"多能性幹細胞の増殖を支持するアルブミン不含培地。各々、多能性幹細胞増殖を支持するのに十分な量の、水と、塩類と、アミノ酸と、ビタミン類と、炭素源と、インスリンと、FGFと、セレンと、トランスフェリンと、TGF-β及びNODALのうちの1つと、を含む、請求項1に記載の培地。多能性幹細胞を培養する方法であって、マトリクス上に多能性幹細胞を置く工程、及び前記細胞を多能性幹細胞増殖を支持するアルブミン不含培地と接触させる工程、を含む、方法。前記培地が、各々、多能性幹細胞増殖を支持するのに十分な量の、水と、塩類と、アミノ酸と、ビタミン類と、炭素源と、インスリンと、FGFと、セレンと、トランスフェリンと、TGF-β及びNODALのうちの1つと、を含む、請求項3に記載の方法。前記マトリクスが、ラミニンを含む、請求項3に記載の方法。前記マトリクスが、ビトロネクチンを含む、請求項3に記載の方法。前記細胞を低酸素条件下で前記培地と接触させる、請求項3に記載の方法。前記多能性幹細胞が胚性幹細胞である、請求項3に記載の方法。前記多能性幹細胞が、誘導多能性幹細胞である、請求項3に記載の方法。前記多能性幹細胞が、ヒト細胞である、請求項3に記載の方法。多能性幹細胞をクローン化する方法であって、多能性幹細胞を、クローン化密度で、多能性幹細胞のクローン化を支持するアルブミン不含培地中にプレーティングする工程、を含む、方法。前記培地が、各々、多能性幹細胞のクローン化を支持するのに十分な量の、水と、塩類と、アミノ酸と、ビタミン類と、炭素源と、インスリンと、FGFと、セレンと、トランスフェリンと、TGF-β及びNODALのうちの1つと、を含む、請求項11に記載の方法。前記培地が、ROCK阻害剤を更に含む、請求項11に記載の方法。前記ROCK阻害剤が、HA100及びY27632からなる群から選択される、請求項13に記載の方法。前記培地が、ブレビスタチンを更に含む、請求項11に記載の方法。多能性幹細胞を凍結保存する方法であって、多能性幹細胞をアルブミン不含培地中で凍結させる工程、を含む、方法。前記培地が、各々、多能性幹細胞増殖を支持するのに十分な量の、水と、塩類と、アミノ酸と、ビタミン類と、炭素源と、インスリンと、FGFと、セレンと、トランスフェリンと、TGF-β及びNODALのうちの1つと:を含む、請求項16に記載の方法。定義された条件下で誘導多能性幹iPS細胞を誘導する方法であって、体細胞を、iPS細胞を誘導するために、体細胞のリプログラミングを支持するアルブミン不含培地中でリプログラミングさせる工程、を含む、方法。前記培地が、各々、iPS細胞の誘導を支持するのに十分な量の、水と、塩類と、アミノ酸と、ビタミン類と、炭素源と、インスリンと、FGFと、セレンと、トランスフェリンと、TGF-β及びNODALのうちの1つと、を含む、請求項18に記載の方法。前記リプログラミングさせる工程が、前記細胞をTGF-βと5~10日間接触させることを含む、請求項18に記載の方法。前記TGF-βを5~10日後に除去する工程、及び前記細胞を水と、塩類と、アミノ酸と、ビタミン類と、炭素源と、インスリンと、FGFと、セレンと、トランスフェリンと、から本質的になる培地と接触させる工程、を更に含む、請求項20に記載の方法。前記リプログラミングさせる工程が、前記細胞をヒドロコルチゾンと接触させることを含む、請求項18に記載の方法。前記リプログラミングさせる工程が、前記細胞を酪酸塩と接触させることを含む、請求項18に記載の方法。前記iPS細胞が、異種成分を含まない条件下で誘導される、請求項18に記載の方法。前記体細胞が、成人体細胞である、請求項18に記載の方法。前記リプログラミングさせる工程が、ウイルスベクターを用いることを含む、請求項18に記載の方法。前記リプログラミングさせる工程が、エピソームベクターを用いることを含む、請求項18に記載の方法。多能性幹細胞の長期培養を支持するアルブミン不含成長培地であって、各々、長期の多能性幹細胞培養を支持するのに十分な量の、水と、塩類と、アミノ酸と、ビタミン類と、炭素源と、インスリンと、FGFと、セレンと、トランスフェリンと、TGF-β及びNODALのうちの1つと、から本質的になる、アルブミン不含成長培地。多能性幹細胞を培養する方法であって、マトリクス上に多能性幹細胞を置く工程、並びに前記細胞を、各々、長期の多能性幹細胞培養を支持するのに十分な量の、水と、塩類と、アミノ酸と、ビタミン類と、炭素源と、インスリンと、FGFと、セレンと、トランスフェリンと、TGF-β及びNODALのうちの1つと、から本質的になるアルブミン不含培地と接触させる工程、を含む、方法。0045本発明は、様々な変更及び代替形態が許容されるが、その例示的な実施形態が、図面で例として示され、本明細書で詳細に記載されている。しかしながら、例示的な実施形態の記載は、本発明を開示されている特定の形態に限定することを意図したものではなく、逆に、その意図は、添付の特許請求の範囲によって定義されるような本発明の精神及び範囲内に含まれる全ての変更、等価物、及び代替物を網羅することであることが理解されるべきである。0046本発明は、かつては多能性細胞を培養するのに必須であると考えられていた特定の培地成分を、特定の培養目的を達成するために調剤される多能性細胞培養培地から省くことができるという本発明者らの観察に関する。0047本明細書で使用されるように、多能性細胞という用語は、三胚葉全ての細胞に分化することができる細胞を意味する。多能性細胞の例としては、胚性幹細胞及び誘導多能性幹iPS細胞が挙げられる。本明細書で使用されるように、iPS細胞は、そのそれぞれの分化した起源体細胞と実質的に遺伝的に同一であり、かつ本明細書に記載されているような、より高い能力の細胞、例えば、ES細胞と同様の特徴を示す細胞を指す。この細胞は、非多能性例えば、寡能性又は体細胞をリプログラミングさせることによって得ることができる。0048本発明は、特定の培養目的に必須ではない因子を含まない新しい培地に関する。培養目的の例としては、細胞の生存、継代、増殖、多能性、クローン化、及びiPS細胞の誘導が挙げられるが、これらに限定されない。具体的には、本発明は、アルブミン不含培地に関する。0049明確にしておくと、継代とクローン化は、別個の方法である。継代は、培養容器中である密度にまで培養して凝集体になった細胞を分割し、その後、それを新しい培養容器に入れるプロセスを説明するものである。これらの凝集体は、任意の数の細胞、通常、100~1,000個の細胞を含むことができ、これは、培養液中ですぐに成長を開始する。対照的に、クローン化は、単一の個々のES細胞からヒトES細胞コロニーを成長させることによって、クローン性のコロニーを発生させることを指す。本明細書で使用されるように、クローン化効率は、培養液中にプレーティングされた個々の細胞の数で割った新しい細胞コロニーを形成する個々の細胞の数を意味する。クローン化効率は、培養条件によってかなり異なる。例えば、MATRIGEL登録商標上での、定義され、かつ異種成分を含まない条件下での、ヒトES細胞のクローン化効率は非常に低いがすなわち、約0.1未満、線維芽細胞馴化培地を用いて培養されたこれらの細胞のクローン化効率は、依然として低いもののすなわち、約2未満、クローン性のES細胞コロニーを発生させる程度には十分高い。0050現在使用されている特定の培地成分は、培養細胞に損傷を与えるか、又は分化を誘導することができる。例えば、β-メルカプトエタノールは、培養多能性細胞を損傷し、死滅させることすらできる。ウシ血清アルブミンBSA又は胎仔ウシ血清FCSなどの血清培地添加物は、培養多能性細胞の分化を誘導することができる。また、市販の血清成分は、同じ供給源から供給された場合であっても、その組成が大きく異なり、予測不可能な培養のばらつきをもたらすことがあり得る。本明細書に記載の培地は、ほとんどの従来の多能性細胞培養培地中に存在する損傷を与える因子、分化させる因子、及び定義されていない因子を実質的に含まない。開示された培地は、短期例えば、24時間の多能性細胞の生存性、短期例えば、4~5日の増殖を支持すること、長時間の培養期間、例えば、3カ月で25回を超える継代の間、多能性細胞を維持すること、並びにレンチウイルス及びエピソームベクターを用いて胎児と成人の両方の線維芽細胞からiPS細胞を誘導することなどの、様々な培養目的で用いるのに成功している。0051特定の細胞培養目的のために特別に作られた新しい最小培地を開発した。塩類、ビタミン類、グルコース源、ミネラル、及びアミノ酸などの、様々な培地成分を単独で又は組み合わせて試験し、生存性、増殖、又は多能性に対するその個々の効果を決定した。新しい生存アッセイを開発し、それを用いて、どの成分が解離後の多能性細胞生存に必須であるかを決定した。新しい培地を、増殖を支持し、多能性を持続するその能力について試験した。これらの培地をクローン化アッセイで用いて、各々の培地が単一の細胞及びそのクローン化効率にどのように影響を及ぼすかということも明らかにした。本明細書に記載の各々の新しい培地の成分の完全なリストを表1に示す薄い影付きの欄及び濃い影付きの欄は、培地中での成分の存在を示し、格子柄の欄は、交換可能な成分を示し、空の欄は、培地中での成分の不在を示す。00520053本明細書に記載の様々な培地を基本成分から調製することができる。或いは、当業者は、開示された新しい培地を調製するために基礎培地を出発材料として用いることの有利な効率性を理解している。本明細書で使用される基礎培地という用語は、特別な培地添加物を必要としない特定の単細胞の生物及び細胞の成長を支持する培地を意味する。典型的な基礎培地成分は当技術分野で公知であり、これには、塩類、アミノ酸、ビタミン類、及び炭素源例えば、グルコースが含まれる。pH指示薬のフェノールレッドなどの、培地の基本的な特徴を変化させないが、それ以外の面では望ましい、他の成分を含めることもできる。例えば、ダルベッコの改変イーグル培地:栄養混合物F-12DMEM/F12は、哺乳動物細胞培養のための好適な成長培地を作製するために一般に用いられる基礎培地である。DMEM/F12の成分の完全なリストを表2に示す。00540055特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が関連する分野の当業者によって共通に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと同様又は同等の任意の方法及び材料を本発明の実施又は試行で用いることができるが、好ましい方法及び材料を本明細書で記載する。0056実施形態を説明し、本発明を特許請求する際に、以下の専門用語を以下に示す定義に従って使用する。0057本明細書で使用されるように、約は、記述された濃度範囲の5以内、又は記述された時間枠の5以内を意味する。0058本明細書で使用されるように、本質的に血清を含まないは、培地が血清も血清代替物も含有しないこと、又はそれが、本質的に血清も血清代替物も含有しないことを意味する。例えば、本質的に血清を含まない培地は、約10、9、8、7、6、5、4、3、2、又は1未満の血清を含有することができ、その場合、培地の培養能力が依然として観察される。0059本明細書で使用される定義された培養培地又は定義された培地という用語は、各々の培地成分の内容及び量が公知であることを意味する。0060本明細書で使用されるように、から本質的になる培地は、特定の成分、及び任意に、その基本的な性質に実質的には影響を及ぼさない他の成分を含有する培地を意味する。0061本明細書で使用されるように、有効量は、本発明による特定の細胞効果を誘発するのに十分な薬剤の量を意味する。0062本明細書で使用されるように、生存性は、生存可能である状態を意味する。生存可能である多能性細胞は、細胞プレート表面に付着し、膜破壊がない限り、色素のヨウ化プロピジウムで染まらない。短期の生存性は、細胞を培養液中にプレーティングした後の最初の24時間に関するものである。通常、細胞は、その時間では増殖しない。0063本明細書で使用されるように、短期の成長は、培養液中での4~5日間の細胞増殖を意味する。0064本明細書で使用されるように、長時間の成長は、少なくとも5回の継代の間の成長を意味する。通常、培地は、20回を超える継代約2~3カ月の間、多能性細胞成長を支持するその能力について試験される。0065本明細書で使用されるように、長期の培養は、15回を超える継代培養液中で約2カ月を意味する。0066本明細書で使用されるように、多能性は、三胚葉全ての細胞に分化する細胞の能力を意味する。0067本明細書で使用されるように、クローン化は、出発培養物から、理想的には、単一の多能性細胞から又は少なくともごくわずかの細胞から、細胞培養を開始するプロセスを意味する。未分化多能性細胞のクローン培養を可能にする培養条件は、通常の多能性細胞の培養及び増殖において必要とされる全ての条件の中で最も厳しい条件であり得る。0068本明細書で使用されるように、iPS細胞の誘導は、多能性ではない細胞を多能性になるようにリプログラミングさせることを意味する。0069本明細書で使用されるように、異種成分を含まないは、その培養細胞の種以外の種のいかなる細胞も細胞産物も含まない細胞培養条件を意味する。0070本明細書で使用されるように、正常酸素条件は、約20酸素の条件を意味する。0071本明細書で使用されるように、低酸素条件は、約20未満の酸素、例えば、約5酸素の条件を意味する。0072本発明は、以下の非限定的な実施例を考慮することによって、より完全に理解されるであろう。0073実施例1:多能性細胞生存アッセイ。0074500マイクロリットルの様々な試験培地を12ウェルプレートの各々のウェルに充填した後、細胞を添加した。接着性多能性細胞を、TrypLEInvitrogenを用いて、5分間又は培養プレートから完全に剥離するまで解離させた。等量の培地を培養液に添加することによって、TrypLEを中和した。細胞をカウントし、洗浄し、300,000~1,000,000細胞/mlの濃度で新鮮な培地に再懸濁した。約100μlのこの細胞溶液を12ウェルプレートの各々のウェルに添加し、細胞を37°C、5O2及び10CO2でインキュベートした。細胞を0.4mlのTrypLEを用いて様々な時点で再び解離させ、その後、それを等量のDMEM中の10FBSで中和した。細胞をフローサイトメトリーでカウントした。5000カウントの明るいビーズを各々の試料に内部対照として添加した約200個のビーズを各々の試料についてカウントした。全ての実験を3つ1組で実施した。0075実施例2:生存及び短期の成長のための成長因子。0076TeSR培地は、基礎培地中に存在するものに加えて、線維芽細胞成長因子FGF、形質転換成長因子ベータTGF-β、γ-アミノ酪酸GABA、ピペコリン酸、塩化リチウムLiCl、及びインスリン表1という6つの成長因子を含有する。これら6つの成長因子を除く、全てのTeSR商標成分を含有する、基本栄養培地NMを作製した。約2×105個のH1ES細胞を解離させ、Matrigel上にプレーティングした。24時間後、生存指数を決定した。NMだけでは、解離後の細胞生存を支持しなかった。NMへのインスリンの添加は、TeSR商標で観察されるのと同様の細胞生存をもたらしたが、細胞成長は支持しなかった図1A。インスリン20ug/mlとFGF2100ng/mlの両方の添加は、細胞生存を支持し、更に、TeSR商標培地を用いて観察されるのと同程度である96時間での細胞成長をもたらした図1B。従って、FGF及びインスリンが補充されたNMは、ヒトES細胞培養を支持する。上記のように補充された12種の異なる基礎栄養培地は、細胞の生存及び成長を支持することができた図1E。0077実施例3:L-アスコルビン酸は短期の増殖を支持する。0078NMは、11種の栄養成分、すなわち、DMEM/F12、微量元素B、微量元素C、L-アスコルビン酸、チアミン、セレン、L-グルタミン、BSA、BME、重炭酸ナトリウムNaHCO3、及びトランスフェリンを含有する表1。DMEM/F12は、基礎培地としての役割を果たし、NaHCO3は、pHを修飾するのに用いられる。インスリン及びFGFが存在するときに、他のどの栄養成分が必須であるかを明らかにするために、各々の因子をDMEM/F12、NaHCO3、インスリン、及びFGFに個々に添加した。これらの栄養因子はいずれも、継代後の生存に必須ではなかったが、L-アスコルビン酸64mg/Lは、継代後の細胞増殖に必要であった図1C。ビタミンCとして知られるL-アスコルビン酸は、主な酸化防止剤であり、かついくつかの酵素の共因子である。ヒドロキシプロリンは、一部、L-アスコルビン酸の代わりになり得る。DMEM/F12、NaHCO3、L-アスコルビン酸、インスリン、及びFGF定義された因子5、DF5、表1中にプレーティングされたヒトES細胞は、TeSR中にプレーティングされたヒトES細胞と同様の形態を維持した。0079実施例4:長時間の継代のための培地成分。0080DF5は、1回の継代の間しか、細胞成長を支持しなかった。2回目の経代の後、細胞はあまり付着せず、最終的に死滅した図1C。細胞は、NMインスリンFGFデータは示さない及びDF12図1D、表1中で継代することができ、これは、NMインスリンFGF及びDF12中に存在する1以上の因子が長時間の継代に重要であることを示唆している。NM中に存在する各々の栄養因子をDF5に個々に添加し、複数回の継代後の細胞拡大を支持するその能力を決定した。複数回の継代を通して細胞増殖を支持するのに、セレンのみの添加で十分であった図1D、DF5セレン、DF5S、表1。0081DF5Sを用いて、H1細胞を拡大した。DF5S中で成長させた細胞は、TeSR商標中で成長させた細胞よりも分化しやすい傾向があった。しかしながら、H1細胞は、数週間15回を超える継代の間、成長させることができ、その間、この細胞は、ヒトES細胞形態及び高レベルのOCT4発現を維持した図1E、図1F。NODAL100ng/ml又はTGF-β2ng/mlのいずれかが添加されたDF5S中で成長させたH1細胞は、DF5S中で培養されたH1細胞と比べて、有意により高いレベルのNANOGmRNAを発現した。多能性マーカーOCT4の高発現によって明らかにされているように、DF5SNODALは、試験した2つのヒトiPS細胞株の多能性も支持した。NODAL又はTGF-βのいずれかを含むDF5S中で成長させた全ての細胞hES細胞及びiPS細胞は、長期の継代の後に、正常な核型を維持した。0082実施例5:低酸素状態は細胞の成長及びクローン化を改善する。0083H1細胞は、TeSR商標中で成長させた細胞と比べて、DF5S培地中でより速く成長した図1C及び2A。多能性細胞成長条件を最適化するために、細胞を、様々なオスモル濃度、pH、酸素レベル、及びCO2レベルのDF5S中で成長させた。アッセイ感度を高めるために、5,000個の細胞だけを各々のウェルに播種し、生存24時間及び増殖124時間について解析した。O2レベル及びCO2レベルを変化させたときに、最も大きい改善が認められた。通常の培養条件は、約15の酸素及び5のCO2O15C5を用いる。より多くのCO2は、24時間後に、わずかにより多くの生存をもたらすことが多かった。より低い酸素レベルは、DF5SとTeSR商標の両方での細胞成長を増大させた。10のCO2を伴う15の酸素O15C10、及び10のCO2を伴う5の酸素O5C10は、細胞生存を増大させた図2A。細胞は、より高いO2レベルO15C5及びO15C10で成長しなかったが、それらは、より低い酸素レベルO5C10で増殖した図2A。DF5S中の細胞は、TeSR商標中で成長させた細胞よりも速く成長し、5O2及び10CO2で最も早く成長した図2A。2への酸素レベルの更なる減少は、5O2と比べて細胞成長を低下させた。0084様々な酸素及びCO2濃度でのクローン化効率を決定するために、500個の細胞を各々のウェルに播種した。低酸素でさえも、クローン化効率は非常に低く<2、クローン化に対する様々な条件の効果を決定することができなかった。酸素及びCO2濃度を検討するために、クローン化効率を増大させることが知られているROCK阻害剤のHA100を用いて、クローン化効率を増大させた。クローン化のための最良の培地であることが知られている馴化培地CMを対照として用いた。HA100の添加は、O5C10とO15C5の両方のCM中でのクローン化効率を有意に改善し、クローン化効率は、O15C5よりもO5C10でより高かった図2B。DF5S中での細胞のクローン化効率は、両方の条件下のCM中での細胞のクローン化効率と同程度であった図2B。0085細胞生存に対する低酸素のプラスの効果のために、後の実施例のうちのいくつかでは、細胞を低密度で維持した場合に、低酸素条件が利用されている。しかしながら、細胞を低い細胞密度で培養しない場合、実験は、正常酸素条件と低酸素条件の両方の下で実施された図2B。0086実施例6:改善されたiPS細胞クローン化効率。0087DF5Sがクローン化効率にどのように影響を及ぼすかを明らかにするために、2つのiPS細胞株をDF5S中で成長させ、HA100の存在下、クローン化密度12ウェルプレートウェル当たり約500細胞でプレーティングした。DF5S中で成長させたiPS細胞のクローン化効率は、TeSR商標又はCMのいずれか図2Cの中で成長させたiPS細胞のクローン化効率よりも低く、これは、クローン化効率を増強する因子が、TeSR商標培地中には存在するが、DF5Sには存在しないことを示唆している。そのような因子を同定するために、個々のTeSR商標成分をDF5Sに個々に添加し、クローン化効率に対する効果について試験した。DF5Sへのホロ-トランスフェリンの添加DF5SFeは、TeSR商標を用いたクローン化効率と同程度のクローン化効率を生じさせた図2D。トランスフェリンは、DF5S培地中のH1細胞のクローン化効率の顕著な改善ももたらす。0088インスリンと、トランスフェリンと、セレンと、L-アスコルビン酸と、FGFと、TGF-β又はNODAL;E8とが補充されたDMEM/F12中のROCK阻害剤HA100及びY27632、並びにブレビスタチンによって、H1細胞のクローン化効率は増大し図2E、これは、トランスフェリンの添加によって、及び低酸素条件下での培養によって更に増大した図2F。細胞は、25回を超える継代の後、正常な核型を維持した。0089実施例7:NODAL及びTGF-βは、アルブミン不含培地中でのH1及びiPS細胞の多能性の長期の維持を支持する。0090実施例3に記載したように、H1、H9、及びiPS細胞などのヒト多能性細胞は、DF5S中で成長させ、15回を超えて継代することができたが、分化しやすい傾向があったため、DF5S中で多能性を持続させるには格別の注意が必要である。多能性は、TeSR商標中でより簡単に維持することができるので、長期の多能性を支持する因子を同定するために、TeSR商標中に存在する成長因子を、それまで分化させないでDF5S中で培養されたH1細胞を成長させるために用いられるDF5SFeに個々に添加した。細胞を、コンフルエンシーに達した後、約1日間継代して、細胞分化を促進し、フローサイトメトリーによって評価されるOct4発現を多能性の指標として用いた。0091DF5SFe中で成長させたヒト多能性細胞は伸張し、互いに沿って並び、分化の直前に紡錘形に似ていた。この表現型は、TGF-β/BMP経路によって通常は抑制されている神経分化の開始時に観察されることが多い。従って、TGF-β経路の組換えタンパク質を、長期の多能性を支持するその能力について試験した。TeSR商標濃度で用いられるNODALが補充されたDF5SFeE8NODALは、高いOct4発現を持続させた。TeSR商標濃度0.6ng/mlで用いられるTGF-βが補充されたDF5SFeE8TGF-βは、低レベルのOct4発現を支持したが、より高い濃度1ng/mlで用いたときに、高いOct4発現を維持することができた。0092H1及びH9などのヒトES細胞株は、様々な複雑な培養成分、例えば、FBS、フィーダー細胞、及びノックアウト血清代替物への曝露を含む培養歴を有する。これらの成分への曝露は、おそらく、これらの成分への依存性を生じさせ、結果的に、簡易培地に対する細胞応答を変化させることができる。誘導条件がそれほど複雑ではないので、リプログラミングされた体細胞から誘導されるiPS細胞については、培養歴がそれほど大きな役割を果たさない可能性がある。それゆえ、DF5SFe中で成長させた2つのもとのレンチウイルスiPS細胞株Yu,etal.,Science318:19172007を用いて、様々な因子を試験した。細胞を、1回の継代の間、MEFプレートから直接DF5SFe培地に移し、その後、様々な成長因子条件に移行させた。DF5SFeへのTGF-β2ng/ml又はNODAL100ng/mlのいずれかの添加それぞれ、E8TGF-β及びE8NODALは、iPS細胞の長期の多能性を支持した。多能性表面マーカーSSEA4、SSEA3、Tra-1-60、及びTra-1-81も発現した。正常な核型を有する細胞は、20回を超える継代の間、連続的に維持された。これらの細胞は、重症複合免疫不全SCIDマウスに注射された5~7週間後に、奇形腫を形成することができた。0093E8TGF-β及びE8NODALは、25回を超える継代約3カ月の間、分化の兆候を示すことなく、試験した全ての多能性細胞株、すなわち、2つのヒトES細胞株H1及びH9並びに5つのiPSC株の多能性を支持した図3。E8培地中で成長させたH1ES細胞は、TeSR商標中で成長させたH1ES細胞と比べて同様の遺伝子発現プロファイルを有する図3B。0094実施例8:アルブミン不含培地中でのiPS細胞の誘導。0095利用可能なリプログラミングプロトコルは、ウイルスによる形質導入又はエレクトロポレーション後の最初の数日間のFBS中での細胞インキュベーション、その後のUM100その全体が示されているかのように本明細書に組み込まれる、米国特許第7,439,064号又はCMへの細胞の移し替えを含む。先の実施例に記載された簡易培地を、リプログラミングを支持するその能力について試験した。ES由来体細胞は、FBS含有培地中での最初の2日の培養があってもなくても、レンチウイルス又はエピソームベクターを用いて、DF5S培地中で効率的にリプログラミングさせることができた。しかしながら、DF5Sは、Nanog、Oct4、Sox2、及びLin28を用いた初代包皮細胞のリプログラミングを支持しなかった。DF5SFeは、細胞を最初にFBS含有培地中でインキュベートした場合に、改良型レンチウイルスその全体が示されているかのように参照により本明細書に組み込まれる、Ebertetal.,Nature4577227:277-2802009を用いた、Matrigel又はMEF上での包皮及び成人細胞のリプログラミングを支持した。DF5SFeは、リプログラミングの支持においてCMと同じぐらい効率的であったが、最初のFBSへの曝露が、リプログラミングに重要であるように思われた。0096包皮細胞は、FBS培地中よりもDF5SFe中で有意に遅く成長する。初代包皮細胞成長を助けることができる成長因子を決定するために、FBS中に含まれる個々の成長因子を試験した。FGFファミリーの成長因子は、いくつかのメンバーを有しており、そのうちの1つ又は複数が線維芽細胞培養に一般に用いられる。DF5SFeは、100ng/mlのゼブラフィッシュ組換えFGF2を含有している。各々のFGFファミリーメンバーを、包皮細胞成長を支持するその能力について試験した。包皮細胞を培養プレートのウェルに分注し、FGFを含まないDF5SFe中で24時間インキュベートした。個々のFGFタイプを100ng/mlで96時間添加した。FGF1、zFGF2、FGF4、FGF6、及びFGF9は、最も効率的に包皮細胞成長を支持したが、FBS含有培地と同じぐらいよく細胞成長を支持したものはなかった図4A。非FGFファミリーメンバー成長因子が、FBSで見られる包皮細胞成長と同程度の包皮細胞成長を促進することができるかどうかを確認するために、いくつかの既知の線維芽細胞成長促進因子を試験した。FBSの代わりにするためにDF5SFeに添加されたヒドロコルチゾン図4B、その誘導体、及びデキサメタゾンは、細胞成長を有意に改善した。DF5SFeヒドロコルチゾンDF5SFeCは、iPS細胞クローン化効率も改善した。0097DF5Sベースの培地を、ウイルスを使用しないiPS細胞の誘導に用いることができるかどうかを明らかにするために、包皮細胞を、その全体が示されているかのように参照により本明細書に組み込まれる、Yuetal.,Science324:7972009に記載されているように、ウイルスを使用しないエピソームベクターを用いて、低酸素条件O5C10でリプログラミングさせた。プラスミド組合せ4pEP4EP2SCK2MEN2L及びpEP4EO2SET2K、表3、6pEP4EO2SEN2L、pEP4EO2SET2K、及びpEP4EO2SEM2K、表3、並びに19pEP4EO2SEN2K、pEP4EO2SET2K、及びpCEP4-M2L、表3を使用し、二次継代の後、2つのクローンを106個の細胞から単離した。00980099プラスミド組合せ6及び19をリプログラミングに用いた。核へのプラスミド侵入を促進するために、ENBAmRNAをプラスミドDNAと一緒に電気穿孔した。約100万個の細胞を、2枚の6ウェルプレート上に移し、DF5SFeC中に5日間入れた。その後、培地を、更に18~25日間、DF5SFeに切り替えた。これらのウェルのうちのいくつかの細胞に、様々な時点で1:6の比率を用いて、2回目の継代を行なった。プラスミド組合せ19は、プラスミド組合せ6よりも多くのコロニーを生じさせたが、それらの大部分は、典型的なヒトES細胞形態に似ていなかった。約25日後、両方のプラスミド組合せについて、ヒトES細胞様コロニーが一次プレート上に出現し、プラスミド組合せ19を用いて包皮細胞100万個当たり24個のリプログラミングされた細胞、及びプラスミド組合せ6を用いて包皮細胞100万個当たり8個のリプログラミングされた細胞と推定された。ヒトES細胞様コロニーの数は、二次継代プレートの後、有意に増加し、各々のプラスミド組合せについて、>500個/100万個の包皮細胞と推定された。二次継代プレート上でのiPS細胞コロニーの増加は、一次プレート上でのiPS細胞の分裂によるものである可能性が高い。場合によっては、一次プレートは、典型的なヒトES細胞形態に似たコロニーを有していなかったが、多くのiPS細胞が二次継代後に出現し、おそらくは、いくつかのiPS細胞が体細胞と混合されていたために、それらを同定することができなかったことを示唆している。0100DF5SFe中で誘導されたiPS細胞コロニーの細胞は、わずか2回の経代の後に分化し始めた。6つのiPS細胞コロニーを一次プレートから採取し、Nodal含有DF5SFeNE8NODALに直接移した。これらの細胞を、15回を超える継代の間、E8Nodal中で維持し、TeSR商標を用いて観察されるES細胞様形態と同様のそのES細胞様形態を維持することができた。これらの細胞は、正常な核型を有し、Oct4及びSSEA4を発現し図4C、注射して5~7週後に、SCIDマウスで奇形腫を形成した。0101包皮線維芽細胞はE8培地中でもリプログラミングされた。E8培地中で誘導されたiPS細胞の全体的な遺伝子発現は、フィーダー細胞上で誘導されたH1細胞図4D及びE又はiPS細胞図4D及びFの全体的な遺伝子発現と類似していた。多能性マーカーは、ES細胞とiPS細胞の両方で高度に発現されたが、線維芽細胞特異的マーカー遺伝子は発現されなかった図4D。また、iPS細胞は、例えば、レンチウイルス又はエピソームベクターを用いる、様々な戦略を用いて、E8培地中で誘導することができた。0102実施例9:アルブミン不含培地中での患者細胞株からのiPS細胞の誘導。0103成人ドナー由来の細胞を、簡易培地中でウイルスを使用しないエピソームベクターを用いてリプログラミングさせることができるかどうかを明らかにするために、患者細胞株OAT又はPRPT8の200万個の細胞に、プラスミド組合せ4又は6を、EBNAmRNAと一緒に電気穿孔し、これらを2枚の10cmプレート上に移した。リプログラミングを最大化するために、最初の6日間、FBS含有培地を用いた。通常の成人細胞維持条件と一致させるために、細胞をO15C5で維持した。その後、更に14~21日間、培地をDF5SFeに切り替えた。1枚のプレートの細胞を様々な時点で1:2の比で継代した。プラスミド組合せ6は、4よりも多くのコロニー細胞100万個当たり約5個を生じさせたが、これらの細胞の大部分は、典型的なヒトES細胞形態に似ていなかった。約22日後、プラスミド組合せ4について、ヒトES細胞様コロニーが一次プレート上に出現した。プラスミド組合せ6を用いたとき、更に多くのヒトES細胞様コロニーが二次継代プレート上に出現し、細胞100万個当たり約40個のコロニーと推定された。プラスミド組合せ4を用いたとき、iPS細胞は生じなかった。iPS細胞コロニーは、一次プレート上の他の密に集合した細胞の真ん中に出現し、その境界を越えて成長することができなかった。しかしながら、二次プレート上のコロニーは、コロニー単離に好適な大きいサイズに拡大した。コロニーを採取して、TeSR商標に直接移すと、採取された32個のコロニーが生き残り、ES細胞形態を示した。遺伝子解析から、これらのコロニーがOAT細胞株に由来するものであり、正常な核型を示すことが確認された。0104成人細胞のリプログラミング効率を改善するために、TGF-βをリプログラミング培地に添加した。iPSクローンは有意には増加しなかったが、コロニーの総数は有意に増加した。ヒドロコルチゾン除去の時点でTGF-βを培地から除去した場合、iPS細胞コロニーの数は有意に増加し、TGF-βが、このプロセスの最初の数日のうちにリプログラミングを支持することを示唆した。0105iPSではないと思われる多くのクローンは、二次継代後にiPSクローンを生じさせることができ、iPS細胞の誘導が、周囲の細胞によって阻害され得ることを示唆している。いくつかの試薬を、この効果を克服するその能力について試験した。酪酸塩はリプログラミング効率を改善した。TGF-βと酪酸塩の両方を培地に添加したとき、包皮細胞のリプログラミング効率の約10倍の増加が観察された図5B。TGF-βは、リプログラミングの初期段階では、そのプラスの効果を示すように見えたが、酪酸塩は、より後の段階でプラスの役割を果たした。TGF-β添加は、リプログラミング時のコロニー数の増加をもたらしたが、真のiPS細胞コロニーの数は低いままであった。酪酸塩は、コロニーの数を増加させなかったが、真のiPS細胞対非iPS細胞コロニーの比率を有意に改善した図5C。0106TGF-β及び酪酸塩を用いることによって、エピソームベクター系を用いて、完全に定義された条件下での成人個体由来の体細胞のリプログラミングの成功が可能になった。iPS細胞は、1×106個のPRPF8-2細胞から1~100個、及び100,000個の細胞GRC1-29から1個の効率で、3つの独立した成人体細胞株OAT、GRCM1-29、及びPRPF8-2から誘導された。0107実施例10.完全に定義された条件での成人個体由来のiPS細胞の誘導。0108生検を男性成人ドナーの皮膚から採取し、抗生物質及び抗真菌剤を含むハンクス緩衝塩溶液HBSSで数回洗浄し、2mlの0.25トリプシン/EDTA表4又はTrypLEセレクト中、4°Cで一晩インキュベートした。試料を3回すすぎ、2回目のすすぎの後、トリプシン阻害剤表4を用いた。滅菌ピンセットを用いて真皮及び表皮を分離した。真皮を切って小片にし、規定の酵素を含む0.75mlの酵素溶液表4中、室温で3時間インキュベートした12ウェル又は24ウェルプレート。約35分後、組織構造が分解し始めた。10ug/mlのポリビニルピロリドンPVPを含む等量の培地を添加し、上下に約10回ピペッティングすることによって、組織を機械的に解離させた。試料を、400gで、室温で10分間遠心分離し、新鮮な培地/PVPで2回洗浄した。上清を廃棄し、ペレットを3mlの完全培地に再懸濁し、1mlの細胞懸濁液を、3μg/ウェルのビトロネクチンをコーティングした6ウェルプレートのウェルに移した。プレートを5CO2、37°Cでインキュベートし、培地を毎日交換した。線維芽細胞はプレートに接着したが、非接着細胞と破片は、培地を交換するときに除去された。0109011020日後、リプログラミングプラスミドをエレクトロポレーションを用いて線維芽細胞に導入した。次の25日以内に、複数のiPSコロニーが出現し、これらを更なる解析のために採取した。リプログラミング効率は、二次継代なしでは、電気穿孔した線維芽細胞100万個のうち約10個であった。iPS細胞を更に継代して、ベクターを含まない細胞株を単離した。0111実施例11.二次継代を伴わないアルブミン不含培地中での成人個体由来のiPS細胞の誘導。0112成人線維芽細胞を、図6Aに示した一般的なプロトコルに従って、E8インスリンと、トランスフェリンと、セレンと、L-アスコルビン酸と、FGF2と、TGF-β又はNODALとが補充されたDMEM/F12中でリプログラミングさせた。20回を超える経代の間、E8中で維持されたリプログラミングiPS細胞株は、多能性マーカーOCT4及びSSEA4を発現し続けた図6B。0113E8培地は、マウス線維芽細胞フィーダー細胞MEF図7A又はTeSR商標図7Bを用いたリプログラミング効率と比べて、リプログラミング効率を有意に高めた。酪酸塩100μMは、TGF-βの存在下E8又はTGF-βの非存在下TGF-βを含まないE8、すなわち、DF5SFe図7Cで、リプログラミング効率を更に高めた。0114実施例12.アルブミン不含培地中での多能性幹細胞の凍結保存。0115多能性細胞を、本質的に上で記載された通りに、E8培地に入れて6ウェルプレート中で培養した。培養培地を各々のウェルから吸引し、細胞を1.0mLのEDTA/PBS0.5mMEDTAを含むPBS、オスモル濃度340で2回洗浄した。その後、細胞を、EDTA/PBS中、37°Cで5分間インキュベートした。PBS/EDTAを除去し、細胞を1mlのE8培地で素速くすすいだ。その後、細胞を等量の20ジメチルスルホキシドDMSO及びE8培地最終濃度:E8培地中、10DMSOに再懸濁し、低温保存用バイアルに分注し、CRYOBOX商標を用いて、-80°Cで凍結させた。その後、細胞を液体窒素タンクに移した。0116本発明は、最も実用的でかつ好ましい実施形態と現在考えられているものに関して記載されている。しかしながら、本発明は、実例として提示されているのであって、開示された実施形態に限定されることを意図するものではない。従って、当業者であれば、本発明が、添付の特許請求の範囲に示されているような本発明の精神及び範囲内に全ての変更及び代替配置を包含することを意図するものであることを理解するであろう。"