ラベル付けされた生体試料20を照明する200ステップと、画像の時系のメンバーを生成する205、210ステップと、前記時系列画像の後期メンバーと前記時系列画像の初期のメンバーとの間の複数の差分画像を生成する215ステップと、最終像を生成するために前記複数の差分画像を結合する225ステップと、を含むラベル付けされた生体試料20の画像化の方法。フィルタを前記差分画像に適用する220ステップを更に含む請求項1に記載の方法。前記フィルタは、高域フィルタと、トップハットフィルタと、メキシカンハットフィルタとのうちの1つである、請求項2に記載の方法。前記照明は、レーザ照射によって提供される、請求項1ないし3のいずれか1項に記載の方法。前記ラベル付けされた生体試料20は、フルオロフォアでラベル付けされている、請求項1ないし4のいずれか1項に記載の方法。前記時系列画像のメンバーの1つを生成するために、ラベル付けされた生体試料20をスキャンするステップを更に含む請求項1ないし4のいずれか1項に記載の方法。前記複数の差分画像の前記生成ステップ215は、前記時系列画像の後のメンバーから前記時系列画像の前記前のメンバーのピクセル強度を引くステップを含む、請求項1ないし6のいずれか1項に記載の方法。前記複数の差分画像の前記生成ステップ215は、前記時系列画像のシーケンシャルなメンバーの間で前記差分画像を生成するステップを含む、請求項1ないし7のいずれか1項に記載の方法。合成三次元画像を生成するために、前記最終画像をラベル付けされた生体試料の三次元画像と結合する230ステップを更に含む請求項1ないし9のいずれか1項に記載の方法。ラベル付けされた生体試料20の一部を照明するための照明源60と、ラベル付けされた生体試料20から放射線を検出するための検出デバイス80と、前記検出デバイス80によって生成される時系列画像のメンバーを保存するための画像メモリ110と、時系列画像の後のメンバーと時系列画像の前のメンバーの間で、複数の差分画像を生成し、ラベル付けされた生体試料20の最終像を生成するために、複数の差分画像を結合するのに適応した画像プロセッサ105と、を備える、ラベル付けされた生体試料20の画像化のための装置10。前記照明源60は、走査型レーザである、請求項10に記載の装置。前記検出デバイス80は、電荷結合素子である、請求項10又は請求項11に記載の装置。前記ラベル付けされた生体試料20からの放射線は、蛍光放射線である、請求項10ないし12のいずれか1項に記載の装置。前記画像プロセッサ105は、前記差分画像にフィルタを適用するのに適応している、請求項10ないし13のいずれか1項に記載の装置。前記最終像を表示するための表示装置120を更に備える請求項10ないし14のいずれか1項に記載の装置。顕微鏡に請求項1ないし9のいずれか1項に記載の方法による、ラベル付けされた生体試料20の画像化のための方法を実行させる制御ロジックを内部に有する非一時的コンピュータ可読媒体を備えるコンピュータプログラム製品。請求項1ないし9のいずれか1項に記載の瘍細胞の画像化の方法の使用。ラベル付けされた生体試料を形成するためにラベルで腫瘍細胞にラベル付けするステップと、請求項1ないし9のいずれか1項に記載の方法にしたがって、ラベル付けされた生体試料を画像化するステップであって、それによって腫瘍細胞を識別する、ステップと、を含む、腫瘍細胞の識別のための方法。本願発明は、次に、図面に基づいて記述される。ここに記述される発明の実施形態と態様は、例としてのみであり、いかなる形であれ、特許請求の範囲の保護範囲を制限しないことが理解される。本願発明は、特許請求の範囲とその均等価物によって定義される。本願発明の1つの態様または実施例の特徴は、本願発明の異なる実施形態や態様の特徴と結合することができることが理解される。図1は、特に、顕微鏡10における本願発明の態様にしたがう装置の実施例を示す。生体試料20は、励起光源60から発される光65で照明される。光65は、第1の開口50を通って、対物レンズ30に通過する。対物レンズ30が、光65を生体試料20に照明し集中させるのに用いられる。本願開示で用いられる用語生体試料または生物学的試料は、複雑な試料を指し、たとえば、人間や動物、植物、バクテリア、ウイルス、イースト、真菌、その他の生物源から採集した生物物質のサンプルを意味する。用語生体試料は、制限的な目的なしで、器官、オルガネラ、組織、体液、細胞、組織または細胞の培養物、ならびに、それらの上澄とリンスを含む。生体試料は、また、例えば多糖などの分子、核酸、蛋白、ペプチド、脂質、および、それらの由来物を含む生体試料は、また、例えば、均質化または抽出など必要に応じて生体試料に前処理を受けることによって、得ることができる。そのような前処理は、検査対象の生体試料に依存して、当業者によって適切に選ぶことができる。本願開示はまた、制限的ではなく、例えば、舌下細胞、脳サンプル、皮膚サンプル、器官サンプル、胎盤組織、胎児細胞またはその入手可能な細胞の他のどのソースを含む人間のまたは動物の体からの組織サンプルなどの生体試料を含む。本願開示はまた、例えば人間や動物の体からの体液などの生体試料を含む。特に、サンプルは、全血、血漿、血清、脳体液、痰、便、生検材料、骨髄、口のリンス、組織、尿またはそれらの混合物でありえる。本願開示で使われる用語ラベル付けされた生体試料は、検出可能なラベルを含む生体試料20の任意のタイプを含むことを意図する。生体試料20は、検出可能なラベルとして機能する粒子図示せずでラベル付けすることができる。検出可能なラベルは、制限するものではないが、酵素、フルオロフォア、蛍光染料、電磁ラベルまたは放射性ラベルであり得る。本願開示の態様において、ラベル付けされた生体試料20で使われる検出可能なラベルは、フルオロフォアであり、励起光源60は、レーザである。この励起光源60は、前記検出可能なラベルすなわちフルオロフォアにラベル付けされた生体試料20において、蛍光を発光させるのに適している波長の光を発する。励起光源60は、レーザに限られておらず、ラベル付けされた生体試料20を可視化するいかなる光源60でも光源60として使用することができることが理解される。ラベルの非限定的な例は、さらにここ下記の例参照に提供される。特定の例にしたがって、生体試料20は、複数の検出可能なラベルを運ぶことができる。したがって、生体試料は、以下に記すように、2、3以上の検出可能なラベルを有することができる。検出可能なラベルは、同一のラベル例えば信号を強化するためにでありえる。検出可能なラベルは、同じ性質を有するが互いと異なる場合があり、例えば2枚の異なる蛍光ラベル、異なる性質を有する例えば蛍光と電磁ラベル場合がある、あるいは、その組合せもあり得る例えば、2つの同一の蛍光ラベルと、第3の異なる蛍光ラベル。蛍光を発するとともに、光65は、ラベル付けされた生体試料20から散乱し、反射する。光65は、また、対物レンズ30によって集められ、ビームスプリッタ40にパスされる。ビームスプリッタ40は、散乱し、反射した蛍光を分離し、散乱し、反射した蛍光を、第2の開口70を通して、フォト検出デバイス80へパスする。フォト検出デバイス80は、光電子増倍管チューブ、APD、相補型MOSデバイスCMOSまたはCCDのうちの1つでありえる。例えば散光と反射光などただし、蛍光ではない特定の波長の光を取り除くために、フィルタ図示せずを、フォト検出デバイス80の前に配置することができる。フォト検出デバイス80は、フォト検出デバイス80によって受け取られる光信号をコンピュータ100にパスされる電気信号に変換する。コンピュータ100は、コンピュータ100と、ラベル付けされた生体試料20の画像を表示できるまたは印刷できるディスプレイ120に接続された画像メモリ110を有する。コンピュータ100は、画像プロセッサ105を更に含む。画像プロセッサ105は、特殊画像プロセッサか、コンピュータ100の従来のプロセッサでありえる。画像プロセッサは、ラベル付けされた生体試料20の画像を処理するように構成される。本願発明の1つの態様において、光源65を静止状態に保って、生体試料20は、平面的に移動させることができる図1の中のx-y軸として示される。典型的には、生体試料20は、生体試料20の表面に入る光65が生体試料20の表面ないし体積上で走査するように動くことができるステージ図示せずの上へマウントされる。他の態様において、ラベル付けされた生体試料20を静止状態に保って、光源60は、平面的に移動させることができる図1の中のx-y軸として示される。光検出デバイス80は、ラベル付けされた生体試料20の照明された部分からの光信号を記録する。次に、光検出デバイス80は記録された光信号を電気信号として、コンピュータ100にパスする。ここで、ラベル付けされた生体試料の20照明された部分の画像が画像メモリ110に格納される。当該技術において知られていているように、ラベル付けされた生体試料20の画像メモリ110の複数の画像部分は、ラベル付けされた生体試料20の単一の画像を形成するために結合することができる。例えば、顕微鏡の露光時間、利得、光源60の電力や、他の設定値を調整するためにフィードバックループを装置10に含むことがさらに可能である。これらのフィードバックループは、コンピュータ100に実装することができる。ラベル付けされた生体試料20の画像化のための改善が、図2に関して示されるように、ラベル付けされた生体試料20の画像化のための方法に関連して説明される。ステップ200において、ラベル付けされた生体試料20は、光源60からの光65で照明される。ラベル付けされた生体試料20は、光65がラベル付けされた生体試料20の表面の関心領域のすべての部分を連続して照明するように、ステージで移動される。ステップ205において、ラベル付けされた生体試料20の時系列画像の第1のメンバーは、画像メモリ110においてフォト検出デバイス80によって記録される光信号から生成される。ステップ210において、更なる画像は、ラベル付けされた生体試料20の関心領域の部分について生成される。更なる画像は、毎秒2コマの率で画像を取ることによって、典型的には生成される。次に、画像の更なるセットは、ステップ210で繰り返し生成される。画像の更なるセットは、時系列画像の相当な数のメンバーが生成されるまでたとえば毎秒2コマの率で期間ごとに後繰り返し生成される生成された画像数は、後で説明されるように、要因の数に依存する。典型的には、数百画像もの時系列画像の画像が生成される。ステップ215において、一連のラベル付けされた生体試料20の差分画像が生成される。ラベル付けされた生体試料20の差分画像のこの系列は、時系列内の画像と次のあるいは逐次の画像を選択することによってなされる。コンピュータ100の画像プロセッサ105は、次のあるいは逐次の画像を比較して、差分画像を生成する。差分画像の生成は、画像のそれぞれにおけるピクセルの強度を比較することによって行うことができる。差分画像の系列の結果は、画像メモリ110に格納することができる。時系列における非順次画像が、差分画像を生成するために、互いに比較される、または、微分画像が、最大強度に関して正規化され、例えば、カールマン雑音を推定するためのフィルタが使われる、という状況がありえることが、また、理解される。微分画像が正規化されないならば、第1のより強い画像の方への固有のバイアスが存在することが理解される。また、ピクセルの合計数にわたって正規化することが可能である。放射光の強度の個々の揺らぎは、たとえば圧力感知性フォト変換またはフルオロフォア漂白など、主に光物理的イベントに起因する。これらの光物理的イベントは、系列画像の連続したものにおける局所的な減少した強度という結果になる。例えば、増加した局所的な強度、などの個々の揺らぎは、ラベル付けされた生体試料20における、検出可能なラベルから生じる蛍光、ショット雑音と染料点滅を量子化するホモ親和性蛍光共鳴エネルギー転移に起因する場合がある。これらの光物理イベントは、ラベル付けされた生体試料20における、個々の分子の蛍光と関係しており、次に、画像の中で個別化された分子の正確な局在化に貢献することができる。数学的フィルタは、ステップ220で差分画像の系列に適用される。適用される数学的フィルタは、典型的にはより高い空間周波数にたいして濾過することを目的とするハイパスフィルタであり、ステップ215において、フィルタ処理した差分画像を供給するために、生成される差分画像の違いを強調する。これは、差分画像で雑音を減らしているなかで、光漂白のピークの強化という結果になる。フィルタ処理した差分画像は、ステップ225で、次に合計される。フィルタ処理した差分画像の追加は、表示装置120の上で次に表示することができるか、あるいは、さらに処理することができるラベル付けされた生体試料20の最終画像を生成する。フィルタ処理した差分画像の追加は、以下の方程式によって説明することができる。ここでIは、最終の生成画像であり、Ixyは、時刻tnにおいて取得された画像のセットのメンバーである。フィルタリングステップについては、以下のトップハット数学的フィルタが、例示的に使用された。更なる処理の1つの例は、最終画像を、ラベル付けされた生体試料20の三次元画像を生成するために従来の共焦点レーザ走査型顕微鏡法によって生成された画像と結合することである。本願発明の方法は、既存の顕微鏡に取り込むことができるコンピュータプログラム製品によって実行することができる。以下に記す例において、光漂白が、光物理効果として使われる。他の光物理効果を使うことができ、また、この光物理効果と互いに組み合わせることもできることが理解される。ラベル付けされた生体試料20の全てが、照明される必要があるというわけではないことが、さらに、理解される。照明の任意のパターンを使用することができる。ラベル付けされた生体試料20に付着されるラベルは、複数であってもよいことが理解される。つまり、従来の技術において知られていているように、ある程度の冗長性がある。例えば、インビトロゲンによって生み出される二次抗体は、5つの複数のフルオロフォアを持つ。したがって、下で述べるように5つの潜在的なラベルがある。複数のラベリングの理由は、光漂白の間に、構造的情報が決定されることである。上で説明されたように、いくつかの画像は、十分な情報を回復するために取得される。複数のラベリングラベリングの冗長性は、最終生成画像Iを生成するのに十分な情報を回復するのに、有益である。これは、典型的生物学的製剤を考慮する以下の例から理解されることができる。読み出される構造的情報と標準的なラベリングと、表現プロトコルを、考慮することができる。次の例は、下の例で説明されるように、Brpと微小管を用いる。25Brp分子が単一のTバーを形成すると期待される。それは、一次抗体は、それらの抗原を高度な特異性で結びつけていることを意味する。次に、多クローンの二次抗体が使われる。多クローンの二次抗体の複数のものは、一次抗体の単一のものを結びつけることができる。二次抗体は、複数のフルオロフォアでラベル付けされる市販の抗体である。たとえば、インビトロゲンマニュアルは、免疫グロブリンGAlexa全体抗体複合体は、2-8フルオロフォアを有することを開示する。したがって、当業者は、ラベルの5つのフルオロフォアは、標準的な二次抗体の妥当な見積であることを理解する。当業者は、異なるフルオロフォアを持つことができるであることを理解するが、5つのフルオロフォアの各々は、典型的には同一である、したがって、Tバーにつき250フルオロフォアと推定される。微細管に対して、およそ13のプロトフィラメントが、準螺旋形のシリンダー25nmの幅を、1回転が4nm長で、形成する。それは、構造的情報は55nm25nm二重二次抗体長×2215nmであることを意味する。それは、およそ13回転で169抗原の結果になる。微細管結合タンパク質のために、抗原のおよそ半分が利用できるならば、およそ840フルオロフォアを期待できる。タンパク質を結合するGFP接合微細管を使用する場合には、84フルオロフォアを期待することができる。以下に記すシミュレーションにおいて、50~100の間のフルオロフォアが使用された。ラベル付けされた生体試料20が準備される方法から、フルオロフォアのクラスタの仮定が合理的であることが分かる。[例1.インシリコモデル]ここでの開示の方法は、コンピュータでモデル化され、この方法は、次に、いくつかのシミュレーションされた状況の下でテストされた。16の定期的に配置された蛍光性ラベル付けされた構造のオブジェクトを含んでいるモデルが生成された。16のラベル付けされた構造の各々は、100のフルオロフォアを、最初に含み、Abbe0.5λ/NAで定義されるような回折制限の92の他のものの各々から離れて配置されるAbbeEContributionstothetheoryofthemicroscopeandthemicroscopicperceptionArchMikrAnat9413468参照。100のフルオロフォアによるモデリングを正当化する理由は、上で概説される。16のラベル付けされた構造を含んでいるオブジェクトが、図5aで示すように159.9nmの相互の距離において55ピクセルの一次元配列でモデル化された。そうすると、ラベル付けされた構造の個々のものの間の距離は、回折制限より短い。シミュレーションされた点広がり関数PSFは、均一な台地を形成し、したがって、図5aの一次元の配列の上の相対的強度を図示する図5bで示すように、個々のラベル付けされた構造の解像度をじゃまする。PSFは、Nassetほかの結果を使って、数値的に計算されたRealisticmodellingoftheilluminationpointspreadfunctioninconfocalscanningopticalmicroscopyJOptSocAmA27295302参照。それらの積分が1に等しいように、PSFの個々のものは正規化された。共焦点照明PSFが単純さのために使用され、100のフルオロフォアが表現された。フルオロフォアのこの例における光物理イベントである次の統計漂白イベントは、100の画像の時系列の取得の間に、シミュレーションされる。16のラベル付けされた構造の各々に位置するフルオロフォアの一定の漂白率を仮定する場合には、期間t、tτ内の漂白剤イベントの数の可能性は、ポアソンプロセスによって説明される。光漂白は、ポアソン分散ランダム数を、出発状態としての100分子においてK=5の場合、期待値が以前の値の0.05倍である出発状態ないし以前の状態から引くことによって、近似される。これは、図5cに示される。第1のフレームに対する漂白イベントの期待数は、5K=5であり、5つの異なる走査に対して、各々16ポイントにおいて漂白されたフルオロフォアの数が示される。典型的には、微分画像は、光漂白イベントの統計ピークを示す。そのような不均一性光漂白ピークは、微分画像の中で検出可能な強度の最大という結果になる。光漂白図5bの前に、台地状を示した強度プロフィールは、次に、フルオロフォアの統計光漂白イベントにおけるピークと谷図5c、右辺を示す。対応する微分画像は、下にある16の個々の点における光漂白イベントに対応する回折限界光漂白の最大を表す。100の微分画像の中の個々の写真-漂白最大は、10の隣接ピクセルのスライディング最大の検出を使って決定された。微分画像は、トップハットフィルタを使ってフィルタされ、続いて、ヘヴィサイド階段関数によって、マイナス値がゼロにセットされる。最後に、フィルタ処理した微分画像を合計して、回折制限図5dより近くに配置される16ポイントの位置を明らかにする。本願開示の方法の1つの態様は、微分画像の中で漂白イベントを検出する能力を使用する。漂白率の貢献をテストするために、55本のピクセル配列で画像化された16のラベル付けされた構造のモデルが採用され、非常に低い光漂白率が、シミュレーションされ、未満のフルオロフォア;フレームにつき1つのフルオロフォアより少なく、K=0.1、単一フルオロフォア検出アプローチをまねする徐々に、より多くの漂白剤イベントK=5とK=100が同時に起こる。16のラベル付けされた構造は、各々、100のフルオロフォアを有し、光子雑音は、フルオロフォアにつき10000の光子にセットされた。あるいは、代替の実験においては、フルオロフォア図5gにつき1000の光子にセットされた。一つの例を示すよりはむしろ、状態ごとにシリコ実験において、同じことが、100回繰り返された。平均強度は±SEMを報告した図5g。独立した実験は、再現性を支えるごくわずかなバリエーションしか示さなかった16のピークの平均ピーク高さは、10000の光子、K=5のケースに対して、0.4である、個々のラベル付けされた構造上で、最大SEMで11であった。データは、非常に低い光漂白率があまりに小さい非対称が微分画像の中で検出されるので、より高い光漂白率が16ポイントを分解することができず、光子雑音の結果としての劣った解像度という結果になることを示す。したがって、回折制限を越えて構造を分解する方法の能力は、画像化された生体試料20の光漂白率と結合している。この方法が動作する範囲の評価をするために、スパロウ制限50/50のラベリング密度、10000/1000の光子の下で設定された所定の距離に対して2つのガウスプロフィールの分離が、異なる漂白率に対して測定された。図5H500の繰返しの平均が示されるは、極値は別として、2つの構造は、光漂白率の幅広い範囲において、よく分離されていることを示す。分離の値は、y軸で曲線をシフトして実際の距離から変動することができることに留意する。本願開示の方法の解像度限界を近似するために、スパロウ基準の下で2つの構造が、2つのガウスプロフィールを使った上記のシミュレーションと同様に、シミュレーションされた25/25のラベリング密度、K-2.1、10000の光子。1.4のNA対物レンズと500nmにおける蛍光放射を考慮し、画像の上で、レーリー基準を適用することにより、0.61λ/NA、それは、2つの構造の間で20のディップに対応するこの例における解像度限界は、通常の光学顕微鏡法解像度のおよそ半分であると見積もることができる218nmではなく107nm。より複雑な二次元のテスト画像が、図6に示される。PIMPという語がフォト漂白されて、画像化されている。図6の第1の線は、時間上の語オブジェクトを示す。語がフォト漂白されて、認識できなくなった。第100番目の画像の強度は、第100番目の画像は、さもなければ事実上見えないので、増加したのであることに留意すべきである。2本目の線は、その語がどのように共焦顕微鏡で画像化されるかを示す。時間とともに、語がぼやけるのを見ることができる。ここでも、第100番目の画像は、強度が増えている。3本目の線は、微分画像を示すすなわち第1および第2の画像の微分画像、第9と第10の画像の間の微分画像、第19と第20の画像の間で微分画像、そして、最後に第100と第99の画像の間の高輝度微分画像。3本目の線のこれらの微分画像は、適用されたトップハットフィルタの非線形の変形を有するマイナス値は非線形性を導入するためにゼロにとめられた。使用されたトップハットフィルタは、最も高い最大を選び出し、そして、また、いかなる第二のピークも考慮する。最後に、5本目の線は、シーケンシャルなフィルタ処理した微分画像の合計を示す第1の画像PIMPに1-10とラベルをつけたの方法の使用を示すすなわち1-2、2-3、3-4、4-5、5-6、6-7、7-8、8-9、9-10。同様に、第2の画像PIMP1-20とラベルをつけたが、第20番目の画像2本目の線の上の第3の画像まで、シーケンシャルなフィルタ処理した微分画像の全てを含む。第3番目の画像PIMPに1-100とラベルをつけたは、第100番目の画像2本目の線の上の第4の画像まで順次フィルタ処理した微分画像の全てを含む。この例は、本願開示の方法が、たとえ生画像がぼやけるとしても、語に関して情報の回復を可能にすることを示す。また、たとえば、バンドパスフィルタリングによって、またはウィーナーフィルタリングなど、画像に関してデータを前処理することも、考えられる、前処理は漂白の可視性を強化することができ、雑音を抑制することができる。[例2]図3aは、本願開示に従ってデータが処理される方法の更なる例を表す。この例は、生体試料20として515nmで発光するインビトロゲンカールズバッド、カリフォルニアによって供給される40nmのビーズを利用する、系列画像の個々のメンバーは、画像1から最後の画像nまで示され、第1カラムの中にオリジナル走査画像を含み、第2のカラムの中に差分画像を含む。第3のカラムは、フィルタ処理した差分画像を示す。図3anラインの第4行は、n画像の時系列の終わりに、蛍光画像は見られないことを示す。差分画像第3のカラムは、興味領域について何も現さないことが予期される。図3aの第4行の第4のカラムは、n-1差分画像の全ての合計を示す。図3bは、図3aの一番上の線で、矢印で示される線プロフィールのための正規化強度分布を示す。半値全幅FHMWは、本願発明によって、従来の共焦点顕微鏡法と比較して減少する。つまり、40nmのビーズは、従来の共焦点顕微鏡法によって観察されるときに、本願発明によって、>160nmと比較して70nmの直径で観察することができることが分かる。[例3]微細管は、マウス胎生期線維芽細胞MEFで免疫標識され、図4に示される。図4Aは、共焦点顕微鏡を用いた第1の画像を示し、図4Bは、共焦点顕微鏡を用いて撮られた96のシーケンシャルな系列画像の合計を示す。図4Cは、トップハットフィルタを使ってフィルタに通される図4Bの画像を示す。一方、図4Dは、この開示の教示を使って得られた画像を示す。免疫ラベル付けされた微細管の細胞は、共焦点顕微鏡10を用いて、202回走査された。生体試料の進行的な漂白という結果になった図4F。画像の個々のものは、微分画像を生成するために互いに引かれ、微分画像の中の最大は、マイナス値の0クリッピングと結合され、トップハットフィルタを使って強化された。合計されたフィルタ処理した微分画像図4Dは、ラベル付けされた微細管を、1つのエアリーAiryに対応するピンホールを使用して図4B、通常の共焦点像取得と比較して、より高い解像度に現した。この方法は、微分画像図4C、4Eの上で使われる前処理ステップの対象となる共焦点画像よりよく微細管を現す図4B。異なる深さの免疫ラベル付けされた微細管の走査は、免疫ラベル付けされた微細管の複雑な三次元細胞小器官組織の分析を可能とする図4G。MEFは、10FCSを補ったDNEN/F12で成長し、PBSで4のパラホルムアルデヒドで固定され、直接免疫蛍光法で処理された。MEFの微細管は、α-tubulinに対してmAbを使用しSigmaによって供給されたmAbDMIA、続いてAlexa-568複合化ヤギ抗マウス二次抗体インビトロゲンによって供給されるを使用して、免疫標識された。MEFの活性のもの例9は、メーカーの指示によって、リポフェクタミン2000インビトロゲンからとダブルコルチン-GFPフォームドクターケスターでトランスフェクションされた。[例4]本願開示の方法が、活性領域関連のBruchpilotタンパク質BRPに対して免疫標識された、ラベル付けされたシナプス活性領域いわゆるTバーの時系列画像を得るために、ショウジョウバエ神経筋接合部神経筋接合部NMJ生体試料に適用された。上記は、RJKittel他、Science3121051により知られる。三齢野生型ショウジョウバエ幼虫が固定され、Fouquet他、JCellBiol186129により以前に記述された免疫染色の処理をされた。野生型とGFPタグ構成を表す変異体を用いた。以下の抗体とGFPタグ構成が使用された:C末端BRPを認識する単クローン抗体NC82mAbNC82;N末端BRPを認識するポリクローナル抗体BRP-N-term;GFPタグ構成UAS-GluRIIAGAL4ドライバなしのGFPタググルタミン酸塩受容体タイプIIAを表す。二次抗体は、Alexa-488、パシフィックブルーとAlexa-555インビトロゲンからの蛍光染料に接合された。使用されたレーザ線は、青励起のための405nm、緑励起のための488nmと赤励起のための561nmであった。ラベル付けされたシナプスは、小出力の通常の共焦点顕微鏡を用いて300回走査された150mWのレーザモジュールの1が低い漂白率を供給するために使われた。使われた顕微鏡は、ニコン株、東京、日本からのTI2000倒立顕微鏡の上に搭載されたニコンAIR共焦点ユニットであったこの顕微鏡は、1.40のN.A.によるPlanApo60x油浸レンズを備えていた。PlanApo60x油浸レンズは、いくつかの収差、視野平面性、色収差に対して修正される対物レンズである。時系列画像のシーケンシャルなものは、図4で示すように、拡張解像度でBRP点の再構築を可能にするために、引かれた。図4Kは、従来の共焦点レーザ走査型顕微鏡法を使用した結果を示し、図4Lは、本願開示の方法による結果を示す。本願開示図4Lによる結果がBRP-NC82抗原のリング状外観を示すことが明らかに観測される。従来の技術システムにおいて、BRP-NC82抗原のリング状の外観は、Kittel他Science3121051で報告された超解像誘導放射抑制顕微鏡法によってのみ視覚化することができた。さらに、透過型電子顕微鏡TEMに視覚化されたTバーのサイズは、本願開示によって、測定した内リング直径と、非常によく合致する図4M。透過型電子顕微鏡によって視覚化されたTバーのサイズの比較、および、本願開示を、図4Nに示す。ここで、バーPIMPは、本願開示の結果であり、バーEMは、透過型電子顕微鏡を使っている結果である。生体試料の構造が、図40に示される。解剖した三齢野生型幼虫が、KasprowiczetalJCellBiol1821007に以前に記載されたように、TEMのために処理された。シナプスボタンとTバーの電子顕微鏡写真が、00kVで作動するJEOL2100のEM顕微鏡を用いて、得られた。Tバーサイズは、3匹の動物からとられた19のTバーのテーブルトップ長として測定された。本願開示の方法に対して、図4Nで示すTバーの環サイズは、19のTバーの内リング直径として測定された。[例5]本願開示の教示を、ナノスコピックレンジの解像度における多色の画像化に使用することができる。WFouquet他JCellBiol186129から、BRPは、シナプス後グルタミン酸塩受容体クラスタに対して、Tバー内のクラスタで適応することが知られている。三色方法が、ラベルBRP-NとC末端特異抗体とグルタミン酸塩-レセプター-GFP例4と、図4Pおよび4Sで示される隣接ドメインを明確に示すのに用いられた。したがって、複数の色方法は、マクロ分子構造の特別な解像度を可能にする。図40は、Bruchpilotタンパク質および、シナプスのグルタミン酸塩受容体クラスタの組織のモデルを示す。図40で示すこのモデルは、以前提案され、WFouquet他JCellBiol186129の論文に記載されている。しかしながら、WFouquet他JCellBiol186129に記載されたセットアップは、1つの超解像度チャンネルだけを有しており、W.フーケほかの教示による結果は、構造を決定するために、長い時間を要した。図4P、4Qおよび図4Rは、図40に示される特徴の個々の部分の画像を示す。図4Sに、三色チャンネルのオーバーレイが使用された図4P、4Qおよび4Rで示す特徴の完全な組合せが示される。図4Pにおいて、Bruchpilotタンパク質のNC82染色が示されれ、図4L、図4Qにおいて、シナプス後側でグルタミン酸塩受容体を示すように、環構造が示される。図4Rは、BRPのN末端側を示す。図4A-4Gの結果は、本願開示の教示が、三色超解像度測定のために使ることができること、単一の超解像度方法を用いて異なる生体試料を使って考え出されたW.フーケほかによって以前に記述されたモデルを確かめることができることを示す。複数色チャンネルをハイライトする図4P、4Aおよび4Rの結果は、マルチカラー超解像度画像を作るために、本願開示により用いることができ、そしてそれは従来の方法と比較して本願開示の融通性を示す。[例6]本願開示は、3次元での複雑な微小管性ネットワークの画像化を可能にする。その結果は、図4A~4Gに示される。図4Aは、複雑な微小管性ネットワークの共焦点画像を示し、図4Dは、本願開示による、複雑な微小管性ネットワークの画像を示す。図4Aの中のスケールバーは、1μmである図4A~4Gにおいても同一値。図4Dにおいて、本願開示によって、解像度は、従来の技術に比較的に明らかにより大きい。図4Gも、本願開示の方法を用いて、従来の共焦点レーザ走査型顕微鏡によって生成された画像と、本願開示によって生成される画像を組み合わせることよる、三次元画像の生成を図示する。三次元画像が図4Gに示され、3-D-PIMPとして参照される。MEF細胞は、10のウシ胎仔血清FCSを補ったDMEM/F12の細胞培養培地で成長し、リン酸緩衝液PBSで、4のパラホルムアルデヒドで固定された。次に、これは、間接蛍光抗体法で処理された。MEF細胞の微小管は、α-tubulinmAbDMIA、Sigmaに対して単クローン抗体mAb、続いて、Alexa-568複合化ヤギ抗マウス二次抗体インビトロゲンを用いて免疫標識された。RPE細胞は、蛋白REPlp、GM130、GMAP210に対してトリプル免疫染色された。内因性RERlpは、主に、中間コンパートメントICに存在し、Spasic他JCellBiol176629GM130とGMAP210の両方は、シスゴルジの異なったサブドメインに局所化されるCardenas他BMCBiol756。GM130とポリクローナル抗体GMAP210に対する単クローン抗体は、BiosciencesとCardenas他グループによって、それぞれ供給された。純化されたRERlpポリクローナル抗体Spasic他JCellBiol176629は、メーカーの説明によると、Alexafluor-555に直接接合された。GM130とGMAP210は、ヤギ反ウサギと抗マウス二次抗体インビトロゲンをそれぞれ接合したAlexa-488とAlexa-647を用いてラベル付けされた。[例7]本願開示は、図4Tを参照して見られるように決定するために、始原海馬ニューロンのポスト-シナプス部位からプレシナプス部位の区別と解像度を可能にする。また、本願開示の教示もまた、図4Uに参照して見られるように、並設された中間のコンパートメントとRPE細胞のシスゴルジ槽の区別と解像度を可能にする。本願開示発明による結果は、図においてPIMPとして参照され、従来の技術の図では、共焦点として参照される。本願開示による図は、従来の技術の教えにしたがって、生成された図より、より大きな解像度を持つことは、明らかである。RPE細胞は、10のウシ胎仔血清FCSを補ったDMEM/F12の細胞培養培地で成長した。リン酸緩衝液PBSで、4のパラホルムアルデヒドで固定された。始原海馬ニューロンは、胎生期日17ネズミ胚に由来し生体外DIVの17日、完全に区別される21のDIVまで、膠フィーダー層のもとで培養された。固定ニューロンのシナプスは、ポスト-シナプスタンパク質PSD95ポリクローナル抗体pAbB102、インビトロゲンとシナプス前シナプトフィジンSynクローンSVP38Sigmaから生じたmAbに対して抗体で免疫標識され、Alexa-488、Alexa-568接合ヤギ反ウサギマウス二次抗体を用いて視覚化された。蛍光DAPI核酸着色4′、6-ジアミジノ-2-フェニルインドールが、核を染色するのに用いられた。[例8]ゆっくり進行するプロセスをライブでの画像化フレーム:分のために、GFPにタグを付けられたダブルコルチンDCX、MEFs図4H~4Jのニューロン微細管結合タンパク質をもう一度表すことによって、本願開示の方法が使用された。25秒にわたる0.5Hzの微分画像が生成され、1つの時点に、50画像を割り当てた。この時点内において、ミクロ細管を結びつけているフルオロフォアの全てが漂白されたわけではなく、おそらく、続くの時点において、50の画像いわゆるFRAP効果の漂白系列を生成するために使用することができるフルオロフォアの新しいものが、組み込まれた。このように、時間分解能が分の範囲であるが、微細管の成長をモニターすることがライブで、本願開示の方法を用いたナノスコピック解像度であることは、まだ可能である。達成できる時間分解能は、主に描画速度と画像を再構築するために必要な微分画像の数に依存している。しかしながら、PALM画像化とは異なり、再構築のために必要とされる画像の数は非常に少ない。[例9]前記の例は、高いNAレンズ付きの共焦顕微鏡10を用いた、この開示の方法を図示した。ショウジョウバエ神経筋接合部NMJのシナプスボタンにおける後シナプスマーカシンダピンが、異なる対物レンズを用いた広視野システムで、画像化された。図7Aでは、0.45NA20xレンズが使用された。個々のボタンの広視野画像は、場構造として現れる。同じ対物レンズとカメラを使用して、同一領域を多数回画像化し、この開示の教示によってデータを処理することで、シナプス領域の論文を可能にする解像度の増加を現した図7A~7C。1.4NA100xレンズが、また、用いられ図7E、シンダピンのラベルが付いた神経筋接合部NMJの広視野画像が得られた。これらの状況の下の画像化は、シンダピンラベルの後シナプス蓄積を明らかにする。この開示の教示による例の広視野画像の処理は、シンダピンラベルは、DLG/PSD95を含む他のシナプス後性局所化蛋白と同類の並べて置かれたシナプス側の別々の焦点に集中することを示す図7F。これらの所見は、共焦点顕微鏡法を使って確かめられた図7G、7H。[例10]ここで開示した方法は、外科的なセッティングで使われる稼動中の顕微鏡に取り込むことができる。そのような稼動中の顕微鏡は、典型的には、殺菌することが可能で、患者と実質的に直接に接するように配置可能でありえるコンポーネントを含む。患者の関心領域の生物組織は、フルオロフォアのラベルで染めることができ、着色された生物組織は、レーザ光線で照明される。外科医は、モニターで生物組織を見ることができ、取り除かれる必要がある不健康な生物組織を取り除くことができる。一方、実質的に、除去される必要はない健康な組織を保つことができる。例えば、エミッタで腫瘍にラベルをつけることが、できる。健康な組織を保ちつつ、外科医はガン組織を取り出すことができる。[画像化]図7A-Fで得られる画像以外のすべての画像化は、Ti2000の倒立顕微鏡ニコン株式会社、東京に搭載されたNIKONAIR共焦点ユニットを使って実行された。この顕微鏡は、PlanApo60x液浸レンズNA1.40を備えていた。0.1μm小球体ビーズは、ニコン1.4のNA油浸レンズを備えたRadiance2100共焦点顕微鏡を用いて、画像化された。図7A-Dにおいて、0.45のNA20xレンズ付きの広視野システムが使用されたINCellAnalyzer、GEHealthcare。図7E-Fにおいて、63×1.4のNA油浸レンズを備えているツァイス直立部分顕微鏡が使用された。QimagingQICAMカメラサリー、BC、カナダおよび、シャッターは、μManagerソフトウェアにより駆動された。サンプルは、表1にリストされる画像化状況を使って、シーケンシャルに画像化された。画像化状況と抗体希釈レーザ強度は、オフルノバレーザパワーメータを使って測定された。本願発明の種々の実施形態が上で記述されるが、それらは例証として紹介されているのみであり、それらは制限でないことを理解すべきである。発明の要旨を逸脱しない範囲で、形態および細部の種々の変化は、その範囲でなされることができることは当業者にとって明らかである。特許によって保護の望むことは、以下の特許請求の範囲において述べられる。