野生型と比べて遺伝的に改変され、かつ自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列を含む細胞であって、ここで該自己蛍光タンパク質の発現が特定の代謝産物の細胞内濃度に依存する、細胞。自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列の発現の制御が、転写レベルで特定の代謝産物の細胞内濃度に応じて達成される、請求項1に記載の細胞。自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列が異種プロモーターの制御下にあり、該異種プロモーターが、野生型細胞での発現が特定の代謝産物の細胞内濃度に依存する遺伝子の発現を野生型の細胞において制御するものである、請求項1または2に記載の細胞。自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列の発現の制御が翻訳レベルで特定の代謝産物の細胞内濃度に応じて達成される、請求項3に記載の細胞。自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列が、転写レベルまたは翻訳レベルで自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列の発現を調節するリボスイッチの機能をmRNAレベルで果たすDNA配列に機能的に結合している、請求項2または4に記載の細胞。細胞がコリネバクテリウムまたはエシェリキア属の細胞である、請求項1~5のいずれか一項に記載の細胞。代謝産物が、アミノ酸、ヌクレオチド、脂肪酸および炭水化物からなる群から選択される、請求項1~6のいずれか一項に記載の細胞。代謝産物がアミノ酸である、請求項7に記載の細胞。アミノ酸がLリシンである、請求項8に記載の細胞。プロモーターがlysEプロモーターであり、かつ遺伝子がlysE遺伝子である、請求項2および6~9のいずれか一項に記載の細胞。自己蛍光タンパク質が緑色蛍光タンパク質またはこのタンパク質の変異体である、請求項1~10のいずれか一項に記載の細胞。細胞懸濁液中で特定の代謝産物の増加した細胞内濃度を有する細胞を特定するための方法であって、以下の方法ステップ請求項1~11のいずれか一項に記載の細胞を含む細胞懸濁液を提供するステップ細胞を遺伝的に改変して、細胞が特定の代謝産物の細胞内濃度において異なる細胞懸濁液を得るステップ細胞内蛍光活性の検出によってこの特定の代謝産物の増加した細胞内濃度を有する細胞懸濁液中の個別の細胞を特定するステップを含む、方法。方法ステップの遺伝的改変を非標的化突然変異誘発によって行う、請求項12に記載の方法。以下の方法ステップ特定された細胞を細胞懸濁液から分離するステップをさらに含む、請求項12または13に記載の方法。フローサイトメトリーによって分離を行う、請求項14に記載の方法。特定の代謝産物の生産が最適化されている、野生型と比べて遺伝的に改変された細胞を製造するための方法であって、以下の方法ステップ請求項1~11のいずれか一項に記載の細胞を含む細胞懸濁液を提供するステップ細胞を遺伝的に改変して、細胞が特定の代謝産物の細胞内濃度において異なる細胞懸濁液を得るステップ細胞内蛍光活性の検出によって特定の代謝産物の増加した細胞内濃度を有する細胞懸濁液中の個別の細胞を特定するステップ特定された細胞を細胞懸濁液から分離するステップ特定の代謝産物の細胞内濃度の増加の原因となる、特定されかつ分離された細胞中の遺伝的に改変された遺伝子G1~Gnまたは突然変異M1~Mmを特定するステップ野生型と比べて遺伝的に改変され、特定の代謝産物の生産が最適化されている細胞であってそのゲノムが遺伝子G1~Gnの少なくとも1つおよびまたは突然変異M1~Mmの少なくとも1つを含む細胞を、製造するステップを含む、方法。方法ステップの遺伝的改変を非標的化突然変異誘発によって行う、請求項16に記載の方法。請求項16または17に記載の方法によって得られる細胞。代謝産物の製造方法であって、以下の方法ステップ請求項16または17に記載の方法によって、特定の代謝産物の生産が最適化されている、野生型と比べて遺伝的に改変された細胞を、作製するステップ栄養素を含む培養培地中で、細胞が栄養素から特定の代謝産物を生産する条件下で細胞を培養するステップを含む、方法。代謝産物が、アミノ酸、ヌクレオチド、脂肪酸および炭水化物からなる群から選択される、請求項19に記載の方法。代謝産物がアミノ酸である、請求項20に記載の方法。アミノ酸がLリシンである、請求項21に記載の方法。混合物の調製方法であって、以下の方法ステップ請求項19~22のいずれか一項に記載の方法によって代謝産物を製造するステップ代謝産物を、該代謝産物とは異なる混合物成分と混合するステップを含む、方法。代謝産物がLリシンであり、かつ混合物が食品または医薬組成物である、請求項23に記載の方法。しかし、ここでの問題は、非標的化突然変異誘発の場合、特に細胞の収集物中、いずれの細胞で、目的の代謝産物の細胞内合成の増加を生じさせる突然変異が生じているかを検出することが困難であることである。これに必要とされるスクリーニング方法は、非常に時間がかかり、かつ費用がかかる。本発明は、特定の代謝産物を過剰生産する遺伝的に改変された細胞の検出に関して、先行技術に起因する不都合を克服する目的に基づくものであった。特に、本発明は、突然変異後に、特定の代謝産物の過剰生産を生じさせる突然変異体を単純な方法で特定でき、かつ場合により残りの細胞から分離することができる遺伝的改変細胞を提供する目的に基づくものであった。本発明の基礎となる別の目的は、特定の代謝産物の増加した細胞内濃度を有する細胞の特定のための方法を提供することからなるものであった。該方法は、特に単純でかつ安価な様式で、多数の細胞中または多数の細胞からの、例えば細胞懸濁液中または細胞懸濁液からのそのような細胞の特定および場合により標的化された分離を可能にする。本発明はまた、上記スクリーニング方法によってこの代謝産物の過剰生産に好都合であると特定されている遺伝子または突然変異が、標的化された様式で導入されるか、または標的化突然変異によって作製される、特定の代謝産物の生産が最適化されている細胞を提供する目的に基づくものであった。野生型と比べて遺伝的に改変され、かつ自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列を含む細胞であって、自己蛍光タンパク質の発現が特定の代謝産物の細胞内濃度に依存する細胞は、上記目的の達成に貢献する。本明細書中で使用される用語代謝産物とは、かなり全般的に、生化学的代謝経路の中間代謝物を意味すると理解されるものとし、本発明では、アミノ酸またはアミノ酸誘導体、例えばLイソロイシン、Lロイシン、Lバリン、Lリシン、Lアルギニン、Lシトルリン、Lヒスチジン、Lメチオニン、Lシステイン、Lトリプトファン、LグリシンまたはOアセチルLセリン、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体、例えばキサンチン、GTPまたはサイクリックジグアノシン一リン酸、脂肪酸または脂肪酸誘導体、例えばアシル補酵素Aチオエステル、糖または糖誘導体、例えばグルコース、ラムノース、リブロースビスリン酸、ベータDガラクトシドまたはDグルコサミン6リン酸、ケト酸、例えばオキソグルタル酸、抗生物質、例えばチエナマイシン、アビラマイシン、ノカルジシンまたはテトラサイクリン、ビタミンまたはビタミン誘導体、例えばビオチンまたはチアミンピロリン酸、またはプリンアルカロイド、例えばテオフィリンを意味すると理解されるものとする。上記代謝産物の誘導体とは、特に、対応する化合物のアミン、リン酸化合物またはエステルを意味すると理解される。非常に特に好ましい代謝産物は、アミノ酸、特に、Lイソロイシン、Lロイシン、Lバリン、Lリシン、Lアルギニン、Lシトルリン、Lヒスチジン、Lメチオニン、Lシステイン、Lトリプトファン、OアセチルLセリンからなる群から選択されるアミノ酸、特に好ましくは、Lリシン、Lアルギニン、LシトルリンおよびLヒスチジンからなる群から選択されるアミノ酸である。本発明で最も好ましい代謝産物はLリシンである。細胞の野生型とは、好ましくは、そのゲノムが、進化によって天然に形成されたような状態で存在する細胞を意味すると理解される。該用語は、細胞全体および個別の遺伝子の両者に関して使用される。したがって、特に、遺伝子配列が、組み換え法を用いて人間により少なくとも部分的に改変されている細胞または遺伝子は、用語野生型に該当しない。本発明で特に好ましい細胞は、コリネバクテリウム、ブレビバクテリウム、バシラス、ラクトバシラス、ラクトコッカス、カンジダ、ピキア、クルイベロミセス、サッカロミセス、エシェリキア、ザイモモナス、ヤロウイア、メチロバクテリウム、ラルストニアおよびクロストリジウム属の細胞であり、Brevibacteriumflavum、Brevibacteriumlactofermentum、Escherichiacoli、Saccharomycescerevisiae、Kluveromyceslactis、Candidablankii、Candidarugosa、Corynebacteriumglutamicum、Corynebacteriumefficiens、Zymonomasmobilis、Yarrowialipolytica、Methylobacteriumextorquens、RalstoniaeutrophaおよびPichiapastorisが特に好ましい。本発明で最も好ましい細胞は、コリネバクテリウムおよびエシェリキア属の細胞であり、CorynebacteriumglutamicumおよびEscherichiacoliは特に好ましい菌株である。特に代謝産物がLリシンである場合、遺伝的に改変されている細胞は、特にCorynebacteriumglutamicumATCC13032、CorynebacteriumacetoglutamicumATCC15806、CorynebacteriumacetoacidophilumATCC13870、CorynebacteriummelassecolaATCC17965、CorynebacteriumthermoaminogenesFERMBP1539、BrevibacteriumflavumATCC14067、BrevibacteriumlactofermentumATCC13869およびBrevibacteriumdivaricatumATCC14020、ならびに、Lアミノ酸を生産する、それらから作製された突然変異体および株、例えば、Lリシン産生株CorynebacteriumglutamicumFERMP1709、BrevibacteriumflavumFERMP1708、BrevibacteriumlactofermentumFERMP1712、CorynebacteriumglutamicumFERMP6463、CorynebacteriumglutamicumFERMP6464およびCorynebacteriumglutamicumDSM5715または、例えば、Lメチオニン産生株CorynebacteriumglutamicumATCC21608からなる群から選択される細胞から誘導することができる。挙げることができる好適なEscherichiacoli株の例はEscherichiacoliAJ11442、EscherichiacoliVL611株およびEscherichiacoliWC196株である。野生型と比べて遺伝的に改変されている本発明の細胞は、それらが、自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列を含み、この自己蛍光タンパク質の発現が特定の代謝産物の細胞内濃度に依存する点を特徴とする。自己蛍光タンパク質をコードする、当業者に公知のすべての遺伝子配列が、自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列として使用可能である。Aequora属の蛍光タンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質、および異なる波長帯の蛍光を発するその変異体、または蛍光が増強されているその変異体をコードする遺伝子配列が特に好ましい。さらに、他の自己蛍光タンパク質、例えば、BDBiosciencesFranklinLakesUSAより公知のようなDsRed、HcRed、AsRed、AmCyan、ZsGreen、AcGFP、ZsYellowをコードする遺伝子配列を本発明に従って使用することもできる。自己蛍光タンパク質の発現が、特定の代謝産物の細胞内濃度に依存し、したがってこの代謝産物濃度に応じて細胞により制御されうるという特徴は、本発明にしたがって種々の様式および方法で実現することができる。本発明の細胞の第1の特定の実施形態では、自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列の発現の制御を転写レベルで特定の代謝産物の細胞内濃度に応じて達成する。特定の代謝産物の細胞内濃度に応じて、リボソームで翻訳されて自己蛍光タンパク質を形成することができる多い又は少ないmRNAが結果的に形成される。本発明の細胞のこの第1の特定の実施形態に関連して、自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列が、野生型細胞でのその発現が特定の代謝産物の細胞内濃度に依存する遺伝子の発現を該細胞の野生型において制御する異種プロモーターの制御下にあることによって、翻訳レベルでの発現の制御を達成することができる。自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列は、そのようなプロモーターから誘導されたプロモーターの制御下にあってもよい。表現異種プロモーターの制御下とは、該プロモーターが、天然の様式では、特に該プロモーター配列の単離元であって場合によっては該プロモーター配列がプロモーター効率をさらに高めるように遺伝的に改変されている野生型細胞において、自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列の発現を調節しないことを示す。この関連で、表現そのようなプロモーターから誘導されたとは、遺伝的改変細胞に含まれかつ自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列の発現を調節するプロモーターが、野生型細胞と同一核酸配列で含まれなければならないプロモーターである必要がないことを意味する。むしろ、プロモーター効率を高める目的で、このプロモーター配列は、例えば、個々の塩基の挿入、欠失または交換によって、例えば個々の核酸配列のパリンドローム化によって改変されていてよい。自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列の発現を調節するプロモーターはまた、必ずしも、遺伝的改変細胞自身のゲノムに含まれるプロモーターである必要はなく、また、遺伝的改変細胞自身のゲノムに含まれるプロモーターから誘導される必要はない。それにもかかわらず、プロモーターが、遺伝的改変細胞自身のゲノムに含まれるプロモーターであるか、または遺伝的改変細胞自身のゲノムに含まれるプロモーターから誘導されるが、特定の代謝産物の細胞内濃度に発現が依存する遺伝子の発現を制御するものである場合には、全体的に好都合であることが判明しうる。本発明の細胞のこの実施形態では、自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列はプロモーターの制御下にある。この関連で用語プロモーターの制御下とは、好ましくは、自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列がプロモーターに機能的に連結されていることを意味すると理解されるものとする。プロモーターおよび自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列は、これらの2つの配列および場合により別の調節要素、例えばターミネーターが、各調節要素が核酸配列のトランスジェニック発現においてその機能を果たすことができるように連続的に配置されている場合に、機能的に連結されている。このために、化学的意味での直接連結が絶対的に必要なわけではない。遺伝的制御配列、例えばエンハンサー配列は、さらに離れた位置から、または他のDNA分子からさえ、標的配列に対してその機能を発揮することもできる。自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列がプロモーター配列の後ろに、2つの配列が互いに共有結合によって結合するように位置する配置が好ましい。好ましくは、この関連で、自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列とプロモーター配列との間の距離は200塩基対未満であり、特に好ましくは100塩基対未満であり、非常に特に好ましくは50塩基対未満である。自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列およびプロモーターを、これらの2つの遺伝子配列の間に相同遺伝子の部分配列が依然として存在するように、互いに機能的に連結することも可能である。そのようなDNA構築物の発現では、自己蛍光タンパク質と相同遺伝子の対応する部分配列によってコードされるアミノ酸配列との融合タンパク質が得られる。自己蛍光タンパク質の機能的能力が、すなわち、特定の波長の光で励起された場合に蛍光を発するその特性が著しく損なわれない限り、そのような相同遺伝子の部分配列の長さは重要ではない。プロモーターおよび自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列に加えて、この特定の実施形態では、本発明の細胞は、調節因子をコードする遺伝子配列を含むこともでき、ここで該調節因子は、好ましくは代謝産物およびプロモーターと任意の様式で相互作用し、かつこの様式でRNAポリメラーゼに対するプロモーター配列の結合親和性に影響するタンパク質である。この関連で、調節因子とプロモーター配列との間の相互作用は代謝産物の存在に依存する。一般に、代謝産物は特定の、調節因子の機能的領域に結合し、かつこの様式で調節因子のコンフォメーションを変化させる影響を有し、該変化は調節因子とプロモーター配列との間の相互作用に対して影響を及ぼす。この関連で、調節因子は原則としてアクチベーターまたはリプレッサーであってよい。本発明では、プロモーター候補は、原則として、その発現が特定の代謝産物の細胞内濃度に依存する遺伝子の発現を機能的連結を介して通常制御するすべてのプロモーターである。非常に特に好ましくは、プロモーターは、その発現が特定の代謝産物の細胞内濃度に依存し、かつ代謝産物の化学反応または細胞からの代謝産物の流出によって代謝産物の細胞内濃度の減少を可能にするタンパク質をコードする遺伝子の発現を通常制御するプロモーターである。したがって、このタンパク質は、代謝産物から該代謝産物と異なる代謝生成物への反応を触媒する酵素、または細胞からの代謝産物の流出を触媒する能動的もしくは受動的輸送体である。プロモーターは、さらに、代謝産物の存在下で特定のアクチベーターと相互作用し、かつこの様式で自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列の発現を生じさせるプロモーターであるか、またはリプレッサーによって阻害されるプロモーターであってよく、該リプレッサーは特定の代謝産物との相互作用によってプロモーターから拡散し、その結果、阻害が排除されて、自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列の発現が達成される。この第1の特定の実施形態の本発明の細胞の好適な例を以下にさらに詳細に説明する。しかし、本発明は、本発明の細胞の第1の特定の実施形態に該当する以下の例に限定されないことがこの時点で強調されるべきである。第1の実施形態の遺伝的改変細胞は、bkdプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列を含む遺伝的改変細胞、好ましくは遺伝的改変Pseudomonasputida細胞であってよいpages28892894JBact187page664を参照のこと。ここでLイソロイシン、Lロイシン、LバリンまたはDロイシンの細胞内濃度の増加は自己蛍光タンパク質の発現を生じさせる。そのような細胞は、好ましくは、bkdプロモーターおよびこのプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質の遺伝子配列に加えて、BkdR調節因子をコードする遺伝子配列をさらに含む。BkdR調節因子によって調節されるbkdプロモーターのDNA配列は配列番号1に再現され、BkdR調節因子自身の配列は配列番号2に再現される。第1の実施形態の遺伝的改変細胞は、さらに、ackAプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列を含む遺伝的改変細胞、好ましくは遺伝的改変Bacillussubtilis細胞であってよいpage811を参照のこと。ここでまた、Lイソロイシン、LロイシンおよびLバリンの細胞内濃度の増加は自己蛍光タンパク質の発現を生じさせる。そのような細胞は、好ましくは、ackAプロモーターおよびこのプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質の遺伝子配列に加えて、CodYリプレッサーをコードする遺伝子配列をさらに含む。CodYアクチベーターによって調節されるackAプロモーターのDNA配列は配列番号3に再現され、CodYアクチベーター自身の配列は配列番号4に再現される。第1の実施形態の遺伝的改変細胞は、mdeAプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列を含む遺伝的改変細胞、好ましくは遺伝的改変Pseudomonasputida細胞であってもよいpage3956を参照のこと。ここでLメチオニンの細胞内濃度の増加は自己蛍光タンパク質の発現を生じさせる。そのような細胞は、好ましくは、mdeAプロモーターおよびこのプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質の遺伝子配列に加えて、MdeR調節因子をコードする遺伝子配列をさらに含む。MdeR調節因子によって調節されるmdeAプロモーターのDNA配列は配列番号5に再現され、MdeR調節因子自身の配列は配列番号6に再現される。第1の実施形態の遺伝的改変細胞は、さらに、brnFプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列を含む遺伝的改変細胞、好ましくは遺伝的改変Corynebacteriumglutamicum細胞であってよいpages39473956を参照のこと。ここで、Lイソロイシン、LロイシンおよびLバリンの細胞内濃度の増加は自己蛍光タンパク質の発現を生じさせる。そのような細胞は、好ましくは、brnFプロモーターおよびこのプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質の遺伝子配列に加えて、Lrp調節因子をコードする遺伝子配列をさらに含む。Lrp調節因子によって調節されるbrnFプロモーターのDNA配列は配列番号7に再現され、Lrp調節因子自身の配列は配列番号8に再現される。第1の実施形態の遺伝的改変細胞は、さらに、cysPプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列を含む遺伝的改変細胞、好ましくは遺伝的改変Escherichiacoli細胞であってよいpage791を参照のこと。ここでOアセチルLセリンの細胞内濃度の増加は自己蛍光タンパク質の発現を生じさせる。そのような細胞は、好ましくは、cysPプロモーターおよびこのプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質の遺伝子配列に加えて、CysB調節因子をコードする遺伝子配列をさらに含む。CysB調節因子によって調節されるcysPプロモーターのDNA配列は配列番号9に再現され、Lrp調節因子自身の配列は配列番号10に再現される。第1の実施形態の遺伝的改変細胞は、cadBプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列を含む遺伝的改変細胞、好ましくは遺伝的改変Escherichiacoli細胞であってもよいpages14011412を参照のこと。ここでカダベリンまたはプトレシンなどのジアミンの細胞内濃度の増加は自己蛍光タンパク質の発現を生じさせる。そのような細胞は、好ましくは、cadBプロモーターおよびこのプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質の遺伝子配列に加えて、CadC調節因子をコードする遺伝子配列をさらに含む。CadC調節因子によって調節されるcadBプロモーターのDNA配列は配列番号11に再現され、CadC調節因子自身の配列は配列番号12に再現される。第1の実施形態の遺伝的改変細胞は、さらに、metY、metK、hom、cysK、cysIまたはsuuDプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列を含む遺伝的改変細胞、好ましくは遺伝的改変Corynebacteriumglutamicum細胞であってよいpages871887を参照のこと。ここでSアデノシルホモシステインの細胞内濃度の増加は自己蛍光タンパク質の発現を生じさせる。そのような細胞は、好ましくは、metY、metK、hom、cysK、cysIまたはsuuDプロモーターおよびこのプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質の遺伝子配列に加えて、McbR調節因子をコードする遺伝子配列をさらに含む。McB調節因子によって調節されるmetYプロモーターのDNA配列は配列番号13に再現され、MecR調節因子自身の配列は配列番号14に再現される。第1の実施形態の遺伝的改変細胞は、argOプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列を含む遺伝的改変細胞、好ましくは遺伝的改変Escherichiacoli細胞であってもよい。ここでLリシンの細胞内濃度の増加は自己蛍光タンパク質の発現を生じさせる。そのような細胞は、好ましくは、argOプロモーターおよびこのプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質の遺伝子配列に加えて、ArgP調節因子をコードする遺伝子配列をさらに含む。ArgO調節因子によって調節されるargOプロモーターのDNA配列は配列番号15に再現され、ArgP調節因子自身の配列は配列番号16に再現される。第1の実施形態の特に好ましい構成の遺伝的改変細胞は、さらに、lysEプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列を含む遺伝的改変細胞、好ましくは遺伝的改変Corynebacteriumglutamicum細胞であってよいpage1765を参照のこと。ここで、Lリシン、Lアルギニン、LヒスチジンおよびLシトルリンの細胞内濃度の増加は自己蛍光タンパク質の発現を生じさせる。そのような細胞は、好ましくは、lysEプロモーターおよびこのプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質の遺伝子配列に加えて、LysG調節因子をコードする遺伝子配列をさらに含む。LysG調節因子によって調節されるlysEプロモーターのDNA配列は配列番号17に再現され、LysG調節因子自身の配列は配列番号18に再現される。Corynebacteriumglutamicumでは、lysE遺伝子は、有機分子およびカチオンの流出に関与する12の公知の輸送体スーパーファミリーの1つと、分子レベルでも構造レベルでも類似性を有さない二次担体をコードする。新規機能およびまれな構造に基づいて、LysEは新規輸送体ファミリーの第1のメンバーとして特定されている。ゲノムシークエンシングの関連で、以来、このファミリーに多数のタンパク質を割り当てることが可能になっているが、今のところ、依然として大部分が未知の機能のタンパク質である。LysEが属するLysEファミリーは、RhtBファミリーおよびCadDファミリーとともに、LysEスーパーファミリーを形成する。該スーパーファミリーには、これまでにトータルで22メンバーが割り当てられている。LysEファミリーのうち、Corynebacteriumglutamicum由来のリシン排出体はこれまでに唯一の機能的に特徴付けられたメンバーである。遺伝子レベルで、lysEは調節因子LysGによって調節される。LysGはLTTRファミリーの細菌性調節タンパク質と高い類似性を有する。この関連で、Lリシンは、LysGによって媒介されるlysEの転写の誘導物質として作用する。Lリシンに加えて、2つの塩基性アミノ酸LアルギニンおよびLヒスチジン、ならびにLシトルリンも、LysGによって媒介されるlysE発現の誘導物質である。第1の特定の実施形態の遺伝的改変細胞は、さらに、fadEまたはfadBAプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列を含む遺伝的改変細胞、好ましくは遺伝的改変Escherichiacoli細胞であってよいpages937943を参照のこと。ここでアシル補酵素Aの細胞内濃度の増加は自己蛍光タンパク質の発現を生じさせる。そのような細胞は、好ましくは、fadEまたはfadBAプロモーターおよびこのプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質の遺伝子配列に加えて、FadR調節因子をコードする遺伝子配列をさらに含む。FadR調節因子によって調節されるfadEプロモーターのDNA配列は配列番号19に再現され、LysG調節因子自身の配列は配列番号20に再現される。第1の特定の実施形態の遺伝的改変細胞は、fadMプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列を含む遺伝的改変細胞、好ましくは遺伝的改変Bacillussubtilis細胞であってもよいpages63206328を参照のこと。ここでまた、アシル補酵素Aの細胞内濃度の増加は自己蛍光タンパク質の発現を生じさせる。そのような細胞は、好ましくは、fadMプロモーターおよびこのプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質の遺伝子配列に加えて、FabR調節因子をコードする遺伝子配列をさらに含む。FabR調節因子によって調節されるfadMプロモーターのDNA配列は配列番号21に再現され、FabR調節因子自身の配列は配列番号22に再現される。第1の特定の実施形態の遺伝的改変細胞は、さらに、rhaSR、rhaBADまたはrhaTプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列を含む遺伝的改変細胞、好ましくは遺伝的改変Escherichiacoli細胞であってよい269271を参照のこと。ここでラムノースの細胞内濃度の増加は自己蛍光タンパク質の発現を生じさせる。そのような細胞は、好ましくは、rhaSR、rhaBADまたはrhaTプロモーターおよびこのプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質の遺伝子配列に加えて、RhaRまたはRhaS調節因子をコードする遺伝子配列をさらに含む。RhaR調節因子によって調節されるrhaSRプロモーターのDNA配列は配列番号23に再現され、rhaBADプロモーターの配列は配列番号24に再現され、RhaR調節因子の配列は配列番号25に再現され、RhaS調節因子の配列は配列番号26に再現される。第3の構成の遺伝的改変細胞は、hetC、nrrAまたはdevBプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列を含む遺伝的改変細胞、好ましくは遺伝的改変されたアナベナ属種の細胞であってもよいpages61266133を参照のこと。ここでオキソグルタル酸の細胞内濃度の増加は自己蛍光タンパク質の発現を生じさせる。そのような細胞は、好ましくは、hetC、nrrAまたはdevBプロモーターおよびこのプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質の遺伝子配列に加えて、NtcA調節因子をコードする遺伝子配列をさらに含む。NtcA調節因子によって調節されるhetCプロモーターのDNA配列は配列番号27に再現され、nrrAプロモーターの配列は配列番号28に再現され、devBプロモーターの配列は配列番号29に再現され、NtcA調節因子の配列は配列番号30に再現される。第1の特定の実施形態の遺伝的改変細胞は、さらに、cbbLS2またはcbbLS1プロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列を含む遺伝的改変細胞、好ましくは遺伝的に改変されたマイコバクテリウム属種の細胞であってよいpage297を参照のこと。ここでリブロースビスリン酸の細胞内濃度の増加は自己蛍光タンパク質の発現を生じさせる。そのような細胞は、好ましくは、cbbLS2またはcbbLS1プロモーターおよびこのプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質の遺伝子配列に加えて、CbbR調節因子をコードする遺伝子配列をさらに含む。CbbR調節因子のDNA配列は配列番号31に再現される。第1の特定の実施形態の遺伝的改変細胞は、さらに、pcbABプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列を含む遺伝的改変細胞、好ましくは遺伝的改変Streptomycescattleya細胞であってよいpage633を参照のこと。ここでチエナマイシンの細胞内濃度の増加は自己蛍光タンパク質の発現を生じさせる。そのような細胞は、好ましくは、pcbAプロモーターおよびこのプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質の遺伝子配列に加えて、ThnU調節因子をコードする遺伝子配列をさらに含む。ThnU調節因子によって調節されるpcbABプロモーターのDNA配列は配列番号32に再現され、ThnU調節因子自身の配列は配列番号33に再現される。第1の特定の実施形態の遺伝的改変細胞は、aviRaプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列を含む遺伝的改変細胞、好ましくは遺伝的改変Streptomycesviridochromogenes細胞であってもよいpage461を参照のこと。ここでアビラマイシンの細胞内濃度の増加は自己蛍光タンパク質の発現を生じさせる。そのような細胞は、好ましくは、aviRaプロモーターおよびこのプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質の遺伝子配列に加えて、AviC1およびまたはAviC2調節因子をコードする遺伝子配列をさらに含む。AviC1またはAviC2調節因子によって調節されるaviRaプロモーターのDNA配列は配列番号34に再現され、AviC1またはAviC2調節因子自身の配列は配列番号35に再現される。第1の特定の実施形態の遺伝的改変細胞は、さらに、nocFプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列を含む遺伝的改変細胞、好ましくは遺伝的改変Nocardiauniformis細胞であってよいpage1066を参照のこと。ここでノカルジシンの細胞内濃度の増加は自己蛍光タンパク質の発現を生じさせる。そのような細胞は、好ましくは、nocFプロモーターおよびこのプロモーターの制御下にある自己蛍光タンパク質の遺伝子配列に加えて、NocR調節因子をコードする遺伝子配列をさらに含む。NocR調節因子によって調節されるnocFプロモーターのDNA配列は配列番号36に再現され、NocR調節因子自身の配列は配列番号37に再現される。原則的に、上記プロモーターおよび、自己蛍光タンパク質をコードしかつこのプロモーターの制御下にある核酸を含む第1の特定の実施形態の本発明の細胞を作製するための種々の可能性が存在する。第1の可能性は、例えば、ゲノムが上記プロモーターの1つおよび好ましくは対応する調節因子をコードする遺伝子配列をすでに含む細胞から出発し、次いで自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列を、この遺伝子配列が該プロモーターの制御下にあるように細胞のゲノムに導入することからなる。適切であれば、プロモーター自身の核酸配列を、プロモーター効率を高める目的で、自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列をゲノムに組み込む前またはその後に、1個以上のヌクレオチド交換、ヌクレオチド欠失またはヌクレオチド挿入によって改変することができる。第2の可能性は、例えば、プロモーター配列および、自己蛍光タンパク質をコードしかつ該プロモーターのコンロール下にある遺伝子配列を含む1種以上の核酸構築物を細胞に導入することからなり、ここで、プロモーター効率を高める目的で、1個以上のヌクレオチド交換、ヌクレオチド欠失またはヌクレオチド挿入によってプロモーター自身の核酸配列を改変することも可能である。核酸構築物の挿入は、染色体上または染色体外で、例えば染色体外複製ベクター上で行うことができる。好適なベクターは、特定の菌株中で複製するベクターである。多数の公知のプラスミドベクター、例えばpZ164549554、pEKEx1またはpHS21は、潜在プラスミドpHM1519、pBL1またはpGA1に基づく。他のプラスミドベクター、例えばpCG4、またはpNG2、またはpAG1に基づくプラスミドベクターを同様に使用することができる。しかし、このリストは本発明に関して限定的ではない。プロモーターおよびこのプロモーターの制御下にある遺伝子配列を含む遺伝子構築物を作製するための説明はおよびそのような構築物を細胞の染色体に導入するかまたはこの遺伝子構築物を含む染色体外複製ベクターを細胞に導入するための説明は、例えば、Martinetal、Guerreroetal、TsuchiyaandMorinaga、Eikmannsetal、EPA0472869、US4601893、SchwarzerandPuehler、Remscheidetal、LaBarreetal、WOA9615246、Malumbresetal、JPA10229891、JensenandHammerおよび公知の遺伝学および分子生物学の教科書から当業者に十分に公知である。本発明の細胞の第2の特定の実施形態では、自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列の発現の制御は、いわゆるリボスイッチを用いて、特定の代謝産物の細胞内濃度に応じて達成され、転写レベルおよび翻訳レベルの両レベルでそのようなリボスイッチを用いて発現を調節することが可能である。リボスイッチとは、mRNAのみからなる調節要素を意味すると理解される。それらはセンサーとしておよび同時に調節要素として作用する。リボスイッチの概要は、例えば、VitrechaketalTrendsinGenetics20pages4450に見出すことができる。リボスイッチを用いる遺伝子発現の調節に関するさらなる詳細は、theFacultyofBiochemistryChemistryandPharmacyoftheJohannWolfgangGoetheUniversityinFrankfurtamMainに提出されたJonasNoeskeによる学術論文表題StrukturelleUntersuchungenanMetabolitbindendenRiboswitchRNAsmittelsNMRに見出すこともできる。リボスイッチは、自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列が、mRNAレベルで代謝産物に結合可能なDNA配列に機能的に結合している、この第2の特定の実施形態の本発明の細胞中で使用することができ、DNAに沿ったさらなる転写またはリボソームでの翻訳は代謝産物とmRNAとの結合に応じて影響を受ける。自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列の発現は、この様式で転写レベルまたは翻訳レベルでリボスイッチによって調節される。リボスイッチ要素を有する本発明の細胞では、いかなるタンパク質因子の関与もなしに代謝産物がmRNAの5UTR中の構造領域に直接結合し、RNA二次構造の変化を誘発する。5UTR中のこのコンフォメーション変化は、自己蛍光タンパク質をコードするそれに続く遺伝子の発現のモジュレーションを導く。この関連で、遺伝子調節作用は、転写もしくは翻訳、または、適切であれば、RNAプロセシングにも影響することによって達成することができる。リボスイッチの代謝産物結合領域はモジュール式の独立したRNAドメインである。リボスイッチの残りの部分は、通常、アプタマードメインの下流にある。代謝産物がアプタマードメインに結合しているか否かに応じて、発現プラットフォームはアプタマードメインの領域との塩基対形成に入ることができる。ほとんどの場合、発現プラットフォームとアプタマードメインとの間のこれらの塩基対形成は代謝産物未結合状態で生じ、遺伝子発現の活性化を生じさせる。逆に、これらの塩基対形成はリガンド結合状態で阻害され、それにより、通常、遺伝子発現の阻害が生じる。調節メカニズムが転写または翻訳に影響を有するかどうかは、代謝産物結合または代謝産物未結合状態で発現プラットフォームがとる二次構造に依存する。発現プラットフォームは、転写ターミネーターおよび転写アンチターミネーターを形成できる配列をしばしば含むが、2種の二次構造は互いに排他的である。よく存在する別のモチーフは、代謝産物結合状態に応じて、SD配列を一本鎖型に変換するか、またはマスクする二次構造である。SD配列が二次構造の形成によってマスクされると、リボソームはSD配列を認識できない。転写の早期中断または翻訳の開始は、この様式でリボスイッチによって調節することができる。挙げることができる、転写レベルまたは翻訳レベルで自己蛍光タンパク質の発現の制御を可能にする好適なリボスイッチ要素の例は、例えば、Bacillussubtilis由来のリシンリボスイッチ、Bacillussubtilis由来のグリシンリボスイッチpages275279によって報告されている、Bacillussubtilis由来のアデニンリボスイッチpages2935によって報告されているまたはBacillusanthracis由来のTPPタンデムリボスイッチpages573582によって報告されているである。これらの天然に存在するリボスイッチ要素に加えて、合成リボスイッチ要素、例えば、テオフィリンリボスイッチpages14251429またはDesaiandGellivanJAmChemSoc126pages1324754によって報告されている、ビオチンリボスイッチpages1441014419によって報告されているまたはTetリボスイッチpages25492556によって報告されているを使用することもできる。細胞懸濁液中で特定の代謝産物の増加した細胞内濃度を有する細胞を特定するための方法であって、以下の方法ステップ野生型と比べて遺伝的に改変されていて、かつ自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列を含む上記本発明の細胞を含み、ここで自己蛍光タンパク質の発現が特定の代謝産物の細胞内濃度に依存する、細胞懸濁液、を提供するステップ細胞を遺伝的に改変して、細胞が特定の代謝産物の細胞内濃度において異なる細胞懸濁液を得るステップ細胞内蛍光活性の検出によってこの特定の代謝産物の増加した細胞内濃度を有する細胞懸濁液中の個別の細胞を特定するステップを含む方法もまた、上記目的の達成に貢献する。本発明の方法のステップでは、まず、栄養培地および多数の上記遺伝的改変細胞を含む細胞懸濁液を提供する。本発明の方法のステップでは、細胞懸濁液中の1個以上の細胞を遺伝的に改変して、細胞が特定の代謝産物の細胞内濃度において異なる細胞懸濁液を得る。細胞懸濁液の遺伝的改変は標的化または非標的化突然変異誘発によって行うことができ、非標的化突然変異誘発が特に好ましい。標的化突然変異誘発では、制御された様式で細胞の特定の遺伝子において突然変異を生じさせる。突然変異の候補は、トランジション、トランスバージョン、挿入および欠失である。酵素活性に対するアミノ酸交換の影響に応じて、ミスセンス突然変異またはナンセンス突然変異と称される。遺伝子中の少なくとも1個の塩基対の挿入または欠失はフレームシフト突然変異を生じさせ、その結果、誤ったアミノ酸が組み入れられるか、または翻訳が早期中断される。いくつかのコドンの欠失は、典型的に、酵素活性の完全喪失を生じさせる。そのような突然変異を作製するための説明は先行技術に属し、公知の遺伝学および分子生物学の教科書、例えばKnippersによる教科書、Winnackerによる教科書またはHagemannによる教科書に見出せる。これらの標的化突然変異誘発法に関する詳細、特に有用な参考文献は、例えば、DEA10224088中に見出せる。しかし、本発明では、方法ステップの遺伝的改変が非標的化突然変異誘発によって行われれば、特に好ましい。そのような非標的化突然変異誘発の例は、例えばNメチルNニトロNニトロソグアニジンなどの化学物質での細胞の処理または紫外光での細胞の照射である。突然変異を誘発するためのそのような方法は概して公知であり、とりわけ、MillerまたはtheAmericanSocietyforBacteriologyのハンドブックManualofMethodsforGeneralBacteriologyに見出せる。方法ステップでの細胞の遺伝的改変によって、細胞中で生じている突然変異の性質に応じて、特定の細胞で、例えば酵素活性の増加もしくは減少、特定の酵素の発現の増加もしくは減少、特定の輸送タンパク質の活性の増加もしくは減少、特定の輸送タンパク質の発現の増加もしくは減少、調節タンパク質中の突然変異、構造タンパク質中の突然変異、またはRNA調節要素中の突然変異の結果として、プロモーターを介する対応する調節タンパク質との相互作用によってまたはリボスイッチ要素との相互作用によって自己蛍光タンパク質の発現に影響を及ぼす該代謝産物の細胞内濃度の増加が存在しうる。突然変異の結果、特定の代謝産物の濃度が増加している細胞は、したがって、この細胞で自己蛍光タンパク質が形成される点で識別される。自己蛍光タンパク質の遺伝子は細胞内代謝産物濃度の増加のレポーター遺伝子として働く。本発明の方法の方法ステップでは、したがって、この特定の代謝産物の増加した細胞内濃度を有する細胞懸濁液中の個々の細胞を細胞内蛍光活性の検出によって特定する。このために、細胞懸濁液を、自己蛍光タンパク質を励起させて発光させる周波数の電磁放射線に曝露する。本発明の方法の特定の構成では、方法ステップでの細胞の特定後、好ましくはその直後に、さらなる方法ステップを行う。該ステップでは、特定された細胞を細胞懸濁液から分離する。この分離は、好ましくは、フローサイトメトリーを用いて、非常に特に好ましくは高性能フローサイトメトリーを用いて行う。フローサイトメトリーによる細胞懸濁液の分析に関する詳細は、例えば、SackUTarnokARotheGZellulaereDiagnostikGrundlagenMethodenundklinischeAnwendungenderDurchflusszytometrieBaselKarger2007pages2770に見出せる。したがって、本発明の方法を用いて、標的化または非標的化突然変異が細胞中で生じている細胞懸濁液中で、突然変異によって特定の代謝産物の細胞内濃度の増加を生じている細胞を、細胞の生存性に影響することなく、標的化された様式で単離することが可能である。野生型と比べて遺伝的に改変され、特定の代謝産物の生産が最適化されている細胞の製造方法であって、以下の方法ステップ野生型と比べて遺伝的に改変されていて、かつ自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列を含む上記本発明の細胞を含み、ここで自己蛍光タンパク質の発現が特定の代謝産物の細胞内濃度に依存する、細胞懸濁液を提供するステップ細胞を遺伝的に改変して、細胞が特定の代謝産物の細胞内濃度において異なる細胞懸濁液を得るステップ細胞内蛍光活性の検出によって特定の代謝産物の増加した細胞内濃度を有する細胞懸濁液中の個別の細胞を特定するステップ特定された細胞を細胞懸濁液から分離するステップ特定の代謝産物の細胞内濃度の増加の原因となる、特定されかつ分離された細胞中の遺伝的に改変された遺伝子G1~Gnまたは突然変異M1~Mmを特定するステップ野生型と比べて遺伝的に改変され、特定の代謝産物の生産が最適化されている細胞であって、そのゲノムが遺伝子G1~Gnの少なくとも1つおよびまたは突然変異M1~Mmの少なくとも1つを含む細胞を、製造するステップを含む方法も、上記目的を達成するために貢献する。方法ステップ~では、まず、特定の代謝産物の増加した細胞内濃度を有する細胞を突然変異誘発によって作製し、細胞懸濁液から分離する。ここで上記方法ステップ~を参照することができる。方法ステップでは、特定されかつ分離された細胞において、特定の代謝産物の細胞内濃度の増加の原因となる遺伝的に改変された遺伝子G1~Gnまたは突然変異M1~Mmを、当業者に公知の遺伝学的方法によって特定し、数値nおよびmは、それぞれ、特定されかつ分離された細胞中で観察される改変遺伝子の数および観察される突然変異の数に依存する。好ましくは、この関連での手順は、特定の代謝産物の形成を刺激することが知られている細胞中の遺伝子の配列またはプロモーター配列が最初に分析されるように行われる。代謝産物がLリシンの場合、これらは、例えば、遺伝子lysC、hom、zwf、mqo、leuC、gndまたはpykである。これらの遺伝子のいずれにも突然変異が認識されなければ、特定されかつ分離された細胞のゲノム全体を分析して、適切な場合には、さらなる改変遺伝子Giまたはさらなる突然変異Miを特定する。細胞中の特定の代謝産物の細胞内濃度の増加を生じさせる好都合な改変遺伝子配列Giまたは好都合な突然変異Miをこの様式で特定することができる。さらなる方法ステップでは、野生型と比べて遺伝的に改変され、特定の代謝産物の生産が最適化されている細胞であって、そのゲノムが遺伝子G1~Gnの少なくとも1つおよびまたは突然変異M1~Mmの少なくとも1つを含む細胞を製造することができる。このために、方法ステップで観察された1個以上の好都合な改変遺伝子Gおよびまたは改変突然変異Mを、標的化された様式で細胞に導入する。特定の突然変異のこの標的化された導入は、例えば、遺伝子置換によって行うことができる。この方法では、突然変異、例えば欠失、挿入または塩基交換をinvitroで目的の遺伝子中で生じさせる。生じた対立遺伝子を、次いで、標的宿主に関して非複製性のベクターにクローニングし、これを形質転換またはコンジュゲーションによって標的宿主に導入する。組み込みを達成する第1のクロスオーバーイベントおよび標的遺伝子または標的配列中の切除を達成する好適な第2のクロスオーバーイベントによる相同組換え後、突然変異または対立遺伝子の取り込みが達成される。上記方法によって得られた、特定の代謝産物の生産が最適化されている細胞も、上記目的の達成に貢献する。代謝産物の製造方法であって、以下の方法ステップ上記方法によって、特定の代謝産物の生産が最適化されている、野生型と比べて遺伝的に改変された細胞を作製するステップ栄養素を含む培養培地中で、細胞が該栄養素から特定の代謝産物を生産する条件下で細胞を培養するステップを含む方法も、上記目的の達成に貢献する。方法ステップで作製された特定の代謝産物の生産が最適化されている本発明の遺伝的改変細胞を、代謝産物の生産のために、バッチ法で、または流加法または反復流加法で連続的または不連続的に方法ステップで栄養培地中で培養することができる。GBA1009370に記載されるような半連続法も想定できる。公知の培養方法の概要は、Chmielによる教科書またはStorhasによる教科書に記載されている。使用される栄養培地は、好適な様式で特定の菌株の要求性を満たす必要がある。種々の微生物の培養培地の説明は、theAmericanSocietyforBacteriologyのハンドブックManualofMethodsforGeneralBacteriologyに含まれる。栄養培地は、炭水化物、例えばグルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、デンプンおよびセルロース、油および脂肪、例えばダイズ油、ヒマワリ油、ラッカセイ油およびココナツ脂肪、脂肪酸、例えばパルミチン酸、ステアリン酸およびリノール酸、アルコール、例えばグリセロールおよびメタノール、炭化水素、例えばメタン、アミノ酸、例えばLグルタミン酸もしくはLバリン、または有機酸、例えば酢酸を炭素の供給源として含むことができる。これらの物質は個別にまたは混合物として使用することができる。栄養培地は、有機窒素含有化合物、例えばペプトン、酵母抽出物、肉エキス、麦芽抽出物、コーンスティープリカー、ダイズ粉および尿素、または無機化合物、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウムを窒素の供給源として含むことができる。窒素の供給源は個別にまたは混合物として使用することができる。栄養培地は、リン酸、リン酸二水素カリウムもしくはリン酸水素二カリウムまたは対応するナトリウム含有塩をリンの供給源として含むことができる。栄養培地は、さらに、金属塩、例えば硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄を含む必要があり、それは成長に必要である。最後に、上記物質に加えて、必須の成長物質、例えばアミノ酸およびビタミンを用いることができる。さらに、好適な前駆体を栄養培地に加えることができる。上記出発物質を1回のバッチの形式で培養物に加えるか、または好適な様式で培養の期間中に供給することができる。塩基性化合物、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアもしくはアンモニア水、または酸性化合物、例えばリン酸もしくは硫酸を好適な様式で用いて、培養物のpHを調節する。脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を用いて、泡の発生を抑制することができる。例えば抗生物質などの選択作用を有する好適な物質を培地に加えて、プラスミドの安定性を維持することができる。酸素または酸素含有ガス混合物、例えば空気を培養物に導入して、好気条件を維持する。培養物の温度は、通常、20°C~45°Cであり、好ましくは25°C~40°Cである。混合物の調製方法であって、以下の方法ステップ上記方法によって代謝産物を製造するステップ代謝産物を、該代謝産物と異なる混合物成分と混合するステップを含む方法も、上記目的の達成に貢献する。代謝産物がアミノ酸、特にLリシンである場合、混合物は、好ましくは食品、非常に特に好ましくは動物飼料、または医薬組成物である。以下、図面および非限定的な実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明する。図面の簡単な説明は上述のとおり図1は、本発明の細胞の第1の実施形態の自己蛍光タンパク質の遺伝子配列がプロモーターの制御下にある構築物の候補を示す。変異体Aは、代謝産物依存的調節因子がその標的遺伝子のすぐ隣にある初期状態を示し、該標的遺伝子は代謝産物濃度に従って調節因子によって調節される。変異体Bでは、最も単純な事例において、標的遺伝子が蛍光タンパク質によって置換される。変異体Cでは、標的遺伝子の最初のアミノ酸群と蛍光タンパク質との翻訳融合が生じている。変異体Dでは、標的遺伝子の最初のアミノ酸群を含むプロモーター領域から出発し、終止コドンによって終結し、リボソーム結合部位および蛍光タンパク質のオープンリーディングフレームが続く、長い転写物が形成されるように、転写融合が生じている。変異体Eでは、標的遺伝子の最初のアミノ酸群を含むプロモーター領域から出発し、終止コドンによって終結し、リボソーム結合部位および公知でかつ十分に発現されるタンパク質、例えばEcoli由来のβガラクトシダーゼ、LacZの開始部分が続き、それが次いで蛍光タンパク質と融合される、長い転写物が形成されるように、転写融合が生じている。実施例自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列がlysEプロモーターの制御下にありかつ自己蛍光タンパク質の発現が細胞内Lリシン濃度に依存する細胞により例示する、第1の実施形態の本発明の細胞の作製。ベクターpJC1lysGEeYFPの構築lysEとレポーター遺伝子eyfpとの融合物の構築をオーバーラップエクステンションPCRによって達成した。様々に転写される調節因子LysGの遺伝子とともにlysEのコード配列を保持するpUC1823kblysGEBamHI、およびeyfpの増幅を可能にするpEKEx2yfptetRを鋳型として使用した。lysGEeyfp断片を確立するために、まず、オリゴヌクレオチドの組み合わせplysGEforおよびplysGErevを用いてコード配列lysGEおよびlysGEnsを増幅した。eyfpのコード配列の増幅には、2つのオリゴヌクレオチドの組み合わせpeYFPrevおよびpeYFPfw2を使用した。plysGEfor5CGCGGATCCCTAAGCCGCAATCCCTGATTG3plysGErev5TCCGATGGACAGTAAAAGACTGGCCCCCAAAGCAG3peYFPrev5TGAGGATCCTTATTACTTGTCAGCTCGTCCATGCCGAGAGTGATCC3peYFPfw25CTTTTACTGTCCATCGGAACTAGCTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACC3。1濃度アガロースゲルから増幅断片を精製した後、外側プライマーplysGEforおよびpeYFPrevを用いる第2のPCR反応でこれらを鋳型として用いた。内側オリゴヌクレオチドプライマーplysGErevおよびpeYFPfw2から生成された17bpの相補領域における鋳型断片のハイブリダイゼーションによって、重複伸長断片を確立することができた。この方法で形成された生成物lysGEeyfpを制限酵素BamHIで消化し、反応バッチの精製後、同様にBamHIで開環されかつ脱リン酸化されたベクターpJC1とのライゲーション反応に用いた。ライゲーションバッチをEcoliDH5αMCRの形質転換に直接使用して、50μgmlのカナマイシンを含むLBプレートで形質転換体の選択を行った。これらのプレートで生育し、したがってカナマイシン耐性であった20コロニーをコロニーPCRに用いた。それぞれについて上記のオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いてコロニーPCRを行い、断片lysGEeyfpがベクターpJC1に挿入されたかどうかを確認した。アガロースゲルでのコロニーPCRの分析では、分析されたサンプル中でサイズ1010bpの予測されたPCR産物が示され、その後、ラージスケールでのプラスミド作製のためにコロニーを培養した。制限酵素BglII、XhoIおよびPvuIでの試験切断によって、挿入断片pJC1lysGEeYFPの存在を実証することができた。挿入物の配列決定により、予測配列との100一致が示された。pJC1lysGEeYFPを用いるCorynebacteriumglutamicumの形質転換Tauchetal2002pages3627によって記載されているようにして、CglutamicumATCC13032株およびDM1800株のコンピテント細胞を調製した。ATCC13032株は、リシンを分泌する野生型であるが、DM1800株は遺伝子特異的突然変異誘発によってリシン分泌体となったpages291301。Tauchetalpages3627によって記載されるようにして、pJC1lysGEeYFPでのエレクトロポレーションによってこれらの細胞を形質転換した。25μgmlのカナマイシンを含むBHISプレートで形質転換体の選択を行った。これらのプレートで生育し、したがってカナマイシン耐性であったコロニーを、プラスミド調製および酵素BglII、XhoIおよびPvuIでの試験切断によってベクターの存在に関して確認した。それぞれについて1つの正しいクローンをATCC13032pJC1lysGEeYFPおよびDM1800pJC1lysGEeYFPと名付けた。リシン特異的蛍光の検出ZeissAxioImagerM1を用いる共焦点顕微鏡検査によって蛍光のinvivo発光を試験した。この目的で、ATCC13032pJC1lysGEeYFP株およびDM1800pJC1lysGEeYFP株の3μlの細胞懸濁液をスライドに載せ、それに1濃度のアガロースの薄層を適用して固定した。固定された懸濁液を波長514nmおよび照射時間700msの光で励起させた。505nm~550nmの範囲の広帯域フィルターを使用してeYFPの蛍光発光測定を行った。AxioVision46ソフトウェアを用いて蛍光細胞をデジタル記録した。リシン形成株DM1800pJC1lysGEeYFPの場合にのみ蛍光の発光が生じ、リシンを形成しないATCC13032pJC1lysGEeYFP株は蛍光を発しないことが画像中に認められる。自己蛍光タンパク質の発現がアデニンリボスイッチによって下方制御され、かつ自己蛍光タンパク質の発現が細胞内アデニン濃度に依存する細胞により例示する、第2の実施形態の本発明の細胞の作製。まず、BacillussubtilisのゲノムDNAから出発し、プライマーARSforおよびARSrevを用いてBacillussubtilis由来のアデニンリボスイッチpages2935を参照のことを増幅した。第2のPCRでは、QiagenMinEluteGelExtractionKitを用いて精製されたARS増幅物から出発して、プライマーARSforBamHIおよびARSrevNdeIを使用して、5末端BamHIおよび3末端NdeI切断部位を有するARS増幅物を増幅し、これらの制限酵素で切断した。プライマーEYFPforNdeIおよびEYFPrevEcoRIを用いて、pEKEx2EYFPに基づいてレポーター遺伝子eyfpを増幅し、酵素NdeIおよびEcoRIで制限切断し、QiagenMinEluteGelExtractionKitを用いて同様に精製した。ARSfor5TCAACTGCTATCCCCCCTGTTA3ARSrev5AAACTCCTTTACTTAAATGTTTTGATAAATAAA3EYFPforNdeI5TACATATGGTGAGCAAGGGCGA3EYFPrevEcoRI5TAGAATTCTTATCTAGACTTGTACAGCTCG3。2つの制限切断PCR産物を、あらかじめBamHIおよびEcoRIで制限切断されたベクターpEKEx2に一緒にライゲートし、したがって、IPTG誘導性プロモーターptacの制御下に置いた。次いでライゲーションバッチでEcoliXL1ブルーを形質転換した。カナマイシン耐性形質転換体を構築物pEKEx2ARSEYFPの存在に関してコロニーPCRを用いて試験しおよびEYFPrev、さらなる分析のためにプラスミドを精製した。作製された構築物pEKEx2ARSEYFPの確認のために、これを制限酵素NdeIで切断し、バンドパターンに基づいて検査した。図4に示されるアデニンセンサーの配列決定で、アデニン依存的リボスイッチと自己蛍光タンパク質EYFPとの無傷の融合が確認された。pEKEx2for5CGGCGTTTCACTTCTGAGTTCGGC3EYFPrev5TAGAATTCTTATCTAGACTTGTACAGCTCG3。自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列がbrnFEプロモーターの制御下にありかつ自己蛍光タンパク質の発現が細胞内Lメチオニン濃度に依存する細胞によって例示される、第1の実施形態の本発明の細胞の作製。ベクターpJC1lrpbrnFeYFの構築brnFとレポーター遺伝子eyfpとの融合物の構築のための手順は以下の通りであった。2つの別々の反応で、オリゴヌクレオチドペアlrpfwABamHIlrpbrnFrvINdeIを用いて、最初にコードlrpおよびbrnF配列の最初の30ヌクレオチドを遺伝子間領域とともに増幅し、またオリゴヌクレオチドペアeyfpfwHNdeIeyfprvDSalIを用いてeyfpを増幅した。Cglutamicum由来のゲノムDNAおよび、eyfpの増幅を可能にするベクターpEKEx2yfptetRを鋳型として使用した。オリゴヌクレオチドfwABamHIおよびlrpbrnFrvINdeIに5末端BamHIおよびNdeI制限切断部位を追加し、オリゴヌクレオチドeyfpfwHNdeIおよびeyfprvDSalIに5末端NdeIおよびSalI制限切断部位を追加した。lrpbrnF増幅物をBamHIおよびNdeIで制限切断し、かつeyfp増幅物をNdeIおよびSalIで制限切断した後、ライゲーションバッチ中でNdeI切断部位の遊離端を介してlrpbrnF増幅物をeyfp増幅物と融合させ、同時に、BamHIおよびSalIによって同様に開環されたベクターpJC1中にクローニングした。ライゲーションバッチをEcoliDH5αの形質転換に直接使用した。50μgmlのカナマイシンを含むLBプレートで形質転換体の選択を行った。これらのプレートで生育し、したがってカナマイシン耐性であったコロニーをコロニーPCRに用いた。断片lrpbrnFeyfpがベクターpJC1に挿入されたかどうかを確認するために、ベクターpJC1中の多重クローニング部位の領域に隣接するオリゴヌクレオチドを用いてコロニーPCRを行った。アガロースゲルでのコロニーPCRの分析では、分析されたサンプル中でサイズ1530bpの予測されたPCR産物が示され、その後、ラージスケールでのプラスミド作製のためにコロニーを培養した。制限酵素BamHI、NdeIおよびSalIでの試験切断によって挿入断片の存在を実証した。挿入物の配列決定により、予測配列との100一致が示された。TauchandKirchner45362367の方法によってベクターpJC1lrpbrnFeYFPでのコンピテントCglutamicum細胞の形質転換を行い、CglutamicumATCC13032pJC1lrpbrnFeYFP株を得た。lrpfwABamHI5GCGCGGATCCTCACACCTGGGGGCGAGCTG3lrpbrnFrvINdeI5GCGCCATATGATATCTCCTTCTTAAAGTTCAGCTTGAATGAATCTCTTGCG3eyfpfwHNdeI5GCGCCATATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG3eyfprvDSalI5GCGCGTCGACTTATCTAGACTTGTACAGCTCGTC3SeqpJC1for15CGATCCTGACGCAGATTTTT3SeqpJC1rev15CTCACCGGCTCCAGATTTAT3。細胞内メチオニン濃度と蛍光出力との相関さらに詳細な特徴づけのために、Lメチオニンに関するセンサーの感度および動的範囲を測定した。このために、ATCC13032pJC1lrpbrnFeYFPでペプチドを用いて種々のメチオニン内部濃度を確立した。この方法は、例えば、Troetscheletalによって記載されている。以下のジペプチドLアラニルLメチオニン、LメチオニルLメチオニン、およびLアラニルLアラニンを用いた。種々のLメチオニン濃度を達成するために、以下の混合比03mMAlaMet27mMAlaAla、06mMAlaMet24mMAlaAla、09mMAlaMet21mMAlaAla、15mMAlaMet15mMAlaAla、21mMAlaMet09mMAlaAla、27mMAlaMet03mMAlaAla、3mMAlaMet、3mMMetMetを使用し、それをCGXII培地に加えた。BioLectorシステムにおいてマイクロタイタースケールMTP48Bで06mlの培地で培養を行った。ペプチドを加えた7分後、200μlの細胞懸濁液由来の細胞をシリコーン油での遠心分離によって培地から分離し、KlingenbergandPfaffによって記載されているようにして不活性化した。サンプルの細胞質画分をEbbinghausenetal151238244によって記載されているようにして用意し、LindrothandMopper5111671174によって記載されているようにして逆相HPLCを用いてアミノ酸濃度を定量した。種々のペプチド濃度を有するATCC13032pJC1lrpbrnFeYFPの培養物の蛍光をBioLectorシステムでオンラインで検出した。内部Lメチオニン濃度と蛍光出力シグナルとの相関を図6に示す。センサープラスミドpJC1lrpbrnFeYFPが約02~25mMの線形範囲でメチオニンの細胞内検出を可能にすることが認められる。メチオニンの蓄積は、低いmM範囲ですでに検出することができる。実施例4リシン形成が増加している細胞の単離およびリシン形成を生じさせる新規突然変異の特定のための代謝産物センサーの使用。リシンセンサーpSenLysTKCを含む組換え野生型のCorynebacteriumglutamicumの構築ベクターpJC1はCremeretalによって記載されている。このベクターをBamHIおよびSalIで切断し、GATCによって合成された1765kb断片BamHISalIとライゲートした。得られたベクターpSenLysTKを制限酵素BamHIで消化し、GATCによって合成された2506kb断片BamHIT7ターミネーターBamHIとライゲートした。得られたベクターをpSenLysTKCと称した。それは、転写融合物としてEYFPを含み、生存マーカーとしてタンパク質クリムゾンを含む。Tauchetalpages3627によって記載されているようにして野生型のコンピテント細胞にセンサープラスミドpSenLysTKCを導入し、CorynebacteriumglutamicumATCC13032pSenLysTKC株を得た。CorynebacteriumglutamicumATCC13032pSenLysTKCの突然変異誘発得られたATCC13032pSenLysTKC株をDifcoBrainHeartInfusion培地中で30°Cで一晩培養し、この培養物5mlに、1mlのジメチルスルホキシドに溶解された05mgのNメチルNニトロソNニトログアニジンの溶液01mlを加えた。この培養物を30°Cで15分振とうした。次いで細胞を4°Cおよび2500gで遠心分離し、5mlの09NaClに再懸濁した。遠心分離ステップおよび再懸濁を反復した。このように得られた細胞懸濁液に75mlの80濃度グリセロールを加え、この突然変異細胞懸濁液のアリコートを20°Cで保存した。ハイスループットサイトメトリーおよびセルソーティングで得られた細胞懸濁液200μlを20mlのCGXIIKan25液体培地5595603に加え、培養物を30°Cおよび180rpmでインキュベートした。45分後、イソプロピルβDチオガラクトピラノシドを終濃度01mMで加えた。さらに2時間のインキュベーション後、光学特性の分析およびBectonDickinsonのFACSAriaIIセルソーターでの細胞粒子のソーティングを行った。FACS設定の前方散乱および側方散乱の限界値は、前方散乱の場合は50mVおよび側方散乱の場合は550mVの電子増幅で500であった。波長488nmおよび、625mVで530~30のパラメーターゲインによる検出によってEYFPの励起を達成した。波長633nmおよび、700mVで660~20のPMTによる検出によってクリムゾンの励起を達成した。2百万のクリムゾン陽性細胞を20mlのCGXIIKan25中でソートし、培養物を180rpmおよび30°Cで22時間培養した。次いで再びイソプロピルβDチオガラクトピラノシドを終濃度01mMで加えた。さらに2時間後、EYFPおよびクリムゾン蛍光に関して分析速度10000粒子秒で18000000細胞を分析し、580細胞を選別し、FACSAriaIIセルソーターを用いて自動的にBHISKan25プレートに載せた。プレートを30°Cで16時間インキュベートした。プレートに載せた580細胞のうち、270が生育した。これらをすべてマイクロタイタープレートの08mlのCGXIIKan25中に移し、400rpmおよび30°Cで48時間培養した。プレートをマイクロタイタープレートローターで4000xgで30分、4°Cで遠心分離し、上清を水で1100希釈し、HPLCを用いて分析した。185クローンをリシン形成体として特定した。さらに詳細な特徴づけのため、これらのクローンのうち40クローンの生成物形成に関する分析を振とうフラスコ中の50mlのCGXIIKan25中で再び行った。出発株ATCC13032pSenLysTKCはリシンを分泌しないが、40の突然変異体は2~35mMの範囲の種々の量のリシンを形成する。lysC、hom、thrBおよびthrC中の突然変異の特定40の突然変異体のさらなる特徴づけのため、QiagenのDNeasyキットを用いてそれらの染色体DNAを単離した。遺伝子lysCをプライマーlysC32FおよびlysC1938Rを用いて増幅し、増幅物をEurofinsMWGOperonによって配列決定した。lysC32F5GAACATCAGCGACAGGACAA3lysC1938R5GGGAAGCAAAGAAACGAACA3。既知の突然変異T311I、T308I、A279T、A279VおよびA279Tを得た。さらに、新規突然変異H357Y、T313I、G277DおよびG277Sを得た。野生型のコードトリプレットとそれに続く、突然変異体の対応する突然変異型トリプレットをそれぞれについて括弧内に記載する。プライマーhom289FおよびthrB2069Rを用いて遺伝子homを増幅し、増幅物をEurofinsMWGOperonによって配列決定した。hom289F5CCTCCCCGGGTTGATATTAG3thrB2069R5GGCCAGCACGAATAGCTTTA3。新規突然変異A346V、V211F、G241S、A328V、T233I、および二重突然変異R158CT351Iを得た。プライマーペアhom1684FおよびthrB2951Rを用いて突然変異体のthrBをさらに配列決定して、新規突然変異S102Fを得た。hom1684F5AGGAATCTCCCTGCGTACAA3thrB2951R5CCGGATTCATCCAAGAAAGC3。プライマーペアthrC22FおよびthrC2046Rを用いて突然変異体のthrCをさらに配列決定して、新規突然変異A372Vを得た。thrC22F5GCCTTAAAACGCCACTCAAT3thrC2046R5GGCCGTTGATCATTGTTCTT3。murEの突然変異の特定lysC中の突然変異でも、hom、thrBまたはthrC中の突然変異でもない突然変異を含む突然変異体で突然変異をさらに特定するために、さらにmurEを配列決定した。プライマーmurE34FおよびmurE1944Rを用いて遺伝子murEを増幅し、増幅物をGATCによって配列決定した。murE34F5AACTCCACGCTGGAGCTCAC3murE1944R5AGAACGCGGAGTCCACG3。ヌクレオチド361でのCからTへのトランジションを含み、それがMurEタンパク質において、タンパク質の121位のアミノ酸交換L121Fを生じさせる、murE遺伝子配列が決定された。野生型でのリシン形成に対するmurE突然変異の影響プライマー739LFおよび739RRを用いて、実施例で得られたCglutamicum突然変異体M39の染色体DNAから1kbの遺伝子murEを増幅し、新たに特定された突然変異を保持するmurE断片を得た。得られた増幅物をBamHIおよびSalIによって、Cglutamicumで複製できないベクターpK19mobsacB中にクローニングし、それを相同組換えによって野生型ゲノムに導入したpages3627SchaeferetalGene19941456973。次いで、得られたCglutamicumLys39株を50mlのBHISKan25中で30°Cおよび130rpmで12時間培養した。500μlのこの培養物を50mlのCGXIIKan25中に移し、再び30°Cおよび130rpmで24時間培養した。これから出発し、初期ODが05の50mlのCGXII本培養物を接種し、この培養物を130rpmおよび30°Cで48時間培養した。培養上清を水で1100に希釈し、表1に得られるLリシン濃度をHPLCによって決定した。739LF5TAGGATCCCGACAACATCCCACTGTCTG3739RR5AAGTCGACGTCTGCTTCTTGCCCAAGG3。配列配列番号1配列番号2配列番号3配列番号4配列番号5配列番号6配列番号7配列番号8配列番号9配列番号10配列番号11配列番号12配列番号13配列番号14配列番号15配列番号16配列番号17配列番号18配列番号19配列番号20配列番号21配列番号22配列番号23配列番号24配列番号25配列番号26配列番号27配列番号28配列番号29配列番号30配列番号31配列番号32配列番号33配列番号34配列番号35配列番号36配列番号37配列番号38配列番号39配列番号40配列番号41配列番号42配列番号43配列番号44配列番号45配列番号46配列番号47配列番号48配列番号49配列番号50配列番号51配列番号52配列番号53配列番号54配列番号55配列番号56配列番号57配列番号58配列番号59配列番号60配列番号61配列番号62配列番号63配列番号64配列番号65配列番号66配列番号67配列番号68配列番号69配列番号70配列番号71配列番号72