"生体の運動を自動的に決定するシステム100であって、当該システムが、a経時フレームf1~fn及び基準フレームfRを含む生体の第1の時系列の画像を取得するための撮像装置104と、bi時系列の差分画像fR-1~fR-nを生成し、ii時系列の差分画像から1以上の測定値を導き出し、iii1以上の測定値を解析して、第1の時系列の画像における運動を定量化するように動作し得るプロセッサー107とを備えており、時系列の差分画像fR-1~fR-nを生成することが、基準フレームfRから各経時フレームf1~fnを減算することを含んでいるか、或いは時系列の差分画像fR-1~fR-nを生成することが、各経時フレームf1~fnから基準フレームfRを減算することを含んでいる、システム。各フレームが、それぞれの強度値を伴う複数のピクセルを含んでおり、前記プロセッサーが、強度値によって時系列の差分画像を生成するように動作し得る、請求項1記載のシステム。前記1以上の測定値が、平均ピクセル強度、合計ピクセル強度及びメジアンピクセル強度からなる群から選択される、請求項1又は請求項2記載のシステム。前記生体が培養生物又は細胞培養である、請求項1乃至請求項3のいずれか1項記載のシステム。前記培養生物がゼブラフィッシュ又はエレガンス線虫からなる群から選択される、請求項4記載のシステム。前記細胞培養が、細菌細胞培養、真菌細胞培養、昆虫細胞培養、魚類細胞培養及び哺乳類細胞培養からなる群から選択される、請求項4記載のシステム。前記哺乳類細胞培養がヒト細胞培養である、請求項6記載のシステム。前記ヒト細胞培養が心筋細胞培養である、請求項7記載のシステム。生体の運動を決定する方法であって、当該方法が、i経時フレームf1~fn及び基準フレームfRを含む生体の第1の時系列の画像を取得する段階と、ii時系列の差分画像fR-1~fR-nを生成する段階と、iii時系列の差分画像から1以上の測定値を導き出す段階と、iv1以上の測定値を解析して、第1の時系列の画像における運動を定量化する段階とを含んでいて、時系列の差分画像fR-1~fR-nを生成する段階が、基準フレームfRから各経時フレームf1~fnを減算することを含んでいるか、或いは時系列の差分画像fR-1~fR-nを生成する段階が、各経時フレームf1~fnから基準フレームfRを減算することを含んでいる、方法。各フレームが、それぞれの強度値を伴う複数のピクセルを含んでおり、段階iiが、各フレームの強度値を基準フレームfRの対応強度値から減算するか或いは基準フレームfRの強度値を各フレームの対応強度値から減算することを含む、請求項9記載の方法。前記1以上の測定値が、平均ピクセル強度、合計ピクセル強度及びメジアンピクセル強度からなる群から選択される、請求項9又は請求項10記載の方法。前記生体が培養生物又は細胞培養である、請求項9乃至請求項11のいずれか1項記載の方法。前記培養生物がゼブラフィッシュ又はエレガンス線虫からなる群から選択される、請求項12記載の方法。前記細胞培養が、細菌細胞培養、真菌細胞培養、昆虫細胞培養、魚類細胞培養及び哺乳類細胞培養からなる群から選択される、請求項12記載の方法。前記哺乳類細胞培養がヒト細胞培養である、請求項14記載の方法。前記ヒト細胞培養が心筋細胞培養である、請求項15記載の方法。当該方法が自動化された方法である、請求項9乃至請求項16のいずれか1項記載の方法。創薬及び/又は毒性試験における請求項1乃至請求項17のいずれか1項記載のシステム又は方法の使用。請求項9乃至請求項18のいずれか1項記載の方法を実行するようにデータ処理装置を構成するように動作し得る機械命令を含む、コンピュータプログラム。本発明は、細胞密度、画像コントラスト、又は検出可能なエッジの存在に依存しない、単純な画像差分法を用いて、生体の運動を決定するシステム及び方法を提供することによって、先行技術による方法の限界を克服しようとするものである。さらに、本発明は、複雑なデータの縮約法又は分解法を必要とせず、自動化されたハイスループット撮像装置を用いて実行することができる。本発明の方法は、生体の運動を定量化するための単純で簡易な自動化手段を提供する。本方法は、心筋細胞の拍動頻度を測定するなど、細胞培養の運動を定量化するのに特に適する。本発明の第1の態様では、生体の運動を自動的に決定するシステム100であって、a経時フレームf1~fn及び基準フレームfRを含む生体の第1の時系列の画像を取得するための撮像装置104と、bi時系列の差分画像fR-1~fR-nを生成し、ii時系列の差分画像から1以上の測定値を導き出し、iii1以上の測定値を解析して、第1の時系列の画像における運動を定量化するように動作し得るプロセッサー107とを備えており、時系列の差分画像fR-1~fR-nを生成することが、基準フレームfRから各経時フレームf1~fnを減算することを含んでいるか、或いは時系列の差分画像fR-1~fR-nを生成することが、各経時フレームf1~fnから基準フレームfRを減算することを含んでいる、システムを提供する。一態様では、各フレームはそれぞれの強度値を伴う複数のピクセルを含んでおり、プロセッサーは、強度値によって時系列の差分画像を生成するように動作し得る。別の態様では、1以上の測定値は、平均ピクセル強度、合計ピクセル強度及びメジアンピクセル強度からなる群から選択される。追加の態様では、生体は培養生物又は細胞培養である。好ましくは、培養生物はゼブラフィッシュ又は線虫からなる群から選択される。ゼブラフィッシュDaniorerio又は略してDrerio又はエレガンス線虫Caenorhabditiselegans又は略してCelegansは、各種の生理学的研究、発生研究、遺伝学的研究、疾患研究及び毒性学的研究に用いられている。好ましくは、細胞培養は、細菌細胞培養、真菌細胞培養、昆虫細胞培養、魚類細胞培養及び哺乳類細胞培養からなる群から選択される。さらに好ましくは、哺乳類細胞培養はヒト細胞培養である。最も好ましくは、ヒト細胞培養は心筋細胞培養である。本発明の第2の態様では、生体の運動を決定する方法であって、i経時フレームf1~fn及び基準フレームfRを含む生体の第1の時系列の画像を取得する段階と、ii時系列の差分画像fR-1~fR-nを生成する段階と、iii時系列の差分画像から1以上の測定値を導き出す段階と、iv1以上の測定値を解析して、第1の時系列の画像における運動を定量化する段階とを含んでいて、時系列の差分画像fR-1~fR-nを生成する段階が、基準フレームfRから各経時フレームf1~fnを減算することを含んでいるか、或いは時系列の差分画像fR-1~fR-nを生成する段階が、各経時フレームf1~fnから基準フレームfRを減算することを含んでいる、方法を提供する。一態様では、各フレームはそれぞれの強度値を伴う複数のピクセルを含んでおり、段階iiは、各フレームの強度値を基準フレームfRの対応強度値から減算するか或いは基準フレームfRの強度値を各フレームの対応強度値から減算することを含む。別の態様では、1以上の測定値は平均ピクセル強度、合計ピクセル強度及びメジアンピクセル強度からなる群から選択される。別の態様では、生体は培養生物又は細胞培養である。好ましくは、培養生物はゼブラフィッシュ又はエレガンス線虫からなる群から選択される。好ましくは、細胞培養は、細菌細胞培養、真菌細胞培養、昆虫細胞培養、魚類細胞培養及び哺乳類細胞培養からなる群から選択される。さらに好ましくは、哺乳類細胞培養はヒト細胞培養である。最も好ましくは、ヒト細胞培養は心筋細胞培養である。追加の態様では、本方法は自動化方法である。本発明の第3の態様では、創薬及び/又は毒性試験における上述のシステム又は方法の使用を提供する。本システム及び/又は方法を用いて、生体の運動における、物理的刺激又は被験薬剤などの被験薬剤の効果を評価することができる。特に、システム及び/又は方法を用いて、被験薬剤が生体に対して悪影響又は毒性作用を及ぼすか否かを決定することができる。例えば、非処理の対照培養物と対比して、心筋細胞培養の運動に対する被験薬剤の効果を求め、被験薬剤が心拍数に対して悪影響を及ぼすか否かを確認することができる。本発明の第4の態様では、上述の方法を実行するようにデータ処理装置を構成するように動作し得る機械命令を含んでなるコンピュータプログラムを提供する。当業者には、生体の運動を決定する本発明の方法を、運動が認められる多くの多様な用途に適用しうることが明らかであろう。運動としては、特に限定されないが、心筋細胞の収縮が挙げられ、秒単位又は何分の1秒かの時間スケールで起こる迅速な運動であってもよい。或いは、運動は、分単位、時間単位又は日単位の比較的緩慢な運動であってもよい。かかる運動の例としては、特に限定されないが、細胞の遊走、運動、ケモタキシス又は創傷治癒の際の細胞の移動、又はゼブラフィッシュ若しくはエレガンス線虫など、小型の生物の動きが挙げられる。いずれの場合も、運動は、研究すべき運動の速度に適合させた撮像頻度で、時系列の画像を取得することによって運動を測定し、本明細書で説明される画像差分の工程を用いて運動を定量化する。以下の図面を参照して、本発明の方法を説明する。本発明の主要な態様を、細胞培養で例示される生体の運動を自動的に決定するシステム[100]を図解する図1に示す。1以上の容器[103]で培養される細胞[102]を、撮像装置[104]により撮像し、第1のフレーム[105]で始まり、最後のフレーム[106]で終わる時系列の画像を生成させるが、画像の数及び画像間の時間間隔は解析すべき運動に適合するように選択される。一般に、撮像の頻度が、解析すべき細胞の運動の頻度又は速度よりも大きくなるように、フレーム間の時間間隔を選択する。画像差分[107]を用いて、時系列の画像[105~106]を処理し、第1の画像[108]で始まり、最後の画像[109]で終わる系列の差分画像を生成させるが、この場合、各差分画像は、時系列における逐次画像を、時系列から選択した基準画像系列における第1の画像[105]の場合もあり、或いは、系列における最後の画像[106]の場合もあるから減算する得られる。この手順は、差分画像の派生系列[108~109]を生成させるが、この場合、画像の最大数は、時系列における画像[105~106]の数より1枚少ない。時系列の差分画像から1以上の測定値を導き出[110]し、これらの測定値を解析[111]にかけ、運動データ[112]を定量化する。画像差分は、2つの画像間の差異を決定するための、実行の容易な数学的手段である。画像差分を実施するには、2つの画像における等価ピクセルのピクセル強度値を減算し、得られる絶対ABS値すなわち、正又は負の符合を伴わない強度値を記録する。ピクセル強度値が、0黒色~255白色の範囲の8ビットのグレースケール256のグレーレベルの場合、差分画像で得られるピクセル強度値は、0画像間のピクセルに差異がない乃至255一方の画像のピクセルが白色であり、第2の画像のピクセルが黒色であるである。差分画像を形成するには、各等価ピクセルの対すなわち、各画像の同じx,y座標に位置するピクセルのピクセル強度値PであるP1xyとP2xyとを減算し、得られるピクセル対の強度差値を等価位置すなわち、同じx,y座標にあるピクセルに適用ΔPxyして第3の画像を生成することによって、得られる値を用いて第3の派生差分画像を創出する。或いは、例えば以下に示すように、他の異なる測定値を、等価ピクセル対に適用することもできる。ピクセルごとの画像差分を、図2に概略的に図解する。範囲1~3内のx,y座標を伴う3×3のピクセルアレイを含むデジタル画像[201]は、3つの中間グレーピクセルの列[203]を有する。ピクセル1,2が白色ピクセルで置換され、ピクセル2,2が中間グレーピクセル[204]で置換されていることを除き、第2のデジタル画像[202]は、画像[201]と同一である。時系列の画像における画像[201]と画像[202]との間の1つのピクセルの差異は、2枚の画像の取り込み時点間における、撮像された生体の動きを表しうる。画像[202]を、画像[201]から減算することによって、画像[201]と画像[202]との間の差異についての情報を含有する第3の差分画像[205]が得られる。差し引きされた画像間で変化しないピクセル、すなわち、画像[201]及び画像[202]のいずれでも白色又は中間グレーであるピクセルは、等しいピクセル値どうしを減算すると、差分画像のピクセル値0が得られるので、差分画像[205]では黒色ピクセルをもたらす。画像[201]と画像[202]との間で異なるピクセルは、ピクセル値の差の絶対値に等しい値を有する差分画像[205]におけるピクセル値をもたらす。結果として、差分画像におけるピクセル1,2[206]及びピクセル2,2[207]のいずれも、画像[201]と画像[202]との間で異なる2つのピクセルを表す中間グレーの値を有する。したがって、差分画像[205]におけるピクセル値の解析を用いて、2つの画像[201]と画像[202]との間の差異についての定量的な測定値をもたらすことができる。モデル画像全体についての画像差分の工程を、図3に概略的に図解するが、この場合、2つの同一の画像[A]と画像[A]とを減算すると、差分画像[A-A]がもたらされ、この場合、すべてのピクセル値はゼロとなり、完全な黒色画像が得られる。同一でない画像[A]と画像[B]とを減算すると、黒色ピクセルと中間グレーピクセルとが混合した差分画像[A-B]が結果としてもたらされる。差分画像[A-B]において、黒色ピクセルは、画像[A]と画像[B]とが同一である領域、すなわち、等価ピクセルがいずれも白色255-255=0であるか、又はいずれも中間グレー128-128=0である領域を示す。差分画像[A-B]における中間グレーの領域は、画像[A]と画像[B]とが異なる領域、すなわち、ABS128-255=127又はABS255-128=127であるので、1つの画像ではピクセルが白色であり、他の画像ではピクセルが中間グレーである領域を指す。結果として、画像[A]及び画像[B]を時系列の画像から抜き出す場合、差分画像[A-B]を用いて、例えば、画像[A]における円が、画像[B]における楕円へと変形する、運動及び/又は変換を解析することができる。画像の任意の時系列で、撮像される生体又は標本が、撮像中にカメラ又は他の画像捕捉デバイスに対して動かないと仮定し、照明の強度が一定に維持されるとさらに仮定すれば、逐次に記録される画像間における任意の差異は、生体領域内の運動に起因し、本発明の方法による画像差分を用いて生体内の運動を解析するのに、時系列の画像を用いることができる。ヒト胚性幹細胞を分化させることによって誘導した、自発的に拍動する心筋細胞のビデオ顕微鏡法によるシークエンスからの2つのフレームを用いる図4に、この工程を図解する。時系列からの2つの画像[A]と画像[B]とを減算すると、差分画像[A-B]が得られ、この場合、大半のピクセルが低値黒色及び暗いグレーであることから、これらの点では、2つの画像間の差異が最小であることが示される。他の領域では、ピクセルが高値であることから、[A]と[B]との間の差異が示される。ビデオ画像を取得する間、心筋細胞培養もビデオカメラも動かさなかったので、差分画像[A-B]で>0のピクセル値を結果としてもたらす、フレーム[A]とフレーム[B]との差異は、画像領域内の運動に起因する、すなわち、心筋細胞の拍動に起因する運動である。画像差分の工程は、時系列における多数の画像の解析、例えば、ビデオ画像のシークエンス全体における複数のフレームの解析を可能とするように拡張することができる。時系列の画像における複数のフレームを解析する場合図5、個別のフレーム[f1]~[fn]を、基準フレーム[fR]から差し引いて、対応する差分画像[fR-1]~[fR-n]をもたらす。基準フレーム[fR]は、系列[f1]~[fn]の外部にある時系列中の任意の時点から選択することができる、すなわち、系列の差分画像[fR-1]~[fR-n]から抽出される得られるデータが連続であることを確保するため、[fR]を、[f1]に先行するフレームであるように選択することもでき、[fn]に後続するように選択することもできる。差分画像をもたらす工程は、半自動化された工程又は完全に自動化された工程で、標準的な画像処理ソフトウェアを用いて容易に実行することができる。次いで、系列の差分画像を用いて、1以上の測定値を導き出し、これを用いて、画像の差異を定量化してグラフ表示し、撮像時系列内の運動をさらに解析することができる。適切な測定値としては、特に限定されないが、平均ピクセル強度、合計ピクセル強度及びメジアンピクセル強度が挙げられる。得られるデータを時系列として、例えば、平均ピクセル強度を画像取り込み時間に対してプロットすると、ある時間にわたる細胞培養内の運動についてのグラフ表示が得られる。自発的に拍動する心筋細胞培養により示されるような一定の収縮運動及び弛緩運動を示す培養物の場合、定義域を時間とする運動のグラフ表示は、反復波の形態をとるであろう。検出される運動の頻度、例えば、心筋細胞培養の拍動数を確立するには、標準的なフーリエ解析手順FastFourierTransformsWalkerJSCRCPress1996を用いて、データを、定義域を時間とするものから、定義域を周波数とするものへと変換することができる。或いは、時系列データに対して相関解析を実施して、反復の頻度を確立することもできる。実施例1心筋細胞は、米国特許第7452718号に記載されている通り、H7ヒト胚性幹細胞hESC系列を分化させることによって得た。未分化のH7hESC細胞を、24ウェルのMatrigelでコーティングしたプレートに播種した。未分化細胞として1週間にわたり増殖させた後で、培地を、50ng/mLのアクチビンA及び50ng/mLのBMP-4を伴うRPMIB27補充培地に交換した。4日後、培地の交換により、増殖因子を除去し、次いで、単独のRPMIB27培地中でさらに14日間にわたり細胞を培養したところ、Nkx2.5、α-アクチニン、及び心筋細胞の他のマーカーを発現する細胞が結果として得られ、これらは、自発的な拍動を示した。10フレーム/秒で取り込んだ、hESCに由来する、自発的に拍動する心筋細胞のビデオ画像ファイルを、AdobeImageReadyへとインポートし、114枚のビデオ画像フレームの代表的な系列を、.wmvによるビデオ画像ファイルから抽出し、AdobePhotoshopへとエクスポートした。得られるファイルは、各々が、時系列で昇順に並べられた、元のビデオ画像からの単一のフレームを含む、114の画像層を含有した。画像対の差引は、フレーム114を基準フレームと指定し、Photoshopの画像層ブレンドモードを、この画像層についての差に設定した。1~113の各画像フレーム層を逐次に選択することによって、系列の差分画像が得られた。画像10を基準フレームから減算する差分画像[fR-10]から、画像18を基準フレームから減算する差分画像[fR-18]までの差分画像の例を、図6に示す。差分画像[fR-10]~[fR-18]を目視により検討したところ、画像のピクセル強度は、黒色が優勢な[fR-10]から、ピクセル強度が増大し、次いで減少する、[fR-11]~[fR-17]の画像を経て継時的に変化し、系列における最後の画像である[fR-18]は、低値のピクセル強度値が優勢となった。差分画像におけるピクセル強度のこれらの変化は、画像フレームと基準フレームとの間における画像の差異の周期的な変化を示す。Photoshopのヒストグラム表示関数を用いてピクセル強度値を検討した図7ところ、目視検討により観察されるピクセル強度の変化が、差分画像[fR-10]の平均ピクセル強度値を6.42とし、差分画像[fR-12]の平均ピクセル強度値を25.12とする、ピクセル強度の定量的変化と相関することが示された。系列の差分画像について平均ピクセル強度値をプロットした図8ところ、各々のフレーム間における画像の差異について観察される周期的パターンが確認されたことから、この方法により、ビデオによる時系列画像における運動が検出されていることが示された。ビデオ画像における心筋細胞の拍動頻度を測定するため、113枚の差分画像についての平均ピクセル強度を、それらの対応するフレーム番号に対してプロットした図9。結果は、8フレームごとに1回の拍動サイクルの頻度で、ビデオ画像のシークエンスの持続時間にわたり振幅の変化がわずかである、連続的な自発的拍動を示す。113のフレームにわたる平均ピクセル強度値の系列図8と、1フレームの増分でシフトさせた同じデータ系列との絶対差の合計を計算することによる相関解析図10を用いて、心筋細胞の拍動頻度を数学的に裏付けた。データにおいて、8フレームのシフトにより差異の最小値が得られたこと図10は、画像差分により検出された、8フレームの運動周期と符合する。これは、x及びyによるデータ間における8回の位置シフトを用いる、時系列データについてのスタガード格子による散布図に対して、線形回帰解析r2=0.99及び傾き=0.99の相関をもたらすを用いて裏付けた。ビデオによる撮像に用いた10フレーム/秒の場合、これは、自発的に拍動するヒト心筋細胞の典型的な値である、1秒間当たりの拍動1.25回、又は1分間当たりの拍動75回の拍動数に相当する。実施例210フレーム/秒で取り込んだ、ヒト胚性幹細胞に由来する、自発的に拍動する心筋細胞の第2のビデオ画像ファイルからの画像フレームを、ImageJhttprsbwebnihgovijへとインポートし、332枚の時系列画像を解析した。撮像フィールド内で、4つの矩形の部分領域を規定し、331枚の時系列画像の各々における各部分領域を、画像差分の基準としてのフレーム332における等価部分領域を用いて個別に処理した。異なる領域における心筋細胞の拍動頻度を測定するため、4つの領域の各々について、331枚の差分画像の平均ピクセル強度を、それらの対応するフレーム番号に対してプロットした図11。これらの領域のうちの1つに由来するデータに対して、MicrosoftExcelによりフーリエ解析を実施した図12ところ、心筋細胞の拍動について、1分間当たりの拍動124回に相当する主周波数2.07Hzが示された。本発明を、多様な実施形態との関連で説明してきたが、当業者は、多くの異なる実施形態及び変更が可能であることを認めるであろう。かかる変更及び実施形態のすべては、付属の特許請求の範囲により規定される、本発明の範囲内に収まることを意図する。"