"糖タンパク質上のN-グリカンに対して1,6マンノシルトランスフェラーゼ活性を示さない下等真核生物宿主細胞において、ヒト様糖タンパク質を生成するための方法であって、該方法は、Man5GlcNAc2炭水化物構造の生成のための1以上の酵素を該宿主細胞に導入する工程を包含し、ここで、インビボでGnT1の基質として働き得る少なくとも30のMan5GlcNAc2が該宿主細胞内で生成される、方法。少なくとも1つの前記酵素が、前記炭水化物構造が生成される前記宿主細胞中の位置のpHで最適な活性を有するように選択される、請求項1に記載の方法。少なくとも1つの前記酵素が、該酵素が局在する細胞小器官中の他の代表的な酵素の平均至適pHの、1.4pH単位内に至適pHを有するように選択される、請求項2に記載の方法。前記酵素が、通常は該酵素に結合しない細胞標的化シグナルペプチドによって標的化される、請求項1に記載の方法。少なくとも1つの導入された酵素が、前記宿主細胞の小胞体、初期ゴルジ、中間ゴルジ、後期ゴルジ、またはトランスゴルジ網に標的化される、請求項1に記載の方法。少なくとも1つの前記酵素が、マンノシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼおよびグリコシダーゼからなる群より選択される、請求項5に記載の方法。前記酵素が、ゴルジ装置または小胞体に優勢に局在するマンノシダーゼである、請求項5に記載の方法。前記糖タンパク質が、6個未満のマンノース残基を有するN-グリカンを含む、請求項1に記載の方法。前記糖タンパク質が、4個未満のマンノース残基を有するN-グリカンを含む、請求項1に記載の方法。前記糖タンパク質が、ガラクトース、シアル酸およびフコースからなる群より選択される1以上の糖を含む、請求項1に記載の方法。前記糖タンパク質が、構造NeuNAc-Gal-GlcNAc-Manを含む、少なくとも1つのオリゴ糖分枝を含む、請求項1に記載の方法。請求項1に記載の方法であって、前記宿主が、Pichiapastoris、Pichiafinlandica、Pichiatrehalophila、Pichiakoclamae、Pichiamembranaefaciens、Pichiaopuntiae、Pichiathermotolerans、Pichiasalictaria、Pichiaguercuum、Pichiapijperi、Pichiastiptis、Pichiamethanolica、Pichiasp.、Saccharomycescervisiae、Saccharomycessp.、Hansenulapolymorpha、Kluyveromycessp.、Candidaalbicans、AspergillusnidulansおよびTrichodermareeseiからなる群より選択される、方法。前記宿主が、マンノシルトランスフェラーゼおよびホスホマンノシルトランスフェラーゼからなる群より選択される1以上の酵素の活性を欠損している、請求項1に記載の方法。前記宿主が、1,6マンノシルトランスフェラーゼ;1,3マンノシルトランスフェラーゼ;および1,2マンノシルトランスフェラーゼからなる群より選択される酵素を発現しない、請求項13に記載の方法。前記宿主が、P.pastorisのOCH1変異体である、請求項1に記載の方法。前記宿主が、GnTIおよびUDP-GlcNac輸送因子を発現する、請求項1に記載の方法。前記宿主が、UDP特異的ジホスファターゼまたはGDP特異的ジホスファターゼを発現する、請求項1に記載の方法。前記宿主から前記糖タンパク質を単離する工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。前記単離された糖タンパク質を、少なくとも1回のさらなるインビトロのグリコシル化反応に供し、続いて前記宿主からの単離に供する工程をさらに包含する、請求項18に記載の方法。Man5GlcNAc2炭水化物構造の生成のための1以上の酵素をコードする核酸分子を、前記宿主に導入する工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。Man8GlcNAc2またはMan9GlcNAc2からのMan5GlcNAc2の生成に関与する1以上のマンノシダーゼ酵素をコードする核酸分子を、前記宿主に導入する工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。少なくとも1つのコードされたマンノシダーゼ酵素が、該マンノシダーゼ酵素が局在する細胞小器官中の他の代表的酵素の平均至適pHの、1.4pH単位内に至適pHを有するか、または5.1~8.0の間のpHで最適な活性を有する、請求項21に記載の方法。前記マンノシダーゼ酵素が、5.9~7.5の間のpHで最適な活性を有する、請求項22に記載の方法。前記マンノシダーゼ酵素が、マウス、ヒト、Lepidoptera、Aspergillusnidulans、またはBacillussp.に由来するα-1,2-マンノシダーゼである、請求項22に記載の方法。少なくとも1つの酵素が、該酵素の触媒ドメインと細胞標的化シグナルペプチドとの間の融合タンパク質を形成することによって局在化される、請求項20に記載の方法。前記融合タンパク質が、細胞標的化シグナルペプチドをコードするDNAフラグメントと、グリコシル化酵素またはその触媒的に活性なフラグメントをコードするDNAフラグメントとのインフレームのライゲーションによって形成される少なくとも1つの遺伝子構築物によってコードされる、請求項25に記載の方法。前記触媒ドメインが、GnTI、GnTII、GnTIII、GnTIV、GnTV、GnTVI、GalT、フコシルトランスフェラーゼおよびSTからなる群のメンバーに由来するグリコシダーゼまたはグリコシルトランスフェラーゼをコードし、ここで、該触媒ドメインが、該酵素が局在する細胞小器官中の他の代表的酵素の平均至適pHの、1.4pH単位内に至適pHを有するか、または5.1~8.0の間のpHで最適な活性を有する、請求項20に記載の方法。前記核酸分子が、UDP-GlcNAcトランスフェラーゼ、UDP-ガラクトシルトランスフェラーゼ、GDP-フコシルトランスフェラーゼ、CMP-シアリルトランスフェラーゼ、UDP-GlcNAc輸送因子、UDP-ガラクトース輸送因子、GDP-フコース輸送因子、CMP-シアル酸輸送因子、およびヌクレオチドジホスファターゼからなる群より選択される1以上の酵素をコードする、請求項20に記載の方法。前記宿主が、GnTIおよびUDP-GlcNAc輸送因子を発現する、請求項20に記載の方法。前記宿主が、UDP特異的ジホスファターゼまたはGDP特異的ジホスファターゼを発現する、請求項20に記載の方法。糖タンパク質上のN-グリカンに対して1,6マンノシルトランスフェラーゼ活性を示さない下等真核生物宿主細胞において、ヒト様糖タンパク質を生成するための方法であって、該方法は、DNAライブラリーに由来する少なくとも1つのグリコシル化酵素を発現する、遺伝的に混合された細胞集団を生成するために該ライブラリーで宿主細胞を形質転換する工程を包含し、ここで、該ライブラリーは、少なくとも2つの異なる遺伝子構築物を含み、これらのうち少なくとも1つが、グリコシル化酵素またはその触媒的に活性なフラグメントをコードするDNAフラグメントにインフレームでライゲーションされた、細胞標的化シグナルペプチドをコードするDNAフラグメントを含む、方法。前記混合された細胞集団から、所望のヒト様グリコシル化表現型を生成する細胞を選択する工程をさらに包含する、請求項31に記載の方法。請求項32に記載の方法であって、前記選択が、以下:a質量分析法;b液体クロマトグラフィー;c蛍光活性セルソーター、分光光度計、蛍光定量計またはシンチレーションカウンターを使用する細胞の特徴づけ;d所望のオリゴ糖部分に特異的な親和性を有するレクチンまたは抗体に対する宿主細胞の曝露;ならびにe糖、抗体およびレクチンからなる群より選択される細胞傷害性分子または放射性分子に対する細胞の曝露、からなる群より選択される1以上の方法によって、グリコシル化タンパク質または単離されたN-グリカンを分析する工程を包含する、方法。前記ライブラリーが、以下:遺伝子シャッフリング、インビトロの変異誘発およびエラー傾向性のポリメラーゼ連鎖反応、から選択される技術に予め供せられた、少なくとも1つの遺伝子または遺伝子構築物を含む、請求項31に記載の方法。酵素活性をコードする前記DNAフラグメントが、マンノシダーゼ活性、UDP-GlcNAcトランスフェラーゼ活性、UDP-ガラクトシルトランスフェラーゼ活性、およびCMP-シアリルトランスフェラーゼ活性からなる群より選択される活性を有し、ここで、前記細胞標的化シグナルペプチドが、該酵素を小胞体、シスゴルジ、中間ゴルジおよびトランスゴルジからなる群より選択される宿主細胞の細胞小器官に優勢に局在させる、請求項31に記載の方法。前記ライブラリーが、グリコシル化酵素をコードする少なくとも1つの野生型遺伝子を含む、請求項31に記載の方法。請求項1または31に記載の方法によって生成される、宿主細胞。請求項1または31に記載の方法によって生成される、ヒト様糖タンパク質。少なくとも2つの異なる遺伝子構築物を含むDNAライブラリーであって、ここで、少なくとも1つの遺伝子構築物が、グリコシル化酵素またはその触媒的に活性なフラグメントをコードするDNAフラグメントとインフレームでライゲーションされた、細胞標的化シグナルペプチドをコードするDNAフラグメントを含む、DNAライブラリー。実施例上記の一般方法の使用は、以下の非限定的な実施例を参照することによって理解され得る。好ましい実施形態の例をまた、表6に要約する。実施例1:インシュリンを産生するためのα-1,2-マンノシダーゼを用いたP.pastorisの操作α-1,2-マンノシダーゼは、Man5GlcNAc2複雑なN-グリカン形成のための必須の中間体を得るためのMan8GlcNAc2のトリミングのために必要である。P.pastorisのOCH1変異体を、aoxプロモーターの制御下で分泌ヒトインターフェロンαを発現するように操作する。DNAライブラリーを、初期ゴルジ局在化ペプチドをコードする配列を含むサブライブラリーと、ヒトマンノシダーゼIBα-1,2-マンノシダーゼの触媒ドメインとのインフレーム連結によって構築する。次いで、このDNAライブラリーを、宿主生物体に形質転換し、遺伝的に混合された集団を生じ、ここで、個々の形質転換体は、インターフェロンβおよびこのライブラリー由来の合成マンノシダーゼ遺伝子をそれぞれ発現する。個々の形質転換体コロニーを培養し、そしてインターフェロンの産生をメタノールの添加によって誘導する。これらの条件下、90を超えるこの分泌タンパク質は、インターフェロンβを含む。上清を精製して、塩および低分子量の夾雑物をC18シリカ逆相クロマトグラフィーによって除去する。適切に標的化された活性α-1,2-マンノシダーゼを発現する所望の形質転換体は、構造Man5GlcNAc2のN-グリカンを含むインターフェロンβを産生し、これは、親株のインターフェロンと比較して低減した分子量を有する。インターフェロンβを含む精製した上清を、MALDI-TOF質量分析によって分析し、そして所望の形態のインターフェロンβを発現するコロニーを同定する。実施例2:GlcNAcトランスフェラーゼIを発現するための株の操作GlcNAcトランスフェラーゼI活性は、複雑なN-グリカンの成熟に必要である。Man5GlcNAc2は、GlcNAcトランスフェラーゼIによる末端α-1,3マンノース残基へのGlcNAcの付加後、マンノシダーゼIIによってトリミングのみされ得るこれはヒト糖形態の形成に必要な工程であるSchachter,1991Glycobiology15:453-461。従って、ライブラリーを、適切に標的化するGlcNAcトランスフェラーゼI遺伝子をコードするDNAフラグメントを含むよう調製する。宿主生物体は、株例えば、高マンノシル化を欠く酵母例えばOCH1変異体であり、ゴルジおよび/またはERに基質UDP-GlcNAcを提供し、そしてゴルジおよび/またはERに構造Man5GlcNAc2のN-グリカンを提供する。DNAライブラリーを用いた宿主の形質転換後、形質転換体を、細胞表面上に最高濃度の末端GlcNAcを有するか、あるいは最高の末端GlcNAc含有量を有するタンパク質を分泌する形質転換体についてスクリーニングする。このようなスクリーニングを、視覚的方法例えば、染色手順、特異的末端GlcNAc結合抗体、またはレクチンを用いて実施する。あるいは、所望の形質転換体は、末端マンノース残基に特異的な特定のレクチンの低減した結合を示す。実施例3:マンノシダーゼIIを用いた株の操作別の実施例において、微生物におけるヒト糖形態を生成するために、マンノシダーゼIIの作用によって構造GlcNAcMan5GlcNAc2から2つの残っている末端マンノースを除去することが望ましい。シスゴルジおよび中間medialゴルジ局在化シグナルをコードする配列を含むDNAライブラリーを、インフレームでマンノシダーゼII触媒ドメインをコードするライブラリーに融合させる。宿主生物体は、株例えば、これは、高マンノシル化を欠く酵母例えば、OCH1変異体であり、そしてゴルジおよび/またはERにおいて構造GlcNAcMan5GlcNAc2を有するN-グリカンを提供する。形質転換後、所望のグリコシル化表現型を有する生物体を、選択する。インビトロでのアッセイを1つの方法において用いる。所望の構造GlcNAcMan3GlcNAc2しかし、GlcNAcMan5GlcNAc2は、望ましくないは、酵素GlcNAcトランスフェラーゼIIのための基質である。したがって、単一コロニーを、この基質UDP-GlcNAc存在下でインビトロでこの酵素を用いてアッセイし得る。UDPの遊離を、HPLCまたはUDPについての酵素アッセイのいずれかによって決定する。あるいは、放射性標識化UDP-GlcNAcを用いる。前述のインビトロでのアッセイを、ハイスループットスクリーニング装置を用いて個々のコロニーにおいて好都合に実施する。あるいは、レクチン結合アッセイを用いる。この場合、末端マンノースに特異的なレクチンの低減した結合は、所望の表現型を有する形質転換体の選択を可能にする。例えば、Galantusnivalisレクチンは、末端α-1,3-マンノースに特異的に結合し、この濃度は、作動可能に発現したマンノシダーゼII活性の存在下で低減する。1つの適切な方法において、固体アガロース支持体SigmaChemical,St.Louis,MOより利用可能に接着したG.nivalisレクチンを用いて、高レベルの末端α-1,3マンノースを有する細胞の形質転換された集団を枯渇させる。実施例4:シアル酸トランスフェラーゼを発現するための生物体の操作酵素α2,3-シアル酸トランスフェラーゼおよびα2,6-シアル酸トランスフェラーゼは、末端のシアル酸を、新生ヒトN-グリカン中のガラクトース残基に付加し、成熟糖タンパク質をもたらす。ヒトにおいて、この反応は、トランスゴルジまたはTGNにおいて生じる。従って、DNAライブラリーを、シアル酸トランスフェラーゼの触媒ドメインをコードする配列の、トランスゴルジまたはTGN局在化シグナルをコードする配列とのインフレームの融合によって構築する。宿主生物体は、株例えば、高マンノース化を欠く酵母例えば、OCH1変異体であり、これは、トランスゴルジまたはTGNにおいて末端のガラクトース残基を有するN-グリカンを提供し、そしてトランスゴルジまたはTGNにおける十分な濃度のCMPシアル酸を提供する。形質転換に続いて、所望の表現型を有する形質転換体を、末端にシアル酸を有するN-グリカンに特異的な蛍光抗体を用いて選択する。実施例5:UDP-GlcNAc輸送因子を発現するために株を操作する方法ヒトゴルジUDP-GlcNAc輸送因子のcDNAは、Ishidaおよび共同研究者らによってクローニングされたIshida,N.ら,1999J.Biochem.1261:68-77。Guillenおよび共同研究者らは、ゴルジUDP-GlcNAc輸送を欠損したKluyveromyceslactis変異体の表現型補正によって、イヌ腎臓のゴルジUDPGlcNAc輸送因子をクローニングしたGuillen,E.ら,1998。従って、哺乳動物のゴルジUDP-GlcNAc輸送因子遺伝子は、酵母のゴルジ装置を発現し、そしてこれを機能的に標的化するタンパク質についての全ての必要な情報を有する。実施例6:GDP-フコース輸送因子を発現するように株を操作する方法ラット肝臓のゴルジ膜のGDP-フコース輸送因子は、Puglielli,L.およびC.B.Hirschberg1999J.Biol.Chem.27450:35596-35600によって同定され、そして精製された。対応する遺伝子を、標準的技術例えば、縮重DNAプローブを用いたN末端の配列決定法およびサザンブロット法を用いて同定し得る。次いで、インタクトな遺伝子を、フコシルトランスフェラーゼもまた発現する宿主の微生物において発現させ得る。実施例7:UDP-ガラクトース輸送因子を発現するように株を操作する方法ヒトUDP-ガラクトースUDP-Gal輸送因子は、クローニングされ、そしてS.cerevisiaeにおいて活性であることが示されたKainuma,M.ら,1999Glycobiology92:133-141。第2のヒトUDP-ガラクトース輸送因子hUGT1は、クローニングされ、そしてチャイニーズハムスター卵巣ChineseHamsterOvary細胞において機能的に発現された。Aoki,K.ら,1999J.Biochem.1265:940-950。同様に、Segawaおよび共同研究者らは、SchizosaccharomycespombeからUDP-ガラクトース輸送因子形態をクローニングしたSegawa,H.ら,1999FebsLetters4513:295-298。CMP-シアル酸輸送因子ヒトCMP-シアル酸輸送因子hCSTは、Aokiおよび共同研究者ら1999によって、クローニングされ、そしてLec8CHO細胞において発現された。ハムスターCMP-シアル酸輸送因子の分子クローニングもまた、達成されたEckhardtおよびGerardySchahn1997Eur.JBiochem.2481:187-192。マウスのCMP-シアル酸輸送因子の機能的発現は、Saccharomycescerevisiaeにおいて、Berninsone,P.ら,1997J.Biol.Chem.27219:12616-12619によって達成された。表6.真核微生物例えば、Pichiapastorisにおけるグリコシル化を改変するための方法の好ましい実施形態の例グリコシル化を改変するための方法において使用され得るさらなる方法および試薬は、以下の文献に記載される:例えば、米国特許第5,955,422号;同第4,775,622号;同第6,017,743号;同第4,925,796号;同第5,766,910号;同第5,834,251号;同第5,910,570号;同第5,849,904号;同第5,955,347号;同第5,962,294号;同第5,135,854号;同第4,935,349号;同第5,707,828号;および同第5,047,335号。適切な酵母発現系は、AmericanTypeCultureCollection、Rockville、MDのような供給源から獲得され得る。ベクターは、種々の供給源から市販される。図1Aは、代表的な真菌性N-グリコシル化経路の概念図である。図1Bは、ヒトN-グリコシル化経路の概念図である。"