ヒスチジンタグを有するポリペプチドを含む溶液を、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料にアプライする段階、ならびにイミダゾールまたはイミダゾール誘導体を含む溶液で、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料から、ヒスチジンタグを含むポリペプチドを回収する段階、およびそれによりヒスチジンタグを含むポリペプチドを精製する段階を含む、ヒスチジンタグを含むポリペプチドを精製するための方法。ヒスチジンタグを含むポリペプチドをコードする核酸を含む原核細胞または真核細胞を培養する段階、ヒスチジンタグを含むポリペプチドを、細胞または/および培養培地から回収する段階、以下の工程:ヒスチジンタグを有するポリペプチドを含む溶液を、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料にアプライする工程と、イミダゾールまたはイミダゾール誘導体を含む溶液で、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料から、ヒスチジンタグを含むポリペプチドを回収する工程、およびそれによりヒスチジンタグを含むポリペプチドを生産する工程とを含む疎水性相互作用クロマトグラフィー法でヒスチジンタグを含むポリペプチドを精製する段階を含む、ヒスチジンタグを含むポリペプチドを生産するための方法。疎水性相互作用クロマトグラフィー材料が、疎水性リガンドが付加されているアガロースのマトリクスを含むことを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。リガンドが、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ポリ、またはポリリガンドであることを特徴とする、請求項3記載の方法。リガンドがフェニルリガンドであり、かつ回収段階における溶液がさらに2プロパノールを含むことを特徴とする、請求項3記載の方法。第1の溶液を、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料にアプライする段階、ヒスチジンタグを含むポリペプチドを含む第2の溶液を、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料にアプライする段階、ならびにイミダゾールまたはイミダゾール誘導体を含む第4の溶液で、ヒスチジンタグを含むポリペプチドを回収する段階、およびそれにより該ポリペプチドを生産または精製する段階を含む前記請求項のいずれか一項記載の方法であって、第1の溶液が第1の緩衝物質を含み、第2の溶液が第2の緩衝物質を含み、かつ第4の溶液が、イミダゾールまたはイミダゾール誘導体である第4の緩衝物質を含み、かつ、第2の緩衝物質および第4の緩衝物質が、異なる緩衝物質である、前記方法。第2の溶液をアプライする段階の後および回収する段階の前に、第3の溶液を、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料にアプライする段階を含むことを特徴とする請求項6記載の方法であって、第3の溶液が第3の緩衝物質を含み、第2の緩衝物質および第3の緩衝物質および第4の緩衝物質が、すべて異なる緩衝物質である、前記方法。発明の詳細な説明本明細書において、ヒスチジンタグを含むポリペプチドの精製のために結合溶出モードで操作される拡大縮小可能な疎水性相互作用クロマトグラフィー法が報告され、本方法では、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料からのポリペプチドの回収が、イミダゾール、またはヒスチジンなどのイミダゾール誘導体を含む溶液を伴う。この溶出系を用いることにより、選択性および収率を失わずに、2プロパノールのような有機溶媒を含有する溶出緩衝液の実施が回避され得る。~にアプライするという用語およびその文法上の相当語句は、精製されるべき関心対象の物質を含有する溶液を固定相と接触させる、精製法の部分的な段階を意味する。これは、a固定相が配置されているクロマトグラフィー装置に溶液を添加すること、またはb関心対象の物質を含む溶液に固定相を添加すること、を意味する。aの場合、精製されるべき関心対象の物質を含有する溶液が、固定相を通過し、固定相と溶液中の物質との間の相互作用を可能にする。例えば、pH、伝導性、塩濃度、温度、および/または流速などの条件に応じて、溶液のいくつかの物質は固定相に結合し、および従って、溶液から除去される。他の物質は、溶液中にとどまる。溶液中にとどまる物質は、フロースルーにおいて見出され得る。フロースルーとは、その起源に関係なく、クロマトグラフィー装置の通過後に得られる溶液を意味する。フロースルーは、関心対象の物質を含有するアプライされた溶液、または、カラムを洗い流すために使用されるか、もしくは固定相に結合した一つまたは複数の物質の溶出を引き起こすために使用される緩衝液のいずれかであり得る。一つの態様において、クロマトグラフィー装置は、カラムまたはカセットである。関心対象の物質は、精製された形態、または一様で実質的に均質の形態において関心対象の物質を得るために、例えば、沈殿、塩析、限外濾過、ダイアフィルトレーション、凍結乾燥、親和性クロマトグラフィー、または溶媒容積削減などの、当業者になじみ深い方法により、精製段階後に溶液から回収され得る。bの場合、固定相が、例えば固体として、精製されるべき関心対象の物質を含有する溶液に添加され、固定相と溶液中の物質との間の相互作用を可能にする。相互作用後、例えば濾過により固定相が除去され、関心対象の物質は、固定相に結合してそれと共に溶液から除去されるか、または固定相に結合せずに溶液中にとどまるかのいずれかである。本出願中で使用される緩衝化されたという用語は、酸性または塩基性物質の添加または放出によるpHの変化が、緩衝物質によって平均化される溶液を意味する。そのような効果をもたらす任意の緩衝物質が使用され得る。一つの態様において、緩衝物質は、リン酸もしくはその塩、酢酸もしくはその塩、クエン酸もしくはその塩、モルホリン、2エタンスルホン酸もしくはその塩、イミダゾールもしくはその塩、ヒスチジンもしくはその塩、グリシンもしくはその塩、またはトリスアミノメタンTRISもしくはその塩より選択される。一つの態様において、緩衝物質は、イミダゾールもしくはその塩、またはヒスチジンもしくはその塩より選択される。任意で、緩衝溶液はまた、追加的な無機塩を含んでもよい。一つの態様において、無機塩は、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、クエン酸ナトリウム、およびクエン酸カリウムより選択される。ポリペプチドとは、天然に生産されていようとまたは合成的に生産されていようと、ペプチド結合により連結されたアミノ酸からなるポリマーである。約20アミノ酸残基未満のポリペプチドをペプチドと呼んでもよく、他方で、二つもしくはそれ以上のポリペプチドからなる分子、または100アミノ酸残基より多い一つのポリペプチドを含む分子をタンパク質と呼んでもよい。ポリペプチドはまた、炭水化物基、金属イオン、またはカルボン酸エステルなどの非アミノ酸成分を含んでもよい。非アミノ酸成分は、ポリペプチドが発現される細胞により付加され得、かつ細胞のタイプと共に変動し得る。ポリペプチドは、本明細書において、そのアミノ酸バックボーン構造または同一物をコードする核酸に関して定義される。炭水化物基などの付加物は、一般に特定されないが、それにもかかわらず存在する場合もある。結合溶出モードという用語は、クロマトグラフィー精製法を行う手段を意味する。本明細書において、精製されるべき関心対象のポリペプチドを含有する溶液は、固定相、特に固体相にアプライされ、それにより関心対象のポリペプチドは固定相と相互作用し、かつその上に保持される。関心対象でない物質は、それぞれフロースルーまたは上清と共に除去される。関心対象のポリペプチドはその後、溶出溶液をアプライすることにより第2の段階において固定相から回収される。単量体形態におけるポリペプチドという用語は、第2のポリペプチド分子と会合していない、すなわち、同じ種類または異なる種類のいずれかの別のポリペプチド分子に、共有結合でも非共有結合でも結合していないポリペプチドを意味する。凝集形態におけるポリペプチドという用語は、少なくとも一つの追加的なポリペプチドと共有結合または非共有結合のいずれかで会合しており、かつサイズ排除クロマトグラフィーカラムから単一のピークで溶出されるポリペプチドを意味する。単量体形態におけるという用語は、ポリペプチドの100サイズ排除クロマトグラフィーにより測定された際が単量体形態において存在することを必ずしも意味しない。さらに、ポリペプチドが本質的に単量体形態である、すなわち、ポリペプチドの少なくとも90サイズ排除クロマトグラフィーにより測定された際が単量体形態であるか、またはポリペプチドの少なくとも95が単量体形態であるか、またはポリペプチドの少なくとも98が単量体形態であるか、またはポリペプチドの少なくとも99が単量体形態であるか、または特に、ポリペプチドの99より多くサイズ排除クロマトグラフィーにより測定された際が単量体形態であることを意味する。単量体形態および凝集形態におけるという用語は、他のポリペプチド分子と会合していないポリペプチド分子と、他のポリペプチド分子と会合しているポリペプチド分子との混合物を意味する。この混合物において、単量体形態または凝集形態のいずれも排他的には存在しない。封入体という用語は、原核細胞のすべての細胞成分を含む細胞タンパク質全体の有意な部分を構成する、凝集した関心対象のポリペプチドの、高密度の細胞内の塊を意味する。変性されたという用語は、ポリペプチドの形態であって、天然のものではない二次構造、三次構造、および/または四次構造を有する形態を意味する。この非天然形態におけるポリペプチドは、可溶性であるが、同時に生物学的に不活性の立体配座であってもよい。または、ポリペプチドは、不溶性であり、かつ、例えば不適切なまたは形成されていないジスルフィド結合を伴う生物学的に不活性の立体配座であってもよい。この不溶性のポリペプチドは、封入体中に含有される可能性があるが、含有されている必要はない。リフォールディングされたという用語は、変性された形態から取得されるポリペプチドを指す。典型的に、リフォールディングの目標は、タンパク質がリフォールディング段階なしで生産された場合に有するであろうよりも高いレベルの活性を有するタンパク質を生産することである。フォールディングされたタンパク質分子は、最小の自由エネルギーを有する立体配座において最も安定である。大抵の水溶性タンパク質は、疎水性アミノ酸の大部分が水から離れて分子の内側部分にある様式で、フォールディングする。タンパク質を結びつける弱い結合は、ポリペプチドをアンフォールディングさせる、すなわち変性させる多数の処理により破壊され得る。フォールディングされたタンパク質は、イオン結合、ファンデルワールス相互作用、水素結合、ジスルフィド結合、および共有結合を含む、アミノ酸自体とその環境との間のいくつかのタイプの相互作用の産物である。本明細書において使用される変性したまたは変性されたという用語は、天然またはリフォールディングされた状態において分子に存在するイオン結合および共有結合、ならびにファンデルワールス相互作用が破壊されているポリペプチドを指す。ポリペプチドの変性は、例えば、8M尿素、メルカプトエタノールなどの還元剤、熱、pH、温度、および他の化学物質での処理により達成され得る。8M尿素などの試薬は、水素結合および疎水結合の両方を破壊し、かつメルカプトエタノールも添加された場合、システイン間に形成されているジスルフィド架橋SSは二つのSH基に還元される。天然またはリフォールディングされた状態においてジスルフィド結合を含有するポリペプチドのリフォールディングはまた、タンパク質がジスルフィド結合を再形成するようにシステイン残基上に存在するSH基の酸化を含んでもよい。一般に、疎水性相互作用クロマトグラフィーの位置は、ポリペプチドの多段階の精製配列において可変である。ポリペプチドを精製するための方法は、十分に確立されており、かつ広範に使用される。それらは、単独または組み合わせのいずれかで使用される。そのような方法は、例えば、複合した金属イオンを伴うチオールリガンドを使用する親和性クロマトグラフィー例えば、NiおよびCu親和性材料を用いる、または微生物由来タンパク質を使用する親和性クロマトグラフィー例えば、プロテインAまたはプロテインG親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー例えば、陽イオン交換カルボキシメチル樹脂、陰イオン交換アミノエチル樹脂、および混合様式交換クロマトグラフィー、チオフィリック吸着例えば、βメルカプトエタノールおよび他のSHリガンドを用いる、疎水性相互作用または芳香族吸着クロマトグラフィー例えば、フェニルsepharose、アザアレノフィリック樹脂、またはmアミノフェニルボロン酸を用いる、サイズ排除クロマトグラフィー、ならびに調製用電気泳動法ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動などである。免疫グロブリンの精製過程は、一般に、多段階のクロマトグラフィー部分を含む。第1の段階において、免疫グロブリンでないポリペプチドおよびタンパク質が、例えばプロテインAを用いる親和性クロマトグラフィーにより免疫グロブリン画分から分離される。その後、イオン交換クロマトグラフィーが行われて、個々の免疫グロブリンクラスを分離し、かつ第1のカラムから共溶出された微量のプロテインAを除去することができる。最終的に、免疫グロブリンの単量体を同一のクラスの多量体および断片から分離するために、第3のクロマトグラフィー段階が必要である。時々、凝集体の量が高く5またはそれ以上、かつ第3の精製段階において効率よく分離できず、さらなる精製段階を必要とする。ヒスチジンタグを含むポリペプチドが、イミダゾールまたはイミダゾール誘導体を含む溶液で疎水性相互作用クロマトグラフィー材料から回収され得ることが見出された。イミダゾールまたはイミダゾール誘導体は一般に、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料からではなく、金属親和性クロマトグラフィー材料からヒスチジンタグが付加されたポリペプチドを回収するように使用されるため、この知見は非常に驚くべきことであった。すべての異なる形態は、ヒスチジンタグを含み、かつ金属親和性クロマトグラフィー材料に結合するため、金属親和性クロマトグラフィー材料を使用することによっては、正確にフォールディングされたポリペプチド形態、凝集したポリペプチド形態、部分的にフォールディングされたポリペプチド形態、およびアンフォールディングされたポリペプチド形態を区別できない。しかしながら、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料を使用することにより、これらの密接に関連したポリペプチド形態を分解できることが見出された。同時に、このクロマトグラフィー材料は、工業生産規模の分離に十分な結合能力を有する。そのため、本明細書において、第1の局面として、以下の段階を含む、ヒスチジンタグを有するポリペプチドを精製するための方法が報告される:‐ヒスチジンタグを有するポリペプチドを含む溶液を、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料にアプライする段階、ならびに‐ヒスチジンタグを含むポリペプチドを、イミダゾールまたはイミダゾール誘導体を含む溶液で回収し、それによりヒスチジンタグを含むポリペプチドを精製する段階。イミダゾールまたはイミダゾール誘導体が、結合したポリペプチドの回収に使用されるため、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料にアプライされるポリペプチドを含む溶液は、イミダゾールおよびいずれのイミダゾール誘導体も無い状態である。疎水性相互作用クロマトグラフィー材料上に保持されたポリペプチドは、イミダゾールまたはイミダゾール誘導体を含む溶液で回収される。本方法は、結合溶出モードで操作され、すなわち、ヒスチジンタグを含むポリペプチドは、最初に疎水性相互作用クロマトグラフィー材料に結合され、およびその後、さらなる段階において、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料から回収される。間欠的な洗浄段階が、本明細書において報告される方法に含まれ得る。これらの洗浄段階において、アプライされる溶液は、イミダゾールおよびイミダゾール誘導体が無い状態である。本明細書中で報告される方法において、ヒスチジンタグを含むポリペプチドを疎水性相互作用クロマトグラフィー材料から回収するための溶液以外のすべての溶液は、イミダゾールまたはイミダゾール誘導体が無い状態であり、すなわちそれらを含有しない。一つの態様において、イミダゾールまたはイミダゾール誘導体を含む溶液は、水溶液である。さらなる態様において、イミダゾールまたはイミダゾール誘導体を含む溶液は、有機溶媒および/または脂肪族アルコールを含まない、すなわちそれらが無い状態である。さらなる態様において、イミダゾールまたはイミダゾール誘導体を含む溶液は、水、イミダゾールまたはイミダゾール誘導体、緩衝物質、および任意で、一つまたは二つまたは三つの無機塩からなる。イミダゾールまたはイミダゾール誘導体という用語は、イミダゾール、置換されたイミダゾール、ヒスチジン、およびヒスチジン誘導体より選択される化合物を意味する。一つの態様において、イミダゾールまたはイミダゾール誘導体は、イミダゾールおよびヒスチジンより選択される。一つの態様における疎水性相互作用クロマトグラフィー材料は、疎水性リガンドが共有結合で連結されているアガロースのマトリクスを含む。さらなる態様において、リガンドは、n、イソ、もしくはネオ脂肪族リガンド、またはオリゴリガンドである。さらなる態様において、リガンドは、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ポリ、またはポリリガンドである。一つの態様において、リガンドは、ポリリガンドである。別の態様において、リガンドは、フェニルリガンドであり、かつ回収段階における溶液は、さらに2プロパノールを含む。ヒスチジンタグを含むまたはヒスチジンタグが付加されたという用語は、ポリペプチドのC末端またはN末端のいずれかの、ヒスチジン残基の連続した配列の存在を意味する。ヒスチジンタグは、それぞれの末端に直接的であってもよいし、または最高でそれぞれの末端の10残基以内であってもよい。ヒスチジンタグにおけるヒスチジン残基の数は、3残基から10残基まで、すなわち、3、または4、または5、または6、または7、または8、または9、または10残基である。一つの態様において、ヒスチジン残基の数は、4残基から8残基までである。本明細書中で報告される局面の一つの態様において、ヒスチジンタグを含むポリペプチドを精製または取得するための方法は、以下の段階を含む:‐調整された疎水性相互作用クロマトグラフィー材料を生じるように、第1の溶液を、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料にアプライする段階、‐ヒスチジンタグを含むポリペプチドを含む第2の溶液を、調整された疎水性相互作用クロマトグラフィー材料にアプライする段階、‐任意で、第3の溶液を疎水性相互作用クロマトグラフィー材料にアプライする段階、‐イミダゾールまたはイミダゾール誘導体を含む第4の溶液で、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料からポリペプチドを回収し、それによりポリペプチドを精製または取得する段階。第1~第3の溶液は、イミダゾールおよびいずれのイミダゾール誘導体も無い状態である。ヒスチジンタグを含むポリペプチドは、CHO細胞、HEK細胞、および大腸菌など真核細胞および原核細胞において組み換えにより生産され得る。ポリペプチドが原核細胞において生産される場合、一般に、不溶性の封入体の形態で取得される。封入体は、原核細胞および培養培地から容易に回収され得る。封入体において不溶性形態で取得されたポリペプチドは、精製および/またはリフォールディング手順が実施され得る前に、可溶化されなければならない。一般に、金属親和性クロマトグラフィーは、例えば、可溶化および/またはリフォールディング後に取得された、溶液中に含有される正確にフォールディングされたポリペプチド形態、凝集したポリペプチド形態、部分的にフォールディングされたポリペプチド形態、およびアンフォールディングされたポリペプチド形態を区別できない。これは、異なるポリペプチド形態がすべて、金属親和性クロマトグラフィー材料との相互作用を担うヒスチジンタグを含むという事実のためである。疎水性相互作用クロマトグラフィー材料は、イミダゾールまたはイミダゾール誘導体を含有する溶液が回収に使用される際、これらの異なるが密接に関連したポリペプチド形態を分離できることが見出された。イミダゾールおよびイミダゾール誘導体は一般に、ヒスチジンタグを含むポリペプチドをキレートクロマトグラフィー材料から回収するように使用されるため、この知見は全く予想外であった。ヒスチジンタグを欠如するポリペプチドでの対照は、イミダゾールにより誘導される回収の効果は、ヒスチジンタグを含むポリペプチドに特異的であることを示した。従って、本明細書において報告される第2の局面は、以下の段階を含む、ヒスチジンタグを含むポリペプチドを生産するための方法である:‐ヒスチジンタグを含むポリペプチドをコードする核酸を含む原核細胞または真核細胞を培養する段階、‐ヒスチジンタグを含むポリペプチドを、原核細胞もしくは真核細胞または/および培養培地から、原核細胞の場合は任意で封入体の形態で、回収する段階、‐任意で、ヒスチジンタグを含むポリペプチドを可溶化および/またはリフォールディングする段階、‐ヒスチジンタグを含むポリペプチドを、本明細書において報告される疎水性相互作用クロマトグラフィー法で精製し、それによりヒスチジンタグを含むポリペプチドを生産する段階。一つの態様において、疎水性相互作用クロマトグラフィー法は、‐調整された疎水性相互作用クロマトグラフィー材料を生じるように、第1の溶液を、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料にアプライする段階、‐ヒスチジンタグを含むポリペプチドを含む第2の溶液を、調整された疎水性相互作用クロマトグラフィー材料にアプライする段階、‐任意で、第3の溶液を疎水性相互作用クロマトグラフィー材料にアプライする段階、‐イミダゾールまたはイミダゾール誘導体を含む第4の溶液で、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料からポリペプチドを回収し、それによりポリペプチドを取得する段階を含み、ここで、第1~第3の溶液は、イミダゾールおよびイミダゾール誘導体が無い状態である。以下に、先に報告されたすべての局面の様々な態様が提示される。一つの態様において、第1の溶液は第1の緩衝物質を含み、第2の溶液は第2の緩衝物質を含み、第3の溶液は第3の緩衝物質を含み、および第4の溶液は第4の緩衝物質を含み、ここで、少なくとも第2の緩衝物質および第3の緩衝物質および第4の緩衝物質がすべて異なる緩衝物質であるという条件で、第4の緩衝物質は、イミダゾールまたはイミダゾール誘導体である。一つの態様において、第1の溶液および/または第2の溶液および/または第3の溶液は、イミダゾールおよびイミダゾール誘導体が無い状態である。別の態様において、第1の溶液をアプライする段階は、3~20カラム容積である。別の態様において、第1の溶液をアプライする段階は、3~10カラム容積である。一つの態様において、第2の溶液をアプライする段階は、1~10カラム容積である。別の態様において、第3の溶液をアプライする段階は、1~10カラム容積である。疎水性相互作用クロマトグラフィー材料は、第1の段階において、緩衝溶液で調整される。この溶液は、イミダゾールまたはイミダゾール誘導体を含まない。調整用の第1の緩衝溶液の緩衝物質は、ヒスチジンタグを含むポリペプチドを含む第2の溶液の緩衝物質と同一であり得るか、または異なり得る。その後、ヒスチジンタグを含むポリペプチドを含む第2の溶液が、調整された疎水性相互作用クロマトグラフィー材料にアプライされる。この段階において、ヒスチジンタグを含むポリペプチドは、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料上に保持される。この溶液は、イミダゾールまたはイミダゾール誘導体を含まない。ローディング用、すなわち第2の緩衝溶液の緩衝物質は、第3の溶液の緩衝物質と同一であり得るか、または異なり得る。ヒスチジンタグを含むポリペプチドでのクロマトグラフィー材料のローディングの後、任意で、洗浄用、すなわち第3の溶液が、ローディングされた疎水性相互作用クロマトグラフィー材料にアプライされ得る。この溶液は、イミダゾールまたはイミダゾール誘導体を含まない。最終的に、ヒスチジンタグを含むポリペプチドを疎水性相互作用クロマトグラフィー材料から回収するために、イミダゾールまたはイミダゾール誘導体を含む回収用、すなわち第4の溶液が、クロマトグラフィー材料にアプライされる。一つの態様において、ヒスチジンタグを含むポリペプチドを精製または取得するための方法は、カラムクロマトグラフィー法である。異なる段階において疎水性相互作用クロマトグラフィー材料にアプライされる容積は、互いに独立して、3~20カラム容積であり、一つの態様において、4~10カラム容積である。一つの態様において、第1の溶液の伝導性は、ヒスチジンタグを含むポリペプチドを含む第2の容積の伝導性と同一かもしくはそれより高く、ならびに/または、第3の溶液の伝導性および/もしくは第4の溶液の伝導性よりも高い。本明細書において報告される方法における溶液のpH値は、pH5~pH8である。本明細書において報告される方法は、インスリン様成長因子1およびヒスチジンタグの結合体を用いて実施例において例証される。その調製法は、例えばWO2008025527参照により本明細書に組み入れられるにおいて報告されている。このデータは、本方法を例証するためだけに提示され、かつ本発明の限定として扱われるべきではない。以下の実施例および図面は、本発明の理解を手助けするために提供され、本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に示される。本発明の趣旨から逸脱することなく、示される手順を改変できることが理解される。実施例1材料および方法:他の方法で示されない場合、クロマトグラフィー材料製造業者の取扱説明書に従って、様々なクロマトグラフィー法が行われた。組み換えDNA技術:SambrookJetalMolecularcloningAlaboratorymanualColdSpringHarborLaboratoryPressColdSpringHarborNewYork1989に記載されているような標準的な方法を使用して、DNAを操作した。製造業者の指示書に従って、分子生物学用試薬を使用した。タンパク質の測定:アミノ酸配列に基づいて計算したモル吸光係数を用いて、320nmの参照波長と共に280nmの光学密度ODを測定することにより、タンパク質濃度を測定した。サイズ排除HPLC:クロマトグラフィーを、ASI100HPLCシステムDionexIdsteinGermany上でTosohHaasTSK3000SWXLカラムを用いて行った。溶出ピークを、UVダイオードアレイ検出器Dionexにより280nmでモニタリングした。濃い試料を1mgmlに溶解した後、安定なベースラインが達成されるまで、200mMリン酸二水素カリウムおよび250mM塩化カリウムpH70からなる緩衝液でカラムを洗浄した。分析ランを、アイソクラティック条件下で05ml分の流速を用いて、30分間室温で行った。クロマトグラムを、手動でChromeleonDionexIdsteinGermanyに取り込んだ。逆相HPLCRPHPLC純度を、RPHPLCにより分析する。アッセイを、アセトニトリル/水性TFA勾配を用いてPhenomenexC18カラム上で行う。溶出プロファイルを、215nmでのUV吸光度としてモニタリングする。溶出された物質のパーセンテージを、溶出されたタンパク質のピーク領域全体に基づいて計算する。DNA閾値系:例えば、MerrickHandHawlitschekGBiotechForumEurope9398403を参照されたい。宿主細胞タンパク質の測定:マイクロタイタープレートのウェルの壁を、血清アルブミンおよびストレプトアビジンの混合物でコーティングする。HCPに対するヤギ由来のポリクローナル抗体を、マイクロタイタープレートのウェルの壁に結合させる。洗浄段階の後、マイクロタイタープレートの異なるウェルを、異なる濃度のHCP較正配列および試料溶液と共にインキュベーションする。インキュベーションの後、緩衝溶液での洗浄により、結合していない試料材料を除去する。検出のために、ウェルを抗体ペルオキシダーゼ結合体と共にインキュベーションし、結合した宿主細胞タンパク質を検出する。固定したペルオキシダーゼ活性を、ABTSとのインキュベーションおよび405nmでの検出により検出する。DNAの測定:ビオチンをマイクロタイタープレートに結合させた。ストレプトアビジン、一本鎖DNA、およびビオチン化一本鎖DNA結合タンパク質の反応混合物を添加した。結合タンパク質はDNAに結合することができ、かつビオチン化されていた。この様式において、試料混合物からDNAを特異的に除去することができた。ストレプトアビジンは、マイクロタイタープレート上のビオチン、および一本鎖DNA結合タンパク質に連結したビオチンに結合した。ウレアーゼに連結したDNA特異的抗体を、この複合体全体に添加した。尿素の添加が尿素の加水分解をもたらし、pHの局所的な変化を引き起こした。この変化を、変化した表面電位として検出することができる。表面電位における変化は、結合したDNAの量に比例していた。一本鎖DNAは、プロテイナーゼK消化およびSDSでの変性により取得した。封入体からのペプチドの単離、可溶化、およびリフォールディングのための一般的方法:封入体の調製は、引用された文献において行われている方法に加えて、例えば、Rudolphらによる方法に従って行われ得るRudolphRetalFoldingProteinsInTECreightonProteinfunctionAPracticalApproach5799。封入体を70°Cで保存した。封入体の可溶化は同様に、Rudolphらによる方法に従って行われ得るRudolphRetalFoldingProteinsInTECreightonProteinfunctionAPracticalApproach5799。実施例2イミダゾール溶出を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム上での、ヒスチジンタグが付加されたIGFIの精製樹脂:TOYOPEARL登録商標Polypropylenglycol600;TOYOPEARL登録商標PPG600MTosohBioscienceStuttgartGermanyローディング:a118mgポリペプチドb1034mgポリペプチドc1034mgポリペプチドカラム寸法:a高さ13cm、総容積11mlb高さ22cm、総容積108mlc高さ22cm、総容積108ml平衡化緩衝液/第1の溶液:20mMKH2PO4、08MNaCl、pH35洗浄緩衝液1/第2の溶液:1MTRISHCl、015MNaCl、pH35洗浄緩衝液2/第3の溶液:20mMKH2PO4、08MNaCl、pH35溶出緩衝液/第4の溶液:20mMイミダゾール、pH97溶出法:a20カラム容積における100溶出緩衝液への直線勾配b10カラム容積における50溶出緩衝液への直線勾配c100溶出緩衝液への段階溶出結果:図1~3より見られ得るように、ヒスチジンタグが付加されたIGFI分子は、3種類の使用された溶出法のうち任意のもので、ポリ疎水性相互作用クロマトグラフィー材料から回収され得る。実施例3ヒスチジン溶出を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム上での、ヒスチジンタグが付加されたIGFIの精製樹脂:TOYOPEARL登録商標Polypropylenglycol600;TOYOPEARL登録商標PPG600MTosohBioscienceStuttgartGermanyローディング:123mgポリペプチドカラム寸法:高さ13cm、総容積11ml平衡化緩衝液/第1の溶液:20mMKH2PO4、08MNaCl、pH35洗浄緩衝液1/第2の溶液:1MTRISHCl、015MNaCl、pH35洗浄緩衝液2/第3の溶液:20mMKH2PO4、08MNaCl、pH35溶出緩衝液/第4の溶液:a100mMヒスチジン、pH97b20mMヒスチジン、pH97溶出法:20カラム容積における100溶出緩衝液への直線勾配結果:図4および5より見られ得るように、ヒスチジンタグが付加されたIGFI分子は、2種類の使用された溶出溶液のうち任意のもので、ポリ疎水性相互作用クロマトグラフィー材料から回収され得る。実施例4イミダゾール溶出を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム上での、ヒスチジンタグが付加されたIGFIの精製樹脂:Capto商標ButylGEHealthcareUppsalaSwedenローディング:104mgポリペプチドカラム寸法:高さ135cm、総容積107ml平衡化緩衝液/第1の溶液:20mMKH2PO4、08MNaCl、pH35洗浄緩衝液1/第2の溶液:1MTRISHCl、035MNaCl、20mMクエン酸、pH35洗浄緩衝液2/第3の溶液:20mMKH2PO4、08MNaCl、pH35溶出緩衝液/第4の溶液:20mMイミダゾール、pH97溶出法:10カラム容積における50溶出緩衝液への直線勾配結果:図6より見られ得るように、ヒスチジンタグが付加されたIGFIは、溶出緩衝液でブチル疎水性相互作用クロマトグラフィー材料から回収され得る。実施例5比較実施例‐リン酸溶出を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム上での、ヒスチジンタグが付加されたIGFIの精製樹脂:TOYOPEARL登録商標Ether650MTosohBioscienceStuttgartGermanyローディング:102mgポリペプチド平衡化緩衝液/第1の溶液:20mMKH2PO4、1MNaCl、pH70洗浄緩衝液1/第2の溶液:20mMKH2PO4、1MNaCl、pH70溶出緩衝液/第4の溶液:20mMKH2PO4、pH70溶出法:100溶出緩衝液への段階溶出結果:図7より見られ得るように、ヒスチジンタグが付加されたIGFI分子は、リン酸を含有する緩衝液単独では、エーテル疎水性相互作用クロマトグラフィー材料から回収できない。実施例6比較実施例‐異なる溶出を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム上での、ヒスチジンタグが付加されたIGFIの精製樹脂:aPhenylSepharose商標GEHealthcareUppsalaSwedenbTOYOPEARL登録商標PPG600MTosohBioscienceStuttgartGermanyローディング:80mgポリペプチドカラム寸法:高さ14cm、総容積11ml平衡化緩衝液/第1の溶液:a20mMKH2PO4、08MNaCl、pH35b20mMKH2PO4、15MNaCl、pH35洗浄緩衝液1/第2の溶液:a1MTRISHCl、035MNaCl、20mMクエン酸、pH35b洗浄緩衝液2/第3の溶液:a20mMKH2PO4、08MNaCl、pH35b20mMKH2PO4、15MNaCl、pH35溶出緩衝液/第4の溶液:a5mMイミダゾール、20vv2プロパノール、pH70b15MNaCl、20vv2プロパノール、pH35溶出法:a10カラム容積における50溶出緩衝液への直線勾配b30カラム容積における100溶出緩衝液への直線勾配結果:図8より見られ得るように、ヒスチジンタグが付加されたIGFIは、イミダゾールおよび2プロパノールを含有する溶出緩衝液で、PhenylSepharose商標疎水性相互作用クロマトグラフィー材料から急なピークで回収され得る。これは、イミダゾールを含まない溶出緩衝液では達成できない図9を参照されたい。実施例7比較実施例‐イミダゾール溶出を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム上での、ヒスチジンタグが付加されたIGFIの精製樹脂:Capto商標PhenylGEHealthcareUppsalaSwedenローディング:117mgポリペプチドカラム寸法:高さ135cm、総容積107ml平衡化緩衝液/第1の溶液:20mMKH2PO4、08MNaCl、pH35洗浄緩衝液1/第2の溶液:1MTRISHCl、035MNaCl、20mMクエン酸、pH35洗浄緩衝液2/第3の溶液:20mMKH2PO4、08MNaCl、pH35溶出緩衝液/第4の溶液:20mMイミダゾール、pH97溶出法:10カラム容積における50溶出緩衝液への直線勾配結果:図10より見られ得るように、ヒスチジンタグが付加されたIGFIは、溶出緩衝液でフェニル疎水性相互作用クロマトグラフィー材料から回収できない。実施例8比較実施例‐イミダゾール溶出を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム上での、Herceptin登録商標の精製培養上清を、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料にアプライする前に、pH35および08モルlのNaCl濃度に調整し、かつSartobranPフィルターで濾過する。樹脂:TOYOPEARL登録商標Polypropylenglycol600;TOYOPEARL登録商標PPG600MTosohBioscienceStuttgartGermanyローディング:189mgポリペプチドカラム寸法:高さ16cm、総容積126ml平衡化緩衝液/第1の溶液:20mMKH2PO4、08MNaCl、pH35洗浄緩衝液1/第2の溶液:1MTRISHCl、035MNaCl、20mMクエン酸、pH35溶出緩衝液/第4の溶液:a20mMイミダゾール、pH97b20mMKH2PO4、pH89溶出法:a10カラム容積における50溶出緩衝液への直線勾配b20カラム容積における100溶出緩衝液への直線勾配結果:Herceptin登録商標の画分は、イミダゾール溶出によりフロースルーにおいて見出され得る。さらなる画分が、溶出の初めに小さなピークとしてカラムから回収され得る。それと対照的に、図11に示されるように、リン酸緩衝溶液での溶出により、Herceptin登録商標は急なピークとして取得され得る。