"式の化合物を生産する方法であり:a適切な条件下、適切な補因子の存在下で維持することにより、式の4オキソ4356ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル1ブタン2オンを、選択的にケトンを還元してアルコールを形成する適切な酵素と反応させる工程;及びb適切な中間体を単離する工程;を含む方法。前記適切な酵素がオキシドレダクターゼである、請求項1に記載の方法。前記適切な酵素がケトレダクターゼである、請求項1に記載の方法。前記適切な酵素が短鎖デヒドロゲナーゼである、請求項1に記載の方法。前記適切な酵素がアルコールデヒドロゲナーゼである、請求項1に記載の方法。前記適切な酵素がアルドケトレダクターゼである、請求項1に記載の方法。前記適切な酵素が、サッカロマイケス、ロドトルラ、ピキア及びEコリから単離される、請求項1に記載の方法。前記適切な酵素が、サッカロマイケスセレウィシアエ、ロドトルラルブラ、ピキアメタノリカ及びEコリから選択される種から単離される、請求項1に記載の方法。前記適切な酵素が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12及び配列番号13のいずれかに記載のヌクレオチド配列にコードされている、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。前記酵素をコードする、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12及び配列番号13のいずれかに記載のヌクレオチド、又はその変異体が、ベクター中にクローニングされ、適切な組換え全細胞中で前記酵素が発現される、請求項1~9のいずれか1項に記載の方法。前記組換え全細胞が、更に、酸化NADから補因子を再生産する機能を有するポリペプチドを共発現する、請求項10に記載の方法。前記全細胞が、MTCC5642、MTCC5643、MTCC5644、MTCC5645、MTCC5646、MTCC5647、MTCC5648、MTCC5649、MTCC5650、MTCC5651、MTCC5652、MTCC5653、MTCC5654から選択される、請求項1~11のいずれか1項に記載の方法。前記全細胞が、a宿主細胞中で前記ベクターの複製及び維持を制御する1つ以上の領域;bオキシドレダクターゼをコードする、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12及び配列番号13のいずれかに記載のヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列又はその変異体と動作可能に連結した第一のプロモーター;c補因子を再生産する機能を有するポリペプチドをコードする配列番号7に記載のヌクレオチド配列と動作可能に連結した第二のプロモーター;d適切な抗生物質マーカー;を含む発現ベクターを含む、請求項12に記載の方法。式の適切な中間体を生産する方法であり:a適切な条件下、適切な補因子の存在下で維持することにより、式の4オキソ4356ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル1ブタン2オンを、立体選択的にケトンを還元してアルコールを形成する適切な全細胞と反応させる工程;及びb適切な中間体を単離する工程;を含む方法。前記全細胞が、MTCC5642、MTCC5643、MTCC5644、MTCC5645、MTCC5646、MTCC5647、MTCC5648、MTCC5649、MTCC5650、MTCC5651、MTCC5652、MTCC5653、MTCC5654から選択される、請求項14に記載の方法。前記補因子が、酵素に基づく再生産系により持続的に再生産され、当該酵素が、適切な補基質を酸化することにより補因子を再生産する、請求項1に記載の方法。前記補因子の再生産に採用される酵素が、グルコースデヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、グルコース6リン酸デヒドロゲナーゼ、亜リン酸デヒドロゲナーゼから選択される、請求項1又は16のいずれかに記載の方法。前記補因子の再生産に採用される酵素が、配列番号7に記載のヌクレオチド配列又はその変異体にコードされるグルコースデヒドロゲナーゼである、請求項16又は17に記載の方法。前記補因子が、基質に基づく補因子再生産系により持続的に再生産され、当該酵素が、適切な補基質を酸化することにより補因子を再生産する、請求項1に記載の方法。前記酵素が、オキシドレダクターゼ、ケトレダクターゼ、短鎖デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ及びアルドケトレダクターゼから選択される、請求項19に記載の方法。前記補基質がイソプロピルアルコールである、請求項19に記載の方法。前記式の濃度が01~30wvから選択される、請求項1又は14のいずれかに記載の方法。前記補因子が、NADH及びNADである、クレーム1に記載の方法。前記pHが、5~9、又は7~8に維持される、請求項2に記載の方法。a複製を制御する1つ以上の領域b配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12及び配列番号13のいずれかに記載のヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列又はその変異体と動作可能に連結した適切なプロモーターc抗生物質マーカーを含む、キラルアルコールを生産するベクター。配列番号7に記載のポリヌクレオチド配列、又はその変異体を更に含む、請求項25に記載のベクター。pET11aZBG511pET11aZBG641pET11aZBG201pET11aZBG2511pET11aZBG811pET11aZBG1311pET27bZBG511pET27bZBG201pET27bZBG811pET27bZBG209pET27bZBG1311pET27bZBG208pET27bZBG2011pET27bZBG205pET27bZBG1122pET27bZBG112pET27bZBG204から選択される、オキシドレダクターゼ酵素を発現する請求項23に記載のベクター。pET27bZBG209である、オキシドレダクターゼを発現する請求項31に記載のベクター。pET27bZBG1311である、グルコースデヒドロゲナーゼを発現する請求項23に記載のベクター。pZRC2G2ZBG209C1である、オキシドレダクターゼ及びグルコースデヒドロゲナーゼを発現する請求項23に記載のベクター。のいずれかの化合物。式の化合物を生産する方法であり:a式の3ヒドロキシ156ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル4ブタン1オンを、塩化メタンスルホニルと反応させることにより、式の化合物を取得する工程;bアジ化ナトリウムを使用して、式の化合物を、式の化合物に変換する工程;c式の化合物が、Pdc及び水素化ホウ素ナトリウムを使用して、式の化合物に変換される工程;を含む方法。本発明は、式の化合物を生産する方法を提供し、当該方法は:a適切な条件下、適切な補因子の存在下で維持することにより、式の4オキソ4356ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル1ブタン2オン、又はその金属イオン塩を、立体選択的にケトンを還元してアルコールを形成する適切な酵素又はその変異体と反応させる工程;及びb適切な中間体を単離する工程;を含む。一つの態様において、本発明は、3ヒドロキシ156ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル4ブタン1オンを提供する。一つの態様において、本発明は、3ヒドロキシ156ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル4ブタン1オンを提供する。一つの態様において、本発明は、3156ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル4ブタン1オンを提供する。一つの態様において、本発明は、3156ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル4ブタン1オンを提供する。一つの態様において、本発明は、3アジド156ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル4ブタン1オンを提供する。一つの態様において、本発明は、3アジド156ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル4ブタン1オンを提供する。一つの態様において、本発明は、3ヒドロキシ156ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル4ブタン1オンの、ラセミ体、又は光学活性体又は、又はいずれかのフォームの鏡像体過剰混合物を調製する方法を提供し、当該方法は:a適切な条件下で維持することにより、式の4オキソ4356ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル1ブタン2オン又はその金属イオン塩を、立体選択的にケトンを還元してアルコールを形成する適切な酵素又はその変異体と反応させて、3ヒドロキシ156ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル4ブタン1オンの、ラセミ体、又は光学活性体又は、又はいずれかのフォームの鏡像体過剰混合物を調製する工程を含む。一つの態様において、本発明は、4オキソ4356ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル1ブタン2アミンのラセミ体又は光学活性体又はを鏡像異性体的に高純度で合成するための重要な中間体である、3ヒドロキシ156ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル4ブタン1オンを調製するための立体選択的酵素的還元方法を提供する。一つの態様において、本発明は、式の4オキソ4356ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル1ブタン2オンを、適切な酵素及びその変異体と、そして任意で他の補因子と反応させ、そして当該溶液を、好ましくは撹拌しながら、3ヒドロキシ156ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル4ブタン1オンが、酵素的還元により、そのラセミ体、又は光学活性体又は、又はいずれかのフォームの鏡像体過剰混合物に変換されるのに十分な時間維持することによる、3ヒドロキシ156ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル4ブタン1オンのラセミ体、又は光学活性体又はを調製する方法を提供する。一つの態様において、本発明は、3ヒドロキシ156ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル4ブタン1オンの鏡像異性体を提供する。他の態様において、本発明は、3ヒドロキシ156ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル4ブタン1オンの鏡像異性体を提供する。一つの態様において、本発明は、シタグリプチンを調製する方法を提供する。当該方法は、3ヒドロキシ156ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル4ブタン1オン又はそのフォームの鏡像体過剰混合物を3156ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル4ブタン1オンに変換する工程を含み、当該産物は、更に、3アジド1356ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル4ブタン1オンに変換され得て、そして最後に、4オキソ4356ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル1ブタン2アミンに変換され得る。一つの態様において、本発明は、シタグリプチンを調製する方法を提供する。当該方法は、上記のように調製された光学的に純粋な3ヒドロキシ156ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル4ブタン1オンをシタグリプチンに変換する工程を含む。本発明の一つの態様は、本発明に使用される酵素のアミノ酸配列を提供する。本発明の一つの態様は、本発明に使用される酵素のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を提供する。本発明の更なる他の態様は、サッカロマイケス、ピロコッカス、クプリアウィドゥス、ロドトルラ、ピキア及びE.コリ種に由来する、オキシドレダクターゼ酵素、並びにそのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を提供する。本発明の更なる態様は、オキシドレダクターゼ酵素活性を有する所望のポリペプチドをコードする遺伝子を含む発現ベクターを提供する。本発明の尚も他の態様は、オキシドレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、及びNADからNADHのように、酸化された補因子から還元された補因子を生産する酵素活性を有する第二のポリペプチドをコードする他のポリヌクレオチド配列を有する多シストロン性発現ベクターを提供する。従って、本発明の一つの態様は、オキシドレダクターゼ酵素及び還元された補因子を生産する酵素活性を有するポリペプチドを共発現する方法を提供する。本発明の尚も他の態様は、基質会合又は酵素会合系から選択される、補因子再生産系を提供する。本発明の更なる態様は、式の4オキソ4356ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル1ブタン2オン、又はその金属イオン塩を、サッカロマイケスセレウィシアエ、ピロコッカスフリオスス、ロドトルラムキラギノサ、クプリアウィドゥスネカトー、ピキアメタノリカ及びEコリ由来のオキシドレダクターゼ酵素の存在下で還元することによる、3ヒドロキシ156ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル4ブタン1オンのラセミ体、又はその光学活性体、又はいずれかのフォームの鏡像体過剰混合物を生産する方法を提供する。本発明の尚も更なる態様は、式の4オキソ4356ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル1ブタン2オン又はその金属イオン塩を全細胞生体触媒を使用して還元することによる、33ヒドロキシ156ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル4ブタン1オンのラセミ体、又はその光学活性体、又はいずれかのフォームの鏡像体過剰混合物を生産する方法を提供する。かかる態様において、全細胞は、MTCC5642MTCC5643MTCC5644MTCC5645MTCC5646MTCC5647MTCC5648MTCC5649MTCC5650MTCC5651MTCC5652MTCC5653及びMTCC5654から選択される。本発明の他の態様は、Eコリ形質転換細胞中に所望のオキシドレダクターゼ酵素活性を有するポリペプチドを過剰発現することを提供する。他の態様において、本発明は、3ヒドロキシ156ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル4ブタン1オンを提供する。一つの態様において、本発明は、3ヒドロキシ156ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル4ブタン1オンを提供する。一つの態様において、本発明は、3156ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル4ブタン1オンを提供する。一つの態様において、本発明は、3156ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル4ブタン1オンを提供する。一つの態様において、本発明は、3アジド156ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル4ブタン1オンを提供する。一つの態様において、本発明は、3ヒドロキシ156ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル4ブタン1オンのラセミ体、又はその光学活性体、又はいずれかのフォームの鏡像体過剰混合物を調製する方法を提供する。当該方法は、a適切な条件下、適切な補因子の存在下、式の4オキソ4356ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル1ブタン2オン又はその金属イオン塩を、適切なオキシドレダクターゼ、又はその適切な変異体と反応させる工程;及びb3ヒドロキシ156ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル4ブタン1オンのラセミ体、又はその光学活性体、又はいずれかのフォームの鏡像体過剰混合物を単離する工程;を含む。一つの態様において、本発明の酵素は、補因子NADの存在下で機能し、当該補因子は、酵素会合系又は基質会合系により再生産される。また、本発明は、オキシドレダクターゼ活性を有する適切なポリペプチドをコードする遺伝子のみ、又は追加で前記補因子を酵素的に再生産する機能を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含む組換えベクターを提供する。前記ベクターは適切な宿主細胞に形質転換される。一つの態様において、本発明は、シタグリプチンを調製する方法を提供する。前記方法は、3ヒドロキシ156ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル4ブタン1オン又はその鏡像体過剰混合物を、3156ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル4ブタン1オンに変換し、当該産物は、更に、3アジド1356ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル4ブタン1オンに変換され、最後に、4オキソ4356ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル1ブタン2アミンに変換され得る。アミノ酸配列番号1~13及びそれらに対応するヌクレオチド配列番号14~26を以下に示す。アミノ酸配列番号1~13への言及は、それらに対応するヌクレオチド配列番号14~24をも含むものと理解されたい。配列配列番号1アミノ酸配列MKRVNAFNDLKRIGDDKVTAIGMGTWGIGGRETPDYSRDKESIEAIRYGLELGMNLIDTAEFYGAGHAEEIVGEAIKEFEREDIFIVSKVWPTHFGYEEAKKAARASAKRLGTYIDLYLLHWPVDDFKKIEETLHALEDLVDEGVIRYIGVSNFNLELLQRSQEVMRKYEIVANQVKYSVKDRWPETTGLLDYMKREGIALMAYTPLEKGTLARNECLAKIGEKYGKTAAQVALNYLIWEENVVAIPKASNKEHLKENFGAMGWRLSEEDREMARRCV配列番号14配列番号1に対応DNA配列ATGAGGCCAGTTAATTAAGAGGTACCATATGAAACGCGTGAATGCCTTTAATGATCTGAAACGCATTGGTGATGATAAAGTTACCGCAATTGGTATGGGCACCTGGGGTATTGGTGGTCGTGAAACACCGGATTATAGCCGTGATAAAGAAAGCATTGAAGCCATTCGTATTGGTGGTCGTGAAACACCGGATTATAGCCGTGATAAAGAAAGCATTGAAGCCATTCGTTATGGTCTGGAACTGGGCATGAATCTGATTGATACCGCAGAATTTTATGGTGCAGGCCATGCAGAAGAAATTGTTGGCGAAGCCATCAAAGAATTTGAACGCGAGGATATCTTTATTGTTAGCAAAGTGTGGCCGACCCATTTTGGTTATGAAGAAGCCAAAAAAGCAGCACGTGCAAGTTATATTGGCGTGAGCAACTTTAATCTGGAACTGCTGCAGCGTAGCCAAGAAGTTATGCGCAAATACGAAATTGTTGCCAACCAGGTGAAATATAGCGTTAAAGATCGTTGGCCTGAAACCACCGGTCTGCTGGATTATATGAAACGTGAAGGTATTGCACTGATGGCATATACACCGCTGGAAAAAGGCACCCTGGCACGTAATGAATGTCTGGCCAAAATTGGCGAAAAATATGGTAAAACCGCAGCACAGGTTGCACTGAATTATCTGATCTGGGAAGAAAATGTTGTTGCAATTCCGAAAGCCAGCAACAAAGAACATCTGAAAGAAAATTTTGGTGCAATGGGTTGGCGTCTGAGCGAAGAGGATCGTGAAATGGCACGTCGTTGTGTTTAA配列番号2アミノ酸配列MNWEKVPQELYTRLGSSGLQISKIIVGCMSFGTKAWGGDWVLEDEDEIFAIMKKAYDQGIRTFDTADSYSNGVSERLLGKFIRKYNIDRSKLVILTKVFFPAPEEYESFSFFNHNFPGHELVNRSGLSRKHILDSAAASVERLGTYIDVLQIHRYDPNTPAEETMEALNDCIKQGLTRYIGASTMRAYQFIKYQNVAEKHGWAKFISMQSYYSLLYREEEAELIAYCNETGVGLIPWSPNAGGFLTRPVSKQDTARSASGAAALYGLEPFSEADKAIIDRVEELSKKKGVSMASVALAWVISKNSWPIIGFSKPGRVDDALDGFKLKLTEEDIKFLEEPYVPKPLPRLYSVIL配列番号15配列番号2に対応DNA配列ATGAGGCCAGTTAATTAAGAGGTACCATATGAATTGGGAAAAAGTGCCGCAGGAACTGTATACCCGTCTGGGTAGCAGCGGTCTGCAGATTAGCAAAATTATTGTGGGTTGTATGAGCTTTGGCACCAAAGCATGGGGTGGTGATTGGGTTCTGGAAGATGAAGATGAAATTTTTGCCATTATGAAAAAAGCCTATGATCAGGGTATTCGTACCTTTGATACCGCAGATAGCTATAGCAATGGTGTTAGCGAACGTCTGCTGGGTAAATTCATCCGCAAATACAACATTGATCGCAGCAAACTGGTTATTCTGACCAAAGTTTTTTTTCCGGCACCGGAAGAATATGAAAGCTTCAGCTTTTTTAACCATAACTTTCCGGGTCATGAACTGGTTAATCGTAGCGGTCTGAGCCGTAAACATATTCTGGATAGCGCAGCAGCAAGCGTTGAACGTCTGGGCACCTATATTGATGTTCTGCAGATCCATCGTTATGATCCGAATACACCGGCTGAAGAAACAATGGAAGCCCTGAACGATTGTATTAAACAGGGTCTGACCCGTTATATTGGTGCAAGCACCATGCGTGCCTATCAGTTCATTAAATATCAGAACGTGGCCGAAAAACATGGTTGGGCCAAATTTATTAGCATGCAGAGCTATTATAGCCTGCTGTATCGTGAAGAAGAAGCAGAACTGATTGCCTATTGCAATGAAACCGGTGTTGGTCTGATTCCGTGGAGCCCGAATGCCGGTGGTTTTCTGACCCGTCCGGTTAGCAAACAGGATACCGCACGTAGCGCAAGCGGTGCAGCAGCACTGTATGGTCTGGAACCGTTTAGCGAAGCAGATAAAGCCATTATTGATCGTGTGGAAGAACTGAGCAAAAAAAAAGGTGTTAGCATGGCAAGCGTTGCACTGGCATGGGTTATTAGCAAAAACAGCTGGCCGATTATTGGTTTTAGCAAACCGGGTCGTGTTGATGATGCACTGGATGGCTTTAAACTGAAACTGACCGAAGAGGATATCAAATTCCTGGAAGAACCGTATGTTCCGAAACCGCTGCCTCGTCTGTATAGCGTTATTCTGTAA配列番号3アミノ酸配列MSQGRKAAERLAKKTVLITGASAGIGKATALEYLEASNGDMKLILAARRLEKLEELKKTIDQEFPNAKVHVAQLDITQAEKIKPFIENLPQEFKDIDILVNNAGKALGSDRVGQIATEDIQDVFDTNVTALINITQAVLPIFQAKNSGDIVNLGSIAGRDAYPTGSIYCASKFAVGAFTDSLRKELINTKIRVILIAPGLVETEFSLVRYRGNEEQAKNVYKDTTPLMADDVADLIVYATSRKQNTVIADTLIFPTNQASPHHIFRG配列番号16配列番号3に対応DNA配列ATGAGGCCAGTTAATTAAGAGGTACCATATGAGCCAGGGTCGTAAAGCAGCAGAACGTCTGGCAAAAAAAACCGTTCTGATTACCGGTGCAAGCGCAGGTATTGGTAAAGCAACCGCACTGGAATATCTGGAAGCAAGCAATGGCGATATGAAACTGATTCTGGCAGCACGTCGTCTGGAAAAACTGGAAGAACTGAAAAAAACCATCGATCAGGAATTTCCGAACGCAAAAGTTCATGTTGCACAGCTGGATATTACCCAGGCAGAAAAAATCAAACCGTTTATCGAAAATCTGCCGCAGGAATTCAAAGATATCGATATTCTGGTGAATAATGCAGGTAAAGCACTGGGTAGCGATCGTGTTGGTCAGATTGCAACCGAAGATATCCAGGATGTGTTTGATACCAATGTGACCGCACTGATTAATATTACACAGGCCGTTCTGCCGATTTTTCAGGCAAAAAACAGCGGTGATATTGTGAATCTGGGTAGCATTGCAGGTCGTGATGCATATCCGACCGGTAGCATTTATTGTGCAAGCAAATTTGCAGTTGGTGCATTTACCGACAGTCTGCGCAAAGAACTGATTAATACCAAAATCCGCGTTATTCTGATTGCACCGGGTCTGGTTGAAACCGAATTCAGCCTGGTTCGTTATCGTGGTAATGAAGAACAGGCCAAAAACGTGTATAAAGATACCACACCGCTGATGGCAGATGATGTTGCCGATCTGATTGTTTATGCAACCAGCCGTAAACAGAATACCGTTATTGCCGATACCCTGATTTTTCCGACCAATCAGGCATCTCCGCATCATATTTTTCGTGGTTAA配列番号4アミノ酸配列MTQRIAYVTGGMGGIGTAICQRLAKDGFRVVAGCGPNSPRREKWLEQQKALGFDFIASEGNVADWDSTKTAFDKVKSEVGEVDVLINNAGITRDVVFRKMTRADWDAVIDTNLTSLFNVTKQVIDGMADRGWGRIVNISSVNGQKGQFGQTNYSTAKAGLHGFTMALAQEVATKGVTVNTVSPGYIATDMVKAIRQDVLDKIVATIPVKRLGLPEEIASICAWLSSEESGFSTGADFSLNGGLHMG配列番号17配列番号4に対応DNA配列ATGAGGCCAGTTAATTAAGAGGTACCATATGACCCAGCGTATTGCCTATGTTACCGGTGGTATGGGTGGTATTGGCACCGCAATTTGTCAGCGTCTGGCAAAAGATGGTTTTCGTGTTGTTGCAGGTTGTGGTCCGAATTCTCCGCGTCGTGAAAAATGGCTGGAACAGCAGAAAGCACTGGGTTTTGATTTTATTGCCAGCGAAGGTAATGTTGCAGATTGGGATAGCACCAAAACCGCCTTTGATAAAGTTAAAAGCGAAGTGGGTGAAGTTGATGTGCTGATTAACAATGCAGGTATTACCCGTGATGTTGTGTTTCGCAAAATGACCCGTGCCGATTGGGATGCAGTTATTGATACCAATCTGACCAGCCTGTTTAATGTTACCAAACAGGTGATTGATGGTATGGCAGATCGTGGTTGGGGTCGTATTGTTAATATTAGCAGCGTGAATGGTCAGAAAGGTCAGTTTGGTCAGACCAATTATAGCACCGCAAAAGCAGGTCTGCATGGTTTTACAATGGCACTGGCACAGGAAGTTGCAACCAAAGGCGTTACCGTTAATACCGTTTCTCCGGGTTATATTGCCACCGATATGGTTAAAGCAATTCGTCAGGATGTGCTGGATAAAATTGTTGCCACCATTCCGGTTAAACGTCTGGGTCTGCCGGAAGAAATTGCAAGCATTTGTGCATGGCTGAGCAGCGAAGAAAGCGGTTTTAGCACAGGTGCAGATTTTAGCCTGAATGGTGGTCTGCACATGGGTTAA配列番号5アミノ酸配列MSSPSDGPFPKATPQLPNSVFDMFSMKGKVTAITGGGGGIGFAAAEAIAEAGGDVALLYRSAPNMEERSAELAKRFGVKVKSYQCEVTEHESVKQAIEAVEKDFGRLDCYIANAGGGVPGSINPDYPLEAWHKTQSVNLHSTFYAARECARIFKAQGSGSFIATTSISARIVNVPYDQPAYNSSKAAVVHFCRSLARDWRNFARVNTISPGFFDTPMGPSDKAVEDVLYQKSVLGRAGDVKELKAAYLYLASNASTYTTGADLLIDGGYCLT配列番号18配列番号5に対応DNA配列ATGAGGCCAGTTAATTAAGAGGTACCATATGAGCAGCCCGTCTGATGGTCCGTTTCCGAAAGCAACACCGCAGCTGCCGAATAGCGTTTTTGACATGTTTAGCATGAAAGGTAAAGTTACCGCAATTACCGGTGGTGGTGGTGGCATTGGTTTTGCAGCAGCAGAAGCAATTGCCGAAGCCGGTGGTGATGTTGCACTGCTGTATCGTAGCGCACCGAATATGGAAGAACGTAGCGCAGAACTGGCAAAACGTTTTGGTGTGAAAGTGAAAAGCTATCAGTGCGAAGTTACCGAACATGAAAGCGTTAAACAGGCAATTGAAGCCGTGGAAAAAGATTTTGGTCGCCTGGATTGTTATATTGCAAATGCGGGTGGTGGTGTTCCGGGTAGCATTAATCCGGATTATCCGCTGGAAGCATGGCATAAAACCCAGAGCGTTAATCTGCATAGCACCTTTTATGCAGCACGTGAATGCGCACGTATTTTTAAAGCACAGGGCAGCGGTAGCTTTATTGCAACCACCTCTATTAGCGCACGTATTGTGAATGTTCCGTATGATCAGCCTGCATATAATAGCAGCAAAGCAGCCGTTGTTCATTTTTGTCGTAGCCTGGCACGTGATTGGCGTAATTTTGCCCGTGTTAATACCATTAGCCCTGGTTTTTTTGATACCCCGATGGGTCCGAGCGATAAAGCAGTTGAAGATGTGCTGTATCAGAAAAGCGTTCTGGGTCGTGCCGGTGATGTTAAAGAACTGAAAGCAGCATATCTGTATCTGGCAAGCAATGCAAGCACCTATACCACCGGTGCAGATCTGCTGATTGATGGTGGTTATTGTCTGACCTAA配列番号6アミノ酸配列MVPKFYKLSNGFKIPSIALGTYDIPRSQTAEIVYEGVKCGYRHFDTAVLYGNEKEVGDGIIKWLNEDPGNHKREEIFYTTKLWNSQNGYKRAKAAIRQCLNEVSGLQYIDLLLIHSPLEGAVDEGLVKSIGVSNYGKKHIDELLNWPELKHKPVVNQIEISPWIMRQELADYCKSKGLVVEAFAPLCHGYKMTNPDLLKVCKEVDRNPGQVLIRWSLQHGYLPLPKTKTVKRLEGNLAAYNFELSDEQMKFLDHAP配列番号19配列番号6に対応DNA配列ATGGTTCCTAAGTTTTACAAACTTTCAAACGGCTTCAAAATCCCAAGCATTGCTTTGGGAACCTACGATATTCCAAGATCGCAAACAGCCGAAATTGTGTATGAAGGTGTCAAGTGCGGCTACCGTCATTTCGATACTGCTGTTCTTTATGGTAATGAGAAGGAAGTTGGCGATGGTATCATTAAATGGTTGAACGAAGATCCAGGGAACCATAAACGTGAGGAAATCTTCTACACTACTAAATTATGGAATTCGCAAAACGGATATAAAAGAGCTAAAGCTGCCATTCGGCAATGTTTGAATGAAGTCTCGGGCTTGCAATACATCGATCTTCTTTTGATTCATTCGCCACTGGAAGGTTCTAAATTAAGGTTGGAAACTTGGCGCGCCATGCAAGAAGCGGTTGATGAAGGATTGGTTAAGTCTATAGGGGTTTCCAACTATGGGAAAAAGCACATTGATGAACTTTTGAACTGGCCAGAACTGAAGCACAAGCCAGTGGTCAACCAAATCGAGATATCACCTTGGATTATGAGACAAGAATTAGCAGATTACTGTAAATCTAAAGGTCTCGTCGTCGAAGCCTTTGCCCCATTGTGTCACGGCTACAAAATGACTAATCCAGATTTATTAAAAGTTTGCAAAGAGGTGGACCGTAATCCAGGTCAAGTTTTGATTCGTTGGTCTTTACAACACGGTTATTTACCACTACCGAAGACTAAAACTGTGAAGAGGTTAGAAGGTAACCTTGCAGCCTACAACTTTGAACTGTCAGACGAACAGATGAAATTTCTTGATCATCCTGATGCTTATGAGCCTACCGATTGGGAATGCACAGACGCGCCATAA配列番号7アミノ酸配列配列番号20配列番号7に対応DNA配列ATGTATACCGACCTGAAAGATAAAGTTGTTGTTGTGACCGGTGGTAGCAAAGGTCTGGGTCGTGCAATGGCAGTTCGTTTTGGTCAGGAACAGAGCAAAGTTGTTGTGAATTATCGCAGCAATGAAGAAGAAGCCCTGGTTGGTCAGGAACAGAGCAAAGTTGTTGTGAATTATCGCAGCAATGAAGAAGAAGCCCTGGCCAAAGAAGAGGACGTTGTTAATCTGGTTGAAACCGCAGTTAAAGAATTTGGCACCCTGGATGTGATGATTAATAATGCCGGTGTTGAAAATCCGGTTCCGAGCCATGAACTGAGCCTGGAAAATTGGAATCAGGTGATTGATACCAATCTGACCGGTGCATTTCTGGGTAGCCGTGAAGCCATTAAATATTTTGTGGAAAATGATATTAAAGGCAATGTGATCAATATGAGCAGCGTTCATGAAATGATTCCGTGGCCTCTGTTTGTTCATTATGCAGCAAGCAAAGGTGGTATGAAACTGATGACCGAAACCCTGGCACTGGAATATGCACCGAAAGGTATTCGTGTGAATAATATTGGTCCGGGTGCAATTGATACCCCGATCAATGCAGAAAAATTTGCAGATCCGGAACAGCGTGCAGATGTTGAAAGCATGATTCCGATGGGTTATATTGGCAATCCGGAAGAAATTGCAAGCGTTGCAGCATTTCTGGCAAGCAGCCAGGCAAGCTATGTTACCGGTATTACCCTGTTTGCAGATGGTGGTATGACCAAATATCCGAGCTTTCAGGCAGGTCGTGGTTAATAA配列番号8アミノ酸配列MTDLFKPLPEPPTELGRLRVLSKTAGIRVSPLILGGASIGDAWSGFMGSMNKEQAFELLDAFYEAGGNCIDTANSYQNEESEIWIGEWMASRKLRDQIVIATKFTGDYKKYEVGGGKSANYCGNHKRSLHVSVRDSLRKLQTDWIDILYIHWWDYMSSIEEVMDSLHILVQQGKVLYLGVSDTPAWVVSAANYYATSHGKTPFSVYQGKWNVLNRDFERDIIPMARHFGMALAPWDVMGGGRFQSKKAMEERKKNGEGLRTFVGGPEKIAEEHGTESVTAIAIAYVRSKAKNVFPLIGGRKIEHLKQNIEALSIKLTPEQIEYLESIVPFDVGFPKSLIGDDPAVTKKLSPLTSMSARIAFDN配列番号21配列番号8に対応DNA配列ATGACTGACTTGTTTAAACCTCTACCTGAACCACCTACCGAATTGGGACGTCTCAGGGTTCTTTCTAAAACTGCCGGCATAAGGGTTTCACCGCTAATTCTGGGAGGAGCTTCAATCGGCGACGCATGGTCAGGCTTTATGGGCTCTATGAATAAGGAACAGGCCTTTGAACTTCTTGATGCTTTTTATGAAGCTGGAGGTAATTGTATTGATACTGCAAACAGTTACCAAAATGAAGAGTCAGAGATTTGGATAGGTGAATGGATGGCATCAAGAAAACTGCGTGACCAGATTGTAATTGCCACCAAGTTTACCGGAGATTATAAGAAGTATGAAGTAGGTGGTGGTAAAAGTGCCAACTACTGTGGTAATCACAAGCGTAGTTTACATGTGAGTGTGAGGGATTCTCTCCGCAAATTGCAAACTGATTGGATTGATATACTTTACATTCACTGGTGGGATTATATGAGTTCAATCGAAGAAGTTATGGATAGTTTGCATATTTTAGTTCAGCAGGGCAAGGTCCTATATTTAGGAGTATCTGATACACCTGCTTGGGTTGTTTCTGCGGCAAATTACTACGCTACATCTCATGGTAAAACTCCTTTTAGCGTCTATCAAGGTAAATGGAATGTATTGAACAGGGACTTTGAGCGTGATATTATTCCAATGGCTAGGCATTTTGGTATGGCTCTAGCCCCATGGGATGTCATGGGAGGTGGAAGATTTCAGAGTAAAAAAGCAATGGAAGAACGGAAGAAGAATGGAGAGGGTCTGCGTACTTTTGTGGGTGGCCCCGAACAAACAGAATTGGAGGTTAAAATCAGCGAAGCATTGACTAAAATTGCTGAGGAACATGGAACAGAGTCTGTTACTGCTATCGCTATTGCCTATGTTCGCTCTAAAGCGAAAAATGTTTTCCCATTGATTGGAGGAAGGAAAATTGAACATCTCAAGCAGAACATTGAGGCTTTGAGTATTAAATTAACACCGGAACAAATAGAATACCTGGAAAGTATTGTTCCTTTTGATGTTGGCTTTCCCAAAAGTTTAATAGGAGATGACCCAGCGGTAACCAAGAAGCTTTCACCCCTCACATCGATGTCTGCCAGGATAGCTTTTGACAATTAG配列番号9アミノ酸配列MCDSPATTGKPTILFIADPCETSATLNSKAFKEKFRILRYQLDTKEAFLNFLERHEQDKICAIYAGFPAFKKIGGMTRSIIEHKSFPRKNLKCIVLCSRGYDGWDLDTLRKHEIRLYNYQDDENEKLIDDLKLHQVGNDVADCALWHILEGFRKFSYYQKLSRETGNTLTARAKAAEKSGFAFGHELGNMFAESPRGKKCLILGLGSIGKQVAYKLQYGLGMEIHYCKRSEDCTMSQNESWKFHLLDETIYAKLYQFHAIVVTLPGTHCNPGLILVNLGRGKILDLRAVSDALVTGRINHLGLDVFNKEPEIDEKIRSSDRLTSITPHLGSATKDVFEQSCELALTRILRVVSGEAASDEHFSRVV配列番号22配列番号9に対応DNA配列ATGTGCGATTCTCCTGCAACGACTGGAAAGCCTACTATTCTTTTCATCGCAGATCCGTGCGAAACATCAGCCACACTTAATTCCAAGGCATTCAAAGAGAAGTTCAGGATCTTGCGCTATCAGCTGGACACCAAAGAAGCATTTCTTAACTTTTTAGAAAGGCATGAACAAGACAAAATATGTGCCATTTATGCTGGGTTTCCGGCATTCAAAAAAATCGGTGGGATGACTCGAAGTATCATCGAACACAAGTCATTTCCAAGGAAAAATTTAAAATGTATCGTGCTTTGCTCAAGAGGTTACGACGGATGGGATCTGGATACATTACGCAAGCATGAAATTCGATTATACAACTACCAAGACGATGAAAATGAAAAATTGATAGACGATTTAAAGCTTCATCAAGTCGGTAATGATGTGGCAGATTGTGCCTTGTGGCACATTCTGGAGGGCTTTAGAAAGTTCTCCTATTACCAAAAACTTAGTAGAGAAACTGGAAATACATTAACTGCAAGGGCGAAAGCTGCAGAAAAGAGCGGATTTGCTTTTGGCCATGAACTGGGGAATATGTTTGCTGAATCACCAAGAGGAAAGAAATGCTTAATTCTTGGTTTAGGAAGTATTGGAAAGCAAGTAGCCTACAAGTTGCAATACGGGCTAGGAATGGAAATACATTATTGCAAAAGAAGCGAAGATTGCACAATGAGTCAAAACGAAAGCTGGAAATTTCATTTGCTAGATGAAACAATATATGCAAAACTATACCAGTTTCATGCAATCGTGGTCACATTGCCGGGAACTCCACAAACAGAACATTTAATCAACAGGAAATTTTTGGAACACTGCAATCCAGGCCTAATTTTAGTCAACTTGGGAAGAGGTAAAATTTTGGACTTGCGGGCTGTTTCTGACGCCTTGGTAACGGGACGAATCAACCATCTCGGTTTAGACGTCTTTAATAAAGAACCAGAAATAGATGAAAAAATCAGATCTTCTGATAGACTTACTTCAATTACTCCGCATTTGGGTAGTGCGACAAAGGATGTTTTTGAGCAAAGTTGTGAACTGGCATTGACAAGAATCTTACGGGTAGTGTCTGGGGAAGCCGCAAGCGATGAGCATTTCTCCCGTGTAGTTTGA配列番号10アミノ酸配列MSSLVTLNNGLKMPLVGLGCWKIDKKVCANQIYEAIKLGYRLFDGACDYGNEKEVGEGIRKAISEGLVSRKDIFVVSKLWNNFHHPDHVKLALKKTLSDMGLDYLDLYYIHFPIAFKYVPFEEKYPPGFYTGADDEKKGHITEAHVPIIDTYRALEECVDEGLIKSIGVSNFQGSLIQDLLRGCRIKPVALQIEHHPYLTQEHLVEFCKLHDIQVVAYSSFGPQSFIEMDLQLAKTTPTLFENDVIKKVSQNHPGSTTSQVLLRWATERLLGNLEIEKKFTLTEQELKDISALNANIRFNDPWTWLDGKFPTFA配列番号23配列番号10に対応DNA配列ATGTCTTCACTGGTTACTCTTAATAACGGTCTGAAAATGCCCCTAGTCGGCTTAGGGTGCTGGAAAATTGACAAAAAAGTCTGTGCGAATCAAATTTATGAAGCTATCAAATTAGGCTACCGTTTATTCGATGGTGCTTGCGACTACGGCAACGAAAAGGAAGTTGGTGAAGGTATCAGGAAAGCCATCTCCGAAGGTCTTGTTTCTAGAAAGGATATATTTGTTGTTTCAAAGTTATGGAACAATTTTCACCATCCTGATCATGTAAAATTAGCTTTAAAGAAGACCTTAAGCGATATGGGACTTGATTATTTAGACCTGTATTATATTCACTTCCCAATCGCCTTCAAATATGTTCCATTTGAAGAGAAATACCCTCCAGGATTCTATACGGGCGCAGATGACGAGAAGAAAGGTCACATCACCGAAGCACATGTACCAATCATAGATACGTACCGGGCTCTGGAAGAATGTGTTGATGAAGGCTTGATTAAGTCTATTGGTGTTTCCAACTTTCAGGGAAGCTTGATTCAAGATTTATTACGTGGTTGTAGAATCAAGCCCGTGGCTTTGCAAATTGAACACCATCCTTATTTGACTCAAGAACACCTAGTTGAGTTTTGTAAATTACACGATATCCAAGTAGTTGCTTACTCCTCCTTCGGTCCTCAATCATTCATTGAGATGGACTTACAGTTGGCAAAAACCACGCCAACTCTGTTCGAGAATGATGTAATCAAGAAGGTCTCACAAAACCATCCAGGCAGTACCACTTCCCAAGTATTGCTTAGATGGGCAACTCAGAGAGGCATTGCCGTCATTCCAAAATCTTCCAAGAAGGAAAGGTTACTTGGCAACCTAGAAATCGAAAAAAAGTTCACTTTAACGGAGCAAGAATTGAAGGATATTTCTGCACTAAATGCCAACATCAGATTTAATGATCCATGGACCTGGTTGGATGGTAAATTCCCCACTTTTGCCTGA配列番号11アミノ酸配列MANPTVIKLQDGNVMPQLGLGVWQASNEEVITAIQKALEVGYRSIDTAAAYKNEEGVGKALKNASVNREELFITTKLWNDDHKRPREALLDSLKKLQLDYIDLYLMHWPVPAIDHYVEAWKGMIELQKEGLIKSIGVCNFQIHHLQRLIDETGVTPVINQIELHPLMQQRQLHAWNATHKIQTESWSPLAQGGKGVFDQKVIRDLADKYGKTPAQIVIRWHLDSGLVVIPKSVTPSRIAENFDVWDFRLDKDELGEIAKLDQGKRLGPDPDQFGG配列番号24配列番号11に対応DNA配列ATGGCTAATCCAACCGTTATTAAGCTACAGGATGGCAATGTCATGCCCCAGCTGGGACTGGGCGTCTGGCAAGCAAGTAATGAGGAAGTAATCACCGCCATTCAAAAAGCGTTAGAAGTGGGTTATCGCTCGATTGATACCGCCGCGGCCTACAAGAACGAAGAAGGTGTCGGCAAAGCCCTGAAAAATGCCTCAGTCAACAGAGAAGAACTGTTCATCACCACTAAGCTGTGGAACGACGACCACAAGCGCCCCCGCGAAGCCCTGCTCGACAGCCTGAAAAAACTCCAGCTTGATTATATCGACCTCTACTTAATGCACTGGCCCGTTCCCGCTATCGACCATTATGTCGAAGCATGGAAAGGCATGATCGAATTGCAAAAAGAGGGATTAATCAAAAGCATCGGCGTGTGCAACTTCCAGATCCATCACCTGCAACGCCTGATTGATGAAACTGGCGTGACGCCTGTGATAAACCAGATCGAACTTCATCCGCTGATGCAACAACGCCAGCTACACGCCTGGAACGCGACACACAAAATCCAGACCGAATCCTGGAGCCCATTAGCGCAAGGAGGGAAAGGCGTTTTCGATCAGAAAGTCATTCGCGATCTGGCAGATAAATACGGCAAAACCCCGGCGCAGATTGTTATCCGCTGGCATCTGGATAGCGGCCTGGTGGTGATCCCGAAATCGGTCACACCTTCACGTATTGCCGAAAACTTTGATGTCTGGGATTTCCGTCTCGACAAAGACGAACTCGGCGAAATTGCAAAACTCGATCAGGGCAAGCGTCTCGGTCCCGATCCTGACCAGTTCGGCGGCTAA配列番号12アミノ酸配列MAIPAFGLGTFRLKDDVVISSVITALELGYRAIDTAQIYDNEAAVGQAIAESGVPRHELYITTKIWIENLSKDKLIPSLKESLQKLRTDYVDLTLIHWPSPNDEVSVEEFMQALLEAKKQGLTREIGISNFTIPLMEKAIAAVGAENIATNQIELSPYLQNRKVVAWAKQHGIHITSYMTLAYGKALKDEVIARIAAKHNATPAQVILAWAMGEGYSVIPSSTKRKNLESNLKAQNLQLDAEDKKAIAALDCNDRLVSPEGLAPEWD配列番号25配列番号12に対応DNA配列ATGGCTATCCCTGCATTTGGTTTAGGTACTTTCCGTCTGAAAGACGACGTTGTTATTTCATCTGTGATAACGGCGCTTGAACTTGGTTATCGCGCAATTGATACCGCACAAATCTATGATAACGAAGCCGCAGTAGGTCAGGCGATTGCAGAAAGTGGCGTGCCACGTCATGAACTCTACATCACCACTAAAATCTGGATTGAAAATCTCAGCAAAGACAAATTGATCCCAAGTCTGAAAGAGAGCCTGCAAAAATTGCGTACCGATTATGTTGATCTGACGCTAATCCACTGGCCGTCACCAAACGATGAAGTCTCTGTTGAAGAGTTTATGCAGGCGCTGCTGGAAGCCAAAAAACAAGGGCTGACGCGTGAGATCGGTATTTCCAACTTCACGATCCCGTTGATGGAAAAAGCGATTGCTGCTGTTGGTGCTGAAAACATCGCTACTAACCAGATTGAACTCTCTCCTTATCTGCAAAACCGTAAAGTGGTTGCCTGGGCTAAACAGCACGGCATCCATATTACTTCCTATATGACGCTGGCGTATGGTAAGGCCCTGAAAGATGAGGTTATTGCTCGTATCGCAGCTAAACACAATGCGACTCCGGCACAAGTGATTCTGGCGTGGGCTATGGGGGAAGGTTACTCAGTAATTCCTTCTTCTACTAAACGTAAAAACCTGGAAAGTAATCTTAAGGCACAAAATTTACAGCTTGATGCCGAAGATAAAAAAGCGATCGCCGCACTGGATTGCAACGACCGCCTGGTTAGCCCGGAAGGTCTGGCTCCTGAATGGGATTAA配列番号13アミノ酸配列MPATLHDSTKILSLNTGAQIPQIGLGTWQSKENDAYKAVLTALKDGYRHIDTAAIYRNEDQVGQAIKDSGVPREEIFVTTKLWCTQHHEPEVALDQSLKRLGLDYVDLYLMHWPARLDPAYIKNEDILSVPTKKDGSRAVDITNWNFIKTWELMQELPKTGKTKAVGVSNFSINNLKDLLASQGNKLTPAANQVEIHPLLPQDELINFCKSKGIVVEAYSPLGSTDAPLLKEPVILEIAKKNNVQPGHVVISWHVQRGYVVLPKSVNSTEDFEAINNISKEKGEKRVVHPNWSPFEVFK配列番号26配列番号13に対応DNA配列ATGCCTGCTACTTTACATGATTCTACGAAAATCCTTTCTCTAAATACTGGAGCCCAAATCCCTCAAATAGGTTTAGGTACGTGGCAGTCGAAAGAGAACGATGCTTATAAGGCTGTTTTAACCGCTTTGAAAGATGGCTACCGACACATTGATACTGCTGCTATTTACCGTAATGAAGACCAAGTCGGTCAAGCCATCAAGGATTCAGGTGTTCCTCGGGAAGAAATCTTTGTTACTACAAAGTTATGGTGTACACAACACCACGAACCTGAAGTAGCGCTGGATCAATCACTAAAGAGGTTAGGATTGGACTACGTAGACTTATATTTGATGCATTGGCCTGCCAGATTAGATCCAGCCTACATCAAAAATGAAGACATCTTGAGTGTGCCAACAAAGAAGGATGGTTCTCGTGCAGTGGATATCACCAATTGGAATTTCATCAAAACCTGGGAATTAATGCAGGAACTACCAAAGACTGGTAAAACTAAGGCCGTTGGAGTCTCCAACTTTTCTATAAATAACCTGAAAGATCTATTAGCATCTCAAGGTAATAAGCTTACGCCAGCTGCTAACCAAGTCGAAATACATCCATTACTACCTCAAGACGAATTGATTAATTTTTGTAAAAGTAAAGGCATTGTGGTTGAAGCTTATTCTCCGTTAGGTAGTACCGATGCTCCACTATTGAAGGAACCGGTTATCCTTGAAATTGCGAAGAAAAATAACGTTCAACCCGGACACGTTGTTATTAGCTGGCACGTCCAAAGAGGTTATGTTGTCTTGCCAAAATCTGTGAATCCCGATCGAATCAAAACGAACAGGAAAATATTTACTTTGTCTACTGAGGACTTTGAAGCTATCAATAACATATCGAAGGAAAAGGGCGAAAAAAGGGTTGTACATCCAAATTGGTCTCCTTTCGAAGTATTCAAGTAA本明細書中、酵素は、所望の酵素活性を示す、ポリヌクレオチド配列によりコードされたポリペプチドを指す。酵素は、本明細書中、特段の言及が無い限り、下記で定義する、適切な変異体をも含み得る。変異体は、1つ以上のヌクレオチドが、付加、欠失、置換又は挿入した上記ヌクレオチド配列に由来するポリペプチドを指す。本明細書中で使用されるとき、オキシドレダクターゼ又はオキシドレダクターゼ酵素は、任意で補因子の助けを借りて、立体選択的にケトンを還元して対応するアルコールを形成する反応を触媒する酵素を指す。本明細書中、補因子は、所望の反応を触媒する酵素と協調して機能する有機化合物を指す。例えば、補因子は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、及びそれらの任意の誘導体又は類似体である。本明細書中、発現コンストラクトは、所望の遺伝子のヌクレオチド配列及び所望の遺伝子の発現を制御する配列を含む。本明細書中、単シストロン性発現コンストラクトは、単一の遺伝子を発現する発現コンストラクトを意味する。本明細書中、多シストロン性発現コンストラクトは、2つ以上の遺伝子を発現する単一の発現コンストラクトを意味する。本明細書中、酵素会合補因子再生産系は、反応の過程で、発現ベクターが、酸化されたNADから還元された補因子を再生産する能力を有する酵素的ポリペプチドを発現することを意味する。本明細書中、基質会合補因子再生産系は、反応の過程で、酸化されたNADから還元された補因子を再生産する能力を有する適切な基質H供与体を使用することを意味する。pET11aZBG511は、GenbankIDNoNP5796891の配列番号1のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を有する発現ベクターで、当該遺伝子は、アンピシリン薬物耐性マーカーを利用するpET11a中でT7プロモーターのコントロール下にある。pET11aZBG641は、GenbankIDNoYP3997031の配列番号2のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を有する発現ベクターで、当該遺伝子は、アンピシリン薬物耐性マーカーを利用するpET11a中でT7プロモーターのコントロール下にある。pET11aZBG201は、GenbankIDNoNP0139531の配列番号3のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を有する発現ベクターで、当該遺伝子は、アンピシリン薬物耐性マーカーを利用するpET11a中でT7プロモーターのコントロール下にある。pET11aZBG2511は、GenbankIDNoAAA219731の配列番号4のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を有する発現ベクターで、当該遺伝子は、アンピシリン薬物耐性マーカーを利用するpET11a中でT7プロモーターのコントロール下にある。pET11aZBG811は、GenbankIDNoBAH288331の配列番号5のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を有する発現ベクターで、当該遺伝子は、アンピシリン薬物耐性マーカーを利用するpET11a中でT7プロモーターのコントロール下にある。pET11aZBG1311は、GenbankIDNoAAX311451の配列番号7のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を有する発現ベクターで、当該遺伝子は、アンピシリン薬物耐性マーカーを利用するpET11a中でT7プロモーターのコントロール下にある。pET27bZBG511は、GenbankIDNoNP5796891の配列番号1のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を有する発現ベクターで、当該遺伝子は、カナマイシン薬物耐性マーカーを利用するpET27b中でT7プロモーターのコントロール下にある。pET27bZBG201は、GenbankIDNoNP0139531の配列番号3のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を有する発現ベクターで、当該遺伝子は、カナマイシン薬物耐性マーカーを利用するpET27b中でT7プロモーターのコントロール下にある。pET27bZBG811は、GenbankIDNoBAH288331の配列番号5のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を有する発現ベクターで、当該遺伝子は、カナマイシン薬物耐性マーカーを利用するpET27b中でT7プロモーターのコントロール下にある。pET27bZBG209は、GenbankIDNoNP0126301の配列番号6のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を有する発現ベクターで、当該遺伝子は、カナマイシン薬物耐性マーカーを利用するpET27b中でT7プロモーターのコントロール下にある。pET27bZBG1311は、GenbankIDNoAAX311451の配列番号7のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を有する発現ベクターで、当該遺伝子は、カナマイシン薬物耐性マーカーを利用するpET27b中でT7プロモーターのコントロール下にある。pET27bZBG208は、GenbankIDNoNP014068の配列番号8のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を有する発現ベクターで、当該遺伝子は、カナマイシン薬物耐性マーカーを利用するpET27b中でT7プロモーターのコントロール下にある。pET27bZBG2011は、GenbankIDNoNP011330の配列番号9のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を有する発現ベクターで、当該遺伝子は、カナマイシン薬物耐性マーカーを利用するpET27b中でT7プロモーターのコントロール下にある。pET27bZBG205は、GenbankIDNoNP0119721の配列番号10のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を有する発現ベクターで、当該遺伝子は、カナマイシン薬物耐性マーカーを利用するpET27b中でT7プロモーターのコントロール下にある。pET27bZBG1122は、GenbankIDNoACB040981の配列番号11のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を有する発現ベクターで、当該遺伝子は、カナマイシン薬物耐性マーカーを利用するpET27b中でT7プロモーターのコントロール下にある。pET27bZBG112は、GenbankIDNoACB013801の配列番号12のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を有する発現ベクターで、当該遺伝子は、カナマイシン薬物耐性マーカーを利用するpET27b中でT7プロモーターのコントロール下にある。pET27bZBG204は、GenbankIDNoNP0147631の配列番号13のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を有する発現ベクターで、当該遺伝子は、カナマイシン薬物耐性マーカーを利用するpET27b中でT7プロモーターのコントロール下にある。本明細書中、全細胞は、ブタペスト条約に従い寄託された受入れ番号MTCC5642MTCC5643MTCC5644MTCC5645MTCC5646MTCC5647MTCC5648MTCC5649MTCC5650MTCC5651MTCC5652MTCC5653MTCC5654の組み換えEコリを意味する。金属イオン塩とは、NaKLiCaMgCu及びCsとの塩を指す。本発明は、式の適切な中間体を調製する方法を提供し、当該方法は:a適切な条件下、適切な補因子の存在下で維持することにより、式の4オキソ4356ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル1ブタン2オン、又はその金属イオン塩を、立体選択的にケトンを還元してアルコールを形成する適切な酵素と反応させる工程;及びb適切な中間体を単離する工程;を含む。本発明の方法は、以下の式:の反対のキラリティの3ヒドロキシ156ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル4ブタン1オンの2つの鏡像異性体を提供する。本発明は、式の4オキソ4356ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル1ブタン2オン又はその金属イオン塩の酵素的還元による、3ヒドロキシ156ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル4ブタン1オンの、ラセミ体又はその光学活性体及びのいずれかを調製する方法に関し、当該方法は:式の4オキソ4356ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル1ブタン2オン又はその金属イオン塩を、適切な条件下で維持することにより、ケトンを立体選択的に還元してアルコールを形成する適切な酵素及びその変異体と反応させることにより、3ヒドロキシ156ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル4ブタン1オンの、ラセミ体、又は光学活性体又は、又はいずれかのフォームの鏡像体過剰混合物を取得する工程を含む。本発明の一つの態様において、前記所望の酵素活性を有するポリペプチド及びその変異体は、適切な細菌、酵母又は真菌から単離され得る。一つの態様において、前記酵素活性を有する適切なポリペプチドは、オキシドレダクターゼから選択される。好ましい態様において、前記適切な酵素は、アルドケトレダクターゼから選択される。他の態様において、前記適切な酵素は、デヒドロゲナーゼから選択される。一つの態様において、NAD依存的レダクターゼは、サッカロマイケス種に由来される。他の好ましい態様において、NAD依存的レダクターゼは、サッカロマイケスセレウィシアエに由来し、GenebankIDNoNP0126301を有する。他の好ましい態様において、NAD依存的レダクターゼは、サッカロマイケスセレウィシアエに由来し、GenebankIDNoNP0139531NP0147631NP0119721NP014068及びNP011330を有する。好ましい態様において、適切な酵素は、短鎖デヒドロゲナーゼである。そのような短鎖デヒドロゲナーゼの例として、NADNADH依存的アルコールデヒドロゲナーゼが挙げられる。他の態様において、前記短鎖デヒドロゲナーゼは、NADH依存的3キヌクリジノンレダクターゼから選択される。一つの態様において、NADH依存的3キヌクリジノンレダクターゼは、ロドトルラ種から選択される。好ましい態様において、NADH依存的3キヌクリジノンレダクターゼはロドトルラムキラギノサに由来し、GenebankIDNoBAH288331を有する。他の態様において、前記酵素は、適切なアルドケトレダクターゼから選択される。そのようなアルドケトレダクターゼの例として、アルドースレダクターゼ、アルデヒドレダクターゼ、カルボニルレダクターゼ及びケトレダクターゼが挙げられる。好ましい態様において、前記ケトレダクターゼは、ピキア種に由来する。好ましい態様において、NAD依存的ケトレダクターゼは、ピキアメタノリカに由来し、GenebankIDNoAAW069211を有する。他の態様において、前記アルドースレダクターゼは、ピロコッカス種に由来する。そのような態様において、アルドースレダクターゼハ、ピロコッカスフリオススに由来し、GenebankIDNoNP5796891を有する。他の態様において、前記アセトアセチルレダクターゼは、クプリアウィドゥス種に由来する。そのような態様において、アルドースレダクターゼは、クプリアウィドゥスネカトーに由来し、GenebankIDNoAAA219731を有する。他の好ましい態様において、アルドースレダクターゼは、好ましくは2,5ジケトDグルコン酸レダクターゼBであり、エスケリキアコリに由来し、GenebankIDNoYP0029980681を有する。他の好ましい態様において、アルドースレダクターゼは、好ましくは2,5ジケトDグルコン酸レダクターゼAであり、エスケリキアコリに由来し、GenebankIDNoACB040981を有する。一つの態様において、所望の酵素活性を有するポリペプチド又はそれらの変異体をコードする遺伝子は適切なベクターにクローニングされてもよい。、当該ベクターは、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクター、及びシャトルベクターから選択されてもよい。そのようなベクターは、典型的には、調節エレメント、例えばlacUV5プロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、tacプロモーター、lppプロモーター、tufBプロモーター、recAプロモーター、又はpLプロモーター等を有し、そして好ましくは、本発明のポリヌクレオチドと動作可能に連結した発現単位を含む発現ベクターとして採用される。所望の酵素活性を有するポリペプチド又はそれらの変異体をコードする遺伝子は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12及び配列番号13に記載の配列、又はそれらの変異体から選択される。好ましい態様において、オキシドレダクターゼ酵素活性を有するこれらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、SambrooketalMolecularcloningColdSpringHarborLaboratoriesに記載の周知技術に従い、クローニングベクターコンストラクトpET11a又はpET27bにクローニングされる。当該コンストラクトベクターは、以後、pET11aZBG511pET11aZBG641pET11aZBG201pET11aZBG2511pET11aZBG811pET11aZBG1311pET27bZBG511pET27bZBG201pET27bZBG811pET27bZBG209pET27bZBG1311pET27bZBG208pET27bZBG2011pET27bZBG205pET27bZBG1122pET27bZBG112及びpET27bZBG204と称される。加えて、これらのベクターは、更に、NAD、NADP、NADH、NADPH等の補因子を再生産できる酵素をコードする遺伝子を含む。調節エレメントは、本明細書中、機能的プロモーター、及び何らかの転写エレメントを有するヌクレオチド配列を指す。本発明のポリヌクレオチドは、プロモーター及びエンハンサー等の調節エレメントと連結しており、これらの調節エレメントは、当該ポリヌクレオチドの発現を制御出来る。かかる調節エレメントが宿主細胞によって様々であることは、当業者にとって周知である。一つの態様において、本発明は、所望のオキシドレダクターゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の単シストロン性発現コンストラクトを提供する。あるいは、当該ヌクレオチド配列の単シストロン性発現コンストラクトは、反応の過程で酸化したNADから補因子を生産する能力を有するポリペプチドをコードする。そのような態様において、ヌクレオチド配列にコードされるオキシドレダクターゼポリペプチドは、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12及び配列番号13から選択され、NADHNADから選択される補因子と会合して、式の化合物を還元することにより、光学的に純粋な式の化合物、又はそのラセミ体、又はその光学活性体、又はいずれかのフォームの鏡像体過剰混合物を生産する。ここで、当該補因子は、反応媒体中に外的に添加され、又は酵素基質会合再生産系により取得される。一つの態様において、本発明の方法は、所望のオキシドレダクターゼ酵素活性を有するポリペプチド、及び反応の過程で酸化されたNADから補因子を再生産する能力を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の多シストロン性発現コンストラクトを提供する。そのような態様において、本発明で開示されている配列番号1~13から選択されるオキシドレダクターゼポリペプチドの配列は、NADHNADから選択される補因子と会合して、式の4オキソ4356ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル1ブタン2オンを還元することにより、33ヒドロキシ156ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル4ブタン1オンのラセミ体、又はその光学活性体、又はいずれかのフォームの鏡像体過剰混合物を生産する。ここで、当該補因子を再生産する酵素は、同一のベクター中で、オキシドレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と共発現される。一つの態様において、前記ベクターは、本発明で開示される配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12及び配列番号13又はその変異体から選択されるオキシドレダクターゼポリペプチドと、反応の過程で酸化したNADから補因子を再生産する能力を有するポリペプチドとを共発現し、当該ベクターは:a宿主細胞中で前記ベクターの複製及び維持を制御する1つ以上の領域;bオキシドレダクターゼをコードする、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12及び配列番号13のいずれかに記載のヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列又はその変異体と動作可能に連結した第一のプロモーター;c補因子を再生産する機能を有するポリペプチドをコードする配列番号7に記載のヌクレオチド配列又はその変異体と動作可能に連結した第二のプロモーター;d適切な抗生物質マーカー;を含む一つの態様において、前記遺伝子の位置は変化してもよく、更に、上記及びの位置は入れ替わってもよい。一つの態様において、ベクターは、pET11aZBG511pET11aZBG641pET11aZBG201pET11aZBG2511pET11aZBG811pET11aZBG1311pET27bZBG511pET27bZBG201pET27bZBG811pET27bZBG209pET27bZBG1311pET27bZBG208pET27bZBG2011pET27bZBG205pET27bZBG1122pET27bZBG112pET27bZBG204から選択される。本発明において、所望のオキシドレダクターゼ酵素活性を有するポリヌクレオチド又はその変異体を含む単シストロン性又は多シストロン性ベクターは、当該技術分野で周知のように、リン酸カルシウム法を使用してトランスフェクションされる。宿主細胞は、細菌、酵母、カビ、植物細胞、及び動物細胞から選択される。好ましい態様において、宿主細胞は、エスケリキアコリ等の細菌である。そのような態様において、上記所望のポリペプチドは、Eコリ中で過剰発現される。本発明の好ましい態様において、式の化合物、その光学活性体、又はいずれかのフォームの鏡像体過剰混合物を生産する方法が提供され、当該方法は:a適切な溶媒中に式の化合物又はその金属イオン塩を溶解させる工程;b式の化合物又はその金属イオン塩を、適切な条件下、適切な補因子の存在下で、適切なオキシドレダクターゼ酵素と反応させる工程;c任意で反応の過程でpHを維持する工程;d式の化合物の、光学活性体、又はいずれかのフォームの鏡像体過剰混合物を単離する工程;を含む。前記反応に適したオキシドレダクターゼ酵素は、本発明に開示の配列番号に記載の配列と、50以上の類似性同一性を有する。一つの態様において、前記補因子は、反応媒体中に外的に添加される。他の態様において、前記補因子は、酵素会合再生産系により取得される。酵素会合再生産系に使用される酵素は、グルコースデヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、グルコース6リン酸デヒドロゲナーゼ、亜リン酸デヒドロゲナーゼから選択される。1つの好ましい態様において、前記酵素は、グルコースデヒドロゲナーゼである。一つの態様において、オキシドレダクターゼ酵素は、単シストロン性ベクター中で発現される。他の態様において、オキシドレダクターゼ酵素は、単一の発現系中の多シストロン性ベクター中で、グルコースデヒドロゲナーゼと共発現される。好ましい態様において、当該発現系は、細菌、例えばエスケリキアコリである。他の態様において、本発明で開示される、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、及びバイ列番号13に記載のオキシドレダクターゼポリペプチド、又はその変異体は、NADHNADから選択される補因子と会合して、式の化合物を還元することにより、式の化合物の、光学活性体、又はいずれかのフォームの鏡像体過剰混合物を生産する。ここで、前記補因子は、基質会合再生産系により再生産される。基質会合再生産系は、エタノール、2プロパノール、4メチル2ペンタノール、2ヘプタノール、2ペンタノール、2ヘキサノールから選択される補基質を含む。好ましい態様において、基質会合再生産系に使用される補基質は、2プロパノールである。更に、基質会合再生産系は、1つ以上の酵素の作用を必要とする。好ましい態様において、基質会合再生産系は、本発明で開示される配列番号に記載のポリペプチド配列を有する酵素の作用を必要とする。好ましい態様において、本発明で開示される配列番号に記載のポリペプチド配列を有するポリペプチド又はその変異体は、単シストロン性ベクター中で発現する。好ましい態様において、NADH等の還元された補因子は、本発明で開示される配列番号に記載のポリペプチド配列を有する酵素による2プロパノールの脱水素化によるアセトンの生産により再生産される。更に、還元された補因子は、前記酵素と会合して、酸塩基触媒機構により、基質と反応する。故に、このプロセスにおいて、還元された補因子NADHは、同一のオキシドレダクターゼ酵素によるアルコールの脱水素化により、持続的に再生産される。一つの態様において、式の光学的に純粋な化合物、又はその光学活性体、又はいずれかのフォームの鏡像体過剰混合物は、適切な反応条件で、本発明で開示される、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12及び配列番号13に記載の配列、又はその変異体から選択される所望の配列を有するポリペプチドを含有する無細胞系を用いて、式の化合物を還元することにより生産される。当該無細胞系は、本発明で開示される、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12及び配列番号13に記載の配列、又はその変異体から選択される所望の配列を有するオキシドレダクターゼ酵素及びその変異体をコードするポリヌクレオチド配列を有する単シストロン性ベクターを有し、所望の補因子が外的に添加される。あるいは、前記無細胞系は、本発明で開示される、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12及び配列番号13に記載の配列、又はその変異体から選択される所望の配列を有するオキシドレダクターゼ酵素及びその変異体、並びに酸化したNADから補因子を再生産する能力を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む多シストロン性ベクターを含有する、宿主細胞の溶解物から取得される。任意で、前記無細胞抽出物は、凍結乾燥又は噴霧乾燥等の当業者に周知の手段により、凍結乾燥又は乾燥されて、水分が除去されてもよい。このような手段により取得された粉末は、本発明で開示される配列番号に記載のポリペプチド配列を有する1つ以上のオキシドレダクターゼ及びその変異体を含有しており、当該粉末は、式の化合物、又はその金属イオン塩を還元することにより、光学的に純粋な式の化合物、その光学活性体、又はいずれかのフォームの鏡像体過剰混合物を生産するのに使用される。一つの態様において、適切な反応条件下、式の化合物を還元することによる、光学的に純粋な式の化合物、その光学活性体、又はいずれかのフォームの鏡像体過剰混合物の生産は、全細胞生体触媒を用いて行われ、当該触媒は、配列番号1及び14、配列番号2及び15、配列番号3及び16、配列番号4及び17、配列番号5及び18、配列番号6及び19、配列番号8及び21、配列番号9及び22、配列番号10及び23、配列番号11及び24、配列番号12及び25、並びに配列番号13及び26に記載の配列を有する、1つ以上の所望のポリペプチド若しくはポリヌクレオチド、又はそれらの変異体を有し、補因子は、反応の過程で外的に添加されてもよい。好ましい態様において、本発明は、式の化合物、その光学活性体、又はいずれかのフォームの鏡像体過剰混合物を生産する方法を提供し、当該方法は、a適切な溶媒中に式の化合物又はその金属イオン塩を溶解させる工程;b式の化合物又はその金属イオン塩を、オキシドレダクターゼ酵素と、補因子を再生する能力を有するポリペプチドとを共発現する発現ベクターを含有する組換え全細胞と反応させる工程、ここで、当該オキシドレダクターゼ酵素は、本発明で開示される配列番号に記載のポリペプチド配列から選択される配列を有し、又はその変異体である;c反応の過程でpHを維持する工程;d式の化合物、その光学活性体、又はいずれかのフォームの鏡像体過剰混合物を単離する工程;を含む。そのような態様において、前記全細胞は、受入れ番号MTCC5642MTCC5643MTCC5644MTCC5645MTCC5646MTCC5647MTCC5648MTCC5649MTCC5650MTCC5651MTCC5652MTCC5653MTCC5654組み換えEコリであり、当該細胞は、本発明で開示される配列番号に記載の所望のポリペプチド配列を有するポリペプチド又はその変異体、及びNADHの還元型を生産する能力を有するポリペプチドを発現する。尚も他の態様において、光学的に純粋な式の化合物、その光学活性体、又はいずれかのフォームの鏡像体過剰混合物は、適切な反応条件下、式の化合物、又はその金属イオン塩を、単離及び精製された、本発明で開示される配列番号に記載のポリペプチド配列を有する所望のポリペプチド、又は本発明で開示される配列番号に記載のポリペプチド配列と50以上の類似性を有する変異体と反応させることにより取得される。本発明の一つの一般的態様において、式のケトンは、好ましくは、01~30WVの量で使用される。好ましい態様において、前記ケトンの量は、10WVである。本発明の方法は、水溶液系で実施される。そのような態様において、酵素的還元が行われる当該反応混合物の水性部分は、好ましくは、緩衝剤を含有する。そのような緩衝剤の濃度範囲は、50~200mMで、コハク酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸緩衝剤、Tris緩衝剤から選択される。pHは5~9に維持され、反応温度は約15~50°Cに維持される。好ましい態様において、pH値は7~8で、温度範囲は、25~40°Cである。あるいは、前記反応は、有機溶媒と組み合わせられた水性溶媒中で実施されてもよい。そのような溶媒として、中性のpHで緩衝能を有する緩衝剤が挙げられ、リン酸緩衝剤及びTrisHCl緩衝剤から選択される。あるいは、酸及びアルカリの使用により、反応の過程でのpHの変動が所望の範囲内で維持される場合は、緩衝剤は必要ではない。有機溶媒は、nブタノール、イソプロピルアルコール、酢酸エチル、酢酸ブチル、クロロホルム、nヘキサン、エタノール、アセトン、ジメチルスルホキシド、及びアセトニトリル等から選択される。他の態様において、前記反応は、反応の過程でのpHの変動を所望の範囲内で維持するる酸及びアルカリの存在下、緩衝剤なしで実施される。あるいは、当該反応は、エタノール、アセトン、ジメチルスルホキシド及びアセトニトリル等の水混和性溶媒からなる混合溶媒系中で実施され得る。配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12及び配列番号13から選択されるポリペプチド配列を有する所望の酵素活性を有するポリペプチド、又はその変異体は、凍結乾燥され、水に再懸濁された粗溶解物の形態で、5mgmL以上の濃度で使用される。更に、そのような態様において、任意で、NADHの酵素的還元により形成されたNADは、エタノール、2プロパノール、4メチル2ペンタノール、2ヘプタノール、2ペンタノール、2ヘキサノールから選択される補基質の酸化により、再びNADHに変換され得る。更に、補因子NAD又はNADHの濃度は、0001mM~100mMである。一つの好ましい態様において、式の化合物又はその金属イオン塩の還元は、本発明で開示される配列番号のポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド又はその変異体により実施される。他の態様において、式の化合物又はその金属イオン塩の還元は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12及び配列番号13から選択されるポリペプチド配列を有する所望の酵素活性を有するポリペプチド又はその変異体と、グルコースデヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、グルコース6リン酸デヒドロゲナーゼ、亜リン酸デヒドロゲナーゼから選択されるポリペプチドとの組み合わせにより実施される。そのような態様において、前記補因子は、その濃度がケト基質の01~10倍となるように、適切な濃度のグルコースデヒドロゲナーゼの存在下、補基質として使用されるグルコースの酸化により再生される。そのような態様において、前記酵素の濃度は、凍結乾燥され、水に再懸濁された粗溶解物の形態で、5mgmL以上である。本発明において、式の化合物、又はその光学活性体、又はいずれかのフォームの鏡像体過剰混合物を調製する方法は、組み換え宿主細胞、組み換え宿主細胞から取得した無細胞抽出粗溶解物、又は無細胞抽出粗溶解物又は組み換え宿主細胞から単離された所望の酵素を用いた様々な方法により実施出来る。反応が終了して産物が形成された後、当該産物は、当該技術分野で公知の方法で単離される。上記のように取得された又は3ヒドロキシ156ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル4ブタン1オン又はそれらの鏡像体過剰混合物は、シタグリプチン調製用の中間体に適している。3ヒドロキシ156ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル4ブタン1オンは、塩化メタンスルホニルと反応して3156ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル4ブタン1オンに変換され、更にアジ化ナトリウムと反応して3アジド1356ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル4ブタン1オンに変換され、更に、Pdc及び水素化ホウ素ナトリウムを使用して、4オキソ4356ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル1ブタン2アミンに変換され得る。同様に、4オキソ4356ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル1ブタン2アミンは、3ヒドロキシ156ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル4ブタン1オンから取得できる。他の態様において、式の化合物の調製に使用できる、新規な中間体の式の光学活性体及び式の光学活性体、又はそれらの鏡像体過剰混合物が提供される。他の態様において、式の化合物の調製に使用できる、新規な中間体の式の光学活性体及び式の光学活性体、又はそれらの鏡像体過剰混合物が提供される。本発明は、更に、下記実施例により例示される。下記実施例は、本発明を例示することを目的としており、本発明の範囲を限定することを目的としない。実施例1化学的に合成されたオキシドレダクターゼ及び補因子再生産酵素のクローニング及び遺伝子発現解析配列番号1、2、3、4、5及び7に示されたポリペプチド配列から推定されるDNA配列は、Eコリ中での発現にコドンが最適化され、pET11aプラスミドベクター中にクローニングされた。各ケースにおいて、繋ぎ合わされたDNAは、更にコンピーテントEコリ細胞内に形質転換され、当該形質転換混合物を、アンピシリンを含有するLuria寒天プレート上にプレーティングした。陽性クローンは、アンピシリン耐性により上記プレート上で増殖可能であることに基づいて同定が可能であった。当該陽性クローンから取得したプラスミドDNAを、更に制限酵素で消化した。所望の長さの断片を生じる消化されたプラスミドDNA試料を、推定陽性クローンとした。各DNA配列において、そのような推定陽性クローンの1つをヌクレオチド配列解析に供して、化学合成に使用したDNA配列と100の類似性を有することが判明した。これらの配列番号1、2、3、4、5及び7の配列に対応するpET11aクローンはそれぞれ、表1Aに記載したように名づけられた。これらのクローンから単離されたプラスミドDNAは、Ecoli発現宿主であるBL21に形質転換され、アンピシリン含有Luria寒天プレート上にプレーティングされ、そして37°Cで一昼夜インキュベーションされた。各クローンのコロニーを各プレートからピックアップし、これらをアンピシリン含有LuriaBroth中で培養し、培養物からプラスミドDNAを単離し、更に、これらを制限酵素を用いた制限消化解析に供して、クローンが所望のものであることを確認した。また、これらの培養物を、適切な濃度のIPTGを用いた発現誘導に供した。同時にIPTG誘導を行った培養物を溶解し、遠心分離して清澄溶解物を取得し、これをSDSPAGEにかけて、適切なサイズのポリペプチドの発現が誘導されることを確認した。制限酵素断片の確認及び発現解析の後、これらのクローンの新鮮な培養物をグリセロールストックとして調製した。これらのクローンを、以後の生体触媒試験における配列番号1、2、3、4、5及び7の酵素的ポリペプチドの供給源として使用した。より環境負荷の小さい方法を構築するために、都合の良い抗生物質のクラスが選択され、アンピシリンに代えてカナマイシン耐性遺伝子を有するベクターのpET27bにおいて、上記酵素の幾つかのサブクローニングが行われた。pET27bは、抗生物質耐性遺伝子以外は全てpET11aと類似している。要約すると、pET11aクローン由来のプラスミドDNAをクローニング酵素NdeIBamHIで消化して、所望の遺伝子をベクターから切り出した。これらの酵素による消化の後、表1に示す配列番号1、3、5及び7に対応する配列のDNAを、クローニング酵素NdeIBamHIで予め消化したpET27bと繋ぎ合わせた。当該繋ぎ合わされたDNAを更にコンピーテントEコリTop10F’細胞に形質転換し、当該形質転換混合物を、カナマイシンを含有するLuria寒天プレート上にプレーティングした。陽性クローンは、カナマイシン耐性により上記プレート上で増殖可能であること、及びプラスミドDNA試料が上記クローニング酵素により所望の長さの断片を生じることに基づいて同定され、そのようなクローンは推定陽性クローンとして選択された。pET27bの推定陽性クローンの1つが選択され、表1Aに記載のように名づけられた。これらのpET27bクローンから単離されたプラスミドDNAは、Ecoli発現宿主であるBL21に形質転換され、カナマイシン含有Luria寒天プレート上にプレーティングされ、そして37°Cで一昼夜インキュベーションされた。このプレートからピックアップされたコロニーをカナマイシン含有LuriaBroth中で培養し、培養物からプラスミドDNAを単離し、更に、これらを制限酵素を用いた制限消化解析に供して、クローンが所望のものであることを確認した。また、これらの培養物を、適切な濃度のIPTGを用いた発現誘導に供した。同時にIPTG誘導を行った培養物を溶解し、遠心分離して清澄溶解物を取得し、これをSDSPAGEにかけて、適切なサイズのポリペプチドの発現が誘導されることを確認した。制限酵素断片の確認及び発現解析の後、これらのクローンの新鮮な培養物をグリセロールストックとして調製した。これらのクローンを、以後の生体触媒試験における配列番号1、3、5及び7の酵素的ポリペプチドの供給源として使用した。実施例2ゲノムDNA由来のオキシドレダクターゼ酵素のクローニング及び発現解析表1に記載の配列番号6、8、9、10及び13に示されるポリペプチド配列から推定されるSセレウィシアエのDNA配列、並びに配列番号11及び12に示されるポリペプチド配列から推定されるEコリのDNA配列を、表1Bに記載の各プライマーを用いてPCRで増幅した。これらの増幅されたPCR産物を精製し、制限酵素で消化して、所望のPCR産物の生成を確認した。配列番号9、11、12及び13に対応する正しいバンドサイズのPCR産物を、NdeIBamHIクローニング酵素で消化して、同じくNdeIBamHIで消化したベクターpET27bと繋ぎ合わせた。また、配列番号6、8及び10に対応する正しいバンドサイズのPCR産物を、NdeIで消化したブラントベクターpET27bと繋ぎ合わせた。当該繋ぎ合わされたDNAを更にコンピーテントEコリ細胞に形質転換し、当該形質転換混合物を、カナマイシンを含有するLuria寒天プレート上にプレーティングした。陽性クローンは、カナマイシン耐性により上記プレート上で増殖可能であること、及びプラスミドDNA試料が上記クローニング酵素により所望の長さの断片を生じることに基づいて同定され、そのようなクローンは推定陽性クローンとして選択された。配列番号6、8、9、10、11、12、13の推定陽性クローンの1つが選択され、表1Aに記載のように名づけられた。これらのプレートからピックアップされたコロニーをカナマイシン含有LuriaBroth中で培養し、培養物からプラスミドDNAを単離し、更に、これらを制限酵素を用いた制限消化解析に供して、クローンが所望のものであることを確認した。また、これらの培養物を、適切な濃度のIPTGを用いた発現誘導に供した。IPTG誘導を行った培養物を溶解し、遠心分離して清澄溶解物を取得し、これをSDSPAGEにかけて、適切なサイズのポリペプチドの発現が誘導されることを確認した。制限酵素断片の確認及び発現解析の後、これらのクローンの新鮮な培養物をグリセロールストックとして調製した。これらのクローンを、以後の生体触媒試験における配列番号6、8、9、10、11、12、13の酵素的ポリペプチドの供給源として使用した。オキシドレダクターゼ及び補因子再生産酵素の共発現のためのプラスミドpZRC2G2ZBG209c1の構築Eコリでの発現に最適化された配列番号7に示されるポリペプチド配列から推定されるDNA配列が組み込まれたpET27bプラスミドベクターpET27bZBG1311を、pET27bZBG209ベクターから推定されるDNA配列番号6の他のDNA発現カセットのクローニング及び発現に使用した。当該ベクターにおいて、配列番号6及び7の両方のポリペプチドが、単一の宿主系において発現される。T7プロモーター、RBS及びZBG209遺伝子を有する発現コンストラクトは、pET27bZBG209をテンプレートとして、Duetプライマーフォワード1及びリバース1を用いて増幅された。かかるT7プロモーター、RBS及びZBG209遺伝子を有するPCR産物を精製した後、RBS及びZBG209遺伝子は、Bpu1102I制限酵素部位を有するフォワードF2及びリバースR1プライマーを用いて再び増幅された。取得されたPCR産物を、Bpu1102Iで消化し、予めBpu1102Iで消化したpET27bZBG1311と繋ぎ合わせた。当該繋ぎ合わされたDNAを更にコンピーテントEコリTop10F’細胞に形質転換し、当該形質転換混合物を、カナマイシンを含有するLuria寒天プレート上にプレーティングした。陽性クローンは、カナマイシン耐性により上記プレート上で増殖可能であること、及びプラスミドDNA試料が上記クローニング酵素により所望の長さの断片を生じることに基づいて同定され、そのようなクローンの1つは陽性クローンとして選択され、pZRC2G2ZBG209c1と名づけられた。このクローンから単離されたプラスミドDNAは、Eコリ発現宿主BL21に形質転換され、カナマイシン含有Luria寒天プレート上にプレーティングされ、そして37°Cで一昼夜インキュベーションされた。このプレートからピックアップされたコロニーをカナマイシン含有LuriaBroth中で培養し、培養物からプラスミドDNAを単離し、更に、これらを制限酵素を用いた制限消化解析に供して、クローンが所望のものであることを確認した。また、これらの培養物を、適切な濃度のIPTGを用いた発現誘導に供した。同時にIPTG誘導を行った培養物を溶解し、遠心分離して清澄溶解物を取得し、これをSDSPAGEにかけて、適切なサイズのポリペプチドの発現が誘導されることを確認した。制限酵素断片の確認及び発現解析の後、pZRC2G2ZBG209c1BL21として知られるこのクローンの新鮮な培養物をグリセロールストックとして調製した。このクローンpZRC2G2ZBG209c1BL21を、以後の生体触媒試験における配列番号6及び7の酵素的ポリペプチドの供給源として使用した。実施例4撹拌フラスコ条件での酵素の調製実施例1、2及び3で取得した組換え形質転換Eコリクローンを、水1Lあたり10gのペプトン、5gの酵母抽出物、10gのNaClを含有する50mlのLuriaBertani培地中、16時間、37°C、200rpmで撹拌しながら培養した。配列番号13789101112及び13のクローンの培養では75μgmlのカナマイシンが、そして配列番号2、4及び5のクローンの培養では100μgmlのアンピシリンが添加された。これらの培養物は、13789101112及び13のクローンにおいて75μgmlのカナマイシンが、そして配列番号2、4及び5のクローンにおいて100μgmlのアンピシリンが添加された750mlのLB培地への播種に使用された。培養物のOD600が06~08に達したときに2mMのイソプロピルβDチオガラクトピラノシドを用いてタンパク質の発現を誘導し、引き続き16時間、37°C、200rpm撹拌で培養した。15分、7000rpm、4°Cで遠心分離することにより細胞を回収し、上澄みを捨てた。細胞ペレットを冷やした100mMのリン酸カリウム緩衝液に再懸濁し、上記と同様に回収した。洗浄された細胞を、1mgmlのリソザイム、1mMのPMSF及び1mMのEDTAを含有する10容の冷やした100mMKPBに再懸濁し、当該均一な懸濁物を、4°Cに維持しながら、超音波装置による細胞の溶解に供した。清澄な粗溶解上澄を凍結乾燥して、粗凍結乾燥粉末を、更なる酵素反応のために4°C以下で保存した。実施例54オキソ4356ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル1ブタン2オンを還元するオキシドレダクターゼのスクリーニングEコリ中で過剰発現させた実施例1及び2の様々なオキシドレダクターゼ遺伝子が、WO2010032264に記載のように調製されたオキソ4356ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル1ブタン2オンの酵素的還元能力についてスクリーニングされた。スクリーニングにおいて、約240mgの誘導された細胞から取得されたオキシドレダクターゼの粗凍結乾燥粉末が、100mMリン酸カリウム緩衝液、76mMβニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸ナトリウム塩又は9mMβニコチンアミドアデニンジヌクレオチド遊離酸、10mg4オキソ4356ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル1ブタン2オンを含有する反応混合物に添加された。当該均一なスクリーニング反応混合物を、24~48時間、37°C±05°C、200rpmで撹拌してインキュベーションした。反応終了後、反応混合物を等量の酢酸エチルで抽出した。分離した有機槽を回収し、対応する化学合成された3ヒドロキシ1356ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル1ブタン1オンを参照して、薄層クロマトグラフィーで解析した。HPLCにより更に純度を解析し、また、スクリーニングされた粗凍結乾燥酵素により調製された形成されたアルコールの鏡像体選択性を判定するために、下記のキラルHPLC法によりキラル純度を解析した。キラルHPLC解析は、ChiralcelOJ’Hで実施され、5μlの試料が、移動相がnヘキサンであるカラムにロードされ、30°Cで、アルコール中005TFAで溶出された当該カラムは、流速08mLminで50分間稼働した。保持時間で2つのピークが見られ、化学合成されたラセミアルコール3ヒドロキシ1356ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル1ブタン1オンの解析開始後、ピーク1が約310分で、第二のピークが約35.0であった。同一の方法論が、酵素的に調製されたアルコール産物のキラル構造の判定に適用された、その結果を、表2に示す。実施例6発酵槽レベルでの酵素の調製-pET27bZBG209発酵は、グルコース10gL、クエン酸17gL、酵母抽出物10gL、リン酸二水素カリウム133gL、リン酸二水素アンモニウム4gL、硫酸マグネシウム7水和物12gL、微量金属溶液20mlL及び硫酸カナマイシン75mgLを含有する増殖培地10Lを入れた30L発酵槽中で、撹拌及び通気をしながら実施された。遅発指数増殖を示すpET27bZBG209による組換えEコリを発酵槽に播種し、OD600を05に設定した。通気は5~15Lminで行われ、溶存酸素が50~70サチュレーションで維持され、200~1000rpmで撹拌された。培養物のpHは、125水酸化アンモニウム溶液を用いて68±02で維持された。培養物の増殖は、グルコース700gL、酵母抽出物50gL、微量金属20mlL、硫酸マグネシウム7水和物10gLを含有する培養培地のフィード溶液を用いて維持された。タンパク質の発現は、OD600が500±20に達した時点で、DCW1gあたり最終濃度01mMのイソプロピルβDチオガラクトピラノシドを用いて誘導された。発酵は、更に、グルコース200gL酵母抽出物200gL及び硫酸カナマイシン750mgLを含有する生産培地のフィード溶液を用いて、12±2時間続行された。この培養物を10~15°Cまでゆっくり冷やし、6500rpm、30分、4°Cの遠心分離で液体成分を回収した。細胞ペレットは、005Mリン酸カリウム緩衝液で洗浄した後、8000mpm、30分、4°Cで遠心分離して回収された。細胞は、生体触媒的変換に使用されるまで、4°Cで保存され、あるいは50mMKPB緩衝液中20グリセロール等の適切な凍結防止剤を用いて70°Cで保存された。粗凍結乾燥酵素の調製のため、細胞ペレットは、予冷した10容の005Mリン酸カリウム緩衝液に懸濁された。当該均一な単一細胞の調製物を、1000±100psig、4°Cで高圧ホモジナイザーに2回通して、細胞を破壊した。得られたホモジネートを、8000rpm、120分の遠心分離により清澄した。当該清澄な上澄を回収し、凍結乾燥して、粗凍結乾燥粉末を、更なる酵素反応のために4°C以下で保存した。実施例7発酵槽レベルでの酵素の調製pZRC2G2ZBG209C1発酵は、グルコース10gL、クエン酸17gL、酵母抽出物10gL、リン酸二水素カリウム133gL、リン酸二水素アンモニウム4gL、硫酸マグネシウム7水和物12gL、微量金属溶液20mlL及び硫酸カナマイシン75mgLを含有する増殖培地10Lを入れた30L発酵槽中で、撹拌及び通気をしながら実施された。遅発指数増殖を示す所望の遺伝子を有する組換えEコリを発酵槽に播種し、OD600を05に設定した。通気は5~15Lminで行われ、溶存酸素が50~70サチュレーションで維持され、200~1000rpmで撹拌された。通気は5~15Lminで行われ、溶存酸素が50~70サチュレーションで維持され、200~1000rpmで撹拌された。培養物のpHは、125水酸化アンモニウム溶液を用いて68±02で維持された。培養物の増殖は、グルコース700gL、酵母抽出物50gL、微量金属20mlL、硫酸マグネシウム7水和物10gL、硫酸カナマイシン750mgLを含有する培養培地のフィード溶液を用いて維持された。タンパク質の発現は、OD600が500±20に達した時点で、DCW1gあたり最終濃度01mMのイソプロピルβDチオガラクトピラノシドを用いて誘導された。発酵は、更に、グルコース200gL酵母抽出物200gL及び硫酸カナマイシン750mgLを含有する生産培地のフィード溶液を用いて、12±2時間続行された。この培養物を10~15°Cまでゆっくり冷やし、6500rpm、30分、4°Cの遠心分離で液体成分を回収した。細胞ペレットは、005Mリン酸カリウム緩衝液で洗浄した後、8000mpm、30分、4°Cで遠心分離して回収された。細胞は、生体触媒的変換に使用されるまで、4°Cで保存され、あるいは50mMKPB緩衝液中20グリセロール等の適切な凍結防止剤を用いて70°Cで保存された。粗凍結乾燥酵素の調製のため、細胞ペレットは、予冷した10容の005Mリン酸カリウム緩衝液に懸濁された。当該均一な単一細胞の調製物を、1000±100psig、4°Cで高圧ホモジナイザーに2回通して、細胞を破壊した。得られたホモジネートを、8000rpm、120分の遠心分離により清澄した。当該清澄な上澄を回収し、凍結乾燥して、得られた粗凍結乾燥粉末を、更なる酵素反応のために4°C以下で保存した。実施例8オキシドレダクターゼ及びグルコースデヒドロゲナーゼの酵素活性実施例2及び3で取得されたpET27bZBG209及びpZRC2G2ZBG209C1の清澄粗溶解物のオキシドレダクターゼ活性は、340nm、25°Cで、NADH依存的アッセイにおいて、分光光度法によりアッセイされた。標準アッセイ混合物は、100mMKPB、01mMNADH、及び25mM4オキソ4356ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル1ブタン2オンからなる。当該混合物1mlにオキシドレダクターゼの粗溶解物100μlを添加して、10分間反応をモニタリングした。酵素1ユニットは、1分間で1μモルのNADHを生産するのに必要な酵素の量として定義された。pET27bZBG209の無細胞抽出物の酵素活性は015Umlと判定され、pZRC2G2ZBG209C1は009Umlと判定された。実施例1で取得された清澄粗溶解物のグルコースデヒドロゲナーゼ活性は、340nm、25°Cで、NADH依存的アッセイにおいて、分光光度法によりアッセイされた。準アッセイ混合物は、100mMKPB、2mMNAD、及び01Mグルコースからなる。当該混合物1mlに適切に希釈した粗溶解物100μlを添加して、10分間反応をモニタリングした。酵素1ユニットは、1分間で1μモルのNADHを酸化するのに必要な酵素の量として定義された。pET27bZBG1311の無細胞抽出物の酵素活性は47Umlと判定され、pZRC2G2ZBG209C1は450Umlと判定された。実施例9酵素会合補因子再生系においてオキシドレダクターゼを使用した、4オキソ4356ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル1ブタン2オンナトリウム塩からの4オキソ4356ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル1ブタン2オンの合成温度計、流入口、pHセンサー及びオーバーヘッドスターラーを取り付けた250mlの丸底フラスコに、100mlの水に溶解したグルコース628g及びβニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸二ナトリウム塩を充填した。実施例4のグルコースデヒドロゲナーゼ凍結乾燥粉末を当該反応混合物に添加し、懸濁物を得た。50mlの水に懸濁した実施例6に記載のように調製された細胞50gを当該反応混合物に添加し、均一な調製物を撹拌条件下、25~30°Cでインキュベートした。10gの基質、即ち4オキソ4356ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル1ブタン2オンのナトリウム塩はWO2010032264に記載のように調製され、部分的に添加された。当該反応はpH駆動的であり、当該基質は本質的に塩基性であるから、当該反応混合物への基質の添加は、制御され、NaOHの存在下、3~4時間にわたり、段階的に行われ、当該反応混合物の総量は200mlになる。当該反応の進行は、TLCで観察された。25~30時間にかけて、徐々に基質が消滅し、生産物のスポットが見られるようになった。反応混合物は、等量の酢酸エチルで2回抽出され、当該溶媒を蒸発させて、所望の生産物が60の収率で取得された。前記生産物は、更にHPLC解析にかけられて対応するアルコールがHPLC純度90を示し、続いてキラルHPLC解析では、単一の鏡像異性体が99の鏡像体過剰を示した。キラルHPLC解析でP1として生じた、当該酵素的に合成されたアルコールのキラル構造は、下記実施例19で示した検討に基づいて、であることが判明した。実施例10オキシドレダクターゼ及びグルコースデヒドロゲナーゼを共発現する全細胞触媒の粗溶解物を使用した、4オキソ4356ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル1ブタン2オンナトリウム塩からの3ヒドロキシ1356ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル1ブタン1オンの合成温度計、流入口、pHセンサー及びオーバーヘッドスターラーを取り付けた1000mlの丸底フラスコに、50mlの水に溶解したグルコース628g及びβニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸二ナトリウム塩を充填した。実施例7に記載のように調製された細胞50gを水500mlに懸濁して、細胞溶解に供し、そして得られた清澄無細胞抽出物を、前記反応混合物中に添加した。当該均一な反応調製物を25~30°C、撹拌条件下でインキュベートした。グルコースデヒドロゲナーゼ凍結乾燥粉末を当該反応混合物に添加し、懸濁物を得た。50mlの水に懸濁した実施例6に記載のように調製された細胞50gを当該反応混合物に添加し、均一な調製物を撹拌条件下、25~30°Cでインキュベートした。10gの4オキソ4356ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル1ブタン2オンのナトリウム塩はWO2010032264に記載のように調製され、部分的に前記反応混合物に添加され、上記実施例9に記載したように、pHが70~80に維持された。当該反応の進行は、TLCで観察された。25~30時間にかけて、基質材料はほとんど消滅し、生産物のスポットが見られるようになった。反応混合物は、等量の酢酸エチルで2回抽出され、当該溶媒を蒸発させて、所望の生産物が72の収率で取得された。前記生産物は、更にHPLC解析にかけられて対応するアルコールがHPLC純度90を示し、続いてキラルHPLC解析では、単一の鏡像異性体が99の鏡像体過剰を示した。キラルHPLC解析でP1として生じた、当該酵素的に合成されたアルコールのキラル構造は、下記実施例19で示した検討に基づいて、であることが判明した。実施例11オキシドレダクターゼ及びグルコースデヒドロゲナーゼを共発現する全細胞触媒の粗溶解物を使用した、4オキソ4356ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル1ブタン2オンナトリウム塩からの3ヒドロキシ1356ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル1ブタン1オンの、大スケールでの合成温度計、流入口、pHセンサー及びオーバーヘッドスターラーを取り付けた1000mlの丸底フラスコに、100mlの水に溶解したグルコース及びβニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸二ナトリウム塩を充填した。水250mlに懸濁した、実施例7に記載のように調製された細胞250gを水250mlを当該反応混合物に添加し、続いてトルエン125mlを添加した。当該均一な反応調製物を25~30°C、撹拌条件下でインキュベートした。25gの4オキソ4356ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル1ブタン2オンのナトリウム塩はWO2010032264に記載のように調製され、部分的に前記反応混合物に添加され、上記実施例9に記載したように、pHが70~80に維持された。当該反応の進行は、TLCで観察された。25~30時間にかけて、出発材料はほとんど消滅し、生産物のスポットが見られるようになった。反応混合物は、等量の酢酸エチルで2回抽出され、当該溶媒を蒸発させて、所望の生産物が72の収率で取得された。当該酵素的に調製されたアルコール産物は、融点、比旋光度、赤外線スペクトル及び核磁気共鳴分光及びESIMS等、様々な公知のツールにより解析された。それらの結果を以下に示す。SORαD25232oIR346816261519ESIMS4091HNMRδ24524926527838939940140942142248650573874713CNMRδ3543743834014144224304376731054114511711195123014231444146514881510154615691702前記生産物は、更にHPLC解析にかけられて対応するアルコールがHPLC純度961を示し、続いてキラルHPLC解析では、単一の鏡像異性体が997のキラル純度を示した。キラルHPLC解析でP1として生じた、当該酵素的に合成されたアルコールのキラル構造は、下記実施例19で示した検討に基づいて、であることが判明した。実施例123156ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル4ブタン1オンの化学的調製乾燥した25ml丸底フラスコに、3ヒドロキシ156ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル4ブタン1オン及びジクロロメタンを25~30°Cで充填し、そして当該反応混合物は0~5°Cに冷却された。続いて、NNジイソプロピルエチルアミンを、0~5°Cで、当該反応混合物に徐々に添加した。その後、ジクロロメタンに溶解した塩化メタンスルホニルを0~5°Cで徐々に添加し、当該反応混合物を、0~5°Cで15時間撹拌した。再びジクロロメタンに溶解した塩化メタンスルホニルを0~5°Cで徐々に添加し、当該反応混合物を、0~5°Cで10時間撹拌した。反応混合物はジクロロメタンで希釈され、分液漏斗に移された。当該反応混合物を、希塩酸、飽和重炭酸ナトリウム、水及びブラインで洗浄した。有機層が回収され、無水硫酸ナトリウムで脱水された。溶媒が減圧下で蒸発されて、標記化合物が取得された。実施例133156ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル4ブタン1オンの化学的調製乾燥した100ml丸底フラスコに、3ヒドロキシ156ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル4ブタン1オン及びジクロロメタンを25~30°Cで充填し、そして当該反応混合物は0~5°Cに冷却された。続いて、NNジイソプロピルエチルアミンを、0~5°Cで、当該反応混合物に徐々に添加した。その後、ジクロロメタンに溶解した塩化メタンスルホニルを0~5°Cで徐々に添加し、当該反応混合物を、0~5°Cで15時間撹拌した。再びNNジイソプロピルエチルアミン及びジクロロメタンに溶解した塩化メタンスルホニルを0~5°Cで添加し、当該反応混合物を、0~5°Cで10時間撹拌した。反応混合物はジクロロメタンで希釈され、分液漏斗に移された。当該反応混合物を、希塩酸、飽和重炭酸ナトリウム、水及びブラインで洗浄した。有機層が回収され、無水硫酸ナトリウムで脱水された。溶媒が減圧下で蒸発されて、標記化合物が取得された。1HNMRδ282313395396406415419424488493498503516521744755IR304316581525ESIMS487SORαD25115o実施例143アジド1356ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル4ブタン1オンの化学的調製25ml丸底フラスコに、3156ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル4ブタン1オン及びジメチルホルムアミドを充填した。続いて、当該反応混合物に、25~30°Cでアジ化ナトリウムを添加し、そして当該反応混合物を、40~42°Cで2時間撹拌した。3時間後、アジ化ナトリウムを添加し、当該反応混合物を、更に3時間、40~42°Cで撹拌した。続いて、当該反応混合物を、25~30°Cまで冷却した。当該反応混合物に再びアジ化ナトリウムを添加し、14時間25~30°Cで撹拌した。反応混合物を冷水に浸した。これを酢酸エチルで抽出した。有機層を水及びブライン溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水した。溶媒を減圧下で蒸発させ、標記化合物を取得した。3アジド1356ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル4ブタン1オンの化学的調製100ml丸底フラスコに、3156ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル4ブタン1オン及びジメチルホルムアミドを充填した。続いて、当該反応混合物に、25~30°Cでアジ化ナトリウムを添加し、そして当該反応混合物を、40~42°Cに加熱して2時間撹拌した。3時間後、アジ化ナトリウムを添加し、当該反応混合物を、更に3時間、40~42°Cで撹拌した。続いて、当該反応混合物を、25~30°Cまで冷却した。当該反応混合物に再びアジ化ナトリウムを添加し、14時間25~30°Cで撹拌した。反応混合物を冷水に浸した。これを酢酸エチルで抽出した。有機層を水及びブライン溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水した。溶媒を減圧下で蒸発させ、標記化合物を取得した。実施例16純粋な3アジド1356ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル4ブタン1オンの化学的調製粗3アジド1356ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル4ブタン1オンを、シリカゲルのカラムクロマトグラフィーにより精製し、溶出液としてDIPEEAを使用した。1HNMRδ261270282294398426495510693697710716IR212116641521ESIMS434SORαD2533o実施例174オキソ4356ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル1ブタン2アミンの化学的調製25mlの丸底フラスコに、3アジド1356ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル4ブタン1オン、メタノール及び5PdCを取った。当該反応混合物を0~5°Cに冷却した後、NaBH4を添加した。当該反応混合物を25~30°Cまで加熱して、25~30°Cで4~6時間撹拌した。当該反応混合物に、水及びハイフロスーパーセルを添加した。これを濾過し、メタノールで洗浄した。濾液を50mlの一首丸底フラスコに取った。溶媒を減圧下で蒸発させた。残留物を酢酸エチルに溶解させ、水及びブライン溶液で洗浄した。有機層を回収し、無水硫酸ナトリウムで脱水した。溶媒を減圧下で蒸発させて、粗4オキソ4356ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル1ブタン2アミンを取得した。通常のクロマトグラフィー精製を行い、純粋な産物を取得した。実施例184オキソ4356ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル1ブタン2アミンの化学的調製25mlの丸底フラスコに、3アジド1356ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル4ブタン1オン、メタノール及び5PdCを取った。当該反応混合物を0~5°Cに冷却した後、NaBH4を添加した。当該反応混合物を25~30°Cまで加熱して、25~30°Cで42時間撹拌した。当該反応混合物に、水、メタノール及びハイフロスーパーセルを添加し、5~10分間撹拌した。これを濾過し、メタノールで洗浄した。濾液を100mlの一首丸底フラスコに取った。溶媒を減圧下で蒸発させて、粗4オキソ4356ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル1ブタン2アミンを取得した。通常の酸塩基精製を行い、純粋な産物を取得した。1HNMRδ258280282295364369370398407422488506688694710716IR16491518ESIMS408実施例19化合物のキラル構造の判定アミン化合物のキラル構造は、4オキソ4356ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル1ブタン2アミンのラセミ体及びその異性体シタグリプチンとして知られる市販の薬物のキラルHPLC解析により同定された。実施例17及び18において取得された産物のRTは、キラルHPLC解析におけるシタグリプチンの公知の異性体のRTと一致した。従って、上記実施例の最終アミン産物は異性体であることが判明した。4オキソ4356ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル1ブタン2アミンの調製は、古典的な化学原則に基づく、有機合成の分野で周知の変換ステップによっても説明出来る。実施例17及び18において、4オキソ4356ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル1ブタン2アミンの異性体は、古典的な化学で周知である構造の保持を伴う還元反応を経て、3アジド1356ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル1ブタン2オンから取得された。従って、保持化学の使用は、実施例14、15及び16で生産された化合物が構造に基づくことを保証する。同様に、実施例14、15及び16において、3アジド1356ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル1ブタン2オンは、3156ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル4ブタン1オンから、古典的な化学において周知である、キラル中心における構造の反転を伴う求核置換反応により調製された。従って、反転化学は、実施例12及び13で生産された化合物が構造に基づくことを保証する。最後に、実施例12及び13において、3156ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル4ブタン1オンは、3ヒドロキシ1356ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル1ブタン1オンから、古典的な化学で周知であるキラル中心上の構造の保持により取得された。従って、保持化学は、実施例9、10及び11で生産された化合物が構造に基づくことを保証する。この構造は、実施例5においても、ピーク1として記載されている。故に、実施例5のP1は、キラルアルコールの構造、3ヒドロキシ1356ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル1ブタン1オンを表していると結論付けられる。同様に、実施例19で議論されていた、ラセミキラルアルコールの3ヒドロキシ1356ジヒドロ124トリアゾロ43aピラジン7イル1ブタン1オンのキラル解析におけるもう一つのピークであるピーク2は、当該キラルアルコールの構造を表していると結論付けられる。"