"患者における癌を治療するための方法であって、治療上有効量の式Iの化合物およびHER3を標的とする治療上有効量の機能性核酸を、前記患者に共投与することを含む、方法。患者における癌を治療するための方法であって、治療上有効量の式Iの化合物ならびに治療上有効量のHER2および/またはHER3阻害物質を、前記患者に共投与することを含む、方法。前記式Iの化合物は、表1に具体的に列挙される化合物である、請求項1および2のいずれか1項に記載の方法。前記式Iの化合物は、化合物Aである、請求項1、2、および3のいずれか1項に記載の方法。前記HER2および/またはHER3阻害物質は、ラパチニブ、機能性核酸、抗HER2抗体、または抗HER3抗体である、請求項1、2、3、および4のいずれか1項に記載の方法。前記機能性核酸は、siRNA分子、shRNA分子、miRNA分子、またはアンチセンス核酸分子である、請求項1、2、3、4、および5のいずれか1項に記載の方法。前記siRNAは、18~30個のヌクレオチドを有するポリヌクレオチドを含み、HER2および/またはHER3mRNAに結合するように作動可能である、請求項1、2、3、4、5、および6のいずれか1項に記載の方法。前記mRNAは、配列番号1に提供されるヌクレオチド配列を含む、請求項7に記載の方法。前記siRNAは、配列番号3、4、6、7、または8のポリヌクレオチド配列を含む、請求項7に記載の方法。前記siRNAは、裸であるか、連結されているか、あるいは、封入されている、請求項6に記載の方法。前記アンチセンス核酸は、HER2および/またはHER3ポリペプチドをコードする、2本鎖cDNA分子に相補的であるか、またはmRNA配列に相補的である、請求項6に記載の方法。前記2本鎖cDNA分子は、配列番号2のアミノ酸配列を有するHER2ポリペプチド、またはその断片もしくはその変異体をコードするように作動可能である、請求項11に記載の方法。HER2ポリペプチドをコードする前記mRNA配列は、配列番号1のポリヌクレオチド配列またはその断片もしくはその変異体を有する、請求項11に記載の方法。前記機能性核酸は、組換えベクターにおいて被検体に投与され、前記ベクターは、腫瘍中または腫瘍の部位の近くで前記機能性核酸を発現し、前記腫瘍中のHER2および/またはHER3の発現および/または活性を阻害するように作動可能である、請求項5、6、7、8、9、10、11、12、および13のいずれか1項に記載の方法。前記抗HER2抗体は、トラスツズマブ、ペルツズマブ、4D5、520C9、452F2、736G9、741F8、758G5、761B10、huMAb4D5-1、huMAb4D5-2、huMAb4D5-3、huMAb4D5-4、huMAb4D5-5、huMAb4D5-6、huMAb4D5-7、4D5-8、またはそれらの組み合わせを含む、請求項5に記載の方法。前記抗HER2抗体は、トラスツズマブである、請求項15に記載の方法。HER3阻害物質が投与され、前記HER3阻害物質が抗HER3抗体である、請求項2に記載の方法。前記抗HER3抗体は、配列番号9を含む重鎖可変領域CDR1、配列番号10を含む重鎖可変領域CDR2、配列番号11を含む重鎖可変領域CDR3、配列番号12を含む軽鎖可変領域CDR1、配列番号13を含む軽鎖可変領域CDR2、および配列番号14を含む軽鎖可変領域CDR3を含む、請求項17に記載の方法。前記抗HER3抗体は、配列番号15を含む重鎖可変領域および配列番号16を含む軽鎖可変領域を含む、請求項17に記載の方法。前記抗HER3抗体は、MM-121である、請求項17に記載の方法。前記抗HER3抗体は、MM-121であり、前記式Iの化合物は、化合物Aである、請求項17に記載の方法。治療上有効量の式Iの化合物ならびに治療上有効量のHER2および/またはHER3阻害物質を前記患者に共投与することは、前記式Iの化合物を前記HER2および/またはHER3阻害物質と同時に、あるいは前記HER2および/またはHER3阻害物質を投与する前あるいは後に投与することを含む、請求項1に記載の方法。前記患者に投与される前記式Iの化合物の量は、1日当たり約0.01~約1,000mgの式Iの化合物を投与することを含む、請求項22に記載の方法。投与される前記式Iの化合物の量は、1日につき体重1キログラム当たり約0.01~約100mgの範囲の式Iの化合物の量を投与することを含む、請求項22に記載の方法。前記HER2および/またはHER3阻害物質を投与することは、1日につき体重1キログラム当たり約0.001~約100mgの前記HER2および/またはHER3阻害物質を投与することを含む、請求項22に記載の方法。前記癌は、心臓:肉腫血管肉腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、粘液腫、横紋筋腫、線維腫、脂肪腫、および奇形腫;肺:気管支原性癌扁平上皮細胞、未分化小細胞、未分化大細胞、腺癌、肺胞細気管支癌、気管支腺腫、肉腫、リンパ腫、軟骨性過誤腫chondromatoushanlartoma、中皮腫inesothelioma;乳:非浸潤性乳管癌、浸潤性乳管癌、髄様癌、浸潤性小葉腺癌、管状癌、粘液癌、炎症性乳癌;胃腸:食道扁平上皮癌、腺癌、平滑筋肉腫、リンパ腫、胃癌腫、リンパ腫、平滑筋肉腫、膵臓膵管腺癌、インスリノーマ、グルカゴノーマ、ガストリノーマ、カルチノイド腫瘍、ビポーマ、小腸腺癌、リンパ腫、カルチノイド腫瘍、カポジ肉腫、平滑筋腫、血管腫、脂肪腫、神経線維腫、線維腫、大腸腺癌、管状腺腫、絨毛腺腫、過誤腫、平滑筋腫;尿生殖路:腎臓腺癌、ウィルムス腫瘍[腎芽細胞腫]、リンパ腫、白血病、膀胱および尿道扁平上皮癌、移行上皮癌、腺癌、前立腺腺癌、肉腫、精巣セミノーマ、奇形腫、胚性癌腫、奇形癌腫、絨毛癌、肉腫、間質細胞癌腫、線維腫、線維腺腫、類腺腫瘍、脂肪腫;肝臓:肝癌肝細胞癌、胆管癌、肝芽腫、血管肉腫、肝細胞腺腫、血管腫;骨:骨原性肉腫骨肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性リンパ腫細網細胞肉腫、多発性骨髄腫、悪性巨細胞腫瘍脊索腫、骨軟骨腫osteochronfroma骨軟骨性外骨症、良性軟骨腫、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液線維腫、類骨骨腫、および巨細胞腫瘍;神経系:頭蓋骨腫、血管腫、肉芽腫、黄色腫、変形性骨炎、髄膜髄膜腫、髄膜肉腫、神経膠腫症、脳星状細胞腫、髄芽細胞腫、神経膠腫、上衣腫、胚細胞腫[松果体腫]、多形膠芽腫、乏突起神経膠腫、シュワン細胞腫、網膜芽細胞腫、先天性腫瘍、脊髄神経線維腫、髄膜腫、神経膠腫、肉腫;婦人科:子宮子宮内膜癌、子宮頚部子宮頚癌、前腫瘍性子宮頚部異形成、卵巣卵巣癌[漿液性嚢胞腺癌、粘液嚢胞腺癌、未分類癌腫]、顆粒膜-莢膜細胞腫瘍、セルトリライディッヒ細胞腫瘍、未分化胚細胞腫、悪性奇形腫、外陰部扁平上皮癌、上皮内癌、腺癌、線維肉腫、黒色腫、膣明細胞癌、扁平上皮癌、ブドウ状肉腫胚性横紋筋肉腫]、卵管癌腫;血液系:血液骨髄性白血病[急性および慢性]、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫[悪性リンパ腫];皮膚:悪性黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮癌、カポジ肉腫、黒子異形成母斑、脂肪腫、血管腫、皮膚線維腫、ケロイド、乾癬;副腎:神経芽細胞腫を含む、請求項1~25のいずれか1項に記載の方法。前記癌は、乳癌、結腸癌、直腸癌、子宮体癌、胃癌胃腸カルチノイド腫瘍および消化管間質腫瘍を含む、膠芽腫、肝細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌NSCLC、黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、膵臓癌、前立腺癌腫、急性骨髄性白血病AML、慢性骨髄性白血病CML、非ホジキンリンパ腫、および甲状腺癌である、請求項26に記載の方法。前記癌は、HER2過剰発現癌である、請求項26に記載の方法。前記HER2過剰発現癌は、HER2過剰発現乳癌である、請求項28に記載の方法。前記癌は、HER2非過剰発現癌を含む、請求項26に記載の方法。前記癌は、非HER2増幅腫瘍を含む、請求項26に記載の方法。治療上有効量の化合物Aが、治療上有効量のMM-121と共投与される、請求項30または31に記載の方法。前記組み合わせは、前記癌の治療における治療的相乗効果を示す、請求項32に記載の方法。前記組み合わせは、少なくとも2.8、少なくとも2.9、または少なくとも3.0のlog10細胞死滅を達成する、請求項33に記載の方法。前記癌は、肺癌である、請求項30~34のいずれかに記載の方法。生物学的実施例実施例1乳癌細胞中のPI3K阻害を補償するキナーゼの特定本研究の目的は、ヒト乳癌細胞中のPI3K阻害を補償するキナーゼおよびキナーゼ調節性シグナル伝達経路を特定することである。この目的のために、特異的キナーゼの下方調節が、HCC1937ヒト乳癌細胞の、式Iのおよび表1の化合物であるPI3K阻害物質化合物Aに対する感受性を増加させるかどうかを決定するために、779個のヒトキナーゼを標的とするsiRNAスクリーニングを用いる。化合物Aは、PI3Kのp110α触媒サブユニットを39nMの体外IC50で阻害するATP模倣体である。HCC1937細胞は、PI3K経路の負の調節因子であるPTENを欠き、増殖は化合物Aによって10μMのIC50で阻害される。siRNAライブラリでのリバーストランスフェクションに続いて、細胞をDMSOまたは10μM化合物Aのいずれかにより、2.5ウシ胎児血清を含有する培地中で72時間処置し図1Aおよび2、アラマーブルーアッセイを使用して、細胞生存率を測定する図1B。並行して、PI3Kの阻害時にどのキナーゼおよび経路が上方調節されるかを決定するために、遺伝子発現を、マイクロアレイ、ホスホ受容体チロシンキナーゼRTKアレイ、およびホスホ細胞内キナーゼアレイを使用して図3および4、RNA、またはHCC1937細胞からのライセート±化合物Aを使用して行う。化合物A処置は、8~48時間以内で、多くのRTKおよび細胞内キナーゼの増加された発現および/またはリン酸化をもたらす。化合物Aでの8時間および24時間の処置は、S473およびT308の両方でホスホ-Aktを抑制したが、48時間で、S473におけるリン酸化が部分的に復元する。これらのアプローチから、化合物Aによって上方調節される複数のキナーゼおよび経路が特定されるが、それはsiRNAによって下方調節されるとき、化合物Aに対する感受性を増加させた。これらには、HER3、MSPR、およびAxl等の複数のRTK、ならびに複数のMAP3K/MEKK等のMAPキナーゼシグナル伝達経路の成員が含まれる。ウエスタンブロッティングにより、化合物A処置が、S473およびT308でホスホAktを減少させ、ホスホHER3および総体HER3を増加させることが確認される。化合物Aはまた、MAPキナーゼERK、JNK、およびp38MAPKのリン酸化を増加させる。HCC1937細胞を、10μM化合物Aで、2.5FBSを含有する培地中、0、2、8、または24時間処置した。RNAをトリゾールで単離し、RNeasyカラムQiagenを使用して精製した。3つの独立した実験からの遺伝子発現を、Genetitan3’マイクロアレイを使用して測定した。図5に示されるように、p<0.05、p<0.01対0時間。化合物AおよびHER3siRNAでの組み合わせ処置は、HCC1937細胞増殖を、単独の各介入よりも大幅に阻害し図5、それはホスホHER3の上方調節が、PI3Kの薬理学的阻害の結果としての増殖阻害を補償することを示唆する。これらの結果により、PI3K阻害物質と共にこれらのキナーゼまたは経路を阻害する化合物を組み合わせることにより、PI3K阻害物質の抗腫瘍活性が改善され得ることが示唆される。結果は、表2および3に更に要約される。表2HCC1937細胞生存率に必須のキナーゼ表3化合物Aでの処置時に上方調節またはリン酸化された候補キナーゼ実施例2PI3K阻害物質で処置した細胞中の、HER3ErbB3媒介型補償のsiRNA阻害PI3K阻害物質化合物Aの抗腫瘍効果を、PI3K/Akt経路の突然変異性活性化PIK3CA突然変異、PTEN喪失、および/またはHER2遺伝子増幅の結果としてを有するヒト乳癌細胞のパネルにおいて検査する。阻害物質を24時間毎に添加した、化合物A処置されたBT-474細胞での時間経過は、6時間時点で始まり、72時間まで増加するHER3RNAおよびタンパク質の時間依存性上方調節を示す図7。部位特異的抗体は、HER3の6つのp85結合部位のうちの2つである、Y1197およびY1289におけるHER3リン酸化を示す。P-HER3の回復は、T308およびS473P-Aktの回復に一時的に相関し図7、それはPI3Kが外来性阻害物質によって遮断されるとき、細胞がPI3K上流の機構を上方調節することを示唆する。HER3RNAおよびタンパク質の上方調節ならびにP-HER3およびP-Aktの部分的維持は、HER3およびPI3Kの組み合わされた阻害が、腫瘍細胞生存率を相乗的に阻害する場合があることを示唆する。HER3siRNAでのトランスフェクションは、BT-474細胞を化合物Aに対して感作した図6Aおよび図6B。同様の結果が、SKBR-3およびMDA-453細胞で得られる。双方の細胞株は、HER2遺伝子増幅を示す。MDA-453細胞はまた、PIK3CAおよびPTEN突然変異対立遺伝子におけるH1047Rエクソン20突然変異を有する。双方の細胞株において、P-Akt、P-S6、および増殖の阻害は、化合物Aで処置し、またHER3siRNAでトランスフェクトしたとき、単独の各介入と比較して細胞中で強化される。BT-474細胞図7においてと同様に、P-Erkは、化合物Aで処置した細胞中で上方調節され、この上方調節は、SKBR-3においてHER3siRNAのトランスフェクション時に減衰するが、MDA-453細胞においては減衰しない図8。図7および8に示される結果は、PI3K/Aktの阻害活性がHER3の転写を抑制することを示唆する。これらの転写機構に加えて、PI3Kの化合物A媒介型阻害時のP-HER3の回復は、HER3をトランス活性化する上流チロシンキナーゼの関与が、今度は、PIP3レベルを部分的に維持することを示唆する。HER3のこの代償性リン酸化は、PI3K/Aktを部分的に維持し、PI3Kアンタゴニストの完全な作用に対向する。実施例3PI3K阻害物質で処置した細胞中の、HER3ErbB3媒介型補償の抗体阻害の体外評価抗HER3Abが、PI3K阻害物質で処置されたヒト乳癌細胞中のHER3のフィードバック上方調節を遅延または撤廃することを確証するために、HER2の過剰発現を有するまたは有さないヒト乳癌細胞を化合物A±MM-121等の飽和濃度の抗HER3Abで処置する。実験のエンドポイントは次の通りである:1p85のHER3との会合、23D-マトリゲル中の増殖、3軟寒天中のコロニー形成、4無血清条件および懸濁液中の両方におけるアポトーシスアッセイアノイキスを誘導するため、5創傷閉鎖およびトランスウェルアッセイにおける運動性、6体外PI3K反応に供したHAプルダウンにおけるPI3K活性、ならびに7免疫ブロットによる総体HER3およびP-HER3、P-Akt、P-Erk、P-S6、P-4EBP-1。実施例4PI3K阻害物質で処置した細胞中の、HER3ErbB3媒介型補償の抗体阻害の体内評価胸腺欠損マウスにおける異種移植片を、既知の方法に従って確立する。一旦、腫瘍が容積≧250mm3に到達すると、これらを次の4つの処置群に無作為化する:1対照IgG130mg/kg×2/週、腹腔内、2化合物A経口胃強制飼養を介して100mg/kg/日、3MM-12130mg/kg×2/週、腹腔内、および4化合物AとMM-121等の抗HER3AbMerrimackPharmaceuticals,Cambridge,MA,USA。処置を最大5週間送達し、その後、腫瘍増殖を監視する。1週間および5週間の処置後、ならびに治療の中止に続いて、研究エンドポイントを査定する。1週間の処置後、幾つかの腫瘍を採取し、ホルマリン中に固定するか、または液体N2中に急速冷凍する。この時点を使用して、腫瘍反応の早期の分子前兆を特定することができる。mm3単位の腫瘍容積を次の式によって算出する:容積=幅2×長さ/2。腫瘍が完全に排除されるマウスを、最大1年間追跡し、腫瘍再発について段階的に評価することになる。≧3mm3の測定値を示す再発腫瘍を、陽性としてスコア化し、収集することになる。生化学および分子分析。ホルマリン固定、バラフィン包埋腫瘍切片を、腫瘍悪性度の査定のためにHEで染色する。腫瘍切片をIHCに供して、総体HER3、Y1289、Y1197、およびY1222P-HER3、T308P-Akt、S473P-Akt、ならびにP-Erk抗体を、確立された方法を使用して検出する。加えて、腫瘍ライセートの免疫ブロットを、同じ抗体で行うことができる。免疫沈降、続いて免疫ブロット分析を使用して、異種移植片中のp85のHER3との会合時の抗HER3Abの影響を決定することができる。HER3転写レベルを、HER3mRNAレベルにおける何らかの増加を確認するために、瞬間冷凍腫瘍アリコートからのRNAを使用して測定する。実施例5細胞株および阻害物質全ての細胞株は、AmericanTypeCultureCollectionから購入した。培地およびウシ胎児血清FBSは、InvitrogenCarlsbad,CA,USAから購入した。次の増殖培地を使用した:HCC1937、HCC1954:RPMI-1640/10FBS;BT474について:IMEM/10FBS;SKBR3:McCoy’s5A/15FBS;UACC893:DMEM/10FBS;MDA453:DMEM/F121:1/20FBS;およびSUM190:DMEM/F121:1/5FBS。全ての細胞を加湿5CO2インキュベーター中、37°Cで増殖させた。次の試薬を使用した:ラパチニブGW-572016、LCLaboratories、トラスツズマブGenentech,SanFrancisco,CA,USA、LY294002Calbiochem、アロステリックAKT1/2阻害物質5J8、ラパマイシンLCLaboratories、および式Iの化合物である化合物AExelixis,Inc.。実施例6細胞増殖およびクリスタルバイオレットアッセイ細胞を、12ウェルプレート中に、2.5FBS±阻害物質を含有する培地中、2.5~3.5×104細胞/ウェルの密度で播種した。培地および阻害物質を3日毎に交換した。図に示される日に、細胞をトリプシン処理し、ベックマンコールターカウンター中で計数した。クリスタルバイオレットアッセイのために、5×104細胞/ウェルを、6ウェルプレート中に播種し、化合物Aの不在または存在下で6日間増殖させ、メタノール中に固定し、クリスタルバイオレットで染色し、OlympusDP10カメラを使用して撮影した。実施例7細胞周期分析細胞を、100mmの皿中、2.5FBS±化合物Aを含有する培地中にプレートした。3日後、剥離細胞および接着細胞の両方をプールし、固定し、APO-BrdUキットPhoenixFlowSystemsを使用してヨウ化プロピジウムで標識した。標識化された細胞を、BectonDickinsonFACScalibur系を使用して分析した。実施例8細胞質および核分画細胞質および核抽出物を、ActiveMotifからの核抽出物キットを使用して調製した。簡潔に述べると、細胞を100mmの皿中にプレートし、阻害物質により示される濃度で3~4時間処置し、氷冷PBS/ホスファターゼ阻害物質で洗浄し、低張緩衝液中に溶解させ、14,000rpmで30秒間、4°Cで遠心分離して、上清細胞質抽出物を収集した。ペレット核分画を完全溶解緩衝液中に再懸濁させ、14,000rpmで10分間、4°Cで遠心分離して、上清核分画を収集した。実施例9癌細胞中のホスファチジルイノシトール-3キナーゼPI3Kシグナル伝達ホスファチジルイノシトール-3キナーゼPI3Kは、細胞増殖、代謝、サイズ、運動性、および生存率を調節するリガンド誘導性受容体チロシンキナーゼRTKからのシグナルを、細胞内分子へと伝達する。多数のPI3Kファミリーが、高等真核生物中に存在する。これまで、主にクラスIAPI3Kが癌に関連付けられている。クラスIAPI3Kは、調節性p85およびp110触媒サブユニットからなるヘテロ二量体である。PI3Kは、p85のN-SH2ドメインを関与させる、YXXMモチーフを含有するリン酸化アダプターまたは受容体によって活性化される。この結合は、p85によるp110の阻害を軽減し、p85-p110二量体を形質膜におけるホスファチジルイノシトール-4,5-ビスリン酸塩PIP2に集める。PI3Kは、PIP2をリン酸化させて、第2のメッセンジャーホスファチジルイノシトール-3,4,5-トリスリン酸塩PIP3を産生する。この経路の負の調節は、PIP3脂質ホスファターゼPTEN染色体10におけるホスファターゼおよびテンシン相同体によって媒介される。AKTおよびPDK1を含む、プレクストリン相同性PHドメイン含有タンパク質のサブセットは、形質膜においてPIP3に結合する。mTOR/RictorTORC2を伴う、PDK1によるT308における、および複合体によるS473におけるAKTのリン酸化は、この酵素の完全な活性化をもたらす。AKTは、生存率および細胞周期進入を促進するために、GSK3α、GSK3β、FoxO転写因子、MDM2、BAD、およびp27KIP1を含む、細胞タンパク質の宿主をリン酸化する。加えて、AKTは、Ras相同体RhebのためのGTPase活性化タンパク質GAPであるツベリンをリン酸化および不活性化する。ツベリンの不活性化は、GTP結合-Rhebが、mTOR/RaptorTORC1複合体を蓄積および活性化することを可能にし、それは最終的にタンパク質合成および細胞増殖を調節する。豊富な証拠により、PI3K/AKTは、ほぼ間違いなく、ヒト癌において最も一般的に変化させられるシグナル伝達経路ことが示される。第1に、p110αをコードする遺伝子であるPIK3CAにおける機能獲得型突然変異は、多数のヒト腫瘍において高頻度で存在する。第2に、ホスファターゼPTENは、突然変異、遺伝子欠失、マイクロRNAによる標的化、およびプロモーターメチル化によって頻繁に不活性化される腫瘍抑制遺伝子である。更に、PI3Kは、それ自体が突然変異性活性化および/または遺伝子増幅の標的である、突然変異体RasおよびBcr-Abl、HER2ErbB2、MET、KIT等の多くのチロシンキナーゼのような発癌遺伝子によって強力に活性化される。卵巣癌、膵臓癌、乳癌、および胃癌において、PI3K経路はまた、Akt1またはAkt2遺伝子増幅によって活性化される。形質膜における構造的局在性および活性化をもたらす、AKT1E17KのPHドメインにおける形質転換突然変異は、僅かな割合の乳癌、結腸直腸癌、および卵巣癌において検出されている。合わせて、これらは、PI3K/AKT経路における分子変化を有する腫瘍の幅広いレパートリーが、特異的阻害物質により治療的に標的化可能であることを示す。複数のPI3K経路アンタゴニストが開発されており、それらは最近の概説の主題である。これらの化合物のうちの幾つかは、p110のキナーゼドメインのATP結合ポケットにおいて、競合的および可逆的に結合するATP模倣体であり、また、この酵素の発癌性突然変異型に対して活性である。本実施例は、Exelixis,Incからの化合物Aの効果を、HER2遺伝子増幅、PIK3CAp110α活性化突然変異、および/またはPTENの喪失等のPI3K依存性を示す分子変化を有する、ヒト乳癌細胞株のパネルに対して検査した。化合物Aは、第I相臨床開発を完了したばかりの、39nMのp110αに対するIC50を有するATP競合可逆的PI3K阻害物質である。HER2過剰発現ヒト乳癌細胞株のパネルにおいて、化合物Aでの処置は、PI3K/AKT経路の2つの主要なエフェクターである、AKTおよびS6のリン酸化を撤廃した。この阻害はまた、HER3および他のRTKの、発現およびリン酸化の両方の誘導にも関連した。これらのRTKのmRNA発現における増加は、AKTによって負の調節を受ける、フォークヘッド転写因子FoxO3aおよびFoxO1による転写に依存した。HER2細胞中で、上方調節されたHER3共受容体のリン酸化は、HER2チロシンキナーゼによって維持されたが、それが今度は、pAKTの部分的回復をもたらし、故に、PI3K阻害物質の抗腫瘍作用を限定する。HER3のsiRNAによるノックダウン、またはHER2阻害物質トラスツズマブもしくはラパチニブでの同時処置は、体外および体内の両方で、HER2乳癌細胞を化合物Aに対して感作した。更に、PI3K/AKTシグナル伝達を最大限に無能にするために、HER2/HER3を標的とする療法が、HER2依存性細胞中のPI3K阻害物質に追加されるべきである。実施例10癌細胞中の相乗効果本実施例は、構造的PI3K活性化を有するヒト乳癌細胞株に対する、ホスファチジルイノシトールphosphatidilinositol-3キナーゼPI3Kの阻害物質、すなわち化合物Aの、細胞および分子効果への洞察を提供している。化合物Aでの処置は、細胞増殖、ならびにPI3K/AKT/TOR経路におけるシグナルトランスデューサである、pAKTおよびpS6のレベルの用量依存性阻害をもたらした。HER2過剰発現細胞中で、PI3Kの阻害と同時に、HER3を含む多数のRTKの発現およびリン酸化の上方調節が存在した。FoxO1およびFoxO3aタンパク質のノックダウンは、PI3Kの阻害時にHER3、InsR、IGF-IR、およびFGFR-2mRNAの誘導を抑制した。HER2細胞中で、HER3のsiRNAによるノックダウンまたはHER2阻害物質トラスツズマブもしくはラパチニブでの共処置は、pAKTおよびpS6の、化合物A誘導型細胞死および化合物A媒介型阻害を強化した。トラスツズマブおよびラパチニブは各々、pAKTの阻害および確立されたBT474異種移植片の増殖について、化合物Aと協同した。これらのデータは、PI3KアンタゴニストがAKTを阻害し、RTK発現およびそれらの活性の抑制を軽減するであろうことを示唆する。このフィードバックの軽減は、その経路の持続的阻害を限定し、これらの薬剤に対する反応を減弱する。HER2乳癌を有する患者において、PI3K阻害物質は、HER2-HER3アンタゴニストと組み合わせて使用されるべきである。実施例113次元3D増殖細胞を、8ウェルのチャンバスライド中、増殖因子低減マトリゲルBDBiosciences,SanJoseCA,USA±化合物A中に、公開された方法に従って播種した。新鮮な培地および薬物を3日毎に補充した。コロニーを、倒立光学顕微鏡により、10倍の接眼レンズの倍率で、本明細書の図に列挙される日に撮影した。実施例12免疫沈降、免疫ブロット法、および受容体チロシンキナーゼRTKアレイ免疫沈降、免疫ブロット法、およびRTKアッセイを公開された方法に従って行った。第一抗体には、AKT、pAKTS473、pAKTT308、ERK、pERKT202/Y204、pHER2Y1248、pHER3Y1197、pHER3Y1222、pHER3Y1289、S6、pS6S240/244、p27、pRbS780、FoxO1、FoxO3a、MEK1/2CellSignalingTechnology,Danvers,MA,USA、p85、4G10pTyrMillipore,Billerica,MA,USA、HER3、CyclinD1、RhoA、HDAC3SantaCruzBiotechnology,SantaCruz,CA,USA、PARPBDTransductionLaboratories、β-アクチンSigma,St.Louis,MO,USA、およびHER2Neomarkers,divisionofThermoScientific,Freemenot,CA,USAが含まれた。種特異的西洋ワサビペルオキシダーゼ共役第二抗体は、PromegaMadisonWI,USAからのものであった。免疫反応性シグナルを強化化学発光法Pierce,Rockford,IL,USAによって検出した。ホスホ-RTKアレイは、RDSystemsMinneapolis,MN,USAからのものであり、総細胞ライセートを使用して、製造業者の指示に従ってアレイとハイブリッド形成した。実施例13RNA干渉ミスマッチ対照およびヒトHER3に対するsiRNA二重鎖は、以前に記載されWang,S.E.,etal.2008Mol.Cell.Biol.28:5605-5620、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、HumanFoxO1およびFoxO3a-specificSilencer登録商標SelectsiRNA二重鎖は、AmbionAppliedBiosystems,Austin,TX,USAFoxO1センス鎖、配列番号19:CCAUGGACAACAACAGUAAtt;FoxO3aセンス鎖、配列番号20:GCCUUGUCGAAUUCUGUCAttから購入した。ヒトIGF-IRおよびInsRsiRNA二重鎖は、QiagenValencia,CA,USAIGF-IRセンス鎖、配列番号21:GGAGAAUAAUCCAGUCCUAtt;InsRセンス鎖、配列番号22:GAACGAUGUUGGACUCAUAttから得た。トランスフェクションをLipofectamineRNAiMAXInvitrogen,Carlsbad,CA,USAにより行った。実施例14異種移植片実験動物実験は、VanderbiltUniversityMedicalCenterVUMCのInstitutionalAnimalCareCommitteeによって承認された。マウスを、公認のVUMCのAnimalCareFacility中に収容した。17β-エストラジオールペレットInnovativeResearchofAmericaを、各6週~7週齢の胸腺欠損メスマウスHarlanSpragueDawley,Inc.へ、腫瘍細胞注射の前日に皮下注射s.c.した。マトリゲルBDBiosciencesと1:1で混合したBT474細胞3×106を各マウスの右脇腹中に皮下注射した。腫瘍直径を、カリパスで週2回測定し、mm3単位の容積を次の式により算出した:容積=幅2×長さ/2。一旦、腫瘍が≧200mm3に到達すると、処置を、次のものを用いて、単独または組み合わせのいずれかで開始した:トラスツズマブ30mg/kg腹腔内に週2回、ラパチニブ100mg/kg経口胃強制飼養を介して毎日、化合物A100mg/kg経口胃強制飼養を介して毎日。28日間の処置後、マウスを安楽死させた。実施例15免疫組織学全ての腫瘍試料最後の処置の1時間以内に収集を10中性緩衝ホルマリン中に室温で24時間固定し、続いて脱水およびバラフィン包埋を行った。免疫染色を5μm組織切片に対して行った。キシレンおよび段階的アルコール中での脱パラフィン後、熱誘導型抗原取り込みをpH6.0クエン酸塩緩衝液中で行い、続いて3過酸化水素で20分間、タンパク質ブロックDakoで10分間、および最後に第一抗体で一晩、4°Cでインキュベーションを行った。EnvisionVisualizationSystemDako,Carpinteria,CA,USA、続いてクロマジェンとしてDABを使用し、ヘマトキシリンで対比染色した。腫瘍切片を光学顕微鏡上で、400倍の接眼レンズの倍率で研究した。腫瘍細胞染色の平均百分率および強度をヒストスコアHスコアとして算出した参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Goulding,H.,etal.1995,Hum.Pathol.26:291-294に記載されるように。切片をスコア化する専門の病理学者MGKは、処置タイプに対して盲検化された。実施例16PI3Kの阻害は、HER3およびpHER3の誘導に関連する調節不全PI3K活性を有する乳癌細胞株のパネルを、漸増用量の化合物Aにより、2次元および3次元2Dおよび3D増殖条件下で処置した。別途定めのない限り、全ての実験を2.5FBS含有培地中で行った。化合物Aでの処置は、図9Aに示されるように、全ての細胞株の2D増殖を用量依存性様態で阻害した。≦6μMの同様のIC50を、図9Bに示されるように3Dで試験した細胞中で観察し、それは本実験において選択された細胞株の全てが、PI3K経路における分子変化を有するという事実と一貫していた。処置の開始時の細胞の最初の量をベースラインとして使用した増殖曲線の分析は、およそ6μMのIC50で、化合物Aの主要な効果が細胞増殖の阻害であることを示した。しかしながら、20μMで、化合物Aは、図10Aに示されるように、ベースラインを下回る細胞数の低減によって示されるように細胞死を誘導した。これは更に、図10Bに示されるように、化合物Aで24時間処置した細胞からのライセート中の細胞死およびG1-S細胞周期移行のバイオマーカーの免疫ブロット分析によって確認された。全ての細胞株中で、化合物Aでの処置は、pAKTS473によって測定したとき、PI3Kシグナル伝達の用量依存性阻害をもたらした。20μMを下回る濃度での細胞増殖の阻害と一貫して、化合物Aは、サイクリンD1およびpRBにおける低減ならびにCDK阻害物質p27KIP1のレベルの増加を誘導したが、細胞死のバイオマーカーである総計または開裂PARPのレベルは変化しなかった図10Bを参照されたい。PI3KおよびTORシグナル伝達経路における分子のより包括的なパネルに対する化合物Aの効果を検査するために、実験を行った。全ての細胞株中で、化合物Aでの処置は、pAKTS473/T308およびpS6S240/244における用量依存性低減をもたらした。驚くべきことに、6/7細胞株中で、化合物Aはまた、24時間で、総体HER3および/またはpHER3Y1289レベルの上方調節を引き起こした。5/6HER2過剰発現細胞株中で、総体HER2および/またはpHER2Y1248はまた、PI3Kの阻害時に、中程度に上方調節されたが、その結果を図11に例証する。実施例17HER3の化合物A誘導型上方調節は、FoxO媒介型転写に依存する化合物Aの不在および存在下でのHER3タンパク質の半減期を、タンパク質合成の阻害物質であるシクロヘキシミドを使用して決定した。HER3の崩壊率は、BT474細胞の化合物Aでの処置時に有意に変化しなかったデータ図示されず。次に、HER3mRNAのレベルを、qPCRによってPI3Kの阻害時に、時間経過にわたって、化合物AのおよそのIC506μMを使用して検査した。BT474、SKBR3、およびMDA453細胞は、図12Aおよび12Cに示されるように、6時間で極大であったと思われる、HER3mRNAにおける増加を示し、それは、p110α阻害物質の添加後最大48時間維持された。他のPI3K経路阻害物質は、同様の効果を誘導した:図12Bに示されるように、mTOR阻害物質ラパマイシンではなく、AKT1/2のアロステリック阻害物質である5J8、およびPI3K阻害物質LY294002がまた、HER3mRNAレベルを上方調節した。HER3転写の上方調節の機構を描出するために、フォークヘッド転写因子のFoxOファミリーを検査したが、それはAKTが、リン酸化によってこれらの分子の細胞下の局在性調節し、それによって、それらが核へ転座することを防止し、転写を調節するためである。FoxOファミリーは、標的遺伝子のプロモーターにおけるコンセンサス配列TTGTTTACを通じてモノマーとして結合する、3つの成員、FoxO1、FoxO3a、およびFoxO4それぞれFKHR、FKHR-L1、およびAFXとしても知られるからなる。AKT活性の不在下で、FoxOは、優勢的に核であると考えられ、したがって転写を活性化することができる。更に、PROMOデータベースFarre,D.,etal.,2003,NucleicAcidsRes.31:3651-3653、およびMesseguer,X.,etal.,2002,Bioinformatics18:333-334を使用して、HER3ERBB3プロモーター転写開始部位の最大5000bp上流における多数の推定FoxO結合部位を特定した。第1に、PI3KおよびAKTの、それぞれ化合物Aおよび5J8での阻害に続く、FoxOタンパク質の細胞内分布を決定した。FoxO4はほぼ検出不可能であり、故に、FoxO1およびFoxO3aに集中した。化合物Aおよび5J8での処置は、図12Dに実証されるように、BT474およびMDA453細胞の核における双方のFoxO因子の蓄積をもたらし、時にサイトゾルのベースラインレベルにおける低減を伴った。FoxOが、PI3K/AKTの阻害の後のHER3転写の増加に関与するかどうかを決定するために、細胞を、FoxO1およびFoxO3aに特異的なsiRNA二重鎖または対照siRNAでトランスフェクトし、HER3mRNAのレベルをqPCRによって検査した。siRNAは、図12Fに示されるように、全ての3つの細胞株中の双方のFoxOmRNAのレベルを70~80低減した。最後に、FoxO1およびFoxO3の同時ノックダウンは、BT474、SKBR3、およびMDA453細胞中のHER3mRNAにおける化合物A誘導型増加を撤廃した図12Eを参照されたい。実施例18HER3に対する代償性フィードバックのノックダウンは、PI3K阻害物質に対して感作する6μM化合物Aで0~72時間で処置したBT474細胞の詳細な時間経過分析は、総体HER3、Y1197およびY1289においてリン酸化されたHER3、2つのPI3K結合部位、ならびにそのPDK1部位およびそのTORC2部位S473においてリン酸化されたAKTT308の時間依存性上方調節を示した。総体およびpHER3における増加と一致して、pAKT、およびpS6レベルもまた、図13Aに示されるように、薬物処置の6時間内に回復し、PI3K/AKT/mTORシグナル伝達の部分的復活を暗示した。pHER3は、アダプタータンパク質Shcを通じたその相互作用を介して細胞外シグナル調節キナーゼERK/MAPKを活性化することが知られるが、HER3のフィードバック再活性化時のpERKの回復は、図13Aに示されるように一貫しては検出されなかった。pAKTの回復はより低かったが、総体HER3およびpHER3のフィードバック上方調節は、図13Bに例証されるように、上記の20μMの薬理学的用量でより顕著であり、PI3Kの阻害がHER3のフィードバック活性化を引き起こすことを更に示唆した。これらのデータにより、PI3Kの、p110αのATP模倣体での阻害時に、細胞は、PIP3の幾らかのレベルを維持するためにHER3リン酸化を部分的に回復させ、それが今度は、PI3K/AKT経路に対する化合物Aの総阻害性効果に対向またはそれを限定することが示唆される。HER2過剰発現細胞中で、いかなる特定の理論にも拘束されるものではないが、PI3Kの活性化の主要な機構は、pHER3の、PI3Kの調節サブユニットであるp85のN末端におけるSH2ドメインとのカップリングであると考えられる。これらの細胞中で、p85抗体で沈殿させた主要なチロシンリン酸化タンパク質は、pHER3であり、HER3とp85PI3Kとの間のこの会合は、それがHER2チロシンキナーゼ阻害物質TKIによって妨害されるため、HER2の触媒活性に依存する。上記の会合を所与として、PI3Kの阻害時に、かつpHER3の回復と一貫して、HER3とp85との間の会合の維持または回復が存在するかどうかを検査した。BT474細胞を化合物Aの漸増濃度で処置し、続いてp85抗体でのプルダウン、ならびにその後のpTyrおよびHER3免疫ブロット分析を行った。化合物Aでの処置後に、図13Cに示されるように、矢印でマークされる、およそ200kDaの主要なpTyrバンド、ならびに他のより小さいかつより少量のpTyrタンパク質の用量依存性増加が存在した。以前の研究と一貫して、p85関連のおよそ200kDaのバンドもまた、図13Dおよび13Fに示されるように、HER3およびpHER3Y1197抗体により検出した。HER3のsiRNAでのノックダウンは、図13Eおよび13Fに示されるように、化合物A処置細胞からのライセートのp85プルダウンにおけるHER3およびpHER3Y1197バンドを排除し、HER3をasp85関連のおよそ200kDapTyrバンドとして更に確認した。PI3Kの阻害時の、総体HER3の代償性の上方調節ならびにpHER3およびpAKTの部分的維持は、PI3KおよびHER3の組み合わされた阻害が、腫瘍細胞増殖および/または生存率を相乗的に阻害するであろうことを示唆した。したがって、我々は、BT474細胞を対照またはHER3siRNA二重鎖のいずれかでトランスフェクトし、それらを化合物Aで処置し、細胞増殖およびアポトーシスを測定した。単層での細胞増殖は、図13Gおよび13Hに示されるように、HER3ノックダウンおよび化合物Aの組み合わせによって、いずれかの単独の介入と比較して有意に低減された。相乗アポトーシス促進性効果と一貫して、組み合わせのみが、図14Aおよび14Bに示されるように、サブG1期DNA分画分解DNAにおけるより高い割合の細胞、ならびにPARP開裂を誘導し、それは両方とも細胞死のバイオマーカーであった。同様の結果を、図15Bおよび15Dに示される、単層中にプレートしたMDA453およびSKBR3細胞で得た。これらの細胞株の両方において、HER3ノックダウンおよび化合物Aの組み合わせは、T308およびS473pAKTならびにpS6を、各処置単独よりも有効に阻害した図15Aおよび15Cを参照されたい。実施例19HER3リン酸化の回復は、HER2に依存し、HER2阻害物質によって限定されるHER2遺伝子増幅を有する乳癌HER2過剰発現乳癌細胞中で、HER2受容体は、HER3をリン酸化する主要なチロシンキナーゼであり、それが今度は、PI3Kに直接に結合し、それを活性化する。化合物Aは、HER2の触媒活性または自己リン酸化に影響を及ぼさないため例えば、図11を参照されたい、HER2過剰発現細胞中で、HER2がチロシンキナーゼとして留まり、PI3Kの阻害時にHER3のリン酸化を維持および/または増加させると憶測することは道理にかなっている。したがって、HER2抗体トラスツズマブまたはHER2可逆的チロシンキナーゼ阻害物質ラパチニブと組み合わせた化合物Aの効果を、細胞増殖およびHER3リン酸化に関して検査した。BT474細胞中で、これらの組み合わせのうちのいずれかは、図16Aおよび16Bに示されるように、化合物AまたはHER2阻害物質の単独よりも、細胞増殖を阻害する際に有意により有効であった。図16に示されるように、Lapは、ラパチニブであり、Trasは、トラスツズマブである。この結果と一貫して、PARP開裂は、図16Cに示される、単一の阻害物質で処置した細胞中ではなく、組み合わせで処置した細胞中のみで観察した。同様の結果を、図17A~17Dに示される、2つの他のHER2過剰発現株であるMDA453およびSKBR3細胞で得た。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、細胞増殖に対する化合物Aのラパチニブまたはトラスツズマブと組み合わせた相乗作用は、HER3mRNA転写の阻害ではなくpHER3の回復における低減に起因すると考えられる。化合物Aとラパチニブもしくは化合物Aとトラスツズマブ、または各阻害物質単独で処置したBT474細胞から単離したRNAにおけるHER3についての定量PCRqPCRを使用して、実験を行った。トラスツズマブ単独での処置は、図16Dに示されるように、HER3mRNAレベルにおいて増加しなかったが、化合物Aとの組み合わせにおいて、PI3K阻害物質によって誘導されるHER3mRNAの上方調節を強化した。ラパチニブ単独は、HER3mRNAを顕著に誘導し、この作用は、化合物Aにあるように、PI3K阻害、続いてFoxO媒介型転写の抑制の結果である。ラパチニブの効果は、図16Dに示されるように、恐らく、いずれかの薬剤単独と比較して、より著しいPI3K/AKTの阻害の結果として、化合物Aと組み合わせて使用したときより顕著であった。mRNAデータとは対照的に、化合物Aとラパチニブまたは化合物Aとトラスツズマブの組み合わせでの24時間の処置は、図16Eに示されるように、化合物A単独で処置した細胞と比較して、pHER3の回復を減弱したが、それはHER2キナーゼのラパチニブでの阻害、またはリガンド非依存性HER2/HER3二量体のトラスツズマブでの阻害が、HER2のHER3への活性化入力を限定することを示唆する。実施例20HER2およびPI3Kの組み合わされた阻害は、HER2依存性異種移植片に対して相乗的であるPI3Kの組み合わされた阻害およびpHER3のフィードバック回復が、HER2依存性異種移植片に対して相乗的であるかどうかを決定するために、実験を更に行った。故に、トラスツズマブまたはラパチニブの添加が、体内でのBT474異種移植片に対する化合物Aの抗腫瘍効果を強化するかどうかを試験するために、実験を行った。確立したBT474異種移植片を担持する胸腺欠損マウスを、化合物A、ラパチニブ、トラスツズマブ、または化合物Aと各HER2アンタゴニスト/阻害物質での4週間の治療に対して無作為化した。各単剤療法は、腫瘍増殖を有意に遅延させ、このうちトラスツズマブが1/8マウスにおいて完全な腫瘍反応を誘導した唯一の薬剤であった。双方の組み合わせが、単独で与えられた薬物よりも優れていた。ラパチニブと化合物Aの組み合わせは、腫瘍容積を有意に低減した一方で、化合物Aおよびトラスツズマブの組み合わせは、完全な腫瘍退縮誘導した図18A。処置群のいずれにおいても、有意な薬物関連毒性はなかった。免疫組織学IHCを使用して、28日間の処置後の異種移植片中の標的不活性化の薬力学的バイオマーカーを検査するために、実験を行った。処置群のいずれにおいても、IHCによるHER3のレベルは変化しなかった。しかしながら、図16Eに示されるデータと一貫して、図18Bおよび18Cに示されるように、化合物Aは、膜pHER3を低減せず、ラパチニブは、腫瘍含量中のpHER3を低減することにおいてトラスツズマブよりも有効であり、化合物Aとトラスツズマブの組み合わせは、pHER3レベルについて、単独で与えられた各薬物よりも明らかにより阻害性であった。AKTの発癌性作用は、細胞質pAKTS473および核pAKTS473の両方のレベルと相関することが示されている。したがって、異種移植切片中の細胞質コンパートメントおよび核コンパートメントの両方におけるpAKTS473発現の差異を定量化するために、実験を行った。処置群の間の腫瘍増殖における差異と一致して、核pAKTは、化合物Aとラパチニブまたは化合物Aとトラスツズマブで処置した異種移植片中で、各々、単一薬剤阻害物質で処置した腫瘍と比較して、より低かった。全ての3つの薬物のうち、化合物Aは、核pAKTレベルを統計的に阻害した唯一の薬物であった。図18Bおよび18Cに示されるように、pAKTの細胞中質含量における検出可能な変化はなかった。全体的に、これらの結果は、PI3K/AKT経路のシグナル伝達出力を最大限に阻害するために、HER2過剰発現異種移植片中のHER2およびPI3Kの組み合わされた阻害が要求されることを示唆する。図18B、最上行に示されるように、28日間の処置後に観察した総体HER3のレベルは、より短期間のアッセイ後の培養中の細胞中で示される、HER3mRNAおよびタンパク質の上方調節を再生しなかった。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、これは異種移植片の分析の遅れたタイミング28日間の結果であり得ると考えられる。実施例21PI3Kの阻害は、HER3以外のRTKを誘導する図13Cは、BT474細胞中のPI3Kの化合物A媒介型阻害時の、検出可能なレベルのp85関連pTyrタンパク質における増加を示す。本明細書に提供される結果はまた、p85PI3Kと共沈殿する顕著なおよそ200kDapTyrのバンドが、図13D~13Fに示されるように、HER3およびpHER3抗体によって認識され、図13Eおよび図13Fに示されるようにHER3のsiRNAでのノックダウン時に排除されることを実証する。しかしながら、PI3Kが阻害されるときの図13Cに示されるより低いMWpTyrバンドにおける用量依存性増加は、HER3以外のp85関連タンパク質における増加を示唆する。加えて、図19Aに提供される結果は、HER3のsiRNAでのノックダウン時に、p85関連のおよそ200kDaバンドにおける増加が依然として存在することを示し、それはPI3Kを活性に部分的に維持することを目的とした、他の代償性p85関連チロシンキナーゼおよび/またはアダプターの存在の憶測に更につながる。この仮説を試験するために、24時間の時間経過にわたって化合物Aで処置した、2つの異なる濃度高濃度および低濃度のBT474細胞からのライセートを、チロシンキナーゼの42個の異なる受容体RTKに対するプローブを含有するアレイとハイブリッド形成させた。化合物Aでの処置は、図19Bおよび19Cに示されるように、HER3だけでなく、EGFR、ERBB4/HER4、線維芽細胞成長因子受容体FGFR-1、-2、-3、および-4、インスリン受容体InsR、インスリン様成長因子-I受容体IGF-IR、エフリン受容体A1EphA1、内皮細胞特異的受容体チロシンキナーゼ2Tie2、神経栄養性チロシンキナーゼ受容体1型TrkA、Fms様チロシンキナーゼ3受容体Flt3、チロシン-タンパク質キナーゼMerMER、ならびにマクロファージ刺激タンパク質受容体MSPRを含む、多数の他のRTKにおける増加もまたもたらした。EGFR、ERBB4、およびInsR等の、これらのRTKのうちの複数は、およそ200kDaで遊走し、図19Aに示されるように、HER3がノックダウンされた細胞中のp85に関連する持続的な高MWpTyrバンドを説明し得る。これらのRTKの上方調節が転写レベルで生じたかどうかを決定するために、qPCRを行い、分析した。図19Dに示されるように、化合物Aでの処置に続いてBT474細胞中で、ERBB4、IGF-IR、InsR、EphA1、FGFR2、およびFGFR3mRNAにおける増加が存在し、このうちIGF-IRおよびInsRが最も顕著であった。PROMOデータベースを使用して、InsR、IGF-IR、およびFGFR2遺伝子プロモーター転写開始部位の最大5000bp上流における多数の推定FoxO結合部位を特定した。FoxO媒介型調節と一貫して、FoxO1およびFoxO3aのsiRNAでのノックダウンは、図19Eに示されるように、化合物Aで処置したBT474細胞中のIGF-IR、InsR、およびFGFR2mRNAの誘導を限定した。このフィードバックの可能性のある治療上の妥当性を決定するために、これらのRTKの除去が、細胞をPI3K阻害物質に対して感作したかどうかを検査するための実験を行った。この目的のために、HER2過剰発現BT474およびMDA453細胞ならびにPI3K-突然変異体MCF7細胞を、IGF-IRおよびInsRに対するsiRNA二重鎖でトランスフェクトし、続いて化合物Aでの処置を行った。双方のRTKのノックダウンは、図20Aおよび20Bに示されるように、全ての3つの細胞株中で有効であった。いずれかのRTKの除去は、図20C~20Eに示されるように、全ての3つの細胞を、化合物A媒介型増殖阻害に対して感作した。20C-20E.総合すると、これらのデータは、癌細胞が、p85を関与させ、故にPI3Kを活性化することが可能な、多数のRTKまたはアダプターを上方調節するフィードバック機構によって、PI3Kの阻害を限定することを示唆する。今度は、これらの分子は、PI3K/AKTシグナル伝達を部分的にかつ時間をかけて維持し、単独で与えられたPI3K/AKT経路の治療的阻害物質の抗腫瘍効果を限定する。実施例22式Iの化合物ならびにHER2および/またはHER3の阻害物質を用いた癌治療本発明は、特定の機構に限定されない。実際、機構の理解は、本発明を実践するために必要ではない。癌細胞株のパネルにおける小分子化合物AでのPI3K阻害の細胞効果は、PI3K依存性を示唆する。本明細書に提供される例証的な実験では、HER2遺伝子増幅を有する乳癌細胞中のPI3K阻害およびその細胞効果が検査されている。pAKT、pS6、および細胞増殖を撤廃した用量で、PI3Kの化合物Aでの阻害は、時間依存性のHER3発現およびリン酸化のフィードバック上方調節をもたらした。今度は、pHER3は、図11、13、および15に示されるように、p85を関与させ、PI3Kを活性化し、pAKTおよびpS6の部分的回復を誘導した。AKTは、転写因子のFoxOファミリーをリン酸化し、それによってそれらの核転座を防止することが示されている。したがって、AKTの最初の阻害は、図12Dに示されるように、核中のFoxO3aおよびFoxO1タンパク質の蓄積をもたらした。双方のFoxOタンパク質のノックダウンは、PI3K/AKTの化合物Aでの阻害時に、HER3mRNAの誘導を抑制した図12E。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、本明細書に提供される結果が、HER3がPI3K/AKTによって下方調節されることを示唆していると考えられ、それは、HER3活性化リガンドヘレグリンでの処置時にPI3K阻害物質GDC-0941がHER3mRNAの下方調節を遮断した、卵巣癌細胞における最近の観察と一貫している。HER3発現およびリン酸化の上方調節は、PI3K阻害物質の抗腫瘍効果を限定した。これは、図14に示されるように、HER3のsiRNA媒介型ノックダウンが化合物A誘導型細胞死に対して感作し、図15Aおよび15Cに示されるように、pAKTおよびpS6の化合物A媒介型阻害を強化したという事実によって支持される。この結果は、HER2過剰発現細胞に対して特に妥当性を有し、ここでキナーゼ欠損HER3共受容体は、一旦、HER2キナーゼと二量体化され、それによって活性化されると、p85を関与させ、PI3Kを活性化する主要な機構となる。実際、HER2増幅を有する乳癌細胞は、PI3K阻害物質によって誘導されるアポトーシスに特に感受性がある。更に、p85とのHER2/HER3二量体のこの会合は、他の者によって、HER2依存性細胞の生存率に必須であることが見出されており、したがって、PI3Kに対するHER2/HER3の出力の持続的阻害が、HER2阻害物質の抗腫瘍効果に要求される。PI3Kの阻害は、HER2キナーゼに影響を及ぼさなかったため、HER3リン酸化は、維持され、更に増加され、図13D~13Fに示されるように、化合物A処置細胞中でp85と会合して留まった。HER2抗体トラスツズマブまたはHER2TKIラパチニブの添加は、図16Eに示されるように、HER3転写が、阻害物質の組み合わせによって、各阻害物質単独と比較して更に増加されていても例えば、図16Dを参照されたい、化合物Aでの処置時にpHER3の反跳を減弱した。更に、化合物Aの各HER2アンタゴニストとの両方の組み合わせは、図18に示されるように、HER2過剰発現異種移植片中のpHER3およびpAKTレベルを低減すること、ならびにそれらの増殖を阻害することにおいて、各阻害物質単独よりも有効であった。これらのデータは強力に、HER2過剰発現細胞中で、PI3Kが阻害されるとき、HER2キナーゼのラパチニブでの阻害またはリガンド非依存性HER2/HER3二量体のトラスツズマブでの破壊が、上方調節されたHER3共受容体に対するHER2の活性化入力を限定することを示唆する。本明細書に提示されるデータは、mTORのラパマイシンまたはラパログでの阻害が、IRS-1の上方調節を介してインスリンおよびIGF-Iシグナル伝達の抑制を軽減し、それによってPI3K/AKTおよびERKを活性化するという報告を回想させる。更に、TORC1およびPI3Kの二重阻害物質もまた、HER3発現を誘導することが示されている。しかしながら、TORC1阻害物質ラパマイシンは、HER3mRNAに対する化合物AまたはAKT阻害物質5J8の効果を反映しなかった図11B。同様に、TORC1阻害物質RAD001での処置エベロリムスおよびMEK阻害物質CI-1040は、HER3mRNA/タンパク質またはpHER3を上方調節しなかったデータ図示されず。これは、HER3のFoxO媒介型フィードバック上方調節に対するAKT阻害の効果がTORC1によって媒介されないことを示唆する。本明細書に提供される実験的データは、HER2等のPI3K/AKTシグナル伝達に依存するRTKの治療的阻害物質に当てはまる関連を有する。例えば、トラスツズマブは、単独で与えられるとき、図18Bおよび18Cに示されるように、AKTの弱い阻害物質であり、故に、FoxO誘導型HER3転写のAKT媒介型抑制を軽減しない。他方で、pAKTのTKIラパチニブでの迅速かつより強力な阻害は、図16Dに示されるBT474、SKBR3、およびSUM225細胞データ図示されずにおけるHER3発現の強力な上方調節をもたらす。ラパチニブおよび化合物Aの組み合わせは、図16Aならびに図16Aおよび16Cに示されるように体外で、また図18Aに示されるように体内で、相乗的であったが、それはまた、図16Dに示されるようにHER3mRNAを誘導することにおいて最も強力であった。トラスツズマブによるpAKTのより弱い阻害にもかかわらず、化合物Aおよびトラスツズマブの組み合わせは、pAKTおよびBT474異種移植片の増殖を阻害することにおいて、化合物Aおよびラパチニブの組み合わせよりも優れているようであった。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、これらの差異は、1トラスツズマブの、抗体依存性細胞媒介型細胞傷害性ADCCの免疫エフェクターを関与させる能力、および2トラスツズマブの、代償性HER3発現を抑制する相対的な能力欠如によって説明され得ると考えられる。本明細書に提供される実験証拠は、PI3Kの化合物Aでの阻害時の、p85に関連するチロシンリン酸化タンパク質における増加を示唆する。実際、HER3と共遊走するp85関連のおよそ200kDaのP-Tyrバンドは、図19Aに示されるように、HER3がsiRNAでノックダウンされた後に、化合物A処置されたBT474細胞中で依然として検出可能であった。この結果は、PI3Kを活性に部分的に維持することを目的とした、他の代償性p85関連のRTKおよび/またはアダプターの存在を示唆する。RTKアレイおよびsiRNAノックダウン実験を使用して、データは、図19C~19Eに示されるように、PI3K/AKTの化合物Aでの阻害時の、InsR、IGF-IR、およびFGFR2のFoxO依存性上方調節の知見を提供した。複数の細胞株中で、InsRおよびIGF-IRのノックダウンは、図20C~20Eに示されるように、PI3K阻害物質に対して感作した。これらのうちの1つである、MCF-7細胞株は、PIK3CAにおける活性化突然変異を有するが、HER2遺伝子増幅は有さない。興味深いことに、これらの3つのRTKの遺伝子プロモーターは、推定FoxO結合部位を含有するPROMO分析。これらのデータは、PI3K阻害が、様々な腫瘍細胞にわたるRTKの一群の発現およびリン酸化の誘導に関連する可能性があることを暗示する。これらの知見は、複数の臨床的関連を有する。癌細胞中で、PI3K経路の治療的アンタゴニストは、AKTを阻害し、RTK発現およびそれらの活性の抑制を軽減するであろう。このフィードバックの軽減は、その経路の持続的阻害を限定し、これらの薬剤に対する治療反応を減弱する。このフィードバックの軽減は、AKTの阻害の大きさおよび強度に見合い、全てのタイプのPI3K経路アンタゴニストに適用することはできないすなわち、トラスツズマブ対ラパチニブ対化合物A。このフィードバックの軽減がまた、正常な組織においても生じ、かつ/または薬物関連毒性を寛解させるかどうかは、更なる研究を有する。いかなる具体的な理論にも拘束されるものではないが、HER2過剰発現細胞中で、HER3の上方調節発現およびHER3のHER2誘導型リン酸化は、PI3K/AKTの阻害に対向する主要な機構であると考えられる。したがって、PI3K阻害物質は、このサブタイプの乳癌においてHER2アンタゴニストと組み合わせて使用されるべきである。HER2遺伝子増幅を有さない他のPI3K依存性癌においてPI3K/AKT阻害物質と組み合わせるために最も適切な抗癌剤は、この経路の阻害時に活性化される主要な代償性フィードバック機構に依存するであろう。実施例23非HER2増幅腫瘍における化合物AおよびMM-121の組み合わせの評価本研究は、非HER2増幅腫瘍を治療する際の化合物AおよびMM-121の組み合わせの有効性を評価するために設計した。肺癌細胞株A549をこの研究のために選択した。この点に関して、A549細胞は、Bunnetal.,ClinicalCancerResearch,7:3239-32502001に示されるように、高度なHER2レベルを発現しない。肺A549細胞を、標準的な技法を使用して、メスSwissヌードマウスの皮下に埋め込んだ。腫瘍が152.9±94.7mm3の平均容量に到達したとき、A549異種移植片を、4つの組み合わせ条件で、MM-121および化合物Aの2つの投薬を用いて、1群当たり7匹のマウスを使用して処置した。対照群は、無処置のまま残した。化合物Aを、100または30mg/kg/投与で、毎日経口投与によって、32日間連続で投与したD37~D68:Q1D×32。MM-121を、5または30mg/kg/注射で、腹腔内経路によって、3日に1回投与したD37、D40、D43、D46、D49、D52、D55、D58、D61、D64、およびD67;Q3D×11。4つの組み合わせ条件は、次の通りであった:化合物Aを100mg/kg/投与で毎日投与しながら、MM-121を30mg/kgで3日毎に1日1回;化合物Aを100mg/kg/投与で毎日投与しながら、MM-121を5mg/kgで3日毎に1日1回;化合物Aを30mg/kg/投与で毎日投与しながら、MM-121を30mg/kgで3日毎に1日1回;および化合物Aを30mg/kg/投与で毎日投与しながら、MM-121を5mg/kgで3日毎に1日1回。共役体の抗腫瘍活性の評価のために、動物を毎日計量し、腫瘍をカリパスによって週2回測定した。ナディア群の平均期の20体重減少もしくは3回連続した15体重減少群の平均、または薬物死をもたらした投薬を過度に毒性の投薬と見なした。動物体重は、腫瘍重量を含んだ。腫瘍重量を、質量式mg=[長さmm×幅mm2]/2を使用して算出した。主要有効性エンドポイントは、ΔT/ΔC、中央値回帰パーセント、偏回帰および完全回帰PRおよびCR、ならびに無腫瘍生存対象TFSであった。各々処置Tおよび対照Cについての腫瘍容積における変化を、各腫瘍につき、最初の処置日開始日の腫瘍容積を、具体的な観察日の腫瘍容積から差し引くことによって算出した。中央ΔTを治療群について算出し、中央DCを対照群について算出した。次いで、比率DT/ΔCを算出し、百分率:ΔT/ΔC=デルタT/デルタC×100として表した。用量は、ΔT/ΔCが40よりも低いとき治療的に活性と見なし、ΔT/ΔCが10よりも低いとき非常に活性と見なす。ΔT/ΔCが0よりも低い場合、その用量を高度に活性として見なし、回帰の百分率に日付を付ける。パーセント腫瘍退縮は、具体的な観察日での処置群における、最初の処置の初日のその容積と比較した腫瘍容積減少のパーセントとして定義する。具体的な時点で、各動物について、回帰パーセントを算出する。中央回帰パーセントを次いで、群について算出した。回帰t値=[容積t0-容積t/容積nt0]×100。偏回帰PR:回帰は、腫瘍容積が処置の開始時の腫瘍容積の50まで減少した場合、偏回帰として定義する。完全回帰CR:完全回帰は、腫瘍容積=0mm3であるとき達成される腫瘍容積が記録不可能であるときCRと見なされる。TFS:無腫瘍は、研究の終了時最後の処置から>100日後に腫瘍が検出不可能である動物として定義する。結果を表4に提示する。D37~D68に算出した平均体重変化に基づいて、用量依存性体重減少を、30および100mg/kgの化合物Aで処置したマウスについて観察したそれぞれ、ナディア期に-7.3および-10.3。同じ様態で、用量依存性体重減少を、5および30mg/kgのMM-121で処置し、続いて間善意回復したマウスについて観察したそれぞれ、ナディア期に-3.9および-6.2。用量依存性体重減少を、同じそれぞれの用量で単独投与して化合物AまたはMM-121で処置したそれぞれ、ナディア期に-8.4、-11.4、-12.4、および-12.9マウスと比較したときの、5または30mg/kgのMM-121と組み合わせて30および100mg/kgの化合物Aで処置したマウスについて観察した。5または30mg/kgのMM-121と組み合わせた100mg/kgの化合物Aについて、同じ用量の化合物A単独と比較して、体重減少に対する有意な際は観察されなかった。化合物AおよびMM-121の組み合わせは、追加された毒性を誘導しなかった。MM-121は、30mg/kgで31のΔT/ΔCを有して僅かに活性であり、5mg/kgで66のΔT/ΔCを有して不活性であった。化合物Aは、30mg/kgで5のΔT/ΔCp<0.05対対照を有して非常に活性であり、100mg/kgで-4のΔT/ΔCp<0.001および15の腫瘍退縮を有して高度に活性であった。30mg/kgのMM-121と組み合わせた100mg/kgの化合物Aは、-20のΔT/ΔCp<0.001対対照および39の腫瘍退縮を有して高度に活性であった。この組み合わせは、最高の単一薬剤100mg/kgの化合物A、p<0.01よりも活性であり、これらの組み合わせ条件における治療的相乗効果を示した。5mg/kgのMM-121と組み合わせた100mg/kgの化合物Aは、-17のΔT/ΔCp<0.001対対照および41の腫瘍退縮を有して高度に活性であった。30mg/kgのMM-121と組み合わせた30mg/kgの化合物Aは、-7のΔT/ΔCp<0.001対対照および15の腫瘍退縮を有して高度に活性であった。この組み合わせは、最高の単一薬剤30mg/kgの化合物A、p<0.01よりも活性であり、これらの組み合わせ条件における治療的相乗効果を示した。5mg/kgのMM-121と組み合わせた30mg/kgの化合物Aは、16のΔT/ΔCp<0.01対対照および16の腫瘍退縮を有して活性であった。結論として、増幅または過剰発現されたHER2を有さないA549腫瘍異種移植片を担持するマウスにおいて、治療用量で共投与される2つの薬剤の組み合わせは、死亡率および体重変化によって査定したとき、追加された毒性を示さなかった。MM-121単一薬剤は、30mg/kgで僅かな活性を示し、化合物A単一薬剤は、30および100mg/kgで高度な活性を示した。100mg/kgの化合物Aおよび30mg/kgのMM-121の間の組み合わせで、ならびに30mg/kgの化合物Aおよび30mg/kgのMM-121の間の組み合わせで、双方の条件についての最高の単一薬剤それぞれ、100mg/kg、p<0.01の化合物Aおよび30mg/kg、p<0.01の化合物Aと比較して、治療的相乗効果を観察した。加えて、化合物AおよびMM-121によるHER3調節を、2つの用量での各化合物について、および1つの組み合わせ条件について、メスSwissヌードマウスの皮下に埋め込まれた測定可能な肺A549腫瘍に対して評価した。簡潔に述べると、皮下に埋め込まれた測定可能な肺A549腫瘍を担持するマウスを無処置で残したか、あるいは単一薬剤としてのMM121によって5mg/kgまたは30mg/kgの用量で1回投与、もしくは単一薬剤としての化合物Aによって30mg/kgまたは100mg/kgの用量で毎日投与、または両方の組み合わせによってMM121について30mg/kgでおよび化合物Aについて100mg/kgでのいずれかで処置した。異種移植片腫瘍におけるHER3発現レベルを、最大96時間にわたって追跡した。表5における結果は、化合物AによるPI3K阻害が、A549肺モデルにおけるHER3発現の若干の増加を誘導する一方で、MM-121治療が、HER3発現を有意に減少させることを示す。化合物AおよびMM-121での組み合わせ処置は、HER3の有意な減少をもたらした。HER3レベルを下方調節することによって、MM-121は、PI3K-AKT経路の阻害、および故に、化合物Aの抗腫瘍活性を強化する。実施形態1.患者における癌を治療するための方法であって、治療上有効量の式Iの化合物ならびに治療上有効量のHER2および/またはHER3阻害物質を、該患者に共投与することを含む、方法。2.式Iの化合物は:Iの化合物、またはその単一の異性体であり、ここで化合物は、任意にその薬学的に許容される塩として、更に任意に水和物として、および更に任意に溶媒和物としてのものである、実施形態1に記載の方法であるか、あるいは治療上有効量の式Iの化合物および薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤を含む薬学的組成物を、HER3、HER2、MSPR、Axl、MAP3KERK、JNK、およびp38MAPK、MEKKキナーゼ/キナーゼ受容体、INSR、IGF-IR、およびFGFR2の1つ以上の阻害物質と組み合わせて投与する方法であり、ここで式Iの化合物は:W1、W2、W3、およびW4が-CR1=であるか、またはW1、W2、W3、およびW4のうちの1つもしくは2つが独立して-N=であり、残りのものが-CR1=であり、ここで各R1が、独立して水素、アルキル、ハロアルキル、ニトロ、アルコキシ、ハロアルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、シアノ、アミノ、アルキルアミノ、またはジアルキルアミノであり、R51が水素またはアルキルであり、R52が水素またはハロであり、R50、R53、およびR54が独立して、水素、アルキル、アルケニル、ハロ、ハロアルキル、ハロアルケニル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルケニルオキシ、ハロアルコキシ、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、-NR55CO-C1-C6-アルキレン-NR55aR55b、アルキルカルボニル、アルケニルカルボニル、カルボキシ、アルコキシカルボニル、シアノ、アルキルチオ、-SO2NR55R55a、またはアルキルカルボニルアミノであり、R55およびR55bが独立して、水素、アルキル、またはアルケニルであり、R55aが水素、アルキル、アルケニル、ヒドロキシ、またはアルコキシであるか、あるいはR53およびR54が、それらが結合される炭素と一緒になって、5員もしくは6員ヘテロアリールまたは5員もしくは6員ヘテロシクロアルキルを形成し、Bが、R3aで置換され、かつ1つ、2つ、または3つのR3で任意に更に置換されるフェニルであるか、あるいはBが、1つ、2つ、または3つのR3で任意に置換されるヘテロアリールであり、R3aが、シアノ、ヒドロキシアミノ、カルボキシ、アルコキシカルボニル、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルカルボニル、ハロアルコキシ、アルキルスルホニル、アミノアルキルオキシ、アルキルアミノアルキルオキシ、またはジアルキルアミノアルキルオキシであるか、あるいはa-NR7CO-C1-C6-アルキレン-NR7aR7bであり、式中、R7が水素、アルキル、またはアルケニルであり、R7aおよびR7bが独立して、水素、アルキル、アルケニル、ヒドロキシアルキル、ハロアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルキルアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、アリール、アリールアルキル、またはアリールアルキルオキシであり、ここでR7aおよびR7bにおけるアリール、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、およびヘテロアリール環単独で、またはアリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキルアルキル、およびヘテロアリールアルキルの一部としてのいずれかが独立して、アルキル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシ、ハロ、アルコキシ、アルキルチオ、およびオキソから独立して選択される、1個、2個、または3個の基で任意に置換されるか、b-CONR8R8aであり、式中、R8が水素、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキル、アルケニル、ハロアルキル、またはハロアルコキシであり、R8aが水素、アルキル、アルケニル、ヒドロキシアルキル、シアノアルキル、アルコキシアルキル、アルキルチオアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルキルアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、アリール、またはアリールアルキルであり、ここでR8aにおけるアリール、シクロアルキル、ヘテロアリール、およびヘテロシクロアルキル環単独でまたはアリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキルアルキル、およびヘテロアリールアルキルの一部としてのいずれかが独立して、任意に、独立してアルキル、アルケニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、オキソ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルカルボニル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、アルコキシカルボニル、および-COHから選択される1個、2個、または3個の基で置換されるか、c-NR9COR9aであり、式中、R9が水素、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキル、アルケニル、ハロアルキル、またはハロアルコキシであり、R9aが水素、C2-C6アルキル、アルケニル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルキルアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、アリール、またはアリールアルキルであり、ここでR9aにおけるアリール、シクロアルキル、ヘテロアリール、およびヘテロシクロアルキル環単独で、またはアリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキルアルキル、およびヘテロアリールアルキルの一部としてのいずれかが独立して、アルキル、アルケニル、アルコキシ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ハロ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、オキソ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルカルボニル、アルコキシカルボニル、-COH、アリール任意に1個または2個のハロで置換される、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルキルアルキル、シロアルキルcyloalkylアルキルアルキルcyloalkylalkyl、およびシクロアルキルカルボニルから独立して選択される1個、2個、または3個の基で任意に置換されるか、d-CONR10-C1-C6-アルキレン-NR10aR10bであり、式中、R10aが水素、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキル、アルケニル、ハロアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、またはヒドロキシアルキルであり、R10およびR10bが独立して、水素、アルキル、アルケニル、ハロアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、またはヒドロキシアルキルであるか、e-NR11CONR11aR11bであり、式中、R11aが水素、アルキル、アルケニル、ヒドロキシ、またはアルコキシであり、R11およびR11bが独立して、水素、アルキル、アルケニル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、またはジアルキルアミノアルキルであるか、f-COR12であり、式中、R12が、アルキル、オキソ、アミノ、アルキルアミノ、およびヘテロシクロアルキルアルキルから選択される1個、2個、または3個の基で任意に置換されるヘテロシクロアルキルであるか、g-NR13COOR13aであり、式中、R13が水素、アルキル、またはアルケニルであり、R13aがアミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、アリール、またはアリールアルキルであるか、h-CONR14NR14aR14bであり、式中、R14、R14a、およびR14bが独立して、水素、アルキル、またはアルケニルであるか、i-SO2NR15-C1-C6-アルキレン-NR15aR15bであり、式中、R15、R15a、およびR15bが独立して、水素、アルキル、またはアルケニルであるか、j-CONR16-C1-C6-アルキレン-COOR16aであり、式中、R16が水素、アルキル、またはアルケニルであり、R16aがアルキルまたはアルケニルであるか、k1個または2個のアミノアルキル、アルキルアミノアルキル、またはジアルキルアミノアルキルで任意に置換されるヘテロアリールであるか、l-NR17-C=NR17bR17aNR17cR17dであり、式中、R17、R17a、R17b、R17c、およびR17dが独立して、水素、アルキル、またはアルケニルであるか、m-NR18CO-C1-C6-アルキレン-NR18bCOR18aであり、式中、R18aが水素、アルキル、アルケニル、またはアルコキシであり、R18およびR18bが独立して、水素、アルキル、またはアルケニルであるか、n-CONR19-C1-C6-アルキレン-COR19aであり、式中、R19が水素、アルキル、またはアルケニルであり、R19aがアミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、またはヘテロシクロアルキルであるか、o-NR20CO-C1-C6-アルキレン-COR20aであり、式中、R20が水素、アルキル、またはアルケニルであり、R20aがシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルであるか、-p-NR21SO2-C1-C6-アルキレン-NR21bR21aであり、式中、R21が水素、アルキル、またはアルケニルであり、R21aおよびR21bが独立して、水素、アルキル、またはアルケニルであるか、q-NR22CO-C1-C6-アルキレン-NR22b-NR22cR22aであり、式中、R22、R22aおよびR22bが独立して、水素、アルキル、またはアルケニルであるか、r-C0-C6-アルキレン-NR23-C1-C6-アルキレン-NR23bR23aであり、式中、R23、R23aおよびR23bが独立して、水素、アルキル、またはアルケニルであるか、あるいはs-NR24CO-C1-C6-アルキレン-OR24aであり、式中、R24が水素、アルキル、またはアルケニルであり、R24aが、1個または2個のハロまたはアルキルで任意に置換されるアルコキシアルキルまたはアリールであり、式中、R3aにおけるアルキレンの各々が独立して、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、およびジアルキルアミノから選択される1個、2個、3個、4個、5個の基で任意に更に置換され、各R3R3が存在するときは、独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロ、ヒドロキシ、オキソ、アルコキシ、シアノ、ヒドロキシアミノ、カルボキシ、アルコキシカルボニル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルカルボニル、ハロアルコキシ、アルキルスルホニル、アミノアルキルオキシ、アルキルアミノアルキルオキシ、またはジアルキルアミノアルキルオキシであるか、あるいはa-NR7CO-C1-C6-アルキレン-NR7aR7bであり、式中、R7が水素、アルキル、またはアルケニルであり、R7aおよびR7bが独立して、水素、アルキル、アルケニル、ヒドロキシアルキル、ハロアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルキルアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、アリール、アリールアルキル、またはアリールアルキルオキシであり、ここでR7aおよびR7bにおけるアリール、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、およびヘテロアリール環単独で、またはアリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキルアルキル、およびヘテロアリールアルキルの一部としてのいずれかが独立して、アルキル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシ、ハロ、アルコキシ、アルキルチオ、およびオキソから独立して選択される、1個、2個、または3個の基で任意に置換されるか、b-CONR8R8aであり、式中、R8が水素、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキル、アルケニル、ハロアルキル、またはハロアルコキシであり、R8aが水素、アルキル、アルケニル、ヒドロキシアルキル、シアノアルキル、アルコキシアルキル、アルキルチオアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルキルアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、アリール、またはアリールアルキルであり、ここでR8aにおけるアリール、シクロアルキル、ヘテロアリール、およびヘテロシクロアルキル環単独でまたはアリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキルアルキル、およびヘテロアリールアルキルの一部としてのいずれかが独立して、任意に、独立してアルキル、アルケニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、オキソ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルカルボニル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、アルコキシカルボニル、および-COHから選択される1個、2個、または3個の基で置換されるか、c-NR9COR9aであり、式中、R9が水素、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキル、アルケニル、ハロアルキル、またはハロアルコキシであり、R9aが水素、C2-C6アルキル、アルケニル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルキルアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、アリール、またはアリールアルキルであり、ここでR9aにおけるアリール、シクロアルキル、ヘテロアリール、およびヘテロシクロアルキル環単独で、またはアリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキルアルキル、およびヘテロアリールアルキルの一部としてのいずれかが独立して、アルキル、アルケニル、アルコキシ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ハロ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、オキソ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルカルボニル、アルコキシカルボニル、-COH、アリール任意に1個または2個のハロで置換される、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルキルアルキル、シロアルキルcyloalkyl、シロアルキルアルキルcyloalkylalkyl、およびシクロアルキルカルボニル独立してから選択される1個、2個、または3個の基で任意に置換されるか、d-CONR10-C1-C6-アルキレン-NR10aR10bであり、式中、R10aが水素、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキル、アルケニル、ハロアルキル、またはヒドロキシアルキルであり、R10およびR10bが独立して、水素、アルキル、アルケニル、ハロアルキル、またはヒドロキシアルキルであるか、e-NR11CONR11aR11bであり、式中、R11aが水素、アルキル、アルケニル、ヒドロキシ、またはアルコキシであり、R11およびR11bが独立して、水素、アルキル、アルケニル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキルalkylaminooalkyl、またはジアルキルアミノアルキルであるか、f-COR12であり、式中、R12が、アルキル、オキソ、アミノ、アルキルアミノ、およびヘテロシクロアルキルアルキルから選択される1個、2個、または3個の基で任意に置換されるヘテロシクロアルキルであるか、g-NR13COOR13aであり、式中、R13が水素、アルキル、またはアルケニルおよびR13aは、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、アリール、またはアリールアルキルであるか、h-CONR14NR14aR14bであり、式中、R14、R14a、およびR14bが独立して、水素、アルキル、またはアルケニルであるか、i-SO2NR15-C1-C6-アルキレン-NR15aR15bであり、式中、R15、R15a、およびR15bが独立して、水素、アルキル、またはアルケニルであるか、j-CONR16-C1-C6-アルキレン-COOR16aであり、式中、R16が水素、アルキル、またはアルケニルであり、R16aがアルキルまたはアルケニルであるか、k1個または2個のアミノアルキル、アルキルアミノアルキル、またはジアルキルアミノアルキルで任意に置換されるヘテロアリールであるか、l-NR17-C=NR17bR17aNR17cR17dであり、式中、R17、R17a、R17b、R17c、およびR17dが独立して、水素、アルキル、またはアルケニルであるか、m-NR18CO-C1-C6-アルキレン-NR18bCOR18aであり、式中、R18aが水素、アルキル、アルケニル、またはアルコキシであり、R18およびR18bが独立して、水素、アルキル、またはアルケニルであるか、n-CONR19-C1-C6-アルキレン-COR19aであり、式中、R19が水素、アルキル、またはアルケニルであり、R19aがアミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、またはヘテロシクロアルキルであるか、o-NR20CO-C1-C6-アルキレン-COR20aであり、式中、R20が水素、アルキル、またはアルケニルであり、R20aがシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルであるか、p-NR21SO2-C1-C6-アルキレン-NR21bR21aであり、式中、R21が水素、アルキル、またはアルケニルであり、R21aおよびR21bが独立して、水素、アルキル、またはアルケニルであるか、q-NR22CO-C1-C6-アルキレン-NR22b-NR22cR22aであり、式中、R22、R22aおよびR22bが独立して、水素、アルキル、またはアルケニルであるか、r-C0-C6-アルキレン-NR23-C1-C6-アルキレン-NR23bR23aであり、式中、R23、R23aおよびR23bが独立して、水素、アルキル、またはアルケニルであるか、あるいはs-NR24CO-C1-C6-アルキレン-OR24aであり、式中、R24が水素、アルキル、またはアルケニルであり、R24aが、任意に1つまたは2つのハロまたはアルキルで置換されるアルコキシアルキルまたはアリールであり、式中、R3におけるアルキレンの各々が独立して、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、およびジアルキルアミノから選択される1個、2個、3個、4個、5個の基で任意に更に置換されるが、R50およびR52が水素であり、R51が水素またはメチルであり、R53が水素またはメトキシであり、かつR54が水素またはメトキシであるとき、Bは、1つのR3R3はハロであるで置換される、2,3-ヒジドロ-1,4-ベンゾジオキシニルbenzodioxinyl、チエン-2-イル、またはチエン-2-イルでないことを条件とする、化合物である。3.式Iの化合物は、表1に具体的に列挙される化合物である、実施形態1および2のいずれか1つに記載の方法。4.HER2および/またはHER3阻害物質は、ラパチニブ、機能性核酸、抗HER2、または抗HER3抗体である、実施形態1、2、および3のいずれか1つに記載の方法。5.HER3阻害物質は、抗HER3抗体である、実施形態1、2、および3のいずれか1つに記載の方法。6.癌は、HER2非過剰発現癌を含む、実施形態1、2、および3のいずれか1つに記載の方法。7.癌は、非HER2増幅腫瘍を含む、実施形態1、2、および3のいずれか1つに記載の方法。8.治療上有効量の化合物Aは、治療上有効量のMM-121と共投与される、実施形態1、2、および3のいずれか1つに記載の方法。9.組み合わせは、癌の治療における治療的相乗効果を示す、実施形態1、2、および3のいずれか1つに記載の方法。10.組み合わせは、少なくとも2.8、少なくとも2.9、または少なくとも3.0のlog10細胞死滅を達成する、実施形態9に記載の方法。11.癌は、肺癌である、実施形態1、2、および3のいずれか1つに記載の方法。12.機能性核酸は、siRNA分子、shRNA分子、miRNA分子、またはアンチセンス核酸分子である、実施形態1、2、3、および4のいずれか1つに記載の方法。13.siRNAは、18~30個のヌクレオチドを有するポリヌクレオチドを含み、HER2および/またはHER3mRNAに結合するように作動可能である、実施形態1、2、3、4、および5のいずれか1つに記載の方法。14.mRNAは、配列番号1に提供されるヌクレオチド配列を含む、実施形態12に記載の方法。15.siRNAは、配列番号3、4、6、7、または8のポリヌクレオチド配列を含む、実施形態12に記載の方法。16.siRNAは、裸であるか、連結されているか、あるいは、封入されている、実施形態12に記載の方法。17.アンチセンス核酸は、HER2および/またはHER3ポリペプチドをコードする、2本鎖cDNA分子に相補的であるか、またはmRNA配列に相補的である、実施形態5に記載の方法。18.2本鎖cDNA分子は、配列番号2のアミノ酸配列を有するHER2ポリペプチド、その断片、またはその変異体をコードするように作動可能である、実施形態17に記載の方法。19.HER2ポリペプチドをコードするmRNA配列は、配列番号1のポリヌクレオチド配列、その断片、またはその変異体を有する、実施形態17に記載の方法。20.機能性核酸は、組換えベクターにおいて被検体に投与され、このベクターは、腫瘍中または腫瘍の部位の近くで機能性核酸を発現し、腫瘍中のHER2および/またはHER3の発現および/または活性を阻害するように作動可能である、実施形態5~19のいずれか1つに記載の方法。21.抗HER2抗体は、トラスツズマブ、ペルツズマブ、4D5、520C9、452F2、736G9、741F8、758G5、761B10、huMAb4D5-1、huMAb4D5-2、huMAb4D5-3、huMAb4D5-4、huMAb4D5-5、huMAb4D5-6、huMAb4D5-7、4D5-8、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態4に記載の方法。22.抗HER2抗体は、トラスツズマブである、実施形態21に記載の方法。23.治療上有効量の式Iの化合物ならびに治療上有効量のHER2および/またはHER3阻害物質を患者に共投与することは、式Iの化合物をHER2および/またはHER3阻害物質と同時に、あるいはHER2および/またはHER3阻害物質を投与する前あるいは後に投与することを含む、実施形態1に記載の方法。24.患者に投与される式Iの化合物の量は、1日当たり約0.01~約1,000mgの式Iの化合物を投与することを含む、実施形態23に記載の方法。25.投与される式Iの化合物の量は、1日につき体重1キログラム当たり約0.01~約100mgの範囲の式Iの化合物の量を投与することを含む、実施形態24に記載の方法。26.HER2および/またはHER3阻害物質を投与することは、1日につき体重1キログラム当たり約0.001~約100mgのHER2および/またはHER3阻害物質を投与することを含む、実施形態25に記載の方法。27.癌は、心臓:肉腫血管肉腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、粘液腫、横紋筋腫、線維腫、脂肪腫、および奇形腫;肺:気管支原性癌扁平上皮細胞、未分化小細胞、未分化大細胞、腺癌、肺胞細気管支癌、気管支腺腫、肉腫、リンパ腫、軟骨性過誤腫、中皮腫;乳:非浸潤性乳管癌、浸潤性乳管癌、髄様癌、浸潤性小葉腺癌、管状癌、粘液癌、炎症性乳癌;胃腸:食道扁平上皮癌、腺癌、平滑筋肉腫、リンパ腫、胃癌腫、リンパ腫、平滑筋肉腫、膵臓膵管腺癌、インスリノーマ、グルカゴノーマ、ガストリノーマ、カルチノイド腫瘍、ビポーマ、小腸腺癌、リンパ腫、カルチノイド腫瘍、カポジ肉腫、平滑筋腫、血管腫、脂肪腫、神経線維腫、線維腫、大腸腺癌、管状腺腫、絨毛腺腫、過誤腫、平滑筋腫;尿生殖路:腎臓腺癌、ウィルムス腫瘍[腎芽細胞腫]、リンパ腫、白血病、膀胱および尿道扁平上皮癌、移行上皮癌、腺癌、前立腺腺癌、肉腫、精巣セミノーマ、奇形腫、胚性癌腫、奇形癌腫、絨毛癌、肉腫、間質細胞癌腫、線維腫、線維腺腫、類腺腫瘍、脂肪腫;肝臓:肝癌肝細胞癌、胆管癌、肝芽腫、血管肉腫、肝細胞腺腫、血管腫;骨:骨原性肉腫骨肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性リンパ腫細網細胞肉腫、多発性骨髄腫、悪性巨細胞腫瘍脊索腫、骨軟骨腫骨軟骨性外骨症、良性軟骨腫、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液線維腫、類骨骨腫、および巨細胞腫瘍;神経系:頭蓋骨腫、血管腫、肉芽腫、黄色腫、変形性骨炎、髄膜髄膜腫、髄膜肉腫、神経膠腫症、脳星状細胞腫、髄芽細胞腫、神経膠腫、上衣腫、胚細胞腫[松果体腫]、多形膠芽腫、乏突起神経膠腫、シュワン細胞腫、網膜芽細胞腫、先天性腫瘍、脊髄神経線維腫、髄膜腫、神経膠腫、肉腫;婦人科:子宮子宮内膜癌、子宮頚部子宮頚癌、前腫瘍性子宮頚部異形成、卵巣卵巣癌[漿液性嚢胞腺癌、粘液嚢胞腺癌、未分類癌腫]、顆粒膜-莢膜細胞腫瘍、セルトリライディッヒ細胞腫瘍、未分化胚細胞腫、悪性奇形腫、外陰部扁平上皮癌、上皮内癌、腺癌、線維肉腫、黒色腫、膣明細胞癌、扁平上皮癌、ブドウ状肉腫胚性横紋筋肉腫]、卵管癌腫;血液系:血液骨髄性白血病[急性および慢性]、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫[悪性リンパ腫];皮膚:悪性黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮癌、カポジ肉腫、黒子異形成母斑、脂肪腫、血管腫、皮膚線維腫、ケロイド、乾癬;副腎:神経芽細胞腫を含む、実施形態1~26のいずれか1つに記載の方法。27.癌は、乳癌、結腸癌、直腸癌、子宮体癌、胃癌胃腸カルチノイド腫瘍および消化管間質腫瘍を含む、膠芽腫、肝細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌NSCLC、黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、膵臓癌、前立腺癌腫、急性骨髄性白血病AML、慢性骨髄性白血病CML、非ホジキンリンパ腫、および甲状腺癌である、実施形態26に記載の方法。28.癌は、HER2過剰発現癌である、実施形態26に記載の方法。29.HER2過剰発現癌は、HER2過剰発現乳癌である、実施形態28に記載の方法。30.化合物は、式Ia:に従った化合物、Ia。またはその単一立体異性体もしくは立体異性体の混合物であり、任意にその薬学的に許容される塩としてのものであって、式中、W1、W2、W3、およびW4は、-CH-であり、R50は、水素であり、R51は、メチルであり、R52は、水素であり、R53は、水素またはアルコキシであり、R54は、水素、アルキル、アルコキシ、またはハロであるか、あるいはR53およびR54は、それらが結合される炭素と一緒になって、6員のヘテロアリールを形成し、R3は、ハロまたはメチルであり、R3aは、-NR7CO-C1-C6-アルキレン-NR7aR7bであり、ここでR7は、水素であり、R7aおよびR7bは独立して、水素、アルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、またはジアルキルアミノアルキルである、実施形態1に記載の方法。R51は、メチルであり、R50、R52、およびR53は、水素であり、R54は、ハロまたはアルコキシであるか、あるいはR50、R52、およびR54は、水素であり、R53は、アルコキシであるか、またはその単一の立体異性体もしくは立体異性体の混合物であり、任意にその薬学的に許容される塩としてのものである、実施形態30に記載の化合物。R3aは、-NHCOCH2NHCH3、-NHCOCHCH3NH2、-NHCOCCH32NH2、-NHCO-CH2NCH32、-NHCOCH2NCH3CH2CH2NCH32、-NHCOCHNH2CH2CH3、-NHCOCH2NCH3CH2CH2NCH32、もしくは-NHCOCHCH3NHCH3、またはその幾何異性体であり、任意にその薬学的に許容される塩としてのものである、実施形態31に記載の化合物。であるか、またはその薬学的に許容される塩である、実施形態31に記載の化合物。であるか、またはその薬学的に許容される塩である、実施形態31に記載の化合物。上記の明細書で言及される全ての刊行物および特許は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明は、具体的な好ましい実施形態に関連して記載されているが、特許請求される本発明は、かかる具体的な実施形態に過度に限定されるべきでないことが理解されるべきである。実際、関連分野の専門家にとって明白である、本発明を行うための記載される様式の種々の修正は、次の特許請求の範囲内にあることが意図される。"