"外部回路に接続可能な導電性基材と、電極触媒として酵素結晶を備え、前記酵素結晶が導電性基材に固定化されている酵素結晶固定化電極。微細化された導電性基材上に酵素結晶が固定化された微小電極として構成されている請求項1に記載の酵素結晶固定化電極。前記酵素結晶が、酸化反応を触媒する酵素の結晶である請求項1又は2に記載の酵素結晶固定化電極。前記酵素結晶が、アシネトバクターカルコアセティカス由来のピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼの結晶である請求項3に記載の酵素結晶固定化電極。前記アシネトバクターカルコアセティカス由来のピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼが、下記A~Cの何れかのアミノ酸配列を有する請求項4に記載の酵素結晶固定化電極。A配列番号2に示すアミノ酸配列B配列番号4に示すアミノ酸配列CAまたはBのアミノ酸配列と80以上の相同性を有するアミノ酸配列前記酵素結晶が、還元反応を触媒する酵素である請求項1又は2に記載の酵素結晶固定化電極。前記酵素結晶が、バチルスサブティリス由来のCotAラッカーゼの結晶である請求項6に記載の酵素結晶固定化電極。前記バチルスサブティリス由来のCotAラッカーゼが、下記A~Cの何れかのアミノ酸配列を有する請求項7に記載の酵素結晶固定化電極。A配列番号6に示すアミノ酸配列B配列番号8に示すアミノ酸配列CA又はBのアミノ酸配列と80以上の相同性を有するアミノ酸配列外部回路に接続可能な導電性基材に電極触媒として酵素結晶を固定化した酵素結晶固定化電極の製造方法であって、前記導電性基材に前記酵素結晶を固定化することにより酵素結晶固定化電極を製造する酵素結晶固定化電極の製造方法。前記酵素結晶の固定化に先立って、酵素溶液から酵素の結晶化を行う請求項9に記載の酵素結晶固定化電極の製造方法。酵素の結晶化を、蒸気拡散法の環境下において行う請求項10に記載の酵素結晶固定化電極の製造方法。外部回路に接続可能な導電性基材に電極触媒として酵素結晶を固定化した酵素結晶固定化電極の製造方法であって、酵素溶液からの酵素の結晶化を前記導電性基材上で行って、前記導電性基材に酵素結晶を固定化することにより酵素結晶固定化電極を製造する酵素結晶固定化電極の製造方法。酵素の結晶化を、蒸気拡散法の環境下において行う請求項12に記載の酵素結晶固定化電極の製造方法。請求項12又は13に記載の酵素結晶固定化電極の製造方法により製造された酵素結晶固定化電極。微細化された導電性基材上に酵素結晶が固定化された微小電極として構成されている請求項14に記載の酵素結晶固定化電極。前記酵素結晶が、酸化反応を触媒する酵素の結晶である請求項14又は15に記載の酵素結晶固定化電極。前記酵素結晶が、アシネトバクターカルコアセティカス由来のピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼの結晶である請求項16に記載の酵素結晶固定化電極。前記アシネトバクターカルコアセティカス由来のピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼが、下記A~Cの何れかのアミノ酸配列を有する請求項17に記載の酵素結晶固定化電極。A配列番号2に示すアミノ酸配列B配列番号4に示すアミノ酸配列CAまたはBのアミノ酸配列と80以上の相同性を有するアミノ酸配列前記酵素結晶が、還元反応を触媒する酵素の結晶である請求項14又は15に記載の酵素結晶固定化電極。前記酵素結晶が、バチルスサブティリス由来のCotAラッカーゼの結晶である請求項19に記載の酵素結晶固定化電極。前記バチルスサブティリス由来のCotAラッカーゼが、下記A~Cの何れかのアミノ酸配列を有する請求項20に記載の酵素結晶固定化電極。A配列番号6に示すアミノ酸配列B配列番号8に示すアミノ酸配列CA又はBのアミノ酸配列と80以上の相同性を有するアミノ酸配列請求項1~8、及び14~21の何れか一項に記載の酵素結晶固定化電極を備えるバイオ電池。請求項3~5、16~18の何れか一項の酵素結晶固定化電極をアノードとして備える請求項22に記載のバイオ電池。請求項6~8、19~21の何れか一項の酵素結晶固定化電極をカソードとして備える請求項22又は23に記載のバイオ電池。アノードとカソードを対向させて電極を形成し、前記アノードと前記カソードを隔離するようにイオン伝導性物質を配置する酵素固定化電極を備えるバイオ電池の製造方法であって、前記電極が請求項1~8、及び14~21の何れか一項に記載の酵素結晶固定化電極であるバイオ電池の製造方法。前記アノードが、請求項3~5、16~18の何れか一項の酵素結晶固定化電極である請求項25に記載のバイオ電池の製造方法。前記カソードが、請求項6~8、19~21の何れか一項の酵素結晶固定化電極である請求項25又は26に記載のバイオ電池の製造方法。請求項1~8、及び14~21の何れか一項に記載の酵素結晶固定化電極を備えるバイオセンサー。そこで、本発明は、上記問題点を解決すべく、電極性能の向上した酵素電極の構築のため、均一、高密度、かつ一定の配向性を揃えて酵素を導電体基材に固定化できる技術の構築を目的とする。また、本発明は、均一、高密度、かつ一定の配向性を揃えて酵素を導電体基材に固定化することにより構築された酵素結晶固定化電極を提供することを目的とし、電極の円滑な電子伝達を通した電極性能の向上を目的とする。更には、かかる酵素結晶固定化電極を利用したバイオ電池及びバイオセンサーの提供を目的とする。本発明者らは、上記課題を解決すべく研究を重ねた結果、酵素結晶を導電性基材表面に固定化することによって、均一、高密度、かつ一定の配向性を揃えて酵素を導電性基材表面に固定化でき、これにより触媒機能を円滑に発揮できる酵素結晶固定化電極を構築できることを見出した。そして、かかる酵素結晶固定化電極は、電極上での電子伝達の円滑な進行を実現でき、優れた電極性能を発揮するものであることを見出した。本発明者らは、これらの知見に基づき本発明を完成するに至った。即ち、上記目的を達成するため、以下の[1]~[28]に示す発明を提供する。[1]外部回路に接続可能な導電性基材と、電極触媒として酵素結晶を備え、前記酵素結晶が導電性基材に固定化されている酵素結晶固定化電極。[2]微細化された導電性基材上に酵素結晶が固定化された微小電極として構成されている。[3]前記酵素結晶が、酸化反応を触媒する酵素の結晶である。[4]前記酵素結晶が、アシネトバクターカルコアセティカス由来のピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼの結晶である。[5]前記アシネトバクターカルコアセティカス由来のピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼが、下記A~Cの何れかのアミノ酸配列を有する。A配列番号2に示すアミノ酸配列B配列番号4に示すアミノ酸配列CAまたはBのアミノ酸配列と80以上の相同性を有するアミノ酸配列[6]前記酵素結晶が、還元反応を触媒する酵素の結晶である。[7]前記酵素結晶が、バチルスサブティリス由来のCotAラッカーゼの結晶である。[8]前記バチルスサブティリス由来のCotAラッカーゼが、下記A~Cの何れかのアミノ酸配列を有する請求項5に記載の酵素結晶固定化電極。A配列番号6に示すアミノ酸配列B配列番号8に示すアミノ酸配列CA又はBのアミノ酸配列と80以上の相同性を有するアミノ酸配列上記[1]の構成によれば、酵素結晶が導電性基材に固定化された酵素結晶固定化電極を提供できる。酵素結晶は酵素分子が分子レベルでの規則性を保持した状態で整列していることから、酵素結晶固定化電極は、電極触媒である酵素を導電性基材表面に、均一、高密度、かつ一定の配向性を揃えて固定化されている。そして、酵素結晶は機能性分子のまま触媒活性を保持した形態で固定化されている。そのため、酵素結晶固定化電極は、電子伝達を円滑に進めることができ、優れた電極性能を発揮することができる。従来の酵素を溶媒に分散させた溶液状態での固定化では、酵素濃度が高くなると、分散性が悪くなり、酵素は導電性基材に凝集した状態で固定化されてしまい、電極の電子伝達の円滑な進行を妨げ電極性能の低下をもたらすという問題点があった。しかし、酵素が均一、高密度、かつ一定の配向性を揃えた状態で固定化された酵素結晶固定化電極は、かかる問題点を解消するものである。したがって、従来型の酵素電極よりも極めて優れた電極性能を有する酵素結晶固定化電極は、バイオ電池やバイオセンサーをはじめとして種々の産業分野に利用することができる産業上利用価値の高い電極である。更に、上記[2]の構成によれば、微小な領域に超高濃度の酵素を、均一、高密度、かつ一定の配向性を揃えた状態で固定化された微小電極を提供でき、微小電極の利用価値を更に高めることができる。また、上記[3]~[5]の構成によれば、酸化反応を触媒する酵素を酵素結晶として固定化することにより、バイオ電池及びバイオセンサー等に利用可能な電極を提供できる。バイオ電池の電極とする場合には、アノードとして利用することができる。また、ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼは、反応速度が非常に速く、また溶存酸素の影響を受けにくく、電極に直接固定できることから電極反応、引いては電極構造を簡素化することができるという利点があることから、更に産業上利用価値の高い電極を提供することができる。ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼはグルコースを基質とすることから、グルコースセンサーや、グルコースを燃料としたバイオ電池への応用等、電子、医療、食品、環境分野等の様々な分野に利用することができる。更に、上記[6]~[8]の構成によれば、還元反応を触媒する酵素を酵素結晶として固定化することにより、バイオ電池及びバイオセンサー等に利用可能な電極を提供できる。バイオ電池の電極とする場合には、カソードとして利用することができる。また、バチルスサブティリス由来のCotAラッカーゼは、マルチ銅オキシダーゼであり、分子内に酵素活性に必要な4原子の銅を含むタンパク質である。そして、基質から取り出した電子を用いて分子状酸素を電子還元し水分子を生成する反応を触媒する酵素であることから、電極触媒として利用することができる。特に、酸素を還元できることからバイオ電池のカソードとして利用価値が高い。更に、フェノール性化合物を検出するためのバイオセンサーとしても利用価値が高い。したがって、電子、医療、食品、環境分野等の様々な分野に利用することができる。[9]外部回路に接続可能な導電性基材に電極触媒として酵素結晶を固定化した酵素結晶固定化電極の製造方法であって、前記導電性基材に前記酵素結晶を固定化することにより酵素結晶固定化電極を製造する酵素結晶固定化電極の製造方法。[10]前記酵素結晶の固定化に先立って、酵素溶液から酵素の結晶化を行う。[11]酵素の結晶化を、蒸気拡散法の環境下において行う。上記[9]の構成によれば、酵素結晶が導電性基材上に固定化された酵素結晶固定化電極の製造方法を提供できる。酵素結晶は酵素分子が分子レベルでの規則性を保持した状態で整列していることから、電極触媒である酵素を導電性基材表面に、均一、高密度、かつ一定の配向性を揃えて固定化することができる。そして、酵素結晶は機能性分子のまま触媒活性を保持した形態で固定化される。これにより、電子伝達を円滑に進めることができ、かつ優れた電極性能を発揮することができる酵素結晶固定化電極を提供することができる。従来の酵素を溶媒に分散させた溶液状態での固定化方法では、酵素濃度が高くなると、分散性が悪くなり、酵素は導電性基材表面上に凝集した状態で固定化されてしまい、電極上での電子伝達の円滑な進行を妨げ電極性能の低下をもたらすという問題点があった。しかし、均一、高密度、かつ一定の配向性を揃えた状態での酵素の固定を可能とする酵素結晶固定化電極の製造方法は、かかる問題点を解消するものである。したがって、従来型の酵素電極よりも極めて優れた電極性能を有する酵素結晶固定化電極を製造できることから、バイオ電池やバイオセンサーをはじめとして種々の産業分野に利用することができる産業上利用価値の高い技術である。上記[10]~[11]の構成によれば、酵素結晶固定化電極に固定化される酵素結晶を、電極触媒としての機能が最大限に発揮できる所望の大きさ、形状及び品質に調整することができ、これにより、電子伝達を円滑に進めることができ、かつ優れた電極性能を発揮することができる酵素結晶固定化電極を提供することができる。[12]外部回路に接続可能な導電性基材に酵素結晶を固定化した酵素結晶固定化電極の製造方法であって、酵素溶液からの酵素の結晶化を前記導電性基材上で行って、前記導電性基材に酵素結晶を固定化することにより酵素結晶固定化電極を製造する酵素結晶固定化電極の製造方法。[13]酵素の結晶化を、蒸気拡散法の環境下において行う。[14]本発明の酵素結晶固定化電極の製造方法により製造された酵素結晶固定化電極。[15]微細化された導電性基材上に酵素結晶が固定化された微小電極として構成されている。[16]前記酵素結晶が、酸化反応を触媒する酵素の結晶である。[17]前記酵素結晶が、アシネトバクターカルコアセティカス由来のピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼの結晶である。[18]前記アシネトバクターカルコアセティカス由来のピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼが、下記A~Cの何れかのアミノ酸配列を有する。A配列番号2に示すアミノ酸配列B配列番号4に示すアミノ酸配列CA又はBのアミノ酸配列と80以上の相同性を有するアミノ酸配列[19]前記酵素結晶が、還元反応を触媒する酵素の結晶である。[20]前記酵素結晶が、バチルスサブティリス由来のCotAラッカーゼの結晶である。[21]前記バチルスサブティリス由来のCotAラッカーゼが、下記A~Cの何れかのアミノ酸配列を有する請求項5に記載の酵素結晶固定化電極。A配列番号6に示すアミノ酸配列B配列番号8に示すアミノ酸配列CA又はBのアミノ酸配列と80以上の相同性を有するアミノ酸配列上記[12]の構成によれば、酵素結晶が導電性基材に固定化された酵素結晶固定化電極の製造方法を提供できる。酵素結晶は酵素分子が分子レベルでの規則性を保持した状態で整列していることから、電極触媒である酵素を導電性基材表面に、均一、高密度、かつ一定の配向性を揃えて固定化することができる。そして、酵素結晶は機能性分子のまま触媒活性を保持した形態で固定化される。特に、導電性基材表面上で酵素の結晶化を行うことにより、更に配向性を揃えることが可能となり、また、結晶状態を崩すことがない様態で酵素結晶を電極に固定化できる。これにより、電子伝達を円滑に進めることができ、かつ優れた電極性能を発揮することができる酵素結晶固定化電極を提供することができる。また、電極の電流密度、特に初期電流の増加を期待できる。従来の酵素を溶媒に分散させた溶液状態での固定化方法では、酵素濃度が高くなると、分散性が悪くなり、酵素は導電性基材表面上に凝集した状態で固定化されてしまい、電極の電子伝達の円滑な進行を妨げ電極性能の低下をもたらすという問題点があった。しかし、均一、高密度、かつ一定の配向性を揃えた状態での酵素の固定を可能とする酵素結晶固定化電極の製造方法は、かかる問題点を解消するものである。したがって、従来型の酵素電極よりも極めて優れた電極性能を有するが酵素結晶固定化電極を製造できることから、バイオ電池やバイオセンサーをはじめとして種々の産業分野に利用することができる産業上利用価値の高い技術である。上記[13]の構成によれば、酵素結晶固定化電極に固定化される酵素結晶を、電極触媒としての機能が最大限に発揮できる所望の大きさ、形状及び品質に調整することができ、これにより、電子伝達を円滑に進めることができ、かつ優れた電極性能を発揮することができる酵素結晶固定化電極を提供することができる。上記[14]の構成によれば、酵素結晶が導電性基材上に固定化された酵素結晶固定化電極を提供できる。導電性基材上で酵素の結晶化を行ったことから、酵素結晶は酵素分子が分子レベルの規則性を保持した状態で整列された状態で導電性基材上に固定化される。したがって、酵素結晶固定化電極は、電極触媒である酵素を導電性基材表面に、均一、高密度、かつ一定の配向性を揃えて固定化され、特に配向性の統一が図れている。そして、酵素結晶は機能性分子のまま触媒活性を保持した形態で、かつ、結晶状態を崩すことがない様態で、導電性基材上に固定化されている。そのため、酵素結晶固定化電極は、電子伝達を更に円滑に進めることができ、優れた電極性能を発揮することができる。従来の酵素を溶媒に分散させた溶液状態での固定化では、酵素濃度が高くなると、分散性が悪くなり、酵素は導電性基材上に凝集した状態で固定化されてしまい、電極の電子伝達の円滑な進行を妨げ電極性能の低下をもたらすという問題点があった。しかし、均一、高密度、かつ一定の配向性を揃えた状態で酵素が固定された酵素結晶固定化電極は、かかる問題点を解消するものである。したがって、従来型の酵素電極よりも極めて優れた電極性能を有するが酵素結晶固定化電極は、バイオ電池やバイオセンサーをはじめとして種々の産業分野に利用することができる産業上利用価値の高い電極である。更に、上記[15]の構成によれば、微小な領域に超高濃度の酵素を、均一、高密度、かつ一定の配向性を揃えた状態で固定化された微小電極を提供でき、微小電極の利用価値を更に高めることができる。また、上記[16]~[18]の構成によれば、酸化反応を触媒する酵素を酵素結晶として固定化することにより、バイオ電池及びバイオセンサー等に利用可能な電極を提供できる。バイオ電池の電極とする場合には、アノードとして利用することができる。また、ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼは、反応速度が非常に速く、また溶存酸素の影響を受けにくく、電極に直接固定化できることから電極反応、引いては電極構造を簡素化することができるという利点があることから、更に産業上利用価値の高い電極を提供することができる。ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼはグルコースを基質とすることから、グルコースセンサーや、グルコースを燃料としたバイオ電池への応用等、医療、食品、環境分野等、様々な分野に利用することができる。更に、上記[19]~[21]の構成によれば、還元反応を触媒する酵素を酵素結晶として固定化することにより、バイオ電池及びバイオセンサー等に利用可能な電極を提供できる。バイオ電池の電極とする場合には、カソードとして利用することができる。また、バチルスサブティリス由来のCotAラッカーゼは、マルチ銅オキシダーゼであり、分子内に酵素活性に必要な4原子の銅を含むタンパク質である。そして、基質から取り出した電子を用いて分子状酸素を電子還元し水分子を生成する反応を触媒する酵素であることから、電極触媒として利用することができる。特に、酸素を還元できることからバイオ電池のカソードとして利用価値が高い。更に、フェノール性化合物を検出するためのバイオセンサーとしても利用価値が高い。したがって、電子、医療、食品、環境分野等の様々な分野に利用することができる。[22]本発明の酵素結晶固定化電極を備えるバイオ電池。[23]前記酵素結晶が、酸化反応を触媒する酵素である。若しくは、アシネトバクターカルコアセティカス由来のピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼの結晶である。又は、下記A~Cの何れかのアミノ酸配列を有するアシネトバクターカルコアセティカス由来のピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼの結晶である。A配列番号2に示すアミノ酸配列B配列番号4に示すアミノ酸配列CA又はBのアミノ酸配列と80以上の相同性を有するアミノ酸配列[24]前記酵素結晶が、前記酵素結晶が、還元反応を触媒する酵素である。若しくは、バチルスサブティリス由来のCotAラッカーゼの結晶である。又は、下記A~Cの何れかのアミノ酸配列を有するバチルスサブティリス由来のCotAラッカーゼの結晶である。A配列番号6に示すアミノ酸配列B配列番号8に示すアミノ酸配列CA又はBのアミノ酸配列と80以上の相同性を有するアミノ酸配列[25]アノードとカソードを対向させて電極を形成し、前記アノードとカソードを隔離するようにイオン伝導性物質を配置する酵素固定化電極を備えるバイオ電池の製造方法であって、前記電極が本発明の酵素結晶固定化電極である。[26]アノードが、酸化反応を触媒する酵素の結晶を固定化した酵素結晶固定化電極である。若しくは、アシネトバクターカルコアセティカス由来のピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼの結晶を固定化した酵素結晶固定化電極である。又は、下記A~Cの何れかのアミノ酸配列を有するアシネトバクターカルコアセティカス由来のピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼの結晶を固定化した酵素結晶固定化電極である。A配列番号2に示すアミノ酸配列B配列番号4に示すアミノ酸配列CA又はBのアミノ酸配列と80以上の相同性を有するアミノ酸配列[27]カソードが、還元反応を触媒する酵素の結晶を固定化した酵素結晶固定化電極である。若しくは、バチルスサブティリス由来のCotAラッカーゼの結晶を固定化した酵素結晶固定化電極である。又は、下記A~Cの何れかのアミノ酸配列を有するバチルスサブティリス由来のCotAラッカーゼの結晶を固定化した酵素結晶固定化電極である。A配列番号6に示すアミノ酸配列B配列番号8に示すアミノ酸配列CA又はBのアミノ酸配列と80以上の相同性を有するアミノ酸配列上記[22]~[24]の構成によれば、電子伝達を更に円滑に進めることができ、優れた電極性能を発揮することができる酵素結晶固定化電極を備えたバイオ電池を提供することができる。酵素結晶固定化電極は、優れた電極性能を発揮することができることから、これを利用することにより高容量及び高出力の発電を可能とし、発電効率が非常に高く、かつ耐久性に優れた高性能なバイオ電池を提供することができる。そして、上記[25]~[27]の構成によれば、電子伝達を更に円滑に進めることができ、優れた電極性能を発揮することができる酵素結晶固定化電極を備えたバイオ電池の製造方法を提供することができる。酵素結晶固定化電極は、優れた電極性能を発揮することができることから、これを利用することにより高容量及び高出力の発電を可能とし、発電効率が非常に高く、かつ耐久性に優れた高性能なバイオ電池を製造することができる。[28]本発明の酵素結晶固定化電極を備えるバイオセンサー。上記[28]の構成によれば、電子伝達を更に円滑に進めることができ、優れた電極性能を発揮することができる酵素結晶固定化電極を備えたバイオセンサーを提供することができる。酵素結晶固定化電極は、優れた電極性能を発揮することができることから、これを利用することにより高精度、かつ耐久性に優れたバイオセンサーを提供することができる以下、本願発明について詳細に説明する。本発明の酵素結晶固定化電極は、外部回路に接続できる導電性基材、及び前記導電性基材上に固定化された酵素結晶を含んで構成される。酵素結晶は酵素分子が分子レベルの規則性を保持した状態で整列していることから、酵素結晶固定化電極は、電極触媒である酵素を導電性基材表面に、均一、高密度、かつ一定の配向性を揃えて固定化される。具体的には、酵素は4000mgcm2以上の密度で固定化でき、従来技術における最大固定化量に比べて固定化量を大幅に増加することができる。本発明の酵素結晶固定化電極で使用できる酵素は、酵素の触媒反応と、電極反応を共役させ得ることができる限り特に制限は無く、何れの酵素をも利用することができる。例えば、酸化還元酵素、加水分解酵素、転移酵素等を利用することができる。これに限定するものではないが、酸化還元酵素の利用が好ましい。酸化還元酵素としては、国際生化学分子生物学連合による酵素番号EnzymeCommissionnumberEC1に分類される酵素が利用できる。例えば、デヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ヒロドキシラーゼ、又はオキシゲナーゼ、レダクターゼ等を含む。具体的には、グルコースオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、アルデヒドオシキダーゼ、乳酸オキシダーゼ、ピルビル酸オキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ザルコシンオキシダーゼ、フルクトシルアミンオキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、フルクトースデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ピルビル酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、アルデヒドレダクターゼ、グルコースフルクトースオキシドレダクターゼ、脂肪酸ペルオキシダーゼ、アスコルビン酸ペルオキシダーゼ及びカタラーゼ、ラッカーゼ等のマルチ銅酵素等を例示することができる。補酵素要求性の有無についても特に制限はなく、補酵素としては、ニコチン酸、リボフラビン等のビタミン補酵素、ピロロキノリンキノン等のキノン補酵素等が例示される。また、補酵素を要求する酵素についても、アポ形態、ホロ形態の別をも問わない。これら酵素は単独で、若しくは複数組み合わせて利用することができる。したがって、例えば、任意の酵素と、その酵素に共役する他の任意の酵素とを組み合わせて用いることによって、共役系を構築することもできる。好ましくは、グルコースデヒドロゲナーゼであり、ピロロキノリンキノン以下、PQQと略する。をその触媒活性の発現において補酵素として要求するPQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ、NADをその触媒活性の発現において要求するNAD依存性ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ等が含まれる。特には、アシネトバクターカルコアセティカスAcinetobactercalcoaceticus由来のグルコースデヒドロゲナーゼGENBANKACCESSIONNo15871、CletonJansenAMGoosenNVinkKandvandePutteP他著、CloningcharacterizationandDNAsequencingofthegeneencodingtheMr50000quinoproteinglucosedehydrogenasefromAcinetobactercalcoaceticusアシネトバクターカルコアセティカス由来のMr50000のキノプロテイングルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のクローニング、特徴付け、及びDNAシークエンシング、JOURNALMolGenGenet、第217巻、第2~3巻、第430~436頁、1989年を好適に利用することができる。この酵素は、Acinetobacter細菌のペリプラズム画分に存在しており、酸化により得られた電子を呼吸鎖に渡すことでエネルギー生産に関与している。活性の発現には、PQQとカルシウムイオンが必須で、カルシウムイオンは触媒反応に関与する他にホモ2量体形成にも関係していることが知られている。この酵素は、他のグルコース酸化酵素に比べ、反応速度が非常に速く、また溶存酸素の影響を受けにくいという特徴があるため酵素電極として利用価値が非常に高い酵素である。そのため自己血糖測定器に広く利用され、またグルコースを燃料とした酵素電池の酵素触媒としての応用が期待されている。グルコースデヒドロゲナーゼをバイオ電池の酵素触媒とする場合には、負極つまりアノード側触媒とすることが好ましい。また、ラッカーゼをも好ましく利用することができる。ラッカーゼは、フェノールオキシダーゼの総称である。酸素の存在下、基質としてフェノール性化合物を酸化する酵素である。この酵素は、マルチ銅オキシダーゼであり、分子内に酵素活性に必要な4原子の銅を含むタンパク質である。そして、基質から取り出した電子を用いて分子状酸素を電子還元し水分子を生成する反応を触媒する酵素である。基質としては、2,2’-アジノビス3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸アンモニウム塩22Azinobis、第1490~3頁先行技術文献の非特許文献2を好適に利用することができる。また、酵素の由来も特に限定されない。したがって、天然に存在する細菌、酵母、及び動植物等の任意の生物体から適当なタンパク質の単離精製技術により調製された天然由来のものであってもよく、遺伝子工学的手法により組換え体として製造されたもの、あるいは化学的に合成されたものであってもよい。本発明においては、遺伝子組換え手法を用いて、組換えタンパク質として酵素を取得することが好ましい。多くの酵素のアミノ酸配列及びそれをコードする遺伝子の塩基配列は公知であり、GenBank、EMBL、DDBJ等の遺伝子配列データベースから取得することができる。そして、当業者であれば、塩基配列の情報に基づいて、所望の酵素遺伝子をクローニングすることができる。一例として、上述のアシネトバクターカルコアセティカス由来のグルコースデヒドロゲナーゼの配列情報を配列表の配列番号1塩基配列及び配列番号2アミノ酸配列に示す。また、ここで提示する配列番号3塩基配列及び配列番号4アミノ酸配列をも利用することができる。また、バチルスサブティリス由来CotAラッカーゼの配列情報を配列表の配列番号5塩基配列及び配列番号6アミノ酸配列に示す。また、ここで提示する配列番号7塩基配列及び配列番号8アミノ酸配列をも同様に利用することができる。具体的には、所望の酵素遺伝子の塩基配列を基にして作製したDNAをプローブとして用いるハイブリダイゼーション法により、生物体由来のゲノムDNA、全RNAから逆転写反応によって合成したcDNA等から所望の酵素をコードする核酸分子を調製することができる。ここで用いられるプローブは、所望の酵素と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドであり、常法に基づいて調製することができる。例えば、ホスホアミダイト法等に基づく化学合成法、既に標的となる核酸が取得されている場合にはその制限酵素断片等が利用可能である。このようなプローブとしては、所望の酵素をコードする核酸分子の塩基配列に基づき、この塩基配列の連続する10以上、好ましくは15以上、更に好ましくは約20~50の塩基からなるオリゴヌクレオチドが例示される。そして、プローブは必要に応じて適当な標識が付されていてよく、このような標識として放射線同位体、蛍光色素等が例示される。また、所望の酵素遺伝子の塩基配列を基にして作製したプライマーとして用いるPCRによっても同様に、生物体由来のゲノムDNA、cDNAを鋳型として所望の酵素をコードする核酸分子を調製することができる。PCRを利用する場合に用いられるプライマーは、所望の酵素をコードする核酸配列と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドであり、常法に基づいて調製することができる。例えば、ホスホアミダイト法等に基づく化学合成法、既に標的となる核酸が取得されている場合にはその制限酵素断片等が利用可能である。化学合成法に基づきプライマーを調製する場合には、合成に先立って標的核酸の配列情報に基づいてプライマーの設計を行う。プライマーの設計は、所望の領域を増幅するように、例えばプライマー設計支援ソフト等を利用して設計することができる。プライマーは合成後、HPLC等の手段により精製される。また、化学合成を行う場合には市販の自動合成装置を利用することも可能である。このようなプライマーとしては、所望の増幅領域を挟んで設計され、10以上、好ましくは15以上、更に好ましくは約20~50の塩基からなるオリゴヌクレオチドが例示される。ここで、相補的とは、プローブ又はプライマーと標的核酸分子とが塩基対合則に従って特異的に結合し安定な二重鎖構造を形成できることを意味する。ここで、完全な相補性のみならず、プローブ又はプライマーと標的核酸分子が互いに安定な二重鎖構造を形成し得るのに十分である限り、いくつかの核酸塩基のみが塩基対合則に沿って適合する部分的な相補性であっても許容される。その塩基数は、標的核酸分子を特異的に認識するために十分に長くなければならないが、長すぎると逆に非特異的反応を誘発するので好ましくない。したがって、適当な長さはGC含量等の標的核酸の配列情報、並びに、反応温度、反応液中の塩濃度等のハイブリダイゼーション反応条件など多くの因子に依存して決定される。更に、常法のホスホルアミダイト法等のDNA合成法を利用して、所望の酵素をコードする核酸分子を化学的に合成することができる。そして、得られた核酸分子用いて、当業者に公知の遺伝子組換え技術により所望の酵素を製造することができる。具体的には、所望の酵素をコードする核酸分子を適当な発現ベクター中に挿入し、これを宿主に導入することによって形質転換体を作製する。ここで、利用可能なベクターとしては、外来DNAを組み込め、かつ宿主細胞中で自律的に複製可能なものであれば特に制限はない。したがって、ベクターは、外来遺伝子を挿入できる少なくとも1つの制限酵素部位の配列を含むものである。例えば、プラスミドベクターpEX系、pUC系、及びpBR系等、ファージベクターλgt10、λgt11、及びλZAP等、コスミドベクター、ウイルスベクターワクシニアウイルス、及びバキュロウイルス等等が包含される。そして、ベクターは、外来遺伝子がその機能を発現できるように組み込まれ、機能発現に必要な他の既知の塩基配列が含まれていてもよい。例えば、プロモータ配列、リーダー配列、シグナル配列、並びにリボソーム結合配列等が挙げられる。プロモータ配列としては、例えば、宿主が大腸菌の場合にはlacプロモータ、trpプロモータ等が好適に例示される。しかしながら、これに限定するものではなく既知のプロモータ配列を利用できる。更に、宿主において表現型選択を付与することが可能なマーキング配列等をも含ませることができる。このようなマーキング配列としては、薬剤耐性、栄養要求性などの遺伝子をコードする配列等が例示される。具体的には、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子等が例示される。ベクターへの外来遺伝子の挿入は、例えば、適当な制限酵素で所望の酵素をコードする核酸分子を切断し、適当なベクターの制限酵素部位、又はマルチクローニング部位に挿入して連結する方法などを用いることができるが、これに限定されない。連結に際しては、DNAリガーゼを用いる方法等、既知の方法を利用できる。また、DNALigationKitタカラバイオ社等の市販のライゲーションキットを利用することもできる。形質転換体の作製に際して宿主となる細胞としては、外来遺伝子を効率的に発現できる宿主細胞であれば、特に制限はない。原核生物細胞を好適に利用でき、特には大腸菌を利用することができる。その他、枯草菌、バシラス属細菌、シュードモナス属細菌等をも利用できる。大腸菌としては、例えば、EcoliDH5α、EcoliBL21、EcoliJM109等を利用できる。更に、原核生物に限定されず真核生物細胞を利用することが可能である。例えば、サッカロマイセスセルビシエSaccharomycescerevisiae等の酵母、Sf9細胞等の昆虫細胞、CHO細胞、COS7細胞等の動物細胞等を利用することも可能である。形質転換法としては、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソームフェクション法、マイクロインジェクション法等を既知の方法を利用することができる。続いて、得られた形質転換体を、導入された核酸分子の発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培養し、所望の酵素を製造する。培養は、常法に準じて行うことができ、宿主細胞の栄養生理学的性質を勘案して、培養条件を選択すればよい。使用される培地としては、宿主細胞が資化し得る栄養素を含み、形質転換体におけるタンパク質の発現を効率的に行えるものであれば特に制限はない。したがって、宿主細胞の生育に必要な炭素源、窒素源その他必須の栄養素を含む培地であることが好ましく、天然培地、合成培地の別を問わない。例えば、炭素源として、グルコース、デキストラン、デンプン等が、また、窒素源としては、アンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、ペプトン、カゼイン等が挙げられる。他の栄養素としては、所望により、無機塩類、ビタミン類、抗生物質等とを含ませることができる。宿主細胞が大腸菌の場合には、LB培地、M9培地等が好適利用できる。また、培養形態についても特に制限はないが、大量培養の観点から液体培地が好適に利用できる。所望の組換えベクターを保持する宿主細胞の選別は、例えば、マーキング配列の発現の有無により行なうことができる。例えば、マーキング配列として薬剤耐性遺伝子を利用する場合には、薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤含有培地で培養することによって行うことができる。形質転換体の培養物から、所望の酵素を単離精製するには、通常のタンパク質の単離、精製法を用いることができる。精製は、上記形質転換体の培養物から、所望の酵素の存在する画分に応じて、一般的なタンパク質の単離精製方法に準じた手法を適用すればよい。具体的には、所望の酵素が宿主細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離、濾過等の手段により宿主細胞を除去して培養上清を得る。続いて、培養上清に、公知のタンパク質精製方法を適宜選択することにより、単離精製することができる。例えば、硫酸アンモニウム沈殿、透析、SDSPAGE電気泳動、ゲル濾過、疎水、陰イオン、陽イオン、アフィニティークロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー等の公知の単離精製技術を単独、又は適宜組み合わせて適用することができる。特にアフィニティークロマトグラフィーを利用する場合、所望の酵素をヒスチジンタグHistag等のタグペプチドとの融合タンパク質として発現させて、かかるタグペプチドに対する親和性を利用することが好ましい。また、所望の酵素が宿主細胞内で産生される場合には、培養物を遠心分離、濾過等の手段により宿主細胞を回収する。続いて、リゾチーム処理などの酵素的破砕方法、又は超音波処理、凍結融解、浸透圧ショック等の物理的破砕方法等により、宿主細胞を破砕する。破砕後、遠心分離、濾過等の手段により可溶化画分を収集する。得られた可溶化画分を、前述の細胞外に生産できる場合と同様に処理することにより単離精製することができる。また、アミノ酸配列が公知である酵素については、化学的合成技術によっても製造することができる。例えば、所望の酵素のアミノ酸配列の全部、又は一部を、ペプチド合成機を用いて合成し、得られるポリペプチドを適当な条件の下で、再構築することにより調製することもできる。本発明で使用する酵素はさらに、天然由来の酵素に人為的に変異を施した改変体であってもよい。また、蛍光物質、放射線同位体等の各種標識化合物による修飾、抗体やタグペプチド等の他のタンパク質と融合した形態のものであってもよい。ここで、改変体とは、天然由来の酵素の特定のアミノ酸に改変が生じている改変部位を有するアミノ酸配列を含むものを意味する。改変とは、改変の基礎となるタンパク質のアミノ酸配列のうち、1又は複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入および付加の少なくとも1つからなる改変が生じていることを意味する。そして、1又は複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び付加の少なくとも1つからなる改変とは、改変の基礎となるタンパク質をコードする遺伝子に対する公知のDNA組換え技術、点変異導入方法等によって、欠失、置換、挿入又は付加することができる程度の数のアミノ酸が、欠失、置換、挿入又は付加されることを意味し、これらの組み合わせをも含む。例えば、このような改変体は、配列番号2又は4で示すアミノ酸配列に対して、アミノ酸レベルで70以上、好ましくは80以上、更に好ましくは90以上の相同性を保持するものとすることができる。このような改変体は、公知の変異導入技術を利用することにより作製できる。例えば、部位特異的突然変異誘発法、PCR等を利用して点変異を導入するPCR突然誘発法、あるいは、トランスポゾン挿入突然変異誘発法などの公知の変異導入技術を利用することができる。市販の変異導入用キット例えば、QuikChange登録商標SitedirectedMutagenesisKitStratagene社製等を利用してもよい。また、常法のホスホルアミダイト法等のDNA合成法を利用して、所望の改変を施した酵素をコードする核酸分子を構築することによって行なうことができ、これを、上記した当業者に公知の遺伝子組換え技術により所望の酵素を製造することができる。酵素の結晶化に際しては、高純度に精製された酵素を使用することが好ましい。したがって、結晶化に先立って、必要に応じて酵素を精製する。酵素の精製には、通常のタンパク質の分離精製手法を使用することができ、例えば、液体クロマトグラフィゲルろ過法、イオン交換クロマトグラフィ、等電点クロマトグラフィ、疎水性クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、また、精製対象とするタンパク質が耐熱性を有する場合は熱処理法、等の公知の分離精製技術を単独、又は適宜組み合わせて適用することができる。更に、結晶化に際しては、酵素は濃縮された状態であることが好ましく、精製後に必要に応じて濃縮処理される。例えば減圧濃縮、限外濾過膜等による膜濃縮、更に硫酸アンモニム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理を例示することができるが、これに限定されるものではない。酵素の結晶化は、酵素を過飽和させた溶液中で、塩濃度、蒸発、温度、pHまたは沈殿剤濃度を変化させることにより、溶解度を徐々に下げることによって、溶液内に溶けていた酵素を析出させることによって行われる。一般には、酵素の結晶化は、酵素溶液に酵素溶解度を下げる沈殿剤を加えることによって行われ、沈殿剤として、例えば、塩化ナトリウム、硫酸アンモニウム、リン酸ナトリウム等の無機塩類、ポリエチレングリコール等の高分子、および2メチル24ペンタネジオール、エタノール、イソプロパノール等の有機化合物等、いずれを使用することができる。具体的な手法としては、公知のいずれの手法をも用いることができ、例えば、蒸気拡散法、透析法、バッチ法、界面拡散法、温度勾配法等を利用することができ、蒸気蒸散法としては、ハンギングドロップ法、シッティングドロップ法、サンドイッチドロップ法等を利用できる。なかでも、シッティングドロップ法、ハンギングドロップ法が汎用技術として当業者間で認識されている。両者は、沈殿剤を含む酵素溶液の液滴と、より高濃度の沈殿剤溶液を、一つの閉鎖空間内に直接接触しないように密閉し静置する方法である。これにより、沈殿剤濃度の低い酵素溶液の液滴から発した水蒸気は、蒸気平衡によって濃度の高い沈殿剤溶液に徐々に取り込まれ、それにより、酵素溶液の液滴中のタンパク質濃度と沈殿剤濃度が同時に上昇し、過飽和状態が形成され、結晶化に至るというものである。液滴の置き方によりシッティングドロップ法、ハンギングドロップ法に区別され、シッティングドロップ法とは、閉鎖空間内部に液滴台を設置し、その液滴台上に酵素溶液の小滴を静置して密閉する方法であり、ハンギングドロップは、酵素溶液の液滴を、閉鎖空間内の上部のガラス板からぶらさげて密閉する方法である。酵素の結晶化に最適な条件は、酵素の種類によって全く異なることから、固定化の対象となる酵素の種類に応じて、好適な条件を適宜選択し決定する。例えば、アシネトバクターカルコアセティカス株由来のPQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの場合には、OubrieARozeboomHJKalkKHOlsthoornAJDuineJADijkstraBW著、Structureandmechanismofsolublequinoproteinglucosedehydrogenase可溶性キノプロテイングルコースデヒドロゲナーゼの構造とメカニズム、EMBOJ、1999年、第18巻、第19号、第5187~5194頁、OubrieARozeboomHJKalkKHDuineJADijkstraBW著、The17AcrystalstructureoftheapoformofthesolublequinoproteinglucosedehydrogenasefromAcinetobactercalcoaceticusrevealsanovelinternalconservedsequencerepeatアシネトバクターカルコアセティカス由PersonName良の可溶性キノプロテインのアポ型の17A結晶構造が新規な内部保存配列反復を明らかにするJMolBiol、1999年、第289巻、第2号、第319~333頁を参照することができる。具体的には実施例3に記載の条件に準ずる条件を例示できる。また、バチルスサブティリス由来のCotAラッカーゼの場合には、EnguitaFJ他著、ActaCrystallogrDBiolCrystallogr、2002年、58、第1490~3頁を参照することができる。具体的には実施例15に記載の条件に準ずる条件を例示できる。しかしながら、好適な結晶化条件が確立されていない酵素の場合には、結晶化条件検索のためのスクリーニングを行う必要がある。結晶化の条件は、例えば、結晶化対象となる酵素の純度、濃度、酵素溶液のイオン強度、濃度、温度、沈殿剤の種類等の最適化を行う必要がある。検討を行った条件が、当該酵素の結晶化において好適であるか否かの判断は、結晶の成否、生成した結晶の大きさ、X線結晶構造解析データ等を検討することにより行うことができる。本発明の酵素結晶固定化電極に適した酵素結晶の大きさは、可能な限り大きい方が好ましいが、通常は01~1mm、特に好ましくは05~1mm程度である。また、結晶化条件のスクリーニングには、ハンプトンリサーチ社のCrystalScreenキット、CrystalScreenIIキット等の市販のスクリーニングキットを使用することもできる。本発明において、酵素結晶は、水等の溶媒を40~70程度含んだ酵素結晶として調製されることが好ましく、単結晶、多結晶の別は問わない。また、補酵素を要求する酵素の場合には、アポ型のみならずホロ型酵素の形態で結晶化させることも可能である。本発明の酵素結晶固定化電極で使用できる導電性基材としては、グラファイト、グラッシーカーボン等のカーボン材、アルミニウム、銅、金、白金、銀、ニッケル、パラジウム等の金属又は合金、SnO2、In2O3、WO3、TiO2等の導電性酸化物等、従来公知の材質の導電性基材を使用することができる。また、これを単層又は2種以上の積層構造をもって構成してもよい。また、導電性向上のため、市販のケッチェンブラック等のカーボンブラック、活性炭粉末等の導電性カーボン微粒子を基材に塗布してもよい。導電性基材の大きさ及び形状等は特に限定されるものではなく、使用目的に応じて適宜調整することができる。特に本発明の酵素結晶固定化電極は、マイクロメートルオーダーに電極面積を小さくした微小電極として構成することができる。電極を微細化することによって、高速な応答特性や感度の向上などこれまでの測定限界を凌駕することから、微小電極を用いる電気化学測定が注目を集めている。微小電極では、拡散のプロフィールが、従来の平板電極における面拡散とは異なり、半円柱状拡散や半球状となるため、単位面積当たりに拡散してくる酸化還元種の量が増加する。このため、従来の拡散律速の状態では物質移動が電極反応に追いつかず、拡散層が時間と共に沖合いに成長していくため、応答は定常状態とならなかった。これに対し、微小電極を用いると十分に物質が供給できるようになり、その形状によっては、定常な応答を示すようになる。本発明の酵素結晶固定化電極は、微小な領域に、超高濃度の酵素を固定化することができる唯一の技術となり得る。導電性基材上への酵素の固定化は、公知の方法によって行うことができる。例えば、導電性基材上に酵素結晶を塗布した後、これをポリマーで被覆して固定化することが例示される。また、アルギン酸,カラギーナン等の多糖類、導電性ポリマー、酸化還元ポリマー、光架橋性ポリマー等の網目構造をもつポリマー、透析膜等の半透性膜内に封入して固定化する包括法等をも利用することができる。物理的吸着、イオン結合,共有結合を介して固定化する担体結合法を利用することもできる。好ましくは、親水性のポリマーで被覆することが好ましい。また、これらを組み合わせて用いてもよく、各々の酵素結晶に最適化な酵素固定化法を適宜選択することが望ましい。導電性基材上で酵素を結晶化させることにより固定化することもできる。例えば、上記で説明したシッティングドロップ法において、閉鎖空間内部に形成される液滴台を導電性基材とし、その導電性基材上に酵素溶液の小滴を静置して密閉することにより、導電性基材表面上で酵素の結晶化と同時に酵素の固定化を行うことができる。これにより、結晶状態を崩すことがない様態で、酵素結晶を電極に固定化できると共に、更に、酵素の配向性の統一を図ることができる。そして、補酵素を要求する酵素の場合には、アポ型のみならずホロ型酵素の形態で結晶化と同時に固定化させることも可能である。酵素として、ピロロキノリンキノンPQQ、ナイアシンNAD、NADP等の補酵素又は補因子を必要とする酵素、例えば、グルコースデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ等を用いる場合には、補酵素を含むホロ酵素の状態で固定化することが好ましい。しかしながら、アポ酵素の形態で固定化し、補酵素を別の層として、又は、適当な緩衝液に溶解させた形態で供給してよい。また、その他の、酵素の触媒活性の発現のために必要な物質を、別の層として、又は、適当な緩衝液に溶解させた形態で供給してよい。以上のように構成することにより、本発明の酵素結晶固定化電極は、電極触媒である酵素を導電性基材表面に、均一、高密度、かつ一定の配向性を揃えて固定化されている。そのため、酵素結晶固定化電極は、電子伝達を円滑に進めることができ、優れた電極性能を発揮することができる。従来の酵素を溶媒に分散させた溶液状態での固定化では、酵素濃度が高くなると、分散性が悪くなり、酵素は導電性基材表面上に凝集した状態で固定化されてしまい、電極の電子伝達の円滑な進行を妨げ電極性能の低下をもたらすという問題点があった。しかし、均一、高密度、かつ一定の配向性を揃えた状態で酵素が固定された酵素結晶固定化電極は、かかる問題点を解消するものである。また、本発明の酵素結晶固定化電極は、触媒機能を保持した、機能性分子の形態で酵素を高密度に固定化できる初めての技術である。酵素分子同士を多官能性の試薬により架橋すると、架橋化の度合いが大きいほど酵素分子間の結合が強化され安定性は増大するが、同時に酵素活性が低下することが知られている特開2007236317。つまり、本発明は、触媒活性の低下の要因となる架橋剤等を使用することなく、酵素結晶を機能性分子のまま固定化することができ、これにより優れた電極性能を発揮することができる。特に、結晶を電極上で成長させることで、結晶状態を崩すことがない様態で、酵素結晶を電極に固定化できる。したがって、本願発明の酵素結晶固定化電極は、電極触媒として高い触媒活性を維持できることから、バイオ電池、バイオセンサー等に好適に利用することができる。本発明のバイオ電池本発明の酵素結晶固定化電極は、バイオ電池に利用することができる。本発明の酵素結晶固定化電極は、電極の電子伝達が円滑に進行することができる電極性能に優れたものである。これを利用することのより、高容量及び高出力の発電が可能となり、発電効率が非常に高く、かつ優れた耐久性をもつ高性能なバイオ電池を構築することができる。つまり、酵素をはじめとするタンパク質は、溶液状態よりも結晶化状態にあるときに安定であることから、酵素結晶を固定化電極を利用したバイオ電池は優れた耐久性を有する。本発明のバイオ電池は、例えば、酸化反応を行うアノード極負極と、還元反応を行うカソード極正極から構成され、必要に応じてアノードとカソードを隔離する電解質層であるイオン伝導性物質を含んで構成される。したがって、本発明においては、アノード側電極は、酸化反応を触媒する酵素の結晶が固定化された電極として構成されることが好ましい。酸化反応を触媒する酵素としては、好ましくは、糖、アルコール、有機酸、アミン、水素、無機化合物等のバイオ電池の燃料とすることができる物質を酸化することができるものであり、特に好ましくは、触媒活性が非常に高いPQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼである。カソード側電極には、酸素や過酸化水素等の酸化剤を還元して電子を伝達することのできる触媒を固定化して構成される。カソード側電極として酵素結晶固定化電極を利用する場合には、例えば、ピルビン酸オキシダーゼ、ラッカーゼ等のマルチ銅酵素が好ましく例示される。特に好ましくはバチルスサブティリス由来のCotAラッカーゼである。また、電解質層としては、電子伝達能を有さず、イオン伝導性を有するものであれば、何れの物質をも利用することができる。また、必要に応じて、酵素反応と電極間の電子伝達を媒介する電子メディエーターを用いる。メディエーターは、固定化される酵素結晶の種類に応じて最適な物質を選択すればよく、特に限定されるものではない。例えば、キノン類、シトクロム類、ビオロゲン類、フェナジン類、フェノキサジン類、フェノチアジン類、フェリシアン化物、フェレドキシン類、フェロセンおよびその誘導体等が例示される。酵素として、ピロロキノリンキノンPQQ、ナイアシンNAD、NADP等の補酵素又は補因子を必要とする酵素を用いる場合には、補酵素を含むホロ酵素の状態で電極に固定化することが好ましい。しかしながら、アポ酵素の形態で固定化し、補酵素を別の層として、又は、適当な緩衝液に溶解させた形態で供給してよい。また、その他の、酵素の触媒活性の発現のために必要な物質を、別の層として、又は、適当な緩衝液に溶解させた形態で供給してよい。本発明のバイオ電池は、アノード及びカソード側電極の少なくとも一方を酵素結晶固定化電極として構成する。バイオ電池は、アノード極プラス極とカソード極マイナス極から構成されるが、マイナス極では燃料から電極に電子移動が生じ、その電子をプラス極で受け取ることにより、はじめて電流が流れる仕組みである。そのため、片方の極として酵素結晶固定化電極を使用しない場合には、その極での触媒電流値がリミットになり、両極を酵素結晶固定化電極とした場合と比較して、酵素結晶固定化電極としたバイオ電池の性能向上効果が低くなる。したがって、バイオ電池の性能の観点からは、双方の極を酵素結晶固定化電極として構成することが好ましい。このように構成することにより、アノード電極側の酵素結晶が燃料である基質を酸化して電子を受け取る。燃料としては、メタノール、エタノール、プロパノール、グリセロール等のアルコール類、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド等のアルデヒド類、グルコース、フルクトース等の糖類やケトン類、アミン類、脂肪類、タンパク質、及びそれらの代謝中間生成物等を利用することができ、電極に固定化される酵素結晶の基質に応じて選択される。そして、この電子は、直接、又は酵素反応と電極間の電子伝達を仲介するためのメディエーターを通してアノード電極に受け渡たされる。そして、アノード電極から外部回路を通ってカソード電極に電子が受け渡されることによって電流が発生する。一方、アノード電極側で発生したイオンが電解質層を通ってカソード電極側に移動し、外部回路を通してアノード側から移動してきた電子と反応し水を生成する。グルコースデヒドロゲナーゼの酵素結晶を固定化し電極として利用する場合には、以下に示す電流応答が生じ、電流を発生することができる。グルコースグルコースデヒドロゲナーゼ酸化型→グルコノラクトングルコースデヒドロゲナーゼ還元型H→グルコースデヒドロゲナーゼHeまた、ラッカーゼの酵素結晶を固定化し電極として利用する場合には、例えば、以下に示す電流応答が生じ、電流を発生することができる。この反応は、メディエーターとしてABTSを用いたものである。4ABTSO24H→4ATBS2H2OATBSe→ATBS本発明のバイオセンサー本発明の酵素結晶固定化電極は、バイオセンサーに利用することができる。本発明の酵素結晶固定化電極は、電極の電子伝達が円滑に進行することができる電極性能に優れたものであり、これを利用することにより、高精度、かつ耐久性に優れたバイオセンサーを構築することができる。本発明の酵素結晶固定化電極は、例えば、バイオセンサーの電極、好ましくは作用極として利用することができる。本発明のバイオセンサーは、酵素結晶固定化電極を作用電極、及びその対極を設けて二電極方式で構成してもよいし、測定精度の信頼性を高める観点から、銀塩化銀などの参照極を設けた三電極方式として構成してもよい。バイオセンサーによる測定は、測定試料をバイオセンサーと接触させ、電極上の固定化酵素結晶と基質の酸化還元反応により発生した電流を検知することで行われ、これにより、試料中の基質の存在の有無若しくは濃度を測定することができる。本発明のバイオセンサーを用いた測定法としては、酸化電流もしくは還元電流を測定するクロノアンペロメトリーまたはクーロメトリー、サイクリックボルタンメトリーACCESSIONNo15871のアミノ酸配列と同じアミノ酸となるよう配列の書き換えを行った。書き換えた配列をpET22bベクターのNdeIBamHIの制限酵素サイトに組み込み、発現プラスミドとした。このプラスミドをpET22bsGdhと命名した。また、その塩基配列を配列表の配列番号3に、また該塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列表の配列番号4に示す。ステップ2:大腸菌による組換え型タンパクの発現pET22bsGdhを用いて大腸菌BL21株を形質転換し、得られたコロニーをアンピシリン50μgmlを含むLB培地LuriaBertani培地以下LBAmp培地と略する。300mlに接種し、37°Cで一晩培養した。続いて、ジャーファーメンターにLBAmp培地を20L入れ、上記で調製した大腸菌の培養液200mlを加えて、37°Cで培養液の吸光度がOD60001となるまで約1時間培養した。そして、組換えタンパク質合成誘導のため終濃度001mMのイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシドisopropylβDthiogalactopyranoside:IPTGを添加して、28°Cで一晩振盪培養した。培養液を遠心分離に供し、上清を除去した後、沈殿菌体を-80°Cで以下の実験に使用するまで凍結保存した。これを以下のタンパク質精製に供した。精製は、アフィニティークロマト法ステップ3と、タンパク質の電荷特性に従うイオン交換クロマトグラフィー法ステップ3~4の2種の酵素精製法を組み合わせて行った。ステップ3:アフィニティークロマトグラフィーによるHistagタンパク質精製上記ステップ2で発現させたタンパク質はHistag融合タンパク質であり、Histagを介してタンパク質を精製した。凍結保存していたタンパク質発現菌体を、25mMリン酸カリウム緩衝液に懸濁し、界面活性剤04Brij58を加え、氷中で30分間静置した。次に、超音波破砕処理を行い、菌体懸濁液の粘性がなくなることを確認した後、遠心分離4°C、40000×g、30分間に供し、上清を分取した。次に、Histag融合タンパク質精製用の金属アフィニティー担体TALONをオープンカラムに適当量充填し、20mMリン酸ナトリウム、5mMイミダゾール、05MNaCl溶液で前洗浄し、カラムを平衡化した。次に、遠心分離後の上清に05MNaClを加え、これをカラムにアプライした。続いて、20mMリン酸ナトリウム、5mMイミダゾール、05MNaCl溶液で洗浄した後、20mMリン酸ナトリウム、500mMイミダゾール、05MNaCl溶液でタンパク質を溶出した。溶出後、溶出に用いた塩類イミダゾールやNaCl等を除去するため、25mMTrisHCl緩衝液を外液として、透析を一晩行った。ステップ4:イオン交換クロマトグラフィーによるタンパク質精製上記ステップ3で取得したタンパク質溶液を、更に、タンパク質の電荷特性に従うイオン交換クロマトグラフィーを用いて精製した。クロマトグラフィー担体仕様担体:RESOURCESGEHealthcare製カラムサイズ:046×10cmベッド体積:17ml荷電基:負電化OCH2CHOHCH2OCH2CHOHCH2SO3-結合容量:25mgカラム推奨流速:6ml分RESOURCESによる精製は、25mMリン酸カリウムpH74、1mMEDTAをベース緩衝液として、担体を洗浄し平衡化した。続いて、ステップ3で取得した酵素溶液をカラムにアプライし、タンパク質を担体に吸着させた後、上記ベース緩衝液で担体を洗浄し不純物を除去した。続いて、ベース緩衝液を開始用緩衝液とし、0~500mMKClの塩濃度勾配によりタンパク質を溶出した。具体的には、以下の条件で溶出した。溶出緩衝液組成緩衝液A:25mMリン酸カリウムK1H2PO4、1mMEDTA緩衝液B:25mMリン酸カリウムK1H2PO4、1mMEDTA、1MKClそして、各溶出フラグメントについて、酵素濃度の尺度である280nmでの吸光度を分光光度計で測定するとともに、溶出フラクションをSDSポリアクリルアミドSDSPAGE電気泳動に供し、タンパク質の溶出挙動について解析した。結果を図1に示す。図1Aは、各溶出フラクションにおける280nmでの吸光度をプロットした図であり、図1Bは、各溶出フラクションの電気泳動結果を示す。なお、図1中のセグメントはKCl濃度100~105mMで溶出される酵素溶液、セグメントはKCl濃度105~110mMで溶出される酵素溶液、セグメントはKCl濃度115~130mMで溶出される酵素溶液、セグメントはKCl濃度130~150mMで溶出される酵素溶液のフラクションを夫々集めたものである。その結果、溶出初期KCl濃度100mM前後にタンパク質の溶出を示すシグナルが検出され、溶出後半で夾雑物のブロードなシグナルが検出された。タンパク質のシグナルは主に2つのピークに分かれており、これは、酵素の立体構造に係る何らかの要因に起因するものであると推察できる。続いて、ここで精製されたタンパク質は、タンパク質の溶出に用いたKClを除去するため、25mMTrisHCl緩衝液、1mMEDTAを外液として、透析を一晩行った。実施例2:精製酵素の純度検定本実施例では、実施例1で取得した精製酵素が、結晶化に求められる高純度の酵素であることを確認した。具体的には、実施例1にて、アフィニティークロマトグラフィーで精製したタンパク質溶液中に存する酵素、及び、アフィニティークロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーを組み合わせて精製したタンパク質溶液中に存する酵素を定量することによって行った。なお、アフィニティークロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーを組み合わせて精製したサンプルとしては、図1B中のセグメントcの領域に相当するフラクションを使用した。まず定量に先立って溶出タンパク質の確認を行った。上記精製後のタンパク質溶液をSDSPAGE電気泳動後、タンパク質染色剤FlamingoFluorescentGelStainバイオラド社製で染色し、フルオロイメージングアナライザーFLA-3000富士フィルム社製によりバンドの可視化を行った。結果を図2に示す。図中、レーン1は、アフィニティークロマトグラフィーのみで精製した酵素で、レーン2はアフィニティークロマトグラフィーとイオン交換クロマトクロマトグラフィーを組み合わせて精製した酵素の結果を示す。この結果から、アフィニティークロマトグラフィーとイオン交換クロマトクロマトグラフィーを組み合わせて精製することにより、夾雑物がほぼ除去されることが確認できた。続いて、純度を定量するために、各レーンの全シグナルの領域と、酵素シグナル領域のみの濃度測定を行った。具体的には、FLA-3000により可視化されたゲル上のタンパク質のバンドのシグナル強度を、全シグナルサンプルの泳動開始の位置から、泳動の先端部までの短冊形と、酵素シグナル酵素のシグナル部分だけを付属の専用ソフトを使って数値化した。結果を表1に示す。この結果から、アフィニティークロマトグラフィーとイオン交換クロマトクロマトグラフィーを組み合わせて精製することで、夾雑物がほぼ除去された高純度の酵素溶液を得られることが確認できた。なお、図1Bのセグメントの酵素の比活性を4200unitmgであるとした。実施例3:酵素の結晶化条件のスクリーニング、及び酵素の結晶化本実施例においては、実施例1で精製した酵素を結晶化するための検討を行った。結晶化の対象として、実施例1で取得した酵素の図1Bのセグメントcの領域に相当するフラクションを使用し、結晶化は蒸気拡散法によって行った。図1Bのセグメントを選択した理由は、図1Bのセグメントbcの領域に相当するフラクションにつき、酵素の沈殿剤溶液の緩衝液組成50mMTrisHCl、120mMNaCl、3mMCaCl2中での安定性を比較したところ、数日間以上の保存安定性がセグメントbの方が僅かに低いことが判明した。そのため、酵素の質と量でもっとも好ましいセグメントを結晶化対象として選択した。まず、結晶が析出する条件を突き止めるために、本実施例の対象としたアシネトバクターカルコアセティカスの可溶性のPQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの立体構造解析のための酵素結晶の製造方法について開示された文献OubrieARozeboomHJKalkKHOlsthoornAJDuineJADijkstraBW著、Structureandmechanismofsolublequinoproteinglucosedehydrogenase可溶性キノプロテイングルコースデヒドロゲナーゼの構造とメカニズム、EMBOJ、1999年、第18巻、第19号、第5187~5194頁、OubrieARozeboomHJKalkKHDuineJADijkstraBW著、The17AcrystalstructureoftheapoformofthesolublequinoproteinglucosedehydrogenasefromAcinetobactercalcoaceticusrevealsanovelinternalconservedsequencerepeatアシネトバクターカルコアセティカス由来の可溶性キノプロテインのアポ型の17A結晶構造が新規な内部保存配列反復を明らかにするJMolBiol、1999年、第289巻、第2号、第319~333頁に記載の結晶化条件を参考に、結晶化条件のスクリーニングを行った。具体的には、4μlの反応スケールで、酵素溶液と沈殿剤溶液を混合した。このとき、酵素濃度を75、10、125、15μgμlとし、沈殿剤成分として19、20、21、22、23、24のポリエチレングリコールを用いた。なお、沈殿剤溶液は、上記沈殿剤成分であるポリエチレングリコールを50mMTrisHCl、120mMNaCl、3mMCaCl2緩衝液組成中に混和することにより調製した。次に、上記酵素溶液と沈殿剤溶液の混合液の液滴を、シリコンコートしたカバーグラス上に調製し、続いて、カバーグラス片を裏返して液滴のくぼみにかぶせて蒸気拡散法により結晶化を行った。30°Cのインキュベーター中で7日間静置した後、結晶析出の有無を顕微鏡観察倍率400倍した。その結果、透明感のある膜状の固形物や、同じく透明感のある微結晶約002mmが観察され、膜状の固形物は、酵素が集合しフィルム状になったものと推察された。また、酵素濃度が低い条件酵素濃度75μgμl、ポリエチレングリコール21では、1個の酵素結晶約01mmが確認できたが、三次的な結晶成長は確認できなかった。したがって、本実験の反応条件では酵素濃度が高すぎるために、3次元的な結晶成長ができず、膜状になったり、微結晶で成長が停止したりしていると考えられた。上記の実験の結果をうけ、酵素濃度を05、1、2、3μgμlに下げ、ポリエチレングリコール濃度20、21、22として、再スクリーニングを行った。上記と同様に30°Cのインキュベーター中で7日間静置した後で、結晶析出の有無を顕微鏡観察倍率400倍した。その結果、多数の酵素結晶約10mmが確認できた。詳細には、酵素濃度:01~05μgμlでは約01mm大の結晶が、酵素濃度1~2μgμlでは約05mm大の結晶が、酵素濃度3~4μgμlでは約1~5mm大の結晶が形成できることが確認できた。この観察結果から、高めの酵素濃度3~4μgμlでは、図3Aに示すような大きな結晶の集合体ができること、低い酵素濃度1~2μgμlでは、図3Bに示すようなPersonName良質でX線解析など構造解析に適した単結晶ができることが判明した。以上の結果を鑑み、本発明の利用に最適な05mm程度の酵素結晶が形成できる条件として、結晶化条件を表2のように決定した。次に、反応をスケールアップさせるために、蒸気拡散法の一つであるシッティングドロップ法での結晶化反応を行った。これにより、反応スケールを4μlから5倍の20μlにスケールアップすることができた。ここで実施したシッティングドロップ法の模式図を図4Aに示し、実際に結晶化反応を実施している様子を示す写真を図4Bに示す。説明を加えると、密閉容器内において、沈殿剤溶液の液層に酵素溶液を座らせるための専用容器である椅子を置き、その上で結晶成長させる仕組みになっている。なお、反応スケールをスケールアップしたため、結晶化のための反応時間を、30°Cのインキュベーターで20日間と延長した。そして、上記と同様に、結晶析出の有無を顕微鏡観察倍率400倍に行った。結果を図4Cに示す。この結果、本条件下で、約05~10mmの大きさの単結晶の形成が確認された。これにより、本発明の酵素結晶固定化電極の構築のための利用に適当した酵素結晶の取得ができることが判明した。実施例4:酵素結晶中のタンパク質濃度の比較本実施例では、実施例3においてシッティングドロップ法により得られた酵素結晶中に含まれるタンパク質濃度を、溶液状態として存在することができる酵素の量と比較した。実施例3にて得られた酵素結晶1個を、結晶化反応液から分離した。結晶の分離は、結晶化反応液から専用の紙縒りハンプトンリサーチ社を用いて液体部分を吸い取った後、顕微鏡下で専用の結晶ピッカーハンプトンリサーチ社を使って拾い上げることで分離した。この酵素結晶1個の顕微鏡観察像を図5Aに示す。結晶化反応液から分離した酵素結晶を、20μlの50mMTrisHCl緩衝液pH74に溶解させ、酵素結晶溶液とした。そして、酵素結晶溶液に含まれる酵素量を測定し、酵素結晶中に含まる酵素量を算出した。酵素量は、タンパク質濃度の尺度である280nmでの吸光度を分光光度計で測定し、モル吸光係数ε=67420と、分子量MW53665として算出した。計算上、酵素結晶には、4000mgcm3濃度で酵素が含まれることが判明した。また、顕微鏡の視野にある定規から、結晶の縦横高さを計測し大まかに体積を見積もった。そして、この結晶の体積に相当する酵素の溶液に含まれると酵素量と、酵素結晶中の酵素量を比較した。なお、酵素溶液中に含まれる酵素量は、濃度40mgmlとして比較した。40mgmlという値は、ここで用いたアシネトバクターカルコアセティカス由来のPQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼが、溶液状態の場合に濃度が50mgmlを超えると沈殿が生じたことから、溶液状態として存在することができる最高濃度は40mgmlであるとして導かれた数字である。この結果、酵素結晶とすることで、溶液状態の場合と比べて約100倍高い濃度の酵素を含め得ることが判明した。続いて、酵素結晶中に含まれる酵素量と、溶液状態の酵素溶液に含まれる酵素量を電気泳動により比較した。具体的には、上記で調製した酵素結晶溶液の一部を125アクリルアミドゲル電気泳動に供し、CBB染色によりタンパク質のバンドを可視化した。比較対照として、結晶の体積に相当する酵素の溶液についても同様に電気泳動に供した。このとき、酵素の溶液の濃度は、上記した通り40mgmlである。結果を図5Bに示す。図中、レーン1は上記で調製した酵素結晶の溶解液の原液、レーン2はレーン1での原液の12量、レーン3はレーン1での原液の14量の泳動結果を示す。レーン4は、比較対照の濃度40mgmlの酵素溶液、レーン5はレーン4での酵素溶液の12量、レーン6はレーン4での酵素溶液の14量の泳動結果を示す。この結果からも、上記した計算上の比較と同様、酵素溶液に比べ、酵素結晶が遥かに高い濃度の酵素を含んでいることが判明した。実施例5:酵素結晶固定化電極の作製本実施例では、バイオ電池の電極触媒としての利用を想定し、酵素結晶固定化電極を作製するため、酵素結晶の導電性基材への固定化方法を検討した。酵素結晶の導電性基材への固定化は、光架橋性ポリマーを用いる方法を選択した。具体的には、酵素固定化キット東洋合成工業製を用いて、そのキットに付属の標準プロトコル可溶性のPQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ固定化電極作製手順が開示されているに従い実施した。この酵素固定化キットは、電気化学検出のバイオセンサーの初期検討に最適な実験キットである。また、固定化材としては、上記キット付属の酵素固定化用ポリマーBIOSURFINEを使用し、酵素結晶を導電性基材に固定化し酵素結晶固定化電極を調製した。具体的な手順の詳細を以下に示す。まず、酵素結晶を、酵素活性の発現に必要な補酵素PQQを結合させるためホロ化処理をした。本実施例で取得された酵素結晶はアポ型であり、活性型酵素に変換するためにはPQQを取り込ませるホロ化処理を行う必要があるため、実施例3で得られた酵素結晶が形成されている溶液に、PQQ溶液を終濃度01mMとなるように添加し、室温で30分間静置することによりホロ型酵素に変換した。なお、酵素溶液にPQQを加えてホロ化処理した後に、PQQが結合したホロ型酵素の形態で結晶化させることも可能である。そして、ホロ化処理後、結晶化反応液から専用の紙縒りを用いて液体部分を10μl程度残して吸い取り結晶を濃縮した。濃縮した結晶液をすべて導電性基材表面平板状で電極面積25mm2に滴下し、さらに紙縒りろ紙を用いて完全に液体部分を吸い取った。酵素を固定化する導電性基材としては、カーボン電極三極型印刷電極を使用した。次に、2に希釈したポリマー溶液5μlを導電性基材に滴下し乾燥させた後、UV露光を5分間行い、酵素結晶を固定化した。結晶化に際して使用したポリエチレングリコールが酵素結晶中に含まれるが、これは、酵素固定化用ポリマーBIOSURFINEとは混和及び反応しない物性をもっているため、固定化の支障にはならない。なお、ここで、使用した酵素固定化ポリマーとカーボン電極は、酵素活性測定等の電気化学測定やバイオセンサーなど、研究開発向けのディスポーサブル印刷電極DEPChip:北陸先端科学技術大学院大学発のベンチャー企業製でグラッシーカーボンと同等の電極性能である。実施例6:導電性基材固定化した酵素結晶の触媒機能評価-1本実施例では、実施例5の手順で、予め結晶化された酵素結晶を導電性基材の表面に固定化して作製された酵素結晶固定化電極の触媒機能評価を行った。実施例5の手順に従って酵素結晶を導電性基材に固定化した電極を作製した。ここで、図6Aに、本実施例において実際の固定化に使用した酵素結晶の顕微鏡像を示す。これは、実施例3にて形成された酵素結晶である。これにより、結晶は、3次元方向だけでなく、微結晶や2次元方向に成長してフィルム状のものも多く含まれることが理解できる。次に、これを用いて、酵素の基質であるグルコースの酸化反応に伴う電流応答を、外部電源ポテンショスタットを用いて3電極の電気化学測定系で測定した。具体的には、作用電極として実施例5の手順に従って作製された酵素結晶固定化電極、対極としてカーボン電極、および参照電極として銀塩化銀電極を用い、この3電極を反応混合液25mMリン酸緩衝液pH74、0又は100mMグルコース、および1mMmPMS1methoxy5methylphenaziniummethylsulfateに浸して、一定の電圧01Vvs銀/塩化銀電極の定電位測定mPMSの酸化還元電位における電流測定を行った。電子メディエーターとしてmPMSを使用したため、mPMSの標準酸化還元電位0063Vから定電位電解電位は01Vとした。このようにして構築した酵素結晶固定化電極を用いて、グルコース濃度0mMと100mM条件下での電流応答をクロノアンペロメトリー法電圧固定で電流の時間変化を測定、以下CAと略する場合がある。で測定した。結果を図6Bに示す。波形1は、グルコース濃度100mM条件下での結果を示し、波形2は、グルコース濃度0mM条件下、即ちグルコースを含まない反応混合液での結果を示す。この結果から、グルコース濃度100mM条件下では、15μA30秒後の電流値波形1が得られた。一方、グルコースを含まない場合には、電流値は限りなく0であった。このように、電流値がグルコースに依存して得られたことから、ここで作製した酵素結晶固定化電極が酵素触媒機能電極として機能することが確認された。ポテンショスタットのCA測定条件InitE0開回路電位、HighE01、LowE0InitPNN、Step1、PulseWidthsec30、SampleInterval001、QuietTime5実施例7:導電性基材に固定化した酵素結晶の触媒機能評価-2本実施例では、導電性基材表面上で、酵素の結晶化反応を行うことで作製された酵素結晶固定化電極の触媒機能評価を行った。導電性基材上で酵素の結晶化反応を行うことにより酵素結晶固定化電極を作製した。これを、実施例6において作製された、予め作製した酵素結晶を導電性基材上に固定化した酵素結晶固定化電極と比較して、導電性基材上で酵素の結晶化反応を行うことによって、電極機能が優れた電極を作製できる可能性を検証した。実施例3で実施したシッティングドロップ法による酵素結晶化反応で、酵素溶液を座らせるための椅子の代わりに、導電性基材を置き、その表面で酵素結晶化反応を行った。図7Aに、電極とする導電性基材上で酵素の結晶化反応を行っている様子を示す。ここで使用した導電性基材は、カーボン電極をフィルム上に印刷してあり、小さく加工することが可能である。そのため、実施例3に記述したシッティングドロップ法での結晶化条件をそのまま使うことができる利点がある図7Bに、導電性基材表面で作製した酵素結晶の顕微鏡像を示す。結晶は、3次元方向だけでなく、微結晶や2次元方向に成長してフィルム状のものも多く含まれる。導電性基材上での酵素結晶の固定化方法は、実施例5の方法において、導電性基材表面に結晶を滴下した工程以降は同じ手順により行った。ここで構築した酵素結晶固定化電極を用いて、グルコース濃度0mMと100mM条件下で電流応答を、クロノアンペロメトリー法電圧固定で電流の時間変化を測定で測定した。結果を図8に示す。図中、波形1は、グルコース濃度100mM条件下での結果を示し、波形2は、グルコース濃度0mM条件下、即ちグルコースを含まない反応混合液での結果を示す。この結果から、グルコース濃度100mM条件下では、15μA30秒後の電流値波形1が得られた。一方、グルコースを含まない場合には、電流値は限りなく0であった。このように、電流値がグルコースに依存して得られたことから、ここで作製した酵素結晶固定化電極が酵素触媒機能電極として機能することが確認された。ポテンショスタットのCA測定条件InitE0開回路電位、HighE01、LowE0InitPNN、Step1、PulseWidth30、SampleInterval001、QuietTime5実施例8:導電性基材に固定化した酵素結晶の触媒機能評価-3本実施例では、実施例6における導電性表面上に予め作製した酵素結晶を固定化することにより作製した酵素結晶固定化電極と、本実施例7における導電性基材表面上で酵素の結晶化反応を行うことで作製された酵素結晶固定化電極を、その電極機能について比較した。実施例6における導電性表面上に予め作製した酵素結晶を固定化することにより作製した酵素結晶固定化電極と、本実施例7における導電性基材表面上で酵素の結晶化反応を行うことで作製された酵素結晶固定化電極につき、その電極機能を比較するため、実施例6と実施例7で得られたクロノアンペロメトリー法による測定結果を、電流密度に換算して比較した。結果を図9に示す。図中、波形1は、本実施例7における導電性基材表面上で酵素の結晶化反応を行うことで作製された酵素結晶固定化電極での結果を示し、波形2は、実施例6における導電性表面上に予め作製した酵素結晶を固定化することにより作製した酵素結晶固定化電極の結果を示す。どちらの酵素結晶固定化電極でも、グルコースの酸化反応による電流応答として、電流密度06mAcm2波形1及び2を超える電流値が得られた。したがって、両者の酵素結晶固定化電極が共に、酵素触媒機能電極として十分に機能できることが判明した。特に、電極表面で結晶化反応を行い、酵素結晶を固定化した酵素結晶固定化電極では、測定開始5秒以内では、電流密度10mAcm2を超える優れた電流値が得られ、初期出力の著しい向上が確認できた。実施例9:酵素結晶化効率の見積もり本実施例では、酵素の結晶化に際して、導電性基材上と専用容器での酵素の結晶化効率の比較を行った。本実施例は、本発明の有用性を確認することを目的とし、実施例7のように酵素結晶固定化電極の作製に際して導電性基材表面上で酵素の結晶化反応を行った場合の結晶化効率と、実施例6において酵素結晶固定化電極に固定化された酵素結晶のように実施例3の方法により予め専用容器内で結晶化反応を行った場合の結晶化効率を調べた。具体的には、酵素量を50μgとして、シッティングドロップ法にて、専用容器及び導電性基材上で、各々実施例3及び7に従って、酵素の結晶化反応を行った。続いて、生成した結晶を20μlの水に溶解させ、酵素量を測定した。酵素量は、タンパク質濃度の尺度である280nmでの吸光度を分光光度計で測定し、モル吸光係数ε=67420と、分子量MW53665として算出した。結果を下記表3に示す。タンパク質濃度の測定結果この結果より、酵素の結晶化量は、電極上での結晶成長、及び専用容器内での結晶成長共に約20μgであり、約50の効率で結晶化されていることが判明した。これにより、双方の技術とも実用的価値のあることが確認できた。なお、導電性基材上での結晶成長のNo6は沈殿剤を加えず結晶化反応を行ったコントロールである。続いて、電極上での結晶成長、及び専用容器内での結晶成長により形成された酵素結晶を電気泳動により確認した。具体的には、上記で調製した酵素結晶溶液の一部を125アクリルアミドゲル電気泳動に供し、CBB染色によりタンパク質のバンドを可視化した。結果を図10A、Bに示す。図10Aは、導電性基材上で結晶成長を行った場合、図10Bは、専用容器内で結晶成長を行った場合の結果を示す。図10Aは、1中、レーン1は導電性基材上で結晶成長したサンプル番号1の酵素結晶溶液、レーン2はサンプル番号2、レーン3はサンプル番号3、レーン4はサンプル番号4、レーン5はサンプル番号5、レーン6はコントロールの結果を示す。図102中、レーン1は専用容器内での結晶成長したサンプル番号1の酵素結晶溶液、レーン2はサンプル番号2、レーン3はサンプル番号3、レーン4はサンプル番号4、レーン5はサンプル番号5、レーン6はサンプル番号6の結果を示す。この結果からも、上記した計算上の比較と同様、双方の技術ともほぼ同じ割合で結晶化され、実用的価値のあることが確認できた。次に実施例10~20において、バチルスサブティリス由来CotAラッカーゼを酵素結晶固定化電極の触媒とした例について説明する。実施例10:酵素発現系の構築、大腸菌タンパク質合成系による酵素合成、及びタンパク精製結晶化に際して、高純度の酵素を取得するため、遺伝子工学的手法を用いて組換えタンパク質として酵素を産生し、各種クロマトグラフィーを組み合わせることによって精製した。特に、結晶化に際しては、結晶化条件の最適化のためのスクリーニング用に大量の精製酵素が必要である。ステップ1:バチルスサブティリス由来CotAラッカーゼの発現ベクターの構築先行技術文献の非特許文献1として提示するJBiolChem、第277巻、第21号、第18849~59頁に記載のバチルスサブティリス由来CotAラッカーゼのアミノ酸配列をコードするDNA配列を、pET22bベクターの制限酵素認識部位NdeIとHidIIIの間に組み込み、pET22bの制限酵素認識部位HidIII下流のヒスチジン配列を利用して、酵素のC末端側にヒスチジンが付加されるようにデザインし酵素発現ベクターを構築した。ここで発現させたタンパク質の塩基配列を配列表の配列番号7に、また該塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列表の配列番号8に示す。ステップ2:大腸菌による組換え型タンパク質の発現上記ステップ1で得た酵素発現ベクターを大腸菌BL21pLysS株に形質転換し、菌体をLB培地に接種し37°Cで18時間培養した。本培養として、培養した菌体をLB培地に添加し培養液量の120量、37°Cで約1時間OD02まで培養し、02mMIPTGを加えて、20°Cで18時間振盪培養した。酵素発現菌体を遠心分離により回収し、-80°Cで凍結保存した。これを以下のタンパク質精製に供した。精製は、アフィニティークロマト法ステップ3と、タンパク質の電荷特性に従うイオン交換クロマトグラフィー法ステップ3~4の2種の酵素精製法を組み合わせて行った。ステップ3:アフィニティークロマトグラフィーによるHistagタンパク質精製上記ステップ2で発現させたタンパク質はHistag融合タンパク質であり、Histagを介してタンパク質を精製した。凍結保存していた酵素発現菌体を10mMTrisHCl1mMEDTApH74に懸濁し、04の界面活性剤Brij58を加え、氷中で30分間放置した。次に、超音波破破砕を行った後、遠心分離により細胞破砕液を分取した。ヒスチジンタグ融合タンパク質精製用金属アフィニティー担体TALONによる精製担体をオープンカラムに適当量充填し、20mMリン酸ナトリウム、5mMイミダゾール、05MNaCl溶液で前洗浄後、細胞破砕液に05MNaClを加えカラムにアプライした。20mMリン酸ナトリウム、5mMイミダゾール、05MNaCl溶液で洗浄後、20mMリン酸ナトリウム、500mMイミダゾール、05MNaCl溶液で酵素を溶出した。溶出に用いた塩類イミダゾールやNaClを除去するため、25mMTrisHClpH74緩衝液を外液として、透析を一晩行った。ステップ4:イオン交換クロマトグラフィーによるタンパク質精製上記ステップ3で取得したタンパク質溶液を、更に、タンパク質の電荷特性に従うイオン交換クロマトグラフィーを用いて精製した。陰イオン交換体の1つであるMonoQクロマトグラフィーによる精製を行った。CotAラッカーゼC末端ヒスチジンタグ付は、分子量601kDa、pI61のタンパク質である。CotAラッカーゼの可溶化用緩衝液をpH75とすると、pI値よりも高いため陰イオン交換体に吸着することが考えられる。なお、文献公知の陽イオン交換体であるMonoSでは精製では担体にタンパク質が吸着しなかった。具体的には、MonoQ550GLGEHealthcare:カラム容量が約1mlを使用した。MonoQは、非常に高い分離能と高い結合容量を有する多孔性粒子であるMonoビーズ基盤とし、イオン交換体としてQuaternaryammoniumを持つ強陰イオン交換体である。製造者の取り扱い説明書によるとMonoQの結合容量は65mgmlgelである。MonoQカラムに使用する緩衝液および添加するタンパク質は、あらかじめ022μmのフィルターに通した。ここで、使用した装置、器具及び試薬を以下に示す。装置:AKTAexplorer10S担体:MonoQ550GL試薬:緩衝液A20mMTrisHCl5mMEDTA5mM2mercaptoethanol緩衝液B20mMTrisHCl5mMEDTA5mM2mercaptoethanol1MNaClMonoQによる精製手順は、25mMリン酸カリウムpH74、1mMEDTAをベース緩衝液として、担体を洗浄し平衡化した。続いて、ステップ3で取得したタンパク質溶液をカラムにアプライし、タンパク質を担体に吸着させた後、上記ベース緩衝液で担体を洗浄し不純物を除去した。続いて、ベース緩衝液を開始用緩衝液とし、0~500mMKClの塩濃度勾配によりタンパク質を溶出した。つぎにKClを除去するため、25mMTrisHCl緩衝液、1mMEDTAを外液として、透析を一晩行った。具体的には、以下の手順で溶出した。精製手順1MonoQカラムを10カラム量の緩衝液Aで平衡化。MonoQの製造者推奨流速は、05~30mLmin、限界圧が4MPa。210カラム量の緩衝液Aで平衡化されたMonoQカラムにタンパク質緩衝液Aに透析済みを添加。310カラム量の緩衝液Aでカラムを洗浄し、非吸着タンパク質を除去。4緩衝液Aと緩衝液Bとを用いたリニアグラジエントにより、10カラム量でタンパク質をフラクションコレクターで分画しながら溶出。タンパク質の溶出は、KCl濃度を0から500mMまで増加させる塩濃度勾配による方法で行った。5タンパク質の溶出画分をSDSPAGEに供してタンパク質を確認。6カラムを超純水に置換。その後、2MNaCl、2MNaOH、75酢酸の順番でカラムを洗浄。タンパク質の溶出画分をSDSPAGEに供した結果を図11A及びBに示す。詳細には、図11Aは溶出初期KCl濃度:100mM前後の画分以下、酵素溶液画分Iと称する。、図11Bは溶出後期KCl濃度:100mM前後の画分以下、酵素溶液画分IIと称する。の電気泳動の結果を示す。何れも約60kDaの分子量を持つバンドが検出できた。ここではタンパク質の溶出は、KCl濃度を0から500mMまで増加させる塩濃度勾配による方法で行ったが、溶出初期に溶出される酵素溶液画分と、溶出後期に溶出される酵素溶液画分が2つあることがわかった。クロマトチャートここでは図示しないと図11A、Bの電気泳動図を並べてみると、2つの画分がシャープに分離できているようには見えないが、MonoQに弱く結合した酵素と、強く結合した酵素の両方が混在しているようであった。これは、何らかの酵素の物性に起因すると推察できる。実施例11:精製酵素の純度確認本実施例においては、実施例10で取得した精製酵素が、結晶化に求められる高純度の酵素であることを確認した。具体的には、実施例10にて、大腸菌タンパク質合成系による合成を行った直後のタンパク質溶液ステップ1~2、アフィニティークロマトグラフィーで精製したタンパク質溶液ステップ1~3、及びアフィニティークロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーを組み合わせて精製したタンパク質溶液ステップ1~4を、SDSPAGE電気泳動に供した。結果を図12に示す。詳細には、パネルAは大腸菌タンパク質合成系による合成を行った直後のタンパク質溶液であり、レーン1はタンパク質発現させた大腸菌の全破砕液、レーン2はその可溶化画分、レーン3はレーン2その可溶化画分のステップ3のアフィニティークロマトグラフィー担体を素通りした溶液の電気泳動結果である。パネルBは大腸菌の全破砕液をアフィニティークロマトグラフィーにより精製したタンパク質溶液、パネルCはアフィニティークロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーを組み合わせて精製したタンパク質溶液の電気泳動結果である。なお、パネルB及びCのレーンMは分子量マーカーである。パネルAの結果から、大腸菌の破砕液には約60kDaの分子量を持つタンパク質のバンドが見られタンパク質が発現していることがわかる。さらに、パネルBの結果から、アフィニティークロマトグラフィー担体に効率PersonName良くタンパク質が結合していることが理解できる。そして、パネルCにおいて、ほぼ1本の目的のタンパク質のシグナルバンドのみ認められた。したがって、アフィニティークロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーを組み合わせることによって高純度なCotAラッカーゼを精製できることが判明した。実施例12:精製酵素の活性測定本実施例においては、実施例10で取得した精製酵素の活性を測定した。実施例10のステップ1~4を経て取得した酵素溶液画分Iと画分IIの酵素溶液は、精製後の透析によって、25mMTris751mMEDTA、5mM2メルカプトエタノール、50Glycerolに置換されている。結晶化用の酵素溶液として調製するため、酵素溶液画分を100mMクエン酸ナトリウム緩衝液pH55に対して透析した。その結果、酵素溶液画分Iはタンパク質が沈殿し変性した。沈殿が生じる酵素濃度を調べたところ、CotAラッカーゼは酵素濃度05mgml以上で沈殿が生じ活性を失うことが確認された。この変性は、実施例1のステップ3後のアフィニティークロマトグラフィー精製のみを行った精製酵素でも生じ、酵素溶液に還元剤として2メルカプトエタノールを添加して透析を行うと沈殿を生じなかった。一方、酵素溶液画分IIついては沈殿を生じることなく、100mMクエン酸ナトリウム緩衝液へ置換することができた。結晶化用の酵素溶液として、2メルカプトエタノールを添加することはできないため、酵素溶液画分IIを結晶化用の酵素溶液として選択した。次に、酵素溶液画分IIを透析して得られた酵素溶液の触媒活性基質ABTSの酸化活性について、透析前の酵素溶液と比較した。両者は酵素溶液に含まれる酵素量は同じであり、溶媒の組成のみが相違する。その結果、透析後の方が、2倍近く触媒活性が高くなった。かかる理由の詳細は不明であるが、透析によって2メルカプトエタノールが除去されたことに起因すると推定される。なお、ラッカーゼ活性の測定は以下の手順により行った。基質として1mMABTS、01mM硫酸銅を含む20mM酢酸ナトリウム緩衝液pH50を反応液として用いて比色法で行った。まず、反応液に酵素溶液を添加し反応を開始させた。反応は50°Cで行った。基質ABTSの酸化に伴う418nmの吸光度の変化酵素反応速度により測定した。続いて、上記酵素溶液の比活性を、ABTSを基質として測定した。04mMABTSを含む50mM酢酸ナトリウム緩衝液pH55を反応液とし、酵素溶液を加えて全量200μlとした。反応は25°Cで行った。1Uを1μmolminのABTSを酸化させる酵素量と定義して比活性を算出した。83Umgproteinその結果、上記酵素溶液中に含まれる酵素は、結晶化用酵素として十分な触媒活性を有していた。実施例13:酵素の緒性質pH特性本実施例では、酵素の諸性質うちpH特性について検討を行った。実施例10のステップ1~4を経て取得した精製酵素のpH特性を、pH35から100の範囲における触媒活性を測定することにより検討した。触媒活性の測定は、1mMABTS、01mM硫酸銅を含む20mM酢酸ナトリウム緩衝液pH50を反応液として用いて比色法で行った。まず、反応液に酵素溶液を添加し反応を開始させた。反応は50°Cで行った。基質ABTSの酸化に伴う418nmの吸光度の変化酵素反応速度により測定した。なお、各pH域の緩衝液の緩衝成分として、pH35~55:クエン酸、pH5~7:リン酸、pH65~9:トリス塩酸、pH85~10:グリシンNaOHを活性測定に使用した。結果を図13に示す。この結果、至適pHは弱酸性域であった。かかるpH特性は、同じ酸素還元酵素であるマルチ銅オキシダーゼCueO等に類似する。実施例14:酵素の緒性質温度依存性本実施例では、酵素の諸性質うち温度依存性について検討を行った。実施例10のステップ1~4を経て取得した精製酵素の温度依存性を、25~80°Cにおける触媒活性を測定することにより検討した。触媒活性の測定は、1mMABTS、01mM硫酸銅を含む20mM酢酸ナトリウム緩衝液pH50を反応液として用いて比色法で行った。まず、反応液に酵素溶液を添加し反応を開始させた。反応は上記所定の温度で行い、基質ABTSの酸化に伴う418nmの吸光度の変化酵素反応速度により活性を測定した。なお、緩衝液の緩衝成分として、pH35~55:クエン酸を使用した。結果を図14に示す。その結果、至適温度は70°C付近であった。これは、同じ酸素還元酵素である大腸菌由来CueOラッカーゼと類似する。高温度領域で活性を維持できることから、高温領域を含む様々な使用条件及び長期使用に耐え得る有用な酵素電極触媒として利用することができる。実施例15:酵素の結晶化条件のスクリーニング、及び酵素の結晶化本実施例では、酵素の結晶化条件のスクリーニングを行い、続いて酵素結晶を作製した。実施例10のステップ1~4を経て取得した精製酵素と同じバチルスサブティリス由来CotAラッカーゼについての結晶化及び構造決定について開示するEnguitaFJ他著、ActaCrystallogrDBiolCrystallogr、2002年、58、第1490~1493頁を参考に結晶化反応を行った。本文献は、先行技術文献の非特許文献2として提示している。ステップ1:透析と濃縮実施例10のステップ1~4を経て取得した精製酵素を、結晶化反応母液の緩衝液100mMクエン酸ナトリウム緩衝液pH55に対する透析を行った。緩衝液交換の後、限外ろ過スピンカラムによる濃縮15mgmlを行った。透析後の酵素溶液の状態を確認したところ、実施例12で確認した通り酵素溶液画分Iでは酵素の沈殿が生じた。これは、緩衝液交換によって酵素の溶解度が低下したためであると考えられる。沈殿が生じた酵素溶液は結晶化反応用には使えないため、酵素の沈殿の生じなかった酵素溶液画分IIにて結晶化反応を行った。濃縮後に、酵素濃度と純度を、分光光度計を使った各波長光のスキャンにより測定した。その結果、酵素結晶化の妨げとなる核酸の混在の程度を示す2波長260280の比率が052であり核酸の混在はないことが確認できた。イオン交換クロマトでの精製を組み合わせたことにより、アフィニティー精製だけでは除去が困難な核酸の混在をほぼ完全に除去できた。ステップ2:結晶化結晶が析出する条件を突き止めるために、上記非特許文献に記載の結晶化条件を参考に結晶化条件のスクリーニングを行った。まず、上記先行技術文献の項に提示した非特許文献2に記載の結晶化条件に前後10程度の条件幅を持たせて初回のスクリーニングを行った。このとき、スクリーニングプレート2枚を使用し、15×2で実施した。具体的には、4μLの反応スケールで、下記に示す酵素濃度と沈殿剤濃度の配合で、酵素溶液と沈殿剤溶液を混合した液滴をカバーグラス上に調製し、カバーグラスを裏返して沈殿剤溶液の入った容器にかぶせて蒸気拡散法により行った。20°Cのインキュベータで5日間静置し結晶化反応させた後、結晶の有無を顕微鏡観察により確認した。ここに、酵素溶液の酵素濃度と沈殿剤濃度を以下に示す。酵素溶液の酵素濃度:8mgml結晶化反応母液の組成及び沈殿剤濃度:100mMクエン酸ナトリウム緩衝液pH5515グリセロール10、15、20イソプロピルアルコール10、12、14、16、18、20ポリエチレングリコール4K結果を表4に示す。表4中の丸印を付けた条件で、それぞれ図15A、Bに示すような針状結晶約10mmの形成が顕微鏡による観察により確認できた。この結果から、沈殿剤濃度が高い条件でのみ結晶化したことが理解できる。また、同時に、酵素結晶以外の夾雑沈殿物が多く生じていることが確認できた。これは、酵素濃度が高すぎることに起因すると予想される。上記実験の結果を受け、夾雑沈殿物の形成を減少させることを目的として次のスクリーニングを行った。本実験では、酵素濃度を下げて結晶化条件を調べた。初回と同じく20°Cのインキュベータで5日間静置し結晶化反応させた後、結晶の有無を顕微鏡観察により確認した。ここに、酵素溶液の酵素濃度と沈殿剤濃度を以下に示す。酵素溶液の酵素濃度:4又は8mgml結晶化反応母液の組成及び沈殿剤濃度:100mMクエン酸ナトリウム緩衝液pH5515グリセロール14、16、18、20イソプロピルアルコール10、12、14、16、18、20ポリエチレングリコール4K結果を表5に示す。表5中の二重丸印を付けた条件で、それぞれ、図16A、Bに示すような多数の酵素結晶約05~10mmの形成が確認できた。この結果においても、酵素結晶以外の夾雑沈殿物の量の減少させることができなかった。かかる夾雑沈殿物は沈殿剤の濃度が高いために生じるものであって、今回の酵素結晶化に際しては混在するものであると考える。また、高めの酵素濃度8mgmlでは大きな結晶の集合体固まりができること図16A、低い酵素濃度4mgmlでは小さめの多数の酵素結晶約05mmができる傾向図16Bが認められた。このことより、酵素溶液の酵素濃度を調節することにより結晶サイズを作り分けることができることが確認できた。以上の結果から、酵素結晶が析出する条件は、沈殿剤:20、酵素濃度:4~8mgml、緩衝液pH:55、温度20°C、必要日数5日間前後であることが判明した。かかる結晶化条件に基づけば、酵素結晶を再現性よく確実に作製できることが確認できた。実施例16:酵素固定化電極の作製と触媒機能の評価本実施例では、バイオ電池の電極触媒としての利用を想定して酵素固定化電極を作製した。そして、その触媒機能を評価した。酵素固定化電極の電極触媒として実施例10のステップ1~4を経て取得した精製酵素を使用した。酵素の導電性基材への固定化は、光架橋性ポリマーを用いる方法を選択した。具体的には、酵素固定化キット東洋合成工業製を用いて、そのキットに付属の標準プロトコルに従い実施した。この酵素固定化キットは、電気化学検出のバイオセンサーの初期検討に最適な実験キットである。また、固定化材としては、上記キット付属の酵素固定化用ポリマーBIOSURFINEを使用し、酵素を導電性基材に固定化し酵素固定化電極を調製した。続いて、ポテンショスタットを用いて酵素固定化電極の評価を行った。評価は、クロノアンペロメトリー法電圧固定で電流の時間変化を測定による触媒電流の測定により行った。具体的には、反応混合液50mMクエン酸ナトリウムpH52、1mMABTSに、作用電極として精製酵素50μg固定化電極、対極カーボンおよび参照電極銀塩化銀を浸して、ABTS酸化還元電位:05Vの還元反応に伴う電流応答を測定することにより行った。電気化学の反応式は以下の通りある。4ABTSO24H→4ATBS2H2OATBSe→ATBS上記ポテンショスタットのCA測定条件を以下に示す。InitE0開回路電位、HighE01、LowE0、InitPNN、Step1、PulseWidthsec30、SampleInterval001、QuietTime2結果を図17に示す。波形1は酵素の固定化反応処理を行った電極、波形2は酵素を添加せずに上記固定化処理を行った電極で観察された触媒電流を示す。その結果、酵素固定化電極では、触媒電流の電流密度:009mAcm2であった波形1。ABTSカチオンラジカルの再還元波が観測されるため電流は負側に観察できる。一方、酵素の固定化がなされていない電極では、触媒電流の電流密度は003mAcm2であった。これらの結果から、精製酵素CotAラッカーゼによって負側の触媒電流が流れ、バイオ電池のカソード側触媒として使えることが確認できた。実施例17:酵素結晶固定化電極の作製本実施例では、バイオ電池の電極触媒としての利用を想定し酵素結晶固定化電極を作製した。酵素結晶固定化電極の電極触媒として実施例15にて作製した酵素結晶を使用した。酵素結晶の導電性基材への固定化は、実施例16と同様、光架橋性ポリマーを用いる方法で行った。具体的には、酵素固定化キット東洋合成工業製を用いて、そのキットに付属の標準プロトコルに従い実施した。この酵素固定化キットは、電気化学検出のバイオセンサーの初期検討に最適な実験キットである。また、固定化材としては、上記キット付属の酵素固定化用ポリマーBIOSURFINEを使用し、酵素結晶をカーボン電極に固定化し酵素固定化電極を調製した。具体的には、実施例15で取得した酵素結晶を、それぞれ酵素活性の発現に必要な補欠因子CuSO4を結合させるホロ化反応を行った。続いて、結晶化反応液から専用の紙縒りを用いて液体部分を10μl程度残して吸い取り結晶を濃縮した。濃縮した結晶液をすべて電極表面平板上で電極面積25mm2に滴下し、さらに紙縒りろ紙を用いて完全に液体部分を吸い取った。次に、2に希釈したポリマー溶液5μlを電極に滴下し乾燥させた後、UV露光を5分間行うことにより、酵素結晶を固定化した。実施例18:酵素結晶固定化電極の触媒機能評価-1本実施例では、実施例15に記載の酵素結晶化反応により作製した酵素結晶を実施例17に記載の方法で導電性基材の表面に固定化して作製した酵素結晶固定化電極の触媒機能評価を行った。実施例15に記載した酵素結晶化反応により作製した酵素結晶を、実施例17に記載の方法で電極に固定化し、サイクリックボルタンメトリー以下、CVと略する場合がある。法により触媒電流を測定した。上記BASポテンショスタットのCV測定条件を以下に示す。InitE02、HighE06、LowE02、InitPNP、ScanRate002、Segment2、SampleInterval0001、QuietTime5、Sensitivity1e5結果を図18に示す。以下に示す電気化学反応のABTSカチオンラジカルの再還元波が観察された。これにより、本実施例で作製した酵素結晶固定化電極が、酵素触媒機能電極として機能することが確認された。4ABTSO24H→4ATBS2H2OATBSe→ATBS実施例19:酵素結晶固定化電極の触媒機能評価-2本実施例では、実施例15に記載の酵素結晶化反応により作製した酵素結晶を実施例17に記載の方法で導電性基材の表面に固定化して作製した酵素結晶固定化電極の触媒機能評価を行った。実施例15に記載した酵素結晶化反応により作製した酵素結晶を、実施例17に記載の方法で電極に固定化し、クロノアンペロメトリー法により触媒電流を測定した。具体的には、時間t後の印加電圧による電流の変化を測定した。CA測定のパラメータ設定は、実施例18のCVの結果を参考にして、初期電位は開回路ポテンシャル、印加電圧を05V、印加電圧をかけ始める時間を5秒で行った。ここで固定化した酵素はラッカーゼであるので、観測したい電流は酸素の還元に消費される電流になるので、再還元波より負側の電位に設定することが望ましい。結果を図19に示す。波形1は酵素結晶の固定化反応処理を行った電極、波形2はコントロール実験としてあえて結晶化しないように沈殿剤の濃度を下げて作製した酵素結晶擬似物の固定化反応処理を行った電極で観察された触媒電流を示す。その結果、酵素結晶固定化電極では電流密度018mAcm2の触媒電流が観察された波形1。一方、コントロール実験ではとしてあえて結晶化しないように沈殿剤の濃度を下げて作製した酵素結晶では電流密度:007mAcm2の触媒電流が観察された波形2。これらの結果から、バイオ電池のカソード側触媒として使えるCotAラッカーゼについて、酵素結晶化することによって触媒電流が向上することが判明した。ラッカーゼは酸素を基質として反応するため、反応溶液の溶存酸素濃度の限界で反応速度が頭打ちになることがわかっている。今回得られた電流密度018mAcm2についても、溶存酸素に相当する応答電流値であると考えられる。そのため、酵素結晶化による電流値向上のレベルについては、大気酸素を反応に使うことでさらに効果が大きくなると予想される。実施例20:酵素結晶固定化電極を用いたバイオ電池セルによる性能評価本実施例では、本発明の酵素結晶固定化電極を用いて実際にバイオ電池セルを構築し、その性能評価を行った。実施例15に記載の酵素結晶化反応を、結晶化反応容器ではなくバイオ電池セルのカソードに使う炭素材中で酵素結晶化反応を行った。つまり、導電性基材上で酵素の結晶化反応を行うことにより酵素結晶固定化電極を作製した。ここで使用した炭素材は、カーボンペーパー以下、CPと略するに、高導電性カーボン微粒子のケッチェンブラック以下、KBと略するを塗布したものである。以下に具体的手順を示す。ステップ1:CPへのKBの塗布処理CPに、適当量の高導電性カーボン微粒子のKBを塗布した。ステップ2:CotAラッカーゼの電極中での結晶化実施例15に記載の通り、実施例10のステップ1~4を経て取得した精製酵素を、結晶化反応母液の緩衝液100mMクエン酸ナトリウム緩衝液pH55に対する透析を行った。続いて、酵素結晶化反応液100mMクエン酸緩衝液pH55、15Glycerol、182propanol、20PEGと、酵素溶液15mgmlを混ぜ合わせ、実施例15に記載の手順に沿って上記ステップ1で調製したCPKP電極中で結晶化反応を行った。これをカソードとしてバイオ電池セルを構築した実施例。ステップ3:バイオ電池セルの作製本実施例においては、2種類のバイオ電池セルを組み立てた。図1のバイオ電池セルは、アクリル製型枠に、カソード|燃料ゲル|アノードの順番で重ね四方をネジ止めし組み立てた。カソード及びアノードは共に14mm×14mmとした。外枠はアクリル製型枠とし、厚さ1mmのアクリル板、厚さ2mmのアクリル板の中央部に1cm×1cmの角穴を開けたものを使用した。角穴の四辺にはネジ止め用に穴を開けた。燃料ゲルは、アクリル板の中央部に角穴を開けたアクリル製型枠に保持し装着した。アクリル板の厚さは、装着する燃料ゲルの厚さに従って適宜2mm、5mm、10mmとした。なお、集電板としてチタンメッシュAlfaAesar40921、10mm幅×40mm長に切断して使用、スペーサーとして05mm厚のシリコンシートアズワン等を使用し、カソード及びアノードと燃料ゲルの間のシリコンシートの中央部には燃料ゲルと電極が接触するように電極大の14mmの角穴を開け、アノードとアノード側の外枠との間のシリコンシートには角穴は開けずに構成した。つまり、アクリル板外枠:角穴/チタンメッシュ/カソード/シリコンシート角穴/中央部に燃料ゲルを保持したアクリル板/シリコンシート角穴/アノード/チタンメッシュ/シリコンシート/アクリル板外枠の順に積層した。なお、アノード、及び燃料ゲルは以下の通り調製を行った。1.アノード用酵素溶液の調製アノード用酵素溶液として、グルコース脱水素酵素溶液を調製した。なお、グルコース脱水素酵素としてアシネトバクターカルコアセティカスNBRC12552株由来のグルコース脱水素酵素を以下の通り調製した。酵素発現プラスミドpET22bsGdhを大腸菌BL21株をトランスフォーメーションし、コロニーをLBAmp含アンピシリン50μgml培地300mlに接種し、37°Cで一晩培養した。つぎにジャーファーメンターにLBAmp培地を20L仕込み、前培養液200mlを加え、37°Cで約1時間OD01になるまで培養し、001mMIPTGを加えてタンパク発現誘導をかけ、28°Cで一晩振盪培養した。培養液を遠心、上清を除去した沈殿を-80°Cで凍結保存した。凍結保存された酵素発現菌体5gをPBS緩衝液15mlに懸濁した。氷上で、超音波破砕機15Wで15秒間、XL2000、MISONIX社製を用いて破砕を10回行なった。破砕液は4°C、5000rpmで20分間遠心分離し、分取した上清をCelluloseAcetate045μmfilterADBANTECでフィルタリングした。オープンカラムにヒスチジンタグ精製用レジンTALON、Clontech社製を10ml充填し、ベッドボリュームの5倍量の平衡化緩衝液300mMNaCl、1XPBSで平衡化した。前処理を行なったサンプルをカラムにアプライし、ベッドボリュームの5倍量の洗浄用緩衝液300mMNaCl、10mMImidazol、1XPBSで洗浄後、ベッドボリュームの3倍量の溶出用緩衝液で300mMNaCl、150mMImidazol、1XPBS溶出した。回収した溶出液を限外ろ過膜AmiconUltra44、Millipore社製を用いて濃縮した後、最終の酵素溶液Bufferに透析した10mMTrisHClpH75、01mMCaCl2た。酵素溶液は、電極使用前に、15000rpmで5分間遠心分離し、分取した上清を20mgml以上になるように再度濃縮した。2.アノードの調製上記1で調製したアノード用酵素溶液に1mMCaCl2、1μmPQQとなるよう添加し4°Cでインキュベートする。カーボンフェルトカーボンマット50gm2のものを14cm×14cmにカッターで切断する。酵素溶液に更に01MSodiumphosphateBufferpH70、5mMmPMSとなるよう添加した溶液022mlをカーボンフェルトに滴下、風乾して使用した。3.燃料ゲルの調製1Agarose、60mMDGlucose、01MSodiumphosphateBufferpH70に調製した溶液を電子レンジで溶解、アクリル製型枠に注いで固めた。なお、比較として、上記ステップ結晶化酵素のステップ2で調製した酵素溶液を結晶化せずにそのままカソードの電極触媒として用いたバイオ電池セルを構築した比較例A。また、ビリルビンオキシダーゼBilirubinOxidase:天野エンザイム、BOアマノ3、以下BODと略する。の20mgmlとなるように濃度調整した酵素溶液を結晶化せずにそのままカソードの電極触媒として用いたバイオ電池セルをも構築した比較例B。更に、カソード用の導電性基材として、KB塗布を行わないCPを用いて、ステップ2の手順でCotAラッカーゼの酵素結晶を固定化したカソードを用いたバイオ電池セルをも構築した比較例C。ステップ4:バイオ電池セルの電気化学的な測定電子付加装置で一定電流を流したときの電圧を測定し、電流値から電力密度を求めた。ステップ5:電極上の酵素量の測定電極上の酵素量を酵素免疫測定法EIA法により測定し、電力密度の値を補正した。EIA法の詳細手順を以下に示す。購入試薬PBSPhosphateBufferedSaline、シグマアルドリッチ社製PBSTPhosphateBufferedSalinewithTween20、シグマアルドリッチ社製ブロッキング剤ブロックエース粉末、大日本製薬社製反応Buffer445mlPBS、05ml1TritonX100、5mlブロックエースHRP標識抗マウスIgG抗体AntiMouseIg、HRPLinkedWholeAb、アマシャム社製発色試薬TMBOneSolution、プロメガ社製測定試薬抗血清溶液反応バッファーで10000倍希釈二次抗体溶液ブロッキング剤で4000倍希釈測定手順1.測定後の電極をチューブに入れ、ブロックエース中で2時間静置3.PBSTで洗浄ラ3回繰り返し4.抗血清溶液中で1時間静置6.PBSTで洗浄ラ3回繰り返し8.二次抗体溶液中で1時間静置9.PBSTで洗浄×3回繰り返し後、PBSで洗浄ラ2回繰り返し10.発色試薬中で5分間静置した後、2ml塩酸1Nで反応停止12.分光光度計で測定450nm吸光度から595nm吸光度バックグラウンドの差分値測定結果を図20に示す。図中、KBCP電極BODは比較例B、KBCPCotAは比較例A、KBCPCotA結晶の本実施例、及びCPCotAは上記比較例Cの結果を示す。かかる結果から、カソード側触媒として用いる酵素を結晶化することによって、電池セルの出力が向上することが確認できた。また、導電性基材上で酵素を結晶化し固定化することによっても、実用価値の高い電極を作成できることが判明した。"