"目的の免疫原をコードするRNAを中に被包しているリポソームであって、ここで該リポソームは、ポリエチレングリコールが該リポソームの外側に存在するように、ポリエチレングリコール部分を含む少なくとも1種の脂質を含み、ここで該ポリエチレングリコールの平均分子量は、1kDa~3kDaである、リポソーム。PEG-DMGおよび/もしくは式Xの脂質を含む、請求項1に記載のリポソーム。前述の請求項のいずれかに記載のリポソームであって、80nm~160nmの範囲の直径を有する、リポソーム。前述の請求項のいずれかに記載のリポソームであって、カチオン性頭部を有する脂質を含む、リポソーム。前述の請求項のいずれかに記載のリポソームであって、両性イオン性頭部を有する脂質を含む、リポソーム。前記RNAは、自己複製RNAである、前述の請求項のいずれかに記載のリポソーム。前記自己複製RNA分子は、iRNAを該自己複製RNA分子から転写し得るRNA依存性RNAポリメラーゼ、およびii免疫原をコードする、請求項6に記載のリポソーム。前記RNA分子は、2個のオープンリーディングフレームを有し、該2個のオープンリーディングフレームのうちの第1のものは、アルファウイルスレプリカーゼをコードし、該2個のオープンリーディングフレームのうちの第2のものは、前記免疫原をコードする、請求項7に記載のリポソーム。前記RNA分子は、9000~12000ヌクレオチド長である、前述の請求項のいずれかに記載のリポソーム。前記免疫原は、細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生生物に対してインビボで免疫応答を誘発し得る、前述の請求項のいずれかに記載のリポソーム。前述の請求項のいずれかに記載のリポソームを含む、薬学的組成物。脊椎動物における防御免疫応答を惹起するための方法であって、該方法は、該脊椎動物に、請求項1~10に記載のリポソームまたは請求項11に記載の薬学的組成物の有効量を投与する工程を包含する、方法。さらなる改善された核酸ワクチン、特に、核酸ワクチンの送達の改善された方法への必要性が存在している。発明の開示本発明によれば、核酸免疫化は、リポソーム内に被包されたRNAを送達することによって達成される。上記RNAは、目的の免疫原をコードする。上記リポソームは、PEG化脂質を含む。すなわち、上記脂質は、ポリエチレングリコールの共有結合によって改変されている。PEGは、上記リポソームに、有利な薬物動態特性を付与し得るコーティングを提供する例えば、それは、上記リポソームの安定性を増大し得、かつ非特異的吸着を妨ぎ得る。本発明者らは、上記PEGの長さが、被包RNAのインビボ発現に影響を及ぼし得ることを見いだしたので、本発明は、1kDa~3kDaの平均分子量を有するPEGを含むリポソームを使用する。低分子量例えば、500Daもしくは750Daを有するPEGは、安定なリポソームを形成しない。従って、本発明は、目的の免疫原をコードするRNAを中に被包しているリポソームを提供し、ここで上記リポソームは、ポリエチレングリコール部分を含む少なくとも1種の脂質を含み、ここで、ポリエチレングリコールは、リポソームの外側に存在し、ここで、上記ポリエチレングリコールの平均分子量は、1kDa~3kDaである。これらリポソームは、脊椎動物細胞への上記RNAのインビボ送達に適しているので、それらは、種々の疾患に対して被験体を免疫化するための薬学的組成物中の成分として有用である。本発明はまた、RNA含有リポソームを調製するためのプロセスを提供し、上記プロセスは、RNAと、1種以上の脂質とを、上記脂質が上記RNAを中に被包するリポソームを形成するような条件下で、混合する工程を包含し、ここで少なくとも1種の脂質は、上記プロセス中に上記リポソームの外側に位置するようになるポリエチレングリコール部分を含み、そして上記ポリエチレングリコールの平均分子量は、1kDa~3kDaである。リポソーム本発明は、免疫原コードRNAを中に被包しているリポソームを利用する。従って、上記RNAは、任意の外部媒体から分離している天然ウイルスにおけるように。上記リポソーム内の被包は、RNAをRNase消化から保護することが見いだされた。上記リポソームは、いくつかの外部RNAを例えば、それらの表面に含み得るが、上記RNAのうちの少なくとも半分および理想的には、そのうちの全ては、上記リポソームのコア中に被包される。リポソーム内での被包は、例えば、参考文献1で開示される脂質/RNA複合体とは異なるここでRNAは、予め形成されたリポソームと混合される。種々の両親媒性脂質は、水性環境中で二重層を形成して、RNA含有水性コアを、リポソームとして被包し得る。これら脂質は、アニオン性、カチオン性もしくは両性イオン性の親水性頭部headgroupを有し得る。アニオン性リン脂質からのリポソームの形成は、1960年代にさかのぼり、カチオン性リポソーム形成脂質は、1990年代以来研究されてきた。あるリン脂質はアニオン性であるのに対して、他のものは両性イオン性であり、そして他のものはカチオン性である。リン脂質の適切なクラスとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、およびホスファチジルグリセロール。そしていくつかの有用なリン脂質は、表1に列挙される。有用なカチオン性脂質としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパンDOTAP、1,2-ジステアリルオキシ-N,N-ジメチル-3-アミノプロパンDSDMA、1,2-ジオレイルオキシ-N,Nジメチル-3-アミノプロパンDODMA、1,2-ジリノレイルオキシ-N,N-ジメチル-3-アミノプロパンDLinDMA、1,2-ジリノレニルオキシ-N,N-ジメチル-3-アミノプロパンDLenDMA。両性イオン性脂質としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:アシル両性イオン性脂質およびエーテル両性イオン性脂質。有用な両性イオン性脂質の例は、以下である:DPPC、DOPC、DSPC、ドデシルホスホコリン、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルエタノールアミンDOPE、および1,2-ジフィタノイルdiphytanoyl-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミンDPyPE。上記脂質は、飽和であってもよいし、不飽和であってもよい。リポソームを調製するための少なくとも1種の不飽和脂質の使用が好ましい。不飽和脂質が2つのテールを有する場合、両方のテールが不飽和であり得、またはそれは、1つの飽和テールおよび1つの不飽和テールを有し得る。脂質は、例えば、RV05におけるように、1つのテールにステロイド基を含み得る。従って、一実施形態において、本発明は、水性コアを被包する脂質二重層を有するリポソームを提供し、ここで:i上記脂質二重層は、ポリエチレングリコールがリポソームの外側に存在するように、ポリエチレングリコール部分を含む少なくとも1種の脂質を含み、ここで上記ポリエチレングリコールの平均分子量は、1kDa~3kDaであり;そしてii上記水性コアは、免疫原をコードするRNAを含む。本発明のリポソームは、単一の脂質から、または脂質の混合物から形成され得る。混合物は、iアニオン性脂質の混合物、iiカチオン性脂質の混合物、iii両性イオン性脂質の混合物、ivアニオン性脂質とカチオン性脂質との混合物、vアニオン性脂質と両性イオン性脂質との混合物、iv両性イオン性脂質とカチオン性脂質との混合物、またはviiアニオン性脂質と、カチオン性脂質と、両性イオン性脂質との混合物を含み得る。同様に、混合物は、飽和脂質および不飽和脂質の両方を含み得る。例えば、混合物は、DSPC両性イオン性,飽和、DlinDMAカチオン性,不飽和、および/もしくはDMGアニオン性,飽和を含み得る。脂質の混合物が使用される場合、上記混合物中の成分の脂質の全てが、両親媒性である必要はない例えば、1種以上の両親媒性脂質が、コレステロールと混合され得る。本発明のリポソームが脂質の混合物から形成される場合、本明細書に記載されるような、PEG化されているそれらの脂質の割合は、脂質の全量のうちの10未満例えば、0.5~5、1~4、もしくは約2であることが好ましい。例えば、有用なリポソームは、以下に示され、ここで全脂質のうちの2は、PEG-DMGである。その残りは、例えば、コレステロール例えば、35~50コレステロールおよび/もしくはカチオン性脂質例えば、30~70および/もしくはDSPC例えば、5~15から構成され得る。このような混合物は、以下で使用される。これらパーセンテージの値は、モルパーセンテージである。従って、リポソームは、カチオン性脂質例えば、DlinDMA、RV05、両性イオン性脂質例えば、DSPC、DPyPE、コレステロール、およびPEG化脂質から形成され得る。DSPC、DlinDMA、PEG-DMGおよびコレステロールの混合物は、実施例において使用され、いくつかのさらなる混合物もまた同様に使用され得る。上記リポソーム内の少なくとも1種の脂質は、ポリエチレングリコール部分を含む。これらPEG化脂質を含むリポソームは、上記リポソームの少なくとも外側にPEGが存在するように配向されたPEGを有するしかし、いくらかのPEGは、上記リポソームの内部すなわち、上記水性コアに曝露されていてもよい。この配向は、上記PEGを上記脂質の適切な部分に結合させることによって達成され得る。例えば、両親媒性脂質において、上記PEGは、上記親水性頭部に結合される。なぜなら、この頭部は、上記脂質二重層の水性側に面する外側にそれ自体を配向するからである。このように、PEG化は、例えば、参考文献2および3において開示されるもののような技術を使用して、脂質へのPEGの共有結合によって達成され得る。従って、上記PEG化脂質は、PEG構造:を含み、ここでnは、1kDa~3kDaのPEGについての分子量を提供する例えば、2kDaのPEG化についてては、23~68、もしくは約45例えば、図16を参照のこと。上記PEG部分は、-O-メチル基で終わり得るので、PEG化脂質は、以下を含み得る:従って、脂質の頭部における窒素への結合を含めると、本発明で有用なPEG化脂質は、以下を含み得る:本発明での使用のための1つの適切なPEG化脂質は、実施例において使用されるとおり、PEG-DMGである。図17A~17Eは、さらなる有用なPEG化脂質を示す。PEG化コレステロールもまた、使用され得る。他のPEG化脂質、例えば、式Xの脂質が使用され得る:ここで:Zは、PEG、ならびにポリオキサゾリン、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリグリセロール、ポリN-ビニルピロリドン、ポリ[N-2-ヒドロキシプロピルメタクリルアミド]およびポリアミノ酸に基づくポリマーから選択される親水性頭部成分であり、ここで上記ポリマーは、直鎖状であっても分枝状であってもよく、そして上記ポリマーは、必要に応じて置換されていてもよく;Zは、nサブユニットで重合され;nは、Zの10~200ユニットの数平均重合度でありそして種々のZ基に関して最適化され得る;L1は、エーテル例えば、-O-、エステル例えば、-COO-、スクシネート例えば、-OOC-CH2-CH2-COO-、カルバメート例えば、-OCO-NR’-、カーボネート例えば、-OCOO-、ウレア例えば、-NRCONR’-、アミン例えば、-NR’-、アミド例えば、-CONR’-、イミン例えば、-CNR’-、チオエーテル例えば、-S-、キサンテート例えば、-OCSS-、およびホスホジエステル例えば、-OPO2O-のうちの0個、1個もしくは2個を含む、必要に応じて置換された、C1-10アルキレンもしくはC1-10ヘテロアルキレンリンカーであり、ここでR’は、独立して、-H、-NH-、-NH2、-O-、-S-、ホスフェート、もしくは必要に応じて置換されたC1-10アルキレンから選択され;X1およびX2は、炭素、または-NH-、-O-、-S-もしくはホスフェートから選択されるヘテロ原子から独立して選択され;A1およびA2は、いずれも、C6-30アルキル、C6-30アルケニル、およびC6-30アルキニルから独立して選択され、ここでA1およびA2は、同じであっても異なっていてもよく、またはA1およびA2は、A1およびA2が結合する炭素原子と一緒になって、必要に応じて置換されたステロイドを形成する。本発明のリポソームは、代表的には、多数のPEG部分を含み、上記PEG部分は、同じであってもよいし、異なっていてもよい。本発明のリポソームにおけるPEGの平均分子量は、1kDa~3kDa例えば、1.5~2.5kDa、1.7~2.3kDa、1.8~2.2kDa、1.9~2.1kDa、もしくは2kDaである。従って、上記PEGは、PEG2000もしくはPEG2kとして一般に公知のPEGであり得るが、より短いPEG1000およびより長いPEG3000もまた、使用され得る。上記PEGは、通常は、直鎖状のポリマー鎖を含むが、いくつかの実施形態においては、上記PEGは、分枝状のポリマー鎖を含み得る。単一の脂質分子が1個より多いPEG基を含む例えば、脂質の頭部における異なる炭素原子に結合されることもまた、可能である例えば、図18を参照のこと。これらの状況において、リポソームにおけるPEGの分子量への言及は、PEG置換基あたりではなく、脂質分子あたりの分子量である。従って、唯一のPEG化脂質が図18に示される構造を有するリポソームにおいて、ボックスで囲まれた分子量は、2kDaであり、各々1kDaの2つの鎖から構成され、上記PEGの平均分子量は、2kDaであり、1kDaではない。いくつかの実施形態において、上記PEGは、置換されたPEG例えば、ここで上記ポリマー中の1個以上の炭素原子が、1個以上のアルキル、アルコキシ、アシルもしくはアリール基によって置換されているであり得る。いくつかの実施形態において、上記PEGは、PEGポリプロピレンポリマーを形成するために、コポリマー基例えば、1個以上のプロピレンモノマーを含み得る。PEG化の代替として、脂質は、PEGとは異なる部分の共有結合によって改変され得る。例えば、いくつかの実施形態において、脂質は、ポリホスファゼンを含み得る。いくつかの実施形態において、脂質は、ポリビニルピロリドンを含み得る。いくつかの実施形態において、脂質は、ポリアクリルアミドを含み得る。いくつかの実施形態において、脂質は、ポリ2-メチル-2-オキサゾリンを含み得る。いくつかの実施形態において、脂質は、ポリ2-エチル-2-オキサゾリンを含み得る。いくつかの実施形態において、脂質は、ホスファチジルポリグリセロールを含み得る。いくつかの実施形態において、脂質は、ポリ[N-2-ヒドロキシプロピルメタクリルアミド]を含み得る。いくつかの実施形態において、脂質は、PEG以外のポリアルキレンエーテルポリマーを含み得る。リポソームは、通常、3つの群に分けられる:多層小胞MLV;小さな単層小胞SUV;および大きな単層小胞LUV。MLVは、各小胞において複数の二重層を有し、いくつかの別個の水性区画を形成する。SUVおよびLUVは、水性コアを被包する単一の二重層を有する;SUVは、代表的には、直径≦50nmを有し、LUVは、直径>50nmを有する。本発明のリポソームは、理想的には、60~180nmの範囲、好ましくは、80~160nmの範囲の直径を有するLUVである。本発明のリポソームは、複数のリポソームを含む組成物の一部であり得、上記複数の中の上記リポソームは、ある範囲の直径を有し得る。異なる直径を有するリポソームの集団を含む組成物に関して:i上記リポソームの数で少なくとも80は、60~180nmの範囲、および好ましくは、80~160nmの範囲の直径を有するべきであり、そして/またはii上記集団の平均直径強度で、例えば、Z平均は、理想的には、60~180nmの範囲、および好ましくは、80~160nmの範囲にある。上記複数の中の直径は、理想的には、多分散性指数<0.2を有するべきである。参考文献1のリポソーム/RNA複合体は、600~800nmの範囲の直径を有し、高い多分散性を有すると予測される。適切なリポソームを調製するための技術は、当該分野で周知である例えば、参考文献4~6を参照のこと。1つの有用な方法は、参考文献7に記載され、i上記脂質のエタノール性溶液、ii上記核酸の水性溶液、およびiii緩衝液を混合する工程、その後の、混合、平衡化、希釈および精製を包含する。好ましい本発明のリポソームは、この混合プロセスによって得られ得る。所望の直径を有するリポソームを得るために、混合は、水性RNA溶液の2つの供給ストリームが1つの混合ゾーンにおいて、脂質のエタノール性溶液の1つのストリームと、全て同じ流量において、例えば、以下に記載されるとおりのマイクロ流体チャネルにおいて、合わされるプロセスを使用して行われ得る。RNA本発明のリポソームは、免疫原をコードするRNA分子参考文献2に記載されるような、siRNAとは異なるを含む。上記粒子のインビボ投与後、RNAは、上記粒子から放出され、上記免疫原をインサイチュで提供するように、細胞の中で翻訳される。上記RNAは、プラス鎖であるので、いかなる介在複製工程例えば、逆転写をも必要とすることなく、細胞によって翻訳され得る。それはまた、免疫細胞によって発現されるTLR7レセプターに結合し得、それによって、アジュバント効果を開始する。好ましいプラス鎖RNAは、自己複製性である。自己複製RNA分子レプリコンは、あらゆるタンパク質なしで脊椎動物細胞に送達される場合でも、上記自己複製RNA分子自体からの転写によって上記自己複製RNA分子自体から生成するアンチセンスコピーを介して、複数の娘RNAの生成をもたらし得る。自己複製RNA分子は、従って、代表的には、細胞へ送達された後に直接翻訳され得るプラス鎖分子であり、この翻訳は、RNA依存性RNAポリメラーゼを提供し、次いで、これは、上記送達されたRNAからアンチセンス転写物およびセンス転写物の両方を生成する。従って、上記送達されたRNAは、複数の娘RNAの生成をもたらす。これら娘RNA、ならびに同一線上collinearのサブゲノム転写物は、それ自体が翻訳されて、コードされた免疫原のインサイチュ発現を提供し得るか、または転写されて、上記送達されたRNAと同じセンスのさらなる転写物上記免疫原のインサイチュ発現を提供するように翻訳されるを提供し得る。この一連の転写の全体的な結果は、上記導入されたレプリコンRNAの数における非常に多くの増幅であり、よって、上記コードされた免疫原は、上記細胞の主なポリペプチド生成物になる。自己複製を達成するための1つの適切なシステムは、アルファウイルスベースのRNAレプリコンを使用することである。これらのプラス鎖レプリコンは、細胞への送達後に翻訳され、レプリカーゼもしくはレプリカーゼ-転写酵素をもたらす。上記レプリカーゼは、上記送達されたプラス鎖RNAのゲノムマイナス鎖コピーを作り出す複製複合体を提供するように自己切断するポリプロテインとして翻訳される。これらマイナス鎖転写物は、これ自体が、上記プラス鎖親RNAのさらなるコピーを与え、そしてまた、免疫原をコードするサブゲノム転写物を与えるように転写され得る。従って、上記サブゲノム転写物の翻訳は、上記感染した細胞による上記免疫原のインサイチュ発現をもたらす。適切なアルファウイルスレプリコンは、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルスなどに由来するレプリカーゼを使用し得る。変異型ウイルスもしくは野生型ウイルスの配列が使用され得る例えば、VEEVの弱毒化TC83変異体は、レプリコンにおいて使用されてきた[8]。好ましい自己複製RNA分子は、従って、i上記自己複製RNA分子からRNAを転写し得るRNA依存性RNAポリメラーゼ、およびii免疫原をコードする。上記ポリメラーゼは、アルファウイルスレプリカーゼ例えば、アルファウイルスタンパク質nsP1、nsP2、nsP3およびnsP4のうちの1種以上を含むであり得る。天然のアルファウイルスゲノムが、上記非構造レプリカーゼポリプロテインに加えて、構造的ビリオンタンパク質をコードするのに対して、本発明の自己複製RNA分子は、アルファウイルス構造タンパク質をコードしないことが好ましい。従って、好ましい自己複製RNAは、細胞においてそれ自体のゲノムRNAコピーの生成をもたらし得るが、RNA含有ビリオンの生成はもたらさない。これらのビリオンを生成できないことは、野生型アルファウイルスとは異なり、上記自己複製RNA分子が、感染性形態においてそれ自体を永続させられないことを意味する。野生型ウイルスにおいて永続に必要な上記アルファウイルス構造タンパク質は、本発明の自己複製RNAには存在せず、それらの位置は、上記目的の免疫原をコードする遺伝子によってしめられている。その結果、上記サブゲノム転写物は、上記構造的アルファウイルスビリオンタンパク質ではなく、上記免疫原をコードする。従って、本発明で有用な自己複製RNA分子は、2個のオープンリーディングフレームを有し得る。第1の5’側オープンリーディングフレームは、レプリカーゼをコードし;第2の3’側オープンリーディングフレームは、免疫原をコードする。いくつかの実施形態において、上記RNAは、例えば、さらなる免疫原以下を参照のことをコードするために、もしくは補助ポリペプチドをコードするために、さらなる例えば、下流のオープンリーディングフレームを有し得る。自己複製RNA分子は、コードされたレプリカーゼと適合性の5’配列を有し得る。自己複製RNA分子は、種々の長さを有し得るが、それらは、代表的には、5000~25000ヌクレオチド長例えば、8000~15000ヌクレオチド、もしくは9000~12000ヌクレオチドである。従って、上記RNAは、siRNA送達において認められるものより長い。本発明で有用なRNA分子は、5’キャップ例えば、7-メチルグアノシンを有し得る。このキャップは、上記RNAのインビボ翻訳を増強し得る。本発明で有用なRNA分子の上記5’ヌクレオチドは、5’トリホスフェート基を有し得る。キャップされたRNAにおいて、これは、5’から5’への架橋を介して、7-メチルグアノシンに連結され得る。5’トリホスフェートは、RIG-I結合を増強し得るので、アジュバント効果を促進し得る。RNA分子は、3’ポリ-Aテールを有し得る。それはまた、その3’末端付近にポリ-Aポリメラーゼ認識配列例えば、AAUAAAを含み得る。本発明で有用なRNA分子は、代表的には、一本鎖である。一本鎖RNAは、一般に、TLR7、TLR8、RNAヘリカーゼおよび/もしくはPKRへの結合によって、アジュバント効果を開始し得る。二本鎖形態において送達されるRNAdsRNAは、TLR3に結合し得、このレセプターはまた、一本鎖RNAの複製の間もしくは一本鎖RNAの二次構造内のいずれかで形成されるdsRNAによって誘発され得る。本発明で有用なRNA分子は、便宜上、インビトロ転写IVTによって調製され得る。IVTは、細菌においてプラスミド形態において作られ、増やされたか、または合成で作製された例えば、遺伝子合成および/もしくはポリメラーゼ連鎖反応PCR操作法によってcDNAテンプレートを使用し得る。例えば、DNA依存性RNAポリメラーゼ例えば、バクテリオファージT7、T3もしくはSP6RNAポリメラーゼは、DNAテンプレートからRNAを転写するために使用され得る。適切なキャッピングおよびポリA付加反応は、必要時に使用され得るしかし、上記レプリコンのポリAは、通常、上記DNAテンプレート内にコードされる。これらRNAポリメラーゼは、転写される5’ヌクレオチドについてストリンジェントな要件を有し得、いくつかの実施形態において、これらの要件は、上記IVT転写RNAが、自己がコードするレプリカーゼの基質として効率的に機能し得ることを確実にするために、上記コードされたレプリカーゼの要件とマッチしなければならない。参考文献9において考察されるように、上記自己複製RNAは、任意の5’キャップ構造に加えて改変された核酸塩基を有する1個以上のヌクレオチドを含み得る。従って、上記RNAは、以下を含み得る:m5C5-メチルシチジン、m5U5-メチルウリジン、m6AN6-メチルアデノシン、s2U2-チオウリジン、Um2’-O-メチルウリジン、m1Al-メチルアデノシン;m2A2-メチルアデノシン;Am2’-O-メチルアデノシン;ms2m6A2-メチルチオ-N6-メチルアデノシン;i6AN6-イソペンテニルアデノシン;ms2i6A2-メチルチオ-N6イソペンテニルアデノシン;io6AN6-cis-ヒドロキシイソペンテニルアデノシン;ms2io6A2-メチルチオ-N6-cis-ヒドロキシイソペンテニルアデノシン;g6AN6-グリシニルカルバモイルアデノシン;t6AN6-スレオニルカルバモイルアデノシン;ms2t6A2-メチルチオ-N6-スレオニルカルバモイルアデノシン;m6t6AN6-メチル-N6-スレオニルカルバモイルアデノシン;hn6AN6.-ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン;ms2hn6A2-メチルチオ-N6-ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン;Arp2’-O-リボシルアデノシンホスフェート;Iイノシン;m111-メチルイノシン;m’Im1,2’-O-ジメチルイノシン;m3C3-メチルシチジン;Cm2T-O-メチルシチジン;s2C2-チオシチジン;ac4CN4-アセチルシチジン;f5C5-ホルミルfonnylシチジン;m5Cm5,2-O-ジメチルシチジン;ac4CmN4アセチル2TOメチルシチジン;k2Cリシジン;m1G1-メチルグアノシン;m2GN2-メチルグアノシン;m7G7-メチルグアノシン;Gm2’-O-メチルグアノシン;m22GN2,N2-ジメチルグアノシン;m2GmN2,2’-O-ジメチルグアノシン;m22GmN2,N2,2’-O-トリメチルグアノシン;Grp2’-O-リボシルグアノシンホスフェート;yWワイブトシン;o2yWペルオキシワイブトシン;OHyWヒドロキシワイブトシン;OHyW改変未満undermodifiedヒドロキシワイブトシン;imGワイオシン;mimGメチルグアノシン;Qキューオシン;oQエポキシキューオシン;galQガラクトシルgaltactosyl-キューオシン;manQマンノシル-キューオシン;preQo7-シアノ-7-デアザグアノシン;preQi7-アミノメチル-7-デアザグアノシン;Gアルカエオシンarchaeosine;Dジヒドロウリジン;m5Um5,2’-O-ジメチルウリジン;s4U4-チオウリジン;m5s2U5-メチル-2-チオウリジン;s2Um2-チオ-2’-O-メチルウリジン;acp3U3-3-アミノ-3-カルボキシプロピルウリジン;ho5U5-ヒドロキシウリジン;mo5U5-メトキシウリジン;cmo5Uウリジン5-オキシ酢酸;mcmo5Uウリジン5-オキシ酢酸メチルエステル;chm5U5-カルボキシヒドロキシメチルウリジン;mchm5U5-カルボキシヒドロキシメチルウリジンメチルエステル;mcm5U5-メトキシカルボニルメチルウリジン;mcm5UmS-メトキシカルボニルメチル-2-O-メチルウリジンmethyluricjine;mcm5s2U5-メトキシカルボニルメチル-2-チオウリジン;nm5s2U5-アミノメチル-2-チオウリジン;mnm5U5-メチルアミノメチルウリジン;mnm5s2U5-メチルアミノメチル-2-チオウリジン;mnm5se2U5-メチルアミノメチル-2-セレノウリジン;ncm5U5-カルバモイルメチルウリジン;ncm5Um5-カルバモイルメチル-2’-O-メチルウリジン;cmnm5U5-カルボキシメチルアミノメチルウリジン;cnmm5Um5-カルボキシメチルアミノメチル-2-L-O-メチルウリジン;cmnm5s2U5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン;m62AN6,N6-ジメチルアデノシン;Tm2’-O-メチルイノシン;m4CN4-メチルシチジン;m4CmN4,2-O-ジメチルシチジン;hm5C5-ヒドロキシメチルシチジン;m3U3-メチルウリジン;cm5U5-カルボキシメチルウリジン;m6AmN6,T-O-ジメチルアデノシン;rn62AmN6,N6,O-2-トリメチルアデノシン;m2’7GN2,7-ジメチルグアノシン;m2’2’7GN2,N2,7-トリメチルグアノシン;m3Um3,2T-O-ジメチルウリジン;m5D5-メチルジヒドロウリジン;f5Cm5-ホルミル-2’-O-メチルシチジン;m1Gm1,2’-O-ジメチルグアノシン;m’Am1,2-O-ジメチルアデノシンイリノメチルウリジン;tm5s2US-タウリノメチル-2-チオウリジン;imG-144-デメチルグアノシン;imG2イソグアノシン;もしくはac6AN6-アセチルアデノシン、ヒポキサンチン、イノシン、8-オキソ-アデニン、7-置換されたその誘導体、ジヒドロウラシル、シュードウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-アミノウラシル、5-C1-C6-アルキルウラシル、5-メチルウラシル、5-C2-C6-アルケニルウラシル、5-C2-C6-アルキニルウラシル、5-ヒドロキシメチルウラシル、5-クロロウラシル、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-ヒドロキシシトシン、5-C1-C6-アルキルシトシン、5-メチルシトシン、5-C2-C6-アルケニルシトシン、5-C2-C6-アルキニルシトシン、5-クロロシトシン、5-フルオロシトシン、5-ブロモシトシン、N2-ジメチルグアニン、7-デアザグアニン、8-アザグアニン、7-デアザ-7-置換グアニン、7-デアザ-7-C2-C6アルキニルグアニン、7-デアザ-8-置換グアニン、8-ヒドロキシグアニン、6-チオグアニン、8-オキソグアニン、2-アミノプリン、2-アミノ-6-クロロプリン、2,4-ジアミノプリン、2,6-ジアミノプリン、8-アザプリン、置換された7-デアザプリン、7-デアザ-7-置換プリン、7-デアザ-8-置換プリン、または無塩基ヌクレオチド。例えば、自己複製RNAは、1つ以上の改変されたピリミジン核酸塩基例えば、シュードウリジンおよび/もしくは5-メチルシトシン残基を含み得る。しかし、いくつかの実施形態において、上記RNAは、改変された核酸塩基を含まず、改変されたヌクレオチドを含まなくてもよいすなわち、上記RNA中のヌクレオチドのすべては、標準的なA、C、GおよびUというリボヌクレオチドである任意の5’キャップ構造を除く。これは、7’-メチルグアノシンを含み得る。他の実施形態において、上記RNAは、7’-メチルグアノシンを含む5’キャップを含み得、最初の1個、2個もしくは3個の5’リボヌクレオチドは、リボースの2’位においてメチル化され得る。本発明で使用されるRNAは、理想的には、ヌクレオチド間にホスホジエステル結合のみを含むが、いくつかの実施形態において、それは、ホスホロアミデート結合、ホスホロチオエート結合、および/もしくはメチルホスホネート結合を含み得る。理想的には、リポソームは、10より少ない種の異なるRNA例えば、異なる5種、4種、3種、もしくは2種を含み;最も好ましくは、リポソームは、単一のRNA種を含み、すなわち、上記リポソーム中の全てのRNA分子は、同じ配列および同じ長さを有する。リポソームあたりのRNAの量は変動し得る。リポソームあたりの個々の自己複製RNA分子の数は、代表的には、1リポソームあたり≦50個例えば、<20個、<10個、<5個、もしくは1~4個である。免疫原本発明で使用されるRNA分子は、ポリペプチド免疫原をコードする。上記リポソームの投与後に、上記RNAは、インビボで翻訳され、上記免疫原は、レシピエントにおける免疫応答を誘発し得る。上記免疫原は、細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生生物に対してあるいは、いくつかの実施形態において、アレルゲンに対して;および他の実施形態において、腫瘍抗原に対して免疫応答を誘発し得る。上記免疫応答は、抗体応答通常は、IgGを含むおよび/もしくは細胞媒介性免疫応答を含み得る。上記ポリペプチド免疫原は、代表的には、対応する細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生生物またはアレルゲンもしくは腫瘍ポリペプチドを認識する免疫応答を誘発するが、いくつかの実施形態において、上記ポリペプチドは、細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生生物のサッカリドを認識する免疫応答を誘発するように、ミモトープとして作用し得る。上記免疫原は、代表的には、表面ポリペプチド例えば、アドヘシン、ヘマグルチニン、エンベロープ糖タンパク質、スパイク糖タンパク質などである。RNA分子は、単一のポリペプチド免疫原もしくは複数のポリペプチドをコードし得る。複数の免疫原は、単一のポリペプチド免疫原融合ポリペプチドとして、または別個のポリペプチドとして提示され得る。免疫原が、1つのレプリコンから別個のポリペプチドとして発現される場合、これらのうちの1種以上は、上流のIRESもしくはさらなるウイルスプロモーターエレメントとともに提供され得る。あるいは、複数の免疫原は、短い自己触媒性プロテアーゼ例えば、口蹄疫ウイルス2Aタンパク質に融合された個々の免疫原をコードするポリプロテインから、またはインテインとして発現され得る。参考文献1および10とは異なり、上記RNAは、免疫原をコードする。不確かさを避けるために、本発明は、ホタルルシフェラーゼをコードするRNA、E.coliβ-ガラクトシダーゼの融合タンパク質をコードするRNA、緑色蛍光タンパク質GFPをコードするRNAを含まない。このようなポリペプチドは、マーカーとして、またはさらに遺伝子治療の状況において有用であり得るが、本発明は、免疫学的応答系を誘発するためのRNAの送達に関する。従って、上記免疫原はまた、防御的宿主タンパク質を補充するかもしくはその代わりになる遺伝子治療におけるようにように送達される自己タンパク質ではない。また、上記RNAは、全マウス胸腺RNAではない。いくつかの実施形態において、上記免疫原は、これら細菌のうちの1種に対して免疫応答を誘発する:Neisseriameningitidis:有用な免疫原としては、膜タンパク質、例えば、アドヘシン、オートトランスポーター、毒素、鉄獲得タンパク質、およびH因子結合タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。3種の有用なポリペプチドの組み合わせが、参考文献11に開示される。Streptococcuspneumoniae:有用なポリペプチド免疫原は、参考文献12に開示される。これらとしては、RrgB線毛サブユニット、β-N-アセチル-ヘキソサミニダーゼ前駆体spr0057、spr0096、一般的なストレスタンパク質generalstressproteinGSP-781spr2021、SP2216、セリン/スレオニンキナーゼStkPSP1732、および肺炎球菌表面アドヘシンPsaAが挙げられるが、これらに限定されない。Streptococcuspyogenes:有用な免疫原としては、参考文献13および14に開示されるポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。MoraxellacatarrhalisBordetellapertussis:有用な百日咳免疫原としては、百日咳毒素もしくはトキソイドPT、線維状ヘマグルチニンFHA、ペルタクチン、ならびに凝集原2および3が挙げられるが、これらに限定されない。Staphylococcusaureus:有用な免疫原としては、参考文献15に開示されるポリペプチド例えば、溶血素、esxA、esxB、フェリクロム結合タンパク質sta006および/もしくはsta011リポプロテインが挙げられるが、これらに限定されない。Clostridiumtetani:代表的な免疫原は、破傷風トキソイドである。Cornynebacteriumdiphtheriae:代表的な免疫原は、ジフテリアトキソイドである。Haemophilusinfluenzae:有用な免疫原としては、参考文献16および17に開示されるポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。PseudomonasaeruginosaStreptococcusagalactiae:有用な免疫原としては、参考文献13に開示されるポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。Chlamydiatrachomatis:有用な免疫原としては、PepA、LcrE、ArtJ、DnaK、CT398、OmpH様、L7/L12、OmcA、AtoS、CT547、Eno、HtrAおよびMurG例えば、参考文献18に開示されるとおりが挙げられるが、これらに限定されない。LcrE[19]およびHtrA[20]は、2つの好ましい免疫原である。Chlamydiapneumoniae:有用な免疫原としては、参考文献21に開示されるポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。Helicobacterpylori:有用な免疫原としては、CagA、VacA、NAP、および/もしくはウレアーゼ[22]が挙げられるが、これらに限定されない。Escherichiacoli:有用な免疫原としては、腸毒素産生性E.coliETEC、腸管凝集性E.coliEAggEC、分散接着性diffuselyadheringE.coliDAEC、腸病原性E.coliEPEC、腸管外病原性E.coliExPECおよび/もしくは腸管出血性E.coliEHECに由来する免疫原が挙げられるが、これらに限定されない。ExPEC株としては、尿路病原性E.coliUPECおよび髄膜炎/敗血症関連E.coliMNECが挙げられる。有用なUPECポリペプチド免疫原は、参考文献23および24に開示される。有用なMNEC免疫原は、参考文献25に開示される。いくつかのE.coliタイプに有用な免疫原は、AcfDである[26]。BacillusanthracisYersiniapestis:有用な免疫原としては、参考文献27および28に開示されるものが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、上記免疫原は、これらウイルスのうちの1種に対して免疫応答を誘発する:オルソミクソウイルス:有用な免疫原は、インフルエンザA、BもしくはCウイルスに由来し得る例えば、ヘマグルチニン、ノイラミニダーゼもしくはマトリクスM2タンパク質。上記免疫原がインフルエンザAウイルスヘマグルチニンである場合、それは、任意のサブタイプ例えば、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15もしくはH16に由来し得る。パラミクソウイルス科のウイルス:ウイルス免疫原としては、肺炎ウイルス例えば、RSウイルス、RSV、ルブラウイルス例えば、ムンプスウイルス、パラミクソウイルス例えば、パラインフルエンザウイルス、メタニューモウイルスおよびモルビリウイルス例えば、麻疹ウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。ポックスウイルス科:ウイルス免疫原としては、オルトポックスウイルス例えば、真正痘瘡大痘瘡および小痘瘡が挙げられるが、これらに限定されないに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。ピコルナウイルス:ウイルス免疫原としては、ピコルナウイルス例えば、エンテロウイルス、ライノウイルス、ヘパルナウイルス、カルジオウイルスおよびアフトウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、上記エンテロウイルスは、ポリオウイルス例えば、1型、2型、および/もしくは3型のポリオウイルスである。別の実施形態において、上記エンテロウイルスは、EV71エンテロウイルスである。別の実施形態において、上記エンテロウイルスは、コクサッキーAもしくはBウイルスである。ブンヤウイルス:ウイルス免疫原としては、オルソブンヤウイルス例えば、カリフォルニア脳炎ウイルス、フレボウイルス例えば、リフトバレー熱ウイルス、もしくはナイロウイルス例えば、クリミアコンゴ出血熱ウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。ヘパルナウイルス:ウイルス免疫原としては、ヘパルナウイルス例えば、A型肝炎ウイルスHAVに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。フィロウイルス:ウイルス免疫原としては、フィロウイルス例えば、エボラウイルスザイールエボラウイルス、アイボリーコーストエボラウイルス、レストンエボラウイルスもしくはスーダンエボラウイルスを含むまたはマールブルグウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。トガウイルス:ウイルス免疫原としては、トガウイルス例えば、ルビウイルス、アルファウイルス、もしくはアルテリウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。これは、風疹ウイルスを含む。フラビウイルス:ウイルス免疫原としては、フラビウイルス例えば、ダニ媒介脳炎TBEウイルス、デング1、2、3もしくは4型ウイルス、黄熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、キャサヌール森林ウイルス、ウエストナイル脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ロシア春夏脳炎ウイルス、ポワッサン脳炎ウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。ペスチウイルス:ウイルス免疫原としては、ペスチウイルス例えば、牛ウイルス性下痢BVDV、豚コレラCSFVもしくはボーダー病BDVに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。ヘパドナウイルス:ウイルス免疫原としては、ヘパドナウイルス例えば、B型肝炎ウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。組成物は、B型肝炎ウイルス表面抗原HBsAgを含み得る。他の肝炎ウイルス:組成物は、C型肝炎ウイルス、デルタ型肝炎ウイルス、E型肝炎ウイルス、もしくはG型肝炎ウイルスに由来する免疫原を含み得る。ラブドウイルス:ウイルス免疫原としては、ラブドウイルス例えば、リッサウイルス例えば、狂犬病ウイルスおよびベシクロウイルスVSVに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。カリシウイルス科:ウイルス免疫原としては、カリシウイルス科例えば、ノーウォークウイルスノロウイルス、およびノーウォーク様ウイルス例えば、ハワイウイルスおよびスノーマウンテンウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。コロナウイルス:ウイルス免疫原は、SARSコロナウイルス、トリ伝染性気管支炎IBV、マウス肝炎ウイルスMHV、およびブタ伝染性胃腸炎ウイルスTGEVに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。上記コロナウイルス免疫原は、スパイクポリペプチドであり得る。レトロウイルス:ウイルス免疫原としては、オンコウイルス、レンチウイルス例えば、HIV-1もしくはHIV-2またはスプマウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。レオウイルス:ウイルス免疫原としては、オルトレオウイルス、ロタウイルス、オルビウイルス、もしくはコルチウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。パルボウイルス:ウイルス免疫原としては、パルボウイルスB19に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。ヘルペスウイルス:ウイルス免疫原としては、ヒトヘルペスウイルス例えば、例示に過ぎないが、単純ヘルペスウイルスHSV例えば、HSV1型および2型、水痘帯状疱疹ウイルスVZV、エプスタインバーウイルスEBV、サイトメガロウイルスCMV、ヒトヘルペスウイルス6HHV6、ヒトヘルペスウイルス7HHV7、およびヒトヘルペスウイルス8HHV8に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。パポバウイルス:ウイルス免疫原としては、パピローマウイルスおよびポリオーマウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。上記ヒトパピローマウイルスは、血清型1、2、4、5、6、8、11、13、16、18、31、33、35、39、41、42、47、51、57、58、63もしくは65のもの例えば、血清型6、11、16および/もしくは18のうちの1種以上に由来するであり得る。アデノウイルス:ウイルス免疫原としては、アデノウイルス血清型36Ad-36に由来するものが挙げられる。いくつかの実施形態において、上記免疫原は、魚類に感染するウイルス例えば:伝染性サケ貧血ウイルスISAV、サケ膵臓病ウイルスSPDV、伝染性膵臓壊死症ウイルスIPNV、アメリカナマズウイルスCCV、魚類リンホシスチス病ウイルスFLDV、伝染性造血器壊死症ウイルスIHNV、コイヘルペスウイルス、サケピコルナ様ウイルス大西洋サケピコルナ様ウイルスとしても公知、ヤマメウイルスLSV、大西洋サケロタウイルスASR、マスイチゴ病ウイルスTSD、銀ザケ腫瘍ウイルスCSTV、もしくはウイルス性出血性敗血症ウイルスVHSVに対する免疫応答を誘発する。真菌免疫原は、皮膚糸状菌類Dermatophytres以下が挙げられる:に由来し得る。いくつかの実施形態において、上記免疫原は、Plasmodium属例えば、P.falciparum、P.vivax、P.malariaeもしくはP.ovaleに由来する寄生生物に対する免疫応答を誘発する。従って、本発明は、マラリアに対して免疫化するために使用され得る。いくつかの実施形態において、上記免疫原は、Caligidae科に由来する寄生生物、特に、Lepeophtheirus属およびCaligus属に由来する寄生生物例えば、LepeophtheirussalmonisもしくはCaligusrogercresseyiのようなフナムシに対する免疫応答を誘発する。いくつかの実施形態において、上記免疫原は、以下に対する免疫応答を誘発する:花粉アレルゲン樹木花粉、草本花粉、雑草の花粉、および草の花粉のアレルゲン;昆虫もしくは蛛形類のアレルゲン吸入、唾液および毒液のアレルゲン、例えば、ダニアレルゲン、ゴキブリアレルゲンおよび小虫アレルゲン、膜翅類毒液アレルゲンhymenoptheravenomallergen;動物の毛およびふけのアレルゲン例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、マウスなどに由来する;ならびに食物アレルゲン例えば、グリアジン。樹木、草および草本に由来する重要な花粉アレルゲンは、Fagales、Oleales、Pinalesの分類学上の目およびスズカケノキ科platanaceaeカバノキBetula、ハンノキAlnus、ハシバミCorylus、シデCarpinusおよびオリーブOlea、シーダーCryptomeriaおよびJuniperus、プラタナスPlatanusが挙げられるが、これらに限定されない、Poalesの目属Lolium、Phleum、Poa、Cynodon、Dactylis、Holcus、Phalaris、Secale、およびSorghumの草が挙げられる、AsteralesおよびUrticalesの目属Ambrosia、Artemisia、およびParietariaの草本が挙げられるから由来するそのようなものである。他の重要な吸入アレルゲンは、属DermatophagoidesおよびEuroglyphusのチリダニ類、コナダニ類storagemite例えば、Lepidoglyphys、GlycyphagusおよびTyrophagus、ゴキブリ、小虫およびノミに由来するもの例えば、Blatella、Periplaneta、ChironomusおよびCtenocepphalides、ならびに哺乳動物例えば、ネコ、イヌおよびウマに由来するもの、毒液のアレルゲン刺咬昆虫stingingorbitinginsectに由来するようなもの、例えば、Hymenopteraの分類学上の目蜂Apidae、スズメバチVespidea、およびアリFormicoidaeが挙げられるが挙げられるに由来するものである。いくつかの実施形態において、上記免疫原は、以下から選択される腫瘍抗原である:aがん-精巣cancer-testis抗原、例えば、NY-ESO-1、SSX2、SCP1ならびにRAGE、BAGE、GAGEおよびMAGEファミリーのポリペプチド例えば、GAGE-1、GAGE-2、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、およびMAGE-12、これらは、例えば、黒色腫、肺、頭頸部、NSCLC、乳房、胃腸、および膀胱の腫瘍に対処するために使用され得る;b変異した抗原、例えば、p53種々の固形腫瘍例えば、結腸直腸がん、肺がん、頭頸部がんと関連、p21/Ras例えば、黒色腫、膵臓がんおよび結腸直腸がんと関連、CDK4例えば、黒色腫と関連、MUM1例えば、黒色腫と関連、カスパーゼ-8例えば、頭頸部がんと関連、CIA0205例えば、膀胱がんと関連、HLA-A2-R1701、β-カテニン例えば、黒色腫と関連、TCR例えば、T細胞非ホジキンリンパ腫と関連、BCR-abl例えば、慢性骨髄性白血病と関連、トリオースホスフェートイソメラーゼ、KIA0205、CDC-27、およびLDLR-FUT;c過剰発現された抗原、例えば、ガレクチン4例えば、結腸直腸がんと関連、ガレクチン9例えば、ホジキン病と関連、プロテイナーゼ3例えば、慢性骨髄性白血病と関連、WT1例えば、種々の白血病と関連、炭酸脱水酵素例えば、腎がんと関連、アルドラーゼA例えば、肺がんと関連、PRAME例えば、黒色腫と関連、HER-2/neu例えば、乳がん、結腸がん、肺がんおよび卵巣がんと関連、マンマグロビン、α-フェトプロテイン例えば、肝がんと関連、KSA例えば、結腸直腸がんと関連、ガストリン例えば、膵臓がんおよび胃がんと関連、テロメラーゼ触媒タンパク質、MUC-1例えば、乳がんおよび卵巣がんと関連、G-250例えば、腎細胞がんと関連、p53例えば、乳がん、結腸がんと関連、ならびにがん胎児性抗原例えば、乳がん、肺がん、および胃腸管のがん例えば、結腸直腸がんと関連;d共通抗原sharedantigen、例えば、黒色腫-メラノサイト分化抗原、例えば、MART-1/MelanA、gp100、MC1R、メラノサイト刺激ホルモンレセプター、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質-1/TRP1およびチロシナーゼ関連タンパク質-2/TRP2例えば、黒色腫と関連;e前立腺関連抗原例えば、PAP、PSA、PSMA、PSH-P1、PSM-P1、PSM-P2例えば、前立腺がんと関連;fイムノグロブリンイディオタイプ例えば、骨髄腫およびB細胞リンパ腫と関連。特定の実施形態において、腫瘍免疫原としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:p15、Hom/Mel-40、H-Ras、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、エプスタインバーウイルス抗原、EBNA、ヒトパピローマウイルスHPV抗原E6およびE7を含む、B型肝炎ウイルスおよびC型肝炎ウイルスの抗原、ヒトTリンパ球向性ウイルス抗原、Mac-2結合タンパク質/シクロフィリンC関連タンパク質、TAAL6、TAG72、TLP、TPSなど。薬学的組成物本発明のリポソームは、種々の疾患に対して被験体を免疫化するための薬学的組成物中の成分として有用である。これらの組成物は、代表的には、上記リポソームに加えて、薬学的に受容可能なキャリアを含む。薬学的に受容可能なキャリアの詳細な考察は、参考文献29において入手可能である。本発明の薬学的組成物は、1種以上の低分子免疫強化因子を含み得る。例えば、上記組成物は、TLR2アゴニスト例えば、Pam3CSK4、TLR4アゴニスト例えば、アミノアルキルグルコサミニドホスフェート例えば、E6020、TLR7アゴニスト例えば、イミキモド、TLR8アゴニスト例えば、レシキモドおよび/もしくはTLR9アゴニスト例えば、IC31を含み得る。任意のこのようなアゴニストは、理想的には、分子量<2000Daを有する。いくつかの実施形態において、このようなアゴニストもまた、上記RNAとともにリポソーム内に被包されるが、他の実施形態において、それらは、被包されない。本発明の薬学的組成物は、上記リポソームを、ただの水plainwater例えば、w.f.i.もしくは緩衝液例えば、リン酸緩衝液、Tris緩衝液、ホウ酸緩衝液、コハク酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、もしくはクエン酸緩衝液中に含み得る。緩衝塩は、代表的には、5~20mM範囲において含まれる。本発明の薬学的組成物は、5.0~9.5例えば、6.0~8.0のpHを有し得る。本発明の組成物は、張度を与えるために、ナトリウム塩例えば、塩化ナトリウムを含み得る。10±2mg/mlNaClの濃度が代表的である例えば、約9mg/ml。本発明の組成物は、金属イオンキレート化剤を含み得る。これらは、ホスホジエステル加水分解を加速し得るイオンを除去することによって、RNA安定性を延長し得る。従って、組成物は、EDTA、EGTA、BAPTA、ペンテト酸などのうちの1種以上を含み得る。このようなキレート化剤は、代表的には、10~500μM例えば、0.1mMで存在する。クエン酸塩例えば、クエン酸ナトリウムはまた、キレート化剤として作用し得るのと同時に、有利なことには、緩衝化活性も提供し得る。本発明の薬学的組成物は、200mOsm/kg~400mOsm/kg例えば、240~360mOsm/kg、もしくは290~310mOsm/kgの重量オスモル濃度を有し得る。本発明の薬学的組成物は、1種以上の保存剤例えば、チオメルサールもしくは2-フェノキシエタノールを含み得る。水銀非含有組成物が好ましく、保存剤非含有ワクチンが調製され得る。本発明の薬学的組成物は、好ましくは、無菌である。本発明の薬学的組成物は、好ましくは、非発熱性である例えば、1用量あたり<1EUエンドトキシンユニット、標準尺度、および好ましくは、1用量あたり<0.1EUを含む。本発明の薬学的組成物は、好ましくは、グルテンを含まない。本発明の薬学的組成物は、単位用量形態において調製され得る。いくつかの実施形態において、単位用量は、0.1~1.0ml例えば、約0.5mlの容積を有し得る。上記組成物は、注射物として調製され得る溶液もしくは懸濁物のいずれかとして。上記組成物は、微細スプレーを使用する、肺投与例えば、吸入器によるのために調製され得る。上記組成物は、鼻、耳もしくは眼への投与例えば、スプレーもしくは滴剤としてのために調製され得る。筋肉内投与のための注射物が、代表的である。組成物は、免疫学的に有効量のリポソーム、ならびに任意の他の成分必要であればを含む。免疫学的に有効な量とは、個体への投与量が、単一用量においてもしくはシリーズのうちの一部としてのいずれかで、処置もしくは予防に有効であることを意味する。この量は、処置されるべき個体の健康状態および身体的状態、処置されるべき個体の年齢、分類学上の群例えば、非ヒト霊長類、霊長類など、上記個体が抗体を合成する免疫系の能力、所望される防御の程度、ワクチンの処方、その処置している医師の医学的状況の評価、および他の関連因子に依存して変動する。上記量は、慣用的な治験を通じて決定され得る比較的広い範囲に入ると予測される。本発明の組成物のリポソームおよびRNA含有量は、一般に、1用量あたりのRNAの量に関して表される。好ましい用量は、≦100μgRNA例えば、10~100μg例えば、約10μg、25μg、50μg、75μgもしくは100μgを有するが、発現は、遙かに低いレベル、例えば、≦1μg/用量、≦100ng/用量、≦10ng/用量、≦1ng/用量などにおいてみられ得る。本発明はまた、本発明の薬学的組成物を含む送達デバイス例えば、シリンジ、ネブライザ、噴霧器、吸入器、皮膚パッチなどを提供する。このデバイスは、上記組成物を脊椎動物被験体に投与するために使用され得る。本発明のリポソームは、リボソームを含まない。処置方法および医学的使用参考文献10で開示される粒子とは対照的に、本発明のリポソームおよび薬学的組成物は、目的の免疫原に対する免疫応答を誘発するためのインビボでの使用のためのものである。本発明は、本発明のリポソームもしくは薬学的組成物の有効量を投与する工程を包含する、脊椎動物において免疫応答を惹起するための方法を提供する。上記免疫応答は、好ましくは、防御的であり、好ましくは、抗体および/もしくは細胞媒介性免疫を含む。上記方法は、ブースター応答を惹起し得る。本発明はまた、脊椎動物における免疫応答を惹起するための方法において使用するための本発明のリポソームもしくは薬学的組成物を提供する。本発明はまた、脊椎動物における免疫応答を惹起するための医薬の製造における本発明のリポソームの使用を提供する。これら使用および方法により上記脊椎動物における免疫応答を惹起することによって、上記脊椎動物は、上記で考察されるように、種々の疾患および/もしくは感染から例えば、細菌疾患および/もしくはウイルス疾患から防御され得る。上記リポソームおよび組成物は、免疫原性であり、より好ましくは、ワクチン組成物である。本発明に従うワクチンは、予防的であるすなわち、感染を妨ぐか、もしくは治療的であるすなわち、感染を処置するのいずれかであり得るが、代表的には、予防的である。上記脊椎動物は、好ましくは、哺乳動物、例えば、ヒトもしくは大型の獣医学的哺乳動物例えば、ウマ、ウシ、シカ、ヤギ、ブタである。上記ワクチンが予防的使用のためのものである場合、上記ヒトは、好ましくは、小児例えば、幼児もしくは乳児またはティーンエイジャーである;上記ワクチンが治療的使用のためのものである場合、上記ヒトは、好ましくは、ティーンエイジャーもしくは成人である。小児用に意図されたワクチンはまた、例えば、安全性、投与量、免疫原性などを評価するために、成人に投与され得る。本発明に従って調製されるワクチンは、小児および成人の両方を処置するために使用され得る。従って、ヒト患者は、1歳未満、5歳未満、1~5歳、5~15歳、15~55歳、もしくは少なくとも55歳であってもよい。上記ワクチンを受けるのに好ましい患者は、高齢者例えば、≧50歳、≧60歳、および好ましくは、≧65歳、若年者例えば、≦5歳、入院患者、ヘルスケアワーカー、軍従事者、および軍職員、妊婦、慢性疾患患者、もしくは免疫不全患者である。しかし、上記ワクチンは、これらの群にのみ適切であるわけではなく、より一般に、集団において使用され得る。本発明の組成物は、一般に、患者に直接投与される。直接送達は、非経口注射によって達成され得る例えば、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮内、もしくは組織の間隙空間に;参考文献1とは異なり、舌内intraglossal注射は、代表的には、本発明で使用されない。代替の送達経路としては、直腸、経口例えば、錠剤、スプレー、口内、舌下、膣、局所、経真皮transdermalもしくは経皮transcutaneous、鼻内、眼、耳、肺もしくは他の粘膜投与が挙げられる。皮内および筋肉内投与は、2つの好ましい経路である。注射は、針を介してであってもよい例えば、皮下針が、針なしの注射が、代わりに使用され得る。代表的な筋肉内用量は、0.5mlである。本発明は、全身免疫および/もしくは粘膜免疫を誘発するために、好ましくは、増強された全身免疫および/もしくは粘膜免疫を誘発するために、使用され得る。投与量は、単一用量スケジュールもしくは複数用量スケジュールによってであり得る。複数用量は、一次免疫スケジュールにおいて、および/もしくはブースター免疫スケジュールにおいて使用され得る。複数用量スケジュールにおいて、種々の用量が、同じ経路もしくは異なる経路例えば、非経口の一次と粘膜のブースト、粘膜の一次と非経口のブーストなどによって与えられ得る。複数用量は、代表的には、少なくとも1週間間隔を空けて例えば、約2週間、約3週間、約4週間、約6週間、約8週間、約10週間、約12週間、約16週間など投与される。一実施形態において、複数用量は、生後約6週間、10週間、および14週間で例えば、世界保健機関のExpandedProgramonImmunisationEPIにおいてしばしば使用されるように、6週齢、10週齢および14週齢において投与され得る。代替の実施形態において、2回の一次用量が、約2ヶ月間間隔を空けて例えば、約7週間、8週間もしくは9週間間隔を空けて投与され、続いて、1回以上のブースター用量が、2回目の一次用量の約6ヶ月から1年後に例えば、2回目の一次用量の約6ヶ月後、8ヶ月後、10ヶ月後もしくは12ヶ月後投与される。さらなる実施形態において、3回の一次用量が、約2ヶ月間間隔を空けて例えば、約7週間、8週間もしくは9週間間隔を空けて投与され、続いて、1回以上のブースター用量が、3回目の一次用量の約6ヶ月後から1年後に例えば、3回目の一次用量の約6ヶ月後、8ヶ月後、10ヶ月後もしくは12ヶ月後投与される。式X式Xの化合物は、脂質部分に連結された親水性ポリマー頭部を含む。それらは、ステルス脂質stealthlipidとして記載され得、それらは、以下の式を有する:ここで:Zは、PEG、ならびにポリオキサゾリン、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリグリセロール、ポリN-ビニルピロリドン、ポリ[N-2-ヒドロキシプロピルメタクリルアミド]およびポリアミノ酸に基づくポリマーから選択される親水性頭部成分であり、ここで上記ポリマーは、直鎖状であっても分枝状であってもよく、そして上記ポリマーは、必要に応じて置換されていてもよく;ここでZは、nサブユニットで重合され;nは、Zの10~200ユニットの数平均重合度であり、ここでnは、種々のポリマータイプに関して最適化され;L1は、エーテル例えば、-O-、エステル例えば、-COO-、スクシネート例えば、-OOC-CH2-CH2-COO-、カルバメート例えば、-OCO-NR’-、カーボネート例えば、-OCOO-、ウレア例えば、-NRCONR’-、アミン例えば、-NR’-、アミド例えば、-CONR’-、イミン例えば、-CNR’-、チオエーテル例えば、-S-、キサンテート例えば、-OCSS-、およびホスホジエステル例えば、-OPO2O-のうちの0個、1個もしくは2個を含む、必要に応じて置換された、C1-10アルキレンもしくはC1-10ヘテロアルキレンリンカーであり、ここでR’は、-H、-NH-、-NH2、-O-、-S-、ホスフェートもしくは必要に応じて置換されたC1-10アルキレンから独立して選択され;X1およびX2は、炭素、または-NH-、-O-、-S-もしくはホスフェートから選択されるヘテロ原子から独立して選択され;A1およびA2は、C6-30アルキル、C6-30アルケニル、およびC6-30アルキニルから独立して選択され、ここでA1およびA2は、同じであっても異なっていてもよく、またはA1およびA2は、A1およびA2が結合する炭素原子と一緒になって、必要に応じて置換されたステロイドを形成する。一実施形態において、式Xの化合物は、式X’を有する:ここでPEGは、ポリエチレングリコールサブユニットであり、ここで上記PEGは、直鎖状であっても分枝状であってもよく;nは、PEGの10~200ユニット、好ましくは、約45ユニットの数平均重合度であり;L1は、エーテル、エステル、スクシネート、カルバメート、カーボネート、ウレア、アミン、アミド、イミン、チオエーテル、キサンテート、およびホスホジエステルのうちの1個もしくは2個を含む、必要に応じて置換されたC1-10ヘテロアルキレンリンカーであり;X1およびX2は、酸素で有り;A1およびA2は、C6-30アルキル、C6-30アルケニル、およびC6-30アルキニルから独立して選択され、ここでA1およびA2は、同じであっても異なっていてもよく、またはここでA1およびA2は、A1およびA2が結合する炭素原子と一緒になって、必要に応じて置換されたステロイドを形成する。式Xおよび式X’の脂質は、カチオン性脂質と処方されてリポソームを形成する場合、リポソームがインビボで例えば、血中に存在し得る時間の長さを増大させ得る。それらは、リポソーム表面を保護し得、それによって、血液タンパク質によるオプソニン効果およびマクロファージによる取り込みを低下させ得る。さらなる詳細は、参考文献30および31にある。一実施形態において、上記脂質は、PEGときおり、ポリエチレンオキシドといわれる、ならびにポリオキサゾリン、ポリビニルアルコール、ポリグリセロール、ポリN-ビニルピロリドン、ポリ[N-2-ヒドロキシプロピルメタクリルアミド]およびポリアミノ酸に基づくポリマーから選択される基を含む。本発明での使用に適したPEG化脂質としては、ポリエチレングリコール-ジアシルグリセロールもしくはポリエチレングリコール-ジアシルグリカミドPEG-DAG結合体約C4~約C40の飽和もしくは不飽和の炭素原子を独立して含むアルキル鎖長を有するジアルキルグリセロールもしくはジアルキルグリカミド基を含むものが挙げられるが挙げられる。上記ジアルキルグリセロールもしくはジアルキルグリカミド基は、1個以上の置換されたアルキル基をさらに含み得る。上記PEG化脂質は、PEG-ジラウリルグリセロール、PEG-ジミリスチルグリセロールNOFのカタログ番号GM-020、PEG-ジパルミトイルグリセロール、PEG-ジステリルグリセロール、PEG-ジラウリルグリカミド、PEG-ジミリスチルグリカミド、PEG-ジパルミトイル-グリカミド、およびPEG-ジステリルグリカミド、PEG-コレステロール1-[8’-コレスト-5-エン-3[β]-オキシカルボキサミド-3’,6’-ジオキサオクタニル]カルバモイル-[ω]-メチル-ポリエチレングリコール、PEG-DMB3,4-ジテトラデコキシルベンジルditetradecoxylbenzyl-[ω]-メチル-ポリエチレングリコールエーテル、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシポリエチレングリコール-2000]AvantiPolarLipidsのカタログ番号880150Pから選択され得る。他の有用なPEG化脂質は、S001、S002、S003、S004、S005、S006、S007、S008、S009、S010、S011、およびCS-020SANOFであり;S010およびS011は、それぞれ、表示IVaおよびIVcの下で参考文献32に開示されている。参考文献32において、本明細書で報告されたものとは異なる合成が、IVaおよびIVcを調製するために使用されている。化学用語および定義ハロ用語ハロゲンもしくはハロは、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素を含む。アルキル、アルキレン、アルケニル、アルキニル、シクロアルキルなど用語アルキル、アルキレン、アルケニルおよびアルキニルとは、直鎖および分枝鎖の両方の非環式形態に言及するために本明細書で使用される。その環式類似体は、シクロアルキルなどといわれる。用語アルキルは、一価の直鎖状もしくは分枝状の、飽和非環式ヒドロカルビル基を含む。一実施形態において、アルキルは、C1-10アルキルであり、別の実施形態において、C1-6アルキルであり、別の実施形態において、C1-4アルキル例えば、メチル、エチル、n-プロピル、i-プロピルもしくはt-ブチル基である。用語シクロアルキルとは、一価で飽和の環式ヒドロカルビル基を含む。一実施形態において、シクロアルキルは、C3-10シクロアルキルであり、別の実施形態において、C3-6シクロアルキル例えば、シクロペンチルおよびシクロヘキシルである。用語アルコキシとは、アルキル-O-を意味する。用語アルケニルは、少なくとも1個の炭素-炭素二重結合を有し、そして一実施形態において、炭素-炭素三重結合を有さない、一価で、直鎖状もしくは分枝状の、不飽和の非環式ヒドロカルビル基を含む。一実施形態において、アルケニルは、C2-10アルケニルであり、別の実施形態において、C2-6アルケニルであり、別の実施形態において、C2-4アルケニルである。用語シクロアルケニルは、少なくとも1個の炭素-炭素二重結合を有し、そして一実施形態において、炭素-炭素三重結合を有さない、一価の、部分不飽和の環式ヒドロカルビル基を含む。一実施形態において、シクロアルケニルは、C3-10シクロアルケニルであり、別の実施形態において、C5-10シクロアルケニル例えば、シクロヘキセニルもしくはベンゾシクロヘキシルである。用語アルキニルは、少なくとも1個の炭素-炭素三重結合を有し、そして一実施形態において、炭素-炭素二重結合を有さない、一価の、直鎖状もしくは分枝状の、不飽和非環式ヒドロカルビル基を含む。一実施形態において、アルキニルは、C2-10アルキニルであり、別の実施形態において、C2-6アルキニルであり、別の実施形態において、C2-4アルキニルである。用語シクロアルキニルは、少なくとも1個の炭素-炭素三重結合を有し、そして一実施形態において、炭素-炭素二重結合を有さない、一価の、部分不飽和の環式ヒドロカルビル基を含む。一実施形態において、シクロアルキニルは、C3-10シクロアルケニルであり、別の実施形態において、C5-10シクロアルキニルである。用語アルキレンは、二価の、直鎖状もしくは分枝状の、飽和非環式ヒドロカルビル基を含む。一実施形態において、アルキレンは、C1-10アルキレンであり、別の実施形態において、C1-6アルキレンであり、別の実施形態において、C1-4アルキレン例えば、メチレン、エチレン、n-プロピレン、i-プロピレンもしくはt-ブチレン基である。用語アルケニレンは、少なくとも1個の炭素-炭素二重結合を有し、そして一実施形態において、炭素-炭素三重結合を有さない、二価の、直鎖状もしくは分枝状の、不飽和非環式ヒドロカルビル基を含む。一実施形態において、アルケニレンは、C2-10アルケニレンであり、別の実施形態において、C2-6アルケニレンであり、別の実施形態において、C2-4アルケニレンである。用語アルキニレンは、少なくとも1個の炭素-炭素三重結合を有し、そして一実施形態において、炭素-炭素二重結合を有さない、二価の、直鎖状もしくは分枝状の不飽和非環式ヒドロカルビル基を含む。一実施形態において、アルキニレンは、C2-10アルキニレンであり、別の実施形態において、C2-6アルキニレンであり、別の実施形態において、C2-4アルキニレンである。ヘテロアルキルなど用語ヘテロアルキルは、最大6個までの炭素原子、一実施形態においては、最大5個までの炭素原子、別の実施形態においては、最大4個までの炭素原子、別の実施形態においては、最大3個までの炭素原子、別の実施形態においては、最大2個までの炭素原子、別の実施形態においては、1個の炭素原子が、O、SOq、N、POrもしくはSiそして好ましくは、O、SOqもしくはNで独立して各々置換されているが、アルキル炭素原子のうちの少なくとも1個は残っている、アルキル基を含む。上記ヘテロアルキル基は、C連結もしくはヘテロ連結され得る。すなわち、上記ヘテロアルキル基は、炭素原子を介して、またはO、SOq、N、POrもしくはSiを介して、分子の残りに連結され得る。用語ヘテロシクロアルキルは、最大6個までの炭素原子、一実施形態においては、最大5個までの炭素原子、別の実施形態においては、最大4個までの炭素原子、別の実施形態においては、最大3個までの炭素原子、別の実施形態においては、最大2個までの炭素原子、別の実施形態においては、1個の炭素原子が、O、SOqもしくはNで各々独立して置換されているが、シクロアルキル炭素原子のうちの少なくとも1個は残っている、シクロアルキル基を含む。ヘテロシクロアルキル基の例としては、以下が挙げられる:オキシラニル、チアラニル、アジリジニル、オキセタニル、チアタニル、アゼチジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフェニル、ピロリジニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、ピペリジニル、1,4-ジオキサニル、1,4-オキサチアニル、モルホリニル、1,4-ジチアニル、ピペラジニル、1,4-アザチアニル、オキセパニル、チエパニル、アゼパニル、1,4-ジオキセパニル、1,4-オキサチエパニル、1,4-オキサアゼパニル、1,4-ジチエパニル、1,4-チエアゼパニルおよび1,4-ジアゼパニル。上記ヘテロシクロアルキル基は、C連結されてもよいし、N連結されてもよい。すなわち、上記ヘテロシクロアルキル基は、炭素原子を介して、もしくは窒素原子を介して、分子の残りに連結され得る。用語ヘテロアルケニルは、最大3個までの炭素原子、一実施形態においては、最大2個までの炭素原子、別の実施形態においては、1個の炭素原子が、O、SOqもしくはNで各々独立して置換されているが、アルケニル炭素原子のうちの少なくとも1個は残っている、アルケニル基を含む。上記ヘテロアルケニル基は、C連結されてもよいし、ヘテロ連結されてもよい。すなわち、上記ヘテロアルケニル基は、炭素原子を介して、またはO、SOqもしくはNを介して、分子の残りに連結され得る。用語ヘテロシクロアルケニルは、最大3個までの炭素原子、一実施形態においては、最大2個までの炭素原子、別の実施形態においては、1個の炭素原子が、O、SOqもしくはNで各々独立して置換されているが、シクロアルケニル炭素原子のうちの少なくとも1個は残っている、シクロアルケニル基を含む。ヘテロシクロアルケニル基の例としては、以下が挙げられる:3,4-ジヒドロ-2H-ピラニル、5-6-ジヒドロ-2H-ピラニル、2H-ピラニル、1,2,3,4-テトラヒドロピリジニルおよび1,2,5,6-テトラヒドロピリジニル。上記ヘテロシクロアルケニル基は、C連結されてもよいし、N連結されてもよい。すなわち、上記ヘテロシクロアルケニル基は、炭素原子を介して、もしくは窒素原子を介して、分子の残りに連結され得る。用語ヘテロアルキニルは、最大3個までの炭素原子、一実施形態においては、最大2個までの炭素原子、別の実施形態においては、1個の炭素原子が、O、SOqもしくはNで各々独立して置換されているが、アルキニル炭素原子のうちの少なくとも1個は残っている、アルキニル基を含む。上記ヘテロアルキニル基は、C連結されてもよいし、ヘテロ連結されてもよい。すなわち、上記ヘテロアルキニル基は、炭素原子を介して、またはO、SOqもしくはNを介して、分子の残りに連結され得る。用語ヘテロシクロアルキニルは、最大3個までの炭素原子、一実施形態においては、最大2個までの炭素原子、別の実施形態においては、1個の炭素原子が、O、SOqもしくはNで各々独立して置換されているが、シクロアルキニル炭素原子のうちの少なくとも1個は残っている、シクロアルキニル基を含む。上記ヘテロシクロアルケニル基は、C連結されてもよいし、N連結されてもよい。すなわち、上記ヘテロシクロアルケニル基は、炭素原子を介して、もしくは窒素原子を介して、分子の残りに連結され得る。用語ヘテロアルキレンは、最大3個までの炭素原子、一実施形態において、最大2個までの炭素原子、別の実施形態において、1個の炭素原子が、O、SOqもしくはNで各々独立して置換されているが、アルキレン炭素原子のうちの少なくとも1個は残っている、アルキレン基を含む。用語ヘテロアルケニレンは、最大3個までの炭素原子、一実施形態においては、最大2個までの炭素原子、別の実施形態においては、1個の炭素原子が、O、SOqもしくはNで各々独立して置換されているが、アルケニレン炭素原子のうちの少なくとも1個は残っている、アルケニレン基を含む。用語ヘテロアルキニレンは、最大3個までの炭素原子、一実施形態においては、最大2個までの炭素原子、別の実施形態においては、1個の炭素原子が、O、SOqもしくはNで各々独立して置換されているが、アルキニレン炭素原子のうちの少なくとも1個は残っている、アルキニレン基を含む。アリール用語アリールは、一価の芳香族環式ヒドロカルビル基例えば、フェニルもしくはナフチル例えば、1-ナフチルもしくは2-ナフチルを含む。一般に、上記アリール基は、単環式もしくは多環式の縮合環芳香族基であり得る。好ましいアリールは、C6-C14アリールである。アリール基の他の例は、アセアントリレン、アセナフチレン、アセフェナントリレン、アントラセン、アズレン、クリセン、コロネン、フルオランテン、フルオレン、as-インダセン、s-インダセン、インデン、ナフタレン、オバレン、ペリレン、フェナレン、フェナントレン、ピセン、プレイアデン、ピレン、ピラントレンおよびルビセンの一価誘導体である。用語アリールアルキルは、アリール基例えば、ベンジルで置換されたアルキルを意味する。用語アリーレンは、二価の芳香族環式ヒドロカルビル基例えば、フェニレンを含む。一般に、上記アリーレン基は、単環式もしくは多環式の縮合環芳香族基であり得る。好ましいアリーレンは、C6-C14アリーレンである。アリーレン基の他の例は、アセアントリレン、アセナフチレン、アセフェナントリレン、アントラセン、アズレン、クリセン、コロネン、フルオランテン、フルオレン、as-インダセン、s-インダセン、インデン、ナフタレン、オバレン、ペリレン、フェナレン、フェナントレン、ピセン、プレイアデン、ピレン、ピラントレンおよびルビセンの二価誘導体である。ヘテロアリール用語ヘテロアリールは、O、S、NおよびNRNから独立して選択される1個以上のヘテロ原子を追加的に含む、一価ヘテロ芳香族の環式ヒドロカルビル基であって、ここでRNは、以下に定義されるおよび一実施形態においては、Hもしくはアルキル例えば、C1-6アルキルである。一般に、上記ヘテロアリール基は、単環式もしくは多環式例えば、二環式縮合環ヘテロ芳香族基であり得る。一実施形態において、ヘテロアリール基は、5~13個の環員好ましくは、5~10員、ならびにO、S、NおよびNRNから独立して選択される1個、2個、3個もしくは4個の環ヘテロ原子を含む。一実施形態において、ヘテロアリール基は、5員、6員、9員もしくは10員、例えば、5員の単環式、6員の単環式、9員の縮合二環式環もしくは10員の縮合二環式環であり得る。単環式ヘテロ芳香族基は、5~6環員、ならびにO、S、NもしくはNRNから選択される1個、2個、3個もしくは4個のヘテロ原子を含むヘテロ芳香族基を包含する。一実施形態において、5員の単環式ヘテロアリール基は、-NRN-基、-O-原子もしくは-S-原子である1個の環員、および必要に応じて、=N-原子である1~3個の環員例えば、1個もしくは2個の環員を含むここで上記5個の環員のうちの残りは、炭素原子である。5員の単環式ヘテロアリール基の例は、ピロリル、フラニル、チオフェニル、ピラゾリル、イミダゾリル、イソオキサゾリル、オキサゾリル、イソチアゾリル、チアゾリル、1,2,3トリアゾリル、1,2,4トリアゾリル、1,2,3オキサジアゾリル、1,2,4オキサジアゾリル、1,2,5オキサジアゾリル、1,3,4オキサジアゾリル、1,3,4チアジアゾリル、ピリジル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピラジニル、1,3,5トリアジニル、1,2,4トリアジニル、1,2,3トリアジニルおよびテトラゾリルである。6員の単環式ヘテロアリール基の例は、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニルおよびピラジニルである。一実施形態において、6員の単環式ヘテロアリール基は、=N-原子である1個もしくは2個の環員を含むここで上記6個の環員のうちの残りは、炭素原子である。二環式のヘテロ芳香族基としては、9~13個の環員およびO、S、NもしくはNRNから選択される1個、2個、3個もしくは4個以上のヘテロ原子を含む縮合環のヘテロ芳香族基が挙げられる。一実施形態において、9員の二環式ヘテロアリール基は、-NRN-基、-O-原子もしくは-S-原子である1個の環員、および必要に応じて、=N-原子である1~3個の環員例えば、1個もしくは2個の環員を含むここで上記9個の環員のうちの残りは、炭素原子である。9員の縮合環の二環式ヘテロアリール基の例は、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、インドリル、ベンゾイミダゾリル、インダゾリル、ベンゾトリアゾリル、ピロロ[2,3-b]ピリジニル、ピロロ[2,3-c]ピリジニル、ピロロ[3,2-c]ピリジニル、ピロロ[3,2-b]ピリジニル、イミダゾ[4,5-b]ピリジニル、イミダゾ[4,5-c]ピリジニル、ピラゾロ[4,3-d]ピリジニル、ピラゾロ[4,3-c]ピリジニル、ピラゾロ[3,4-c]ピリジニル、ピラゾロ[3,4-b]ピリジニル、イソインドリル、インダゾリル、プリニル、インドリニニル、イミダゾ[1,2-a]ピリジニル、イミダゾ[1,5-a]ピリジニル、ピラゾロ[1,2-a]ピリジニル、ピロロ[1,2-b]ピリダジニルおよびイミダゾ[1,2-c]ピリミジニルである。一実施形態において、10員の二環式ヘテロアリール基は、=N-原子である1~3個の環員を含むここで上記10個の環員のうちの残りは、炭素原子である。10員の縮合環の二環式ヘテロアリール基の例は、キノリニル、イソキノリニル、シンノリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、フタラジニル、1,6-ナフチリジニル、1,7-ナフチリジニル、1,8-ナフチリジニル、1,5-ナフチリジニル、2,6-ナフチリジニル、2,7-ナフチリジニル、ピリド[3,2-d]ピリミジニル、ピリド[4,3-d]ピリミジニル、ピリド[3,4-d]ピリミジニル、ピリド[2,3-d]ピリミジニル、ピリド[2,3-b]ピラジニル、ピリド[3,4-b]ピラジニル、ピリミド[5,4-d]ピリミジニル、ピラジノ[2,3-b]ピラジニルおよびピリミド[4,5-d]ピリミジニルである。用語ヘテロアリールアルキルとは、ヘテロアリール基で置換されたアルキルを意味する。用語ヘテロアリーレンは、O、S、NおよびNRNから独立して選択される1個以上のヘテロ原子を追加的に含む、二価のヘテロ芳香族の環式ヒドロカルビル基を含み、ここでRNは、以下で定義されるおよび一実施形態においては、Hもしくはアルキル例えば、C1-6アルキルである。一般に、上記ヘテロアリーレン基は、単環式もしくは多環式例えば、二環式縮合環ヘテロ芳香族基であり得る。一実施形態において、ヘテロアリーレン基は、5~13個の環員好ましくは、5~10員、ならびにO、S、NおよびNRNから独立して選択される1個、2個、3個もしくは4個の環ヘテロ原子を含む。一実施形態において、ヘテロアリーレン基は、5員、6員、9員もしくは10員、例えば、5員の単環式、6員の単環式、9員の縮合環二環式もしくは10員の縮合環二環式であり得る。用語ヘテロアリーレンは、上記で考察されるヘテロアリール基の各々の二価の誘導体を含む。用語アリール、芳香族、ヘテロアリールおよびヘテロ芳香族はまた、部分的に還元されている基を含む。従って、例えば、ヘテロアリールは、環のうちの1個が、飽和環へと還元された縮合種例えば、1,2,3,4-テトラヒドロ-1,8-ナフチリジン-2-イルを含む。一般別段明示的に示されなければ、基の組み合わせが、1個の部分として本明細書で言及される場合例えば、アリールアルキル、その最後に言及される基は、上記部分を分子の残りに結合する原子を含む。O、SOq、NもしくはPOrで置換されているアルキル基もしくは他の基の炭素原子に対して言及がなされる場合、が、ここでEは、Hではない場合があるによって置換されているか;-CH=が、-N=もしくは-POr=によって置換されているか;≡C-Hが、≡Nもしくは≡POrによって置換されているか;または-CH2-が、-O-、-SOq-、-NRN-もしくは-POrRN-によって置換されていることが意図され、ここでRNは、H、あるいは必要に応じて置換された、C1-6アルキル、C1-6ヘテロアルキル、C3-6シクロアルキル、C3-6ヘテロシクロアルキル、C2-6アルケニル、C2-6ヘテロアルケニル、C3-6シクロアルケニル、C3-6ヘテロシクロアルケニル、フェニル、または5個もしくは6個の環員を含むヘテロアリールである。RNは、好ましくは、H、C1-6アルキルもしくはC3-6シクロアルキルである。qは、独立して、0、1もしくは2である。一実施形態において、qは、0である。rは、独立して、0もしくは1である。一実施形態において、rは、0である。Siで置換されている炭素原子に対して言及がなされる場合、上記炭素原子が、ケイ素原子で交換されているが、他の点で、結合は同じままであることが意図される。従って、例えば、-CH2-は、-SiH2-で置換され;-CH=は、-SiH=で置換され;そして≡C-Hは、≡Si-Hで置換される。明瞭にするために、上記のヘテロ原子含有基例えば、ヘテロアルキルなどに関して、炭素原子の数が与えられる場合例えば、C3-6ヘテロアルキル、3~6個の鎖炭素原子のうちの1個以上が、O、SOqもしくはNで置換されているC3-6アルキルに基づく基が意図される。よって、C3-6ヘテロアルキル基は、例えば、3~6個未満の鎖炭素原子を含む。別の例として、ピリジル基は、これが5個の炭素原子を含むとしても、C6ヘテロアリール基として分類される。置換本発明の化合物の基例えば、アルキル、シクロアルキル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、アルキレン、アルケニレン、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロシクロアルケニル、ヘテロアルキニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレンアリール、アリールアルキル、アリールヘテロアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキルもしくはヘテロアリールヘテロアルキル基などは、置換されていてもよいし、置換されていなくてもよく、一実施形態においては、置換されていない。代表的には、置換は、置換基での水素原子の観念上の置換もしくは=Oによる置換の場合には、2個の水素原子を含む。置換される場合、一般に、各基には、1~5個の置換基が存在し、一実施形態においては、1~3個の置換基、一実施形態においては、1個もしくは2個の置換基、一実施形態においては、1個の置換基が存在する。一実施形態は、同じ原子上に1個超の置換基を含む例えば、アセタール基。一実施形態において、上記置換基は、独立して、Sub1もしくはSub2一実施形態においては、Sub2であり、ここで:Sub1は、独立して、ハロゲン、トリハロメチル、トリハロエチル、-NO2、-CN、-NRs2O-、-CO2H、-CO2Rs、-SO3H、-SORs、-SO2Rs、-SO3Rs、-OC=OORs、-C=OH、-C=ORs、-OC=ORs、=O、-NRs2、-C=ONH2、-C=ONRs2、-NRsC=OORs、-NRsC=ONRs2、-OC=ONRs2、-NRsC=ORs、-C=SNRs2、-NRsC=SRs、-SO2NRs2、-NRsSO2Rs、-NRsC=SNRs2、-NRsSO2NRs2、-Rsもしくは-ZsRsであり、ここで;Zsは、独立して、O、SもしくはNRsであり;Rsは、独立して、H、またはC1-6アルキル、C1-6ヘテロアルキル、-Alkaf-C3-6シクロアルキル、-Alkaf-C3-6ヘテロシクロアルキル、C2-6アルケニル、C2-6ヘテロアルケニル、-Alkaf-C3-6シクロアルケニル、-Alkaf-C3-6ヘテロシクロアルケニル、C2-6アルキニル、C2-6ヘテロアルキニル、-Alkaf-C6-14アリール、-Alkaf-C6-14アリールもしくは-Alkaf-ヘテロアリールここでヘテロアリールは、5~13個の環員を含むであり、ここでfは、0もしくは1であり;Alkaは、C1-6アルキレンもしくはC1-6ヘテロアルキレンであり;そしてRsは、1~3個の置換基Sub2によってそれ自体が必要に応じて置換され一実施形態においては、置換されていない;Sub2は、独立して、ハロゲン、トリハロメチル、トリハロエチル、-NO2、-CN、-NC1-6アルキル2O-、-CO2H、-CO2C1-6アルキル、-SO3H、-SOC1-6アルキル、-SO2C1-6アルキル、-SO3C1-6アルキル、-OC=OOC1-6アルキル、-C=OH、-C=OC1-6アルキル、-OC=OC1-6アルキル、=O、-NC1-6アルキル2、-C=ONH2、-C=ONC1-6アルキル2、-NC1-6アルキルC=OOC1-6アルキル、-NC1-6アルキルC=ONC1-6アルキル2、-OC=ONC1-6アルキル2、-NC1-6アルキルC=OC1-6アルキル、-C=SNC1-6アルキル2、-NC1-6アルキルC=SC1-6アルキル、-SO2NC1-6アルキル2、-NC1-6アルキルSO2C1-6アルキル、-NC1-6アルキルC=SNC1-6アルキル2、-NC1-6アルキルSO2NC1-6アルキル2、-C1-6アルキル、-C1-6ヘテロアルキル、-C3-6シクロアルキル、-C3-6ヘテロシクロアルキル、-C2-6アルケニル、-C2-6ヘテロアルケニル、-C3-6シクロアルケニル、-C3-6ヘテロシクロアルケニル、-C2-6アルキニル、-C2-6ヘテロアルキニル、-C6-14アリール、-C5-13ヘテロアリール、-Zt-C1-6アルキル、-Zt-C3-6シクロアルキル、-Zt-C2-6アルケニル、-Zt-C3-6シクロアルケニル、もしくは-Zt-C2-6アルキニルであり;そしてZtは、独立して、O、S、NHもしくはNC1-6アルキルである。Sub1におけるRsは、1~3個の置換基Sub2によって必要に応じて置換され得る一方、Sub2は、置換されない。しかし、一実施形態において、Rsは、置換されない。一実施形態において、Rsは、HもしくはC1-6アルキル1~3個の置換基Sub2で必要に応じて置換されるである。一実施形態において、Sub2は、独立して、ハロゲン、トリハロメチル、トリハロエチル、-NO2、-CN、-NC1-6アルキル2O-、-CO2H、-SO3H、-SOC1-6アルキル、-SO2C1-6アルキル、-C=OH、-C=OC1-6アルキル、=O、-NC1-6アルキル2、-C=ONH2、-C1-6アルキル、-C3-6シクロアルキル、-C3-6ヘテロシクロアルキル、-Zt-C1-6アルキルもしくは-Zt-C3-6シクロアルキルである。一実施形態において、置換される基が非環式例えば、アルキル、ヘテロアルキル、アルケニルなどである場合、Sub1は、-Rsではなく、Sub2は、-C1-6アルキル、-C1-6ヘテロアルキル、-C2-6アルケニル、-C2-6ヘテロアルケニル、-C2-6アルキニル、-C2-6ヘテロアルキニルではない。Sub2以外の基が、置換されてもよい少なくとも2個の位置を有する場合、上記基は、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレンもしくはヘテロアルキニレン鎖一実施形態において、1~6個の原子、さらなる実施形態においては、3~6個の原子、およびさらなる実施形態においては、3個もしくは4個の原子を含むの両方の末端によって置換されて、環式部分を形成してもよい。その鎖は、1~3個の置換基Sub2で必要に応じて置換される。一実施形態において、その鎖は、置換されない。従って、用語、必要に応じて置換された、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルケニル、ヘテロシクロアルキニル、アリールおよびヘテロアリールは、縮合種を含む。例えば、必要に応じて置換されたシクロアルキルは、2個のシクロアルキル環が縮合している種を含み、必要に応じて置換されたヘテロアリールは、ヘテロシクロアルキル環が上記芳香族環に縮合されている種を含む例えば、5,6,7,8-テトラヒドロ-1,8-ナフチリジン-2-イル。Sub2以外の基が、2回置換され得る原子を有する場合、その原子は、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレンもしくはヘテロアルキニレン鎖一実施形態においては、2~8個の原子、さらなる実施形態においては、3~6個の原子、およびさらなる実施形態においては、4個もしくは5個の原子を含むの両方の末端によって置換されて、環式部分を形成し得る。その鎖は、1~3個の置換基Sub2によって必要に応じて置換される。一実施形態において、その鎖は、置換されない。従って、用語、必要に応じて置換された、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルケニル、ヘテロシクロアルキニル、アリールおよびヘテロアリールは、スピロ種を含む。明瞭さのために、基がヘテロ原子を含む場合、置換基は、上記ヘテロ原子に結合され得る。従って、例えば、必要に応じて置換されたヘテロアルキルは、-CH2-NSub1-CH2-、-CHSub1-NH-CH2-および-CHSub1-NSub1-CH2-などを含む。修飾語句modifierの用語列挙の前に修飾語句が置かれている場合、上記修飾語句は、上記列挙中の項目の各々に適用されると理解されるべきであると解釈される。例えば、語句必要に応じて改変された、C3-20-ヘテロシクロアルキル、C3-20-ヘテロシクロアルケニル、C3-20-ヘテロシクロアルキニルもしくはC5-20-ヘテロアリール基とは、上記列挙中の4つの項目の各々、すなわち、上記C3-20-ヘテロシクロアルキル基、上記C3-20-ヘテロシクロアルケニル基、上記C3-20-ヘテロシクロアルキニル基および上記C6-20-ヘテロアリール基が、必要に応じて置換されていてもよいことを意味する。第1の修飾語句によって基が特徴付けられ、続いて、後ろで、同じ基が、続く修飾語句によって特徴付けられる場合、上記基は、両方の修飾語句によって同時に特徴付けられることが意味される。例えば、基が、C3-20-ヘテロシクロアルキニル第1の修飾語句基として記載され、その後、同じ基が、C5-16続く修飾語句基として記載される場合、C5-16ヘテロシクロアルキニル基であることが意味される。ステロイド本明細書で使用される場合、用語ステロイドとは、以下の構造を含む任意の基に言及するその構造は、ステロイド骨格として本明細書で言及される。単に例示目的で、ステロイド骨格を、完全飽和として上記で描いた。しかし、用語ステロイドはまた、上記ステロイド骨格中に不飽和が存在する場合を包含すると解釈される。例えば、用語ステロイドは、完全不飽和マンキュード基本骨格を含む基を包含する15H-シクロペンタ[a]フェナントレン。用語ステロイドはまた、部分不飽和ステロイド骨格を含む基を包含する。用語ステロイドはまた、上記ステロイド骨格のseco誘導体、すなわち、開環がもたらされた基;それぞれ、環縮小および環拡大を伴う上記ステロイド骨格のノルおよびホモ誘導体D.Hellwinkel,SystemicNomenclatureofOrganicChemistry,Springer発行,2001,ISBN:3-540-41138-0,secoについては203ページ、ならびにノルおよびホモについては204ページを参照のことを包含する。しかし、一実施形態において、このようなseco誘導体は、用語ステロイドによっては包含されない。別の実施形態において、このようなノル誘導体は、用語ステロイドによっては包含されない。別の実施形態において、このようなホモ誘導体は、用語ステロイドによっては包含されない。従って、一実施形態において、このようなseco、ノルおよびホモ誘導体は、用語ステロイドによっては包含されない。用語ステロイドはまた、ステロイド骨格と表示された構造における炭素原子のうちの1個以上が、ヘテロ原子によって置換されている場合を包含する。1つのこのような実施形態において、最大6個までの炭素原子、一実施形態においては、最大5個までの炭素原子、別の実施形態においては、最大4個までの炭素原子、別の実施形態において、最大3個までの炭素原子、別の実施形態において、最大2個までの炭素原子、別の実施形態においては、1個の炭素原子は、各々、O、SOq、N、POrもしくはSiおよび好ましくは、O、SOqもしくはNによって独立して置換されている。しかし、一実施形態において、用語ステロイドは、上記ステロイド基本骨格が、ヘテロ原子を含まない種を包含する。ステロイド環系は、以下に示される慣例に従って番号づけられる。用語ステロイドは、ステロール、ステロイドホルモン、胆汁酸および胆汁酸塩を包含する。ステロールは、A環の3位においてヒドロキシル基を有する任意のステロイドである。不飽和標準的使用によれば、ω-3位とは、鎖のメチル末端からの3番目の結合に言及する;ω-6位とは、鎖のメチル末端からの6番目の結合に言及し、ω-9位は、鎖のメチル末端からの9番目の結合に言及する。一般本発明の粒子は、別段示されなければ、化学、生化学、分子生物学、免疫学および薬理学の、当該分野の技術内の従来の方法を使用する。このような技術は、文献中に十分に説明されている。例えば、参考文献33~39などを参照のこと。用語含むcomprisingは、含むincludingならびにからなるconsistingを包含し、例えば、Xを含むcomprising組成物は、Xから専らなってもよいし、何かさらなるものを含んでいてもよい例えば、XY。数値xに関して用語約とは、選択的であり、例えば、x±10を意味する。語句実質的にとは、完全にを排除せず、例えば、Yを実質的に含まない組成物は、Yを完全に含まない場合もある。必要な場合、語句実質的には、本発明の定義から省略され得る。電荷、カチオン、アニオン、両性性イオンなどへの言及は、pH7において取り扱われる。TLR3は、Toll様レセプター3である。これは、先天的免疫系において重要な役割を果たす一回膜貫通レセプターである。既知のTLR3アゴニストは、ポリI:Cを含む。TLR3は、このレセプターをコードする遺伝子の承認されたHGNC名であり、その特有のHGNCIDは、HGNC:11849である。ヒトTLR3遺伝子のRefSeq配列は、GI:2459625である。TLR7は、Toll様レセプター7である。これは、先天的免疫系において重要な役割を果たす一回膜貫通レセプターである。既知のTLR7アゴニストは、例えば、イミキモドを含む。TLR7は、このレセプターをコードする遺伝子の承認されたHGNC名であり、その特有のHGNCIDは、HGNC:15631である。ヒトTLR7遺伝子のRefSeq配列は、GI:67944638である。TLR8は、Toll様レセプター8である。これは、先天的免疫系において重要な役割を果たす一回膜貫通レセプターである。既知のTLR8アゴニストは、例えば、レシキモドを含む。TLR8は、このレセプターをコードする遺伝子の承認されたHGNC名であり、その特有のHGNCIDは、HGNC:15632である。ヒトTLR8遺伝子のRefSeq配列は、GI:20302165である。RIG-I様レセプターRLRファミリーは、先天的免疫系において重要な役割を果たす種々のRNAヘリカーゼを含む[40]。RLR-1RIG-Iもしくはレチノイン酸誘導性遺伝子Iとしても公知は、そのN末端付近にある2つのカスパーゼリクルートドメインを有する。上記RLR-1ヘリカーゼをコードする遺伝子の承認されたHGNC名は、DDX58DEADAsp-Glu-Ala-Aspボックスポリペプチド58DEADAsp-Glu-Ala-Aspboxpolypeptide58についてであり、その特有のHGNCIDは、HGNC:19102である。ヒトRLR-1遺伝子のRefSeq配列は、GI:77732514である。RLR-2MDA5もしくは黒色腫分化関連遺伝子5melanomadifferentiation-associatedgene5としても公知はまた、そのN末端付近にある2つのカスパーゼリクルートドメインを有する。RLR-2ヘリカーゼをコードする遺伝子の承認されたHGNC名は、IFIH1ヘリカーゼCドメイン1で誘導されるインターフェロンinterferoninducedwithhelicaseCdomain1についてであり、特有のHGNCIDは、HGNC:18873である。ヒトRLR-2遺伝子のRefSeq配列は、GI:27886567である。RLR-3LGP2もしくは遺伝学および生理学研究室2laboratoryofgeneticsandphysiology2としても公知は、カスパーゼリクルートドメインを有さない。RLR-3ヘリカーゼをコードする遺伝子の承認されたHGNC名は、DHX58DEXHAsp-Glu-X-Hisボックスポリペプチド58についてであり、特有のHGNCIDは、HGNC:29517である。ヒトRLR-3遺伝子のRefSeq配列は、GI:149408121である。PKRは、二本鎖RNA依存性プロテインキナーゼである。これは、先天的免疫系において重要な役割を果たす。EIF2AK2真核生物翻訳開始因子2-αキナーゼ2eukaryotictranslationinitiationfactor2-alphakinase2については、この酵素をコードする遺伝子の承認されたHGNC名であり、その特有のHGNCIDは、HGNC:9437である。ヒトPKR遺伝子のRefSeq配列は、GI:208431825である。発明を実施するための態様RNAレプリコン種々のレプリコンは、以下で使用される。一般に、これらは、ベネズエラウマ脳炎ウイルスVEEVに由来する非構造タンパク質、VEEV由来のパッケージングシグナル、およびシンドビスウイルスもしくはVEEV変異体に由来する3’UTRを有するハイブリッドアルファウイルスゲノムに基づく。上記レプリコンは、約10kb長であり、ポリAテールを有する。アルファウイルスレプリコンをコードするプラスミドDNA名称:pT7-mVEEV-FL.RSVFもしくはA317;pT7-mVEEV-SEAPもしくはA306;pSP6-VCR-GFPもしくはA50を、インビボでのRNA合成のテンプレートとして供した。上記レプリコンは、RNA複製に必要とされるアルファウイルス遺伝的エレメントを含むが、粒子アセンブリに必要な遺伝子産物をコードするエレメントを欠いている;構造タンパク質は、代わりに、目的のタンパク質レポーター例えば、SEAPもしくはGFPまたは免疫原例えば、全長RSVFタンパク質のいずれかによって置き換えられるので、上記レプリコンは、感染性粒子の生成を誘導できない。上記アルファウイルスcDNAの上流にあるバクテリオファージT7もしくはSP6プロモーターは、インビトロで上記レプリコンRNAの合成を促進し、上記ポリAテールの直ぐ下流にあるデルタ型肝炎ウイルスHDVリボザイムは、その自己切断活性を介して正確な3’末端を生成する。適切な制限エンドヌクレアーゼで上記HDVリボザイムの下流で上記プラスミドDNAを直線状にした後に、ランオフ転写物run-offtranscriptを、T7もしくはSP6バクテリオファージ由来DNA依存性RNAポリメラーゼを使用して、インビトロで合成した。転写を、製造業者Ambionによって提供される指示書に従って、ヌクレオシドトリホスフェートATP、CTP、GTPおよびUTPの各々の7.5mMT7RNAポリメラーゼもしくは5mMSP6RNAポリメラーゼの存在下で、37°Cにおいて2時間にわたって行った。転写の後、上記テンプレートDNAを、TURBODNaseAmbionで消化した。上記レプリコンRNAを、LiClで沈殿させ、ヌクレアーゼ非含有水中で再構成した。キャップのないRNAを、ScriptCapm7GキャッピングシステムEpicentreBiotechnologiesを使用して、ユーザーマニュアルに概説されるとおり、ワクシニアキャッピング酵素VCEで転写後にキャップした;このようにキャップしたレプリコンに、vの接頭文字を付ける例えば、vA317は、VCEによってキャップされたA317レプリコンである。転写後キャップされたRNAを、LiClで沈殿させ、ヌクレアーゼ非含有水中で再構成した。上記RNAサンプルの濃度を、OD260nmを測定することによって決定した。上記インビトロ転写物の完全性を、変性アガロースゲル電気泳動によって確認した。リポソーム被包RNAを、実質的に参考文献7および41の方法によって作製したリポソーム中に被包した。上記リポソームを、10DSPC両性イオン性、40DlinDMAカチオン性、48コレステロールおよび2PEG結合体化DMGから作製した。これら割合は、全リポソーム中のモルに言及する。DlinDMA1,2-ジリノレイルオキシ-N,N-ジメチル-3-アミノプロパンを、参考文献2の手順を使用して合成した。DSPC1,2-ジアステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリンを、Genzymeから購入した。コレステロールを、Sigma-Aldrichから得た。PEG結合体化DMG1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシポリエチレングリコール,アンモニウム塩、DOTAP1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン,塩化物塩およびDC-chol3β-[N-N’,N’-ジメチルアミノエタン-カルバモイル]コレステロールヒドロクロリドは、AvantiPolarLipidsからであった。簡潔には、脂質をエタノール2ml中に溶解し、RNAレプリコンを、緩衝液2ml,100mMクエン酸ナトリウム,pH6中に溶解し、これらを2mlの緩衝液と混合し、続いて、1時間平衡化させた。上記混合物を6mlの緩衝液で希釈し、次いで、濾過した。得られた生成物は、リポソームを含み、約95の被包効率であった。図2は、これら方法によって調製されるリポソームの例示的電子顕微鏡写真を示す。これらリポソームは、全長RSVF抗原をコードする被包化RNAを含む。1つのバッチの動的光散乱は、平均直径141nm強度でもしくは78nm数でを示した。1つの特定の被包化方法において、エタノール中に新たな脂質ストック溶液を調製した。37mgのDlinDMA、11.8mgのDSPC、27.8mgのコレステロールおよび8.07mgのPEG結合体化DMGを秤量し、7.55mLのエタノール中に溶解した。5種類の異なる結合体化PEGを使用した:PEG-500、PEG-750、PEG-1000、PEG-2000もしくはPEG-3000。上記新たに調製した脂質ストック溶液を、37°Cにおいて約15分間にわたって穏やかに振盪して、均質な混合物を形成した。次いで、226.7μLの上記ストックを、1.773mLエタノールに添加して、作業脂質ストック溶液2mLを作製した。さらに、RNAの2mL作業溶液を、100mMクエン酸緩衝液pH6中約1μg/μLのストック溶液から調製した。3本の20mLガラスバイアル撹拌子有りを、RNaseAway溶液ですすぎ、使用前に多量のMilliQ水で洗浄して、バイアルのRNAseの汚染を除去した。上記バイアルのうちの1本を、上記RNA作業溶液のために使用し、他を、脂質およびRNA混合物を集めるために使用した後に記載されるとおり。作業脂質溶液およびRNA溶液を、37°Cにおいて10分間にわたって加熱し、その後、3ccルーアーロックシリンジに入れた。クエン酸緩衝液pH62mLを、別の3ccシリンジに入れた。RNAを含むシリンジおよび脂質を含むシリンジを、FEPチューブフッ素化エチレン-プロピレン;使用した全てのFEPチューブは、2mm内径および3mm外径を有した;IdexHealthScienceから得たを使用して、TミキサーPEEKTM500μmID接合部に接続した。上記Tミキサーからの出口もまた、FEPチューブであった。上記クエン酸緩衝液を含む第3のシリンジを、別個の1つのチューブに接続した。次いで、全てのシリンジを、シリンジポンプを使用して、流量7mL/分において作動させた。上記チューブ出口を、20mLガラスバイアルに上記混合物を集めるように配置した撹拌しながら。上記撹拌子を取り出し、上記エタノール/水性溶液を、室温へと1時間にわたって平衡化させた。次いで、上記混合物を、5ccシリンジへと入れ、これを、FEPチューブの1つに接続し、別の5ccシリンジを、等しい長さのFEPチューブに接続し、等量の100mMクエン酸緩衝液pH6を入れた。上記2本のシリンジを、シリンジポンプを使用して、7mL/分の流量において作動させ、最終の混合物を、20mLガラスバイアルに集めた撹拌しながら。次に、リポソームを、接線流濾過TFFシステムを使用して、2mLに濃縮し、10~15容積の1×PBSに対して透析し、その後、最終生成物を収集した。上記TFFシステムおよび中空ファイバー濾過膜を、SpectrumLabsから購入し、製造業者のガイドラインに従って使用した。100kD孔サイズカットオフおよび20cm2表面積を有する中空ファイバー濾過膜を使用した。インビトロ実験およびインビボ実験に関しては、処方物を、1×PBSで、必要とされるRNA濃度へと希釈した。被包されたRNAのパーセンテージおよびRNAの濃度を、Quant-iTRiboGreenRNA試薬キットInvitrogenによって、製造業者の指示書に従って決定した。上記キット中に提供されたリボソームRNA標準を使用して、標準曲線を作成した。リポソームを、1×TE緩衝液キットから中で、10×もしくは100×に希釈し、その後、色素を添加した。別個に、リポソームを、0.5TritonXを含む1×TE緩衝液中で10×もしくは100×に希釈し、その後、色素を添加した上記リポソームを破壊するため。従って、総RNAをアッセイするため。その後、等量の色素を各溶液に添加し、次いで、色素添加後の約180μLの各溶液を、二連において、96ウェル組織培養プレートに入れた。蛍光励起485nm,発光528nmを、マイクロプレートリーダーで読み取った。すべてのリポソーム処方物を、被包されたRNAの量に基づいて、インビボで投与した。より小さなリポソームを得るために、上記シリンジ/チューブ法を、上記脂質溶液および上記RNA溶液をマイクロ流体チップ上のチャネルにおいて混合する方法に交換した。エタノール中の新たな脂質ストック溶液を調製した。37mgのDlinDMA、11.8mgのDSPC、27.8mgのコレステロールおよび8.07mgのPEG-DMGを秤量し、7.55mLのエタノール中に溶解した。上記新たに調製した脂質ストック溶液を、37°Cにおいて約15分間にわたって穏やかに振盪させて、均質な混合物を形成した。次いで、上記ストック226.7μLを、1.773mLエタノールに添加して、作業脂質ストック溶液2mLを作製した。さらに、RNAの作業溶液4mLを、100mMクエン酸緩衝液pH6中で約1μg/μLのストック溶液から調製した。4本の20mLガラスバイアル撹拌子ありを、RNaseAway溶液ですすぎ、使用前に多量のMilliQ水で洗浄して、上記バイアルのRNAseの汚染を除去した。上記バイアルのうちの2本を、上記RNA作業溶液各バイアル中に2mLのために使用し、他のものを、脂質およびRNA混合物を集めるために使用した。作業脂質溶液およびRNA溶液を、37°Cにおいて10分間にわたって加熱し、その後、3ccルーアーロックシリンジの中に入れた。RNAを含むシリンジおよび上記脂質を含むシリンジを、4ウェイエッジコネクタを使用するPTFEチューブ0.03インチID×1/16インチOD,Syrrisを使用して、MitosDroplet接合チップSyrrisから得たガラス製マイクロ流体デバイス,部品番号3000158に接続した。2本のRNAストリームおよび1本の脂質ストリームを、シリンジポンプによって作動させ、エタノール相および水相の混合を、上記チップのX接合部100μm×105μmにおいて行った。3本全てのストリームの流量を、1.5mL/分において維持し、従って、全水性の流量対エタノール性の流量の比は、2:1であった。上記チューブ出口を、20mLガラスバイアル中に上記混合物を集めるために配置した撹拌しながら。上記撹拌子を取り出し、上記エタノール/水性溶液を、室温へと1時間にわたって平衡化させた。次いで、上記混合物を、5ccシリンジに入れ、これを、1本のPTFEチューブ0.03インチID×1/16インチODに接続し、別の5ccシリンジを等しい長さのPTFEチューブに接続し、等容積の100mMクエン酸緩衝液pH6を入れた。上記2本のシリンジを、3mL/分流量において、シリンジポンプを使用して作動させ、最終混合物を、20mLガラスバイアルに集めた撹拌しながら。次に、リポソームを、TFFシステムを使用して、2mLに濃縮し、10~15容積の1×PBSに対して透析し、その後、最終生成物を収集した。100kDa孔サイズカットオフおよび20cm2表面積を有する中空ファイバー濾過膜を、使用した。インビトロ実験およびインビボ実験のために、処方物を、1×PBSで、必要とされるRNA濃度へと希釈した。上記シリンジ/チューブ法を使用して、75μgRNAで調製したリポソームは、Z平均直径Zav148nmおよび多分散性指数pdI0.122を有したのに対して、上記チップ混合は、Zav97nmおよびpdI0.086を有するリポソームを与えた。被包RNAの割合は、90から87へと僅かに低下した。リポソームにおける被包は、RNase消化からRNAを保護することを示した。実験では、3.8mAUのRNaseA/μgRNAを使用し、30分間にわたって室温においてインキュベートした。RNaseを、プロテイナーゼKで、55°Cにおいて10分間にわたって不活性化した。次いで、サンプル対25:24:1v/v/v,フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコールの1:1v/v混合物を添加して、上記RNAを上記脂質から水相へと抽出した。サンプルを、数秒間にわたってボルテックスすることによって混合し、次いで、12kRPMにおける15分間にわたる遠心分離に置いた。上記水相上記RNAを含むを取り出し、上記RNAを分析するために使用した。ローディング前に400ngRNA/ウェル、上記サンプルすべてを、ホルムアルデヒドローディング色素とともにインキュベートし、10分間にわたって65°Cにおいて変性させ、室温へと冷却した。AmbionMillenniumマーカーを使用して、上記RNA構築物の分子量を概算した。上記ゲルを、90Vにおいて泳動した。上記ゲルを、室温において1時間にわたって振盪することによって、製造業者のガイドラインに従って、水中の0.1SYBRゴールドを使用して染色した。図1は、被包の非存在下でRNaseがRNAを完全に消化することを示すレーン3。RNAは、被包後に検出不能でありレーン4、これらリポソームがRNaseで処理されても全く変化が認められないレーン4。RNase処理リポソームをフェノール抽出に供した後、消化されていないRNAが認められるレーン6。4°Cにおいて1週間後ですら、上記RNAを、いかなるフラグメント化もなしに認めることができた図4,矢印。インビボでのタンパク質発現は、4°Cにおいて6週間および1回の凍結融解サイクル後にも変化しなかった。従って、リポソーム被包RNAは安定である。上記RNAのインビボ発現を評価するために、免疫原ではなく、レポーター酵素SEAP;分泌型アルカリホスファターゼを、上記レプリコン中にコードさせた。発現レベルを、化学発光アルカリホスファターゼ基質を使用して、1×Phospha-Light希釈緩衝液中で1:4希釈した血清中で測定した。8~10週齢BALB/cマウス5匹/群に、0日目に、0.1μgもしくは1μgRNA用量で50μl/脚を筋肉内に注射した。同じベクターを、1μgにおいて上記リポソームなしでRNase非含有1×PBS中でも投与した。ビリオンパッケージングされたレプリコンもまた、試験した。本明細書で使用したビリオンパッケージングされたレプリコンVRPと呼ぶを、参考文献42の方法によって得た。ここでアルファウイルスレプリコンは、変異VEEVに由来するか、またはシンドビスウイルスの3’UTRおよびシンドビスウイルスパッケージングシグナルPSを含むように操作されたVEEVのゲノムから得られるキメラであり、シンドビスウイルスキャプシドおよび糖タンパク質遺伝子をコードする欠損性ヘルパーRNAと共にBHK細胞へと共エレクトロポレーションco-electroporatingすることによってパッケージングした。図5に示されるように、被包は、1μg用量においてSEAPレベルを約1/2対数増大させ、6日目において、0.1μg被包用量からの発現は、1μg非被包用量で認められたレベルに匹敵した。3日目までに、発現レベルは、VRPで達成されたものを超えた四角。従って、発現は、裸のRNAコントロールと比較して、10×低用量においてすら、上記RNAが上記リポソーム中に処方された場合に増大された。発現はまた、上記VRPコントロールと比較して高かったが、発現の動態は、非常に異なっていた図5を参照のこと。エレクトロポレーションを用いた上記RNAの送達は、上記裸のRNAコントロールと比較して増大した発現を生じたが、これらレベルは、リポソームでのものより低かった。上記リポソーム群において認められる効果が、上記リポソーム成分にのみ起因していたのか、または上記被包に関連していたのかを評価するために、上記レプリコンを、被包形態2つの異なる精製プロトコルとともに、0.1μgRNAにおいて、または上記リポソーム形成後に上記リポソームと混合して非被包リポプレックスlipoplex,0.1μgRNA、または裸のRNA1μgとして投与した。図10は、上記リポプレックスが、最低レベルの発現を与えたことを示す。このことは、被包が、強力な発現に必須であることを示す。さらなるSEAP実験から、インビボで明らかな用量応答が示された。発現は、1ngほどのRNAの送達後にも認められた図6。被包レプリコンからの発現と裸のレプリコンからの発現とを比較するさらなる実験から、0.01μg被包RNAは、1μgの裸のRNAに等しいことが示された。RNAの0.5μg用量において、上記被包物質は、6日目において12倍高い発現を与えた;0.1μg用量レベルでは、6日目において24倍高かった。上記群において平均レベルで調べるだけでなく、個々の動物もまた研究した。いくらかの動物は、裸のレプリコンに対して非応答者であったのに対して、被包は、非応答者を排除した。さらなる実験では、DlinDMAをDOTAPで置換した。DOTAPリポソームは、裸のレプリコンより良好な発現を与えたが、それらは、DlinDMAリポソームより劣っていた1日目において2~3倍の差異。インビボでの免疫原性を評価するために、レプリコンを構築して、RSウイルスRSVに由来する全長Fタンパク質を発現させた。これを、裸1μg、リポソーム中に被包0.1もしくは1μg、またはビリオン中でパッケージング106IU;VRPで、0日目および21日目に送達した。図7は、2回目の用量の2週間後の抗FのIgG力価を示す。上記リポソームは、明らかに免疫原性を増強する。図8は、2週間後の力価を示す。この時点までに、0.1μgの上記被包RNAと、1μgの上記被包RNAと、上記VRP群との間に統計学的差異は何らなかった。中和力価60のプラーク減少として測定,PRNT60は、2回目の用量の2週間後に、これら3群において有意差はなかった図9。図12は、2回目の用量の4週間後のIgG力価およびPRNT力価の両方を示す。図13は、上記RNAが堅調なCD8T細胞応答を誘発することを確認する。さらなる実験において、VRP、0.1μgリポソーム被包RNA、もしくは1μgリポソーム被包RNAを与えられたマウスにおけるF特異的IgG力価を比較した。2回目の用量の後の種々の時点での力価比VRP:リポソームは、以下のとおりであった:従って、上記リポソーム被包RNAは、ビリオン送達で認められるのと本質的に同程度の免疫応答を誘導する。さらなる実験から、優れたF特異的IgG応答が10μg用量で示され、これは、1μgおよび0.1μg用量についての応答と等しく、0.01μg用量ではより低い応答が示された。図11は、3種の異なる用量における裸の形態において、4種の異なる用量におけるリポソームにおいて、もしくはVRP106IUとして、上記レプリコンを与えられた動物におけるIgG力価を示す。1μgリポソーム被包RNAで認められた応答は、VRPと比較した場合に統計的に有意ではなかったANOVAが、10μgリポソーム被包RNAで認められたより高い応答は、これらの群の両方と比較した場合、統計的に有意であったp<0.05。さらなる研究から、上記0.1μgのリポソーム被包RNAは、0.1μgの送達されたDNAより遙かに高い抗FIgG応答を与え2回目の用量の15日後、さらに、エレクトロポレーションElgenTMDNADeliverySystem,Inovioによって送達された、上記F抗原をコードする20μgプラスミドDNAより免疫原性であることが確認された。リポソーム製造法一般に、8つの異なる方法を、本発明に従うリポソームを調製するために使用した。これらは、方法A~Hとして本文中で言及され、主に濾過およびTFF工程に関連して異なっている。詳細は、以下のとおりである。Aエタノール中の新鮮な脂質ストック溶液を調製した。37mgのDlinDMA、11.8mgのDSPC、27.8mgのコレステロールおよび8.07mgのPEGDMG2000を秤量し、7.55mLのエタノール中に溶解した。上記新たに調製した脂質ストック溶液を、37°Cにおいて約15分間にわたって穏やかに振盪して、均質な混合物を形成した。次いで、上記ストックのうちの755μLを、1.245mLエタノールに添加して、作業脂質ストック溶液2mLを作製した。この量の脂質を使用して、250μgRNAとともにリポソームを形成した。RNAの2mL作業溶液をまた、100mMクエン酸緩衝液pH6中のストック溶液約1μg/μLから調製した。3つの20mLガラスバイアル撹拌子有りを、RNaseAway溶液MolecularBioProducts,SanDiego,CAですすぎ、使用前に多量のMilliQ水で洗浄して、上記バイアルのRNaseの汚染を除去した。上記バイアルのうちの1つを、上記RNA作業溶液に使用し、他のものを脂質およびRNA混合物を集めるために使用した後に記載されるとおり。作業脂質溶液およびRNA溶液を、37°Cにおいて10分間にわたって加熱し、その後、3ccルーアーロックシリンジに入れた。2mLクエン酸緩衝液pH6を、別の3ccシリンジに入れた。RNAおよび脂質を含むシリンジを、FEPチューブフッ素化エチレン-プロピレン;すべてのFEPチューブは、2mm内径×3mm外径を有した;IdexHealthScienceによって供給を使用して、TミキサーPEEKTM500μmID接合部,IdexHealthScience,OakHarbor,WAに接続した。上記Tミキサーからの出口もまた、FEPチューブであった。上記クエン酸緩衝液を含む第3のシリンジを、別個の1つのFEPチューブに接続した。次いで、すべてのシリンジを、流量7mL/分においてシリンジポンプを使用して作動させた。上記チューブ出口を、20mLガラスバイアルに上記混合物を集めるように配置した撹拌しながら。上記撹拌子を取り出し、上記エタノール/水性溶液を、室温へと1時間にわたって平衡化させた。上記混合物のうちの4mlを、5ccシリンジに入れ、これを、FEPチューブの1つに接続し、別の5ccシリンジを、等しい長さのFEPチューブに接続し、等量の100mMクエン酸緩衝液pH6を入れた。上記2本のシリンジを、上記シリンジポンプを使用して7mL/分の流量において作動させ、最終の混合物を、20mLガラスバイアルに集めた撹拌しながら。次に、第2の混合工程リポソームから集めた上記混合物を、MustangQ膜PallCorporation,AnnArbor,MI,USAから得られる、結合してアニオン性分子を除去するアニオン交換支持体を通過させた。上記リポソームを通過させる前に、4mLの1MNaOH、4mLの1MNaClおよび10mLの100mMクエン酸緩衝液pH6が、上記Mustang膜を連続して通過した。リポソームを、10分間にわたって37°Cにおいて加温し、その後、上記膜を通過させた。次に、TFFを使用して、リポソームを2mLに濃縮し、10~15容積の1×PBSに対して透析し、その後、最終生成物を収集した。上記TFFシステムおよび中空ファイバー濾過膜を、SpectrumLabsから購入し、上記製造業者のガイドラインに従って使用した。100kD孔サイズカットオフおよび8cm2表面積を有するポリスルホン中空ファイバー濾過膜部品番号P/N:X1AB-100-20Pを使用した。インビトロおよびインビボ実験に関しては、処方物を、1×PBSで、必要とされるRNA濃度へと希釈した。B振盪後、上記ストックのうちの226.7μLを、1.773mLエタノールに添加して、作業脂質ストック溶液2mLを作製したこと従って、上記脂質:RNA比を改変を除いて、方法Aのとおり。C上記Mustang濾過を省略したので、リポソームが、上記20mLガラスバイアルから上記TFF透析へと向かったことを除いて、方法Bのとおり。D上記TFFが、100kD孔サイズカットオフおよび20cm2表面積を有するポリエーテルスルホンPES中空ファイバー膜部品番号P-C1-100E-100-01Nを使用したことを除いて、方法Cのとおり。E方法AのようにMustang膜を使用したことを除いて、方法Dのとおり。F上記Mustang濾過を省略したので、リポソームが、上記20mLガラスバイアルから上記TFF透析へと向かったことを除いて、方法Aのとおり。GRNAの4mL作業溶液を、100mMクエン酸緩衝液pH6中の約1μg/μLのストック溶液から調製したことを除いて、方法Dのとおり。次いで、4つの20mLガラスバイアルを、同じ方法で調製した。それらのうちの2本を、上記RNA作業溶液各バイアル中2mLに使用し、他のものを、Cのように、上記脂質およびRNA混合物を集めるために使用した。Tミキサーを使用するのではなく、RNAおよび脂質を含むシリンジを、MitosDroplet接合チップSyrrisから得られるガラス製マイクロ流体microfluidicデバイス部品番号3000158に、PTFEチューブ0.03インチ内径×1/16インチ外径を使用して、4ウェイエッジコネクタSyrrisを使用して接続した。2つのRNAストリームおよび1つの脂質ストリームを、シリンジポンプによって作動させ、上記エタノールおよび水相の混合を、上記チップのX接合部100μm×105μmにおいて行った。3つすべてのストリームの流量を、1.5mL/分において維持し、従って、全水性の流量対エタノールの流量の比は、2:1であった。上記チューブ出口を、20mLガラスバイアルに上記混合物を集めるように配置した撹拌しながら。上記撹拌子を取り出し、上記エタノール/水性溶液を、室温へと1時間にわたって平衡化させた。次いで、上記混合物を5ccシリンジに入れ、これを、上記PTFEチューブの別の1つにはめた;等しい長さのPTFEチューブ付きの別の5ccシリンジに、等容積の100mMクエン酸緩衝液pH6を入れた。上記2本のシリンジを、3mL/分の流量において、シリンジポンプを使用して作動させ、最終混合物を、20mLガラスバイアルに集めた撹拌しながら。次に、Dにおけるように、TFFを使用して、リポソームを2mLに濃縮し、10~15容積の1×PBSに対して透析した。H上記2mL作業脂質ストック溶液を、120.9μLの上記脂質ストックと1.879mLエタノールとを混合することによって作製したことを除いて、方法Aのとおり。また、上記Tミキサーにおいて混合した後に、上記20mLバイアルからの上記リポソームを、PierceSlide-A-LyzerDialysisCassetteThermoScientific,特に強力,0.5~3mL容量に入れ、オートクレーブしたプラスチック容器中、400~500mLの1×PBSに対して一晩4°Cにおいて透析し、その後、最終生成物を収集した。RSV免疫原性RSVFタンパク質をコードするvA317自己複製レプリコンを、0日目および21日目に、上記レプリコン1μg単独で、またはDlinDMARV01もしくはDOTAPRV13もしくは図14に示される脂質RV05を有するリポソームとして処方して、両側の筋肉内ワクチン接種50μL/脚によって、BALB/cマウス1群あたり4匹もしくは8匹の動物に投与した。上記RV01リポソームは、40DlinDMA、10DSPC、48コレステロールおよび2PEG-DMGを有し、異なる量のRNAを伴った。上記RV05リポソームは、40RV05、10DSPC、48コレステロールおよび2PEG-DMG、または60RV05、38コレステロールおよび2PEG-DMGのいずれかを有した。上記RV13リポソームは、40DOTAP、10DOPE、48コレステロールおよび2PEG-DMGを有した。全ての場合において、上記PEGはPEG-2000すなわち、2kDaPEGであった。比較のために、同じRSV-F抗原を発現する裸のプラスミドDNA20μgを、エレクトロポレーションを使用して、もしくはRV0110リポソーム0.1μgDNAを用いて、のいずれかで送達した。4匹のマウスを、ナイーブコントロール群として使用した。リポソームを、方法Aもしくは方法Bによって調製した。方法Aによって作製したいくらかのリポソームに関しては、2倍量もしくは半量のRNAを使用した。Z平均粒子直径および多分散性指数は、以下のとおりであった:血清を、14日目、36日目および49日目に抗体分析のために集めた。脾臓を、49日目に、T細胞分析のためにマウスから採取した。F特異的血清IgG力価GMTは、以下のとおりであった:サイトカイン陽性であり、かつRSVF51-66ペプチドに対して特異的なT細胞の割合は、以下のとおりであり、統計的に有意にゼロを上回る数字のみを示す:従って、上記リポソーム処方物は、増大したF特異的IgG力価およびT細胞頻度によって決定される場合、上記裸のRNAコントロールと比較して免疫原性を顕著に増大した。リポソームとともに処方したか、またはエレクトロポレーションを使用して裸で送達されたプラスミドDNAは、リポソーム処方された自己複製RNAより顕著に免疫原性が低かった。さらなるRV01リポソームを、DMGに結合体化した2kDaPEGを再び使用して、150μgRNARSVの表面融合糖タンパク質をコードするvA375レプリコンを被包するか、もしくは緩衝液のみを被包するかのいずれかで、方法Hによって調製した。従って、これらリポソームは、40DlinDMA、10DSPC、48Chol、および2PEG-DMGを有した。サイズおよび被包は、以下のとおりであった:上記リポソームを、0日目および21日目に、両側の筋肉内注射50μl/脚によってBALB/cマウス10匹/群に投与した。用量は、0.01μg、0.03μg、0.1μg、0.3μgもしくは1μgであった。F特異的血清IgGおよびPRNT60力価GMTは、以下のとおりであった第1および第2の注射の2週間後:サイトメガロウイルス免疫原性DLinDMAをカチオン性脂質として有し、さらに2kDaPEGを有するRV01リポソームを使用して、CMV糖タンパク質をコードするRNAレプリコンを送達した。vA160レプリコンは、全長糖タンパク質HおよびLgH/gLをコードするのに対して、vA322レプリコンは、可溶性形態gHsol/gLをコードする。上記2種のタンパク質は、単一のレプリコン中の別個のサブゲノムプロモーターの制御下にある;2種の別個のベクター1つは、gHをコードし、1つは、gLをコードするの共投与は、良好な結果を与えなかった。BALB/cマウス10匹/群に、0日目、21日目および42日目に、gH/gLを発現するVRP1×106IU、gHsol/gLを発現するVRP1×106IUおよびコントロールとしてPBSを、両側の筋肉内ワクチン接種50μL/脚で与えた。2つの試験群に、リポソーム40DlinDMA、10DSPC、48Chol、2PEG-DMG;方法Dを使用するが、150μgRNAバッチサイズを用いて作製した中に処方した、1μgの上記vA160レプリコンもしくはvA322レプリコンを与えた。上記vA160リポソームは、Zav直径168.8nm、pdI0.144、および87.4被包を有した。上記vA322リポソームは、Zav直径162nm、pdI0.131、および90被包を有した。上記レプリコンは、単一のベクターから2種のタンパク質を発現できた。63日目3wp3に、血清を、免疫学的分析のために集めた。CMV中和力価コントロールと比較して、陽性ウイルスフォーカス/ウェルの数において50減少を生じる血清希釈の逆数は、以下のとおりであった:全長もしくは可溶性形態の上記CMVgH/gL複合体のいずれかを発現するRNAは、従って、上皮細胞でアッセイされる場合、高い力価の中和抗体を誘発した。上記リポソーム被包RNAによって誘発された平均力価は、その対応するVRPについてのものと少なくとも同程度に高かった。反復実験から、上記レプリコンが、単一のベクターから2種のタンパク質を発現できることが確認された。上記RNAレプリコンは、VRPでの3wp3力価5516と比較して、3wp3力価11457を与えた。発現動態ルシフェラーゼレポーター遺伝子lucを発現する自己複製RNAレプリコンvA311を、注射後のタンパク質発現の動態を研究するために使用した。BALB/cマウス1群あたり5匹の動物に、0日目に、以下の両側の筋肉内ワクチン接種50μL/脚を与えた:群1エレクトロポレーションを使用して送達される、ルシフェラーゼを発現するDNA10μg群2リポソーム40DlinDMA、10DSPC、48コレステロール、2DMGに結合体化したPEG-2000中に処方した自己複製RNA1μg群3カチオン性ナノエマルジョンCNE17とともに処方された自己複製RNA1μg群4様々なカチオン性ナノエマルジョンとともに処方された自己複製RNA1μg群5ルシフェラーゼを発現するVRP1×106IU。ワクチン接種の前に、マウスを除毛した。マウスに麻酔をかけ酸素中2イソフルラン、まず、電気カミソリで除毛し、次いで、Nairで化学的に除毛した。次いで、3日目、7日目、14日目、21日目、28日目、35日目、42日目、49日目、63日目および70日目に、生体発光データを、XenogenIVIS200画像化システムCaliperLifeSciencesを使用して取得した。画像化する5分前に、マウスに、8mg/kgのルシフェリン溶液を腹腔内注射した。次いで、動物に麻酔をかけ、上記画像化システムへと移した。生体発光シグナルを冷却CCDカメラで測定する際に、画像取得時間を一定に維持した。視覚的な点から、ルシフェラーゼ発現細胞は、RNA注射の部位において主に保持されていることが認められた。大腿四頭筋quadsを除去した後に画像化した動物は、何らシグナルを示さなかった。定量的な点から、ルシフェラーゼ発現を、70日間の期間にわたる平均輝度p/s/cm2/srとして測定し、結果は、上記5群に関して以下のとおりであった:上記カチオン性ナノエマルジョンとともに処方した自己複製RNAは、3日目に測定可能な生体発光を示した。これは、7日目にピークに達し、次いで、28日目~35日目までにバックグラウンドレベルへと低下した。リポソーム中で処方された場合、上記RNAは、3日目に、測定可能な生体発光を示した。これは、7日目にピークに達し、63日目までにはバックグラウンドレベルへと低下した。VRPを使用して送達されたRNAは、上記処方されたRNAと比較した場合、21日目に増強された生体発光を示したが、発現は、28日目までにバックグラウンドレベルへと低下した。エレクトロポレーションしたDNAは、測定したすべての時点において最高レベルの生体発光を示し、生体発光のレベルは、実験の70日間内でバックグラウンドレベルへは低下しなかった。送達容積流体力学的送達は、大容積の溶液の迅速な注射によって生成される力を使用して、細胞膜これは、大きく、膜不透過性である化合物が細胞に入るのを妨げるの物理的障壁を克服する。この現象は、DNAワクチンの細胞内送達に有用であることが以前に示された。筋肉内注射に代表的なマウス送達容積は、後肢に50μlであり、これは、マウスの脚の筋肉に関して、比較的高い容積である。対照的に、ヒト筋肉内用量約0.5mlは、比較的小さい。マウスにおける免疫原性が容積依存性である場合、上記レプリコンワクチンの効力は、少なくとも一部は、流体力学的力に起因し得る。このことは、ヒトおよびより大きな動物における同じワクチンの使用を促進しない。上記vA317レプリコンを、0日目および21日目に、両側の筋肉内ワクチン接種5もしくは50/脚によってBALB/cマウス10匹/群に送達した:群1には、50μL/脚において裸のレプリコン、0.2μgを与えた。群2には、5μL/脚において裸のレプリコン、0.2μgを与えた。群3には、エマルジョン処方レプリコン0.2μg,50μL/脚を与えた。群4には、エマルジョン処方レプリコン0.2μg,5μL/脚を与えた。群5には、リポソーム処方レプリコン0.2μg,50μL/脚を与えた。群6には、リポソーム処方レプリコン0.2μg,5μL/脚を与えた。群5および群6についてのリポソームは、40DlinDMA、10DSPC、48コレステロール、および2DMGに結合体化したPEG-2000であった。14日目および35日目に、抗体分析のために血清を集めた。F特異的血清IgGGMTは、以下であった:従って、上記処方レプリコンの免疫原性は、上記送達した容積に従って変動しなかった。よって、このことは、これらRNAワクチンが、それらの効力に関して流体力学的送達に依存しないことを示す。コットンラットマウスの代わりに、コットンラットSigmodonhispidisにおいて研究を行った。1μg用量において、リポソーム被包は、裸のRNAと比較して、F特異的IgG力価を8.3倍に増大させ、PRNT力価を9.5倍に増大させた。上記抗体応答の程度は、5×106IUVRPによって誘導されるものに等しかった。裸のRNAおよびリポソーム被包RNAはともに、RSVチャレンジ1×105プラーク形成単位から上記コットンラットを防御することができ、肺のウイルス負荷を少なくとも3.5対数低下させた。被包は、低下を約2倍に増大させた。コットンラットにおけるさらなる研究は、4種の異なるレプリコンを使用した:vA317は、全長RSV-Fを発現する;vA318は、短縮型膜貫通および細胞質テールが除去されたRSV-Fを発現する;vA142は、その融合ペプチドが欠失した、RSV-Fを発現する;vA140は、やはり上記ペプチドなしで上記短縮型RSV-Fを発現する。コットンラット1群あたり4~8匹の動物に、0日目および21日目に、方法Dによって2kDaPEG結合体化DMGを用いて、150μgRNAバッチサイズで作製されたリポソーム中に処方された、2種の用量1.0μgおよび0.1μgにおける、上記4種の異なるレプリコンの筋肉内ワクチン接種1本の脚において100μLを与えた。コントロール群に、アラムalumをアジュバント添加したRSV-Fサブユニットタンパク質ワクチン5μg8匹の動物/群、全長RSV-Fを発現するVRP1×106IU,8匹の動物/群、もしくはナイーブコントロール4匹の動物/群を与えた。0日目、21日目および34日目に、血清を、抗体分析のために集めた。21日目および34日目のF特異的血清IgG力価およびRSV血清中和抗体力価は、以下であった:この研究において評価した4種のレプリコンvA317、vA318、vA142、vA140はすべて、リポソームによって送達される場合に、コットンラットにおいて免疫原性であったが、血清中和力価は、アジュバント添加したタンパク質ワクチンによってもしくはVRPによって誘導されたものの少なくとも1/10に低下した。上記リポソーム/RNAワクチンは、1回目のワクチン接種の後に、血清F特異的IgGおよびRSV中和抗体を誘発し、2回目のワクチン接種は、上記応答を効率的にブーストした。1μgレプリコンでの上記2回目のワクチン接種の後のF特異的IgG力価は、0.1μgレプリコンでの上記第2回目のワクチン接種後より2~3倍高かった。上記4種のレプリコンは、同等の抗体力価を誘発した。このことは、全長および短縮型のRSV-F各々、融合ペプチドありもしくはなしが、コットンラットにおいて同様に免疫原性であることを示唆する。コットンラットにおけるさらなる研究は、上記vA317、vA318およびvA142レプリコンを再び使用した。コットンラット1群あたり2~8匹の動物に、0日目および21日目に、方法Dによるが、150μgRNAバッチサイズで作製したRV01リポソームPEG-2000を伴う中に被包した上記レプリコン0.1μgもしくは1μgでの筋肉内ワクチン接種1本の脚において100μLを与えた。コントロール群に、アラムでアジュバント添加したRSV-Fサブユニットタンパク質ワクチン5μgもしくは全長RSV-Fを発現するVRP1×106IU,8匹の動物/群を与えた。これらの動物すべてに、アラムでアジュバント添加したRSV-Fサブユニットタンパク質ワクチン5μgでの3回目のワクチン接種56日目を与えた。さらに、ナイーブコントロールが存在した4匹の動物/群。さらに、追加の群に、0日目および56日目に、リポソーム中の1μgvA317RNAでの両側の筋肉内ワクチン接種50μL/脚を与えたが、上記サブユニットタンパク質ワクチンでの3回目のワクチン接種を与えなかった。0日目、21日目、35日目、56日目、70日目に、加えて、追加の群に関しては14日目、28日目および42日目に、血清を、抗体分析のために集めた。F特異的血清IgG力価GMTは、以下のとおりであった:血清中和力価は、以下のとおりであった1群あたり3~4匹の動物の2プールに関して、60RSV中和力価、1群あたりこれら2プールのGMT:上記追加の群に関する血清力価および中和力価は、以下のとおりであった:従って、上記レプリコンは、コットンラットにおいて免疫原性であると確認され、上記1回目のワクチン接種後に血清F特異的IgGおよびRSV中和抗体を誘発する。2回目のワクチン接種は、上記応答を効率的にブーストした。1.0μgレプリコンでの上記2回目のワクチン接種後のF特異的IgG力価は、0.1μgレプリコンでの上記2回目のワクチン接種後より1.5~4倍高かった。上記3回目のワクチン接種56日目にタンパク質は、Fトリマーサブユニットアラムを以前にワクチン接種したラットにおいて力価をブーストしなかったが、レプリコンを以前にワクチン接種したコットンラットにおいて大きな力価のブーストを提供した。大部分の場合において、2回のレプリコンワクチン接種、続いて、タンパク質ブーストの後の上記RSV血清中和力価は、2回もしくは3回の連続的なタンパク質ワクチン接種によって誘導された力価に等しいかもしくはこれより大きかった。この研究はまた、1.0μgvA317への抗体応答の動態を評価した。1回のワクチン接種によって誘導されるF特異的血清IgGおよびRSV中和力価は、21日目あたりにそのピークに達し、少なくとも56日目まで維持されたF特異的IgG力価において50~70低下,RSV中和力価においてはほとんど変化なし。同族の2回目のワクチン接種を、56日目にこれらの動物に与えたところ、上記2回目のワクチン接種が21日目に投与された場合に達成されたものに少なくとも等しいレベルへと抗体力価をブーストした。さらなる実験は、ウイルスチャレンジを伴った。上記vA368レプリコンは、RSVの全長野生型表面融合糖タンパク質融合ペプチドは欠失されており、発現は、上記EV71IRESによって駆動されるをコードする。コットンラット7匹/群に、0日目および21日目に、方法H、175μgRNAバッチサイズにより調製されたリポソーム中のvA368、もしくは同じレプリコンを有するVRPでの筋肉内ワクチン接種100μL/脚を与えた。上記リポソームは、2kDaPEGDMGに結合体化を含んだ。コントロール群に、5μgアラムアジュバント添加タンパク質を与え、ナイーブコントロール群もまた、含めた。すべての群に、最終免疫化の4週間後に、1×106PFURSVでの鼻内チャレンジi.n.を与えた。0日目、21日目、35日目に、血清を、抗体分析のために集めた。ウイルス肺力価を、チャレンジの5日後、測定した。結果は以下のとおりであった:従って、上記RNAワクチンは、非ワクチン接種コントロールコットンラットにおける約106PFU/gから、ワクチン接種したコットンラットにおける103PFU/g未満へと、3対数を超えて、上記肺ウイルス負荷を低下させた。大型哺乳動物研究大型動物研究を、ウシにおいて行った。仔ウシ4~6週齢,約60~80kg,5頭/群を、0日目、21日目、86日目および146日目に、66μgの、全長RSVFタンパク質をコードするレプリコンvA317で免疫化した。上記レプリコンを、方法Eによって、ただし1.5mgRNAバッチサイズで作製したリポソーム中に処方した;それらは、40DlinDMA、10DSPC、48コレステロール、および2PEG-2000DMGに結合体化を有した。PBS単独を、陰性コントロールとして使用し、認可されたワクチンを、陽性コントロールとして使用したFortDodgeのTriangle4,死滅ウイルスを含む。全ての仔ウシに、146日目に、MF59エマルジョンをアジュバント添加した15μgFタンパク質を与えた。上記RNAワクチンは、ヒトRSVFをコードしたのに対して、上記Triangle4ワクチンは、ウシRSVFを含むが、上記RSVFタンパク質は、BRSVとHRSVとの間で非常によく保存されている。仔ウシに、各実験ワクチン2mlを与え、頸部の各側に2×1mlとして筋肉内投与した。対照的に、上記Triangle4ワクチンは、頸部に単一の2ml用量として与えた。0日目、14日目、21日目、35日目、42日目、56日目、63日目、86日目、100日目、107日目、114日目、121日目、128日目、135日目、146日目、160日目、167日目、174日目、181日目、188日目、195日目、および202日目に、抗体分析のために血清を集めた。個々の動物が検出限界未満の力価を有した場合、それに、力価5を割り当てた。図15は、210日間にわたるF特異的IgG力価を示す。最初の63日間にわたって、上記RNAレプリコンは、リポソームを介して、雌ウシにおいて免疫原性であったが、それは、上記認可されたワクチンより低い力価を与えた。全てのワクチン接種した雌ウシは、上記第2の用量後にF特異的抗体を示し、力価は、第2の用量後の2~6週の期間、非常に安定であったそして特に、上記RNAワクチンに関しては安定であった。202日目までの力価は、以下のとおりであった:RSV血清中和抗体力価は、以下のとおりであった:上記2回目のリポソーム用量に使用した物質は、新たに調製せず、同じロットのRNAは、マウス免疫原性研究において効力の低下を示した。従って、上記ワクチンは、新鮮な物質をすべてのワクチン接種のために使用した場合に、より免疫原性であった可能性がある。補体とともにアッセイされる場合、中和抗体は、すべてのワクチン接種したウシにおいて検出された。このアッセイにおいて、すべてのワクチン接種した仔ウシは、上記2回目のRNAワクチン接種後に良好な中和抗体力価を有した。さらに、上記RNAワクチンは、上記2回目のワクチン接種後に数頭の仔ウシにおいて、および上記第3回目の後にすべての仔ウシにおいて検出されたF特異的血清IgG力価を誘発した。MF59アジュバント添加したRSV-Fは、以前にワクチン接種したすべての仔ウシにおいてIgG応答をブーストでき、RNAで以前にワクチン接種された仔ウシの補体非依存性中和力価をブーストできた。大型動物におけるRNAワクチンの構想の証明は、小動物モデルから大型動物およびヒトへと移行する場合に以前に観察された、DNAベースのワクチンでの効力の喪失を踏まえると、特に重要である。ウシDNAワクチンに代表的な用量は、0.5~1mg[43,44]であるので、免疫応答がわずか66μgのRNAで誘導されたことは、非常に有望である。PEGの長さの効果上記で言及されるように、リポソームを、5種の異なるPEGが結合体化されたDMGを使用して調製した。上記PEGの平均分子量は、500Da、750Da、1kDa、2kDaもしくは3kDaであった。上記のより短いPEG500Daおよび750Daを使用して形成したリポソームは、不安定であったか、またはTFF精製の間に凝集した。PEG-750は、著しく高いZ平均直径669nmおよび多分散性指数0.21と、77被包を有するリポソームを与えた。上記PEG-500リポソームは、上記TFFプロセスの間に溶液中で目に見えて凝集し、上記実験を終えた。従って、これらの短いPEGリポソームは不安定であったが、上記のより長いPEGは、安定なリポソームを形成した。異なるPEGの長さ図16は、リポソーム直径および多分散性指数に対してわずかな影響を有した。上記Z平均直径は、上記1kDaPEGに関しては197nm0.119pdI、上記2kDaPEGに関しては142nm0.137pdI、および上記3kDaPEGに関しては147nm0.075pdIであった。RNA被包は、PEGの長さが増大するにつれて、81.7から85.9、そして91.5へと徐々に増大したしかし、この関係性は、その後の実験において常に認められるわけではなかった。上記リポソームを、0日目に、筋肉内注射によってマウスに投与した。血清SEAPレベルを、化学発光アッセイによって1日目、3日目および6日目に測定した。図3に示されるように、上記3種のPEGの長さは全て有効であったが、上記PEGの長さを変えると、血清SEAPレベルに対していくらかの影響があり、PEG2000は、最高の発現を与えた。種々の脂質およびPEGの長さ上記vA317レプリコンを、種々の異なる脂質と異なるPEGの長さを有するリポソーム中で投与した。上記リポソームは全て、40DlinDMA、10DSPCおよび48コレステロールを有したが、残りの2は異なり、異なるPEG化脂質例えば、図17A~17Eおよび異なるPEGの長さを有した。上記リポソーム方法Hによって作製したの物理的特徴は、以下であった:BALB/cマウス8匹/群に、0日目および21日目に、上記レプリコンを、裸で1μg、またはこれらリポソーム0.1μg中に被包してのいずれかで、両側の筋肉内ワクチン接種により与えた50μL/脚。14日目および35日目に、抗体分析のために血清を集めた。F特異的血清IgG力価GMTは、以下のとおりであった上記2回の注射の2週間後2wp1:結果は、より高分子量のPEG頭部が、より免疫原性である傾向を示す。DMG結合体化PEGの長さが、1000Daから3000Daへと増大するにつれて、上記2wp2F特異的IgG力価は、7412から15659、そして22378まで増大する。リンカー領域を、エステルからエーテルへと変更したところ、上記力価には実質的に影響しなかった。また、上記頭部の同じ分子量2000において、上記脂質テールの長さを増大させたところ、力価は低下するという傾向があったC14ジアルキルを有するH対C18ジアルキルを有するI。PEGジアルキル脂質テールをコレステロールで置換しても、免疫原性にはほとんど影響がなかったDMGを有するA対コレステロールを有するG。類似の実験を、PEGの2kDaを、2×1kDa基に分割した異なる脂質で行った図18,ボックスで囲んだ領域における全MWは、2000である。上記vA317レプリコンを、再び使用して、BALB/cマウス8匹/群に、0日目および21日目に、1μg裸のRNAもしくは0.1μgリポソーム被包RNAを、両側の筋肉内ワクチン接種によって与えた50μL/脚。上記リポソームは全て、40カチオン性脂質DlinDMA、10DSPCおよび48コレステロールを有したが、残り2は異なり、異なるPEG化脂質を有したただし、全て2kDaPEGを有する。それらを、方法Hによって作製した。上記リポソームの物理的特徴は、以下であった:さらなるリポソームを、RV05で作製した。上記リポソームは、40カチオン性脂質RV05および2PEG化DMG2kDaPEGを有したが、残りの成分は異なったしかし、コレステロールは常に含めた。上記リポソームを、pH5を用いることを除いて、方法Hによって作製した。物理的特徴は、以下であった:BALB/cマウス8匹/群に、0日目および21日目に、裸で1μgもしくは被包して0.1μgのいずれかで、上記レプリコンを両側の筋肉内ワクチン接種で与えた50μL/脚。14日目および35日目に、抗体分析のために血清を集めた。F特異的血清IgG力価GMTは、以下のとおりであった2回の注射の2週間後2wp1:このように上記PEG頭部を分割すると、インビボでの力価が低下した。上記PEG脂質テールに二重結合を含めたアルキルテール1つあたり1不飽和度degreeofinstaurationところ、14日目に6倍、および35日目に7倍にIgG力価が増大した。非対称脂質テールアルキルコレステロールを有するカチオン性脂質に関しては、中性脂質を、DSPC飽和C18脂質テールから18:2もしくは18:3PCテール1つあたり2個もしくは3個の不飽和二重結合を有するに変更したところ、全IgG力価が増大した。DSPCをDPyPEで置換して、匹敵する結果が認められた。本発明は、例示によって記載されてきたに過ぎず、本発明の範囲および趣旨内に留まりながら、改変が行われ得ることは、理解される。表1:有用なリン脂質DDPC1,2-ジデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリンDEPA1,2-ジエルコイル-sn-グリセロ-3-ホスフェートDEPC1,2-エルコイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリンDEPE1,2-ジエルコイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルエタノールアミンDEPG1,2-ジエルコイル-sn-グリセロ-3[ホスファチジル-rac-1-グリセロール...DLOPC1,2-リノレオイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリンDLPA1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスフェートDLPC1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリンDLPE1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルエタノールアミンDLPG1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3[ホスファチジル-rac-1-グリセロール...DLPS1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルセリンDMG1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミンDMPA1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスフェートDMPC1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリンDMPE1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルエタノールアミンDMPG1,2-ミリストイル-sn-グリセロ-3[ホスファチジル-rac-1-グリセロール...DMPS1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルセリンDOPA1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスフェートDOPC1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリンDOPE1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルエタノールアミンDOPG1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3[ホスファチジル-rac-1-グリセロール...DOPS1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルセリンDPPA1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスフェートDPPC1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリンDPPE1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルエタノールアミンDPPG1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3[ホスファチジル-rac-1-グリセロール...DPPS1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルセリンDPyPE1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミンDSPA1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスフェートDSPC1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリンDSPE1,2-ジステアロイルDiostearpyl-sn-グリセロ-3-ホスファチジルエタノールアミンDSPG1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3[ホスファチジル-rac-1-グリセロール...DSPS1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルセリンEPC卵-PCHEPC水素化卵PCHSPC高純度水素化ダイズPCHSPC水素化ダイズPCLYSOPCMYRISTIC1-ミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリンLYSOPCPALMITIC1-パルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリンLYSOPCSTEARIC1-ステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリンミルクスフィンゴミエリンMPPC1-ミリストイル,2-パルミトイル-sn-グリセロ3-ホスファチジルコリンMSPC1-ミリストイル,2-ステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリンPMPC1-パルミトイル,2-ミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリンPOPC1-パルミトイル,2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリンPOPE1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルエタノールアミンPOPG1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3[ホスファチジル-rac-1-グリセロール...]PSPC1-パルミトイル,2-ステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリンSMPC1-ステアロイル,2-ミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリンSOPC1-ステアロイル,2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリンSPPC1-ステアロイル,2-パルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリン"