"ストレス耐性植物またはその前駆体を生産する方法であり、i1つまたは複数の親植物を、相対湿度、水可用性、周期的な乾燥、栄養、太陽光、風、温度、pH、外来化学物質、塩類等の化学的毒素、植食、予防用化学物質、肥料、細菌/真菌/ウィルス感染等の病原体攻撃および害虫被害に関与する好適ではない条件から選択される1つまたは複数のストレス条件にかけ、ii前記1つまたは複数の親植物から子孫を形成する方法であって、前記子孫の、相対湿度、水可用性、周期的な乾燥、栄養、太陽光、風、温度、pH、外来化学物質、塩類等の化学的毒素、植食、予防用化学物質、肥料、細菌/真菌/ウィルス感染等の病原体攻撃および害虫被害に関与する好適ではない条件から選択される1つまたは複数のストレス条件に対する耐性が、1つまたは複数の親植物との比較において増強している方法。子孫が、植物成体またはその前駆体である、請求項1に記載の方法。子孫が種子または栄養繁殖体である、請求項1または2に記載の方法。子孫が、1つまたは複数の親植物によって経験された1つまたは複数のストレス条件に対し耐性を持つ、上記請求項のいずれかに記載の方法。子孫が、1つまたは複数の親植物によって経験されていない1つまたは複数のストレス条件に対し耐性を持つ、上記請求項のいずれかに記載の方法。1つまたは複数の親植物が、低い相対湿度、周期的な乾燥およびボトリチス属例えば灰色カビ病菌への感染から選択される1つまたは複数のストレス条件にかけられ、および/または前記子孫の、低い相対湿度、周期的な乾燥およびボトリチス属例えば灰色カビ病菌への感染から選択される1つまたは複数のストレス条件に対する耐性が増強している、上記請求項のいずれかに記載の方法。1つまたは複数の親植物が、高等植物、顕花植物、および双子葉植物から選択される、上記請求項のいずれかに記載の方法。1つまたは複数の親植物が作物植物である、上記請求項のいずれかに記載の方法。1つまたは複数の親植物が真正双子葉類に属し、好ましくは、1つまたは複数の親植物がアブラナ科またはアオイ科の一員であり、好ましくは、1つまたは複数の植物がシロイヌナズナ科植物およびカカオ科植物から選択される、例えばシロイヌナズナおよびチョコレートノキから選択される、上記請求項のいずれかに記載の方法。子孫の生物量、花数、種子数および/または種子重量が、収穫の時期を問わず、1つまたは複数の親植物と比べて増加している、上記請求項のいずれかに記載の方法。前記請求項のいずれかによる方法で生産される植物またはその前駆体。請求項1~10のいずれかによる方法で生産される植物またはその前駆体を特定するためのアッセイであり、前記アッセイにおいて、ゲノムのメチル化の1つまたは複数の部位の有無について、前記方法によって生産されたと考えられる植物またはその前駆体を解析し、前記1つまたは複数の部位でのメチル化の有無が、前記方法で生産された植物またはその前駆体の指標となるアッセイ。SPEECHLESSまたはFAMA遺伝子もしくはいずれかの遺伝子の機能的同族体に、あるいは約10kb以内におけるゲノムのメチル化の存在が、低い相対湿度および/または周期的な乾燥に耐性のある植物またはその前駆体の指標となる、請求項12に記載のアッセイ。相対湿度、水可用性、周期的な乾燥、栄養、太陽光、風、温度、pH、外来化学物質、塩類等の化学的毒素、植食、予防用化学物質、肥料、細菌/真菌/ウィルス感染等の病原体攻撃および害虫被害に関与する好適ではない条件から選択される1つまたは複数のストレス条件に対し耐性のある植物またはその前駆体を特定するためのアッセイであり、前記アッセイにおいて、ゲノムのメチル化の1つまたは複数の部位の有無について、前記方法によって生産されたと考えられる植物またはその前駆体を解析し、前記1つまたは複数の部位でのメチル化の有無が、前記植物が前記1つまたは複数のストレス条件に対し耐性を持つという指標になるアッセイ。SPEECHLESSまたはFAMA遺伝子もしくはいずれかの遺伝子の機能的同族体に、あるいは10kb以内におけるゲノムのメチル化の存在が、低い相対湿度および/または周期的な乾燥に対し耐性を持つ植物またはその前駆体の指標となる、請求項14に記載のアッセイ。本発明は、1つまたは複数のストレス条件に耐性のある植物およびその前駆体を生産する方法に関する。特に本発明は、1つまたは複数の最適以下の生育条件ストレス下に置かれたときに生き残り、生長および/または収穫可能な生産物を生産する能力が増強された種子および/または栄養繁殖体を生産する方法に関し、ここで最適以下の生育条件とは、親の植物および未処理の系統において生長、生存率、生物量、種子生産および/または収穫高作物の場合に重大な減少を引き起こすものである。本発明で用いられている方法および本発明の具体例を以下に説明する。本明細書中で、実施態様は、明細書の記載が明瞭かつ簡潔になるように記載されているが、実施態様が、本発明から離れることなく様々に組み合わせられたり区別されたりし得ることが意図されており、そのように解釈されるであろう。本明細書中で、~で構成される/~を含むは、他のものと一緒に含むと解釈されることとする。これらの用語はそれのみを含むを意図するものではない。本明細書中で、約という用語は、プラスマイナス20、より好ましくはプラスマイナス10、さらに好ましくはプラスマイナス5、最も好ましくはプラスマイナス2を意味する。本明細書において、同族体という用語は、祖先が共通であるDNA配列に遡る第2の遺伝子に関与する遺伝子を意味するとしてもよい。この用語が、構造および進化の起点において別の種での遺伝子に類似している遺伝子を意味するものであってもよい。本明細書において、後代子孫という用語は、植物の繁殖を目的として用いることのできるあらゆる植物材料を意味する。無性生殖においては、後代子孫は、木質/半熟枝/緑枝の挿穂、葉の切片、またはその他あらゆる植物の部分であってもよい。有性生殖における後代子孫は、種子または胞子である。マイクロプロパゲーション無性生殖の1タイプではその植物のどの部分を用いてもよいが、通常は、根および茎の先端または芽等、分裂の盛んな部分である。本明細書において、栄養繁殖体という用語は、生物学的種子以外の植物性材料を経由して伝わる単一の親植物のクローンのすなわち、遺伝的に同一の末裔である子孫を意味する。これは、通常は有性生殖の結果つまり2体以上の親植物の末裔である種子とは対照的である。本明細書において、耐性という用語は、その子孫/栄養繁殖体が、親植物と比べて1つまたは複数のストレスに対する耐性が増大していることを意味する。この増加が統計的に顕著であることが好ましい。実施例1シロイヌナズナ科の子孫における低湿度ストレスに対する遺伝性応答水ストレスの一形態低相対湿度LRHにさらされたシロイヌナズナ科の植物が、葉の気孔孔の数を減少させることによって短期間で応答し、それによって余分な量の水を失わず生き残ることが発見されている。結果としてできた植物は小型ではあるが生き残り、多少は結実する。しかしながら特筆すべきことに、これらの植物から採取された種子は、同一の条件に置かれたときに、より優れた能力を発揮する。また、それらの植物は、より大型化しはるかに多くの種子を生産する。使用されるそれらの植物は近親交配されすぎているため、子孫が事実上親と遺伝的に全く同一である。よって、親植物にストレスを与えると、次の世代で子孫が同じストレスに対して予め適応させられることが、はっきり証明された。同様の現象が、他のストレス、すなわち寒さや熱のストレスWhittleetal2009、UV-C光Molinieretal2006および細菌等の病原体Molinieretal2006についてもみられる。ここに記載されている発明は、作物の商業的種子生産に特に適している。その上、適正なストレス条件下で商業用種子のロットを生産するために用いられる親クローン/個体群を育成するにあたっては、発芽時に同じストレスに適応する能力を増大させるために、その種子の後成プロファイルを事前にプログラミングする必要がある。重要なのは、そのような効果が多くの世代に渡って持続することなく急速に消滅することである。よって、本発明は、遺伝子コードを変えることなく植物生産を向上させる手段を提供する。葉表面の気孔の密度および動作開口はいずれも、環境的な合図に大いに影響される。それらは共に、短時間分~時間および長時間季節~寿命規模で、水蒸気gsに対する葉の気孔コンダクタンスを制御する。そのような可塑性のおかげで、植物は、光合成のために大気中の二酸化炭素CO2を捕捉することと蒸散による水の喪失を最小限にすることという相反する需要のバランスを取ることができ、水使用効果率wueは植物の一生を通して葉の気孔密度と逆相関する。気孔の発生の遺伝的規則については、我々の理解に近年進展があった。気孔の孔辺細胞の発生を支配する経路は、前表皮細胞が気孔を形成するというデフォルトの運命を伴うが、一連のパターニング遺伝子の発現が、気孔系統への参入そして口辺細胞の形成をブロックして、結果的に気孔密度を設定する。正のレギュレーターが気孔系統への参入および口辺細胞を形成する非対称性分裂を決定する。植物が、受け取った環境的合図に応答して保水性および炭素固定の可塑性を維持できるようにするメカニズムは余りはっきりしていない。その植物の一生の初期に経験された環境ストレスへの可塑的応答が、後に発生中、または精液形成中でさえも、同様のストレスを予期して順応的な調整を実現する可能性が調査された。異なるレベルの周囲湿度に対する気孔経路の応答が解析された。シロイヌナズナ生態型LandsbergerectaまたはColumbiaを、常時低相対湿度LRH;45±5または実験用コントロール65±5湿度下で、種子から種子の収穫まで育成した。気孔度数表皮細胞のパーセンテージとしての気孔指数SIは、LRHストレスの影響を受けた図1。Landsbergerecta生態型では、繰り返し実施された各実験で、各回で大きな成果を伴って減少しCohensdtest080、wueは増加した。しかしながらLRH処理親の同質遺伝子的後代子孫では、後代子孫が同じLRHストレスにさらされたときLRHLRH、SIはそれ以上減少しなかった図1。Wueはそれ以上SIと相関することなく増加した。同様に、フィットネスパラメータとして生物量および種子数を測定は、最初の暴露世代でLRHストレスによって減少したが、LRH-LRH植物ではそうではなかった図2。ストレスを受けた植物が生育途中にコントロールRHに戻されるとLRH→コントロール、SIはなおも減少し続け25減、p0028、ストレスを受けた植物がコントロール植物と交配されるとLRH×コントロールコントロール植物からの雑種コントロール×コントロール-LRHと比較して、SIはLRHストレス下でコントロール×コントロール-LRH増加したされるか否かをみるため、調査が行われた。DNAメチル化の相違を、コントロール環境と比較するため、11の気孔パターニングおよび形成遺伝子で、LRH下においてスクリーニングした表1。RH処理に関連した特異的メチル化が、SPEECHLESSSPCHおよびFAMA遺伝子の調節領域および5’コーディング領域の両方で見つかった。SPCHおよびFAMA遺伝子は、転写因子と推定されるbasicHelixLoopHelixbHLHタンパク質をコードするパラログである。MUTEおよびその二量化パートナーICE1ならびにSCREAM2を備えた経路において、これらの遺伝子の発現は、前表皮細胞の気孔系統への参入を調節し、その後の、気孔の孔辺細胞形成で終結する非対称的増幅性細胞分裂を制御する。SPCHはメリステモイドを形成する非対称細胞分裂を開始することに必要であり、FAMAは孔辺母細胞の最終分裂を調節する。SPCHとFAMAはLRHにさらされた葉から、有意により多くメチル化された。転写因子遺伝子の5’領域でのメチル化はシロイヌナズナ科ゲノムでは稀であり、異常発現によって引き起こされるか、または同発現を引き起こす可能性がある。両方の遺伝子の発現はLRH条件下で抑制された。遺伝子発現は、DNAがLRH下でメチル化すると抑制され31~58図1、葉の表皮上の気孔数の減少と相関関係にあった。気孔度数を調節する上でのメチル化の役割を、メチルトランスフェラーゼ変異種を用いてさらに調査した。維持シトシンメチルトランスフェラーゼMET1用の変異種減メチル化2DNAでは、SIはLRHで増加し、処理による特異的メチル化は、PSCHとFAMAの双方で減少した。SPCHの発現はLRH処理によってそれ以上減少することはなく、FAMA発現は増加した図1。DomainRearrangedMethyltransferase1および2の二重変異種において、SIはLRHによって減少せず、FAMAの発現もなく、SPCH発現は増加し、処理によって特異的メチル化は検出されなかった図1。DOMAINSREARRANGEDMETHYLTRANSFERASE2は、シロイヌナズナ科でDNAをデノボメチル化することが知られている今のところ唯一の酵素である。SPCHとFAMAのデノボメチル化は、LRHストレスへの応答で生じた。SPCHとFAMA遺伝子座の断片の単一塩基解像配列により、対称CGおよび非対称Hが塩基であるCHHのコンテクストでの処理による特異的メチル化が示された図1。野生型WTにおけるLRH下での追加的非対称メチル化は、いずれの遺伝子座においても、drml2植物で課されなかった図1。非CGメチル化は、DRM2およびタンパク質CHROMOMETHYLASE3CMT3によって重複して維持された。我々はまた、cmt3変異種の応答についても検査を行い、それが、WT植物同様に、SI減少、発現減少、LRHにおけるメチル化の増加というように、LRHに応答させられることを発見したデータ提示無し。FAMAのLRH誘発非対称メチル化は、cmt3植物で無効化された。2つの遺伝子間のこのような相違により、非対称メチル化のデノボ確立がFAMAでの応答には必要であるが、誘発されたメチル化のCG依存維持がSPCHの特異的な環境応答にとって、同程度に重要であり得ることが暗示された。シロイヌナズナ科での遺伝子プロモーター配列の単方向性メチル化によるDRM2媒介転写遺伝子サイレンシングは、24nt低分子干渉RNAssiRNAsによって指令される。2122nt二次siRNAsによる転写後遺伝子サイレンシングPTGSもまた、転写された領域の双方向メチル化と関連する。観察されたDNAメチル化および物理的応答におけるsiRNA方向の調節を調査する目的で、RNA指令DNAメチル化RdDM用のある範囲の変異種を、コントロールおよびLRH環境で育成した。TGSでは、RDR2rna依存rnaポリメラーゼ2が、2本鎖短RNAの合成に必要である。PTGSの維持および他動性のいずれもRDR6を必要とし標的遺伝子の転写に依存している。ダイサー様RNAIIIタンパク質は、手始めにRDR2産生RNAに作用するDCL3およびRDR6産生RNAに作用するDCL4を用いて、dsRNAまたはヘアピンRNAを加工する。しかしながら、単一のdcl変異種に4つのシロイヌナズナ科DCLsによる若干の重複および代償性プロセシングが存在する。本当のrdr2またはdcl3変異種は、いずれもLRHストレス下で発芽しなかった。どちらの遺伝子も発現されデータは示されず、トータル小型RNA量がWTと比べて増加し、24ntsiRNAは、極低いレベルではあったが実生に存在した図3。コントロールの処理では、興味深いことに、rdr2とdcl3変異種双方の気孔度数がそれらのバックグラウンド生態型Columbiaに比べて高かったデータは示されず。このことにより、siRNAがその経路のいずれかのポイントで気孔形成の抑制に必要とされるかもしれないことが示唆される。SPCHもFAMAも、drm12同様rdr2での非対照的塩基において、比較的非メチル化の状態を維持し図1、FAMAの発現は、先の観察を裏付けるように増加した。いずれの処理でも21ntsiRNAsはdcl4植物に存在したが、rdr6では測定可能なレベルではなかったデータは示されず。LRH誘発メチル化は、rdr6では全体的に減少したが、SPCHまたはFAMAの対称または非対称コンテクストのいずれにおいても無効化されなかった図1。SPCHとFAMA両方の発現はrdr6で増加し図1、先の結果を裏付ける、SIはWTコントロールとLRH下の両方で増加した。これらのデータは、環境ストレス下でSPCHとFAMAがいずれもRdDMの標的であることを証明するものであり、両方の座がTGSおよびPTGSの対象になり得ることを暗示するものである。シロイヌナズナのハイスループットシーケンシングデータからの小型RNAの読取値は、FAMA遺伝子の上流300bp内に位置する7個の小型RNAを示すTAIR9httpgbrowsearabidopsisorgにアクセス。これらの小型RNAの発現はFAMAと共に定量化され、驚くべきことに、rdr2植物においてFAMAの発現が増加した場合、FAMAの発現と正に相関したP0014R2097。SPCHの上流および未知のタンパク質については予測177bp遺伝子At5g53205は、42小型RNAsと427bp分散反復領域内で40bpタンデムリピートに対応するローリングカーブ型ヘリトロンファミリートランスポゾンのクラスターである。これらのような小型トランスポゾンは、サイレンシング用のDRM12を介してRdDMに優先的に依存すると考えられる。SUPPRESSOROFdrm1drm2cmt3SDCによりコードされたFボックスタンパク質の7個のタンデムリピートおよびFWAの転写開始部位周辺でタンデムダイレクトリピートから生じるRdDMについて示されているように、転移性エレメントTEsを越えて拡大しSPCHの転写に影響を及ぼした非CGメチル化を、これらの小型RNAが指令可能か否かが仮定された。SPCHの発現を、これらのsiRNAのサブセットと共に測定した。それは、これらsiRNAsの発現が増加調節されSPCHがLRHでメチル化されたときにSPCHが減少調節されるように逆相関するP0004R2087ことが判明した。LRHストレスに暴露されると、SPCH座のTEs上流に対応する24ntsiRNAsは誘発され、SPCHの調節領域および遺伝子領域まで拡大したDNAメチル化をアッセイした。次に、LRHにさらされた単独親からの同質遺伝的後代子孫におけるSPCHおよびFAMAのメチル化について、それが遺伝子発現およびSIに相関するかどうかみるために検査を行った。LRHコントロール後代子孫は、SPCHについてはコーディング領域および非コーディング領域で親のメチル化ステータスを保持し、同様に抑制された発現を呈示した。したがって、SPCH座のメチル化は遺伝性であると結論付けられた。一方、SPCHのメチル化ステータスはLRHLRH後代子孫では喪失した。そのためこの遺伝子は非メチル化されかつ過剰発現された図1。Drm12後代子孫LRHコントロールは、非メチル状態のままであった表2。WTとは異なり、cmt3LRHコントロール後代子孫はSPCHでメチル化されなかったが、メチル化は、パーセンテージを問わずLRHによって誘発されたcmt3LRHLRHおよびcmt3コントロールLRH植物。LRHLRH植物のSPCHでのメチル化の喪失については、RdDMの喪失を含め、幾つかの原因が考えられる。後代子孫からのトータルRNAの等量において、小型RNA二体鎖の完全相補体はLRHLRH植物では減少し図3、SPCHについての上流siRNAsの発現が減少した図3。これは、LRH誘発メチル化の遺伝性保持がRdDMに影響を及ぼした結果、繰り返されたストレス下で進行不可能になったことを暗示するものであった。これは、cmt3植物がメチル化をその後代子孫に伝達できなかったこととも一致する。世代を超えたDNAメチル化およびsiRNAsがコントロール環境で喪失しなかったので、親の生殖相間のゲノムのリセットおよびメチル化の再活性化よりもむしろ、後でのLRHストレス負担が原因となったことは間違いない。ここで、siRNAsの喪失は活発な脱メチル反応を引き起こす可能性がある。LRHLRH植物およびcmt3変異種LRHコントロールのSPCHで遺伝されたメチル化の喪失は、対称配列で明らかであった図1。met1の後続世代からの証拠は、メチル化CGの維持がシロイヌナズナ科シトシンデメチラーゼの発現に必要であること、および、脱メチル化CGが、DRM2を含むデノボ再メチル化から引き続き保護されることを示唆している。実生全体で、脱メチル化DNAグリコシラーゼのサイレンシング阻害剤1の転写物は、WT植物のLRHによって無効化され、LRHLRH植物では検出できなくなってそこではSPCHのCGメチル化が既に無効化いたが、世代を超えてメチル化した後代子孫で発現された043×コントロール、P0001。デメチラーゼDEMETERDMEの発現も同様に、WT植物ではLRHによって無効化され、LRH親のメチル化後代子孫では減少した074×コントロールが、LRHLRHでは大幅に増加した503×コントロール。両デメチラーゼの発現はmet1コントロール植物では検出不可能であったが、LRH処理によりmet1ではWTに対して増加したROS1103×、およびDME57×コントロール。これらのデータは、ストレスへの応答におけるCGメチル化の動的パターンを編成する際の脱メチル化での役割を示唆するものである。LRHはCGメチル化を誘発するが、ここでこれが複製され持続されない場合、デメチラーゼが、おそらくは、確率型のデノボのゲノム全般での非対称メチル化および表現型異常物増加に対抗する保護目的で誘発される。SPCH座では、CGメチル化の喪失は非対称メチル化での増加を引き起こさなかったが、met1におけるFWA座に関して既に証明されているように、SPCHのメチル化CGの喪失に関連したsiRNA転写物の減少があった。DMEはシロイヌナズナ科刷り込み遺伝子における母方の対立遺伝子の活性メチル化の原因となっており、生育中の種子では、中央細胞でのその発現が胚および胚乳ゲノムでの特異的メチル化を引き起こす。種子の生育中のDME介在型特異的組織脱メチル化は、TEsヘリトロンTE残余を含むの活性化および抑制、特異的siRNAの集積および分配ならびに極近接した遺伝子のメチル化と関連する。ここで提示されている発見は、類似のメカニズムが気孔前駆体細胞のSPCH座での遺伝的メチル化を動作させていることを強力に示唆している。ROS1もまた早期の段階で世代を超えたメチル化CGの活性脱メチル化に関わっていたことを除外することは不可能である。このことから、SPCHが脱メチル化済の時点でLRH-LRH実生でその検出が不可能であった理由が説明できる。しかしながら、このタイプの急速かつ進行型脱メチル化については、ROS1は他のDMEファミリーの酵素に比べ不適かもしれないという点に注意を要する。rdr2およびdcl3変異種はLRHで発芽しないので、TE関連siRNA集積およびそれに続くRdDMが、ストレス下での種子の適切な生育のために必要であると思われる。SPCHの遺伝性メチル化は、世代を超えてメチル化した親の後代子孫LRHコントロールコントロールでは喪失しており図1、脱メチル化した親の後代子孫LRHLRHコントロールでは、LRHストレス下で復活した図1。完全な標的SPCH遺伝子断片の予測性第1世代植物で特異的にメチル化されたは、3世代を通して高いままであったそれぞれ85、95および80。SPCHの転写開始部位での配列反復の下流にある1つの対称部位のメチル化ステータスは、その遺伝子の観察された処理親メチル化パターンおよびその発現を、高い忠実度で明らかにするものであった。反復配列自体はパーセンテージまたは処理を問わず、全標本植物で低メチル化した。全ての調査標本およびアンプリコン図1で、CpGはコントロール植物では常に非メチル化し、LRHではメチル化し、LRHコントロール後代子孫では世代を超えてメチル化した。この塩基で、LRHLRHにおける脱メチル化の予測性は71まで減少し第3世代でのメチル化の喪失および獲得の予測性はLRHコントロールコントロールではさらに55、LRHLRHコントロールでは43まで減少した。この部位での世代間LRH誘発メチル化の予測性の減少は、したがって、脱メチル化のプロセスと関連付けられた。SPCHでの遺伝に続くストレス下の脱メチル化と再建メチル化のプロセスは、異なる段階での核のコホートを引き起こすので、有系分裂および減数分裂の生殖で異なるメチル化ステータスを有する。換言するなら、先に提案したように、シトシンは脱メチル化の後に起こる再メチル化から保護されるが、この保護は不完全である。SPCHとは対照的に、FAMAでは、親植物によって呈示される特異的メチル化のパターンは、FAMAが全てのLRH植物でメチル化されるように、後代子孫で複製された図1。LRHコントロールの子孫の極一部5にFAMAの遺伝的メチル化の証拠が存在したが、これはそれほど予測できるものではなかった。FAMAの特異的メチル化生育中の植物の経験した育成条件によって優先的に決定され、SPCHとは異なり遺伝性は弱いものに過ぎなかった。遺伝子のCGメチル化はLRHLRHに存在し、LRHコントロール植物では第1世代のWTコントロールに対し緩和され、rdr6では不在だったただしrdr2ではそうでもなかった図1。このメチル化は、減数分裂の間に稀に放出された古いほうのPTGSイベントの顕著な特徴といえるものであったかもしれない。アッセイされたsiRNAsはLRHコントロール子孫に引き続き存在し、FAMA発現と正に相関したP0035R2080。ただし例外は遺伝子の21ntsiRNA転写物で、これらは今度はFAMAmRNAと逆相関したP0006R2098。このような実験から、減数分裂に先立つストレス誘導性RdDMが遺伝子メチル化のこのような放出に役割を果たすことが示唆される。タバコの場合のように、PTGS由来の遺伝子のメチル化の存在は、FAMA発現にもその放出にも影響を及ぼさなかった。全ての処理親条件で、FAMA発現はSPCHの発現および最終SIと高い相関関係があった。このことは、FAMAと気孔経路上流にある他の遺伝子との間の相互作用により説明がつく。これらの遺伝子は、用量依存的に、SPCHとFAMAのICE1SCRM2のヘテロダイマーパートナーおよびSPCH自体を含むその後の分裂を推進する。LRHLRH植物でのFAMAの発現の増加は、FAMAのデノボメチル化よりむしろ、SPCHの発現の増加により大きく推進されたと考えられ、CGメチル化の喪失およびsiRNA相補体の減少後のSPCHの再抑制と密接な関係がある。SPCH→FAMA気孔発生経路と相互作用する分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼシグナリングカスケードの2種のストレス関連キナーゼMKK7およびMKK9もまた、系統決定段階でSPCHプロモーターによって促進されるかあるいは孔辺母細胞でFAMAプロモーターによって促進されるかで、逆の結果をもたらすことが証明されたといえよう。気孔発生の通常の阻害剤を、気孔形成分裂を促進するために導入することができる。ここで提示されているデータは、植物体で、SPCHで一旦気孔系統に関係付けられると、メリステモイドの大部分が機能性孔辺細胞を形成することになり、これは、少なくともSPCHとFAMAの協調発現によるものである。LRHLRH植物のgsはSIの増加時に減少したが、これらの植物では、変形気孔腫、奇形前駆体または気孔のクラスターが、WT程は認められなかった。さらに、SPCHは気孔パターニング経路での幾つかの遺伝子の発現を調節し、YDA指令MAPK信号送受信滝の末端でのMPK3およびMPK6によるリン酸化用の基板となっている。したがってSPCHは、発生合図および環境合図を協調させるための重要なハブであり、それ自身がRdDMを介して環境ストレスに応答するように思われる。SPCHにおけるデノボおよび遺伝性のメチル化および脱メチル化のわずかな相互作用が、自身の親たちが経験した気孔発生中の同じストレスに対して後代子孫を効果的に免疫化したと考えられる。このことは、標的DNAメチル化によって媒介されている、世代を超えた適応刷り込み応答として説明することができる。LRHLRHおよびLRHコントロール後代子孫が、生物量および種子生産の増加という点で有利になったのは明らかである図2。これらの後代子孫のフィットネスプロファイルは、それらの親の経験にしたがって変更された。シロイヌナズナは自家受粉性一年生の種であり、個体群間の変異と比較して、個体群中では通常極わずかな遺伝的変異を包含することになるであろう。局地的には、個体群はしたがって生長条件の変動に順応するための可塑的弾性に依拠するところが大きいはずである。このコンテクストでみると、親の経験に照らして欠陥生理学的応答を中和する能力は、同系交配の個体群にとって、局地的な遺伝子的変異性の欠如を補う上でかなり有効であるといえよう。個体が多くの季節に渡って環境の変動に否応なく周期的にさらされる同系交配または無性生殖の多年生植物の間では、それが最も強固に適用されることが予想される。方法-要約提供されたシロイヌナズナHeynhLandsbergerectaの種子を、相対湿度RHが低い45グロースチャンバおよびコントロール65用グロースチャンバで育成して、種子を採取した。両方の処理を施された個々の親から採取した種子を、未処理の種子および、幾つかの周知のメチルトランスフェラーゼ変異種用に提供された種子と一緒に育成した。この実験は4回繰り返された。周知のRNAi変異種として提供された種子は、4度目に繰り返された実験で育成された。各回で、気孔密度気孔mm2および指数気孔を形成する表皮細胞のパーセンテージを成長の同じ段階で、背軸葉表面の刷を顕微鏡で調べることにより評価した。老化後に植物の乾燥重量、種子重量および種子数を評価した。標本DNAの重亜硫酸塩転換後に、処理および親子関係による特異的メチル化を、気孔形成経路における周知の遺伝子からのPCR生成物の高解像性解析によりスクリーニングした。標本ゲノムのメチル化部分を捕捉し、対象となる遺伝子の300bp断片について得られたDNAのqPCRを実施することによって、標的遺伝子の全長および上流を特異的メチル化について解析した。研究対象の標的遺伝子領域についての≧32のクローン化PCR断片の重亜硫酸塩シーケンシングによって、単独の塩基解析メチル化プロファイルが確認された。SPCHおよびFAMA発現レベルは、実生RNAで多重タンデムqPCRMTqPCRによって測定された。MTqPCRデータは、二標準曲線解析により標的遺伝子に対し同等の効果のあるハウスキーピング遺伝子との比較で解析された。多重siRNA発現は、溶液内交雑および特殊用途合成プローブを備えた強化小型RNAフラクションのRNase温浸法によって解析され、その後、保護されたプローブの電気泳動分離や定量化が行われた。方法-植物と育成環境シロイヌナズナLHeynh生態型LandsbergerectaLerrefNW20およびColumbiaCol0refN1092、MET1のメチルトランスフェラーゼ減メチル化2DNA、metlrefN854300、Chromomethylasecmt3refN6365およびDomainsrearrangedmethyltransferase12drmldrm2refN6366ならびにRNAi変異種としてRNA依存rnaポリメラーゼ2rdr2refN850602、RNA依存rnaポリメラーゼ6rdr6refN24285、ダイサー様3dcl3refN505512およびダイサー様4dcl4refN6954の種子は、NASCNottinghamUKから提供された。ARBC要綱に沿って、実生コンポストSinclairLincolnUKに播種し、発芽させ、環境を制御したグロースキャビネットSaxcilRKSaxtonBredburyCheshireUK内で収穫まで育成した。ただし、一方のキャビネットの相対湿度は45±5、他方のキャビネットの相対湿度は65±5に制御されていた。64日後の段階970で、各個体から種子を採取した。採取したLer種子、提供されたLer種子前述、および提供された変異種の種子前述を前記同様に播種し、発芽させて育成した。ただし、グロースキャビネットの交換を行い、層積処理は行わなかった。グロースチャンバ間のバラツキを抑えるため、4回繰り返された実験では各回で別々のグロースキャビネットを巡回させて用いた。目の細かさを段階的に変えた一連のメッシュで脱穀を行ってから、収穫された個々の植物の完全乾燥生物量および種子量の計量を行い、採取された種子のデジタル画像をEpsonPerfection3170scannerHemelHempsteadUKを用いて取り込むことによって、種子数を数えた。その後、ImageJsoftwareversion137を用いて、粒子の解析を行った。方法-気孔解析48体の植物処理親実験における3体の各親からの16体の複製植物それぞれから1枚の成熟したロゼッタ葉挿入6-8、長さ略40mmおよび1枚の茎出葉挿入13-15、長さ略15mmの全背軸表面の刷を作ることにより、反復実験毎に同じ生理学的段階650で気孔密度気孔mm2および指数気孔を形成する表皮細胞のパーセンテージを判断した。その後AxioVision31ImageAssociatesOxfordshireUKソフトウェアおよびImageJソフトウェア前述を用いて数えた単位面積毎の気孔およびその他の表皮細胞の数を用いて、AxiocamカメラCarlZeissLtdを搭載したAxioscope2顕微鏡からデジタル画像を取り込んだ。シロイヌナズナ科葉チャンバを備えたLcpro赤外線ガス解析器ADCBioScientificGreatAmwellUKを用い、12時間暗所の周囲RHで予備調整された6体の複製植物で、ガス交換水蒸気および瞬間リーフレベル水使用効率に対する気孔コンダクタンスの測定を行った。方法-DNAメチル化解析≧12の複製植物から得られた実生株第1本葉段階の全身、成熟葉および未成熟葉を液体窒素中で瞬間冷凍して-80°Cで貯蔵した。DneasyPlantminikitQiagenUKを用いて、メーカーの指示に従いDNAを抽出した。それから、2μgのゲノムのDNAを、EZDNAMethylationkitZymoResearchOrangeCAを用いて、メーカーの指示に従い、重亜硫酸塩処理により修飾した。脱硫処理したDNAを5分の1に希釈した。WojdaczTKDobrovicAMethylationsensitivehighresolutionmeltinganewapproachforsensitiveandhighthroughputassessmentofmethylationNucleicAcidsRes35No6e41この内容は参照のため本文中に全文記載されているにあるような処理でもって特異的メチル化を解析する目的で、高解像度溶解HRM解析が用いられた。ただし、20μlの各反応混合物は1×BiomixBiolineLondonUK、25μΜのSyto9染料InvitrogenCarlsbadCA、および、対象遺伝子用としてそれぞれ300nMのフォワードおよびリバース重亜硫酸塩特異プライマーを含有していた。用いられたPCR増幅条件は、95°Cで2分の後、95°Cで15秒および50°Cで30秒を50サイクル、60°Cで1分間保留して58~80°Cで0.5°Cs1からHRM。各遺伝子について、未処理のゲノムのDNA1000分の1に希釈が、等価物ただし重亜硫酸塩特異ではないプライマーを用いた正のコントロールとして含まれていた。処理による特異的メチル化は、RotorGene登録商標6000SeriesSoftwareversion17CorbettResearchUKLtdCambsUKを用いて、80の信頼度で特定された。特異的にメチル化したと推定的に特定された遺伝子について、アッセイが6~8回繰り返された。SPCHおよびFAMA遺伝子の特異的メチル化を示す正の結果を、MethylampMethylatedDNACaptureKitEpigentekCambridgeBioscienceCambridgeUKを用いてゲノムDNAのメチル化部分を捕捉しそのキットに設けられた負のコントロールIgマウス抗体を用いて比較qPCR解析を実施することで実証した。その後、SPCHおよびFAMA遺伝子の5’上流領域の600bpについて、またSPCHのゲノム領域の2.3kb上流について、コーディング領域の各300bpを標的とするようプライマーを設計した。qPCRおよびHRM条件は、上記の通りであった。ただし、15ngのテンプレートDNAが用いられ、Taは56°Cで、1分間保留の代わりに66°Cで6分間の延伸位相とした。HRMは68~90°Cからであった。塩基対解像メチル化プロファイルは、上記のように、重亜硫酸塩処理およびPCRの後で、プールした複製植物GeneserviceSourceBiosciencePLCNottinghamUK3標本毎に≧32のクローン化アンプリコンベクトルpCR21;InvitrogenCarlsbadCAをシーケンシングすることにより得られた。ただし、完全な重亜硫酸塩転換についての正コントロールとして、重亜硫酸塩処理に先立って各PCR生成物SigmaAldrichLtdGillinghamUK用の、メチル化および非メチル化シトシンを備えた5nM標識の合成DNAを2μgの標本DNAに添加した。特異的メチル化を、非修飾ゲノムDNA配列および処理間のシトシンからチミンへの転換の比較を参照して評価した。ClustalW2を用いて配列を一列に並べ、BioEditv7090を用いてエントロピーの逆数として予測性を計算した。HRM、qPCRおよびPCRの各ラウンドの後、生成物の標本を、AgilentBioanalyzerSeriesIIDNA1000chipAgilentWinnershUKを用いて寸法精密度および純度について解析した。方法-RNA発現解析RNeasyPlantMinikitQiagenUKを用い、メーカーの指示に従ってトータルRNAを凍結した葉材料から分離した。MultiplexedTandemPCR用のプライマーを、標的遺伝子SPCHおよびFAMA用として、ならびに内的コントロール遺伝子PP2AおよびSAND用として設計した。StanleyKKSzewczukEMultiplexedtandemPCRgeneprofilingfromsmallamountsofRNAusingSYBRgreendetectionNucleicAcidsRes3320el80この内容は参照のため本文中に全文記載されているにあるように、500ngの出発RNAを用いて、MTPCRを実施した。ただし、ここではSensimixQuantaceLondonUK逆転写酵素およびバッファーが用いられ、逆転写は45°Cで15分間、その後70°Cで15分間実行された。第1ラウンドの複合増幅は、ABI9700サーマルサイクラー内で、SybrPremixExTaqポリメラーゼTakaraBioEuropeSaintGermainenLayeFranceを用いて実施され、プライマー毎の最終的な容量は、200nMであった。PCRは、以下の条件下で実施された。すなわち、95°Cで1分、それから、95°Cで15秒、58°Cで20秒および72°Cで15秒を10~15サイクル実施した後に72°Cで7分であった。予備増幅生成物を1:1に希釈し、前述SybrPremixExTaqおよび内的プライマーならびに1μlテンプレートcDNAを用いて第2ラウンドのPCRを作成した。qPCRは、RotorGene登録商標6000サーマルサイクラーCorbettResearchUKLtdCambsUK内で、以下の条件を用いて実施された。すなわち、95°Cで1分、その後、95°Cで10秒、60°Cで20秒、および72°Cで8秒を40サイクルの後、0.5°Cs1で70~96°CからのHRMであった。全ての反応を3回繰り返して行い、対象遺伝子およびコントロールについての連続希釈を完了した。二標準曲線法を用いて遺伝子増幅能率およびRNA定量化前述を判断するのに、RotorGene登録商標6000Seriessoftwareversion17を用いた。PCRおよびqPCRの各ラウンドの後、生成物の標本を、寸法精密度および純度について、前述AgilentBioanalyzerDNA1000chipandkitを用いて解析した。方法-siRNA解析トータルRNAを、mirVanamiRNAisolationkitを用い、メーカーの指示にしたがって、実生標本から分離し、AgilentBioanalyzerRNA6000NanoandSmallRNAchipsandkitsを用いて点検および小型dsRNA標準NewEnglandBiolabsHitchinUKに対する定量化を行った。各標本からの200ngのトータルRNAを、分離キット前述を用いて小型RNAフラクション用に濃縮した。nt長の異なる標識無しアンチセンスRNAプローブを、SPCH、FAMAおよびローカルsmRNAs用のmirVanaprobeconstructionkitAmbionWarringtonUKを用いて設計および構築した。メーカーの指示に従い、mirVanaprobeconstructionkitAmbionWarringtonUKを用いた反応毎に≦4個のプローブが検出された。AgilentBioanalyzerSmallRNAchip前述および小型dsRNA標準ラダー前述を用いて、プローブを後標識化および蛍光可視化した。方法-プライマー設計DNAメチル化、RNAおよびsiRNA解析用のプライマー設計は、表1および3~5として記載されている。全てのプライマーはPrimer3softwareを用いて設計された。重亜硫酸塩特異的プライマーは、MethPrimersoftwareからの返還重亜硫酸塩特異的配列に基づくものであった。実施例2シロイヌナズナ科における低相対湿度により誘発された遺伝性後天的乾燥耐性親植物をコントロール相対湿度下で育成すると、短期間乾燥させることによって葉緑素含有量図4、Gen1、コントロールRHおよび総植物乾燥質量図5、GenlコントロールRHの顕著かつ重大な減少が生じた。対照的に、同じ遺伝子型を常時低い相対湿度LRH下で育成すると、同じく周期的な乾燥に遭わせたときに、そのような乾燥を経験しないコントロールと比べ、葉緑素含有量の減少が生じ図4、Gen1LRH、驚くべきことに、最終乾燥質量の増加にも関連した図5、Gen1コントロールRH。コントロール相対湿度にさらされた植物から採取された種子から作成された子孫は、コントロール条件では同様の反応を示し、葉緑素含有量図4、コントロールコントロールおよび最終乾燥生物量図5、コントロールコントロールの減少が顕著であった。特筆すべきことに、低相対湿度にさらされた親植物から採取された種子から作成された子孫は、同じ周期的な乾燥図4、LRHコントロールにさらされたときに葉緑素含有量が大幅に増加し、同様に総乾燥生物量図5、LRHコントロールも大幅に増加した。よって、親がLRHにさらされると、周期的な乾燥に対する子孫の応答が正方向に変化した。さらに特筆すべきことに、低相対湿度下で成長した親植物からの子孫が親と同レベルの低相対湿度にさらされると、葉緑素含有量図4、LRHLRHおよび乾燥生物量図5、LRHLRHでみると、それらの子孫は周期的な乾燥に対する感受性が低くなった。意外にも、第1世代からの低RH予備調整の効果は、葉緑素含有量図4、LRHコントロールコントロールおよび生物量図5、LRHコントロールコントロールでみると、コントロール条件下で育てられた場合、第3世代まで遺伝するものではないということであった。2回連続してLRH条件にさらされた後で乾燥を伴うまたは伴わないコントロール条件にさらされた第3世代は、LRHコントロール処理と略同様の反応を示した図4および5。デノボメチル化drm12用および余分にメチル化の維持cmt3の変異種は、同様にコントロールRHで乾燥の影響を受けたが、drm12変異種のみが低RH予備調整のおかげで生き残った。よって、親植物を可変的な相対湿度条件にさらすと、その世代およびその後の世代では周期的な乾燥への後成的な応答の変化が引き起こされることになった。方法-植物と育成環境シロイヌナズナLHeynh生態型LandsbergerectaLerrefNW20、Chromomethylasecmt3refN6365およびDomainsrearrangedmethyltransferase12drmldrm2refN6366の種子が、NASCNottinghamUKから提供された。ARBC要綱に沿って、苗床SinclairLincolnUKに播種し、発芽させ、制御環境グロースキャビネットSaxcilRKSaxtonBredburyCheshireUK内で収穫まで育成した。ただし、一方のキャビネットの相対湿度は45±5、他方のキャビネットの相対湿度は65±5に制御されていた。採取したLer種子、提供されたLer種子前述、および提供された変異種の種子前述を先にコントロールRH下で播種し、発芽させて育成した。ただし、各遺伝子型からの植物に対し40日半後に、4日間水遣りを控えることによる乾燥処理を行った。この処理の後、64日目に各個体から種子が収穫されるまで、水遣りを再開した。グロースキャビネットを取り替え、層積処理は行われなかった。グロースチャンバ間のバラツキを抑えるために、4度繰り返された実験では各回で別々のグロースチャンバSanyoGallenkampLoughboroughUKを巡回させて用いた。各回で、同じ生長段階での気孔密度気孔mm2および指数気孔を形成する表皮細胞のパーセンテージを、背軸表面の刷を顕微鏡で検査することにより評価した前述。目の細かさを段階的に変えた一連のメッシュで脱穀を行ってから、採取された種子のデジタル画像をEpsonPerfection3170scannerHemelHempsteadUKを用いて取り込むことによって、収穫された個々の植物の完全乾燥生物量および種子量の計量を行い、種子数を数えた。その後、ImageJsoftwareversion137を用いて、粒子の解析を行った。実施例3:シロイヌナズナ科子孫における病原体灰色カビ病菌に対する遺伝的抵抗性の増加シロイヌナズナ科植物は、灰色カビ病菌の病原株を接種したとき、特異な病気抵抗性遺伝子の発現を活性化することにより短期間で応答することが判明した。それと同時に、植物ゲノムの全体的なメチル化パターンも変化する。しかしながら特筆すべきことに、これらの植物から採取された種子は、接種時に病原体に対しより高い抵抗性を呈示する。用いられている植物は同系交配が進んでいるため、子孫は、遺伝子的にみると親と実質的に同一になる。第2世代野生型植物を、メチル化レベルの何らかの変化が次の世代に伝達されるかどうかを比較する目的で播種した。形態学的データから、野生型Langsbergerecta遺伝子型において灰色カビ病菌への抵抗性が世代を超えて後天的に増加することが明らかになった。一方で、メチル化変異種の場合はいずれも、抵抗性にそのような増加がみられなかった図6。ジェネレーション2の植物を、灰色カビ病菌で処理した。写真には、Langsbergerectaでの接種から3日後の真菌感染によって生じた病巣が示されている。非接種植物Aの子孫、接種植物Bの子孫。矢印は、接種された葉を示す。非接種植物の子孫C、非接種植物の子孫Dから採った接種葉の細部。CpHpGモチーフ上のメチル化に感受性のある酵素コンビネーションMspIEcoRIとのMSAPを用いた灰色カビ病菌の感染により誘発された全体的なメチル化変化の解析では、感染植物および非感染植物との間に大きな差異が認められなかった図7。逆に、CpHpGおよびCpGモチーフ上のメチル化に感受性のある酵素コンビネーションHpaIIEcoRIが用いられたとき、遺伝子型drml2およびchrlが、ボトリチス属の感染により誘発された全体的なDNAメチル化で大きな変化を示した。驚くべきことに、遺伝子型野生型Laerおよびkyp2の処理の間で差異は認められなかった。一方で遺伝子型cmt37は、ボトリチス属に感染した標本と非感染の標本との間である程度の有意ではない差を示した図8。特筆すべきことに、ボトリチス属感染に関する全体的なDNAメチル化で観察された変化は、上記の後天的に増加した抵抗性と逆相関することが判明した。これらの結果は、DNAメチル化の維持が、後天的な抵抗性を形成するのに必要であることを示唆するものである。方法-植物および育成環境シロイヌナズナLHeynh生態型LandsbergerectaLerrefNW20および変異種ChromatinremodelingATPaseCHR1refN30937、Chromomethylasecmt3refN6365およびDomainsrearrangedmethyltransferase12drmldrmlrefN6366およびKryptonite2KYP2refN6367の種子を、EuropeanArabidopsisStockCentreから入手した。植物を、24個のセルトレイで、実生コンポストSinclairLincolnUKで育成した。4cm×4cmのセル毎に1体の植物を入れて、ARBC要綱に従って発芽させ、制御環境のグロースキャビネットSaxcilRKSaxtonBredburyCheshireUK内で収穫まで育成した。底面給水ができるように、セルの1つを除去した。種子を4°Cで発芽させ、制御環境のグロースルーム内で実験条件に移すまでフレーム内で1週間育成した。開花させないように8時間の光周期約70μmolm2s下22°Cで植物を育成した。64日後、段階970で、各個体から種子を収穫した。目の細かさを段階的に変えた一連のメッシュで脱穀を行ってから、採取された種子のデジタル画像をEpsonPerfection3170scannerHemelHempsteadUKを用いて取り込むことによって、収穫された個々の植物の完全乾燥生物量および種子量の計量を行い、種子数を数えた。その後、ImageJsoftwareversion137を用いて、粒子の解析を行った。ジェネレーション0G0植物材料全体でメチル化のレベルを均質にしかつ標準化するために、ジェネレーション0遺伝子型毎に植物5体を標準的な条件、すなわち、24°Cの短日8時間明/16時間暗、光度100μmolm2s1、で育成した。その結果、種子の貯蔵条件の多様性により生じ得る後成変異の可能性を排除することが可能となった。ジェネレーション0の各遺伝子型のそれぞれ単独の植物から得られた種子を、後続の部分実験、すなわち、ジェネレーション1G1の育成に用いた。植物材料全体で遺伝子の均質性を確実に最大レベルにするために、単独の個体から種子を採取した。収穫されたLer種子、提供されたLer種子、および収穫された変異種種子と変異種として提供された種子である。前述のように種子を播種し、発芽させ育成した。ただし、グロースキャビネットは交換された。ジェネレーション1G14個のトレイに植物92体を植え付けた。植物のトレイを、2種類の処理灰色カビ病菌の接種およびコントロールに無作為に割り当てた。発芽の5週間後に、植物に寄生灰色カビ病真菌iMi169558株、InternationalMycologicalInstituteKewUKを接種した。植物を、1×105芽胞mL1懸濁液で処理した。すなわち、ピペットを用いて、それらが確実に同じ生育段階にあるようにするため葉No.5の上面に直接2滴たらした。接種の7日後、葉No.6を、処理毎に半数の植物から標本として採取し、標本を採取した植物を廃棄した。残りの個体のうち5体から種子を採取し、処理によって誘発される後成の変異性がはっきり分かるようにプールした。それらは収穫されたLer種子、提供されたLer種子および収穫された変異種種子、変異種用に提供された種子である。前記のように種子を播種し、発芽させて育成した。ただし、後の部分実験、つまりジェネレーション2G2の育成でグロースキャビネットを交換した。ジェネレーション2G28個のトレイに植物を植え付けた184体。上記同様、植物のトレイを、2種類の処理灰色カビ病菌の接種およびコントロールに無作為に割り当てた。処理済および未処理の植物から得られた種子から成長した植物に、上記のように再度菌を接種した表6参照。接種の5日後に、資料管理および画像解析目的で遺伝子型G1-G2処理グループのそれぞれについて、植物の全身および接種された葉を撮影した。真菌感染に対する感受率または抵抗性を、灰色カビ病菌接種から生じた病巣の寸法および強度を測定することにより評価した。接種の7日後に、処理別に半数の植物から葉No.6を標本として採取し、標本を採取した植物を廃棄した。残りの個体のうち5体から種子が採取され、処理によって誘発される後成の変異性がはっきりわかるようにプールされた。ジェネレーション2植物については特に、同じG2処理グループ内で異なるバックグラウンドG1処理に関連した形態学的変化をみた。方法-DNA抽出Quiagenのキットを用い、メーカーの指示に従って、全DNA抽出が実施された。DNeasy商品名plantminikitを用いて、処理毎に46体の植物中23体のシロイヌナズナ標本からDNAを抽出した。下記の試薬はいずれもこのキットに由来する。植物組織約100mgを、1.5mlマイクロ遠心管に入った液体窒素中で鋏を用いて粉砕した。組織が融解しないよう、直ちに、65°Cまで予備加熱した400μlのリーシスバッファーAP1および4μlのRNaseAを各遠心管に添加した。管を上下逆にして内容物を混ぜ、2~3分おきに混ぜながら65°Cで10分間培養した。引き続き、130μlのAP2バッファーを各標本に添加し、遠心管を氷の上で5分間培養してタンパク質と多糖類を析出させた。それから遠心管を5分間13,000rpmで遠心分離にかけ、粘性溶解物およびその他の固形物を析出させた。それから上澄み液をQIAshredder商標カラムシリカゲルマトリックス入に移し替えて13,000rpmで2分間遠心分離することで、析出物および細胞破壊片を除去した。カラムのフロースルーを集めて新しい試験管に移し替え、0.5容積の洗浄バッファーおよび1容積のエタノールと混合した。この混合物を第2のDNeasyミニスピンカラムに移し替え、8,000rpmで1分間遠心分離した。DNA分子がカラム上に残留するので、フロースルーを廃棄した。8,000rpmの1分間遠心分離でカラムに500μlの洗浄バッファーAWを通過させることにより、結合DNAを2度洗浄した。その後、65°Cに予備加熱した100μlのバッファーAEを添加しかつ室温で5分間培養してから、13,000rpmで1分間遠心分離することによって、皮膜を乾燥させた。方法-アガロースゲルによる定量化DNAのアリコート1~5μlを1w/vアガロースゲル電気泳動にかけて、存在するDNAの質および量を判断した。ゲルの製造にあたっては、適量のアガロースを適切な容積の1×TAEバッファートリスアセテートを40mM、EDTAを1mMに溶解させ、その後、アガロースが全て溶融するまで電子レンジ内で加熱した。ゲル溶液を50°Cまで冷却してから10mg/mlの臭化エチジウムを、最終濃度が0.35μg/mlになるまで添加し、適切なコームを設置したキャスティングトレイに注ぐことによりローディングウェルを作成した。硬化時に、ゲルを、陰極端にゲルコームを備えた水平電気泳動装置に移し替えた。ゲルコームを除去し、十分な1×TAEバッファーを電極チャンバに添加してゲルを約1mmまで被覆した。製造されたDNA標本5μlDNA:1μlブルーローディング染料[0.23w/vブロモフェノールブルー、60mMのEDTA、40w/vの蔗糖]をそれからゲルウェルにローディングした。HyperLadderllBioline、BIO33040サイズマーカーをフランキングレーンにローディングした。ゲルを3~5V/cm範囲の定電圧で15~60分間電気泳動にかけた。UVトランスイルミネーター波長320nmを用いてDNAを可視化した。方法-メチル化感受性増幅断片長多型処理毎に無作為に選択された8つのDNA標本上でメチル化感受性増幅断片長多型AFLPを実施した。Vosetal1995に記載されているAFLPプロトコルを根拠としつつも、同じ認識モチーフを標的とするアイソシゾマーが用いられた。同技術の基本は、ポリメラーゼ連鎖反応PCR増幅を介してゲノムDNAの制限された断片を検出することである。それにより、限られた遺伝子プライマーのセットを用いていかなる起点または複合体のDNAからも指紋の作成が可能となり、配列の予備知識を必要としない。メチル化に感受性のある制限酵素の使用により、この方法をメチル化の検出に適用できるようになっている。そのDNAは、2つの制限酵素、すなわち、シトシンメチル化に感受性のあるコモンカッター1つとレアカッター1つによって制限された。2つの別々の制限は、異なるタイプのシトシンメチル化に感受性のあるコモンカッターのアイソシゾマーを用いて実施された。酵素は全て、カナダのFermentasから入手したものである。MspI酵素:配列5CCGG3の2つのシトシン間の切断およびその作用は最初のC上のメチル化によって防止されるのであり、2番目のC上のメチル化によってではない。Hpall酵素:配列5CCGG3の2つのシトシン間の切断およびその作用は2番目のC上のメチル化によって防止されるのであり、最初のC上のメチル化によってではない。制限部位に特異的なアダプターをDNA表面に連結反応させることにより、遺伝子プライマーで断片を増幅することが可能になり、配列情報を最初に入手する必要はない。酵素は全てFermentas製、アダプターはSigmaGenosysLtd製である。アダプターミックスは、1nMのEcoRIアダプターと10nMのMspIHpaIIアダプターとを組み合わせることにより作成された。増幅ラウンドは、EcoRI末端に対応する1つのオリゴヌクレオチドプライマーおよびMspIHpaII末端に対応する1つのオリゴヌクレオチドプライマーとを用いて実施された。増幅の第1ラウンドは、プライマーの3末端で余分な塩基を1つ添加することにより、候補の断片の数を減少させ、その一方で、増幅の第2ラウンドは、プライマーの3末端で1個か2個の追加塩基を添加することにより候補の断片の量をさらに減少させる。第2ラウンドのEcoRIプライマーが6Famカルボキシフルオレセインと標識され、それにより生成物の可視化が実現した。選択的増幅ステップの生成物を、AppliedBiosystemsGeneticAnalyzerで処理した。その結果はGeneMapper解析ソフトウェアを用いて可視化および解明され、さらなる解析のためMicrosoftExcelにデータ転送された。AFLPプロトコル内部の各バンドは、単独の座の単独の対立遺伝子であると考えられた。各処理についてまず、それぞれの座についての対立形質素性を、各複製個体について、1存在または0不在というシンプルな定性法で割り当てた。その座の個体の対立遺伝子のプロファイルが3以上の個体間で異なる場合、1つの座は1対のストレス処理間で、またはコントロールとストレス処理間で異なる例えば、11111111対11111000は異なるが、11111111対00111111はそうではないと考えられるかもしれないと考えられた。多変量解析主座標解析が、GenAlexhttpwwwkovcompcoumvspを用いて実施された。AFLPの性質が優勢である結果、例えば、細胞型特異メチル化変化のため個体間後成変異の一部は存在/不在スコアに捕捉されない。しかしながら、これらの変化は断片ピーク強度における有意義な変異に貢献するかもしれない。例えば、AFLPプロトコルにおけるPCRステップのせいで当初の断片コピー数とピーク高さとの関係が直線状でなくてもRodriguezLopezetal2004、Verhoevenetal2009、強度データが、定量解析を用いて捕捉可能な後成の変異についての生物学的な情報を、少なくともいくらか含有しているかもしれないCastiglionietal、1999;Klahretal、2004。従って第2のアプローチは、MSAFLPマーカー存在/不在スコアリングでは単一形の更に小さいセットを定量的に解析するのに用いられ、それについての、断片強度スコアが、GeneMapperソフトウェアを用いて得られた。各断片ピーク高さスコアを、各標本から得られた全断片のトータル蛍光値で除算することにより、強度の素点を規格化した。この規格化は、例えば、標本間の当初のDNA濃度のわずかな差異の結果としての、標本間の強度スコアにおける総合的な差異の根拠となる。規格化された強度は、Minitab152PilliterriLJSloanDBBogenschutzNLToriiKUTerminationofasymmetriccelldivisionanddifferentiationofstomataNature4455015053HetheringtonAMWoodwardFITheroleofstomatainsensinganddrivingenvironmentalchangeNature4249019084MiyazawaSILivingstonNJTurpinDHStomataldevelopmentinnewleavesisrelatedtothestomatalconductanceofmatureleavesinpoplarJofExpBot573733805SekiyaNYanoKStomataldensityofcowpeacorrelateswithcarbonisotopediscriminationindifferentphosphoruswaterandCO2environmentsNewPhytol1797998076BergerDAltmannTAsubtilisinlikeserineproteaseinvolvedintheregulationofstomataldensityanddistributioninArabidopsisthalianaGenesDev14111911317vonGrollUBergerDAltmannTThesubtilisinlikeserineproteaseSDD1mediatescelltocellsignalingduringArabidopsisstomataldevelopmentPlantCell14152715398NadeauJASackFDControlofstomataldistributionontheArabidopsisleafsurfaceScience296169717009BergmannDCLukowitzWSomervilleCRStomataldevelopmentandpatterncontrolledbyaMAPKKkinaseScience3041494149710ShpakEDMcAbeeJMPillitteriLJToriiKUStomatalpatterninganddifferentiationbysynergisticinteractionsofreceptorkinasesScience30929029311MacAlisterCAOhashiItoKBergmannDCTranscriptionfactorcontrolofasymmetriccelldivisionsthatestablishthestomatallineageNature44553754012MolinierJRiesGZipfelCHohnBTransgenerationmemoryofstressinplantsNature4421046104913JonesLRatcliffFBaulcombeDCRNAdirectedtranscriptionalgenesilencinginplantscanbeinheritedindependentlyoftheRNAtriggerandrequiresMet1formaintenanceCurrentBiology1174775714SazeHScheidOMPaszkowskiJMaintenanceofCpGmethylationisessentialforepigeneticinheritanceduringplantgametogenesisNatureGenetics34656915MathieuOReindersJCaikovskiMSmathajittCPaszkowskiJTransgenerationalstabilityoftheArabidopsisepigenomeiscoordinatedbyCGmethylationCell13085186216ZhangXetalGenomewidehighresolutionmappingandfunctionalanalysisofDNAmethylationinArabidopsisCell1261189120117ZilbermanDGehringMTranRKBallingerTHenikoffSGenomewideanalysisofArabidopsisthalianaDNAmethylationuncoversaninterdependencebetweenmethylationandtranscriptionNatureGenet39616918CokusSJetalShotgunbisulphitesequencingoftheArabidopsisgenomerevealsDNAmethylationpatterningNature45221521919ListerRetalHighlyintegratedsinglebaseresolutionmapsoftheepigenomeinArabidopsisCell13352353620OhashiItoKBergmannDCArabidopsisFAMAcontrolsthefinalproliferationdifferentiationswitchduringstomataldevelopmentPlantCell182493250521FinneganEJDennisESIsolationandidentificationbysequencehomologyofaputativecytosinemethyltransferasefromArabidopsisthalianaNuclAcidsRes212383238822KishimotoNetalSitespecificityoftheArabidopsisMET1DNAmethyltransferasedemonstratedthroughhypermethylationofthesupermanlocusPlantMolBiol4617118323CaoXJacobsenSERoleoftheArabidopsisDRMmethyltransferasesindenovoDNAmethylationandgenesilencingCurrBiol121138114424CaoXetalRoleoftheDRMandCMT3methyltransferasesinRNAdirectedDNAmethylationCurrBiol132212221725LindrothAMetalRequirementofCHROMOMETHYLASE3formaintenanceofCpXpGmethylationScience2922077208026BarteeLMalagnacFBenderJArabidopsiscmt3chromomethylasemutationsblocknonCGmethylationandsilencingofanendogenousgeneGenesDev151753175827WasseneggerMHeimesSRiedelLSangerHLRNAdirecteddenovomethylationofgenomicsequencesinplantsCell7656757628WasseneggerMPelissierTAmodelforRNAmediatedgenesilencinginhigherplantsPlantMolBiol3734936229ChanSWLetalRNAsilencinggenescontroldeNovoDNAmethylationScience303133630DaxingerLetalAstepwisepathwayforbiogenesisof24ntsecondarysiRNAsandspreadingofDNAmethylationEMBOJ28485731MetteMFAufsatzWvanderWindenJMatzkeMAMatzkeAJMTranscriptionalsilencingandpromotermethylationtriggeredbydoublestrandedRNAEMBOJ195194520132VaistijFEJonesLBaulcombeDCSpreadingofRNAtargetingandDNAmethylationinRNAsilencingrequirestranscriptionofthetargetgeneandaputativeRNAdependentRNApolymerasePlantCell1485786733XieZetalGeneticandfunctionaldiversificationofsmallRNApathwaysinplantsPloSBiol20642065234EamensAVaistijFEJonesLNRPD1aandNRPD1barerequiredtomaintainposttranscriptionalRNAsilencingandRNAdirectedDNAmethylationinArabidopsisPlantJournal5559660635GasciolliVMalloryACBartelDPVaucheretHPartiallyredundantfunctionsofArabidopsisDICERlikeenzymesandaroleforDCL4inproducingtransactingsiRNAsCurrBiol151494150036KasschauKDetalGenomewideprofilingandanalysisofArabidopsissiRNAsPLoSBiol5e5737RajagopalanRVaucheretHTrejoJBartelDPAdiverseandevolutionarilyfluidsetofmicroRNAsinArabidopsisthalianaGenesDev203407342538AxtellMJJanCRajagopalanRBartelDPAtwohittriggerforsiRNAbiogenesisinplantsCell12756557739FahlgrenNetalHighthroughputsequencingofArabidopsismicroRNAsEvidenceforfrequentbirthanddeathofMIRNAGenesPLoSONE2e21940HowellMDetalPhasingpatternsandgenomewideprofilesofRDR6DCL4dependentsmallRNAsinArabidopsisPlantCell1992641SwarbreckDetalTheArabidopsisInformationResourcegenestructureandfunctionannotationNucleicAcidsRes36D1009D101442TranRKetalChromatinandsiRNApathwayscooperatetomaintainDNAmethylationofsmalltransposableelementsinArabidopsisGenomeBiol6R90doi101186gb2005611r9043HendersonIRJacobsenSETandemrepeatsupstreamoftheArabidopsisendogeneSDCrecruitnonCGmethylationandinitiatesiRNAspreadingGenesDev221597160644SoppeWJetalThelatefloweringphenotypeoffwamutantsiscausedbygainoffunctionepigeneticallelesofahomeodomaingeneMolCell679180245LippmannZetalRoleoftransposableelementsinheterochromatinandepigeneticcontrolNature43047147646KinoshitaYetalControlofFWAgenesilencinginArabidopsisthalianabySINErelateddirectrepeatsPlantJournal49384547ChanSWLZhangXBernatavichuteYVJacobsenSETwosteprecruitmentofRNAdirectedDNAmethylationtotandemrepeatsPloSBiol4e36348TexeiraFKetalAroleforRNAiintheselectivecorrectionofDNAmethylationdefectsScience3231600160449GehringMBubbKLHenikoffSExtensivedemethylationofrepetitiveelementsduringseeddevelopmentunderliesgeneimprintingScience3241447145150HsiehTFetalGenomewidedemethylationoftheArabidopsisendospermScience3241451145451PentermanJetalDNAdemethylationintheArabidopsisgenomePNAS1046752675752PonferradaMarinMIRoldanArjonaTArizaRRROS15methylcytosineDNAglycosylaseisaslowturnovercatalystthatinitiatesDNAdemethylationinadistributivepatternNucleicAcidsRes374264427453LunerovaBedrichovaJetalTransgenerationinheritanceofmethylationpatternsinatobaccotransgenefollowingaposttranscriptionalsilencingeventPlantJournal541049106254KanaokaMMetalSCREAMICE1andSCREAM2specifythreecellstatetransitionalstepsleadingtoArabidopsisstomataldifferentiationPlantCell201775178555LampardGRLukowitzWEllisBEBergmannDCNovelandexpandedrolesforMAPKsignalinginArabidopsisstomatalcellfaterevealedbycelltypespecificmanipulationsPlantCell213506351756WhittleCAOttoSPJohnstonMOKrochkoJEAdaptiveepigeneticmemoryofancestraltemperatureregimeinArabidopsisthalianaBotany8765065757BoyesDCetalGrowthstagebasedphenotypicanalysisofArabidopsisamodelforhighthroughputfunctionalgenomicsinplantsPlantCell131499151058WojdaczTKDobrovicAMethylationsensitivehighresolutionmeltinganewapproachforsensitiveandhighthroughputassessmentofmethylationNucleicAcidsRes35No6e4159WhiteHEHallVJCrossNCPMethylationsensitivehighresolutionmeltingcurveanalysisoftheSNRPNgeneasadiagnosticscreenforPraderWilliandAnglemansyndromesClinicalChemistry531960197560OrdwayJMetalIdentificationofnovelhighfrequencyDNAmethylationchangesinbreatcancerPloSONE2e1314doi101371journalpone000131461StanleyKKSzewczukEMultiplexedtandemPCRgeneprofilingfromsmallamountsofRNAusingSYBRgreendetectionNucleicAcidsRes3320e18062CzechowskiTStittMAltmannTUdvardiMKScheibleWRGenomewideidentificationandtestingofsuperiorreferencegenesfortranscriptnormalizationinArabidopsisPlantPhysiol13951763LarkinMAetalClustalWandClustalXversion20Bioinformatics232947294864HallTABioEditauserfriendlybiologicalsequencealignmenteditorandanalysisprogramforWindows9598NTNuclAcidsSympSer41959865LiLCDahiyaRMethPrimerdesigningprimersformethylationPCRsBioinformatics18142731"