架橋構造により安定化された二次構造を有するペプチドであって、以下の式で表される特殊アミノ酸と、側鎖にスルファニル基を有するアミノ酸との組を少なくとも1つを含み、式中、Aは、単結合、又は主鎖の原子数が1-10である連結基を示し;Bは、少なくとも一つのπ結合を含む基を示し;Cは、水素原子、又は置換基で置換されていてもよいアルキル基を示し;Xは、スルファニル基による置換反応で置換されうる基を示す。前記特殊アミノ酸残基の側鎖と、前記スルファニル基とのチオエーテル結合による架橋構造が形成されている、ペプチド。前記式Iにおいて、Aは、単結合;置換基で置換されていてもよい、炭素数1-10のアルキレン基、炭素数2-10のアルケニレン基、又は炭素数2-10のアルキニレン基;主鎖の1-2個の炭素原子が、酸素原子、窒素原子、若しくは硫黄原子に置換された、置換基で置換されていてもよい、主鎖の原子数が10以下のアルキレン基、アルケニレン基、及びアルキニレン基からなる群より選択され、Bは、-C≡C-、-C=C-、-Ar-、-Ar-Ar-、-Ar-C≡C-、-Ar-C=C-、-NHCO-、-CO-、-Ar-NHCO-、-Ar-CO-からなる群より選択され、Cは、水素、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、及びペンチル基からなる群より選択され、Xは、Cl、Br、I、-OSO2Me、トシル基、ノシル基、-OSO2-Ar-R式中、RはCH3、NO2、CF3及びHからなる群より選択される基を表す。からなる群より選択される、請求項1に記載のペプチド。前記式Iの特殊アミノ酸が、以下の式II~IVのいずれかで示される、式中、mは1~10から選択される整数を示し、Cl、Br、I、-OSO2Me、トシル基、ノシル基、-OSO2-Ar-R式中、RはCH3、NO2、CF3及びHからなる群より選択される基を表す。からなる群より選択される。請求項1又は2に記載のペプチド。前記スルファニル基を有するアミノ酸が、システイン、並びに以下の式V及びVIで表されるシステインアナログからなる群より選択される、請求項1から3のいずれか1項に記載のペプチド。前記特殊アミノ酸残基と、前記側鎖にスルファニル基を有するアミノ酸残基とが、各組において、2、3、6又は10アミノ酸残基隔てて配置されている、請求項1から4のいずれか1項に記載のペプチド。架橋構造により安定化された二次構造を有するペプチドの製造方法であって、iスルファニル基を側鎖に持つアミノ酸、および、以下の式I式中、Aは、単結合、又は主鎖の原子数が1-10である連結基を示し;Bは、少なくとも一つのπ結合を含む基を示し;Cは、水素原子、又は置換基で置換されていてもよいアルキル基を示し;Xは、スルファニル基による置換反応で置換されうる基を示す。で表される特殊アミノ酸の組が、少なくとも1つ分子内に配置された特殊ペプチドを翻訳によって合成する工程;及びii前記各組において前記スルファニル基と式Iの特殊アミノ酸の側鎖をチオエーテル結合させて架橋構造を形成する工程、を含む前記方法。前記スルファニル基を側鎖に持つアミノ酸と式Iの特殊アミノ酸が、各組において、2、3、6、または10アミノ酸残基隔てて配置される、請求項6に記載の方法。前記の翻訳合成工程が、式Iの特殊アミノ酸をtRNAに連結して得られるアミノアシルtRNAを利用して、該特殊アミノ酸をコードする改変コドンを有する鋳型mRNAを翻訳することを含む、請求項6又は7に記載の方法。前記スルファニル基を側鎖に持つアミノ酸が改変コドンでコードされる特殊アミノ酸であり、前記の翻訳合成工程が、式Iの特殊アミノ酸及び該スルファニル基を側鎖に持つ特殊アミノ酸をそれぞれtRNAに連結して得られるアミノアシルtRNAを利用して、それぞれの特殊アミノ酸をコードする改変コドンを有する鋳型mRNAを翻訳することを含む、請求項8に記載の方法。前記アミノアシルtRNAは、アシルtRNA合成酵素様活性を持つRNA触媒を用いて特殊アミノ酸をtRNAに連結して得られたものである、請求項8または9に記載の方法。前記式Iで示される特殊アミノ酸が、以下の式II~IVのいずれかで示される、請求項6~10のいずれか1項に記載の方法。前記スルファニル基を有するアミノ酸が、システイン、並びに以下の式V及びVIで示されるシステインアナログからなる群より選択される、請求項6~11のいずれか1項に記載の方法。請求項1から5のいずれか1項に記載のペプチドを2種以上含む、ペプチドライブラリー。前記各ペプチドが、それをコードするmRNAと連結されている、請求項13に記載のペプチドライブラリー。請求項13に記載のペプチドライブラリーを構築する方法であって:iランダムなアミノ酸配列をコードするRNA中に、スルファニル基を側鎖に持つアミノ酸を指定するコドン、および、請求項1に記載の式Iで表される特殊アミノ酸を指定するコドンの組を少なくとも一つ含み、各組においてスルファニル基を側鎖に持つアミノ酸を指定するコドンと式Iの特殊アミノ酸を指定するコドンが、2、3、6、または10アミノ酸単位隔てて配置されているmRNAのライブラリーを調製する工程;ii前記特殊アミノ酸を連結したtRNAを含む無細胞翻訳系で前記mRNAを翻訳して、ランダム配列中に前記特殊アミノ酸が配置されたペプチドの集合体を得る工程;及び各ペプチドにおいてスルファニル基と式Iの特殊アミノ酸の側鎖を結合させて架橋構造を形成する工程、を含む方法。請求項14に記載のペプチドライブラリーを構築する方法であって:請求項15に記載の工程において、さらに、mRNAの3’末端にピューロマイシンを結合させ、ピューロマイシン結合mRNAライブラリーを得る工程;、工程において、前記ピューロマイシン結合mRNAライブラリーを無細胞翻訳系で発現させ、ランダム配列中に前記特殊アミノ酸が配置されたペプチド-mRNA複合体を得る工程;及び工程を行う工程、を含む方法。式Iの特殊アミノ酸を指定する改変コドンがAUGコドンであり、mRNAランダム配列が、NNCまたはNNU配列NはAUGCのいずれか一つの塩基を表す。のいずれかのトリプレットの繰り返しからなる、請求項15又は16に記載の方法。以下の式で表される特殊アミノ酸。式中、Aは、単結合、又は主鎖の原子数が1-10である連結基を示し;Bは、少なくとも1つの炭素原子間の二重結合を含む基、少なくとも1つの炭素原子間の三重結合を含む基、又は少なくとも1つの芳香環を含む基を示し;Cは、水素原子又は炭素数が1-3である置換基を有していてもよいアルキル基を示し;Xは、スルファニル基による置換反応で置換されうる基を示す。請求項13又は14に記載のペプチドライブラリーから標的タンパク質に結合するペプチドを選択する方法であって、ペプチドライブラリーを標的タンパク質に接触させ、インキュベートする工程;及び標的タンパク質に結合するペプチド分子を選択する工程、を含む方法。請求項13又は14に記載のペプチドライブラリーから標的タンパク質の分子間相互作用に対する阻害活性を有するペプチドを選択する方法であって、請求項19に記載の工程及びを含む、標的タンパク質に結合するペプチドを選択する一次スクリーニング、および一次スクリーニングで選択されたペプチドの標的タンパク質の分子間相互作用に対する阻害活性を評価し、前記ペプチドが標的タンパク質の分子間相互作用に対する阻害活性を有するペプチドであることを決定する二次スクリーニング、を含む方法。標的タンパク質に結合するペプチドの製造方法であって:請求項14に記載のペプチドライブラリーを標的タンパク質に接触させ、インキュベートする工程;標的タンパク質に結合するペプチド-mRNA複合体を選択する工程;選択されたペプチド-mRNA複合体のmRNAを増幅し、ペプチド-mRNA複合体を得る工程;~を1回以上繰り返して、親和性の高いペプチド-mRNA複合体を濃縮する工程;及びで濃縮されたペプチド-mRNA複合体のmRNAからペプチドを発現させる工程、を含む方法。標的タンパク質がアポトーシスを抑制する分子である、請求項19~20のいずれか1項記載の方法。本発明は、翻訳合成条件下で架橋構造形成が自発的に起きるように設計された特殊アミノ酸をペプチド鎖に翻訳導入することで得られる、安定化された二次構造をもつペプチドを提供すること等を課題とする。本発明者らにより近年開発された遺伝暗号のリプログラミングによる特殊ペプチド合成技術を利用して、スルファニル基SH基を側鎖にもつシステインあるいはその類縁体と反応し得る側鎖をもつ特殊ペプチドを合成し、目的の二次構造を固定した特殊ペプチドを翻訳合成する図1。本発明について詳述する前に、以下ではまず背景技術となる遺伝暗号のリプログラミングについて概説する。生体の翻訳では、mRNAの3つの塩基の並びトリプレットが一つのコドンとして一つのアミノ酸を指定しており、その並びに対応するペプチドが合成される。このとき、コドンとアミノ酸との対応付けは、以下の2段階で行われる。tRNAの末端にアミノアシルtRNA合成酵素aminoacyltRNAsynthetase:ARSが対応するアミノ酸を連結する。tRNAのアンチコドンが対応するmRNAのコドンと対合することにより、mRNAの情報に沿ってtRNA上のアミノ酸が重合されペプチドが合成される。こうしたコドンとアンチコドンとの対応関係は、ほとんど普遍的に決定されており、64種類のコドンそれぞれに、20種類のアミノ酸のいずれか一つが割り当てられている。普遍遺伝暗号表を以下に示す。しかしながら、再構成型の翻訳系と人工アミノアシル化RNA触媒フレキシザイムを利用することで、この遺伝暗号をリプログラミングすることができる。再構成型の翻訳系とは、リボソーム、翻訳因子、tRNA、アミノ酸、およびATPやGTP等のエネルギーソースなど、タンパク質やペプチドの翻訳合成に関わる因子をそれぞれ単離精製し、混ぜ合わせた翻訳系である。例えば、大腸菌のリボソームを用いる系として次の文献に記載された技術が公知である:HFKungBRedfieldBVTreadwellBEskinCSpearsandHWeissbachDNAdirectedinvitrosynthesisofbetagalactosidaseStudieswithpurifiedfactorsTheJournalofBiologicalChemistryVol252No1968896894MCGonzaCCunninghamandRMGreenIsolationandpointofactionofafactorfromEscherichiacolirequiredtoreconstructtranslationProceedingofNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmericaVol8216481652MYPavlovandMEhrenbergRateoftranslationofnaturalmRNAsinanoptimizedinVitrosystemArchivesofBiochemistryandBiophysicsVol328No1916YShimizuAInoueYTomariTSuzukiTYokogawaKNishikawaandTUedaCellfreetranslationreconstitutedwithpurifiedcomponentsNatureBiotechnologyVol19No8751755;HOhashiYShimizuBWYingandTUedaEfficientproteinselectionbasedonribosomedisplaysystemwithpurifiedcomponentsBiochemicalandBiophysicalResearchCommunicationsVol352No1270276。一方、フレキシザイムflexizymeは、任意のtRNAに任意のアミノ酸またはヒドロキシ酸を連結アシル化することのできる人工RNA触媒アシルtRNA合成酵素様活性を持つRNA触媒である。例えば、以下の文献に記載されたものが公知である:HMurakamiHSaitoandHSugaChemistryBiologyVol10655662;HMurakamiDKourouklisandHSugaChemistryBiologyVol1010771084;HMurakamiAOhtaHAshigaiHSugaNatureMethods3357359TheflexizymesystemahighlyflexibletRNAaminoacylationtoolforthesynthesisofnonnaturalpeptides;NNiwaYYamagishiHMurakamiHSugaBioorganicMedicinalChemistryLetters1938923894Aflexizymethatselectivelychargesaminoacidsactivatedbyawaterfriendlyleavinggroup;及びWO2007066627多目的化アシル化触媒とその用途。フレキシザイムは、原型のフレキシザイムFx、及び、これから改変されたジニトロベンジルフレキシザイムdFx、エンハンスドフレキシザイムeFx、アミノフレキシザイムaFx等の呼称でも知られる。あるいは、任意のtRNAに任意のアミノ酸を連結可能な方法の変法として、化学的アミノアシル化等の他の方法を用いることもできる。遺伝暗号のリプログラミングには、翻訳系の構成因子を目的に合わせて自由に取り除き、必要な成分だけを再構成してできる翻訳系を利用する。例えば、特定のアミノ酸を除去した翻訳系を再構成すると、当該アミノ酸に対応するコドンが空きコドンになる。続いて、フレキシザイムあるいは化学的アミノアシル化、あるいは変異タンパク質酵素を用いたアミノアシル化を利用して、その空きコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAに特殊なアミノ酸を連結し、これを加えて翻訳を行う。これによって、特殊なアミノ酸がそのコドンでコードされることになり、除去したアミノ酸の代わりに特殊なアミノ酸が導入されたペプチドが翻訳される。本発明における限定を意図しない一つの態様として、遺伝暗号のリプログラミング技術により、例えば、側鎖にプロパルギルクロリド構造を有する特殊なペプチドを合成する。このとき、ペプチド中に、上記側鎖構造を持つ残基の位置から適切な残基数を挟んでシステイン残基を配置しておくと、翻訳後に自発的にそのスルファニル基によるプロパルギル位上での置換反応が進行し、ペプチド側鎖間にチオエーテル結合による架橋構造が形成される。すなわち、求電子剤としてはプロパルギルクロリド構造を、求核剤としてはスルファニル基という結合形成が可能な一組の構造をアミノ酸内へ組み込むことにより、その間に結合を形成させ架橋構造を構築することができる。この架橋構造がヘリックス形成の鍵となる位置特異的な水素結合を補助してヘリックス構造を誘導させ、ペプチドに所望の二次構造を与える。このような結合形成が可能な分子構造の対は、プロパルギルクロリド構造とシステインに限定されない。詳細は後述する。さらに、本発明では、上記の技術を利用して特殊なペプチドライブラリーを構築し、そこから生体内分子間相互作用の阻害剤を獲得する技術を提供する。本発明の要旨は以下の通りである。1架橋構造により安定化された二次構造を有するペプチドであって、以下の式で表される特殊アミノ酸と、側鎖にスルファニル基を有するアミノ酸との組を少なくとも1つを含み、式中、Aは、単結合、又は主鎖の原子数が1-10である連結基を示し;Bは、少なくとも一つのπ結合を含む基を示し;Cは、水素原子、又は置換基で置換されていてもよいアルキル基を示し;Xは、スルファニル基による置換反応で置換されうる基を示す。前記特殊アミノ酸残基の側鎖と、前記スルファニル基とのチオエーテル結合による架橋構造が形成されている、ペプチド;2前記式Iにおいて、Aは、単結合;置換基で置換されていてもよい、炭素数1-10のアルキレン基、炭素数2-10のアルケニレン基、又は炭素数2-10のアルキニレン基;主鎖の1-2個の炭素原子が、酸素原子、窒素原子、若しくは硫黄原子に置換された、置換基で置換されていてもよい、主鎖の原子数が10以下のアルキレン基、アルケニレン基、及びアルキニレン基からなる群より選択され、Bは、-C≡C-、-C=C-、-Ar-、-Ar-Ar-、-Ar-C≡C-、-Ar-C=C-、-NHCO-、-CO-、-Ar-NHCO-、-Ar-CO-からなる群より選択され、Cは、水素、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、及びペンチル基からなる群より選択され、Xは、Cl、Br、I、-OSO2Me、トシル基、ノシル基、-OSO2-Ar-R式中、RはCH3、NO2、CF3及びHからなる群より選択される基を表す。からなる群より選択される、上記1に記載のペプチド;3前記式Iの特殊アミノ酸が、以下の式II~IVのいずれかで示される、式中、mは1~10から選択される整数を示し、Cl、Br、I、-OSO2Me、トシル基、ノシル基、-OSO2-Ar-R式中、RはCH3、NO2、CF3及びHからなる群より選択される基を表す。からなる群より選択される。上記1又は2に記載のペプチド;4前記スルファニル基を有するアミノ酸が、システイン、並びに以下の式V及びVIで表されるシステインアナログからなる群より選択される、上記1から3のいずれか1項に記載のペプチド;5前記特殊アミノ酸残基と、前記側鎖にスルファニル基を有するアミノ酸残基とが、各組において、2、3、6又は10アミノ酸残基隔てて配置されている、上記1から4のいずれか1項に記載のペプチド;6架橋構造により安定化された二次構造を有するペプチドの製造方法であって、iスルファニル基を側鎖に持つアミノ酸、および、以下の式I式中、Aは、単結合、又は主鎖の原子数が1-10である連結基を示し;Bは、少なくとも一つのπ結合を含む基を示し;Cは、水素原子、又は置換基で置換されていてもよいアルキル基を示し;Xは、スルファニル基による置換反応で置換されうる基を示す。で表される特殊アミノ酸の組が、少なくとも1つ分子内に配置された特殊ペプチドを翻訳によって合成する工程;及びii前記各組において前記スルファニル基と式Iの特殊アミノ酸の側鎖をチオエーテル結合させて架橋構造を形成する工程、を含む前記方法;7前記スルファニル基を側鎖に持つアミノ酸と式Iの特殊アミノ酸が、各組において、2、3、6、または10アミノ酸残基隔てて配置される、上記6に記載の方法;8前記の翻訳合成工程が、式Iの特殊アミノ酸をtRNAに連結して得られるアミノアシルtRNAを利用して、該特殊アミノ酸をコードする改変コドンを有する鋳型mRNAを翻訳することを含む、上記6又は7に記載の方法;9前記スルファニル基を側鎖に持つアミノ酸が改変コドンでコードされる特殊アミノ酸であり、前記の翻訳合成工程が、式Iの特殊アミノ酸及び該スルファニル基を側鎖に持つ特殊アミノ酸をそれぞれtRNAに連結して得られるアミノアシルtRNAを利用して、それぞれの特殊アミノ酸をコードする改変コドンを有する鋳型mRNAを翻訳することを含む、上記8に記載の方法;10前記アミノアシルtRNAは、アシルtRNA合成酵素様活性を持つRNA触媒を用いて特殊アミノ酸をtRNAに連結して得られたものである、上記8または9に記載の方法;11前記式Iで示される特殊アミノ酸が、以下の式II~IVのいずれかで示される、上記6~10のいずれか1項に記載の方法;12前記スルファニル基を有するアミノ酸が、システイン、並びに以下の式V及びVIで示されるシステインアナログからなる群より選択される、上記6~11のいずれか1項に記載の方法;13上記1から5のいずれか1項に記載のペプチドを2種以上含む、ペプチドライブラリー;14前記各ペプチドが、それをコードするmRNAと連結されている、上記13に記載のペプチドライブラリー;15上記13に記載のペプチドライブラリーを構築する方法であって:iランダムなアミノ酸配列をコードするRNA中に、スルファニル基を側鎖に持つアミノ酸を指定するコドン、および、上記1に記載の式Iで表される特殊アミノ酸を指定するコドンの組を少なくとも一つ含み、各組においてスルファニル基を側鎖に持つアミノ酸を指定するコドンと式Iの特殊アミノ酸を指定するコドンが、2、3、6、または10アミノ酸単位隔てて配置されているmRNAのライブラリーを調製する工程;ii前記特殊アミノ酸を連結したtRNAを含む無細胞翻訳系で前記mRNAを翻訳して、ランダム配列中に前記特殊アミノ酸が配置されたペプチドの集合体を得る工程;及び各ペプチドにおいてスルファニル基と式Iの特殊アミノ酸の側鎖を結合させて架橋構造を形成する工程、を含む方法;16上記14に記載のペプチドライブラリーを構築する方法であって:上記15に記載の工程において、さらに、mRNAの3’末端にピューロマイシンを結合させ、ピューロマイシン結合mRNAライブラリーを得る工程;、工程において、前記ピューロマイシン結合mRNAライブラリーを無細胞翻訳系で発現させ、ランダム配列中に前記特殊アミノ酸が配置されたペプチド-mRNA複合体を得る工程;及び工程を行う工程、を含む方法;17式Iの特殊アミノ酸を指定する改変コドンがAUGコドンであり、mRNAランダム配列が、NNCまたはNNU配列NはAUGCのいずれか一つの塩基を表す。のいずれかのトリプレットの繰り返しからなる、上記15又は16に記載の方法;18以下の式で表される特殊アミノ酸;式中、Aは、単結合、又は主鎖の原子数が1-10である連結基を示し;Bは、少なくとも1つの炭素原子間の二重結合を含む基、少なくとも1つの炭素原子間の三重結合を含む基、又は少なくとも1つの芳香環を含む基を示し;Cは、水素原子又は炭素数が1-3である置換基を有していてもよいアルキル基を示し;Xは、スルファニル基による置換反応で置換されうる基を示す。19上記13又は14に記載のペプチドライブラリーから標的タンパク質に結合するペプチドを選択する方法であって、ペプチドライブラリーを標的タンパク質に接触させ、インキュベートする工程;及び標的タンパク質に結合するペプチド分子を選択する工程、を含む方法;20上記13又は14に記載のペプチドライブラリーから標的タンパク質の分子間相互作用に対する阻害活性を有するペプチドを選択する方法であって、上記19に記載の工程及びを含む、標的タンパク質に結合するペプチドを選択する一次スクリーニング、および一次スクリーニングで選択されたペプチドの標的タンパク質の分子間相互作用に対する阻害活性を評価し、前記ペプチドが標的タンパク質の分子間相互作用に対する阻害活性を有するペプチドであることを決定する二次スクリーニング、を含む方法;21標的タンパク質に結合するペプチドの製造方法であって:上記14に記載のペプチドライブラリーを標的タンパク質に接触させ、インキュベートする工程;標的タンパク質に結合するペプチド-mRNA複合体を選択する工程;選択されたペプチド-mRNA複合体のmRNAを増幅し、ペプチド-mRNA複合体を得る工程;~を1回以上繰り返して、親和性の高いペプチド-mRNA複合体を濃縮する工程;及びで濃縮されたペプチド-mRNA複合体のmRNAからペプチドを発現させる工程、を含む方法;及び22標的タンパク質がアポトーシスを抑制する分子である、上記19~20のいずれか1項記載の方法、に関する。本発明により、所望の位置に架橋構造が導入され、安定した二次構造例えばαヘリックス構造を持つペプチドを得ることが可能となる。かかるペプチドは、安定した二次構造を有するので、通常のペプチドでは持ち得ない機能、例えば標的に対する高親和性、高選択性、細胞膜透過性、安定性に優れる。また、かかるペプチドにおいてアミノ酸配列をランダムにしたペプチドライブラリーを作製し、これを用いてスクリーニングを行うことにより、標的タンパク質等に対して高親和性を有するペプチドや、標的タンパク質の機能を阻害するペプチドなど生理活性を有するペプチドを得ることができる。さらに、ペプチドライブラリーにおいて、ペプチドとこれをコードする核酸を連結させてinvitroディスプレイ法を適用することにより、選択されたペプチドの濃縮及び増幅を容易にすることができる。架橋構造が導入されたペプチド本発明は、架橋構造を備えることにより安定化した二次構造を有する新規なペプチドを提供する。本明細書において、二次構造とは、ペプチド主鎖中の水素結合によって形成される比較的狭い範囲にみられる特殊な構造をいい、ヘリックスやβ構造を意味する。本発明は、αヘリックス、310ヘリックス構造等のヘリックス構造の安定化に適しているが、他の二次構造も安定化しうる。また、本明細書において、ペプチドの二次構造を安定化するとは、ペプチドが標的分子にある程度の再現性をもって結合できる程度に二次構造が安定化されることを意味する。ペプチドに架橋構造を付与して二次構造を安定化させると、プロテアーゼ耐性が向上する、膜透過性が向上する。標的タンパク質との親和性が向上する、と考えられている。背景技術で述べたように、これまでも、アミノ酸側鎖間をアミド結合やジスルフィド結合で架橋することにより、ペプチド二次構造を安定化させる試みがなされてきた。また、化学触媒を用いたアルケン形成による架橋反応も報告されている。しかしながら、これまでの方法と異なり、本発明のペプチドに形成された架橋構造は生体内で容易に分解されない構造であり、具体的には、アミド結合のように酵素的に分解されることも、ジスルフィド結合のように還元されてしまうこともない。本発明のペプチドは、以下の式Iで表される特殊アミノ酸と、側鎖にスルファニル基を有するアミノ酸との組を少なくとも1つ含み、特殊アミノ酸の側鎖とスルファニル基とのチオエーテル結合による架橋構造が形成されている。式中、Aは、スペーサーとして機能を果たす部位を示す。Aは、単結合又は主鎖の原子数が1-10の連結基であって、後述するBCH2-Xとスルファニル基との架橋反応が好適に生じる限り、どのような基であってもよいが、例えば、単結合;置換基で置換されていてもよい、炭素数1-10のアルキレン基、炭素数2-10のアルケニレン基、又は炭素数2-10のアルキニレン基;主鎖の1-2個の炭素原子が、酸素原子、窒素原子、若しくは硫黄原子に置換された、置換基で置換されていてもよい、主鎖の原子数が10以下のアルキレン基、アルケニレン基、又はアルキニレン基、等が挙げられるがこれらに限定されない。なお、本発明のペプチドを翻訳合成法により合成する場合、Aがあることが翻訳反応の進行に好ましいという利点もある。Bは、スルファニル基によるXの置換反応を誘起させる限り、どのような基であってもよいが、例えば、少なくとも一つのπ結合を含む基とすることができる。π結合を含む基としては、置換基で置換されていてもよい、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基;置換基で置換されていてもよい少なくとも一つの芳香環を含む基;少なくとも一つのケトン又はアミドを含む基とすることができる。Bの炭素数は、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基の場合、例えば1-10個、2-8個、2-5個等とすることができる。少なくとも一つの芳香環を含む基、少なくとも一つのケトン又アミドを含む基の場合、主鎖の原子数を例えば1-10個、2-8個、2-5個等とすることができる。π結合の位置は、スルファニル基によるXの置換反応が好適に進む限り特に限定されないが、π結合を構成している原子の少なくとも1つがスルファニル基による置換反応が行われる炭素原子と結合していることが望ましく、XからCH2基を挟んで直接π結合が位置していることが最も好ましい。Bの例としては、-C≡C-、-C=C-、-Ar-、-Ar-Ar-、-Ar-C≡C-、-Ar-C=C-、-NHCO-、-CO-、-Ar-NHCO-、-Ar-CO-が挙げられるがこれらに限定されない。スルファニル基と、式Iで表される特殊アミノ酸の側鎖とのチオエーテル結合による架橋構造の例を以下に示す。Xは、スルファニル基による置換反応により脱離されうる原子又は基であれば特に限定されないが、例えば、Cl、Br、I、-OSO2Me、-OSO2-Ar-R式中、RはCH3、NO2、CF3及びHからなる群より選択される基を表す。であり得る。Cは、水素原子、又は置換基で置換されていてもよいアルキル基を示す。例えば、置換基で置換されていてもよいメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基であり、分岐していてもよい。本明細書において、アルケニレン基とは、主鎖中に1-3個の二重結合を有するアルキレン基をいい、アルキニレン基とは、主鎖中に1-3個の三重結合を有するアルキレン基をいう。二重結合又は三重結合の位置は、ペプチドが目的とする効果を奏する限り特に限定されない。本明細書において、置換基とは、特に限定されないが、ハロゲン原子、置換されていてもよい炭素数1-6のアルキル基、置換されていてもよい炭素数1-6のアルコキシ基、シアノ基、ニトロ基、ヒドロキシ基、カルボキシル基、アシル基、アミノ基、アリール基、ヘテロアリール基、フェノキシ基、非芳香族複素環基等が挙げられる。本発明のペプチドにおいては、式Iの特殊アミノ酸の側鎖部分とスルファニル基との結合形成によって架橋構造が形成されるため、このペプチドを構成する要素であるアミノ酸一残基を一つの単位として、これらの一組の官能基は、異なった構成要素の単位上に存在し、架橋構造が形成された際に二次構造が安定化されるように配置されることが必要である。説明の便宜のため、そのような構成要素の単位をアミノ酸単位と称する。求電子剤となるアミノ酸単位特殊アミノ酸に相当とスルファニル基を有するアミノ酸単位は、、、、又はで示される位置に配置されることが好ましい。図2を参照されたい。ここで、iは0以上の任意の整数であり、架橋前駆体を含むペプチドのN末端の残基から数えたアミノ酸単位の位置を示す。たとえばi3の場合、はN末端0番目から数えて3アミノ酸単位の位置と7アミノ酸単位の位置に、求電子剤となるアミノ酸単位とスルファニル基を有するアミノ酸単位が配置され、架橋構造が形成されることを示す。i3やi4の場合、αヘリックスであれば1ターンで架橋させることになり、i7やi11になると、それぞれ2ターン、3ターンで架橋させることになる。言い換えると、例えば、2、3、6又は10アミノ酸単位が架橋構造を形成するアミノ酸単位の間に存在することが好ましい。架橋構造を形成するアミノ酸単位の間および前後に位置するアミノ酸単位は、N末端の開始アミノ酸を除き、分子内にアミノ基-NR2とカルボキシル基-COOHの二つの官能基を持つ化合物アミノカルボン酸である任意のアミノ酸であることが好ましく、典型的にはα-アミノカルボン酸であり、より好ましくはタンパク質性アミノ酸である。求電子剤となるアミノ酸単位とスルファニル基を有するアミノ酸単位の配置は、いずれがN末側でもC末側でも構わない。特殊アミノ酸とは、天然の翻訳で使用される20種類のタンパク質性アミノ酸とは構造の異なるアミノ酸全般を指し、人工的に合成したものであっても、自然界に存在するものであってもよい。つまり、タンパク質性アミノ酸の側鎖構造の一部が化学的に変更修飾された非タンパク質性アミノ酸や人工アミノ酸、D体アミノ酸、Nメチルアミノ酸、Nアシルアミノ酸、βアミノ酸、アミノ酸骨格上のアミノ基やカルボキシル基が置換された構造を有する誘導体等が全て含まれる。特殊ペプチドは、特殊アミノ酸を一つ以上含む、2個以上のアミノ酸が主にペプチド結合環状構造やエステル結合が存在することもあるによって結合したものを指す。本発明において、スルファニル基を有するアミノ酸の代表例はシステインまたはその類縁体システインアナログであり、これと反応しうる求電子剤となるアミノ酸の代表例は式Iの特殊アミノ酸である。後述のとおり、スルファニル基を有するアミノ酸について、これがシステインである場合は普遍コドンを使用できるが、非タンパク質性アミノ酸である場合は改変コドンでコードされる。一方、式Iの特殊アミノ酸は、常に改変コドンによりコードされる。また、本発明においては、ペプチド鎖N末端となる開始アミノ酸もメチオニンに限定されず、メチオニン以外の任意のタンパク質性アミノ酸あるいは任意の特殊アミノ酸であることができる。例えば、後述の実施例では、通常の20種類のアミノ酸からメチオニンが除去された翻訳系を構築し、代わりに、開始tRNAにNα-アセチル化アミノ酸を連結させたものを用いて翻訳を開始している。このようなN末端修飾はペプチドの安定性を保つために有効であり得る。あるいは、架橋前駆体を構成するアミノ酸の一方が開始アミノ酸であることも可能であるすなわち、iが0の場合。架橋前駆体を構成するアミノ酸の配置に関してより典型的な態様は、これらのアミノ酸がいずれも伸長反応により導入され、ペプチド鎖内部に配置される態様であり、すなわちiが1以上の整数である場合である。また、本発明が適用されるペプチドの大きさには特に制限はないが、一般的に、ヘリックス構造を保ちにくい25アミノ酸残基以下のペプチドに対して、本発明は好適に使用される。式Iの化合物の具体例としては、例えば、式VII:の化合物が挙げられる。式中、mは1乃至10の整数を表す。式VIIの化合物の具体例としては、mが1の化合物を挙げることができ、この化合物は、例えば、Schollkopfの不斉補助基を利用して高い鏡像体過剰率で製造することができる。また、式VIII:の化合物も挙げられる。式中、mは前記と同義である。また、式IX:の化合物も挙げられる。式中、mは前記と同義である。式IXの化合物の具体例としては、mが1になる下記の式Xの化合物が挙げられる。さらに、式IにおいてCがアルキル鎖である化合物の具体例としては、式VIIに対応する式XI、式Xに対応する式XII:の化合物が挙げられる。一方、システインアナログの具体例としては、例えば、式Vまたは式VIの化合物を挙げることができる。式V、VI中、mは前記と同義である。また、ホモシステインやメルカプトノルバリン等のスルファニル基を有する特殊アミノ酸を挙げることもできる。架橋構造が導入されたペプチドの製造方法次に、本発明のペプチドの製造方法を説明する。本発明のペプチドは、化学合成による方法や、翻訳合成系を用いる方法等、種々の公知の方法又はそれに準ずる方法を利用して製造することができる。例えば、化学合成の場合、液相合成、FmocやBoc等の保護基を用いた固相合成、液相合成と固相法を組み合わせたハイブリッド法等各種の方法で、式Iの特殊アミノ酸と、スルファニル基を有するアミノ酸を含むペプチドを合成することができる。ペプチドを合成すると、後述のように、酵素等を用いることなく、式Iの特殊アミノ酸の側鎖とスルファニル基との間にチオエーテル結合が自発的に形成され、架橋ペプチドを得ることができる。本発明のぺプチドの製造方法の一例として、無細胞翻訳合成系を用いて製造する方法を以下に説明する。当該方法は、翻訳合成されたペプチド内に含まれる特殊アミノ酸が関与する高選択的な分子内反応を利用して、ペプチド側鎖間に共有結合を形成させ、架橋構造を構築するものであって、以下の工程を含む。スルファニル基を側鎖に持つアミノ酸、および、式Iで表される特殊アミノ酸の組が、少なくとも1つ分子内に配置された特殊ペプチドを翻訳によって合成する工程;及び前記各組において前記スルファニル基と式Iの特殊アミノ酸の側鎖をチオエーテル結合させて架橋構造を形成する工程、を含む。工程を翻訳合成工程、工程を架橋構造形成工程と呼ぶ。工程である翻訳合成工程においては、以下の二種類のアミノ酸アスルファニル基を側鎖に持つアミノ酸、及びイ式Iで表される特殊アミノ酸が、適切なアミノ酸残基数だけ離れて配置されたペプチドを、翻訳合成によって得る。以降、工程で合成される特殊ペプチドにおいて、スルファニル基及びこれと反応し得る特殊アミノ酸の官能基からなる一組の官能基を含む化学構造を架橋前駆体と呼ぶ。すなわち、適切なアミノ酸残基数だけ離れて配置された、これらア及びイのアミノ酸の組が架橋前駆体を構成する。例えば図2の模式図を参照されたい。図2においては、これらのアミノ酸の組が、ペプチド鎖内部に配置された一組の濃い黒丸で表されている。また、一個のペプチド鎖に含まれることができる架橋前駆体は一組だけではなく、複数個の架橋前駆体を配置することもできる。複数個の架橋前駆体を含むペプチド鎖が翻訳合成された場合は、工程の架橋構造形成工程において複数個の架橋構造を形成することが可能である。式Iの特殊アミノ酸は、架橋のための共有結合の形成が可能な側鎖構造として、求核性官能基であるスルファニル基-SHと結合形成反応が可能な構造を有する。この反応の結果として、工程である架橋構造形成工程において、架橋前駆体を含むペプチドは架橋構造が形成されたペプチドへ変換される。本発明において、架橋前駆体からの架橋構造形成は、翻訳合成条件下で自発的に起きるため、化学触媒を必要としない。工程を無細胞翻訳系で行う場合、遺伝暗号リプログラミング技術を利用して既存コドンに特殊アミノ酸を人為的に割り当てることによりペプチド鎖に導入する。具体的には、特殊アミノ酸をコードするコドンを有するmRNAを調製し、これを改変遺伝暗号表の下で翻訳することにより、改変されたコドン改変コドンで指定された位置に特殊アミノ酸が導入されたペプチドを得ることができる。本願において、コドンとは、改変コドンおよび天然の翻訳で使用される普遍コドンの両方を指す。改変コドンとは、遺伝暗号リプログラミングによってタンパク質性アミノ酸との対応付けが解消され、特殊アミノ酸と対応づけられたコドンを指す。特殊アミノ酸は、改変コドンでのみコードされ得る。上述のようにして合成されたペプチド化合物に架橋構造を導入することによってヘリックスペプチド化合物が合成される。架橋構造形成のための反応の条件は官能基の組の種類に応じて設定されるが、一般に、このペプチド化合物を合成するための無細胞翻訳系の条件下において高選択的に反応は進行する。したがって、特段の反応条件の調整を行うことなく、自発的に結合が形成され、架橋ペプチド化合物を得ることができる。例えば、図3を参照されたい。ホルミルメチオニンで翻訳を開始し、伸長コドンで導入された様々なアミノ酸の組合せがii4の位置関係で配置されたペプチド鎖を合成したところ、式Iの特殊アミノ酸XおよびシステインCの組のみがチオエーテル結合で架橋構造を形成している。同様に、後述の実施例においては、アミノ酸側鎖に配置されたプロパルギルクロリドを含む特殊アミノ酸とシステインを配置したペプチド配列を翻訳合成して得られる、架橋前駆体を含むペプチドが記載されている。例示された態様では、翻訳後にプロパルギル位へのスルファニル基による置換反応が自発的に進行し、チオエーテル結合が形成されることにより架橋構造が完成する。無細胞invitro翻訳系翻訳系とは、ペプチド翻訳合成のための場であり、一般的には方法及びキット物の両方を含む概念である。本発明において使用される無細胞翻訳系は、公知の再構成型の翻訳系をさらに細分化し、より不純物の少ない系を構築して利用することが好ましい。従来の系と対比させながら、本発明で利用可能なキット物としての翻訳系の具体的な構成成分について説明する。翻訳系の構成成分の具体例としては、リボソーム、IF群、EF群、RF群、RRF、目的のペプチド合成に最低限必要となる天然アミノ酸tRNA特異的なARSタンパク質酵素のセット、翻訳反応のためのエネルギーソース、などがある。リボソームとしては、大腸菌から単離され、精製されたリボソームが好適に利用される。タンパク質類では、翻訳開始因子例えば、IF1、IF2、IF3、翻訳伸長因子例えばEFTu、EFTs、EFG、翻訳終結因子例えば、RF1、RF2、RF3、RRF、エネルギーソース再生のための酵素例えばcreatinekinasemyokinasepyrophosphatasenucleotidediphosphatasekinaseを使用する。この中で、翻訳終結因子エネルギーソース再生のための酵素の添加は任意である。鋳型DNAからの転写を行うためにT7RNApolymeraseを加えることもあるが、あらかじめ転写したmRNAを翻訳系に加える場合、RNApolymeraseの添加は不要である。その他、従来の系と同様、適当な緩衝溶液、翻訳反応のエネルギーソースとしてのNTP類、Creatinephosphate、リボソーム活性化、RNA安定化、タンパク質安定化のために必要な因子等を適宜使用することができる。また、通常の翻訳反応では、開始コドンAUGには、開始tRNAにより、Nホルミルメチオニンが規定されるため、10formyl5678tetrahydroforlicacidBaggottetal1995のようなホルミルドナーが必須であるが、本発明において特殊アミノ酸で翻訳反応を開始する場合は、ホルミルドナーは任意である。同様の理由で、methionyltRNAformyltransferaseMTFも必須でない。本発明で利用される翻訳系において、天然のタンパク質性アミノ酸に対しては、従来の系と同様に、対応する天然のtRNA及びARSを利用することができる。天然tRNAの例は、大腸菌を集め、破砕し、そこからtRNA画分を精製した混合物であり、市販品も入手可能である。天然tRNA中の特定のA、U、C、Gは、酵素によって化学修飾を受けている。あるいは、試験管内で転写した天然配列をもつtRNAの使用も可能である。一方、特殊アミノ酸に対しては、天然tRNAではなく、オルソゴナルtRNAとしてtRNA転写産物である人工tRNAを利用することが好ましい。人工tRNAは、DNAを鋳型として適当なRNAポリメラーゼを用いたinvitro転写反応で調製可能である。このような人工tRNAには、化学修飾は全く存在しない。翻訳産物であるペプチドに特殊アミノ酸を導入するためには、予め特殊アミノ酸でアシル化されたオルソゴナルtRNAを翻訳系に加える。好ましい態様において、特殊アミノ酸でアシル化されたtRNAは、他のtRNAやARSが存在しない条件で、フレキシザイムを用いて、単離されたオルソゴナルtRNAの3末端に特殊アミノ酸を結合することにより調製される。あるいは、化学的あるいは酵素的に特殊アミノ酸をtRNAに結合したものも使用可能である。ペプチドライブラリー本明細書において、ペプチドライブラリーとは、上述した架橋構造が導入されたペプチドを2種以上含む、すなわち配列が異なる2種以上のペプチドを含むライブラリーをいう。ペプチドライブラリーを構成する各ペプチドにおいては、側鎖にスルファニル基を有するアミノ酸と式Iで表される特殊アミノ酸以外のアミノ酸を、任意のアミノ酸とすることができる。したがって、例えば25アミノ酸残基からなるペプチドは、スルファニル基を有するアミノ酸と式Iで表される特殊アミノ酸を一組のみ含む場合、天然のアミノ酸20種のみ使用するとしても理論的に2023種あることになり、ライブラリーとしては十分なサイズとなる。本発明のペプチドライブラリーは架橋により二次構造が安定していることから、細胞膜透過性にも優れており、これを用いてスクリーニングを行うことによって、標的に対して高い親和性を用いるペプチドや、標的タンパク質の機能を阻害するペプチドなど生理活性を有するペプチド等、有用なペプチドを得ることが可能である。また、ペプチドライブラリーの一態様として、各ペプチドがそれをコードするmRNAと連結されていてもよい。これにより、表現型ペプチドのアミノ酸配列が遺伝型核酸配列にディスプレイされたライブラリーとなり、invitroディスプレイに応用することができる。言い換えると、遺伝情報が、その翻訳産物であるペプチドとして提示ディスプレイされているディスプレイライブラリーから、ペプチドの選択を行う。これにより、ライブラリー中のそれぞれのランダムペプチド分子に、分子生物学的手法により増幅及び読み取りが可能なタグが付加されている事になる。invitroディスプレイとは、無細胞翻訳系invitro翻訳系ともいうを用いて合成されたペプチドが遺伝情報と対応付けて提示されたものであり、リボソームディスプレイ、mRNAディスプレイ、DNAディスプレイ等が公知である。また、RAPIDディスプレイ未公開も利用可能である。いずれのディスプレイも、mRNAもしくはDNAに記録された遺伝情報と、その遺伝情報によってコードされるペプチドを連結することにより、遺伝情報-翻訳産物の複合体として対応付けるメカニズムを有する。リボソームディスプレイにおいては、mRNA-リボソーム-ペプチドの3者が複合体を形成する。mRNAディスプレイ及びRAPIDディスプレイにおいては、mRNA-ペプチドの複合体が形成される。DNAディスプレイにおいては、DNA-ペプチドの複合体が形成される。本発明においては任意のinvitroディスプレイライブラリーの利用が可能である。ペプチドライブラリーの製造方法ランダム配列を持つペプチドのライブラリーの製造方法は特に限定されないが、例えば、無細胞翻訳系において、ペプチドをコードする領域にランダム配列を持つ鋳型核酸mRNAもしくは対応するDNAから翻訳合成を行うことにより得ることができる。したがって、ペプチドライブラリーの製造方法の一態様は、iランダムなアミノ酸配列をコードするRNA中に、スルファニル基を側鎖に持つアミノ酸を指定するコドン、および、式Iで表される特殊アミノ酸を指定するコドンの組を有し、各組においてスルファニル基を側鎖に持つアミノ酸を指定するコドンと式Iの特殊アミノ酸を指定するコドンの位置が、2、3、6、または10アミノ酸単位隔てて配置されている、mRNAのライブラリーを調製する工程;ii前記特殊アミノ酸を連結したtRNAを含む無細胞翻訳系で前記mRNAを翻訳して、ランダム配列中に前記特殊アミノ酸が配置されたペプチドの集合体を得る工程;及び各ペプチドにおいてスルファニル基と式Iの特殊アミノ酸の側鎖を結合させて架橋構造を形成する工程、を含む。ランダム配列を持つ架橋ペプチドライブラリーを構築するためには、mRNA配列中のペプチドをコードする領域中に、複数のトリプレットの繰り返しからなるランダム配列および架橋前駆体となるアミノ酸を指定するコドンが配置される。例えば、図5に示すように、プロパルギルクロリド構造を側鎖に持つ特殊アミノ酸を伸長コドンのひとつに割り当て、そこから適切なアミノ酸単位上述で説明したように、例えば2、3、6又は10アミノ酸単位のランダム配列のコドン塩基だけ間を置いた位置へシステインを導入する。さらに、これら二つのアミノ酸が割り当てられた各コドンおよび開始コドン以外に、任意の長さのランダム配列のコドン塩基を配置した鋳型mRNAを構築する。このmRNAを翻訳することにより、システインの側鎖に位置するスルファニル基によるプロパルギルクロリドとの求核置換反応によってチオエーテル結合が構築され、ランダム配列を持った架橋ペプチドライブラリーの構築が可能となる。ランダム配列をもつライブラリーを構築するためには、20種類全てのタンパク質性アミノ酸が無作為に出現するように、その鋳型となるmRNAのコドン配列をNNKNはGACあるいはUから選択される任意の塩基、KはUあるいはGを示すにするのが一般的である。しかし、架橋構造を形成させるための求電子剤となる式Iの特殊アミノ酸を伸張コドンのひとつ、例えばAUGAUGは開始コドンと伸張コドンの両方に使えるに当てはめた場合、NNKのライブラリーでペプチドライブラリーを構築すると、NNKが表すコドンの一つとしてAUGが無作為に出現するために、ペプチドライブラリーには複数の上記の特殊アミノ酸が組み込まれる。そこで、式Iの特殊アミノ酸を指定するコドンをAUGとする場合、ランダム配列としてNNCもしくはNNUNはA、U、G、Cのいずれか一つの塩基を表す配列からなるトリプレットの繰り返しを用いる場合は、ランダム配列中にAUGが出現しないようにすることが可能となり、ランダム配列中の指定された位置にだけ式Iの特殊アミノ酸を導入することができる。NNUあるいはNNCのランダム配列の塩基のライブラリーを用いた場合は、5つのアミノ酸MetTrpGlnLysGluは出現しなくなる。これらを出現させることによるメリットが、本特殊アミノ酸が所望の位置以外に配置されることによるデメリットを超える場合などは、NNU、NNCに加えて、NNKを用いてもよい。また、NNU又はNNCを用いた場合に出現しないアミノ酸に対応するコドンを、架橋構造を形成させるための別の特殊アミノ酸、あるいは別の付加的な機能を有する特殊アミノ酸を指定された位置に導入するために利用することも可能である。例えば、AUGに加えUGGCAGAAGGAGの4つのコドンを利用して、かかる特殊アミノ酸を指定された位置に導入することも可能である。NNU、NNC、NNKを含むmRNAは、例えば各種のDNA合成装置によって、NNT、NNC、NNKを含むDNAを合成し、これを転写することによって得ることができる。上述の例示的な一態様において、式Iの特殊アミノ酸は伸長用tRNAによりペプチド鎖伸長反応で導入される。ここで、開始tRNAは翻訳開始位置のAUGコドンに対合して連結されているアミノ酸をペプチドN末端に導入するが、それ以外の位置のAUGコドンはCAUコドンを有する伸長用tRNAと対合する。このため、AUGコドンには2種類のtRNAによって2種類のアミノ酸が対応づけられる。本明細書では、開始tRNAと対合するAUGコドンを開始AUG、伸長用tRNAに対合するAUGコドンを単にAUGと呼ぶ。本発明では、目的に合わせて最適化された成分からなる無細胞翻訳系に、翻訳の鋳型となる塩基配列に対応するDNAまたはRNA分子を加えて利用する。核酸配列には、生細胞を利用したタンパク質発現系と同様に、目的のアミノ酸配列をコードする領域に加えて、使用する翻訳系に合わせて、翻訳に有利な塩基配列を付加的に含むことができる。例えば、大腸菌由来のリボソームを利用する系の場合は、開始コドンの上流にShineDalgarno配列やイプシロン配列などを含むことにより翻訳反応の効率が上昇する。ペプチドをコードする領域のN末端には、開始コドンが配置される。開始コドンは通常はトリプレット配列AUGである。しかしながら、invitro転写反応により合成された開始tRNAにおいてアンチコドン配列を任意の配列とすることで、開始コドンのリプログラミングが可能であるので、AUGコドンに加えて、他の塩基配列も開始コドンとして利用できる。C末端側には、invitroディスプレイ用に、核酸分子とその翻訳産物であるペプチドを連結するための配列が含まれる。例えば、ピューロマイシンリンカーを用いたmRNAディスプレイ法を利用する場合、mRNAライブラリーにピューロマイシンリンカーが予め連結されたものを翻訳系に加えることにより、mRNA-ペプチドの複合体ライブラリーが形成される。ピューロマイシンをリボソームのAサイトに効率良く取り込ませるために、通常、mRNAの3’末端側とピューロマイシンの間にリンカーが挿入される。ピューロマイシンはリボソーム上でペプチド転移反応の基質アミノアシルtRNA類似体として機能し、伸長ペプチドのC末端に結合することにより、mRNAとペプチドを連結する。mRNAディスプレイ法は、invitro翻訳系でmRNAとペプチドを適当なリンカーを介して連結することにより遺伝子型と表現型を一体化させる技術であり、このような目的が達成される限り、ピューロマイシンに代えて他の同様の機能を有する物質を含むリンカーも利用可能であることは当業者の認識の範囲内である。また別の方法として、リンカーを予め連結したmRNAを用いるのではなく、invitro翻訳系内でのリンカーとmRNAのハイブリダイゼーションにより、mRNAペプチドの複合体ライブラリーを形成する方法も利用可能である。例えば、フレキシザイムを利用して調製したフェニルアラニンリンカーをmRNAライブラリーと相補鎖を組ませることで、mRNAペプチドの複合体ライブラリーが形成される未公開出願であるPCTJP201068549に記載されるRAPIDディスプレイ法。この場合、mRNAのペプチドをコードする領域の下流3末端領域に、リンカーとハイブリダイゼーションするための塩基配列が含まれる。後述の具体的な実施例においては、ペプチドのN末端に開始AUGコドンが、途中のいくつかのアミノ酸残基に相当するランダム配列のあとに、式Iの特殊アミノ酸をコードする伸長AUGコドンもしくはCysをコードするコドンUGCが、さらに適切なアミノ酸単位のランダム配列が続いた後、CysをコードするコドンUGCもしくは式Iの特殊アミノ酸をコードする前述のコドンが配置され、さらにランダム配列がC末端まで続く。図2および図5を参照されたい。その直後、リンカーとなるGlySerGlySerGlySerをコードするコドンが続くように配置される。フレキシザイムによるアミノアシル化反応フレキシザイムは、所望の構造を持つアミノ酸基質を任意のtRNAにアシル化する機能を有するRNA触媒ARSリボザイムである。フレキシザイムは、天然のARSタンパク質酵素とは異なり、各アミノ酸及び各tRNAに対して特異性を持たず、本来連結すべきアミノ酸以外の任意のアミノ酸を用いたアミノアシル化が可能である。具体的には、アミノ酸の認識部位にα位の置換基が含まれていないため、Lアミノ酸に限らず、ヒドロキシ酸α位が水酸基、αNメチルアミノ酸、αNアシルアミノ酸、Dアミノ酸なども基質とすることができる。また、εNアセチルリシンやεNメチルリシンなどの翻訳後修飾を受けたようなアミノ酸も基質とすることが可能である。詳細については、前述のフレキシザイムに関する文献に加え、YGotoHSugaTranslationinitiationwithinitiatortRNAchargedwithexoticpeptidesJournaloftheAmericanChemicalSocietyVol131No1450405041、WO2008059823N末端に非天然骨格をもつポリペプチドの翻訳合成とその応用、GotoetalACSChemBiol20083120129、TJKangetalChemBiol20081511661174ExpressionofhistoneH3tailswithcombinatoriallysinemodificationsunderthereprogrammedgeneticcodefortheinvestigationonepigeneticmarkers、WO2008117833環状ペプチド化合物の合成方法などにも記載されている。本発明では、フレキシザイムを用いて特殊アミノ酸でアシル化された直交性オルソゴナルtRNAを、無細胞翻訳系に添加することにより、ペプチド配列に特殊アミノ酸が導入される。オルソゴナルtRNAとは、翻訳系に内在する天然由来のARS例えば大腸菌由来のARSタンパク質酵素によって認識されないので、翻訳系内でアミノアシル化されることはないが、リボソーム上のペプチド合成反応では効率よくmRNAのコドンと対合して指定されたアミノ酸を発現させ得るtRNAである。オルソゴナルtRNAとして、例えば、異なる種に由来する天然のサプレッサーtRNA、あるいは、人工的に構築したtRNAが使用される。上述のように、本発明において特殊アミノ酸の導入のために好適に使用されるものは、人工的な転写産物であるオルソゴナルtRNAである。フレキシザイムは、活性化アミノ酸エステルを基質として、アミノ酸の反応点であるカルボニル基、及びアミノ酸側鎖あるいは脱離基である芳香環、並びにtRNAの3’末端に存在する5RCC3配列部分RはA又はGを認識して、3’末端のアデノシンにアシル化する触媒能を有する。フレキシザイムは、tRNAのアンチコドン部分に対して特異性がない。つまり、tRNAのアンチコドン部分をどのような配列に変えても、アミノアシル化の効率には影響がない。フレキシザイムにより、任意の特殊アミノ酸を任意のアンチコドン配列を持つtRNAに連結することができるので、任意の特殊アミノ酸を任意のコドンに対応させることができる。従って、任意の特殊アミノ酸を導入したライブラリーの調製が可能である。公知のフレキシザイムの構造RNA配列を以下に示す。原型のフレキシザイムFxGGAUCGAAAGAUUUCCGCAGGCCCGAAAGGGUAUUGGCGUUAGGU345ntジニトロベンジルフレキシザイムdFx5GGAUCGAAAGAUUUCCGCAUCCCCGAAAGGGUACAUGGCGUUAGGU346ntエンハンスドフレキシザイムeFx5GGAUCGAAAGAUUUCCGCGGCCCCGAAAGGGGAUUAGCGUUAGGU345ntアミノフレキシザイムaFx5GGAUCGAAAGAUUUCCGCACCCCCGAAAGGGGUAAGUGGCGUUAGGU347ntフレキシザイムは、天然のARSタンパク質酵素とは異なり、アミノアシル化反応の第1段階目である高エネルギー中間体アミノアシルAMPの生成の過程をスキップしてアミノ酸基質のtRNAへの結合の過程のみを触媒するため、アミノ酸基質としてはあらかじめ弱活性化されたアミノ酸を用いる必要がある。つまり、アミノ酸のアデニル化をスキップする代わりに、アシル化が進行するカルボニル基において弱活性化されたエステル結合を持つアミノ酸誘導体を使用する。一般にアシル基の活性化は電子求引性基を備えたエステル結合させることで達成できるが、あまり強力な電子求引性基を有するエステルでは水中で加水分解が起きるばかりか、ランダムなRNAへのアシル化が併発してしまう。したがって、アミノ酸基質としては無触媒状態でこのような副反応が起きにくいように弱活性化したものを用いる必要がある。このような弱活性化は、例えば、AMP、シアノメチルエステル、チオエステル、又はニトロ基やフッ素その他の電子求引性の官能基をもったベンジルエステル等を使用して行うことができる。また、アミノ酸基質は、フレキシザイムで認識されるように、アミノ酸側鎖または脱離基内に芳香環を有していなければならない。活性化アミノ酸エステルは、天然のアミノアシル化反応におけるアミノアシルAMPのような弱活性化されたエステル結合を持ち、且つアミノ酸側鎖または脱離基内に芳香環を有するアミノ酸基質のことである。好適な活性化アミノ酸エステルの例としては、アミノアシルシアノメチルエステルCME:cyanomethylester、アミノアシルジニトロベンジルエステルDNB:35dinitrobenzylester、又はアミノアシル4クロロベンジルチオエステルCBT:pchlorobenzylthioester等が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、後述の実施例では、NαアセチルLフェニルアラニンAcFを人工的に構築された開始tRNAに連結させ、ペプチドN末端に導入を行うとともに、プロパルギルクロリドを側鎖に持つ2アミノ6クロロヘキシ4イオニック酸、2アミノ7クロロヘプト5イオニック酸、2アミノ8クロロヘプト6イオニック酸の3つのアミノ酸実施例中の表1下の構造式を参照されたいをそれぞれ人工的に構築された伸長tRNAに連結させた。これら3つの化合物の場合、2アミノ6クロロヘキシ4イオニック酸DNB、2アミノ7クロロヘプト5イオニック酸DNB、2アミノ8クロロヘプト6イオニック酸DNB、をそれぞれ基質として用いることで、dFxとtRNAを混合し、これらの結合されたtRNAを調製できる。一方、NαアセチルLフェニルアラニンの場合は、NαアセチルLフェニルアラニンCMEを基質として用いることで、eFxとtRNAを混合し、NαアセチルLフェニルアラニン結合tRNAを調製することができる。フレキシザイムによるアシル化反応は、溶液中で行ってもよいし、担体に固定化したARSリボザイムを用いたカラムを用いて反応させてもよい。例えば、もし翻訳の反応スケールが100μl以下の少ない量であれば、溶液中でフレキシザイムによるtRNAのアシル化を行い、反応溶液をエタノール沈殿したペレットを適当な緩衝液例えば1mMの酢酸カリウム、pH5等に溶解し、翻訳系に添加すれば良い。反応の条件は適宜好適な条件を選べばよいが、少量スケールの反応条件の一例としては、最終濃度で05~20μMのtRNA、05~20μMのフレキシザイム、2~10mMのアミノ酸基質、06MのMgCl2を含むpH75、01Mの反応緩衝液を、0度°Cで1時間~24時間、反応させるとよい。翻訳の反応スケールが100μlを超える場合は、フレキシザイムの再利用を考慮し、担体に固定化したフレキシザイムを用いたほうが好都合である。担体として、例えば、樹脂、アガロース、セファロース、磁気ビーズなどを用いることもできるが、特に限定されない。フレキシザイムを担体に固定化して反応を行わせる場合は、例えば、MurakamiHBonzagniNJandSugaHAminoacyltRNAsynthesisbyaresinimmobilizedribozymeJAmChemSoc12468346835に記載の方法に従って行うことができる。反応産物であるアミノアシル化tRNAの分離は、様々な方法で行える。一例としては、10mM程度のEDTAを含有する緩衝液でカラムから溶出する方法がある。ARSリボザイムを固定化した樹脂は、例えば反応バッファーで平衡化することにより、十数回リサイクルすることができる。開始tRNAと伸長tRNA天然の翻訳反応において、開始tRNAは翻訳開始のみに用いられ、伸長反応では使用されず、反対に、伸長用tRNAは開始反応には使用されないことは重要である。このような開始tRNAと伸長用tRNAの区別は本願発明においても同様である。本願では、特殊アミノ酸をアシル化するために人工tRNAが好適に用いられる。伸長tRNAである人工tRNAの非限定的な一例がtRNAAsnE2である。このtRNAの塩基配列は、大腸菌由来の伸長反応用tRNAである天然tRNAAsnがベースになっている。本発明者らは、この天然tRNAに対して、修飾塩基を無くし、かつ変異を導入することで、大腸菌の20種類のアミノアシル化酵素によってアミノアシル化を受けない伸長反応用のtRNAであるtRNAAsnE2をinvitro転写によって作製した。NNNの箇所がアンチコドンに相当し、コドンに対応するように変化させる。開始tRNAである人工tRNAの非限定的な一例がtRNAfMetである。このtRNAの塩基配列は、大腸菌の天然tRNAfMetがベースになっている。。本発明者らは、この天然tRNAに対して、修飾塩基を無くし、5末端最初のCをGに変化させた開始反応用のtRNAであるtRNAfMetをinvitro転写によって作製した。CAUの箇所がアンチコドンに相当し、開始AUGコドンに対応する。が、72番目の塩基と相補鎖を組まないことである。この非相補鎖によって、メチオニルホルミルトランスフェラーゼによりMettRNAfMetにホルミル基が転移されたり、またEFTuとの結合が抑制されたりする。後述の実施例では、NαアセチルLフェニルアラニンをtRNAfMetCAUに連結させ、ペプチドN末端に導入を行うとともに、プロパルギルクロリドを側鎖に持つ3つの特殊アミノ酸をそれぞれtRNAAsnE2CAUに連結させた。tRNAAsnE2NNNは、アンチコドン配列NNN、Nは任意の塩基を表すを様々に変化させて用いることができるが、プロパルギルクロリド構造を側鎖に備えた特殊アミノ酸を指定する改変コドンがAUGである場合、アンチコドン配列はCAUとなる。これらの開始用及び伸長用の人工tRNAは天然のARSに対して直交性を持つため、翻訳系中で天然のアミノ酸が連結されることがないが、翻訳開始反応、リボソーム上のペプチド鎖伸長反応に際しては問題なく受け入れられる。これらの人工tRNAは実施例で使用された具体的な無細胞翻訳系において実際に使用可能であることが確認されている。しかしながら、本発明で使用可能な人工tRNAはこれに限定されない。当業者であれば、本発明において特殊アミノ酸を導入するために利用可能なtRNAは、使用する無細胞翻訳系の成分に合わせて適宜に選択可能であることが理解できるであろう。invitroセレクション本発明において、無細胞翻訳系で構築される特殊ペプチドライブラリーは、mRNAディスプレイを始めとするinvitroディスプレイ技術と完全に適合可能であるため、1013種類以上の高い多様性からなる特殊ペプチドライブラリーから、標的に結合するペプチド分子の創出が可能である。invitroディスプレイ技術は、進化分子工学のツールとして利用される。進化分子工学では、所望の機能や性質を持つタンパク質やペプチドを創製することを目的として、可能性のある遺伝子を大規模に準備し、その中から所望の表現型を有するクローンを選択する。基本的には、最初にDNA集団DNAライブラリーを調製し、invitro転写産物としてRNA集団RNAライブラリーを得て、invitro翻訳産物としてペプチド集団ペプチドライブラリーを得る。このペプチドライブラリーから、所望の機能や性質を持つものを何らかのスクリーニング系で選択することになる。例えば、特定のタンパク質に結合するペプチド分子を得たい場合は、標的タンパク質を固相化したカラムにペプチド集団を流し込み、カラムに結合したペプチド分子の混合物を回収することができる。このとき、invitroディスプレイ技術により、各ペプチド分子には、その鋳型である核酸分子がタグのように付加されている。mRNAディスプレイライブラリーであれば、各ペプチド分子にはmRNAが付加されている。そこで、回収したペプチド-mRNA複合体の集団から逆転写酵素でDNAに戻し、PCRで増幅して所望の表現型を有するクローンが多く含まれるバイアスのかかったライブラリーを得た後に、再度同じような選択実験を行う。あるいは、RNAアプタマーを回収してしまう可能性を回避するため、核酸部分を2本鎖DNARNAハイブリッドにする目的で、選択前に逆転写反応を行うことも可能である。この操作を繰り返すことで、世代の経過とともに所望の表現型を有するクローンが集団中で濃縮されていく。ペプチドアプタマーを同定する場合、invitroディスプレイライブラリーと標的物質を混合し、標的物質に結合したペプチドを提示する対応付け分子活性種を選択し、選択された対応付け分子の核酸部分からPCRにより核酸ライブラリーを調製する工程を繰り返すことで、標的物質に結合するペプチドアプタマーの遺伝子をクローニングできる。標的物質としては、一般的には、タンパク質、ペプチド、核酸、糖質、脂質、これらのいずれかの複合体、その他どのような化合物でもよい。活性種を選択するためには、遺伝情報-ペプチド複合体を標的物質と接触させ、標的物質に結合したペプチドを提示する複合体を、標的物質に結合していない他の多数の複合体から適当な方法で分離して回収する必要がある。このような回収の方法としては多くの技術が公知である。例えば、標的物質に、固相への結合により回収可能な修飾を施しておくと便利である。例えば、標的物質にポリヒスチジンタグを連結しておき、NiNTAが担持された担体へのポリヒスチジンタグの特異的な結合を利用して回収することができる。このような特異的な結合としてはポリヒスチジンペプチド金属イオンニッケル、コバルトなどの組合せの他にも、ビオチン結合タンパク質アビジン、ストレプトアビジンなどビオチン、マルトース結合タンパク質マルトース、グルタチオンSトランスフェラーゼグルタチオン、抗体抗原エピトープなどの組み合わせが、利用可能であるが、これらに限定されるものではない。本発明は、ペプチドライブラリーを標的物質と接触させ、標的物質に結合したぺプチドを提示する活性種を選択し、選択された活性種の核酸配列を増幅し、増幅された核酸配列を鋳型として無細胞翻訳系で再び合成されたペプチドのライブラリーから活性種を選択するというinvitroセレクションを繰り返すことにより、標的物質に結合する特殊ペプチドを創製することを含む。特に、直鎖状ペプチドへ架橋構造を組み込むことにより、ヘリックス構造という特定の二次構造を多く存在させることを目指したライブラリーである、二次構造指向性のペプチドを含むライブラリーを用いることで、分子間相互作用に適切と考えられる3次元構造が備わることから、単に標的タンパク質に結合しやすい分子が得られるのではなく、その分子間相互作用に関与する部位に結合して阻害活性を示すペプチドの獲得が可能である。標的物質に結合する特殊ペプチド化合物の創製は、標的物質に結合したぺプチドを提示する活性種を回収して核酸配列を解析し、核酸配列からペプチド配列を決定し、得られたペプチド配列に基づき適当な特殊ペプチドを選択することにより、標的物質に結合する特殊ペプチドのアミノ酸配列及び核酸配列を得ることを含む。さらに、得られた配列情報に基づき、任意の方法を用いて、特殊ペプチドを合成、精製及び単離することが可能である。得られたペプチドを用いて、標的タンパク質の結合評価や阻害活性の確認を行い、活性の高い特殊ペプチドを得ることができる。したがって、本発明は、標的タンパク質に結合するペプチドを選択する一次スクリーニング段階と、一次スクリーニングで選択されたペプチドの結合能力を評価し、前記ペプチドが確かな結合力を示すペプチドであることを決定する二次スクリーニング段階を含み、前記一次スクリーニング段階が二次構造指向性を有するペプチドを含むライブラリーを用意し、ペプチドライブラリーを標的タンパク質に接触させ;そして標的タンパク質に結合するペプチド分子を選択する工程を含む、ペプチドライブラリーから標的タンパク質の分子間相互作用に対する阻害活性を有するペプチドを得る方法を含む。Bcl2を標的とした場合のヘリックス含有ライブラリーの構築法とそこからの分子間相互作用を阻害するペプチドの取得法以下では、後述の実施例の項で取り上げるBcl2を標的タンパク質とした場合のペプチドライブラリーの構築法とそこからの阻害ペプチド取得法について述べる図4。ここで説明される態様はあくまで例示であり、本発明はこの態様に限定されない。標的タンパク質Bcl2細胞のプログラムされた死であるアポトーシスにはさまざまな経路があるが、その1つとしてBcl2タンパク質が寄与している制御機構が存在する。Bcl2タンパク質はアポトーシスを誘導するタンパク質と結合することでその活性を抑制する。Bcl2タンパク質は、癌化した細胞中では多く発現しているために、アポトーシスが誘導されにくくなっていることが知られている。そこで、Bcl2に高選択的かつ強力に結合する分子が獲得できれば、それがBcl2とアポトーシス誘導タンパク質との結合を阻害し、癌化した細胞にアポトーシスを導くことが可能となる。したがって、近年この阻害分子が精力的に研究されてきたが、このようなタンパク質同士の相互作用を阻害する分子の開発は難しかった。この分子間相互作用にはBcl2タンパク質に含まれるBH3ドメインと呼ばれるヘリックス構造が利用されていることから、ヘリックス構造を持つ分子のライブラリーを形成させることが出来れば、そこから高選択的、かつ強力な阻害剤を得ることが可能であると考えられ、前述のアルケン形成による架橋ペプチドによる化学ライブラリーからの探索もおこなわれた。しかし、強力な阻害活性を有する分子は得られていない。mRNAライブラリーの構築まず、ペプチドライブラリーを翻訳で構築するために、鋳型となるmRNAライブラリーを調製する。mRNAの翻訳される部分の配列の長さは、任意である。例えば、16~24コドンを含む長さのものとすることができる例えば、図5のpool161から244。このうち、N末端は開始AUGコドンである。また、C末端側にはリンカーとなるGlySerGlySerGlySerをコードするコドンが付加してもよい。開始AUGコドンの下流は、NNUもしくはNNCのランダムなコドン配列とすることができるNはAUGCのいずれか一つの塩基をそれぞれ表す。。このランダム配列中の特定の1コドンを、式Iの特殊アミノ酸導入用にAUGコドンとし、そこから2、3、6、又は10アミノ酸単位離れた位置にCysをコードするコドンUGCを配置する。ペプチドライブラリーの構築得られたmRNAライブラリーを改変された遺伝暗号表の下で翻訳する。例えば、通常の20種類のアミノ酸からメチオニンが除去された翻訳系を構築し、代わりに、itRNAfMetCAUにNα-アセチル化アミノ酸を連結させたもの、iitRNAAsnE2CAUにプロパルギルクロリド構造を側鎖に持つ特殊アミノ酸を連結させたものを利用して鋳型mRNAを翻訳する。これら2つのアミノアシルtRNAは、フレキシザイムを用いて調製することができる。ここで、iのアミノアシルtRNAは開始因子に認識されて開始AUGコドンに対合するのに対し、iiのアミノアシルtRNAは伸長因子に認識されてAUGコドンと対合する。このために、メチオニンを除去するだけで、AUGコドンに2種類のアミノ酸を導入することが可能である。翻訳されたペプチドにおいては、プロパルギルクロリド構造にシステインのスルファニル基が作用して得られるチオエーテル結合により、架橋構造が形成される。さらに、mRNAライブラリーの各mRNAの3末端にピューロマイシンを結合させておくことにより、翻訳後、ペプチドのC末端がPuピューロマイシンを介してmRNAと連結される。開始には、NαアセチルLフェニルアラニン以外の任意の特殊アミノ酸、又はメチオニン若しくは他の19種類のタンパク質性アミノ酸を利用してもよい。阻害ペプチドの獲得得られたペプチドライブラリーをmRNAディスプレイ法やリボソームディスプレイ法などの各種invitroディスプレイ法によりスクリーニングし、Bcl2に結合するペプチドを選択する。標的タンパク質と相互作用するBH3ドメインのようなヘリックス構造が翻訳ペプチド中で安定に形成されるように設計された、二次構造指向性のペプチドライブラリーを用いているので、結合だけを指標にスクリーニングを行っても、得られたペプチドは標的タンパク質の分子認識部位に結合し、その分子間相互作用を阻害する可能性が高い。異なる標的に対するペプチドライブラリーの構築本発明は、BCl2に限らず、種々の分子を標的とするスクリーニングに応用される。標的分子としては、分子間相互作用がヘリックス構造を認識して行われるものが好ましく選択される。ヘリックス構造を認識して分子間相互作用をする分子としては、例えば、p53やhDM2が挙げられるがFBernalAFTylerSJKorsmeyerLDWalenskyGLVerdineJAmChemSoc12924562457、これらに限定されない。以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。Bcl2のBH3ドメインによる分子間相互作用部位に結合しその分子間相互作用を阻害するペプチドを獲得するために、配列中に特殊アミノ酸とシステインから形成される架橋構造を備えたペプチドライブラリーNNUmRNAライブラリーを構築し、mRNAディスプレイ法によって選択を行った。NNUmRNAライブラリーまず、下記の配列を有する二本鎖DNAを調製した。以下では、Forward鎖のみを5→3の順で記載する。TAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATs3tGACGGGGGGCGGAAA翻訳領域は一つのコドンを一つので括った。NはATGCのいずれか一つを表す。sとtはトリプレットの繰り返しの数を表し、それぞれ、2と8、あるいは6と4、あるいは2と12、あるいは6と8、あるいは10と4、あるいは2と16、あるいは6と12、あるいは10と8、あるいは14と4、に相当する。続いてこれをT7RNAポリメラーゼを用いて転写し、下記の配列で表されるmRNAプールからなるライブラリーを得た図5の下の表を参照されたい。。GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUs3tGACGGGGGGCGGAAA上記の転写産物を等量ずつ混合し、下記の実験に使用した。mRNAdisplay以下のピューロマイシンリンカーとの連結から回収したペプチドの配列情報の増幅までのサイクルを繰り返すことで、ランダムなペプチドライブラリーからBcl2に結合するペプチドを選択した図4。ピューロマイシンリンカーとの連結下記の配列で表されるピューロマイシンリンカーを上記のmRNAライブラリーとアニールさせ、T4RNAligaseで連結した。SPC18はCとOの総数が18であるPEGを表す。pdCTCCCGCCCCCCGTCC5CC翻訳リンカーと連結されたmRNAを改変された遺伝暗号表の下で翻訳した図6。本実施例では、通常の20種類のアミノ酸からメチオニンを除去した翻訳系を構築し、代わりに、フレキシザイムを用いて調製された、以下の及びの2種類のアミノアシルtRNA:itRNAfMetCAUにNαアセチルLフェニルアラニンを連結させたもの、iitRNAAsnE2CAUに2アミノ6クロロヘキシ4イオニック酸、2アミノ7クロロヘプト5イオニック酸、2アミノ8クロロヘプト6イオニック酸をそれぞれ連結させたものを添加して翻訳を行った。翻訳に続き、これらの特殊アミノ酸に含まれるプロパルギルクロリド構造とシステインのスルファニル基との間でチオエーテル結合が形成され、架橋ペプチドライブラリーが合成され、ペプチドのC末端にPuを介してmRNAが結合した複合体が構築された。Bcl2に結合するペプチドの取得TALONビーズに固定化したBcl2に、調製した架橋ペプチドライブラリーを混合し、4°Cで30分間撹拌した。磁石を利用して上澄みを除去し、残った磁性粒子をバッファーで洗浄した。ビーズにPCR用の溶液を加えて95°Cで5分間加熱し、ペプチドをビーズからはずし、上澄みを回収した。回収したペプチドの配列情報の増幅Bcl2に結合して回収されてきたペプチド-mRNAを、逆転写PCRによってDNAとして増幅した。得られたDNAを転写してmRNAとした。選択されたペプチド配列の同定上記の一連の操作を繰り返し、ペプチド-mRNAの回収率が飽和したところで、増幅されたDNAを用いてTAクローニングを行い、得られたペプチドの配列を同定した。結果NNUmRNAライブラリーを翻訳すると、ランダム配列中のAUGコドンが側鎖にプロパルギルクロリドを備えた特殊アミノ酸分子に翻訳され、そこから4アミノ酸単位はなれた位置にコードされたシステインのスルファニル基との間に共有結合が形成され、架橋ペプチドライブラリーが生成する。このペプチドライブラリーを用いてmRNAディスプレイを行ったところ、プロパルギルクロリドとアミノ酸主鎖構造の間のリンカー長の異なる3種類、すなわち、2アミノ6クロロヘキシ4イオニック酸、2アミノ7クロロヘプト5イオニック酸、2アミノ8クロロヘプト6イオニック酸の3つの特殊アミノ酸のうち、いずれを用いたペプチドライブラリーにおいても、7ラウンド目でmRNAの回収率が飽和した。そこで、6ラウンド後のペプチド配列を同定したところ、大部分の配列が架橋構造をもち、その配列の中央付近に2つのアスパラギン酸を有するペプチドが得られていることが分った表1。濃縮されたペプチド配列において、2つのアスパラギン酸を有する共通の構造が見られたことは、mRNAディスプレイ法により、Bcl-2との相互作用を阻害する分子が期待通り得られたことを示唆する。以上の結果から、ペプチドの架橋構造を含むペプチドを用いて、invitroディスプレイが有効に機能することが確認できた。選択されたペプチドのBcl2結合能力評価次に、上表に示されたアミノ酸配列を有する架橋ペプチドをFmoc固相法により合成し、SPRを利用した評価法によって解離定数KDを算出することにより、結合能力を評価した。具体的にはまず、Niを結合できる基板にNiCl2を含む溶液を流してから、HistagをC末端側に備えたBcl2タンパク質を流すことによって基板上にタンパク質を固定化させた。その後、固相合成したペプチドを含む溶液を適切な濃度で順次加えていき、そのときに基板上の重さに依存した屈折率の変化を読み取ることによってそのペプチドの結合速度と解離速度を算出することによって結合力を評価した。結果を下表に示す。合成したペプチド全てがKD1nMより小さな値を示す強力な結合能を示すことが分った。