"明細書中に記載の発明。本発明の目的は、限定されるものではないが、水平細胞および無軸索細胞を含めた神経細胞、桿体および錐体のような網膜細胞、角膜細胞、血管細胞、および幹細胞からのRPEおよびRPE-様細胞を含めた目の細胞の誘導のための改良された方法を提供し、および網膜変性の治療のための改良された方法および療法を提供することにある。特に、これらの細胞は、ヒト胚性幹細胞に由来するRPEおよびRPE-様細胞の使用を含む。本発明の1つの具体例は、RPE細胞、RPE-様細胞、これらの細胞の先祖、または哺乳動物胚性幹細胞に由来するこれまでのもののいずれかの2つまたは3つの組合せを用いて網膜変性のための療法用の細胞を生じさせて、限定されるものではないが、色素性網膜炎および黄斑変性および関連疾患を含めた種々の疾患を治療する改良された方法を提供する。本発明を用いて生産することができる細胞型は、限定されるものではないが、RPE、RPE-様細胞、およびRPE先祖を含む。やはり生産することができる細胞は虹彩色素沈着上皮IPE細胞を含む。介在ニューロン例えば、内部核層INLのリレーニューロンおよび無軸索細胞光受容体-二極-神経節細胞鎖よりなる垂直に直接的な経路の第二のシナプスレベルにおいて相互作用する介在ニューロン-それらは内部網状層IPLにおいてシナプスで活性であり、神経節細胞に提示される視覚メッセージに対する時間的ドメインを一体化し、変調し、および間に挟み働きをするを含めた視覚関連神経細胞もまた本発明を用いて生産することができる。加えて、網膜細胞、桿体、錐体、および角膜細胞を生産することができる。本発明のさらなる具体例において、目の血管系を供する細胞もまた生産することができる。本発明の細胞は、硝子体切除外科的処置を用いることによって網膜下空間に移植することができる。非限定的例は懸濁液、マトリックスまたは基材へのこれらの細胞の移植を含む。治療することができる色素性網膜炎の動物モデルはげっ歯類rdマウス、RPE-65ノックアウトマウス、たるのようなマウス、RCSラット、ネコアビシニアンネコ、イヌ錐体変性cdイヌ、進行性桿体-錐体変性prcdイヌ、初期網膜変性erdイヌ、桿体-錐体形成異常1、2および3rcd1、rcd2およびrcd3イヌ、光受容体形成異常pdイヌ、およびBriardRPE-65イヌを含む。評価は、挙動テスト、蛍光アンジオグラフィー、組織学、あるいはファゴサイトーシス光受容体断片、ビタミンA代謝、密な接合導電率、または電子顕微鏡を用いる評価を用いて行う。ここに提示された方法に対する多くの利点の1つは、もし目ドナー組織を用いることに制限されるならば治療が可能であろうよりもより多くの患者を生じ、および治療する能力である。本発明のさらなる具体例は、RPEの多数の特徴を持つ細胞へのhES細胞の自然発生分化のための方法を提供する。これらのRPE調製物は、培養において表現型変化が可能であり、かつ多数の通過を通じてRPE特徴を維持することができる。また、本発明は、bFGFまたはFGFの使用を介する非限定的例として、樹立されたRPE細胞系を別のニューロン系列、角膜細胞、網膜細胞に分化する方法も提供する。本発明のもう1つの具体例は、存在するおよび新しいES細胞系からの新しいRPE系および先祖細胞の誘導方法である。それらが異なるES細胞系に由来する場合、RPE-様細胞の、成長速度、色素の発現、または培養における脱分化および細分化のような特性の変動があり得る。それらの機能および核型安定性にはある種の変動があり得、従って、クローン的に選択して、高い品質のRPE-様細胞の純粋な集団を生産することができる所望の特性を持つ系の選択を可能とする新しいRPE系および新しいES細胞系の誘導方法を提供するのが望ましい。なお、もう1つの具体例において、本発明は、成長速度、色素の発現、培養における脱分化、および培養における細分化よりなる群から選択される特徴の少なくとも1つにおいて樹立されたRPE細胞系から変化する単離されたRPEまたはRPE-様細胞系を提供する。存在するおよび新しいES細胞系にやはり由来し得る細胞は虹彩色素沈着上皮IPE細胞を含む。さらなる具体例において、介在ニューロン例えば、内部核層INLのリレーニューロンおよび無軸索細胞を含めた視覚関連神経細胞も本発明を用いて生産することができる。加えて、網膜細胞、桿体、錐体、および角膜細胞を生産することができる。本発明のさらなる具体例において、目の血管系を供する細胞もまた生産することができる。本発明のもう1つの具体例は、血管新生を妨げる増大した能力を有するRPE系またはRPE細胞に対する前駆体の誘導方法である。そのような細胞は、テロメラーゼが短くなるように患者からの体細胞を老化させることによって生産することができ、ここに、該細胞の正常な複製寿命の少なくとも10は過ぎており、従って、核移動ドナー細胞としての該体細胞の使用は、色素上皮由来因子PEDF/EPC-1のような脈管形成阻害剤を過剰発現する細胞を作り出す。別法として、そのような細胞は血管新生を阻害する外因性遺伝子で遺伝的に修飾することができる。本発明のもう1つの具体例は、該細胞がそれらのHLA抗原の低下した複雑性を有するように、HLA領域におけるホモ接合性を持つESまたは胚-由来細胞のバンクを利用した。従って、本発明のさらなる具体例は、ES-由来RPE-様細胞の特徴付けを含む。ES-由来色素沈着上皮細胞は、それらの形態、挙動および分子マーカーによってRPEに非常に似ているが、それらの治療的価値は、RPE機能を行い、かつ非-癌形成性のままであるそれらの能力に依存するであろう。従って、ES-由来RPE細胞は以下の技術iそれらの機能、すなわち、光受容体断片のファゴサイトーシス、ビタミンA代謝、創傷治癒能力の評価;ii動物モデル移植を通じてのRPE-様ES細胞誘導体の多能性の評価非限定的例として、これはSCIDマウスを含むことができる;iiiRPE-様細胞のフェノタイピングおよびカリオタイピング;iv遺伝子発現プロファイリングによるES細胞-由来RPE-様細胞およびRPE組織の評価、vベストロフィン、CRALBP、RPE-65、PEDFを含めた蛋白質レベルにおけるRPEの分子マーカーの発現、およびESマーカーの不存在の評価、およびviRPEおよび神経マーカーの比率の評価の1以上を用いて特徴付けられる。該細胞が、rx/rax、chx10/vsx-2/alx、ots-1、otx-2、six3/optx、six6/optx2、mitf、pax6/mitf、およびpax6/pax2を含めた、目の発生に通常必要な転写アクチベーターのそれらの発現に基づいて評価することもできるFischerandReh,2001,Baumeretal.,2003。本発明のさらなる具体例は、iES-由来RPE-様細胞機能の評価;ii動物モデル移植を通じてのRPE-様ES細胞誘導体の多能性の評価;iiiRPE-様細胞のフェノタイピングおよびカリオタイピング;iv遺伝子発現プロファイリングの評価、v蛋白質レベルにおけるRPEの分子マーカーの発現の評価;およびvi目発生に通常必要な転写アクチベーターの評価よりなる群から選択される技術の少なくとも1つを用いてES-誘導RPE-様細胞を特徴付ける方法である。さらなる具体例において、これらの技術は、多数のhES細胞-由来細胞型の評価で用いることができる。本発明のもう1つの具体例は、ES細胞系の発生なくして、ヒトおよび非-ヒト動物桑実胚または胚盤胞-段階の胚EDCから直接的にRPE細胞およびRPE前駆体細胞を誘導する方法である。胚性幹細胞ESは未分化段階においてインビトロではっきりとせずに維持することができるが、実質的にいずれの細胞型へ分化することもできる。かくして、ヒト肺性幹hES細胞はヒト細胞の分化についての研究で有用であり、移植療法のための潜在的源と考えることができる。今日、多数の細胞型へのヒトおよびマウスES細胞の分化が報告されておりSmith,2001によってレビューされている、心筋細胞[Kehatetal.2001,Mummeryetal.,2003Carpenteretal.,2002]、ニューロンおよび神経前駆体Reubinoffetal.2000,Carpenteretal.2001,Schuldineretal.,2001、脂肪細胞Bostetal.,2002,Aubertetal.,1999、肝細胞-様細胞Rambhatlaetal.,2003、造血細胞Chadwicketal.,2003、卵細胞Hudneretal.,2003、胸腺細胞-様細胞LinRYetal.,2003、膵臓島細胞Kahan,2003、および骨芽細胞ZurNiedenetal.,2003。本発明のもう1つの具体例は、そのような細胞のメッセンジャーRNA転写体をインビボで誘導された細胞と比較することによって、胚、胚性幹細胞系、または有用な細胞型へ分化する能力を持つ他の胚性細胞に由来する、細胞療法または研究で有用なRPE細胞、造血細胞、筋肉細胞、肝臓細胞、膵臓ベータ細胞、ニューロン、内皮、先祖細胞または他の細胞のような細胞を同定する方法である。この方法は、正常な表現型を持ち、かつ研究用の細胞療法につき最適化された細胞を誘導するための細胞の同定を容易とする。本発明は、ニューロン系、網膜色素上皮RPEにおける特殊化された細胞へのヒトES細胞の分化を提供する。RPEは、脈絡膜および神経網膜の間の密に色素沈着した上皮単層である。それは血流および網膜の間のバリアーの一部として働き、その機能は放出された桿体および錐体の外側セグメントのファゴサイトーシス、迷光の吸収、ビタミンA代謝、レチノイドの再生、および組織修復を含むGriersonetal.,1994,FisherandReh,2001,Marmorsteinetal.,1998。RPEは黒色色素沈着細胞の丸石細胞形態によって容易に認識される。加えて、細胞レチナルデヒド-結合蛋白質CRALBP、先端微小絨毛においても見出される細胞質蛋白質Bunt-MilamandSaari,1983;RPE65、レチノイド代謝に関与する細胞質蛋白質Maetal.,2001,Redmondetal.,1998;ベストロフィン、ベスト卵黄黄斑ジストロフィー遺伝子の産物VMD2、Marmorsteinetal.,2000、および色素上皮由来因子PEDF、毛細血管性出血特性を持つ48kD分泌蛋白質Karakousisetal.,2001,Jablonskietal.,2000を含めた、RPEのいくつかの公知のマーカーがある。RPEの異常な特徴はその見掛けの可塑性である。RPE細胞は通常は分裂時に休止するが、負傷または光凝固に応答して分裂を開始する。負傷に隣接するRPE細胞は扁平となり、増殖し、新しい単層を形成するZhaoetal.,1997。いくつかの研究は、RPE単層が、後にそれらの元のRPE形態に復帰することができる線維芽細胞外観の細胞を生産することができるのを示したGriersonetal.,1994,Kirchhofetal.,1988,Leeetal.,2001。RPE細胞の2つの集団:上皮および紡錘状が単離されているので、分裂する細胞および色素沈着上皮層が同一系からのものであるか否かは明瞭でないMcKayandBurke,1994。インビトロにおいて、成長因子および下層の組合せに応じて、RPEは上皮として維持できるか、または迅速に脱分化し、増殖性となることができるZhao1997,OpasandDziak,1994。興味深いことには、上皮表現型は長期休止培養において再度樹立させることができるGriersionetal.,1994。哺乳動物の発生において、RPEは神経網膜、目小胞の神経上皮と同一先祖を共有する。ある種の条件下では、RPEはニューロン先祖OpasandDziak,1994、ニューロンChenetal.,2003,Vinoresetal.,1995、およびレンズ上皮Eguchi,1986にトランス分化することができることが示唆されている。ニューロンへのRPEの変化を指摘することができる因子の1つはbFGFでありOpazandDziak,1994、これは、rx/rax、chx10/vsx-2/alx、ots-1、otx-2、six3/optx、six6/optx2、mitf、およびpax6/pax2を含めた、目の発生に通常必要な転写アクチベーターの発現に関連するプロセスであるFischerandReh,2001,Baumeretal.,2003。最近、ニワトリ網膜の縁が神経幹細胞を含有しFischerandReh,2000、およびpax6/mitfを発現するその領域における色素沈着細胞がFGFに応答してニューロン細胞を形成できるFisherandReh,2001ことが示されている。本発明は、hESからの小柱メッシュワーク細胞の誘導、および緑内障の治療のための遺伝的に修飾された小柱メッシュワーク細胞を提供する。また、本発明は、RPE先祖およびRPE-様細胞からの小柱メッシュワーク細胞の誘導、および緑内障の治療用の遺伝的に修飾された小柱メッシュワーク細胞も提供する。もう1つの具体例において、本発明は、RPE-様細胞を単離する方法を提供する。そのような方法はa増殖、およびhES細胞のRPE-様細胞へのトランス分化を支持する培地中でhES細胞を培養し;b神経系に沿って分化の兆候を呈する工程aの細胞を選択し;cコラゲナーゼまたはコラゲナーゼの組合せのような酵素および/または解離緩衝液これらの非限定的例はトリプシン、コラゲナーゼIV、コラゲナーゼI、ジスパーゼ、EDTA、または他の商業的に入手可能な解離緩衝液を用いて、工程bで選択された細胞を、色素沈着上皮島が出現し、または数が増大するまで継代し;次いで、d高純度のRPE-様培養の樹立のために、工程cで継代した色素沈着または非-色素沈着細胞を選択することを含むことができる。ある態様において、本発明のhES細胞は、増殖およびトランス分化を支持するいずれかの培地において培養することができる。他の態様において、hES細胞は、血清置換を含有する培地中で培養される。具体的な態様において、本発明のhES細胞は、50u/mlペニシリン、500μg/mlストレプトマイシン、1非-必須アミノ酸溶液、2mMGlutaMAXI、0.1mMベータ-メルカプトエタノール、4ないし80ng/mlbFGF、および8.4ないし20血清置換を補足したノックアウト高グルコールDMEMを含む培地中で培養することができる。所望により、本発明のhES細胞は、さらに10ないし100ng/mlヒトLIFを含む培地中で培養される。所望により、本発明のhES培養基はさらにプラズマネートPlasmanateを含む。プラズマネートは約1ないし約25例えば、約1、4、6、8、12、16または20の最終濃度まで加えることができる。もう1つの態様において、本発明のhES細胞は反復して継代することができ、2、3、5、7、10回以上を含む。分化する細胞が、神経-系特異的マーカーのそれらの発現により選択することができる。例示的な神経-系特異的マーカーはPax6を含む。好ましい具体例において、bFGFは増殖の間にRPE培養に加え、細胞は分化の間にbFGFなくして培養される。本発明は、ES細胞系の発生なくして、ヒトおよび非-ヒト動物桑実胚または胚盤胞-段階の胚EDCから直接的にRPE細胞およびRPE前駆体細胞を誘導する方法を含む。1つの具体例において、そのような方法は:aインビトロにてES細胞を未分化状態に維持し;bES細胞をRPEおよびRPE前駆体細胞に分化させ;cそのような細胞のメッセンジャーRNA転写体をインビボで誘導された細胞と比較することによってRPE細胞を同定し、および/または蛋白質発現プロフィールを公知のRPE細胞および/または表現型評価と比較することによってRPE細胞を同定し;次いで、eRPE細胞および/またはRPE前駆体を同定し、および/または単離する工程を含む。本発明によってさらに提供されるのは、血管新生を妨げる増大した能力を有するRPE系またはRPE細胞への前駆体を誘導する方法であり、該方法は:aテロメラーゼが短くなるように動物からの体細胞を老化させ、ここに、該細胞の正常な複製寿命の少なくとも10は経過しており;次いで、b該体細胞を核移動ドナー細胞として用いて、脈管形成阻害剤を過剰発現する細胞を作成することを含み、ここに、該脈管形成阻害剤は色素上皮誘導因子PEDF/EPC-1であり得る。本発明は、hES細胞-誘導RPE、RPE-様および/またはRPE先祖細胞でパーキンソン病を治療する方法を提供する。これらは、マイクロキャリアーと共に定位層間移植によって送達することができる。別法として、それらはマイクロキャリアーを用いることなく送達することができる。該細胞は培養において拡大培養することもでき、当業者に知られたいずれかの方法によってパーキンソン病の治療に用いることもできる。本発明は例えば、以下の項目を提供する:項目1ahES細胞の増殖およびRPE-様細胞へのトランス分化を支持する培地中でhES細胞を培養する工程;b神経系に沿って分化の兆候を呈する工程aの細胞を選択する工程;c色素沈着上皮島が出現し、または数が増加するまで、トリプシン、コラゲナーゼIV、コラゲナーゼI、およびジスパーゼよりなる群から選択される酵素を用いて工程bで選択された細胞を継代する工程;およびd高純度RPE-様培養物の樹立のために、工程cで継代した色素沈着または非-色素沈着細胞を選択する工程;を含む、RPE-様細胞を単離する方法。項目2工程cにおける細胞の継代を少なくとも2回反復する、項目1記載の方法。項目3工程bにおける細胞の選択が、ネスチンまたはPax6神経系-特異的マーカーを発現する細胞の選択である、項目1記載の方法。項目4該培地が血清置換物を含有する、項目1記載の方法。項目5該培地が、500u/mlペニシリン、500μg/mlストレプトマイシン、1非-必須アミノ酸溶液、2mMGlutaMAXI、0.1mMベータ-メルカプトエタノール、4ないし80ng/mlbFGF、および8.4ないし20血清置換物を補充したノックアウト高グルコールDMEMを含む項目4記載の方法。項目6該培地が10ないし100ng/mlヒトLIFをさらに含む、項目5記載の方法。項目7該培地がプラズマネートをさらに含む、項目5記載の方法。項目8増殖速度、色素の発現、培養における脱分化、培養における再分化よりなる群から選択される特徴の少なくとも1つにおいて樹立されたRPE細胞系から変化する、単離されたRPEまたはRPE様細胞系。本発明の他の特徴および利点は以下の詳細な記載から明らかであろう。本発明の種々の具体例を詳細に記載し、これは、提供された実施例によってさらに説明することができる。本明細書中において、以下の請求項を通じて用いるように、あるおよび該の意味は、文脈上明瞭にその他のことを支持するのでなければ複数の参照を含む。また、ここに明細書で用いるように、文脈上明瞭に他のことを指令するのでなければ、におけるの意味はにおけるおよびにおいてを含む。本明細書中および請求の範囲を通じて、用語含む、またはを含むまたは含んでいるのような変形は、述べられた整数または整数の群を含めることを意味するが、いずれかの他の整数または整数の群を排除することを意味しないと理解されるであろう。本明細書中で用いる用語は、一般には、発明の文脈内において、および各用語が用いられる具体的な文脈において、当該分野におけるそれらの通常の意味を意味する。発明を記載するのに用いるある用語は以下に、または明細書中の他の箇所において議論して、発明の組成物および方法、およびどのようにしてそれらを製造し使用するかを記載するにおいて実行者に対するさらなるガイダンスを提供する。便宜のために、例えば、イタリック体および/またはコーテンションマークを用いてある用語を強調することができる。強調の使用は用語の範囲および意味に対して影響を有さず;用語の範囲および意味は、それが強調されているか否かに拘わらず、同一の文脈において同一である。同一の事は1を超える方法で述べることができると認識されるであろう。その結果、代替言語および同義語を本明細書中で議論する用語のいずれかの1以上で用いることができ、用語が本明細書中において技巧を凝らしたもの、または議論されるか否かに基づいて、特殊な意義がもたらされるものではない。ある用語に対する同義語が供される。1以上の同義語の引用は、他の同義語の使用を排除しない。本明細書中で議論するいずれかの用語の例を含めた、本明細書中におけるいずれかの箇所での例の使用は単に説明するものであり、データが、いずれかの特定の議論または作用のスキームに関することなく、本発明に従って処理され、サンプリングされ、変換されるなどされる限り、断じて本発明の範囲を限定するものではない。定義胚または胚性は、母親宿主の子宮膜に着床していない発生する細胞塊を意味する。胚性細胞は、胚から単離された、または胚に含まれる細胞である。これは、できる限り早く2-細胞段階で得られた分割球、および凝集した分割球も含む。用語胚性幹細胞とは胚-由来細胞をいう。より具体的には、それは、未分化胚芽細胞または桑実胚の内部細胞塊から単離され、細胞系として系列的に継代された細胞をいう。用語ヒト胚性幹細胞hES細胞とは、ヒト胚-由来細胞をいう。より具体的にはhESとは、ヒト未分化胚芽細胞または桑実胚の内部細胞塊から単離され、細胞系として系列的に継代された細胞をいう、分割球および凝集した分割球を含むことができる。用語ヒト胚-由来細胞hEDCとは、桑実胚-由来細胞、内部細胞塊のものを含めた未分化胚芽細胞-由来細胞、胚性シールド、または原外胚葉、または原始内胚葉、外胚葉、および中胚葉を含めた、また、分割球および凝集された単一分割球からの細胞塊、あるいは発生の種々の段階からの胚も含めた、初期胚の他の全能性または多能性幹細胞をいうが、細胞系として継代されているヒト胚性幹細胞を排除する。ヒト身体の実質的にいずれの組織にも分化する能力を有する胚性幹ES細胞は、移植療法のための再若年化および組織適合細胞の制限のない供給を提供することができる。というのは、免疫拒絶の問題は核移動および単為生殖技術でもって克服できるからである。Hiranoetal.2003の最近の知見は、マウスES細胞がインビトロにて分化実験において目-様構造を生産できることを示した。それらのうち、網膜色素上皮に似ている色素沈着上皮細胞が記載された。霊長類およびヒトES細胞系でもってAdvancedCellTechnologyで行われた予備的実験は、特殊化された培養系において、これらの細胞は、単離し、継代できるRPE-様細胞に分化することを示す。ヒトおよびマウスNT、CynoパルテノートparthenoteES細胞誘導体はRPEの複数の特徴を有し;これらの色素沈着上皮細胞はRPEの分子マーカー-ベストロフィン、CRALBP、PEDFおよびRPE65を発現する;RPEのように、培養中のそれらの増殖には脱分化-その双方は細胞が単層を形成し、休止し始めた後に維持される色素および上皮継代の喪失が伴う。そのようなRPE-様細胞は容易に継代し、凍結および解凍でき、かくして、それらの拡大培養を可能とする。分化するES培養の組織学的分析は、桿体および錐体と同様な細胞の凝集体を含めた、初期網膜発生と合致する細胞のパターンを示す。RPE移植現在、RPE同種異系移植片の慢性的なゆっくりとした拒絶は、科学者がこのRPE移植の治療効果を判断するのを妨げる。いくつかの方法がこの傷害を克服すると考えられている。最も容易な方法は、癌および感染のようなひどい副作用に関連する、全身免疫抑制を用いることである。第2のアプローチは患者自身のRPE、すなわち、ホモグラフトを移植することであるが、これは、古い病気のRPEを用いて、より多くの病気のRPEを置き換える欠点を有する。しかしながら、3番目のアプローチは同一患者からの虹彩上皮IPEを用いることであるが、これは、IPEがRPEのすべての視覚関連機能を実行できない欠点を有する。本発明は、移植拒絶が起こる確率を実質的に低下させる。なぜならばhES細胞に由来するRPEまたはRPE-様細胞は、HLA領域におけるホモ接合性を持つhES細胞のバンクから由来でき、あるいはクローン化されたhES細胞系から由来できるからである。また、核移動および単為生殖はグラフテッドRPE細胞および先祖の組織適合性を容易とする。色素性網膜炎におけるRPEの欠陥色素性網膜炎は、視覚受容体が異常な遺伝的プログラミングを介して徐々に破壊される遺伝的疾患である。いくつかの形態は比較的若い年齢において完全な盲目を引き起こし、ここに、他の形態は特徴的な骨スピクラー網膜変化を示し、視覚破壊はほとんど伴わない。この病気は世界中で約150万の人々に影響する。常染色体劣性RPを引き起こす2つの遺伝子の欠陥がRPEにおいて専ら発現される遺伝子で見出されており:1つはビタミンA代謝に関与するRPE蛋白質シスレチナルデヒド結合蛋白質によるものである、第2のものはRPE、RPE65に対してユニークなもう1つの蛋白質を含む。非ヒト動物細胞を用いることなく培養されたhES細胞由来RPE細胞系の使用では、RPのこれらの形態の双方はRPE移植によって直ちに処理可能であるべきである。この処理は、RPが絶望的に処理できず、かつまだよく理解されていない盲目の形態であった数年前では考えることができなかった。RPE移植における新しい研究は、黄斑変性を含めた網膜変性の治療で融合であることを示唆する。加えて、進行したRPを持つ多数の患者は胎児網膜細胞移植に続いていくらか有用な視覚を回復している。患者の一人は、例えば、患者の顔から約6フィートの距離で保持された指をカウントできるまでほとんど光が見えない状態から改善された。第2の場合には、視覚は、トンネル視覚を通じて文字を見ることができるまで改善された。これらの研究における移植は注入によって行われ、新しい網膜細胞を現存する神経網膜直下に導入した。細胞の全てが生存したのではない。というのは、生存したものは他のニューロンとの結合を形成し、それらの周りの光受容体のように機能し始めたが、移植された胎児細胞は同種異系すなわち遺伝子的にマッチしなかったからである。最初の8人の人々が移植を受けてからほぼ1年後に、4人はいくらか視覚機能を回復し、5番目の人はそうする兆候を示す。3つの新しく誘導されたヒト胚性幹細胞系は従前に記載されたものと特性が同様であるThomsonetal.,1998,Reibunoffetal.,2000,Richardsetal.,2000,Lanzendorfetal.,2001:それらは、培養において45継代を通じて、あるいは130集団倍化にわたって、未分化表現型を維持し、未分化hES細胞、Oct-4、アルカリ性ホスファターゼ、SSEA3、SSEA-4、TRA-I-60、TRA-I-81の公知のマーカーを発現する。全てのhES細胞系はEBまたは長期接着性培養において、およびテラトーマにおいて、3つの染色系層の誘導体に分化する。hES細胞の分化誘導体の1つは、以下の基準によって網膜色素上皮と同様である:形態学的には、それらは典型的な上皮丸石単層外観を有し、それらの細胞質において暗茶色色素を含有し、これは、メラノサイト、ケラチノサイト、網膜および虹彩色素上皮IPEにおいてのみヒト身体で存在することが知られている。しかしながら、メラノサイトは非-上皮細胞であり、ケラチノサイトはメラニンを分泌せず、蓄積するに過ぎない。これらの細胞に存在するRPE-特異的蛋白質-ベストロフィン、CRALBP、PEDFの組は、それらがIPEに対してではなくRPEに対して同様であるようであることを示す。もう1つの同様性は、増殖する細胞においてほとんどまたは全く色素が見られないが、密にパッキングされた上皮島に保持され、あるいは細胞が休止状態となった後に新しく樹立された丸石単層で再度発現される場合に、培養中の単離された色素沈着細胞の挙動である。そのような挙動は培養中のRPE細胞について記載されておりZhaoetal.,1997によってレビューされている、ニューロンマーカーのチューブリンベータIIIはインビトロにおいて脱RPE細胞では特異的に局所化されており、典型的なRPE系体を持つ細胞では局所化されていないことが従前に報告されておりVinoresetal.,1995、これは、それがRPEの可塑性、および神経系に脱分化するその能力を反映することを示唆する。本発明者らは、培養中のそのような細胞の脱分化を反映でき、あるいは長期培養においてhES細胞の分化を通じて色素沈着細胞の隣に元来は位置し、RPE-様細胞と共-単離できたであろう、ニューロン運命に委ねられる細胞の別々の集団を示すことができる、RPEおよびRPE-様細胞の初代および継代培養におけるチューブリンベータIII局所化の同一パターンを観察した。成長する目小胞において、RPEおよび神経網膜は同一の2能力神経上皮先祖を共有し、それらの運命はPax2、Pax6およびMitfによって決定されることが示されておりBaumeretal.,2003、後者は最初の2つの標的である。初期段階におけるPax6はプロ神経遺伝子のアクチベーターとして作用し、さらなる発生においてRPEでダウンレギュレートされ、成熟網膜中で無軸索および神経節細胞に留まるAshery-PadanandGruss,2001によってレビューされている。金魚において、それは再生するニューロンの有糸分裂的に活性な先祖においても見出されるHitchcocketal.,1996。本発明者らは、RPE-様細胞の多くは、チューブリンベータIIIと同様なパターンでmitfおよびPax6を発現し、長期培養において、または軽く色素沈着し、ゆるくパッキングされた部分的RPE表現型を持つ細胞において色素沈着上皮島を囲う非-上皮継代の非-色素沈着細胞においてのみ見出されたことを発見した。最近継代された培養における増殖する細胞において、全てのこれらのマーカーはほとんど各細胞で見出され、これは、増殖の開始における先祖段階へのRPE-様細胞の復帰、または網膜先祖の実質的増殖いずれかを示唆する。興味深いことには、上皮継代の色素沈着細胞の島も見出されたテラトーマにおいて、Pas6は色素沈着領域に隣接した非-色素沈着細胞で発現されたデータは示さず。多数の研究は、培養中のRPEの脱分化、およびニューロン表現型の細胞RehandGretton,1987,Skaguchietal.,1997,Vinoresetal.,1995,Chenetal.,2003、ニューロン、無軸索および光受容体細胞Zhaoetal.,1995、神経膠Sakaguchietal.,1997、神経網膜Galyetal.,2002、およびニューロン先祖OpazandDziak,1993の細胞へのそれらのトランス分化を従前に示している。そのような先祖は、今度は、培養中の成熟RPE-様細胞と共存することができ、あるいはRPE-様細胞の脱分化の結果として出現することができる。同時に、神経網膜の細胞はインビトロにてRPEへトランス分化することができOpasetal.,2001、従って、別法としてチューブリンベータIIIおよびPax6陽性細胞は、共単離された神経細胞または神経先祖のRPE-様細胞へのそのようなトランス分化の一過性段階を表すことができる。hES細胞のRPE-様細胞への分化は、後の実施例に記載された方法を用いた場合に自然に起こり、本発明者らは、色素沈着上皮細胞は6ないし8週間よりも古い培養で信頼性よく出現し、それらの数は経時的に進行し-3ないし5ヶ月以内、ほとんどEB毎の培養は大きな色素沈着領域に有したことに気が付いた。記載されたhES系に加えて、6つのより新しく誘導されたhES系はRPE-様細胞に変化し、これは、神経の運命は通常は自然にES細胞によって選択されるので、RPE-様細胞はそのような経路の進行した段階として欠陥によって生起し得ることを示唆する。また、分化するhES細胞が多層環境を形成するそのような長期培養において、許容性および/または指令性分化シグナルは、hES細胞の分化する誘導体によって生産された細胞外マトリックスおよび成長因子から来る。hES細胞のRPE-様細胞への分化のモデルは、そのようなミクロ環境がRPE分化およびトランス分化を協調させるのかを調べる有用なツールとなりえるであろう。RPEは光受容体の維持において重要な役割を演じており、種々のRPE機能障害は、インビボにて、RPE脱落、形成不全、萎縮、網膜障害、色素性網膜炎、年齢-関連黄斑変性を含めた黄斑のジストロフィーまたは変性のような、光受容体損傷および盲目をもたらしかねない、多数の視覚-改変疾患と関連する。その創傷治癒能力のため、RPEは移植療法への適用において広く調べられている。いくつかの動物モデルにおいて、およびヒトにおいてLundetal.,2001によってレビューされたGourasetal.,2002,Stangaetal.,2002,Binderetal.,2002,Schraermeyeretal.,2001、RPE移植は視覚回復の良好な能力を有することが示されている。最近、RPE移植についてのもう1つの有望なニッチェが提案されており、臨床試験の相に到達さえしている:これらの細胞はドーパミンを分泌するのでそれらはパーキンソン病の治療で用いることができようSubramanian,2001。しかしながら免疫-特権目においてさえ、移植片拒絶の問題があり、もし同種異系移植片が用いられれば、このアプローチの進行を妨げる。他の問題は胎児組織に対する依存性である。というのは、成人RPEは非常に引くい増殖能力を有するからである。本発明は、移植片拒絶が起こる尤度を減少させ、胎児組織の腫瘍に対する依存性を除去する。免疫適合組織の源として、hES細胞は移植療法に対して有望である。というのは、免疫拒絶の問題は核移動技術で克服できるからである。網膜色素上皮-様細胞およびニューロン前駆体細胞を含めた、ヒトES細胞の新しい分化誘導体の使用、およびそれを生産するための分化システムの使用は、RPEの魅力的な潜在的供給、および移植のためのニューロン前駆体細胞を提供する。実施例1長期培養における色素沈着上皮細胞への自然分化LIF、FGFおよびプラズマネート存在下でhES細胞培養をMEFで過剰増殖させた場合、それらは細胞の厚い多層を形成する。約6週間後に、細胞の暗い島がより大きなクラスター内に出現する図1。これらの暗い細胞は、図1Aに示すように、裸眼で容易に見られ、細胞のプレートにおいて小斑点のように見えた。より高い倍率においては、これらの島は、細胞質における茶色色素と共に、上皮細胞に典型的な、丸石単層における密にパッキングされた多角形細胞として出現する図1C。ほとんどの色素を有する島およびエッジ近くの島の中央部分における細胞とで、細胞における色素の量に差がある図1Eおよび1F。hES細胞が胚様体EBを形成する場合-色素沈着上皮細胞が最初の6ないし8週間以内にEBの約1ないし2で出現する図1B。経時的に、より多くのEBが色素沈着細胞を発生させ、3ヶ月までにほとんど各EBは色素沈着上皮領域を有した図1D。EBの色素沈着領域における細胞の継代は、接着性培養のそれと非常に似ていた図1D。実施例2色素沈着上皮細胞の単離および培養本発明者らは、双方の接着性hES細胞培養から、およびEBから色素沈着上皮細胞を単離した。色素沈着多角形細胞を酵素トリプシン、および/またはコラゲナーゼ、および/またはジスパーゼで消化し、これらの色素沈着島からの細胞をガラスキャピラリーで選択的に拾った。色素沈着細胞のみを拾うように注意を払ったにも拘わらず、単離された細胞の集団はいくつかの非-色素沈着細胞を相変わらず含んだ。細胞をゼラチンまたはラミニンで1ないし2日間平板培養した後、細胞は初代培養P0と考えた。初代培養は、色素沈着多角形細胞およびいくつかの単一色素沈着細胞の島を含有した。培養における3ないし4日後に、上皮継代扁平およびラメリポディウムを持つ細胞を喪失したように見える非-色素沈着細胞はいくつかの島の周辺部に出現した図2。そのような周辺細胞の数は経時的に増加し、これは、これらの細胞が増殖性であることを示唆し、2週間後に、新しく形成された単層におけるほとんどの細胞はほとんどまたは全く色素を含有しなかった。さらに2ないし3週間の継続的培養の後、色素沈着上皮細胞は再度出現し始め、元の培養におけるものから視覚的に区別できなかった図2。実施例3RPEマーカーの検出RPEとしてのこれらの分化したヒト細胞の予備的特徴付けは、従前に記載されたRPE培養に対するそれらの同様性;主としてそれらの上皮継代および色素の保有に基づく。ヒト身体には3つのタイプの色素沈着上皮細胞:網膜および虹彩色素沈着上皮およびケラチノサイトがあるが、後者は色素を分泌しない。上皮構造および丸石継代は他の色素沈着細胞、例えば、メラノサイトによって保有されない。また、RPE細胞は培養で増殖させるとそれらの色素および上皮継代を喪失し、獲得することが示されておりZhao1997,OpasandDriak,1994、色素沈着細胞は同様に挙動し、従って、ES由来細胞はRPEであり得るという仮説を検定するために、それらをRPEに対する公知のマーカー:ベストロフィンおよびCRALBPに対する抗体で染色した。図3左側パネルはベストロフィンAおよびCRALBPCの膜局所化を示し、双方は色素沈着上皮島で見出される。該細胞の全てがこれらの抗体で染色されるのではなく、染色の強度は色素発現およびコロニーの緻密性と相関し-細胞がより大きく、よりゆるくパッキングされた各色素沈着島の境界は、双方の蛋白質のより低い発現を示した。RPE細胞を推定的にさらに特徴付けるために、ウェスタンブロッティングによってベストロフィン、CRALBPの発現に対して分析を行った。図3右側パネル、頂部は、細胞溶解物において、ベストラフィン、68kDa、CRALBP、36kDbに対応するバンドを示す。全てのこれらの蛋白質は初代培養および引き続いての継代双方において見出された。もう1つの公知のPREマーカーであるRPE65が、リアル-タイム、PT-PCRによってRPE-様細胞で見出された図3、右側パネル、底部。図3、右側パネル、底部に示すように、RPE65の発現が分析した全てのhES-RPE試料で確認された。興味深いことには、継代から7週間後の成熟培養は対照の未分化hES細胞よりも4ないし9倍多いRPE65mRNAを有し、他方、より初期の継代2週齢培養のみが1.5ないし2.5倍だけ対照を超えた。図3、右側パネル、底部参照。PEDFELISAアッセイは、全ての推定されたRPE培養の細胞溶解物におけるPEDFの存在を示し、およびウェスタンブロットはほぼ48kDのバンドを示した示さず。RPE-様培養におけるニューロンおよび網膜先祖のマーカーの検出。PAX-6、Pax2、mitfおよびチューブリンベータIIIは、最近継代された細胞の大部分において、およびhES細胞に由来するRPE-様細胞の古い培養での少数の細胞においてのみ発現されることが示された図4。増殖する細胞のRPE-様継代が失われるトリプシン処理から3日後の増殖培養において、ほとんど各細胞はmitf、Pax6、チューブリンベータIIIおよびネスチンの存在を示した。Pax2はmitf-陰性のように見えた細胞の小さなサブセットのみで見出され、他方、Pax6/mitf、mitf/チューブリンベータIIIおよびPax6/チューブリンベータIIIのかなりの程度の共局所化があった。色素沈着上皮島が再度確立された後の21日齢休止培養において、PAX-6およびmitfの群は、色素沈着上皮島の間の非-上皮継代の非-色素沈着細胞においてほとんどが見出され図4、AないしC、チューブリンベータIIIは同様な分布のパターンを有した示さず。しかしながら、色素沈着島の周辺近くに位置する、mitf-陽性およびPax6-陰性細胞の集団があった図4、AないしC。Pax2はmitf-陰性細胞の非常に小さなサブセットにおいてのみ見出された図4、EないしH。これらの蛋白質のいずれかの存在は成熟色素沈着上皮島の細胞で決して検出されなかった。しかしながら、いくらかのRPE特徴を有するに過ぎない細胞におけるこれらのマーカーはしばしば目に見え、すなわち、上皮のように見えるが、色素沈着上皮島から離れたある単一色素沈着細胞においては色素を有しなかった。実施例4Cyno-1ES細胞からのhES細胞系ACTJ-1から誘導されたRPE-様細胞の特徴付け、および存在するhES細胞系H1、H9およびH7からのRPE-様細胞の誘導RPE-様細胞系を拡大培養し、凍結および回収についてテストし、以下の方法およびRPE細胞の分子マーカーを用いて特徴付けた:ウェスタンブロットおよび免疫蛍光によってベストロフィンおよびCRALBP、ELISAおよびウェスタンブロットによってPEDFおよびRT-PCRによってRPE65。細胞を対照としての未分化hESまたはCyno-1細胞と共にSCIDマウスに注入して、腫瘍形成性を評価した。RPE-様細胞のカリオタイピングは市販ベースにて臨床試験上によってなされるであろう。次いで、RPE-様細胞の機能的特性の特徴付け、およびそれらの移植能力の試験を、本出願に記載されたようにまた当業者に知られた技術を用いて行う。遺伝子発現プロファイリング実験は、Affymetrixヒトゲノムアレイを用いて行う。遺伝子発現は、ES細胞に由来するRPE-様細胞、およびオートプシからの網膜試料において比較する。限定されるものではないが、アカゲザル、ラットおよびウサギを含めたいくつかの動物モデルを用いて、移植されたRPE-様細胞の有効性を確認することができる。実施例5RPE-様細胞の高い収率を保証する分化培養系の最適化ES細胞を、bFGFインスリン、TGFベータ、IBMX、bmp-2、bmp-4、または段階的添加を含めたそれらの組合せのような因子の存在下で、フィーダー細胞上で、あるいは胚様体EBとして培養する。別法として、ES細胞は、RPE系性におけるECMの役割を評価するにおいて、種々の細胞外マトリックス-被覆プレートラミニン、フィブロネクチン、コラーゲンI、コラーゲンIV、Matrigelなど上で増殖させる。初期RPE先祖のPax6、Pax2、mitf、およびRPE細胞のCRALBP、ベストロフィン、PEDF、RPE65分子マーカーの発現を、リアル-タイムRT-PCRによって種々の時間間隔で評価して、前記剤、およびRPE-様細胞またはそれらの先祖において豊富化を生じる段階的手法の首尾よい組合せを確認し、決定する。また、このアプローチを用いて、RPEの共通の先祖、および単離し、それらの分化能力についてさらに特徴付け、および移植実験で用いることができる光受容体または神経網膜のような他の目の組織を表示させることもできる。実施例6RPE、および現存するおよび新しいEP細胞系からの他の目組織先祖の誘導遺伝子発現プロファイリングからのデータを用い、RPE先祖マーカーの発現を表面蛋白質の発現と関連付けて、RPE先祖細胞に対する表面マーカーのユニークな組合せを見出す。もしそのように見出されれば、表面蛋白質に対する抗体を用いてRPE先祖の純粋な集団を単離することができ、これは、次いで、培養し、培養中にさらに分化させることができ、あるいは移植実験で用いて、グラフティング後のそれらの分化を可能とすることができる。もし遺伝子発現プロファイリング実験からのデータが不十分であれば、RPE先祖を単離するために、以下のアプローチを用いる。ES細胞およびRPE-様細胞をPax6のようなプロモーターの存在下でGFPでトランスフェクトし、安定なトランスフェクタントを選択する。トランスフェクトされた分化ES細胞または分化脱分化RPE細胞の培養から、GFP/Pax6―陽性細胞をFACSによって単離し、これをマウス注射のための抗原源として用いて、Pax6陽性細胞の表面分子に対するモノクローナル抗体を生起させる。Pax6はRPE先祖にのみ存在するのではないので、スクリーングはいくつかの戦略を用い:a増殖するRPE-様細胞に対して、bPax2-陽性RPE細胞に対して、cmitf-陽性RPE細胞に対してFACSによってなされる。bおよびcでは、RPE細胞は対応するプロモーター下でGFPでトランスフェクトし;陰性対照として、これらの抗原によって陰性なRPEまたはES細胞を用いる。全てのこれらの戦略によって選択される陽性クローンの拡大培養後に、抗体を、スクリーニングで用いた全てのタイプの細胞に対してテストし、さらに分析する:この戦略は、RPE先祖に対して特異的なおよび非特異的な細胞表面抗原を認識する抗体を表示させることができるので、これらの抗体で選択されたES細胞またはRPE細胞の分化する全集団からの細胞を、RPE先祖の分子マーカーにつき、およびRPEを生産するそれらの能力について評価する。RPE、または目組織の他の初期先祖、およびそれらのユニークな表面マーカーに対する抗体を生産するための最適化された規定段階的手法を用い、そのような先祖は分化されたES細胞から単離し、インビトロで培養される。目の種々の組織に分化するそれらの能力を、Aim2に記載された戦略を用いて調べる。RPE-様細胞H1、H7、H9、ACTJ1、ACT-4、Cyno-1、RPE-様細胞を既に生じたES細胞系を用いて、Aim1および2に記載したように、継続的にRPE-様細胞およびそれらの先祖を誘導する。RPEの分子マーカーについての拡大培養および特徴付けの後、これらの系を単一-細胞をクローン化し、得られた系をAim1に記載したように特徴付ける。RPE細胞についての基準を満足する系を移植実験のために用いる。新しいヒトES細胞系は未使用IVF胚から、受精なくして発生するように刺激した提供された卵細胞からパルテノート、および核移動技術の適用で提供された卵細胞から得られた作成された発生する未分化胚芽細胞から誘導する。RPE-様細胞および共通する目先祖はAim2におけるアプローチを用いてこれらの系から誘導し、得られた系はAim1におけるように特徴付ける。任意新しいヒトES細胞系はウィルス-フリー系で誘導し、特徴付け、臨床試験のために提出する。実施例7色素性網膜炎および黄斑変性の種々の動物モデルにおけるRPE-様細胞および先祖の治療的能力霊長類ES細胞をカニクイザルマタクザルにおいてテストする。最初に、硝子体切除外科的処置を行い、細胞を動物の網膜下空間に移植する。第1の工程は懸濁液様式における細胞の移植であり、その後、基材またはマトリックスを用いて、単層移植を生じさせる。これは、ヒトES-細胞から由来する細胞を用いる免疫抑制ウサギにおいて、また、げっ歯類rdマウス、RPE65ノックアウトマウス、たるのようなマウス、RCSラット、ネコアビジニアンネコ、イヌ錐体変性cd、イヌ、進行性桿体-錐体変性prdcイヌ、初期網膜変性erdイヌ、桿体-錐体形成異常1、2および3rcd1、rcd2およびrcd3イヌ、光受容体形成異常pdイヌ、およびBriardRPE-65イヌを含めた、色素性網膜炎の種々の他の動物モデルにおいて行うこともできる。評価は蛍光アンジオグラフィー、組織学光受容体の回復およびおそらくはERGがあるかないかを問わないを用いて行う。機能的テストも行い、これは、ファゴサイトーシス光受容体断片、ビタミンA代謝、密な接合導電率、および電子顕微鏡観察を含む。実施例8ヒト胚-由来細胞からのRPE細胞の直接的分化ヒト未分化胚芽細胞-段階の胚を免疫外科的処置の有または無にてネズミまたはニワトリ胚線維芽細胞の存在下で平板培養して、栄養外胚葉を除去し、あるいは細胞外マトリックス蛋白質-被覆組織培養器具上で直接的に平板培養する。細胞を培養および継代して、ヒトES細胞系を生じさせる代わりに、細胞を直接的に分化させる。hEDC細胞培養をLIF、FGFおよびプラズマネートの存在下でMEF上で過剰増殖させた場合、それらは細胞の厚い多層を形成するであろう別の成長因子、培地およびFBSを用いて、当業者に知られているように、直接的分化を代わりに行うことができる。約6週間後に、細胞の暗い島がより大きなクラスター内に出現する。これらの暗い細胞は裸眼で容易に見られ、図5Bに示したように、細胞のプレートにおいて小斑点のように見えた。より高い倍率では、これらの島は、細胞質における茶色色素と共に、上皮細胞に典型的な、丸石単層における密にパッキングされた多角形細胞として出現する図5A。ほとんどの色素を有する島、およびエッジ近くの島の中央部分における細胞とで、細胞中の色素の量の差がある図5B。hEDC細胞を直接的に分化させた場合、それらは、典型的にはそうでないが、胚様体EBを形成することができる。色素沈着上皮細胞は、最初の6ないし8週間内に、これらの分化した細胞および/またはEBの約1ないし2で出現する。経時的に、より多くのEBが色素沈着細胞を発生させ、3ヶ月までに、ほとんど各EBは色素沈着上皮領域を有した。EBの色素沈着領域における細胞の継代は、接着性培養のそれと非常に似ていた。材料および方法MEF培地:2mMGlutaMaxI、および500u/mlペニシリン、500ug/mlストレプトマイシン全てInvitrogenからおよび16FCSHyCLoneを補足した高グルコースDMEM。hES細胞増殖培地:500u/mlペニシリン、500μg/mlストレプトマイシン、1非―必須アミノ酸溶液、2mMGlutaMAXI、0.1mMベータ-メルカプトエタノール、4ng/mlbFGFInvitrogen、1-ng/mlヒトLIFChemicon,Temecula,CA、8.4の血清置換物SR,Invitrogenおよび8.4プラズマネートBayerを補足したノックアウト高グルコースDMEM。誘導培地は、培養基と比較して、より低い濃度のSRおよびプラズマネート各々4.2および8.4FCSおよび2×濃度のヒトLIFおよびbFGFをそれが有する以外は培養基と同一の成分を含有した。EB培地:bFGF、LIF、およびプラズマネートを除いて増殖培地に同じ;SR濃度は13であった。RPE培地:50EB培地および50MEF培地。hES細胞系分化実験は接着性hES細胞で、あるいは胚様体EBで行った。接着分化では、hESコロニーがそれらの密な境界を失い、その時点で、培養基をEB培地で交換するまで通常継代から8ないし10日後hES細胞をMEFで過剰増殖させた。培地を1ないし2日ごとに交換した。EB形成のためhES細胞をトリプシン処理し、低接着性プレート上でEB倍地中で培養したCoster。免疫染色細胞を2パラホルムアルデヒドで固定し、細胞内抗原の局所化のための0.1NP-40で浸透させ、およびPBSInvitrogen中の10ヤギ血清、10ラバ血清JacksonImmunoresearchLaboratoriesWestGrove,PAで少なくとも1時間ブロックした。初代抗体とのインキュベーションを4°Cにて一晩行い、二次抗体JacksonImmunoresearchLaboratoriesWestGrove,PAを1時間で加えた。すべてのインキュベーションの間に、検体をPBS中の0.1Tween-20Sigma3ないし5回、各洗浄につき10ないし15分間洗浄した。DAPIを備えたVectashieldVectorLabolatories,Burlingame,CAを用いて検体を設置し、蛍光顕微鏡Nikon下で観察した。用いた抗体:ベストロフィンNovusBiologicals,Littleton,CO、抗-CRALBP抗体は親切にもWashinton大学のSaari博士から贈られた。二次抗体はJacksonImmunoresearchLaborotoriesからのものであり、ストレプトアビジン-FITCはAmershamから購入した。RPE-様細胞の単離継代hES細胞およびEBの接着性培養をPBSで2回濯ぎ、単層がゆるめられるまで、37°Cにて0.25トリプシン/1mMEDTAInvitrogen中でインキュベートした。色素沈着領域からの細胞をガラスキャピラリーで掻き落とし、MEF培地に移し、200×gで遠心し、RPE培地中のゼラチン-被覆プレート上に平板培養した。培地を細胞が付着した後に交換し通常、1ないし2日以内、その後5ないし7日毎に;細胞を0.05トリプシン/0.53mMEDTAInvitrogenにて2ないし4週間毎に継代した。ウェスタンブロットおよびELISA試料を、5メルカプトエタノールおよびプロテアーゼ阻害剤カクテルRocheを補足したLaemmli緩衝液Laemmli,1970中で調製し、5分間煮沸し、Mini-Protean装置を用いて8ないし16グラジエントゲルBio-Rad,Hercules,CA上に付加し;ゲルをゲル当たり25ないし30mAで流し;蛋白質を20ボルトにて一晩0.2ニトロセルロース膜SchleicherandShull,Keene,NHに移した。ブロットをポンソレッドSigmaで軽く染色してバンドを可視化し、Milli-Q水で洗浄し、0.1TBST中の5無脂肪ドライミルクBio-Radで1時間ブロックした。ベストロフィン、CRALBPまたはPEDFChemiconに対する初代抗体を2時間で加え、続いて、TBSTで3回15分間洗浄し;ペルオキシダーゼ-コンジュゲーテッド二次抗体を1時間で加え、洗浄を反復した。Super-Signal試薬Pierceを備えたECLシステムを用いてブロットを検出した。製造業者のプロトコルに従い、PEDFELISAキットChemiconを用い、PEDFELISAを細胞溶解物で行った。リアル-タイムRT-PCR2工程手法によって、全RNAを分化するES培養から精製し、粗製RNAをTrizol試薬Invitrogenを用いて単離し、RNeasyミニカラムQiagenでさらに精製した。製造業者Qiagenプロとコロルに従い、RPE65検出のための市販のプライマー組AssayonDemandHs00165642ml,AppliedBiosystemsおよびQuantitectProbeRT-PCR試薬Qiagenを用いて、RPE65転写体のレベルを例アル-タイムPCRによってモニターした。実施例9エクスビボで分化した正常な分化細胞を同定するためのトランスクリプトミックの使用hES-細胞誘導体は、再生医学の将来において重要な役割を演じるようである。これらおよび他の幹細胞誘導体の定量的評価は、依然として、機能的ゲノミックスを用いてアプローチすることができる挑戦のままである。我々は、hES-RPEの転写プロフィールVSその移植値について広く研究されているそのインビボカウンターパートの胎児RPE細胞を比較した。次いで、双方のプロフィールをヒトRPE細胞系について既に公表されたRogojinaetal.,2003トランスクリプトミックデータと比較した。我々のデータ組の遺伝子発現プロフィールを2つのヒトRPE細胞系非-形質転換ARPE-19および形質転換D407、Rogojinaetal.,2003と比較して、hES-RPEが同様な全体的転写プロフィールを有するか否かを判断した。全ての細胞において発現された共通するハウスキーピング遺伝子を説明するために、我々は、共通のハウスキーピングおよび上皮遺伝子を排除し、RPE-特異的遺伝子を同定するのを可能とするその共通の上皮起源に基づく対照としての未分化hES細胞H1系、h1-hES,――Satoetal.,2003および気管支上皮細胞BE,Wrightetal.,2004からの公に入手可能なAffymetrixデータ組を用いた。hES-RPE、hES-RPE-TD、ARPE-19、D407の間に同様性および差がある。該同様性は、BEではなくhES-RPE/ARPE-19に存在する遺伝子の間の排除的交差を分析することによってさらに示した1026遺伝子。バックグラウンドを説明するために、我々は、これを、BEと比較した場合に、hES-RPEおよびARPE-19における5倍または6倍大きな同様性をもたらす、ARPE-19ではなくBE/hES-RPEに存在する遺伝子の排除的交差と比較した186遺伝子。D497/ARPE19は、長期継代細胞に典型的な、RPE65、ベストロフィン、CRALBP、PEDFのようなRPE特異的遺伝子を失うように見える図6。さらなるデータマイニングは、ARPE19ではなく胎児RPEおよびES-RPEのみにおける、メラニン生合成、視覚、レチノール-結合のような公知のRPE特異的存在論を明らかにした。それらのインビボカウンターパートである、新たに単離されたヒト胎児RPEfeRPEに対するhES-RPE、ARPE-19およびD407の比較は我々の従前のデータと合致し、これは、ヒトfeRPEに対するhES-RPEの転写同一性がfeRPEに対するD4072.3倍の差-849遺伝子/373遺伝子およびfeRPEに対するARPE-191.6倍の差-588遺伝子/364遺伝子よりも有意に大きいことを示す図5c/5d。ARPE-19またはD407ではなくhES-PREのみに存在する前記で同定されたRPE特異的マーカーもまたfeRPEにやはり存在し、これは、培養されたRPE系よりもそのインビボカウンターパートに対するhES-RPEのより高い同様性を示す。hES-RPEに存在する784遺伝子はfeRPEおよびARPE-19データ組に存在しなかった。幹性遺伝子の保持は、もし患者に移植すれば、hES誘導体の悪性テラトーマへのトランスフォーメーションを潜在的に引き起こしかねないので、我々は、現在利用可能なAffymetrixマイクロアレイデータ組を用いて保存的潜在的幹性遺伝子を作り出したAbeytaetal.,2004Sato2003。この結果、共通のハウスキーピング遺伝子を含めた全ての12のデータ組に存在する3806遺伝子のリストがもたらされた。feRPE-ARPE-19ではなくhES-RPEデータ組に存在する784遺伝子のうち36のみが3806の潜在的幹性遺伝子と共通した。これらのいずれも、Oct4、Sox2、TDGF1のような公知の幹性遺伝子ではなかった。実施例10パーキンソン病の治療のためのRPE細胞の使用hRPEはパーキンソン病の細胞療法のための細胞の代替源として用いることができる、なぜならばそれらはL-ドーパを分泌するからである。研究は、ゼラチン-被覆マイクロキャリアーに付着したそのような細胞が半パーキンソン病サルに首尾よく移植することができ、顕著な改善標的当たり1万ないし5万細胞を生じ、2000年に開始されたFDA-認可試験において、患者は有害効果なくしてhRPE線条体内移植を受けたことを示した。hES細胞-由来RPEを用いる多くの利点のうち1つは、それがドナーの目の組織の決定を回避することである。それは遺伝子療法の使用も容易とする。実施例11光受容体の喪失を救済しまたは予防するための幹細胞由来RPE細胞系の使用RPE細胞系の誘導ヒト胚性幹hES細胞を、2mMGlutaMAXIまたはグルタミン、500u/mlペニシリン、500μg/mlストレプトマイシン全てInvitrogenからおよび16FCS8ないし10の範囲とできるHyCLoneを補足した高グルコースDMEMを含有するMEF培地中で増殖させた。hES細胞は、500u/mlペニシリン、500μg/mlストレプトマイシン、1非-必須アミノ酸溶液、2mMGlutaMAXI、0.1mMベータ-メルカプトエタノール、4ng/mlまたは80までbFGFInvitorogen、10ng/mlまたは100までヒトLIFLIFは任意であるChemicon,Temecula,CA、8.4の血清置換物20まで用いることができるSR,Invitorogenおよび8.4プラズマネート任意Bayerを補足したノックアウト高グルコースDMEMを含有する増殖培地中で増殖させることができる。EB培地は、bFGF、LIF、およびプラズマネートが含まれておらず、SR濃度が13である以外は増殖培地と同一である。RPE培地は50EB培地および50MEF培地である。別法として、hES細胞はヒト血清またはFBSの存在下で培養することができる。RPE培養では、分化した表現型のその増殖、トランス分化および再樹立を支持する異なる培地を用いることができる。その例は、限定されるものではないが、2mMGlutaMAXIまたはグルタミン、500u/mlペニシリン、500μg/mlストレプトマイシン抗生物質は任意全てInvitrogenからおよび16FCS8ないし20の範囲とできるHyCloneまたはヒト血清を補足した高グルコースDMEM;1.2g/L炭酸水素ナトリウム、2.5mML-グルタミン、15mMHEPES0.5mMピルビン酸ナトリウム;胎児ウシ血清、10を含有するダルベッコの修飾イーグル培地およびハムのF12培地の1:1混合物;ATCCから、ヒトRPE細胞から樹立されたARPE-19細胞系の増殖用に推奨される。ヒト網膜色素上皮の機能的に局化された単層への分化を支持する細胞培養基もこの目的で使用することができる。RPEは、従前に記載されているように培養することができその開示をここに引用して援用するHuandBok,MolecularVision20007:14-19、あるいは血清または血清置換成分、あるいはRPE増殖を支持する成長因子組合せを有する他の培養基中で培養することができる。これらの実験で用いたhES細胞の2つは記載されているように誘導し双方の開示をここに引用して援用する、Cowanetal.,N.Eng.J.Med.350:1353-13562004,KlimanskayaandMcMahon,HandbookofStemCells,Vol.1:EmbryonicStemCells,EditedbyLanzaetal.,Elsevier/AcademicPress,pp.437-4492004、3つの系はJamieThomsonH1、H7およびH9によって誘導した。ヒト凍結未分化胚芽細胞は、彼らの受精処理を完了したカップルによって研究に寄付された。分化実験は接着性hES細胞で、または胚様体ESで行った。接着性分化では、hES細胞を、hESコロニーがその密な境界を喪失し、その時点で、培養基をEB培地で交換する通常、継代から8ないし10日後まで、MEF上で過剰増殖させた。培地が黄色になれば、あるいは密な培養では1ないし2日毎に、あるいはまばらな培養またはEBでは頻度低く、培地を交換した。EB形成では、hES細胞をトリプシン処理し、低接着性プレートCostarでEB培地中で培養した。免疫染色細胞を2パラホルムアルデヒドで固定し、細胞内抗原の局所化のための0.1NP-40で浸透させ、PBSInvitrogen中の10ヤギ血清、10ロバ血清、JacksonImmunoresearchLaboratories,WestGrove,PAで少なくとも1時間ブロックした。次いで、検体を一次抗体と共に4°Cにて一晩インキュベートし、次いで、二次抗体JacksonImmunoresearchLaboratories,WestGrove,PAと共に1時間インキュベートした。全てのインキュベーションの間に、検体をPBS中の0.1Tween-20Sigmaで3ないし5回、各洗浄につき10ないし15分洗浄した。DAPIを備えたVectashieldVectorLaboratories,Burlingame,CAを用いて検体を設置し、蛍光顕微鏡Nikon下で観察した。用いた抗体は抗-ベストロフィン抗体NovusBiologicals,Littleton,CO、および抗-CRALBP抗体Washington大学のSaari博士からの贈物を含む。二次抗体はJacksonImmunoresearchLaboratoriesから入手し、ストレプトアビジン-FITCはAmershamから購入した。RPE-様細胞の単離および継代hES細胞またはEBの接着性培養をPBSで2回濯ぎ、37°Cにて、単層が緩くなるまで0.25トリプシン/1mMEDTAInvitrogen中でインキュベートした。色素沈着領域からの細胞をガラスキャピラリーで掻き落とし、MEF培地に移し、200×gで遠心し、RPE培地中のゼラチン-被覆プレート上に平板培養した。細胞が付着した後通常、1ないし2日以内、その後5ないし7日毎に、培地を交換した。細胞を0.05トリプシン/0.53mMEDTAInvitrogenで2ないし4週間毎に継代した。細胞を継代し、あるいは1ないし10の濃度のトリプシンまたはコラゲナーゼIV、コラゲナーゼI、またはジスパーゼを用いて移植用に集めた。各々、1ないし10の濃度のこれらのいずれの組合せも、色素沈着細胞の単離および継代のために、トリプシンの代わりに用いることができよう。この関係で組合せは、一緒のまたは順次のそのような酵素の使用、例えば、コラゲナーゼ消化、続いてのトリプシン消化を意味することを意図する。継代希釈は、希釈無しから1:6以上まで変化させることができる。移植に先立っての培養用の基材は、限定されるものではないが、ゼラチン、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲンまたは異なるタイプの細胞外マトリックス、被覆されていないプラスチック表面、フィルター――ECM細胞外マトリックス蛋白質で未被覆または被覆、Matrigel、角膜、RPE、線維芽細胞のような他の細胞培養から単離されたECM、未被覆ビーズ、またはECMで被覆したビーズのような、hES-RPEの増殖および特徴を支持するいずれのものであってもよい。継代の間の時間は1日から7週間まで変化させることができる。以前の実験において、表面のRPEのシートと共に9ヶ月齢胚様体を用いて、hES-RPEの継代可能な培養を樹立し、従って、どれくらい長く細胞を継代することなく培養に維持できるかについて知られた制限はない。培養は適切なRPE継代を持つ細胞-すなわち、多角形の密にパッキングされた色素沈着細胞-のみならず、種々の程度のトランス分化細長い色素沈着または非-色素沈着細胞等、およびhES細胞から共分化する他の細胞型を持つ細胞よりなることができる。細胞を培養のために個々に選択するのでなければ、そのような培養は、通常、非-RPE細胞によって分離されるRPE島を含有する。色素沈着細胞の島、または上皮シート、または空胞化細胞の凝集体であり得る個々の細胞の、RT-PCR、ウェスタンブロット、免疫染色、組織学、または継代によって検出できるような、ネスチン、Pax6等のようなこの系のマーカーを発現する神経系に沿った分化の兆候を呈した分化するES細胞の培養をトリプシン、コラゲナーゼ、ジスパーゼ、またはその混合物で継代し、拡大し、色素沈着上皮島が出現し、または数が増加するまで通常、1または2継代培養した。色素沈着上皮および非-色素沈着非-上皮細胞のそのような混合培養を用いて、コラゲナーゼまたはコラゲナーゼ-ジスパーゼ消化の後に色素沈着および非-色素沈着細胞を選択的に手で拾うことができよう。次いで、これらの手で拾った色素沈着および非-色素沈着細胞をより小さな業種体または単一細胞に分散させ、あるいは分散なくして平板培養でき、その結果、高純度のRPE培養が樹立された。ウェスタンブロットおよびELISA試料は、5メルカプトエタノールおよびプロテアーゼ阻害剤カクテルRocheを補足したLaemmli緩衝液Laemmli,1970中で調製し、5分間煮沸し、Mini-Protean装置を用いて8ないし16グラジエントゲルBio-Rad,Hercules,CAに負荷し;ゲルをゲル当たり25ないし30mAで流した。次いで、蛋白質を20ボルトにて一晩、ゲルから0.2ニトロセルロース膜SchleicherandShull,Keene,NHに移した。ブロットをポンソレッドSigmaで軽く染色して、バンドを可視化し、Milli-Q水で洗浄し、0.1TBST中の5無脂肪ドライミルクBio-Radで1時間ブロックした。ベストロフィン、CRALBPまたはPEDFに対する一次抗体Chemiconを2時間でブロットに加え、続いて、TBSTで3回15分間洗浄を行った。次いで、ペルオキシダーゼ-コンジュゲーテッド二次抗体を1時間でブロットに加え、洗浄を反復した。Super-Signal試薬Pierceを備えたECLシステムを用いてブロットを検出した。製造業者のプロトコルに従い、PEDFELISAキットChemiconを用い、PEDFELISAを細胞溶解物で行った。リアル-タイムRT-PCR2-工程手法によって、全RNAを分化するES培養から精製した。Trizol試薬Invitrogenを用いて粗製RNAを単離し、RNeasyミニカラムQiagenでさらに精製した。RPE65転写体のレベルは、製造業者Qiagenプロトコルに従い、RPE65検出AssayonDemandHs00165642ml,AppliedBiosystemsについての市販のプライマーのための組およびQuantiTectProbeRT-PCR試薬Qiagenを用い、RPE65転写体のレベルをリアル-タイムPCRによってモニターした。hES-由来RPE細胞系の移植hES細胞系の培養を23日齢RCSラットの1つの目に対する移植細胞として用いて、光受容体の喪失を救済または予防することができる。異なる形態および/または分化の異なる程度の細胞を選択することができる。移植は記載されているように行ったその開示をここに引用して援用する、Lundetal.2001Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:9942-47;DelPrioreetal.InvestigativeOphthalmologyVisualScience200445:985-992;Gourasetal.2002OphthalmologyVisualScience43:3307-11。前記したようなトリプシンまたは他の酵素での消化に続き、hES細胞を洗浄し、2μl注射当たり2×105細胞の密度にて懸濁液に経強膜送達した。送達は、約75ないし150μmの内径を持つ微細なガラスピペットを用いてハムのF-10培地中で達成した。注射は、機能的劣化および有意な光受容体死滅の前の時点で、麻酔した23日齢のジストロフィー-色素沈着RCSラットの1つの目の側頭背後網膜下空間に送達されるべきである。シャム-注射ラットはhES-由来細胞なくしてキャリアー媒体単独を受ける。手術後ラットの組織学的評価をより短い時点で例えば、手術から1ケ月後に行って、移植に関連する短期の変化を評価し、より長い時点で例えば、手術後5ヶ月で行って、ドナー細胞の生存を調べることができる。細胞は、移植前48時間、20μmBrdUrdを含有する培地中で培養することによってタグを付し、または標識することができる。移植されたhES-由来細胞の機能的評価Lundetal.2001Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:9942-47にも記載されているように、移植されたラットの挙動評価を、該動物を含有する静止保持チャンバーの周りに12度/秒の一定速度で回転する円形ドラムよりなる頭部-トラッキング装置で行うことができる。刺激の提示は、度当たり0.125、0.25および0.5サイクルのような種々の空間的周波数にて黒色および白色ストライプで被覆した相互交換可能なパネル上に置くことができる。動物は手術後10ないし20週間でテストすることができる。全ての動物評価は唯一のオペレーターによって盲検的に行うことができる。挙動データはANOVAを用いて分析することができる。生理学的実験は、60および90日において、角膜心電図ERGで動物に対して行うことができる。テストに先立ち、ラットは暗所に一晩適合させ、ケタミンおよびキシラジンで赤色光下で麻酔すべきである。例えば、Peachyetal.,VisNeurosci.2002Nov-Dec;196:693-701参照。瞳孔は膨張し、ERGを綿ガーゼ生理食塩水電極で角膜から記録すべきである。皮下30-ゲージ針を、各々、参照および設置電極として、前頭および体幹に挿入することができる。対象ラットの体温を35ないし36°Cに維持しつつ、光刺激を約0.7×103μW/cm2の角膜にて測定した最大フラッシュ強度で適用すべきである。種々の周波数においてコンピューター化データ獲得システムによって応答は記録し平均化すべきである。ERG振幅はa-波の初期府ピークから、またはb-波の正のピークに対してベースラインから測定すべきである。Lundetal.2001Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:9942-47におけるように、100日における上丘からの視覚受容場の照明に対する閾値応答を記録すべきである。動物は末端ウレタン麻酔1.25g/kg/i.p.下におくべきである。データは概略200μm空間的に離れた独立した点において全視野にわたって収集すべきであり、各点は視野における約10ないし15°変位に対応する。視覚閾値はバックグラウンドに対する強度の増加として測定し、3°直径のスポット光で上丘の表層200μmにおけるユニットを活性化するために0.02cd/m2に[桿体飽和未満の少なくとも2.6対数logユニットに]維持すべきである。閾値マップは各動物について表示させ、網膜表示として示すべきである。H9細胞系に由来するRPE細胞を移植した7つの目、およびJ1細胞系に由来するRPE細胞を移植した6つの目をERG分析に付した。RPE移植は23日齢ラットで行い、ERG分析は移植後36日に行った。H9群は均一に良好な応答を生じ、他方、J1群は最小応答を伴うに過ぎない一匹の動物を生じた。移植された細胞の組織学的分析Lundetal.2001Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:9942-47に記載されているように、動物は組織学的分析に付すべきである。動物はオイタナールで安楽死させ、PBS、続いて、過ヨウ素酸塩-リシン-パラホルムアルデヒドPLPで経心臓灌流した。目を切開し、クレジルバイオレットで染色すべきである。BrdU群の動物からの目を抗-BrdUrd抗体で標識し、適当な二次抗体および各試薬を用いて可視化すべきである。他の目は0.1Mカコジレート緩衝液中の2.5パラホルムアルデヒド、2.5グルタルアルデヒド、および0.01ピクリン酸での注射によって固定することができる。目は1四酸化オスニウム中でポスト固定し、引き続いて、エポキシプロパンに対する特級アルコールを通じて脱水することができる。組織を樹脂に包埋し、それから半-薄いセクションを切断し、1ホウ酸緩衝液中のトルイジンブルーで染色することができる。実施例12網膜変性の処理のための幹細胞由来神経先祖細胞の使用神経先祖の生成hES細胞例えば、H1、H7およびH9、NationalInstitutesofHealth-WA01、WA07およびWA09として登録を、MEF培地2mMGlutaMAXIまたはグルタミン、および500u/mlペニシリン、500μg/mlストレプトマイシン抗生物質、任意全てInvitrogenからおよび15FCS8ないし20の範囲とできるHyCloneを補足した高グルコースDMEM上で、あるいは細胞外マトリックス上で過剰増殖させた。次いで、継代から一週間またはそれ以上後に、sES細胞をトリプシン、コラゲナーゼまたはジスパーゼ、または2つの後者の酵素の組合せで分裂させ、EB培地中のゼラチン上で平板培養する実施例11参照。培地をそれが黄色となれば、通常は2ないし4日毎に交換する。これらの条件下で増殖する細胞の大部分は神経先祖として陽性である。なぜならば、それらはネスチンおよび/またはチューブリンベータIIIを発現し、神経先祖細胞の典型的な外観-細長い紡錘-様細胞を有するからである。それらは同一条件下で再度継代することができ、これはネスチン-およびチューブリンベータIII-陽性細胞での細胞集団の豊富化に導く。RT-PCRを、そのような培養においてネスチン、Pax6、N-CAM、チューブリンベータIIIの存在を確認する。別法として、hES細胞の分化する培養におけるスフェロイド形成を除去し、EB培地中で培養皿ゼラチンまたはもう1つの細胞外マトリックスで被覆することができ、記載された細胞型の形成を可能とする上に平板培養することができ、あるいはそのようなスフェロイドは分化するhES細胞の全集団の最初の継代後に形成され、同様にしてアプローチすることができる。数日以内に、紡錘-様細胞の増殖が認められ、これは、後に、拡大培養し、神経先祖細胞についての前記マーカーを発現することができる。hES細胞からの目組織の分化hES細胞の実施例11に記載された分化条件は、ロドプシン、オプシン5、オプシン1、およびレコベリンの発現を確認する、分化する培養の組織学的調査によって図9a、およびRT-PCR分析によって示される桿体および錐体-様構造の出現を可能とすることができる図9b、9cおよび9d。また、我々は、そのような培養はRT-PCR検出ケラチン12、角膜マーカーとして角膜細胞を含有することができることも示す図9e。他の具体例これまでの記載から、変形および修飾を本明細書中に記載された発明に対して行って、それを種々の用法および条件に適用することができるのは明らかである。"