"少なくとも1つの液体試料中に存在し得る少なくとも第1および第2の標的核酸を増幅するための自動化された方法であって、該方法は:d該核酸と、逆転写酵素活性を有するポリメラーゼを含む増幅試薬を含む溶液および該第1または第2の標的核酸に特異的なオリゴヌクレオチドとを、該逆転写酵素活性を有するポリメラーゼによるRNAの転写が起こるのに適当な期間、該逆転写酵素活性を有するポリメラーゼによるRNAの転写が起こるのに適当な条件下で、少なくとも2つの反応槽中で別々にインキュベートする工程、およびe該少なくとも2つの反応槽中で、該標的核酸と、該増幅試薬を含む溶液および該第1または第2の標的核酸に特異的なオリゴヌクレオチドとを、該第1および第2の標的核酸の存在または非存在を示す増幅反応が起こるのに充分な期間、該第1および第2の標的核酸の存在または非存在を示す増幅反応が起こるのに充分な条件下で別々にインキュベートする工程を含み、該第1および該第2の反応槽中の溶液は、同じ割合の増幅試薬を含み、該第1の標的核酸に対するオリゴヌクレオチドは、該少なくとも2つの反応槽の第1の反応槽中に存在し、該少なくとも2つの反応槽の第2の反応槽中に存在せず、該第2の標的核酸に対するオリゴヌクレオチドは、該少なくとも2つの反応槽の第2の反応槽中に存在し、該少なくとも2つの反応槽の第1の反応槽中に存在しない、方法。該第1および該第2の反応槽中の溶液が、同じ濃度の増幅試薬を含む、請求項1記載の自動化された方法。該標的核酸がRNAである、請求項1または2記載の自動化された方法。該標的核酸がDNAである、請求項1または2記載の自動化された方法。工程eおよびdの前に:a1異なる型の液体試料を含む複数の槽を提供する工程、a2標的核酸を含む核酸が固相支持材上に固定化されるのに充分な期間、標的核酸を含む核酸が固相支持材上に固定化されるのに充分な条件下で、固相支持材と、該複数の槽中の該複数の異なる型の液体試料とを共に合わせる工程、b分離ステーションにおいて、該液体試料中に存在する他の材料から該固相支持材を単離する工程、およびc該固相支持材から液体試料を分離し、該固相支持材を、洗浄バッファで一回以上洗浄することにより、分離ステーション中で核酸を精製する工程が行なわれ、工程a2における条件および期間が複数の異なる型の液体試料のいずれか1つについて同じである、請求項1~4のいずれか記載の自動化された方法。工程dおよびeにおける転写および増幅の条件が、該第1および第2の反応槽に含まれる少なくとも第1および第2の標的核酸について同じである、請求項4または5記載の方法。該第1および第2の標的核酸が、別々の槽中で同時に増幅される、請求項1~6いずれか記載の方法。該第1の標的核酸を増幅するための反応混合物が、該第1の標的核酸に特異的な最適化された濃度のオリゴヌクレオチドを含み、該第2の標的核酸を増幅するための反応混合物が、該第2の標的核酸に特異的な最適化された濃度のオリゴヌクレオチドを含む、請求項1~7いずれか記載の方法。該第1の標的核酸を増幅するための反応混合物中の該第1の標的核酸に特異的なオリゴヌクレオチドの濃度が、該第2の標的核酸を増幅するための反応混合物中の該第2の標的核酸に特異的なオリゴヌクレオチドの濃度と実質的に同じである、請求項1~8いずれか記載の方法。少なくとも1つの試料中に存在し得る少なくとも2つの異なる核酸を単離および増幅するための分析システムであって、他の材料から該核酸を分離するために構築され、かつ配置された分離ステーション、増幅試薬を含む溶液を含む少なくとも1つの容器を含むキット、第1の標的核酸を増幅するためのオリゴヌクレオチドを含む第1の溶液、第2の標的核酸を増幅するためのオリゴヌクレオチドを含む第2の溶液、および反応槽を含む増幅ステーションを含み、該増幅試薬を含む溶液と、オリゴヌクレオチドを含む第1または第2の溶液とは、該反応槽が増幅試薬、分離された標的核酸およびオリゴヌクレオチドを含むように合わされ、増幅試薬の割合は、第1の標的核酸を増幅するためのオリゴヌクレオチドを含む反応槽中と、第2の標的核酸を増幅するためのオリゴヌクレオチドを含む反応槽中で同じである、分析システム。該増幅試薬の濃度が全ての反応槽中で同じである、請求項10記載のシステム。少なくとも第1および第2の標的核酸を、別々の反応槽中で別々に逆転写して増幅するためのキットであって、該キットは、少なくとも1つの容器を含み、該容器は、逆転写酵素活性を有するポリメラーゼを含み、かつオリゴヌクレオチドを含まない溶液を含む、キット。少なくとも1つの液体試料中に存在し得る少なくとも2つの異なる標的核酸を別々に増幅するための方法であって、a標的核酸を増幅するための溶液を含み、かつオリゴヌクレオチドを含まない少なくとも1つの容器を提供する工程、bある容量の該溶液を少なくとも2つの容器に移す工程、c第1の標的核酸を増幅するための特異的なオリゴヌクレオチドを、該容器の第1の容器に添加して、第2の標的核酸を増幅するための特異的なオリゴヌクレオチドを、該容器の第2の容器に添加する工程、d該容器の内容物を混合する工程、e該第1および第2の容器を、該第1の標的核酸を自動的に増幅するための自動分析器に装填する工程、f該第1の標的核酸と、第1の反応槽中の該第1の容器のある容量の混合内容物とを合わせ、該第2の標的核酸と、第2の反応槽中の該第2の容器のある容量の混合内容物とを合わせる工程、およびg工程fの後、該第1および第2の反応槽の内容物を、該第1または第2の標的核酸の存在または非存在を示す増幅反応が起こるのに充分な期間、該第1または第2の標的核酸の存在または非存在を示す増幅反応が起こるのに充分な条件下でインキュベートする工程を含み、工程bが工程cの前または後に実施される、方法。工程dの後に、該第1の容器の混合内容物を第1の試薬容器に移し、該第2の容器の混合内容物を第2の試薬容器に移す工程、および工程fにおいて、該第1および第2の容器の混合内容物を含む第1および第2の試薬容器を該自動分析器に装填する工程をさらに含む、請求項13記載の方法。本発明の課題は、増幅用一般バッファーを提供することである。即ち、本発明の要旨は、1少なくとも1つの液体試料中に存在し得る少なくとも第1および第2の標的核酸を増幅するための自動化された方法であって、該方法は:d該核酸と、逆転写酵素活性を有するポリメラーゼを含む増幅試薬を含む溶液および該第1または第2の標的核酸に特異的なオリゴヌクレオチドとを、該逆転写酵素活性を有するポリメラーゼによるRNAの転写が起こるのに適当な期間、該逆転写酵素活性を有するポリメラーゼによるRNAの転写が起こるのに適当な条件下で、少なくとも2つの反応槽中で別々にインキュベートする工程、およびe該少なくとも2つの反応槽中で、該標的核酸と、該増幅試薬を含む溶液および該第1または第2の標的核酸に特異的なオリゴヌクレオチドとを、該第1および第2の標的核酸の存在または非存在を示す増幅反応が起こるのに充分な期間、該第1および第2の標的核酸の存在または非存在を示す増幅反応が起こるのに充分な条件下で別々にインキュベートする工程を含み、該第1および該第2の反応槽中の溶液は、同じ割合の増幅試薬を含み、該第1の標的核酸に対するオリゴヌクレオチドは、該少なくとも2つの反応槽の第1の反応槽中に存在し、該少なくとも2つの反応槽の第2の反応槽中に存在せず、該第2の標的核酸に対するオリゴヌクレオチドは、該少なくとも2つの反応槽の第2の反応槽中に存在し、該少なくとも2つの反応槽の第1の反応槽中に存在しない、方法、2該第1および該第2の反応槽中の溶液が、同じ濃度の増幅試薬を含む、1記載の自動化された方法、3該標的核酸がRNAである、1または2記載の自動化された方法、4該標的核酸がDNAである、1または2記載の自動化された方法、5工程eおよびdの前に:a1異なる型の液体試料を含む複数の槽を提供する工程、a2標的核酸を含む核酸が固相支持材上に固定化されるのに充分な期間、標的核酸を含む核酸が固相支持材上に固定化されるのに充分な条件下で、固相支持材と、該複数の槽中の該複数の異なる型の液体試料とを共に合わせる工程、b分離ステーションにおいて、該液体試料中に存在する他の材料から該固相支持材を単離する工程、およびc該固相支持材から液体試料を分離し、該固相支持材を、洗浄バッファで一回以上洗浄することにより、分離ステーション中で核酸を精製する工程が行なわれ、工程a2における条件および期間が複数の異なる型の液体試料のいずれか1つについて同じである、1~4のいずれか記載の自動化された方法、6工程dおよびeにおける転写および増幅の条件が、該第1および第2の反応槽に含まれる少なくとも第1および第2の標的核酸について同じである、4または5記載の方法、7該第1および第2の標的核酸が、別々の槽中で同時に増幅される、1~6いずれか記載の方法、8該第1の標的核酸を増幅するための反応混合物が、該第1の標的核酸に特異的な最適化された濃度のオリゴヌクレオチドを含み、該第2の標的核酸を増幅するための反応混合物が、該第2の標的核酸に特異的な最適化された濃度のオリゴヌクレオチドを含む、1~7いずれか記載の方法、9該第1の標的核酸を増幅するための反応混合物中の該第1の標的核酸に特異的なオリゴヌクレオチドの濃度が、該第2の標的核酸を増幅するための反応混合物中の該第2の標的核酸に特異的なオリゴヌクレオチドの濃度と実質的に同じである、1~8いずれか記載の方法、10少なくとも1つの試料中に存在し得る少なくとも2つの異なる核酸を単離および増幅するための分析システムであって、他の材料から該核酸を分離するために構築され、かつ配置された分離ステーション、増幅試薬を含む溶液を含む少なくとも1つの容器を含むキット、第1の標的核酸を増幅するためのオリゴヌクレオチドを含む第1の溶液、第2の標的核酸を増幅するためのオリゴヌクレオチドを含む第2の溶液、および反応槽を含む増幅ステーションを含み、該増幅試薬を含む溶液と、オリゴヌクレオチドを含む第1または第2の溶液とは、該反応槽が増幅試薬、分離された標的核酸およびオリゴヌクレオチドを含むように合わされ、増幅試薬の割合は、第1の標的核酸を増幅するためのオリゴヌクレオチドを含む反応槽中と、第2の標的核酸を増幅するためのオリゴヌクレオチドを含む反応槽中で同じである、分析システム、11該増幅試薬の濃度が全ての反応槽中で同じである、10記載のシステム、12少なくとも第1および第2の標的核酸を、別々の反応槽中で別々に逆転写して増幅するためのキットであって、該キットは、少なくとも1つの容器を含み、該容器は、逆転写酵素活性を有するポリメラーゼを含み、かつオリゴヌクレオチドを含まない溶液を含む、キット、13少なくとも1つの液体試料中に存在し得る少なくとも2つの異なる標的核酸を別々に増幅するための方法であって、a標的核酸を増幅するための溶液を含み、かつオリゴヌクレオチドを含まない少なくとも1つの容器を提供する工程、bある容量の該溶液を少なくとも2つの容器に移す工程、c第1の標的核酸を増幅するための特異的なオリゴヌクレオチドを、該容器の第1の容器に添加して、第2の標的核酸を増幅するための特異的なオリゴヌクレオチドを、該容器の第2の容器に添加する工程、d該容器の内容物を混合する工程、e該第1および第2の容器を、該第1の標的核酸を自動的に増幅するための自動分析器に装填する工程、f該第1の標的核酸と、第1の反応槽中の該第1の容器のある容量の混合内容物とを合わせ、該第2の標的核酸と、第2の反応槽中の該第2の容器のある容量の混合内容物とを合わせる工程、およびg工程fの後、該第1および第2の反応槽の内容物を、該第1または第2の標的核酸の存在または非存在を示す増幅反応が起こるのに充分な期間、該第1または第2の標的核酸の存在または非存在を示す増幅反応が起こるのに充分な条件下でインキュベートする工程を含み、工程bが工程cの前または後に実施される、方法、14工程dの後に、該第1の容器の混合内容物を第1の試薬容器に移し、該第2の容器の混合内容物を第2の試薬容器に移す工程、および工程fにおいて、該第1および第2の容器の混合内容物を含む第1および第2の試薬容器を該自動分析器に装填する工程をさらに含む、13記載の方法に関する。本発明により、増幅用一般バッファーが提供される。本発明は、種々の型のパラメータを試験するための改善された方法、システム、方法、キットおよび試薬を提供する。一般説明本発明は、少なくとも1つの液体fluid試料中に存在し得る少なくとも第1および第2の標的核酸を増幅するための方法に関する。前記方法は、少なくとも2つの反応槽内で、前記核酸を、増幅試薬を含む溶液と前記第1および第2の標的核酸に特異的なオリゴヌクレオチドとともに、逆転写酵素活性を有するポリメラーゼによるRNAの転写が起こるのに適した期間および条件下で、別々にインキュベートする工程を含み、前記増幅試薬は、逆転写酵素活性を有するポリメラーゼを含む。この第1のインキュベーション後、標的核酸を、該少なくとも2つの反応槽内で、増幅試薬を含む溶液と前記第1または第2の標的核酸に特異的なオリゴヌクレオチドとともに、前記第1および第2の標的核酸の存在または非存在を示す増幅反応が起こるのに充分な期間および条件下で、別々にインキュベートする。該方法において、第1および第2の反応槽内の溶液は同じ割合の増幅試薬を含む。第1標的核酸に対するオリゴヌクレオチドは、少なくとも2つの反応槽の第1のものに存在し、少なくとも2つの反応槽の第2のものには存在せず、第2標的核酸に対するオリゴヌクレオチドは、少なくとも2つの反応槽の第2のものに存在し、少なくとも2つの反応槽の第1のものには存在しない。本発明はまた、少なくとも1つの試料中に存在し得る少なくとも2種類の異なる核酸を単離および増幅するためのシステムに関する。該システムは、他の材料から前記核酸を分離するために構築され、かつ配置された分離ステーション、少なくとも1つの容器を含むキット、前記少なくとも1つの容器は、増幅試薬を含む溶液を含む、第1標的核酸を増幅するためのオリゴヌクレオチドを含む第1溶液、第2標的核酸を増幅するためのオリゴヌクレオチドを含む第2溶液、反応槽を含む増幅ステーションを含む。増幅試薬を含む溶液とオリゴヌクレオチドを含む第1または第2の溶液は、前記反応槽が増幅試薬、別個の標的核酸およびオリゴヌクレオチドを含むように合わされ、ここで、増幅試薬の割合は、第1標的核酸を増幅するためのオリゴヌクレオチドを含む反応槽と、第2標的核酸を増幅するためのオリゴヌクレオチドを含む反応槽において同一である。本発明は、さらに、少なくとも第1および第2の標的核酸を別々の反応槽内で別々に逆転写し、増幅するためのキットに関し、前記キットは少なくとも1つの容器を含み、前記容器は、逆転写酵素活性を有するポリメラーゼを含み、オリゴヌクレオチドを含まない溶液を含む。さらに、本発明は、少なくとも1つの液体試料中に存在し得る少なくとも2種類の異なる標的核酸を別々に増幅するための方法に関する。該方法は、標的核酸を増幅するための溶液を含み、オリゴヌクレオチドを含まない少なくとも1つの容器を提供する工程を含む。ある容量の前記溶液を少なくとも2つの容器に移し、第1標的核酸の増幅に特異的なオリゴヌクレオチドを前記容器の第1のものに、および第2標的核酸の増幅に特異的なオリゴヌクレオチドを前記容器の第2のものに添加する。また、オリゴヌクレオチドを、溶液を添加する前に容器に移してもよい。次いで、容器の内容物を混合する。次いで、前記第1および第2の標的核酸を自動的に増幅するために、第1および第2容器を自動分析器に装填loadする。分析器において、第1標的核酸を第1反応槽の第1容器のある容量の混合された内容物と合わせ、第2標的核酸を、第2反応槽の第2容器のある容量の混合された内容物と合わせる。この工程後、反応槽の内容物を、第1および第2の標的核酸の存在または非存在を示す増幅反応が起こるのに充分な期間および条件下でインキュベートする。詳細説明本発明は、少なくとも1つの液体試料中に存在し得る少なくとも第1および第2の標的核酸を増幅するための方法に関する。前記方法は、少なくとも2つの反応槽内で、前記核酸を、増幅試薬を含む溶液と前記第1または第2の標的核酸に特異的なオリゴヌクレオチドとともに、逆転写酵素活性を有するポリメラーゼによるRNAの転写が起こるのに適した期間および条件下で、別々にインキュベートする工程を含み、前記増幅試薬は、逆転写酵素活性を有するポリメラーゼを含む。この第1のインキュベーション後、標的核酸を、該少なくとも2つの反応槽内で、増幅試薬を含む溶液と前記第1および第2の標的核酸に特異的なオリゴヌクレオチドとともに、前記第1および第2の標的核酸の存在または非存在を示す増幅反応が起こるのに充分な期間および条件下で、別々にインキュベートする。該方法において、第1および第2の反応槽内の溶液は同じ割合の増幅試薬を含む。第1標的核酸に対するオリゴヌクレオチドは、少なくとも2つの反応槽の第1のものに存在し、少なくとも2つの反応槽の第2のものには存在せず、第2標的核酸に対するオリゴヌクレオチドは、少なくとも2つの反応槽の第2のものに存在し、少なくとも2つの反応槽の第1のものには存在しない。本発明の利点の1つは、単一の溶液を用いて、種々の核酸を充分な効率で増幅できることである。これにより、核酸すなわち、オリゴヌクレオチドおよび/または対照核酸のみが最適化する必要があるので、アッセイの開発が単純化される。最適化は、配列の最適化、核酸の修飾の最適化および/またはアッセイにおける濃度の最適化を含むと理解されたい。核酸増幅方法の1つは、数ある参考文献の中で、米国特許第4683202号、同第4683195号、同第4800159号、および同第4965188号に開示されたポリメラーゼ連鎖反応PCRである。PCRでは、典型的に、選択された核酸鋳型例えば、DNAまたはRNAに結合する2種類以上のオリゴヌクレオチドプライマーが使用される。核酸分析に有用なプライマーとしては、標的核酸の核酸配列内での核酸合成の開始点として作用し得るオリゴヌクレオチドが挙げられる。プライマーは、従来の方法による制限消化によって精製され得るか、または合成により作製され得る。プライマーは、通常、増幅における最大効率のために一本鎖であるが、プライマーは二本鎖であってもよい。二本鎖プライマーを、まず、変性、すなわち、鎖を分離するための処理をする。二本鎖核酸を変性させる方法の1つは加熱によるものである。熱安定性ポリメラーゼは、熱安定性であるポリメラーゼ酵素である、すなわち、鋳型に相補的なプライマー伸長産物の形成を触媒するが、二本鎖鋳型核酸の変性が行なわれるのに必要な時間、高温に供された場合、不可逆的に変性しない酵素である。一般的に、合成は、各プライマーの3’末端において開始され、5’から3’の方向に鋳型鎖に沿って進行する。熱安定性ポリメラーゼは、例えば、サーマスフラバス、T.ルベール、T.サーモフィラス、T.アクアチカス、T.ラクテウス、T.ルーベンス、バチルスステアロサーモフィラス、およびメタノサーマスフェルビダスから単離されている。それにもかかわらず、熱安定性でないポリメラーゼも、該酵素が補給されるのであれば、PCRアッセイにおいて使用され得る。鋳型核酸が二本鎖である場合、PCRにおいて鋳型として使用され得る前に、2つの鎖を分離することが必要である。鎖の分離は、物理的、化学的または酵素的手段などの任意の適当な変性方法によってなされ得る。核酸鎖を分離する方法の1つは、大部分が変性される例えば、50、60、70、80、90または95より多くが変性されるまで核酸を加熱することを伴う。鋳型核酸を変性させるために必要な加熱条件は、例えば、バッファー塩濃度ならびに変性させる核酸の長さおよびヌクレオチド組成に依存するが、温度および核酸の長さなどの反応の特徴に応じた時間の間で、典型的に、約90°C~約105°Cの範囲である。変性は、典型的に、約5秒~9分間行なわれる。例えば、Z05DNAポリメラーゼなどのそれぞれのポリメラーゼを、かかる高温に長すぎる時間、曝露させず、したがって、機能性酵素の損失のリスクを負わないようにするため、通常、短い変性工程が使用される。本発明の一態様において、変性工程は30秒まで、20秒まで、10秒まで、5秒まで、または約5秒である。二本鎖鋳型核酸を、熱によって変性させる場合、反応混合物を、各プライマーのその標的核酸上の標的配列へのアニーリングが促進される温度まで冷却させる。アニーリングの温度は、約35°C~約70°C、もしくは約45°C~約65°C;または約50°C~約60°C、もしくは約55°C~約58°Cである。アニーリング時間は、約10秒~約1分例えば、約20秒~約50秒;約30秒~約40秒であり得る。これに関連して、それぞれのアッセイの包括性を増大させるために種々のアニーリング温度を使用することが有利であり得る。簡単には、これは、比較的低いアニーリング温度で、プライマーは、単一のミスマッチを有する標的にも結合し得、そのため、特定の配列のバリアントも増幅され得ることを意味する。これは、例えば、特定の生物が、同じく検出されるべき既知または未知の遺伝子バリアントを有する場合、望ましいものであり得る。他方、比較的高いアニーリング温度は、高温になるほど、プライマーが、正確にマッチしていない標的配列に結合する可能性が連続的に減少するため、高い特異性をもたらすという利点を有する。両方の現象の利益を受けるため、本発明のいくつかの態様では、上記の方法が、異なる温度での、または最初は低温、次いで高温でのアニーリングを含むことが有利である。例えば、第1のインキュベーションが55°Cで約5サイクル行なわれる場合、正確にマッチしていない標的配列は予備増幅され得る。この後、例えば、58°Cで約45サイクルが行なわれ得、実験の大部分の間において、より高い特異性がもたらされる。このように、潜在的に重要な遺伝子バリアントは失われずに、特異性は比較的高いままである。次いで、反応混合物は、ポリメラーゼの活性が促進または最適化される温度に、すなわち、アニーリングされたプライマーから伸長が起こり、分析される核酸に相補的な産物が生成されるのに充分な温度に調整される。温度は、核酸鋳型にアニーリングされる各プライマーから伸長産物が合成されるのに充分であるべきだが、その相補的な鋳型から伸長産物が変性するほど高いべきでない例えば、伸長の温度は、一般的に、約40~80°Cの範囲例えば、約50°C~約70°C;約60°Cである。伸長時間は、約10秒~約5分、または約15秒~2分、または約20秒~約1分、または約25秒~約35秒であり得る。新たに合成された鎖は二本鎖分子を形成し、これは、その後の反応工程で使用され得る。鎖分離、アニーリングおよび伸長の工程は、標的核酸に対応する所望の量の増幅産物が生成されるのに必要なだけ多く繰り返され得る。反応における制限因子は、反応中に存在するプライマー、熱安定性酵素およびヌクレオシド三リン酸の量である。サイクル工程すなわち、変性、アニーリング、および伸長は、少なくとも1回繰り返される。検出における使用では、サイクル工程の回数は、例えば、試料の性質に依存する。試料が核酸の複雑な混合物である場合、検出に充分な標的配列を増幅するのに、より多くのサイクル工程が必要とされる。一般的に、サイクル工程は、少なくとも約20回繰り返されるが、40回、60回、さらには100回ほど多く繰り返してもよい。本発明の範囲内で、アニーリング工程と伸長工程が同じ工程で行なわれるPCR一工程PCRを行なってもよく、上記のように、別々の工程二工程PCRで行なってもよい。アニーリングと伸長を一緒に、したがって、同じ物理的および化学的条件下で、例えば、Z05DNAポリメラーゼなどの適当な酵素を用いて行なうことは、各サイクルにおいてさらなる工程のための時間が節約され、また、アニーリングと伸長間のさらなる温度調整の必要性が排除されるという利点を有する。したがって、一工程PCRにより、それぞれのアッセイの全体的な複雑さが低減される。一般に、結果までの時間が短くなり、早期診断の可能性がもたらされるため、増幅全体の時間が短いほどよい。本発明に関連して使用される他の核酸増幅方法は、リガーゼ連鎖反応LCR;WuDYandWallaceRB,Genomics4198956069;およびBaranyF,ProcNatlAcadSciUSA881991189193;ポリメラーゼリガーゼ連鎖反応BaranyF,PCRMethodsandApplic11991516;GapLCRWO9001069;修復連鎖反応EP0439182A2、3SRKwohDYetal,ProcNatlAcadSciUSA86198911731177;GuatelliJC,etal,ProcNatlAcadSciUSA87199018741878;WO9208808、およびNASBAUS5130238を含む。さらに、鎖置換増幅SDA、転写媒介性増幅TMA、例えば、リアルタイムTMA、およびQβ増幅総説については、例えば、WhelenACandPersingDH,AnnuRevMicrobiol501996349373;AbramsonRDandMyersTW,CurrOpinBiotechnol419934147を参照のことがある。適当な核酸検出方法は、当業者に公知であり、SambrookJetal,MolecularCloning:ALaboratoryManual、ColdSpringHarborLaboratoryPress、ColdSpringHarbor、NewYork、1989およびAusubelFetal:CurrentProtocolsinMolecularBiology1987、JWileyandSons、NYなどの標準的な教科書に記載されている。また、核酸検出工程を行なう前に、例えば、沈殿工程などのさらなる精製工程を行なってもよい。検出方法としては、限定されないが、二本鎖DNA内にインターカレートし、その後、その蛍光を変化させるエチジウムブロミドなどの特異的色素の結合またはインターカレーションが挙げられ得る。また、精製された核酸を、制限消化後、任意に電気泳動法によって分離し、その後、可視化してもよい。また、特定の配列に対するオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションおよびその後のハイブリッドの検出を利用するプローブ系アッセイが存在する。増幅された標的核酸は、分析の結果を評価するため、増幅反応中または増幅反応後に検出され得る。特に、リアルタイムでの検出では、核酸プローブを使用することが有利である。市販のリアルタイムPCR装置例えば、LightCyclerTMまたはTaqManを使用することにより、PCR増幅と増幅産物の検出を単一の密閉キュベット内で併合することができ、サイクル時間が劇的に低減される。検出が増幅と同時に行なわれるため、リアルタイムPCR法では、増幅産物の操作の必要性が省かれ、増幅産物間の交差汚染のリスクが低減される。リアルタイムPCRにより、所要時間が大きく低減され、臨床検査室における従来のPCR技術の魅力的な代替法である。しかしながら、当業者に公知の他の検出方法も使用され得る。第1標的核酸および第2標的核酸は異なる核酸である。用語液体fluid試料は、本明細書で使用される場合、核酸を標的とする診断アッセイに供され得る任意の液体fluid材料を含み、通常、生物学的供給源に由来する。いくつかの態様において、前記液体試料は、ヒトに由来し、体液である。本発明の一態様において、液体試料は、ヒトの血液、尿、痰、汗、スワブ、ピペット使用可能な便、または脊髄液である。用語反応槽reactionvesselは、本明細書で使用される場合、限定されないが、例えば、逆転写またはポリメラーゼ連鎖反応などの液体試料の分析のための反応が起こるチューブ、またはマイクロウェル、ディープウェルもしくは他の型のマルチウェルプレートなどのウェルのプレートに関する。かかる槽の外側境界または壁は、内部で起こっている分析反応を妨げないように化学的に不活性である。また、上記の核酸の単離はマルチウェルプレート内で行なわれる。これに関連して、分析系内のマルチウェルプレートでは、多数の試料の並行した分離および分析または保存が可能である。マルチウェルプレートは、最大の液体の取込みのため、または最大の熱移動のために最適化され得る。本発明との関連における使用のためのマルチウェルプレートの一態様は、自動分析器で分析物をインキュベートするため、または分離するために最適化される。別のマルチウェルプレートは、磁性デバイスおよび/または加熱デバイスと接触するように構築され、かつ配置されたものである。マルチウェルプレートの態様を、本明細書において以下にさらに説明する。核酸ならびに標的核酸は、当業者に公知のヌクレオチドのポリマー化合物である。標的核酸は、本明細書において、分析すべき試料中の、すなわち、試料中のその存在、非存在および/または量を測定すべき核酸を表すために使用される。本発明によれば、オリゴマー化合物は、ヌクレオチド単独または非天然化合物下記参照、より詳しくは、修飾ヌクレオチドもしくはヌクレオチドアナログまたは非ヌクレオチド化合物の単独またはその組合せであり得るモノマー単位からなる化合物である。オリゴヌクレオチドおよび修飾オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドアナログは、オリゴマー化合物の亜群である。本発明との関連において、用語オリゴヌクレオチドは、モノマー単位として複数のヌクレオチドから形成された成分をいう。リン酸基は、一般に、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間主鎖backboneを形成しているといわれる。RNAおよびDNAの通常の結合または主鎖は、35ホスホジエステル結合である。本発明に有用なオリゴヌクレオチドおよび修飾オリゴヌクレオチド下記参照は、主に、当該技術分野で記載されているようにして、および当業者に公知のようにして合成され得る。特定配列のオリゴマー化合物の調製方法は、当該技術分野で公知であり、例えば、適切な配列のクローニングおよび制限ならびに直接化学的合成が挙げられる。化学合成法としては、例えば、NarangSAetal,MethodsinEnzymology6819799098に記載のリン酸トリエステル法、BrownEL,etal,MethodsinEnzymology681979109151に開示されたホスホジエステル法、Beaucageetal,TetrahedronLetters2219811859に開示されたホスホロアミダイト法、Gareggetal,ChemScr251985280282に開示されたHホスホネート法、およびUS4458066に開示された固相法が挙げられ得る。本発明による方法において、オリゴヌクレオチドは化学修飾されていてもよい、すなわち、プライマーおよび/またはプローブは修飾ヌクレオチドまたは非ヌクレオチド化合物を含む。その場合、プローブまたはプライマーは修飾オリゴヌクレオチドである。用語増幅試薬は、本明細書で使用される場合、核酸の増幅を可能にする化学的または生化学的成分に関する。かかる試薬は、限定されないが、核酸ポリメラーゼ、バッファー、ヌクレオシド三リン酸などのモノヌクレオチド、例えばオリゴヌクレオチドプライマーなどのオリゴヌクレオチド、塩およびそのそれぞれの溶液、検出プローブ、色素等を含む。一態様において、第1および第2の反応槽内の溶液は、同じ濃度の増幅試薬を含む。一態様において、本明細書に記載の方法では、任意の1つの標的核酸がその他の標的核酸とともに同時に増幅される。これは、多数の標的が並行して分析され得、柔軟性およびスループットが増大するため有利である。一態様において、任意の1つの標的核酸は、本明細書において前記に記載の方法によって効率的に増幅される。これにより、診断試験のスループットおよび弾力性flexibilityを増大させることが可能になる。同時には、本発明の意味において、第1および第2またはそれ以上の核酸の増幅などの2つの作用が同じときに同じ物理的条件下で行なわれることを意味する。一態様において、少なくとも第1および第2の標的核酸の同時増幅は、1つの槽内で行なわれる。別の態様において、同時増幅は、少なくとも1つの核酸は1つの槽内で、少なくとも第2核酸は第2槽内で、同じときに、特に温度およびインキュベーション時間に関して同じ物理的条件下で行なわれる。したがって、一態様において、上記の方法は、1~100cpmlもしくは05~50IUml、または1~75cpmlもしくは05~30IUml、または1~25cpmlもしくは1~20IUmlのLODをもたらす。かかるLODは、診断目的のための充分に感度のよい試験を有するために必要である。検出限界またはLODは、試料中の核酸の検出可能な最小の量または濃度を意味する。低いLODは高い感度に対応し、逆もまた同じである。LODは、通常、単位cpml、または特に核酸がウイルス核酸である場合はIUmlのいずれかによって示される。cpmlはコピー/ミリリットルを意味し、この場合、コピーは、それぞれの核酸のコピーである。IUmlは国際単位mlを表し、WHO標準を参照されたい。LODを計算するための広く使用されている方法は、プロビットProbit分析であり、これは、刺激用量と量子的quantal全か無か応答間の関係の分析方法である。典型的な量子的応答実験において、動物群に種々の用量の薬物を与える。各用量レベルでの死亡パーセントを記録する。次いで、これらのデータはプロビット分析を用いて分析され得る。プロビットモデルでは、応答パーセントが累積正規分布として用量の対数と関連していると仮定する。すなわち、用量の対数は、累積正規から死亡パーセントを読み取るための変数として使用され得る。他の確率分布ではなく、この正規分布を使用すると、可能な用量の高値側の端および低値側の端では、予測される応答率は影響を受けるが、中央付近では、ほとんど影響を受けない。プロビット分析は、異なるヒット率で適用され得る。当該技術分野で公知のように、ヒット率hitrateは、一般に、パーセントで示され、分析物の特定の濃度での陽性結果の割合を示す。したがって、例えば、LODが95ヒット率で測定され得る場合、これは、LODが、有効な結果の95が陽性である状況settingで計算されることを意味する。特定のウイルス由来の可能な標的核酸のいくつかの例に関して、一態様において、本発明による方法は、以下のLOD:HIV:60cpmlまで、または50cpmlまで、または40cpmlまで、または30cpmlまで、または20cpmlまで、または15cpmlまでHBV:10IUmlまで、または75IUmlまで、または5IUmlまでHCV:10IUmlまで、または75IUmlまで、または5IUmlまでWNVI:20cpmlまで、または15cpmlまで、または10cpmlまでWNVII:20cpmlまで、または15cpmlまで、または10cpmlまで、または5cpmlまでJEV:100cpmlまで、または75cpmlまで、または50cpmlまで、または30cpmlまでSLEV:100cpmlまで、または75cpmlまで、または50cpmlまで、または25cpmlまで、または10cpmlまでを提供する。本明細書において前記のLODを伴うアッセイは、インビトロ診断試験に使用され得るという利点を有する。高いLODは充分な感度ではない。したがって、本発明の特定の利点の1つは、本明細書において前記のLODを伴う本明細書に記載の種々の標的核酸の増幅のために使用され得る一般的な溶液を含む、インビトロ診断に適当な標的核酸の増幅のための単純化された方法が提供され得ることである。一態様において、標的核酸はRNAである。RNAは、限定されないが、ウイルスRNAを含む。非限定的な例を本明細書に開示する。別の態様において、標的核酸はDNAである。DNAはウイルスまたは細菌のDNAを含む。非限定的な例を本明細書に開示する。一態様において、第1および前記第2標的核酸は富化enrichされる。用語富化されるenrichedは、本明細書で使用される場合、試料中に存在する他の材料の少なくとも一部分から標的核酸を分離することを可能にする、標的核酸を含む試料を処理する任意の方法に関する。したがって、富化は、他の材料よりも多くの量の標的核酸の生成と理解することができる。核酸の精製のためにはいくつかの方法例えば:アフィニティクロマトグラフィー固定化されたプローブへのハイブリダイゼーションのような配列依存性または生体特異的方法例えば:例えば、フェノールクロロホルムを用いる液体液体抽出例えば、純粋エタノールを用いる沈殿濾紙を用いる抽出セチルトリメチルアンモニウムブロミドのようなミセル形成剤での抽出固定化されたインターカレート色素、例えば、アクリジン誘導体に対する結合シリカゲルまたはケイソウ土への吸着カオトロピック条件下での磁性ガラス粒子MGPまたは有機シラン粒子への吸着のような、配列非依存性または物理化学的方法がある。標的核酸を富化するための方法の1つは、Qiagenから市販されているPuregeneKits例えば、オーダー番号158389を用いる富化である。逆転写酵素活性を有するポリメラーゼは、RNA鋳型に基づいてDNAを合成することができる核酸ポリメラーゼである。また、これは、RNAが一本鎖cDNAに逆転写されたら、二本鎖DNAを形成することもできる。本発明の一態様において、逆転写酵素活性を有するポリメラーゼは熱安定性である。一態様において、本発明による方法は、RNA鋳型を含む試料を、前記RNA鋳型にハイブリダイズするのに充分相補的なオリゴヌクレオチドプライマーとともに、および一態様において熱安定性DNAポリメラーゼとともに、少なくとも4種類すべての天然または修飾デオキシリボヌクレオシド三リン酸の存在下、pHと金属イオン濃度の両方を緩衝する金属イオンバッファーを含む適切なバッファー中でインキュベートする工程を含む。このインキュベーションは、前記プライマーが前記RNA鋳型にハイブリダイズし、前記DNAポリメラーゼが前記デオキシリボヌクレオシド三リン酸の重合を触媒して前記RNA鋳型の配列に相補的なcDNA配列を形成するのに充分な温度で行なわれる。本明細書で使用される場合、用語cDNAは、鋳型としてリボ核酸鎖RNAを用いて合成される相補的なDNA分子をいう。RNAは、例えば、mRNA、tRNA、rRNA、またはウイルスRNAなどの別の形態のRNAであり得る。cDNAは、一本鎖、二本鎖であり得るか、またはRNAcDNAハイブリッドの場合のように相補的なRNA分子に水素結合され得る。RNA鋳型へのアニーリングに適当なプライマーはまた、PCRによる増幅にも適当であり得る。PCRでは、逆転写されたcDNA鎖に相補的な第2プライマーが伸長産物の合成の開始部位を提供する。DNAポリメラーゼによるRNA分子の増幅において、第1伸長反応はRNA鋳型を用いた逆転写であり、DNA鎖が生成される。DNA鋳型を使用する第2伸長反応では二本鎖DNA分子が生成される。したがって、DNAポリメラーゼによるRNA鋳型からの相補的なDNA鎖の合成は増幅のための出発材料を提供する。熱安定性DNAポリメラーゼは、カップリングされた一酵素逆転写増幅反応において使用され得る。これに関連して、用語均一なは、RNA標的の逆転写および増幅のための二工程の単一付加反応をいう。均一な、により、逆転写RT工程後、反応槽を開けたり、あるいは増幅工程前に反応成分を調整したりする必要がないことが意図される。不均一RTPCR反応において、逆転写後および増幅前、増幅試薬などの1種類以上の反応成分が、例えば、調整、添加または希釈され、そのために反応槽を開放しなければならないか、または少なくともその内容物を操作しなければならない。均一態様および不均一態様の両方とも本発明の範囲に含まれるが、RTPCRには均一形式が有利である。逆転写はRTPCRにおいて重要な工程である。例えば、RNA鋳型は、プライマー結合および/またはそれぞれの逆転写酵素によるcDNA鎖の伸長を障害し得る二次構造を形成する傾向を示すことが当該技術分野で公知である。したがって、転写の効率に関してRT反応には比較的高温が有利である。他方、インキュベーション温度を上げると、特異性も高くなることが示唆される、すなわち、RTプライマーは、予測される配列1つまたは複数にミスマッチを示す配列にアニーリングしない。特に、多数の異なる標的RNAの場合、例えば、液体試料中に未知または稀な亜系統または亜種の生物が存在する可能性がある場合、単一のミスマッチを有する配列を転写し、続いて増幅および検出することが望ましい場合もあり得る。上記の両方の利点すなわち、二次構造の低減およびミスマッチを有する鋳型の逆転写から利益を受けるため、1つより多くの異なる温度でRTインキュベーションを行なうことは本発明の一局面である。したがって、本発明の一局面は、工程dにおいて、逆転写酵素活性を有するポリメラーゼのインキュベーションが、30°C~75°C、または45°C~70°C、または55°C~65°Cの異なる温度で行なわれる上記の方法である。逆転写のさらなる重要な局面として、長いRT工程は、液体試料中に存在し得るDNA鋳型を損傷し得る。したがって、液体試料がRNA種およびDNA種の両方を含む場合、RT工程の持続期間ができるだけ短く維持されることが好ましいが、それと同時に、その後の増幅および増幅物の任意の検出のためにcDNAの充分な量の合成が確保されることが好ましい。したがって、本発明の一局面は、工程dにおいて、該期間が、30分まで、20分まで、15分まで、125分まで、10分まで、5分まで、または1分までである上記の方法である。本発明のさならる局面は、逆転写酵素活性を有し、かつ変異を含むポリメラーゼが、aCS5DNAポリメラーゼbCS6DNAポリメラーゼcサーモトガマリチマDNAポリメラーゼdサーマスアクアチカスDNAポリメラーゼeサーマスサーモフィラスDNAポリメラーゼfサーマスフラバスDNAポリメラーゼgサーマスフィリホルミスDNAポリメラーゼhサーマス種sps17DNAポリメラーゼiサーマス種Z05DNAポリメラーゼjサーモトガネアポリタナDNAポリメラーゼkサーモシホアフリカヌスDNAポリメラーゼlサーマスカルドフィラスDNAポリメラーゼからなる群より選択される上記の方法である。これらの要件に特に適当であるのは、伸長速度が速くなることに関して、その逆転写効率が向上するポリメラーゼドメイン内の変異を有する酵素である。したがって、本発明の一局面は、逆転写酵素活性を有するポリメラーゼが、それぞれの野生型ポリメラーゼと比べて、改善された核酸伸長速度および/または改善された逆転写酵素活性を付与する変異を含むポリメラーゼである上記の方法である。一態様において、上記の方法において、逆転写酵素活性を有するポリメラーゼは、それぞれの野生型ポリメラーゼと比べて、改善された逆転写酵素活性を付与する変異を含むポリメラーゼである。本発明に関連して特に有用となる点変異を有するポリメラーゼはWO2008046612に開示されている。本発明との関連において使用される有利なポリメラーゼは、ポリメラーゼドメイン内に少なくとも以下のモチーフ:TGRLSSXb7Xb8PNLQNを含む変異DNAポリメラーゼであり;式中、Xb7は、SまたはTから選択されるアミノ酸であり、Xb8は、G、T、R、K、またはLから選択されるアミノ酸であり、ポリメラーゼは、3’5’エキソヌクレアーゼ活性を含み、野生型DNAポリメラーゼと比べて改善された核酸伸長速度および/または改善された逆転写効率を有し、前記野生型DNAポリメラーゼにおいて、Xb8は、D、EまたはNから選択されるアミノ酸である。一例は、サーマス種Z05由来の熱安定性DNAポリメラーゼの変異体である例えば、US5455170に記載であり、前記変異体は、それぞれの野生型酵素Z05と比べて、ポリメラーゼドメインに変異を含む。本発明による方法の変異体の一例は、変異体Z05DNAポリメラーゼであり、580位のアミノ酸がG、T、R、KおよびLからなる群より選択される。DNA標的核酸を保存しつつ、RNA標的核酸をcDNAに逆転写し、cDNAおよびDNAの両方がその後の増幅に使用され得ることは本発明の範囲内であるため、本発明による方法は、RNAを有する生物またはDNAゲノムを有する生物の両方に由来する標的核酸の同時増幅に特に有用である。この利点により、同一の物理的条件下で分析され得る異なる生物、特に病原体の範囲がかなり増大する。したがって、本発明の一局面は、少なくとも2種類の標的核酸がRNAおよびDNAを含む上記の方法である。特に、適切な温度最適度optimumのため、Tthポリメラーゼなどの酵素または上記の変異体Z05DNAポリメラーゼは、標的核酸の後の増幅工程を行なうために適する。逆転写および増幅の両方に同じ酵素を利用することは、液体試料をRT工程と増幅工程の間で操作しなくてもよいため、方法の実施を容易にすることに寄与し、自動化を容易にする。したがって、一態様において、上記の方法において、逆転写酵素活性を有する同じポリメラーゼが工程dおよび工程eに使用される。一態様において、酵素は上記の変異体Z05DNAポリメラーゼである。ポリメラーゼまたは本発明に関連して使用される反応混合物の他の成分を必要な時間よりも長時間高温に曝露しないようにするため、一態様において、90°Cより上の工程は20秒まで、または15秒まで、または10秒まで、または5秒まで、および5秒長である。また、これにより、結果までの時間が短くなり、必要とされる全体的なアッセイ時間を削減する。かかる均一な構成において、RTおよび増幅を開始する前に反応槽を密閉し、それにより汚染のリスクを低減することは、かなり有利であり得る。密閉は、例えば、透明なホイル、キャップを適用することにより、または反応槽に油を添加し、液の上面に密閉層として親油相を形成することによりなされ得る。したがって、本発明の一局面は、さらに、工程cと工程dの間に、少なくとも2つの反応槽を密閉する工程を含む上記の方法である。増幅工程の標的は、RNADNAハイブリッド分子であり得る。標的は、一本鎖または二本鎖核酸であり得る。最も広く使用されているPCR手順では二本鎖標的が使用されるが、これは、必要事項ではない。一本鎖のDNA標的の第1増幅サイクル後、反応混合物は、一本鎖標的および新たに合成された相補的な鎖からなる二本鎖DNA分子を含む。同様に、RNAcDNA標的の第1増幅サイクル後、反応混合物は二本鎖cDNA分子を含む。この点で、連続増幅サイクルは上記のようにして進行する。核酸増幅は、特に、PCRの場合だけではないが、サイクル反応として行なわれる場合、非常に効率的であるため、本発明の一局面は、工程eの増幅反応が、多数のサイクル工程からなる上記の方法である。溶解工程後の試料調製工程において、目的の成分はさらに富化される。目的の非タンパク質性成分が、例えば核酸である場合、核酸は、通常、プローブ系アッセイに使用される前に、複雑な溶解混合物から抽出される。一態様において、本明細書において前述の方法において、工程eおよびdの前に以下の工程が行なわれる。異なる型の液体試料を含む複数の槽を提供する。固相支持材を複数の異なる型の液体試料と槽内で、標的核酸を含む核酸が固相支持材上に固定化されることを可能にするのに充分な期間および条件下で一緒に合わせる。次いで、分離ステーション内で液体試料中に存在するその他の材料から固相支持材を単離し、液体試料を固相支持材から分離し、固相支持材を洗浄バッファーで1回以上洗浄することにより分離ステーション内で核酸を精製する。固相支持材と複数の異なる型の液体試料を合わせる物理的条件および期間は、複数の異なる型の液体試料のいずれか1つのものと同一である。本発明の意味において、核酸の精製、単離または抽出は以下のことに関する:核酸は、例えば、増幅によって診断アッセイにおいて分析され得る前に、典型的に、異なる成分の複雑な混合物を含む生物学的試料から精製され、単離され、または抽出されなければならない。第1工程では、核酸の富化を可能にする方法が使用され得る。かかる富化方法は本明細書に記載されている。洗浄バッファーは、特に、精製手順において望ましくない成分が除去されるように設計された液である。かかるバッファーは当該技術分野で周知である。核酸の精製との関連において、洗浄バッファーは、固定化された核酸を任意の望ましくない成分から分離するために固相支持材を洗浄するように適している。洗浄バッファーは、例えば、上記のエタノールおよび/またはカオトロピック剤を有さない酸性pHを有する緩衝化溶液1つまたは複数中にエタノールおよび/またはカオトロピック剤を含み得る。しばしば、洗浄溶液または他の溶液は、使用前に希釈されなければならないストック溶液として提供される。本発明による方法における洗浄は、多かれ少なかれ、固相支持材およびその上面に固定化された核酸と洗浄バッファーとの激しいintensive接触を必要とする。これを達成するために、異なる方法、例えば、それぞれの槽1つまたは複数内で、または層とともに洗浄バッファーを固相支持材とともに振ることが可能である。別の有利な方法は、洗浄バッファーおよび固相支持材を含む懸濁液を、1回以上、吸引および分注することである。この方法は、一態様において、ピペットを用いて行なわれ、前記ピペットは、内に前記懸濁液が吸引され、そこから懸濁液が再度分注される使い捨てピペットチップを含む。かかるピペットチップは、廃棄され、交換される前に数回使用され得る。本発明に有用な使い捨てピペットチップは、少なくとも10μl、または少なくとも15μl、または少なくとも100μl、または少なくとも500μl、または少なくとも1ml、または約1mlの容積を有する。また、本発明に関連して使用されるピペットは、ピペッティングニードルneedleであってもよい。したがって、本発明の一局面は、工程cの前記洗浄が、固相支持材を含む洗浄バッファーを吸引および分注する工程を含む上記の方法である。特に、高い試料スループットを伴う臨床研究室用のためだけでなく、複数の異なる型の液体試料に由来する多数の標的核酸の迅速で、容易で、信頼性のある同時単離のためのかかる改善された方法が提供されることは非常に好ましい。上記の自動化工程を含む該方法は種々の利点を示す。まず、本発明による試料調製手順と、例えば、自動様式でのRNAの逆転写および標的核酸の増幅との組合せにより手動介入の必要性が有意に低減され、それにより、夾雑のリスクの可能性が有意に低減される。さらに、種々の異なる試料、すなわち、異なる供給源の核酸が処理され得る単一の方法が提供される可能性は、核酸診断の全体的な複雑さの低減に有意に寄与する。例えば、先行技術においてそうであるように、全ての型の液体試料に異なる方法が適用されなければならない場合、試料調製は、よりずっと複雑になり、時間がかかり、資源が多く必要である。ほとんどの場合、異なる試薬を利用しなければならず、コストの増大がもたらされ、迅速かつ複雑でない自動化溶液の開発が妨げられる。本発明による試料調製は、例えば、DNAおよびRNAなどの異なる型の核酸を含む多数の異なる試料型を取り扱うための適切な弾力性flexibilityおよび作業の流れを示す。本発明による方法は、必要とされる手作業時間がかなり少なく、試験は、先行技術で使用される試料調製方法よりも行なうことがずっと簡単である。本発明による方法は、いくつかのウイルスの並行した試料調製と下流増幅が並行実験において可能になるため、例えば、臨床ウイルス学の分野において大きな利点を提供する。したがって、本発明の一局面は、工程aが、さらに、複数の異なる液体試料中に潜在的に存在する細胞および/またはウイルスキャプシドを溶解させることにより、核酸をその細胞環境および/またはウイルス環境から放出させる工程を含む上記の方法である。細胞またはウイルス粒子の内容物を放出させるため、細胞壁またはウイルス粒子を溶解、分解または変性させるため、細胞またはウイルス粒子を酵素または化学物質で処理してもよい。この方法は、一般に溶解と称される。かかる溶解物質を含む得られた溶液を溶解液と称する。しばしば、分析される核酸は、当該液体試料中で溶液中に遊離状態であるのではなく、例えば、細胞またはウイルスなどの閉鎖構造内に配置される。診断アッセイでは、しばしば、臨床試料などの液体試料において、特に、病原性の細胞またはウイルスを同定することが目的である。かかる病原体は、例えば、例えば、ヒト免疫不全ウイルスHIV、C型肝炎ウイルスHCV、西ナイルウイルスWNV、ヒト乳頭腫ウイルスHPV、日本脳炎ウイルスJEV、セントルイス脳炎ウイルスSLEVおよび他のもの等のRNAウイルス、または例えば、B型肝炎ウイルスHBC、サイトメガロウイルスCMVおよび他のもの等のDNAウイルス、または例えば、クラミジアトラコマチスCT、淋菌NGおよび他のもの等の細菌を含み得る。本発明による方法は、上記ならびに他の生物からの核酸の抽出に有用である。細胞および/またはウイルスキャプシドまたは類似構造を溶解させるのに適当な薬剤は、一般に溶解バッファー中に提供される。したがって、本発明の一態様において、上記の方法は、さらに、工程aにおいて、複数の異なる液体試料への溶解バッファーの添加を含む。本発明による方法は、ハイスループット、効率および並行化に関して特に有利であるため、本発明の一局面は、前記溶解バッファーが前記複数の異なる型の液体試料の構成員memberと同一である上記の方法である。そのように、処理する異なる試料に対して異なる溶解試薬を個々に提供しなくてもよいため、試料調製手順の複雑さがさらに低減される。さらに、単一の溶解バッファーで作業する場合は、より容易に手順を制御することができる。溶解バッファーは、例えば、単一の容器からマルチピペッターで、抜き取られ、続いて、異なる試料に同時に分注され得る。本発明の一態様において、上記の方法における溶解バッファーは、カオトロピック剤緩衝物質アルコール還元剤の群から選択される1つ以上の成分を含む。一般的に溶液中の水分子の整列した構造ならびに、分子内および分子間の非共有結合力を乱すカオトロピック剤は、試料調製の手順にいくつかの寄与をし得る。特に、ヌクレアーゼの3次構造を乱すことにより、RNaseインヒビターとして適用され得るが、それだけではない。通常、さらなるRNaseインヒビターを溶解バッファーに適用しなくてもよい。加えて、カオトロピック剤は、原形質膜または存在する場合は細胞の細胞小器官の膜などの生体膜の破壊に寄与する。また、カオトロピック剤は、ガラスなどの表面への核酸の接着性結合に相当な役割を果し得る下記参照。本発明に関連するカオトロピック剤は、チオシアン酸グアニジニウムもしくは塩酸グアニジニウムもしくは塩化グアニジニウムもしくはイソチオシアン酸グアニジニウムなどのグアニジニウム塩、尿素、例えば過塩素酸カリウムなどの過塩素酸塩、他のチオシアン酸塩またはヨウ化カリウムである。しかしながら、他のカオトロピック剤もまた、本発明の範囲内で使用され得る。緩衝物質は、一般的に、溶液において特定のpH値またはpH範囲を維持するために重要である。これは、ほとんどの生物学的系で必要条件であり、たいていは、インビトロ反応についても望ましい。また、本発明の方法にも有利であり得る。溶解バッファーとの関連におけるバッファーは、クエン酸ナトリウムなどのクエン酸バッファー、また他にはTrisHClなどのTrisトリスヒドロキシメチルアミノメタンバッファー、リン酸塩、N2ヒドロキシエチルピペラジンN’2エタンスルホン酸HEPES、酢酸バッファーであるが、本発明との関連において、他のバッファーも使用され得る。核酸調製の溶解バッファーにおけるアルコールの使用もまた、当業者に公知のように、有利であり得る。有用なアルコールの1つはポリドカノールであるが、上記の溶解バッファーに他のアルコールも使用され得る。核酸の調製のためのポリドカノールの使用は、例えば、EP1932913に記載されている。還元剤も、上記のRNaseAなどの望ましくない成分の変性に寄与し得る。特に、還元剤は、当該技術分野で広く公知のように、多くのタンパク質の3次構造に特に重要な分子間および分子内ジスルフィド結合を切断する。本発明に関連する実施形態は、ジチオトレイトールDTTなどの還元剤であるが、例えば、2メルカプトエタノールなどの当該技術分野で公知の他の還元剤もまた、本発明との関連において有利に使用され得る。上記のことに鑑み、本発明の一局面は、前記溶解バッファーが以下の成分:チオシアン酸グアニジニウム、クエン酸Na、ポリドカノール、DTTを含む、上記の方法である。本発明の一態様において、溶解バッファーの上記の成分の濃度は以下のとおりチオシアン酸グアニジニウム:4Mクエン酸Na:50mMポリドカノール:5wvDTT:2wvである。上記の溶解バッファーのpHは特定のpH値に限定されない。しかしながら、一態様において、前記溶解バッファーは、酸性pHまたは55~65または約58のpHを有する。かかる溶解または上記の試料調製方法に使用される酵素は、タンパク質基質内のアミド結合を切断し、プロテアーゼ、または互換的にペプチダーゼに分類される酵素であるWalsh、1979、EnzymaticReactionMechanismsWHFreemanandCompany、SanFrancisco、第3章参照。先行技術で使用されているプロテアーゼは、アルカリプロテアーゼWO9804730または酸性プロテアーゼUS5386024を含む。先行技術における核酸の単離における試料調製に広く使用されているプロテアーゼは、中性pH付近で活性であり、ズブチリシンとして当業者に公知のプロテアーゼファミリーに属する、トリチラチウムアルバム由来のプロテイナーゼKである例えば、SambrookJetal,MolecularCloning:ALaboratoryManual、ColdSpringHarborLaboratoryPress、ColdSpringHarbor、NewYork、1989参照。高アルカリ度および高温の両方でその活性を保持している頑強なプロテアーゼである酵素エスペラーゼは、上記の溶解または試料調製方法に有用である。ガラス表面への核酸の吸着は、精製目的に特に興味深いが、他の表面が可能である。核酸のガラス表面に結合する挙動の使用によって核酸をその天然環境から単離するための多くの手順が、近年、提案されている。非修飾核酸が標的である場合、数ある理由の中でも、核酸を修飾しなくてもよく、天然の核酸でも結合し得るので、シリカ表面を有する物質への核酸の直接結合が有利である。これらの方法は、種々の文献に詳細に記載されている。例えば、VogelsteinBetal,ProcNatlAcadUSA7619796159には、ヨウ化ナトリウムの存在下で、核酸をアガロースゲルから粉砕フリントガラスに結合させるための手順が提案されている。過塩素酸ナトリウムの存在下で、ガラス粉末上での細菌からのプラスミドDNAの精製は、MarkoMAetal,AnalBiochem1211982382387に記載されている。DEA3734442には、酢酸を用いたファージ粒子の沈殿および過塩素酸塩を用いたファージ粒子の溶解によるガラス繊維フィルター上での一本鎖M13ファージDNAの単離が記載されている。ガラス繊維フィルターに結合された核酸を洗浄し、次いで、メタノール含有TrisEDTAバッファーで溶出させる。λファージからDNAを精製するための同様の手順は、JakobiRetal,AnalBiochem1751988196201に記載されている。該手順は、カオトロピック塩溶液中でのガラス表面への核酸の選択的結合、およびアガロース、タンパク質または細胞残渣などの夾雑物からの核酸の分離を伴う。夾雑物からガラス粒子を分離するため、粒子は、遠心分離され得るか、または、液をガラス繊維フィルターから抜き取るかのいずれかである。しかしながら、これは、該手順が大量の試料を処理するために使用されることを妨げる制限工程である。また、多孔質の特定のガラスマトリックス中に磁性粒子を含み、ストレプトアビジンを含有する層で覆われた多孔質の磁性ガラスも市販されている。この製品は、生物学的材料がビオチンに共有結合するように複雑な調製工程で修飾される場合、生物学的材料、例えば、タンパク質または核酸を単離するために使用され得る。磁化性の特定の吸着体は、非常に効率的であり、自動試料調製に適当であることが証明された。フェリ磁性および強磁性ならびに超常磁性顔料が、この目的に使用される。磁性ガラス粒子およびその使用方法はWO0137291に記載のものである。本発明による方法の弾力性flexibilityは、該方法に使用されるそれぞれの液体試料の容量を適合させることにより、さらに改善され得る。この態様は、異なる型の液体試料ならびに場合によっては試料中に存在する生物および核酸の型の多様性に焦点をあてている。例えば、全血試料中の特定のウイルスは、通常、これらの特定の場合において低コピー数しか存在しないことがわかっている場合、他の試料よりも多くの出発材料を必要とし得る。したがって、本発明の一局面は、前記複数の異なる液体試料の少なくとも1つの液体試料がその他の液体試料と異なる容量を有する上記の方法である。一態様において、代替的または付加的に、異なる容量の溶解バッファーが前記複数の異なる液体試料に添加される。さらなる態様において、前記複数の異なる液体試料の少なくとも1つの液体試料がその他の液体試料と異なる容量を有する場合、溶解バッファーは、添加後、すべての試料が同じ容量になるように試料に添加される。この態様において、異なる試料において同時に自動方法を行なうことがさらにより都合がよい。試料の型に応じて適切な出発容量を選択でき、単離および任意に例えば、増幅および検出を行なうために同一容量を有する利点は、このアプローチにおいて合わされる。用語固相支持材は、核酸の固定化に関連して上記の任意の固体材料、例えば、磁性ガラス粒子、ガラス繊維、ガラス繊維フィルター、濾紙などを含むが、固相支持材はこれらの材料に限定されない。本発明の一局面は、固相支持材が核酸結合粒子、またはシリカ、金属、金属酸化物、プラスチック、ポリマーおよび核酸から選択される1種類以上の材料を含む上記の方法である。本発明の一態様において、固相支持材は磁性ガラス粒子である。固定化するは、本発明との関連において、例えば核酸などの対象物を、可逆的または不可逆的様式で捕捉することを意味する。特に、固相支持材上に固定化されるは、対象物1つまたは複数が、任意の周囲媒体からの分離の目的で固相支持材と結合しており、例えば固相支持材からの分離によって後の時点で回収され得ることを意味する。これに関連して、固定化は、例えば、上記のような、ガラスへのまたは固体材料の他の適当な表面への核酸の吸着を含み得る。さらに、核酸は、捕捉プローブへの結合によって特異的に固定化され得、この場合、核酸は、固相支持体に結合された本質的に相補的な核酸に、塩基対形成によって結合される。後者の場合、かかる特異的固定化により、標的核酸の有力な結合がもたらされる。本明細書において前述の方法の一態様において、工程dは、精製核酸を、少なくとも2つの反応槽において逆転写酵素活性を有するポリメラーゼを含む前記増幅試薬と接触させる工程、ここで、少なくとも第1反応槽は少なくとも前記第1標的核酸を含み、少なくとも第2反応槽は少なくとも前記第2標的核酸を含む;前記反応槽内で、前記精製核酸を前記増幅試薬と、逆転写酵素活性を有する前記ポリメラーゼによるRNAの転写が起こるのに適した期間および条件下でインキュベートする工程を含む。本明細書において前述の方法の一態様において、工程dおよびeにおける転写および増幅の条件は、第1および第2反応槽内に含まれる少なくとも第1および第2の標的核酸に対して同一である。本発明の一局面において、前記第1および前記第2の核酸は、少なくとも2つの液体試料中に存在する。本発明の別の局面において、前記第1および第2の標的核酸は同時に増幅される。本発明の一局面において、前記第1標的核酸を増幅するための反応混合物は、前記第1標的核酸に特異的な最適化濃度の前記オリゴヌクレオチドを含み、前記第2標的核酸を増幅するための反応混合物は、前記第2標的核酸に特異的な最適化濃度の前記オリゴヌクレオチドを含む。本明細書に記載の方法の一局面において、前記第1標的核酸を増幅するための反応混合物中の前記第1標的核酸に特異的なオリゴヌクレオチドの濃度は、前記第2標的核酸を増幅するための反応混合物中の前記第2標的核酸に特異的なオリゴヌクレオチドの濃度と実質的に同じである。本明細書に記載の本発明の一局面において、増幅試薬はまた、内部対照ICおよび/または内部定量標準QSを含む。一態様において、前記ICおよび/またはQSは、増幅のための酵素を含む溶液中に含まれる。本発明の一態様において、内部対照ICおよび/または内部定量標準QSの増幅のためのオリゴヌクレオチドもまた、前記溶液中に含まれる。本発明の別の態様において、前記内部対照ICおよび/または内部定量標準QSの濃度はまた、個々に最適化される。一態様において、内部対照および/または内部定量標準の配列は、少なくとも第1と第2の標的核酸で、または2つより多くの標的核酸で同一である。さらなる態様において、ICおよびIQSの配列は同一である。この一般的な内部対照ICおよび/または内部定量標準QSにより、前記異なるパラメータおよび/または核酸型に対して同じ内部対照核酸配列を使用しながら、複数のパラメータおよび/または核酸型に対する同時アッセイの開発が可能になる。したがって、これは、種々のレベルでの対応する実験の全体的な複雑さの低減に貢献する。例えば、設計し、それぞれの増幅混合物に添加しなければならない内部対照核酸配列は1種類だけであり、したがって、多数の対照核酸配列を設計および合成または購入するための時間とコストが節約される。該アッセイ1種類または複数種は合理化され得、取り扱いのエラーのリスクが低減される。また、1つのアッセイまたは同じ条件下で同時に行なわれる並行アッセイに使用される異なる対照核酸配列が多いほど、それぞれの条件を調整することになり得る複雑さが大きくなる。さらに、複数の標的核酸の検出に適当な単一の対照は、単一の供給源から、例えば、前記異なる標的核酸を含む異なる槽内に分配され得る。本発明の範囲内で、単一の対照核酸配列は、定性的対照および定量的対照としての機能も果たし得る。内部対照配列は配列番号45~48を含む群から選択される。上記の対照のさらなる利点として、後に行なうかもしれない実験での他の核酸に関する特定の生物学的試料の試験では、本発明に使用される対照は、異なる核酸の増幅を制御するためにも使用され得るため、異なる内部対照核酸の添加を伴う別の試料調製手順を含む必要がない。したがって、いったん内部対照核酸を添加したら、同じ試料中で同じ条件下で、他のパラメータが試験され得る。内部対照核酸は、競合的、非競合的または一部競合的であり得る。競合的内部対照核酸は、標的と本質的に同じプライマー結合部位を有し、したがって、同じプライマーに関して標的と競合する。この原理により、同様の構造のため、それぞれの標的核酸の良好な模倣が可能になるが、標的核酸1種類または複数種に関して増幅効率が低下し得、したがって、アッセイの感度の低下がもたらされ得る。非競合的内部対照核酸は、標的と異なるプライマー結合部位を有し、したがって、異なるプライマーに結合する。かかる構成の利点は、とりわけ、反応混合物中の異なる核酸の単一の増幅事象が、全く競合効果なしで、互いに独立して起こり得るという事実を含む。したがって、競合的構成の場合と同様に、アッセイの検出限界に関する有害効果は生じない。最終的に、部分競合構成を使用した増幅において、それぞれの対照核酸および少なくとも1つの標的核酸は、同じプライマーに対して競合するが、少なくとも1つのほかの標的核酸は異なるプライマーに結合する。上述の方法には前記標的核酸のそれぞれについての別個の組のプライマーおよび前記内部対照核酸についての別個の組のプライマーが含まれるという事実は、該方法をかなり弾力的flexibleなものにする。この非競合的構成において、競合構成の場合のように対照核酸に標的特異的結合部位を導入する必要はなく、上述の競合構成の欠点が回避される。非競合構成において、内部対照核酸は、任意の標的配列のプライマーおよびまたはプローブと競合しないようにするために、任意の標的配列とは異なる配列を有する。一態様において、内部対照核酸の配列は、液体試料中のほかの核酸配列とは異なる。液体試料がヒト由来である場合、例としては、内部対照核酸は、ヒトの体内で内在的にも生じる配列を有さない。従って、配列の違いは、プライマーおよびまたはプローブがそれぞれの内在性核酸1つ以上にストリンジェントな条件下で結合せず、そのため該構成が競合的にならない程十分に少なくとも有意であるべきである。かかる障害を回避するために、本発明に使用される内部対照核酸の配列は、一態様において、液体試料の起源とは異なる供給源由来である。一態様において、該配列は天然に存在するゲノム由来である。一態様において、該配列は植物ゲノム由来であり、さらなる態様においてはブドウゲノム由来である。一態様において、天然に存在するゲノム由来の核酸は、ごたまぜにされるscrambled。当該技術分野で公知のように、ごたまぜにするscramblingは、配列にある程度の塩基変異を導入することを意味する。一態様において、本発明に使用される内部対照核酸の配列は、それが由来する天然に存在する遺伝子に対して実質的に改変される。このことは、プライマーおよびプローブと液体試料中の核酸の交差反応性が大きく低下するという利点を有する。一態様において、ICIQSはDNAである。標的核酸がRNAである場合、ICIQSはRNAである。RNAおよびDNAの両方が上述の方法において分析される場合、内部対照核酸は多数の標的を含むアッセイの最も感受性のある標的を模倣し、RNA標的は通常、より密に調節される必要があるので、内部対照核酸はRNAである。RNAは、アルカリ性pH、リボヌクレアーゼなどの影響等によってDNAよりも分解し易いので、一態様において、RNA製の内部対照核酸は、外装armored粒子として提供される。特に外装RNAなどの外装粒子は、例えばEP910643に記載される。簡潔に、化学的に生成され得るか、または一態様において例えば大腸菌などの細菌により異種により生成され得るRNAは、少なくとも部分的にウイルスコートタンパク質に封入される。後者は、外的影響、特にリボヌクレアーゼに対するRNAの耐性を付与する。内部対照DNAも、外装粒子として提供され得ることが理解される必要がある。外装されたRNAおよびDNAは両方、本発明に関連して、内部対照核酸として有用である。一態様において、RNA対照核酸は、大腸菌中のMS2コートタンパク質で外装される。さらなる態様において、DNA対照核酸は、λファージGT11を使用して外装される。上述の自動化工程を含む方法はまた、種々のさらなる利点を示す:1つの反応槽中で実施される多重化multiplexアッセイにおいて、異なる標的核酸の数は、適切な標識の数により制限されるということは、先行技術における課題であった。リアルタイムPCRアッセイにおいて、例えば蛍光色素スペクトルの潜在的な重複は、アッセイ性能に大きな影響を及ぼす偽陽性結果、低い精度のリスク等。そのため、それぞれのフルオロフォアは、診断試験の望ましい性能を保証するために、注意深く選択され、スペクトル的に充分に分離される必要がある。典型的に、異なる使用可能なフルオロフォアの数は、PCR機器蛍光チャンネルの一桁の数に対応する。対照的に、異なる反応槽中ではシグナルは互いに独立して検出され得るので、上述の方法において、少なくとも第1および第2の標的核酸の内部対照がとられたinternallycontrolled増幅は、少なくとも2種類の異なる反応槽中で行なわれ、より多数の異なる種類の標的核酸の同時増幅が可能になる。これは、第1の標的核酸は第2の槽ではなく第1の槽中で増幅され、第2の標的核酸は第1の槽ではなく第2の槽中で増幅されることを意味する。1つ以上の多数の反応槽中で多重multiplex反応が行なわれ、それにより同時にかつ同じ条件下で増幅され得る標的の数を増やす態様は、依然として本発明の範囲内にある。かかる態様において、内部対照核酸は、一槽中の異なる標的核酸および異なる槽中の異なる標的核酸についての対照として機能する。従って、本発明の一局面は、少なくとも2つの標的核酸が同じ反応槽中で増幅される上述の方法に関する。他の場合において、例えば問題になっている試料およびまたは標的核酸1つ以上に依存して、第1反応槽中で第2標的核酸ではなく第1標的核酸を増幅することが好都合であり得る。そのため、本発明の一態様は、第1の反応溶液中に第2の標的核酸が存在しない上述の方法である。特に、液体試料が異なる生物由来の標的核酸を含むと疑われる場合、もしくはたとえそのような異なる生物を含むとしても、またはどのような異なる核酸もしくは生物が前記試料中に存在し得るかが明らかでない場合、本発明の一態様は、第1の標的核酸および第2の標的核酸が異なる生物由来である上述の方法である。上述のように、上述の方法は、少なくとも第1および第2の標的核酸の増幅を定性的または定量的に調節するために有用である。生物学的試料中の核酸の定性的な検出は、例えば個体の感染を認識するために非常に重要である。それにより、微生物感染の検出のためのアッセイのための重要な要件は、偽陰性または偽陽性の結果がそれぞれの患者の治療に関して重大な結果をほとんど不可避的にもたらすので、偽陰性または偽陽性の結果を回避することである。従って、特にPCRベース法において、検出混合物に定性的な内部対照核酸が添加される。前記対照は、試験結果の妥当性を確認するために特に重要である:少なくともそれぞれの標的核酸に関して陰性結果の場合、定性的内部対照反応は、所定の設定において反応的に行なわれる必要があり、すなわち定性的内部対照が検出される必要があり、さもなくば試験自体が無効であると見なされる。しかしながら、定性的な設定において、前記定性的内部対照は、陽性結果の場合には必ずしも検出される必要はない。定性的試験について、反応の感度が保証され、そのために厳密に調節されることが特に重要である。結果的に、定性的内部対照の濃度は、例えばわずかに阻害の状況にあっても定性的内部対照が検出されず、そのために試験が無効になるように、比較的に低くある必要がある。従って、本発明の一局面は、前記標的核酸の1つ以上について増幅産物が非存在の場合であっても、前記内部対照核酸の増幅産物の存在が、反応混合物中で増幅が起こったことを示す上述の方法である。一方で、試料中の核酸の存在または非存在の単なる検出に加えて、しばしば、前記核酸の量を測定することが重要である。例として、ウイルス疾患の病期および重症度は、ウイルス負荷に基づいて評価され得る。さらに、治療の成功を評価するためには、任意の治療のモニタリングに、個体中に存在する病原体の量の情報が必要である。定量的アッセイには、標的核酸の絶対量を測定するための参照として機能する定量的標準核酸を導入することが必要である。定量化は、外部較正を参照すること、または内部定量標準を実行することのいずれかにより実施され得る。外部較正の場合、量が分かっている同一の核酸または同等の核酸を使用して、別々の反応で標準曲線を作成する。その後、標的核酸の絶対量は、分析された試料で得られた結果と前記標準関数の比較により決定される。しかしながら、外部較正は、可能な抽出手順、その効率の変動、ならびに可能性がありかつしばしば予測できない増幅反応およびまたは検出反応を阻害する薬剤の存在が、対照に反映されないという欠点を有する。この状況は、任意の試料関連効果に適用される。そのため、不成功の抽出手順または他の試料に基づく要因のために試料が陰性と判断されるが、検出および定量対象の標的核酸は実際には試料中に存在する場合があり得る。これらおよび他の理由のために、試験反応自体に添加される内部対照核酸が有利である。定量的標準として機能する場合、前記内部対照核酸は、定量試験において、少なくとも以下の2つの機能を有する:i反応の妥当性をモニタリングする。ii力価較正において参照として機能し、そのために阻害の影響を補償し、調製および増幅手順を調節して、より正確な定量を可能にする。そのため、標的陰性試験においてのみ陽性である必要がある定性的試験における定性的内部対照核酸とは対照的に、定量的試験における定量対照核酸は、2つの機能:反応対照および反応較正を有する。そのため、該対照核酸は、標的陰性反応および標的陽性反応に両方において陽性かつ有効である必要がある。該対照核酸はさらに、高い核酸濃度の較正について信頼性の高い参照値を提供することに適している必要がある。したがって、内部定量対照核酸の濃度は比較的高くある必要がある。本発明の一態様において、該方法は自動化される。本発明はまた、少なくとも1つの試料に存在し得る少なくとも2種類の異なる核酸を単離および増幅するための分析システムに関するものであり、他の材料から前記核酸を分離するために構築され、かつ配置された分離ステーションseparationstation、増幅試薬を含む溶液を含む、少なくとも1つの容器containerを含むキット、第1の標的核酸を増幅するためのオリゴヌクレオチドを含む第1の溶液、第2の標的核酸を増幅するためのオリゴヌクレオチドを含む第2の溶液、反応槽reactionvesselを含む増幅ステーションamplificationstationを含み、前記増幅試薬を含む溶液と、オリゴヌクレオチドを含む第1または第2の溶液とは、前記反応槽が増幅試薬、分離された標的核酸およびオリゴヌクレオチドを含むように合わされ、増幅試薬の割合は、第1の標的核酸を増幅するためのオリゴヌクレオチドを含む反応槽中と、第2の標的核酸を増幅するためのオリゴヌクレオチドを含む反応槽中で同じである。前記系の態様は、前述および後述される。図5には、1つの例示的システムが示される。前記システムは、溶液およびを含む容器およびを含むキットを含む。容器は、オリゴヌクレオチドを含む溶液である溶液を含む。容器およびまたは由来の溶液は、溶液と合わされる。これは、溶液を容器もしくはに添加して、その後全ての溶液を合わせること、あるいは溶液およびまたはを反応槽に添加して、その後溶液を添加することのいずれかにより達成され得る。容器、、から、その内容物の全てではなく必要な量だけを反応槽に添加することが理解される。反応槽に適当な量を添加した後、反応槽を増幅ステーション中でインキュベーションする。溶液、容器および槽の態様は本明細書に記載のとおりである。本発明のシステムの1つの利点は、本明細書に記載されるLODでは、先行技術のように、異なる標的核酸を効率的に増幅するための増幅試薬を含む異なる嵩の溶液を作製する必要がないことである。その代わり、いずれか1つの標的核酸のための全ての増幅試薬は、一態様において、第1の溶液および第2の溶液由来の同じ嵩の溶液1つ以上から調製される。合わされた反応溶液は、オリゴヌクレオチド以外の必要な全ての増幅試薬を含む。その後、オリゴヌクレオチドは反応溶液中で最適な性能について最適化され得る。最適化としては、オリゴヌクレオチド配列の設計、オリゴヌクレオチドの性能を向上するための修飾、およびまたは一般的な反応溶液中で良好な性能を得るためのオリゴヌクレオチドの濃度の最適化が挙げられ得る。従って、最適化は、当業者に周知の方法を含む。しかしながら、すでに最適化されたオリゴヌクレオチド濃度を含む溶液を調製してもよい。図5に示すように、本発明の一局面において、キットは、少なくとも、第1の溶液を含む第1の容器および第2の溶液を含む第2の容器を含む。該キットはまた、さらなる溶液を含むさらなる容器を含み得る。前記溶液は、オリゴヌクレオチドおよび標的核酸を含む溶液と混合される場合に前記標的核酸の増幅に必要な全ての試薬を含む、濃縮ストック溶液である。本発明の一局面は、少なくとも第1の溶液および第2の溶液を含むストック溶液にも関するものであり、前記第1および第2の溶液を混合して得られる最終濃度は、本明細書に開示のようなLODを有する標的核酸のいずれか1つを増幅することに適している。一態様において、前記第1および第2の溶液は、それぞれの標的核酸に特異的なオリゴヌクレオチドを添加することにより、別々の反応槽中で異なる標的核酸を別々に検出するための反応混合物の調製に使用される。一態様において、前記第1の溶液は、Mg2の存在下または非存在下で、Mn2を含む。一態様において、前記第1の溶液は、Mg2の非存在下でMn2を含む。一態様において、第1の溶液は、MnOAcおよび非活性補助的成分からなる。非活性補助的成分は、試験の実行に必ずしも必要ではない成分であると理解される。かかる成分は、例えば保存剤として作用する成分である。1つの非活性補助的成分はNaN3である。この態様において、Mg2イオンは存在しない。最終濃度は1または2または3から、5または4または35mMまでのMn2である。一態様において、Mn2はMnOAcの形態である。一態様において、該ストック溶液は、トリシンを含む第2の溶液を含む。313xに濃縮された第2の溶液について、トリシンの濃度は、100mMからまたは150mMから300mMまでまたは250mMまでである。一態様において、前記濃度は200mMである。より多く濃縮されるかまたはより少なく濃縮されるストック溶液について、313x濃縮ストック溶液の濃度はしかるべく適合される。一態様において、前記第2の溶液はTrisを含まない。一態様において、前記ストック溶液はさらに、カリウムイオンを含む。313x濃縮ストック溶液の濃度は、300mMからまたは350mMから、500mMまでまたは450mMまでである。一態様において、カリウムイオンの濃度は400mMである。より多く濃縮されるかまたはより少なく濃縮されるストック溶液について、313x濃縮ストック溶液の濃度はしかるべく適合される。一態様において、カリウムイオンを提供するために酢酸カリウムが使用される。一態様において、前記第2の溶液はさらに、グリセロールを含む。313x濃縮ストック溶液の濃度は、2からまたは5からまたは7から20までまたは17までまたは15までまたは12までである。一態様において、前記グリセロール濃度は10である。より多く濃縮されるかまたはより少なく濃縮されるストック溶液について、313x濃縮ストック溶液の濃度は、しかるべく適合される。一態様において、前記第2の溶液はさらに、DMSOを含む。313x濃縮ストック溶液の濃度は、5からまたは10からまたは12からまたは17から、30までまたは25までまたは20までである。一態様において、前記濃度は18である。より多く濃縮されるかまたはより少なく濃縮されるストック溶液について、313x濃縮ストック溶液の濃度はしかるべく適合される。一態様において、前記第2の溶液はさらに、界面活性剤を含む。一態様において、前記界面活性剤はTweenまたはTween20である。313x濃縮ストック溶液の濃度は、001からまたは0025から、01までまたは0075までである。一態様において、前記濃度は、005である。より多く濃縮されるかまたはより少なく濃縮されるストック溶液について、313x濃縮ストック溶液の濃度はしかるべく適合される。第2の溶液はまた、溶液の保存に適した濃度のNaN3を含み得る。313x濃縮ストック溶液の濃度は、001からまたは0025から、01までまたは0075までである。一態様において、前記濃度は009である。より多く濃縮されるかまたはより少なく濃縮されるストック溶液について、313x濃縮ストック溶液の濃度はしかるべく適合される。一態様において、第2の溶液はさらにアプタマーを含む。313x濃縮ストック溶液の濃度は、01uMからまたは025uMからまたは05uMから、1uMまでまたは08uMまでまたは075uMまでである。一態様において、濃度は074uMである。より多く濃縮されるかまたはより少なく濃縮されるストック溶液について、313x濃縮ストック溶液の濃度はしかるべく適合される。一態様において、313x濃縮第2の溶液のpHは、70からまたは75からまたは80から、90までまたは85までまたは82までである。一態様において、pHは81である。より多く濃縮されるかまたはより少なく濃縮されるストック溶液について、pHはしかるべく適合される。本発明の一局面において、第2の溶液は、増幅に必要なヌクレオチドを含む。一態様において、前記ヌクレオチドは、デオキシヌクレオチドdNTPである。一態様において、前記ヌクレオチドは、dATP、dGTP、dCTP、およびdTTPもしくはdUTP、またはdATP、dGTP、dCTPおよびdUTPを含む。313xストック溶液中の濃度は、5mMからまたは4mMからまたは3mMから、05mMまでまたは1mMまでまたは2mMまでである。一態様において、dATP、dGTPおよびdCTPについての濃度は、133333uMであり、dUTPについての濃度は266667uMである。より多く濃縮されるかまたはより少なく濃縮されるストック溶液について、313x濃縮ストック溶液の濃度はしかるべく適合される。本発明の一局面において、第2の溶液はさらに核酸の増幅のためのポリメラーゼを含む。ポリメラーゼの態様は本明細書に開示される。313x濃縮ストック溶液の濃度は、1000KUlからまたは2000KUlからまたは2500KUlから、6000KUlまでまたは5000KUlまでまたは4000KUlまでである。一濃度は3000KUlである。より多く濃縮されるかまたはより少なく濃縮されるストック溶液について、313x濃縮ストック溶液の濃度はしかるべく適合される。本発明の一局面において、第2の溶液はさらにUNGを含む。313x濃縮ストック溶液の濃度は、450KUlからまたは500KUlからまたは600KUlから、1000KUlまでまたは800KUlまでまたは700KUlまでである。一濃度は、670KUlUNGである。より多く濃縮されるかまたはより少なく濃縮されるストック溶液について、313x濃縮ストック溶液の濃度は、しかるべく適合される。本発明の一局面において、第2の溶液はさらにEDTAを含む。EDTAを含むことの利点は、第1および第2の溶液を合わせる前に、EDTAが、酵素活性を促進し得る夾雑物を錯体化および不活性化することにより第2の溶液に含まれる酵素の不活性状態を促進することである。EDTAの濃度は、1uMからまたは10uMからまたは40uMから、200uMまでまたは100uMまでまたは50uMもしくは44uMまでである。ストック溶液は、2xからまたは3xからまたは4xから、20xまでまたは10xまでまたは5xまで濃縮され得る。一態様において、ストック溶液は、313xまたは5x濃縮される。異なるストック溶液のx倍濃度はまた、異なり得る。第2の溶液はまた、1つ以上のさらなるストック溶液に分割され得る。しかしながら、ストック溶液は、前述の成分の濃度を提供する必要がある。一態様において、第1および第2の溶液ならびに任意のさらなる溶液の組合せは、マンガン2、トリシン、カリウムイオン、グリセロール、DMSO、Tween、アジ化ナトリウム、dNTP、ポリメラーゼ、UNGおよびアプタマーからなる。従って、ストック溶液のいずれにも他の成分は存在しない。最終PCR反応混合物の一態様において、以下の塩濃度は、異なるストック溶液および任意にオリゴヌクレオチドの組み合わせの後に存在する:Mn2は、1mMからまたは2mMからまたは25mMから、5mMまでまたは4mMまでまたは35mMまでの最終濃度を有する。一最終濃度は33mMである。グリセロールは、1からまたは2からまたは25から、5までまたは45までまたは4までまたは35の最終濃度を有する。グリセロールの一濃度は3である。は、と理解される。トリシンは、30mMからまたは40mMからまたは45mMもしくは50mMから、70mMまでまたは65mMまでまたは60mMまでの最終濃度を有する。一濃度は60mMトリシンである。DMSOは、0からまたは1からまたは2もしくは3から、65までまたは6までまたは55までの最終濃度を有する。一態様は、54のDMSO最終濃度である。は、と理解される。Kは、80mMからまたは90mMからまたは100mMもしくは110mMから、150mMまでまたは145mMまでまたは135mMもしくは125mMまでの最終濃度を有する。一つのK最終濃度は120mMである。一態様は120mMKOAcの最終濃度である。Tween20が溶液中に含まれるように選択される場合、最終濃度は、0からまたは0005からまたは0015から、003までまたは0025までまたは002までである。一Tween20濃度は0015である。は、と理解される。反応混合物中のUNGの含有量は、一反応当たり2Uからまたは5Uからまたは7Uもしくは8Uから、20Uまでまたは15Uまでまたは12Uまでである。一態様において、一反応当たり10UのUNGが含まれる。一態様において、反応混合物の容積は50ulである。そこからさらなる濃度が計算され得る。Z05Dの一態様において、ポリメラーゼの含有量は、最終反応物中、一反応当たり25Uからまたは30Uからまたは35Uもしくは40Uから、55Uまでまたは50Uまでまたは45Uまでである。一態様において、含有量は、一反応当たり45Uである。反応混合物の一態様の容積は、50ulである。そこからさらなる濃度が計算され得る。最終反応溶液は、さらに、例えばストック溶液の保存に適しており、そのために最終反応混合物中にも存在する非活性成分を含み得る。かかる非活性成分は、例えばNaN3である。本発明はまた、さらにオリゴヌクレオチドを含む本明細書に記載されるストック溶液に関する。オリゴヌクレオチドの313xストック溶液の濃度は、01uMからまたは02667uMから、5uMまでまたは4uMまでである。一局面において、第2の溶液は、標的および対照の核酸の増幅のための最適化された濃度のオリゴヌクレオチドを含む。別の局面において、第2の溶液は、標的核酸の増幅および検出のための、01uM~4uMのオリゴヌクレオチドのいずれかを含む。一態様において、オリゴヌクレオチド濃度は、005uM~05uMまたは03uMである。一態様において、いずれかのオリゴヌクレオチドの使用される濃度は同じである。従って、ある態様において、03uMのいずれかのオリゴヌクレオチドが使用される。他の態様において、オリゴヌクレオチドの濃度は、個々に最適化され、0025uM~075uMまたは005uM~05uMの範囲である。第2の溶液がオリゴヌクレオチドをさらに含む場合、1mM未満または05mM未満または03mM以下の濃度でTrisなどのさらなる成分が、低濃度で溶液に導入され得る。5uM未満または25uM未満または1uM未満の濃度でEDTAが導入され得る。トリシンまたはカリウムイオンがオリゴヌクレオチドと共に導入される場合、第2の溶液の濃度は、最初に10~15だけ変化し得るか、またはオリゴヌクレオチドを含む最終ストック溶液は本明細書に記載される濃度の10~15だけ変化し得る。当業者は、本発明の溶液中で使用されるそれぞれのオリゴヌクレオチドの濃度を最適化する方法を知っている。本発明の一局面において、第2の溶液は、内部対照核酸を検出するためのオリゴヌクレオチドをさらに含む。対照核酸およびオリゴヌクレオチドの態様は、本明細書に開示される。前記内部対照を検出するためのオリゴヌクレオチドの濃度は、前述のように最適化される。濃度は前述されるとおりである。一態様において、前記第2の溶液は、標的核酸の検出のためのオリゴヌクレオチドの非存在下で内部対照核酸を検出するためのオリゴヌクレオチドを含む。前述のキットの一態様において、該キットは、対照核酸を含む少なくとも1つの容器をさらに含む。前記対照核酸の態様は本明細書に開示される。一態様において、前記キットは、DNAを含む対照核酸を有する1つの容器およびRNAを含む対照核酸を含むさらなる容器を含む。このキットは、RNAおよびDNAの両方の標的核酸の同時試験に特に有用である。前述のシステムの一局面において、前記増幅試薬の濃度は全ての反応槽中で同じである。同じidenticalは、20または15または10の変動性を含むことを意味する。分離ステーションseparationstationは、液体試料中に存在する他の材料からの固相支持材の単離を可能にする分析システムのデバイスまたは構成部分である。かかる分離ステーションは、例えば、限定されないが、遠心分離機、フィルターチューブを有するラック、磁石または他の適切な構成部分を含み得る。本発明の一態様において、分離ステーションは、1つ以上の磁石を含む。一態様において、1つ以上の磁石は、固相支持体としての磁性粒子、例えば磁性ガラス粒子の分離に使用される。例えば、液体試料および固相支持材がマルチウェルプレートのウェルに一緒に合わされる場合、次いで分離ステーションに含まれる1つ以上の磁石は、例えば、該磁石をウェル中に導入することにより液体試料自身と接触され得るか、または前記1つ以上の磁石は、磁性粒子をひきつけ、続いて磁性粒子を周囲の液体から分離するために、ウェルの外壁に接近され得る。核酸を単離および精製するさらなる方法は、本発明に関連して有用であり、前記分離ステーションである。該方法は、核酸をマルチウェルプレートの槽中の磁性粒子に結合させる工程を含む。該槽は、上部開口部、中央部および底部を含む。液体の大部分が、槽の円錐形部が長方形形状を有する中央部で置き換わる区画よりも上に位置する場合、その後磁石を第2の位置から第1の位置に移動させ、前記第1の位置で中央部に磁場を印加し、任意に、さらに前記槽の底部に磁場を印加することにより、結合した材料は、液体に含まれる結合していない材料から分離される。磁性粒子は、任意に洗浄溶液で洗浄され得る。液体の大部分が、槽の円錐形部が長方形形状を有する中央部で置き換わる区画よりも下に位置する場合は、前記槽の底部に選択的に磁場を印加することにより、少量の液体が前記磁性粒子から分離される。増幅ステーションamplificationstationは、少なくとも2つの反応槽の内容物をインキュベートするための温度調節されたインキュベーターを含む。増幅ステーションはさらに、PCRなどの試料の分析のための反応が起こるチューブまたはプレートなどの種々の反応槽を含む。かかる槽の外側境界または壁は、槽中で起こる増幅反応を阻害しないように化学的に不活性である。取り扱いの容易さのため、および自動化を容易にするために、少なくとも2つの反応槽は一体型の配置であり、そのために該槽は一緒に操作され得る。従って、本発明の一局面は、少なくとも2つの反応槽が一体型配置に組み合わされた、上述の分析システムである。一体型配置は、例えば互いに可逆的もしくは不可逆的に結合されるかまたはラック中に配置されるバイアルまたはチューブであり得る。一態様において、一体型配置はマルチウェルプレートである。本発明の一局面において、該システムはさらに、前記標的核酸を増幅するためのマルチウェルプレートを含む。本発明の一局面において、該システムはさらに、前記標的核酸を単離するためのマルチウェルプレートを含む。一態様において、一体型配置で合わされる少なくとも2つの反応槽は、該システムのステーション間を移動される。第二の態様において、精製された標的核酸は、前記分離ステーションから前記増幅ステーションに移動される。一態様において、ピペットチップが取り付けられたピペットを含むピペッターで、精製された核酸を含む液体を移動させる。第三の態様において、精製された核酸は、前記分離ステーションから、保持ステーションholdingstation中に保持された一体型配置の反応槽に移動される。一態様において、一体型配置の前記反応槽は、次いで前記保持ステーションから前記増幅ステーションに移動される。一態様において、本発明の分析システムはさらに、ピペッティングユニットを含む。前記ピペッティングユニットは、少なくとも1つのピペットまたは多数のピペットを含む。一態様において、前記多数のピペットは、ピペットを個々に操作し得る1つ以上の一体型配置に組み合わされる。本発明に関連して使用されるピペットは、本明細書に記載されるようにピペットチップを含むピペットである。別の態様において、ピペットはピペッティングニードルpipettingneedleである。代替的に、分離ステーションにおいて試料調製に使用され、精製された標的核酸を含む液体を含む反応槽または反応槽の配置arrangementは、分離ステーションから増幅ステーションに移動され得る。一態様において、この目的のために、本発明の分析システムは、移送ユニットをさらに含む。一態様において、前記移送ユニットはさらに、ロボットデバイスを含む。一局面において、該デバイスはさらに、ハンドラーhandlerを含む。本発明の方法に関して上述の理由のために、以下が本発明のさらなる局面である:少なくとも1つの反応槽がRNA標的核酸およびDNA標的核酸を含む、上述の分析システム。少なくとも1つの反応槽がRNA標的核酸を含み、少なくとも他方の反応槽がDNA標的核酸を含む、上述の分析システム。一局面において、上述の分析システムはさらに:被検物により引き起こされたシグナルを検出するための検出モジュールシーラー試薬およびまたは使い捨て品のための貯蔵モジュール、システム構成部分を制御するための制御ユニットからなる群より選択される、1つ以上の要素を含む。図3および4に例示的なシステムを示す。検出モジュールは、例えば増幅手順の結果または効果を検出するための光学検出ユニットであり得る。光学検出ユニットは、光源、例えばキセノンランプ、ミラー、レンズ、光学フィルター、光ファイバーなどの光のガイドおよびフィルタリングのための光学機器、1つ以上の参照チャンネル、またはCCDカメラもしくは異なるカメラを含み得る。シーラーは、本発明の分析システムに関連して使用される任意の槽を密封するために構築され、かつ配置される。かかるシーラーは、例えばチューブを適切なキャップで、またはマルチウェルプレートをホイルまたは他の適切なシーリング材で密封し得る。貯蔵モジュールは、液体試料の分析に重要な化学反応または生物学的反応を引き起こすために必要な試薬を保存する。貯蔵モジュールはまた、本発明の方法に有用なさらなる構成部分、例えばピペットチップあるいは分離ステーションおよびまたは増幅ステーション中で反応槽として使用される槽などの使い捨て品を含み得る。一局面において、本発明の分析システムはさらに、システム構成部分を制御するための制御ユニットを含む図4。かかる制御ユニットは、前記分析システムの異なる構成部分が、正確に働き、相互作用してかつ正確なタイミングで働き、相互作用する、例えばピペットなどの構成部分を協調した様式で移動させ、操作することを確実にするためのソフトウェアを含み得る。該制御ユニットはまた、リアルタイムアプリケーションを意図するマルチタスキングオペレーティングシステムであるリアルタイムオペレーティングシステムRTOSを稼動させるプロセッサを含み得る。換言すると、該システムプロセッサは、リアルタイムな制約、すなわちシステムロードに関係なく、事象からシステム応答への操作上の期限を管理し得る。制御ユニットは、システム中の異なるユニットが所定の命令に従って正確に作動し応答することをリアルタイムに制御する。図3に示される例示的システムは、以下の特徴を示す:該システムは、試料の調製のためのモジュールを有する分析器、試料の処理のためのモジュール、増幅のためのモジュールおよび移送モジュールを含む。さらに、該システムは、液体操作モジュールを含む。試料の調製のためのモジュールは、保持ステーションを含む。試料の処理のためのモジュールは、保持ステーション、処理ステーションまたは分離ステーション、保持ステーション、加熱デバイスおよびシーリングステーションを含む。増幅のためのモジュールは、インキュベーターを含む。分析器はさらに、モジュールとモジュールの間にエアーロックを含む。これらの特徴のいくつかは、図4に示される例示的システムにも表示される。図4では、試料の調製のためのモジュールはさらに、ピペットチップを保持するチップラックを保持するためのホルダーを含む。該システムはさらに、液体試料が添加され得るレセプタクルreceptacleを含む、深ウェルプレートを保持するためのホルダーを含む。該システムはまた、液体試料を含む第1のレセプタクルを含むラックのためのホルダーを含む。試料の調製のためのモジュールはさらに、第1のプロセッサにより制御される第1のピペッティングデバイスを含む。試料の処理のためのモジュールは、分離ステーション、または処理プレートを含む加熱デバイスを含む。処理プレートは、レセプタクルを含む。該システムはまた、ピペットチップを含むピペットチップラックを保持する保持ステーションを含む。試料の処理のためのモジュールはさらに、第2のプロセッサにより制御されるピペッティングデバイスを含む。分析システムは、分析器ならびに第1のプロセッサおよび第2のプロセッサを制御する制御ユニットを含む。さらに、分析器は、移送システムを含む。一局面において、本発明は、少なくとも2つの標的核酸を別々に増幅するためのキットに関し、該キットは、少なくとも1つの容器を含み、該容器は、少なくとも2つの異なる標的核酸のいずれか1つを別々に増幅するために使用される溶液を含む。容器は、液体を保持するための任意の型の貯蔵槽である。一態様において、前記キットは、少なくとも2つの容器を含み、第1の容器は第1の溶液を含み、第2の容器は、少なくとも2つの標的核酸のいずれか1つの別々の増幅における使用のための合わされた溶液を調製するための第2の溶液を含む。一態様において、前記第1の溶液は、核酸の増幅に必要な少なくとも1つの塩を含み、前記第2の溶液は、核酸およびdNTPを増幅するための少なくとも酵素を含む。本発明はまた、第1の容器および第2の容器を含むキットに関し、前記第1の容器は、Mn2イオンまたはMnAcの溶液を含み、前記第2の容器は、核酸を増幅するための酵素を含む。一局面において、前記第2の容器はさらに、dNTPを含む。溶液についてのさらなる態様は前述されるとおりである。さらなる局面において、本発明は、標的核酸を増幅するための溶液を含む少なくとも1つの容器を提供する工程、前記標的核酸を増幅するために特異的なオリゴヌクレオチドを前記溶液に添加する工程、前記標的核酸と、前記溶液およびオリゴヌクレオチドとを合わせる工程、反応槽中で、前記標的核酸、前記溶液および前記オリゴヌクレオチドを、前記標的核酸の存在または非存在を示す増幅反応が起こるのに充分な期間、前記標的核酸の存在または非存在を示す増幅反応が起こるのに充分な条件下でインキュベートする工程を含む、少なくとも1つの液体試料中に存在し得る少なくとも1つの標的核酸を増幅するための方法に関する。一局面において、第1の容器は、核酸の増幅に必要な少なくとも1つの塩を含む第1の溶液を含み、第2の容器は、核酸の増幅に必要な酵素およびデオキシヌクレオチドを含む第2の溶液を含み、前記第1および前記第2の溶液は、前記溶液を得るための前記反応槽中で合わされる。本発明のシステムおよび方法のある態様を図6に示す。容器およびまたはに含まれる第1およびまたは第2の溶液は、オリゴヌクレオチド以外の増幅に必要な全ての試薬を含む。溶液およびまたはは、容器に含まれるオリゴヌクレオチドの溶液と合わされる。該溶液は容器に含まれ、そのため溶液を構成する。次いで、溶液は、容器に移送される。この容器は分析器に装填loadされるように設計される。本発明の方法において、容器は、分析器に装填される。前記溶液のさらなる態様は、前述されるとおりである。ここで、本発明を以下の非限定的な実施例により例示する:実施例以下の表に列挙される装置を、それぞれの製造業者の指示書に従って使用した:試料調製本実施例には、単一の一般的な内部対照核酸を使用する、少なくとも第1および第2の標的核酸を単離および同時に増幅するための方法が記載される。簡潔に、示される態様において、細菌クラミジアトラコマチス、CTならびにDNAウイルスHBVおよびRNAウイルスHIVを含む、いくつかの異なる標的のパネルに対して同一の条件下で、同時にリアルタイムPCRを行なう。以下の試料を調製して、その後分析した:適切な標準または他の型の標的が当業者に利用可能である。試料調製について、以下の試薬を希釈剤として使用した:以下の希釈物を予め調製して、一晩保存したプラスミド希釈物を60~90°Cで:それぞれの試料の各々およびそれぞれの検体希釈剤の各々は、ピペッティングにより手動で深ウェルプレートに移し、ここで3重の分析のために、それぞれの試料を3つの異なるウェルに添加した。HIVまたはHBV試料を含むそれぞれのウェルに、50ulの内部対照核酸を手動で添加した。定性的HIVアッセイについて、定性的対照として機能するRNAを添加した100外装粒子試料。定量的HIVアッセイについて、定量的標準として機能するRNAを添加した500外装粒子試料。定量的HBVアッセイについて、定量的標準として機能するDNAを添加した1E4コピー試料。前記対照核酸の配列は、全ての場合において同じであり、配列番号45~48の群から選択した。HamiltonStarで試料調製を行い、図1に示すスキームに従って作業の流れを続けた。最終工程の後、HamiltonStar装置のプロセスヘッドprocessheadにより、増幅試薬を含むそれぞれのマスターミックスMMxがそれぞれのウェルに添加され、単離された核酸を含む液とMMxが混合され、それぞれの得られた混合物が、増幅を行なうマイクロウェルプレートの対応するウェルに移された。増幅および検出増幅について、2種類のストック溶液R1およびR2を、別々の標的核酸R1HBVおよびR2HBV、R1HCVおよびR2HCV、R1HIVおよびR2HIVについて別々に、または全量50ul中で以下の濃度の一般的な溶液R1HxVおよびR2HxVとしてのいずれかで調製した。R1HBV:25mMMnOAc、pH61、25mMMgOAcpH61および002アジ化ナトリウムpH70。R2HBV:003アジ化ナトリウムpH70、252mMKOH、1218mMKOAcpH70、5グリセロール、003Tween20、40mMトリシンpH77、02325uMアプタマー、2UUNG、042mMdGTP、042mMdATP、042mMdCTP、084mMdUTP、35UZ05Dポリメラーゼ、12uMHBVフォワードプライマー、01uMHBVセンスプローブ、12uMHBVリバースプライマー;06uM対照フォワードプライマー、06uM対照リバースプライマー、015uM対照プローブ。R1HCV:25mMMnOAc、pH61および002アジ化ナトリウムpH70。R2HCV:003アジ化ナトリウムpH70、4DMSO、110mMKOAcpH70、4グリセロール、002Igepal、50mMトリシンpH80、208vvのTRIS、pH80、02222uMアプタマー、10UUNG、05mMdGTP、05mMdATP、05mMdCTP、10mMdUTP、30UZ05Dポリメラーゼ、225vvプローブ貯蔵バッファーJA270、01uMHCVフォワードプライマー、01uMHCVリバースプライマー、01uMHCVプローブ1、01uMHCVプローブ2;03uM対照フォワードプライマー、03uM対照リバースプライマー、01uM対照プローブ。R1HIV:35mMMnOAc、pH61、および002アジ化ナトリウムpH70。R2HIV:003アジ化ナトリウムpH70、1DMSO、110mMKOAcpH70、45グリセロール、45mMトリシンpH77、60mMTrispH77、03uMアプタマー、10UUNG、175mMdGTP、175mMdATP、175mMdCTP、175mMdUTP、40UZ05Dポリメラーゼ、03uMHIVGAGフォワードプライマー、03uMHIVGAGリバースプライマー、01uMHIVGAGプローブ、01uMHIVLTRフォワードプライマー1、01uMHIVLTRフォワードプライマー2、01uMHIVLTRリバースプライマー1、01uMHIVLTRリバースプライマー2;01uMHIVLTRプローブ、03uM対照フォワードプライマー、03uM対照リバースプライマー、01uM対照プローブ。R1HxV:33mMMnOAc、pH61、および002アジ化ナトリウムpH70。HBVについてのR2HxV:003アジ化ナトリウムpH70、54DMSO、120mMKOAcpH70、3グリセロール、002Tween20、60mMトリシンpH80、02222uMアプタマー、10UUNG、04mMdGTP、04mMdATP、04mMdCTP、08mMdUTP、45UZ05Dポリメラーゼ、12uMHBVフォワードプライマー、01uMHBVセンスプローブ、12uMHBVリバースプライマー;06uM対照フォワードプライマー、06uM対照リバースプライマー、015uM対照プローブ。HCVについてのR2HxV:003アジ化ナトリウムpH70、54DMSO、120mMKOAcpH70、3グリセロール、002Tween20、60mMトリシンpH80、02222uMアプタマー、10UUNG、04mMdGTP、04mMdATP、04mMdCTP、08mMdUTP、45UZ05Dポリメラーゼ、01uMHCVフォワードプライマー、01uMHCVリバースプライマー1、01uMHCVリバースプライマー2、01uMHCVプローブ1、01uMHCVプローブ2;03uM対照フォワードプライマー、03uM対照リバースプライマー、01uM対照プローブ。HIVについてのR2HxV:003アジ化ナトリウムpH70、54DMSO、120mMKOAcpH70、3グリセロール、002Tween20、60mMトリシンpH80、02222uMアプタマー、10UUNG、04mMdGTP、04mMdATP、04mMdCTP、08mMdUTP、45UZ05Dポリメラーゼ、03uMHIVGAGフォワードプライマー、03uMHIVGAGリバースプライマー、01uMHIVGAGプローブ、01uMHIVLTRフォワードプライマー1、01uMHIVLTRフォワードプライマー2、01uMHIVLTRリバースプライマー1、01uMHIVLTRリバースプライマー2;01uMHIVLTRプローブ、03uM対照フォワードプライマー、03uM対照リバースプライマー、01uM対照プローブ。増幅試薬の最終濃度を以下の表に示す:オリゴヌクレオチド配列は、HIV1GAGフォワードプライマーまたはHIV1GAGリバースプライマーについて配列番号1~16、ならびにHIV1GAGプローブについて17~21、HIV1LTRフォワードプライマーまたはHIV1LTRリバースプライマーについて配列番号22~29、HIV1LTRプローブについて配列番号33または34、HIV2フォワードプライマーまたはHIV2リバースプライマーについて配列番号30~32、HIV2プローブについて配列番号35、HBVフォワードプライマーおよびHBVリバースプライマーについて配列番号36~37、HBVプローブについて配列番号38、内部対照について配列番号42~44、HCVフォワードプライマーについて配列番号49~63、HCVリバースプライマーまたはプローブについて配列番号64~92から選択する。増幅および検出について、マイクロウェルプレートを自動化プレートシーラー上記参照で密封して、プレートをLightCycler480上記参照に移した。以下のPCRプロフィールを使用した:プレPCRプログラムは、RNA鋳型の逆転写のために最初の変性ならびに55°C、60°Cおよび65°Cでのインキュベーションを含む。3種類の温度でインキュベーションすることは、低温でわずかにミスマッチの標的配列生物の遺伝的バリアントなども転写され、一方で高温でRNA二次構造の形成が抑制されて、それにより、より効果的な転写がもたらされるという有利な効果を組み合わせる。PCRサイクルを2つの測定に分割するが、ここで両方の測定には1段階設定アニーリングおよび伸長をあわせるを適用する。55°Cでの最初の5サイクルで、わずかにミスマッチの標的配列のプレ増幅による包括性の増加が可能になり、一方で、第2測定の45サイクルで、58°Cのアニーリング伸長温度を使用することによる特異性の増加がもたらされる。上述のマイクロウェルプレートに含まれる全ての試料にこのプロフィールを使用して、図2に示されるように、全ての試料において増幅および検出を達成した。これは、増幅前の試料調製も成功裡に行われたことを示す。定性的および定量的HIV内部対照ならびに定量的HBV内部対照についての結果を、明確化のために図2に別々に示す。全ての場合において対照も成功裡に増幅されたことが見られ得る。定量的設定におけるHIVおよびHBV標的の定量化は、定量的標準として機能する内部対照核酸との比較により計算した。比較結果を以下に示す:表7には、50ulのPCR反応における本発明の方法における使用のための第2の溶液のストックから得られた最終濃度のさらなる実施例が示される:"