式の化合物式中、AはC2~8アルキレン基でありR1、R2、R3、およびR4は、水素、C1~4アルキル、C2~4ジヒドロキシアルキルから独立して選択され、またはR2およびR3は一緒に、R2およびR3が結合している窒素原子とともに複素環式環を形成しているC2~6アルキレン基を形成しておりX1、X2およびX3は、水素、ヒドロキシル、NR1ANR2R3R41m、ハロゲノアミノ、C1~4アルコキシまたはC2~8アルカノイルオキシから独立して選択され1mは、電荷mのアニオンであるまたは基NR1が四級化されている誘導体。X1、X2およびX3のうちの少なくとも1つが、NR1ANR2R3R41mである、請求項1に記載の化合物。X1およびX3ではなくX2が、NR1ANR2R3R41mである、請求項2に記載の化合物。X1およびX3が両方ともヒドロキシルである、請求項1から3のいずれか一項に記載の化合物。X1およびX3が両方とも水素である、請求項1から3のいずれか一項に記載の化合物。R1が水素である、請求項1から5のいずれか一項に記載の化合物。R2、R3およびR4がC1~4アルキルである、請求項1から6のいずれか一項に記載の化合物。R2、R3およびR4がメチルである、請求項7に記載の化合物。Aが2である、請求項1から8のいずれか一項に記載の化合物。式の化合物式の化合物核酸および式の化合物式中、AはC2~8アルキレン基でありR1、R2、R3、およびR4は、水素、C1~4アルキル、C2~4ジヒドロキシアルキルから独立して選択され、またはR2およびR3は一緒に、R2およびR3が結合している窒素原子とともに複素環式環を形成しているC2~6アルキレン基を形成しておりX1、X2およびX3は、水素、ヒドロキシル、NR1ANR2R3R41m、ハロゲノアミノ、C1~4アルコキシまたはC2~8アルカノイルオキシから独立して選択され1mは、電荷mのアニオンであるまたは基NR1が四級化されている誘導体を含む蛍光複合体。核酸がDNAである、請求項12に記載の複合体。DNAが細胞中に存在する、請求項13に記載の複合体。DNAが、インタクトではない細胞中に存在する、請求項14に記載の複合体。核酸を含有する細胞または別の生体材料の試料を分析する方法であって、a式の化合物式中、AはC2~8アルキレン基でありR1、R2、R3およびR4は、水素、C1~4アルキル、C2~4ジヒドロキシアルキルから独立して選択され、またはR2およびR3は一緒に、R2およびR3が結合している窒素原子とともに複素環式環を形成しているC2~6アルキレン基を形成しておりX1、X2およびX3は、水素、ヒドロキシル、NR1ANR2R3R41m、ハロゲノアミノ、C1~4アルコキシまたはC2~8アルカノイルオキシから独立して選択され1mは、電荷mのアニオンであるまたは基NR1が四級化されている誘導体を含有する生物学的に適合性の溶液を調製するステップb細胞または別の生体材料の試料を前記生物学的に適合性の溶液で処理するステップおよびc式の化合物による電磁放射線の吸収と関連した分光学的特性を検出するステップを含む方法。式の化合物による電磁放射線の吸収と関連した分光学的特性が蛍光であり、ステップcが、式の化合物を電磁放射線で励起するステップ、および放射された蛍光シグナルを検出するステップを含む、請求項16に記載の方法。式の化合物による電磁放射線の吸収と関連した分光学的特性が色度特性である、請求項16に記載の方法。細胞の試料において細胞核を識別するための請求項16から18のいずれか一項に記載の方法であって、ステップbを実施して、式の化合物による細胞核中での核酸の結合を引き起こし、細胞核の識別が、ステップcにおいて検出される分光学的特性に少なくとも一部基づく、方法。ステップbを実施して、細胞の試料を式の化合物で染色する、請求項16から19のいずれか一項に記載の方法。細胞死発生がモニターされる請求項20に記載の方法であって、ステップbを、アッセイ期間の前またはその期間中に実施し、それによって前記アッセイ期間中の細胞死発生の連続的なまたは高頻度の読み出しを可能にする、方法。ステップcが、個々の細胞によって放射される蛍光をフローサイトメトリーによって検出するステップを含む、請求項17または請求項17に従属する請求項18から21のいずれか一項に記載の方法。ステップcが、蛍光顕微鏡法による細胞内局在の検出を含む、請求項17または請求項17に従属する請求項18から21のいずれか一項に記載の方法。固定または透過処理した細胞を分析するための請求項16から23のいずれか一項に記載の方法であって、細胞の試料が、固定剤または透過剤での処理によって固定される、方法。ステップbが、試料を少なくとも1種の別の蛍光色素または発光化合物で処理するステップをさらに含み、ステップcが、前記蛍光色素または発光化合物による電磁放射線の吸収と関連した分光学的特性を検出するステップをさらに含む、請求項16から24のいずれか一項に記載の方法。インタクト細胞とインタクトではない細胞とを識別するための請求項25に記載の方法であって、式の化合物が細胞不透過性であり、ステップbが、試料を、細胞透過性である第2の蛍光色素または発光化合物で処理するステップをさらに含み、ステップcが、第2の蛍光色素または発光化合物による電磁放射線の吸収と関連した分光学的特性を検出するステップをさらに含み、式の化合物による電磁放射線の吸収と関連した分光学的特性の検出が、インタクトではない細胞の存在と相関し、第2の蛍光色素または発光化合物による電磁放射線の吸収と関連した分光学的特性の検出が、インタクト細胞の存在と相関する、方法。第2の蛍光色素または発光化合物が、識別される細胞中の核酸およびまたは別の巨大分子材料に対する、式の化合物の結合能より低い結合能を有し、結果として式の化合物の存在下において、識別される細胞中の核酸およびまたは別の巨大分子材料に対する結合についてより低い効率で競合し、その結果、第2の蛍光色素または発光化合物が、インタクトではない細胞に対する結合から実質的に排除される、または式の化合物によって遮蔽される、請求項26に記載の方法。第2の蛍光色素または発光化合物が、式の化合物またはそのNオキシド誘導体式中、Aは、C2~8アルキレン基でありR1、R2およびR3は、水素、C1~4アルキル、C2~4ジヒドロキシアルキルから独立して選択され、またはR2およびR3は一緒に、R2およびR3が結合している窒素原子とともに複素環式環を形成しているC2~6アルキレン基を形成しておりX1、X2およびX3は、水素、ヒドロキシル、NR1ANR2R3、ハロゲノアミノ、C1~4アルキルオキシまたはC2~8アルカノイルオキシから独立して選択されるである、請求項26または請求項27に記載の方法。X1およびX3ではなくX2がNR1ANR2R3である、請求項28に記載の方法。潜在的に細胞毒性である、または別様に細胞死を誘導することができる作用物質の、細胞の試料に対する作用をモニターするために、インタクト細胞とインタクトではない細胞との識別が、細胞の試料が前記作用物質に曝露された後に行われる、請求項26から29のいずれか一項に記載の方法。ステップbが、試料を少なくとも第3の蛍光色素または発光化合物で処理するステップをさらに含み、ステップcが、少なくとも第3の蛍光色素または発光化合物による電磁放射線の吸収と関連した分光学的特性を検出するステップおよび前記分光学的特性を、インタクト細胞およびまたはインタクトではない細胞の特徴または特性と相関させるステップをさらに含む、請求項26から30のいずれか一項に記載の方法。第3の蛍光色素または発光化合物の検出される分光学的特性が、式の化合物の検出される分光学的特性と同様であり、かつ第2の蛍光色素または発光化合物の検出される分光学的特性とは違っており、第3の蛍光色素または発光化合物の検出される分光学的特性が、インタクト細胞の特徴または特性と相関する、請求項31に記載の方法。第3の蛍光色素または発光化合物の検出される分光学的特性が、第2の蛍光色素または発光化合物の検出される分光学的特性と同様であり、かつ式の化合物の検出される分光学的特性とは違っており、第3の蛍光色素または発光化合物の検出される分光学的特性が、インタクトではない細胞の特徴または特性と相関する、請求項31に記載の方法。ステップcにおいて検出される分光学的特性が、電磁スペクトルの所定の領域において放射される蛍光であり、ステップcが、式の化合物、第2のおよび任意選択により第3のおよび任意のさらなる蛍光色素または発光化合物を電磁放射線で励起するステップを含む、請求項26から33のいずれか一項に記載の方法。式の化合物、第2のおよび任意選択により第3の蛍光色素または発光化合物が、単一の電磁放射線源によって同時励起される、請求項34に記載の方法。第3の蛍光色素または発光化合物の放射される蛍光が、i好ましくは赤色およびまたは近赤外領域内の、式の化合物の放射される蛍光のものと同様であり、ii第2の蛍光色素または発光化合物の放射される蛍光のものとは違っている、電磁スペクトルの事前に定めた領域内にある、請求項32に従属する請求項35に記載の方法。第3の蛍光色素または発光化合物の放射される蛍光が、i好ましくは橙色領域内の、第2の蛍光色素または発光化合物の放射される蛍光のものと同様であり、ii式の化合物の放射される蛍光のものとは違っている、電磁スペクトルの事前に定めた領域内にある、請求項33に従属する請求項35に記載の方法。ステップcが、フローサイトメトリーを使用して実施される、請求項26から37のいずれか一項に記載の方法。ステップcが、細胞からの光散乱の測定をさらに含む、請求項26から38のいずれか一項に記載の方法。インタクト細胞とインタクトではない細胞とを識別する方法であって、a細胞不透過性の蛍光色素または発光化合物を含有する生物学的に適合性の溶液を調製するステップb識別される細胞中の核酸およびまたは別の巨大分子材料に対して、細胞不透過性の蛍光色素または発光化合物の結合能より低い結合能を有し、結果として、細胞不透過性の蛍光色素または発光化合物の存在下において、識別される細胞中の核酸およびまたは別の巨大分子材料に対する結合についてより低い効率で競合し、その結果、細胞透過性の蛍光色素または発光化合物が、インタクトではない細胞に対する結合から実質的に排除される、または細胞不透過性の蛍光色素または発光化合物によって遮蔽される、細胞透過性の蛍光色素または発光化合物を含有する生物学的に適合性の溶液を調製するステップc細胞の試料を、前記生物学的に適合性の溶液で処理するステップおよびd細胞不透過性の蛍光色素または発光化合物による電磁放射線の吸収と関連した分光学的特性を検出し、それをインタクトではない細胞の存在と相関させ、細胞透過性の蛍光色素または発光化合物による電磁放射線の吸収と関連した分光学的特性を検出し、それをインタクト細胞の存在と相関させるステップを含む方法。請求項26から40までのいすれか一項に記載の方法において使用するための検出システムであって、前記方法において使用される蛍光色素および発光化合物を励起するための1つまたは複数の電磁放射線源蛍光色素および発光化合物による電磁放射線の吸収と関連した分光学的特性を検出するための複数の検出器および検出される分光学的特性をインタクト細胞およびインタクトではない細胞の存在と相関させ、それによってインタクト細胞とインタクトではない細胞とを識別するように適合された検出器分析システムを含むシステム。前記検出器が蛍光検出器である、請求項41に記載の検出システム。蛍光色素および発光化合物を同時励起するための単一の電磁放射線源を有する、請求項41または請求項42に記載の検出システム。複数の検出器が、蛍光色素および発光化合物のすべての分光学的特性を検出する検出器の対の形態である、請求項41から43のいずれか一項に記載の検出システム。請求項1に記載の化合物の、少なくとも第2の蛍光色素または発光化合物との混合物を含む組成物。請求項1に記載の化合物、ならびに関連する容器および試薬を含む、請求項16から39のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキットオブパーツ。式の化合物のアミノアルキルアミノ前駆体化合物を提供するステップおよび前記アミノアルキルアミノ前駆体化合物を四級化するステップを含む、請求項1に記載の化合物を製造する方法。加えて、細胞および別の生体材料の分析のための蛍光色素の有用な特性を改善することが継続して必要である。本発明は、その実施形態の少なくともいくつかにおいて、上述した問題および必要性に対処する。特に、本発明は、その実施形態の少なくともいくつかにおいて、改善された細胞不透過性色素を提供し、細胞不透過性色素および細胞透過性色素を使用した生死細胞識別のために使用することができる改善されたシステムをさらに提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、遠赤外における好ましい発光を有し、橙色赤色スペクトル領域における減少した発光を有する細胞不透過性色素を提供する。本発明の第1の態様によれば、式の化合物式中、Aは、C2~8アルキレン基でありR1、R2、R3、およびR4は、水素、C1~4アルキル、C2~4ジヒドロキシアルキルから独立して選択され、またはR2およびR3は一緒に、R2およびR3が結合している窒素原子とともに複素環式環を形成しているC2~6アルキレン基を形成しておりX1、X2およびX3は、水素、ヒドロキシル、NR1ANR2R3R41m、ハロゲノアミノ、C1~4アルコキシまたはC2~8アルカノイルオキシから独立して選択され1mは、電荷mのアニオンであるまたは基NR1が四級化されている誘導体が提供される。好ましくは、mは1である。細胞および別の生体材料を分析するための色素として使用される場合、非常に多くの利点がこれらの化合物の少なくともいくつかと関連している。利点は、以下を含む細胞ベースのアッセイにおいて、一般に使用される等張緩衝液条件と適合性の濃度の範囲でのアッセイへの即時の組み込みのための水溶性。マルチプルアッセイ内で、再現可能な配備および好都合な保管のための、化学的純度および安定性。ほとんどまたは全くスペクトルの重なりのない可視範囲の蛍光を用いるマルチパラメーターアッセイへの即時の組み込みのための赤色遠赤外蛍光特性、または赤色蛍光との容易な使用のための、橙色蛍光有核細胞の分析を必要とする用途のための、高親和性核酸結合特性。既知の程度の蛍光発光の強度とDNA結合の程度との間の化学量論比を可能にするために、核酸への結合時に蛍光を増強しないこと。結合している分子の局在化した濃度に起因する、核の結合時の増加したシグナルに対する、結合していない色素のバックグラウンド蛍光の相対的な低減を提供するための低い内因性蛍光。膜が損なわれているまたは色素分子を排除することができない細胞の選択的および陽性染色のための、細胞不透過特性。イメージングまたはフローサイトメトリーまたは別の検出プラットホームによる蛍光発光の検出による、すべての有核細胞のための直接DNA染色剤として使用するための、固定細胞における核識別特性。色素が、増殖の阻害などの有害な作用を有さずに、生物学的適用の間、長期間にわたって細胞とともに同時インキュベートすることができるような、インタクト細胞に対する低毒性。多様な期間にわたる細胞の細胞不透過性色素とのインキュベーションおよび細胞染色を検出するための同じ集団の一時的なサンプリングによってモニターされる細胞の完全性の喪失の時間依存的な分析を可能にする、上記の特性の組み合わせ。本発明は、とりわけ蛍光色素として使用されてもよい、四級化されたアミノアルキルアミノアントラキノン化合物を提供する。四級化されたアミノアルキルアミノ置換基は、少なくとも1位に存在する。さらに四級化されたアミノアルキルアミノ置換基は、4位、5位、もしくは8位、またはこれらの組み合わせに存在してもよい。国際公開WO9105824およびWO9965992は、本発明の化合物の合成の前駆体として使用することができる様々な種類のアミノアルキルアミノアントラキノン化合物を開示している。好ましくは、X1、X2およびX3のうちの少なくとも1つは、NR1ANR2R3R41mである。特に好ましい実施形態において、X2が、NR1ANR2R3R41m、すなわち、四級化されたアミノアルキルアミノ基で1位、5位が置換されているアントラキノンである。別の好ましいクラスの化合物において、X1が、NR1ANR2R3R41m、すなわち、1位、4位に四級化されたアミノアルキルアミノ置換基を有するアントラキノンである。18置換されている類似体もまた可能である。有利には、X1およびX3は両方ともヒドロキシルである。別の好ましい実施形態において、X1およびX3は両方とも水素である。好ましくは、R1は水素であるが、この位置のアミノ部分が第三級アミンである化合物を利用することが可能である。これらの実施形態において、R1はC1~4アルキルであることが好ましい。R2、R3およびR4は、C1~4アルキルであることが好ましい。有利には、R2、R3およびR4は、メチルである。好ましい実施形態において、Aは2である。特に好ましい実施形態において、化合物は、式のものである別の好ましい化合物は、式である本発明の化合物の具体的な例は、ヨウ化物などの適した対アニオンと組み合わせて下記に列挙されている化合物によって提供される。12エチルアミノアントラセン910ジオン12エチルアミノ58ジヒドロキシアントラセン910ジオン18ビス2エチルアミノアントラセン910ジオン18ビス2エチルアミノ58ジヒドロキシアントラセン910ジオン14ビス2エチルアミノアントラセン910ジオン14ビス2エチルアミノ58ジヒドロキシアントラセン910ジオン12エチルアミノアントラセン910ジオン12エチルアミノ58ジヒドロキシアントラセン910ジオン15ビス2エチルアミノアントラセン910ジオン15ビス2エチルアミノ58ジヒドロキシアントラセン910ジオン14ビス2エチルアミノアントラセン910ジオン14ビス2エチルアミノ58ジヒドロキシアントラセン910ジオン18ビス2エチルアミノアントラセン910ジオン18ビス2エチルアミノ58ジヒドロキシアントラセン910ジオン12プロピルアミノ58ジヒドロキシアントラセン910ジオンヨージド18ビス2プロピルアミノ58ジヒドロキシアントラセン910ジオン15ビス2プロピルアミノ58ジヒドロキシアントラセン910ジオン14ビス2プロピルアミノ58ジヒドロキシアントラセン910ジオン12プロピルアミノ58ジヒドロキシアントラセン910ジオン15ビス2プロピルアミノ58ジヒドロキシアントラセン910ジオン14ビス2プロピルアミノ58ジヒドロキシアントラセン910ジオン18ビス2プロピルアミノ58ジヒドロキシアントラセン910ジオン15ビス2ブチルアミノアントラセン910ジオン14ビス2ブチルアミノアントラセン910ジオン18ビス2ブチルアミノアントラセン910ジオン15ビス2ブチルアミノ58ジヒドロキシアントラセン910ジオン14ビス2ブチルアミノ58ジヒドロキシアントラセン910ジオン18ビス2ブチルアミノ58ジヒドロキシアントラセン910ジオン本発明の化合物は、任意の適した対アニオンを含み得る。対アニオンの例は、リン酸および硫酸などの無機酸、ならびに酢酸、アスコルビン酸、安息香酸、クエン酸、フマル酸、グルコン酸、イセチオン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、コハク酸、スルファミン酸および酒石酸などの有機酸から得られる、塩化物、臭化物およびヨウ化物などのハロゲン化物、生理学的に許容されるアニオンである。本発明の化合物は、式の化合物のアミノアルキルアミノ前駆体化合物の四級化によって好都合に調製することができる。四級化プロセスは、前駆体のアルキル化または適した有機または無機酸を使用した酸付加塩の形成を経由する四級化を含むことができる。国際公開WO9105824およびWO9965992に関連して以前に論じられたアミノアルキルアミノアントラキノン化合物は、四級化ステップの適した前駆体化合物として機能することができる。四級化されて本発明の化合物を生成する前駆体化合物の合成のための別の経路は、当業者に容易に明らかであるだろう。本発明は、上記に定義されている式の化合物を、生理学的に許容される希釈剤または担体とともに含む組成物に及ぶ。本発明の第2の態様によれば、核酸および式の化合物式中、Aは、C2~8アルキレン基でありR1、R2、R3、およびR4は、水素、C1~4アルキル、C2~4ジヒドロキシアルキルから独立して選択され、またはR2およびR3は一緒に、R2およびR3が結合している窒素原子とともに複素環式環を形成しているC2~6アルキレン基を形成しておりX1、X2およびX3は、水素、ヒドロキシル、NR1ANR2R3R41m、ハロゲノアミノ、C1~4アルコキシまたはC2~8アルカノイルオキシから独立して選択され1mは、電荷mのアニオンであるまたは基NR1が四級化されている誘導体を含む蛍光複合体が提供される。核酸は、DNAであってもよく、DNAは、細胞中に存在してもよい。DNAは、インタクトではない細胞中に存在してもよい。本発明の第3の態様によれば、核酸を含有する細胞または別の生体材料の試料を分析する方法であって、a式の化合物式中、Aは、C2~8アルキレン基でありR1、R2、R3、およびR4は、水素、C1~4アルキル、C2~4ジヒドロキシアルキルから独立して選択され、またはR2およびR3は一緒に、R2およびR3が結合している窒素原子とともに複素環式環を形成しているC2~6アルキレン基を形成しておりX1、X2およびX3は、水素、ヒドロキシル、NR1ANR2R3R41m、ハロゲノアミノ、C1~4アルコキシまたはC2~8アルカノイルオキシから独立して選択され1mは、電荷mのアニオンであるまたは基NR1が四級化されている誘導体を含有する生物学的に適合性の溶液を調製するステップb細胞または別の生体材料の試料を生物学的に適合性の溶液で処理するステップおよびc式の化合物による電磁放射線の吸収と関連した分光学的特性を検出するステップを含む方法が提供される。有利には、式の化合物による電磁放射線の吸収と関連した分光学的特性は蛍光であり、ステップcは、式の化合物を電磁放射線で励起するステップ、および放射された蛍光シグナルを検出するステップを含む。事前に定めたスペクトル領域中の蛍光強度が測定されてもよいが、蛍光寿命の測定などの別の検出スキームが使用されてもよい。代替として、式の化合物による電磁放射線の吸収と関連した分光学的特性は色度特性であってもよい。有利には、方法は、細胞の試料における細胞核の識別のために使用されてもよく、ここで、ステップbを実施して、式の化合物による細胞核中での核酸の結合を引き起こし、細胞核の識別は、ステップcにおいて検出される分光学的特性に少なくとも一部基づく。ステップbを実施して、細胞の試料を式の化合物で染色してもよい。有利には、方法は、細胞死発生がモニターされる方法であってよく、ここで、ステップbを、アッセイ期間の前またはその期間中に実施し、それによってアッセイ期間中の細胞死発生の連続的なまたは高頻度の読み出しを可能にする。式の化合物は、これらの方法において使用するために特に好ましい。このアプローチは、不透過性の本発明の化合物の非毒性を利用する。このことは、式の化合物を細胞混合物とともに含み、その結果、式の化合物が試験の間に存在することが可能であることを意味する。細胞が死ぬとき、細胞は、式の化合物で染色される。式の化合物は、細胞死を引き起こす可能性がある任意の処理の前、処理中または処理後に添加されてもよい。このことは、連続的に行われ得る試験の間のサンプリングを許容する。ステップcは、フローサイトメトリーによって個々の細胞によって放射される蛍光を検出すること、蛍光顕微鏡法による細胞内局在の検出、または任意の別の適した種類の蛍光に基づく検出技術を含んでもよい。イメージング技術が用いられてもよい。蛍光強度、偏光、蛍光寿命、蛍光スペクトル、および標本または分析されている試料内のそのような性質の空間的配置を含むが排他的ではない蛍光シグナルの分析のために、様々なイメージングシステムが用いられてもよいことが理解される。特定の好ましい実施形態において、固定または透過処理した細胞が分析され、ここで、細胞の試料は、固定剤または透過剤での処理によって固定される。固定および透過処理した細胞における細胞核の識別および染色は、特に好ましい実施形態である。別の好ましい実施形態において、ステップbは、試料を少なくとも1種の別の蛍光色素または発光化合物で処理するステップをさらに含み、ステップcは、蛍光色素または発光化合物による電磁放射線の吸収と関連した分光学的特性を検出するステップをさらに含む。別の蛍光色素または発光化合物と関連したステップbおよびcは、式の化合物と関連したステップbおよびcと同時に、または別々に実施されてもよい。特に好ましい実施形態において、方法は、インタクト細胞とインタクトではない細胞とを識別し、ここで、式の化合物は細胞不透過性であり、ステップbは、試料を、細胞透過性である第2の蛍光色素または発光化合物で処理するステップをさらに含み、ステップcは、第2の蛍光色素または発光化合物による電磁放射線の吸収と関連した分光学的特性を検出するステップをさらに含み、式の化合物による電磁放射線の吸収と関連した分光学的特性の検出は、インタクトではない細胞の存在と相関し、第2の蛍光色素または発光化合物による電磁放射線の吸収と関連した分光学的特性の検出は、インタクト細胞の存在と相関する。インタクトではない細胞は、死細胞、および損なわれているまたは破壊された膜を有する損傷細胞を含むと理解される。有利には、第2の蛍光色素または発光化合物は、識別される細胞中の核酸およびまたは別の巨大分子材料に対する、式の化合物のものより低い結合能を有し、結果として式の化合物の存在下において、識別される細胞中の核酸およびまたは別の巨大分子材料に対する結合についてより低い効率で競合し、その結果、第2の蛍光色素または発光化合物は、インタクトではない細胞に対する結合から実質的に排除される、または式の化合物によって遮蔽される。損傷細胞中の式の化合物による第2の蛍光色素または発光化合物の好ましい完全な排除は、蛍光発光の二重分析に基づいた最適な識別を提供する。さらに、第2の蛍光色素または発光化合物からの蛍光シグナルは、式の化合物で最適に標識された損傷細胞において効率的に消去されるが、また、第2の蛍光色素または発光化合物の比に対する式の化合物の比を単に変化させることによって、弱めたレベルで検出可能でもあり、上述したような範囲の共染色条件によって達成される蛍光のレシオメトリック分析を提供することができる。好ましくは、第2の蛍光色素または発光化合物のモル比に対する式の化合物の化合物のモル比は、110および101、より好ましくは320の範囲であるだろう。好ましくは、第2の蛍光色素または発光化合物の存在を排他的に報告するインタクト細胞の染色は、全色素結合に関連する細胞量および有核細胞について陽性の蛍光を識別するものとしての細胞内核酸の存在を含むが排他的ではない細胞状態の決定において、価値のあるさらなる情報を提供する。細胞の量の変化の好ましい指示は、好ましくは長期の増殖阻害または細胞周期停止を受けている細胞の分析において、細胞分裂に介入することなく代謝が進行し続けている細胞間で区別が行われることを許容する。好ましくは、第2の蛍光色素または発光化合物は、式の化合物またはそのNオキシド誘導体式中、Aは、C2~8アルキレン基でありR1、R2、およびR3は、水素、C1~4アルキル、C2~4ジヒドロキシアルキルから独立して選択され、またはR2およびR3は一緒に、R2およびR3が結合している窒素原子とともに複素環式環を形成しているC2~6アルキレン基を形成しておりX1、X2およびX3は、水素、ヒドロキシル、NR1ANR2R3、ハロゲノアミノ、C1~4アルキルオキシまたはC2~8アルカノイルオキシから独立して選択されるである。好ましい実施形態において、式の化合物は、15アミノ置換アントラキノンであり、すなわち、X2はNR1ANR2R3であるが、X1およびX3はそうではない。このクラスの15アミノ置換アントラキノンの特に好ましい実施形態は、式の化合物である。有利には、潜在的に細胞毒性である、または別様に細胞死を誘導することができる作用物質の細胞の試料に対する作用をモニターするために、インタクト細胞とインタクトではない細胞との識別は、細胞の試料が作用物質に曝露された後に行われる。さらに好ましい実施形態において、ステップbは、試料を、少なくとも第3の蛍光色素または発光化合物で処理するステップをさらに含み、ステップcは、電磁放射線の吸収と関連した分光学的特性を、少なくとも第3の蛍光色素または発光化合物によって検出するステップおよび前記分光学的特性を、インタクト細胞およびまたはインタクトではない細胞の特徴または特性と相関させるステップをさらに含む。第3の蛍光色素または発光化合物の検出される分光学的特性は、式の化合物の検出される分光学的特性と同様であり、かつ第2の蛍光色素または発光化合物の検出される分光学的特性とは違っていてもよく、ここで、第3の蛍光色素または発光化合物の検出される分光学的特性は、インタクト細胞の特徴または特性と相関する。第3の蛍光色素または発光化合物の検出される分光学的特性は、第2の蛍光色素または発光化合物の検出される分光学的特性と同様であり、かつ式の化合物の検出される分光学的特性とは違っていてもよく、ここで、第3の蛍光色素または発光化合物の検出される分光学的特性は、インタクトではない細胞の特徴または特性と相関する。好ましくは、ステップcにおいて検出される分光学的特性は、電磁スペクトルの事前に定めた領域中の放射される蛍光であり、ステップcは、式の化合物、第2の、および任意選択により第3の、および任意のさらなる蛍光色素または発光化合物を電磁放射線で励起するステップを含む。有利には、式の化合物、第2のおよび任意選択により第3の蛍光色素または発光化合物は、単一の電磁放射線源によって同時励起される。有利には、第3の蛍光色素または発光化合物の放射される蛍光は、i好ましくは赤色およびまたは近赤外領域内の、式の化合物の放射される蛍光のものと同様であり、ii第2の蛍光色素または発光化合物の放射される蛍光のものとは違っている、電磁スペクトルの事前に定めた領域内にある。第3の蛍光色素は、Qdot705nm放射ナノ結晶であってもよい。有利には、第3の蛍光色素または発光化合物の放射される蛍光は、i好ましくは橙色領域内の、第2の蛍光色素または発光化合物の放射される蛍光のものと同様であり、ii式の化合物の放射される蛍光のものとは違っている、電磁スペクトルの事前に定めた領域内にある。方法が、インタクト細胞とインタクトではない細胞とを識別する実施形態において、ステップcは、フローサイトメトリーを使用して、およびまたは蛍光顕微鏡法を使用して実施されて、蛍光発光の細胞局在に関する情報を提供してもよい。蛍光強度、偏光、蛍光寿命、蛍光スペクトル、および標本または分析されている試料内のそのような性質の空間的配置を含むが排他的ではない蛍光シグナルの分析のために、様々なイメージングシステムが用いられてもよいことが理解される。ステップcは、細胞からの光散乱の測定をさらに含んでもよい。しかしながら、有用な結果は、光散乱測定が実施されることを必要とせずに同様に得ることができる。測定は、時間分解されたデータを取得するために、例えば、細胞の完全性の発生した変化を調査するために、または第2のおよびまたは第3の蛍光色素または発光化合物の存在と相関する特性によって決定される、識別されるインタクト細胞の変化を調査するために、ある期間にわたって行われてもよい。本発明の第4の態様によれば、インタクト細胞とインタクトではない細胞とを識別する方法であって、a細胞不透過性の蛍光色素または発光化合物を含有する生物学的に適合性の溶液を調製するステップb識別される細胞中の核酸およびまたは別の巨大分子材料に対する、細胞不透過性の蛍光色素または発光化合物の結合能よりも低い結合能を有し、結果として、細胞不透過性の蛍光色素または発光化合物の存在下において、識別される細胞中の核酸およびまたは別の巨大分子材料に対する結合についてより低い効率で競合し、その結果、細胞透過性の蛍光色素または発光化合物が、インタクトではない細胞に対する結合から実質的に排除される、または細胞不透過性の蛍光色素または発光化合物によって遮蔽される、細胞透過性の蛍光色素または発光化合物を含有する生物学的に適合性の溶液を調製するステップc細胞の試料を、生物学的に適合性の1種または複数の溶液で処理するステップおよびd細胞不透過性の蛍光色素または発光化合物による電磁放射線の吸収と関連した分光学的特性を検出し、それをインタクトではない細胞の存在と相関させ、細胞透過性の蛍光色素または発光化合物による電磁放射線の吸収と関連した分光学的特性を検出し、それをインタクト細胞の存在と相関させるステップを含む方法が提供される。上記で論じた細胞透過性色素に加えて、以下の色素が、細胞透過性の蛍光色素または発光化合物として使用されてもよいSYTOX色素より低い親和性を有し、生細胞に流入することができる細胞透過性のシアニン色素、排他的ではないが好ましくは、SYTO40青色蛍光核酸染色剤、SYTO59赤色蛍光核酸染色剤、SYTO60赤色蛍光核酸染色剤、SYTO61赤色蛍光核酸染色剤、SYTO62赤色蛍光核酸染色剤、SYTO63赤色蛍光核酸染色剤、SYTO64赤色蛍光核酸染色剤、SYTOX青色核酸染色剤、SYTO40青色蛍光核酸染色剤、SYTO41青色蛍光核酸染色剤、SYTO42青色蛍光核酸染色剤、SYTO45青色蛍光核酸染色剤、SYTO80橙色蛍光核酸染色剤、SYTO81橙色蛍光核酸染色剤、SYTO82橙色蛍光核酸染色剤、SYTO83橙色蛍光核酸染色剤、SYTO84橙色蛍光核酸染色剤、SYTO85橙色蛍光核酸染色剤、SYTOX橙色核酸染色剤、SYTO10緑色蛍光核酸染色剤、SYTO9緑色蛍光核酸染色剤、SYTOBC緑色蛍光核酸染色剤、SYTOX青色死細胞染色剤、SYTOX緑色核酸染色剤、SYTO21緑色蛍光核酸染色剤、SYTO24緑色蛍光核酸染色剤、SYTO25緑色蛍光核酸染色剤、SYTO11緑色蛍光核酸染色剤、SYTO12緑色蛍光核酸染色剤、SYTO13緑色蛍光核酸染色剤、SYTO14緑色蛍光核酸染色剤、SYTO16緑色蛍光核酸染色剤、およびSYTO17赤色蛍光核酸染色剤。DAPIUV励起可能なDNA結合蛍光色素4’6ジアミジノ2フェニルインドール、二塩酸塩または4’6ジアミジノ2フェニルインドール、ジラクテート副溝結合Hoechst色素、排他的ではないが好ましくはHoechst34580、青色蛍光AT選択的、副溝結合dsDNA選択的蛍光色素である五水和物としてのHoechst33258、青色蛍光AT選択的、副溝結合dsDNA選択的結合性の三塩酸塩、三水和物としてのHoechst33342核酸染色剤であるLDS7517アミノアクチノマイシンDRNAで赤色寄りの発光およびDNAでは緑色寄りの発光による細胞の異染色を示すアクリジンオレンジ上記で論じた細胞不透過性色素に加えて、以下の色素が、細胞不透過性の蛍光色素または発光化合物として使用されてもよいTOTOファミリーシアニン二量体色素のシアニン二量体、排他的ではないが好ましくはTOTO1ヨウ化物、TOPRO1ヨウ化物、TOTO3ヨウ化物TOPROファミリーの色素のシアニン単量体、排他的ではないが好ましくはYOPRO1、TOPRO、TOPRO3ヨウ化物、TOPRO5ヨウ化物、YOYO1ヨウ化物、YOPRO1ヨウ化物、YOYO3ヨウ化物、YOPRO3ヨウ化物。核酸SYTOX色素、排他的ではないが好ましくはSYTOX青色、SYTOX緑色およびSYTOX橙色。ヨウ化プロピジウムおよび細胞不透過性臭化エチジウム7アミノアクチノマイシンDRNAで赤色寄りの発光およびDNAでは緑色寄りの発光による細胞のアクリジンオレンジ異染色。蛍光強度、偏光、蛍光寿命、蛍光スペクトルを含むが排他的ではない本発明を使用して得られる異なる蛍光シグナルの分析のために、様々な検出システムが用いられてもよいことが理解される。細胞イメージング方法は、標本内または分析されている試料のそのような性質の空間的配置および動態分析をさらに提供してもよいことがさらに理解される。本発明の第5の態様によれば、本発明の第3または第4の態様による方法において使用するための検出システムであって、方法において使用される蛍光色素および発光化合物を励起するための1つまたは複数の電磁放射線源蛍光色素および発光化合物による電磁放射線の吸収と関連した分光学的特性を検出するための複数の検出器および検出される分光学的特性をインタクト細胞およびインタクトではない細胞の存在と相関させ、それによってインタクト細胞とインタクトではない細胞とを識別するように適合された検出器分析システムを含むシステムが提供される。好ましくは、検出器は蛍光検出器である。非常に有利には、検出システムは、蛍光色素および発光化合物を同時励起するための単一の電磁放射線源を有してもよい。非常に有利には、複数の検出器は、蛍光色素および発光化合物のすべての分光学的特性を検出する検出器の対の形態である。本発明は、多様な範囲の細胞タイプおよび用途における細胞完全性の調査に適用され得る。細胞または細胞タイプが本明細書において言及される場合、細胞または細胞タイプは生きている真核細胞であることが好ましい。本発明は、すべての細胞タイプと併せて使用することができる。細胞は、以下の細胞タイプから制限なく選択することができる生検標本として、組織外植片として、初代培養物として、形質転換細胞系として、不死化細胞系として、または樹立腫瘍細胞系として得られる、ヒト細胞および哺乳動物細胞を含む動物細胞。植物細胞および細菌細胞。治療上、診断上および分析上興味深い特定の部位および疾患を表すもの、好ましくは、基質上での付着性増殖を示すことができるもの、例えば脳がん、膀胱がん、乳がん、結腸および直腸がん、子宮内膜がん、腎臓がん、白血病、肺がん、メラノーマ、膵臓がん、前立腺がん、皮膚がん、甲状腺がんを含むヒト腫瘍細胞系。また、米国国立がん研究所腫瘍細胞系パネルNCI60において示されているものなどの、薬物スクリーニング方法論の目的のために常法に従って利用可能であるヒト腫瘍細胞系生体異物分子の輸送体などの特定の分子的実体のそれらの機能的発現について選択されるヒト腫瘍細胞系、および遺伝子導入研究におけるそれらの好都合な性能について選択されるヒト腫瘍細胞。機能的ゲノミクス研究において使用される哺乳動物細胞系脊椎動物の単細胞形態レリオの解離した細胞調製物から得られる胚、幼生形態または細胞の構成要素。ADMEToxスクリーニングプロトコールにおいて使用される細胞系。ヒトまたはマウス供給源から得られる胚性幹細胞。成体幹細胞中枢神経系のニューロンおよびまたは支持細胞。抗体を分泌するハイブリッドを含む不死体細胞ハイブリッド。非幹細胞に対する幹細胞有核細胞血液成分老化細胞、非老化細胞、付着性細胞、非付着性細胞、静止細胞および非静止細胞。用途は、以下の分野の調査から制限なく選択することができる細胞における生理的変化による細胞完全性の変化。疾患プロセスに反応する細胞における変化による細胞完全性の変化。細菌およびウイルスを含む感染性病原体によって誘導される細胞完全性の変化寄生体によって誘導される細胞完全性の変化。物理的作用物質に反応する細胞における変化による細胞完全性の変化。光学活性な物理的作用物質または染色色素の組み込みによる細胞完全性の変化。以下の目的のための、既知のまたは未知の生物活性剤に反応する細胞における変化による細胞完全性の変化毒素の環境センシングのためのモニターとしての細胞完全性の変化。電子顕微鏡法または別の高解像度イメージングアプローチを使用する明確な分析のための、粒子の毒性負荷を保有する細胞が蛍光色素と同時局在することができるという利点を有するナノ粒子剤毒性の細胞完全性の変化。毒素の検出のための細胞完全性の変化。安全性モニタリング目的および迅速な診断のための、毒性のまたは有害な作用物質の検出のための細胞完全性の変化。発酵プロセスの進行をモニターするための細胞完全性の変化。バイオ医薬品調製プロセスの進行をモニターするための細胞完全性の変化。細胞死と関連した状態移行を見分けるための細胞完全性の変化。生理的および病理学的系における細胞周期進行の分析のための、細胞完全性の変化。薬物スクリーニングまたは発見の目的のための薬力学的反応の分析。内部プログラムの影響下での、または摂動剤により強制される状態変化を受けるときの細胞構造および機能を調節する細胞のシステムの研究のための細胞完全性の変化参考文献本発明を上記に記載したが、本発明は、上記に、または以下の記載、図面または特許請求の範囲において記載されている特徴の任意の発明の組み合わせに及ぶ。例えば、本発明の一態様の要素は、本発明の別の態様の要素と一緒に組み込まれてもよい。本発明による化合物、蛍光複合体、方法および検出システムの実施形態を、添付の図面を参照して以下に説明する。本発明は、透過性色素および不透過性色素の組み合わせを使用した、生細胞および死細胞を標識する手段を提供する。色素のこの組み合わせは、透過性色素の検出は、生細胞の存在と関連することができ、細胞不透過性色素の検出は、死細胞の存在と関連することができるという意味において、実質的に相互に排他的であり得る。この原理を、下記のTable1に示す。Table1細胞透過性細胞不透過性色素の検出による生細胞死細胞の陽性標識。したがって、本発明は、色素間でチャネル間干渉がほとんどまたは全くないため、生細胞を細胞透過性色素からの蛍光と関連させること、および死細胞を細胞不透過性色素からの蛍光と関連させることを可能にする。このことは、非常に多くの有利な2色2蛍光色素実験を実施する機会をもたらすことが理解されるであろう。そのうえ、本発明者らは、このタイプの色素の組み合わせがまた、1つまたは複数のさらなる蛍光色素を使用した様々な有利な実験を実施するためのプラットホームも提供することに気付いた。Table2は、このタイプの検出システムの例を、式の化合物式の化合物の特定の細胞透過性細胞不透過性色素の組み合わせに関して、限定することなく示す。Table2細胞透過性細胞不透過性色素の組み合わせと一緒に使用して、陽性または陰性染色パターンを予測することができる蛍光プローブの例。これらの可能な検出システムおよび別のものを、図1~9に関して以下により詳細に説明する。図1は、式の化合物、および式の化合物の励起および蛍光スペクトルを概略的に示す。したがって、式の化合物蛍光は概して、可視スペクトルの橙色部分内にあるが、化合物蛍光は概して、可視スペクトルの遠赤外部分内にある。図1bは、式の化合物単独の蛍光スペクトルを示す。式の化合物は細胞透過性色素であり、したがって、蛍光サインBが、生細胞または死細胞と関係するであろうことが予期される。図1cは、化合物単独の蛍光サインAを示す。化合物は細胞不透過性色素であり、したがって、蛍光サインAは、死細胞または瀕死のおよび生きていない細胞と関係して観察されるのみであるだろう。図2aは、生細胞と併せて、細胞透過性色素の化合物などおよび細胞不透過性色素などの特定の組み合わせが使用される場合に得られる蛍光を示す。おそらく予期されるように、観察されるのは、細胞透過性色素と関連した蛍光サインBのみである。図2bは、式の化合物化合物の組み合わせなどの細胞透過性細胞不透過性色素の特定の組み合わせが使用される場合に、本発明によってもたらされる全く予期しない作用を示す。観察される蛍光の顕著な寄与は、式の化合物色素から発することが予期され得る。しかしながら、死細胞で、式の化合物色素からほとんどまたは全く蛍光が観察されないことが見出された。それどころか、観察される蛍光のすべてまたは事実上すべては、細胞不透過性色素である化合物によるものである。したがって、化合物色素は、式の化合物シグナルを消光するようである。非常に驚くべきことに、式の化合物シグナルのこの消光は、細胞核内のみでなく細胞の全体にわたって起こるようである。任意の特定の理論に拘束されるつもりはないが、本発明によってもたらされる驚くべき消光作用は、死細胞中の核酸およびことによると別の巨大分子材料に対する、細胞不透過性色素のものよりも高い結合親和性を有する細胞不透過性色素によるものである可能性があると考えられる。しかしながら、別の機構が役割を果たす可能性がある。結論として、1つのスペクトル領域Aにおける蛍光が死細胞と関連し、別のスペクトル領域Bにおける蛍光が生細胞と関連する、細胞の状態を示すための信号灯システムを提供することが可能である。このシステムの1つの有用な重要性は、スペクトル領域AおよびBにおいて2色検出を使用して第3の検出チャネルを提供することが可能であることである。図3は、特定の細胞透過性細胞不透過性色素の組み合わせ式の化合物化合物に関して、3チャネル2色検出システムがどのように提供されるかのいくつかの例を示す。図3aは、スペクトル範囲AおよびBを使用して生細胞において検出される蛍光を示す。範囲Bにおける蛍光は、前述の通り、式の化合物からの発光と関連する。このスキームにおいて、式の化合物は、化合物および、好ましくはQdot705nm放射ナノ結晶などのインタクト細胞と関連する、さらなる赤色色素または発光剤と組み合わせて使用される。このシステムは、陽性の式の化合物シグナルを提供する細胞が、化合物のために赤色においてシグナルを示さず、生細胞として陽性に特定することができるということを利用する。本発明は、橙色で式の化合物蛍光によってこのようにタグ付けされた生細胞が、化合物発光からの干渉のない赤色領域Aにおいて潜在的な検出チャネルを有することを包含する。図3bは、式の化合物蛍光からの干渉が実質的にない橙色領域Bにおいて、死細胞における潜在的な検出チャネルが存在することを利用する検出スキームを表す。図3bにおいて示されているように、赤色スペクトル領域Aにおける化合物蛍光の存在は、細胞を死細胞として効率的にタグ付けする。第2の橙色色素が使用されるなら、図3bにおいて示されているものなどの蛍光スペクトルを得ることができ、ここで、第2の橙色色素を使用して、死細胞についてのさらなる情報を提供することができる。このタイプの3蛍光色素2色検出システムを利用することは、比較的単純な検出システムを使用して大量の情報を抽出することができるため、非常に好都合である。しかしながら、本発明は、電磁スペクトルの2つを超える領域における蛍光を利用するマルチカラー色素の組み合わせの使用を含む。図3cは、スペクトル領域AおよびBとは異なるスペクトル領域において蛍光を発する1つまたは複数の色素が使用される汎用のマルチカラー色素蛍光スキームを表す。図4は、緑色スペクトル領域において蛍光を発するAnnexinVFITCなどのAnnexinVアッセイと組み合わせて化合物を利用する検出システムから得られ得る結果を示す。色素のこの組み合わせは、アポトーシスと関係した細胞死の段階の増強された識別を提供する。図4において示されているように、弱い化合物弱いAnnexinVシグナルは、正常な細胞の指標となる。アポトーシス細胞は、弱い化合物シグナルと組み合わせた増加したAnnexinVシグナルによって示される。細胞死の開始は、強いAnnexinVシグナルと制限された化合物シグナルの両方の存在によって示される。追加の識別は、細胞残屑の指標となる、弱いAnnexinVシグナルおよび強い化合物シグナルを含むチャネルによって提供される。図5は、図4において示されているものと同じ一般的なタイプのプロットであり、これはこの場合、式の化合物化合物色素の組み合わせを利用する検出システムにおける蛍光強度を示す。この場合もやはり、あるレベルの識別が、細胞死までの細胞の進行において観察される。より詳細には、弱い化合物蛍光シグナルが報告される場合、3つの違うチャネルを特定することができる。弱い化合物シグナルと組み合わせた式の化合物についての橙色での陽性シグナルは、正常な細胞の指標となるが、増強された式の化合物シグナルは、停止した細胞の指標となる。化合物および式の化合物の両方についての陰性シグナルは、細胞残屑の指標となることに留意されたい。陰性の式の化合物シグナルと組み合わせた陽性の化合物シグナルは、死細胞の指標となる。潜在的に、利用可能な2つのさらなるチャネル、すなわち、強い赤色シグナルと、強い橙色または増強された橙色シグナルのいずれかとの組み合わせが存在することを、図5の考察から当業者は認識するであろう。強いまたは増強された橙色シグナルは生細胞の存在と関連するため、これらの橙色シグナルと組み合わせた強い化合物シグナルを得ることは不可能である。その代わり、Qdot705nm放射ナノ結晶などの赤色領域において蛍光を発する第3の蛍光色素を利用して、2色3蛍光色素分析システムを提供することが可能である。そのようなシステムでの利点は、例えばArイオンレーザーからの488nm放射線を使用して、単一のレーザー色を使用してすべての3つの蛍光色素を励起してもよいことである。図6は、図5において示されているものと同じ一般的なタイプのプロットであり、化合物および式の化合物と組み合わせてQdot705nm放射ナノ結晶を使用した2色3蛍光色素分析システムを表す。Qdotナノ結晶からの赤色スペクトル領域における蛍光が、生細胞からの化合物蛍光の非存在のおかげで利用可能となる2つのチャネルにおいて観察されることが分かる。図7は、式の化合物化合物細胞透過性細胞不透過性色素の組み合わせに基づく3色システムから得ることができる結果を示す。この実施形態において、式の化合物蛍光の検出によって陽性に標識される生細胞をプローブするために、スペクトルの赤色領域において蛍光を発するQdot705nm放射ナノ結晶などの第3の蛍光色素が使用される。加えて、AnnexinVFITCなどの第4の蛍光色素もまた使用され、検出は、スペクトルの緑色領域において行われる。この検出構成は、2レーザー3色4蛍光色素分析技術と特徴付けることができる。図7において示されているように、そのようなシステムから得られ得る結果は、3軸システムを使用して表現して、3色範囲において得られる蛍光を表すことができる。したがって、得られる結果はデータの3次元体積の点から理解することができ、これは正常な状態からアポトーシスおよび細胞死までの細胞の推移において、増強されたレベルの識別を提供する。詳細には、弱い化合物シグナルと、増強された式の化合物シグナルと、強いAnnexinVFITCシグナルとの組み合わせは、停止した細胞およびアポトーシス細胞の両方の指標となり、一方、強い化合物シグナルと、弱い式の化合物シグナルと、強いAnnexinVFITCシグナルとの組み合わせは、死細胞の指標となる。このシステムは、細胞プロセスに関する相当量の情報を提供することができることが分かる。すべての細胞は、図7に表されている検出体積中に存在することに留意するべきである。結果を解釈するために、適したマルチカラー分析を実施することができる。異なるまたはさらなるレベルの識別および情報を提供するために、蛍光色素の別の組み合わせが使用されてもよい。原理上は、さらなる情報を提供するために、さらなる蛍光色素がなお利用されてもよい。さらなる蛍光色素は、異なるスペクトルまたは領域において蛍光を発して、追加の色チャネルを提供することができ、またはことによると、橙色または緑色スペクトル領域において蛍光を発する蛍光色素が使用されてもよく、ただし、そのような追加の蛍光色素の検出特徴は式の化合物またはAnnexinVFITC検出チャネルを妨げない。細胞変化プロセスを追跡するために、緑色およびまたはシアン色素が使用されてもよい。式の化合物15ビス2エチルアミノアントラセン910ジオンおよび式の化合物15ビスN2エチルアミノアントラセン910ジオンヨウ化物の合成15ビス2エチルアミノアントラセン910ジオンを、WO9965992の実施例1に従って合成した。クロロホルムを、15ビス2エチルアミノアントラセン910ジオンに添加した。暗紫色溶液に、MeCN、続いてヨウ化メチルを添加した。10分間の撹拌後、沈殿物が形成する。4時間の撹拌後、揮発性物質を蒸発させた。残渣をクロロホルムから摩砕し、濾過によって回収し、ジクロロメタンおよびジエチルエーテルで洗浄した。暗いピンク色の固体が単離された。1HNMRδ969、772、752、730、391、362、318式の化合物15ビス2エチルアミノ58ジヒドロキシアントラセン910ジオンヨウ化物の合成15ビス2エチルアミノ58ジヒドロキシアントラセン910ジオンを、WO9965992の実施例1に従って合成した。クロロホルムを、15ビス2エチルアミノ58ジヒドロキシアントラセン910ジオンに添加した。暗紫色溶液に、MeCN、続いてヨウ化メチルを添加した。1分間の撹拌後、沈殿物が形成する。4時間の撹拌後、揮発性物質を蒸発させた。残渣をクロロホルムから摩砕し、濾過によって回収し、ジクロロメタンおよびジエチルエーテルで洗浄した。暗青色固体が単離された。収率1730121HNMRδ1397、977、749、740、396、409、319化合物のスペクトル特性化合物を、実施例2に記載されている原理を使用して合成し、緩衝液中の5mM化合物希釈のストック溶液として4°Cで保存した。吸光度スペクトルを、分光計およびPBS中に溶解させた作用物質の20μM溶液を使用して得、および1cm光路石英シリカキュベットにおいて測定した。1cm光路長セミマイクロ石英キュベットにおける20μM化合物の溶液についての蛍光スペクトルを、633、589、534、488nmでの励起によって決定した。蛍光測定は、PerkinElmerLS50分光蛍光計においてスリット幅を10nmに設定して行った。分光蛍光計は、赤色感受性の光電子倍増管、日本を備えていた。データを蓄積し、スプレッドシートにエクスポートして、緩衝液対照について補正し、発光最大を決定した。結果を、図8に示す。化合物の488nmから647nmまでの波長による励起は、最適に及ばなくてもよい。典型的には、細胞イメージングでは、励起は633nmまたは647nmのいずれかの波長で実施される。発光スペクトルは、励起波長と無関係であり、すなわち、すべての発光スペクトルは、励起波長に関係なく同一である。細胞死の誘導のためのAnnexinVアッセイにおける生細胞と死細胞とを区別するための化合物の細胞不透過特性の適用この実施例は、細胞毒性薬物に曝露させたヒトB細胞リンパ腫細胞中の原形質膜のホスファチジルセリン分子の内部小葉からの移動と関連する、より後の段階の細胞死に関する。アポトーシスの用量依存的な誘導の検出を、フローサイトメトリーを使用して実施した。本発明者らは、選択的励起を使用することによる、別の一般に使用される蛍光色素のもの由来の深紅色蛍光プローブを使用することのスペクトルの利点を含めて、エトポシドによって誘導されたアポトーシスの結果として膜透過性が増強された細胞に起因する生存不能な部分を決定する細胞生存可能性マーカーとしての、化合物の適用を実証しようとした。化合物IAは、ヨウ化プロピジウムと同様の精度で生存不能な部分を検出することができた。この部分は、エトポシドの用量増加に対して用量依存的な増加を示した。タイミングを調節した取り込みを行い、化合物標識を最適化した。用量変更もまた実施して、化合物の最適な濃度を決定した。試薬VP16は、34mMストック溶液として提供され、4°Cで保存した。フルオレセインコンジュゲートアネキシンVは、Pharmingenから購入した。ヨウ化プロピジウムは、H2O中の1mgml溶液として得た。化合物は、水中に5mM溶液として配合し、4°Cで保存した。細胞培養および薬物処理ヒト濾胞性Bリンパ腫細胞系をこの研究において使用した。DoHH2は、JCKluinNelemans博士Leiden、オランダの好意により提供され、DoHH2は、5FCSおよび100Uml1ペニシリン、100μgml1ストレプトマイシン、および2mMグルタミンを添加したRPMI1640中で常法に従って維持した。細胞を、37°Cで5CO295空気の加湿した雰囲気中で培養した、5×104細胞ml1の開始濃度で、1週間に2回継代した。細胞を、様々なVP16用量に曝露させて、アポトーシスを誘導したPaulJSmith、MarieWiltshire、SharonDavies、SuetFeungChin、AnthonyKCampbell、およびRachelJErringtonDNAdamageinducedZn2itransientscorrelationwithcellcyclearrestandapoptosisinlymphomacellsAmJPhysiolCellPhysiol283609~622。ヒトJurkat細胞を同様にして培養した。AnnexinV標識のための試料調製アポトーシス変化を受けている細胞に対するAnnexinVFITC表面結合の検出ために試料を調製し、PIまたは化合物で共染色して原形質膜完全性の喪失を検出した。試料を、Vermesらに従って調製した。手短に述べると、細胞試料を冷PBSで洗浄し、1×結合緩衝液中に2×105細胞mlの濃度で再懸濁した。この溶液100μlを、試料毎にポリスチレン丸底フローチューブに移し、これにAnnexinVFITC5μlおよび10μlのPIを要求に応じて添加した。対照試料は、必要に応じて疑似処理した。試料を穏やかにボルテックスにかけ、次いで暗所で15分間、室温でインキュベートした。1×結合緩衝液400μlを、各チューブに添加し、フローサイトメトリーによる分析の前に試料を最長で1時間氷上に保持した。フローサイトメトリー488nmおよびマルチラインUV出力を有するCoherentEnterpriseIIアルゴンイオンレーザーを備えたFACSVantageフローサイトメーターを使用した。EnterpriseIIレーザー出力は30mWに制御した。CELLQuestソフトウェアを、シグナル取得および分析のために使用した。前方散乱および側方散乱を線形モードにおいて取得した。488nm励起から得られるFITCおよびPI蛍光シグナルを、光学フィルターによってスペクトルで選択される発光を検出する光電子倍増管で対数モードにおいて検出した488nm励起から得られる化合物シグナルは、対数または線形モードにおいて検出したが、光学システムに好都合に組み込まれた第3のレーザーを使用して633nmでの励起に続いても検出することができる。488nmでの励起から得られる式の化合物シグナルを、対数または線形モードの両方において検出した。前方および側方散乱ならびに蛍光についてのシグナルを、マスターシグナルとして前方光散乱パラメータを使用して10000細胞について回収した。当技術分野において容易に理解されるように、蛍光シグナルのパルス分析および蛍光補正設定を変更して、マルチ蛍光組み合わせにおける細胞部分集合の認識を改善した。データは、平均蛍光強度値として表し、図9において示す。蛍光顕微鏡法によって検出される、式の化合物による固定したU2OSヒト骨肉腫細胞の顕著な核染色。本発明者らは、核のDNAを効率的に標的化する化合物の特性を求めた。細胞培養ヒト骨肉腫細胞U2OS細胞を、10ウシ胎児血清、1mMグルタミン、および抗生物質を添加したMcCoy’s5a培地中で培養し、37°Cで空気中5CO2の雰囲気中でインキュベートした。蛍光イメージング実験のために、細胞を、1×105細胞ml1の密度で単層としてカバーグラス底のチャンバーにおいて増殖させた。イメージング24時間後、次いで細胞をPBS中で4パラホルムアルデヒドで15~30分間室温で固定した。洗浄ステップは必要とされない。任意の処理の後に、最後の染色手順であるために適切なように化合物を使用した。化合物を、付着性細胞の05mlPBS上層中に20μMで直接添加した。細胞を、広視野の蛍光顕微鏡法を使用して直接検鏡した。チャンバーを、Axiovert100顕微鏡に置いた。蛍光画像は、ORCAERCCDカメラおよびMetaMorph取得ソフトウェアを使用して取り込んだ。細胞は、核において高レベルの化合物の局在化を示した。核の化合物染色を、核を表す単純な閾値アルゴリズムを使用してセグメント化し、それぞれの核局在化のバイナリまたはマスク情報を提供した。もとの化合物核の局在化およびセグメント化後を示す。結果を図10において示す。式の化合物による膜が損なわれている細胞の染色は、インタクト細胞の陰性染色による特定を可能にする。この実施例は、フローサイトメトリーによって分析されるヒトJurkat細胞集団におけるスタウロスポリンによる細胞死誘導の分析を示す。本発明者らは、スタウロスポリンにより誘導された細胞死の結果として膜透過性が増強された細胞に起因する生存不能な部分を決定する細胞生存可能性マーカーとしての、化合物の適用を実証しようとした。細胞培養および薬物処理Jurkat細胞系をこの研究において使用した。Jurkat培養物を、10FCSおよび100Uml1ペニシリン、100μgml1ストレプトマイシン、および2mMグルタミンを添加したRPMI1640中で常法に従って維持した。細胞を、37°Cで5CO295空気の加湿した雰囲気中で培養した5×104細胞ml1の開始濃度で、1週間に2回継代した。細胞をフラスコ当たり5mlで、05×105細胞mlに設定した。細胞を、0および2μMスタウロスポリンに24時間、標準的な培養条件下で曝露させて、細胞死を誘導した。5mMストックから化合物を、各試料に添加し、フローサイトメトリーによって分析した。フローサイトメトリー488nmおよびマルチラインUV出力を有するCoherentEnterpriseIIアルゴンイオンレーザーを備えたFACSVantageフローサイトメーターを使用した。EnterpriseIIレーザー出力を、30mWに制御した。CELLQuestソフトウェアを、シグナル取得および分析のために使用した。前方散乱および側方散乱を線形モードにおいて取得した。488nm励起から得られる化合物蛍光シグナルを、FL3695LPで対数モードにおいて検出した。前方および側方散乱および蛍光についてのシグナルを、マスターシグナルとして前方光散乱パラメータを使用して10000細胞について回収した。データは、細胞の大きさを示すための前方散乱シグナルに対する化合物についての等高線図蛍光強度として表示する。結果を、図11において示す。所与の処理と関連した細胞死の発生を決定するための長期生細胞インキュベーション研究への組み込みのために有利な特性を示す、細胞不透過性色素の低毒性を明らかにする、式の化合物によるヒトB細胞リンパ腫細胞のインキュベーションの作用。細胞培養および処理ヒト濾胞性Bリンパ腫細胞系をこの研究において使用した。SUDHL4を、10FCSおよび100Uml1ペニシリン、100μgml1ストレプトマイシン、および2mMグルタミンを添加したRPMI1640中で常法に従って維持した。細胞を、37°Cで5CO295空気の加湿した雰囲気中で培養した5×104細胞ml1の開始濃度で、1週間に2回継代した。細胞をフラスコ当たり5mlで、05×105細胞mlに設定した。各培養物を、3つの化合物用量のうちの1つに、標準的な培養条件下で96時間、継続的に曝露させた。時間0、24、48、72および96時間で、細胞密度を、各フラスコの04ml試料のCoulter計数によって決定した。データは、所与の濃度の化合物について時間に対する相対的細胞数の増加として表示する。結果を、図12に示す。アポトーシス誘導剤スタウロスポリンに反応するミトコンドリア膜潜在能の喪失と関連したヒトJurkat細胞死における初期段階。インタクト細胞と損傷細胞とを区別する手段を提供するための、アッセイへの同時組み込みのための利点を有する、細胞の完全性の喪失の報告における、対象とする特性を有する別の蛍光試薬を使用した、典型的なマルチパラメータ分析への好ましい細胞不透過性色素の化合物の組み込み。この実施例において、色素JC1は、ミトコンドリア膜中に組み込まれる親油性蛍光カチオンであり、膜中でこの色素は、ミトコンドリアの生理的維持の膜潜在能のために凝集物を形成し得る。凝集は、JC1の蛍光特性を変更し、緑色から橙色蛍光への変化をもたらす。フローサイトメトリーまたはイメージングを使用して、橙色蛍光の減少および緑色蛍光の増加をモニターし、アポトーシス細胞が非アポトーシス細胞と区別されることを可能にした。ここで、赤色を有するが橙色蛍光特性を有さない好ましい細胞不透過性色素のさらなる組み込みにより、膜完全性の喪失と関連した細胞死の後期段階に既にある細胞の同時特定が可能となり、以前には到達不可能だった細胞死の段階のより微細な解明を提供する。細胞培養および薬物処理Jurkat細胞系をこの研究において使用した。Jurkat培養物を、10FCSおよび100Uml1ペニシリン、100μgml1ストレプトマイシン、および2mMグルタミンを添加したRPMI1640中で常法に従って維持した。細胞を、37°Cで5CO295空気の加湿した雰囲気中で培養した5×104細胞ml1の開始濃度で、1週間に2回継代した。アッセイのために、細胞を、1ウェル当たり1mlで、05×105細胞mlに設定した。細胞を、0および1μMスタウロスポリンに4時間曝露させた。細胞を洗浄し、JC1に曝露させた。5mMストックから化合物を、各試料に添加した。これらを次いで、フローサイトメトリーによって分析するか、またはNunc、2WellLabTekIIに置き、3チャネル共焦点顕微鏡法によって分析した。スタウロスポリン処理した細胞のマルチパラメータフローサイトメトリー。FACSVantageフローサイトメーター。前方散乱および側方散乱を線形モードにおいて取得した。JC1の2パラメータ蛍光シグナルは、488nm励起から得られ、対数モードにおいて検出した。緑色J単量体は、FL1を使用して検出した橙色J凝集物は、FL2を使用して検出した。488nm励起からまた得られる化合物蛍光シグナルを、695LPでFL3で対数モードにおいて検出した。前方および側方散乱および蛍光についてのシグナルを、マスターシグナルとして前方光散乱パラメータを使用して10000細胞について回収した。結果を図13に示す。JC1データは、J単量体についての蛍光強度に対するJ凝集物についての等高線図蛍光強度として表示する。これらをさらにセグメント化し、強いミトコンドリア膜潜在能を有する細胞および低いミトコンドリアの潜在能を有する細胞を得る。細胞生存可能性を、化合物によるこれらの2つの部分において同時に表す。上部の領域は、主に生細胞からなり、下部の領域は生存不能な細胞および生細胞の両方からなり、化合物機能性は、これらの小部分陰性および後期アポトーシス陽性および透過性を表し得る。スタウロスポリン処理した細胞のマルチパラメータイメージング。スキャニング装置は、プランアポ60×14NA油浸レンズを使用した、NikonEclipseTE300倒立顕微鏡と連結したBioRadRadianceMPシステムであった。3チャネル3次元画像を、共焦点構成を使用して回収した。すべてのチャネル緑色橙色および赤色を同時に回収した。3D画像シーケンスを処理して単一の最大値投影像にし、すべての3チャネルを、J単量体、J凝集物およびDNA核細胞として表示した。結果を、図13において示す。本発明者らは、好ましい細胞不透過性色素と第2の好ましい細胞透過性色素との標的競合によるシグナル消光の概念を利用するマルチ蛍光色素適用の利用を求めた。スペクトルの分離は、任意の所与細胞内で1つの色素のみから生じる排他的シグナルを提供し、したがって、当分野の範囲内で容易に理解される多色分析のより高いレベルでの既存のマルチ蛍光色素アッセイへのそれらの単純な統合を可能にする。細胞状態の組み合わせ追跡。生存可能な停止した陽性および損傷した陽性細胞を明らかにするアッセイを得るための、VP16で処理したDoHH2培養物における部分集団が同時標識されないことを実証するための、式の化合物に加えて化合物による細胞集団の標識。細胞培養および薬物処理ヒト濾胞性Bリンパ腫細胞系をこの研究において使用した。DoHH2を、5FCSおよび100Uml1ペニシリン、100μgml1ストレプトマイシン、および2mMグルタミンを添加したRPMI1640中で常法に従って維持した。細胞を、37°Cで5CO295空気の加湿した雰囲気中で培養した5×104細胞ml1の開始濃度で、1週間に2回継代した。細胞を5×105細胞mlに設定し、VP16用量に曝露させてアポトーシスを誘導した。20μM化合物および4μM化合物を、1mlの細胞に添加し、標準的な培養条件下で10分間インキュベートした。試料をフローサイトメトリーによって分析した。FACSVantageフローサイトメーターを使用した。488nm励起から得られる化合物および化合物蛍光シグナルを、化合物についてFL2で線形モードにおいて検出した488nmから得られる化合物シグナルを、695LPフィルターでFL3およびFL12560nmSP二色性SPで線形モードにおいて検出し、散乱特性を決定した。前方および側方散乱および蛍光についてのシグナルを、マスターシグナルとして前方光散乱パラメータを使用して10000細胞について回収した。データは、等高線図として表し、図14において示す。側方対前方散乱の等高線図は、2つの細胞集団を表す。化合物および化合物の添加は、これらの培養物の機能的状態をもたらす。まず、すべての細胞を、これらの2つの同時標的化フルオロフォアを使用してアッセイにおいて評価する。化合物はインタクトではない細胞部分を特定し、一方、化合物陽性細胞は、生細胞部分に相当する。この生存可能な部分は、停止した集団の発生をさらに表す2つの集団を有することに留意されたい。さらに、化合物部分は、より高い前方散乱特性を有する特有の部分に相当し、一方、化合物集団は、より低い平均前方散乱特性を表示した。