"がんもしくは骨髄増殖性疾患に対する感受性があるか、またはそれに罹患している個体がチロシンキナーゼ阻害剤を用いる処置に対する耐性を生じる見込みがあるか、を予測する方法であって、5’から3’の順序で、配列番号5に示すヌクレオチド配列と、その直後に続く配列番号7に示すヌクレオチド配列とを含むBIMBCL2L11遺伝子の多型バリアントを前記個体が有するかを決定するステップを含み、好ましくは、前記BIMBCL2L11遺伝子の前記多型バリアントが、配列番号6に示すヌクレオチド配列を欠く方法。a前記BIMBCL2L11遺伝子の前記多型バリアントを有する前記個体の指標として、配列番号1に示す配列を含む核酸増幅生成物の存在を検出するステップ、またはb前記BIMBCL2L11遺伝子の前記多型バリアントを欠く前記個体の指標として、配列番号2に示す配列を含む核酸増幅生成物の存在を検出するステップを含む、請求項1に記載の方法。a配列番号3に示すヌクレオチド配列、もしくはb配列番号4に示すヌクレオチド配列、または例えばプライマーセットとしてのaおよびbの組合せを、用いる核酸増幅生成物を含む、請求項1または2に記載の方法。a前記個体が前記BIMBCL2L11遺伝子の前記多型バリアントを有すると決定されるならば、前記個体が、チロシンキナーゼ阻害剤を用いる処置に対する耐性を生じる見込みがあり、またはb前記個体が前記BIMBCL2L11遺伝子の前記多型バリアントを有さないと決定されるならば、前記個体は、チロシンキナーゼ阻害剤を用いる処置に対する耐性を生じる見込みが低い、請求項1~3のいずれかに記載の方法。がんもしくは骨髄増殖性疾患の個体についての治療を選択する方法であって、請求項1から4のいずれかに記載の方法により、患者が、チロシンキナーゼ阻害剤を用いる処置に対する耐性を生じる見込みがあるかを決定するステップと、前記個体がそのような耐性を生じる見込みがあると決定される場合に、a前記患者のより頻度が高いモニタリング、bより頻度が高い血液検査および骨髄検査、c骨髄移植、dニロチニブもしくはダサチニブのようなより効力が高いチロシンキナーゼ阻害剤TKIの投与、e例えばTKIとの組合せでのBH3模倣剤、例えばABT-263の投与、fチロシンキナーゼ阻害剤、例えばイマチニブの用量の、例えば400mg/日の標準用量を超えて600または800mg/日までの増加、またはgBCL2群タンパク質の生存促進性効果を阻害する薬物を用いる処置のいずれか1または複数を含む治療を選択するステップとを含む方法。がんもしくは骨髄増殖性疾患の個体に対する特定の治療の成功の見込みを決定する方法であって、前記治療を、請求項5に記載の方法により決定された治療と比較するステップを含む方法。a前記がんもしくは骨髄増殖性疾患が、慢性骨髄性白血病CMLを含み、チロシンキナーゼ阻害剤を用いる処置に対する前記耐性が、例えば、イマチニブのようなチロシンキナーゼ阻害剤に対する耐性のようなBCR-ABL非依存性TKI耐性を含むか、b前記がんもしくは骨髄増殖性疾患が、消化管間質性腫瘍GISTを含み、チロシンキナーゼ阻害剤を用いる処置に対する前記耐性が、例えば、イマチニブのようなチロシンキナーゼ阻害剤に対する耐性のようなc-KIT/PDGFR非依存性TKI耐性を含むか、c前記がんもしくは骨髄増殖性疾患が、非小細胞肺がんNSCLCを含み、チロシンキナーゼ阻害剤を用いる処置に対する前記耐性が、例えば、エルロチニブもしくはゲフィチニブのようなチロシンキナーゼ阻害剤またはその他のキナーゼ阻害剤、例えばスニチニブ、ニロチニブおよびソラフェニブに対する耐性のようなEGFR非依存性TKI耐性を含むか、d前記がんもしくは骨髄増殖性疾患が、真性赤血球増加症、本態性血小板血症および原発性骨髄線維症からなる群から選択されるような骨髄増殖性疾患を含み、チロシンキナーゼ阻害剤を用いる処置に対する前記耐性が、例えば、JAK阻害剤に対する耐性のようなJAK2非依存性TKI耐性を含むか、あるいはe前記がんもしくは骨髄増殖性疾患が、血液悪性腫瘍、慢性リンパ球性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、骨髄増殖性疾患真性赤血球増加症、本態性血小板血症および原発性骨髄線維症を含む、固形腫瘍、小細胞肺がん、乳がん、結腸直腸がん、卵巣がん、メラノーマおよび神経芽腫からなる群から選択される、請求項1から6のいずれかに記載の方法。5’から3’の順序で、配列番号5に示すヌクレオチド配列と、その直後に続く配列番号7に示すヌクレオチド配列とを含む、BIMBCL2L11遺伝子の多型バリアント。配列番号6に示すヌクレオチド配列を欠くことによって特徴付けられるBIMBCL2L11遺伝子の多型バリアント。請求項8または9に記載のBIM多型バリアントから、例えば核酸増幅により得ることができる、配列番号1または配列番号2に示すヌクレオチド配列。このような多型を含む個体において、iBCR-ABL再活性化がない慢性骨髄性白血病についてのチロシンキナーゼ阻害剤を用いる処置に対する耐性BCR-ABL非依存性TKI耐性、iic-KIT/PDGFR再活性化がない消化管間質性腫瘍GISTについてのチロシンキナーゼ阻害剤を用いる処置に対する耐性c-KIT/PDGFR非依存性TKI耐性、iiiEGFR再活性化がない非小細胞肺がんNSCLCについてのチロシンキナーゼ阻害剤を用いる処置に対する耐性EGFR非依存性TKI耐性またはivJAK2再活性化がない骨髄増殖性疾患についてのチロシンキナーゼ阻害剤を用いる処置に対する耐性JAK2非依存性TKI耐性と関連する、請求項8もしくは9に記載のBIMBCL2L11遺伝子の多型バリアントまたは請求項10に記載のヌクレオチド配列。a配列番号3に示すヌクレオチド配列、もしくはb配列番号4に示すヌクレオチド配列、またはaおよびbの組合せ、例えばプライマーセット。個体における請求項8または9に記載のBIMBCL2L11多型の存在または非存在を検出する方法であって、配列番号1に示す配列または配列番号2に示す配列を含む核酸増幅生成物を、例えば請求項12に記載のプライマーセットを用いることにより検出するステップを含む方法。がんもしくは骨髄増殖性疾患に罹患している患者を処置する方法であって、前記がんもしくは骨髄増殖性疾患が、BCR-ABL非依存性TKI耐性CMLがん、c-KIT/PDGFR非依存性TKI耐性GISTがん、EGFR非依存性TKI耐性NSCLCがん、またはJAK2非依存性TKI耐性骨髄増殖性疾患であるかを、請求項1から7のいずれかに記載の方法により決定するステップと、請求項5に示すa~gから選択されるステップを行うことにより前記患者を処置するステップとを含む方法。配列番号1に示す配列を含む核酸増幅生成物を、例えば請求項5に記載のプライマーセットを用いることにより検出するステップを含む、請求項13または14に記載の方法。添付の図面の図1から26を参照して実質的に上に記載され、かつ図1から26に示すような多型バリアント、ヌクレオチド配列または方法。本発明は、我々が東アジア人集団においてBIM遺伝子中で見出した新規な多型について記載する。この多型は、慢性骨髄性白血病CMLの患者における薬物耐性の発生と関連する。この多型を保有するCML患者は、有さない患者よりも、CMLについての標準的な治療に対する耐性を生じる見込みが高い。この多型を検査することは、薬物耐性の予測、ならびに代替および/またはより攻撃的な治療により利益を受ける可能性がある患者の早期の同定のためのバイオマーカーとして有用である。さらに、BIM遺伝子は、他の型のがんにおける治療誘発性細胞死の重要なメディエーターであるので、我々の発明は、東アジア人集団における広範囲のヒトのがんにも関連し得る。TKI耐性の機構を見出すために、我々は、ハイスループット配列決定と結び付けたゲノムペアエンドタグまたはDNA-PETとよばれる新規な技術参考文献A2、参考文献A3を用いて、薬物耐性を有するかまたは有さない患者からのCML細胞のゲノムを調べた。このようにすることにより、我々は、BCR-ABL非依存性TKI耐性の発生と関連する、BIM遺伝子中の以前は知られていなかった欠失を明らかにした。この欠失を有する患者は、欠失を有さない患者よりも、BCR-ABL非依存性TKI耐性を有する見込みが4から5倍17.4対3.9高いp=0.04、Fisherの両側正確検定。さらに、我々は、BIM欠失の存在または非存在を、患者からのCML株化細胞におけるBCR-ABL非依存性TKI耐性と相関させることもでき、これは、TKI耐性におけるBIM欠失についての直接的な機構的役割を示唆する。BIMタンパク質のアポトーシス促進性アイソフォームの上方制御がTKI媒介CML細胞死に必要であることがわかっているので参考文献A4~A7、我々は、BIM欠失がアポトーシス促進性BIMの発現を減退させると仮定する。BIM多型我々は、1または複数のBIM多型核酸分子を含む単離ポリヌクレオチドについて記載する。これらは、対応するポリペプチドとともに、本文書において、BIMBCL2L11遺伝子の多型バリアントまたは単純にBIM多型として様々に記載される。単離ポリヌクレオチドは、様々な診断法において用いることができる。単離多型BIM核酸分子は、本明細書で記載する場合、以下の方法の1または複数において用いることができる:aスクリーニングアッセイ、b予測のための医薬例えば診断アッセイ、予後アッセイ、モニタリング臨床試験および薬理遺伝学およびc処置方法例えば治療的および予防的。BIM遺伝子は、本文書の他の場所で記載するように、当該技術において知られている。BIM遺伝子の起源は、任意の哺乳動物BIM遺伝子であり得る。一般的に、診断アッセイのために、BIM遺伝子の動物起源は、試験される核酸を有する動物と同じ種である。単離多型BIM核酸分子は、1または複数のBIM多型を含む。例えば、BIM多型は、5’から3’の順序で、配列番号5に示すヌクレオチド配列と、その直後に続く配列番号7に示すヌクレオチド配列とを含み得る。BIM多型バリアントは、配列番号6に示すヌクレオチド配列を欠くことによって特徴付けられ得る。いくつかの、例えばスクリーニングアッセイにおける使用のために、BIM多型核酸分子は、少なくとも約15ヌクレオチドnt、少なくとも約18nt、少なくとも約20ntまたは少なくとも約25ntの長さであり、しばしば少なくとも約50ntである。このような小さいDNA断片は、ポリメラーゼ連鎖反応PCR、ハイブリダイゼーションスクリーニングなどのためのプライマーとして有用である。より大きいポリヌクレオチド断片、例えば少なくとも約50nt、少なくとも約100nt、少なくとも約200nt、少なくとも約300nt、少なくとも約500nt、少なくとも約1000nt、少なくとも約1500nt、コード領域全体まで、またはコード領域全体とBIM遺伝子からの約1000ntまでの5’および/もしくは約1000ntまでの3’フランキング配列は、コードされるポリペプチド、プロモーターモチーフなどを生成するために有用である。PCRのような増幅反応における使用のために、プライマーの対を用いる。プライマー配列の正確な組成は重要でないが、ほとんどの用途のために、プライマーは、当該技術において知られるように、ストリンジェント条件下で対象配列とハイブリダイズする。プローブとして用いる場合、単離多型BIM核酸分子は、追加の非BIMヌクレオチド配列が検出アッセイに干渉しない限り、非BIMヌクレオチド配列を含んでよい。プローブは、単離多型BIM配列と、任意の数の非BIMヌクレオチド配列例えば約1bpから約1kb以上までを含んでよい。スクリーニングの目的のために、多型配列のハイブリダイゼーションプローブを用いることができ、ここでは、両方の形が、別々の反応において、固相マトリクス上で空間的に離れて、または互いに区別できるように標識されて存在する。アッセイは、記載される多型の1または複数とハイブリダイズする核酸を利用してよい。本明細書で記載する単離多型BIM核酸分子は、固体基材と直接または間接的例えばリンカー分子を介してに結合例えば化学的コンジュゲートできる。固体基材は、それらに限定されないが、ビーズ、例えばポリスチレンビーズ;チップ、例えばガラス、シリカなど;プラスチック表面、例えばポリスチレン、ポリカーボネートプラスチックマルチウェルプレートなどを含む、当該技術において知られるいずれであってもよい。単離多型BIM核酸分子は、化学的もしくは生化学的合成により、組換えDNA技術により、もしくは生物学的供給源から核酸を単離することにより、または上記の任意の組合せにより得ることができる。例えば、核酸は、当該技術において知られるように固相合成技術を用いて合成できる。オリゴヌクレオチド合成は、Edgeら1981Nature292:756頁;Duckworthら1981NucleicAcidsRes.9:1691頁ならびにBeaucageおよびCaruthers1981Tet.Letters22:1859頁にも記載されている。核酸の調製の後に、核酸を、次いで、発現系の他のメンバーにライゲーションして、転写開始および終結領域これらが、適切な条件下で対象ポリペプチド生成物への核酸の発現をもたらすと作動可能に組み合わさった対象生成物をコードする核酸を含む発現カセットまたは系を生成する。追加のBIM遺伝子多型は、それらに限定されないが、SSCP、変性HPLCおよび配列決定を含む当該技術において知られる任意の様々な方法を用いて同定してよい。SSCPは、追加のBIM遺伝子多型を同定するために用いてよい。一般的に、PCRプライマーおよび制限酵素は、約25bpから約500bpまで、または約100bpから約250bpまで、またはその範囲内の任意の中間もしくは重複する範囲のサイズの生成物を生じるように選択される。多型BIMポリペプチド我々は、単離多型BIMポリペプチドについてさらに記載する。単離多型BIMポリペプチドは、BIMポリペプチドの生物活性を改変する薬剤をスクリーニングするためのアッセイにおいて有用であり得る。用語多型BIMポリペプチドは、全長天然ポリペプチドおよびその断片、特に生物活性断片および/または機能的ドメイン、例えば生物活性を有する領域もしくはドメインなどに相当する断片;その抗原性断片を含み、かつ他のタンパク質もしくはその一部と対象ポリペプチドとの融合体を含む、既知のBIMポリヌクレオチドのオープンリーディングフレームORFによりコードされるアミノ酸配列を包含する。BIMポリペプチドのアミノ酸配列は開示されている。例えばMooreら、既出を参照されたい。BIMポリペプチドにおける多型は、一般的に、参照配列に対して定義される。本明細書で用いる場合、多型BIMポリペプチドは、i天然多型BIMポリペプチド、ii多型BIMポリペプチドの断片、iii多型BIMポリペプチドのポリペプチド類似体、iv多型BIMポリペプチドのバリアント、v多型BIMポリペプチドの免疫活性断片およびvi多型BIMポリペプチドを含む融合タンパク質のアミノ酸配列を有する組換えまたは非組換えポリペプチドのアミノ酸配列のことをいう。多型BIMポリペプチドは、生体試料から、または自然、合成、半合成もしくは組換えのいずれかの供給源から得ることができる。用語多型BIMポリペプチドは、少なくとも約5アミノ酸、少なくとも約10アミノ酸、少なくとも約15アミノ酸、少なくとも約25アミノ酸、少なくとも約50アミノ酸、少なくとも約75アミノ酸、少なくとも約100アミノ酸、少なくとも約200アミノ酸、少なくとも約300アミノ酸、少なくとも約400アミノ酸から、または多型BIMポリペプチドのポリペプチド全体までを含むポリペプチドを包含する。いくつかの実施形態では、多型BIMポリペプチドは、生物活性を示し、例えば、ポリペプチドは、invitroアッセイにおいてB細胞の増殖および免疫グロブリンの生成を引き起こす。BIM生物活性についての他のアッセイは、当該技術において知られており、多型BIMポリペプチドが生物活性を示すかを決定し、かつ所望により、BIM生物活性を定量するために用いることができる。BIM生物学的アッセイは、様々な出版物、例えばMooreら、既出に記載されている。多型BIMポリペプチドは、融合タンパク質の一部であってよい。適切な融合パートナー例えば非BIMポリペプチドまたは異種ポリペプチドは、それらに限定されないが、免疫認識をもたらす異種ポリペプチド、例えばエピトープタグ;検出可能なシグナルをもたらす異種ポリペプチド、例えば緑色蛍光タンパク質GFP、β-ガラクトシダーゼなど;触媒機能をもたらす異種ポリペプチド;および細胞への侵入を容易にする異種ポリペプチドを含む。融合パートナーは、多型BIMポリペプチドのN末端、C末端またはその両方にインフレームで、ポリペプチドの合成の標準的な方法を用いて、または組換え法を用いて結合させることができる。多型BIMポリペプチドは、自然の供給源からの単離;化学合成による生成;および標準的な組換え技術による生成を含む任意の既知の方法、またはそのような方法の組合せにより得ることができる。多型BIMポリペプチドは、生物学的供給源から、親和性クロマトグラフィーを用いて、例えば固体支持体に固定化されたBIMポリペプチドに特異的な抗体を用いて単離できる。ポリペプチドは、発現の目的に応じて、従来の様式に従って原核または真核生物において発現できる。タンパク質の大規模生成のために、E.coli、B.subtilis、S.cerevisiaeのような単細胞生物、バキュロウイルスベクターと組み合わせた昆虫細胞、または脊椎動物、特に哺乳動物のような高等生物の細胞、例えばCOS7細胞、CHO細胞、HEK293細胞などを発現宿主細胞として用いてよい。いくつかの状況では、遺伝子を真核細胞において発現させることが望ましく、ここでは、タンパク質は、天然のフォールディングと翻訳後修飾により利益を受ける。ポリペプチドは、次いで、細胞培養物上清または細胞溶解物から、上記のように親和性クロマトグラフィー法またはアニオン交換/サイズ排除クロマトグラフィー法を用いて単離できる。発現宿主を採用することにより大量のタンパク質またはその断片を入手して、タンパク質を従来の様式に従って単離および精製してよい。溶解物を発現宿主から調製し、溶解物を、HPLC、排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、親和性クロマトグラフィーまたは他の精製技術により精製できる。BIM多型の検出多型または変異、例えば本明細書に記載するBIM多型についてDNAを分析するためにいくつかの異なる方法が、通常、用いられる。よって、個体に由来するポリヌクレオチド試料中のBIM多型の検出は、それらに限定されないが、特異的プライマーを用いる配列の増幅;ポリヌクレオチド試料のヌクレオチド配列の決定;ハイブリダイゼーション分析;1本鎖高次構造多型分析;変性勾配ゲル電気泳動;ミスマッチ切断検出などを含む当該技術において知られる任意の手段により達成できる。BIM多型の検出は、BIM遺伝子のmRNA転写産物レベルの変化;BIM遺伝子の異常改変、例えば異常メチル化パターン;BIMmRNAの非野生型スプライシングパターンの存在;BIMポリペプチドレベルの変化;および/またはBIMポリペプチド生物活性の変化の検出により達成することもできる。試料個体に由来する例えば個体から得られるポリヌクレオチド試料は、個体から採取された生体試料から得られる。個体からのポリヌクレオチドを含む任意の生体試料は、用いるのに適している。生体試料は、ポリヌクレオチドを単離するように処理してもよい。代わりに、全細胞または他の生体試料を、その中に含まれるポリヌクレオチドを単離することなく用いてよい。核酸増幅ポリヌクレオチド試料を分析することによるBIM多型の検出は、いくつかの様式で行うことができる。試験核酸試料は、BIM多型複数可を含むことが知られている配列領域を増幅するプライマーを用いて増幅できる。ゲノムDNAまたはmRNAを、直接用いることができる。代わりに、対象の領域を適切なベクターにクローニングして、分析のために十分な量に成長させることができる。核酸は、分析のために十分な量を提供するために、ポリメラーゼ連鎖反応PCR、リガーゼ連鎖反応LCRなどのような従来の技術により増幅してよい。ポリメラーゼ連鎖反応の使用は、例えばPCRProtocolsMethodsinMolecularBiology2000J.M.S.BartlettおよびD.Stirling編、HumanaPress;ならびにPCRApplications:ProtocolsforFunctionalGenomics1999Innis、GelfandおよびSninsky編、AcademicPressを含む様々な出版物に記載されている。検出可能な標識を増幅反応に含めてよい。適切な標識は、蛍光色素、例えばフルオレセインイソチオシアネートFITC、ローダミン、テキサスレッド、フィコエリスリン、アロフィコシアニン、6-カルボキシフルオレセイン6-FAM、2’,7’-ジメトキシ-4’,5’-ジクロロ-6-カルボキシフルオレセインJOE、6-カルボキシ-X-ローダミンROX、6-カルボキシ-2’,4’,7’,4,7-ヘキサクロロフルオレセインHEX、5-カルボキシフルオレセイン5-FAMまたはN,N,N’,N’-テトラメチル-6-カルボキシローダミンTAMRA、放射活性標識、例えば32P、35S、3Hなどを含む。標識は、2段階系であってよく、ここでは、増幅DNAが、高親和性結合パートナー、例えばアビジン、特異的抗体などを有するビオチン、ハプテンなどとコンジュゲートし、結合パートナーが検出可能な標識とコンジュゲートする。標識は、プライマーの一方または両方とコンジュゲートしてよい。代わりに、増幅に用いたヌクレオチドのプールを標識して、標識を増幅生成物中に組み込む。BIM多型を含む領域を一旦増幅すると、BIM多型は、PCR生成物中で、ヌクレオチド配列決定により、SSCP分析により、または当該技術において知られる任意の他の方法により検出できる。核酸配列決定最も決定的な方法は、DNAまたは転写されたmRNA入手可能であればを配列決定して、実際の塩基配列を決定することであるMaxamおよびGilbert、1977;Sangerら、1977。試料の核酸は、ジデオキシ鎖ターミネーション法またはその他の公知の方法により配列決定できる。ゲノムDNAまたはmRNAを直接用いてよい。mRNAを用いるならば、cDNAコピーをまず作製してよい。所望により、試料の核酸は、PCRを用いて増幅できる。当該技術において知られる様々な配列決定反応を用いて、BIM遺伝子または特定の多型が生じることが知られているその一部を直接配列決定して、試料の核酸の配列を、BIM多型を含有する参照ポリヌクレオチドと比較することにより多型を検出できる。様々な自動化配列決定手順のいずれも用いることができる。例えば、WO94/16101;Cohenら1996Adv.Chromatography36:127~162頁を参照されたい。このような方法は最も決定的であるが、これは、最も費用と時間がかかる方法でもある。制限マッピング分析RFLP分析個体における特定のDNA配列、例えばBIMBCL2L11遺伝子の多型バリアントをコードする遺伝子は、DNAの配列の欠失、重複する配列の挿入、配列の逆位または単一ヌクレオチドから別のものへの変換のような多くの異なる変化を受けることがある。特定のDNA配列中の変化は、4~6ヌクレオチドの特異的DNA配列を認識する制限酵素を用いることにより追跡できる。制限マッピング分析は、よって、多型についてのDNAの分析においても用いることができる。ある制限酵素についての認識部位を変化させる部位にて既知の多型について探しているならば、この制限酵素を用いて単純にDNAを消化し、断片をゲル上でまたはサザンブロットを用いて分析して、多型の存在または非存在を決定することが可能である。この型の分析は、全体的な挿入または欠失の存在または非存在を決定するためにも有用である。対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションは、既知の多型の存在を決定するためのさらに別の方法である。制限酵素は、DNAを、それらの特異的認識配列にて切断消化し、1百万程度の破片をもたらす。制限酵素により認識される配列を、認識されないものに変化させる相違が存在する場合、領域を切断することにより生成されるDNAの破片は、異なるサイズのものである。よって、ある領域からの様々な可能性のある断片サイズは、領域内のDNAの精密な配列に依存する。生成される断片の変動は、制限断片長多型RFLPとよばれる。異なるバリアントDNA配列を反映する異なるサイズの断片は、消化されたDNAをそのサイズに従って分離することにより視覚化できる。ゲルまたはキャピラリー電気泳動、特にアクリルアミドまたはアガロースゲルのような様々な手段により分画を行ってよい。例えば、DNA断片は、アガロースゲル上にあって、放射活性標識DNAプローブとのアニーリングにより個別の断片を視覚化してよい。各個体は、特定の配列の2つの異なる形を有することがある。2つのホモログが同じ形の多型を保有する場合、1つのバンドが観察される。2以上の形の多型が、集団中の特定のDNAマーカーについて存在することがあるが、1つの家系において、4つの形だけが可能であるそれぞれの親から2つ。それぞれの子供は、それぞれの親から1つの形の多型を受け継ぐ。よって、各染色体領域の起源を追跡できる母性または父性起源。上記の技術は、当該技術において公知である。これらの技術についての詳細な記載は、例えばLaboratoryMethodsfortheDetectionofMutationsandPolymorphismsinDNA1997G.R.Taylor編、CRCPressおよびそこで引用される参考文献を含む様々な出版物において見出すことができる。逆転写ポリメラーゼ連鎖反応RT-PCR代わりにまたはさらに、RT-PCRを行うことができる。PCRは、よって、多型に特異的なプライマーを用いることにより多型が存在するかを決定するためにも用いてよい。このような方法は、鋳型として個体の遺伝物質を含む生体試料を個体から回収するステップと、場合によって、鋳型核酸ゲノムDNA、mRNAまたはその両方を生体試料から単離するステップと、鋳型核酸試料を、BIM多型核酸分子と特異的にハイブリダイズする1もしくは複数のプライマーと、試料中の鋳型核酸分子のハイブリダイゼーションおよび増幅が生じる条件下で接触させるステップと、増幅生成物の存在、非存在および/もしくは相対的量を検出するステップと、タイの長さを対照試料と比較するステップとを含み得る。予想されるサイズの増幅生成物が観察されることは、BIM多型プライマー内に含まれるBIM多型が、試験核酸試料中に存在することを示す。ハイブリダイゼーション条件、BIM多型プライマー長、およびBIM多型プライマー内の多型の位置のようなパラメータは、プライマー複数可内に存在する多型が試料の核酸内にも存在しない限りハイブリダイゼーションが生じないように選択できる。当業者は、このようなパラメータをどのように選択し、変動させるかをよく認識している。例えば、Saikiら1986Nature324:163頁;およびSaikiら1989Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:6230頁を参照されたい。ハイブリダイゼーション分析バリアント配列とのハイブリダイゼーションを用いて、BIM多型の存在を決定することもできる。ハイブリダイゼーション分析は、それらに限定されないが、サザンブロット、ノザンブロット、ドットブロット、マイクロアレイなどを含むいくつかの異なる様式で行うことができる。米国特許第5,445,934号またはWO95/35505に記載されるような、固体支持体上に固定化されたオリゴヌクレオチドプローブのアレイへの対照およびバリアント配列のハイブリダイゼーションパターンは、バリアント配列の存在を検出するための手段として用いてもよい。核酸試料中の多型の同定は、試料および対照の核酸を、数百または数千のオリゴヌクレオチドプローブを含有する高密度アレイにハイブリダイズさせることにより行うことができる。Croninら1996HumanMutation7:244~255頁;およびKozalら1996NatureMed.2:753~759頁。質量分析既知遺伝子内の多型の存在を決定するための質量分析の使用は、米国特許第5,869,242号に開示されている。オリゴヌクレオチドライゲーション代わりに、オリゴヌクレオチドライゲーションを、多型を検出する手段として利用する様々な方法が当該技術において知られている。例えばRileyら1990NucleicAcidsRes.18:2887~2890頁;およびDelahuntyら1996Am.JHum.Genet.58:1239~1246頁を参照されたい。1本鎖高次構造多型SSCP分析1本鎖高次構造多型SSCP分析は、多型を検出するための迅速で有効な方法であるDeanら、Cell61:863頁、1990;GlavacおよびDean、Hum.Mutation2:404頁、1993;Podusloら、Am.J.Hum.Genet.49:106頁、1992。SSCPでは、ゲル上での異常な鎖の移動性は、遺伝子内の変異事象と関連する。ゲルマトリクス中での変性勾配ゲル電気泳動DGGE、ミスマッチ切断検出およびヘテロ2重鎖分析も、多型を検出するために用いてよい。制限エンドヌクレアーゼフィンガープリンティングREF制限エンドヌクレアーゼフィンガープリンティングREFを、場合によってRT-PCRを行った後に行うこともできる。REFは、1本鎖高次構造多型SSCP法の改変であり、2kbの長さまでのDNA断片中の配列の変更を効率よく検出することを可能にするLiuおよびSommer、1995。多型の遺伝子分析は、なかでも米国特許第5,552,28号、第5,654,13号、第5,670,33号、第5,807,67号、第5,858,66号、第5,691,15号、第5,922,57号、第5,972,60号、第6,136,53号および第5,955,26号に詳細に開示されている。対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドASOドットブロット分析特定の遺伝子上の多型を検出するための別の方法は、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドASOドットブロット分析に従うことであるConner,B.J.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.、80、278~282頁1983。この方法は、標的多型を挟むように設計されたフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いたPCR増幅遺伝子断片の対立遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズ可能なDNA断片をドットブロット分析に供することにより行うことができる。この様式で、このようなDNA断片上の多型を検出できる。ポリペプチド分析多型がアミノ酸の変化を含む場合、分析される遺伝子の発現生成物を用いて多型の分析を行うことが可能である。この場合、多型部位に相当するアミノ酸を含有する限り、部分タンパク質または部分ペプチドを分析のための試料として用いることができる。多型部位にてアミノ酸を直接アッセイする方法または免疫学的方法をこの場合に用いてよい。エドマン法のような既知のアミノ酸配列分析法を前者において用いてよく、遺伝子の発現生成物に特異的な結合活性を有するモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いる方法、例えば酵素結合免疫吸着アッセイ法ELISA法、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降法または免疫拡散法を後者において用いてよい。上記のようにして得られる多型についての情報は、統計的に合計して、疾患の診断、罹患についての相対的リスクの検出および識別、ならびに療法の選択のために用いてよい。発現分析特定の試料中の多型BIM核酸分子、例えば多型BIMmRNAまたは多型BIMポリペプチドの発現レベルを決定するために、いくつかの方法が利用可能である。診断をいくつかの方法により行って、患者の試料中の正常もしくは異常BIMmRNAの存在または非存在または量の変化を決定してよい。例えば、検出は、従来の方法に従って行われる、標識抗体を用いる細胞または組織学的切片の染色を利用してよい。細胞は、細胞質の分子を染色するために透過にされる。対象の抗体を細胞試料に加え、エピトープとの結合を可能にするのに十分な時間、通常少なくとも約10分間インキュベートする。抗体は、放射性同位体、酵素、蛍光剤、化学発光剤または直接検出のためのその他の標識を用いて標識してよい。代わりに、第2段階の抗体または試薬を用いてシグナルを増幅する。このような試薬は、当該技術において公知である。例えば、1次抗体をビオチンとコンジュゲートさせ、セイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲートアビジンを第2段階試薬として加えてもよい。代わりに、2次抗体を蛍光化合物、例えばフルオレセイン、ローダミン、テキサスレッドなどとコンジュゲートさせる。最終検出は、ペルオキシダーゼの存在下で色の変化を経る基質を用いる。抗体結合の非存在または存在は、解離細胞のフローサイトメトリー、顕微鏡観察、X線撮影法、シンチレーション計数などを含む様々な方法により決定してよい。多型BIMポリペプチドの存在および/またはレベルは、当業者に知られる任意の様式で検出および/または定量してもよい。さらに、試験は、BIMmRNAの発現の測定を含み得る。生化学的研究を行って、BIMコード領域または制御領域内の配列多型が疾患と関連するかを決定してよい。疾患関連多型は、遺伝子の欠失もしくは切断、発現レベルを変更する変異、タンパク質の活性に影響する変異などを含むことがある。BIMの発現レベルに影響し得るプロモーターまたはエンハンサー配列中の変化を、当該技術において知られる様々な方法により、正常対立遺伝子の発現レベルと比較できる。プロモーターまたはエンハンサー強度を決定する方法は、発現した自然タンパク質の定量;簡便な定量をもたらすβ-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼなどのようなレポーター遺伝子とともにベクターへのバリアント制御エレメントの挿入などを含む。多型BIMポリペプチド中の変異についてのスクリーニングは、タンパク質の機能的または抗原性の特徴に基づいてよい。タンパク質切断アッセイは、タンパク質の生物活性に影響し得る欠失を検出するために有用である。多型BIMポリペプチド内の多型を検出するために設計された様々なイムノアッセイを、スクリーニングにおいて用いてよい。多くの多様な遺伝子変異が特定の疾患表現型を導く場合、機能的タンパク質アッセイが、効果的なスクリーニングツールであることが証明されている。コードされる多型BIMポリペプチドの活性は、特定の多型を欠く参照BIMポリペプチドとの比較により決定できる。BIM遺伝子発現のレベルが興味の対象である診断方法は、対象の試料のBIM核酸の豊富さを、対照値のものと比較して、いずれかの相対的な相違を決定することを典型的に含み、ここで、相違は、定性的および/または定量的に測定してよく、この相違を、次いで、異常BIM遺伝子発現パターンの存在または非存在と関連させる。試料中の核酸の豊富さを決定するための様々な異なる方法が当業者に知られており、対象の具体的な方法は、Pietuら、GenomeRes.1996年6月6:492~503頁;Zhaoら、Gene1995年4月24日156:207~213頁;Soares、Curr.Opin.Biotechnol.1997年10月8:542~546頁;Raval、J.PharmacolToxicolMethods1994年11月32:125~127頁;Chalifourら、Anal.Biochem1994年2月1日216:299~304頁;StolzおよびTuan、Mol.Biotechnol.19960年12月6:225~230頁;Hongら、BioscienceReports19822:907頁;ならびにMcGraw、Anal.Biochem.1984143:298頁に記載されるものを含む。また、WO97/27317その開示は、本明細書に参照により組み込まれているに開示される方法も対象である。BIMBCL2L11BIMは、BAM;BIM;BOD;BimL;BimEL;BIM-ベータ6;BIM-ベータ7;BIM-アルファ6;BCL2L11としても知られる。BIM遺伝子およびポリペプチドのGenBank受託番号およびUCSC遺伝子IDは、次のとおりである。GeneBank受託番号:遺伝子転写産物タンパク質NM_207002NP_996885NM_138621NP_619527NM_006538NM_006538UCSC遺伝子ID:遺伝子転写産物タンパク質uc002tgw.1タンパク質なしuc002tgx.1タンパク質なしuc010fkd.1タンパク質なしuc002tgy.1タンパク質なしuc002tgz.1O43521uc010fke.1タンパク質なしuc002tha.1O43521uc002thb.1タンパク質なしuc002thc.1タンパク質なしuc002thd.1O43521以下の転写産物についての記載は、上に列挙するGeneBank受託番号およびUCSC遺伝子IDに相当する。NCBIGeneBankRefSeqNM_207002.2HomosapiensBCL2様11アポトーシス促進物質BCL2L11、転写産物バリアント9、mRNA。NM_138621.3HomosapiensBCL2様11アポトーシス促進物質BCL2L11、転写産物バリアント1、mRNA。NM_006538.3HomosapiensBCL2様11アポトーシス促進物質BCL2L11、転写産物バリアント6、mRNA。UCSC遺伝子bim-アルファ1uc002tgw.1Bim-アルファ1、完全cds。RefSeqNM_006538:bim-アルファ1uc002tgx.1Bim-アルファ1、完全cds。RefSeqNM_006538:bim-アルファ1uc010fkd.1Bim-アルファ1、完全cds。RefSeqNM_006538:bim-アルファ1uc002tgy.1Bim-アルファ1、完全cds。RefSeqNM_006538:bim-アルファ1uc002tgz.1BCL2様11転写産物バリアント9。RefSeqNM_006538bim-アルファ1uc010fke.1Bim-アルファ1、完全cds。RefSeqNM_006538:BCL2L11uc002tha.1BCL2様11アイソフォーム9RefSeqNM_138621:bim-アルファ1uc002thb.1Bim-アルファ1、完全cds。RefSeqNM_006538:bim-アルファ1uc002thc.1Bim-アルファ1、完全cds。RefSeqNM_006538:BCL2L11uc002thd.1BCL2様11アイソフォーム9RefSeqNM_006538:UCSCゲノムブラウザデータベース/データについての文献RheadB、KarolchikD、KuhnRM、HinrichsAS、ZweigAS、FujitaP、DiekhansM、SmithKE、RosenbloomKR、RaneyBJ、PohlA、PheasantM、MeyerL、HsuF、Hillman-JacksonJ、HarteRA、GiardineB、DreszerT、ClawsonH、BarberGP、HausslerD、KentWJ.TheUCSCGenomeBrowserdatabase:update2010.NucleicAcidsRes.2010年1月;38データベース版:D613~9.Epub2009年11月11日。この遺伝子によりコードされるタンパク質は、BCL-2タンパク質ファミリーに属する。BCL-2ファミリーメンバーは、ヘテロ二量体またはホモ二量体を形成し、広い多様性の細胞活動に関与する抗アポトーシスまたはアポトーシス促進性の調節物質として働く。この遺伝子によりコードされるタンパク質は、Bcl-2ホモロジードメイン3BH3を含有する。これは、BCL2、BCL2L1/BCL-XLおよびMCL1を含むBCL-2タンパク質ファミリーの他のメンバーと相互作用し、アポトーシスアクチベーターとして働くことが示されている。この遺伝子の発現は、神経増殖因子NGFにより、およびフォークヘッド転写因子FKHR-L1により誘発でき、このことは、神経およびリンパ球アポトーシスにおけるこの遺伝子の役割を示唆する。マウスでの対応物のトランスジェニック研究は、この遺伝子が、胸腺細胞の負の選択におけるアポトーシスの必須の発動因子として機能することを示唆した。この遺伝子のいくつかの代替スプライス転写産物バリアントが同定されている[RefSeqにより提供される]。慢性骨髄性白血病CMLにおけるチロシンキナーゼ阻害剤処置に対する耐性の予測我々の発見は、以下の状況において臨床的利用性を有し得る。BIM欠失を有する患者は、その状態をより頻繁にモニタリングすることにより利益を受けることができる。このことにより、代替および/またはより攻撃的な治療、例えば骨髄移植をより早期に用いることが可能になり、より良好な臨床転帰を潜在的に導くことができる。BIM欠失は、治療の手引きとして用いることができる。例えば、欠失を有する患者は、BH3模倣剤として知られるクラスの薬物に対して特に感受性が高いことがあるTKI耐性患者の部分群であり得る参考文献A8~A12。ABT-263現在、早期段階の臨床試験中のようなこのような薬物は、BCL2ファミリーのタンパク質の生存促進性メンバーこれは、通常、BIMタンパク質の死滅促進性ファミリーに対抗するを選択的に標的にする。CMLは、造血幹細胞のがんであり、BCR-ABLとよばれる発癌性融合遺伝子これは、疾患の原因因子であると考えられるの存在により引き起こされる。BCR-ABLは、正常な対応物と比較した場合にCML細胞の生存および増殖の増加を媒介する構成的活性型チロシンキナーゼをコードする。CMLに対する効果的な処置は、BCR-ABLのキナーゼ活性を阻害するクラスの薬物の形であり、これらは、一般的に、チロシンキナーゼ阻害剤TKIとよばれる。しかし、時間が経つと、一部分の患者は、これらの薬物に対して臨床耐性を生じ、この事象は、急性転化BCCMLへの転換およびより短い生存にしばしば随伴する。約60の患者において、TKI耐性は、TKIをBCR-ABLと結合しにくくするBCR-ABL遺伝子の変異、または野生型BCR-ABL遺伝子もしくはタンパク質の過剰発現によるBCR-ABLの再活性化を伴う。両方の場合において、BCR-ABLキナーゼ活性は、TKIの存在下で回復し、よってBCR-ABL依存性TKI耐性との用語が用いられる。残りの40の症例では、TKI耐性は、BCR-ABL再活性化の非存在下で生じ、BCR-ABL非依存性TKI耐性とよばれる。現在までに、BCR-ABL非依存性TKI耐性の原因は不明であり、この形の耐性を媒介する機構の理解が深まることは、TKI耐性を克服するための方策を決定するために重要である。TKI耐性は、TKI耐性を生じる患者とそうでない患者との間の後天性または遺伝性の遺伝子の相違により媒介されるはずであるので、我々は、このような相違の同定が、TKI耐性の機構を解明するための見込みのあるアプローチであると推論する。したがって、我々は、ハイスループット配列決定と結び付けたゲノムペアエンドタグまたはDNA-PETとよばれる新規な技術を用いて、薬物耐性を有するかまたは有さず、BCR-ABLキナーゼドメイン変異を有するおよび有さない患者からの初代CML細胞のゲノムを調べた。本開示では、我々は、我々のチームによる以下の新規な発見について記載する。DNA-PETの使用により、我々は、BCR-ABL非依存性TKI耐性の発生と関連する、BIM遺伝子中の以前は知られていなかった欠失を明らかにした。CML患者試料の臨床的にアノテートされたセットを用いて、我々は、この欠失を有する患者が、欠失を有さない患者よりも、BCR-ABL非依存性TKI耐性を有する見込みが4から5倍高いことを見出したp=0.04、Fisherの両側正確検定。次に、我々は、患者由来CML株化細胞におけるBIM欠失の存在が、BCR-ABL非依存性TKI耐性と強く関連することを見出した。7つの患者由来CML株化細胞のパネルを用いて、我々は、欠失を有する1つの株化細胞を見出した。重要なことに、BIM欠失含有株化細胞だけが、BCR-ABL非依存性TKI耐性を示した。これらの結果は、BCR-ABL非依存性TKI耐性におけるBIM欠失についての直接的な機構的役割を示唆する。BIMタンパク質の上方制御がTKI媒介CML細胞死に必要であることがわかっているので、我々は、BIM欠失がBIMのアポトーシス促進性アイソフォームの発現を減退させると仮定する。BIM欠失のさらなる分析図4Cに示す配列番号3および4に記載するプライマーを用いる実施例2に記載するようなPCRアッセイ、SNP分析ならびにHapMapデータを用いてにより、欠失が、実際は、東アジア系の個体のおよそ10の頻度を有する正常な多型であることが明らかになった。欠失多型は、60の白人HapMap試料および446のドイツ人血液提供者のスクリーニングに基づいて白人には存在しない見込みがあるか、または60のヨルバ族HapMap試料のスクリーニングに基づいて、アフリカ人ヨルバ族集団にも存在しない見込みがある表E6。BIM欠失の人種による分離と一貫して、b.に記載する欠失を有する株化細胞は、CMLの日本人個体に由来することが見出された参考文献A31。この知見は、以下の項に記載するように、いくつかの意味および潜在的な臨床的使用を有する。本発明は、次のようにして用いることができる。CML患者がTKI耐性を生じるかを発症時に予測することは、現在のところ不可能である。TKI耐性を生じるリスクの増加と関連する遺伝的因子を同定することにより、東アジア人集団において、このような個体を同定することが今回可能になり得る。BIM欠失を有する患者を、次いで、医師がより密接に追跡し、現在推奨されているよりも高い頻度で疾患状態をモニタリングすることを勧めることができる。これらは、より頻度が高い血液および骨髄検査を含み得る。さらに、BIM欠失の存在は、特定の代替治療方策に対する感受性を予測できる。これらは、400mg/日の標準用量を超えて600または800mg/日までイマチニブの用量を増加することを含む。代わりに、このような患者は、BCL2群タンパク質BIMタンパク質が通常対抗するの生存促進性効果を阻害する新規なクラスの薬物を用いて処置できる可能性がある。この後者の可能性について、我々の研究室で現在調べている。重要なことに、TKIおよび他の標的治療は非常に高価であるので、BIM欠失を有することが見出された患者を管理する医師は、この知見を、より高い薬物用量の使用もしくは治療の変更に伴う費用の増加を患者および/または第三者支払人に対して正当化するため、または欠失の非存在下でのこれらの方策を回避するための根拠として用いることができる。その他の疾患他のがんの患者におけるBIM欠失の存在も、薬物耐性の発生についての予測因子および代替治療のための手引きとして用いることができる。これは、CMLについて記載した状況と同じであり、他の血液悪性腫瘍慢性リンパ球性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病および多発性骨髄腫、骨髄増殖性疾患真性赤血球増加症、本態性血小板血症および原発性骨髄線維症を含むならびに最も一般的な固形腫瘍非小細胞および小細胞肺がん、乳がん、結腸直腸がん、卵巣がん、メラノーマおよび神経芽腫および消化管間質性腫瘍GISTを包含し得る。よって、本明細書で開示するBIM多型は、EGFR駆動型非小細胞肺がんNSCLCおよび消化管間質性腫瘍GIST、GordonおよびFisher、2010のような他の疾患におけるキナーゼ阻害剤処置に対する耐性を検出するために用いることもできる。したがって、本明細書で開示するBIM多型を保有するこのようながんおよび腫瘍の患者は、それらのそれぞれの発癌性キナーゼを標的にする治療に対して耐性がある見込みがより高い。さらに、Willら、ApoptosisinducedbyJAK2inhibitionismediatedbyBimandenhancedbytheBH3mimeticABT-737inJAK2mutanthumanerythroidcells.Blood82010年4月、115巻、14号も参照される。この文書は、JAK2活性化変異によって特徴付けられる骨髄増殖性疾患について記載している。この文献は、JAK阻害剤も感受性のためにBIM発現を必要とすることの証拠を提供する。したがって、本明細書で開示するBIM多型は、さらに、真性赤血球増加症、本態性血小板血症および原発性骨髄線維症のような骨髄増殖性疾患におけるキナーゼ阻害剤処置に対する耐性を検出するために用いることができる。本明細書で開示するBIM多型を保有する患者のような骨髄増殖性疾患の患者は、それらのそれぞれの発癌性キナーゼを標的にする治療に対して耐性がある見込みがより高い。我々は、このような多型を含む個体における、EGFR駆動型非小細胞肺がんNSCLC、c-KIT/PDGFR駆動型消化管間質性腫瘍GISTまたはJAK2駆動型骨髄増殖性疾患に罹患している個体におけるキナーゼ阻害剤を用いる処置に対する耐性と関連するBIMBCL2L11遺伝子の多型バリアントを開示する。EGFR駆動型非小細胞肺がんNSCLCを処置するために用いるキナーゼ阻害剤の例は、ゲフィチニブおよびエルロチニブを含み、消化管間質性腫瘍GISTを処置するために用いるキナーゼ阻害剤の例は、イマチニブである。骨髄増殖性疾患は、それらの原因因子キナーゼに対するキナーゼ阻害剤、例えばJAK2に対する阻害剤を用いて処置できる。BIM多型は、5’から3’の順序で、配列番号5に示すヌクレオチド配列と、その直後に続く配列番号7に示すヌクレオチド配列とを含む、BIMBCL2L11遺伝子の多型バリアントを含み得る。多型バリアントBIMBCL2L11は、配列番号6に示すヌクレオチド配列を欠くことによって特徴付けられ得る。我々は、非小細胞肺がんNSCLCに罹患している個体が、キナーゼ阻害剤を用いる処置に対する耐性を生じる見込みがあるかを予測する方法であって、個体が、記載されるBIMBCL2L11多型を有するかを決定するステップを含む方法を開示する。耐性は、EGFR再活性化に依存しないことがある。非小細胞肺がんNSCLCは、EGFR駆動型非小細胞肺がんNSCLCのようにEGFR活性化と関連するかまたはそれにより引き起こされる非小細胞肺がんNSCLCを含み得る。我々は、さらに、消化管間質性腫瘍GISTに罹患している個体が、キナーゼ阻害剤を用いる処置に対する耐性を生じる見込みがあるかを予測する方法であって、個体が、記載されるBIMBCL2L11多型を有するかを決定するステップを含む方法を開示する。耐性は、c-KIT/PDGFR再活性化に依存しないことがある。消化管間質性腫瘍GISTは、c-KIT/PDGFR駆動型消化管間質性腫瘍GISTのようなc-KIT/PDGFR活性化と関連するかまたはそれにより引き起こされる消化管間質性腫瘍GISTを含み得る。我々は、骨髄増殖性疾患に罹患している個体が、キナーゼ阻害剤を用いる処置に対する耐性を生じる見込みがあるかを予測する方法であって、個体が、記載されるBIMBCL2L11多型を有するかを決定するステップを含む方法も開示する。耐性は、JAK2再活性化に依存しないことがある。骨髄増殖性疾患は、JAK2駆動型骨髄増殖性疾患のようなJAK2活性化と関連するかまたはそれにより引き起こされる骨髄増殖性疾患を含み得る。我々は、例えば配列番号3に示すヌクレオチド配列と配列番号4に示すヌクレオチド配列とを含むプライマーセットを用いることにより、配列番号1に示す配列を含む核酸増幅生成物の存在を検出するステップを含む方法であって、個体がBIMBCL2L11多型を有すると決定されるならば、該個体は、キナーゼ阻害剤を用いる非小細胞肺がんNSCLCの処置に対する耐性を生じる見込みがある方法を開示する。我々は、さらに、個体がBIMBCL2L11多型を有すると決定されるならば、該個体は、キナーゼ阻害剤を用いる消化管間質性腫瘍GISTの処置に対する耐性を生じる見込みがあるそのような方法を開示する。我々は、個体がBIMBCL2L11多型を有すると決定されるならば、該個体は、キナーゼ阻害剤を用いる骨髄増殖性疾患の処置に対する耐性を生じる見込みがあるそのような方法も開示する。逆に、このような個体がBIMBCL2L11多型を有さないと決定されるならば例えば配列番号2に示す配列を含む核酸増幅生成物の存在が検出されるならば、該個体は、キナーゼ阻害剤を用いる非小細胞肺がんNSCLCの処置に対する耐性を生じる見込みがより低い。同様に、このような方法では、個体がBIMBCL2L11多型を有さないと決定されるならば、該個体は、キナーゼ阻害剤を用いる消化管間質性腫瘍GISTの処置に対する耐性を生じる見込みがより低い。また、このような方法では、個体がBIMBCL2L11多型を有さないと決定されるならば、該個体は、キナーゼ阻害剤を用いる骨髄増殖性疾患の処置に対する耐性を生じる見込みがより低い。我々は、非小細胞肺がんNSCLCもしくは消化管間質性腫瘍GISTもしくは骨髄増殖性疾患または上記のいずれかの組合せの個体に対する特定の治療の成功の見込みを決定する方法であって、該治療を、上記の方法により決定される治療と比較するステップを含む方法について記載する。我々は、さらに、個体におけるキナーゼ阻害剤耐性非小細胞肺がんNSCLCの診断方法であって、個体における上記のBIMBCL2L11多型の存在を検出するステップを含む方法について記載する。我々は、個体におけるキナーゼ阻害剤耐性消化管間質性腫瘍GISTの診断方法であって、個体における上記のBIMBCL2L11多型の存在を検出するステップを含む方法についても記載する。我々は、個体におけるキナーゼ阻害剤耐性骨髄増殖性疾患の診断方法であって、個体における上記のBIMBCL2L11多型の存在を検出するステップを含む方法について記載する。我々は、非小細胞肺がんNSCLCおよび/または消化管間質性腫瘍GISTおよび/または骨髄増殖性疾患に罹患している患者を処置する方法であって、がんがキナーゼ耐性がんであるかを上記の方法により決定するステップと、患者を処置するステップとを含む方法を提供する。実施例1.Bim-アルファ1における欠失の存在をスクリーニングするためのアッセイ標準的プロトコール/DNA抽出用キット血液からのDNA抽出のためにQiagen血液および細胞培養物DNAMidiキットcat.No13343詳細についてQIAGEN_Genomic_DNA_Handbook.pdfを参照されたいまたは頬側スワブからのDNA抽出のためにMasterAmp商標頬側スワブDNA抽出キット。QiagenAllprepDNA/RNAミニキットcat.No80204、QiagenInc、Valencia、California、UnitedStatesofAmericaを用いることも可能である。実施例2.Bim欠失検出のためのゲノムDNAを用いるPCRアッセイプライマー100uM各0.2μlゲノムDNA1μl50ngdNTP10mM2.5μlJumpstartTaq2.5μlSigma;Cat.D131310×緩衝液5μlH2O50μlまで加えるPCRプログラムステップ1:96°C、30秒ステップ2:94°C、15秒ステップ3:64°C、30秒ステップ4:68°C、5分ステップ5:ステップ2~4を11回反復ステップ6:94°C、15秒ステップ7:60°C、30秒ステップ8:68°C、5分ステップ9:ステップ6~8を17回反復ステップ10:68°C、20分16°Cを永続プライマーBim_del_FAATACCACAGAGGCCCACAGchr2:111,599,051..111,599,070Bim_del_RGCCTGAAGGTGCTGAGAAAG-chr2:111,603,257..111,603,276PCR生成物は、臭化エチジウムを用いて1アガロースゲル上で泳動させ、欠失なしで4,226bp欠失ありで1,323bpのサイズの生成物をUVスクリーン上で視覚化する。実施例3.材料および方法:患者および試料臨床試料は、IRB承認プロトコールに従って、theSingaporeGeneralHospitalおよびUniversityofMalayaで診察された患者から得た。単核細胞をFicoll遠心分離により単離し、製造者の使用説明に従ってAllPrepDNA/RNAミニキットQiagenを用いてDNA/RNAを抽出した。実施例4.材料および方法:DNA-PET分析および検証ゲノムDNAをハイドロシェアにかけて5、7および9Kbの断片にし、配列決定ライブラリーの構築のために用い、大量並列SOLiDシーケンサー表E1および以下の記載を参照されたいを用いて配列決定した。ペアエンドAppliedBiosystemsの用語:メイトペアライブラリーを、図9に示すようにして構築した。簡単に述べると、5~9KbのDNA断片の両端に対応した2×25bpのタグ構築物を、EcoP15Iを用いて作製した。2×25bpライブラリーのハイスループット配列決定を、製造者の推奨に従ってSOLiDシーケンサーAppliedBiosystemsで行った。配列タグを、ヒト参照配列NCBIBuild36、hg18に対してマッピングし、タグあたり2つの色コードミスマッチを可能にするSOLiDシステム分析パイプラインツール、CoronaLiteAppliedBiosystemsを用いて対合させた。ライブラリー挿入分布内であったペアエンドタグPETを、調和性PETcPETに類別した。cPET基準により却下されたPETを、不調和性PETdPETに類別した。これらは、さらに、5つの異なるカテゴリーに分けた;i異なる染色体上にマッピングされた2つのタグ、ii同じ染色体上であるが異なる鎖上にマッピングされた2つのタグ、iii同じ染色体上であるが、間違った順序3’の下流に5’でマッピングされた2つのタグ、iv同じ染色体上、同じ鎖上に正しい順序であるが、1.1×最大ライブラリーサイズより大きいスパン距離でマッピングされた2つのタグ、v同じ染色体上、同じ鎖上に正しい順序であるが、最小ライブラリーサイズより小さいスパン距離でマッピングされた2つのタグ。カテゴリーvをさらなる分析から除外した。配列タグが10Kb以内で同じゲノム領域に対して両側にマッピングされたdPETを、一緒にクラスタ分けした。第1タグの左および右に対する10Kb検索ウィンドウを、最も外側のタグ座標に従って10Kbに広げた。左5’および右3’のタグがマッピングされた領域を、アンカー領域と記載した。サイズ3以上のクラスタを、SVの同定のために保存した。単一dPETクラスタは、5’マッピングアンカー領域が3’マッピングアンカー領域から遠く離れているならば欠失、マッピング順序が通常の5’から3’でなく3’から5’であるならば直列重複、マッピングの向きが逆異なる鎖上であるならば不対合逆位、ならびに5’および3’アンカーが異なる染色体にマッピングされるならば孤立染色体間転座のような1つの再編成点を有するSVを同定できた。2つの位置が近いdPETクラスタを用いて、図10に記載する逆位、挿入および均衡転座のような2つの再編成点を有するSVを推測できた。異なるゲノムにわたるクラスタの比較を、両側に10Kbだけ拡張した5’および3’アンカー領域のオーバーラップに基づいて行った。第2ライブラリーのクラスタの5’アンカー領域が第1ライブラリーのクラスタの5’拡張アンカー領域とオーバーラップし、同じことが3’アンカー領域にもいえるならば、2つのクラスタを一緒に群分けし、アンカー領域の10Kb拡張を最も外側の開始および終了アンカー座標に従って調整した。遺伝子アノテーションは、ライブラリー特異的切断点を用いて2009年5月14日にUCSChttp://genome.ucsc.edu/;Rheadら、2010からダウンロードしたRefSeq遺伝子に基づいた。同定したSVを、本文書の他の場所で記載する32の正常個体のSVおよびDNA-PET品質基準に基づいてふるい分けした。いくつかの遺伝子座は、dPETクラスタの蓄積を示した。これらの遺伝子座にて、特定のSVをあるdPETクラスタに割り当てることは誤り導く可能性がある例えば、直列重複の切断点が欠失および/または転座に囲まれているならば、再編成は直列重複と解釈しないほうがよい。よって、切断点に基づく相互接続ネットワークを確立して、複雑な領域内の切断点を、孤立し、かつ複雑さがより少ないSVから分けた。切断点の近隣を決定するために、各dPETクラスタアンカー領域の始点および終点を、検索ウィンドウとしてそれぞれのゲノムライブラリーの最大挿入サイズだけ拡張した。近隣クラスタのウィンドウが互いにオーバーラップするならば、dPETクラスタを一緒にスーパークラスタに群分けした。この手順により、クラスタBを介してクラスタAからCへの間接的接続が可能になった。スーパークラスタに一緒に加えることができるdPETクラスタの数を、スーパークラスタサイズとして表した。3を超えるdPETクラスタを相互接続した場合、切断点の対は複雑と分類した染色体内および染色体間。蛍光insituハイブリダイゼーションFISHを次のようにして行った。細胞を0.75MKClで20分間、37°Cにて処置することにより核を採集した。次いで、数回の固定の後に、核をFISH用のスライド上に滴下した。EVI1プローブクローンRP11-137H17を緑色で標識し、chr8:127,950,637から130,664,919の挿入それぞれクローンRP11-828L6およびRP11-159N7をそれぞれ赤および黄で標識した。フォスミドプローブ調製のために、DNAを、ニックトランスレーションシステムInvitrogenを用いるビオチン-16-dUTPの存在下でのニックトランスレーションにより標識した。1μg/μlのCot1DNAの存在下で、DNAコスミドクローンを5ng/μlの濃度でハイブリダイゼーション緩衝液2SSC、10デキストラン硫酸、1×PBS、50ホルムアミドに再懸濁した。ハイブリダイゼーションの前に、核のスライドを0.01ペプシンで37°Cにて5分間処置した後に、1×PBSでのすすぎ、1ホルムアルデヒドでの10分間の処置、1×PBSでのすすぎ5分間および一連のエタノールによる脱水70、80および100を行った。変性プローブを、これらの前処置したスライドに施用し、75°Cにて5分間同時変性させ、37°Cにて1晩ハイブリダイズした。2回のハイブリダイゼーション後の洗浄を45°Cにて2SSC/50ホルムアミド中で7分間行い、それぞれの後に2SSC中、45°Cにて7分ずつの洗浄を2回行った。ブロッキングの後に、スライドを、アビジンコンジュゲートフルオレセインイソチオシアネートFITCVectorLaboratoriesを用いて明示した。洗浄の後に、vectashieldを用いてスライドを顕微鏡に載せ、落射蛍光顕微鏡で観察した。画像分析は、Metasystemソフトウェアを用いて行った。予測されるSVの検証のために、予測される切断点を挟むPCRプライマーを用いて、後続のSanger配列決定のために再編成領域を増幅した。リアルタイムPCRアッセイのために、製造者の使用説明に従ってRNeasyミニキットQiagenを用いて、トータル細胞RNAを抽出した。RNAを、SuperscriptIII第1鎖合成システムInvitrogenを用いて逆転写し、iQ5マルチカラーリアルタイム検出システムBio-Radを、25ulの全反応容量で用いて定量的に評価した。プライマーを59°Cにて20秒間アニーリングし、アンプリコンを72°Cにて30秒間伸長した。定めたサイクルの総数は、40であった。β-アクチンまたはBIMのエキソン2Aの転写産物レベルを用いて、試料間を標準化した。用いたプライマーは次のとおりである:BIMエキソン2A順方向:ATGGCAAAGCAACCTTCTGATG;逆方向:GGCTCTGTCTGTAGGGAGGT、BIMエクソン3順方向:CAATGGTAGTCATCC-TAGAGG;逆方向:GACAAAATGCTCAAGGAAGAGG、BIMエクソン4順方向:TTCCATGAGGCAGGCTGAAC;逆方向:CCTCCTTGCATAGTAAGCGTT、β-アクチン順方向:GGACTTCGAGCAAGAGATGG;逆方向:AGCACTGTGTTGGCGTAC-AGおよびEVI1順方向:ACCCACTCCTTTCTTTATGGACC;逆方向:TGATC-AGGCAGTTGGAATTGTG。実施例5.材料および方法:株化細胞および組織培養CML系統は、ATCCMEG-01およびKU812、JCRBNCO2およびDSMZKCL22、K562、KYO1、JK1、BV173およびNALM1から得た。細胞を、ペニシリン、ストレプトマイシン、グルタミンおよび10胎児ウシ血清を補ったRPMI1640培地で成長させ、37°、5CO2の湿潤インキュベータ中でインキュベートした。実施例6.結果:CML患者試料我々は、4つのフィラデルフィアPh染色体陽性CML患者試料および1つのCML株化細胞を、DNA-PET分析のために選択した図2A。これらの試料は、チロシンキナーゼ阻害剤に対する臨床感受性または耐性を示す患者を代表し、慢性および骨髄急性転化期の患者を2名ずつ含む。慢性期の患者のうち1名と両方の急性転化期の患者はチロシンキナーゼ阻害剤に耐性であり、急性転化期試料のうちの一方はPh染色体とともにさらなる核型異常を示した。我々は、K562CML株化細胞および処置感受性患者からの寛解試料も、Ph染色体についてのそれぞれ陽性および陰性対照として含めた。実施例7.結果:CMLゲノムのDNA-PET分析我々は、278百万を超える重複のないPETに由来する72.1Gbのマッピング可能DNA配列を作製し、各ゲノムについて平均で109倍の物理的断片カバー範囲を達成した上の表E1。85.4のPETが参照ゲノムと調和してマッピングされ、14.6のPETはそのようにマッピングされなかった。後者を不調和性PETdPETとして分類した。同じ2つのゲノム領域を接続する多重dPETのクラスタ分けにより、我々は、3,408の異なる構造変動SVを同定でき、かつ各dPETについてSVの型を定義できた図10ならびに以下の表E2およびE3を参照されたい。正常集団に存在するさらなるSVを除外するためおよび偽陽性の割合を減らすために、32の正常で無関係の個体から得られたさらなるDNA-PETデータにより、および以下のバイオインフォマティクスにより定義される品質基準によりSVをさらにふるい分けした。iクラスタが、100を超えるスーパークラスタサイズにより示される100以上の他のクラスタと相互接続される、iiクラスタが、切断点に向かう15Kbの拡張を含む2つのアンカー領域間の2000を超えるBlastスコアで示される2つの接合切断点領域間で高い配列類似性を有する、iiiクラスタが、2つのアンカー/拡張領域間で300を超えるBlastスコアを示し、配列類似性が、一方の側でアンカー内にあり、他方の側で拡張内にあるECタイプ、ivクラスタが、2のクラスタサイズを有するならば、クラスタを除外した。このことにより、459のCML特異的SV表E3および表E4およびコピー数情報図7が得られ、我々は、各ゲノムについて核ゲノムマップを作製できた図2B。重要なことに、DNA-PETを用いて、我々は、寛解試料以外の全てにおいてBCR-ABL転座を同定できた。このデータセットを次に、疾患段階または薬物耐性のいずれかとともに追跡されるSVを同定するために用いた。実施例8.結果:急性転換のDNA-PET分析急性転化期において見出されるさらなる染色体異常および分子異常が、臨床挙動に貢献すると考えられる。しかし、これらの事象の数的または構造的性質のいずれについての網羅的な評価も、特にコピー数の変化がないSVの検出について、技術的に難しい。したがって、我々は、急性転化期の発生の際に生じるSVの分析に注目することにした。ここで、表E4に示すように、我々は、急性転化期におけるSVの数の漸進的な増加を観察し、これは、核型決定およびFISH分析と良好に相関した表E7ならびに図3Dおよび11。我々は、次いで、SVの性質を類別し、2名の急性転化期患者におけるSVの最も顕著なカテゴリーが欠失P098およびP022、n=81[全てのSVの58.7]であり、続いて不対合逆位n=24[17.4]、孤立転座n=12[8.7]および直列重複n=9[6.5]であり、他のSVカテゴリーのそれぞれについて5未満であったことを見出した図2A。急性転化期株化細胞K562は、予想されたように、急性転化期患者試料と比較して、より多くの再編成を示した237に対してそれぞれ63および75。K562において最も顕著なカテゴリーは直列重複でありn=104[43.9、続いて欠失n=71[30]、不対合逆位n=26[11]および複雑な染色体内再編成n=14[5.9]であった。興味深いことに、2つの急性転化期試料およびK562株化細胞においてBCR-ABL1に加えて均衡転座は観察されなかった。我々は、次に、急性転化期特異的SVを、UCSCゲノムバイオインフォマティクスホームページhttp://genome.ucsc.edu/Rheadら2010からダウンロードしたRefSeq遺伝子と交差させることにより、個別の体細胞性SVのうちのどれが急性転化期に対して生物学的に貢献できるかについて調べて、遺伝子機能に直接影響すると予測される205の候補SVを同定した。この群のうちで、我々は、dPETクラスタサイズの増加として認識可能であったBCR-ABL1自体の増幅を観察し、これは、転換の認識された特徴である図126、10。我々は、相互ABL1-BCR転座を示すクラスタサイズと段階との間の逆の相関も観察した図12。注目すべきことに、DNA-PETは、FISHによるder9中の欠失と一貫して、試料P098におけるABL1-BCRの完全喪失を検出した図12。我々が同定した別の候補は、第3染色体上のMECOMのイントロン1以前はEVI1およびMDS1として知られていたへの第8染色体の2.7Mbの挿入図3Aであり、これについて、我々は、FISHにより確認した図3C。EVI-1は、ジンクフィンガー転写因子であり、正常造血幹細胞HSCの増殖および維持において必須の役割を演じ11~13、HSCにおいて過剰発現されると、骨髄過剰増殖およびミエロイド分化遮断をもたらす。我々が知るところでは、EVI1内またはその上流の同等の挿入は報告されておらず、挿入部位の分析は、第8染色体の挿入が、より短い転写産物の転写レベルを変更し得ることを示唆し、これについて、我々は、RT-PCRにより確認した図3B。これらをまとめると、我々のDNA-PET分析は、急性転化期増悪の既知および新規な特徴をともに同定でき、ヒトがんモデルにおいて生じる構造変化の数および性質についての最初の評価を提供する。実施例9.結果:イマチニブ耐性試料における東アジア人BIM多型我々は、次に、耐性関連SVについて調べ、3つ全ての耐性試料に生じる2つの欠失と、3つのうち少なくとも2つにおける6つのSVとを見出した。2.5Kbのサイズの1つの欠失は、CMLとまだ結び付けられていない遺伝子であるZNF385Dのイントロン1内にあった。興味深いことに、3つ全ての耐性試料において観察された他方の欠失は、アポトーシス促進性遺伝子BCL2L11BOD、BIML、BIMELまたはBIMとしても知られるのイントロン2内にあった図4A。重要なことに、BIM上方制御を妨げることによりCMLがイマチニブ耐性になるので14~16、イマチニブによるBIM上方制御は、この薬物がアポトーシスを誘発するために必要であると他者は報告している。我々は、この欠失をPCRおよび配列決定により確認し、3つ全ての試料において同一の2,903bpの欠失を見出し図4Cおよび図4D、このことは、欠失が生殖系列であり、よって多型を構成することを示唆した。したがって、我々は、国際HapMapプロジェクト17からの74の正常東アジア人試料をスクリーニングして、BIM欠失キャリアの頻度が17.6であることを決定した12のヘテロ接合性および1のホモ接合性個体;9.5の対立遺伝子頻度。BIM欠失は、再発性の体細胞性事象ではなく構造的多型であることがわかったが、我々は、3名全ての耐性患者が、イマチニブ感受性にとって必要な遺伝子である14~16BIM欠失のキャリアであるという事実に興味を持った。実施例10.結果:BIM多型の機能的影響BIM遺伝子構造の分析は、欠失が、互いに排他的な様式でのエキソン3および4の選択的スプライシングをもたらす可能性を示唆した。この可能性は、欠失が、エキソン3のイントロン-エキソン境界の5’端の近傍107bpにあるとともに、エキソン3自体の中に停止コドンが存在することにより示唆された図5A。この仮説を試験するために、我々は、欠失を有するn=12および有さないn=11初代CML試料を得て、エキソン3含有転写産物およびエキソン4含有転写産物ならびに全般的なBIM転写についての読出しとしてのエキソン2含有転写産物エキソン2は、全てのBIMアイソフォームに存在するので18の発現レベルを測定した。図5Bに示すように、我々は、欠失が、エキソン3含有転写産物の増加とともにエキソン4含有転写産物の減少と関連するが、全般的なBIM転写は影響されなかったことを見出した。これらの結果は、正常個体からのリンパ芽球様株化細胞において反映され、このことは、欠失の影響が、系統非依存性であることを示した図13。BIMのアポトーシス促進性の特性はエキソン4のみで見出される図5A18、19BH3ドメイン内にあるので、我々は、エキソン4含有転写産物の減少が、イマチニブ耐性と関連するかという疑問を持った。幸運なことに、我々は、欠失を保有する1つのCML株化細胞KCL22を同定でき、これらの細胞を用いてこの疑問に対処した図5C。顕著なことに、この系統は、日本人患者から元々得られ、ほとんどの他のCML系統とは対照的に、イマチニブ耐性を最初から示していた20~22。我々は、細胞が、エキソン3/エキソン4転写産物の比の増加を示し図5D、このことが、欠失を有さない系統と比較して、イマチニブ曝露の前後両方でKCL22株化細胞において主要なエキソン4含有BIMアイソフォームであるBIMELのタンパク質発現の減少と関連したことを確認した図5E。我々は、KCL22細胞が、イマチニブとともにより効力が高い第2世代チロシンキナーゼ阻害剤に対して耐性であったことも確認した図5F。これらの結果から、我々は、早期の臨床試験23にあるBH3模倣剤が、KCL22細胞をイマチニブに対して感受性にし得るかという疑問を持った。図5Gに示すように、我々は、このことが実際にそうであり、イマチニブまたはダサチニブとABT-737との組合せが、KCL22細胞においてしかしKYO-1細胞においてではないアポトーシスを相乗的に誘発するように働いたことを見出した。実施例11.結果:BIM多型と慢性骨髄性白血病におけるチロシンキナーゼ阻害剤に対するBCR-ABL非依存性臨床耐性との関連我々は、次に、東アジア人CML患者のより大きいコホートにおける多型の頻度を決定し、これが12.0158名のうち19名に存在することを見出した。我々は、多型が、臨床耐性を予測できるという仮説についても試験した。この分析において、我々は、KCL22細胞により例示されるように多型の存在が、チロシンキナーゼ阻害剤に対する耐性を与えるために十分であるが、その非存在下では、耐性は、耐性を与えるBCR-ABL変異を保有するクローンの出現を必要とする24と推論した。したがって、我々は、耐性を有する全ての患者からの試料を、BCR-ABL変異を有するものと有さないものとに分け、2つの群の間の多型の頻度の有意な相違を見出した:BCR-ABL変異を有するもの42のうち24.8に対して、有さないもの55のうち1323.6p=0.01図6A。BCR-ABL変異の非存在下で感受性疾患の患者と耐性疾患の患者とにおける多型の頻度を我々が決定した場合に、相違はこれもまた有意であった:イマチニブ感受性患者において61名のうち4名に対してイマチニブ耐性患者について55名のうち13名p=0.02図6B。しかし、イマチニブ感受性患者61名のうち4名と、全てのイマチニブ耐性患者97名のうち15名との間に多型の頻度の有意な相違はなかったp=0.13図6C。この結果は、ここでの統計的有意性が、一般的なCML集団におけるBIM多型の頻度に依存することに鑑みて、予想できたことであった。実施例12.考察我々は、invitroおよびinvivo両方でのチロシンキナーゼ阻害剤に対する臨床耐性と関連するBIM遺伝子のイントロン2における新規な多型について報告する。正常東アジア人集団における欠失キャリアの頻度は17.6であり、2つの東南アジアの紹介センターで診察されたCML患者において12.0である。このコホートでは、多型は、BCR-ABL変異の非存在下で、耐性を有する症例の4分の113/55または23.6を占めた。我々は、CMLの世界的な発生率において地理的な変動が欠如していること25に鑑みて、原因論的役割の可能性が低いと考えている。我々は、多型の存在が、BIM遺伝子のエキソン4を含有する転写産物に対してエキソン3を含有する転写産物の発現の増加をもたらすことも示し、臨床耐性の発生と多型の存在との間の著しい関連を見出し、これは、欠失を有する個体が、有さない個体よりも耐性を発生するリスクが相対的に1.34倍であるヘテロ接合性遺伝子型の相対的リスク;95信頼区間0.94~1.59というものであった。さらに、耐性がBCR-ABL阻害に依存しないことを決定することにより、我々は、耐性および欠失を有する患者が、欠失を有さない患者よりも、BCR-ABL中に耐性を与える変異を有するCMLクローンを保有する見込みが低いと予測することができた。この知見は、このようなクローンが、治療の選択圧の下でのみ、他の耐性を与える機構の非存在下24で出現するという考えと一貫している。現在の臨床ガイドラインは、耐性の出現の際にチロシンキナーゼ阻害剤の用量を増加することまたはより効力が高いチロシンキナーゼ阻害剤に変更すること5について支持している。よって、これらのガイドラインに従い、後続の応答データが入手可能であったBIM多型関連耐性を有する4名の患者がだれも応答しなかったことは大きな関心事である。事例的であるが、この観察結果は、BIM欠失関連耐性がBCR-ABL非依存性であるという我々の知見と一貫する。しかし、我々のinvitroでの観察結果は、この状況での耐性が、チロシンキナーゼ阻害剤とBH3模倣剤とを組み合わせることにより克服できることも示唆する。つまり、BIM多型は、チロシンキナーゼ阻害剤に対する耐性とBH3模倣剤に対する応答との両方の予測因子として用いることができる。この多型のスクリーニングは、よって、東アジアのCML患者の管理において有用である可能性がある。我々の知見を、薬物感受性がBIM媒介アポトーシスに依存する他のがんに適用できることも、調査を正当化する26~28。実施例13および14.BIM多型と非小細胞肺がんNSCLCにおけるチロシンキナーゼ阻害剤に対するEGFR非依存性臨床耐性との関連TKIがNSCLC株化細胞を死滅させることができるようにするために、変異EGFR駆動型NSCLCがBIM発現を必要とすることが以前に示されているCraggらPLOSMedicine、2007;CostaらPLOSMedicine、2007。したがって、我々は、BIM多型を保持する株化細胞および拡張により患者が、変異EGFRを標的にする薬物に対して耐性であると予測する。さらに、我々は、耐性株化細胞が、BH3模倣薬例えばABT-737およびABT-263と抗EGFR薬との組合せに対する感受性があると予測する。実施例13.BIM多型と非小細胞肺がんNSCLCにおけるチロシンキナーゼ阻害剤に対するEGFR非依存性臨床耐性との関連-invitroでの相関EGFRに活性化変異を有するNSCLC株化細胞を同定する。株化細胞を、次いで、以前に記載されるPCR分析により、BIM多型の存在または非存在について分析する。抗EGFR薬に対する様々な株化細胞の感受性および/または耐性を、細胞成長、増殖およびアポトーシスについての標準的な細胞アッセイを用いて決定する。株化細胞を、単独薬剤としてまたはEGFRを標的にする薬物との組合せのいずれかでのBH3模倣剤に対する感受性についても試験する。多型の存在または非存在を、次いで、試験される薬物に対するNSCLC株化細胞の感受性/耐性の程度と相関させる。我々は、BIM多型の存在と薬物耐性との間に正の相関があると予想する。具体的に、我々は、BIM多型を保持するEGFRの活性化変異を有するNSCLC系統は、BIM多型を保持しないものよりも抗EGFR薬に対してより耐性であると予測する。さらに、我々は、BIM多型を有し、かつEGFRを標的にする薬物に対して耐性がある株化細胞は、BH3模倣薬例えばABT-737およびABT-263と抗EGFR薬との組合せに対する感受性があると予測する。実施例14.BIM多型と非小細胞肺がんNSCLCにおけるチロシンキナーゼ阻害剤に対するEGFR非依存性臨床耐性との関連-患者の相関EGFRに活性化変異を有するNSCLC患者を同定する。患者および/またはその腫瘍からのDNAを、以前に記載されるPCR分析により、BIM多型の存在または非存在について分析する。抗EGFR治療に対する患者の応答を、次いで、臨床基準を用いて決定する。これらのデータは、腫瘍サイズ、腫瘍増殖停止期間、無増悪生存期間、全生存および活動指標のような臨床パラメータを含む。多型の存在または非存在を、次いで、上記の臨床パラメータと相関させる。我々は、BIM多型の存在と、多型を有さない患者と比較して劣った抗EGFR治療に対する応答との間に正の相関が存在すると予想する。このことは、腫瘍のサイズが減少できないこととして観察されることがある。さらに、このような患者は、より短い腫瘍増殖停止期間、無増悪生存期間および/または全生存を有することがある。実施例15および16.BIM多型と消化管間質性腫瘍GISTにおけるチロシンキナーゼ阻害剤に対するc-KIT/PDGFR非依存性臨床耐性との関連TKIがGIST株化細胞を死滅させることができるようにするために、c-KIT/PDGFR駆動型GISTがBIM発現を必要とすることが以前に示されているGordonらJBC、2010。したがって、我々は、BIM多型を保持する株化細胞および拡張により患者が、変異c-KITを標的にする薬物に対して耐性であると予測する。さらに、我々は、耐性株化細胞が、BH3模倣薬例えばABT-737およびABT-263と抗c-KIT薬との組合せに対する感受性があると予測する。実施例15.BIM多型と消化管間質性腫瘍GISTにおけるチロシンキナーゼ阻害剤に対するc-KIT/PDGFR非依存性臨床耐性との関連-invitroでの相関c-KITに活性化変異を有するc-KIT駆動型GIST株化細胞を同定する。株化細胞を、次いで、以前に記載されるPCR分析により、BIM多型の存在または非存在について分析する。抗c-KIT薬に対する様々な株化細胞の感受性および/または耐性を、細胞成長、増殖およびアポトーシスについての標準的な細胞アッセイを用いて決定する。株化細胞を、単独薬剤としてまたはc-KITを標的にする薬物との組合せのいずれかでのBH3模倣剤に対する感受性についても試験する。多型の存在または非存在を、次いで、試験される薬物に対するGIST株化細胞の感受性/耐性の程度と相関させる。我々は、BIM多型の存在と薬物耐性との間に正の相関があると予想する。具体的に、我々は、BIM多型を保持するc-KITの活性化変異を有するGIST系統は、BIM多型を保持しないものよりも抗c-KIT薬に対してより耐性であると予測する。さらに、我々は、BIM多型を有し、かつc-KITを標的にする薬物に対して耐性がある株化細胞は、BH3模倣薬例えばABT-737およびABT-263と抗c-KIT薬との組合せに対する感受性があると予測する。実施例16.BIM多型と消化管間質性腫瘍GISTにおけるチロシンキナーゼ阻害剤に対するc-KIT/PDGFR非依存性臨床耐性との関連-患者の相関c-KITに活性化変異を有するGIST患者を同定する。患者および/またはその腫瘍からのDNAを、以前に記載されるPCR分析により、BIM多型の存在または非存在について分析する。抗c-KIT治療に対する患者の応答を、次いで、標準的臨床基準を用いて決定する。これらのデータは、腫瘍サイズ、腫瘍増殖停止期間、無増悪生存期間、全生存および活動指標のような臨床パラメータを含む。多型の存在または非存在を、次いで、上記の臨床パラメータと相関させる。我々は、BIM多型の存在と、多型を有さない患者と比較して劣った抗c-KIT治療に対する応答との間に正の相関が存在すると予想する。このことは、腫瘍のサイズが減少できないこととして観察されることがある。さらに、このような患者は、より短い腫瘍増殖停止期間、無増悪生存期間および/または全生存を有することがある。実施例1~16についての参考文献実施例H1~H8実施例H1~H8は、BIM遺伝子中の共通の欠失多型が、慢性骨髄性白血病におけるイマチニブに対する内在性の耐性に貢献することを証明する。実施例H1.材料および方法倫理委員会承認臨床CML試料は、theSingaporeGeneralHospital、秋田大学医学部付属病院、theUniversityofMalayaMedicalCentreおよびtheNationalUniversityCancerInstitute,Singaporeで診察された患者から得た。ドイツ人の対照試料は、theUniversityHospitalofBonnでの血液提供者から得た。マレー人、中国人およびインド人の対照試料は、最近行われた地方集団研究に由来した4、5。書面でのインフォームドコンセントおよび参加施設における施設調査委員会の承認を、本研究に試料を提供した全ての患者および正常個体から得た。配列タグのマッピングペアタグを、SOLiDシステム分析パイプラインツールCoronaLiteAppliedBiosystemsにより、タグあたり2つの色コードミスマッチを可能にする色空間で参照配列NCBIbuild36に対して個別にマッピングした。未解明の位置を有する参照配列のコンティグrandom_chrおよび代替MHCハプロタイプを、マッピングのための参照から除外した。個別にマッピングしたタグを、CoronaLiteにより対合させた。一方または両方のタグが多重のマッピング位置を有する場合、レスキューとよばれるプロセスにより、調和性PETが創出できた両方のタグが同じ染色体、同じ鎖、同じ向き、正しい5’→3’の順序および互いに予想される距離にある。不調和性PETdPETのクラスタ分けペアエンドタグPETを、両方のタグが同じ染色体、同じ鎖、正しい5’から3’の順序および予想されるスパン範囲内にマッピングされる調和性PETcPETとして類別した。スパン範囲は、Hillmerら1に記載されるようなスパン分布の勾配に基づいて決定した。cPET基準から却下されたPETは、不調和性PETdPETと分類した。同じ融合点に広がる異なるdPETをクラスタ分けするために、以下の手順を用いた。あるdPETの5’および3’タグのマッピング位置を、両方向に、それぞれのゲノムライブラリーの最大挿入サイズだけ拡張して、5’および3’ウィンドウを創出した。第2dPETの5’および3’タグが第1dPETの5’および3’ウィンドウ内にマッピングされたならば、2つのPETは、サイズ2のクラスタと定義し、5’および3’ウィンドウを、最大ライブラリーサイズの第2dPETのタグ拡張を含有するように調整した。その後、5’および3’タグがそれぞれこの5’および3’ウィンドウ内にマッピングされたdPETを、このクラスタに割り当て、必要であればウィンドウを調整した。融合点の周囲に一緒にクラスタ分けされるdPETの数を、クラスタサイズにより表した。クラスタの5’タグによりカバーされるゲノム領域を5’アンカーと定義し、クラスタの3’タグによりカバーされるゲノム領域を3’アンカーと定義した。500bp未満のアンカー領域を有するdPETクラスタを、さらなる分析から除外した。K562のDNA-PET配列決定は、以前に記載されている1。同じK562dPETクラスタを本研究で用いたが、セントロメア領域は除外せず以前の研究ではそのようにされた、500bp未満のアンカー領域を有するdPETクラスタを除外し以前は1000bp未満、新しい除外/ふるい分け手順を用いた以下を参照されたい。低信頼度クラスタの除外我々は、一連の統計検定を用いて、低信頼度クラスタをさらなる分析から除外した。検定は、キメラ配列構築物または局所挿入サイズ変動から生じ得るdPETクラスタについてのライブラリー特異的閾値を決定する。特に、短い欠失を示すdPETクラスタは、非均一スパン分布のアーチファクトとして生じ得るので、我々は、ゲノム最大ライブラリーサイズのビンに離散化される上の伸展dPET端が最大ライブラリーサイズより長く離れていることだけによる不調和性の分布について2項分布モデルを用いて、最小クラスタサイズ閾値を見積もり、平均で1未満の偽陽性が予想されるようにしたゲノムビンの数によりp値をボンフェローニ補正した。具体的に、閾値端が最大ライブラリーサイズの2倍未満隔たっているクラスタにのみ当てはめたは:ここで、Nは、伸展dPETの数であり、bは、ビンの数であり、fk;n,pは、成功確率pでのn回の独立試行についてkでの2項分布密度関数であると計算される。ライブラリー準備における環状化ステップから生じるキメラPET構築物は、ゲノムにわたって分散し、よって、dPETクラスタを形成する見込みは低いと予想される。しかし、莫大な量の配列により、少数のこのようなクラスタが生じ、我々は、以前と同様の2項分布モデルを採用して、ライブラリー特異的最小クラスタサイズ閾値を設定した平均で1未満の偽陽性が予想される。ここで、Dは、dPETの数である。なお、伸展dPETクラスタは単一のビン第1の近似に対してにより定義できるが、一般的に、dPETクラスタを定義するために2つのビンを選択しなければならず、このことは、上の等式における2次因数を説明する。キメラPETクラスタは、端が互いに非常に近傍にあるように生じる見込みが低いので、上記の閾値は、端が、式中、Gは、ゲノムのサイズであり、btは、サイズtの領域内のビンの数であるより近いクラスタには当てはめない。この方法論により定義されるクラスタサイズ閾値を、表H12に示す。スーパークラスタ分けいくつかの遺伝子座は、dPETクラスタの蓄積を示した。これらの遺伝子座では、特定のSVをあるdPETクラスタに割り当てることは誤り導く可能性があるので、我々は、切断点に基づく相互接続ネットワークスーパークラスタ分け1を確立して、複雑な領域にある切断点を、孤立し、かつ複雑さが低いSVから分けた。切断点の近隣を決定するために、各dPETクラスタアンカー領域の始点および終点を、各ゲノムライブラリーの最大挿入サイズだけ、検索ウィンドウとして拡張した。近隣クラスタのウィンドウが互いにオーバーラップするならば、dPETクラスタをスーパークラスタに一緒に群分けした。この手順により、クラスタBを介してクラスタAからCへの間接的接続が可能になった。スーパークラスタに一緒に加えることができるdPETクラスタの数を、スーパークラスタサイズとして表した。3を超えるdPETクラスタを相互接続した場合、切断点の対は複雑と分類した染色体内および染色体間。この相互接続ネットワークを、低信頼度クラスタの除外上を参照されたいの後であるが、DNA-PETデータキュレーション以下を参照されたいの前に確立した。DNA-PETデータキュレーション未処理DNA-PETデータは、6つのCML試料において3,408の異なるSVを予測した表H4。我々は、以下の品質基準に基づいてデータをふるい分けした:i我々は、対合した慢性期/寛解試料P145およびP440のdPETクラスタのクラスタサイズを比較し、クラスタを2つの群に分けた:a両方の試料で同定されたクラスタ、およびb2つのうち一方だけで観察されたクラスタ。この階層化により、サイズ2から4のクラスタは、アーチファクトが豊富であることが示唆された図24。確実にするために、我々は、サイズ2~5の全てのdPETクラスタを、SV召集から除外した。iiマッピングアーチファクトは、配列類似性が高い領域間にdPETクラスタを創出できる。SOLiD対合パイプラインのレスキューとよばれる手順は、このようなアーチファクトを、2つのタグの調和性の対合に有利にすることにより大きく低減するが、領域間の配列類似性は、それでもアーチファクトを創出できる。しかし、配列類似性が非対立遺伝子相同組換えによる再編成を誘引できるので、配列類似性が高い全てのdPETクラスタを除外することは問題である。切断点間の配列類似性を評価するために、我々は、左および右のアンカー領域を15Kbだけ、切断点に向かって拡張し、2つの領域をBLASTプログラムbl2seq6によりアラインメントした。2つの領域のアラインメントは、通常、多重のアラインメントをもたらすが、我々は、最も高いスコアのものを用いた表H6においてBlastScore1と定義する。Blastスコアが2,000を超えた場合では、検証のために特異的PCRプライマーを設計することは通常困難であったので、我々は、このような高いBlastスコアを有するdPETクラスタを除外した。iii特に、2つの予測される対合切断点の一方の側のアンカー領域と他方の側のアンカーの拡張との間の配列類似性は、マッピングアーチファクトの指標である拡張-クラスタについてのECアラインメントタイプ。これは、他のアンカーの拡張に対するアンカータグの正しいマッピングこれらは配列特徴を共有するがcPETを創出するという仮定に基づく。我々は、300を超えるBlastスコアおよびECアラインメントタイプを有するdPETクラスタを除外した。ivいくつかのゲノム領域は、マッピングアーチファクトを蓄積する傾向があり、我々は、100を超えるスーパークラスタサイズを有する全てのdPETクラスタを除外した。我々は、株化細胞においてのみしかし、臨床試料および未公開のデータにおいてではない1このような複雑さの真の再編成を観察した。このふるい分け手順は、CML試料において1,349の異なる予測SVをもたらした表H4。交差ゲノム比較異なるゲノムにわたるクラスタの比較を、両側に10Kbだけ拡張した5’および3’アンカー領域のオーバーラップに基づいて行った。第2ライブラリーのクラスタの5’アンカー領域が、第1ライブラリーのクラスタの5’拡張アンカー領域とオーバーラップし、同じことが3’アンカー領域にもいえるならば、2つのクラスタを一緒に群分けし、アンカー領域の10Kb拡張を最も外側の開始および終了アンカー座標に従って調整した。切断点の位置を用いて、同定したSVを、がんでない個体のペアエンド配列決定研究7、8に基づく、公開されているSVと比較した。公開されているSVとオーバーラップする予測SVの画分を、より大きい事象に対するオーバーラップのパーセンテージにより算出した。遺伝子アノテーションは、UCSChttp://genome.ucsc.edu/;9から2009年5月14日にダウンロードしたRefSeq遺伝子に基づいた。我々は、9名の中国人、6名のヨーロッパ人、3名のアフリカ人、2名のメキシコ人および1名のインド人を含む21名の正常個体のDNA-PETデータ22のライブラリー、未公開データを、交差ゲノム比較に含めた。21の正常試料の1または複数のSVとマッチしたCML患者の全てのSVを生殖系列SVに類別し、さらなる分析から除外した。さらに、5名のアフリカ人、3名のヨーロッパ人、1名の日本人および1名の中国人を含む10名のがんでない個体におけるペアエンド配列決定アプローチ7、8により同定されたSVと80以上オーバーラップしたSVを生殖系列と類別して除外した。31の正常試料を用いるこの生殖系列ふるい分け手順は、CML試料における309の異なる予測SVをもたらした表H4~H6。CMLゲノムにおける予測SVの検証のために、予測切断点を挟むPCRプライマーを用いて、後続のSanger配列決定のために再編成領域を増幅した。急性転化期再編成の特徴付け急性転化期への移行における一貫した分子的知見は、BCR-ABLタンパク質自体のレベルの増加である3、10、11。このことは、BCR-ABL遺伝子増幅およびPh染色体の重複を含むいくつかの機構により生じる3、10、11。したがって、我々は、2つの慢性期試料P145およびP308と比較した場合に、急性転化期試料P022、P098、K562においてBCR-ABLについてのDNA-PETシグナルの増加を検出でき、我々は、これをFISHと相関させた図19Bおよび図19C。我々は、相互ABL-BCR転座を表すDNA-PETシグナルと段階との間の逆の相関も観察した図19B。der9上のABL-BCR再編成点の欠失について記載されており12、我々は、逆の相関の根底にある急性転化試料P098およびK562におけるABL-BCRの完全喪失図19Bおよび19Cを検出した。我々は、急性転化期試料における可能性のある体細胞性SVの性質を類別し、2名の急性転化期患者におけるSVの最も顕著なカテゴリーが欠失P098およびP022、n=79[全てのSVの79]、続いて直列重複n=6[6]および孤立転座n=5[5]であり、他のSVカテゴリーのそれぞれについて5未満であったことを見出した表H5。1SV統計は、dPETクラスタの数を反映する逆位、挿入および均衡転座は、事象あたり2のdPETクラスタで構成される2相互ABL-BCRではないBCR-ABL転座が、派生第9染色体の欠失により存在する3相互ABL-BCRではないBCR-ABL転座が、派生第9染色体の喪失または複雑な再編成により存在する4慢性期患者試料P145における4つの予測SVは、同じ患者の寛解試料P440において予測されず寛解における非存在、P145においてDNA-PETが示されなかった7つのSVがP440において予測された慢性における非存在。寛解における非存在カテゴリーにおいて、再編成点のうち2つはBCR-ABLおよびABL-BCRであり、2つの5Kb欠失がP440で見つからなかったが、両方の試料においてPCRにより同定された。慢性における非存在カテゴリーにおいて、欠失および孤立転座はPCRにより検証できず、リストから除外され、5つの残りの矛盾したSVは、慢性および寛解試料の両方でPCRにより検出でき、DNA-PETにより慢性試料において見つからなかった。急性転化期株化細胞K562は、予想されたように、急性転化期患者試料と比較してより多くの再編成を示した153に対してそれぞれ40および60。K562においても欠失が最も顕著なカテゴリーでありn=70[46、続いて直列重複n=39[25]、不対合逆位n=20[13]、孤立転座n=11[7]および複雑な染色体内再編成n=11[7]であった。興味深いことに、2つの急性転化期試料およびK562株化細胞においてBCR-ABLに加えて均衡転座は観察されなかった。株化細胞および細胞培養条件CML系統は、ATCCMEG-01およびKU812、独立行政法人医薬基盤研究所JCRB細胞バンクNCO2およびtheGermanCollectionofMicroorganismsandCellCulturesKCL22、K562、KYO-1、JK1、BV173およびNALM1から得た。細胞は、ペニシリン/ストレプトマイシン、グルタミンおよび10FBSを補ったRPMI-1640培地で成長させ、37°C、5CO2の湿潤インキュベータ中でインキュベートした。蛍光InSituハイブリダイゼーションFISH細胞を0.75MKClで15分間、37°Cにて処置することにより核を採集した。固定の後に、核をFISH用のスライド上に滴下した。BCR-ABL融合は、VysisLSI遺伝子座特異的識別子BCR/ABL12重融合転座プローブAbbottMolecularにより検出した。LSIBCRプローブを、SpectrumGreenで標識し、LSIABL1プローブを、SpectrumOrangeで標識した。LSIBCR/ABL12色2重融合転座プローブAbbottMolecularを用いるFISHアッセイを、製造者の使用説明にわずかな改変を加えて、固定細胞に対して行った。簡単に述べると、スライドを一連のアルコール中で脱水し、同時変性を3分間、75°Cにて行い、その後、37°Cにて1晩ハイブリダイゼーションした。FISHシグナルの評価は、1000倍の倍率の下で蛍光顕微鏡OlympusBX60を用いて行った。それぞれの場合に、約200の間期の核をシグナルパターンについて評価した。リアルタイムRT-PCR製造者の使用説明に従ってRNeasyミニキットQiagenを用いて、トータル細胞RNAを抽出した。RNAを、SuperscriptIII第1鎖合成システムInvitrogenを用いて逆転写し、iQ5マルチカラーリアルタイム検出システムBio-Radを、25μlの全反応容量で用いて定量的に評価した。プライマーを59°Cにて20秒間アニーリングし、アンプリコンを72°Cにて30秒間伸長した。定めたサイクルの総数は、40であった。β-アクチンまたはBIMのエキソン2Aの転写産物レベルを用いて、試料間を標準化した。以下のプライマーを用いた:BIMエクソン2A順方向:ATGGCAAAGCAACCTTCTGATG;逆方向:GGCTCTGTCTGTAGGGAGGT、BIMエクソン3順方向:CAATGGTAGTCATCCTAGAGG;逆方向:GACAAAATGCTCAAGGAAGAGG、BIMエクソン4順方向:TTCCATGAGGCAGGCTGAAC;逆方向:CCTCCTTGCATAGTAAGCGTTおよびβ-アクチン順方向:GGACTTCGAGCAAGAGATGG;逆方向:AGCACTGTGTTGGCGTAC-AG。ウェスタンブロットウェスタンブロッティングを、ヒトBIM、CrkL、pCrkL、カスパーゼ3、切断カスパーゼ3、PARP全てCellSignalingTechnologyからおよびβ-アクチンSigmaに対する抗体を用いて行った。検出は、ウサギSigmaまたはマウスIgGSantaCruzに特異的なHRPコンジュゲート2次抗体を用いて行った。メンブレンは、WesternLightning化学発光試薬PerkinElmerを用いて視覚化した。アネキシンV染色による細胞死の検出製造者の使用説明に従ってアネキシンV-FITC/7-AADキットBeckmanCoulterを用いてアポトーシスを測定した。簡単に述べると、処置または未処置細胞を、アネキシンV-FITCおよび7-AADで、1×結合緩衝液中で15分間、室温にて染色し、次いで、フローサイトメトリーにより分析した。E3含有BIM転写産物のsiRNAノックダウンE3含有BIM転写産物に対する小型干渉RNAsiRNABIMγsiRNA1:CCACCAUAGUCAAGAUACA;BIMγsiRNA2:CAGAACAACUCAACCACAAおよび陰性対照siRNAON-TARGETplus非ターゲティングsiRNA1を、DharmaconInc.から購入した。ヌクレオフェクションを、KCL22細胞に対して、Nucleofector溶液VLonzaをsiRNAの存在下で用いて行った。BIMにおける欠失についてのスクリーニング我々は、HapMap13ホームページhttp://snp.cshl.org/からダウンロードしたAffymetrixゲノムワイドヒトSNPアレイ6.0強度データを用いて、BIMにおける欠失多型のコピー数を推測した。2つの遺伝子型決定された単一ヌクレオチド位置が、欠失内にあった:SNP_A-4195083およびCN_173550。2つのマーカーの未処理強度を用いて、Kornら14により提案されるアルゴリズムと類似の混合ガウスモデルを用いてコピー数変動事象を求めた。この手順を用いて、我々は、コピー数を予測し、それにより、ヨーロッパ人n=60、ヨルバ族n=60および中国人/日本人n=90起源の無関係のHapMap試料における欠失の存在または非存在を予測した。我々は、次いで、以下の温度サイクル条件:96°Cで30秒間、94°Cで15秒間、64°Cで30秒間、68°Cで5分間×12、94°Cで15秒間、60°Cで30秒間、68°Cで5分間×18、68°Cで20分間を用いて、プライマーBim_del_FAATACCACAGAGGCCCACAGおよびBim_del_RGCCTGAAGGTGCTGAGAAAGならびにJumpStartRedAccuTaqLADNAポリメラーゼSigmaを用いるPCRにより、我々が有していた中国人/日本人DNA試料n=74における欠失の遺伝子型を決定した。欠失を有する1,323bpおよび欠失を有さない4,226bp得られたPCR生成物を、1アガロースゲル上で分析した。我々は、PCRに基づく遺伝子型を用いて、ヨーロッパ人およびヨルバ族試料における遺伝子型召集についての単一ヌクレオチド強度カットオフを精密化し、頻度評価のために東アジア人試料のPCRにより検証された遺伝子型だけを用いた。ヨーロッパ人集団における欠失が中程度の頻度であるが、HapMap試料において偶然見つからなかったのかをさらに調べ、アジアにおける欠失頻度をより精密に決定するために、我々は、PCRアッセイにより、595のドイツ人、600のマレー人、608の中国人および605のインド人試料について遺伝子型決定した。BIM欠失についての寄与分画の算出東アジア人患者の処置耐性の集団寄与分画を算出するために、我々は、PAF=fOR-1/fOR-11患者のうちの欠失キャリアの頻度f=0.135f、およびTKI処置に対して耐性の患者と感受性の患者との間の欠失キャリアのオッズ比OROR=3.19を用いた。ミニ遺伝子プラスミド構築pI-12スプライシング構築物を、MarianoGarcia-Blancoからの厚意として得た。標準的なクローニング技術を用いて、2つの他のミニ遺伝子構築物であるpI-12-WTおよびpI-12-MUTを構築した。簡単に述べると、BIMエキソン4とエキソン4の上流の659bp配列とを一緒に、KCL22ゲノムDNAから、5’-GCCGCTCGAGTCTCTCCATGTGGTGTTTG-3’をフォワードプライマーとしておよび5’-GCCGAAGCTTCCTCCTTGCATAGTAAGCGTT-3’をリバースプライマーとして用いて増幅した。PCR生成物を、XhoIおよびHindIIIで消化し、pI-12プラスミドのXhoIおよびHindIII部位にクローニングした。BIMエキソン3と欠失多型を有するおよび有さない上流領域とを、KCL22ゲノムDNAから、5’-GCCGGATATCATGGAAGGAACTGACCTGGTG-3’をフォワードプライマーとしておよび5’-GCCGATCGATGTAGGAAACTGGGTGAATGGC-3’をリバースプライマーとして用いて増幅した。4500bpおよび1597bpのサイズの2つのPCR生成物を得て、これらをゲル精製し、EcoRVおよびClaIで消化し、プラスミドのEcoRVおよびClaI部位にクローニングして、欠失多型を含有しないpI-12-WT構築物および欠失多型を含有するpI-12-MUT構築物を得た。BIM欠失多型をゲノム編集するために用いたジンクフィンガーヌクレアーゼZFNZFNは、Sigma-AldrichCompoZrTMZFNTechnologyUSAにより注文製作された。このZFNは、欠失多型に相当する領域の5’端から551bp下流の部位を切断した図14B。修復鋳型は、2つのフランキングホモロジーアームだけを含有したが、BIM欠失多型領域を含有しなかった図16A。修復鋳型を、鋳型としてKCL22ゲノムDNAと、以下のプライマー:5’CATAAATACCACAGAGGCCCACAGC3’このフォワードプライマーは、BIM欠失多型領域の5’端から619bp上流にある、5’CCCTCGAAGACACCTCTATTGGGAGGC3’このリバースプライマーは、BIM欠失多型領域の3’端の743bp下流にあるとを用いるPCRにより構築した。我々は、1362bp長のPCR生成物を単離し、これをDNAベクターpCR登録商標-BluntII-TOPO登録商標Invitrogen、USAにクローニングした。我々は、修復鋳型を配列決定し、正しい配列が得られたことを確認した。修復鋳型およびZFNコードプラスミドをK562細胞に、以前に言及されたプロトコール15を用いることによりトランスフェクトした。PCRに基づく検出アッセイを開発して、トランスフェクトされたK562細胞集団のうちでBIM欠失多型を有するクローンの存在を検出した。このPCRに基づくアッセイにおいて用いたプライマーは、修復鋳型の外側で見出されるBIMイントロン領域にアニーリングした図16A。その結果、このアッセイは、修復鋳型を検出しなかったデータは示さず。用いたプライマーの配列は、5’GGCCTTCAACCACTATCTCAGTGCAATGG3’このフォワードプライマーは、BIM欠失多型領域の5’端から1507bp上流にある、5’GGTTTCAGAGACAGAGCTGGGACTCC3’このリバースプライマーは、BIM欠失多型領域の3’端の767bp下流にあるであった。BIM欠失多型を有するゲノム編集されたK562クローンを、希釈クローニングにより単離した。トランスフェクトしたK562細胞を、2.5細胞/mlの密度に希釈した。96ウェルプレートフォーマットを用いて、各ウェルに、次いで、200ulの希釈したトランスフェクトされたK562細胞を播種した。各ウェルからうまく増幅したクローンを採集し、ゲノムDNAを、QiagenDNEasyキットを用いて単離した。ゲノム編集されたK562クローンに対するイマチニブおよびABT-737実験野生型およびゲノム編集されたK562クローンを、ペニシリン/ストレプトマイシン、グルタミンおよび20FBSを補ったRPMI-1640培地で培養し、37°C、5CO2の湿潤インキュベータ中でインキュベートした。6ウェルプレート中で、1×106細胞を各ウェルに2×105細胞/mlの密度で播種した。適当な薬物との48時間のインキュベーションの後に、細胞をウェスタン分析のために採集した図16。アポトーシスアッセイのために、4×105細胞を12ウェルプレートの各ウェルに2×105細胞/mlの密度で播種した。アポトーシス細胞中のモノヌクレオソームおよびオリゴヌクレオソームの存在を、細胞死検出ELISARocheを用い、製造者の使用説明に従うことにより検出した。1発症P145および寛解P440にて同じ個体246,XY,8,t9;22q34;q11.2,i17q10[cp2]/48,idem,der22t9;22[7]/48,idem,19[cp4]/48,idem,t12;17p13;q11.2,19[cp3]/49,idem,8,19[2]/46,XY[3]。表H1.DNA-PET分析に用いた患者およびCML株化細胞K562の臨床病理学的特徴表H2.SOLiDプラットフォームでの大量並列PET配列決定の統計1配列決定した25bpタグの数2ヒト参照ゲノムNCBIbuild36に対してマッピングした25bpタグの数3マッピングした25bpタグを対合した後に作製されたペアエンドタグPETの数4非重複PET;両方のペアタグについて同じ始点を有するPETを、これらが同じPCR生成物に由来する独立した生物学的情報でないという仮定に基づいて除外した5調和性PET6非重複cPET4を参照されたい7cPETによる物理的カバー範囲;染色体位置を交差するcPET接続の平均数8非重複不調和性PET4を参照されたい9低信頼度クラスタの除外を通過した同じ潜在的再編成点の周囲のdPETのクラスタ。表H3.5つの患者試料およびK562株化細胞においてDNA-PETにより予測されるSV11SV統計は、dPETクラスタの数を反映する逆位、挿入および均衡転座は、事象あたり2のdPETクラスタで構成される2相互ABL-BCRではないBCR-ABL転座が、派生第9染色体の欠失により存在する3相互ABL-BCRではないBCR-ABL転座が、派生第9染色体の喪失または複雑な再編成により存在する表H4.5つの患者試料およびK562株化細胞においてDNA-PETにより予測されるSVのふるい分け1SV統計は、dPETクラスタの数を反映する逆位、挿入および均衡転座は、事象あたり2のdPETクラスタで構成される2異なるゲノムにおける同じSVは1回計数する。3スーパークラスタサイズが100を超えるか、またはBlastスコアが2000を超えるか、またはBlastアラインメントがECタイプであるか、またはクラスタサイズが2~5である上記を参照されたいdPETクラスタをふるい分けした421名の正常個体の22の正常ライブラリーのDNA-PET情報および10の正常試料の公開されているペアエンド配列決定データ7、8によりデータをふるい分けした後。表H5.5つの患者試料およびK562株化細胞においてDNA-PETにより予測されるCML特異的SV11SV統計は、dPETクラスタの数を反映する逆位、挿入および均衡転座は、事象あたり2のdPETクラスタで構成される2相互ABL-BCRではないBCR-ABL転座が、派生第9染色体の欠失により存在する3相互ABL-BCRではないBCR-ABL転座が、派生第9染色体の喪失または複雑な再編成により存在する。4慢性期患者試料P145における4つの予測SVは、同じ患者の寛解試料P440において予測されず寛解における非存在、P145においてDNA-PETが示されなかった7つのSVがP440において予測された慢性における非存在。寛解における非存在カテゴリーにおいて、再編成点のうち2つはBCR-ABLおよびABL-BCRであり、2つの5Kb欠失がP440で見つからなかったが、両方の試料においてPCRにより同定された。慢性における非存在カテゴリーにおいて、欠失および孤立転座はPCRにより検証できず、リストから除外され、5つの残りの矛盾したSVは、慢性および寛解試料の両方でPCRにより検出でき、DNA-PETにより慢性試料において見つからなかった。表H7.PCRにより検証した再編成点1両方の切断点にて同じ配列のマイクロホモロジーを太字で示し、左の切断点に割り当てる。2つのゲノム切断点の間の挿入配列を太字および下線で示す。CHR=血液学的完全応答、PCyR=細胞遺伝学的部分応答、CCyR=細胞遺伝学的完全応答、CCA=クローン染色体異常。表H8.早期慢性期におけるファーストラインイマチニブに対する奏功の欧州LeukemiaNetELN基準16表H9.BIM欠失多型とベースライン特徴との関連。BIM多型とベースライン特徴との間の関連について試験する統計分析は、個別のコホート表にあるt検定、Wilcoxon順位和^およびFisherの正確検定を用いて行った。組み合わせたコホートデータについてのロジスティック回帰分析は、BIM多型群BIM、BIMなし間の平均年齢の有意差p=0.020と、コホート間の有意でない差p=0.984とを示した。BIM多型とチロシンキナーゼ阻害剤に対する臨床耐性との関連は、統計的に有意であったp=0.022。主文献における表1について、両方のコホートにおいて示される群年齢の相違のかなりの大きさおよそ7歳と、シンガポール人/マレーシア人コホートの年齢の相違が統計的有意性に近づいたp=0.055という事実とにより、年齢の相違を調整することが適当であると考えられた。表H10.BIM欠失多型を有する患者の臨床特徴。略語:IFN、インターフェロン;IM、イマチニブ;TKI、チロシンキナーゼ阻害剤;ELN、欧州LeukemiaNet;CP、慢性期;AP、移行期;BC、急性転化;H、高;L、低;UNK、不明;CHR、血液学的完全応答;PCyR、細胞発生的部分応答;CCyR、細胞遺伝学的完全応答;MMR、主要分子学的応答;CMR、分子学的完全応答。表H11.BIM欠失多型とBCR-ABLキナーゼドメイン変異の非存在下でのイマチニブ耐性との関連。表1における患者の2つのコホートをそれぞれ3つの群にさらに分けた:BCR-ABL変異なしの耐性群I、BCR-ABL変異ありの耐性群IIおよび感受性群III。したがって、これらのデータを、ロジスティック回帰を用いて分析した。シンガポール人/マレーシア人と日本人コホートとの間に有意差はなかったp=0.31が、Fisherの正確検定により示されるように群の間に有意差があったp=0.03。オッズ比についてのペアワイズ95信頼区間は、群I対群III、ならびに群I対群IIおよびIIIの間の有意差を示したが、群I対群IIオッズ比=2.03、0.68~7.58の95CI、および群II対群IIIオッズ比=1.66、0.41~5.89の95CIの間に有意差はなかった。群I対群IIIを比較することにより、3.37のオッズ比1.35~9.23の95CIが得られ、群I対群IIおよびIIIを比較することにより、1.90のオッズ比2.08~4.35の95CIが得られた。全ての計算は、SASV9.217を用いて行った。表H12.低信頼度クラスタの除外により定義される閾値1左アンカー開始が右アンカー開始の2×最大ライブラリーサイズ未満離れている欠失クラスタについての最小dPETクラスタサイズ22×ライブラリーサイズまで伸展したものおよび近傍閾値内のものを除く全てのdPETクラスタについての最小dPETクラスタサイズ3サイズ2のdPETクラスタは、両方のアンカーが記載される距離以内伸展dPET規則以外であるならば、許容する。上記の閾値を通過したdPETクラスタは、スーパークラスタ分け以下を参照されたいの基礎となった。表H13.アネキシンV染色により決定した、イマチニブで処置したKCL22、KYO-1およびNCO2株化細胞のIC50実施例H2.実施例H1についての参考文献以下は、実施例H1.材料および方法についての参考文献である。実施例H3.序論慢性骨髄性白血病CMLの患者のほとんどは、BCR-ABLチロシンキナーゼ阻害剤TKIでの治療に応答する1。しかし、患者の15~20は、TKIに対して最適に応答せず2、TKI耐性を有する。代替治療に対する臨床耐性または感受性を予測するための信頼できるバイオマーカーは、現在のところない。今回、我々は、BIM遺伝子中の2.9Kb欠失多型により媒介される固有のTKI耐性の新規な機構を同定する。この欠失は、死滅促進性BH3ドメインを含有するBIMアイソフォームからスプライシングがなくなるように偏らせ、BH3含有転写産物を上方制御するTKIの能力を減退させた。このことにより、鈍いアポトーシス応答と固有のTKI耐性BH3模倣薬を用いて克服できた耐性が導かれた。興味深いことに、多型は、東アジア人個体に制限され12.3キャリア率、アフリカ人および白人には存在しなかった0。東アジア人CML患者n=203は、多型の存在と劣ったTKI応答との間の強い関連を示したp=0.02。我々の結果は、共通の欠失多型がどのようにしてTKI広範囲のキナーゼ駆動型がんに対して効力が証明されたクラスの薬物に対する臨床応答に影響できるかを示す。重要なことに、BIM機能に対する多型の影響を明らかにすることにより、我々は、BH3模倣剤がこの形のTKI耐性を克服できることを証明する。BIMは、BCL2ファミリーの生存促進性メンバーBCL2、BCL-XL、MCL1およびA1に対抗するか、または細胞死の遠位エフェクターBAXおよびBAKに直接結合することにより細胞死を活性化する3、BH3のみのタンパク質のファミリーメンバーである。BCR-ABL1は、部分的に、BIM転写を抑制することとともにBIMタンパク質をERK依存性リン酸化によるプロテアソーム分解に向ける4~6ことにより、CML細胞の生存についての有利性を維持する。重要なことに、TKIは、CML細胞において、BIM転写を上方制御することによりアポトーシスを誘発するが、BIM発現を妨げることは、invitroでのTKI耐性を与えるために十分である4~6。TKI臨床耐性は、BCR-ABL1のキナーゼドメインにおける後天性体細胞変異これは、BCR-ABL1と結合してそれを阻害するTKIの能力を減少させる7と最も一般的に関連する。しかし、このような変異は、応答に全く失敗するかまたは臨床基準により定義されるように2準最適TKI応答を有する患者の大部分において見出すことができない。さらに、TKIに対する患者の様々な応答は、生殖系列バリアントまたは多型も、CMLにおける薬物耐性に貢献する可能性をもたらす2、8。実施例H4.TKI感受性CMLにおけるBIM遺伝子のイントロン2における構造バリアントCMLにおける新規なTKI耐性機構を同定するために、我々は、ペアエンドタグの大量並列DNA配列決定9、10図14を用いて、TKIに対して感受性または耐性である患者から得られた5つのCML試料のゲノムを調べた表H1。我々は、全てのCML試料しかし対照ではないにおいて、BCR-ABL1転座とともにいくつかの新規な構造変動SVを同定した図18および図19ならびに表H2~H7。全ての耐性試料において共通のSVのうち、我々は特に1つに注目した。なぜなら、これは、BIM遺伝子のイントロン2中に生じたからである図14A。このSVは、同一の2,903bp欠失を含み図14A、図14Bおよび図14C、これが生殖系列および多型であることを示唆した。実際に、2465の正常個体のスクリーニングにより、我々は、欠失多型が、東アジア人の個体に共通して生じる12.3~14.3のキャリア頻度が、アフリカ人およびヨーロッパ人集団には存在しない0ことを見出した図14D。実施例H5.BIM遺伝子のスプライシングBIM遺伝子構造を調べることは、欠失多型が、互いに排他的な様式でエキソン3および4のスプライシングをもたらすことを示唆し、この可能性は、エキソン3のイントロン-エキソン境界の5’端の近傍107bpにあるとともに、エキソン3自体の中に停止コドンおよびポリアデニル化シグナルが存在する図15Aおよび図2011ことにより示唆された。BIM発現に対する多型の影響を確認するために、我々は、ミニ遺伝子を構築して、欠失の存在下または非存在下でのエキソン4に対するエキソン3のスプライシングを測定し図15B12、欠失が、エキソン4よりもエキソン3へのスプライシングに少なくとも5倍好ましいことを見出した図15C。重要なことに、多型含有試料は、エキソン4含有転写産物に対して高いレベルのエキソン3含有転写産物を発現したが、全般的なBIM転写は影響されなかった図15Dので、患者からの初代CML細胞は同じ現象を示した。同様の結果が、正常HapMap個体から得られたリンパ芽球様株化細胞において観察され、このことは、細胞系統非依存性の影響を示した図23。アポトーシス促進性BH3ドメインは、エキソン4においてのみ見出され図14A、BIMアポトーシス機能のために必要である13、14ので、我々の観察結果は、TKI耐性についての新規な機構を示唆した。このモデルにおいて、TKI曝露の際に、多型含有CML細胞は、エキソン4含有BIM転写産物に対してエキソン3含有BIM転写産物の発現に有利となり、BH3含有BIMアイソフォームの発現を減少させ、その結果、BH3ドメイン依存性アポトーシスを減退させた。これらの研究を容易にするために、我々は、欠失を含有する日本人CML株化細胞KCL22を同定し15図15E、これらが、欠失非含有細胞と比較して、エキソン3/エキソン4転写産物の比の増加を示すことを確認した図15F。KCL22細胞は、また、TKI曝露の後のエキソン4含有転写産物の誘発の減少図15Gと、主要BH3含有BIMアイソフォームであるBIMELタンパク質のより低いレベル図15Hとを示した16。以前の報告15、17、18と一貫して、KCL22細胞は、効果のあるBCR-ABL阻害にもかかわらずイマチニブに対して耐性であり図15Hおよび表H13、イマチニブ曝露の際のアポトーシスシグナル伝達の減退を示した図15I。KCL22細胞は、エキソン4/BH3含有しかしエキソン3含有ではないBIMアイソフォームの増加する発現に対しても非常に感受性であったが図21、エキソン3含有転写産物のsiRNA媒介ノックダウンは、イマチニブに対してKCL22細胞を感受性にせず図22、このことは、イマチニブにより誘発されるアポトーシスの減退が、BH3模倣薬の添加により回復できることを示唆した19。図14Jに示すように、我々は、これが実際にそうであることを見出した。実施例H6.欠失多型を再現するための遺伝子ターゲティング我々は、次に、ジンクフィンガーヌクレアーゼにより促進される遺伝子ターゲティングを採用して、イマチニブ感受性K562CML細胞のBIM遺伝子における欠失多型を精密に再現した図15A。我々は、次いで、BIMスプライシングおよび発現の変化ならびにTKIにより誘発されるアポトーシスについてこれらの細胞を分析した。我々は、欠失多型についてヘテロ接合性K562-BIMイントロン/-またはホモ接合性K562-BIMイントロン-/-のサブクローンを作製し図16B、これらの細胞において、多型量依存性の様式で増加するエキソン3/エキソン4転写産物の比を確認した図16C。欠失多型含有細胞は、また、イマチニブ曝露の後のエキソン4含有転写産物の誘発の減少図16D、BIMELタンパク質の上方制御の減退およびアポトーシスシグナル伝達と細胞死の両方の減衰図16E、図16Fおよび図16Gを示した。KCL22細胞においてと同様に、ABT-737をイマチニブに加えることにより、多型含有細胞においてアポトーシスを活性化する後者の能力が増強された図16H。これらをまとめると、我々の研究は、多型が、BH3含有BIMアイソフォームからスプライシングがなくなるように偏らせることによりイマチニブに対するアポトーシス応答を減退させ、CML細胞をイマチニブに対して元来耐性にするために十分であることを確立する。重要なことに、我々は、イマチニブに対するアポトーシス応答が、多型含有細胞において、BH3模倣薬により回復できることも示す。実施例H7.回顧的分析RetrospectiveAnalysis次に、我々は、東アジア人CML患者におけるTKI応答に対する多型の影響について回顧的分析を行った。2つの独立する東アジア人シンガポール/マレーシアおよび日本コホートからの新しく診断された慢性期CML患者の群n=203を用いて、我々は、標準的な用量のイマチニブ400mg/日を用いるファーストライン治療に対する臨床応答を、欠失多型を有する個体と有さない個体との間で比較した。臨床応答は、欧州LeukemiaNetELN基準表H82に従って分類し、耐性患者は、ELN基準により準最適応答者または失敗と定義し、感受性患者は、ELNにより定義される最適応答者に相当した。両方の地理的コホートにおいて、欠失多型を有する患者は、対照と比較して、感受性疾患に対して耐性疾患を有する見込みがより高かった表1。一緒に分析した場合に、欠失多型を有さない患者に対して、欠失多型を有する患者のうちで耐性疾患についての全体的なオッズ比は、2.94であったp=0.02、1.17~7.43の95CI。比較により、我々は、診断からイマチニブの開始までの時間の中央値、診断時のSokalスコアまたはインターフェロンの以前の使用表H9を含む他の可能性のある予後または交絡因子に関して2つの群の間に有意な差を見出さなかった。事例的であるが、我々は、多型を有する耐性患者の大多数が、その後、第2世代TKI治療に対して応答しないことにも注目し表H10、この知見は、我々が株化細胞において観察した固有の耐性と一致した。TKI耐性は、BCR-ABLキナーゼドメインにおける体細胞性変異の獲得と最も一般的に関連する7。しかし、欠失多型は、固有のTKI耐性と関連するので図16、我々は、このような患者が、キナーゼドメイン変異の非存在下で耐性であると予測した。したがって、我々は、患者を次の3つの臨床群に分けた:BCR-ABL変異なしの耐性群I、BCR-ABL変異ありの耐性群IIまたは感受性群III。我々は、多型を有する患者が、有さない患者と比較して、群IIおよび群IIIを組み合わせたものに対して群Iにある見込みがより高いことを見出したオッズ比=1.90、2.08~4.35の95CI表H11。これらのデータは、我々の仮説に対する第2の臨床的検証を提供する。実施例H8.考察実施例H1~H6まとめると、我々の知見は、がんはそれらの体細胞により獲得された駆動変異に従って分類されるべきであるが、生殖系列多型は、標的治療に対するこのようながんの応答を直接調節でき、臨床転帰に影響できるという原理を証明する。重要なことに、我々は、共通BIM欠失多型がどのようにして、部分的に、均一に定義され処置されたCML患者の群において見られる不均質な応答の原因になり得るかを示す。著しいことに、多型は、東アジア諸国の個体においてのみ見出され、これらについて、ヨーロッパおよび北米と比較して26、イマチニブに対する細胞遺伝学的不完全応答のより高い比率約50が報告されている8。これらの人種の相違に対する欠失多型の相対的貢献を評価するために、我々は、多型が、東アジア人の症例における約23の耐性集団寄与分画の根底にあると見積もった。このことは、これらの世界の2つの集団の間で観察される細胞遺伝学的完全応答比率における相違を部分的に説明し得る。BIM機能に対する欠失多型の影響を明らかにすることにより、我々は、それにより多型がCMLにおける薬物耐性に貢献する新規なスプライシング機構についても記載する。つまり、耐性がBH3含有BIMアイソフォームの発現の減退によることを証明することにおいて、我々は、BIM機能の薬理学的回復が、この特定の形のTKI耐性を克服できたことを確認できた。我々は、欠失多型の存在は臨床TKI耐性と強く関連するが、後天的および遺伝的なその他の遺伝的因子が、CML患者におけるTKI治療に対する最終応答を指図する見込みがあることに注目する。それにもかかわらず、この多型についてのスクリーニングは、TKIに対する耐性を予測するために、東アジア人系統のCML患者の管理において有用である可能性がある。BIM発現は、広範囲のヒトのがんにおけるTKI感受性に必要であるので20~23、我々は、上皮増殖因子受容体EGFR駆動型非小細胞肺がんNSCLCにおけるBIM欠失多型の影響についても調べた。随伴する文献において記載されるように、我々は、欠失多型が、NSCLC株化細胞におけるEGFR阻害剤に対する固有の耐性をもたらし、EGFR活性化変異を有することがわかっているNSCLC患者においてEGFR阻害剤に対して著しくより短い無増悪生存期間を予測する24ことを見出した。まとめると、我々のデータは、BIM欠失多型が、ヒトのキナーゼ駆動型がんにおけるinvitroおよびinvivoでのTKI耐性についての生殖系列バイオマーカーであることを明確に証明する。最後に、多型の人種による分離はそれ自体で興味深いが、これが、異なる世界の集団における固有の薬物耐性の原因であるまだ見つかっていない他の多型の原型であることが、我々の知見においてより重要であると考えられる。実施例H9.実施例H3~H8についての参考文献以下は、実施例H3~実施例H8についての参考文献である。実施例N1~N4実施例N1~N4は、EGFR駆動型非小細胞肺がんにおけるBIM欠失多型と関連する無増悪生存期間の短縮を証明する。実施例N1.材料および方法倫理委員会承認臨床NSCLC試料は、theNationalCancerCentre、Singapore、東邦大学医療センター大森病院、日本、愛知県がんセンター、日本およびtheNationalUniversityCancerInstitute、NationalUniversityHealthSystem、Singaporeで診察された患者から得た。書面でのインフォームドコンセントおよび参加施設における施設調査委員会の承認を、本研究に試料を提供した全ての患者から得た。細胞培養条件および試薬NSCLC細胞PC9およびHCC2279は、ペニシリン/ストレプトマイシン、グルタミンおよび10FBSを補ったRPMI-1640培地で成長させ、37°C、5CO2の湿潤インキュベータ中でインキュベートした。ゲフィチニブおよびABT-737は、DMSOに再懸濁して-20°Cにて保存した。リアルタイムRT-PCRQ-PCR製造者の使用説明に従ってRNeasyミニキットQiagenを用いて、トータル細胞RNAを抽出した。RNAを、SuperscriptIII第1鎖合成システムInvitrogenを用いて逆転写し、iQ5マルチカラーリアルタイム検出システムBio-Radを、25μlの全反応容量で用いて定量的に評価した。プライマーを59°Cにて20秒間アニーリングし、アンプリコンを72°Cにて30秒間伸長した。定めたサイクルの総数は、40であった。β-アクチンまたはBIMのエキソン2Aの転写産物レベルを用いて、試料間を標準化した。以下のプライマーを用いた:BIMエクソン2A順方向:ATGGCAAAGCAACCTTCTGATG;逆方向:GGCTCTGTCTGTAGGGAGGT、BIMエクソン3順方向:CAATGGTAGTCATCCTAGAGG;逆方向:GACAAAATGCTCAAGGAAGAGG、BIMエクソン4順方向:TTCCATGAGGCAGGCTGAAC;逆方向:CCTCCTTGCATAGTAAGCGTTおよびβ-アクチン順方向:GGACTTCGAGCAAGAGATGG;逆方向:AGCACTGTGTTGGCGTAC-AG。ウェスタンブロットウェスタンブロッティングを、ヒトBIM、カスパーゼ3、切断カスパーゼ3、PARP、ホスホ-EGFRY1068全てCellSignalingTechnologyからおよびβ-アクチンSigmaに対する抗体を用いて行った。検出は、ウサギSigmaまたはマウスIgGSantaCruzに特異的なHRPコンジュゲート2次抗体を用いて行った。メンブレンは、WesternLightning化学発光試薬PerkinElmerを用いて視覚化した。トリパンブルー生存性アッセイPC9またはHCC2279細胞を、24ウェルプレート中に、ウェルあたり5×105または1.6×10細胞にて3重に播種し、DMSO薬物なし、0.5μMゲフィチニブ、2.5μMABT-737またはゲフィチニブとABT-737との組合せで処置した。トリパンブルー染色を行って、処置の48時間後の生存細胞の数を評価した。EGFR変異分析肺腫瘍のFFPEスライドを、キシレンおよび無水エタノールでスライドを洗浄することによりパラフィン除去した。各スライドからの肺がん領域を掻きとり、1.5mlチューブに移し、QIAGENQIAampFFPE組織キットを用いてゲノムDNAを抽出した。EGFRエキソン18から21を、配列決定した。50ngのFFPEgDNAを、10μlのGoTaqホットスタートTaq無色マスターミックスM5133、Promegaを含有する20ulの反応容量でのPCRにより増幅した。PCR条件は、95°Cで5分間、35サイクルの95°Cで50秒間、58°Cで50秒間、72°Cで60秒間のDNA増幅、および72°Cで10分間の最終伸長であった。用いたPCRプライマーは、エキソン18フォワード:TGGCACTGCTTTCCAGCATGG;リバース:CTCCCCACCAGACCATGAGAGG、エクソン19順方向:ATCACTGGGCAGCATGTGGCA;逆方向:CCTGAGGTTCAGAGCCATGGAC、エクソン20順方向:CATGCGAAGCCACACTGACGTG;逆方向:GCATGTGAGGATCCTGGCTC、エクソン21順方向:GATCTGTCCCTCACAGCAGG;逆方向:GGTGTCAGGAAAATGCTGGCTGであった。PCR生成物を、エキソヌクレアーゼIM0293L、NewEnglandBiolabs,Inc-エビアルカリホスファターゼM8201、Promega処置により精製した。精製PCR生成物を、フォワードおよびリバース方向に、ABIPRISMBigDyeターミネーターサイクル配列決定レディ反応キットバージョン3をABIPRISM3730遺伝子分析機AppliedBiosystems、CAにおいて用いて配列決定した。クロマトグラムを、SeqScapeV2.5および手動での調査により分析した。BIMにおける多型欠失のスクリーニングDNAを、患者の血液試料から抽出するか、またはホルマリン固定パラフィン包埋FFPE生検スライド/ブロックから回収した。血液からのゲノムDNAについて、我々は、以下の温度サイクル条件:96°Cで30秒間、94°Cで15秒間、60°Cで60秒間、68°Cで10分間×29、68°Cで20分間を用いて、プライマーBim_del_FAATACCACAGAGGCCCACAGおよびBim_del_RGCCTGAAGGTGCTGAGAAAGならびにJumpStartRedAccuTaqLADNAポリメラーゼSigmaを用いる単一PCR反応により、試料中の欠失の遺伝子型を決定した。欠失1,323bpおよび野生型4,226bp対立遺伝子から得られたPCR生成物を、1アガロースゲル上で分析した。FFPE組織から回収したDNAについて、PCR反応を独立して行って、野生型および欠失対立遺伝子の存在を決定した。プライマーBIMFFPEF5CCACCAATGGAAAAGGTTCAおよびBIMFFPER1CTGTCATTTCTCCCCACCACを用いて、野生型対立遺伝子を遺伝子型決定した。プライマーBIMFFPEF5CCACCAATGGAAAAGGTTCAおよびBIMDelFFPER2GGCACAGCCTCTATGGAGAAを用いて、欠失対立遺伝子を遺伝子型決定した。PCR反応は、GoTaqホットスタートポリメラーゼpromegaを用い、以下の温度サイクル条件:95°Cで5分間、95°Cで50秒間、58°Cで50秒間、72°Cで1分間×39、72°Cで10分間を用いて行った。欠失284bpおよび野生型362bp対立遺伝子からのPCR生成物を、2アガロースゲル上で分析し、配列決定して切断点を確認した。EGFRNSCLC患者データ分析1次エンドポイントは、東アジア諸国からのEGFRTKIで処置されたEGFR変異NSCLC患者の無増悪生存期間PFSに対するBIM欠失多型の影響を調べることであった。PFSは、EGFRTKI治療の開始から腫瘍増悪または任意の原因での死亡のいずれかまでで算出した。TKI治療が副作用により停止されるならば、観察を検閲した。生存曲線を比較するKaplan-Meier検定のP値は、Wilcoxon検定およびログランク検定を用いて算出した。t検定およびFisherの正確検定を用いて、BIM欠失および野生型集団の臨床特徴間の差について検定した。Cox比例ハザード回帰分析を用いて、単変量および多変量ハザード比を、以下の因子について得た:年齢、性別、組織学、喫煙歴、エキソンおよび特異的変異によるEGFR変異の型、段階、ファーストまたはセカンドラインTKI治療、民族、TKIゲフィチニブまたはエルロチニブおよびECOG指標。段階的回帰において変量を入力するための有意水準は、0.05であった。Windows用SASシステム、バージョン9.2PHREG手順を用いて計算を行った。表N1.BIM多型の状態による患者の特徴実施例N2.序論上皮増殖因子受容体EGFR中に活性化変異を有する全てではないが多くの非小細胞肺がんNSCLC患者は、EGFR阻害剤に応答する。しかし、EGFR阻害剤に対する初期の応答は、応答持続期間を予測しない。我々は、新規なBIM欠失多型が、株化細胞におけるEGFR阻害剤に対するアポトーシス促進性BIM応答を減退させ、患者における無増悪生存期間のかなりの短縮を予測することを報告する。EGFRにおける活性化変異は、NSCLC患者のうちで高い応答比率を予測する1、2。このようながんは、東アジア諸国において特に一般的であり、ここでは、非小細胞肺がんの50まででEGFR変異を見出すことができ、これは、興味深いことに、女性、東アジア人、非喫煙者においてより一般的である3~5。これとは対照的に、EGFR活性化変異は、西洋における肺がんの約10で見出すことができるだけである。しかし、患者の人種と関係なく、活性化変異を保有する腫瘍におけるEGFRチロシンキナーゼ阻害剤TKIを用いる治療は、より高い応答比率6~8、および細胞毒性化学療法と比較して著しく延長された無増悪生存期間9と関連する。しかし、高い奏功率にもかかわらず、応答持続期間週から年および腫瘍縮小の程度完全応答から安定疾患に関してかなりの不均質性が存在する10~12。これらの臨床的観察結果は、根底にある駆動変異、例えばBCR-ABLまたはEGFRキナーゼが効果的に阻害されていても、遺伝子的またはエピジェネティックな修飾因子がTKI治療に対する腫瘍応答を調節し得ることを示唆する。ゲノムワイドなペアエンド配列決定アプローチを用いて、我々は、最近、慢性骨髄性白血病株化細胞における固有のイマチニブ耐性と、イマチニブに対する劣った臨床応答とをもたらすBIM遺伝子中の欠失多型を見出した13。著しいことに、多型は、東アジア人系統の個体に限定され12.3キャリア率13、これは、上記のように、感受性を増すEGFR変異を有するNSCLC患者について豊富になる、興味をそそる人口統計である。機構的に、欠失は、死滅促進性BH3ドメインをコードするエキソン4を含有するBIMアイソフォームからスプライシングがなくなるように偏らせ、そのことによりBH3含有BIMタンパク質アイソフォームを上方制御するTKIの能力を減退させる。このことは、次に、TKI曝露の後の鈍いアポトーシス応答と、TKIに対する固有の耐性とを導く13。EGFR阻害剤は、アポトーシスを活性化するためにBH3含有BIMアイソフォームの誘発も必要とし14、15、17、18、BIM誘発を妨げることにより、TKIに対してEGFR変異肺がん細胞を耐性にしたので16、17、我々は、BIM欠失多型も、EGFR変異を有するNSCLCにおいてTKI応答を減退させるかという疑問を持った。実施例N3.HCC2779は、TKI感受性を増すEGFR変異を有するが、TKI耐性であるこの疑問に答えることを補助するために、我々は、TKI感受性を増すEGFR変異を保有するが、不可解なことにTKI耐性である既知の2次耐性を与える変異のいずれも欠くと定義されるNSCLC株化細胞を検索した。我々は、あるそのような系統であるHCC2279を同定でき、これは、特に、有効なEGFR阻害にもかかわらずアポトーシスを活性化できない16、17、19、20。我々は、HCC2779細胞におけるBIM欠失多型の存在を確認し図25A、BIM機能に対する欠失多型の影響を決定した。予想されたように、欠失は、多型を有さない細胞と比較して、エキソン4/BH3含有BIMアイソフォームに対するエキソン3含有BIMアイソフォームの発現が増加した図25B。さらに、TKI曝露は、対照細胞と比較して、転写産物およびタンパク質のレベルにてエキソン4/BH3含有BIMアイソフォームの発現の減少と、アポトーシスシグナル伝達の活性化の減退を伴った図25Cおよび図25D。TKI耐性は、BH3含有BIMタンパク質のレベルの減少によるとの見解と一貫して、BH3模倣薬であるABT-737の添加は、TKIにより誘発されるアポトーシスシグナル伝達および細胞死を増強した図25Eおよび図25F。これとは別に、我々は、イマチニブ感受性CML細胞に欠失多型を新規導入することが、このような細胞を元来イマチニブ耐性にするために十分であることも示し16、このことは、多型がHCC2279細胞におけるTKI耐性の大部分を担うことを示唆する。実施例N4.BIMにおける欠失は、EGFRTKIに対する応答の持続期間と相関する次に、我々は、欠失が、EGFR活性化変異を有するNSCLC患者におけるEGFRTKIに対する応答の持続期間と相関するかという疑問を持った。欠失多型を有するかまたは有さない患者は、既知の予後因子に関して異ならなかった表N1。それにもかかわらず、多型の存在は、著しくより短い無増悪生存期間を予測でき、多型を有さない個体についての11.9カ月と比較して6.6カ月の中央値であったn=141、p=0.0027図26。Cox回帰モデルを用いる多変量分析では、TKI耐性エキソン20変異の存在ハザード比=6.00、95信頼区間2.05~17.57、p=0.001118、19に加えて欠失多型ハザード比=2.14、95信頼区間1.30~3.50、p=0.0026だけが、より不良な無増悪生存期間についての独立した予後因子であることがわかった。まとめとして、我々は、BIM欠失多型が、正常およびがん細胞におけるBH3含有BIMアイソフォームのスプライシングおよび発現の減退をもたらすことを見出す図25および参考文献16。チロシンキナーゼ駆動型がんの状況では、多型により与えられる異常スプライシングは、根底にある駆動変異にかかわらずTKIに対する固有の細胞耐性をもたらすために十分である図25および参考文献16。重要なことに、CMLまたはEGFR変異NSCLCのいずれかの患者では、多型の存在は、著しく劣ったTKI応答とも関連する図26および参考文献16。標的がん治療の関係において、我々の結果は、均質に定義され、処置された患者のうちでの腫瘍応答の不均質性についての説明を提供する。我々のデータは、単一生殖系列多型がどのようにして、重要な遺伝子内にそれが生じた場合に、共通の生物学による異なるがんにおける臨床転帰に強く影響できるかにも光を当てる。このことは、これらの疾患におけるTKI感受性の媒介におけるBIMの中心的役割を反映するようである14、15、20。我々は、BIM多型がTKI応答に影響するがんのリストが、感受性についてBIM発現に依存する21~23他のものも含むように拡大されると期待する。我々のデータは、治療応答に対する多型の影響に焦点を当てているが、ヒト多型が、がんの生物学の他の態様のうちでの不均質性の原因でもあることが可能である。BIM欠失と異なって、これらは、おそらく、治療応答の増強をもたらし得るか、または駆動変異と協調してがんの増悪を加速または遅延させることさえできる。我々が証明したように、このような多型がどのようにして遺伝子機能に影響するかを機構的に理解することにより、予後判定および治療に関するがん患者の管理の改善を導き得る。BIM多型を有する患者におけるTKI耐性の場合、BH3模倣剤を標準的なTKI治療に加えることにより、耐性を克服するための個別化された処置が可能になることがある。実施例N5.実施例N2~N4についての参考文献以下は、実施例N2~実施例N4についての参考文献である。本文書で言及する各出願および特許、ならびに上記の各出願および特許において引用または参照される各文書各出願および特許の審査中出願引用文書を含む、ならびに各出願および特許ならびにいずれの出願引用文書においても引用または言及されたいずれの製品についてのいずれの製造者の使用説明またはカタログも、本明細書に参照により組み込まれる。さらに、本文において引用した全ての文書、および本文において引用した文書において引用または参照される全ての文書、および本文において引用または言及したいずれの製品についてのいずれの製造者の使用説明またはカタログも、本明細書に参照により組み込まれる。本発明の記載される方法およびシステムの様々な改変および変形が、本発明の範囲および精神を逸脱することなく当業者にとって明らかである。本発明を、具体的な好ましい実施形態との関連において記載したが、請求される本発明は、このような具体的な実施形態に不当に限定されないことが理解される。実際に、分子生物学または関連する分野の当業者にとって明らかな本発明を行うための記載される形態の様々な改変が、特許請求の範囲内であることを意図する。"