"乾燥細胞重量の質量として測定して、少なくとも25質量のエイコサペンタエン酸を含んでなる油を産生する、組換え微生物宿主細胞。油が、総脂肪酸の質量として測定して、少なくとも45質量のエイコサペンタエン酸を含んでなる、請求項1に記載の組換え微生物宿主細胞。油の総脂肪酸の質量として測定されたリノール酸と、総脂肪酸の質量として測定されたエイコサペンタエン酸との比率が少なくとも2.4である、請求項1または2に記載の組換え微生物宿主細胞。a少なくとも1つのΔ8デサチュラーゼに連結された少なくとも1つのΔ9エロンガーゼを有するポリペプチドを含んでなる、少なくとも1つのマルチザイム;bその発現が下方制御されている、少なくとも1つのペルオキシソーム形成因子タンパク質;およびc少なくともリゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ[LPAAT]活性を有する、少なくとも2つのポリペプチド;d少なくともリン脂質:ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ[PDAT]活性を有する、少なくとも1つのポリペプチドを含んでなる、組換え宿主細胞。iL35F変異;iiL35M変異;iiiL35G変異;ivL35G変異と、S9A、S9D、S9G、S9I、S9K、S9Q、Q12K、A21D、A21T、A21V、V32F、Y84C、Q107E、L108G、G127L、W132T、M143N、M143W、L161T、L161Y、W168G、I179M、I179R、C236N、Q244N、A254W、およびA254Yからなる群から選択される少なくとも1つのその他の変異;vL35G、A21V、L108G、およびI179R変異;viL35G、W132T、およびI179変異;viiL35G、S9D、Y84C、およびI179R変異;viiiL35G、Y84C、I179R、およびQ244N変異;ixL35G、A21V、W132T、I179R、およびQ244N変異;xK58RおよびI257T変異;xiD98G変異;xiiL130MおよびV243A変異;およびxiiiK58R、L35F、L35G、L35M、S9A、S9D、S9G、S9I、S9K、S9Q、Q12K、A21D、A21T、A21V、V32F、Y84C、D98G、Q107E、L108G、G127L、L130M、W132T、M143N、M143W、L161T、L161Y、W168G、I179M、I179R、C236N、V243A、Q244N、A254W、A254Y、およびI257Tからなる群から選択される、少なくとも2つの変異を含んでなる任意の組み合わせからなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸変異によって、配列番号3と異なる、配列番号1に記載のアミノ酸配列を含んでなる、少なくとも1つの変異Δ9エロンガーゼポリペプチドをさらに含んでなる、請求項4に記載の組換え微生物宿主細胞。少なくとも1つの変異Δ9エロンガーゼポリペプチドがL35G置換を含んでなり、変異Δ9エロンガーゼポリペプチドが配列番号3のΔ9エロンガーゼ活性と比べて改善されたΔ9エロンガーゼ活性を有する、請求項5に記載の組換え微生物宿主細胞。マルチザイムが、aリンカーが、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、および配列番号10からなる群から選択される;およびb配列が、配列番号12、配列番号14、および配列番号16からなる群から選択される配列から本質的になるからなる群から選択される特性を有する、請求項4に記載の組換え微生物宿主細胞。少なくとも2つのリゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼが、a配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号23、および配列番号25からなる群から選択される配列から本質的になる配列;およびb配列番号18、配列番号22、および配列番号23からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して、アラインメントのClustalW法に基づいて少なくとも43.9のアミノ酸同一性を有し、配列番号26および配列番号27からなる群から選択される少なくとも1つの1-アシル-sn-グリセロール-3-リン酸アシルトランスフェラーゼファミリーモチーフをさらに含んでなるポリペプチドからなる群から選択される、請求項4に記載の組換え微生物宿主細胞。少なくとも1つのリン脂質:ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼが、a配列番号29および配列番号30からなる群から選択される配列から本質的になる配列;およびb配列番号29および配列番号30からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して、アラインメントのClustalW法に基づいて少なくとも90のアミノ酸同一性を有するポリペプチドからなる群から選択される、請求項4に記載の組換え微生物宿主細胞。宿主細胞がヤロウィア属Yarrowiaのものである、請求項4に記載の組換え微生物宿主細胞。宿主細胞が、少なくとも1つの変異Δ5デサチュラーゼポリペプチドをさらに含んでなり、ここで該変異Δ5デサチュラーゼポリペプチドが、a配列番号180[HxGx]に記載のアミノ酸モチーフと、配列番号182[HxxxH]に記載のアミノ酸モチーフとを含んでなり、配列番号180[HxGx]が配列番号181[HPGG]と同一でなく、配列番号182[HxxxH]が配列番号183[HDASH]と同一でない、変異ポリペプチド;b配列番号106[EgD5Mまたはコドン最適化EgD5R-34g158g]、配列番号108[EgD5R-34g158g347s]、配列番号110[EgD5S-36s157g]、配列番号112[EaD5S-35a158g]、配列番号299[EgD5R-34g157g]、配列番号301[EgD5R-34g158a]、配列番号303[EgD5R-34g158g]、配列番号329[EgD5S-36s156e]、配列番号331[EgD5S-36s158a]、配列番号333[EgD5S-36s158g]、配列番号363[EaD5S-35a158s]、および配列番号365[EaD5S-35a159g]からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、変異ポリペプチドからなる群から選択される、請求項4~10のいずれか一項に記載の組換え微生物宿主細胞。aエイコサペンタエン酸を含んでなる微生物油が生産される、請求項1~10のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養するステップと;b任意選択的に、ステップaの微生物油を回収するステップとを含んでなる、エイコサペンタエン酸を含んでなる微生物油を製造する方法。ステップbの回収された油をさらに処理する、請求項12に記載の方法。上で引用した開示にもかかわらず、リノール酸[LA;ω-6]などの中間体脂肪酸生成や、最終油生成物中の副産物脂肪酸を最小化しながら、高い総脂質含量すなわち高いEPA生産性に加えて、総脂肪酸の重量として高いEPA生産を可能にする、EPAの商業生産のために株の改良が必要である。出願人らは、ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaの改善された最適化株を操作することで既述の問題を解決し、改善は、乾燥細胞重量の重量としての測定で、少なくとも25重量のEPAを含んでなる微生物油の製造を可能にする。第1の実施形態では、本発明は、乾燥細胞重量の重量としての測定で、少なくとも25重量のエイコサペンタエン酸を含んでなる油を産生する、組換え微生物宿主細胞に関する。第2の実施形態では、本明細書で開示されるのは、総脂肪酸の重量としての測定で、少なくとも45重量のエイコサペンタエン酸を含んでなる油である。好ましくは、前出のいずれの油も、総脂肪酸の重量として測定されたリノール酸に対する、総脂肪酸の重量として測定されたエイコサペンタエン酸の比率が、少なくとも2.4である。第3の実施形態では、本明細書で開示されるのは、a少なくとも1つのΔ8デサチュラーゼに連結した少なくとも1つのΔ9エロンガーゼを有するポリペプチドを含んでなる、少なくとも1つのマルチザイム;bその発現が下方制御されている、少なくとも1つのペルオキシソーム形成因子タンパク質;およびc少なくともリゾホスファチジン酸アシル基転移酵素[LPAAT]活性を有する、少なくとも2つのポリペプチド;d少なくともリン脂質:ジアシルグリセロールアシル基転移酵素[PDAT]活性を有する、少なくとも1つのポリペプチドを含んでなる組換え微生物宿主細胞である。第4の実施形態では、組換え微生物宿主細胞は、少なくとも1つの変異Δ9エロンガーゼポリペプチドをさらに含んでなってもよく、前記変異Δ9エロンガーゼポリペプチドは、配列番号1に記載のアミノ酸配列を含んでなり、配列番号1は、iL35F変異;iiL35M変異;iiiL35G変異;ivL35G変異と、S9A、S9D、S9G、S9I、S9K、S9Q、Q12K、A21D、A21T、A21V、V32F、Y84C、Q107E、L108G、G127L、W132T、M143N、M143W、L161T、L161Y、W168G、I179M、I179R、C236N、Q244N、A254W、およびA254Yからなる群から選択される、少なくとも1つのその他の変異;vL35G、A21V、L108G、およびI179R変異;viL35G、W132T、およびI179変異;viiL35G、S9D、Y84C、およびI179R変異;viiiL35G、Y84C、I179R、およびQ244N変異;ixL35G、A21V、W132T、I179R、およびQ244N変異;kK58RおよびI257T変異;xiD98G変異;xiiL130MおよびV243A変異;およびxiiiK58R、L35F、L35G、L35M、S9A、S9D、S9G、S9I、S9K、S9Q、Q12K、A21D、A21T、A21V、V32F、Y84C、D98G、Q107E、L108G、G127L、L130M、W132T、M143N、M143W、L161T、L161Y、W168G、I179M、I179R、C236N、V243A、Q244N、A254W、A254Y、およびI257Tからなる群から選択される、少なくとも2つの変異を含んでなるあらゆる組み合わせからなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸変異によって、配列番号3と異なる。好ましくは、少なくとも1つの変異Δ9エロンガーゼポリペプチドはL35G置換を含んでなり、変異Δ9エロンガーゼポリペプチドは、配列番号3のΔ9エロンガーゼ活性と比べて改善されたΔ9エロンガーゼ活性を有する。好ましくは、少なくとも1つのマルチザイムは、a配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、および配列番号10からなる群から選択されるリンカー;およびb配列番号12、配列番号14、および配列番号16からなる群から選択される配列から本質的になるアミノ酸配列からなる群から選択される特性を有する。好ましくは少なくとも2つのリゾホスファチジン酸アシル基転移酵素の少なくとも1つは、a配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号23、および配列番号25からなる群から選択される配列から本質的になるアミノ酸配列、およびb配列番号18、配列番号22、配列番号23からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して、アラインメントのClustalW法に基づいて少なくとも43.9のアミノ酸同一性を有し、配列番号26および配列番号27からなる群から選択される少なくとも1つの1-アシル-sn-グリセロール-3-リン酸アシル基転移酵素ファミリーモチーフをさらに含んでなるポリペプチドからなる群から選択される。好ましくは、少なくとも1つのリン脂質:ジアシルグリセロールアシル基転移酵素は、a配列番号29および配列番号30からなる群から選択される配列から本質的になるアミノ酸配列;およびb配列番号29および配列番号30からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して、アラインメントのClustalW法に基づいて少なくとも90のアミノ酸同一性を有するポリペプチドからなる群から選択される。好ましくは、宿主細胞はヤロウィア属Yarrowiaである。第5の実施形態では、本発明は、aエイコサペンタエン酸を含んでなる微生物油が生成される、本発明のいずれかの宿主細胞を培養するステップと;bステップaの微生物油を任意選択的に回収するステップとを含んでなる、エイコサペンタエン酸を含んでなる微生物油を製造する方法に関する。第6の実施形態では、本発明は、本発明の方法によって生成される油のさらなる処理に関する。生物学的寄託以下の生物学的材料が、AmericanTypeCultureCollectionATCC,10801UniversityBoulevard,Manassas,VA20110-2209に寄託され、以下の名称、受入番号、および寄託日を有する。上に列挙した生物学的材料は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条項に従って寄託された。列挙された寄託は、指定の国際寄託機関で少なくとも30年間維持され、それを開示する特許の付与に際して公的に入手可能となる。寄託株の利用可能性は、政府の行動によって付与された特許権を失墜させて主題発明を実施する認可とはみなされない。ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaY9502は、米国特許出願公開第2010-0317072-A1号明細書に記載される手順に従って、ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaY8412から誘導された。本明細書において引用される、全ての特許、特許出願、および刊行物は、その内容全体を参照によって援用する。本開示では、いくつかの用語および略称が使用される。標準三文字コードまたは一文字コードを使用して、アミノ酸に言及する。以下の定義が提供される。読み取り枠は、ORFと略記される。ポリメラーゼ連鎖反応は、PCRと略記される。AmericanTypeCultureCollectionは、ATCCと略記される。多価不飽和脂肪酸は、PUFAと略記される。トリアシルグリセロールは、TAGと略記される。補酵素Aは、CoAと略記される。総脂肪酸は、TFAと略記される。脂肪酸メチルエステルは、FAMEと略記される。乾燥細胞重量は、DCWと略記される。重量は、wtと略記される。本明細書の用法では、発明または本発明という用語は、特許請求の範囲および明細書に記載される、本発明の全ての態様および実施形態を指すことが意図され、いかなる特定の実施形態または態様にも限定されないものと解釈される。食品、医薬品、乳児用調製粉乳、健康補助食品、動物飼料、および水産養殖飼料という用語は、米国特許出願公開第2010-0317072-A1号明細書で定義される通りである。本明細書の用法では、バイオマスという用語は、具体的には、商業的に有意な量でEPAを産生する組換え生産宿主の発酵からの消耗済みまたは使用済み細胞物質を指す。好ましい産生宿主は油性酵母の組換え株、好ましくはヤロウィア属Yarrowiaの、より好ましくはヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaの組換え株である。バイオマスはホールセル、ホールセル溶解産物、均質化細胞、部分的加水分解細胞物質、および/または部分的精製細胞物質例えば微生物産生油の形態であってもよい。脂質という用語は、あらゆる脂溶性すなわち親油性天然分子を指す。脂質の概説は、米国特許出願公開第2009-0093543-A1号明細書で提供されるその中の表2を参照されたい。油という用語は25°Cで液体の脂質物質を指し;油は疎水性であるが、有機溶媒に可溶性である。油性生物では、油が総脂質の大部分を構成する。油は主にトリアシルグリセロール[TAG]からなるが、その他の中性脂質、リン脂質、および遊離脂肪酸もまた含有してよい。油中の脂肪酸組成と総脂質の脂肪酸組成は、一般に類似しており;したがって総脂質中の脂肪酸濃度の増大または減少は、油中の脂肪酸濃度の増大または減少に対応し、逆もまた然りである。中性脂肪とは、脂肪体の細胞中に貯蔵脂肪として一般に見られる脂質を指し、細胞のpHでは脂質は荷電基を有さないため、このように称される。一般にそれらは完全に非極性で、水に対する親和性がない。中性脂質とは、一般に脂肪酸によるグリセロールのモノ-、ジ-、および/またはトリエステルを指し、それぞれモノアシルグリセロール、ジアシルグリセロールまたはトリアシルグリセロールと称され、または集合的にアシルグリセロールとも称される。アシルグリセロールから遊離脂肪酸を放出するためには、加水分解反応が起きなくてはならない。トリアシルグリセロール[TAG]という用語は、グリセロール分子にエステル化された3つの脂肪酸アシル残基から構成される中性脂質を指す。TAGは、長鎖PUFAおよび飽和脂肪酸、ならびに鎖長のより短い飽和および不飽和脂肪酸を含有し得る。総脂肪酸[TFA]という用語は、本明細書では、例えば生物由来資源または油であってもよい特定サンプル中で、当該技術分野で知られているような塩基エステル交換法によって脂肪酸メチルエステル[FAME]に誘導体化し得る、細胞性脂肪酸の総和を指す。したがって総脂肪酸は、中性脂質画分ジアシルグリセロール、モノアシルグリセロール、およびTAGをはじめとするからの脂肪酸、および極性脂質画分例えばホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミン画分をはじめとするからの脂肪酸を含むが、遊離脂肪酸は含まない。細胞の総脂質含量という用語は、乾燥細胞重量[DCW]のとしてのTFA測定値であるが、総脂質含量は、DCWのとしてのFAME測定値[FAMEDCW]として近似し得る。したがって総脂質含量[TFADCW]は、例えば100ミリグラムのDCWあたりの総脂肪酸のミリグラムと同等である。総脂質中の脂肪酸濃度は、本明細書では、例えば100ミリグラムのTFAあたりの特定の脂肪酸のミリグラムのように、TFAの重量[TFA]として表される。本開示中では、特に断りのない限り、総脂質に対する特定脂肪酸のパーセントへの言及は、TFAとしての脂肪酸濃度に等しい例えば総脂質のEPAは、EPATFAに等しい。場合によっては、細胞中の特定脂肪酸含量をその乾燥細胞重量の重量DCWとして表すことが有用である。したがって、例えばEPA生産性の尺度[EPADCW]は、次式に従って判定される。EPATFATFADCW]/100しかし乾燥細胞重量の重量DCWとしての細胞中の特定脂肪酸含量は、以下のように近似し得る。EPATFAFAMEDCW]/100脂質プロフィールおよび脂質組成という用語は同義であり、総脂質中または油中などの特定の脂質画分に含有される個々の脂肪酸の量を指し、この量はTFAの重量として表される。混合物中に存在する個々の脂肪酸の総和は、100になるべきである。抽出油という用語は、その中で油が合成される微生物などのその他の細胞物質から分離された油を指す。抽出油は多種多様な方法を通じて得られ、最も単純なものは物理的手段のみを伴う。例えば、様々なプレス構造例えばスクリュー、エキスペラー、ピストン、ビードビーターなどを使用した機械的破砕が、細胞物質から油を分離し得る。それに代えて、油抽出は様々な有機溶剤例えばヘキサンによる処理を通じて、酵素的抽出を通じて、浸透圧衝撃を通じて、超音波抽出を通じて、超臨界流体抽出例えばCO2抽出を通じて、鹸化を通じて、そしてこれらの方法の組み合わせを通じて行い得る。抽出油は精製され、またはさらに濃縮されてもよい。本明細書に記載される抽出油は、少なくとも45のEPATFAを含んでなる。混合油という用語は、所望の組成物を得るために、本明細書に記載される抽出油と、任意の油の組み合わせまたは個々の油とを混合またはブレンドして得られる油を指す。したがって、例えば異なる微生物からの数種類の油を共に混合して、所望のPUFA組成物が得られ得る。代案としては、またはそれに加えて、本明細書で開示されるPUFA含有油と、魚油、植物油または双方の混合物とをブレンドして、所望の組成物が得られ得る。脂肪酸という用語は、約C12~C22の様々な鎖長の長鎖脂肪酸アルカン酸を指すが、鎖長のより長い酸およびより短い酸の双方も知られている。優勢な鎖長は、C16~C22の間である。脂肪酸の構造はX:Yの簡易表記体系によって表され、式中、Xは特定の脂肪酸中の炭素[C]原子の総数であり、Yは二重結合数である。飽和脂肪酸対不飽和脂肪酸、一不飽和脂肪酸対多価不飽和脂肪酸[PUFA]、およびω6脂肪酸[ω-6またはn-6]対ω3脂肪酸[ω-3またはn-3]の間の区別の追加的詳細は、参照によって本明細書に援用する米国特許第7,238,482号明細書中に提供される。本明細書でPUFAを記述するのに使用される命名法を表2に示す。略記法と題された欄ではω-基準系を使用して、炭素数、二重結合数、そしてこの目的で1番目であるω炭素から数えたω炭素に最も近い二重結合の位置を示す。表の残りは、ω-3およびω-6脂肪酸とそれらの前駆体の一般名、明細書全体を通じて使用される略称、および各化合物の化学名を要約する。PUFA生合成経路という用語は、オレイン酸をLA、EDA、GLA、DGLA、ARA、DTA、およびDPAn-6などのω-6脂肪酸に、およびALA、STA、ETrA、ETA、EPA、DPA、およびDHAなどのω-3脂肪酸に変換する代謝過程を指す。この過程は、文献で十分に記載されている。例えば米国特許第7,932,077号明細書および米国特許出願公開第2009-0093543-A1号明細書を参照されたい。簡単に述べるとこの過程は、小胞体膜内に存在するPUFA生合成経路酵素と称される一連の特有な延長酵素および不飽和化酵素による、炭素原子の付加を通じた炭素鎖の延長と、二重結合の付加を通じた分子の不飽和化とを伴う。より具体的にはPUFA生合成経路酵素とは、PUFAの生合成と関連付けられている以下の酵素のいずれかおよび前記酵素をコードする遺伝子を指す。Δ4デサチュラーゼ、Δ5デサチュラーゼ、Δ6デサチュラーゼ、Δ12デサチュラーゼ、Δ15デサチュラーゼ、Δ17デサチュラーゼ、Δ9デサチュラーゼ、Δ8デサチュラーゼ、Δ9エロンガーゼ、C14/16エロンガーゼ、C16/18エロンガーゼ、C18/20エロンガーゼおよび/またはC20/22エロンガーゼ。Δ9エロンガーゼ/Δ8デサチュラーゼ経路という用語は、少なくとも1つのΔ9エロンガーゼと少なくとも1つのΔ8デサチュラーゼを含んで、それによってEDAおよび/またはETrAを中間体脂肪酸として、LAおよびALAから、それぞれDGLAおよび/またはETAの生合成が可能になるPUFA生合成経路を指す。その他のデサチュラーゼおよびエロンガーゼの発現により、ARA、DTA、DPAn-6、EPA、DPA、およびDHAもまた合成されてもよい。変換効率および基質変換と言う用語は、例えばデサチュラーゼ、エロンガーゼまたはマルチザイムなどの特定の酵素が、基質を生成物に変換し得る効率を指す。変換効率は、次式に従って判定される。[生成物]/[基質生成物]100式中、生成物は、即時生成物と、経路中のそれから誘導される全ての生成物とを含む。デサチュラーゼという用語は、不飽和化させ得る、すなわち1つまたは複数の脂肪酸に二重結合を導入して対象の脂肪酸または前駆体を生成し得るポリペプチドを指す。特定脂肪酸に言及するための明細書全体を通じたω基準系の使用にもかかわらず、Δシステムを使用して、基質のカルボキシル末端から数えることで、デサチュラーゼ活性を示すことがより都合良い。本明細書において特に興味深いのは、Δ8デサチュラーゼ、Δ5デサチュラーゼ、Δ17デサチュラーゼ、およびΔ12デサチュラーゼである。その他の有用なデサチュラーゼとしては、Δ4デサチュラーゼ、Δ6デサチュラーゼ、Δ15デサチュラーゼ、およびΔ9デサチュラーゼが挙げられる。エロンガーゼという用語は、脂肪酸炭素鎖を伸長して、エロンガーゼが作用する脂肪酸基質よりも炭素2個分だけ長い酸を生成し得るポリペプチドを指す。この伸長過程は、米国特許第7,659,120号明細書に記載されるように、脂肪酸シンターゼと共同して多段階機序で起きる。エロンガーゼ系によって触媒される反応の例は、GLAからDGLA、STAからETA、ARAからDTA、およびEPAからDPAへの変換である。一般に、エロンガーゼの基質選択性はやや広範であるが、鎖長と、不飽和の程度およびタイプとの双方によって区別される。例えば、C14/16エロンガーゼはC14基質例えばミリスチン酸を利用し、C16/18エロンガーゼはC16基質例えばパルミチン酸を利用し、C18/20エロンガーゼはC18基質例えばGLA、STAを利用し、C20/22エロンガーゼ[Δ5エロンガーゼまたはC20エロンガーゼとも称される]はC20基質例えばARA、EPAを利用する。本明細書の目的では、2つの異なるタイプのC18/20エロンガーゼを定義し得る。Δ6エロンガーゼは、それぞれGLAおよびSTAからDGLAおよびETAへの変換を触媒するのに対し、Δ9エロンガーゼは、それぞれLAおよびALAからEDAおよびETrAへの転換を触媒し得る。C18からC20への延長変換効率は、それによってC18//20エロンガーゼが、C18基質すなわちLA、ALA、GLA、STAをC20生成物すなわちEDA、ETrA、DGLA、ETAに変換し得る効率を指す。これらのC18//20エロンガーゼは、Δ9エロンガーゼまたはΔ6エロンガーゼのいずれかであり得る。Δ9延長変換効率という用語は、それによってΔ9エロンガーゼが、C18基質すなわちLA、ALAをC20生成物すなわちEDA、ETrAに変換し得る効率を指す。EgD9eという用語は、本明細書で配列番号31によってコードされる、ミドリムシEuglenagracilisから単離されたΔ9エロンガーゼ配列番号32を指す。同様にEgD9eSという用語は、ヤロウィアリポリティカYarrowialipolytica中での発現のためにコドン最適化された、ミドリムシE.gracilisに由来する合成Δ9エロンガーゼすなわち配列番号2および3を指す。EgD9eおよびEgD9eS、同様にΔ9エロンガーゼモチーフに関するさらなる詳細は、米国特許第7,645,604号明細書に記載される。EaD9eという用語は、本明細書において配列番号33によってコードされる、ユーグレナアナベナEuglenaanabaenaから単離されたΔ9エロンガーゼ配列番号34を指す。同様にEaD9eSという用語は、ヤロウィアリポリティカYarrowialipolytica中での発現のためにコドン最適化された、E.アナベナE.anabaenaに由来する合成Δ9デサチュラーゼすなわち配列番号35および36を指す。EaD9eおよびEaD9eSに関するさらなる詳細は、米国特許第7,794,701号明細書に記載される。E389D9eという用語は、本明細書で配列番号37によってコードされる、ユートレプチエラ属EutreptiellaCCMP389種から単離されたΔ9エロンガーゼ配列番号38を指す。同様にE389S9eSという用語は、ヤロウィアリポリティカYarrowialipolytica中での発現のためにコドン最適化された、ユートレプチエラ属EutreptiellaCCMP389種に由来する合成Δ9デサチュラーゼすなわち配列番号39および40を指す。E389D9eおよびE389D9eSに関するさらなる詳細は、米国特許第7,645,604号明細書に記載される。IgD9eという用語は、本明細書において配列番号41によってコードされる、イソクリシスガルバナIsochrysisgalbanaから単離されたΔ9エロンガーゼ配列番号42;NCBI受入番号AAL37626GI17226123を指す。変異Δ9エロンガーゼまたは変異EgD9eSという用語は、ヤロウィアリポリティカYarrowialipolytica中での発現のためにコドン最適化された、ミドリムシEuglenagracilisに由来する合成Δ9エロンガーゼすなわちEgD9eS[配列番号2および3]と比較して、少なくとも1つの変異を有するΔ9エロンガーゼを指す。変異としては、あらゆる欠失、挿入、および点変異またはそれらの組み合わせが挙げられるが、好ましい実施形態では、変異EgD9eSは配列番号1図16Bで記載され、配列番号1は、aL35F変異;bL35M変異;cL35G変異;dL35G変異と、S9A、S9D、S9G、S9I、S9K、S9Q、Q12K、A21D、A21T、A21V、V32F、Y84C、Q107E、L108G、G127L、W132T、M143N、M143W、L161T、L161Y、W168G、I179M、I179R、C236N、Q244N、A254W、およびA254Yからなる群から選択される、少なくとも1つのその他の変異;eL35G、A21V、L108G、およびI179R変異;fL35G、W132T、およびI179R変異;gL35G、S9D、Y84C、およびI179R変異;hL35G、Y84C、I179R、およびQ244N変異;iL35G、A21V、W132T、I179R、およびQ244N変異;jK58RおよびI257T変異;kD98G変異;lL130MおよびV243A変異;およびmK58R、L35F、L35G、L35M、S9A、S9D、S9G、S9I、S9K、S9Q、Q12K、A21D、A21T、A21V、V32F、Y84C、D98G、Q107E、L108G、G127L、L130M、W132T、M143N、M143W、L161T、L161Y、W168G、I179M、I179R、C236N、V243A、Q244N、A254W、A254Y、およびI257Tからなる群から選択される、少なくとも2つの変異を含んでなるあらゆる組み合わせからなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸変異によって、配列番号3と異なる。列挙された各置換では、最初の文字はEgD9eS配列番号3中のアミノ酸に対応し、2番目の文字は変異体配列番号1中の同じ位置に見られるアミノ酸に対応し、すなわちL35Fは、EgD9eS中の位置35のLeu[L]から、EgD9eS変異体中のPhe[F]への変化を示す。この命名法は、本明細書に記載されるΔ9エロンガーゼタンパク質内の変異に言及するために明細書全体を通じて使用され;同様の表記法が、ヌクレオチド配列内の置換を記述するのに使用されるすなわちC62Tは、EgD9eS配列番号2中の位置62のシトシン[C]から、EgD9eS変異体中のチミン[T]への変化を示す。異なるポリペプチド配列にもかかわらず、酵素活性を比較すると、変異EgD9eSは、EgD9eSよりも改善されたΔ9エロンガーゼ活性を有する。したがって変異EgD9eS配列は、EgD9eSと比べて酵素活性が増大しているすなわちEgD9eSの酵素活性の少なくとも約101~110、好ましくは少なくとも約110~125、より好ましくは少なくとも約125~150、最も好ましくは約150を超える。好ましい範囲は上述の通りであるが、有用な変換効率の例としては、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、および150などの50から少なくとも150のあらゆる整数百分率が挙げられる。EgD9eS-L35Gという用語は、本明細書で配列番号43によってコードされるEgD9eS配列番号3と比較して、単一L35G変異を有する合成変異Δ9エロンガーゼ配列番号44を指す。マルチザイムまたは融合タンパク質という用語は、少なくとも2つの独立して分離可能な酵素機能を有する単一ポリペプチドを指し、第1の酵素活性は、好ましくは第2の酵素活性に連結する米国特許出願公開第2008-0254191-A1号明細書。少なくとも2つの独立して分離可能な酵素機能間のリンカーは、単一ポリペプチドからなってもよいが、リンカーはまた、Proなどの1つのアミノ酸残基から、または少なくとも1つのProを含んでなるポリペプチドからなってもよい。好ましいリンカーは、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、および配列番号10からなる群から選択される。DGLAシンターゼという用語はマルチザイムを指し、Δ9エロンガーゼはΔ8デサチュラーゼに連結する。EgD9eS/EgD8Mという用語は、リンカー配列すなわち配列番号4[GAGPARPAGLPPATYYDSLAVMGS];米国特許出願公開第2008-0254191-A1号明細書による、Δ9エロンガーゼEgD9eS米国特許第7,645,604号明細書とΔ8デサチュラーゼEgD8M米国特許第7,709,239号明細書との連結によって生成する、DGLAシンターゼ配列番号11および12を指す。同様に、EaD9eS/EaD8Sという用語は、配列番号4に記載のリンカー配列による、Δ9エロンガーゼEaD9eS米国特許第7,794,701号明細書とΔ8デサチュラーゼEaD8S米国特許第7,790,156号明細書との連結によって生成する、DGLAシンターゼ配列番号13および14を指す。そしてE389D9eS/EgD8Mという用語は、配列番号4に記載のリンカー配列による、Δ9エロンガーゼE389D9eS米国特許第7,645,604号明細書とΔ8デサチュラーゼEgD8M前出との連結によって生成する、DGLAシンターゼ配列番号15および16を指す。アシル基転移酵素という用語は、供与体脂質から受容体脂質分子へのアシル基の転移に関与する酵素を指す。アシルCoA:リゾリン脂質アシル基転移酵素またはリゾリン脂質アシル基転移酵素[LPLAT]という用語は、sn-2位で多様なリゾリン脂質基質をアシル化する能力を有する、アシル基転移酵素の広範なクラスを指す。より具体的には、LPLATとしては、LPAからホスファチジン酸[PA]への変換を触媒する能力を有するリゾホスファチジン酸[LPA]アシル基転移酵素[LPAAT]、LPCからホスファチジルコリン[PC]への変換を触媒する能力を有するリゾホスファチジルコリン[LPC]アシル基転移酵素[LPCAT]、LPEからホスファチジルエタノールアミン[PE]への変換を触媒する能力を有するリゾホスファチジルエタノールアミン[LPE]アシル基転移酵素[LPEAT]、LPSからホスファチジルセリン[PS]への変換を触媒する能力を有するリゾホスファチジルセリン[LPS]アシル基転移酵素[LPSAT]、LPGからホスファチジルグリセロール[PG]への変換を触媒する能力を有するリゾホスファチジルグリセロール[LPG]アシル基転移酵素[LPGAT]、およびLPIからホスファチジルイノシトール[PI]への変換を触媒する能力を有するリゾホスファチジルイノシトール[LPI]アシル基転移酵素[LPIAT]が挙げられる。少なくともリゾホスファチジン酸アシル基転移酵素[LPAAT]活性を有するポリペプチドという用語は、アシルCoA1-アシル-sn-グリセロール3-リン酸→CoA1,2-ジアシル-sn-グリセロール3-リン酸EC2.3.1.51の反応を触媒できる酵素を指す。したがってLPAATは、米国特許出願公開第2010-0317072-A1号明細書および米国特許出願公開第2010-0317882-A1号明細書に記載されるような、1LPAAT活性を有し、配列番号18MaLPAAT1、配列番号22YlLPAAT1、および配列番号23ScLPAAT1からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して、アラインメントのClustalW法に基づいて少なくとも約43.9のアミノ酸同一性を共有する;および/または、2LPAAT活性を有して、NHxxxxD配列番号26およびEGTR配列番号27からなる群から選択される、少なくとも1つの1-アシル-sn-グリセロール-3-リン酸アシル基転移酵素ファミリーモチーフを有する、タンパク質を指す。LPAATポリペプチドの例としては、後述するScLPAAT、ScLPAATS、MaLPAAT1、MaLPAAT1S、およびYlLPAAT1が挙げられる。ScLPAATという用語は、サッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiaeから単離されたLPAAT配列番号23を指すORFYDL052C。対照的に、ScLPAATSという用語は、ヤロウィアリポリティカYarrowialipolytica中での発現のためにコドン最適化された、S.セレヴィシエS.cerevisiaeに由来する合成LPAATを指すすなわち配列番号24および25米国特許出願公開第2010-0317882-A1号明細書。MaLPAAT1という用語は、配列番号17に記載のヌクレオチド配列によってコードされる、モルティエラアルピナMortierellaalpinaから単離されたLPAAT配列番号18を指す。対照的に、MaLPAAT1Sという用語は、ヤロウィアリポリティカYarrowialipolytica中での発現のためにコドン最適化された、M.アルピナM.alpinaに由来する合成LPAATを指すすなわち配列番号19および20米国特許第7,879,591号明細書。YlLPAAT1という用語は、配列番号21に記載のヌクレオチド配列によってコードされる、ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaから単離されたLPAAT配列番号22を指す。少なくともリン脂質:ジアシルグリセロールアシル基転移酵素[[PDAT]]活性を有するポリペプチドという用語は、脂肪酸アシル基をリン脂質例えばホスファチジルコリンのsn-2位から、1,2-ジアシルグリセロール[E.C.2.3.1.158]のsn-3位置に転移でき、したがってリゾリン脂質とTAGをもたらす酵素を指す。PDATおよびジアシルグリセロールアシル基転移酵素DAGAT[E.C.2.3.1.20]のどちらもTAG生合成の最終段階に関与するが、PDATのみがアシルCoA-非依存性機序を介してTAGを合成してもよい。配列番号30に記載の代表的PDAT酵素は、サッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiae中のLRO1遺伝子によってコードされるDahlqvistetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:64872000。YlPDATという用語は、配列番号28に記載のヌクレオチド配列によってコードされる、ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaから単離されたPDAT配列番号29を指す米国特許第7,901,928号明細書。コリンリン酸シチジリルトランスフェラーゼという用語は、シチジン三リン酸[CTP]コリンリン酸⇔二リン酸シチジン二リン酸コリン[CDPコリン]の化学反応を触媒する、ホスファチジルコリン[PC]生合成経路の酵素EC2.7.7.15を指す。したがってこの酵素は、リン含有ヌクレオチド基を転移できるトランスフェラーゼすなわちヌクレオチジルトランスフェラーゼであり、したがってグリセロリン脂質代謝に関与する。YlPCTという用語は、ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaから単離され、配列番号45によってコードされる、コリンリン酸シチジリルトランスフェラーゼ配列番号46を指す。ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼという用語は、CDPコリンと1,2-ジアシルグリセロールからのホスファチジルコリンの合成を触媒する、ホスファチジルコリン[PC]生合成経路の酵素EC2.7.8.2を指す。YlCPT1という用語は、ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaから単離され、配列番号47によってコードされる、ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ配列番号48を指す。YlCPT1は、国際公開第2006/052870号パンフレットに記載されるGenBank受入番号XM_501703YALI0C10989gもまた参照されたい。マロニルCoAシンセターゼ[EC6.2.1.-]は、マロン酸ATPCoA→マロニルCoAAMPピロリン酸PPiの酵素反応を触媒する。酵素は、最初にマロン酸培養シュードモナスフルオレッセンスPseudomonasfluorescensから精製されたがKim,Y.S.andS.K.Bang,J.Biol.Chem.,260:5098-51041985、それ以来、様々な根粒菌相同体が、マメ科植物根粒内のバクテロイドから単離されている例えば,Kim,Y.S.andH.Z.Chae,Biochem.J.,273:511-5161991;およびKim,Y.S.andS.W.Kang,Biochem.J.,297:327-3331994参照。MCSという用語は、ヤロウィアリポリティカYarrowialipolytica中での発現のためにコドン最適化された、リゾビウムレグミノサーラムRhizobiumleguminosarum次亜種ビシアエviciae3841GenBank受入番号YP_766603に由来する、マロニルCoAシンセターゼをコードする合成遺伝子を指すすなわち配列番号49および50米国特許出願公開第2010-0159558-A1号明細書。ペルオキシソームという用語は、全ての真核生物細胞に見られる遍在性細胞小器官を指す。それらは、細胞質ゾルからそれらの内容物を隔てて、後述する機能に必須の様々な膜タンパク質を含有する、単一脂質二重膜を有する。ペルオキシソームは、拡張シャトル機構を介してタンパク質を選択的に移入する。より具体的には、ペルオキシソーム膜を通じたATP加水分解の手段によるタンパク質移入過程に関与する、ペルオキシンと称される、少なくとも32個の既知のペルオキシソームタンパク質がある。細胞タンパク質がペルオキシソームに移入されると、それらは典型的にいくつかの分解手段にさらされる。例えばペルオキシソームは、細胞にとって毒性の物質を分解できる、例えばカタラーゼ、D-アミノ酸オキシダーゼ、および尿酸オキシダーゼなどの酸化酵素を含有する。代案としては、ペルオキシソームは、脂肪酸分子を分解してアセチルCoAの自由分子を生成し、それはβ酸化と称される過程において、細胞質ゾルに搬出されて戻される。ペルオキシソーム形成因子タンパク質、ペルオキシン、およびPexタンパク質という用語は同義であり、ペルオキシソーム形成に関与し、および/またはペルオキシソーム膜を通じたATP加水分解の手段による、細胞タンパク質の移入過程に関与するタンパク質を指す。これらのタンパク質のいずれかをコードする遺伝子の頭字語は、Pex遺伝子である。命名システムは、Disteletal.,J.CellBiol.,135:1-31996に記載される。これまでに様々な真核生物生物中で、少なくとも32個の異なるPex遺伝子が同定されている。17の異なる真菌種のゲノム配列のコンピュータシミュレーションによる分析を実施した、Kiel,J.A.K.W.らTraffic,7:1291-13032006によるレビューに基づいて、以下のPexタンパク質が同定された。Pex1p、Pex2p、Pex3p、Pex3Bp、Pex4p、Pex5p、Pex5Bp、Pex5Cp、Pex5/20p、Pex6p、Pex7p、Pex8p、Pex10p、Pex12p、Pex13p、Pex14p、Pex15p、Pex16p、Pex17p、Pex14/17p、Pex18p、Pex19p、Pex20p、Pex21p、Pex21Bp、Pex22p、Pex22p様、およびPex26p。集合的に、これらのタンパク質は、本明細書でPexタンパク質と称され、Pex遺伝子によってコードされる。少なくとも1つのペルオキシソーム形成因子タンパク質中における、またはそれと関連した下方調節という用語は、野生型タンパク質の活性と比較した、天然Pexタンパク質の活性の低下または完全破壊を指す。下方制御は、典型的に、天然Pex遺伝子が、その遺伝子の一部内における挿入、消去、または標的化変異を指す破壊を有して、遺伝子がゲノムから欠失し、いかなるタンパク質も翻訳されないような完全遺伝子ノックアウトがもたらされ、または挿入、欠失、アミノ酸置換またはその他の標的変異を有するPexタンパク質の翻訳がもたらされる場合に起きる。下方制御されたPexタンパク質は、下方制御されていないPexタンパク質と比較して、活性が損なわれ、非機能性であり得る。Pexタンパク質の低発現またはその欠如をもたらす下方制御はまた、制御配列、転写および翻訳要素および/または情報伝達経路の操作を介して、またはセンス、アンチセンスまたはRNAi技術などの使用によってももたらし得る。保存ドメインまたはモチーフという用語は、進化的に関連したタンパク質の整合配列に沿った特定位置で保存される、一連のアミノ酸を意味する。その他の位置のアミノ酸が相同タンパク質間で変化し得るのに対し、特定位置で高度に保存されたアミノ酸は、これらのアミノ酸が、タンパク質の構造、安定性、または活性にとって重要であり得ることを示唆する。それらはタンパク質相同体ファミリーの整合配列中のそれらの高度な保存によって同定されるので、それらは新しく判定された配列があるタンパク質が、以前同定されたタンパク質ファミリーに属するかどうかを判定する識別子またはシグネチャーとして使用し得る。微生物宿主細胞および微生物宿主生物という用語は本明細書で同義的に使用され、外来性または異種遺伝子を受け入れることができ、それらの遺伝子を発現できる微生物を指す。組換え微生物宿主細胞とは、組換え遺伝子操作されている微生物宿主細胞を指す。一般に油性という用語は、それらのエネルギー源を油の形態で貯蔵する傾向がある生物を指すWeete,In:FungalLipidBiochemistry,2ndEd.,Plenum,1980。この過程において、油性微生物の細胞油含量は概してS字形曲線に従い、脂質濃度は対数後期または初期定常期にそれが最大に達するまで増大し、次に静止後期および死滅期において徐々に低下するYongmanitchaiandWard,Appl.Environ.Microbiol.,57:419-251991。本出願の目的では、油性という用語は、それらの乾燥細胞重量[DCW]の少なくとも約25を油として蓄積し得る微生物を指す。油性酵母という用語は、油を産生し得る、すなわち油がそれらのDCWの約25を超えて蓄積し得る、酵母に分類される油性微生物を指す。油性酵母の例としては、ヤロウィアYarrowia属、カンジダCandida属、ロドトルラRhodotorula属、ロドスポリジウムRhodosporidium属、クリプトコッカスCryptococcus属、トリコスポロンTrichosporon属、およびリポマイセスLipomyces属が挙げられるが、これに限定されるものではない。酵母がDCWの約25を超えて油を蓄積する能力は、組換え遺伝子操作の試みを通じた、または生物の天然能力を通じたものであってもよい。発酵性炭素源という用語は、微生物が代謝してエネルギーを得る炭素源を意味する。典型的な炭素源としては、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、多糖類、アルカン、脂肪酸、脂肪酸エステル、グリセロール、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、二酸化炭素、メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸、および炭素含有アミンが挙げられるが、これに限定されるものではない。ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド配列、核酸配列、核酸断片、および単離核酸断片という用語は、本明細書において同義的に使用される。これらの用語は、ヌクレオチド配列などを包含する。ポリヌクレオチドは、合成、非天然または改変ヌクレオチド塩基を任意選択的に含有する、一本鎖または二本鎖のRNAまたはDNAのポリマーであってもよい。DNAポリマーの形態のポリヌクレオチドは、cDNA、ゲノムDNA、合成DNA、またはそれらの混合物の1つ以上のセグメントを含んでなってもよい。ヌクレオチド通常それらの5’一リン酸の形態で見られるは、次のような一文字名によって言及される。Aはアデニル酸またはデオキシアデニル酸それぞれRNAまたはDNA、Cはシチジル酸またはデオキシシチジル酸、Gはグアニル酸またはデオキシグアニル酸、Uはウリジル酸、Tはデオキシチミジル酸、RはプリンAまたはG、YはピリミジンCまたはT、KはGまたはT、HはAまたはCまたはT、Iはイノシン、およびNは任意のヌクレオチドである。アミノ酸またはヌクレオチド配列のかなりの部分とは、当業者による配列の手動評価、またはBLASTBasicLocalAlignmentSearchTool;Altschul,S.F.,etal.,J.Mol.Biol.,215:403-4101993などのアルゴリズムを使用したコンピュータ自動化配列比較および同定のいずれかによって、そのポリペプチドまたは遺伝子を推定的に同定するのに十分な、ポリペプチドのアミノ酸配列または遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなる部分である。相補的という用語は、互いにハイブリダイズできるヌクレオチド塩基間の関係性を記述するために使用される。例えばDNAに関して、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。コドン縮重とは、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響を及ぼさないヌクレオチド配列のバリエーションを可能にする、遺伝子コードの性質を指す。当業者は、所定のアミノ酸を特定するヌクレオチドコドン使用における、特定の宿主細胞によって示されるコドンバイアスについて良く知っている。したがって宿主細胞中の改善された発現のために遺伝子を合成する場合、そのコドン使用頻度が、宿主細胞の好むコドン使用頻度に近くなるように遺伝子をデザインすることが望ましい。合成遺伝子は、宿主細胞のコドンバイアスを反映するヌクレオチド配列の最適化に基づいて、最適遺伝子発現のために調整される。当業者は、宿主によって好まれるコドンに向けて、コドン使用頻度を偏らせた場合の成功裏の遺伝子発現の可能性を認識する。好ましいコドンの判定は、配列情報が利用できる宿主細胞に由来する遺伝子の調査に基づき得る。例えば、ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaのコドン使用頻度プロフィールが、米国特許第7,125,672号明細書に提供される。遺伝子とは、特異的タンパク質を発現する核酸断片を指し、それはコード領域のみを指してもよく、またはコード領域の上流および/または下流の調節配列例えばコード領域の転写開始部位上流の5’非翻訳領域、3’非コード領域を含んでもよい。天然遺伝子とは、それ自体の制御配列と共に天然に見られる遺伝子を指す。キメラ遺伝子とは、自然界では一緒に見られない調節およびコード配列を含んでなる、天然遺伝子でないあらゆる遺伝子を指す。したがってキメラ遺伝子は、異なる起源に由来する調節配列およびコード配列、または同じ起源に由来するが、天然に見られるのとは異なる様式で配列された調節配列およびコード配列を含んでなってもよい。内在性遺伝子とは、生物のゲノム中のその自然な位置にある天然遺伝子を指す。外来性遺伝子とは、遺伝子移入によって宿主生物に導入された遺伝子を指す。外来性遺伝子は、非天然生物中に挿入された天然遺伝子、天然宿主内の新たな位置に導入された天然遺伝子、またはキメラ遺伝子を構成し得る。導入遺伝子は、形質転換手順によってゲノムに導入された遺伝子である。コドン最適化遺伝子は、宿主細胞の好むコドン使用頻度を模倣するように、そのコドン使用頻度がデザインされている遺伝子である。コード配列とは、特定のアミノ酸配列をコードするDNA配列を指す。調節配列は、コード配列の転写開始部位上流に位置するヌクレオチド配列、5’非翻訳領域および3’非コード領域を指し、それらは関連するコード配列の転写、RNAプロセシングまたは安定性、または翻訳に影響を及ぼすこともある。調節配列としては、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、5’非翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、RNAプロセシング部位、作動体結合部位、およびステムループ構造が挙げられる。プロモーターという用語は、コード配列または機能性RNAの発現を制御できるDNA配列を指す。一般にプロモーター配列は、コード配列の5’上流である。プロモーターはその全体が天然遺伝子に由来してもよく、または自然界に見られる異なるプロモーターに由来する異なる要素から構成されてもよく、または合成DNAセグメントを含んでなってさえよい。当業者は、異なる組織または細胞タイプにおいて、または異なる細胞成長および/または発達段階において、または異なる環境的または生理学的条件に答えて、異なるプロモーターが遺伝子の発現を指示してもよいことを理解する。ほとんどの場合にほとんどの細胞型中で遺伝子が発現されるようにするプロモーターは、一般に構成的プロモーターと称される。ほとんどの場合、制御配列の正確な境界は完全に画定されていないので、異なる長さのDNA断片が、同一のプロモーター活性を有してもよいこともさらに認識される。3’非コード配列、転写ターミネーター、およびターミネーターという用語は、コード配列3’下流に位置するDNA配列を指す。これは、ポリアデニル化認識配列と、mRNAプロセッシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼすことができる調節シグナルをコードするその他の配列とを含む。ポリアデニル化シグナルは、通常、mRNA前駆体の3’末端へのポリアデニル酸トラクトの付加に影響を及ぼすことで特徴付けられる。3’領域は、関連するコード配列の転写、RNAプロセシングまたは安定性、または翻訳に影響し得る。作動的に結合するという用語は、一方の機能が他方の機能によって影響される、単一核酸断片上の核酸配列のつながりを指す。例えばプロモーターがコード配列の発現に影響を及ぼすことができる場合、それはコード配列と作動的に連結する。すなわちコード配列は、プロモーターの転写制御下にある。コード配列は、センスまたはアンチセンスオリエンテーションで制御配列に作動的に結合し得る。組み換えという用語は、例えば化学合成による、または遺伝子操作技術を通じた核酸の単離セグメントの操作による、2つのさもなければ分離した配列セグメントの人為的組み合わせを指す。発現という用語は、本明細書での用法では、センスmRNAまたはアンチセンスRNAの転写および安定した蓄積を指す。発現はまた、mRNAのポリペプチドへの翻訳も含む。形質転換は、核酸分子の宿主生物への移入を指す。核酸分子は、自律的に複製するプラスミドであってもよく;またはそれは宿主生物のゲノムに組み込まれてもよい。形質転換された核酸断片を含有する宿主生物は、遺伝子導入または組換えまたは形質転換生物または形質転換体と称される。安定形質転換は、遺伝的に安定した遺伝形質がもたらされるすなわち核酸断片が安定して組み込まれる、核および細胞小器官ゲノムの双方を含む宿主生物ゲノムへの核酸断片の移入を指す。対照的に、一過性形質転換は、組み込みまたは安定遺伝形質のない遺伝子発現がもたらされる、宿主生物の核、またはDNA含有細胞小器官への核酸断片の移入を指す。プラスミドおよびベクターという用語は、細胞の中央代謝の一部ではない遺伝子を保有することが多く、通常は環状二本鎖DNA断片の形態である染色体外要素を指す。このような要素は、あらゆる起源に由来する、一本鎖または二本鎖のDNAまたはRNAの直線または環状であってもよい、自己複製配列、ゲノム組み込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列を有してもよく、その中ではいくつかのヌクレオチド配列が結合しまたは組み換えされて、細胞に発現カセットを導入できる特有な構造になる。発現カセットという用語は、選択された遺伝子のコード配列と、選択された遺伝子産物の発現に必要である、コード配列に先行する5’非コード配列および後続の3’非コード配列制御配列とを含んでなる、DNA断片を指す。したがって発現カセットは、典型的に、1プロモーター;2コード配列すなわちORF;および3真核生物中では通常、ポリアデニル化部位を含有するターミネーターから構成される。発現カセットは通常はベクター内に含めて、クローニングおよび形質転換を容易にする。各宿主に対して妥当な制御配列を使用しさえすれば、異なる発現カセットを細菌、酵母、植物、および哺乳類細胞をはじめとする異なる生物に形質転換できる。配列分析ソフトウェアという用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析に有用なあらゆるコンピュータアルゴリズム、またはソフトウェアプログラムを指す。配列分析ソフトウェアは市販されることもあり、または独立して開発されることもある。典型的な配列分析ソフトウェアとしては、1GCGプログラムスイートWisconsinPackageVersion9.0,GeneticsComputerGroupGCG,Madison,WI;2BLASTP、BLASTN、BLASTXAltschuletal.、J.Mol.Biol.、215:403-4101990;3DNASTARDNASTAR、Inc.Madison、WI;4SequencherGeneCodesCorporation,AnnArbor,MI;および5Smith-Watermanアルゴリズムを組み込んだFASTAプログラムW.R.Pearson,Comput.MethodsGenomeRes.,[Proc.Int.Symp.]1994,MeetingDate1992,111-20.Editors:Suhai,Sandor.Plenum:NewYork,NYが挙げられるが、これに限定されるものではない。本出願の文脈内では、特に断りのない限り、分析のために配列分析ソフトウェアが使用される場合、分析結果は、言及されるプログラムのデフォルト値に基づくものと理解される。本明細書での用法ではデフォルト値とは、ソフトウェアを初期化した際に、初めからロードされる値またはパラメーターのあらゆる組を意味する。核酸またはポリペプチド配列の文脈において配列同一性または同一性は、特定の比較ウィンドウ間で最大一致のために整列させると同じになる、2つの配列中の核酸塩基またはアミノ酸残基を指す。したがって配列同一性百分率または同一性は、比較ウィンドウ間で最適に整列させた2つの配列を比較して判定される値を指し、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、2配列の最適配列比較のために、付加または欠失を含まない基準配列との比較で、付加または欠失すなわちギャップを含んでなってもよい。百分率は、双方の配列内で同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が存在する位置数を判定して、一致する位置数を得て、一致する位置数を比較ウィンドウ内の総位置数で除して、結果に100を乗じて同一性百分率を得て、計算される。同一性および類似性を判定する方法は、公的に入手可能なコンピュータプログラムで体系化されている。同一性および類似性は、1ComputationalMolecularBiologyLesk,A.M.,Ed.OxfordUniversity:NY1988;2Biocomputing:InformaticsandGenomeProjectsSmith,D.W.,Ed.Academic:NY1993;3ComputerAnalysisofSequenceData,PartIGriffin,A.M.,andGriffin,H.G.,Eds.Humania:NJ1994;4SequenceAnalysisinMolecularBiologyvonHeinje,G.,Ed.Academic1987;および5SequenceAnalysisPrimerGribskov,M.andDevereux,J.,Eds.Stockton:NY1991に記載されるものをはじめとするが、これに限定されるものではない公知の方法によって容易に計算され得る。配列アラインメントおよび同一性または類似性の計算は、LASERGENEバイオインフォマティクス演算スイートのMegAlign商標プログラムDNASTARInc.,Madison,WIをはじめとするが、これに限定されるものではない、相同的な配列を検出するようにデザインされた多様な比較法を使用して判定されてもよい。それに代えて、配列比較のBLASTN法は、デフォルトパラメーターを使用してヌクレオチド配列を比較する、NationalCenterforBiotechnologyInformation[NCBI]によって提供されるアルゴリズムであるのに対し、BLASTPアラインメント法は、デフォルトパラメーターを使用してタンパク質配列を比較する、NCBIによって提供されるアルゴリズムである。本明細書で使用される標準組換えDNAおよび分子クローニング技術は、当該技術分野で周知であり、Sambrook,J.,Fritsch,E.F.andManiatis,T.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,2nded.,ColdSpringHarborLaboratory:ColdSpringHarbor,NY1989以下Maniatis;Silhavy,T.J.,Bennan,M.L.andEnquist,L.W.,ExperimentswithGeneFusions,ColdSpringHarborLaboratory:ColdSpringHarbor,NY1984;およびAusubel,F.M.etal.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingAssoc.andWiley-Interscience,Hoboken,NJ1987による出版によって、詳しく記載される。図1Aおよび図1Bは組み合わさって、後述するようなEPA生成の複数経路を描写する。全ての経路は、オレイン酸がΔ12デサチュラーによって、第1のω-6脂肪酸であるリノール酸[LA]に最初に変換されることを要する。次にΔ9エロンガーゼ/Δ8デサチュラーゼ経路および基質としてLAを使用して、長鎖ω-6脂肪酸が次のように形成される。1LAがΔ9エロンガーゼによってエイコサジエン酸[EDA]に変換され;2EDAがΔ8デサチュラーゼによってジホモ-γ-リノレン酸[DGLA]に変換され;3DGLAがΔ5デサチュラーゼによってアラキドン酸[ARA]に変換され;4ARAがC20/22エロンガーゼによってドコサテトラエン酸[DTA]に変換され;5DTAがΔ4デサチュラーゼによってドコサペンタエン酸[DPAn-6]に変換される。Δ9エロンガーゼ/Δ8デサチュラーゼ経路はまた、基質としてα-リノレン酸[ALA]を使用して、長鎖ω-3脂肪酸を次のように生成し得る。1LAがΔ15デサチュラーゼによって第1のω-3脂肪酸ALAに変換され;2ALAがΔ9エロンガーゼによってエイコサトリエン酸[ETrA]に変換され;3ETrAがΔ8デサチュラーゼによってエイコサテトラエン酸[ETA]に変換され;4ETAがΔ5デサチュラーゼによってエイコサペンタエン酸[EPA]に変換され;5EPAがC20/22エロンガーゼによってドコサペンタエン酸[DPA]に変換され;6DPAがΔ4デサチュラーゼによってドコサヘキサエン酸[DHA]に変換される。任意選択的に、ω-6脂肪酸がω-3脂肪酸に変換されてもよい。例えばETAおよびEPAはΔ17デサチュラーゼ活性によって、それぞれDGLAおよびARAから生成される。本明細書の目的で有利には、Δ9エロンガーゼ/Δ8デサチュラーゼ経路は、顕著な量のγ-リノレン酸[GLA]を欠く、EPA油の生成を可能にする。ω-3/ω-6脂肪酸生合成の代わりの経路は、Δ6デサチュラーゼおよびC18/20エロンガーゼを利用し、すなわちΔ6デサチュラーゼ/Δ6エロンガーゼ経路である。より具体的には、Δ6デサチュラーゼによって、LAおよびALAがそれぞれGLAおよびステアリドン酸[STA]に変換されてもよく、次にC18/20エロンガーゼが、GLAをDGLAにおよび/またはSTAをETAに変換する。組換え微生物宿主細胞中における経済的なEPAの商業生産には、EPA濃度[EPATFA]、総脂質含量[TFAsDCW]およびEPA生産性[EPADCW]をはじめとする、多様な変数の考察が必要である。さらに所望の脂肪酸、すなわちEPAの生成を最大化するために、中間体脂肪酸と、最終油生成物中の副産物脂肪酸の生成とを低下させることが望ましい。中間体脂肪酸は、その他の代謝経路酵素の作用によって、EPAにさらに変換し得る脂肪酸例えばオレイン酸、LA、ALA、EDA、DGLA、ETAである。対照的に、副産物脂肪酸例えばシアドン酸、ジュニペロン酸は、EPAでもなく、またはEPAにさらに変換され得る中間体脂肪酸でもない、生成するあらゆる脂肪酸を指す。米国特許出願公開第2009-0093543-A1号明細書は、約23.6未満のLATFAEPA:LA比1.83で少なくとも約43.3のEPATFAを含んでなる、微生物油を産生する能力を有する、組換えヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaの最適化株を記載する。好ましい株はY4305であり、その最大生産量は、EPA:LA比3.03で55.6のPATFAであった。一般に、米国特許出願公開第2009-0093543-A1号明細書のEPA株は、ω-3/ω-6脂肪酸生合成経路の以下の遺伝子を含んでなる。aΔ9エロンガーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子;およびbΔ8デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子;およびcΔ5デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子;およびdΔ17デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子;およびeΔ12デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子;およびfC16/18エロンガーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子;およびg任意選択的に、ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼCPT1をコードする少なくとも1つの遺伝子。上述の酵素機能を有する好ましい遺伝子の例は、米国特許出願公開第2009-0093543-A1号明細書の表3に記載される。これらの遺伝子は限定的であることは意図されず;それよりむしろ米国特許出願公開第2009-0093543-A1号明細書の遺伝子は、Δ9エロンガーゼ、Δ8デサチュラーゼ、Δ5デサチュラーゼ、Δ17デサチュラーゼ、Δ12デサチュラーゼ、C16/18エロンガーゼおよび/またはCPT1機能性を有する、ω-3/ω-6脂肪酸生合成経路の適切な遺伝子の選択を導くために、有用な参考の役割を果たすものである。当業者は理解するように、特定の各宿主細胞は、所与のアミノ酸を特定するヌクレオチドコドンの使用において、コドンバイアスを呈示する。したがってそのコドン使用頻度が、EPA生成のために遺伝子操作される組換え微生物宿主細胞の好むコドン使用頻度に近くなるように、特定の各Δ9エロンガーゼ、Δ8デサチュラーゼ、Δ5デサチュラーゼ、Δ17デサチュラーゼ、Δ12デサチュラーゼ、C16/18エロンガーゼおよび/またはCPT1遺伝子をデザインすることが望ましい。その他の種から同一または同様の機能または活性を有するポリペプチドを同定する上で、多くのレベルの配列同一性が有用であることを当業者は良く理解している。好ましい核酸断片、すなわちΔ9エロンガーゼ、Δ8デサチュラーゼ、Δ5デサチュラーゼ、Δ17デサチュラーゼ、Δ12デサチュラーゼ、C16/18エロンガーゼおよび/またはCPT1ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドが、米国特許出願公開第2009-0093543-A1号明細書の表3に記載されるものと少なくとも約70~80同一であるポリペプチドをコードする一方、より望ましい核酸断片は、少なくとも約80~85または少なくとも約85~90または少なくとも約90~95にさえ至って同一であるアミノ酸配列をコードする。米国特許出願公開第2010-0317072-A1号明細書は、EPATFAおよびEPA:LA比に基づいて、米国特許出願公開第2009-0093543-A1号明細書に記載される株と比較して改善された微生物油を産生する能力を有する、組換えヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaの最適化株を記載する。好ましい株はY9502であり、その最大生産量は57のEPATFAであり、EPA:LA比は4.49で、EPA生産性は21.3のEPADCWであった。米国特許出願公開第2009-0093543-A1号明細書に詳述されるω-3/ω-6脂肪酸生合成経路の遺伝子の発現に加えて、これらの改善された株は、以下によって際立っている。1少なくとも1つのマルチザイムを含んでなり、前記マルチザイムは、少なくとも1つの脂肪酸Δ8デサチュラーゼに連結する少なくとも1つの脂肪酸Δ9エロンガーゼ[DGLAシンターゼ]を有するポリペプチドを含んでなる;2任意選択的に、マロニルCoAシンセターゼ[MCS]またはアシルCoAリゾリン脂質アシル基転移酵素[LPLAT]からなる群から選択される酵素をコードする、少なくとも1つのポリヌクレオチドを含んでなる;3その発現が下方制御されている、少なくとも1つのペルオキシソーム形成因子タンパク質を含んでなる;4少なくとも約50のEPATFAを産生する;および5少なくとも約3.1のEPA:LA比を有する。マルチザイムリンカーは、好ましくは配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、および配列番号10からなる群から選択され;マルチザイムは、好ましくはEgD9eS/EgD8M配列番号12、EaD9eS/EaD8S配列番号14、およびE389D9eS/EgD8M配列番号16からなる群から選択される配列から本質的になる配列である。その発現が下方制御されている少なくとも1つのペルオキシソーム形成因子タンパク質は、好ましくはPex1p配列番号51、Pex2p配列番号52、Pex3p配列番号53、Pex3Bp配列番号54、Pex4p配列番号55、Pex5p配列番号56、Pex6p配列番号57、Pex7p配列番号58、Pex8p配列番号59、Pex10p配列番号60、Pex12p配列番号61、Pex13p配列番号62、Pex14p配列番号63、Pex16p配列番号64、Pex17p配列番号65、Pex19p配列番号66、Pex20p配列番号67、Pex22p配列番号68、およびPex26p配列番号69からなる群から選択され、Pex3pノックアウトが特に好ましい。上の配列は、組換えヤロウィア属Yarrowia宿主細胞で使用するのに好ましいが、これらの遺伝子が限定的であることは意図されない。組換え微生物宿主細胞内で発現される特定のデサチュラーゼおよびエロンガーゼに関して先に考察したように、所与のアミノ酸を特定するヌクレオチドコドン使用におけるコドンバイアスを考慮しなくてはならない。したがってDGLAシンターゼマルチザイムのデザインと好ましいPex遺伝子ノックアウトに関する、米国特許出願公開第2010-0317072-A1号明細書に記載される教示を、EPA生成のために遺伝子操作されるあらゆる組換え微生物宿主細胞に応用してもよい。好ましい核酸断片、すなわちDGLAシンターゼおよび/またはPexポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドが、上に記載されるものと少なくとも約70~80同一であるポリペプチドをコードする一方、より望ましい核酸断片は、少なくとも約80~85または少なくとも約85~90または少なくとも約90~95にさえ至って同一であるアミノ酸配列をコードする。本明細書で提供されるのは、EPA生産性の増大すなわちEPADCWの増大として測定されるに基づいて、米国特許出願公開第2009-0093543-A1号明細書および米国特許出願公開第2010-0317072-A1号明細書に記載される株と比較して、改善された微生物油を産生する能力を有する、さらに改善された最適化組換え微生物宿主細胞である。本明細書で開示される改善された組換え微生物宿主細胞は、米国特許出願公開第2010-0317072-A1号明細書に記載されるように、少なくとも1つのΔ8デサチュラーゼに連結した少なくとも1つのΔ9エロンガーゼを有するポリペプチドを含んでなる少なくとも1つのマルチザイムを含んでなり、米国特許出願公開第2010-0317072-A1号明細書に記載されるようにその発現が下方制御されている少なくとも1つのペルオキシソーム形成因子タンパク質を含んでなる、ω-3/ω-6脂肪酸生合成経路の遺伝子を発現することの他に、以下によって際立っている。1少なくともリゾホスファチジン酸アシル基転移酵素[LPAAT]活性を有する、少なくとも2つのポリペプチドを含んでなる;2少なくともリン脂質:ジアシルグリセロールアシル基転移酵素[PDAT]活性を有する、少なくとも1つのポリペプチドを含んでなる;3任意選択的に、少なくとも1つの変異Δ9エロンガーゼポリペプチドを含んでなり、前記変異Δ9エロンガーゼポリペプチドは、配列番号1に記載のアミノ酸配列を含んでなり、前記配列番号1は、iL35F変異;iiL35M変異;iiiL35G変異;ivL35G変異と、S9A、S9D、S9G、S9I、S9K、S9Q、Q12K、A21D、A21T、A21V、V32F、Y84C、Q107E、L108G、G127L、W132T、M143N、M143W、L161T、L161Y、W168G、I179M、I179R、C236N、Q244N、A254W、およびA254Yからなる群から選択される少なくとも1つのその他の変異;vL35G、A21V、L108G、およびI179R変異;viL35G、W132T、およびI179変異;viiL35G、S9D、Y84C、およびI179R変異;viiiL35G、Y84C、I179R、およびQ244N変異;ixL35G、A21V、W132T、I179R、およびQ244N変異;xK58RおよびI257T変異;xiD98G変異;xiiL130MおよびV243A変異;およびxiiiK58R、L35F、L35G、L35M、S9A、S9D、S9G、S9I、S9K、S9Q、Q12K、A21D、A21T、A21V、V32F、Y84C、D98G、Q107E、L108G、G127L、L130M、W132T、M143N、M143W、L161T、L161Y、W168G、I179M、I179R、C236N、V243A、Q244N、A254W、A254Y、およびI257Tからなる群から選択される、少なくとも2つの変異を含んでなるあらゆる組み合わせからなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸変異によって配列番号3と異なる;および4DCWの重量としての測定で、少なくとも25重量のEPAを含んでなる微生物油を産生する。上述のように、本明細書で開示される改善された組換え微生物宿主細胞は、株が、少なくともLPAAT活性を有する少なくとも2つのポリペプチドと、少なくともPDAT活性を有する少なくとも1つのポリペプチドとを有することで特有であり;したがって新生グリセロリン脂質生合成経路の構成要素の上方制御が所望される。生体膜の主要構成要素であるグリセロリン脂質は、sn-1位とsn-2位においてR基として付着し、極性頭部基がリン酸ジエステル結合を介してsn-3位置で連結する脂肪酸があるグリセロールコアを含有する米国特許出願公開第2010-0317882-A1号明細書を参照されたい。グリセロリン脂質は、変わりやすいホスホリル頭部基に起因するだけでなく、またそれらの脂肪酸の異なる鎖長と飽和度の結果としてのおびただしい多様性を有する。一般に、飽和および一不飽和脂肪酸がsn-1位でエステル化されるのに対し、PUFAはsn-2位でエステル化される。グリセロリン脂質の生合成は、複雑である。下の表3は、最初にKennedyandWeissJ.Biol.Chem.,222:193-2141956によって記載された、新生経路の段階を要約する。それらの新規合成に続いて、グリセロリン脂質は、sn-2位における脂肪酸アシル組成物の迅速な交代を被り得る。この再構築またはアシル編集は、膜の構造および機能、ストレス状態への生物学的応答、および生物工学的応用における脂肪酸組成と量の操作にとって重要である。具体的には、再構築は、グリセロリン脂質の脱アシル化と、得られたリゾリン脂質の引き続く再アシル化すなわち細胞アシルCoAプールからアシルCoA脂肪酸が除去され、リン脂質プール中で様々なリゾリン脂質基質がsn-2位でアシル化されるに帰するとされている。脂肪酸生合成は、アシルCoAプールとリン脂質プール間のアシル基の迅速な交換を要するすなわち不飽和化が主にリン脂質のsn-2位で起きるのに対し、延長はアシルCoAプール中で起きるため、多様な研究が、アシルCoA:リゾリン脂質アシル基転移酵素[LPLAT]をPUFA生合成遺伝子と共に同時発現させて、遺伝子導入生物の油中の所望の脂肪酸量を増大させ、全含油量を増大させ、または所望の脂肪酸を選択的に増大させることの有益な効果について検討している国際公開第2004/076617号パンフレット、国際公開第2004/087902号パンフレット、国際公開第2006/069936号パンフレット、国際公開第2006/052870号パンフレット、国際公開第2009/001315号パンフレット、国際公開第2009/014140号パンフレットを参照されたい。しかし米国特許出願公開第2010-0317882-A1号明細書で開示される研究が、EPAの高レベル生産のために遺伝子操作された油性生物中における、LPAATおよびLPCATの効果を調べるために行われた最初の研究であった。より具体的には、米国特許出願公開第2010-0317882-A1号明細書の実施例3、4、7、および8は、Δ9エロンガーゼ/Δ8デサチュラーゼ経路の発現を介して、総脂質に対して約51EPAを産生するように遺伝子操作されたヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaの組換え株Y8406中における、ScLPAAT1S、MaLPAAT1S、およびYlLPAAT1の過剰発現効果を比較する下の表4に記載される。MaLPAAT1とYlLPAAT1が34.0の配列同一性を共有したのに対し、ScLPAATとYlLPAAT1は43.9の配列同一性を共有し;Lewin,T.W.etal.Biochemistry,38:5764-57711999と、YamashitaらBiochim,Biophys.Acta,1771:1202-12152007によって記載されるように、3つの野生型タンパク質は全て、NHxxxxD配列番号26およびEGTR配列番号27に記載の1-アシル-sn-グリセロール-3-リン酸アシル基転移酵素ファミリーモチーフを有した。ヤロウィアリポリティカYarrowialipolytica中における、ScLPAAT1S、MaLPAAT1S、およびYlLPAAT1の過剰発現は、a染色体への組み込みによって、MaLPAAT1SまたはYlLPAAT1のいずれかを保有する直線化DNAを形質転換して安定した組み込みをもたらし、形質転換体を比較的富栄養の非選択培地で培養した後;またはb自己複製配列とYlLPAATまたはScLPAAT1Sのどちらかを保有する環状プラスミドDNAを形質転換し、形質転換体を選択培地上で培養した後に分析された[すなわち表4で染色体への組み込みまたはプラスミド発現のどちらかとして標識される]。LPAATの過剰発現が、染色体への組み込みではなく、プラスミド発現を介して起きた場合、結果は最小化され、現象phenomenumは、恐らく染色体への組み込みの位置効果および/または異なる増殖条件に起因し;さもなければプラスミドの喪失もまた、観察された結果に寄与し得る。しかしいずれにしても、表4の結果は、これらの各パラメータを対照と比較すると、LPAAT過剰発現が、TFAの重量としてのLA18:2濃度[LATFA]の有意な低下、TFAの重量としてのEPA濃度[EPATFA]の増大、およびΔ9エロンガーゼの変換効率増大をもたらしたことを実証する。上で要約した結果に基づいて、改善されたEPADCWを産生する能力を有する、組換え微生物宿主細胞の改善された最適化株は、したがってa配列番号18MaLPAAT1、配列番号20MaLPAAT1S、配列番号22YlLPAAT1、配列番号23ScLPAAT1、および配列番号25ScLPAAT1Sからなる群から選択される配列から本質的になる配列;およびbアラインメントのClustalW法に基づいて、配列番号18MaLPAAT1、配列番号22YlLPAAT1、および配列番号23ScLPAAT1からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して、少なくとも43.9のアミノ酸同一性を有し、配列番号26および配列番号27からなる群から選択される、少なくとも1つの1-アシル-sn-グリセロール-3-リン酸アシル基転移酵素ファミリーモチーフをさらに含んでなる、ポリペプチドからなる群から選択される、少なくとも2つのLPAATを含んでなる。明確さのために、少なくとも2つのLPAATは、以下のどちらかであり得る。1単一種から単離された特定のLPAATの同一コード配列の2つのコピー;または2集合的に2つのLPAATがもたらされる、A種から単離されたLPAATの1つのコード配列と、B種から単離されたLPAATの1つのコード配列。本発明の最適化組換え微生物宿主細胞はまた、PDAT活性を有する少なくとも1つのポリペプチドを含んでなる。DahlqvistらProc.Nat.Acad.Sci.USA,97:6487-64922000およびOelkersらJ.Biol.Chem.,275:15609-156122000は、レシチン:コレステロールアシル基転移酵素タンパク質ファミリーと構造的に関連するアシルCoA-非依存性PDAT酵素によって、アシルCoA不在下でTAG合成を行い得ることを最初に認識した。より具体的には、DahlqvistらおよびOelkersらは、PDATをコードする、サッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiaeLRO1遺伝子配列番号30;ScPDATの過剰発現が、TAG含有量の増大をもたらす一方、ScPDATの欠失はTAG合成の有意な低下を引き起こすことを実証した。この研究に続いて、米国特許第7,267,976号明細書は、ScPDATと47.1のアミノ酸配列同一性を共有すると判定された、PDATすなわち本明細書の配列番号28および29をコードするヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaATCC90812遺伝子のクローニング、過剰発現、およびノックアウトについて記載した。中断されたPDATを有するY.リポリティカY.lipolytica株は、野性型株約29~38と比較してより低い含油量[TFADCW]を有することが判明した一方、PDAT2およびDGAT2の中断の双方を有する株は、対照と比べてわずか17~27の含油量を有すると判定された。次にY.リポリティカY.lipolyticaPDATが、その天然PDATおよびDGAT2遺伝子に中断を有するS.セレヴィシエS.cerevisiae株中で発現され;TFADCWは対照と比較して形質転換株中で倍増した。上の考察に基づいて、当業者は、総脂質含量の変更においてPDATの果たす役割を理解するであろう。したがって本明細書に記載される組換え微生物宿主細胞は、a配列番号29および配列番号30からなる群から選択される配列から本質的になる配列、およびbアラインメントのClustalW法に基づいて、配列番号29および配列番号30からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して、少なくとも約90のアミノ酸同一性、またはより好ましくは少なくとも約95のアミノ酸同一性を有するポリペプチドからなる群から選択される少なくとも1つのPDATを含んでなる。以前の研究は、リン脂質とアシルCoAプール間のアシル基の転移不良のために、Δ9延長Δ6延長も同様にが長鎖PUFA生合成における支障であることを示しているため、最近、商業的に有用な組換え微生物宿主細胞中のPUFA生合成経路への組み込みに適した、高活性を有するΔ9エロンガーゼ変異体を同定するために、E.I.duPontdeNemoursCompanyによってかなりの努力がなされている。2010年8月26日に出願された米国仮特許出願第61/377248号明細書[代理人整理番号CL4783USPRV、その内容全体を参照によって援用する]に記載され、本明細書において実施例10A-10Jとして記載されるように、変異EgD9eSポリペプチドすなわちEgD9eS[配列番号3]に由来する中で特異的変異が同定され、それは配列番号3の酵素活性と比べると、LAからEDAへの変換に基づく酵素活性に最高45の改善をもたらした。より具体的には、Δ9エロンガーゼからの結晶構造が欠如しており、イソクリシスガルバナIsochrysisgalbanaΔ9エロンガーゼ[IgD9e;配列番号41および42]の変種ヒスチジンボックス[His-box]モチーフ中のGln残基の重要性に関する一研究のみQi,B.,etal.,FEBSLett.,547:137-1392003があることを踏まえて、Δ9エロンガーゼ内で適切な変異を同定する合理的なrationale標的化アプローチは、理想的ではなかった。Δ9エロンガーゼ活性により同定された最初のPUFA-特異的エロンガーゼであるIgD9eは、Δ6エロンガーゼ中に存在する高度に保存されたHis-Xaa-Xaa-His-His[HxxHH;配列番号72]モチーフの代わりに、Gln-Xaa-Xaa-His-His[QxxHH;配列番号71]モチーフを有することが分かった。Qi,B.らは、GlnのHis、AlaまたはPhe残基による置換が、分析された各変異IgD9eポリペプチド中のΔ9エロンガーゼ活性の低下をもたらしたことを実証し、したがってヒスチジンボックス中のグルタミン残基は、最適な酵素触媒作用に必須なように見えると結論した。Qiらの研究に加えて、IgD9e配列番号42、ミドリムシEuglenagracilisΔ9エロンガーゼ[EgD9e;配列番号32;米国特許第7,645,604号明細書]、およびユートレプチエラ属EutreptiellaCCMP389種Δ9エロンガーゼ[E389D9e;配列番号38;米国特許第7,645,604号明細書]の間で、7つのモチーフが保存されていることが知られている。これらのモチーフは、米国特許第7,645,604号明細書に記載され、Y-N-X-LまたはF-X4-S-X2-S-F配列番号73;F-Y-X-S-K-X2-EまたはD-Y-X-D-TまたはS-X2-L配列番号74;L-QまたはH-X-F-H-H-X-G-A配列番号75;M-Y-X-Y-Y-X7-KまたはRまたはN-F配列番号76;K-X-L-IまたはLまたはM-T-X2-Q配列番号77;W-X-F-N-Y-X-Y配列番号78;およびY-X-G-X-V-X2-L-F配列番号79が挙げられ、式中、Xは任意のアミノ酸であり得て、下線付きアミノ酸はΔ9エロンガーゼに特有であってもよい。したがってΔ9エロンガーゼをコードする変異配列のライブラリーは、EgD9eS配列番号2をテンプレートとして使用して、誤りがちなPCR[ePCR]によって合成的に遺伝子操作され、EgD9eSは、キメラFBAINm::EgD9eS::Pex20遺伝子を含んでなるプラスミドコンストラクト内に含有された。次にePCRライブラリーをヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaに形質転換し、GC分析およびEDA生成に基づいて、改善されたΔ9エロンガーゼ活性についてスクリーニングした。完全に非機能的な変異Δ9エロンガーゼすなわち検出可能なΔ9エロンガーゼ活性を有さない、または野生型酵素EgD9eSと比較して実質的に低下したΔ9エロンガーゼ活性を有する変異Δ9エロンガーゼをもたらす、多数のクローンが同定された。しかし驚くことに、LAからEDAへの変換効率[[EDA]/[LAEDA]100として計算される]の改善をもたらす、様々な変異が同定された。具体的には、4つの異なる変異Δ9エロンガーゼ遺伝子を含んでなるすなわちEgD9eS[配列番号3]のタンパク質配列と比較して、それぞれK58R/I257T変異、L35F変異、D98G変異、およびL130M/V243A変異を含んでなる、5つの個々の形質転換体が同定され、Δ9エロンガーゼ変換活性は野性型EgD9eS表5、後述の105~117の範囲であり、5~17の改善に相当した。したがってこの研究は、EgD9eSのΔ9エロンガーゼ活性が、タンパク質工学によって実際に改善され得ることを実証した。次に、上のEgD9eSePCRライブラリーから得られる最初のデータを利用して、部位飽和ライブラリー作成の標的とするのに適する、EgD9eS内の2つの異なるアミノ酸残基すなわち残基35および107を合理的に同定した。この場合もやはり、得られた変異EgD9eSのΔ9エロンガーゼ活性に対する各変異の効果をスクリーニングし、このようにしてLAからEDAへの変換効率の改善をもたらす2つの追加的な変異を同定できるようにした。具体的には、変異Δ9エロンガーゼ内にL35G変異またはL35M/Q107E変異のいずれかを含んでなる形質転換株が同定され、Δ9エロンガーゼ変換活性は、野生型EgD9eS表5、後述の142~145または132のいずれかであり、32~45の改善に相当した。L35G変異の同定に続いて、SlonoMax登録商標技術および標的としてEgD9eS-L35G遺伝子を使用して、50個の異なるアミノ酸残基を標的にする引き続くライブラリーを作成した。それぞれL35G変異と組み合わさった25個の異なる変異が同定され、親エロンガーゼ、すなわちEgD9eS-L35G表5、後述と比べて、96~141のΔ9エロンガーゼ変換活性をもたらし-4~41の改善に相当した。最後に、最近の研究は、SlonoMax登録商標ライブラリー内で同定された複数の有益な変異を組み合わせまたはスタックし、それによって合成コドン最適化EgD9eS配列内の適切な個々のアミノ酸変異をスタックすることを試みている。このようにして、例えば配列番号3と比較して、A21V、L35G、W132T、I179R、およびQ244N変異を含んでなる変異Δ9エロンガーゼは、EgD9eS表5、後述と比較して、123のΔ9エロンガーゼ変換活性をもたらすことが実証されており、23の改善に相当する。したがって上に詳述した研究の結果として、本明細書に記載される組換え微生物宿主細胞は、少なくとも1つの変異Δ9エロンガーゼポリペプチドを含んでなってもよく、前記変異Δ9エロンガーゼポリペプチドは、配列番号1に記載のアミノ酸配列を含んでなり、図16Bに表されるように、配列番号1は、iL35F変異;iiL35M変異;iiiL35G変異;ivL35G変異と、S9A、S9D、S9G、S9I、S9K、S9Q、Q12K、A21D、A21T、A21V、V32F、Y84C、Q107E、L108G、G127L、W132T、M143N、M143W、L161T、L161Y、W168G、I179M、I179R、C236N、Q244N、A254W、およびA254Yからなる群から選択される少なくとも1つのその他の変異;vL35G、A21V、L108G、およびI179R変異;viL35G、W132T、およびI179変異;viiL35G、S9D、Y84C、およびI179R変異;viiiL35G、Y84C、I179R、およびQ244N変異;ixL35G、A21V、W132T、I179R、およびQ244N変異;xK58RおよびI257T変異;xiD98G変異;xiiL130MおよびV243A変異;およびxiiiK58R、L35F、L35G、L35M、S9A、S9D、S9G、S9I、S9K、S9Q、Q12K、A21D、A21T、A21V、V32F、Y84C、D98G、Q107E、L108G、G127L、L130M、W132T、M143N、M143W、L161T、L161Y、W168G、I179M、I179R、C236N、V243A、Q244N、A254W、A254Y、およびI257Tからなる群から選択される、少なくとも2つの変異を含んでなるあらゆる組み合わせからなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸変異によって、配列番号3と異なる。好ましい実施形態では、変異EgD9eSは、配列番号3と比較して、少なくとも1つのL35G変異を含んでなる。例えば、配列番号3と比較して単一L35G変異を有する、配列番号44に記載のEgD9eS-L35Gとして本明細書に記載される変異Δ9エロンガーゼポリペプチドのΔ9エロンガーゼ活性は、EgD9eSのΔ9エロンガーゼ活性と比較して142~145であり、42~45の改善に相当した。上述されるような少なくとも2つのLPAAT、少なくとも1つのPDATと任意選択的に少なくとも1つの変異Δ9エロンガーゼ、ならびにEPA生合成のためのΔ9エロンガーゼ/Δ8デサチュラーゼω-3/ω-6脂肪酸生合成経路すなわち少なくとも1つのΔ9エロンガーゼ、少なくとも1つのΔ8デサチュラーゼ、少なくとも1つのΔ5デサチュラーゼ、少なくとも1つのΔ17デサチュラーゼ、少なくとも1つのΔ12デサチュラーゼ、および少なくとも1つのC16/18エロンガーゼを含んでなり、少なくとも1つのΔ8デサチュラーゼに連結した少なくとも1つのΔ9エロンガーゼを含んでなる少なくとも1つのマルチザイムが存在するをコードする遺伝子を発現するのに加えて、少なくとも25のEPADCWを産生する発明の組換え宿主細胞は、様々なその他の異種遺伝子を任意選択的に発現してもよい。これらとしては、以下に詳述するように、例えばコリンリン酸シチジリルトランスフェラーゼ[PCT]、ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ[CPT1]、マロニルCoAシンセターゼ[MCS]、および/またはΔ9デサチュラーゼをコードする遺伝子が挙げられる。ホスファチジルコリン[PC]生合成経路は、3つのステップを含んでなる。iコリンキナーゼ[EC2.7.1.32]によって触媒される、ATPコリン→ADPO-ホスホコリン;iiコリンリン酸シチジリルトランスフェラーゼ[PCT;EC2.7.7.15]によって触媒される、シチジン三リン酸[CTP]コリンリン酸←→二リン酸シチジン二リン酸-コリン[CDP-コリン];およびiiiジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ[CPT1;EC2.7.8.2]によって触媒される、CDP-コリン1,2-ジアシルグリセロール←→シチジン-5’-一リン酸[CMP]ホスファチジルコリン。米国特許出願公開第2009-0093543-A1号明細書は、CPT1をコードする、少なくとも1つの遺伝子の任意の同時発現を記載する。上記明細書では、PCTをコードする少なくとも1つの遺伝子の任意の同時発現が提案される。これらの酵素のいずれかまたは双方の発現はPC生合成経路を上方制御し、それによってPCの生合成増大がもたらされる。PUFAはPCおよびその他のグリセロリン脂質のsn-2位でエステル化される。したがってこれらの酵素の発現増大は、組換え微生物宿主細胞中にPUFAが貯蔵されてもよい、追加的な機序を提供してもよいすなわちPUFAの一次貯蔵はTAGの形態であるが。PCの生成増大はまた、1PCのsn-2位から脂肪酸を遊離するホスホリパーゼA2などのホスホリパーゼ;および2sn-2位でLPCを再アシル化するLPCATなどのLPLATの協奏的作用を通じて、引き続く細胞内の再構築またはアシル編集を促進してもよい。これは細胞アシルCoAプールからのアシルCoA脂肪酸の除去と、リン脂質プール中におけるsn-2位での様々なリゾリン脂質基質のアシル化を容易にする。上に記載した特定の理論に拘束されることなく、本開示に従って遺伝子操作された組換え宿主細胞内における、PCTおよび/またはCPT1のいずれかの過剰発現が望ましいことがある。PCTおよび/またはCPT1をコードする遺伝子は、宿主細胞に天然または異種であってもよい。例えばヤロウィア属Yarrowiaの最適化株中では、配列番号45に記載のヤロウィア属YarrowiaPCT遺伝子配列番号46のタンパク質をコードするおよび/または配列番号47に記載のヤロウィア属YarrowiaCPT1遺伝子配列番号48のタンパク質をコードする、または配列番号46および/または配列番号48と配列および機能に実質的に類似性を有する関連酵素を発現することが好ましい。米国特許出願公開第2010-0317072-A1号明細書は、EPA生合成のために遺伝子操作された組換え宿主細胞中でマロニルCoAシンセターゼ[MCS]をコードする、少なくとも1つのポリヌクレオチドの任意の同時発現を記載する。以前の研究は、ヤロウィアリポリティカYarrowialipolytica中のPUFAの遺伝子工学生産に関わる遺伝子変異の多くが、微生物発酵中にさらに利用され得ない有機酸副産物の蓄積増大をもたらすと判定したマロン酸が全有機酸蓄積の約45を構成する。特に米国特許出願公開第2010-0159558-A1号明細書は、EPAを産生するY.リポリティカY.lipolytica組換え株中における異種MCS[EC6.2.1.-]の発現を記載し、それは以下の酵素反応を触媒する。マロン酸ATPCoA→マロニルCoAAMPピロリン酸PPi。副産物すなわちマロン酸をマロニルCoAに変換することで、この基質は、生物内における脂肪酸合成中に使用可能になった。したがって約94g/gDCWのマロン酸副産物生成の低下に加えて、異種MCSの発現もまた、生物内における炭素およびエネルギーの浪費を回避するのを助け、発酵プロセス中の最適pH範囲の維持に必要な塩基の量を低下させ、発酵廃液内の中和が必要な副産物有機酸の量を低下させる。好ましいMCSは、リゾビウムレグミノサーラムRhizobiumleguminosarum次亜種ビシアエviciae3841GenBank受入番号YP_766603から誘導され、Y.リポリティカY.lipolytica中での発現のためにコドン最適化されたすなわち配列番号49および50。ヤロウィア属Yarrowiaの最適化株中で、または本開示に従って遺伝子操作されたその他の組換え宿主細胞中で、前出の配列番号49および50に記載のMCS、または配列番号50と配列および機能に実質的に類似性を有する関連酵素を発現することが、望ましいことがある。本明細書に記載される組換え微生物宿主細胞中で任意選択的に発現されてもよい別の遺伝子は、Δ9デサチュラーゼである。当業者には明らかであるように、この特定酵素の過剰発現は、ステアリン酸[18:0]からオレイン酸[18:1]への変換を増大させ、それによってPUFA生合成経路中への炭素のより大きなプッシングpushingがもたらされる。本明細書に記載される組換え微生物宿主細胞は、少なくとも1つの変異Δ5デサチュラーゼをさらに含んでなってもよい。Δ6、Δ8、およびΔ4デサチュラーゼと並んで、Δ5デサチュラーゼは長鎖PUFAフロントエンドデサチュラーゼとして知られているメチル依存性不飽和化とは対照的に、既存の二重結合と脂肪酸のアシル基のカルボキシル末端との間で不飽和化が起きる。これらのデサチュラーゼは、3個のヒスチジンボックス[HX3-4H配列番号186および187、HX2-3HH配列番号188および189、およびH/QX2-3HH配列番号190および191]によって特徴付けられ、電子供与体として機能するそれらのN末端に融合チトクロームb5ドメインを有することから、チトクロームb5融合スーパーファミリーのメンバーである。残るチトクロームb5ドメイン配列の多様性にもかかわらず、チトクロームb5ドメインは、保存されたヘム結合モチーフすなわちHPGG配列[配列番号181]もまた含有する。酵素活性に対するHDASHモチーフの重要性は未だ解明されていないが、Δ5デサチュラーゼの特性として以前同定された追加的な保存されたシグネチャーモチーフもまた、ヒスチジンに富むようであるすなわちHDASH配列[配列番号183]。本発明のいくつかの実施形態では、少なくとも1つの変異Δ5デサチュラーゼは、a配列番号180[HxGx]に記載のアミノ酸モチーフと、配列番号182[HxxxH]に記載のアミノ酸モチーフとを含んでなり、配列番号180[HxGx]が配列番号181[HPGG]と同一でなく、配列番号182[HxxxH]が配列番号183[HDASH]と同一でない、変異ポリペプチド;b配列番号106[EgD5Mまたはコドン最適化EgD5R-34g158g]、配列番号108[EgD5R-34g158g347s]、配列番号110[EgD5S-36s157g]、配列番号112[EaD5S-35a158g]、配列番号299[EgD5R-34g157g]、配列番号301[EgD5R-34g158a]、配列番号303[EgD5R-34g158g]、配列番号329[EgD5S-36s156e]、配列番号331[EgD5S-36s158a]、配列番号333[EgD5S-36s158g]、配列番号363[EaD5S-35a158s]、配列番号365[EaD5S-35a159g]からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、変異ポリペプチドからなる群から選択されてもよい。本明細書に記載される組換え微生物宿主細胞は、少なくとも約25のEPADCW、好ましくは少なくとも約25~30のEPADCW、より好ましくは少なくとも約30~32.5のEPADCW、より好ましくは少なくとも約32.5~35のEPADCW、および最も好ましくは少なくとも約35~40のEPADCWを含んでなる、微生物油を産生できる。発酵当業者は、発酵作業それ自体、培地条件、工程パラメータ、スケールアップなど、ならびに培養物が試料採取される特定の時点次第で、特定組換え微生物宿主細胞の油プロファイルに変動性が現れることを理解するであろう。したがって指定された遺伝子型を有する、特定の組換え微生物宿主は、最適条件下で培養した際に、少なくとも約25のEPADCWを含んでなる微生物油を産生できることもあるが、少なくとも約25のEPADCWを含んでなる微生物油を必ずしも常に産生しない例えば発酵時間が不十分な場合など。したがって本考察は、適切な条件下で培養した際に、少なくとも約25のEPADCWを産生する生物の能力に言及する。当業者には明らかであるように、本明細書に記載される手順を使用して、少なくとも約25のEPADCWを産生できる、多数の異なる最適化組換え株を遺伝子操作し得る。総脂肪酸の百分率としてのEPA濃度[EPATFA]および総脂質含量[TFADCW]の双方の要素が、乾燥細胞重量の百分率としてのEPAの細胞内含有量[EPADCW]に影響を及ぼすので、商業目的のために好ましい株の選択では双方を検討する。すなわちEPADCWは、次のように計算される。EPATFATFADCW]/100例えば、40のEPATFAを産生して62.5のTFADCWを有する株、45のEPATFAを産生して55.55のTFADCWを有する株、50のEPATFAを産生して50のTFADCWを有する株、55のEPATFAを産生して45.45のTFADCWを有する株、60のEPATFAを産生して41.67のTFADCWを有する株、および65のEPATFAを産生して38.46のTFADCWを有する株は全て、25のEPADCWを産生する。好ましい実施形態では、改善された組換え微生物宿主細胞は、少なくとも25のEPADCWを含んでなる油を産生でき、少なくとも45のEPATFAを産生する。より好ましくは、油は、少なくとも約47~50のEPATFA、好ましくは少なくとも約50~55のEPATFA、より好ましくは少なくとも約55~60のEPATFA、より好ましくは少なくとも60~70のEPATFA、および最も好ましくは少なくとも約70~80のEPATFAを含んでなる。別の実施形態では、改善された組換え微生物宿主細胞は、少なくとも25のEPADCWを含んでなる油を産生でき、改善された組換え微生物宿主細胞内の脂質プロフィール、またはそれからの抽出油または未濃縮油内の脂質プロフィールは、少なくとも約2.4のEPATFA対LATFA比を有する。米国特許出願公開第2009-0093543-A1号明細書で先に考察されたように、中間体脂肪酸LAの濃度を最小化するEPA:LAの比率増大をもたらすことで、PUFA生合成経路を通過する炭素のより大きなプッシングpushingがもたらされ、EPAの合成増大が可能になる。好ましい実施形態では、EPA:LAの比率は、少なくとも約2.4~2.75、より好ましくは少なくとも約2.75~3.25、より好ましくは少なくとも約3.25~4、そして最も好ましくは少なくとも約4~5.5である。様々な細菌、酵母、藻類、ユーグレナ属、ストラメノパイル、真菌、およびそれらの混合物をはじめとする多様な微生物宿主細胞が、微生物油を自然に産生する。そしてEPAは、利用される特定微生物[例えば従属栄養珪藻キクロテラCyclotella種およびニッチアNitzschia種米国特許第5,244,921号明細書;シュードモナス属Pseudomonas、アルテロモナス属AlteromonasまたはシュワーネラShewanella種米国特許第5,246,841号明細書;ピシウム属Pythium米国特許第5,246,842号明細書の糸状菌;またはモルティエラエロンガータMortierellaelongata、M.エクシグアM.exigua、またはM.ハイグロフィラM.hygrophila米国特許第5,401,646号明細書]の天然能力に基づく多数の異なる方法によって、微生物を利用して製造し得る。天然でEPAを産生する微生物について述べる役立つレビューは、Z.WenandF.Chen,InSingleCellOils;C.RatledgeandZ.Cohen,Eds.;AOCSPublishing,2005;Chapter10のProspectsforEPAproductionusingmicroorganismsと題されたレビューである。本明細書の目的では、組換え微生物宿主細胞は、遺伝子工学ツールによって遺伝的に操作し得て、少なくとも25のEPADCWを含んでなる微生物油を産生できる細胞でなくてはならない。例えばΔ5デサチュラーゼ、Δ6デサチュラーゼ、Δ12デサチュラーゼ、Δ15デサチュラーゼ、Δ17デサチュラーゼ、Δ9デサチュラーゼ、Δ8デサチュラーゼ、Δ9エロンガーゼ、C14/16エロンガーゼ、C16/18エロンガーゼ、およびC18/20エロンガーゼの特定の組み合わせなどの適切なPUFA生合成経路遺伝子を導入することで、EPAを産生する天然能力を欠く微生物を遺伝子操作して、PUFA生合成経路を発現させ得るが、導入される特定酵素およびこれらの酵素をコードする遺伝子は、本発明をどのようにも限定するものではないと認識される。例えば公共および特許文献は、低濃度の生産ではあるがEPA生合成のために大腸菌EscherichiacoliOrikasa,A.etal.,CellMol.Biol.50:625-6302004、サッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiaeTavares,S.,etal.,AEM,7751854-18612011を遺伝子操作する手段を教示する。好ましい実施形態では、微生物宿主細胞は油性であり、それらはDCWの約25超を油として蓄積する。油性微生物宿主細胞は、例えばモルティエラ属Mortierella、スラウストキトリウム属Thraustochytrium、シゾキトリウム属Schizochytrium、および油性酵母からなる群から選択される属のメンバーであってもよい。油性酵母は油を合成して蓄積することができ、全油含量は、DCWの約25を超えて、より好適にはDCWの約30を超えて、最も好適にはDCWの約40を超えて構成し得る。代わりの実施態様では、例えばサッカロミセスセレヴィシエSaccharomycescerevisiaeなどの非油性酵母が、DCWの25を上回る油を産生し得るように、それを遺伝子操作して油性にし得る国際公開第2006/102342号パンフレット。典型的に油性酵母として同定される属としては、ヤロウィア属Yarrowia、カンジダ属Candida、ロドトルラ属Rhodotorula、ロドスポリジウム属Rhodosporidium、クリプトコッカス属Cryptococcus、トリコスポロン属Trichosporon、およびリポマイセス属Lipomycesが挙げられるが、これに限定されるものではない。より具体的には、例証的な油合成酵母としては、ロドスポリジウムトルロイデスRhodosporidiumtoruloides、リポマイセススターケイLipomycesstarkeyii、L.リポフェラスL.lipoferus、カンジダレブカウフィCandidarevkaufi、C.プリケリーマC.pulcherrima、C.トロピカリスC.tropicalis、C.ユチリスC.utilis、トリコスポロンプランズTrichosporonpullans、T.クタネウムT.cutaneum、ロドトルラグルチヌスRhodotorulaglutinus、R.グラミニスR.graminis、およびヤロウィアリポリティカYarrowialipolytica以前はカンジダリポリチカCandidalipolyticaに分類されたが挙げられる。最も好ましいのは、油性酵母ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaであり;さらなる実施形態では、最も好ましいのはATCC20362、ATCC8862、ATCC18944、ATCC76982および/またはLGAMS71と称されるY.リポリティカY.lipolytica株であるPapanikolaouS.,andAggelisG.,Bioresour.Technol.821:43-92002。前述の属のいずれかが、少なくとも25のEPADCWを含んでなる微生物油を産生できる宿主細胞を生成する、本明細書の開示に従った組換え遺伝子操作に適することもある。したがって遺伝子操作は、適切なPUFA生合成経路の導入または上方制御に限定されないことは明らかであり;それよりむしろ宿主生物を遺伝的にさらに操作して、蓄積する総脂質を変更し、グリセロリン脂質生合成biosythesisを変更し、細胞を通過する炭素流動を変更し、直接または間接的PUFA分解をもたらす経路を変更するなどしてもよい。EPAの構造形態は限定的でなく;したがって例えば、EPAは総脂質中に、FFAまたはエステル化形態で存在してもよいことが留意される。好適には、少なくとも1つのPUFAはTAGの形態である。本明細書の開示に従って、EPA生産のために多数の組換え微生物宿主細胞を遺伝子操作し得るが、本発明はヤロウィアリポリティカYarrowialipolytica中で実証されている。しかし当業者は、本発明の手順が、その中で本発明が実証されている、種または属の使用に限定されないことを理解するであろう。それよりむしろ、少なくとも25のEPADCWを含んでなる微生物油を産生できる、あらゆる油性酵母またはあらゆるその他の適切な微生物が、本手順で使用するのに等しく適する。外来性遺伝子の高レベル発現を誘導する制御配列を含有する、微生物発現系および発現ベクターは、当業者に良く知られている。これらのいずれかを使用して、好ましいデサチュラーゼ、エロンガーゼ、DGLAシンターゼ、LPAAT、PDAT、PCT、CPT1、およびMCSタンパク質をコードするキメラ遺伝子を構築し得る。標準形質転換法を使用して、これらのキメラ遺伝子を微生物宿主細胞に導入し、コードされた酵素の高レベル発現を提供し得る。微生物宿主細胞の形質転換に有用なベクター例えばコンストラクト、プラスミドおよびDNA発現カセットは、当該技術分野で周知である。コンストラクト中に存在する配列の特定の選択は、所望の発現産物、宿主細胞の性質、および形質転換細胞と非形質転換細胞とを分離する提案される手段に左右される。しかし典型的に、ベクターは、少なくとも1つの発現カセット、選択可能なマーカー、および自律複製または染色体への組み込みを可能にする配列を含有する。適切な発現カセットは、典型的に、プロモーター、選択された遺伝子のコード配列、およびターミネーターを含んでなる。双方の制御領域が、形質転換宿主細胞からの遺伝子に由来することが最も望ましい。2つ以上の遺伝子が別個の自己複製ベクターから発現される場合、各ベクターが異なる選択手段を有することが望ましく、その他のコンストラクトとの相同性を欠いて、安定発現を維持し、コンストラクト間の要素の再集合を妨げるべきである。調節領域の賢明な選択、選択手段、および導入コンストラクトの増殖法は、導入遺伝子が所望の生成物の合成を提供するのに必要なレベルで発現されるように、実験的に判定し得る。対象遺伝子を含んでなるコンストラクトまたはベクターは、あらゆる標準技術によって宿主細胞に導入してもよい。これらの技術としては、例えば酢酸リチウム形質転換[MethodsinEnzymology,194:186-1871991]などの形質転換、微粒子銃衝撃、電気穿孔、マイクロインジェクション、または関心のある遺伝子を宿主細胞に導入するその他の任意の方法が挙げられる。一例として、米国特許第4,880,741号明細書および米国特許第5,071,764号明細書、およびChen,D.C.etal.Appl.Microbiol.Biotechnol.,482:232-2351997は、直線化DNA断片に基づくヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaのための組み込み技術を記載する。便宜上、DNA配列例えば発現カセットを取り込むように、あらゆる方法によって操作されている宿主細胞を形質転換されたまたは形質転換体または組み換えと本明細書で称する。形質転換宿主は、発現カセットがゲノムに組み込まれるのか、または複数のコピー数を有する染色体外要素上に存在するのかに応じて、発現カセットの少なくとも1つのコピーを有し、2つ以上を有してもよい。形質転換宿主細胞は、米国特許第7,238,482号明細書、および米国特許第7,259,255号明細書に記載されるような様々な選択技術によって同定し得る。本明細書で使用される好ましい選択方法は、カナマイシン、ハイグロマイシン、およびアミノグリコシドG418に対する耐性、ならびにウラシル、ロイシン、リジン、トリプトファンまたはヒスチジンが欠如している培地上で増殖する能力である。代わりの実施態様では、酵母Ura-変異体を選択するために5-フルオロオロト酸5-フルオロウラシル-6-カルボン酸一水和物;5-FOAが使用され米国特許出願第2009-0093543-A1号明細書、または形質転換体を選択するためにスルホニル尿素除草剤耐性を与える天然アセトヒドロキシ酸シンターゼまたはアセト乳酸シンターゼ;E.C.4.1.3.18が利用される国際公開第2006/052870号パンフレット。部位特異的リコンビナーゼシステムの使用によって、複数の逐次形質転換で使用するために好ましい選択マーカーのペアを再利用する特有の方法もまた、米国特許出願公開第2009-0093543-A1号明細書で教示される。当業者には周知のように、例えばデサチュラーゼ、エロンガーゼ、DGLAシンターゼ、LPAAT、PDAT、PCT、CPT1、MCS遺伝子を単にクローニングベクターに挿入するだけでは、所望の速度、濃度、量などでのその発現は保証されない。転写、RNA安定性、翻訳、タンパク質安定性、およびタンパク質位置、酸素制限、および宿主細胞からの分泌の側面を制御する、いくつかの異なる遺伝要素を操作することが望ましいことがある。より具体的には、遺伝子発現は、以下を変更することで制御してもよい。関連するプロモーターおよびターミネーター配列の性質;クローン遺伝子のコピー数;遺伝子がプラスミド由来であるかまたは宿主細胞のゲノム中に組み込まれているかどうか;合成外来性タンパク質の最終的細胞内所在;宿主生物中における翻訳効率;宿主細胞内のクローン遺伝子タンパク質の固有の安定性;およびその使用頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に近くなるようなクローン遺伝子中のコドン使用頻度。これらの過剰発現法のいくつかは下で考察され、例えばデサチュラーゼ、エロンガーゼ、DGLAシンターゼ、LPAAT、PDAT、PCT、CPT1、およびMCSをコードする遺伝子の過剰発現手段としての組換え微生物宿主細胞の遺伝子操作において有用である。発現増大を引き起こすより強力な調節または構成いずれかのプロモーターの使用を通じて、mRNAまたはコードされたタンパク質のいずれかから不安定配列を除去/消去し、またはmRNAに安定化配列を付加する米国特許第4,910,141号明細書ことによって、所望の遺伝子の発現を転写レベルで増大し得る。微生物宿主細胞中における異種遺伝子発現を駆動する有用なプロモーターは多数あり、当業者に知られている。発現は、誘導性または構成的様式で達成され得る。誘導性発現が、関心のある遺伝子と作動可能に結合する調節可能プロモーターの活性を誘導することで達成され得る一方、構成的発現は、関心のある遺伝子と作動可能に結合する構成的プロモーターの使用によって達成され得る。宿主種からの転写および翻訳領域が特に有用ではあるが、デサチュラーゼ、エロンガーゼ、DGLAシンターゼ、LPAAT、PDAT、PCT、CPT1、およびMCS遺伝子の発現を誘導できる実質的にあらゆるプロモーターすなわち天然、合成、またはキメラが適切である。一般に、ターミネーターは、それからプロモーターが得られる遺伝子の3’領域、または異なる遺伝子に由来し得る。多数のターミネーターが知られており、それらが由来したのと同じおよび異なる属および種のどちらで使用した場合も、多様な宿主中で満足に機能する。ターミネーターは、通常いかなる特性のためでもなく、便宜上選択される。好ましくは、ターミネーターは酵母遺伝子から誘導される。当業者は、入手できる情報を利用してターミネーターをデザインおよび合成し得るので、ターミネーターはまた合成もされ得る。ターミネーターは不要なこともあるが、高度に好ましい。限定することは意図されないが、ヤロウィア属Yarrowiaの組換え微生物宿主細胞で使用するための好ましいプロモーターおよびターミネーターは、それぞれの開示を参照によって本明細書に援用する、米国特許公開第2009-0093543-A1号明細書、米国特許公開第2010-0068789-A1号明細書、米国特許公開第2011-0059496-A1号明細書、米国仮特許出第61/469,933号明細書代理人整理番号CL4736USPRV、2011年3月31日出願、米国仮特許出第61/470,539号明細書代理人整理番号CL5380USPRV、2011年4月1日出願、米国仮特許出第61/471,736号明細書代理人整理番号CL5381USPRV、2011年4月5日出願、および米国仮特許出第61/472,742号明細書代理人整理番号CL5382USPRV、2011年4月7日出願で教示されるものである。PUFA生合成経路デサチュラーゼ、エロンガーゼ、DGLAシンターゼ、LPAAT、PDAT、PCT、CPT1、およびMCS遺伝子の追加的なコピーすなわち2つ以上のコピーを組換え微生物宿主細胞に導入し、それによってEPAの生産と蓄積を増大させてもよい。具体的には、遺伝子の追加的なコピーを単一発現コンストラクト内でクローンしてもよく、および/またはプラスミドコピー数を増大させることで、またはゲノム後述へのクローン遺伝子の複数組み込みによって、クローン遺伝子の追加的なコピーを宿主細胞に導入してもよい。本明細書の手順に従って最適化組換え微生物宿主細胞を作成する際は、様々なデサチュラーゼ、エロンガーゼ、DGLAシンターゼ、LPAAT、PDAT、PCT、CPT1、およびMCSのコピーについてしばしば言及されることに、留意することが重要である。例えばΔ9エロンガーゼの2つのコピーが必要である場合、これは以下を指し得る。1単一種から単離された特定のΔ9エロンガーゼの同一コード配列の2つのコピー;または2集合的に2つのΔ9エロンガーゼがもたらされる、A種から単離されたΔ9エロンガーゼの1つのコード配列と、B種から単離されたΔ9エロンガーゼの1つのコード配列。一般に、組換え宿主細胞中における発現に適する例えばプロモーター、ORF、およびターミネーターを含んでなるキメラ遺伝子を含んでなるDNAカセットが得られると、それは宿主細胞中で自律複製できるプラスミドベクターに入れられ、または宿主細胞のゲノムに直接組み込まれる。発現カセットの組み込みは、宿主ゲノム内で無作為に生じ得て、または宿主遺伝子座との組換えを標的とするのに十分な、宿主ゲノムとの相同領域を含有するコンストラクトの使用を通じて、標的化し得る。本明細書では依存しないが、転写および翻訳調節領域の全部または一部は内在性遺伝子座によって提供され得て、コンストラクトは内在性遺伝子座を標的とする。遺伝子改変組換えヤロウィアリポリティカYarrowialipolytica宿主細胞に関しては、この微生物宿主中で遺伝子を発現する好ましい方法は、宿主ゲノムへの線状DNA断片の組み込みによる。ゲノム内の複数位置への組み込みは、遺伝子の高レベルの発現が所望される場合に、特に有用である。好ましい遺伝子座としては、米国特許公開第2009-0093543-A1号明細書で教示されるものが挙げられる。さらにJuretzekらYeast,18:97ー1132001は、ヤロウィアリポリティカYarrowialipolytica中に組み込まれたDNA断片の安定性が、使用される個々の形質転換体、受容者株、および標的プラットフォームに左右されることを指摘する。したがって当業者は、所望の発現レベルとパターンを示す株を得るために、特定の組換え微生物宿主の複数の形質転換体をスクリーニングしなくてはならないことを認識する。このようなスクリーニングは、DNAブロットのサザン分析Southern,J.Mol.Biol.,98:5031975、mRNA発現のノーザン分析Kroczek,J.Chromatogr.Biomed.Appl.,6181-2:133-1451993、タンパク質発現のウェスタン分析、PUFA生成物の表現型分析またはGC分析によって達成されてもよい。本開示の形質転換組換え微生物宿主細胞は、例えばデサチュラーゼ、エロンガーゼ、DGLAシンターゼ、LPAAT、PDAT、PCT、CPT1、およびMCSをコードするキメラ遺伝子の発現を最適化し、EPAの最大かつ最も経済的な収率を生じる条件下で、培養される。一般に、炭素源のタイプと量、窒素源のタイプと量、炭素対窒素比、異なる無機イオンの量、酸素レベル、増殖温度、pH、バイオマス生産段階の長さ、油蓄積相の長さ、および細胞収穫時期と方法を変更することで、培地条件を最適化してもよい。例えばヤロウイアリポリティカYarrowialipolyticaは、酵母抽出物-ペプトン-デキストロース液体培地[YPD]などの複合培地中で、または生育に必要な構成要素が欠如していることで所望の発現カセットの選択を強要する合成最少培地例えば酵母窒素ベースDIFCOLaboratories,Detroit,MI上で一般に培養される。本明細書に記載される方法および宿主細胞のための発酵培地は、米国特許第7,238,482号明細書および米国特許出願公開第2011-0059204-A1号明細書で開示されるような、適切な炭素源を含有しなくてはならない。本明細書の方法で利用される炭素源は多種多様な炭素含有源を包含してもよいことが考察されるが、好ましい炭素源は糖例えばグルコース、転化糖、果糖、およびそれらの組み合わせ、グリセロールおよび/または脂肪酸例えば10~22個の炭素を含有するものである。窒素は、無機例えばNH42SO4または有機例えば尿素またはグルタミン酸原料から供給されてもよい。適切な炭素および窒素源に加えて、発酵培地はまた、組換え微生物宿主の増殖と、EPA産生酵素経路の促進とに適することが当業者に知られている、適切なミネラル、塩、補助因子、緩衝液、ビタミン、およびその他の構成要素を含有しなくてはならない。Fe2、Cu2、Mn2、Co2、Zn2、およびMg2などの脂質およびPUFAの合成を促進するいくつかの金属イオンが注目されているNakahara,T.etal.,Ind.Appl.SingleCellOils,D.J.KyleandR.Colin,eds.pp61-971992。本明細書に記載される方法および宿主細胞に好ましい増殖培地は、酵母窒素ベースDIFCOLaboratories,Detroit,MIなどの一般的な商業的に調製された培地である。その他の規定培地または合成増殖培地もまた使用してよく、例えばヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaの増殖に適した培地は、微生物学または発酵化学当業者に知られている。発酵のための適切なpH範囲は、典型的に約pH4.0~pH8.0の間であり、初期成長条件範囲としてはpH5.5~pH7.5が好ましい。発酵は好気性または嫌気性条件下で実行されてもよく、微好気条件が好ましい。典型的に、代謝状態は、増殖と脂肪合成/貯蔵の間で平衡状態でなくてはならないので、油性酵母細胞中の高レベルのPUFA蓄積は、二段階過程を必要とする。したがって最も好ましくは、ヤロウィアリポリティカYarrowialipolytica中でのEPA生成のために、二段階発酵過程が必要である。このアプローチは米国特許第7,238,482号明細書に記載され、様々な適切な発酵過程デザインすなわちバッチ、流加、および連続および増殖中の配慮についても同様である。米国特許出願公開第2009-0093543-A1号明細書の実施例10もまた、組換えヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaY4305株の2L発酵に必要なパラメータの詳細な説明を提供する162時間にわたるその最大生産量は、12.1のEPADCWであった[すなわち55.6のEPATFAであり、EPATFA対LATFA比は3.03であった]。本開示は、凍結培養物から接種菌液を調整して種培養を作成し、最初に高い細胞密度への迅速な増殖を促進する条件下で酵母を培養し、次に酵母を培養して窒素を欠乏させ、グルコースを連続的に供給することで脂質およびPUFA蓄積を促進させる手段の記述を含む。標準操作条件によって、温度30~32°Cに制御、pH5~7に制御、溶存酸素濃度、およびグルコース濃度をはじめとするプロセス変量をモニターして制御し、一貫した工程性能および最終PUFA油の品質を確保した。特に米国特許出願公開第2009-0093543-A1号明細書の実施例10のデータを利用して、本明細書の図2で示され下の表6で要約されるように、発酵の間にEPATFAおよびLATFAがどのように変動するかを実証するグラフを作成し得る。特に約40~125時間の発酵中にEPATFAが増大し、約40~125時間の発酵中にLATFAが低下し、EPA:LA比が増大したことに留意すべきである。この分析から、ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaY4305株が12.1のEPADCWを産生できた一方で、組換え微生物宿主細胞の油プロファイルは、発酵作業それ自体、培地条件、工程パラメータ、スケールアップなど、ならびに培養物が試料採取される特定の時点に依存することが明らかである。したがって遺伝子操作株は、多様な異なる脂質含量および組成すなわちEPATFA、LATFA、およびEPA:LA比に基づくを有する微生物油を産生できた。本明細書に記載される組換え微生物宿主細胞培養する際には、これらの要素を考慮して遺伝子改変宿主細胞の潜在能力を最大限に実現し、あらゆる特定の発酵作業において少なくとも25のEPADCWを達成しなくてはならない。本明細書のいくつかの態様では、一次産物は組換え微生物バイオマスである。したがって微生物バイオマスからのEPA含有油の単離および精製は、必要ないこともあるすなわちホールセルバイオマスが生成物である。しかし特定の最終用途および/または最終産物形態が、微生物バイオマスからのEPA含有油の部分的および/または完全単離/精製を要することもあり、部分的精製微生物バイオマス、精製油、および/または精製EPAがもたらされる。これらの態様についてさらに詳しくは、米国特許出願公開第2010-0317072-A1号明細書を参照されたい。精製および/または純化EPAを含有する油を水素化し、それによって様々な融解特性とテクスチャがある脂肪をもたらし得る。スプレッド、製菓用脂肪、ハードバター、マーガリン、ベーキング用ショートニングなどをはじめとする多数の加工脂肪は、室温における様々な程度の固体性を要し、原料油の物理特性変更を通じてのみ製造し得る。これは、通常、接触水素化を通じて達成される追加的詳細および参考文献については、国際公開第2006/052870号パンフレットを参照されたい。EPAを含んでなる油性酵母バイオマスを含んでなる、食品、乳児用調製粉乳、機機能性食品、メディカルフード、医療栄養物、健康補助食品、医薬組成物、動物飼料、およびパーソナルケア製品は、米国特許出願公開第2010-0317072-A1号明細書で教示され、これらの用途は、EPAそれ自体を含んでなる組換え微生物バイオマス、またはそれから単離されたEPAを含んでなる微生物油のいずれについても、本明細書で同様に当てはまる。加工および処方の当業者は、標的種および/または最終用途に準じて、一定量および組成の組換え微生物バイオマス、部分的精製バイオマス、精製油、および/または精製EPAをどのように特定製品に添加してもよいかを理解する。より具体的には、製品処方に有効量を組み込むべきであるが、この量は食品または飼料製品、製品が栄養補給することが意図される食餌、またはメディカルフードまたは医療栄養物が矯正しまたは治療することが意図される疾患に依存する。最も望ましくは、EPAの有効量は、ω-3/ω-6PUFAの消費と関連付けられている、望ましい健康特性を提供するのに十分である。典型的に、製品に組み込まれるEPAの量については、数例を挙げれば、処理条件と典型的な取り扱いと貯蔵条件とに付随する損失、製品中のEPAの安定性、および標的種中における生物学的利用能/生物学的吸収効率を考慮する。加工および処方の当業者は、本明細書に記載される組換え微生物宿主細胞から生成された微生物油を濃縮し、それによって、それが少なくとも約55~60、少なくとも約60~65、少なくとも約65~70、少なくとも約70~85、少なくとも約85~90、少なくとも約90~95のEPAまたは95~99にさえ至るEPAを含んでなるように、総脂質画分中のEPA濃度を増大する方法に精通している。本明細書に記載される精製油をその他の精製脂肪酸例えばLA、GLA、EDA、DGLA、ARA、DTA、DPAn-6、ALA、STA、ETrA、ETA、DPA、およびDHAと、または代わりの脂肪酸を好ましい濃度で含有する油と混合する手段もまた、当業者に良く知られている。これらの技術は、特有に調整された脂肪酸プロファイルを含んでなる油を容易に作成できるようにする。好ましい実施形態の説明以下の実施例に詳述するように、DCWの25を超えるEPAを産生する、油性酵母ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaの様々な組換え株が本明細書で実証される。表7は、フラスコアッセイによる測定で、遺伝子型、総脂質含量、および脂質組成に基づいて、先に遺伝子操作されて22.5のEPADCWを産生する組換えヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaZ1978株と比較した、これらの組換え株のいくつかの要約を提供する。表内の各ブロックは、単一形質転換において生成された株または株群に相当しすなわちZ1977株、Z1978株、Z1979株、Z1980株、およびZ1981株は、単一形質転換からの個々のコロニーであった、したがって同一遺伝子型を共有することが予測される。形質転換体内で発現された追加的な遺伝子、ならびにこれらの遺伝子のコピー数に注目する略語を使用して、Z1978株に由来する株の遺伝子型を、Z1978株の遺伝子型と比較して要約する。したがって、例えば、Z1978株と比べて、L250株はYlLPAAT1を含んでなる1つの追加的な発現カセット、およびYlPDATを含んでなる1つの追加的な発現カセットで形質転換され;L258株は、Z1978株と比べて、L258株はYlLPAAT1を含んでなる2つの追加的な発現カセット、およびYlPDATを含んでなる2つの追加的な発現カセットで形質転換された。表は、細胞の総乾燥細胞重量[DCW]、細胞の総脂質含量[TFADCW]、TFAの重量としての各脂肪酸濃度[TFA]、乾燥細胞重量の百分率としてのEPA含有量[EPADCW]、およびEPATFA対LATFAの比率[EPA:LA比]を要約する。脂肪酸は、16:0パルミチン酸、16:1パルミトレイン酸、18:0ステアリン酸、18:1オレイン酸、18:2リノール酸、ALAα-リノレン酸、EDAエイコサジエン酸、DGLAジホモ-γ-リノレン酸、ARAアラキドン酸、ETrAエイコサトリエン酸、ETAエイコサテトラエン酸、EPAエイコサペンタエン酸、その他である。少なくともLPAAT活性を有する少なくとも2つのポリペプチドと、少なくともPDAT活性を有する少なくとも1つのポリペプチドとを含んでなる株内では、EPADCWは25.6~28の範囲であり、EPATFAは45.2~50.4の範囲であり、EPATFA対LATFAの比率EPA:LA比は2.42~3.29の範囲である。これらの株は全てDCWの25を超えるEPAを産生したが、総発酵時間を短縮することで、同一株を使用してDCWの25未満のEPAを生成してもよいことは、注目に値する。図2に関して、上で論じた組換えヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaY4305株の性能と類似して、表7の株はより少ないEPATFAと、より多くのLATFAを産生し、発酵時間が短縮されればEPA:LA比が低下することが予測される。したがって、当業者は、これらの遺伝子操作Y.リポリティカY.lipolytica株が、発酵中の特定の試料採取時点次第で、様々なEPA:LA比率で、多様な濃度のEPAを有する微生物油を産生できることを理解するであろう。EPA、LA、およびオレイン酸が、TFAのおよそ70~75を構成する。本明細書に記載される改善された最適化組換えY.リポリティカY.lipolytica株はまた、約0.1に至る検出可能レベルを有する装置を使用してGC分析により測定した場合約0.5未満のGLAまたはDHAを有し、約8未満の飽和脂肪酸含量を有することで際立っている。この飽和脂肪酸すなわち16:0および18:0の低い百分率は、ヒトおよび動物にかなりの健康上の利点をもたらす。本発明を以下の実施例でさらに定義する。これらの実施例は本発明の好ましい実施形態を示しながら、例証としてのみ提供されるものと理解すべきである。上の考察およびこれらの実施例から、当業者は本発明の本質的特徴を見極め得て、その範囲と精神を逸脱することなく、本発明に様々な変更と修正を加えて、それを様々な用途と条件に適応させ得る。一般方法実施例で使用される標準組換えDNAおよび分子クローニング技術は当該技術分野で周知であり、1Sambrook,J.,Fritsch,E.F.andManiatis,T.,MolecularCloning:ALaboratoryManual;ColdSpringHarborLaboratory:ColdSpringHarbor,NY1989Maniatis;2T.J.Silhavy,M.L.Bennan,andL.W.Enquist,ExperimentswithGeneFusions;ColdSpringHarborLaboratory:ColdSpringHarbor,NY1984;および3Ausubel,F.M.etal.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,publishedbyGreenePublishingAssoc.andWiley-Interscience,Hoboken,NJ1987に記載される。微生物培養の維持および成長に適した材料と方法は、当該技術分野で周知である。以下の実施例で使用するのに適した技術は、ManualofMethodsforGeneralBacteriologyP.Gerhardt,R.G.E.Murray,R.N.Costilow,E.W.Nester,W.A.Wood,N.R.KriegandG.B.Phillips,Eds,AmericanSocietyforMicrobiology:Washington,D.C.1994;またはThomasD.BrockinBiotechnology:ATextbookofIndustrialMicrobiology,2nded.,SinauerAssociates:Sunderland,MA1989に記載される。全ての試薬、制限酵素、および微生物細胞の増殖と維持のために使用された材料は、特に断りのない限り、DIFCOLaboratoriesDetroit,MI、NewEnglandBiolabs,Inc.Beverly,MA、GIBCO/BRLGaithersburg,MD、またはSigma-AldrichChemicalCompanySt.Louis,MOから得られた。大腸菌E.coli株は、典型的に、ルリアベルターニ[LB]プレート上で37°Cで培養された。一般的分子クローニングは、標準法Sambrookら、前出に従って実施された。PCRまたは部位特異的変異誘発がサブクローニングに伴う場合、コンストラクトを配列決定して、配列にいかなる誤りも導入されなかったことを確認した。PCR産物は、PromegaのpGEM-T-easyMadison,WIまたはpCR4TOPOInvitrogen,SanDiego,CAベクターにクローンされた。略称の意味は、次の通り。secは秒を意味し、minは分を意味し、hは時間を意味し、dは日を意味し、μLはマイクロリットルを意味し、mLはミリリットルを意味し、Lはリットルを意味し、μMはマイクロモルを意味し、mMはミリモルを意味し、Mはモルを意味し、mmolはミリモルを意味し、μmoleはマイクロモルを意味し、gはグラムを意味し、μgはマイクログラムを意味し、ngはナノグラムを意味し、Uは単位を意味し、bpは塩基対を意味し、kBはキロベースを意味し、DCWは乾燥細胞重量を意味し、TFAは総脂肪酸を意味し、FAMEは脂肪酸メチルエステルを意味する。発現カセット命名法発現カセットの構造は簡易表記体系X::Y::Zで表され、Xはプロモーター断片を記載し、Yは遺伝子断片を記載し、Zはターミネーター断片を記載し、それらは全て互いに作動的に連結する。ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaの形質転換および培養ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaATCC20362株は、AmericanTypeCultureCollectionRockville,MDから購入された。Y.リポリティカY.lipolytica株は、典型的に下に示すレシピに従った、いくつかの培地中で28~30°Cで培養した。寒天プレートは、標準手順に従って、各液体培地に20g/Lの寒天を添加して、必要に応じて調製した。YPD寒天培地1Lあたり:10gの酵母抽出物[Difco]、20gのBactoペプトン[Difco]、および20gのグルコース。基礎最少培地MM1Lあたり:20gのグルコース、1.7gのアミノ酸非含有酵母窒素ベース、1.0gのプロリン、およびpH6.1調節の必要なし。最少培地5-フルオロオロト酸MM5-FOA1Lあたり:20gのグルコース、6.7gの酵母窒素ベース、75mgのウラシル、75mgのウリジン、および100mg/L~1000mg/Lの様々な濃度範囲に対するFOA活性試験に基づく適量のFOAZymoResearchCorp.,Orange,CA供給元から受領された各バッチには変動があるため。高グルコース培地HGM1リットルあたり:80グルコース、2.58gのKH2PO4、および5.36gのK2HPO4、pH7.5調節不要。発酵培地[FM]1リットルあたり:6.70g/Lの酵母窒素ベース、6.00gのKH2PO4、2.00gのK2HPO4、1.50gのMgSO47H2O、20gのグルコース、および5.00gの酵母抽出物BBL。Y.リポリティカY.lipolyticaの形質転換は、参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第2009-0093543-A1号明細書に記載されるように実施した。ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaの脂肪酸分析脂肪酸[FA]分析のために、Bligh,E.G.Dyer,W.J.Can.J.Biochem.Physiol.,37:911-9171959に記載されるようにして、細胞を遠心分離によって収集し脂質を抽出した。ナトリウムメトキシドによる脂質抽出物のエステル交換によって脂肪酸メチルエステル[FAME]を調製しRoughan,G.andNishidaI.,ArchBiochemBiophys.,2761:38-461990、引き続いて30m×0.25mmi.d.HP-INNOWAXHewlett-Packardカラムを装着した、Hewlett-Packard6890GCで分析した。オーブン温度は、170°C25分間の保持時間から3.5°C/分で185°Cにした。直接塩基エステル交換のために、ヤロウィアYarrowia細胞0.5mLの培養物を収集して蒸留水で1回洗浄し、Speed-Vac内で5~10分間真空乾燥させた。ナトリウムメトキシド100μlの1および既知量のC15:0トリアシルグリセロールC15:0TAG;カタログ番号T-145、Nu-CheckPrep,Elysian,MNをサンプルに添加し、次にサンプルをボルテックスして30°Cで50分間振盪した。3滴の1MNaClおよび400μLのヘキサンを添加した後、サンプルをボルテックスして遠沈した。上層を取り出して、GCによって分析した。代わりとして、発酵またはフラスコサンプルのいずれかからのブロスサンプルをルーチン分析するために、LipidAnalysis,WilliamW.Christie,2003に記載される塩基触媒エステル交換法の変法を使用した。具体的には、ブロスサンプルを室温水中で迅速に解凍し、次に0.22μmのCorning登録商標Costar登録商標Spin-X登録商標遠心管フィルターカタログ番号8161と共に、風袋を測定した2mL微量遠心管内に量り入れた0.1mg。あらかじめ測定したDCWに応じて、サンプル75~800μlを使用した。エッペンドルフ5430遠心分離機を使用して、サンプルを14,000rpmで5~7分間、またはブロスを除去するのに必要な時間遠心分離した。フィルターを取り出して液体を排出し、約500μlの脱イオン水をフィルターに添加してサンプルを洗浄した。遠心分離して水を除去した後、フィルターを再度取り出して、液体を排出してフィルターを再度挿入した。遠心管を遠心分離機に今度は蓋を開けたまま、約3~5分間再度挿入して乾燥させた。次にフィルターに遠心管の半ばまで切り込みを入れて、新鮮な2mL丸底エッペンドルフ管カタログ番号2236335-2に挿入した。切断されたフィルター容器の縁のみに接触し、サンプルまたはフィルター材料に接触しない適切な道具によって、フィルターを遠心管の底に押しつけた。既知量のトルエン中のC15:0TAG前出、および500μlの新鮮に調整されたメタノール溶液中の1ナトリウムメトキシドを添加した。サンプルペレットを適切な道具によってしっかりと砕き、遠心管を閉じて50°Cヒートブロックに30分間入れたVWRカタログ番号12621-088。次に遠心管を少なくとも5分間放冷した。次に400μlのヘキサンおよび500μlの1MNaCl水溶液を添加して、遠心管を2×6秒間ボルテックスして1分間遠心分離した。およそ150μlの上有機層をインサート付きGCバイアルに入れ、GCによって分析した。GC分析を通じて記録されたFAMEピークは、既知の脂肪酸との比較でそれらの滞留時間によって同定され、FAMEピーク面積を既知量の内部基準C15:0TAGと比較することで定量化された。したがってあらゆる脂肪酸FAME[μgFAME]の近似量μgは、式、特定脂肪酸のFAMEピーク面積/標準FAMEピーク面積標準C15:0TAGのμgに従って計算され、1μgのC15:0TAGは0.9503μgの脂肪酸に等しいので、あらゆる脂肪酸の量μg[μgFA]は、式、特定脂肪酸のFAMEピーク面積/標準FAMEピーク面積標準C15:0TAGのμg0.9503に従って計算される。換算係数0.9503は大部分の脂肪酸について測定された値の近似であり、それは0.95~0.96の範囲にわたることに留意されたい。TFAのwtとして個々の各脂肪酸量を要約する脂質プロフィールは、個々のFAMEピーク面積を全てのFAMEピーク面積の和で除して100を乗じて判定される。フラスコアッセイによるヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaの総脂質含量および組成の分析Y.リポリティカY.lipolyticaの特定株の総脂質含量および組成の詳細な分析のために、フラスコアッセイを次のように行った。具体的には、1ループ量の新鮮な画線塗抹細胞を3mLのFM培地に接種して、250rpmおよび30°Cで培一晩養した。OD600nmを測定し、最終OD600nmが0.3になるように、125mLフラスコ内の25mLFM培地に細胞のアリコートを添加した。250rpmおよび30°Cの振盪インキュベーターに2日間入れた後に、6mLの培養物を遠心分離によって収集し、125mLフラスコ内の25mLのHGMに再懸濁した。250rpmおよび30°Cの振盪インキュベーターに5日間入れた後に、脂肪酸分析前出のために1mLのアリコートを使用し、乾燥細胞重量[DCW]測定のために10mLを乾燥させた。DCW測定のために、BeckmanGS-6R遠心分離機内のBeckmanGH-3.8回転子内において、4000rpmで5分間の遠心分離によって10mLの培養物を収集した。ペレットを25mLの水に再懸濁して、上のように再収集した。洗浄ペレットを20mLの水に再懸濁し、あらかじめ秤量したアルミニウムパンに移した。細胞懸濁液を80°Cの真空オーブン内で一晩乾燥させた。細胞重量を測定した。細胞の総脂質含量[TFADCW]を計算し、各脂肪酸濃度をTFA[TFA]の重量として、EPA含量を乾燥細胞重量のパーセント[EPADCW]として表にするデータと併せて考察した。実施例1少なくとも約38.3のTFADCWで少なくとも約58.7のEPATFAを産生するヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaZ1978株の作成本実施例は、Δ9エロンガーゼ/Δ8デサチュラーゼ経路の発現を介して、38.3のTFADCWで約58.7のEPATFAを産生できる、ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaATCC20362に由来するZ1978株の構築を記載する。ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaY9502株の遺伝子型Y9502株の作成は、米国特許出願公開第2010-0317072-A1号明細書に記載される。ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaATCC20362に由来するY9502株は、Δ9エロンガーゼ/Δ8デサチュラーゼ経路の発現を通じて、総脂質に対して約57.0のEPAを産生できた図3A。野生型ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaATCC20362と比較したY9502株の最終遺伝子型は、次の通りであった。Ura,Pex3-,unknown1-,unknown2-,unknown3-,unknown4-,unknown5-,unknown6-,unknown7-,unknown8-,unknown9-,unknown10-,YAT1::ME3S::Pex16,GPD::ME3S::Pex20,YAT1::ME3S::Lip1,FBAINm::EgD9eS::Lip2,EXP1::EgD9eS::Lip1,GPAT::EgD9e::Lip2,YAT1::EgD9eS::Lip2,FBAINm::EgD8M::Pex20,EXP1::EgD8M::Pex16,FBAIN::EgD8M::Lip1,GPD::EaD8S::Pex162copies,YAT1::E389D9eS/EgD8M::Lip1,YAT1::EgD9eS/EgD8M::Aco,FBAINm::EaD9eS/EaD8S::Lip2,GPD::FmD12::Pex20,YAT1::FmD12::Oct,EXP1::FmD12S::Aco,GPDIN::FmD12::Pex16,EXP1::EgD5M::Pex16,FBAIN::EgD5SM::Pex20,GPDIN::EgD5SM::Aco,GPM::EgD5SM::Oct,EXP1::EgD5SM::Lip1,YAT1::EaD5SM::Oct,FBAINm::PaD17::Aco,EXP1::PaD17::Pex16,YAT1::PaD17S::Lip1,YAT1::YlCPT1::Aco,YAT1::MCS::Lip1,FBA::MCS::Lip1,YAT1::MaLPAAT1S::Pex16.略称は、次の通り。FmD12は、フザリウムモニリフォルメFusariummoniliformeΔ12デサチュラーゼ遺伝子[米国特許第7,504,259号明細書]であり;FmD12Sは、フザリウムモニリフォルメFusariummoniliforme[米国特許第7,504,259号明細書]に由来するコドン最適化Δ12デサチュラーゼ遺伝子であり;ME3Sは、モルティエラアルピナMortierellaalpina[米国特許第7,470,532号明細書]に由来するコドン最適化C16/18エロンガーゼ遺伝子であり;EgD9eは、ミドリムシEuglenagracilisΔ9エロンガーゼ遺伝子[米国特許第7,645,604号明細書]であり;EgD9eSは、ミドリムシEuglenagracilis[米国特許第7,645,604号明細書]に由来するコドン最適化Δ9エロンガーゼ遺伝子であり;EgD8Mは、ミドリムシEuglenagracilis[米国特許第7,256,033号明細書]に由来する合成変異Δ8デサチュラーゼ遺伝子[米国特許第7,709,239号明細書]であり;EaD8Sは、ユーグレナアナベナEuglenaanabaena[米国特許第7,790,156号明細書]に由来するコドン最適化Δ8デサチュラーゼ遺伝子であり;E389D9eS/EgD8Mは、ユートレプチエラ属EutreptiellaCCMP389種米国特許第7,645,604号明細書に由来するコドン最適化Δ9エロンガーゼ遺伝子E389D9eSと、Δ8デサチュラーゼEgD8M前出[米国特許出願公開第2008-0254191-A1号明細書]とを連結させて作成されたDGLAシンターゼであり;EgD9eS/EgD8Mは、Δ9エロンガーゼEgD9eS前出とΔ8デサチュラーゼEgD8M前出[米国特許出願公開第2008-0254191-A1号明細書]とを連結させて作成されたDGLAシンターゼであり;EaD9eS/EgD8Mは、ユーグレナアナベナEuglenaanabaena[米国特許第7,794,701号明細書]に由来するコドン最適化Δ9エロンガーゼ遺伝子EaD9eSと、Δ8デサチュラーゼEgD8M前出[米国特許出願公開第2008-0254191-A1号明細書]とを連結させて作成されたDGLAシンターゼであり;EgD5MおよびEgD5SMは、ミドリムシEuglenagracilis[米国特許第7,678,560号明細書]に由来する変異HPGs配列番号427モチーフ[米国特許出願公開第2010-0075386-A1号明細書]を含んでなる、合成変異Δ5デサチュラーゼ遺伝子であり;EaD5SMは、ユーグレナアナベナEuglenaanabaena[米国特許第7,943,365号明細書]に由来する変異HaGG配列番号428モチーフ[米国特許出願公開第2010-0075386-A1号明細書]を含んでなる、合成変異Δ5デサチュラーゼ遺伝子であり;PaD17は、ピシウムアファニデルマタムPythiumaphanidermatumΔ17デサチュラーゼ遺伝子[米国特許第7,556,949号明細書]であり;PaD17Sは、ピシウムアファニデルマタムPythiumaphanidermatum[米国特許第7,556,949号明細書]に由来するコドン最適化Δ17デサチュラーゼ遺伝子であり;YlCPT1は、ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ遺伝子[米国特許第7,932,077号明細書]であり;MCSは、リゾビウムレグミノサーラムRhizobiumleguminosarum次亜種ビシアエviciae3841[米国特許出願公開第2010-0159558-A1号明細書]に由来するコドン最適化マロニルCoAシンセターゼ遺伝子であり、MaLPAAT1Sは、モルティエラアルピナMortierellaalpina[米国特許第7,879,591号明細書]に由来するコドン最適化リゾホスファチジン酸アシル基転移酵素遺伝子である。Y9502株の総脂質含量および組成の詳細な分析のために、細胞を二段階で合計7日間培養するフラスコアッセイを実施した。分析に基づいて、Y9502株は、3.8g/LDCW、37.1TFADCW、21.3EPADCWを産生し、脂質プロフィールは、16:0パルミチン酸-2.5、16:1パルミトレイン酸-0.5、18:0ステアリン酸-2.9、18:1オレイン酸-5.0、18:2LA-12.7、ALA-0.9、EDA-3.5、DGLA-3.3、ARA-0.8、ETrA-0.7、ETA-2.4、EPA-57.0、その他-7.5であり、各脂肪酸濃度はTFAの重量[TFA]である。ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaY9502株からのZ1978株の作成Y9502株からのZ1978株の開発は図3Bに示され、参照によって本明細書に援用する、米国仮特許出願第61/377248号明細書および米国仮特許出願第61/428,277号明細書に記載される。特に、Y9502株中でUra3遺伝子を中断するために、SalI/PacI消化されたコンストラクトpZKUM図4A;配列番号82;参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第2009-0093543-A1号明細書の表15に記載されるを使用して、一般方法に従って、Ura3変異遺伝子をY9502株のUra3遺伝子に組み込んだ。合計27個の形質転換体第1群から選択された8個の形質転換体、第2群から選択された8個の形質転換体、および第3群から選択された11個の形質転換体を含んでなるを最少培地5-フルオロオロト酸[MM5-FOA]選択プレート上で培養して、30°Cに2~5日間保った。さらなる実験は、形質転換体の第3群のみが、真のUra-表現型を有すると判定した。Ura-細胞をMM5-FOAプレートから掻き取って、一般方法に従って脂肪酸分析を行った。このようにして、GC分析は、第3群のMM5-FOAプレート上で培養されたpZKUM-形質転換体1、3、6、7、8、10、および11中に、それぞれTFAの28.5、28.5、27.4、28.6、29.2、30.3、および29.6のEPAがあったことを示した。これらの7株をそれぞれ、Y9502U12株、Y9502U14株、Y9502U17株、Y9502U18株、Y9502U19株、Y9502U21株、およびY9502U22株と命名した集合的にY9502U。次に、コンストラクトpZKL3-9DP9N図4B;配列番号83を作成して、Y9502U株のヤロウィアYarrowiaYALI0F32131p遺伝子座GenBank受入番号XM_506121に、1つのΔ9デサチュラーゼ遺伝子、1つのコリンリン酸シチジリルトランスフェラーゼ遺伝子、および1つのΔ9エロンガーゼ変異遺伝子を組み込んだ。Δ9デサチュラーゼ変異遺伝子は、EgD9eS[配列番号3]と比較して、L35G変異を含有した参照によって本明細書に援用する米国仮特許出願第61/377248号明細書[代理人整理番号CL4783USPRV、2010年8月26日出願]に記載される;実施例10A-10Fもまた参照されたい。したがってpZKL3-9DP9Nプラスミドは、以下の構成要素を含有した。pZKL3-9DP9NプラスミドをAscI/SphIで消化し、次にY9502U17株の形質転換のために使用した。形質転換細胞を最少培地[MM]プレート上に播種して、30°Cに3~4日間保った。単一コロニーをMMプレート上に再度画線塗抹して、次に30°Cの液体MMに接種し、250rpm/分で2日間振盪した。細胞を遠心分離によって収集して高グルコース培地[HGM]に再懸濁し、次に250rpm/分で5日間振盪した。細胞に、前出の脂肪酸分析を行った。GC分析は、pZKL3-9DP9NがあるY9502U17の選択された96株の大部分が、TFAの50~56のEPAを産生したことを示した。TFAの約59.0、56.6、58.9、56.5、および57.6のEPAを産生した5株すなわち、31、32、35、70、および80をそれぞれ株Z1977、Z1978、Z1979、Z1980、およびZ1981と命名した。野生型ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaATCC20362と比較したこれらのpZKL3-9DP9N形質転換株の最終遺伝子型は、次の通りであった。Ura,Pex3-,unknown1-,unknown2-,unknown3-,unknown4-,unknown5-,unknown6-,unknown7-,unknown8-,unknown9-,unknown10-,unknown11-,YAT1::ME3S::Pex16,GPD::ME3S::Pex20,YAT1::ME3S::Lip1,FBAINm::EgD9eS::Lip2,EXP1::EgD9eS::Lip1,GPAT::EgD9e::Lip2,YAT1::EgD9eS::Lip2,YAT1::EgD9eS-L35G::Pex20,FBAINm::EgD8M::Pex20,EXP1::EgD8M::Pex16,FBAIN::EgD8M::Lip1,GPD::EaD8S::Pex162copies,YAT1::E389D9eS/EgD8M::Lip1,YAT1::EgD9eS/EgD8M::Aco,FBAINm::EaD9eS/EaD8S::Lip2,GPDIN::YlD9::Lip1,GPD::FmD12::Pex20,YAT1::FmD12::Oct,EXP1::FmD12S::Aco,GPDIN::FmD12::Pex16,EXP1::EgD5M::Pex16,FBAIN::EgD5SM::Pex20,GPDIN::EgD5SM::Aco,GPM::EgD5SM::Oct,EXP1::EgD5SM::Lip1,YAT1::EaD5SM::Oct,FBAINm::PaD17::Aco,EXP1::PaD17::Pex16,YAT1::PaD17S::Lip1,YAT1::YlCPT1::Aco,YAT1::MCS::Lip1,FBA::MCS::Lip1,YAT1::MaLPAAT1S::Pex16,EXP1::YlPCT::Pex16。Z1977、Z1978、Z1979、Z1980、およびZ1981株中のYALI0F32131p遺伝子座GenBank受入番号XM_50612のノックアウトは、pZKL3-9DP9Nでの形質転換によって生じたEPA株のいずれでも確認されなかった。Z1977株、Z1978株、Z1979株、Z1980株、およびZ1981株のYPDプレートからの細胞を培養し、総脂質含量と組成について分析した。具体的には、フラスコアッセイは、一般方法に記載されるようにして行われた。したがって好ましい実施形態の説明前出の記述内の表7は、フラスコアッセイによる測定で、Z1977株、Z1978株、Z1979株、Z1980株、およびZ1981株の全DCW、TFADCW、各脂肪酸濃度[TFA]、およびEPADCWを要約する。米国仮特許出願第61/377248号明細書代理人整理番号CL4783USPRV、2010年8月26日提出の提出に引き続いて、Z1978株に部分的ゲノム配列決定を行った。この研究は、米国仮特許出願第61/428,277号明細書代理人整理番号CL5267USPRV、2010年12月30日出願記載されるように、ヤロウィアYarrowiaゲノムに組み込まれた6つのΔ5デサチュラーゼ遺伝子の代わりに、遺伝子操作株が実際には4つのみを保有したと判定した。より具体的には、下でさらに記述されるように、2つの別個のプラスミド断片またはその部分は、Z1978株中に検出されなかった。1コンストラクトpZKL2-5mB89C米国特許出願公開第2010-0317072-A1号明細書の配列番号131参照は、1つのΔ5デサチュラーゼ遺伝子をY8069U株のLip2遺伝子座に組み込み、それによってより高いEPA産生を可能にすることが意図された。しかしゲノムの配列決定は、pZKL2-5mB89C断片のLip2.3N末端部分、およびGPDIN::EgD5SM::Acoキメラ遺伝子を検出できなかった。DNA再配置は、Y8154株作成中に、GPDIN::EgD5SM::Acoカセットの喪失をもたらした可能性がある図3A。2コンストラクトpZKL1-2SR9G85米国特許出願公開第2010-0317072-A1号明細書の配列番号132参照は、1つのΔ5デサチュラーゼ遺伝子をY8154U1株のLip1遺伝子座に組み込むことが意図された。しかしゲノム配列決定またはPCR増幅のどちらも、Z1978株中のΔ5デサチュラーゼ遺伝子を検出できなかった。DNA再配置は、Y8269株作成中に、GPM::EgD5SM::Octカセットの喪失をもたらした可能性がある図3A。さらにコンストラクトpZSCP-Ma83米国特許出願公開第2010-0317072-A1号明細書の中の配列番号133参照、およびコンストラクトpZP2-85m98F米国特許出願公開第2010-0317072-A1号明細書中の配列番号135参照が、どちらもYALI0B21890g遺伝子座に組み込まれたと判定された。したがって野生型ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaATCC20362と比較した、Z1978株の最終遺伝子型は、次の通りであった。Ura,Pex3-,unknown1-,unknown2-,unknown3-,unknown4-,YALI0E12947g-,unknown6-,YALI0B21890g-,unknown8-,unknown10-,unknown11-,YAT1::ME3S::Pex16,GPD::ME3S::Pex20,YAT1::ME3S::Lip1,FBAINm::EgD9eS::Lip2,EXP1::EgD9eS::Lip1,GPAT::EgD9e::Lip2,YAT1::EgD9eS::Lip2,YAT1::EgD9eS-L35G::Pex20,FBAINm::EgD8M::Pex20,EXP1::EgD8M::Pex16,FBAIN::EgD8M::Lip1,GPD::EaD8S::Pex162コピー,YAT1::E389D9eS/EgD8M::Lip1,YAT1::EgD9eS/EgD8M::Aco,FBAINm::EaD9eS/EaD8S::Lip2,GPDIN::YlD9::Lip1,GPD::FmD12::Pex20,YAT1::FmD12::Oct,EXP1::FmD12S::Aco,GPDIN::FmD12::Pex16,EXP1::EgD5M::Pex16,FBAIN::EgD5SM::Pex20,EXP1::EgD5SM::Lip1,YAT1::EaD5SM::Oct,FBAINm::PaD17::Aco,EXP1::PaD17::Pex16,YAT1::PaD17S::Lip1,YAT1::YlCPT1::Aco,YAT1::MCS::Lip1,FBA::MCS::Lip1,YAT1::MaLPAAT1S::Pex16,EXP1::YlPCT::Pex16。ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaY9502株およびZ1978株の比較Z1978株中で発現される異種遺伝子は、1つのΔ9デサチュラーゼ遺伝子、1つのコリンリン酸シチジリルトランスフェラーゼ遺伝子、および1つのΔ9エロンガーゼ変異体の追加的発現のみによって、Y9502株中で発現されるものと異なるすなわち配列番号43および44に記載のEgD9eS-L35G。LAおよびALAからEPAへの全Δ9エロンガーゼ変換効率[変換]は、表9でY9502株およびZ1978株について、次式によって計算された。[生成物]/[基質生成物]100式中、生成物は、EDATFA、ETrATFA、DGLATFA、ETATFA、ARATFA、およびEPATFAの合計であり、基質は、LATFA、ALATFA、EDATFA、ETrATFA、DGLATFA、ETATFA、ARATFA、およびEPATFAの合計であった。上で示されるように、全Δ9エロンガーゼ変換効率がY9502株で83.3と判定された一方、Z1978株では効率が改善されたすなわち85.3。実施例2少なくとも約57.1のTFADCWで少なくとも約45.2のEPATFAを産生するヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaL258株の作成本実施例は、Δ9エロンガーゼ/Δ8デサチュラーゼ経路の発現を介して、57.1のTFADCWで、約45.2のEPATFAを産生できる、ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaZ1978株実施例1に由来するL258株の構築を記載する。中間株Z1978U、L250、およびL250Uの構築に必要なL258株図3Bの構築Z1978UUra3-株の作成Ura3遺伝子を中断するために、Y9502株のpZKUM形質転換について記載される実施例1のと同様の方法で、コンストラクトpZKUM図4A;配列番号82;米国特許出願公開第2009-0093543-A1号明細書の表15に記載されるを使用して、Z1978株のUra3遺伝子にUra3変異遺伝子を組み込んだ。合計16個の形質転換体第1のB群から選択された8個の形質転換体、および第2のC群から選択された8個の形質転換体を含んでなるが培養され、Ura-表現型を有すると同定された。GC分析は、MM5-FOAプレート上で培養されたB群pZKUM-形質転換株1、2、3、および4中で、それぞれTFAの30.8、31、30.9、および31.3のEPAの存在を示した。これらの4株をそれぞれZ1978BU1株、Z1978BU2株、Z1978BU3株、およびZ1978BU4株と命名した。GC分析は、MM5-FOAプレート上で培養された、C群pZKUM-形質転換株1、2、5、および6中にそれぞれTFAの34.4、31.9、31.2、および31のEPAの存在を示した。これらの4株をそれぞれZ1978CU1株、Z1978CU2株、Z1978CU3株、およびZ1978CU4株と命名した。株Z1978BU1、Z1978BU2株、Z1978BU3株、Z1978BU4株、Z1978CU1株、Z1978CU2株、Z1978CU3株、およびZ1978CU4株は、Z1978U株と集合的に命名された。ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaL250株の作成コンストラクトpY187図5A;配列番号84を作成して、Z1978U株のゲノムに、1つのリゾホスファチジン酸アシル基転移酵素遺伝子[LPAAT]および1つのリン脂質:ジアシルグリセロールアシル基転移酵素遺伝子[PDAT]を組み込んだ。pY187プラスミドは、以下の構成要素を含有した。pY187プラスミドをSwaI/ApaIで消化し、6.7kBの大型の断片をアガロースゲルから精製して、次に一般方法に従って、Z1978CU4株の形質転換のために使用した。形質転換細胞をMMプレート上に播種して、30°Cに5日間保った。次に単一コロニー19をMMプレート上に再度画線塗抹した。一般方法に従ってフラスコアッセイによって、これらの株の総脂質含量と脂肪酸組成を評価した。分析に基づいて、L250株は、4.4g/LのDCW、51.5のTFADCW、および26のEPADCWを産生した。脂質プロフィールは、16:0パルミチン酸-2.0、16:1パルミトレイン酸-0.7、18:0ステアリン酸-2.8、18:1オレイン酸-6.1、18:2LA-16.7、ALA-0.9、EDA-3.3、DGLA-4.9、ARA-0.7、ETrA-0.6、ETA-3.2、EPA-50.4、およびその他-7.4であり、各脂肪酸濃度はTFAの重量[TFA]である前出の好ましい実施形態の説明の記述内の表7もまた参照されたい。L250UUra3-株の作成Ura3遺伝子を中断するために、Y9502株のpZKUM形質転換について記載される実施例1のと同様の方法で、コンストラクトpZKUM図4A;配列番号82;米国特許出願公開第2009-0093543-A1号明細書の表15に記載されるを使用して、L250株のUra3遺伝子にUra3変異遺伝子を組み込んだ。合計12個の5-FOA耐性コロニーが培養され、Ura-表現型を有すると同定された。株2および株3をそれぞれ、L250U2およびL250U3と命名した集合的にL250U株。ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaL258株の作成プラスミドpY187表10;配列番号84を使用して、L250U株のヤロウィア属Yarrowiaゲノムに、YlLPAAT遺伝子配列番号21およびYlPDAT遺伝子配列番号28の追加的なコピーを組み込んだ。一般方法に従って、プラスミドpY187の6.7kBの精製大型断片をL250U2株の形質転換のために使用した。形質転換細胞をMMプレート上に播種して、30°Cに5日間保った。次に単一コロニーをMMプレート上に再度画線塗抹した。一般方法に従って、フラスコアッセイによって、細胞総脂質含量および組成を評価した。分析に基づいて、L258株は、5.0g/LのDCW、57.1のTFADCW、および25.8のEPADCWを産生した。脂質プロフィールは、16:0パルミチン酸-2.3、16:1パルミトレイン酸-0.9、18:0ステアリン酸-3.4、18:1オレイン酸-7.8、18:2LA-18.7、ALA-0.9、EDA-4.0、DGLA-5.3、ARA-0.8、ETrA-0.6、ETA-3.2、EPA-45.2、およびその他-6.6であり、各脂肪酸濃度はTFAの重量[TFA]である前出の好ましい実施形態の説明の記述内の表7もまた参照されたい。野生型Y.リポリティカY.lipolyticaATCC20362と比較した、L258株の最終遺伝子型は、次の通りであった。Ura,Pex3-,unknown1-,unknown2-,unknown3-,unknown4-,YALI0E12947g-,unknown6-,YALI0B21890g-,unknown8-,unknown10-,unknown11-,unknown12-,unknown13-,YAT1::ME3S::Pex16,GPD::ME3S::Pex20,YAT1::ME3S::Lip1,FBAINm::EgD9eS::Lip2,EXP1::EgD9eS::Lip1,GPAT::EgD9e::Lip2,YAT1::EgD9eS::Lip2,YAT1::EgD9eS-L35G::Pex20,FBAINm::EgD8M::Pex20,EXP1::EgD8M::Pex16,FBAIN::EgD8M::Lip1,GPD::EaD8S::Pex162コピー,YAT1::E389D9eS/EgD8M::Lip1,YAT1::EgD9eS/EgD8M::Aco,FBAINm::EaD9eS/EaD8S::Lip2,GPDIN::YlD9::Lip1,GPD::FmD12::Pex20,YAT1::FmD12::Oct,EXP1::FmD12S::Aco,GPDIN::FmD12::Pex16,EXP1::EgD5M::Pex16,FBAIN::EgD5SM::Pex20,EXP1::EgD5SM::Lip1,YAT1::EaD5SM::Oct,FBAINm::PaD17::Aco,EXP1::PaD17::Pex16,YAT1::PaD17S::Lip1,YAT1::YlCPT1::Aco,YAT1::MCS::Lip1,FBA::MCS::Lip1,EXP1::YlPCT::Pex16,YAT1::MaLPAAT1S::Pex16,FBAINm::YlLPAAT1::Lip12コピー,YAT1::YlPDAT::Lip12コピー。実施例3少なくとも約53のTFADCWで少なくとも約47のEPATFAを産生するヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaZ5565株、Z5567株、Z5575株、およびZ5576株の作成本実施例は、Δ9エロンガーゼ/Δ8デサチュラーゼ経路の発現を介して、DCWの53を超えるTFAで、約47のEPATFAを産生できる、ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaL258株実施例2に由来するZ5565株、Z5567株、Z5575株、およびZ5576株の構築を記載する。中間株L258Uの構築に必要なZ5565株、Z5567株、Z5575株、およびZ5576株図3Bの開発L258UUra3-株の作成Ura3遺伝子を中断するために、Y9502株のpZKUM形質転換について記載される実施例1のと同様の方法で、コンストラクトpZKUM図4A;配列番号82;米国特許出願公開第2009-0093543-A1号明細書の表15に記載されるを使用して、L258株のUra3遺伝子にUra3変異遺伝子を組み込んだ。合計20個の形質転換体が培養され、Ura-表現型を有すると同定された。GC分析は、MM5-FOAプレート上で培養されたpZKUM-形質転換株7および9中に、それぞれ37.6および37.2EPAの存在を示した。これらの2株をそれぞれ、L258U5およびL258U6と命名し、集合的にL258U株と命名した。ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaZ5565株、Z5567株、Z5575株、およびZ5576株の作成コンストラクトpZK16-ML8N図5B;配列番号85は、米国特許出願公開第2010-0317072-A1号明細書の表15に記載される。それは、ヤロウィアYarrowiaYALI0B14795p遺伝子座GenBank受入番号XM_500900に、キメラYAT1::EgD8M::Pex20遺伝子内の1つのΔ8デサチュラーゼ、キメラFBA::MCS::Lip1遺伝子内の1つのマロニルCoAシンセターゼ、およびキメラYAT1::MaLPAAT1S::Pex16遺伝子内の1つのリゾホスファチジン酸アシル基転移酵素を組み込むために作成された。一般方法に従って、pZK16-ML8NプラスミドをAscI/SphIで消化し、次にL258U5株およびL258U6株の形質転換のために使用した。形質転換細胞をMMプレート上に播種して、30°Cに5~6日間保った。単一コロニーをMMプレート上に再度画線塗抹して、次に30°Cの液体MMに接種し、250rpm/分で2日間振盪した。細胞を遠心分離によって収集してHGMに再懸濁し、次に250rpm/分で5日間振盪した。一般方法に従って、細胞に脂肪酸分析を行った。GC分析は、pZK16-ML8Nがある選択された48のL258U5株の内7株が、TFAの48を超えるEPAを産生したことを示した。TFAの約49.7および50.9のEPAを産生した2株すなわち3および36をそれぞれZ5565およびZ5567と命名した。GC分析は、pZK16-ML8Nがある選択された48のL258U6株のほとんどが、TFAの49を超えるEPAを産生したことを示した。TFAの約53.7および50.2のEPAを産生した2株すなわち2および5をそれぞれZ5575およびZ5576と命名した。野生型ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaATCC20362と比較した、これらのpZK16-ML8N形質転換株の最終遺伝子型は、次の通りであった。Ura,Pex3-,unknown1-,unknown2-,unknown3-,unknown4-,YALI0E12947g-,unknown6-,YALI0B21890g-,unknown8-,unknown10-,unknown11-,unknown12-,unknown13-,unknown14-,YAT1::ME3S::Pex16,GPD::ME3S::Pex20,YAT1::ME3S::Lip1,FBAINm::EgD9eS::Lip2,EXP1::EgD9eS::Lip1,GPAT::EgD9e::Lip2,YAT1::EgD9eS::Lip2,YAT1::EgD9eS-L35G::Pex20,FBAINm::EgD8M::Pex20,EXP1::EgD8M::Pex16,FBAIN::EgD8M::Lip1,YAT1::EgD8M::Pex20,GPD::EaD8S::Pex162コピー,YAT1::E389D9eS/EgD8M::Lip1,YAT1::EgD9eS/EgD8M::Aco,FBAINm::EaD9eS/EaD8S::Lip2,GPDIN::YlD9::Lip1,GPD::FmD12::Pex20,YAT1::FmD12::Oct,EXP1::FmD12S::Aco,GPDIN::FmD12::Pex16,EXP1::EgD5M::Pex16,FBAIN::EgD5SM::Pex20,EXP1::EgD5SM::Lip1,YAT1::EaD5SM::Oct,FBAINm::PaD17::Aco,EXP1::PaD17::Pex16,YAT1::PaD17S::Lip1,YAT1::YlCPT1::Aco,YAT1::MCS::Lip1,FBA::MCS::Lip12コピー,EXP1::YlPCT::Pex16,YAT1::MaLPAAT1S::Pex162コピー,FBAINm::YlLPAAT1::Lip12コピー,YAT1::YlPDAT::Lip12コピー。pZK16-ML8Nによる形質転換で生じたEPA株のいずれにおいても、Z5565株、Z5567株、Z5575株、およびZ5576株のYALI0B14795p遺伝子座GenBank受入番号XM_500900のノックアウトは確認されなかった。フラスコアッセイによる総脂質含量および組成の分析一般方法に従って、Z5565株、Z5567株、Z5575株、およびZ5576株のYPDプレートからの細胞を培養し、総脂質含量および組成について分析した。好ましい実施形態の説明前出内の表7の記述は、Z5565株、Z5567株、Z5575株、およびZ5576株の総DCW、TFADCW、TFAの重量[TFA]としての各脂肪酸濃度、およびEPADCWを要約する。平均DCWは4.8g/Lであり、平均TFADCWは55.4であり、平均EPATFAは48.3であり、平均EPADCWは26.75であった。実施例4少なくとも約51のTFADCWで少なくとも約49のEPATFAを産生するヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaZ5620株、Z5623株、およびZ5625株の作成本実施例は、Δ9エロンガーゼ/Δ8デサチュラーゼ経路の発現を介して、DCWの51を超えるTFAで、約49のEPATFAを産生できる、ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaL258U株実施例3に由来するZ5620株、Z5623株、およびZ5625株の構築を記載する。コンストラクトpZK16-MyL8Nを作成して、L258U株のヤロウィアYarrowiaYALI0B14795p遺伝子座GenBank受入番号XM_500900に、1つのΔ8デサチュラーゼ遺伝子、1つのマロニルCoAシンセターゼ遺伝子、および1つのリゾホスファチジン酸アシル基転移酵素遺伝子を組み込んだ。より具体的には、ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaLPAAT遺伝子YlLPAAT;配列番号21およびLip1ターミネーターが、Y.リポリティカY.lipolytica中での発現のためにコドン最適化されたモルティエラアルピナMortierellaalpinaLPAAT遺伝子MaLPAAT1S;配列番号19およびPex16ターミネーターを置き換えていることを除いては、コンストラクトpZK16-MyL8N図6A;配列番号86は、pZK16-ML8N図5B;配列番号85;実施例3と同一であった。pZK16-MyL8Nプラスミドは、以下の構成要素を含有した。一般方法に従って、pZK16-MyL8NプラスミドをAscI/SphIで消化し、次にL258U6株の形質転換のために使用した。形質転換体細胞をMMプレート上に播種して、30°Cに5~6日間保った。単一コロニーをMMプレート上に再度画線塗抹して、次に30°Cの液体MMに接種し、250rpm/分で2日間振盪した。細胞を遠心分離によって収集してHGMに再懸濁し、次に250rpm/分で5日間振盪した。上の一般方法に記載されるようにして、細胞を脂肪酸分析した。GC分析は、pZK16-MyL8Nで形質転換された選択された48のL258U6株のほぼ全てが、TFAの49を超えるEPAを産生したことを示した。TFAの約52.8、53.0、および49.9のEPAを産生した3株すなわち、5、21、および48をそれぞれZ5620、Z5623、およびZ5625と命名した。野生型ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaATCC20362と比較した、これらのpZK16-MyL8N形質転換株の最終遺伝子型は、次の通りであった。Ura,Pex3-,unknown1-,unknown2-,unknown3-,unknown4-,YALI0E12947g-,unknown6-,YALI0B21890g-,unknown8-,unknown10-,unknown11-,unknown12-,unknown13-,unknown14-,YAT1::ME3S::Pex16,GPD::ME3S::Pex20,YAT1::ME3S::Lip1,FBAINm::EgD9eS::Lip2,EXP1::EgD9eS::Lip1,GPAT::EgD9e::Lip2,YAT1::EgD9eS::Lip2,YAT1::EgD9eS-L35G::Pex20,FBAINm::EgD8M::Pex20,EXP1::EgD8M::Pex16,FBAIN::EgD8M::Lip1,YAT1::EgD8M::Pex20,GPD::EaD8S::Pex162コピー,YAT1::E389D9eS/EgD8M::Lip1,YAT1::EgD9eS/EgD8M::Aco,FBAINm::EaD9eS/EaD8S::Lip2,GPDIN::YlD9::Lip1,GPD::FmD12::Pex20,YAT1::FmD12::Oct,EXP1::FmD12S::Aco,GPDIN::FmD12::Pex16,EXP1::EgD5M::Pex16,FBAIN::EgD5SM::Pex20,EXP1::EgD5SM::Lip1,YAT1::EaD5SM::Oct,FBAINm::PaD17::Aco,EXP1::PaD17::Pex16,YAT1::PaD17S::Lip1,YAT1::YlCPT1::Aco,YAT1::MCS::Lip1,FBA::MCS::Lip12コピー,EXP1::YlPCT::Pex16,YAT1::MaLPAAT1S::Pex16,YAT1::YlLPAAT::Lip1,FBAINm::YlLPAAT1::Lip12コピー,YAT1::YlPDAT::Lip12コピー。pZK16-MyL8Nによる形質転換で生じたEPA株のいずれにおいても、Z5620株、Z5623株、およびZ5625株のYALI0B14795p遺伝子座GenBank受入番号XM_500900のノックアウトは確認されなかった。フラスコアッセイによる総脂質含量および組成の分析一般方法に従って、Z5620株、Z5623株、およびZ5625株のYPDプレートからの細胞を培養し、総脂質含量および組成について分析した。好ましい実施形態の説明前出内の表7の記述は、Z5620株、Z5623株、およびZ5625株の総DCW、TFADCW、TFAの重量[TFA]としての各脂肪酸濃度、およびEPADCWを要約する。平均DCWは4.5g/Lであり、平均TFADCWは52.4であり、平均EPATFAは48.4であり、平均EPADCWは25.9であった。実施例5少なくとも約55のTFADCWで少なくとも約48のEPATFAを産生するヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaZ5581株、Z5582株、Z5583株、およびZ5584株の作成本実施例は、Δ9エロンガーゼ/Δ8デサチュラーゼ経路の発現を介して、DCWの55を超えるTFAで、約48EPATFAを産生できる、ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaL258U株実施例3に由来するZ5581株、Z5582株、Z5583株、およびZ5584株の構築を記載する。コンストラクトpZK16-ML3図6B、配列番号89を作成して、L258U株のヤロウィアYarrowiaYALI0B14795p遺伝子座GenBank受入番号XM_500900に、1つのマロニルCoAシンセターゼ遺伝子、および1つのリゾホスファチジン酸アシル基転移酵素遺伝子、および1つのC16/18エロンガーゼ遺伝子を組み込んだ。pZK16-ML3プラスミドは、以下の構成要素を含有した。一般方法に従って、pZK16-ML3プラスミドをAscI/SphIで消化し、次にL258U5株の形質転換のために使用した。形質転換体細胞をMMプレート上に播種して、30°Cに4~5日間保った。単一コロニーをMMプレート上に再度画線塗抹して、次に30°Cの液体MMに接種し、250rpm/分で2日間振盪した。細胞を遠心分離によって収集してHGMに再懸濁し、次に250rpm/分で5日間振盪した。一般方法に従って、細胞に脂肪酸分析を行った。GC分析は、pZK16-ML3で形質転換された選択された48のL258U5株の内19株が、TFAの50を超えるEPAを産生したことを示した。TFAの約50.9、52.4、51.5、および51.7のEPAを産生した4株すなわち、16、42、46、および47をそれぞれZ5581、Z5582、Z5583、およびZ5584と命名した。野生型ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaATCC20362と比較した、これらのpZK16-ML3形質転換株の最終遺伝子型は、次の通りであった。Ura,Pex3-,unknown1-,unknown2-,unknown3-,unknown4-,YALI0E12947g-,unknown6-,YALI0B21890g-,unknown8-,unknown10-,unknown11-,unknown12-,unknown13-,unknown14-,YAT1::ME3S::Pex16,GPD::ME3S::Pex20,YAT1::ME3S::Lip1,GPAT::ME3S::Pex20,FBAINm::EgD9eS::Lip2,EXP1::EgD9eS::Lip1,GPAT::EgD9e::Lip2,YAT1::EgD9eS::Lip2,YAT1::EgD9eS-L35G::Pex20,FBAINm::EgD8M::Pex20,EXP1::EgD8M::Pex16,FBAIN::EgD8M::Lip1,GPD::EaD8S::Pex162コピー,YAT1::E389D9eS/EgD8M::Lip1,YAT1::EgD9eS/EgD8M::Aco,FBAINm::EaD9eS/EaD8S::Lip2,GPDIN::YlD9::Lip1,GPD::FmD12::Pex20,YAT1::FmD12::Oct,EXP1::FmD12S::Aco,GPDIN::FmD12::Pex16,EXP1::EgD5M::Pex16,FBAIN::EgD5SM::Pex20,EXP1::EgD5SM::Lip1,YAT1::EaD5SM::Oct,FBAINm::PaD17::Aco,EXP1::PaD17::Pex16,YAT1::PaD17S::Lip1,YAT1::YlCPT1::Aco,YAT1::MCS::Lip1,FBA::MCS::Lip12コピー,EXP1::YlPCT::Pex16,YAT1::MaLPAAT1S::Pex162コピー,FBAINm::YlLPAAT1::Lip12コピー,YAT1::YlPDAT::Lip12コピー。pZK16-ML3による形質転換で生じたEPA株のいずれにおいても、Z5581株、Z5582株、Z5583株、およびZ5584株のYALI0B14795遺伝子座GenBank受入番号XM_500900のノックアウトは確認されなかった。フラスコアッセイによる総脂質含量および組成の分析一般方法に従って、Z5581株、Z5582株、Z5583株、およびZ5584株のYPDプレートからの細胞を培養し、総脂質含量および組成について分析した。好ましい実施形態の説明前出内の表7の記述は、Z5581株、Z5582株、Z5583株、およびZ5584株の総DCW、TFADCW、TFAの重量[TFA]としての各脂肪酸濃度、およびEPADCWを要約する。平均DCWは4.8g/Lであり、平均TFADCWは56であり、平均EPATFAは48.65であり、平均EPADCWは27.2であった。実施例6少なくとも約54のTFADCWで少なくとも約48のEPATFAを産生するヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaZ5570株、Z5571株、Z5572株、およびZ5574株の作成本実施例は、Δ9エロンガーゼ/Δ8デサチュラーゼ経路の発現を介して、DCWの54を超えるTFAで、約48EPATFAを産生できる、ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaL258U株実施例3に由来するZ5570株、Z5571株、Z5572株、およびZ5574株の構築を記載する。コンストラクトpZKMP-ML9DP図7A、配列番号92を作成して、L258U株のヤロウィア属YarrowiaYALI0F02211g遺伝子座GenBank受入番号XP_504895に、1つのリゾホスファチジン酸アシル基転移酵素遺伝子、1つのΔ9デサチュラーゼ遺伝子、および1つのコリンリン酸シチジリルトランスフェラーゼ遺伝子を組み込んだ。pZKMP-ML9DPプラスミドは、以下の構成要素を含有した。一般方法に従って、pZKMP-ML9DPプラスミドをAscI/SphIで消化し、次にL258U5株の形質転換のために使用した。形質転換細胞をMMプレート上に播種して、30°Cに5日間保った。単一コロニーをMMプレート上に再度画線塗抹して、次に30°Cの液体MMに接種し、250rpm/分で2日間振盪した。細胞を遠心分離によって収集してHGMに再懸濁し、次に250rpm/分で5日間振盪した。一般方法に従って、細胞に脂肪酸分析を行った。GC分析は、pZKMP-ML9DPで形質転換された選択された48のL258U5株の内22株が、TFAの50を超えるEPAを産生したことを示した。TFAの約53.5、51.8,52.9、および51.8のEPAを産生した4株すなわち、17、25、40、および46をそれぞれZ5570、Z5571、Z5572、およびZ5574と命名した。野生型ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaATCC20362と比較した、これらのpZKMP-ML9DP形質転換株の最終遺伝子型は、次の通りであった。Ura,Pex3-,unknown1-,unknown2-,unknown3-,unknown4-,YALI0E12947g-,unknown6-,YALI0B21890g-,unknown8-,unknown10-,unknown11-,unknown12-,unknown13-,unknown14-,YAT1::ME3S::Pex16,GPD::ME3S::Pex20,YAT1::ME3S::Lip1,FBAINm::EgD9eS::Lip2,EXP1::EgD9eS::Lip1,GPAT::EgD9e::Lip2,YAT1::EgD9eS::Lip2,YAT1::EgD9eS-L35G::Pex20,FBAINm::EgD8M::Pex20,EXP1::EgD8M::Pex16,FBAIN::EgD8M::Lip1,GPD::EaD8S::Pex162コピー,YAT1::E389D9eS/EgD8M::Lip1,YAT1::EgD9eS/EgD8M::Aco,FBAINm::EaD9eS/EaD8S::Lip2,DGAT2M::YlD9::Lip1,GPDIN::YlD9::Lip1,GPD::FmD12::Pex20,YAT1::FmD12::Oct,EXP1::FmD12S::Aco,GPDIN::FmD12::Pex16,EXP1::EgD5M::Pex16,FBAIN::EgD5SM::Pex20,EXP1::EgD5SM::Lip1,YAT1::EaD5SM::Oct,FBAINm::PaD17::Aco,EXP1::PaD17::Pex16,YAT1::PaD17S::Lip1,YAT1::YlCPT1::Aco,YAT1::MCS::Lip1,FBA::MCS::Lip1,EXP1::YlPCT::Pex162コピー,YAT1::MaLPAAT1S::Pex16,ALK2LM1::MaLPAAT1S::Pex20,FBAINm::YlLPAAT1::Lip12コピー,YAT1::YlPDAT::Lip12コピー。pZKMP-ML9DPによる形質転換で生じたEPA株のいずれにおいても、Z5570株、Z5571株、Z5572株、およびZ5574株のYALI0F02211g遺伝子座GenBank受入番号XP_504895のノックアウトは確認されなかった。フラスコアッセイによる総脂質含量および組成の分析一般方法に従って、Z5570株、Z5571株、Z5572株、およびZ5574株のYPDプレートからの細胞を培養し、総脂質含量および組成について分析した。好ましい実施形態の説明前出内の表7の記述は、Z5570株、Z5571株、Z5572株、およびZ5574株の総DCW、TFADCW、TFAの重量[TFA]としての各脂肪酸濃度、およびEPADCWを要約する。平均DCWは4.9g/Lであり、平均TFADCWは54.2であり、平均EPATFAは48.9であり、平均EPADCWは26.55であった。実施例7少なくとも約52のTFADCWで少なくとも約49のEPATFAを産生するヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaZ5585株およびZ5627株の作成本実施例は、Δ9エロンガーゼ/Δ8デサチュラーゼ経路の発現を介して、DCWの52を超えるTFAで、約49EPATFAを産生できる、ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaL258U株実施例3に由来するZ5585株およびZ5627株の構築を記載する。コンストラクトpZKMP-ML9DCB図7B、配列番号95を作成して、L258U株のヤロウィアYarrowiaYALI0F02211g遺伝子座GenBank受入番号XP_504895に、1つのリゾホスファチジン酸アシル基転移酵素遺伝子、1つのΔ9デサチュラーゼ遺伝子、および1つのジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を組み込んだ。pZKMP-ML9DCBプラスミドは、以下の構成要素を含有した。一般方法に従って、pZKMP-ML9DCBプラスミドをAscI/SphIで消化し、次にL258U5株およびL258U6株の形質転換のために使用した。形質転換体細胞をMMプレート上に播種して、30°Cに5~6日間保った。単一コロニーをMMプレート上に再度画線塗抹して、次に30°Cの液体MMに接種し、250rpm/分で2日間振盪した。細胞を遠心分離によって収集してHGMに再懸濁し、次に250rpm/分で5日間振盪した。一般方法に従って、細胞に脂肪酸分析を行った。GC分析は、pZKM-ML9DCBで形質転換された選択された50のL258U5株の内21株が、TFAの50を超えるEPAを産生したことを示した。TFAの約52.3および51.9のEPAを産生した2株すなわち1および1BをそれぞれZ5585およびZ5627と命名した。野生型ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaATCC20362と比較した、これらのpZKMP-ML9DCB形質転換株の最終遺伝子型は、次の通りであった。Ura,Pex3-,unknown1-,unknown2-,unknown3-,unknown4-,YALI0E12947g-,unknown6-,YALI0B21890g-,unknown8-,unknown10-,unknown11-,unknown12-,unknown13-,unknown14-,YAT1::ME3S::Pex16,GPD::ME3S::Pex20,YAT1::ME3S::Lip1,FBAINm::EgD9eS::Lip2,EXP1::EgD9eS::Lip1,GPAT::EgD9e::Lip2,YAT1::EgD9eS::Lip2,YAT1::EgD9eS-L35G::Pex20,FBAINm::EgD8M::Pex20,EXP1::EgD8M::Pex16,FBAIN::EgD8M::Lip1,GPD::EaD8S::Pex162コピー,YAT1::E389D9eS/EgD8M::Lip1,YAT1::EgD9eS/EgD8M::Aco,FBAINm::EaD9eS/EaD8S::Lip2,DGAT2M::YlD9::Lip1,GPDIN::YlD9::Lip1,GPD::FmD12::Pex20,YAT1::FmD12::Oct,EXP1::FmD12S::Aco,GPDIN::FmD12::Pex16,EXP1::EgD5M::Pex16,FBAIN::EgD5SM::Pex20,EXP1::EgD5SM::Lip1,YAT1::EaD5SM::Oct,FBAINm::PaD17::Aco,EXP1::PaD17::Pex16,YAT1::PaD17S::Lip1,YAT1::YlCPT1::Aco,EXP1::YlCPT1::OCT,YAT1::MCS::Lip1,FBA::MCS::Lip1,EXP1::YlPCT::Pex16,YAT1::MaLPAAT1S::Pex16,ALK2LM1::MaLPAAT1S::Pex20,FBAINm::YlLPAAT1::Lip12コピー,YAT1::YlPDAT::Lip12コピー。pZKMP-ML9DCBによる形質転換で生じたEPA株のいずれにおいても、Z5585株およびZ5627株のYALI0F02211g遺伝子座GenBank受入番号XP_504895のノックアウトは確認されなかった。フラスコアッセイによる総脂質含量および組成の分析一般方法に従って、Z5585株およびZ5627株のYPDプレートからの細胞を培養し、総脂質含量および組成について分析した。好ましい実施形態の説明前出内の表7の記述は、Z5585株およびZ5627株の総DCW、TFADCW、TFAの重量[TFA]としての各脂肪酸濃度、およびEPADCWを要約する。平均DCWは4.7g/Lであり、平均TFADCWは54.3であり、平均EPATFAは49.4であり、平均EPADCWは26.8であった。実施例8少なくとも約45のTFADCWで少なくとも約36のETATFAを産生するヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaYOS9607株およびYOS9608株の作成本実施例は、フラスコアッセイにおいて、DCWの45を超えるTFAで、TFAの36を超えるETAを産生できる、ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaZ5567株実施例3に由来するYOS9607株およびYOS9608株の構築を記載する。Z5567株中の元の4つのΔ5デサチュラーゼ遺伝子を欠失させてYOS9607株およびYOS9608株を得て、EPAの産生なしにETAを産生できるようにした。中間体Z5567U株、YOS9601株、およびYOS9602株図9の構築に必要なYOS9607株およびYOS9608株の開発Z5567UUra3-株の作成Ura3遺伝子を中断するために、Y9502株のpZKUM形質転換について記載される実施例1のと同様の方法で、コンストラクトpZKUM図4A;配列番号82;米国特許出願公開第2009-0093543-A1号明細書の表15に記載されるを使用して、Z5567株のUra3遺伝子にUra3変異遺伝子を組み込んだ。合計19個のC群の形質転換体が培養され、Ura-表現型を有すると同定された。GC分析は、MM5-FOAプレート上で培養されたpZKUM-形質転換株6、11、13、15、および16の中に、36.9、37.0、35.6、36.8、および36.0のEPAの存在を示した。これらの5株をそれぞれ、Z5567U14、Z5567U19、Z5567U21、Z5567U23、およびZ5567U24、集合的にZ5567Uと命名した。YOS9607株およびYOS9608株の作成Z5567株中の4つのΔ5デサチュラーゼ遺伝子は、キメラEXP1::EgD5M::Pex16、FBAIN::EgD5SM::Pex20およびYAT1::EaD5SM::OCT遺伝子を含んでなるpZKSL-5S5A5図8A;配列番号96、およびキメラEXP1::EgD5SM::Lip1遺伝子を含んでなるpZP2-85m98F図8B;配列番号97の2つの異なるコンストラクトからの染色体に最初組み込まれた。これらのキメラ遺伝子を除去するために、3つの別個の相同的組換え事象が必要であった。最初に、Z5567U株のゲノム中のキメラFBAIN::EgD5SM遺伝子と、Leu遺伝子の大部分すなわちpZKSL-5S5A5からとが、相同的組換え図10Aによって、プラスミドpYPS234図10B;配列番号99内の993bpのstufferDNA断片配列番号98で置き換えられ、ここで993bpのstufferは、ヤロウィアYarrowiaカルニチン/アシルカルニチンキャリア遺伝子の5’および3’部分を含んでなった。より具体的には、pYSP234プラスミドは、以下の構成要素を含有した。第1の乗換え事象がLys5-5’DNA断片内で起きたのに対し、第2の乗換え事象はYAT1プロモーター領域内で起きた。この相同的組換えから、そのゲノム中に、Leu-、Ura-表現型と、3つのΔ5デサチュラーゼ遺伝子を有するYOS9601株が生じた。次にYOS9601株のゲノム中のキメラEXP1::EgD5M::Pex16およびYAT1::EaD5SM::OCT遺伝子が、相同的組換え図11Aによって、プラスミドpYPS233図11B;配列番号101内の1019bpのstufferDNA断片配列番号100で置き換えられ、ここで1019bpのstufferは、ヤロウィアYarrowiaALK2遺伝子の5’および3’部分を含んでなった。pYSP233プラスミドは、以下の構成要素を含有した。第1の乗換え事象がLys5-3’DNA断片内で起きたのに対し、第2の乗換え事象は3’LeuまたはYAT1プロモーター領域内で起きた。この相同的組換えから、Leu-Ura-表現型と、ゲノム内に残る1つの機能性Δ5デサチュラーゼ遺伝子とを有するYOS9602株が生じた。最後に、YOS9602株のゲノム中のキメラEXP1::EgD5SM::Lip1遺伝子を相同的組換え図12Aによって、プラスミドpYSP241図12B;配列番号102内の機能性Leu2遺伝子で置き換えた。pYSP241プラスミドは、以下の構成要素を含有した。第1の乗換え事象が染色体Bの位置2870148と2871250の間の領域で起きたのに対し、第2の乗換え事象はプラスミドpYSP241のEaD8S領域内で起き、それによってYOS9607Ura-株およびYOS9608Ura-株が生じた。この相同的組換えから、それぞれゲノム内にUra-表現型を有し、Δ5デサチュラーゼ遺伝子を有さない、YOS9607株およびYOS9608株同一遺伝子型を有する2つの別個のコロニーに相当するが生じた。野生型ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaATCC20362と比較した、YOS9607株およびYOS9608株の最終遺伝子型は、次の通りであった。Ura-,Pex3-,unknown1-,unknown2-,unknown3-,unknown4-,YALI0E12947g-,unknown6-,YALI0B21890g-,unknown8-,unknown10-,unknown11-,unknown12-,unknown13-,unknown14-,YAT1::ME3S::Pex16,GPD::ME3S::Pex20,YAT1::ME3S::Lip1,FBAINm::EgD9eS::Lip2,EXP1::EgD9eS::Lip1,GPAT::EgD9e::Lip2,YAT1::EgD9eS::Lip2,YAT1::EgD9eS-L35G::Pex20,FBAINm::EgD8M::Pex20,EXP1::EgD8M::Pex16,FBAIN::EgD8M::Lip1,YAT1::EgD8M::Pex20,GPD::EaD8S::Pex162コピー,YAT1::E389D9eS/EgD8M::Lip1,YAT1::EgD9eS/EgD8M::Aco,FBAINm::EaD9eS/EaD8S::Lip2,GPDIN::YlD9::Lip1,GPD::FmD12::Pex20,YAT1::FmD12::Oct,EXP1::FmD12S::Aco,GPDIN::FmD12::Pex16,FBAINm::PaD17::Aco,EXP1::PaD17::Pex16,YAT1::PaD17S::Lip1,YAT1::YlCPT1::Aco,YAT1::MCS::Lip1,FBA::MCS::Lip12コピー,EXP1::YlPCT::Pex16,YAT1::MaLPAAT1S::Pex162コピー,FBAINm::YlLPAAT1::Lip12コピー,YAT1::YlPDAT::Lip12コピー。YOS9601Leu-、Ura-株、YOS9602Leu-、Ura-株、YOS9607Ura-株、YOS9608Ura-株、およびZ5567UUra-対照株の脂肪酸組成および含油量を分析するために、上の一般方法に記載の三連フラスコアッセイを実施した。表18は、全DCW、TFADCW、TFAの重量としての各脂肪酸濃度[TFA]、およびEPADCWを要約する。脂肪酸は表7の通りであり、20:45,11,14,17はジュニペロン酸を指す。各サンプル中の全脂肪酸の総計は、100になる。フラスコ実験のデータは、YOS9601Leu-、Ura-株がゲノム内に3つのΔ5デサチュラーゼ遺伝子を含んでなり、約33のEPATFAを産生した一方、YOS9602Leu-、Ura-株は、そのゲノム内に1つのΔ5デサチュラーゼ遺伝子のみを含んでなり、約30のEPATFAを産生したことを実証した。対照的に、YOS9607Ura-株およびYOS9608Ura-株はEPAを全く産生できなかったが、約36のETAを産生した。YOS9607Ura-株およびYOS9608Ura-株中のΔ5デサチュラーゼ活性の欠如は、上の全脂肪酸分析によって検証され;PCR分析もまた、Δ5デサチュラーゼ遺伝子をコードするあらゆるDNA配列の欠如を確認した。フラスコアッセイ中において、Z5567UUra-株は、Z5567株と比較してより少ないEPADCWを産生した。実施例9少なくとも約49のTFADCWで少なくとも約50のEPATFAを産生するヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaY8174株、Y8184株、およびY8187株の作成本実施例は、フラスコアッセイにおいて、DCWの49を超えるTFAで、TFAの約50を超えるEPAを産生できる、ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaYOS9607株およびYOS9608株実施例8に由来するY8174株、Y8184株、およびY8187株の構築を記載する。これらの株は、YOS9607Ura-株およびYOS9608Ura-株の染色体に、3つの二重変異Δ5デサチュラーゼを組み込むことで作成され、それによってEPAを産生する形質転換株の能力を復元した。より具体的には、HPGG[配列番号181]およびHDASH[配列番号183]モチーフの双方における変異を含んでなる二重変異Δ5デサチュラーゼ参照によって本明細書に援用する米国仮特許出願第61/428,277号明細書[代理人整理番号CL5267USPRV、2010年12月30日出願]に記載されるは、EgD5S-36s157g配列番号110;実施例11L、EaD5S-35a158g配列番号112;実施例11M、EgD5MすなわちEgD5R-34g158g;配列番号106;実施例11I、および11K、およびEgD5M1すなわちEgD5R-34g158g347s;配列番号108;実施例11Jおよび11Kからなる群から選択された。コンストラクトpZR5AU-555図13A;配列番号113を作成して、YOS9607株およびYOS9608株の染色体Cの1685392および1687267の間の領域に、3つのキメラ変異Δ5デサチュラーゼ遺伝子すなわち、FBAIN::EgD5S-36s157g::Pex20、YAT1::EaD5S-35a158g::Oct、およびEXP1::EgD5MEgD5R-34g158g::Pex16を組み込み、それによってEPAの生成を可能にした。pZR5AU-555プラスミドは、以下の構成要素を含有した。pZR5AU-555のキメラEXP1::EgD5MEgD5R-34g158g::Pex16遺伝子の代わりにキメラEXP1::EgD5M1EgD5-34g158g347s::Pex16遺伝子が使用されたすなわちEgD5-34g158g347sが配列番号107で記載されることを除いては、コンストラクトpZR5AU-555M図13B;配列番号114はpZR5AU-555と同一であった。一般方法に従って、pZR5AU-555およびpZR5AU-555MプラスミドをAscIで別々に消化し、次にYOS9607株およびYOS9608株を個々に形質転換するために使用した。形質転換細胞をMMプレート上に播種して、30°Cに5日間保った。単一コロニーをMMプレート上に再度画線塗抹して、引き続いて30°Cの液体MMに接種し、250rpm/分で2日間振盪した。細胞を遠心分離によって収集してHGMに再懸濁し、次に250rpm/分で5日間振盪した。一般方法に従って、細胞に脂肪酸分析を行った。YOS9607株中への96個のpZR5AU-555m形質転換体のGC分析は、TFAの50.8のEPAを産生する1株すなわち86を同定し、この株をZ8184株と命名した。同様に、YOS9608株中への96個のpZR5AU-555形質転換体のスクリーニングは、TFAの51.3のEPAを産生する1株すなわち68を同定し、この株をZ8174株と命名した。そしてYOS9608株中への96個のpZR5AU-555m形質転換体のGC分析は、TFAの51.2のEPAを産生する1株すなわち56を同定し、この株をZ8187株と命名した。複製フラスコアッセイを実施して、これらの新しいEPA株脂肪酸の組成および含油量を判定した。表20は、全DCW、TFADCW、TFAの重量としての各脂肪酸濃度[TFA]、およびEPADCWを要約する。脂肪酸は表7前出の通りに同定され、20:45,11,14,17はジュニペロン酸を指す。各サンプル中の全脂肪酸の総計は、100になる。3株は全て、TFAの50を超えるEPAを産生でき、TFAはDCWの49を超えた。実施例10リノール酸からエイコサジエン酸への変換効率が改善された変異Δ9エロンガーゼ本実施例は、実施例10A、10B、10C、10D、10E、10F、10G、10H、10I、および10Jとして本明細書に分けて記載し、配列番号1に記載のアミノ酸配列を含んでなる変異Δ9エロンガーゼポリペプチドの説明を支持する実験データを記載し、配列番号1は、iL35F変異;iiL35M変異;iiiL35G変異;ivL35G変異と、S9A、S9D、S9G、S9I、S9K、S9Q、Q12K、A21D、A21T、A21V、V32F、Y84C、Q107E、L108G、G127L、W132T、M143N、M143W、L161T、L161Y、W168G、I179M、I179R、C236N、Q244N、A254W、およびA254Yからなる群から選択される少なくとも1つのその他の変異;vL35G、A21V、L108G、およびI179R変異;viL35G、W132T、およびI179変異;viiL35G、S9D、Y84C、およびI179R変異;viiiL35G、Y84C、I179R、およびQ244N変異;ixL35G、A21V、W132T、I179R、およびQ244N変異;xK58RおよびI257T変異;xiD98G変異;xiiL130MおよびV243A変異;およびxiiiK58R、L35F、L35G、L35M、S9A、S9D、S9G、S9I、S9K、S9Q、Q12K、A21D、A21T、A21V、V32F、Y84C、D98G、Q107E、L108G、G127L、L130M、W132T、M143N、M143W、L161T、L161Y、W168G、I179M、I179R、C236N、V243A、Q244N、A254W、A254Y、およびI257Tからなる群から選択される、少なくとも2つの変異を含んでなるあらゆる組み合わせからなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸変異によって、配列番号3と異なる。実施例10A、10B、10C、10D、10E、10F、10G、10H、10I、および10Jはまた、その内容全体を参照によって本明細書に援用する、米国仮特許出願第61/377248号明細書[代理人整理番号CL4783USPRV、2010年8月26日出願にも記載される。実施例10A:ヤロウィアリポリティカYarrowialipolytica中での発現のためにコドン最適化された、ミドリムシEuglenagracilisに由来する合成Δ9エロンガーゼ遺伝子[EgD9eS]を含んでなる、ヤロウィアリポリティカYarrowialipolytica発現ベクターpZuFmEgD9ESの構築キメラFBAINm::EgD9eS::Pex20遺伝子を含んでなり、EgD9eSがヤロウィア属Yarrowia中での発現のためにコドン最適化されたミドリムシEuglenagracilisに由来する合成Δ9エロンガーゼである、ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaベクターpZuFmEgD9ES図14;配列番号115の構築は、参照によって本明細書に援用する、米国特許第7,645,604号明細書の実施例8に記載される。EgD9eS配列番号2のヌクレオチド配列は、翻訳開始部位の修正に加えて、777bpコード領域の内117bp15.1が修飾され、106コドン40.9が最適化されているので、野性型ミドリムシEuglenagracilisΔ9エロンガーゼEgD9e;配列番号31のヌクレオチド配列と異なるそれにもかかわらずコドン最適化遺伝子[すなわち配列番号3]によってコードされるタンパク質配列は、野生型タンパク質配列[すなわち配列番号32]と同一である。実施例10B:Δ9エロンガーゼ変換効率の増大した変異Δ9エロンガーゼを含んでなるヤロウィアリポリティカYarrowialipolytica形質転換体を分析するための一般的な方法本実施例は、誤りがちなポリメラーゼ連鎖反応[ePCR]ライブラリー実施例10C、部位飽和ライブラリー実施例10E、SlonoMax登録商標ライブラリー実施例10G、またはコンビナトリアルライブラリー実施例10I後述中で作成され、非変異EgD9eS遺伝子配列番号9対照または野生型と称されるまたは様々な変異EgD9eS遺伝子のいずれかを発現する、ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaY2224株野生型ヤロウィア属YarrowiaATCC20362株のUra3遺伝子の自律突然変異からのFOA耐性変異体[単離は国際公開第2008/073367号パンフレットの実施例7に記載される]のpZUFmEgD9ES形質転換体内の脂質プロファイルを分析する、一般的手段を記載する。変異体ライブラリーの大腸菌EscherichiacoliおよびヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaへの形質転換電気穿孔によって、各変異体ライブラリーからのプラスミドを大腸菌E.coliTop10エレクトロコンピテント細胞カタログ番号C404052;Invitrogen,Carlsbad,CAに形質転換した。形質転換細胞を100mg/Lのアンピシリン添加ルリアベルターニ[LB]寒天プレート上に塗り広げ、37°Cのインキュベーター内で一晩培養した。製造業者のプロトコルに従って、QIAprep登録商標SpinMiniprepキットQiagenInc.,Valencia,CAを使用して、大腸菌E.coli形質転換体からプラスミドDNAを抽出した。次に一般方法に記載されるようにして、DNA分子をY.リポリティカY.lipolyticaY2224株に形質転換し、形質転換体をMMプレート上で選択した。30°Cでの培養の2日後、MMプレート上で選択された形質転換体を拾って、新鮮なMMプレート上に再度画線塗抹した。迅速スクリーニングプレートアッセイ各変異体ライブラリーの予備機能解析のために、迅速スクリーニングプレートアッセイを使用した。このプレートアッセイのためには、上の再画線塗抹MMプレートからのY.リポリティカY.lipolytica形質転換体を培地プレートから直接分析した。水酸化トリメチルスルホニウム[TMSH]を使用して、FAMEを調製した。TMSHは、メタノール中における酸化銀との反応による水酸化物溶液への転換後に、ヨウ化トリメチルスルホニウム[TMSI]から調製された。具体的には、4.4gのTMSIを100mLのMeOHに混合し、50°Cの水浴中で1時間インキュベートして;次に5gのAg2Oを溶液に添加し、室温で4時間撹拌した。最終溶液を使用前に濾過した。TMSHは、O-アシル脂質すなわちTAGの塩基触媒エステル交換と、遊離脂肪酸のエステル化を引き起こしたA.H.El-HamdyW.W.Christie,J.ofChromatography,630:438-4411993。1μlループを使用して、再画線塗抹MMプレートから細胞を直接取り、0.35mLインサート付きガスクロマトグラム[GC]バイアル内の50μlのTMSHに懸濁した。次にヘプタン150μlをバイアルインサートに添加し、バイアルに蓋をして、次に室温で撹拌しながら20分間インキュベートした。引き続いてFAMEのGC分析のために、Omegawax320溶融シリカキャピラリーカラムSupelcoInc.,Bellefonte,PAを装着したHewlettPackard7890GCに、ヘプタン層からの1μlを注入した。滞留時間を市販の標準物質標準461,Nu-ChekPrep,Inc.,Elysian,MNからのメチルエステルと比較した。EgD9eS変異体を含んでなる細胞から得られたFAMEプロファイルを非変異EgD9eS対照のものと比較した。この一次スクリーニングの結果は、二次確認アッセイを実施する変異体の選択の基礎としての役割を果たした。確認アッセイのための変異体を選択するのに使用される基準は、脂質プロフィール、特に全ての総合ピークの合計[EDATFA]と比較したパーセントとして対応するFAMEのGCピーク面積から計算されるEDAの濃度、および/またはLAからEDAへの変換効率に基づいた。各形質転換体のLAからEDAへの変換効率[変換]は、次式に従って計算された。[生成物]/[基質生成物]100式中、生成物はEDATFAであり、基質はTFAの面積パーセントとしてのLA濃度[LATFA]であった。確認アッセイ迅速スクリーニングプレートアッセイにより、対照と比較してΔ9伸長活性の改善が実証されたEgD9eS変異体を引き続く確認アッセイのために選択した。EgD9eS変異体を含んでなるY.リポリティカY.lipolytica形質転換体を最初にMMプレート上に再画線塗抹して、次に個々の形質転換体を30°Cの3mLの液体MMの三連培養物に接種し、250rpm/分で2日間振盪した。細胞を遠心分離によって収集して脂質を抽出し、ナトリウムメトキシドでの脂質抽出物のエステル交換によってFAMEを調製しRoughan,G.,andNishidaI.,Arch.Biochem.Biophys.,2761:38-461990、引き続いてプレートアッセイ前出で記載されたようにして、GCによって分析した。Δ9伸長活性の改善の確認に続いて、製造会社が推奨する通りに、Zymoprep商標YeastPlasmidMiniprepIIキットカタログ番号D2004;ZymoResearch,Orange,CAを使用して、各変異pZUFmEgD9ESプラスミドをY.リポリティカY.lipolyticaY2224株形質転換体から回収した。レスキューしたプラスミドを、ベクターおよび挿入特異的プライマーを用いたダイターミネーター技術米国特許第5,366,860号明細書;欧州特許第272,007号明細書を使用して、ABI自動配列決定装置上で配列決定した。遺伝子配列の比較は、当該技術分野で周知の標準ツールを使用して達成した。実施例10C:2つのEgD9eS誤りがちなPCRライブラリーの構築本実施例は、2つのΔ9エロンガーゼ誤りがちなポリメラーゼ連鎖反応[ePCR]ライブラリーの合成を記載する。2つのePCRライブラリーは二段法で作成され、それは、最初にテンプレート内にランダム変異を含んでなる一連のメガプライマーの生成を要し、これらのメガプライマーを使用したpZuFmEgD9ES中の点変異の作成がそれに続いた。コンストラクトpZuFmEgD9ES配列番号115実施例10Aを第1のePCRライブラリーのためのDNAテンプレートとして使用した。第2のePCRライブラリーは、第1のePCRライブラリーのスクリーニングからのヒットをDNAテンプレートとして使用した。ランダム変異誘発キットを使用したメガプライマーの作成GeneMorphIIランダム変異誘発キットカタログ番号200550;Stratagene,LaJolla,CAを使用して、標的タンパク質中にランダムアミノ酸置換を作成した。それは、GおよびCとの対比でAおよびTにおいて同等の変異率がある、偏りのより少ない変異スペクトルを生じる、2種の異なるポリメラーゼの組み合わせを含んでなる、新しい誤りがちなPCR酵素混合組成を使用して、誤りがちなPCR中に、標的遺伝子に変異を導入することで機能する。生成物の高収率のために最適化された緩衝液条件の単一セットを使用して、1kBあたり1~16個の変異の変異率が達成され得ると宣伝されている。所望の変異率は、単に、反応中の最初のテンプレートDNA量および/または実施される増幅サイクル数を変えることで制御し得る。製造会社が推奨するプロトコルを使用して、上のキットを利用し、EgD9eSメガプライマーを作成した。これらのメガプライマーは約930bpの長さであり、EgD9eS配列番号2をコードする777bpを含んでなった。反応混合物は、1μlの第1のePCRライブラリーあたり16ngのDNAテンプレート、または1μlの第2のライブラリーあたり2.0ngのDNAテンプレートのいずれかを含有した。それはまた、反応緩衝液、dNTP0.8mM、プライマーpZUFm_6980_012208f配列番号1162μM、プライマーpZUFm_40_012208r配列番号1172μM、およびMutazyme登録商標IIDNAポリメラーゼ0.25U/μlも含んでなった。PCR反応は、Mastercycler勾配装置BrinkmannInstruments,Inc.,Westbury,NY内の薄壁200μl管内で実施した。以下の条件を使用して、PCR増幅を実施した。95°Cで2分間、それに続く95°Cで30秒間の変性、55°Cで30秒間のアニーリング、および72°Cで90秒間の伸長を30サイクル。72°Cで4分間の最終伸長サイクルを実施し、4°Cでの反応終結がそれに続いた。製造会社が推奨する通り、DNACleanConcentrator商標-5キットカタログ番号D4003;ZymoResearch,Orange,CAを使用して、PCR産物を精製した。精製二本鎖PCR産物をそれぞれEgD9eS内に様々な変異を含有するメガプライマーとして利用した。EgD9eSのPCR変異遺伝子を作成する標準クローニング法第1のePCRライブラリーのために、メガプライマーをNcoIおよびNotI制限酵素で消化した。次に室温で5時間の連結反応によって、T4DNAリガーゼPromega,Madison,WIを使用して、ゲル精製NcoI/NotI遺伝子断片をゲル精製NcoI/NotIpZUFmEgD9ESベクター配列番号115に直接ライゲートした。EgD9eSのePCR変異遺伝子を作成する部位特異的変異誘発第2のePCRライブラリーを作成するために、pZuFmEgD9ES図14;配列番号115に、メガプライマー内のEgD9eS変異体を導入するようにデザインされた反応中で、上述のメガプライマーを利用し、それによって非変異EgD9eS遺伝子を様々な変異EgD9eS遺伝子で置換した。これは、QuikChange登録商標IIXL部位特異的変異誘発キットカタログ番号200524;Stratagene,LaJolla,CAを使用して達成された。双方のプラスミド鎖の変異原性プライマー誘導複製のための高忠実度PfuUltraDNAポリメラーゼを使用して、QuikChange登録商標II部位特異的変異誘発キットを使用して、二本鎖ベクター中の関心のあるインサート内に点変異を作成し、アミノ酸を置換して、単一/複数の隣接するアミノ酸を消去しまたは挿入した。キットは、特化ベクター、特有な制限酵素認識部位、または複数形質転換を必要とせず、実質的にあらゆる二本鎖プラスミド中において、部位特異的変異を可能にする。基本的手順は、どちらも所望の変異を含有してベクターの逆ストランドに相補的であり、温度サイクル中にプライマーの転置なしに、高忠実度DNAポリメラーゼによって伸長される、2つの合成オリゴヌクレオチドプライマーを利用する。オリゴヌクレオチドプライマーの伸長からは、互い違いに位置するニックを含有する変異プラスミドが生成し、次にそれをDpnIエンドヌクレアーゼで処理した。この制限酵素はメチル化および半メチル化DNAに対して特異的であり、それによって親DNAテンプレートの消化と、変異含有合成DNAの選択を可能にする。次に所望の変異を含有するニックのあるベクターDNAを大腸菌Escherichiacoli宿主に形質転換して、増殖させる。しかし本手順では、従来の合成オリゴヌクレオチドプライマーの代わりに、様々な変異EgD9eS遺伝子を含んでなる二本鎖メガプライマーを使用した。具体的には、キットが提供する5.0μlの10×反応緩衝液、1.0μlの50ng/μlpZUFmEgD9ESテンプレート配列番号115、42μlのメガプライマー、キットが提供する1.0μlの40mMdNTPミックス、およびキットが提供する1.0μlのPfu-UltraDNAポリメラーゼを含んでなる、50μlの反応を調製した。この反応混合物を薄壁200μl容量PCR管に入れ、以下の条件を使用してPCR増幅を実施した。95°Cで30秒間、それに続く95°Cで30秒間の変性、55°Cで1分間のアニーリング、および68°Cで6分間の伸長を25サイクル。68°Cで8分間の最終伸長サイクルを実施し、4°Cでの反応終結がそれに続いた。完了した部位特異的変異誘発反応混合物に、キットが提供するDpnI制限酵素1.0μlを直接添加し、酵素消化を37°Cで1時間実施してDNAテンプレートを除去した。DNA浄化キットZymoResearchを使用して消化生成物を精製して溶出し、pZUFmEgD9ESベクター主鎖内に含有される様々な変異EgD9eS遺伝子を含んでなる、10μlの精製DNAを得た。実施例10D:Δ9エロンガーゼ変換効率の改善を有するePCREgD9eSライブラリー変異体の同定本実施例は、1野生型タンパク質EgD9eS配列番号3と比較して、LAからEDAへのΔ9エロンガーゼ変換効率が改善されたEgD9eSePCRライブラリー変異体の同定;および2これらのEgD9eSePCRライブラリー変異体の配列分析を記載する。EgD9eSePCR変異体の同定実施例10Bに記載されるようにして、実施例10Cで調製されたePCR遺伝子ライブラリー変異体を大腸菌E.coliTop10エレクトロコンピテント細胞に形質転換して精製し、引き続いてY.リポリティカY.lipolyticaY2224株に形質転換した。実施例10Bの迅速スクリーニングプレートアッセイを使用して、1,724個のヤロウィア属Yarrowia形質転換体の脂肪酸プロファイルをスクリーニングした。これらの変異体のほとんどは、対照と比較して低下した活性を呈示した。しかし5つの形質転換体は、実施例10Bの確認アッセイに基づいて、対照と比較して改善されたΔ9伸長活性を呈示することが確認された。2つの独立した確認アッセイからのデータを表21および表22に提示し、個々のpZuFmEgD9ES対照形質転換体のFAMEプロファイルをePCR変異体と比較する。より具体的には、各株について、実施例10Bに記載されるようにして判定される対応するFAMEのGCピーク面積から、全ての総合ピークの合計と比較したパーセントとして計算される各脂肪酸濃度[TFA]、およびLAからEDAへの変換を下の表21および表22に示し、平均値は灰色で強調され平均として示される。脂肪酸は、16:0パルミチン酸、16:1パルミトレイン酸、18:0ステアリン酸、18:1オレイン酸、LA、およびEDAとして同定される。EgD9eS対照と比較した各変異体の性能比較は、変異体がその中で分析される特定の確認アッセイ内のみで実施すべきであるすなわちアッセイ1とアッセイ2の間では比較を実施し得ない。上に示す確認アッセイ1中のデータを要約すると、非変異コドン最適化EgD9eS遺伝子を含んでなるpZuFmEgD9ESで形質転換されたY.リポリティカY.lipolyticaY2224株のクローンは、平均で3.1のEDATFAを産生し、これらの5つのクローン中のLAからEDAへの平均変換効率[変換]は、約15.5と判定された。対照的に、変異株1.2ep-8のLAからEDAへの平均変換は17.8または対照との比較で115であり;変異株1.9ep-63の平均変換は16.3または対照との比較で105であり;変異株1.4ep-161の平均変換は16.4または対照との比較で106であった。確認アッセイ2では、pZuFmEgD9ESで形質転換されたY.リポリティカY.lipolyticaY2224株のクローンは、2.9のEDATFAを産生し、これらの4株中のLAからEDAへの平均変換は約16.9と判定された。変異株2.1ep-94のLAからEDAへの平均変換は19.8または対照との比較で117であり;変異株2.1ep-95の平均変換は18.8または対照との比較で111であった。したがってこれらの実験は、EgD9eSePCR変異体1.2ep-8、1.9ep-63、1.4ep-161、2.1ep-94、および2.1ep-95によって呈示された、Δ9エロンガーゼ変換効率の改善を確認した。EgD9eSePCR変異体の配列変異体1.2ep-8、1.9ep-63、1.4ep-161、2.1ep-94、および2.1ep-95からレスキューされたプラスミドをDNA配列決定によって特性解析し、解析は、表23に示されるように、変異EgD9eS遺伝子内の様々なヌクレオチド置換、および発現されるアミノ酸の置換を明らかにした。各変異EgD9eS遺伝子に、および変異EgD9eS遺伝子を含んでなる各変異pZuFmEgD9ESプラスミドに、アミノ酸置換を示唆する名称を与えた。列挙される各置換すなわちL35Gについて、第1の文字は非変異EgD9eSすなわち配列番号3中のアミノ酸に対応し、第2の文字は変異体中の同じ位置に見られるアミノ酸に対応し、すなわちL35Gは、位置35のEgD9eSからEgD9eS変異体中のGlyへの変化を示す。したがって、例えば変異体1.2ep-8からレスキューされたプラスミドは、2つのヌクレオチド置換すなわちC103TおよびA654Gを含んでなった。これらの2つのヌクレオチド置換は、1つの発現されるアミノ酸置換すなわちL35F、および1つのサイレントアミノ酸変異すなわちG218G;GGAおよびGGGはどちらもGlyをコードするため、A654Gヌクレオチド置換の結果として、このアミノ酸は変異タンパク質中で無変化であるに相当する。アミノ酸変化L35FをもたらすC103TおよびA654G変異を含んでなるプラスミドがpZuFmEgD9ES-L35F配列番号120と命名された一方、その中の変異Δ9エロンガーゼのヌクレオチド配列はEgD9eS-L35F配列番号118と命名され、配列番号119に記載のタンパク質配列を有した。実施例10E:2部位飽和EgD9eS遺伝子ライブラリーの構築本実施例は、EgD9eS配列番号3内のアミノ酸位置35および107の標的化によって作成された、部位飽和[SS]ライブラリーの合成を記載する。位置35を標的化する理論的根拠が実施例10Dの結果に基づいたのに対し、位置107を標的にする理論的根拠は後述される。SSライブラリーは二段法で作成され、それは、最初にテンプレート内に標的化変異を含んでなるメガプライマーの生成を要し、これらのメガプライマーを使用したpZuFmEgD9ES中の点変異の作成がそれに続いた。EgD9eSの位置107を標的にする理論的根拠最初に、配列比較のClustalW法を使用して、下の表24に記載される17個の脂肪酸エロンガーゼのアミノ酸配列を配列比較した。デフォルトパラメータすなわちproteinweightmatrix=Gonnet250、gapopeningpenalty=10、gapextensionpenalty=0.2および全長配列比較アルゴリズムで、ClustalWパッケージバージョン1.83を使用して、ThompsonらNucleicAcidsRes.22:4673-46801994によって記載されるClustalW配列比較法を実施した。配列比較結果を図15A、15B、15C、15D、15E、15F、15G、および15Hを含んでなる図15に示す。Trace_1、Trace_2、Trace_3、およびTrace_4は、下で定義される機能性I群、II群、III群、およびIV群の各列のコンセンサスを表し、すなわちTrace1は、Ci_elo、Om_elo、Mp_elo1、Pp_elo1、Mp_d5e、およびOt_elo1を含んでなるGroupI中のタンパク質配列のコンセンサスを表す。各列のコンセンサスは、以下のように定義された。具体的には、列が完全に保存されているならば、コンセンサスは、大文字で示される保存アミノ酸として表される。物理化学的特性の観点から列が保存されている場合、コンセンサスは小文字で表され、kはアミノ酸DおよびE負の電荷を表し、qはアミノ酸H、K、およびR正の電荷を表し、pはアミノ酸NおよびQ極性を表し、aはアミノ酸I、L、およびV脂肪族を表し、dはアミノ酸F、W、およびY芳香族を表し、hはアミノ酸AおよびG小型を表し、sはアミノ酸D、E、N、Q、H、K、R、S、およびT親水性を表し、fはアミノ酸I、L、V、F、W、Y、C、およびM疎水性を表す。列が保存されていない場合、コンセンサスは大文字Xで表された。近隣結合系統樹は、ClustalW配列比較から作成された。系統樹トポロジーに基づいて、異なる基質特異性の官能基に相当すると仮定された4群に、17個の配列を分割した。I群は、Ci_elo、Om_elo、Mp_elo1、Pp_elo1、Mp_d5e、およびOt_elo1を含んでなり;II群は、Pav_elo2、Ps_elo2、およびOt_elo2を含んでなり;III群は、Ea_d9e、Eg_d9e、E398_d9e、およびIg_d9eを含んでなり;IV群は、Tp_elo2、Tp_elo1、Ma_d6e、およびTh_elo2を含んでなる。図15の配列比較および近隣結合系統樹の分類を考慮して、以下の結論が導かれた。第1にいくつかの位置は、I、II、III、およびIV群内で、17配列の全てにわたり完璧に保存されている。これらの位置は、エロンガーゼの触媒活性に恐らく必須であると見なされ、したがって変異標的から除外された。いくつかの位置は、I、II、III、およびIV群内の配列のいくつかのみで保存されたすなわち完璧に保存されなかった。これらの位置は、I、II、III、およびIV群の官能基内のエロンガーゼによって呈示される基質特異性に恐らく重要であると見なされた。いくつかの位置は、III群4つの既知のΔ9エロンガーゼを全て含んでなる内で比較的保存されが、バリエーションもまた呈示された;EgD9eの番号を付けに基づく、アミノ酸位置22、47、54、101、107、111、115、161、182、192、および242を参照されたい。これらの位置は、Δ9エロンガーゼの活性に恐らく重要であると見なされ、Ea_d9e配列番号34、Eg_d9e配列番号32、E398_d9e配列番号38、およびIg_d9e配列番号42の基質特異性の相違を調節すると仮定された。TMHMMプログラムPredictionoftransmembranehelicesinproteins;TMHMMServerv.2.0,CenterforBiologicalSequenceAnalysis,BioCentrum-DTU,TechnicalUniversityofDenmark,DK-2800Lyngby,Denmarkを使用して、EgD9eS内の膜貫通ドメイン[TM]の分析を実施した。予測は、NおよびC末端の双方が細胞質側に位置する、6個の膜貫通らせんアミノ酸残基32~51、66~88、114~136、156~175、188~206、221~243に相当するを示唆した。TMHMMプログラムを使用して、Ot_elo2、Ig_elo1、Pav_elo2、およびTp_elo2を同様に分析すると、膜貫通らせん数は4~8個で変動した。したがって、これらの変動する予測を統合するために、以下のいくつかの機能性情報を使用した。1.高度に保存されたヒスチジンに富むモチーフ[Q/H]xxHHHis-boxは、Ig_d9e配列番号42の最適酵素活性に必須であることが示されているが、基質特異性の直接原因ではないQietal.,FEBSLetters,547:137-1392003。したがって、これはHis-boxEgD9eS中のアミノ酸残基134~138に相当するが活性部位に関与することを強力に示唆し;基質が活性部位にアクセスし得るように、それは折り畳みタンパク質の細胞質側またはその近くに位置しなくてはならない。2.荷電残基があるいくつかの高度に保存された位置が、EgD9eSのC末端に存在する。それらは恐らく活性と関係があり、したがってC末端は折り畳みタンパク質の細胞質側に位置する。His-boxは膜の外面に位置し得ないので、アミノ酸残基114~136間、およびアミノ酸残基156~175間の膜貫らせんを予測するTMHMM結果とは対照的に、上の考察は、残基114~136間の配列領域が膜を貫通しないことを示唆する。C末端が細胞質側に位置する場合、156~175間の予測されたTMドメインもまた膜を貫通しない。エロンガーゼの基質は高度に疎水性であるので、それは恐らく脂質二重層中に分配される。His-boxをはじめとする活性部位は、膜表面またはその非常に近くにあってもよい。したがって本明細書では、これらの2つの疎水性領域すなわちアミノ酸残基114~136およびアミノ酸残基156~175に相当するは、内膜小葉中またはその近くに位置して、活性部位が膜に近いことを確実にすることが予測される。EgD9eSについて予測された最終的な膜トポロジーモデルを図16Aに示す。具体的には、各垂直円柱が膜貫通断片を示す一方、各水平円柱は内膜小葉の中または近くに位置する疎水性ストレッチを示す。His-boxすなわちアミノ酸残基134~138に相当する内の保存されたGln[Q]およびHis[H]は、小さな丸で示される。最後に、中が細胞質空間に対応するのに対し、外は細胞質空間に相当する。保存パターン解析が、III群Δ9脂肪酸エロンガーゼ内に、酵素活性に影響を及ぼすと予測された11個の異なるアミノ酸残基すなわちEa_d9e[配列番号34]、Eg_d9e[配列番号32]、E398_d9e[配列番号38]、およびIg_d9e[配列番号42]を同定したのに対し、予測されたトポロジーモデルからの結果は、候補残基をさらに限定した。具体的には、酵素活性にとって重要な位置は、活性部位がある細胞質側またはその近くになくてはならないと理由付けられた。アミノ酸残基47、54、および192は、この基準を満たせず、したがってそれらはΔ9エロンガーゼの活性を調節する上で重要であり得ないと推測された。上の理論的根拠に基づいて、EgD9eSの9エロンガーゼ活性に恐らく顕著に影響を及ぼす候補残基は、配列番号3の完全長タンパク質内の258残基から、位置22、101、107、111、115、161、182、および242に相当する、わずか8残基に減少した。これらの8つの位置は、EgD9eSの基質変換率を改善するための部位特異的変異誘発の標的として推奨された。下の実験データは、位置107を標的とした。部位飽和ライブラリー構築のためのメガプライマーの作成オリゴヌクレオチドEgD9E_102_053008f配列番号146およびEgD9E_760_053008r配列番号147をデザインして、それぞれEgD9eS配列番号3のアミノ酸残基35および107を標的とした。これらのオリゴヌクレオチドの商業的合成に続いて、それらをPCR反応で利用して、SSライブラリー構築で使用するための適切なメガプライマーを作成した。具体的には、Pfu-UltraポリメラーゼStratageneと共に提供される5.0μlの10×反応緩衝液、1.0μlの50ng/μlEgD9eS配列番号2、1.0μlの10pmol/μlプライマーEgD9E_102_053008f配列番号146、1.0μlの10pmol/μlプライマーEgD9E_760_053008r配列番号147、1.0μlの40mMdNTPミックスPromega,Madison,WI、1.0μlの高忠実度Pfu-UltraDNAポリメラーゼStratagene、および40μlの水を含有する、50μlの反応混合物を調製した。Mastercycler勾配装置BrinkmannInstruments,Inc.Westbury,NY内におけるPCR反応のために、混合物を薄壁200μl管に入れた。以下の条件を使用して、PCR増幅を実施した。95°Cで30秒間、それに続く95°Cで30秒間の変性、54°Cで1分間のアニーリング、および72°Cで2分間の伸長を30サイクル。72°Cで4分間の最終伸長サイクルを実施し、4°Cでの反応終結がそれに続いた。製造会社が推奨する通りに、DNACleanConcentrator商標-5キットカタログ番号D4003;ZymoResearch,Orange,CAを使用して、PCR産物を精製した。精製二本鎖PCR産物は、それぞれEgD9eS内に様々な変異を含有するメガプライマーとして利用した。EgD9eSの部位飽和変異遺伝子を作成する部位特異的変異誘発次に、pZuFmEgD9ES図14;配列番号115に、メガプライマー内のEgD9eS変異体を導入するようにデザインされた反応中で、上述のメガプライマーを利用し、それによって非変異EgD9eS遺伝子を様々な変異EgD9eS遺伝子で置換した。これは、実施例10Cに記載されるように、QuikChange登録商標IIXL部位特異的変異誘発キットカタログ番号200524;Stratagene,LaJolla,CAを使用して達成された。具体的には、部位特異的変異誘発反応組成物および増幅条件は、実施例10Cに記載されるのと同一であり、DpnI制限酵素およびDNA浄化方法についても同様であった。実施例10F:Δ9エロンガーゼ変換効率が改善されたEgD9eS部位飽和ライブラリー変異体の同定本実施例は、1野生型タンパク質EgD9eS配列番号3と比較して、LAからEDAへのΔ9エロンガーゼ変換効率が改善されたEgD9eS変異体の同定;および2これらのEgD9eS変異体の配列分析を記載する。EgD9eS部位飽和変異体の同定実施例10Bに記載されるようにして、実施例10Eで調製されたSSライブラリー変異体を大腸菌E.coliTop10エレクトロコンピテント細胞に形質転換して精製し、引き続いてY.リポリティカY.lipolyticaY2224株に形質転換した。実施例10Bの迅速スクリーニングプレートアッセイを使用して、SSライブラリーからのコンストラクトによる510個のヤロウィア属Yarrowia形質転換体の脂肪酸プロファイルを分析した。3つの形質転換体が、実施例10Bの確認アッセイに基づいて、対照と比較して改善されたΔ9伸長活性を呈示することが確認された。確認アッセイからのデータを表25に提示し、個々のpZuFmEgD9ES対照形質転換体のFAMEプロファイルをSSライブラリー変異体と比較する。より具体的には、各株について、実施例10Bに記載されるようにして判定されるTFAの面積パーセントとしての各脂肪酸濃度[TFA]、およびLAからEDAへの変換を下の表25に示し、平均値は灰色で強調され平均として示される。脂肪酸は、実施例10Dの略称に基づいて同定される。確認アッセイでは、非変異コドン最適化EgD9eS遺伝子を含んでなるpZuFmEgD9ESで形質転換されたY.リポリティカY.lipolyticaY2224株のクローンは、平均で3.5のEDATFAを産生し、これらの4株中のLAからEDAへの平均変換効率[変換]は、約18.7と判定された。比較すると、変異株2.4sd2-24のLAからEDAへの平均変換は27.2または対照との比較で145であり;変異株2.4sd2-52の平均変換は26.6または対照との比較で142であり;変異株2.4sd2-53の平均変換は24.6または対照との比較で132であった。したがってこのアッセイは、部位飽和変異体2.4sd2-24、2.4sd2-52、および22.4sd2-53によって呈示された、Δ9エロンガーゼ変換効率の改善を確認した。EgD9eS部位飽和変異体の配列変異体2.4sd-24、2.4sd-52、および2.4sd-53からレスキューされたプラスミドをDNA配列決定によって特性解析し、解析は、表26に示されるように、変異EgD9eS遺伝子内の様々なヌクレオチド置換、および発現されるアミノ酸の置換を明らかにした。各変異EgD9eS遺伝子に、および変異EgD9eS遺伝子を含んでなる各変異pZuFmEgD9ESプラスミドに、アミノ酸置換を示唆する名称を与えた。当業者には明白であるように、出願人らは、遺伝コードの縮重に基づいて、多様なヌクレオチド配列が、例えばEgD9eS-L35Gに記載のタンパク質をコードし得ることを認識する。したがって、例えばアミノ酸残基位置35で配列番号44に記載の変異タンパク質中でコードされるGlyは、GGG配列番号43に記載のΔ9エロンガーゼ読み取り枠[ORF]、GGA配列番号152に記載のΔ9エロンガーゼORF、GGC配列番号153に記載のΔ9エロンガーゼORF、およびGGT配列番号154に記載のΔ9エロンガーゼORFによってコードされ得る。コードされたタンパク質中にサイレント変異をもたらす多様なその他のヌクレオチド置換もまた検討され、したがってEgD9eS-L35G配列番号44をコードする本明細書で提供されるヌクレオチド配列は、本開示を制限するものと解釈すべきでない。本発明の変異タンパク質をコードして、Δ9エロンガーゼ活性を有する、本明細書に記載されるヌクレオチド配列のいずれかの中における同様のバリエーションが検討された。実施例10G:EgD9eS-L35GSlonoMax登録商標ライブラリーの作成本実施例は、親酵素と比べてLAからEDAへの変換効率の42~45の改善を実証した、EgD9eS-L35G変異体配列番号44;実施例10F内の50個の異なったアミノ酸位置を標的にすることで作成された、SlonoMax登録商標ライブラリーの合成を記載する。したがって本実施例は、L35変異を含んでなるEgD9eS変異体中にスタックし得る、追加的な有益な変異を同定することを求めた。下でさらに詳細に記載する自動ロボットプラットフォームであるSlonomics登録商標は、SlonoMax登録商標ライブラリーを作成し、配列位置あたりの変異体数およびそれらの比率を非常に正確に制御し得る。したがって自動工程は、部位飽和ライブラリー実施例10E作成時に考察された限定的残基とは対照的に、Δ9エロンガーゼ活性に対するそれらの影響を判定するために、実験的に検査し得る候補残基数を大幅に増大させ得る利点を提供する。機能部位評価のためにEgD9eS内の50個の異なった残基を標的にする理論的根拠Δ-9エロンガーゼは、イソクリシスガルバナIsochrysisgalbana[IgD9e]配列番号42;国際公開第2002/077213号パンフレット、国際公開第2005/083093号パンフレット、国際公開第2005/012316号パンフレット、および国際公開第2004/057001号パンフレット;GenBank受入番号AAL37626、ユートレプチエラ属EutreptiellaCCMP389種[E389D9e]配列番号38;米国特許第7,645,604号明細書、ミドリムシEuglenagracilis[EgD9e]配列番号32;米国特許第7,645,604号明細書、およびE.アナベナE.anabaena[EaD9e]配列番号34;米国特許第7,794,701号明細書から同定され、機能解析されている。これらの各エロンガーゼは、LAをEDAに変換できることが示されている。デフォルトパラメータすなわちproteinweightmatrix=Gonnet250、gapopeningpenalty=10、gapextensionpenalty=0.2、および全長配列比較アルゴリズムを使用したClustalWバージョン1.83分析に基づいてEgD9e、EaD9e、およびE389D9eが、互いに60を超える配列類似性を共有するのに対し、IgD9Eは、EgD9e、EaD9e、およびE389D9eのいずれか1つとわずか約35の配列類似性を共有する。Δ9エロンガーゼ変換効率が改善されている変異体例えばD98G[実施例10D]およびL35G[実施例10F]をもたらす位置は、中程度の配列保存性を有することが観察された。VectorNTI登録商標のAlignXprogramInvitrogenCorporation,Carlsbad,CAのデフォルトパラメータを使用して、IgD9e、EgD9e、EaD9e、およびE389D9eのアミノ酸配列アラインメントを作成し、その他の中程度に保存された残基を同定した。全ての整合配列中で保存された、米国特許第7,645,604号明細書のΔ9エロンガーゼモチーフは、共通配列内の下線付き太字として図に示される。配列番号3に記載のEgD9eSの配列と同一である配列番号32のEgD9e配列内の太字の残基は、変異されてΔ9エロンガーゼ活性が改善された変異エロンガーゼをもたらす残基を示す。これらの変異の位置はまた、配列比較の各横列上の星印で強調表示されている。これらの中程度に保存された残基は、非変異EgD9eS対照と比較して改善された活性を有する、変異酵素の第2世代を潜在的にもたらすアミノ酸置換の標的の有望な候補かもしれないという仮説が立てられた。これらの4つの相同的な酵素配列の比較で、258個のアミノ酸位置の内58個は4つのエロンガーゼ酵素の全てで保存されていると判定され;したがってこれらの残基は、検討から除外された。さらに92個の位置は、EgD9e、EaD9e、およびE389D9eの間で保存されていると判定され;これらの残基もまた、検討から除外された。最後に、相同体間でランダムなアミノ酸変化を有する位置は、常態ではタンパク質機能に重要な役割を果たさないので、4つのエロンガーゼ酵素の全てで4つの異なるアミノ酸残基を有すると判定された追加的な22個の位置が、機能評価のための標的化位置としての検討から除外された。配列番号32内の残る86個の位置すなわち位置1、3、4、5、9、12、21、22、27、28、29、32、35、37、41、42、45、47、48、51、52、53、54、57、58、60、62、63、66、67、70、71、73、74、80、83、84、85、89、94、98、101、104、105、107、108、111、115、127、131、132、143、149、152、153、155、156、161、168、169、179、181、182、192、196、204、207、209、210、211、216、218、222、223、225、229、236、239、242、244、245、247、250、254、257、および258が、機能部位評価のための潜在的標的と見なされた。EgD9e配列番号32、EaD9e配列番号34、およびE389E9e配列番号38中のこれらの各1つの位置でコードされるアミノ酸残基の比較を下の表27に示す。上の表27で同定された86個の位置の内、図16Aの膜トポロジーモデルに基づいて、細胞膜周辺腔への最大近接を有する部位が、検討から除外されたすなわち位置45、47、48、51、52、53、54、57、58、60、62、63、66、67、70、71、73、74、204、207、209、210、211、216、218、222、223、225、および229。灰色の太字で強調表示された部位すなわちEgD9eSの位置3、5、9、12、21、22、27、28、32、37、41、42、80、84、85、94、98、101、104、105、107、108、111、115、127、131、132、143、149、152、153、156、161、168、169、179、181、182、192、196、236、239、242、244、245、247、250、254、257、および258をさらなる実験的評価のために選択した。EgD9eS-L35GのSlonoMax登録商標変異遺伝子を作成するSlonomics登録商標Slonomics登録商標米国特許第7,695,906号明細書は、コンビナトリアルライブラリーをコドン1つずつ合成する普遍的構成単位として二本鎖DNAの三つ組みを使用するSloningBioTechnology,Puchheim,Germany。ライブラリー生成のために、複数コドンをあらゆる所望の配列位置に並行して導入し得る。機能的バイアスの不在と、20個までのコドンを選択してあらゆる比率で正確に制御送達する能力は、所望の変異体の完全なセットを含有する、ひときわ高品質のライブラリーをもたらす。SlonoMax登録商標遺伝子ライブラリー全部で50個は、このようにしてSloningBioTechnologyによって作成され、各遺伝子ライブラリーは、pZuFmEgD9ES-L35G配列番号148をテンプレートとして使用して、標的位置すなわちEgD9eSの位置3、5、9、12、21、22、27、28、32、37、41、42、80、84、85、94、98、101、104、105、107、108、111、115、127、131、132、143、149、152、153、156、161、168、169、179、181、182、192、196、236、239、242、244、245、247、250、254、257または258に、少なくとも16個の独立した特有な配列変異を有する。実施例10Bに記載されるように、全てのEgD9eS-L35G変異体は、pZuFmEgD9ES-L35Gによって提供されるベクター主鎖にクローンし、引き続いてY.リポリティカY.lipolyticaY2224株に形質転換して培養した。形質転換細胞凍結グリセロール貯蔵品として提供されるおよびDNAは、SloningBioTechnologyから得られた。形質転換細胞とDNAのごく一部を配列決定して確認した。実施例10H:Δ9エロンガーゼ変換効率が改善されたEgD9eS-L35GSlonoMax登録商標ライブラリー変異体の同定本実施例は、実施例10F配列番号44で同定された変種タンパク質EgD9eS-L35Gと比較して、LAからEDAへのΔ9エロンガーゼ変換効率が改善されたEgD9eS-L35GSlonoMax登録商標変異体の同定を記載する。実施例10Bの確認アッセイ手順を使用し、新鮮な再画線塗抹MMプレート上の細胞培養を使用して、3mLの液体MMを含んでなる三連培養物を個々に接種して、SlonoMax登録商標ライブラリーからのコンストラクトによる807個のヤロウィア属Yarrowia形質転換体の脂肪酸プロファイルをスクリーニングした。807個の変異体に加えて、pZuFmEgD9ES-L35G配列番号148を含んでなるヤロウィア属YarrowiaY2224株形質転換体、を実験対照として三連で接種した。確認アッセイ中の選択された変異体からのデータを表28に提示し、3つの代表的EgD9eS-L35G対照のFAMEプロファイルをSlonoMax登録商標ライブラリー変異体を比較して、LAからEDAへの平均変換の増大を実証する。より具体的には、各株について、実施例10Bに記載されるようにして判定されるTFAの面積パーセント[TFA]としての各脂肪酸濃度の平均平均で示される、およびLAからEDAへの平均変換を下の表28に示す。脂肪酸は、実施例10Dの略称に基づいて同定される。各株の説明は、それぞれ変異EgD9eS遺伝子中に存在する特定のアミノ酸置換を示唆する。したがってEgD9eS-L35G/S9A株は、配列番号3に記載のEgD9eSの配列と比較してL35G変異およびS9A変異を有する変異EgD9eS遺伝子を含んでなる、変異pZuFmEgD9ESプラスミドを含んでなる。表28に提示される、複製EgD9eS-L35G対照の脂肪酸プロファイルおよびLAからEDAへの変換が、先に提示されたEgD9eS-L35Gプロファイルとはいくぶん異なることは注目に値する。本実験セットでは、EgD9eS-L35G対照は、以前の分析と比較して伸び悩んだすなわちLAからEDAへの平均変換が上で約18.1と判定されたのに対し、LAからEDAへの平均変換は、実施例10Fの表25では約26.6および27.2と判定された。しかしEgD9eS-L35Gによる形質転換体は、4.3のEDATFA平均、前出を産生し、これはEgD9eSによる形質転換体中の生産量を顕著に上回ったすなわち3.1のEDATFA[実施例10、表21]、2.9のEDATFA[実施例10、表22]、および3.5のEDATFA[実施例10、表25]。この理由から、表28で提示されるEgD9eS部位-評価ライブラリーからの変異体比較のための基準として、本実験のEgD9eS-L35G性能に加えて、EgD9eS-L35Gの機能解析を反復した以前の実験からの性能データ示さずを使用した。表28に提示される26個の選択されたエロンガーゼ変種の内、11個は表28の対照データと比較して、同等のまたは顕著に改善されたΔ9エロンガーゼ変換活性を実証すると同定された太字で強調表示される。これらの変異体には、EgD9eS-L35G/S9D141増大、EgD9eS-L35G/A21V118増大、EgD9eS-L35G/V32F104増大、EgD9eS-L35G/Y84C144増大、EgD9eS-L35G/L108G104増大、EgD9eS-L35G/W132T100増大、EgD9eS-L35G/M143N96増大、EgD9eS-L35G/L161T131増大、EgD9eS-L35G/I179R141増大、EgD9eS-L35G/C236N102増大、およびEgD9eS-L35G/Q244N134増大が含まれ、EgD9eSと比較したΔ9エロンガーゼ変換活性は括弧内に示される。したがってLAからEDAへの変換効率の最大44の改善が、実証された。実施例10I:EgD9eS-L35G/S9D/A21V/V32F/Y84C/L108G/W132T/M143N/L161T/I179R/C236N/Q244Nコンビナトリアルライブラリーの作成本実施例は、L35変異を含んでなるEgD9eS変異体中に、上の実施例10Hで同定された有益な変異すなわちL35G、S9D、A21V、V32F、Y84C、L108G、W132T、M143N、L161T、I179R、C236N、およびQ244Nの様々な組み合わせを共にスタックする、変異EgD9eSコンビナトリアルライブラリーの合成を記載する。コンビナトリアルライブラリー構築のための合成プライマーの作成11対のプライマーは、配列番号155~176に記載されるように商業的に合成された下の表29参照。各プライマー対は、EgD9eS-L35G遺伝子に、S9D、A21V、V32F、Y84C、L108G、W132T、M143N、L161T、I179R、C236N、およびQ244Nの変異の1つを導入するようにデザインされた。T4ポリヌクレオチドキナーゼ[PNK]カタログ番号70031Z;USBCorp.を使用して、プライマーを37°Cで60分間リン酸化し、次に65°Cで20分間不活性化した。各20μlのリン酸化反応混合物は、2.0μlの10×T4PNK緩衝液、15.0μlのプライマーDNA約7μM、0.6μlの100mMATP、0.4μlのT4PNK、および2.0μlの水を含有した。EgD9eS-L35Gのコンビナトリアル変異体遺伝子を作成するための複数変異部位変異誘発Change-IT商標複数変異部位特異的変異誘発キットカタログ番号78480、USBCorporation,Cleveland,OHを使用して、各反応最終反応を除くが、プライマーセットAの順方向プライマーおよび逆方向プライマー、そしてプライマーセットBの順方向プライマーおよび逆方向プライマーの封入に基づいて、2つの新しい変異を導入する、一連の6つの反応中で、EgD9eS-L35GにS9D、A21V、V32F、Y84C、L108G、W132T、M143N、L161T、I179R、C236N、およびQ244N変異を導入した表29。一連の反応の最初のテンプレートがEgD9eS-L35Gであった一方、Change-IT商標反応1の生成物がChange-IT商標反応2のテンプレートの役割を果たした。より具体的には、それぞれ2.5μlの10×Change-IT商標緩衝液、2.5μlのリン酸化順方向プライマー、2.5μlのリン酸化逆方向プライマー、1.0μlのテンプレート50ng/μl、15.5μlのヌクレアーゼ非含有水、および1.0μlのChange-IT商標FideliTaq酵素を含んでなる、2つの25μlのPCR反応混合物を調製した。第1の反応がプライマーセットAからのプライマーを利用した一方、第2の反応はプライマーセットBからのプライマーを利用した。以下の条件を使用して、PCR増幅を実施した。95°Cで2分間、それに続く95°Cで30秒間の変性、55°Cで30秒間のアニーリング、および68°Cで25分間の伸長/ライゲーションを30サイクル。68°Cで30分間の最終伸長/ライゲーションサイクルを実施し、4°Cでの反応終結がそれに続いた。増幅に続いて、DpnI酵素の添加によってテンプレートを除去し、消化を37°Cで3時間実施した。PCRDNAを使用して、電気穿孔によって大腸菌E.coliTop10エレクトロコンピテント細胞カタログ番号C404052;Invitrogen,Carlsbad,CAを形質転換した。形質転換細胞を100mg/Lのアンピシリン添加LB寒天プレート上に塗り広げ、37°Cのインキュベーター内で一晩培養した。製造業者のプロトコルに従って、QIAprep登録商標SpinMiniprepキットQiagenInc.,Valencia,CAを使用して、形質転換大腸菌E.coli細胞からプラスミドDNAを抽出した。次に精製DNAを次のChange-IT商標反応でテンプレートとして使用した。11個の変異の残りを最初のEgD9eS-L35Gテンプレートに導入する6つ目の反応に続いて、上述したように形質転換体大腸菌E.coli細胞からDNAを精製した。次にDNAをY.リポリティカY.lipolyticaY2224株前出、実施例10Bに形質転換した。実施例10J:Δ9エロンガーゼ変換効率が改善されたEgD9eS-L35G/S9D/A21V/V32F/Y84C/L108G/W132T/M143N/L161T/I179R/C236N/Q244Nコンビナトリアルライブラリー変異体の同定本実施例は、1野生型タンパク質EgD9eS配列番号3と比較して、LAからEDAへのΔ9エロンガーゼ変換効率が改善された、EgD9eS-L35G/S9D/A21V/V32F/Y84C/L108G/W132T/M143N/L161T/I179R/C236N/Q244Nコンビナトリアルライブラリー変異体の同定;2これらのEgD9eS変異体の配列分析;および3Δ9エロンガーゼ変換効率の改善を確認するための配列決定されたEgD9eS変異体の再現を記載する。EgD9eS-L35G/S9D/A21V/V32F/Y84C/L108G/W132T/M143N/L161T/I179R/C236N/Q244Nコンビナトリアルライブラリー変異体の同定実施例10Bの迅速スクリーニングプレートアッセイを使用して、コンビナトリアルライブラリー実施例10Iからのコンストラクトによる2,388個のヤロウィア属Yarrowia形質転換体の脂肪酸プロファイルをスクリーニングした。これらの変異体のほとんどは、野性型対照EgD9eS配列番号3と比較してLAからEDAへの変換の低下を呈示した。しかし5つの形質転換体は、実施例10Bの確認アッセイに基づいて、対照と比較して改善されたΔ9伸長活性を呈示することが確認された。コロニーPCRを使用して、変異EgD9eS遺伝子のDNA配列を判定した。手短に述べると、無菌ピペットチップを使用して、新鮮画線塗抹プレートから少量の酵母細胞を採取し、細胞を20μlの分子等級水に懸濁した。細胞懸濁液2μlを製造会社TakaraBiotechnologyCo.,LTD.の推奨事項に従って調製したTaKaRaExTaqPCRミックスに移した。コロニーPCRのために使用されたプライマーは、順方向プライマーFBAIN-F配列番号366および逆方向プライマーY1026配列番号367であった。サーマルサイクラープログラムは、94°Cで5分間のテンプレートの最初の変性と、それに続く40サイクルの94°Cで30秒間の変性、56°Cで30秒間のアニーリング、および72°Cで3分間の伸長を含んだ。72°Cで6分間の最終伸長を実施した。PCR産物をプライマーFBAIN-F配列番号366およびY1026配列番号367によって配列決定した。DNA配列データの解析は、変異EgD9eS遺伝子内のヌクレオチド置換、および発現されたアミノ酸置換を明らかにした。表30に示すように、変異EgD9eS遺伝子に、および変異EgD9eS遺伝子を含んでなる変異pZuFmEgD9ESプラスミドに、アミノ酸置換を示唆する名称を与えた。表30のアミノ酸置換に基づいて、部位特異的変異誘発のための新しいプライマーをデザインした。次にメガプライマー内のEgD9eS変異体をpZuFmEgD9ES図2;配列番号115に導入するようにデザインされた反応中で、これらのプライマーを利用し、それによって非変異EgD9eS遺伝子を表30で同定される様々な変異EgD9eS遺伝子で置換した。これは、実施例10Cに記載されるように、QuikChange登録商標IIXL部位特異的変異誘発キットカタログ番号200524;Stratagene,LaJolla,CAを使用して達成された。実施例10Bに記載されるように、これらの変異遺伝子を大腸菌E.coliTop10エレクトロコンピテント細胞に形質転換して、精製し、配列決定し、引き続いてY.リポリティカY.lipolyticaY2224株に形質転換した。このようにして、表30に示される変異EgD9eS遺伝子をプラスミド上に再現し、Y2224株に再導入して戻し、EgD9eSコンビナトリアル変異体によって呈示されるΔ9エロンガーゼ変換効率の改善が、同定されたアミノ酸置換のためであることを確認した。これらの確認アッセイからのデータを表31に提示し、個々のpZuFmEgD9ES対照形質転換体のFAMEプロファイルをコンビナトリアルライブラリーの変異体と比較する。保守的比較のために、各株について示されるデータは、各株についてLAからEDAへの変換が最も高い3分離株のFAMEプロファイルを表す。より具体的には、各株について、実施例10Bに記載されるようにして判定されるTFAの面積パーセントとしての各脂肪酸濃度[TFA]、およびLAからEDAへの変換を下に示し、平均値は灰色で強調され平均として示される。脂肪酸は、実施例10Dの略称に基づいて同定される。配列番号2のコドン最適化EgD9eS遺伝子非変異体を含んでなる、pZuFmEgD9ESで形質転換されたY.リポリティカY.lipolyticaY2224株のクローンは、平均で2.5のEDATFAを産生し、これらの3つのクローンのLAからEDAへの平均変換効率[変換]は約16.1と判定された。対照的に、変異株EgD9EN-427のLAからEDAへの平均変換は17.8または対照との比較で110であった。同様に、変異株EgD9EN-1043のLAからEDAへの平均変換は17.5または対照との比較で108であった。変異株EgD9EN-1534のLAからEDAへの平均変換は16.8または対照との比較で104であり;変異株EgD9EN-1635の平均変換は18.0または対照との比較で111であり;変異株EgD9EN-1734の平均変換は20.0または対照との比較で123であった。したがってこれらの実験は、それによってEgD9eSコンビナトリアルライブラリー変異体EgD9EN-427、EgD9EN-1043、EgD9EN-1534、EgD9EN-1635、およびEgD9EN-1734によって呈示されたΔ9エロンガーゼ変換効率の改善を確認し、改善は4~23の範囲に及んだ。実施例11変異HPGG配列番号181モチーフおよびHDASH配列番号183モチーフΔ5デサチュラーゼ本実施例は、実施例11A、11B、11C、11D、11E、11F、11G、11H、11I、11J、11K、11Land11Mとして分けて記載し、a配列番号180[HxGx]に記載のアミノ酸モチーフであって、配列番号180[HxGx]が配列番号181[HPGG]と同じでないアミノ酸モチーフ;およびb配列番号182[HxxxH]に記載のアミノ酸モチーフであって、配列番号182[HxxxH]が配列番号183[HDASH]と同じでないアミノ酸モチーフを含んでなる、Δ5デサチュラーゼ活性を有する変異ポリペプチドの説明を支持する実験データを記載する。より具体的には、以下が、Δ5デサチュラーゼ活性を有し、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する変異ポリペプチドの説明である。配列番号110[EgD5S-36s157gまたはEgD5S-HPGs_HDgSH];配列番号112[EaD5S-35a158gまたはEaD5S-HaGG_HDgSH];配列番号106[EgD5R-34g158gまたはEgD5R-HgGG_HDAgH];および配列番号108[EgD5R-34g158g347sまたはEgD5R-HgGG_HDAgH_347s]。実施例11A、11C、11D、11E、11F、11G、11H、11I、11J、11K、11L、および11Mはまた、その内容全体を参照によって本明細書に援用する、米国仮特許出願第61/428,277号明細書[代理人整理番号CL5267USPRV、2010年12月30日出願]にも記載される。後述する実施例11D、11E、11F、11H、11I、および11Kでは、国際公開第2008/073367号パンフレットに記載されるY.リポリティカY.lipolyticaY4036U株Leu-、Ura-を宿主として使用した。Y4036U株は、Y2224株Ura3-、Ura3遺伝子の自律変異からのFOA耐性変異体、Y4001株Leu-表現型で17EDAを産生する、Y4001U1株Leu-およびUra-、およびY4036株Leu-表現型で18DGLAを産生するの構築を介して、Y.リポリティカY.lipolyticaATCC20362から誘導された。野性型Y.リポリティカY.lipolyticaATCC20362と比較した、Y4036U株の最終遺伝子型は、次の通りであった。Ura3-,YAT1::ME3S::Pex16,EXP1::EgD9eS::Lip1,FBAINm::EgD9eS::Lip2,GPAT::EgD9e::Lip2,FBAINm::EgD8M::Pex20,EXP1::EgD8M::Pex16,GPD::FmD12::Pex20,YAT1::FmD12::OCT。実施例11A:ミドリムシEuglenagracilisΔ5デサチュラーゼ[EgD5]のための位相モデルの開発ミドリムシE.gracilisからのΔ5デサチュラーゼ[EgD5;米国特許第7,678,560号明細書;配列番号184および185]内のHDASHモチーフの可能な重要性をより良く予測するために、下の論理および分析に基づいて位相モデル図18を開発した。最初に、TMHMMプログラムPredictionoftransmembranehelicesinproteins;TMHMMServerv.2.0,CenterforBiologicalSequenceAnalysis,BioCentrum-DTU,TechnicalUniversityofDenmark,DK-2800Lyngby,Denmarkを使用して、EgD5の膜貫通ドメインの分析を実施した。予測は、NおよびC末端の双方が膜の細胞質側に位置する、6つの膜貫通らせんアミノ酸残基103~125、130~152、165~187、234~256、280~302、および306~328を示唆した。以下のEgD5の相同体を使用して、同様のTMHMM分析を実施した。GenBank受入番号AAT09160[ニッチアクロステリウムNitzschiaclosteriumミヌティシマminutissima品種]、GenBank受入番号BAG71007[オブロンギキトリウム属OblongichytriumSEK347種]、およびGenBank受入番号AAL92562[フェオダクチラムトリコルナタムPhaeodactylumtricornutum]。各相同体毎に、4つの膜貫通部分が予測され、それはEgD5で予測された最初の2つおよび最後の2つの膜貫通ドメインに相当した。膜結合脂肪酸デサチュラーゼは3つのヒスチジンに富むHisに富むモチーフ、HX3-4H配列番号186および187、HX2-3HH配列番号188および189、およびH/QX2-3HH配列番号190および191を特徴とする、膜二鉄タンパク質のスーパーファミリーに属する。これらのHisに富む残基は、膜の細胞質面に位置することが予測されており、酵素活性に重要であることが示されているShanklin,J.etal.,Biochemistry,33:12787-127941994;Shanklin,J.,andCahoon,E.B.,Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.,49:611-6411998。EgD5内では、最初のHisに富む領域HDASH[配列番号183]が、アミノ酸残基165~187に及ぶ第3の予測された膜貫通部分の前に位置する一方、第2のHisに富む領域HIMRHH[配列番号189]はこの膜貫通部分の後ろに位置する。第3の膜貫通部分が実際に膜の内外にまたがれば、第2のHisに富む領域は細胞膜周辺腔内に位置し、したがってその鉄活性部位への関与を妨げる。その結果、第3の膜貫通部分アミノ酸残基165~187または第4の膜貫通部分アミノ酸残基234~256のどちらも、膜貫通でないというという仮説が立てられた。これは3つのΔ5デサチュラーゼ相同体すなわちGenBank受入番号AAT09160、BAG71007、およびAAL92562のTMHMM予測と一致した。Δ5デサチュラーゼ基質すなわちDGLA、ETAは高度に疎水性であるので、恐らく脂質二重層内に分配されることが推測された。同様に、3つのHisに富むクラスターから組み立てられる活性部位は、恐らく膜表面にまたはその非常に近くに現れることが推測された。したがって、それぞれ残基165~187および234~256の間に発見され、TMHMMによって最初は膜を貫通すると予測された第3および第4の膜貫通部分は、そうではなく、膜表面近くに位置して、活性部位が確実に膜の近くに配置されるようにすることが予測された。アミノ酸残基103~125、130~152、280~302、および306~328の膜貫通領域は、TMHMMによる予測通りであった。このようにして、EgD5について予測された最終トポロジーモデルを図18に示す。垂直の円柱が膜貫通ドメインを示す一方、水平の円柱は膜を貫通しないが、内膜表面近くに位置する2つの高度に疎水性の領域を示す。丸は、恐らくは活性部位に関与するHis残基に相当する。HPGG配列番号181モチーフおよびHDASH配列番号183モチーフの位置もまた同定された。最後に、中が細胞質空間に対応するのに対し、外は細胞膜周辺腔に相当する。実施例11B:デサチュラーゼ中の天然HDASH配列番号183モチーフ変動の測定選択されたデサチュラーゼタンパク質配列を検査して、HDASH配列番号183モチーフ内に自然変動が起きたかどうかを判定した。具体的には、デサチュラーゼタンパク質としては、ミドリムシEuglenagracilisΔ5デサチュラーゼ[EgD5;米国特許第7,678,560号明細書]と、モルティエラアルピナMortierellaalpinaΔ5デサチュラーゼ[MaD5;米国特許第5,972,664号明細書]と、その他の既知のΔ5デサチュラーゼに対するおよび/またはΔ5デサチュラーゼに密接に関係していることが知られているΔ6デサチュラーゼに対するBLASTヒットとが挙げられる。LASERGENEバイオインフォマティクス演算スイートDNASTARInc.,Madison,WIのMegAlign商標プログラムを使用して、選択された配列を配列比較し、HDASHモチーフまたはその変種を下の表32に要約する。上の分析に基づいて、HDASH配列番号183モチーフのAsp[D]残基は恐らくGlu残基[E]によって置換され、Ala[A]残基は恐らくGly[G]、Ser[S]、Phe[F]、Tyr[Y]またはMet[M]残基によって置換され、および/またはHDASH配列番号183モチーフのSer[S]残基は恐らくCys[C]、Asn[N]、Gly[G]、Ala[A]またはThr[T]残基によって置換され得るようであった。実施例11C:野生型ミドリムシEuglenagracilisΔ5デサチュラーゼ[EgD5]の配列米国特許第7,678,560号明細書は、ミドリムシE.gracilisからのΔ5デサチュラーゼすなわちEgD5、配列番号185の単離およびクローニングを記載する。最近、クローンされたEgD5のより詳細な分析が、以前に認識されていなかった、EgD5Rと称されて本明細書で配列番号192および193として記載される、もう1つの変種野生型ミドリムシE.gracilisΔ5デサチュラーゼ配列を同定した。米国特許第7,678,560号明細書に記載されるEgD5の位置347のSer残基の代わりに、EgD5R配列番号193は、位置347にArg残基を含んでなる。この矛盾は、PCRまたはcDNA作成手順の結果として生じるという仮説が立てられた。具体的には、ミドリムシE.gracilisの二本鎖cDNAをテンプレートとして5’-および3’-RACE技術を使用して、EgD5配列番号184;米国特許第7,678,560号明細書の配列番号1に相当するが得られた米国特許第7,678,560号明細書の実施例4~5。次にミドリムシE.graciliscDNAをテンプレートとして使用して、ミドリムシE.gracilisΔ5デサチュラーゼをコードするORFをPCRによって増幅し、精製して制限酵素消化して、次に適切なベクターに一方向性にライゲートしてpDMW367を得た米国特許第7,678,560号明細書の実施例6。pDMW367の配列は、米国特許第7,678,560号明細書で配列番号23として提供された本明細書の配列番号194に相当する。米国特許第7,678,560号明細書では、pDMW367はキメラFBAIN::EgD5::Pex20遺伝子を含んでなると報告されたが、このキメラ遺伝子内のΔ5デサチュラーゼ配列は、実際にはEgD5R配列番号192のヌクレオチド配列であることが今は理解されている。EgD5配列番号184とEgD5R配列番号192図19Aおよび19Bの配列比較は、4つのヌクレオチドの相違を示し、配列番号184に関する変異は、G819GA、T948C、C1041A、およびG1349Aである。G1349Aの変異は、pDMW367へのクローニングのためにEgD5を増幅するのに利用される、特定プライマー配列に起因する。EgD5配列番号185およびEgD5Rすなわち配列番号193の翻訳産物の配列比較は、単一アミノ酸の相違、すなわちS347Rの変異を明らかにする。米国特許第7,678,560号明細書の実施例9はまた、Y.リポリティカY.lipolytica中での発現のためにコドン最適化された、EgD5に由来する、合成Δ5デサチュラーゼすなわちEgD5S;配列番号195および196の作成を記載する。EgD5のコドン最適化は、1350bpのコード領域の内196bp14.5の修飾、および全449コドンの内189コドン42の最適化をもたらした。コドン最適化EgD5S遺伝子すなわち配列番号196によってコードされるタンパク質配列は、野生型タンパク質配列すなわち配列番号185と同一であり、347位置のアミノ酸はSerである。実施例11D:4つの制限エンドヌクレアーゼ部位が除去された野生型EgD5Rを含んでなるコンストラクトpDMW367-M4[EgD5R]の作成本実施例は、キメラFBAIN::EgD5R::Pex20遺伝子を含んでなるプラスミドpDMW367-M4図20A、20B、および20Cの構築を記載する。EgD5R配列番号197は、引き続くクローニング手順を容易にするために作成された野生型EgD5R配列番号192の修飾変種であり、修飾は、野生型EgD5Rコード領域からの4つの制限酵素部位すなわちEcoRI、HindIII、BglII、およびNcoIの除去をもたらした。EgD5R配列番号193およびEgD5R配列番号198のアミノ酸配列は、同一であった。具体的には、プラスミドpDMW367-M4配列番号199;図20Cは、pDMW367配列番号194、実施例11C;図20Aに由来した。EgD5Rコード領域から、天然EcoRI、HindIII、BglII、およびNcoI制限酵素部位を逐次除去して、pDMW367-M4を作成した。最初に、pDMW367配列番号194をテンプレートとして、2対のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して、生体外変異誘発によってEcoRIおよびBglII部位を除去した。YL813配列番号200およびYL814配列番号201のプライマー対が、EcoI部位の変異を可能にした一方、YL815配列番号202およびYL816配列番号203のプライマー対は、BglII部位の変異を可能にした。これらの反応は、コンストラクトpDMW367-M2図20B;配列番号204を生成した。配列分析は、pDMW367-M2中の変種EgD5Rのアミノ酸配列が、pDMW367中のEgD5Rのアミノ酸配列と同一であることを確認した。次に、pDMW367-M2をテンプレートとして、2対のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して、生体外変異誘発によってHindIIIおよびNcoI部位を除去した。YL829配列番号205およびYL830配列番号206のプライマー対が、HindIII部位の変異を可能にした一方、YL831配列番号207およびYL832配列番号208のプライマー対は、NcoI部位の変異を可能にした。これは、pDMW367-M4の生成をもたらした。この場合もやはり、配列分析は、pDMW367-M4中の変種EgD5すなわちEgD5Rのアミノ酸配列が、pDMW367中のEgD5Rのアミノ酸配列と同一であることを確認した。引き続く実施例では、野生型EgD5への言及は、特に断りのない限り、事実上、EgD5R配列番号192および193およびEgD5R配列番号197および198への言及を含む。実施例11E:EgD5RのΔ5デサチュラーゼ活性と同様のΔ5デサチュラーゼ活性をもたらすHDxSH配列番号434変異の同定HDASH配列番号183モチーフは、EgD5R配列番号198のアミノ酸残基155から159に広がる。pDMW367-M4実施例11Dをテンプレートとして、19対のオリゴヌクレオチド配列番号209~246;後述の表33をプライマーとして使用して、単一アミノ酸変異を実施し、部位特異的変異誘発QuickChangeKit,Stratagene,CAによって、EgD5RのHDASH配列番号183モチーフのAla残基を個々に変異させ、それによって全ての可能なアミノ酸置換を作り出したすなわちHDxSH[配列番号434]変異体。各変異からのプラスミドを大腸菌E.coliXL2Blue細胞に形質転換した。19個の各形質転換から3個のコロニーを拾い、液体培地中において37°Cで一晩、個別培養した。プラスミドすなわち合計57個をこれらの培養物から単離し、個々に配列決定して変異を確認した。一般方法に記載されるように、野性型pDMW367-M4プラスミドおよび単離された変異プラスミドをY.リポリティカY.lipolyticaY4036U1株に個々に形質転換した。形質転換体をMMLeuプレート上で選択した。30°Cで2日間の培養後、形質転換反応からの各3つの形質転換体を新しいMMLeuプレート上に画線塗抹し、30°Cでさらに2日間培養した。次にコロニーを使用して、24ウェルQiagenブロック内の3mLのMMLeuに接種した。30°Cの恒温器内でブロックを200rpmで振盪しながら、インキュベートした。培養物を2日間インキュベートした後、ブロックを遠心分離して上清を除去し、3mLのHGMを添加した。ブロックを30°Cの恒温器内に戻し、さらに5日間200rpmで振盪した。細胞を遠心分離により収集して脂質を抽出し、エステル交換により脂肪酸メチルエステル[FAME]を調製して、引き続いてHewlett-Packard6890GCで分析した。各変異HDASH配列番号183モチーフに起因する、Δ5デサチュラーゼ活性3つの形質転換体の平均を下の表33に要約する。EgD5R変異体を含んでなる、変異pDMW367M4コンストラクトを含んでなる、形質転換体は、EgD5R内の位置157のAla残基で起きたアミノ酸置換に準じて命名されるすなわち形質転換体pDMW367M4-157cは、EgD5R-157cと称される、位置157でAlaを置換するCysを有し、それによってHDcSH[配列番号390]モチーフをもたらす、変異Δ5デサチュラーゼを含んでなり;形質転換体pDMW367M4-157gは、EgD5R-157gと称される、Alaを置換するGlyを有し、それによってHDgSH[配列番号429]モチーフなどをもたらす、変異Δ5デサチュラーゼを含んでなる。変換効率Avg.Conv.Effic.は、次式に従って測定された。[生成物]/[基質生成物]100式中、生成物は、即時生成物と、経路中のそれから誘導される全ての生成物とを含む。結果はプラスミドpDMW367-M4内の野生型EgD5R配列番号198と比較され、GC分析は、形質転換体によって総脂質の10.8のDGLAおよび3.6のARAが生成されたと判定したすなわち平均変換効率は24.8であった。上に基づいて、HDASH配列番号183モチーフ内のAla残基は、EgD5RのΔ5デサチュラーゼ活性に実質的に影響を及ぼすことなく、GlyまたはSerのいずれかで置換し得ることが明らかである。具体的には、pDMW367M4-157g形質転換体中のEgD5R-157g配列番号247が、23.8の変換効率でDGLAをARAに変換できたのに対し、pDMW367M4-157s形質転換体中のEgD5R-157s配列番号248は、23.3の変換効率でDGLAをARAに変換できた。実施例11F:EgD5RのΔ5デサチュラーゼ活性と同様のΔ5デサチュラーゼ活性をもたらすHDAxH配列番号435変異の同定pDMW367-M4実施例11Dをテンプレートとして、19対のオリゴヌクレオチド配列番号249~286;後述の表34をプライマーとして使用して、単一アミノ酸変異を実施し、部位特異的変異誘発QuickChangeKit,Stratagene,CAによって、EgD5R配列番号198のHDASH配列番号183モチーフのSer残基を個々に変異させ、それによって全ての可能なアミノ酸置換を作り出したすなわちHDAxH[配列番号435]変異体。実施例11Eに記載されるようにして、変異誘発に続いてプラスミドをヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaY4036U1に形質転換し、MMLeuおよびHGM中で形質転換体を選択して培養し、FAMEを調製してGCによって分析した。HDASH配列番号183モチーフ内の各変異に起因する、Δ5デサチュラーゼ活性3つの形質転換体の平均を下の表34に要約する。EgD5R変異体を含んでなる、変異pDMW367M4コンストラクトを含んでなる、形質転換体は、EgD5R内の位置158のSer残基で起きたアミノ酸置換に準じて命名されるすなわち形質転換体pDMW367M4-158aは、EgD5R-158aと称される、位置158でSerを置換するAlaを有し、それによってHDAaH[配列番号431]モチーフをもたらす、変異Δ5デサチュラーゼを含んでなり;形質転換体pDMW367M4-158rは、EgD5R-158rと称される、Serを置換するArgを有し、それによってHDArH[配列番号419]モチーフをもたらす、変異Δ5デサチュラーゼなどを含んでなる。変換効率は、実施例11Eに記載される式に従って判定した。結果をプラスミドpDMW367-M4内の野生型EgD5R配列番号198と比較し、GC分析は、形質転換体によって総脂質の11.3のDGLAおよび3.4のARAが生成されたと判定したすなわち平均変換効率は23.3であった。結果は、HDASH配列番号183モチーフ内のSer残基が、EgD5RのΔ5デサチュラーゼ活性に実質的に影響を及ぼすことなく、AlaまたはGlyのいずれかで置換し得ることを実証した。具体的には、pDMW367M4-158a形質転換体中のEgD5R-158a配列番号287が23.5の変換効率でDGLAをARAに変換できたのに対し、pDMW367M4-158g形質転換体中のEgD5R-158g配列番号288は、25.1の変換効率でDGLAをARAに変換できた。実施例11G:EgD5RのΔ5デサチュラーゼ活性と同様のΔ5デサチュラーゼ活性をもたらすHxGx配列番号180およびHDxxH配列番号424変異の同定米国特許出願公開第2010-0075386-A1号明細書は、チトクロームb5様ドメインのHPGG配列番号181モチーフ内に少なくとも1つの変異を有する、変異Δ5デサチュラーゼを記載するすなわちHxGx[配列番号180]変異。HPGG配列番号181モチーフは、EgD5R配列番号198のアミノ酸残基33から36に広がる。本実施例は、EgD5R-157g実施例11E、配列番号247、EgD5R-158a実施例11F、配列番号287、およびEgD5R-158g実施例11F、配列番号288のHPGG配列番号181モチーフ内に変異を導入して、HPGG配列番号181およびHDASH配列番号183ドメイン内の二重変異の効果を調べる。pDMW367M4-157g実施例11E、配列番号289,pDMW367M4-158a実施例11F、配列番号290、およびpDMW367-158g実施例11F、配列番号291をテンプレートとして、数対のオリゴヌクレオチド配列番号292~297;表35をプライマーとして使用して、単一アミノ酸変異を実施し、部位特異的変異誘発QuickChangeKit,Stratagene,CAによって、変異Δ5デサチュラーゼ遺伝子のHPGG配列番号181モチーフのPro残基または第2のGly残基のいずれかを個々に変異させ、それによってHPGG配列番号181およびHDASH配列番号183モチーフ内に二重変異を作り出した。実施例11Eに記載されるようにして、変異誘発に続いてプラスミドをY.リポリティカY.lipolyticaY4036U1株に形質転換し、MMLeuおよびHGM中で形質転換体を選択して培養し、FAMEを調製してGCによって分析した。HxGx配列番号180およびHDxxH配列番号424変異の双方がある、変異Δ5デサチュラーゼのΔ5デサチュラーゼ活性を下の表35に要約する。EgD5R変異体を含んでなる、変異pDMW367M4コンストラクトを含んでなる、形質転換体は、EgD5RのHDASH配列番号183モチーフ内のAla残基またはSer残基のアミノ酸置換と組み合わさった、EgD5RのHPGG配列番号181モチーフ内のPro残基または第2のGly残基のアミノ酸置換に準じて命名される。すなわち、例えば形質転換体pDMW367-34g158gは、EgD5R-34g158gと称される、位置34でProを置換するGlyを有しそれによってHgGG[配列番号425]モチーフをもたらし、位置158でSerを置換するGlyを有するそれによってHDAgH[配列番号432]モチーフをもたらす、変異Δ5デサチュラーゼを含んでなる。変換効率は、実施例11Eに記載される式に従って判定した。結果はプラスミドpDMW367-M4内の野生型EgD5Rと比較され、GC分析は、形質転換体によって総脂質の11.7のDGLAおよび4.4のARAが生成されたと判定したすなわち平均変換効率は27.5であった。結果は、HPGG配列番号181モチーフおよびHDASH配列番号183モチーフがΔ5デサチュラーゼ酵素活性にとって重要ではあるが、野生型と比べて少なくとも64のΔ5デサチュラーゼ活性を保つ、HxGx配列番号180およびHDxxH配列番号424モチーフを有するデサチュラーゼが構築されてもよいことを実証した。具体的には、1HDASH配列番号183モチーフ内のAla残基のGlyによる置換;または2残基HDASH配列番号183モチーフ内のSerのAlaまたはGlyによる置換のいずれかの同時置換と共に、HPGG配列番号181モチーフ内のPro残基をGlyで置換し得る。HDASH配列番号183モチーフ内のSer残基のAlaまたはGlyのいずれかによる同時置換と共に、HPGG配列番号181モチーフ内のPro残基もまたHisで置換し得る。そしてHDASH配列番号183モチーフ内のSerのAlaまたはGlyのいずれかによる同時置換と共に、HPGG配列番号181モチーフ内の第2のGly残基をSerで置換し得る。好ましい二重変異体は、EgD5R-34g157g配列番号298および299;pDMW367-34g157g形質転換体中において22.9の変換効率でDGLAをARAに変換できる、EgD5R-34g158a配列番号300および301;pDMW367-34g158a形質転換体中において24.3の変換効率でDGLAをARAに変換できる、およびEgD5R-34g158g配列番号302および303;pDMW367-34g158g形質転換体中において26.8の変換効率でDGLAをARAに変換できるであった。実施例11H:EgD5R-34g158gに由来する、ヤロウィアリポリティカYarrowialipolytica中における発現のためのN末端コドン最適化変異Δ5デサチュラーゼ遺伝子EgD5Mの合成米国特許第7,125,672号明細書に記載されるのと同様の方法で、EgD5R-34g158g配列番号302、実施例11Gの5’部分のコドン使用頻度をY.リポリティカY.lipolytica中での発現のために最適化した。具体的には、EgD5R-34g158gの最初の204bpをコドン最適化して、EgD5M配列番号105および106と称されるコドン最適化Δ5デサチュラーゼ遺伝子の合成をもたらした。EgD5Mは、ヤロウィア属Yarrowiaコドン使用頻度パターン米国特許第7,125,672号明細書ATG翻訳開始コドン周囲の共通配列、およびRNA安定性の一般則Guhaniyogi,G.andJ.Brewer,Gene,2651-2:11-232001に従って、EgD5R-34g158gのΔ5デサチュラーゼ遺伝子のコード配列に基づいてデザインされた。翻訳開始部位の修飾の他に、コード領域のN末端内の204bpの内52bpが修飾され25.5;図21、デサチュラーゼタンパク質のN末端内の68個のアミノ酸の内45個のコドンが最適化された66.2。NcoI部位およびNotI部位は、EgD5Mの翻訳開始コドン周囲および停止コドン後に、それぞれ組み込まれた。コドン最適化EgD5M遺伝子すなわち配列番号106によってコードされるタンパク質配列は、野生型EgD5R-34g158gタンパク質配列すなわち配列番号303と同一である。デザインされたEgD5M遺伝子配列番号105は、GenScriptCorporationPiscataway,NJによって合成され、pUC57GenBank受入番号Y14837にクローンされて、pEgD5M図22A;配列番号304を生じた。実施例11I:EgD5Mを含んでなるコンストラクトpDMW367-5Mの作成本実施例は、キメラFBAIN::EgD5M::Pex20遺伝子を含んでなる、プラスミドpDMW367-5Mの構築を記載する。pDMW367-M4図20C;配列番号199のNcoI/NotIEgD5R断片をpEgD5M図22A;配列番号304からのNcoI/NotIEgD5M断片で置換して、プラスミドpDMW367-5M図22B;配列番号305を構築した。このライゲーションの生成物はpDMW367-5Mであり、それは以下の構成要素を含有した。実施例11J:N末端コドン最適化変異Δ5デサチュラーゼ遺伝子の変種EgD5M1を含んでなるコンストラクトpDMW367-5M1の作成本実施例は、キメラFBAIN::EgD5M1::Pex20遺伝子を含んでなる、プラスミドpDMW367-5M1配列番号307の構築を記載する。EgD5M中の位置347のArgのためのCGAコドンが、EgD5M1中ではSerのためのAGCコドンをコードするように変化していることを除いて、EgD5M1配列番号107のヌクレオチド配列は、EgD5M配列番号105と同一である。この修飾は、Δ5デサチュラーゼ活性に対する、R347S変異実施例11Cに記載されるの効果を分析するためにデザインされた。デザインされたEgD5M1遺伝子EgD5R-34g158g347sとも称される;配列番号107は、GenScriptCorporationPiscataway,NJによって合成され、pUC57GenBank受入番号Y14837にクローンされて、pEgD5M1配列番号306を生じた。pDMW367-M4図20C;配列番号199のNcoI/NotIEgD5R断片をpEgD5M1配列番号306からのNcoI/NotIEgD5M1断片で置換して、プラスミドpDMW367-5M1配列番号307を構築した。このライゲーションの生成物は、キメラFBAIN::EgD5M1::Pex20遺伝子を含んでなるpDMW367-5M1であった。実施例11K:ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaY4036U1株中のEgD5MおよびEgD5M1Δ5デサチュラーゼの機能分析対照プラスミドpDMW367-M4配列番号199;実施例11DおよびプラスミドpDMW367-5M配列番号305;実施例11IおよびpDMW367-5M1配列番号307;実施例11JをY.リポリティカY.lipolyticaY4036U1株に、それぞれ別々に形質転換した。実施例11Eに記載されるようにして、形質転換体をMMLeuおよびHGM上で選択して培養し、FAMEを調製してGCによって分析した。EgD5R、EgD5M、およびEgD5M1のΔ5デサチュラーゼ活性3つの形質転換体の平均を下の表37に要約する。変換効率Conv.Effic.は、実施例11Eに記載される式に従って判定した。結果はプラスミドpDMW367-M4内の野生型EgD5R配列番号198と比較され、GC分析は、形質転換体によって総脂質の10.8のDGLAおよび3.6のARAが生成されたと判定したすなわち平均変換効率は24.8であった。結果は、EgD5M配列番号106およびEgD5M1配列番号108の双方が、野生型EgD5R配列番号198よりも高いΔ5デサチュラーゼ活性を有したことを実証した。EgD5Mと比べて改善されたEgD5M1のΔ5デサチュラーゼ活性は、アミノ酸残基347がタンパク質のΔ5デサチュラーゼ活性に影響を及ぼし、Argとは対照的にSerが好ましいことを実証する。実施例11L:ヤロウィアリポリティカYarrowialipolytica中での発現のためにコドン最適化された、ミドリムシEuglenagracilisに由来する、合成Δ5デサチュラーゼ遺伝子EgD5S中のHPGs配列番号427およびHxxxH配列番号186変異の同定本実施例は、変異EgD5S-36sまたはEgD5S-HPGs遺伝子のHDASH配列番号183モチーフ内に変異を導入して、HPGG配列番号181およびHDASH配列番号183の保存ドメイン内の二重変異の効果を判定する。EgD5S配列番号195および196は、Y.リポリティカY.lipolytica中での発現のためにコドン最適化された、EgD5実施例11Cに由来する合成Δ5デサチュラーゼである米国特許第7,678,560号明細書。EgD5Sのアミノ酸配列はEgD5と同一であるが、ヌクレオチド配列が異なり;具体的には、翻訳開始部位の修飾に加えて、1350bpのコード領域の内196bp14.5が修飾され、189コドン42が最適化されていた。GC含有量は、野性型遺伝子すなわちEgD5内の55.5から、合成遺伝子すなわちEgD5S内の54.4に低下した。そしてNcoI部位およびNotI部位は、EgD5Sの翻訳開始コドン周囲および停止コドン後に、それぞれ組み込まれた。米国特許出願公開第2010-0075386-A1号明細書の実施例1~4は、チトクロームb5様ドメインのアミノ酸残基33~36に広がる、EgD5SのHPGG配列番号181モチーフ内の第2のGly残基の修飾すなわちHPGx[配列番号436]変異を標的とする、部位特異的変異誘発反応のテンプレートとしてEgD5Sを使用した、変異EgD5S-36s配列番号308の同定を記載する。このようにして、変異EgD5S-36sはHPGs配列番号427モチーフを含んでなり、ここでHPGG配列番号181モチーフの第2のGly残基は、EgD5S配列番号196をテンプレートとして使用してSerによって置換された。EgD5S-36sのΔ5デサチュラーゼ活性米国特許出願公開第2010-0075386-A1号明細書は、EgD5SのΔ5デサチュラーゼ活性の約106.9であった。プラスミドpDMW369S配列番号309は変異EgD5S-36s遺伝子を含有し;ベクター構成要素は、EgD5M遺伝子の代わりに変異EgD5S-36s遺伝子があることを除いて、pDMW367-5M本明細書の図22Bと同様である。実施例11Gにおける二重EgD5R変異体すなわち変異HPGG[配列番号181]と変異HDASH[配列番号183]モチーフを同時に含んでなるの成功裏の作成に基づいて、同様のHxxxH配列番号186変異をEgD5S-36sに導入した際に、耐容されることが予期された。具体的には、pDMW369SキメラFBAIN::EgD5S-36S::Pex20遺伝子を含んでなるをテンプレートとして、9対のオリゴヌクレオチド配列番号310~327;表38をプライマーとして使用して、単一アミノ酸変異を実施し、部位特異的変異誘発QuickChangeKit,Stratagene,CAによって、EgD5S-36s配列番号308のHDASH配列番号183モチーフ内のAsp、AlaまたはSer残基のいずれかを個々に変異させ、それによって選択された9個のアミノ酸置換を作り出した。実施例11Eに記載されるようにして、変異誘発に続いてプラスミドをY.リポリティカY.lipolyticaY4036U1株に形質転換し、MMLeuおよびHGM中で形質転換体を選択して培養し、FAMEを調製してGCによって分析した。HPGs配列番号427およびHxxxH配列番号186変異の双方がある、変異Δ5デサチュラーゼのΔ5デサチュラーゼ活性3つの形質転換体の平均を下の表38に要約する。EgD5S-36sの変異体を含んでなる、変異pDMW369Sコンストラクトを含んでなる、形質転換体は、HDASH配列番号183モチーフ内のAsp、AlaまたはSer残基で起きたアミノ酸置換に準じて命名されるすなわち形質転換体pDMW369S-156eは、EgD5S-36s156eと称される、位置156でAspを置換するGluを有し、それによってHeASH[配列番号433]モチーフをもたらす、変異Δ5デサチュラーゼを含んでなり;形質転換体pDMW369S-157gはEgD5S-36s157gと命名される変異Δ5デサチュラーゼを含んでなり、Alaを置換するGlyを有し、それによってHDgSH[配列番号429]モチーフなどをもたらす。変換効率は、実施例11Eに記載される式に従って判定した。結果はプラスミドpDMW369S内のEgD5S-36S配列番号308と比較され、GC分析は、形質転換体によって総脂質の8.1のDGLAおよび6.8のARAが生成されたと判定したすなわち平均変換効率は45.8であった。結果は、変異HPGGモチーフすなわちHPGs[配列番号427]のみを有する変異EgD5S-36sと比べて、なおも妥当なΔ5デサチュラーゼ活性を保ちながら、コドン最適化EgD5SΔ5デサチュラーゼが、変異HPGG配列番号181および変異HDASH配列番号183モチーフの双方を含んでなるように、修飾され得ることを実証した。好ましい二重変異体は、EgD5S-36s156e配列番号328および329;pDMW369S-156e形質転換体中において36.2の変換効率でDGLAをARAに変換できる、EgD5S-36s157g配列番号109および110;pDMW369S-157g形質転換体中において36.6の変換効率でDGLAをARAに変換できる、EgD5S-36s158a配列番号330および331;pDMW369S-158a形質転換体中において39.1の変換効率でDGLAをARAに変換できる、およびEgD5S-36s158g配列番号332および333;pDMW369S-158g形質転換体中において34.3の変換効率でDGLAをARAに変換できるであった。実施例11M:ヤロウィアリポリティカYarrowialipolytica中での発現のためにコドン最適化された、ユーグレナアナベナEuglenaanabaenaに由来する合成Δ5デサチュラーゼ遺伝子EaD5S中のHaGG配列番号428およびHxxxH配列番号186変異の同定本実施例は、変異EaD5S-35aまたはEaD5S-HaGG遺伝子のHDASH配列番号183モチーフ内に変異を導入して、HPGG配列番号181およびHDASH配列番号183の保存ドメイン内の二重変異の効果を判定する。米国特許第7,943,365号明細書は、E.アナベナE.anabaenaからのΔ5デサチュラーゼすなわちEaD5、配列番号335および336の単離およびクローニングを記載する。次にこの遺伝子は、Y.リポリティカY.lipolytica中での発現のためにコドン最適化され、合成Δ5デサチュラーゼEaD5S配列番号337および338がもたらされる。EaD5Sのアミノ酸配列はEaD5と同一であるが、ヌクレオチド配列が異なり;具体的には、翻訳開始部位の修飾に加えて、1362bpのコード領域の内183bp13.4が修飾され、174コドン38.3が最適化されていた。GC含量は野性型遺伝子すなわちEaD5;配列番号335内の57.6から、合成遺伝子すなわちEaD5S;配列番号337内の54.6に低下した。そしてNcoI部位およびNotI部位は、EaD5Sの翻訳開始コドン周囲および停止コドン後に、それぞれ組み込まれた。米国特許出願公開第2010-0075386-A1号明細書の実施例6は、チトクロームb5様ドメインのアミノ酸残基34~37に広がる、EaD5SのHPGG配列番号181モチーフのPro残基の修飾すなわちHxGG[配列番号437]変異を標的とする、部位特異的変異誘発反応のテンプレートとしてEaD5Sを使用した、変異EaD5S-35a配列番号334の同定を記載する。このようにして、変異EaD5S-35a配列番号334はHaGG配列番号428モチーフを含んでなり、ここでHPGG配列番号181モチーフのPro残基は、EaD5S配列番号338をテンプレートとして使用してAlaで置換された。EaD5S-35aのΔ5デサチュラーゼ活性米国特許出願公開第2010-0075386-A1号明細書は、EaD5SのΔ5デサチュラーゼ活性の約99.2であった。プラスミドpZuFmEaD5S-AS配列番号339は変異EaD5S-35a遺伝子を含有し;ベクター構成要素は、EgD5M遺伝子の代わりに変異EaD5S-35a遺伝子があることを除いて、pDMW367-5M本明細書の図22B;配列番号305と同一である。実施例11Gにおける二重EgD5R変異体、および実施例11Lにおける二重EgD5S変異体すなわち変異HPGG[配列番号181]と変異HDASH[配列番号183]モチーフを同時に含んでなるの成功裏の作成に基づいて、同様のHxxxH配列番号186変異をEaD5S-35aに導入した際に、耐容されることが予期された。HDASH配列番号183モチーフは、EaD5SおよびEaD5S-35aのアミノ酸残基156~160に広がる。pZuFmEaD5S-ASキメラFBAIN::EaD5S-35a::Pex20遺伝子を含んでなるをテンプレートとして、9対のオリゴヌクレオチド配列番号340~361;表39をプライマーとして使用して、単一アミノ酸変異を実施し、部位特異的変異誘発QuickChangeKit,Stratagene,CAによって、EaD5S-35a配列番号334のHDASH配列番号183モチーフ内のAsp、AlaまたはSerを個々に変異させ、それによって選択された9個のアミノ酸置換を作り出した。実施例11Eに記載されるようにして、変異誘発に続いてプラスミドをY.リポリティカY.lipolyticaY4036U1株に形質転換し、MMLeuおよびHGM中で形質転換体を選択して培養し、FAMEを調製してGCによって分析した。HaGG配列番号428およびHxxxH配列番号186変異を含んでなる、変異Δ5デサチュラーゼのΔ5デサチュラーゼ活性3つの形質転換体の平均を下の表39に要約する。EaD5S-35aの変異体を含んでなる、変異pZuFmEaD5S-ASコンストラクトを含んでなる、形質転換体は、HDASH配列番号183モチーフ内のAsp、AlaまたはSer残基で起きたアミノ酸置換に準じて命名される。すなわち形質転換体pZuFmEaD5S-AS-157eは、EaD5S-35a157eと称される、位置157でAspを置換するGluを有し、それによってHeASH[配列番号433]モチーフをもたらす、変異Δ5デサチュラーゼを含んでなり;形質転換体pZuFmEaD5S-AS-158gは、EaD5S-35a158gと称される、Alaを置換するGlyを有し、それによってHDgSH[配列番号429]モチーフなどをもたらす、変異Δ5デサチュラーゼを含んでなる。変換効率は、実施例11Eに記載される式に従って判定した。結果はプラスミドpZuFmEaD5S-AS内のEaD5S-35a配列番号334と比較され、GC分析は、形質転換体によって総脂質の8.6のDGLAおよび5.1のARAが生成されたと判定したすなわち平均変換効率は37.2であった。結果は、変異HPGGモチーフすなわちHaGG[配列番号428]のみを有する変異EaD5S-35aと比べて、なおも妥当なΔ5デサチュラーゼ活性を保ちながら、コドン最適化EaD5SΔ5デサチュラーゼが、変異HPGG配列番号181および変異HDASH配列番号183モチーフの双方を含んでなるように、修飾され得ることを実証した。好ましい二重変異体は、EaD5S-35a158g配列番号111および112;pZuFmEaD5S-AS-158g形質転換体中において28.4の変換効率でDGLAをARAに変換できる、EaD5S-35a158s配列番号362および363;pZuFmEaD5S-AS-158s形質転換体中において27.4の変換効率でDGLAをARAに変換できる、およびEaD5S-35a159g配列番号364および365;pZuFmEaD5S-AS-159g形質転換体中において26.5の変換効率でDGLAをARAに変換できるであった。"