メガヌクレアーゼ変異型が由来する当初メガヌクレアーゼの部位とは異なる認識切断部位を示すことを特徴とするメガヌクレアーゼ変異型。a当初メガヌクレアーゼからメガヌクレアーゼ変異型のライブラリを作製する工程;及びbDNA標的配列を切断できる変異型を単離する工程を含む方法により得ることができることを特徴とする請求項1に記載のメガヌクレアーゼ。請求項1又は2に記載のカスタムメイドメガヌクレアーゼをエンコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。請求項1又は2に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とするベクター。ターゲティングDNA構築物をさらに含むことを特徴とする請求項4に記載のベクター。前記ターゲティングDNA構築物が、請求項1又は2に記載のメガヌクレアーゼの切断部位の周囲の領域と相同性を共有する配列を含むことを特徴とする請求項4又は5に記載のベクター。前記ターゲティングDNA構築物が:a請求項1又は2に記載のメガヌクレアーゼの切断部位の周囲の領域と相同性を共有する配列、及びbaの配列で挟まれる導入される配列を含むことを特徴とする請求項4又は5に記載のベクター。請求項3に記載のポリヌクレオチド又は請求項4~7のいずれか1項に記載のベクターにより改変されたことを特徴とする細胞。請求項3に記載のポリヌクレオチド又は請求項4~7のいずれか1項に記載のベクターを含むことを特徴とするトランスジェニック植物。請求項3に記載のポリヌクレオチド又は請求項4~7のいずれか1項に記載のベクターを含むことを特徴とするヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。請求項1又は2に記載のメガヌクレアーゼ、請求項3に記載のポリヌクレオチド、請求項4~7のいずれか1項に記載のベクター、請求項8に記載の細胞、請求項9に記載のトランスジェニック植物、請求項10に記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物の、分子生物学、インビボ又はインビトロ遺伝子工学及びインビボ又はインビトロゲノム工学のための使用。DNA標的配列を含む対象の部位に二本鎖破壊を導入し、それによりDNA組換え事象、DNA損失又は細胞死を導くための請求項11に記載の使用。前記二本鎖破壊が、特定配列を修復するため、特定配列を改変するため、変異した遺伝子の代わりに機能的遺伝子を回復させるため、対象の内因性遺伝子を減弱させるか又は活性化するため、対象の部位に突然変異を導入するため、外因性遺伝子又はその一部分を導入するため、内因性遺伝子又はその一部分を不活性化するか又は欠失させるため、染色体腕を転座させるため、あるいはDNAを修復されないままにして分解させるためであることを特徴とする請求項12に記載の使用。前記メガヌクレアーゼ、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、トランスジェニック植物又はヒト以外の哺乳動物が、請求項6又は7に規定されるターゲティングDNA構築物と関連することを特徴とする請求項11~13のいずれか1項に記載の使用。請求項1又は2に記載のメガヌクレアーゼを用いてベクターに位置しかつDNA標的配列を含む対象の部位において二本鎖破壊を導入し、それにより切断部位の周囲の配列と相同性を示す別のベクターとの相同的組換えを誘導する工程を含むことを特徴とする遺伝子工学の方法。次の工程:1請求項1又は2に記載のメガヌクレアーゼの少なくとも1つの認識切断部位を含むゲノム遺伝子座に二本鎖破壊を導入する工程;2標的された遺伝子座と相同性を共有する配列で挟まれる導入される配列を含むターゲティングDNA構築物を提供する工程を含むことを特徴とするゲノム工学の方法。次の工程:1請求項1又は2に記載のメガヌクレアーゼの少なくとも1つの認識切断部位を含むゲノム遺伝子座に二本鎖破壊を導入する工程;2切断部位の周囲の領域と相同性を共有する染色体DNAと、相同的組換えに適切な条件下で保持する工程を含むことを特徴とするゲノム工学の方法請求項1~7のいずれか1項に記載の少なくとも1つのメガヌクレアーゼ、ポリヌクレオチド又はベクターを含むことを特徴とする組成物。標的遺伝子座と相同性を共有する配列で挟まれる対象の部位を修復する配列を含むターゲティングDNA構築物をさらに含むことを特徴とする請求項18に記載の組成物。請求項1~7のいずれか1項に記載の少なくとも1つのメガヌクレアーゼ、ポリヌクレオチド又はベクターの、遺伝子疾患の予防、改善又は治療を必要とする個体において該個体にいずれの手段により投与される該遺伝子疾患を予防、改善又は治療するための医薬品を製造するための使用。請求項1~7のいずれか1項に記載の少なくとも1つのメガヌクレアーゼ、ポリヌクレオチド又はベクターの、DNA媒介物を提示する感染性因子により引き起こされる疾患の予防、改善又は治療を必要とする個体において該個体にいずれの手段により投与される該疾患を予防、改善又は治療するための医薬品を製造するための方法。請求項1~7のいずれか1項に記載の少なくとも1つのメガヌクレアーゼ、ポリヌクレオチド又はベクターの、生物学的に得られた物質又は生物学的使用もしくは物体の消毒を意図する物質において、インビトロで、DNA媒介物を提示する感染性因子の増殖を阻害するかあるいは該感染性因子を不活性化又は除去するための使用。前記感染性因子がウイルスである請求項22に記載の使用。これらの努力にかかわらず、認識および切断についての新規な配列特異性を有する新規なレアカットエンドヌクレアーゼへの強い必要性がある。本発明は、当初のメガヌクレアーゼに由来する標的DNA配列を切断可能なカスタムメイドメガヌクレアーゼを製造する方法に関する。該方法は、メガヌクレアーゼ変異型のライブラリを作製する工程および標的DNA配列を切断できる変異型を選択する工程を含む。カスタムメイドメガヌクレアーゼを製造する方法の第一の実施形態において、当初のメガヌクレアーゼは天然のメガヌクレアーゼである。または、上記の当初のメガヌクレアーゼは天然のものではない。好ましくは上記の当初のメガヌクレアーゼは、ホーミングエンドヌクレアーゼ、より好ましくはLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼである。より好ましい実施形態において、該LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼはICreIである。カスタムメイドメガヌクレアーゼを製造する方法の第二の実施形態において、メガヌクレアーゼ変異型のライブラリは、標的突然変異誘発によるか、ランダム突然変異誘発によるか、DNAシャッフリングによるか、直接突然変異誘発によるかまたはこれらの組み合わせにより作製される。好ましくは、該ライブラリは標的突然変異誘発により作製される。該標的突然変異誘発は、DNA標的と相互作用するメガヌクレアーゼセグメントにおいて行なわれ、より好ましくは相互作用するアミノ酸の位置に導入される。必要に応じて、可変の位置に存在するアミノ酸は、D、E、H、K、N、Q、R、S、T、Yを含むかまたはこれらからなる群より選択される。本発明の具体的な実施形態において、ICreI変異型のライブラリは、Q26、K28、N30、S32、Y33、Q38、Q44、R68、R70およびT140からなる群より選択される位置にアミノ酸多様性を導入することにより製造される。好ましくは、ICreI変異型のライブラリは、位置:aQ26、K28、N30、Y33、Q38、Q44、R68、R70、T140;bQ26、K28、N30、Y33、Q38、Q44、R68、R70;cQ26、K28、N30、Y33、Q44、R68、R70;またはdQ26、K28、Y33、Q38、Q44、R68、R70に多様性を導入することにより製造される。より好ましくは、ICreI変異型のライブラリは、位置Q26、K28、N30、Y33、Q38、Q44、R68およびR70に多様性を導入することにより製造される。カスタムメイドメガヌクレアーゼを製造する方法の第三の実施形態において、標的DNA配列またはその一部分を切断可能な変異型の選択は、次の工程:a結合能力の選択工程、結合能力のスクリーニング工程、切断活性の選択工程および切断活性のスクリーニング工程;b結合能力の選択工程結合能力のスクリーニング工程および切断活性のスクリーニング工程;c結合能力の選択工程、切断活性の選択および切断活性のスクリーニング工程;またはd結合能力のスクリーニング工程および切断活性のスクリーニング工程を含む。好ましくは、標的DNA配列またはその一部分を切断可能な変異型の選択は、結合能力の選択工程、切断活性の選択工程および切断活性のスクリーニング工程を含む、任意に、結合能力に基づく選択工程の後に結合能力のスクリーニングアッセイを、結合能力を示すメガヌクレアーゼ変異型についてのライブラリの濃縮を評価するために行うことができる。好ましくは、結合能力に基づく選択およびスクリーニングは、ファージディスプレイ技術を用いる。好ましくは、切断活性に基づく選択は、切断が正の選択マーカーの活性化または負の選択マーカーの不活性化のいずれかに導く試験を用いる。好ましくは、切断活性に基づくスクリーニングは、切断がa正の選択マーカーまたはレポーター遺伝子の活性化;あるいはb負の選択マーカーまたはレポーター遺伝子の不活性化に導く試験を用いる。よって、本発明のある目的は、上記の方法により製造されたカスタムメイドメガヌクレアーゼ、該カスタムメイドメガヌクレアーゼをエンコードするポリヌクレオチドおよびそのいずれの使用に関する。さらに、本発明は、該カスタムメイドメガヌクレアーゼもしくは該カスタムメイドメガヌクレアーゼをエンコードするポリヌクレオチドを含む細胞、動物または植物に関する。本発明は、カスタムメイドメガヌクレアーゼの抗ウイルス治療、ゲノム治療または遺伝子治療のための分子生物学、インビボもしくはインビトロの遺伝子工学またはインビボもしくはインビトロのゲノム工学のための使用に関する。より具体的には、本発明は、カスタムメイドメガヌクレアーゼの、該メガヌクレアーゼの認識切断部位を含む対象の部位への二本鎖破壊を導入し、それによりDNA組換え事象、好ましくは相同的組換え事象、DNA欠失または細胞死を誘導するための使用に関する。遺伝子工学の方法の第一の実施形態において、カスタムメイドメガヌクレアーゼは、ベクター上に位置する位置しかつ該メガヌクレアーゼの認識切断部位を含む対象の部位に二本鎖破壊を導入し、それにより該切断部位の周囲の配列と相同性を示す別のベクターとの相同的組換えを誘導する。ゲノム工学の方法の第二の実施形態において、該方法は、次の工程:1本発明によるカスタムメイドメガヌクレアーゼの少なくとも1つの認識切断部位を含むゲノム遺伝子座に二本鎖破壊を導入する工程;2標的された遺伝子座と相同性を共有する配列で挟まれる導入される配列を含むターゲティングDNA構築物を提供する工程を含む。ゲノム工学の方法の第三の実施形態において、該方法は、次の工程:1本発明によるカスタムメイドメガヌクレアーゼの少なくとも1つの認識切断部位を含むゲノム遺伝子座に二本鎖破壊を導入する工程;2切断部位の周囲の領域と相同性を共有する染色体DNAと、相同的組換えに適切な条件下で保持する工程を含む。これらの遺伝子工学およびゲノム工学の方法は、特定配列を修復するため、特定配列を改変するため、対象の内因性遺伝子を減弱させるかまたは活性化するため、対象の部位に突然変異を導入するため、外因性遺伝子を導入するため、内因性遺伝子またはその一部分を不活性化するかまたは欠失させるため、染色体腕を転座させるため、あるいは細胞を殺すために用いることができる。本発明は、得られる細胞およびそれらの使用にも関する。よって、本発明は、本発明による少なくとも1つのカスタムメイドメガヌクレアーゼの、特異的配列を修復するため、変異した遺伝子の代わりに機能的遺伝子を回復させるため、特定配列を改変するため、対象の内因性遺伝子を減弱させるかまたは活性化するため、対象の部位に突然変異を導入するため、外因性遺伝子またはその一部分を導入するため、内因性遺伝子またはその一部分を不活性化するかもしくは欠失させるため、染色体腕を転座させるため、あるいはDNAを修復されないままにして分解させるための、細胞、動物または植物を該メガヌクレアーゼに曝露することによる使用に関する。任意に、該細胞、動物または植物は、標的された遺伝子座と相同性を共有する配列で挟まれる導入されるべき配列を含むターゲティングDNA構築物にさらに曝露される。本発明は、少なくとも1つの本発明によるカスタムメイドメガヌクレアーゼを含む組成物にも関する。該組成物は、特定配列を修復するため、特定配列を改変するため、対象の内因性遺伝子を減弱させるかまたは活性化するため、対象の部位に突然変異を導入するため、外因性遺伝子またはその一部分を導入するため、内因性遺伝子またはその一部分を不活性化するかもしくは欠失させるため、染色体腕を転座させるため、あるいはDNAを修復されないままにするために用いられ、細胞、動物または植物を該メガヌクレアーゼに曝露することにより用いられる。任意に、該組成物は、標的された遺伝子座と相同性を共有する配列で挟まれる導入されるべき配列を含むターゲティングDNA構築物をさらに含むことができる。本発明は、遺伝子疾患の治療または予防を必要とする個体において該疾患を治療または予防する方法にも関し、該方法は、該個体の細胞において、本発明によるカスタムメイドメガヌクレアーゼの少なくとも1つの認識切断部位を含む対象の部位に二本鎖切断を誘導し、そして個体にターゲティングDNAを導入することを含み、該ターゲティングDNAは、切断部位の周囲の領域に対して相同性を共有するDNAおよび染色体DNAにおける対象の部位を修復するために用いられるDNAを含む。第二の実施形態において、遺伝子疾患の治療または予防を必要とする個体において該疾患を治療または予防する方法は、該個体の細胞において、本発明によるカスタムメイドメガヌクレアーゼの少なくとも1つの認識切断部位を含む対象の部位に、該対象の部位を修復するために用いられる切断部位の周囲の領域に相同なDNAに適切な条件下で、二本鎖破壊を誘発することを含む。さらに本発明は、得られる細胞および個体の疾患または障害の治療もしくは予防のためのようなそれらの使用に関する。本発明は、少なくとも1つの本発明によるカスタムメイドメガヌクレアーゼの、該メガヌクレアーゼに細胞、動物または患者を曝露することにより遺伝子疾患を予防、改善または治療するための使用に関する。任意に、該細胞、動物または植物は、標的された遺伝子座と相同性を共有する配列で挟まれる対象の部位を修復する配列を含むターゲティングDNA構築物にも曝露される。本発明は、少なくとも1つの本発明によるカスタムメイドメガヌクレアーゼを含む組成物にも関する。好ましくは、該組成物は、遺伝子疾患を、細胞、植物、動物または患者を該組成物に曝露することにより予防、改善または治療するために用いられる。任意に、該組成物は、標的された遺伝子座と相同性を共有する配列で挟まれる対象の部位を修復する配列を含むターゲティングDNA構築物をさらに含むことができる。本発明によるカスタムメガヌクレアーゼは、DNA媒介物を提示する感染性因子により引き起こされる疾患の治療における治療剤としても使用できる。よって、本発明の目的は、該感染性因子および/または感染した細胞、動物、植物または患者を該メガヌクレアーゼに曝露することにより、感染性因子による感染を予防、改善または治療するための少なくとも1つの本発明のカスタムメイドメガヌクレアーゼの使用である。そのDNA標的配列は、該感染性因子のゲノム内に存在する。好ましくは、該感染性因子はウイルスである。本発明の別の目的は、少なくとも1つの本発明によるメガヌクレアーゼを、生物学的に得られた物質または生物学的使用を意図する物質の中の感染性因子を、該メガヌクレアーゼで該物質を処理することにより不活性化または除去するために用いることである。好ましくは、該感染性因子はウイルスである。本発明のさらなる目的は、感染性因子または感染した細胞、動物もしくは患者を組成物に曝露することにより感染性因子による感染を予防、改善または治療するための少なくとも1つの本発明によるカスタムメイドメガヌクレアーゼを含む組成物である。好ましくは、該感染性因子はウイルスである。本発明のさらなる目的は、感染性因子の増殖を阻害するか、あるいは生物学的に得られた物質または生物学的使用もしくは物質の消毒を意図する物質の中の感染性因子を不活性化または除去するための少なくとも1つの本発明によるカスタムメイドメガヌクレアーゼを含む組成物を提供することである。好ましくは、該感染性因子はウイルスである。本発明は、感染性因子による感染を、該感染の治療または予防を必要とする個体において治療または予防する方法にも関し、該方法は、個体の個々の細胞に、感染性因子の配列内に認識切断部位を示す少なくとも1つのカスタムメイドメガヌクレアーゼを導入し、そして該認識切断部位に二本鎖破壊を誘導することにより、該感染性因子の不活性化または欠失をもたらす組換え事象に導くことを含む。-定義本明細書において、メガヌクレアーゼにより、14~40bpのポリヌクレオチド認識部位を有する二本鎖エンドヌクレアーゼを意図する。該メガヌクレアーゼは、モノマー性またはダイマー性のいずれかである。よって、該メガヌクレアーゼは、レアカットエンドヌクレアーゼまたは高レアカットエンドヌクレアーゼとも呼ばれる。ホーミングエンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼの1種である。カスタムメイドメガヌクレアーゼにより、当初のメガヌクレアーゼの部位とは異なる認識切断部位を示す、当初のメガヌクレアーゼに由来するメガヌクレアーゼを意図する。異なるにより、カスタムメイドメガヌクレアーゼが天然のメガヌクレアーゼより少なくとも10倍、好ましくは少なくとも50倍、より好ましくは少なくとも100倍の効率で該部位を切断することを意図する。当初のメガヌクレアーゼは、天然のメガヌクレアーゼまたは修飾されたメガヌクレアーゼであり得る。天然のとは、物質が天然で見出され得ることをいう。例えば、生物体内に存在し、天然の起源から単離することができかつ実験室で人により意図的に改変されていないメガヌクレアーゼは天然である。同一性とは、2つの核酸分子またはポリペプチド間の配列の同一性をいう。同一性は、比較のために整列させ得る各配列における位置を比較することにより決定できる。比較される配列中の位置が同じ塩基で占められるとき、該分子はその位置において同一である。核酸またはアミノ酸配列の間の類似性または同一性の程度は、核酸配列が共有する位置における同一または適合するヌクレオチドの数の関数である。GCG配列分析パッケージの部分として入手可能であるFASTAまたはBLASTを含む種々の整列アルゴリズムおよび/またはプログラムを、2つの配列の間の同一性を計算するのに用いることができ、例えばデフォルト設定で用い得る。相同なにより、別の配列と配列間の相同的組換えを導くのに充分な同一性を有し、具体的には少なくとも95、好ましくは97、より好ましくは99の同一性を有する配列を意図する。ベクターの語は、それが連結されているその他の核酸を移すことができる核酸分子のことをいう。好ましいベクターのあるタイプは、エピソーム、すなわち染色体外の複製が可能な核酸である。好ましいベクターは、自律複製および/またはそれらが連結されている核酸の発現が可能なものである。それらが動作可能に連結されている遺伝子の発現に指向できるベクターは、本明細書において発現ベクターという。本発明によるベクターは、限定されないが、YAC、BAC、バキュロウイルスベクター、ファージ、ファージミド、コスミド、ウイルスベクター、プラスミド、RNAベクター、または染色体、非染色体、半合成もしくは合成DNAからなり得る直鎖もしくは環状DNAもしくはRNA分子を含む。一般に、組換えDNA技術において実用性のある発現ベクターは、しばしば、一般に環状二本鎖DNAループをいうプラスミドの形態にあり、そのベクターの形態においてそれらは染色体に結合しない。適切なベクターの多数は、次の細菌ベクター:pQE7O、pQE6O、pQE9、pbs、pDIO、phagescript、psiXl74、pbluescriptSK、pbsks、pNH8A、pNH16A、pNH18A、pNH46A;ptrc99a、pKK2233、pKK2333、pDR540、pRlT5;pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXTI、pSG;pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL;pQE30、pETのように当業者に知られており市場で入手可能である。ウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス、コロナウイルス、オルトミクソウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルスのようなマイナス鎖RNAウイルス、ピコルナウイルスおよびαウイルスのようなプラス鎖RNAウイルス、ならびにアデノウイルス、ヘルペスウイルスおよびポックスウイルスを含む二本鎖DNAウイルスを含む。その他のウイルスは、例えばノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルス、および肝炎ウイルスを含む。レトロウイルスの例は、トリ白血病肉腫、哺乳動物C型、B型ウイルス、D型ウイルス、HTLVBLVグループ、レンチウイルス、スプマウイルスを含む。その他の例は、マウス白血病ウイルス、マウス肉腫ウイルス、マウス乳腺癌ウイルス、ウシ白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、ヒトT細胞白血病ウイルス、ヒヒ内在性ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、メイソンファイザーサルウイルス、サル免疫不全性ウイルス、サル肉腫ウイルス、ラウス肉腫ウイルスおよびレンチウイルスを含む。ベクターのその他の例は、例えばMcVeyら、米国特許第5801030号に記載され、この教示は本明細書に参照として組み込まれる。ベクターは、選択マーカーを含み得る。しかしながら、本発明は、同等の機能を提供し、かつ本発明に続いて知られることとなる発現ベクターのようなその他の形態を含むことを意図する。本明細書において用いられる対象の部位、標的部位および特異的部位の用語は、そこで二本鎖破壊がメガヌクレアーゼにより導入される明確なDNAの位置、好ましくは染色体の位置をいう。本明細書において用いられるように、個体の用語は、哺乳動物と共に他の脊椎動物を含む。本明細書で用いられる哺乳動物および哺乳類の用語は、その幼体に哺乳しかつ生体の幼体を出産するかまたは産卵するかいずれかの単孔類、有袋類および胎盤性のいずれの脊椎動物のことをいう。哺乳類の種の例は、ヒトおよび他の霊長類、げっ歯類および反芻動物を含む。遺伝子疾患により、部分的または完全に、直接的または間接的に1つもしくはいくつかの遺伝子における異常を原因とするいずれの疾患を意図する。該異常は、突然変異、挿入または欠失であり得る。該突然変異は、点状の突然変異であり得る。該異常は、遺伝子のコーディング配列またはその調節配列に影響し得る。該異常は、ゲノム配列の構造またはエンコードされたmRNAの構造もしくは安定性に影響し得る。該遺伝子疾患は、劣性または優性であり得る。このような遺伝子疾患は、限定されないが、嚢胞性線維症、ハンチントン舞踏病、家族性高ステロール血症、肝芽腫、ウィルソン病、先天性肝性ポルフィリン症、肝臓代謝の先天的障害、レッシュ-ナイハン症候群、鎌状赤血球貧血、サラセミア、色素性乾皮症、ファンコーニ貧血、色素性網膜炎、毛細血管拡張性運動失調、ブルーム症候群、網膜芽腫、デュシェンヌ型筋ジストロフィーおよびテイ-サックス病であり得る。-メガヌクレアーゼ変異型の作製本発明は、多様性の導入により当初のメガヌクレアーゼに由来する標的DNA配列に特異的なカスタムメイドメガヌクレアーゼを製造する方法に関する。任意に、該当初のメガヌクレアーゼは天然のメガヌクレアーゼである。この方法は、メガヌクレアーゼ変異型のライブラリを製造する工程と、選択および/またはスクリーニングにより標的DNA配列もしくはその一部分に結合できるかおよび/またはそれを切断できる変異型を単離する工程とを含む。多様性は、メガヌクレアーゼ中に当業者に入手可能ないずれの方法により導入することができる。好ましくは、多様性は標的突然変異導入、ランダム突然変異導入PCR、DNAシャッフリング、定方向突然変異またはこれらの技術の組み合わせにより導入される。メガヌクレアーゼ変異型は、当初のメガヌクレアーゼの標的突然変異誘発により製造されるのが好ましい。多様性は、DNA標的と直接もしくは間接的に接触するかまたは相互作用する残基の位置に導入される。多様性は、DNA標的と相互作用する領域に導入されるのが好ましく、相互作用するアミノ酸の位置に導入されるのがより好ましい。標的突然変異誘発により作製されたライブラリにおいて、20のアミノ酸を選択された可変性の位置に導入することができる。好ましくは、可変性の位置に存在するアミノ酸は、タンパク質DNA相互作用に一般的に含まれることが知られているアミノ酸である。より具体的には、これらのアミノ酸は、一般的に親水性アミノ酸である。より好ましくは、可変性の位置に存在するアミノ酸は、D、E、H、K、N、Q、R、S、T、Yを含む。任意に、可変性の位置に存在するアミノ酸は、D、E、H、K、N、Q、R、S、T、Yからなる群より選択される。合成または修飾アミノ酸も本発明において意図される。定方向ライブラリを作製する好ましい方法のひとつは、多様性を導入しなければならない位置での縮重コドンの使用である。いくつかの種類の縮重コドンを使用することができる。縮重コドンNNKは、20のアミノ酸と1つの停止をエンコードする32の異なるコドンを導く。縮重コドンNVKは、15のアミノ酸と1つの停止コドンをエンコードする24の異なるコドンを導く。縮重コドンVVKは、12のアミノ酸と停止なしをエンコードする18の異なるコドンを導く。縮重コドンRVKは、9つのアミノ酸をエンコードする12の異なるコドンを導く。好ましくは、12のアミノ酸をエンコードする18の異なるコドンを導く縮重コドンVVKをライブラリの作製に用いる。実際に、VVK縮重コドンはいずれの停止コドンも含有せずかつ全ての親水性アミノ酸を含む。定方向ライブラリを作製した場合、DNA標的と相互作用するアミノ酸についての知見が有用である。この知見は、例えばX線結晶解析、アラニンスキャンまたは架橋実験により提供することができる。DNA標的と相互作用するアミノ酸は、相同性タンパク質との配列アラインメントにより導き出すこともできる。カスタムメイドメガヌクレアーゼは、いずれの当初のメガヌクレアーゼに由来する。当初のメガヌクレアーゼにより、天然のものまたは改変されたものを意図する。該改変されたものは、天然のものからハイブリッド作製、または天然のものの物理化学的特性の改変により得ることができる。任意に、当初のメガヌクレアーゼは、その天然の認識切断部位が標的DNA部位に最も近いように選択される。好ましくは、当初のメガヌクレアーゼは、上記の定義で示すようにホーミングエンドヌクレアーゼである。ホーミングエンドヌクレアーゼは、よく保存されたアミノ酸モチーフに基づいて4つの別々のファミリー、つまりLAGLIDADGファミリー、GIYYIGファミリー、HisCysボックスファミリーおよびHNHファミリーに分けられる。いくつかのホーミングエンドヌクレアーゼ、すなわちIDmoI、PISceI、PIPfuI、ICreI、IPpoIおよびEDreIとよばれるハイブリッドホーミングエンドヌクレアーゼIDmoIICreIの詳細な3次元構造は既知である。LAGLIDADGファミリーは、それらの最も一般的に保存された配列モチーフにより集められたタンパク質の最も大きいファミリーである。1つのドデカペプチドを有するホーミングエンドヌクレアーゼは、約20kDaの分子質量で、ホモダイマーとして作用する。2コピーを有するホーミングエンドヌクレアーゼは、各モチーフの間に70~150の残基を有する25kDa~50kDaの範囲であり、モノマーとして作用する。切断は認識部位の中で起こり、3OH突出を有する4ntのジグザグのカットを残す。ICeuIおよびICreIは、1つのドデカペプチドモチーフを有するホモダイマーホーミングエンドヌクレアーゼを表す。IDmoI、ISceI、PIPfuIおよびPISceIは、2つのドデカペプチドモチーフを有するモノマーホーミングエンドヌクレアーゼを表す。当初のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼは、ISceI、IChuI、IDmoI、ICreI、ICsmI、PISceI、PITliI、PIMtuI、ICeuI、ISceII、ISceIII、HO、PICivI、PICtrI、PIAaeI、PIBsuI、PIDhaI、PIDraI、PIMavI、PIMchI、PIMfuI、PIMflI、PIMgaI、PIMgoI、PIMinI、PIMkaI、PIMleI、PIMmaI、PIMshI、PIMsmI、PIMthI、PIMtuI、PIMxeI、PINpuI、PIPfuI、PIRmaI、PISpbI、PISspI、PIFacI、PIMjaI、PIPhoI、PITagI、PIThyI、PITkoIおよびPITspI;好ましくはISceI、IChuI、IDmoI、ICreI、ICsmI、PISceI、PIPfuI、PITliI、PIMtuIおよびICeuI;より好ましくはIDmoI、ICreI、PISceIおよびPIPfuIからなる群から選択され;さらに好ましくはICreIである。LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼの4つの構造、すなわちIDmoI、PISceI、PIPfuIおよびICreIの構造は、LAGIDADGモチーフの機能的重要性およびDNA結合界面の性質を明らかにする。ホモダイマーホーミングエンドヌクレアーゼの核のαββαββα折り畳みは、モノマーホーミングエンドヌクレアーゼ中で2回繰り返され、該モノマーに擬ダイマー構造を与える。各ドメインまたはサブユニットの最初のαヘリックスは、明確なLAGLIDADGモチーフを含有する。各タンパク質の2つのLAGLIDADGヘリックスは、密に詰まったダイマーまたはドメイン界面を形成する。DNA結合界面は、逆平行βシートに折り畳まれる各ドメインまたはサブユニットの4つのβ鎖により形成される。最小のDNA結合部分は、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ中にβヘアピンとして規定され得るが、このような2つのβヘアピンは4ストランドのβシートに連結される。各ドメインまたはサブユニットは、半分の認識部位と相互作用する。外部の四分認識部位は、各ドメインまたはサブユニットの2つのβヘアピンの1つだけとのその相互作用により規定することができる。よって、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼに由来するメガヌクレアーゼ変異型は、いくつかの定方向ライブラリにおいて断片化されることができる。当初のメガヌクレアーゼ進化のためのこの断片化アプローチは、より大きい多様性の導入を許容する。各ライブラリにおいて、多様性は、半分の認識部位または四分認識部位との相互作用に関与する領域にのみ導入され、標的DNAは、導入された多様性を含む領域と相互作用する部分についてのみ改変される。より具体的には、新規な半分の部位を探索する場合、多様性は1つのドメインまたはサブユニットの4ストランドのβシートに導入されるのが好ましく、より好ましくはこの構造中のDNAと相互作用するアミノ酸の位置である。新規な四分部位を探索する場合、多様性は対応するβヘアピン中に導入され、より好ましくはこの構造のDNAと相互作用するアミノ酸の位置である。好ましくは、ライブラリの組は、標的DNA部位の全体をカバーする。よって、ライブラリが半分の部位と相互作用する領域にのみ多様性を含む場合、少なくとも2つ、好ましくは2つのライブラリが必要である。しかしながら、当初のメガヌクレアーゼがダイマーである場合、半分の部位のアプローチでは1つのライブラリで充分である。ライブラリが四分部位と相互作用する領域にのみ多様性を含む場合、少なくとも4つ、好ましくは4つのライブラリが必要である。当初のメガヌクレアーゼがダイマーである場合、四分部位のアプローチでは2つのライブラリで充分であり得る。一次ライブラリの選択またはスクリーニングの後、一次ライブラリから選択された要素は、選択の新たなサイクルのための次のライブラリに融合されるかまたは組み合わされる。例えば2つのライブラリをシャッフリングにより融合することができる。次いで、選択の新たなサイクルは、全体の標的DNA部位について行うことができる。任意に、選択の新たなサイクルは、最初のライブラリが四分部位に基づくのであれば、半分の標的DNA部位について行うことができる。続いて、半分の部位の選択および/またはスクリーニングの結果を組み合わせて、全体の標的DNA部位についてスクリーニングすることができる最終的なライブラリを得る。代わりに、各ライブラリからの最もよい要素を一緒にして、標的DNA部位に結合して切断できるメガヌクレアーゼを得る。他のアプローチにおいて、半分の認識部位または四分認識部位との相互作用に関与する領域にのみ位置する多様性を有するライブラリを製造する。次いで、このライブラリの選択またはスクリーニングの後、ライブラリから選択された要素は、認識部位との相互作用に関与する別の領域に多様性を導入するように改変され、次のライブラリを導く。ライブラリは、完全な標的DNA部位が選択されたメガヌクレアーゼにより結合されかつ切断されるまで作製される。より具体的には、ダイマーホーミングエンドヌクレアーゼについて、ライブラリは、半分の部位と相互作用する領域にのみ多様性を導入することにより作製でき、該半分の部位は当初のホーミングエンドヌクレアーゼの1つのモノマーに対応する。このライブラリは、標的DNA配列の各半分の部位についての選択および/またはスクリーニングに用いることができる。ライブラリから陽性の要素が各半分の部位について選択された場合、最初の半分の部位についての変異型と他の半分の部位についての変異型は、全体の標的DNA配列に結合して切断するために一緒にされる。代わりに、陽性の変異型は、単鎖メガヌクレアーゼ構造に導入され得る。実施例1で説明するように、単鎖メガヌクレアーゼは、当初のダイマーホーミングメガヌクレアーゼの2つのモノマーがリンカーにより共有結合した酵素である。四分部位によるアプローチを当初のダイマーホーミングエンドヌクレアーゼから選択すると、各四分認識部位との相互作用に関与する領域にのみ多様性を導入することにより、少なくとも2つのライブラリが作製される。一次ライブラリの選択またはスクリーニングの後、一次ライブラリから選択された変異型を、半分の部位についての新たな選択サイクルのための次のライブラリに融合させる。代わりに、各ライブラリからの最もよい要素を一緒にして、半分の部位に結合できるモノマーを得る。そうでなければ、四分認識部位との相互作用に関与する領域内にのみ多様性を有するライブラリを製造する。次いで、このライブラリの選択またはスクリーニングの後、ライブラリから選択された要素を、他の四分部位との相互作用に関与する領域に多様性を導入するように改変して次のライブラリを導く。この第二のライブラリの選択および/またはスクリーニングは、半分の部位に結合できる変異型モノマーを導く。ライブラリから陽性の要素が各半分の部位について選択される場合、最初の半分の部位についての変異型と、他の半分の部位についての変異型を、標的DNA配列に結合して切断するために一緒にする。代わりに、陽性の変異型を単鎖メガヌクレアーゼ構造内に導入することができる。好ましい実施形態において、本発明は、所望のポリヌクレオチド標的を認識して切断しかつホーミングエンドヌクレアーゼICreIの指向性の進化に由来するカスタムメイドメガヌクレアーゼを製造する方法に関する。ホーミングエンドヌクレアーゼはホモダイマーであるので、この場合のアプローチは半分の認識部位または四分部位のいずれかに基づく。指向性の進化は、ICreI変異型のライブラリに基づく。これらのICreI変異型は、ポリヌクレオチド標的と相互作用することが予想されるいくつかの位置でアミノ酸の多様性を示す。ICreエンドヌクレアーゼとそのDNA標的とのX線構造により、次の位置が関係することが予想された:Q26、K28、N30、S32、Y33、Q38、Q44、R68、R70およびT140。Seligmanらは、S32およびT140は、DNA認識に比較的重要ではないとみられることを示した。本発明のある実施形態において、ICreI変異型の組は、Q26、K28、N30、S32、Y33、Q38、Q44、R68、R70およびT140からなる群より選択される位置にアミノ酸多様性を導入することにより製造される。好ましい実施形態において、ICreI変異型の組は、位置aQ26、K28、N30、Y33、Q38、Q44、R68、R70、T140;bQ26、K28、N30、Y33、Q38、Q44、R68、R70;cQ26、K28、N30、Y33、Q44、R68、R70;またはdQ26、K28、Y33、Q38、Q44、R68、R70に多様性を導入することにより製造される。好ましくは、ICreI変異型の組は、位置Q26、K28、N30、Y33、Q38、Q44、R68およびR70に多様性を導入することにより製造される。任意に、ICreIのD75残基は、Nのような非荷電のアミノ酸に変異され得る。実際に、このアミノ酸は、ライブラリにおいて改変されることが好ましい2つの残基と相互作用する。この電荷が構造の核に存在するので、この電荷をなくすのが好ましい。ホーミングエンドヌクレアーゼICreIの進化アプローチが四分認識部位に基づく場合、βヘアピンにより表されるDNA結合残基を置換することが実際的な解決である。これらの残基は制限された長さの要素の一部分であるので、例えばカセット置換によりこれらの残基を一度に一緒に変異させることができる。構造1g9yの視覚的検査は、第一のβヘアピンが、標的の最後の6つの塩基の認識に独特なまたは主要な貢献をするものであることを示す。よって、残基S22~残基Q44まで、より好ましくは残基I24~残基T42までの置換は、標的部位の最後の6つの塩基についての新規な相互作用特異性を特定するのに充分であるはずである。より好ましくは、DNAと直接相互作用する残基は、改変されるはずである:I24、Q26、K28、N30、S32、Y33、Q38、S40およびT42。代わりに、非常に末端にある24bp長のDNA標的と相互作用するβヘアピンの中間のターンは、DNA塩基の置換に耐性があるであろう短いフレキシブルなループにより置換することができる。例えば、残基30~36は、2、3、4、5または6のグリシン残基により置換され得る。このストラテジは、類似の3D構造を示す全てのメガヌクレアーゼで試験する価値がある。第二のヘアピンは、単一の単位として同様に置換され得る。しかしながら、このヘアピンは主に内部の四分部位と相互作用するが、ヘアピンから離れた他の残基は、相互作用の特異性を指向させる役割を果たすことができる。つまり、ライブラリは残基Y66、R68、R70、V73、D75およびI77を置換することによりつくることができる。並行して、S22、Q44およびT46は、さわらないままにしておくか、小さい極性アミノ酸により置換するかまたは無作為化されるかしてライブラリに寄与することができる。別々のライブラリから選択された突然変異体は、相同DNA領域での組換えに基づく標準的なDNAシャッフリング法により一緒にすることができる。しかしながら、第二のライブラリが残基S22、Q44およびT46の突然変異を含む場合、組換えは実現不可能になり、より古典的なDNAタンパク質工学が必要である。ホーミングエンドヌクレアーゼICreIの進化アプローチが四分認識部位に基づく場合、ICreI変異型のライブラリは、aI24、Q26、K28、N30、S32、Y33、Q38、S40およびT42;またはbY66、R68、R70、V73、D75およびI77からなる群より選択される位置で多様性を導入することにより製造される。選択肢bにおいて、多様性はS22、Q44およびT46からなる群より選択される位置においても導入することができる。代わりに、所望のポリヌクレオチド標的を認識して切断するカスタムメイドメガヌクレアーゼは、単鎖ICreIエンドヌクレアーゼの指向性の進化により製造することもできる。単鎖ICreI変異型の組は、Q26、K28、N30、S32、Y33、Q38、Q44、R68、R70、Q123、K125、N127、S129、Y130、Q135、Q141、R165、R167からなる群より選択される位置にアミノ酸多様性を導入することにより製造される。-選択およびスクリーニングメガヌクレアーゼの2つの特性、すなわち標的DNA配列に結合できる能力とそれを切断できる能力は、選択工程および/またはスクリーニング工程に用いることができる。メガヌクレアーゼ変異型は、選択かつスクリーニングされるか、またはスクリーニングだけされ得る。選択および/またはスクリーニングは、メガヌクレアーゼの標的DNA配列を切断する能力について直接行うことができる。代わりに、選択および/またはスクリーニングは、標的DNA配列に対する結合能力について、次いでメガヌクレアーゼのそれを切断する能力について行うことができる。好ましくは、カスタムメイドメガヌクレアーゼを製造する方法は、次の各工程:a結合能力の選択工程、結合能力のスクリーニング工程、切断活性の選択および切断活性のスクリーニング工程;b結合能力の選択工程、結合能力のスクリーニング工程および切断活性のスクリーニング工程;c結合能力の選択工程、切断活性の選択および切断活性のスクリーニング工程;d結合能力のスクリーニング工程および切断活性のスクリーニング工程;e切断活性の選択工程およびスクリーニング工程;またはf切断活性のスクリーニング工程を含むかまたはこれらの工程からなる。より好ましくは、カスタムメイドメガヌクレアーゼを製造する方法は、次の工程:結合能力の選択工程、切断活性の選択および切断活性のスクリーニング工程を含むかまたはこれらの工程からなる。結合能力に基づく選択工程の後の結合能力についてのスクリーニングアッセイは、結合能力を示すメガヌクレアーゼ変異型のライブラリの濃縮を評価するために行うことができる。選択およびスクリーニングアッセイは、二本鎖切断が導入されなければならないDNA領域またはその断片について行なわれる。好ましくは、標的配列は少なくとも15ヌクレオチド、好ましくは18~40、より好ましくは18~30ヌクレオチドを含む。ダイマーメガヌクレアーゼの場合、標的DNAポリヌクレオチドは、結合だけのために少なくとも8ヌクレオチドに減少させることができる。好ましくは、標的DNAポリヌクレオチドの長さは、10kb未満、好ましくは3kb未満、より好ましくは1kb未満である。DNA結合アッセイについて、標的DNAポリヌクレオチドの長さは、好ましくは500bp未満、より好ましくは200bp未満である。いずれの標的配列を、それをしかるべく切断可能なカスタムメイドメガヌクレアーゼを作製するのに用いることができる。任意に、標的配列は、当初のメガヌクレアーゼの元来の認識切断部位と最大の同一性を示すように選択される。よって、二本鎖破壊が導入されなければならないDNA領域を分析して、当初のメガヌクレアーゼの元来の認識切断部位と少なくとも25の同一性、好ましくは50の同一性、より好ましくは75の同一性を有する少なくとも15ヌクレオチド長、好ましくは18~40ヌクレオチド、より好ましくは18~30ヌクレオチドの少なくとも1、2、3または5の配列を選択する。標的DNA配列は、メガヌクレアーゼ変異型ライブラリのタイプに適合させる。ライブラリが半分の部位のアプローチに基づく場合、選択スクリーニングに用いられる標的DNA配列は、元来の半分の部位および所望のDNA配列の半分の部位を含む。ライブラリが四分部位アプローチに基づく場合、選択スクリーニングに用いられる標的DNA配列は、元来の部位の4分の3と所望のDNA配列の4分の1の部位とを含む。選択工程および/またはスクリーニング工程から得られるメガヌクレアーゼ変異型は、多様性の導入の別のサイクルのためのインプットに任意になることができる。選択工程および/またはスクリーニング工程により選択された陽性のメガヌクレアーゼ変異型は、インビトロおよび/またはエクスビボの切断アッセイにより確認される。-メガヌクレアーゼの結合特性に基づく選択および/またはスクリーニング結合能力に基づくメガヌクレアーゼ変異型の選択およびスクリーニングは、切断活性に影響を及ぼさない条件を用いて行なわれなければならない。例えば、ほとんどのホーミングエンドヌクレアーゼは、それらの切断活性のためにマンガンまたはマグネシウムを必要とする。よって、このタイプのホーミングエンドヌクレアーゼ変異型についての結合アッセイは、マンガンまたはマグネシウムなしで、好ましくはカルシウムにより置換して行なわれる。-メガヌクレアーゼの結合特性に基づく選択結合選択アッセイは、標的DNAポリヌクレオチドに結合できるメガヌクレアーゼの変異型の濃縮に基づく。よって、ライブラリによりエンコードされるメガヌクレアーゼ変異型は、固定化された標的DNAポリヌクレオチドと共に、固定化された標的DNAポリヌクレオチドに結合するメガヌクレアーゼ変異型がいずれの結合能力も示さないものから差異に基づいて分配され得るように、インキュベートされる。固定化された標的DNAポリヌクレオチドと結合するメガヌクレアーゼ変異型は、次いで親和性濃縮と増幅の後続の回のために回収されて増幅される。親和性の濃縮および増幅を数回行った後に、このようにして選択されるライブラリのメンバーを単離することができる。任意に、選択されるメガヌクレアーゼ変異型をエンコードするヌクレオチド配列が決定され、それにより標的DNA配列に結合できるメガヌクレアーゼ変異型を同定する。メガヌクレアーゼ変異型の選択は、遺伝子型と表現型とを連結する系、例えばファージディスプレイ、リボソームディスプレイ第25巻p5132~5143およびmRNAタンパク質融合309~312;これらの開示は参照により本明細書に組み込まれるを必要とする。ファージディスプレイは、典型的にはバクテリオファージコートタンパク質との融合としての繊維状バクテリオファージの表面上のメガヌクレアーゼ変異型の提示に関係する。メガヌクレアーゼ変異型のライブラリは、ファージ染色体またはファージミドに、バクテリオファージコートタンパク質、好ましくはpIIIタンパク質とのタンパク質融合体を得るように導入される。当初のメガヌクレアーゼがホモダイマーである場合、メガヌクレアーゼのモノマー変異型は、ディスプレイされるように導入され、そして一定のモノマーがペリプラズムにおいて産生されるように導入することができる。バクテリオファージライブラリは、DNAに結合し得る要素を選択するために固定化標的DNA配列とインキュベートすることができる。mRNAタンパク質融合系は、1013の異なるメガヌクレアーゼ変異型から選択する可能性を開く。この系は、翻訳の最後に共有的mRNAタンパク質融合に導くmRNAの3末端にピューロマイシンを介してmRNAとエンコードされるタンパク質との間の連結を創造することにある。よって、メガヌクレアーゼ変異型のコーディング領域を含む二本鎖DNAライブラリは、3ピューロマイシンを含有する翻訳のためのmRNA鋳型を再生するのに用いられる。mRNAピューロマイシンコンジュゲートは、インビトロで翻訳されてmRNAメガヌクレアーゼ融合体がつくられる。cDNA合成の後、該融合体は、固定化標的DNAポリヌクレオチドに結合する能力について試験される。次いで、PCRを用いて、結合能力を示すメガヌクレアーゼ変異型に富む二本鎖DNAを作製する。当初のメガヌクレアーゼがホモダイマーである場合、一定のモノマーはこのモノマーをエンコードするDNAもしくはmRNAとして、またはモノマータンパク質のいずれかとして導入することができる。この場合、単鎖メガヌクレアーゼを用いるアプローチが好ましく用いられる。リボソームディスプレイは、翻訳のためのmRNA鋳型を作製するために使用されるメガヌクレアーゼ変異型のコーディング配列を含む二本鎖DNAライブラリを含む。短いインキュベーションの後、Mg2の添加および低温でのインキュベーションまたは翻訳阻害剤の添加により翻訳を停止する。次いでリボソーム複合体を、固定化された標的DNAポリヌクレオチドに結合する能力について試験する。選択されたmRNAは、cDNAを構築するのに用いられ、PCRは、結合能力を提示するメガヌクレアーゼ変異型に富む二本鎖DNAを作製する。当初のメガヌクレアーゼがホモダイマーである場合、一定のモノマーは、このモノマーをエンコードするDNAもしくはmRNAまたはモノマータンパク質のいずれかとして導入される。この場合、単鎖メガヌクレアーゼを用いるアプローチが好ましく用いられる。標的DNA配列は、固体支持体上に固定化され得る。該固体支持体は、カラム、常磁性のビーズまたはマイクロプレートのウェルであり得る。例えば、標的DNA配列を含むポリヌクレオチドは一方の末端でリガンドを提示し、該リガンドはリガンドの標的をもつ固体支持体上への固定化を許容する。メガヌクレアーゼ変異型の選択は、これらのメガヌクレアーゼの結合または切断能力に基づくスクリーニングアッセイにより、通常、モニターすることができる。しかしながら、選択されたメガヌクレアーゼ変異型は、切断能力に基づく選択工程に直接導入することもできる。-メガヌクレアーゼの結合特性に基づくスクリーニングスクリーニングアッセイを行うために、選択されたメガヌクレアーゼ変異型をクローニングする必要がある。選択をファージディスプレイシステムを用いて行った場合、各メガヌクレアーゼ変異型をエンコードするクローンを容易に単離することができる。選択をmRNAタンパク質融合またはリボソームディスプレイにより行なった場合、選択されたメガヌクレアーゼ変異型は発現ベクターにサブクローニングされなければならない。スクリーニングアッセイは、標的DNAポリヌクレオチドが固定化されたマイクロプレートで行なわれるのが好ましい。メガヌクレアーゼ変異型の発現の後、これらの変異型を固定化標的DNAポリヌクレオチドと共にインキュベートする。メガヌクレアーゼ変異型の発現は、インビボまたはインビトロのいずれかで、好ましくはインビトロ発現系により行うことができる。好ましくは、メガヌクレアーゼ変異型は、標的ポリヌクレオチドとのインキュベーションの前に精製される。次いで、保持されたメガヌクレアーゼ変異型を検出する。検出は、当業者に公知のいくつかの手段により行うことができる。例えば、ファージを用いる場合は、検出はファージに対する抗体を用いて行うことができる。そうでなければ、発現を、放射活性のメガヌクレアーゼを得るために、S35アミノ酸の存在下に行うことができる。つまり、結合を放射活性測定により評価する。本発明は、メガヌクレアーゼによるDNA結合の検出の当業者に入手可能な他の手段も考慮する。任意に、陽性にスクリーニングされたメガヌクレアーゼ変異型をエンコードするヌクレオチド配列を決定し、それにより標的DNA配列に結合できるメガヌクレアーゼ変異型を同定する。陽性にスクリーニングされたメガヌクレアーゼ変異型は、その切断能力について試験しなければならない。よって、該メガヌクレアーゼ変異型は、切断の選択および/またはスクリーニング実験、好ましくはインビボ切断スクリーニングアッセイに組み込まれる。任意に、該メガヌクレアーゼ変異型は、インビトロ切断アッセイにより試験できる。スクリーニングアッセイは、結合能力を示すメガヌクレアーゼ変異型の濃縮を評価するためにだけ用いることもできる。この評価は、結合能力に基づく選択の新しい回が必要であるか、または選択されたライブラリを切断の選択および/またはスクリーニング、好ましくはインビボでの切断の選択および/またはスクリーニングに付すことができるかを決定する助けとなる。-メガヌクレアーゼの切断特性に基づく選択および/またはスクリーニング切断能力に基づくメガヌクレアーゼ変異型の選択およびスクリーニングは、切断活性に影響を及ぼさない条件下で行なわれなければならない。切断能力に基づく選択および/またはスクリーニングにおいて用いられるメガヌクレアーゼ変異型は、メガヌクレアーゼ変異型の最初のライブラリまたは結合活性について選択および/またはスクリーニングされたメガヌクレアーゼ変異型のいずれかであり得る。必要であれば、選択および/またはスクリーニングされたメガヌクレアーゼ変異型は、インビトロおよびインビボ切断アッセイのために適切な発現ベクターにサブクローニングされる。このようなサブクローニング工程は、バッチにおいてまたは個別に行うことができる。より具体的には、当初のメガヌクレアーゼがダイマーである場合。サブクローニング工程は、単鎖メガヌクレアーゼ構造内への選択されたライブラリの導入を許容する。2つのライブラリが2つの半分の認識切断部位について選択および/またはスクリーニングされた場合、サブクローニング工程は、単鎖メガヌクレアーゼ構造内で2つの選択されたライブラリを一緒にすることを許容する。-メガヌクレアーゼの切断特性に基づく選択メガヌクレアーゼ変異型の切断能力に基づくメガヌクレアーゼ変異型のインビボ選択の一般的な原理は、二本鎖破壊が正の選択マーカーの活性化または負の選択マーカーの不活性化に導くことである。選択が負の選択マーカーの不活性化に基づく場合、該方法は、負の選択マーカーと所望のメガヌクレアーゼについての標的DNA配列のコーディング配列を含む発現ベクターおよびメガヌクレアーゼ変異型のライブラリを含む発現ベクターを含有する細胞の使用を含む。好ましくは、該発現ベクターはプラスミドである。好ましくは、該標的DNA配列は、負の選択遺伝子の近くまたは負の選択遺伝子内のいずれか、好ましくは負の選択遺伝子の発現を駆動するプロモーターとORFとの間に位置する。負の選択マーカーの発現は、メガヌクレアーゼ変異型が切断する機会を有するまで細胞を生存したままにするために、条件的でなければならない。このような条件的発現は、条件的プロモーターを用いて容易に行うことができる。しかしながら、用い得る他の条件的システムもある。メガヌクレアーゼ変異型を発現カセット内に導入する。メガヌクレアーゼをエンコードする配列は、誘導性プロモーターまたは構成性プロモーターに動作可能に連結する。もちろん、プロモーターはアッセイで用いられる細胞と矛盾しない。メガヌクレアーゼ変異型が標的DNAを切断する能力を有する場合、負のマーカー遺伝子全体もしくはその部分の欠失またはベクターの分解のいずれかにより負の選択マーカーは不活性化される。負の選択条件での培養は、標的DNA配列を切断できるメガヌクレアーゼ変異型を含む細胞の選択を許容する。負の選択マーカーを含むベクターは、メガヌクレアーゼ変異型をエンコードするベクターの導入前にトランスフェクションされるのが好ましい。任意に、負の選択マーカーを含むベクターは、細胞内でエピソームの形で保存され得る。代わりに、負の選択マーカーを含むベクターおよびメガヌクレアーゼ変異型をエンコードするベクターは、細胞に共トランスフェクションすることができる。細胞は原核細胞または真核細胞であり得る。好ましくは、原核細胞はEcoliである。好ましくは、真核細胞は酵母細胞である。負の選択マーカーは細胞にとって直接または間接的に毒性のタンパク質である。例えば、負の選択マーカーは、細菌についてはトキシン、翻訳阻害剤、バーナーゼおよび抗生物質、酵母については5FOA培地と用いるURA3、αAA培地と用いるLYS2、および高等真核細胞についてはチミジンキナーゼからなる群から選択することができる。負のマーカー選択の例については、Gruenら2002NucleicAcidsResearch30e29を参照。この開示は参照として本明細書に組み込まれる。選択が正の選択マーカーの活性化に基づく場合、該方法は、不活性な正の選択マーカーと所望のメガヌクレアーゼについての標的DNA配列とを含む発現ベクターおよびメガヌクレアーゼ変異型のライブラリを含む発現ベクターを含む細胞の使用を含む。任意に、不活性な正の選択マーカー、標的DNA配列およびメガヌクレアーゼ変異型のライブラリは、同じベクター上にあることができる。好ましくは、該発現ベクターはプラスミドである。メガヌクレアーゼ変異型は、発現カセット中に導入される。メガヌクレアーゼエンコード配列は、誘導性プロモーターまたは構成性プロモーターに動作可能に連結することができる。もちろん、プロモーターはアッセイで用いられる細胞と矛盾しない。例えば、正の選択マーカーは、細菌については抗生物質耐性または栄養要求性マーカー、酵母についてはTRP1、URA3または栄養要求性マーカー、および高等真核細胞についてはネオマイシンまたはピューロマイシンであり得る。任意に、正の選択マーカーは細菌と酵母の両方に矛盾しない栄養要求性マーカーであり得る。不活性な正の選択マーカー遺伝子および標的DNA配列は、二本鎖破壊が活性な正のマーカーにおいてマーカーの転位を導くように配置されなければならない。2種の修復プロセスは、活性な正の選択マーカー、すなわち一本鎖アニーリングまたは遺伝子変換に導くことができる。インビボ一本鎖アニーリング組換え試験は当業者に周知であり、例えばRudinらLinらおよびRouetらに開示される。これらの開示は参照として本明細書に組み込まれる。メガヌクレアーゼ変異型を試験するために、細胞内、好ましくは細菌または酵母細胞でのSSAに基づくインビボアッセイが開発されている。例えば、該方法は酵母細胞を用いる。この生物は、高い頻度で相同的組換えを介してそのDNAを自然に組み換える点で有利である。このインビボ試験は、活性なメガヌクレアーゼ変異型により作製される二本鎖破壊により誘発される正の選択マーカーのSSAによる修復に基づく。標的は、標的DNA配列を含む介在配列により分離される内部重複を有する改変された正の選択遺伝子からなる。内部重複は、少なくとも50bp、好ましくは少なくとも200bpを含むべきである。SSA試験の効率は、内部重複のサイズにより増加する。介在配列は少なくとも標的DNA配列である。介在配列は、細胞が自発的組換え事象により正の選択マーカーを修復していないことを確かめることを許容する選択マーカーを任意に含み得る。正の選択マーカー遺伝子は、アッセイにおいて用いる細胞に関連する構成性プロモーターに動作可能に連結されるのが好ましい。該アッセイ方法によると、細胞は、活性なメガヌクレアーゼ変異型により導入された二本鎖破壊の後にSSA事象が起こる場合にのみ選択される。任意に、各ベクターは細胞内にプラスミドが存在することを確実にするために選択可能なマーカーを含み得る。この選択可能なマーカーの存在は、酵母細胞内で行われるアッセイについて好ましい。例えば、酵母について、標的遺伝子を含む第一の構築物は、形質転換された酵母がいずれのロイシンも含有しない合成培地上で増殖するのを許容するLeu2選択マーカーを含むことができ、第二の構築物は、形質転換された酵母がいずれのトリプトファンも含有しない合成培地上で増殖するのを許容するTrp1選択マーカーを含むことができる。正の選択マーカーを含むベクターは、メガヌクレアーゼ変異型をエンコードするベクターの導入の前にトランスフェクションされるのが好ましい。任意に、正の選択マーカーを含むベクターは、細胞内でエピソームの形で保持され得る。代わりに、正の選択マーカーを含むベクターおよびメガヌクレアーゼ変異型をエンコードするベクターは、細胞内に共トランスフェクションすることができる。メガヌクレアーゼ変異型のインビボ選択は、遺伝子変換アッセイを用いて行うこともできる。例えば、選択ベクターは、欠失または変異と欠失の位置にメガヌクレアーゼのための標的DNA配列の挿入とを有する第一の改変された正の選択遺伝子を含む。正の選択遺伝子は、標的DNA配列を含む挿入による遺伝子の分断により不活性化されることもできる。選択構築物は、欠失の境をなす正の選択マーカー遺伝子配列により両側で挟まれる欠失された正の選択マーカー遺伝子のセグメントをさらに含む。境界配列は、両側にある正の選択マーカー遺伝子と少なくとも100bp、好ましくは少なくとも300pbの相同性を含む。標的DNA配列内で活性なメガヌクレアーゼ変異型により作製された二本鎖破壊は、遺伝子変換事象を引き起こし、機能的な正の選択マーカー遺伝子をもたらす。この種類のアッセイは、次の文献に記載される:Rudinら、FishmanLobellHaber、PaquesHaber。これらの開示は本明細書に参照として組み込まれる。そうでなければ、メガヌクレアーゼ変異型のインビボ選択は、染色体標的上での組換えアッセイにより行うことができる。組換えはSSAまたは遺伝子変換の機構に基づくことができる。インビボ選択はいくつのSSA標的、好ましくは少なくとも2つのSSA標的に基づくことができる。SSAに基づく第一の例は次のとおりである。所望のメガヌクレアーゼ変異型についての標的DNA配列を含む介在配列により分離される内部重複を有する改変された正の選択遺伝子を、細胞の染色体内へ導入する。内部重複は、少なくとも50bp、好ましくは少なくとも200bpを含むべきである。SSA試験の効率は、内部重複のサイズにより増加する。介在配列は少なくとも標的DNA配列である。細胞内でのメガヌクレアーゼ変異型の生成を許容する発現構築物での細胞のトランスフェクションにより、活性なメガヌクレアーゼ変異型により作製した二本鎖破壊の相同的組換えによる修復が機能的な正の選択マーカー遺伝子を導く。遺伝子変換に基づく別の例は、次のとおりである。所望のメガヌクレアーゼ変異型についての標的DNA配列を含む変異された非機能的な正の選択マーカー遺伝子を、細胞の染色体内へ導入する。該標的DNA配列は、変異の近傍、好ましくは変異から1kb未満、より好ましくは変異の周囲500bp、200bpまたは100bp未満になければならない。変異領域に対応する機能的な正の選択マーカー遺伝子の断片と細胞内でメガヌクレアーゼ変異型の産生を許容する発現構築物とで細胞をトランスフェクションすることにより、活性なメガヌクレアーゼ変異型により作製された二本鎖破壊の相同的組換えによる修復は、機能的な正の選択マーカー遺伝子を導く。代わりに、修復を許容する機能的な正の選択マーカーの断片を、染色体上に組み込むことができる。この種類のアッセイは、次の文献に記載される:Rouetら;Choulikaら;Donohoら。これらの開示は本明細書に参照により組み込まれる。選択されたクローンは、標的DNA配列を切断する能力を示すメガヌクレアーゼ変異型を含む。スクリーニングアッセイにより選択を確認するのが好ましい。このスクリーニングアッセイは、インビボまたはインビトロ、好ましくはインビボで行うことができる。任意に、陽性にスクリーニングされたメガヌクレアーゼ変異型をエンコードするヌクレオチド配列を決定し、それにより標的DNA配列を切断することができるメガヌクレアーゼ変異型を同定する。-メガヌクレアーゼの切断特性に基づくスクリーニングスクリーニングアッセイを行うために、選択されたメガヌクレアーゼ変異型をクローニングする必要があり、切断アッセイは各クローンについて個別に行われる必要がある。スクリーニングについてのインビボ切断アッセイは、選択工程で用いられるものと類似である。これは、負の選択マーカーまたはレポーター遺伝子のいずれかの不活性化あるいは正の選択マーカーまたはレポーター遺伝子のいずれかの活性化に基づくことができる。レポーター遺伝子により、容易にアッセイされる物質、例えばβガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、緑蛍光タンパク質、チロシナーゼ、DsRedタンパク質をエンコードするいずれの核酸を意図する。レポーター遺伝子は、アッセイにおいて用いられる細胞に関係する構成性プロモーターに動作可能に連結されるのが好ましい。このスクリーニングアッセイで用いられる細胞は、原核細胞、好ましくはEcoli、または真核細胞、好ましくは酵母細胞または哺乳動物細胞であり得る。より具体的には、エクスビボ切断アッセイによる陽性のメガヌクレアーゼ変異型の確認のために哺乳動物細胞を用いるのが興味深い。-インビトロ切断アッセイメガヌクレアーゼ変異型による標的DNA配列またはその一部分の認識および切断は、当業者に公知のいずれの方法によりアッセイすることができる。メガヌクレアーゼ変異型の活性を試験するある方法は、標的DNA配列またはその一部分を含むポリヌクレオチド基質に対するインビトロ切断アッセイを用いることである。該ポリヌクレオチド基質は、-全体の標的DNA部位;-半分の標的DNA部位と半分の元来の部位;または-4分の1の標的DNA部位と4分の3の元来の部位に対応する合成標的部位であり得る。該ポリヌクレオチド基質は、直鎖状または環状であることができ、唯一の切断部位を含むのが好ましい。アッセイされたメガヌクレアーゼ変異型は、適切な条件においてポリヌクレオチド基質とインキュベートされる。得られるポリヌクレオチドは、いずれの既知の方法、例えばアガロース上での電気泳動またはクロマトグラフィーにより分析される。ポリヌクレオチド基質が直線化されたプラスミドである場合、メガヌクレアーゼ活性は2つのバンドの出現および元来の全長の基質のバンドの消滅により検出される。好ましくは、該アッセイされたメガヌクレアーゼ変異型は、得られるポリヌクレオチドの分析の前に例えばプロテイナーゼKにより消化される。例えば、ポリヌクレオチド基質は、標的部位の配列を含むポリヌクレオチドのプラスミド内へのTAまたは制限酵素クローニングによる導入により、任意にプラスミドの直線化を続けて製造される。好ましくは、このような直線化は、標的DNA配列の周囲では行なわない。Wangら1997NucleicAcidResearch253767~3776;ExamplesMaterialsMethodsinvitroactivityassaysのセクションの実施例、および当初のホーミングエンドヌクレアーゼの特徴付けの文献を参照。代わりに、このようなインビトロ切断アッセイは、蛍光体に連結されたポリヌクレオチド基質を用いて行うことができ、このような基質は標的DNA配列を含む。これらのポリヌクレオチド基質は、固体支持体に固定化される。該固体支持体は、好ましくはマイクロプレートである。例えば、標的DNA配列を含むポリヌクレオチドは、一方の末端でリガンドを提示し、該リガンドはリガンドの標的を有する固体支持体上への固定化を許容する。固定化された末端の反対側の末端は、蛍光体と連結される。切断は、固体支持体からの蛍光色素の放出により蛍光の減少を導く。そうでなければ、いくつかのインビトロ切断アッセイは、蛍光消失に基づくことができる。蛍光体および消光物質は、ポリヌクレオチド基質上に、消光物質が蛍光発光を阻害するように位置する。消光は、ポリヌクレオチド基質上でメガヌクレアーゼ変異型による切断が起こるときに撤廃される。この消光アッセイのいくつかの例は、EisenschmidtらおよびWO0242497号に説明され、これらの文献の開示は本明細書中に参照として組み込まれる。-カスタムメイドメガヌクレアーゼ、カスタムメイドメガヌクレアーゼをエンコードするポリヌクレオチド、ベクター、細胞および動物/植物本発明は、本発明による方法により製造されるいずれのカスタムメイドメガヌクレアーゼおよびいずれのその使用に関する。任意に、該メガヌクレアーゼは、精製タグを含む。本発明は、本発明による方法により製造されるカスタムメイドメガヌクレアーゼをエンコードする組換えポリヌクレオチドに関する。本発明は:a本発明によるカスタムメイドメガヌクレアーゼをエンコードするポリヌクレオチド配列を含むいずれのベクター;b本発明によるカスタムメイドメガヌクレアーゼをエンコードするポリヌクレオチド配列またはaによるベクターのいずれかを含むいずれの原核または真核細胞;およびc本発明によるカスタムメイドメガヌクレアーゼをエンコードするポリヌクレオチド配列またはaによるベクターまたはbによる細胞を含むいずれのヒト以外の動物あるいは植物に関する。本明細書において用いられるように、細胞は原核細胞、例えば細菌細胞または真核細胞、例えば動物、植物または酵母細胞のことをいう。動物または植物起源の細胞は、幹細胞または体細胞であり得る。適切な動物細胞は、例えば哺乳動物、鳥類または無脊椎動物の起源であり得る。哺乳動物細胞の例は、ヒト、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギおよびサルの細胞を含む。該細胞は、胚細胞、骨髄幹細胞または他の前駆細胞であり得る。細胞が体細胞である場合、細胞は例えば上皮細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞、血液細胞、腫瘍細胞、心筋細胞、マクロファージ、肝細胞、樹状細胞、ニューロン細胞または病原体感染細胞であり得る。細胞は、市販または受託機関から得ることができるかあるいは生検のように個体から直接得ることができる。細胞は、それらが返される個体または同じもしくは異なる種の個体から得ることができる。例えば、ヒト以外の細胞、例えばブタの細胞を、DNA構築物を含むように改変してヒトに入れることができる。代わりに、細胞を例えば個体から単離する必要があり、遺伝子治療においては個体にベクターを送達するのが望まれる。カスタムメイドメガヌクレアーゼをエンコードするポリヌクレオチドを含むベクターは、1以上の発現調節配列に動作可能に連結された該メガヌクレアーゼのコーディング配列の全体または一部分を含有し、それによりコーディング配列が該メガヌクレアーゼの産生または合成を許容する翻訳シグナルの制御下に置かれる。よって、カスタムメイドメガヌクレアーゼをエンコードするポリヌクレオチド配列は、発現カセット中に含まれる。より具体的には、ベクターは複製起点、エンコードするポリヌクレオチドに動作可能に連結されたプロモーター、リボソーム部位、RNAスプライシング部位、ポリアデニル化部位および転写終結部位を含む。ベクターはエンハンサーを含むこともできる。プロモーターの選択は、メガヌクレアーゼを発現するための所望の経路に依存する。本発明は、発現ベクターを該発現ベクターと矛盾しない細胞へ導入することを含むカスタムメイドメガヌクレアーゼを製造する方法に関する。カスタムメイドメガヌクレアーゼをエンコードするポリヌクレオチド配列は、当業者に公知のいずれの方法により製造できる。-本発明によるメガヌクレアーゼの使用本発明によるカスタムメイドメガヌクレアーゼは、非常に有用である。もちろん、これらのカスタムメイドメガヌクレアーゼは、分子生物学および遺伝子工学、抗ウイルス療法、ゲノム療法および遺伝子治療、より具体的にはその開示が本明細書に参照として組み込まれるWO9614408号、米国特許第5830729号、WO0046385号、WO0046386号に記載された方法にしたがって、重要である。本発明による新規な特異性を有するカスタムメイドメガヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼを含む遺伝子工学の方法において天然のメガヌクレアーゼについての認識切断部位を導入する制限工程を廃止する。-遺伝子工学および遺伝子治療本発明によるカスタムメイドメガヌクレアーゼは、ベクターの製造のための遺伝子工学において用いることができる。インビトロにおいて、該メガヌクレアーゼは、レアカットエンドヌクレアーゼがベクター構築において必要である場合に有用である。該カスタムメイドメガヌクレアーゼは、インビボベクター構築にも用いることができる。例えば、カスタムメイドメガヌクレアーゼについての認識切断部位がベクター上に位置する場合、該メガヌクレアーゼは、切断部位の周囲の配列と相同性を示す他のベクターとの相同的組換えを誘導するのに用いることができる。該ベクターはプラスミドまたはウイルスベクターである。同様に、該カスタムメイドメガヌクレアーゼは、レトロウイルス、AAVまたはアデノウイルスの産生のためのトランスコンプレメント細胞株においてヘルパーベクターを欠失させるのに用いることができる。ゲノム工学は、生細胞および/または生物の遺伝子プログラムにおける変化を誘導するのに用いられる一連の方法である。本発明により得られるメガヌクレアーゼは、細胞ゲノムの合理的な部位特異的改変を許容する。これらの技法の目的は、改変されるべき染色体を、ゲノムの残りの部分を無傷のままにして正確に上書きすることである。ゲノム工学の適用分野は多様である:動物モデルの作製、タンパク質産生、農学的生物工学、代謝経路の改変および研究または遺伝子疾患もしくはウイルス疾患の治療。本発明によるカスタムメイドメガヌクレアーゼは、1メガヌクレアーゼの少なくとも1つの認識切断部位を含むゲノム遺伝子座で二本鎖破壊を導入し、そして2標的遺伝子座と相同性を共有する配列で挟まれる導入されるべき配列を含むターゲティングDNA構築物を提供することを含むゲノム工学の方法において用いることができる。実際に、共有されるDNA相同性は、ターゲティングDNA構築物における破壊の部位の上流および下流を挟む領域に位置し、導入されるべきDNAは、2つの腕の間に位置するべきである。該メガヌクレアーゼは、細胞に直接または該メガヌクレアーゼをエンコードするポリヌクレオチドを含みかつ用いられる細胞内のその発現に適する発現ベクターを介して提供され得る。または、ゲノム工学の方法は、1該メガヌクレアーゼの少なくとも1つの認識切断部位を含むゲノム遺伝子座に二本鎖破壊を導入し;2切断部位の周囲の領域と相同な染色体DNAと相同的組換えに適切な条件下に維持することを含む。これらの遺伝子工学の方法のいずれも、特定配列の修復、特定配列の改変のため、内因性遺伝子の減弱または活性化のため、対象の部位への突然変異の導入のため、外因性遺伝子またはその一部分の導入のため、内因性遺伝子またはその一部分の不活性化または欠失のため、遺伝子のCpGジヌクレオチドのメチル化または脱メチル化のために用いることができる。本発明は、得られる細胞およびそれらの使用に関する。本発明によるカスタムメイドメガヌクレアーゼは、テロマーの付加または置換のため、細胞を殺すため、染色体転位のため、クロマチン化の変更のためあるいは染色体損失のためにも用いることができる。少なくとも1つの本発明によるカスタムメイドメガヌクレアーゼを、特定配列の修復のため、特定配列の改変のため、対象の内因性遺伝子の減弱または活性化のため、対象の部位への突然変異の導入のため、外因性遺伝子またはその一部分の導入のため、および内因性遺伝子もしくはその一部分の不活性化または欠失のために、細胞、動物、植物を該メガヌクレアーゼに曝露することにより使用することは本発明の目的である。本発明の別の目的は、少なくとも1つの本発明によるカスタムメイドメガヌクレアーゼを含む組成物である。好ましくは、該組成物は、特定配列の修復のため、特定配列の改変のため、対象の内因性遺伝子の減弱または不活性化のため、対象の部位への突然変異の導入のため、外因性遺伝子またはその一部分の導入のため、内因性遺伝子またはその一部分の不活性化または欠失のために、細胞、動物または植物を該メガヌクレアーゼに曝露することにより使用される。好ましくは、該組成物は、1つのカスタムメイドメガヌクレアーゼまたは2つの異なるカスタムメイドメガヌクレアーゼを含む。任意に、該組成物は、標的遺伝子座に相同な配列に接する導入される配列を含むターゲティングDNA構築物をさらに含む。より具体的には、本発明は、本発明による方法により得られるカスタムメイドメガヌクレアーゼの、該メガヌクレアーゼの少なくとも1つの認識切断部位を含む対象の部位にて個体の細胞に二本鎖切断を導入し、該個体に、切断部位の周囲の領域と相同性を共有するDNAおよびターゲティングDNAと染色体DNAとの間の組換えの際に対象の部位を修復するDNAを含むターゲティングDNAを導入することを含む、遺伝子疾患の治療または予防を必要とする個体における該遺伝子疾患の治療または予防の方法における使用にも関する。ターゲティングDNAは、対象の部位へのターゲティングDNAの導入に適する条件下で個体に導入される。第二の実施形態において、遺伝子疾患の治療または予防を必要とする個体における遺伝子疾患の治療または予防の方法は、個体の細胞において、該メガヌクレアーゼの少なくとも1つの認識切断部位を含む対象の部位に、周囲の領域に相同な染色体DNAが対象の部位に導入されるかまたは欠失され、そして対象の部位が修復されるのに適切な条件下で二本鎖破壊を誘導することを含む。代わりに、細胞を治療される個体から除去し、本発明の方法により改変し、そして個体に自己移植により再導入することができる。本発明は、細胞の染色体DNAでの遺伝的損傷または遺伝的異常を修正するための方法における本発明による方法により得られたカスタムメイドメガヌクレアーゼに関し、該修正するための方法は、細胞において、二本鎖破壊を、該メガヌクレアーゼの少なくとも1つの認識切断部位を含む遺伝的損傷または異常の中の対象の部位に、切断部位の周囲の領域に相同な染色体DNAが対象の配列に導入され、遺伝的損傷または異常が修正されるのに適切な条件下で誘導することを含む。ここでも、該方法は、個体において存在する細胞または個体から移動され改変されて個体に返される細胞において用いることができる。さらに本発明は、得られる細胞および個体における状態または障害の治療あるいは予防のためのそれらの使用に関する。例えば、細胞は、本明細書に記載の方法により製造され、そして既知の方法を用いて個体に導入され得る。代わりに、該細胞は、個体において改変され得る。よって本発明の目的は、本発明による少なくとも1つのカスタムメイドメガヌクレアーゼの、該メガヌクレアーゼを細胞、動物または患者に曝露することによる遺伝子疾患の予防、緩和または治療のための使用である。好ましくは、本発明は1つのカスタムメイドメガヌクレアーゼまたは2つの異なるカスタムメイドメガヌクレアーゼの使用に関する。本発明の別の目的は、本発明による少なくとも1つのカスタムメイドメガヌクレアーゼを含む組成物である。好ましくは、該組成物は、該組成物に細胞、動物または患者を曝露することにより遺伝子疾患を予防、緩和または治療するために用いられる。好ましくは、該組成物は少なくとも1つのカスタムメイドメガヌクレアーゼを含む。任意に、該組成物は、標的遺伝子座に相同な配列で挟まれる導入されるべき配列を含むターゲティングDNA構築物をさらに含む。上記のようにして細胞、動物、植物または個体に導入されるターゲティングDNAおよび/またはカスタムメイドメガヌクレアーゼは、ベクターに挿入することができる。ターゲティングDNAおよび/またはメガヌクレアーゼをエンコードする核酸を含むベクターは、種々の方法により細胞に導入することができる、発射物打込み、リポソーム。メガヌクレアーゼは、発現ベクターを用いて細胞内で安定的にまたは一過的に発現することができる。真核細胞における発現の技術は、当業者に周知である。任意に、組換えタンパク質に核局在化シグナルを組み込んで、それが核内で発現されることを確実にすることが好ましいだろう。カスタムメイドメガヌクレアーゼは、当業者に周知で、特定のメガヌクレアーゼおよび細胞の種類に適切な方法により細胞に導入することもできる。本発明によるカスタムメイドメガヌクレアーゼは、リポソームを用いてまたは膜貫通ペプチドとの融合により細胞内に導入することができる。一旦細胞内に入ると、カスタムメイドメガヌクレアーゼならびにターゲティングDNAおよび/またはカスタムメイドメガヌクレアーゼをエンコードする核酸を含むベクターは、細胞により細胞質から核内の活動する部位に取り込まれるかまたは移動される。カスタムメイドメガヌクレアーゼならびに切断部位の周囲の領域に相同なターゲティングDNAおよび/またはカスタムメイドメガヌクレアーゼをエンコードする核酸を含むベクターは、当該技術において一般に知られた投与経路を用いて個体に導入することができる。投与は、局所的または内部的あるいは患者に治療剤を導入するのに適したいずれの他の経路によるものであり得る。局所的投与は、皮膚への塗布または目、耳もしくは鼻への適用によるものであり得る。内部的投与は、皮内、皮下、筋肉内、腹膜内、動脈内もしくは静脈内またはいずれの他の適切な経路により行い得る。本発明の組成物を経口摂取によるかまたは呼吸、直腸もしくは膣により投与することが有利な場合もあり得る。カスタムメイドメガヌクレアーゼおよびベクターは、医薬的に許容される担体、例えば食塩水、滅菌水、リンゲル液および等張塩化ナトリウム溶液中に投与することができる。典型的には、治療の適用のために、カスタムメイドメガヌクレアーゼは、計画された投与経路に適切な医薬的に許容される賦形剤と組み合わせる。種々の医薬的に許容される賦形剤が周知であり、そのうちメガヌクレアーゼを感染の部位に効果的に送達するものが選択できる。AmericanPharmaceuticalAssociationにより出版されるHANDBOOKOFPHARMACEUTICALEXCIPIENTSは、本発明の使用のための適切な賦形剤についての有用な指針である。構成物は、受容者がその投与に耐え得る場合は医薬的に許容される賦形剤とよばれる。滅菌リン酸緩衝食塩水は、静脈内投与に適する医薬的に許容される賦形剤の一例である。投与の形態は、標的細胞の位置が好ましい。投与頻度を含む、個体に投与される本発明のカスタムメイドメガヌクレアーゼまたはベクターの用量は、投与の形態および経路;受容者のサイズ、年齢、性別、健康、体重および食餌;治療される疾患または障害の性質および症状の程度;並行して行う治療の種類、治療の頻度および所望される効果を含む種々の因子に応じて変動する。医薬的な剤形およびそれらの使用の簡単なレビューについては、PHARMACEUTICALDOSAGEFORMSANDTHEIRUSEを参照。治療の目的のために、カスタムメイドメガヌクレアーゼと医薬的に許容される賦形剤とは治療上有効量で投与される。このような組み合わせは、投与される量が生理的に意義がある場合に治療上有効量で投与されるという。剤は、その存在が受容者の生理機能に検出できる変化をもたらす場合に、生理的に意義がある。本発明の関係において、剤は、その存在が標的疾患の1以上の症状の重篤度の減少または障害もしくは異常のゲノムの修正をもたらす場合に、生理的に意義がある。本発明のある実施形態において、カスタムメイドメガヌクレアーゼは、実質的に非免疫原性であり、すなわち有害な免疫応答をほとんどまたは全く発生させない。この種類の有害な免疫反応を緩和または消去する種々の方法を、本発明の方法に従って用いることができる。好ましい実施形態において、メガヌクレアーゼは、Nホルミルメチオニンを実質的に有さない。望ましくない免疫反応を回避するための別の方法は、メガヌクレアーゼをポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールと結合させることであるが500~20000ダルトン。例えばDavisらに記載されるようなPEGまたはPPGとの結合は、抗ウイルス活性を有する非免疫原性の生理活性な水溶性エンドヌクレアーゼコンジュゲートを提供することができる。ポリエチレン-ポリプロピレングリコールコポリマーを用いる類似の方法がSaiferらに記載されている。別の使用において、カスタムメイドメガヌクレアーゼは、1つまたは2つの異なるカスタムメイドメガヌクレアーゼについての少なくとも1つ、好ましくは2つの認識切断部位に接するポリヌクレオチド断片のインビボでの切除のためであり得る。本発明によるカスタムメイドメガヌクレアーゼは、ベクターを取り込んだ細胞内のベクターからの標的DNAまたはポリヌクレオチド断片の切除を含む方法において用い得る。このような方法は、カスタムメイドメガヌクレアーゼの少なくとも1つ、好ましくは2つの認識切断部位に接する該ポリヌクレオチド断片を含むベクターと、用いられる細胞内での発現に適する標的部位に対応する該カスタムメイドメガヌクレアーゼをエンコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターまたは該カスタムメイドメガヌクレアーゼのいずれかとの使用に関係する。このような切除されるポリヌクレオチド断片は、2002年9月13日にファイルされた米国特許出願第10242664号に詳細に記載されるトランスジェネシスのために用いることができる。任意に、該切除されるターゲティングDNAは、ターゲティングDNA構築物内の破壊の部位の上流および下流を挟む領域に位置する共有DNA相同性を含み、導入されるべきDNAは2つの腕の間に位置する。より詳細にはWO0046385号を参照。細胞内のベクターからのターゲティングDNAの切除の方法は、染色体DNAの対象の特定配列の修復、染色体DNA内の特定配列または遺伝子の改変、対象の内因性遺伝子の減弱、標的部位での突然変異の導入、または個体における遺伝子疾患の治療または予防のために用いることができる。-抗ウイルスの適用ウイルスにより伝染される多くの疾患がヒトの苦痛および死亡の原因となっているが、現在、有効な抗ウイルス剤は非常に少ない。つまり、生命を脅かし致命的な疾患を含むこれらの疾患、例えばB型肝炎およびAIDSの治療に役に立つことができる安全で効果的な抗ウイルス剤に対する大きな必要性がある。ヒトの癌の15はウイルスを原因とする。この割合は、子宮癌および肝臓癌については80まで増加する。今日では、ウイルスはヒトにおける第三番目の発癌因子である。細胞に感染したウイルスを殺しかつそのような感染をしていない細胞を治療することが専門のウイルス治療は存在しない。ウイルス感染の治療における主要な目的は、感染した細胞および患者においてウイルスの負荷を減少することである。今日入手可能な抗ウイルス薬剤は、一般的に毒性がありほとんど特異性がない。ある薬剤は、ウイルスの複製装置の要素、例えば酵素チミジンキナーゼまたは逆転写酵素を阻害するように設計されている。これらの剤は、ウイルスDNAを破壊しない。他の抗ウイルス剤は、宿主の免疫応答を促進して感染した細胞がより効率的に殺されるように作用する。このことは、ウイルスおよび宿主細胞の両方の非特異的な破壊をもたらす。今日、宿主細胞を破壊または変化させることなくウイルスDNAを特異的に破壊する新規な治療剤への必要性がある。ほとんどのウイルスDNAの合成は、細胞の核内でおこる。よって、ウイルスDNAと宿主細胞DNAとの間を区別できる治療剤を作ることが重要である。Sechlerは、ウイルスに対する制限エンドヌクレアーゼの使用を開示した。この方法は、標的ウイルスを切断し得る制限エンドヌクレアーゼを用いる組成物を患者に投与する工程を含む。この方法の問題点は、制限エンドヌクレアーゼの特異性が非常に低いことおよび患者のゲノムを切断する可能性が高いことである。Chandrasegaranは、ウイルス疾患の治療におけるハイブリッドエンドヌクレアーゼの使用に関する見込みのある例を開示した。しかしながら、このようなハイブリッドエンドヌクレアーゼは、一般に、DNA標的部位内で単一の独特なホスホジエステル結合または塩基対として特異的に作用する能力を欠き、これらは高い配列特異性またはいずれの抗ウイルス性の証明も示していない。本発明によるカスタムメイドメガヌクレアーゼのある適用は、DNA媒介物を示すウイルスまたはレトロウイルスにより引き起こされるウイルス疾患の治療における治療剤としてである。実際に、真核細胞に感染する多くのウイルスが、そのライフサイクルの少なくとも一部分の間に、メガヌクレアーゼにより容易に切断され得る二本鎖DNAからなるゲノムを有する。本発明によるカスタムメイドメガヌクレアーゼは、ウイルス特異的DNA配列を特異的に標的するように設計され得る。制限エンドヌクレアーゼおよびジンクフィンガーハイブリッドエンドヌクレアーゼと正反対に、本発明によるカスタムメイドメガヌクレアーゼはそのウイルスDNA標的に対して良好な特異性を示し、それらはそのウイルス標的にのみ独特な二本鎖破壊を作製する。このストラテジは、ウイルス特異的なウイルスゲノム内のDNA配列の同定を含む。一旦同定されると、高い親和性および特異性をもってこのような配列に特異的に結合して切断するメガヌクレアーゼは、本発明において記載されるカスタムメイドメガヌクレアーゼの製造方法を用いて設計することができる。次いで、設計されたメガヌクレアーゼは、ウイルス感染の治療に用いられる。よって本発明の目的は、本発明による少なくとも1つのカスタムメイドメガヌクレアーゼを、ウイルス感染を予防、緩和または治療するために、これらのメガヌクレアーゼにウイルスおよび/または感染した細胞、植物、動物もしくは患者を曝露することにより用いることである。好ましくは、本発明は1つのメガヌクレアーゼまたは2つの異なるメガヌクレアーゼの使用に関する。本発明の別の目的は、本発明による少なくとも1つのメガヌクレアーゼを、生物学的に得られた物質または生物学的使用を意図する物質において、該物質を該メガヌクレアーゼで処理することにより使用することである。具体的な実施形態において、該生物学的な物質は、血液または血液に由来する物質である。好ましくは、本発明は少なくとも1つのメガヌクレアーゼ、任意に2つの異なるカスタムメイドメガヌクレアーゼの使用に関する。本発明の別の目的は、組成物をウイルスまたは感染した細胞、植物、動物もしくは患者に曝露することによりウイルス感染を予防、緩和または治療するための本発明による少なくとも1つのカスタムメイドメガヌクレアーゼを含む組成物である。好ましくは、該組成物は少なくとも1つのカスタムメイドメガヌクレアーゼ、任意に2つのメガヌクレアーゼを含む。本発明の別の目的は、生物学的に得られた物質または生物学的使用もしくは物体の殺菌を意図する物質におけるウイルスの増殖の阻害、ウイルスの不活性化または除去のための本発明による少なくとも1つのメガヌクレアーゼを含む組成物である。具体的な実施形態において、該生物学的な物質は、血液または血液に由来する物質である。好ましくは、該組成物は1つのカスタムメイドメガヌクレアーゼまたは2つの異なるカスタムメイドメガヌクレアーゼを含む。そのライフサイクルの間に二本鎖DNAの段階を含むいずれのウイルスも、ウイルスゲノムに特異的なDNA配列を認識するメガヌクレアーゼを創ることにより、除去または不活性化の標的となり得る。これらのウイルスは、複製型または潜伏型であり得る。これらは、エピソームとしてかまたは宿主のゲノムに組み込まれるかのいずれかでとどまることができる。二本鎖DNAゲノムウイルスは、本発明で規定されるメガヌクレアーゼを用いることにより処理されるのに非常に適する。これらのうち、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ヘパドナウイルス、パポバウイルスおよびポックスウイルスが見出されている。ヘルペスウイルスのうち、単純ヘルペスウイルス、水痘ウイルス、エプスタインバーウイルス、サイトメガロウイルス、ヘルペスウイルス6、7および8が見出されている。ヘパドナウイルスのうち、ヒトB型肝炎ウイルスが見出されている。パピローマウイルスのうち、パピローマウイルスおよびポリオーマウイルスが見出されている。アデノウイルスのうち、アデノウイルス11および21が見出され、これらは急性出血性膀胱炎に関連する。植物ウイルスも本発明により意図される。レトロウイルスも、本発明によるメガヌクレアーゼを用いることにより処理するのに非常に適する。これらはRNAウイルスであるが、宿主のゲノムに二本鎖DNAの形で組み込まれる。レトロウイルスのうち、ヒト免疫不全ウイルスおよびヒトTリンパ腫ウイルスが見出されている。いくつかの上記のウイルスは、発癌性に関係することが周知である。バーキットリンパ腫、その他のリンパ組織増殖性の疾患および上咽頭癌におけるEBV;カポジ肉腫におけるヘルペスウイルス8;肝細胞癌におけるHBV;性器の癌におけるHPV;T細胞白血病におけるHTLV1である。エピソームウイルスについて、そのゲノムに導入された二本鎖破壊は、ゲノムの直線化およびその分解に導く。エピソームウイルスの例は、HSV1、EBVおよびHPVである。実施例3を参照。組込みウイルスについて、組み込まれたウイルス配列の中またはその近くに導入された二本鎖破壊は、組み込まれたウイルス配列の部分的または完全な欠失に導く。組込みウイルスの例は、HPV、HTLV、HBVおよびHIVである。欠失にはいくつかの機構が関係し得る。染色体の二本鎖破壊は、相同な染色体との遺伝子変換を誘発し、よってウイルス配列の欠失を導く。二本鎖破壊の近くに直列反復配列が存在する場合、該破壊はSSAにより修復することができ、部分的または完全なウイルスの欠失を導く。2つの二本鎖破壊を導入すると、二本鎖破壊の位置に応じて、染色体は末端結合により修復されることができ、ウイルスの部分的または完全な欠失が導かれる。米国特許第5948678号の実施例5を参照。標的ウイルスDNA配列が宿主のゲノムに存在しないことを確実にするために、このようなDNA標的配列は、少なくとも15ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも18ヌクレオチド長であるべきである。ホーミングエンドヌクレアーゼは12~40bpにわたる認識配列を示すので、この条件は本発明により規定されるカスタムメイドメガヌクレアーゼが充足する。より具体的には、ICreIホーミングエンドヌクレアーゼは22bpの認識配列を有する。ウイルスゲノムのいずれのDNA配列も、本発明により規定されるメガヌクレアーゼによる切断のために標的され得る。好ましい標的部位は、ウイルスの株の間で保存され、および/またはその遺伝子がウイルスの増殖および感染性に必須である配列を含む。これらの位置は、少なくとも2つの理由から好ましい。第一に、ウイルスの必須の部分は他より突然変異が少ない。第二に、ウイルスの不活性化を最大限にするためにウイルスの必須の領域を標的することが好ましい。カスタムメイドメガヌクレアーゼの良好な標的は、ウイルスの複製起点および/またはori結合タンパク質をエンコードするウイルス遺伝子であり得る。ori結合タンパク質の例は、HSV1UL9遺伝子産物、VZV遺伝子51産物、ヒトヘルペスウイルス6BCH6R遺伝子産物、EBVEBNA1遺伝子産物ならびにHPVE1およびE2遺伝子産物である。HPVについての他の対象の標的は遺伝子E6およびE7であるが、これはこれらの産物が増殖および悪性の表現型の開始および維持に関係するからである。好ましい標的は、HPVのプレコア/コア領域内の高度に保存された62ヌクレオチド配列である。EBVについての対象の標的の例は、遺伝子EBNAおよびLMPである。ウイルスの発癌性効力を仲介すると考えられるHTLV1の遺伝子Taxを標的することは興味深いであろう。HBVについて、対象の標的はX遺伝子であろう。なぜなら、Xタンパク質はDNA修復システムの要素と相互作用しかつp53の変異率を増加させ得るからである。HIVについて、好ましい標的はTAT、REVまたはTAR遺伝子の中にある。ウイルスの標的は、上記の例に限定されない。任意に、標的DNAは、ウイルスの反復配列、例えばITRおよびLTRであり得る。好ましくは、少なくとも2つの異なる標的部位を用いる。実際に、ウイルスの主要な防御はそれらの変異する能力である。よって、2つの標的部位は、本発明によるカスタムメイドメガヌクレアーゼを用いることによる処理からウイルスが逃れるのを回避する。さらに、異なるカスタムメイドメガヌクレアーゼの継続使用により、有害な免疫応答を回避することができる。該異なるカスタムメイドメガヌクレアーゼは、異なる当初のメガヌクレアーゼを示すことができ、よって異なる免疫原性を示す。本発明によるカスタムメイドメガヌクレアーゼによる処理は、細胞、好ましくは患者から採取された細胞または患者の全身のいずれかに、器官を標的とするかまたはせずに適用することができる。細胞療法の場合、細胞を患者から採取するのが好ましい。これらの細胞を、ウイルスを不活性化または除去するために本発明によるカスタムメイドメガヌクレアーゼにより処理する。処理の後、細胞を患者に再び導入する。これらの細胞は、感染した組織で増殖して再び繁殖する。好ましくは、該細胞は幹細胞、全能細胞または多能性細胞である。例えば、幹細胞は造血、ニューロン、間葉、胚、筋肉由来であり得る。細胞の別の例は、肝細胞のように再生できるものである。カスタムメイドメガヌクレアーゼによる処理は、メガヌクレアーゼの細胞への導入または該メガヌクレアーゼをエンコードする発現ベクターを用いるトランスフェクションのいずれかにより行うことができる。トランスフェクションは、一過的または安定的であり得る。カスタムメイドメガヌクレアーゼの一過性の発現は、細胞がウイルスから浄化されることを許容する。安定的なトランスフェクションは、細胞がウイルスから浄化されることを許容しかつ標的ウイルスによる処理した細胞のさらなる感染を回避する。全身療法の場合、本発明によるカスタムメイドメガヌクレアーゼまたは該メガヌクレアーゼをエンコードするベクターは、いずれの簡便な手段により個体に導入される。カスタムメイドメガヌクレアーゼが感染した細胞に導入されるかまたは発現される場合、ウイルスは不活性化されるかおよび/または除去される。カスタムメイドメガヌクレアーゼでの処理は、健康な細胞に機能的な影響を及ぼさない。同様に、少なくとも1つのカスタムメイドメガヌクレアーゼの使用に基づくこのような細胞または全身の抗ウイルス療法は、異物移植を専門として動物の細胞または器官を処理するのに用い得る。ウイルスの増殖および感染を阻害するメガヌクレアーゼの効率は、インビトロおよびインビボの感染アッセイにより評価されるのが好ましい。このようなアッセイは、まず細胞培養において、ウイルスの増殖に有害に影響する方式でウイルスDNAを切断する異なるメガヌクレアーゼの潜在能力を確立するために行うことができる。このタイプの予備的な研究に続いて、適切な動物モデルにおける研究を行う。最後に臨床試験を行う。異なるウイルスに適切な宿主および培養条件は大きく変動するので、異なるウイルスは異なるアッセイシステムを必要とする。しかしながら、このような適切な条件は多くのウイルスの培養について記載されており、これらの条件を用いてウイルスおよび/または宿主をメガヌクレアーゼに曝露する効果を試験して、エンドヌクレアーゼがウイルス感染を阻害する能力を決定することができる。特定のウイルスについての培養条件の議論についてはFieldsおよびKnipe編FIELDSVIROLOGY第2版RavenPressNYの第17章を参照。宿主および/またはウイルスは、感染の経過において、変更しうるいくつかの関係するパラメータに言及すると、種々の回数、種々の条件下で、いくつかの量で、そして種々の賦形剤で曝露して、潜在的な治療効果を達成するメガヌクレアーゼの潜在能力を評価することができる。さらに、培養細胞においてエクスビボで試験するために、潜在的な治療のメガヌクレアーゼを動物モデルにおいて試験して、単独または他の治療剤との組み合わせのいずれかでの予防、緩和、治療および/または治癒的な能力を評価することができる。ウイルスの培養が可能でなく、全ての生物学的アッセイを動物モデルにおいて行うことが必要な場合がある。異なる動物モデルが異なるウイルスに適切であることが容易に認識されるであろう。しかしながら、いずれの動物モデルも、メガヌクレアーゼの治療的能力を評価するのに用いることができる。アッセイされるメガヌクレアーゼの潜在的有効量は、動物の適切な個体群に投与することができ、ウイルス感染の経過におけるメガヌクレアーゼの効果は、適切なコントロールとの比較により評価できる。薬理学的効果を評価するためのこのような方法は、当該技術において周知であり、メガヌクレアーゼの治療的プロフィールを測定するのに容易に適応させることができる。本発明による使用のある実施形態において、メガヌクレアーゼは実質的に非免疫原性であり、すなわち有害な免疫応答をほとんどまたは全く発生させない。この種類の有害な免疫反応を緩和または消去する種々の方法を、本発明の方法に従って用いることができる。好ましい実施形態において、メガヌクレアーゼは、Nホルミルメチオニンを実質的に有さない。望ましくない免疫反応を回避するための別の方法は、メガヌクレアーゼをポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールと結合させることであるが500~20000ダルトン。例えばDavisらに記載されるようなPEGまたはPPGとの結合は、抗ウイルス活性を有する非免疫原性の生理活性な水溶性エンドヌクレアーゼコンジュゲートを提供することができる。ポリエチレン-ポリプロピレングリコールコポリマーを用いる類似の方法がSaiferらに記載されている。本発明によるカスタムメイドメガヌクレアーゼは、細胞内にリポソームを用いてまたは膜貫通ペプチドとの融合により細胞内に導入することができる。そうでなければメガヌクレアーゼは、細胞内で発現ベクターを用いて安定的にまたは一過的に発現することができる。真核細胞における発現の技術は、当業者に周知である。任意に、組換えタンパク質に核局在化シグナルを組み込んで、それが核内で発現されることを確実にすることが好ましいだろう。典型的に、治療の適用のために、カスタムメイドメガヌクレアーゼを計画された投与経路に適する医薬的に許容される賦形剤と組み合わせる。種々の医薬的に許容される賦形剤が周知であり、そのうちメガヌクレアーゼを感染の部位に効果的に送達するものが選択できる。AmericanPharmaceuticalAssociationにより出版されるHANDBOOKOFPHARMACEUTICALEXCIPIENTSは、本発明の使用のための適切な賦形剤についての有用な指針である。構成物は、その投与が受容者に耐えられ得る場合は医薬的に許容される賦形剤とよばれる。滅菌リン酸緩衝食塩水は、静脈内投与に適する医薬的に許容される賦形剤の一例である。治療の目的のために、カスタムメイドメガヌクレアーゼと医薬的に許容される賦形剤とは治療上有効量で投与される。該組成物は、1種のカスタムメイドメガヌクレアーゼまたは異なる特異性を有するいくつかのカスタムメイドメガヌクレアーゼのいずれかを含み得る。このような組み合わせは、投与される量が生理的に意義がある場合に治療上有効量で投与されるという。剤は、その存在が受容者の生理機能に検出できる変化をもたらす場合に、生理的に意義がある。この関係において、剤は、その存在がウイルス性疾患の1以上の症状の重篤度の減少をもたらす場合に、生理的に意義がある。投与は、局所的または内部的あるいは患者に治療剤を導入するのに適したいずれの他の経路によるものであり得る。局所的投与は、皮膚への塗布または目、耳もしくは鼻への適用によるものであり得る。内部的投与は、皮内、皮下、腹膜内、動脈内もしくは静脈内またはいずれの他の適切な経路により行い得る。本発明の組成物を経口摂取によるかまたは呼吸、直腸もしくは膣により投与することが有利な場合もあり得る。医薬的な剤形およびそれらの使用の簡単なレビューについては、PHARMACEUTICALDOSAGEFORMSANDTHEIRUSEを参照。局所的および内部的な治療の適用のために、本発明によるカスタムメイドメガヌクレアーゼは、いずれの適切な薬理学的技術を用いて処方することができる。例えば、メガヌクレアーゼは持続性放出用に処方され得る。上記のように、メガヌクレアーゼの抗ウイルス活性の持続性は、メガヌクレアーゼをリポソームに組み込むことにより増加または修飾することができる。さらに、本発明において記載される方法は、メガヌクレアーゼの物理化学的性質を改変するのに用い得る。例えば、該方法は、温度、pHまたは塩濃度に対するメガヌクレアーゼの感受性、およびその溶解性または安定性あるいはその反応ターンオーバーを変更するのに用いることができる。さらに、本発明に記載の方法は、所定のメガヌクレアーゼの好ましいDNA配列標的に対する特異性を緩和または濃縮するのに用いることもできる。本発明は、追加の記載および次の図面によりさらに説明される。追加の記載は、本発明によるカスタムメイドメガヌクレアーゼを製造する方法ならびに抗ウイルス療法および遺伝子治療におけるその使用を説明する実施例に言及する。しかしながら、これらの実施例は、本発明の説明のためにのみ与えられ、本発明をいずれの様式においても限定しないことが理解されるべきである。-図1は、単鎖ICreIメガヌクレアーゼのアミノ酸配列および該単鎖メガヌクレアーゼをエンコードするあるポリヌクレオチドを開示する。タンパク質配列において、2つの最初のN末端残基はメチオニンとアラニンであり、3つのC末端残基はアラニンとアラニンとアスパラギン酸である。これらの配列は、NcoIおよびEagI制限部位を含むDNAコーディング配列を有することを許容し、これらは種々のベクターにクローニングするのに用いられる。-図2はポリヌクレオチド配列を開示する。図2Aは、ICreIホーミングエンドヌクレアーゼをエンコードする天然とよばれるポリヌクレオチドを開示する。図2Bは、ICreIホーミングエンドヌクレアーゼをエンコードする非相同とよばれるポリヌクレオチド配列を開示する。図2Cは、変異D75NJを含むICreIホーミングエンドヌクレアーゼをエンコードする鋳型とよばれるポリヌクレオチド配列を開示する。各ICreIホーミングエンドヌクレアーゼは、N末端の端に2つのさらなるアミノ酸およびC末端の端に3つのさらなるアミノ酸を有する。図2Dは、ライブラリUlibIおよびUlibIIを作製するのに用いられるUlibIfor、UlibIrev、UlibIIforおよびUlibIIrevとよばれるプライマーのポリヌクレオチド配列を開示する。-図3は、D75N変異を含むICreIホーミングエンドヌクレアーゼをエンコードする鋳型とよばれるポリヌクレオチド配列の模式図である。濃い矢印は、2つのライブラリUlibIおよびUlibIIを作製するのに用いられるプライマーUlibIfor、UlibIrev、UlibIIforおよびUlibIIrevの位置を示す。DヘリックスはLAGLIDADGヘリックスのことである。N75は変異D75Nのことである。-図4は、ライブラリ構築のストラテジの模式図である。工程1:pET24CTはポリヌクレオチド鋳型を含むプラスミドである。2つのPCR増幅、PCRulib1およびulib2は、UlibIforとUlibIIrevまたはUliblIforとUliblIIrevのいずれかを用いて行なわれる。PCRulib1産物をファージミドpCes4NHTにクローニングする。PCRulib2産物をプラスミドpET24CTにクローニングする。工程2:Ulib2ベクターの断片のUlib1ファージミドへのサブクローニング。-図5:COS細胞単層を、ISceIを発現するベクターまたはコントロールプラスミドを用いてトランスフェクションする。トランスフェクションの48時間後、細胞をrHSV1を用いて感染させる。2日後、単層を固定して染色する。感染した細胞は青色になった。-図6:図6A:細胞単層を30PFUで感染させる。HSV1増殖を、細胞溶解物中のβガラクトシダーゼ活性により定量する。図6B:細胞単層を300PFUで感染させる。細胞の生存率を細胞溶解物中のタンパク質測定により測定する。ISceIはISceIを発現するベクターのことである。ISceIは、ISceIのORFが逆方向に挿入されたベクターのことである。ネガティブコントロールは、コントロールプラスミドのことである。-図7:図7Aは、組換えHSV1のゲノムDNAの模式図である。Lac遺伝子を駆動するCMVプロモーターを含むカセットを、主要LAT転写産物に挿入した。ISceI制限部位をプロモーターとレポーター遺伝子との間にクローニングした。aおよびbは、半定量的PCRに用いたプライマーを示す。COS7単層をISceIを発現するベクターまたはコントロールプラスミドを用いて感染させた。トランスフェクションの48時間後、細胞をrHSV1を用いて感染させた。DNAを感染の1、2または3日後に抽出した。PCRを実験方法に記載のようにして行った。Stdは内部標準のことであり;LacはrHSV1Lac遺伝子のアンプリコンのことである。ISceIはISceIを発現するベクターのことであり;ISceIはISceIのORFが逆方向に挿入されたベクターのことであり、ネガティブコントロールは、コントロールプラスミドのことである。図7B;ウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子のPCR定量。PCRを2つのDNA濃度で行なった。ISceIはISceIを発現するベクターのことであり;ISceIはISceIのORFが逆方向に挿入されたベクターのことであり、ネガティブコントロールは、コントロールプラスミドのことである。-図8は、トランスフェクションした細胞の感染の後に培地に放出されたウイルスの力価を示す。培地を毎日回収して新鮮な培地を加えた。ウイルスを、標準的なプラークアッセイにより測定した。ISceIはISceIを発現するベクターのことであり;ISceIはISceIのORFが逆方向に挿入されたベクターのことであり、ネガティブコントロールは、コントロールプラスミドのことである。-図9は、ICreIDNA標的および5つの関係する標的を示す。保存された位置は灰色の箱である。-図10は、6つの標的を用いてLib2ライブラリをスクリーニングした後に得られる4つの結合パターンを示す。陽性のものは最初のスクリーニングで同定され、第二のスクリーニングにおいて確認されたが、その間にそれらは標的のそれぞれについて8回アッセイされた。ヒストグラムは各クラスからの1つのクローンについて示される。標的は図9に示す。-図11は、標的ベクターの模式図を示す。CpG欠失LacZ遺伝子は、ヒト伸長因子1アルファプロモーターにより駆動される。LagoZ遺伝子は、ISceI切断部位の挿入により不活性化される。挟む反復を白抜きの矢印で示す。相同配列の長さをボールドで示す。-図12は、一本鎖アニーリング効率に対する相同性の長さの影響を示す。細胞単層を、等モル量の異なる長さの相同反復配列を有する標的プラスミドおよびISceIを発現するベクターを用いるかまたはコントロールプラスミドを用いてトランスフェクションした。トランスフェクションの72時間後、細胞を回収して細胞溶解物中のβガラクトシダーゼ活性を定量した。ISceI、ISceIを発現するベクターを用いた共トランスフェクション;ISceI、ISceIのORFが逆方向に挿入された発現ベクターを用いた共トランスフェクション。-図13:細胞単層をISceIを発現するベクターまたはコントロールプラスミドISceIを用いて共トランスフェクションした。トランスフェクションの72時間後、細胞を固定して染色した。図13A:遺伝子修復が起こった細胞が暗く現れた。図13B:70および220bp重複標的ベクター上のISceI誘導組換えの頻度。頻度は、青色の細胞/トランスフェクションされた細胞の比により計算される。-図14A:標的LagoZ遺伝子およびISceI発現ベクターの混合物を注射されたマウスからの肝臓のXGal染色。図14B:標的LagoZ遺伝子およびISceIのORFが逆方向に挿入された発現ベクターの混合物を注射されたマウスからの肝臓のXGal染色。-図15:IVによりAdISceIアデノウイルスを用いて感染させた2つの独立した系統の半接合体トランスジェニックマウスの肝臓のXGal染色。A感染の5日後、βガラクトシダーゼ活性が、1010感染性単位で感染された58A半接合体の肝臓全体の多数の細胞で検出される。これに比べて、Adcontrolで感染された半接合体または感染していない58A同腹子の肝臓のXGal染色により、βガラクトシダーゼ活性は検出できない。BおよびC感染の14日後、βガラクトシダーゼ活性が、109感染性単位で感染されたマウスおよび1010感染性単位で感染されたマウスの肝臓全体の多数の細胞で検出される。より強いシグナルはBに比べてCで検出され、これはおそらくより多数の細胞がAdISceIを用いて感染されたからであろう。これに比べて、感染していない361同腹子の肝臓のXGal染色により、βガラクトシダーゼ活性は検出できない。-図16:肝臓抽出物の蛍光βガラクトシダーゼアッセイ。トランスジェニックマウスの2つの独立した系統に109または1010PFUのISceIを発現するアデノウイルスまたはコントロールウイルスを注入した。マウスを注射の5または14日後に犠牲にし、肝臓を切開し、タンパク質を抽出した。肝臓タンパク質抽出物30μlを37°Cでフルオレセインジガラクトシドの存在下にインキュベートした。バーは、アッセイの標準偏差を示す。NI:注射されていないマウス;AdISceI:ISceIを発現するアデノウイルスを注射したマウス;Adcontrol:コントロールアデノウイルスを注射したマウス。実施例1:ダイマーホーミングエンドヌクレアーゼに由来する単鎖メガヌクレアーゼいくつかのLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼは、ホモダイマーとして活性である。各モノマーはそれらのドデカペプチドモチーフを介して主にダイマー化する。単鎖メガヌクレアーゼは、この酵素の2つのサブユニットの間に共有結合を導入するようにして改変された2つのモノマーを共有結合させることによりつくることができる。好ましくは、共有結合は2つのモノマーの間にペプチド結合を創ることにより導入される。しかしながら、他の簡便な共有結合も意図する。単鎖メガヌクレアーゼは、単鎖ICreIおよび単鎖ICeuIのような同じホーミングエンドヌクレアーゼからの2つのサブユニットを含むのが好ましい。単鎖メガヌクレアーゼは多数の利点を有する。例えば、単鎖メガヌクレアーゼはより操作しやすい。単鎖メガヌクレアーゼは、ダイマー構造に比べて例えば標的配列の認識のために熱力学的に好ましい。単鎖メガヌクレアーゼは、オリゴマー化の制御を許容する。ICreIの単鎖バージョンを手本とし作製した。scICreIは、その同種のDNA基質をインビトロで切断し、酵母および哺乳動物細胞の両方において相同的組換えを誘発する。-単鎖ICreIメガヌクレアーゼの設計ChlamydomonasreinhardtiiからのICreIは、小さいLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼであり、これはより大きいモノマーLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼのものに類似の構造にダイマー化する。ICreIの単鎖バージョンをつくるために、2つのICreIコピーを融合させた。このことは2つのドメインの間にリンカー領域を配置することを必要とし、ICreIタンパク質のかなりの部分がリンカーに先行するドメインの末端で除去されなければならなかった。IDmoIの三次元構造は、IDmoIはある明確なドメインから他のドメインへ導くリンカー領域を含むことを除いてICreIのものに匹敵する。このリンカーの境界は、ICreIダイマーの関係する主鎖原子に精巧に調和する。第一のドメインにおいて、ICreIとIDmoIの第三のαヘリックスからの残基93~95は、構造的に等しい。第二のLAGLIDADGαヘリックスの最初では、IDmoIの残基104~106はICreIの残基7~9に対応する。さらに、IDmoIからのLeu95およびGlu105は、ICreIにおいて同一性を保存しており、IDmoIの残基Arg104はICreI中の別の塩基性残基と整列する。つまり、単鎖ICreIは、残基94~104のIDmoIリンカー領域を第一のICreIドメインと第二のICreIドメインとの間に挿入することにより設計された。どのようにして新しいリンカーがscICreIタンパク質ドメインを連結するかの詳細な構造解析により、矛盾の可能性は見られなかった。例えば、IDmoIからの非極性アミノ酸の側鎖であるMet94、Ile98およびPhe109は、内部に向いてICreIのキャビティにフィットする。しかしながら、単一の突然変異を作製してリンカー領域に先行するαヘリックスにおける主軸の規則性を促進した。-材料および方法タンパク質の発現および精製Hisタグをつけたタンパク質を、pET24dベクターを用いてEcoliBL21細胞で過剰発現させた。IPTGを用いて25°Cで誘導した。細胞をプロテアーゼ阻害剤および5グリセロールを含有する25mMHEPES溶液中で超音波破砕した。細胞溶解物を2回遠心分離した。次いでHisタグをつけたタンパク質を、コバルトをのせた5mlのHiTrapキレーティングカラムを用いて親和性精製した。イミダゾールの直線勾配を用いる溶出の間にいくつかのフラクションを回収した。タンパク質に富むフラクションを、10kDaカットオフのセントリプレップAmiconシステムを用いて濃縮した。最後に得られたサンプルをSuperdex75PGHiLoad2660カラムでの排除クロマトグラフィーにより精製した。回収したフラクションをSDSPAGEに付した。選択したタンパク質フラクションを濃縮して25mMHEPESおよび20グリセロールの溶液に対して透析した。インビトロ切断アッセイ単一のメガヌクレアーゼDNA標的切断部位を有するpGEMプラスミドを、まずXmnIを用いて直線化した。切断アッセイを37°Cまたは65°Cで125mMHEPES、25グリセロールおよび10mMMgCl2の中で行なった。反応を01容量の01MTrisHCl、025MEDTA、5SDSおよび05mgmlのプロテイナーゼKの添加および37°Cで20分間のインキュベーションにより停止した。反応産物を、1アガロースゲルでの電気泳動による分離の後に調べた。酵母比色アッセイ酵母の形質転換法を、以前のプロトコルから適合させた。染色には、伝統的な定性のXGalアガロースオーバーレイアッセイを用いた。各プレートを、60°Cで01M燐酸ナトリウムバッファー、pH70、02SDS、12ジメチルホルムアミド、14mMβメルカプトエタノール、04XGal中の1アガロース25mlで被覆した。プレートを37°Cでインキュベーションした。哺乳動物細胞アッセイCOS細胞を、Superfectトランスフェクション試薬を用いて、供給業者のプロトコルに従ってトランスフェクションした。トランスフェクションの72時間後、細胞をPBS1Xで2回リンスし、溶解バッファー中でインキュベーションした。溶解物を遠心分離し、上清をタンパク質濃度測定およびβガラクトシダーゼ液体アッセイに用いた。典型的に、抽出物30μlを3μlのMg100Xバッファー、33μlのONPG8mgmlおよび234μlのリン酸ナトリウム01MpH75と合わせた。37°Cでのインキュベーション後、反応を500μlの1MNa2CO3で停止してODを415nmで測定した。相対的なβガラクトシダーゼ活性を、このODの関数として測定し、反応時間およびタンパク質の全量で標準化する。-結果:単鎖ICreIはそのDNA基質をインビトロおよび生細胞内で切断する新規な酵素に対応する合成遺伝子をつくり、scICreIタンパク質をEcoliで過剰発現させた。精製scICreIのインビトロでDNA基質を切断する能力を、ICreIホーミング部位のコピーを有する直線化したプラスミドを用いて試験した。親のICreIと同様に、新規な酵素はICreI標的部位を37°Cで切断する。インビボでのscICreIの機能性を試験するために、酵母および哺乳動物細胞でのメガヌクレアーゼにより誘導された相同的組換えをモニターするためのアッセイを設計した。酵母、ツメガエルの卵母細胞および哺乳動物細胞においては、2つの直列反復の間のDNA切断が、これらの反復の間の相同的組換えを非常に高レベルで誘導することが知られている。単鎖アニーリングとしばしばよばれる組換え経路は、1つの反復ユニットおよび全ての介在配列を除去する。つまり、細菌のLacZ遺伝子の2つの短縮された非機能的コピーおよび介在配列内のICreI切断部位を有するSSAレポーターベクターを、酵母複製プラスミド内で構築した。切断部位の切断は、Xgal染色により簡単に検出され得る機能的なユニークLacZコピーをもたらすはずである。レポーターベクターを酵母細胞を形質転換するのに用いた。細胞のわずかのフラクションが機能性LacZを発現したようであり、これはおそらく形質転換の間の組換え事象による。これに比べて、ICreIまたはscICreIのいずれかを発現するプラスミドとの共形質転換は、プレートに播種した全ての細胞に青色の染色をもたらした。非誘導条件の下でさえも、タンパク質の残存レベルはSSAを誘導するのに充分であり、このことは、scICreIが、ICreIと同程度に、酵母細胞内で非常に有効であることを示唆する。さらに、SSA誘導はICreIタンパク質による標的切断部位の切断に完全に依存した。なぜなら、この部位を欠くベクターはバックグラウンドのレベルに比べてβガラクトシダーゼ活性の増加がないからである。SSAアッセイを、哺乳動物細胞での試験のために改変した。レポーターおよびメガヌクレアーゼ発現プラスミドのプロモーター配列と終結配列を変更して、プラスミド組換えを一過性トランスフェクションアッセイにおいて評価した。scICreIまたはICreIのいずれかを用いて、同様のレベルの組換えの誘導が観察された。酵母での実験のように、ICreI切断部位がないとβガラクトシダーゼの増加がないので、組換えは反復の間のICreI切断部位に依存する。逆方向反復の間の組換えに基づく別の組換えアッセイも、COS細胞でのメガヌクレアーゼに誘導される組換えをモニターするために用いた。直列反復がSSAにより組換え可能であるので、間接反復の間の相同的組換えは遺伝子変換事象を必要とする。遺伝子変換の同様の刺激が、scICreIまたはICreIのいずれかを用いて観察された。真の相同的組換え事象に予想されるように、相同の供与体鋳型の不在下では増強が観察されなかった。実施例2:HIV2標的のためのICreIホーミングエンドヌクレアーゼに由来するカスタムメイドメガヌクレアーゼ-ICreI変異型のファージディスプレイライブラリの構築特異性が変化した新規なメガヌクレアーゼを作るために、DNA結合残基を置換するICreIホーミングエンドヌクレアーゼの突然変異誘発によりコンビナトリアルライブラリを構築した。次いで、選択およびスクリーニングの適用により、特定の選択されたDNA標的に結合し得る変異型を発見することができた。ファーディスプレイについて、ICreIはホモダイマーであるので、2つの別個のICreIタンパク質をエンコードするファージミドベクターが必要であった。2つのICreIコピーのうちの1つのみを突然変異させた。ファージディスプレイフォーマットで得られたタンパク質ライブラリは、ICreI野生型変異体へテロダイマーを含んだ。DNA標的部位内の単一の半分の部位のほとんどの塩基との特異的相互作用可能な8残基を選択した。我々のコンビナトリアルライブラリは、8つの対応するコドンをユニーク縮重VVKコドンで置換することにより得た。結局、タンパク質ライブラリ中の変異体は、8つの残基の位置でVVKコドンによりエンコードされる12アミノ酸のいずれの独立した組み合わせに対応した。ゆえに、タンパク質ライブラリの最大の多様性は、128または429×108であった。-ライブラリの構築まず、R68およびR70により溶媒から遮蔽されている残基D75をNに変異させた。これは、ライブラリにおけるこれらの2つの塩基性残基の置換によりもたらされるエネルギーのひずみのようなものを除くためである。変異型D75Nのホモダイマーは、ICreIホーミング部位を切断することが示された。次いで、野生型ICreIをエンコードするファージミドベクターをつくり、ファージコードタンパク質p3に融合されたD75N変異体およびファージディスプレイ野生型D75Nヘテロダイマーは、その標的DNAに結合することが示された。次に、中ぐらいのサイズの2つの媒介物のライブラリをつくった:Lib1およびLib2。所望の突然変異の組み合わせを有するDNA断片は、縮重プライマーおよびDNA鋳型としてD75N遺伝子を用いるPCRにより得られた。Lib1およびLib2は、特定の制限酵素を用いて消化した対応するPCR産物を、ファージミドベクター内およびpET発現ベクター内のD75N変異遺伝子中にそれぞれライゲーションすることにより構築した。ベクターおよび挿入DNAの消化は2つの工程で行い、これらの工程の間にDNAサンプルを抽出し、EtOH沈殿させた。消化されたベクターDNA10μgを、挿入DNAの5:1の超過でライゲーションに用いた。EcoliTG1細胞は、得られたベクターを用いてエレクトロポレーションにより形質転換した。いずれのライブラリの理論的多様性を越えるいくつかの細胞クローンを製造するために、Lib1ライゲーションサンプルの35回までのエレクトロポレーションおよびLib2ライゲーションサンプルの4回のエレクトロポレーションが必要であった。4×106および6×104のクローンをLib1およびLib2についてそれぞれ得た。最後に、Lib1およびLib2細菌クローンをプレートからかきとり、対応するプラスミドベクターを抽出して精製した。次いで完全なライブラリを、Lib2ベクターの断片をLib1ファージミドベクター中にサブクローニングすることにより得た。DNA2工程消化、脱リン酸化、精製、定量、ライゲーションおよびエレクトロポレーションのサイクルを数回行なった。150エレクトロポレーションショットの4回目の後に、55×107細菌クローンを得た。細菌をかきとり、グリセロールストックとして貯蔵した。さらに、このグリセロールストックの一定量を、200mlの培養に植菌するために用い、ライブラリベクターを、貯蔵および可能性のあるサブクローニングのためにこの培養から抽出して精製した。-材料および方法タンパク質の発現および精製Hisタグをつけたタンパク質を、pET24dベクターを用いてEcoliBL21細胞において過剰発現させた。IPTGを用いる誘導を15°Cで5晩にわたって行なった。細胞を、プロテアーゼ阻害剤およびDNaseIヌクレアーゼを含むBPer溶液中に1時間、4°Cで破砕した。あるいは、細胞を、プロテアーゼ阻害剤および5グリセロールを含む25mMHEPESの溶液中で超音波破砕した。細胞溶解物を2回遠心分離した。次いでHisタグをつけたタンパク質を、コバルトをのせたHiTrapキレーティングカラム1mlを用いて親和性精製した。イミダゾールの直線勾配を用いる溶出の間にいくつかのフラクションを回収した。タンパク質に富むフラクションを、10kDaカットオフのセントリプレップAmiconシステムを用いて濃縮した。最後に、得られたサンプルをSuperdex75PGHiLoad2660カラムでの排除クロマトグラフィーにより精製した。回収したフラクションをSDSPAGEに付した。選択したタンパク質フラクションを濃縮して25mMHEPESおよび20グリセロールの溶液に対して透析した。インビトロ切断アッセイ単一のメガヌクレアーゼDNA標的切断部位を有するpGEMプラスミドを、まずXmnIを用いて直線化した。切断アッセイを37°Cで125mMHEPES、25グリセロールおよび10mMMgCl2の中で行なった。反応を01容量の01MTrisHCl、025MEDTA、5SDSおよび05mgmlのプロテイナーゼKの添加および37°Cで20分間のインキュベーションにより停止した。反応産物を、1アガロースゲルでの電気泳動による分離の後に調べた。ファージミド構築ICreID75Nヘテロダイマーのファージディスプレイを、プロモーターpLacの調節下で、バイシストロンとして2つの異なるORFを有するファージミドを用いることにより得た。最初の1つは、N末端シグナル配列に融合された可溶性タンパク質を産生し、これが生成物をEcoliのペリプラズム空間に指向させる。遺伝子1CreIWTを制限酵素ApaLIおよびAscIを用いてこのORFにクローニングした。D75NドメインをNcoIおよびEagI制限酵素を用いて第二のORFにクローニングして、6Hisタグ、CMycタグおよびアンバー停止コドンを介するファージコートタンパク質p3との融合体に導く。この最終のファージミドはpCes1CreTとよばれる。TG1またはXL1blueのような抑制株において、およびヘルパーファージによる感染の後に、D75Np3融合体はファージコートタンパク質に組み込まれ、同じ区画で生成される可溶性ICreIモノマーは、ダイマー化するかまたはディスプレイされたD75Nドメインと相互作用するかのいずれかにより、ICreIWTD75Nヘテロダイマーをディスプレイする粒子を産生する。ファージ生成100μgmlのアンピシリンおよび2グルコースを含む2xTYの5mLの培養液に、ファージミドpCes1CreTを含む細菌の一晩培養物の1100希釈物を植菌し、37°Cで攪拌した。OD600が05のとき、ファージヘルパーM13K07を、20:1のファージ:細菌比で加えた。攪拌せずに37°Cで30分経過後、培養物を4000rpmで10分間遠心分離し、ペレットを100μgmLのアンピシリンおよび25μgmLのカナマイシンを含む2xTY25mlに再懸濁し、30°Cで一晩攪拌した。培養物を遠心分離し、上清をそのままファージELISAに用いた。ファージELISAマイクロタイタープレートを、PBS中の2μgmLのビオチン化BSA100μlウェルを用いて37°Cで1時間コートした。01Tween20を含むPBS中での数回の洗浄の後、ウェルをPBS中の10μgmLのストレプトアビジン100μlウェルを用いてインキュベートし、RTで1時間インキュベートした。プレートをさらに洗浄して、PBS中に250pMの標的部位を有するビオチン化PCR断片とインキュベートした。RTで1時間のインキュベーションの後、プレートを、3粉ミルクおよび25mMCaCl2を含むPBS200μlウェルと飽和させた。PMCを捨て、プレートをPMC80μlおよびファージ粒子を含む培養上清20μlウェルで満たした。RTで1時間のインキュベーションの後、プレートをPBSTで広範に洗浄し、PMC中に15000に希釈した抗25M13HRPコンジュゲート抗体100μlウェルとインキュベートした。プレートをRTで1時間インキュベートし、洗浄し、TMB溶液とインキュベートした。反応を50μlウェルの1MH2SO4でブロックした。プレートを450nmで読み取った。バックグラウンドの3倍より高いシグナルを陽性とみなすことができる。PCRベースの突然変異誘発遺伝子ICreID75Nを含むプラスミドpET24T45を、PCRの鋳型として用いるために、1ngμlで希釈した。所望のランダム化をエンコードする縮重オリゴヌクレオチドを用いて、挿入断片当たり4×50μlのPCR反応においてPCR断片Lib1およびLib2を増幅した。PCR産物をプールし、EtOH沈殿させ、50μlの10mMTris中に再懸濁した。DNA消化全ての酵素および対応するバッファーはNEBiolabsからであった。10μgまでのDNAの消化を、100Uまでの第一の制限酵素を用いて、37°Cで150~500μlの最終反応容積で行った。2~6時間後に、消化したDNAをフェノール抽出してEtOH沈殿させた。消化基質および産物を、アガロースゲル電気泳動を用いて分離し、所望の産物をゲルから抽出して精製した。PCR挿入断片については、消化産物をNucleospinカラムで直接精製した。次いで、第二の消化を同じ条件で行なった。この第二の消化反応の最後に、01容量の1OXCAPバッファーおよび05μlのCAPを消化したベクターに加え、サンプルをさらに30分間、37°Cでインキュベートした。最後に、消化して脱リン酸化したDNAをフェノール抽出し、EtOH沈殿させて10mMTrispH830μl中に再懸濁した。最終のDNA濃度を、電気泳動の後のアガロースゲルでのバンドの強度の比較により見積もった。ライゲーション大規模ライゲーションを16°Cで、200μl反応容積中で、消化したベクター1400ngおよび5:1モル超過の消化したものならびに4000UのT4DNAリガーゼを用いて行なった。ライゲーションの後、反応サンプルを65°Cで20分間インキュベートしてリガーゼを不活性化した。ベクターDNAは、最後にEtOH沈殿させ、25ngμlの10mMTrispH8中に再懸濁した。エレクトロポレーション自家製のエレクトロコンポーネント細胞TG140μlを、2mmのキュベット中にライゲーションしたDNA25ngと混合した。氷上で1分経過後、細胞をパルスし、2xTY2グルコース1mlに直ちに再懸濁した。細胞を37°Cで1時間、攪拌下におき、次いでアンピシリンまたはカナマイシンおよび2グルコースを含む2xTYの大きいプレートにおいて、30°Cで一晩インキュベートした。一定量を2xTY中に希釈し、2xTYアンピシリングルコースの小さいプレートにおいて、単離されたコロニーを得たが、このコロニーはライブラリの多様性の算出および制限分析によるいくつかのクローンの特徴づけを可能にする。-ファージディスプレイを用いるICreI変異型のライブラリからのHIV2由来DNA標的へのメガヌクレアーゼの結合の選択およびスクリーニングこのプロジェクトの目的は、HIV2のゲノムで見出された配列を切断可能なメガヌクレアーゼを得ることであった。ホーミングエンドヌクレアーゼICreIを骨格として用いて、1つのICreIモノマーのDNA結合界面に位置する8残基のランダム化による108の変異型のライブラリを構築した。このライブラリを、HIV2に由来する標的を有するビオチン化DNA断片を用いる数回の選択/増幅により結合物について濃縮した。続いて、選択された標的をファージELISAを用いて結合についてスクリーニングした。-材料および方法ファージミドフォーマットpCeslベースのファージミドを選択した。このプラスミドは、プロモーターpLacの調節下で、バイシストロンとして2つの異なるORFを有した。最初の1つは、N末端シグナル配列に融合された可溶性タンパク質を産生し、これが生成物をEcoliのペリプラズム空間に指向させる。我々の場合、この第一の産物がICreIの野生型モノマーであった。第二のORFは、6Hisタグ、CMycタグおよびアンバー停止コドンを介してファージコートタンパク質p3と融合したICreIモノマーをエンコードした。TG1またはXL1blueのような抑制株において、およびヘルパーファージによる感染の後に、このファージミドを有する細菌はファージ粒子を産生し、それらの約1~10はそれらの表面上で組換えタンパク質をディスプレイする。p3に融合され、DNA結合界面についてランダム化されたモノマーをファージコート中に組込み、可溶性ICreIモノマーが、同じ区画内で、ダイマー化するかまたはディスプレイされたモノマーと相互作用して産生され、それによりICreIホモダイマーをディスプレイする粒子を産生した。標的産生所望の配列をエンコードするが3に余分のアデノシンを有する2つの相補的プライマーをアニールして、pGEMtEasyにライゲーションした。配列決定の後、正しいクローンを、ビオチン化200pb断片をキットKODならびにプライマーSP6およびbiotT7を用いてPCR増幅するための鋳型として選択した。PCR産物の濃度をゲル上で見積もり、断片をそのままELISAまたは選択手順において用いた。ファージミドライブラリのレスキューライブラリの標本の一定量を用いて、100μgmlのアンピシリンおよび2グルコースを含む2xTY50mlに植菌し、培養物を37°Cで攪拌した。05のOD600で、この培養物5mlにヘルパーファージK07を20:1のファージ:細菌の比で感染させ、攪拌せずに37°Cで30分間インキュベートした。室温にて4000rpmで10分間遠心分離した後、ペレットを100μgmlのアンピシリンおよび25μgmlのカナマイシンを含む2xTY25mlに再懸濁して、30°Cで一晩攪拌した。培養物を4°Cにて4000rpmで20分間遠心分離し、ファージ粒子を、02容量の20PEG600025MNaClを氷上で1時間添加することにより沈殿させた。4°Cにて4000rpmで20分間遠心分離した後、ファージのペレットをPBS1mlに再懸濁し、1000rpmで5分間遠心分離した。上清に02容量の20PEG600025MNaClを加え、混合物を10000rpmで遠心分離してファージ粒子をペレット化した。粒子を最後にPBS250μl中に再懸濁した。選択手順ファージ粒子を、3乾燥ミルクおよび25mMCaClを含むPBS1ml中に希釈し、RTで1時間インキュベートした。100pIストレプトアビジンビーズをPMC中に3回洗浄し、同じバッファー中に1時間ブロックした。ビオチン化された標的を、示された濃度でファージに添加し、混合物をRTで1時間攪拌した。ビーズを混合物に添加し、RTで15分間インキュベートした。ビーズをバイアルの壁上で磁石を用いて回収し、01Tweenを含むPMC中で10回洗浄した。PBS中での最後の洗浄の後、ビーズを100mMのトリエタノールアミンpH1205ml中に再懸濁し、ちょうど10分間インキュベートした。上清を回収し、1MTrispH805mlで直ちに中和した。この溶出物の一定量を、タイトレーションのために2xTY4mlで段階的に希釈した。指数関数的に増殖するTG1細胞5mlを加え、混合物を攪拌せずに37°Cで30分間インキュベーションした。細胞を2TYAGの大きいプレート上におき、30°Cで一晩インキュベーションした。コロニーを2TYAG中に再懸濁し、OD600を100に調整し、15グリセロールの添加後に-80°Cで保存した。ファージELISAによるスクリーニング選択アウトプットからの単離されたコロニーを楊枝でついて96ウェルプレート中の2TYAG100μlに入れ、37°Cで一晩攪拌した。次の日、2TYAG100μlを含む新しいプレートをトランスファー装置を用いて分離した。滅菌60グリセロール50μlを一晩インキュベートしたプレートに加え、このマスタープレートを-80°Cで保存した。新しいプレートを37°Cで25時間攪拌し、2×109pfuのヘルパーファージM13K07を含む2TYAGの添加によりレスキューし、30°Cで30分間インキュベーションし、1700rpmで15分間スピンした。細胞のペレットを2TYAK150μl中に再懸濁し、30°Cで一晩攪拌した。遠心分離後、上清20μlを前の節で記載したようにして用いた。-結果選択ICreI変異型をディスプレイするファージ粒子を、ファージミドライブラリを有する細菌をヘルパーファージM13KO7で感染させることにより産生した。ファージ粒子をPEG沈殿により精製し、HIV6335標的を有するビオチン化PCR断片とインキュベーションした。室温で1時間のインキュベーションの後、ストレプトアビジンでコートした磁気ビーズを溶液に添加して、ビオチン化DNAおよび結合したファージを回収した。ビーズを充分に洗浄し、結合したファージをpHショックにより溶出させた。細菌を溶出させたファージで感染させ、アンピシリンおよび2グルコースを含む2xTYの大きいプレート上においた。溶出させたファージの一定量の段階希釈を用いて細菌に感染させ、ファージ粒子の数を算出して単離されたコロニーを得た。1日後、細菌を大きいプレートからかきとり、グリセロールストックとして保存した。一定量を用いて、選択の第2回目のためのファージ粒子の新しいバッチを作製した。選択の強度は、各回の後に増加させた。第一の選択を、ビオチン化標的10nMを用いて行なった。第二を400pMを用いて行ない、洗浄工程を延長した。第三回目は250pMを用い、洗浄をより延長した。表1に示すように、HIV2標的に対する第1回目および第2回目の選択は、バックグラウンドの値に特徴的なアウトプット力価に導く。しかしながら、第3回目では有意な濃縮が測定された。ファージELISAによるスクリーニング各アウトプットから無作為に採取した80のクローンおよび選択されなかったクローンを用いて、モノクローナルの様式でICreI変異型をディスプレイするファージ粒子を生成した。ファージ粒子を含む上清を、ストレプトアビジンを介してプラスチック上に固定化されたビオチン化PCR断片上でインキュベートした。結合したファージを、HRP標識抗p8モノクローナル抗体を用いて染色した。表2に示すように、選択されなかったクローンの中からまたは選択の第1回目のアウトプットから結合物は検出されなかった。しかしながら、第2回目の後に採取されたクローンの60は、H6335に対して陽性であるが、無関係な標的に対しては陰性である。この結果は、アウトプット力価とよく一致している。実際に、この選択は温和な濃縮をもたらすだけであり、このことはクローンの多数がまだバックグラウンドから生じることを示唆する。予期されたように、選択の第3回目は強い結合物の99を導き、このことはこの第3の選択の後のアウトプットファージが多数であることを説明する。ファージディスプレイを用いて、新規なメガヌクレアーゼをICreI変異型の大きいライブラリから選択する。ビオチン化DNA標的での選択は、DNA標的に結合できる分子の濃縮に特徴的なアウトプット力価の増加を導く。この濃縮は、ファージELISAにより確認された。これらの結果は、選択およびスクリーニング法の効率を証明する。新規なメガヌクレアーゼを同定するための酵母での選択/スクリーニング実験材料および方法細菌株および酵母株全てのサブクローニングおよびプラスミド調製は、Stratageneにより提供されるXLIblue:Ecoliで標準の手順に従って行う。Scerevisiaeでの実験は、次の株を用いて行う:FYC26A:アルファtrp1Δ63leu2Δ1his3Δ200FYBL27B:aura3Δ851trp1Δ63leu2Δ1lys2Δ202YASP3:アルファura3SSAura3HIV2KanRade2SSAade2HIV2TRP1trp1Δ63leu2Δhis3Δ200プラスミドpCLS0279:ADH1プロモーター、TRP1選択マーカーおよびARSCEN複製起点、βガラクトシダーゼSSA標的、HIV26335切断部位。pCLS0569:カナマイシン耐性カセット、HIV26335、URA3遺伝子の内部断片。pCLS0570:カナマイシン耐性カセット、HIV26335、LYS2遺伝子の内部断片。pCLS0576:TRP1選択マーカー、HIV26335、ADE2遺伝子の内部断片。pCLS0047:ガラクトース誘導プロモーター、LEU2選択マーカーおよび2ミクロン複製起点。結果特定の標的に対する検出可能な活性を有する突然変異誘発したICreIタンパク質変異型のスクリーニングを許容する、酵母でのインビボアッセイを行った。変異ICreIメガヌクレアーゼのライブラリを、まずファージディスプレイ法により選択し、HIV26335標的に結合し得る対象の変異型について濃縮されたサブライブラリを得る。この濃縮されたサブライブラリからの挿入断片を、酵母でのさらなる選択のためにガラクトース誘導プロモーターの調節の下のpCLS0047にサブクローニングする。しかしながら、我々は適切な酵母発現ベクターにおいて直接ライブラリを製造し、ファージディスプレイの工程を除くことができる。染色体に組み込まれた2つのレポーター系を含む特定の酵母株を製造した。これらの2つのレポーター系は、単鎖アニーリングによる組換えに基づく。SSAは、HIV26335部位の特異的切断により誘導される。すなわち、URA3SSA標的およびADE2SSA標的を導入した。URA3SSA標的は、43kbにより分けられた600塩基対の2つの直列反復を有する改変されたura3遺伝子であった。この株は、ウラシルを欠く最少培地では増殖できないが、G418耐性であった。この標的が適切に切断されて組み換えられたとき、酵母はウラシルを含まない培地で増殖でき、G418感受性であった。ADE2SSA標的は、36kbにより分けられた11kbの2つの直列反復を有する改変されたade2遺伝子であった。この変異されたade2遺伝子により、酵母株はアデニンを欠く最少培地上で増殖できないが、アデニン含量が低い培地上で赤色を有した。トリプトファン選択マーカーにより、この株はトリプトファンを含まない最少培地上で増殖できた。この標的が適切に切断されて組み換えられたとき、酵母は白色で、アデニンを含まない培地上で増殖できかつトリプトファンを欠く最少培地上で増殖できなかった。基本的に、受容酵母株は赤色で、G418耐性で、トリプトファン原栄養性でかつウラシルおよびアデニンについて栄養要求性であった。特定のメガヌクレアーゼがこの株で発現され、その標的部位を切断すると、得られる酵母クローンは白色で、G418感受性で、トリプトファンについて原栄養性でかつウラシルおよびアデニンについて栄養要求性である。YASP3株は、各標的単独の自発的組換えおよび両方の標的を一緒にした自発的組換えのレベルを測定することにより、確認した。URA3SSA10標的は、ウラシル原栄養性、約6104の割合でG418感受性として自発的に組み換えた。ADE2SSA標的は、約27103の割合でアデニン原栄養性として自発的に組み換えた。両方のマーカーの組み換えは、約106の割合で自発的に起こった。ウラシルエルアデニン原栄養体のバックグラウンドレベルを示さなかった形質転換体15x10を用いるパイロット実験は、約100万の独立したクローンを産生するであろうライブラリを用いた形質転換実験の後に擬陽性クローンの数が10未満であるはずであることを意味する。ライブラリをYASP3を形質転換するのに用いる。通常、DNA1pg当たり106の独立した形質転換体を与える伝統的な化学/熱ショックプロトコルを用いた。酢酸リチウム/一本鎖キャリアDNA/ポリエチレングリコール法による酵母の形質転換。該ライブラリを用いる菌株の形質転換は、106より多い独立した酵母形質転換体を与え、これらの中からいくつかのクローンがウラシル、ロイシンを含まず、炭素源としてのガラクトースおよび少量のアデニンを含む選択培地上で増殖可能である。これらのクローンのうち、対象のものは白く、これらがHIV26335部位に特異的なメガヌクレアーゼの発現を許容するLEU2ベクターを含みかつ酵素がURA3レポーターおよびADE2レポーターの両方を切断できることを示す。陽性のクローンを単離し、プラスミドのSSAβガラクトシダーゼ標的の特異的組換えを誘導するそれらの能力についてスクリーニングした。このプラスミド性レポーターは、13kbにより分けられた825塩基対の2つの直列反復を有する改変されたLacZ遺伝子であった。ベクターを用いて酵母株を形質転換し、クローンを、ウラシルを欠く最少培地35で維持して、未組換えのLacZ標的を維持する。選択実験から得られた酵母クローンを、SSAβガラクトシダーゼ標的を含む酵母株とかけ合わせる。2倍体を選択し、誘導されたβガラクトシダーゼ活性についてアッセイする。いくつかのクローンは、この工程で擬陽性としてふるまうことが予想される。これらはURA3およびADE2SSA標的の自発的組換えのバックグラウンドのレベルに対応する。全ての残りのクローンは、インビボでHIV26335標的を切断するメガヌクレアーゼを発現する真の陽性である。上記の実験に基づく他の実験も、このような新規な酵素の活性をより精密に測定するのに用いることができる。実施例3:抗ウイルス治療のためのメガヌクレアーゼの使用-実験手順細胞AmericanTypeCultureCollectionからのCOS7細胞株を、10ウシ胎児血清を含むDMEMで培養した。ATCCからのPC12細胞は、10熱失活ウマ血清および5熱失活ウシ胎児血清を補ったRPMI1640で増殖した。PC12細胞を、以前に記載されたようにして分化させた。簡単に、細胞を6ウェルプレートにウェル当たり5104細胞で播種した。次の日、細胞を100ngmlの25SNGFを含むPC12培地でインキュベートした。培地は3日毎に変えた。インキュベーションの7日後、未分化細胞を2μMのフルオロデオキシウリジンの添加により除去した。組換えHSV1の構築HSV1はATCCから購入した。ウイルスを低MOIでCOS7細胞で増殖させた。組換えウイルスを、以前に記載されたようにして得た。46KbのpstIbamHIウイルスゲノムDNA断片をpUC19にクローニングした。データベースからのHSV1配列に基づくと、この領域はヌクレオチド118867~123460を表す。Lac遺伝子の発現を駆動するCMVプロモーターからなるカセットを168bpのHpaI欠失に導入した。この領域は、HSV1の主要LAT遺伝子座の中に位置する。ISceI切断部位を、最終的に、CMVプロモーターのすぐ後にクローニングした。この構築物を組換えウイルスを作製するのに用いた。プラスミドはXmnI消化により直線化し、このプラスミドDNA2μgを、COS7感染細胞からCaCl2法により調製したHSV1ゲノムDNA15μgと共トランスフェクションさせた。3または4日後、感染した細胞を回収して超音波破砕した。溶解した細胞の一定量を用いてCOS単層を感染させた。ウイルス組換え体を、COS単層に300μgmlのXGalを含む培地中の1アガロースをオーバーレイすることにより選択した。青いクローンを採取し、3回のプラーク精製にさらに付した。ISceI部位の存在をPCRおよびインビトロISceI酵素消化により確認した。ウイルス阻害6ウェルプレートにウェル当たり2104細胞を播種した。次の日、COS7細胞をISceIを発現するかまたはISceIORFを逆方向に含むプラスミド05μgを用いて製造業者のプロトコルに従うEFFECTENE法によりトランスフェクションした。この方法を用いて、我々の実験室では、通常、60~70の効率を達成した。48時間後、亜集密なトランスフェクションされた細胞をrHSV1を用いて感染させた。感染には、rHSV1を1ウシ胎児血清を含むPBSで希釈し、5CO2の湿性インキュベーター中に37°Cで20~40分間細胞に吸着させた。それぞれウイルス阻害実験または細胞生存実験のために、6ウェルのプレートにウェル当たり30~300PFUで感染させた。細胞を第1、2および3日に回収し、βガラクトシダーゼ活性を分析してDNAを抽出した。βガラクトシダーゼ活性細胞単層を、1mMMgCl2を含む100mMPBS中の05グルタルアルデヒド中に4°Cで10分間固定した。洗剤溶液で1回洗浄後、細胞を37°CでXGal染色溶液63H2O、33mMK3Fe6、01XGal中で発色するまでインキュベートした。βガラクトシダーゼ活性を細胞抽出液についても基質としてoニトロフェニルβDガラクトピラノシドを用いて測定した。細胞単層をPBSで1回洗浄した。次いで、細胞を10mMTrispH75、150mMNaCl、1TritonX100、プロテアーゼ阻害剤を用いて溶解した。氷上で30分間のインキュベーションの後、細胞溶解物を遠心分離してβガラクトシダーゼをアッセイした。典型的には、上清30μlを800μgmlONPG含有反応バッファー270μlと合わせた。反応を37°Cで行い、1MNaCO305mlで停止した。吸光度を415nmで測定した。βガラクトシダーゼ活性は、タンパク質濃度およびインキュベーション時間について標準化した相対単位として算出する。半定量PCRrHSV1のウイルス複製を測定するために、オリゴヌクレオチドを設計してLac遺伝子から217bpの断片を増幅した。このアッセイにおいて用いた標準DNAは、この断片をBluescriptプラスミドにクローニングし、5オリゴヌクレオチドの下流に50bpの断片を挿入することにより作製した。標準物のPCRにより267bpのアンプリコンを産生した。一連のPCRを行なって標準およびDNAサンプルの量ならびにサイクル数を固定して増幅の直線的な応答を達成した。基本的な半定量的PCRを、全容量30μl中に、各プライマー20pmolおよびDNA180pgとともにREADYMIXTAQを用いて行なった。チューブを94°Cで4分間加熱し、22サイクル:94°Cで1分、62°Cで50秒、72°Cで2分および72°Cで7分に付した。ウイルス力価ある一連の実験において、培養液を第1、2、3および4日の毎日回収し、新しい培地を加えた。別の実験において、実験の間に培地を交換せず、一定量を毎日回収した。HSV1の子孫の放出を監視するために、培地の一定量を標準プラークアッセイによりCOS7細胞に対して力価測定した。-結果ウイルス複製に対するISceIの影響を、ISceI制限部位を有する組換え単純ヘルペスウイルスを用いて調べた。簡単に、rHSV1を、Lac遺伝子を駆動するCMVプロモーターを含むカセットを用いて構築した。ISceI部位をCMVプロモーターとLac遺伝子との接合部に挿入した。発現カセットを、主要LAT遺伝子座における相同的組換えによりクローニングしたが、該遺伝子座はCOS7細胞単層における溶菌感染の間にβガラクトシダーゼの発現を許容した。ウイルス感染前のISceI発現ベクターのストリンキングトランスフェクションは、XGalの呈色により示されるようにCOS細胞でのHSV1プラーク形成を実質的に完全に阻害した。これに対して、いずれの機能的転写も許容しない、ISceIオープンリーディングフレームを逆方向に含む発現ベクターを用いたコントロールトランスフェクションは、ウイルス複製に影響しなかった。さらに、感染の48時間後、細胞をISceI発現について調べた。ISceI発現ベクターでトランスフェクションされた細胞単層において形成された全ての溶菌プラークは、ISceIを発現しなかった細胞を表した。しかしながら、溶菌プラークの周囲のISceIを発現する細胞は、ウイルスの増殖を阻害した。ISceIの影響は、細胞溶解物中のβガラクトシダーゼ活性を測定することにより確認された。ウェル当たり30Pfuを用いるISceIを一過的に発現するCOS7細胞単層の感染の後、細胞単層を感染後第1、2および3日に回収してβgalをアッセイした。図6Aは、rHSV1複製の阻害を反映して、βガラクトシダーゼ活性の大きな低下を示す。rHSV1感染の時間経過の間にわたるISceIの防御効果を、次に評価した。感染の3日後、ISceI発現ベクターでトランスフェクションされた細胞は細胞変性効果の徴候を示さなかったが、コントロールの培養物は、図6Bに示すように完全に溶解した。ISceIによるウイルスDNA複製の阻害の程度を定量するために、半定量的PCRを設定した。ゲノムDNAを、感染後第1、2および3日に細胞から抽出した。PCRを、Lac遺伝子で217bpのアンプリコンを発生するプライマーaおよびbを用いて行なった。内部標準をPCRの前にサンプルに添加してDNAを定量した。Lac遺伝子は、感染の3日後のISceIを発現する細胞において、実質的に検出できなかった。これに対して、ISceI発現ベクターを受容していない細胞は、高いレベルのウイルスDNAを示した。この結果は、ウイルスの内因性遺伝子内のプライマーを用いるPCRにより確認された。チミジンキナーゼ遺伝子の増幅は、ISceIがウイルスの複製を阻害したことを示した。最後に、活性ISceIまたは逆方向にISceIORFを発現するCOS7細胞にrHSV1を感染させ、異なる時間点で培地中に放出されたウイルスの濃度を、プラークアッセイにより測定した。ウイルスをISceIが産生された第1日に大ざっぱな配列で定量した。ウイルス産生は、ISceIを発現しなかった細胞と比較したときに、感染の2日後でさえかなり減少しており、このことはISceIがウイルス複製をかなり効率的に阻害したことを示した。この影響は、より少ない程度ではあるが、第3日にも確認された。おそらくウイルス複製の間に高い割合で起こる突然変異が、ISceI活性から逃れることができる変異HSV1の出現を許容した。ひとまとめにして考えると、これらの結果はISceI、より一般的にはメガヌクレアーゼをウイルス感染を阻害するのに用いることができることを証明する。特定のウイルスの配列を切断するように設計されたカスタムメイドメガヌクレアーゼまたはカスタムメイドメガヌクレアーゼの組み合わせの使用は、抗ウイルス療法の強力な新規のストラテジとなり得る。実施例4:ICreIホーミングエンドヌクレアーゼに由来する、変更された結合特性を有するメガヌクレアーゼこの実験の目的は、ICreIの天然の標的部位の近くの標的部位に結合する新規なメガヌクレアーゼを得ることであった。野生型で天然のICreI標的、実施例2で記載したHIV2標的およびさらなる4つの標的を含む一連の6つの標的を用いた。これらのさらなる4つの標的は、12bpの半分のICreIまたはHIV2標的部位の逆方向反復に対応する24bpのパリンドロームである。C1221およびC4334は、それぞれC1234標的の第一の半分および第二の半分の逆方向反復である。H1221およびH4334は、それぞれH1234標的の第一の半分および第二の半分の逆方向反復である。実施例2と比べて、ここで用いる方法はいずれの選択工程も含まないが、Lib2ライブラリの広範囲なスクリーニングに基づいた。DNA標的との塩基特異的相互作用が可能な3つの残基を選択した。3つの対応するコドンをユニーク縮重VVKコドンで置き換えることにより、コンビナトリアルライブラリを得た。結局、タンパク質ライブラリ中の変異体は、3つの残基の位置でVVKコドンによりエンコードされるいずれの12アミノ酸の独立した組み合わせに対応した。結果として、タンパク質ライブラリの最大限の多様性は123または1728であった。材料および方法ICreI変異型のファージディスプレイされたライブラリの構築まず、R68およびR70により溶媒から遮蔽される残基D75を、ライブラリ中のこれらの2つの塩基性残基の置換によりもたらされるエネルギーのひずみのようなものを除くために、Nに変異させた。突然変異型D75Nのホモダイマーは、ICreIホーミング部位を切断することが示された。次いで、ファージコートタンパク質p3に融合したD75N突然変異型をエンコードするファージミドベクターを作製し、ファージディスプレイされたD75Nモノマーは、ICreI天然DNA標的に結合することを示した。次いで、所望の変異の組み合わせを有するDNA断片を、縮合プライマーと、DNA鋳型としてD75N遺伝子とを用いてPCRにより得た。Lib2を、特異的制限酵素で消化した対応するPCR産物を実施例2に記載のようにしてファージミドベクター内のD75N変異遺伝子にライゲーションすることにより構築した。6つの異なる標的に結合するメガヌクレアーゼのスクリーニングスクリーニングは、実施例2に記載のようにしてファージELISAにより行なった。-結果4560クローンを個別に採取し、6つの異なる標的を用いてファージELISAによりスクリーニングした。28の陽性を同定した。確認のために、これらの28のクローンを6つの異なる標的を用いて8回並行してファージELISAにより再アッセイした。これにより、20のクローンが真の陽性であると確認された。最後に、28全てのクローンを配列決定した。4つの異なるパターンを確認することができた。図10は、それぞれについて1つの代表的な例を取り上げる。第一のクラスは、C1234、C1221、C4334およびH4334の強い結合に対応する。野生型タンパク質がこのクラスにおいて回収され、このことはクラスIのプロフィールが本来の骨格の規則的な結合プロフィールであることを示す。2つの変異型もこのような結合をディスプレイすることが示された。第二のクラスからの変異型は、H4334を除いて全ての標的についてそれらの親和性を低下させた。なぜなら、C1234、C1221およびC4334との結合が観察されなかったからである。8つの異なるタンパク質とその配列が決定できなかった1つのタンパク質がこのクラスに属することが見出された。クラスIIの配列変異型のうち、5つが野生型配列からのQ44アミノ酸および位置68または70の2つのアルギニンのうち1つを保存する。しかしながら、1つの変異体において、位置44、68および70からのアミノ酸のいずれも保存されていなかった。クラスIIIは、C1221およびH4334標的について明確な結合を保持しているので、より複雑なパターンを有する。最後に、1つのタンパク質は、標的C1221に対してわずかな結合を保持し、いずれの他の標的も全く結合しない。クラスIVから結論を導き出すのは困難である。なぜなら、C1221との残存結合は非常に低く、ユニークなクラスIV変異体の配列決定は失敗したからである。しかしながら、クラスIIおよびIIIとクラスIの野生型プロフィールとの比較は、結合特異性が変更されたことを明確に示す。結論は、Lib2のような小さいライブラリからであってさえも、変更された結合プロフィールを有する変異型は、図10に示すように単離することができることである。よって、より大きい変異体ライブラリから出発するスクリーニングに基づくストラテジは、例えば当初のタンパク質骨格が結合しなかった標的に対する結合のような、より劇的な変更の同定を許容するはずである。さらに、このアプローチは、各プロフィールについて多くの異なるタンパク質の同定を導く。この種類の広範囲の研究は、DNAメガヌクレアーゼ相互作用のよりよい理解の基礎ももたらすはずである。実施例5:酵母ライブラリにおける選択とスクリーニングの比較ここでの目的は、酵母でのスクリーニング法と選択法の比較である。スクリーニングはその所望の特性についての個体群の各個別のクローンの広範囲の検査であるが、選択は、濃縮工程である。当初のライブラリを選択プロセスに付し、所望の特性を有するクローンについて濃縮されたサブライブラリをもたらす。スクリーニングプロセスの処理量が非常に多数のクローンを加工するのに不充分であり得ることから、1回で非常に高い多様性を扱わなければならない場合に1または数回の選択工程が有用であり得る。しかし、選択はいくつかの予期しない偏りをもたらし、オペレータにより所望される特性とは別の特性の選択をもたらし得る。つまり、いずれの選択プロセスも注意深く確認することが非常に重要である。よって、酵母で特異的DNA標的を切断するメガヌクレアーゼを探索するために、選択方法およびスクリーニング方法を開発した。両者とも相同的組換えによる、より正確には単鎖アニーリングによる、酵母細胞内でのメガヌクレアーゼによるDNA標的の切断の間の特異的マーカーの産生に基づく。これらのアッセイの原理は、実施例2に記載される。選択は栄養要求性マーカーの回復に基づくが、スクリーニングは発色マーカーの回復に基づく。よって、小さいライブラリについて選択を用いておよび用いずに陽性として選択されたクローンを、選択方法が適するかを調べるために比較した。-材料および方法細菌株および酵母株全てのサブクローニングおよびプラスミド調製は、Stratageneにより提供されるXLIblue:Ecoliで標準の手順に従って行う。Scerevisiaeでの実験は、次の株を用いて行う:FYC26A:アルファtrp1Δ63leu2Δ1his3Δ200FYBL27B:aura3Δ851trp1Δ63leu2Δ1lys2Δ202YAP4およびYDD6:アルファlys2SSAura3cutICreIKanRade2SSAade2cutICreITRP1trp1Δ63leu2Δ1his3Δ200プラスミドpCLS050:ADH1プロモーター、TRP1選択マーカーおよびARSCEN複製起点、βガラクトシダーゼSSA標的、ICreI切断部位。pCLS0047:ガラクトース誘導プロモーター、LEU2選択マーカーおよび2ミクロン複製起点。-結果変異ICreIメガヌクレアーゼのライブラリ、すなわちLib2を酵母ベクター中に導入した。染色体に組み込まれた2つのレポーター系を有する2つの特異的酵母株を調製した。これらの2つのレポーター系は、単鎖アニーリングによる組換えに基づく。SSAは、ICreI部位の特異的切断により誘導される。すなわち、LYS2SSA標的およびADE2SSA標的を導入した。LYS2SSA標的は、43kbにより分けられた3240bp塩基対の2つの直列反復を有する改変されたlys2遺伝子であった。この株は、リジンを欠く最少培地上では増殖できなかったが、G418耐性であった。この標的がICreIの過剰発現の際に切断されて適切に組み換えられたとき、酵母はリジンを欠く培地上で増殖できず、G418感受性であった。ADE2SSA標的は、36kbにより分けられた11kbの2つの直列反復を有する改変されたade2遺伝子であった。この変異されたade2遺伝子により、酵母株はアデニンを欠く最少培地上で増殖できなかった。トリプトファン選択マーカーにより、これはトリプトファンを含まない最少培地上で増殖できた。この標的が切断されて適切に組み換えられたとき、酵母はアデニンを含まない培地上で増殖でき、トリプトファンを欠く最少培地上で増殖できなかった。基本的に、受容体酵母はG418耐性、トリプトファン原栄養性およびリジンとアデニンの両方の栄養要求性であった。この株で特異的メガヌクレアーゼが発現しかつICreI標的部位を切断すると、得られる酵母クローンはG418感受性、トリプトファン栄養要求性およびリジンとアデニンの原栄養性である。Lib2ライブラリを用いてYAP4およびYDD6を形質転換した。DNA1μgあたり106の独立した形質転換体を通常与える古典的な化学/熱ショックプロトコルを用いた。ライブラリを用いた株の形質転換は、106を超える独立した酵母形質転換体を、ロイシンを含まずかつ炭素源としてグルコースを含み少量のアデニンを含む選択培地上で与える。このようなクローンは、SSAβガラクトシダーゼ標的を含む酵母菌株と掛け合わせた後にスクリーニングすることができる。2倍体を選択し、誘導されたβガラクトシダーゼ活性についてアッセイした。2400の独立したクローンのスクリーニングは、15の陽性の同定をもたらした。これらのクローンからDNAを回収し、メガヌクレアーゼ発現プラスミドの回収のためにEcoliにエレクトロポレーションした。これらの15の陽性のそれぞれについて、2つのEcoliクローンを増幅して配列決定した。同じ陽性の酵母クローンから得られた2つのEcoliクローンの間に配列の違いは見られなかった。次いで、プラスミドを酵母YAP4またはYDD6株に再形質転換し、再びスクリーニングを行なった。このことにより、15の異なる酵母クローンについての一次スクリーニングの結果を確認した。次いで、選択工程を付加する以外は同じようにしてスクリーニング実験を行った。Lib2ライブラリをYDD6に形質転換し、細胞を、ロイシンを含まずかつ炭素源としてグルコースを含む選択培地上に播種した。3日間の増殖の後、コロニーを水中に再懸濁し、ロイシン、アデニンおよびリジンを含まずかつ炭素源としてガラクトースを含む選択培地上に播種した。960のクローンを得て、845を、SSAβガラクトシダーゼ標的を含む酵母菌株と掛け合わせた後に陽性としてスクリーニングした。これらのうち18を第2回目のスクリーニングにより確認した。これらの結果は、選択の単一のラウンドにおける濃縮の測定を与える。スクリーニングは、選択なしで2400クローンのうち15の陽性を与え、選択ありで960のうち845を与えたので、濃縮は140である。次いで、33の確認されたクローンを配列決定した。以下の表は、選択およびスクリーニングにより得られたクローンを示す。Lib2はICreIの残基Q44、R68およびR70の変異に起因するので、クローンは、位置44、68および70に存在するアミノ酸に対応する3文字により表される。例えば、野生型はQRRと表され、TRR変異体は位置44でグルタミンをスレオニンで置換した単独変異に対応する。選択の後に140の濃縮係数が観察されることから、明らかに選択プロセスは非常に有効である。陽性のうち、クローンTRRおよびQRAが、選択の有無のどちらも最も頻度が高い。4つの配列が単純なスクリーニングの後に見出され、選択の後には見られなかった。しかしながら、これらの差は統計的に有意ではない。選択の後に見出された845の陽性のうち18だけを配列決定し、より大きいサンプルの特性決定は、より異なる陽性変異型を同定するはずである。これらの結果は、Lib2のような小さいライブラリを用いて陽性を効率的に選択することはできるが、この選択系により導入され得る偏りはあったとしても非常に小さい。つまり、この選択法は、対象の変異型のためのより大きいライブラリを、例えばこれらのライブラリがスクリーニング法により完全に加工できない場合に、濃縮するのに用いることができる。この例においては、ICreI標的部位を切断する能力をまだ有する変異体を回収した。しかしながら、新規な標的を切断する変異体を全く同じ様式で得ることができる。実施例6:インビトロおよび哺乳動物細胞中でのそれらの切断特性に基づく活性メガヌクレアーゼのスクリーニング。この実験の目的は、活性および不活性なメガヌクレアーゼが、インビトロおよび哺乳動物細胞での単純なスクリーニングアッセイにおいて区別され得ることを証明することである。インビトロアッセイは制限アッセイに類似であり、哺乳動物細胞でのアッセイは切断誘導組換えに基づく。哺乳動物細胞における切断は、酵母におけるアッセイに類似である。切断誘導組換えは、機能的LacZレポーター遺伝子をもたらし、これは標準的な方法によりモニターすることができる。しかしながら、安定な複製プラスミドに依拠する酵母アッセイに比較して、細胞ベースのアッセイは一過性のマトリックスと働く。実施例4および5について、Lib2ライブラリを用いた。DNA標的と塩基特異的相互作用が可能な3つの残基を選択した。3つの対応するコドンをユニーク縮合VVKコドンで置換することにより、コンビナトリアルライブラリを得た。結局、タンパク質ライブラリ中の変異体は、3つの残基の位置でVVKコドンによりエンコードされる12アミノ酸のいずれの独立した組み合わせに対応した。ゆえに、タンパク質ライブラリの最大の多様性は123または1728であった。用いた標的は、天然のICreI標的であった。2000のクローンを別個に採取し、2つのスクリーニング法を用いて試験してこれらの方法の比較を確立した。次いで陽性を配列決定して分析した。-材料および方法インビトロ発現のためのICreIのライブラリの構築まず、R68およびR70により溶媒から遮蔽されている残基D75をNに変異させた。これは、ライブラリにおけるこれらの2つの塩基性残基の置換によりもたらされるエネルギーのひずみのようなものを除くためである。変異体D75Nのホモダイマーは、ICreIホーミング部位を切断することが示された。ライブラリは、pTriexベクター中で構築した。次いで、所望の変異の組み合わせを有するDNA断片を、縮合プライマーと、DNA鋳型としてD75N遺伝子とを用いてPCRにより得た。Lib2を、特異的制限酵素を用いて消化した対応するPCR産物を実施例2に記載のようにしてpTriexベクター内のD75N変異遺伝子にライゲーションすることにより構築した。インビトロでのメガヌクレアーゼの産生2μl中の50ngのDNAプラスミド溶液を4μlのRTS溶液と混合した。タンパク質の産生をインビトロで30°Cにおいて少なくとも4時間行なった。タンパク質の産生の後、メガヌクレアーゼ活性を試験する前に新鮮な調製物を蒸留水で希釈した。インビトロ切断アッセイ単一のメガヌクレアーゼDNA標的切断部位を有するpGEMTプラスミドを、まずXmnIで直線化した。切断アッセイを37°Cで125mMHEPES、25グリセロールおよび10mMMgCl2中に行なった。反応を、1時間後に01容量の01MTrisHCl、025MEDTA、5SDSおよび05mgmlプロテイナーゼKの添加および37°Cで20分間のインキュベーションにより停止した。反応産物を1アガロースゲルでの電気泳動による分離に続いて調べた。哺乳動物細胞での切断CHO細胞を、pTriExプラスミドとレポータープラスミドとを発現するメガヌクレアーゼで共トランスフェクションした。レポータープラスミドは、適切なプロモーターの調節下に不活性なLacZ遺伝子を含む。LacZが不活性なのは、これが220bpの内部重複および2つの220bpの反復の間に位置する標的部位の挿入断片を有するからである。トランスフェクションのために、Polyfectトランスフェクション試薬を供給業者のプロトコルに従って用いた。トランスフェクションの72時間後、組織培養培地を除き、細胞を溶解バッファー中にインキュベートした。全溶解物を、01容量のMg100Xバッファー、11容量のONPG8mgmlおよび78容量のリン酸ナトリウム01MpH75と合わせた。37°Cでのインキュベーションの後、反応を05容量の1MNa2CO3を用いて停止し、ODを415nmで測定した。相対的βガラクトシダーゼ活性を、このODの関数として測定した。陽性のクローンを、細胞に空の発現ベクターを感染させたネガティブコントロールとの比較により選択した。それらのβガラクトシダーゼ活性は、より高い。-結果2000のクローンを別個に採取し、96ディープウェルプレートで培養した。プラスミドDNAをBioRobot8000プラットフォームをQiaprep96TurboBioRobotキットとともに用いて抽出した。pTriExプラスミドは細菌および哺乳動物細胞内でのタンパク質の発現を駆動するように設計されているので、プラスミドDNAは、次に、インビトロアッセイと細胞内でのアッセイの両方に用いられた。いずれかの方法で得られた全ての陽性をインビトロおよび細胞内での切断について再び確認した。インビトロアッセイを用いるスクリーニングについて、メガヌクレアーゼをインビトロで個別のプラスミドからRTSシステムを用いて産生し、次いで標的を含む直線化pGEMTプラスミドの切断について試験した。次に、消化物を電気泳動ゲル上を移動させて予想される切断産物を検出した。哺乳動物細胞内でのアッセイを用いるスクリーニングについて、プラスミドを標的部位を含むレポータープラスミドを用いてCHO細胞に共トランスフェクションし、そして切断誘導組換えを72時間後にβガラクトシダーゼ活性の関数としてモニターした。2000クローンのうち、206クローンがインビトロアッセイで陽性であると見いだされた。哺乳動物細胞において、85クローンが陽性であると見いだされた。これらの291クローンのうち、82が両方の方法で陽性であった。121の異なる変異型タンパク質を、陽性クローンの配列決定の後に同定した。これらの121の変異型の情報および切断特性を以下の表に示す。54の変異型が両方のアッセイにおいて検出可能な切断活性を示し、66はインビトロでの切断にのみ陽性である。単一の変異型が細胞ベースのアッセイで陽性でかつインビトロで陽性でなかった。これらの結果は、インビトロでの切断および哺乳動物細胞での切断に基づく2つの異なるアッセイにおいて、陽性クローンと陰性クローンの区別が達成できることを明らかに示す。インビトロでの切断は、より多くの陽性が同定されたことから、より感度が高いようである。これらの差は、メガヌクレアーゼ発現または活性あるいは組換えに基づく検出のいずれかに起因する多くの因子によるものであり得る。しかしながら、細胞内で同定された1つのクローン以外の全てのクローンは、インビトロで確認されたようであり、このことは細胞ベースのアッセイが、機能的エンドヌクレアーゼを同定するのに信頼できることを示す。実施例7:ISceI発現プラスミドを用いる染色体外レポーターのイントトメガヌクレアーゼ誘導組換えAレポーター系の最適化-実験手順ベクター構築標的ベクターは、ヒトEF1アルファ遺伝子のプロモーターにより駆動されるLagoZ発現ベクターに基づく。このプロモーターは、以前に、インビボでの発現スペクトルが広いことが示されている。プロモーター領域は、スプライス供与体および受容体部位をhEF1アルファ遺伝子の5非翻訳領域に含む。LagoZは、トランスジェニックマウスでサイレントになる遺伝子を破壊するように設計された、LacZ遺伝子を欠くCpG島である。異なる長さの相同性を有する標的ベクターを構築するために、LagoZ遺伝子の3断片をまず欠失させ、ISceI切断部位により置換した。異なる長さの3断片を親のプラスミドの消化により作製した。これらの断片は、LagoZ遺伝子の5断片との相同性を種々の量で有した。最後にこれらのDNA断片をISceI切断部位に近接してそれぞれクローニングして、それぞれ0、70、220、570および1200bpの相同性を有する種々の標的ベクターを創った。細胞培養AmericanTypeCultureCollectionからのCOS7およびCHOK1細胞株をそれぞれ10ウシ胎児血清を加えたDMEMまたはHamsF12K培地で培養した。ISceI誘導単鎖アニーリングアッセイのために、細胞をトランスフェクションの1日前に12ウェルプレートにウェル当たり15103細胞で播種した。一過性のトランスフェクションを、次の日に、500ngのDNAを用いて、EFFECTENEトランスフェクションキットを用いて行なった。等モル量の標的プラスミドとISceI発現ベクターとを用いた。次の日に、培地を置換して細胞をさらに72時間インキュベートした。βガラクトシダーゼ活性細胞単層を、1mMMgCl2を含む100mMPBS中の05グルタルアルデヒド中で4°Cで10分間固定した。洗浄溶液を用いて1回洗浄した後、細胞を37°CでXGal染色溶液63H2O、33mMK3Fe6、01XGal中に発色するまでインキュベートした。βガラクトシダーゼ活性を細胞抽出物中でもoニトロフェニルβDガラクトピラノシドを基質として用いて測定した。細胞単層をPBSで1回洗浄した。次いで、細胞を10mMTrispH75、150mMNaCl、1TritonX100、プロテアーゼ阻害剤を用いて溶解した。氷上で30分間インキュベーションした後、細胞溶解物を遠心分離してβガラクトシダーゼを測定した。典型的には、上清30μlを、800μgmlONPGを含む反応バッファー270μlと合わせた。反応を37°Cで行い、1MNaCO305mlで停止した。吸光度を415nmで測定した。βガラクトシダーゼ活性を、タンパク質濃度およびインキュベーション時間について標準化した相対単位として算出した。-結果DNA二本鎖破壊が2つの反復配列の間に導入されるとき、これは相同的組換えを誘導して全ての介在配列とともに反復の欠失をもたらす。組換え経路は、しばしば、単鎖アニーリング経路とよばれる。レポーター系は、メガヌクレアーゼ誘導SSAをイントト動物モデルにおいてモニターするように設計された。レポーター系を最適化するために、メガヌクレアーゼ誘導SSAの効率と反復の長さとの間の相関関係をまず調べた。種々のサイズの重複を含むLagoZ遺伝子を有する種々の標的ベクターを構築した。重複の存在およびISceI切断部位の存在が、遺伝子を不活性化する。SSAによるLagoZ遺伝子の修復は、1つの反復の損失および切断部位の損失をもたらしかつ機能的LagoZ遺伝子の回復をもたらす。LagoZは、比色分析により検出できるβガラクトシダーゼ酵素をコードする。等モル量の標的ベクターとISceI発現ベクターまたはメガヌクレアーゼを発現しない発現ベクターを用いる一過性トランスフェクションを、CHOまたはCOS7細胞で行なった。種々の構築物で得られた結果を図12に示す。ISceI誘導DSBは、明らかにSSA修復機構を刺激する。さらに、70bpの相同性は、誘導されたSSAの最大限に近い効率を達成するのに充分であったが、自発的組換えのレベルは最小であった。220bpの重複を用いると最大限の効率が達成されたが、より長い重複を用いてもSSA効率におけるさらなる向上は観察されなかった。同様の結果がCOS7細胞で得られた。70および220bpの相同性は、活性対バックグラウンドの最良の比を与えた。βガラクトシダーゼを細胞溶解物中でアッセイしかつ1つの単一細胞が標的プラスミドのいくつかのコピーを有し得るので、この方法により絶対的なSSA効率を評価することは不可能である。よって、細胞単層の直接の着色を、トランスフェクションの72時間後に行なった。メガヌクレアーゼの不在下では、青い細胞は実質的に検出されなかった。これに比べて、ISceIが標的ベクターを用いて共トランスフェクションされるときに多数のβガラクトシダーゼ陽性細胞が存在し、このことはメガヌクレアーゼ誘導DSBによる相同的組換えの刺激を証明する。ISceI誘導SSAの効率は、青い細胞を計数することおよびそれをトランスフェクションされた細胞の数と比較することにより算出した。図13Bは、ISceIが70または220bpの重複を有する標的ベクターとともに存在する場合に、細胞の50~60が相同的組換えをおこすが、自発的組換えは事象の01未満を表すことを示す。つまり、導入遺伝子とともに70bpおよび220bpの相同性を有する構築物を動物での研究に選択した。Bイントト染色体外レポーターのメガヌクレアーゼ誘導組換え-実験手順インビボでの流体力学ベースのトランスフェクションマウス肝臓細胞の形質導入を、流体力学的尾部静脈注射により以前に記載されたようにして行った。この方法は、動物における効率的な形質導入および外因性遺伝子の発現を、尾部静脈注射によるプラスミドDNAの投与により許容する。簡単に、DNAを15~2mlのPBSに混合し、これは動物の体重の10である。続いて、尾部静脈注射を26ゲージ針を用い、5~10秒にわたって、滅菌の材料および作業状況を用いて行う。このようなプロトコルを用いて、ほぼ肝臓細胞のみに形質導入し、それによりLagoZ遺伝子の修正に導くISceI媒介SSA事象を肝臓において研究した。用いたISceI発現ベクターはpCLS197であり、これはpUC主軸内のCMVプロモーターの制御下でのISceIコーディング配列に相当しかつ5737bpの長さである。15~20gの体重のOF1マウスをCharlesRiverLaboratoriesFranceから得た。等量の標的ベクターとISceI発現ベクターまたはコントロールベクターのいずれかを含む合計20μgのDNAを、マウスの尾部静脈に注射した。標的ベクターは、相同性の70bpを含む直列反復配列で挟まれるISceI切断部位により分断されたLagoZ遺伝子を含む。コントロールマウスは、標的ベクターとISceIを発現しないプラスミドとの混合物を注射された。βガラクトシダーゼ活性注射の3日後、マウスを頸部脱臼により安楽死させ、マウスの肝臓のXGal染色を行なった。肝臓を動物から冷1×PBS中に解剖し、組織にXGalがより接近することを許容するために、肝葉を約1/4cmの破片に切断した。次いで、肝臓の破片を、氷上に保持した12ウェル細胞培養プレート内の新鮮な冷PBS1×中に入れ、4パラホルムアルデヒド中に1時間、攪拌下に4°Cで固定した。サンプルを3回、室温で30分間、洗浄バッファーで洗浄した。イントトXGal染色を一晩、37°Cで染色溶液中に行なった。最後に、サンプルを広範にPBSで洗浄し、顕微鏡で調べた。写真をNikonCoolpixカメラでNikonSMZ1500双眼顕微鏡の下で撮影した。-結果細胞の研究は、70bpの相同性がDSB誘導SSAのほぼ最大限の効率を達成するのに充分であるが、一方、自発的組換えは最小であることを示す。よって、インビボで組換えを刺激する最初の試みにおいて、一過性の実験を行った。標的ベクターとISceI発現プラスミドまたはコントロールプラスミドのいずれかとの混合物を、流体力学的尾部静脈注入法により肝臓に導入した。図14は、注射の3日後に回収し、染色した肝臓の拡大図を示す。青色の点は、70bpの重複に接するISceI部位を有する不完全なLagoZ遺伝子が修復された細胞を表す。メガヌクレアーゼ誘導DSBの後、SSA経路は1つの反復の欠失および機能的遺伝子の再構築をもたらす。LagoZ遺伝子によりエンコードされる活性なβガラクトシダーゼは、次いで、XGal染色により検出され得る。さらに、メガヌクレアーゼ発現ベクターの不在下では遺伝子修正が検出されなかった。これらのデータは、メガヌクレアーゼ誘導組換えが肝臓において刺激され、染色体外標的のイントト修復が達成できることの最初の証拠である。実施例8:ISceI発現アデノウイルスを用いるイントト染色体外レポーターのメガヌクレアーゼ誘導組換え種々のマウス組織におけるイントト染色体外レポーターのメガヌクレアーゼ誘導ゲノム外科治療を証明するために、イントトlagoZ遺伝子の修復を、いくつかの器官の形質導入化細胞により、ISceI発現アデノウイルスであるAdISceIを用いて試験した。コントロールのトランスジェニック同腹子に、ISceI非発現アデノウイルスであるAdcontrolを感染させた。トランスジェニックマウスでのアデノウイルス感染は、静脈内注射により行なった。イントトlagoZ遺伝子のいくつかの組織における修復を、イントトβガラクトシダーゼ活性を検出する2つの方法、Xgal染色およびFDGアッセイにより試験した。-実験手順トランスジェニックマウストランスジェニック創始者の発生のために用いられた導入遺伝子は、ヒト伸長因子1アルファプロモーターの制御下にあり、70bpまたは220bpのLagoZ重複およびISceI切断部位により不活性化された不完全なLagoZ遺伝子を有する5919bpのBglIINotI断片であった。トランスジェニック創始者を古典的なトランスジェネシスにより、すなわち直線状の精製された上記のBglIINotI断片を500コピーピコリットルを超えて、ElevageJanvierから購入したB6D2F1の雄と雌の交配に由来する単核細胞段階の受精卵の雄の前核にマイクロインジェクションすることにより作製した。マイクロインジェクションは、NikonTE2000顕微鏡の下でNormarskiDICとエッペンドルフtransferManNK2マイクロマニピュレーターおよびエッペンドルフFemtojet5247マイクロインジェクターを用いて行なった。注入後、発育と出産のために卵を代理の偽妊娠B6CBAF1Jの雌に移した。この方法により作製したトランスジェニックマウスを、F0マウスの尾部の生検から抽出したゲノムDNAについてのPCRおよびサザンブロット解析により同定した。次いで、半接合体トランスジェニックF1動物を得るために、創始者をB6D2F1マウスに交配した。導入遺伝子の発現を、トランスジェニックF1動物の尾部生検から抽出したRNAに対するRTPCRをQiagenRNeasyキットを用いて行うことにより試験した。次いで、F2半接合体トランスジェニック株を創るために、半接合体F1マウスをB6D2F1マウスに交配した。220bpまたは70bpのいずれかの長さのlagoZ遺伝子反復配列を有する2つの独立した株を用いた。これらのトランスジェニック株は、それぞれ株361および58Aという。導入遺伝子組込みの分子的な特徴付けは、組込みが361ではBglIINotI導入遺伝子の約5つの直列反復であり、58Aでは2つの逆方向反復と5つの直列反復であることを示す。半接合体マウスを、尾部生検、ゲノムDNA抽出およびPCR分析により同定した。次いで、361および58A半接合体マウスを、イントトISceI媒介lagoZ遺伝子修復のために用い、トランスジェニック同腹子をネガティブコントロールとして用いた。アデノウイルスベースのイントト形質導入CMVプロモーターの制御下にISceIメガヌクレアーゼコーディング領域を有する組換えV型アデノウイルスAdISceIは、QBIOジーンカンパニーから、TCID50法により評点された1581011感染性単位濃度で提供された。ネガティブアデノウイルスコントロールAdcontrolもQBIOジーンカンパニーから、3761011感染性単位濃度で提供された。組換えV型アデノウイルス感染は、トランスジェニックマウスの尾部静脈での静脈内注射により行なった。トランスジェニックマウスを秤量し、キシラシンとケタミンの混合物の腹腔内注射により感染の前に麻酔をかけた。IV感染を、400μlの容量中の1010感染性単位動物で行なった。感染は、4~7週齢のトランスジェニックマウスに行なった。アデノウイルスに感染したマウスと未感染のコントロール同腹子とをアイソレーター中に、βガラクトシダーゼアッセイのために犠牲にするまで飼育した。βガラクトシダーゼ活性アデノウイルスに感染したマウスを、感染後5~14日でCO2吸入により犠牲にし、その器官をβガラクトシダーゼアッセイのために加工した。肝臓の約10をタンパク質抽出のために用い、残りの90を、βガラクトシダーゼのイントトXgalアッセイのために用いた。蛍光βガラクトシダーゼアッセイを、96ウェルプレート中に37°Cでインキュベートした。アッセイを、タンパク質抽出物30μl、1μMのフルオレセインジガラクトシド、01βメルカプトエタノール、1mMMgCl2および100mMリン酸バッファー、pH70を含む合計容量100μl中に行なった。プレートをFuoroskanAscentで5分のインターバルでスキャンした。βガラクトシダーゼ活性を、タンパク質濃度およびインキュベーション時間について標準化した相対単位として算出する。-結果2匹の58Aトランスジェニックマウスを、70bpの重複lagoZ配列の間のDSBを標的し、レポーター遺伝子の修復を誘導するために、1010感染性単位のAdISceIアデノウイルスでIV注入した。注入後の種々の時間においてマウスを犠牲にし、いくつかの器官を解剖してイントトXgalアッセイにより分析した。青色の染色が、5dpiで安楽死させた感染したマウスの肝臓全体にわたって分散した細胞として検出された。試験したほかの器官、すなわち腎臓、脾臓、心臓および肺において染色は検出できなかった。2匹の58Aトランスジェニックマウス同腹子をコントロールとして用い、1匹は1010感染性単位のコントロールアデノウイルスAdcontrolをIV注入し、もう一方は感染させなかった。いずれのコントロールの肝臓でもβガラクトシダーゼ活性は検出できなかった。同様の結果が、AdISceIアデノウイルスの109および1010感染性単位で感染させた2匹の361トランスジェニックマウスで得られた。これらの結果は、肝臓抽出物でのβガラクトシダーゼ活性の測定により確認された。ISceIを発現するアデノウイルスを注入したマウスの肝臓において、高い活性が検出された。これに比べて、注入しなかったマウスは、コントロールアデノウイルスを注入したマウスで検出される活性と類似の残存バックグラウンド活性だけを示した。Ad1SceIアデノウイルス1010感染性単位をIV注入したマウスは、Ad1SceIアデノウイルス109感染性単位をIV注入したマウスより染色された肝臓細胞およびより高いβガラクトシダーゼ活性を示した。これらの結果は、ISceI誘導組換えが用量依存性であり、ISceI誘導組換えのよりよい収率が、注入されるアデノウイルスの力価を増加させることにより得ることができることを示唆する。よって、ISceI誘導ゲノム外科治療は、V型アデノウイルス感染への感受性がより低いことが報告されている他の器管において検出されるはずである。まとめると、これらのデータは、レポーター遺伝子の修復がISceIメガヌクレアーゼの活性により誘導されたことを強く示唆する。この結果は、ISceIおよびより一般的にはメガヌクレアーゼが、効果的な部位特異的相同的組換えを誘導するのにイントトで用いることができ、染色体遺伝子の修復に導くことの最初の証拠である。よってこの結果は、哺乳動物における遺伝子治療の分野における適用を切り開く。