"iドメインVのステムa又はb内に塩基対ミスマッチを有さないように改変された、Sabin3の5’非コード領域からなる5’非コード領域であって、ステムa及びb内の塩基対のうちの7個又は8個がU-A塩基対又はA-U塩基対である5’非コード領域と、iiSabin1、Mahoney、MEF又はSaukett株からのカプシドタンパク質とを有する弱毒化組換えポリオウイルス。Sabin3に由来する非構造コード領域及び3’非コード領域を有する、請求項1に記載のポリオウイルス。iU-A塩基対がステムa内の471~538位及び472~537位並びにステムb内の478~533位、480~531位及び481~530位に存在し、A-U塩基対がステムb内の479~532位及び482~529位に存在する、又はiiU-A塩基対がステムa内の471~538位及び472~537位並びにステムb内の478~533位、480~531位及び481~530位に存在し、A-U塩基対がステムb内の477~534位、479~532位及び482~529位に存在する、改変された、Sabin3の5’非コード領域のドメインVを含む、請求項1又は2に記載のポリオウイルス。プロテアーゼ2A遺伝子内に変異をさらに含み、前記変異が、サル起源の細胞における免疫原性粒子の収量の増加と関連している、請求項1~3のいずれかに記載のポリオウイルス。プロテアーゼ2A遺伝子内の変異が、請求項1~3のいずれかに記載のポリオウイルスをVero細胞内で継代することによって得ることができる、請求項4に記載のポリオウイルス。変異が、残基H20、D38又はC109を変化させない、請求項4又は5に記載のポリオウイルス。変異が、A8V、Y10C、17CY、N18S、T19C、Y19H、T23I、E25G、A30P、I33V、W35R、K45E、G48D、E65K、E65V、Y70C、T79A、F80L、Y82H、Y93H、H96Y、S105T、P106S、I122V、V123A、G127R、V131A及びS134Tのうちのいずれか1又は2以上のアミノ酸の変化である、請求項4~6のいずれかに記載のポリオウイルス。不活化されている、請求項1~7のいずれかに記載のポリオウイルス。ワクチンにおいて使用するための、請求項8に記載のポリオウイルス。請求項8に記載のポリオウイルスと、薬学的に許容される担体又は希釈剤とを含むワクチン。不活化ポリオワクチンIPVの種としての、請求項1~7のいずれかに記載のポリオウイルスの使用。不活化ポリオワクチンを調製する方法であって、i請求項1~7のいずれかに記載のポリオウイルスを生体外の細胞培養で増殖させるステップと、ii前記ポリオウイルスを不活化するステップと、iii前記不活化ポリオウイルスを、薬学的に許容される担体又は希釈剤と共に製剤化するステップとを含む方法。ポリオウイルスを非ヒト細胞内で増殖させる、請求項12に記載の方法。ポリウイルスに対してワクチン接種する方法において使用するための医薬品の製造における、請求項8に記載のポリオウイルスの使用。ポリオウイルスに対して対象にワクチン接種をする方法であって、それを必要としている対象に請求項8に記載のポリオウイルスの有効量を投与するステップを含む方法。本発明者らは、IPVの種として使用するための内部型組換えポリオウイルス株を開発した。本発明のポリオウイルス株は、免疫原性特性が改良され、組織培養細胞内での増殖能力が高められている。本発明のポリオウイルス株はさらに、弱毒化され遺伝的に安定であり、IPV生成に使用するのに安全であるようにされている。特に、本発明者らは、驚くべきことに、遺伝的に改変されたSabin3の5’非コード領域と、Sabin1、Mahoney、MEF又はSaukettからのカプシドタンパク質capsidproteinと、Sabin3からの非構造コード領域及び3’非コード領域とを含む内部型組換えポリオウイルスが、5’非コード領域に同一の遺伝的改変を有するSabin3株と比較して改良された免疫原性特性を有することを見出した。本発明のポリオウイルス株は、組織培養で増殖させることができ、IPVの種として機能するのに必要な免疫原性を有するが、ヒトではそれらが大量に曝露された場合でさえ全く複製しないことになる。したがって、本発明は、iドメインVのステムa又はb内に塩基対ミスマッチを有さないように改変された、Sabin3の5’非コード領域からなる5’非コード領域であって、ステムa及びb内の塩基対のうちの7個又は8個がU-A塩基対又はA-U塩基対である5’非コード領域、iiSabin1、Mahoney、MEF又はSaukett株からのカプシドタンパク質とを有する弱毒化組換えポリオウイルスを提供する。本発明は、-ワクチンにおいて使用するための本発明の不活化ポリオウイルス-不活化ポリオワクチンIPVの種としての本発明のポリオウイルスの使用と、-不活化ポリオウイルス及び薬学的に許容される担体又は希釈剤を含み、アジュバントを含んでもよいワクチン並びに-不活化ポリオワクチンを調製する方法であって、i請求項1~7のいずれかに記載のポリオウイルスを生体外の細胞培養で増殖させるステップと、ii前記ポリオウイルスを不活化するステップと、iii前記不活化ポリオウイルスを、薬学的に許容される担体又は希釈剤と共に製剤化するステップとを含む方法も提供する。ポリオウイルスゲノムは、1本の長いポリペプチドとして宿主細胞によって翻訳される単一線状RNA分子である。ポリオウイルスRNAは、高度に構造化された長い5’末端を含み、これは、ポリペプチド産物をコードしておらず、I~VIの6つのドメインを含有している。これらのドメインのうちのいくつかドメインVを含むは、翻訳の開始を決定する内部リボソーム進入部位IRES,InternalRibosomeEntrySiteを共に含む。ポリオウイルスRNAのコード領域は、2つの領域に分けられ、1つは、ウイルスのカプシドを構成する構造タンパク質をコードし、もう1つは、ウイルスのプロテアーゼ及びウイルスのRNA依存性RNAポリメラーゼ等の非構造タンパク質をコードしている。3’非翻訳領域は、5’非コード領域よりも複雑でない。本発明者らは、5’非コード領域のドメインVに変異を有し、そのため、野生型ポリオウイルス株と比較して弱毒化されていると共に遺伝的に安定である、ポリオウイルスの内部型組換え株を開発した。本発明の内部型組換えポリオウイルス株は、Sabin1、Sabin2、Sabin3、Mahoney、MEF又はSaukettポリオウイルス株からの1種又は2種以上のカプシドタンパク質も有する。ポリオウイルスのカプシドタンパク質は、ポリオウイルス粒子を囲むタンパク質外殻を形成する。したがって、これらのカプシドタンパク質は、宿主の免疫系に曝露され、ポリオウイルスに対する宿主の免疫応答を導く。内部型組換えポリオウイルスのカプシドタンパク質を変化させることにより、ポリオウイルスの免疫原性特性の操作が可能になる。したがって、本発明の弱毒化ポリオウイルスは、Sabin3の5’非コード領域を含み、それは、ドメインVのステムa及びbが塩基対ミスマッチを含まず、且つステムa及びb内の塩基対のうちの7個又は8個がA-U又はU-A塩基対であるように改変されている。本発明の弱毒化ポリオウイルスは、Sabin1、Sabin2、Sabin3、Mahoney、MEF又はSaukett株からの、好ましくは、Sabin1、Mahoney、MEF及び/又はSaukettからの、より好ましくは、Mahoney、MEF及び/又はSaukettからの、カプシドタンパク質、こうした1種のカプシドタンパク質、2種以上のカプシドタンパク質、又は全構造タンパク質も含む。ドメインVの改変本発明の弱毒化ポリオウイルスは、遺伝的に安定であり、IPVの種として使用するのに安全である。これは、野生型を再生するのに2つの同時の変異が必要とされるようにGC塩基対をAU塩基対で置き換えることにより、並びに単一変異によるGCへの復帰及び構造を強化する結果を防ぐためにGU塩基対をAU塩基対で置き換えることにより、5’非コード領域内のドメインVの構造を弱めることによって達成される。ドメインVの熱力学的安定性がSabin3型ワクチン株のものと同じになるように調整されたウイルスは、同一の生物学的特性を有するが、継代において安定であることが示されているMacadametalJVirol80865363。本発明の弱毒化ポリオウイルスは、ドメインVのステムa又はb内に塩基対ミスマッチを有さないように改変された、Sabin3の5’非コード領域からなる5’非コード領域であって、ステムa及びb内の塩基対のうちの7個又は8個がU-A又はA-U塩基対である5’非コード領域を含む。好ましい一実施形態において、本発明の弱毒化ポリオウイルスは、U-A塩基対がステムa内の471~538位及び472~537位並びにステムb内の478~533位、480~531位及び481~530位に存在し、A-U塩基対がステムb内の479~532位及び482~529位に存在する、改変された、Sabin3の5’非コード領域のドメインVを含む。改変されたVドメインの配列は、以下の通りであってもよい:AUUCUAACUAUUAAGCAGGCAGCUGCAACCCAGCAGCCAGCCUGUCGUAACGCGCAAGUUAAUAGCGAAA配列番号1。他の好ましい一実施形態において、本発明の弱毒化ポリオウイルスは、U-A塩基対がステムa内の471~538位及び472~537位並びにステムb内の478~533位、480~531位及び481~530位に存在し、A-U塩基対がステムb内の477~534位、479~532位及び482~529位に存在する、改変された、Sabin3の5’非コード領域のドメインVを含む。改変されたドメインVの配列は、以下の通りであってもよい:AUUCUAAAUAUUAAGCAGGCAGCUGCAACCCAGCAGCCAGCCUGUCGUAACGCGCAAGUUAAUAUCGAAA配列番号2。本発明のポリオウイルスは、対応して、Sabin1又はSabin2ポリオウイルスのステムa及びbの配列に由来していてもよい。本発明のポリオウイルスの5’非コード領域内の変異は、ウイルスの毒性を弱毒化させてウイルスを遺伝的に安定化し、それによって、それらが毒性に復帰する可能性を少なくする。したがって、これらの変異は、ウイルスを不活化ポリオワクチンの生成に現在使用されている野生型ウイルスに必要とされる封じ込めレベルよりも低い封じ込めレベルで生成しても安全であるようにする。ドメインV内の変異は、当技術分野において知られている変異誘発の標準的な方法うちのいずれによって導入されてもよい。例えば、変異は、ポリオウイルスのゲノムRNAに対応するコピーDNAの部位特異的変異誘発により、ポリオウイルスの株、通常はSabin株に導入され得る。これは、ポリオウイルスゲノムの感染性のDNAコピーからの適切な領域を、M13等のバクテリオファージの1本鎖DNA内にサブクローニングすることによって達成されてもよい。代替的に、変異配列は、完全にインビトロで合成することもできる。当該変異又は各変異の導入後、改変されサブクローニングされたコピーDNAは、それらが由来する完全なコピーDNA内に再導入される。生ウイルスは、インビトロで転写を導くためにT7プロモーターを典型的には使用してポジティブセンスRNAを生成することにより、変異した全長コピーDNAから回収されるVanderWerfetalProcNatlAcadSciUSA83233023341986。回収されたRNAは、標準的な技術を使用して組織培養に適用され得るKochCurrTopMicrobiolImmunol61891381973。インキュベーションの2~3日後に、ウイルスは、組織培養の上清から回収され得る。次いで、ヒトのポリオウイルス受容体のトランスジェニックマウスにおいて標準的なLD50試験を使用して、又はサルにおいてWHOに承認されているワクチン安全性試験を使用して、神経毒性のレベル及びしたがって改変されたウイルスの弱毒化のレベルを未改変のウイルスのものと比較することもできるWHOTechRepSer687107175。ドメインVを弱めることによる弱毒化は、BGM細胞においてMacadametalVirology1814514581991又はMacadametalVirology1894154221992においてCM-1細胞について記載されているようにL20B細胞において温度感受性とほぼ相関することも示されている。したがって、予想される弱毒化のレベルを決定するための予備的なスクリーニングとして、改変ウイルスの温度感受性を決定することができる。これは、同一の細胞において例えば33°C又は35°Cで得られる数からの10の累乗1.0log10によって、プラーク形成単位pfu,plaqueformingusingの数が減少する温度Tとして表され得る。Tの値が小さいほど弱毒化の程度が大きくなる。構造コード領域ポリオウイルスゲノムの構造コード領域は、カスピドタンパク質をコード化しており、これは、ポリオウイルス粒子の保護性のタンパク質外殻を形成する。本発明の弱毒化ポリオウイルスは、Sabin1、Sabin2、Sabin3、Mahoney、MEF又はSaukett株からの、好ましくは、Mahoney、MEF及び/又はSaukett株からの1種又は2種以上のカプシドタンパク質を含んでいてもよい。好ましい一実施形態において、本発明の弱毒化ポリオウイルスは、Sabin1、Mahoney、MEF又はSaukett株の全てのカプシドタンパク質を含む。本発明のポリオウイルスは、異なる株の任意の組合せからの、例えば、Mahoney及びMEFからの、Mahoney及びSaukettからの、MEF及びSaukettからの、又はMahoney、MEF及びSaukettからのカプシドタンパク質を含んでいてもよい。内部型組換え株は、当技術分野において知られている標準的な技術によって生成され得る。非構造コード領域及び3’非コード領域本発明のポリオウイルスは、Sabin1、Sabin2、Sabin3、Mahoney、MEF及びSaukett株のうちのいずれかからの非構造コード領域及び3’非コード領域を有していてもよい。好ましい一実施形態において、本発明の弱毒化ポリオウイルスは、Sabin3に由来する非構造コード領域及び3’非コード領域を有する。Sabin3を骨格とする株においてカプシドタンパク質をカセットとして交換することによって本発明のポリオウイルスを生成することは、インビトロ又はインビボにおける、カプシド領域外での株間の組換えの、可能性のある既知又は未知のあらゆる影響を排除する。これはまた、構築をより容易にし、ウイルスの特性をより予測可能にする。一実施形態において、本発明の弱毒化ポリオウイルスは、特に、5’非コード領域がSabin1又はSabin2に由来している場合に、Sabin1又はSabin2に由来する非構造コード領域及び3’非コード領域を有する。プロテアーゼ2A遺伝子内の変異本発明の弱毒化ポリオウイルスは、プロテアーゼ2A遺伝子内に変異を含んでいてもよく、前記変異は、Vero細胞のような、サル起源の細胞株における免疫原性粒子の収量の増加と関連している。こうした変異は、本発明のポリオウイルスをVero細胞内で継代することによって又は任意の標準の変異誘発技術によって得られ得る。プロテアーゼ2A遺伝子内の変異は、典型的には、本発明のポリオウイルスをVero細胞内で継代することによって得られるものである。サル細胞株内でポリオウイルスの収量を増加させる、プロテアーゼ2A遺伝子内の他の変異も導入され得る。プロテアーゼ2A遺伝子内の変異は、感染性のポリオウイルスのクローンを直接に変異させることによって導入されてもよい。一実施形態において、本発明の弱毒化ポリオウイルスは、プロテアーゼ2A遺伝子内に、残基H20、D38又はC109を変化させない変異を含む。好ましい一実施形態において、ポリオウイルスのプロテアーゼ2A遺伝子の変異は、A8V、Y10C、17CY、N18S、T19C、Y19H、L21R、T23I、E25G、A30P、I33V、W35R、K45E、G48D、E65K、E65V、Y70C、T79A、F80L、Y82H、Y93H、H96Y、S105T、P106S、I122V、V123A、G127R、V131A及びS134Tのうちの1個のアミノ酸の変化を含む。プロテアーゼ2A遺伝子内のこれらの変異は、Vero細胞のような、サル起源の細胞株における温度感受性の低下及び/又は適応度の増大と関連すると同時に、プロテアーゼ2Aの変異を欠いた対応するポリオウイルスにおいて認められる弱毒化の程度を保持している。したがって、本発明は、本発明のポリオウイルスをVero細胞内で継代することと、免疫原性粒子の収量の増加に関連する変異をプロテアーゼ2A遺伝子内に有するポリオウイルスを選択することとを含む、プロテアーゼ2A遺伝子内に変異を含む弱毒化ポリオウイルスを生成する方法も提供し、前記選択は、iプロテアーゼ2A遺伝子を配列決定して、適切な変異を特定すること、又はiiポリオウイルスをスクリーニングして、Vero細胞内で継代されていない本発明のポリオウイルスと比較して、不変の、若しくは実質的に不変の弱毒化の程度及び温度感受性の低下を有するウイルス粒子を特定することを伴う。温度感受性アッセイは、例えば、MacadametalVirology189415221992に記載のようにVero細胞を使用して行われ得る。プロテアーゼ2A遺伝子内の変異は、上記のようにDNA内に変異を導入する既知のいかなる方法によっても導入され得る。IPVの生成方法において、Vero細胞のように、ヒト以外の細胞内で増殖させる本発明のポリオウイルスは、好ましくは、本明細書中に記載のプロテアーゼ2A遺伝子内に少なくとも1個の変異を含む。ワクチン本発明のポリオウイルスは、血清有病率試験等の調査活動において小規模で使用されてもよく、IPV生成において大規模で使用されてもよい。本発明のポリオウイルスは、ポリオウイルスの根絶の前に最低限の封じ込めを必要とし、ヒトに感染性の生存可能な株についての現行のWHOの指針によって必要とされているようなカテゴリーBSL3-ポリオでの根絶後の封じ込めは必要とされないことになる。したがって、弱毒化ポリオウイルスは、IPVの種として使用されてもよい。したがって、本発明は、本発明の不活化された弱毒化ポリオウイルスを提供する。本発明は、IPVの種としての本発明によるポリオウイルスの使用も提供する。本発明によってさらに提供されるのは、不活化ポリオワクチンを調製する方法であって、i本発明による弱毒化ポリオウイルスを生体外の細胞培養で増殖させるステップと、ii前記ポリオウイルスを不活化するステップと、iii前記不活化ポリオウイルスを、薬学的に許容される担体又は希釈剤と共に製剤化するステップとを含む方法である。当該弱毒化ポリオウイルスは、非ヒト培養細胞、例えばL20B細胞及びVero細胞内で増殖させてもよい。当該弱毒化ポリオウイルスは、ヒトの培養細胞、例えばMRC5及びHep2C細胞内で増殖させてもよい。当該ポリオウイルスは、いかなる好適な方法によって不活化されていてもよい。典型的には、現在使用されているIPVにおいて野生型ポリオウイルスを不活化するのに使用される方法が用いられる。例えば、当該ポリオウイルスは、ホルムアルデヒド、β-プロピオラクトン又はバイナリーエチレンイミン処理によって、好ましくはホルムアルデヒド処理によって、不活化されていてもよい。本発明による弱毒化ポリオウイルスは、不活化されていてもよい。本発明の不活化された弱毒化ポリオウイルス株は、薬学的に許容される担体又は希釈剤と組み合わされていてもよい。IPV製剤のような、不活化ウイルス製剤に入れて従来通りに使用されるいかなる担体又は希釈剤が用いられてもよい。IPV製剤は、1型、2型及び/又は3型のカプシドタンパク質を含む不活化ポリオウイルスを含んでいてもよい。したがって、本発明の弱毒化不活化ポリオウイルスは、ヒト患者において灰白髄炎に対してワクチン接種するために使用され得る。したがって、本発明は、ポリオウイルスに対して対象にワクチン接種をする方法であって、それを必要としている対象に本発明の不活化ポリオウイルスの有効量を投与するステップを含む方法を提供する。有効量は、ポリオウイルスに対する防御免疫応答を誘発するのに十分な量である。この目的のために、これらは、非経口等の、任意の好適な経路によって投与され得る。非経口投与は、皮下、皮内又は筋肉内の注射によるものであってもよい。本発明の不活化ポリオウイルスは、アジュバントと共に投与されてもよい。8~40ユニットのD抗原のように、従来のIPVについて投与される量に相当する用量が投与されてもよい。本発明の不活化された内部型組換えポリオウイルスの用量は、必要とされる程度の免疫原性を達成するために調整され得る。例えば、カプシドタンパク質がSabin2又はSabin3に由来しているときに、カプシドタンパク質がSabin1、MEF、Mahoney又はSaukettに由来しているときよりも高い用量を使用することもできる。例えば、約16~約80ユニットのD抗原の用量、例えば約30ユニットのD抗原例えば、32ユニットのD抗原又は約60ユニットのD抗原例えば、64ユニットのD抗原などを使用することもできる。ワクチンが適切なアジュバントと共に投与される場合には、より低い用量を使用することもできる。本発明は、本発明の不活化ポリオウイルスと、薬学的に許容される担体又は希釈剤とを含むワクチンを提供する。当該ワクチンは、アジュバントをさらに含んでいてもよい。当該ワクチンは、1種又は2種以上の異なる本発明の内部型組換えポリオウイルス株を含んでいてもよい。例えば、当該ワクチンは、1型及び2型、1型及び3型、2型及び3型、又は1型、2型及び3型のポリオウイルス株からの構造タンパク質を含むウイルスの混合物を含んでいてもよい。典型的には、1型カプシドタンパク質は、Sabin1又はMahoney、好ましくはMahoneyから、2型カプシドタンパク質は、Sabin2又はMEF、好ましくはMEFから、3型カプシドタンパク質は、Sabin3又はSaukett、好ましくはSaukettからであることになる。本発明の1型、2型及び3型のポリオウイルスの異なる相対免疫原性からみて、当該ワクチンは、1型、2型及び/又は3型のカプシドタンパク質を含有する異なる量のポリオウイルスを含んでいてもよい。例えば、1型:2型:3型の比率のx:y:zは、x<y<zで使用され得る。特定の一例において、当該比率は、D抗原の30:32:45ユニットであってもよい。本発明の不活化ポリオウイルスは、独立のポリオワクチンとして投与されてもよく、又は、例えばDTPジフテリア、百日咳、破傷風、HibヘモフィルスHaemophilusインフルエンザB型若しくはB型肝炎等の他の構成要素を含有する組合せワクチンにおいて投与されてもよい。本発明は、ポリオウイルスに対してワクチン接種する方法において使用するための医薬品の製造における、本発明による不活化ポリオウイルスの使用、及びポリオウイルスに対してワクチン接種する方法において使用するための、本発明による不活化ポリオウイルスも提供する。以下の例は、本発明を例示するものである。[実施例]新しい株の構築S15、S17、S18及びS19表1、図1は、3型経口ポリオワクチン株Sabin3の派生株である。標準的な方法によってウイルスを構築して回収した。変異したヌクレオチドは図1に太字で示しており、それ以外の場合、配列はSabin3と同一である。UA又はAU塩基対によるCG塩基対の置換は、ドメインVの熱力学的安定性を次第に低下させる;次いで、何らかの単一の変異が関連した塩基対を弱めることになるので、全てのUG塩基対の除去は、構造を遺伝的に安定にする。構造を強化するためには、それが、UA塩基対をCG又はGC塩基対に変えることによってのみ達成され得るので、2個の同時の変異が必要とされることになる。標準的な方法によってウイルスを構築して回収した。より詳細には、PCR変異誘発によってS17、S18及びS19を構築した。各プラスミドについて、ヌクレオチドa31~50及び471~489、b471~489及び522~540並びにc522~540及び755~778に位置する、Sabin3の5’非コード領域の3種の断片を、図1に示しているように必要な配列の変更が組み込まれているプライマーを使用してPCRによって増幅した。部分的に重複したこの3種の断片a~cをゲル精製して、外側のプライマーと混合してそれで再増幅し、次いで、変異した5’非コード領域を含む747bpの断片をpCR21Invitrogen社製内にクローニングしてその配列を決定した。正しい配列を有するMluI-SacI279~751断片を、SacI-SacI751~1900断片を欠いているSabin3クローン内に連結させた。部分的なSacI/SmaI2768断片の添加によって全長の感染性のクローンを作製した。S18及びS19の双方のカプシドタンパク質コード領域P1を、血清型1及び血清型2の弱毒化生ワクチン株Sabin1及びSabin2のP1領域と、又は現在の野生型のIPVの種株であるMahoney1型、MEF2型及びSaukett3型のP1領域と正確に置き換えた。コード配列を変更することなく、5’及び3’末端にSacI及びSacIIの制限部位を組み込んだ図2、関連したポリオウイルス株からのRNAを鋳型及びプライマーとして使用してPCRによってカプシド配列を増幅した。以下のプライマーを使用してSabin1及びMahoneyのP1領域を増幅した:SACI5’ATCATAATGGGAGCTCAGGTTTCA3’配列番号3及び2ASAC15’TTGTAACCCGCGGTGTACACAGCTTTATTCTGATGCCCAAAGCCATATGTGGTCAGAT3’配列番号4。以下を用いてSabin2のP1領域を増幅した:SAC2a5’ACAATGGGCGCTCAA3’配列番号5及び2ASAC25’TTGTAACCCGCGGTGTACACAGCTTTATTCTGATGCCCAAAGCCATAAGTCGTTAATC3’配列番号6。以下を用いてMEFのP1領域を増幅した:SAC2b5’ACAATGGGAGCTCAA3’配列番号7及び2ASACMEF5’TTGTAACCCGCGGTGTACACAGCTTTATTCTGATGCCCAAAGCCATAGGTTGTCAAGC3’配列番号8。以下のプライマーを使用してSaukettのP1領域を増幅した:S3P15’AACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGGAGCTCAAGTATCATCCCAA3’配列番号9及び2ASACSkt5’TTGTAACCCGCGGTGTACACAGCTTTATTCTGATGCCCAAAGCCGTAGGTGGTCAAAC3’配列番号10。以下のプライマーを使用してPCR変異誘発によってSacII制限部位をS18内に導入した:2ASAC35’GTGTACACCGCGGGTTACAA3’配列番号11及び2ASAC35’TTGTAACCCGCGGTGTACAC3’配列番号12。SacI及びSacIIの制限部位を使用して全長ゲノムプラスミド内に組み込む前に、全てのP1領域のコピーを含むDNA断片の配列を確認した。こうして、ドメインVの配列内S18様又はS19様及びカプシドタンパク質コード配列内Sabin又は野生;血清型1、2又は3で異なった最終的な12株が生成された表2、図2。RNA抽出及びRT-PCR後に、全変異体の5’非コード領域の配列を確認した。2μg以上のT7転写産物を用いた、HEp2C単層のトランスフェクションVanderWerfetalProcNatlAcadSciUSA83233023341986によってウイルスを回収し、その後、完全な細胞変性効果が明らかになるまでの時間である、24~48時間、33°Cでのインキュベーションを行った。弱毒化の表現型及び感染力過去15年間にわたり、ポリオウイルスの毒性を評価するための、ヒトのポリオウイルス受容体を発現しているトランスジェニックマウスの使用が確立され、その有効性が認められてきている。ポリオウイルス受容体を発現しているトランスジェニックマウスTgPVRマウスの脊髄内接種は、ウイルスの複製によりニューロンの欠失と麻痺の明らかな臨床徴候とがもたらされるので、インビボでの感染力を測定する感度が高い方法である。10PFUより少ない野生型ウイルスは、通常、この接種経路を使用して50のマウスを麻痺させるのに十分であるChumakovetalDevBiol1051711772001。変異したSabin3株及び内部型組換え株の弱毒化表現型を、この標準的な方法によって決定した。これらの結果を表1及び2に示している。感度が高い脊髄内経路を使用して、10細胞培養感染単位未満の野生型株Mahoney及びLeonは、半分のマウスを麻痺させるのに十分であった表1。サルの試験で認められているようにMacadametal2006、株S15はSabin3と区別できず、S18由来の全てのウイルスは108CCID50を超えるPD50を有していた表1及び2。これらは、5μlである、接種された用量において実行可能な最高の力価を表しているので、過小評価であろう。S19由来のウイルスにおける3個のCG-UA塩基対の交換の効果は、外挿法によって、このモデルにおける感染力が10億分の1よりも減少しそうである。これらの結果により、S18及びS19に基づいたウイルスは、ドメインVにおいて復帰しない限りこれらの株がそうなることはあり得ない低い感染力を有する、Sabin3よりもヒトへの感染性が実質的に低くなることが示唆される。継代における安定性安定性を評価するために、ヒト腸管内における選択を模した、Sabin3のドメインVにおける復帰を急速に選択する条件下で、L20B細胞において37°Cでウイルスを継代した。これらの条件下でS15及び表現型的にS15と同様のS16のドメインV配列は、完全に安定であったMacadametal2006。S18及びS19由来のウイルスも継代において安定であって、復帰不能なさらなる対の変異を有するという利点を有する。Vero細胞においても同様であったが、Sabin3のドメインVにおける復帰の選択がより遅い速度で生じた。Veroで選択された全てのウイルスがプロテアーゼ2A遺伝子内に変異を有しており、限られた程度まで、それらの親よりも高温で増殖した。この現象はサル細胞に対する適応を表しており、ヒト又はマウス起源の細胞では認められない。これらの変異は、インビボでの表現型に対して影響しないようである表3。Vero細胞における37°Cでの10回継代後のウイルスのうちの1つのPD50、及び37°Cで選択された3個のプラークは、これらの親であるS18のものと区別できなかった。同様に、2AにおけるN18S変異の存在は、野生型カプシドを有するS19-IPV株の表現型の弱毒化に対して影響しなかった表4。脊髄内に投与した最高用量において、いずれのマウスにも臨床疾患はなかった。灰白髄炎のサルモデルにおいて同様の結果が以前に得られた。ドメインV内の481における弱毒化変異によって引き起こされる、Sabin2の温度感受性表現型を抑制する異なる2個の2A変異は、弱毒化に影響を及ぼさなかったRoweetalVirology2692842932000。細胞培養における増殖特性細胞培養において、ドメインVのRNA二次構造が次第に弱まることにより、ウイルスが複製できる温度の上限が次第に低下した図3。実際の限度は、使用した細胞の基質に依存しており、Hep2C細胞が最も許容性であり、L20B細胞が最低でVero細胞は中程度であった。MRC5細胞も中程度であるが、Vero細胞よりも許容性である。全ての株の増殖及び収量の動態は33°CでのMRC5細胞におけるのと同様であり、24時間以内に野生型ウイルス108~109TCID50/mlと同じくらい多い収量を生成した図4。MRC5細胞は、IPV生成に有効であることが認められており認可されているが、これを使用する製造業者は多くなく、マイクロキャリア上での無血清Vero細胞培養が好まれている。Vero細胞における初期収量は、細胞の供給源及び継代レベルに依存して、変動したが、常にMRC5細胞におけるよりも少なかった。これまでのところ、S18ウイルスについては2×108/mlの力価が、S19ウイルスについては5×107/mlの力価が24時間で得られている。それでもやはり、本発明者らの予備的な証拠下記により、現在の野生型の種で得られるものと等しい、Vero細胞におけるD-抗原の収量を得ることができることが示唆される。免疫原性IPV産物についての2つの標準的なバッチリリースアッセイは、D-抗原ELISA試験及びラット免疫原性試験であるEuropeanPharmacopoeiasupplement20012000021412891293。ELISAアッセイは、天然のポリオビリオンに特異的な抗体を使用して抗原性を測定し、次いで、標準製剤と比較して効力が表される。インビボアッセイの場合は、複数の群のラットに4種の希釈のワクチンで免疫し、抗体を中和する存在についてそれらの血清を試験する。被験製剤についてのセロコンバージョン率を標準製剤で得られたものと統計的に比較することによってワクチン効力を算出する。本明細書に記載の新しい株の免疫原性を評価するために、これらの双方のアッセイを用いている。表5に挙げている全てのウイルスについて、製造業者のプロトコルMartinetalJGenVir84178117882003を規模を縮小して使用して、ウイルスの高い力価のストックを調製し、ホルムアルデヒドで不活化した。不活化の前及び後の材料についてD-抗原ELISAを行った。これらのデータを使用して、ワクチンバッチリリース標準操作手順を使用して行われるインビボアッセイに適切な用量を算出した。ワクチンは、効力の95信頼限界が値1.0を含む場合にこのラットの試験を通過する;したがって、野生型カプシド及びS18/S1P1を有する全ての構築物は、IPVとして発売されるのに十分に免疫原性であった。ポリオウイルスMEF-1は、1942年に単離され、少なくとも2つの密接に関連した構成要素を含有していた;IPV製造業者によって現在使用されているMEF-1株は、いくつかのヌクレオチド位置においても異なっているOdoomJKPhDThesisLondonSchoolofHygieneandTropicalMedicine2008。ウイルスS18/MEFP1のカプシドタンパク質のアミノ酸配列は、1位置においてIPV効力の参照株のものと異なることが見出され、そのため、参照と同一のカプシドアミノ酸配列を有する、もう1つのバージョンであるS18/MEF2P1を構築した。ラット免疫原性アッセイにおいて、S18/MEF2P1は、1.0の相対効力を有する参照株表4と区別できなかったが、ウイルスS18/MEFP1は、わずかにより低い効力を有していた。いずれの株もワクチンバッチリリース試験CIが1.0の値を含まなければならないを通過するのに十分に効力があったが、ワクチン生成にはMEF2P1カプシドタンパク質配列を有する株が好ましくなりそうである。統計解析後、これらの結果により、以下のことが示された:iドメインV内に導入された変更は、不活化、抗原性又は免疫原性に対する影響を有さなかった。iiDAgU/初期感染力価の観点からの免疫原の収量は、製造業者のデータと一致していた。iii野生型カプシドタンパク質を有する株は、同等のIPV株とほぼ同じくらいに免疫原性があった。iv関連した野生型参照株と比較して、Sabinカプシドタンパク質を有する株は、免疫原性が、1型ではわずかに高く、2型でははるかに低く、3型ではわずかに低かった。Vero細胞における増殖及び安定性ポリオウイルスのS18及びS19株をVero細胞内で増殖させるとき、それらの初期の複製はかなり遅い。プロテアーゼ2A遺伝子内に特定の変異を有するポリオウイルスは、Vero細胞内でより効率良く増殖する。多数のポリオウイルスをVero細胞内で増殖させるときには、それらはこの細胞型における増殖のために適応し、増殖効率を上昇させる役割を果たしているのはプロテアーゼ2A遺伝子内の変異である。2A遺伝子内に導入された好適な改変例えば、変異N18Sを有するS18及びS19株のバージョンは、この適応のステップを必要とせず、Vero細胞内で最初から効率良く複製する。Vero細胞を1.0の感染多重度で感染させて、それらの細胞を33°Cで48時間インキューベートすることにより、Vero細胞における増殖に対する、Sabin3、S18及びS19のプロテアーゼ2A遺伝子内のV123A変異の効果を実証した。33°CでのHep2C細胞におけるCCID50アッセイによって収量を測定した。これらの結果を以下の表6に示している。S18/MahP1ウイルスと、2A遺伝子内に導入された変異を有する同等のウイルスであるS18/MahP1/2AN18Sとの双方をVero細胞内で3種の異なる温度で10回の継代にわたって増殖させて、プロテアーゼ2A遺伝子配列及びドメインV配列の安定性を決定した。下記の表7に示しているように、ドメインV配列、及びN18Sが変異したプロテアーゼ2A遺伝子配列は完全に安定であった。未変異のプロテアーゼ2A遺伝子配列は、予想した通りに、Vero細胞内での増殖を促進する変異を獲得した。"