"i発酵性炭素基質を含有する培地と、iiグルコース利用率が少なくとも約0.5グラム/乾燥菌体質量グラム/時である酵母菌の培養物と、iii培地中少なくとも約2w/vの濃度のブタノールと、を含む、ブタノールの発酵生産用の生産培養物。菌密度が少なくとも乾燥菌体質量約2.4グラム/リットルである、請求項1に記載の生産培養物。菌密度が少なくとも乾燥菌体質量約7グラム/リットルである、請求項2に記載の生産培養物。ブタノール産生酵母菌のグルコース利用率が少なくとも約1グラム/乾燥菌体質量グラム/時である、請求項1に記載の生産培養物。ブタノール産生酵母菌がi突然変異誘発と、ii3イソブタノールに対する曝露と、iii繰り返される凍結融解サイクルと、を含む方法により生産される、請求項4に記載の生産培養物。酵母がクラブトリー陽性である、請求項1に記載の生産培養物。酵母がサッカロミセスSaccharomyces、シゾサッカロミセスSchizosaccharomyces、ハンゼヌラHansenula、カンジダCandida、クルイベロミセスKluyveromyces、ヤロウイアYarrowia、イサチェンキアIssatchenkia、及びピキアPichiaからなる群から選択される属のメンバーである、請求項1に記載の生産培養物。酵母がイソブタノール経路又は1-ブタノール経路を含む、請求項1に記載の生産培養物。以下:i約20°C~約45°Cの温度、ii微好気性条件にて3より上に維持される溶存酸素、iii液化バイオマスによって過剰に供給された炭素基質、iv約3~約7.5のpH、及びv真空応用及び液液抽出から選択されたブタノールの除去、の条件で、培養が約1時間から約200時間維持される、請求項1に記載の生産培養物。i酵母がイソブタノール経路又は1-ブタノール経路を含む、請求項1に記載の生産培養物を調製する工程と、ii酵母をブタノールを産生する条件下で発酵させる工程と、を含む、ブタノールの生産方法。i発酵性炭素基質を含有する培地と、ii菌密度が少なくとも乾燥菌体質量約2.4グラム/リットルである酵母菌の培養物と、iii培地中少なくとも約2w/vの濃度のブタノールと、を含む、ブタノールの発酵生産用の生産培養物。培養物のグルコース利用率が少なくとも約0.5グラム/乾燥菌体質量グラム/時である、請求項11に記載の生産培養物。培養物のグルコース利用率が少なくとも約1グラム/乾燥菌体質量グラム/時である、請求項11に記載の生産培養物。菌密度が少なくとも乾燥菌体質量約7グラム/リットルである、請求項11に記載の生産培養物。ブタノール濃度が少なくとも約2.5であり、培養物のグルコース利用率が少なくとも約0.4グラム/乾燥菌体質量グラム/時である、請求項11に記載の生産培養物。酵母がサッカロミセスSaccharomyces、シゾサッカロミセスSchizosaccharomyces、ハンゼヌラHansenula、カンジダCandida、クルイベロミセスKluyveromyces、ヤロウイアYarrowia、イサチェンキアIssatchenkia、及びピキアPichiaからなる群から選択される属のメンバーである、請求項11に記載の生産培養物。酵母がイソブタノール経路又は1-ブタノール経路を含む、請求項11に記載の生産培養物。以下:i約20°C~約37°Cの温度、ii微好気性条件にて3より上に維持される溶存酸素、iii液化バイオマスによって過剰に供給された炭素基質、iv約3~約7.5のpH、及びv真空応用及び液液抽出から選択されたブタノールの除去、の条件で、培養が約1時間から約200時間維持される、請求項11に記載の生産培養物。a.酵母がイソブタノール経路、1-ブタノール経路、及び2-ブタノール経路からなる群から選択されるブタノール生合成経路を含む、請求項11に記載の生産培養物を調製する工程と、b.酵母をブタノールを産生する条件下で発酵させる工程と、を含む、ブタノールの生産方法。i発酵性炭素基質を含有する培地を備える工程と、iiグルコース利用率が少なくとも約0.5グラム/乾燥菌体質量グラム/時であるブタノール産生酵母菌の培養物を備える工程と、iii酵母培養物を発酵性炭素基質と接触させ、それによりグルコース利用率を適した期間にわたって維持し、ブタノールを生産させる工程と、を含む、ブタノールの発酵生産用の生産培養物の耐性を増大させる方法。i発酵性炭素基質を含有する培地と、iiグルコース利用率が少なくとも約2.4グラム/乾燥菌体質量グラム/時である酵母菌の培養物と、iii培地中少なくとも約1w/vの濃度のブタノールと、を含む、ブタノールの発酵産生用の生産培養物。菌密度が少なくとも乾燥菌体質量約2.7グラム/リットルである、請求項21に記載の生産培養物。本発明は、酵母菌を高密度で存在させたことでブタノールに対する耐性を高めた、ブタノール産生用の培養物を提供する。本明細書に記載されているのは、ブタノールの発酵産生のための生産培養物であり、a酵母の代謝に適した炭素基質を含有する培地と、bグルコース利用率が少なくとも約0.5グラム/乾燥菌体重量のグラム換算値/時g/gdcw/hであるブタノール産生用酵母菌の培養物と、c培地内での濃度が少なくとも約2重量/容量であるブタノールとを含んで構成される。別の実施形態において、本発明はブタノールの発酵産生用の生産培養物が提供する。この生産培養物は、a酵母の代謝に適した炭素基質を含有する培地と、b菌密度が少なくとも乾燥菌体重量約2.4グラム/リットルgdcw/lであるブタノール産生用酵母菌の培養物と、c培地内での濃度が少なくとも約2重量/容量であるブタノールとを含む。更に別の実施形態において、本発明はブタノールの生産方法を提供する。この方法は、本発明の生産培養物を調製する工程であって、酵母がイソブタノール経路及び1-ブタノール経路からなる群から選択されるブタノール生合成経路を含む、工程と、酵母をブタノール生産条件の下で発酵させる工程とを含む。本明細書に記載されているのはブタノールの発酵産生のための生産培養物であり、a酵母の代謝に適した炭素基質を含有する培地と、bグルコース利用率が少なくとも約0.5グラム/乾燥菌体重量のグラム換算値/時であるブタノール産生用酵母菌の培養物と、c培地内での濃度が少なくとも約2w/vであるブタノールとを含む。いくつかの実施形態において、菌密度は少なくとも乾燥菌体重量約2.4グラム/リットルである。いくつかの実施形態において、菌密度は少なくとも乾燥菌体重量約7グラム/リットルである。いくつかの実施形態においては、ブタノール産生用酵母菌のグルコース利用率が少なくとも約1グラム/乾燥菌体重量のグラム換算値/時である。いくつかの実施形態において、ブタノール産生用酵母菌は、a突然変異誘発の工程と、b3イソブタノールへ曝露する工程と、C凍結融解サイクルを反復する工程とを含む方法によって生成された。いくつかの実施形態において、凍結融解サイクルは3回以上繰り返される。いくつかの実施形態において、菌体は少なくとも5回の凍結融解サイクルを含む方法で生成される。いくつかの実施形態において、ブタノール産生用酵母菌は、aエタノールを含有する培地でブタノール産生用酵母菌を育成する工程と、b菌体を30gdcw/Lの範囲の密度に濃縮する工程と、c3イソブタノールへ曝露する工程と、d凍結融解サイクルを反復する工程とを含む方法によって生成された。いくつかの実施形態において、凍結融解サイクルは3回以上繰り返される。いくつかの実施形態において、菌体は少なくとも5回の凍結融解サイクルを含む方法で生成される。いくつかの実施形態においては、ブタノール産生用酵母菌が、aエタノールを含有する培地でブタノール産生用酵母菌を育成する工程と、b最小10時間、最大72時の間にわたって生育させるために、0.1~2.0ブタノールを含有する培地に順次に移す工程と、cブタノール産生用の菌体の成長速度を上昇させるために後続の経路にて培地のブタノール濃度を次第に増加させる工程と、d生育速度の高い菌体を貯留する工程と、e3イソブタノールへ曝露する、及び/又は凍結融解サイクルを反復する工程とを含む方法によって生成された。いくつかの実施形態において、酵母はクラブトリーCrabtree陽性であり、いくつかの実施形態において、酵母はクラブトリーCrabtree陰性である。いくつかの実施形態において、酵母はサッカロミセスSaccharomyces、分裂酵母Schizosaccharomyces、ハンゼヌラHansenula、カンジダCandida、クルイベロマイセスKluyveromyces、ヤロウイアYarrowia、イサチェンキアIssatchenkia、及びピキアPichiaからなる群から選択される属のメンバーである。いくつかの実施形態において、酵母はイソブタノール経路及び1-ブタノール経路からなる群から選択されるブタノール生合成経路を含む。いくつかの実施形態においては、a約20°C~約37°Cの温度、b微好気性条件の範囲内で3より上に維持された溶存酸素、c液化バイオマスによって過剰に供給された炭素基質、d約3~約7.5のpH、d真空適用及び液液抽出から選択されたブタノールの除去法、という条件で、培養が約1時間から約200時間にわたって維持される。いくつかの実施形態において、培養物のグルコース利用率は少なくとも約0.5グラム/乾燥菌体重量のグラム換算値/時である。いくつかの実施形態において、菌密度は少なくとも乾燥菌体重量約7グラム/リットルである。いくつかの実施形態において、ブタノール濃度は少なくとも約2.5であり、かつ培養物のグルコース利用率は少なくとも約0.4グラム/乾燥菌体重量のグラム換算値/時である。いくつかの実施形態において、酵母はイソブタノール経路、1-ブタノール経路及び2-ブタノール経路からなる群から選択されるブタノール生合成経路を含む。いくつかの実施形態において、培養物はPNY0602又はPNY0614を含んで構成される。いくつかの実施形態において、培養物は、PNY0602又はPNY0614を含みかつブタノール生合成経路を更に含む。いくつかの実施形態において、ブタノール生合成経路は、イソブタノール生合成経路である。本発明の種々の実施形態は、下掲の詳細な説明、図面、及び本出願の一部を構成する添付の配列の記述からより完全に理解し得る。特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条件下で、次の生物学的材料が寄託された。参照によって本明細書に援用されている、次の配列及びこれに添えて提供される配列表は、連邦規則法典第37巻1.821条~1.825条ヌクレオチド配列及び/又はアミノ酸配列開示を含む特許出願の要件-配列規則RequirementsforPatentApplicationsContainingNucleotideSequencesand/orAminoAcidSequenceDisclosures-theSequenceRulesに準拠し、世界知的所有権機関WIPO標準ST.252009、及びEPO及びPCTの配列表要件規則5.2及び49.5a-bis、及び実施細則第208号及び附属書Cに一致する。ヌクレオチド及びアミノ酸配列データに使用される記号及び型式は、連邦規則法典第37巻1.822条に記載されている規則に従う。本出願の一部を構成する詳細な説明から、本発明をより完全に理解できる。別途定義がない限り、本明細書で用いられる技術用語及び科学用語は全て、本発明の帰属する当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有する。矛盾が生じる場合は、当該の定義を含む本出願によって統制されるものとする。文脈により別段要求されない限り、その用語が単数形であっても複数を含み、その用語が複数形であっても単数を含むものとする。特許又は特許公報を特定の項のみに限定して参照により引用したことが明示されていない限り、本明細書中で言及されている全ての公告、特許及び他の参照は、あらゆる目的のために、個々の公告又は特許出願を参照により引用したことを具体的かつ個別に示してあるかのように、全体として参照することによって引用したものとする。本発明は、ブタノール生産において培地内に存在するブタノールに対する感度を低減することで発酵面での改良を施した酵母生産培養物に関する。ブタノールは、イソブタノールと1-ブタノールとを含有する。加えて、本発明は本培養物を用いたブタノール生産方法に関する。ブタノールは溶剤及び/又は抽出剤として利用されているほか、化石燃料の代替としても役立つ。特許請求の範囲及び明細書を解釈するにあたって、次の定義及び略語を使用する。本明細書において含むcomprises、含むcomprising、含むincludes、含むincluding、有するhas、有してなるhaving、含有するcontains若しくは含有するcontainingという用語、又は他の何らかの変形態様は、非排除的な包含を規定することを意図したものである。例えば、要素のリストを含む組成物、混合物、工程、方法、物品又は装置は、必ずしもそれらの要素だけに限定されるわけでなく、明示的に記載されていない他の要素、又はそのような組成物、混合物、工程、方法、物品若しくは装置に固有の他の要素も含み得る。更に、そうでない旨を明示的に記述しない限り、又はorは、排他的な又はでなく包含的な又はを指す。例えば、条件A又はBは、Aが真で又は存在しかつBが偽である又は存在しない、Aが偽で又は存在せずかつBが真である又は存在する、並びにA及びBが共に真である又は存在するのいずれかよって満たされる。また、本発明の要素又は成分に先行する不定冠詞1つのa、及び1つのanは、要素又は成分の実例即ち、実現値の数に関して非制限的であることを意図したものである。したがって、1つのa又は1つのanは1つ又は少なくとも1つを含むものとして読むべきであり、数が単一である旨が明らかに意味されていない限り、要素又は成分の単数形の単語も複数を含むものとする。本明細書で用いられる発明invention又は本発明presentinventionは非制限的な用語であり、特定の発明に係る何らかの単一の実施形態に言及するものではなく、明細書及び特許請求の範囲に記載されている、可能なあらゆる実施形態を含む。本明細書において、本発明に用いられる成分又は反応物の数量を修飾する約という用語は、例えば、現実世界で濃縮物を作成する際若しくは溶液を使う際に用いられる典型的な測定手順及び液体処理手順、それらの手順における不注意による誤り、組成物の製造又は方法の実施に用いられる原料の製造過程、供給源、又は純度における差異、並びにこれらに類するものを通して発生し得る、数量における変形態様を指す。約という用語はまた、特定の初期混合物から生じる組成物の様々な平衡条件に起因する分量の誤差も含む。約という用語によって修飾されるかどうかを問わず、特許請求の範囲には量に対する等価物が含まれる。一実施形態において約という用語は、報告された数値の10の範囲内、好ましくは5の範囲内に収まることを意味する。本明細書においてブタノールという用語は、1-ブタノール、イソブタノール、又はそれらの混合物を指す。イソブタノール生合成経路又はイソブタノール経路という用語は、ピルベートからイソブタノールを産生する酵素経路のことを指す。1-ブタノール生合成経路又は1-ブタノール経路という用語は、ピルベートから1-ブタノールを産生する酵素経路のことを指す。低菌体密度という用語は、約6×105菌体/ml未満の菌体濃度を指す。例えば、OD600が0.05の培養物は、1.0OD600が107菌体/mlに相当するという関係を基準にすると、低菌体密度の培養物である。高菌体密度という用語は、約5×107菌体/mlを超える菌体濃度を指す。例えば、OD600が5.0及び乾燥菌体重量約2.4グラム/リットルgdcw/Lの培養物は、1.0OD600が107菌体/ml及び0.4gdcw/Lに相当するという関係を基準にすると、高菌体密度の培養物である。グルコース利用率及びグルコース消費率という用語は、過剰なグルコース条件下で菌体培養物が代謝するグルコースの分量を指す。グルコース利用率は、本明細書中の実施例3に記載されている培養条件に基づき、炭素基質としてグルコースを用い、定義済みの菌体密度の培養物にて定義済みのブタノール濃度で測定される。生産に用いられる培地に代替の炭素基質が存在する場合は、その培養物ではグルコース利用率を測定できない。この場合は、炭素基質としたグルコースを含む別個の培養物で測定する必要がある。炭素基質、又は発酵性炭素基質若しくは好適な炭素基質という用語は、本発明に係る培養物で代謝可能な炭素供与源を指し、特に、単糖、オリゴ糖、及び多糖からなる群から選択される炭素供与源を含む。発酵産生という用語は、微生物の代謝活性によってこの場合、本発明に係る培養物によって炭素供与源が生成物に変換されることを指す。生育可能という用語は、本明細書に記載されている生育条件下で、又はブタノール含有の生育培地にて少なくとも約2w/vの濃度で繁殖可能若しくは培養可能な菌体例えば、酵母菌培養物を指す。一部の実施形態において生育可能な培養物は、上述した条件下で24時間繁殖可能又は培養可能である。様々な宿主の形質転換のための核酸分子の遺伝子又はコード領域について言及する場合のコドン最適化という用語は、DNAによってコードされたポリペプチドを変化させることなく、宿主有機体の典型的なコドン使用を反映するような核酸分子の遺伝子又はコード領域におけるコドンの変化を指す。そのような最適化には、少なくとも1つ若しくは2つ以上、又は有意数のコドンを、その有機体の遺伝子内で使用頻度の高い1つ以上のコドンで置換することが含まれる。高菌体密度の培養物におけるブタノール耐性の改善本明細書に開示されているのは、高菌体密度の培養物内の酵母菌が、低菌体密度の培養物内の酵母菌と比較して高いブタノール耐性を示すという発見である。本目的に供する高菌体密度の培養物とは、菌体密度が少なくとも乾燥菌体重量約2.4グラム/リットルgdcw/lである培養物を指す。菌体密度が約2.4のgdcw/Lより大きい培養物例えば、24gdcw/L以上を含む、少なくとも約3.8gdcw/l以上は、高菌体密度の培養物である。高菌体密度は、約3gdcw/L超、約5gdcw/L超、約7gdcw/L超、約10gdcw/L超、約20gdcw/L超、又は約30gdcw/L超であり得る。約35~40gdcw/Lと同程度の菌体密度が有用となり得ると想定される。酵母にとっては、高菌体密度は、菌体濃度が約5×107菌体/mlを超えるか、又はOD600の測定値が少なくとも5であると特徴づけることができる。一部の実施形態において、菌体密度は、本明細書に記載されている任意の範囲の菌体密度であり得る。例えば、約2.4gdcw/L~約40gdcw/L、約2.4dgdcw/L~約35gdcw/L、約2.4gdcw/L~約30gdcw/L、約2.4gdcw/L~約20gdcw/L、約2.4gdcw/L~約10gdcw/L、約2.4gcdw/L~約7gdcw/L、約2.4gdcw/L~約5gdcw/L、約3dcw/L~約40gdcw/L、約3dgdcw/L~約35gdcw/L、約3gdcw/L~約30gdcw/L、約3gdcw/L~約20gdcw/L、約3gdcw/L~約10gdcw/L、約3gcdw/L~約7gdcw/L、約3gdcw/L~約5gdcw/L、約7dcw/L~約40gdcw/L、約7dgdcw/L~約35gdcw/L、約7gdcw/L~約30gdcw/L、約7gdcw/L~約20gdcw/L、約7gdcw/L~約10gdcw/Lである。比較目的のために、低菌体密度の培養物は約6×105菌体/ml未満である。本明細書で、酵母のブタノール耐性の上昇が、生存率及び/又はグルコース利用率によって評価された。これにより、低菌体密度の酵母菌体培養物と比較して高菌体密度の培養物の方が、ブタノール耐性が改善されたことが発見された。一定量の生きた菌体のコロニー形成単位CFUの数を分析して生存を測定した。1ブタノールの存在下における高菌体密度の酵母培養物の生存率は、本明細書で検定された条件下にてブタノールを含まない対照培養物の生存率と比較して、少なくとも約40、50、60、70、75、80、及び最大100であることが見出された。生存率は変化し、ブタノール濃度、特定のブタノール異性体、酵母の菌株等の複数因子に影響される。一方、1ブタノール中での低菌体密度1/100の培養物の生存率は、ブタノールを含まない対照培養物の生存率と比較して最大13であることが見出された。酵母菌体密度がアルコール耐性に及ぼす影響は、アルコール類の存在に対すして一般化される反応のひとつでないことが分かった。菌体密度がブタノール耐性に及ぼす影響は、最も広範に生産されるアルコールであるエタノールの存在下で菌体密度が及ぼす影響とは異なっていた。事実上、本明細書に記載されているように実施例1を参照、エタノール中では逆の影響が観測された。つまり、高菌体密度培養物よりも低菌体密度の培養物の方が、高い生存率を示した。本明細書で、高菌体密度3.8gdcw/L及び24gdcw/Lの培養物が、1.5イソブタノール中では少なくとも1グラム/乾燥菌体重量のグラム換算値/時の速度でグルコースを利用することが見出された。1イソブタノール中では、計算速度は少なくとも約1.4グラム/乾燥菌体重量のグラム換算値/時であった。2イソブタノール中では、速度は少なくとも約0.5グラム/乾燥菌体重量のグラム換算値/時、2.5イソブタノール中では、速度は少なくとも約0.4グラム/乾燥菌体重量のグラム換算値/時、3イソブタノール中では、速度は少なくとも約0.2グラム/乾燥菌体重量のグラム換算値/時であった。ゆえに、本明細書で提供されるのは、ブタノール耐性の上昇を達成するために、少なくとも約2.4gdcw/Lの高菌体密度を有するブタノール産生用の培養物である。高菌体密度の培養物は、少なくとも約2.4gdcw/L、3.8gdcw/L、又は24gdcw/L以上であってもよい。生産培養物中のブタノール濃度は少なくとも約1であり、少なくとも約1.5、2.0、2.5、又は3.0w/vであってもよい。いくつかの実施形態において、ブタノール濃度は、少なくとも約2.0である。いくつかの実施形態において、ブタノール濃度は、本明細書に開示されている任意の範囲のブタノール濃度である。例えば、約1~約3、約1.5~約3、約2~約3、約1.5~約2.5、又は約2~約3w/vである。ブタノールはイソブタノール又は1-ブタノールのいずれであってもよい。本生産培養物において、グルコース利用率は、少なくとも約0.2グラム/乾燥菌体重量のグラム換算値/時g/gdcw/hである。グルコース利用率はそれよりも上昇してもよい。例えば、少なくとも約0.3、0.4、0.5、0.6、1、1.5、2.4又は3g/gdcw/hである。一部の実施形態においてブタノール濃度は少なくとも約2w/vであり、グルコース利用率は少なくとも約0.5、0.6、1、1.5、2.4又は3g/gdcw/hである。一部の実施形態において、グルコース利用率は、少なくとも約0.5g/gdcw/hである。一部の実施形態において、グルコース利用率は、本明細書に記載されている任意の範囲のグルコース利用率であり得る。例えば、約0.3g/gdcw/h~約3g/gdcw/h、約0.3g/gdcw/h~約2.4g/gdcw/h、約0.3g/gdcw/h~約1.5g/gdcw/h、約0.3g/gdcw/h~約1g/gdcw/h、約0.3g/gdcw/h~約0.6g/gdcw/h、約0.3g/gdcw/h~約0.5g/gdcw/h、約0.3g/gdcw/h~約0.4g/gdcw/h、約0.5g/gdcw/h~約3g/gdcw/h、約0.5g/gdcw/h~約2.4g/gdcw/h、約0.5g/gdcw/h~約1.5g/gdcw/h、約0.5g/gdcw/h~約1g/gdcw/h、約0.5g/gdcw/h~約0.6g/gdcw/h、約1g/gdcw/h~約3g/gdcw/h、約1g/gdcw/h~約2.4g/gdcw/h、又は約1g/gdcw/h~約1.5g/gdcw/hであり得る。一部の実施形態において、グルコース濃度は少なくとも約2.0w/vであり、グルコース利用率は約0.5g/gdcw/h~約3g/gdcw/h、約0.5g/gdcw/h~約2.4g/gdcw/h、約0.5g/gdcw/h~約1.5g/gdcw/h、約0.5g/gdcw/h~約1g/gdcw/h、約0.5g/gdcw/h~約0.6g/gdcw/h、約0.5g/gdcw/h~約3g/gdcw/h、約0.5g/gdcw/h~約2.4g/gdcw/h、約0.5g/gdcw/h~約1.5g/gdcw/h、約0.5g/gdcw/h~約1g/gdcw/h、約0.5g/gdcw/h~約0.6g/gdcw/h、約1g/gdcw/h~約3g/gdcw/h、約1g/gdcw/h~約2.4g/gdcw/h、又は約1g/gdcw/h~約1.5g/gdcw/hであり得る。達成されるグルコース利用率は、ブタノール濃度及び培地内の特定の種類のブタノールによって決まる。一般的に、ブタノール濃度が増えるにつれ、速度は低減する。酵母菌は一般的に、イソブタノール及び1-ブタノールに対して同様に反応するが、2-ブタノールに対する感度は低い。グルコース利用率は、約30°C~約45°Cの温度で定量されるのが一般的であるが、約30°C~約37°Cの温度で定量することもできる。一部の実施形態において、本明細書に記載されている培養物のグルコース利用率は、約30°C~約45°Cの温度で約0.5グラム/乾燥菌体重量のグラム換算値/時を上回る。一部の実施形態において、本明細書に記載されている培養物のグルコース利用率は、約30°C~約37°Cの温度で約0.5g/gdcw/hを上回る。一部の実施形態において、本明細書に記載されている培養物のグルコース利用率は、約30°C~約32°Cの温度で約0.5グラム/乾燥菌体重量のグラム換算値/時を上回る。一部の実施形態においては、少なくとも約2w/vの濃度のブタノールを含む培地に少なくとも約6時間接触させた培養物について、グルコース利用率を定量する。一部の実施形態において、本明細書に記載の培養物は、少なくとも約2w/vの濃度のブタノールを含む培地に少なくとも約6時間接触させた培養物のグルコース利用率は、約0.5グラム/乾燥菌体重量のグラム換算値/時を上回る。一部の実施形態において本明細書に記載されている培養物は、生育可能な培養物である。高菌体密度の生産培養物の調製本ブタノール産生用の高菌体密度の培養物は、菌体密度を少なくとも約2.4gdcw/Lとする任意の方法で調整できる。菌体密度が、例えば2.4gdcw/L、2.7gdcw/L、2.8gdcw/L、3.8gdcw/L、又は24gdcw/L以上の培養物は、高菌体密度の培養物として調整し得る。一部の実施形態において菌体密度は、本明細書に記載されている任意の範囲の菌体密度であり得る。例えば、約2.4gdcw/L~約40gdcw/L、約2.4gdcw/L~約35gdcw/L、約2.4gdcw/L~約30gdcw/L、約2.4gdcw/L~約20gdcw/L、約2.4gdcw/L~約10gdcw/L、約2.4gcdw/L~約7gdcw/L、約2.4gdcw/L~約5gdcw/L、約3gdcw/L~約40gdcw/L、約3gdcw/L~約35gdcw/L、約3gdcw/L~約30gdcw/L、約3gdcw/L~約20gdcw/L、約3gdcw/L~約10gdcw/L、約3gcdw/L~約7gdcw/L、約3gdcw/L~約5gdcw/L、約7gdcw/L~約40gdcw/L、約7gdcw/L~約35gdcw/L、約7gdcw/L~約30gdcw/L、約7gdcw/L~約20gdcw/L、又は約7gdcw/L~約10gdcw/Lである。例えば、ブタノール生産能を有する酵母菌を、曝気された培養物中で生育させることにより、ブタノール産量を最小限に抑えるという方法もある。例えば、クラブトリーCrabtree陽性酵母菌は、高曝気かつ低グルコース濃度にて生育することができ、これにより、当該技術分野で周知であるように、ブタノール産量ではなく、呼吸及び菌体の量産が最大となる。グルコース濃度は概して約0.2g/L未満に維持される。曝気された培養物は、高菌体密度に生育させた後、本生産培養物として使用できる。別の態様では、ブタノール生産能を有する酵母菌を生育させ、濃縮して高菌体密度の培養物を生産し得る。更に、酵母菌の生育中に活性を最小限に抑えられるようにブタノール生合成経路の発現を調節することによっても、高菌体密度を得ることができる。生育条件又は培地成分により制御可能なプロモーターからその経路の1種以上の遺伝子を発現させ、その発現を調節することもできる。本培養物においては菌体を高菌体密度まで生育させ、生産培養物として用いるか又は種培養物として用い、高菌体密度の生産培養を開始することもできる。高菌体密度の培養物は、下掲の発酵培地及び培養条件の項に記載されている条件を用いた培地にて生育される。ただし、呼吸による成長を最大にするために、グルコースを約2g/Lまでに制限し、好気条件を上に記載した通りとする。ブタノール産生用酵母菌本高菌体密度の生産培養物は、ブタノールを産生する任意の酵母の培養物であってもよい。酵母はクラブトリーCrabtree陽性であってもよいし、クラブトリーCrabtree陰性であってもよい。クラブトリーCrabtree陽性の酵母菌は、クラブトリーCrabtree効果、即ち、好気性培地に高濃度のグルコースを添加したときに細胞呼吸が阻害されるという現象を示す。好適な酵母としては、サッカロミセスSaccharomyces、分裂酵母Schizosaccharomyces、ハンゼヌラHansenula、カンジダCandida、クルイベロマイセスKluyveromyces、ヤロウイアYarrowia、イサチェンキアIssatchenkia、及びピキアPichiaが挙げられるが、これらに限定されない。好適な菌株としては、サッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiae、シゾサッカロミセスポンベSchizosaccharomycespombe、クルイベロミセスラクチスKluyveromyceslactis、クルイベロマイセスサーモトレランスKluyveromycesthermotolerans、カンジダグラブラタCandidaglabrata、カンジダアルビカンスCandidaalbicans、ピキアスティピティスPichiastipitis、イサチェンキアオリエンタリスIssatchenkiaorientalis、及びヤロウイアリポリティカYarrowialipolyticaが挙げられるが、これらに限定されない。エンジニアリング又は別の方法によってブタノールを産生し得る酵母であればどのようなものでも、本培養物に使用できる。酵母菌体内にイソブタノール、1-ブタノール、又は2-ブタノール産生用の生合成経路が構成されると、ブタノールが生産されるようになる。経路遺伝子は、内因性遺伝子及び/又は非相同遺伝子を含み得る。組み換え宿主菌体のための標準組み換えDNA及び分子クローニング技術は当該技術分野において周知であり、Sambrook,J.,Fritsch,E.F.andManiatis,T.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,SecondEdition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY1989以下Maniatisと称するによって記載されているほか、Silhavy,T.J.,Bennan,M.L.andEnquist,L.W.,ExperimentswithGeneFusions,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY1984、及びAusubel,F.M.etal.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,publishedbyGreenePublishingAssoc.andWiley-Interscience1987によっても記載がなされている。当該技術分野で周知の分子ツール及び技術としては、ほかにも、オーバラップ伸長PCRポリメラーゼ連鎖反応によるスプライシングYu,etal.2004FungalGenet.Biol.41:973-981、サッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiaeのURA3遺伝子座における突然変異のための陽性選択Boeke,J.D.etal.1984Mol.Gen.Genet.197,345-346;MARomanos,etal.NucleicAcidsRes.1991January11;191:187、Cre-lox部位特異的組み換えシステム、変異体lox部位及びFLP基質の突然変異Sauer,B.1987MolCellBiol7:2087-2096;Senecoff,etal.1988JournalofMolecularBiology,Volume201,Issue2,Pages405-421;Albert,etal.1995ThePlantJournal.Volume7,Issue4,pages649-659、シームレスな遺伝子欠失Akada,etal.2006Yeast;235:399-405、並びにギャップ修復の方法論Maetal.,Genetics58:201-216;1981が挙げられる。酵母の遺伝子発現の方法は、例えば、MethodsinEnzymology,Volume194,GuidetoYeastGeneticsandMolecularandCellBiologyPartA,2004,ChristineGuthrieandGeraldR.FinkEds.,ElsevierAcademicPress,SanDiego,CAに記載されているように、当該技術分野で知られている。例えば、プロモーター及びターミネーターをコード領域に操作可能に結合することによって、キメラ遺伝子を発現用に構築できる。使用し得るプロモーターとしては、例えば、構成的プロモーターFBA1、TDH3、ADH1及びGPM1、並びに誘導性プロモーターGAL1、GAL10及びCUP1が挙げられる。他の酵母プロモーターとしては、ハイブリッドプロモーターUASPGK1-FBA1p配列番号:55、UASPGK1-ENO2p配列番号:56、UASFBA1-PDC1p配列番号:57、UASPGK1-PDC1p配列番号:58、及びUASPGK-OLE1p配列番号:59が挙げられる。キメラ遺伝子構造内に発現用に使用し得る好適な転写ターミネーターとしては、FBA1t、TDH3t、GPM1t、ERG10t、GAL1t、CYC1t、及びADH1tが挙げられるが、これらに限定されない。好適なプロモーター、転写ターミネーター及びコード領域は、大腸菌E.coli-酵母シャトルベクターにクローニングすることによって、酵母菌内に入れて形質転換できる。これらのベクターは、大腸菌E.coli及び酵母菌株の両方での繁殖を可能にしている。ベクターは典型的には、所望の宿主内での自律増殖又は染色体組み込みを可能にする、選択可能マーカー及び配列を含んでいる。酵母内で一般に使用されるプラスミドは、大腸菌E.coli複製起点例えば、pMB1、酵母の2μ複製起点、及び栄養選択用のマーカーを含んだシャトルベクターpRS423、pRS424、pRS425及びpRS426米国培養細胞系統保存機関AmericanTypeCultureCollection,Rockville,MDであり、これら4つのベクター用の選択マーカーは、HIS3ベクターpRS423、TRP1ベクターpRS424、LEU2ベクターpRS425及びURA3ベクターpRS426である。発現用のキメラ遺伝子を有する発現ベクターの構築は、大腸菌E.coli内での標準分子クローニング技術、又は酵母内でのギャップ修復組み換え法のいずれかかによって実施できる。ギャップ修復クローニング手法は、酵母内での高効率な相同組み換えを利用する。典型的には、酵母ベクターDNAは例えば、その多重クローニング部位内で消化されるため、その配列内にはギャップが生じる。5’末端及び3’末端の両方に21番目以降の塩基対配列を含んだインサートDNAがいくつか生成され、それらの末端は互いに順次に重なり、ベクターDNAの5’及び3’終端とも順次に重なる。例えば、遺伝子X用に酵母発現ベクターを構築するには、酵母プロモーター及び酵母ターミネーターを発現カセット用として選択する。プロモーター及びターミネーターは発酵ベクターDNAから増幅され、遺伝子Xは、そのソース有機体からPCR増幅されるか、又は遺伝子X配列を含むクローニングベクターから採取される。線状化ベクターの5’末端とプロモーター配列との間、プロモーターと遺伝子Xとの間、遺伝子Xとターミネーター配列との間、及びターミネーターと線状化ベクターの3’末端との間には少なくとも21番目の塩基対オーバーラップ配列が存在する。次いで、ギャップを生じたベクター及びインサートDNAを一緒に酵母菌株に入れて形質転換し、プラスミド上での栄養選択マーカーの相補を可能にする適切な混合化合物を含む培地上に蒔く。正しい挿入物の組み合わせが存在することは、選択した菌体から調製したプラスミドDNAを用いてPCRマッピングにより確認できる。次いで、酵母菌から単離されたプラスミドDNA通常は低濃度を大腸菌E.coli株例えば、TOP10に入れて形質転換することができ、その後、ミニプレップ及び制限酵素マッピングを行ってプラスミド構築物を更に検証する。最後に、構築物をDNA配列分析で検証してもよい。ギャップ修復技術と同様に、酵母ゲノムへの組み込みにおいても酵母内の相同組み換え系を利用する。典型的に、制御要素プロモーター及びターミネーターを加えたコード領域と栄養要求性マーカーとを含んでなるカセットは、高忠実度DNAポリメラーゼでPCR増幅する際、プライマーを用いる。このプライマーはカセットにハイブリダイズし、かつ挿入の所望されるゲノム領域の領域5’及び3’に対して配列相同性を有する塩基対を40~70個含んだプライマーである。次いで、PCR生成物を酵母に入れて形質転換し、組み込まれた栄養選択マーカーの選択を可能にする適切な混合化合物を含む培地上に蒔く。例えば、遺伝子Xを染色体の位置Yに組み込むためには、プロモーターとコード領域Xとターミネーターとの構築物をプラスミドDNA構築物からPCR増幅し、SOEPCRHortonetal.1989Gene77:61-68によるか又は一般の制限消化及びクローニングによるかのいずれかで独立栄養性マーカーURA3などに結合させる。プロモーターとコード領域XとターミネーターとURA3領域とを含む全カセットを、酵母菌染色体上の場所Yの領域5’及び3’に対して相同性を有する塩基対を40~70個含んだプライマー配列を用いて、PCR増幅する。PCR生成物を酵母に入れて形質転換し、ウラシル欠乏の生育培地上で選択する。形質転換体は、コロニーPCR又は染色体DNAの直接シークエンシングのいずれかで検証できる。ブタノール生合成経路ブタノール産生用の好適な経路は、当該技術分野において周知であり、特定の好適な経路は本明細書に記載されている。一部の実施形態において,ブタノール生産経路は、宿主菌体に対して非相同遺伝子を少なくとも1つ含んで構成される。一部の実施形態においてブタノール生合成経路は、宿主菌体に対して非相同遺伝子を2つ以上含んで構成される。一部の実施形態においてブタノール生合成経路は、生合成経路のあらゆるステップと一致するポリペプチドをコードする非相同遺伝子を含んで構成される。当該技術分野で公知であるように、配列は宿主菌体における発現のためにコドン最適化できる。基質から生成物への変換に使用できる遺伝子及びポリペプチドは本明細書に記載されており、そのような遺伝子及びポリペプチドを同定する方法は本明細書及び/又は当該技術分野において記載されている。例えば、イソブタノールに関しては米国特許第7,851,188号明細書に記載がある。本菌体においてエンジニアリングし得る2-ブタノール産生用の生合成経路は、当該技術分野例えば、参照により本明細書に援用されている米国特許出願公開第20070292927A1号明細書及び米国特許出願公開第20070259410A1号明細書に開示されている。図1は、開示されている2-ブタノール生合成経路の線図である。例えば、米国特許出願公開第20070292927A1号明細書中の経路は、-例えばアセト乳酸シンターゼで触媒される、ピルベートからアセト乳酸への変換ステップ図1のステップaと、-例えばアセト乳酸デカルボキシラーゼで触媒される、アセト乳酸からアセトインへの変換ステップ図1のステップbと、-例えばブタンジオールデヒドロゲナーゼで触媒される、アセトインから2,3-ブタンジオールへの変換ステップ図1のステップiと、-例えばジオールデヒドラターゼ又はグリセロールデヒドラターゼで触媒される、2,3-ブタンジオールから2-ブタノンへの変換ステップ図1のステップjと、-例えばブタノールデヒドロゲナーゼで触媒される、2-ブタノンから2-ブタンノールへの変換ステップ図1のステップfとを含む。米国特許出願公開第2009-0305363号明細書に開示されているように、酵母pdc-宿主菌体内での2,3-ブタンジオール中間体の生成においては、細胞質ゾル内にアセト乳酸シンターゼが発現し得る。EC2.2.1.62002年に4.1.3.18から転換されたに属するアセト乳酸シンターゼ酵素別称:アセトヒドロキシ酸シンターゼは周知であり、蛋白新生アミノ酸ロイシン及びバリンの生合成経路、並びに若干の有機体のアセトインからの2,3-ブタンジオールの発酵産生の経路に関与する。アセト乳酸シンターゼ活性を有するポリペプチドが様々な供与源から単離されることは、当業者であれば理解されよう。ケト酪酸よりも寧ろピルベートに対して強い基質選択性を有するアセト乳酸シンターゼAlsの酵素活性は、バシラスBacillusのalsS及びクレブシエラKlebsiellaのbudBを介してコードされるといったように、用益が特定されているGollopetal.,J.Bacteriol.1726:3444-34491990;Holtzclawetal.,J.Bacteriol.1213:917-9221975。AlsはバシラスサチリスBacillussubtilisDNA:配列番号:3、蛋白質:配列番号:4由来、クレブシエラニューモニエKlebsiellapneumoniaeDNA:配列番号:1、蛋白質:配列番号:2由来のものと、及びラクトコッカスラクチスLactococcuslactisDNA:配列番号:5、蛋白質:配列番号:6由来のものとがあり、それらは本明細書に記載されている。使用し得る付加的なAlsコード領域及びコードされた蛋白質としては、黄色ブドウ球菌StaphylococcusaureusDNA:配列番号:7、蛋白質:配列番号:8、リステリアモノサイトジェネスListeriamonocytogenesDNA:SEQIDNO:9;蛋白質:配列番号:10、ストレプトコッカスムタンStreptococcusmutansDNA:配列番号:11、蛋白質:配列番号:12、ストレプトコッカス好熱性StreptococcusthermophilusDNA:配列番号:13、蛋白質:配列番号:14、ビブリオアングスタムVibrioangustumDNA:配列番号:15、蛋白質:配列番号:16、及びバシラス-セレウスBacilluscereusDNA:配列番号:17、蛋白質:配列番号:18由来のものが挙げられる。アセト乳酸シンターゼをコードするAls遺伝子で、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16又は18を有する任意の遺伝子に対して少なくとも約80~85、85~90、90~95、又は少なくとも約96、97若しくは98の配列同一性を有し、かつピルベートをアセト乳酸に変換するものであれば、どのようなものでも使用できる。同一性算出はClustalWアライメント法で、GAPPENALTY=10、GAPLENGTHPENALTY=0.1及び蛋白質重量マトリックスのGonnet250シリーズというデフォルトパラメーターを用いることによって行う。加えて、米国特許出願公開第20090305363号明細書には、B.サチリスB.subtilisAlsS配列の最も近い100個のアセト乳酸シンターゼ類を記述した系統樹が提供されており、それらはいずれも使用し得る。当業者に周知であるように、本菌株に使用できる付加的なAls配列は、文献及びバイオインフォマティクスデータベースで同定し得る。バイオインフォマティクスを使用したコード及び/又は蛋白質配列の同一性算出は、典型的には、BLAST上述を使用し、一般公開されているデータベースで、本明細書に記載されているような既知のAlsコード配列又はコードされたアミノ酸配列で検索して行う。すでに特定したように、同一性算出はClustalWアライメント法に基づく。加えて、上に記載したように、自然における他の相同体を同定する際は、本明細書に記載されている配列、又は当該技術分野において記述されている配列を用いることもできる。アセト乳酸シンターゼの細胞質ゾル発現は、アセト乳酸シンターゼ蛋白質をコードする配列を含むがミトコンドリアターゲティングシグナル配列を含まない遺伝子で形質転換するによって達成される。酵母の遺伝子発現の方法は、当該技術分野で知られている例えば、MethodsinEnzymology,Volume194,GuidetoYeastGeneticsandMolecularandCellBiologyPartA,2004,ChristineGuthrieandGeraldR.FinkEds.,ElsevierAcademicPress,SanDiego,CAを参照のこと。キメラ遺伝子プロモーター及びターミネーターを作動可能に結合したコード領域を含む、ベクター、クローニング法及び組み込み法を使用した発現は、上に記載した通りである。アセト乳酸からアセトインへの変換は、EC4.1.1.5と呼ばれるアセト乳酸デカルボキシラーゼ酵素による。この酵素は、例えば、バシラスサチリスBacillussubtilisDNA:配列番号:21、蛋白質:配列番号:22、クレブシエラ-テリゲナKlebsiellaterrigenaDNA:配列番号:23、蛋白質:配列番号:24、及びクレブシエラニューモニエKlebsiellapneumoniaeDNA:配列番号:19、蛋白質:配列番号:20から得られる。アセト乳酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子で、配列番号:20、22又は24を有する任意の遺伝子に対して少なくとも約80~85、85~90、90~95、又は少なくとも約96、97若しくは98の配列同一性を有し、かつアセト乳酸をアセトインに変換するものであれば、どのようなものでも使用できる。アセトインから2,3-ブタンジオールへの変換は、ブタンジオールデヒドロゲナーゼ別名:アセトインレダクターゼによる。ブタンジオールデヒドロゲナーゼは、アルコール生成物におけるR-又はS-立体化学的生成に対して特異性を有し得る。S-特異的ブタンジオールデヒドロゲナーゼは、EC1.1.1.76として知られており、例えば、クレブシエラニューモニエKlebsiellapneumoniaeDNA:配列番号:25、蛋白質:配列番号:26から得られる。R-特異的ブタンジオールデヒドロゲナーゼは、EC1.1.1.4として知られており、例えば、バシラスセレウスBacilluscereusDNA:配列番号27、蛋白質:配列番号:28、ラクトコッカスラクチスLactococcuslactisDNA:配列番号29、蛋白質:配列番号30、及びサッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiaeBDH1;DNA:配列番号:54、蛋白質:配列番号55から得られる。ブタンジオールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子で、配列番号:26、28、30又は55を有する任意の遺伝子に対して少なくとも約80~85、85~90、90~95、又は少なくとも約98の配列同一性を有し、かつアセトインを2,3-ブタンジオールに変換するものであれば、どのようなものでも使用できる。補因子アデノシルコバラミンビタミンB12を利用するジオールデヒドラターゼ別称:ブタンジオールデヒドラターゼは、EC4.2.1.28として知られている。同じく補因子アデノシルコバラミンを利用するグリセロールデヒドラターゼは、EC4.2.1.30として知られている。ジオールデヒドラターゼ及びグリセロールデヒドラターゼは、活性に必要な3種のサブユニットを有する。米国特許出願公開第20070292927A1号明細書には、本菌体における2-ブタノン経路若しくは2-ブタノール経路に使用できる様々なジオールデヒドラターゼ類及びグリセロールデヒドラターゼに関して一連の3種のサブユニットが記載されているほか、使用し得る付加的なジオール酵素及びデヒドラターゼ酵素を同定する隠れマルコフモデルの作成及び使用例も記載されている。ブタノールデヒドロゲナーゼは、アルコールデヒドロゲナーゼの広範なファミリーのサブセットであり、NAD依存又はNADP依存であってもよい。NAD依存酵素はEC1.1.1.1として知られており、NADP依存酵素はEC1.1.1.2として知られている。米国特許出願公開第20070292927A1号明細書には、本菌体における開示の2-ブタノール生合成経路内に使用し得るブタノールデヒドロゲナーゼの配列の例が挙げられている。その全体が参照により本明細書に援用されている米国特許出願公開第20090155870A1号明細書には、米国特許出願公開第20070292927A1号明細書に開示されている生合成経路を用いた2-ブタノール生産のための、キメラ遺伝子の構築物及び酵母の遺伝子工学が記載されている。遺伝子構築及び発現の詳細は上述の通りであり、本明細書の実施例にも記載されている。この経路でのロゼブリアイヌリニボランスRoseburiainulinivoransRdhtA蛋白質配列番号:32、コード領域配列番号:31からのブタンジオールデヒドラターゼの酵母に使用する方法は、共通に所有されている同時係属の米国特許出願公開第20090155870A1号明細書に開示されている。この酵素は、ロゼブリアイヌリニボランスRoseburiainulinivoransRdhtBから蛋白質配列番号:34,コード領域配列番号:33からのブタンジオールデヒドラターゼレアクティバーゼと共に用いられる。このブタンジオールデヒドラターゼは、補酵素B12を必要としないため多くの宿主内で所望される。使用し得る別のB12依存ジオールデヒドラターゼは、クレブシエラニューモニエKlebsiellapneumoniae由来で、かつpduC、pduD及びpduEの3つのサブユニットを有するものであり、国際公開第2009046370号パンフレットに開示されている。図2のあらゆる経路内での2-ブタノンから2-ブタノールへの変換の最終ステップに有用な酵素は、アクロモバクターキシロスオキシダンスAchromobacterxylosoxidansとして同定されるバクテリアの環境分離から単離されるブタノールデヒドロゲナーゼは、であり、参照により本明細書に援用されている米国特許出願公開第20090269823号明細書DNA:配列番号:35、蛋白質配列番号:36に開示されている。図2の他の経路における遺伝子及びその発現は、米国特許出願公開第20070259410A1号明細書に開示されている。当業者に周知であるように、開示されている酵素活性を本菌株内で発現させるために使用し得る付加的な配列は、バイオインフォマティクスデータベース内の文献で同定し得る。バイオインフォマティクスを用いたコード及び/又は蛋白質配列の同一性算出は、典型的には、BLASTBLASTP,BLASTN,BLASTXAltschuletal.,J.Mol.Biol.,215:403-4101990等の配列分析ソフトを使用し、一般公開されているデータベースで、本明細書に記載されているような既知のコード配列又はコードされたアミノ酸配列で検索して行う。同一性算出は、ClustalWアラインメント法に基づいて行うHigginsandSharp,CABIOS.5:151-1531989;Higgins,D.G.etal.,Comput.Appl.Biosci.8:189-1911992に記載されているほか、LASERGENEバイオインフォマティクスコンピューティングスイートDNASTARInc.のMegAlign商標v6.1プログラムにも見られる。マルチプルアラインメント用のデフォルトパラメーターギャップペナルティ=10、ギャップ長ペナルティ=0.2、遅延分岐配列=30、DNAトランジション重量=0.5、蛋白質重量マトリックス=Gonnetシリーズ、DNA重量マトリックス=IUB。加えて、本明細書に記載されている配列、又は当該技術分野において記述されている配列を用いて、自然における他の相同体を同定することもできる。例えば、本明細書に記載されているコード用の核酸フラグメントのそれぞれを用い、相同蛋白質をコードする遺伝子を単離することもできる。配列依存プロトコールを使用した相同遺伝子の単離は、当該技術分野において周知である。配列依存プロトコールの例としては、1核酸ハイブリダイゼーションの方法、2DNA及びRNA増幅の方法。核酸増幅技術例えば、Mullisetal.、米国特許第4,683,202号明細書に記載のポリメラーゼ連鎖反応PCR、Tabor,S.etal.,Proc.Acad.Sci.USA82:10741985に記載のリガーゼ連鎖反応LCR、又はWalker,etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,89:3921992に記載の鎖置換増幅SDA等の多様な用途によって例証されているもの。並びに3ライブラリ構築及び相補によるスクリーニングの方法が挙げられるが、これらに限定されない。本菌体内でエンジニアリングし得るイソブタノール産生用の生合成経路は、当該技術分野例えば、参照により本明細書に援用されている米国特許出願公開第20070092957A1号明細書において開示されている。図2は、開示されているイソブタノール生合成経路の線図である。米国特許出願公開第20070092957A1に記載されているように、実施例のイソブタノール生合成経路におけるステップは、-例えばアセト乳酸シンターゼで触媒される、ピルベートからアセト乳酸への変換ステップ図2のステップaと、-例えばアセトヒドロキシ酸イソマーレダクターゼ別称:ケトール酸レダクトイソメラーゼで触媒される、アセト乳酸から2,3-ジヒドロキシイソ吉草酸への変換ステップ図2のステップbと、-例えばアセトヒドロキシ酸デヒドラターゼ別称:ジヒドロキシ酸脱水酵素デヒドラターゼで触媒される2,3-ジヒドロキシイソ吉草酸からα-ケトイソ吉草酸への変換ステップ図2のステップcと、-例えば分岐鎖α-ケト酸デカルボキシラーゼで触媒される、α-ケトイソ吉草酸からイソブチルアルデヒドへの変換ステップ図2のステップdと、-例えば分岐鎖アルコールデヒドロゲナーゼで触媒される、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換ステップ図2のステップeとを含む。アセト乳酸シンターゼについては、2,3-ブタンジオール経路との関連で上述した通りである。アセトヒドロキシ酸イソマーレダクターゼ別称:ケトール酸レダクトイソメラーゼKARIは、電子供与体としてNADPH還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸塩を当然使用し得る。KARIには、EC番号1.1.1.86によって知られているものが含まれる。KARI酵素の配列及びそのコード領域の例は、米国特許第20070092957A1号明細書に、サッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiaeDNA:配列番号:37、蛋白質:配列番号:38からのILV5を含めて記載されている。ケトール酸リダクトイソメラーゼKARIは、米国特許出願公開第20080261230A1号明細書、米国特許出願公開第20090163376A1号明細書、米国特許出願公開第20100197519A1号明細書、及びPCT出願国際公開第2011/041415号パンフレットに記載されており、全ては参照により本明細書に援用される。上記特許文献で開示されているKARIの実施例は、コレラ菌DNA:配列番号:39、蛋白質:配列番号:40、緑膿菌PseudomonasaeruginosaPAO1DNA:配列番号:41、蛋白質:配列番号:42、蛍光菌PF5DNA:配列番号:43、蛋白質:配列番号:44、及びPf5.IlvC-Z4B8変異体蛍光菌アセトヒドロキシ酸リダクトイソメラーゼDNA:配列番号:45、蛋白質:配列番号:46由来のものである。別のKARIは、ラクトコッカスラクチスLactococcuslactisDNA:配列番号:58、蛋白質:配列番号:59のilvC遺伝子によってコードされる。KARIには、アナエロスティペスカカエAnaerostipescaccaeKARI変種K9G9及びK9D3それぞれ配列番号:62及び61も含まれる。アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼ別称:ジヒドロキシ酸デヒドラターゼDHADは、EC番号4.2.1.9によって知られている。ジヒドロキシ酸デヒドラターゼDHAD酵素の配列及びそのコード領域の例は、米国特許第7,851,188号明細書に、サッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiaeDNA:配列番号:47、蛋白質:配列番号:48のILV3を含めて記載されている。ストレプトコッカスムタンStreptococcusmutansDHADDNA:配列番号:49、蛋白質:配列番号:50等の付加的な[2Fe-2S]2DHAD配列、及び使用し得る付加的なDHAD配列を得る目的に使用可能な[2Fe-2S]2DHAD酵素の同定方法は、参照により本明細書に援用されている同時係属の米国特許出願公開第20100081154号明細書に開示されている。分岐鎖α-ケト酸デカルボキシラーゼKivDは、EC番号4.1.1.72で知られている。分岐鎖α-ケト酸デカルボキシラーゼ酵素の配列及びそのコード領域の例は、米国特許出願公開第20070092957A1号明細書に、ラクトコッカスラクチスLactococcuslactisKivDDNA:配列番号:51、S.セレビシエS.cerevisiae配列番号53における発現のために最適化されたコドン、蛋白質:配列番号:52を含めて記載されている。付加的な分岐鎖α-ケト酸デカルボキシラーゼとしては、S.セレビシエS.cerevisiaeDNA:配列番号:54、蛋白質:配列番号:55内での発現用に最適化されたコード配列を持つバシラスサチリスBacillussubtilis由来のもの、及び上述のようにバイオインフォマティクスを用いれば当業者によって容易に同定されるその他のものが挙げられる。分岐鎖アルコールデヒドロゲナーゼは、EC番号1.1.1.265によって知られているが、他のアルコールデヒドロゲナーゼの項特に、EC1.1.1.1又は1.1.1.2にも分類し得る。これらの酵素は、NADH還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド及び/又はNADPHを電子供与体として利用する。分岐鎖アルコールデヒドロゲナーゼ酵素の配列及びそのコード領域の例は、米国特許出願公開第20070092957A1号明細書に記載されている。米国特許出願公開第20090269823A1号明細書には、アクロモバクターキシロスオキシダンスAchromobacterxylosoxidans由来のアルコールデヒドロゲナーゼADHであるSadBDNA:配列番号:35、蛋白質:配列番号:36が記載されている。アルコールデヒドロゲナーゼは、ウマ肝臓ADHHADH;S.セレビシエS.cerevisiaeにおける発現のために最適化されたコドン、DNA:配列番号:56、蛋白質:配列番号:57及びベイエリンキアインディカBeijerinkiaindicaADH蛋白質配列番号:74、及び上述のようにバイオインフォマティクスを用いれば当業者によって容易に同定されるその他のものも含有している。付加的な2つのイソブタノール経路用の酵素を発現させる目的に使用できる遺伝子は、米国特許出願公開第20070092957A1に記載されている。上に記載したように、3つの経路全てに使用できる付加的な遺伝子は、当業者であれば同定し得る。加えて、米国特許出願公開第20070092957A1明細書には、キメラ遺伝子及び酵母の遺伝子エンジニアリングの構築物が記載されており、開示されている生合成経路を用いたイソブタノールの生成についてはサッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiaeの例を挙げて説明してある。遺伝子構築及び発現の詳細は上述の通りであり、本明細書の実施例にも記載されている。本菌体においてエンジニアリングが可能な1-ブタノール産生用の生合成経路は、参照により本明細書に援用されている同時係属の米国特許出願公開第20080182308号明細書に開示されている。図3は、開示されている1-ブタノール生合成経路の図である。米国特許出願公開第20080182308A1号明細書に記載されているように、開示されている1-ブタノール生合成経路のステップは、-例えばアセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼで触媒される、アセチル-CoAからアセトアセチル-CoAへの変換工程図3のステップaと、-例えば3-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドロゲナーゼで触媒される、アセトアセチル-CoAから3-ヒドロキシブチリル-CoAへの変換工程図3のステップbと、-例えばクロトナーゼで触媒される、3-ヒドロキシブチリル-CoAからクロトニル-CoAへの変換工程図3のステップcと、-例えばブチリル-CoAデヒドロゲナーゼで触媒される、クロトニル-CoAからブチリル-CoAへの変換工程図3のステップdと、-例えばブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼで触媒される、ブチリル-CoAからブチルアルデヒドへの変換工程図3のステップeと、-例えばブタノールデヒドロゲナーゼで触媒される、ブチルアルデヒドから1-ブタノールへの変換工程図3のステップfとを含む。これらの酵素を発現させる目的に使用できる遺伝子は、米国特許出願公開第20080182308A1号明細書に記載されている。上に記載したように、使用可能な付加的な遺伝子は、当業者であれば同定し得る。これらの遺伝子を酵母内で発現させる方法は、本明細書で上述されているほか、米国特許出願公開第20080182308A1号明細書にも記載されている。一部の実施形態において、ブタノール生合成経路は、酵母菌体に対して非相同遺伝子を少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ含んで構成される。いくつかの実施形態において、組み換え宿主菌体内のブタノール生合成経路での基質から生成物への変換はそれぞれ、異種ポリペプチドで触媒される。いくつかの実施形態において、ブタノール生合成経路はイソブタノール生合成経路であり、アセト乳酸から2,3-ジヒドロキシイソ吉草酸への生成物変換を行うポリペプチド及び/又は基質を触媒してイソブチルアルデヒドからイソブタノールへの生成物変換を行うポリペプチドは、NADHを補因子として利用し得る。本明細書中に提供されているイソブタノール生合成経路等のブタノール生合成経路を含んで構成される宿主菌体は、1つ以上の付加的な変形態様を更に含んでもよいことは明らかである。参照により本明細書に援用されている米国特許出願公開第20090305363号明細書には、細胞質ゾル局在性アセト乳酸シンターゼの発現及びピルベートデカルボキシラーゼ活性の実質的除去を目的に、酵母をエンジニアリングすることによってピルベートからアセト乳酸への変換を増加させる方法が開示されている。米国特許出願公開第20090305363号明細書参照によって本明細書に援用されるに記載されているように、グリセロール-3-リン酸脱水素酵素活性、及び/又はピルベートデカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの遺伝子の中断、若しくはピルベートデカルボキシラーゼ遺伝子発現を制御する調整要素をコードする少なくとも1つの遺伝子の中断を抑えることを目的とした修正、米国特許出願公開第20100120105号明細書参照によって本明細書に援用されるに記載されているように、エントナー-ドゥドロフ経路を介して炭素フラックスを増加させるか当量バランスを減少させるように宿主菌体を修正。その他の修正としては、ピルベート利用生合成経路のステップを触媒するように、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを少なくとも1つ組み込むことが挙げられる。その他の修正では、アセト乳酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドにおいて削除、突然変異及び/又は置換を少なくとも1回行う。いくつかの実施形態において、アセト乳酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドは、サッカロミセスセレビサエSaccharomycescerevisaeのYMR226C配列番号63又はその相同体である。付加的な変形態様は、アルデヒド脱水素酵素及び/又はアルデヒド酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドにおける削除、突然変異及び/又は置換を含む。いくつかの実施形態において、アルデヒド脱水素酵素活性を有するポリペプチドは、サッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiae由来のALD6配列番号:60又はその相同体である。グルコース抑制を低下させる効果を有しかつ酵母生成宿主菌体がpdcである遺伝子組み換えは、参照により本明細書に援用されている米国特許出願公開第20110124060号明細書に記載されている。組み換え宿主菌体は、aジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの非相同ポリヌクレオチドと、biFe-Sクラスター生合成に影響するポリペプチドをコードする内因性遺伝子を少なくとも1回削除、突然変異及び/若しくは置換する工程、並びに/又はiiFe-Sクラスター生合成に影響するポリペプチドをコードする少なくとも1つの非相同ポリヌクレオチドを更に含んでもよい。いくつかの実施形態において、Fe-Sクラスター生合成に影響するポリペプチドは、AFT1核酸配列番号:64、アミノ酸配列番号:65、AFT2配列番号:66及び67、FRA2配列番号:68及び69、GRX3配列番号:70及び71、又はCCC1配列番号:72及び73によってコードされる。いくつかの実施形態において、Fe-Sクラスター生合成に影響するポリペプチドは、構成的突然変異株AFT1L99A、AFT1L102A、AFT1C291F、又はAFT1C293Fである。発酵培地本明細書に開示されている高菌体密度の生産培養物は、ブタノール生産のための代謝を支持する培地内で維持される。培地によって培養物の生存力も得られ、ブタノール生産が可能になる。典型的には、本発明に使用される培地は、少なくとも約2g/Lグルコース又は当量の炭素基質を含んでいてもよい。炭素基質はフルクトース等の単糖類、ラクトース、マルトース、ガラクトース、若しくは蔗糖等のオリゴ糖類、澱粉やセルロース等の多糖類、又はそれらの混合物、及び乳清濾液、コーンスティープリーカー、甜菜糖蜜、大麦モルト等の再生可能な原料からの精製混合物を含んでもよいが、これらに限定されない。他の炭素基質は、エタノール、乳酸塩、コハク酸塩又はグリセリンを含んでもよい。したがって、培地内の炭素源は、基質を含有する多種多様な炭素を含んでいてもよいと考えられる。炭素基質は、コーン粉餌、砂糖黍液、糖蜜、小麦粉餌、又は他の形態のバイオマスで提供されてもよい。代謝を最大限に高められるように、典型的には炭素基質を過度に維持する。発酵培地は、適切な炭素供与源に加えて、好適な無機質、塩類、補因子、緩衝液、及び当業者に知られていて培養物の代謝及び酵素の経路促進に好適でありかつブタノールの生成に必要な他の成分を含有する必要がある。好適な培地としては、炭素/エネルギー源又はYPD培地ペプトン、酵母抽出物及びブドウ糖の配合物として酵母窒素塩基、硫酸アンモニウム及びブドウ糖を大抵のサッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiae菌株を生育させるための最適比率に含むブロス等の、商業的に調製された一般的な培地が挙げられる。微生物学又は発酵サイエンスの当業者に公知である、他の定義済み又は合成生育培地も使用できる。培養条件典型的には、培養物は生育可能なブタノール産生用酵母菌体を支持する条件適当な培地内での約20°C~約37°Cの範囲の温度を含むで維持される。発酵に好適なpH範囲は典型的にpH3.0~pH7.5であり、実施形態における始源条件はpH4.5~pH6.5である。発酵は好気性又は嫌気的条件下のどちらでも可能である。一部の実施形態においては、微好気性条件の範囲内で溶存酸素を3を超えるように維持する。発酵培地内のブタノールの分量は、高速液体クロマトグラフィーHPLCで定量されるのが一般的であるが、他の公知技術の方法を使用してもよい。培養物は、回分培養、半回分培養又は連続培養系のいずれでも発酵できる。半回分培養系は、発酵の進行につれて炭素供与源基質を漸増的に添加することを除き、典型的な回分系に類する。回分培養及び半回分培養は当該技術分野において広く用いられ周知となっており、参照により本明細書に援用されているThomasD.Brock,Biotechnology:ATextbookofIndustrialMicrobiology,SecondEdition1989SinauerAssociates,Inc.,Sunderland,MA.,又はDeshpande,MukundV.,Appl.Biochem.Biotechnol.,36:227,1992に例を見ることができる。典型的な生成条件は、一定期間に半回分工程を含むが、いったん全ての炭素供与源が添加されたら回分様式に切り替えてもよい。商業的な条件では、液化粉餌又は原料を一定期間にわたって供給するだけでなく、澱粉から経時的にグルコースが放出されるように発酵槽に糖化酵素も添加する。このような澱粉からの経時的なグルコースの徐放は、発酵槽に添加される糖化酵素の分量によって制御される。砂糖黍液の場合、基質は経時的にゆっくりと発酵槽に添加されていき、最終的に全て添加された後は、回分様式で発酵が進行する。発酵の実施期間は約1~200時間にわたってもよい。発酵培地からの生成物の単離生成中は、真空適用や液液抽出等の当該技術分野で公知の工程を用いてブタノール生成物を発酵培地から除去できる。生成物は、当業者に知られている方法によって発酵培地から単離できる。例えば、生物還元されたイソブタノールは、当該技術分野において公知のABE発酵方法を用いて発酵培地から単離できる例えば、Durre,Appl.Microbiol.Biotechnol.49:639-6481998,Grootetal.,Process.Biochem.27:61-751992、及びその文献に記載されている参考文献を参照のこと。例えば、遠心分離、濾過、デカンテーション又はこれらに類するものによって、発酵培地から固形物を除去することができる。続いて、蒸留、共沸蒸留、液液抽出、吸着、気体ストリッピング、膜蒸発、浸透気化法、又は真空閃光発酵等の方法を用いて、イソブタノールを発酵培地から単離することができる。例えば、米国特許出願公開第20090171129A1明細書、及び国際公開第2010/151832A1号パンフレット両方ともその全体が参照によって本明細書に援用されているを参照のこと。水相からブタノールを除去するには、発酵ブロスの一部又は全体に真空を適用することができる。ブタノールは水と一緒になって沸点の低い共沸混合物を化成するため、蒸留を用いて混合物の分離により共沸組成物を生じ得る。蒸留と別の分離方法とを組み合わせて使用して分離を行うことで、共沸様組成物を生じ得る。ブタノールを単離して精製する際に蒸留と組み合わせて使用できる方法としては、デカンテーション、液液抽出、吸着及び膜による技術が挙げられるが、これらに限定されない。ブタノールを単離する方法としては、ほかにも、共沸蒸留にて共沸剤を用いる方法も挙げられる例えば、DohertyandMalone,ConceptualDesignofDistillationSystems,McGrawHill,NewYork,2001を参照のこと。ブタノールと水の混合液は、不均一な共沸混合物を生じるため、蒸留とデカンテーションとを組み合わせて使用することによってイソブタノールを単離、精製できる。この方法では、イソブタノール含有の発酵ブロスを共沸様組成物が得られるまで蒸留し、次いで、その共沸混合物を凝縮して、デカンテーションで発酵培地からイソブタノールを分離する。デカンテーション後の水相は、還流として第1の蒸留カラムに戻り得る。デカンテーション後のイソブタノール含量の多い有機相を、第2の蒸留カラムにて蒸留によって更に精製してもよい。液液抽出と蒸留とを組み合わせて使用して、発酵培地からブタノールを単離することもできる。この方法では、好適な溶媒を用いた液液抽出によって、発酵ブロスからイソブタノールを抽出する。次いで、イソブタノール含有の有機相を蒸留し、溶媒からブタノールを分離する。発酵中に水溶媒質からブタノールを除去する際に液液抽出LLE用に添加する抽出剤の分量は、発酵槽容量の5~50とすることができる。蒸留と吸着とを組み合わせて使用して、発酵培地からイソブタノールを単離することもできる。この方法では、イソブタノール含有の発酵ブロスを共沸様組成物が得られるまで蒸留し、その後、モレキュラーシーブ等の吸着剤を用いて残留水分を除去するAdenetal.,LignocellulosicBiomasstoEthanolProcessDesignandEconomicsUtilizingCo-CurrentDiluteAcidPrehydrolysisandEnzymaticHydrolysisforCornStover,ReportNREL/TP-510-32438,NationalRenewableEnergyLaboratory,June2002。他にも、浸透気化法と蒸留とを組み合わせて使用して、発酵培地からイソブタノールを単離、精製してもよい。この方法では、イソブタノール含有の発酵ブロスを共沸様組成物が得られるまで蒸留し、その後、親水性膜を用いた浸透気化によって残留水分を除去するGuoetal.,J.Membr.Sci.245,199-2102004。ブタノール又は他の発酵アルコールは、生成されると、Insitu生成物除去ISPR別称:抽出発酵によって発酵槽から除去でき、これにより、微生物がブタノールを高収率で生成することが可能になる。ISPRによる発酵アルコールの除去法のなかで、当該技術分野において記載されてきたものの1つとしては、液液抽出が挙げられる。一般に、ブタノール発酵に関しては、例えば、ブタノール濃度が毒性レベルに達する前の一時点で、微生物を含む発酵培地を有機抽出剤と接触させる。有機抽出剤及び発酵培地は二相性混合物を形成する。有機抽出剤相中へのブタノールの分配によって、微生物を含有する水相の濃度が低下し、結果として阻害性ブタノールに対する微生物の曝露が制限される。例えば、その開示内容全体が本明細書に援用されている米国特許出願公開第20090305370号明細書の工程記述に従って、液液抽出を実行できる。米国特許出願公開第20090305370号明細書には、液液抽出を用いて発酵ブロスからブタノールを生成して回収する方法が記載されている。この方法は、水に混ざらない抽出剤に発酵ブロスを接触させて、水相と有機相とを含む二相混合を形成するステップを含む。典型的には、抽出剤は、飽和、単不飽和。多価不飽和及びそれらの混合物、C12~C22脂肪族アルコール、C12~C22脂肪酸、C12~C22脂肪酸のエステル類、及びC12~C22脂肪アルデヒド、並びにそれらの混合物からなる群から選択される有機抽出剤であり得る。ISPR用の抽出剤は、非アルコール抽出剤であってもよい。ISPR抽出剤は、オレイルアルコール、ベヘニルアルコール、セチルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、ステアリルアルコール、1-ウンデカノール、オレイン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、ミリスチン酸メチル、オレイン酸メチル、ウンデカナール、ラウリンアルデヒド、20-メチルウンデカナール等の外来性有機抽出剤、及びそれらの混合物であり得る。一部の実施形態においては、発酵培地中のアルコールを有機酸例えば、脂肪酸、及びアルコールを有機酸でエステル化できる触媒例えば、リパーゼ等の酵素に接触させることによって、アルコールをエステル化できる。そのような実施形態において有機酸は、アルコールエステル類が分配されるISPR抽出剤として作用し得る。有機酸は、発酵槽に供給することも、及び/又は発酵槽に送給されたバイオマス供給用の発酵性炭素から取り出すこともできる。原料中に存在する脂質は、触媒的作用に加水分解されて有機酸を生じ得る。また、同じ触媒例:酵素によって有機酸をアルコールでエステル化することも可能である。触媒は、発酵に先だって原料に供給してもよいし、又は原料の供給前又は供給と同時に発酵槽に供給してもよい。触媒を発酵槽に供給すると、脂質が有機酸に加水分解され、それとほぼ同時に有機酸が発酵槽内に存在するブタノールでエステル化され、それによってアルコールエステル類が生じ得る。原料由来でない有機酸及び/又は天然油も、天然油が有機酸に加水分解されている状態で、発酵槽に送給してよい。アルコールでエステル化されない有機酸はどのようなものも、ISPR抽出剤の一部として作用し得る。アルコールエステル類を含有する抽出剤を発酵培地から分離でき、その抽出剤からアルコールを回収し得る。抽出剤は発酵槽に入れて再利用できる。したがって、ブタノール生産の場合、例えば、ブタノールからエステルへの変換によって発酵培地内の遊離ブタノール濃度が低下し、ブタノール濃度の増大に起因する毒性作用から微生物が保護される。加えて、脂質は触媒作用的に有機酸に加水分解できるため、分画されていない粒子を、その粒子に含まれる脂質を分離せずに原料として使用してもよく、それによりISPR抽出剤中の脂質の蓄積速度が低下する。Insitu生成物除去は、回分様式又は連続様式で実施できる。Insitu生成物除去の連続様式では、反応器から生成物を連続的に除去する。Insitu生成物除去の回分様式では、多量の有機抽出剤が発酵槽に添加され、工程中に抽出剤は除去されない。Insitu生成物除去では、発酵の開始時に有機抽出剤を発酵培地に接触させて、二相性発酵培地を形成できる。別の態様では、発酵培地と有機抽出剤との接触を、微生物が所望量の生育を達成した後で行うことができる。この微生物の生育は、培養物の光学濃度を測定することによって定量できる。更に、発酵培地と有機抽出剤との接触を、発酵培地中の生成物アルコールレベルが、予め選択されたレベルに到達した時点で行うこともできる。本発明の一部の実施形態に係るブタノール生産の例では、ブタノール濃度が毒性レベルに達する前の時点で、有機酸抽出剤を発酵培地に接触させてブタノールを有機酸でエステル化してブタノールエステル類を生成できるので、結果として発酵槽内のブタノール濃度が低下する。その場合、ブタノールエステル滴定値が所望の有効値に達した後で、エステル含有の有機相を発酵槽から除去発酵ブロスから分離して水相を構成し得る。一部の実施形態では、発酵槽内の有効な発酵性糖の発酵が実質的に完了した後で、エステル含有の有機相が水相から分離される。本発明は、更に以下の実施例にて定義される。これらの実施例が本発明の実施形態を示す一方であくまで例示目的にのみ挙げられていることを理解すべきである。上記の考察及びこれらの実施例から、当業者は本発明の本質的な特徴を確認でき、その趣旨及び範囲から逸脱することなく本発明に種々の変更及び改良を施して本発明の様々な利用及び条件に適合させ得る。使用されている略語の意味は、以下の通りである。即ち、minは分を意味し、hは時間を意味し、μLはマイクロリットルを意味し、mLはミリリットルを意味し、Lはリットルを意味し、nmはナノメートルを意味し、mmはミリメートルを意味し、cmはセンチメートルを意味し、μmはマイクロメートルを意味しmMはミリモルを意味し、Mはモルを意味し、mmolはミリモルを意味し、μmoleはマイクロモルを意味し、gはグラムを意味し、μgはマイクログラムを意味し、mgはミリグラムを意味し、OD600は600nmの波長で測定された光学密度を意味し、CFUはコロニー形成単位を意味し、HPLCは高速液体クロマトグラフィーを意味する。一般的方法:酵母の培地及び生育については、Amberg,BurkeandStrathern,2005,MethodsinYeastGenetics,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NYに記載されている。方法は酵母プロトコールEditorW.Xiao,HumanaPress,Totowa,NewJerseyにも記載されている。600nmでの光学密度OD600は、Ultraspec3100分光光度計GEHealthcareLifeSciences,Piscataway,NJを使用して測定された。実施例1低菌体密度及び高菌体密度におけるサッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiaeBY4743の24時間の時点での生存率サッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiaeBY4743ATCC201390をフリーザーバイアルからYPDアガーTeknova,Hollister,CA;カタログ番号Y1000に蒔き、30°Cで一晩インキュベートした。YPDプレートからの菌体を初期OD600が0.06~0.08のYPDブロスTeknova;カタログ番号Y5000の前培養物25ml中に接種した。前培養を好気性撹拌器中で7時間30°Cにて生育させた。前培養のアリコートをYPDブロス200ml中に接種し、初期OD600を0.06~0.08にして、この培養物を曝気にて30°Cで約17時間インキュベートした。培養物の光学濃度を測定し、その培養物を遠心分離して菌体を再懸濁させ、OD600が5の新鮮なYPDブロスを得た。この培養物は、高菌体密度HCDの培養物と呼ばれる。この培養物を新鮮なYPDブロス中に100倍に希釈し、OD600が0.05を有する培養物を得た。この培養物は、低菌体密度LCDの培養物と呼ばれる。これらの培養物を振盪させて30°Cで30分間インキュベートした。30分の順化期間終了後、OD600を測定した。それぞれ異なる濃度のアルコールが入った15mlコニカルチューブに、試験対象の培養物を5mlずつ分取した。対照用のチューブにはアルコールを入れなかった。チューブを30°Cの回転ドラムに置き、24時間インキュベートした。菌体が付加された時点を0時間と呼んだ。試験の対象となった濃度は以下の通りである。すなわち、1-ブタノール:1.0w/v、1.5及び2、イソブタノール:1.0、1.5及び2.5、2-ブタノール:2.0、3.0及び3.5、並びにエタノール:2.0、4.0及び5。24時間後に、各培養物のアルコール濃度をHPLCで測定した。この測定から、インキュベーション期間に0.01未満のアルコールが失われたことが確認された。YPDプレート上のコロニー形成単位CFUを、対照群に関しては0時間の時点で、対照培養物を含めた各培養物に関しては24時間の時点で、標準の微生物学的方法にて定量した。マイクロタイタープレートで培養物20μlの培養物及び180μlのYPDブロスを順次に希釈し、3枚の寒天板にそれぞれ異なる希釈剤を10μlずつ斑点状に付着させ、30°Cで24時間及び48時間インキュベートした。48時間後にコロニーを計数し、CFU/mlを計算した。0時間の時点で低菌体密度の培養物は約4.8×105CFU/mlを有し、高菌体密度の培養物は約5.4×107CFU/mlを有した。24時間の時点での対照用の0ブタノールHCD又はLCD培養物のCFU/mlを基準に、生存率を計算した。その結果を表2に示す。アルコールを含まない対照用の高菌体密度の培養物は、24時間で5.4×107菌体/mlから6.5×107菌体/mlに増加した。アルコールを含まない対照用の低菌体密度の培養物は、24時間で4.8×105菌体/mlから2.8×107菌体/mlに増加した。1-ブタノール、イソブタノール、又は2-ブタノールに曝された培養物においては、高菌体密度培養物の方が低菌体密度の培養物よりも高い生存率を示した表2。対照的に、低菌体密度の培養物よりも高菌体密度培養物の方が、2.0又は4.0エタノールに対する感応性が高かった。実施例2酵母の高菌体密度及び低菌体密度の培養物におけるサッカロミケスSaccharomyces以外の24時間の時点での生存率サッカロミケスSaccharomyces以外の酵母菌株を試験して、イソブタノール耐性がこれらの酵母の菌体密度に影響されるかどうかを確認した。試験の対象となったのは、クルイベロマイセスマルシアヌスKluyveromycesmarxianusPNY0577米国培養細胞系統保存機関:AmericanTypeCultureCollectionATCC,Manassas,VA;ATCC8554、クルイベロマイセスマルシアンスKluyveromycesmarxianusPNY0578ATCC16045、ピキアメンブラニファシエンスPichiamembranifaciensPNY0572、ピキアアノマラPichiaanomalaPNY0573、ピキアエスピーPichiasp.PNY0574、イサチェンキアオリエンタリスIssatchenkiaorientalisPNY0575及びイサチェンキアオリエンタリスIssatchenkiaorientalisPNY0576である。使用されたピキアPichia及びイサチェンキアIssatchenkia菌株は、指定された属の野生型の代表である。他の代表的な菌株は、例えば、ATCCから市販されている。サッカロミケスSaccharomyces以外の酵母菌株をフリーザーバイアルからYPDアガーTeknova,Hollister,CAに蒔き、30°Cで一晩インキュベートした。YPDプレートからの各菌株の菌体をYPDブロスTeknova,Hollister,CAの前培養物25ml中に接種し、初期OD600を0.06~0.08にして、好気振盪機内で30°Cにて7時間生育させた。各前培養のアリコートをYPDブロス200ml中に接種し、初期OD600が0.06~0.08になるようにして、結果として得られた培養物を曝気にて30°Cで約17時間インキュベートした。培養物の光学濃度を測定し、その培養物を遠心分離して菌体を再懸濁させ、OD600が5の新鮮なYPDブロスを得た。この培養物は、高菌体密度HCDの培養物と呼ばれる。この培養物を新鮮なYPDブロス中に100倍に希釈し、OD600が0.05を有する培養物を得た。この培養物は、低菌体密度LCDの培養物と呼ばれる。順化期間にわたって、これらの培養物を振盪させて30°Cで30分間インキュベートした。30分の順化期間終了後、OD600を測定した。試験対象のイソブタノール濃縮物を入れた15mlコニカルチューブに、5mlの低菌体密度又は高菌体密度の培養物を分取した。そのチューブを回転ドラムに置き、30°Cで24時間インキュベートした。イソブタノール濃度は1.0又は2.0であった。菌株ごとの対照培養物はイソブタノールを含有していなかった。菌体が付加された時点を時間0とした。24時間後に各試料のイソブタノール濃度をHPLCで測定したところ、インキュベーション中に失われたアルコール分は0.01未満であることがわかった。全ての試料をAcrodiscCRPTFE0.2μmフィルターPallLifeSciences,PortWashington,NYで濾過し、ShodexSH1011カラム8mmID×300mm長;ShowaDenkoAmerica,Inc.,NewYork,NYを使用したほかガードカラムとしてShodexSH-Gを使用して分析した。注入容量は10μLであった。移動相は0.01Nの硫酸であった。カラム温度は50°Cで、移動相流速は0.5mL/分であった。検出の目的に、210nmにて光度測定検出器を使用したほか、屈折率検出器も使用した。YPDプレート上のコロニー形成単位CFUを、対照群に関しては0時間の時点で、対照培養物を含めた全ての試料に関しては24時間の時点で、標準の微生物学的方法にて定量した。基本的に、マイクロタイタープレートで培養物20μlの培養物及び180μlのYPDブロスを順次に希釈し、3枚の寒天板にそれぞれ異なる希釈剤を10μlずつ斑点状に付着させ、30°Cで24時間及び48時間インキュベートした。48時間後にコロニーを計数し、CFU/mlを算出した。菌株ごとに、24時間の時点におけるHCD又はLCDの対照培養物のCFU/mlを基準に生存率を計算した。結果を表3に示す。イソブタノールを含まない対照用の高菌体密度の培養物は、24時間で約1.0×108菌体/mlから約1.5×108菌体/mlへ増加した。イソブタノールを含まない対照用の低菌体密度の培養物は、24時間で約1.1×106菌体/mlから約1.0×108菌体/mlへ増加した。サッカロミケスSaccharomyces以外の酵母菌株は全て、1.0イソブタノールに曝されたHCD培養物の方が、LCD培養物よりも有意に高い生存レベルを呈した表3。2.0イソブタノールに曝された出菌株のうち生存したのは1株PNY0574のみであった。この菌株はまた、イソブタノールを2.0に曝されたLCDの培養物よりもHCD培養物における方が、有意に高い生存レベルを呈した。実施例3高菌体密度の酵母培養物における、イソブタノールの存在下でのサッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiae菌株のグルコース利用率サッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiaeBY4743をフリーザーバイアルからYPDアガーTeknova、Hollister,CA;カタログ番号Y1000に蒔き、30°Cで一晩インキュベートした。YPDプレートからの菌体をYPDブロスTeknova、Hollister,CA;、カタログ番号Y5000の前培養物25ml中に接種し、初期OD600を0.06~0.08にして、この培養物を空気振盪機内で30°Cにて7時間生育させた。前培養のアリコートをYPDブロス200ml中に接種し、初期OD600を0.06~0.08にして、この培養物を30°Cで約17時間曝気にてインキュベートした。培養物の光学濃度を定量し、その培養物を遠心分離して菌体を再懸濁させ、OD600が8の新鮮なYPDブロスを得た。この時点で、培養物10mlのアリコートを使用して乾燥菌体重量を定量した。結果として3.89のgdcw/Lが算出された。0.0、0.5、1.0、1.25、1.5、1.75、又は2.0のイソブタノールを入れたフラスコに、培養物を20mlずつ移した。菌体が付加された時点を0時間と呼んだ。異なる時点で、試料1.5mlを回収し、微量遠心管SorvallBiofugepicoで10,000rpmにて2分間遠心分離した。上澄みを0.2μmフィルターPallLifeSciences,PortWashington,NYPallGHPAcrodisc13mmシリンジフィルター、0.2μmGHPメンブレン付きで濾過し、濾過液を10倍に希釈して、YSIグルコース分析計YSI2700Select;YSL,Inc.,YellowSprings,Ohioを使用してグルコース濃度を定量した。菌体濃度が18gdcw/L又は24gdcw/Lのときの、イソブタノールの存在下でのグルコース消費率も定量した。YPDプレートからの菌体をYPDブロスTeknova,Hollister,CA、カタログ番号Y5000の前培養物25ml中に接種し、初期OD600を0.06~0.08にして、この培養物を空気振盪機内で30°Cにて7時間生育させた。YPDブロス300ml入りのフラスコ8本にそれぞれ前培養のアリコートを接種し、初期OD600を0.1にして、この培養物を30°Cで約17時間曝気にてインキュベートした。培養物の光学濃度を定量し、その培養物を遠心分離して菌体を再懸濁させ、OD600が3818gdcw/Lの新鮮なYPDブロスを得た。2、3、又は4イソブタノールを入れた各フラスコに試料15mlを移した後、150分間グルコースを消費させた。開始時のOD600を49.124gdcw/Lとしたことを除いて、同じ実験を繰り返した。1.5、3、又は4イソブタノールを入れた各フラスコに試料を15mlずつ移した後、150分間グルコースを消費させた。図4に、BY4743の結果をグラフ化して示す。対照培養物イソブタノールを含まないにおいては、試験された実験条件の下でのグルコース消費率が約2.17g/gdcw/hであった。1.5イソブタノールでは、3.8及び24gdcw/Lの両方の培養物のグルコース消費率は、対照速度の約50約1.1g/gdcw/hであった。2.0及び2.5イソブタノールの存在下でのグルコース消費を観測し、対照速度の20~25の範囲に及んだ。対照群における実際のグルコース消費率は実験ごとに5変化し得る。しかしながら、相対的なイソブタノール阻害率は再現可能であった。実施例4高菌体密度の培養を生成する工程サッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiaeBY4743をフリーザーバイアルからYPDアガーTeknova,Hollister,CA;カタログ番号Y1000に蒔き、30°Cで一晩インキュベートした。YPDプレートからの菌体をYPDブロスTeknova,Hollister,CA;カタログ番号Y5000の前培養物25ml中に接種し、初期OD600を0.06~0.08にした。前培養物を好空気振盪機内で30°Cにて7時間生育させた。前培養のアリコートをYPDブロス125ml中に接種し、初期OD600を0.06~0.08にして、この培養物を30°Cで約17時間曝気にてインキュベートした。YPD150mlの種培養に一晩培養物5mlを接種し、初期OD600を0.15にした。この培養物を2時間曝気にて30°Cでインキュベートしたところ、OD600が0.38に達した。表4に示すように、この時点時間=0で異なる濃度のイソブタノールにそれぞれ培養物を曝露させ、OD600を5時間にわたって1時間ごとにアッセイしたほか、24時間経過した時点でもアッセイした。結果を表4に示す。この菌株の場合、1OD600が107菌体/mlに等しいため、1イソブタノールの存在下でS.セレビシエS.cerevisiaeは一晩生育させた後で約4×107菌体/mlに増殖した。1イソブタノール又はそれ未満1未満のイソブタノール濃度イソブタノール中で4.41又はそれ以上のOD600に増殖した培養物は、高菌体密度の培養物であり、イソブタノール生成の用に供することができる。実施例5グルコース消費量の多い菌株を生成する工程使用されたS.セレビシエS.cerevisiae菌株は、PNY0602及びPNY0614のほか、CentraalbureauvoorSchimmelcultures,FungalandYeastCollectionNetherlandsから入手されたPNY0569CEN.PK122MATaMAL2-8cSUC2/MATalphaMAL2-8cSUC2及びPNY0571CEN.PK113-7DMATaMAL2-8cSUC2であった。PNY0602及びPNY0614は、PNY0571の突然変異を誘発された培養物から単離された。PNY0571CEN.PK113-7Dに対しては10回にわたって、標準方法を用い、N-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジンNTG及びエチルメタンスルホン酸塩EMSで化学物質突然変異を誘発させたBarbour,L.,M.HannaandW.Xiao.2006.Mutagenesis,p.121-127.InW.Xiaoed.,YeastProtocols,SecondEdition.HumanaPress,NJ。YPD10ml中で30°Cで振盪して菌体を一晩生育させた。一晩培養物を遠心分離させ、pH7.0の50mMリン酸カリウム緩衝液中でペレットを再懸濁させた。菌体を再び遠心分離し、10mlの同じ緩衝液中で再懸濁させた。再懸濁させた菌体の一部2.5mlをプラスチック製の15mlネジ蓋の付いた遠心管に移し、菌体を振盪せずに30°Cにて40分間NTG終濃度10μg/ml又はEMS3w/vで処理した。等量のフィルター殺菌済み10w/vチオ硫酸ナトリウムを加えて、突然変異原を不活性化した。処理済みの菌体を遠心分離し、水中で2回再懸濁させた。処理プロトコールには突然変異原のうちの1つ例えば、NTGを有する酵母細胞を繰り返し処理するサイクルが含まれ、これにより、生存中の菌体を、1イソブタノール含有のYPD中で一晩生育させ、その後、他の突然変異原例えば、EMSで一晩培養物を処理する。5回目のサイクル即ち、突然変異原を用いて合計10回処理の後、イソブタノール耐性に関して菌体をスクリーニングした。PNY0602を3.0イソブタノールに長時間24時間曝した後で単離した。突然変異を起こした培養物の冷凍及び解凍サイクルを5回繰り返した後、蒸留水中で突然変異細胞を再懸濁させ、菌体をドライアイス-エタノール槽、及び37°Cの水槽にそれぞれ20分間移すことによって、PNY0614を単離した。ATCC受託番号PTA-11918に関連する単離された微生物は、本明細書中でPNY0602とも呼ばれている。ATCC受託番号PTA-11918に関連する単離された微生物は、ブダペスト条約に基づき、2011年6月1日付けで、米国培養細胞系統保存機関AmericanTypeCultureCollectionATCCの特許保管所10801、UniversityBoulevard,Manassas.VA20110-2209に寄託された。ATCC受託番号PTA-11919に関連する単離された微生物は、本明細書中でPNY0614とも呼ばれている。ATCC寄託番号PTA-11919に関連する単離された微生物は、ブダペスト条約に基づき、2011年6月1日付けで、米国培養細胞系統保存機関AmericanTypeCultureCollectionATCCの特許保管所10801、UniversityBoulevard,Manassas.VA20110-2209に寄託された。YPD中でイソブタノールの存在下、菌体濃度が約8O.D.約3.9gdcw/Lのときのグルコース消費率も定量された。サッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiae菌株PNY0571、PNY0602、及びPNY0614をフリーザーバイアルからYPDアガーTeknova,Hollister,CA;カタログ番号Y1000に蒔き、30°Cで一晩インキュベートした。YPDプレートからの菌体をYPDブロスTeknova,Hollister,CA;カタログ番号Y5000の前培養物25ml中に接種し、初期OD600を0.06~0.08にして、この培養物を空気振盪機内で30°Cにて7時間生育させた。前培養のアリコートをYPDブロス200ml中に接種し、初期OD600を0.06~0.08にして、この培養物を30°Cで約17時間曝気にてインキュベートした。培養物の光学濃度を定量し、その培養物を遠心分離して菌体を再懸濁させ、OD600が8の新鮮なYPDブロスを得た。この時点で、培養物10mlのアリコートを使用して乾燥菌体重量を定量した結果、3.89gdcw/Lの範囲内の乾燥菌体重量が算出された。0.0、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0又は2.5のイソブタノールを入れたフラスコに、培養物を20mlずつ移した。菌体が付加された時点を0時間と呼んだ。異なる時点で、試料500~700ulを等量の10TCAが入ったチューブに移した。試料を遠心分離し、YSIグルコース分析計YSI2700Selectでグルコースを定量した。結果を表5に示す。これらの結果から、突然変異誘発及び選択により、グルコース消費率が原種parentと比較して改善される可能性のあることがわかった。イソブタノールの生成は、生育に関係する場合もあれば関与しない場合もある。そのため、非生育条件の下で3通りのpH緩衝液を使用してグルコース消費率を測定した。Diderich,J.A.,etal.,Microbiology,1999,145p.3447-54によって概説されているように、pH6.5のリン酸緩衝液中のグルコース消費率を定量した。また、MES緩衝液を使用してpH5.25及びpH4.0でのグルコース消費率も定量した。YPD500mlフラスコ中125ml中で30°Cにて菌体を一晩生育させた。菌体を再び遠心分離し、緩衝液0.1Mリン酸緩衝液pH6.0、又は0.1MMES緩衝液pH5.25、又は0.1MMES緩衝液pH4.0中で再懸濁させ、1回洗浄した後、各菌体懸濁液が約16OD、即ち、1億6000万菌体/mlとなるように再懸濁した。これらの株の菌体10mlを、対応する10mlの緩衝液40g/Lグルコースとそれぞれ別の濃度のイソブタノールとを含むが入ったフラスコに移した。異なる時点で、試料500~700ulを等量の10TCAが入ったチューブに移した。試料を遠心分離し、YSIグルコース分析計でグルコースを定量した。経時的に消費されたグルコースの分量をプロットすることによってグルコース消費率を定量した。結果を表6に示す。pH6.5未満のpHでは、20g/Lイソブタノールの存在下でのグルコース消費率が上昇したことが観測された。実施例6高菌体密度の培養物における、イソブタノールの存在下でのイサチェンキアオリエンタリスIssatchenkiaorientalis菌株のグルコース利用率菌株イサチェンキアオリエンタリスIssatchenkiaorientalisPNY0660は、ATCC20381菌株旧称:カンジダアシッドサーモフィリアムCandidaacidothermophiliumから取り出された。菌株PNY0660をフリーザーバイアルからYPDアガーTeknova,Hollister,CA;カタログ番号Y1000に蒔き、30°Cで一晩インキュベートした。YPDプレートからの菌体をYPDブロスTeknova,Hollister,CA;カタログ番号Y5000の前培養物50ml中に接種し、初期OD600を0.06~0.08にして、この培養物を空気振盪機内で30°Cにて5時間生育させた。前培養のアリコートをYPDブロス200ml中に接種し、初期OD600を0.6にして、この培養物を30°Cで約17時間曝気にてインキュベートした。培養物の光学濃度を定量し、その培養物を遠心分離して、コーン試験液で糖消費率を定量した。0.2カザミノ酸、2グルコース、及び100mM/LMES緩衝液pH5.25を含有するコーン試験液i塩類:硫酸アンモニウム5.0g、リン酸カリウム一塩基2.8g、及び硫酸マグネシウム七水和物0.5g、iiビタミン:ビオチンD-0.40mg、Dパントテン酸カルシウム8.00mg、ミオイノシトール200.00mg、ピリドキシン塩酸塩8.00mg、p-アミノ安息香酸1.60mg、リボフラビン1.60mg、葉酸0.02mg、ナイアシン30.0mg及びチアミン30mg、並びにiii微量成分:EDTATitriplexIII799.38mg、硫酸亜鉛七水和物29.81mg、塩化マンガン無水物5.57mg、塩化コバルトII六水化物1.99mg、硫酸銅II五水和物1.99mg、モリブデン酸二ナトリウム無水物2.65mg、塩化カルシウム無水物29.81mg、硫酸鉄七水和物19.88mg及びホウ酸。0.0、0.5、1.0、1.5、1.75又は2.0イソブタノールを入れたフラスコに、コーン試験液中の20ml培養物2.7gdcw/Lを移した。菌体が付加された時点を0時間と呼んだ。異なる時点で、試料1.5mlを回収し、微量遠心管SorvallBiofugepicoで10,000rpmにて2分間遠心分離した。上澄みを0.2μmフィルターPallLifeSciences,PortWashington,NYPallGHPAcrodisc13mmシリンジフィルター、0.2μmGHPメンブレン付きで濾過し、濾過液を10倍に希釈して、YSIグルコース分析計YSI2700Select;YSI,Inc.,YellowSprings,Ohioを使用してグルコース濃度を定量した。0時間~6時間経過後に測定された糖消費率を、表7に示す。I.オリエンタリスI.orientalis菌株は、20g/lイソブタノールの存在下での糖消費率が0.7g/gdw/hであった。本発明の前述の記述は、図解及び説明の目的に提示されている。更にまた、説明は発明を本明細書に開示された形態だけに制限することを意図するものではない。本明細書に記載されている種々の態様、実施形態及び選択肢はすべて、あらゆる変形態様で併用できる。本明細書に記載されている公告、特許及び特許出願はすべて、あたかも個々の公告、特許、又は特許出願の各々が参照によって援用されているのと同じ程度に、参照によって本明細書に援用される。"