"修飾生ウシウイルス性下痢症ウイルス1b型BVDV-1b、および獣医学的に許容可能な担体を含む、免疫原性組成物。該修飾生ウシウイルス性下痢症ウイルスが細胞変性BVDV-1bウイルスである、請求項1に記載の免疫原性組成物。パラインフルエンザウイルス3型PI3、ウシ呼吸器合胞体ウイルスBRSV、ウシヘルペスウイルスBHV-1、ウシウイルス性下痢症ウイルス1a型BVDV-1a、ウシウイルス性下痢症ウイルス2型BVDV-2、もしくは感染性ウシ鼻気管炎IBRウイルスの1種以上、またはそれらの任意の組み合わせ、あるいはそれらから得られる1種以上のウイルス特異的抗原をさらに含む、請求項1に記載の免疫原性組成物。修飾生IBRV、修飾生BRSV、修飾生BHV-1、修飾生BVDV1a型、修飾生BVDV2型、もしくは修飾生PI3、またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項1に記載の免疫原性組成物。アジュバントをさらに含む、請求項1に記載の免疫原性組成物。免疫学的に有効量の少なくとも1つの第1の抗原をさらに含む、請求項1に記載の免疫原性組成物。該少なくとも1つの第1の抗原が、アクチノバチルスActinobacillus、アクチノマイセスActinomyces、バチルスBacillus、ボルデテラBordetella、ブラキスピラBrachyspira、カンピロバクターCampylobacter、クロストリジウムClostridium、エーリキアEhrlichia、エリジペロトリックスErysipelothrix、エシェリキアEscherichia、ヒストフィルスHistophilus、レプトスピラLeptospira、リステリアListeria、マンヘミアMannheimia、モラクセラMoraxella、マイコバクテリウムMycobacterium、マイコプラズマMycoplasma、パスツレラPasteurella、サルモネラSalmonella、およびストレプトコッカスStreptococcus、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される生物に特異的である、請求項6に記載の免疫原性組成物。該少なくとも1つの第1の抗原が不活性である、請求項6に記載の免疫原性組成物。哺乳動物ワクチンとして製剤化される、請求項1に記載の免疫原性組成物。ウシワクチンとして製剤化される、請求項9に記載の免疫原性組成物。予防的に有効量の請求項1に記載の免疫原性組成物、およびアジュバントを含む、ワクチン。免疫学的に有効量の少なくとも1つの微生物病原体特異的抗原をさらに含む、請求項11に記載のワクチン。哺乳動物におけるウシウイルス性下痢症ウイルス1b型BVDV-1b特異的免疫反応を誘発する方法であって、複数のBVDV1b型修飾生ウイルス、および獣医学的に許容可能な担体を含む免疫学的に有効量の組成物を該哺乳動物に投与する工程を含む、方法。該組成物が予防的に該哺乳動物に投与される、請求項13に記載の方法。該組成物の投与が、該哺乳動物における治療効果を与える、請求項13に記載の方法。該組成物が、経口、皮下、非経口、筋肉内、もしくは鼻腔内、またはそれらの組み合わせで投与される、請求項13に記載の方法。該組成物が、修飾生ウイルスの1用量当たり、約102~約1010TCID50を含む、請求項13に記載の方法。動物における輸送熱を予防する方法であって、修飾生BVDV-1bウイルスおよび獣医学的に許容可能な担体を含む、予防的に有効量の組成物を該動物に投与する工程を含む、方法。該組成物が、アジュバントをさらに含む、請求項18に記載の方法。該動物が、ペスチウイルスにより感染されているか、またはペスチウイルスからの感染に感受性がある、請求項18に記載の方法。該動物がウシである、請求項18に記載の方法。ペスチウイルス感染に感受性がある動物においてペスチウイルスにより引き起こされる疾患の1つ以上の症状を予防、処置、管理、または改善する方法であって、修飾生BVDV-1bウイルスおよび薬学的に許容可能な担体を含む予防的または治療的に有効量の組成物を該動物に投与する工程を含む、方法。該組成物がアジュバントをさらに含む、請求項22に記載の方法。該組成物が、1種以上のウシロタウイルス、BRSV、BHV-1、ウシコロナウイルス、PI3、ウシパラミクソウイルス、口蹄疫ウイルス、BRV、BVDV-1a、BVDV-2、マンヘモアヘモリチカMannheimiahaemolyticaA1型、マンヘモアヘモリチカMannheimiahaemolyticaA6型、パスツレラムルトシダPasteurellamultocida、ヒストフィルスソムニHistophilussomni、およびマイコプラズマボビスMycoplasmabovis由来の免疫原をさらに含む、請求項22に記載の方法。該動物がウシである、請求項22に記載の方法。BVDV-1bにより引き起こされる疾患に対して動物を予防する方法であって、修飾生BVDV-1bウイルスおよび薬学的に許容可能な担体を含む予防的に有効量の組成物を該動物に投与する工程を含む、方法。該組成物が、修飾生BVDV-1bウイルスの1用量当たり、約102~約1010TCID50単位を含む、請求項26に記載の方法。該動物に投与される組成物の量が約0.1~約5.0mL/用量である、請求項26に記載の方法。ウシ鼻気管炎ウイルス、ウシ呼吸器合胞体ウイルス、もしくはパラインフルエンザ3ウイルス、またはそれらの組み合わせの同時投与をさらに含む、請求項26に記載の方法。該疾患が、輸送熱、ウシ呼吸器病症候群、またはウシウイルス性下痢症である、請求項26に記載の方法。したがって、先行技術に固有のこれらのおよび他の理由のため、活発でそして多くの局面を持つ免疫反応を誘発するBVDVワクチン配合物、および特にBVDVの1b型に対する免疫反応を誘発するものが必要である。ワクチン接種されていない群れにおける大きな経済的損失のため、哺乳動物家畜集団におけるBVDV感染に対する予防を誘導する、修飾された生BVDV-1bウイルスを含有する費用効率的および好ましくは単回用量ワクチンの必要性がある。同様に、BRDCおよび関連する輸送熱疾患などの多因子疾患に対する現代の多価ワクチンは、BVDV-1bによる感染を予防するにはほぼ無効であるため、BVDV-1b感受性の家畜における疾患大流行の予防および抑制をよりよく達成する、改善されたワクチン接種様式に関する必要性もまたある。発明の簡単な要約本発明は、新規でそして有用な組成物、ならびにその必要がある動物に対する予防的および/または療法的剤の送達を好適に改善可能である、該組成物の使用法を含む。本発明は、慣用的な配合物より優れた利点を提供するワクチン組成物を提供し、そして1またはそれより多いペスチウイルスによって引き起こされる疾患、および特に1b型下位遺伝子型のものすなわちBVDV-1bを含むBVDVウイルスによって引き起こされるものを予防するかまたは抑制する方法を特に提供する。全体のそして一般的な意味において、本発明は、組成物、こうした組成物を作製する方法、ならびにウイルスおよび/または微生物感染、発病、および疾患の予防、治療、および/または管理におけるその使用法を含む。本明細書に開示する免疫原性組成物、ならびにその使用法は、獣医学業において、現在利用可能な、慣用的な輸送熱予防法/治療法より優れている、本発明のワクチン組成物およびその使用法を用いた、感受性哺乳動物における輸送熱/BRDCの1またはそれより多い症状の予防、治療、および/または改善において特定の使用を見出す。特定の態様において、本発明は、修飾された生BVDV-1bウイルスを含む免疫原性組成物、ならびに該組成物を含有する薬学的配合物、および多様な予防および/または療法措置において、こうしたワクチンを作製するための方法を提供する。こうした組成物および方法は、BVDV感染に感受性である哺乳動物家畜などの動物において、ウイルス性および多因子疾患の予防に特定の使用を見出す。関連する態様において、本発明はまた、動物におけるウイルス特異的免疫学的反応を誘発するために、開示するワクチン組成物を用いるための方法も提供する。全体のそして一般的な意味において、こうした方法は、一般的に、選択された動物に、動物においてウイルス特異的免疫学的反応を、そして特にBVDV特異的免疫学的反応を誘発するのに有効な量単数または複数で、そして有効な時間、本明細書に開示する1またはそれより多い免疫原性組成物を提供する工程を含む。こうした態様において、動物は、好ましくは、偶蹄目哺乳動物であり、そしてより好ましくはウシ科Bovidaeのメンバーである。本発明はまた、1またはそれより多い選択された哺乳動物集団において、ウイルスおよび/または微生物感染単数または複数ならびに特にBVDVおよび関連する種によって引き起こされるペスチウイルス感染の大流行を予防するかまたは抑制する方法も提供する。該方法は、一般的に、1またはそれより多い開示する免疫原性またはワクチン組成物の有効量を、こうした集団の感受性があるかまたはリスクがあるメンバーに、一般集団においてこうした感染の大流行を遅延させ、和らげ、減少させ、阻害し、そして/または予防するのに十分な時間、提供する工程を含む。例示的な哺乳動物集団には、限定なしに、ウシ亜科Bovinaeおよびヤギ亜科Caprinae、そして特に、バイソン属Bison、ウシ属Bos、スイギュウ属Bubalus、ヤギ属Capra、シロイワヤギ属Oreamnos、ジャコウウシ属Ovibos、ヒツジ属Ovis、アフリカスイギュウ属Syncerus等のものが含まれる。例示的態様において、これらの方法は、限定なしに、アメリカバイソンBisonbison、ウシBostaurus、ヒマラヤヤギCaprahircusおよびヒツジOvisariesを含む、バイソン属、ウシ属、ヤギ属、およびヒツジ属の商業的家畜の治療において特に望ましい。別の側面において、本発明は、動物の免疫系を刺激して、ウイルス感染、および特にウシ科病原性ペスチウイルス感染に対して防御免疫反応を生じるための方法を提供する。こうした方法は、一般的に、少なくとも必要がある動物に、免疫学的および予防的に有効な量の1またはそれより多い開示するワクチン組成物を、動物の免疫系を刺激するのに十分な量で、そして十分な時間、投与する工程を含む。1つの態様において、この方法の慣用的な実施において、1またはそれより多い開示する免疫学的および予防的に活性であるワクチン組成物の投与は、好ましくは、少なくとも、動物において抗ペスチウイルス抗体の第一の検出可能な量を誘導し、そしてより好ましくはなお、少なくとも、動物において抗BVDV-1b抗体の第一の検出可能な量を誘導する。好ましい態様において、組成物の投与は、好ましくは、BVDVウイルスの1またはそれより多いタイプ、株、およびサブタイプ限定なしに、BVDV-1a、BVDV-2、および他の遺伝的に類似のペスチウイルスを含むを含む、1またはそれより多い遺伝的に類似のまたはエピトープ的に関連するウイルスによる、最初の、続く、そして/または再発性の感染に対して、動物を免疫する。さらに別の態様において、本発明は、動物において、ペスチウイルスに対する防御免疫反応を産生するための方法を提供する。こうした方法には、一般的に、必要な動物に、免疫学的にそして予防的に有効な量の1またはそれより多い開示するBVDV-1b免疫原性組成物を、1またはそれより多いペスチウイルス種、亜種、または株に対する、そして好ましくは1またはそれより多いBVDV種、株、サブタイプ、または血清型に対する防御免疫反応を産生するのに十分な条件下で、そして十分な時間、提供する工程が含まれる。同様に、本発明はまた、哺乳動物宿主において、第一の細胞に、予防的または療法的組成物を提供する方法も提供する。この方法は、一般的に、必要な哺乳動物に、予防的または療法的に有効な量の1またはそれより多い本明細書に開示するBVDV特異的免疫原性組成物を、こうした哺乳動物の少なくとも第一の細胞、組織、臓器、または臓器系に組成物を提供するのに有効な条件下で、そして有効な時間、提供する工程を伴う。本発明はまた、哺乳動物において、BVDV感染の1またはそれより多い症状を予防し、治療し、そして/または改善するための方法も提供する。こうした方法には、一般的に、必要な哺乳動物に、免疫学的および予防的に有効な量の1またはそれより多い開示するBVDV-1b免疫原性組成物を、哺乳動物におけるBVDV感染の1またはそれより多い症状を予防し、治療し、そして/または改善するのに十分な条件下で、そして十分な時間、提供する工程が含まれる。同様に、本発明はまた、哺乳動物において、BRDCのような多因子疾患、そして特に、少なくとも第一のBVDVが疾患の原因または寄与病原体として関与している疾患の1またはそれより多い症状を予防し、治療し、そして/または改善するための方法も提供する。こうした方法は、一般的に、選択された哺乳動物に、少なくとも第一の免疫学的または予防的に有効な量の少なくとも第一の抗BVDV-1bワクチン組成物を、哺乳動物における疾患の1またはそれより多い症状を予防し、治療し、そして/または改善するのに十分な条件下で、そして十分な時間、投与する工程を伴う。さらに別の態様において、本発明は、ウシ科メンバーにおいて、輸送熱の1またはそれより多い症状を予防し、治療し、そして/または改善するための方法を提供する。こうした方法には、一般的に、ウシ科動物に、修飾された生BVDV-1bウイルス集団を含む少なくとも第一の免疫学的または予防的に有効な量の第一の組成物を、ウシ科動物における輸送熱の1またはそれより多い症状を予防し、治療し、そして/または改善するのに十分な条件下で、そして十分な時間、投与する工程を伴う。免疫原性組成物1またはそれより多いペスチウイルス、そして特に、ウシ科のメンバーにおけるBRDCおよび輸送熱に関与する1またはそれより多いウイルス病原体に対するより広い防御を提供するため、本発明者らは1またはそれより多いBVDV-1b特異的抗原を含む安全でそして有効なワクチン配合物を開発した。一価および多価ワクチン配合物の両方が記載されてきており、これには一価ワクチンの場合、BVDVのみに特異的な免疫反応を誘発する1またはそれより多い抗原、エピトープ、または修飾生ウイルス、あるいは多価ワクチンの場合、BVDVに対してだけではなく、1またはそれより多いさらなる病原体に対しても特異的免疫反応を誘発する1またはそれより多い抗原、エピトープ、または修飾生ウイルスを含有するものが含まれる。例示的な態様において、修飾生BVDV-1bを含む一価免疫原性組成物は、BVDV-1b感染から家畜を保護するように開発されてきている。さらに、BRDCおよび関連する輸送熱に特異的な多価免疫原性組成物もまた、本発明によって提供され、これには、動物における、1またはそれより多い、好ましくは2またはそれより多い、そしてより好ましくは3またはそれより多いBHV-1、PI3、BRSV、BVDV1型の2つの下位遺伝子型1aおよび1b、およびBVDV2型に対する免疫反応を特異的に誘導するための抗原性構成要素を含む、例示的な六種six-wayすなわち六価修飾生ウシウイルス配合物が含まれる。より好ましい態様において、配合物は、前述の各々に対して、典型的には多様なレベルに、免疫反応を誘導する。さらなる態様において、本発明は、前述の免疫原を含有するワクチン配合物、ならびに動物におけるペスチウイルス感染、そして特に哺乳動物家畜におけるBVDV-1b感染の1またはそれより多い症状の予防、療法、および/または改善における使用のための方法を提供する。本発明はさらに、ワクチン配合物、ならびにウシ科および他の関連哺乳動物種における、輸送熱、例えばBRDCの1またはそれより多い症状の予防、治療、および/または改善において該配合物を使用する方法を含む。ワクチン配合物本発明は、1またはそれより多いウイルス感染の予防において使用するための免疫原性組成物およびそのワクチン配合物、ならびに選択された哺乳動物における1またはそれより多い多因子疾患症候群の予防または療法において使用するための組成物を提供する。特に、本発明は、予防、予防、または療法のためのワクチン薬剤の製造における、開示する1またはそれより多い免疫原性組成物の使用、ならびに特に、哺乳動物における1またはそれより多い疾患、あるいはこうした疾患の1またはそれより多い症状、例えば家畜におけるBVDV感染を予防し、管理し、改善し、そして/または治療するための獣医学的に許容されうる薬剤の製造において使用を提供する。一般の当業者に利用可能な選択された哺乳動物のための任意の適切な投与経路によって、好ましくは筋内または皮下注射、あるいは鼻内、経口、皮膚、経皮または皮内投与によって、本発明のワクチンを投与しうる。好ましくは、BVDV-1bに対するワクチンのため、ワクチン接種は、皮下的に、あるいは筋内または鼻内経路によって投与され、皮下送達が最も好ましい。ワクチンは、典型的には、離乳前に、離乳時に、あるいは牧場またはフィードロットに入る際に投与される。進行中の成体畜牛操作の一部として、こうしたワクチンの1またはそれより多いブースター用量もまたルーチンに使用可能であり、これには例えば、毎年の再ワクチン接種/維持スケジュールの一部としてのものが含まれる。本発明の薬学的配合物およびワクチンは、任意の適切な獣医学的に許容されうる配合物中で調製可能であるが、特定の態様において、本発明は、獣医学業の一般の当業者に知られるように、すぐに投与可能な溶液または懸濁物の形の、投与前に希釈するのが適切な濃縮ストック溶液中の、あるいは凍結乾燥、フリーズドライ、または凍結調製物などの再構成可能な型のワクチンを提供する。修飾生ペスチウイルス組成物の調製、ならびに他の免疫原1またはそれより多いアジュバントを伴うまたは伴わない本発明の組成物およびワクチンの配合はどちらも、本明細書の指針に基づいて慣用的であり、そしてこれには、生弱毒化ペスチウイルスと薬学的に許容されうるキャリアーまたは希釈剤を、場合によって他の免疫原と、そして場合によってアジュバントと混合する工程が含まれる。薬学的配合物およびワクチンのキャリアー、希釈剤、あるいは他の不活性または非活性構成要素は、獣医学業で使用可能であるような、1またはそれより多い安定化剤、保存剤および/または緩衝剤を含むことも可能である。例示的な安定化剤には、限定なしに、SPGA、および1またはそれより多い以下が含まれる:炭水化物限定されるわけではないが、ソルビトール、マンニトール、デンプン、スクロース、デキストラン、グルタメートまたはグルコース、タンパク質限定されるわけではないが、粉乳、血清アルブミン、カゼイン、あるいは植物または微生物由来などの他の供給源由来のタンパク質等。適切な緩衝剤には、限定なしに、1またはそれより多いアルカリ金属ホスフェートが含まれる。開示する薬学的組成物およびワクチンの配合において有用な例示的な保存剤には、限定なしに、チメロサール、メルチオレートmerthiolate、ゲンタマイシン、ネオマイシン、ナイスタチン、アンホテリシンB、テトラサイクリン、ペニシリン、ストレプトマイシン、ポリミキシンB、およびその任意の組み合わせが含まれる。例示的な希釈剤には、限定なしに、無菌水、1またはそれより多い水性緩衝液例えば緩衝生理食塩水等、1またはそれより多いアルコールポリオール、例えばグリセロール等を含む、およびその任意の組み合わせが含まれる。望ましい場合、本発明のワクチン組成物はまた、さらに場合によって1またはそれより多いアジュバントも含んでもよい。アジュバント活性を有する適切な化合物および組成物の限定されない例には、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムまたは酸化アルミニウム、限定なしにDrakeol登録商標、Bayol登録商標、またはMarcol登録商標などのミネラルオイルに基づく水中油、油中水、水中油中水エマルジョン;植物油、例えば限定なしに綿実油、ピーナツ油、またはコーン油;酢酸ビタミンE;サポニン;魚油、例えば限定なしにスクアレンまたはスクアラン;あるいはその任意の組み合わせが含まれる。本発明記載のBVDV特異的ワクチン配合物はまた、さらに場合によって、免疫される動物に対してやはり潜在的に病原性である1またはそれより多いさらなるウイルスおよび/または微生物に特異的な、1またはそれより多い他の免疫原も含有しうる。例えば、畜牛および関連するウシ類において、組成物中に存在しうるさらなる免疫原は、ウシ病原性ウイルスの1またはそれより多い種由来であることも可能であり、これには限定なしに、ロタウイルス、ウシ呼吸器合胞体ウイルス、ウシヘルペスウイルス1型を含む、ウシコロナウイルス、パラインフルエンザウイルス3型を含む、ウシパラミクソウイルス等、あるいは1またはそれより多いウシ病原性微生物種、例えば限定なしに、パスツレラマルトシダ、マンヘミアヘモリチカ以前のパスツレラヘモリチカPasteurellahaemolytica、ヒストフィルスソムニ以前のヘモフィルスソムヌス、マイコプラズマボビス等、あるいは前述のいずれかの組み合わせが含まれる。いくつかの態様において、一般の当業者に理解されるであろうように、関連する場合、本発明の免疫原性組成物およびワクチンには、動物への単回用量の投与が含まれることも可能であり、あるいは長期に渡って、動物への多数回の、および/または連続した用量の投与が含まれることも可能である。あるいは、本発明の免疫原性組成物はまた、単独で、あるいはさらに1またはそれより多い別個の微生物特異的免疫原またはワクチン配合物の投与と組み合わされて、1またはそれより多い抗ウイルスまたは抗微生物化合物と同時投与されうる。本発明の別の重要な側面は、開示する免疫原性組成物を用いて、哺乳動物の感染または疾患の1またはそれより多い症状を治療するかまたは改善するための1またはそれより多い療法剤を送達するための方法に関する。こうした方法は、一般的に、必要がある哺乳動物に、1またはそれより多い開示する免疫原性組成物を、こうした哺乳動物においてこうした疾患または感染の重症度、期間、または度合いを治療するか、改善するか、または和らげるのに十分な量で、そして十分な時間、投与することを伴う。本発明の方法および組成物はまた、疾患の1またはそれより多い臨床症状の診断または開始、あるいはその1またはそれより多い症状の出現の前、その間、またはその後のいずれかで、1またはそれより多い感染および/または疾患を有するか、有すると推測されるか、発展させるリスクがあるか、またはあると診断されている、動物の防止、予防、および/またはワクチン接種において使用可能である。免疫反応を誘導するための方法本発明にはさらに、感受性動物において、1またはそれより多いウイルス病原体に対する検出可能免疫反応を誘導するための方法が含まれる。1つの好ましい方法には、必要がある動物、あるいは例えば所定の疾患または感染に関する既知のリスク要因に基づいて潜在的に必要がある動物に、動物において検出可能な免疫反応を誘導するのに十分な量の本明細書に開示するようなワクチン組成物を投与する工程が含まれる。いくつかの態様において、本発明は、ペスチウイルス感染、例えばBVDVに対して、あるいはペスチウイルス感染が関係しているかまたは原因であるかいずれかである多因子疾患、例えばBRDCに対して、被験体にワクチン接種する方法を含む。こうした方法は、一般的に、必要がある動物に、予防的および/または療法的に有効な量のペスチウイルス特異的ワクチン組成物、および1またはそれより多い薬学的または獣医学的に許容されうるキャリアー、緩衝剤、希釈剤、ビヒクル等を投与して、ペスチウイルス感染、あるいはこうしたペスチウイルス感染によって引き起こされるかまたは悪化する疾患に対して、動物において検出可能な免疫反応を提供する工程を含む。この目的に向けて、本発明は、開示する免疫原性組成物およびワクチン配合物を、動物における1またはそれより多いウイルスまたは微生物疾患または感染、あるいは1またはそれより多いその症状の予防、治療、改善または管理のために用いる方法を提供する。本発明はまた、疾患の予防または防止のための獣医学的薬剤またはワクチンの製造における、1またはそれより多い開示する免疫原性組成物の使用も提供し、これには、動物における、例えばBVDVを含むペスチウイルス感染の1またはそれより多い症状を防止するかまたは改善する予防的投与に適した1またはそれより多いワクチンの調製における使用が含まれる。本発明はまた、哺乳動物において、第一の細胞に療法的または予防的免疫原性化合物を提供するための方法も提供し、該方法は一般的に、必要がある哺乳動物に、活性成分として複数の修飾生ウイルス粒子を含む本明細書に開示するようなBVDV免疫原性組成物の有効量を、免疫されるまたは治療される哺乳動物において、望ましい療法および/または予防を提供するのに有効な時間、提供する工程も含む。療法および予防キット1またはそれより多い開示する免疫原性組成物またはこうした組成物を含む薬学的配合物を含むキット;ならびに1またはそれより多い予防的または療法的措置において、該キットを用いるための使用説明書もまた、本開示の例示的側面に相当する。こうしたキットには、好ましくは、単独で、あるいは1またはそれより多いさらなる療法化合物、薬剤等と組み合わせた、1またはそれより多い開示する免疫原性組成物またはワクチン、および動物における疾患の予防または治療における構成要素の使用のための使用説明書が含まれる。本発明記載のキットは、商品流通のためにパッケージングされることも可能であり、そしてまた場合によって、選択された動物に組成物単数または複数を投与するための1またはそれより多い送達デバイス例えばシリンジ、バイアル、注射物質等もさらに含むことも可能である。こうしたキットのための容器単数または複数には、典型的には、免疫原性組成物単数または複数またはワクチン配合物単数または複数を配置し、そして好ましくは動物への投与のために1またはそれより多いアリコットに適切に分配しうる、少なくとも1つのバイアル、試験管、フラスコ、瓶、シリンジまたは他の容器が含まれうる。第二の免疫原性組成物あるいは第一の抗ウイルスまたは抗微生物化合物もまた望ましい場合、キットはまた、第二の別個の容器中に、あるいは投与のための調製まで、2つの構成要素を分離する、壊れやすいまたは壊れにくいバリアを含む単一の容器中に、第二の免疫原性組成物あるいは第一の抗ウイルスまたは抗微生物化合物を含むことも可能である。あるいは、複数の別個の免疫原性組成物単数または複数および/または別個の抗ウイルスまた抗微生物化合物単数または複数を単一の配合物中で調製することも可能であるし、そして単一の容器、バイアル、フラスコ、シリンジ、カテーテル、カニューレ、瓶、試験管、アンプル、または他の適切な容器中にパッケージングすることも可能である。キットにはまた、上記容器を他の装置等とともに含む場合のように、より大きい容器が含まれうる。多数の用量は、容器内の適切な入れ物vessel内に含有されてもよく、望ましい場合、好ましくは必要に応じてあらかじめ選択された用量を計測する、任意の適切な重量または容量測定デバイスとともに含有されうる。薬剤調製において使用するための組成物本発明の別の重要な側面は、動物、例えば脊椎動物哺乳動物において、疾患、またはその症状を予防するか、治療するかまたは改善するための薬剤調製における、開示する免疫原性組成物ならびに該組成物を含む配合物を用いるための方法に関する。開示する免疫原性組成物の使用はまた、微生物またはウイルス起源の1またはそれより多い疾患の療法および/または予防においても意図される。こうした使用は一般的に、1またはそれより多い開示する免疫原性組成物を、罹患した動物における1またはそれより多い疾患またはその症状を予防するか、治療するか、または管理するのに十分な量で、そして十分な時間、投与する工程を含む。1またはそれより多い開示する免疫原性配合物を含む組成物はまた、本発明の一部を形成し、そして特に、ウイルスおよび/または微生物起源の1またはそれより多い疾患の療法または予防において使用するための少なくとも第一の薬学的に許容されうる賦形剤をさらに含む組成物である。本発明の免疫原性組成物を、単価すなわち一価ワクチンとして、あるいは二価、三価またはさらに多価multivalentすなわち多価polyvalentワクチンとして調製することも可能である。例えば、一価ワクチンには、好ましくは、選択されたレシピエント哺乳動物、および特にBVDV感染に感受性である哺乳動物の体内に導入された際に、特異的な抗BVDV免疫反応を誘発可能である、本発明の単一の免疫原性組成物例えば修飾生BVDV-1bウイルスの単一免疫原性組成物が含まれるであろう。同様に、二価ワクチン組成物には、好ましくは、各々、哺乳動物において特異的な免疫反応を誘発可能である、少なくとも第一のBVDV-1b特異的組成物、および少なくとも第二のウイルスまたは微生物特異的免疫原が含まれるであろう。多価三価または多価を含むワクチン組成物には、好ましくは、それぞれ、3またはそれより多いウイルスまたは微生物特異的免疫原が含まれるであろう。本明細書に例示する1つの態様において、本発明者らは、驚くべきことに、そして予期せぬことに、哺乳動物集団において、そして特に家畜において、BRDC感染を抑制するための、BVDV-1b、BVDV1a型BVDV-1a、BVDV2型BVDV-2、PI3、ウシ呼吸器合胞体ウイルスBRSV、および感染性ウシ鼻気管炎IBRの病原体であるBHV-1に特異的な免疫原を含む、好適な六価六種修飾生ワクチン配合物を開発した。例示的態様の説明本発明の例示的態様を以下に記載する。明確にするために、本明細書には実際の実施のすべての特徴は記載しない。もちろん、こうした実際の態様の開発のいずれにおいても、1つの実施と別の実施とでは異なるであろう、開発者の特定の目的、例えばシステムに関連するおよびビジネスに関連する制約との適合を達成するため、多くの実施特異的決定を行わなければならないことが認識されるであろう。さらに、こうした開発上の努力は、複雑で、そして時間を消耗するが、本開示の利点を有する一般の当業者にはルーチンの作業であろうことが認識されるであろう。輸送熱輸送熱は、畜牛およびヒツジにおける急性の非常に伝染性が強い敗血症性症候群に与えられた用語であり、熱、気道の急性炎症、鼻分泌物、食欲不振、抑鬱、線維素性肺炎、および感染組織の壊死によって臨床的に特徴付けられる。輸送後のフィードロットで最も頻繁に見られる輸送熱は、若い畜牛の主な死因であり、そして産業に対して、推定5億ドルを超える年間損失の原因となっている。1991年のみで、輸送熱は、主に、治療、産生損失、および死亡の費用のため、米国畜牛産業に、ほぼ6億2400万ドルの概算費用を課した。輸送熱の病因は、一般的に、不都合な外部影響を含み、動物を最初のウイルス呼吸器感染に罹りやすくし、これが次に、1またはそれより多い二次的細菌感染の増殖に好ましい条件を生じることによる。ウシ呼吸器病BRD症候群BRDC輸送熱の主な病原体は、ウシ呼吸器病BRDまたはウシ呼吸器病症候群BRDCとして知られる多因子状態である。BRDCは、肉牛産業における経済的損失の主因であり、ウイルスおよび細菌病原体両方による、付随する連続または同時感染によって特徴付けられる。BRDCに関与するウイルス病原体には、ウシヘルペスウイルス1BHV-1、ウシPI3、ウシウイルス性下痢症ウイルスBVDV、およびウシ呼吸器合胞体ウイルスBRSVが含まれる。ウイルス感染後、罹患した動物は次いで、1またはそれより多い続く細菌感染例えばマンヘミア以前のパスツレラヘモリチカ、パスツレラマルトシダ、ヒストフィルスソムニ以前のヘモフィルスソムヌス、アクチノミセスピオゲネスActinomycespyogenesおよび多様なマイコプラズマ属種を発展させ、これらはしばしば急性肺炎を示す。肺炎の最も一般的でそして最も早期に認識されうる臨床徴候は、抑鬱である。抑鬱を示す子ウシは、垂下した耳、伸びた頭部、および彎曲した背中を有し、そして/または、しばしば、他の畜牛から離れるisolatethemselvesであろう。子ウシの健康は次第に悪化し、食べるのをやめ、呼吸速度増加を示し、そして顕著な熱典型的には104°F~108°Fの範囲を発展させる。ペスチウイルスペスチウイルスは、世界中で動物において経済的に重要な疾患を引き起こす。フラビウイルス科内のペスチウイルス属は、3種の一本鎖鎖RNAウイルス:ウシウイルス性下痢症ウイルスBVDV、古典的ブタ発熱ウイルスCSFV、ボーダー病ウイルスBDVを含む。近年、BVDVに遺伝的に関連する、第四の別個の群のペスチウイルスが同定されてきており、そして文献において、ウシウイルス性下痢症ウイルス2型BVDV-2と称される例えば、各々、その全体が明確に特に本明細書に援用される、Thielら、1996;およびBecherら、1995を参照されたい。その結果、現在の教科書は、2種を区別するため、BVDVの元来の種をBVDV-1と称する。ウシウイルス性下痢症ウイルスBVDVペスチウイルスの基準種は、BVDV1型BDVD-1であり、そのゲノムは長さおよそ12.5kbであり、そして1つの大きなオープンリーディングフレームORFを含有するその全体が明確に特に本明細書に援用されるCollettら、1988。該ORFは、宿主またはウイルスプロテアーゼによって、翻訳と同時にそしてその後でプロセシングされる、およそ450kDaの大きなポリタンパク質をコードする。標準的BVDVポリタンパク質のN末端は、非構造タンパク質p20Npro、カプシドタンパク質p14C;エンベロープ糖タンパク質gp48E0、gp25E1、gp53E2;非構造タンパク質p125NS23、p10NS4A、p32NS4B、p58NS5Aおよびp75NS5Bを生じる例えば、各々、その全体が明確に特に本明細書に援用される、Tautzら、1997;Xuら、1997;Elbersら、1996;およびWiskerchenら、1991を参照されたい。BVDV-1は、2つの生物型、細胞変性型cpと称されるまたは非細胞変性型ncp、で存在し、これらは、細胞変性変異体において、単一の80kDaポリペプチド非構造タンパク質p80、NS3が産生される点が異なる例えば、その全体が明確に特に本明細書に援用される、Gillespieら、1960を参照されたい。多くのBVDV単離体の系統発生分析に基づいて、BVDV-1は、少なくとも13の別個の下位遺伝子型BVDV-1aからBVDV-1lと称されるを含むことが示されてきており、BVDV-2に関しては、2つの下位遺伝子型BVDV-2aおよびBVDV-2bが同定されてきている例えば、各々、その全体が明確に特に本明細書に援用される、Pellerinら、1994;Ridpathら、1994、およびXueら、2010を参照されたい。BVDV-1およびBVDV-2は、どちらも、畜牛において急性感染下痢、発熱、出血性症候群を引き起こし、そして感染が妊娠中に起こると、流産、胎児の奇形および子ウシの持続感染を引き起こす。持続感染動物は、ウイルスの主な貯蔵所に相当し、そしてこうした動物は、致死性粘膜疾患MDで倒れる可能性もある。BVDVは、ヒツジにおいてより広い疾患を引き起こすウイルス、およびブタにおける古典的ブタ発熱を引き起こすウイルスに緊密に関連する。感染した畜牛は、典型的には、全身性粘膜疾患を示し、該疾患は、体温上昇、下痢、咳および消化器粘膜の潰瘍によって特徴付けられる例えば、各々、その全体が明確に特に本明細書に特に援用される、Olafsonら、1946;およびRamseyら、1953を参照されたい。BVDウイルスは、妊娠した畜牛の胎盤を横断することが可能であり、そしてウイルスに対して免疫寛容性であり、そして残りの一生に渡り持続してウイルス血症性である、持続感染PI子ウシの誕生を生じる可能性もある。これらのPI畜牛は、微生物が引き起こす肺炎または腸疾患の感染に対して非常に素因があり、畜牛におけるMD疾患の大流行に必要なウイルス貯蔵所を提供する例えば、各々、その全体が明確に特に本明細書に援用される、Liessら、1974;Barberら、1985;Malmquist、1968;およびRossら、1986を参照されたい。BVDVは、糞口方式で群れに広がり、そしてウイルスを抑制する戦略は、単に経済的な損失を減少させる努力の中でのより厳密な管理実施から、有効であるが典型的には許容されえないレベルのコストを伴う、感染動物を同定する精巧な試験法までの範囲に渡る。過去30年間、修飾生ウイルスMLVおよび不活化弱毒化ウイルスまたはウイルス粒子両方の、BVDVに関する、ほぼ150のワクチンが、多様な度合いの成功を伴って、畜牛業界に市販されてきている;商業的ワクチン配合物が広く利用可能になり、そして使用されているにもかかわらず、BVDVの大流行はなお、毎年報告されている。疾患管理に対する現在のアプローチは、畜牛に対する毎年反復されるワクチン接種を伴い、そしてPIキャリアーとして生まれる子ウシがいないことを確実にすることを試みるさらなる工程が一般的に行われる。BVDVの検出、そして/またはBVDV感染動物の検出のためにいくつかの異なる試験法が開発されてきており、これには逆転写ポリメラーゼ連鎖反応RT-PCR、酵素連結イムノアッセイELISA、標準ウイルス単離技術、および多様な免疫組織化学アッセイが含まれる。例示的な定義用語約およびおよそは、本明細書において、交換可能であり、そして一般的に、所定の数値の周囲の数値範囲、ならびに数値の列挙される範囲中のすべての数値を指す例えば、約5~15は、別に言及しない限り、約5~約15を意味する。さらに、本明細書のすべての数値範囲は、範囲内の各整数を含むと理解されるべきである。本明細書において、用語抗原または免疫原は、宿主動物において、特異的免疫反応を誘導する物質を意味する。抗原は、全生物、死滅、弱毒化または生存生物;生物のサブユニットまたは部分;免疫原性特性を持つ挿入物を含有する組換えベクター;宿主動物への提示に際して、免疫反応を誘導可能なDNAの片または断片;タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、エピトープ、ハプテン、またはその任意の組み合わせを含むことも可能である。あるいは、免疫原または抗原は、毒素または抗毒素を含むことも可能である。抗原は、一般的に、任意の免疫原性物質、すなわち、感受性動物の組織内に導入されると、免疫反応例えば特異的抗体分子の産生を誘発し、そして抗原の導入に反応して産生される抗体に特異的に結合可能である、任意の物質を含む。抗原は、免疫系によって認識され、体液性免疫反応を誘導し、そして/または細胞性免疫反応を誘導して、Bおよび/またはTリンパ球の活性化を導くことが可能である。抗原には、単一エピトープ、あるいは2またはそれより多いエピトープが含まれうる。本明細書において、用語抗体は、それぞれ、重鎖および軽鎖可変ドメイン、VHおよびVLを通じて他の分子抗原に結合するタンパク質を指す。用語抗体は、任意の免疫グロブリン分子を指し、これには例えば、限定されるわけではないが、IgM、IgG、IgA、IgE、IgD、およびその任意のサブクラスまたはその組み合わせが含まれる。用語抗体はまた、免疫グロブリン分子の機能性断片も意味し、これには例えば、限定されるわけではないが、別に明らかに記載されない限り、Fab、Fab’、Fab’2、Fv、Fd、scFvおよびsdFv断片が含まれる。本明細書において、抗原性ポリペプチドまたは免疫原性ポリペプチドは、脊椎動物内に導入された際、脊椎動物免疫系分子と反応する、すなわち抗原性であり、そして/または脊椎動物において免疫反応を誘導する、すなわち免疫原性である、ポリペプチドである。本発明の単離抗原性および免疫原性ポリペプチドは、本発明のポリヌクレオチドにコードされるものに加えて、組換えタンパク質、精製サブユニット、該タンパク質を発現するウイルスベクターとして提供されうるし、あるいは不活化ウイルスワクチン、例えば生弱毒化ウイルスワクチン、熱殺菌ウイルスワクチン等の形で提供されうる。本明細書において、修飾生ワクチンは、典型的には組織培養細胞において継代されて、疾患を引き起こす能力が弱毒化されるように改変されているが、続いて動物に投与された際に疾患または感染に対して防御する能力を保持するウイルスを含むワクチンである。本明細書において、アジュバントは、こうしたウイルス集団または複数のこうした抗原を含有するワクチン組成物中に存在した際、修飾生ウイルスまたは抗原の免疫原性および有効性を増進する1またはそれより多い物質で構成される組成物を意味する。本明細書において、ウイルスの感染単位はTCID50、または感受性細胞の組織培養の50を感染させるかまたは殺すのに必要な量として定義される。本明細書において、用語キャリアーは、適切な動物への投与に薬学的に許容されうる、任意の溶媒単数または複数、分散媒体、コーティング単数または複数、希釈剤単数または複数、緩衝剤単数または複数、等張性剤単数または複数、溶液単数または複数、懸濁物単数または複数、コロイド単数または複数、不活性物質単数または複数等、またはその組み合わせを含むよう意図される。一般に化学的化合物、そして特に免疫原のための、1またはそれより多い送達ビヒクルの使用は、薬学業の一般の当業者に周知である。任意の慣用的媒体または剤が活性成分と不適合である場合を除いて、診断、予防、および療法組成物におけるその使用が意図される。1またはそれより多い補助活性成分単数または複数もまた、1またはそれより多い開示する免疫原性組成物およびそのワクチン配合物内に取り込まれることも、またはこれと会合されて投与されることも可能である。本明細書において、用語免疫するまたは免疫または類似の用語は、特定の抗原性エピトープまたは免疫原に対して、検出可能な、または好ましくは実質的な免疫反応を生じさせる能力を与えることを指す。これらの用語は、必ずしも完全な免疫を暗示せず、むしろ、免疫反応は、ベースライン、例えば本発明の免疫原性組成物が投与されていない場合、または慣用的なワクチンを投与した場合よりも実質的に大きい免疫反応を生じる。例えば、哺乳動物は、本明細書に開示するワクチン組成物の投与後に、ターゲット免疫原単数または複数に対する細胞性および/または体液性免疫反応が起こる場合そして好ましくは実質的な免疫反応、1またはそれより多いターゲット免疫原に対して免疫されると見なされる。本明細書において、用語、組成物またはワクチンに対する免疫学的反応は、宿主動物における、細胞性および/または抗体仲介性免疫反応の発展を示す。一般的に、免疫学的反応には、限定されるわけではないが1またはそれより多い以下の効果が含まれる:所定の抗原またはハプテンに対して特異的に向けられる、a抗体産生;bB細胞産生;cヘルパーT細胞産生;および/またはd細胞傷害性T細胞産生。本明細書において、用語免疫原性は、また、宿主動物において、免疫学的反応を誘発する、物質、例えばアミノ酸配列、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチド内のアミノ酸配列の一部、あるいは修飾または弱毒化死滅または生ウイルスも指す。本明細書において、用語免疫原性タンパク質、免疫原性ペプチド、または免疫原性ポリペプチドは、ひとたび宿主に投与されると、該タンパク質に対して向けられる体液および/または細胞型の免疫反応を誘発可能であるという意味で、免疫学的に活性である、タンパク質、ペプチド、およびポリペプチドを指す。用語、エピトープは、体液型B細胞および/または細胞型T細胞の免疫反応を誘導可能なタンパク質部位に関する。用語病原体は、本明細書において、例えばウイルス、プリオン、原生動物、寄生虫、ならびに細菌、酵母、カビ、真菌等の微生物を含む任意の種類の感染性病原体と定義される。本明細書において、用語個体または交換可能に、宿主、被験体、レシピエント、患者等とも称されるは、本明細書に開示する1またはそれより多い薬学的組成物またはワクチン配合物を投与可能ないかなる動物も指す。好ましくは、被験体は脊椎動物であり、いかなる動物種および好ましくは哺乳動物種も指すよう意図される。特定の態様において、個体は、好ましくは、限定されるわけではないが、非ヒト霊長類、ウシ、イヌcanine、ヤギcaprines、イヌcavines、カラスcorvines、エピネスepines、ウマequines、ネコfelines、ヤギhircines、ラピネスlapines、ウサギleporines、オオカミlupines、ヒツジovines、ブタporcines、ラシネスracines、キツネvulpines等を含み、家畜、動物学的標本、外来のもの、ならびにコンパニオン動物、ペット、および獣医師にケアされている任意の動物を含む、任意の哺乳動物宿主である。句獣医学的に許容されうるおよび薬学的に許容されうるは、哺乳動物に投与された際、アレルギー性または類似の有害な反応を生じない、分子実体および組成物を指す。本明細書において、薬学的に許容されうる塩は、親化合物の望ましい生物学的活性を保持し、そして望ましくないいかなる毒性学的影響も与えない、塩を指す。こうした塩の例には、限定されるわけではないが、無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸等で形成される酸付加塩;ならびに有機酸、例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルクロン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パモエンボン酸、アルギン酸、ナフトエ酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸で形成される塩;多価金属陽イオン、例えば亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウム等を含む塩;N,N’-ジベンジルエチレンジアミンまたはエチレンジアミンから形成される有機陽イオンで形成される塩;ならびにその組み合わせが含まれる。本明細書において、防御免疫反応または療法的免疫反応は、抗原に対するCTLおよび/またはHTL反応を指し、これは何らかの方式で、疾患、または症状、副作用または進行を予防するかまたは少なくとも部分的に抑止する。免疫反応にはまた、ヘルパーT細胞の刺激によって促進されている抗体反応もまた含まれうる。本明細書において、用語ワクチンは、脊椎動物に、そして好ましくは哺乳動物などの動物に投与されることが可能な型の、本発明の免疫原性組成物を含有する組成物または配合物を指す。典型的には、本発明のワクチンには、その必要がある動物への投与のために配合された、本明細書に開示する1またはそれより多い免疫原性組成物1またはそれより多い修飾生ウイルス粒子またはその複数のものが含まれるであろう。こうした組成物は、いかなる適切な配合物であってもよく、限定なしに、水性ビヒクル中で調製されるもの、ならびに、凍結、フリーズドライ、凍結乾燥または脱水型であり、次いで、投与前に慣用的な薬学的に許容されうるビヒクル例えば無菌生理食塩水または類似の緩衝水溶液中で再水和されるかまたは懸濁されるものが含まれる。こうした型において、本発明のワクチン組成物を、感受性動物においてウイルスおよび/または微生物感染の1またはそれより多い状態あるいは1またはそれより多い症状を予防するか、管理するか、または別の方式で治療するために、本明細書に開示する1またはそれより多い方法またはワクチン接種措置において、容易に使用可能な、好適な単回または多数回用量アリコットで製造しうる。動物宿主内への導入に際して、免疫原性組成物および該組成物を含むワクチンは、生じる免疫反応が、限定されるわけではないが、ワクチン接種された動物の細胞および組織内で、特異的抗体、サイトカインの産生および/または細胞傷害性T細胞、抗原提示細胞、ヘルパーT細胞、樹状細胞および/または他の細胞反応の活性化を検出するアッセイを含む、免疫学業の一般の当業者に知られる慣用的アッセイを用いて容易に検出であるように、免疫反応、および好ましくは導入された抗原単数または複数に特異的な免疫反応を誘発可能である。本発明のワクチン組成物には、1またはそれより多いアジュバントが、単独で、あるいは1またはそれより多いさらなる抗原単数または複数等と組み合わされて含まれるか、あるいは該ワクチン組成物がこうしたアジュバント中でまたはアジュバントと同時に投与されることも可能である。本発明のワクチンおよび免疫原性組成物は、免疫後に、動物に免疫反応を与える。本明細書において、用語免疫反応は、Bおよび/またはTリンパ球の活性化または増殖を導く、体液性免疫反応および/または細胞性免疫反応を指す。しかし、いくつかの例において、免疫反応は、より低い強度である可能性もあり、そして本発明にしたがった少なくとも1つの物質を用いた際にのみ検出可能となる可能性もある一方、他のものは、反復投与、アジュバント、第二のまたはさらなる活性剤、あるいは1またはそれより多いその組み合わせを必要とする可能性もある。用語アジュバントは、免疫系の1またはそれより多い機能が増加し、そして免疫原性剤に対して向けられるように、生存生物の免疫系を刺激するために用いられる剤を指す。本明細書において、用語治療、治療する、治療された、または治療しているは、その発展が感受性動物に影響を及ぼす前または後のいずれかでの、疾患の1またはそれより多い症状の療法または改善、あるいは疾患またはその症状の度合いまたは重症度の減少を指す。感染性疾患に関して用いた際、例えば該用語は、感染の重症度を減少させるか、あるいは感染に起因しうる疾病の1またはそれより多い症状を和らげるかまたは遅延させる、ならびに例えば治療される個体の身体からの感染の減少および/または除去を含む、感染動物が感染と闘う能力、あるいは疾患が悪化するのを、または罹患動物と接触する他の動物に広がるのを和らげるかまたは予防する能力を増加させる、治療または治療措置を指す。用語免疫原性的に有効な量は、当該技術分野において、通常の意味を有し、すなわち免疫原と免疫学的特徴を共有する病原体を有意に関与させるengage免疫反応を誘導可能な免疫原の量を指す。この用語はまた、療法的または予防的に有効な量、あるいはその両方も含むことも可能である。本明細書において、用語予防、予防する、予防された、予防している、ワクチン接種するおよびワクチン接種は、予防、あるいは感染の部分的または完全な阻害、あるいは疾患に対する素因がある可能性があるが、まだ曝露されていないかまたは該疾患を有すると診断されていない動物において、1またはそれより多い疾患あるいは1またはそれより多いその症状の減少または開始の遅延を指す。例えば感染性疾患に関して用いる場合、該用語は、本発明の1またはそれより多い免疫原性組成物の予防的投与を指し、これは1またはそれより多いウイルスまたは微生物病原体での感染に対して、動物の耐性を増加させる傾向があるか、あるいは言い換えると、被験体が病原体単数または複数に感染する可能性を減少させるか、または感染した場合、感染動物において、症状を遅延させるか、感染の重症度を減少させるか、または感染に起因しうる疾病の症状を減少させるか、またはその任意の組み合わせである、本発明の1またはそれより多い免疫原性組成物の予防的投与を指す。予防するおよび治療するの各々には、動物における、特定の感染、疾患、状態、またはその症状を管理すること、ならびに疾患または状態の、あるいはその任意の症状の候補状態または経過の任意の有益な修飾が含まれる。管理は、根底にある感染、あるいはそこから生じる疾患または状態いずれかに実際に患わされることを伴いまたは伴わず、症状のいくつかまたはすべてと取り組むことも可能である。用語例えばは、本明細書において、単に例示として用いられ、限定は意図されず、そして本明細書に明確に列挙する項目のみを指すと見なしてはならない。長年に渡る特許法慣例にしたがって、単語aおよびanは、本出願で用いた際、請求項を含めて、1またはそれより多いを指す。以下の実施例は、本発明の例示的態様を実証するために含まれる。一般の当業者には、以下の実施例に開示する技術は、本発明の実施においてよく機能することが発見された技術に相当し、そしてしたがって、その実施のための好ましい様式を構成すると見なされうることが認識されなければならない。しかし、一般の当業者は、本開示を考慮して、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、開示する特定の態様において、多くの変化を実行し、そしてなお同様のまたは類似の結果を得られうることを認識しなければならない。実施例1-BVDV修飾生ウイルスの産生本実施例は、BVDV-1b修飾生ウイルスMLVの大規模産生のための例示的方法を提供する。材料および方法ウイルスおよび微生物BVDV-1bのTGAC株は、米国農務省USDA、動植物衛生検査部APHIS、獣医学生物学研究所CVB-L米国アイオワ州エームズより得た。マスターシードMSは、続いて、TVL-BVDV1bMS04/27/2007DW3-095と名付けられ、そして現在ここにともに出願されている、本出願者の同時係属米国仮特許出願第61/427,404号に記載するように、37C.F.R.§1.14および35U.S.C.§122の下に権利を与えられている、特許および商標局長によって決定されるものに対する本特許出願の係属中に、培養へのアクセスが利用可能であることを確実にする条件下で寄託されている。寄託物は、本出願の対応物またはその成果progenyが出願されている国の外国特許法によって必要とされるように入手可能である。しかし、寄託物の入手可能性は、政府の法的措置によって許諾される特許権の逸脱において、本発明を実施する許可を構成しないことが理解されなければならない。本培養寄託物は、微生物寄託に関するブダペスト条約の規定にしたがって、保存され、そして公共に入手可能となり、すなわち該寄託物は、寄託物の試料の最終加工物に関する最近の要求後、少なくとも5年間、そしていかなる場合であっても、寄託日後、少なくとも30年間、または寄託された培養の開示を生じうる、任意の特許の法的効力存続期間に渡って、寄託物が生存し、そして混入されないまま維持されるために必要である、すべての注意を伴って保存されるであろう。寄託者は、寄託物の状態のために、要求された際に寄託物が試料を与えることが不可能である場合には、寄託物を交換する義務を認識している。本培養寄託物の公共に対する利用可能性に関するすべての制限は、開示する特許の付与に際して、取り消し不能に除去されるであろう。TVLBVDV1bMS04/27/2007DW3-095ウイルスの寄託物は、ブダペスト条約の条件下で、2010年12月21日、10801UniversityBlvd.,Manassas,VA,20110-2209,USAに位置する、アメリカンタイプカルチャー研究所の特許寄託物の永続的コレクションに入っており、この際、貯蔵所によって、寄託番号ATCCPTA-11553を割り当てられた。逆転写ポリメラーゼ連鎖反応RT-PCRアッセイを用いて、MSウイルスMSVの同定を実行して、MSウイルスがBVDV-1bとして陽性に同定された。PCRによるBVDVの分化に関するプロトコルは、RidpathおよびBolin、1998その全体が明確に特に本明細書に援用されるによって開発された。免疫蛍光アッセイIFAを用いて、陽性同定を行ったMcNultyら、1984。TexasVetLabウシ腎臓TVL-BK細胞におけるこれらのウイルスの複製は、容易に認識可能な細胞変性変化を生じた。微生物の同定の頻度産生シードウイルスをTVL-BK細胞に接種する前に、細胞を顕微鏡的に視覚化して、細胞が先に記載される形態を示すことを確認する。産生ウイルスの各バッチを採取する前に、TVL-BK細胞を観察して、これらが、ウイルスに関連する典型的な細胞変性効果CPEを示すことを確認する。培養または継代培養の病原性、維持、および範囲このワクチンに用いるBVDV-1bの病原性、強度、および抗原性の一貫性を、凍結乾燥または凍結条件での保存、ならびに継代または継代培養数に対する制限によって、助長した。範囲:産生ウイルス=MSV10有効性連続継代であるが、5~10の間の任意の継代であることも可能である。産生細胞ストック=MCS20有効性連続継代であるが、しかし20未満の任意の継代であることも可能である。シードおよび産生培養に用いる培地の組成および反応シードおよび産生培養に用いる培地の組成および反応は以下の通りであった:作業ウイルス接種物MSV1~MSV8および産生ウイルス接種物典型的には、排他的ではないがMSV9であったをTVL-BK細胞中で増殖させ;但し、ウイルス増殖のためのTVL-BK細胞継代数は、MCSから20継代を超えない。増殖培地作業および産生細胞調製物両方のためのものは、ダルベッコの修飾イーグル培地DMEMであった。生じたMSVを凍結乾燥し、凍結保存培地中、液体窒素中で保存するか、または凍結保存培地中、-70~-85°Cで保存しうる。MCSを凍結保存培地中液体窒素中で保存しうるし、または凍結保存培地中、-70~-85°Cで保存しうる。シーディングおよび接種のための懸濁物を調製する方法凍結TVL-BK細胞を含有する凍結バイアルを迅速に融解した。培養フラスコを、推奨される容量の培地で満たし、そして懸濁細胞を凍結バイアルから培養フラスコに無菌的に移した。また、1:3~1:6cm2:cm2の範囲の比で、活発に増殖している培養を分割することによってもまた、培養容器に植え付けた。継代培養が意図されるフラスコまたはローラーボトル中のTVL-BKを、増殖培地を無菌的に除去し、そして1xトリプシン-EDTA溶液を添加することによって、培養表面から遊離させた。インキュベーション後5分間、35~39°C、単層を分散させた。分散させた細胞を増殖培地とともに培養容器に添加することによって、トリプシンを不活化した。ウイルスの凍結アリコットを迅速に融解するか、またはシードが凍結乾燥されている場合は、培地に再懸濁した。TVL-BK細胞20またはそれ未満にウイルスを接種した。フラスコまたはローラーボトル中で複製している、継代培養が意図されるウイルスを、適切なインキュベーション時間後に、そして/またはCPEを観察した後に、収集した。次いで、ウイルス液を6~-80°Cで保存するか、または直ちに用いて、他の培養容器に接種した。標準細胞培養技術を用いて、シードおよび産生培地の両方に接種した。継代数20またはそれ未満のTVL-BK細胞を接種した。典型的にはMSV9である凍結産生ウイルス接種物を迅速に融解した。細胞あたり0.01~1.0ウイルスの範囲の感染多重度を達成するための、ウイルス接種物の体積は、培養面積1600cm2あたり、1~25mLであった。最小接種力価は以下のとおりであった:BVDV-1bに関しては、mLあたり105.0TCID50。接種培養物を37±2°Cおよび5±1CO2で2~4日間インキュベーションした。採取採取当日、ウイルス特異的CPEおよび無菌性に関して培養を調べた。典型的な最小インキュベーション時間は、BVDV-1b接種後2日間であった。典型的な最大インキュベーション時間は、BVDV-1b接種後4日間であった。ウイルス懸濁物を産生容器から無菌的に採取した。試料を収集して、採取物のTCID50を決定した。採取材料を6~-80°Cで保存した。採取材料は、最終産物の製造前に、凍結より上では、最長1ヶ月、そして凍結状態では最長6ヶ月、保存可能であった。非典型的なCPEまたは混入の証拠を示す採取液を廃棄した。典型的なCPEおよび混入不含を示す採取液のみが、さらなる産生使用に適格であった。最小許容採取ウイルス力価は、106TCID50/mLであった。採取液の純度を以下のように確認した。2mLの採取液試料を無菌的に38mLのSCDBに添加し、そして陰性培地のみおよび陽性対照とともに、35~39°Cで、46~50時間インキュベーションした。培養中の巨視的増殖の不在ならびに陰性対照によって、採取液が純粋であり、そしてさらなる産生使用に満足出来ることが確立された。純粋でないことが見出された採取液を廃棄した。BVDV生修飾ウイルスの例示的な配合物無菌技術を用いて、すべての操作を行った。適切な抗生物質、例えばネオマイシンおよびナイスタチンマイコスタチンを、それぞれ15μgおよび15単位/用量の率で、ワクチンのシリーズまたはサブシリーズ集合中に添加した。濃度を調整するために、必要に応じて、採取液をDMEM中で希釈し、そして0.2μmでろ過したスクロース溶液を添加することによって安定化させ、20±1の最終スクロース濃度を生じた。場合によって、10kDa分子量カットオフフィルターを用いた無菌限外ろ過によって、ウイルス採取液を濃縮した。濃縮の度合いは、典型的には50倍を超えなかった。採取ウイルス液の各バッチを分析して、TCID50を決定した。簡潔には、採取材料の対数希釈10-1~10-8を用いて、96ウェルプレート上のTVL-BK細胞に接種した。プレートを37±2°Cおよび5±1CO2で、96±6時間インキュベーションした。インキュベーション後、プレートを100倍の拡大で読み取り、そしてCPEに関して調べる。Finney1978によって修飾されるようなSpearman-Karber法によって力価を決定した。あらかじめ滅菌しておいた最終容器に無菌的に満たした。最終容器を無菌内部密封栓で部分的にキャップした。最終産物バイアルをフリーズドライ装置に移し、そして乾燥させた。乾燥周期時間は、24~72時間の間であり、最大産物温度は22°Cであった。乾燥最終産物の水分含量5を超えず、そして最終容器中の用量あたりの抗原性物質の最小量は、好ましくは、用量あたりおよそ8x103TCID50であった。実施例2-BDVD-1B一価ワクチン子ウシ曝露研究本実施例は、ワクチン接種動物における感染を予防する際のBVDV-1b一価ワクチンの有効性を立証する。材料および方法動物健康な4~5ヶ月の雑種雌子ウシを商業的供給源より購入し、ランダムに引き当てた耳標によって同定し、そしてBVDVに対する感受性に関して血清学的にスクリーニングした。すべての子ウシには、到着時に、1用量のセフチオフル結晶遊離酸Excede登録商標、PfizerAnimalHealth、米国ニューヨーク州ニューヨークを投与した。子ウシは、水、干し草およびペレット状餌配給に自由選択でアクセス可能であった。ワクチンBVDV-1bワクチン、修飾生ウイルスを上述のように調製した。簡潔には、BVDV-1bマスターシードウイルスをTVL-BK細胞株第20継代中で増殖させ、第10継代で採取し、産生概略にしたがって安定化させ、ボトルを満たし、そしてフリーズドライした。BVDV濃度は、Spearman-Karber法例えばFinney、1978を参照されたいによって決定されるように、8x103TCID50であった。希釈剤として無菌水を用いて、ワクチンを再水和した。ワクチンおよび子ウシの曝露19頭のBVDV陰性子ウシを選別路地ally中で混合した。CVB-Biometrics米国アイオワ州エームズによって提供されるマッチセットランダム化スキーム表1を用いることによって、各子ウシを2つの群ワクチン接種または非ワクチン接種対照の一方に入れた。血清学的に陰性の子ウシ10頭に、1用量のBVDV-1bワクチンを接種した。各ワクチン接種動物に、第0日、首の左側への皮下注射によって、2mL用量の産物を投与した。残りの子ウシにはいかなるウイルスワクチンも投与されなかった。ワクチン接種後、曝露2日前まで、2群の子ウシを分けて、しかし同等の囲い中に維持した。血液試料を到着日に収集し、そしてBVDV力価に関して試験した。血液試料をまた、ワクチン接種日および曝露日にも収集した。一定ウイルス減少血清中和法Schefersら、2008によって、BVDV-1b抗体力価を決定した。曝露2日前、ワクチン接種および非ワクチン接種対照群の両方を、曝露前臨床観察の目的のため、混合した。ワクチン接種14日後、囲いで死亡した子ウシの肺から得たBVDV-1bの病原性単離体に、ワクチン接種および対照子ウシを曝露した。10ウマ血清を含有するDMEMを用いて、TVL-BK細胞上、invitroでウイルスを継代した。4mL中、8x107TCID50の曝露用量を各子ウシに投与し、各2mLを吸気中、各鼻孔に投与した。各ウシに関して、曝露前2日間、曝露日、および曝露後連続14日間、直腸温度を毎日記録した。各子ウシに関して、曝露前2日間、曝露日、および曝露後連続14日間、白血球WBC数を決定した。試料をEDTAVacutainer登録商標試験管中に収集し、そしてDrewScientific米国コネチカット州ウォーターベリー、Hemavet950TM示差WBC計数装置を用いて、計数を行った。BVDV単離の目的のため、各子ウシから、曝露前2日間、曝露日、および曝露後連続14日間、鼻スワブおよびバフィーコートを収集した。液体Stuart培地を含むBBL培養スワブBecton,DickinsonandCompany、米国メリーランド州スパークスを用いて鼻スワブを収集した。試料由来の培地を滅菌ろ過し、そして培養中の80集密confluentTVL-BK細胞に接種するのに用いた。EDTAバキュテーナー試験管からバフィーコートを収集し、そして培養中の80集密TVL-BK細胞に接種するのに用いた。1時間インキュベーションした後、バフィーコートを取り除いた。培養を37±3°C、5±2CO2で4~5日間インキュベーションした。適切な検出プローブを用いて、本発明者らが開発したBVDV-1b特異的プライマーセットBVDV-1b第一を用いたRT-PCRによって、すべての培養試料由来の上清を、BVDV-1bの存在に関してアッセイした:BVDV-1b第一:フォワードプライマー:5’-CACCCTATCAGGCTGTATTCATAGC-3’配列番号1;リバースプライマー:5’-TGCCCACAGCACATCTTAACC-3’配列番号2;およびBVDV-1b検出プローブ:5’-TCACCTGGACGACCC-3’配列番号3BVDV-1b第二:第二のフォワードプライマー:5’-GTCGTCCAGGTGAAAACGGT-3’配列番号19;第二のリバースプライマー:5’-GTCGTCCAGGTGAAAACGGT-3’配列番号20;および第二のBVDV-1b検出プローブ:5’-GTCGTCCAGGTGAAAACGGT-3’配列番号21。BVDV-1b第一は許容されうる結果を提供するが、BVDV-1b第二は、より優れた結果を示す。すべての臨床的観察は独立に行われ、そしてワクチン接種および非ワクチン接種対照群の両方が混合され、唯一の区別特徴は耳標番号であったため、観察者はブラインド化された。研究のどの時点でも、観察者は、臨床評価が結論づけられるまで、個々の試験動物のワクチン接種状態の知識を提供されなかった。統計分析白血球減少症:第-2日~第0日の白血球数を平均することによって、曝露前白血球平均値を計算した。曝露後各々第1日~第14日まで、曝露前平均に比較して毎日の白血球数の比曝露前の比率としての白血球数を計算した。この比率データを分析して、ベースラインからの数の25減少として定義されるような白血球減少症を、個々の動物が発展させたかどうかを決定した。TannerおよびMorgan1993によって記載されるように、予防可能分率を計算して、本研究において、ワクチン接種が白血球減少症の発展を予防したかどうかを決定した。鼻排出:鼻スワブ分析によるウイルス単離データは、BVDVが曝露後から単離された対照の比率に比較した際の、BVDVが単離されたワクチン接種動物の比率に基づく。BVDV-1b排出の予防可能分率を、TannerおよびMorgan1993によって記載されるように計算した。ウイルス血症:BVDV-1bが曝露後から単離された対照の比率に比較した際の、BVDV-1bが単離されたワクチン接種動物の比率に基づいて、血液試料のバフィーコートからのウイルス単離データを分析した。予防可能分率を、TannerおよびMorgan1993によって記載されるように計算した。抗体力価:通常のスケールの力価の群比較を、Mann-WhitneyU検定を用いて分析した。直腸温度:曝露前平均直腸温度を各動物に関して測定した。群、日および群日相互作用に関する項を含む反復測定分散分析ANOVAにおける共変数として、この平均を用いた。MicrosoftWindows登録商標用のSASLearningEditionv2.0SASInstitute,Inc.、米国ノースカロライナ州キャリーを用いて、すべての統計分析を行った。結果白血球減少症は、10頭のワクチン接種動物のうち1頭で、そして9頭の対照のうち8頭で検出され、87の予防可能分率を生じた。白血球の生データを表2に記録する。各個々の子ウシの曝露前平均の毎日の比率を表3に示す。BVDV-1bは、10頭のワクチン接種動物のうち1頭、そして9頭の対照のうち8頭の鼻分泌物から単離され、90の予防可能分率を生じた。これらのデータを表4に記録する。は陽性の結果を示し;-は陰性の結果を示す。BVDV-1bは、2頭のワクチン接種子ウシ、および9頭すべての対照子ウシのバフィーコートから単離され、80の予防可能分率を生じた。これらのデータを表5に示す。ワクチン接種は、BVDV-1bSN抗体力価の統計的に有意なP<0.05増加を誘導した。ワクチンは、BVDV-1aまたはBVDV-2SN力価の有意な増加を引き起こさなかった。個々のSN抗体力価を表6に示す。直腸温度データの分析は、ワクチン接種のいかなる統計的に有意な影響も明らかにしなかった。直腸温度データを表7に示す。本研究経過中、いずれの子ウシにおいてもBVDV感染の臨床徴候は観察されなかった。健康な4~5ヶ月齢の雑種雌子ウシに1用量のBVBV-1bワクチン修飾生ウイルスをワクチン接種すると、白血球減少症に対して87、BVDV-1bの鼻排出に対して90、そしてウイルス血症に対して80のワクチン有効性が生じた。血清学的分析もまた、ワクチン接種子ウシにおいて、抗原性反応を明らかにした。実施例3-BVDV-1Bウイルス逆継代backpassage評価本実施例は、TVL-BVDV-1bMSVの安定性を評価し、これが動物に投与された際に病原性に復帰しないことを保証する。ウイルスの1本のアンプルを融解し、そしてこれを用いてTVL-BK細胞に接種し、TVL-BVDV-1b15x107TCID50/mLを産生する。このウイルスを用いて、10頭の初乳無摂取colostrum-deprived乳牛子ウシの第1組に、子ウシ当たり1x106TCID50の率で鼻内接種する。第2組~第5組の子ウシには、先行する子ウシ組由来のプールした鼻分泌物を鼻内接種する。第1組は10頭の子ウシからなり、第2組~第5組の子ウシの数は、10頭の子ウシの第1組由来のウイルスを排出した子ウシの数に応じて、2~5頭の子ウシの範囲である。各子ウシは、単離された囲い中に留まり、そして研究の主な転帰は、子ウシにおけるBVDVの臨床徴候の欠如、および少なくとも5回の連続invivo継代を通じたMSの遺伝的安定性である。実験の単位は、一定ウイルス減少血清中和法によって決定されるように、スクリーニング時に≧2のBVDV-1a、BVDV-1bまたはBVDV-2力価を有するならば、研究から排除される。接種日第0日および研究終了時のスクリーニングプロセス中、子ウシから血清学用の血液試料を収集する。鼻分泌物は、第1組の各個々の子ウシから、接種後第2日~第8日まで収集する。これらの日各々に関して、各個々の子ウシからの鼻分泌物アリコットをウイルス単離に関してアッセイし、そして凍結保存する。BVDV-1bを排出する個々の子ウシの数が最大であった日すなわち最大排出日を決定し、そしてその日からすべての鼻分泌試料をプールし、そして第2組の子ウシに接種するのに用いる。鼻分泌物を、このあらかじめ決定した最大排出日に、続く群の子ウシから採取する。次いで、これらの試料をウイルス単離に関してアッセイし、そしてウイルスの存在を確認し、そして試料をプールし、そして次の組の子ウシに接種するか、またはさらなるウイルスが単離されなくなるまで、凍結保存する。耳標番号によって子ウシを同定し、そして育種のための一般的な畜産および飼育実施を用いて、牛乳代替物で6~8週間飼育した。転帰変数には、BVDVの臨床徴候、鼻試料からのウイルス排出、および5回の連続invivo継代を通じたウイルスの遺伝的安定性が含まれる。すべての子ウシを、BVDV感染の臨床徴候に関して観察し、そして最後の逆継代群を回収ウイルスの投与後21日間観察する。すべての臨床徴候を記録し、そして臨床疾患の病因に関して決定を行う。鼻分泌標本を子ウシから採取し;各試料の個々のアリコットをウイルス単離および分析用に維持する。0.2μmフィルターを通じた滅菌ろ過によって試料をプロセシングする。次いで、TVL-MDBK~80集密を含有する12ウェルプレートの各ウェルに、試料を接種する。プレートあたり1つのウェルは未接種のままにし、そして陰性対照として用いる。プレートの1つのウェルにMSの希釈を接種し、そして陽性対照として用いる。プレートを35~39°Cの温度で、5~7日間、3~7CO2でインキュベーションする。試料を二次プレート上でさらに5~7日間、継代培養する。典型的なBVDV-1b細胞変性形態を示すウェル由来の培地をさらにプロセシングして、PCRアッセイによって感染性病原体の同一性を決定する。マスターシードに、子ウシから回収した最高継代BVDVを比較することによって、マスターシードの遺伝的安定性を分析する。研究の第1組のすべての10頭の子ウシからの排出物がなくなるか、または病原性に復帰しないウイルスが単離されたらBVDVの定義臨床徴候の欠如によって立証されるように、これは逆継代研究の成功およびMSの遺伝的安定性の指標である。実施例4-六価BRDCワクチン修飾生ウイルスの調製本実施例は、上述のようなBVDV-1bMSを取り込んだ多価六種BRDCワクチンの調製を記載する。材料および方法用いる微生物BHV-1:BHVのCooperコロラド単離体は、上気道疾患を有するウシ科の肺から、1956年に単離されたYorkら、1957。このマスターシードウイルスは、TVL-BHVCooperPO、1997年8月5日、DW-1-21-Wと同定された。BVDV-1a:BVDV-1aのSinger株は、APHISから得られた。このマスターシードは、TVL-BVDSingerP0、1998年12月、DW4-29と同定された。BVDV-1b:BVDV-1bのTGAC株は、APHISから得られた。このマスターシードは、TVL-BVDV1bMS04/27/2007DW3-095と同定された。BVDV-2:BVDV-2の125株は、APHISから得られた。このマスターシードは、TVL-BVDV2株125P011/01/01DW3-90と同定された。PI3:PI3のReisingerSF4株は、APHISから得られた。このマスターシードは、TVL-PI3ReisingerSF-4P0、2001年4月2日SM-83と同定された。BRSV:BRSVのN375株は、APHISから得られた。このマスターシードは、TVL-BRSVP0、2001年7月20日、DW3-87と同定された。プロトコルTVL-BK細胞に産生シードウイルスを接種する前に、細胞を顕微鏡的に可視化して、細胞が、先に記載される形態を示していることを確認した。産生ウイルスの各バッチを採取する前に、TVL-BK細胞を観察して、これらがウイルスに関連する典型的な細胞変性効果CPEを示していることを確認した。このワクチンに用いるBHV-1、BVDV-1a、BVDV-1b、BVDV-2、PI3、およびBRSVの病原性、強度、および抗原性の一貫性を、凍結乾燥または凍結条件での保存、ならびに継代数または継代培養数に対する制限によって、助長した。産生ウイルス=MSV10有効性連続継代であるが、5~10の間の任意の継代であることも可能である。産生細胞ストック=MCS20有効性連続継代であるが、20未満の任意の継代であることも可能である。作業ウイルス接種物MSV1~MSV8および産生ウイルス接種物典型的には、排他的ではないがMSV9であったを、典型的にはTVL-BK細胞中で増殖させ;但し、ウイルス増殖のためのTVL-BK細胞継代数は、MCSから約20継代を超えない。作業および産生細胞調製物用の増殖培地は、5~10ウマ血清を含有するDMEMであった。上述のようにMSVを調製し、そして保存した。培養容器に、1:3~1:6cm2:cm2の範囲の比で、活発に増殖している培養を分割することによって植え付けた。実施例1に記載するように、フラスコまたはローラーボトル中のTVL-BK継代培養を意図されるを、増殖培地を無菌的に除去し、そして実施例1に記載するように1xトリプシン-EDTA溶液を添加することによって、培養表面から遊離させた。35~39°Cで約5分間、インキュベーションした後、単層を分散させた。分散させた細胞を増殖培地とともに培養容器に添加することによって、トリプシンを不活化した。シードが凍結乾燥されている場合、ウイルスの凍結アリコットを迅速に融解するか、または培地に懸濁した。TVL-BK細胞20またはそれ未満にウイルスを接種した。フラスコまたはローラーボトル中で複製している、継代培養が意図されるウイルスを、適切なインキュベーション時間そして/またはCPEが観察された後に収集した。ウイルス液を6°C~-80°Cで保存するか、または直ちに用いて、他の培養容器に接種した。標準細胞培養技術を用いて、シードおよび産生培地の両方に接種した。継代20またはそれ未満のTVL-BK細胞を接種した。典型的にはMSV9である凍結産生ウイルス接種物を迅速に融解した。細胞あたり0.01~1ウイルスの範囲の感染多重度を達成するための、ウイルス接種物の体積は、典型的には、培養面積1600cm2あたり、1~25mLであった。最小接種力価は以下のとおりであった:BHVに関しては、mLあたり105.5TCID50、BVDV-1aに関しては、mLあたり105.0TCID50、BVDV-1bに関しては、mLあたり105.0TCID50、BVDV-2に関しては、mLあたり105.0TCID50、PI3ウイルスに関しては、mLあたり106.0TCID50、そしてBRSVに関しては、mLあたり104.5TCID50。接種培養物を37±2°Cおよび5±1CO2でインキュベーションした。BHVおよびPI3は2~4日間、BVDV-1a、BVDV-1b、およびBVDV-2は4~6日間、そしてBRDVは5~8日間、インキュベーションした。採取採取当日、ウイルス特異的CPEおよび無菌性に関して培養を調べた。最小インキュベーション時間は、BHVまたはPI3接種後2日間、BVDV-1a、BVDV-1bまたはBVDV-2接種後4日間、そしてBRSV接種後5日間であった。最大インキュベーション時間は、BHVまたはPI3接種後4日間、BVDV-1a、BVDV-1b、またはBVDV-2接種後6日間、そしてBRSV接種後8日間であった。ウイルス懸濁物を産生容器から無菌的に採取した。試料を収集して、採取物のTCID50を決定した。採取材料を6°C~-80°Cで保存した。採取材料は、最終産物の製造前に、凍結より上では、最長1ヶ月、そして凍結状態では最長6ヶ月、保存可能であった。標準的無菌技術を用いて、すべての操作を行った。ネオマイシンおよびナイスタチンマイコスタチン登録商標、Bristol-MyersSquibb、米国ニューヨーク州ニューヨークを、それぞれ15μgおよび15単位/用量の率で、ワクチンのシリーズまたはサブシリーズ集合中に添加した。採取液をDMEM中で希釈し、そして0.2μmでろ過したスクロース溶液を添加することによって安定化させ、10±1の最終スクロース濃度を生じた。10kDa分子量カットオフフィルターを用いた無菌限外ろ過によって、ウイルス採取液を濃縮した。濃縮の度合いは、典型的には50倍を超えなかった。採取ウイルス液のバッチを分析して、TCID50を決定した例えば、Spearman-Karber法。実施例5-六価BRDCワクチン修飾生ウイルスのための有効性研究実施例5~10は、六価BRDC修飾生ワクチンが、含有されるウイルス各々によって引き起こされる疾患を予防する際の有効性を立証する。この第一の実施例において、ワクチンは、BVDV-1bによって引き起こされる疾患を予防する際に有効であることが示される。材料六価ワクチン修飾生ウイルスを、上記産生法にしたがって調製した。簡潔には、BHV-1Cooper株、BVDV-1aSinger株、BVDV-1bTGAC株、BVDV-2125、PI3ReisingerSF-4、およびBRSVN375をTVL-BK細胞株第20継代中で増殖させた。個々の分画を第10継代で採取し、そして六種産物とともにブレンドした。欠失プラセボを有効性シリーズ各々と平行して作製した。例えば、BVDV欠失プラセボは、対応する有効性シリーズと同じBRSV、BHV、およびPI3採取バッチを含有した。BVDV構成要素の代わりに培地を用いて、有効性シリーズおよびBVDV欠失プラセボ間で同等の体積を維持した。六価ワクチンMLVの各構成要素に関して、類似の欠失プラセボを構築した。実験法各研究のため、およそ3~4ヶ月齢の商業的な若い食肉牛/肥育素牛を得て、ランダム化し、そして耳標によって同定した。これらの子ウシを駆虫し、そしてパスツレラ病、マイコプラズマ病、および黒脚病に対してワクチン接種した。ワクチン接種および対照群にいる子ウシを分けて、隣接させないが、同等の囲い中で曝露2日前第-2日まで維持し、この時点で1つの囲い中で混合した。第0日、すべての子ウシを、関心対象のウイルスの病原性単離体に曝露した。例えば、病原性BVDV-1bPokeyFeeders米国カンザス州スコットシティの囲いで死亡した子ウシの肺から得られたものを、10ウマ血清を含むDMEMを用いて、TVL-BK細胞上、invitroで継代した。4mL中、およそ8x107TCID50の曝露用量を各子ウシに投与し、2mLを吸気中、各鼻孔に投与した。子ウシは、水、沿岸性バミューダ乾草、および抗コクシジウム剤を含有するが、抗生物質を含有しないペレット状餌配給に自由選択でアクセス可能であった。ランダム化マッチランダム化スキームを用いて、CVB-Biometricsによって提供されるランダム化表を用い、子ウシを2つの処置群ワクチン接種またはプラセボワクチン接種対照に割り当てた表1を参照されたい。傾斜台に進入する一連の3頭の子ウシを、2:1の比で2つの処置群にランダム化した。血清学的評価のために、最初に血液を抜き取る際に、バケツからランダムに耳標を抜き取り、子ウシを同定する。曝露前、ウシの2群を分けて、しかし同等の囲いに維持した。曝露2日前第-2日、子ウシを1つの囲い中で混ぜた。ブラインド化ブラインド化された職員は、対照またはワクチン接種動物の同一性の知識を持たなかった。すべての野外および実験室職員は、記録者を除いて、研究に対してブラインド化された。転帰選択された一次転帰は、曝露後の白血球減少症であった。白血球減少症は、ベースラインWBC数からの25の減少と定義された。ワクチンの有効性をさらに支持する他の転帰には、鼻排出、ウイルス血症、発熱、抗体産生およびウイルス感染の臨床徴候が含まれた。評価因子個々の白血球WBC数を、曝露前平均のパーセントに変換し、そして連続間隔スケールで測定した。これらの変換WBC数のパーセントを曝露後少なくとも14日間、毎日決定し、そして評価のための一次基準として用いた。白血球減少症の検出は、曝露に対する耐性罹患せずまたは感受性罹患を決定するための一次基準として働いた。罹患および非罹患群を比較して、ワクチン接種がウイルス曝露後の白血球減少症を予防したかどうかを決定した。呼吸器疾患の臨床徴候および鼻/バフィーコート試料からのウイルスの検出は、曝露に対する感受性を決定するための二次基準として働いた。白血球減少症の期間および排出期間個々の子ウシからウイルスが検出される日数を分析して、ワクチン接種がこれらのパラメータに対して緩和効果を有するかどうかを決定した。曝露前平均温度ベースラインを共変数として用いて、すべての個々の毎日直腸温度を分析した。研究開始時に、≧2のウイルス力価を有する場合、実験単位を研究から排除した。試料採取フレームおよび方法有効性シリーズまたは対応する欠失プラセボのワクチン接種直前第-28日~第-21日、子ウシから血液試料を収集した。曝露直前に第0日、そして再び、曝露14日後第14日、血液試料をまた収集した。示差WBC数およびウイルス単離用の血液試料を、第-2日~少なくとも第14日まで収集した。試料をEDTAVacutainer登録商標Becton-DickinsonandCo.、米国ニュージャージー州フランクリンレークス試験管中に収集し、そしてDrewScientific、Hemavet950示差WBC計数装置を用いて、計数を行った。ウイルス単離用の鼻スワブを第-2日~少なくとも第14日に採取した。観察およびデータ収集第2日~第14日、鼻試料および血液試料を収集し、そして子ウシをウイルス感染の臨床徴候に関して観察した。第-2日~第14日、各子ウシの直腸温度を測定した。WBC数のデータを分析して、曝露後数の減少を決定した。各動物に関して、第-2日~第0日のWBC数を平均することによって、曝露前平均を計算した。観察者の裁量で、各々、曝露1日後~14日後、またはそれより長期間、曝露前平均に対する毎日WBC数の比を計算した曝露前の比率としてのWBC数。比率が25減少していたならば、個体は白血球減少症と分類された。両方の鼻孔を、液体Stuart培地を含むBBL培養スワブ登録商標で拭き取ることによって、曝露日および曝露後連続14日間、各子ウシから鼻スワブを採取した。収集日、0.2μmフィルターを通じて滅菌ろ過することによって、試料をプロセシングした。次いで、TVL-MDBK~80集密を含有する12ウェルプレートの各ウェルに、試料を接種した。プレートあたり1つのウェルは未接種のままにし、そして陰性対照として用いた。プレートの1つのウェルに曝露ウイルスの希釈を接種し、そして陽性対照として用いた。プレートを35~39°Cの温度で、2~4日間、3~7CO2でインキュベーションした。各ウェルから培地を採取し、そして-18°C~-22°Cで保存した。すべてのウェル由来の培地をRT-PCRRidpathおよびBolin1998によって評価して、特定のウイルスが培養中に存在するかどうかを決定した。ウイルスが培養陽性であった個体を排出と分類した。血液試料由来のバフィーコートを用いて、TVL-MDBK~80集密を含有する12ウェルプレートの各ウェルに接種した。プレートあたり1つのウェルは未接種のままにし、そして陰性対照として用いた。プレートの1つのウェルに曝露ウイルスの希釈を接種し、そして陽性対照として用いた。プレートを35~39°Cの温度で、2~4日間、3~7CO2でインキュベーションした。各ウェルから培地を採取し、そして-18°C~-22°Cで保存した。すべてのウェル由来の培地をRT-PCRRidpathおよびBolin1998によって評価して、ウイルスが培養中に存在するかどうかを決定した。特定のウイルスに関して培養陽性であった個体を病原性と分類した。各動物に関する毎日直腸温度を、研究第-2日~第14日の間曝露前2日間、曝露日、および曝露後14日間記録した。各動物に関して、第-2日~第0日の温度値を平均することによって、曝露前平均を計算した。ベースラインを共変数として用いて、毎日温度を分析した。BVDV-1b抗体力価:BVDV-1b有効性の場合、最初のワクチン接種日第-21日、曝露日第0日、および研究終了時、各動物に関して、一定ウイルス減少血清法によって、BVDV-1bに対する血清中和抗体力価を決定した。特別概略A-17、ウシウイルス性下痢症ウイルス1型中和抗体の力価決定の修飾法を用いて抗体力価を決定した。修飾アッセイは、BVDV-1a単離体の代わりに、指標ウイルスとして、細胞変性BVDV-1b単離体を用いた。≧8の抗体力価を発展させる動物をBVDV-1bに血清変換したと見なした。ワクチン接種群および対照群の間の、白血球減少症の期間、排出、およびウイルス血症の相違を概算した緩和分率。曝露前平均温度ベースラインを共変数として用いて直腸温度を分析した。選択された信頼区間は95であった。白血球減少症:白血球減少症データの分析は、ウイルス曝露後、白血球減少症であるプラセボワクチン接種対照の比率に比較した際、白血球減少症であるワクチンの比率に基づいた。TannerおよびMorgan1993によって記載されるような予防可能分率を決定することによってこれを評価した。排出およびウイルス血症:排出およびウイルス血症データの分析は、ウイルス曝露後に排出するかまたはウイルス血症であるプラセボワクチン接種対照の比率に比較した際の、ウイルスを排出するか、またはウイルス血症である、ワクチン接種動物の比率に基づく。TannerおよびMorgan1993によって記載されるような予防可能分率を決定することによって、これらを評価した。2群間の白血球減少症の期間の相違中央値を概算し、そしてFergen2004にしたがって緩和分率を計算した。2群間の排出期間の相違中央値およびウイルス血症期間の相違中央値を概算し、そしてFergen2004にしたがって緩和分率を計算した。臨床観察:ベースラインを共変数として用い、群、日および群日相互作用に関する項を含む反復測定分散分析ANOVAを用いて、第1日~第14日の直腸温度の分析を行った。群日相互作用が有意であるp<0.5場合、各時点に関する群の単純な影響を通じて、ワクチン接種群を対照に比較した。これらの単純な影響の比較を群日相互作用から得た。統計分析:Mann-WhitneyU検定を用いて、抗体力価の群比較を分析した。上述のようなMS-Windows登録商標用のSASLearningEditionv2.0を用いて、すべての統計分析を行った。実施例5A-六価BRDCワクチンに関する有効性研究本研究の結果は、修飾生ウシウイルス性下痢症ウイルス-1b型BVDV1b、ウシ鼻気管炎-ウイルス下痢症-パラインフルエンザ3-呼吸器合胞体ウイルスワクチン修飾生ウイルスは抗原性であり、そしてBVDV1bによって引き起こされる疾患の予防の補助として有効である。1用量のワクチンを21頭のBVDV血清陰性子ウシに投与した。10頭の血清陰性対照子ウシに産物マッチプラセボワクチン1用量をワクチン接種した。すべての子ウシをBVDV1bに鼻内曝露した。ワクチン接種は、増加したBVDV1b抗体力価増加を生じ、そしてBVDV1b誘導性ウイルス血症、鼻排出物、発熱、疾患の臨床徴候および白血球減少症を予防するかまたは減少させた。その結果、用量あたり2x103の最小BVDV1b-TCID50が、このワクチンのBVDV1b分画に関して確立されてきている。このワクチンは、BHV-1、PI3、BRSV、BVDV1型の2つの下位遺伝子型1aおよび1bおよびBVDV2型を含有する。ワクチン接種、曝露および試料収集:31頭のBVDV陰性子ウシを選別路地中で混合した。マッチセットランダム化スキームを用いることによって、各子ウシはランダムに集められる際にゲートで分けられgatecut、3頭の子ウシが同時に、路地を通じて2つの群群A-ワクチン接種、または群B-プラセボワクチン接種対照の一方に分けられた。21頭の子ウシを1用量のウシ鼻気管炎-ウイルス下痢症-パラインフルエンザ3-呼吸器合胞体ワクチン修飾生ウイルスでワクチン接種した。各ワクチン接種動物に、第0日、首の左側への皮下注射によって、2mL用量の産物を投与した。10頭の子ウシには、産物マッチプラセボワクチンBVDV欠失をワクチン接種した。曝露2日前、ワクチン接種および対照群の両方を、曝露前臨床観察の目的のため、そしてベースライン体温およびWBC読み取り値を得るため、混合した。ワクチン接種および対照子ウシを、ワクチン接種21日後、囲いで死亡した子ウシの肺から得られたBVDV1の病原性単離体に曝露した。ウイルスは、10ウマ血清を含むダルベッコの修飾イーグル培地を用いて、TVL-BK細胞上、invitroで継代された。4mL中、4x107TCID50の曝露用量を各子ウシに投与し、2mLを吸気中、各鼻孔に投与した。ワクチン接種前、曝露日ワクチン接種21日後、および曝露後14日間、抗体力価を決定するため、血液試料を収集した。一定ウイルス減少血清中和法によって、ウシウイルス性下痢症ウイルス抗体力価を決定した。液体Stuart培地中のBBL培養スワブ登録商標で両方の鼻孔を拭き取ることによって、曝露日および曝露後連続14日間、ウイルス単離用の鼻スワブを子ウシから収集した。EDTAバキュテーナー試験管内に静脈穿刺することによって、曝露日および曝露後連続14日間、バフィーコートウイルス単離用の血液試料を子ウシから収集した。曝露前連続2日間、曝露日および曝露後連続14日間、各子ウシに関して直腸温度を毎日記録した。各子ウシに関して臨床観察を行い、そして記録した。ワクチン接種および対照群両方が混合され、唯一の区別特徴は耳標番号であったため、観察者はブラインド化された。研究のどの時点でも、観察者は、個々の試験動物のワクチン接種状態の知識を提供されなかった。実験室職員は、ウシのワクチン接種状態の知識を持たなかった。曝露前連続2日間、曝露日および曝露後連続14日間、示差WBC数を決定するための血液試料を収集した。EDTAバキュテーナー試験管中で試料を収集し、そしてDrewScientific、Hemavet950示差WBC計数装置を用いて、カウントを行った。BVDV検出:細胞培養増進PCR技術を利用して、収集試料中のBVDV1bを検出した。簡潔には、培養中のTVL-BK細胞に対して滅菌ろ過0.2μmすることによって、鼻試料をプロセシングした。細胞を洗い流す前、45~75分間、培養中のTVL-BK細胞上に、直接バフィーコートを乗せた。培養を37°C±2°Cおよび5±1CO2で4日間インキュベーションした。慣用的なRTqPCR方法論および以下のプローブ/プライマーセットを用いて、BVDV1bの存在/非存在に関して、すべての培養試料由来の上清を個々にアッセイした:フォワードプライマー:CACCCTATCAGGCTGTATTCATAGC配列番号1リバースプライマー:TGCCCACAGCACATCTTAACC配列番号2TaqManMGBプローブ:TCACCTGGACGACCC配列番号3PCRによる1a、1bおよび2型ウシウイルス性下痢症ウイルスBVDVの区別,JuliaF.RidpathおよびStevenR.Bolin,MolecularandCellularprobes,JournalofVirologicalMethods,1302005145-148に基づいてこの方法を開発した。この方法はまた、CenterforVeterinaryBiologicsandNationalVeterinaryServicesLaboratoriesTestProtocol-GenotypingBovineViralDiarrheaVirus,第BPPR02010.01号にも基づく。BVDVの遺伝子型および下位遺伝子型を区別するこれらの方法はどちらもゲノムの5’非翻訳領域UTRに存在する遺伝子相違を利用する。このプローブ/プライマーセットは、非常に特異的なプローブによってBVDV1b配列がユニークに検出可能な、5’UTRのセクションを増幅するように特異的に設計された。プローブ/プライマーセットの特異性を社内で確認し、そしてこれらは、BHV、PI3、BRSV、BVDV1a、またはBVDV2とは交差反応しなかった。AppliedBiosystems7500上でのTaqman登録商標に基づくアッセイを用いて、RTqPCRアッセイを行った。統計分析:抗体力価:Mann-WhitneyU検定を用いて、一般的にスケーリングされる力価の群比較を分析した。ウイルス血症:BVDV1bが曝露後に単離された対照の比率に比較した際の、BVDV1bが単離されたワクチン接種動物の比率に基づいて、血液試料のバフィーコート由来のウイルス単離データを分析した。BVDV1bウイルス血症に関する予防可能分率を、TannerおよびMorgan1993によって記載されるように計算した。鼻排出:鼻スワブ分析によるウイルス単離データは、BVDV1bが曝露後から単離された対照の比率に比較した際の、BVDV1bが単離されたワクチン接種動物の比率に基づく。BVDV-1b排出の予防可能分率を、TannerおよびMorgan1993によって記載されるように計算した。直腸温度:曝露前平均直腸温度を各動物に関して測定した。群、日および群日相互作用に関する項を含む反復測定分散分析ANOVAにおける共変数として、この平均を用いた。疾患の臨床徴候:各観察者によって独立に、疾患の臨床徴候を毎日記録した。曝露後観察日の少なくとも1日に関して徴候を示した子ウシはいずれも罹患したと見なした。臨床徴候に関する予防可能分率を、TannerおよびMorgan1993によって記載されるように計算した。白血球減少症:各動物に関して、第-2日~第0日の間の白血球数を平均することによって、曝露前白血球平均値を計算した。曝露後各々第1日~第14日まで、曝露前平均に比較して毎日の白血球数の比曝露前の比率としての白血球数を計算した。この比率データを分析して、ベースラインから数の40減少として定義されるような白血球減少症を、個々の動物が発展させたかどうかを決定した。TannerおよびMorgan1993によって記載されるように、予防可能分率を計算して、本研究において、ワクチン接種が白血球減少症の発展を予防したかどうかを決定した。Windows登録商標用のSPSSバージョン16を用いて、すべての統計分析を行った。結果血清中和抗体力価:本研究のすべての子ウシは、<1:2のワクチン接種前BVDVBVDV1a、BVDV1bおよびBVDV2血清中和抗体力価を有した。曝露日第21日までに、ワクチン接種群は、1:83の平均BVDV1b力価を有し、これは対照群<1:2のものより有意にp≦.05大きかった。BVDV1b抗体力価は、対照およびワクチン接種子ウシの両方で曝露14日後に増加し、子ウシがBVDV1bに曝露されたことを示した。バフィーコート由来のBVDV1b単離:本研究における10頭の対照子ウシはすべて、本研究の曝露後の期間の間にウイルス血症となった。しかし、対照子ウシの7頭は、BVDV曝露後ウイルス血症が典型的に観察される臨界時間フレーム中にウイルス血症であった。3頭の対照子ウシ1、14、30は、曝露日にウイルス血症であった。これらの同じ3頭の子ウシとともに子ウシ26は曝露翌日にウイルス血症であった。この観察は、血清学的、鼻スワブ単離および直腸温度データとともに、これらの子ウシが研究のワクチン接種期の後期に、天然に感染し、ウイルス血症となり、そして本研究の曝露期初期に排出し始めたことを示唆する。これらの4頭の子ウシの1頭子ウシ30は、典型的な曝露後ウイルス血症/排出期間中に、ウイルス血症となり、そしてウイルスを排出した。21頭のワクチン接種動物はいずれも曝露後の期間にウイルス血症ではなかった。天然に保護された対照3/10および保護されたワクチン接種動物21/21の比を用いて、予防分率を計算した。これによって、1.0の予防可能分率が生じる。鼻スワブからのBVDV1b単離:本研究において、すべての10頭の対照子ウシは、本研究の曝露後の期間中、BVDV1bを排出した。しかし、対照子ウシ7頭は、BVDV曝露後排出が典型的に観察される臨界時間フレーム中に排出した。2頭の対照子ウシ26および30は、曝露日に排出した。3頭の対照子ウシ1、14および30は、曝露翌日に排出した。この観察は、血清学的、バフィーコート単離および直腸温度データとともに、これらの子ウシが研究のワクチン接種期の後期に、天然に感染し、ウイルス血症となり、そして本研究の曝露期初期に排出し始めたことを示唆する。これらの4頭の子ウシの1頭子ウシ30は、典型的な曝露後ウイルス血症/排出期間中に、ウイルス血症となり、そしてウイルスを排出した。21頭のワクチン接種動物のうち1頭のみが曝露後の期間にBVDV1bを排出した。天然に保護された対照3/10および保護されたワクチン接種動物20/21の比を用いて、予防分率を計算した。これによって、0.93の予防可能分率が生じる。直腸温度:データ分析によって、有意な群日相互作用が示されたp=.034。日による分析によって、対照群の温度が、曝露後第1日、第4日、第7日および第8日に、ワクチン接種群よりも有意にp<0.05高いことが示された。第12日、対照群の直腸温度は低下し、そしてワクチン接種群のものより有意にp<0.05低かった。BVDV1bの臨床徴候:対照群中の10頭の子ウシのうち8頭8/10罹患は、BVDV1b感染に寄与しうる臨床徴候を示した。臨床徴候には、下痢、大量の透明な鼻分泌物、多呼吸および目の分泌物が含まれた。ワクチン接種群の子ウシはいずれも0/21罹患、研究の曝露後の期間中、これらの臨床徴候のいずれも示さなかった。天然に保護された対照2/10および保護されたワクチン接種動物21/21の比を用いて、予防分率を計算した。これによって、1.0の予防可能分率が生じる。子ウシのいずれにおいても、不都合なワクチン接種後反応は観察されなかった。白血球減少症:21頭のワクチン接種動物のうち4頭で、そして10頭の対照のうち5頭で白血球減少症が検出され、62の予防可能分率が生じた。結論先行の記述は、BVDV1bによって引き起こされる疾患の予防における補助として、ウシ鼻気管炎-ウイルス下痢症-パラインフルエンザ3-呼吸器合胞体ウイルスワクチン修飾生ウイルスのBVDV1b分画の抗原性および有効性を立証する。この併合産物のBVDV1b分画の抗原性および有効性は、以下のように証明される:1対照群に比較した際のワクチン接種群におけるBVDV1bに対する抗体力価の有意な増加。ワクチン接種群におけるすべての子ウシは、1回の2ml用量の投与後、BVDV1b力価≧1:8を発展させ、9CFR113.311c5に定義される必要条件を満たす。2ウイルス単離研究によって、1用量の投与が、曝露後BVDV1b誘導性ウイルス血症および鼻排出の有意な減少を生じることが明らかになった。3ワクチン接種子ウシは、対照子ウシに比較した際、有意に低い発熱を示し、そして疾患の臨床徴候をまったく示さなかった。4ワクチン接種はまた、BVDV1b誘導性白血球減少症を発展させる可能性も減少させた。本研究は、対照群の子ウシのうち少なくとも3頭が曝露のわずかに前にBVDV1bに感染したという事実によって、わずかに影響を受けた。感染したものも含めてすべての対照子ウシは、曝露時点でなお、血清陰性であったという事実のため、研究のワクチン接種期後期に、天然曝露が起きたと結論づけられた。おそらく、曝露2日前まで、対照群と別個に維持されていたため、ワクチン接種群においては天然曝露の臨床的証拠はなかった。典型的な若い食肉牛/肥育素牛環境において、曝露研究を行う際には、天然曝露は内在する可能性である。TannerおよびMorganによれば、予防可能分率によって決定されるようなワクチン有効性の概算は、自然免疫のいくつかのレベルに関する、観察された保護およびワクチン有効性の間の関係を考慮する。本研究の知見は、統計的に有意であり、そしてかつ臨床的に適切であり、したがって、ワクチン中に含有されるBVDV1b分画の有効性が立証された。実施例6-BRSV有効性プロトコル本実施例は、六価MLVワクチンのウシ呼吸器合胞体ウイルスBRSV分画は、BRSVによって引き起こされる疾患の予防を補助することを立証する。材料および方法BRSV欠失プラセボを調製し、そしてBVDV-1bに関して実施例5に記載したものと類似の方式の有効性シリーズと一緒に用いる。このBRSV欠失プラセボは、有効性シリーズと同じBVDV-1a、BVDV-1b、BVDV-2、BHVおよびPI3採取バッチを含有し、BRSV構成要素の代わりに培地を用いて、有効性シリーズおよびBRSV欠失プラセボ間で同等の体積を維持する。無菌希釈剤を用いて、本明細書に記載するように、六価MLVワクチンおよびBRSV欠失プラセボの両方を再水和する。実験法ほぼ同じ起源、種類、体重および年齢を有する比較的均質な集団由来の、およそ3~4ヶ月齢の商業的な若い食肉牛/肥育素牛を用いる。子ウシを駆虫し、そしてパスツレラ病、マイコプラズマ病、および黒脚病に対してワクチン接種する。このプロトコルにおいて、同数のワクチン接種子ウシおよび対照子ウシを用いる;子ウシ2群を分けて、隣接させないが、同等の囲い中で維持し、そして曝露2日前第-2日に1つの囲い中で混合する。子ウシは、水、沿岸性バミューダ乾草、および抗コクシジウム剤を含有するが、抗生物質を含有しないペレット状餌配給に自由選択でアクセス可能である。ランダム化マッチランダム化スキームを用いて、CVB-Biometricsランダム化表を用い、子ウシを2つの処置群ワクチン接種またはプラセボワクチン接種対照に割り当て、ここで傾斜台に進入する一連の3頭の子ウシを、2:1の比で2つの処置群にランダム化する。血清学的評価のために、最初に血液を抜き取る際に、バケツからランダムに耳標を抜き取り、子ウシを同定する。ブラインド化職員はすべて研究に対してブラインド化され記録者を例外とする、そして対照またはワクチン接種動物の同一性の知識を持たない。転帰一次転帰は、曝露後のBRSVウイルスの鼻排出の予防であり、これはプロトコル中のすべての子ウシの鼻孔から毎日収集される鼻試料におけるBRSVの存在または非存在によって決定される。他の二次転帰には、1またはそれより多いBRSV感染の減少した臨床徴候、発熱の減少、および/またはBRSVを排出する子ウシにおける排出期間の減少が含まれうる。ワクチン接種および対照群によるBRSVの排出は、曝露後14日間、毎日測定され、BRSVの検出は、曝露に対する耐性罹患せずまたは感受性罹患を決定するための一次基準として働く。罹患および非罹患群を比較して、ワクチン接種がBRSV曝露後のBRSV排出を予防したかどうかを決定する。呼吸器疾患の臨床徴候は、曝露に対する感受性を決定するための二次基準として働く。排出期間個々の子ウシからBRSVが検出される日数を分析して、ワクチン接種がこのパラメータに対して緩和効果を有するかどうかを決定する。曝露前平均温度ベースライン共変数に対して、すべての個々の毎日直腸温度を分析する。研究開始時に、≧2のBRSVSN力価を有する場合、実験単位を研究から排除する。試料採取フレームおよび方法有効性シリーズまたはBRSV欠失プラセボを用いたワクチン接種直前第-28日~第-21日、子ウシから血液試料を収集し、そして再び曝露直前に第0日、そして再び、曝露14日後第14日、採取する。観察およびデータ収集両方の鼻孔を、液体Stuart培地を含むBBL培養スワブ登録商標で拭き取ることによって、曝露日および曝露後連続14日間、各子ウシから鼻スワブを採取する。BRSVを検出するために特異的に設定されたプローブ/プライマーセットを用いたリアルタイムPCRによって、試料由来の培地をBRSVの存在に関してアッセイする。フォワードプライマー:5’AATGCTGCAGGACTAGGTATAAT-3’配列番号4;リバースプライマー:5’-ACACTGTAATTGATGACCCCATTCT-3’配列番号5;およびBRSVTaqMan登録商標MGBプローブ:5’-AAGACTTGTATGATGCTGCCAA-3’配列番号6期間データを分析して、ワクチン接種が、鼻試料中でBRSVが検出される期間に対して緩和効果を有することを立証する。臨床観察:各動物に関する毎日直腸温度を、研究第-2日~第14日の間曝露前2日間、曝露日、および曝露後14日間記録し、各動物に関して、第-2日~第0日の温度値を平均することによって、曝露前平均を計算する。次いで、ベースラインを共変数として用いて、毎日温度を分析する。ワクチン接種日、研究の第0日および第14日、各動物に関して、一定ウイルス減少血清法によって、血清中和抗体力価を決定するSchefersら、2008。肉牛子ウシにおけるBRSVの臨床徴候は、Baker1986によって先に記載されてきている。臨床徴候には、限定されるわけではないが、鼻および涙腺分泌物、呼吸数増加、直腸温度上昇、軽い抑鬱、餌摂取減少、過流涎および呼吸困難が含まれる。BRSV感染臨床徴候は、伝統的な曝露モデルよりもより明らかではなく、それは曝露に用いられるウイルスが、invitroでの増殖によって弱毒化されているためであり、そしてこれらのモデルを評価する際の唯一の重要なパラメータは、ウイルス排出であるWren、2001。それゆえ、臨床徴候を曝露前2日間、曝露日、および曝露後14日間記録する。BRSVの臨床徴候の観察をデータ分析中に考慮するが、一次転帰とは見なさず、これは、これらの徴候が、商業的なウシにおいて一般的に見られる多くの呼吸器疾患を示しうるためである。罹患または非罹患のいずれかと分類されるワクチン接種群およびプラセボワクチン接種対照群の比率予防分率を概算し、ワクチン接種および対照群間の排出期間の相違もまた概算する緩和分率。六価MLVワクチンのBRSVウイルス分画の有効性は、TannerおよびMorgan1993によって記載されるような予防可能分率を決定することによって、容易に評価可能である。この分析は、耐性であるプラセボワクチン接種対照の比率に比較した際の、BRSV曝露に対して耐性であるワクチン接種動物の比率に基づく。統計分析:Fergenの方法2004にしたがって、2群間の排出期間の相違中央値を概算可能であり、そして緩和分率を計算可能である。Mann-WhitneyU検定を用いて、抗体力価の群比較を分析可能である。上述のようなMicrosoftWindows登録商標用のSASLearningEdition2.0を用いて、すべての統計分析を行った。実施例6A-BRSV有効性研究本研究の結果は、ウシ鼻気管炎-ウイルス下痢症-パラインフルエンザ3-呼吸器合胞体ウイルスワクチン修飾生ウイルスの修飾生ウシ呼吸器合胞体ウイルスBRSV分画が抗原性であり、そして若い食肉牛/肥育素牛におけるウシ呼吸器合胞体ウイルスの排出の予防の補助として有効であることを立証する。1用量のワクチンを22頭のBRSV血清陰性子ウシに投与した。11頭の血清陰性対照子ウシに産物マッチプラセボワクチン1用量をワクチン接種した。すべての子ウシをBRSVに鼻内曝露した。ワクチン接種は、増加したBRSV抗体力価増加を生じ、そして曝露後のBRSV排出を予防した。その結果、用量あたり7x102の最小BRSV-TCID50が、このワクチンのBRSV分画に関して確立されてきている材料および方法ワクチン接種および子ウシの曝露:33頭のBRSV陰性子ウシを選別路地中で混合した。CVB-Biometricsによって提供されるマッチセットランダム化スキームを用いることによって、各子ウシはランダムに集められる際にゲートで分けられ、3頭の子ウシが同時に、路地を通じて2つの群群A-ワクチン接種、または群B-プラセボワクチン接種対照の一方に分けられた。22頭の血清陰性子ウシにウシ鼻気管炎-ウイルス下痢症-パラインフルエンザ3-呼吸器合胞体ワクチン修飾生ウイルスワクチンの1用量をワクチン接種した。各ワクチン接種動物に、第0日、首の左側への皮下注射によって、2mL用量の産物を投与した。11頭の子ウシには、産物マッチプラセボワクチンBRSV欠失をワクチン接種した。鼻スワブを収集し、子ウシから出血させ、そして血清学的にスクリーニングして、一定ウイルス減少血清中和アッセイによって、BRSVに対する感受性を確認した。曝露2日前、ワクチン接種および対照群の両方を、曝露前臨床観察の目的のため、混合した。ワクチン接種および対照子ウシを、ワクチン接種32日後、4ml鼻孔あたり2mlのTVL-BRSV、N375単離体に曝露した。曝露ウイルスを曝露直前に力価決定し106.6/mlのTCID50、そして再び曝露直後に力価決定した106.2/mlのTCID50。曝露ウイルスは、曝露プロセス中、冷却して維持された。ワクチン接種日、曝露日、および曝露後14日間、血液試料を収集した。一定ウイルス減少血清中和法によって、ウシ呼吸器合胞体ウイルス抗体力価を決定した。曝露日および曝露後連続14日間、鼻スワブを収集した。曝露前連続2日間、曝露日および曝露後連続14日間、各子ウシに関して直腸温度を毎日記録した。臨床観察を行った。ワクチン接種群および対照群が混合され、唯一の区別特徴は耳標番号であったため、観察者はブラインド化された。研究のどの時点でも、観察者は、個々の試験動物のワクチン接種状態の知識を提供されなかった。実験室職員は、子ウシのワクチン接種状態の知識を持たなかった。BRSV検出:液体Stuart培地中のBBL培養スワブ登録商標で両方の鼻孔を拭き取ることによって、鼻スワブを子ウシから収集した。細胞培養増進PCR技術とともに、BRSV特異的CPEの視覚的観察を利用して、収集試料中のBRSVを検出した。簡潔には、培養中のTVL-BK細胞に対して滅菌ろ過0.2μmすることによって、試料をプロセシングした。培養を37°C±2°Cおよび5±1CO2で5日間インキュベーションした。BRSV特異的CPEに関して培養を観察し、そして結果を記録した。M.Boxusらウシ呼吸器合胞体ウイルスの検出および定量化のためのリアルタイムRT-PCR,M.Boxus,C.Letellier,P.Kerkhofs,JournalofVirologicalMethods,1252005125-130に記載されるプローブ/プライマーセットを用いて、BRSVの存在/非存在に関して、すべての培養試料由来の上清および-CPE両方を個々にアッセイした。プローブ/プライマーセットの特異性を社内で確認し、そしてこれはBHV、PI3、BVDV1a、BVDV1bまたはBVDV2とは交差反応しなかった。Taqman登録商標に基づくアッセイを用いて、AppliedBiosystems7500上、RTqPCRアッセイを行った。BRSV特異的CPE陽性であるすべての試料はまた、PCR陽性でもあった。BRSV特異的CPEに関して陰性であり、そしてPCRアッセイによってBRSVに関して陽性であった10の試料があった。これは、PCRに基づくアッセイが、BRSV特異的CPEの観察に基づくアッセイよりもより感受性であることを示す社内研究と一致する。初代培養後、BRSVに関して陰性である試料を継代培養し、そして継代培養した液体由来の上清を、同じ方法にしたがって、BRSVの存在/非存在に関してアッセイした。統計分析:このワクチンのBRSV分画の有効性は、主に、曝露後、BRSVを排出する対照の比率に比較した際の、BRSVを排出するワクチン接種動物の比率に基づいた。予防可能分率をTannerおよびMorgan1993に記載されるように計算した。研究中に個々の子ウシからBRSVが単離される曝露後の日数を評価した。群を比較して、BRSV単離排出頻度が、BRSV曝露後、対照群に比較した際、ワクチン接種群で有意に減少しているかどうかを決定した。一般的なスケールの力価データの群比較を、Mann-WhitneyU検定によって比較した。曝露前温度平均を共変数として用いて、直腸温度を分析した。反復測定分散分析ANOVAを用いて、第1日~第14日の曝露後温度の分析を行った。Windows登録商標用のSASを用いて、すべての統計分析を行った。結果血清中和抗体力価:本研究のすべての子ウシは、<1:2のワクチン接種前血清中和抗体力価を有した。ワクチン接種後、対照群のものに比較した際、ワクチン接種群では、血清中和抗体力価は有意にp≦.05大きかった。22頭のワクチン接種子ウシのうち21頭がワクチン接種後、BRSV力価の増加を示し、一方、11頭のプラセボワクチン接種対照すべてが、曝露前のワクチン接種期間全体で陰性のままであった。ワクチン接種群の平均抗体力価は8.5であり、一方、対照群の平均力価は<2であった。BRSV単離:本研究において、本研究の曝露後の期間中、11頭の対照子ウシすべてがBRSVを排出した。22頭のワクチン接種動物のうち、3頭のみがこの期間にBRSVを排出した。これは、0.8636の予防可能分率を生じる。排出頻度においてもまた、有意な相違p<0.05があった。対照群は、平均6.00日間BRSVを排出し、一方、ワクチン接種動物はわずか0.227日間排出した。これは5.773日の相違である。直腸温度:共変数として曝露前平均温度を用いた曝露後直腸温度分析によって、群間に統計的に有意な相違がないことが明らかになった。このデータのさらなる分析は追究しなかった。BRSVの臨床徴候:曝露前連続2日間、曝露日および曝露後連続14日間、呼吸器疾患の臨床徴候に関して、各動物を調べた。BRSV感染に間違いなく寄与しうる臨床徴候はまったく観察されなかった。しかし、子ウシが活発にBRSVを排出する期間と同時に、11頭の対照のうち7頭に関して、臨床徴候として、過剰な透明な鼻分泌物が記録された。本研究中、ワクチン接種群に関しては、臨床徴候は記録されなかった。子ウシいずれにおいても、不都合なワクチン接種後反応は観察されなかった。結論先行する報告は、若い食肉牛/肥育素牛において、BRSVの排出予防における補助として、ウシ鼻気管炎-ウイルス下痢症-パラインフルエンザ3-呼吸器合胞体ウイルスワクチン修飾生ウイルスのBRSV分画の有効性を立証する。この組み合わせ産物のBRSV分画の有効性および抗原性は、以下のように証明される:1ウイルスBRSV単離研究によって、1用量のワクチンの投与が、対照における100感受性11/11に比較した際、ワクチン接種子ウシにおける8619/22の防御を提供することが明らかになった予防可能分率=0.8636。2対照群に比較した際の、ワクチン接種群の排出頻度の有意な減少。対照子ウシは、ワクチン接種動物よりも、5,773日より長くBRSVを排出した。3対照群に比較した際のワクチン接種群のBRSVに対する抗体力価の有意な増加。実施例7-IBRHBV-1有効性プロトコルこの実施例は、六価MLVワクチンのBHV-1ウイルス分画がIBRの予防に役立つことを実証する。材料および方法六価修飾した生ウイルスワクチンを上記のように調製する。つまり、BHV-1Cooper株、BVDV-1aSinger株、BVDV-1bTGCA株、BVDV-2125、PI3ReisingerSF-4、およびBRSVN375をTVL-BK細胞株第20継代中で増殖させる。個々の分画を第10継代で採取し、そして六種産物とともにブレンドした。BHV-1欠失プラセボを有効性シリーズと平行して作製する。BHV-1欠失プラセボは、有効性シリーズと同じBVDV-1a、BVDV-1b、BVDV-2、PI3およびBRSV採取バッチを含有する。BHV-1構成要素の代わりに培地を用いて、有効性シリーズおよびBHV-1欠失プラセボ間で同等の体積を維持する。滅菌希釈剤を使用してワクチンおよびBHV-1欠失プラセボの両方を再水和する。およそ3~4ヶ月齢の商業的な若い食肉牛/肥育素牛を上記のようにランダム化し、次いで駆虫し、パスツレラ病、マイコプラズマ病、および黒脚病に対してワクチン接種する。全ての子ウシは、水、沿岸性バミューダ乾草、および抗コクシジウム剤を含有するが、抗生物質を含有しないペレット状餌配給に自由選択でアクセス可能である。子ウシに給餌した後、干し草利用可能性は後で制限できる。約20個以上のワクチンおよび10頭以上の対照の子ウシをこの単一レベルの研究に使用する。曝露前に、2群の子ウシを別々だが、同等の囲い中に維持する。次いで子ウシを曝露2日前第-2日に1つの囲い中で混合する。ランダム化子ウシのマッチランダム化スキームを用いて、子ウシを2つの処置群ワクチン接種またはプラセボワクチン接種対照に割り当てることができる。例えば、傾斜台に進入する一連の3頭の子ウシを、2:1の比で2つの処置群にランダム化する。血清学的評価のために、最初に血液を抜き取る際に、バケツからランダムに取った耳標を、子ウシを識別するために使用する。ブラインド化ブラインド化された職員は、対照またはワクチン接種動物の識別の知識を持たず、すべての野外および実験室職員は、記録者を除いて研究の間、ブラインド化される。転帰この研究についての一次転帰は、IBRと関連する鼻病変の差である。これは鼻病変の存在または非存在として定義する。鼻病変の期間および重症度、鼻孔からのBHV-1の単離、および体温を含むIBRの他の臨床兆候は全て二次転帰とみなす。鼻病変スコア自体を、順序を示すカテゴリーとして評価する。IBRの目に見える鼻粘膜特徴の病変の期間および重症度の両方が評価のための基準として役立つ。呼吸器疾患および鼻排出の臨床的兆候もまた、曝露に対する耐性影響を受けないまたは感受性影響を受けるを決定するための基準として使用されてもよい。曝露前の平均温度ベースラインを共変量として用いて個体の毎日の直腸温度を定期的に分析する。研究の開始時に実験単位が2以上のBHV-1SN力価を有する場合、それらを研究から除外する。有効性シリーズまたはBHV-1欠失プラセボでのワクチン接種直前第-28日から第-21日に子ウシから血液試料を採取する。同様に血液試料を曝露の直前第0日および曝露の14日後第14日に再び採取する。試料採取フレーム、データ収集、および臨床的観察鼻試料を採取し、第0日~第14日に目に見える鼻粘膜の病変およびIBRの臨床徴候について子ウシを観察する。第-2日~第14日に各々の子ウシについて直腸温度を測定する。結果因子は、IBR、直腸温度、ウイルス単離、抗体力価およびIBRの臨床徴候と一致する目に見える鼻粘膜の病変を含む。IBRの肉視的鼻病変はRosner1968により記載されている。観察される典型的な病変としては、出血を伴う鼻腔の炎症および浮腫ならびに粘液内層に対するフィブロネクチン滲出物の付着が挙げられる。時々、壊死滲出物は下層組織から分離される偽膜性滲出物を生成する鼻腔内にその壊死滲出物は非常に広範に及ぶことがRosnerにより報告されている。Rosnerはまた、それらの病理学的所見がIBRの推定診断をするのに高度の信頼性を与えると報告している。鼻病変スコアは、確立された基準、およびワクチン接種が、病変が観測される期間に対する軽減効果を有するかどうかを実証するのに分析される期間データに従って割り当てられ得る。直腸温度評価、ウイルス単離、抗体力価、および統計的方法は以前の実施例に記載されている。IBRの臨床徴候は、Rosner1968により記載され、限定されないが、呼吸促迫、食欲不振、発熱、咳嗽、鼻汁、体重減少および病態が挙げられる。臨床徴候は、曝露の2日前、曝露の日、および曝露後14日間に記録される。IBRの臨床徴候の観察はデータの分析の間に考慮され得るが、それらの徴候はまた、商業的な子ウシに一般に見出される多くの他の呼吸器疾患の指標でもあり得るため、一次転帰とみなされない。統計的分析:Mann-WhitneyU検定を用いて抗体力価の群比較を分析した。上記のようにMS-Windows登録商標用のSASLearningEditionv2.0を使用して全ての統計的分析を実施した。実施例7a-IBRHBV-1有効性研究この研究の結果は、ウシ鼻気管炎の修飾された生ウシヘルペスウイルス-1BHV-1分画-ウイルス性下痢症-パラインフルエンザ3-呼吸器合胞体ウイルスワクチン、修飾された生ウイルスが、ウシ伝染性鼻気管炎IBRの減少に役立つ抗原性があり、有効であることを実証する。2用量のワクチンを22頭のBHV-1血清陰性子ウシに投与した。2用量の生成物に頭敵するプラシボワクチンを用いて12頭の血清陰性対照子ウシにワクチン接種した。全てのウシにBHV-1を鼻腔内に曝露した。ワクチン接種により、高いBHV-1抗体力価ならびにIBRと関連する鼻病変の期間および重症度の減少が生じた。ワクチン接種はまた、典型的に子ウシにおけるBHV曝露の後に続く排出および発熱反応の期間を減少させた。したがって、5×103/用量の最小のBHV-1TCID50がこのワクチンのBHV-1分画について確立される。材料および方法子ウシのワクチン接種および曝露:34頭のBHV-1陰性子ウシを選別路地中で混合した。CVB-Biometricsによって提供されるマッチセットランダム化スキームを用いることによって、各々の子ウシをランダムに集める際にゲートで分け、3頭の子ウシが同時に、路地を通じて2つの群群A-ワクチン接種、または群B-プラセボワクチン接種対照の一方に分けた。21頭の子ウシを1用量のウシ鼻気管炎-ウイルス下痢症-パラインフルエンザ3-呼吸器合胞体ワクチン、修飾された生ウイルスでワクチン接種した。各ワクチン接種動物に、第0日、首の左側への皮下注射によって、2ml用量の産物を投与した。12頭の子ウシには、産物マッチプラセボワクチンBHV-1欠失をワクチン接種した。鼻スワブをBHV-1ウイルス単離のために採取し、血液をBHV-1に対する感受性の血清学的確認のために全ての子ウシから抜いた。13日目に、ワクチンおよび対照子ウシに、首の右側への皮下注射によって、2回目の2ml用量の有効性シリーズおよび産物マッチプラセボを与えた。曝露2日前、ワクチン接種および対照群の両方を、曝露前臨床観察の目的のため、そしてベースライン体温読み取りを得るために混合した。ワクチン接種および対照子ウシを、曝露15日後、USDA-APHIS-CVB、Coopers株、ロット番号05-08、充填日-2005年10月26日により提供される4ml2ml/鼻孔のBHV-1曝露ウイルスで2回目のワクチン接種をした。CVBにより曝露ウイルス力価を108.2TCID50/2mLであると決定した。曝露ウイルスを曝露直前に滴定し、108.0TCID50/4mLであると決定し、再び曝露直後に、107.4TCID50/4mLであると決定した。曝露ウイルスは曝露プロセスの間中、冷却を維持した。ワクチン接種の日、曝露の日、曝露14日後に血液試料を採取した。一定のウイルス減少血清中和法によってウシヘルペスウイルス抗体力価を決定した。ワクチン接種の日、曝露の日および曝露後連続して14日間、鼻スワブを採取した。各子ウシについて曝露前2日、曝露の日および曝露後連続して14日間、直腸温度を毎日記録した。臨床的観察を行い、鼻病変スコアを割り当てた。BHVにより引き起こされる肉視的病変は、S.F.Rosner,JAVMAVol153,No.12,1968年12月,p.1631-1638に記載されている。観測される典型的な病変としては、出血を伴う鼻腔の炎症および浮腫ならびに粘液内層に対するフィブロネクチン滲出物の付着が挙げられる。時々、壊死滲出物が、下層組織から分離される偽膜性滲出物を形成する鼻腔にその壊死滲出物が非常に広範に及ぶことはRosnerにより報告されている。Rosnerはまた、それらの病理学的所見が、IBRの推定診断をする際に高度の信頼性を与えることを報告している。以下に記載した基準に従って鼻病変スコアを割り当てた:ワクチン接種および対照群の両方が、識別する特徴が耳標の数字のみである状態で混合されることに起因して観測者はブラインド化された。研究の間中、観測者は、個々の試験動物のワクチン接種状態に関する知識を与えられなかった。実験職員は子ウシのワクチン接種状態の知識を有さなかった。BHV-1検出:液体Stuart培地中のBBLCultureSwab登録商標を用いて両方の鼻孔をスワブすることによって子ウシから鼻スワブを採取した。細胞培養を高めるPCR技術と共にBHV-1特異的CPEの視覚的観察を利用して、採取した試料中にBHV-1を検出した。つまり、培地中のTVL-BK細胞上で滅菌濾過0.2μmにより試料を処理した。37°C±2°Cおよび5±1CO2にて4日間、培養物をインキュベートした。培養物をBHV-1特異的CPEについて観察し、結果を記録した。全ての培養物試料および-の両方のCPEからの上清を、従来のRTqPCR方法および以下のプローブ/プライマーセット:フォワードプライマー:CCATGTTAGCGCTCTGGAACC配列番号16リバースプライマー:CGTCTTTACGGTCGACGACTCC配列番号17TaqManMGBプローブ:ACGGACGTGCGCGAA配列番号18を使用してBHV-1の存在/非存在について個々にアッセイした。社内でプローブ/プライマーセットの特異性を確認し、PI3、BRSV、BVDV1a、BVDV1bまたはBVDV2と交差反応しなかった。AppliedBiosystems7500においてTaqman登録商標ベースのアッセイを使用してRTqPCRアッセイを実施した。BHV-1特異的CPE陽性であった全ての試料はまた、PCR陽性でもあった。PCRアッセイにより、BHV-1特異的CPEについて陰性であり、BHVについて陽性である8個の試料が存在した。これは、PCRベースのアッセイが、BHV-1特異的CPEの観察に基づいたアッセイよりわずかに高い感受性であることを示す社内での研究と一致する。最初の培養後にBHV-1について陰性であった試料を継代培養し、CPEについて観察した。継代培養した流体からの上清を、同じ方法に従ってBHV-1の存在/非存在についてアッセイした。鼻病変:研究の一次転帰はBHV-1と関連する鼻病変の相違であった。予防された分率を、個々の子ウシにおける病変の存在または非存在に基づいてTannerおよびMorgan1993に記載されているように算出した。影響を受けた子ウシにおける病変の重症度の推定される条件付きの軽減した分画は、B.J.Fergen,EstimatinganInterventionEffectonOutcomeSeverity,USDA,CVBに従って決定した。病変の期間病変を観測した最初から最後の日までの日数を、各々の影響を受けた子ウシについて決定し、2つの群の間の病変の期間の相違を推定した。体温:研究の二次転帰は、ワクチン接種した子ウシと対照群の子ウシとの間の体温の相違であった。1~14日間の直腸温度の分析を、群、日および群日相互作用についての項を含み、共変量としてベースライン温度を使用する分散の反復測定分析ANOVAを用いて行った。群日相互作用は有意p<0.5であったので、ワクチン接種した群を各時点についての群の簡単な作用により対照と比較した。それらの簡単な作用は群日相互作用から得た。ウイルス排出:研究の別の二次転帰は、ワクチン接種した子ウシと対照子ウシとの間の曝露後のBHV排出の相違であった。予防された分率を、個々の子ウシからの鼻試料中のBHVの単離および同定に基づいてTannerおよびMorgan1993に記載されるように算出した。排出期間BHV-1が検出された最初から最後の日までの日数を、各々の影響を受けた子ウシについて決定し、2つの群の間の排出期間の相違を推定した。Windows登録商標用のSPSSバージョン17を使用して全ての統計的分析を実施した。結果血清中和抗体力価:この研究において全ての子ウシはワクチン接種前に1:2未満のBHV-1血清中和抗体力価を有した。対照群における全ての12頭の子ウシは依然として曝露の日に血清陰性であった1:2未満の抗体力価。22頭の子ウシのうち21頭は、曝露の日までに1:2以上の力価を有する血清変換を有した1:4の群平均力価。曝露後14日までに全ての子ウシはBHV-1に対する血清変換を有した平均ワクチン接種力価>256、平均対照力価128。鼻病変:12頭全ての対照子ウシ100および22頭のうちの20頭のワクチン接種した子ウシ91において鼻病変を観測した。観測される鼻病変についての推定される予防分率は9であった。影響を受けた子ウシの重症度についての推定される軽減した分率は9095CI:72、100であった。影響を受けた対照の中での病変は影響を受けたワクチン接種した中より重症であった。鼻病変を観測した平均期間はワクチン接種について6日および対照について10.5日であった。2つの群の間の期間の推定される変化は4.5日であった。直腸温度:共変量として曝露前の平均温度を使用した曝露後の直腸温度分析により、統計的有意性p<0.05の群および日の効果による群が明らかにされた。その分析により、対照群の温度は、曝露後3~9日および11日にワクチン接種した群と比較してベースラインから有意p<0.05に増加することが明らかにされた。BHV-1単離:対照およびワクチン接種した子ウシの全てはこの研究の曝露後の段階の間、BHV-1を排出した。ワクチン接種した群からのBHV-1単離の平均期間は6日であり、対照について10.5日であった。排出期間の推定した変化は4.5日であった。BHV特異的CPEを示した全ての試料をPCRにより確認した。しかしながら、CPEがまだ観察されなかった8個の試料が存在し、それらは弱い陽性PCR信号を有した。それらの8個の試料はこの分析について陽性として含まれなかった。BHV-1の臨床徴候:曝露前の連続した2日間、曝露の日および曝露後連続した14日間、呼吸器疾患の臨床徴候について各動物を検査した。BHV-1感染に起因し得る臨床徴候を観察し、記録した。いずれの子ウシにおいても有害なワクチン接種後の反応は観測されなかった。結論先行の報告は、若い食肉牛/肥育素牛におけるBHV-1に起因する疾患の減少に役立つ、BHV-1分画のウシ鼻気管炎-ウイルス性下痢症-パラインフルエンザ3-呼吸器合胞体ウイルスワクチン、修飾された生ウイルスの有効性を実証する。この組み合わせた生成物のBHV-1分画の有効性および抗原性は以下により証明される:1対照群と比較してワクチン接種した群における鼻病変の重症度および期間の減少。2対照群と比較してワクチン接種した群における発熱の減少。3対照群と比較してワクチン接種した群のBHV-1に対する血清変換。実施例8-PI3有効性プロトコルこの実施例は、六価MLVワクチンのPI3分画がPI3により引き起こされる疾患の予防に役立つことを実証する。材料および方法六価の修飾された生ウイルスワクチンは上記のように調製する。PI3欠失プラセボは有効性シリーズと共に生成する。PI3欠失プラセボは、有効性シリーズとして同じBHV-1、BVDV-1b、BVDV-2、BVDV-1a、およびBRSV収集バッチを含む。培地は、有効性シリーズとPI3欠失プラセボとの間で等体積を維持するためにPI3成分と置き換える。滅菌希釈剤を使用して、ワクチンおよびPI3欠失プラセボの両方を再水和する。ほぼ3~4ヶ月齢の商業的な若い食肉牛/肥育素牛を上記のようにランダム化し、次いで駆虫し、パスツレラ病、マイコプラズマ病、および黒脚病に対してワクチン接種する。全ての子ウシは、水、沿岸性バミューダ乾草および抗コクシジウム剤を含有するが、抗生物質を含有しないペレット状餌配給に自由選択でアクセス可能である。子ウシに給餌した後、干し草利用可能性は後で制限できる。約20頭以上のワクチン接種した子ウシおよび10頭以上の対照子ウシをこの単一レベル研究において使用する。2つの群の子ウシを曝露前に別々だが、同等の囲いに維持する。次いで曝露の2日前第-2日に子ウシを1つの囲いに合わせる。ランダム化子ウシのマッチランダム化スキームを用いて、子ウシを2つの処置群ワクチン接種またはプラセボワクチン接種対照に割り当てる。例えば、傾斜台に進入する一連の3頭の子ウシを、2:1の比で2つの処置群にランダム化できる。血清学的評価のために、最初に血液を抜き取る際に、バケツからランダムに取った耳標を、子ウシを識別するために使用する。ブラインド化された職員は、対照またはワクチン接種動物の識別の知識を持たない。すべての野外および実験室職員は、記録者を除いて研究の期間の間、ブラインド化される。転帰この研究についての一次転帰は、曝露後のPI3ウイルスの鼻排出の予防である。これは研究過程の間に全ての子ウシの鼻孔から毎日採取した鼻試料中のPI3の存在または非存在により決定される。他の予測される二次転帰は、PI3を排出する子ウシにおけるPI3感染の減少した臨床徴候、発熱の減少および排出器官の減少を含む。実験単位は、それらが研究の開始時に2以上のPI3力価を有する場合、この研究から除外する。試料採取フレーム、データ収集、および臨床観察有効性シリーズまたはPI3欠失プラセボのワクチン接種直前-28日~-21日に子ウシから血液試料を収集する。曝露直前に0日および再び曝露14日後14日に血液試料をまた収集する。示差WBC数用の血液試料を、第-2日~少なくとも第14日まで収集する。全ての試料をEDTAVacutainer登録商標管中に収集し、DrewScientific、Hemavet950示差WBC計数装置を使用して計数を実施する。第-2日~少なくとも第14日に鼻スワブをウイルス単離のために採取する。ワクチン接種および対照群によるPI3の排出を、曝露後14日間、毎日決定する。PI3の検出は、曝露に対する耐性影響を受けていないまたは感受性影響を受けたを決定するための一次基準として役立つ。PI3曝露後にワクチン接種がPI3の排出を予防するかどうかを決定するために影響を受けた群と影響を受けていない群を比較する。呼吸器疾患の臨床徴候は、曝露に対する感受性または耐性を決定するための二次基準として役立つ。ワクチン接種がこのパラメータに対して軽減した作用を有するかどうかを決定するために排出期間PI3が個々のウシから検出された日数を分析する。共変量として曝露前の平均温度ベースラインを使用して全ての個体の毎日の直腸温度を分析する。PI3検出:液体Stuart培地と共にBBLCultureSwab登録商標を用いて両方の鼻孔をスワブすることによって曝露の日および曝露後連続して14日に各子ウシから鼻スワブを採取する。本明細書に記載されるPI3特異的プローブ/プライマーセットを使用したリアルタイムPCRによりPI3の存在について試料由来の培地をアッセイする。排出期間:PI3が個々の子ウシの鼻スワブ中で検出される日数として排出期間を定義する。ワクチン接種が、PI3が鼻試料中に検出される期間に対して軽減した作用を有するかどうかを決定するために収集した期間データを分析する。直腸温度:第-2日から第14日曝露の2日前、曝露の日、および曝露後14日の各動物についての毎日の直腸温度を記録する。第-2日~第0日についての温度値を平均化することにより曝露前の平均を各動物について算出する。共変量としてベースラインを使用して毎日の温度を分析する。抗体力価:ワクチン接種の日、0日および研究の14日に各動物についての一定のウイルス減少血清法によって血清中和抗体力価を決定する。臨床徴候:PI3の臨床徴候はBrysonら1989により記載されている。臨床徴候としては、限定されないが、鈍麻、呼吸促迫、発熱、咳嗽、偶発的および/または不快な肺音が挙げられる。曝露の2日前、曝露の日および曝露の14日後に臨床徴候を記録する。データの分析の間、PI3の臨床徴候の観察を考慮するが、これらの徴候は一般に商業的な子ウシに見出される多くの呼吸器疾患を示し得るという事実に起因して一次転帰とみなさない。実施例8a-PI3有効性研究この研究の結果は、ウシ鼻気管炎の修飾された生ウシパラインフルエンザ3ウイルスPI3分画-ウイルス性下痢症-パラインフルエンザ3-呼吸器合胞体ウイルスワクチン、修飾された生ウイルスが、食肉牛/肥育素牛におけるウシパラインフルエンザ3ウイルスの排出の予防に役立つ抗原性があり、有効であることを実証する。20頭のPI3血清陰性子ウシに2用量のワクチンを投与した。10頭の血清陰性対照子ウシを、産物マッチプラセボワクチンでワクチン接種した。全ての子ウシにPI3を鼻内に曝露した。ワクチン接種により、曝露後、増加したPI3抗体力価および予防されたPI3排出が生じた。従って、6×104/用量の最小PI3-TCID50をこのワクチンのPI3分画について確立した。材料および方法子ウシのワクチン接種および曝露:三十30頭のPI3陰性子ウシを選別路地中で混合した。マッチセットランダム化スキームを用いることによって、各子ウシはランダムに集められる際にゲートで分けられ、3頭の子ウシが同時に、路地を通じて2つの群A群-ワクチン接種またはB群-プラセボワクチン接種対照の一方に分けられた。21頭の子ウシを1用量のウシ鼻気管炎-ウイルス下痢症-パラインフルエンザ-3-呼吸器合胞体枠林、修飾した性ウイルスでワクチン接種した。各ワクチン接種動物に、0日、首の左側への皮下注射によって、2ml用量の産物を投与した。10頭の子ウシには、産物マッチプラセボワクチンPI3欠失をワクチン接種した。PU3ウイルス単離のために鼻スワブを収集し、PI3に対する感受性の血清学的確認のために全ての子ウシから血液を抜き取った。25日に、ワクチン接種した子ウシおよび対照子ウシに、首の右側への皮下注射によって、2回目の2ml用量の有効性シリーズおよび産物マッチプラセボを与えた。曝露2日前、ワクチン接種および対照群の両方を、曝露前臨床観察の目的のため、およびベースライン体温読み取り値を得るために混合した。ワクチン接種した子ウシおよび対照子ウシを、2回目のワクチン接種の15日後に、USDA-APHIS-CVB、Reisinger株、ロット番号05-07、充填日2005年6月26日により提供される4ml2ml/鼻孔のPI3曝露ウイルスで曝露した。曝露ウイルス力価をCVBにより108.2TCID50/2mLであると決定した。曝露直前に曝露ウイルスを滴定し、108.3TCID50/4mLであると決定し、再び曝露直後に108.2TCID50/4mLであると決定した。曝露プロセスの間中、曝露ウイルスを冷却して維持した。ワクチン接種の日、ワクチン接種の6日後、曝露の日、曝露の6日後および曝露の14日後に血液試料を採取した。ウシパラインフルエンザ3ウイルス抗体力価を、一定のウイルス減少血清中和法により測定した。ワクチン接種の日、曝露の日および曝露後連続して10日間、鼻スワブを採取した。曝露前の2日間、曝露の日、および曝露後連続して14日間、各ウシについて直腸温度を毎日記録した。臨床観察を行った。識別する特徴が耳標番号のみであるワクチン接種および対照群の両方を混合することに起因して観察はブラインド化した。研究全体にわたって、観察者が個々の試験動物のワクチン接種状態の知識を得る時間はなかった。検査室の職員はウシのワクチン接種状態の知識を有さなかった。PI3検出:液体Stuart培地中のBBLCultureSwab登録商標を用いて両方の鼻孔をスワブすることによって子ウシから鼻スワブを採取した。細胞培養を高めるPCR技術と共にPI3特異的CPEの視覚的観察を利用して、採取した試料中にPI3を検出した。つまり、培地中のTVL-BK細胞上で滅菌濾過0.2μmにより試料を処理した。37°C±2°Cおよび5±1CO2にて4日間、培養物をインキュベートした。培養物をPI3特異的CPEについて観察し、結果を記録した。全ての培養物試料および-の両方のCPEからの上清を、従来のRTqPCR方法および以下のプローブ/プライマーセット:フォワードプライマー:GGAGACCAAGACCAAGGAGATG配列番号13リバースプライマー:CGTCTGCCCATGCATAAGG配列番号14TaqManMGBプローブ:ACCTCGGTCATCCATAG配列番号15を使用してBHV-1の存在/非存在について個々にアッセイした。この方法は、A.HuらDevelopmentofareal-timeRT-PCRassayfordetectionandquantitationofparainfluenzavirus3.A.Hu,M.Colella,P.Zhao,F.Li,J.S.Tam,R.Rappaport,S.M.Cheng.JournalofVirologicalMethods,1302005145-148の研究に基づいて開発された。プローブ/プライマーセットの特異性を社内で確認し、BHV、BRSV、BVDV1a、BVDV1bまたはBVDV2と交差反応しなかった。AppliedBiosystems7500でTaqman登録商標ベースのアッセイを使用してRTqPCRアッセイを実施した。PI3特異的陽性であった全ての試料はまた、PCR陽性でもあった。PCRアッセイにより、PI3特異的CPEについて陰性であり、PI3について陽性である17個の試料が存在した。これは、PCRベースのアッセイが、PI3特異的CPEの観察に基づくアッセイより感受性があることを示す社内での研究と一致する。最初の培養後、PI3について陰性であった試料をサブクローニングし、CPEについて観察した。サブクローニングした流体からの上清を、同じ方法に従ったPI3の存在/非存在についてアッセイした。統計的分析:このワクチンのPI3分画の効果は、曝露後にPI3を排出した対照の割合と比較してPI3を排出するワクチン接種の割合に主に基づいた。TannerおよびMorgan1993に記載されているように予防可能な分画を算出した。通常のスケールの力価データの群比較をMann-WhitneyU検定によって比較した。曝露後の1~14日間の温度の分析を、分散の反復測定ANOVAを用いて行った。Windows登録商標用のSASを使用して全ての統計的分析を実施した。結果血清中和抗体力価:本研究のすべての子ウシは、<1:2のワクチン接種前PI3血清中和抗体力価を有した。ワクチン接種した子ウシのどれも、ワクチンに対する既往の免疫反応を示さなかった。曝露日までに、ワクチン接種群は、1:16の平均PI3力価を有し、これは対照群<1:3のものより有意にp≦.05大きかった。この研究過程の間、対照群の1頭の子ウシ、子ウシ7は1:16の力価を発生した。この子ウシはまた、曝露に対する既往反応を示し、曝露後6日に1:128の力価を有した。他の9頭の対照子ウシは曝露の日に血清陰性であり、曝露に対する既往反応を示さなかった。PI3単離:この研究における全ての10頭の対照子ウシは、この研究の曝露段階の後、PI3を排出した。20頭のワクチン接種のうちの4頭のみがこの時間の間にPI3を排出した。これにより、0.80の予防可能な分画が生じる。PI3特異的CPEを示す全ての試料をPCRにより確認した。しかしながら、CPEがまだ観察されなかった17個の試料が存在し、それらは弱い陽性PCR信号を有した。これらの17個の試料はこの分析についてPI3陽性として含まれる。直腸温度:共変量として曝露前の平均温度を使用した曝露後の直腸温度分析により、群間で統計的に有意な差は現れなかった。このデータのさらなる分析は追跡しなかった。PI3の臨床徴候:曝露前2連続日、曝露の日および曝露後14連続日の間、呼吸器疾患の臨床徴候について各動物を試験した。PI3感染に明らかに起因し得る臨床徴候は観察されなかった。いずれの子ウシにおいてもワクチン接種後の有害な反応は観察されなかった。結論以前の報告は、若い食肉牛/肥育素牛のPI3の排出の予防に役立つとしてPI3分画ウシ鼻気管炎-ウイルス下痢症-パラインフルエンザ3-呼吸器合胞体ウイルスワクチン、修飾生ウイルスの効果を実証している。この組み合わせた生成物のPI3分画の効果および抗原性を以下により証明する:1ウイルスPI3単離研究により、2ワクチンの用量の投与が、対照予防可能な分画=0.80における10010/10感受性と比較して、ワクチン接種した子ウシにおいて8016/20防御を与えたことが明らかになった。2対照群と比較してワクチン接種した群のPI3に対する抗体力価の顕著な増加。実施例9-BVDV-2有効性プロトコルこの実施例は、六価MLVワクチンのBVDV2型分画が、BVDV-2により引き起こされる疾患の予防に役立つことを実証する。材料および方法六価修飾生ウイルスワクチンを上記のように調製する。BVDV-2欠失プラセボを有効性シリーズと共に生成する。BVDV-2欠失プラセボは、有効シリーズとして同じBHV-1、BVDV-1b、BVDV-1a、PI3およびBRSV収集バッチを含有する。有効性シリーズとBVDV-2欠失プラセボとの間の等体積を維持するために培地をBVDV-2成分と置き換える。滅菌希釈剤を使用して、ワクチンおよびBVDV-2欠失プラセボの両方を再水和する。約3~4ヶ月齢の商業的な若い食肉牛/肥育素牛を上記のようにランダム化し、次いで駆虫し、パスツレラ病、マイコプラズマ病、および黒脚病に対してワクチン接種する。全ての子ウシは、水、沿岸性バミューダ乾草、および抗コクシジウム剤を含有するが、抗生物質を含有しないペレット状餌配給に自由選択でアクセス可能であった。子ウシに給餌した後、干し草利用可能性は後で制限できる。約20頭以上のワクチン接種した子ウシおよび10頭以上の対照子ウシをこの単一レベル研究に使用する。曝露前に2つの群の子ウシを別々だが同等の囲いに維持する。次いで曝露の2日前第-2日に子ウシを1つの囲いに混合する。ランダム化、ブラインド化、および転帰ランダム化、ブラインド化、および転帰を実施例10に記載する。試料採取フレーム、データ収集、および臨床観察有効性シリーズまたはBVDV-2欠失プラセボのワクチン接種直前第-28日~第-21日、子ウシから血液試料を収集する。曝露直前に第0日、そして再び、曝露14日後第14日、血液試料をまた収集する。示差WBC数用の血液試料を、第-2日~少なくとも第14日まで収集する。全ての試料をEDTAVacutainer登録商標管中に収集し、DrewScientific,Hemavet950示差WBC計数装置を使用して計数を実施する。ウイルス単離用の鼻スワブを第-2日~少なくとも第14日に単離する。転帰変数には、白血球減少、発熱、鼻ウイルス排出、ウイルス血症、中和抗体生産および臨床徴候が含まれる。一次転帰は、BVDV-2曝露後の対照と比較して、ワクチン接種群におけるBVDV-2により誘発される白血球減少症の予防である。白血球減少:曝露後の数の減少が存在するかどうかを決定するためにWBC数データを分析する。第-2日~第0日間のWBC数を平均化することにより各動物について曝露前の平均を計算する。曝露前の平均に対する毎日のWBC数の比を、観察者の裁量で、曝露後1~14日またはそれより長期間、計算する曝露前の比率としてWBC数。比率が25減少する場合、個体は白血球減少症と分類される。排出:曝露の日および曝露後14連続日に、液体Stuart培地を含むBBL培養スワブを用いて両方の鼻孔を拭き取ることによって鼻スワブを各子ウシから採取する。採取の日に、0.2μmフィルターを通して試料を滅菌濾過により処理する。次いでTVL-MDBK約80コンフルエントを含有する12ウェルプレートの各ウェルを試料とインキュベートする。1つのウェル/プレートは未接種の状態にし、陰性対照として役立てる。プレートの1つのウェルは、曝露ウイルスの希釈物を接種し、陽性対照として役立てる。プレートを35~39°Cの温度にて2~4日間、3~7のCO2で接種する。各ウェルから培地を収集し、-18~-22°Cに保存する。典型的なBVDV-1a細胞変性形態を示すウェルからの培地をさらに処理して、感染因子の識別を決定する。培養陽性である個体を排出と分類する。ウイルス血症:血液試料由来のバフィーコートを使用して、TVL-MDBK約80コンフルエントを含有する12ウェルプレートの各ウェルを接種する。1つのウェル/プレートは未接種の状態にし、陰性対照として役立てる。プレートの1つのウェルは、曝露ウイルスの希釈物を接種し、陽性対照として役立てる。プレートを35~39°Cの温度にて2~4日間、3~7のCO2で接種する。各ウェルから培地を収集し、-18~-22°Cに保存する。典型的なBVDV-2細胞変性形態を示すウェル由来の培地をさらに処理して、感染因子の識別を決定する。BVDV-2について培養陽性である個体をウイルス血症とみなす。抗体力価:開始ワクチン接種の日第-21日、曝露の日第0日、および研究の結果において、各動物についての一定のウイルス減少血清法によってBVDV-2に対する血清中和抗体力価を決定する。特別概略A-17、ウシウイルス性下痢症ウイルス2型中和抗体の力価に従って抗体力価を決定する。≧8の抗体力価を発展させる動物をBVDV-2に血清変換したと見なす。臨床徴候:BVDV-2の臨床徴候には、限定されないが、発熱、白血球減少症、呼吸困難、鼻汁および軟便が含まれる。BVDV感染の全ての関連する臨床徴候を、曝露の2日前、曝露の日および曝露後14日間に記録する。データ分析の間のBVDV-2の臨床徴候の観察を考慮するが、一次転帰とみなさない。なぜなら、それらの徴候は、このクラスの畜牛において一般に遭遇する他の疾患を示す場合があるからである。実施例9A-BVDV-2有効性研究この研究の結果により、ウシ鼻気管炎の修飾生ウシウイルス性下痢症ウイルス-2型BVDV2分画-ウイルス性下痢症-パラインフルエンザ3-呼吸器合胞体ウイルス、修飾生ウイルスは抗原性であり、BVDV2により引き起こされる疾患の予防に役立つことが実証される。1用量を20頭のBVDV血清陰性子ウシに投与した。10頭の血清陰性対照子ウシに、1用量の産物マッチプラセボワクチンをワクチン接種した。全ての子ウシにBVDV2株1373を鼻腔内に曝露した。ワクチン接種により、高いBVDV2抗体力価<2の平均~24、曝露後の低い死亡率7/10の対照の死、0/20のワクチン接種した死が得られた。したがって、3×103TCID50/用量の最小のBVDV2-TCID50を、このワクチンのBVDV2分画について確立する。実施例10-BVDV-1A有効性プロトコルこの実施例は、六価MLVワクチンのBVDV1a型分画が、BVDV-1aにより引き起こされる疾患の予防に役立つことを実証する。材料および方法六価修飾生ウイルスワクチンを上記のように調製する。BVDV-1a-欠失プラセボを有効性シリーズと共に生成する。BVDV-1a欠失プラセボは、有効性シリーズとして同じBHV-1、BVDV-1b、BVDV-2、PI3およびBRSV収集バッチを含有する。有効性シリーズとBVDV-1a欠失プラセボとの間で同等の体積を維持するために培地をBVDV-1a成分と置き換える。滅菌希釈物を使用して、ワクチンおよびBVDV-1a欠失プラセボの両方を再水和する。約3~4ヶ月齢の商業的な若い食肉牛/肥育素牛を上記のようにランダム化し、次いで駆虫し、パスツレラ病、マイコプラズマ病および黒脚病に対してワクチン接種する。全ての子ウシは、水、沿岸性バミューダ乾草、および抗コクシジウム剤を含有するが、抗生物質を含有しないペレット状餌配給に自由選択でアクセス可能であった。子ウシに給餌した後、干し草利用可能性は後で制限できる。約20頭以上のワクチン接種子ウシおよび10頭以上の対照子ウシをこの単一レベルの研究に使用する。曝露前に2群の子ウシを別であるが、同等の囲いに維持する。次いで子ウシを曝露の2日前第-2日に1つの囲いに混合する。ランダム化子ウシのマッチしたランダム化スキームを使用して、子ウシを2つの処置群ワクチン接種またはプラセボワクチン接種した対照に割り当てることができる。例えば、傾斜台に進入する一連の3頭の子ウシを、2:1の比で2つの処置群にランダム化できる。血清学的評価のために、最初に血液を抜き取る際に、バケツからランダムに抜き取った耳標を使用して子ウシを識別する。ブラインド化ブラインド化された職員は、対照またはワクチン接種動物の同一性の知識を持たなかった。すべての野外および実験室職員記録者を除くは、研究の期間、ブラインド化される。転帰一次転帰は曝露後の白血球減少症である。白血球減少症はベースラインWBC数から25減少と定義する。ワクチンの効果をさらに支持する他の転帰には、鼻排出、ウイルス血症、発熱、抗体産生およびBVDVの臨床徴候が含まれる。実験単位が研究の開始時にBVDV-1力価≧2を有する場合、この研究から排除する。試料採取フレーム、データ収集、および臨床観察有効性シリーズまたはBVDV欠失プラセボのワクチン接種直前第-28日~第-21日、子ウシから血液試料を収集する。曝露直前に第0日、そして再び、曝露14日後第14日、血液試料をまた収集する。示差WBC数用の血液試料を、第-2日~少なくとも第14日まで収集する。全ての試料をEDTAVacutainer登録商標管中に収集し、DrewScientific,Hemavet950示差WBC計数装置を使用して計数を実施する。ウイルス単離用の鼻スワブを第-2日~少なくとも第14日に単離する。転帰変数には、白血球減少、発熱、鼻ウイルス排出、ウイルス血症、中和抗体生産および臨床徴候が含まれる。一次転帰は、BVDV-1a曝露後の対照群と比較して、ワクチン接種群におけるBVDVにより誘発される白血球減少症の予防である。白血球減少、排出、およびウイルス血症:WBC数データを実施例9に記載されるように分析し、液体Stuart培地を含むBBLCultureSwab登録商標を用いて両方の鼻孔を拭き取ることによって曝露の日および曝露後14連続日に鼻スワブを各子ウシから採取して、同様に実施例9に記載されるように排出を決定する。血液試料由来のバフィーコートを使用して、TVL-MDBK約80コンフルエントを含有する12ウェルプレートの各ウェルを接種し、実施例9に記載されるようにアッセイする。抗体力価:開始ワクチン接種の日第-21日、曝露の日0日、および研究の結果において、各動物について一定ウイルス減少血清法によりBVDV-1aに対する血清中和抗体力価を決定する。特別概略A-17、ウシウイルス性下痢症ウイルス1a型中和抗体の力価に従って抗体力価を決定する。抗体力価≧8を発展させる動物をBVDV-1に血清変換したとみなす。臨床徴候:BVDV-1aの臨床徴候には、限定されないが、発熱、白血球減少症、呼吸困難、鼻汁および軟便が含まれ得る。BVDV感染の全ての関連する臨床徴候を、曝露の2日前、曝露の日および曝露後14日に記録する。BVDV-1の臨床徴候の観察はデータの分析の間に考慮に入れるが、一次転帰とみなさない。なぜならそれらの徴候は、このクラスの子ウシに一般に遭遇される他の疾患を示す場合があるからである。実施例10A-BVDV-1A有効性研究この研究の結果は、ウシ鼻気管炎の修飾生ウイルスウシウイルス性下痢症ウイルス-1a型BVDV1a分画-ウイルス性下痢症-パラインフルエンザ3-呼吸器合胞体ウイルスワクチン、修飾生ウイルスが、抗原性で、有効性である、BVDV1aにより引き起こされる感染の予防に役立つことを実証する。ワクチンの1用量を20頭のBVDV血清陰性子ウシに投与した。10頭の血清陰性対照子ウシに、1用量の産物マッチプラセボワクチンをワクチン接種した。全ての子ウシにBVDV1aを鼻孔内に曝露した。ワクチン接種により、高いBVDV1a抗体力価が得られ、BVDV1aにより誘発されるウイルス血症、鼻排出、発熱、リンパ球減少症および白血球減少症を予防または減少させた。したがって、5×103TCID50/用量の最小BVDV1a-TCID50を、このワクチンのBVDV1a分画について確立する。材料および方法ワクチン接種、曝露および試料採取:30頭のBVDV陰性子ウシを選別路地中で混合した。各子ウシはランダムに集められる際にゲートで分けられ、3頭の子ウシが同時に、CVB-Biometricsにより提供されるマッチしたセットランダム化スキームを使用することによって、路地を通じて2つの群群A-ワクチン接種、または群B-プラセボワクチン接種対照の一方に分けられた。20頭の子ウシに、1用量の鼻気管炎-ウイルス性下痢症-パラインフルエンザ3-呼吸器合胞体ワクチン、修飾生ウイルスをワクチン接種した。各ワクチン接種は、0日に首の左側への皮下注射により2ml用量の産物を与えた。10頭の子ウシに産物マッチプラセボBVDV欠失をワクチン接種した。曝露の2日前に、ワクチン接種群および対照群の両方を、曝露前の臨床観察の目的のため、およびベースライン体温およびWBC読み取り値を獲得するために混合した。ワクチン接種子ウシおよび対照子ウシを、カンザス州ハンストンのRuffファームにおける囲いの死んだ子ウシの肺から得たBVDV1aの悪性単離株を用いてワクチン接種後21日に曝露した。ウイルスを、10のウマ血清を含むダルベッコ改変イーグル培地を使用してTVL-BK細胞においてインビトロで継代した。曝露ウイルスを滴定し、曝露直前に107.8TCID50/4mlであると測定し、曝露直後に107.3TCID50/4mlであると測定した。2mlの曝露ウイルスを刺激の間に各鼻腔内に投与した。曝露プロセスの間、曝露ウイルスを冷却し続けた。ワクチン接種前、曝露の日ワクチン接種後21日、および曝露の14日後に抗体力価を測定するために血液試料を採取した。ウシウイルス性下痢症ウイルス抗体力価を一定ウイルス減少血清中和法によって測定した。ウイルス単離用の鼻スワブを、曝露の日および曝露後14連続日の間、液体Stuart培地中のBBLCultureSwab登録商標を用いて両方の鼻孔を拭き取ることによって子ウシから採取した。曝露の日および曝露の連続14日後にEDTAバキュテーナー管中での静脈穿刺によりバフィーコートウイルス単離用の血液試料を各子ウシから採取した。曝露前の2連続日の間、曝露の日および曝露後14連続日、各子ウシについて直腸温度を毎日記録した。各子ウシについての臨床観察を行い、記録した。識別する特徴が耳標の番号であることのみで混合されたワクチン接種群および対照群の両方により観察者はブラインド化された。研究の間中、観察者は個々の試験動物のワクチン接種状態の知識を得る時間はなかった。実験室の作業員は子ウシのワクチン接種状態の知識を有さなかった。曝露前の2連続日、曝露の日、および曝露後14連続日に示差WBC数を決定するための血液試料を採取した。試料をEDTAバキュテーナー管に採取し、DrewScientific、Hemavet950示差WBC計数装置を用いて計数測定を実施した。BVDV検出:CPEの観察および細胞培養を高めたPCR技術を利用して、採取した試料中のBVDV1aを検出した。手短に述べると、培養物中のTVL-BK細胞において滅菌濾過0.2μmにより鼻試料を処理した。バフィーコートを、細胞を洗い落とす前に45~75分間、培養物中のTVL-BK細胞上に直接置いた。37°C±2°Cおよび5±1CO2にて4日間、培養物をインキュベートした。BVDV特異的CPEの存在/非存在について各培養物を観察し、各培養物からの上清を、従来のRTqPCR方法および以下のプローブ/プライマーセット:フォワードプライマー:GGTCGCCCAGGTAAAAGCA配列番号7リバースプライマー:GCCTCTGCAGCACCCTATCA配列番号8TaqManMGBプローブ:AACCGACTGTTACGAATAC配列番号9を使用してBVDV1aの存在/非存在について個々にアッセイした。この方法は、Differentiationoftypes1a,1band2bovineviraldiarrheavirusBVDVbyPCR,JuliaF.RidpathandStevenR.Bolin,MolecularandCellularprobes,JournalofVirologicalMethods,1302005145-148に基づいて開発された。この方法はまた、CenterforVeterinaryBiologicsandNationalVeterinaryServicesLaboratoriesTestProtocol-GenotypingBovineViralDiarrheaVirus,第BPPR02010.01号に基づく。BVDVの遺伝子型および下位遺伝子型を区別するこれらの方法はどちらもゲノムの5’非翻訳領域UTRに存在する遺伝子相違を利用する。このプローブ/プライマーセットは、非常に特異的なプローブによってBVDV1b配列がユニークに検出可能な、5’UTRのセクションを増幅するように特異的に設計された。プローブ/プライマーセットの特異性を社内で確認し、そしてこれらは、BHV、PI3、BRSV、BVDV1a、またはBVDV2とは交差反応しなかった。AppliedBiosystems7500上でのTaqman登録商標に基づくアッセイを用いて、RTqPCRアッセイを行った。統計分析:抗体力価:Mann-WhitneyU検定を用いて、一般的にスケーリングされる力価の群比較を分析した。鼻排出:鼻スワブ分析によるウイルス単離データは、BVDV1aが曝露後から単離された対照の比率に比較した際の、BVDV1aが単離されたワクチン接種動物の比率に基づく。予防可能分率をCPEの観察およびPCRによる検出に基づいて独立して計算した。BVDV-1a排出の予防可能分率を、TannerおよびMorgan1993によって記載されるように計算した。ウイルス血症:BVDV1aが曝露後から単離された対照の比率に比較した際の、BVDV1aが単離されたワクチン接種動物の比率に基づいて、血液試料のバフィーコートからのウイルス単離データを分析した。予防可能分率をCPEの観察およびPCRによる検出に基づいて独立して計算した。BVDV1aウイルス血症の予防可能分率を、TannerおよびMorgan1993によって記載されるように計算した。直腸温度:曝露前平均直腸温度を各動物に関して測定した。群、日および群日相互作用に関する項を含む反復測定分散分析ANOVAにおける共変数として、この平均を用いた。疾患の臨床徴候:各観察者により独立して疾患の臨床徴候を毎日記録した。リンパ球減少症:第-2日~0日間、リンパ球数を平均化することによって曝露前のリンパ球平均を各動物について計算した。曝露前の平均に対する毎日のリンパ球数の比を、曝露後1~14日の各々について計算した曝露前の比率としてリンパ球数。ベースラインからの数の25減少により定義されるように、個々の動物がリンパ球減少症を発生するかどうかを決定するために、この比率データを分析した。ワクチン接種がこの研究においてリンパ球減少症の発生を予防するかどうかを決定するために、予防可能分率を、TannerおよびMorgan1993によって記載されるように計算した。白血球減少症:第-2日~第0日の間、白血球数を平均化することにより曝露前の白血球平均を各動物について計算した。曝露前の平均に対する毎日の白血球数の比を、曝露後1~14日の各々について計算した曝露前の比率として白血球数。ベースラインからの数の25減少により定義されるように、個々の動物が白血球減少症を発生するかどうかを決定するためにこの比率データを分析した。ワクチン接種がこの研究においてリンパ球減少症の発生を予防するかどうかを決定するために、予防可能分率を、TannerおよびMorgan1993によって記載されるように計算した。Windows登録商標用のSPSSバージョン16を用いて全ての統計的分析を実施した。結果血清中和抗体力価:この研究における全ての子ウシは、ワクチン接種前に<1:2のBVDVBVDV1a、BVDV1bおよびBVDV2血清中和抗体力価を有した。曝露の日第21日までに、ワクチン接種群は、1:21の平均BVDV1a力価を有し、これは対照群<1:2のものより有意p≦0.5であった。対照子ウシおよびワクチン接種子ウシの両方における曝露後14日のBVDV1a抗体力価は増加し、子ウシがBVDV1aで曝露されたことを示す。鼻スワブからのBVDV1a単離:BVDV特異的CPEの観察に基づいて、この研究における全ての10頭の対照子ウシは、この研究の曝露後の段階の間、BVDV1aを排出した。20頭のワクチン接種した子ウシのうちの3頭のみが、曝露後の期間の間にBVDV1aを排出した。0/10の自然に予防された対照および17/20のワクチン接種による予防の比を使用して予防可能分率を計算した。この結果、0.85の予防可能分率が得られる。BVDV1aの細胞培養を高めたPCR検出に基づいて、この研究における全ての10頭の対照子ウシは、この研究の曝露後の段階の間、BVDV1bを排出した。20頭のワクチン接種のうちの5頭のみが、曝露後の期間、BVDV1aを排出した。0/10の自然に予防された対照および15/20のワクチン接種による予防を使用して予防分画を計算した。この結果、0.75の予防可能分率が得られる。バフィーコートからのBVDV1a単離:BVDV特異的CPEに基づいて、この研究の曝露後の段階の間、この研究における10頭の対照子ウシのうち6頭はウイルス血症であった。曝露後の期間の間、20頭のワクチン接種のいずれもウイルス血症ではなかった。4/10自然に予防された対照および20/20のワクチン接種による予防を使用して予防可能分率を計算した。この結果、1.0の予防可能分率が得られる。BVDV1aの細胞培養を高めたPCR検出に基づいて、この研究において10頭の対照のうちの7頭は、この研究の曝露後の段階の間、ウイルス血症であった。20頭のワクチン接種のうちの2頭は、曝露後の期間の間、ウイルス血症であった。3/10の自然に予防された対照および18/20のワクチン接種による予防を使用して予防可能分率を計算した。この結果、0.86の予防可能分率が得られる。直腸温度:共変量として曝露前の平均温度を使用した曝露後の直腸温度分析により、日の作用による群間の統計的有意性p<0.05が明らかにされた。その分析により、対照群の温度が、6、8および14日におけるワクチン接種群より有意に高く、5および11日に有意性が近づいたことが明らかにされた。BVDV1aの臨床徴候:対照群の1頭の子ウシが、BVDV1a感染の原因となり得る臨床徴候を示した。子ウシ21から観察した臨床徴候は、多量の粘液膿性鼻排出であった。ワクチン接種群の子ウシのいずれも、この研究の曝露後の段階の間、BVDV1a感染の臨床徴候を示さなかった。子ウシのいずれにおいてもワクチン接種後の有害な反応を感作しなかった。リンパ球減少症:20頭のワクチン接種のうちの2頭および10頭の対照のうちの5頭においてリンパ球減少症を検出し、80の予防可能な分画を生じた。比率データの毎日の平均により、BVDV曝露リンパ球減少症後の反発したスパイクに対する対照子ウシの典型的な反応が明らかにされる。ワクチン接種した子ウシは同様に反応しなかった。白血球減少症:20頭のワクチン接種のうちの5頭および10頭の対照のうちの4頭において白血球減少症を検出し、37の予防可能分率を得た。比率データの毎日の平均を図3にグラフにより表す。結果上記の報告により、BVDV1aにより引き起こされる感染の予防に役立つ、BVDV1a分画ウシ鼻気管炎ウイルス-ウイルス性下痢症-パラインフルエンザ3-呼吸器合胞体ウイルスワクチン、修飾生ウイルスの抗原性および有効性が実証される。この混合した産物のBVDV1a分画の抗原性および有効性を以下により証明する:1対照群と比較してワクチン接種群におけるBVDV1aに対する抗体力価の有意な増加。ワクチン接種群における20頭の子ウシのうちの19頭は、2ml用量ワクチンの投与後、BVDV1a力価≧1:8を発生し、これは9CFR113.311c5に定義された必要性を満たす。2ウイルス単離研究により、1用量の投与が、曝露後のウシにおいてBVDV1aにより誘発される鼻排出およびウイルス血症を減少させることが明らかにされた。3ワクチン接種子ウシは、対照子ウシと比較して、有意に低い熱を示した。4ワクチン接種はまた、曝露後のウシにおいてBVDV1aにより誘発されるリンパ球減少症および白血球減少症を減少させた。この研究の結果は、両方統計的に有意であり、臨床的に関連するので、ウシ鼻気管炎ウイルス-ウイルス性下痢症-パラインフルエンザ3-呼吸器合胞体ウイルスワクチン-修飾生ウイルスに含有されるBVDV1a分画の効果を実証する。実施例11-熱輸送ワクチンについての有効性アッセイプロトコルCompositionsandMethodsforIdentifyingandDifferentiatingViralComponentsofMultivalentShippingFeverVaccinesという発明の名称の同時係属の米国仮特許出願第61/427,404号2010年12月27日において本願と同時に出願され、その全体は本明細書に参照することにより具体的に組み込まれるにおいて、本発明者らは、多価ワクチンにおける個々のウイルス成分の各々の直接ウイルス定量すなわち有効性を得るのに有用な修飾された遺伝子ベースのアッセイプロトコルの開発を報告した。本発明は、従来のFA/IFAアッセイ現在のSAM101アッセイに記載されているものなどをRT-qPCRアッセイと置き換えて、個々のアッセイウェルすなわち希釈物における特定のウイルス種、型、または亜種の存在または非存在を測定する。本明細書に記載される六価MLVワクチンなどの多価ワクチンの個々の成分についての有効性試験もまた、CPEの視覚的観察を個々のウェルのRT-qPCR/qPCR分析に置き換えることにより十分に客観的になされ得る。例えば、ウイルス力価アッセイにおけるCPEの観察は主観的であり得、しばしば、試験施設間のMLVワクチン力価の差異の源であるとみなされる。しかしながら、アッセイの客観性を増加させることにより、実験室間の再産生も増加するはずである。パラインフルエンザ3ウイルスワクチンMVSAM102.01の力価のための修飾された捕捉アッセイ法を使用してPI3についての有効性試験を実施できる。ワクチンMVSAM0129.01中のウシ呼吸器合胞体ウイルスの力価のための修飾された捕捉アッセイ法を使用してBRSVについての有効性試験を実施できる。これらのアッセイは、CPEの視覚観察のための個々のウェルのリアルタイムqPCR分析に置き換えることにより修飾される。ワクチンMVSAM0105.01中のウシ伝染性鼻気管炎ウイルスの力価のための修飾された捕捉アッセイ法を使用してBHV分画の力価を実施する。このアッセイにおいて、多価ワクチン分析のためのアッセイを標準化するために、標準的な6ウェルフォーマットの代わりに96ウェルフォーマットを使用してもよい。重要なことには、このプロトコルは、より正確かつ信頼できるアッセイを提供するために、視覚観察のための個々のウェルのqPCR分析を置き換えること、およびBHVプラークを計数することを含む。本実施例は、本明細書に記載される六価MLVワクチンの6個の個々のウイルス成分の各々の有効性を首尾良く決定するために、本発明者らの同時係属米国仮特許出願第61/427,404号に記載されている定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応qPCR技術の使用を実証する。本発明者らは、このアッセイが、多価の例において遺伝的に関連する株の個々の有効性を決定するのに既存の方法より特に有益であることを示す。モデルとして六価MLVBRDCワクチンを使用することにより、このアッセイが、下位遺伝子型に含まれるBVDV-1a、BVDV-1b、およびBVDV-2の3つの遺伝的な下位遺伝子型の個々の有効性を効果的に定量することを実証する。材料および方法細胞培養従来の技術、およびFreshney1987に記載されている供給物を使用して全ての培養物を調製する。培養物中の典型的な上皮様形態を示す、TVL-ウシ腎臓細胞株を全ての培養アッセイに使用する。プライマー/プローブセットの特異性RNAを、以下の米国農務省USDAにより承認されたウイルス種:BVDV-1aSinger株、BVDV-1bTGAC株、BVDV-2125、PI3ReisingerSF-4、およびBRSVN375抽出プロセスはBHV-1[銅株]において実施しない。なぜならそれらはDNAウイルスだからであるの各々由来のウイルス流体から抽出する。RNAqueous登録商標-4PCRAmbion;Austin,TX,USAを使用して抽出を実施する。RNAウイルス試料の各々を、TaqMan登録商標ワンステップRT-PCR化学を使用して6個のプライマー/プローブセットの各々について別のRT-qPCR反応においてテンプレート試料として使用する。DNAウイルスBHV-1もまた、上記の6個のプライマー/プローブの各々と共に別のqPCR反応においてテンプレート試料として使用する。六価ワクチンの全ての6個のウイルス分画に対するBRSVプライマー/プローブセットの分析により、他のウイルス分画のいずれか1つとプライマー/プローブセットの各々について交差反応が存在しないことが示される。qPCRアッセイAppliedBiosystems7500リアルタイムPCRシステムを使用してqPCRアッセイを実施する。オリゴヌクレオチドプライマーおよび標識された分子プローブ以下の慣用のTaqMan登録商標プローブおよびウイルス特異的フォワードおよびリバースプライマー対をAppliedBiosystemsFosterCity,CA,USAにより作製した。BVDV-1b第1:フォワードプライマー:5’-CACCCTATCAGGCTGTATTCATAGC-3’配列番号1;リバースプライマー:5’-TGCCCACAGCACATCTTAACC-3’配列番号2;およびBVDV-1bTaqMan登録商標MGBプローブ:5’-TCACCTGGACGACCC-3’配列番号3。BVDV-1b第2:第2のフォワードプライマー:5’-GTCGTCCAGGTGAAAACGGT-3’配列番号19;第2のリバースプライマー:5’-GTCGTCCAGGTGAAAACGGT-3’配列番号20;および第2のBVDV-1b検出プローブ:5’-GTCGTCCAGGTGAAAACGGT-3’配列番号21。BRSV:フォワードプライマー:5’-GCAATGCTGCAGGACTAGGTATAAT-3’配列番号4;リバースプライマー:5’-ACACTGTAATTGATGACCCCATTCT-3’配列番号5;およびBRSVTaqMan登録商標MGBプローブ:5’-AAGACTTGTATGATGCTGCCAA-3’配列番号6。BVDV-1a:フォワードプライマー:5’-GGTCGCCCAGGTAAAAGCA-3’配列番号7;リバースプライマー:5’-GCCTCTGCAGCACCCTATCA-3’配列番号8;およびBVDV-1aTaqMan登録商標MGBプローブ:5’-AACCGACTGTTACGAATAC-3’配列番号9。BVDV-2:フォワードプライマー:5’-GCTAGCCATGCCCTTAGTAGGAC-3’配列番号10;リバースプライマー:5’-GACGAGTCCCCTGTACTCAGG-3’配列番号11;およびBVDV-2TaqMan登録商標プローブ:5’-CAGTGAGTCCATTGGATGG-3’配列番号12。PI3:フォワードプライマー:5’-GGAGACCAAGACCAAGGAGATG-3’配列番号13;リバースプライマー:5’-CGTCTGCCCATGCATAAGG-3’配列番号14;およびPI3TaqMan登録商標プローブ:5’-ACCTCGGTCATCCATAG-3’配列番号15。BHV-1:フォワードプライマー:5’-CCATGTTAGCGCTCTGGAACC-3’配列番号16;リバースプライマー:5’-CGTCTTTACGGTCGACGACTCC-3’配列番号17;およびBHV-1TaqMan登録商標MGBプローブ:5’-ACGGACGTGCGCGAA-3’配列番号18。多価ワクチンについての有効性アッセイ以下のアッセイの各々についてのプロトコルは、力価プレートの個々のウェルが等価の基準ウェルより多量のウイルスを含有するかどうかを決定するために、AppliedBiosystems7500比較閾値サイクルCT方法を利用する。ほとんどのウイルス試料はPCRアッセイにより検出できるいくらかの非生存ウイルス粒子を含有するので、潜在的に偽陽性結果を与える。この問題は細胞を含まない基準プレートの使用により解決される。試料は、ウイルス複製についての可能性を排除するために細胞を含まないが、アッセイプレートにおけるように、基準プレート中で正確に希釈される。各アッセイにおけるウェルの各々についてベースラインまたはバックグランドCT値を生成するために基準プレートが使用される。アッセイプレートにおけるウェルがより高い。アッセイプレートにおけるウェルが対応するバックグランドウェルより高いCT値を有する場合、ウイルス複製が生じ、ウェルは陽性であるとみなされる。ウェルについてのCT値を測定しない場合、またはCT値がバックグランドCT値と等しい場合、ウェルは陰性であるとみなされる。多価ワクチンについての有効性アッセイIBR/BVDV-1a、-1b、-2/PI3/RSV六価ワクチン、修飾生ウイルアスのパイロットシリーズを本明細書に記載されるように調製した。手短に述べると、BHV-1Cooper株、BVDV-1aSinger株、BVDV-1bTGAC株、BVDV-2125、PI3ReisingerSF-4、およびBRSVN375をTVL-BK細胞株第20継代中で増殖させた。六種ワクチンの各分画についての有効性試験を、適切な中和抗血清を加えることにより本明細書に記載されるように実施できる。各々のウイルス分画のTCID50を、CPE/FA/IFA結果に基づいて決定し、RT-qPCR/qPCRに基づいたものと皮革する。BVDV-1A、-1Bおよび-2有効性試験一価BVDV-1a、BVDV-1bおよびBVDV-2試料は、ワクチンSAM101中のウシウイルス性下痢症ウイルスの滴定のための捕捉アッセイ法に従って別々に滴定できる。手短に述べると、アッセイを二連で実施し、プレートの1つを上記のようにCPEおよび/またはFA/IFAに基づいた力価計算のために使用する。もう1つのプレートはRT-qPCRに基づいた力価を測定するために使用する。細胞欠損基準プレートはウイルスの各々について上記のように含まれる。PI3有効性試験PI3についての有効性試験を二連で実施し、プレートの1つはCPEに基づいた力価計算のために使用する。もう1つのプレートは、RT-qPCRにより測定されるようにPI3の比較CT値に基づいた力価を測定するために使用する。細胞欠損基準プレートは上記のように含まれる。BRSV有効性試験BRSVについての有効性試験を二連で実施し、プレートの1つは上記のようにCPEに基づいた力価計算のために使用し、残りのプレートは、RT-qPCRにより測定されるBRSVの比較CT値に基づいた力価を決定するために使用する。上記に説明したように、細胞欠損基準プレートもまた、このアッセイに含まれる。BHV有効性試験BHVについての有効性試験を、従来の視覚観察を個々のウェルのqPCR分析に置き換え、プラークを計数することにより、96ウェルフォーマットにおいて実施する。このアッセイは二連で実施し、プレートの1つは、個々のウェル希釈物中のCPEの存在または非存在に基づいた力価計算のために使用し、一方で、残りのプレートは、QPCRにより測定されるようにBHVの比較CT値に基づいて力価を計算するために使用する。細胞欠損プレートは上記のように含まれる。参考文献以下の参考文献は、それらが例示的な手順または本明細書に記載されるものに対する他の詳細な補足を与える程度に、それらの全体が本明細書に参照することにより本明細書に具体的に組み込まれる。Caruthersらによる米国特許出願第4,415,732号Caruthersらによる米国特許出願第4,458,066号Mullisらによる米国特許出願第4,683,195号Mullisらによる米国特許出願第4,683,202号Kosterらによる米国特許出願第4,725,677号Caruthersらによる米国特許出願第4,973,679号Molkoらによる米国特許出願第4,980,460号Piconeらによる米国特許出願第5,614,388号Agrawaletal.,Nucl.AcidsRes.,18:5419-5423,1990Baker,J.C.,Theclinicalmanifestationsofbovineviraldiarrheainfection,Vet.Clin.N.Am.FoodAnim.Pract.,11:425-445,1995.Baker,J.C.,Werdin,R.E.,Ames,T.R.,Markham,R.J.,andLarson,V.L.,Studyontheetiologicroleofbovinerespiratorysyncytialvirusinpneumoniaofdairycalves,J.Am.Vet.Med.Assoc.,1891:66-70,1986.Barber,D.M.,Nettleton,P.F.,andHerring,J.A.,Diseaseinadairyherdassociatedwiththeintroductionandspreadofbovinediarrhoeavirus,Vet.Rec.,11718:459-464,1985.BeaucageandIyer,Tetrahedron,48:2223-2311,1992.Becher,P.,Konig,M.,Paton,D.J.,andThiel,H.J.,Furthercharacterizationofborderdiseasevirusisolates:evidenceforthepresenceofmorethanthreespecieswithinthegenuspestivirus,Virology,2091:200-206,1995.Collett,M.S.,R.Larson,S.K.Belzer,andE.Retzel,Proteinsencodedbybovineviraldiarrheavirus:thegehomicorganizationofapestivirus,Virology,1651:200-208,1988.Elbers,K.,N.Tautz,P.Becher,D.Stoll,T.Rumenapf,andH.J.Thiel,ProcessinginthepestivirusE2-NS2region:identificationofproteinsp7andE2p7,J.Virol.,706:4131-4135,1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