"ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド及びその誘導体からなる群から選択される1種以上の化合物からなる、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤。前記化合物は、非メチル化CG配列を含まず、長さが5~100塩基のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである、請求項1に記載の抑制剤。前記化合物は、配列番号40に記載の塩基配列、又は、配列番号40に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であって、HMGBタンパクに対する結合能を有する塩基配列、からなるホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである、請求項2に記載の抑制剤。前記化合物は、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの誘導体であり、当該誘導体は、塩基フリーホスホロチオエートデオキシリボースホモポリマーである、請求項1に記載の抑制剤。細胞内において、免疫応答を活性化する核酸とHMGBタンパクとの結合を阻害する、請求項1~4のいずれか一項に記載の抑制剤。HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化が、抗原特異的な適応免疫系、多発性硬化症、死細胞による過剰な免疫応答、移植臓器拒絶反応、自己免疫疾患、炎症性腸疾患、アレルギー、敗血症、炎症による腫瘍の増殖、及び核酸含有病原体により引き起こされる炎症性疾患からなる群から選択される、請求項1~5のいずれか一項に記載の抑制剤。請求項1~6のいずれか一項に記載の抑制剤及び薬学的に許容される担体を含有する、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制用組成物。被検物質の存在下及び非存在下で、HMGBタンパクと標識核酸とを混合する混合ステップと、標識核酸に結合したHMGBタンパクを定量する定量ステップと、被検物質の存在下で標識核酸に結合したHMGBタンパクの量が、被検物質の非存在下で標識核酸に結合したHMGBタンパクの量よりも少ない場合に、当該被検物質が、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤であると判定し、被検物質の存在下で標識核酸に結合したHMGBタンパクの量が、被検物質の非存在下で標識核酸に結合したHMGBタンパクの量よりも多い場合に、当該被検物質が、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の促進剤であると判定する、判定ステップと、を含む、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤又は促進剤のスクリーニング方法。被検物質の存在下及び非存在下で、固相化されたHMGBタンパクを放置する放置ステップと、放置ステップ後の固相化されたHMGBタンパクに、標識核酸を接触させる、標識核酸接触ステップと、固相化されたHMGBタンパクに結合した標識核酸を定量する定量ステップと、被検物質の存在下で放置ステップを行った、固相化されたHMGBタンパクに結合した標識核酸の量が、被検物質の非存在下で放置ステップを行った、固相化されたHMGBタンパクに結合した標識核酸の量よりも少ない場合に、当該被検物質が、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤であると判定し、被検物質の存在下で放置ステップを行った、固相化されたHMGBタンパクに結合した標識核酸の量が、被検物質の非存在下で放置ステップを行った、固相化されたHMGBタンパクに結合した標識核酸の量よりも多い場合に、当該被検物質が、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の促進剤であると判定する、判定ステップと、を含む、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤又は促進剤のスクリーニング方法。被検物質の存在下及び非存在下で、固相化された核酸とHMGBタンパクとを接触させる、接触ステップと、固相化された核酸に結合したHMGBタンパクを定量する定量ステップと、被検物質の存在下で固相化された核酸に結合したHMGBタンパクの量が、被検物質の非存在下で固相化された核酸に結合したHMGBタンパクの量よりも少ない場合に、当該被検物質が、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤であると判定し、被検物質の存在下で固相化された核酸に結合したHMGBタンパクの量が、被検物質の非存在下で固相化された核酸に結合したHMGBタンパクの量よりも多い場合に、当該被検物質が、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の促進剤であると判定する、判定ステップと、を含む、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤又は促進剤のスクリーニング方法。本発明は、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤及び、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤又は促進剤のスクリーニング方法を提供することを目的とする。本発明は、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド及びその誘導体からなる群から選択される1種以上の化合物からなり、HMGBタンパクに結合することによって、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化を抑制する、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤を提供する。本発明はまた、生体にホスホロチオエートオリゴヌクレオチド及びその誘導体からなる群から選択される1種以上の化合物を投与する工程を含む、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制方法を提供する。本発明はまた、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤としての使用のための、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド及びその誘導体からなる群から選択される1種以上の化合物を提供する。本発明はまた、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド及びその誘導体からなる群から選択される1種以上の化合物の、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤への応用を提供する。発明者らは、核酸によって仲介される免疫応答の活性化には、HMGBタンパクが必須であることを明らかにした。すなわち、発明者らは、核酸によって仲介される免疫応答の活性化は、HMGBタンパクによって仲介されることを明らかにした。発明者らは、さらに、上記の化合物が、HMGBタンパクに強く結合することによって、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化を強力に抑制することを明らかにした。したがって、上記の化合物は、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤として利用することができる。上記の抑制剤は、核酸によって仲介される免疫応答に限らず、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化を抑制する。上記の化合物は、非メチル化CG配列を含まず、長さが5~40塩基のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドであることが好ましく、1配列番号40に記載の塩基配列又は2配列番号40に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であって、HMGBタンパクに対する結合能を有する塩基配列、からなるホスホロチオエートオリゴヌクレオチドであることがより好ましい。これらのホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤として利用することができる。上記の化合物は、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの誘導体であり、当該誘導体は、塩基フリーホスホロチオエートデオキシリボースホモポリマー以下、PSという場合がある。であってもよい。PSは、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドから塩基部分を除いた構造を有する化合物である。実施例で示すように、PSは、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤として利用することができる。本発明の抑制剤は、細胞内において、免疫応答を活性化する核酸とHMGBタンパクとの結合を阻害することにより、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化を強力に抑制する。すなわち、本発明の抑制剤は、発明者らが今回初めて明らかにした機構に基づいて、細胞内のHMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化を抑制するものである。HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化としては、抗原特異的な適応免疫系、多発性硬化症、死細胞による過剰な免疫応答、移植臓器拒絶反応、自己免疫疾患、炎症性腸疾患、アレルギー、敗血症、炎症による腫瘍の増殖、核酸含有病原体により引き起こされる炎症性疾患等が例示される。本発明の抑制剤を投与することにより、ヒト及び動物の生体において、これらの症状を予防又は治療改善することができる。本発明はまた、上記の抑制剤及び薬学的に許容される担体を含有する、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制用組成物を提供する。本発明はまた、被検物質の存在下及び非存在下で、HMGBタンパクと標識核酸とを混合する混合ステップと、標識核酸に結合したHMGBタンパクを定量する定量ステップと、被検物質の存在下で標識核酸に結合したHMGBタンパクの量が、被検物質の非存在下で標識核酸に結合したHMGBタンパクの量よりも少ない場合に、当該被検物質が、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤であると判定し、被検物質の存在下で標識核酸に結合したHMGBタンパクの量が、被検物質の非存在下で標識核酸に結合したHMGBタンパクの量よりも多い場合に、当該被検物質が、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の促進剤であると判定する、判定ステップと、を含む、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤又は促進剤のスクリーニング方法を提供する。本発明はまた、被検物質の存在下及び非存在下で、固相化されたHMGBタンパクを放置する放置インキュベーションステップと、放置ステップ後の固相化されたHMGBタンパクに、標識核酸を接触させる、標識核酸接触ステップと、固相化されたHMGBタンパクに結合した標識核酸を定量する定量ステップと、被検物質の存在下で放置ステップを行った、固相化されたHMGBタンパクに結合した標識核酸の量が、被検物質の非存在下で放置ステップを行った、固相化されたHMGBタンパクに結合した標識核酸の量よりも少ない場合に、当該被検物質が、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤であると判定し、被検物質の存在下で放置ステップを行った、固相化されたHMGBタンパクに結合した標識核酸の量が、被検物質の非存在下で放置ステップを行った、固相化されたHMGBタンパクに結合した標識核酸の量よりも多い場合に、当該被検物質が、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の促進剤であると判定する、判定ステップと、を含む、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤又は促進剤のスクリーニング方法を提供する。本発明はまた、被検物質の存在下及び非存在下で、固相化された核酸とHMGBタンパクとを接触させる、接触ステップと、固相化された核酸に結合したHMGBタンパクを定量する定量ステップと、被検物質の存在下で固相化された核酸に結合したHMGBタンパクの量が、被検物質の非存在下で固相化された核酸に結合したHMGBタンパクの量よりも少ない場合に、当該被検物質が、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤であると判定し、被検物質の存在下で固相化された核酸に結合したHMGBタンパクの量が、被検物質の非存在下で固相化された核酸に結合したHMGBタンパクの量よりも多い場合に、当該被検物質が、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の促進剤であると判定する、判定ステップと、を含む、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤又は促進剤のスクリーニング方法を提供する。上記本発明のスクリーニング方法によれば、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤又は促進剤のスクリーニングを可能にすることができる。これらのスクリーニング方法は、発明者らが今回初めて明らかにした、免疫応答の活性化がHMGBタンパクによって仲介されるという新たな機構に基づくものである。これらのスクリーニング方法により、簡便に効率よくスクリーニングを行うことができる。本発明により、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化、すなわち、死細胞による過剰な免疫応答、移植臓器拒絶反応、自己免疫疾患、炎症性腸疾患、アレルギー、敗血症、炎症による腫瘍の増殖、核酸含有病原体により引き起こされる炎症性疾患等の新たな原理に基づいた抑制剤が提供される。また、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤又は促進剤のスクリーニング方法が提供される。発明者らが新たに解明した機構に基づいた、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤が提供される。この抑制剤は、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド及びその誘導体からなる群から選択される1種以上の化合物からなる。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドとは、オリゴデオキシリボヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体である。抑制剤は、非メチル化CG配列を含まず、長さが5~100塩基であるホスホロチオエートオリゴヌクレオチドからなることが好ましい。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの長さは、10~40塩基であることがより好ましく、15~30塩基であることが更に好ましく、15~20塩基であることが特に好ましい。このようなホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、HMGBタンパクと結合して、HMGBタンパクをマスクすることにより、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化を抑制することができる。非メチル化シトシングアニンCG配列とは、5’-CG-3’の塩基配列であって、メチル化されていない配列を意味する。非メチル化CG配列を含まない5~100塩基のオリゴヌクレオチドは、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答を活性化しない。一方、100塩基を超える長さのオリゴヌクレオチドは、免疫応答を活性化する場合がある。上記のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、配列番号40に記載の塩基配列又は配列番号40に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であって、HMGBタンパクに対する結合能を有する塩基配列からなるホスホロチオエートオリゴヌクレオチドであることがより好ましい。配列番号40の塩基配列は、5’-TCCATGAGSTTCCTGATGCT-3’であり、ここでSはG又はCを表す。また、SがCである場合の塩基配列からなるホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは後述するCpG-RevS配列番号38に対応し、SがGである場合の塩基配列からなるホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは後述するCpG-MS配列番号39に対応する。また、1若しくは数個とは、1~10個、より好ましくは1~5個、更により好ましくは1~3個、特に好ましくは1又は2個を意味する。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、配列番号40に記載の塩基配列からなることが更に好ましい。このような塩基配列からなるホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化を強力に抑制することができる。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの誘導体としては、HMGBタンパクに対する結合能を有するものであれば特に制限されず、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの骨格の少なくとも一部をリン酸ジエステル結合に変換したもの、少なくとも一部のデオキシリボースをリボースに変換したもの、少なくとも一部の塩基を除いたもの、少なくとも一部をPNApeptidenucleicacidに変換したもの、少なくとも一部をLNALockednucleicacidに変換したもの、少なくとも一部の塩基を塩基アナログに変換したもの等を例示できる。これらの誘導体の中でも、塩基フリーホスホロチオエートデオキシリボースホモポリマーPSが好ましい。PSとは、化学式C5H8O4PSnで表される化合物であり、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドから塩基部分を全て除いた構造を持つ。nは10~100であることが好ましく、15~25であることがより好ましい。上記のホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、PS又はこれらの誘導体は、核酸合成装置等を用いて合成したものでもよく、北海道システムサイエンスやファスマック等のメーカーから購入したものでもよい。実施例に示すように、PSは、インビトロにおいて、0.1~50μM、より好ましくは1~10μM、特に好ましくは5μMの濃度で投与することにより、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化を抑制することができる。この結果は、そのままインビボにも適用することができる。CpG-BODNは、実施例に示すように、TLR9Toll様受容体9を欠失した細胞、又は、TLR9の発現量が少ないMEF等の細胞を用いたインビトロ実験において、0.1~10μM、より好ましくは0.3~3μM、特に好ましくは1μMの濃度で投与することにより、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化を抑制することができる。この結果は、そのままインビボにも適用することができる。HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤を臨床で使用する際には、抑制剤に、賦形剤、安定化剤、保存剤、緩衝剤、溶解補助剤、乳化剤、希釈剤、等張化剤等の添加剤が適宜混合された、組成物の形態であってもよい。HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制用組成物は、必須成分である上記の抑制剤の他に、薬学的に許容される担体を含む。薬学的に許容される担体としては、医薬品等に通常使用される各種の成分、すなわち、水、低級アルコール、多価アルコール、油剤、界面活性剤、保湿剤、水溶性高分子化合物、増粘剤、皮膜剤、粉体、キレート剤、pH調整剤、動植物微生物由来の抽出物、糖類、アミノ酸類、有機アミン類、合成樹脂エマルジョン、皮膚栄養剤、ビタミン類、酸化防止剤、酸化防止助剤、香料、各種薬効剤等が挙げられ、上記の抑制剤の効果を損なわない範囲で適宜加えることができる。投与形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口剤、注射剤、坐剤、液剤等による非経口剤、あるいは軟膏剤、クリーム剤、貼付剤等による局所投与等を挙げることができる。抑制剤の使用量は症状、年齢、体重、投与方法等に応じて適宜選択される。1実施形態において、上記の抑制剤が抑制する、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化は、核酸によって仲介される免疫応答の活性化である。免疫応答を活性化する核酸とは、二本鎖RNAdouble-strandedRNA、dsRNA、一本鎖RNAsingle-strandedRNA、ssRNA、5’三リン酸化RNA、microRNA、ウイルスRNA、ウイルスDNA、微生物DNA微生物由来のDNA、真核生物DNA、B-DNA通常のDNAの立体構造をとった合成DNA、B型DNAISDIFN-stimulatoryDNA、非メチル化オリゴヌクレオチド等を意味する。ISDとは、45塩基の合成DNA配列番号36であり、ISDを細胞内に導入するとI型IFN誘導が起こるが、これはTLR非依存性に、IRF-3の活性化を介して行われることが知られている。本明細書において、これらの免疫応答を活性化する核酸を総称して全ての免疫原性核酸と呼ぶ場合がある。また、本明細書において、用語免疫応答は自然免疫応答及び適応免疫応答の双方を含む。1実施形態において、上記の抑制剤が抑制する、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化は、核酸によって仲介される免疫応答の活性化ではなく、HMGBタンパクのサイトカインとしての機能に基づく免疫応答の活性化である。上記の抑制剤がHMGBタンパクに結合することによって、HMGBタンパクのサイトカインとしての機能に基づく免疫応答の活性化が抑制される。HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化としては、抗原特異的な適応免疫系、多発性硬化症、死細胞による過剰な免疫応答、移植臓器拒絶反応、関節リウマチ等の自己免疫疾患、炎症性腸疾患、アレルギー、敗血症、炎症による腫瘍の増殖、核酸含有病原体により引き起こされる炎症性疾患が例示される。これらの免疫応答は不利益をもたらす例である。ここで、過剰な免疫応答とは、例えば肝臓の壊死性炎症のように、ウイルス感染、循環異常や代謝異常、単純炎症反応等の外的要因で壊死した細胞が炎症を誘発し、さらにこの炎症が新たな細胞の壊死を引き起こすという負の連鎖反応を意味する。また、死細胞は、壊死細胞であることが好ましい。また、核酸含有病原体とは、ウイルス、微生物、寄生虫等を意味する。上記の免疫応答を活性化する核酸をリポフェクトアミン商品名、インビトロジェン社やDOTAP商品名、ロシュ社等の陽イオン性脂質を用いてヒト細胞を含む動物細胞の細胞質内に投与すると、IFN-β、IFN-α1、IFN-α4等のI型IFNインターフェロンやケモカイン、炎症性サイトカインの遺伝子発現を誘導し、免疫応答が惹起されることが知られている。非メチル化オリゴヌクレオチドとしてCpGオリゴデオキシリボヌクレオチド以下、CpGODNという場合がある。が、dsRNAとしてpolyI:Cが、ssRNAとしてpolyUが、B-DNAとしてpolydA:dTdT:dA等が用いられる場合がある。CpGODNとは、細菌DNAに出現頻度の高い、非メチル化CG配列5’-CG-3’を含む合成オリゴヌクレオチドである。CpGODNにはポリGテールを有するCpG-AODND型とも言われる。や、B細胞を強力に活性化し、Th1型サイトカインの産生を誘導するCpG-BODNK型とも言われる。等が存在する。CpG-BODNとしては、例えば、5’-TCCATGACGTTCCTGATGCT-3’配列番号1等の配列を有するものが使用可能である。また、CpG-AODNとしては、例えば、5’-GGTGCATCGATGCAGGGGGG-3’配列番号2等の配列を有するものが使用可能である。これらのCpGODNは、部分的にリン酸ジエステル結合をホスホロチオエート結合等に変換した構造を持つものであってもよい。CpGODNは10~30merのものが好ましく、polyI:Cは10~10000merのものが好ましく、polyUは10~10000merのものが好ましく、polydA:dTdT:dAは10~10000merのものが好ましい。本発明は、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤又は促進剤のスクリーニング方法を提供する。このスクリーニング方法の第1の実施形態は、被検物質の存在下及び非存在下で、HMGBタンパクと、標識核酸とを混合する混合ステップと、標識核酸に結合したHMGBタンパクを定量する定量ステップと、被検物質の存在下で標識核酸に結合したHMGBタンパクの量と、被検物質の非存在下で標識核酸に結合したHMGBタンパクの量とを比較し、被検物質の存在下で標識核酸に結合したHMGBタンパクの量が、被検物質の非存在下における標識核酸に結合したHMGBタンパクの量よりも少ない場合に、被検物質が、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤であると判定し、被検物質の存在下で標識核酸に結合したHMGBタンパクの量が、被検物質の非存在下で標識核酸に結合したHMGBタンパクの量よりも多い場合に、被検物質が、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の促進剤であると判定する、判定ステップと、を含むものである。混合ステップにおいて、HMGBタンパクとしては、HMGB1、2又は3の組換え体をいずれも好適に使用できる。発明者らは、HMGBタンパクが、全ての免疫原性核酸に結合することを初めて明らかにした。標識核酸としては特に制限はないが、CpGODN、polyI:C、polyU、B-DNA、5’三リン酸化RNA、microRNA等の合成核酸、HSV-1やワクシニアウイルスDNA等のウイルスDNA、微生物DNA、ウシ胸腺DNA等が例示できる。しかしながら、より均質であることから合成核酸であることがより好ましい。上記の合成核酸は10~100merであることが好ましく、15~25merであることがより好ましい。標識には特に制限はなく、ビオチン、FITC等の蛍光色素、ジゴキシゲニンdigoxigenin、放射性同位元素等で行われてよい。被検物質としては、被検物質単体でヒト細胞を含む動物細胞を刺激した場合に、免疫応答を活性化しないものであれば特に制限はなく、核酸、核酸類似体、タンパク、低分子化合物等を使用できる。被検物質で動物細胞を刺激した場合に免疫応答が活性化されるか否かは、被検物質による刺激によって、IFN-β、IFN-α1、IFN-α4等のI型IFNインターフェロンやケモカイン、炎症性サイトカインなどの発現が増加するか否かを測定することにより調べることができる。こららの遺伝子又はタンパクの発現が増加した場合には、免疫応答が活性化したと判断することができる。混合ステップにおいて、被検物質の濃度は、0.1~100μMであることが好ましい。また、HMGBタンパクの濃度は1~200μg/mlであることが好ましい。また、標識核酸の濃度は0.1~100μMであることが好ましい。これらを適切なプロテアーゼ阻害剤を含むバッファー等の溶媒中で混合し、0.5~24時間反応させることが好ましい。定量ステップは、ストレプトアビジン結合磁性ビーズや、抗FITC抗体結合磁性ビーズ等を用いたプルダウンアッセイによって行ってもよいし、ElectrophoreticMobilityShiftAssayEMSA等によって行ってもよい。例えば、標識核酸にビオチン標識核酸を用い、ストレプトアビジン結合磁性ビーズを用いたプルダウンアッセイを行う場合、混合ステップにより得られたサンプルにストレプトアビジン結合磁性ビーズを添加し、サンプル中のビオチン標識核酸をストレプトアビジン結合磁性ビーズに結合させる。続いて、磁性ビーズの磁気を利用して、標識核酸に結合したHMGBタンパクを回収する。回収したサンプルを、例えばSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動SDS-PAGEに供した後、ゲル上のHMBGタンパクを、例えばPVDF膜に転写し、抗HMGB抗体を用いて染色した後、デンシトメトリー解析等により定量することができる。判定ステップにおいて、被検物質の存在下及び非存在下で標識核酸に結合したHMGBタンパクの量を比較し、被検物質の存在下で標識核酸に結合したHMGBタンパクの量が、被検物質の非存在下における標識核酸に結合したHMGBタンパクの量よりも少ない場合に、被検物質が、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤であると判定する。また、被検物質の存在下で標識核酸に結合したHMGBタンパクの量が、被検物質の非存在下における標識核酸に結合したHMGBタンパクの量よりも多い場合に、被検物質が、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の促進剤であると判定する。第1実施形態のスクリーニング方法において、次のような変形が可能である。標識核酸として、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド及びその誘導体からなる群から選択される化合物、例えば、配列番号40に記載の塩基配列からなるホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを用いる。ここで、上記の標識核酸と、HMGBタンパクのそれぞれを、互いにFRETFluorescenceResonanceEnergyTransfer、蛍光共鳴エネルギー移動を起こす関係にある蛍光物質で標識しておく。このような関係にある蛍光物質の対としては、例えば、N,N,N’,N-テトラメチル-6-カルボキシローダミンTAMRAと5-カルボキシフルオレセインFAM、6-カルボキシ-X-ローダミンROXとFAM、BHQ-1と2’7’-ジメトキシ-4’5’-ジクロロ-6-カルボキシフルオレセインJOE等が挙げられる。これにより、上記の化合物とHMGBタンパクが結合するとFRETが起こり、励起波長に対して生じる蛍光波長が変化する。したがって、試料の蛍光を観察することにより、上記の化合物とHMGBタンパクとが結合したか否かを容易に検出することが可能となる。混合ステップにおいて、被検物質の存在下及び非存在下で、標識した標識核酸と、標識したHMGBタンパクとを混合する。そして、定量ステップにおいて、蛍光観察によりFRETが起きたか否かを測定することにより、標識核酸とHMGBタンパクとの結合の程度を定量的に評価することにより、標識核酸に結合したHMGBタンパクを定量する。続いて、判定ステップにおいて、被検物質の存在下及び非存在下で標識核酸に結合したHMGBタンパクの量を比較し、被検物質の存在下で標識核酸に結合したHMGBタンパクの量が、被検物質の非存在下における標識核酸に結合したHMGBタンパクの量よりも少ない場合に、被検物質が、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤であると判定する。また、被検物質の存在下で標識核酸に結合したHMGBタンパクの量が、被検物質の非存在下における標識核酸に結合したHMGBタンパクの量よりも多い場合に、被検物質が、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の促進剤であると判定する。このような変形により、更に簡便に、効率よく、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤又は促進剤のスクリーニングを行うことができる。HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤又は促進剤のスクリーニング方法の第2実施形態は、被検物質の存在下及び非存在下で、固相化されたHMGBタンパクを放置する放置インキュベーションステップと、放置ステップ後の固相化されたHMGBタンパクに、標識核酸を接触させる、標識核酸接触ステップと、固相化されたHMGBタンパクに結合した標識核酸を定量する定量ステップと、被検物質の存在下で放置ステップを行った、固相化されたHMGBタンパクに結合した標識核酸の量が、被検物質の非存在下で放置ステップを行った、固相化されたHMGBタンパクに結合した標識核酸の量よりも少ない場合に、被検物質が、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤であると判定し、被検物質の存在下で放置ステップを行った、固相化されたHMGBタンパクに結合した標識核酸の量が、被検物質の非存在下で放置ステップを行った、固相化されたHMGBタンパクに結合した標識核酸の量よりも多い場合に、被検物質が、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の促進剤であると判定する、判定ステップと、を含むものである。このスクリーニング方法により、より簡便に、効率よく、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤又は促進剤のスクリーニングを行うことができる。放置ステップでは、固相化されたHMGBタンパクを被検物質の存在下及び非存在下で放置する。HMGBタンパクとしては、HMGB1、2又は3の組換え体をいずれも好適に使用できる。HMGBタンパクは固相担体にあらかじめ固相化して使用する。固相担体としては、特に制限されないが、例えば、ガラス、セラミックス、金属酸化物等の無機物質、天然高分子、合成高分子等からなり、マイクロプレート、マイクロチップ、ビーズ、フィルム、シート等の形態のものが利用できる。固相担体は、表面がアミノ基-NH2やカルボキシル基-COOH等の官能基で修飾されていてもよい。例えば、固相担体として、96ウェルマイクロプレートを用いる場合、リン酸緩衝生理食塩水PBS等の緩衝液に1~100μg/mlの濃度で溶解したHMGBタンパクの溶液を、マイクロプレートの各ウェルに分注し、4~37°Cで0.5~24時間放置することにより、HMGBタンパクを固相化することができる。このマイクロプレートは、使用前にPBS等の緩衝液で洗浄し、結合しなかったHMGBタンパクを除去することが好ましい。また、非特異的な吸着を抑制するために、2ウシ血清アルブミンBSA含有PBS2BSA-PBS等の緩衝液を添加してブロッキングすることが好ましい。被検物質としては、被検物質単体でヒト細胞を含む動物細胞を刺激した場合に、免疫応答を活性化しないものであれば特に制限はなく、核酸、核酸類似体、タンパク、低分子化合物等を使用できる。被検物質の溶媒としては、PBS等の緩衝液を用いることができる。被検物質の非存在下で放置ステップを行う場合には、被検物質を含まない緩衝液のみを用いればよい。放置ステップにおける被検物質の濃度は、0.1~100μMであることが好ましい。また、放置ステップにおいて、対照物質の存在下で放置ステップを行う試験群を設けてもよい。対照物質としては、HMGBタンパクに結合することが分かっている核酸や、結合しないことが分かっている化合物等を用いることができ、例えば、HMGBタンパクに結合することが分かっているものとしてB-DNAを用いることができる。放置ステップは、4~37°Cで0.5~24時間行うことが好ましい。放置ステップの後にPBS等の緩衝液で洗浄し、未反応の被検物質や対照物質を除去することが好ましい。標識核酸接触ステップにおいて、放置ステップ後の固相化されたHMGBタンパクに、標識核酸を接触させる。標識核酸としては特に制限はないが、CpGODN、polyI:C、polyU、B-DNA、5’三リン酸化RNA、microRNA等の合成核酸、HSV-1やワクシニアウイルスDNA等のウイルスDNA、微生物DNA、ウシ胸腺DNA等が例示できる。しかしながら、より均質であることから合成核酸であることがより好ましい。上記の合成核酸は10~100merであることが好ましく、15~25merであることがより好ましい。HMGBタンパクがHMGB1である場合には、標識核酸はRNAであってもよい。標識には特に制限はなく、ビオチン、FITC等の蛍光色素、ジゴキシゲニンdigoxigenin、放射性同位元素等で行われてよい。標識核酸接触ステップの後にPBS等の緩衝液で洗浄し、未反応の標識核酸を除去することが好ましい。ここで、放置ステップで添加した被検物質が、標識核酸のHMGBタンパクへの結合を阻害する場合があり、このような阻害を行う被検物質は、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤である。定量ステップにおいて、固相化されたHMGBタンパクに結合した標識核酸を定量する。標識核酸の定量方法には特に制限はない。例えば、標識核酸がビオチンで標識されていた場合には、セイヨウワサビペルオキシダーゼHRPやアルカリフォスファターゼAP等で標識された、抗ビオチン抗体を反応させ、未反応の抗体を洗浄した後、抗体に結合していたHRPやAP等の酵素に対応した基質を反応させて、発光や発色を得る。得られた発光や発色を、プレートリーダー等を用いて定量する。あるいは、標識核酸がビオチンで標識されていた場合には、抗ビオチン抗体の代わりにHRPやAPで標識されたストレプトアビジンを用いてもよい。例えば、標識核酸がFITCで標識されていた場合には、抗FITC抗体を反応させて標識核酸を定量してもよいし、標識核酸のFITCに励起光を照射し、発生する蛍光を、蛍光プレートリーダー等を用いて定量してもよい。例えば、標識核酸が放射性同位元素で標識されていた場合には、マイクロプレートシンチレーションカウンター等を用いて標識核酸を定量してもよい。判定ステップにおいて、被検物質の存在下で放置ステップを行った、固相化されたHMGBタンパクに結合した標識核酸の量と、被検物質の非存在下で放置ステップを行った、固相化されたHMGBタンパクに結合した標識核酸の量とを比較し、被検物質の存在下で放置ステップを行った、固相化されたHMGBタンパクに結合した標識核酸の量が、被検物質の非存在下で放置ステップを行った、固相化されたHMGBタンパクに結合した標識核酸の量よりも少ない場合に、被検物質が、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤であると判定する。また、被検物質の存在下で放置ステップを行った、固相化されたHMGBタンパクに結合した標識核酸の量が、被検物質の非存在下で放置ステップを行った、固相化されたHMGBタンパクに結合した標識核酸の量よりも多い場合に、被検物質が、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の促進剤であると判定する。図44に、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤又は促進剤のスクリーニング方法の1つの態様を示す。放置ステップ図44aにおいて、被検物質3の存在下及び非存在下並びに陽性対照物質2の存在下で、固相化されたHMGBタンパク1を放置する。続いて標識核酸接触ステップ図44bにおいて、ビオチン標識B-DNA4を接触させる。続いて定量ステップ図44c及び図44dにおいて、固相化されたHMGBタンパク1に結合したビオチン標識B-DNA4を定量する。図44cでは、酵素標識された抗ビオチン抗体5を反応させている。続いて酵素の基質6を添加し図44d、発光又は発色をプレートリーダー等を用いて定量する。被検物質3の非存在下陰性対照で放置ステップを行ったサンプルにおいては、固相化されたHMGBタンパク1に標識核酸が結合する。これに対し、陽性対照物質2の存在下で放置ステップを行ったサンプルにおいては、固相化されたHMGBタンパク1への標識核酸の結合が阻害される。図44の被検物質3の場合は、被検物質3の存在下で放置ステップを行ったサンプルにおいて、固相化されたHMGBタンパク1へのビオチン標識B-DNA4標識核酸の結合が阻害されている。そして、被検物質3の非存在下で放置ステップを行った、固相化されたHMGBタンパク1に結合したビオチン標識B-DNA4の量よりも、被検物質3の存在下で放置ステップを行った、固相化されたHMGBタンパク1に結合したビオチン標識B-DNA4の量が少ないため、被検物質3が、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤であると判定される。HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤又は促進剤のスクリーニング方法の第3実施形態は、被検物質の存在下及び非存在下で、固相化された核酸とHMGBタンパクとを接触させる、接触ステップと、固相化された核酸に結合したHMGBタンパクを定量する定量ステップと、被検物質の存在下で固相化された核酸に結合したHMGBタンパクの量が、被検物質の非存在下で固相化された核酸に結合したHMGBタンパクの量よりも少ない場合に、被検物質が、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤であると判定し、被検物質の存在下で固相化された核酸に結合したHMGBタンパクの量が、被検物質の非存在下で固相化された核酸に結合したHMGBタンパクの量よりも多い場合に、被検物質が、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の促進剤であると判定する、判定ステップと、を含むものである。このスクリーニング方法により、より簡便に、効率よく、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤又は促進剤のスクリーニングを行うことができる。接触ステップでは、被検物質の存在下及び非存在下で固相化された核酸とHMGBタンパクとを接触させる。核酸としては、例えば、配列番号40に記載の塩基配列からなるホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを用いることができる。核酸の固相化方法は特に制限されないが、例えば、ストレプトアビジンをコートしたマルチウェルプレートに、ビオチン標識した上記の核酸を結合させること等によって行うことができる。HMGBタンパクとしては、HMGB1、2又は3の組換え体をいずれも好適に使用できる。被検物質としては、被検物質単体でヒト細胞を含む動物細胞を刺激した場合に、免疫応答を活性化しないものであれば特に制限はなく、核酸、核酸類似体、タンパク、低分子化合物等を使用できる。被検物質の溶媒としては、PBS等の緩衝液を用いることができる。接触ステップにおける被検物質の濃度は、0.1~100μMであることが好ましい。接触ステップは、4~37°Cで0.5~24時間行うことが好ましい。接触ステップの後にPBS等の緩衝液で洗浄し、未反応の被検物質や対照物質を除去することが好ましい。接触ステップで添加した被検物質が、核酸とHMGBタンパクとの結合を阻害する場合があり、このような阻害を行う被検物質は、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤である。定量ステップにおいて、固相化された核酸に結合したHMGBタンパクを定量する。標識核酸の定量方法には特に制限はない。例えば、予めHMGBタンパクを蛍光物質で標識しておき、この蛍光を定量することができる。あるいは、HMGBタンパクに対する抗体を用いてHMGBタンパクを定量してもよい。判定ステップにおいて、被検物質の存在下で固相化された核酸に結合したHMGBタンパクの量と、被検物質の非存在下で固相化された核酸に結合したHMGBタンパクの量とを比較し、被検物質の存在下で固相化された核酸に結合したHMGBタンパクの量が、被検物質の非存在下で固相化された核酸に結合したHMGBタンパクの量よりも少ない場合に、被検物質が、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤であると判定する。また、被検物質の存在下で固相化された核酸に結合したHMGBタンパクの量が、被検物質の非存在下で固相化された核酸に結合したHMGBタンパクの量よりも多い場合に、被検物質が、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の促進剤であると判定する。上記のスクリーニング方法により得られた、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の促進剤は、ウイルス、微生物、寄生虫等による感染症の防御機構の活性化、抗ウイルス活性の増大、免疫細胞の分化のバランスを制御してアレルギーの病状を改善する、抗腫瘍応答を活性化する等の目的で使用することができる。これらの免疫応答は有利な効果をもたらす例である。プルダウンアッセイ質量分析の前に、マウス胎児繊維芽細胞mouseembryonicfibroblast、MEFsをpolydA:dTdT:dAB-DNA、10μg/mlで4時間刺激した。刺激後、細胞をダウンスホモジナイザーWheatonscience社を用いてホモジナイザーションバッファー20mMHEPESpH7.4、20グリセロール、50mMKCl、2mMMgCl2、1mMPMSF、10μg/mlアプロチニン、10μg/mlロイペプチン中でホモジナイズした。細胞質タンパク抽出物は、ホモジナイズしたサンプルを14500rpmで30分遠心して調製した。細胞質タンパク抽出物を、5’末端をビオチン標識したB-DNA1.4μg/mlとともにインキュベートした後、ストレプトアビジン結合磁気ビーズインビトロジェン社を添加して4°Cで15分間インキュベートした。プルダウンしたサンプルをDNaseIインビトロジェン社と反応バッファー20mMTris-ClpH8.4、20mMMgCl2、50mMKCl中で反応させ、上清を銀染色インビトロジェン社又は質量分析に供した。インビトロプルダウンアッセイは、次のようにして行った。HMGB1、2又は3の組換え体を、まず、競合物質の存在下及び非存在下で室温で30分処理した。上清をビオチン標識B-DNAと4°Cで30分混合した後、ストレプトアビジン結合磁気ビーズインビトロジェン社を添加して結合バッファー50mMTris-ClpH7.5、150mMNaCl、1mMEDTA、1NP-40、100μg/mlロイペプチン、1mMPMSF、1mMNa3VO4中でインキュベーションした。続いて混合物を結合バッファーでよく洗浄し、SDS-PAGEで分離後、抗HMGB1、2又は3抗体を用いてイムノブロットした。マウス、細胞、試薬Balb/cの遺伝的背景を持つTlr9-/-マウス以外は、C57BL/6の遺伝的背景を持つマウスを用いた。Tlr9-/-、Hmgb1-/-、Hmgb2-/-マウスの作成は常法により行った。MEFs、RAW264.7、NIH3T3、HEK293T細胞、Tlr9-/-マウスの骨髄由来cDCsconventionaldendriticcells及びpDCsplasmacytoiddendriticcellprecursorsの維持は常法により行った。Hmgb1-/-マクロファージ、cDCs及びpDCsは、胎児肝臓造血前駆細胞分化マーカーのない細胞をミルテニー社のMACSLineagedepletionkitで精製したものを、SCF20ng/ml、IL-310ng/ml及びIL-610ng/mlの存在下で2日間培養した後、20ng/mlM-CSFマクロファージ、20ng/mlGM-CSFcDCs、100ng/mlヒトFlt3LpDCsの存在下で6日間培養することにより調製した。SCF、IL-3及びIL-6はペプロテック社から購入した。IFN-γ及びTNF-αはRDシステムズから購入した。IFN-βは東レ株式会社から親切にも提供された。B-DNA及びウシ胸腺DNAはシグマ社から購入した。ビオチン標識polydA:dTdT:dAは北海道システムサイエンス社から購入した。ISDIFN-stimulatoryDNA、CpGODN、FITC標識塩基フリーホスホロチオエートデオキシリボースホモポリマーPS、20mer及びFITC標識塩基フリーナチュラルデオキシリボースホモポリマーPD、20merはファスマック社から購入した。PDとは、PSのホスホロチオエート結合をホスホジエステル結合に変換したものである。精製ワクシニアウイルスDNAMO株はA.Kato及びM.Kidokoroより提供された。HSVDNAはY.Kawaguchiから親切にも提供された。5’-三リン酸RNAはC.ReiseSousa及びJ.Rehwinkelから提供された。大腸菌DNA微生物DNA及びR837はインビボジェン社から購入した。polyU及びリポポリサッカライドLPSはシグマ社から購入した。polyI:CはGEヘルスケアバイオサイエンス社から購入した。B-DNA、polyI:C及びその他の核酸リガンドは、特記しない限り10μg/mlの濃度で使用した。CpG-AODNとDOTAPロシュ社の複合体形成は常法により行った。MitoTrackerDeepRed633はインビトロジェン社から購入した。抗HMGB1抗体及び抗HMGB2抗体はアブカム社から購入した。抗HMGB3抗体はトランスジェニック社から購入した。抗IRF3抗体ZM3はZymed社から購入した。抗β-アクチン抗体AC-15はシグマ社から購入した。抗NF-κBp65抗体C20はサンタクルズバイオテクノロジー社から購入した。抗リン酸化STAT1抗体58D6はセルシグナリング社から購入した。プラスミド構築マウスHMGBcDNAはMEFs由来の全RNAをもとに、RT-PCRにより得て、pGEX4T3ベクターGEヘルスケアバイオサイエンス社のSalI及びNotIサイトにクローニングした。グルタチオンSトランスフェラーゼGSTタグ付きHMGBタンパクは、グルタチオンセファロースビーズGEヘルスケアバイオサイエンス社を用いて精製した。HMGBタンパク及びGSTタンパクはトロンビンプロテアーゼノバジェン社処理によって分離した。マウスRIG-I配列番号3、HMGB1配列番号4及びRab5配列番号5のcDNAは、MEF由来の全RNAに対する、逆転写を伴うポリメラーゼ連鎖反応以下、RT-PCRという場合があるにより得られ、pCAGGS-CFP、pCAGGS-YFP及びpCAGGS-RFPベクターProc.Natl.Acad.Sci.USA、101、15416-15421、2004を参照のXhoI及びNotI認識部位にそれぞれクローニングし、CFP-RIG-I、YFP-HMGB1及びRFP-Rab5を得た。イムノブロット解析細胞溶解及びイムノブロット解析は常法により行った。IRFダイマーはネイティブPAGE及び後に続く抗マウスIRF3抗体を使用したイムノブロット解析により行った。IRF3ダイマーの定量はNIHImageソフトウエアにより行った。3回の独立した実験により同様の結果が得られた。RNA解析RNA抽出及び逆転写反応は常法により行った。定量的リアルタイムRT-PCR解析定量的RT-PCRはライトサイクラー480商品名、ロシュ社及びSYBRGreenシステムロシュ社を用いて行った。全データはグリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素GAPDH遺伝子について得られた結果を用いて標準化した、相対的発現単位で表示した。データは3重に測定し、平均±標準偏差として表示した。全てのデータについて、2回以上の独立した実験において同様の結果が得られた。定量的RT-PCRのためのプライマー配列は次のとおりであった。HMGB1センス5’-CCAAAGGGGAGACCAAAAAG-3’配列番号6、HMGB1アンチセンス5’-TCATAGGGCTGCTTGTCATCT-3’配列番号7、HMGB2センス5’-TGCCTTCTTCCTGTTTTGCT-3’配列番号8、HMGB2アンチセンス5’-GGACCCTTCTTTCCTGCTTC-3’配列番号9、HMGB3センス5’-GGAGATGAAAGATTATGGACCAG-3’配列番号10、HMGB3アンチセンス5’-CTTTGCTGCCTTGGTG-3’配列番号11、GBP1センス5’-CTCAGCAGCAGTGCAAAAGG-3’配列番号12、GBP1アンチセンス5’-GCTCCTGGAGGGTTTCTGTG-3’配列番号13、IRF7センス5’-GCAAGGGTCACCACACTA-3’配列番号14、IRF7アンチセンス5’-CAAGCACAAGCCGAGACT-3’配列番号15、IL-12p40センス5’-GACACGCCTGAAGAAGATGAC-3’配列番号16、IL-12p40アンチセンス5’-TAGTCCCTTTGGTCCAGTGTG-3’配列番号17、GAPDHセンス5’-CTCATGACCACAGTCCATGC-3’配列番号18、GAPDHアンチセンス5’-CACATTGGGGGTAGGAACAC-3’配列番号19、IL-6センス5’-ATGAAGTTCCTCTCTGCAAGAGACT-3’配列番号20、IL-6アンチセンス5’-CACTAGGTTTGCCGAGTAGATCTC-3’配列番号21、RANTESセンス5’-ACGTCAAGGAGTATTTCTACAC-3’配列番号22、RANTESアンチセンス5’-GATGTATTCTTGAACCCACT-3’配列番号23、IκB-αセンス5’-TTGGTGACTTTGGGTGCT-3’配列番号24、IκB-αアンチセンス5’-TGACATCAGCCCCACATTT-3’配列番号25、IFN-α1センス5’-GCCTTGACACTCCTGGTACAAATGAG-3’配列番号26、IFN-α1アンチセンス5’-CAGCACATTGGCAGAGGAAGACAG-3’配列番号27、IFN-α4センス5’-GACGACAGCCAAAGAAGTGA-3’配列番号28、IFN-α4アンチセンス5’-GAGCTATGTCTTGGCCTTCC-3’配列番号29、IFN-βセンス5’-CCACCACAGCCCTCTCCATCAACTAT-3’配列番号30、IFN-βアンチセンス5’-CAAGTGGAGAGCAGTTGAGGACATC-3’配列番号31。但し、実施例50、54及び56における定量的RT-PCRで使用したプライマーの塩基配列は次の通りであった。Ifna4フォワード鎖Fw5’-CAATGACCTCAAAGCCTGTGTG-3’配列番号47、Ifna4リバース鎖Rv5’-CACAGTGATCCTGTGGAAGT-3’配列番号48、Ifnb1Fw5’-CCACCACAGCCCTCTCCATCAACTAT-3’配列番号49、Ifnb1Rv5’-CAAGTGGAGAGCAGTTGAGGACATC-3’配列番号50、Il6Fw5’-ACGATGATGCACTTGCAGAA-3’配列番号51、Il6Rv5’-GTAGCTATGGTACTCCAGAAGAC-3’配列番号52、TnfaFw5’-TCATACCAGGAGAAAGTCAACCTC-3’配列番号53、TnfaRv5’-GTATATGGGCTCATACCAGGGTTT-3’配列番号54、Ccl5RANTESFw5’-ACGTCAAGGAGTATTTCTACAC-3’配列番号22、Ccl5RANTESRv5’-GATGTATTCTTGAACCCACT-3’配列番号23、GapdhFw5’-CTCATGACCACAGTCCATGC-3’配列番号18、GapdhRv5’-CACATTGGGGGTAGGAACAC-3’配列番号19。統計解析対照群及び試験群の結果はスチューデントのt検定により評価した。ELISAマウスIFN-β、IL-6及びIL-1βはELISAにより測定した。IFN-βELISAキットはPBLバイオメディカルラボラトリーズ社から購入した。IL-6及びIL-1βELISAキットはRDシステムズ社から購入した。全データについて、追加の独立した2回の試験において同様の結果が得られた。RNA干渉siRNAベクターは、オリゴヌクレオチドをpSUPER.retro.puroレトロウイルスベクターのEcoRI及びHindIIIサイトに挿入することにより構築した。マウスHMGB1、2及び3pan-HMGB-siRNA、以下、HMBG-siという場合がある。;HMGB2;及びレニラルシフェラーゼRenillaluciferase対照、以下、Ctrl-siという場合がある。のsiRNAの標的配列は、それぞれ5’-GTATGAGAAGGATATTGCT-3’配列番号32、5’-GCGTTACGAGAAACCAGTT-3’配列番号33及び5’-GTAGCGCGGTGTATTATACA-3’配列番号34であった。遺伝子導入されたMEFs細胞はピューロマイシンシグマ社2μg/mlで、RAW264.7細胞はピューロマイシン4μg/mlで48時間選択した。ElectrophoreticmobilityshiftassayEMSAEMSAは常法により行った。NF-κBのコンセンサス配列5’-TCGACCCGGGACTTTCCGCCGGGACTTTCCGCCGGGACTTTCCGG-3’、配列番号35を用いた。NF-κB-DNA複合体中に存在するp65の存在は、抗p65抗体を用いたスーパーシフトバンドの検出により確認した。ウイルス感染MOImultiplicityofinfection1.0のHSV-1又はVSVを12時間細胞に感染させた。HSV-1及びVSVの収率を測定する場合には、常法によりプラーク形成アッセイを行った。全データについて、追加の独立した2回の試験において同様の結果が得られた。ウイルスの調製は常法により行った。蛍光顕微鏡観察HeLa細胞5×104個を、底面がガラス製の35mm組織培養ディッシュ松浪硝子工業株式会社上で培養した。蛍光顕微鏡観察は、レーザー走査型共焦点顕微鏡IX81オリンパス株式会社を用いて行った。2重及び3重カラーイメージは連続取得モードにより撮影し、交差励起を防いだ。オリゴヌクレオチドホスホロチオエートオリゴヌクレオチドであるCpG-B配列番号37、以下CpG-BSと標記する場合がある。、CpG-Rev配列番号38、以下CpG-RevSと標記する場合がある。及びCpG-M配列番号39、以下CpG-MSと標記する場合がある。並びにPSを用いた。これらの化合物の塩基配列を図46に示す。図46において、下線を付した、CGCpG-BS、GCCpG-RevS及びGGCpG-MSは、各ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドにおける特徴的な塩基配列である。また、上記のほか、次のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドも使用した。CpGODN1018S5’-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3’配列番号55、ODN1019S5’-TGACTGTGAAGGTTAGAGATGA-3’配列番号56。また、次のオリゴヌクレオチドも使用した。CpG-A5’-ggTGCATCGATGCAgggggG-3’配列番号2。CpG-Aは、小文字表記の塩基はホスホロチオエート骨格をもち、大文字表記の塩基はリン酸ジエステル骨格をもつ。マウス脾細胞の調製C57BL/6Jマウスの脾臓を摘出し、これにDNaseIcollagenaseD入りPBSを25Gの注射針Niproで注入し、滲出した細胞浮遊液を回収した。さらに脾臓を新たなDNaseIcollagenaseD入りPBS中で細切し、これを回収して37°Cインキュベーション30分した。両者をセルストレイナーメッシュサイズ40μm、BDに通し、PFEPBSpH7.2インビトロジェンに1mMEDTAGIBCO及び2FCSHyCloneを添加したもので洗浄した後1×RBCLysisBuffereBioscienceに懸濁し赤血球を溶血させた。得られた細胞をさらに2度PFEで洗浄した後、再度セルストレイナーメッシュサイズ40μm、BDに通し、RPMI培地に懸濁した。ウェスタンブロッティングによるシグナル伝達経路の活性化の解析実施例53において、1次抗体として、次の抗体を使用した。ウサギ抗IRF3ポリクローナル抗体Invitrogen、ウサギ抗リン酸化IRF3Ser3964D4G抗体CellSignaling、マウス抗IκBαL35A5抗体CellSignaling、ウサギ抗リン酸化IκBαSer3214D4抗体、CellSignaling、ウサギ抗JNK抗体CellSignaling、ウサギ抗リン酸化JNKThr183/Tyr18581E11抗体CellSignaling、ウサギ抗p38MAPキナーゼ抗体CellSignaling、ウサギ抗リン酸化p38MAPキナーゼThr180/Tyr182抗体CellSignaling。また、2次抗体として、次の抗体を使用した。抗ウサギIgGHRP結合抗体GEHealthcare抗マウスIgGHRP結合抗体GEHealthcare。細胞質DNA又はRNAにより活性化される免疫応答におけるHMGBの役割実施例1Hmgb1/MEF細胞又はHmgb1-/-MEF細胞を、B-DNA図1a又はpolyI:C図1bで6時間、又はリポポリサッカライドLPS200ng/ml図1cで2時間刺激した。IFN-βmRNAの誘導レベルを定量的RT-PCRで測定した。結果を図1に示す。はHmgb1/MEF細胞と比較した場合にp<0.01であることを示す。データは全て平均±標準偏差n=3として表示した。NDは検出されなかったことを意味する。Hmgb1-/-MEF細胞では、細胞質へのDNA又はRNAの送達によるIFN-β誘導が低下した。実施例2Hmgb2/MEF細胞又はHmgb2-/-MEF細胞をB-DNA図2a又はpolyI:C図2bで6時間、又はLPS200ng/ml図2cで2時間刺激した。IFN-βmRNAの誘導レベルを定量的RT-PCRで測定した。結果を図2に示す。はHmgb2/MEF細胞と比較した場合にp<0.001であることを示す。データは全て平均±標準偏差n=3として表示した。NDは検出されなかったことを意味する。Hmgb2-/-MEF細胞における、IFN-β誘導の低下は、細胞質へのDNAの送達により観察されたが、RNAの送達によっては観察されなかった。実施例3全てのHMGBを標的としたsiRNAHMBG-si、又は対照siRNACtrl-siを発現するレトロウイルスで形質転換したMEFに、B-DNA又はpolyI:Cを脂質導入リポフェクションした。続いて、IFN-β図3a及びe、IFN-α4図3b及びf、IL-6図3c及びg、RANTES図3d及びhのmRNAの発現レベルを定量的RT-PCRで測定した。結果を図3に示す。はCtrl-si-MEFと比較した場合にp<0.01であることを示す。データは全て平均±標準偏差n=3として表示した。NDは検出されなかったことを意味する。全てのHMGBを欠失したMEFは、細胞質DNA又はRNAに対する免疫応答が欠損していた。実施例4全てのHMGBを欠失したMEFに、様々な供給源から調製された核酸、すなわち、HSV-1DNA図4a、ワクシニアウイルスDNA図4b、5’-三リン酸RNA図4c、微生物DNA図4d、ウシ胸腺DNA図4e、ISD図4fを、脂質導入により、細胞質に送達した。ISDの塩基配列は5’-TACAGATCTACTAGTGATCTATGACTGATCTGTACATGATCTACA-3’配列番号36である。対照としてLPSによる刺激も行った図4g。脂質導入から6時間後におけるIFN-βmRNAの発現量を定量的RT-PCRで測定した。結果を図4に示す。はCtrl-si-MEFと比較した場合にp<0.01であることを示す。データは全て平均±標準偏差n=3として表示した。NDは検出されなかったことを意味する。全てのHMGBを欠失したMEFを、LPS200ng/mlにより2時間刺激した結果、IFN-βが誘導された図4g。これに対し、全てのHMGBを欠失したMEFは、様々な供給源から調製された核酸の細胞質への送達から6時間後におけるIFN-β誘導が欠損していた図4a~h。細胞質核酸受容体に媒介されたシグナル経路の活性化、及び抗ウイルス免疫応答におけるHMGBの必要性実施例5全てのHMGBを標的としたsiRNAHMBG-si、又は対照siRNACtrl-siを発現するレトロウイルスで形質転換したMEFに、B-DNA又はpolyI:Cを脂質導入リポフェクションした。IRF3の二量体化をネイティブPAGE及びそれに続くイムノブロットにより評価した。結果を図5に示す。実施例6全てのHMGBを標的としたsiRNAHMBG-si、又は対照siRNACtrl-siを発現するレトロウイルスで形質転換したMEFに、B-DNA又はpolyI:Cを脂質導入リポフェクションした。NF-κBの活性化をEMSAにより評価した。結果を図6に示す。実施例7ウイルス感染によるI型IFNの誘導を検討した。全てのHMGBを標的としたsiRNAHMBG-si、又は対照siRNACtrl-siを発現するレトロウイルスで形質転換したMEFに、VSV又はHSV-1を感染させた。I型IFN、すなわち、IFN-β図7a及びb、IFN-α1図7c及びd、IFN-α4図7e及びfのmRNAの発現レベルを定量的RT-PCRで測定した。結果を図7に示す。データは全て平均±標準偏差n=3として表示した。NDは検出されなかったことを意味する。はCtrl-si-MEFと比較した場合にp<0.01であることを示し、はCtrl-si-MEFと比較した場合にp<0.05であることを示す。実施例8樹状細胞DCsのサブセットの1つである形質細胞様樹状細胞の前駆細胞plasmacytoiddendriticcellprecursors、pDCsにおいては、TLR9を介して大量のI型IFNの産生が誘導されることが知られている。脾臓由来のpDCsにおいては、DNAウイルスである1型単純ヘルペスウイルスherpessimplexvirustype1、HSV-1により感染を受けると、TLR9を介してI型IFNの発現が誘導されるが、骨髄由来のpDCsやcDCsconventionalDCsにおいては、HSV-IによるI型IFNの発現誘導に、TLR9非依存性の経路も存在することが報告されている。Hmgb1/又はHmgb1-/-cDCsを、TLRリガンド、すなわち、polyI:C図8a及びb、CpG-BODN図8c及びdで刺激した。対照としてLPSによる刺激も行った図8e及びf。続いて、IL-6図8a、c、e及びTNF-α図8b、d、fのmRNAの発現レベルを定量的RT-PCRで測定した。結果を図8に示す。データは全て平均±標準偏差n=3として表示した。NDは検出されなかったことを意味する。は野生型細胞と比較した場合にp<0.01であることを示す。実施例9Hmgb1/又はHmgb1-/-pDCsを、TLRリガンド、すなわち、CpG-BODN図9a及びpolyU図9bで刺激した。対照としてR837TLR7アゴニストによる刺激も行った図9c。続いて、IFN-βのmRNAの発現レベルを定量的RT-PCRで測定した。結果を図9に示す。データは全て平均±標準偏差n=3として表示した。は野生型細胞と比較した場合にp<0.01であることを示す。HMGBへの高結合親和性核酸類似体を用いた、核酸により活性化される免疫応答の干渉実施例10MEFはTLR9の発現量が少ないことが知られている。MEFを、1μMのCpG-BODNによる30分間の前処理の有無の後に、B-DNA図10a、polyI:C図10b又はLPS図10cの細胞質への送達により刺激した。IFN-βmRNAの発現レベルを定量的RT-PCRで測定した。結果を図10に示す。データは全て平均±標準偏差n=3として表示した。NDは検出されなかったことを意味する。は前処理された細胞の結果が、前処理されなかった細胞の結果に対してp<0.01であることを示す。実施例11骨髄由来のTlr9-/-pDCsを、5μMPS又は1μMCpG-BODNによる30分間の前処理の有無の後に、1μg/mlのpolyU図11aの脂質導入又は25μg/mlのR837図11bのいずれかにより8時間刺激した。IFN-βmRNAの発現を定量的RT-PCRで測定した。結果を図11に示す。は前処理された細胞の結果が、前処理されなかった細胞の結果に対してp<0.01であることを示す。HMGBの同定とそのDNA及びRNAへの結合実施例12HMGBを同定した。B-DNAで4時間刺激したMEFの細胞質抽出物を、ビオチン結合B-DNA及びストレプトアビジン結合磁性ビーズを用いたプルダウンアッセイに供した。B-DNAに結合したタンパクをDNaseI処理により溶出した。溶出されたタンパク質は、SDS-PAGE及びそれに続く銀染色により可視化され図12a、続いて質量分析により解析された。図12aに銀染色の結果を示す。図12bにHMGB1、2及び3に対する抗体を用いたイムノブロット解析の結果を示す。実施例13HMGBのDNA、RNA及び塩基フリーホスホロチオエートデオキシリボースホモポリマーPSへの結合を検討した。図13に結果を示す。組換えHMGB1又は2並びにビオチン結合B-DNAを用いたインビトロプルダウンアッセイを、1、3、10、30、100μg/mlの非標識核酸B-DNA、polyI:C、polyU、ウシ胸腺DNA、微生物DNA、R8371、3、10、30、100μg/ml上及び中段パネル、塩基フリーナチュラルデオキシリボースホモポリマーPD;0.01、0.1、0.3、1、3μg/ml;下段パネル、及び塩基フリーホスホロチオエートデオキシリボースホモポリマーPS;0.01、0.1、0.3、1、3μg/ml;下段パネルの存在下で行った。下段パネルでは、段階的に増加する非標識B-DNA又はCpG-BODN0.1、0.3、1、3μg/mlも使用した。CpG-BODN及びPSの半数阻害濃度IC50は非標識B-DNAのそれよりも、それぞれ150分の1及び100分の1であった。実施例14組換えHMGB1及びビオチン結合polyUを用いて、段階的に増加する非標識CpG-BODN、PS又はR8370.1、1又は10μg/mlの存在下で、インビトロプルダウンアッセイを行った。結果を図14に示す。実施例15組換えHMGB3及びビオチン結合B-DNAを用いて、1又は10μg/mlの非標識B-DNA又はpolyI:Cの存在下又は非存在下で、インビトロプルダウンアッセイを行った。結果を図15に示す。核酸により活性化される免疫応答におけるHMGBの必須の役割実施例16Hmgb1/又はHmgb1-/-MEFにB-DNA図16a、b、c又はpolyI:C図16d、e、fを脂質導入リポフェクションした。続いて、IFN-α4図16a及びd、IL-6図16b及びe、RANTES図16c及びfのmRNAの発現レベルを定量的RT-PCRで測定した。結果を図16に示す。データは全て平均±標準偏差n=3として表示した。NDは検出されなかったことを意味する。はHmgb1/MEF細胞と比較した場合にp<0.01であることを示す。HMGB1の非存在下では、様々なサイトカイン及びケモカイン遺伝子の誘導が低下した。実施例17野生型及び同腹仔由来のHmgb1-/-MEFを段階的に増加するB-DNA0.1、1、5、10μg/ml図17a及びb又はpolyI:C0.1、1、5、10μg/ml図17c及びdで6時間刺激、又はLPS10、50、100、500ng/ml図17e及びfで2時間刺激した。IFN-β図17a、c、e及びIL-6図17b、d、fのmRNAの発現を定量的RT-PCRで測定した。結果を図17に示す。実施例18Hmgb1/又はHmgb1-/-cDCsconventionaldendriticcellsにB-DNA図18a、b、c又はpolyI:C図18d、e、fを脂質導入リポフェクションした。続いて、IFN-β図18a及びd、IFN-α4図18b及びe、IL-6図18c及びfのmRNAの発現レベルを定量的RT-PCRで測定した。結果を図18に示す。データは全て平均±標準偏差n=3として表示した。NDは検出されなかったことを意味する。はHmgb1/cDCs細胞と比較した場合にp<0.01であることを示す。HMGB1の非存在下では、様々なサイトカイン及びケモカイン遺伝子の誘導が低下した。cDCsにおけるpolyI:Cに対する応答はRLR及びTLR3の双方により媒介されていると考えられる。実施例19HMGB2の非存在下でのサイトカイン遺伝子の誘導を検討した。野生型及び同腹仔由来のHmgb2-/-MEFを段階的に増加するB-DNA0.1、1、5、10μg/ml図19a及びb又はpolyI:C0.1、1、5、10μg/ml図19c及びdで6時間刺激、又はLPS10、50、100、500ng/ml図19e及びfで2時間刺激した。IFN-β図19a、c、e及びIL-6図19b、d、fのmRNAの発現を定量的RT-PCRで測定した。結果を図19に示す。データは全て平均±標準偏差n=3として表示した。実施例20Hmgb1-/-MEFにおけるHMGB2のノックダウンの影響を検討した。HMGB2を標的としたsiRNAHMBG2-si、又は対照siRNACtrl-siを発現するレトロウイルスで形質転換したHmgb1-/-MEFを、B-DNA図20a及びb又はpolyI:C図20c及びdで刺激し、IFN-β図20a及びc又はIFN-α4図20b及びdのmRNAの発現を定量的RT-PCRで測定した。対照siRNACtrl-siを発現するHmgb1/についても、比較のために解析した。結果を図20に示す。データは全て平均±標準偏差n=3として表示した。は対照siRNACtrl-siを発現する細胞と比較した場合にp<0.01であることを示す。実施例21HMGB2を標的としたsiRNAの効果を検討した。野生型のMEFを、示されたsiRNAレトロウイルスで形質転換し、各HMGBタンパクの発現をイムノブロット解析により解析した。結果を図21に示す。実施例22全てのHMGBを標的としたsiRNAの効果を検討した。野生型のMEFを、全てのHMGBを標的としたsiRNAHMBG-si、又は対照siRNACtrl-siを発現するレトロウイルスで形質転換し、HMGB1図22a、HMGB2図22b及びHMGB3図22cタンパクの発現を定量的RT-PCRにより解析した。結果を図22に示す。はCtrl-siを導入したMEFと比較した場合にp<0.01であることを示す。実施例23全てのHMGBを標的としたsiRNAの効果を検討した。野生型のMEFを、全てのHMGBを標的としたsiRNAHMBG-si、又は対照siRNACtrl-siを発現するレトロウイルスで形質転換し、各HMGBタンパクの発現をイムノブロット解析により解析した。結果を図23に示す。実施例24HMGB欠失細胞における、様々な核酸による細胞質の刺激に対する、免疫応答の欠損を検討した。全てのHMGBを標的としたsiRNAHMBG-si、又は対照siRNACtrl-siを発現するレトロウイルスで形質転換したMEFを、HSV-1DNA図24a、ワクシニアウイルスDNA図24b、5’-三リン酸RNA図24c、微生物DNA図24d、ウシ胸腺DNA図24e、ISD図24f示された核酸で6時間、又はLPS200ng/ml図24gで2時間刺激した。IL-6遺伝子のmRNA発現レベルを定量的RT-PCRで測定した。結果を図24に示す。データは全て平均±標準偏差n=3として表示した。はCtrl-siを導入したMEFと比較した場合にp<0.01であることを示す。実施例25HMGB欠失細胞における、様々な濃度の核酸リガンドに対する免疫応答の欠損を検討した。全てのHMGBを標的としたsiRNAHMBG-si、又は対照siRNACtrl-siを発現するMEFを、段階的に増加するB-DNA0.1、1、5、10μg/ml図25a、d又はpolyI:C0.1、1、5、10μg/ml図25b、eで6時間刺激、又はLPS10、50、100、500ng/ml図25c、fで2時間刺激した。IFN-β図25a、b、c又はIL-6図25d、e、fのmRNAの発現を定量的RT-PCRで測定した。結果を図25に示す。データは全て平均±標準偏差n=3として表示した。実施例26HMGB欠失細胞における、様々な濃度の核酸リガンドに対する免疫応答の欠損を検討した。全てのHMGBを標的としたsiRNAHMBG-si、又は対照siRNACtrl-siを発現するMEFを、段階的に増加するB-DNA0.1、1、5、10μg/ml図26a、c又はpolyI:C0.1、1、5、10μg/ml図26b、dで6時間刺激、又はLPS10、50、100、500ng/ml図26eで2時間刺激した。IFN-β図26a及びb又はIL-6図26c、d、eの発現をELISAで測定した。結果を図26に示す。データは全て平均±標準偏差n=3として表示した。実施例27HMGB欠失細胞の、様々なサイトカイン刺激への応答を検討した。全てのHMGBを標的としたsiRNAHMBG-si、又は対照siRNACtrl-siを発現するMEFを、B-DNA10μg/mlで6時間図27a、IFN-β500ユニット/mlで6時間図27b、IFN-γ1ユニット/mlで2時間図27c又はTNF-α10ng/mlで2時間図27d刺激した。IFN-β図27a、IRF7図27b、GBP1図27c及びIκB-α図27dのmRNA発現量を定量的RT-PCRで測定した。結果を図27に示す。データは全て平均±標準偏差n=3として表示した。基本的に、これらのリガンドの異なる量においても同じ結果が得られた。実施例28HMGB欠失細胞における、IFN-γに誘導されたSTAT1の活性化を検討した。全てのHMGBを標的としたsiRNAHMBG-si、又は対照siRNACtrl-siを発現するMEFをIFN-γ1又は10ユニット/mlで30分間刺激した。リン酸化されたSTAT1及びβ-アクチンを、抗リン酸化STAT1p-STAT1及び抗β-アクチン抗体でそれぞれ検出した。結果を図28に示す。実施例29HMGB欠失RAW264.7細胞における、核酸による細胞質刺激に対する免疫応答の欠損を検討した。全てのHMGBを標的としたsiRNAHMBG-si、又は対照siRNACtrl-siを発現するRAW264.7細胞を、B-DNA図29a又はpolyI:C図29bで示された時間刺激した。IFN-β遺伝子のmRNA発現量を定量的RT-PCRで測定した。結果を図29に示す。はCtrl-si発現細胞と比較した場合にp<0.01であることを示す。実施例30HMBG-si又はCtrl-siを発現するRAW264.7細胞を、段階的に増加するB-DNA0.1、1、5、10μg/ml図30a及びd又はpolyI:C0.1、1、5、10μg/ml図30b及びeで6時間刺激、又はLPS10、50、100、500ng/ml図30c及びfで2時間刺激した。示されたサイトカイン遺伝子のmRNA発現量を定量的RT-PCRで測定した。結果を図30に示す。データは全て平均±標準偏差n=3として表示した。実施例31HMGB欠失NIH3T3細胞における、核酸による細胞質刺激に対する免疫応答を検討した。全てのHMGBを標的としたsiRNAHMBG-si、又は対照siRNACtrl-siを発現するNIH3T3細胞を、B-DNA図31a又はpolyI:C図31bで示された時間刺激した。IFN-β遺伝子のmRNA発現量を定量的RT-PCRで測定した。結果を図31に示す。はCtrl-si発現細胞と比較した場合にp<0.01であることを示す。実施例32HMBG-si又はCtrl-siを発現するNIH3T3細胞を、段階的に増加するB-DNA0.1、1、5、10μg/ml図32a及びc又はpolyI:C0.1、1、5、10μg/ml図32b及びdで9時間刺激、又はLPS10、50、100、500ng/ml図32eで2時間刺激した。IFN-β図32a及びb又はIL-6図32c、d、eのmRNA発現量を定量的RT-PCRで測定した。結果を図32に示す。データは全て平均±標準偏差n=3として表示した。実施例33B-DNA刺激によるインフラマソームinflammasome経路の活性化と細胞死におけるHMGBの関与を検討した。Hmgb1/又はHmgb1-/-胎児肝臓造血前駆細胞由来マクロファージ図33a、及び全てのHMGBを標的としたsiRNAHMBG-si、又は対照siRNACtrl-siを発現するRAW264.7細胞図33bにB-DNAを脂質導入し、12時間後に分泌された成熟IL-1βの量をELISAで測定した。RAW264.7細胞は50ng/mlのLPSで16時間刺激し、インフラマソームを活性化させた。結果を図33に示す。データは全て平均±標準偏差n=3として表示した。図33に結果を示す。は野生型細胞又はCtrl-si発現細胞と比較した場合にp<0.01であることを示す。NDは検出されなかったことを意味する。HMBG-si又はCtrl-siを発現するRAW264.7細胞を、段階的に増加するB-DNAで刺激した。細胞は24時間の刺激後に回収し、トリパンブルーで染色した。未処理細胞に対する生細胞の百分率を計算した。結果を図33cに示す。HMGB-siを発現しているRAW264.7細胞は、DNAに誘導される細胞死に対して、より耐性であった。データは全て平均±標準偏差n=3として表示した。実施例34全てのHMGBを標的としたsiRNAHMBG-si、又は対照siRNACtrl-siを発現するMEFに、VSV図34a又はHSV-1図34bを感染させ、24時間後にウイルスタイターを測定した。結果を図34に示す。データは全て平均±標準偏差n=3として表示した。はCtrl-si発現細胞と比較した場合にp<0.01であることを示す。実施例35全てのHMGBを標的としたsiRNAHMBG-si、又は対照siRNACtrl-siを発現するRAW264.7細胞に、VSV図35a、b、c又はHSV-1図35d、e、fを感染させた。続いて、IFN-β図35a及びd、IFN-α1図35b及びe及びIFN-α4c及びfのmRNA発現量を測定した。結果を図35に示す。はCtrl-si発現細胞と比較した場合にp<0.01であることを示し、はCtrl-si発現細胞と比較した場合にp<0.05であることを示す。NDは検出されなかったことを意味する。実施例36全てのHMGBを標的としたsiRNAHMBG-si、又は対照siRNACtrl-siを発現するRAW264.7細胞に、VSV又はHSV-1を感染させた。続いて、ウイルスタイターを測定した。結果を図36に示す。はCtrl-si発現細胞と比較した場合にp<0.01であることを示す。核酸に媒介されたTLRの活性化にはHMGBが必要である実施例37全てのHMGBを標的としたsiRNAHMBG-si、又は対照siRNACtrl-siを発現するRAW264.7細胞を、polyI:C図37a及びb又はCpG-BODN図37c及びdで刺激し、IL-6図37a及びc及びTNF-α図37b及びdのmRNAの発現量を定量的RT-PCRで測定した。結果を図37に示す。データは全て平均±標準偏差n=3として表示した。はCtrl-si発現細胞と比較した場合にp<0.01であることを示す。NDは検出されなかったことを意味する。実施例38全てのHMGBを標的としたsiRNAHMBG-si、又は対照siRNACtrl-siを発現するRAW264.7細胞を、CpG-AODN、並びにCpG-AODN及びDOTAPで刺激し、IFN-β図38a及びIFN-α4図38bのmRNAの発現量を定量的RT-PCRで測定した。DOTAP商品名、ロシュダイアグノスティックス株式会社はDNA、RNA等の負に帯電した分子を真核細胞中にカチオンリポソームを介して導入するための試薬である。結果を図38に示す。データは全て平均±標準偏差n=3として表示した。はCtrl-si発現細胞と比較した場合にp<0.01であることを示す。実施例39核酸類似体を用いた刺激による、核酸により活性化される免疫応答の阻害を検討した。MEFにB-DNAを脂質導入した後、1μMCpG-BODNで0、1、2、3時間共刺激し、IFN-βの誘導をELISAで測定した。結果を図39に示す。データは全て平均±標準偏差n=3として表示した。はCpG-BODNでの刺激を伴わない、B-DNAによる刺激と比較した場合に、p<0.01であることを示す。実施例40骨髄由来Tlr9-/-cDCsを、5μMPS又は1μMCpG-BODNで30分の前処理の有無の後に、50μg/mlのpolyI:C脂質導入なし図40a、又は25μg/mlのR837図40bで4時間刺激した。IL-12p40mRNAの発現量を定量的RT-PCRで測定した。結果を図40に示す。データは全て平均±標準偏差n=3として表示した。は、前処理された細胞の結果に対する、前処理されなかった細胞の結果がp<0.01であることを示す。NDは検出されなかったことを意味する。実施例41HMGB1及びRIG-Iの細胞内局在を検討した。HeLa細胞に、CFPタグを付けたRIG-ICFP-RIG-I及びYFPタグを付けたHMGB1YFP-HMGB1の発現ベクターを、RFPタグを付けたRab5RFP-Rab5と共に又はRFP-Rab5なしで導入した。遺伝子導入から16時間後、細胞をpolyI:Cで2時間刺激し、レーザー走査型共焦点顕微鏡を用いて蛍光顕微鏡観察を行った。図41に発現ベクターCFP-RIG-I、YFP-HMGB1、RFP-Rab5を共導入された細胞の蛍光顕微鏡写真を示す。図41の上段及び下段は、それぞれ単独左から右に、RIG-I、HMGB1、Rab5及び重ね合わせ左から右に、CFP-RIG-IYFP-HMGB1、CFP-RIG-IRFP-Rab5、YFP-HMGB1RFP-Rab5、CFP-RIG-IYFP-HMGB1RFP-Rab5の写真を示す。スケールバーは5μmを示す。多くの細胞で観察された、代表的な結果を示す。RIG-I及びHMGB1の双方が部分的にRab5と重なっており、これは、RIG-I及びHMGB1のエンドソーム膜への動員、及びおそらくはHMGBによるRIG-Iの活性化を示している。実施例42CFP-RIG-I及びYFP-HMGB1発現ベクターを共導入した細胞を、polyI:C刺激後に、MitoTrackerDeepRed633mitoTR、インビトロジェン社で染色し、レーザー走査型共焦点顕微鏡を用いて蛍光顕微鏡観察を行った。図42に細胞の蛍光顕微鏡写真を示す。図42の上段及び下段は、それぞれ単独左から右に、CFP-RIG-I、YFP-HMGB1、mitoTR及び重ね合わせ左から右に、CFP-RIG-IYFP-HMGB1、CFP-RIG-ImitoTR、YFP-HMGB1mitoTR、CFP-RIG-IYFP-HMGB1mitoTRの写真をそれぞれ示す。スケールバーは5μmを示す。ここで示されるように、RIG-IはmitoTRと重なっており、HMGB1及びmitoTRの間には、重なりは全く見られなかった。実施例41で示された結果と共に、この結果は、次のように解釈される。HMGB1によるpolyI:C認識の後、RIG-Iが活性化されてミトコンドリアに局在化し、そこでIPS-1/MAVSと相互作用する。これらの観察は、核酸認識及び免疫応答の活性化の一連の活動におけるスナップショットであり、この観察においては、RIG-Iの一部の画分がHMGB1と相互作用し、一方で他の画分がHMGB1から解離してIPS-1/MAVSと結合している。図43に、上記の実施例の結果に基づいて作成した、核酸によって仲介される免疫応答の活性化、すなわちHMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の概略図を示す。全ての免疫原性核酸はHMGBに結合しpromiscuoussensing、広範な認識、これは後に続く免疫応答を活性化するための特異的パターン認識受容体による認識discriminativesensing、特異的な認識に必要である。実施例43マイクロプレートを用いて、固相化されたHMGBタンパクを用いた、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤のスクリーニング方法を評価した。5μg/mlの濃度でPBSに溶解した組換えHMGB1タンパクを、100μlずつ、96ウェルマイクロプレートに分注し、25°Cで1時間放置して固相化した。各ウェルをPBS溶液で2回洗浄後、2BSA-PBS溶液を100μlずつ加え、25°Cで1時間放置してブロッキングした。各ウェルをPBS溶液で2回洗浄後、PBS溶液のみ、75μg/mlのB-DNA、100μg/mlのpolyI:C、100ng/mlのLPS及び25μg/mlのR837を溶解したPBS溶液を100μlずつ添加し、25°Cで1時間放置した。続いて、各ウェルをPBS溶液で2回洗浄後、1μMの5’末端をビオチン標識したB-DNA又はPBS溶液のみを100μlずつ加え、25°Cで1時間放置した。続いて、各ウェルをPBS溶液で2回洗浄後、PBS溶液で200倍希釈したHRP標識抗ビオチン抗体RD社を100μlずつ加え、25°Cで1時間放置した。各ウェルをPBS溶液で2回洗浄後、HRPの基質溶液BDバイオサイエンス社を100μlずつ加え、25°Cで15分間発色させた。各ウェルの吸光度をマイクロプレートリーダーModel680、バイオラッド社で定量した。図45aに発色後のマイクロプレートの写真を示し、図45bに各サンプルの吸光度のグラフを示す。データは全て平均±標準偏差n=3として表示した。HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化に対する、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド及びPSの効果ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドであるCpG-BS、CpG-RevS及びCpG-MS並びにPSを用いた実験を行った。これらの化合物の塩基配列を図46に示す。図46において、下線を付した、CGCpG-BS、GCCpG-RevS及びGGCpG-MSは、各ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドにおける特徴的な塩基配列である。インビトロプルダウンアッセイ実施例44実施例13と同様にして、0.1、0.5、2.5、12.5、62.5μg/mlのCpG-BS、CpG-RevS、CpG-MS及びPSを競合物質として、組換えHMGB1及びビオチン結合B-DNAを用いたインビトロプルダウンアッセイを行った。結果を図47に示す。CpG-RevS及びCpG-MSデータ示さずはPSよりも強い競合性を示した。HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制実施例45MEFの培地に0.1、0.25、0.5、0.75、1μMの濃度のCpG-BS、CpG-RevS又はPSを添加し、1時間処理した。続いて、これらのMEFに5μg/mlのB-DNA又は5μg/mlのpolyI:Cを脂質導入して24時間刺激し、IFN-βの産生をELISA法により測定した。結果を図48に示す。データは全て平均±標準偏差n=3として表示した。a~cはB-DNAで刺激した結果を示し、d~fはpolyI:Cで刺激した結果を示す。その結果、CpG-BS図48a及びd又はCpG-RevS図48b及びeで処理したMEFにおいて、IFN-βの産生が顕著に減弱していた。また、今回実験した濃度においては、PSを用いた場合のMEFによるIFN-βの産生の抑制は、CpG-BS又はCpG-RevSを用いた場合と比較して弱いことが明らかとなった図48c及びf。以上の結果から、MEFによるIFN-βの産生の抑制には、塩基部分の存在が重要であることが明らかとなった。TLR9を介した免疫応答の活性化にはCpG-B配列番号1の第8番目及び第9番目の塩基がCGの配列であることが重要であることが知られているが、この配列をGCに変え、リン酸ジエステル結合を全てホスホロチオエート結合に置き換えたCpG-RevS配列番号38で処理したMEFにおいて、IFN-βの産生が顕著に減弱していた。この結果から、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制には、非メチル化CG配列5’-CG-3’は重要ではなく、1ホスホロチオエート結合を有していること、及び2塩基を有していること、が重要であると考えられる。実施例46野生型マウス由来の骨髄細胞を、上述したようにヒトFlt3Lで分化誘導してpDCsを得た。このpDCs以下、Flt3-DCsという場合がある。を、3μMのCpG-MSの存在下で1時間処理した後、1μMのCpG-ATLR9アゴニスト又は5μg/mlのpolyUTLR7アゴニストを脂質導入して24時間刺激し、IFN-α及びIFN-βの産生をELISA法により測定した。結果を図49に示す。a及びbはIFN-αの産生量の測定結果を示し、c及びdはIFN-βの産生量の測定結果を示す。また、a及びcはCpG-Aで刺激した結果を示し、b及びdはpolyUで刺激した結果を示す。データは全て平均±標準偏差n=3として表示した。その結果、Flt3-DCsは、CpG-MSによる処理によって、CpG-A又はpolyUで刺激された場合のIFN-α及びIFN-βの産生が顕著に抑制されることが明らかとなった。インビボ敗血症モデル実施例47マウスへのLPS投与は、敗血症のモデルとして用いられる。致死量のLPSをマウスに投与した場合、血中における炎症性サイトカインTNF-α、IL-1β、IL-6の濃度はLPS投与後間もなく上昇し、2~3時間後にピークを迎え、その後数時間で基底濃度に戻る。一方、マウスの生存の経過を追うと、多くの個体が死に至るにはLPS投与から12~48時間の経過を要する。この時期に血中で高濃度に存在するサイトカインとして見出されたのが、HMGB1である。HMGB1の血中濃度は、LPS投与後8時間のうちには変化が見られず、その後上昇して、投与から16~36時間後に高濃度を維持する。血中のHMGB1濃度と敗血症の重症度が相関していること、HMGB1の中和抗体を投与すると生存率が上昇することから、敗血症の致死性に対するHMGB1の寄与の重要性が伺える。また、敗血症モデルにおいては肝細胞が壊死ネクローシスを起こすことが知られており、壊死細胞によって放出される核酸などのDAMPsが症状を増悪させている可能性が考えられる。これらのいわゆる炎症メディエーターを阻害することで、症状を改善できる可能性について検討した。C57BL/6マウスにLPS1.25mg/匹を腹腔内投与した場合に惹起される敗血症モデルにおいて、CpG-MSの効果を検討した。LPSの投与の1時間前に、100μg/匹のCpG-MS又は生理食塩水を尾静脈投与し、マウスの生存率を測定した。結果を図50に示す。CpG-MSを投与したマウスにおいて、生存率の改善が認められた。LPSの投与により、肝臓等において細胞死が生じ、核酸が放出され、これらの核酸によって、HMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化が誘導されると考えられる。特定の理論に拘泥する物ではないが、CpG-MSの投与により、このようなHMGBタンパクによって仲介される免疫応答の活性化が抑制されていることが考えられる。図50に示すように、CpG-MSの投与を行わなかった対照群n=10ではLPS注射後12~48時間後に全個体が死亡したのに対し、CpG-MSを投与後にLPSを注射したサンプル群n=10では70が生存した。塩基配列の検討実施例48MEFに5mer、10mer配列番号41、15mer配列番号42及び20mer配列番号43の塩基数のpolydAプリン塩基の塩基配列を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチド以下polydASと標記する場合がある。又は5mer、10mer配列番号44、15mer配列番号45及び20mer配列番号46の塩基数のpolydCピリミジン塩基の塩基配列を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチド以下polydCSと標記する場合がある。を1時間1μMで前処理した。続いて、5μg/mlの濃度のB-DNAを脂質導入することで前処理後のMEFを刺激し、3時間後又は6時間後のIFN-βのmRNAの誘導をRT-PCRにて検討した。結果を図51に示す。データは全て平均±標準偏差n=3として表示した。aはpolydASの結果を示し、bはpolydCSの結果を示す。陽性対照としてCpG-MSで前処理したものを用い、陰性対照としてオリゴを添加せずに前処理したものを用いた。polydAS及びpolydCSのいずれも、B-DNA刺激によるIFN-βmRNAの誘導を抑制した。特にプリン塩基であるpolydASを用いた場合のIFN-βmRNAの誘導の抑制は顕著であった。また、15mer以上の長さのホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、IFN-βmRNAの誘導の抑制効果が大きかった。核酸認識受容体シグナルを阻害する非免疫原性オリゴデオキシリボヌクレオチドの探索各種オリゴデオキシリボヌクレオチドODNのI型IFN産生抑制能の比較実施例49polydA:dTdT:dAB型コンフォメーションをとるdsDNA、以下、B-DNAという。、dsRNAであるpolyI:Cをマウス胎児線維芽細胞MEFの細胞内にリポフェクション法によって導入すると、I型IFNIFN-α/β及び炎症性サイトカインが産生されることが報告されている。そこでまず、予め培地中にODNを加えておくこと以下、ODN前処理という。による免疫応答抑制を、核酸刺激によるI型IFNの産生量を指標として検討した。核酸刺激の1時間前に各種ODNによる前処理を行った場合、行わなかった場合について、MEFにおけるI型IFNの産生量をELISAにて定量した。その結果、CpG-BS、CpG-RevS、CpG-MS、CpGODN1018S、ODN1019Sを前処理に用いると、培地中のODN濃度上昇に依存してI型IFNの産生が抑制された。また、塩基をもたずホスホロチオエート骨格のみからなるODNPSは、上記の塩基をもつODNで前処理を行った場合よりも、I型IFN産生抑制能が低いことが明らかになった。結果を図52に示す。より詳細には、MEFにおいて、各種ODNCpG-BS、CpG-RevS、CpG-MS、CpGODN1018S、ODN1019S、PSによる前処理の1時間後に、5μg/mLB-DNAA-F、或いは5μg/mLpolyI:CG-Lで刺激を行い、24時間後の培養液上清中のIFN-βをELISAで定量した。それぞれ独立した2つのサンプルを用いて、平均値と標準偏差を示した。図52中、はP<0.05で、はP<0.01でCpG-MSとCpG-MS-の値に有意差があることを示す。実施例50タンパク質の合成阻害がODNによる免疫応答抑制の原因である可能性を検討した。CpG-BS及びCpG-MSについて、MEFにおけるI型IFN及び炎症性サイトカインのmRNAの誘導を定量的RT-PCRにて検討した。その結果、図53に示すように、CpG-BS、又はCpG-MSを前処理に用いると、I型IFN及び炎症性サイトカインのいずれも、mRNAの発現誘導が抑制された。よって、これらのODNはmRNA発現誘導より上流を標的として免疫応答抑制を行っていることが示唆された。また、CpG-MSと同じ塩基配列をもち且つリン酸ジエステル骨格からなるODNCpG-Mを前処理に用いた場合には、CpG-MSで前処理を行った場合のようなI型IFN及び炎症性サイトカインの発現誘導の抑制が見られなかった。より詳細には、MEFにおいて、各種ODNCpG-BS、CpG-MS、CpG-MSと同じ配列でリン酸ジエステル骨格をもつODNCpG-Mによる前処理の1時間後に、5μg/mLB-DNA、或いは5μg/mLpolyI:Cを細胞内に導入し、刺激を行った。刺激から3、6時間後に全RNAを回収し、AIfna4、BIfnb1、CIl6、DCcl5のmRNAの誘導を定量的RT-PCRにより定量した。それぞれ独立した2つのサンプルを用いて、平均値と標準偏差を示した。図53中、N.D.は検出不能を示す。はP<0.05で、はP<0.01でCpG-MS-の値との間に有意差があることを示す。核酸の取込み効率の解析実施例51実施例50の解析より、MEFにODN前処理を施すことでB-DNA、polyI:C刺激によるIFN産生が抑制されることが示された。これについて、ODNはどのような機構でIFN産生を抑制しているのかについて検討した。B-DNA、polyI:Cを用いて細胞を刺激する際、リポフェクション法によって核酸を導入する必要がある。したがって、実施例50においては、ODNがリポフェクションによるB-DNA、polyI:Cの細胞内への取込みを阻害することにより、結果としてIFN産生が抑制されている可能性が考えられた。そこで、5’末端がFITC標識されたB-DNAを細胞内に取り込ませる際、TLR9を活性化しないと考えられるCpG-RevS、CpG-MS、ODN1019Sの前処理の有無がB-DNA取込みに与える影響について検討した。結果を図54に示す。FITC標識B-DNAを導入したMEFにおいて、FITCに由来する蛍光をフローサイトメトリーにて観測した。フローサイトメトリー解析はFACSCaliburBDを用いて行った。この条件下において、IFN産生を阻害するCpG-BS、CpG-RevS、CpG-MSで前処理したサンプル図54、C、D、Eでは処理無しのコントロール図54、Bと比較し、同程度若しくはより強い蛍光が観測され、B-DNAの取り込みを阻害していないことが明らかとなった。一方で、ODN1019Sによる前処理を行ったMEF図54、Fでは、コントロールの細胞群図54、Bと比較し、FITC由来の蛍光を発する細胞が少なかったことから、ODN1019SはリポフェクションによるB-DNAのMEFへの取込みを阻害していることが判明した。より詳細には、各種ODNによる前処理を行わず、FITC標識B-DNAを導入しなかったMEFA、3μg/mLFITC標識B-DNAのみを導入したMEFB、及び1μMCpG-BSC、1μMCpG-RevSD、1μMCpG-MSE、1μMODN1019SFによる前処理を1時間行った後、3μg/mLFITC標識B-DNAを導入したMEFについて、細胞内に取込まれたFITC標識B-DNA由来の蛍光を、フローサイトメトリーにて検出した。FITC由来蛍光の蛍光強度を横軸とし、細胞数をヒストグラムで示した。図54中、各パネル中の数値は、FITC陽性細胞の全体に占める割合を示す。ODN1019Sがどのようにリポフェクションによる核酸の細胞質内への導入を阻害しているかその機構は不明であるが、この様式の抑制作用の解析は、ここでは主眼とはしていない。したがって本明細書においては、ODN1019Sによる取り込み阻害機構についてはこれ以上の解析を行わず、以下の実験には、CpG-BSと同様に核酸の取込みを阻害しないCpG-MSを用いた。CpG-MSとHMGBタンパク質との結合及び核酸受容体シグナル経路の抑制実施例52上記の結果から、CpG-MSによるIFN産生の抑制は、核酸の取り込み阻害によるものではないことが明らかとなった。そこで、CpG-MSによる抑制の作用点はどこかについて検討した。核酸認識に関連するシグナル伝達分子に着目し、解析を進めた。B-DNAやpolyI:Cの刺激によってI型IFNの誘導のみならずNF-κB経路及びMAPキナーゼ経路が活性化されることが知られているが、B-DNAやpolyI:CとHMGBタンパク質との結合を阻害することで、これらのシグナル伝達経路の活性化が抑制される可能性を検討した。CpG-MSとHMGBタンパク質との結合についてインビトロプルダウンアッセイにて検討した。HMGB1の組換えタンパク質を精製し、ビオチン標識B-DNAと混合すると、図55Aに示すように、HMGB1はB-DNAと結合した。この結合はCpG-BSを競合物として加えていくことで完全に阻害された。次に、このHMGB1とCpG-BSとの強い結合をCpG-MSによって阻害できるかどうかを検討した。図55Bに示すように、ビオチン標識CpG-BSとHMGB1タンパク質を混合し、ここにCpG-MSを添加していくと用量依存的にCpG-BSとHMGB1との強い結合を阻害できることが判明した。ビオチン標識していないCpG-BSを添加した場合と同等に結合が阻害されたことから、CpG-MSはCpG-BSと同程度に強くHMGB1と結合することが示唆された。また同時に、図55Bに示すように、CpG-MSは、塩基をもたないホスホロチオエート骨格のみのODNPS及びCpG-MSと同じ配列でリン酸ジエステル骨格をもつODNCpG-Mよりも強くHMGB1と結合することが示された。より詳細には、HMGB1の組換えタンパク質2μgと終濃度2.5μg/mLのビオチン標識B-DNAに対し、競合物Competitorとして終濃度0、0.1、0.5、2.5、12.5、62.5μg/mLのCpG-BSを加え、インキュベーションした室温、30分。ストレプトアビジン結合磁気ビーズを用いてビオチン標識B-DNAをプルダウンし、共沈したタンパク質に対し抗HMGB1抗体を用いて、ウェスタンブロッティングによりHMGB1を検出した。結果を図55Aに示す。また、HMGB1の組換えタンパク質2μgと終濃度0.2μMのビオチン標識CpG-BSに対し、競合物として終濃度0、1、2、4、8、16、32μMのビオチン標識していないCpG-BS、CpG-MS、塩基をもたないホスホロチオエート骨格のみのODNPS、CpG-MSと同じ配列でリン酸ジエステル骨格をもつODNCpG-Mを加えた。ストレプトアビジン結合磁気ビーズを用いてビオチン標識CpG-Bをプルダウンし、共沈したタンパク質に対し抗HMGB1抗体を用いて、ウェスタンブロッティングによりHMGB1を検出した。結果を図55Bに示す。実施例53実施例49の検討において、HMGB1に高い結合親和性を有すると考えられるCpG-MSの方が、ホスホロチオエート骨格のみのPSよりも核酸刺激によるIFN誘導の抑制能が強かったこと、実施例50の検討において、CpG-MSがI型IFN及び炎症性サイトカインのmRNA誘導を抑制するのに対しCpG-Mは抑制しなかったことを考慮すると、CpG-MSによる免疫応答抑制作用は、CpG-MSがHMGBタンパク質と強く結合することによって、免疫原性核酸のHMGBタンパク質への結合による下流の免疫受容体への結合及びシグナル伝達を阻害することに起因するのではないかと考えられた。この仮説に則れば、CpG-MSの抑制作用はI型IFNの誘導のみにとどまらず、NF-κBやMAPキナーゼの活性化経路にまで及んでいるはずである。そこで次に、核酸刺激によるこれら転写因子やシグナル伝達分子の活性化へのCpG-MSの抑制作用について検討した。B-DNAやpolyI:C等の核酸刺激によるI型IFNの誘導には転写因子であるIFNregulatoryfactor3IRF3が重要な役割を果たしていることが報告されている。IRF3は、無刺激時は単量体として細胞質内に存在するが、リン酸化等によって活性化を受けると、ホモ二量体を形成し核内移行することが知られている。そこでIRF3の活性化を、リン酸化を指標に検討した。図56に結果を示す。核酸刺激によるIRF3のリン酸化は、CpG-MSの前処理によって顕著に抑制されていることが明らかになった。次に、NF-κB経路の活性化をIκBαのリン酸化を指標として、またMAPキナーゼ経路の活性化をc-JunN-terminalkinaseJNK、p38のリン酸化を指標として検討した。その結果、やはりCpG-MSの前処理により、これらの転写因子、シグナル伝達分子の活性化も著明に減弱していることが明らかとなった。以上のことから、CpG-MSはHMGBタンパク質と結合することにより、B-DNAやpolyI:CとHMGBタンパク質との結合を阻害し、それらによる自然免疫受容体刺激によるシグナル経路を抑制していることが示唆された。より詳細には、1μMCpG-MSによる1時間の前処理を行った、或いは行わなかったC57BL/6Jマウス由来のMEFに対し、1μg/mLB-DNAA或いは1μg/mLpolyI:CBを細胞質内に導入し、刺激を行った。刺激後0.5、1、1.5、2、3、4時間後のタンパク質のサンプルを回収し、IRF3、IκBα、JNK、p38のリン酸化p-IRF3、p-IκBα、p-JNK、p-p38を、ウェスタンブロッティングにより検出した。CpG-MSの抑制作用におけるTLR9の関与の検討実施例54上記の結果から、CpG-MSはB-DNAの細胞内への取込みには影響を与えず、細胞内核酸認識受容体下流のシグナル伝達経路の活性化を阻害することが明らかになった。CpG-MSはHMGBタンパク質を標的として免疫応答を抑制していることが強く示唆される。ところで、CpG-MSは、TLR9アゴニストであるCpG-BSと1塩基のみ異なる配列をもつ。そこで、TLR9が発現している細胞種においても、CpG-MSは核酸刺激による免疫系の活性化を抑制できるか否かについて検討した。また、CpG-MS自体がTLR9によって認識され、アゴニストとして作用してしまう可能性について検討した。Tlr9遺伝子欠損Tlr9-/-マウス及び対照Tlr9/-マウス由来のcDCを用い、細胞内核酸刺激に対する応答がCpG-MS前処理によって抑制されるか検討した。図57に示すように、これらのマウス由来のcDCをB-DNA又はpolyI:Cで刺激すると、両者のcDCにおいてI型IFN及び炎症性サイトカインの遺伝子の発現が同等に誘導された。このとき、CpG-MSの前処理によって、Tlr9/-cDC、Tlr9-/-cDCのいずれの場合においてもI型IFN及び炎症性サイトカイン遺伝子の発現誘導が抑制された。以上のことより、MEF以外の細胞種においてもCpG-MSは核酸刺激による免疫系活性を抑制することが明らかになった。また、この抑制作用はTLR9のシグナルには依存せず、TLR9より上流の、おそらくHMGBタンパク質とCpG-MSの結合によってもたらされるものと推察された。さらに、B-DNA又はpolyI:Cで刺激せず、CpG-MSのみ添加した場合にはI型IFNも炎症性サイトカインも誘導されなかったことから、CpG-MSはTLR9のアゴニストであるCpG-BSとは異なり、免疫原性をもたないことが明らかになった。より詳細には、Tlr9遺伝子欠損マウスTlr9-/-及び対照マウスTlr9/-由来のcDCに1μMCpG-MSにより前処理を行い、或いはコントロールとして前処理を行わず、1時間後に5μg/mLB-DNA、5μg/mLpolyI:Cを細胞内に導入し、刺激を行った。刺激から3、6時間後に全RNAを回収し、AIfna4、BIfnb1、CIl6、DTnfaのmRNAの誘導を定量的RT-PCRにより定量した。それぞれ独立した2つのサンプルを用いて、平均値と標準偏差を示した。図54中、N.D.は検出不能を示す。はP<0.05で、はP<0.01でCpG-MSとCpG-MS-の値に有意差があることを示す。CpG-MSによるTLR経路の抑制の検討実施例55実施例54の結果より、CpG-MSがTLR9のさらに上流を標的として核酸刺激による免疫系活性を抑制すると考えられた。そこで、同じく核酸を認識する膜型受容体であるTLR7の下流のシグナル経路も、同様にCpG-MSによって抑制され得るかについて検討した。CpG-MSはTLR9のアゴニストとして免疫原性をもたない。よって、TLR7及びTLR9を多く発現し、それぞれのリガンドであるssRNA、CpGモチーフをもつDNAを認識すると大量のI型IFNを産生する細胞、pDCを用いて、TLR7、TLR9が核酸認識した際のI型IFNの誘導がCpG-MSによって抑制されるか検討した。図58に示すように、pDCをTLR9リガンドであるCpG-A、又はTLR7リガンドであるpolyUで刺激すると、IFN-αの産生が誘導されたが、この産生はCpG-MSでの前処理によって抑制された。より詳細には、3μMCpG-MSで前処理を行った、或いは行わなかったC57BL/6Jマウス由来のpDCを、ATLR9リガンドである1μMCpG-A、BTLR7リガンドである5μg/mLpolyUで刺激し、24時間後の培養上清中のIFN-αをELISAにて定量した。はCpG-MS-ととの値にP<0.01で有意差があることを示す。実施例56次に、定量的RT-PCRにてI型IFN遺伝子の発現誘導を解析したところ、図59に示すように、CpG-A、polyUのいずれを用いて刺激した場合も、mRNAのレベルでI型IFN遺伝子の発現が抑制された。このことから、CpG-MSはTLR7、TLR9による核酸認識に共通した機構を標的として、I型IFNの誘導を抑制していることが示唆された。より詳細には、10μMCpG-MSで前処理を行った、或いは行わなかったC57BL/6Jマウス由来のpDCを、1μMCpG-Aで刺激した際のAIfna4、BIfnb1、及び、5μg/mLpolyUで刺激した際のCIfna4、DIfnb1のmRNA誘導を定量的RT-PCRにて定量した。いずれもそれぞれ独立した2つのサンプルを用いて、平均値と標準偏差を示した。N.D.は検出不能を示す。はP<0.05で、はP<0.01でCpG-MSとCpG-MS-との値に有意差があることを示す。CpG-MSの核酸刺激による適応免疫系活性化の抑制及び病態モデルにおける評価上記の結果から、インビトロにおけるCpG-MSの自然免疫応答抑制能が示された。病原体由来分子パターンPathogen-associatedmolecularpatterns;PAMPsや自己の組織に由来するダメージ関連分子パターンDamage-associatedmolecularpatterns;DAMPsを素早く認識し、応答を行う自然免疫は、生体内の非自己を速やかに排除する点で重要である。しかし同時に、適応免疫系を活性化し、より特異性の高い免疫応答を惹起することもまた自然免疫の重要な役割である。そこで、まず、インビボにおける自然免疫応答、及びこれにより活性化される適応免疫応答は、CpG-MSによって抑制され得るか否かをCD8T細胞の活性化を指標に検討した。さらに、CpG-MSによる適応免疫系の抑制に加え、上記の結果から示された、CpG-MSには免疫原性がないことに着眼し、実験的自己免疫性脳脊髄炎Experimentalautoimmuneencephalomyelitis;EAEや敗血症などの病態モデルにおいてCpG-MSが与える影響について検討した。CpG-MSによる抗原特異的CD8T細胞の活性化抑制実施例57自然免疫系の活性化は適応免疫系の活性化と密接に関連している。抗原とアジュバントを投与することで抗原に特異的な適応免疫系が活性化されることは良く知られており、アジュバントが自然免疫系を活性化し、樹状細胞等において共刺激分子を発現させ、成熟化を促すことでT細胞への抗原提示を促進していると考えられている。核酸と抗原の投与によって抗原特異的な適応免疫系が惹起されることは多数報告されており、ここでは適応免疫系の活性化をCpG-MSが抑制できるか否か、核酸としてB-DNAを用い、抗原として卵白アルブミンタンパク質ovalbumin;OVAを投与した際に誘導されるOVA特異的CD8T細胞を指標に検討を行った。マウスをOVAとB-DNAで免疫する際、CpG-MSを投与する群と投与しない群を用意した。免疫後8日目に脾細胞を調製し、OVA特異的MHCクラスIテトラマーを用いてOVAに特異的に反応するCD8T細胞をフローサイトメトリーにて検出した。図60に示すように、OVAのみでマウスを感作させた場合0.97と比較し、B-DNAと一緒にOVAで免疫した場合ではOVA特異的CD8T細胞の割合12.6は有意に増強していた。このとき、CpG-MSを投与したマウスではこの割合2.41は著明に減弱していた。すなわち、CpG-MSは核酸による適応免疫系の活性化を抑制できることが示された。より詳細には、AOVAのみB-DNA-、BOVAとB-DNAB-DNA、又はCOVAとB-DNAに更にCpG-MSを加えたものB-DNACpG-MSをC57BL/6Jマウスに腹腔内投与した。8日後の脾臓におけるOVA特異的CD8T細胞の割合を、MHCクラスIテトラマーを用いて、フローサイトメトリーにより解析した。図60に、CD8T細胞についてゲートをかけた細胞を表示している。また、CD44陽性且つMHCテトラマー陽性の分画を赤枠で囲んでいる。表記の数字はCD8T細胞にゲートをかけた細胞集団におけるCD44陽性且つMHCテトラマー陽性分画の割合を示す。EAE病態におけるCpG-MSの評価実施例58EAEはヒトの多発性硬化症Multiplesclerosis;MSの動物モデルのひとつである。MSは中枢神経系における自己免疫性の脱ミエリン炎症疾患であり、マウスのEAEでは、ミエリン由来のペプチドMOGペプチド35-55、Operon、以下MOGペプチドという。をフロイント完全アジュバントcompleteFreund’sadjuvant;CFAとともに正常マウスに投与し、免疫することで発症させることができる。MSとEAEに共通する病理的所見は、中枢神経系へのB細胞、T細胞、マクロファージの浸潤とその結果生じる神経障害であり、その病態の増悪には核酸が関与しているという報告もある。そこで、CpG-MSを投与することによってEAEの病態を軽減できるのではないかと考え、実験を行った。EAEでは、尾や四肢の麻痺といった神経障害の重症度をスコア化することで、自己免疫性炎症の進行を評価できる。EAEの病態スコアは、表1の基準に基づいて判定した。MOGペプチドとCFAとをマウス後背部に皮下注射し、免疫した。注射1週間後から2日おきに3回、CpG-MSn=4又はコントロールとしてPBSを投与n=4し、その後の病態の評価を行った。結果を図61に示す。CpG-MS投与群では、対照群と比較しEAEの病態が顕著に軽減されていた。すなわち、CpG-MSはEAEの病態を軽減できることが示された。より詳細には、C57BL/6Jマウスの後背部へのMOGペプチド及びCFAの投与後1週間後から2日おきに3回、CpG-MSCpG-MS、n=4又は対照としてPBSCpG-MS-、n=4を尾静脈注射により投与した。図61に、MOGペプチドの投与からの日数を横軸として、各群の病態スコアの経過を平均値と標準偏差で示した。はP<0.05で、はP<0.01で、はP<0.001でCpG-MSとCpG-MS-との値に有意差があることを示す。壊死細胞による免疫系活性化に対するCpG-MSの抑制効果実施例59次に、壊死細胞によって惹起される免疫系の活性化死細胞による過剰な免疫応答をCpG-MSが抑制できるかどうかについて検討した。マウスマクロファージ系細胞株であるJ774.1細胞を繰り返し凍結融解することで壊死を誘導し、この壊死細胞をCpG-MSの存在下、非存在下で脾細胞と混合して、炎症性サイトカインであるIL-6及びTNF-αの産生をELISAにて検討した。図62に示すように、CpG-MSで前処理した脾細胞では、前処理のCpG-MSの濃度の上昇に依存してIL-6及びTNF-αの産生量が減弱する結果が得られた。これらの結果は、ターゲットの脾細胞での応答を抑制しているのか、又は壊死細胞によって放出される炎症性メディエーターを直接阻害しているのか不明ではあるが、CpG-MSが壊死細胞によって惹起される免疫系活性化を抑制できることを示しているものと考えられた。図62において、J774.1細胞に壊死を誘導させ、CpG-MSの存在下、非存在下で脾細胞と混合し、24時間後の培養上清中のAIL-6及びBTNF-αをELISAにて定量した結果を示す。考察免疫応答抑制ODNの探索とCpG-MSの作用点の解析CpG-BSはCGモチーフを1箇所もち、このCGがTLR9に認識されることで細胞内の免疫応答が惹起される。よって、TLR9の発現が低いMEFにおいてはCpG-BSは免疫応答を惹起しないものの、TLR9を発現するpDCやマクロファージも存在する生体内においては、免疫応答抑制効果のみを期待することは困難である。したがって、TLR9による認識を免れることを目的として、CpG-BSの配列中のCGをGCに置き換えたCpG-RevS、GGに置き換えたCpG-MSを合成し、これらがMEFにおいてCpG-BSと同様のI型IFN産生抑制効果を持つことを確認した。また同じくCGモチーフをもつCpGODN1018Sに対し、CGをGG及びAGで置き換えたODN1019Sを合成し、同様に検討したところ、CpGODN1018S、ODN1019Sの両者ともにMEFにおいてI型IFN産生抑制を示した。続いて行った各種ODNによるB-DNA取込み阻害の検討において、CpG-RevS及びCpG-MSと、ODN1019Sとでは大きな違いが見られた。CpG-RevS及びCpG-MSではB-DNAの取り込みに影響を与えなかったものの、ODN1019Sによる前処理を行ったMEFでは細胞内に取込まれたB-DNAが少なかったことから、ODN1019SはB-DNAの細胞内への取り込みを阻害していると考えられた。取り込み阻害機構の詳細は不明であるが、ODNの全体配列やこれに起因するODNの立体構造が何らかの影響を与えていると考えられる。取り込み阻害による免疫系抑制効果は本研究の焦点とするものではないため、ODN1019Sを用いたその後の検討は行なわず、CpG-MSに焦点をあて、解析を進めた。CpG-MSはどのようにして核酸刺激に対する応答を阻害しているのか、阻害の作用点はどこかについて検討した。CpG-MSはHMGBタンパク質と強く結合し、その機能を阻害することで、核酸に対する免疫応答を抑制しているのではないかと考えた。まずインビトロプルダウンアッセイによる解析から、CpG-MSはHMGB1と強く結合することが示された。さらに、CpG-MSがHMGBタンパク質の機能を阻害することで核酸刺激による応答を抑制しているとする仮説は、本研究で得られた以下の4つの結果によって支持される。i細胞内核酸刺激によって活性化される主要な転写因子、シグナル伝達分子である、IRF3、NF-κB及びMAPキナーゼのいずれも、CpG-MSでの前処理によって活性化が顕著に抑制されていた。このことから、CpG-MSがこれらの転写因子やシグナル伝達分子の活性化経路の上流で作用していることが示唆される。また、B-DNA、polyI:Cのどちらの刺激によるシグナル経路活性化もCpG-MSによって抑制されたことから、CpG-MSは細胞内のDNA及びRNAの両者の認識機構に共通するしくみを標的としていると考えられる。iiCpG-MSによる抑制作用は、Tlr9遺伝子欠損cDCにおいても観察された。すなわち、CpG-MSによる抑制の作用点はTLR9のシグナル伝達系よりさらに上流であることが示唆される。TLR9のシグナル経路の活性化にもHMGB1が必要であるという報告と併せて考えると、CpG-MSはTLR9より上流においてHMGB1を阻害しているものと考えられた。iiipDCにおいて、TLR7、9のどちらの刺激によるI型IFN誘導もCpG-MSによって抑制された。このことから、上述のi、iiと併せて、CpG-MSは細胞内核酸認識機構のみならずTLRによる核酸認識にも共通するしくみを標的としていると考えられる。これは、CpG-MSがHMGB1を阻害しているとする仮説を支持するものと考えられる。ivCpG-MSのHMGB1に対する結合は、塩基部分をもたずホスホロチオエート骨格のみからなるPSのそれと比較し、非常に強いことが明らかとなった。PSもHMGB1と結合はするものの結合親和性は低く、また同時に核酸刺激に対する免疫応答の抑制作用も、CpG-MSと比較して非常に弱いことが判明した。このことは、ODNとHMGB1との結合の強さがODNの免疫応答の抑制作用の強さと相関していることを示唆しており、ODNがHMGB1を阻害することによってこの抑制作用がもたらされるという仮説を支持しているものと考えられる。HMGBタンパク質に強く結合するための核酸の要因として、以下の3つの要素が必要であると考えられる。iホスホロチオエート結合骨格を有するオリゴDNAは、通常のホスホジエステル結合骨格のオリゴDNAよりも、HMGB1との結合が強い。ii塩基部位が存在するODNの方が、塩基をもたない骨格のみのものより、HMGB1との結合が強い。このとき、結合親和性は塩基配列には依存しないと考えられる。実際、塩基部位が全てアデニンもしくはチミンであり且つホスホロチオエート骨格をもつODNを前処理に用いた場合においても、核酸刺激による免疫応答は抑制されるという知見を得ている。ただし、CpG-BSのようにオリゴDNA内にCGモチーフをもつことでTLR9に認識されてしまい、免疫応答を活性化してしまう可能性も考えられる。なお、CGモチーフを有しないCpG-MSには免疫系活性化能は認められなかった。iiiODNによる抑制作用には15mer以上の鎖長が必要である。上記のホスホロチオエート骨格、及びアデニンもしくはチミンのみから成る塩基部位を有する、鎖長5mer、10mer、15mer又は20merのODNを用いて抑制作用を検討したところ、20merのものでは抑制効果が見られたが、それ以下の鎖長ではほとんど抑制が認められなかった。これらの知見から、オリゴDNAとHMGBタンパク質との結合、及び免疫応答の抑制作用には、ホスホロチオエート骨格を有し、20mer程度の鎖長で且つ塩基部位を有することが重要であると推察される。これらの特徴を明らかにしたことは、HMGBタンパク質を標的とした抑制剤を考える上で有用な情報であると期待される。次に、CpG-MSには免疫系活性化能はないことに着眼し、核酸が関与するような病態を軽減する抑制剤として、CpG-MSを用いることについて検討した。OVAを抗原としてB-DNAと一緒にマウスに免疫した際のOVA特異的CD8T細胞の活性化はCpG-MSの投与によって顕著に抑制されていることが明らかとなった。すなわち、CpG-MSは自然免疫系の活性化を抑制するのみならず、インビボにおいて適応免疫系をも抑制できることが判明した。抗原特異的CD8T細胞の活性化に関しては、CD40とTLRの刺激が相乗的に働くことが報告されており、このときのTLRの刺激はI型IFNの誘導を行う要因として考えられている。したがって、CpG-MS投与によって観察されたCD8T細胞の活性化の抑制は、CpG-MSが樹状細胞等において自然免疫系の活性化を阻害されることで、引き続いて誘導される適応免疫系をも抑制されるものと考えられる。しかし、CpG-MSが直接CD8T細胞に感作する可能性等、その他の影響も厳密には否定できない。CpG-MSは自然免疫系のみならず適応免疫系をも抑制できるという観点から、自己免疫疾患のモデルの1つであるEAE病態モデルにおいて、CpG-MSの評価を行った。その結果、CpG-MSの投与によってEAEの病態が劇的に改善できることが判明した。今回の解析で用いたプロトコルでは、MOGペプチドをCFAと混合して正常マウスに投与した。よって、MOGペプチド特異的MHCクラスII拘束性CD4T細胞の活性化が誘導される。しかし、EAEの病態には、T細胞応答に留まらず、様々な因子がその増悪に寄与していることが報告されており、TLR9を介したシグナルの関与も指摘されている。EAEの病態の軽減は、こうした核酸認識受容体シグナルをCpG-MSが抑制している可能性も考えられた。HMGB1の炎症性サイトカインとしての役割とCpG-MSCpG-MSを抗HMGB1抗体のように個体に投与することによってHMGB1の炎症性サイトカイン機能を阻害し、敗血症の病態を抑制できる可能性を検討した。マウスへのLPS投与による敗血症モデルにおいて評価した結果、CpG-MSを予め投与しておくことによって、生存率が顕著に改善することが明らかとなった。MEFやRAW264.7などの細胞において、LPS刺激によるサイトカインの産生自体はCpG-MSは抑制しないという知見が得られており、CpG-MSは細胞へのLPS刺激そのものを抑制しているものではないことが示唆される。CpG-MSの作用点の可能性として、LPS投与によって血中に放出されたHMGB1とCpG-MSが会合し、HMGB1の炎症性メディエーターとしての機能を阻害していることが考えられる。或いは、LPS投与によって肝細胞が壊死を起こすことが知られていることから、壊死などによって放出された核酸が惹起する免疫応答を、CpG-MSが抑制していることも考えられる。そこで、J774.1細胞に壊死を生じさせ、脾細胞と混合したところ、ODNを投与しない場合には脾細胞において産生されるIL-6やTNF-αなどの炎症性サイトカインが、CpG-MSの投与によって抑制されていた。調製した壊死細胞溶液には、細胞から流出したHMGB1と壊死細胞由来の核酸の両者に加え、それらの複合体も含まれていると考えられることから、この結果は、現段階では上記の2つのいずれの仮説にも矛盾しない。炎症性メディエーターとしてのHMGB1をCpG-MSが結合することで阻害しているのか、壊死細胞による免疫系活性化を抑制しているのか、その両者の可能性があるのか、さらには核酸の関与の有無などを明らかすることで、今後CpG-MSを生体に投与することも視野に入れることができると考えられる。"