"支持体に固定化されたa.少なくとも1つのメガリンポリペプチド、およびb.少なくとも1つのキュビリンポリペプチド、を含む分離媒体。支持体に固定化された少なくとも1つのメガリンポリペプチドを含む分離媒体。支持体に固定化された少なくとも1つのキュビリンポリペプチドを含む分離媒体。請求項1乃至2のいずれか1項に記載の分離媒体において、前記メガリンポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11および配列番号12と、それらと少なくとも80、たとえば少なくとも85、たとえば少なくとも90、たとえば少なくとも95の同一性を有するアミノ酸配列とからなる群から選択されることを特徴とする分離媒体。請求項1、3および4のいずれか1項に記載の分離媒体において、前記キュビリンポリペプチドは、存在する場合、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19および配列番号20と、それらと少なくとも80、たとえば少なくとも85、たとえば少なくとも90、たとえば少なくとも95の同一性を有するアミノ酸配列とからなる群から選択されることを特徴とする分離媒体。請求項1乃至5のいずれか1項に記載の分離媒体を含む、複雑な生物学的液体を体外処理するための医療装置。請求項6に記載の医療装置において、前記複雑な生物学的液体は血液であることを特徴とする医療装置。請求項6乃至7のいずれか1項に記載の医療装置において、前記複雑な生物学的液体は低分子量タンパク質を含むことを特徴とする医療装置。請求項8に記載の医療装置において、前記低分子量タンパク質はペプチドホルモン、酵素、免疫グロブリン軽鎖、ミオグロブリンおよびビタミン結合タンパク質からなる群から選択されることを特徴とする医療装置。請求項6乃至9のいずれか1項に記載の医療装置において、前記装置はサイズフィルターを含むことを特徴とする医療装置。請求項6乃至10のいずれか1項に記載の医療装置において、前記装置は電荷フィルターを含むことを特徴とする医療装置。請求項6乃至11のいずれか1項に記載の医療装置を含む、複雑な生物学的液体を体外処理するための透析装置。複雑な生物学的液体から低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体を体外に除去する方法において、aメガリンおよび/またはキュビリンに対して結合親和性を有する、低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体を含む複雑な生物学的液体のサンプルを用意するステップと、b前記低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体が前記少なくとも1つのメガリンポリペプチドおよび/または前記少なくとも1つのキュビリンポリペプチドに結合できる条件下で、前記サンプルを請求項1乃至5のいずれか1項に記載の分離媒体、または請求項6乃至12のいずれか1項に記載の装置と接触させるステップと、c前記支持体から前記サンプルを分離して、前記サンプル中に最初に存在していた前記低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体の総量の少なくとも一部が前記支持体上に保持されるようにするステップと、d量が減少した前記低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体を含む前記サンプルを回収するステップと、を含むことを特徴とする方法。請求項13に記載の方法において、前記サンプルにサイズ分離濾過ステップが施されることをさらに含み、それによりステップbを実施する前に高分子量成分が前記サンプルから除去されることを特徴とする方法。請求項13乃至14のいずれか1項に記載の方法において、前記サンプルに電荷濾過ステップが施されることをさらに含み、それによりステップbを実施する前にpIが8以下の成分が前記サンプルから除去されることを特徴とする方法。請求項13乃至15のいずれか1項に記載の方法において、前記保持された低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体が溶出されるステップeをさらに含むことを特徴とする方法。低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体により引き起こされた、または悪化した状態に罹患している哺乳動物の被検体を処置するための方法においてa前記被検体から血液を抽出するステップと、b請求項13乃至16のいずれか1項に記載の方法を用いて、前記抽出された血液から低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体を除去して、前記血液中に最初に存在していた前記低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体の総量の少なくとも一部が前記支持体上に保持されるようにするステップと、c量が減少した前記低分子量タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体を含む前記血液を前記被検体に再導入するステップと、を含むことを特徴とする方法。血液透析、血液濾過および/または血液透析濾過のための、請求項6乃至12のいずれか1項に記載の医療または透析装置の使用。以下の非限定的な実施例1~10では、複雑な生物学的液体から少なくとも1つの低分子量タンパク質を除去するための、メガリンポリペプチドおよびキュビリンポリペプチドの使用の原理を示す。さらに、非限定的な実施例11~13は、ある種の環境において複雑な生物学的液体から少なくとも1つの低分子量タンパク質を除去する場合、メガリンポリペプチドは、満足のいく結果を得るのに十分であることを示す。実施例1メガリンおよびキュビリンのcDNAの作製AndersenCBetal,2010,Nature464:445-448に記載された手順に従った。手短に言えば、製造者の指示通りAllPrep登録商標DNA/RNA/ProteinMiniKitQiagenを用いて、ヒト腎皮質3個体の腎生検標本から全RNAを抽出した。mRNAは、Oligotex登録商標キットQiagenを用いて単離した。cDNAを得るため、表1および2に示したプライマーを用いQiagenReverseTranscriptionKitを使用してRACEを行い、表記のメガリンポリペプチドおよびキュビリンポリペプチドその全アミノ酸配列を添付の配列表に示すと、表記の制限酵素の切断部位とをコードするDNAを作製した。品質を保証するため1ホルムアルデヒドゲルおよび1μgのmRNAを用いて100Vで1時間ノーザンブロッティングを行い、西洋わさびペルオキシダーゼ標識リボプローブで可視化して品質を点検した図1。実施例2大腸菌E.coliを用いたGST結合メガリンポリペプチドおよびキュビリンポリペプチドの発現実施例1に記載されているように作製されたcDNA産物をpGEX-4T-3ベクターGEHealthcareにライゲートし、エレクトロポレーションを用いてエシェリキアコリEscherichiacoli株DH5αNewEnglandBiolabsInc.に形質転換した。cDNA産物の再利用をDNAGelExtractionKitPromegaにより行った。形質転換細胞は、100mg/mlのアンピシリンを含むLB寒天プレートに蒔き、37°Cで一晩インキュベーションを行うことにより同定した。単一コロニーを3mlのLB-アンピシリン培地に接種し、オービタルシェーカーにて250rpmで一定の振盪を行いながら、37°Cにて一晩増殖させた。次いで、培養液を1:100で200mlの新鮮なLB-アンピシリン100mg/ml培地に希釈し、250rpmで一定の振盪を行いながら、OD600がほぼ0.5になるまで2~3時間37°Cでインキュベートした。次いでIPTGを0.5mMの最終濃度になるように培養液に添加してタンパク質を誘導し、250rpmで一定の振盪を行いながら培養液を15°Cで一晩再びインキュベートした。翌日、培養液を6000g、4°Cで10分間遠心して細胞ペレットを形成させた。さらに4°Cでペレットを10mlの冷やした溶解緩衝液に再懸濁し、氷上で超音波処理し30振幅、5回の10秒バースト、各バースト間に30秒の冷却間隔、タンパク質の遊離をBradford反応によりモニターした10μlの画分90μlの水1mlのBradford試薬Pierce;590nmおよび450nmで吸光度を測定し、それらの間の比率を使用してタンパク質濃度を算出した。ライセートを20000g、4°Cで30分間遠心分離により清澄にし、その後上清をアリコートに分割し、氷上で保存した。品質管理のため、IllustraPlasmidPrepMiniSpinGEHealthcareにより、製造者の指示に従い組換えプラスミドを抽出し、表記のポリペプチドの表1に示す制限酵素を用いて切断し、キットに用意されたゲルを用いて評価した。発現したコンストラクトの精製を、Hodnelandetal,2002,ProcNatlAcadSciUSA,9121:9725-9に記載されているようにグルタチオンS-トランスフェラーゼGSTアフィニティークロマトグラフィーにより行った。簡単に説明すると、2mlのグルタチオン-セファロースSigma樹脂をガラスカラム中で細胞ライセートおよび0.25MのNaCl1mlと混合し、穏やかに1時間撹拌した。洗浄は、3カラム体積、各回15mlの洗浄用緩衝液20mMのトリス、pH7.50.25MのNaCl2mMのEDTA2mMのEGTA0.03Brij-35Sigmaを用いて行った。次いで、pH8.0になるように20mMのグルタチオンSigmaおよびNaOHを加えて予め混合した洗浄用緩衝液を用いてタンパク質の溶出を行った。各溶出後、Bradford反応を用いてタンパク質の収量を調べた。次に純粋なタンパク質典型的な収量:MEG1で9~12mg/l培養液、およびCUB5-8で18~21mg/l培養液をPBSで溶出し、4°C、3000gでVivaSpin20SartoriusStedimBiotech限外濾過スピンカラムを用いて濃縮し、最後に-80°Cで保存した。得られた産物のウエスタンブロットのゲルの代表的なサンプルを図2に示す。実施例3大腸菌E.coliを用いたビオチン結合メガリンポリペプチドおよびキュビリンポリペプチドの発現以前に記載されているようにシステイン-ビオチンを合成したLiuetal,2008,MolBiotechnol.392:141-53。簡単に説明すると、2.6mmolのN-t-Boc-S-トリチル-L-システイン、3.1mmolのテトラメチル-O-ベンゾトリアゾール-1-イルウロニウムテトラフルオロボレートTBTUおよび3.9mmolの1-ヒドロキシベンゾトリアゾールを50mlの乾燥ジメチルホルムアミドDMFに加えた。この混合物を室温で20分間撹拌した。次に、7.8mmolのN-メチルモルホリンおよび2.6mmolのビオチニルエチレンジアミンPromegaを加えた。穏やかに撹拌しながら反応を3時間継続させ、その後オイルポンプを備えたロータリーエバポレーターを用いて、溶媒を真空蒸発させた。この粗反応混合物を200mlのジクロロメタンDCMに溶解させ、有機層を水で抽出し3×100ml、次いで無水MgSO425gを加えて周期的に撹拌しながら5分間乾燥させた。得られた溶液180mlを清浄なフラスコにデカントし、エバポレーターを用いて真空濃縮した。システイン-ビオチンの精製は、ガラスカラムに充填したシリカゲルシリカゲル200gを用いたフラッシュクロマトグラフィー4~8v/vのMeOHを含むDCM溶液により行った。実施例1に記載されているように作製されたcDNA産物1バッチ当たり1つのプライマー対をpMD-18-TXベクターPromegaにライゲートし、エレクトロポレーションを用いてエシェリキアコリEscherichiacoli株ER2566に形質転換した。形質転換細胞は、100mg/mlのアンピシリンを含むLB寒天プレートに蒔き、37°Cで一晩インキュベートした。単一コロニーを3mlのLB-アンピシリン培地に接種し、オービタルシェーカーにて250rpmで一定の振盪を行いながら、37°Cにて一晩増殖させた。次いで、培養液を1:100で200mlの新鮮なLB-アンピシリン100mg/ml培地に希釈し、250rpmで一定の振盪を行いながら、OD600がほぼ0.5になるまで2~3時間37°Cでインキュベートした。次いで0.5mMの最終濃度になるように培養液に添加したイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシドIPTGによりタンパク質を誘導し、250rpmで一定の振盪を行いながら培養液を15°Cで一晩再びインキュベートした。翌日、培養液を6000g、4°Cで10分間遠心して細胞ペレットを形成させた。さらに4°Cでペレットを10mlの冷やした溶解緩衝液に再懸濁し、氷上で超音波処理し30振幅、5回の10秒バースト、各バースト間に30秒の冷却間隔、タンパク質の遊離をBradfordタンパク質アッセイによりモニターした。ライセートを20000g、4°Cで30分間遠心分離により清澄にし、その後上清をアリコートに分割し、氷上で保存した。カラム中に培養液1リットル当たり20mlのキチンビーズを用い0.5~1ml/分の流量でHPLCクロマトグラフィーによりタンパク質を単離し、30mMの2-メルカプトエタンスルホン酸Sigmaおよび1mMのシステイン-ビオチンを用いてカラムでビオチン化した。最後に、ビオチン化タンパク質を10mlのPBSで溶出し、-80°Cで保存した。実施例4HEK293細胞を用いた全長His10タグ付きメガリンおよびキュビリンの発現ベクターpcDNA商標4/HisMaxA,B,Cと共にInvitrogen登録商標FreeStyle商標MAX293ExpressionSystemカタログ番号K9000-10を用いて発現を行い、N末端にHis10-タグを付加したCMVプロモーターの制御下で組換えタンパク質を発現させた。表2に示すプライマーを用いて実施例1に従いcDNAを得た。実験の開始前に、細胞を少なくとも5回継代して樹立した。実験には初期継代細胞を使用した10継代未満。1×106~3×106生細胞/mlの細胞密度になった時点で一般に48~72時間毎に培養液を分割した。トリパンブルー排除を用いて細胞生存率を判定した下記を参照。FreeStyle商標293ExpressionMediumを記載されているように使用した。懸濁したFreeStyle商標293-F細胞のトランスフェクションでは、キットに含まれていたカチオン性脂質ベースのFreeStyle商標MAX試薬を導入した。陽性対照pCMVSPORT-βgalをトランスフェクションおよび発現の陽性対照ベクターとして用意した。30ml量の懸濁液のFreeStyle商標293-F細胞にトランスフェクトするため、37.5μgのプラスミドDNAを加えた。トランスフェクションのほぼ24時間前、FreeStyle商標293-F細胞を6~7×105細胞/mlで継代した。フラスコをオービタルシェーカーのプラットフォーム上に置き、135rpm、37°C、8CO2で回転させた。トランスフェクションの当日、細胞密度を調べ、1.2×106細胞/ml未満を含むコロニーを捨てた。次に、細胞を1×106細胞/mlに希釈した。次いで125mlの振盪フラスコにそれぞれ30mlの細胞を加えた。次いでFreeStyle商標MAXTransfectionReagentのチューブを数回反転させ、全量0.6mlとなるように37.5μgのプラスミドDNAを含む、キットに用意されたOptiPro商標SFMInvitrogenで希釈した。別のチューブで、37.5μlのFreeStyle商標MAX試薬を含むOptiPro商標SFMを全量0.6mlになるように希釈し、揺動により穏やかに混合した。混合物を室温で10分間穏やかにインキュベートして複合体を形成させた。次いで、細胞を含む125mlのフラスコにそれぞれ1.2mlのDNA-脂質混合物を加えた。次に、トランスフェクトした細胞培養液をオービタルシェーカープラットフォーム上で37°C、8CO2にてインキュベートし、135rpmで5日間回転させた。タンパク質発現は、トランスフェクションから4~8時間以内で検出可能であり、タンパク質の収率は、発現したコンストラクトによってトランスフェクションから2~7日後に最大となった。発現したコンストラクトの精製は、SmithTetal2000,ArchBiochemBiophys3751:195-200に記載されているようにNi-親和性およびイオン交換FPLCクロマトグラフィーにより行った。次に純粋なタンパク質を緩衝液で溶出し、4°C、3000gでVivaSpin20SartoriusStedimBiotech限外濾過スピンカラムを用いて濃縮し、最後に-80°Cで保存した。発現タンパク質は、遅延引き出しおよびリフレクターを備えたBrukerBiflexIII機器BrukerDaltonicsを用いてマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型MALDI-TOF質量分析法MSにより解析した。ペプチドのスペクトルは、トリプシン自己消化ペプチド内部標準を使用して校正した。タンパク質を同定するため、ProFound検索エンジンを用いてNCBInr配列データベースの検索を行った。1つのミスカット、アルキル化、およびメチオニンの部分酸化を許容した。同定の重要性は、確率値であるZ値、およびシーケンスカバー率により評価した。ペプチドの予想m/zはすべて、質量スペクトルの主要なピークとして出現した。実施例5GSTを用いた、MEG1およびCUB5-8のビーズへの末端結合実施例2に記載されているように発現させたMEG1およびCUB5-8を、HodnelandCDetal,上掲に記載されているようにグルタチオン-Sephadex登録商標ビーズに結合させた。簡単に説明すると、2mgのグルタチオン-SephadexSigmaを、ガラスカラム中で20μgの精製されたMEG1、20μgのCUB5-8および2mlの0.25MのNaClと混合し、穏やかに1時間撹拌した。洗浄は、緩衝液20mMのトリス、pH7.50.25MのNaCl2mMのEDTA2mMのEGTA0.03Brij-35Sigmaで行った。成功した結合の検出は、最初にカラムをPBSで5回合計5カラム体積洗浄し、次いで1mgのビーズを0.5mlの洗浄用緩衝液20mMのトリス0.25MのNaCl2mMのEDTA2mMのEGTA0.03Brij-3520mMのグルタチオンおよびNaOHとpH8.0まで混合し、上清のウエスタンブロット解析を行い、MEG1およびCUB5-8を検出することにより行った。実施例6ビオチン-アビジン結合を用いた、MEG3およびCUB1-7のビーズへの末端結合ビオチン化タンパク質を実施例3に記載されているように合成した。結合には、製造者の指示に従いDynabeads登録商標MyOne商標ストレプトアビジンC1Invitrogenを使用した。簡単に説明すると、PBSに再懸濁し、3回洗浄した後、ビーズ1mgに対して10μgの精製されたMEG3タンパク質および10μgの精製されたCUB1-7タンパク質を加えた。混合液を穏やかに回転させながら室温で30分間インキュベートした。コーティングされたビーズを磁石を使用して分離し、次いでPBSで6回洗浄し、これに0.1BSAおよび0.01Tween-20を加えた。カラムは、使用時まで湿保存した。成功した結合の検出は、最初にカラムをPBSで15回合計15カラム体積洗浄し、次いで1mgのビーズを10mlの1,8mg/mlのEDTApH8.2および95ホルムアミドと混合することにより行った。室温で4時間穏やかに撹拌した後、上清のウエスタンブロット解析を行い、MEG3およびCUB1-7を検出した。実施例7His10-tagを用いた、全長メガリンおよびキュビリンのビーズへの末端結合ニッケル-ニトリロ三酢酸Ni-NTAアガロースビーズQiagenを、5mMのCaCl2および1mMのMgCl2を含むトリス-緩衝食塩水TBS25mMのトリス-HCl、137mMのNaClおよび3mMのKCl、pH7.0で平衡化し、実施例4に記載されているように発現させて同じ緩衝液で調製した10μgの組換えHisタグ付きメガリンタンパク質およびキュビリンタンパク質を室温で1時間インキュベートした。結合が飽和するまで残った上清中の過剰なタンパク質を検出して判定さらにタンパク質を加えた。1mlのニッケルアガロースビーズでは、約12μgのキュビリンおよびメガリンがそれぞれ結合した。次いで、タンパク質コーティングされたビーズを1mlのTBS20mMのイミダゾールで4回それぞれ5分間洗浄し、TBSに50スラリーとして懸濁した。成功した結合の検出は、最初にカラムを15回合計15カラム体積洗浄し、次いで1mgのビーズを150mMのイミダゾール1mlと混合し、室温で5分間穏やかに振盪することにより行った。次いで上清をウエスタンブロットにより解析して結合したメガリンおよびキュビリンを検出した。実施例8メガリンポリペプチドおよびキュビリンポリペプチドでコーティングされたビーズを用いた、循環血中のペプチドホルモンの結合実施例2に記載されているように作製されたGSTとMEG1およびCUB5-8、またはMEG3およびCUB1-7との融合タンパク質を、実施例5に記載されているようにグルタチオンSepharose登録商標4Bビーズ上にタンパク質のモル比1:1で固定化した。次いでビーズを5mlのカラムHEPと呼ぶ;4mlのビーズ、デッドスペース1mlに詰めた。対照カラムは、セファロース4Bビーズのみで調製したCTRと呼ぶ;4mlのビーズ、デッドスペース1ml。静脈血各10mlを健常ヒトドナーおよび維持血液透析患者1例から採取し、ダルテパリンPfizer;1IE/mlの血液と混合し、回転させて細胞を除去した。得られた血漿のうち、各個体の1つのアリコートを1gで各カラムHEPおよびCTRに通した。次いで非結合の画分を二次元ゲル電気泳動に直接使用し、続いてカラムをPBSで10回洗浄し、その後結合した画分を、15mlの溶出緩衝液50mMのトリス-HClのpH8および10mMのReducedGlutathione、Sigmaを使用し、栓をしたカラムにそれぞれ溶出し、これを室温で20分間揺動し、次いで500gで5分間遠心し、排出し、液体を集めた。カラム毎にこの溶出手順を合計3回繰り返し、各カラムの全溶出液を二次元ゲル電気泳動用にプールした。通過の前および後の血漿について、Bradford反応を用いて総タンパク質含有量を試験した10μlの画分90μlの水1mlのBradford試薬Pierce;590nmおよび450nmで吸光度を測定し、これらの間の比率を使用してタンパク質濃度を算出した。次いで同じアリコートを、β-メルカプトエタノールを含む等量のSDS-PAGEローディングバッファーと混合し、100°Cで5分間煮沸した。次いで変性したタンパク質を個別に10SDS-ポリアクリルアミドゲル上で分離し、その後銀溶液およびクーマシーブリリアントブルー溶液で染色した。精製されたタンパク質をニトロセルロース膜にトランスファーし定電流20mA、4°Cで一晩、5粉乳を含むPBSでブロッキングした室温2時間。ゲルを乾燥させ、露出させてFujiX2000ホスホイメージャーFujiでスキャンした。次いで銀染色したゲルを、MagicScan32AmershamおよびAIDAIMGソフトウェアを含むImageScannerAmershamでスキャンし、ImageMaster2DEliteソフトウェアAmershamで解析した。得られた画像を図3に示す。実施例9タンパク質結合に対するサイズ排除の影響維持血液透析を必要とする慢性腎疾患の7例の患者から静脈血各5mlを採取し、プールし、ダルテパリンPfizer;1IE/mlの血液と混合した。次いで混合物を遠沈させて細胞を除去した。得られた血漿のうち1mlのアリコート1つを、実施例6によりMEG3およびCUB1-7にビオチン化し、調製した2mgのSephadex登録商標を含むカラムに通した。1mlの血漿の別のアリコートをサイズ排除フィルターCentricone30K,Millipore;5000gで10分間回転に通し、次いで実施例6により調製したMEG3およびCUB1-7を含む別のカラムに通した。4群のそれぞれのサンプルサイズ排除を用いたものおよび用いないものと、カラムの前のものおよび後のものを、rpHPLCを用いて別々に解析した。300μgの血漿をmRP-C18カラムAgilentTechnologiesにロードした。各サンプルに、尿素ペレット22mgを6μlの純氷酢酸と共に加え、最終濃度を6Mの尿素および0.1酢酸とした。逆相HPLCを0.75ml/分の流量、および80°Cのカラム温度で行った。緩衝液A水/0.1TFAおよびBアセトニトリル/0.1TFAの直線マルチセグメントグラジエントは、以下の通りである:時間0分3B;1分3B;6分30B;39分55B;49分100B;53分100B;58分3B。予想通り、サイズ排除により、比較的高分子量のタンパク質のかなりの量が除去されたが、全部が除去されるわけではなかった。この除去の結果、おそらく競合的結合が減少したため、残りのペプチドがカラムに非常に結合しやすくなった。得られたクロマトグラムの代表的なサンプルを図4として示す。実施例10総タンパク質結合に対する通過量およびメガリン:キュビリン比の影響精製されたメガリンドメインおよびキュビリンドメインの比w/wを1:101μgのMEG1および10μgのCUB5-8/mlのビーズ~10:110μgのMEG1および1μgのCUB5-8/mlのビーズに変更したこと以外は、実施例5に記載されているようにカラムを作製した。次に、静脈血漿を実施例9に記載されているように採取した。1mlの血漿のアリコート1つを、メガリンおよびキュビリンを表面固定化した2mgのビーズを含むガラスカラムに通す一方、1mlの血漿を直ちに解析した。実施例8に記載されているようにBradford反応を用いて総タンパク質含有量TPCを判定した。実験は3回繰り返し、タンパク質濃度の変化の平均差アリコートの前後を図5に示す。このように、2molのメガリンと1molのキュビリンとの比率では、1molのメガリンと2molのキュビリンと同様にタンパク質が減少した。しかしながら、10molのメガリンと1molのキュビリンでは、カラムを通過する過程で著しく高レベルのタンパク質が除去された。実施例11アフィニティーカラム中のMEG5-8に対するインスリンの結合GST融合タンパク質MEG5-8を実施例2に記載されているように作製し、実施例5に記載されているようにグルタチオン-Sephadex登録商標4Bビーズ上に固定化した2mgのマトリックスをそれぞれ20μgの精製されたMEG5-8と混合。次いでビーズを3つの同等の5mlカラムに詰めた4mlのビーズ、デッドスペース1ml。リガンドに対するメガリンの結合の特異性を試験するため、5mlの最終容量になるように5BSASigmaおよびPBSと混合した60pg/mlの精製されたヒトインスリンヒューマリン100IE/ml;Sanofi-Aventisを使用した。この混合物をそのままブランクで、抗メガリン抗体Abcam;20ngと混合して、抗インスリン抗体Millipore;20ngと混合して、または両方の抗体2020ngと共にカラムに加えた。通過画分を集め、ウエスタンブロットを行った。その代表的なサンプルを図6Bに示す。さらに市販のELISAMilliporeを用いて、通過したサンプル中のインスリン濃度を評価した図6Aを参照。図6Bに示すように、抗メガリンは、インスリンのカラムへの結合を著しく低下させたが、抗インスリンはそうではなかったことから、我々の装置によりメガリン特異的にインスリンが捕捉されることが証明された。実施例12全長メガリンカラムの調製Invitrogen登録商標Freestyle商標MAXHEK-293細胞カタログ番号R790-07を用いて既に調製したpcDNA商標4ベクターを使用して、実施例4と同様に全長His10タグ付きメガリンを調製した。発現は、Prof.RenataKozyraki,INSERM,Parisから好意により提供された抗体を用いて、以前に記載されているようにウエスタンブロット解析により確認したLePanseetal1995EurJCellBiol672:120-129;Moestrupetal1993JBiolChem268:16564-16570。5mMのCaCl2および1mMのMgCl2を含むトリス-緩衝食塩水TBS25mMのトリス-HCl、137mMのNaClおよび3mMのKCl、pH7.0でニッケル-ニトリロ三酢酸Ni-NTAアガロースビーズQiagenを平衡化し、同じ緩衝液で調製した2μgの組換えHis10タグ付きタンパク質を室温で1時間インキュベートした。結合が飽和するまでBradfordアッセイを用いて残った上清中の過剰なタンパク質を検出して判定さらにタンパク質を加えた。1mlのニッケルアガロースビーズでは、約10μgのメガリンが結合した。次いで、タンパク質コーティングされたビーズを1mlのTBS20mMのイミダゾールで4回洗浄しそれぞれ5分間、50スラリーとしてTBSに懸濁した。成功した結合の検出は、最初にカラムを15回合計15カラム体積洗浄し、次いで1mgのビーズを150mMのイミダゾール1mlと混合し、室温で5分間穏やかに振盪することにより行った。次いで上記のように上清をウエスタンブロットにより解析して結合メガリンを検出した。最後に、8μMのフリットWhatman登録商標Grade40ディスクフィルターを備えた、1.5mlのオートクレーブ処理したガラスカラムを、ビーズを用いて調製し、室温で乾燥させ、穏やかに振盪しながら20エタノールを一杯となるまで充填した。最終カラムにキャップし、シールし、使用時まで8°Cで保存した8日以内。実施例13全長メガリンカラムを用いた5/6腎摘出したラットの処置。動物:雌雄の8週齢Sprague-DawleyラットをCharlesRiverLabsから取得した。この動物をメガリンMEGカラムもしくはプラセボCTRLカラム、またはシャム手術SHAMに1:1:1の比で無作為に割り付けた。カラム:全長メガリンカラムを実施例12と同様に調製した。プラセボカラムは、まったく同じように調製したが、結合メガリンタンパク質を含まないニッケル-ニトリロ三酢酸Ni-NTAアガロースビーズQiagenを使用した。動物の取扱い:1週間の馴化期間後、以前に記載されているように8匹の雄ラットに5/6腎亜全摘出を施行したShimamuraandMorrison1975AmJPathol79:95-106。4匹の他の雄ラットには、腎実質の除去を行わずに偽腹壁切除術を施行した。各腎摘出群の動物1匹が手術中に死亡した。種々後、ラットに2週間の回復期間を与え、実験ストレスを低下させるように毎日面倒を見た。全試験期間中、水および標準的な固形飼料を自由に与えた。ラットは、標準的なケージにそれぞれ雄1匹および雌2匹を収容して飼育した。環境エンリッチメントを実施した。試験のサンプリング:本試験は、手術から15日後に開始した。セボフロウランガス吸入によりラットを1日1回朝麻酔し、全手順中O2を補給した。以前の麻酔軟膏を用いて各アフェレーシス後に除去した尾静脈カテーテルを使用して、2mlの血液を、抗凝固薬として1.1mgのクエン酸一水和物を含むチューブに移した。血液を混合し、直ちに30kDaカットオフCentriCone登録商標フィルターMilliporeを通して回転させ、ずっと39°Cの加熱フードで保管した。次いでフィルターを後方から、38°Cに予め加熱した0.5mlの等張食塩水で慎重に洗浄した。次にサイズフィルター通過画分を予め洗浄したビーズカラムを通過させ試験群に従い決定されたMEGまたはCTRL、0.1mlを集め、その後のプール解析のため-80°Cで保存した。処理した残りの血漿は、サイズフィルター溶出液/非通過画分と混合した。得られた処理血液を直ちにカテーテルにより再注入し、この手順を3回繰り返した。偽手術動物は、プラセボカラムすなわち結合メガリンを含まないに流した。行動のモニタリング:試験の20日目から3日間の期間、ラットを1日24時間記録した。記録は、PC接続されたデジタルビデオカメラSonyHDR-CX550でIRを用いて行った。保存された画像を検討し、ラットの摂食頻度および性行動SiskandMeek2001、SexualandReproductiveBehaviorsinCurrentProtocolsinNeuroscience,sections8.2.1-8.2.15に記載されているを、ソフトウェアSBRを用いて定量したClaroetal1990PhysiolBehav483:489-493。結果:8日にわたる24回のカラム通過で処理された、プール画分のゲルおよびタンパク質含有量を図7に示す。正常な腎機能を持つSHAM群と比較して、腎摘出ラットは、血清クレアチニンSHAM0.8±0.1mg/dlとMEG1.8±0.4mg/dlおよびCTRL1.5±0.4mg/dl;SHAMとそれ以外の群のp<0.05、および尿素22.7±6.1mg/dlと45.0±5.7mg/dlおよび57.8±8.2mg/dl;p<0.05のレベルが有意に高かった。さらに、図8に示すように、腎摘出していないSHAMラットと比較して、CTRLラットでは性行動および摂食行動がどちらも有意に抑制されたのに対して、MEGラットではそうではなかった。SHAMとCTRLとの差はすべて有意であったのに対し、SHAMとMEGとの差は有意ではなかった。摂食、勃起行動およびquickflip行動は、CTRLラットよりMEGラットで有意にp<0.05よく認められるのに対し、longflip行動の差はこれらの2群間で統計学的に有意ではなかった。"