"パクリタキセル又はその薬学的に許容される塩の治療有効量、及び式Iの化合物又はその薬学的に許容される塩から選択されるCDK阻害剤の治療有効量を含む、三重陰性乳癌の治療における使用のための薬学的組合せ;式中、Arは、非置換であるか、或いは:塩素、臭素、フッ素、もしくはヨウ素から選択されるハロゲン;ニトロ、シアノ、C1-C4-アルキル、トリフルオロメチル、ヒドロキシル、C1-C4-アルコキシ、カルボキシ、C1-C4-アルコキシカルボニル、CONH2、又はNR1R2から選択される1個、2個、又は3個の同一の又は異なる置換基によって置換されているフェニルであり;ここで、R1及びR2は、各々独立に、水素又はC1-C4-アルキルから選択される。前記CDK阻害剤が式Iの化合物又はその薬学的に許容される塩であり;ここで、前記フェニル基が:塩素、臭素、フッ素、もしくはヨウ素から選択されるハロゲン;C1-C4-アルキル、又はトリフルオロメチルから選択される1個、2個、又は3個の同一の又は異なる置換基によって置換されている、請求項1に記載の使用のための薬学的組合せ。前記CDK阻害剤が式Iの化合物又はその薬学的に許容される塩であり;ここで、前記フェニル基が、塩素、臭素、フッ素、又はヨウ素から選択される1個、2個、又は3個のハロゲンによって置換されている、請求項1又は2に記載の使用のための薬学的組合せ。前記CDK阻害剤が式Iの化合物又はその薬学的に許容される塩であり;ここで、前記フェニル基が塩素によって置換されている、請求項1~3のいずれか一項に記載の使用のための薬学的組合せ。式Iの化合物によって表されるCDK阻害剤が、-トランス-2-2-クロロ-フェニル-5,7-ジヒドロキシ-8-2-ヒドロキシメチル-1-メチル-ピロリジン-3-イル-クロメン-4-オン塩酸塩化合物Aである、請求項4に記載の使用のための薬学的組合せ。前記CDK阻害剤が式Iの化合物又はその薬学的に許容される塩であり;ここで、前記フェニル基が、クロロ及びトリフルオロメチル基で二置換されている、請求項1又は2に記載の使用のための薬学的組合せ。前記式Iの化合物によって表されるCDK阻害剤が、-トランス-2-2-クロロ-4-トリフルオロメチルフェニル-5,7-ジヒドロキシ-8-2-ヒドロキシメチル-1-メチル-ピロリジン-3-イル-クロメン-4-オン塩酸塩化合物Bである、請求項6に記載の使用のための薬学的組合せ。パクリタキセル、又はその薬学的に許容される塩の治療有効量;及び式Iの化合物又はその薬学的に許容される塩によって表されるCDK阻害剤の治療有効量;が、それを必要とする対象に連続的に投与される、請求項1~7のいずれか一項に記載の使用のための薬学的組合せ。パクリタキセル、又はその薬学的に許容される塩の治療有効量;が、式Iの化合物又はその薬学的に許容される塩によって表されるCDK阻害剤の治療有効量の前に投与される、請求項8に記載の使用のための薬学的組合せ。治療的相乗効果を示す、請求項1~9のいずれか一項に記載の使用のための薬学的組合せ。対象における三重陰性乳癌を治療する方法であって、前記対象に、パクリタキセル又はその薬学的に許容される塩の治療有効量、及び請求項1に記載の式Iの化合物又はその薬学的に許容される塩から選択されるCDK阻害剤の治療有効量を投与することを含む方法。前記CDK阻害剤が式Iの化合物又はその薬学的に許容される塩であり;ここで、前記フェニル基が:塩素、臭素、フッ素、もしくはヨウ素から選択されるハロゲン;C1-C4-アルキル、又はトリフルオロメチルから選択される1個、2個、又は3個の同一の又は異なる置換基によって置換されている、請求項11に記載の方法。前記CDK阻害剤が式Iの化合物又はその薬学的に許容される塩であり;ここで、前記フェニル基が、塩素、臭素、フッ素、又はヨウ素から選択される1個、2個、又は3個のハロゲンによって置換されている、請求項11又は12に記載の方法。前記CDK阻害剤が式Iの化合物又はその薬学的に許容される塩であり;ここで、前記フェニル基が塩素によって置換されている、請求項11~13のいずれか一項に記載の方法。前記式Iの化合物によって表されるCDK阻害剤が、-トランス-2-2-クロロ-フェニル-5,7-ジヒドロキシ-8-2-ヒドロキシメチル-1-メチル-ピロリジン-3-イル-クロメン-4-オン塩酸塩化合物Aである、請求項14に記載の方法。前記CDK阻害剤が式Iの化合物又はその薬学的に許容される塩であり;ここで、前記フェニル基が、クロロ及びトリフルオロメチル基で二置換されている、請求項11又は12に記載の方法。前記式Iの化合物によって表されるCDK阻害剤が、-トランス-2-2-クロロ-4-トリフルオロメチルフェニル-5,7-ジヒドロキシ-8-2-ヒドロキシメチル-1-メチル-ピロリジン-3-イル-クロメン-4-オン塩酸塩化合物Bである、請求項16に記載の方法。パクリタキセル、又はその薬学的に許容される塩の治療有効量;及び式Iの化合物又はその薬学的に許容される塩によって表されるCDK阻害剤の治療有効量;が、それを必要とする対象に連続的に投与される、請求項11~17のいずれか一項に記載の方法。パクリタキセル、又はその薬学的に許容される塩の治療有効量;が、式Iの化合物又はその薬学的に許容される塩によって表されるCDK阻害剤の治療有効量の前に投与される、請求項18に記載の方法。パクリタキセル及び前記CDK阻害剤が治療的相乗効果を示す、請求項11~19のいずれか一項に記載の方法。三重陰性乳癌の治療における使用のための薬剤の製造のための請求項1に記載の薬学的組合せの使用。請求項1に記載の薬学的組合せに含まれるCDK阻害剤が、-トランス-2-2-クロロ-フェニル-5,7-ジヒドロキシ-8-2-ヒドロキシメチル-1-メチル-ピロリジン-3-イル-クロメン-4-オン塩酸塩化合物Aである、請求項21に記載の使用。請求項1に記載の薬学的組合せに含まれるCDK阻害剤が、-トランス-2-2-クロロ-4-トリフルオロメチルフェニル-5,7-ジヒドロキシ-8-2-ヒドロキシメチル-1-メチル-ピロリジン-3-イル-クロメン-4-オン塩酸塩化合物Bである、請求項22に記載の使用。パクリタキセル、又はその薬学的に許容される塩、及び式Iの化合物本明細書に記載のもの又はその薬学的に許容される塩から選択されるCDK阻害剤を含む、本発明の薬学的組合せが;三重陰性乳癌の治療で使用されたときに、相乗効果を示すことが現在見出されている。特に、本発明は、対象における三重陰性乳癌を治療又は管理する方法であって、対象にパクリタキセルの治療有効量を、式Iの化合物から選択されるCDK阻害剤の治療有効量と組み合わせて投与することを含む方法を提供する。本発明の薬学的組合せ中に含まれるCDK阻害剤は、本明細書に記載の式Iの化合物から選択される。以下の式Iによって表されるCDK阻害剤は、参照により本明細書に組み込まれるPCT特許公開WO2004004632号米国特許第7,272,193号に対応する及びPCT特許公開WO2007148158号に開示されている。式Iの化合物は、様々な癌細胞の増殖を阻害するCDK阻害剤である。本発明の薬学的組合せ中に含まれる式Iの化合物は、様々な固形悪性腫瘍及び血液悪性腫瘍に対して効果がある。本発明の発明者らは、式Iの化合物をパクリタキセルと組み合わせると、アポトーシス、すなわち、プログラム細胞死が増加することを観察した。本発明で使用されるCDK阻害剤は、以下の式Iによって表される化合物から選択される。式中、Arは、非置換であるか、或いは:クロロ、ブロモ、フルオロ、もしくはヨードから選択されるハロゲン;ニトロ、シアノ、C1-C4-アルキル、トリフルオロメチル、ヒドロキシ、C1-C4-アルコキシ、カルボキシ、C1-C4-アルコキシカルボニル、CONH2、又はNR1R2から選択される1個、2個、又は3個の同一の又は異なる置換基によって置換されているフェニル基であり;ここで、R1及びR2は、各々独立に、水素又はC1-C4-アルキルから選択される。式Iの化合物は、参照により本明細書に組み込まれるPCT公開WO2004004632号及びPCT公開WO2007148158号に開示されている方法に従って調製することができる。式Iの化合物、又はその薬学的に許容される塩の一般的な調製プロセスは、以下の工程を含む:a式VIAの中間体化合物の分割されたエナンチオマー的に純粋な--トランスエナンチオマーを、ルイス酸触媒の存在下、無水酢酸で処理して、式VIIAの分割されたアセチル化化合物を得ること、b式VIIAの分割されたアセチル化化合物を、塩基及び溶媒の存在下、式ArCOOHの酸又は式ArCOClの酸塩化物又は式ArCO2Oの酸無水物又は式ArCOOCH3のエステル式中、Arは、式Iの化合物に関連して上で定義されている通りであると反応させて、式VIIIA;の分割された化合物を得ること、c式VIIIAの分割された化合物を、好適な溶媒中、塩基で処理して、式IXA;式中、Arは、上で定義されている通りであるの対応する分割されたβ-ジケトン化合物を得ること;d式IXAの分割されたβ-ジケトン化合物を塩酸などの酸で処理して、式XAの対応する環化化合物を得ることe式XAの化合物を120~180°Cの範囲の温度で脱アルキル化剤とともに加熱することによって、それを脱アルキル化に供して、式Iの化合物の-トランスエナンチオマーを得ること、及び任意に、対象化合物をその薬学的に許容される塩に変換すること。上記の工程aで利用されるルイス酸触媒は:BF3、Et2O、塩化亜鉛、塩化アルミニウム、及び塩化チタンから選択することができる。プロセス工程bで利用される塩基は、トリエチルアミン、ピリジン、及びDCC-DMAP組合せN,N’-ジシクロヘキシルカルボジイミドと4-ジメチルアミノピリジンの組合せから選択することができる。式VIIIAの化合物から式IXAの対応するβ-ジケトン化合物への転位がベーカーベンカタラマン転位として知られることが当業者には明らかであろうJ.Chem.Soc.,1933,1381およびCurr.Sci.,1933,4,214。プロセス工程cで使用される塩基は:リチウムヘキサメチルジシラジド、ナトリウムヘキサメチルジシラジド、カリウムヘキサメチルジシラジド、水素化ナトリウム、及び水素化カリウムから選択することができる。好ましい塩基は、リチウムヘキサメチルジシラジドである。式IXAの化合物の脱アルキル化のためにプロセス工程eで使用される脱アルキル化剤は:ピリジン塩酸塩、三臭化ホウ素、三フッ化ホウ素エーテラート、及び三塩化アルミニウムから選択することができる。好ましい脱アルキル化剤は、ピリジン塩酸塩である。式VIAの出発化合物の調製は、1-メチル-4-ピペリドンを1,3,5-トリメトキシベンゼンの氷酢酸溶液と反応させて、1-メチル-4-2,4,6-トリメトキシフェニル-1,2,3,6-テトラヒドロピリジンを生じさせ、これを、三フッ化ホウ素ジエチルエーテラート、水素化ホウ素ナトリウム、及びテトラヒドロフランと反応させて、1-メチル-4-2,4,6-トリメトキシフェニルピペリジン-3-オールを生じさせることを含む。1-メチル-4-2,4,6-トリメトキシフェニルピペリジン-3-オールから式VIAの化合物への変換は、トリエチルアミン、ピリジン、炭酸カリウム、又は炭酸ナトリウムなどの酸素求核剤の存在下でのp-トルエンスルホニルクロリド、メタンスルホニルクロリド、トリフルオロメタンスルホン酸無水物、又は五塩化リンなどの適当な試薬による処理と、それに続く、イソプロパノール、エタノール、又はプロパノールなどのアルコール溶媒中、酢酸ナトリウム又は酢酸カリウムなどの酸素求核剤の存在下での環縮小によって、化合物1-メチル-4-2,4,6-トリメトキシフェニルピペリジン-3-オールのピペリジン環上に存在するヒドロキシル基を、トシル、メシル、トリフレート、又はハライドなどの脱離基に変換することを含む。一実施形態では、CDK阻害剤は、フェニル基が:塩素、臭素、フッ素、又はヨウ素から選択されるハロゲン;C1-C4-アルキル、及びトリフルオロメチルから選択される1個、2個、又は3個の同一の又は異なる置換基によって置換されている、式Iの化合物である。別の実施形態では、CDK阻害剤は、フェニル基が、塩素、臭素、フッ素、又はヨウ素から選択される1個、2個、又は3個のハロゲンによって置換されている、式Iの化合物である。別の実施形態では、CDK阻害剤は、フェニル基が塩素によって置換されている、式Iの化合物である。さらなる実施形態では、式Iの化合物によって表されるCDK阻害剤は、-トランス-2-2-クロロ-フェニル-5,7-ジヒドロキシ-8-2-ヒドロキシメチル-1-メチル-ピロリジン-3-イル-クロメン-4-オン又はその薬学的に許容される塩である。またさらなる実施形態では、式Iの化合物によって表されるCDK阻害剤は、-トランス-2-2-クロロ-フェニル-5,7-ジヒドロキシ-8-2-ヒドロキシメチル-1-メチル-ピロリジン-3-イル-クロメン-4-オン塩酸塩本明細書において化合物Aと表されるである。別の実施形態では、CDK阻害剤は、フェニル基が、クロロ及びトリフルオロメチル基で二置換されている、式Iの化合物である。さらなる実施形態では、式Iの化合物によって表されるCDK阻害剤は、-トランス-2-2-クロロ-4-トリフルオロメチルフェニル-5,7-ジヒドロキシ-8-2-ヒドロキシメチル-1-メチル-ピロリジン-3-イル-クロメン-4-オン;又はその薬学的に許容される塩である。またさらなる実施形態では、式Iの化合物によって表されるCDK阻害剤は、-トランス-2-2-クロロ-4-トリフルオロメチルフェニル-5,7-ジヒドロキシ-8-2-ヒドロキシメチル-1-メチル-ピロリジン-3-イル-クロメン-4-オン塩酸塩本明細書において化合物Bと表されるである。一実施形態では、式Iの化合物によって表されるCDK阻害剤は、抗血管新生剤である。一実施形態では、式Iの化合物によって表されるCDK阻害剤は、HIF-1α阻害剤である。一実施形態では、式Iの化合物によって表されるCDK阻害剤は、VEG-F阻害剤である。一実施形態では、式Iの化合物によって表されるCDK阻害剤は、PARP酵素阻害剤である。薬学的に許容される塩の形態であり得る、式Iの化合物の製造、並びに上記の化合物を含有する経口及び/又は非経口薬学的組成物の製造は、PCT公開WO2004004632号米国特許第7,272,193号に対応する及びPCT公開WO2007148158号に開示されている。これらのPCT公開は、式Iによって表されるCDK阻害剤が多くの癌細胞の増殖を阻害することを開示している。本明細書において上で示されているように、式IのCDK阻害剤は、その塩の形態で使用することができる。式Iの化合物の好ましい塩としては、塩酸塩、メタンスルホン酸塩、及びトリフルオロ酢酸塩が挙げられる。式Iの化合物は、少なくとも2つのキラル中心を含み、したがって、2つの異なる光学異性体すなわち、又は-エナンチオマーの形態で存在する。全てのそのようなエナンチオマー、及びラセミ混合物を含むその混合物が本発明の範囲内に含まれる。式Iの化合物のエナンチオマーは、PCT公開WO2004004632号、WO2008007169号、及びWO2007148158号に開示されている方法によって、上記のように得ることができるか、又は式Iの化合物のエナンチオマーは、キラルHPLC及び酵素的分割などの、当技術分野で周知の技術によって得ることもできる。用語エナンチオマー的に純粋なは、95を超えるエナンチオマー過剰eeで存在する化合物を記述するものである。別の実施形態では、エナンチオマー過剰は97を超える。また別の実施形態では、エナンチオマー過剰は99を超える。用語エナンチオマー過剰は、あるエナンチオマーの量と生成物混合物中に存在する別のエナンチオマーの量の差を記述するものである。或いは、式Iの化合物のエナンチオマーは、光学活性のある出発材料を用いることによって合成することができる。したがって、式Iの化合物の定義は、全てのあり得る立体異性体及びそれらの混合物を含む。式Iの化合物の定義は、規定の活性を有するラセミ体及び単離された光学異性体を含む。パクリタキセルは、本発明の薬学的組合せ中に含まれる細胞傷害性抗腫瘍剤であるが、これは、タイヘイヨウイチイの木であるタクススブレビフォリアTaxusbrevifoliaから単離された天然のジテルペン産物であるRowinskyet.al.,J.Natl.CancerInst.,82,1247-12591990。パクリタキセルの単離及びその構造は、J.Am.Chem.Soc.93,23251971に開示されている。それは、チューブリン二量体からの微小管の集合を促進し、脱重合を妨げることによって微小管を安定化する抗微小管剤である。パクリタキセルは、肺癌、卵巣癌、乳癌、頭頸部癌、及び進行型のカポジ肉腫を有する患者を治療するのに用いられる。パクリタキセルは、卵巣癌の治療においてMerkmanetal.;YaleJournalOfBiologyandMedicine,64:583,1991及び乳癌の治療に対してHolmesetal;J.Nat.cancerInst.,83;1797,1991臨床使用が承認されているが、それは、他の癌を治療する際にも有用であり、例えば、それは、頭頸部癌Forastireet.al.,Sem.Oncol.,20:56,1990及び肺癌M.Ghaemmaghamietal;Chest;113;86-911998の治療のための有力な候補であると考えられている。パクリタキセルは、米国特許第5,670,537号に開示されており、この文献は、感受性のある癌の治療におけるパクリタキセルの使用又は投与に関するその教示について、参照により本明細書に組み込まれる。パクリタキセルは、注射溶液のTaxol登録商標として市販されている。パクリタキセルがアルブミンに結合している製剤は、Abraxane登録商標AbraxisBioScience,Inc.という商標で販売されている。別途示されない限り、上記又は下記に使用される一般用語は、好ましくは、本開示との関連において以下の意味を有する:本明細書で使用される場合、用語組合せ又は薬学的組合せは、抗癌剤、すなわち、パクリタキセルとCDK阻害剤式Iの化合物の組合せ投与を意味し;抗癌剤は、独立して同時に、又はとりわけ、組合せ相手が相乗効果を示すことを可能にする時間間隔内で別々に、投与することができる。本明細書で使用される場合、用語相乗的なは、本発明の方法及び組合せを用いて達成される効果が、パクリタキセル又はその薬学的に許容される塩、及びCDK阻害剤である式Iの化合物又はその薬学的に許容される塩を別々に用いて得られる効果の和よりも大きいことを意味する。有利には、そのような相乗作用は、同じ用量でより大きい効力を提供し、かつ/又は多剤耐性の構築を防止するかもしくは遅延させる。三重陰性乳癌の治療との関連における治療有効量は、本発明の組合せを受容する対象において以下の効果のうちの1つ又は複数をもたらすことができる量を指す:i減速及び完全な成長停止を含む、腫瘍成長のある程度の阻害;ii癌細胞の数の低下;iii腫瘍サイズの縮小;iv末梢器官への腫瘍細胞浸潤の阻害すなわち、低下、減速、もしくは完全な停止;v転移の阻害すなわち、低下、減速、もしくは完全な停止;vi腫瘍の退縮もしくは拒絶をもたらし得るが、必ずしもその必要はない、抗腫瘍免疫応答の増強;並びに/又はvii三重陰性乳癌と関連する1以上の症状のある程度の軽減。本明細書で使用される場合、用語管理する、管理すること、及び管理は、対象又は患者が、TNBCの進行又は悪化を予防するために該患者又は対象に投与されたときに、本発明の薬学的組合せから得る有益な効果を指す。本明細書で使用される場合、用語三重陰性乳癌複数可又はTNBCは、様々な組織病理学的表現型の癌腫を包含する。例えば、あるTNBCは、腫瘍細胞が、乳房の正常な基底/筋上皮細胞に通常見られる遺伝子、例えば、高分子量基底サイトケラチンCK、CK5/6、CK14、CK17、ビメンチン、p-カドヘリン、ccBクリスタリン、ファシン、並びにカベオリン1及び2を発現する基底様BLに分類される。しかしながら、ある他のTNBCは、異なる組織病理学的表現型を有し、その例としては、乳房の非特殊型の高悪性度浸潤性腺管癌、化生性癌、髄様癌、及び唾液腺様腫瘍が挙げられる。本発明の薬学的組合せが提供される治療のためのTNBCは、非応答性又は不応性TNBCであってもよい。本明細書で使用される用語非応答性/不応性は、三重陰性乳癌TNBCを有する対象または患者のうち、TNBCの治療のために現在利用可能な癌療法例えば、化学療法、放射線療法、外科手術、ホルモン療法、及び/又は、生物療法/免疫療法を受けているけれども、その療法が患者の治療に臨床的に十分ではなく、さらなる効果的な療法を必要とする例えば、治療に感受性のない者を表すために用いられる。この語句は、療法に応答するが、副作用に苦しむ、再発する、耐性を発症するなどの、対象又は患者を記述することもできる。様々な実施形態では、非応答性/不応性は、癌細胞の少なくとも相当な部分が死滅しないか、又はその細胞分裂が停止しないことを意味する。癌細胞が非応答性/不応性であるかどうかの決定は、当技術分野で認められている不応性の意味をそのような文脈で用いて、癌細胞に対する治療の有効性を検定するための当技術分野で公知の任意の方法によって、インビボ又はインビトロのいずれかで行なうことができる。癌細胞の数が、顕著には低下していないか、又は増加している場合、癌は、非応答性/不応性である。本明細書で使用される場合、用語治療周期は、パクリタキセル又はその薬学的に許容される塩、及び式Iの化合物又はその薬学的に許容される塩のCDK阻害剤の投与の連続シークエンスが実行される期間を指す。用語アポトーシスは、細胞内の一連の分子工程がその死をもたらす細胞死の一種を指す。これは、不要な又は異常な細胞を取り除く身体の正常なやり方である。アポトーシスの過程は、癌細胞で遮断されている場合がある。プログラム細胞死とも呼ばれる癌用語辞典、米国国立癌研究所。本明細書で使用される場合、用語アポトーシスを増加させるは、プログラム細胞死の割合の増加、すなわち、抗腫瘍剤のみ又はCDK阻害剤のみのいずれかへの曝露接触と比べて、より多くの細胞が死の過程に誘導されることと定義される。本明細書で使用される用語対象は、治療、観察、又は実験の対象となっている、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを指す。一実施形態では、本発明は、対象における三重陰性乳癌の治療方法であって、対象に、パクリタキセル又はその薬学的に許容される塩の治療有効量、及び式Iの化合物本明細書に記載のもの又はその薬学的に許容される塩から選択されるサイクリン依存性キナーゼCDK阻害剤を投与することを含む方法に関する。したがって、本発明の方法では、三重陰性乳癌は、それを必要とする対象に、パクリタキセル又はその薬学的に許容される塩の治療有効量を、式Iの化合物又はその薬学的に許容される塩から選択されるCDK阻害剤の治療有効量と組み合わせて投与することによって治療され、その場合、相乗効果が得られる。一実施形態では、本発明は、対象における三重陰性乳癌を治療する方法であって、対象に、パクリタキセル又はその薬学的に許容される塩の治療有効量、及び式Iの化合物又はその薬学的に許容される塩から選択されるCDK阻害剤の治療有効量を投与することを含む方法に関し、ここで、パクリタキセル及び該CDK阻害剤は、連続的に投与される。一実施形態では、本発明は、対象における三重陰性乳癌を治療する方法であって、対象に、パクリタキセル又はその薬学的に許容される塩の治療有効量、及び式Iの化合物又はその薬学的に許容される塩から選択されるCDK阻害剤の治療有効量を投与することを含む方法に関し、ここで、パクリタキセルは、該CDK阻害剤の投与の前に投与される。一実施形態では、本発明の三重陰性乳癌を治療する方法は、パクリタキセル及びCDK阻害剤を本明細書に記載の用量範囲で投与することを含む。一実施形態では、本発明は、対象における三重陰性乳癌を治療する方法であって、対象に、パクリタキセル又はその薬学的に許容される塩の治療有効量、及び化合物A又は化合物Bから選択されるCDK阻害剤の治療有効量を投与することを含む方法に関する。一実施形態では、本発明は、対象における三重陰性乳癌を治療する方法であって、対象に、パクリタキセル又はその薬学的に許容される塩の治療有効量、及び化合物A又は化合物Bから選択されるCDK阻害剤の治療有効量を投与することを含む方法に関し、ここで、パクリタキセル及び該化合物A又は化合物Bは、連続的に投与される。一実施形態では、本発明は、対象における三重陰性乳癌を治療する方法であって、対象にパクリタキセル又はその薬学的に許容される塩の治療有効量、及び化合物A又は化合物Bから選択されるCDK阻害剤の治療有効量を投与することを含む方法に関し、ここで、パクリタキセルは、化合物A又は化合物Bの投与の前に投与される。一実施形態では、本発明は、三重陰性乳癌の治療における使用のための薬学的組合せに関し、ここで、該薬学的組合せは、パクリタキセル又はその薬学的に許容される塩の治療有効量、及び式Iの化合物又はその薬学的に許容される塩から選択されるCDK阻害剤の治療有効量を含む。一実施形態では、本発明は、三重陰性乳癌の治療における使用のための薬学的組合せに関し、ここで、該薬学的組合せは、パクリタキセル又はその薬学的に許容される塩の治療有効量、及び式Iの化合物又はその薬学的に許容される塩から選択されるCDK阻害剤の治療有効量を含み、ここで、パクリタキセル及び該CDK阻害剤は、連続的に投与される。一実施形態では、本発明は、三重陰性乳癌の治療における使用のための薬学的組合せに関し、ここで、該薬学的組合せは、パクリタキセル又はその薬学的に許容される塩の治療有効量、及び式Iの化合物又はその薬学的に許容される塩から選択されるCDK阻害剤の治療有効量を含み、ここで、パクリタキセルは、CDK阻害剤の投与の前に投与される。一実施形態では、本発明は、三重陰性乳癌の治療における使用のため薬剤の製造のための薬学的組合せの使用に関し、ここで、該薬学的組合せは、パクリタキセル又はその薬学的に許容される塩の治療有効量、及び式Iの化合物又はその薬学的に許容される塩によって表されるCDK阻害剤の治療有効量を含む。一実施形態では、三重陰性乳癌の治療における使用のために提供される薬学的組合せ中に含まれるCDK阻害剤は、化合物A又は化合物Bから選択される。一実施形態では、薬学的組合せに含まれるCDK阻害剤は、化合物Aである。一実施形態では、薬学的組合せに含まれるCDK阻害剤は、化合物Bである。一実施形態では、本発明の薬学的組合せ中に含まれる抗癌剤は、それらの異なる物理的及び化学的特徴のために、異なる投与経路を必要とし得る。例えば、式IのCDK阻害剤を、その良好な血液レベルを生成させ、かつ維持するために、経口又は非経口のいずれかで投与し得る一方で、抗腫瘍剤を、静脈内、皮下、又は筋肉内経路で非経口的に投与し得る。経口使用のために、式IのCDK阻害剤を、例えば、錠剤もしくはカプセル、粉末、分散性顆粒、又はカシェーの形態で、或いは水性溶液又は懸濁液として投与し得る。経口使用のための錠剤の場合、一般に使用される担体には、ラクトース、トウモロコシデンプン、炭酸マグネシウム、タルク、及び糖が含まれ、ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤が一般に添加される。カプセル形態での経口投与のために、有用な担体には、ラクトース、トウモロコシデンプン、炭酸マグネシウム、タルク、及び糖が含まれる。筋肉内、腹腔内、皮下、及び静脈内使用のために、活性成分パクリタキセル又はCDK阻害剤の滅菌溶液が通常利用され、これらの溶液のpHは、好適に調整及び緩衝化されるべきである。一実施形態では、使用される活性成分の滅菌溶液は、生理食塩水又は蒸留水中で調製される。活性成分、すなわち、組合せ中に含まれる抗癌剤の実際の投薬量は、患者の要件及び治療されている状態の重症度によって様々に異なり得る。通常、治療は、化合物の最適用量に満たないより少ない用量で開始される。その後、各成分の用量を、その状況下での最適効果に達するまで少量ずつ増加させる。しかしながら、薬学的組合せ中の各成分の量は、通常、単独で投与された場合に治療効果をもたらす量に満たない。便宜のため、全日用量を、必要に応じて分割し、1日の間に少しずつ投与することができる。一実施形態では、パクリタキセルが、各々10mg~1000mgの範囲の相乗的有効用量で投与され、かつCDK阻害剤が、5mg/m2/日~1000mg/m2/日の範囲の相乗的有効用量、特に、9mg/m2/日~約259mg/m2/日の範囲の用量で投与されるように、パクリタキセル又はその薬学的に許容される塩、及び式Iの化合物又はその薬学的に許容される塩から選択されるCDK阻害剤は、注射可能な形態で連続的に投与される。一実施形態では、三重陰性乳癌の治療における使用のために提供される薬学的組合せは、それを必要とする対象に、以下の工程を含む、6~8回の治療周期、特に、6回の治療周期;2回連続の治療周期の間、投与される。:i治療周期の1日目のパクリタキセルと化合物Aの薬学的組合せ単回用量投与;ii2日目から、連続4日間の1日1用量の化合物Aの投与;iii薬物抗癌剤を投与しない2日間のインターバル;iv連続5日間の化合物Aの任意投与、次いで、薬物抗癌剤投与をしない2日間のインターバル;v任意に、工程ivを反復すること;及びvi工程iの開始から3週間のインターバルの後、工程i~vを第二の治療周期として繰り返すこと一実施形態では、薬学的組合せは、それを必要とする対象に、外科手術前もしくは外科手術後に、又は外科手術前に一部及び外科手術後に一部、2回~6回の治療周期の間、投与される。本発明によって提供される組合せは、特定のアッセイ系で、及びいくつかの異なるインビトロでの投与スケジュールで評価されている。実験の詳細は、本明細書で以下に提供されている通りである。本明細書で提示されるデータは、式Iの化合物から選択されるCDK阻害剤と組み合わせたときに、パクリタキセルが相乗効果を示すことを明確に示している。三重陰性乳癌の治療において組み合わせて使用したときの抗癌剤が、細胞をCDK阻害剤のみ、式Iの化合物のみ、又はパクリタキセルのみで処理したときよりも、増殖性細胞におけるアポトーシス又は細胞傷害性を増大させることが明確に示されている。薬理学的アッセイで使用される、代表的な化合物の化合物Aは、-トランス-2-2-クロロ-フェニル-5,7-ジヒドロキシ-8-2-ヒドロキシメチル-1-メチル-ピロリジン-3-イル-クロメン-4-オン塩酸塩を指し、これは、参照により本明細書に組み込まれる、公開されたPCT公開WO2004004632号に開示されている化合物のうちの1つであった。これから、パクリタキセル及びCDK阻害剤を含む本発明の組合せの相乗効果を、その好ましい実施形態に関して、より詳細に説明する。これらは単なる例として提供されており、本発明を限定することを意図するものではないことに留意すべきである。以下の略語又は用語を本明細書で使用する:ATCC:アメリカンタイプカルチャーコレクション,USAATP:アデノシン三リン酸CHCl3:クロロホルムCDCl3:重水素化クロロホルムCO2:二酸化炭素CoA:補酵素ASigmaAldrich,USADCC:N,N’-ジシクロヘキシルカルボジイミドDBTA:ジベンゾイル酒石酸DMAP:4-ジメチルアミノピリジンDMF:N,N-ジメチルホルムアミドDMSO:ジメチルスルホキシドDNA:デオキシリボ核酸DTT:ジチオスレイトールSigmaAldrich,USAEDTA:エチレンジアミン四酢酸EtOAc:酢酸エチルFBS:胎仔ウシbovine血清Gibco,USAFCS:胎仔ウシcalf血清Gibco,USAg:グラムh:時間HCl:塩酸IPA:イソプロピルアルコールKBr:臭化カリウムKg:キログラムL:リットルMgSO4:硫酸マグネシウムMeOH:メタノールMin:分mL:ミリリットルμL:マイクロリットルμM:マイクロモルmmol:ミリモルmol:モルNa2CO3:炭酸ナトリウムNa2SO4:硫酸ナトリウムNaBH4:水素化ホウ素ナトリウムNaOH:水酸化ナトリウムNCI:米国国立癌研究所°C:セ氏度PARP:ポリADP-リボースポリメラーゼPBS:リン酸緩衝生理食塩水SigmaAldrich,USAPI:ヨウ化プロピジウムSigmaAldrich,USARPMI:米国ロズウェルパーク記念研究所SDS-PAGE:ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動TFA:トリフルオロ酢酸THF:テトラヒドロフラン細胞株供給源:ATCC,USA:TNBC:三重陰性乳癌MCF-7:HER低、ER、PR、BRCA/-アレル欠失乳癌細胞株T47-D:HER低、ER、PR乳癌細胞株ZR-75-1:HER低、ER、PR乳癌細胞株MDA-MB-468:HER-、ER-、PR-三重陰性乳癌細胞株MDA-MB-231:HER-、ER-、PR-三重陰性乳癌細胞株MDA-MB-435-S:HER-、ER-、PR-三重陰性乳癌細胞株MDA-MB-361:HER-、ER-、PR-三重陰性乳癌細胞株HBL-100:HER-、ER-、PR-三重陰性乳癌細胞株BT-549:HER-、ER-、PR-三重陰性乳癌細胞株HUVEC:ヒト臍帯静脈内皮細胞細胞株供給源:NCI,USA:U251HRE:遺伝子改変膠芽腫細胞U251pGL3:遺伝子改変膠芽腫細胞抗体供給源:CellSignalingTechnology,USA:サイクリンD1細胞周期タンパク質Bcl-2抗アポトーシスタンパク質CDK4サイクリン依存性キナーゼ-4RbレチノブラストーマpRbSer780ホスホ-レチノブラストーマPARPARP酵素の基質PARPポリADP-リボースポリメラーゼβ-アクチンハウスキーピングタンパク質、ウェスタンブロット解析のローディング対照として使用される細胞株のインキュベーション条件:37°C及び5CO2本発明を、以下の非限定的な実施例によってさらに説明するが、この実施例は、本発明をさらに例示するものであって、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、また、それらは、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきでもない。実施例1:-トランス-2-2-クロロフェニル-5,7-ジヒドロキシ-8-2-ヒドロキシメチル-1-メチル-ピロリジン-3-イル-クロメン-4-オン塩酸塩化合物Aの調製水素化ナトリウム50、0.54g、11.25mmolを、窒素雰囲気下で、撹拌しながら、0°Cの--トランス-1-[2-ヒドロキシ-3-2-ヒドロキシメチル-1-メチルピロリジン-3-イル-4,6-ジメトキシフェニル-エタノン0.7g、2.2mmolの無水DMF15mL溶液に少しずつ添加した。10分後、メチル2-クロロベンゾエート1.15g、6.75mmolを添加した。反応混合物を25°Cで2時間撹拌した。メタノールを20°C未満で注意深く添加した。反応混合物をクラッシュアイス300g上に注ぎ、1:1のHClpH2で酸性化し、EtOAc2×100mLを用いて抽出した。水性層を飽和Na2CO3pH10を用いて塩基性化し、CHCl33×200mLを用いて抽出した。有機層を乾燥させ無水Na2SO4、濃縮した。残渣に濃HCl25mLを添加し、室温で2時間撹拌した。反応混合物をクラッシュアイス300g上に注ぎ、飽和水性Na2CO3溶液を用いて塩基性にした。混合物をCHCl33×200mLを用いて抽出した。有機抽出物を水で洗浄し、乾燥させ無水Na2SO4、濃縮すると、化合物の-トランス-2-2-クロロ-フェニル-8-2-ヒドロキシメチル-1-メチル-ピロリジン-3-イル-5,7-ジメトキシ-クロメン-4-オンが得られた。[収率:0.67g64;mp:91~93°C;[α]D25=5.8°c=0.7、メタノール]溶融ピリジン塩酸塩4.1g、35.6mmolを-トランス-2-2-クロロ-フェニル-8-2-ヒドロキシメチル-1-メチル-ピロリジン-3-イル-5,7-ジメトキシ-クロメン-4-オン0.4g、0.9mmolに添加し、180°Cで1.5時間加熱した。反応混合物を25°Cに冷却し、MeOH10mLで希釈し、Na2CO3を用いてpH10に塩基性化した。混合物を濾過し、有機層を濃縮した。残渣を水5mLに懸濁させ、30分間撹拌し、濾過し、乾燥させると、化合物の-トランス-2-2-クロロ-フェニル-5,7-ジヒドロキシ-8-2-ヒドロキシメチル-1-メチル-ピロリジン-3-イル-クロメン-4-オンが得られた。[収率:0.25g70]-トランス-2-2-クロロ-フェニル-5,7-ジヒドロキシ-8-2-ヒドロキシメチル-1-メチル-ピロリジン-3-イル-クロメン-4-オン0.2g、0.48mmolをIPA5mLに懸濁させ、3.5HCl25mLを添加した。懸濁液を加熱して、透明な溶液を得た。この溶液を冷却し、固体を濾過すると、化合物の-トランス-2-2-クロロフェニル-5,7-ジヒドロキシ-8-2-ヒドロキシメチル-1-メチル-ピロリジン-3-イル-クロメン-4-オン塩酸塩、すなわち、化合物Aが得られた。収率:0.21g97;mp:188~192°C;[α]D25=21.3°c=0.2、メタノール;実施例2:-トランス-2-2-クロロ-4-トリフルオロメチル-フェニル-5,7-ジヒドロキシ-8-2-ヒドロキシ-メチル-1-メチルピロリジン-3-イル-クロメン-4-オン塩酸塩化合物Bの調製トランス-1-[2-ヒドロキシ-3-2-ヒドロキシメチル-1-メチルピロリジン-3-イル-4,6-ジメトキシフェニル-エタノンの化合物1.16g、3.2mmol、2-クロロ-4-トリフルオロメチル安息香酸0.88g、4mmol、DCC1.35g、6.5mmol、及びDMAP0.4g、3.27mmolの混合物をジクロロメタン50mLに溶解させ、室温で12時間撹拌した。反応混合物を0°Cに冷却し、沈殿したジシクロヘキシル尿素を濾過し、有機層を濃縮し、残渣を、クロロホルム中の1メタノール及び0.01アンモニアを溶離剤として用いるカラムクロマトグラフィーにより精製すると、化合物の-トランス-2-クロロ-4-トリフルオロメチル安息香酸2-2-アセトキシメチル-1-メチル-ピロリジン-3-イル-6-アセチル-3,5-ジメトキシフェニルエステルが得られた[収率:1.44g78.8]。窒素雰囲気下、0°Cで維持されたn-BuLi15ヘキサン溶液、2.2mL、5mmolのTHF10mL溶液に、ヘキサメチルジシラザン1.08mL、5.1mmolを滴加し、15分間撹拌した。これに、-トランス-2-クロロ-4-トリフルオロメチル安息香酸2-2-アセトキシメチル-1-メチル-ピロリジン-3-イル-6-アセチル-3,5-ジメトキシフェニルエステル1.44g、2.5mmolのTHF10mL溶液を滴加し、温度を0°Cに維持した。添加後、反応液を室温にまで温めさせておき、2.5時間撹拌した。反応混合物を希HClで酸性化し、10重炭酸ナトリウムでpH8~9に塩基性化した。水性層をクロロホルム3×25mLで抽出した。有機層を水25mL、ブライン25mLで洗浄し、無水Na2SO4上で乾燥させた。有機層を減圧下で濃縮し、真空下で乾燥させると、酢酸3-{3-[3-2-クロロ-4-トリフルロメチル-フェニル-3-オキソ-プロピオニル]-2-ヒドロキシ-4,6-ジメトキシ-フェニル}-1-メチル-ピロリジン-2-イルメチルエステルが油1.3g、90.2として得られた。このエステルを濃HCl10mLに溶解させ、3時間撹拌して、環化をもたらした。3時間後に、反応混合物を固体NaHCO3でpH8~9に塩基性化した。水性層をクロロホルム25×3mLで抽出し、水25mL及びブライン25mLで洗浄した。有機層を無水Na2SO4上で乾燥させ、減圧下で濃縮し、真空上で乾燥させた。残渣を、クロロホルム中の3メタノールと0.1アンモニアとを溶離剤として用いるカラムクロマトグラフィーで精製すると、化合物の-トランス-2-2-クロロ-4-トリフルオロメチルフェニル-8-2-ヒドロキシメチル-1-メチルピロリジン-3-イル-5,7-ジメトキシ-クロメン-4-オンが黄色の固体として得られた。[収率:0.56g48.2]-トランス-2-2-クロロ-4-トリフルオロメチルフェニル-8-2-ヒドロキシメチル-1-メチルピロリジン-3-イル-5,7-ジメトキシ-クロメン-4-オン0.25g、0.5mmol、ピリジン塩酸塩0.25g、2.16mmol、及び触媒量のキノリンの混合物を180°Cで2.5時間加熱した。反応混合物をメタノール25mLで希釈し、固体Na2CO3でpH10に塩基性化した。反応混合物を濾過し、メタノールで洗浄した。有機層を濃縮し、残渣を、0.1アンモニアとクロロホルム中の4.5メタノールとを溶離剤として用いるカラムクロマトグラフィーで精製すると、化合物の-トランス-2-2-クロロ-4-トリフルオロメチルフェニル-5,7-ジヒドロキシ-8-2-ヒドロキシ-メチル-1-メチルピロリジン-3-イル-クロメン-4-オンが黄色の固体として得られた。[収率:0.15g63.7]-トランス-2-2-クロロ-4-トリフルオロメチルフェニル-5,7-ジヒドロキシ-8-2-ヒドロキシ-メチル-1-メチルピロリジン-3-イル-クロメン-4-オン0.1g、0.2mmolをメタノール2mLに懸濁させ、エーテルHClで処理し、有機溶媒を蒸発させると、化合物の-トランス-2-2-クロロ-4-トリフルオロメチル-フェニル-5,7-ジヒドロキシ-8-2-ヒドロキシメチル-1-メチル-ピロリジン-3-イル-クロメン-4-オン塩酸塩が得られた。[収率:0.1g92.8]薬理学的アッセイ:実施例3:ヨウ化プロピジウムPIを用いた細胞傷害性アッセイヨウ化プロピジウム蛍光アッセイPIは、AnticancerDrugs,1995,6,522-32に記載の手順に従って実施した。ヒト腫瘍細胞株のインビトロ成長を特徴付けるため、及び化合物の細胞傷害活性を試験するために、アッセイを開発した。損傷した細胞膜にのみ透過するヨウ化プロピジウムPIを色素として用いた。インターカレーション複合体は、PIと二本鎖DNAとによって形成され、これにより、蛍光の増幅がもたらされる。細胞を-20°Cで24時間凍結させた後、PIは全DNAにアクセスすることができ、全細胞集団のカウントが可能になった。バックグラウンド測定値は、培地及びヨウ化プロピジウムを含む無細胞ウェルから得られた。ヒト乳癌細胞株すなわち、MCF-7、T47-D、ZR-75-1、MDA-MB-468、MDA-MB-231、MDA-MB-435-S、MDA-MB-361、HBL-100、BT-549を、10FCSを含む180μLのDMEMダルベッコ改変イーグル培地、Gibco,USA又はRPMI1460中、1500~3000細胞/ウェルの密度で、96ウェルプレートに播種し、約16時間インキュベートして、細胞を接着させておいた。その後、細胞を様々な濃度の化合物A0.1~3μMで処理した。上記の手順を、様々な濃度の化合物A、パクリタキセルSigmaAldrich,USA、及びスニチニブSutent登録商標、LCLaboratories,USAについて、3つのTNBC細胞株MDA-MB-231、MDA-MB-468、及びBT-549で繰り返した、すなわち、化合物Aの濃度範囲を0.1~3μMとし、パクリタキセルの濃度範囲を0.1~10μMとし、一方、スニチニブSutent登録商標については、濃度範囲を48時間の全期間の間1~100μMとした。プレートを、37°C±1°Cの加湿5CO2インキュベーター内でインキュベートした。対照ウェルをビヒクルDMSOで処理した。インキュベーション期間の最後に、これらのプレートを、PI細胞傷害性アッセイプロトコルを用いてアッセイした。パーセント細胞傷害性を様々な薬物濃度で計算し、プロットされたグラフから、IC50値を決定した。本研究の結果を表1A及び1Bに示す。表1Aは、化合物処理の48時間後に行なわれた細胞傷害性アッセイによって決定された、MDA-MB-231、BT-549、及びMDA-MB-468における化合物A、パクリタキセル、及びスニチニブSutent登録商標のIC50値単位μMを示している。表1Bは、化合物Aが、遺伝子マーカーに関係なく、0.3~1.0μMの範囲のIC50で、全ての乳癌細胞株に対して有効に抗増殖性であることが分かったことを示している。実施例4:クローン形成アッセイ又はコロニー形成アッセイMDA-MB-231、MDA-MB-468、及びMCF-7細胞株を、6ウェルプレート中、1500細胞/ウェルの密度で、10FCSを含むRPMI1460中に播種した。24時間のインキュベーションの後、細胞を実施例3の手順により決定されるIC10、IC30、及びIC50濃度の化合物Aで48時間処理した。このIC10、IC30、及びIC50値を表2に示す。培地を処理の最後に除去し、新鮮な培地薬物なし中で14日間インキュベートした。14日後、培地を吸引し、コロニーを、2:1の比率のメタノールと酢酸の混合物で固定し、水ですすぎ、固定手順を繰り返した。プレートを乾燥させ、コロニーを0.1クリスタルバイオレットで5分間染色した。最後に、ウェルを水ですすぎ、乾燥させた。結果は図1に示されており、これは、MDA-MB-231、MDA-MB-468、及びMCF-7細胞株播種密度:1500細胞/プレートにおけるIC10、IC30、及びIC50用量の化合物Aによる応答の視覚的増強を示している。化合物Aは、用量依存的な様式でコロニー形成能を阻害することが分かった。実施例5:多細胞腫瘍スフェロイド3D形成に対する化合物Aの効果このアッセイは、MethodsinMolecularMedicine,2007,140,141-151に開示されている方法に従って実施した。多細胞腫瘍スフェロイドMCTSモデルは、最もよく記載されている3Dインビトロ腫瘍モデル系のうちの1つであり、これは、腫瘍組織の特徴の多くを表現し、再現性のある実験を可能にし、優れたインビトロスクリーニング系を提供する。MCTSをハンギングドロップ法を用いて増殖させた。簡潔に述べると、細胞単層をトリプシン-EDTAを用いて剥離した。細胞数を調整し、1,000細胞/滴を含む20μLのハンギングドロップ滴を細菌等級ペトリ皿の中で生成させた。これらのハンギングドロップを、5CO2の加湿雰囲気で、37°Cで24時間インキュベートした。このように生成されたMCTSを、様々な濃度0.3μM~30μMの化合物Aの存在下又は非存在下で72時間、培養した。結果を図2に示す。MCF-7細胞懸濁液を、MCTSの増殖のために、様々な濃度の化合物A0.3μM~30μMと共インキュベートしたとき、3μM濃度以降の化合物Aで、スフェロイド形成が停止した。1μMで形成されたMCTSのサイズも対照と比べてより小さかった。MCTSは、患者腫瘍の病態生理学的環境をシミュレートすることが十分によく特徴付けられているので、この観察は臨床的観点から重要である。腫瘍の低酸素状態の形成をもたらすスフェロイド中での酸素勾配のために、それは、腫瘍組織に広がる微小環境を模倣する。スフェロイド形成に対する化合物Aの効果は、化合物Aが低酸素状況下で有効であり得ることを示している。実施例6:MCF-7Her低、ER、PR、BRCA/-アレル欠失及びTNBC細胞株MDA-MB-231における細胞周期進行及びアポトーシスに対する化合物Aの時間依存的効果細胞周期進行及びアポトーシスに対する化合物Aの時間依存的効果を2つの乳癌細胞株で評価した。非同期ヒト乳癌細胞株のMCF-7Her低、ER、PR、BRCA/-アレル欠失及びMDA-MB-231細胞を、10FCSを含むRPMI1460中、フラスコ当たり0.5×106細胞の密度で、25mm3組織培養フラスコに播種した。24時間後、細胞を4.5μMの化合物Aで0、24、48、及び72時間処理した。剥離された細胞と接着している細胞の両方を、表3に挙げられている様々な時点で回収したトリプシン処理した。リン酸緩衝生理食塩水PBS中で洗浄した後、細胞を氷冷70エタノール中で固定し、さらなる解析まで-20°Cで保存した。解析の前に、細胞をPBSで2回洗浄して、固定液を除去し、50μg/mLのヨウ化プロピジウム及び50μg/mLのRNアーゼAを含むPBSに再懸濁させた。室温20~35°Cで20分間のインキュベーションの後、フローサイトメトリーを用いて細胞を解析した。BectonDickinsonFACSCaliburフローサイトメーターBD,USAをこれらの研究に用いた。488nmに設定されたアルゴンイオンレーザーを励起源として用いた。赤色蛍光のレベルで規定したとき、2n~4nのDNA含量を有する細胞は、細胞周期のG1、S、及びG2/M期にあると表した。2n未満のDNA含量を示す細胞は、サブ-G1アポトーシス集団細胞と表した。各細胞周期コンパートメント内の細胞の数は、存在する細胞の総数のパーセンテージとして表した。結果を表3に示し、図3AMCF-7細胞株及び図3BMDA-MB-231細胞株にグラフで示す。上の表に示した結果から、化合物Aが、MCF-7Her低、ER、PR、BRCA/-アレル欠失及びTNBC細胞株MDA-MB-231でアポトーシスを誘導したことが明らかである。最大のアポトーシスは48時間及び72時間で見られた。実施例7:ウェスタンブロット解析を用いたMCF-7及びMDA-MB-231細胞における化合物Aの効果:若干の修正を加えて、MolecularCancerTherapeutics,2007,6,918-925に開示されている手順に従って、ウェスタンブロットアッセイを実施した。MCF-7細胞及びMDA-MB-231細胞を、25mm3組織培養フラスコ中の10FCSを含むRPMI1460培地中に播種し、24時間インキュベートした。これらの細胞を、1.5及び4.5μMの化合物Aで処理した。様々な時点で、すなわち、6、24、及び30時間で、細胞を回収するか又はトリプシン処理し、溶解緩衝液SigmaAldrich,USAを用いて溶解させた。タンパク質含量を推定した。溶解物をドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動SDS-PAGE、次いで、ウェスタンブロッティングに適用したMolecularCancerTherapeutics,2007,6,918-925。Bcl-2及びアクチンに対する特異的抗体を用いて、ウェスタンブロッティングを行なった。結果を図4に示す。図4から、化合物Aが、両方の細胞株において用量依存的な様式で、抗アポトーシスタンパク質Bcl-2を下方調節することを理解することができる。MCF-7細胞では、Bcl-2が、24時間以降、顕著に下方調節される一方、MDA-MB-231では、顕著な下方調節は、30時間で観察された。実施例8:細胞周期進行及びアポトーシスに対する化合物Aの効果:細胞周期進行及びアポトーシスに対する化合物A及びPARP阻害剤BSI-201Sanofi-Aventisにより開発されたイニパリブ。BSI-201は自前で調製するの効果の比較を、2つのTNBC細胞株で評価した。同期していないヒトTNBC細胞株のMDA-MB-231とMDA-MB-468を、25mm3組織培養フラスコ中、フラスコ当たり0.5×106細胞の密度で、10FCSを含むRPMI1460中に播種した。24時間後、細胞を、1.5及び3.0μMの化合物A又は50μMのPARP阻害剤BSI-201のいずれかで72時間処理した。インキュベーション後、細胞を回収しトリプシン処理し、実施例6に示したように処理した。結果を表4A及び4Bに示し;図5A、5B、及び5Cにグラフで示す。TNBC細胞株のMDA-MB-231及びMDA-MB-468は、化合物Aで処理したとき、用量依存的なアポトーシスの増加を示した。BSI-20150μMは、MDA-MB-231におけるアポトーシスの誘導を示さなかった。しかしながら、最小限のアポトーシス12.67が、MDA-MB-468で観察された。実施例9:MCF-7細胞周期タンパク質及びCDK4キナーゼ活性に対する化合物Aの効果ステップ1:サイクリン-D1発現の基礎レベルサイクリン-D1発現の基礎レベルを、様々な乳癌細胞株、すなわち、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-435S、MDA-MB-453、BT-549、及びHBL-100にわたって、ウェスタンブロット解析を用いて調べたMolecularCancerTherapeutics,2007,6,918-925。これらの細胞を、25mm3組織培養フラスコ中の10FCSを含むRPMI1460培地中に播種し、24時間インキュベートした。これらの細胞を回収しトリプシン処理し、溶解緩衝液を用いて溶解させた。タンパク質含量を推定した。溶解物をドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動SDS-PAGE、次いで、ウェスタンブロッティングに適用した。サイクリンD1抗体を用いて、ウェスタンブロッティングを行なった。アクチンはローディング対照として使用される。結果を図6Aに示す。高サイクリンD1レベルは、三重陰性乳癌細胞株を含む乳癌細胞株の大部分で観察された。ステップ2:MCF-7細胞周期タンパク質及びCDK4キナーゼ活性に対する化合物Aの効果MCF-7細胞を、25mm3組織培養フラスコ中の10FCSを含むRPMI1460培地中に播種し、24時間インキュベートした。これらの細胞を1.5μMの化合物Aで処理した。様々な時点、すなわち、3時間、6時間、9時間、12時間、及び24時間で、細胞を回収しトリプシン処理し、溶解緩衝液を用いて溶解させた。タンパク質含量をブラッドフォード法Anal.Biochem.,1976,72,248-254で推定した。溶解物をドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動SDS-PAGE、次いで、ウェスタンブロッティングに適用した。様々な細胞周期タンパク質、すなわち、サイクリンD1、CDK4、Rb、及びpRbSer780に対する特異的抗体を用いて、ウェスタンブロッティングを行なった。免疫沈降アッセイのために、MCF-7細胞を血清飢餓によって同期させた。これらの細胞を、様々な時点、すなわち、3時間、6時間、9時間、及び12時間で、1.5μMの化合物Aで処理した。細胞を回収しトリプシン処理し、溶解緩衝液を用いて溶解させ、タンパク質含量を推定した。CDK4に対する特異的抗体を用いる免疫沈降によって、CDK4-D1サイクリンD1及びCDK4を溶解物から精製した。免疫複合体をプロテインAセファロースビーズSigmaAldrich,USAを用いてさらに精製した。免疫複合体を用いて、基質としてのpRbと32P標識ATPBRIT,Indiaとを用いて、CDK4活性を決定した。混合した反応液をSDS-PAGE、次いで、転写及びオートラジオグラフィーに適用した。結果を図6Bに示す。化合物Aは、MCF-7Her低、ER、PR、BRCA/-、アレル欠失ありにおいて、時間依存的な様式でサイクリンD1及びpRbを下方調節する。サイクリンD1及びpRb発現は、6時間以降、顕著には12時間での減少を示す。24時間を除き、Rb全体の顕著な変化は見られない。細胞ベースのアッセイにおけるCDK4キナーゼ活性の減少は早くも3時間から見られた。実施例10:PARポリマーで測定されるPARP酵素活性に対する化合物Aの効果ポリADP-リボースポリメラーゼPARPは、ポリADP-リボシル化PAR触媒能を保有する酵素のファミリーの原理メンバーである。PARP酵素活性を調べるために、PARポリマー形成を測定した。MDA-MB-231及びMDA-MB-468細胞を、25mm3組織培養フラスコ中の10FCSを含むRPMI1460培地中に播種し、24時間インキュベートした。これらの細胞を1.5μM及び5μMの化合物Aで24時間処理した。細胞を回収しトリプシン処理し、溶解緩衝液を用いて溶解させた。PARに対する特異的抗体を用いてウェスタンブロッティングMolecularCancerTherapeutics,2007,6,918-925を行なった。結果を図7に示す。MDA-MB-231細胞株におけるPARポリマー形成の阻害によって観察されるように、化合物Aは、PARP酵素活性を阻害する。しかしながら、MDA-MB-468では、PARポリマーの形成が阻害されないことが観察された。実施例11:TNBC細胞株におけるPARP及び細胞周期タンパク質に対する化合物A24時間の効果PARP活性と細胞周期タンパク質サイクリンD1、全Rb、及びpRb780との相関を、2つのTNBC細胞株、すなわち、MDA-MB-468及びMDA-MB-231で調べた。MDA-MB-231及びMDA-MB-468細胞を、25mm3組織培養フラスコ中の10FCSを含むRPMI1460培地中に播種し、24時間インキュベートした。これらの細胞を1.5μM及び5μMの化合物Aで24時間処理した。細胞を回収しトリプシン処理し、溶解緩衝液を用いて溶解させた。PAR、PARP、サイクリンD1、CDK4、及びpRbSer780に対する特異的抗体を用いて、ウェスタンブロッティングを実施したMolecularCancerTherapeuticallyeffectives,2007,6,918-925。結果を図8に示す。MDA-MB-231では、PARポリマー形成の阻害によって見られるように、化合物Aは、PARP酵素活性を阻害する。これは、pRb、サイクリンD1、及びCDK4の用量依存的な減少を伴う。MDA-MB-468では、PARポリマー形成の変化は見られなかったものの、アポトーシスの指標であるPARP切断は顕著であった。TNBC細胞株MDA-MB-231を化合物Aで処理し、24時間インキュベートしたとき、この細胞株でPARP活性の阻害が観察された。しかしながら、MDA-MB-468は、PARP酵素阻害を示さず、その代わりに、PARPの切断を示した。これらは両方とも、アポトーシスを経ている細胞のマーカーである。したがって、化合物Aがこれらの細胞株の両方において顕著なアポトーシスを誘導することが明らかである。実施例12:HIF-1α阻害に対する化合物Aの効果HIF-1α受容体遺伝子ベースのアッセイにおける試験系:1U251HRE:ルシフェラーゼレポーター遺伝子が3コピーの同族HREの制御下にある組換えベクターを安定に発現する遺伝子改変細胞U251HRE。2U251pGL3:対照細胞株は、非特異的及び/又はHIF-1非依存的様式でルシフェラーゼ発現を阻害する化合物を除外するのに役立つ構成的活性型SV40プロモーター及びエンハンサーの制御下にホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子を含む。これらの細胞は、酸素正常条件で高い基礎レベルのルシフェラーゼを発現し、低酸素条件で若干より低いレベルのルシフェラーゼを発現した。U251HRE細胞を、180μLの容量中、10000~15000細胞/ウェルで、96ウェルの白色平底プレートに播種し、37°C、5CO2、及び周囲O2で24時間インキュベートした。化合物Aを、様々な濃度、すなわち、0.01、0.03、0.1、0.3、1.0、3.0、及び10μMで試験し、プレートを、37°C、5CO2、1O2、及び94N2のモジュール式低酸素チャンバーBillupsRothenberg,MIC101,USA内で20時間インキュベートした。20時間のインキュベーション後、プレートを取り出し、室温、5CO2、及び周囲O2で1.5時間インキュベートした。40μLのBrightGloルシフェラーゼ試薬Promega,USAを添加し、3分後、発光モードでPolarStarPlateReaderUSAを用いて、発光を測定した。適当な対照細胞U251pGL3を、それらを37°C、5CO2、及び周囲O2で処理したことを除き、同様に処理した。化合物毒性をMTSアッセイを用いて検定した。結果を図9にグラフで示す。化合物Aによる処理は、低酸素下<1O2のU251HRE細胞株において用量依存的な様式でHIF-1αの発現を効果的に遮断した。これらの化合物は、正常酸素下の対照細胞株U251pGL3におけるルシフェラーゼ発現を阻害しなかった。これは、化合物AがHIF-1αを特異的に阻害することを示している。実施例13:VEGF阻害に対する化合物Aの効果:細胞株M-9は、VEGF-LucコンストラクトpGL2-basic中のVEGFプロモーターと、VEGFプロモーターレポーター遺伝子を形成するジェネティシンG418耐性遺伝子を含むプラスミドとで安定にコトランスフェクトされているMDA-MB-231である。ルシフェラーゼ活性によって測定される、クローン細胞におけるレポーター遺伝子の発現は、安定である。VEGF受容体遺伝子ベースのアッセイを用いて、VEGF阻害に対する化合物Aの効果を評価した。VEGFアッセイの試薬:溶解アッセイ緩衝液1×トリス-リン酸塩pH7.8-125mM、DTT-10mM、EDTA-10mM、グリセロール-50、及びTritonX-100-5。ルシフェラーゼアッセイ試薬LARルシフェラーゼアッセイ緩衝液-8mL、530μMATP-530μL、270μMCoA-1mL、及び170μMルシフェリン-1mL。ルシフェラーゼアッセイ緩衝液LAB1×トリシンpH7.8-20mM、マグネシアアルバ-1.07mM、MgSO4-2.67mM、EDTA-0.1mM、及びDTT-33.3mM。LAB中で作製されるATPストック=5.85mg/mLLAB中で作製されるCoAストック=2.1mg/mLLAB中で作製されるルシフェリンストック=1.5mg/mLVEGFアッセイ用のプロトコル:1.M-9細胞を継代培養し、37°C及び5CO2の加湿インキュベーター内で、10FBS、及び4μL/mlG418ストック100mg/mLを補充したRPMI-1640培地中で維持した。2.細胞を、組織培養等級の96ウェル白色プレート及び透明プレートに、180μL容量中、3×104細胞/ウェルの密度で播種し、37°Cの加湿CO2インキュベーター5CO2内で16~20時間接着させておいた。インキュベーション条件が異なるので、合計2組のプレートを作製した。3.最終所望濃度がそれぞれのウェルで達成されるように、化合物A、Sutent登録商標、及びBSI-201を培地に連続希釈した。ウェル中のDMSO濃度は0.5を超えない。4.インキュベーション条件:1組のプレートを、周囲大気条件下、5CO2でインキュベートし、以後、正常酸素/有酸素プレートと表す。一方、もう1組のプレートを、酸素濃度が1未満、窒素が94、CO2が5である無酸素条件とし、以後、低酸素プレートと表す。インキュベーションの温度を37°Cとし、湿度を75超とする。5.低酸素条件及び正常酸素条件下での20~24時間のインキュベーションの後、プレートをインキュベーターから取り出し、全てのウェルの培地を白色プレートから除去する。細胞を100~150μL/ウェルのリン酸緩衝生理食塩水PBSで速やかに洗浄する。細胞を40~50μLの溶解緩衝液で20分間溶解させる。6.全てのウェルに、100μLのルシフェラーゼアッセイ試薬LARを添加し、TOPCOUNT商標Packard,USAで、発光について直ちにプレートを読み取る。阻害率及び阻害濃度IC50又は有効濃度EC50を対照未処理値と比較して計算する。低酸素下でのVEGF阻害のIC50値μM:化合物A:0.31μMSutent:15μMBSI-201:>100μM結果を図10にグラフで示す。化合物Aによる処理は、VEGFの発現を用量依存的な様式で効果的に遮断した。実施例14:創傷治癒アッセイにおける化合物Aの効果創傷治癒アッセイは、単純で、費用がかからず、インビトロでの有向性の細胞遊走を調べるための最も初期に開発された方法の1つである。この方法は、インビボでの創傷治癒時の細胞遊走を模倣する。プロトコル:1.MCF-7細胞を、25mm3組織培養フラスコ中の10FCSを含むRPMI1460培地中に播種し、24時間インキュベートした。2.細胞をトリプシン処理し、滅菌6ウェルプレートに1ウェル当たり0.5~2.0×106の密度で播種した。3.プレートを、周囲酸素レベル下、37°Cの加湿CO2インキュベーター5CO2内で、約16時間インキュベートした。細胞は、ウェルの全面にコンフルエントな均一の単層を形成することが観察された。コンフルエントな単層のための必要とされる細胞数は、具体的な細胞型とディッシュの大きさの両方によって決まる。4.一直線の細胞単層をピペットの先端で均等に擦って、引っ掻き傷を生成させた。化合物の添加前に、引っ掻き傷の1枚目の画像を取得した。5.化合物Aを1μM及び3μMの濃度で添加した。6.その後、さらなるインキュベーションのために、プレートをインキュベーター内で保持した。インキュベーションの時間枠は、使用した具体的な細胞型について実験的に決定した。7.インキュベーション後、デュッシュを位相差顕微鏡ZeissAxioObserver,Germany下に置き、基準点を一致させ、1枚目の画像の撮影領域を位置合わせし、2枚目の画像を取得した。各画像について、引っ掻き傷の一方の側ともう一方の側の距離を測定した。BT-549及びMDA-MB-231細胞株についても、同様のプロトコルに従った。結果を図11A、11B、及び11Cに示す。化合物Aは、三重陰性乳癌細胞株を含む全ての乳癌細胞株で強力な抗遊走効果を示した。対照細胞は、24時間のインキュベーションの後、完全な治癒を示した。化合物Aで処理した細胞は、両側からの非常に少ない遊走を示し、したがって、強力な抗遊走効果が示された。実施例15:内皮管形成アッセイにおける化合物Aの血管新生管形成アッセイは、血管新生の阻害及び誘導を研究するための、単純であるが、強力なモデルである。このアッセイは、細胞外マトリックスBDMatrigel商標Matrix,USA中に明白な血管様の管を形成する内皮細胞の能力に依存しており、このマトリックス中で、この血管様の管を顕微鏡観察により後から可視化することができる。それにより、ネイティブな生理的環境によく似ている3次元マトリックス中での血管新生性の管の解析が可能となる。プロトコル内皮細胞管形成アッセイコンフルエントなHUVECヒト臍帯静脈内皮細胞を、所望のコンフルエンスになるまで上述の内皮培地を用いて培養した。HUVECについては、60~80コンフルエンスが推奨される。細胞単層をトリプシン処理し、細胞を5~10血清を含む培養培地に再懸濁させることによって、内皮細胞懸濁液を調製した。24ウェルプレートの1ウェルにつき細胞懸濁液180μL当たり0.5~1×106個の細胞を、4°Cで解凍しておいた培地BDMatrigelMatrixに添加した。その後、この懸濁液をプレートに添加し、インキュベーションのために保持した。細胞を2~3時間接着させておき、その後、化合物A1μM、ロテノン1μMSigma-Aldrich,USA、及びトポテカン3μMSigma-Aldrich,USA20μLの10×ストックをそれぞれのウェルに添加した。DMSOを対照として用いた。24~48時間のインキュベーションの後、細胞を、管形成及び血管新生について位相差顕微鏡ZeissAxioObserver,Germany下で観察した。結果を図12に示す。化合物Aは、3DゲルHUVEC管形成アッセイにおいて、内皮細胞管形成、したがって、血管新生を効果的に阻害した。1μMの化合物Aは、ロテノン標準的なVEGF阻害剤に匹敵し、トポテカン臨床試験における既知のHIF-1阻害剤よりも優れていた。実施例16:インビトロ細胞傷害性アッセイ:方法ヨウ化プロピジウムPIアッセイを用いた三重陰性乳癌細胞株MDA-MB-231に対する化合物Aとパクリタキセルの組合せの効果アッセイプロトコル:ヨウ化プロピジウム蛍光アッセイPIをAnticancerDrugs,1995,6,522-32に言及されている手順に従って実施した。ヒト腫瘍細胞株のインビトロ成長を特徴付けるため、及び試験化合物の細胞傷害活性を試験するために、アッセイを開発した。損傷した細胞膜にのみ透過するヨウ化プロピジウムPIを色素として用いた。インターカレーション複合体はPIと二本鎖DNAとによって形成され、これにより、蛍光の増幅がもたらされる。細胞を-20°Cで24時間凍結させた後、PIは全DNAにアクセスすることができ、全細胞集団のカウントが可能になった。バックグラウンド測定値は、培地及びヨウ化プロピジウムを含む無細胞ウェルから得られた。ヒト三重陰性乳癌細胞株MDA-MB-231を、96ウェルプレートに、180μLのRPMI-1640培地中、1500~3000細胞/ウェルの密度で播種し、37±1°Cの加湿5CO2インキュベーター内で約16時間インキュベートして、細胞を接着させた。その後、表5に示す薬物処理のスケジュールに従って細胞を処理した。このスケジュールは、6つの処理グループからなる。全ての処理グループにおいて、20μLの10×化合物最初にDMSOに溶解させ、その後、細胞培地に希釈したもの、最終DMSO濃度は0.5を超えないをウェル中で用い、プレートを、37±1°Cの加湿5CO2インキュベーター内でインキュベートした。培地をウェルから除去し、PBSで洗浄した。1ウェル当たり100μLのPIワーキング溶液7μg/mLを添加し、プレートを-80°Cで約16時間保存した。プレートを解凍し、POLARstaroptimaプレートリーダーUSAを用いて、励起536nm及び放出590nmで蛍光を測定した。1mg/mLのPIストック溶液は、1mgのPIを1mLの蒸留水に溶解させることによって調製した。PIワーキング溶液は、140μLのストック溶液をPBSに添加して、容量を220mLにすることによって調製した7μg/mL。スケジュール:それは、6つの処理グループからなる。1MDA-MB-231細胞を、パクリタキセル0.03、0.1、0.3、1.0、及び3.0μM濃度のICμMで処理し、24時間インキュベートし、次いで、培地を除去し、完全培地CMを添加し、72時間インキュベートしたグループIA。2細胞を完全培地で処理し、24時間インキュベートし、次いで、培地を除去し、化合物AIC50=1μMを添加し、72時間インキュベートしたグループIIA。3細胞を完全培地で処理し、24時間インキュベートし、次いで、培地を除去し、スニチニブSutent登録商標、IC50=7.8μMを添加し、72時間インキュベートしたグループIIIA。4細胞を、様々な濃度のパクリタキセル0.03、0.1、0.3、1.0、及び3.0μMで処理し、24時間インキュベートし、次いで、培地を除去し、化合物AIC50=1μMを添加し、72時間インキュベートしたグループIVA。5細胞を、パクリタキセル0.03、0.1、0.3、1.0、及び3.0μMで処理し、24時間インキュベートし、次いで、培地を除去し、スニチニブSutent登録商標、IC50=7.8μMを添加し、72時間インキュベートしたグループVA。6細胞をDMSOビヒクルで処理し、24時間インキュベートし、次いで、培地を除去し、完全培地CM:培地10FCSを添加し、72時間インキュベートしたグループVIA。薬物処理のスケジュールを表5に示す。インキュベーション期間の最後に、PI細胞傷害性アッセイプロトコルを用いてプレートを検定した。結果を表6、表7、及び図13に示す。TNBCMDA-MB-231細胞株における相乗効果を、PharmacologicalReviews,2006,58,621-681に記載されている、Chou及びTalalayによるCompuSynソフトウェアを用いて評価した。組合せ指数CIを用いて、組合せが、相加的であるか、相乗的であるか、又は拮抗的であるかを評価する。CI<1は相乗的であり、CI=1は相加的であり、CI>1は拮抗的である。組合せグループを評価したときの組合せ指数を表7に示す。TNBC細胞株MDA-MB-231における組合せ指数の値から明らかであるように、パクリタキセルと化合物Aの組合せは、パクリタキセルとSutent登録商標よりも比較的相乗的であった。細胞傷害性の決定:実施例3の表1Aで明らかにされている、化合物処理の48時間後に行なわれた細胞傷害性アッセイで決定されたMDA-MB-231、BT-549、及びMDA-MB-468における化合物A、パクリタキセル、及びスニチニブSutent登録商標のIC50値単位μMを実施例16で用いた。化合物処理の終了後、すなわち、48時間後に、プレートをPIアッセイのために処理し、DMSOビヒクル対照と比較して細胞傷害性パーセントを計算した。組合せ実験で用いたスケジュールの結果は、パクリタキセルと組み合わせて使用したときに、化合物Aが相乗的であることを示した。実施例17:インビトロ細胞傷害性アッセイ:方法ヨウ化プロピジウムPIを用いた三重陰性乳癌細胞株BT-549に対する化合物Aとパクリタキセルの組合せの効果アッセイプロトコル:ヨウ化プロピジウム蛍光アッセイPIをAnticancerDrugs,1995,6,522-32に言及されている手順に従って実施した。ヒト腫瘍細胞株のインビトロ成長を特徴付けるため、及び化合物の細胞傷害活性を試験するために、アッセイを開発した。損傷した細胞膜にのみ透過するヨウ化プロピジウムPIを色素として用いた。インターカレーション複合体はPIと二本鎖DNAとによって形成され、これにより、蛍光の増幅がもたらされる。細胞を-20°Cで24時間凍結させた後、PIは全DNAにアクセスすることができ、全細胞集団のカウントが可能になった。バックグラウンド測定値は、培地及びヨウ化プロピジウムを含む無細胞ウェルから得られた。ヒト三重陰性乳癌細胞株BT-549を、96ウェルプレートに、180μLのRPMI-1640培地中、1500~3000細胞/ウェルの密度で播種し、37±1°Cの加湿5CO2インキュベーター内で約16時間インキュベートして、細胞を接着させた。その後、表8のスケジュールに従って細胞を処理した。各スケジュールは、6つの処理グループからなる。全ての処理グループにおいて、20μLの10×化合物最初にDMSOに溶解させ、その後、細胞培地に希釈したもの、最終DMSO濃度は0.5を超えないをウェル中で用い、プレートを、37±1°Cの加湿5CO2インキュベーター内でインキュベートした。培地をウェルから除去し、PBSで洗浄した。1ウェル当たり100μLのPIワーキング溶液7μg/mLを添加し、プレートを-80°Cで約16時間保存した。プレートを解凍し、POLARstaroptimaプレートリーダーUSAを用いて、励起536nm及び放出590nmで蛍光を測定した。1mg/mLのPIストック溶液は、1mgのPIを1mLの蒸留水に溶解させることによって調製した。PIワーキング溶液は、140μLのストック溶液をPBSに添加して、容量を220mLにすることによって調製した7μg/mL。スケジュール:それは、6つの処理グループからなる。1BT-549細胞をパクリタキセル0.03、0.1、0.3、1.0、及び3.0μM濃度で処理し、24時間インキュベートし、次いで、培地を除去し、完全培地を添加し、72時間インキュベートしたグループIB。2細胞を完全培地で処理し、24時間インキュベートし、次いで、培地を除去し、化合物AIC50=1μMを添加し、72時間インキュベートしたグループIIB。3細胞を完全培地で処理し、24時間インキュベートし、次いで、培地を除去し、スニチニブSutent登録商標、IC50=7.8μMを添加し、72時間インキュベートしたグループIIIB。4細胞を、パクリタキセル0.03、0.1、0.3、1.0、及び3.0μMで処理し、24時間インキュベートし、次いで、培地を除去し、化合物AIC50=1μMを添加し、72時間インキュベートしたグループIVB。5細胞を、パクリタキセル0.03、0.1、0.3、1.0、及び3.0μMで処理し、24時間インキュベートし、次いで、培地を除去し、スニチニブSutent登録商標、IC50=7.8μMを添加し、72時間インキュベートしたグループVB。6細胞をDMSOビヒクルで処理し、24時間インキュベートし、次いで、培地を除去し、完全培地CM:培地10FCSを添加し、72時間インキュベートしたグループVIB。薬物処理のスケジュールを表8に示す。組合せグループを評価したときの組合せ指数を表9に示す。結果を図14に示す。TNBC細胞株BT-549における組合せ指数によって示されるように、パクリタキセルと化合物Aの組合せは、パクリタキセルとSutent登録商標よりも比較的相乗的であった。実施例18:インビトロ細胞傷害性アッセイ:方法ヨウ化プロピジウムPIを用いた三重陰性乳癌細胞株MDA-MB-468に対する化合物Aとパクリタキセルの組合せの効果アッセイプロトコル:ヨウ化プロピジウム蛍光アッセイPIをAnticancerDrugs,1995,6,522-32に言及されている手順に従って実施した。ヒト腫瘍細胞株のインビトロ成長を特徴付けるため、及び化合物の細胞傷害活性を試験するために、アッセイを開発した。損傷した細胞膜にのみ透過するヨウ化プロピジウムPIを色素として用いた。インターカレーション複合体はPIと二本鎖DNAとによって形成され、これにより、蛍光の増幅がもたらされる。細胞を-20°Cで24時間凍結させた後、PIは全DNAにアクセスすることができ、全細胞集団のカウントが可能になった。バックグラウンド測定値は、培地及びヨウ化プロピジウムを含む無細胞ウェルから得られた。ヒト三重陰性乳癌細胞株MDA-MB-468を、96ウェルプレートに、180μLのRPMI-1640培地中、1500~3000細胞/ウェルの密度で播種し、37±1°Cの加湿5CO2インキュベーター内で約16時間インキュベートして、細胞を接着させた。その後、表10のスケジュールに従って細胞を処理した。各スケジュールは、6つの処理グループからなる。全ての処理グループにおいて、20μLの10×化合物最初にDMSOに溶解させ、その後、細胞培地に希釈したもの、最終DMSO濃度は0.5を超えないをウェル中で用い、プレートを、37±1°Cの加湿5CO2インキュベーター内でインキュベートした。培地をウェルから除去し、PBSで洗浄した。1ウェル当たり100μLのPIワーキング溶液7μg/mLを添加し、プレートを-80°Cで約16時間保存した。プレートを解凍し、POLARstaroptimaプレートリーダーUSAを用いて、励起536nm及び放出590nmで蛍光を測定した。1mg/mLのPIストック溶液は、1mgのPIを1mLの蒸留水に溶解させることによって調製した。PIワーキング溶液は、140μLのストック溶液をPBSに添加して、容量を220mLにすることによって調製した7μg/mL。スケジュール:それは、6つの処理グループからなる。1MDA-MB-468細胞を、パクリタキセル0.03、0.1、0.3、1.0、及び3.0μM濃度で処理し、24時間インキュベートし、次いで、培地を除去し、完全培地を添加し、72時間インキュベートしたグループIC。2細胞を完全培地で処理し、24時間インキュベートし、次いで、培地を除去し、化合物AIC50=1μMを添加し、72時間インキュベートしたグループIIC。3細胞を完全培地で処理し、24時間インキュベートし、次いで、培地を除去し、スニチニブSutent登録商標、IC50=7.8μMを添加し、72時間インキュベートしたグループIIIC。4細胞を、パクリタキセル0.03、0.1、0.3、1.0、及び3.0μMで処理し、24時間インキュベートし、次いで、培地を除去し、化合物AIC50=1μMを添加し、72時間インキュベートしたグループIVC。5細胞を、パクリタキセル0.03、0.1、0.3、1.0、及び3.0μMで処理し、24時間インキュベートし、次いで、培地を除去し、スニチニブSutent登録商標、IC50=7.8μMを添加し、72時間インキュベートしたグループVC。6細胞をDMSOビヒクルで処理し、24時間インキュベートし、次いで、培地を除去し、完全培地CM:培地10FCSを添加し、72時間インキュベートしたグループVIC。薬物処置のスケジュールを表10に示す。組合せグループを評価したときの組合せ指数を表11に示す。結果を図14に示す。TNBC細胞株MDA-MB-468における組合せ指数によって示されるように、パクリタキセルと化合物Aの組合せは、パクリタキセルとSutent登録商標よりも比較的相乗的であった。本発明は記載されている。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、文脈上そうでないことが明白に示されない限り、単数形a、an、及びtheは、複数の指示対象を含むことに留意すべきである。したがって、例えば、化合物acompoundを含む組成物に対する言及は、2以上の化合物の混合物を含む。文脈上そうでないことが明白に示されない限り、用語又はorは、一般に、及び/又はand/orを含むその意味において利用されることにも留意すべきである。本明細書中の刊行物及び特許出願は全て、本発明が関連する分野の当業者のレベルを示すものである。本発明は、様々な特定の及び好ましい実施形態及び技術に関して記載されている。しかしながら、本発明の精神及び範囲内にとどまりつつ、多くの変形及び修正が行なわれ得ることが理解されるべきである。"