"第一のH鎖、第二のH鎖および共通のL鎖を有する二重特異性抗体の作製方法であって、以下の工程を含む方法:1第一の抗原に対する第一の抗体と、第二の抗原に対する第二の抗体とを用意する工程;2第一の抗体および第二の抗体の可変領域を有する第一の抗原および第二の抗原に対する二重特異性抗体を作製する工程;3前記2で作製した二重特異性抗体の抗原への結合活性または抗体の生物活性を測定する工程;4第一の抗体のH鎖および第二の抗体のH鎖を、第一の抗体または第二の抗体のL鎖で共通化して共通L鎖抗体を作製する工程;5前記4で作製した共通L鎖抗体の抗原への結合活性または抗体の生物活性を測定する工程;6前記4で作製した共通L鎖の1または2個または3個のCDRを、第一の抗体、第二の抗体または他の抗体であって第一の抗体または第二の抗体のCDRのアミノ酸配列に対して高い相同性を有する抗体のCDRにより置換して共通L鎖抗体を作製する工程;7前記6で作製した共通L鎖抗体と、前記2で作製した元の二重特異性抗体または前記4で作製した共通L鎖抗体とを抗原への結合活性または抗体の生物活性について比較し、所望の活性を有する共通L鎖抗体を選択する工程;および8前記7で選択した共通L鎖抗体について、必要に応じて前記6および7の工程を反復して前記2で作製した元の二重特異性抗体と同等以上の活性を有する共通L鎖抗体を得る工程。前記6および7の工程が2回以上反復される請求項1に記載の方法。請求項1または2の方法により得られる共通のL鎖を有する二重特異性抗体。前記6の他の抗体が第一の抗原もしくは第二の抗原に対する抗体である請求項1に記載の方法。前記6および7の工程が2回以上反復される請求項4に記載の方法。請求項4または5の方法により得られる共通のL鎖を有する二重特異性抗体。前記6の抗体が第一の抗体または第二の抗体である請求項1に記載の方法。前記6および7の工程が2回以上反復される請求項7に記載の方法。請求項7または8の方法により得られる共通のL鎖を有する二重特異性抗体。本発明は、酵素反応を増強する補因子である血液凝固第VIII因子の作用を代替する多重特異性抗体の提供を課題とする。本発明者らは鋭意研究を行った結果、FIXFIXa及びFXの双方に特異的に結合し、FVIIIaの補因子作用、すなわちFIXaによるFX活性化を促進する作用を代替する種々の二重特異性抗体を見出すことに成功した。さらに本発明者らは、これらの抗体の中から、FVIII欠乏ヒト血漿を用いた凝固時間測定系において、抗体無添加時に比べて凝固時間を50秒以上短縮させた抗体について、その抗体のL鎖をA44のL鎖で共通化したところ、共通化前の抗体に比べて活性が減弱するものの、A44Lにて共通化が可能であることを明らかにした。また、A44由来のL鎖のフレームワークにA44のL鎖およびB26のL鎖由来のCDRを組み合わせたL鎖を作製し、これらを用いたL鎖共通化によりFVIII活性の回復を試みたところ、CDR123がBBACDR123がそれぞれ、B26のL鎖由来のCDR、B26のL鎖由来のCDR、A44のL鎖由来のCDRの組み合わせの場合、FVIII活性はA44B26の活性を大きく上回り、抗体無添加時に比べて凝固時間を70秒以上短縮させることができた。この抗体は、FVIIIの作用を減弱させず相加的に作用していた。この他にもCDR123がABA、BAAの場合に、抗体無添加時に比べて凝固時間を60秒以上短縮させることができた。またA50、A69というA44に相同性の高い抗体のH鎖をB26H及び上記ハイブリッドL鎖との組み合わせで活性を評価したところ、A44Hを用いた場合よりもさらに高い活性を有する抗体を得ることができた。さらにA44L、B26L、A50L、A69LのCDRを組み合わせたハイブリッドL鎖を作製し、これらを用いて活性を確認したところ、上記のA44B26由来ハイブリッドL鎖BBAを超えないものの高い活性を有する抗体を得ることができた。またA69HとB26Hに種々のハイブリッドL鎖を組み合わせて活性を評価したところ、高い活性を有する抗体が取得でき、特にBBAまたはBBaの組み合わせの場合、抗体無添加時に比べて凝固時間を80秒以上短縮させることができた。さらに、これら抗体のヒト化について検討したところ、1ヒト化A69H、2ヒト化したB26H、3ヒト化したハイブリッドL鎖の組合せにより元の抗体と同等の活性を達成することができた。上述のように、本発明は、血液凝固第VIII因子の作用を代替する高活性の多重特異性抗体の作製に成功し、本発明を完成させた。また本発明は、該抗体のL鎖の共通化により低下した活性を回復もしくは向上させる方法を提供する。即ち本発明は、酵素反応を増強する補因子である血液凝固第VIII因子の機能を代替する多重特異性抗体、および該抗体の作製方法、並びに、該抗体のL鎖の共通化により低下した活性を回復もしくは向上させる方法に関し、より具体的には、1血液凝固第IX因子および/または活性化血液凝固第IX因子を認識する第一のドメイン、および血液凝固第X因子を認識する第二のドメインを含む、血液凝固第VIII因子の機能を代替し得る多重特異性抗体であって、第一のドメインは血液凝固第IX因子または活性化血液凝固第IX因子に対する抗体のH鎖の全部または一部を含む第一のポリペプチドを含み、第二のドメインは血液凝固第X因子に対する抗体のH鎖の全部または一部を含む第二のポリペプチドを含み、第一のドメインおよび第二のドメインは更に抗体のL鎖の全部または一部であって共通の配列を有する第三のポリペプチドを含む多重特異性抗体、2第三のポリペプチドが血液凝固第IX因子、活性化血液凝固第IX因子または血液凝固第X因子に対する抗体のL鎖の全部または一部の配列を含む1に記載の多重特異性抗体、3第三のポリペプチドが2以上の抗体の各L鎖のCDR123からそれぞれ独立に選択されるCDR123からなる抗原結合部位またはこれと機能的に同等な抗原結合部位を含む1に記載の多重特異性抗体、4第一のポリペプチドが下記a1またはa2またはのCDRのアミノ酸配列からなる抗原結合部位またはこれと機能的に同等の抗原結合部位を含み、第二のポリペプチドが下記bのアミノ酸配列からなる抗原結合部位またはこれと機能的に同等の抗原結合部位を含む1に記載の多重特異性抗体:a1H鎖CDR1、2、3が配列番号:3、5、7A44のH鎖CDRに記載のアミノ酸配列a2H鎖CDR1、2、3が配列番号:21、5、22A69のH鎖CDRに記載のアミノ酸配列a3H鎖CDR1、2、3が配列番号:16、17、18A50のH鎖CDRに記載のアミノ酸配列bH鎖CDR1、2、3が配列番号:26、28、30B26のH鎖CDRに記載のアミノ酸配列、5血液凝固第IX因子および/または活性化血液凝固第IX因子、並びに血液凝固第X因子を認識する血液凝固第VIII因子の機能を代替し得る多重特異性抗体であって、血液凝固第VIII因子の代替機能が、抗体溶液50μL、FVIII欠乏血漿Biomerieux50μL及びAPTT試薬DadeBehring50μLの混合液を37°Cで3分間加温した後、20mMのCaCl250μLを同混合液に加え、凝固するまでの時間を測定する活性化部分トロンボプラスチン時間APTT試験において、抗体無添加時に比べた凝固時間の短縮が50秒以上である多重特異性抗体、6抗血液凝固第IX/IXa因子抗体のH鎖の抗原結合部位またはこれと機能的に同等な抗原結合部位と、抗血液凝固第X因子抗体のH鎖の抗原結合部位またはこれと機能的に同等な抗原結合部位とを含む5に記載の多重特異性抗体、7抗血液凝固第IXIXa因子抗体における下記a1またはa2またはのCDRのアミノ酸配列からなる抗原結合部位またはこれと機能的に同等の抗原結合部位と、抗血液凝固第X因子抗体における下記bに記載のCDRのアミノ酸配列からなる抗原結合部位またはこれと機能的に同等の抗原結合部位とを含む6に記載の多重特異性抗体:a1H鎖CDR1、2、3が配列番号:3、5、7A44のH鎖CDRに記載のアミノ酸配列a2H鎖CDR1、2、3が配列番号:21、5、22A69のH鎖CDRに記載のアミノ酸配列a3H鎖CDR1、2、3が配列番号:16、17、18A50のH鎖CDRに記載のアミノ酸配列bH鎖CDR1、2、3が配列番号:26、28、30B26のH鎖CDRに記載のアミノ酸配列、81~7のいずれかに記載の抗体および薬学的に許容される担体を含む組成物、9出血、出血を伴う疾患、もしくは出血に起因する疾患の予防およびまたは治療に用いられる医薬組成物である、8に記載の組成物、10出血、出血を伴う疾患、もしくは出血に起因する疾患が、血液凝固第VIII因子およびまたは活性化血液凝固第VIII因子の活性の低下ないし欠損によって発症およびまたは進展する疾患である、9に記載の組成物、11血液凝固第VIII因子およびまたは活性化血液凝固第VIII因子の活性の低下ないし欠損によって発症およびまたは進展する疾患が、血友病Aである、10に記載の組成物、12血液凝固第VIII因子およびまたは活性化血液凝固第VIII因子の活性の低下ないし欠損によって発症およびまたは進展する疾患が、血液凝固第VIII因子およびまたは活性化血液凝固第VIII因子に対するインヒビターが出現している疾患である、10に記載の組成物、13血液凝固第VIII因子およびまたは活性化血液凝固第VIII因子の活性の低下ないし欠損によって発症およびまたは進展する疾患が、後天性血友病である、10に記載の組成物、14血液凝固第VIII因子およびまたは活性化血液凝固第VIII因子の活性の低下によって発症およびまたは進展する疾患が、フォンビルブランド病である、10に記載の組成物、151~7のいずれかに記載の抗体、または8~14のいずれかに記載の組成物を投与する工程を含む、出血、出血を伴う疾患、もしくは出血に起因する疾患を予防およびまたは治療する方法、161~7のいずれかに記載の抗体の、8~14のいずれかに記載した組成物の製造のための使用、17少なくとも1~7のいずれかに記載の抗体、または8~14のいずれかに記載の組成物を含む、15に記載の予防およびまたは治療する方法に用いるためのキット、181~7のいずれかに記載の抗体、または8~14のいずれかに記載の組成物を投与する工程を含む、出血、出血を伴う疾患、もしくは出血に起因する疾患を、血液凝固第VIII因子と併用して予防およびまたは治療する方法、19少なくとも1~7のいずれかに記載の抗体、または8~14のいずれかに記載の組成物を含み、かつ血液凝固第VIII因子を含む15に記載の予防およびまたは治療する方法に用いるためのキット、20第一のH鎖、第二のH鎖および共通のL鎖を有する二重特異性抗体の作製方法であって、以下の工程を含む方法:1第一の抗原に対する第一の抗体と、第二の抗原に対する第二の抗体とを用意する工程;2第一の抗体および第二の抗体の可変領域を有する第一の抗原および第二の抗原に対する二重特異性抗体を作製する工程;3前記2で作製した二重特異性抗体の抗原への結合活性または抗体の生物活性を測定する工程;4第一の抗体のH鎖および第二の抗体のH鎖を、第一の抗体または第二の抗体のL鎖で共通化して共通L鎖抗体を作製する工程;5前記4で作製した共通L鎖抗体の抗原への結合活性または抗体の生物活性を測定する工程;6前記4で作製した共通L鎖の1または2個または3個のCDRを、第一の抗体、第二の抗体または他の抗体であって第一の抗体または第二の抗体のCDRのアミノ酸配列に対して高い相同性を有する抗体のCDRにより置換して共通L鎖抗体を作製する工程;7前記6で作製した共通L鎖抗体と、前記2で作製した元の二重特異性抗体または前記4で作製した共通L鎖抗体とを抗原への結合活性または抗体の生物活性について比較し、所望の活性を有する共通L鎖抗体を選択する工程;および8前記7で選択した共通L鎖抗体について、必要に応じて前記6および7の工程を反復して前記2で作製した元の二重特異性抗体と同等以上の活性を有する共通L鎖抗体を得る工程、21前記6および7の工程が2回以上反復される20に記載の方法、2220または21の方法により得られる共通のL鎖を有する二重特異性抗体、23前記6の他の抗体が第一の抗原もしくは第二の抗原に対する抗体である20に記載の方法、24前記6および7の工程が2回以上反復される23に記載の方法、2523または24の方法により得られる共通のL鎖を有する二重特異性抗体、26前記6の抗体が第一の抗体または第二の抗体である20に記載の方法、27前記6および7の工程が2回以上反復される26に記載の方法、2826または27の方法により得られる共通のL鎖を有する二重特異性抗体、を提供するものである。さらに本発明は、以下の29および30を提供するものである。29第一のポリペプチドがH鎖可変領域を含み、第二のポリペプチドがH鎖可変領域を含み、第三のポリペプチドがL鎖可変領域を含み、各ポリペプチドの可変領域の組合わせが以下の通りである請求項1に記載の多重特異性抗体:a1第一のポリペプチドのH鎖可変領域が配列番号:130hA69aに記載のアミノ酸配列b1第二のポリペプチドのH鎖可変領域が配列番号:132hB26F123e4に記載のアミノ酸配列c1第三のポリペプチドのL鎖可変領域が配列番号:134hALF123j4に記載のアミノ酸配列;a2第一のポリペプチドのH鎖可変領域が配列番号:136hA69PFLに記載のアミノ酸配列b2第二のポリペプチドのH鎖可変領域が配列番号:138hB26PFに記載のアミノ酸配列c2第三のポリペプチドのL鎖可変領域が配列番号:140hALs8に記載のアミノ酸配列;a3第一のポリペプチドのH鎖可変領域が配列番号:142hA69KQに記載のアミノ酸配列b3第二のポリペプチドのH鎖可変領域が配列番号:138hB26PFに記載のアミノ酸配列c3第三のポリペプチドのL鎖可変領域が配列番号:144hALAQに記載のアミノ酸配列。30第一のポリペプチドおよび第二のポリペプチドがヒトIgG4定常領域を含み、第三のポリペプチドがヒトκ定常領域を含む29に記載の多重特異性抗体。本明細書中に記載される多重特異性抗体とは、少なくとも2種類の異なる抗原に対して特異的に結合することができる抗体である。好ましい多重特異性抗体として2つの抗原に対して特異的に結合することができる二重特異性抗体二種特異性抗体と呼ばれる場合もあるを挙げることができる。本発明において、異なる抗原とは必ずしも抗原自体が異なる必要はなく、抗原決定基が異なる場合等も本発明の異なる抗原に含まれる。従って、例えば、単一分子内の異なる抗原決定基も本発明の異なる抗原に含まれ、このような単一分子内の異なる抗原決定基を各々認識する2つの抗体は、本発明において異なる抗原を認識する抗体として扱われる。また、本発明において共通軽鎖とは、異なる2種以上の重鎖と会合し、それぞれの抗原に対して結合能を示し得る軽鎖である。ここで、異なる重鎖とは、好ましくは異なる抗原に対する抗体の重鎖を指すが、それに限定されず、アミノ酸配列が互いに異なっている重鎖を意味する。本発明における多重特異性抗体好ましくは、二重特異性抗体は、2種以上の異なる抗原に対して特異性を有する抗体もしくは抗体断片からなる分子である。本発明の抗体は特に制限されないが、モノクローナルであることが好ましい。また、本発明の多重特異性抗体は、共通軽鎖L鎖を有することを特徴とする。本発明における多重特異性抗体は、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体であることが好ましい。例えば、BorrebaeckCAKandLarrickJWTHERAPEUTICMONOCLONALANTIBODIESPublishedintheUnitedKingdombyMACMILLANPUBLISHERSLTD1990参照。組換え型抗体は、それをコードするDNAをハイブリドーマ、または抗体を産生する感作リンパ球等の抗体産生細胞からクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得ることができる。さらに、本発明における抗体は、その抗体断片や抗体修飾物であってよい。抗体断片としては、ダイアボディ、線状抗体、一本鎖抗体以下、scFvとも記載する分子などが含まれる。ここで、Fv断片は最小の抗体断片であり、完全な抗原認識部位と結合部位を含む。Fv断片は1つの重H鎖可変領域VHおよび軽L鎖可変領域VLが非共有結合により強く連結されたダイマーVHVLダイマーである。各可変領域の3つの相補鎖決定領域complementaritydeterminingregion;CDRが相互作用し、VHVLダイマーの表面に抗原結合部位を形成する。6つのCDRが抗体に抗原結合部位を付与している。しかしながら、1つの可変領域または、抗原に特異的な3つのCDRのみを含むFvの半分であっても、全結合部位よりも親和性は低いが、抗原を認識し、結合する能力を有する。また、Fab断片Fとも呼ばれるはさらに、L鎖の定常領域およびH鎖の定常領域CH1を含む。Fab断片は、抗体のヒンジ領域からの1またはそれ以上のシステインを含むH鎖CH1領域のカルボキシ末端由来の数残基を付加的に有する点でFab断片と異なっている。FabSHとは、定常領域の1またはそれ以上のシステイン残基が遊離のチオール基を有するFabを示すものである。F断片は、F2ペプシン消化物のヒンジ部のシステインにおけるジスルフィド結合の切断により製造される。化学的に結合されたその他の抗体断片も当業者には知られている。ダイアボディは、遺伝子融合により構築された二価の抗体断片を指す、EP404097号、WO9311161号等。ダイアボディは、2本のポリペプチド鎖から構成されるダイマーであり、ポリペプチド鎖は各々、同じ鎖中でL鎖可変領域及びH鎖可変領域が、互いに結合できない位に短い、例えば、5残基程度のリンカーにより結合されている。同一ポリペプチド鎖上にコードされるVLとVHとは、その間のリンカーが短いため単鎖可変領域フラグメントを形成することが出来ず二量体を形成するため、ダイアボディは2つの抗原結合部位を有することとなる。一本鎖抗体またはscFv抗体断片には、抗体のVHおよびVL領域が含まれ、これらの領域は単一のポリペプチド鎖中に存在する。一般に、FvポリペプチドはさらにVHおよびVL領域の間にポリペプチドリンカーを含んでおり、これによりscFvは、抗原結合のために必要な構造を形成することができるscFvの総説については、PluckthunThePharmacologyofMonoclonalAntibodiesVol113RosenburgandMooreedpp2693151994を参照。本発明におけるリンカーは、その両端に連結された抗体可変領域の発現を阻害するものでなければ特に限定されない。IgGタイプ二重特異性抗体はIgG抗体を産生するハイブリドーマ二種を融合することによって生じるhybridhybridomaによって分泌させることが出来るMilsteinCetalNature1983305537540。また目的の二種のIgGを構成するL鎖及びH鎖の遺伝子、合計4種の遺伝子を細胞に導入することによって共発現させることによって分泌させることが出来る。この際H鎖のCH3領域に適当なアミノ酸置換を施すことによってH鎖についてヘテロな組合せのIgGを優先的に分泌させることも出来るRidgwayJBetalProteinEngineering19969617621、MerchantAMetalNatureBiotechnology199816677681。また、L鎖に関しては、H鎖可変領域に比べてL鎖可変領域の多様性が低いことから、両H鎖に結合能を与え得る共通のL鎖が得られることが期待され、本発明の抗体は、共通のL鎖を有することを特徴とするものである。この共通L鎖と両H鎖遺伝子を細胞に導入することによってIgGを発現させることで効率の良い二重特異性IgGの発現が可能となる。また、Fab’を化学的に架橋することによっても二重特異性抗体を作製し得る。例えば一方の抗体から調製したFab’をoPDMにてマレイミド化し、これともう一方の抗体から調製したFab’を反応させることにより、異なる抗体由来Fab’同士を架橋させ二重特異性F2を作製することが出来るKelerTetalCancerResearch19975740084014。またFab’チオニトロ安息香酸誘導体とFab’チオール等の抗体断片を化学的に結合する方法も知られているBrennanMetalScience19852298183。化学架橋の代わりにFosJunなどに由来するロイシンジッパーを用いることも出来る。FosJunはホモダイマーも形成するが、ヘテロダイマーを優先的に形成することを利用する。Fosロイシンジッパーを付加したFab’とJunのそれを付加したもう一方のFab’を発現調製する。温和な条件で還元した単量体Fab’FosFab’Junを混合し反応させることによって二重特異性F2が形成できるKostelnySAetalJofImmunology1992148154753。この方法はFab’には限定されず、scFvFvなどにおいても応用可能である。ダイアボディにおいても二重特異性抗体を作製し得る。二重特異性ダイアボディは二つのcrossoverscFv断片のヘテロダイマーである。つまり二種の抗体AB由来のVHとVLを5残基前後の比較的短いリンカーで結ぶことによって作製されたVHVLVHVLを用いてヘテロダイマーを構成することによって出来るHolligerPetalProcoftheNationalAcademyofSciencesoftheUSA19939064446448。この際、二種のscFvを15残基程度の柔軟な比較的長いリンカーで結ぶ、適当なアミノ酸置換を行うことによって目的の構成を促進させることも出来る。二種のscFvを15残基程度の柔軟な比較的長いリンカーで結ぶことによって作製できるsc2も二重特異性抗体となり得るMallenderWDetalJofBiologicalChemistry1994269199206。抗体修飾物としては、例えば、ポリエチレングリコールPEG等の各種分子と結合した抗体を挙げることができる。本発明の抗体修飾物においては、結合される物質は限定されない。このような抗体修飾物を得るには、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。これらの方法はこの分野において既に確立されている。本発明の抗体は、ヒト抗体、マウス抗体、ラット抗体など、その由来は限定されない。またキメラ抗体やヒト化抗体などの遺伝子改変抗体でもよい。ヒト抗体の取得方法は既に知られており、例えば、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を目的の抗原で免疫することで目的のヒト抗体を取得することができる国際特許出願公開番号WO9312227WO9203918,WO9402602WO9425585,WO9634096WO9633735参照。遺伝子改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。具体的には、たとえばキメラ抗体は、免疫動物の抗体のH鎖、およびL鎖の可変領域と、ヒト抗体のH鎖およびL鎖の定常領域からなる抗体である。免疫動物由来の抗体の可変領域をコードするDNAを、ヒト抗体の定常領域をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることによって、キメラ抗体を得ることができる。ヒト化抗体は、再構成reshapedヒト抗体とも称される改変抗体である。ヒト化抗体は、免疫動物由来の抗体のCDRを、ヒト抗体の相補性決定領域へ移植することによって構築される。その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウス抗体のCDRとヒト抗体のフレームワーク領域frameworkregion;FRを連結するように設計したDNA配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからPCR法により合成する。得られたDNAを、ヒト抗体定常領域をコードするDNAと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる欧州特許出願公開番号EP239400、国際特許出願公開番号WO9602576参照。CDRを介して連結されるヒト抗体のFRは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよいSatoKetalCancerResearch199353851856。また、様々なヒト抗体由来のフレームワーク領域に置換してもよい国際特許出願公開番号WO9951743参照。本発明の多重特異性抗体は、血液凝固線溶関連因子の血液凝固第IX因子および/または活性化血液凝固第IX因子、および、血液凝固第X因子を認識し、補因子のFVIIIFVIIIaの機能を代替する活性を有する抗体であって、共通のL鎖を有することを特徴とする。また、本発明の抗体は、通常、抗FIXa抗体における可変領域と、抗FX抗体における可変領域とを含む構造を有する。本発明における多重特異性抗体は、血液凝固第IX因子および/または活性化血液凝固第IX因子を認識する第一のドメイン、および血液凝固第X因子を認識する第二のドメインを含み、第一のドメインおよび第二のドメインは更に抗体の共通のL鎖の全部または一部の配列を有する第三のポリペプチドを含む抗体である。即ち、本発明の抗体の好ましい態様においては、血液凝固第IX因子および/または活性化血液凝固第IX因子を認識する第一のドメイン、および血液凝固第X因子を認識する第二のドメインを含む、血液凝固第VIII因子の機能を代替し得る多重特異性抗体であって、第一のドメインは血液凝固第IX因子または活性化血液凝固第IX因子に対する抗体のH鎖の全部または一部を含む第一のポリペプチドを含み、第二のドメインは血液凝固第X因子に対する抗体のH鎖の全部または一部を含む第二のポリペプチドを含み、第一のドメインおよび第二のドメインは更に抗体のL鎖の全部または一部であって共通の配列を有する第三のポリペプチドを含む多重特異性抗体を提供する。活性化血液凝固第VIII因子FVIIIaは、FIXaとFXの両方に結合することによって、FIXaによるFXの活性化を増強する。上記の酵素FIXa、基質FXの両方を認識する二重特異性抗体の中には、FXの活性化を増強する作用を有するものがある。このような抗体の中には、補因子FVIIIFVIIIaの作用機能を代替する作用を有するものが存在すると考えられる。なお、本発明におけるFVIIIFVIIIaは、トロンビン等の蛋白分解酵素により限定分解を受けるが、FVIIIFVIIIaの補因子活性を有している限り、その形態は問わない。また、変異FVIIIFVIIIaや、遺伝子組換技術により人為的に改変したFVIIIFVIIIaに関しても、FVIIIFVIIIaの補因子活性を有している限り、本発明のFVIIIFVIIIaに含まれる。本発明における第三のポリペプチドは、好ましくは、血液凝固第IX因子FIX、活性化血液凝固第IX因子または血液凝固第X因子FXに対する抗体のL鎖の全部または一部の配列を含むものである。さらに、本発明における第三のポリペプチドは、2以上の抗体の各L鎖のCDR1、2、3からそれぞれ独立に選択されるCDR1、2、3からなる抗原結合部位、またはこれと機能的に同等な抗原結合部位を含むものであることが好ましい。本発明の抗体の第一のポリペプチドのH鎖CDR1、2、3は、好ましい態様として具体的には、後述の実施例に記載のA44またはA69のH鎖CDR1、2、3の各配列配列番号:3、5、7または21、5、22のアミノ酸配列からなる抗原結合部位、またはこれらと機能的に同等の抗原結合部位を挙げることができる。また、第二のポリペプチドのH鎖CDR1、2、3は、好ましい態様として具体的には、後述の実施例に記載のB26のH鎖CDR1、2、3の各配列配列番号:26、28、30に記載のアミノ酸配列からなる抗原結合部位、またはこれらと機能的に同等の抗原結合部位を挙げることができる。本発明に記載のA44、A50、A69、B26のH鎖可変領域のアミノ酸配列はそれぞれ、以下の配列番号で示される。A44:配列番号:1A50:配列番号:15A69:配列番号:20B26:配列番号:24また、A44、A50、A69、B26のH鎖CDRの塩基配列括弧内は該塩基配列によってコードされるアミノ酸配列は、CDR1、2、3の順にそれぞれ、以下のような配列番号で示される。A44:配列番号:23、45、67A50:配列番号:10916、11017、11118A69:配列番号:11221、1135、11422B26:配列番号:2526、2728、2930また、本発明記載のA44、A50、A69、B26のL鎖可変領域のアミノ酸配列はそれぞれ、以下の配列番号で示される。A44:配列番号:8A50:配列番号:115A69:配列番号:116B26:配列番号:31また、A44、A50、A69、B26のL鎖CDRの塩基配列括弧内は該塩基配列によってコードされるアミノ酸配列は、CDR1、2、3の順にそれぞれ、以下のような配列番号で示される。A44:配列番号:910、1112、1314A50:配列番号:11710、11812、11919A69:配列番号:12023、12112、12214B26:配列番号:3233、3435、3637なお、CDR1を表すアミノ酸配列は以下のとおりである。A44:配列番号:3、10A50:配列番号:16、10A69:配列番号:21、23B26:配列番号:26、33CDR2を表すアミノ酸配列は以下のとおりである。A44:配列番号:5、12A50:配列番号:17、12A69:配列番号:5、12B26:配列番号:28、35CDR3を表すアミノ酸配列は以下のとおりである。A44:配列番号:7、14A50:配列番号:18、19A69:配列番号:22、14B26:配列番号:30、37本発明で開示されている可変領域を用いて全長抗体を作製する場合、定常領域は特に限定されず、当業者に公知の定常領域を用いることが可能であり、例えば、SequencesofproteinsofimmunologicalinterestUSDepartmentofHealthandHumanServicesPublicHealthServiceNationalInstitutesofHealthや、AnefficientroutetohumanbispecificIgGNatureBiotechnologyvol16677681、等に記載されている定常領域を用いることができる。本発明の好ましい態様における二重特異性抗体については、FXIaFIX活性化酵素、FIX、FX、FXaの合成基質S2222、リン脂質から成る測定系で、FVIIIFVIIIaFIXaによるFX活性化の補因子を代替する活性を評価した。その結果を以って、FVIIIFVIIIa代替活性を有する二重特異性抗体として、原則本測定系で01以上のFVIIIa様活性を示したものを選択した。なお、ここでいうFVIIIa様活性とは、抗体溶液または抗体発現培養上清の30分間または60分間の吸光度変化値から、溶媒または抗体非発現培養上清の30分間または60分間の吸光度変化値を引いた値である。上記で選択された二重特異性抗体あるいはその類縁の二重特異性抗体に関しては、FVIII欠乏ヒト血漿を用いた凝固時間測定系を用い、凝固回復能を測定した。その結果、抗体無添加時に比べて、凝固時間を短縮する二重特異性抗体を得た。ここでいう凝固時間は実施例7に示したように、FVIII欠乏ヒト血漿を用いた活性化部分トロンボプラスチン時間を測定したものである。それら二重特異性抗体の中で、好ましい二重特異性抗体は10秒以上の、より好ましい二重特異性抗体は20秒以上の、さらに好ましい二重特異性抗体は40秒以上の、最も好ましい二重特異性抗体は50秒以上の凝固時間短縮能を有していた。即ち、本発明の好ましい態様としては、血液凝固第IX因子および/または活性化血液凝固第IX因子、並びに血液凝固第X因子を認識する血液凝固第VIII因子の機能を代替し得る多重特異性抗体である。本発明の多重特異性抗体のFVIII代替機能は、FVIII欠乏ヒト血漿を用いた凝固時間測定系において、抗体無添加時に比べた凝固時間の短縮を測定することにより示すことができる。ここでいう凝固時間は、例えば、実施例21に示すFVIII欠乏ヒト血漿を用いた凝固時間測定系における、活性化部分トロンボプラスチン時間APTTを意味する。本発明の多重特異性抗体の一態様は、50秒以上の凝固時間短縮能を有する抗体であり、好ましくは60秒以上、より好ましくは70秒以上、更に好ましくは80秒以上の凝固時間短縮能を有している。本発明の上記多重特異性抗体は、好ましくは、抗血液凝固第IX/IXa因子抗体のH鎖CDRまたはこれと機能的に同等なCDRと、抗血液凝固第X因子抗体のH鎖CDRまたはこれと機能的に同等なCDRとを含む抗体である。また本発明の抗体は、抗血液凝固第IXIXa因子抗体における、配列番号:3、5、7A44のH鎖CDRに記載のH鎖CDR1、2、3のアミノ酸配列、または配列番号:21、5、22A69のH鎖CDRに記載のH鎖CDR1、2、3のアミノ酸配列からなる抗原結合部位またはこれと機能的に同等の抗原結合部位と、抗血液凝固第X因子抗体における配列番号:26、28、30B26のH鎖CDRに記載のH鎖CDR1、2、3のアミノ酸配列からなる抗原結合部位またはこれと機能的に同等の抗原結合部位とを含む抗体であることが好ましい。なお、本発明において、抗原結合部位が機能的に同等であるとは、本明細書に記載された各種CDRを含む抗原結合部位と同様の結合特性を有することをいう。つまり、以下に示す安定化を目的としたアミノ酸残基の置換によっても同様の抗原決定基エピトープを認識する場合は、機能的に同等とする。また、本願の抗体クローンについては、脱アミド化、メチオニン酸化などの回避や抗体の構造安定化を目的に以下のようにアミノ酸残基を置換してもよい。本発明の抗体は、必要に応じて、脱アミド化、メチオニン酸化などの回避や抗体の構造安定化を目的にアミノ酸残基を改変してもよい。脱アミド化、メチオニン酸化などの回避を目的として、NとMを改変してもよい。また、A44、A69のH鎖CDR3内のNG配列のG、B26のH鎖CDR2のNT配列のTを改変してもよい。また、Met酸化回避のためにMを改変してもよい。また、ターン構造改善による熱安定性向上のため、A44、A69のH鎖CDR2の最後のRD配列のD、A50のH鎖CDR2のKV配列のVを改変してもよい、改変する場合は特にG、S、Tへの改変が好ましい。同じくA44L鎖のL鎖CDR3、kabat95のYをPに改変してもよい。また、疎水コア改善による熱安定性向上のため、B26L鎖のL鎖CDR1、kabat33のVをLに改変してもよい。さらに、VHVL界面の乱れを修正するために、A44、A50、A69のH鎖CDR3の最後のLDY配列のL、FDY配列のFを改変してもよい。同じくA44、A50、A69のL鎖CDR3の最後のIT配列のI、LT配列のLを改変してもよい。また、B26L鎖のCDR2のRYS配列のYを改変してもよい。以下にA44、A50、A69、B26の各CDRの配列と置換の可能性の考えられるアミノ酸残基を下線にて示す。A44H鎖CDR1:SSWMH配列番号:3A50H鎖CDR1:TYWMH配列番号:16A69H鎖CDR1:DYYMH配列番号:21B26H鎖CDR1:DNNMD配列番号:26A44A69H鎖CDR2:YINPSSGYTKYNRKFRD配列番号:5A50H鎖CDR2:YINPSSGYTKYNQKFKV配列番号:17B26H鎖CDR2:DINTKSGGSIYNQKFKG配列番号:28A44H鎖CDR3:GGNGYYFDY配列番号:7A50H鎖CDR3:GNLGYFFDY配列番号:18A69H鎖CDR3:GGNGYYLDY配列番号:22B26H鎖CDR3:RRSYGYYFDY配列番号:30A44A50L鎖CDR1:KASQDVGTAVA配列番号:10A69L鎖CDR1:KASQDVSTAVA配列番号:23B26L鎖CDR1:KASQNVGTAVA配列番号:33A44A50A69L鎖CDR2:WASTRHT配列番号:12B26L鎖CDR2:SASYRYS配列番号:35A44A69L鎖CDR3:QQYSNYIT配列番号:14A50L鎖CDR3:QQYSSYLT配列番号:19B26L鎖CDR3:QQYNSYPLT配列番号:37さらに本発明は、L鎖が共通化される前の二重特異性抗体に対して、L鎖の共通化によって低下した活性を回復させる、あるいは、元の活性より向上させる方法に関する。本発明は、この方法を利用して本発明の二重特異性抗体を作製する方法を提供する。即ち本発明は、第一のH鎖、第二のH鎖および共通のL鎖を有する二重特異性抗体の作製方法であって、以下の工程を含む方法を提供する。1第一の抗原に対する第一の抗体と、第二の抗原に対する第二の抗体とを用意する工程;2第一の抗体および第二の抗体の可変領域を有する第一の抗原および第二の抗原に対する二重特異性抗体を作製する工程;3前記2で作製した二重特異性抗体の抗原への結合活性または抗体の生物活性を測定する工程;4第一の抗体のH鎖および第二の抗体のH鎖を、第一の抗体または第二の抗体のL鎖で共通化して共通L鎖抗体を作製する工程;5前記4で作製した共通L鎖抗体の抗原への結合活性または抗体の生物活性を測定する工程;6前記4で作製した共通L鎖抗体の1または2個または3個のCDRを、第一の抗体、第二の抗体または第一の抗体または第二の抗体のCDRのアミノ酸配列に対して高い相同性を有する抗体のCDRにより置換して共通L鎖抗体を作製する工程;7前記6で作製した共通L鎖抗体と、前記2で作製した元の二重特異性抗体または前記4で作製した共通L鎖抗体とを抗原への結合活性または抗体の生物活性について比較し、所望の活性を有する共通L鎖抗体を選択する工程;および8前記7で選択した共通L鎖抗体について、必要に応じて前記6および7の工程を反復して前記2で作製した元の二重特異性抗体と同等以上の活性を有する共通L鎖抗体を得る工程本発明の上記方法においては、まず、L鎖が共通化されていない二重特異性抗体の作製を行う。本発明の二重特異性抗体を得る方法は特に制限されず、どのような方法で取得されてもよい。一例を示せば、酵素A及び基質Bに対する補因子機能代替二重特異性抗体を得る場合、酵素A、基質Bそれぞれを免疫動物に免疫し、抗酵素A抗体及び抗基質B抗体を取得する。その後、抗酵素A抗体のH鎖とL鎖及び抗基質B抗体のH鎖とL鎖を含む二重特異性抗体を作製する。ここで、抗酵素A抗体と抗基質B抗体はそれぞれ複数種得られていることが望ましく、これらを用いてなるべく多くの組合せの二重特異性抗体を作製することが好ましい。二重特異性抗体を作製後、補因子機能代替活性を有する抗体を選択する。酵素あるいは基質に対する抗体は、当業者に公知の方法により得ることができる。例えば、免疫動物に対して抗原を免疫することにより調製することができる。動物を免疫する抗原としては、免疫原性を有する完全抗原と、免疫原性を有さない不完全抗原ハプテンを含むが挙げられる。本発明においては、本発明の補因子機能代替抗体が補因子として作用すると考えられる酵素あるいは基質を、上記抗原免疫原として使用する。免疫する動物として、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ニワトリまたはアカゲザル等を用いることができる。これら動物に対して、抗原を免疫することは、当業者においては、周知の方法によって行うことができる。本発明において好ましくは、免疫された動物または該動物の細胞から抗体のL鎖およびH鎖の可変領域の回収を行う。この操作は、当業者においては一般的に公知の技術を用いて行うことができる。抗原によって免疫された動物は、とりわけ脾臓細胞において該抗原に対する抗体を発現する。従って、例えば、免疫された動物の脾臓細胞からmRNAを調製し、該抗体の可変領域に対応するプライマーを用いて、RTPCRによりL鎖およびH鎖の可変領域の回収を行うことができる。詳細には、動物に酵素、基質それぞれを免疫する。免疫原とする酵素、基質は、蛋白質全体、もしくは該蛋白質の部分ペプチドであってもよい。また、動物を免疫するのに用いる免疫原としては、場合により抗原となるものを他の分子に結合させ可溶性抗原とすることも可能であり、また、場合によりそれらの断片を用いてもよい。免疫されたマウスの脾臓から脾細胞を単離し、マウスミエローマ細胞と融合し、ハイブリドーマを作製する。抗原に結合するハイブリドーマをそれぞれ選択し、可変領域に対応するプライマーなどを用いてRTPCRにてL鎖、H鎖の可変領域を回収することが出来る。CDRに対応するプライマー、CDRよりも多様性の低いフレームワークに対応するプライマー、あるいはシグナル配列とCH1もしくはL鎖定常領域CLに対応するプライマーを用いることもできる。あるいは、免疫された動物の脾細胞からmRNAを抽出し、可変領域付近に対応するプライマーを用いてRTPCRにてL鎖、H鎖可変領域のcDNAを回収する。また、invitroにおいてリンパ球を免疫することもできる。これを用いてscFvもしくはFabを提示するライブラリーを構築する。パンニングによって抗原結合抗体クローンを濃縮クローン化し、可変領域を得ることが出来る。この際、ヒトや免疫していない動物の末梢血単核球、脾臓、扁桃腺などに由来するmRNAを材料とする同様のライブラリーを用いてスクリーニングを行うことも可能である。その可変領域を用いて抗体発現ベクターを作製する。抗酵素抗体発現ベクターと抗基質抗体発現ベクターを同一の細胞に導入し、抗体を発現させることにより二重特異性抗体を得ることができる。次いで、本発明の上記方法においては、作製された二重特異性抗体の抗原への結合活性または抗体の生物活性を測定する。例えば、補因子機能代替活性を有する抗体の選択としては、以下のような方法により行うことができる。1該酵素該基質を含む反応系を用い、該抗体を加えることによる該酵素活性基質分解能の上昇を指標とし、選択する。2該酵素該基質該補因子が関わる生体機能を測定するあるいは模倣する系を用い、該補因子非存在条件下にて該抗体を加えることによる機能回復活性を指標とし選択する。より具体的には、例えば血液凝固因子欠乏ヒト血漿を用いた凝固時間測定系によって、被検抗体の凝固能を測定することにより活性を測定することができる。得られた抗体は、均一にまで精製することができる。抗体の分離、精製は通常の蛋白質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えばアフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組合せれば、抗体を分離、精製することができるが、これらに限定されるものではない。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインAカラム、プロテインGカラムなどが挙げられる。本発明の二重特異性抗体の好ましい態様においては、代替する補因子がFVIIIFVIIIaであり、すなわち酵素および基質の組合せが、血液凝固線溶関連因子のFIXa、及びFXであるため、好ましくは、抗FIXa抗体における可変領域と、抗FX抗体における可変領域とを含む構造を有する。より詳細には、例えば、FVIIIFVIIIa機能代替二重特異性抗体は、以下の方法で作製することができる。市販のFIXa及びFXをそれぞれマウスの皮下に免疫する。抗体価の上昇した免疫マウスの脾臓から脾細胞を単離し、マウスミエローマ細胞と融合し、ハイブリドーマを作製する。抗原FIXa、FXに結合するハイブリドーマをそれぞれ選択し、可変領域に対応するプライマーを用いてRTPCRにてL鎖、H鎖の可変領域を回収する。L鎖可変領域はCLを含むL鎖発現ベクターに、H鎖可変領域はH鎖定常領域を含むH鎖発現ベクターにそれぞれ組み込む。また、この免疫マウスの脾臓からmRNAを抽出し、可変領域に対応するプライマーを用いてRTPCRにてL鎖、H鎖可変領域のcDNAを回収する。これら可変領域を用いてscFvを提示するファージライブラリーを構築する。次いで、パンニングによって抗原結合抗体クローンを濃縮クローン化し、その可変領域を用いて抗体発現ベクターを作製し、抗FIXa抗体H鎖、L鎖の発現ベクターと抗FX抗体H鎖、L鎖の発現ベクターを同一の細胞に導入し、抗体を発現させることにより二重特異性抗体を得ることができる。本発明の上記方法においては、次いで、第一の抗体例えば、抗FIXa抗体のH鎖および第二の抗体例えば、抗FX抗体のH鎖を、第一の抗体または第二の抗体のL鎖で共通化して第一の共通L鎖抗体を作製し、該共通L鎖抗体の抗原への結合活性または抗体の生物活性を測定する。また、共通のL鎖は、特にこの方法に限定されるものではないが、例えば以下の1~の工程のようにして取得することも可能である。抗原Aに対する抗体A、及び抗原Bに対する抗体Bをそれぞれ選択し、該抗体のH鎖をコードする遺伝子の発現ベクターを導入して各H鎖の分泌株Ha及びHbを用意し、別に、L鎖がファージの表面蛋白との融合蛋白質として発現されるライブラリーを構築し、該L鎖ライブラリーを前記大腸菌Haに導入して抗体AのH鎖と様々なL鎖から成る抗体を表面に提示したファージライブラリーを分泌させ、該ライブラリーから、抗原Aによるパニングにてクローンを濃縮し、得られたクローンをさらに大腸菌Hbに感染させ、抗体BのH鎖と様々なL鎖から成る抗体を表面に提示したファージライブラリーを得、該ライブラリーを抗原Bによるパニングによってクローンを濃縮する。上記1~の工程を繰り返すことによって、二重特異性抗体の作成に利用可能な異なるH鎖に対応し、抗原に対し高いアフィニティーを示す共通L鎖を得ることができる。より詳細には、以下のa~eに示す工程のようにして共通L鎖を得ることができる。所望の抗原に対して結合する抗体のH鎖を分泌する宿主を製造する工程抗体L鎖ライブラリーを工程の宿主に導入し、前記H鎖及び前記L鎖により構成される抗体を提示するファージライブラリーを分泌させる工程工程記載の所望の抗原に対して特異的に結合する抗体を提示するファージライブラリーを選択する工程工程において選択されたファージライブラリーを、工程の抗原とは異なる所望の抗原に対して結合する抗体のH鎖を分泌する宿主に対して導入し、該H鎖及びL鎖により構成される抗体を提示するファージライブラリーを分泌させる工程工程記載の所望の抗原に対して特異的に結合する抗体を提示するファージライブラリーを選択する工程さらに、以下のa~eに示す工程のようにしても共通L鎖を得ることができる。所望の抗原に対して結合する抗体のH鎖を分泌する宿主を製造する工程抗体L鎖ライブラリーを工程の宿主に導入し、前記H鎖及び前記L鎖により構成される抗体を提示するファージライブラリーを分泌させる工程工程記載の所望の抗原に対して特異的に結合する抗体を提示するファージライブラリーを選択する工程工程において選択されたファージライブラリーを、工程のH鎖とは異なるアミノ酸配列を有するH鎖を分泌する宿主に対して導入し、該H鎖及びL鎖により構成される抗体を提示するファージライブラリーを分泌させる工程工程記載のH鎖が認識する抗原に対して特異的に結合する抗体を提示するファージライブラリーを選択する工程続いて、上述のようにして作製した共通L鎖抗体の1または2個または3個のCDRを、第一の抗体、第二の抗体または第一の抗原もしくは第二の抗原に対する他の抗体であって第一の抗体または第二の抗体のCDRのアミノ酸配列に対して高い相同性を有する抗体のCDRにより置換して共通L鎖抗体を作製する。このCDRの置換は、当業者においては、公知の技術、例えば、CDRシャフリング法によって適宜、実施することができる。より具体的には、後述の実施例に記載の方法によって行うことが可能である。この共通L鎖抗体と、工程2のL鎖の共通化前の元の二重特異性抗体、または前記の工程4で作製した共通L鎖抗体とを抗原への結合活性または抗体の生物活性について比較し、所望の活性を有する共通L鎖抗体を選択する。本発明において所望の活性とは、例えば、L鎖を共通化する前の抗体と比較して同等もしくは増強されているような活性を指す。より具体的には、L鎖が共通化される前の抗体の有する補因子FVIIIFVIIIaとしての活性が、同等もしくは増強されているような活性を言う。従って上記工程においては、例えば、補因子FVIIIFVIIIaとしての活性が、同等もしくは増強されているような共通L鎖抗体を選択する。上記方法においては、必要に応じて、前記の工程7で選択した共通L鎖抗体について、前記の工程6および7の工程を反復し、前記の工程2で作製した元の二重特異性抗体と同等もしくはそれ以上の活性を有する共通L鎖抗体を取得する。なお、上記反復は、特に制限されないが、好ましくは、2回以上反復される。本発明の上記方法によって作製された共通のL鎖を有する二重特異性抗体もまた、本発明に含まれる。本発明における抗体の1つの態様としては、補因子FVIIIの機能を代替する作用を有することから、本発明の抗体は、該補因子の活性機能低下に起因する疾病に対して、有効な薬剤となることが期待される。上記疾病として、例えば、出血、出血を伴う疾患、もしくは出血に起因する疾患等を挙げることができる。特に、FVIIIFVIIIaの機能低下や欠損は、血友病と呼ばれる出血異常症を引き起こすことで知られる。血友病のうち、先天性のFVIIIFVIIIa機能低下または欠損による出血異常症は、血友病Aと呼ばれる。血友病A患者が出血した場合、FVIII製剤の補充療法が行われる。また、激しい運動や遠足の当日、頻回に関節内出血を来たす場合、あるいは重症血友病に分類される場合には、FVIII製剤の予防投与が行われることがあるNilssonIMら著、JInternMed、1992年、Vol232、p2532およびLofqvistToはウムラウトが付くら著、JInternMed、1997年、Vol241、p395400。このFVIII製剤の予防投与は、血友病A患者の出血エピソードを激減させるため、近年、大きく普及しつつある。出血エピソードを減らすことは、致死性及び非致死性の出血の危険及びそれに伴う苦痛を低下させるだけでなく、頻回の関節内出血に起因する血友病性関節障害を未然に防ぐ。その結果、血友病A患者のQOL向上に大きく寄与する。FVIII製剤の血中半減期は短く、約12~16時間程度である。それ故、継続的な予防のためには、FVIII製剤を週に3回程度投与する必要がある。これは、FVIII活性として、概ね1以上を維持することに相当する第24回日本血栓止血学会学術集会学術専門部会血友病標準化検討部会ミニシンポジウム、2001年。また、出血時の補充療法においても、出血が軽度な場合を除き、再出血を防ぎ、完全な止血を行うため、一定期間、FVIII製剤を定期的に追加投与する必要がある。また、FVIII製剤は、静脈内に投与される。静脈内投与実施には、技術的な困難さが存在する。特に年少の患者に対する投与においては、投与に用いられる静脈が細い故、困難さが一層増す。前述の、FVIII製剤の予防投与や、出血の際の緊急投与においては、多くの場合、家庭療法自己注射が用いられる。頻回投与の必要性と、投与の際の技術的困難さは、投与に際し患者に苦痛を与えるだけでなく、家庭療法自己注射の普及を妨げる要因となっている。従って、現存の血液凝固第VIII因子製剤に比し、投与間隔が広い薬剤、あるいは投与が簡単な薬剤が、強く求められていた。さらに、血友病A患者、特に重症血友病A患者には、インヒビターと呼ばれるFVIIIに対する抗体が発生する場合がある。インヒビターが発生すると、FVIII製剤の効果がインヒビターにより妨げられる。その結果、患者に対する止血管理が非常に困難になる。このような血友病Aインヒビター患者が出血を来たした場合は、通常、大量のFVIII製剤を用いる中和療法か、複合体製剤complexconcentrateあるいはFVIIa製剤を用いるバイパス療法が、実施される。しかしながら、中和療法では、大量のFVIII製剤の投与が、逆に、インヒビター抗FVIII抗体力価を上げてしまう場合がある。また、バイパス療法では、複合体製剤やFVIIa製剤の短血中半減期約2~8時間が問題となっている。その上、それらの作用機序が、FVIIIFVIIIaの機能、すなわちFIXaによるFX活性化を触媒する機能に非依存であるため、場合によっては、止血機構をうまく機能させられず、不応答になってしまうケースがある。そのため、血友病Aインヒビター患者では、非インヒビター血友病A患者に比し、十分な止血効果を得られない場合が多いのである。従って、インヒビターの存在に左右されず、且つFVIIIFVIIIaの機能を代替する薬剤が、強く求められていた。ところで、FVIIIFVIIIaに関係する出血異常症として、血友病、抗FVIII自己抗体を有する後天性血友病のほかに、フォンビルブランド因子vWFの機能異常または欠損に起因するフォンビルブランド病が知られている。vWFは、血小板が、血管壁の損傷部位の内皮下組織に正常に粘着するのに必要であるだけでなく、FVIIIと複合体を形成し、血漿中FVIIIレベルを正常に保つのにも必要である。フォンビルブランド病患者では、これらの機能が低下し、止血機能異常を来たしている。さて、投与間隔が広く、投与が簡単であり、インヒビターの存在に左右されず、FVIIIFVIIIa非依存的にその機能を代替する医薬品の創製には、抗体を利用する方法が考えられる。抗体の血中半減期は、一般に、比較的長く、数日から数週間である。また、抗体は、一般に、皮下投与後に血中に移行することが知られている。すなわち、一般に抗体医薬品は、上記の、を満たしている。本発明では、本発明に記載の抗体および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。例えば、本発明の抗体がFIXもしくはFIXa、およびFXの両方を認識し、FVIIIの機能を代替する抗体は、例えば、出血、出血を伴う疾患、もしくは出血に起因する疾患の予防および/または治療のための医薬品医薬組成物もしくは薬剤となることが期待される。本発明において、出血、出血を伴う疾患、もしくは出血に起因する疾患とは、好ましくは血液凝固第VIII因子および/または活性化血液凝固第VIII因子の活性の低下ないし欠損によって発症および/または進展する疾患である。このような疾患としては、例えば上記の血友病A、血液凝固第VIII因子および/または活性化血液凝固第VIII因子に対するインヒビターが出現している疾患、後天性血友病、フォンビルブランド病を挙げることができるが、これら疾患に特に制限されない。治療または予防目的で使用される本発明の抗体を有効成分として含む医薬組成物は、必要に応じて、それらに対して不活性な適当な薬学的に許容される担体、媒体等と混和して製剤化することができる。例えば、滅菌水や生理食塩水、安定剤、賦形剤、酸化防止剤、緩衝剤、防腐剤、界面活性剤、キレート剤、結合剤等を挙げることができる。また、その他の低分子量のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチンや免疫グロブリン等の蛋白質、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン及びリシン等のアミノ酸、多糖及び単糖等の糖類や炭水化物、マンニトールやソルビトール等の糖アルコールを含んでいてもよい。注射用の水溶液とする場合には、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えば、Dソルビトール、Dマンノース、Dマンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、ポリアルコール、非イオン性界面活性剤等と併用してもよい。また、必要に応じ本発明の抗体をマイクロカプセルヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン、ポリメチルメタクリル酸等のマイクロカプセルに封入したり、コロイドドラッグデリバリーシステムリポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル等とすることもできるRemingtonsPharmaceuticalScience16theditionOsloEd等参照。さらに、薬剤を徐放性の薬剤とする方法も公知であり、本発明の抗体に適用し得るLangeretalJBiomedMaterRes15267277LangerChemtech1298105米国特許第3773919号欧州特許出願公開第58481号SidmanetalBiopolymers22547556EP第133988号。本発明の抗体または医薬組成物は、血液凝固第VIII因子と併用することができる。本発明の抗体または医薬組成物は、血液凝固第VIII因子と同時に投与してもよく、または、時期をずらして投与してもよい。また、本発明の抗体または医薬組成物と血液凝固第VIII因子を組み合わせたキットとして実施してもよい。さらに、本発明の抗体または医薬組成物と血液凝固第VIII因子を併用する場合は、いずれかを単独で用いる場合に比べて、所望により各々の投与量を少なくすることも可能である。本発明の二重特異性抗体または医薬組成物は2種以上を併用することが可能であり、また、他のFIXFIXaおよびFXに対する二重特異性抗体、抗FIX/FIXa抗体、抗FX抗体またはこれらの組み合せと併用することができる。本発明の二重特異性抗体または医薬組成物の2種以上を併用する場合、または、他のFIXFIXaおよびFXに対する二重特異性抗体、抗FIX/FIXa抗体、抗FX抗体またはこれらの組み合せと併用する場合は、同時に投与してもよく、または、時期をずらして投与してもよい。また、本発明の二重特異性抗体または医薬組成物の2種以上、または、他のFIXFIXaおよびFXに対する二重特異性抗体、抗FIX/FIXa抗体、抗FX抗体またはこれらの組み合せと組み合わせたキットとして実施してもよい。さらに、本発明の二重特異的抗体または医薬組成物の2種以上を併用する場合、または、他のFIXFIXaおよびFXに対する二重特異性抗体、抗FIX/FIXa抗体、抗FX抗体またはこれらの組み合せと併用する場合は、いずれかを単独で用いる場合に比べて、所望により各々の投与量を少なくすることも可能である。本発明の医薬組成物の投与量は、剤型の種類、投与方法、患者の年齢や体重、患者の症状、疾患の種類や進行の程度等を考慮して、最終的には医師の判断により適宜決定されるものであるが、一般に大人では、1日当たり、01~2000mgを1~数回に分けて投与することができる。より好ましくは1~1000mg/日、更により好ましくは50~500mg/日、最も好ましくは100~300mg/日である。これらの投与量は患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。投与期間も、患者の治癒経過等に応じて適宜決定することが好ましい。また、本発明の抗体をコードする遺伝子を遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。投与方法としては、nakedプラスミドによる直接投与の他、リポソーム等にパッケージングするか、レトロウィルスベクター、アデノウィルスベクター、ワクシニアウィルスベクター、ポックスウィルスベクター、アデノウィルス関連ベクター、HVJベクター等の各種ウィルスベクターとして形成するかAdolphウィルスゲノム法CRCPressFlorid参照、または、コロイド金粒子等のビーズ担体に被覆WO9317706等して投与することができる。しかしながら、生体内において抗体が発現され、その作用を発揮できる限りいかなる方法により投与してもよい。好ましくは、適当な非経口経路により十分な量が投与される。exvivoにおいてリポソームトランスフェクション、粒子衝撃法米国特許第4945050号、またはウィルス感染を利用して血液細胞及び骨髄由来細胞等に投与して、該細胞を動物に再導入することにより本発明の抗体をコードする遺伝子を投与してもよい。遺伝子治療では、本発明の抗体をコードする任意の遺伝子を使用することが可能であり、例えば、前述のA44、A69、B26のCDRをコードする塩基配列を含む遺伝子が挙げられる。また本発明は、本発明の抗体もしくは組成物を投与する工程を含む、出血、出血を伴う疾患、または出血に起因する疾患の予防および/または治療するための方法を提供する。抗体もしくは組成物の投与は、例えば、前記の方法により実施することができる。また本発明は、本発明の抗体の、本発明の医薬組成物の製造のための使用に関する。さらに本発明は、少なくとも本発明の抗体もしくは組成物を含む、上記方法に用いるためのキットを提供する。該キットには、その他、注射筒、注射針、薬学的に許容される媒体、アルコール綿布、絆創膏、または使用方法を記載した指示書等をパッケージしておくこともできる。なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。実施例1FactorIXaFIXaに対する非中和抗体の作製11.免疫およびハイブリドーマ作製BALBcマウス雄、免疫開始時6週齢、日本チャールスリバー8匹およびMRLlprマウス雄、免疫開始時6週齢、日本チャールスリバー5匹に、humanFactorIXaβEnzymeResearchLaboratoriesIncを以下の通り免疫した。初回免疫としてFCAフロイント完全アジュバントH37RaDifcolaboratoriesでエマルジョン化したFactorIXaβを40μghead皮下投与した。2週間後にFIAフロイント不完全アジュバントDifcolaboratoriesでエマルジョン化したFactorIXaβを40μghead皮下投与した。以後1週間間隔で追加免疫を3~7回行った。FactorIXaβに対する血清抗体価の上昇を12に示したELISAEnzymelinkedimmunosorbentassayで確認後、最終免疫としてPBSに希釈したFactorIXaβを40μghead静脈内投与した。最終免疫の3日後、マウスの脾臓を摘出し、その一部は実施例10-2で使用し、残りの脾臓細胞とマウスミエローマ細胞P3X63Ag8U1P3U1と称す、ATCCCRL1597を、PEG1500ロシュダイアグノスティックスを用いた常法に従い細胞融合した。10FBSを含むRPMI1640培地Invitrogenに懸濁した融合細胞を96wellcultureplateに播種し、融合1235日後にHAT選択培地10FBSRPMI16402HAT50xconcentrate大日本製薬5BMCondimedH1ロシュダイアグノスティックスへの置換を行うことにより、ハイブリドーマの選択培養を行った。融合後8日目または9日目に採取した培養上清を用いて、12に示したELISAによりFactorIXaに対する結合活性を測定することにより、FactorIXa結合活性を有するハイブリドーマを選択した。続いて13に示した方法でFactorIXaの酵素活性に対する中和活性を測定し、FactorIXaに対する中和活性を有さないハイブリドーマを選択した。ハイブリドーマは、96wellcultureplateに1wellあたり1個の細胞を播種することによる限界希釈を2回行ってクローン化した。顕微鏡観察により単一コロニーであることが確認された細胞について、12、13に示したELISAおよび中和活性測定を行い、クローンを選択した。14に示した方法により、クローン化した抗体の腹水を作製し、腹水から抗体を精製した。精製抗体が、APTT活性化部分トロンボプラスチン時間を延長させないことを、15に示した方法で確認した。12.FactorIXaELISACoatingbuffer100mMsodiumbicarbonatepH96002sodiumazideで1μgmLに希釈したFactorIXaβを、NuncImmunoplateNuncImmunoTM96MicroWellTMplatesMaxiSorpTMNalgeNuncInternationalに100μLwellで分注後、4°Cで一晩インキュベーションした。Tween20を含むPBSで3回洗浄後、diluentbuffer20002sodiumazideでplateを室温で2時間blockingした。Bufferを除去後、plateにdiluentbufferで希釈したマウスの抗血清またはハイブリドーマの培養上清を100μLwell添加し、室温で1時間インキュベーションした。Plateを3回洗浄後、diluentbufferで12000希釈したアルカリホスファターゼ標識ヤギ抗マウスIgGZymedLaboratoriesを100μLwell添加し、室温で1時間インキュベーションした。Plateを6回洗浄後、発色基質BluePhosTMMicrowellPhosphataseSubstrateKirkegaardPerryLaboratoriesを100μLwell添加し、室温で20分インキュベーションした。BluePhosTMStopSolutionKirkegaardPerryLaboratoriesを100μLwell添加した後、595nmにおける吸光度をMicroplateReaderModel3550BioRadLaboratoriesで測定した。13.FactorIXa中和活性測定PhospholipidSigmaAldrichを注射用蒸留水で溶解し、超音波処理を施すことにより、400μgmLのphospholipid溶液を調製した。01ウシ血清アルブミンを含むトリス緩衝生理食塩液以下、TBSB40μLと30ngmLFactorIXaβEnzymeResearchLaboratories10μLと400μgmLphospholipid溶液5μLと100mMCaCl2、20mMMgCl2を含むTBSB5μLとハイブリドーマ培養上清10μLを96穴プレート中で混和し、室温で1時間インキュベーションした。この混合溶液に、50μgmLFactorXEnzymeResearchLaboratories20μLおよび3UmLFactorVIIIAmricandiagnostica10μLを加え、室温で30分間反応させた。これに10μLの05MEDTAを添加することにより反応を停止させた。この反応溶液に、50μLのS2222溶液Chromogenixを添加し、室温で30分間インキュベーションした後、測定波長405nm、対照波長655nmにおける吸光度をMicroplateReaderModel3550BioRadLaboratoriesIncにより測定した。14.腹水の作製および抗体の精製樹立したハイブリドーマの腹水作製は常法に従って行った。すなわち、invitroで培養したハイブリドーマ2x106個を、あらかじめプリスタン261014tetramethylpentadecane和光純薬工業を2回腹腔内に投与しておいたBALBcマウス雄、実験開始時5~7週齢、日本チャールスリバーまたはBALBcヌードマウス雌、実験開始時5~6週齢、日本チャールスリバーおよび日本クレアの腹腔内に移植した。移植後1~4週目で腹部が肥大したマウスから腹水を回収した。腹水からの抗体精製はProteinGSepharoseTM4FastFlowAmershamBiosciencesカラムを用いて行った。BindingBuffer20mMsodiumacetatepH50にて2倍希釈した腹水をカラムにアプライし、10カラム容量のBindingBufferで洗浄した。5カラム容量のElutionBuffer01MglycineHClpH25にて抗体を溶出し、NeutralizingBuffer1MTrisHClpH90で中和した。これをCentriprepTM10Milliporeにて濃縮し、TBS50mMTrisbufferedSalineに溶媒を置換した。抗体濃度は、280nmの吸光度から、A135として算出した。吸光度の測定は、DU650BeckmanCoulterにて測定した。15.APTT活性化部分トロンボプラスチン時間の測定APTTはCRAAmelungを接続したKC10AAmelungにより測定した。TBSBで希釈した抗体溶液50μL、標準ヒト血漿DadeBehring50μL及びAPTT試薬DadeBehring50μLの混合液を37°Cで3分間加温した。20mMのCaCl2DadeBehring50μLを同混合液に加えることにより凝固反応を開始させ、凝固時間を測定した。実施例2FactorXFXに対する非中和抗体の作製21.免疫およびハイブリドーマ作製BALBcマウス雄、免疫開始時6週齢、日本チャールスリバー8匹およびMRLlprマウス雄、免疫開始時6週齢、日本チャールスリバー5匹に、humanFactorXEnzymeResearchLaboratoriesを以下の通り免疫した。初回免疫としてFCAでエマルジョン化したFactorXを40μghead皮下投与した。2週間後にFIAでエマルジョン化したFactorXを20または40μghead皮下投与した。以後1週間間隔で追加免疫を合計3~6回行った。FactorXに対する血清抗体価の上昇を22に示したELISAで確認後、最終免疫としてPBSに希釈したFactorXを20または40μghead静脈内投与した。最終免疫の3日後、マウスの脾臓を摘出し、その一部を実施例10-2で使用し、残りの脾臓細胞とマウスミエローマ細胞P3U1を、PEG1500を用いた常法に従い細胞融合した。10FBSRPMI1640培地に懸濁した融合細胞を96wellcultureplateに播種し、融合1235日後にHAT選択培地への置換を行うことにより、ハイブリドーマの選択培養を行った。融合後8日目に採取した培養上清を用いて22に示したELISAによりFactorXに対する結合活性を測定した。FactorX結合活性を有するハイブリドーマを選択し、23に示した方法でFactorXaの酵素活性に対する中和活性を測定した。FactorXaに対する中和活性を有さないハイブリドーマを、限界希釈を2回行うことによりクローン化した。14に示した方法により、クローン化した抗体の腹水を作製し、腹水から抗体を精製した。精製抗体が、APTTを延長させないことを、1-5に示した方法で確認した。22.FactorXELISACoatingbufferで1μgmLに希釈したFactorXを、NuncImmunoplateに100μLwellで分注後、4°Cで一晩インキュベーションした。Tween20を含むPBSで3回洗浄後、diluentbufferでplateを室温で2時間blockingした。Bufferを除去後、plateにdiluentbufferで希釈したマウスの抗血清またはハイブリドーマの培養上清を添加し、室温で1時間インキュベーションした。Plateを3回洗浄後、diluentbufferで12000希釈したアルカリホスファターゼ標識ヤギ抗マウスIgGを添加し、室温で1時間インキュベーションした。Plateを6回洗浄後、発色基質BluePhosTMPhosphateSubstrateKirkegaardPerryLaboratoriesを100μLwell添加し、室温で20分インキュベーションした。BluePhosTMStopSolutionKirkegaardPerryLaboratoriesを100μLwell添加した後、595nmにおける吸光度をMicroplateReaderModel3550BioRadLaboratoriesで測定した。23.FactorXa中和活性測定TBSBで15希釈したハイブリドーマ培養上清10μLと40μLの250pgmLFactorXaEnzymeResearchLaboratoriesを含むTBCP278mMCaCl2、222μMリン脂質フォスファチジルコリン:フォスファチジルセリン=75:25、SigmaAldrichを含むTBSBを混和し、室温で1時間インキュベーションした。この混合溶液に、20μgmLプロトロンビンEnzymeResearchLaboratoriesおよび100ngmL活性化凝固第V因子FactorVaHaematologicTechnologiesを含むTBCPを50μL添加して室温で10分間反応させた。05MEDTAを10μL添加することにより反応を停止させた。この反応溶液に、1mMS2238溶液Chromogenixを50μL添加し、室温で30分間インキュベーションした後、405nmにおける吸光度をMicroplateReaderModel3550BioRadLaboratoriesで測定した。実施例3キメラ二重特異性抗体発現ベクターの構築31ハイブリドーマからの抗体可変領域をコードするDNA断片の調製抗FIXa抗体あるいは抗FX抗体を産生するハイブリドーマから、QIAGENRNeasyMiniKitQIAGENを用いて説明書記載の方法に従い全RNAを抽出した。全RNAを40μLの滅菌水に溶解した。精製されたRNA1~2μgを鋳型に、SuperScriptcDNA合成システムInvitrogenを用いて説明書記載の方法に従いRTPCR法により一本鎖cDNAを合成した。32抗体H鎖可変領域のPCRによる増幅と配列解析マウス抗体H鎖可変領域VHcDNAの増幅用プライマーとして、Krebberらの報告JImmunolMethods19972013555に記載のHBプライマー混合物、およびHFプライマー混合物を用意した。各05μLの100μMHBプライマー混合物および100μMHFプライマー混合物を用いて、反応液25μL31で調製したcDNA溶液25μl、KODplusbuffer東洋紡績、02mMdNTPs15mMMgCl2075unitsDNApolymeraseKODplus東洋紡績を調製した。PCRは、サーマルサイクラーGeneAmpPCRsystem9700ParkinElmerを用いて、cDNA断片の増幅の効率性に応じて、条件A98°Cで3分間加熱後、98°C20秒、58°C20秒、72°C30秒からなる反応を1サイクルとして32サイクルないし条件B94°Cで3分間加熱後、94°C20秒、46°C20秒、68°C30秒からなる反応を1サイクルとして5サイクル、さらに94°C20秒、58°C20秒、72°C30秒からなる反応を1サイクルとして30サイクルのいずれかの条件で行った。PCR後、反応液を1アガローズゲル電気泳動に供した。目的のサイズ約400bpの増幅断片をQIAquickGelExtractionKitQIAGENを用い、添付説明書記載の方法で精製し、滅菌水30μlで溶出した。各DNA断片の塩基配列は、BigDyeTerminatorCycleSequencingKitAppliedBiosystemsを用い、DNAシークエンサーABIPRISM3100GeneticAnalyzerAppliedBiosystemsにて、添付説明書記載の方法に従い決定した。本方法により決定した配列群を解析ソフトGENETYXSVRCVersion61Genetyxにて比較解析し、異なる配列を有するものを選択した。33クローニング用抗体可変領域DNA断片の調製クローニング用制限酵素SfiI切断サイトを抗体可変領域増幅断片の両末端へ付加するために、以下の操作を行った。SfiI切断部位付加VH断片SfiIVH増幅のために、プライマーHBの2リンカー配列をSfiI切断部位を有するに示す配列配列番号:42へ変更したものプライマーVH5’endを用意した。各05μlの10μM配列特異的プライマーVH5’endおよび10μMプライマーscforJImmunolMethods19972013555を用いて、反応液20μL32で調製した精製VHcDNA増幅断片溶液1μlKODplusbuffer東洋紡績、02mMdNTPs15mMMgCl205unitsDNApolymeraseKODplus東洋紡績を調製した。PCRは、サーマルサイクラーGeneAmpPCRsystem9700ParkinElmerを用いて、断片の増幅の効率性に従い、条件A98°Cで3分間加熱後、98°C20秒、58°C20秒、72°C30秒からなる反応を1サイクルとして32サイクルないし条件B94°Cで3分間加熱後、94°C20秒、46°C20秒、68°C30秒からなる反応を1サイクルとして5サイクル、さらに94°C20秒、58°C20秒、72°C30秒からなる反応を1サイクルとして30サイクルのいずれかの条件で行った。PCR後、反応液を1アガローズゲル電気泳動に供した。目的のサイズ約400bpの増幅断片をQIAquickGelExtractionKitQIAGENにて添付説明書記載の方法で精製し、滅菌水30μLで溶出した。マウス抗体L鎖可変領域cDNA断片増幅のために、まずKrebberらの報告JImmunolMethods19972013555記載の各05μLの100μMLBプライマー混合物および100μMLFプライマー混合物を用いて、反応液25μL31で調製したcDNA溶液25μLKODplusbuffer東洋紡績、02mMdNTPs15mMMgCl2075unitsDNApolymeraseKODplus東洋紡績を調製した。PCRは、サーマルサイクラーGeneAmpPCRsystem9700ParkinElmerを用いて、断片の増幅の効率性に従い、94°Cで3分間加熱後、94°C20秒、46°C20秒、68°C30秒からなる反応を1サイクルとして5サイクル、さらに94°C20秒、58°C20秒、72°C30秒からなる反応を1サイクルとして30サイクルの条件で行った。PCR後、反応液を1アガローズゲル電気泳動に供した。目的のサイズ約400bpの増幅断片をQIAqucickGelExtractioKitQIAGENにて添付説明書記載の方法で精製し、滅菌水30μLで溶出した。該断片はそのC末端にプライマーLF由来の3リンカー配列が付加された状態にある。該断片C末端へSfiI切断部位を付加する目的で、プライマーLFの3リンカー配列をSfiI切断部位を有するに示す配列配列番号:43へ変更したものプライマーVL3’endを用意した。SfiI切断部位付加VL断片SfiIVL増幅のために、各05μLの10μMVL3’endプライマー混合物および10μMscbackプライマーを用いて、反応液20μL精製VLcDNA増幅断片溶液1μLKODplusbuffer東洋紡績、02mMdNTPs15mMMgCl205unitsDNApolymeraseKODplus東洋紡績を調製した。PCRは、サーマルサイクラーGeneAmpPCRsystem9700ParkinElmerを用いて、94°Cで3分間加熱後、94°C20秒、46°C20秒、68°C30秒からなる反応を1サイクルとして5サイクル、さらに94°C20秒、58°C20秒、72°C30秒からなる反応を1サイクルとして30サイクルの条件で行った。PCR後、反応液を1アガローズゲル電気泳動に供した。目的のサイズ約400bpの増幅断片をQIAquickGelExtractionKitQIAGENを用い、添付説明書記載の方法で精製し、滅菌水30μLで溶出した。精製SfiIVHおよびSfiIVL断片はSfiI宝酒造にて添付説明書記載の方法に従い反応液を調製し、50°Cで一晩消化を行った。その後、反応液をQIAquickPCRPurificationKitQIAGENを用いて添付説明書記載の方法で精製し、該キット添付のBufferEB30μLで溶出した。34二重特異性IgG抗体発現用プラスミド目的の二重特異性IgG抗体を産生する際に、各H鎖のヘテロ分子を形成させるためにIgG1のknobsintoholes技術RidgwayetalProteinEng19969617621を参考にIgG4のCH3部分へのアミノ酸置換体を作製した。タイプaIgG4γaはY349C、T366W置換体であり、タイプbIgG4γbはE356C、T366S、L368A、Y407Vの置換体である。さらに、両置換体のヒンジ領域にも置換ppcpScpppcpPcpを導入した。本技術により、殆どヘテロ体となり得るが、L鎖についてはその限りでなく、不必要な抗体分子の生成がその後の活性測定へ影響を及ぼしかねない。そのため、本方策では各特異性を有する抗体分子片腕HL分子と称するを別々に発現させ細胞内で目的型二重特異性IgG抗体を効率的に作らせる為に各HL分子に対応する発現ベクターとして異なる薬剤で誘導がかかるものを用いた。抗体分子片腕便宜上右腕HL分子と称するの発現用として、テトラサイクリン誘導型ベクターpcDNA4InvitrogenへH鎖ないしL鎖それぞれの該領域図1ないし図2、すなわち動物細胞用シグナル配列IL3ssProcNatlAcadSciUSA1984811075の下流に適当なマウス抗体可変領域VHないしVLとヒトIgG4γa定常領域配列番号:44ないしκ定常領域配列番号:45を組み込んだものpcDNA4g4HないしpcDNA4g4Lを作製した。まず、pcDNA4をそのマルチクローニングサイトに存在する制限酵素切断サイトEcoRVおよびNotI宝酒造で消化した。適当な抗体可変領域を有するキメラ二重特異性抗体右腕H鎖ないしL鎖発現ユニットそれぞれ約16kbないし約10kbをXhoI宝酒造で消化した後に、QIAquickPCRPurificationKitにて添付説明書記載の方法で精製し、DNApolymeraseKOD東洋紡績を用いて添付説明書記載の反応液組成にて72°C10分間反応させ、末端を平滑化した。該平滑化末端断片をQIAquickPCRPurificationKitQIAGENにて添付説明書記載の方法で精製し、NotI宝酒造で消化した。該NotIblunt断片それぞれ約16kbないし10kbと該EcoRVNotIで消化したpcDNA4を、LigationHigh東洋紡績を用いて添付説明書記載の方法に従い連結反応を行った。該反応液により大腸菌DH5α株CompetenthighDH5α東洋紡績を形質転換した。得られたアンピシリン耐性クローンよりQIAprepSpinMiniprepKitQIAGENを用いて各々プラスミドDNAを単離した。もう一方の片腕便宜上左腕HL分子と称するはエクダイソン類似体誘導型ベクターpINDInvitrogenへH鎖ないしL鎖それぞれを図3ないし図2、すなわち動物細胞用シグナル配列IL3ssEMBOJ198762939の下流に適当なマウス抗体可変領域VHないしVLとヒトIgG4γb定常領域配列番号:46ないしκ定常領域配列番号:45を組み込んだものpINDg4HないしpINDg4Lを前述の方法に則り作製し、各々のプラスミドDNAを単離した。35二重特異性抗体発現ベクター構築34で調製されたテトラサイクリン誘導型発現プラスミドpcDNA4g4HないしpcDNA4g4LをSfiIで消化し、反応液を1アガローズゲル電気泳動に供した。もともと有していた抗体可変領域部分VHないしVL図1ないし図2参照が除かれた断片約5kbをQIAquickGelExtractionKitQIAGENを用い、添付説明書記載の方法で精製し、滅菌水30μLで溶出した。該断片と、それぞれに対応する33で調製されたSfiI消化抗FIXa抗体由来SfiIVHないしSfiIVL断片をQuickLigationKitNewEnglandBiolabsを用いて添付説明書記載の方法に従い連結反応を行った。該反応液により大腸菌DH5α株CompetenthighDH5α東洋紡績を形質転換した。また、SfiI消化エクダイソン類似体誘導型発現プラスミド実施例34、pINDg4HないしpINDg4Lから、上述と同様の手法で抗体可変領域部分VHないしVL図3ないし図2参照を除いた断片と、それぞれに対応する33で調製されたSfiI消化抗FX抗体由来SfiIVHないしSfiIVL断片を、同様の手法にて組込んだ。得られた各々のアンピシリン耐性形質転換体は、挿入断片を挟み込むようなプライマーを用いて、コロニーPCR法にて目的断片の挿入を確認した。まず、抗FIXa抗体キメラH鎖ないしL鎖発現ベクターのために、挿入部位上流に存在するCMVForwardprimingsiteへアニールする21merのプライマーCMVF配列番号:47と挿入部位下流に存在するBGHReverseprimingsiteへアニールする18merのプライマーBGHR配列番号:48を合成したSigmaGenosys。抗FX抗体キメラH鎖ないしL鎖発現ベクターのために、挿入部位上流へアニールする24merのプライマーEcdF配列番号:49と挿入部位下流に存在するBGHReverseprimingsiteへアニールする18merのプライマーBGHR配列番号:48を合成したSigmaGenosys。コロニーPCRのために、反応液20μL各10μMプライマー02μL、KODdashbuffer東洋紡績、02mMdNTPs、075unitsDNApolymeraseKODdash東洋紡績を調製した。該反応液へ、形質転換株細胞を適量投入しPCRを行った。PCRは、サーマルサイクラーGeneAmpPCRsystem9700ParkinElmerを用いて、96°Cで1分間加熱後、96°C10秒、55°C10秒、72°C30秒からなる反応を1サイクルとして30サイクル反応させる条件より行った。PCR後、反応液を1アガローズゲル電気泳動に供し、目的サイズの増幅断片が得られたクローンを選択した。該PCR産物は、ExoSAPITAmershamBiosciencesを用いて添付説明書に従い、過剰のプライマーとdNTPsの不活性化を行った。各DNA断片の塩基配列は、BigDyeTerminatorCycleSequencingKitAppliedBiosystemsを用い、DNAシークエンサーABIPRISM3100GeneticAnalyzerAppliedBiosystemsにて添付説明書記載の方法に従い決定した。本方法により決定した配列群を解析ソフトGENETYXSVRCVersion61Genetyxにて解析し、VHについて挿入欠失変異等の入っていない目的クローンを、また、VLについてハイブリドーマで使用されたP3U1由来偽VL遺伝子とは異なり挿入欠失変異等のはいっていない目的クローンを選択した。該目的クローンから、QIAprepSpinMiniprepKitQIAGENを用いて各々プラスミドDNAを単離し、100μLの滅菌水へ溶解した。抗FIXa抗体キメラH鎖発現ベクター、抗FIXa抗体キメラL鎖発現ベクター、抗FX抗体キメラH鎖発現ベクター、そして抗FX抗体キメラL鎖発現ベクターを、それぞれpcDNA4g4IXaHn、pcDNA4g4IXaLn、pINDg4XHnそしてpINDg4XLnと名付けた。各プラスミド溶液は、使用するまで4°Cで保存した。実施例4キメラ二重特異性抗体の動物細胞での発現41DNA溶液の調製抗体右腕HL分子発現用ベクターpcDNA4g4IXaHnそしてpcDNA4g4IXaLnはテトラサイクリンにより発現誘導がかかる。テトラサイクリンが存在しない状況下で発現を完全に抑制する為にTetリプレッサーをコードするプラスミドpcDNA6TRInvitrogenが要求される。また、抗体左腕HL分子発現用ベクターpINDg4XHnそしてpINDg4XLnは昆虫ホルモンであるエクダイソン類似体ポナステロンAにより発現誘導がかかる。このとき、ポナステロンAと反応し誘導を行うエクダイソンレセプターとレチノイドXレセプターをコードするプラスミドpVgRXRInvitrogenが要求される。従って、動物細胞のトランスフェクションの為に計6種類のプラスミドDNA混液を調製した。細胞培養液1mLの為に、pcDNA4g4IXaHn、pcDNA4g4IXaLn、pINDg4XHnそしてpINDg4XLnを各2188ng、pcDNA6TRそしてpVgRXRを各13125ng用いた。42動物細胞のトランスフェクションヒト胎児腎癌細胞由来HEK293H株Invitrogenを10FCSを含むDMEM培地へ懸濁し、5×105個mLの細胞密度で接着細胞用12wellプレートCORNINGの各wellへ1mLずつ蒔きこみCO2インキュベーター37°C、5CO2内で培養した。41で調製したプラスミドDNA混液をトランスフェクション試薬、Lipofectamine2000Invitrogen7μLとOptiMEMI培地Invitrogen250μLの混液へ加えて室温20分間静置したものを各wellの細胞へ投入し、4~5時間、CO2インキュベーター37°Cにて5CO2内でインキュベートした。43二重特異性IgG抗体の発現誘導前項のようにトランスフェクションした細胞培養液から培地を吸引除去し、1μgmLのテトラサイクリン和光純薬工業を含む1mLCHOSSFMIIInvitrogen培地を投入し、CO2インキュベーター37°C、5CO2内で1日培養して、抗体右腕HL分子の第一次発現誘導を行った。その後、培地を吸引除去し、一旦1mLCHOSSFMII培地にて洗浄した後、5μMのポナステロンAInvitrogenを含む1mLCHOSSFMII培地を投入し、CO2インキュベーター37°C、5CO2内で2日ないし3日培養して、抗体左腕HL分子の第二次発現誘導を行い培地中へ二重特異性IgG抗体を分泌させた。培養上清は回収された後、遠心分離約2000g、5分間、室温して細胞を除去し、必要に応じてMicroconYM50Milliporeで濃縮を行った。該サンプルは使用するまで4°Cで保存した。実施例5ヒトIgG濃度の定量GoataffinitypurifiedantibodytohumanIgGFcCappelをcoatingbufferにて1μgmLに調製し、NuncImmunoplateに固相化した。DiluentbufferDBにてブロッキング処理した後、DBを用いて適当に希釈した培養上清サンプルを添加した。また、抗体濃度算出のためのスタンダードとして、1000ngmLから2倍系列でDBにて11段階希釈したヒトIgG4ヒト型化抗TF抗体、WO9951743参照を同様に添加した。3回洗浄したのち、GoatantihumanIgGalkalinephosphataseBiosourceInternationalを反応させた。5回洗浄したのち、Sigma104phosphatasesubstrateSigmaAldrichを基質として発色させ、吸光度リーダーModel3550BioRadLaboratoriesにより、参照波長655nmとして405nmの吸光度を測定した。MicroplateManagerIIIBioRadLaboretoriesソフトウェアを用いて、スタンダードの検量線から培養上清中のヒトIgG濃度を算出した。実施例6FVIIIa活性化凝固第VIII因子様活性アッセイ二重特異性抗体のFVIIIa様活性は、以下の酵素アッセイで評価した。また、以下の反応は全て室温で行った。375μgmLのFactorIXEnzymeResearchLaboratories40μLと抗体溶液10μLの混合液を96穴プレート中で1時間インキュベーションした。さらにその混合液に、10ngmLのFactorXIaEnzymeResearchLaboratories10μL50μgmLのFactorXEnzymeResearchLaboratories20μL400μgmLのphospholipid実施例13参照5μL5mMCaCl2と1mMMgCl2を含むTBSB以下、TBSBSと称す15μLを添加し、酵素反応を開始させた。30分間反応させたのち、05MEDTA10μLを加えることにより停止させた。発色基質溶液50μLをそれぞれのウェルに加えた後、0分、30分の405nm参照波長655nmにおける吸光度をModel3550MicroplateReaderBioRadLoboratoriesにより測定した。FVIIIa様活性は、抗体添加の30分間の吸光度変化値から抗体無添加の30分間の吸光度変化値を引いた値で表した図4および5参照。Phospholipidの溶媒にはTBSB、FactorXIa、FactorIX及びFactorXの溶媒にはTBSBSを用いた。発色基質溶液は、添付説明書に従い溶解したテストチーム発色基質S2222Chromogenixとポリブレン液06mgLhexadimethrinebromideSigmaの11混合液である。さらに、最も活性の高かったXB12SB04について、FVIIIa様活性の濃度依存性を測定した図6。実施例7血漿凝固アッセイ血友病A血液の凝固能を二重特異性抗体が是正するか明らかにするために、FVIII欠乏血漿を用いた活性化部分トロンボプラスチン時間APTTに対する同抗体の影響を検討した。様々な濃度の抗体溶液50μL、FVIII欠乏血漿Biomerieux50μL及びAPTT試薬DadeBehring50μLの混合液を37°Cで3分間加温した。凝固反応は20mMのCaCl2DadeBehring50μLを同混合液に加えることにより開始させた。CRAAmelungが接続されたKC10AAmelungにより凝固するまでの時間を測定した図7および8。さらに、最も凝固時間の短縮効果の高かったXB12SB04について濃度依存性を測定した図9。実施例8抗体精製実施例4に記載の方法で得られた10mLの培養上清をCentriconYM50Milliporeにより、1mLまで濃縮した。これに10μLの10BSA、10μLの1Tween20及び100μLのrProteinASepharoseTMFastFlowAmershamBiosciencesを添加し、4°Cで一晩転倒混和した。その溶液を022μmのフィルターカップUltrafreeMCMilliporeに移し、001Tween20を含むTBS500μLにて3回洗浄後、rProteinASepharoseTM樹脂を100μLの001Tween20を含む10mMHClpH20に懸濁して3分間静置したのち、抗体を溶出させた。直ちに、5μLの1MTrisHClpH80を加えて中和した。MicroplateManagerIIIBioRadLaboretoriesソフトウェアを用いて、スタンダードの検量線から培養上清中のヒトIgG濃度を算出した。抗体濃度は実施例5に従い定量した。実施例9抗FX抗体のGSTAPウェスタンブロッティングFXの活性化ペプチドとグルタチオンSトランスフェラーゼとの融合タンパクを発現する組換え大腸菌を構築した。ヒトFXの全長翻訳領域をカバーするcDNAをヒト肝臓MarathonReadycDNAからPCR法により増幅後、これを鋳型にさらにAP領域をコードする領域をPCR法により増幅しpGEMTベクターへサブクローニングしGSTAPをコードするpGEXF10APを得た。該プラスミドを形質転換した大腸菌を培養し、OD60008にて1mMIPTGを添加しGSTAPの発現誘導を行った。培養液を遠心後、菌体を回収し使用に供するまで20°Cにて保存した。その菌体ペレットを培養量の120量のPBSで再懸濁し、懸濁液01mLに対し、24mLの割合でSDSPAGEサンプルバッファーIWAKIを加え、95°C、5分間ボイルした。SDSPAGEminiゲル旭テクノグラスの各ウェルにその反応溶液10μLを加え、電気泳動を行った。電気泳動後のゲルをセミドライブロッターを用いてImmobilonPTMTransferMembraneへ転写し、BTPBS20を含むPBSでブロッキングした。ブロッキング終了後、実施例1-4で精製された抗FXマウス抗体SB04またはSB06をBTPBSで2μgmLに希釈したものと1時間反応させた。005Tween20を含むPBSで洗浄後、BTPBSで2000倍希釈したアルカリホスファターゼ標識ヤギ抗マウスIgGZymedLaboratoriesと1時間反応させた。005Tween20を含むPBSで洗浄後、発色基質BCIPNBTPhosphataseSubstrateKirkegaardPerryLaboratoriesで発色させた。実施例10免疫マウス脾臓由来scFvライブラリーからの二重特異性抗体の取得10-1.抗原および免疫BALBcマウス雄、免疫開始時6週齢、日本チャールスリバー3匹、MRLlprマウス雄、免疫開始時6週齢、日本チャールスリバー3匹、およびC57BL6Nマウス雄、免疫開始時6週齢、日本チャールスリバー3匹に、抗原であるFactorIXaβEnzymeResearchLaboratoriesIncもしくはFactorXEnzymeResearchLaboratoriesIncを以下の通り免疫した。初回免疫としてFCAフロイント完全アジュバントH37RaDifcolaboratoriesでエマルジョン化した抗原を40μghead皮下投与した。2週間後にFIAフロイント不完全アジュバントDifcolaboratoriesでエマルジョン化した抗原を40μghead皮下投与した。以後1週間間隔で追加免疫を3回行い、最終免疫の8日後にマウスより脾臓を摘出した。10-2.ファージライブラリーの構築実施例1-1および2-1で作出した免疫マウス摘出脾臓の一部、ならびに実施例10-1にて作出した免疫マウスからの摘出脾臓をTrizolReagentへ投入し、ガラスホモジナイザーを用いて均質化した。その後、試薬添付マニュアル記載の方法に従い、TotalRNAを抽出した。抽出溶液からPolyATractSystem1000キットを用いて添付マニュアル記載の方法に従いpolyARNAを抽出した。RTPCRにてcDNAを合成し、使用に際するまで20°Cで保存した。マウス抗体重鎖可変領域VHおよび軽鎖可変領域cDNAの増幅用プライマーとして、実施例3-2および3-3で用いたHBプライマー混合物、HFプライマー混合物、LBプライマー混合物、そしてLFプライマー混合物を用意した。VH増幅用として各1μLの100μMHBプライマー混合物および100μMHFプライマー混合物を用いて、反応液50μLcDNA溶液25μl、KODplusbuffer東洋紡績、02mMdNTPs15mMMgCl2375unitsDNApolymeraseKODplus東洋紡績を調製した。また、VL増幅用として各1μLの100μMLBプライマー混合物および100μMLFプライマー混合物を用いて、上記と同様の組成反応液を調製した。PCRは、サーマルサイクラーGeneAmpPCRsystem9700ParkinElmerを用いて、98°Cで3分間加熱後、98°C20秒、58°C20秒、72°C30秒からなる反応を1サイクルとして32サイクルを行った。PCR後、反応液を2アガローズゲル電気泳動に供した。目的のサイズ約400bpの増幅断片をQIAquickGelExtractionKitQIAGENを用い、添付説明書記載の方法で精製し、滅菌水50μlで溶出した。次にscFv断片を増幅するために、反応液100μLVH断片溶液3μl、VL断片溶液3μl、KODplusbuffer東洋紡績、02mMdNTPs1mMMgCl25unitsDNApolymeraseKODplus東洋紡績を10本調製し、1stPCR94°Cで3分間加熱後、94°C1分、63°C4分、からなる反応を1サイクルとして7サイクルを行った後、63°Cに保温した状態で各チューブへ10μMscforプライマー、および10μMscbackプライマーを各25μlずつ添加し、さらに2ndPCRにて精製し、精製産物を制限酵素SfiIにて50°Cで一晩消化を行った。消化物は2アガローズゲル電気泳動に供した後、目的のサイズ約800bpの増幅断片をQIAquickGelExtractionKitQIAGENを用い、添付説明書記載の方法で精製し適量の滅菌水にて溶出した。ファージgeneIIIタンパク上にscFvを提示させるため、ファージミドベクターとして、pELBGlacIを用いた。該ベクター10μgを制限酵素SfiIにて50°Cで一晩消化を行った後、目的のサイズ約5kbの切断断片をQIAquickGelExtractionKitQIAGENを用い、添付説明書記載の方法で精製し適量の滅菌水にて溶出した。精製PCR産物と精製ベクター断片を、LigationHighを用いて添付説明書記載の方法に従い、16°C一晩連結反応を行った。該反応液により大腸菌XL1blueelectrocompetentcellあるいはエレクトロマックスDH12sを添付説明書記載の方法に従いエレクトポレーション法による形質転換を行った。得られたアンピシリン耐性形質転換体を全て回収し、組換え大腸菌ライブラリーとして使用に供するまで20°Cにて保存した。該大腸菌ライブラリー2x109cfuを50mL2xYTAG100μgmLアンピシリン、2グルコースを含む2xTYに植菌し、OD60004~05まで37°Cにて培養した。4x1011のヘルパーファージVCSM13を加え37°C、15分間静置して感染させた。ここに450mL2xYTAK100μgmLアンピシリン、25μgmLカナマイシンを含む2xTY、25μL1molLIPTGを添加し、30°C10時間培養した。遠心分離にて培養上清を回収し、100mLPEGNaCl溶液10ポリエチレングリコール800025molLNaClを混合後、4°C、60分間静置した。10800xg、30分間遠心にてファージを沈殿させ、沈殿物を40mLの水に懸濁し、8mLPEGNaCl溶液を混合後、4°C、1時間静置した。10800xg、30分間遠心にてファージを沈殿させ5mLPBSに懸濁しファージライブラリーを得た。該ファージは使用に際するまで、4°Cにて保存した。10-3.パンニング法による結合ファージ濃縮FactorIXaβもしくはFactorXをNoWeighPremeasuredNHSPEO4BiotinMicrotubesPierceを用いてビオチン標識した。10-2で作成されたファージライブラリー溶液600μlに100pmolのビオチン標識FactorIXaβもしくはFactorXを加え、60分間抗原と接触させた。5MPBS5wvスキムミルクを含むPBSで洗浄したDynabeadsM280Streptavidin600μLを加え、15分間結合させた。ビーズ結合ファージを1mLのPBST01Tween20を含むPBSにて何回か洗浄した後、PBSにて洗浄した。08mLの01molLグリシンHClpH22中にビーズを5分間懸濁し、ファージを溶出した。あるいは、イムノプレートへ固相化したFactorIXaβもしくはFactorXに、25wvスキムミルクで15分間インキュベートしたファージライブラリーを加え、60分間抗原と接触させた。抗原結合ファージを1mLのPBST01Tween20を含むPBSにて何回か洗浄した後、PBSにて洗浄した。08mLの01molLグリシンHClpH22にて5分間インキュベートし、ファージを溶出した。回収したファージ溶液に45μL2molLTrisを添加して中和し、対数増殖期OD60004~05XL1Blue10mLに添加、37°C、30分間静置することで感染させた。これを2xYTAGプレートに広げ、30°Cで培養した。コロニーを回収し、2xYTAGに植菌、OD60004~05まで37°Cにて培養した。培養液10mLに5μL1molLIPTG、1011pfuヘルパーファージVCSM13を添加し37°C30分間静置した。遠心集菌後、2xYTAK100mLに再懸濁し、30°C、10時間培養した。遠心分離にて培養上清を回収し、20mL10PEG5molLNaCl溶液を混合後、4°C、20分間静置した。10800xg、30分間遠心にてファージを沈殿させ、2mLPBSに懸濁したものを次のパンニングに供した。10-4.ファージELISA上記のシングルコロニーを100μL2xYTAGに植菌し、30°Cで一晩培養した。この5μLを500μL2xYTAGに植菌、37°C、5時間培養後、ヘルパーファージ2x108pfuを投入し37°Cにて30分間静置、さらに37°Cにて30分間攪拌培養後、05mMIPTGを含む2xYTAKを120μL添加した。30°Cにて一晩培養し、遠心上清をELISAに供した。ビオチン標識抗原のパンニングにて得られたクローンのELISAのために、10μgmLのビオチン標識抗原でコートしたStreptaWell96マイクロタイタープレートRocheを用いた。また、ネイティブ抗原のパンニングにて得られたクローンのELISAのために、10μgmLのネイティブ抗原を固相化したイムノプレートを用いた。PBSTにて洗浄し抗原を除いた後、ブロッキングバッファーとして2MPBS200μLあるいは2BSAPBSで室温1時間ブロッキングした。バッファーを除き、ここに培養上清を加え60分間静置しファージを結合させた。洗浄後、結合ファージはブロッキングバッファーにて希釈したHRP結合抗M13抗体AmershamPharmaciaBiotechとTMB基質Zymedで検出し、1molLH2SO4添加により反応を停止した後、プレートリーダーにてA450の値を測定した。10-5.配列決定とクローン選択ELISAにて陽性であったクローンの組換え大腸菌2xYTAG培養液からプライマーPBG3F15CAGCTATGAAATACCTATTGCC3/配列番号:38とPBG3R15CTTTTCATAATCAAAATCACCGG3/配列番号:39を用いてPCRにてscFv領域を増幅し、その塩基配列決定した。培養液1μL、10xKODDash緩衝液15μL、10μmolLプライマーを02μLづつ、KODDashポリメラーゼ東洋紡績、25UμL03μLを含むPCR反応液15μLを、サーマルサイクラーGeneAmpPCRsystem9700で96°C、10秒、55°C、10秒、72°C、30秒、30サイクルの増幅を行った。PCR後、5μLの反応液にExoSAPITアマシャムを3μL添加し、37°C、15分間、引き続き80°C、15分間保温した。このサンプルについてPBG3F25ATTGCCTACGGCAGCCGCT3/配列番号:40あるいはPBG3R25AAATCACCGGAACCAGAGCC3/配列番号:41をプライマーとしてBigDyeTerminatorCycleSequencingkitAppliedBiosystemsにて反応を行い、AppliedBiosystemsPRISM3700DNASequencerで泳動した。塩基配列から推定されるアミノ酸配列のCDR3の異なるクローンを抗FactorIXaについて52クローン、及び抗FactorXについて33クローンを選択した。10-6.二重特異性IgG抗体発現ベクターの構築scFv抗体をIgG型として発現させるために、実施例3-3、3-4、そして3-5に示す同様の方策にて抗体可変領域を誘導型発現ベクターにクローニングを行った。抗FIXa抗体可変領域はテトラサイクリン誘導型ベクターそれぞれpcDNA4g4HおよびpcDNA4g4Lへ組み込まれた。抗FX抗体可変領域はエクダイソン類似体誘導型ベクターそれぞれpINDg4HおよびpcDNA4g4Lへ組み込まれた。目的クローンからQIAprepSpinMiniprepKitを用いて各々プラスミドDNAを単離し、100μLの滅菌水へ溶解した。10-7.キメラ二重特異性抗体の動物細胞での発現実施例4-1に示す同様の方策で調製されたDNA溶液を用いて、実施例4-2および4-3に示す同様の方策にて動物細胞で発現させ、培養上清を回収した。該サンプルは使用するまで4°Cで保存した。実施例11抗体精製実施例10-7に記載の方法で得られた10mLの培養上清に100μLのrProteinASepharoseTMFastFlowAmershamBiosciencesを添加し、4°Cで一晩転倒混和した。その溶液を022μmのフィルターカップUltrafreeMCMilliporeに移し、001Tween20を含むTBS500μLにて3回洗浄後、rProteinASepharoseTM樹脂を100μLの001Tween20を含む10mMHClpH20に懸濁して3分間静置したのち、抗体を溶出させた。直ちに、5μLの1MTrisHClpH80を加えて中和した。MicroplateManagerIIIBioRadLaboretoriesソフトウェアを用いて、ヒトIgG4ヒト型化抗TF抗体、WO9951743参照の検量線から培養上清中のヒトIgG濃度を算出した。抗体濃度は実施例5に従い定量した。実施例12FVIIIa活性化凝固第VIII因子様活性アッセイ二重特異性抗体のFVIIIa様活性は、以下の酵素アッセイで評価した。また、以下の反応は全て室温で行った。15μgmLのFactorIXEnzymeResearchLaboratories10μLと100mMCaCl2と20mMMgCl2を含むTBSB5μLと実施例10-7記載の方法で得られた培養上清50μLの混合液を96穴プレート中で1時間インキュベーションした。さらにその混合液に、10ngmLのFactorXIaEnzymeResearchLaboratories10μL50μgmLのFactorXEnzymeResearchLaboratories20μL400μgmLのphospholipid5μLを添加し、酵素反応を開始させた。30分間反応させたのち、05MEDTA10μLを加えることにより停止させた。発色基質溶液50μLをそれぞれのウェルに加えた後、0分、60分の405nm参照波長655nmにおける吸光度をModel3550MicroplateReaderBioRadLoboratoriesにより測定した。FVIIIa様活性は、抗体発現培養上清の60分間の吸光度変化値から抗体非発現培養上清の60分間の吸光度変化値を引いた値で表した図12を参照。Phospholipid、FactorXIa、FactorIX及びFactorXの溶媒にはTBSBを用いた。発色基質溶液は、添付説明書に従い溶解したテストチーム発色基質S2222Chromogenixとポリブレン液06mgLhexadimethrinebromideSigmaの11混合液である。実施例13血漿凝固アッセイ実施例11の方法に従い調製した二重特異性抗体が血友病A血液の凝固能を回復するか明らかにするために、FVIII欠乏血漿を用いた活性化部分トロンボプラスチン時間APTTに対する同抗体の影響を、実施例7で示す同様の方法で評価した図13を参照。さらに、凝固時間の短縮効果の高かったA44B26、A69B26について濃度依存性を測定した図14、図15を参照。実施例14二重特異性IgG抗体とFVIIIとの併用検討二重特異性抗体とFVIIIとの併用検討は、以下の血漿凝固アッセイ条件で評価した。25μgmL抗体溶液40μL、FVIII欠乏血漿Biomerieux50μLの混合液を室温で、30分間インキュベーションした。さらにその混合液に、1UmLの遺伝子組換え型血液凝固第VIII因子製剤コージネイトFSBAYER10μL及びAPTT試薬DadeBehring50μLを加え、37°Cで3分間加温した。凝固反応は20mMのCaCl2DadeBehring50μLを同混合液に加えることにより開始させた。CRAAmelungが接続されたKC10AAmelungにより凝固するまでの時間を測定した図16を参照。実施例15インヒビター血漿における二重特異性IgG抗体の効果インヒビター血漿における二重特異性IgG抗体の効果は、以下の血漿凝固アッセイ条件で評価した。FVIII欠乏血漿Biomerieux50μLに100μgmL抗ヒトFVIII中和抗体CatalogNumberMAB3440、CHEMICON10μLの混合液を室温で、30分間インキュベーションした。この血漿をインヒビター血漿として用いた。このインヒビター血漿に、25μgmL抗体溶液40μL及びAPTT試薬DadeBehring50μLを加え、37°Cで3分間加温した。凝固反応は20mMのCaCl2DadeBehring50μLを同混合液に加えることにより開始させた。CRAAmelungが接続されたKC10AAmelungにより凝固するまでの時間を測定した図17を参照。実施例16二重特異性抗体のヒト化実施例1~7で取得した二重特異性抗体の中で、血液凝固時間の短縮効果が最も高かったXB12SB04について、以下のようにヒト化を実施した。16-1.ヒト抗体の相同性検索一般公開されているKabatDatabaseおよびIMGTDatabaseよりヒト抗体アミノ酸配列データを入手し、構築したDatabaseを用いてマウスXB12H鎖可変領域、マウスXB12L鎖可変領域、マウスSB04H鎖可変領域、マウスSB04L鎖可変領域に分けてホモロジー検索を行った。その結果、以下に示すヒト抗体配列と高い相同性を持つことが確認されたことからヒト化抗体のフレームワーク領域に使用することにした。XB12H鎖可変領域:KABATID020619XB12L鎖可変領域:EMBLAccessionNoX61642SB04H鎖可変領域:KABATID025255SB04L鎖可変領域:EMBLAccessionNoAB064111のヒト抗体のFRに各マウス抗体の相補性抗原決定領域以下、CDRを移植したヒト化抗体を作製した。また、NCBIより一般公開されている相同性検索WebsitehttpwwwncbinlmnihgovBLASTを使用して、のヒト抗体に相同性の高いヒト抗体の分泌シグナル配列を検索した。検索により得られた以下に示す分泌シグナル配列を使用した。XB12H鎖可変領域:GenBankAccessionNoAF062120XB12L鎖可変領域:GenBankAccessionNoM74019SB04H鎖可変領域:GenBankAccessionNoBC019337SB04L鎖可変領域:GenBankAccessionNoAY20475616-2.ヒト化抗体遺伝子発現ベクターの構築分泌シグナル配列から抗体可変領域にいたるアミノ酸配列をコードする塩基配列において、50base程度の合成オリゴDNAを3’末端側が約20base程度ハイブリダイズするように交互に12本作製した。さらに、抗体可変領域遺伝子の5’末端側にハイブリダイズし、XhoI切断配列を有するプライマーと抗体可変領域遺伝子の3’末端側にハイブリダイズし、SfiI切断配列を有するプライマーを作製した。25μMに調製した合成オリゴDNAを各1μLで混合し、1xTaKaRaExTaqBuffer04mMdNTPs05unitsTaKaRaExTaqを加え、反応液48μLになるように調製した。94°C5分保温した後に、94°C2分、55°C2分、72°C2分からなる反応を2サイクル行い、各合成オリゴDNAのアッセンブルおよび伸長反応を実施した。次に、抗体遺伝子の5’末端側および3’末端側にハイブリダイズするプライマーを1μL添加し、94°C30秒、55°C30秒、72°C1分からなる反応を35サイクル行い、72°C5分反応させ、抗体可変領域遺伝子を増幅した。PCR後、反応液全量を1アガローズゲル電気泳動に供した。目的のサイズ約400bpの増幅断片をQIAquickGelExtractionKitQIAGENを用いて、添付説明書記載の方法で精製し、滅菌水30μlで溶出した。該断片をpGEMTEasyVectorSystemsを用いて、添付説明書記載の方法でクローニングを行った。各DNA断片の塩基配列は、BigDyeTerminatorCycleSequencingKitAppliedBiosystemsを用い、DNAシークエンサーABIPRISM3700DNASequencerAppliedBiosystemsにて、添付説明書記載の方法に従い決定した。正しいヒト化抗体可変領域遺伝子配列であることが確認されたプラスミドをXhoIおよびSfiIで消化した後に、反応液を1アガローズゲル電気泳動に供した。目的のサイズ約400bpのDNA断片をQIAquickGelExtractionKitQIAGENを用いて、添付説明書記載の方法で精製し、滅菌水30μlで溶出した。また、実施例3-4で作製したテトラサイクリン誘導型発現プラスミドpcDNA4g4H、pcDNA4g4Lおよびエグダイソン類似体誘導型発現プラスミドpINDg4H、pINDg4LをXhoIおよびSfiIで消化した後に、抗体定常領域を含む断片約5kbをQIAquickGelExtractionKitQIAGENを用いて、添付説明書記載の方法で精製し、滅菌水30μlで溶出した。XhoIおよびSfiIで消化したヒト化XB12抗体遺伝子断片またはL鎖可変領域とXhoIおよびSfiIで消化したテトラサイクリン誘導型発現プラスミドpcDNA4g4H、pcDNA4g4LをRapidDNALigationKitを用いて添付説明書記載の方法で連結反応を行った。また、XhoIおよびSfiIで消化したヒト化SB04抗体遺伝子断片とXhoIおよびSfiIで消化したエグダイソン類似体誘導型発現プラスミドpINDg4H、pINDg4LをRapidDNALigationKitを用いて添付説明書記載の方法で連結反応を行った。各反応液の一部を用いて大腸菌DH5α株を形質転換した。16-3.ヒト化二重特異性抗体の調製4種類のヒト化抗体発現ベクターとpcDNA6TR、pVgRXRを用いて、実施例4-2、4-3に示す方法でHEK293Hへ遺伝子導入および発現誘導を行った。さらに、実施例8、5に示す方法で抗体精製および抗体濃度の定量を実施した。16-4.ヒト化二重特異性抗体の活性評価および抗体配列の改変調製したヒト化ニ種特異性抗体およびキメラニ種特異性抗体の血漿凝固能を評価するために、実施例7の方法に従って、FVIII欠乏血漿を用いてAPTTに対する抗体の影響を検討した。血液凝固能が低下したヒト化ニ種特異性抗体について、活性上昇を目指して、ヒト抗体FRのアミノ酸の改変した。また、熱安定性低下などが危惧されるXB12抗体VHのCDR3のシステイン残基についてもアラニン残基に改変した。具体的には、QuikChangeSiteDirectedMutagenesisKitを用いて、添付説明書記載の方法でヒト化抗体発現ベクターに変異を導入した。FR配列のアミノ酸改変および血液凝固能の評価を繰り返すことでXB12SB04と同等の活性を有するヒト化ニ種特異性抗体ヒト化XB12抗体VHhXB12fAVLhXBVLヒト化SB04抗体を取得した図18。実施例17二重特異性IgG4抗体H鎖発現用プラスミドの構築さらに、CDRシャフルされたL鎖を用いたA44とB26の二重特異性抗体の発現を実施した。CAGGプロモーターの下流に、2つのSfiIサイトを挟んだ動物細胞シグナル配列とヒトIgG1CH1直前のイントロン、さらにその下流にヒトIgG4定常領域cDNAを有するベクターpCAGGssg4CHを構築した。これらSfiI間にシグナル配列プロセシング部位とスプライシングドナー配列に挟まれたVH遺伝子を挿入することによってIgG4H鎖として分泌させる動物細胞用発現ベクターを構築することが出来る。さらにH鎖がヘテロな組み合わせであるIgG4を優先的に発現させるために、IgG1のknobsintoholesを参考にIgG4のCH3部分へのアミノ酸置換体を用いた。タイプaはY349C、T366W置換体、タイプbはE356C、T366S、L368A、Y407Vの置換体である。さらにH鎖のダイマー形成促進のためにヒンジにもアミノ酸置換ppcpScp→ppcpPcpを導入した。シグナル配列はタイプaにはマウスIL3、タイプbにはヒトIL6のものをそれぞれ用いて構築したpCAGGIL3ssg4CHPapCAGGIL6ssg4CHPb。pCAGGIL3ssg4CHPaのSfiIサイトに上記実施例で得られた抗体A44のVH断片を挿入してpCAGGchiA44g4aを、抗体A69のVH断片を挿入してpCAGGchiA69g4aを得た。一方、pCAGGIL6ssg4CHPbのSfiIサイトに同じく抗体B26のVH断片を挿入し、pCAGGchiB26g4bを得た。実施例18CDR交換L鎖発現ベクターの構築CAGGプロモーターの下流に、2つのSfiIサイトを挟んだマウスIL3シグナル配列とヒトkappa定常領域直前のイントロン、さらにその下流にヒトkappa鎖定常領域エクソンを有するベクターpCAGGkappaを構築した図19。これらSfiI間にシグナル配列プロセシング部位とスプライシングドナー配列に挟まれたVL遺伝子を挿入することによってkappa鎖として分泌させる動物細胞用発現ベクターを構築することが出来る。A44抗体L鎖のフレームワーク、CDR及びA50A69B26抗体L鎖のCDRを組み合わせたL鎖可変領域をコードするDNAを合成するために、60塩基程度の合成オリゴDNAを末端が約20base程度ハイブリダイズするように交互に作製した。さらに、VL遺伝子の5’末端側にハイブリダイズし、シグナル配列プロセシング部位とSfiIサイトを有するプライマーscbackと、VL遺伝子の3’末端側にハイブリダイズし、スプライシングドナー配列とSfiIサイトを有するプライマーscforを作製した。A44LF1配列番号:50GCCATGGCGGACTACAAAGATATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACA44LR1配列番号:51GGCTACAGCAGTCCCCACATCCTGACTGGCCTTGCAGGTGATGCTGACCCTGTCTCCTACTGATGTGGAA44LF2配列番号:52GTGGGGACTGCTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGGCAATCTCCTAAACTACTGATTTACA44LR2配列番号:53GAAGCGATCAGGGACTCCAGTGTGCCGGGTGGATGCCCAGTAAATCAGTAGTTTAGGA44LF3配列番号:54GGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTAGATATGGGACAGATTTCACTCTCACCATTA44LR3配列番号:55ACAGAGATAATCTGCCAGGTCTTCAGACTGCACATTGCTAATGGTGAGAGTGAAATCA44LF4配列番号:56CTGGCAGATTATCTCTGTCAGCAATATAGCAACTATATCACGTTCGGTGGTGGGACCA44LR4配列番号:57GGAATTCGGCCCCCGAGGCCGACTTACCACGTTTCAGCTCCAGCTTGGTCCCACCACCGAACGTA44LR4Gly配列番号:58GGAATTCGGCCCCCGAGGCCGACTTACCTCGTTTCAGCTCCAGCTTGGTCCCACCACCGAACGTB26LR1A44fr配列番号:59GGCTACAGCAGTCCCCACATtCTGACTGGCCTTGCAGGTGATGCTGACCCTGTCTCCTACTGATGTGGAB26LR2A44fr配列番号:60GAAGCGATCAGGGACTCCACTGTACCGGTAGGATGCCGAGTAAATCAGTAGTTTAGGB26LF4A44fr配列番号:61CTGGCAGATTATCTCTGTCAGCAATATAACAGCTATCCACTCACGTTCGGTGGTGGGACCA69LR1A44fr配列番号:62GGCTACAGCAGTACTCACATCCTGACTGGCCTTGCAGGTGATGCTGACCCTGTCTCCTACTGATGTGGAA50LF4A44fr配列番号:63CTGGCAGATTATCTCTGTCAGCAATATAGCAGCTATTTAACGTTCGGTGGTGGGACCscback配列番号:64TTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCGGACTACAAAGscfor配列番号:65GGAATTCGGCCCCCGAG10μMに調製した合成オリゴDNAを下記表1の組み合わせで各1μL混合し、1x酵素添付Buffer033mMdNTPs25単位ProofStartPolymeraseもしくはLATaqから成る反応液45μLを調製した。94°C5分保温した後に、94°C1分、63°C4分からなる反応を7サイクル行い、続けて、5μMscback5μMscfor溶液を5μL添加し、94°C30秒、55°C30秒、72°C30秒からなる反応を30サイクル行い、VL遺伝子を増幅した。PCR後、反応液全量をQIAquickPCRPurificationKitQiagenを用いて、添付説明書記載の方法で精製し、滅菌水で溶出した。該断片を制限酵素SfiIにて処理した後、2アガローズゲル電気泳動に供した。約04kbの増幅断片をQIAquickGelExtractionKitQiagenを用いて、添付説明書記載の方法で精製し、滅菌水で溶出した。LigationHighを用いて、SfiI処理した上記L鎖発現ベクターpCAGGkappaとLigationした。各反応液の一部を用いて大腸菌DH5α株を形質転換した。塩基配列は、BigDyeTerminatorCycleSequencingKitAppliedBiosystemsを用い、DNAシークエンサーABIPRISM3700DNASequencerAppliedBiosystemsにて、添付説明書記載の方法に従い決定し、確認した。BBA断片を挿入してpCAGGA44BBAを、他のVL断片も同様にして発現ベクターを得た。各抗体可変領域配列を以下の配列番号に示した。実施例19抗体の調製ヒト胎児腎癌細胞由来HEK293を10FCSを含むDMEM培地へ懸濁し、接着細胞用10cm径ディッシュCorningに6×106個の細胞を播種しCO2インキュベーター37°C5CO2内で一晩培養した。実施例18の任意のL鎖発現ベクターと実施例17のpCAGGchiB26g4bとpCAGGchiA44g4aもしくはpCAGGchiA69g4aの2種のH鎖発現ベクターと15mLのOPTIMEMI培地の混合液をトランスフェクション試薬Lipofectamine2000Invitrogen60μLとOptiMEMI培地Invitrogen15mLの混合液へ加えて室温20分間静置したものをディッシュへ加え、CO2インキュベーター37°C5CO2内で3日間培養した。得られた培養上清に100μLのrProteinASepharoseTMFastFlowAmershamBiosciencesを添加し、4°Cで一晩転倒混和した。遠心操作により樹脂を沈殿させ、001Tween20を含むTBSにて3回洗浄後、樹脂を100μLの001Tween20を含む10mMHCl150mMNaClpH20に懸濁して3分間静置したのち、抗体を溶出させた。直ちに、5μLの1MTrisHCl150mMNaClpH80を加えて中和した。実施例20IgG濃度の定量GoataffinitypurifiedantibodytohumanIgGFcCappelをPBSにて1μgmLに調製し、NuncImmunoplateに固相化した。2BSAを含むPBSにてブロッキング処理した後、このBufferを用いて適当に希釈した培養上清サンプルを添加した。また、抗体濃度算出のためのスタンダードとして、1μgmLから2倍系列でDBにて11段階希釈したヒトIgG4ヒト型化抗TF抗体、WO9951743参照を同様に添加した。3回洗浄したのち、GoatantihumanIgGalkalinephosphataseBiosourceInternationalを反応させた。5回洗浄したのち、Sigma104phosphatasesubstrateSigmaAldrichを基質として発色させ、吸光度リーダーSUNRISERAINBOWTECANにより、参照波長655nmとして405nmの吸光度を測定した。LSPLATEmanager2001TECANソフトウェアを用いて、スタンダードの検量線から培養上清中のヒトIgG濃度を算出した。実施例21血漿凝固アッセイ血友病A血液の凝固能を二重特異性抗体が是正するか明らかにするために、FVIII欠乏血漿を用いた活性化部分トロンボプラスチン時間APTTに対する同抗体の影響を検討した。様々な濃度の抗体溶液50μL、FVIII欠乏血漿Biomerieux50μL及びAPTT試薬DadeBehring50μLの混合液を37°Cで3分間加温した。凝固反応は20mMのCaCl2DadeBehring50μLを同混合液に加えることにより開始させた。CRAAmelungが接続されたKC10AAmelungにより凝固するまでの時間を測定した図20~26。その結果、抗体無添加時に比べて、二重特異性抗体は凝固時間を短縮した。実施例22ハイブリッドL鎖を持つ二重特異性抗体のヒト化血液凝固時間の短縮効果が最も高かった抗FactorIXa抗体A69VH、抗FactorX抗体B26VH、ハイブリッドL鎖の組み合わせから成る二重特異性抗体について、以下のようにヒト化を実施した。22-1.ヒト抗体の相同性検索一般公開されているKabatDatabaseおよびIMGTDatabaseよりヒト抗体アミノ酸配列データを入手し、構築したDatabaseを用いてマウスA69H鎖可変領域アミノ酸配列配列番号:20、マウスB26H鎖可変領域アミノ酸配列配列番号:24、マウスBBAL鎖可変領域アミノ酸配列配列番号:69に分けてホモロジー検索を行った。その結果、以下に示すヒト抗体配列と高い相同性を持つことが確認されたことからヒト化抗体のフレームワーク領域に使用することにした。A69H鎖可変領域:KABATID000064B26H鎖可変領域:EMBLAccessionNoAB063872BBAL鎖可変領域:KABATID024300のヒト抗体のFRに各マウス抗体の相補性抗原決定領域以下、CDRを移植したヒト化抗体を作製した。また、NCBIより一般公開されている相同性検索Websitehttpwww.ncbi.nlm.nih.govBLASTを使用して、のヒト抗体に相同性の高いヒト抗体の分泌シグナル配列を検索した。検索により得られた以下に示す分泌シグナル配列を使用した。A69H鎖可変領域:GenBankAccessionNo.AF062257配列番号:123塩基配列、配列番号:124アミノ酸配列B26H鎖可変領域:GenBankAccessionNo.AAC18248配列番号:125塩基配列、配列番号:126アミノ酸配列BBAL鎖可変領域:GenBankAccessionNo.AAA59100配列番号:127塩基配列、配列番号:128アミノ酸配列22-2.ヒト化抗体遺伝子発現ベクターの構築分泌シグナル配列から抗体可変領域にいたるアミノ酸配列をコードする塩基配列において、50base程度の合成オリゴDNAを3’末端が約20base程度ハイブリダイズするように交互に12本作製した。合成オリゴDNAは、5’末端から3’末端までがヒト抗体配列になるように、もしくは5’末端がヒト抗体配列であり3’末端がマウス抗体配列になるように設計した。さらに、抗体可変領域遺伝子の5’末端にアニ-ルし、XhoI切断配列を有するプライマーと抗体可変領域遺伝子の3’末端側にアニ-ルし、SfiI切断配列を有し且つイントロン配列の5’末端配列をコードするプライマーを作製した。25μMに調製した合成オリゴDNAを各1μLで混合し、1xTaKaRaExTaqBuffer04mMdNTPs05unitsTaKaRaExTaqを加え、反応液48μLになるように調製した。94°C5分保温した後に、94°C2分、55°C2分、72°C2分からなる反応を2サイクル行い、各合成オリゴDNAのアッセンブルおよび伸長反応を実施した。次に、抗体遺伝子の5’末端および3’末端にアニ-ルするプライマーを1μL添加し、94°C30秒、55°C30秒、72°C1分からなる反応を35サイクル行い、72°C5分反応させ、抗体可変領域遺伝子を増幅した。PCR後、反応液全量を1アガローズゲル電気泳動に供した。目的のサイズ約400bpの増幅断片をQIAquickGelExtractionKitQIAGENを用いて、添付説明書記載の方法で精製し、滅菌水30μlで溶出した。該断片をpGEMTEasyVectorSystemsを用いて、添付説明書記載の方法でクローニングを行った。各DNA断片の塩基配列は、BigDyeTerminatorCycleSequencingKitAppliedBiosystemsを用い、DNAシークエンサーABIPRISM3700DNASequencerまたはABIPRISM3730xLDNASequencerAppliedBiosystemsにて、添付説明書記載の方法に従い決定した。正しいヒト化抗体可変領域遺伝子配列であることが確認されたH鎖可変領域断片挿入プラスミドをXhoIおよびSfiIで、L鎖可変領域断片挿入プラスミドをEcoRIで消化した後に、反応液を1アガローズゲル電気泳動に供した。目的のサイズ約400bpのDNA断片をQIAquickGelExtractionKitQIAGENを用いて、添付説明書記載の方法で精製し、滅菌水30μlで溶出した。その後、調製した可変領域遺伝子を、以下に示す方法にて実施例17で作製した2本のH鎖がヘテロダイマーを形成するIgG4を優先的に発現させるため動物細胞用発現ベクターpCAGGIL3ssg4CHPapCAGGIL6ssg4CHPbに挿入した。pCAGGIL3ssg4CHPaをXhoIおよびSfiIで消化した後に、1アガローズゲル電気泳動に供してベクター領域断片を回収することでマウスIL3シグナル配列を含む断片を除き、上記で得られたヒト化A69H鎖可変領域遺伝子断片を挿入してヒト化A69H鎖発現ベクター定常領域はY349C、T366W置換体を作製した。同様に、pCAGGIL6ssg4CHPbをXhoIおよびSfiIで消化した後に、1アガローズゲル電気泳動に供してベクター領域断片を回収することでマウスIL6シグナル配列を含む断片を除き、上記で得られたヒト化B26H鎖可変領域遺伝子断片を挿入してヒト化B26H鎖発現ベクター定常領域はE356C、T366S、L368A、Y407Vの置換体を作製した。同様に、調製したH鎖可変領域遺伝子を実施例17で作製した野生型の定常領域遺伝子をもつ動物細胞用発現ベクターpCAGGssg4CHに挿入した。pCAGGssg4CHをXhoIおよびSfiIで消化した後に、1アガローズゲル電気泳動に供してベクター領域断片を回収することでシグナル配列を含む断片を除き、上記で得られたヒト化H鎖可変領域遺伝子断片を挿入してヒト化H鎖発現ベクター定常領域は野生型を作製した。また、実施例18で作製したL鎖発現ベクターをEcoRIで消化した後に、1アガローズゲル電気泳動に供してベクター領域断片を回収することでマウスIL3シグナル配列を含む断片を除き、上記で得られたヒト化BBAL鎖可変領域遺伝子断片を挿入してヒト化BBAL鎖発現ベクター発現プラスミドを作製した。連結反応はRapidDNALigationKitを用い、大腸菌DH5α株を形質転換した。22-3.ヒト化二重特異性抗体の調製ヒト化二重特異性抗体の発現は、実施例4-2に記載した方法か以下の方法を用いて行った。ヒト胎児腎癌細胞由来HEK293H株Invitrogenを10FetalBovineSerumを含むDMEM培地へ懸濁し、5~6×105個mLの細胞密度で接着細胞用ディッシュ直径10cmCORNINGの各ディッシュへ10mLずつ蒔きこみCO2インキュベーター37°C、5CO2内で一昼夜培養した後に、培地を吸引除去し、1のFetalBovineSerumを含むCHOSSFMII培地69mLを添加した。22-2で調製したプラスミドDNA混合液合計138μgを1μgmLPolyethylenimine207μLとCHOSSFMII培地690μLと混合して室温10分間静置したものを各ディッシュの細胞へ投入し、4~5時間、CO2インキュベーター37°Cにて5CO2内でインキュベートした。その後、1のFetalBovineSerumを含むCHOSSFMIIInvitrogen培地69mLを添加して、3日間CO2インキュベーター内で培養した。培養上清を回収した後、遠心分離約2000g、5分間、室温して細胞を除去し、さらに022μmフィルターMILLEXGVMilliporeを通して滅菌した。該サンプルは使用するまで4°Cで保存した。つづいて、実施例11に示す方法で抗体精製および実施例5に示す方法または以下に示す方法で抗体濃度の定量を実施した。Biacore1000を使用し、SensorChipCM5にProteinAを固定化した。具体的にはメーカーのプロトコールに従い、活性化したセンサーチップに10mM酢酸ナトリウム水溶液で50μgmLに希釈したProteinA溶液を5μL分で30分間反応させ、その後ブロッキング操作を実施してProteinA固定化センサーチップを作製した。このセンサーチップを用いて、Biacore1000を使用して培養上清および精製品の濃度を測定した。センサーチップの固定および濃度測定にはHBBufferを使用した。また、濃度測定時の標準品として4000ngmLから2倍系列でHBBufferにて6段階希釈したヒトIgG4ヒト型化抗TF抗体、WO9951743参照を使用した。22-4.ヒト化二重特異性抗体の活性評価および抗体配列の改変調製したヒト化二重特異性抗体およびキメラ二重特異性抗体の血漿凝固能を評価するために、実施例21の方法に従って、F.VIII欠乏血漿を用いてAPTTに対する抗体の影響を検討した。血液凝固能が低下したヒト化二重特異性抗体について、活性上昇を目指してヒト抗体FRのアミノ酸を改変した。また、発現分泌時にはヒト化A69ヒト化BBA抗体ヒト化B26ヒト化BBA抗体、ヒト化A69ヒト化B26ヒト化BBA二重特異性抗体の3種類の抗体が発現するが、この3種類の抗体を分離し、二重特異性抗体のみ精製することを目的として、ヒト化A69H鎖可変領域の等電点を下降させ、ヒト化B26H鎖可変領域の等電点を上昇させるアミノ酸改変を行った。また、同時にH鎖アミノ末端のピログルタミル化を防ぐためのアミノ酸改変、CDR配列の脱アミド化を抑制するためのアミノ酸改変、熱安定性を上昇させるためのアミノ酸改変を実施した。具体的には、QuikChangeSiteDirectedMutagenesisKitを用いて、添付説明書記載の方法でヒト化抗体可変領域に変異を導入した。目的のヒト化抗体可変領域遺伝子配列であることが確認されたH鎖可変領域断片挿入プラスミドをXhoIおよびSfiIで、L鎖可変領域断片挿入プラスミドをEcoRIで消化した後に、反応液を1アガローズゲル電気泳動に供した。目的のサイズ約400bpのDNA断片をQIAquickGelExtractionKitQIAGENを用いて、添付説明書記載の方法で精製し、滅菌水30μlで溶出した。その後、実施例22-2に示す方法で抗体定常領域遺伝子と連結し、抗体発現プラスミドを作製した。実施例22-3に示す方法でヒト化二重特異性抗体の調製し、実施例21に示す方法で血液凝固活性を評価した。FR配列のアミノ酸改変および血液凝固活性の評価を繰り返すことでキメラ二重特異性抗体と同等の活性を有するヒト化二重特異性抗体ヒト化A69hA69aヒト化B26ヒト化BBAhALF123j4およびヒト化A69hA69PFLヒト化B26ヒト化BBAhALs8を取得した。図27に定常領域配列にknobsintoholes技術を用いてヘテロダイマーを形成させたヒト化二重特異性抗体の血液凝固活性を示した。各ヒト化抗体の可変領域配列を以下の配列番号に示した。ヒト化A69抗体VHhA69a配列番号:129塩基配列、配列番号:130アミノ酸配列ヒト化B26抗体VHhB26F123e4配列番号:131塩基配列、配列番号:132アミノ酸配列ヒト化BBA抗体VLhALF123j4配列番号:133塩基配列、配列番号:134アミノ酸配列ヒト化A69抗体VHhA69PFL配列番号:135塩基配列、配列番号:136アミノ酸配列ヒト化B26抗体VHhB26PF配列番号:137塩基配列、配列番号:138アミノ酸配列ヒト化BBA抗体VLhALs8配列番号:139塩基配列、配列番号:140アミノ酸配列22-5.野生型定常領域をもつヒト化二重特異性抗体の活性評価および抗体配列の改変L鎖を共通化した二重特異性抗体は、動物細胞における発現分泌時に3種類の抗体が発現することが考えられる。本実施例の抗体においてもヒト化A69ヒト化BBA抗体ヒト化B26ヒト化BBA抗体、ヒト化A69ヒト化B26ヒト化BBA二重特異性抗体の3種類の抗体が発現することが予想された。この3種類の抗体を分離し、二重特異性抗体のみ精製することを目的として、ヒト化A69H鎖可変領域の等電点を下降させ、ヒト化B26H鎖可変領域の等電点を上昇させるアミノ酸改変を行った。その結果、所望の二重特異性抗体の分離が可能になったことから、野生型定常領域を持つヒト化二重特異性抗体を調製し、凝固活性評価を実施した。熱安定性向上のために、実施例22-4に示したヒト化二重特異性抗体ヒト化A69hA69PFLヒト化B26ヒト化BBAhALs8のヒト化A69およびヒト化BBAの可変領域アミノ酸配列を改変した。各ヒト化抗体の可変領域配列を以下の配列番号に示した。ヒト化A69抗体VHhA69KQ配列番号:141塩基配列、配列番号:142アミノ酸配列ヒト化BBA抗体VLhALAQ配列番号:143塩基配列、配列番号:144アミノ酸配列実施例22-2に示す方法で野生型定常領域遺伝子ヒトIgG4定常領域ないしκ定常領域と連結し、抗体発現プラスミドを作製した。実施例22-3に示す方法でヒト化二重特異性抗体の調製し、陽イオン交換クロマトグラフィー分析を用いて二重特異性抗体を精製した。陽イオン交換クロマトグラフィー分析条件は以下のとおりであり、ヒト化A69のホモ会合体、ヒト化A69とヒト化B26のヘテロ会合体である目的の二重特異性抗体、ヒト化B26のホモ会合体の3種類のピークが得られることから、二重特異性抗体のピークを分取することで、二重特異性抗体を精製した。二重特異性抗体が含まれる画分をAmiconUltraMWCO10000による濃縮後、20mMsodiumacetate150mMNaClpH60に対して一晩冷所で透析を行い、濃度定量を行った。カラム:ProPacWCX104×250mm移動相:A10mmolLNaH2PO4Na2HPO4pH625B10mmolLNaH2PO4Na2HPO4500mmolLNaClpH625流速:10mLminグラジエント:10B→→60B→→100B検出:220nm精製した二重特異性抗体を用いて実施例21に示す方法で血液凝固活性を評価した。図28に示すとおり実施例22-4でキメラ抗体と同等の活性を示したヒト化抗体ヒト化A69hA69PFLヒト化B26ヒト化BBAhALs8と新たに調製したヒト化抗体ヒト化A69hA69KQヒト化B26ヒト化BBAhALAQは同等の血液凝固活性を有することが確認された。実施例232種以上の抗体の併用二重特異性抗体と1種以上の他の抗体の併用による効果を血漿凝固アッセイにより確認した。抗体溶液50μL、FVIII欠乏血漿Biomerieux100μL、03カオリン溶液Biomerieux50μLを混合し、37°Cで3分間加温した。凝固反応は20mMのCaCl2DadeBehring100μLを同混合液に加えることにより開始させた。CRAAmelungが接続されたKC10AAmelungにより凝固するまでの時間を測定した。二重特異性抗体A69B26BBAに抗FIXa抗体XB12、抗FX抗体SB04、XB12とSB04、二重特異性抗体XB12SB04を混合したときの血漿凝固時間の結果を図29に示す。混合後の各抗体濃度は20μgmLである。"