"ai配列番号1のCDR1、ii配列番号2のCDR2、およびiii配列Phe-Gln-Gly-Ser-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5配列番号3を有し、Xaa1がArg、LysまたはTyrであり、Xaa2がVal、AlaまたはLeuであり、Xaa3がPro、HisまたはGlyであり、Xaa4がAla、ProまたはValであり、Xaa5がSer、GlyまたはPheであるCDR3を含む軽鎖可変領域;ならびにbi配列番号4のCDR1、ii配列番号5のCDR2、およびiii配列番号6のCDR3を含む重鎖可変領域を含む、アミロイドβ由来拡散性リガンドADDLと結合する単離抗体またはこれらの抗原結合断片。軽鎖可変領域CDR3が、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12および配列番号13からなる群から選択される、請求項1に記載の単離抗体または抗原結合断片。軽鎖可変領域CDR3が配列番号10である、請求項1に記載の単離抗体または抗原結合断片。前記抗体の軽鎖可変領域が配列番号15を含み、前記抗体の重鎖可変領域が配列番号17を含む、請求項1に記載の単離抗体。配列番号21の重鎖定常領域をさらに含む、請求項1に記載の単離抗体。配列Arg-Ser-Ser-Gln-Ser-Ile-Val-His-Ser-Xaa1-Gly-Xaa2-Thr-Thy-Leu-Glu配列番号53を有し、Xaa1がAsn、Ser、Thr、Ala、AspまたはGluであり、Xaa2がAsn、His、Gln、Ser、Thr、AlaまたはAspである、軽鎖可変領域CDR1をさらに含む、請求項1に記載の単離抗体または抗原結合断片。配列Lys-Ala-Ser-Xaa1-Arg-Phe-Ser配列番号54を有し、Xaa1がAsn、Gly、Ser、Thr,またはAlaである軽鎖可変領域CDR2をさらに含む、請求項1に記載の単離抗体または抗原結合断片。抗体がモノクローナル抗体である、請求項1に記載の単離抗体。請求項1に記載の抗体または抗原結合断片を、医薬として許容可能な担体と混合して含む医薬組成物。ニューロンと、請求項1に記載の抗体または抗原結合断片とを、Aβ由来拡散性リガンドとニューロンとの結合が減衰されるように接触させるステップを含む、ニューロンへのアミロイドβ由来拡散性リガンドの結合を減衰させる方法。アミロイドβ1-42ペプチドを含有する試料と、請求項1に記載の抗体または抗原結合断片とを接触させ、その結果Aβ由来拡散性リガンドのアセンブリを阻害するステップを含む、アミロイドβ由来拡散性リガンドのアセンブリを阻害する方法。タウタンパク質を含有する試料と、請求項1に記載の抗体または抗原結合断片とを接触させ、その結果Ser202/Thr205におけるタウタンパク質のリン酸化を阻害するステップを含む、Ser202/Thr205におけるタウタンパク質のリン酸化を阻害する方法。請求項9に記載の医薬組成物の有効量を投与するステップを含む、アミロイドβ由来拡散性リガンドに関連する疾患の症状を減衰させる方法。aニューロンを含む組成物とアミロイドβ由来拡散性リガンドとを、薬剤の存在下で接触させるステップ、b該組成物と請求項1に記載の抗体または抗原結合断片とを接触させるステップ、およびc薬剤の存在下で結合した、抗体または抗原結合断片の量を検出するステップを含み、薬剤の不在下で結合した抗体の量と比較して、薬剤の存在下で結合した抗体または抗原結合断片の量の減少が、薬剤が、ニューロンへのアミロイドβ由来拡散性リガンドの結合を減衰させるための推定治療薬であることを示す、ニューロンへのアミロイドβ由来拡散性リガンドの結合を減衰させる推定治療薬を同定する方法。試料と請求項1に記載の抗体または抗原結合断片とを接触させるステップ、およびアミロイドβ由来拡散性リガンドおよび前記抗体または抗原結合断片を含む複合体の存在を決定するステップを含む、試料中のアミロイドβ由来拡散性リガンドを検出する方法。試料と請求項1に記載の抗体または抗原結合断片とを接触させるステップおよびアミロイドβ由来拡散性リガンドおよび前記抗体または抗原結合断片を含む複合体の存在を決定するステップを含み、前記複合体が、アミロイドβ由来拡散性リガンドに関連する疾患の診断である、アミロイドβ由来拡散性リガンドに関連する疾患を診断する方法。請求項1に記載の抗体または抗原結合断片を含む、アミロイドβ由来拡散性リガンドを検出するためのキット。本発明は、アルツハイマー病ADなどのADDLに関連する疾患の治療のための、1つまたは複数のアミロイドβ由来拡散性リガンドADDLの多次元構造を差次的に認識できる単離抗体またはこれらの断片を対象とする。本発明はまた、本発明の単離抗体を、単独または1種または複数種の治療活性薬剤、担体または希釈剤と組み合わせて含む医薬組成物を提供する。本発明は、試料中のADDLを検出する方法、ADDLのアセンブリを阻害する方法、ニューロンへのADDLの結合を防止する治療薬を同定する方法およびADDLに関連する疾患の症状を減衰する方法などの単離抗体の使用方法ならびにADDLに関連する疾患の診断または試料中のADDLの検出に使用する、バイオマーカーとしての単離抗体の使用方法もまた対象とする。本発明は、アミロイドβAβ由来拡散性リガンドADDL、すなわち抗ADDLと結合し、ニューロンに対するADDLの結合を減衰する、抗体または抗原結合断片を対象とする。定量的な細胞に基づくアッセイの結果により、抗ADDL抗体がADDLに優先的に結合し、海馬ニューロンへのADDLの結合を和らげ、血液脳関門を越えて、薬物動態学PKプロファイルを改善したことが明らかになった。一実施形態において、本発明は、ai配列Arg-Ser-Ser-Gln-Ser-Ile-Val-His-Ser-Asn-Gly-Asn-Thr-Tyr-Leu-Glu配列番号1を有するCDR1、ii配列Lys-Ala-Ser-Asn-Arg-Phe-Ser配列番号2を有するCDR2、およびiii配列Phe-Gln-Gly-Ser-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5配列番号3を有し、Xaa1がArg、LysまたはTyrであり、Xaa2がVal、AlaまたはLeuであり、Xaa3がPro、HisまたはGlyであり、Xaa4がAla、ProまたはValであり、Xaa5がSer、GlyまたはPheであるCDR3を含む軽鎖可変領域;ならびにbi配列Gly-Phe-Thr-Phe-Ser-Ser-Phe-Gly-Met-His配列番号4を有するCDR1、ii配列Tyr-Ile-Ser-Arg-Gly-Ser-Ser-Thr-Ile-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Thr-Val-Lys-Gly配列番号5を有するCDR2、およびiii配列Gly-Ile-Thr-Thr-Ala-Leu-Asp-Tyr配列番号6を有するCDR3を含む重鎖可変領域を含む、アミロイドβ由来拡散性リガンドADDLと結合する単離抗体またはこれらの抗原結合断片を対象とする。別の実施形態において、本発明は、ai配列Arg-Ser-Ser-Gln-Ser-Ile-Val-His-Ser-Xaa1-Gly-Xaa2-Thr-Tyr-Leu-Glu配列番号53を有し、Xaa1がAsn、Ser、Thr、Ala、AspまたはGluであり、Xaa2がAsn、His、Gln、Ser、Thr、AlaまたはAspであるCDR1、ii配列Lys-Ala-Ser-Xaal-Arg-Phe-Ser配列番号54を有し、Xaa1がAsn、Gln、Ser、ThrまたはAlaであるCDR2、およびiii配列Phe-Gln-Gly-Ser-Arg-Leu-Gly-Pro-Ser配列番号10を有するCDR3を含む軽鎖可変領域、ならびにbi配列Gly-Phe-Thr-Phe-Ser-Ser-Phe-Gly-Met-His配列番号4を有するCDR1、ii配列Tyr-Ile-Ser-Arg-Gly-Ser-Ser-Thr-Ile-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Thr-Val-Lys-Gly配列番号5を有するCDR2、およびiii配列Gly-Ile-Thr-Thr-Ala-Leu-Asp-Tyr配列番号6を有するCDR3を含む重鎖可変領域を含む、アミロイドβ由来拡散性リガンドADDLと結合する単離抗体またはこれらの抗原結合断片を対象とする。別の実施形態において、本発明は、配列Phe-Gln-Gly-Ser-Arg-Val-Pro-Ala-Ser配列番号7を有する17.1、配列Phe-Gln-Gly-Ser-Arg-Val-Pro-Pro-Gly配列番号8を有する14.2、配列Phe-Gln-Gly-Ser-Lys-Ala-His-Pro-Ser配列番号9を有する13.1、配列Phe-Gln-Gly-Ser-Arg-Leu-Gly-Pro-Ser配列番号10を有する19.3、配列Phe-Gln-Gly-Ser-Tyr-Ala-Pro-Pro-Gly配列番号11を有する7.2、配列Phe-Gln-Gly-Ser-Arg-Ala-Pro-Pro-Phe配列番号12を有する9.2および配列Phe-Gln-Gly-Ser-Arg-Val-Pro-Val-Arg配列番号13を有する11.4からなる群から選択される軽鎖可変領域CDR3を有する、ADDLと結合する単離抗体、すなわち抗ADDL抗体またはこれらの抗原結合断片である。下位実施形態において、軽鎖可変領域CDR3は配列番号10である。本発明のさらに別の実施形態において、単離抗ADDL抗体は、配列番号15の軽鎖可変領域および配列番号17の重鎖可変領域をさらに含む。本発明のその上別の実施形態において、単離抗ADDL抗体は、配列番号21の重鎖定常領域をさらに含む。本発明の別の実施形態において、単離抗ADDL抗体はモノクローナル抗体である。本発明の別の実施形態は、単離抗ADDL抗体またはこれらの抗原結合断片を、医薬として許容可能な担体と混合して含む医薬組成物である。本発明の別の実施形態は、ニューロンと、単離抗ADDL抗体またはこれらの抗原結合断片とを、Aβ由来拡散性リガンドとニューロンとの結合が減衰されるように接触させるステップを含む、ニューロンへのADDLの結合を減衰させる方法である。本発明の別の実施形態は、アミロイドβ1-42ペプチドを含有する試料と単離抗ADDL抗体またはこれらの抗原結合断片とを接触させ、その結果ADDLのアセンブリを阻害するステップを含む、ADDLのアセンブリを阻害する方法である。本発明の別の実施形態は、タウタンパク質を含有する試料と単離抗ADDL抗体またはこれらの抗原結合断片とを接触させ、その結果Ser202/Thr205におけるタウタンパク質のリン酸化を阻害するステップを含む、Ser202/Thr205におけるタウタンパク質のリン酸化を阻害する方法である。本発明の別の実施形態は、単離抗ADDL抗体またはこれらの抗原結合断片を含む医薬組成物を、これらを必要とする患者に有効量投与するステップを含む、ADDLに関連する疾患の症状を減衰させる方法である。本発明の別の実施形態は、aニューロンを含む組成物とADDLとを、薬剤の存在下で接触させるステップ、b該組成物と単離抗ADDL抗体またはこれらの抗原結合断片とを接触させるステップ、およびc薬剤の存在下で結合した、抗体または抗原結合断片の量を検出するステップを含み、薬剤の不在下で結合した抗体の量と比較して、薬剤の存在下で結合した抗体または抗原結合断片の量の減少が、薬剤が、ニューロンへのADDLの結合を減衰させるための推定治療薬であることを示す、ニューロンへのアミロイドβ由来拡散性リガンドADDLの結合を減衰させる推定治療薬を同定する方法である。本発明の別の実施形態は、試料と単離抗ADDL抗体またはこれらの抗原結合断片とを接触させるステップ、およびADDLおよび前記抗体または抗原結合断片を含む複合体の存在を決定するステップを含む、試料中のADDLを検出する方法である。本発明の別の実施形態は、試料と単離抗ADDL抗体またはこれらの抗原結合断片とを接触させるステップおよびADDLおよび前記単離抗体または抗原結合断片を含む複合体の存在を決定するステップを含み、前記複合体の存在が、ADDLに関連する疾患の診断である、ADDLに関連する疾患を診断する方法である。本発明のさらに別の実施形態は、ADDLと結合する単離抗ADDL抗体またはこれらの抗原結合断片を含む、ADDLを検出するためのキットである。Aβ由来拡散性リガンドADDLの多次元構造を差次的に認識するモノクローナル抗体は当分野において公知であり米国特許第7,780,963号明細書、米国特許第7,731,962号明細書および米国特許第7,811,563号明細書を参照されたい、これらすべてはその全体を参照により本明細書に組み込まれる、細胞に基づくアッセイにおいて、ニューロンへのADDLの結合の減少が示されている。抗ADDL抗体は、アルツハイマー病ADと対照のヒト脳抽出物とを識別でき、AD脳の薄片および海馬細胞において内因性オリゴマーを同定でき、溶液中で内因性ADDLおよび合成ADDLを中和できる。抗ADDL抗体は、ADDLの1つまたは複数の多次元構造と特異的に結合し、Aβ42のオリゴマー化に由来する特定のADDLと結合するが、Aβ1-40を含む他のAβペプチドに関する親和性は低下している。本発明は、ADDLと優先的に結合し、ADDLに関するそれらの特異性および選択性を特徴としている、抗ADDL抗体、特に抗体17.1、14.2、13.1、19.3、19.3T33、19.3S33、7.2、9.2および11.4を対象とする。重要なことには、本発明のこれらの抗ADDL抗体の特異性および選択性は、それらが結合するAβの線形エピトープからは予測できず、この活性は、ウェスタンブロットによるADDLを検出するそれらの能力またはニューロンに結合した、免疫染色されたADDLを検出するそれらの能力からも予測できなかった。さらに、ADDLを中和し、初代海馬ニューロンとの結合を遮断する本発明の抗ADDL抗体の差次的能力は、抗ADDL抗体が、ニューロンへのADDLの結合を防止する、より関連のある立体構造エピトープとの結合を介して作用するという信念を支持する。本発明の一実施形態である抗ADDL抗体19.3は、ADDLと初代ニューロンとの結合を遮断するだけでなく、ADDL-神経の結合のインピーダンスが有意な生理学的分岐、例えばニューロンの生存、ニューロンの接続およびシグナル伝達を有することの現れである、海馬のスパインの形態に対するADDL誘導性変化を和らげる。抗ADDL抗体19.3は、インビトロおよびインビボモデルの両方において査定した場合、すでに公知である抗ADDL抗体、3B3と比較して薬物動態PKプロファイルの改善をさらに有した。さらに、アミロイド前駆体タンパク質hAPPのヒト型を過剰発現するトランスジェニックマウスに投与した場合、抗ADDL抗体19.3は、血液脳関門を貫通し、脳において濃縮されることが示された。ADDLは脳に局在し、ニューロン機能に悪影響を与えるように作用するので、当業者は、脳における抗体の貫通および濃縮が免疫療法に対して有益であるであろうことを理解および認識すると思われる。総合すると、これらのデータは、抗体19.3などの選択的抗ADDL抗体が、学習および記憶に深く関与する海馬ニューロンへのADDLの結合を遮断できることを実証している。ADの治療のための抗ADDL抗体の有用性は、ADDLがこの疾患に関連する認知低下において基本的な役割を果たしていることを示唆するが、アミロイドプラークそれ自体は示唆しないという証拠が増えていることに基づくWalshandSelkoe,2004,ProteinPept.Lett.,11:213-228。げっ歯類に中枢投与した場合、ADDLはAD脳において上昇し、行動および電気生理学的なエンドポイントにおける損失を誘導するWalshら、2002,Nature,416:535-539;Clearyら、2004,Nat.Neurosci.,8:79-84;Klyubinら、2005,Nat.Med.11:556-561;Balducciら、2010,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,107:2295-2300。学習および記憶における損失もまた、ADDLレベルの上昇に関連する機能障害が発症したhAPP発現マウスモデルにおいて観察されているWestermanら、2002,J.Neurosci.,22:1858-1867;Ashe,2005,Biochem.Soc.Trans.,33:591-594;Leeら、2005,J.Biol.Chem.,281:4292-4299;Lesneら、2006,Nature,440:352-357。認知についてのこれらの効果を仲介する細胞性事象および細胞下事象は完全には理解されていないが、ADDLが海馬ニューロンの樹状突起に局在するシナプス末端に結合しLacoreら、2004,J.Neurosci.,24:10191-1022、樹状スパインの形態および数を改変するLacorら、2007,J.Neurosci.,27:796-807;Shankarら、2007,J.Neurosci.,27:2866-2875;Shughrueら、2010,Neurobiol.Aging.31:189-202することは明らかである。ADDLが、海馬においてGABA性ニューロンおよびグルタミン酸作動性ニューロンの両方に結合するShughrueら、2010、AMPA受容体の内在化をもたらすニューロンが学習および記憶に深く関与するZhaoら、2010,J.Biol.Chem.,285:7619-7632という発見が、ADDLが、これらの神経伝達物質系を直接または間接的に調節するという信念をさらに支持する例えば、Venkitaramaniら、2007,J.Neurosci.,27:11832-11837を参照されたい。本発明において、抗ADDL抗体、3B3米国特許第7,780,963号明細書および米国特許第7,811,563号明細書、これらはその全体が参照により本明細書に組み込まれるに由来する抗ADDL抗体のパネルを、初代海馬ニューロンへのADDLの結合を遮断するそれらの能力に関して査定した。その後、選択されたモノクローナル抗体をヒト化し、さらなる特徴付けのために親和性成熟させた。ADDLに結合するそれらの能力に関して選択されたリード抗体を、単一濃度において、モノマーAβ、ADDLおよび線維性Aβと結合する抗体を決定する、三方向ELISAを使用してさらに査定した。図1に示すように、7種の親和性成熟抗ADDL抗体のうちの6種、特異的抗体14.2、7.2、11.4、13.1、17.1および19.3が、モノマーAβおよび線維性Aβと比較した場合、ADDL選択性であった。続いて、11点の滴定曲線およびELISAを使用して、広範囲の濃度にわたる、抗ADDL抗体と、ADDLおよびモノマーAβAβ1-40との、結合親和性を確認した。図2に示すように、抗ADDL抗体3B3および19.3が、高度にADDL選択性であった。さらに、抗体を、細胞に基づく結合アッセイにおいて比較し、ニューロンへのADDLの結合を遮断する抗体の能力を決定した。図3に示すように、漸増濃度の抗ADDL抗体3B3および19.3と一緒に予備インキュベートしたADDLを、初代海馬ニューロンに加え、滴定曲線を使用して、ニューロンへのADDLの結合を遮断する抗体の能力を定量的に示した。総合すると、これらの結果は、抗ADDL抗体が、細胞に基づくフォーマットにおいてニューロンの結合を大きく減衰させることを示している。アミノ酸配列の査定を実施し、脱アミドの候補部位を同定した。治療用抗体のCDR中に存在するアスパラギンおよびアスパラギン酸の残基は、脱アミドを受け、イソアスパラギン酸を形成することが公知でありValsakandIonescu,2008,Curr.Pharm.Biotech.,9:468-481;Aswadら、2000,J.Pharm.Biomed.Anal.21:1129-1136、その形成は、抗体の結合能力を改変でき、順に、治療薬として使用のための抗体有効性を減少させ得る。したがって、当業者は、19.3抗体のCDR内のアスパラギンまたはアスパラギン酸の存在が望ましくないことを認識および理解するであろう。したがって、出願者らは、軽鎖CDR1の33位のアスパラギン残基を改変し、抗ADDL抗体19.3の安定性を最適化した表4B。19.3抗体の誘導体は、セリン配列番号55、トレオニン配列番号56またはグルタミン酸配列番号67をCDR1中の33位のアスパラギン配列番号1と置換することにより作製された。アスパラギン酸配列番号68と33位のアスパラギンとの置換もまた、対照として作製した。これらの変更は、CDR1中の33位のアスパラギンの脱アミドの可能性を取り除くものである。19.3の誘導体は、実施例3に記載のように作製し、実施例4に記載のようにセリン配列番号55、トレオニン配列番号56、グルタミン酸配列番号67およびアスパラギン酸配列番号68の置換を含む誘導体に対して特徴付け、新しい構築物の安定性を評価した。それぞれ図4Bおよび4Cに示すように、2種の代表的な誘導体、19.3S33配列番号55および19.3T33配列番号56が、さまざまな温度における1ヵ月のインキュベーション後の結合安定性が強化していた。軽鎖CDR1における33および35位のアスパラギン配列番号53および軽鎖CDR2における58位のアスパラギン配列番号54に関する他のアミノ酸置換を、さらなる評価のために表4Bおよび4Cに提示した。本発明の親和性成熟抗ADDL抗体の薬物動態を決定するために、一連のインビトロおよびインビボ研究を実施した。pH6.0における抗体とFcRn受容体との結合Zalevskyら、2010,Nat.Biotech.,282:157-159およびpH7.3USSN61/307,182により、ヒトにおける抗体半減期が予測されることが示されている。本発明の抗ADDL抗体と固定化ヒトFcRnとの結合および解離を、Biacore商標LifeSciences、Biacore商標T-100GEHealthcare、Piscataway、NJにより提供されるものなどの、無標識の相互作用分析により査定した。調整されたセンサーグラムを使用して、pH6.0における抗体の初期結合およびその後の180秒からのpH7.3における抗体の解離を示す。報告点安定性を、pH6.0における結合の終了後5秒に挿入し、結合を、RUstability/RUBindingとして計算した。図5に示すように、ヒト化3B3に関する解離速度off-rateは、抗体19.3を含む本発明の7種の抗ADDL抗体および3種の比較抗体より著しく遅かった。解離速度off-rateが遅いことは、インビボのPKが低いことの指標であると考えられることから、さらなるインビボ研究を、トランスジェニックFcRnマウスヘテロ接合276ヒトFcRnマウス、JacksonLaboratories、BarHarbor、MEにおいて実施した。トランスジェニックFcRnマウスに、抗ADDL抗体3B3または19.3のいずれかの10mg/kgを静脈内IVに投与した場合、薬物動態における有意差が決定された。図7に示すように、抗ADDL抗体3B3の半減期t1/2は比較的短く29±9時間、これはインビトロのBiacore商標データからの予測と一致するが、一方、抗ADDL抗体19.3に関する半減期は有意に長かった77±6時間。概して、抗体3B3に見られるように低いPKは、その小さい生体利用効率により、治療薬として使用するための抗体のさらなる開発が不可能であると思われる。霊長類において抗ADDL抗体19.3の予測半減期を確認するために、抗体に対する霊長類の薬物動態研究を、大槽内移植アカゲザルのコホートにおいて実施した。動物に、抗ADDL抗体19.35mg/kgの単回静脈内IVボーラス注射または皮内SC注射を投薬し、抗体投与後血液を採取した。同時に、CSF試料を、大槽内移植から、定期的に区切られた間隔に採取し、血清およびCSF中の抗ADDL抗体19.3の濃度を、抗ヒトIgGELISAアッセイを用いて決定した。動物に、単回IVボーラス注射により抗ADDL抗体19.3を投与した場合、254±28時間のt1/2図8が観察されたが、一方、204±49時間のt1/2が、皮下投与に関して観察された。さらに、出願者らは、抗ADDL抗体19.3が霊長類のCSFを超えることができ、最初の48時間の間に濃度が上昇し、投薬された抗体の約0.1でピークに達したことを見出した図9。血液脳関門を貫通し、CSFおよび脳に進入する抗体の量を解明する試みにおいて、抗ADDL抗体19.3および2種の比較抗体Comp1およびComp2を、125I標識し、ADのげっ歯類モデルである、hAPPを過剰発現する高齢12ヵ月齢のマウスに投与した。IV投薬の2時間後、約0.02の抗体19.3がCSFにおいて見られ図10A、一方、約0.19の抗体19.3が脳において見られた図10B。同様のレベルが2種の比較抗体に関しても見られた図10Aおよび10B。免疫細胞化学的分析を、投薬したマウスの脳切片において実施し、抗ADDL抗体19.3の局在を決定し図10Cの矢印、プラーク内のAβの沈着に関連する抗体濃縮が観察された図10D。これは、抗ADDL抗体19.3がCSFを貫通し、脳において濃縮されたことを実証していた。近年、hAPPを過剰発現するマウスに投与した場合、外因性ADDLがプラーク内に沈着したことが示されているGasparら、2010,Exp.Neurol.,223:394-400。したがって、本明細書における発見により、局在化された抗ADDL抗体l9.3が、プラークに関連する循環ADDLと結合したことが確認された。抗ADDL抗体のインビボの有効性をさらに評価するために、成長するプラーク内へのADDLの沈着を遮断する抗体19.3の能力を、12ヵ月齢のマウスの海馬にビオチン化ADDLbADDLを4週間毎週注入し、既存のプラークを標識後、hAPPトランスジェニックマウスにおいて査定した図11A。その後、動物に抗体19.3の静脈内注入を4週間毎週与えた図11A。新しい材料ADDLの成長するプラーク内への沈着を、免疫細胞化学的分析により査定した。図11Bおよび11Cに見られるように、抗ADDL抗体19.3は、ビヒクル単独で処理したマウス図11Bと比較して、既存のプラークの周辺へのADDLの沈着を有意に減少させた図11C。総合すると、これらの結果は、抗ADDL抗体、特に19.3抗体が血液脳関門を越え、ADDLに結合し、新しい材料が成長するプラーク内に沈着することを遮断できたことを実証した。ADDLの結合は、さらにニューロンに対して長期の効果を有し得る。最近の研究は、海馬ニューロンへのADDLの結合が、タウのリン酸化をもたらすシグナル伝達カスケードを開始できることを示しているDeFeliceら、2006,Neurobiol.Aging,29:394-400。このシグナル伝達カスケードの一成分であるGSK-3βは、インビボおよびインビトロでADDLにより調節されることも示されているMaら、2006,J.Neurosci.Res.,83:374-384。Maら、2006は、ADDLを減少させる抗体を用いたhAPPマウスの受動免疫化もまた、皮質におけるGSK-3βレベルおよびタウのリン酸化を減少させることを見出した。この発見は、Aβおよびリン酸化タウの間の関連性を裏付け、ADDLの結合がタウの細胞内凝集につながる事象を誘発し得ることを示唆している。さらに、このデータは、本発明の抗体などの、ニューロンへのADDLの結合およびシナプスのスパインの関連する消失を防ぐ抗体が、アルツハイマー病および関連する疾患に関連する認知および/または病理学的転帰を改善できることを示唆している。Aβ由来拡散性リガンド、すなわちADDLの多次元構造を差次的に認識するモノクローナル抗体が、現在作製されている。一部の実施形態において、これらの抗体をヒト化し、親和性成熟させた。抗体は、アルツハイマー病と対照のヒトの脳抽出物を有利に識別し、アルツハイマー病の脳切片および培養された海馬細胞中の内因性オリゴマーを同定する。さらに、本発明の抗体は、内因性および合成のADDLを溶液中で中和する。いわゆる合成ADDLは、精製されたAβ1-42を、ADDLを作製する条件下で混合することによってインビトロで作製する。米国特許第6,218,506号明細書を参照されたい。本明細書に開示の抗体は、ADDLに対して高度の選択性を示し、モノマーAβ種の検出は最小である。さらに、これらの抗体は、ADDL含有調製物が、ラット海馬ニューロンの初代培養物および不死化神経線維芽腫細胞系と結合する能力を差次的に遮断し、ADDLのアセンブリもまた遮断する。この発見は、類似の線形配列認識および親和性にもかかわらず、これらの抗体が、ADDLの多次元構造を認識する差次的能力を保有することを実証している。ADDLは、ニューロンのサブセットと会合し、正常なニューロンの機能を崩壊させることが知られているので、本発明の抗体は、ADDLのニューロンへの結合およびADDLのアセンブリの防止における使用が見出され、アルツハイマー病を含むADDL関連疾患の治療に使用できる。したがって、本発明の一実施形態はADDLの1つまたは複数の多次元構造を差次的に認識する単離抗体である。本発明の単離抗体は、他の抗体を実質的に含まない抗体を指す。しかし、この分子は、抗体の基本的特徴に悪影響を与えない、いくつかの追加の作用因子または部分を含んでもよい例えば、結合特異性、中和活性など。ADDLの1つまたは複数の多次元構造を特異的に結合できる抗体は、Aβ1-42のオリゴマー化に由来する特定のADDLと結合するが、他のAβペプチド、すなわち本明細書に開示のウェスタンブロットアナリシスにより決定されたAβ1-12、Aβ1-28、Aβ1-40およびAβ12-28とは結合せず、溶液中で優先的にADDLと結合する。2つの実体の間の特異的結合は、概して少なくとも106、107、108、109または1010M-1の親和性を指す。108M-1を超える親和性は、特異的結合の達成が望まれる。特定の実施形態において、1つまたは複数のADDLの多次元構造を特異的に結合できる抗体は、ADDLの多次元構造に対しても産生される、すなわち、動物はADDLの多次元構造により免疫化される。他の実施形態において、1つまたは複数のADDLの多次元構造を特異的に結合できる抗体は、Aβ1-42[Nle35-Dpro37]などの低n-mer形成ペプチドに対して産生される。エピトープという用語は、B細胞および/またはT細胞が応答する抗原上の部位またはそれに対して抗体が産生される分子および/または抗体が結合すると思われる分子上の部位を指す。例えば、エピトープは、エピトープを定義する抗体により認識され得る。線形エピトープは、アミノ酸一次配列が、認識されるエピトープを含むエピトープである。線形エピトープは、特有の配列中の少なくとも3、より普通には少なくとも5、例えば約6から約10のアミノ酸を通常含む。線形エピトープとは対照的に、立体構造エピトープは、エピトープを含むアミノ酸の一次配列が、認識されるエピトープの唯一の定義要素ではないエピトープである例えば、アミノ酸の一次配列がエピトープを定義する抗体により必ずしも認識されないエピトープ。通常、立体構造エピトープは、線形エピトープと比較して増加したアミノ酸数を包含する。立体構造エピトープの認識に関して、抗体は、ペプチドまたはタンパク質の三次元構造を認識する。例えば、タンパク質分子が三次元構造を形成するようにフォールドしていた場合、立体構造エピトープを形成する特定のアミノ酸および/またはポリペプチド骨格は、抗体がエピトープを認識できるように並置される。エピトープの立体構造を決定する方法は、限定するものではないが、例えば、X線結晶学、二次元核磁気共鳴分光学および部位特異的スピン標識ならびに電子常磁性共鳴分光学を含む。例えば、EpitopeMappingProtocolsinMethodsinMolecularBiology1996Vol.66,Morris編を参照されたい。アミロイドβ由来拡散性リガンドまたはADDLは、8または9未満のAβ1-42ペプチドの凝集体から構成されることが望ましいAβ1-42の可溶性オリゴマーを指し、アルツハイマー病に関連して見出される。これは、高分子量凝集中間体とは対照的であり、高分子量凝集中間体は、線維の形成につながるミセルの糸を形成する。本明細書に例示するように、本発明の抗体は、ADDLの少なくとも1つの多次元構造を結合または認識する。特定の実施形態において、抗体は、ADDLの少なくとも2つ、少なくとも3つまたは少なくとも4つの多次元構造を結合する。ADDLの多次元構造は、SDS-PAGEを介した分析により定義された、ダイマー、トリマー、テトラマー、ペンタマー、ヘキサマー、ヘプタマー、オクタマー、ノナマー、デカマーなどを包含することが意図される。トリマー、テトラマーなどの称号は、用いるアッセイ方法により変動し得るので例えば、Bitanら、2005,Amyloid,12:88-95を参照されたい、本明細書において使用する場合、トリマー、テトラマーなどの定義は、SDS-PAGE分析に従っている。本明細書において抗体の差次的結合能力を例示するために、ある抗体は1つの多次元構造、例えばADDLのテトラマーを認識し米国特許第7,780,963号明細書、ネズミ抗体2D6および4E2、一方他の抗体はいくつかの多次元構造、例えば、ADDLのトリマーおよびテトラマーを認識する米国特許第7,780,963号明細書、ネズミ抗体2A10、2B4、5F10および20C2ならびにヒト化抗体20C2ことが見出されている。したがって、本発明の抗体は、オリゴマー特異的特徴を有する。特定の実施形態において、ADDLの多次元構造は、本発明の抗体により認識される立体構造エピトープをもたらす、特定のポリペプチド構造に関連する。他の実施形態において、本発明の抗体は、およそトリマーまたはテトラマーのサイズ範囲を有し、50kDaを超える分子量を有する多次元構造ADDLを特異的に結合する。本発明の抗体は類似の線形エピトープを有し得るが、このようなエピトープは、これらの抗体の結合特徴、すなわち、ニューロンへのADDLの結合を遮断し、タウリン酸化を防止し、ADDLのアセンブリを阻害する能力の完全な指標ではなく、このことは当業者には周知であるので、線形エピトープは、抗原のエピトープの一部に相当するだけだと思われる例えば、BreitlingandDubel,1999,RecombinantAntibodies,JohnWileySons,Inc.,NY,pg.115を参照されたい。本発明の抗体は、多次元ADDLを差次的に認識でき、したがって、ニューロンへのADDLの結合を差次的に遮断でき、タウリン酸化を差次的に防止でき、ADDLのアセンブリを差次的に阻害できるので、既存のものと識別できる。本発明に従って使用される抗体は、限定するものではないが、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体およびキメラ抗体、ヒト抗体例えばB細胞から単離された抗体、ヒト化抗体、中和抗体、二重特異性抗体またはこれらの一本鎖抗体を含む。一実施形態において、本発明の抗体はモノクローナルである。抗体の作製のために、ヤギ、ウサギ、トリ、ラット、マウス、ヒトなどを含むさまざまな宿主を、合成または天然のADDLを注射することによって免疫化できる。抗体を作製する方法は、当分野において周知である。例えば、KohlerandMilstein,1975,Nature,256:495-497:HarlowandLane,Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,NewYork,1988を参照されたい。宿主の種に依存して、さまざまなアジュバントを使用し、免疫応答を増加させることができる。本発明に従って使用されるアジュバントは、応答の質的形態に影響を与える、免疫源の立体構造の変化を引き起こさずに、ADDLに対する固有の応答を望ましく増大させる。特に好ましいアジュバントは、3デ-O-アシル化モノホスホリルリピドAMPL商標;RIBIImmunoChemResearchInc.,Hamilton,MT;GB2220211を参照されたいおよびスクワレンまたはピーナッツオイルなどの油中水エマルジョン、モノホスホリルリピドAなどの免疫刺激剤と組み合わされてもよいStouteら、1997,N.Engl.J.Med.,336:86-91を参照されたい、ムラミルペプチド例えば、N-アセチルムラリル-L-トレオニル-D-イソグルタミンthr-MDP、N-アセチル-ノルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミンノル-MDP、N-アセチルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミニル-L-アラニン-2-1’-2’ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ヒドロキシホスホリルオキシ-エチルアミンE-PE、N-アセチルグルコサミニル-N-アセチルムラミル-L-Al-D-イソグル-L-Ala-ジパルミトイルプロピルアミドDTP-DPPまたは他の細菌細胞壁成分を含む。油中水エマルジョンの具体例は、5のスクワレン、0.5のTWEEN商標80および0.5のSPAN85さまざまな量のMTP-PEが含有されてもよいを含有する、Model110YマイクロフルダイザーMicrofluidics、Newton、MAなどのマイクロフルダイザーを使用してサブミクロン粒子に製剤化されたMF59国際公開90/14837号パンフレット;サブミクロンエマルジョンにマイクロフルダイズされた、またはボルテックスにかけ、より大きな粒径のエマルジョンを作製するかのいずれかの、10スクワレン、0.4TWEEN商標80、5のPLURONIC登録商標-ブロック化ポリマーL121およびthr-MDPを含有するSAF;ならびに2のスクワレン、0.2のTWEEN商標80を含有するRIBI商標アジュバント系RASRibiImmunoChem,Hamilton、MTならびにモノホスホリルリピドA、トレハロースジミコレートTDMおよび細胞壁骨格CWSなどの1つまたは複数の細菌細胞壁成分を含む。別のクラスのアジュバントは、STIMULON商標QS-21、Aquila、Framingham、MAなどのサオポニンアジュバントまたはISCOM免疫刺激複合体およびISCOMATRIX登録商標CSLLtd.、Parkville、Australiaなどのサオポニンアジュバントから作製される粒子である。他の適切なアジュバントは、完全フロイントアジュバントCFA、不完全フロイントアジュバントIFA、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲルおよびリゾレシチンなどの界面活性物質、PLURONIC登録商標ポリオール、多価陰イオン、ペプチド、CpG国際公開98/40100号パンフレット、キーホールリンペットヘモシニアン、ジニトロフェノールおよびインターロイキンIL-1、IL-2およびIL-12などのサイトカイン、マクロファージコロニー刺激因子M-CSFおよび腫瘍壊死因子TNFを含む。ヒトに使用されるアジュバントの中で、BCGカルメットゲラン桿菌およびコオリネバクテリウムパルヴムCorynebacteriumparvumが特に適切である。多次元構造ADDLに対する抗体は、ADDLを用いて動物を免疫化することによって作製される。概して、ADDLは、合成的または組み換え断片の発現および精製により作製される。合成ADDLは、本明細書に開示のように、または米国特許第6,218,506号明細書および第7,811,563号明細書または同時係属出願、米国特許出願公開第2007/0218499号明細書、米国特許出願公開第2010/0143396号明細書および米国特許出願公開第2010/0240868号明細書に開示の方法に従って調製でき、これらはすべてその全体を参照により本明細書に組み込まれる。さらに、ADDLを、キーホールリンペットヘモシニアンなどの別のタンパク質と融合させ、キメラ分子に対する抗体を作製できる。ADDLを立体構造的に制限し、本明細書に記載の有用なエピトープを形成でき、さらに、例えば、本発明の抗体により認識される立体構造が作製できるような手段で、表面に物理的に付着または化学的に結合させ、ADDLを表面に会合させることができる。ADDLの多次元構造に対するモノクローナル抗体は、培養液中の連続細胞系による抗体分子の産生を提供する任意の技術を使用して調製できる。これらは、限定するものではないが、ハイブリドーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術およびEBVハイブリドーマ技術を含むKohlerら、1975,Nature256:495-497;Kozborら、1985,J.Immunol.Methods81:31-42;Coteら、1983,Proc.Natl.Acad.Sci.80:2026-2030;Coleら、1984,MolCellBiol.62:109-120。特定の実施形態において、本発明の抗体はヒト化抗体である。ヒト化抗体およびキメラ抗体は、適切な抗原特異性および生物学的活性を有する分子を得るための、マウス抗体遺伝子とヒト抗体遺伝子とのスプライシングにより作製できるMorrisonら、1984,Proc.Natl.Acad.Sci.81,6851-6855;Neubergerら、1984,Nature312:604-608;Takedaら、1985,Nature314:452-454;Queenら、1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:10029-10033;国際公開第90/07861号パンフレットを参照されたい。例えば、マウス抗体はファージ選択ベクター中でFvまたはFab断片として発現される。軽鎖に関する遺伝子および並行実験において重鎖に関する遺伝子を、ヒト抗体遺伝子のライブラリと交換する。その後、さらに抗原に結合するファージ抗体を同定する。一般に鎖シャッフリングとして知られるこの方法は、これが由来するマウス抗体と同じエピトープに結合すべきヒト化抗体を提供するJespersら、1994,BiotechnologyNY12:899-903。代替として、鎖シャッフリングはタンパク質レベルにおいて実施できるFiginiら、1994,J.Mol.Biol.239:68-78を参照されたい。ヒト化抗体はまた、ファージディスプレイ法を使用しても得ることができる。例えば、国際公開第91/17271号パンフレットおよび国際公開第92/01047号パンフレットを参照されたい。これらの方法において、メンバーがそれらの外表面にさまざまな抗体を表示するファージのライブラリが作製される。抗体は、通常FvまたはFab断片として表示される。所望の特異性を有する抗体を表示するファージは、ADDLに対する親和性濃縮により選択される。ADDLに対するヒト抗体もまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子座および不活性化された内因性免疫グロブリン遺伝子座のセグメントを少なくともコードするトランス遺伝子を有する非ヒトトランスジェニック哺乳動物から作製できる。例えば、国際公開第93/12227号パンフレットおよび国際公開第91/10741号パンフレットを参照されたい。ヒト抗体は、競合的結合実験または他の方法により、特定のマウス抗体と同じエピトープ特異性を有するように選択できる。このような抗体は、概して、マウス抗体の有用な機能的特性を保有する。ヒトポリクローナル抗体もまた、免疫原性剤を用いて免疫化されたヒトからの血清の形態で提供され得る。このようなポリクローナル抗体を、ADDLを親和性試薬として使用して親和性精製により濃縮できる。本明細書において例示するように、ヒト化抗体は、ネズミ抗体のベニヤリングまたはリサーフェシングにより作製できる。ベニヤリングは、マウスの重鎖および軽鎖可変領域中の表面固定領域アミノ酸だけを相同ヒト抗体配列のものと置き換えるステップを伴う。マウス表面アミノ酸と相同ヒト配列からの同じ位置のヒト残基とを置き換えることは、マウス抗体の免疫原性を低減する一方、そのリガンドの結合を保存ことが示されている。外部残基の置き換えは、一般的に内部ドメインまたはドメイン間の接触に対してほとんどまたは全く影響を及ぼさない。例えば、米国特許第6,797,492号明細書を参照されたい。ヒト抗体またはヒト化抗体は、IgG、IgD、IgA、IgMまたはIgEの定常領域およびIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4を含む任意のアイソタイプを有するように設計することができる。特定の実施形態において、本発明の抗体は、IgGもしくはIgMまたはこれらの組み合わせである。一具体的実施形態において、本発明の抗体はIgG2である。当業者は、他のアイソフォームが本明細書において利用できることを理解しているであろう。これらのアイソフォームに関する例示的配列を配列番号43-45で示す。本発明の他の実施形態は、ヒトIgG4配列を標準ヒトIgG2定常領域へ選択的組み込むことにより形成される定常領域を包含する。例示的突然変異体IgG2Fcは、配列番号46として示されるIgG2m4である。抗体は、別々の重鎖および軽鎖として、または重鎖および軽鎖の可変ドメインがスペーサーを介して連結される一本鎖抗体として、2つの軽鎖および2つの重鎖を含有するテトラマーとして発現され得る。一本鎖抗体の作製技術は、当分野において周知である。CDRのグラフティングおよびベニヤリングにより作製される例示的ヒト化抗体は、米国特許第7,780,963号明細書、第7,731,962号明細書および第7,811,563号明細書に開示されている。二重特異性抗体もまた企図される。二重特異性抗体は、結合する抗体の結合ドメイン重鎖および軽鎖の両方を単離し、同じポリペプチド鎖上に重鎖および軽鎖を接続または動作可能に連結する連結部位を供給し、その結果結合機能を保存することにより調製された、操作された抗体構築体を指すHolligerら、1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444:Poljak,1994.Structure2:1121-1123を参照されたい。これは、本質的に、抗原を結合するために必要な可変ドメインだけを有する、根本的に短縮された抗体を形成する。同じ鎖上に2つのドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーを使用することにより、ドメインを、別の鎖の相補的なドメインと強制的に対形成させ、2つの抗原結合部位を作る。これらのダイマー抗体断片または二重特異的抗体は、二価であり二重特異性である。当業者は、二重特異性抗体を作製する任意の方法が使用できることを理解していると思われる。適切な方法は、Holligerら、1993、上記;Poljak,1994,上記;Zhuら、1996,Biotechnology14:192-196,および米国特許第6,492,123号明細書により記載され、これらはその全体を参照により本明細書に組み込まれる。本発明の単離抗体の断片もまた、本発明に明確に包含される。断片は、Fab断片、Fab’2断片、Fab’断片、二重特異性scFv断片、Fv断片およびFab発現ライブラリにより作製される断片ならびにペプチドアプタマーを含むことが意図される。例えば、Fab’2断片は、本発明の抗体分子のペプシン消化により作製され、一方、Fab断片は、Fab’2断片のジスルフィド結合の還元により作製される。または、Fab発現ライブラリが、所望の特異性を有するモノクローナルFab断片の迅速かつ容易な同定を可能にするように構築できるHuseら、1989,Science,254:1275-1281を参照されたい。特定の実施形態において、本発明の抗体断片は、これらの可変領域結合部位を保有する中和抗体の断片、すなわち抗原結合断片である。例示的には、Fab’2断片、Fab’断片およびFab断片である。一般的には、Immunology:BasicProcesses,1985,第2版、J.Bellanti編95-97頁を参照されたい。ADDLの多次元構造を差次的に認識するペプチドアプタマーは、アプタマーのライブラリ例えば、AptanomicsSA、Lyon、Franceにより提供されるのために合理的に設計またはスクリーニングできる。概して、ペプチドアプタマーは、その設計が抗体の構造に基づく合成の認識分子である。ペプチドアプタマーは、タンパク質足場の両端に結合した可変ペプチドループからなる。この二重の構造的束縛により、ペプチドアプタマーの結合親和性が、抗体の結合親和性ナノモル範囲に匹敵するレベルまで大きく増加する。本発明の抗体および抗体断片の作製に使用する、重鎖および軽鎖の可変領域をコードする例示的核酸配列を、配列番号14および16で本明細書に開示する。当業者に理解されるように、配列番号16で示されるような本明細書に開示の重鎖可変領域を、本明細書に開示の軽鎖可変領域の任意の1つと組み合わせて使用し、親和性、解離、エピトープなどが改良された抗体を作製することができる。本発明の抗体または抗体断片は、それらに結合する追加の部分を有することができる。例えば、ミクロスフェアまたはミクロ粒子を、米国特許第4,493,825号明細書に記載されるように抗体または抗体断片に結合でき、この開示はその全体を参照により本明細書に組み込まれる。さらに、特定の実施形態は、抗原親和性の増加、中和活性すなわち、ニューロン細胞へのADDLの結合を遮断する能力またはADDLのアセンブリを遮断する能力または解離定数の改良に関して突然変異を起こして選択された、抗原または抗原断片を包含する。大腸菌E.coliの突然変異誘発株Lowら、1996,J.Mol.Biol,260:359-368、鎖シャッフリングFiginiら、1994,上記およびPCR突然変異誘発は、抗体をコードする核酸分子を突然変異させる確立された方法である。実例を用いて、親和性の増加を、多数のファージ抗体と少量のビオチン化抗原とを、抗体が結合を競争するように接触させることによって選択できる。この場合、抗原分子の数は、ファージ抗体の数を超えていなければならないが、抗原の濃度は、解離定数より多少低くあるべきである。したがって、親和性が増加した、優勢に突然変異を起こしたファージ抗体は、ビオチン化抗原に結合し、一方、より親和性の弱いファージ抗体の大部分は未結合のままである。その後、ストレプトアビジンは、混合物からより親和性の高い、突然変異を起こしたファージ抗体の、濃縮に支援できる。Schierら、1996,J.Mol.Biol.255:28-43。例示的親和性成熟軽鎖CDR3アミノ酸配列を本明細書に開示し表4を参照されたい、特定の実施形態は配列番号3の軽鎖CDR3アミノ酸配列および配列番号7-13の具体的実施形態を包含する。本発明は、軽鎖CDR1配列番号53およびCDR2配列番号54に関する代替の変形もさらに包含する。いくつかの治療適用に関して、抗原からの抗体の解離を減少させることが望ましいと思われる。このことを達成するために、ファージ抗体をビオチン化抗原に結合させ、過剰の非ビオチン化抗原を加える。一定時間後、主に解離定数がより低いファージ抗体をストレプトアビジンを用いて回収できるHawkinsら、1992,J.Mol.Biol226:889-96。本明細書に開示のものを含むさまざまな免疫アッセイを、ADDLの多次元構造に対して望ましい特異性を有する抗体またはこれらの断片を同定するためのスクリーニングに使用できる。競合的結合例えばELISA、ラテックス凝集アッセイ、免疫放射定量測定法、ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体のいずれかまたはこれらの断片を使用する動態学例えばBiacore商標分析に関する多数のプロトコルが当分野において周知である。このような免疫アッセイは、通常、特異的抗体およびその同種抗原との間の複合体形成の測定を伴う。2つの非干渉性エピトープに反応性のモノクローナル抗体を利用する、2つの部位のモノクローナルに基づく免疫アッセイが適切であるが、競合的結合アッセイもまた用いることができる。このようなアッセイもまた、試料中のADDLの多次元構造の検出に使用することができる。中和活性または薬理学的活性および予防薬または治療薬としての有効性の可能性を評価するために、抗体または抗体断片を、他の生物学的活性アッセイ、例えばニューロンもしくは培養された海馬細胞に対するADDLの結合の置き換えまたはADDLアセンブリの遮断に供することもできる。このようなアッセイは本明細書に記載されており、当分野において周知である。抗体および抗体の断片は、ハイブリドーマとして作製および維持でき、または代替的、組み換え的によく確立されている発現システムで作製され、限定するものではないが、大腸菌E.coli、酵母例えばサッカロミセス属Saccharomycesspp.およびピキア属Pichiaspp.、バキュロウイルス、哺乳動物細胞例えば、骨髄腫、CHO、COS、植物またはトランスジェニック動物BreitlingandDubel,1999,RecombinantAntibodies,JohnWileySons,Inc.,NY,pp.119-132を含む。任意の十分確立された発現系において組み換え的に作製できる。抗体および抗体の断片は、限定するものではないが、アフィニティクロマトグラフィー、免疫グロブリン結合分子例えば、プロテインA、L、GまたはH、抗体または抗体断片に動作可能に連結されたタグ例えば、His-タグ、FLAG登録商標-タグ、Strepタグ、c-mycタグなどを含む任意の適切な方法を使用して単離することができる。BreitlingandDubel,1999上記を参照されたい。本発明の抗体および抗体断片は、ADDLの蓄積に関連する疾患の診断、ニューロン細胞へのADDLの結合の遮断または阻害、ADDLのアセンブリの遮断、ADDLに関連する疾患の予防的治療または治療的治療、ニューロンへのADDLの結合を防止する治療薬およびSer202/Thr205のタウタンパク質のリン酸化を防止する治療薬の同定を含む、さまざまな使用を有する。本発明の抗体および抗体断片は、ニューロン細胞へのADDLの結合の遮断または阻害のための方法において有用である。本発明のこの方法を、インビトロまたはインビボで、ニューロンと本発明の抗体または抗体断片とを、ニューロンへのADDLの結合が遮断されるように接触させることによって実施する。特定の実施形態において、本発明の抗体または抗体断片は、抗体または抗体断片の不在下におけるADDLの結合と比較して、ADDLの結合において少なくとも15、20、30、40、50、60、70、80、90、95または97の減少を達成する。抗体がニューロンへのADDLの結合を遮断できる程度は、本明細書に開示の方法、すなわち、免疫細胞化学または細胞の基づくアルカリホスファターゼアッセイまたは任意の他の適切なアッセイに従って決定することができる。ニューロン細胞へのADDLの結合を減少させるために特に有用な抗体は、米国特許第7,731,962号明細書、第7,780,963号明細書および第7,811,563号明細書に示される例示的抗ADDL抗体ならびにこれらの誘導体および断片を含む。本発明の抗体および抗体断片は、ADDLのアセンブリを遮断または阻害するための方法においてさらに有用である。この方法は、アミロイドβ1-42ペプチドを含有する試料と、本発明の抗体または抗体断片とを、ADDLのアセンブリが阻害されるように接触させるステップを伴う。抗体が、ADDLのアセンブリを遮断できる程度は、本明細書に開示の方法、すなわち、FRETもしくは蛍光偏光または任意の他の適切なアッセイに従って決定することができる。ADDLのアセンブリを遮断するために特に有用な抗体は、配列番号10で示されるCDR3アミノ酸配列を有する抗ADDL抗体ならびにこれらの誘導体および断片を含む。本明細書に開示の抗体は、Ser202/Thr205のタウタンパク質のリン酸化を防止する方法においてもまた有用である。この方法は、タウタンパク質を含有する試料と、本発明の抗体または抗体断片とを、ニューロンへのADDLの結合が遮断され、その結果タウタンパク質のリン酸化が防止されるように接触させるステップを伴う。抗体が、Ser202/Thr205タウタンパク質のリン酸化を防止できる程度は、本明細書に開示の方法または任意の他の適切なアッセイに従って決定することができる。ニューロンへのADDLの結合の遮断または減少、ADDLのアセンブリの阻害およびSer202/Thr205タウタンパク質のリン酸化の防止はすべて、ADDLの蓄積に関連する疾患の予防的治療または治療的治療の方法における適用が見出される。したがって本発明は、本明細書の抗体または抗体断片の、ADDLの蓄積に関連する疾患例えば、アルツハイマー病または類似の記憶関連障害の予防または治療への使用もまた包含する。当分野における証拠は、Aβのレベルの上昇が、アルツハイマー病関連認知症およびその後のタウの異常を引き起こすが、凝集されたプラークは必ずしもそうではないことを示している。Aβ由来拡散性リガンドはアルツハイマー病に関連する神経毒性に直接関与する。当分野は、ADDLが、トランスジェニックマウスおよびアルツハイマー病患者において上昇し、動物モデルにおける記憶を助ける過程に関連する機能活性を調節することを示している。したがって、Aβのこの型を取り除くことにより、アルツハイマー病に関連する神経毒性からの解放を提供できる。したがって、中枢神経系のADDL負荷を減少させる本発明の抗体を用いた治療は、アルツハイマー病の治療に有効であることを証明できる。治療を受け入れられる患者は、疾患の危険性があるが症状を示さない個体ならびに現在症状を示している患者を含む。アルツハイマー病の場合、彼または彼女が十分長く生きていれば、事実上誰もがアルツハイマー病を患う危険性がある。したがって、本発明の抗体または抗体断片は、対象患者の危険性の評価をなんら必要とせずに一般集団に予防的に投与することができる。本方法は、アルツハイマー病の公知の遺伝的危険性を有する個体に特に有用である。このような個体は、この疾患であることが診断された親類を有する人々およびその危険性が、遺伝子マーカーまたはバイオマーカーの分析により決定された人々を含む。アルツハイマー病の危険性の遺伝子マーカーは、APP遺伝子中の突然変異、特に、それぞれHardy突然変異およびSwedish突然変異と称される、717位ならびに670および671位における突然変異を含む。危険性の他のマーカーは、プレセニリン遺伝子PS1およびPS2ならびにApoE4における突然変異、アルツハイマー病の家族歴、高コレステロール血症またはアテローム性動脈硬化である。現在アルツハイマー病を患っている個体を、特徴的な認知症ならびに上記の危険因子の存在から認識することができる。さらに、多くの診断試験が、アルツハイマー病を有する個体を同定するために利用可能である。これらは、CSFタウおよびAβ1-42のレベルの測定を含む。アルツハイマー病を患っている個体もまた、ADRDA基準または本明細書に開示の方法によって診断することができる。無症候性の患者において、治療は任意の年齢で開始することができる例えば、10、20、30歳。しかし、普通は患者が40、50、60または70歳に達するまで治療を開始する必要はない。治療は通常、一定期間にわたる複数回投薬を伴う。治療は、継時的にADDLの存在に関するアッセイによってモニターすることができる。治療適用において、本発明の抗体または抗体断片を含有する医薬組成物または医薬品を、ADDLの蓄積に関連する疾患が疑われる患者またはすでに患っている患者に、その合併症および疾患の発症における中間の病理学的表現型を含む、疾患の症状生化学的、組織学的および/または行動性を治癒する、または少なくとも部分的に停止させるために十分な量で投与する。予防適用において、本発明の抗体または抗体断片を含有する医薬組成物または医薬品を、ADDLの蓄積に関連する疾患が感染しやすい患者またはその危険性がある患者に、患者において受動免疫が得られるために十分な量で投与し、その結果危険性を排除または減少させ、重症度を低下させ、または疾患の生化学的、組織学的および/または行動性の症状、その合併症および疾患の発症の間に提示される中間の病理学的表現型を含む、疾患の発症を遅延させる。いくつかの方法において、薬剤の投与は、特徴的なアルツハイマー病の病理を未だ発症していない患者における筋認識障害myocognitiveimpairmentを減少させる、または排除する。特定の実施形態において、本発明の抗体または抗体断片の有効量は、治療の不在下におけるADDLの結合と比較して、患者におけるニューロンへのADDLの結合が、少なくとも15、20、30、40、50、60、70、80、90、95または97の減少を達成する量である。したがって、長期増強/記憶形成の機能障害が減少される。上記の病態の治療に関する本発明の組成物の有効な用量は、投与の手段、患者の生理学的状態、患者がヒトまたは動物であるかどうか、投与される他の薬剤および治療が予防的であるかまたは治療的であるかどうかなどを含む、多くのさまざまな因子に依存して変動する。普通、患者はヒトであるが、イヌまたはトランスジェニック哺乳動物などの非ヒト哺乳動物もまた治療することができる。治療投薬量は、一般的に、安全性および有効性を最適化するように用量設定される。抗体または抗体断片を用いた受動免疫化に関して、宿主体重に対して約0.0001から100mg/kg、より普通には0.01から5mg/kgの投薬量範囲が適切である。例えば、投薬量は、1mg/kg体重もしくは10mg/kg体重または1-10mg/kgの範囲内であってよい。いくつかの方法において、異なる結合特異性を有する2種以上の本発明の抗体を同時に投与し、この場合において、投与される各抗体の投薬量は、表示の範囲内にある。抗体は普通複数の機会に投与され、1回の投薬の間隔は、週に1回、月に1回または1年に1回であってよい。例示的治療レジメンは、皮下投薬、2週間に1回または月に1回を必要とする。間隔は、患者におけるADDLに対する抗体の血中レベルの測定により示されるように、不定期であってもよい。いくつかの方法において、投薬量は、1-1000μg/mLの血漿抗体濃度を達成するように調整され、いくつかの方法においては、25-300μg/mLの血漿抗体濃度を達成するように調整される。または、抗体または抗体断片は、持続放出製剤として投与でき、この場合、必要な投与の頻度は少なくなる。投薬量および頻度は、患者における抗体の半減期に依存して変動する。概して、ヒト抗体およびヒト化抗体は、キメラ抗体および非ヒト抗体より長い半減期を有する。上記のように、投与の投薬量および頻度は、治療が予防的であるか治療的であるかどうかに依存して変動し得る。予防適用において、比較的低い投薬量を、比較的低頻度の間隔で長期にわたって投与する。一部の患者は、彼らの生涯にわたって治療を受け続ける。治療適用において、比較的高い投薬量を比較的短い間隔で、時として疾患の進行が減少または終了するまで、および好ましくは患者が、疾患の症状の部分的または完全な改善を示すまで要求される。その後、患者は予防的管理体制を投与され得る。本発明の抗体および抗体断片は、医薬組成物または医薬品の成分として投与され得る。医薬組成物または医薬品は、一般的に活性治療薬およびさまざまな他の医薬として許容可能な成分を含有する。Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,AlfonsoR.Gennaro編、第20版、LippincottWilliamsWilkins:Philadelphia,PA,2000を参照されたい。好ましい形態は、投与の意図された様式および治療適用に依存する。医薬組成物は、所望の製剤に依存して、医薬として許容可能な非毒性担体または希釈剤を含有してよく、これらは動物またはヒトへの投与のための医薬組成物を製剤化するために一般的に使用されるビヒクルとして定義される。希釈剤は、組み合わせる生物学的活性に影響を与えないように選択される。このような希釈剤の例は、蒸留水、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液およびハンクス液である。医薬組成物はまた、大型の、緩慢に代謝される巨大分子、例えばタンパク質、キトサンなどの多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸およびコポリマー例えば、ラテックス官能化HAROSE商標、アガロース、セルロースなど、重合体アミノ酸、アミノ酸コポリマーおよび脂質凝集体例えば、油的またはリポソームも含むことができる。本発明の医薬組成物または医薬品の投与は、限定するものではないが、経口、局所、経肺、直腸、皮下、皮内、鼻腔内、頭蓋内、筋肉内、眼球内もしくは髄腔内または関節内注射などを含む、さまざまな経路で実施できる。投与のもっとも典型的な経路は静脈内、次いで皮下であるが、他の経路も同等に有効であり得る。筋肉内注射もまた、腕または足の筋肉に実施できる。いくつかの方法において、薬剤は、沈着物が蓄積する特定の組織に直接注射され、例えば、頭蓋内または髄腔内注射である。いくつかの実施形態において、抗体または抗体断片は、頭蓋またはCSFに直接注射される。他の実施形態において、抗体または抗体断片は、持続放出の組成物または装置、例えばMEDIPAD商標装置として投与される。非経口投与に関して、本発明の抗体または抗体断片は、水、油、食塩水、グリセロールまたはエタノールなどの無菌の液体であってよい医薬担体を含む、生理学的に許容可能な希釈剤中の該物質の溶液または懸濁液の注射可能な剤形として投与できる。さらに、湿潤剤または乳化剤、界面活性剤、pH緩衝物質などの補助物質が、組成物中に存在してもよい。医薬組成物の他の成分は、石油、動物、植物または合成起源のもの、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油および鉱物油である。一般的には、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどのグリコールが、特に注射可能な溶液に適切な担体である。抗体は、活性成分の持続放出を可能にするような様式で製剤化できる、デポー注射または移植調製物の形態で投与することができる。例示的組成物は、等張の緩衝食塩水10mMのヒスチジン、150mMの塩化ナトリウム、0.01w/vのPOLYSORBATE80、pH6.0中少なくとも10mg/mlの濃度で滅菌の透明な溶液として製剤化された、本発明の単離された抗体またはこれらの抗体断片を含有する。例示的抗体製剤は単回投与として充填され、0.6mlのガラスバイアルに3.3mlの溶液/バイアルを充填した。個々のバイアルは、TEFLONによりコーティングされたストッパーにより塞がれ、アルミニウムキャップで密閉される。通常、組成物は、溶液または懸濁液のいずれかとして注射可能に調製され、注射前に液体ビヒクル中の溶液または懸濁液に適した固形もまた調製できる。調製物はまた、送達を強化するために、乳化されても、またはポリラクチド、ポリグリコリドもしくはコポリマーなどのリポソームもしくはミクロ粒子中にカプセル化されてもよい。坐薬に関しては、結合剤および担体は、例えば、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドを含み、このような坐薬は、0.5から10、より望ましくは1-2の範囲で活性成分を含有する混合物から形成することができる。経口製剤は、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロースおよび炭酸マグネシウムなどの賦形剤を含む。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、持続放出製剤または粉末の形態をとり、10-95の活性成分またはより適切には25-70の活性成分を含有する。局所適用は、経皮送達または皮内送達をもたらすことができる。局所投与は、薬剤とコレラ毒素またはこれらの解毒された誘導体もしくはサブユニットまたは他の類似の細菌毒素とを同時投与することにより容易にすることができるGlennら、1998Nature391:851を参照されたい。同時投与は、成分を混合物として、または化学的架橋または融合タンパク質としての発現により得られる連結分子として使用することによって達成することができる。または、経皮送達は、皮膚経路を使用して、またはトランスフェルソームを使用して達成することができるPaulら、1995,Eur.J.Immunol.25:3521-3524;Cevcら、1998,Biochem.Biophys.Acta1368:201-215。本発明の抗体または抗体断片は、アミロイド形成性疾患の治療に少なくとも部分的に有効である他の薬剤と組み合わせて投与されてもよい。例えば、本抗体は、アルツハイマー病の既存の待機治療、例えば、ARICEPT商標、EXELON商標およびREMINYL商標などのアセチルコリンエステラーゼ阻害剤ならびにNMDAアンタゴニスト、NAMENDA商標などと一緒に投与されてもよい。これらの認可された治療に加えて、本抗体を使用して、アルツハイマー病の治療のために現在開発中の、任意のいくつかの取り組みに相乗的/相加的利益を提供でき、これらは限定するものではないが、Aβの産生および凝集の阻害剤を含む。本発明の抗体および抗体断片はまた、ニューロン例えば海馬細胞へのADDLの結合を防止し、その結果ADDLに起因する下流事象を防止する治療薬の同定において適用が見出されている。このようなアッセイは、ニューロンとADDLとを薬剤の存在下で接触させ、本発明の抗体断片の抗体を使用して、ニューロンへのADDLの結合を薬剤の存在下で決定することによって実施される。当業者に理解されるように、ニューロンへのADDLの結合を遮断する薬剤は、薬剤と接触したことがないニューロンと比較して、ニューロンに結合したADDLの量を減少させるものであり、この量は、本発明の抗体および抗体断片を用いる免疫アッセイにおいて検出可能である。ニューロン結合ADDLを検出するための適切な免疫アッセイを、本明細書に開示する。本明細書に提供した方法を使用してスクリーニングされ得る薬剤は、多数の化学的クラスを包含するが、通常、それらは有機分子、好ましくは100ダルトンより大きく、約2,500ダルトン未満の分子量を有する低分子有機化合物である。薬剤は、タンパク質、特に水素結合との構造的相互作用に必要な官能基を包含し、通常、少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基、好ましくは官能化学基の少なくとも2つを含む。薬剤は多くの場合、環状炭素または複素環構造および/または上記官能基の1つまたは複数が置換された芳香族もしくは多環芳香族構造を含有する。薬剤はまた、ペプチド、抗体、単糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造的アナログまたはこれらの組み合わせを含む生体分子の中に見出され得る。薬剤は、天然または合成の化合物のライブラリを含む広範囲の供給源から得られる。塩および中和タンパク質などのさまざまな他の試薬を、スクリーニングアッセイに含むことができる。さらに、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤などの、アッセイの効率を改良する別の試薬を使用することができる。成分の混合物は、必要な結合を提供する任意の順番で加えることができる。本発明のスクリーニングアッセイにより同定される薬剤は、アミロイド形成性疾患および/またはタウオパシーの治療に有利であると思われる。さらに、これらのコンセプトを例示するために使用される実験系は、タウリン酸化のアミロイドベータ誘導に関連する新規な薬剤標的の評価、同定およびスクリーニングのための調査ツールを提示することが企図される。本発明はまた、本明細書の抗体または抗体断片を使用する、ADDLを検出する方法およびADDLの蓄積に関連する疾患を診断する方法を提供する。ADDLの蓄積に関連する疾患は、ADDLの蓄積が長期増強/記憶形成の生理学的機能障害をもたらす任意の疾患を含むことが意図される。この型の疾患は、限定するものではないが、アルツハイマー病および類似の記憶関連疾患を含む。これらの方法に従って、患者由来の試料を本発明の抗体または抗体断片と接触させ、抗体または抗体断片と試料との結合が、試料中のADDLの存在の指標である。本発明の関連で使用する場合、試料は、免疫アッセイを使用する分析を受け入れられる任意の体液または組織を意味することが意図される。本発明の方法に従って分析できる適切な試料は、限定するものではないが、患者例えば、ヒトなどの哺乳動物由来の脳の生検試料および液体試料を含む。インビトロ目的に関しては例えば、オリゴマー形成をモニタリングするアッセイにおいて、試料はニューロン細胞系または組織試料であってよい。診断目的に関しては、試料は、ADDLの蓄積に関連する疾患を有することが疑われる個体またはADDLの蓄積に関連する疾患を有する危険性がある個体、例えば、個体がADDLの蓄積に関連する疾患にかかりやすい家族歴を有する個体由来であってよいことが企図される。試料における抗体または抗体断片とADDLとの結合の検出は、任意の標準免疫アッセイ例えば本明細書に開示のアッセイを使用して実施することができ、または抗体断片が例えばペプチドアプタマーである場合、結合は、例えば、アプタマーに融合された検出可能なマーカータンパク質例えば、β-ガラクトシダーゼ、GFPまたはルシフェラーゼにより直接検出できる。その後、ADDL-抗体複合体の存在または不在が、試料中のADDLのそれぞれ存在または不在、したがって、ADDLの蓄積に関連する疾患のそれぞれ存在または不在と相関する。本発明の1種または複数種の抗体または抗体断片を、現在の非侵襲性の免疫に基づく画像化技術と併せて使用し、ADDLの蓄積に関連する疾患の検出および早期診断を大幅に強化できることが企図される。診断を容易にするために、本発明はまた、本明細書の抗体または抗体断片を含有するキットに関する。このキットは、ADDLの多次元構造を認識する、1種または複数種の抗体または抗体断片を保持する容器および抗体をADDLへの結合目的で使用し、抗体-抗原複合体を形成させ、抗体-抗原複合体の存在または不在が、試料中のADDLの存在または不在と相関するような抗体-抗原複合体の形成を検出するための取り扱い説明書を含む。容器の例は、多数試料におけるADDLの同時検出を可能にするマルチウェルプレートを含む。本明細書に引用したすべての参考文献は、その全体を参照により本明細書に組み込まれる。本発明を、以下の限定されない実施例により、より詳細に記載する。以下の略称を本明細書において使用する:Ab:抗体;Aβ:アミロイドベータタンパク質;AD:アルツハイマー病;ADDL:アミロイドβAβ由来拡散性リガンド;Ag:抗原;APP:アミロイド前駆体タンパク質;bADDL:ビオチン化ADDL;CSF:脳脊髄液;DMSO:ジメチルスルホキシド;hAPP:ヒトアミロイド前駆体タンパク質;HAT培地:ヒポキサンチン-アミノプテリン-チミジン培地;HFIP:ヘキサフルオロ-2-プロパノール;IV:静脈内;LB寒天:溶原ブロス寒天;SC:皮下;PBS:リン酸緩衝生理食塩水;TEA:トリエチルアミン。一般的材料および方法A.ADDLモノクローナル抗体の作製本明細書において合成ADDLと称される種である可溶性Aβオリゴマーを、完全フロイントアジュバント初回および2回目のワクチン接種または不完全フロイントアジュバントその後のすべてのワクチン接種と1:1で混合し、皮下注射最初の2回のワクチン接種または腹腔内注射により3匹のマウスに、全容積1mL/マウスを与えた。個々の注射は、194±25μgの総タンパク量に相当する精製ADDLからなった。マウスに、およそ3週間ごとに注射した。6回の注射後、1匹のマウスが死亡し、その脾臓を凍結した。もっとも高い力価の血清を有するマウス由来の脾臓を、その後ポリエチレングリコールの存在下でSP2/0骨髄腫細胞と融合させ、6枚の96ウェルプレートに播種した。細胞を、37°C、5CO2で10日間、200μLのヒポキサンチン-アミノプテリン-チミジンHAT選択培地において培養し、HAT選択培地は、イスコフ改変ダルベッコ培地IMDM、Sigma-Aldrich、St.Louis、MOなどの栄養強化合成培地に10ウシ胎児血清FBS、1μg/mLのHYBRI-MAX登録商標アザセリン-ヒポキサンチン;Sigma-Aldrich、MOおよびSP2/0細胞培養液から回収した30の馴化培地を補足して構成されている。培養液に、10のFBSを補足したIMDMSigma-Aldrich、St.Louis、MOを、10日目に一度供給し、培養上清を14日目に取り除き、ELISAにおいて陽性のウェルをスクリーニングした。陽性培養液を、限界希釈法により0.3細胞/ウェルの確率でさらにクローニングした。陽性クローンをELISAにおいて確認し、さらに拡大expandedした。その後、モノクローナル抗体を作製し、使用のために精製したQEDBioscience、SanDiego、CA。B.ADDLおよびbADDLの調製ADDLを、すでに記載の方法を使用して調製したHeplerら、2006,Biochemistry,45:15157-15167;Shughrueら、2010,Neurobiol.Aging,31:189-202。簡潔に言うと、合成Aβ1-42ペプチドAmericanPeptide、Sunnyvale、CAを、ヘキサフルオロ-2-プロパノールHFIPに10mg/mlの濃度で溶解し、室温RTで1時間インキュベートした。ペプチド溶液を、ポリプロピレンの1.5mlの微小遠心管中に50μlのアリコートに分配した。HFIPを、SpeedVac登録商標Thermo-FisherScientific、Waltham、MAを使用して取り除き、得られたペプチドフィルムを、必要となるまで-70°Cにおいて保存乾燥させた。0.5mgの乾燥HFIPフィルムを、22μlの無水ジメチルスルホキシドDMSOに、ボルテックスミキサーにおいて10分間撹拌しながら溶解した。次いで、1mlのフェノールレッドを含まない低温ハムF12培地UnitedBiosource、SanFrancisco、CAを急速にDMSO/ペプチド混合物に加えた。管に蓋をし、反転させ、完全な混合を確実にし、4°Cにおいて一晩インキュベートした。翌朝試料を、10分間、12,000×gでBeckmanmicrocentrifugeBeckmanCoulter、Brea、CAにおいて2-8°Cで作動させ、遠心分離した。上清を回収し、ym50分子カットオフ50,000kDaCentricon登録商標遠心ろ過機Millipore、Billerica、MAを介してろ過し、オリゴマー種を濃縮した。ビオチン化ADDLbADDLを同じ方法を使用して調製したが、N末端ビオチン化Aβ1-42ペプチドAmericanPeptide、Sunnyvale、CAで開始した。C.モノマーおよび線維の調製モノマー調製物を作製するために、RTAβ1-40またはAβ1-42ペプチドフィルムを、2mLの25mMホウ酸緩衝液pH8.5/ペプチド1mgに溶解し、アリコートに分割し、使用まで-70°Cにおいて凍結した。線維調製物を、2mLの10mM塩酸/Aβ1-42ペプチドフィルム1mgを加えることによって作製した。溶液をボルテックスミキサーにおいて、可能な限り低い速度で5分から10分間混合し、得られた調製物を使用まで37°Cにおいて18から24時間保存した。D.初代ニューロン初代ニューロン培養液を、BrainBitsSpringfield、ILから購入したラットの海馬および/または皮質組織から調製した。解離後、細胞を35,000細胞/ウェルでラミニンおよびポリ-D-リジンで予備コーティングされた96ウェルプレートにプレーティングしたCorningLifeSciences、Lowell、MA。細胞を、37°C、5CO2で培地2のB27、1のL-グルタミンおよび1のpen/strepを補足したNeurobasal;Invitrogen、Carlsbad、CAにおいて2-3週間維持し、その後結合研究に使用した。E.細胞に基づくADDL結合アッセイ抗ADDL抗体がADDLの結合を遮断する効果を測定するために、抗ADDL抗体を500nMのbADDLと混合し、最終抗体濃度は1.8nMから450nMに及んだ。対照として、同じ濃度の熱変性98°C、30分間させた抗体を、bADDLと混合させた。抗体-bADDL混合物を、シリコン処理をした微小遠心管FischerScientific、Pittsburgh、PAにおいて、低速で初めから終わりまで一定速度で回転しながら、37°Cで1時間インキュベートした。その後、混合物を、初代海馬および/または皮質培養液に適用し、37°Cにおいて1時間インキュベートした。インキュベーションを、培養培地を取り除くことによって終了させた。細胞を、上記のように固定化および固定後処理に供した。その後、細胞をストレプトアビジン標識アルカリホスフェートAPと一緒に一晩4°Cにおいてインキュベートし、PBSで5回洗浄し、Tropix登録商標CDP登録商標-Star化学発光基質LifeTechnologies商標、Carlsbad、CAと一緒に室温において30分間反応させた。bADDLの結合強度を、EnVision登録商標マイクロプレートリーダーPerkinElmer、Waltham、MAを用いて測定し、記録した。F.ELISAビオチン化ADDLbADDLまたはモノマーAβ1-40またはAβ1-42を、PBS中100μl/ウェルのコーティング試薬を1μMで用いた高容量ストレプトアビジンコーティングプレートSigma-Aldrich、St.Louis、MOに加え、2時間、室温においてインキュベートした。プレートを、0.05Tweenを含むPBS中で洗浄し6回、その後PBS単独3回で洗浄し、その後PBS中5脱脂粉乳を用いて、1時間、室温においてウェルを遮断した。その後ウェルを洗浄し、抗体試料の段階希釈液をプレートに加え、2時間、室温において結合させた。インキュベーションおよび洗浄後、抗体の結合を、ホースラッディシュペルオキシダーゼHRPで標識されたヤギ抗ヒトIgG-Fc二次抗体を用いて検出した1:1,000;1時間、室温において。HRP標識を、テトラメチルベンジジンVirolabs、Chantilly、VAを基質として用いて可視化し、マイクロプレートリーダーにおいて450nmで読み取った。抗ADDL抗体の選択A.ヒト化抗体ライブラリのパニング軽鎖CDR3アミノ酸配列の一部がランダム突然変異誘発に供された、ヒト化抗ADDL抗体の親和性成熟ライブラリ、h3B3米国特許出願公開第2006/0228349号明細書および第2008/0175835号明細書を参照されたいを構築した。全CDR3領域を占めるために、2つのサブライブラリを作り上げた。1つのライブラリは、親の重鎖可変領域重鎖および軽鎖CDR3の左半分の変異アミノ酸で構成され、他方は軽鎖CDR3の右半分の変異アミノ酸で構成される。同様の戦略を、3つのサブライブラリを用いた重鎖CDRのランダム突然変異誘発に使用した。ヒト化3B3h3B3を、当分野において公知の方法を使用して親和性成熟に供した。h3B3可変領域を、FabディスプレイベクターpFab3Dにクローニングした。このベクターにおいて、重鎖および軽鎖に関する可変領域をインフレームで挿入し、それぞれ、定常領域のCH1ドメインおよびカッパ定常領域に一致させた。Fab3Dにおいて、mycエピトープおよび6個の連続するヒスチジンアミノ酸がCH1配列の後に続き、これを、次にファージpIIIタンパク質にディスプレイのために連結する。重鎖および軽鎖のCDR3のすべての位置を、PCRプライマーを組み入れた縮重オリゴヌクレオチド配列を使用してランダムに突然変異誘発した。物理的サイズを適合させるために、サブライブラリを、それぞれ5-6アミノ酸に焦点を合わせて構築した。ヒト3B3H3B3のベクターDNAを鋳型DNAとして使用して、重鎖および軽鎖両方を、変異PCRプライマーを用いて増幅させた表1。PCR増幅後、合成されたDNA断片を、1.3アガロースゲルに泳動させ、プライマーを取り除き、制限酵素を用いて可変断片を消化した:軽鎖可変クローニングに関してはBsiWIおよびXbaIクローニング部位、重鎖可変クローニングに関してはXholおよびApaIクローニング部位。pFab3Dファージディスプレイベクター中に親和性成熟ライブラリを構築するために、pFab3D-3B3のDNAを、制限酵素の同じ対を用いて消化し、精製し、重鎖または軽鎖可変領域に関するPCR断片を、T4リガーゼInvitrogenを用いて一晩、16°Cにおいてライゲ―ションした。ライゲ―ション産物を、その後、大腸菌E.coliTGIエレクトロポレーションコンピテント細胞StratageneAgilentTechnologies、SantaClara、CAにトランスフェクトし、細菌培養液のアリコートをLB寒天-カルベニシリン50μg/mLプレートにプレーティングし、ライブラリサイズを滴定した。残りの培養液を、カルベニシリンを含む大型のプレートにプレーティングし、大腸菌ライブラリストックのために30°Cにおいて一晩イキュベートするか、または、室温および37°Cにおいて10分間インキュベートすることによって、ヘルパーファージM13K07Invitrogen、Carlsbad、CA、1011pfu/mLに感染させるかのいずれかであった。その後、カルベニシリンを含む2YT培地50μg/mLを加え、振とうしながら37°Cにおいて1時間インキュベートした。次いでカナマイシン70μg/mlを加え、培養液を振とうしながら30°Cにおいて一晩成長させた。ファージ培養液上清を滴定し、20v/vのPEGポリエチレングリコール/NaClを用いて沈殿させることによって濃縮し、PBSに再懸濁し、0.22μmのフィルターを用いて滅菌し、ファージライブラリのパニングのためにアリコートを作った。その後、ファージライブラリのパニングを、表2に要約したように実施した。Fabディスプレイファージライブラリからのインプットファージ100μl、約1011-12/pfuを、900μLのブロッキング溶液PBS中3脱脂粉乳で遮断し、ファージ表面への非特異的結合を減少させた。ストレプトアビジンによりコーティングされたビーズを、磁気分離器において200μLのビーズ懸濁液を回収し、上清を取り除くことによって調製した。このビーズを、その後1mLのブロッキング溶液に懸濁し、ロータリーミキサーに30分間かけた。非特異的ストレプトアビジン結合ファージを取り除くために、ブロックされたファージライブラリを、ブロックされたストレプトアビジンによりコーティングされたビーズと混合し、ロータリーミキサーに30分間かけた。除外過程からのファージ懸濁液を新しい管に写し、200μLの抗原、10のbADDLを加え、抗体と抗原との結合のために2時間インキュベートした。インキュベーション後、混合物を、ブロックされたストレプトアビジンによりコーティングされたビーズに加え、ロータリーミキサーにおいて1時間インキュベートし、Ab/Ag複合体をストレプトアビジンビーズに捕捉した。捕捉された10のbADDL/ファージ複合体を含むビーズをPBS/0.05Tween20で5回洗浄し、その後、PBS単独で2回洗浄した。結合されたファージを、200μLの100mMTEASigmaAldrich、St.Louis、MOを用いてbADDLから溶出し、20分間インキュベートした。その後、溶出されたファージを50mLの管に移し、100μLの1MTris-HCl、pH7.5を用いて中和し、OD600nmが0.6-0.8の間の10mLの大腸菌TG1細胞に加えた。振とうしながら37°Cにおいて1時間インキュベーション後、培養液のアリコートを、LB寒天-カルベニシリン50μg/mLプレートにプレーティングし、アウトプットファージの数を滴定し、残存する細菌を遠心分離にかけ、500μlの2×YT培地Teknova、Hollister、CA、に懸濁し、100μg/mlのアンピシリンおよび1のグルコースを含有する、バイオアッセイYT寒天プレートTeknova、Hollister、CAにプレーティングした。バイオアッセイプレートを、30°Cにおいて一晩成長させた。パニングの各ラウンドの後で、単一コロニーをランダムに採集し、96ウェルプレートにおいてファージを作製した。96ウェルプレートにおけるファージ調製の手順は、ファージ沈殿ステップを使用しなかったこと以外は上記の手順と同様であった。100μg/mlのアンピシリンおよび0.1のグルコースを含む120μLの2×TY培地において成長するコロニーを含有する培養プレートを、HiGro登録商標シェーカーGenomicSolutions、AnnArbor、MIにおいて30°Cで、450rpmにおいて振とうしながら一晩インキュベートした。ファージ上清約100μLを、上記のADDL結合ELISAにおける分析に直接使用した。1つの違いは、ADDLへのファージの結合を、HRPAmershamBioscience、GEHealthcare、Waukesha、WIで標識された抗M13-抗体を用いて検出したことである。抗ADDL抗体の同定軽鎖親和性成熟の取り組みから、ファージ/FabELISAにおいてh3B3と比較した場合、7種のクローンのパネルがADDLへの強い結合活性を示したデータ未掲載。7種のクローンを、IgG変換のために選択し、さらなる特徴付けのためにモノクローナル抗体を作製し、精製した。A.抗ADDL抗体の選択実施例2に記載のライブラリのパニングおよびスクリーニングの後、7種のリーディングFabクローン表3-5を、IgG変換のために選択した。表3は、親抗体のh3B3に対して、軽鎖親和性成熟ライブラリから選択されたクローンとのアミノ酸類似性を示す。表4Aは、選択されたクローンの軽鎖のCDR3における、親抗体のh3B3に関する軽鎖のCDR3とのアミノ酸の数の違いを要約する。表4Bは、選択されたクローンの軽鎖のCDR1における、親抗体の19.3に関する軽鎖のCDR3とのアミノ酸の数の違いを要約する。表4Cは、選択されたクローンの軽鎖のCDR2における、親抗体の19.3に関する軽鎖のCDR3とのアミノ酸の数の違いを要約する。表5は、選択されたクローンと親抗体h3B3に関する軽鎖可変領域の一部21-117位のアライメントである。各クローンのCDR3は太字で示してある。B.IgG変換変換されたIgGを、プラスミドに基づくベクターを使用して発現させることができる。発現ベクターを、可変領域を除くすべての必要な成分をそれらが含有するように作り上げた。基本ベクターにおいて、軽鎖および重鎖の両方の発現を、ヒトCMVプロモーターおよびウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナルにより駆動させた。IgG変換のために選択された7種のクローンに関して、重鎖可変領域を、ヒトIgG2重鎖定常領域配列番号20および21とインフレーム融合させ、一方、軽鎖可変領域は、カッパ軽鎖定常領域配列番号18および19とインフレーム融合させた。抗体の培養培地への分泌を仲介する、重鎖配列番号29および30および軽鎖配列番号31および32のリーダー配列もまた、それに応じて可変領域とインフレーム融合させた。重鎖発現ベクターに関して、定常領域は、異なるサブクラスのアイソタイプ、例えばIgG1またはIgG2から選択することができる。リーダー配列と定常領域との間の、遺伝子間配列は、In-FusioncloningstrategyClontech、MountainView、CAを使用する、入ってくる可変領域と、その5’末端におけるリーダー配列とのシームレスなインフレーム融合およびその3’末端における定常領域とのシームレスなインフレーム融合のために、クローニング配列を含有する。In-Fusion商標Dry-DownPCRCloningKitsClontech、MountainView、CAを、可変領域のPCR増幅のために使用した。dry-downcloningkitは、PCR反応に必要なすべての成分を含有する。PCRプライマーおよび鋳型DNAを加えた。発現ベクターは、EBVウイルスゲノム由来のoriPを担持する。oriP/EBNA1対は、多くの場合、トランスフェクトされた細胞内部の発現ベクターの存在を遅延するために使用され、293EBNA細胞、カナマイシン選択マーカーのための細菌配列および大腸菌の複製起点における遅延発現のための、発現期間の延長のために広く使用されるLindnerら、2007,Plasmid58:1-12。可変領域を挿入した場合、IgGが、哺乳動物細胞において直接発現された。本明細書のすべての重鎖可変領域を、IgG1発現ベクターpV1JNSA-BF-HCG1内にクローニングし、軽鎖可変領域を、適合するカッパまたはラムダ発現ベクターpV1JNSA-GS-FB-LCK内にクローニングした。C.抗体のクローニング得られた抗体発現ベクターのためのクローニング手順は以下のとおりである。可変領域をPCR増幅し、PCR反応は、高正確性PCRマスターミックスhighfidelityPCRmastermix、鋳型体積1μLおよびフォワードプライマーおよびリバースプライマー:各1μLを含有する体積25μLで実施した。PCR条件:94°C、2分を1サイクル;94°C、1.5分;60°C、1.5分;72°C、1.5分および72°C、7分を25サイクル;取り出しまで4°C。PCR産物を、次いでDpnIを用いて消化し、QIAquickplatekitQiagen、Venlo、TheNetherlandsを用いて精製した。100ngの対応する、すでに直線化された重鎖または軽鎖ベクターを、10ngのPCR断片にIn-FusionreactionIN-FusionDry-DownCloningKit、Clontech、MountainView、CAを用いてアニーリングした。反応混合物を、XL2BlueMRF’コンピテント細胞に形質転換させ、50μg/mLのカナマイシンを含有する寒天プレートに一晩プレーティングした。軽鎖構築体を、HindIIINotIを用いて消化し、重鎖構築体をAspIHindlllを用いて消化し、制限分析により構造を確認した。すべてのクローンに関するDNA配列を、シークエンシングにより確認した。D.哺乳動物細胞における抗体発現および精製軽鎖および重鎖DNAmpシークエンシングにより確認された構築体を、293Freestyle細胞Invitrogen、Carlsbad、CAにトランスフェクトした。293Freestyle細胞を、293TransfectinInvitrogen、Carlsbad、CAを使用してトランスフェクトした。EBNA単相細胞を、PEIに基づくトランスフェクション試薬を使用してトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、37°C/5CO2において7日間、Opti-MEM無血清培地Invitrogen、Carlsbad、CAにおいてインキュベートした。培地を回収し、遠沈させ、0.22μmのろ過系Millipore、Billerica、MAを介してろ過し、その後、Centricon登録商標遠心フィルターMillipore、Billerica、MAにより濃縮した。濃縮された培地を結合緩衝液Pierce、ThermoFisherScientific、Rockford、ILと1:1で混合し、次いで、予備平衡化プロテインA/GカラムPierce、ThermoFisherScientific、Rockford、ILまたはGEHealthcare、Waukesha、WIによるHItraprProteinAFFに添加した。添加されたカラムを結合緩衝液で洗浄し、溶出緩衝液Pierce、ThermoFisherScientific、Rockford、ILで溶出した。溶出された抗体を迅速に中和し、緩衝液PBSに対して一晩透析した。透析された抗体を、Amicon遠心フィルターPierce、ThermoFisherScientific、Rockford、ILを用いて濃縮し、タンパク質濃度を、OD280nmにより1.34mg/mLの減衰係数を用いて決定した。生成された抗体を、SDS-PAGEInvitrogen、Carlsbad、CAまたはタンパク質用ラボチップproteinlabchipCaliperLifeSciences、Hopkinton、MAを使用して分析した。SDS-PAGEを、非還元条件下で行った。抗体19.3に関する軽鎖CDR1の33位のアスパラギンN33の、N33S配列番号55、N33T配列番号56、N33E配列番号67またはN33D配列番号68への突然変異誘発を、QuikChangeIIXLSite-DirectedMutagenesisKitAgilentTechnologies、LaJolla、CAを使用して、WT発現ベクターのpV1JASN-GS-19.3-LCKから部位特異的突然変異誘発により実施した。Nに関するコドンAATを、19.3S33配列番号55においてSに関するAGTに、19.3T33配列番号56においてTに関するACTに、19.3E33配列番号67においてEに関するGAAに、または19.3D33配列番号68においてDに関するGATに突然変異させ、この位置における新しいコドンがDNAシークエンシングにより確認された。これらの突然変異体に関する完全長IgG抗体を作製するために、それぞれの軽鎖プラスミドを、293FreeStylecellsInvitrogen、Carlsbad、CAにおける一時的トランスフェクションのために、同族重鎖プラスミドpV1JNSA-19.3-HCG2と対形成させた。発現および精製の方法は、この実施例の上に記載した。精製された突然変異抗体のアリコートと一緒に19.3親抗体配列番号1を、4°C、25°Cまたは40°Cにおいてさまざまな条件下で1ヵ月間インキュベートし、その後図4A-4Cに示したELISA分析に供した。抗ADDL抗体の特徴付け選択された抗ADDL抗体、すなわち親抗体のh3B3に由来する抗体を、まず三方向AβELISAにおいて査定し、モノマーAβ、ADDLおよび線維性Aβに対する抗体の結合を評価した。図1に示すように、抗体9.2を除くすべての抗ADDL抗体が、h3B3、選択的Comp1および3:ADDLだけに結合、非選択性Comp2:評価したすべてのAβ型と結合する比較因子および対照抗体なしと相対的なADDLの優先的結合を示した。抗体9.2は、Aβのすべての型と低い結合を示し、これは、その結合親和性がIgG変換および/または抗体産生の間に悪影響を及ぼすことを示唆した。全滴定曲線図2を、各抗体およびh3B3に関して作製し、モノマーAβと比較した、ADDLに関するそれらの結合親和性を決定した。7つの親和性成熟抗体のうちの6つがADDLに対して優先的結合を示したにもかかわらず、出願者らは、ADDLへの優先的結合を有するいくつかの抗ADDL抗体が、初代海馬ニューロンへのADDLの結合を防止できないことをすでに示しているShughrueら、2010、Neurobiol.Aging,31:189-202、図1。ADDLに対する優先的結合だけでは有効性の正確な予測因子にはなり得ないので、さらにニューロンへのADDLの結合を遮断する抗ADDL抗体を同定することが望ましいものであり、このことは、以下のような細胞に基づく結合アッセイにおいて評価できる。抗体をADDLと一緒に予備インキュベートし、その後、初代海馬培養液に加え、ADDL結合のそれらの遮断を査定した。この研究の結果は、本明細書の抗ADDL抗体、特に抗体19.3が、ニューロンへのADDLの結合を劇的に減少させたことを示した図3。しかし、抗体を熱変性させた場合、このアッセイにおける抗体活性の著しい減少が観察された図3。EC50の決定。高タンパク質結合プレートCostar、Corning、Lowell、MAを、PBSにおいて一晩、4°Cにおいて標的リガンドを用いてコーティングした。コーティングタンパク質の濃度は、Aβ40AmericanPeptide、Sunnyvale、CAに関しては100pmol/ウェルおよびADDLに関しては50pmol/ウェルであった。ADDLを、実施例1Bに記載のように作製した。翌日、プレートをPBS0.05Tween-20SigmaAldrich、St.Louis、MOを用いて5回洗浄し、カゼインブロッキング緩衝液ThermoScientific、Waltham、MAおよび0.05Tween-20を用いて一晩遮断した。実施例3に記載のように作製された3つの代表的抗体、19.3図A、19.3S33図4Bおよび19.3T33図4Cを、15μg/mlから0μg/mlで、12点の3倍段階希釈液において試験した。室温におけるインキュベーションの2時間後、プレートを洗浄し、アルカリホスファターゼ標識抗ヒトIgGThermoScientific、Waltham、MAを0.08μg/mlで加えた。室温におけるインキュベーションの45分後、プレートを洗浄し、Tropix登録商標CDP登録商標-Star化学発光基質LifeTechnologies商標、Carlsbad、CAを加えた。発光を、30分後にEnVision登録商標マイクロプレートリーダーPerkinElmer、Waltham、MAにおいて検出した。曲線適合を、GraphPadPrismGraphPadSoftware、Inc.,SanDiego、CAソフトウェアを使用して完了した。抗ADDL抗体のインビトロのFcRnの結合固定化されたヒトFcRnと結合および解離する抗ADDL抗体の能力を特徴付けるために、7種の本明細書の抗ADDL抗体を、BiacoreFcRn結合アッセイにおいて評価し、代理系を使用して、抗体のPKを評価し、非ヒト霊長類における抗体の末期相半減期t1/2を予測した。簡潔に言うと、精製されたヒトFcRnタンパク質をBiacoreCM5バイオセンサーチップに固定し、PBSP50mMのNaPO4、150mMのNaClおよび0.05v/vSurfactant20pH7.3を、ランニング緩衝液として使用した。mAbをPBSP、pH6.0を用いて100nMに希釈し、FcRnを3分結合させ、平衡に到達させ、その後pH7.3のランニング緩衝液において解離させた。報告点安定性を、mAbの結合の終了後5秒に報告点安定性を挿入し、結合を、RUStability/RUBindingとして計算した。出願人らは、同一のFc配列を含むが、異なるFabドメインを含むモノクローナル抗体mAbは、かなりの違いでFcRnと結合および解離できるデータ未掲載ことを見出した。さらに、中性pHにおける解離とインビボの薬物動態との間には明らかな相関が観察され、ゆっくりとした解離率を有するmAbすなわちより高い結合は、インビボでより短いt1/2を示す傾向がある。この特性を、抗体の薬物動態に関するインビトロのスクリーニングツールとして使用した。本明細書の7つの抗ADDL抗体とともにh3B3、2つのADDL優先性抗体Comp1および3および非選択性Comp2:評価したすべてのAβ型に結合する比較因子をFcRn結合アッセイにおいて比較した。pH6.0において抗体の初期結合を示し、その後、180秒からpH7.3において抗体の解離を示すセンサーグラムを作成した図5。図5に示されるように、h3B3および査定した他の抗体の間には顕著な違いがある。h3B3は、FcRnへの高い結合パーセントを有したが、一方、7種の本発明の抗ADDL抗体および2つの比較抗体は、大幅に低い結合を示した。抗ADDL抗体19.3の特徴付け親和性成熟抗体19.3を、さらなる特徴付けのために選択した。軽鎖の可変領域に関する完全DNA配列および推定アミノ酸配列、それぞれ配列番号14および15を決定した。重鎖可変領域配列番号17および軽鎖配列番号15可変領域ともっとも近い生殖細胞系配列番号47とのアライメントを図6Aに示した。重鎖および軽鎖の可変領域の3Dモデルおよび6つの相補性決定領域CDRの位置を、図6Bに示す。Biacore商標GEHealthcare、Waukesha、WIおよびKinExASapidyne、Boise、ID分析を実施し、ADDLに対する抗ADDL抗体19.3の結合親和性を確かめ、ADDL対モノマーAβに対する19.3の選択性を決定した。Biacore商標およびKinExAに基づく技術は、抗体およびタンパク質標的などの巨大分子の間の結合親和性の測定に広く使用されている。Biacore商標の基になる表面プラズモン共鳴SPR技術において、1つまたは複数の分子間の結合相互作用の定量的測定は、標的分子のセンサーチップ表面への固定化に依存する。標的に対する結合パートナーはチップを通過するので、それらは捕捉できる。表面プラズモン共鳴SPRは、屈折率の変化を測定することによって、センサーチップ表面に近い水層における質量の変化を検出する。試験溶液中の分子が標的分子に結合した場合、質量は増えka、それらが解離した場合、質量は減るkd。この単純な原理がセンサーグラム-相互作用する分子の会合および解離の、連続するリアルタイムのモニタリング-の基礎を形成する。センサーグラムは、結合特異性、試料中の分子の活性濃度、動態および親和性に関するリアルタイムの定量的情報を提供する。SapidyneInstruments、Boise、IdahoによるKinExA技術は、結合定数を測定し、溶液相中の生体分子結合事象を特徴付けるが、溶液相と固相との間の結合事象は特徴付けない。溶液において、十分なインキュベーション後、結合パートナーは平衡に達する。未結合分子を滴定により定量化し、これはパートナーに結合した分子の部分を反映するものである。KinExA法は、研究下の分子の改変を必要としない。KinExAにより、測定される反応が溶液中の改変されない分子間で起こる。したがって、どのように改良が天然の結合反応を変化させるかの懸念が排除される。KinExA法は、10-13M程度の厳しい、より広範囲の結合定数も可能である。KinExAソフトウェアはデータ分析を実行し、これは、古典的な結合方程式kd数学に対する厳密解に基づき、疑似一次近似には基づかない。KinExAは、任意データ操作および範囲選択を必要としない。表6に示すように、抗体19.3は、Biacore商標アッセイにおいて、モノマーAβに対する150nMの親和性と比較して、ADDLに対して4.8nMの親和性を有した。Aβモノマーに対する親和性を30倍のADDLに対する抗体19.3の選択性は、親抗体のh3B3に見られるものより著しく優れており、親抗体のh3B3は、Aβモノマーと対比してADDLにわずか10倍の優先性を示した。同様に、抗体19.3を、KinExAに基づく平衡定数測定において評価した。表7に示すように、抗体19.3は、2.7nMの平衡定数を有し、これは、同じアッセイにおいて、Aβ40モノマーの結合と対比してADDLオリゴマーに6倍を超える優先性を提示する。抗ADDL抗体19.3の生物物理学的特徴付け抗体凝集体形成に関する可能性を査定するための生物物理学的特徴付けを実施し、本明細書の抗ADDL抗体がストレス条件下で安定であり、治療としての使用に適切であることを示す。抗ADDL抗体19.3を50mg/mLを上回るように濃縮し、pHが5.0から8.0の範囲の多くの製剤に配置した。2組の試料を、37°Cおよび45°Cにおいて1週間インキュベートした。第3の試料のセットは、-70°Cに配置し、5回の凍結/解凍のサイクルを開始した。サイズ排除クロマトグラフィー分析により、抗体調製物が主に>95モノマー状態であり、ダイマーは少量であることが示され、これはモノクローナル抗体に典型的であった。ダイマーおよび高分子量オリゴマーの量は、すべての緩衝液にわたって温度ストレス後に増加せず、分裂は観察されなかった。表8に要約するように、近紫外濁度分析もまた、凝集の欠如を示した。凍結/解凍ストレスがかかった試料は、濁度において緩衝液依存性増加を示し、これは他のモノクローナル抗体に匹敵した。50mg/mLにおける粘度は2センチポイズを下回り、20センチポイズレベルが皮下注射の実用限界であると一般的に考えられているので、許容可能な注射粘度を示した。示差走査熱量測定法もまた、許容可能な熱安定性を明らかにし、Fabは約72°Cにおいてアンフォールディングであり、もっとも安定性が低いCH2ドメインは65°Cより上でアンフォールディングであった。総合すると、抗体19.3は、皮下送達に対応する生物物理学的特性を有する非常に優れた構造安定性が実証された。19.3の薬物動態分析およびADモデルにおける有効性A.ヒトFcRnマウスにおける薬物動態研究ヒトFcRnマウスヘテロ接合Tg276JacksonLaboratories、BarHarbor、MEは、近年、モノクローナル抗体薬物動態を評価するための有益な代理システムとして提案されている。ヒトFcRnマウスにおいて抗ADDL抗体19.3の薬物動態を特徴付けるために、3匹の動物に、尾静脈を介して10mg/kgの抗体19.3の単回静脈内注射を与えた。その後、一連の10μLの血液試料を、抗体19.3またはh3B3のIV投与後0、25、50、75、100、150、250および350時間の時点で回収し、認証された抗ヒトIgG免疫アッセイを使用して、抗体の血中レベルを決定した。図7に示すように、抗体19.3の血中レベルは二相の様式で低下し、明白なt1/2は77±6時間であり、これは親抗体のh3B3の半減期の約29±9時間より大幅に長かった。これらの半減期は、インビトロのFcRn結合アッセイにより予測された差と一致した図5。排出相末期相半減期を、非コンパートメントモデルWinNonlin登録商標、Pharsight、Sunnyvale、CAを使用して決定し、データは、投薬後3日および15日の間を示す。B.非ヒト霊長類における薬物動態研究霊長類における19.3の予測t1/2を確認するために、霊長類の薬物動態研究を、抗ADDL抗体19.3に関して、大槽内移植アカゲザルのコホートにおいて実施した。6匹の動物3匹の雄/3匹の雌に、抗体19.35mg/kgの単回静脈内ボーラス投与または皮下注射を投薬し、抗体投与後に血液試料を回収した。同時に、CSF試料を、大槽内移植から0、2、4、8、12、24、30、48、54および72時間に回収し、血清およびCSF中の抗体19.3の濃度を、抗ヒトIgGELISAアッセイを用いて決定した。動物に、抗体19.3の単回IVボーラス注射を投与した場合、254±28時間のt1/2が観察され、一方、皮下投与後204±49時間のt1/2が見られた図8。さらに、出願者らは、抗体19.3が霊長類のCSFを超えることができ、最初の48時間の間に濃度が上昇し、投薬された抗体の約0.1でピークに達したことを見出した図9。C.マウスの脳における125I標識抗ADDL抗体19.3の分布脳に達する抗体の濃度を決定する試みにおいて、12ヵ月齢の雄Tg2576マウスB6系統;SJL-TgNAPPSWEに、200μgの125I標識19.3抗体約8mg/kg、または2つの比較抗体のうちの1つを注射し尾静脈、血液およびCSFを2時間後に回収した。残留放射能を、脳の取り出し前にPBSを用いて心かん流を介して脳の血管から一掃した。血液、CSFおよび脳全体の試料を、次いでガンマカウンターに配置し、各試料中に存在する放射標識抗体の量を決定した。計数後、脳を、4パラホルムアルデヒドにおいて48時間固定し、その後、浮遊性免疫細胞化学のために処理した。マウス脳における抗体19.3の局在化を、抗ヒト二次抗体および標準ABC検出方法を用いて検出した。この免疫反応性を、次いでチオフラビンS染色プラークを検出する染料と組み合わせ、マウスの脳における抗体とプラークの共局在化を決定した。図10Aおよび10Bに示すように、放射標識抗体19.3は、血液脳関門からマウスCSFおよび脳に貫通できた。さらに、データは、CSFにおいて見られたレベル0.02と比較した場合、抗体19.3が脳において豊富であった0.19ことを示した。脳におけるこの濃度が抗体19.3とAβとの会合によるかどうかを決定するために、脳を固定し、免疫細胞化学のために処理した。老齢のTg2576マウスの脳における抗体分布の分析により、抗体19.3が、脳においてチオフラビンS陽性アミロイドプラークと会合したことが明らかにされた図10Cおよび10D。これらのデータは、抗体19.3が、トランスジェニックマウスの脳に貫通でき、対象となるAβ種と結合できたことの最初の証拠を提供した。プラーク沈着モデル脳においてADDLのアミロイドプラークへの沈着を減らす、抗ADDL抗体19.3の能力をさらに査定するために、12ヵ月齢の雄Tg2576マウスTaconic、NYに、毎週片側性にカニューレを挿入し、bADDL50pmol/μLを毎週、4週間の間海馬に注入した図11A。最終のbADDL処置の1週間後、マウスの半数n=5/処置に、毎週、4週間の間PBSを投薬し尾静脈、一方、残りの動物には、200μgの抗ADDL抗体約8mg/kgを毎週投薬した。すべての動物を、最終処置の1週間後に安楽死させ、それらの脳を免疫細胞化学のために処理した。bADDLおよびプラークの検出のために、脳の切片を、StreptavidinAlexaFluor登録商標594Invitrogen、Carlsbad、CAとともにインキュベートし、スライドに載せ、プラークはチオフラビンSを用いて染色した。その後、プラークの蛍光画像を、PerkinElmerRapidConfocalImagerおよびUltraVIEWERSソフトウェアを用いて取り込み、プラーク成長の違いを定量化した。このモデルの詳細は、近年発表されたGasparら、2010,Exp.Neurol.,223:394-400。処置の1ヵ月後、ビヒクル単独で処置した動物と比較した場合図11B、新しいADDLの既存のプラークへの沈着における有意な減少が、抗体19.3図11Cを用いて処置された動物において見られた。"