"内側多孔質コア及び外側シェルを有するシェルビーズを含む媒体でイオン交換クロマトグラフィーを実施する方法であって、内側コアはpHによりその電荷か変化するリガンドを備えており、シェルは荷電イオン交換リガンドを備えており、以下の工程、すなわち、a第1のpHでシェルリガンドに試料分子を吸着させる工程、bコアリガンドと同一の符号/種類を有するその電荷を増大させることができ、同時に内側コアリガンドからイオンを放出させることにより、シェルリガンドから試料分子を置換する、すなわち溶出を起こさせるイオン強度の増大を生じさせる緩衝物質の添加によって第2のpHで内側コアリガンドの放電を起こさせる工程を含んでなる方法。シェルリガンドが、強イオン交換リガンド、例えば-NCH33並びにあらゆる種類の第四アンモニウムリガンド、非芳香族及び芳香族-SO3リガンドである、請求項1記載の方法。官能化コアのpH単位当たりの電荷変化が>30μmol/pHmLゲルである、請求項1又は請求項2記載の方法。シェルリガンド及びコアリガンドが、同一又は異なる電荷を有しており、カルボン酸イオン-COO、ホスホン酸イオン又はリン酸イオンそれぞれ、-PO32、-POHO2、及び-OPOHO2、-OPO32、スルホン酸イオン又は硫酸イオンそれぞれ、-SO3及び-OSO3、-アリール-Oフェノラート/アリーロラートのようなあらゆる種類の陽イオンリガンド、又は正に荷電したいろいろな窒素、例えば第一アンモニウム、第二アンモニウム、第三アンモニウム、第四アンモニウム及びアミジニウムのようなあらゆる種類の陰イオンリガンドから選択される、請求項1乃至請求項3のいずれか1項記載の方法。コアの多孔質が、試料分子がコア内に浸入するのを防ぐ、請求項1乃至請求項4のいずれか1項記載の方法。コアの多孔質が、試料分子がコア内に浸入するのを許容する、請求項1乃至請求項5のいずれか1項記載の方法。シェルビーズが3~400μmの直径を有する、請求項1乃至請求項6のいずれか1項記載の方法。外側シェルが0.5~100μmの厚さである、請求項7記載の方法。方法をカラム形式で実施し、溶出工程で流れの方向を反対にする、請求項1乃至請求項8のいずれか1項記載の方法。上記請求項のいずれかで使用されるクロマトグラフィー媒体であって、内側多孔質コア及び外側シェルを有するシェルビーズを含んでなり、内側コアがpHにより電荷が変化するリガンドを備えており、シェルが荷電イオン交換リガンドを備えている、クロマトグラフィー媒体。細胞及び/又はその一部、ウイルス及び/又はその一部、タンパク質、複合タンパク質、融合タンパク質、ペプチド、核酸、両性高分子、両性粒子、薬物、薬物断片のような生物及び合成起源の試料分子のイオン交換クロマトグラフィーのための、請求項10記載のクロマトグラフィー媒体の使用。カラム、マイクロタイター又はバッチ形式における請求項11記載の使用。吸着された試料分子の溶出のための塩勾配及び/又はpH勾配の生成のために慣用の2つのポンプ構成を使用するよりも簡単なイオン交換クロマトグラフィーを実施する方法が多くの場合に望ましいであろう。本発明は、吸着された試料分子の溶出のための塩勾配及び/又はpH勾配の生成のために2つのポンプ構成に依存しないイオン交換クロマトグラフィーを実施する新しい原理を提供する。第1の態様では、本発明は、内側多孔質コアと外側シェルを有するシェルビーズを含む媒体上でイオン交換クロマトグラフィーを実施する方法を提供し、ここで内側コアはpHと共にその電荷が変化するリガンドを備え、シェルは荷電イオン交換リガンドを備えており、この方法は、a第1のpHで試料分子をシェルリガンドに吸着させ、bコアリガンドと同じ符号/種類を有する電荷を増大させることができ、同時に内側コアリガンドからイオンを放出させることによりシェルリガンドから試料分子を置換させる、すなわち溶出させるイオン強度の増大を起こさせる緩衝物質の添加によって、第2のpHで内側コアリガンドの放電を起こさせる工程を含む。コアリガンド、例えばアミン-リガンドと同じ種類同じ種類の電荷を有するである限りいかなる種類の緩衝物質でも、例えばアミン緩衝剤を使用し得る。これは、pHが増大すると、次式に従ってイオン強度を増大させる。M-NHR12XNR’3→M-NR12NHR’3XM=ビーズマトリックス。好ましくは、外側シェルリガンドは、強イオン交換リガンド、例えば-NCH33並びにあらゆる種類の第四アンモニウムリガンド、非芳香族及び芳香族-SO3リガンドである。好ましい実施形態では、官能化コアのpH単位当たりの電荷変化は>30μmol/pHmLゲルである。本発明の方法によると、シェルリガンドとコアリガンドは同一又は異なる電荷を有し得、任意の種類の陽イオンリガンド、例えばカルボン酸イオン-COO、ホスホン酸イオン又はリン酸イオンそれぞれ、-PO32、-POHO2、及び-OPOHO2、-OPO32、スルホン酸イオン又は硫酸イオンそれぞれ、-SO3及び-OSO3、-アリール-Oフェノラート/アリーロラート、又は任意の種類の陰イオンリガンド、例えば正に荷電したいろいろな窒素、例えば第一アンモニウム、第二アンモニウム、第三アンモニウム、第四アンモニウム及びアミジニウムから選択される。上記請求項の1以上の方法において、コアの多孔質により、試料分子がコア内に浸入するのが防がれるか又は可能になる。好ましくは、シェルビーズは3~400μmの直径を有しており、外側シェルは0.5~100μmの厚さである。例えば、直径100μmのシェルビーズの場合外側シェルは0.5~10μmである。直径300μmのシェルビーズの場合外側シェルは0.5~30μmである。代わりの実施形態では、この方法をカラム形式で実施する場合、溶出工程で流れの方向を反対にする、すなわちカラムをひっくり返す。これによって、イオン強度の増強のための充分な時間が得られ、試料分子がクロマトグラフィー床を通る輸送距離が短くなり、その結果シャープなピークが得られる。第2の態様では、本発明は、上記方法に使用するクロマトグラフィー媒体に関し、この媒体は内側多孔質コアと外側シェルを有するシェルビーズを含んでおり、内側コアはpHによりその電荷が変化するリガンドを備えており、シェルは荷電イオン交換リガンドを備えている。第3の態様では、本発明は、細胞及び/又はその一部、ウイルス及び/又はその一部、タンパク質、複合タンパク質、融合タンパク質、ペプチド、核酸、両性高分子、両性粒子、薬物、薬物断片のような生物及び合成起源の試料分子のイオン交換クロマトグラフィーのための、上記クロマトグラフィー媒体の使用に関する。この使用はカラム、マイクロタイター又はバッチ形式であり得る。本発明は、プロトン化可能でありかつ脱プロトン化可能な官能基弱イオン交換リガンドで官能化コアを有するシェルビーズを使用することを提案するが、ここで前記官能基は緩衝化合物でpHを変化させることによってその電荷を低減する又は放電することができ、前記化合物はこの過程で次にその電荷を増大し、同時に周囲の溶液移動相におけるイオン強度を変化させ、荷電された好ましい強イオン交換リガンドに吸着されたタンパク質の溶出を達成する。試料吸着のためのイオン交換リガンドは外側の薄いシェルに結合しているのが好ましく、コアリガンドは弱イオン交換リガンドであって用途に適したpH範囲で電荷変化が可能であるpKaを有しており、コアリガンドはシェルリガンドに対して同一の電荷でも又は反対に荷電されることもできる。コアリガンドは、その化学構造に応じて、短いpH間隔で比較的鋭いpH切替によって電荷を変化させるか又は広いpH間隔で遅く緩やかに電荷を変化させるように選択することができる。後者のタイプのリガンドはクロマトグラフィーカラム内にpH及び塩勾配を生成するのに使用し得る。同時係属中のスエーデン国特許出願第1050157-5号に記載の等電点電気泳動媒体と比較して、十分に多量の塩イオンを放出するために、本発明のコア内のリガンド密度は数倍高い。コアの多孔質は、試料置換基の結合を回避するために、タンパク質/ペプチドを排除するように調節することができる。さらにまた、移動相は、コアリガンドを放電させ、同時に同じ符号をもつ電荷を獲得し、従ってコアリガンドから対イオンを放出させることができる標準の緩衝化学種の単純な混合物を使用することができる。当然、ビーズ内及び回りのイオン強度を増大するために1つのポンプ溶離剤を混合する装置ではないが必要なだけである。この種の媒体の主要な応用分野はタンパク質及びペプチドの大規模な精製である。また、この種のビーズは分析用途にも適切である。以下、図面及び実験部に関連して本発明を説明する。実験以下の実施例は例示の目的のみで記載するものであり、後記特許請求の範囲に記載の本発明を制限するものと解してはならない。全般マトリックスの体積とは沈降した床体積をいい、グラムで表したマトリックスの重量とは吸引乾燥重量をいう膨潤したビーズからボイド水を除去したもの。反応の攪拌にはモーター駆動攪拌機を使用する。官能性の分析及びビーズのアリル化の程度、又はアミン含量の程度の決定には慣用法を使用した。架橋アガロースゲルSepharose商標HFA55、GEHealthcare,Uppsala,Swedenから出発して本発明の分離マトリックスを調製する1つの方法を以下に例示する。SepharoseHFA55のビーズ直径は約90μmである。SepharoseHFA55-HFA55Core-PEIShell-SO3に基づく、内部pH及びイオン強度勾配溶出によるアイソクラチックイオン交換クロマトグラフィー用のシェル媒体の調製SepharoseHFA55のアリル活性化ガラスフィルター上でSepharoseHFA55を蒸留水で洗浄した。このゲル、すなわち800mLの水を切ったゲルを三つ首丸底フラスコに入れた。NaOH800mL、50溶液を加え、機械的攪拌を開始し、スラリーを水浴上で50°Cに加熱した。およそ1時間後、168mLのアリルグリシジルエーテルAGEを加えた。その後、スラリーを激しく攪拌しながら一晩放置した。約20時間後スラリーをガラスフィルターに移し、蒸留水×5、エタノール×2及び蒸留水×5で洗浄した。次に滴定によりアリル含量を測定した。230μmol/mL。シェルの活性化部分臭素化アリル化ゲル100mLを秤量してフラスコに入れ、1000mLの蒸留水を加えた。0.354mLの臭素を100mLの蒸留水に溶解させ、この溶液をアリル化ゲルスラリーに加えた。臭素のこの量は約5μmのシェルの厚さに相当する。この臭素溶液を激しく攪拌しながら5回に分けて等量ずつアリルゲルスラリーに加えた。およそ10分後ゲルをガラスフィルター上で蒸留水にで洗浄した。陽イオン交換基のシェルカップリングS-シェルプロトタイプ100mLの部分的に臭素化ゲル上記参照をフラスコに移し、25mLの蒸留水に溶解させた12.5gの亜硫酸ナトリウムと混合した。攪拌しながら、50のNaOHを加えてpH12とした後、50°Cで20h攪拌した。次にゲルをガラスフィルター上で蒸留水にで洗浄した。イオン交換能は25μmol/mLと評価された。ビーズのコア内のPEIポリエチレンイミンのカップリング25mLのS-シェルゲル上記参照をビーカー内でオーバーヘッド攪拌しながら蒸留水25mL及び0.5gの酢酸ナトリウムと混合した。スラリーに濃い橙/黄色が残るまで臭素を加えた。2分間の攪拌後、ギ酸ナトリウムをスラリーが完全に変色するまで加えた。次にゲルをガラスフィルター上で蒸留水にで洗浄した。25mLの水を切ったコア臭素化ゲルをビーカーに移し、10mLの水及び10gのポリエチレンイミン750000g/molと混合した。次に混合物を20°Cで20h攪拌した後、ガラスフィルター上で蒸留水にで洗浄した。ゲルのPEIで官能化コアのイオン交換能は150μmol/mLゲル床と評価された。HFA55CorePEIShell-Sのクロマトグラフィー評価シェル媒体プロトタイプHFA55CorePEIShell-Sの挙動を試験するために、カラムに、S-シェルプロトタイプ上記参照とHFA55CorePEIShell-Sの混合物を充填した。50のプロトタイプHFA55CorePEIShell-Sの使用は、媒体HFA55CorePEIShell-SがpH勾配及びイオン強度工程/勾配を生成する効率を証明するための単なる一例である。実験クロマトグラフィーの性能に関して、シェル媒体上記参照の混合物をHR5/20カラムに充填し、緩衝溶液50mMギ酸、pH2.7で平衡化した後カラム中に試料を注入した100μLのリボヌクレアーゼA、10mg/mL。流量を0.25mL/minに調節し、緩衝液B300mMトリエタノールアミン、pH9.7を流すことによってタンパク質リボヌクレアーゼAをアイソクラチックに溶出した。試料試料は50mMのギ酸pH2.7に溶解させたリボヌクレアーゼAであり、濃度は10.0mg/mlに調節した。試料体積は100μLであった。機器LCSystem:AktaExplore10ソフトウエア:Unicornカラム:HR5/20。結果及び考察タンパク質製造の重大な簡易化をもたらす下流のクロマトグラフィーの足場platformを改良するためには、分離媒体のクロマトグラフィー性能を維持又は増大することが極めて重要である。本発明においては、アイソクラチック条件下でのカラム内で内部pH変化又はpH勾配及び重ね合わせたイオン強度ステップ/勾配を生成することができるイオン交換ビーズを提案する。分離のためのリガンドはシェルに結合され、溶出過程で使用されるリガンドはコアに結合されている。コアリガンドの電荷は、先の平衡化pHと比べて異なるpHに調節された溶離剤/緩衝剤により切り替えることにより、pH勾配及びイオン強度変化を生じさせることができる。加えて、コアの多孔質はタンパク質/ペプチドを排除するように調節することができる。この種類のビーズの設計を、陽イオン交換クロマトグラフィーについて図1に示す。図1では、少なくとも緩やかな電荷シフト及びpH3~10のpH勾配を生成することを可能にする放電可能なIEXコアリガンド他の放電可能なIEXリガンドも当然使用することができるとしてPEIポリエチレンイミンが提案されている。この種のビーズのコアリガンドは、平衡化及び吸着緩衝剤又はより高い濃度の緩衝物質を有する別の平衡化緩衝剤の対イオンで平衡化され予備的に飽和される。この緩衝剤は、コアリガンドが荷電されるpHすなわち酸性の緩衝剤を用いる陰イオン交換リガンドの場合、pH例えば3に調節され、その後リガンドは例えば10に調節されたトリエタノールアミン緩衝剤で溶出される。溶出工程で使用される移動相中の荷電した緩衝剤成分は、その低い濃度のため、自身では、結合したこの例の場合正に荷電している試料生体分子を-SO3基から置換/溶出することができない。PEIリガンド中の窒素を高いpHのトリエタノールアミン緩衝剤で滴定すると、その結果、そのリガンドの電荷が減少し、pHが増大したときにPEIリガンドから対イオンが放出される。この放出されたイオンは次に、滴定過程で増大した電荷を獲得した緩衝剤化合物に対して対イオンとして働く。このようにして、ビーズ内又は回りの移動相中に増大したイオン強度が生じる。アミンが十分にはプロトン化されないか又は全くプロトン化されないpHに調節されたアミン緩衝溶液によるPEIリガンドの遅い滴定によって、pH勾配に加えて内部に生じるイオン強度勾配を得ることが可能である。このイオン強度の増大はビーズのコア内に高いPEI密度を使用することによって強化することができる。この種の媒体をタンパク質の分離に使用することができることを立証するために、カラムに50のプロトタイプHFA55CorePEIShell-Sと50のS-シェルプロトタイプ上記参照を充填した。図2によると、pH勾配が得られ、また導電率にステップが観察される。リボヌクレアーゼAはシャープなピークできれいに溶出される。この結果は、この種のビーズ設計図1をタンパク質の精製に使用することができるということを明らかに示している。ビーズの性能はシェルの厚さ、コア内の緩衝リガンドの種類及びシェル内のリガンドを調節することによって最適化することができる。有利なことに、カラム内の流れの方向は溶出のために変えられる。これにより、イオン強度の増強に充分な時間が可能になり、クロマトグラフィー床を通る試料分子のより短い輸送距離が達成され、結果としてシャープなピークが得られる。"