"目的のオリゴヌクレオチドの機能性を調節する方法において、i前記目的のオリゴヌクレオチドを、前記目的のオリゴヌクレオチドを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させ、前記目的のオリゴヌクレオチド又は前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの一方又は双方にヌクレオチド配列変化を生じさせるステップにおいて、前記配列変化が前記目的のオリゴヌクレオチドの機能性を調節する、ステップ;又はiiアンチセンスオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした目的のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド複合体に配列変化を生じさせるステップにおいて、前記配列変化が、前記複合体の一部を形成するオリゴヌクレオチドに生じ、前記目的のオリゴヌクレオチドの機能性を調節する、ステップを含む方法。前記アンチセンスオリゴヌクレオチドがDNAである、請求項1に記載の方法。前記機能性が、ターゲット核酸に沿って伸長を起こす目的のオリゴヌクレオチドの能力である、請求項1又は2に記載の方法。前記アンチセンスオリゴヌクレオチドがタンパク質又は核酸分子のいずれかを標的とする、請求項3に記載の方法。前記アンチセンスオリゴヌクレオチドがDNA分子を標的とする、請求項4に記載の方法。前記目的のオリゴヌクレオチドが、プライマー、アプタマー、DNAザイム、リボザイム又はRNアーゼである、請求項4に記載の方法。前記目的のオリゴヌクレオチドが、遺伝子、遺伝子断片、染色体遺伝子転座切断点又は核酸増幅により産生されたDNAである、請求項4又は5に記載の方法。前記アンチセンスオリゴヌクレオチドがプライマーである、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。前記オリゴヌクレオチドをアンチセンスオリゴヌクレオチドの3’末端にハイブリダイズし、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドに沿った前記目的のオリゴヌクレオチドの3’伸長を促進するステップを含む請求項1に記載の方法において、前記目的のオリゴヌクレオチドがそれに沿って伸長する前記アンチセンスヌクレオチド配列が、前記オリゴヌクレオチドの伸長部であって、i前記ターゲット核酸のヌクレオチド配列に相補的であり、それにより前記目的のオリゴヌクレオチドを機能性にするものii前記ターゲット核酸のヌクレオチド配列に対してミスマッチを有し、それにより前記目的のオリゴヌクレオチドを非機能性にするもの;又はiii前記目的のオリゴヌクレオチドの別の領域のヌクレオチド配列に相補的なものであって、前記伸長部が前記目的のオリゴヌクレオチドの前記領域とハイブリダイズし、それによりステム-ループ構造を形成して前記目的のオリゴヌクレオチドを非機能性にするもののいずれかである伸長部を生成する、方法。請求項1に記載の方法において、iアンチセンスオリゴヌクレオチドを前記目的のオリゴヌクレオチドの3’末端にハイブリダイズし、前記目的のオリゴヌクレオチドに沿った前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの3’伸長を促進することにより、前記目的のオリゴヌクレオチドを非機能性にするステップ;又はiiアンチセンスオリゴヌクレオチドの3’末端を前記目的のオリゴヌクレオチドの3’末端とハイブリダイズし、前記目的のオリゴヌクレオチドに沿った前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの3’伸長及び前記アンチセンスオリゴヌクレオチドに沿った前記目的のオリゴヌクレオチドの3’伸長を促進することにより、前記目的のオリゴヌクレオチドを非機能性にするステップ;又はiiiアンチセンスオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした目的のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド複合体を、前記目的のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする領域に対して3’側の領域で前記アンチセンスオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするプライマーと接触させて、前記プライマーの3’伸長を生じさせるステップにおいて、前記プライマーは伸長すると前記目的のオリゴヌクレオチドに置き換わり、前記目的のオリゴヌクレオチドが機能性になる、ステップ;又はivループ状アンチセンスオリゴヌクレオチドの直鎖状3’鎖を伸長するステップであって、3’直鎖状鎖は5’直鎖状鎖とハイブリダイズするが、但し5’直鎖状鎖は3’直鎖状鎖より長く、且つ前記目的のオリゴヌクレオチドと相補的な一本鎖領域であって、前記目的のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする一本鎖領域を含むステップにおいて、前記3’直鎖状鎖は前記一本鎖領域に沿って伸長すると前記目的のオリゴヌクレオチドに置き換わり、前記目的のオリゴヌクレオチドが機能性になる、ステップ;又はv直鎖状アンチセンス鎖と目的のオリゴヌクレオチドとの間のステム-ループ核酸分子又は二重鎖のいずれかの前記直鎖状アンチセンス鎖を選択的に分解するステップであって、その分解により前記相補的な直鎖状の目的のオリゴヌクレオチド鎖が一本鎖になり、それにより機能性になるステップ;又はviTmが低い目的のオリゴヌクレオチドをアンチセンスオリゴヌクレオチドとハイブリダイズし、前記目的のオリゴヌクレオチドの伸長を生じさせるステップにおいて、前記伸長した目的のオリゴヌクレオチドがTmの上昇を生じ、それにより機能性になる、ステップ;又はviiアンチセンスオリゴヌクレオチドの3’末端にハイブリダイズした目的のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド複合体と、前記目的のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする領域の3’側で前記アンチセンスオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする第2のオリゴヌクレオチドとを接触させて、前記目的のオリゴヌクレオチドと前記第2のオリゴヌクレオチドとの間にライゲーションを生じさせるステップにおいて、前記目的のオリゴヌクレオチドの機能性が調節される、ステップを含む方法。核酸増幅、シングルチューブネステッド増幅、PCR、等温増幅、一本鎖DNAの産生において用いられる、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。アプタマー、DNAザイム、又はリボザイムの機能性を制御するために用いられる、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。前記核酸増幅方法が、ターゲットDNAを増幅する方法であって、iDNA試料を、a前記ターゲットDNAを標的とする第1のフォワードプライマー及び前記ターゲットDNAを標的とする第1のリバースプライマー;及びb前記ターゲットDNAを標的とする第2のフォワードプライマーであって、前記第1のフォワードプライマーが標的とする配列の下流に位置する核酸配列を標的とする第2のフォワードプライマー;及び前記ターゲットDNAを標的とする第2のリバースプライマーであって、前記第1のリバースプライマーが標的とする配列の上流に位置する核酸配列を標的とする第2のリバースプライマー;及びc前記プライマーの1つ又は複数を標的とする、それにより前記プライマーの機能性が調節可能である、以上に定義するとおりの1つ又は複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させるステップにおいて、前記部分b及びcの分子を、ステップiiの増幅の前、その最中、又はその後に、但しステップiiiの増幅の前に反応に加えることができる、ステップ;及びii前記第1のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件であって、しかし前記第2のプライマーの伸長は可能にしない条件下で、ステップiの前記DNA試料を増幅するステップ;及びiiiステップiiの前記DNA試料を、前記第2のプライマーを機能性にする条件に供するステップ;及びiv前記第2のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件であって、しかし前記第1のプライマーとのアンチセンスオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに起因して前記第1のプライマーの伸長は可能にしない条件下で、ステップiiiの前記DNA試料を増幅するステップを含む方法である、請求項11に記載の方法。前記核酸増幅方法が、ターゲットDNAを増幅する方法であって、iDNA試料を、a前記ターゲットDNAを標的とする第1のフォワードプライマー及び前記ターゲットDNAを標的とする第1のリバースプライマー;及びb前記ターゲットDNAを標的とする第2のフォワードプライマーであって、前記第1のフォワードプライマーが標的とする配列の下流に位置する核酸配列を標的とする第2のフォワードプライマー前記ターゲットDNAを標的とする第2のリバースプライマーであって、前記第1のリバースプライマーが標的とする配列の上流に位置する核酸配列を標的とする第2のリバースプライマー;及びc前記プライマーの1つ又は複数を標的とする、それにより前記プライマーの機能性が調節可能である、以上に定義するとおりの1つ又は複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、前記第1のプライマーを標的とするそのアンチセンスオリゴヌクレオチドが5’核酸タグ配列を含み、そのタグの相補的ヌクレオチド配列が、前記プライマーに対するハイブリダイゼーション部位の5’末端に隣接するDNA領域のヌクレオチド配列に対してミスマッチを有する、アンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させるステップにおいて、前記部分b及びcの分子を、ステップiiの増幅の前、その最中、又はその後に、但しステップiiiの増幅の前に反応に加えることができる、ステップ;及びii前記第1のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件であって、しかし前記第2のプライマーの伸長は可能にしない条件下で、ステップiの前記DNA試料を増幅するステップ;及びiiiステップiiの前記DNA試料を、前記第2のプライマーを機能性にする条件に供するステップ;及びiv前記第2のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件であって、しかし前記タグ付きアンチセンスオリゴヌクレオチドに沿った前記第1のプライマーの伸長に起因して前記第1のプライマーによる増幅は可能にしない条件下で、ステップiiiの前記DNA試料を増幅するステップを含む方法である、請求項11に記載の方法。前記核酸増幅方法が、ターゲットDNAを増幅する方法であって、iDNA試料を、a前記ターゲットDNAを標的とする第1のフォワードプライマー及び前記ターゲットDNAを標的とする第1のリバースプライマー;及びb前記ターゲットDNAを標的とする第2のフォワードプライマーであって、前記第1のフォワードプライマーが標的とする配列の下流に位置する核酸配列を標的とする第2のフォワードプライマー前記ターゲットDNAを標的とする第2のリバースプライマーであって、前記第1のリバースプライマーが標的とする配列の上流に位置する核酸配列を標的とする第2のリバースプライマー;及びc前記プライマーの1つ又は複数を標的とする、それにより前記プライマーの機能性が調節可能である、以上に定義するとおりの1つ又は複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、前記第1のプライマーを標的とするそのアンチセンスオリゴヌクレオチドが5’核酸タグ配列を含み、そのタグの相補的ヌクレオチド配列が同じプライマーの別の領域のヌクレオチド配列に対して相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させるステップにおいて、前記部分b及びcの分子を、ステップiiの増幅の前、その最中、又はその後に、但しステップiiiの増幅の前に反応に加えることができる、ステップ;及びii前記第1のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件であって、しかし前記第2のプライマーの伸長は可能にしない条件下で、ステップiの前記DNA試料を増幅するステップ;及びiiiステップiiの前記DNA試料を、前記第2のプライマーを機能性にする条件に供するステップ;及びiv前記第2のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件であって、しかし前記タグ付きアンチセンスオリゴヌクレオチドに沿った前記第1のプライマーの伸長に起因して前記第1のプライマーによる増幅は可能にしない条件下で、ステップiiiの前記DNA試料を増幅するステップを含む方法である、請求項11に記載の方法。前記核酸増幅方法が、ターゲットDNAを増幅する方法であって、iDNA試料を、a前記ターゲットDNAを標的とする第1のフォワードプライマー及び前記ターゲットDNAを標的とする第1のリバースプライマー;及びb前記ターゲットDNAを標的とする第2のフォワードプライマーであって、前記第1のフォワードプライマーが標的とする配列の下流に位置する核酸配列を標的とする第2のフォワードプライマー前記ターゲットDNAを標的とする第2のリバースプライマーであって、前記第1のリバースプライマーが標的とする配列の上流に位置する核酸配列を標的とする第2のリバースプライマー;及びc前記プライマーの1つ又は複数を標的とする、それにより前記プライマーの機能性が調節可能である、以上に定義するとおりの1つ又は複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドの1つ又は複数が前記第1のプライマーの3’末端にハイブリダイズし、且つ前記プライマーに沿って3’方向に伸長可能である、アンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させるステップにおいて、前記部分b及びcの分子を、ステップiiの増幅の前、その最中、又はその後に、但しステップiiiの増幅の前に反応に加えることができる、ステップ;及びii前記第1のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件であって、しかし前記第2のプライマーの伸長は可能にしない条件下で、ステップiの前記DNA試料を増幅するステップ;及びiiiステップiiの前記DNA試料を、前記第2のプライマーを機能性にする条件に供するステップ;及びiv前記第2のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件であって、しかし前記プライマーに沿った前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの伸長に起因して前記第1のプライマーによる増幅は可能にしない条件下で、ステップiiiの前記DNA試料を増幅するステップを含む方法である、請求項11に記載の方法。前記核酸増幅方法が、ターゲットDNAtを増幅する方法であって、iDNA試料を、a前記ターゲットDNAを標的とする第1のフォワードプライマー及び前記ターゲットDNAを標的とする第1のリバースプライマー;及びb前記ターゲットDNAを標的とする第2のフォワードプライマーであって、前記第1のフォワードプライマーが標的とする配列の下流に位置する核酸配列を標的とする第2のフォワードプライマー前記ターゲットDNAを標的とする第2のリバースプライマーであって、前記第1のリバースプライマーが標的とする配列の上流に位置する核酸配列を標的とする第2のリバースプライマーであって、前記ターゲットDNAのヌクレオチド配列に対してミスマッチを有する3’タグを含むこれらの第2のプライマー;及びc前記プライマーの1つ又は複数を標的とする、それにより前記プライマーの機能性が調節可能である、以上に定義するとおりの1つ又は複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、前記アンチセンスオリゴヌクレオチド配列の1つが、前記第2のプライマーの3’領域と相補的な5’領域と、前記プライマー結合部位に隣接する前記ターゲットDNAの配列と比べて相補的な相補配列を有するさらに5’側の領域との双方を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させるステップにおいて、前記部分b及びcの分子を、ステップiiの増幅の前、その最中、又はその後に、但しステップiiiの増幅の前に反応に加えることができる、ステップ;及びii前記第1のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件であって、しかし前記第2のプライマーの伸長は可能にしない条件下で、ステップiの前記DNA試料を増幅するステップ;及びiiiステップiiの前記DNA試料を、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドに沿った前記第2のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件に供するステップ;及びiv前記目的のDNA領域に沿った前記第2のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件であって、しかし前記第1のプライマーとのアンチセンスオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに起因して前記第1のプライマーの伸長は可能にしない条件下で、ステップiiiの前記DNA試料を増幅するステップを含む方法である、請求項11に記載の方法。本明細書及びそれに続く特許請求の範囲の全体を通じて、文脈上特に必要でない限り、語句~を含むcomprise、並びに~を含むcomprises及び~を含むcomprisingなどの変化形は、記載される完全体integer若しくはステップ又は一群の完全体若しくはステップを包含し、しかし任意の他の完全体若しくはステップ又は一群の完全体若しくはステップを排除するものではないことを含意するものと理解され得る。本明細書で使用されるとき、用語~に由来するは、特定の完全体又は一群の完全体が、指示される種を起源としているが、必ずしもその指示された供給源から直接得られたとは限らないことを示すと解釈されるものとする。さらに、本明細書で使用されるとき、a、and及びtheの単数形は、文脈上特に明確に指示されない限り複数形の指示対象を含む。特に定義しない限り、本明細書で使用される科学技術用語は全て、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。本発明の一態様は、目的のオリゴヌクレオチドの機能性を調節する方法に関し、前記方法は、i前記目的のオリゴヌクレオチドを、前記目的のオリゴヌクレオチドを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させ、目的のオリゴヌクレオチド又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの一方又は双方にヌクレオチド配列変化を生じさせるステップにおいて、前記配列変化が目的のオリゴヌクレオチドの機能性を調節する、ステップ;又はiiアンチセンスオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした目的のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド複合体に配列変化を生じさせるステップにおいて、前記配列変化が、前記複合体の一部を形成するオリゴヌクレオチドに生じ、目的のオリゴヌクレオチドの機能性を調節する、ステップを含む。別の実施形態において、本発明は、ターゲット核酸に沿って伸長を起こすプライマーの能力を調節する方法に関し、前記方法は、i前記プライマーを、前記プライマーを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させ、プライマー又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの一方又は双方にヌクレオチド配列変化を生じさせるステップにおいて、前記配列変化がプライマー機能性を調節する、ステップ;又はiiプライマーであって、前記プライマーを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするプライマーを含むオリゴヌクレオチド複合体に配列変化を生じさせるステップにおいて、前記配列変化が、前記複合体の一部を形成するオリゴヌクレオチドに生じ、プライマー機能性を調節する、ステップを含む。本発明のさらなる態様は、ターゲット核酸に沿って伸長を起こす目的のオリゴヌクレオチドの能力を調節する方法に関し、前記方法は、前記オリゴヌクレオチドをアンチセンスオリゴヌクレオチドの3’末端にハイブリダイズし、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドに沿った前記目的のオリゴヌクレオチドの3’伸長を促進するステップを含み、ここで前記目的のオリゴヌクレオチドがそれに沿って伸長するアンチセンスヌクレオチド配列は、前記オリゴヌクレオチドの伸長部であって、iターゲット核酸のヌクレオチド配列に相補的であり、それにより前記目的のオリゴヌクレオチドを機能性にするもの;iiターゲット核酸のヌクレオチド配列に対してミスマッチを有し、それにより前記目的のオリゴヌクレオチドを非機能性にするもの;又はiii前記目的のオリゴヌクレオチドの別の領域のヌクレオチド配列に相補的なものであって、前記伸長部が前記目的のオリゴヌクレオチドの前記領域とハイブリダイズし、それによりステム-ループ構造を形成して前記目的のオリゴヌクレオチドを非機能性にするもののいずれかである伸長部を生成する。別の態様において、目的のオリゴヌクレオチドの機能性を調節する方法が提供され、前記方法は、iアンチセンスオリゴヌクレオチドを前記目的のオリゴヌクレオチドの3’末端にハイブリダイズし、前記目的のオリゴヌクレオチドに沿った前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの3’伸長を促進することにより、前記目的のオリゴヌクレオチドを非機能性にするステップ;又はiiアンチセンスオリゴヌクレオチドの3’末端を前記目的のオリゴヌクレオチドの3’末端とハイブリダイズし、前記目的のオリゴヌクレオチドに沿った前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの3’伸長及び前記アンチセンスオリゴヌクレオチドに沿った前記目的のオリゴヌクレオチドの3’伸長を促進することにより、前記目的のオリゴヌクレオチドを非機能性にするステップ;又はiiiアンチセンスオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした目的のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド複合体を、目的のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする領域に対して3’側の領域で前記アンチセンスオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするプライマーと接触させて、前記プライマーの3’伸長を生じさせるステップにおいて、前記プライマーは伸長すると前記目的のオリゴヌクレオチドに置き換わり、前記目的のオリゴヌクレオチドが機能性になる、ステップ;又はivループ状アンチセンスオリゴヌクレオチドの直鎖状3’鎖を伸長するステップであって、3’直鎖状鎖は5’直鎖状鎖とハイブリダイズするが、但し5’直鎖状鎖は3’直鎖状鎖より長く、且つ前記目的のオリゴヌクレオチドと相補的な一本鎖領域であって、前記目的のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする一本鎖領域を含むステップにおいて、前記3’直鎖状鎖は前記一本鎖領域に沿って伸長すると前記目的のオリゴヌクレオチドに置き換わり、前記目的のオリゴヌクレオチドが機能性になる、ステップ;又はv直鎖状アンチセンス鎖と目的のオリゴヌクレオチドとの間のステム-ループ核酸分子又は二重鎖のいずれかの前記直鎖状アンチセンス鎖を選択的に分解するステップであって、その分解により相補的な直鎖状の目的のオリゴヌクレオチドの鎖が一本鎖になり、それにより機能性になるステップ;又はviTmが低い目的のオリゴヌクレオチドをアンチセンスオリゴヌクレオチドとハイブリダイズし、前記目的のオリゴヌクレオチドの伸長を生じさせるステップにおいて、前記伸長した目的のオリゴヌクレオチドがTmの上昇を生じ、それにより機能性になる、ステップ;又はviiアンチセンスオリゴヌクレオチドの3’末端にハイブリダイズした目的のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド複合体と、目的のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする領域の3’側で前記アンチセンスオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする第2のオリゴヌクレオチドとを接触させて、前記目的のオリゴヌクレオチドと前記第2のオリゴヌクレオチドとの間にライゲーションを生じさせるステップにおいて、前記目的のオリゴヌクレオチドの機能性が調節される、ステップを含む。一実施形態において、前記核酸はDNAである。別の実施形態において前記目的のオリゴヌクレオチドは、タンパク質又は核酸分子のいずれかであるターゲット分子を標的とする。別の実施形態において前記目的のオリゴヌクレオチドの機能性は、プライマー、アプタマー、DNAザイム、RNアーゼ又はリボザイムとしての機能性である。別の実施形態においてターゲットDNAを増幅する方法が提供され、前記方法は、iDNA試料を、a前記ターゲットDNAを標的とする第1のフォワードプライマー及び前記ターゲットDNAを標的とする第1のリバースプライマー;及びb前記ターゲットDNAを標的とする第2のフォワードプライマーであって、前記第1のフォワードプライマーが標的とする配列の下流に位置する核酸配列を標的とする第2のフォワードプライマー;及び前記ターゲットDNAを標的とする第2のリバースプライマーであって、前記第1のリバースプライマーが標的とする配列の上流に位置する核酸配列を標的とする第2のリバースプライマー;及びc前記プライマーの1つ又は複数を標的とする、それにより前記プライマーの機能性が調節可能である、以上に定義するとおりの1つ又は複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させるステップであって、部分b及びcの分子を、ステップiiの増幅の前、その最中、又はその後に、但しステップiiiの増幅の前に反応に加えることができる、ステップ;及びii前記第1のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件であって、しかし前記第2のプライマーの伸長は可能にしない条件下で、ステップiのDNA試料を増幅するステップ;及びiiiステップiiのDNA試料を、前記第2のプライマーを機能性にする条件に供するステップ;及びiv前記第2のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件であって、しかし前記第1のプライマーとのアンチセンスオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに起因して前記第1のプライマーの伸長は可能にしない条件下で、ステップiiiのDNA試料を増幅するステップを含む。さらに別の実施形態において、本発明はターゲットDNAを増幅する方法に関し、前記方法は、iDNA試料を、a前記ターゲットDNAを標的とする第1のフォワードプライマー及び前記ターゲットDNAを標的とする第1のリバースプライマー;及びb前記ターゲットDNAを標的とする第2のフォワードプライマーであって、前記第1のフォワードプライマーが標的とする配列の下流に位置する核酸配列を標的とする第2のフォワードプライマー前記ターゲットDNAを標的とする第2のリバースプライマーであって、前記第1のリバースプライマーが標的とする配列の上流に位置する核酸配列を標的とする第2のリバースプライマー;及びc前記プライマーの1つ又は複数を標的とする、それにより前記プライマーの機能性が調節可能である、以上に定義するとおりの1つ又は複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、前記第1のプライマーを標的とするそのアンチセンスオリゴヌクレオチドが5’核酸タグ配列を含み、そのタグの相補的ヌクレオチド配列が、前記プライマーのハイブリダイゼーション部位の5’末端に隣接するDNA領域のヌクレオチド配列に対してミスマッチを有する、アンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させるステップであって、部分b及びcの分子を、ステップiiの増幅の前、その最中、又はその後に、但しステップiiiの増幅の前に反応に加えることができる、ステップ;及びii前記第1のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件であって、しかし前記第2のプライマーの伸長は可能にしない条件下で、ステップiのDNA試料を増幅するステップ;及びiiiステップiiのDNA試料を、前記第2のプライマーを機能性にする条件に供するステップ;及びiv前記第2のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件であって、しかし前記タグ付きアンチセンスオリゴヌクレオチドに沿った前記第1のプライマーの伸長に起因して前記第1のプライマーによる増幅は可能にしない条件下で、ステップiiiのDNA試料を増幅するステップを含む。さらに別の実施形態において、本発明はターゲットDNAを増幅する方法に関し、前記方法は、iDNA試料を、a前記ターゲットDNAを標的とする第1のフォワードプライマー及び前記ターゲットDNAを標的とする第1のリバースプライマー;及びb前記ターゲットDNAを標的とする第2のフォワードプライマーであって、前記第1のフォワードプライマーが標的とする配列の下流に位置する核酸配列を標的とする第2のフォワードプライマー前記ターゲットDNAを標的とする第2のリバースプライマーであって、前記第1のリバースプライマーが標的とする配列の上流に位置する核酸配列を標的とする第2のリバースプライマー;及びc前記プライマーの1つ又は複数を標的とする、それにより前記プライマーの機能性が調節可能である、以上に定義するとおりの1つ又は複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、前記第1のプライマーを標的とするそのアンチセンスオリゴヌクレオチドが5’核酸タグ配列を含み、そのタグの相補的ヌクレオチド配列が同じプライマーの別の領域のヌクレオチド配列に対して相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させるステップであって、部分b及びcの分子を、ステップiiの増幅の前、その最中、又はその後に、但しステップiiiの増幅の前に反応に加えることができる、ステップ;及びii前記第1のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件であって、しかし前記第2のプライマーの伸長は可能にしない条件下で、ステップiのDNA試料を増幅するステップ;及びiiiステップiiのDNA試料を、前記第2のプライマーを機能性にする条件に供するステップ;及びiv前記第2のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件であって、しかし前記タグ付きアンチセンスオリゴヌクレオチドに沿った前記第1のプライマーの伸長に起因して前記第1のプライマーによる増幅は可能にしない条件下で、ステップiiiのDNA試料を増幅するステップを含む。さらになお別の実施形態において、ターゲットDNAを増幅する方法が提供され、前記方法は、iDNA試料を、a前記ターゲットDNAを標的とする第1のフォワードプライマー及び前記ターゲットDNAを標的とする第1のリバースプライマー;及びb前記ターゲットDNAを標的とする第2のフォワードプライマーであって、前記第1のフォワードプライマーが標的とする配列の下流に位置する核酸配列を標的とする第2のフォワードプライマー前記ターゲットDNAを標的とする第2のリバースプライマーであって、前記第1のリバースプライマーが標的とする配列の上流に位置する核酸配列を標的とする第2のリバースプライマー;及びc前記プライマーの1つ又は複数を標的とする、それにより前記プライマーの機能性が調節可能である、以上に定義するとおりの1つ又は複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドの1つ又は複数が前記第1のプライマーの3’末端にハイブリダイズし、且つ前記プライマーに沿って3’方向に伸長可能である、アンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させるステップであって、部分b及びcの分子を、ステップiiの増幅の前、その最中、又はその後に、但しステップiiiの増幅の前に反応に加えることができる、ステップ;及びii前記第1のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件であって、しかし前記第2のプライマーの伸長は可能にしない条件下で、ステップiのDNA試料を増幅するステップ;及びiiiステップiiのDNA試料を、前記第2のプライマーを機能性にする条件に供するステップ;及びiv前記第2のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件であって、しかし前記プライマーに沿った前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの伸長に起因して前記第1のプライマーによる増幅は可能にしない条件下で、ステップiiiのDNA試料を増幅するステップを含む。なおもさらに別の実施形態において、ターゲットDNAtを増幅する方法が提供され、前記方法は、iDNA試料を、a前記ターゲットDNAを標的とする第1のフォワードプライマー及び前記ターゲットDNAを標的とする第1のリバースプライマー;及びb前記ターゲットDNAを標的とする第2のフォワードプライマーであって、前記第1のフォワードプライマーが標的とする配列の下流に位置する核酸配列を標的とする第2のフォワードプライマー前記ターゲットDNAを標的とする第2のリバースプライマーであって、前記第1のリバースプライマーが標的とする配列の上流に位置する核酸配列を標的とする第2のリバースプライマーであって、ターゲットDNAのヌクレオチド配列に対してミスマッチを有する3’タグを含むこれらの第2のプライマー;及びc前記プライマーの1つ又は複数を標的とする、それにより前記プライマーの機能性が調節可能である、以上に定義するとおりの1つ又は複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、前記アンチセンスオリゴヌクレオチド配列の1つが、前記第2のプライマーの3’領域に相補的な3’領域と、プライマー結合部位に隣接するターゲットDNAの配列に対して相補的な相補配列を有するより5’側の領域との双方を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させるステップであって、部分b及びcの分子を、ステップiiの増幅の前、その最中、又はその後に、但しステップiiiの増幅の前に反応に加えることができる、ステップ;及びii前記第1のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件であって、しかし前記第2のプライマーの伸長は可能にしない条件下で、ステップiのDNA試料を増幅するステップ;及びiiiステップiiのDNA試料を、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドに沿った前記第2のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件に供するステップ;及びiv目的のDNA領域に沿った前記第2のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件であって、しかし前記第1のプライマーとのアンチセンスオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに起因して前記第1のプライマーの伸長は可能にしない条件下で、ステップiiiのDNA試料を増幅するステップを含む。本発明は、一部には、反応に関与する1つ又は複数のオリゴヌクレオチドの誘導性の不活性化又は活性化を可能にするアンチセンス技法の設計に基礎を置いている。例えば、ネステッド増幅反応との関連においてオリゴヌクレオチドがプライマーである場合に、一定した最適レベルの効率性を維持するシングルチューブネステッドPCR法を設計することができる本発明の方法は極めて有用である。この開発により、プライマーベースの技法との関連においてこれまで不可能であった一定の制御性及びロバスト性が可能となった。さらにまた、増幅方法との関連において、この方法は熱的及び等温的の双方の核酸増幅反応に適用可能である。従って、本発明の一態様は、目的のオリゴヌクレオチドの機能性を調節する方法に関し、前記方法は、i前記目的のオリゴヌクレオチドを、前記目的のオリゴヌクレオチドを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させ、目的のオリゴヌクレオチド又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの一方又は双方にヌクレオチド配列変化を生じさせるステップにおいて、前記配列変化が目的のオリゴヌクレオチドの機能性を調節する、ステップ;又はiiアンチセンスオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした目的のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド複合体に配列変化を生じさせるステップにおいて、前記配列変化が、前記複合体の一部を形成するオリゴヌクレオチドに生じ、目的のオリゴヌクレオチドの機能性を調節する、ステップを含む。目的のオリゴヌクレオチドに対する言及は、それに関する機能性を制御又は修飾しようとする任意のDNA又はRNA分子を指すものと理解されなければならない。そのため、機能性に対する言及は、例えば伸長を起こすプライマーとして働くことによるか、核酸ターゲット又は他のターゲット分子とハイブリダイズすることによるか、又は核酸酵素として働くことにより、ターゲット分子との会合に対して、又はそれにおいて働きを果たすオリゴヌクレオチドの能力を指すものと理解されなければならない。~を調節するに対する言及は、オリゴヌクレオチドの新しい機能の獲得を指すか、或いは既存の機能レベルに変化を生じさせることを指すものと理解されなければならず、それは、遊離しているすなわちハイブリダイズされていないオリゴヌクレオチドの濃度の変化を生じさせることによるか、又はその配列若しくは構造の変化により達成され得る。目的のオリゴヌクレオチドがプライマーである限りにおいて、いくつかのシナリオでプライマーがそのターゲット核酸とハイブリダイズし得るが伸長できない場合、当該のプライマーは本発明との関連では非機能性と見なされることが理解されなければならない。目的のオリゴヌクレオチドとは、その機能性との関連において、相補的な分子領域、最も一般的にはターゲット核酸領域とハイブリダイズすることが特に求められるものである。これは、限定はされないが、プローブベースの技法サザンブロット法など、プライマーベースの技法核酸増幅など、核酸伸長、及びターゲットと結合する、及び/又はターゲットを修飾するオリゴヌクレオチドが関与する反応目的のオリゴヌクレオチドがアプタマー、DNAザイム又はリボザイムとして働く場合などを含め、多様な異なるタイプの反応との関連において行われ得る。一実施形態において、前記目的のオリゴヌクレオチドはプライマーである。この実施形態によれば、本発明は、ターゲット核酸に沿って伸長を起こすプライマーの能力を調節する方法に関し、前記方法は、i前記プライマーを、前記プライマーを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させ、プライマー又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの一方又は双方にヌクレオチド配列変化を生じさせるステップにおいて、前記配列変化がプライマー機能性を調節する、ステップ;又はiiプライマーであって、前記プライマーを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするプライマーを含むオリゴヌクレオチド複合体に配列変化を生じさせるステップにおいて、前記配列変化が、前記複合体の一部を形成するオリゴヌクレオチドに生じ、プライマー機能性を調節する、ステップを含む。ターゲット分子に対する言及は、前記目的のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ又は結合する分子を指すものと理解されなければならない。ターゲット分子は任意の非タンパク質性分子又はタンパク質性分子、例えば核酸又はタンパク質であり得る。しかしながらターゲット核酸分子はアンチセンスオリゴヌクレオチドではなく、又は前記目的のアンチセンスオリゴヌクレオチドを伸長若しくはライゲーションの鋳型として使用する別のプライマーではないことは理解されなければならない。ターゲット分子が核酸、例えば増幅しようとする核酸である限りにおいて、核酸の目的の領域又はターゲット核酸に対する言及は、増幅又はプローブしようとするDNA又はRNAの任意の領域を指すものと理解されなければならない。これは、遺伝子、遺伝子の一部又は遺伝子間領域であり得る。そのため、遺伝子に対する言及は、完全長タンパク質であるにしろ、又はタンパク質断片であるにしろ、タンパク質産物をコードするDNA分子を指すものと理解されなければならない。染色体DNAに関しては、遺伝子はイントロン及びエクソンの双方の領域を含み得る。しかしながら、目的のDNAがベクターDNA又は逆転写されたmRNAである場合に起こり得るように、目的のDNAがcDNAである限りにおいて、イントロン領域は存在しないこともあり得る。しかしかかるDNAは5’又は3’非翻訳領域を含み得る。従って、遺伝子に対する言及は、本明細書では、例えばゲノムDNA及びcDNAを含め、タンパク質又はタンパク質断片をコードする任意の形態のDNAを包含するものと理解されなければならない。対象とする目的の核酸領域はまた、いずれの特異的遺伝子とも会合しないことが知られるゲノムDNAの非コード部分であってもよい一般に称されるところのジャンクDNA領域など。それは、ゲノムDNAの2つの領域間か、又はゲノムDNAの1つの領域とウイルス若しくは導入配列などの外来DNAの領域との間のいずれかに組換え産生されるゲノムDNAの任意の領域であってもよい。それは、一部又は全体が合成的又は組換え的に生成された核酸分子の領域であってもよい。対象とする目的の核酸領域はまた、ポリメラーゼ連鎖反応PCRを含む任意の核酸増幅方法により予め増幅されたDNAの領域であってもよいすなわちそれは増幅法により生成されたものである。対象とする核酸領域又はオリゴヌクレオチドは、DNA若しくはRNA又はその誘導体若しくは類似体であってもよい。目的の領域がタンパク性分子をコードするDNA配列である場合、それは、ゲノムDNA、mRNA転写物から生成されたcDNA、又は核酸増幅により生成されるDNAの形態をとり得る。しかしながら対象とするDNAがタンパク質をコードしない場合、ゲノムDNA又は合成的若しくは組換え的に生成されたDNAのいずれも分析の対象となり得る。当業者であれば理解するであろうとおり、合成的に生成されたDNA及び組換え的に生成されたDNAのいずれもまた、タンパク質の全て又は一部をコードし得る。しかしながら、対象とする方法が目的のRNA領域に関する場合、通常は初めに、RT-PCRを使用するなどしてRNAをDNAに逆転写することが必要となり得ることは理解されるであろう。対象とするRNAは任意の形態のRNA、例えばmRNA、一次RNA転写物、リボソームRNA、トランスファーRNA、マイクロRNAなどであってもよい。好ましくは、前記目的の核酸領域は、目的のDNA領域である。そのため、前記DNAには、最終的に分析の対象となるRNAから逆転写により生成されるDNA、及びPCRなどの核酸増幅法によって生成されるDNAが含まれる。従って、本発明の別の態様は、目的のDNAオリゴヌクレオチドの機能性を調節する方法に関し、前記方法は、i前記目的のオリゴヌクレオチドを、前記目的のオリゴヌクレオチドを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させ、目的のオリゴヌクレオチド又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの一方又は双方にヌクレオチド配列変化を生じさせるステップにおいて、前記配列変化が目的のオリゴヌクレオチドの機能性を調節する、ステップ;又はiiアンチセンスオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした目的のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド複合体に配列変化を生じさせるステップにおいて、前記配列変化が、前記複合体の一部を形成するオリゴヌクレオチドに生じ、目的のオリゴヌクレオチドの機能性を調節する、ステップを含む。一実施形態において、前記目的のオリゴヌクレオチドは、タンパク質又は核酸分子のいずれかであるターゲット分子に関する。別の実施形態において、前記目的のオリゴヌクレオチドは、プライマー、アプタマー、DNAザイム、リボザイム又はRNアーゼである。本発明はより詳細には、ターゲットDNAに沿って伸長を起こすプライマーの能力を調節する方法を提供し、前記方法は、i前記プライマーを、前記プライマーを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させ、プライマー又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの一方又は双方にヌクレオチド配列変化を生じさせるステップにおいて、前記配列変化がプライマー機能性を調節する、ステップ;又はiiプライマーであって、前記プライマーを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするプライマーを含むオリゴヌクレオチド複合体に配列変化を生じさせるステップにおいて、前記配列変化が、前記複合体の一部を形成するオリゴヌクレオチドに生じ、プライマー機能性を調節する、ステップを含む。DNAに対する言及は、デオキシリボ核酸又はその誘導体若しくは類似体を指すものと理解されなければならない。この点について、cDNA及びゲノムDNAを含むあらゆる形態のDNAが包含されることが理解されなければならない。本発明の核酸分子は、天然に存在するもの生体試料に由来し得るものなど、組換え産生されるもの、又は合成的に産生されるものを含め、任意の起源であってよい。誘導体に対する言及は、天然の、合成の、又は組換え的な供給源からの前記DNAの断片、相同体又はオルソログに対する言及を含むものと理解されなければならない。機能的誘導体は、DNAの機能的活性の任意の1つ又は複数を呈する誘導体として理解されなければならない。前記DNA配列の誘導体には、他のタンパク質性又は非タンパク質性分子と融合したDNA分子の特定の領域を有する断片が含まれる。本明細書で企図される類似体としては、限定はされないが、その化学的構成又はコンホメーション全体の修飾など、ヌクレオチド又は核酸分子の修飾が挙げられる。これには、例えば、新規の又は修飾されたプリン又はピリミジン塩基の取り込み、又はヌクレオチド又は核酸分子が他のヌクレオチド又は核酸分子と例えば骨格形成又は相補的塩基対ハイブリダイゼーションのレベルで相互作用する方法に対する修飾が含まれる。ヌクレオチド又は核酸分子のビオチン化又は他の形態の標識は、本明細書で定義されるとおりの機能的誘導体の例である。好ましくは、前記DNAは遺伝子若しくは遺伝子断片、染色体遺伝子転座切断点又は事前の核酸増幅、例えばPCRにより産生されるDNAである。目的のDNAは化学的に合成されてもよく、又は限定はされないが、任意の動物、植物、細菌又はウイルスを含む任意の生物のDNA又はRNAから誘導されてもよい。本発明をいずれの理論又は作用様式にも限定することなく、オリゴヌクレオチド機能性がアンチセンス技法により制御され得ることが見出された。具体的には、オリゴヌクレオチドの機能性例えばプライマーのハイブリダイズする、又は伸長を起こす能力が調節されるようにオリゴヌクレオチド又はアンチセンス分子のいずれかに配列変化を生じさせることと併せたアンチセンス分子の使用に基づき、プライマーなどのオリゴヌクレオチドの機能性の不活性化及び/又はその後の活性化のいずれかを行う方法が開発された。これに関連して伸長に対する言及は、ハイブリダイズする鋳型に沿って3’核酸伸長を起こすようにポリメラーゼに誘導される当該のプライマーの能力を指すものと理解されなければならない。かかる伸長反応は、主にPCRなどの核酸増幅反応との関連において利用される。しかしながら当業者は、プライマー伸長反応について一本鎖DNAの産生などの他の適用もあることを理解するであろう。配列変化は任意の好適な手段により生じさせることができ、それらの手段としては例えばアンチセンス分子の使用が挙げられ、このアンチセンス分子は、ターゲットへのハイブリダイゼーションに続いて伸長する又は逆に機能的プライマーが現れるよう分解され得るオリゴヌクレオチドの能力を直接遮断するか、又はそれ自体が伸長を起こし、若しくはオリゴヌクレオチド伸長の鋳型を形成することによりプライマーの機能性を同様に制御する。古典的なPCRでは、プライマー及び反応条件は、フォワードプライマー及びリバースプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長が最大効率で、又はそれに近い効率で起こり、従ってアンプリコンの数がサイクル毎にほぼ二倍となり、効率的な指数関数的増幅をもたらすように設計される。最適効率を実現するには適切な濃度のプライマーが重要である。連続反応において2つ以上のプライマーセットが使用される場合、DNA増幅のより高い特異性を達成することができる。このように、結合部位が第1のセットの結合部位より内側に位置するプライマーを使用してさらなる増幅を行うことにより、ターゲット以外の範囲から増幅される任意の非特異的産物の影響を最小限に抑えることができる。全てのプライマーの特異性が組み合わされ、通常は単一の産物がもたらされる。ネステッドPCRは逐次的な一連の個別反応として実施することができ、又は単一の反応容器で実施することもできる。シングルチューブネステッドPCR反応の魅力は明らかであるものの、この手法は、異なる増幅ラウンド間の効率性に一貫性がないなどの問題を抱えており、それが量的な結果の達成が求められた場合に大きい制約となっている。異なるプライマーセットから順番に増幅を生じさせるため、先行技術の方法の多くにおいて主に中心となっているのは、外側プライマーの濃度を下げるとともに第1段階に高いアニーリング温度を、且つ第2段階により低い温度を含む方法である。しかしながら増幅の効率性は異なるプライマーセット間にあるとおり著しい差があり、そのためこの方法の有用性は限られている。従って、本発明のネステッドPCRの実施形態との関連では、外側プライマーが伸長を起こしている間は内側プライマーが不活性化され得る。その後外側プライマーを、それとハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して不活性化することができ、その間、反応の条件の変化によるか、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドと内側プライマーとの間のハイブリダイゼーション若しくはそれらの解離によるかのいずれかにより、内側プライマー機能性が回復される。この相互作用は数多くの方法のいずれで行われてもよく、それらの方法については以下でさらに詳細に考察する。アンチセンスオリゴヌクレオチドが外側及び/又は内側プライマーとハイブリダイゼーションすると遊離プライマーの濃度が低下し、次にそれによって当該プライマーのDNAターゲット鋳型とのハイブリダイゼーションが非効率となり得る一方、解離は逆の効果を及ぼし得る。ハイブリダイゼーションは複数の変数に左右される。アンチセンスオリゴヌクレオチドのプライマーとのハイブリダイゼーションの強さ及び程度は、その配列及び長さ、ハイブリダイゼーションを低下させる、或いは増加させる任意のミスマッチ又は修飾の存在、オリゴヌクレオチドの濃度及びアニーリング温度又は時間に依存し得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドの最も3’側の塩基がプライマーの最も5’側の塩基とハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドを除き、アンチセンスオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションはその3’方向への伸長を生じる。これにより、後続のサイクルの間により強力にハイブリダイズし得るより長いアンチセンスオリゴヌクレオチドが産生され得る。オリゴヌクレオチドに対する言及は、ヌクレオチド、又はその機能的誘導体若しくは類似体の配列を含む任意の分子を指すものと理解されなければならない。プライマーに対する言及は、核酸ターゲットとハイブリダイズする機能を有し、且つ伸長又はライゲーション反応を起こす実際の又は潜在的な機能を有するオリゴヌクレオチドを指すものと理解されなければならない。アンチセンスオリゴヌクレオチドに対する言及は、その一部又は全てが目的のオリゴヌクレオチドの一部又は全てと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを指すものと理解されなければならない。オリゴヌクレオチド、プライマー又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは非核酸成分を含み得ることは理解されなければならない。例えば、オリゴヌクレオチド、プライマー又はアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、非核酸タグ、例えば蛍光タグ又は酵素タグ、又は分子のプローブとしての使用を促進するか、又はその他の形でその検出若しくは固定化を促進する他の何らかの非核酸成分も含み得る。オリゴヌクレオチド、プライマー又はアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、さらなる核酸成分も含み得る。別の例では、オリゴヌクレオチド、プライマー又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、核酸側鎖を呈するペプチド骨格を含むタンパク質核酸であってもよい。好ましくは、前記プライマーはDNAプライマーである。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、目的のオリゴヌクレオチド、例えばプライマー又はプローブとハイブリダイズするように設計される。従って、~を標的とするとは、アンチセンスオリゴヌクレオチドが対象とする目的のオリゴヌクレオチドのある領域とハイブリダイズすることを意味する。従ってアンチセンスオリゴヌクレオチドは目的のオリゴヌクレオチドの一部のみにわたってハイブリダイズしてもよく、又はそれは目的のオリゴヌクレオチドの完全長にわたりハイブリダイズしてもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチドと称されるが、この用語の使用には、プライマーなどの対象とする目的のオリゴヌクレオチドとのアンチセンスのハイブリダイゼーションを可能にするようにこのアンチセンスのヌクレオチド配列が設計されることを示す意図があることが理解されなければならない。また、アンチセンスオリゴヌクレオチドについて記載するために本明細書で使用される命名法に関して、目的のオリゴヌクレオチドの3’末端にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドの末端はアンチセンスオリゴヌクレオチドの5’末端と称され、一方で他方の末端がアンチセンスオリゴヌクレオチドの3’末端であることも理解されなければならない。本発明をいずれの理論又は作用様式にも限定することなく、本発明の反応は、反応中に存在する目的のオリゴヌクレオチドの数及び調節することが意図されるその機能に応じて、1種の、或いは2種以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用するように設計され得る。また、ネステッド増幅反応との関連において、利用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは1つ以上のフォワードプライマー又は1つ以上のリバースプライマーのいずれを標的としてもよいことも理解されなければならない。別の代替例において反応は、1つ以上のフォワードプライマーを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドと1つ以上のリバースプライマーを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドとの双方を使用するように設計されてもよい。一態様において、本発明の方法は、アンチセンス:目的のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションイベントを、それらの分子の一方又はその複合体と会合する別のオリゴヌクレオチド分子のいずれかに配列変化を生じさせて目的のオリゴヌクレオチドの機能性を最終的に調節するための基礎として用いることに基づく。~を調節する又は調節に対する言及は、ターゲット分子とハイブリダイズ又は結合すること及び/又はヌクレオチド伸長を起こすことが可能な目的のオリゴヌクレオチドが非機能性にされること、又はその逆が起こること、すなわちターゲット分子とのハイブリダイゼーション又は結合及び/又は伸長を起こすことができない点で不活性な目的のオリゴヌクレオチドが機能性にされることを意味することが意図される。後者の状況では、目的のオリゴヌクレオチドは本発明の方法の増幅によって不活性にされたものであっても、又は最初からその形態で産生されたものであってもよく、その後適切な時点で機能性にされ得る。そのため、ヌクレオチド配列変化に対する言及は、変化イベント以前の配列と比べたときのオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列に対する任意の変化を指すものと理解されなければならず、限定はされないが、目的のオリゴヌクレオチド、アンチセンス分子又はその他の、オリゴヌクレオチド複合体のオリゴヌクレオチド形成部分のヌクレオチド伸長、1つ以上のヌクレオチドの突然変異又は付加又は欠失、又は核酸分子の分解が含まれる。このヌクレオチド配列変化を達成する方法としては、限定はされないが、以下が挙げられる:本発明の一態様におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、プライマーなどのハイブリダイズした機能的な目的のオリゴヌクレオチドがそれに対して伸長し、それによって非機能性になるか、又はその逆が起こる鋳型を提供することに基づき機能する。これはより具体的には以下のとおり説明される:iアンチセンスオリゴヌクレオチド上の5’タグプライマーの伸長を阻害するこの機構は、プライマーの3’末端にハイブリダイズするようにアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計すること、及びアンチセンスオリゴヌクレオチドの5’末端にオリゴヌクレオチドタグまた本明細書では同義的にオリゴヌクレオチド伸長部とも称されるを配置することに基づく。この機構の概略図を図1に示す。プライマーがタグ付きアンチセンスオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすると、プライマーは3’方向に伸長する。この二重鎖の解離後、伸長したプライマーは相補的な鋳型鎖とハイブリダイズし得る。鋳型に沿って効率的に伸長させるため、プライマー伸長部の配列は、その伸長部とハイブリダイズする鋳型鎖の当該配列と相補的でなければならず、そうなるには、オリゴヌクレオチドタグの配列は伸長部とハイブリダイズする鋳型鎖の当該配列と同じでなければならない。しかしながら、オリゴヌクレオチドタグの配列が、伸長部とハイブリダイズする鋳型鎖の当該配列と異なる場合、さらなる伸長及び増幅が起こることはなく、すなわちプライマーは不活性化されたことになり得る。結果として、サイクル数の増加に伴い徐々にプライマー分子の不活性化が起こり、この現象は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの外側プライマーとのハイブリダイゼーションにより生じる直接的な阻害効果と相乗的に作用する。当業者は、タグの本質的な特性が、伸長したプライマーが続く増幅において働くことができないようにプライマーを3’伸長させるための鋳型として働くことであることを理解するであろう。これは、正常なヌクレオチドか、或いは修飾されたヌクレオチド、例えばイソデオキシシトシン又はイソデオキシグアニンのいずれかなどの5’アンチセンスオリゴヌクレオチドタグを含むことにより達成することができる反応には相補的なヌクレオチドが存在しなければならない。オリゴヌクレオチドタグの配列と伸長部にハイブリダイズし得る鋳型鎖の配列との違いが大きいほど、プライマーの不活性化の程度が大きくなる。特に効率的な不活性化は、オリゴヌクレオチドタグの配列を伸長部にハイブリダイズし得る鋳型鎖の当該配列と正確に相補的にすることによってもたらされる。従って、増幅反応が進むに従い、熱サイクリング中の繰り返されるアニーリングによるか、或いは等温反応の一定温度にある間のアニーリングにより、一部のアンチセンスオリゴヌクレオチド分子がプライマーとハイブリダイズし得る。ハイブリダイズしたプライマー分子はタグに沿って3’方向に伸長し、タグの配列は伸長したプライマーの3’末端がここで対応する鋳型配列とミスマッチを有するように選択されている。従って伸長したプライマー分子は、なおも核酸鋳型とハイブリダイズすることはできるが、伸長はできない。従って反応が進むに従い、プライマー分子は徐々に不活性化され、増幅に至ることができない。オリゴヌクレオチドタグに対する言及は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドに連結されるヌクレオチド配列を指すものと理解されなければならない。一実施形態において、タグは1~10塩基長、好ましくは2~5塩基長、及びより好ましくは2~3塩基長である。対象とするタグは、タグの配列に相補的なヌクレオチド配列がプライマーの3’末端のハイブリダイゼーション部位の5’側DNA領域のヌクレオチド配列に対してミスマッチを有するように設計される。ミスマッチを有するとは、タグの配列が、プライマーのアンチセンスオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション及びタグに沿ったプライマーの伸長の後に、伸長したプライマーのうち元のプライマーに対応する部分のみが目的のDNA領域とハイブリダイズすることができ、伸長部分は目的のDNA領域とのそのハイブリダイゼーションを促進しない配列となるようなものであることを意味する。このように、このプライマーの3’末端は目的のDNA領域とハイブリダイズすることができないため、増幅中のこのプライマーのいかなるそれ以上の伸長も阻害される。従って、プライマーがアンチセンスオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすると、プライマーは3’方向に伸長し、このように修飾されるプライマーが続いてそのアンプリコン鋳型とハイブリダイズするときに3’方向への効率的な伸長を阻止する末端配列を生じる。反応の過程では、アニーリング温度の変化又は一定のアニーリング温度にある間の時間的経過のいずれかに起因して、アンチセンスオリゴヌクレオチドとプライマーとがハイブリダイズし、プライマーが伸長してその鋳型とのミスマッチを生じ、このミスマッチは伸長を阻止する。iiステム-ループの形成によるプライマーの不活性化この機構の概略図を図2に示す。アンチセンスオリゴヌクレオチドの5’タグの配列は、それに沿ってプライマーが伸長すると、伸長したプライマーの3’末端の配列が同じプライマーの別の配列と相補的になるように選択される。この状況では、伸長したプライマーの3’末端はループ状に折り返し、その相補配列とハイブリダイズすることが可能となる。相補配列がプライマーの5’末端まで延在しない場合、プライマーの3’末端はプライマーの5’末端に到達するまでプライマーに沿って伸長することができる。いずれの場合にもステム-ループ構造が作られ、ステムの2本のアーム間のハイブリダイゼーション強度を決定するステムの長さ及び配列に応じて、ステム-ループ構造が解けてプライマーがその鋳型とハイブリダイズする能力が阻害される。伸長したプライマーの3’領域がどのようにプライマーの5’領域とハイブリダイズし、次に伸長してステム-ループのより長いステムを形成するかについての例を図11に示す。このようなプライマーの修飾は、反応中にアニーリング温度が変化することにより生じ得るか、又は一定のアニーリング温度にある時間経過において起こり得る。ステム-ループ構造が生じることによるプライマーの不活性化は、プライマーを不活性化してそれがその鋳型又はゲノムの他の領域とハイブリダイズすることを阻止することが所望される場合に特に価値を有し得る。これは、内側プライマーの結合部位が外側プライマーの結合部位と部分的に重複するときに、この状況では外側プライマーの任意のハイブリダイゼーションが、それが伸長できないことにより不活性であっても内側プライマーのハイブリダイゼーションを阻害し得るため、有用であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドの5’タグが伸長したプライマーのステム-ループ構成を作り出すように設計されるとき、ほぼ全ての場合において伸長したプライマーの配列は、ステム-ループが解けて伸長したプライマーがその鋳型と結合してもなおミスマッチが存在し、伸長したプライマーを不活性とするような配列である。iiiタグ付きプライマーの再機能化この機構の概略図を図5に示す。理解され得るとおり、上記の項目iに記載するプライマーは、プライマーの伸長によってプライマーハイブリダイゼーション部位の一部と比べてミスマッチを有するヌクレオチド配列が導入されるため、非機能性となり得る。かかるプライマーは、項目iに記載する方法により生成されるにしろ、又は他の方法で合成的若しくは組換え的に産生されるにしろ、プライマーの3’末端にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、但しその配列が目的の核酸領域の配列に対応するさらなるオリゴヌクレオチドタグを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して、再活性化することができる。このタグに沿ったプライマーの伸長を促進することにより伸長したプライマー分子が生成され、この分子は、その5’末端及び3’末端に、目的の核酸領域と相補的な配列の領域を含む。ミスマッチを有する介在配列は相補領域と比べて十分に短く、従ってそのミスマッチを有する介在配列にもかかわらず、目的のDNA領域とのプライマーのハイブリダイゼーション及び続く伸長が可能である。従ってプライマーは、最初はその3’末端に鋳型とミスマッチを有する2つ以上のヌクレオチドが存在するため不活性である。アンチセンスオリゴヌクレオチドとプライマーとがハイブリダイズすると、プライマーはオリゴヌクレオチドタグに沿って伸長し、その配列は、ここでプライマーの伸長部の配列が鋳型と一致するような配列である。ivTm調節によるプライマーの活性化アンチセンスオリゴヌクレオチドに沿った伸長によりプライマーを活性化する別の変形例を、Tmの調節により達成することができる。この機構の概略図を図7に示す。未変性プライマーのTmは、その鋳型及びアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれとのハイブリダイゼーションも非効率的となるように設計される。しかしながら次第に時間の経過に伴いプライマー分子はアンチセンスオリゴヌクレオチドとハイブリダイズして伸長し、そのTmが上昇するため効率的なプライマーとなる。アンチセンスオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションは鋳型とのハイブリダイゼーションと競合するが、鋳型と一致するプライマーの5’オーバーハングにより、鋳型とのハイブリダイゼーションが優先されることが確実となる。本発明の第2の態様に関して、目的のオリゴヌクレオチドの機能性の制御はアンチセンス分子それ自体の伸長又は分解に基づく。本質的に、この方法を用いることで、プローブ又はプライマーとして機能し得る遊離型の目的のオリゴヌクレオチドの濃度を上昇させるか、或いは低下させることができる。具体的には:i目的のオリゴヌクレオチドの3’末端にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用増幅反応が進むに従い、熱サイクル中の繰り返されるアニーリングによるか、或いは等温反応の一定温度にある間のアニーリングにより、一部のアンチセンスオリゴヌクレオチド分子が目的のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズし、目的のオリゴヌクレオチドに沿って3’方向に伸長し得る。この機構の概略図を図3に示す。これらの伸長したアンチセンスオリゴヌクレオチドは目的のオリゴヌクレオチドとさらに強力にハイブリダイズし、時間とともにその数が徐々に増加し得る。結果として目的のオリゴヌクレオチドの阻害が高まり、遊離型の目的のオリゴヌクレオチドの数が減少するために目的のオリゴヌクレオチド活性が徐々にオフに切り換わる。この方法に対する変形例ではその概略図を図4に示す、目的のオリゴヌクレオチド及びさらなる5’タグを組み込むアンチセンスオリゴヌクレオチド構造の使用を伴い、アンチセンスオリゴヌクレオチド及び目的のオリゴヌクレオチドの双方の伸長がもたらされ、より強固にハイブリダイズされる二重鎖が生じる。5’タグの配列は、伸長した目的のオリゴヌクレオチドがその鋳型とミスマッチを有し、それにより目的のオリゴヌクレオチドが伸長してもプライマーの鋳型との結合性が向上しないことが確実となるような配列であり得る。iiオリゴヌクレオチド複合体さらに別の実施形態では、アンチセンス分子がオリゴヌクレオチド複合体の一部を形成してもよい。オリゴヌクレオチド複合体とは、2つ以上の会合したオリゴヌクレオチドを含む複合体を意味する。本発明との関連において、さらなるオリゴヌクレオチドが複合体と会合してもよく、或いは、複合体の一部を形成する1つ以上のオリゴヌクレオチドが解離又は分解してもよいことは理解されなければならない。また、対象とする複合体は、ハイブリダイゼーションにより会合される別個のオリゴヌクレオチド、又は例えばリン酸ジエステル結合若しくは他の化学結合によってつなぎ合わされ単一の配列を形成し、次にはそれがステム-ループ構造を形成し得るオリゴヌクレオチドに対する言及を含むことも理解されなければならない。従ってこの複合体は、機能的に区別される領域を有する単一のDNA鎖を含む。例えば、複合体はステム-ループ構造の形態をとってもよく、ここでこの構造の一端には目的のオリゴヌクレオチドがある一方、他端にはアンチセンス配列がある。この構造のアンチセンス末端が折り返されて目的のオリゴヌクレオチド末端とハイブリダイズする場合、アンチセンスハイブリダイゼーションが起こっている。従って、アンチセンスオリゴヌクレオチドは目的のオリゴヌクレオチドと別個の分子であってもよく、又は上述のとおり、目的のオリゴヌクレオチドに結合しているか、若しくは他の形でそれと連続していてもよいことが理解されなければならない。その概略図を図6に示す一例において、目的のオリゴヌクレオチドの活性化は置換プライマーを使用して達成され得る。オリゴヌクレオチド複合体は当初、アンチセンス分子とハイブリダイズするプライマー分子などの目的のオリゴヌクレオチドを含む。従って目的のオリゴヌクレオチドは、最初はアンチセンス分子にハイブリダイズされているため不活性である。複合体に置換プライマーが導入されると、それがアンチセンス分子とハイブリダイズして伸長を起こし、それにより目的のオリゴヌクレオチドに置き換わる。それにより遊離型の目的のオリゴヌクレオチドが機能性になる。目的のオリゴヌクレオチドの分解を回避するため、置換プライマーのポリメラーゼ媒介性伸長は置換活性を有しなければならないが、5’-3’ヌクレアーゼ活性を有してはならない。その概略図を図8aに示す別の例において、目的のオリゴヌクレオチドの活性化はアンチセンスオリゴヌクレオチドの分解により達成され得る。オリゴヌクレオチド複合体は当初、潜在的に分解可能なアンチセンス分子とハイブリダイズするプライマー分子などの目的のオリゴヌクレオチドを含む。従って目的のオリゴヌクレオチドは、最初はアンチセンス分子にハイブリダイズされているため不活性である。アンチセンス配列は1つ又は複数のリボヌクレオチド又は修飾リボヌクレオチドを含み得る。それを含む場合、ジヌクレオチド結合の加水分解速度が増加し得る。リボヌクレオチド加水分解速度は、反応にRNアーゼA又はRNアーゼHなどのリボヌクレアーゼを二価陽イオンと共に導入するか、又は反応にテルビウムなどのランタニドの陽イオンを導入することによりさらに増加し得る。アンチセンス配列が徐々に加水分解すると目的のオリゴヌクレオチドが遊離し、次第にその活性が増加し得る。ステム-ループオリゴヌクレオチド複合体の特徴としては、限定はされないが、以下を挙げることができる:a目的のオリゴヌクレオチド、並びにステムの3’鎖が5’鎖とハイブリダイズしているステム-ループ構造を有するように設計されるオリゴヌクレオチドであって、但し5’鎖が3’鎖より長く、且つ目的のオリゴヌクレオチドと相補的な一本鎖領域であって、従って任意の遊離型の目的のオリゴヌクレオチド分子とハイブリダイズしてそれを不活性化することが可能な一本鎖領域を含むオリゴヌクレオチド。従ってステムの5’鎖がアンチセンス配列であり、目的のオリゴヌクレオチド分子を非機能性にする。この機構の概略図を図9に示す。しかしながらこれは動的な状況であり、ステムは開いたり閉じたりし、目的のオリゴヌクレオチドは結合したり解離したりする。従ってステム-ループ分子の3’伸長を促進するように増幅サイクルを設計することができる。サイクル毎にアンチセンス分子が伸長して大きいステムが生じ、これは後続のサイクルで開くことはない。従って目的のオリゴヌクレオチド分子はハイブリダイズすることができず、その目的のDNA領域に結合可能となる。ここでもまた、ステムのポリメラーゼ媒介性3’伸長は5’-3’ヌクレアーゼ活性を有するべきでないことが求められる。二次的なアンチセンス配列を有するステム-ループ構造を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドが利用される場合、ミニステムの長さ及びTmは、反応が進むに従い二次アンチセンス配列の3’伸長が起こり、それによりアンチセンスオリゴヌクレオチド全体が伸長したステムを有する明確なステム-ループ構造を形成するように選択される。従ってアンチセンス活性は徐々に失われ、目的のオリゴヌクレオチド活性が徐々に増加する。bステムの3’鎖が目的のオリゴヌクレオチド配列を有し、ステムの5’鎖がアンチセンス配列を有するステム-ループ構造を有するように設計されるオリゴヌクレオチドは、有効に機能するために必要な折り畳まれていない構造と比べてステム-ループ構造の方がエネルギー的にはるかに有利であるため、機能性のオリゴヌクレオチドとして働くことができない。しかしながら、アンチセンスオリゴヌクレオチド及び目的のオリゴヌクレオチドは単一のステム-ループ分子の一部であるものの、ステムのアンチセンス部分は潜在的に分解性である。当初、目的のオリゴヌクレオチド配列はステム-ループ構造によってアンチセンス配列と強力にハイブリダイズしている。この機構の概略図を図8bに示す。時間の経過に伴い、徐々にアンチセンス配列の分解が起こり、ステム-ループ構造が消失する結果としてここで目的のオリゴヌクレオチド配列が遊離し、その鋳型とハイブリダイズすることが可能となる。一つの分解機構は、アンチセンス内における1つ又は複数のRNAヌクレオチドの存在、及び必要であれば反応混合物中のリボヌクレアーゼの存在である。アンチセンス配列は1つ又は複数のリボヌクレオチド又は修飾リボヌクレオチドを含み得る。それを含む場合、ジヌクレオチド結合の加水分解速度が増加し得る。リボヌクレオチド加水分解速度は、反応にRNアーゼA又はRNアーゼHなどのリボヌクレアーゼを二価陽イオンと共に導入するとさらに増加し得る。アンチセンス配列が徐々に加水分解すると直鎖状アンチセンスオリゴヌクレオチドが目的のオリゴヌクレオチドから解離し、又はステム-ループが解けてアンチセンス阻害が失われ、それにより目的のオリゴヌクレオチド活性が次第に増加し得る。cその概略図を図10に示すオリゴヌクレオチド複合体のさらに別の例において、この複合体はアンチセンスオリゴヌクレオチドにより形成され、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは目的のオリゴヌクレオチドの3’末端に結合し、且つ目的のオリゴヌクレオチドの直ちに3’側にハイブリダイズする第2のオリゴヌクレオチドのための結合部位を提供する5’伸長部を有する。リガーゼ酵素の働きによって目的のオリゴヌクレオチドが前記第2のオリゴヌクレオチドとライゲートして配列を形成し、それにより前記目的のオリゴヌクレオチドの機能の喪失又は獲得がもたらされ、前記機能はターゲット分子との相互作用に関与する。反応の過程において、第2のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション及びライゲーションは反応中に徐々に起こり得るか、又は反応の条件を制御することにより制御され得る。従って、本発明の一態様は、ターゲット核酸に沿って伸長を起こす目的のオリゴヌクレオチドの能力を調節する方法に関し、前記方法は、前記オリゴヌクレオチドをアンチセンスオリゴヌクレオチドの3’末端にハイブリダイズし、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドに沿った前記目的のオリゴヌクレオチドの3’伸長を促進するステップにおいて、前記目的のオリゴヌクレオチドがそれに沿って伸長するアンチセンスヌクレオチド配列が、前記オリゴヌクレオチドの伸長部であって、iターゲット核酸のヌクレオチド配列に相補的であり、それにより前記目的のオリゴヌクレオチドを機能性にするもの;iiターゲット核酸のヌクレオチド配列に対してミスマッチを有し、それにより前記目的のオリゴヌクレオチドを非機能性にするもの;又はiii前記目的のオリゴヌクレオチドの別の領域のヌクレオチド配列に相補的なものであって、前記伸長部が前記目的のオリゴヌクレオチドの前記領域とハイブリダイズし、それによりステム-ループ構造を形成して前記目的のオリゴヌクレオチドを非機能性にするもののいずれかである伸長部を生成する、ステップを含む。一実施形態において、前記目的のオリゴヌクレオチドはプライマーである。別の態様において、目的のオリゴヌクレオチドの機能性を調節する方法が提供され、前記方法は、iアンチセンスオリゴヌクレオチドを前記目的のオリゴヌクレオチドの3’末端にハイブリダイズし、前記目的のオリゴヌクレオチドに沿った前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの3’伸長を促進することにより、前記目的のオリゴヌクレオチドを非機能性にするステップ;又はiiアンチセンスオリゴヌクレオチドの3’末端を前記目的のオリゴヌクレオチドの3’末端とハイブリダイズし、前記目的のオリゴヌクレオチドに沿った前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの3’伸長及び前記アンチセンスオリゴヌクレオチドに沿った前記目的のオリゴヌクレオチドの3’伸長を促進することにより、前記目的のオリゴヌクレオチドを非機能性にするステップ;又はiiiアンチセンスオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした目的のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド複合体を、目的のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする領域に対して3’側の領域で前記アンチセンスオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするプライマーと接触させて、前記プライマーの3’伸長を生じさせるステップにおいて、前記プライマーは伸長すると前記目的のオリゴヌクレオチドに置き換わり、前記目的のオリゴヌクレオチドが機能性になる、ステップ;又はivループ状アンチセンスオリゴヌクレオチドの直鎖状3’鎖を伸長するステップであって、3’直鎖状鎖は5’直鎖状鎖とハイブリダイズするが、但し5’直鎖状鎖は3’直鎖状鎖より長く、且つ前記目的のオリゴヌクレオチドと相補的な一本鎖領域であって、前記目的のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする一本鎖領域を含むステップにおいて、前記3’直鎖状鎖は前記一本鎖領域に沿って伸長すると前記目的のオリゴヌクレオチドに置き換わり、前記目的のオリゴヌクレオチドが機能性になる、ステップ;又はv直鎖状アンチセンス鎖と目的のオリゴヌクレオチドとの間のステム-ループ核酸分子又は二重鎖のいずれかの前記直鎖状アンチセンス鎖を選択的に分解するステップであって、その分解により相補的な直鎖状の目的のオリゴヌクレオチドの鎖が一本鎖になり、それにより機能性になるステップ;又はviTmが低い目的のオリゴヌクレオチドをアンチセンスオリゴヌクレオチドとハイブリダイズし、前記目的のオリゴヌクレオチドの伸長を生じさせるステップにおいて、前記伸長した目的のオリゴヌクレオチドがTmの上昇を生じ、それにより機能性になる、ステップ;又はviiアンチセンスオリゴヌクレオチドの3’末端にハイブリダイズした目的のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド複合体と、目的のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする領域の3’側で前記アンチセンスオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする第2のオリゴヌクレオチドとを接触させて、前記目的のオリゴヌクレオチドと前記第2のオリゴヌクレオチドとの間にライゲーションを生じさせるステップにおいて、前記目的のオリゴヌクレオチドの機能性が調節される、ステップを含む。一実施形態において、前記核酸はDNAである。別の実施形態において、前記目的のオリゴヌクレオチドは、タンパク質又は核酸分子のいずれかであるターゲット分子を標的とする。別の実施形態において、前記目的のオリゴヌクレオチドの機能性は、プライマー、アプタマー、DNAザイム、RNアーゼ又はリボザイムとしての機能性である。従って、ターゲットDNAに沿って伸長を起こすプライマーの能力を調節する方法が提供され、前記方法は、前記プライマーをアンチセンスオリゴヌクレオチドの3’末端にハイブリダイズし、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドに沿った前記プライマーの3’伸長を促進するステップにおいて、それに沿って前記プライマーが伸長するアンチセンスヌクレオチド配列が、プライマー伸長部であって、iターゲットDNAのヌクレオチド配列に相補的であり、それにより前記プライマーを機能性にするもの;又はiiターゲットDNAのヌクレオチド配列に対してミスマッチを有し、それにより前記プライマーを非機能性にするもの;又はiii前記プライマーの別の領域のヌクレオチド配列に相補的なものであって、前記伸長部がプライマーの前記領域とハイブリダイズし、それによりステム-ループ構造を形成して前記プライマーを非機能性にするもののいずれかである伸長部を生成する。別の態様において、DNAプライマーの機能性を調節する方法が提供され、前記方法は、iアンチセンスオリゴヌクレオチドを前記プライマーの3’末端にハイブリダイズし、前記プライマーに沿った前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの3’伸長を促進することにより、前記プライマーを非機能性にするステップ;又はiiアンチセンスオリゴヌクレオチドの3’末端を前記プライマーの3’末端とハイブリダイズし、前記プライマーに沿った前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの3’伸長及び前記アンチセンスオリゴヌクレオチドに沿った前記プライマーの3’伸長を促進することにより、前記プライマーを非機能性にするステップ;又はiiiアンチセンスオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした目的の第1のプライマーを含むオリゴヌクレオチド複合体を、第1のプライマーがハイブリダイズする領域に対して3’側の領域で前記アンチセンスオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする第2のプライマーと接触させて、前記第2のプライマーの3’伸長を生じさせるステップにおいて、前記第2のプライマーは伸長すると前記第1のプライマーに置き換わり、前記第1のプライマーが機能性になる、ステップ;又はivループ状アンチセンスオリゴヌクレオチドの直鎖状3’鎖を伸長するステップであって、3’直鎖状鎖は5’直鎖状鎖とハイブリダイズするが、但し5’直鎖状鎖は3’直鎖状鎖より長く、且つ前記プライマーと相補的な一本鎖領域であって、前記プライマーにハイブリダイズする一本鎖領域を含むステップにおいて、前記3’直鎖状鎖は前記一本鎖領域に沿って伸長すると前記プライマーに置き換わり、前記プライマーが機能性になる、ステップ;又はv直鎖状アンチセンス鎖と目的のオリゴヌクレオチドとの間のステム-ループ核酸分子又は二重鎖のいずれかの前記直鎖状アンチセンス鎖を選択的に分解するステップであって、その分解により相補的な直鎖状のプライマー鎖が一本鎖になり、それにより機能性になるステップ;又はviTmが低いプライマーをアンチセンスオリゴヌクレオチドとハイブリダイズし、前記プライマーの伸長を生じさせるステップにおいて、前記伸長したプライマーがTmの上昇を生じ、それにより機能性になる、ステップ;又はviiアンチセンスオリゴヌクレオチドの3’末端にハイブリダイズしたプライマーを含むオリゴヌクレオチド複合体と、プライマーがハイブリダイズする領域の3’側で前記アンチセンスオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドとを接触させて、前記プライマーと前記オリゴヌクレオチドとの間にライゲーションを生じさせるステップにおいて、前記プライマーの機能性が調節される、ステップを含む。本発明の方法は、全てのアンチセンスオリゴヌクレオチドが同じタイプの構造であるように設計されてもよく、又は一つの方法において任意の2つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチド構造タイプが使用されるように設計されてもよいことが理解されなければならない。以上に詳述したとおり、本発明の方法は広範に適用され、それらの適用としては、限定はされないが、以下が挙げられる:i核酸増幅中に用いられる不活性化方法。これは増幅との関連において適用することができる。用途としては、限定はされないが、以下が挙げられる:ネステッド増幅不活性化は外側プライマーが関わるように設計することができ、及び反応は、外側プライマーが不活性となった後に内側プライマーが活性になることを確実とし得る条件下で実施され得る。当業者は、かかる条件が、i反応全体を通じた内側プライマーの活性を可能にするのに十分なアニーリング温度、又はii内側プライマーが最初は不活性であったが反応の過程で活性になったアニーリング温度の段階的又は漸進的な低下、又はiii先述のとおりのアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用による反応の過程での1つ又は複数の不活性な内側プライマーの活性への変換、を含むであろうことを理解し得る。閉じられた単一のチューブでのネステッドPCRの実施を可能にするためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用については、Briscoetal.2011に記載されている。一本鎖DNAの産生核酸増幅反応の終盤における一本鎖DNAの産生は、配列決定、定量化、及び多様なプローブを増幅産物の検出に使用する能力を含め、様々な目的に有用であり得る。1つ又は複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドが関わる増幅反応による一本鎖DNAの産生は、一方のプライマーが他方のプライマーより時間的に早く不活性化されるように反応条件を調整することによって達成され得る。当業者は、これを達成する一つの方法が、1つのアンチセンスオリゴヌクレオチドのみを使用すること、及び規定のサイクル数後にターゲットプライマーが不活性化され、それにより他方のプライマーがアニーリング及び伸長を続行できることで一本鎖DNA量の増加が生じるように、アニーリング温度などの反応条件を調整することであると認識するであろう。この使用の例を図12に示す。ii核酸増幅中の活性化方法。これはPCR又は等温増幅のいずれとの関連においても適用することができ、これらの増幅はネステッド増幅との関連において用いられ得る。ネステッド増幅について、後順の核酸増幅サイクルにおいてのみ内側プライマーが活性であることを確実にすると、完全に非特異的な産物、或いはターゲット産物に近い配列関係を有するものの、その増幅は求められない産物の非特異的増幅が内側プライマーによって生じる機会が最小限となる。ここでもまた条件は、一定のアニーリング温度で、活性化が反応の過程において漸進的に起こるようにすることができ、又は温度条件は、反応中に活性化が起こる点を制御するように調整することもできる。iiiその活性状態にある目的のオリゴヌクレオチドが、タンパク質分子とハイブリダイズして前記タンパク質分子の構造又は機能の変化を引き起こすアプタマーとして機能するとき、又はそれぞれDNA若しくはRNAからなり、核酸分子とハイブリダイズして酵素として働くDNAザイム若しくはリボザイムとして機能するとき、活性化方法及び不活性化方法の双方を用いることもできる。従って一実施形態において、本発明は、ネステッド増幅反応において使用しようとするプライマーの誘導性の不活性化又は活性化を可能にし、それにより一定した最適レベルの効率性を維持するシングルチューブネステッドPCR法の設計が可能となる。より具体的には、この開発により、シングルチューブネステッドPCRとの関連においてこれまで不可能であった一定の制御性及びロバスト性が可能となった。本発明の方法は、特異的遺伝子などの目的の特異的DNA領域の分析が必要となる任意の適用に関連して有用である。さらにまた、この方法は熱的及び等温的の双方の核酸増幅反応の改善に適用可能である。この実施形態によれば、ターゲットDNAを増幅する方法が提供され、前記方法は、iDNA試料を、a前記ターゲットDNAを標的とする第1のフォワードプライマー及び前記ターゲットDNAを標的とする第1のリバースプライマー;及びb前記ターゲットDNAを標的とする第2のフォワードプライマーであって、前記第1のフォワードプライマーが標的とする配列の下流に位置する核酸配列を標的とする第2のフォワードプライマー;及び前記ターゲットDNAを標的とする第2のリバースプライマーであって、前記第1のリバースプライマーが標的とする配列の上流に位置する核酸配列を標的とする第2のリバースプライマー;及びc前記プライマーの1つ又は複数を標的とする、それにより前記プライマーの機能性が調節可能である、以上に定義するとおりの1つ又は複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させるステップにおいて、部分b及びcの分子を、ステップiiの増幅の前、その最中、又はその後に、但しステップiiiの増幅の前に反応に加えることができる、ステップ;及びii前記第1のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件であって、しかし前記第2のプライマーの伸長は可能にしない条件下で、ステップiのDNA試料を増幅するステップ;及びiiiステップiiのDNA試料を、前記第2のプライマーを機能性にする条件に供するステップ;及びiv前記第2のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件であって、しかし前記第1のプライマーとのアンチセンスオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに起因して前記第1のプライマーの伸長は可能にしない条件下で、ステップiiiのDNA試料を増幅するステップを含む。ハイブリダイゼーションに影響を与える様々な要因を理解することは、当業者が1つ又は複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドプライマーが関与するシングルチューブネステッドPCRの設計において、aアンチセンスオリゴヌクレオチドのプライマーとのハイブリダイゼーションが、当該のプライマーがアニーリング及び伸長することが必要な段階では最小限しかなく、又は存在しないが、他のプライマーが選択的にアニーリング及び伸長することが必要な段階ではそれが起こり、及び/又はbアンチセンスオリゴヌクレオチドの別のプライマーとのハイブリダイゼーションが、当該のプライマーのアニーリング及び伸長が不可能であることが必要で、且つ他のプライマーが選択的にアニーリング及び伸長することが必要な段階では最小限しかなく、又は存在しないが、当該のプライマーが選択的にアニーリング及び伸長することが必要な段階ではそれが起こるように設計するのに役立ち得る。フォワードプライマーに対する言及は、目的のDNA試料中の、及びPCRにおけるターゲットDNAを、そのターゲットDNAのアンチセンス鎖とハイブリダイズすることにより増幅するプライマーを指すものと理解されなければならない。リバースプライマーに対する言及は、目的のDNA試料中の、及びPCRにおけるターゲットDNAを、そのターゲットDNAのセンス鎖とハイブリダイズすることにより増幅するプライマーを指すものと理解されなければならない。位置に関する下流又は上流に対する言及は、センスDNA鎖に対する位置を指し、下流が3’を指して上流が5’を指すすものと理解されなければならない。以上に詳述したとおり、PCR又は等温反応などのネステッド核酸増幅反応は、ターゲットDNA内で徐々により内側の配列とハイブリダイズするよう標的を定める2つ以上のフォワード及びリバースプライマーセットの使用に基礎を置いている。本発明との関連において、第1のフォワード及びリバースプライマーに対する言及は、ターゲットDNAの最も外側の位置にハイブリダイズするプライマーを指すものと理解されなければならない。第2のフォワード及びリバースプライマーは、内側のプライマーを指すものと理解されなければならない。すなわち、これらの第2のプライマーは、それぞれ第1のフォワードプライマーの下流及び第1のリバースプライマーの上流にある配列とハイブリダイズするように設計される。ターゲットDNAに沿ってどのような間隔でこれらのプライマーをハイブリダイズさせるかについての設計は、当業者の技能の範囲内にある。また、それぞれ第2のフォワードプライマーの下流及び第2のリバースプライマーの上流にある配列とハイブリダイズするように設計される第3のフォワード及びリバースプライマーセットを組み込む方法をとってもよいことが理解されなければならない。本発明をいずれの理論又は作用様式にも限定することなく、本発明の反応を、ネステッド反応ではなくセミネステッド反応を用いるように設計することができる。この場合、第2のフォワードプライマー又は第2のリバースプライマーのいずれかが使用されず、残る単一のフォワードプライマー又は単一のリバースプライマーを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドが存在しない。一実施形態において、本発明はターゲットDNAを増幅する方法に関し、前記方法は、iDNA試料を、a前記ターゲットDNAを標的とする第1のフォワードプライマー及び前記ターゲットDNAを標的とする第1のリバースプライマー;及びb前記ターゲットDNAを標的とする第2のフォワードプライマーであって、前記第1のフォワードプライマーが標的とする配列の下流に位置する核酸配列を標的とする第2のフォワードプライマー前記ターゲットDNAを標的とする第2のリバースプライマーであって、前記第1のリバースプライマーが標的とする配列の上流に位置する核酸配列を標的とする第2のリバースプライマー;及びc前記プライマーの1つ又は複数を標的とする、それにより前記プライマーの機能性が調節可能である、以上に定義するとおりの1つ又は複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、前記第1のプライマーを標的とするそのアンチセンスオリゴヌクレオチドが5’核酸タグ配列を含み、そのタグの相補的ヌクレオチド配列が、前記プライマーのハイブリダイゼーション部位の5’末端に隣接するDNA領域のヌクレオチド配列に対してミスマッチを有する、アンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させるステップにおいて、部分b及びcの分子を、ステップiiの増幅の前、その最中、又はその後に、但しステップiiiの増幅の前に反応に加えることができる、ステップ;及びii前記第1のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件であって、しかし前記第2のプライマーの伸長は可能にしない条件下で、ステップiのDNA試料を増幅するステップ;及びiiiステップiiのDNA試料を、前記第2のプライマーを機能性にする条件に供するステップ;及びiv前記第2のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件であって、しかし前記タグ付きアンチセンスオリゴヌクレオチドに沿った前記第1のプライマーの伸長に起因して前記第1のプライマーによる増幅は可能にしない条件下で、ステップiiiのDNA試料を増幅するステップを含む。別の実施形態において、本発明はターゲットDNAを増幅する方法に関し、前記方法は、iDNA試料を、a前記ターゲットDNAを標的とする第1のフォワードプライマー及び前記ターゲットDNAを標的とする第1のリバースプライマー;及びb前記ターゲットDNAを標的とする第2のフォワードプライマーであって、前記第1のフォワードプライマーが標的とする配列の下流に位置する核酸配列を標的とする第2のフォワードプライマー前記ターゲットDNAを標的とする第2のリバースプライマーであって、前記第1のリバースプライマーが標的とする配列の上流に位置する核酸配列を標的とする第2のリバースプライマー;及びc前記プライマーの1つ又は複数を標的とする、それにより前記プライマーの機能性が調節可能である、以上に定義するとおりの1つ又は複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、前記第1のプライマーを標的とするそのアンチセンスオリゴヌクレオチドが5’核酸タグ配列を含み、そのタグの相補的ヌクレオチド配列が同じプライマーの別の領域のヌクレオチド配列に対して相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させるステップにおいて、部分b及びcの分子を、ステップiiの増幅の前、その最中、又はその後に、但しステップiiiの増幅の前に反応に加えることができる、ステップ;及びii前記第1のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件であって、しかし前記第2のプライマーの伸長は可能にしない条件下で、ステップiのDNA試料を増幅するステップ;及びiiiステップiiのDNA試料を、前記第2のプライマーを機能性にする条件に供するステップ;及びiv前記第2のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件であって、しかし前記タグ付きアンチセンスオリゴヌクレオチドに沿った前記第1のプライマーの伸長に起因して前記第1のプライマーによる増幅は可能にしない条件下で、ステップiiiのDNA試料を増幅するステップを含む。別の実施形態において、ターゲットDNAを増幅する方法が提供され、前記方法は、iDNA試料を、a前記ターゲットDNAを標的とする第1のフォワードプライマー及び前記ターゲットDNAを標的とする第1のリバースプライマー;及びb前記ターゲットDNAを標的とする第2のフォワードプライマーであって、前記第1のフォワードプライマーが標的とする配列の下流に位置する核酸配列を標的とする第2のフォワードプライマー前記ターゲットDNAを標的とする第2のリバースプライマーであって、前記第1のリバースプライマーが標的とする配列の上流に位置する核酸配列を標的とする第2のリバースプライマー;及びc前記プライマーの1つ又は複数を標的とする、それにより前記プライマーの機能性が調節可能である、以上に定義するとおりの1つ又は複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドの1つ又は複数が前記第1のプライマーの3’末端にハイブリダイズし、且つ前記プライマーに沿って3’方向に伸長可能である、アンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させるステップにおいて、部分b及びcの分子を、ステップiiの増幅の前、その最中、又はその後に、但しステップiiiの増幅の前に反応に加えることができる、ステップ;及びii前記第1のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件であって、しかし前記第2のプライマーの伸長は可能にしない条件下で、ステップiのDNA試料を増幅するステップ;及びiiiステップiiのDNA試料を、前記第2のプライマーを機能性にする条件に供するステップ;及びiv前記第2のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件であって、しかし前記プライマーに沿った前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの伸長に起因して前記第1のプライマーによる増幅は可能にしない条件下で、ステップiiiのDNA試料を増幅するステップを含む。一実施形態において、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは前記プライマーの3’末端にハイブリダイズし、前記プライマーに沿って伸長する。別の実施形態において、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの3’末端は前記プライマーの3’末端とハイブリダイズし、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの3’末端は前記プライマーに沿って伸長し、及び前記プライマーの3’末端は前記アンチセンスオリゴヌクレオチドに沿って伸長する。さらに別の実施形態において、ターゲットDNAを増幅する方法が提供され、前記方法は、iDNA試料を、a前記ターゲットDNAを標的とする第1のフォワードプライマー及び前記ターゲットDNAを標的とする第1のリバースプライマー;及びb前記ターゲットDNAを標的とする第2のフォワードプライマーであって、前記第1のフォワードプライマーが標的とする配列の下流に位置する核酸配列を標的とする第2のフォワードプライマー前記ターゲットDNAを標的とする第2のリバースプライマーであって、前記第1のリバースプライマーが標的とする配列の上流に位置する核酸配列を標的とする第2のリバースプライマーであって、ターゲットDNAのヌクレオチド配列に対してミスマッチを有する3’タグを含むこれらの第2のプライマー;及びc前記プライマーの1つ又は複数を標的とする、それにより前記プライマーの機能性が調節可能である、以上に定義するとおりの1つ又は複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、前記アンチセンスオリゴヌクレオチド配列の1つが、前記第2のプライマーの3’領域に相補的な3’領域と、プライマー結合部位に隣接するターゲットDNAの配列に対して相補的な相補配列を有するより5’側の領域との双方を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させるステップにおいて、部分b及びcの分子を、ステップiiの増幅の前、その最中、又はその後に、但しステップiiiの増幅の前に反応に加えることができる、ステップ;及びii前記第1のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件であって、しかし前記第2のプライマーの伸長は可能にしない条件下で、ステップiのDNA試料を増幅するステップ;及びiiiステップiiのDNA試料を、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドに沿った前記第2のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件に供するステップ;及びiv目的のDNA領域に沿った前記第2のプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする条件であって、しかし前記第1のプライマーとのアンチセンスオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに起因して前記第1のプライマーの伸長は可能にしない条件下で、ステップiiiのDNA試料を増幅するステップを含む。従って本発明の方法は、最も外側のプライマーの初期増幅が最初は主要な増幅反応として効率的に進行することを可能にする。しかしながら、この増幅を完了して内側の第2のプライマーセットの増幅に移ることが求められるため、アンチセンスオリゴヌクレオチドの第1のフォワードプライマーとのハイブリダイゼーションが生じ、その結果、ターゲットDNAとの関連においてそれ以上のいかなる伸長が起こることも有効に阻止されるプライマーが生成される。アンチセンスオリゴヌクレオチドから結合している内側プライマーが放出されることと併せて、進行中の外側プライマーの不要な増幅が最小限に抑えられ、内側プライマーの増幅が、効率的な増幅を促進する条件下で進行することができる。例えば外側プライマーそれ自体がそのハイブリダイゼーション部位との内側プライマーのハイブリダイゼーションを有効に妨げる場合には、内側プライマーを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを利用する必要はないことが理解されなければならない。以上に詳述したとおり、本発明は、増幅状況によっては、初期増幅サイクルの間に活性な1つ又は一対のプライマーを有すること、及び次に急激に又は漸進的に不活性になること、及び初期サイクルの間に不活性な1つ又は別の対のプライマーを有すること、及び次に後続のサイクルの間に急激に又は漸進的に活性になることが望ましいものであり得るという事実に基礎を置いている。プライマーのアンチセンスオリゴヌクレオチドとの、及びプライマーのターゲットDNAとの相互作用の促進が、任意の好適な方法により行われてもよい。それらの方法は当業者に公知であろう。そのために、アンチセンスオリゴヌクレオチド及び/又は内側プライマーは任意の好適な時点で反応チューブに導入され得ることは理解されなければならない。導入は概して初期増幅サイクルの開始前、すなわちフォワード及びリバース外側プライマーと同時であるが、外側プライマーによる初期増幅サイクルの後に1つ又は複数の導入が行われてもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチド及び/又は内側プライマーの導入方法は、当業者がどのように増幅反応を実施しようとしているかに依存し得るが、一般には使用を簡略化するため、及びコンタミネーションを回避するため、通常、反応全体を単一のチューブで実施可能であることが望ましい。しかしながら、本発明のステップを達成する任意の他の方法を用いることができる。プライマー特異的増幅を達成する方法もまた、当業者に極めて周知されている。好ましい方法では、前記増幅はポリメラーゼ連鎖反応である。試料に対する言及は、生体試料又は非生体試料のいずれかを指すものと理解されなければならない。非生体試料の例としては、例えば、合成的に産生された核酸集団の核酸産物が挙げられる。生体試料に対する言及は、限定はされないが、動物、植物又は微生物微生物培養物を含むなどの任意の生きている生物、並びに限定はされないが、細胞物質、血液、粘液、糞便、尿、組織生検標本、動物の体内に導入され、続いて取り出された流体例えば、肺洗浄後に肺から抜き出した生理食塩水又は腸洗浄から回収した溶液など、植物材料又は種子若しくは花などの植物繁殖材料又は微生物コロニーなどに由来する生物学的材料の任意の試料を指すものと理解されなければならない。本発明の方法により試験される生体試料は直接試験されてもよく、又は試験前に何らかの形の処理が必要であってもよい。例えば、生検試料は試験前に均質化が必要であり得る。さらに、生体試料が液状形態でない限りにおいて、緩衝液などの試薬を添加して試料を流動化させることが必要となり得る。ターゲットDNA又は他の分子が生体試料中に存在する限りにおいて、生体試料は直接試験されてもよく、或いは生体試料中に存在する核酸材料の全て又は一部が試験前に単離されてもよい。ターゲット核酸分子を試験前に前処理すること、例えば生ウイルスの不活性化又はゲル上での泳動は、本発明の範囲内にある。また、生体試料は新しく採取されてもよく、又は試験前に例えば凍結することにより保存されていたか、若しくは他の方法で試験前に処理されたもの培養を受けることによるなどであってもよいことも理解されなければならない。試料をプライマー又はアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させるに対する言及は、プライマーの試料との混合を、相互作用例えばハイブリダイゼーションが起こり得るように促進することを指すものと理解されなければならない。この目的を達成する手段は当業者には周知されているであろう。本発明をいずれの理論又は作用様式にも限定することなく、接触の程度は反応条件並びにプライマー及びアンチセンスオリゴヌクレオチドのそれぞれのTm値により決定される。接触はアニーリング温度を制御することにより操作することができ、従って接触は高温では起こらないが、低温では起こる。或いは接触は、一定の温度にある間に一定の速度で生じさせることもできる。或いはタッチダウンPCRなどにおいてはアニーリング温度が徐々に変化するため、接触の程度が徐々に変化し得る。本明細書に開示される方法における試験にどのような種類の試料が最も好適であるかの選択は、モニタされる病態の性質など、状況の性質に依存し得る。例えば、好ましい実施形態では腫瘍性の病態が分析対象である。腫瘍性の病態が白血病である場合、血液試料、リンパ液試料又は骨髄穿刺液が好適な試験試料を提供し得るであろう。腫瘍性の病態がリンパ腫である場合、リンパ節生検又は血液若しくは骨髄試料が試験に好適な組織源を提供し得るであろう。また、元の腫瘍性細胞源をモニタしているかどうか、又は発生点からの新生物の転移又は他の形態の広がりの存在がモニタされるべきかどうかに関しても考慮が必要であり得る。この点について、任意の一つの哺乳動物から複数の異なる試料を採取して試験することが望ましいこともある。別の例において、別の好ましい実施形態では感染症の病態が分析対象である。性質及び感染部位を確定するには、血液、体液、排泄物又は組織の試料が試験に好適な試料を提供し得るとともに、特定の核酸配列の増幅に必要なプライマーは、感染に関与している可能性のある生物の範囲が検出の対象となり得るように選択され得る。所与の検出シナリオに適切な試料及び増幅システムの選択は、当業者の技能の範囲に含まれ得る。用語哺乳動物には、それが本明細書で使用される限りにおいて、ヒト、霊長類、家畜動物例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ロバ、実験室試験動物例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、伴侶動物例えば、イヌ、ネコ及び捕獲野生動物例えば、カンガルー、シカ、キツネが含まれる。好ましくは、哺乳動物はヒト又は実験室試験動物である。さらにより好ましくは、哺乳動物はヒトである。用語生物は、それが本明細書で使用される限りにおいて、限定はされないが、動物、植物、細菌、ウイルス及び真菌を含めた任意の生きている実体を指す。本発明は以下の非限定的な例を参照してさらに説明される。実施例1表1は、アンチセンスによる活性な外側プライマーの不活性状態への変換及び不活性な内側プライマーの活性状態への変換を示す2つの実験の結果を示す。表2、表3、及び表4は、使用されるプロトコルの様々な態様を示す。実施例2熱サイクリングにおける核酸増幅以下の方法は、PCRの過程におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用した外側プライマーのオフへの切換え及び内側プライマーのオンへの切換えを含む。外側プライマーの機能性が失われる時点より前に内側プライマーがオンに切り換わって完全に機能性になるように条件を調整する。方法PCR:20mMのトリスHClpH8.4、50mMのKCl、2.5mMのMgCl2を含む反応物中、100ngの各外側プライマー、100ngの各内側プライマー、対応する外側及び内側プライマーと等しいモル濃度の各アンチセンスオリゴヌクレオチド、2.5mMのマグネシウム、200nMのdATP、dTTP、dGTP及びdCTP、1uのPlatinumTaqInvitrogen、Taqman加水分解プローブ並びに様々な質量のDNAを含む25μLの反応物を使用。サイクリング条件:96°C2分間、次に40サイクルの94°C15秒間、58°C60秒間、72°C60秒間。外側及び内側プライマー:Tm値の計算には塩基スタッキングモデルを使用しBorerP.N.etal.1974J.Mol.Biol.86:843及びSantaLucia,J.1998Proc.Nat.Acad.Sci.USA95:1460に基づく、http://www.promega.com/biomath/calc11.htmにて利用可能、及び2.5mMのマグネシウム、200nMのdATP、dTTP、dGTP及びdCTP並びに100ngのプライマーを仮定した。プライマーが効率的な増幅を生じる温度の3geを決定するためアニーリング温度の勾配を使用。Tmが60~65°Cの外側及び内側プライマーが十分である。内側プライマーは、プライマーが鋳型鎖とハイブリダイズすると、3’末端の2つの塩基がミスマッチをもたらすように設計される。これにより、PCRの初期サイクルの間にプライマーが不活性となる。アンチセンスオリゴヌクレオチド:a外側プライマーに対するものは、外側プライマーの3’末端に対するアンチセンス配列に基づき、且つ各々が3ヌクレオチドの5’タグ及び3’タグを有する。外側プライマーはハイブリダイゼーション後に5’タグに沿って伸長し得るため、タグの3’-5’配列は、未変性プライマーがハイブリダイズし得る点の直ちに下流にある鋳型鎖の3’-5’配列と相補的である。この設計により、伸長したプライマーの3’末端とその鋳型との間に3塩基のミスマッチが生じ、それが外側プライマーのさらなる伸長を阻止し、従ってターゲットの増幅が防止される。オリゴヌクレオチドの3’末端における3塩基の配列は、オリゴヌクレオチドの潜在的にハイブリダイズする各塩基がプライマーの潜在的にハイブリダイズする塩基と同じであるような配列である。ここでもまた、この設計により3塩基のミスマッチが生じ、それがオリゴヌクレオチドの伸長を阻止する。この戦略により、より高いTmを有し、且つ望ましくない阻害を及ぼし得る過度に長いアンチセンスオリゴヌクレオチドがPCRの初期高温段階にある間に産生されることが防止される。アンチセンスオリゴヌクレオチドの3’方向への伸長もまた3’末端のアミン修飾により防止することができる。b内側プライマーに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ミスマッチ塩基を含め、内側プライマーの3’末端に対するアンチセンス配列に基づく。このアンチセンスオリゴヌクレオチドは5’タグと、3’末端のタグ又はアミン修飾のいずれかとを有する。5’タグは4~6塩基を含み、その配列は、プライマーとのハイブリダイゼーションが起こるとプライマーが伸長し、鋳型配列と完全に一致する3’配列を生じるように選択される。外側プライマーと結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドについては、オリゴヌクレオチドのコアハイブリダイゼーション配列について48~55°CのTm範囲が、外側プライマーの十分な漸進的阻害をもたらす。内側プライマーと結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドについては、52~56°CのTm範囲が、内側プライマーの十分な漸進的活性化を生じる。概して外側プライマーを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドのTm値は49~51°Cとすべきで、一方、内側プライマーを標的とするそれのTm値は52~54°Cとすべきである。実施例3等温核酸増幅以下のプロトコルは、等温核酸増幅中にアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して逐次的にあるプライマーセットの活性をオフに切り換え、別のプライマーセットの活性をオンに切り換える。第2のセットのプライマーは、第1のプライマーセットがターゲットとする部位より内側の部位をターゲットとし、すなわち反応はネステッド増幅である。ヘリカーゼ依存性増幅HDAが、等温増幅に用いられる方法である。方法HDAは、BiohelixCorporationにより供給されるIsoAmpIIUniversaltHDAキットの使用を含むhttp://www.biohelix.com/default.asp。詳細な増幅プロトコル及びHDAについての指示事項は、http://www.biohelix.com/pdf/-H0110S_full_version_BH.pdfに提供され、プロトコルCが、通常用いられるプロトコルである。アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用には、反応物に対する以下の修飾及び/又は添加を伴う:各100ngの全4つのプライマーアンチセンスオリゴヌクレオチド-各々がそのターゲットプライマーと等モル濃度で存在する。外側プライマーを標的とするオリゴヌクレオチドは約50°CのTmを有し、内側プライマーを標的とするオリゴヌクレオチドは約53°CのTmを有する。インキュベーション-60°C120分間実施例4PCRにおけるステム-ループプライマーのステムの伸長この実験の結果は図11に示す。この実験は、図2に示す戦略の一部を例証する。10サイクルにわたるPCR反応において、ステムがループ状に折り返してプライマーのより5’側の領域とハイブリダイズすることが潜在的に可能な配列の、4~12塩基の3’ステムを有するプライマーが存在した。次に融解曲線法を実施することにより、ステムの伸長可能性を分析した。図中のデータは、4塩基又は5塩基のステムがTaqポリメラーゼにより伸長されなかった一方、6塩基以上のステムは12塩基の長さに完全に伸長されたことを示す。実施例5プライマーの不活性化による一本鎖DNAの産生一本鎖DNAには数多くの用途がある。図12に示すこの実験では、一方のプライマーを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドをPCRに組み込んだ。72°Cのアニーリング温度で最初の15サイクルを実施し、これらのサイクル中に指数関数的増幅が起こった。次にアニーリング温度を58°Cに下げると、このとき一方のプライマーのそのアンチセンスオリゴヌクレオチドによる漸進的な不活性化が生じ、次に他方のプライマーの伸長によりもたらされた一本鎖DNAの産生が確認された。2つの異なるアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用し、一方は12塩基のコアで、他方は13塩基のコアであった。実施例6アンチセンスPCR:ネステッドシングルチューブPCRの単純且つロバストな実施方法材料及び方法PCR特に指定しない限り、25μl反応物は、100ngの各外側プライマー、200ngの各内側プライマー、対応する外側プライマーに等しいモル濃度の各アンチセンスオリゴヌクレオチド、2.5mMのマグネシウム、各200nMのdATP、dTTP、dGTP、及びdCTP、1UのPlatinumTaqInvitrogen、Taqman加水分解プローブ、並びに30pg~100ngのDNAを含んだ。反応物は手動でセットアップし、PCRは20mMトリスHClpH8.4、50mMのKCl、及び2.5mMのMgCl2において実施した。特に指定しない限り、サイクリング条件は以下のとおりとした:ホットスタート、96°C2分間;15サイクルの高温第1段階、すなわち94°C15秒間及び72°C60秒間;インキュベーション5分間58°C;次に40サイクルの低温第2段階、すなわち94°C15秒間、58°C90秒間、及び72°C60秒間。このプロファイルは二段階プロトコルと称される。サイクル数について示される全ての結果は、PCRの開始からの総サイクル数を示すすなわち最初の高温15サイクルが含まれる。PCRは、Bio-RadIQ5iCyclerソフトウェアバージョン2.0.148.60623で実施した。DNAは健康被験者の血液約50mlに由来し、これはQiagenQIAampDNABloodMaxiKitによって製造者のプロトコルカラム精製、RNアーゼ不使用に従い採取し、InvitrogenQubit蛍光光度計によりQuant-iTdsDNABRAssayKitを用いて定量化した。外側プライマー及び内側プライマー塩基スタッキングモデルBoreretal.J.Mol.Biol.861974843-853及びSantaLuciaJ.SantaLuciaJr.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA9519981460-1465に基づく、http://www.promega.com/biomath/calc11.htmで利用可能を使用し、2.5mMのマグネシウム及び600nMのプライマーを仮定してTm値を計算した。次にプライマーが効率的な増幅を生じる温度範囲を、アニーリング温度の勾配を用いて実験的に決定した。様々な予想Tm値のプライマーを調べ、最終的に77~78°CのTm値の外側プライマー少なくとも74°Cのアニーリングまで効率的な増幅を生じることが分かったと、58~62°CのTm値の内側プライマー61~64°Cのアニーリングまで効率的な増幅を生じることが分かったとを使用した。アンチセンスオリゴヌクレオチドその分子は外側プライマーの3’末端に対するアンチセンス配列に基づいた。分子は、PCRの初期高温段階における外側プライマーとのハイブリダイゼーションは最小限であるが、後の低温段階では実質的なハイブリダイゼーションが生じ得るTmを有するように設計した。分子は、各々が3ヌクレオチドからなる5’タグ及び3’タグを有した。外側プライマーはハイブリダイゼーション後に5’タグに沿って伸長し得るため、タグの3’-5’配列は、未変性プライマーがハイブリダイズし得る点の直ちに下流にある鋳型鎖の3’-5’配列との相補配列であった。この設計により、伸長したプライマーの3’末端とその鋳型との間に3塩基のミスマッチが生じ、各ミスマッチはa:a、g:g、c:c、又はt:tのいずれかであり得た。これにより外側プライマーのさらなる伸長が阻止され、従ってターゲットの増幅が防止され得た。オリゴヌクレオチドの3’末端における3塩基の配列は、オリゴヌクレオチドの潜在的にハイブリダイズする各塩基が外側プライマーの潜在的にハイブリダイズする塩基と同じであるような配列であった。ここでもまた、この設計により3塩基のミスマッチが生じ、それが外側プライマーに沿ったオリゴヌクレオチドの伸長を阻止し得た。この戦略により、より高いTmを有し、且つ望ましくない阻害を及ぼし得る過度に長いアンチセンスオリゴヌクレオチドが、PCRの初期高温段階中に産生されることが防止された。5’タグ及び3’タグを除くコア配列について各アンチセンスオリゴヌクレオチドのTm値を決定し、各対のメンバーはほぼ同じTmを有した。外側プライマー及びアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むが内側プライマーを含まないPCRを実施することにより、双方のプライマーセット及びアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む完全なPCR、並びに外側プライマーのみを含むPCRの双方を対照として使用して、各対の阻害活性を試験した。対の各メンバーが48~55°CのTmを有するオリゴヌクレオチド対が、高温の第1段階の間には阻害を生じることなしにPCRの低温の第2段階の間に外側プライマーの十分な阻害をもたらしたことが分かった。最終的なプロトコルで用いたアンチセンスオリゴヌクレオチドのTm値は、49~54°Cであった。データ報告及び統計的検定データはMIQE定量的リアルタイムPCR実験の公表における最小限の情報の指針に準拠して報告するBustinetal.Clin.Chem.552009611-622。差はスチューデントt検定で検定した。結果4つの遺伝子についてアンチセンスqPCR戦略を調べた:NRAS神経芽細胞腫RASウイルス癌遺伝子ホモログ、geneID4893、MIM164790の475bpセグメント、BCR切断点クラスター領域、geneID613、MIM151410の287bpのセグメント、APC腺腫性結腸ポリポーシス、geneID324、MIM611731の474bpセグメント、及び再配列免疫グロブリン重鎖IGH遺伝子IGH、geneID3492の184bpセグメント。各システムの開発では複数のプライマー及びアンチセンスオリゴヌクレオチドを調べた。最終的に使用したプライマー及びオリゴヌクレオチドを表5に示す。Tm計算値を様々なアニーリング温度における機能と相関付ける予備調査から、個々のプライマーがそのTm計算値5~7°Cに等しいアニーリング温度まで効率的に増幅し、プライマー対がその平均Tm値2~4°Cに等しいアニーリング温度まで効率的に増幅し、及びアンチセンスオリゴヌクレオチド対が平均オリゴヌクレオチドTm値約10°Cに等しいアニーリング温度まで外側プライマー対の計測可能な阻害を生じたことが示された。アンチセンスオリゴヌクレオチド対による外側プライマーの十分な阻害についての有用な基準は、PCRにおける唯一のプライマーが外側プライマーであるとき、二段階PCRプロトコルを用いたこと、添加したDNAの質量が、6又は7サイクルの低温サイクル後にサイクル閾値Ctに達し、次にアンチセンスオリゴヌクレオチドを加えると5~10サイクルだけCtが増加したような質量であったことであった。そのTmに加え、アンチセンスオリゴヌクレオチドの阻害効果の大きさはまた、そのモル濃度、アニーリングの継続時間、及びアニーリング温度によっても影響を受けることが分かった。アンチセンスオリゴヌクレオチドの阻害効果は、反応に一つのオリゴヌクレオチドのみを使用した場合には低下したが、Tmを2~3°C上げたオリゴヌクレオチドを使用することにより、阻害効果を十分に高めることができた。アンチセンスオリゴヌクレオチドの3’タグを省略すると、PCRの初期高温段階における増幅の阻害に変化が生じたデータは示さず。材料及び方法に記載するとおりの最終的なアンチセンスqPCRプロトコルを用いた結果を図14に示す。様々な範囲のDNA質量の増幅を行い、広範囲のサイクルに関してシステムの性能を試験した。外側プライマー、内側プライマー、及び一対のアンチセンスオリゴヌクレオチドを組み込む完全なシステムが、外側プライマー単独での増幅と同じCt結果をもたらしたことが分かる。外側プライマー及びアンチセンスオリゴヌクレオチドの存在下における増幅の結果を外側プライマーのみによる増幅の結果と比較すると、7又は8サイクルの低温サイクル後には外側プライマーの著しい阻害が既に起こったことが明らかである。他方で、外側プライマー及びアンチセンスオリゴヌクレオチドのみの存在下における増幅の結果を、内側プライマーもまた含む完全なシステムによる増幅の結果と比較すると、7又は8サイクルの低温サイクル後の主要なPCR産物が、内側プライマーによる増幅で生じたものであったことが明らかである。電気泳動法により、最終的な増幅産物が内側プライマーにより誘導された増幅の結果であったことが確認された。一実験の結果を図15に示す。アンチセンスqPCRの増幅効率と標準的なqPCRの増幅効率との直接比較を21の実験-8つはN-RAS、5つはBCR、6つはAPC、及び2つはIGH-で実施し、各実験で0.1~100ngのDNAを増幅した。統計的に有意な差は認められなかった。CtとDNAの質量の対数との関係の平均の傾きは、アンチセンスqPCRについて-3.62及び標準PCRについて-3.58であり、対応のある差の標準誤差は0.065であった。所与のDNA質量についてのアンチセンスqPCRのCt値と標準qPCRのCt値との差の平均は-0.467であり、標準誤差は0.252であったt=1.85、P<0.1、両側。この結果の最も明らかな解釈は、2つの技法間に実質的な増幅効率の差がないことである。現実に小さい実質的な差があったなら、この結果は事実上、アンチセンスqPCRによる増幅がより効率的であることを示唆するものとなったであろう。APC遺伝子を調べてアンチセンスPCRの間における外側及び内側プライマーによる増幅の結果を分析する一実験において、PCRを様々なサイクル数の後に停止させ、アリコートを第2のqPCRによりアッセイして、産生された様々なアンプリコンを定量化した。この二次アッセイでは、外側プライマーは一次PCRにおいて外側プライマーにより産生された長鎖アンプリコンのみを定量化した一方、内側プライマーは全アンプリコンすなわち、内側プライマーにより産生された短鎖アンプリコン及び外側プライマーにより産生された長鎖アンプリコンの双方を定量化した。この結果を図16に示す。Ct値はアンプリコン数の対数と線形関係を有するため、Ctスケールを逆にして示していることに留意されたい。アンチセンスqPCR及び外側プライマーのみを使用した標準qPCRの双方で、産生されたアンプリコン総数は同等に指数関数的に増加した。しかしながらアンチセンスオリゴヌクレオチドが存在すると、アンチセンスPCRにおいても、或いは外側プライマーのみを併う場合においても、外側プライマーによる長鎖の産物の増幅は漸進的な阻害を示した。これはサイクル21すなわち、6低温サイクル後により明らかであり、この時点でネステッドPCRでは長鎖アンプリコンは全アンプリコンの約10のみであった。4つの遺伝子ターゲットの各々について、アンチセンスqPCRの非特異的増幅に対する効果を試験した。30pg~100ngの範囲のDNA質量を、外側プライマーのみを使用する標準的なPCRによるか、又はアンチセンスqPCRいずれかにより増幅し、Ct値は、目的の産物に特異的なTaqmanプローブか、又は全てのPCR産物-目的の産物及び非特異的な産物の双方を計測するSYBRGreenかのいずれかにより決定した。各遺伝子による第1の実験では、アンチセンスqPCR及び標準PCR外側プライマーのみを使用の双方に二段階温度プロファイルを使用した。サイクル15以降のより低いアニーリング温度が外側プライマー単独には僅かに最適以下であった可能性があるため、N-RAS、APC、及びBCRによる第2の比較を実施し、ここではアンチセンスqPCRを通常の温度プロファイルで実施した一方、標準PCRを全サイクルについて72°Cのアニーリング温度で実施した。全サイクルに72°Cのアニーリング温度を使用したIGH遺伝子の増幅試験は、Taqmanプローブのアニーリングが61°Cの温度を上回ると低下したため不可能であった。この結果は、7つの実験全てについて本質的に同じであった。そのうち2つを図17に示す。アンチセンスPCRは外側プライマー単独によるPCRと比較して平均2.98のCtの増加をもたらした標準誤差[SE]=0.66、P<0.01。アンチセンスPCRを用いたときに閾値に達するまでにかかるサイクル数のこの増加は、特異的増幅の減少又は非特異的増幅の減少に起因した可能性があった。しかしながら、Taqmanによる結果が示すとおり、アンチセンスPCRは特異的増幅の減少を生じなかった。アンチセンスPCRは実際には平均0.82Ct単位SE=0.36の減少を生じた;すなわち、アンチセンスPCRでは古典的PCRと比べて僅かに早く閾値に達した。従って、消去法により、アンチセンスPCRのSYBRGreenエンドポイントに対する効果は、非特異的増幅を減少させることであったはずである。希薄なターゲットの定量化には多数のPCRサイクルが必要であり、この状況では、低温サイクルの数を減らし、ひいてはこの段階における非特異的増幅の可能性を最小限に抑えるため、15サイクルより多い高温サイクルの実施が望ましい可能性がある。従って本発明者らは、高温段階の間のアンチセンスオリゴヌクレオチドによる外側プライマーの漸進的な不活性化が最終的に増幅効率を低下させ得るかどうかを調査した。3つの実験を実施した:1つの実験につきN-RAS、BCR、及びAPCの1つを試験した。72°Cのアニーリング温度を使用して、最大35サイクルのCt値が観察されるように様々なDNA質量を外側プライマーによって増幅した。アンチセンスオリゴヌクレオチドも存在した場合には阻害はなかったが、但し、1つの対が50°CのTm値で、1つの対が55°CのTm値である2対のアンチセンスオリゴヌクレオチドを試験したN-RASを調べる実験は例外であった。後者のプライマー対を使用したとき、32サイクル後に僅かな阻害が観測された。従ってデータから、PCRの高温の第1段階について、最大30サイクルまではアンチセンスオリゴヌクレオチドによる計測可能な阻害なしに安全に用いられ得たことが示唆された。表1:実験1024及び実験1025の結果。PCRの過程における活性プライマーの不活性化及び不活性プライマーの活性化を示す。行Aは活性の外側プライマーのみを使用する対照であり、行Bは、反応にアンチセンスオリゴヌクレオチドを加えることにより延長が達成されることを示す。行Cは、外側プライマーが不活性であるにも関わらず、活性の内側プライマーを加えると増幅を維持することができることを示す。しかしながら行Dは、活性の内側プライマーではなく不活性の内側プライマーを加えたもので、再び反応が損なわれたことを示す。行E及び行Fは、不活性の内側プライマーが、それを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを加えることにより活性になり得ることを示す。行Eと行Fとは、行Fで使用したアンチセンスオリゴヌクレオチドが僅かに長いタグを有した点のみが異なる。表2:実験1024及び実験1025で使用したプライマー及びアンチセンスオリゴヌクレオチド。A~Fの説明については表1を参照のこと。各行に示される配列対が当該の反応に重要な可変要素である。表3:実験1024及び実験1025についての試薬ワークシート。双方とも同じプロトコルを使用した。表4:実験1024及び実験1025についてのPCRサイクリング条件注.アンチセンスプライマーの5’タグ及び3’タグは大文字で示す。遺伝子はNRAS神経芽細胞腫RASウイルス癌遺伝子ホモログ、geneID4893、MIM164790、BCR切断点クラスター領域、geneID613、MIM151410、APC腺腫性結腸ポリポーシス、geneID324、MIM611731、及び再配列免疫グロブリン重鎖IGH遺伝子IGH、geneID3492である。当業者は、本明細書に記載される発明が具体的に記載されるもの以外の変形例及び改良例を受け入れ得ることを理解するであろう。本発明はかかる変形例及び改良例を全て包含することが理解されるべきである。本発明はまた、本明細書で参照又は指示されるステップ、特徴、組成物及び化合物も全て、個別に、又はまとめて、並びに前記ステップ又は特徴のうちの任意の2つ以上のあらゆる組み合わせも包含する。参考文献BorerP.N.etal.1974J.Mol.Biol.86:843Brisco,M.J.,Bartley,P.A.,andMorley,A.A.2011AntisensePCR:Asimpleandrobustmethodforperformingnestedsingle-tubePCR.AnalyticalBiochemistry409:176-182Bustinetal.Clin.Chem.552009611-622Chengetal.,1994,EffectiveamplificationoflongtargetsfromclonedinsertsandhumangenomicDNA.ProcNatlAcadSci.91:5695-5699ChingJetal,2006,Closed-systemmulti-stagenucleicacidamplificationreactionsUnitedStatesPatentApplication20060177844DuBreuilLastrucci,etal2007NestedPCRemployingdegradableprimersUnitedStatesPatent7,273,730ErlichHA,etal1994MethodsfornucleicacidamplificationUnitedStatesPatent5,314,809GroszRetal1994MethodforamplificationoftargetedsegmentsofnucleicacidusingnestedpolymerasechainreactionUnitedStatesPatent5,340,728KempDJetal,1990,Simplifiedcolorimetricanalysisofpolymerasechainreactions:detectionofHIVsequencesinAIDSGene,94:223-228SambrookandRussel,2001,MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rdEd.ColdSpringHarbor,N.W.:ColdSpringHarborLaboratoryPress.Chapter8:InvitroAmplificationofDNAbythePolymeraseChainReaction.SantaLucia,J.,1998Proc.Nat.Acad.Sci.USA95:1460XuDingbangXie2008SingletubeinsitunestedpolymerasechainreactionmethodanditsusePublicationCN1858219YournoJ,1996MethodandapparatusfornestedpolymerasechainreactionPCRwithsingleclosedreactiontubesUnitedStatesPatent5,556,773"