血行力学的パターンを培養状態の細胞に適用する方法であって、以下の工程を含む方法第1のセットの細胞をトランズウェル上にプレーティングする工程第2のセットの細胞を前記トランズウェル上にプレーティングする工程、ここで、前記第1のセットの細胞は前記第2のセットの細胞から分離される前記トランズウェルに流体を添加する工程一定期間、前記流体の回転を起こす工程、ここで、前記培地はこれによってせん断力を前記第2のセットの細胞に及ぼす。前記第1のセットの細胞および前記第2のセットの細胞が、膜によって分離される、請求項1に記載の方法。前記第1のセットの細胞をインキュベートする工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。前記第2のセットの細胞をインキュベートする工程をさらに含む、請求項3に記載の方法。第3のセットの細胞をプレーティングする工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。前記第2のセットの細胞が、ペトリ皿の底面上にプレーティングされる、請求項5に記載の方法。追加の前記流体を定期的に添加し、トランズウェルから前記流体の一部を定期的に除去する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。追加の前記流体を連続的に添加し、トランズウェルから前記流体の一部を連続的に除去する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。前記流体が薬剤を含む、請求項1に記載の方法。前記一定期間の後に前記第1のセットの細胞および前記第2のセットの細胞を解析する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。前記回転力が、前もって測定された血行力学的パターンに対応する、請求項1に記載の方法。前記第1のセットの細胞が、内皮細胞または平滑筋細胞のいずれかからなる、請求項1に記載の方法。前記第2のセットの細胞が、内皮細胞または平滑筋細胞のいずれかからなる、請求項1に記載の方法。血行力学的パターンを培養状態の細胞に適用する方法であって、以下の工程を含む方法対象の血行力学的パターンをモニターする工程前記血行力学的パターンを電子的指示のセットへとモデル化する工程前記電子的指示に基づいて、トランズウェル上の細胞の複数のセットに対してせん断応力をもたらすために装置を使用する工程。前記モニターする工程が、超音波の使用を含む、請求項14に記載の方法。前記モニターする工程が、磁気共鳴画像法の使用を含む、請求項14に記載の方法。前記せん断応力が、前記血行力学的パターンと連動して一定期間にわたって変動する、請求項14に記載の方法。以下を含む血行力学的流動装置:電子コントローラー前記電子コントローラーを介して操作されるモーター前記モーターによって回転させられる、前記モーターに接続したコーン膜を備えたトランズウェル、ここで、前記コーンは前記トランズウェル中の培地に少なくとも部分的に浸され、前記コーンは前記培地に対して回転力を及ぼす前記トランズウェルに培地を添加するための流入管および前記トランズウェルから培地を回収するための流出管。前記トランズウェルが、膜のいずれかの側に細胞のセットを受け入れることができる、請求項16に記載の装置。前記トランズウェルが、さらなる細胞のセットをペトリ皿の底面において受け入れることができる、請求項17に記載の装置。前記培地が、前記細胞のセットに対してせん断力を及ぼす、請求項17に記載の装置。前記培地が、少なくとも1つの薬剤を含む、請求項16に記載の装置。本発明の概要本発明の一つの側面は、これらに限定されないが、ヒトの循環をモデルとした血行力学的パターンを培養状態のヒト動物細胞に適用するために用いられるインビトロの生体力学モデルである。本モデルは、非観血的磁気共鳴画像法を用いてヒトの循環から直接測定され、コーンの回転を制御するモーターに変換される血行力学的流動パターンを再現する。コーンは流体中に浸され、プレート表面上で増殖する細胞の表面に近接させられる。コーンの回転は、流体上で運動量を変換し、プレートまたは細胞表面に対する経時変化するせん断応力を作り出す。本モデルは、生体内で内皮細胞に対して与えられる生理学的な血行力学的な力を最も密接に模倣し、より単純化された非生理学的流動パターンの適用に限られていたこれまでの流動装置を乗り越える。本発明の別の側面は、市販のトランズウェル共培養皿、例えば75mm直径のトランズウェルを取込むことに向けられている。これは、2つ、3つまたはそれより多くの異なる細胞型を培養皿環境の中で物理的に分離することを可能にし、一方で内側の細胞表面は、シミュレートされた血行力学的流動パターンに曝される。他の重要な改変は、共培養モデルの内側および外側チャンバーの両方へ、培地、薬剤等を別々に且つ独立して供給するための流入管および流出管を含む。外部部品が、生理学的な温度および気体濃度を制御するために用いられる。人工のトランズウェル膜およびペトリ皿の底面による接着細胞の物理的分離は、各々の細胞層または表面を、一連の生物学的解析のために別々に単離することを可能にする。本発明の方向付けされた使用は、1ヒト動物の内皮および平滑筋細胞-血管壁を構成し、アテローム性動脈硬化および他の血管疾患の病理学的進行に関与する、重要な意味を持つ2つの細胞型の間のクロストークを研究することを含む。2このモデルは、新規な薬剤に基づく治療を毒性、炎症および透過性について試験する際の診断モデルとしても用いることができる。本発明に関する様々な態様のいくつかの代表的な新しい側面は、これらに限定されないが、順不同で、以下を含む装置は、アテローム性動脈硬化に感受性の動脈循環、アテローム性動脈硬化保護性の動脈循環、および他の生理学的または病的状態に感受性の患者からの動脈循環における血行力学的せん断応力特性を、最も高いレベルの忠実度で再現することができる。装置は、動脈、静脈またはあらゆる器官の循環から、あらゆる型の測定可能なまたは理想主義的なせん断応力特性を、最も高いレベルの忠実度で再現することができる。膜の反対側で培養された別の細胞型を伴うかまたは伴わない状態での、トランズウェル膜の内側表面に対する血行力学的流動パターンの曝露。トランズウェル皿の底面上で培養された別の細胞型を伴うかまたは伴わない状態での、トランズウェル膜の内側表面に対する血行力学的流動パターンの曝露。膜の反対側で培養された別の細胞型を伴うかまたは伴わない状態で、且つトランズウェル皿の底面上で培養された第3の細胞型を伴うかまたは伴わない状態での、トランズウェル膜の内側表面に対する血行力学的流動パターンの曝露。第3の細胞は、炎症性の細胞接着アッセイのための単球またはマクロファージを含み得る。膜の反対側で培養された別の細胞型を伴うかまたは伴わない状態で、且つトランズウェル膜の内表面の培地中に浮遊した状態の第3の細胞型を伴うかまたは伴わない状態での、トランズウェル膜の内側表面に対する血行力学的流動パターンの曝露。内側チャンバーおよび外側チャンバーの両方のための流入管および流出管を所定の位置に保つために用いられるクランプは、トランズウェルの側面上に乗っている。これは、流動環境を乱すことなく、トランズウェルの上側およびまたは下側チャンバーの培地、生化学的化合物アゴニスト、アンタゴニスト等を別々に灌流により出入りさせるために用いられる。実験から抽出された培地は、いずれかの層からのサイトカインまたは体液性因子の分泌をさらに試験するために用いられ得る。遺伝子アレイ、プロテオミクスを含むプロセシング後の生物学的解析のために、単一の実験から各々の細胞型を独立に単離する能力。装置は、接着性または非接着性のあらゆる種からのあらゆる細胞型を受容し、試験することができる。装置は、胚の血管発達から成人におけるアテローム性動脈硬化の重症例までの全ての局面を研究するための、血管の生物模倣型細胞培養モデルとして用いることができる。例えば、内皮細胞は内側表面にプレーティングすることができ、およびまたは平滑筋細胞はトランズウェル膜の反対側にプレーティングすることができ、およびまたはマクロファージは上側または下側チャンバー中にプレーティングすることができる。装置は、血行力学的条件下での血管ステント材料からの細胞の適合性、細胞接着および表現型調節を試験するために用いることができる。例えば、内皮およびまたは平滑筋細胞は、材料に隣接して、材料の上部にまたは材料の下に播種することができ、装置の固定された表面上に乗せることができる。材料は、これらに限定されないが、金属性ナノポーラス金属、ポリマー、生分解性ポリマー、炭素表面、引っ掻き傷のあるもしくはエッチングされた表面を含む。装置は、細胞の存在下または非存在下で、血行力学的条件下での血管ステント材料からの薬剤の溶出を試験するために用いることができる。装置は、血行力学的条件下でのポリマー性材料で被覆された表面の上にまたは表面に隣接して播種された細胞の適合性、細胞接着および表現型調節を試験するために用いることができる。装置は、血液脳関門の研究のための血管の生物模倣型細胞培養モデルとして用いることができる。例えば、内皮細胞は、内側表面にプレーティングすることができ、およびまたはグリア細胞およびまたはアストロサイトおよびまたはニューロンは、トランズウェル膜の反対側およびまたはペトリ皿の底面にプレーティングすることができる。装置は、喘息の発生および進行の研究のための気道の生物模倣型細胞培養モデルとして用いることができる。例えば、上皮細胞は、内側表面にプレーティングすることができ、およびまたは平滑筋細胞は、トランズウェル膜の反対側にプレーティングすることができ、およびまたはマクロファージは、下側チャンバー中にプレーティングすることができる。律動的な呼吸パターンは、コーンの動きによって分泌のためによく近接して、およびまたはコーンと上皮の表面の間の人工粘膜層によって、模倣される。装置は、内皮細胞および上皮性有足細胞の相互作用を研究するための腎臓の生物模倣型モデルとして用いることができる。装置は、患者の薬剤治療を模倣する特定の体液性環境を作り出すために用いることができ、その後、患者の薬剤治療と併せて既知または未知の薬剤化合物の適合性を決定することができる。例えば、装置は、培地中に薬剤リピトールを伴った状態で特定の時間動かすことができ、次いで、毒性、炎症および透過性の変化を決定するために、未知の薬剤を添加することができる。装置は、薬剤毒性またはいくつかの病態生理学的エンドポイントに連鎖する同定された遺伝子型を有する患者から採取された血管細胞または他の器官細胞型における機能変化を決定するために用いることができる。例えば、薬剤毒性に関連することが同定された一塩基多型を有する患者からの内皮細胞は、新規なまたは既知の化合物を毒性、炎症および透過性の変化について試験するために用いることができる。これは一般に、ファーマコゲノミクスと称される。本発明の一つの態様は、血行力学的パターンを培養状態の細胞に適用する方法であり、前記方法は、第1のセットの細胞をトランズウェル上にプレーティングする工程、第2のセットの細胞を前記トランズウェル上にプレーティングする工程、ここで前記第1のセットの細胞は前記第2のセットの細胞から分離され、流体を前記トランズウェルに添加する工程および一定期間、前記流体の回転を起こす工程を含み、これによって前記培地は前記第2のセットの細胞にせん断力を及ぼす。本発明の別の態様は、血行力学的パターンを培養状態の細胞に適用する方法であり、前記方法は、対象の血行力学的パターンをモニターする工程前記血行力学的パターンを電子的指示のセットへとモデル化する工程および前記電子的指示に基づいて、トランズウェル上の細胞の複数のセットに対してせん断応力をもたらすために装置を使用する工程を含む。本発明の別の態様は、電子コントローラー前記電子コントローラーを介して操作されるモーター前記モーターによって回転させられる、前記モーターに接続したコーン膜を備えたトランズウェル、ここで前記コーンは前記トランズウェル中の培地に少なくとも部分的に浸され、前記コーンは前記培地に対して回転力を及ぼす前記トランズウェルに培地を添加するための流入管および前記トランズウェルから培地を回収するための流出管を含む血行力学的流動装置である。本発明の詳細な説明アテローム性動脈硬化アテローム性動脈硬化は、乱れた、時間平均の低い、振動性の壁せん断応力によって特徴づけられる動脈の領域、例えば分岐および曲率の高い領域において優先的に発達する。生体内のアテローム易発性領域およびインビトロでの内皮に対するアテローム易発性せん断応力は、下流の炎症性標的の活性化および調節によって示される炎症促進性の準備刺激を誘導し得る。ECおよびSMCは、アテローム硬化性の現象を開始する間に表現型調節または転換を受けることが知られている2つの主要な細胞型であるが、ECに対する血行力学的な力がSMCにおけるこの過程を調節するかまたはこれに貢献するか否かについては本発明まで不明であった。ECに適用されるヒト由来アテローム易発性せん断応力は、クロマチンレベルでの後成的な修飾を介して、ECおよびSMCにおける炎症促進性の表現型ならびにSMCにおけるアテローム生成促進性の表現型転換を調節する。これは、メカノトランスクリプショナルカップリングと呼ばれる過程である。本発明の共培養過程からの結果は、血行動態が血管のECおよびSMC準備刺激をアテローム生成促進性の応答へ向けて誘導するという仮説を支持し、それ故、初期のアテローム硬化性現象の研究のための生理学的に関連する新しい生物模倣型血管モデルとしての共培養系の使用を確証する。これらの結果は、これまでに発表されたアテローム性動脈硬化に関連するインビボおよびインビトロの流動研究と一致する。さらに、これまでのECおよびSMCのトランズウェル共培養モデルは、少数の流動研究を除いて静的な実験に制限されており、生理学的に関連するヒト由来の血行力学的流動パターンを採用した既知の研究は無い。脈管構造中の領域をインビボで正確に比較するためのより生理学的に関連するモデルをもたらし、古典的なSMC分化マーカーに焦点を合わせた本発明の過程は、2つの血行力学的流動パターンを直接的に比較することによってこれらの制限を乗り越える。血管疾患におけるSMC表現型調節の特徴は、収縮性の表現型を定義する遺伝子の変化した発現である。SMC分化マーカーおよび分化したSMCを反映するものである転写因子は、アテローム易発性の流動によって影響を受ける。分化マーカーの発現の消失ならびにmRNAおよびタンパク質の両方のレベルでの炎症性マーカーVCAM1の誘導は、アテローム易発性の流動に曝されたECが、アテローム保護性の流動と比較してSMC表現型を異なって調節することを確証した。ChIP解析によって、アテローム易発性に誘導される、CArG依存性のSMC遺伝子発現の消失を開始するメカニズムが、アテローム保護性の流動と比較してSMαAおよびSMMHCのCArGボックス領域へのSRFの結合の減少ならびにヒストンH4の脱アセチル化を含むことが明らかになった。これは初期の増殖応答遺伝子cfosには当てはまらなかった。これらの結果は、PDGFBB処理に対する応答における単一培養のSMC研究と一致し、そしてより重要なことに、急性の血管傷害に対する応答における、インタクトな血管におけるSMαA、SMMHCおよびcfosについての後成的なフィンガープリントとも一致する。したがって、ヒストンH4のアセチル化が、CArGクロマチンプロモーター領域をSRFが接近可能な状態に維持するために重大な意味を持つという一般的なパラダイムは、ECに対して曝露される2つの異なる血行力学的流動パターンによって、異なって調節される。SRFのコアクチベーターであるミオカルディンは、SMC選択性CArG依存性遺伝子の正の調節のためのSRFとの高次の複合体形成において重大な役割を果たす。対照的に、KLF4は、CArG依存性のSMC分化遺伝子のミオカルディン依存性の調節を抑制し得る。ミオカルディン発現は、アテローム易発性の流動に対する応答において有意に減少したが、一方でKLF4は、発現を増大させる傾向があった。KLF4遺伝子発現は、培養されたSMCにおけるPDGFBBへの応答において迅速に且つ一過性に誘導され得、インタクトな血管においては急性の血管傷害の後6時間まで一過性に誘導されて24時間までにベースラインに戻り得ることから、KLF4発現の最大の且つ最も重要な変化は、この時点においては捕獲されなかった可能性がある。それにもかかわらず、この研究において作られた遺伝子プロファイルは、文献からの現存するデータと相関し、総合すると、結果は、アテローム易発性の流動に曝されたSMCの表現型調節が転写レベルで起こり、かつ、良く特徴付けされたSRFミオカルディンおよびKLF4のシグナル伝達の軸を含むことを示唆する。興味深いことに、ECはアテローム易発性の流動において、減少したKLF4発現を示した。KLF4は、単一培養のECにおいて流動によって調節されることが示されてきたしかし、KLF4が、アテローム保護性の流動と比較して、アテローム易発性の流動によって異なって発現することはこれまで知られていなかった。ECにおけるKLF4の機能的重要性は、KLF2の機能的重要性と類似することが最近示された。さらに、KLF4は細胞周期の調節に関与することが示され、より大きな細胞周期活性がアテローム易発性関連のインビトロの流動および生体内の領域について報告された。したがって、KLF4転写の調節は、血管のECおよびSMC増殖の調節において、同等に重要な役割を果たし得る。さらに、ミオカルディンは急性の機械的血管傷害に伴って減少することが示された一方、KLF4は増加し、この過程は、これらの転写因子が初期のアテローム生成現象を模倣するモデルにおいて異なって調節されることの証拠を提供する。アテローム性動脈硬化における生体内の調節は、現在のところ不明である。驚くべき事に、SMMHCは、期待された調節傾向に従わなかった唯一のSMCマーカーであった。これは、RTPCRプライマーによる両方のSMMHCアイソフォームの認識のためであり得る。各々のアイソフォームについての別々の解析は、他のSMCマーカーと一致する応答を解明し得る。より遅い時点での解析は、これを解決し得る。アテローム易発性の流動の存在下におけるECおよびSMCの両方の組み合わされた表現型応答は、ヒトにおいておよびアテローム性動脈硬化の実験モデルにおいて定義された、歴史的なECおよびSMCの表現型特性に著しく類似する。アテローム保護性の流動と比較してのアテローム易発性の流動に対する応答におけるEC遺伝子発現の評価は、類似の流動特性を用いる唯一の単一培養研究ならびに同様の大きさの定常のせん断応力およびアテローム性動脈硬化のインビボのモデルを用いる研究と一致し、血行動態がEC表現型をSMCの存在よりも頑強に調節することを強調する。24時間のアテローム易発性の流動に曝されたECは、eNOS、Tie2およびKLF2の減少に相応する、IL8、VCAM1およびPCNAに関するより高いレベルのアテローム生成促進性および増殖性の遺伝子およびタンパク質を誘導した。eNOSおよびTie2の発現消失は、より高い割合の再構築および増大した透過性、生体内でのアテローム感受性の領域に特有の特徴を示唆する。証拠は、KLF2のおよびおそらくはKLF4の、アテローム保護の上流の転写調節因子としての役割を確立した。アテローム保護性のインビトロの血行動態および生体内の領域は、KLF2発現および転写の制御の鍵となるモジュレーターであると思われる。SMCはまた、増大したVCAM1mRNAレベルによって示される通り、アテローム易発性の流動に対する初期の炎症性応答をも示した。VCAM1調節は、ヒトのアテローム硬化性プラークのSMCにおいて観察され、インビトロおよびインビボでの初期のアテローム発生の間における増殖に関連づけられた。しかし、増殖性マーカーPCNAは、アテローム易発性の流動に関してSMCにおいて変化を示さなかったため、この系の中にはより遊走性のSMC表現型が存在する可能性がある。初期のアテローム発生の間にSMC表現型調節を制御する、ECから分泌される1または複数のサイトカインマイトジェンは、未だ解明される必要があり、候補、例えばPDGFBB、IL1およびIL8を含む。ECが、アテローム易発性の流動の後、IL8mRNAの産生およびIL8の分泌を増大させることをここに示す。実際、IL8は、SMCにおいて遊走性の表現型の誘導を刺激し得る。そのため、ECによるIL8分泌は、SMCがより総合的な表現型を調節する1つのメカニズムであり得る。興味深いことに、アポリポタンパク質Eマウスにおける最近の研究は、実験的に誘導された低いせん断応力が、増殖関連タンパク質αmRNAの増加をもたらすことを示した。しかし、本研究の生体内の性質を考えると、GroαmRNAの変化がECにおけるものか、SMCにおけるものか、またはその両方におけるものかは決定されていなかった。GroαはIL8と同じ受容体に結合するが、IL8のマウスのホモログは存在しない。そのため、ヒト共培養モデルは、EC由来のIL8のSMCに対する役割を調べるのに理想的であり、今後の研究は、かかる相互情報交換メカニズムの相対的寄与を確立するために進行している。アテローム保護性の流動と対比してアテローム易発性の流動において観察される細胞形態の変化も、局在的な下流のアテローム生成応答をもたらし得る初期の再構築の徴候であった。ECは、本発明者らの系において観察される通り、拍動性の生理的状態の下で流動の方向に再配向し、乱流に曝された後により多角形の形を維持することが知られている。しかし、内皮によって感知されるせん断応力に起因するSMCの再配向についての我々の理解は、その最も初期の段階におけるものである。SMCは、アテローム保護性の波形の下では血行力学的流動に対してより垂直に配向するが、一方でアテローム易発性の流動に曝されたSMCは、よりランダムな整列をもたらした。重要なことに、このSMCの配向は、インタクトな血管における、二股の領域、アテローム性動脈硬化に高度に感受性の領域でのSMCの空間的パターン形成とほぼ同一である。総合すると、この事は、血行力学的流動が、別々のアテローム易発性またはアテローム保護性の流動パターンに固有のユニークな制御メカニズムによってECおよびSMCの両方の配向を調節し得ることを示唆する。本発明は、内皮に対して直接に適用されるアテローム保護性またはアテローム易発性のヒトの血行力学的な力が、SMC表現型を調節することができ、SMC再構築に影響を与えることができるということ、すなわちメカノトランスクリプショナルカップリングとして本発明者らが定義した過程を示す、ヒトのECおよびSMCを用いる新規なインビトロの共培養モデルを提示する。さらに、ECおよびSMCにおける表現型のおよび形態的な変更のスナップショットは、内皮に対する血行力学的な力がアテローム発生の重要なモジュレーターであることを示す。図1に示される通り、トランズウェル100が、血行力学的流動過程において用いられる。トランズウェルは、複数の細胞110、120が並行して試験されるのを可能にし、また、多孔質の界面を提供する。共培養へプレーティングするための代表的な過程も知られているしかし、この過程は、当業者に利用可能な過程によって変更され得る。この態様において、SMC110は最初の時点でプレーティングされ、その後にトランズウェルが反転させられる。SMC110が24から48時間の間インキュベートされ、その後にEC120がトランズウェル上にプレーティングされ、インキュベートされる。トランズウェルが挿入されるためのペトリ皿の底は、トランズウェル膜170に直接プレーティングされた細胞型のように、追加の細胞型または同じ細胞型をプレーティングするための第3の表面としても働き得る。図2に示される通り、モーターおよびコーン装置200は、細胞に対してせん断力を適用するために用いられる。モーター230は、コーン240を正確な回転速度で回転させ、いずれかの方向に回転をもたらすことができる。この回転力は、コーンによって液体培地へ適用される。今度はこの培地が、せん断力をトランズウェル膜270上の細胞260へ直接的に適用する。ソフトウェアが、コーンの連続的な動きを制御するためにプログラムされる。このソフトウェアファイルがモーターコントローラーユニットにアップロードされ、次いで、プログラムされたタスクを実行するために、情報がモーターに直接送られる。好ましい態様において、培地は、実験の間、細胞の完全性および健康を維持するために処方される細胞培養ブロスである。処方は制限されず、用いられる細胞型および実験的研究に応じて異なり得る。さらに、薬剤化合物は、最初にまたは流動実験の過程において細胞培養環境中へ灌流されて、この処方の一部であり得る。これは、これらに限定されないが、細胞におけるタンパク質遺伝子の機能を阻害し得、活性化し得または変更し得る化合物を含み得る。一つの態様において、装置は、血行力学的条件下における血管ステント材料からの細胞の適合性、細胞接着および表現型調節を試験するために用いられ得る。例えば、装置の固定された表面上に乗せられた、材料に隣接して、材料の上部に、または材料の下に播種された内皮およびまたは平滑筋細胞。材料は、これらに限定されないが、金属性ナノポーラス金属、ポリマー、生分解性ポリマー、炭素表面、引っ掻き傷のあるもしくはエッチングされた表面を含む。これらの材料は、非分解性ポリマーもしくはコポリマー、例えばポリエチレン酢酸ビニル共重合体およびポリメタクリル酸nブチルをさらに含み、トランズウェル表面上に被覆することができる。これらの材料は、生分解性ポリマーまたはコポリマー、例えばポリ乳酸グリコール酸もしくはホスホリルコリンをさらに含み、トランズウェル表面上に被覆することができる。これらの材料は、ナノポーラス表面修飾、例えばセラミック、金属または他の材料をさらに含み、ナノポーラス表面修飾としてトランズウェル表面に添加することができる。これらの材料は、ミクロポーラス表面修飾、例えばセラミック、金属、物理的エッチングまたはミクロポーラス表面修飾を形成するためにトランズウェル表面に付加される他の材料をさらに含む。本発明の別の態様において、装置は、トランズウェル膜の1または両方の面にプレーティングされた細胞と共に動作し得る。トランズウェル膜の膜部分は、様々な空隙率および厚さを有するあらゆる生物学的なまたは合成の材料を含み得る。同様に、トランズウェル膜を保持および支持する構造は、あらゆる合成の材料で作られ得る。実施例以下は、本発明を用いる方法の例であり、本発明の範囲を本実施例中に記載される正確な方法に限定することを意図するものではない。ヒト細胞の単離および培養初代ヒトECおよびSMCを、臍帯から単離し、展開し、細胞の源として用いた。ヒトECを、前述の通りに臍帯静脈から単離し、その後、前述の通りに同様の方法を用いて静脈からSMCを単離した。ECは継代2において実験に用いられ、SMCは継代10まで実験に用いられ、両者とも、特定のECおよびSMCマーカーの保持に基づいて、基本的なECSMC表現型を保持するよう樹立された。細胞型を、10FBS、2mMLグルタミン、増殖因子10μgmlヘパリン、5μgml内皮細胞増殖サプリメントおよび100Umlペニシリンストレプトマイシンが補充された培地199を用いて、別々に培養および継代した。トランズウェル共培養プレーティング条件図1に示される通り、多孔質のトランズウェル膜を、上面および底面について、01ゼラチンで最初に被覆した。トランズウェルを反転させ、SMCを2時間の間、底面上に10000細胞cm2の密度でプレーティングした。次いでトランズウェルを元に戻し、48時間の間、ウェルを低血清増殖培地中に保持した。次いで、同じ培地条件のもとでさらに24時間の間、ECを膜の上面に80000細胞cm2の密度でプレーティングした。血行力学的流動実験のために、2つの皿を並行して調製した。共培養の血行力学的流動装置および流動パターン図2に示される通り、ヒトの循環からモデル化された動脈の流動パターンを用いるこの過程の新規な共培養インビトロモデルを、ヒトECに適用した。コーンおよびプレート装置の一つのバージョンは、コーンがモーターによって直接的に駆動される直接駆動である。このモデルを、75mm直径のトランズウェル共培養皿を組み込むよう改変した。さらなる改変は、トランズウェル皿を安全に保持するための土台、トランズウェル区画の内側にフィットするためのより小さなコーンならびにECおよびSMC層の両方に対して連続的に培地を交換するための培養流動環境への直接的接近手段を提供する、トランズウェルの内側および外側チャンバーの両方についての流入管および流出管のための特別な取付けブラケットを含んだ。コーンの回転を介して、系はECSMC共培養のEC層に対して血行力学的せん断応力をかける。この過程で用いられる血行力学的流動パターンは、それぞれアテローム保護性のおよびアテローム易発性のせん断応力パターンをインビトロで最善にシミュレートするために、ヒトの総頚動脈および内頚動脈洞のMRIから得られた。2つの血行力学的流動条件を、各々のECSMC亜集団について並行して実行した。図3は、総頚動脈および内頚動脈洞からのヒトの血行力学的流動特性が、トランズウェルのEC表面に対して課された事を示す。リアルタイムRTPCR24時間の血行力学的流動パターンの適用の後、SMCおよびECを、Ca2Mg2を伴うPBSで2回リンスした。膜を保持皿から取り除き、反転させた。小さく柔軟な細胞スクレーパーを用いて、SMCを皿の中心へ向かって穏やかに掻き集めた。次いで、1mlのPBSを用いて細胞を無菌の表面上へすすぎ落とし、その後、細胞を氷上で微量遠心管に移した。膜を反転させ、無菌の表面上に平らに置き、ECを1mlのPBS中で掻き集めた後、氷上で別々の微量遠心管に移した。管を遠心し、PBSを除去した。TRIzol試薬を用いて全RNAを抽出し、iScriptcDNA合成キットを用いて逆転写した。BeaconDesigner20を用いて、平滑筋αアクチン、ミオカルディン、平滑筋ミオシン重鎖、VCAM1、単球走化性タンパク質1、内皮型一酸化窒素合成酵素、アンジオポエチン受容体Tie2、IL8およびクルッペル様転写因子についてプライマーを設計した。表1は、各々のヒト遺伝子について用いられたセンスおよびアンチセンスプライマーを示す。mRNAの発現を、AmpliTaqGold、SYBRgreenおよびiCyclerを用いるリアルタイムRTPCRを介して解析した。ウエスタンブロット解析血管のSMCおよびECを、リアルタイムPCRで記載した通りに回収し、RIPAバッファー中で溶解した。全タンパク質ライセートを、75SDSPAGEゲル上で分離し、ポリビニル誘導体膜上にブロットした。一次抗体SMαA、eNOS、VCAM1およびPCNAを、室温で1時間または4°Cで一晩、ブロットと共にインキュベートした。セイヨウワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体ヤギ抗ウサギ、ヤギ抗マウスおよびロバ抗ヤギを、室温で1時間、ブロットと共にインキュベートした。AlphaImager8900およびAlphaEaseFCソフトウェアを、それぞれブロット画像の獲得および濃度測定解析のために用いた。ELISA共培養されたトランズウェルを調製し、異なる血行力学的環境に曝露した。4、8、12および24時間後に、膜の各チャンバーについて、流動実験の間を通じて灌流された培地を氷上で回収した。その後、ELISAを介してIL8分泌タンパク質についてアッセイされるまで、サンプルを80°Cで保管した。タンパク質の濃度を、分光光度計を用いて450nmで決定し、1時間あたりの回収された培地の体積に対して規準化した。クロマチン免疫沈降アッセイ流動パターンの適用後、クロマチン免疫沈降を、タンパク質DNA相互作用の定量的解析を可能にする改変を伴って、前述の通りに行った。各実験からの流出培地に1ホルムアルデヒドを補充し、次いで、24時間の流動の後すぐに10分間、細胞と共にインキュベートした。抗体は、ウサギポリクローナル抗血清応答因子および抗ヒストンH4アセチル化を包含した。回収されたDNAを、製造者の推奨にしたがって、picogreen試薬を用いて蛍光によって定量化した。リアルタイムPCRを、ChIP実験からの1ngのゲノムDNAについて、小さな改変を伴って前述の通りに行った。リアルタイムPCRプライマーを、SMαA、SMMHC、cfosCArGの5CC6GGエレメントに隣接するように設計した。表1は、ChIP解析のために用いたプライマーを示す。タンパク質DNA相互作用濃縮の定量化を、以下の式によって決定した22、ここで、CtRefは基準閾値サイクルであり、CtIPは免疫沈降物のCtである。ChIPデータは、一緒にプールされ2つ1組で解析された5から6の独立した実験を代表する。免疫蛍光免疫蛍光のために、トランズウェル膜を、表面調製物および横断面の両方について、4パラホルムアルデヒド中で固定した。表面調製物を、02TritonX100中で透過処理した。SMCのための一次抗体を、1切れのパラフィルム上にピペットで滴下しCy3SMαAおよびSMMHC、サンプルウェルを上に置いた。次いで、ECのための一次抗体血管内皮カドヘリンをウェルの内側へ直接添加し、両方の抗体を同時に1時間インキュベートした。同様に、二次抗体Cy2ロバ抗ヤギおよびAlexafluor546ヤギ抗ウサギを必要なだけサンプルに添加し、1時間インキュベートした。46ジアミジノ2フェニルインドールと共にProlongGoldAntifade試薬を大きなカバースリップに添加し、その上にウェルを降ろすことによって、サンプルをマウントした。DAPIの別の液滴をウェルの内側に添加し、22mm直径のカバースリップを上に置いて、凝固させた。画像化を可能にするため、マウントされたサンプルからメスを用いて保持ウェルを取り除いた。z軸を通してEC層からSMC層まで表面サンプルを画像化するために、共焦点顕微鏡法を用いた。横断面を調製するため、ECSMC培養を、上記の方法を用いてファロイジン488またはFM464FXで染色し、30スクロース中に一晩浸漬し、OCT化合物中で凍結させ、クライオスタットを用いて5μm厚の切片にスライスした後、共焦点顕微鏡法による評価のためにマウントした。IF染色されたサンプルを、前述の通りに、共焦点顕微鏡および微分干渉を用いて、静止状態におけるトランズウェル膜の細孔内での細胞間相互作用について解析した。ECSMC配向および形態計測測定流動の方向に対するECおよびSMCの配向を、IF染色されたサンプルの共焦点顕微鏡法を用いて定量化した。血行力学的流動の後、共培養を上記の通りに固定し、75mm直径の皿からの二等辺三角形のサンプルを、皿の中心を向いた三角形の印の頂点と共に切り取った。この方法は、流動の方向に対する正確な配向を確立した。次いで、サンプルを上記の通りに染色し、2つのカバースリップの間にマウントした。画像化のために、流動の方向が全てのサンプルにわたって一貫するよう、三角形の頂点が右を向いた状態でサンプルを共焦点のステージ上に置いた。膜の距離のみによって分離された同じ位置において、ECおよびSMCの画像を撮った。3つの独立した実験にわたって、少なくとも3つの顕微鏡視野を獲得した。MetaMorphソフトウェアを、流動の方向に対して解析された各々の細胞について配向の角度および形状因子を決定するために用いた。細胞型の伸長を決定するため、ECのVEcadおよびβカテニンについてならびにSMCのSMαA、SMMHCおよびβカテニンについて染色された境界の輪郭を描き、面積および周囲長の測定を出力した。SFを、以下の式を用いて算出したSFP2、ここで、Aは細胞の面積であり、Pは周囲長である。ヒストグラム範囲における各々のSFビンに関して、規準化された頻度を得るため、全範囲にわたって、ビンあたりの細胞数を分析された全細胞数に対して規準化した。各条件についてSFの分布を示すため、ヒストグラムをプロットした。配向の角度については、両方の流動パターンからの流動の方向におよびSMCの長軸に沿って線を描き、ECはアテローム保護性の流動についてのみ線を描いた。2つの線の間の角度を、流動方向に対する配向角度として測定し、同じ配向を持つ細胞の頻度が棒の長さとして表されるようヒストグラムをプロットした。データ解析および統計リアルタイムRTPCR結果は、アテローム保護性流動と比較してのアテローム易発性流動のサンプルについてのサイクル増幅回数の誘導倍率として報告され、内因性に発現する遺伝子β2ミクログロブリンに対して規準化される。血行力学的流動パターンと時間の関数として発現レベルまたは形態の変化における有意性を決定するため、スチューデントのt検定をmRNA、配向および伸長のデータについて行った。条件あたり少なくとも3つの独立した実験からのデータを解析のために用い、P005である。図12は、SMCのみがSMαAを発現し、ECのみがeNOSを発現することを確認するタンパク質解析を示す。IB、イムノブロット解析。アテローム易発性の流動は、ECおよびSMC表現型を異なって調節し、炎症促進性の準備刺激を促進する。主要な目的は、ECに適用される示差的なヒト由来血行力学的流動パターンがSMC表現型調節に影響を与えるかどうか決定することであった。この目的を考慮して、ECおよびSMC表現型調節を示す確立されたマーカーにおける変化を、アテローム易発性またはアテローム保護性の流動の適用後24時間、試験した。興味のある遺伝子を、ECもしくはSMC特異的細胞マーカーまたは炎症性マーカーとして分類した。加えて、マーカーのサブセットについてタンパク質解析を行った。遺伝子およびタンパク質の調節を、アテローム保護性の流動と比較して、アテローム易発性の流動における相対的変化によって決定した。一貫して、ECの静止状態のマーカーeNOS、Tie2、KLF2およびKLF4のmRNAレベルにおける有意な減少が、アテローム易発性の流動に対する応答において観察され、それはeNOSのタンパク質レベルにおける変化によっても確認された。これらのECマーカーの調節はこれまで、アテローム性動脈硬化に関連するせん断応力刺激を介して実証されてきたしかし、SMCの存在下での、血行力学的流動パターンに関する、EC表現型のこのような包括的な試験は今まで存在していない。古典的なSMC分化マーカーはこれまで、あらゆるせん断応力刺激に曝された共培養モデルにおける遺伝子調節について解析されたことがない。アテローム性動脈硬化に関連するSMC表現型調節の特徴は、静止状態の収縮性表現型を定義する遺伝子における減少、総合的な表現型に関連する遺伝子における増大、ならびに増殖性および遊走性の現象の開始を包含した。アテローム易発性の流動の存在下において、SMCは、SMC分化マーカーであるSMαAおよびミオカルディンにおいて有意な減少を示した。タンパク質解析によって、SMαAについてのこの観察がさらに確認された。ミオカルディン依存性の転写を抑制するのに重要であることが最近見出された転写因子KLF4は、アテローム保護性の流動と比べてアテローム易発性の流動に関して有意に誘導されなかったが、この傾向はそれでもSMC表現型転換を調節するメカニズムの方向を指し得る。血管傷害はちょうど4時間後にKLF4を最大に誘導したため、24時間の流動においてはKLF4の最大の応答が失われた可能性がある。とりわけSMMHCは、有意には調節されなかった。最も興味深いのは、ECの静止状態のマーカーおよびSMCの収縮性のマーカーにおける減少が、いくつかの炎症促進性遺伝子の上方制御と対応することであった。VCAM1は、ECおよびSMCの両方において、mRNAおよびタンパク質の両方のレベルで有意に上方制御された。NFκB活性化の下流の炎症促進性遺伝子であるIL8における有意な増大も、ECにおいてmRNAレベルで観察された。ECおよびSMC層からのIL8の分泌は、両方の流動パターンの適用の間、時間の関数としてさらに測定され、ECにおけるアテローム易発性の流動のより遅い時点においてのみ、有意に増大した。対照的に、SMCにおいてはIL8およびMCP1における減少が同時に観察された。最後に、増殖性のマーカーPCNAの解析は、アテローム易発性の流動に曝されたECにおける増大したタンパク質レベルを示したが、SMCに関しては変化を示さなかった。SMC応答に対する、流動に誘導されるECの影響について制御するため、SMCを、単一培養において2つの条件下でプレーティングした図17に示される通り、1トランズウェル膜の存在下におけるトランズウェル保持皿の底面上または2トランズウェル膜の底面上。各々の条件について、ECの無い状態でトランズウェル膜の上面に流動を適用した。サンプルのリアルタイムRTPCR解析は、SMαAおよびVCAM1に関しては各々の条件間で有意差が存在し、ミオカルディンに関しては存在しないことを示した。VCAM1は、両方の条件に関して、アテローム易発性の流動によってかなり誘導された唯一の遺伝子であった。ECが存在する状態の実験においては観察されなかった、SMCT条件について導入された潜在的な交絡因子は、流動が適用されているトランズウェルの上面へ多孔質膜を通して突出するという平滑筋細胞の過程であった。各々の条件間の有意な変化は、SMCのその局所環境に対する感受性を示す。このため、本研究に関して、両方の細胞型の存在下で適用された2つの別々の流動パターン間の比較は、血行力学的共培養環境の全ての特性について制御するための最も頑強な方法であった。動脈の血行動態はSMC遺伝子発現の後成的な調節を制御するSMαAおよびSMMHCを含むSMC選択性の収縮性タンパク質をコードする遺伝子のプロモーター領域の多くは、SRFに結合するCArGシス調節性エレメントを含有する。SMαA、SMMHCおよびcfosプロモーターの5CArGプロモーター領域におけるSRFの結合およびヒストンH4アセチル化が血行力学的流動によって後成的なレベルで調節されるかどうか決定するために、ChIP実験を行った。結果は、SMαAおよびSMMHCに関して、アテローム保護性の流動と比較して、アテローム易発性の流動に対する応答におけるヒストンH4アセチル化およびSRF結合の減少を示した。逆に、cfosCArG領域に対するヒストンH4アセチル化およびSRF結合は、流動条件の間で統計的に異ならなかった。この後成的なフィンガープリントは、PDGFBBに対する応答におけるSMCでのインビトロの実験および急性血管傷害に対する応答におけるインビボの実験と同一であった。薬剤薬剤は、アクチノマイシンD、バチマスタット、cmycアンチセンス、デキサメタゾン、パクリタキセル、タキサン、シロリムス、タクロリムスおよびエベロリムス、未分画のヘパリン、低分子量ヘパリン、エノキサパリン、ビバリルジン、チロシンキナーゼ阻害剤、グリベック、ワートマニン、PDGF阻害剤、AG1295、rhoキナーゼ阻害剤、Y27632、カルシウムチャンネルブロッカー、アムロジピン、ニフェジピン、およびACE阻害剤、合成多糖、チクロピジン、ジピリダモール、クロピドグレル、フォンダパリヌクス、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、rウロキナーゼ、rプロウロキナーゼ、rtPA、APSAC、TNKrtPA、レテプラーゼ、アルテプラーゼ、モンテプラーゼ、ラノテプラーゼ、パミテプラーゼ、スタフィロキナーゼ、アブシキシマブ、チロフィバン、オルボフィバン、ゼミロフィバン、シブラフィバン、ロキシフィバン、抗再狭窄剤、抗血栓形成剤、抗生物質、抗血小板剤、抗凝固剤、抗炎症剤、抗腫瘍剤、抗高血圧剤、キレート剤、ペニシラミン、トリエチレンテトラミンジヒドロクロライド、EDTA、DMSA、デフェロキサミンメシレート、コレステロール降下剤、スタチン、HDLを上昇させる剤、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、セレブレックス、ビオックス、放射性造影剤、放射性同位体、プロドラッグ、抗体断片、抗体、生細胞、治療薬送達ミクロスフェアもしくはミクロビーズ、ならびにそれらのあらゆる組み合わせを含む群から選択され得る。当業者は、さらなる利点および改変に容易に気が付くであろう。それ故、そのより広い側面において本発明は、本明細書において示され、説明される特定の詳細および代表的な態様には限定されない。したがって、添付の特許請求の範囲およびそれと等価なものによって定義される通り、一般的発明概念の精神または範囲から逸脱することなく、様々な改変がなされ得る。