元の正常なエピジェネティック状態を維持することを目的とした、エピジェネティック機構に関連する疾患又は異常に有効な医薬品のスクリーニング開発等に利用することが可能となる。本発明は、ゲノムDNAにおける特定領域にDNAメチル化異常が特異的に導入することにより、人為的にエピジェネティック異常を誘発させることができる培養細胞又はヒト以外のモデル動物以下、モデル動物等ともいう、及び、それらの製造方法等に係る。ここで、DNAメチル化異常とは、正常型又は野生型のゲノムDNAにおけるメチル化状態状況とは異なるメチル化状態にあることを意味し、例えば、正常型又は野生型のゲノムDNAにおいて脱メチル化されている部位がメチル化された状態又は該脱メチル化を阻害される状況を意味する。又、エピジェネティック異常とは、DNAのメチル化とヒストンのメチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、スモリル化等の主に染色体の構成成分に起こる修飾等のエピジェネティック機構に関して、正常型とは異なる状態を意味する。メチル化の対象となるシトシンとしては、例えば、CpG配列、CpApG配列、CpTpG配列、及びCpNpG配列NはA,T,C又はGに含まれるシトシン等が挙げられる。特定領域にDNAメチル化異常が導入されたか否かは、当業者に公知の任意の方法、例えば、bisulfitesequencingバイサルファイトシーケンシング、COBRACombinedbisulfiterestrictionanalysis法、MS-PCR法、サザンブロッティング法などによって確認することが可能である。さらに目的以外の部位の変化を調べる方法としては、マイクロアレイを用いたゲノムワイドDNAメチル化解析法、例えばD-REAM法、HELP法、MIAMI法、さらに次世代シーケンサーを用いたバイサルファイトシーケンシングなどによりDNAメチル化プロフィール解析を行うことにより確認できる。古典的な方法としてはRLGS法RestrictionLandmarkGenomicScanning法も有効である。例えば、RLGS法においては、細胞からゲノムDNAを抽出し、メチル化感受性制限酵素例えば、NotI、BssHII、SalI等で切断してDNA断片を作製し、標識物質例えば32Pで末端を標識した後、一次元電気泳動でDNA断片を分離する。さらに電気泳動後のDNA断片をメチル化感受性制限酵素とは異なる他の制限酵素で消化し、二次元電気泳動にかけ、オートラジオグラフィー等によりスポットを解析する。そして、細胞特有のスポットのパターンから、標的メチル化領域が脱メチル化されたか否かを確認する。この方法によれば、ゲノムDNAの数千箇所に渡る領域のメチル化状況及び脱メチル化状況を一度に解析することができる。本発明のモデル動物等は、エピジェネティック機構に関連する疾患又は異常を人為的に誘発させることができるので、病態モデル動物として利用できる。ここで、エピジェネティック機構に関連する疾患又は異常とは、エピジェネティック機構における何らかの異常に関連して発症すると考えられる各種の疾患、又は、組織、器官及び/又は、発生停止及び発生異常等の個体レベルでの各種の異常を意味する。本発明のモデル動物等においては、ゲノムDNAにおける或る特定領域においてDNAメチル化異常が特異的に導入されること、即ち、他の領域におけるDNAメチル化状態には実質的に影響を与えないDNAメチル化状況に実質的に変化を起さないことを特徴とする。更に、人為的にエピジェネティック異常を誘発することができる出来る限り、該モデル動物において目的とするゲノムDNAの特定領域において完全にDNAメチル化異常が導入されていない例えば、一部の細胞又は或る部位においてはDNAメチル化異常が起こらない等のDNAメチル化異常の程度が一定ではない、及び、新たに部位にメチル化が起こる等場合も本発明の範囲に含まれる。ここで、培養細胞とは、生物個体から分離された状態で培養されている細胞を意味し、分離状態、又は任意の集合状態を取り得る。又、培養とは一般的に生体外インビトロ培養を意味し、組織構築から解放した細胞の水準で行う細胞培養、組織の水準で行う組織培養、器官の構築を保持したままで行う器官培養等が含まれる。培養に使用する培地としては、例えば、RPMI1640培地、EagleのMEM培地、DMEM培地、HamF12培地、HamF12K培地又はこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を使用することができ、培養条件は、通常5CO2存在下、37°Cである。該培養細胞が由来する生物種は特に限定されるものではなく、動物、植物、微生物等のいずれであってもよいが、動物であることが好ましく、哺乳動物であることがさらに好ましい。哺乳動物としては、例えば、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、モルモット等が挙げられる。本発明において、生細胞の種類は特に限定されるものではなく、例えば、体細胞、生殖細胞、幹細胞、又はこれらの培養細胞等が挙げられる。体細胞の具体例としては、脳、脊髄等の神経系組織;網膜細胞、嗅細胞等の感覚器;食道、胃、小腸、大腸等の消化器;肺、気管支等の呼吸器;精巣、卵巣、子宮、胎盤等の生殖器;腎臓、膀胱等の泌尿器;骨髄細胞、血球細胞等の造血器;骨格筋、平滑筋、心筋等の筋組織;骨芽細胞、破骨細胞等の骨組織;皮膚、毛根細胞等の皮膚組織等の各種組織器官から分離された生細胞又はその培養細胞等が挙げられ、生殖細胞の具体例としては、卵、精子又はその培養細胞等が挙げられ、幹細胞の具体例としては、各種方法で作製された人工幹細胞iPS細胞、胚性幹細胞ES細胞、胚性生殖細胞EG細胞、栄養膜幹細胞TS細胞、骨髄幹細胞、神経幹細胞等が挙げられる。又、本発明のモデル動物の種に特に制限はなく、例えば、マウス及びモルモットのような齧歯類に属する当業者に公知の実験動物を挙げることが出来る。本発明のモデル動物等において、DNAメチル化異常が導入されるゲノムDNAにおける特定領域としては、例えば、疾患の発症原因遺伝子若しくは発症に関連するエピジェネティック異常を起こす領域としてこれまでに当業者に知られている任意の領域、又は、それらの候補領域を挙げることが出来る。更に、特定領域として、組織特異的発現が厳密に規定されている遺伝子において組織細胞特異的にメチル化される領域TDMRを挙げることが出来る。TDMRは疾患の発症原因遺伝子若しくは発症に関連するエピジェネティック異常を起こす領域である場合もある。本発明のモデル動物等は当業者に公知の任意の方法、例えば、ES細胞、iPS細胞、初期胚等を用いて行われる発生工学的な手法、遺伝子ターゲッティング及び遺伝子ノックイン等の遺伝子工学的手法、生体に薬剤を投与する、ウイルスベクターやDNAベクターDNA発現ビークルを投与する方法などこれまで実験動物を用いて行われてきた様々な手法を適当に組み合わせて作製することが可能である。本発明のモデル動物等を作製する際に使用する細胞は、正常なゲノム構成を持つ細胞であることが好ましく、また継続的に利用可能な細胞が好ましい。その点でiPS細胞、及びそれらを人為的に分化されることによって得られる分化細胞はモデル動物作成の原材料として好ましい。本発明のモデル動物等の作製に際して、ゲノムDNAにおける特定領域にDNAメチル化異常を特異的に導入するための好適な一例として、コード領域の転写方向とは逆向きの非コードRNAASncRNAである、TDMRの一部又は全体を含む領域の塩基配列に相当する塩基配列からなるRNA、又は、TDMRの近傍領域を含む領域の塩基配列に相当する塩基配列からなるRNAの発現を負に制御する方法を挙げることができる。本発明者らの特許文献4に記載の発明において、このような非コードRNAは、標的メチル化領域の脱メチル化を行うために使用されている。尚、かかる標的メチル化領域の塩基長は特に限定されないが、通常、1~10,000塩基長、好ましくは、100~2,000塩基長である。更に、このような脱メチル化に関連する非コードRNAの存在は、RNAを網羅的に解析するトランスクリプトーム解析結果からも得られておりGenomeResearch20031313241334、多くの転写開始点の転写制御に関与することが示唆され、同様の方法でゲノム上に存在する多数のTDMRにメチル化異常を特異的に導入することが可能である。このような非コードRNA標的RNAの発現を負に制御する具体例な方法として、アンチセンス分子RNA、リボザイム及びRNA干渉を生起させる各種RNA分子等の当業者に公知の任意の機能性RNA分子を作用させることによって、標的RNAの活性を阻害すること、及び標的RNAを切断分解すること等を挙げることが出来る。例えば、RNA干渉RNAiにより標的である上記の非コードRNAを切断分解し、その機能を有効に抑制することもできる。このサイレンシングは2本鎖RNAdsRNAが細胞に入ると、RNaseIII様酵素であるダイサーにより開裂され、3’末端に2個のヌクレオチドオーバーハングを含む21~23bpの2本鎖の短鎖干渉性RNAとなるsiRNA。ATP依存段階において、siRNAはsiRNAを標的RNA配列に案内するRNAi誘導サイレンシング複合体RISCと通称されるマルチサブユニット蛋白質複合体に組込まれ、所定点でsiRNA2本鎖は巻き戻され、アンチセンス鎖はRISCに結合したままであり、エンドヌクレアーゼとエキソヌクレアーゼの組み合わせにより相補的mRNA配列の分解を誘導すると考えられている。siRNAは例えば、化学合成又はPCR等によってインビトロ合成したものでもよいし、60~90bp程度の短鎖ヘアピンRNAshRNAが細胞の内側でプロセシングされてsiRNAとなったものでもよい。このような合成siRNAは、標的RNAの配列に基づき一般にアルゴリズムと従来のDNA/RNA合成手段により容易に調製することが出来る。siRNAは短鎖ヘアピンRNAshRNAの転写により作製するのが一般的である。かかるshRNA発現用のビークル例えば、ベクター又はカセットの作製用キットは市販品として入手可能である。又、アンチセンスRNAはカノニカル又は非カノニカル塩基対合を介して標的RNAと相互作用するように設計される。アンチセンス分子と標的分子の相互作用は例えば、RNAseH介在性RNA-DNAハイブリッド分解により標的分子の破壊を助長するように設計される。あるいは、アンチセンス分子は標的分子で通常行われる機能を妨げるように設計される。アンチセンス分子は標的分子の配列に基づいて設計することができる。標的分子の最も接近し易い領域を見いだすことによりアンチセンス効率を最適化するための多数の公知の方法が存在する。リボザイムは分子内又は分子間の化学反応を触媒することが可能な核酸分子である。従って、リボザイムは触媒核酸である。リボザイムは分子間反応を触媒することが好ましい。天然システムに存在するリボザイムに基づくヌクレアーゼ又は核酸ポリメラーゼ型反応を触媒する多数の異なる型のリボザイムがあり、RNA分子を基質として認識してこれと結合した後に開裂することができる。この認識は主にカノニカル又は非カノニカル塩基対相互作用に基づくことが多い。このような各種の機能性RNA分子を発現させるためのビークル例えば、発現ベクター又は発現カセットは当業者に公知の任意の方法で調製することが出来る。発現ベクター又はカセット等の種類は、作用させる細胞内において自立複製が可能であるか、又は、該細胞のゲノムに組み込まれて機能するものであれば特に限定されるものではなく、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター等を使用することができる。プラスミドベクターとしては、例えば、大腸菌由来のプラスミド例えば、pRSET、pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19、枯草菌由来のプラスミド例えば、pUB110、pTP5、酵母由来のプラスミド例えば、YEp13、YEp24、YCp50が挙げられ、ファージベクターとしては、例えば、λファージ例えば、Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAPが挙げられ、ウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルス、ワクシニアウイルス等の動物ウイルス、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスが挙げられる。尚、発現ベクターに任意の制限酵素部位が含むことが出来、該発現ベクターに制限酵素を作用させ該制限酵素部位で切断することによって、機能性RNA分子を含むカセットを容易に作製することが出来る。このような発現用ビークルには、機能性RNA分子のコード領域に加えて、その種類に応じて、該RNAを発現させるために必要となる様々な調節要素を適宜含むことが出来る。例えば、プロモーター、転写サイレンサーのコード領域、制限酵素部位、薬剤耐性遺伝子、複製開始部位、転写調節領域、転写終始配列、ゲノム組換え配列、導入発現確認用マーカー遺伝子等を挙げることが出来る。該発現用ビークルに含まれるプロモーターの種類は、対象となる細胞中で機能し得る限り特に限定されるものではない。対象となる生細胞が動物細胞である場合、プロモーターとしては、例えば、Rαプロモーター、SV40プロモーター、LTRLongTerminalRepeatプロモーター、CMVプロモーター、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター、CAGプロモーター、各種の等を使用することができる。モデル動物等において、所望の時期又は任意の段階で、ゲノムDNAにおける特定領域にDNAメチル化異常を特異的に導入して人為的にエピジェネティック異常を誘発させ、ひいては、エピジェネティック機構に関連する疾患又は異常を人為的に誘発させるために、テトラサイクリン誘導RNAiシステム等のテトラサイクリン、ミフェプリストン及びエクソジン等の各種薬剤添加による転写誘導をかけることができるプロモーターを使用することが好ましい。更に、Crelox系に基づく機構によって、所望の時期に機能性RNA分子の発現を誘導することも可能である。このような系は当該技術分野における公知技術に基づき当業者には容易に構築することが出来る。機能性RNA分子を有する上記の発現用ビークルにより培養細胞又はヒト以外の動物を形質転換することによって、エピジェネティック機構に関連する疾患又は異常を人為的に誘発することができる本発明の培養細胞又はヒト以外のモデル動物、例えば、トランスジェニック動物を作製することが出来る。尚、細胞への該発現用ビークルの導入方法は、対象となる生細胞へDNAを導入し得る限り特に限定されるものではなく、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法等を使用することができる。更に、このようにして作製した形質転換細胞の細胞核は、クローン動物非ヒトクローン動物を作製する際に、除核した未受精卵に移植する細胞核として有用である。細胞核を提供する生細胞としては、通常、初期胚割球、初期胚由来培養細胞、胚性幹細胞、体細胞等が用いられる。他の細胞核を移植した卵を培養し、移植可能胚へ発生したものを仮親の子宮内に移植することにより、クローン動物を作製することができる。更に、本発明もモデル動物等の製造方法におけるゲノムDNAにおける特定領域におけるDNAメチル化異常の特異的な導入は、当業者に公知の任意の他の手段を用いて行うことも出来る。例えば、既に引用した特許文献等に記載された当業者に公知の方法によって、薬剤処理をした細胞または組織とコントロール群のDNAメチル化プロフィールを特許文献ゲノムワイドに解析することにより、特定の細胞の特定の遺伝子領域を標的とした薬剤をスクリーニングすることができる。このような薬剤処理エピゲノムアソシエーションスタディによって得られるデータベースをケミカルエピゲノムデータベースと呼ぶ。その結果、特定の細胞組織に対して、DNAメチル化変動の標的領域が分かっている薬剤を用いてゲノムDNAにおける特定領域にDNAメチル化異常を特異的に導入することが出来る。DNAのメチル化は、直接的には3種類存在するDNAメチル化転移酵素DNMTによって付加維持されるが、ヒストン修飾によってもDNAメチル化状況は変化する。従って、上記のケミカルエピゲノムデータベース作成手順に従い、標的細胞組織における作用部位を決定することによって、酵素、酵素阻害剤などを用いてゲノムDNAにおける特定領域におけるDNAメチル化異常を特異的に導入することが出来る。更に、例えば、事前に特定の細胞、組織での標的領域が判明している場合には、DNMT1の強い酵素活性阻害効果を持つ5’azacitidineを阻害剤として使用してゲノムDNAにおける特定領域におけるDNAメチル化異常を特異的に導入することが出来る。同様に、ヒストンメチル基転移酵素G9aの欠損で遺伝子領域特異的な脱メチル化が誘発可能である事実GenestoCells12111と考え合わせると、ヒストン修飾酵素に対する阻害剤を用いても、事前に組織、細胞での標的領域が分かっている場合は本発明方法においてDNAメチル化異常を特異的に導入することが出来る。本発明のモデル動物等を利用することによって、医薬品、特に、エピジェネティック機構に関連する疾患又は異常に有効な医薬品をスクリーニングすることが出来る。スクリーニング自体は当業者に公知の任意の方法で行うことが出来る。例えば、エピジェネティック機構に関連する疾患又は異常を人為的に誘発したモデル動物に候補化合物を適当な方法で投与し、このような疾患又は異常に変化があるか否か、又は、軽減されるか等をそれらに応じた臨床的所見又は各種の生理学的パラメーターに基づき測定検出することによって、このような医薬品をスクリ-ニングすることが出来る。又、培養細胞を使用する場合には、例えば、エピジェネティック機構に関連する疾患又は異常を人為的に誘発した培養細胞の培養系に適当な濃度の候補化合物を添加し、該細胞と該化合物とを作用させ、その後、該培養細胞における外疾患又は異常と関連する各種の特性等の変化を測定することによってスクリ-ニングすることが出来る。以下に実施例を参照して本発明を具体的に説明するが、これらは単に本発明の説明のために提供されているものである。従って、これらの実施例は、本願で開示する発明の範囲を限定し、又は制限するものではない。本発明では、特許請求の範囲の請求項に記載された技術的思想に基づく様々な実施形態が可能であることは当業者には容易に理解される。尚、実施例において用いた方法手段などに関して特に記載のない場合には、当該技術分野における標準的な方法で実施した。トランスジェニックTgマウス作製のプロトコール[コンストラクトの詳細]図1に示したpSingletTSshRNAVectorを以下の要領で作製した。即ち、標的Sall4アンチセンスRNAと相補的な配列配列番号1又は配列番号2を有し、二重鎖形成部位の反対鎖配列番号3又は配列番号4にはセンスRNAの分解を防ぐように下線の部分に変異を導入したshRNAを転写することが出来るオリゴヌクレオチド図2をデザインした。アンチセンスRNAと相補的な配列:5’GCCTTTGTCACATGTAGGGCC3’配列番号1又は5’TTTGTCACATGTAGGGCC3’配列番号2;反対鎖:5’GGTCCTATATGTGACGAAGGC3’配列番号3又は5’GGTCCTATATGTGACGAA3’配列番号4。上記配列が転写される二本鎖オリゴヌクレオチドの両端を平滑化し、pSingletTSshRNAVectorのクローニングサイトに存在するXhoI、HindIII部位を制限酵素消化後に平滑化した後にオリゴヌクレオチドを導入し、ドキシサイクリンDox誘導条件下でSall4アンチセンスRNAを特異的に分解するshRNAを発現するコンストラクトを作成した。こうして作製したpSingletTSshRNAVectorの全塩基配列を配列番号5で示す。pSingletTSshRNAに導入したshRNA発現用オリゴヌクレオチドの配列を以下のshRNAオリゴヌクレオチド配列確認用シークエンシングプライマー:SeqR:5’GAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCT3’配列番号6を用いたシークエンシングにより解析し、正しい配列が導入されていることを確認した。pSingletTSshRNAVectorは、恒常的にtTSタンパクを発現し、shRNAの発現を抑えているが、Doxの添加によりtTSによる不活性化が解除され、標的RNAであるSall4アンチセンスRNAを特異的に分解するshRNAを発現する図3。Sall4アンチセンスRNAを特異的に分解するDox誘導性shRNA発現ベクターを組み込んだマウスES細胞MS12細胞株、京都大学末盛博文博士より分与された。KawaseEetalIntJDevBiol38p3853901994を3cmディッシュに2x105細胞を播種し、210μgmlDoxを添加することで、標的のASncRNA量が約4050減少し、それに伴ってSall4mRNA量および細胞の増殖率も低下した図4。標的Sall4アンチセンスRNAと相補的な配列5’GCCTTTGTCACATGTAGGGCC3’または5’TTTGTCACATGTAGGGCC3’を持つshRNAによりアンチセンスRNAを分解したES細胞において、アンチセンスRNAとオーバーラップするSall4遺伝子プロモーター領域のDNAが新たにメチル化された図5。以上より、デザインした2種類のshRNAいずれにおいても、Sall4アンチセンスRNAを分解するshRNAおよび、作成したコンストラクトの有効性が示された。[インジェクション用DNAの準備]Sall4アンチセンスRNA分解用shRNAを模式的に示し図6A、配列番号1及び配列番号3の組み合わせ、上記コンストラクト内のアンピシリン耐性遺伝子のPvuI消化によりコンストラクトを直鎖化し、本発明の発現カセットを調製した図6B。その後、08アガロースゲル電気泳動し、ゲルよりコンストラクトDNAを回収してMagExtractorで精製し、Tg用DNA溶液TrisHClpH7510mMEDTA025mMに溶解した。この際、DNAを5ngμlの濃度に調製した。[Microinjection~founder獲得~founder離乳]11600にC57BL6J♀4週令マウスチャールスリバーへPMSセロトロピンAsuka製薬50IU腹腔内投与した。248時間後、hCG50IU腹腔内投与し、個々にC57BL6J♂8週令~1年マウスチャールスリバーと交配させた。3翌日、午前中に卵管膨大部を摘出し、微量のヒアルロニダーゼ入りM2培地Sigmaを利用して受精卵を採卵し、ホールガラス内にて受精卵より卵丘細胞を取り除いた。4キャピラリーを用いて、ホールガラスより受精卵を回収し、M16培地Dropにて3回ほど洗浄を行った。5洗浄後、受精卵はM16培地DropにてMicroinjectionまで37°Cインキュベーター内にて静置した。61900より、実体顕微鏡Leica下で2つの前核を有する受精卵を選抜した。7MicroinjectorLeicaのセットアップを行い、培地が充填された保持針eppendorfをMicroinjectorへ装着した。さらに、P97micropipettepullerにて注射針を作成注射針作成設定:heatsetto730pullsetto0velocitysetto30timesetto250heatsetto730pullsetto80velocitysetto60andtimesetto200し、針先へ注入用DNAを3μl充填した。8チャンバースライド内に10μldropを作成し、ミネラルオイルで重層した。920個の受精卵をチャンバースライドへ移した。10受精卵が入ったチャンバースライドをMicroinjectorへ装着した。1140倍の視野にて、受精卵および保持針、注射針の位置を合わせた。12400倍の視野にて、注射針の先端を保持針へこすることで注射針の先端を折った。13400倍の視野にて、保持針で受精卵を保持し、保持針のつまみを上下させることで受精卵の前核および注射針の先端のピントを合わせた。14Micromanipulator5171のコントロールレバーを左に倒すことで、注射針を受精卵の前核へ挿入した。15FemtoJetのマウスをクリックしてDNAを前核へ注入した。この時、前核が膨張したことを目視確認した。16Micromanipulator5171のコントロールレバーを右に倒すことで、受精卵より注射針を静かに抜いた。1740倍の視野にて、DNAを打ち終えた受精卵を視野の下部位置に一時静置させた。1820個の受精卵へのインジェクションを終えた後、キャピラリーで受精卵を回収し、M16培地Dropで37°Cインキュベーター内にて一晩培養した。19翌日、2細胞期胚に発生した受精卵を05日目の偽妊娠マウスICRSLCの卵管采へ1匹あたり20個の2細胞期胚を移植した。20移植日を0日目とした場合、19日目にfounderを帝王切開にて摘出し、蘇生させた。21蘇生後、仮親の仔数匹と取り替えることで、仮親にfounderを育てさせた。22帝王切開後20~27日目に仔を離乳し、耳パンチ法にてNumberingおよびgenotyping用に5mmほどtailcutを施した。結果、約300個の受精卵へMicroinjectionし、271個が2細胞期胚へ発生し、すべてを移植した。その後、51匹のfounder候補マウスを得た。[Genotyping]1tailへプロテイナーゼK入りLysisbufferを400μl加え、37°Cで一晩静置した。2PCI抽出を3回行った後、エタノール沈殿によりゲノムDNAを精製した。3TrisEDTA50μlにゲノムDNAを溶解させた。4PCRによりコンストラクト内のネオマイシン耐性遺伝子、U6プロモーター、ColE1の検出を行った。さらに、BamHIでゲノムDNAを消化し、ネオマイシン耐性遺伝子内部に設定したプローブを用いてサザンブロッティングを行った。その結果、51匹のfounder候補マウスの内、founderマウスは8匹であった図7。ネオマイシン耐性遺伝子検出用PCRの設定:96°C5min30cycles4°CNeo1F:5’TGCTCCTGCCGAGAAAGTAT3’配列番号7Neo1R:5’AATATCACGGGTAGCCAACG3’配列番号8PCRproductssize364bpU6プロモーター検出用PCRの設定:96°C5min30cycles4°CU6F15’AGAGAACGATGTCGAGTTTACTCCCT3’配列番号9U6R15’GACCGTACACGCCTACCTCGACA3’配列番号10PCRProductssize211bpColE1検出用PCRの設定:96°C5min30cycles4°CColE1F15’GCCGCGTTGCTGGCGTTTTT3’配列番号11ColE1R15’GGGTTCGTGCACACAGCCCA3’配列番号12PCRProducts282bp[生殖系列移行確認]ファウンダーFounderマウスと野生型C57BL6Jとの交配によりF1を作製し、F1のgenotypeにてfounderの生殖系列移行確認を行った。なお、genotypingはPCRおよびサザンブロッティングによりネオマイシン耐性遺伝子を検出した。その結果、8匹のFounderの内7匹にgermlinetransmissionが確認され、そのうち5匹について以降の解析に用いた図8。Tgマウスのファウンダーマウスの雄と野生型の雌を交配し、交配日から妊娠した母マウスにDoxを飲水より摂取させることでSall4アンチセンスRNAを分解するshRNAの発現を誘導した。胎生75日目に胎仔を回収し、PCRでのネオマイシンNeo耐性遺伝子の検出によるGenotypingを行うと共に、実体顕微鏡下での明視野の観察図9A、およびパラフィン包埋した切片をヘマトキシリンエオジン染色により観察した図9B。その結果、Tg写真右側では、胎生75日目ですでに胎仔が小さく図9A、形態形成も正しく行われていない図9Bことが明らかになった。胎生105日目図9Cでは、Tgはすでに発生が停止していることが観察された。"