"ヒドロキシエチル澱粉を試料に加えて加熱してえる、リムルステストによるエンドトキシン測定用試料の作成法。試料が血液である、請求項1に記載のリムルステストによるエンドトキシン測定用試料の作成法。血液などの試料にヒドロキシエチル澱粉を加えて室温に静置して赤血球を沈殿除去してえた、ヒドロキシエチル澱粉と白血球と血漿を含む、請求項1および2に記載のエンドトキシン測定用試料の作成法。試料に加えるヒドロキシエチル澱粉の最終濃度が0.01から10であり、好ましくは0.01から6である、請求項1~3のいずれかに記載のエンドトキシン測定用試料作成法。ヒドロキシエチル澱粉を含む試料の好ましい加熱温度が70°Cから90°Cで、好ましくは10分ないし20分である、請求項1~4のいずれかに記載のエンドトキシン測定用試料の作成法。白血球と血漿を含む試料の希釈の程度は3倍から20倍である、請求項1~5のいずれかに記載のエンドトキシン測定用試料の作成法。ヒドロキシエチル澱粉を含む白血球と血漿の希釈加熱の操作が、これらの試料に含まれるリムルステストの干渉因子を除去する希釈加熱操作とを兼ねることができる、請求項1~6のいずれかに記載のエンドトキシン測定用試料の作成法。ヒドロキシエチル澱粉はエンドトキシンフリーであり、カブトガニの血球成分とエンドトキシンの反応を阻害あるいは促進しない性質をもつエンドトキシン測定用試料作成用の前処理液。白血球と血漿を含み、赤血球を含まないエンドトキシン測定用試料を容易に得る技術が求められている。さらに、白血球や血漿中のエンドトキシン量は微量であり、その試料の前処理においてはエンドトキシンの失活を防止しなければならない課題がある。本発明では、エンドトキシン量を測定する試料にヒドロキシエチル澱粉溶液を加えて、ヒドロキシエチル澱粉の共存下でこれを加熱してエンドトキシン測定用試料とする。血液にヒドロキシエチル澱粉溶液を加えて室温にて静置するとよく知られているように白血球と血漿を得ることができるが、白血球を用いた実験をするときは遠心洗浄操作によってヒドロキシエチル澱粉を除去して用いるのが通常であるが、本発明ではヒドロキシエチル澱粉を共存した白血球と血漿すなわち多白血球血漿を希釈してから加熱してエンドトキシン測定用試料とする。この操作は、血漿のエンドトキシンをリムルステストで測定する場合の前処理ステップである希釈加熱法を兼ねることが出来る。ヒドロキシエチル澱粉を所定濃度含む試料を直接あるいは適宜希釈した後、これを加熱処理することにより、エンドトキシンの持つリムルス活性の回収率を向上させる効果がもたらされる。血液にヒドロキシエチル澱粉を加えることにより遠心分離操作なしに容易に多白血球血漿を得ることが出来、引き続きの操作である前処理ステップすなわち希釈と加熱は試料中の干渉因子の除去方法であると同時にエンドトキシンの回収率の向上効果も兼ねることが出来、血液から容易にかつ極めて短時間にエンドトキシン測定用試料が得られる。本発明は、ヒドロキシエチル澱粉を試料に加えた後に加熱処理することを特徴とするエンドトキシン測定用試料の前処理方法、並びにヒドロキチエチル澱粉はエンドトキシンフリーであり且つカブトガニ血球抽出液とエンドトキシンとの反応を阻害又は促進しない性質を有することを特徴とするエンドトキシン測定用試料の前処理液、の発明である。ヒドロキシエチル澱粉の分子量は血漿代用剤として用いられる高分子量のもの平均670kD,中分子量のもの平均分子量130~250kD、低分子量のもの平均分子分子量70kDがあるが、赤血球凝集能があれば分子量については特に問わない。血液には抗凝固剤を加えるが、リムルステストに適した一般的な抗凝固剤が用いられる。例えばヘパリンをリムルステストに影響を与えない濃度で加えてもよい。この場合、ヘパリンの終濃度は10~100units/mLにすることが好ましい。ヒドロキシエチル澱粉の濃度は0.01~6が望ましいが特にこの濃度に限定されない。一般的に6のヒドロキシエチル澱粉水溶液と等量の血液を混合して軽く混和して室温に静置する。ヒドロキシエチル澱粉粉末に血液を加えて当該濃度としてもよい。室温とは10°Cから25°C程度をいうがこれにこだわらない。また静置する時間は赤血球が沈降するまでの時間であり、静置する温度に影響されるので5分から30分程度である。いずれの方法においても沈降した赤血球層より上の層を回収する。多白血球血漿の希釈は、血漿の前処理ステップに含まれる希釈操作と同様に、次の加熱操作で試料の加熱による凝固を起こさないためにあらかじめ水で希釈する操作であるが、その希釈の程度は3倍から20倍が適当であるが、希釈することによりエンドトキシン濃度が低下して測定感度以下になることがなければそれ以上の希釈を行ってもかまわない。加熱時間は5分から15分、加熱温度は60°Cから100°C程度が望ましい。加熱処理は前処理ステップを兼ねる場合は干渉因子の除去とエンドトキシンの回収率を向上させる目的で行うが、さらに白血球の破壊の操作を兼ねても良い。また、この加熱処理の条件で、試料中のリムルステストの干渉因子を除去出来なかった場合には、新たにその目的のために加熱をしたり、他の方法で干渉因子を除去しても良い。白血球の破壊が加熱によって十分に行われないときは別の方法で白血球を破壊する操作を加えても良い。試料が血液由来の場合、この水での希釈と加熱の処理により白血球が破壊され、細胞内部のエンドトキシンが露出され測定が可能になるが、加熱前や後に白血球を破壊する操作を付け加えてもかまわない。その方法としては、超音波破壊方法によるもの、物理的破砕方法によるもの、凍結融解方法によるもの等があるが、エンドトキシンが破壊されず白血球を十分に破壊できる方法であれば、これらの方法に限られない。加熱法は試料が十分に加熱されるのであれば加熱方法は問わない。例えば容器ごと恒温槽に入れて加熱してもよい。恒温槽は、ウォーターバスであってもよいし、ヒートブロックであってもよい。また、エアインキュベーターであってもよい。試料は、加熱後に室温放置して放冷してもよいが氷冷等によって冷却してもよい。超音波破壊方法は、前記試料に超音波を加えることによって、超音波の振動で白血球の細胞膜を破壊し、細胞内容物を溶出させる方法である。超音波処理は超音波細胞破砕機ソニケーター等の装置を用いて行ってもよい。当該方法における超音波の強さは、白血球の細胞膜を破壊できるが、エンドトキシンを破壊しない範囲であればよく、血液の分量や超音波の発振出力、発信時間によって適宜調節すればよい。物理的破砕方法は、前記試料に物理的な外力を加えて、白血球を破壊する方法である。物理的破砕処理は、ホモジナイザー等の装置を用いてもよい。当該方法における外力の強さは、白血球の細胞膜を破壊できるが、エンドトキシンを破壊しない範囲であればよい。凍結融解方法は、前記試料を液体窒素中やドライアイス中で急速凍結した後に温湯等で融解する操作を行うことによって血液中の白血球を破壊する方法である。急速凍結による細胞内水分の結晶化による体積膨張と、その後の結晶融解によって細胞膜を破壊する原理に基づくものである。凍結融解の操作は、前記成分血液中の白血球が十分に破壊されるまで複数回繰り返してもよい。リムルステストの方法としては、一般に行われている方法例えば、ゲル化法、発色法、比濁法、エンドトキシン光散乱法などであれば特に限定されない。また、この際に用いるカブトガニ血球抽出液は、通常のエンドトキシンの測定に使用できるもの、例えば和光純薬工業社、生化学バイオビジネス社製、エンドセ-フ社、ロンザ社で、リムルスLimulus属、タキプレウスTachypleusT属あるいはカルシノスコルピウスCarcinoscorpius属のカブトガニの血球から抽出されたものであれば特に限定されない。ヒドロキシエチル澱粉を含む試料を加熱する操作が、試料が血液由来の場合は干渉因子の不活化を兼ねることが出来るが、干渉因子の不活化として別の方法例えば、PCA法、NewPCA法、アルカリ処理法などを行っても差し支えない。この試料作成法は、リムルステストを用いたβ-Dーグルカンの測定にも使用しても良い。この方法は、一般に血液と呼ばれるもの以外にも、赤血球を含む生体由来の試料例えば臍帯血、骨髄細胞、体液、髄液、尿などのエンドトキシンを検出する場合に赤血球を除く目的で用いてもよい。図1参照のこと。本発明の実施に用いる器具や試薬、水等は全てエンドトキシフリーのもの、あるいはエンドトキシン測定結果に影響を及ぼさない程度の極めて微量しかエンドトキシンを含有していないものを使用することを前提とする。LPS大腸菌O111:B4由来、シグマ社製をmg/mlの濃度に燐酸緩衝生理食塩水PBSに浮遊させ、ボルテックスミキサーおよび超音波発生器の端子で十分に浮遊させて用いた。エンドトキシンフリーのチップバイオクリーンチップ;和光純薬工業社製を用いて、PBSで所定の濃度に希釈して実験に用いた。終濃度20pg/mlのLPSを生食水、またはヒドロキシエチル澱粉タカラバイオ社製、生理食塩水に溶解0.02から1.5の濃度の生理食塩溶液に含ませて、70°C、10分加熱し、氷冷後のリムルス活性を測定した。リムルス試薬としてシングルテストワコー和光純薬工業株式会社を使用しトキシノメーターMTー5500和光純薬を用いて測定した。その結果、20pg/mlのLPSのリムルス活性に対して、その回収率は生理食塩水が最も悪かったが、ヒドロキシエチル澱粉の存在下でその濃度に依存して回収率が向上した。なお、LPSをヒドロキシエチル澱粉に0.02から1.5の濃度に含ませてから、加熱せずそのままリムルス活性をしらべたところ、ヒドロキシエチル澱粉を含まない場合に比較してその値は殆ど変わらず、ヒドロキシエチル澱粉はLPSのリムルス活性を阻害あるいは促進しなかった。図2参照のこと。6ヒドロキシエチル澱粉を含む生理食塩水液を健常者血液に等量ヒドロキシエチル澱粉の最終濃度3、1/2量同2、1/3量同1.5、1/4量同1.2加えて混合し、室温で静置したところ、それぞれ約8分、11分、15分、25分で赤血球が凝集沈殿し、上澄すなわち多白血球血漿が採取できた。この多白血球血漿に終濃度20pg/mlのLPSを加えてリムルステストによりエンドトキシンを測定した。すなわち、この100μlを水900μlに加えて10倍希釈したこの場合ヒドロキシエチル澱粉の最終濃度は0.3、0.2、0.15,0.12になった。この液をヒドロキシエチル澱粉の効果を発揮させるためと、血漿中の干渉因子を不活化する二つの目的で70°C、10分ヒートブロックで加熱した。氷冷後リムルス活性を測定した。その結果、何も処理しないLPSの活性を100としたとき、ヒドロキシエチル澱粉を含まない生理食塩水に溶解し加熱したLPSで最も悪く58.7、ヒドロキシエチル澱粉を加えて採取した白血球を含む血漿ではヒドロキシエチル澱粉の濃度依存性に回収率が向上した図中の◆。なお、LPSを加えない1.2ヒドロキシエチル澱粉の場合、3ヒドロキシエチル澱粉の場合いずれもリムルス活性は測定されず、ヒドロキシエチル澱粉や実験操作中のエンドトキシン汚染はなかったことが示された▲。図3参照のこと。ヘパリンを加えて採取したヒト健常者血液にLPSを20pg/ml添加し、37°Cで4時間まで加温し、0,1,2、3,4時間後に一定量をくみ取り、以下の方法でリムルス活性を調べた。16ヒドロキシエチル澱粉と等量の血液加えて軽く混和してから15分室温に静置し、その上澄多白血球血漿を採取して、水で10倍に希釈後強く撹拌してから、70°C、10分加熱して氷冷後リムルス活性を調べた図中の▲。値を10倍して多白血球血漿のエンドトキシン量とした。2血液を卓上遠心器久保田商事社製で1,500回転10分間遠心分離し、上清すなわち血漿をえて、水で10倍に希釈後、70°C、10分加熱して氷冷後リムルス活性を調べた。値を10倍して血漿1ml当たりのエンドトキシン量とした。1、2ともLPS添加直後0のLPSのリムルス活性を100として表した。その結果、ヒドロキシ澱粉を加えて採取した多白血球血漿でのエンドトキシンの回収率が血漿でのエンドトキシンの回収率より高かった。"