aポリヌクレオチドの拮抗剤/阻害剤であって、該ポリヌクレオチドはFZD3又はその生物学的に活性な誘導体の発現を低下又は抑制することが可能である、ポリヌクレオチドの拮抗剤/阻害剤、及び/又はbmiR-31又はその5’若しくは3’イソ型若しくは変異型の拮抗剤/阻害剤を含む、対象の骨障害及び/又は心血管障害を治療又は予防するための組成物。対象の骨障害及び/又は心血管障害を治療又は予防する方法であって、対象に、aFZD3又はその生物学的に活性な誘導体の発現を低下又は抑制することが可能なポリヌクレオチドの拮抗剤/阻害剤を含む組成物を有効量投与すること、及び/又はbmiR-31又はその5’若しくは3’イソ型若しくは変異型の拮抗剤/阻害剤を含む組成物を有効量投与すること、を含む前記方法。前記拮抗される/阻害されるポリヌクレオチドが、FZD3又は生物学的に活性なその誘導体のmRNAにハイブリダイズすることが可能な、請求項1に記載の組成物又は請求項2に記載の方法。前記拮抗される/阻害されるポリヌクレオチドが、マイクロRNA、siRNA、模倣マイクロRNA、長鎖非コードRNA、snRNA、stRNA、fRNA、snRNA、snoRNA.piRNA、tasiRNA、aRNA及びそれらのポリヌクレオチドの前駆体からなる群より選択される、請求項1若しくは3に記載の組成物又は請求項2若しくは3に記載の方法。前記拮抗される/阻害されるポリヌクレオチドの長さが、約15~約100、好ましくは約18~約27ヌクレオチド、また最も好ましくは20~24ヌクレオチドである、請求項1、3若しくは4のいずれか1項に記載の組成物又は請求項2~4のいずれか1項に記載の方法。前記拮抗される/阻害されるポリヌクレオチド又は前記miR-31又はその5’若しくは3’イソ型若しくは変異型が、a配列番号1のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、baのポリヌクレオチドと少なくとも80同一なポリヌクレオチド、c配列番号2のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、及びd配列番号2のヌクレオチド配列を含むbのポリヌクレオチドからなる群より選択される、請求項1若しくは3~5のいずれか1項に記載の組成物又は請求項2~5のいずれか1項に記載の方法。前記組成物が、ポリヌクレオチドa~dのいずれか1種、2種、又は3種以上に対する阻害剤を1種、2種、又は3種以上含む、請求項6に記載の組成物又は方法。前記拮抗される/阻害されるポリヌクレオチドがFZD3又はその生物学的に活性な誘導体のmRNAの3’-UTRにハイブリダイズする、請求項1若しくは3~7のいずれか1項に記載の組成物又は請求項2~7のいずれか1項に記載の方法。前記拮抗される/阻害されるポリヌクレオチドがmiR-31又はその5’若しくは3’イソ型若しくは変異型である、請求項1若しくは3~8のいずれか1項に記載の組成物又は請求項2~8のいずれか1項に記載の方法。前記組成物が体重1kg当たり約1ng~約10mgの前記拮抗剤/阻害剤を含む、請求項1若しくは3~9のいずれか1項に記載の組成物又は請求項2~9のいずれか1項に記載の方法。請求項1若しくは3~10のいずれか1項に記載の組成物又は請求項2~10のいずれか1項に記載の方法であって、FZD3又はその生物学的に活性な誘導体の発現を低下又は抑制することが可能な、前記ポリヌクレオチドの拮抗剤/阻害剤、及び/又は前記miR-31又はその5’若しくは3’イソ型若しくは変異型の拮抗剤/阻害剤が、脂質組成、エキソソーム又はリポソーム中に含まれている、前記組成物又は方法。前記組成物が薬学上許容可能な担体をさらに含む、請求項1若しくは3~11のいずれか1項に記載の組成物又は請求項2~11のいずれか1項に記載の方法。前記組成物を、注入、吸入、経口、直腸、経膣、局所及び/又は局部投与用に調製する、請求項1若しくは3~12のいずれか1項に記載の組成物又は請求項2~12のいずれか1項に記載の方法。前記拮抗剤/阻害剤がmiR-31又はその5’若しくは3’イソ型若しくは変異型にハイブリダイズすることが可能な、請求項1若しくは3~13のいずれか1項に記載の組成物又は請求項2~13のいずれか1項に記載の方法。前記拮抗剤/阻害剤が、アンタゴmiR、miRCURYLNA商標マイクロRNA阻害剤、インビボLNA商標miR阻害剤、tinyLNA、又はmiR-デコイ若しくはmiR-スポンジからなる群より選択される、請求項1若しくは3~14のいずれか1項に記載の組成物又は請求項2~14のいずれか1項に記載の方法。前記アンタゴmiR、miRCURYLNA商標マイクロRNA阻害剤、インビボLNA商標miR阻害剤、tinyLNA、又はmiR-デコイ若しくはmiR-スポンジが、a配列番号5の核酸配列又は配列番号5を含む核酸配列、b配列番号6の核酸配列又は配列番号6を含む核酸配列、c配列番号7の核酸配列又は配列番号7を含む核酸配列、d配列番号8の核酸配列又は配列番号8を含む核酸配列、及びea~dのいずれか1種の核酸配列とすくなくとも90同一の核酸配列、からなる群より選択される核酸分子又は核酸配列を含む、請求項15に記載の組成物又は方法。aFZD3又はその生物学的に活性な誘導体の発現を低下又は抑制することが可能なポリヌクレオチドと特異的に相互作用することが可能な薬剤、及び/又はbFZD3又はその生物学的に活性な誘導体の発現を低下又は抑制することが可能なポリヌクレオチドとハイブリダイズする核酸分子を含み、対象の骨障害及び/又は心血管障害の診断又は骨障害及び/又は心血管障害の治療成功の生体内での監視に使用する組成物。対象の骨障害及び/又は心血管障害を診断する方法であって、a前記対象の生体試料を、FZD3の発現を低下又は抑制することが可能なポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸分子及び/又はmiR-31又はその5’若しくは3’イソ型若しくは変異型にハイブリダイズする核酸分子と接触させる工程、又は前記生体試料を、FZD3の発現を低下又は抑制することが可能な前記ポリヌクレオチドと結合する薬剤及び/又はmiR-31又はその5’若しくは3’イソ型若しくは変異型と結合する薬剤に接触させる工程、baの該核酸分子の該ハイブリダイゼーションシグナルを検出評価するか、又は、aの該薬剤と前記ポリヌクレオチド及び/又は前記miR-31又はその5’若しくは3’イソ型若しくは変異型との該結合シグナルを検出評価する工程、及びcbの該検出評価されたハイブリダイゼーションシグナルを比較するか、又は、bの該検出評価された該結合シグナルを対照試料中の対応する検出評価されたハイブリダイゼーションシグナル又は結合シグナルと比較する工程を含み、前記対照試料のハイブリダイゼーションシグナル又は結合シグナルよりも、該対象の該試料中のハイブリダイゼーションシグナル又は結合シグナルが強いことが、骨障害及び/又は心血管障害を発症する又は患っている可能性の指標となる、診断方法。対象の骨障害及び/又は心血管障害を診断する方法であって、aPCR法により、生体試験試料中のmiR-31又はそのイソ型若しくは変異型のの該発現レベル及び/又は量を検出する工程、及びb前記生体試料中の前記miR-31又は前記イソ型及び変異型の該検出された発現レベル及び/又は量を、対照試料中の対応する前記miR-31の発現レベル及び/又は量と比較する工程を含む、診断方法。前記ハイブリダイズする核酸分子又は前記結合剤が、マーカー分子及び/又はタグ付け分子と結合されている、請求項17に記載の組成物又は請求項18に記載の方法。前記使用される薬剤が特定のタンパク質又はタンパク質断片である、請求項17若しくは20に記載の組成物又は請求項18若しくは20に記載の方法。前記特定のタンパク質又はタンパク質断片が、抗体若しくはその断片、又は、FZD3の発現を低下又は抑制することが可能なポリヌクレオチドと結合及び/又は相互作用することが可能な、及び/又はmiR-31又はその5’若しくは3’イソ型若しくは変異型と結合及び/又は相互作用することが可能な、修飾された転写因子である、請求項21に記載の組成物又は方法。前記骨障害が、骨粗鬆症、骨減少症、骨折、及び骨恒常性の不全からなる群より選択され、前記心血管障害が、心血管疾患、発作、梗塞、高血圧、血栓症、血管狭窄症、冠不全症候群、血管性認知症、心不全、腎不全、ストレス性心血管障害及びアテローム性動脈硬化症からなる群より選択される、請求項1若しくは3~17若しくは20~22のいずれか1項に記載の組成物又は請求項2~16若しくは18~22のいずれか1項に記載の方法。実施例1:細胞培養ヒト臍帯静脈内皮細胞HUVEC内皮細胞をヒトの臍帯から、以下の文献に記載されている通りに単離したChangExpCellRes309121136JaffeJClinInvest5227452756。ゼラチンで予めコーティングしたフラスコに、4mMのグルタミン、15のウシ胎仔血清FCS及び170U/mlのヘパリン含有10内皮細胞増殖サプリメントECGSを補填した、アール塩を含むM199培地を入れ、HUVECを37°C、湿潤環境、5CO2で培養した。細胞を週に1回か2回継代した。継代時の分割比は、成長速度に応じて1:2~1:4とした。HUVECを老化するまで培養し、老化関連βガラクトシダーゼSA-β-gal活性を、既に記載されている通りに染色したChang、上記。上清の回収には、接触阻止した静止した、PD19細胞と老化したPD53、95SA-β-gal陽性細胞を、実験によって、ASC培地又はHUVEC培地中で48時間分泌させた。その後上清を回収し、1900g、4°Cで遠心分離し、直ちにエキソソームの調製に用いるか或いは-80°Cで保存した。上清の容積は、上清を回収した時点で1本のフラスコに分泌されたHUVECの数に基づいて標準化した。37°Cで48時間インキュベートした細胞培地をさらなる対照として用いた。ヒト脂肪由来幹細胞ASC腫脹部脂肪吸引の外来患者から、局所麻酔をして皮下の脂肪組織を得た。ASCをこれまでに記述されているように単離しWolbankTissueEng1311731183WolbankTissueEngPartA、4mMのL-グルタミン、10のウシ胎仔血清FCS、PAAと1ng/mLの組換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子rhFGF、RDシステムズを補填したDMEM-低グルコース/ハムF-12培地中で、37°C、5CO2、95大気湿度で培養した。細胞を週に1回か2回継代した。継代時の分割比は、成長速度に応じて1:2とした。特異的表面マーカーCD13、CD14、CD34、CD45、CD73、CD90、HLAABC、HLADRの発現に基づき、フローサイトメトリーFACSCalibur、ベクトンディッキンソンを標準的な手順で使用して、ASCの特性を評価した。骨形成系統への分化全ての分化手順は24穴の細胞培養プレートで行った。骨形成分化のために、ASCを1穴当たり2×103個の細胞密度で播種した。播種後72時間目から最大4週間、細胞を骨形成分化培地DMEM-低グルコース、10のFCS、4mMのL-グルタミン、10nΜのデキサメタゾン、150μΜのアスコルビン酸-2-リン酸、10mMのβ-グリセロールリン酸及び10nΜのビタミンD3でインキュベートした。アリザリンレッド染色石灰化した構造をアリザリンレッドで染色するために、細胞を1時間、70エタノール中、-20°Cで固定した。簡単に濯いだあと、細胞を40mMアリザリンレッド溶液シグマで20分間染色し、その後PBSで洗浄した。定量するために、200μlのHCl0.1M/SDS0.5溶液で30分間、アリザリンレッドを抽出した。抽出した色素を425nmで測定した。実施例2:形質転換ASCを、siPORT商標NeoFX商標形質転換試薬アプライドバイオシステムズを用いて形質転換した。細胞を、10nMの前駆hsa-miR-31、100nMの抗miR-31又は10nMの陰性対照2アンビオンで、製造業者によるプロトコールに従って形質転換した。細胞を、24時間後、48時間後、又は、前述したように形質転換して3日後の分化が始まった時点で回収した。さらに、ASCを、0.5μgの優性阻害ダイナミン構築物K44A又はダイナミンの野生型構築物MarkAMcNivenDepartmentofBiochemistryandMolecularBiologyCenterforBasicResearchinDigestiveDiseasesMayoClinicandGraduateSchool、ロチェスター、ミネソタ55905、米国から提供されたで、MetafecteneProビオンテックスラボラトリー有限責任会社を使用して、製造業者の手順に従って形質転換した。実施例3:アポトーシス細胞死の評価HUVECを12穴の細胞培養プレートに播種し、ASC培地中で48時間分泌させた。その後細胞を50mMのEDTAで分離し、製造業者の説明に従ってアネキシンV-FITCとPIロシュで染色した。FACSCaliburとCellQuestソフトウェアベクトンディッキンソンにより、アポトーシス細胞とネクローシス細胞/アポトーシスの進行した細胞の百分率を解析した。実施例4:定量リアルタイムPCR別の骨形成分化マーカー遺伝子によってアリザリンレッド染色を確認した。そのため、骨形成が起こる前及び骨形成の最中の様々な時点のASCから、総RNAをトリゾールインビトロジェンを用いて単離した。DyNAmocDNA合成キットバイオザイムで逆転写し、RotorGene2000コーベットでqPCRを行った。miRNAの解析には、特定のタックマンTaqManアッセイアプライドバイオシステムズを製造業者の手順に従って行った。血液試料からのRNAの単離には、250~500μlの血清から、トリゾールLS試薬インビトロジェンを使用して総RNAを単離した。RNAの単離工程での試料間の変動を標準化するために、25fmolの人工センチュウCelegansmiRNAであるcel-miR-39を単離の前に加えた。血清試料27人の健康高齢提供者と21人の健康若年提供者は、DepartmentofGerontologyGeriatricsC2RLeidenUniversityMedicalCenter、オランダ、のRWestendorpから得た。さらに4人の骨減少症血清試料を、DepartmentofPathophysiologyGeneralhospital、ウィーンのPPietschmannから得た。本試験は組織の倫理委員会で承認され、書面による同意書を各対象から得た。実施例5:レンチウイルスの形質導入老化したHUVECに、GFPタンパク質を含むレンチウイルスベクターを形質導入した。ベクターは、InstituteforBiomedicalAgingResearchインスブルック、オーストリアのPidderJansenDurrから好意により提供されたMuckRejuvenationRes11449453。簡単に説明すると、老化したHUVECと老化前のHUVECを用いて、レンチウイルスの形質導入を行った。一般的に、100000~150000個の老化したHUVECと50000個の老化前のHUVECを6穴プレートに薄く広げ、一晩インキュベートした。安定に形質導入された細胞を生成するために、2~8の感染多重MOIを、感染効率を上昇させる8μg/mlのポリブレンを加えて行った。選択圧として、10μg/mlのブラストサイジンを培地に添加した。6~8日後、クローンは安定し、レンチウイルス粒子の混入を、ヒーラ細胞とSNを4日間インキュベートすることで試験した。その後SNを回収し、前述のようにエキソソームの精製に用いた。実施例6:エキソソームの精製エキソソームを、ろ過及び分画遠心法により、既に記載されているように精製したLehmannCancerRes6878647871。簡単に説明すると、48時間インキュベートした後に上清を回収した。この馴化培地を、細胞を沈殿させるために500gで10分間、残渣を除去するために14000gで15分間遠心分離し、その後、アポトーシス小体の画分を除去しながら、0.22μmフィルターを通す。その後、100000gで60分間超遠心してエキソソームを沈降させ、得られたペレットをPBSで洗浄する。エキソソームを新鮮な標本として電子顕微鏡法に用いるか、或いはその後の解析用に-80°Cで保存する。分化試験用には、1ウェルのASCにつき、50μlのPBSに溶解した2×104個のHUVEC由来エキソソームを加えた。実施例7:電子顕微鏡法精製したエキソソームをニッケルのカバーグラス200メッシュ、六法晶形、ピオロフォームでコーティングされたアテネ銅グリッド上で安定するまで放置した。4のホルムアルデヒドで固定した後、エキソソームを2の酢酸ウラニルで30秒間染色し、乾燥させるためにカバーグラスを取り、その後、透過型電子顕微鏡TEM、フィリップスモデルCM12電子顕微鏡フィリップス、アイントホーフェン、オランダで可視化した。電子顕微鏡を用いたその場ハイブリダイゼーションEM-ISH用に、エキソソームのペレットを0.1のトリトン-Xで5分間、室温で透過処理した。PBSで洗浄した後、エキソソームを既に記載されているように、ハイブリダイゼーション緩衝液と少なくとも4時間インキュベートしたObernostererNatProtoc215081514。各試料につき1pMのLNADIG標識一本鎖プローブエキシコン、デンマークを、変性ハイブリダイゼーション緩衝液50ホルムアミド、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.1ツイーン、0.25CHAPS、200μg/ml酵母RNA、500μg/mlサケ精子DNAを含む中、80°Cで5分間インキュベートすることによって変性させた。直ちにプローブを氷上に置いた。エキソソームをプローブと混合し、50°Cで一晩ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、試料を厳しく、0.2×SSC、60°Cで1時間洗浄した。その後、エキソソームを抗DIG抗体ロシュと30分間インキュベートし、5nmの金粒子で標識した二次抗体シグマとさらに1時間インキュベートした。PBSで洗浄した後、エキソソームをエポンに包埋し、平均およそ80nmの切片をウルトラミクロトームで切り出し、その後透過型電子顕微鏡TEM、フィリップスモデルCM12電子顕微鏡フィリップス、アイントホーフェン、オランダで解析した。実施例8:ウェスタンブロット総タンパク質を抽出し、ポリアクリルアミドゲル状で分離し、その後PVDF膜ロス、ドイツに移した。膜を5の脱脂粉乳でブロッキングし、CD63抗体H-193、サンタクルズ、次いで西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体とインキュベートし、その後Chemidocバイオラッドで行う、ECLウェスタンブロット基質ピアスを用いた増強化学発光enhancedchemiluminescenceにかけた。実施例9:ASCの増殖能と分化能に及ぼすHUVEC上清の効果幹細胞の全身環境の阻害ConboyNature433760764に老化内皮細胞が寄与する可能性があるかについて試験するために、十分に特性が評価された老化前のHUVECと老化したHUVECPDLがPD13~PD53を、既に確立されたものとして用いたChangExpCellRes309121136。老化細胞は大きくて扁平な形態を示し、SA-β-gal活性陽性に染色された図1A。内皮から分布される因子をASC培地中で生成するために、内皮細胞をASC培地に48時間曝露した。過剰な細胞死がセクレトームに及ぼす影響を排除するために、アネキシンV染色とPI染色で、回収している間の内皮細胞の細胞死の基礎レベルを試験した。老化前のHUVECと老化したHUVECの間に有意差は見られなかった図1B。さらに、6人の異なる提供者由来の、典型的な形態を示しているASC図1Cに例を示すを用いて、それらの同一性を、既に記載されているようにWolbank2009、上記YanezStemCells2425822591、それらの表面マーカーのプロファイル図1Dの特性評価によって確認した。老化前のHUVECと老化したHUVEC由来の馴化培地がASCの成長の特性に及ぼす影響を試験比較するために、細胞をそれぞれの上清と5日間インキュベートした。試験の全期間を通じて、各試験環境で細胞の生存率は変化しなかったがデータは示さない、老化上清存在下で培養したASCの細胞数は、老化前の上清又は対照培地存在下で培養した細胞と比較して有意に高くなった図2A。加えて、老化細胞由来の上清は21日後に、分化培地とインキュベートした場合と比較して、アリザリンレッドで染色されるASCの骨形成分化能を有意に低下させた図2B。実施例10:老化HUVEC上清のエキソソームはASCの増殖能と分化能を高めるエキソソームは膜で覆われた小胞であり、その直径は40~100nmで、細胞内の多小胞体に由来するPapInflammRes5818。近年になって、エキソソームが様々な環境での傍分泌のシグナル伝達分子として記載されてきたためDeregibusBlood11024402448HunterPLoSONE3e3694Lehmann、上記Pap、上記、エキソソームがASCの挙動の変化に寄与する可能性があるか否かを試験した。そのために、連続遠心分離工程Deregibus、上記によって、エキソソームをHUVEC上清から単離した。エキソソームの同一性を確認するために電子顕微鏡法を行った。粒度分布は、我々のエキソソーム調整物中にアポトーシス小胞が見られないことを強く示している図3A。なぜならば、アポトーシス小体の大きさは500nmを上回るためであるReichExpCellRes315760768。さらに、エキソソームのマーカーとして一般的に用いられるCD63表面タンパク質ValadiNatCellBiol96549に対する抗体を用いたウェスタンブロット解析図3Bと免疫金標識図3Cは、エキソソームの単離が成功したことを示唆している図3A~3C。ASCを老化HUVEC由来エキソソームで処理すると、老化前の内皮細胞由来エキソソームで処理した幹細胞と比較して、増殖速度は再び有意に上昇した図3D。さらに、細胞を老化エキソソームで処理すると骨形成分化能は有意におよそ50低下したが図3E、脂質生成の分化は影響を受けなかったデータは示さない。実施例11:miR-31は内皮細胞から分泌される種々のタンパク質に加えて、miRNAもエキソソーム中に詰め込まれることが示されたValadi、上記。miR-31が老化HUVECで亢進することが示された図4A。さらに、HUVECの培養上清図4B及び老化前の内皮細胞由来のエキソソームに対して、老化内皮細胞由来のエキソソーム図4C中にもそれらが存在しているか否かについて試験した。qPCRで最大12倍の変化が検出されたため、電子顕微鏡を用いたその場ハイブリダイゼーションEM-ISHによりエキソソーム内でのmiRNAの局在を確認した。これまでは、生化学的な試験だけがmiRNAがエキソソーム内にあることを示唆していたが、本発明において、miRNAが実際にエキソソーム内に詰め込まれていることの顕微鏡による初めての証拠が提供される図4D。実施例12:ASCはHUVEC由来エキソソームを取り込む内皮由来miR-31がASCによって取り込まれるか否かを試験するために、ASCをHUVEC由来のSNやエキソソームと共にインキュベートした。確かに48時間後のASC内で、miR-31の4~5倍の上昇が観察された図5A。これらのデータからは、エキソソームがASCによって取り込まれるのか、又はエキソソーム調整物に含まれる他の成分がASC内でのmiR-31の新規の転写を誘導するのかは分からなかった。そこで、近年GFPがエキソソーム内に詰め込まれることが発表されたことからDeregibus、上記、GFPを発現している安定な形質転換老化内皮細胞図5Bを準備した。GFP陽性のエキソソームとインキュベートして2日後のASCでは細胞質内がGFPのシグナルで強調されたが、GFP-エキソソームが枯渇した上清で処理したASCではシグナルは示されなかった図5C。エキソソームの取り込みをさらに確認するために、ASCを優性阻害ダイナミン構築物K44Aと対照としてダイナミンの野生型構築物CaoMolBiolCell925952609CaoJCellSci11319932002で形質転換した。ダイナミンが真核細胞でのエンドサイトーシスに関与していることCao1998、上記Cao2000、上記、及びエンドサイトーシスがエキソソームの取り込みに関与していることValadi、上記が示された。実際に、図5Dで示すように、miR-31レベルは優性阻害ダイナミン構築物K44Aで形質転換したASCで低下した。これらの結果は、miR-31が膜を介したシグナル伝達の結果の誘導によってではなく、実際にエキソソームを介して取り込まれることを示しており、この取り込みは、脂質含有DNAやRNAがそれらの積荷を細胞内に送達する、生体外での形質転換に類似しているように見える。実施例13:miR-31は単独でASCの骨形成分化を低下させるmiR-31が単独で分化に及ぼす影響を研究するために、ASCをmiR-31で一過的に形質転換した。タックマンTaqManアッセイにより、miR-31レベルの上昇を確認した図6A。ASCの分化能に及ぼすmiR-31の影響を研究し、ASCをmiR31で一過的に形質転換すると、骨形成分化はおよそ1/2に有意に阻害された図6B。これはエキソソーム単独で見られたのと同様の範囲である。これらのデータは、miR-31が、内皮細胞、特に老化した内皮細胞から分泌される可能性のある、骨形成分化の阻害剤であることを示している。実施例14:miR-31の標的骨形成条件では、FZD3のmRNAレベルがMSCで上昇することが示されたBakshJCellBiochem10111091124。本発明においては、FZD3のmRNAレベルは対照培地で処理した細胞と比較して4日後に亢進した図7A。さらにFZD3レベルは、幼若エキソソームや対照で処理した細胞と比較して、老化エキソソームでの処理後に有意に下方制御された図7B。miR-31を形質転換して24時間後にも、FDZ3は下方制御されたが、有意なレベルには達しなかった。このことは、細胞が分化していない時点では、FDZ3のmRNAレベルが非常に低い図7Cことで説明できると考えられる。従って、FZD3はマーカーのみでなく、骨形成分化に必須の因子に相当し、ASCでもmiR-31の直接の標的である可能性がある。実施例15:ASCに及ぼす血漿由来エキソソームの効果電子顕微鏡法によって、エキソソームが血漿中に存在することを確認した図8A。次に、21人の健康な若年提供者19~47才と27人の高齢提供者50~91才の血清からRNAを単離し、miR-31レベルを解析した。本発明において明らかになったように、miR-31レベルは高齢者で有意に上昇し、かつ、若年提供者に比べて変動が大きかった図8B。さらに、1mlの培地に、1mlの血漿由来エキソソームを加えて細胞を72時間処理すると分化が始まった。異なる4人の提供者からの高齢エキソソームで処理したASCでは、骨形成分化が約1/3に有意に低下したことが分かった図8C。対照試料で分化が非常に少ないことは、血清由来エキソソームで処理した細胞での分化が非常に早いことで説明できる。加えて本明細書では、骨減少症患者由来の血漿でのmiR-31レベルが、健康な年齢を適合させた対照と比較して高かったことが示された図8D。実施例16:酸化ストレスは老化を誘導する酸化ストレスが内皮の老化と機能不全に関係があることが知られているSealsClinSci120357375。酸化ストレスがmiR-31の分泌を誘導するか否かを試験するために、HUVECを連続して5日間、1日当たり1時間、培地中のtBHPを最終濃度が75μΜ、50μΜ又は35μMになるまで加えるtBHP処理で、SIPSストレス誘導未成熟老化を誘導した。永久的な成長停止は75μΜのtBHPによって誘導された。UnterluggauerExpGerontol3811491160に記載されている手順に従って、顕微鏡法によって14日間評価した。その結果、miR-31がストレスを誘導した未成熟老化内皮細胞のエキソソーム中で増加していることが分かった。H2O2の量を増やすことにより35μM、50μΜ及び75μMのt-ブチルヒドロペルオキシドtBHP、未処理のHUVECに比べて、ストレスを誘導した老化HUVECでは、複製によって老化したHUVECでのレベルと同様の、最大5倍のmiR-31の誘導が観察された図10。さらに、老化内皮細胞の上清でのmiR-31の増加は、ヒト臍帯静脈内皮細胞由来のHUVECには限定されず、老化したヒト網膜内皮細胞や老化したヒト肝臓由来内皮細胞でも、初期継代対照細胞に比べてmiR-31の増加が見られたデータは示さない。実施例17:miR-31拮抗剤は骨形成分化を阻害するmiR-31の阻害が骨形成分化を改善するか否かを試験するために、miR-31を拮抗する固定核酸LNAアンビオン、製品ID:AM11465PNAM17000を解析した。ASCの形質転換の実験手順は、上述した実施例2で行ったのと同様に実施した。既に明かになったように、アリザリンレッド染色によって解析されたCa沈着の有意な増加が観察され、miR-31の一過性の増加は骨形成分化の低下を生じた図11。これらのデータは、miR-31を全身で又は局所的に阻害又は除去すると、例えば骨粗鬆症で、或いは骨折後の骨芽細胞の形成が改善されることを示している。実施例18:miR-3はマウスモデル系での骨形成を阻害するmiR-31がヒトの系においてだけでなく、骨形成の一般的な制御因子であることを確認するために、C3Ht1012細胞株、すなわちBMP2の添加で骨形成分化を誘導することができるマウス間葉多能性細胞株RichardPLoSGenetic1e74を用いた。読出しとして、オステオカルシンプロモーターの制御下でルシフェラーゼをコードしているレポーター構築物FeichtingerTissueEngPartCMethods17401410と共に、細胞を形質転換した。miRNA-31の形質転換が骨形成分化に及ぼす影響を、C3Ht1012細胞株とオステオカルシン特異的レポーター遺伝子試験FeichtingerTissueEngPartCMethods17401410を組み合わせることによってさらに解析した。C3Ht1012細胞は組換えBMPで処理すると骨形成系統に分化することができ、それをアルカリホスファターゼ、オステオカルシン及び他の骨芽細胞特異的遺伝子を誘導することで観察することができる。細胞をT175フラスコに播種し、最初に99μgのオステオカルシンレポーターシステムで形質転換した。24時間後に、アンビオンのsiPORTNeoFXを使用して、30nMのmiRNA-31又は対照のスクランブルmiRNA対照2で逆形質転換した。骨形成分化を300ng/mlの組換えBMP2InductOS、ファイザーで誘導し、対照では成長因子による誘導は行わなかった。分化の6日後にReadyToGlowSecretedLuciferaseSystemKitクロンテックで細胞培養上清のメトリディアルシフェラーゼの活性を決定することにより、オステオカルシンのレポーター活性を評価した。その結果、マウスモデルでも一過性のmiR-31の過剰発現による骨形成の阻害が確認された。さらに、若年対高齢の健康なヒトと同様に、高齢のマウスの血清には、対照とした同系の若いマウスの血清と比較して3~10倍高い濃度のmiR-31が含まれていることが分かったデータは示さない。実施例19:骨減少症患者の血漿でのmiR-31の解析骨減少症と診断された10人の男性患者の血漿を、年齢を適合させた対照PPietschmannDepartmentofPathophysiologyGeneralhospital、ウィーンから提供されたと比較した。本試験は組織の倫理委員会によって承認され、かつ、書面による同意書を各対象から得た。血漿を、miRNAの解析に推奨されている標準の臨床的な手法により調製したTaylorMethodsMolBiol728235246KrohMethods50298301。トリゾールLSを用いて総RNAを単離した。その後、タックマン商標のプロトコールに従ってqPCRを実施した。この方法では、第一の工程は特異的な逆転写であり、その後増幅を行う。miR-31特異的な単位複製配列アンプリコンの増幅を、増幅によって蛍光標識されるプローブを表示することによって監視する。試験を3回行い、miR-31の差次的発現を、smallU6snRNAに基づいて標準化した。加えて、RNAの単離定量工程全体を通じたmiRNAの回収を標準化するために、対照としてCelegansに特異的なmiRNAを添加した。PCRは以下に詳述したように行った。タックマンプロトコールhsamiR31アプライドバイオシステムズcDNA合成:プログラム:16°C:30分42°C:60分85°C:5分4°C:一時停止タックマンプライマー:アプライドバイオシステムズ装置及びソフトウェア:RotorGene6000RotorGeneSoftware6000、SeriesSoftware17