"本願明細書に記載の方法。従って、オリゴヌクレオチドおよびアナログを、それらが合成される固体支持体上に直接、迅速で、経済的、かつ化学的に不安定な官能基に適合する条件下で標識化するための、方法および試薬を提供することが所望される。要旨本発明は、固体支持体上の標識化オリゴヌクレオチドの合成のための新規な方法および組成物に関する。第1の局面では、本発明は、以下の構造を有する標識化固体支持体上の標識化オリゴヌクレオチドの合成のための方法を包含し、ここでSは固体支持体であり、Aは切断可能なリンカーであり、Xは3以上の結合部位を有する部分であり、Lは標識であり、Yは求核剤すなわち、O、NH、NRまたはSそしてP1は酸で切断可能な保護基である。標識化固体支持体は、1YからP1を除去するための試薬、2Yを5’-ホスホラミダイト3’保護ヌクレオシドの5’位とカップリングさせるための試薬、3支持体上の任意の未反応部位例えば、Yを必要に応じてキャップするための試薬、および4任意のホスファイト連結を酸化するための試薬を用いて、循環様式で反応される。これらの4つの工程は、標識化されたオリゴヌクレオチド全体が合成されるまで繰り返される。合成が完了した後、標識化オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間ホスフェートおよび核酸塩基上の保護基は、このオリゴヌクレオチドを固体支持体上に残したまま脱保護によって除去され得る。あるいは、合成が完了した後、標識化オリゴヌクレオチドは、固体支持体から切断され得、次いで脱保護され得る。第2の局面では、本発明は、以下の構造を有する固体支持体に結合されるヌクレオシドを包含し、ここでS、A、X、LおよびYは、上記に規定されるとおりであり、Rはホスフェート保護基またはホスホトリエステル置換基であり;Bは核酸塩基であり;P2は環外窒素保護基であり;そしてP3は酸に不安定な保護基である。第3の局面において、本発明は、以下の構造を有する固体支持体に結合されるオリゴヌクレオチドを含み、ここで変更し得る置換基は上記で規定されるとおりであり、そしてnは好ましくは約0~100の整数である。第4の局面において、本発明は、i求電子剤に変換され得る官能基を有する標識試薬例えば、カルボン酸、スルホン酸、ホスホン酸またはリン酸を反応させる工程、ii固体支持体上のオリゴヌクレオチドを求核的官能基例えば、アルコール、アミン、またはチオールと反応させる工程、およびiiiカップリング試薬を反応させる工程であって、これによりエステル、アミド、チオエステル、スルホンアミド、スルホネート、ホスホネート、ホスホラミデート、ホスホロチオエート、またはリン酸結合が形成される工程により、標識化オリゴヌクレオチドを合成するための方法を包含する。標識化法は、標識部位5’末端、3’末端、核酸塩基、ヌクレオチド間連結、糖、アミノ、スルフィド、ヒドロキシル、およびカルボキシルを含むにおいてオリゴヌクレオチドに対して実施され得る。標識化反応は、1つ以上のDNA、RNA、PNAおよび核酸アナログモノマーユニットを含むオリゴヌクレオチドに対して行われ得る。核酸アナログは、核酸塩基、糖、および/またはヌクレオチド間アナログであり得る。標識化オリゴヌクレオチドは、5’から3’の方向、または3’から5’の方向のいずれかで合成され得る。したがって、本発明によって以下が提供される:15’標識化オリゴヌクレオチドの5’から3’への合成のための方法であって、以下:a以下の構造:を有する標識した固体支持体を提供する工程であって、ここでSは、固体支持体であり;Aは、切断可能なリンカーであり;Xは、3つ以上の結合部位を有する部分であり;Lは、標識であり;Yは、酸素、NH、NRここでRは、メチル、低級アルキル、置換アルキル、フェニル、アリールおよび置換アリールであるならびにイオウからなる群から選択され;そしてP1は、酸により切断可能な保護基である、工程b標識した固体支持体を酸と反応させ、該酸により切断可能な保護基であるP1を除去する工程;およびc5’-ホスホラミダイト、3’保護ヌクレオシドおよび活性化剤を添加し、これによりYと該ヌクレオシドの5’末端との間で結合を形成する工程、を包含する、方法。2項目1に記載の方法であって、以下:d前記固体支持体上の任意の未反応部位をキャップする工程;およびe酸化剤を添加する工程、をさらに包含する、方法。3項目1に記載の方法であって、以下:d前記固体支持体上の任意の未反応部位をキャップする工程;e酸化剤を添加する工程;およびf標識化オリゴヌクレオチドが完全に合成されるまで、前記工程bから工程eを繰り返す工程、をさらに包含する、方法。4前記標識化オリゴヌクレオチドを脱保護する工程をさらに包含する、項目3に記載の方法。5前記固体支持体から標識化合物を切断する工程および前記標識化オリゴヌクレオチドを脱保護する工程をさらに包含する、項目3に記載の方法。6前記固体支持体Sが、ポリスチレン、制御細孔ガラス、シリカゲル、シリカ、ポリアクリルアミド、磁気ビーズ、ポリアクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリアミド、ポリエチレン、ポリエチレンオキシならびにこれらのコポリマーおよびグラフトからなる群から選択される、項目1に記載の方法。7前記固体支持体Sの形態が、小さな粒子、ビーズ、膜、フリット、スライド、プレート、微細加工されたチップ、アルカンチオール-金層、非多孔質表面、アドレス可能なアレイおよびポリヌクレオチドを固定した媒体からなる群から選択される、項目1に記載の方法。8前記切断可能なリンカーAが、以下:からなる群から選択される、項目1に記載の方法。9項目1に記載の方法であって、前記リンカーXが以下:からなる群から選択され、ここでnは、1~12である、方法。10前記標識Lが、ハイブリダイゼーション-安定化部分、蛍光色素、蛍光消光剤、エネルギー移動色素のセット、化学発光色素、アミノ酸、タンパク質、ペプチド、酵素およびアフィニティーリガンドからなる群から選択される、項目1に記載の方法。11前記蛍光色素および蛍光消光剤が、FAM、TET、HEX、JOE、TAMRA、d-TAMRA、JODA、ROX、VIC、NED、dJON、dR139、DABCYL、DABSYL、マラカイトグリーン、4,7-ジクロロ-フルオレセイン、4,7-ジクロロ-ローダミン、NTBおよびシアニンからなる群から選択される、項目10に記載の方法。12前記ハイブリダイゼーション-安定化部分が、Hoechst33258、CDPI13、MGB1、ネトロプシンおよびジスタマイシンからなる群から選択される、項目10に記載の方法。13前記酸により切断可能な保護基P1が、DMT、MMT、トリチル、置換トリチル、ピキシルおよびトリアルキルシリルからなる群から選択される、項目1に記載の方法。14項目1に記載の方法であって、ここで前記5’-ホスホラミダイト、3’保護したヌクレオシドモノマーが、以下の構造:を有し、ここで、Rは、シアノエチル、メチル、低級アルキル、置換アルキル、フェニル、アリールおよび置換アリールからなる群から選択され;R1およびR2は、イソプロピル、モルホリノ、メチル、エチル、低級アルキル、シクロアルキルおよびアリールからなる群から独立して選択され;P2は、ベンゾイル、イソブチリル、アセチル、フェノキシアセチル、アリールオキシアセチル、ジメチルホルムアミジン、ジアルキルホルムアミジンおよびジアルキルアセトアミジンからなる群から選択される環外窒素保護基であり;そしてP3は、DMT、MMT、ピキシル、トリチルおよびトリアルキルシリルからなる群から選択される酸不安定な保護基である、方法。15項目3に記載の方法であって、前記オリゴヌクレオチドが、1つ以上のDNA,RNAおよび核酸アナログモノマーユニットを含む、方法。16項目15に記載の方法であって、前記核酸アナログが、核酸塩基アナログ、糖アナログ、および核酸塩基間アナログからなる群より選択される、方法。17前記核酸塩基アナログが、C-5-アルキルピリミジン、2,6-ジアミノプリン、2-チオピリミジン、C-5-プロピンピリミジン、フェノキサジン、7-デアザプリン、イソシチジン、偽イソシチジン、イソグアノシン、ヒポキサンチン、8-オキソプリンおよび普遍塩基からなる群から選択される、項目15に記載の方法。18前記糖アナログが、2’-O-アルキル-リボヌクレオチド、2’-O-メチル-リボヌクレオチド、2’-O-アリル-リボヌクレオチド、2’-アリル-リボヌクレオチド、2’-ハロ-リボヌクレオチド、2’-O-メトキシチル-リボヌクレオチド、2’-分枝基-リボヌクレオチド、2’-O-分枝基-リボヌクレオチド、4’-α-アノマーヌクレオチドおよび1’-α-アノマーヌクレオチドからなる群から選択される、項目15の方法。19前記ヌクレオチド間アナログが、2-アミノエチルグリシンPNA、2’-5’-結合、逆転3’-3’結合、逆転5’-5’結合、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、非架橋N-置換ホスホラミデート、アルキル化ホスホトリエステル分枝構造および3’-N-ホスホラミデートからなる群から選択される、項目15に記載の方法。20項目1に記載の方法であって、前記標識された固体支持体が以下の式:の化合物を含み、ここでSは、ポリスチレンまたは制御細孔ガラスであり;そしてLは、標識である、方法。21以下の式:の化合物を含む固体支持体であって、ここでSは、固体支持体であり;Aは、切断可能なリンカーであり;Xは、3つ以上の結合部位を有する部分であり;Lは、標識であり;Yは、O、NH、NRおよびSからなる群から選択され;Rは、シアノエチル、メチル、低級アルキル、置換アルキル、フェニル、アリールおよび置換アリールからなる群から選択され;P2は、ベンゾイル、イソブチリル、アセチル、フェノキシアセチル、アリールオキシアセチル、ジメチルホルムアミジン、ジアルキルホルムアミジンおよびジアルキルアセトアミジンからなる群から選択される環外窒素保護基であり;そしてP3は、DMT、MMT、トリチル、置換トリチル、ピキシルおよびトリアルキルシリルからなる群から選択される酸不安定な保護基である、固体支持体。22以下の式:の化合物を含む固体支持体であって、ここでnは、0~100の整数であり;Sは、固体支持体であり;Aは,切断可能なリンカーであり;Xは、3つ以上の結合部位を有する部分であり;Lは、標識であり;Yは、O、NH、NRおよびSからなる群から選択され;Rは、シアノエチル、メチル、低級アルキル、置換アルキル、フェニル、アリールおよび置換アリールであり;P2は、ベンゾイル、イソブチリル、アセチル、フェノキシアセチル、アリールオキシアセチル、ジメチルホルムアミジン、ジアルキルホルムアミジンおよびジアルキルアセトアミジンからなる群から選択される環外窒素保護基である、固体支持体。23標識化オリゴヌクレオチドを合成する方法であって、以下:標識試薬を官能基とカップリングする工程であって、該官能基は、カルボン酸、スルホン酸、ホスホン酸またはリン酸からなり;カップリング試薬を用いて該固体支持体に該オリゴヌクレオチドを結合する、工程を包含し、該工程により、エステル結合、アミド結合、チオエステル結合、スルホンアミド結合、スルホネート結合、ホスホネート結合、ホスホラミデート結合、ホスホロチオエート結合またはホスフェート結合が形成される、方法。24前記標識試薬が、ハイブリダイゼーション-安定化部分、蛍光色素、蛍光消光剤、エネルギー移動色素のセット、化学発光色素、アミノ酸、タンパク質、ペプチド、酵素およびアフィニティーリガンドからなる群から選択される、項目23に記載の方法。25前記蛍光色素および蛍光消光剤が、FAM、TET、HEX、JOE、TAMRA、d-TAMRA、JODA、ROX、VIC、NED、dJON、dR139、DABCYL、DABSYL、マラカイトグリーン、4,7-ジクロロ-フルオレセイン、4,7-ジクロロ-ローダミン、NTBおよびシアニンからなる群から選択される、項目24に記載の方法。26前記ハイブリダイゼーション安定化部分が、Hoechst33258、CDPI13、MGB1、ネトロプシンおよびジスタマイシンからなる群から選択される、項目23に記載の方法。27項目23に記載の方法であって、前記標識が、標識部位において前記オリゴヌクレオチドに結合され、該標識部位は、5’末端、3’末端、核酸塩基、ヌクレオチド間結合、糖、アミノ、スルフィド、ヒドロキシル、およびカルボキシルからなる、方法。28項目23に記載の方法であって、前記固体支持体が、以下の構造:を有する化合物を含み、ここでSは、固体支持体であり;Aは、切断可能なリンカーであり;Xは、3つ以上の結合部位を有する部分であり;Lは、標識であり;Yは、酸素、NH、NRここでRは、メチル、低級アルキル、置換アルキル、フェニル、アリールおよび置換アリールであるならびにイオウからなる群から選択され;そしてP1は、酸により切断可能な保護基である、方法。29前記固体支持体が、ポリスチレン、制御細孔ガラス、シリカゲル、シリカ、ポリアクリルアミド、磁気ビーズ、ポリアクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリアミド、ポリエチレン、ポリエチレンオキシおよびこれらのコポリマーまたはグラフトからなる群から選択される、項目23に記載の方法。30前記固体支持体の形態が、小さな粒子、ビーズ、膜、フリット、非多孔質表面、スライド、プレート、微細加工されたチップ、アルカンチオール-金層、アドレス可能なアレイまたはポリヌクレオチドを固定した媒体からなる群から選択される、項目29に記載の方法。31前記オリゴヌクレオチドが1つ以上のDNA、RNA、PNAおよび核酸アナログモノマーユニットを含む、項目22に記載の方法。32項目31に記載の方法であって、、前記核酸アナログが、核酸塩基アナログ、糖アナログ、および核酸塩基間アナログからなる群より選択される、方法。33前記核酸塩基アナログが、C-5-アルキルピリミジン、2,6-ジアミノプリン、2-チオピリミジン、C-5-プロピンピリミジン、フェノキサジン、7-デアザプリン、イソシチジン、偽イソシチジン、イソグアノシン、ヒポキサンチン、8-オキソプリンおよび普遍塩基からなる群から選択される、項目32に記載の方法。34前記糖アナログが、2’-O-アルキル-リボヌクレオチド、2’-O-メチル-リボヌクレオチド、2’-O-アリル-リボヌクレオチド、2’-アリルリボヌクレオチド、2’-ハロ-リボヌクレオチド、2’-O-メトキシエチル-リボヌクレオチド、2’-分枝基-リボヌクレオチド、2’-O-分枝基-リボヌクレオチド、4’-α-アノマーヌクレオチドおよび1’-α-アノマーヌクレオチドからなる群から選択される、項目32の方法。35前記ヌクレオチド間アナログが、2-アミノエチルグリシンPNA、2’-5’-結合、逆転3’-3’結合、逆転5’-5’結合、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、非架橋N-置換ホスホラミデート、アルキル化ホスホトリエステル分枝構造および3’-N-ホスホラミデートからなる群から選択される、項目32に記載の方法。36オリゴヌクレオチド合成の方向が5’から3’である、請求項23に記載の方法。37オリゴヌクレオチド合成の方向が3’から5’である、請求項23に記載の方法。好ましい実施形態の詳細な説明ここで本発明の好ましい実施形態を詳細に参照すると、これらの例は、添付の図面に図示される。本発明は、好ましい実施形態と共に記載されるが、これらは、その実施形態に本発明が限定されるということを意図されないことが理解される。対照的に、本発明は、上記の特許請求の範囲により規定される本発明の範囲内に含まれる代替物、改変物、および等価物を包含することを意図される。I.定義他に記載されないかぎり、本明細書中で使用される場合、以下の用語および句は、以下の意味を有することが意図される。用語核酸、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドモノマーまたはそれらのアナログのポリマーを意味し、それらの二重鎖および一重鎖の、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、α-アノマー形態などを含む。オリゴヌクレオチドは、1つ以上のDNA、RNAおよび核酸アナログモノマーユニットを含み得る。モノマーは、ヌクレオチド間連結ホスホジエステル結合またはそれらのホスフェートアナログを含むにより連結され、対イオン例えば、H、NH4、Naを伴う。オリゴヌクレオチドは、代表的に少数のモノマーユニット例えば、5~40から数千のモノマーユニットまでの範囲である。オリゴヌクレオチドが文字の配列例えば、ATGCCTGにより表される場合は必ず、ヌクレオチドは、5’から3’の順に、左から右であり、そして他に示されないかぎり、Aは、デオキシアデノシン、Cはデオキシシチジン、Gはデオキシグアノシン、そしてTはチミジンを示す。ヌクレオシドは、ペントースに1’位で連結したプリン核酸塩基、デアザプリン核酸塩基、またはピリミジン核酸塩基例えば、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、デアザアデニン、デアザグアノシンなどからなる化合物をいう。核酸塩基がプリンまたは7-デアザプリンである場合、ペントースはこの核酸塩基にプリンまたはデアザプリンの9位で結合され、そして核酸塩基がピリミジンである場合、ペントースは、この核酸塩基にピリミジンの1位で結合される。ヌクレオチドとは、ヌクレオシドのリン酸エステル例えば、三リン酸エステルをいい、ここで最も一般的なエステル化部位は、ペントースのC-5位に結合されるヒドロキシル基である。用語ワトソン/クリック塩基対合は、配列特異的水素結合により共に結合する、ヌクレオチドおよびそのアナログの特定の対例えば、AはTおよびUと対になり、そしてGはCと対になるのパターンをいう。用語アナログとは、モノマーヌクレオチドアナログ単位から作製され、そして核酸に関連するいくつかの性質および特性を有する核酸のアナログをいう。核酸アナログは、改変された核酸塩基部分、改変された糖部分、および/または改変されたヌクレオチド間連結を有し得るEnglisch,1991。糖およびヌクレオチド間部分が、2-アミノエチルグリシンアミド骨格ポリマーで置換された、好ましい核酸アナログのクラスは、ペプチド核酸PNAであるNielsen,1991。結合部位とは、リンカーが結合される部位をいう。リンカーとは、オリゴヌクレオチドを標識または固体支持体に接続する鎖を含む1つ以上の原子をいう。キメラとは、本明細書中で使用される場合、1つ以上のヌクレオチド単位および1つ以上のヌクレオチドアナログ単位を含むオリゴヌクレオチドをいう。低級アルキル、低級アルキレンおよび低級置換アルキレンとは、1~12個の炭素原子からなる直鎖、分枝、または環式の基をいう。標識とは、オリゴヌクレオチドに共有結合で結合される部分をいう。好ましい標識のクラスは、検出のためのシグナル例えば、蛍光、化学ルミネセンス、および電気化学ルミネセンスを生じるKricka,1992。別の好ましい標識のクラスは、ハイブリダイゼーションを強化するか、安定化するか、または影響を及ぼすように作用する例えば、インターカレーター、小溝バインダーminor-groovebinder、および架橋官能基Blackburn,1996。検出標識としては、蛍光色素例えば、フルオレセインおよびローダミン誘導体、シアニン色素Kubista,1997、化学ルミネセンス色素Bronstein,1990;Bronstein,1994およびエネルギー移動色素Clegg,1992;Cardullo,1988が挙げられるが、これらに限定されない。なお別の好ましい標識のクラスは、特異的または非特異的捕獲手段によって分子の分離または固定化をもたらすように作用するAndrus,1995。検出とは、標識の特性に基づいてオリゴヌクレオチドを検出すること、観察すること、または測定することをいう。カップリング試薬は、固体支持体上の求核性オリゴヌクレオチドと標識との間に、エステル結合、アミド結合、チオエステル結合、スルホンアミド結合、スルホネート結合、ホスホネート結合、ホスホラミデート結合、ホスホロチオエート結合、またはホスフェート結合を形成し得る任意の試薬、活性化剤、または添加剤を含む。II.標識化支持体本発明の1つの局面は、標識化オリゴヌクレオチドの合成のための支持体を含む。本発明のこの局面にしたがった標識化支持体は、以下の構造:を有し、ここでSは一般にオリゴヌクレオチド合成に有用な固体支持体材料をいい、Aは切断可能なリンカーであり、Xは3以上の結合部位を有する部分であり、Lは標識であり、Yは求核剤すなわち、O、NH、NRまたはSであり、そしてP1は、酸で切断可能な保護基である。固体支持体は、モノマーユニットの連続的な結合のための不溶性媒質を提供する。不均一合成法の有意な利点は、液相中の過剰の試薬が、濾過により容易に除去され得、それにより各反応のまたは各サイクルの間の精製工程の必要性を排除することである。固体支持体の特徴例えば、細孔サイズ、架橋含有量cross-linkcontent、膨潤、粒子サイズ、および表面積は、迅速な動態および高収率反応を生じるために、試薬の効率的な拡散を可能にするように最適化されるべきである。好ましい支持体材料としては、高架橋非膨潤ポリスチレンAndrus,1993、制御細孔ガラスCaruthers,1984、シリカ、シリカゲル、ポリアクリルアミド、磁気ビーズStamm,1995、ポリアクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリアミド,ポリエチレン,ポリエチレンオキシ、およびこのような物質のグラフトまたはコポリマーが挙げられる。固体支持体の物理的構成としては、小粒子、ビーズ、膜、フリット、非多孔性表面、スライド、プレート、ミクロ機械加工チップ、アルカンチオール-金層、アドレス可能アレイ、ベクター、プラスミド、またはポリヌクレオチド-固定化媒質が挙げられるFodor,1995。いくつかの実施形態では、例えば、ウエル、隆起した領域、窪み、ピン、溝、ロッド、円筒の内壁または外壁などを伴った、支持体上で物理的に隔てられた合成領域のアレイを作製することが望ましい。切断可能なリンカーAは、以下のような任意の官能基を含み得る:i塩基性試薬により切断されるエステルおよび他の塩基に不安定なリンカー、iiフッ化物イオンのような求核剤により切断されるシリルエーテル、またはiiiジスルフィド基およびジチオトレイトールDTTのような試薬を用いて酸化/還元条件下で切断される他の基。リンカーAの上記の例において切断される結合は、以下に矢印で示される。部分Xは、リンカーA、標識L、およびオリゴヌクレオチドを介する固体支持体の結合のための結合部位を含む任意の基であり得る。標識Lは、オリゴヌクレオチドに共有結合で結合される任意の基または部分である。標識は、ハイブリダイゼーション安定化部分例えば、小溝バインダー、インターカレーター、および架橋剤、蛍光色素、蛍光消光剤、エネルギー移動色素セット、化学ルミネセンス色素、アミノ酸、タンパク質、ペプチド,酵素、および親和性リガンドを含み得る。Yは、炭素と比較して求核性の基例えば、O、NH、NR、およびSであり、そしてXをオリゴヌクレオチドに結合する。Yは、酸で切断可能な保護基P1を有し、DMT、MMT、トリチル、置換トリチル、ピクシルpixyl、またはトリアルキルシリルであり得る。この保護基P1は、オリゴヌクレオチド合成を開始するために求核剤Yから除去される。III.標識化支持体の合成固体支持体Sは、リンカー単位A-X-Yが連結される反応性官能基を用いて誘導体化される。好ましくは、反応性官能基は、好ましくは1グラムにつき5~100個のNH2を添加された1級アミノ基である。次いで、リンカー単位またはスペーサーA-X-Yは、固体支持体の反応性官能基に共有結合で結合される。A-X-Y上の第2の連結部位は、標識に結合する。A-X-Y上の第3の連結部位は、オリゴヌクレオチド鎖の合成を可能にする。代表的にAは、塩基性条件下例えば、水酸化アンモニウムで切断可能なエステル基を含み、オリゴヌクレオチド、およびこのオリゴヌクレオチドに結合される任意の標識からの固体支持体の分離を可能にする。以下のiまたはiiようにリンカーユニットA-X-Yは、固体支持体に結合され得る:iラベルLを有する1ユニット、またはiiラベルLを有さない1ユニットここで、ラベルLは、次いで、以下の反応:によってリンカーXに結合する。図2は、標識化支持体への例示的ルートiiを示し、ここで、このリンカー1X-Y-P1を、2A-X-Y-P1に変換し、そしてアミノメチル高度に架橋されたポリスチレン3に結合する。得られた生成物4を、5へと脱保護する。予め活性化されたラベル例えば、TAMRA-NHS5-カルボキシテトラメチルローダミンのN-ヒドロキシスクシンイミドエステルを、5に共有結合させ、オリゴヌクレオチドの合成のために用意した、標識化支持体6を得る。標識化固体支持体の好ましい群は、構造6として示される図2および以下。ここで、Sは、高度に架橋されたポリスチレンであるか、または制御細孔ガラスであり、Aは、以下:であり、Xは、以下:であり、Lは、小溝バインダーminor-groovebinderシアニン、蛍光色素、またはエネルギー移動色素のセットであり、Yは、酸素であり、そしてP1は、DMTである。6のX中の不斉炭素を、標識化オリゴヌクレオチドのジアステレオ異性体に導く。これらの特定の異性体は、HPLCまたはキャピラリー電気泳動による分析の間に、個々のピークに分割しないとう利点を有する。ラベルをオリゴヌクレオチドに結合するための他のジアステレオマーリンカーは、分析において2重のピークとして例示される、ジアステレオマー分解を示し得るMullah,1998;Woo,1996。6から調製された標識化オリゴヌクレオチドが、DNA配列Lee,1997、DNAフラグメント分析Grossman,1994およびPCRLivak,1996のようなプライマー伸長実験において使用される場合、フラグメントおよび増幅生成物が、データ分析を妨害するジアステレオマー群populationに分割しないことによる同様な利点がある。IV.5’から3’方向での標識化支持体上での標識化オリゴヌクレオチドの合成一般に、本発明の方法および組成物は、効率がよくかつ迅速なカップリングおよび出発ヌクレオチドモノマーの安定性のために好ましい、ホスホラミダイト合成法を利用するCaruthers,1983;Beaucage,1983;Beaucage,1992。ホスホラミダイト法は、固体支持体上で、最も一般的には、3’から5’方向へ3’末端ヌクレオチドは、合成の開始時点で固体支持体に結合されている、ヌクレオチドモノマーユニットのオリゴヌクレオチド成長鎖への周期的添加cyclicaladditionを必要とする。この方法は,通常オートメーション化した市販の合成機を利用して実施されるPEBiosystems,Caruthers,1984。本発明の5’から3’方向への実施形態では、以下の構造7:を有する5’ホスホラミダイト,3’保護ヌクレオシドモノマーWagner,1997を、周期的に添加し、ここで、Rは、保護基または置換基例えば、シアノエチル、メチル、低級アルキル、置換アルキル、フェニル、アリール、および置換アリールであり;R1およびR2は、アミン置換基例えば、イソプロピル、モルホリノ、メチル、エチル、低級アルキル、シクロアルキル、およびアリールであり;P2は、環外窒素保護基例えば、ベンゾイル、イソブチリル、アセチル、フェノキシアセチル、アリールオキシアセチル、ジメチルホルムアミジン、ジアルキルホルムアミジンおよびジアルキルアセトアミジンであり;ならびにP3は、酸ラベル保護基例えば、DMT、MMT、ピキシルpixyl、トリチル、およびトリアルキルシリルである。固体支持体に結合した5’末端および遊離の結合していない3’末端を有するオリゴヌクレオチドが、合成される。以下では、本発明おけるホスホラミダイト法を使用して、合成サイクルの工程を簡潔に記載する。第一に、固体支持体例えば、6は、プロトン酸proticacid例えば、トリクロロ酢酸またはジクロロ酢酸を用いて処理し、続くカップリング反応のために求核性例えば、ヒドロキシル基を有さない酸ラベル保護基例えば、DMTを除去する。次いで、活性化中間体は、5’-ホスホラミダイト,3-保護ヌクレオシドモノマー7および弱酸例えば、テトラゾールなどを、合成機の反応容器合成カラムに同時に添加することによって形成される。ヌクレオシドの付加は、典型的に、30~300秒、好ましくは、約90秒内で完了する。次に、カップリング工程を実施し、この工程は、3’ヒドロキシル基のアシル化によるヌクレオシドの付加を受けない任意のオリゴヌクレオチド鎖で終結する。カップリングは、好ましくは、無水酢酸および1-メチルイミダゾールを用いて実施されるが、他のアシル化剤を使用してもよい。次いで、ヌクレオチド間の結合を、好ましい酸化剤としてヨウ素および酸素供与体として水を使用する酸化によって、ホスファイトphosphiteからより安定なホスホトリエステルに変換し、以下の構造:を得る。あるいは、ヌクレオチド間のホスファイトを酸化して、例えばホスホロチオエートphosphorothioateまたはホスホラミダートphosphoramidateのようなヌクレオチド間アナログにし得る。酸化の後に、次の3’ヒドロキシル保護基例えば、DMTを、プロトン酸例えば、トリクロロ酢酸またはジクロロ酢酸を用いて除去し、そしてこのサイクルを鎖の伸長が完了するまで繰り返す図1。V.固体支持体上でのオリゴヌクレオチドの合成後の標識化標識は、オリゴヌクレオチドおよび核酸アナログ上の種々の結合部位に結合され得、この標識としては、i末端例えば、プローブの5’および/または3’末端、iiヌクレオチド間の結合、iii糖、あるいはiv核酸塩基が挙げられる。標識は、最も好都合におよび効率的に5’末端で標識部位が導入され、この標識部位は、最も少なくハイブリダイゼーションを不活性化させ、そして最もすくなく3’プライマー伸長反応と相互作用するKricka,1992;Hermanson,1996。好ましい5’リンカー試薬は、構造8:を有する、アミノ保護ホスホラミダイトであり、ここで、Rは、酸素保護基または置換基例えば、シアノエチル、メチル、低級アルキル、置換アルキル、フェニル、アリール、または置換アリールであり;そしてR1およびR2は、アミノ置換基例えば、イソプロピル、モルホリノ、メチル、エチル、低級アルキル、シクロアルキル、またはアリールである。上記の試薬と、支持体に結合したオリゴヌクレオチドおよび弱酸の活性剤例えば、テトラゾールとのカップリングにより、モノメトキシトリチルMMT保護オリゴヌクレオチドを得る。ホスファイトの酸化の後に、MMT基は、同じ酸試薬例えば、TCAまたはDCAを用いてアミン基から除去され得、標識試薬とのカップリング反応のための反応性一級アミン求核性を示す。このヘキシルリンカーは、他のより短い不活性なリンカー例えば、エチル、またはより長いリンカー例えば、ドデシルに容易に置換され得、これらのリンカーはまた、アリール基および他の官能基を含む。あるいは、チオールまたはヒドロキシル求核性は、固体支持体に結合したオリゴヌクレオチド上の5’末端または他の部位に導入され得る。好ましいチオール保護ホスホラミダイト試薬は、9および10:である。このような試薬を5’ヒドロキシル基に結合し、ホスフェートを酸化し、そしてチオール保護基を除去し、反応性チオール求核試薬を得る。得られた固体支持体に結合した5’連結求核性オリゴヌクレオチドは、は、以下:にように示され得る。標識化反応は、以下のi~ivの間で処理される:i固体支持体に結合したオリゴヌクレオチドここで、オリゴヌクレオチドは、反応性求核性官能基例えば、HO、HNR、H2N、またはHSを有する、iiCO2Hカルボキシル、SO3Hスルホネート、RPO3Hホスホネート、またはOPO3Hホスフェート官能基を有するラベル、iiiカップリング試薬、およびiv溶媒または溶媒の混合物。この反応は、0~100°Cの間、好ましくは約20°Cの周囲温度で処理され得る。好ましいカップリング試薬としては、以下が挙げられる:HATUO-7-アザベンゾトリアゾール-1-イル-N,N,N’,N’-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート、HBTUO-ベンゾトリアゾール-1-イル-N,N,N’,N’-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート、TBTU21H-ベンゾトリアゾール-1-イル-1-1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート、TFFHN,N’,N’’,N’’’-テトラメチルウロニウム2-フルオロ-ヘキサフルオロホスフェート、BOPベンゾトリアゾール-1-イルオキシトリスジメチルアミノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、PyBOPベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-トリス-ピロリジノ-ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、EEDQ2-エトキシ-1-エトキシカルボニル-1,2-ジヒドロ-キノリン、DCCジクロロヘキシルカルボジイミド;DIPCDIジイソプロピルカルボジイミド、HOBt1-ヒドロキシベンゾトリアゾール、N-ヒドロキシスクシンイミド、MSNT1-メシチレン-2-スルホニル-3-ニトロ-1H-1,2,4-トリアゾール、およびアリールスルホニルハライド例えば、トリイソプロピルベンゼンスルホニルクロリド。これによって、標識官能性の先の活性化または個々の活性化プレpre活性化は、本発明の実施に必要ではない。例えば、本発明は、求核性オリゴヌクレオチドとの反応のために、カルボキシル基のNHSエステルの先の変換を必要としない。VI.標識標識Lは、オリゴヌクレオチドまたは核酸アナログに共有結合した任意の部分であり得る。ラベルの好ましいクラスは、蛍光、化学発光、および電気化学発光Kricka,1992によって標識されたオリゴヌクレオチドの検出のためのシグナルを提供し得る、検出ラベルである。オリゴヌクレオチドをラベルするために有用である蛍光色素としては、フルオレセインMenchen,1993、ローダミンBergot,1994、シアニンKubista,1997、およびポルフィリン金属錯体Stanton,1988が挙げられる。フルオレセイン色素の例としては、以下が挙げられる:6-カルボキシフルオレセイン6-FAM、2’,4’,1,4,-テトラクロロフルオレセインTET、2’,4’,5’,7’,1,4-ヘキサクロロフルオレセインHEX、2’,7’-ジメトキシ-4’,5’-ジクロロ-6-カルボキシローダミンJOE、2’-クロロ-5’-フルオロ-7’,8’-融合フェニル-1,4-ジクロロ-6-カルボキシフルオレセインNED、2’-クロロ-7’-フェニル-1,4-ジクロロ-6-カルボキシフルオレセインVIC、およびJODA図3および4。5-カルボキシル、および他の位置異性体は、有用な検出特性を有し得る。1,4-ジクロロ置換基を有するフルオレセイン色素およびローダミン色素が、特に好ましい。標識の別の好ましいクラスは、消光部分を含む。消光部分の発光スペクトルは、近接した分子内または分子間蛍光色素と重なり、その結果、蛍光色素の蛍光は、実質的に、蛍光共鳴エネルギー移動FRETによって減少するか、または消光する。蛍光色素と消光部分の両方で分子内で標識されるオリゴヌクレオチドは、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ例えば、TaqmanTMエキソヌクレアーゼ切断PCRアッセイLivak,1998;Livak,1996において有用である。特に好ましい消光物質としては、以下のiおよびiiが挙げられるが、これらに限定されない:iテトラメチル-6-カルボキシローダミンTAMRA、テトラプロパノ-6-カルボキシローダミンROXからなる群から選択されるローダミン色素、およびiiDABSYL、DABCYL、ニトロチアゾールブルーを含むシアニン色素、アントラキノン、マラカイトグリーン、ニトロチアゾール、およびニトロイミダゾールなど図5。本発明のフルオレセイン左およびローダミン右誘導体は、以下の一般構造および番号付け方式numberingsystem:を有し得、ここでXは、リンカーであり、そして1以上の番号付けされた位置で置換され得る。シアニン標識は、以下の構造:を有し得、ここで、R1またはR2は、H、低級アルキル、低級アルキレン、低級置換アルキレン、フェニル、またはアリールであり;Zは、CR1R2、S、O、NH、またはN-R1であり、R3は、ニトロ、ハロ、スルホネート、ヒドロキシ、アミノ、低級アルキル、またはチオハロメチルであり、そしてn=0~2であるKubista,1997。オリゴヌクレオチドを標識化するための結合部位Xは、R1、R2、またはR3であり得る。エネルギー移動色素は、オリゴヌクレオチドラベルの好ましいクラスである。エネルギー移動色素標識は、アクセプター色素に連結されるドナー色素を含むLee,1998。例えば、レーザーからの第一波長の光が、ドナー色素例えばFAMによって吸収される。ドナー色素は、アクセプター色素によって吸収された励起エネルギーを発光する。アクセプター色素は、ドナー色素の吸収最大波長よりも約100nm大きい発光最大波長の第二波長で蛍光を発する。エネルギー移動ラベルのドナー色素およびアクセプター色素の部分は、ドナー色素例えば、FAMの4’または5’位置と、アクセプター色素の5-または6-カルボキシル基とを連結する、以下:のようなリンカーによって結合され得る。ポルフィリン金属錯体はまた、オリゴヌクレオチドラベルの好ましいクラスであるStanton、1988。一例としては、以下:に示される構造の、アルミニウムフタロシアニンテトラスルホネートである。別の好ましい標識のクラスは、化学発光化合物を含む。特に好ましくは、以下の構造:を有する、1,2-ジオキサン化学発光部分Bronstein,1994;Bronstein,1990であり、ここで、R1は、水素またはハロゲンであり;R2は、ホスフェート、ガラクトシド、グルコシド、グルクロニド、トリアルキルシリルオキシ、アシルオキシ、または水素であり;R3は、メチル、エチル、および低級アルキルであり、そしてXは、オリゴヌクレオチドへのリンカーである。親和性リガンドとしては、ビオチン、2,4-ジニトロフェニル、ジゴキシゲニン、コレステロール、ポリエチレンオキシ、およびペプチドが挙げられる。本明細書中で、ハイブリダイゼーション安定化部分として言及される、別の好ましい標識のクラスとしては、小溝バインダー、挿入剤intercalator、ポリカチオン例えば、ポリリジンおよびスペルミン、ならびに架橋官能基が挙げられるが、これらに限定されない。ハイブリダイゼーション安定化部分は、塩基対の安定性すなわち、親和性、またはハイブリダイゼーションの速度を増加させ、このことは、二重鎖の高温融解温度Tmによって例示される。ハイブリダイゼーション安定化部分は、塩基対の特異性を増加させるのに役に立ち、このことは、完全に相補的なオリゴヌクレオチドと標的配列との間の大きなTmの違いによって例示され、得られた二重鎖は、一以上のワトソン/クリック塩基対の不整合を含むBlackburn,1996。好ましい小溝バインダーとしては、Hoechst33258、CDPI13、MGB1、ネトロプシンnetropsin、およびジスタマイシンdistamycin図6が挙げられる。小溝バインダーの例は、CDPI3Kutyavin,1996;Lukhtanov,1995であり、これは、以下の構造:を有し、ここで、Xは、リンカーまたはオリゴヌクレオチドの標識化のための結合部位である。オリゴヌクレオチドに標識化された場合、小溝バインダーは、いくつかのまたは実質的にほとんどの標的配列に対するハイブリダイゼーションの親和性および特異性を増加させ得るBlackburn,1996,337~46頁。VII.核酸アナログオリゴヌクレオチドは、核酸塩基、糖、および/またはヌクレオチド間の部分に対する改変体を有する、種々の核酸アナログを含み得る。好ましい核酸塩基アナログ改変体としては、以下が上げられるが、これらに限定されない:C-5-アルキルピリミジン、2-チオピリミジン、2,6-ジアミノプリン、C-5-プロピンピリミジン、フェノキサジンFlanagan,1999、7-デアザプリン、イソシチジン、偽イソシチジン、イソグアノシン、43H-ピリミドン、ヒポキサンチン、8-オキソプリンおよび普遍塩基universalbaseMeyer,1994。1以上のヌクレオシドにおいて、好ましい糖アナログ改変体としては、2’-または3’-改変体が挙げられるが、これらに限定されない。ここで、2’-または3’-位置は、水素、ヒドロキシ、メトキシ、エトキシ、アルキルオキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、メトキシエチル、アルコキシ、フェノキシ、アジド、アミノ、アルキルアミノ、フルオロ、クロロ、およびブロモである。他の好ましい糖アナログ改変としては、4’-α-アノマーヌクレオチド、1’-α-アノマーヌクレオチド、2’-分枝基-リボヌクレオチド、および2’-O-分枝基-リボヌクレオチドが挙げられる。以下の構造は、いくつかの好ましい2’-糖改変を示す。1つ以上のヌクレオチドの間の好ましいヌクレオチド間アナログとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:iヌクレオチド間連結の酸素の、硫黄、炭素、または窒素による置換、およびii硫黄、カルボキシレート、およびアミンの、ヌクレオチド間ホスホジエステル連結。他の好ましいヌクレオチド間アナログとしては:2-アミノエチルグリシンPNA、2’-5’-連結、逆転した3’-3’連結、逆転した5’-5’連結、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、非架橋N-置換ホスホラミデート、アルキル化ホスホチオエステルの分枝構造、および3’-N-ホスホラミデートが挙げられる。本発明の特に好ましいアナログは、ペプチド-核酸PNAオリゴマーであり、ここで、天然のホスホジエステル-デオキシリボース骨格は、N-2-アミノエチル-グリシンペプチド様ユニットで置換されているNielsen、1991。PNAオリゴマーは、Watson/Crick塩基対形成によって、プローブのクランプ特異的部分の相補的配列と、塩基対形成し得る。PNAおよびPNA/DNAキメラは、市販の自動化合成機で、市販の試薬を用いて、従来の方法を使用して合成され得るDueholm、1994;Vinayak、1997;VanderLaan、1997。VIII.支持体からの標識オリゴ体の切断および脱保護合成後に、オリゴヌクレオチドは、固体支持体から除かれ得るか、または切断反応によって固体支持体から除去もしくは分離され得る。固体支持体からオリゴヌクレオチドを除くことが望ましい。なぜなら、いくつかの核酸ハイブリダイゼーションアッセイは、固体支持体例えば、非多孔質表面、平坦な表面のアレイ、埋包またはカプセル化された粒子、あるいは水性媒体中に懸濁した粗い粒子の構成のものに共有結合したオリゴヌクレオチドを使用するからである。オリゴヌクレオチドは、塩基例えば、水酸化アンモニウム、tert-ブチルアミン、メチルアミン、エチルアミン、炭酸カリウム、または水酸化ナトリウムを使用して、支持体から切断され得る。切断および脱保護に適した溶液は、メタノール:tert-ブチルアミン:水1:1:2、v:v:vの混合物であるWoo、1993。切断溶液はまた、オリゴヌクレオチド含有溶液を高温例えば、55~85°Cで1~16時間の間加熱する際に、リン酸保護基例えば、シアノエチル、および核酸塩基の環外アミン上の保護基を除去する。別の好ましい切断方法は、ジスルフィドリンカーAの、還元的切断または酸化的切断であり、ここでAは、以下:-CH2n-S-S-CH2n-であり、ここでnは、1~12である。好ましい切断試薬は、ジチオトレイトールDTTである。別の好ましい切断方法は、シリルエーテル連結Aのフッ化物イオン切断であり、ここでAは、以下:であり、ここでRは、1~20個の炭素原子の低級アルキルである。好ましい切断試薬としては、テトラブチルアンモニウムフルオリドおよびフッ化水素/トリエチルアミンが挙げられる。IX.実施例本発明は、以下の実施例を考慮することによって、さらに明らかとなる。この実施例は、本発明の純粋な例示であることを意図され、そして本発明の範囲をいかなる様式においても限定しないことを意図される。実施例1.ポリスチレン支持体-リンカー-TAMRA6の合成無水ジグリコール酸64mg、0.55mmolの、CH2Cl25ml中の溶液を、Et3N67mg、0.66mmol、4-ジメチルアミノピリジン34mg、0.28mmolおよび化合物1400mg、0.55mmolのCH2Cl215ml中の混合物に、0°C、アルゴン下で添加した図2。この添加の終了後10分に、氷浴を取り除き、そして反応混合物を室温で1時間撹拌した。この反応混合物をCH2Cl230mlで希釈し、そして5水性クエン酸1×50mlおよび飽和ブライン2×50mlで洗浄した。有機層を乾燥しMgSO4、そしてエバポレートして、泡状物を得た。この生成物を、CHCl3-EtOHグラジエント2~10EtOHで溶出してシリカゲルのカラムクロマトグラフィーで精製した。適切な画分を合わせ、そしてエバポレートして、化合物2を無色の泡状物として得た260mg、56。1HNMRCDCl3d:1.20m,2H、1.39m,2H、1.58m,2H、2.18t,J=7.5Hz,2H、2.90~3.25m,4H、3.80s,6H、3.86s,4H、4.00~4.40m,6H、4.85分離されないt,1H、5.92d,J=7.2Hz,1H、6.75d,J=8.1Hz,4H、7.20~7.40m,13H、7.52d,J=7.2Hz,2H、7.69d,J=7.2Hz,2H。高度に架橋したポリスチレン31000Å、10μmol/gアミン負荷、1g、10μmolを、DMF10ml中の化合物217mg、20μmol、HOBt3mg、20μmol、HBTU8mg、20μmol、およびジイソプロピルエチルアミン8mg、60μmolで、wirst作動振盪機で4時間、室温で処理し、4を得た。支持体を、DMF3×10ml、CH3CN2×10mlおよびCH2Cl21×10mlで洗浄し、そして高減圧下で一晩乾燥した。ニンヒドリンアッセイは、支持体に残った0.5μmol/gのアミンを示した。支持体を、THF10溶液、5ml中の無水酢酸/ルチジンおよびTHF16溶液、5mL中の1-メチルイミダゾールで2時間室温でキャップした。支持体4をCH3CN3×10mlおよびCH2Cl21×10mlで洗浄した。トリチルカチオンアッセイは、ポリスチレン支持体上の化合物2の9.2μmol/g負荷を与えた。支持体4を、DMF3×10ml、各洗浄10分中の20ピペリジンで処理して、Fmoc保護基を除去して支持体5を与え、これをDMF3×10ml、CH3CN2×10ml、およびCH2Cl21×10mlで洗浄し、そして減圧下で一晩乾燥した。支持体51g、9.2μmolを、DMF10mL中のTAMRA-NHSエステル15mg、28.5μmolおよびEt3N8.6mg、85μmolで、室温で36時間、振盪機上で処理し、支持体6L=TAMRAを得た。この支持体を、DMF3×10ml、CH3CN2×10mlおよびCH2Cl21×10mlで洗浄し、そして高減圧下で24時間乾燥した。ニンヒドリン試験は、支持体上に残った0.5μmol/g未満のアミンを示した。この支持体を、THF10溶液、5ml中の無水酢酸/ルチジンおよびTHF16溶液、5ml中の1-メチルイミダゾールで1時間キャップし、次いでCH3CN3×10ml、CH2Cl22×10mlで洗浄し、そして高減圧下で24時間乾燥した。トリチルカーボンアッセイは、ポリスチレン支持体-リンカー-TAMRA6について、8.8μmol/gの最終負荷を示した。実施例2.標識支持体6上のFAM-M13-21プライマーの合成FAM-M13-21プライマーの合成5’FAM-TGTAAAACGACGGCCAGT3’配列番号1を、ABI396DNA/RNA合成機Perkin-ElmerCo.で、0.2μモルスケールで、FAM標識したポリスチレン支持体6図2、L=6-カルボキシフルオレセインFAM、S=ポリスチレンを用いて構築した。標準的な0.2μmolCEサイクルを、全ての5’-ホスホラミダイト、3’-DMTホスホラミダイトヌクレオシド7GlenResearchのカップリングについて25秒から90秒へとカップリング時間を増加させることによって、改変した。5’→3’の方向の合成が完了した後に、FAM-M13-21プライマーを切断し、そしてMeOH:t-BuNH2:H2O1:1:2中65°Cで3時間脱保護した。このプライマーを、従来の手段すなわち、アニオン交換HPLCによって分析し、そしてDNA配列決定において使用した。実施例3.固体支持体上のアミノ-207av18マーオリゴヌクレオチドの、TAMRA-CO2Hでの標識5’TCACAGTCTGATCTCGAT3’の合成を、ABI394DNA/RNA合成機Perkin-ElmerCo.で、0.2μモルスケールで、非標識ポリスチレン支持体を用いて3’→5’の方向で、5’-DMT、3’-ホスホラミダイトヌクレオシドAbz、Gdmf、Cbz、Tを用いて実施した。アミノリンカーホスホラミダイト試薬8GlenResearchを、最終モノマーとしてカップリングし、そしてCH2Cl2中の3トリクロロ酢酸で脱トリチル化した。5’-アミノ-207avオリゴヌクレオチドを保有する合成カラムを、合成機から取り外した。2つのルアーチップ型1mlシリンジを、この合成カラムの各端部に取り付けた。1つのシリンジを、500μlの乾燥ジメチルホルムアミドDMF中の10.7mg25μモルのTAMRA-CO2Hで満たした。第二のシリンジを、250μlの1:1のDMF:CH3CN中の9.25mg25μモルのHBTUおよび9μl50μモルのジイソプロピルエチルアミンで満たした。これらのシリンジ内のカップリング剤を、各プランジャーを連続的に押下することによって、カラムを通過させた。約1分間、徹底的に混合した後に、このアセンブリを約15分間静置し、カップリング反応を進行させた。試薬を1つのシリンジに引き込み、そして処分した。この合成カラムを5mlの1:1のDMF:CH3CN、5mlのCH3CNで洗浄し、そして1mlのMeOH:t-BuNH2:H2O1:1:2で処理して、TAMRA-N-207av:5’TAMRA-N-TCACAGTCTGATCTCGAT3’配列番号2を支持体から切断した。TAMRA-N-207avを含有する上清を加熱し、そして65°Cで3時間脱保護して、全ての保護基を除去した。TAMRA-N-207avを、逆相HPLCおよびMALDI-TOF質量分析によって分析し、これらで均一な純度および同一性を確認した。実施例4.チオール-オリゴヌクレオチドのCDPI3-CO2Hでの標識化5’TCACAGTCTGATCTCGAT3’の合成を、ABI394DNA/RNA合成機Perkin-ElmerCo.で、0.2μモルスケールで、非標識ポリスチレンを用いて3’→5’の方向で、5’-DMT、3’-ホスホラミダイトヌクレオシドAbz、Gdmf、Cbz、Tを用いて実施する。チオールリンカーホスホラミダイト試薬10を、最終モノマーとしてカップリングし、そしてDMF中の硝酸銀で脱トリチル化する。5’-チオール-207avオリゴヌクレオチドを保有する合成カラムを、合成機から取り外す。2つのルアーチップ型1mlシリンジを、この合成カラムの各端部に取り付ける。1つのシリンジを、500μlの乾燥ジメチルホルムアミドDMF中の15mg25μモルのCDPI3-CO2H図6、X=OHで満たす。第二のシリンジを、250μlの1:1のDMF:CH3CN中の9.25mg25μモルのHBTUおよび9μl50μモルのジイソプロピルエチルアミンで満たす。これらのシリンジ内のカップリング剤を、各プランジャーを連続的に押下することによって、カラムを通過させる。約1分間、徹底的に混合した後に、このアセンブリを約15分間静置し、カップリング反応を進行させる。試薬を1つのシリンジに引き込み、そして処分する。この合成カラムを5mlの1:1のDMF:CH3CN、5mlのCH3CNで洗浄し、そして1mlのMeOH:t-BuNH2:H2O1:1:2で処理して、CDPI3-S-207av:5’CDPI3-S-TCACAGTCTGATCTCGAT3’配列番号3を支持体から切断する。CDPI3-N-207avを含有する上清を加熱し、そして65°Cで3時間脱保護して、全ての保護基を除去した。CDPI3-S-207avを、逆相HPLCによって分析し、均一な純度を確認した。MALDI-TOF質量分析による分析は、同一性を確認した。実施例5.固体支持体上の5’アミノ-SG1オリゴヌクレオチドの、NTB-CO2Hでの標識5’ATGCCCTCCCCCATGCCATCCTGCGT3’の合成を、ABI394DNA/RNA合成機Perkin-ElmerCo.で、0.2μモルスケールで、非標識ポリスチレン支持体を用いて3’→5’の方向で、5’-DMT、3’-ホスホラミダイトヌクレオシドAbz、Gdmf、Cbz、Tを用いて実施した。アミノ-リンカーホスホラミダイト試薬8GlenResearchを、最終モノマーとしてカップリングし、そしてCH2Cl2中の3トリクロロ酢酸で脱トリチル化した。5’-アミノ-SG1オリゴヌクレオチドを保有する合成カラムを、合成機から取り外した。2つのルアーチップ型1mlシリンジを、この合成カラムの各端部に取り付けた。1つのシリンジを、500μlの乾燥ジメチルホルムアミドDMF中の11mg25μモルのNTB-CO2Hで満たした。第二のシリンジを、250μlの1:1のDMF:CH3CN中の9.25mg25μモルのHBTUおよび9μl50μモルのジイソプロピルエチルアミンで満たした。これらのシリンジ内のカップリング剤を、各プランジャーを連続的に押下することによって、カラムを通過させた。約1分間、徹底的に混合した後に、このアセンブリを約15分間静置し、カップリング反応を進行させた。試薬を1つのシリンジに引き込み、そして処分した。この合成カラムを5mlの1:1のDMF:CH3CN、5mlのCH3CNで洗浄し、そして1mlのMeOH:t-BuNH2:H2O1:1:2で処理して、NTB-N-SG1:5’NTB-N-ATGCCCTCCCCCATGCCATCCTGCGT3’配列番号4を支持体から切断した。NTB-SG1を含有する上清を加熱し、そして65°Cで3時間脱保護して、全ての保護基を除去した。NTB-SG1を、逆相HPLCによって分析し、均一な純度を確認した。MALDI-TOF質量分析による分析は、8390.27の分子量を与え、これは同一性を確認した。実施例6.固体支持体上のSG1の、NTB-ホスフェートおよびMSNTでの標識5’ATGCCCTCCCCCATGCCATCCTGCGT3’の合成を、ABI394DNA/RNA合成機Perkin-ElmerCo.で、0.2μモルスケールで、非標識ポリスチレンを用いて3’→5’の方向で、5’-DMT、3’-ホスホラミダイトヌクレオシドAbz、Gdmf、Cbz、Tを用いて実施した。5’末端ヒドロキシル基を、CH2Cl2中の3トリクロロ酢酸で脱トリチル化した。5’-ヒドロキシル-SG1オリゴヌクレオチドを保有する合成カラムを、合成機から取り外した。2つのルアーチップ型1mlシリンジを、この合成カラムの各端部に取り付けた。1つのシリンジを、500μlの乾燥DMF中の12mg25μモルのNTB-リン酸で満たした。第二のシリンジを、250μlのDMF中の7.5mg25μモルのMSNTおよび9μl50μモルのジイソプロピルエチルアミンで満たした。これらのシリンジ内のカップリング剤を、各プランジャーを連続的に押下することによって、カラムを通過させた。約1分間、徹底的に混合した後に、このアセンブリを約60分間静置し、カップリング反応を進行させた。試薬を1つのシリンジに引き込み、そして処分した。この合成カラムを5mlの1:1のDMF:CH3CN、5mlのCH3CNで洗浄し、そして1mlのMeOH:t-BuNH2:H2O1:1:2で処理して、NTB-P-SG1:5’NTB-P-ATGCCCTCCCCCATGCCATCCTGCGT3’配列番号5を支持体から切断した。NTB-P-SG1を含有する上清を加熱し、そして65°Cで3時間脱保護して、全ての保護基を除去した。NTB-P-SG1を、逆相HPLCおよびMALDI-TOF質量分析によって分析し、これらで均一な純度および同一性を確認した。実施例7.固体支持体上のPNAの、MGB1での標識化PNAおよびPNA/DNAキメラの自動化合成を、ABIModel394DNA/RNA合成機または433Aペプチド合成機Perkin-ElmerCo.を使用して、合成機の製造業者の使用者の手引き、ならびにEgholm、1993に記載される一般的手順に従って、実施した。PNAを、2~5μモルスケールで、MBHAメチルベンズヒドリルアミンリンカー、高負荷ポリスチレン支持体上で、そして標準的な合成技術ならびに核酸塩基Abz、Gbz、Cibu、Tおよび第一級アミノMMT、FmocまたはBoc保護基を用いて、本質的に以前に報告されたようにDueholm、1994、合成した。5μモルスケールにおいて3mlの反応容器を使用し、全反応容量は440mlである。PNAを、MBHA固体支持体上のカルボキシ末端リジンで、t-Boc-lysFmocで予備付加することにより、調製した。カルボキシ末端アミドを有するPNAを、MBHA支持体上で直接か、またはt-BocTPNAモノマーで予備負荷されたMBHA支持体上でのいずれかで、合成した。全ての樹脂を、0.1~0.25mモル/gに負荷した。スペーサーであるO,2-2-アミノエトキシ酢酸が、Fmocでアミノ保護されたシントンとして、カップリングされ得る。1つ以上のスペーサーOユニットが、PNA配列における可撓性の非塩基対形成ヒンジ領域として働く。PNA/DNAキメラ合成のために使用する支持体は、ヒドロキシメチル安息香酸リンカーを有する、非膨潤性の高架橋ポリスチレンビーズであるVinayak、1997。キメラ合成のためのPNAモノマーは、第一級アミノ保護のためにMMT基を使用する。第一工程において、各々DMF/CH3CN、1/1に溶解したモノマーHATUおよびDIPEAを、反応カートリッジに連続的に送達する、16分後、キャッピング試薬を送達する。PNAの第一級アミノ官能基が移動または環化する傾向を最小化するために、最後のMMT基の除去の後に、そのアミノ末端をアセチル化する。DNA部分およびPNA部分を連結するための試薬、ならびにキメラ合成、切断、脱保護、および精製のための他の手順は、記載されたVanderLaan、1997。このアプローチにおいて、キメラを単一のカートリッジ内および単一の合成機において、連続的に作製し得る。固体支持体上のPNAオリゴマーH2N-TCCTCCTT1μモルを、上記手順により合成した。ポリスチレン支持体上のPNAを、MGB1-CO2H5mg、10μモル、図6、Gong、1997、HATU10μモル、5μlDIEAおよび100μlDMFの混合物と反応させ、そして室温で1時間静置した。次いで、この支持体をDMFおよびCH2Cl2で洗浄し、室温で1時間TFMSAトリフルオロメタンスルホン酸で切断し、そしてエーテル中で沈殿させて、MGB1-PNAを得た:MGB1-TCCTCCTT配列番号6MGB1-PNAを、逆相HPLCおよびMALDI-TOF質量分析により分析し、均一な純度および同一性を確認した。実施例8.固体支持体上のPNAの、CDPI3での標識化実施例9と同じ手順および試薬によって、Fmoc-CDPIの3つの連続的なカップリング図6、Lukhtanov、1995で、CDPI3をPNAH2N-TCCTCCTTに結合させ、CDPI3標識化PNAを得た。Fmocで保護したCDPIモノマーユニット1,2-ジヒドロ-3H-ピロロ[3,2-e]インドール-7-カルボキシレート5mg、0.012mmoleを、100μlNMPに溶解し、そして0.95当量のHATUDMF中0.2Mおよび2当量のDIEADMF中0.4mで活性化した。室温で1時間後、活性化したFmoc-CDPI溶液を、支持体に結合したPNAに添加し、そして室温でさらに1時間、カップリングさせた。このカップリングに続いて、この支持体を20mlのDMFで洗浄した。この樹脂支持体を1:4のピペリジン:DMFで室温で10分間処理することによって、Fmocを除去した。このカップリングおよび脱保護のサイクルを、さらに2回繰り返し、合計で3つの手動カップリングとした。次いで、この支持体をDMFおよびCH2Cl2で洗浄し、続いてTFMSAトリフルオロメタンスルホン酸を用いて室温で1時間切断し、続いて粗製CDPI3-PNAをエーテルで沈殿させた:CDPI3-TCCTCCTT配列番号7CDPI3-PNAを、逆相HPLCおよびMALDI-TOF質量分析により分析し、均一な純度および同一性を確認した。実施例9.Taqman自己クエンチプローブの標識化支持体6上への標識化オリゴヌクレオチド5’FAM-CCTGCAGGCCCGTGCCCGT3’を、ABI394DNA/RNA合成機で、0.2μモルスケールで、FAM標識したポリスチレン支持体6図2、L=6-カルボキシフルオレセインFAM、S=ポリスチレンを用いて合成した。標準的な0.2μmolCEサイクルを、全ての5’-ホスホラミダイト、3’-DMTホスホラミダイトヌクレオシドGlenResearchのカップリングについて25秒から90秒へとカップリング時間を増加させることによって、改変した。5’→3’の方向の合成の完了後に、アミノ-リンカーホスホラミダイト試薬8GlenResearchを、最終モノマーとして3’末端にカップリングし、そしてCH2Cl2中3トリクロロ酢酸で脱トリチル化した。固体支持体上に3’-アミノ,5’-FAMオリゴヌクレオチドを保有する合成カラムを、合成機から取り外した。2つのルアーチップ型1mlシリンジを、この合成カラムの各端部に取り付けた。1つのシリンジを、500μlの乾燥ジメチルホルムアミドDMF中の10.7mg25μモルのTAMRA-CO2Hで満たした。第二のシリンジを、250μlの1:1のDMF:CH3CN中の9.25mg25μモルのHBTUおよび9μl50μモルのジイソプロピルエチルアミンで満たした。これらのシリンジ内のカップリング剤を、各プランジャーを連続的に押下することによって、カラムを通過させた。約1分間、徹底的に混合した後に、このアセンブリを約15分間静置し、カップリング反応を進行させた。試薬を1つのシリンジに引き込み、そして処分した。この合成カラムを5mlの1:1のDMF:CH3CN、5mlのCH3CNで洗浄し、そして1mlのMeOH:t-BuNH2:H2O1:1:2で処理して、5’-FAM,3’-N-TAMRATaqman自己クエンチプローブ:5’FAM-CCTGCAGGCCCGTGCCCGT-N-TAMRA3’配列番号8を支持体から切断した。このプローブを含有する上清を加熱し、そして65°Cで3時間脱保護して、全ての保護基を除去した。このプローブを、逆相HPLCおよびMALDI-TOF質量分析によって分析し、均一な純度および同一性を確認した。全ての刊行物および特許出願は、各個々の刊行物または特許出願が、具体的かつ個々に本明細書中に参考として援用されることが示されたと同程度まで、本明細書中に参考として援用される。ほんの数個の実施形態が上に詳細に記載されたが、分子生物学および化学の分野の当業者は、本開示の教示から逸脱することなく、好ましい実施形態において多数の変更が可能であることを、明白に理解する。全てのこのような変更は、上記の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。"