配列番号2で表されるアミノ酸配列における660番目に相当する位置のアミノ酸がリジンであるホスホイノシチド-3キナーゼのp85調節サブユニットβを発現する親細胞に対して、前記リジンを欠失又は他のアミノ酸に置換させる遺伝子の変異を導入することにより、Aktセリン/スレオニンキナーゼを活性化しない変異ホスホイノシチド-3キナーゼを発現する変異細胞を作出することを特徴とする細胞の作出方法。他のアミノ酸が、アルギニンであることを特徴とする請求項1に記載の細胞の作出方法。前記親細胞が、幹細胞、繊維芽細胞、筋芽細胞、又は上皮細胞であることを特徴とする請求項1又は2に記載の細胞の作出方法。請求項1~3のいずれかに記載の細胞の作出方法によって得られる細胞。以下の性質a及びbを有することを特徴とする改変PC12細胞。a神経成長因子を作用させても神経分化が誘導されない、b神経成長因子を作用させてもAktセリン/スレオニンキナーゼを活性化しない、変異ホスホイノシチド-3キナーゼを発現する。ホスホイノシチド-3キナーゼのp85調節サブユニットβをコードする遺伝子に変異が導入されていることを特徴とする請求項5に記載の改変PC12細胞。前記変異が、配列番号2で表されるアミノ酸配列における660番目に相当する位置のリジンを欠失又は他のアミノ酸に置換するものであることを特徴とする請求項6に記載の改変PC12細胞。他のアミノ酸が、アルギニンであることを特徴とする請求項7に記載の改変PC12細胞。Aktセリン/スレオニンキナーゼを活性化しない変異ホスホイノシチド-3キナーゼをコードする、単離された遺伝子。前記変異ホスホイノシチド-3キナーゼが、下記i~iiiのいずれかであることを特徴とする請求項9に記載の遺伝子。i配列番号4で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、ii配列番号4で表されるアミノ酸配列において、1~10個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつAktセリン/スレオニンキナーゼを活性化しない変異ホスホイノシチド-3キナーゼの活性を有する蛋白質、iii配列番号4で表されるアミノ酸配列と80以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつAktセリン/スレオニンキナーゼを活性化しない変異ホスホイノシチド-3キナーゼの活性を有する蛋白質。下記iv又はvの核酸であることを特徴とする請求項9に記載の遺伝子。iv配列番号3で表される塩基配列からなる核酸、v配列番号3で表される塩基配列からなる核酸と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつAktセリン/スレオニンキナーゼを活性化しない変異ホスホイノシチド-3キナーゼの活性を有する蛋白質をコードする核酸。請求項9~11のいずれかに記載の遺伝子によってコードされる、単離された変異ホスホイノシチド-3キナーゼ。上記した新規医薬のスクリーニング等をより効果的に、或いは別の角度から行うために、新たな特性を有する変異PC12細胞を取得することが望まれている。また、新たに取得した変異PC12細胞の機能解析を進めることで、遺伝子治療や再生医療といった先端医療分野や、植物家畜等の農学分野に有用な新たな技術を開発できる可能性が広がる。上記現状に鑑み、本発明の目的は、新たな特性を有する改変PC12細胞を提供し、合わせて、当該改変PC12細胞が有する特性を備えた新規細胞を作出することができる技術を提供することにある。上記した課題を解決するための本発明の1つの様相は、配列番号2で表されるアミノ酸配列における660番目に相当する位置のアミノ酸がリジンであるホスホイノシチド-3キナーゼのp85調節サブユニットβを発現する親細胞に対して、前記リジンを欠失又は他のアミノ酸に置換させる遺伝子の変異を導入することにより、Aktセリン/スレオニンキナーゼを活性化しない変異ホスホイノシチド-3キナーゼを発現する変異細胞を作出することを特徴とする細胞の作出方法である。本様相は細胞の作出方法に係るものであり、ホスホイノシチド-3キナーゼ以下、PI3Kと略記することがあるのp85調節サブユニットβ以下、p85βと略記することがある遺伝子に対して特定の変異を導入することにより、Aktセリン/スレオニンキナーゼ以下、Aktと略記することがあるを活性化しない変異PI3Kを発現する変異細胞を作出することを特徴とするものである。本様相の細胞の作出方法によれば、変異p85βを発現する種々の細胞を作出することができる。例えば、ストレス耐性が付与された新規細胞を作出することができる。ここで配列番号2で表されるアミノ酸配列における660番目に相当する位置のアミノ酸は、実際のN末端からちょうど660番目の位置にあるとは限らない。例えば、配列番号2で表されるアミノ酸配列の一部にアミノ酸の欠失又は挿入があるp85βの場合には、当該アミノ酸の位置は、N末端から661番目以上又は659番目以下の位置になり得る。また本発明においては、親細胞のp85βが、配列番号2と完全一致するアミノ酸配列を有するものである必要もない。なお配列番号2は、後述するオリジナルのPC12細胞におけるp85βのアミノ酸配列であり、既に知られているものである。好ましくは、他のアミノ酸がアルギニンである。好ましくは、前記親細胞が、幹細胞、繊維芽細胞、筋芽細胞、又は上皮細胞である。かかる構成により、細胞医療や再生医療等に有用な新規細胞を作出することが可能となる。本発明の他の様相は、上記の細胞の作出方法によって得られる細胞である。本様相は細胞に係るものであり、上記の細胞の作出方法によって得られるものである。本様相の細胞は、例えば、細胞医療や再生医療等に有用である。本発明の他の様相は、以下の性質a及びbを有することを特徴とする改変PC12細胞である。a神経成長因子を作用させても神経分化が誘導されない、b神経成長因子を作用させてもAktセリン/スレオニンキナーゼを活性化しない、変異ホスホイノシチド-3キナーゼを発現する。本様相は改変されたPC12細胞改変PC12細胞に係るものであり、上記a及びbに示す特異な性質を有している。本様相の改変PC12細胞によれば、新しい作用機序からなる新規医薬のスクリーニング等を行うことができる。さらに、本様相の改変PC12細胞の機能解析を詳細に行うことにより、先端医療等に応用可能な新たな技術開発を可能にする知見を得ることができる。ここで、aにおける神経分化が誘導されないとは、神経分化の誘導が全く観察されない場合の他、オリジナルのPC12細胞と比較して神経分化の誘導が極めて弱く、神経分化は実質的に誘導されていないと判断される場合も含む。bにおけるAktセリン/スレオニンキナーゼを活性化しないについても同様であり、Aktセリン/スレオニンキナーゼの活性化が全く観察されない場合の他、オリジナルのPC12細胞と比較してAktセリン/スレオニンキナーゼの活性化が極めて弱く、活性化は実質的に起こっていないと判断される場合も含む。好ましくは、ホスホイノシチド-3キナーゼのp85調節サブユニットβをコードする遺伝子に変異が導入されている。好ましくは、前記変異が、配列番号2で表されるアミノ酸配列における660番目に相当する位置のリジンを欠失又は他のアミノ酸に置換するものである。ここで配列番号2で表されるアミノ酸配列における660番目に相当する位置のリジンは、実際のN末端からちょうど660番目の位置にあるとは限らない。例えば、配列番号2で表されるアミノ酸配列の一部にアミノ酸の欠失又は挿入があるp85βの場合には、当該リジンの位置は、N末端から661番目以上又は659番目以下の位置になり得る。また本発明においては、変異前のp85βが、配列番号2と完全一致するアミノ酸配列を有するものである必要もない。好ましくは、他のアミノ酸がアルギニンである。本発明の他の様相は、Aktセリン/スレオニンキナーゼを活性化しない変異ホスホイノシチド-3キナーゼをコードする、単離された遺伝子である。好ましくは、前記変異ホスホイノシチド-3キナーゼが、以下i~iiiのいずれかである。i配列番号4で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、ii配列番号4で表されるアミノ酸配列において、1~10個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつAktセリン/スレオニンキナーゼを活性化しない変異ホスホイノシチド-3キナーゼの活性を有する蛋白質、iii配列番号4で表されるアミノ酸配列と80以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつAktセリン/スレオニンキナーゼを活性化しない変異ホスホイノシチド-3キナーゼの活性を有する蛋白質。好ましくは、以下のiv又はvの核酸である。iv配列番号3で表される塩基配列からなる核酸、v配列番号3で表される塩基配列からなる核酸と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつAktセリン/スレオニンキナーゼを活性化しない変異ホスホイノシチド-3キナーゼの活性を有する蛋白質をコードする核酸。本発明の他の様相は、上記の遺伝子によってコードされる、単離された変異ホスホイノシチド-3キナーゼである。本発明の細胞の作出方法によれば、細胞医療や再生医療等に有用な新規細胞を作出することができる。本発明の細胞についても同様であり、細胞医療や再生医療等に有用な新規細胞を提供することができる。本発明の改変PC12細胞によれば、新しい作用機序からなる新規医薬のスクリーニング等を行うことができる。さらに、本発明の改変PC12細胞の機能解析を詳細に行うことにより、先端医療等に応用可能な新たな技術開発を可能にする知見を得ることができる。本発明の遺伝子によれば、細胞医療や再生医療等に有用な新規細胞を作出することができる。本発明の変異ホスホイノシチド-3キナーゼは、新規医薬のスクリーニングや、改変PC12細胞の機能解析に有用である。以下、本発明の実施するための形態について具体例を挙げながら説明する。なお、以下の記述において、オリジナルのPC12細胞非特許文献1を、正常型PC12細胞又は単にPC12細胞を呼ぶことがある。さらに、本発明の改変PC12細胞を、単に改変PC12細胞又は変異PC12細胞と呼ぶことがある。本発明の改変PC12細胞は、下記a及びbの性質:a神経成長因子を作用させても神経分化が誘導されない、b神経成長因子を作用させてもAktセリン/スレオニンキナーゼを活性化しない、変異ホスホイノシチド-3キナーゼを発現する、を有するものである。ホスホイノシチド-3キナーゼPI3Kは、イノシトールリン脂質のイノシトール環3位のヒドロキシル基をリン酸化する酵素である。細胞膜の構成成分の1つであるイノシトールリン脂質は、PI3K等のキナーゼの作用によってリン酸化され、Aktセリン/スレオニンキナーゼを活性化するPI3K-Akt経路。すなわち、PI3KはAktを活性化する作用を有する。PI3Kはp110触媒サブユニットα、β、δとp85調節サブユニットα、βから構成されている。p85調節サブユニットのうち、αサブユニットについてはこれまでに詳細な研究がなされているが、βサブユニット以下、p85βと略記することがあるについては不明な点が多い。PC12細胞にNGFを作用させると、その受容体であるTrkに作用し、結果的にPI3Kが活性化され、Aktが活性化される。そして、本発明の改変PC12細胞は、NGFを作用させてもAktを活性化しない、変異PI3Kを発現するものである。さらに本発明の改変PC12細胞は、NGFを作用させても神経分化が誘導されない特性を有する。本発明の改変PC12細胞を製造する方法としては、例えば、オリジナルのPC12細胞に対して、PI3Kのp85β遺伝子に変異を導入する方法が挙げられる。なお、オリジナルのPC12細胞は広く市販されており、例えば、AmericantypeculturecollectionATCCから入手できる。配列番号1にオリジナルのPC12細胞におけるp85β遺伝子cDNAの塩基配列及びそれに対応するアミノ酸配列を、配列番号2にアミノ酸配列のみを、それぞれ示す。本発明の改変PC12細胞を作製するには、例えば、配列番号2の660番目のリジンをアルギニンに置換するような変異を、オリジナルのPC12細胞に導入することが挙げられる。より具体的には、配列番号1の塩基番号1978~1980660番目のリジンに対応する3塩基のaagを、アルギニンに対応するコドンであるcgt、cgc、cga、cgg、aga、又はaggに置換する突然変異塩基置換を導入すればよい。なお、本発明において、前記変異はNGFを作用させてもAktを活性化しない変異PI3Kを発現可能にする変異であればリジンからアルギニンへの置換に限定されるものではなく、例えば、置換後のアミノ酸はアルギニン以外でもよいし、さらに、他アミノ酸への置換ではなくリジンの欠失であってもよい。p85β遺伝子に塩基置換を導入する方法としては、公知の方法をそのまま採用することができ、例えば、相同組換え、部位特異的変異導入、発現ベクター組換え変異p85β遺伝子の導入等の手法を用いて行うことができる。本発明の改変PC12細胞の培養方法としては、オリジナルのPC12細胞の培養方法をそのまま適用することができる。例えば、馬血清と牛胎児血清を含有するDME培地を用い、5CO2、37°Cの条件で培養することができる。必要に応じて、抗生物質等の他の物質を培地に添加してもよい。本発明の改変PC12細胞は、NGFを作用させてもAktを活性化しない変異PI3Kを発現するものであるが、NGF以外の成長因子等によるAkt活性化の有無は問わない。例えば後述の実施例で示すような、NGFと同じく上皮成長因子EGFや線維芽細胞成長因子FGFを作用させてもAktは活性化されず、一方、インシュリンやインシュリン様成長因子-1IGF-1を作用させるとAktが活性化される変異PC12細胞は、本発明の改変PC12細胞に含まれる。本発明の細胞の作出方法は、配列番号2で表されるアミノ酸配列正常型PC12細胞におけるp85βのアミノ酸配列における660番目に相当する位置のアミノ酸がリジンであるp85βを発現する親細胞に対して、前記リジンを欠失又は他のアミノ酸に置換させる遺伝子の変異を導入することにより、Aktを活性化しない変異PI3Kを発現する変異細胞を新たに作出するものである。変異導入の対象となる親細胞の種類としては特に限定されず、各種の細胞を採用することができる。例えば、幹細胞、繊維芽細胞、筋芽細胞、上皮細胞等を親細胞として採用することができる。幹細胞の例としては、人工多能性幹細胞iPS細胞、胚性幹細胞ES細胞、造血幹細胞、神経幹細胞等が挙げられる。もちろん正常型PC12細胞やPC12m3細胞非特許文献3も対象とすることができ、この場合には、上記した改変PC12細胞を作出することができる。遺伝子変異を導入する方法としては、上記と同じく公知の方法をそのまま採用することができ、例えば、相同組換え、部位特異的変異導入、発現ベクター組換え変異p85β遺伝子の導入等の手法を用いて行うことができる。本発明の改変PC12細胞、細胞の作出方法、及び細胞は、種々の用途に応用することができる。例えば、本発明の改変PC12細胞を用いることで、化合物の新たなスクリーニング系を構築できる可能性がある。また、NGF、EGF、FGF等の増殖因子存在下でAkt活性を抑制する化合物は制がん剤になりうるので、変異PC12細胞と同じような形質を示す物質を選抜することにより、新たな制がん剤やがんの予防薬を開発できる可能性がある。本発明の細胞の作出方法をiPS細胞に適用すると、ストレス耐性の高い高寿命の臓器を作製できる可能性がある。当該臓器は移植分野において有用である。また本発明の細胞の作出方法によって、がん化抑制型臓器に分化するより完全なiPS細胞を作製できる可能性がある。さらに、本発明の細胞の作出方法を植物細胞に適用することにより、熱や塩分に強い植物を作出でき、砂漠の緑化や環境対策に使用できる可能性がある。また本発明は、Aktセリン/スレオニンキナーゼを活性化しない変異ホスホイノシチド-3キナーゼをコードする単離された遺伝子核酸分子を提供することができる。当該遺伝子の例としては、i配列番号4で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする遺伝子が挙げられる。配列番号4は、配列番号2で表されるアミノ酸配列において、660番目のリジンがアルギニンに置換されたアミノ酸配列に相当する。さらに、当該遺伝子の例として、以下のii又はiiiの蛋白質をコードする遺伝子が挙げられる。ii配列番号4で表されるアミノ酸配列において、1~10個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつAktセリン/スレオニンキナーゼを活性化しない変異ホスホイノシチド-3キナーゼの活性を有する蛋白質、iii配列番号4で表されるアミノ酸配列と80以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつAktセリン/スレオニンキナーゼを活性化しない変異ホスホイノシチド-3キナーゼの活性を有する蛋白質。上記iiにおいて、欠失等されたアミノ酸の数は、好ましくは2~7個、より好ましくは2~5個、さらに好ましくは2~3個である。また上記iiiにおいて、アミノ酸配列の相同性は、好ましくは85以上、より好ましくは90以上、さらに好ましくは95以上である。さらに、下記iv又はvの核酸である遺伝子も、前記遺伝子の例として挙げられる。iv配列番号3で表される塩基配列からなる核酸、v配列番号3で表される塩基配列からなる核酸と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつAktセリン/スレオニンキナーゼを活性化しない変異ホスホイノシチド-3キナーゼの活性を有する蛋白質をコードする核酸。ここでストリンジェントな条件とは、0.1×SSC溶液1倍濃度のSSC溶液は、150mM塩化ナトリウム、15mMクエン酸ナトリウム、からなる、1ラウリル硫酸ナトリウムSDS、65°C、24時間の条件をいう。なお配列番号3は、配列番号1において、285番目の塩基gがaに、1979番目の塩基aがgに、それぞれ置換された塩基配列に相当する。本発明は、Aktセリン/スレオニンキナーゼを活性化しない、単離された変異ホスホイノシチド-3キナーゼを提供することができる。本発明の変異ホスホイノシチド-3キナーゼは、例えば、前記した本発明の遺伝子を発現させることにより、得ることができる。以下、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。1.変異PC12細胞の選抜正常型PC12細胞ATCCより入手を、10ウマ血清、5牛胎児血清、及び80μg/mLのカナマイシンを含有する高グルコース型DME培地を用いて継代し、維持した。培養は、炭酸ガス培養器にて5CO2、37°Cの条件で行った。3日毎に培地交換を行った。その後、非特許文献3に記載の手順に従ってPC12m3細胞を選抜した。25cm2のフラスコで正常型PC12細胞又はPC12m3細胞をコンフルエント状態まで培養した。このまま10~14日間、非培地交換低栄養状態で培養を続けた。大半の細胞が死滅する中、生き残った細胞について、新しい培地と交換して1~2週間培養し、コロニーを単離した。各コロニーに対してNGFによるAkt活性と熱によるサバイバルを指標としたリングアイソレーション法を行い、目的の変異PC12細胞をクローニングした。2.変異PC12細胞の解析1遺伝子の変異部位の特定正常型PC12細胞、PC12m3細胞非特許文献3、及び変異PC12細胞について、p85βの塩基配列を決定し、比較した。配列番号3に変異PC12細胞のp85β遺伝子の塩基配列及びそれに対応するアミノ酸配列を、配列番号4にアミノ酸配列のみを、それぞれ示す。すなわち、配列番号1正常型PC12細胞のp85β遺伝子の塩基配列と配列番号3との比較から分かるように、変異PC12細胞では、285番目の塩基についてg→a以下、変異Aと称する、1979番目の塩基についてa→g以下、変異Bと称するの計2箇所の点変異が導入されていた。このうち、変異Aはコドンccg→ccaの置換であり、アミノ酸95番目のProを置換するものではなかった。一方、変異Bはコドンaag→aggの置換であり、660番目のアミノ酸をリジンからアルギニンに置換するものであった。また、PC12m3細胞のp85β遺伝子の塩基配列は、配列番号1に対して変異Aのみが起こったものであり、アミノ酸配列は正常型PC12細胞のものと同じであった。換言すれば、変異BはPC12m3細胞のp85β遺伝子には起こっておらず、変異PC12細胞にのみ起こっていた。以上より、変異Bは変異PC12細胞特異的な突然変異であることが示された。なお、p85αp85調節サブユニットα遺伝子の塩基配列を比較したところ、PC12m3細胞と変異PC12細胞に、ラット正常細胞と異なる複数の変異が導入されていた。しかし、当該変異部位は全てPC12m3細胞と変異PC12細胞とで共通しており、両者に違いはなかった。2NGFによる神経分化の誘導の有無正常型PC12細胞陽性対照、PC12m3細胞、変異PC12細胞について、細胞100万個を25cm2のフラスコに蒔き、精製されたNGF1μLを作用させて1週間培養した。その結果、正常型PC12細胞では神経分化は誘導されたが、PC12m3細胞と変異PC12細胞ではいずれも神経分化が誘導されなかった。3PI3KによるAktの活性化の有無正常型PC12細胞、PC12m3細胞、及び変異PC12細胞について、PI3KによるAkt活性化の有無を以下の手順で調べた。まず、培養した各細胞100万個を25cm2のフラスコに蒔き、5日間培養した。その後、無血清下で、NGF、FGF、インシュリン、若しくはIGF-1による処理30分、又は熱処理44°C、30分を行い、リン酸化したAktホスホAktの検出を行った。検出はウエスタンブロット法によった。すなわち、細胞から全蛋白質を抽出し、8ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分画した後、ポリビニルメンブレンにブロットした。抗ホスホAkt抗体NEB社と標識2次抗体を用いて、メンブレン上のホスホAktを検出した。図1a~dに結果を示す。図中、は処理あり、-は処理なしを示す後述の図2~4についても同じ。図1aに示すように、インシュリンによる処理では、PC12m3細胞と変異PC12細胞のいずれにもホスホAktが検出され、両者に差異は見られなかった。一方、NGFによる処理では、PC12m3細胞のみにホスホAktが検出され、変異PC12細胞ではホスホAktが検出されなかった。これは、変異PC12細胞においてはPI3K特にp85βに変異が起こっており、Aktを活性化することができなかったことを示している。なおインシュリン処理では変異PC12細胞にもホスホAktが検出されたが、これは、インシュリンがTrkに作用したときにドッキング蛋白質であるIRS-1がリン酸化し、それにPI3Kがドッキングするが、IRS-1のリン酸化部位が非常に多いために、PI3Kの変異が大きな影響を及ぼさなかったためと考えられる。以上より、変異PC12細胞は、NGFを作用させてもAktを活性化しない変異PI3Kを発現していることが明らかとなった。なお、正常型PC12細胞は、インシュリンを作用させるとAktを活性化しPC12m3細胞、変異PC12細胞と同じ、NGFを作用させるとAktを活性化したPC12m3細胞と同じ。図1bに示すように、EGFによる処理では、NGFによる処理と同様に、PC12m3細胞のみにホスホAktが検出され、変異PC12細胞ではホスホAktが検出されなかった。これは、NGFとEGFではTrkが同じ構造をしているが、インシュリンのTrkとは異なっていることによると考えられる。なお、正常型PC12細胞は、EGFを作用させるとAktを活性化したPC12m3細胞と同じ。図1cに示すように、IGF-1による処理では、インシュリンによる処理と同様に、PC12m3細胞と変異PC12細胞のいずれにもホスホAktが検出され、両者に差異は見られなかった。一方、FGFによる処理では、NGFやEGFによる処理と同様に、PC12m3細胞のみにホスホAktが検出され、変異PC12細胞ではホスホAktが検出されなかった。なお、インシュリン、IGF-1、FGFによる処理において、ホスホErk-1とホスホErk-2の発現についてはPC12m3細胞と変異PC12細胞との間に相違はなかった。なお、正常型PC12細胞は、IGF-1を作用させるとAktを活性化しPC12m3細胞、変異PC12細胞と同じ、FGFを作用させるとAktを活性化したPC12m3細胞と同じ。図1dに示すように、熱処理では、PC12m3細胞と変異PC12細胞のいずれにもホスホAktが検出され、両者に差異は見られなかった。ただし、血清増殖因子を含むものの存在下では、変異PC12細胞の方がPC12m3細胞よりもホスホAktの発現量がやや高かった。なお、正常型PC12細胞における、血清存在下の熱処理によるAkt活性化レベルは低かったPC12m3細胞と同じレベル。4変異p85β遺伝子を導入することによる新規細胞の作出変異p85β遺伝子のm-RNAから作製したPCR産物をTOPOPCRクローニングベクターTOPOPCRXLTOPO、インビトロジェン社に組み込み、増幅した。増幅産物をEcoRIで切断後、発現ベクターpcDNA3.1インビトロジェン社のEcoR1サイトに組み込んだ。正方向に組み込まれたものを増幅して、以下の遺伝子導入に使用した。正常型PC12細胞又はPC12m3細胞200万個を25cm2のフラスコに蒔き、5日間培養した。2.5mLのDMEMで培地交換を行い、直ちに変異p85β遺伝子の導入を行った。遺伝子導入は、遺伝子導入試薬TransITTKOMirus社を使用して行った。具体的には、無血清のDMEM培地500μLにTransITTKO試薬20μLを加えて10分間放置後、発現ベクターに組み込んだ変異p85βDNA10μL10μgを加えた。10分間放置後、全量530μLを細胞に与え、2日間の発現期間を経て1:4の希釈で継代培養を行った。培地にはGIBCO社のGENETICINネオマイシンを300μg添加した。2週間培養を行い、遺伝子導入細胞の選択を行った。培地交換は5日毎に行った。遺伝子が組み込まれたコロニーについて、2週間後にリングアイソレーション法を用いて20~30個クローニングし、細胞の増幅後、変異細胞と同じ形質を示すかどうかの分析温熱によるサバイバル実験、及び、NGF、インスリンによるAkt活性を行い、変異の確認を行った。これにより、配列番号2で表されるアミノ酸配列の660番目の位置に相当するリジンをアルギニンに置換する変異がp85β遺伝子に導入された、組換え型の変異PC12細胞以下、組換えPC12細胞と称するが作製された。5組換えPC12細胞におけるNGFの影響上記3と同様にして、組換えPC12細胞2クローンにおけるNGF処理の影響を調べた。図2に結果を示す。図中、p85m-1とp85m-2はいずれもクローン名である。すなわち、組換えPC12細胞では変異PC12細胞と同様に、NGF処理によってAktは活性化されなかった。なお、ベクターのみ導入したPC12m3細胞陰性対照は、PC12m3細胞と同様にNGF処理によってAktが活性化された。以上より、PC12m3細胞親細胞のp85β遺伝子に変異を導入することにより、上記変異PC12細胞と同じ特性を有する新規細胞を作出できることが示された。6Foxo蛋白質の活性化の有無寿命の延長に関係する蛋白質であるFoxo蛋白質の活性化の有無について、抗ホスホFoxo抗体サンタクルズ社を用いたウエスタンブロット法により解析した。図3に結果を示す。すなわち、インシュリンによる処理では、PC12m3細胞と変異PC12細胞のいずれにもホスホFoxoが同程度に検出され、両者に差異は見られなかった。一方、NGFによる処理では、変異PC12細胞におけるホスホAkt発現量が大きく低下していた。この結果は、p85βの変異が寿命の延長に働くことを示唆している。7免疫沈降法によるp85調節αサブユニットp85αとドッキング蛋白質の結合評価免疫沈降法により、PC12m3細胞と変異PC12細胞について、p85αと、IRS-1インシュリンによって活性化するドッキング蛋白質又はGab-1NGFによって活性化するドッキング蛋白質との結合性を評価した。図4に結果を示す。すなわち、インシュリンによる処理では、PC12m3細胞と変異PC12細胞のいずれの場合でも、p85αとIRS-1が結合した。一方、NGFによる処理では、PC12m3細胞の場合はp85αとGab-1が結合したが、変異PC12細胞の場合はp85αとGab-1の結合は見られなかった。この結果は、変異PC12細胞がインシュリンには作用するが、NGFではチロシンカイネースが活性化するがGab-1を介したp85αの活性化がないためにPI3Kが働かないことを示している。8熱抵抗性の評価PC12m3細胞と変異PC12細胞について、44°Cの熱処理を20分、30分、40分、50分間加えた後の生存曲線を作成した。結果を図5aに示す。図中、○はPC12m3細胞、●は変異PC12細胞の場合を示す。すなわち、変異PC12細胞の方が約4倍の熱抵抗性を示した。また、PC12m3細胞と組換えPC12細胞について、45°Cの熱処理を10分、20分、30分間加えた後の生存曲線を作成した。結果を図5bに示す。図中、○はPC12m3細胞、●は組換えPC12細胞の場合を示す。すなわち、組換えPC12細胞の方が約6倍の熱抵抗性を示した。以上より、変異PC12細胞と組換えPC12細胞は、いずれもPC12m3細胞よりも高い熱抵抗性を有していることが示された。9標識付加した変異p85β遺伝子を導入することによる新規細胞の作出ラット変異p85β遺伝子配列番号3が導入されたpcDNA3.1-ベクターインビトロジェン社を鋳型とし、PI3KF1-18プライマー配列番号5とPI3K-R2169-2152プライマー配列番号6をプライマー対とし、KODpluspolymeraseを用いてPCRを行った。これにより、5’側にFLAG配列が導入された変異p85β遺伝子FLAG標識変異p85β遺伝子を含むDNA断片が得られた。当該DNA断片は、5’末端から3’末端に向かって、EcoRIサイト、kozak配列、開始コドンATG、FLAG配列、変異p85β遺伝子、HindIIIサイトがこの順番に並んだ構造を有している。得られたDNA断片をEcoRIとHindIIIで処理し、同じ制限酵素で処理したpcDNA3.1-ベクターにクローニングした。ワンパスシークエンス解析によりクローニングされた領域の塩基配列を決定し、所望の配列と一致していること確認した。NucleoBondXtraMaxiEFMACHEREYNAGEL社製を用いて、このプラスミドDNAのMaxi精製を行った。ラット正常p85β遺伝子配列番号1についても、同様の方法でFLAG配列を付加しFLAG標識正常p85β遺伝子、プラスミドDNAを精製した。上記4と同様にして、PC12m3細胞に、FLAG標識変異p85β遺伝子あるいはFLAG標識正常p85β遺伝子を導入した。得られた多数のクローンについて、抗FLAG抗体FLAGDDDDK抗体を用いたウエスタンブロットを行い、遺伝子導入の有無を確認した。これにより、FLAG標識変異p85β遺伝子が導入された変異PC12細胞以下、組換えPC12細胞FLAG導入と称する。と、FLAG標識正常p85β遺伝子が導入されたPC12細胞以下、正常PC12細胞FLAG導入と称する。が得られた。上記5と同様にして、組換えPC12細胞FLAG導入におけるNGF処理の影響を調べた。その結果、変異PC12細胞と同様に、Aktは活性化されなかった。なお、正常PC12細胞FLAG導入では、正常PC12細胞と同様に、Aktが活性化された。上記8と同様にして、組換えPC12細胞FLAG導入における熱抵抗性を調べた。その結果、組換えPC12細胞と同様の高い熱抵抗性が得られた。なお、正常PC12細胞FLAG導入は、正常PC12細胞と同程度の熱抵抗性しか示さなかった。上記7と同様の免疫沈降法により、FLAG標識変異p85βとFLAG標識正常p85βについて、TrkAへの結合様式の違いを調べた。まず、図6に示すように、インスリン処理によるパルスアンドチェイス実験を行ったところ、組換えPC12細胞FLAG導入における、インスリンレセプターへのp85αの結合様式は正常であった。一方、図7に示すように、NGF処理によるパルスアンドチェイス実験を行ったところ、FLAG標識変異p85βは、FLAG標識正常p85βと比べてTrkAに長時間結合し、PI3KのPIへの移行を阻害していることが分かった。このことが、変異p85β遺伝子を持つPC12細胞がNGFに反応できない理由と考えられた。