"プロコアグラント活性を有するTF担持微小胞の調製方法であって、i真核細胞内でTF又はプロコアグラント活性を有するその変異体を発現させ、ii工程iの細胞からTF担持微小胞を回収し、iii負に荷電したリン脂質と工程iiで得られた小胞を、該リン脂質の前記小胞への取込みに適した条件下で接触させることを含む方法。工程iiが、ゲル濾過クロマトグラフィー、タンジェンシャルフロー濾過又はそれらの組み合わせによって行われる、請求項1に記載の方法。プロコアグラント活性を有するTF担持微小胞の調製方法であって、i真核細胞から得られた脂質微小胞を提供し、iiTFタンパク質又はプロコアグラント活性を持つその変異体をiで定義された脂質微小胞と、前記TFタンパク質又はその変異体の前記微小胞への取込みに適した条件下で、接触させ、iii負に荷電したリン脂質と工程iiで得られた小胞を、該リン脂質の前記小胞への取込みに適した条件下で接触させることを含み、工程ii及びiiiは任意の順序で行うことができる方法。真核細胞が、酵母細胞、哺乳類細胞、昆虫細胞、魚類細胞及び植物細胞の群から選択される、請求項1から3のいずれかに記載の方法。接触工程が、微小胞のタンパク質含量が50microgを下回る、0.05μmolの負に荷電したリン脂質、及び微小胞のタンパク質含量が50microgを上回る、0.1μmolの負に荷電したリン脂質を用いて行われる、請求項1から4の何れかに記載の方法。負に荷電したリン脂質が、スフィンゴシン含有リン脂質又はグリセロール含有リン脂質からなる群から選択される、請求項1から5の何れかに記載の方法。グリセロール含有リン脂質がホスファチジルセリンである請求項6に記載の方法。前記TF又はプロコアグラント活性を有するその変異体がグリコシル化されている、請求項1から7の何れかに記載の方法。TFが成熟TFタンパク質、好ましくは、ヒト成熟TFタンパク質である、請求項1から8の何れかに記載の方法。TF又はプロコアグラント活性を有するその変異体が、N124A変異を保有し、及び/又はC末端にヒスチジンタグを保有する、請求項9に記載の方法。請求項1から10の何れかに記載の方法を使用して得られるTF担持微小胞。請求項11に記載のTF担持微小胞と薬学的に許容されるビヒクルを含有する薬学的組成物。少なくとも凝固促進剤を更に含有する請求項12に記載の薬学的組成物。ia真核細胞内で、TF又はプロコアグラント活性を有する機能的に同等なその変異体を発現させ、b工程iの細胞からTF担持微小胞を回収する工程を含む方法により得られる微小胞、ii少なくとも一の凝固を促進する薬剤、及びiii薬学的に有効なビヒクルを含む薬学的組成物。真核細胞が酵母細胞である、請求項14に記載の薬学的組成物。TFが成熟TFタンパク質、好ましくは、ヒト成熟TFタンパク質である、請求項14から15に記載の薬学的組成物。TF又はプロコアグラント活性を有するその変異体が、N124A変異を保有し、及び/又はC末端にヒスチジンタグを保有する、請求項14から16の何れかに記載の薬学的組成物。凝固を促進する薬剤がFVIIa、FXa又はその組合わせの群から選択される、請求項13から17の何れかに記載の薬学的組成物。組成物が凍結乾燥されている、請求項12から18の何れかに記載の薬学的組成物。医薬として使用のための、請求項11に記載のTF担持微小胞、又は請求項12から18の何れかに記載の薬学的組成物。出血の治療における使用のため、創傷治癒を促進するため、又は血管新生関連疾患の治療のための、請求項11に記載のTF担持微小胞、又は請求項12から18の何れかに記載の薬学的組成物。出血が健常被検体及び出血性素因を有する被験体の群から選択される被検体で治療され、前記出血性素因が凝固障害、血小板障害及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項21に記載の使用のためのTF担持微小胞又は薬学的組成物。前記凝固障害が、先天性又は後天性凝固凝固障害である、請求項22に記載の使用のためのTF担持微小胞又は薬学的組成物。前記先天性血液凝固障害が、凝固第V因子、凝固第VII因子、凝固第VIII因子、凝固第IX因子、凝固第X因子、凝固第XI因子、凝固第XII因子、凝固第XIII因子及びその組み合わせから選択された凝固因子の欠損に基づく凝固障害である、請求項22に記載の使用のためのTF担持微小胞又は薬学的組成物。前記血小板障害が、血小板減少性免疫性血小板減少性紫斑病ITP、急性ITP、慢性ITP、輸血後紫斑病、新生児同種免疫性血小板減少症、薬剤誘発性血小板減少症、血栓性血小板減少性紫斑病、溶血性尿毒症症候群HUS、フォンヴィルブランド病、ベルナールスーリエ症候群、グランツマン血小板無力症、尿毒症における血小板機能異常症、及び骨髄異形成症候群、骨髄増殖性症候群に関連付けられている血小板障害から選択される、請求項22に記載の使用のためのTF担持微小胞又は薬学的組成物。TF担持微小胞又は薬学的組成物が局所的に投与される、請求項21から25の何れかに記載の使用のためのTF担持微小胞又は薬学的組成物。試料中の抗凝固療法の要因を決定するための請求項11に定められたTF担持微小胞の使用。請求項11に記載の微小胞を含む、抗凝固療法の要因を決定するためのキット。抗凝固療法の要因が、プロトロンビン時間である、請求項27に記載の使用又は請求項28に記載のキット。方法血漿における凝固アッセイ血漿における自発的プロコアグラント活性無刺激を、4チャネル凝固計Start4,DiagnosticaStagoにて二段階凝固アッセイにより測定した。簡潔に言うと、50μlの血小板プール血漿を、予め強化したキュベットに加え、50μlの試料TFまたは対照としての蒸留水を加えた。この混合物を37°Cで60秒インキュベートし、50μlの25mM炭酸カルシウムを直ちに加え、凝固計で凝固時間を秒数として測定し、血塊の形成により確認した。血小板プール血漿を遠心分離により得て、血小板の数をコールターで測定した。それぞれ血友病A、BまたはC相当する凝固因子欠損血漿FVIII、FIXまたはFXIに対するTFのプロコアグラント作用を、イムノアフィニティー技術により枯渇させた市販の血漿DadeBehringMarburgGmbHを用いることで調べた。各場合で、前記凝固因子の最終含量は1未満であった。一連の遠心分離プロセスで血小板から奪った血漿において、血小板減少様症状におけるプロコアグラント作用を調べた。全血における凝固アッセイ非抗凝固処理全血におけるプロコアグラント活性を凝固法により測定した。試験する種々の薬剤mTFを、0.8mlの非抗凝固処理全血に0.2ml加え、抽出の始めから安定かつ固化した血塊が表れるまでクロノメーターで凝固時間を測定した。種々の薬剤の作用を、血液凝固時間の短長で評価した。全血試料は患者または健常なボランティアから得た。実施例1完全長TFHis-タグ修飾タンパク質の酵母TT-173における発現に基づく、プロコアグラント製品の製造。酵母エピソームベクターは、国際公開第2008080989号に記載されており、URA3遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、複製の酵母2μ起源、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼGPDプロモーター及びホスホグリセリン酸キナーゼの酵母転写終結シグナルを含み、GPDプロモーターの制御下で、18の余分なヌクレオチド6つのヒスチジンをコードするを3’末端に持ち、天然のhTF配列配列番号6のNグリコシル化の候補の一つを不活性化するAsn124Ala変異を持つ、成熟したhTFタンパク質配列番号1のアミノ酸33-295をコードするcDNAのクローニングに使用された。酵母菌株T73ura3-の変換後、ウラシルを含まない培地で生育可能な株が回収され、基本的に国際公開第2008080989号に記載されたように、酵母抽出物のウェスタンブロット分析により、hTFを発現するそれらの能力を測定した。産業化以前のレベルで酵母抽出物の製造のスケーリングの可能性を評価するために、2リットルのバイオリアクターBiostatB-2L.BRAUNが、30°C、250から300rpmの撹拌速度、pH4.5、及び空気流速が6L/mにて細胞を増殖させることにより行われた。培地は、CSM-URA:0.78g/L;YNB:6.7g/L;スクロース:20g/Lであった。培養がODが8.0に達したときに発酵を停止させた。発酵から得られた生成物は、3000rpm1200×gで10分間、遠心分離により回収され、200mlの溶解緩衝液20mMリン酸緩衝液pH7.4、50mMのNaClに再懸濁した。酵母は、高圧1,000バール108PaホモジナイザーNIROSOAVIS.Panda2Kでホモジナイズし、ホモジネートを4°Cで30分間13,000rpmで13,000×gで遠心分離した。ペレットを廃棄し、清澄酵母抽出物CYEと命名した上清を回収した。rTFを含むこのCYEは、クロスフロー濾過システムSartoriussartoflowSlice200Benchtopのタンジェンシャルフロー濾過の連続した工程により、徐々に細孔径を減らした0.45μm、0.2μm及び0.1μm膜Sartorius,ポリスルホンフィルターを使い、分画した。濾過の連続する工程の後の4つの独立したCYEから得られた異なる保留物と透過物のプロコアグラント活性が表1に示されている。4つのMFRが0.1画分の各々におけるTFの存在が、図1に示されている。このようにして、精製された酵母の小胞の調製物以下、TT-173と呼ばれるで、本質的に国際公開第2008080989号に記載されているようにインビボ及びインビトロでのアッセイを用いて測定した異なるプロコアグラント活性を有するものを得た。この結果は、TT-173の産物を精製するために使用されるタンジェンシャルフロー濾過の手順の使用は、酵母由来の膜の微小胞に関連付けられている生物学的に活性なhTFの回収を可能にすることを示している。実施例2PSの添加によるTT-173生物活性の増強。2.1TT-173生物活性に関するホスファチジルセリンPSの効果PS0.1mMを、TT-173に加え、混合物を最大4時間インキュベートした。PSが追加された時間0から始まり、異なる時点で、TT-173/PS混合物のアリコートが標準的な凝固アッセイにおいて凝固活性について調べられた。結果は、図2に示され、PSの添加は、明らかに、凝固時間を約10秒間減少させパネルA、これは特異的活性の6倍の増加に対応しパネルB、この増幅は時間依存性であり、PSの添加後に1から2時間で最大に達している。凝固時間におけるPSそれ自身の無視できる影響図示しない、及びTT-173への添加後の最初の1時間に観測された効果の上昇は、TT-173とPSの間に何らかの相互作用が起こったことを示唆し、この相互作用は、凝固時間を加速するために重要であった。同様の濃度0.1mMでの非荷電又は正に荷電したリン脂質の付加は、TT-173の凝固活性の検出可能な増加を誘発しないため、この効果は、負に荷電したリン脂質に特異的であった。特に、ホスファチジルセリンPS、ホスファチジルエタノールアミンPE、スフィンゴミエリンSM、又はホスファチジルコリンPCの何れもは、凝固活性における検出可能な増加を誘発しない。その後、PS/TT-173の相互作用が酵母由来の構造に限定されていたかどうか、それが人工的に作られた小胞において再作成することができるかどうか試験された。これを試験するため、PSを、TT-173、またはインビトロで再脂肪付加したrTFのいずれかに相当する凝固活性を持つアリコートに、異なる濃度0.05から1mMの範囲で添加した。R/Tで2時間、混合物をインキュベートした後、両方のrTF含有生成物からの試料を、その凝固活性について試験した。結果を図3に示す。以前に見られたように、TT-173へのPSの添加は明らかにその活性を約6倍増加させる。この効果は、PSの0.05から0.5mMの濃度範囲で観察された。高濃度1mMでは、PSは明確な凝固抑制効果を生じた。驚くべきことに、再脂肪付加rTFへのPSの付加は、使用されるPSの濃度のいずれにおいても、プロコアグラント活性のはっきりと認識できる増加をもたらさなかった。繰り返しになるが、試験されたPSの高濃度1mMは明確な阻害効果を生み出した。高濃度でのPS小胞が、可溶性凝固因子と効率的に相互作用し、それらを捕捉し、したがって、rTF含有小胞との相互作用を制限する場合、TT-173又は再脂肪付加rTFの試料の何れかのPSの濃度が高いことにより、この抑制効果は、説明することができる。このことは、PCのPSに対する異なる比率を有する既存のrTF含有ミセルに、増加したPS濃度を加えた結果として、凝固活性に及ぼす影響を試験することにより更に確認された。完全なrTF活性を復元するリン脂質の至適濃度は十分に確立され、それはホスファチジルセリンPSに対するホスファチジルコリンPCの比が、80:20から70:30に対応する。図4黒色バーは、rTFがPC単独PC:PSの濃度が100:0で、又はPCに関するPSの濃度比を増加させてPC:PSの濃度がそれぞれ、95:5、90:10及び80:20、再脂肪付加された典型的な凝固実験を示している。結果は、PSの量を増加して添加すると、凝固時間が減少することを明らかに示している。しかし、余分なPSが、試験された任意のPC:PSの比で既存のミセルに追加された場合、凝固活性のいかなる増加を及ぼさなかった図4、灰色のバー。観察された効果は真核生物由来の構造に制限されており、再脂肪付加によって人工的に作られた小胞に作成し直すことができなかったというさらなる証拠を提供するために、PSを、酵母細胞で産生されたTT-173小胞、又はPC:PSの比が80:20及び70:30でインビトロで再脂肪付加されたrTFのどちらかと同等の凝固活性を持つアリコートに、濃度0.1mMで添加した。異なる小胞を、R/Tで2時間、PCとともにインキュベートした後、異なるrTF含有生成物由来の試料を、その凝固活性について試験した。結果を図5に示す。観察されるように、酵母起源由来のTT-173にPSを添加すると、明らかに凝固時間が減少したが、一方、予想されたように、再脂肪付加されたrTFへのPSの追加は、再脂肪付加に使用されたPC:PSのいかなる割合においても、プロコアグラント活性のはっきりと認識できる増加をもたらさなかった。PSの添加は酵母由来の小胞に関連付けられている場合にのみ有効であったかどうかを試験するために、再脂肪付加されたrTFとTT-100の小胞TFタンパク質配列を含まないプラスミドで形質転換された組換え酵母から得られた微小胞、TT-173と同様の生成手順に従って非組換え酵母から得られた、を用いて実験が行われた。再脂肪付加rTFのアリコートを、2時間、先にPS0.1mMでインキュベートされたTT-100小胞の異なる濃度で混合した。30分mの後、各アリコートの凝固活性を測定した。結果図6は、明らかに、使用するTT-100の量は独立しており、ΤΤ-100/PSの混合物は再脂肪付加されたrTFにおいて検出可能な効果を持っていないことを示している。この結果は、凝固活性におけるPSの効果は、酵母由来の小胞との会合に依存しており、これらの小胞は、rTFを含まなければならないことを示している。上記結果を考慮して、TT-173のPSによって誘発される昇圧凝固効果図2、図3及び図5を参照を、iPSがrTFおよびFVIIの間の相互作用を促進し、相互作用のためのより適切な足場を誘導しii添加されたPSが小胞に構造的な影響を誘発し、PSに富んだ領域を生みだし、活性化血小板におけるように、プロトロンビナーゼ複合体形成のためより適切である、又はiii両方の作用の組み合わせである場合、説明することができた。rTF:FVIIの相互作用におけるPSの影響の可能性を試験するために、TF:FVIIの複合体の酵素活性を定量化するために定められた標準的なアミド分解アッセイが使用された。この実験では、追加されたPSの有無にかかわらず、TT-173の3種類の濃度が、市販の精製されたFVIIaの2つの異なる濃度でインキュベートした。TT-173へFVIIaを添加した後、TF/FVIIaの活性は、特異的発色基質S-2288を酵素的に変換するその複合体の能力によって検出された。図5に示すように、PSの有無にかかわらず、試験された3つの濃度におけるTT-173と、使用されたFVIIaの50nM図示せず又は500nM図7の両方の濃度でのTT-173との間のアミド分解活性において目立った違いはなかった。これらの結果は、TT-173へのPSの添加が初期のrTF-FVIIの相互作用に有意な影響を及ぼさないことを示している。しかし、同じTT-173の試料が、正常血漿図8、パネルA又は正常全血図8、パネルBのプロコアグラント活性について試験された場合、PSがTT-173に会合していたときに、凝固活性において非常に有意な増加が観察された。従って、TT-173活性におけるPSの刺激効果は、初期のTF:FVII相互作用より凝固カスケードの下流における作用に起因するべきである。私たちの解釈は、PSは、TT-173小胞の表面を改変し、活性化血小板で観察されたものと同様、PS依存の足場を提供するということである。2.2TT-173とTT-173PSの作用機序正常な止血時には、活性化段階を達成するのに要する時間FV、FVIIIおよび血小板を活性化するために必要なトロンビン濃度に到達するまでの時間は、約4分である。これは、TF及びFVII分子両方とも血漿中又は損傷した細胞の膜のいずれかで比較的低濃度で存在するの間の相互作用を可能にするために必要な時間である。TFおよびFVIIとの間の分子衝突及び生じる相互作用は、FXのFXaへの変換をもたらし、順に、トロンビンを生成する。従って、適切な膜に組み込まれたTFの濃度を増加させると、例えば、血漿又は血液にTT-173を追加することにより、TF及びFVIIの間の相互作用のための機会を増加させるであろう。これは、FXaのより速くより高い生産性を生じ、したがって、血小板、FVIII及びFVの活性化のために必要なトロンビンの量の迅速な生産をもたらす。TT-173において、TFは、別々のPSのパッチをまた担持する膜状区画に挿入される。従って、血漿又は血液へのTT-173の添加は、高濃度での凝固カスケードのイニシエーターだけでなく、活性なプロトロンビナーゼ複合体の形成のために、適切にPSを含有した生理的足場を提供する適切な表面を与える。図9は、TT-173の作用の提案されたメカニズムをまとめている。正常な血液凝固中は、血液凝固の活性化は約4分かかる。これは、血管に隣接し損傷した組織中の比較的低濃度のTFタンパク質、および血流中を循環するFVIIaの不足量の結果である。このモデルでは、FXaの生産が増加しており、PSのある無しに関わらず、TT-173が正常血漿に添加された場合に、観察された凝固時間の劇的な減少を説明している図10、左。更に、FVIII又はFIX血友病A及びBにおいて欠損が存在しないか、または非常に低い濃度である場合、プロトロンビナーゼ複合体の形成を介して、このモデルは観察された正常な凝固時間を説明している図10、右。凝固因子の欠損の場合、TT-173へのPSの添加は明らかに凝固時間を短縮する。この効果は、FVII又はFVの濃度が1未満図11である血漿でより顕著である図11。そのモデルが予測したように、FVIIおよびFXの後天的欠損を持つ血漿の凝固時間は、ワルファリン治療の効果として、TT-173を添加することにより正規化される図10。2.3TT-173活性における酵母膜の役割酵母の小胞成分は、それ自体限定的なプロコアグラント活性を示したが、しかし、それらの全ては、微粒子の完全性を維持するために不可欠であるべきである。添加されたPSを有する及び有しないTT-173小胞が、透析可能な界面活性剤で処理することにより破砕され、次いで透析によってインビトロで再構成された場合、初期活性の約50が失われた図13、パネルA。しかし、同様の実験が再脂肪付加されたrTF小胞を用いて行われた場合、感知できるほどの差は透析の前後に観察されなかった図13、パネルB。この結果は、凝固活性は、rTF、酵母タンパク質及び酵母脂質の相対的な量で存在するだけでなく、すべてのこれらの成分の空間的配置/向きで存在することを示している。小胞がインビトロで自発的に生産された場合には、TT-173の全ての膜成分が新たに形成された膜にランダムに組み込まれ、真核生物の生きた細胞が提供することができる状況でのみ獲得することができる複雑なコンフォメーションを獲得しなかった。実施例3昆虫細胞におけるTFタンパク質の完全長の発現に基づくプロコアグラント生成物の生産3.1組換えバキュロウイルスの構築成熟したヒト組織因子TFの全長を発現する組換えバキュロウイルスrBVの構築は以下のように行った:成熟ヒトTFタンパク質アミノ酸33-295をコードするcDNAを、ポリメラーゼ連鎖反応PCRにより816-bpの断片として増幅した。このPCR反応のために、TFをコードする遺伝子を含むプラスミドpTT-103をテンプレートとして使用し、オリゴヌクレオチドA5’-CCGCTCGAGCGGTTATGAAACATTCAGTGGGGAGTTCTC-3’配列番号7及びB5’-CCGCTCGAGCGGTTATTCTCTGAATTCCCCTTTCTC-3’配列番号8、それぞれをTF遺伝子の5’又は3’末端でアニーリングし、プライマーとして使用した。得られたDNA断片は、NcoI及びHindIIIで消化し、同じ制限酵素で消化したバキュロウイルストランスファーベクターpFastBacl-mAV-MCSに挿入された。得られたプラスミド、pFB-TFを、挿入されたTF配列の正確さを評価するために塩基配列決定に供し、Bac-to-Bacシステムを用いて、製造業者の指示インビトロジェンに従って、対応するrBVを生成するために使用した。活性なTF含有小胞の生産及び精製のために、昆虫細胞を、5PFU/細胞の多重度でTFを発現するrBVで感染させた。細胞は感染後72時間で回収し、リン酸緩衝生理食塩水で2回洗浄し、溶解緩衝液50nMのTris-HCl、pH8.0、500mMのNaCl中に再懸濁した。その後、細胞抽出物を加圧型細胞破砕装置を用いて破砕した。細胞抽出物のアリコートを、実施例2で前述したプロトコルに従って、凝固活性について試験した。表2は、抽出物によって誘発された凝固活性は示す。3.2野生型TFの生物活性を保有するTT-173昆虫細胞由来微小胞におけるホスファチジルセリンPSの作用観察され、ここで特許請求された効果は真核生物由来の構造に制限されており、再脂肪付加によって人工的に作られた小胞に作成し直すことができなかったというさらなる証拠を提供するために、PSを、酵母細胞で産生されたTT-173小胞、昆虫細胞で産生されたTT-172小胞、又はPC:PSの比が80:20及び70:30でインビトロで再脂肪付加されたrTFのどちらかと同等の凝固活性を持つアリコートに、濃度0.1mMで添加した。異なる小胞を、R/Tで2時間、PSとともにインキュベートした後、異なるrTF含有生成物由来の試料を、その凝固活性について試験した。結果を図14に示す。観察されたように、昆虫細胞の起源からのTT-170へのPSの添加は、酵母細胞を用いて得られたものと同様の凝固時間の減少をもたらし、明らかに凝固時間を短縮した。しかし、予想されたように、再脂肪付加rTFへのPSの付加は、再脂肪付加に使用されるPC:PSのいずれの割合においても、プロコアグラント活性のはっきりと認識できる増加をもたらさなかった。実施例4PS添加のもう一つの予想外の効果は、TT-173小胞の安定性の発生率であった。この効果を試験するために、実施例2に記載されるように、PSとともにインキュベートされたか又はされていない3つの独立したTT-173ロットからのアリコートを、長期間にわたって二つの異なる温度4°Cと20°Cに維持した。異なる時点で、各試料からのアリコートを凝固活性について分析した。この実験の結果を図15に示す。上に示したように、TT-173試料へのPSの添加は、時間0で最大10秒凝固時間を加速し、そして予期せぬことに、PSを含む試料の安定性は、PSの無い試料と比較して延長された。この安定性の効果は20°Cで特に顕著であったが、一方、余分なPSなしのTT-173の試料は5時間後に活性の50以上を失っており、PSが添加された試料は、少なくとも4日間安定していた。PSの添加のある無しによらず、TF-173の異なるバッチの安定性の最小値の平均が、その後20°C及び4°Cで決定された。安定性の最小値の平均を図15パネルCおよびDに示す。実施例5プロコアグラント剤によるTT-173のプロコアグラント効果の増強。異なる濃度のFVII20nM及び60nM、FVIIa20nM及び60nM、FX1000nM及び3000nM及びFXa1000nMが、TT-173に添加された。PSが追加された時間0から始まり、異なる時点で、TT-173/FVII混合物のアリコート及びTT-173/FX混合物のアリコートが標準的な凝固アッセイにおいて凝固活性について調べられた。結果は、図16に示されるように、FVII、FVIIa及びFXの添加は、凝固時間をおよそ2秒減少させ、FXaの添加は、凝固時間をおよそ7秒減少させることを明らかに示している"