関心あるウイルス粒子を含有する粗製ウイルス調製物を精製する方法であって、少なくとも1つの流動床吸着工程を含むことを特徴とする方法。前記流動床が吸着剤の粒子を含有し、機械、電磁気、磁気、重力および電気の力から選んだ1種または2種以上の力の作用下に該粒子を流体中に懸濁させることにより得たものであることを特徴とする、請求項1記載の方法。下記を含む、請求項2記載の方法:特に緩衝液の上昇流を適用することにより、吸着剤粒子をクロマトグラフィーカラム中で展開する段階、この展開段階は流動床が得られるまで続ける;前記粗製ウイルス調製物を、特に前記カラムの下部に注入する段階;カラムに緩衝液を、特に上昇流で通過させることにより洗浄する段階;場合により緩衝液の下降流により助ける、沈降段階、該吸着剤粒子上に吸着されたウイルス粒子を放出させるため、特に下降流で、緩衝液の流れを適用することによる溶離工程。前記吸着剤粒子がポリマー、より具体的にはアガロース、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、またはそれらの誘導体から選ばれたポリマー、からなることを特徴とする、請求項2または3記載の方法。前記吸着剤粒子が、前記関心あるウイルス粒子の全部または一部からなるアンチリガンドに特異的かつ可逆的に結合することができる少なくとも1種のリガンドを保有することを特徴とする、請求項1ないし4のいずれかに記載の方法。前記リガンドが、正電荷を持つ基、有利には塩基性基、より具体的にはジメチルアミノエチル基、ジエチルアミノエチル基、トリメチルアミノエチル基、RCHCH2N3基、グアニジニウム基、またはポリエチレンイミンのようなイミン基から選ばれた基、からなることを特徴とする、請求項5記載の方法。前記吸着剤粒子が、アガロースマトリックスからなり、石英製の中心コアおよび該アガロースマトリックスに共有結合したデキストラン鎖を含み、該アガロースマトリックスには前記正電荷を持つ基、特にQ基が結合していることを特徴とする、請求項2ないし6のいずれかに記載の方法。約25~約70mScm、有利には約30~約40mScm、そして好ましくは約30~約35mScmの範囲内の伝導率条件下で行うことを特徴とする、請求項1ないし7のいずれかに記載の方法。下記工程およびを含む、遺伝子治療に使用することができるウイルス粒子の製造プロトコル:下記工程を含む粗製ウイルス調製物の調製工程:関心ある少なくとも1種のウイルスベクター、好ましくは関心ある組換えウイルスベクターを適当な細胞系に感染またはトランスフェクションし;前記感染またはトランスフェクションした細胞系を、ウイルス複製およびウイルス粒子の産生が可能な条件下で培養し;細胞および/または上清を回収する、請求項1~8のいずれかに記載の方法による前記粗製ウイルス調製物の精製工程。さらに下記工程を含むことを特徴とする、請求項9記載のプロトコル:工程の後の細胞破壊もしくは溶解工程、場合により核酸分解工程が後に続く、包膜ウイルスを不活化する工程、および/または充填床クロマトグラフィー工程、特にゲル濾過クロマトグラフィー工程。前記ウイルス粒子がアデノウイルス粒子であることを特徴とする、請求項1~8のいずれかに記載の方法または請求項9もしくは10記載のプロトコル。本発明の他の特徴および利点は、以下の実施例を読むと明らかとなろう。ただし、本発明はこれらの実施例の内容に制限されるものではない。以下の実施例で使用した組換えアデノウイルスは、Chartierらに記載されている相同的組換え法を用いて構築した。使用した構築物は、Maniatisらに詳述されている遺伝子工学および分子クローニングの一般的な方法に従って、または市販キットを使用した場合には製造業者の推奨に従って、調製した。クローニング工程は、Ecoli5K株DH5asupE44thi1gyrAまたはNM55Dhsd5を使用し、相同的組換えのクローニング工程は、EcoliBJ5183株を使用する。制限部位の修復に関して、使用した方法は、EcoliDNAポリメラーゼIの大断片を使用して、張出し5末端を充填することからなる。このDNA断片はGeneCleanIITMDNA精製キットを使用して精製する。また、ウイルス構築物に用いたアデノウイルスゲノムの断片は、Genebankデータバンクに参照番号M73260として開示されているように、Ad5ゲノムのヌクレオチド配列におけるそれらの位置に従って正確に指示される。細胞生物学に関しては、当業者に周知の標準的方法に従って細胞をトランスフェクションまたは形質導入し、培養する。293A549E1および293E4ORF67細胞系を使用する。他の細胞系も使用できることは当然である。細胞は、1mMグルタミン、1アミノ酸、40mglゲンタマイシンおよび10ウシ胎児血清を添加したDMEM培地中、5CO2で富化した高湿度雰囲気中37°Cの培養条件に保持する。細胞のトランスフェクションは常法に従って行われる。以下の実施例は、マーカー遺伝子または治療用遺伝子を発現する組換えアデノウイルスを用いて実施した。これらはAd5血清型由来のものであり、下記構造を有している:-AdTG6297は、欠損がE1機能とE3機能にあるアデノウイルスベクターであり、そのゲノム中に、E1領域の置換物として、GFPタンパク質をコードするマーカー遺伝子用の発現カセットが挿入されている。GFPタンパク質は、蛍光を発することにより光励起に対して反応し、その発光強度をフィルターで測定する。より正確には、前記カセットは、CMVプロモーターとそれに続くキメライントロン、GFPタンパク質をコードする配列、およびSV40ウイルスのポリAから構成される。イントロン配列は、pCIプラスミドから隔離され、ヒトbグロビン遺伝子のイントロン1のスプライス供与部位と、さらにマウスイムノグロビンの遺伝子の分枝点およびスプライス受容部位とを含んでいる。ウイルス粒子はAdTG6297ベクターをE1相補性細胞系中にトランスフェクションし、許容細胞系上での連続継代により増幅する。-AdTG5643ベクターは、E1、E3およびE4の各領域が欠失した、ヒトCFTR治療用遺伝子を発現するベクターである。その発現カセットは、CMV初期プロモーター、CFTRcDNAおよびラビットb-グロビン遺伝子のポリAからなり、これが欠失したE1配列の代わりに挿入されている。ウイルス粒子は、AdTG5643ベクターをE1およびE4相補性細胞系中にトランスフェクションすることにより産生され、ウイルスストックは許容細胞系上での連続継代により作製される。-AdTG13383ベクターは、E1およびE3の各領域が欠失した、ヒトIL2治療用遺伝子を発現するベクターである。その発現カセットは、CMV初期プロモーター、pCIから隔離された合成イントロン、ヒトIL2をコードするcDNA、およびSV40ポリAからなり、これが欠失したE1配列の代わりに挿入されている。ウイルス粒子は、ベクターpTG13383をE1相補性細胞系中にトランスフェクションすることにより産生される。ウイルスストックは許容細胞系上での連続継代により作製される。相補性細胞からのウイルスの調製A549E1細胞を、1×106細胞/mlの濃度に達するまで培養皿で培養した後、約3のMOIの量でAdTG6297の予備ストックを感染させる。感染させた細胞を、感染から72時間後に回収し、低速で遠心分離する。得られたペレットを、血清を含まない約600mlの培地にとる。こうして得られた調製物は、約20lの培養液の量に相当する。4200rpmの回転速度にセットしたSilversonホモジナイザーの機械作用に7~10分間曝して細胞を破壊した後に、細胞内ウイルス粒子を放出させる。この段階では、細胞破壊後のゲノムDNAの放出により調製物は非常に粘稠である。100mMTris4mMMgCl2および4スクロースからなり、可溶化剤のTween80を2の濃度で予め添加した緩衝液を、ベンゾナーゼの最適作用を可能する量でウイルス調製物に加える。この混合物を室温で攪拌してから、50Umlの割合でベンゾナーゼを添加し、攪拌しながら室温で反応を1~2時間続けさせる。細胞培養液からのウイルスの調製細胞と培養液上清を感染から72時間後に回収し、この混合物を、精製すべき粗製ウイルス調製物を得るように、細胞崩壊工程により直接処理する以外は、実施例1を再現する。流動床クロマトグラフィー工程を用いた粗製ウイルス調製物の精製実施例3の目的は、精製ウイルス粒子を得るための本発明に係る方法の1態様を例示することである。最初に、実施例1および2で得られた粗製ウイルス調製物のいずれか一方を、包膜ウイルスを不活化する工程に付す。この不活化工程は、最終濃度がそれぞれ03および1のTNBP/Tween80の作用により行う。これを行うため、実施例1または2で得られた粗製ウイルス調製物を、2mMMgCl2、2スクロース、450mMNaClおよび06TNBPを含有する50mMTris緩衝液中に、同容積量で希釈する。1mMMgCl2、2スクロース、2MNaClおよび3TNBPを含有する、より高濃度の50mMTris緩衝液を用いて、1/10の量でウイルス調製物に加えることもできる。使用する塩濃度条件はクロマトグラフィーの平衡条件に相当することは認められよう。TNBP/Tween80の作用は、攪拌しながら、室温で3時間または4°Cで4時間続ける。不活化した粗製ウイルス調製物に、次いで流動床イオン交換クロマトグラフィーを受けさせる。これを行うため、2mMMgCl2、2スクロース、400mMNaClを含有する50mMTris緩衝液を使用して予備平衡化したStreamlineTMQXL型の樹脂を入れたカラムに、ウイルス調製物を注入する。カラム内に緩衝液の上昇流を作り出すように、前記緩衝液をクロマトグラフィーカラムの底部に導入し、カラムの頂部から出すようにする。100~300cmh、好ましくは150cmhの流速を用いて、カラムの平衡化と精製すべき粗製ウイルス調製物の注入とを行う。その後、カラムに適用したウイルス調製物を、上昇および下降方向に緩衝液を何回か流してすすぐ。この操作の目的は、非イオン特異的相互作用により吸着されたか、または機械的に捕捉された最初の部分の汚染物質を除去することである。その後、イオン特異的相互作用によりクロマトグラフィー担体に吸着された各種の細胞構成成分を、漸増する塩分濃度を含有する平衡化緩衝液を適用することにより段階的に溶離させる。緩衝液の流れが下降し始めた後は、50~150cmh、好ましくは100cmhの流速を適用する。溶出液を分画回収する。各画分を260nmおよび280nmで吸光度を測定することにより分析する。一般に、280nmだけで検出されるタンパク質は、425mMのNaCl濃度を含有する緩衝液により溶離する。第2の溶離ピークは、280および260nmで検出される。これは、関心あるアデノウイルス粒子を含有し、塩分濃度が450mMの緩衝液により溶離する。この第2の溶離ピークに対応する画分を抜き出し、場合によりゲル濾過クロマトグラフィーにかける。流動床クロマトグラフィーカラムは、表1に示した一連の工程により再生、洗浄および処理することができる。このゲルは、その後、001MNaOH中で数週間保存することができる。ウイルス粒子の取得方法からの収率は下記のように算出することができる。IUは感染単位の数値を意味する。本発明の方法は、約20リットルの量の粗製ウイルス調製物を精製することができ、その間に同時に流動床クロマトグラフィー工程の後で約80の総収率が得られる。これに対し、従来技術の方法は、最高でも、充填床クロマトグラフィー工程の後で約60の収率を得ることができるのがせいぜいである。抗がん用の感染性アデノウイルス粒子の臨床バッチの調製E1相補性細胞をバイオリアクター内のExcell525培地中で1×106細胞/mlの濃度が得られるまで培養した後、約10のMOIとなる量でAdTG13383の予備ストックを感染させる。感染から72時間後に、感染細胞と培養液の上清を回収する。50Hzの回転速度にセットしたSilversonホモジナイザーの機械的作用に細胞を7~10分間さらして破壊した後、細胞内ウイルス粒子を放出させる。こうして得た粗製ウイルス調製物を、不溶物を除去するために清澄化工程により処理する。これは、最初に気孔8μmのフィルター、次に気孔5μmのフィルター、そして最後に、気孔3~08μmのフィルターという、気孔が漸減する複数のフィルターでの逐次的な濾過により行う。清澄化したウイルス調製物に、DNA分解工程と、同時に包膜ウイルスの不活化工程とを受けさせる。これを行うため、清澄化したウイルス調製物に、2の濃度でTween80を添加した、4mMMgCl2および4スクロースを含有する100mMTris緩衝液を同じ量だけ添加する。この混合物を室温で攪拌してから、ベンゾナーゼを10Umlの割合で、およびTNBPを03の最終濃度で添加する。室温で攪拌しながら反応を2時間続ける。こうして得られたウイルス調製物を、流動床イオン交換クロマトグラフィーを実施するのに最適な35mScmの伝導率を得るように、50mMTris2mMMgCl22スクロースおよび2MNaCl中に希釈する。伝導率を調整したウイルス調製物を、2mMMgCl22スクロースおよび360mMNaClを含有する50mMTris緩衝液を用いて予備平衡化したStreamlineTMQXL型の樹脂を入れたカラムに注入する。この緩衝液をクロマトグラフィーカラムの底部に導入し、カラムの頂部から出して、カラム内に緩衝液の上昇流を作り出すようにする。カラムの平衡化とウイルス調製物の注入の間、300cmhの流速を適用する。注入し終わった後、非イオン特異的相互作用により吸着されたか、または機械的にブロックされた汚染物質を除去する目的で、上昇および下降方向で緩衝液を複数回流してカラムをすすぐ。次いで、漸増する濃度の塩を含有する平衡化用緩衝液を適用して、イオン特異的相互作用によりクロマトグラフィー担体に吸着された各種の細胞構成成分を段階的に溶離させる。緩衝液の流れが下降し始めたら、150cmhの流速を適用する。溶出した画分を、260nmおよび280nmでの吸光度を測定することにより分析する。ウイルス粒子はこの二つの波長でOD260/OD280比が約125の吸光度を示し、一般に650mMの塩濃度領域に溶出ピークが存在する。流動床クロマトグラフィーカラムは、上述したプロトコルに従って再生および洗浄することができる。流動床クロマトグラフィー後に得られた、アデノウイルス粒子を含有する画分を、LabscaleでBioMaxPESカセットを用いて、またはカットオフ閾値が300kDaおよび1000kDaのセルロース膜を用いて透析濾過により濃縮する。濃縮したウイルス調製物を、次いでゲル濾過クロマトグラフィーに付す。これを行うため、54mglTween80、2スクロースおよび10mMアスパラギン酸ナトリウムを含有する10mMTris緩衝液を用いて予備平衡化したToyopearlHW65F型の樹脂を入れたカラムにウイルス調製物を注入する。この緩衝液をクロマトグラフィーカラムの頂部から導入し、底部から取り出す。カラムの平衡化と濃縮ウイルス調製物の注入には30cmhの流速を使用する。カラムに適用したウイルス調製物を次いで、カラムを平衡化することができる緩衝液で下降方向にすすぐ。この操作の目的は、ゲルビーズから排除されるウイルスとは異なり、ゲルの細孔内を通過することにより通過速度が遅くなる、低分子量の汚染物質を除去することである。このクロマトグラフィー担体上で遅くなった各種の細胞構成成分をその後、なお同じ緩衝液で徐々に溶出させる。溶出液は分画回収する。各画分を260nmおよび280nmでの吸光度を測定することにより分析する。一般に、260nmおよび280nmで検出された最初のピークは関心あるアデノウイルス粒子を含有しているのに対し、280nmだけで検出されたタンパク質汚染物質は第2の部分中に溶出する。第1のピークに相当する画分を抜き出し、場合により透析濾過により濃縮し、適当な組成の緩衝液中に希釈し、022μmSartolabP20で濾過してから、使用時まで保存する。ウイルス粒子の取得方法における各工程での収率は次表のように算出することができる。IUは、Luskyらに記載のように抗DBP抗体による免疫蛍光を定量的に測定することにより求めた、感染単位の数値を意味する。TPは、260nmおよび280nmで吸着剤を測定することにより求めた、ウイルス粒子の合計数を意味する。本発明の方法は、約20リットルの量の粗製ウイルス調製物を精製することができ、同時に流動床クロマトグラフィー工程後に約90の総収率を得ることができる。これに対し、従来技術の方法は、充填床クロマトグラフィー工程後にせいぜい約60の収率を得ることができるにすぎない。ゲル濾過工程後の総収率は77~86である。