"植物体内で目的のsiRNAを産生させるためのsiRNA産生用ベクターであって、二本鎖RNAを形成させて1次siRNAを産生させるための任意のセンス鎖配列とそのアンチセンス鎖配列をプロモーターとターミネーターの間に有してなるユニットAと、目的のsiRNAが標的とする遺伝子の配列を組み込むためのマルチクローニングサイトと1次siRNAが結合する配列をプロモーターとターミネーターの間に有してなるユニットBを少なくとも含み、目的のsiRNAが標的とする遺伝子の配列をユニットBのマルチクローニングサイトに組み込んで植物体内に導入することで、この配列と1次siRNAが結合する配列からなるキメラ配列からキメラRNAが転写され、このキメラRNAにユニットAによって産生された1次siRNAが結合し、これを切断した後、このキメラRNAの切断物の相補鎖が合成されることによって二本鎖RNAが形成され、この二本鎖RNAが分断されることで目的のsiRNAが産生するようにしたことを特徴とするsiRNA産生用ベクター。ユニットAおよびユニットBのプロモーターとして伴細胞で特異的に機能するプロモーターを用いたことを特徴とする請求項1記載のsiRNA産生用ベクター。請求項1または2記載のsiRNA産生用ベクターのユニットBのマルチクローニングサイトに目的のsiRNAが標的とする遺伝子の配列を組み込んで植物体内に導入することで、植物体内で目的のsiRNAを産生させることを特徴とするsiRNA産生方法。請求項1または2記載のsiRNA産生用ベクターのユニットBのマルチクローニングサイトに目的のsiRNAが標的とする遺伝子の配列を組み込んでなることを特徴とするsiRNA産生ベクター。そこで本発明は、植物体内で目的のsiRNAを産生するsiRNA産生ベクターを簡便に作製することができるsiRNA産生用ベクターを提供することを目的とする。上記の点に鑑みてなされた本発明のsiRNA産生用ベクターは、請求項1記載の通り、植物体内で目的のsiRNAを産生させるためのsiRNA産生用ベクターであって、二本鎖RNAを形成させて1次siRNAを産生させるための任意のセンス鎖配列とそのアンチセンス鎖配列をプロモーターとターミネーターの間に有してなるユニットAと、目的のsiRNAが標的とする遺伝子の配列を組み込むためのマルチクローニングサイトと1次siRNAが結合する配列をプロモーターとターミネーターの間に有してなるユニットBを少なくとも含み、目的のsiRNAが標的とする遺伝子の配列をユニットBのマルチクローニングサイトに組み込んで植物体内に導入することで、この配列と1次siRNAが結合する配列からなるキメラ配列からキメラRNAが転写され、このキメラRNAにユニットAによって産生された1次siRNAが結合し、これを切断した後、このキメラRNAの切断物の相補鎖が合成されることによって二本鎖RNAが形成され、この二本鎖RNAが分断されることで目的のsiRNAが産生するようにしたことを特徴とする。また、請求項2記載のsiRNA産生用ベクターは、請求項1記載のsiRNA産生用ベクターにおいて、ユニットAおよびユニットBのプロモーターとして伴細胞で特異的に機能するプロモーターを用いたことを特徴とする。また、本発明のsiRNA産生方法は、請求項3記載の通り、請求項1または2記載のsiRNA産生用ベクターのユニットBのマルチクローニングサイトに目的のsiRNAが標的とする遺伝子の配列を組み込んで植物体内に導入することで、植物体内で目的のsiRNAを産生させることを特徴とする。また、本発明のsiRNA産生ベクターは、請求項4記載の通り、請求項1または2記載のsiRNA産生用ベクターのユニットBのマルチクローニングサイトに目的のsiRNAが標的とする遺伝子の配列を組み込んでなることを特徴とする。本発明によれば、植物体内で目的のsiRNAを産生するsiRNA産生ベクターを簡便に作製することができるsiRNA産生用ベクターを提供することができる。本発明のsiRNA産生用ベクターは、植物体内で目的のsiRNAを産生させるためのsiRNA産生用ベクターであって、二本鎖RNAを形成させて1次siRNAを産生させるための任意のセンス鎖配列とそのアンチセンス鎖配列をプロモーターとターミネーターの間に有してなるユニットAと、目的のsiRNAが標的とする遺伝子の配列を組み込むためのマルチクローニングサイトと1次siRNAが結合する配列をプロモーターとターミネーターの間に有してなるユニットBを少なくとも含み、目的のsiRNAが標的とする遺伝子の配列をユニットBのマルチクローニングサイトに組み込んで植物体内に導入することで、この配列と1次siRNAが結合する配列からなるキメラ配列からキメラRNAが転写され、このキメラRNAにユニットAによって産生された1次siRNAが結合し、これを切断した後、このキメラRNAの切断物の相補鎖が合成されることによって二本鎖RNAが形成され、この二本鎖RNAが分断されることで目的のsiRNAが産生するようにしたことを特徴とするものである。本発明のsiRNA産生用ベクターを用いれば、その都度、標的遺伝子ごとに多くの作業工程を経て逆方向反復塩基配列構造を有するsiRNA産生ベクターを作製する必要はなく、標的遺伝子の配列をユニットBのマルチクローニングサイトに組み込んで植物体内に導入するだけで、この遺伝子に対するサイレンシングを発動するsiRNAを植物体内で産生させることができる。本発明のsiRNA産生用ベクターにおけるユニットAは、二本鎖RNAを形成させて1次siRNAを産生させるための任意のセンス鎖配列とそのアンチセンス鎖配列をプロモーターとターミネーターの間に有してなるものである。ユニットAの構築は、例えば、特許文献1などに記載のヘアピン型のRNAが形成されるためのセンス鎖配列とそのアンチセンス鎖配列との逆方向反復塩基配列構造をプロモーターとターミネーターの間に組み込んで行えばよい逆方向反復塩基配列構造の間にスペーサーを連結してもよい。また、センス鎖配列とそのアンチセンス鎖配列をそれぞれ別個にプロモーターとターミネーターの間に組み込んだタンデム型に構成してもよい。ユニットAに組み込む配列は、生物由来の遺伝子の配列であってもよいし人工的に設計した配列であってもよく、その配列長は、例えば50~1000bpとすればよい。本発明のsiRNA産生用ベクターにおけるユニットBは、目的のsiRNAが標的とする遺伝子の配列を組み込むためのマルチクローニングサイトと1次siRNAが結合する配列をプロモーターとターミネーターの間に有してなるものである。1次siRNAが結合する配列は、例えばユニットAに組み込んだセンス鎖配列と同じであってよい。ユニットAおよびユニットBで用いるプロモーターは、植物体内でプロモーターとして機能するものであれば特段制限されるものではなく、例えばCaMV35SプロモーターやGASプロモーターなどを用いることができるが、篩管を通してより多くのRNAサイレンシングのシグナルを輸送するためには、伴細胞でより多くのsiRNAが産生されるのが有効であることに鑑みれば、ユニットAおよびユニットBで用いるプロモーターは、伴細胞で特異的に機能するプロモーターが望ましい。このようなプロモーターとしては、例えばCoYMVCommelinayellowmottolevirusプロモーターなどが挙げられる。ユニットAおよびユニットBで用いるターミネーターは、植物体内でターミネーターとして機能するものであれば特段制限されるものではなく、例えばNOSターミネーターなどを用いることができる。なお、本発明のsiRNA産生用ベクターは、pGPTV、pBI121、pBI121-hmなどの植物の形質転換用ベクターを用いて自体公知の遺伝子組換え技術によって作製することができる。ユニットAとユニットBはどちらが上流側5’末端側であってもよい。標的遺伝子の配列例えば配列長が50~1000bpのものを本発明のsiRNA産生用ベクターのユニットBのマルチクローニングサイトに組み込んで植物体内に導入すると、この配列と1次siRNAが結合する配列からなるキメラ配列からキメラRNAが転写される。このキメラRNAにユニットAによって産生された1次siRNAがRISCを形成して結合すると、これを切断し、RNA依存性RNAポリメラーゼRDRによりキメラRNAの切断物を鋳型にした相補鎖の合成が行われて二本鎖RNAが形成される。そして、この二本鎖RNAがダイサーによって分断されることで目的のsiRNAが産生する新たな領域由来のsiRNAが産生されるいわゆるtransitivity現象:図1参照。なお、本発明のsiRNA産生用ベクターのユニットBのマルチクローニングサイトに標的遺伝子の配列を組み込んだsiRNA産生ベクターの植物体内への導入は、自体公知の方法、例えば、このsiRNA産生ベクターをAgrobacteriumtumefacienceEHA105株などのアグロバクテリウムに導入した後、siRNA産生ベクターを保持したアグロバクテリウムをアグロインフィルトレーション法によって植物に感染させることで行うことができる必要であれば例えばBurow,M.D.ら、PlantMol.Biol.Rep.8:124-139.1990やRatchlif,F.CG.ら、PlantCell11:1207-1216.1999などを参照のこと。本発明のsiRNA産生用ベクターを用いれば、RNAサイレンシングによって発現が抑制されることで、例えば品質の改良や病原菌に対する抵抗性の増強といった改変が可能となる遺伝子を標的遺伝子とするRNAサイレンシングを発動するsiRNAを産生させるためのベクターを時間と労力をかけることなく作製することができる。以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。1本発明のsiRNA産生用ベクターを用いたGSA遺伝子を標的にするsiRNA産生ベクターphtsiGSAの作製最初に、pGPTVベクターのビアラフォス抵抗性遺伝子選抜マーカーでない遺伝子部分にユニットAとユニットBを挿入することでユニットBが上流側、本発明のsiRNA産生用ベクターを作製した。ユニットAには緑色蛍光タンパク質GFP遺伝子のORF配列長:792bpの381~480bpの100bpのセンス鎖配列とそのアンチセンス鎖配列との逆方向反復塩基配列構造の間にCAT1カタラーゼ遺伝子由来のイントロン配列長:201bp、Ohta,S.ら、PlantandCellPhysiology31:6:805-813.1990をスペーサーとして連結して組み込んだ。ユニットBにはマルチクローニングサイトとして3種類の制限酵素認識サイトApaLI,AvrII,XhoIを設け、その下流にユニットAに組み込んだGFP遺伝子のセンス鎖配列を組み込んだ。なお、ユニットAおよびユニットBのプロモーターはいずれも伴細胞で特異的に機能するCoYMVプロモーターを用い、ターミネーターはいずれもNOSターミネーターを用いた。次に、ユニットBのマルチクローニングサイトに標的遺伝子として植物の内生遺伝子であるクロロフィル合成経路に関与するGSAGlutamate1-SemialdehydeAminotransferase遺伝子NtGSA2のORF配位長:1437bpの28~891bpの864bpのセンス鎖配列を組み込んで目的とするphtsiGSAを得た図1参照。2phtsiGSAの機能評価aphtsiGSAのアグロバクテリウムへの導入アグロバクテリウムとしてAgrobacteriumtumefacienceEHA105株を用い、その単一コロニーをLB培地組成は表1参照に抗生物質50mg/LのRifampicinを添加した培地に植え付け、28°Cで24時間振盪培養し、継代してさらに12時間振盪培養した。その後、4°Cにて6000rpmで10分間遠心し、回収した菌を滅菌水および10グリセロールで洗浄した。この菌のペレットを10グリセロール1mLで懸濁し、そのうちの40μLを1で作製したphtsiGSA0.5~1.0μgと混合し、混合液をキュベットに移し、20kV/cm,6msの条件でエレクトロポレーションすることで、phtsiGSAをアグロバクテリウムに導入した。電圧をかけたキュベット内の反応液にLB培地1mLを加え、1.5mLチューブに回収し、28°Cで24時間培養した。抗生物質50mg/LのRifampicinおよび50mg/LのKanamycinを含むLB寒天培地上に培養液を塗布し、28°Cで3日間培養した。得られたコロニーを新しいLB培地で培養し、アグロインフィルトレーションに用いた。bphtsiGSAを保持するアグロバクテリウムの植物への感染LB培地5mLに抗生物質50mg/LのRifampicinおよび50mg/LのKanamycinを添加し、phtsiGSAを保持するアグロバクテリウムを28°Cで一晩培養し、継代してさらに12時間振盪培養した。その後、室温にて3000rpmで20分間遠心し、回収した菌をOD600=1.0になるように懸濁液培地組成は表2参照に懸濁した。明所条件下の温室にて4週間栽培したNicotianabenthamianaの葉に8Gの注射針で穴をあけ、0.5mL程度の菌液を注入することでアグロインフィルトレーションした。その後、注入葉および最上位葉の腋芽を残し、葉や腋芽頂芽を剃刀刃にて切除してから、明所条件下の温室にて5日間栽培した後、注入葉からRNA抽出を行った。cRNA抽出液体窒素を用いて注入葉を十分にすりつぶし、RNAextractionbuffer10mMのTris-HCl、pH8.8、20mMのEDTA、200mMのNaCl、4のSarkosyl、16mMのDTTを加えよく混和した。等量のフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコールを加えて2分間ほど混和した後、遠心分離を行った。上層を新しい遠沈管に移し、再び等量のフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコールを加え混和した後、遠心分離を行った。上層を新しい遠沈管に移し、1/3量の8MのLiClを加え、よく混和し、氷上で一晩沈殿させた。遠心分離を行うことで得た上清に対してエタノール沈殿を行い、沈殿産物を滅菌水に溶解し、1/3量の20のPEG8000/2MのNaClを加えて混和し、氷上で1時間静置した後、遠心分離を行い、上清を新しいチューブに移してエタノール沈殿を行い、低分子RNAを含む上清を得、ノーザンブロット分析に供するまでこの状態で-80°Cに静置した。dノーザンブロット分析各サンプルを遠心分離して沈殿させ、適当量の滅菌水に溶解し、1レーンあたり低分子RNAが10μg相当になるように調整した。15アクリルアミド変性ゲルで分離した後、メンブレンに転写した。メンブレンにRNAプローブ適当な領域をinvitro転写によりDIGをラベリングを加えて45°Cで一晩ハイブリダイゼーションした後、常温で2×SSCで2回、55°Cで2×SSC/0.5のSDSで2回メンブレンを洗浄し、CDP-starによりRNAプローブのシグナルを視覚化した。結果を図1に示す。なお、図1には、ユニットAもユニットBも挿入していないベクターを植物体内に導入した場合の結果n.c.、ユニットAのみを挿入したベクターを植物体内に導入した場合の結果silencer、ユニットBのみを挿入したベクターを植物体内に導入した場合の結果amplifier、ユニットAのみを挿入したベクターとユニットBのみを挿入したベクターを混合して同時に植物体内に導入した場合の結果silenceramplifier、ユニットBに組み込んだGSA遺伝子のセンス鎖配列とそのアンチセンス鎖配列の逆方向反復塩基配列構造を組み込んでなるベクターを植物体内に導入した場合の結果GSAp.c.をあわせて示す1レーンあたりの低分子RNA量はすべて10μgに統一。図1から明らかなように、本発明のsiRNA産生用ベクターを用いて作製したphtsiGSAは、植物の内生遺伝子であるGSA遺伝子を標的とするsiRNAsiGSAを大量に産生することがわかった。3phtsiGSAの導入による形質転換タバコの作出2のaで作製したphtsiGSAを保持するアグロバクテリウムを、抗生物質50mg/LのRifampicinおよび50mg/LのKanamycinを含むLbG培地組成は表3参照20mLで28°Cで一晩培養し、継代してさらに6時間振盪培養した。その後、室温にて3000rpmで20分間遠心し、回収した菌をOD600=1.0になるように共存培地組成は表4参照に懸濁した。この懸濁液にNicotianabenthamianaの葉切片を浸し、ペーパータオル上に置床して余分な菌液を取り除いた後、共存培地にgellangumを0.3添加して調製した固体培地上に葉切片を置床し、暗所条件下の室温にて3日間培養した。選抜薬剤4.0mg/Lのビアラフォスおよび375mg/Lのオーグメンチンを含む選抜培地基礎となる培地の組成は表5参照に葉切片を移植し、明所条件下の室温にて2.5~3.5ヶ月間培養した選抜培地は約1ヶ月ごとに更新。カルスから得られてきたシュートは選抜薬剤を含むMS培地組成は表6参照に移植し、ビアラフォス耐性およびPCRによるphtsiGSA由来の塩基配列の検出により形質転換体であることを確認した。こうして得られた形質転換体は、順化し自殖によりその後代を得た後、4.0mg/Lのビアラフォスを含むMS培地に播種し、ビアラフォス耐性により形質転換体であることの確認と挿入コピー数の確認を行い、順次、各系統の世代更新を進めてホモ化を行った。その結果、T2世代のホモ個体は、葉脈に沿って葉緑素が減少しており、phtsiGSAの導入によってその標的遺伝子であるGSA遺伝子のサイレンシングが発動していることが確認できた図2A。また、2のcとdと同様にして、この形質転換タバコの葉からRNA抽出を行い、低分子RNAのノーザンブロット分析を行ったところ、phtsiGSAのユニットAから産生されたsiRNAsiGFPとともに、ユニットBから産生されたsiRNAsiGSAが検出できた図2B:5.8SrRNAは当量の低分子RNAを泳動したことを示すコントロール。"