単細胞生物をジメチルスルホキシド、エチレングリコールおよびプロリンの存在下で凍結させることを含んでなる、単細胞生物の凍結方法。単細胞生物が、酵母、細菌、または微細藻類である、請求項1に記載の凍結方法。微細藻類がクロレラ属の微細藻類である、請求項2に記載の凍結方法。凍結による障害から単細胞生物を保護するための、請求項1~3のいずれか一項に記載の凍結方法。請求項1~4のいずれか一項に記載の方法により凍結させて得られた単細胞生物の凍結物。単細胞生物をジメチルスルホキシド、エチレングリコールおよびプロリンの存在下で凍結させることを含んでなる、凍結させた単細胞生物の製造方法。ジメチルスルホキシド、エチレングリコールおよびプロリンを含んでなる、単細胞生物の凍結保存剤。本発明は、微細藻類、酵母、乳酸菌などの単細胞生物の効果的な凍結方法と、凍結による障害から保護された単細胞生物を提供することを目的とする。本発明はまた、凍結による障害から保護された凍結単細胞生物の製造方法および単細胞生物の凍結保存剤を提供することを目的とする。本発明者は、ジメチルスルホキシド以下、DMSOということがある、エチレングリコール以下、EGといことがある、およびプロリン以下、Prolineということがあるを凍結保存剤として用いることで、微細藻類、酵母、乳酸菌などの単細胞生物において凍結後の生残率を著しく高めることができ、かつ、10年以上にわたる長期凍結保存後もその高い生残率を維持できることを見いだした。すなわち、本発明によれば、以下の発明が提供される。1単細胞生物をジメチルスルホキシド、エチレングリコールおよびプロリンの存在下で凍結させることを含んでなる、単細胞生物の凍結方法。2単細胞生物が、酵母、細菌、または微細藻類である、上記1に記載の凍結方法。3微細藻類がクロレラ属の微細藻類である、上記2に記載の凍結方法。4凍結による障害から単細胞生物を保護するための、上記1~3のいずれかに記載の凍結方法。5上記1~4のいずれかに記載の方法により凍結させて得られた単細胞生物の凍結物。6単細胞生物をジメチルスルホキシド、エチレングリコールおよびプロリンの存在下で凍結させることを含んでなる、凍結させた単細胞生物の製造方法。7ジメチルスルホキシド、エチレングリコールおよびプロリンを含んでなる、単細胞生物の凍結保存剤。本発明では、ジメチルスルホキシド、エチレングリコールおよびプロリンの存在下で凍結を行うことにより、微細藻類、酵母、乳酸菌などの単細胞生物において凍結解凍後の生残率が高められる。特に本発明では、10年以上の長期保存を行った場合でも、生残率の低下がほとんどみられない。従って、本発明は、従来凍結保存が困難とされてきた単細胞生物の保存方法や保存方法が確立されてきた単細胞生物のより効果的な保存方法を提供する点で有利である。以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。実施例1:微細藻類に対する凍結保護効果本実施例では単細胞生物のうち微細藻類に対して凍結試験および凍結保存試験を実施し、凍結保護効果を評価した。1.供試微細藻類株以下の4株を供試株とした。ChlorellavulgarisC27株国立環境研究所から入手。NIES2170株として国立環境研究所において分譲可能な状態で保存されている。ChlorellavulgarisM207A7株キリンビバレッジ株式会社内に保存され、特許法施行規則第27条の3の規定に準じて分譲される。特許第3540951号参照。NannochloropsisoculataST4株国立環境研究所から入手。NIES2145株として国立環境研究所において分譲可能な状態で保存されているTetraselmistetratheleT501株独立行政法人養殖研究所から入手。2.培養用培地ChlorellavulgarisC27株の培養にはA-10培地表1を、CvulgarisM207A7株の培養にはFC培地表2を、NoculataST4株の培養にはA-42培地表3を、TtetratheleT501株の培養にはESS2培地表4NakanishietalJFermentBioeng199375149150をそれぞれ使用した。すべての培地は、121°C、20分間の蒸気加圧滅菌を行った後に使用した。3.培養条件CvulgarisC27株、NoculataST4株及びTtetratheleT501株の3株については、25°Cで、明暗周期12時間明期/12時間暗期、80μmolm-2s-1の光量子束密度の条件下で、96時間照光培養を行った。CvulgarisM207A7株については、同様の照光条件で、35°Cで48時間培養を行った。4.供試藻類懸濁液の調製と凍結保存凍結保存に供する各菌株は、それぞれ寒天を含まない上記2.の培養用培地、上記3.の培養条件にて前培養を行い、凍結保存に際しては、何れの株も対数増殖期後期の増殖ステージのものを使用した。凍結保存液中の生菌数は107細胞/mLに調整した上で凍結を行った。具体的には、前培養した供試藻類培養液を15mL遠心管に写し、3000回転、10分間の遠心分離を行った。沈殿部分を0.5mL残して上澄み液を捨て、後述の基本媒液7mLを添加して全量を7.5mLの供試藻類懸濁液とした。凍結保存には、2mLのクライオバイアルコーニング社製を用いた。クライオバイアルに0.75mLの供試藻類懸濁液を分注し、0°Cの氷水中で後述の試験区1~12の成分を徐々に添加し、1.5mLとした。このとき、生残率測定用の試料用に余分に1本作成し、生菌数を測定しておいた。各種成分を添加した菌体のクライオバイアルは、-40°Cまで1°C/分の速度で冷却することにより緩速凍結を行い、それ以降は液体窒素で一挙に-196°C以下に急速凍結する2段階凍結法KuwanoetalJPhycol199430566570KuwanoetalRecentAdvancesinMarineBiotechnologyVolume4AquacultureSciencePublisherIncNewHampshire2000pp2340にて、凍結を行った。本実施例では、ジメチルスルホキシドDMSO、ソルビトールSorbitol、グリセロールGlycerol、エチレングリコールEGおよびL-プロリンの5種類について検討を行い、これらを単独または混合して検討を行った。これらの成分は、pH6.5に調整した0.01MHEPES水溶液を滅菌したものを基本媒液とし、凍結保存液中の最終濃度が、12.5体積DMSO、25体積DMSO、35.0体積DMSO5.0重量プロリン、42.5体積DMSO0.5MSorbitol、55.0体積DMSO0.5MSorbitol、65.0体積Glycerol0.5Sorbitol、75.0体積DMSO5.0重量プロリン、85.0体積DMSO10.0重量プロリン、95.0体積DMSO5.0体積EG、105.0体積EG5.0重量プロリン、115.0体積DMSO5.0体積EG5.0重量プロリン及び125.0体積DMSO5.0体積EG10重量プロリン12試験区となるよう各種成分を添加して、さらにpH6.5に調整し、滅菌し、供試藻類懸濁液に用いた。5.解凍方法上記4.において凍結した試料バイアルを40°Cの温水中で攪拌しながら解凍した。試料を解凍すると同時に、0°Cの氷水中にバイアルを移し、前記基本媒液0.5mLずつを10回に分けて加え、さらにその後、1mLずつを4回に分けて加えて藻類懸濁液を希釈した。その後、3000rpm、10分間の遠心分離を行い、前記基本媒液で洗浄し、藻体を回収したKuwanoetalRecentAdvancesinMarineBiotechnologyVolume4AquacultureSciencePublisherIncNewHampshire2000pp2340。このとき、解凍した供試藻類懸濁液の生菌数を測定し、生残率を算出した。6.生残率の測定解凍後、前記2.の培養用培地にそれぞれの供試微細藻類株を塗布し、前記3.の培養条件に記載された方法を用いて培養を行い、出現したコロニー数を計測した。生残率は凍結前の各供試微細藻類株のコロニー数を100としたときの、凍結後の供試微細藻類株のコロニー数として算出した。各種成分の存在下で凍結させた直後に、前記5.の解凍方法にて解凍し、計数した前記4種の供試微細藻類株の生残率を表5に示すN=3。表5に示されるように、DMSOのみを単独で用いたときには、供試微細藻類株の4種類のいずれにおいても生残がほとんど認められなかった試験区1および2。また、DMSOに各種成分を混合した場合や、DMSOの代わりにグリセロールを用いた場合には、生残率は低いままであった試験区3~9。また、EGをプロリンと共に用いた場合でも生残率は低かった試験区10。しかしながら、DMSO、EGおよびプロリンの3種の存在下で凍結させた場合には生残率は顕著に上昇し、50以上の高い生残率を示した試験区11および12。7.長期保存後の生残率と全クロロフィル濃度の測定試験区11について冷凍後、長期保存した際の生残率と全クロロフィル濃度の変化を調べた。解凍後の供試微細藻類株4株の生残と性状を示すメルクマールとして、解凍後の供試微細藻類株の全クロロフィル濃度を15年間にわたり1年毎に経年調査したものである。すなわち、長期保存の生残率の計数においては、最初に上記方法による供試微細藻類株凍結保存の2mLのクライオバイアルを50個調製し、15年間にわたり経年的に毎年2個ずつ解凍し、その生残率と全クロロフィル濃度を求めた。生残率の測定は上記6.の方法で行い、全クロロフィル濃度の測定は下記8.の方法で行った。8.全クロロフィル濃度の測定全クロロフィル濃度は供試微細藻類株乾燥重量あたりの吸光度、具体的には、メタノール抽出物の吸光度分析にて評価した。メタノール抽出物の吸光度は以下の操作で求めた。すなわち、寒天を含まない上記2.の培養用培地、上記3.の培養条件にて前培養を行って得た供試微細藻類株試料懸濁液0.5mLにメタノール50mLを加え、25°Cで30分間振とうし、抽出液とした。抽出液を孔径0.45μmのフィルターで濾過後、適当に希釈し、650nm並びに665nmで吸光度ODを測定した。ここで、例えばOD650とは650nmの波長の入射光を用いたときの吸光度ODを示す。また、供試微細藻類株の乾燥重量は、寒天を含まない上記2.の培養用培地、上記3.の培養条件にて前培養を行って得た供試微細藻類株試料懸濁液5mLを4000rpm、5分間遠心分離し、上澄み液を取り除いた後に、供試微細藻類株ペレットに蒸留水2~3mLを加えて懸濁し、その後、アルミ皿に懸濁液を流し込み、乾燥機にて105°C、3時間乾燥し、供試微細藻類株の乾燥重量を計測し、そこから1L当たりの供試微細藻類株の乾燥重量g/Lとして求めた。なお、全クロロフィル濃度は次の式で算出した。全クロロフィル濃度=0.25×OD6504×OD665×0.1×希釈倍率÷懸濁液中の供試微細藻類株の乾燥重量g/L×100結果は図1および図2に示される通りであった。凍結直後の生残率図1と全クロロフィル濃度図2はいずれの微細藻類株でも15年間にわたりほとんど変動しないことがわかった。すなわち、DMSO、EGおよびプロリンを用いた本発明の凍結方法は、15年間の長期保存に対しても問題なく使用できることが実証された。実施例2:酵母および乳酸菌に対する凍結保護効果本実施例では単細胞生物のうち酵母および乳酸菌に対して凍結試験を実施し、凍結保護効果を評価した。供試細胞株としては、酵母として、Saccharomycespastorianus独立行政法人酒類総合研究所保存株SaccharomycespastorianusRIB2010株、乳酸菌として、LactobacillusbrevisIFO3345およびLactococcuslactisIFO12007をそれぞれ用いた。凍結試験は、培養培地および培養条件以外は実施例1に記載された方法に従って行った。培養培地は、酵母は麦芽寒天培地日水製薬、商品コード:05706を用い、乳酸菌はMRS培地Difco、商品コード:DF288110を用いた。培養条件は、酵母は25°Cにて72時間培養とし、乳酸菌は35°Cにて72時間培養とした。本実施例では、ジメチルスルホキシドDMSO、エチレングリコールEGおよびL-プロリンの3種類について検討を行い、これらを単独または混合して検討を行った。これらの成分は、pH6.5に調整した0.01MHEPES水溶液を滅菌したものを基本媒液とし、凍結保存液中の最終濃度が、2110体積DMSO、225重量プロリン、2310体積DMSO5重量プロリン、2410体積EG、2510体積EG5重量プロリン、2610体積DMSO10体積EG5重量プロリン6試験区となるように各種成分を添加して、さらにpH6.5に調整し、滅菌し、供試細胞懸濁液に用いた。結果は表6に示される通りであった。表6に示されるように、DMSOとプロリンを組み合わせた場合やEGとプロリンを組み合わせた場合には凍結後の生残率に若干の上昇が見られたが試験区23および25、DMSO、EGおよびプロリンの3種類を組み合わせた場合には凍結後の生残率が他の試験区に比べて顕著に上昇することが確認された試験区26。このことから、DMSO、EGおよびプロリンを用いる本発明の凍結方法は、酵母のような真核生物や乳酸菌のような細菌においても、高い凍結保護効果を有することがわかった。