真核細胞のゲノムにおいて標的配列を改変する方法であって、該細胞に、Talエフェクタータンパク質のDNA結合ドメインおよび制限ヌクレアーゼの非特異的切断ドメインを含む融合タンパク質、または該融合タンパク質を発現可能な形態でコードする核酸分子を導入する工程を含み、該制限ヌクレアーゼがFokIであり、該融合タンパク質が、標的配列中に特異的に結合し、かつ該標的配列中に二本鎖切断を導入する、方法。該細胞に核酸分子を導入する工程をさらに含む方法であって、標的配列の改変が、ドナー核酸配列との相同組換えによるものであり、該核酸分子が、ドナー核酸配列および標的配列に相同な領域を含む、請求項1記載の方法。該細胞が、哺乳動物細胞または脊椎動物細胞、植物細胞または真菌細胞からなる群より選択される、請求項1または2記載の方法。該細胞が卵母細胞である、請求項1~3いずれか記載の方法。融合タンパク質または該融合タンパク質をコードする核酸分子が、マイクロインジェクションにより細胞に導入される、請求項1~4いずれか記載の方法。の核酸分子が、マイクロインジェクションにより細胞に導入される、請求項2~4いずれか記載の方法。該融合タンパク質を発現可能な形態でコードする核酸分子がmRNAである、請求項1~6いずれか記載の方法。標的配列に相同な領域が、ドナー核酸配列の5末端および3末端に位置する、請求項2~7いずれか記載の方法。の核酸分子に含まれる標的配列に相同な領域が、少なくとも400bpの長さを有する、請求項2~8いずれか記載の方法。標的配列の改変が、標的配列の少なくとも1つのヌクレオチドの置換、挿入および欠失からなる群より選択される、請求項1~9いずれか記載の方法。該細胞が、げっ歯類、イヌ、ネコ、霊長類、ウサギ、ブタもしくはウシからなる群より選択される哺乳動物由来のものであるか、または該細胞が、ニワトリ、シチメンチョウ、キジ、アヒル、ガン、ウズラならびにダチョウ、エミューおよびヒクイドリなどの平胸類からなる群より選択される鳥類由来のものであるか、または該細胞が、ゼブラフィッシュ由来のものである、請求項1~10いずれか記載の方法。請求項1~11いずれか記載の方法により作製された細胞を偽妊娠メス宿主に移す工程を含む、ゲノム中に改変された標的配列を有する非ヒト脊椎動物または非ヒト哺乳動物の作製方法。偽妊娠メス宿主に移す前に、着床前胚を形成するように該細胞を培養するか、または該細胞を胚盤胞に導入する工程をさらに含む、請求項12記載の方法。非ヒト哺乳動物が、げっ歯類、イヌ、ネコ、霊長類、ウサギ、ブタおよびウシからなる群より選択されるか、または非ヒト脊椎動物が、魚類および鳥類からなる群より選択される、請求項12または13記載の方法。Talエフェクタータンパク質のDNA結合ドメインおよび制限ヌクレアーゼの非特異的切断ドメインを含む融合タンパク質であって、該制限ヌクレアーゼがFokIである、融合タンパク質。用語改変は、本発明により使用する場合、ヌクレオチド配列中に変化をもたらす部位特異的なゲノム操作のことをいう。ヌクレオチド配列中にこれらの変化を含む遺伝的物質は、本明細書において改変された標的配列とも称される。用語改変としては、限定されないが、標的配列中の1つ以上のヌクレオチドの置換、挿入および欠失が挙げられる。本明細書で使用する場合、用語置換は、他のヌクレオチドによるヌクレオチドの置き換えのことをいう。該用語は、例えば、点変異を生じる単一のヌクレオチドの置き換えを含む。前記点変異は、得られたタンパク質産物中にアミノ酸交換を引き起こし得るが、アミノ酸レベルでは反映されないこともある。用語置換には、例えば遺伝子の一部、エクソンまたはイントロンの一部など多数のヌクレオチドの置き換えならびに遺伝子全体の置き換えを生じる変異も包含される。本発明に従って、用語挿入は、核酸分子への1つ以上のヌクレオチドの組み込みのことをいう。エクソンまたはイントロンの一部などの遺伝子の一部の挿入、ならびに遺伝子全体の挿入も用語挿入に包含される。挿入されたヌクレオチドの数が3で割り切れない場合、挿入は、遺伝子のコーディング配列中にフレームシフト変異を生じ得る。かかるフレームシフト変異は、変異後の遺伝子にコードされるアミノ酸を変化させる。いくつかの場合、かかる変異は、未熟な終止コドンに出くわす活性な遺伝子の翻訳を引き起こし、翻訳の終結および切断型タンパク質の産生をもたらす。挿入されたヌクレオチドの数が3で割り切れる場合、得られた挿入は、インフレーム挿入である。この場合、リーディングフレームは、挿入後に無傷なまま残り、挿入されたヌクレオチドが終止コドンをコードしない場合は、翻訳は最も高い確率で完了まで進む。しかしながら、挿入されたヌクレオチドのために、完了したタンパク質は、挿入の大きさに依存して、タンパク質の機能に影響し得る1つまたは多数の新たなアミノ酸を含む。本発明に従って使用する場合、用語欠失は、ヌクレオチド、またはエクソンもしくはイントロンなどの遺伝子の一部ならびに遺伝子全体の消失のことをいう。用語挿入に関して定義されるように、3で割り切れない数のヌクレオチドの欠失は、フレームシフト変異を引き起こし、欠失後に生じるコドンの全てが翻訳時に不正確に読まれ、重度に変化したおよび最も高確率には機能しないタンパク質が産生されることがある。欠失がフレームシフト変異を生じない場合、すなわち欠失したヌクレオチドの数が3で割り切れるので、得られるタンパク質は、最終的なタンパク質としては変化するが、欠失の大きさに依存して、いくつかのアミノ酸を欠き、タンパク質の機能に影響を及ぼすことがある。先に定義される改変は、ゲノムのコーディング領域に限定されないが、標的ゲノムのノンコーディング領域、例えばプロモーターまたはエンハンサーエレメントなどの調節領域中またはイントロン中においても生じ得る。標的ゲノムの改変の例としては、限定されないが、遺伝子機能に対する影響を解析するための野生型遺伝子への変異の導入;変異した遺伝子による遺伝子全体の置き換え、または代替的に、標的配列が変異を含む場合、どの変異が特定の影響の原因であるかを同定するためのこれらの変異の変化;遺伝子もしくはタンパク質の全体の除去または遺伝子もしくはタンパク質からの調節領域の除去ならびに例えばhisタグもしくはtapタグ等の精製タグなどの融合パートナーの導入が挙げられる。本発明によると、用語ゲノム中の標的配列は、本発明の方法により改変されるゲノム位置のことをいう。ゲノム中の標的配列は、限定されないが、特定の改変に対するヌクレオチド対象を含む。さらに、用語ゲノム中の標的配列は、第2の核酸分子の相同配列の結合のための領域も含む。言い換えると、用語ゲノム中の標的配列は、改変される関連のあるヌクレオチドの周囲の配列も含む。好ましくは、用語標的配列は、改変される遺伝子全体のことをいう。本明細書で使用される場合、用語真核細胞は、単核または多核真核生物の任意の細胞、例えば脊椎動物などの動物ならびに真菌および植物由来の細胞のことをいう。本発明に従って使用される用語Talエフェクタータンパク質のDNA結合ドメインおよび制限ヌクレアーゼの非特異的切断ドメインを含む融合タンパク質は、DNA結合ドメインを含む融合タンパク質のことをいい、該DNA結合ドメインは、Talエフェクターモチーフおよび制限ヌクレアーゼの非特異的切断ドメインを含むか、それらからなる。本発明の方法に使用される融合タンパク質は、天然のエンドヌクレアーゼの酵素活性を維持するかまたは本質的に維持する。本発明によると、エンドヌクレアーゼ機能は、エンドヌクレアーゼ活性の生物学的活性の少なくとも60が維持される場合に本質的に維持される。好ましくは、エンドヌクレアーゼ活性の少なくとも75または少なくとも85が維持される。エンドヌクレアーゼの生物学的活性の少なくとも90、例えば少なくとも95、さらに好ましくは少なくとも98、例えば少なくとも99が維持されることがより好ましい。生物学的活性が完全に、すなわち100まで維持されることが最も好ましい。また、本発明によると、融合タンパク質は、内因性エンドヌクレアーゼに比べて高い生物学的活性、すなわち100より高い活性を有する。エンドヌクレアーゼの生物学的活性を評価する方法は、当業者に周知であり、限定されないが、エンドヌクレアーゼと組換えDNAのインキュベーションおよびゲル電気泳動による反応産物の分析が挙げられる。本明細書で使用する場合、用語Talエフェクタータンパク質は、タンパク質のTAL転写アクチベーター様ファミリーに属するタンパク質のことをいう。これらのタンパク質は、キサントモナス属の細菌性植物病原体により発現される。大きなTALエフェクターファミリーのメンバーは、キサントモナスの重要なビルレンス因子であり、真核生物転写因子を模倣することにより宿主細胞を再プログラムする。多くの細菌の病原性は、細胞プロセスを操作するための、III型分泌を介したエフェクタータンパク質の真核細胞への注入に依存する。植物病原性キサントモナス由来のTALエフェクタータンパク質は、植物細胞核内で転写アクチベーターとして機能する重要なビルレンス因子である。PthXo1、キサントモナスコメ病原体のTALエフェクタータンパク質は、コメ遺伝子Os8N3の発現を活性化し、キサントモナスにコメ植物をクローン化させる。TALエフェクタータンパク質は、タンデムリピートの中央ドメイン、すなわちDNA結合ドメインならびに核局在化シグナルおよび酸性転写活性化ドメインを特徴とする。このエフェクターファミリーのメンバーは、高度に保存され、主にそのリピートのアミノ酸配列およびリピートの数が異なる。TLAエフェクタータンパク質中のリピートの数および順番により、その特異的な活性が決定される。これらのリピートは、本明細書においてTALエフェクターモチーフと称される。このエフェクターファミリーのある代表的なメンバーの斑点細菌病菌由来のAvrBs3は、175個のリピートを含み、コショウ植物のBs3耐性遺伝子を含むUPA遺伝子の発現を誘導する83848KaySandUBonas2009CurrOpinMicrobiol123743。AvrBs3のリピートは、AvrBs3のDNA結合に必須であり、異なる型のDNA結合ドメインを提示する。配列特異的DNA認識の機構は、TALエフェクターのDNA認識コードを明らかにしたAvrBs3、Hax2、Hax3およびHax4タンパク質に関する最近の研究により解明されている。Talエフェクターモチーフまたはリピートは、32~34アミノ酸タンパク質配列モチーフである。DNA塩基A、G、CまたはTに対する特異性を決定する2つの隣り合う高度に可変性の残基以外、該リピートのアミノ酸配列は保存されている。言い換えると、DNAへの結合は、DNA二重ヘリックスのヌクレオチドと、特定のTalエフェクタータンパク質のTalエフェクターモチーフ中の12位および13位の可変性残基との接触により媒介される。したがって、Talエフェクタータンパク質中の連続アミノ酸リピートと標的DNA中の連続ヌクレオチドの間の1対1対応が見出された。それぞれのTalエフェクターモチーフは、主にDNA基質中の1ヌクレオチドを認識する。例えば、以下の実施例1に示すように、12位のヒスチジンと13位のアスパラギン酸の組合せは、特異的にシチジンに結合し、12位と13位の両方のアスパラギンの組合せは、特異的にグアノシンに結合し、12位のアスパラギンと13位のイソロイシンの組合せは、特異的にアデノシンに結合し、12位のアスパラギンと13位のグリシンの組合せは、特異的にチミジンに結合する。より長いDNA配列への結合は、直列のこれらのTalエフェクターモチーフのいくつかが連結してTalエフェクタータンパク質のDNA結合ドメインを形成することにより達成される。したがって、用語Talエフェクタータンパク質のDNA結合ドメインは、天然に存在するTalエフェクタータンパク質中に見られるDNA結合ドメインならびに以下の実施例に記載された特異的標的ヌクレオチド配列に結合するように設計されたDNA結合ドメインに関する。特異的標的配列を認識して切断するTalエフェクターモチーフヌクレアーゼ融合タンパク質の作製のための、Talエフェクタータンパク質のかかるDNA結合ドメインの使用は、前記特定の標的を特異的に認識し得るTalエフェクタータンパク質のDNA結合ドメインの信頼性の高い作製に依存する。Talエフェクタータンパク質のDNA結合ドメインの作製方法は、本願に添付の実施例に開示される。好ましくは、DNA結合ドメインは、天然に存在するTalエフェクタータンパク質、例えばAvrBs3、Hax2、Hax3またはHax4からなる群より選択されるTalエフェクタータンパク質中に見られるTalエフェクターモチーフに由来する12736Kayetal2005MolPlantMicrobeInteract1883848。好ましくは、制限ヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼである。用語エンドヌクレアーゼおよび制限エンドヌクレアーゼは、本明細書において、当該技術分野により提供される周知の定義に従って使用される。よって、両方の用語は、ポリヌクレオチド鎖中のホスホジエステル結合の切断により核酸を切断し得る酵素のことをいう。好ましくは、エンドヌクレアーゼはII型S制限エンドヌクレアーゼ、例えばFokI、AlwI、SfaNI、SapI、PleI、NmeAIII、MboII、MlyI、MmeI、HpYAV、HphI、HgaI、FauI、EarI、EciI、BtgZI、CspCI、BspQI、BspMI、BsaXI、BsgI、BseI、BpuEIBmrIBcgIBbvI、BaeI、BbsIAlwIもしくはAcuIまたはIII型制限エンドヌクレアーゼである。また、本明細書において、メガヌクレアーゼ、例えばISceIも構想される。より好ましくは、エンドヌクレアーゼはFokIエンドヌクレアーゼである。FokIは、細菌性IIS型制限エンドヌクレアーゼである。これは、二本鎖DNA中の非パリンドロームペンタデオキシリボヌクレオチド5GGATG35CATCC3を認識し、認識部位の913ヌクレオチド下流を切断する。FokIは、切断部位では、いかなる特異的配列も認識しない。一旦、DNA結合ドメインが認識部位に固定されると、エンドヌクレアーゼドメインにシグナルが伝達され、切断が起こる。切断部位から融合タンパク質のDNA結合部位の距離は、融合タンパク質中に存在する特定のエンドヌクレアーゼに依存する。例えば、本発明の実施例で使用される融合タンパク質は、融合タンパク質の2つの結合部位に並ぶ6bp配列の中心を切断する。さらなる例として、FokIおよびEcoP15Iなどの天然に存在するエンドヌクレアーゼは、DNA結合部位からそれぞれ913および27bpの距離を切断する。本発明によると、単一ヌクレアーゼドメインと結合するTalエフェクタータンパク質のDNA結合ドメインを含む機能的モノマーとして提供される融合タンパク質が構想される。Talエフェクタータンパク質のDNA結合ドメインおよびヌクレアーゼの切断ドメインは、互いに直接融合してもよいし、リンカーを介して融合してもよい。本発明に従って使用される用語リンカーは、アミノ酸の続きおよび非ペプチドリンカーに関連する。本発明により構想されるペプチドリンカーは、少なくとも1アミノ酸長のペプチドリンカーである。好ましくは、リンカーは、1~100アミノ酸長である。より好ましくは、リンカーは、5~50アミノ酸長であり、さらに好ましくは、リンカーは10~20アミノ酸長である。リンカーの性質、すなわち長さおよびまたはアミノ酸配列は、分子の安定性およびまたは溶解度を改変し得るかまたは高め得ることが当業者に周知である。よって、リンカーの長さおよび配列は、本発明の融合タンパク質のそれぞれの部分の組成に依存する。当業者は、種々のリンカーの適切性を試験する方法を知っている。例えば、分子の性質は、本発明の融合タンパク質のそれぞれの部分のヌクレアーゼ活性およびDNA結合特異性を試験することにより容易に試験され得る。本発明の融合タンパク質を、発現可能な形態で該融合タンパク質をコードする核酸分子として提供する場合、リンカーは前記核酸分子によりコードされるペプチドリンカーであることが当業者に理解される。本発明に従って使用される用語非ペプチドリンカーは、上述で定義されるペプチドリンカーを除外するが、2つ以上の反応基を有する結合基のことをいう。例えば、非ペプチドリンカーは、本発明の融合タンパク質の個々の部分の反応基に個々に結合する両端、例えばアミノ末端、リジン残基、ヒスチジン残基またはシステイン残基に反応基を有するポリマーであり得る。ポリマーの反応基としては、アルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒド基、マレイミド基、ケトン基、ビニルスルホン基、チオール基、ヒドラジド基、カルボニルジイミダゾール基、炭酸ニトロフェニル基、トリシレート基、イソシアネート基、およびスクシンイミド誘導体が挙げられる。スクシンイミド誘導体の例としては、プロピオン酸スクシンイミジル、ブタン酸スクシンイミジル、スクシンイミジルカルボキシメチレート、スクシンイミジルスクシンアミド、コハク酸スクシンイミジル、炭酸スクシンイミジルおよびNヒドロキシスクシンイミドが挙げられる。非ペプチドポリマーの両端の反応基は、同じであっても異なっていてもよい。例えば、非ペプチドポリマーは、一方の端にマレイミド基を有し、もう一方の端にアルデヒド基を有し得る。好ましい態様において、リンカーはペプチドリンカーである。より好ましくは、ペプチドリンカーは7個のグリシン残基からなる。理論に限定されることを望まないが、本発明者らは、本発明の融合タンパク質による二本鎖切断の機構には、DNA基質を切断するために、ヌクレアーゼドメインの二量体化が必要であると考える。よって、好ましい態様において、工程において少なくとも2つの融合タンパク質が細胞内に導入される。融合タンパク質の二量体化は、1種類のみの融合タンパク質が存在する場合にホモダイマーの形成をもたらし得、異なる種類の融合タンパク質が存在する場合にヘテロダイマーの形成をもたらし得る。本発明によると、Talエフェクタータンパク質の異なるDNA結合ドメインを有する少なくとも2つの異なる種類の融合タンパク質が細胞に導入されることが好ましい。少なくとも2種類の異なる融合タンパク質は、別々にまたは一緒に細胞に導入され得る。本明細書において、細胞への導入前に、同一または異なる融合タンパク質の2つのサブユニットの結合による機能的ダイマーとして提供される融合タンパク質も構想される。適切なリンカーは、上述で定義される。用語発現可能な形態で融合タンパク質をコードする核酸分子は、細胞または細胞非含有系での発現の際に、機能的融合タンパク質を生じる核酸分子のことをいう。本明細書を通じて使用される場合、核酸分子および核酸配列は、DNA、例えばcDNAまたはゲノムDNAおよびRNAを含む。好ましくは、RNAに言及する態様はmRNAに関する。さらに、RNAウイルスのRNAの場合などのゲノムRNAが含まれる。遺伝的コードの縮重のために、1種類より多くの核酸分子が本発明による融合タンパク質をコードし得ることを当業者は容易に理解する。3つ組コードが20種類のアミノ酸および終止コドンを指定するために縮重が生じる。遺伝的情報をコードするために利用される4つの塩基が存在するので、少なくとも21個の異なるコードを生成するために3つ組コドンが必要である。3つ組中の塩基について起こり得る43の可能性は、64個の可能性のあるコドンを生じ、いくつかの縮重が存在しなければならないことを意味する。結果的に、1つより多くから6個までの3つ組によりいくつかのアミノ酸がコードされる。縮重は、主に3つ組中の3番目の位置の変化により生じる。これは、同じ融合タンパク質をコードしているが異なる配列を有する核酸分子が本発明により使用され得ることを意味する。本発明によると、用語標的配列に特異的に結合し、標的配列中に二本鎖切断を導入するは、融合タンパク質が、統計的に特定の配列のみに結合し、ゲノム中の関係のない他の配列には結合しないように設計されることを意味する。好ましくは、本発明による融合タンパク質は、少なくとも18個のTalエフェクターモチーフを含む。言い換えると、前記融合タンパク質中のTalエフェクタータンパク質のDNA結合ドメインは、少なくとも18個のTalエフェクターモチーフで構成される。上述のダイマーからなる融合タンパク質の場合、これは、融合タンパク質のそれぞれのモノマーが少なくとも9個のTalエフェクターモチーフを含むことを意味する。より好ましくは、それぞれの融合タンパク質は、少なくとも12個のTalエフェクターモチーフ、例えば少なくとも14個または少なくとも16個のTalエフェクターモチーフを含む。本発明による融合タンパク質のDNA結合特異性を試験する方法は当業者に公知であり、限定されないが、転写レポーター遺伝子アッセイおよび電気泳動移動度シフトアッセイが挙げられる。好ましくは、融合タンパク質の結合部位は、本発明により改変されるヌクレオチドの上流または下流の500ヌクレオチドまで、例えば250ヌクレオチドまで、100ヌクレオチドまで、50ヌクレオチドまで、25ヌクレオチドまで、10ヌクレオチドまで、例えば5ヌクレオチドまでである。本発明の好ましい態様において、標的配列の改変は、ドナー核酸配列との相同組換えによるものであり、さらに核酸分子を細胞に導入する工程を含み、該核酸分子は、ドナー核酸配列および標的配列に相同な領域を含む。用語相同組換えは、当該技術分野に提供される定義に従って使用される。よって、該用語は、同様のヌクレオチド配列を含む2つのDNA鎖が遺伝物質を交換する遺伝的組換えの機構ことをいう。細胞は、減数分裂の際に相同組換えを使用し、これは完全に特有の半数体染色体の組を作製するためのDNA再配列において機能するが、損傷したDNAの修復、特に二本鎖切断の修復にも機能する。相同組換えの機構は、当業者に周知であり、例えばPaquesandHaberにより記載される。本発明によると、用語ドナー核酸配列は、相同組換えのプロセスにおいて鋳型として機能し、標的配列に導入される改変を有する核酸配列のことをいう。このドナー核酸配列を鋳型として使用して、改変を含む遺伝情報を、細胞のゲノム中の標的配列にコピーする。非限定的な例において、ドナー核酸配列は、異なり、かつ相同組換えの際に点変異の導入をもたらす1つのヌクレオチドを除き、置き換えられる標的配列の一部と本質的に同一であり得るか、または標的配列中には予め存在しないさらなる遺伝子からなり得る。本発明の標的配列の改変方法によると、工程で細胞に導入される核酸分子は、上述のドナー核酸配列および標的配列に相同なさらなる領域を含む。工程で細胞に導入される核酸分子は、融合タンパク質をコードする核酸分子ならびにドナー核酸配列および標的配列に相同な領域を含む核酸分子の両方を含み得ることを当業者は理解する。あるいは、工程の核酸分子は、工程に従って融合タンパク質をコードする核酸分子の他に導入されるさらなる核酸分子であり得る。本発明による用語標的配列に相同な領域は、標的配列への特異的結合を確実にするのに充分な配列同一性を有する領域のことをいう。2つの核酸配列間の同一性レベルを評価する方法は、当該技術分野で周知である。例えば、配列は、当該技術分野に公知の適切なコンピュータープログラムを使用して、電気的に整列され得る。かかるプログラムは、BLASTJMolBiol215403、WUBLASTMethodsEnzymol266460、FASTAProcNatlAcadSciUSA852444などのその変形物またはSmithWatermanアルゴリズムの装置JMolBiol147195を含む。これらのプログラムは、ペアワイズ配列アライメントを提供することに加え、配列同一性レベルおよび偶然のアライメントの起こる可能性も報告する。好ましくは、標的配列に相同な領域は、標的配列の対応する部分と少なくとも95、より好ましくは少なくとも97、より好ましくは少なくとも98、より好ましくは少なくとも99、さらに好ましくは少なくとも999、最も好ましくは100の配列同一性を有する。上述の配列同一性は、相同アームについて結合部位として機能する標的配列の部分に関してのみ定義される。よって、全標的配列と、本発明の標的配列を改変する方法の工程の核酸分子の相同領域の間の全配列同一性は、ドナー核酸配列により置き換えられる標的配列の一部が存在するために、上述の配列同一性とは異なり得る。標的配列に相同な少なくとも2つの領域が、の核酸分子中に存在することが好ましい。本発明の方法によると、融合タンパク質を細胞に導入する工程および核酸分子を細胞に導入する工程はいずれも、両立して、すなわち同時に行なわれるか、または別々に、すなわち個々に異なる時点で行われる。該工程が両立して行なわれる場合、融合タンパク質と核酸分子の両方は、並行して、例えば2つの別々の注入針を使用して投与され得るか、または混合して一緒に、例えば1つの針を使用して注入され得る。本発明によると、驚くべきことに、遺伝子改変、例えば標的化された遺伝子改変を真核細胞のゲノムに導入して、Talエフェクタータンパク質のDNA結合ドメインおよび制限ヌクレアーゼの非特異的切断ドメインを含む融合タンパク質を使用して、10までの予測されない高頻度の相同組換えを達成することが可能であることが見出された。本発明の方法の切断工程を行うことは、非相同末端結合修復による二本鎖切断の修復に伴うヌクレオチド消失により、自発的なゲノム改変を高頻度で引き起こす。また、ドナー核酸配列および標的配列に相同な領域を含む核酸分子を提供することにより、標的化されたゲノムの改変は、高い特異性で達成され得る。頻度が向上された遺伝的改変を達成するためのいくつかの方法が当該技術分野で公知である。かかる方法としては、例えば相同組換えを達成するためのジンクフィンガーヌクレアーゼの使用が挙げられる。しかしながら、新しいDNA標的配列に高い効率で結合するジンクフィンガータンパク質を設計するために、かなりの労力と時間が必要である。さらに、一般的に、隣り合うジンクフィンガーは互いに影響を及ぼす。よって、配列特性を高めるために、組合せ方法においてこれらを単純により大きなタンパク質に合わせることはできない。結果的に、前もって選択されたジンクフィンガータンパク質に新しいジンクフィンガーを付加することには、それぞれ個々の工程について面倒なスクリーニングおよび選択手順が必要である。さらに、分かっているDNA結合コードが不完全であり、ジンクフィンガードメインをコードする供給源が制限されるために、現在では、任意の所定のDNA標的配列に特異的なジンクフィンガータンパク質に融合されたヌクレアーゼを設計することは困難である。現在利用可能な供給源を使用して、哺乳動物ゲノム中の1000塩基対の標的領域中にただ1つのジンクフィンガーヌクレアーゼを見出し得たと理解されている294301Maederetal2009NatProtoc41471501。標的配列特異的DNA二本鎖切断を達成するために使用される別の方法は、哺乳動物ゲノム中には天然に存在しない特異的な18bp認識配列に結合する制限酵素様ISceIを示す酵母由来のメガヌクレアーゼの使用である。しかしながら、メガヌクレアーゼのDNA結合特異性の組合せコードは明らかにされていない。これまで、メガヌクレアーゼのDNA結合ドメインの再設計により、これまでにその天然の結合配列中の1個または数個のヌクレオチドの置換のみが可能になった4966。そのため、メガヌクレアーゼ標的部位の選択は非常に限定され、現在でも、哺乳動物ゲノム中の任意の好ましい標的に結合する新規のメガヌクレアーゼを設計することは可能ではない。これらの方法とは対照的に、TalエフェクターDNA結合ドメインは、任意のゲノム中の任意の標的配列に適用され得る選択された特異性を有して、新規のDNA結合タンパク質の構築のための単純な組合せコードを提供する。本発明によると、現在当業者が直面している上述の課題を解決する標的ゲノムに遺伝的改変を導入する方法が提供される。特に、任意の数のヌクレオチド特異的Talエフェクターモチーフを組み合わせて、本発明の融合タンパク質に使用される配列特異的DNA結合ドメインが形成され得る。したがって、目的の任意の配列は、費用効果的で、簡単かつ迅速な方法でターゲッティングされ得る。好ましい態様において、標的ゲノムの成功裡な改変について細胞が分析される。改変の有無を分析するための方法は、当該技術分野で周知であり、限定されることなく、核酸分子の物理的分離に基づくアッセイ、配列決定アッセイならびに切断および消化アッセイ、およびポリメラーゼ連鎖反応によるDNA分析が挙げられる。核酸分子の物理的分離に基づくアッセイの例としては、限定されることなく、MALDITOF、変性勾配ゲル電気泳動および当該技術分野に公知の他のかかる方法が挙げられる253259HsiaetalTheorApplGenet111218225TostandGutClinBiochem35335350PalaisetalAnalBiochem346167175参照。配列決定アッセイの例は、限定されることなく、直接配列決定、自動DNAシークエンサーにおける蛍光SSCPおよびピロシークエンシングによる配列解析のアプローチを含む。これらの手順は当該技術分野に一般的であるAutomatedDNASequencingandAnalysisAcademicPress1994AlpheyDNASequencingFromExperimentalMethodstoBioinformaticsSpringerVerlagPublishing1997RamonetalJTranslMed19MengetalJClinEndocrinolMetab9034193422参照。切断および消化アッセイの例としては、限定されることなく、制限断片長多形アッセイ、RNase保護アッセイ、化学切断法に基づくアッセイ、酵素ミスマッチ切断アッセイなどの制限消化アッセイが挙げられる8791ToddetalJOralMaxilSurg59660667AmaretalJClinMicrobiol40446452参照。代替的に、所望の改変の有無について細胞を分析する代わりに、適切な選択マーカーの取り込みにより成功裡に改変された細胞を選択し得る。選択マーカーとしては、当該技術分野において周知であり、当業者により常套的に使用される正および負の選択マーカーが挙げられる。選択マーカーの非限定的な例としては、dhfr、gpt、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、G418またはグルタミンシンターゼが挙げられる。これらのマーカーを使用して、細胞を選択培地中で増殖させ、最も高い耐性を有する細胞を選択する。相同組換えまたはランダム組み込みにより標的ゲノム中に組み込まれ得る組み合わされた正負選択マーカーも構想される。正の選択後、リコンビナーゼ認識部位の隣にある正の選択マーカーを含む第1のカセットを、マーカーが少ない第2のカセットに対するリコンビナーゼ媒介カセット交換により交換する。次いで、負の選択により、所望の交換カセットを含むクローンを得る。本発明の方法の好ましい態様において、細胞は、哺乳動物細胞または脊椎動物細胞、植物細胞または真菌細胞からなる群より選択される。本発明の方法のさらに好ましい態様において、細胞は卵母細胞である。本明細書で使用する場合、用語卵母細胞は、生殖に関与するメスの生殖細胞、すなわち卵子または卵細胞のことをいう。本発明によると、用語卵母細胞は、受精前の卵母細胞、および接合子とも称される受精した卵母細胞の両方を含む。したがって、受精前の卵母細胞は、母性染色体のみを含むが、受精後の卵母細胞は、母性および父性の両方の染色体を含む。受精後、卵母細胞は、数時間、例えばマウスでは受精後18時間まで、二重ハプロイド状態のままである。本発明の方法のより好ましい態様において、卵母細胞は受精した卵母細胞である。本明細書で使用する場合、用語受精した卵母細胞は、受精しようとしている精子と融合した後の卵母細胞のことをいう。受精後数時間、卵母細胞は二重ハプロイド状態であり、1つの母性ハプロイド前核および1つの父性ハプロイド前核を含む。2つの前核が一緒に移動した後、それらの膜が壊れて、2つのゲノムが凝縮されて染色体になり、二倍体生物が再構築される。好ましくは、本発明の方法に使用される哺乳動物卵母細胞または鳥類卵母細胞は、二重ハプロイド状態の受精した哺乳動物卵母細胞または鳥類卵母細胞である。受精した卵母細胞の全能性接合子へのリモデリングは、生物学における最も複雑な細胞トランスフォーメーションの1つのことをいう。顕著に、この変化は、転写因子の非存在下で起こり、そのため卵形成の際に卵母細胞中に蓄積したmRNAに依存する。一次減数分裂前期の複糸期で拘束される成長しているマウス卵母細胞は、多くの自身の遺伝子を転写および翻訳して、8細胞期までの発生を補助するのに十分なタンパク質の貯蔵を生成する。これらの転写産物は、卵母細胞成熟および卵活性化の二段階で卵母細胞を誘導し、卵母細胞は接合子になる。典型的に、卵母細胞は、排卵されて、第二の拘束点に到達する前に受精コンピテントになる。卵母細胞が卵に成熟する際に、卵母細胞は二次減数分裂の中期で拘束され、転写が停止して、mRNAの翻訳が低下する。この時点で、排卵されたマウスの卵は直径0085mm、体積約300ピコリットルであり、通常の体細胞の大きさの1000倍を超える。哺乳動物の一生および胚発生は、精子が卵と受精して接合子を形成した際に開始する。卵の受精は、卵活性化を誘発し、減数分裂の完了および前核の形成にシグナル伝達することにより、接合子へのトランスフォーメーションが完了する。この段階で、接合子は1細胞胚であり、精子由来のハプロイド父性前核および卵母細胞由来の母性前核を含む。マウスにおいて、この全能性一細胞期は、約18時間だけ続き、その後最初の体細胞分裂が起こる。全動物の生殖細胞系は一細胞内に接触可能であるので、全能性一実体として、哺乳動物接合子は、ゲノムエンジニアリングの好ましい基質と見なされる。しかしながら実験のアクセスし易さおよび接合子の操作は、利用可能である数が非常に限定されており、性質の持続が非常に短いので、重度に制限される。これらのパラメーターは、105未満の頻度で起こる遺伝子ターゲッティングなどのほとんどのゲノム操作が、1つの標準培養プレート中で107個の細胞数まで増殖される培養胚性幹細胞中でのみ成功裡に実施され得ることを容易に説明する。この規則の例外のみが、注入された接合子の30までのトランスジーン組み込みの高い頻度のために常套的な手順へと発展し前核DNA注入によるトランスジェニックマウスの作製に関わる。マイクロインジェクションされたトランスジーンはゲノムにランダムに組み込まれるので、この方法は、正常なゲノムのバックグラウンドに対してさらなる遺伝子を発現させるためだけに使用され得るが、内因性遺伝子の標的化された改変は可能にならない。標的化された遺伝子操作についての接合子の潜在性を特徴付けるBrinsterによる初期の報告では、14ヶ月の注入において10000を超える接合子からただ1つの標的化されたマウスが得られたので、このアプローチは実用的でないと示された。したがって、Brinsterらは、この方法におけるさらなる試みをあきらめた。低い組換え頻度に加えて、Brinsterらは、組織適合性クラスII遺伝子の機能が大きく損なわれた標的化された対立遺伝子において、望ましくない変異が自発的に多く生じることを記した。Brinsterらの経験から、接合子前核におけるゲノムDNAの生理学的、生化学的および後成的な関連は、高頻度で起こるトランスジーンのランダム組み込み以外の標的化遺伝子操作を達成するためには好ましくないことが推定され得た。また、卵母細胞の胚への発生の生物学は、標的化遺伝子操作のためのさらなる障害をもたらす。受精した哺乳動物の卵において、DNA複製を行なう2つの前核は、直接的に融合せず、2細胞胚を生成する接合子の最初の対細胞分裂の準備においてそれぞれの前核の膜が壊れるまで、互いに近づいて別々のままでる。1細胞接合子段階は、特有の転写および翻訳制御機構を特徴とする。最も大きな特徴の1つは、1細胞胚がS期を完了して2細胞胚を形成したかどうかに関わらず、受精後約24時間、接合子ゲノムの発現を遅らせる接合子時計と称される時間依存的な機構である。自然では、接合子時計は、凝集した減数分裂状態から選択された遺伝子が転写され得る1つへとクロマチンがリモデリングされ得るまで、接合子遺伝子活性化を遅らせるという利点をもたらす。父性ゲノムは、ヒストンで置き換えられなければならないプロタミンで完全に包まれているので、ZGAが防がれなければ、いくつかの遺伝子は未成熟で発現され得る。細胞特異的な転写は、特異的エンハンサーまたはトランスアクチベーターにより特異的プロモーターが活性化され得る段階へと発生が進むまで、新たに形成された染色体は、全部ではないがほとんどのプロモーターを抑制しなければならないということを要する。マウスにおいて、2細胞胚の形成は、母性遺伝子依存から接合子遺伝子活性化への変化を区別する。哺乳動物の間で、接合子遺伝子活性化の前の発生の程度は、1~4回の卵割事象で、種によって異なる。母性mRNAの分解は、減数分裂性の成熟および2細胞胚の90完了により誘発されるが、母性のタンパク質合成は8細胞期まで続く。転写制御に加えて、接合子時計は、2細胞期まで発生期mRNAの翻訳を遅らせる。そのため、前核に注入されたトランスジェニック発現ベクターからのタンパク質の産生は、mRNAの出現の10~12時間後まで達成されない。Geurtsらは、最近、ラット接合子のゲノム中で二本鎖切断を誘導するためにジンクフィンガーヌクレアーゼが使用され得ることを見出した。この研究において、誘導された鎖の切断は、DNA切断の部位でヌクレオチドを消失するかまたは獲得する、ランダムに起こった変異対立遺伝子を後で同定するために、内因性のエラーが起こりやすいDNA修復機構に残った。ジンクフィンガーヌクレアーゼ切断部位が遺伝子のエクソン領域中に位置すると仮定すると、変異対立遺伝子のいくつかにおいてリーディングフレームシフトが起こり、それにより切断された機能しないタンパク質の産生が引き起こされる。しかし、この方法は、遺伝子のコーディング領域中に方向性のない変異の生成をもたらすのみである。これまで、予め計画されたヌクレオチド置換などの方向性のある改変を誘導すること、レポーター遺伝子およびリコンビナーゼ認識部位などの外因性DNA配列を挿入すること、または例えばマウスとヒトのコーディング領域を置き換えることは可能ではなかった。かかる遺伝的改変の導入には、特異的に設計された遺伝子ターゲッティングベクターと標的遺伝子の相同組換えが必要である。接合子において高い割合の相同組換えを達成する手段はこれまで知られていなかったので、体細胞における遺伝子ターゲッティング、ならびにその後のヒツジおよびブタ由来の除核された卵母細胞への核の移動は、代用技術として使用されていた。しかしながら、両方の技術は手間がかかりそれほど効率的でなく、それらの併用は実用的でなく、常套的な適用のために充分に適していない。本発明によると、当業者が現在直面している上述の課題を解決する標的ゲノムに遺伝的改変を導入する方法が提供される。本発明の方法を使用すると、ここでは遺伝的に改変された動物を、従来技術の方法のいずれかを使用するよりも早く、簡単にかつ費用効果的に作製することが可能である。本発明の方法の別の好ましい態様において、融合タンパク質または該融合タンパク質をコードする核酸分子は、マイクロインジェクションにより卵母細胞に導入される。卵母細胞へのマイクロインジェクションは、核、前核への注入、およびまたは細胞質への注入によりなされ得る。受精した卵母細胞を使用する場合、前核への注入は、1つの前核または両方の前核のいずれかに対して行なわれる。本発明の標的配列を改変する方法の工程のTalフィンガーヌクレアーゼまたはTalフィンガーヌクレアーゼをコードするDNAの注入は、好ましくは核前核になされ、工程のTalフィンガーヌクレアーゼをコードするmRNAの注入は、好ましくは細胞質になされる。工程の核酸分子の注入は、好ましくは核前核になされる。しかしながら、工程の核酸分子の注入はまた、前記核酸分子が核局在化シグナルを有する核酸配列として提供される場合に、細胞質になされ得、核前核への送達を確実にし得る。好ましくは、マイクロインジェクションは、核前核および細胞質への注入によりなされる。例えば、核前核に針が導入され得、第1の量のTalフィンガーヌクレアーゼおよびまたは核酸分子が核前核に注入される。卵母細胞から針を抜きながら、第2の量のTalフィンガーヌクレアーゼおよびまたは核酸分子が細胞質に注入される。マイクロインジェクションを実施する方法は当該技術分野で周知であり、例えばNagyらおよび以下の本明細書の実施例に記載される。本発明の方法の別の好ましい態様において、工程の核酸分子は、マイクロインジェクションにより細胞に導入される。より好ましい態様において、発現可能な形態で融合タンパク質をコードする核酸分子はmRNAである。本発明の方法の別の好ましい態様において、標的配列に相同な領域は、ドナー核酸配列の5および3末端に配置される。この好ましい態様において、ドナー核酸配列は、本発明の方法に使用される核酸分子が標的配列に相同な第1の領域、続いてドナー核酸配列、次いで標的配列に相同な第2の領域からなるように、標的配列に相同な2つの領域に並ぶ。本発明の方法のさらに好ましい態様において、核酸分子に含まれる標的配列に相同な領域は、それぞれ少なくとも400bpの長さを有する。より好ましくは、該領域は少なくとも500ヌクレオチド、例えば少なくとも600ヌクレオチド、少なくとも750bpヌクレオチド、より好ましくは少なくとも1000ヌクレオチド、例えば少なくとも1500ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも2000ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも2500ヌクレオチドの長さを有する。核酸分子に含まれる標的配列に相同な領域の最大長さは、使用されるクローニングベクターの種類に依存し、colEI複製起点を使用した大腸菌高コピープラスミド中それぞれ20000ヌクレオチド長までであり得るか、またはF因子起点を使用したプラスミド中それぞれ300000ヌクレオチド長までであり得る。本発明の方法のさらに好ましい態様において、標的配列の改変は、標的配列の少なくとも1つのヌクレオチドの置換、挿入および欠失からなる群より選択される。本発明によると、置換、例えば1~3ヌクレオチドの置換などの置換およびloxP部位などの外因性配列の挿入、または例えばレポーター遺伝子などのcDNAの挿入が好ましい。かかるレポーター遺伝子のcDNAは、例えば6kb長までであり得る。本発明の方法の別の好ましい態様において、細胞は、げっ歯類、イヌ、ネコ、サル、ウサギ、ブタもしくはウシからなる群より選択される哺乳動物由来であるか、またはニワトリ、シチメンチョウ、キジ、アヒル、ガン、ウズラおよびダチョウ、エミューおよびヒクイドリなどの平胸類からなる群より選択される鳥類由来であるか、または細胞は、ゼブラフィッシュ、サケ、マス、コイまたはコイなどの魚類由来である。本明細書に記載される全ての哺乳動物、鳥類および魚類は、当業者に周知であり、従来技術および当業者の一般的な知識により分類学的に定義される。げっ歯類の非限定的な例は、マウス、ラット、リス、シマリス、ジリス、ヤマアラシ、ビーバー、ハムスター、アレチネズミ、モルモット、デグー、チンチラ、プレーリードッグおよびウッドチャックである。イヌの非限定的な例としては、イヌ亜種のメンバーならびにオオカミ、キツネ、ジャッカルおよびコヨーテが挙げられる。ネコの非限定的な例としては、2種類の亜科のメンバー:ヒョウ、例えばライオン、トラ、ジャガーおよびレオパルド、ならびにネコ、例えばクーガー、チーター、サーバル、オオヤマネコ、カラカル、オセロットおよび飼いネコが挙げられる。用語霊長類は、本明細書で使用する場合、例えばオナガザル類または広鼻猿類を含む全てのサル、ならびにキツネザル、メガネザル、類人猿およびマーモセットが挙げられる。一態様において、哺乳動物卵母細胞は、ヒト卵母細胞ではない。別の態様において、受精した卵母細胞はヒト卵母細胞ではない。本発明はさらに、ゲノム中に改変された標的配列を有する非ヒト脊椎動物または非ヒト哺乳動物を作製する方法に関し、該方法は、本発明の方法により作製された細胞を偽妊娠メス宿主に移す工程を含む。本発明によると、用語本発明の方法により作製された細胞を偽妊娠メス宿主に移す工程は、受精した卵母細胞を移すこと以外に例えば2細胞、4細胞、8細胞、16細胞および胚盤胞期の着床前の胚を移すことも含む。前記着床前の胚は、細胞を、着床前の胚に発生するのに適切な条件下で培養することにより得られ得る。さらに、細胞の胚盤胞への注入または融合は、着床前の胚を得る適切な方法である。本発明の方法で作製した細胞が体細胞である場合、誘導された多能性幹細胞の誘導は、例えば細胞を培養する前、細胞の着床前の胚への注入または融合前など細胞をメス宿主に移す前に必要である。卵母細胞または着床前の胚を偽妊娠メス宿主に移す方法は、当該技術分野で周知であり、例えばNagyらに記載される。さらに、ゲノム中に改変された標的配列を有する非ヒト脊椎動物または哺乳動物を作製する方法によると、メス宿主に移す前に成功裡のゲノム改変の分析工程を行うことが構想される。非限定的な例として、卵母細胞は、2細胞、4細胞または8細胞期まで培養され得、得られた胚を破壊または改変することなく1つの細胞を除去し得る。次いで、例えばPCRまたはサザンブロット技術または本明細書上述の方法のいずれかを使用して、ゲノム構成の分析、例えばゲノム改変の有無の分析が行なわれ得る。移す前の成功裡のゲノム決定のかかる分析方法は、当該技術分野で公知であり、例えばPeippoらに記載される。細胞が卵母細胞である場合、ゲノム中に改変された標的配列を有する非ヒト脊椎動物または哺乳動物を作製する方法は、本発明の方法により脊椎動物または哺乳動物の卵母細胞のゲノム中の標的配列を改変する工程;で得られた卵母細胞を偽妊娠メス宿主に移す工程;および任意にメス宿主から産まれた子孫を、改変の存在について分析する工程を含む。この非ヒト脊椎動物または哺乳動物を作製する方法について、卵母細胞の受精が必要である。前記受精は、本発明の非ヒト脊椎動物または哺乳動物を作製する方法による工程における標的配列の改変前に起こり得、すなわち受精した卵母細胞が、本発明による標的配列を改変する方法に使用され得る。受精はまた、工程の標的配列の改変後に行なわれ得、すなわち本発明による標的配列を改変する方法に未受精卵母細胞が使用され得、次いで卵母細胞は、偽妊娠メス宿主に移す前に受精される。メス宿主から産まれた子孫中の改変の存在を分析する工程は、作製された非ヒト脊椎動物または哺乳動物がゲノム中に改変された標的配列を有するかどうかの必要な情報を提供する。したがって、改変の存在は、前記子孫がゲノム中に改変された標的配列を有することを示し、改変の非存在は、前記子孫がゲノム中に改変された標的配列を有さないことを示す。改変の有無を分析する方法は、先に詳述されている。本発明の方法により作製された非ヒト脊椎動物または非ヒト哺乳動物は、とりわけ目的の遺伝子の機能およびかかる動物中のゲノムの改変の表現型的発現結果の研究に有用である。さらに、本発明の非ヒト哺乳動物は、疾患モデルとしておよび治療剤組成物を試験するために使用され得ることが構想される。さらに、本発明の非ヒト脊椎動物または哺乳動物は、家畜繁殖にも使用され得る。好ましい態様において、非ヒト脊椎動物または哺乳動物を作製する方法はさらに、細胞を培養して、着床前の胚を形成する工程または偽妊娠メス宿主に移す前に、胚盤胞に細胞を導入する工程を含む。細胞を培養して着床前の胚を形成する方法または胚盤胞に細胞を導入する方法は、当該技術分野周知であり、例えばNagyらに記載される。本明細書で使用する場合、用語胚盤胞に細胞を導入する工程は、胚盤胞への細胞の注入ならびに胚盤胞と細胞の融合を包含する。胚盤胞に細胞を導入する方法は、当該技術分野、例えばNagyらに記載される。本発明はさらに、本発明の上述の方法により得られる非ヒト脊椎動物または非ヒト哺乳動物に関する。好ましい態様において、非ヒト哺乳動物は、げっ歯類、イヌ、ネコ、霊長類、ウサギ、ブタまたはウシからなる群より選択されるか、あるいは非ヒト脊椎動物は、魚類、例えばゼブラフィッシュ、サケ、マス、コイもしくはコイ、または鳥類、例えばニワトリ、シチメンチョウ、キジ、アヒル、ガン、ウズラおよび平胸類、例えばダチョウ、エミューおよびヒクイドリからなる群より選択される。本発明はさらに、Talエフェクタータンパク質および制限ヌクレアーゼの非特異的切断ドメインを含む融合タンパク質に関する。本発明の方法の文脈における融合タンパク質に関する上述の全ての定義および好ましい態様は、必要な変更を加えて適用される。さらに、本発明はまた、本発明の融合タンパク質を含むキットに関する。該キットの種々の内容物は、1つ以上のバイアルなどの1つ以上の容器に梱包され得る。該バイアルは、内容物の他に、貯蔵のための保存剤または緩衝剤を含み得る。また、該キットは使用説明書を含み得る。実施例1Rosa26特異的TalエフェクターDNA結合ドメインヌクレアーゼ融合タンパク質の構築融合タンパク質設計哺乳動物細胞におけるTalエフェクターDNA結合ドメインヌクレアーゼ融合タンパク質の機能性を実証するために、本発明者らは、マウスRosa26座中のDNA標的配列を認識する一組の融合タンパク質を設計した。2つのTalエフェクターDNA結合ドメインヌクレアーゼ融合タンパク質は、一緒になって、二つに分かれた標的DNA領域に結合し、標的領域のスペーサー領域中に二本鎖切断を誘導して、哺乳動物細胞中の標的座で相同組換えを刺激しようとする。Rosa26標的ヌクレオチドは、融合タンパク質の結合領域が6塩基対のスペーサーにより分離され、それぞれの標的配列の先頭にTがくるように選択された。53方向の最初のTの下流の配列に続いて、NからC末端の順序で塩基特異的TalエフェクターDNA結合ドメインヌクレアーゼ融合タンパク質を一緒に、不変の最初のおよび最後のTalフィンガーで始まる12個または14個のTalフィンガーのアレイに結合させた。それぞれのTalエフェクターモチーフは、34アミノ酸からなり、その12および13位は、標的配列中のA、G、CまたはTの認識についての特異性を決定する。Rosa26特異的TalエフェクターDNA結合ドメインヌクレアーゼ融合タンパク質を誘導するために、本発明者らは、Aを認識するアミノ酸N12およびI13を有するキサントモナスHax3タンパク質11、Cを認識するアミノ酸H12およびD13を有するHax3タンパク質由来のTalエフェクターモチーフ5、ならびにTを認識するアミノ酸N12およびG13を有するキサントモナスHax4タンパク質由来のTalエフェクターモチーフ4を選択した。標的Gヌクレオチドを認識するために、本発明者らは、アミノ酸12をNに、13をNに変えたHax4タンパク質由来のTalエフェクターモチーフ4を使用した。塩基特異的DNA結合ドメインは、不変の最初のTalリピートで始まり、Hax3タンパク質由来の最後のTalリピートが続く。Rosa26標的配列を認識するTalエフェクタータンパク質のDNA結合ドメインは、VectorNTIまたはDNAワークベンチソフトウェアを使用してコンピューター上で設計し、フレーム中でN末端をGFPバリアントVenus、およびC末端を7グリシン残基のリンカーペプチドを介してFokIエンドヌクレアーゼの触媒ドメインと結合させ、TalエフェクターDNA結合ドメインヌクレアーゼ融合タンパク質のペア、すなわちvenusTalRosa1FokELおよびvenusTalRosa2FokKKを誘導した。FokIエンドヌクレアーゼの触媒ドメインは、通常ホモダイマーとして作用する。1つのTalRosaヌクレアーゼの意図しないゲノム標的配列でのホモダイマー形成を回避して、TalエフェクターDNA結合ドメインヌクレアーゼ融合タンパク質ペアの特異性を高めるために、本発明者らは、優先的にヘテロダイマーとして作用するFokI変異ドメインKKおよびEL77885を使用した。本発明の融合タンパク質のDNA標的配列への結合をモデル化するために、本発明者らは、ITasserソフトウェア72538を使用して、マウスRab38遺伝子中の配列5GGTGGCCCGGTAGT3を認識するように設計された14個のTalエフェクターモチーフタンパク質の3D構造を計算し、Discoverystudioソフトウェアを使用して該構造を可視化した。該構造モデルによると、Talエフェクターモチーフは、中央のDNA分子を収容するように準備された超らせん構造に折りたたまれる。それぞれの34残基Talエフェクターモチーフは、DNA配列特異的結合を決定する12および13位で曝露されたアミノ酸により連結される2つのヘリックスに折りたたまれる。発現ベクター哺乳動物細胞におけるTalエフェクターDNA結合ドメインヌクレアーゼ融合タンパク質の発現のためのベクターを誘導するために、市販のサービスプロバイダにより、TalエフェクターDNA結合ドメインのRosa26特異的コーディング領域を合成した。TalエフェクターDNA結合ドメインTalRosa1およびTalrosa2のDNAコーディングフラグメントをフレーム中で、特異的に、N末端でVenus蛍光タンパク質と融合し、C末端でFokIヌクレアーゼのKKまたはEL変異に融合し、哺乳動物細胞におけるmRNAおよびタンパク質発現のための因子を提供するプラスミド主鎖に連結し、プラスミドpCAGvenusTalRosa1FokELおよびpCAGvenusTalRosa2FokKKを誘導した。TalエフェクターDNA結合ドメインは、7個のグリシン残基のペプチドリンカーによりFokドメインに連結される。venusTalRosaFokタンパク質のコーディング領域は、哺乳動物細胞において、CAGハイブリッドプロモーターからmRNAへと転写され得、ウシ成長ホルモン遺伝子由来のポリアデニル化シグナル配列により終結され得る。代替的に、mRNAは、ATG開始コドンの上流に位置するファージ由来のT7プロモーターからインビトロで転写され得、インビトロでvenusTalRosa1FokELおよびvenusTalRosa2FokKKタンパク質に翻訳され得る。TalエフェクターDNA結合ドメインヌクレアーゼ融合タンパク質のDNA切断活性インビトロヌクレアーゼ切断アッセイにより、設計したTalエフェクターDNA結合ドメインヌクレアーゼ融合タンパク質の機能を試験する。この目的のために、PromegaのTnTQuickcoupledインビトロ転写翻訳システム、次いで製造業者の使用説明書を使用して、venusTalRosaFokヌクレアーゼ融合タンパク質のmRNAおよびタンパク質をpCAGvenusTalRosa1FokELおよびpCAGvenusTalRosa2FokKKプラスミドから産生する。インビトロヌクレアーゼアッセイにおいて、合成されたタンパク質の画分を、Rosa26標的配列を含むプラスミドpbsRosatargetseqと一緒にインキュベートし、TalエフェクターDNA結合ドメインヌクレアーゼ融合タンパク質ペアの切断活性を評価する。DNA基質の切断について、アガロースゲル電気泳動により反応を分析し、TalフィンガーヌクレアーゼペアがRosa26標的配列中に二本鎖切断を誘導し得ることを明らかにする。実施例2受精したマウス卵母細胞におけるTalエフェクターDNA結合ドメインヌクレアーゼ融合タンパク質補助相同組換えこの実験で、TalエフェクターDNA結合ドメインヌクレアーゼ融合タンパク質により誘導された二本鎖切断の部位で相同組換えが、妥当な頻度で受精したマウス卵母細胞中で起こるかどうかを試験する。この目的のために、本発明者らは、相同領域を介してマウスRosa26座にレポーター遺伝子カセットが挿入される遺伝子ターゲッティングベクターpRosa2682を構築した。このベクターは、Rosa26座の第1のイントロン由来の1kbの5および4kbの3相同領域と合わされたスプライシングアクセプター因子、βガラクトシダーゼおよびポリアデニル化配列のコーディング領域を含む。Rosa26座は、マウスの全ての組織および発生段階で偏在的に発現することが見いだされ、トランスジーンの発現に適している第6染色体上の領域である。組換えの際に、ベクターのスプライシングアクセプターは、融合転写産物がβガラクトシダーゼをコードするように、Rosa26転写産物のドナー部位にスプライシングされる。A結果直鎖状にされたターゲッティングベクターを、Rosa26の標的配列を認識し、レポーター遺伝子カセットの挿入部位に二本鎖切断を誘導するTalエフェクターDNA結合ドメインヌクレアーゼ融合タンパク質のペアをコードするインビトロで転写されたmRNAと一緒に、受精したマウス卵母細胞にマイクロインジェクションする。マイクロインジェクションの際に、TalエフェクターDNA結合ドメインヌクレアーゼ融合タンパク質mRNAは、発生中の胚の1つ以上の細胞中に一方または両方のRosa26対立遺伝子において二本鎖切断を誘導するタンパク質に翻訳される。この事象は、ベクター中に存在する相同領域を介してpRosa2682ベクターとRosa26対立遺伝子の組換えを刺激し、非相同レポーター遺伝子カセットのゲノムへの部位特異的挿入をもたらす。これらの事象のタイミングに依存して、組換えは、2細胞胚、4細胞胚または8細胞胚の1つのみの細胞において1細胞胚以降で起こり得る。かかる成功裡の組換え事象を検出するために、マイクロインジェクションした接合子をさらにインビトロで培養し、最終的にβガラクトシダーゼ基質として、不溶性の青色産物に変換されるXGalと共にインキュベートする。マイクロインジェクション実験において、本発明者らは、1細胞期以降の発生段階で相同組換えが起こったことを示す高頻度のXGal染色胚を観察する。染色手順の前にこれらの胚を固定するので、この胚からさらにマウスを生じることはできない。Bレポーター遺伝子カセットを有する生きたマウスの作製さらなる実験において、マイクロインジェクションされた接合子を、偽妊娠メスに移して、生きたマウスにまでさらに発生させる。これらの実験により、マイクロインジェクションされた接合子は、マウス胚に発生し得ることおよび組み込まれたレポーター遺伝子が発現することが示される。このような実験において、マイクロインジェクションされた接合子を偽妊娠メスマウスに移し、発生の18日目に胚を回収する。胚を安楽死させ、半分に切断し、半分の片方を上述のようにXGal染色液で染色する。この分析により、6個の胚の1つが、青色反応産物で示されるようにβガラクトシダーゼレポーター遺伝子活性について強く陽性である。C成功裡のゲノム改変の分析以下の実施例に拘束されることを望まないが、さらなる実験において胚および新生児、幼生体または成体のマウス由来のゲノムDNAを抽出することが構想される。次いで、このDNAを、Rosa26座で予想される相同組換え事象について、pRosa26の5Rosa26相同アームの上流に位置する標識されたプローブを使用して、サザンブロット分析により分析し得、次いで115kbのバンドで認識され得、組み換えられたマウスは、365kbのさらなるバンドの存在で同定され得る。DVenusレポーター遺伝子カセットを有する生きたマウスの作製さらなる実験において、本発明者らは、VenusGFPタンパク質の発現についての11kbレポーターカセットを含む以外はpRosa268と同等である遺伝子ターゲッティングベクターpROSA2633と組み合わせたRosa26特異的TalヌクレアーゼTalRosa1およびTalRosa2を使用した。環状DNAとしてターゲッティングベクターpRosa2633を使用して、沈殿させ、注入バッファに溶解した。注入のためのTalヌクレアーゼRNAを、直鎖状にした発現プラスミドpCAGvenusTalRosa1FokELおよびpCAGvenusTalRosa2FokKKから、製造業者の使用説明書に従って、mMessagemMachineキットを使用して、T7プロモーターからのインビトロ転写により調製した。Polyテイリングキットを使用してポリAテイルを付加することによりmRNAをさらに改変して、AmbionのMegaClearカラムを使用して精製した。最終的に、mRNAを沈殿させ、注入バッファに溶解した。注入実験のためのアリコートを30ngμlのpRosa2633および15ngμlのそれぞれのTalヌクレアーゼmRNAの濃度に調整した。マイクロインジェクションのための受精した卵母細胞を単離するために、C57BL6系統のオスとFVB系統の過剰排卵メスを交配した。過剰排卵のために、3週齢のFVBメスを交配の2日前に25IU妊娠雌馬血清および交配日に25IUヒトじゅう毛性ゴナドトロピンで処理した。受精した卵母細胞をプラグ陽性メスの卵管から単離して、標準的な手法に従って、M2培地中でpRosa2682ZFNmRNA調製物を前核および細胞質にマイクロインジェクションした。マイクロインジェクションした接合子を偽妊娠メスに移して、それをさらに生きたマウスに発生させた。マイクロインジェクションした接合子由来の成体マウスから、サザンブロット分析のためにゲノム尾部DNAを抽出した。サザンブロット分析のために、6μgのゲノムDNAを、30単位のBamHI制限酵素で30μlの容積中、一晩消化して、次いで10単位の酵素で2~3時間、再消化した。試料を、TBEバッファ中の08アガロースゲルに充填し、55Vで一晩泳動した。次いで、ゲルを15MNaCl;05MNaOH中で1時間変性させ、01MTrisHClpH75;05MNaCl中で1時間中和して、2xSSCで洗浄し、20xSSCで、HybondN膜に一晩ブロットした。次いで膜を2xSSCで洗浄して、UV架橋して、20°Cで保存した。ハイブリダイゼーションのために、膜を回転させながら65°Cで1時間、Churchバッファ中でプレインキュベートした。記載されるように、プラスミドpCRIIRosa5プローブからRosa265プローブを460bpEcoRIフラグメントとして単離した。Venusプローブとして、pCS2venusから730bpのBamHIEcoRIフラグメントとして単離したvenusコーディング領域を使用した。ハイブリダイゼーションプローブとして使用したDNAフラグメントを熱変性して、ハイプライマーDNA標識キットを使用してP32でマーキングしたdCTPで標識した。標識したプローブDNAをMicroSpinTMS200HRカラムで精製し、熱変性して、ハイブリダイゼーションバッファに添加し、膜を65°Cで一晩回転させた。洗浄バッファを65°Cに予め温めて、振盪しながら65°Cで膜を3回洗浄した。次いで、80°Cで膜をBiomaxMS1フィルムに曝して、現像まで1~5日間増強スクリーンに曝した。透過光ライトテーブルの上で、デジタルカメラでオートラジオグラフの写真を撮りAdobePhotoshopソフトウェアで断片を切り取った。BamHI消化尾部DNA試料を、Rosa2633ベクターの5Rosa26相同アームの上流に位置する標識したプローブを使用して、サザンブロット分析によりRosa26座での相同組換え事象について分析した。次いで、Rosa26野生型対立遺伝子は、58kbのバンドで認識され得、組み換えられたマウスは、31kbのさらなるバンドの存在で同定され得る。venusプローブおよびBamHI消化を使用して、39kbのバンドが検出可能である。このような実験において、pRosa2633およびTalRosamRNAの接合子共インジェクション由来の36pupsの尾部DNAにより、58kb野生型Rosa26断片とは別のさらなる等モル以下のバンドの存在で示される9個の組み換えられたRosa26対立遺伝子が存在することが明らかになった。これらの組換えられたRosa26対立遺伝子は、細胞の画分中にのみ存在し、予想される31kbのサイズの代わりに約39kbのサイズを生じると思われる。しかしながら、ターゲッティングベクターの相同領域の外側にあるRosa265プローブの使用により、これらのバンドの存在は、Rosa26での真の組換え活性を示す。全ての組み替えられた尾部試料は、venusハイブリダイゼーションプローブにより検出される予想される39kbのBamHIバンドの存在により示されるように、venusレポーター遺伝子の存在について陽性を示した。本発明者らは、本発明のTalヌクレアーゼは、受精した卵母細胞で活性であり、ターゲッティングベクターと内因性遺伝子座の相同組換えを容易にすると結論付ける。実施例3材料および方法プラスミド構築物遺伝子ターゲッティングベクターpRosa2682は、pgkジフテリア毒素A遺伝子を含む16kb断片の除去によるベクターpRosa268由来のものである。この目的のために、pRosa268をEcoRIとKpnIで消化して、KlenowおよびT4DNAポリメラーゼでの処理によりベクター末端を平滑にし、124kbベクター断片を再度連結した。pRosa268は、ISceI認識部位の、5Rosa26相同アームの上流に位置するSacII部位への挿入ならびに5相同アームの下流のβガラクトシダーゼおよびポリアデニル化シグナルのコーディングに連結されたスプライシングアクセプター因子の挿入によるpRosa261由来のものであった。マウスRosa26座の第1のイントロン中の標的部位を認識するTalフィンガーヌクレアーゼのための発現ベクターは、上述の実施例に記載される。マイクロインジェクションのためのDNAおよびRNAの調製ISecIでの消化によりプラスミドpRosa2682を直鎖状にし、沈殿させ、注入バッファに溶解する。注入のためのTalエフェクターDNA結合ドメインヌクレアーゼRNAを、直鎖状にした発現プラスミドを調製して、製造業者の使用説明書に従って、mMessagemMachineキットを使用してT7プロモーターから転写する。該mRNAを、Polyテイリングキットを使用してポリAテイルの付加によりさらに改変し、AmbionのMegaClearカラムで精製する。最終的に、mRNAを沈殿させ、注入バッファに溶解する。注入実験のためのアリコートを、5ngμlのpRosa2682および25ngμlのそれぞれのTalエフェクターDNA結合ドメインヌクレアーゼ融合タンパク質mRNAの濃度に調整する。受精した卵母細胞の単離および注入受精した卵母細胞を単離するために、C57BL6系統のオスと、FVB系統の過剰排卵メスを交配する。過剰排卵のために3週齢のFVBメスを、交配の2日前に25IUの妊娠雌馬血清および交配日に25IUのヒトじゅう毛性ゴナドトロピンで処理する。受精した卵母細胞をプラグ陽性メスの卵管から単離し、標準的な手法に従って、M2培地中で、pRosa2682VenusTalRosa12FokKKELmRNA調製物を1つの前核および細胞質にマイクロインジェクションする。胚のインビトロ培養およびXGal染色βガラクトシダーゼ活性の検出のために、マイクロインジェクションした卵母細胞を、さらに3日間、KSOM培地中、37°C5CO25O2で培養し、リン酸緩衝化食塩水中の4ホルムアルデヒド中で10分間固定する。PBSでの洗浄後、胚をXGal染色液6、5mMK46、2mMMgCl2、1mgmlXGalに移し、37°Cで24時間までインキュベートした。実施例4Talヌクレアーゼの発現ベクターおよびレポーターベクターの構築ならびにヒト293細胞中の特異的ヌクレアーゼ活性の決定Talヌクレアーゼ発現ベクターの構築哺乳動物細胞中でのTalヌクレアーゼの発現のために、本発明者らは、BsmBI制限部位のペアの上流に位置するTalヌクレアーゼのN末端アミノ酸1~176をコードする配列を含むCAGハイブリッドプロモーター領域および転写ユニットを含む、遺伝的発現ベクターpCAGTalIXFokを設計した。このN末端領域は、ATG開始コドン、核局在化配列、FLAGTag配列、グリシンリッチリンカー配列、Talタンパク質AvrBs3の110アミノ酸をコードするセグメントおよびHax3Talエフェクターの不変N末端Talリピートを含む。中央BsmBI部位の下流で、転写ユニットは、不変C末端TalリピートおよびTalタンパク質AvrBs3由来の44残基を含む78個のコドン、続いてFokIヌクレアーゼドメインのコーディング配列およびポリアデニル化シグナル配列を含む。Talヌクレアーゼ標的配列に結合するように設計されたTalリピートのアレイをコードするDNAセグメントは、予め設計されたTalFokヌクレアーゼタンパク質の発現を可能にする上流および下流のコーディング領域と共に、フレーム中でpCAGTalIXFokのBsBI部位に挿入され得る。哺乳動物細胞中での発現についてTalヌクレアーゼベクターを作製するために、本発明者らは、4個の異なるTalリピートのアレイのコーディング領域を有する4個の合成DNAセグメントをpCAGTalIXFokのBsBHI部位に挿入した。4個の発現ベクターpCAGArtTal1Fok、pCAGAvrBsFok、TalRab1FokおよびTalRab2Fokは、TalヌクレアーゼArtTal1Fok、AvrBsFok、TalRab1FokおよびTalRab2Fokを発現し得る。TalエレメントアレイArtTal1は人工DNA標的配列1を認識し、TalアレイAvrBsは天然AvrBs3Talタンパク質の標的配列2を認識し、TalアレイTalRab1およびTalRab2は、マウスRab38遺伝子由来の標的配列3および4に結合する。Talヌクレアーゼタンパク質の結合領域がTヌクレオチドで始まるように4個の標的配列を選択した。53の方向に、最初のTの下流の配列に続いて、特異的TalDNA結合ドメインが一緒に、12、17、13または14のTal因子のアレイに結合された。Talヌクレアーゼレポータープラスミドの構築哺乳動物細胞中の4個のTalヌクレアーゼの活性および特異性を決定するために、本発明者らは、それぞれが15個のヌクレオチドスペーサー領域で分離された逆方向の4個の標的配列のうち1つの2コピーを含む4個のTalヌクレアーゼレポータープラスミドを構築した。この配置は、レポータープラスミドの標的配列の逆向きのペアと結合する2つのタンパク質分子のホモダイマーとして相互作用する単一の型のTalヌクレアーゼの活性を測定し得る。DNA結合およびFokIヌクレアーゼドメインの相互作用の際に、レポータープラスミドDNA二本鎖は、15bpスペーサー領域中で切断され、二本鎖切断を生じる。Talヌクレアーゼレポータープラスミドは、CMVプロモーター領域、βガラクトシダーゼのN末端セグメントをコードする400bp配列および終止コドンを含む。このユニットには、ArtTal1Fok、AvrBsFok、TalRab1FokまたはTalRab2FokについてのTalヌクレアーゼ標的領域が続く。レポータープラスミドArtTal1Fok、AvrBsFok、TalRab1FokおよびTalRab2Fokレポーター中、Talヌクレアーゼ標的領域には、βガラクトシダーゼおよびポリアデニル化シグナルの完全コーディング領域が続く。特定の標的配列に対するヌクレアーゼ活性を試験するために、Talヌクレアーゼ発現ベクターを一過的に、その対応するレポータープラスミドと一緒に哺乳動物細胞に共トランスフェクトした。Talヌクレアーゼタンパク質の発現の際に、Talヌクレアーゼ標的配列中のヌクレアーゼ誘導二本鎖切断によりレポータープラスミドは開環する。二本鎖切断に隣接するDNA領域は、同一の400bpを超えるものであり、相同組換えDNA修復により、整列され、組み換えられ得る。開環したレポータープラスミドの相同組換えは、続いて、CMVプロモーターから転写される機能的βガラクトシダーゼのコーディング領域を生じ、βガラクトシダーゼタンパク質の産生をもたらす。トランスフェクトされた細胞の溶解物において、βガラクトシダーゼの酵素活性は、化学発光により決定され得る。ヒト293細胞におけるTalヌクレアーゼ活性および特異性の測定哺乳動物細胞におけるTalヌクレアーゼの活性および特異性を決定するために、本発明者らは、100万個のHEK293細胞に、Talヌクレアーゼ発現ベクターの1つの5μgのプラスミドDNAと一緒に、Talヌクレアーゼレポータープラスミドの1つの5μgをエレクトロポレートした。また、それぞれの試料は、5μgのホタルルシフェラーゼ発現プラスミドpCMVhLucを受け、pBluescriptプラスミドDNAで20μgの全DNA量に調整された。トランスフェクションの際に、細胞を、6ウェル組織培養プレートの3つのウェル中に播種し、分析を開始する前に2日間培養した。分析について、それぞれのウェルのトランスフェクトされた細胞を溶解し、製造業者の使用説明書に従いルミノメーター中、化学発光レポーターアッセイを使用して、溶解物のβガラクトシダーゼおよびルシフェラーゼ酵素活性を個々に決定した。陽性対照として、本発明者らは、5μgのβガラクトシダーゼ発現プラスミドpCMVβと15μgのpBSをトランスフェクトし、陰性対照として、5μgのpCMVhLucと15μgのpBSまたは5μgのpCMVhLucを、5μgのTalヌクレアーゼレポータープラスミドおよび10μgのpBSを一緒にトランスフェクトした。それぞれの試料の3つのβガラクトシダーゼの値を、ルシフェラーゼ活性のレベルに対して標準化し、βガラクトシダーゼ活性の平均値および標準偏差を計算して、10と定義されたpCMVβ陽性対照と比較して表した。この型の組換えアッセイにおいて、βガラクトシダーゼで触媒された発光は、レポータープラスミドの切断および修復を反映するので、それによりTalヌクレアーゼの活性が示される。図9Aで示されるように、pCMVhLucおよびArtTal1FokまたはAvrBsFokレポータープラスミドのトランスフェクションにより、非常に低いバックグラウンドレベルのβガラクトシダーゼが生じた。対照的に、pCAGArtTal1FokとArtTal1Fokレポータープラスミドの共トランスフェクションおよびpCAGAvrBsFokとAvrBsFokレポータープラスミドの共トランスフェクションは、TalヌクレアーゼArtTal1FokおよびAvrBsFokのヌクレアーゼ活性を示すβガラクトシダーゼ活性の30~50倍の増加を生じた。さらに、図9Bに示すように、TalRab1FokまたはTalRab2Fokレポータープラスミドのトランスフェクションは、ヌクレアーゼ発現ベクターなしでは、ルシフェラーゼプラスミド単独のトランスフェクションと同等の低いバックグラウンドレベルのβガラクトシダーゼを生じる。対照的に、pCAGTalRab1FokとTalRab1FokレポータープラスミドおよびpCAGTalRab2FokとTalRab2Fokレポータープラスミドの共トランスフェクションは、TalヌクレアーゼTalRab1FokおよびTalRab2Fokのヌクレアーゼ活性を示す、βガラクトシダーゼ活性の大きな増加を生じた。まとめると、これらの結果は、4個のTalヌクレアーゼが哺乳動物細胞中での発現の際に強力なヌクレアーゼ活性を生じることを示す。観察されたTalヌクレアーゼ活性が対応するヌクレアーゼ標的配列に対して特異性を生じるかどうかを決定するために、本発明者らは、関係のない標的配列と比較して、それらの真性の標的配列に対するTalRab1FokおよびTalRab2Fokヌクレアーゼの活性を試験した。この目的のために、TalRab1Fokレポータープラスミドを単独でトランスフェクトしたか、TalRab1Fokについての対応する発現ベクターと一緒にまたはTalRab2Fok、ArtTal1FokもしくはAvrBsFokについての発現ベクターと一緒に共トランスフェクトした。図10に示すように、ArtTal1Fok発現ベクターとArtTAl1Fokレポータープラスミドの特定の組合せにおいてのみで強力なヌクレアーゼ活性が生じた。逆に、TalRab1Fok発現ベクターは、TalRab2Fokレポータープラスミドに対してヌクレアーゼ活性を生じなかった。まとめると、これらの結果は、本発明のTalヌクレアーゼは、企図する標的配列に対して高度に特異的であり、関係のないDNA配列を切断しないことを示す。