配列番号:12、配列番号:13、配列番号:14、配列番号:50、配列番号:51、配列番号:52、配列番号:72、および配列番号:73から成る群から選択される配列と少なくとも80同一であるアミノ酸配列を含むデルタ9デサチュラーゼ酵素をコードする単離された核酸分子。前記核酸分子が、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:15、配列番号:16、配列番号:17、配列番号:44、及び配列番号:45から成る群から選択される配列に対して少なくとも60同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項1に記載の核酸分子。さらに遺伝子調節エレメントを含む、請求項1に記載の核酸分子。前記遺伝子調節エレメントは、サッカロマイセスセレビシエSaccharomycescerevisiaeデルタ9デサチュラーゼプロモーター、デルタ9デサチュラーゼ3UTRターミネーター、OLE1遺伝子プロモーター、ファゼオリンプロモーター、インゲンマメPhaseolusvulgarisファゼオリン5非翻訳領域、インゲンマメファゼオリン3非翻訳領域、インゲンマメファゼオリンマトリックス結合領域、アグロバクテリウムツメファシエンスAgrobacteriumtumefaciensORF233非翻訳領域、キャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター、アグロバクテリウムツメファシエンスORF13非翻訳領域、タバコNicotianatabacumRB7マトリックス結合領域、オーバードライブ、Tスタンドボーダー配列、LfKCS3プロモーター、FAE1プロモーター、配列番号:40、配列番号:41、配列番号:42、配列番号:43、Mycタグ、およびヘマグルチンhemagglutinタグから成る群から選択される、請求項3に記載の核酸分子。配列番号:12、配列番号:13、配列番号:14、配列番号:50、配列番号:51、配列番号:52、配列番号:72、および配列番号:73から成る群から選択される配列に対して少なくとも80同一のアミノ酸配列を含む単離されたデルタ9デサチュラーゼ酵素。配列番号:72およびまたは配列番号:73を含むキメラデルタ9デサチュラーゼポリペプチドであって、配列番号:77および配列番号:78から成る群から選択されるアミノ酸配列をさらに含むことを特徴とする、ポリペプチド。細胞内の飽和脂肪酸の量を減少させるための方法であって、細胞内の飽和脂肪酸の量が減少するように、請求項1に記載の核酸分子で細胞を形質転換する工程を含む、方法。前記細胞は酵母細胞である、請求項7に記載の方法。前記細胞は植物細胞である、請求項7に記載の方法。請求項1に記載の複数の核酸分子で植物細胞を形質転換する工程を含む、請求項9に記載の方法。前記植物細胞を形質転換することによって、前記植物細胞に、前記植物細胞内で16:0ACPのレベルを減少させるための手段が導入される、請求項9に記載の方法。前記植物細胞において16:0ACPのレベルを減少させるための手段が、植物細胞小器官外extraplastidialデサチュラーゼである、請求項11に記載の方法。前記植物細胞小器官外デサチュラーゼが、LnD9DSデサチュラーゼ、AnD9DSデサチュラーゼ、HzD9DSデサチュラーゼ、およびMgD9DSデサチュラーゼからなる群から選ばれるデサチュラーゼである、請求項12に記載の方法。前記植物細胞が、シロイヌナズナ、ボラゴBorago、キャノーラ、ヒマ、テオブロマ、トウモロコシ、ワタ、ハマナ、クフェア、アマ、レスケレーラLesquerella、リムナンテスLimnanthes、リノラLinola、キンレンカ、マツヨイグサ、オレア、アブラヤシ、落花生、菜種、ベニバナ、大豆Glycine、ソヤSoja、ヒマワリ、ニコチアナ、ベルノニア、コムギ、オオムギ、イネ、エンバク、ソルガム、ライムギ、及びイネ科の他のメンバーからなる群から選ばれる属から選択された植物から得られる、請求項9に記載の方法。請求項1に記載の核酸配列を含む油種子植物。配列番号:12、配列番号:13、配列番号:14、配列番号:50、配列番号:51、および配列番号:52から成る群から選択される植物細胞小器官外デサチュラーゼを発現する植物種子。トランスジェニックセイヨウアブラナBrassicanapus系統の種子であって、同質遺伝子系統バージョンのトランスジェニックセイヨウアブラナ系統に対して減少した16:0レベルを有する種子。野生型植物に比べて減少量の飽和脂肪酸をその植物において含むトランスジェニック植物を作製するための方法であって:請求項1に記載の核酸分子で植物材料を形質転換する工程および形質転換された植物素材を培養して、植物を得る工程を含む、方法。前記植物が、シロイヌナズナ、ボラゴBorago、キャノーラ、ヒマ、テオブロマ、トウモロコシ、ワタ、ハマナ、クフェア、アマ、レスケレーラLesquerella、リムナンテスLimnanthes、リノラLinola、キンレンカ、マツヨイグサ、オレア、アブラヤシ、落花生、菜種、ベニバナ、大豆Glycine、ソヤSoja、ヒマワリ、ニコチアナ、ベルノニア、コムギ、オオムギ、イネ、エンバク、ソルガム、ライムギ、及びイネ科の他のメンバーからなる群から選ばれる属から選択される、請求項18に記載の方法。請求項18に記載の方法により得られる植物。請求項20に記載の植物から得られる植物材料。前記植物材料が種子である、請求項21に記載の植物材料。Iいくつかの実施形態の概要本発明者らは以前に、アスペルギルスニデュランス由来の真菌アシルCoAデルタ9デサチュラーゼをキャノーラに導入したことにより、種子油で飽和脂肪酸レベルの減少を達成した。米国特許出願公開US20080260933A1。Aニデュランスデルタ9デサチュラーゼは、種子油中で、より豊富なパルミチン酸脂肪酸36-49よりもステアリン酸の枯渇61-90の方が大きかった。したがって、パルミチン酸が飽和する上で優先的に作用するデルタ9デサチュラーゼの同時導入は、Anidulansのデルタ9デサチュラーゼのステアリン酸塩優先的stearatepreferring活性を補完することで総飽和のさらなる削減を実現する。本発明のいくつかの実施形態では、様々な基質特異性を有する真菌デルタ9デサチュラーゼポリペプチドが開示されている。特定の実施形態では、パルミチン酸塩優先的palmiatepreferringデルタ9デサチュラーゼ例えば本明細書で開示される天然のの真菌酵素、またはその機能的等価物;およびパルミチン酸基質に対して優先性を有するように設計された合成ポリペプチドを含む。本明細書中、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:15、配列番号:16、配列番号:17、配列番号:44、番号:45、配列番号:48、および配列番号:49からなる群から選択される配列に対して少なくとも60同一であるヌクレオチド配列を含むデルタ9デサチュラーゼポリペプチドをコードする核酸分子が開示される。いくつかの態様において、核酸分子は、デルタ9デサチュラーゼポリペプチドコード配列に作動可能に連結された遺伝子調節エレメントを含むことがある。特定の実施形態では、遺伝子調節エレメントは、ゼオリンプロモーター、ファゼオリン5非翻訳領域、ファゼオリン3非翻訳領域、アグロバクテリアツメファシエンスAgrobacterimtumefaciensORF13非翻訳領域、キャッサバ葉脈モザイクウイルスCassavaveinMosaicVirusプロモーター、タバコNicotianatabacumRB7マトリックス結合地域、T鎖境界配列、LfKCS3プロモーター、およびFAE1プロモーターであり得る。配列番号:12、配列番号:13、配列番号:14、配列番号:50、配列番号:52、配列番号:72、および配列番号:73から成る群から選択される配列と少なくとも80同一であるアミノ酸配列を含むデルタ9デサチュラーゼポリペプチド、ならびにデルタ9デサチュラーゼのポリペプチドをコードする核酸分子もまた開示される。いくつかの実施形態では、核酸分子およびデルタ9デサチュラーゼポリペプチドの本発明の実施形態は、植物材料、細胞、組織、または植物全体の飽和脂肪酸の量を減少させるための方法を含む。このような方法は、植物材料、細胞、組織、または植物全体の飽和脂肪酸の量が減少するように、前述の核酸分子の少なくとも1つを有する植物材料、細胞、組織、または植物全体を形質転換することを含んでもよい。特定の実施形態では、植物材料、細胞、組織、または植物全体におけるパルミチン酸およびまたはステアリン脂肪酸を優先的に減少させるための方法を含む。本明細書に開示される方法は、例えば、植物または植物に由来する植物材料例えば、シロイヌナズナ属の植物、またはキャノーラに対して実施してもよい。特定の実施形態では、同じ種の野生型植物に比べて、植物における飽和脂肪酸の減少量を含むトランスジェニック植物を作製または再生するための方法が記載され、この方法は、少なくとも1つの前述の核酸分子で植物細胞または材料を形質転換する工程、およびその形質転換された植物材料を培養して植物体を得る工程を含む。前述のいずれかの方法によって得られた植物、植物材料、植物細胞、および種子も開示される。II.略語xyΔzx個の炭素およびカルボキシル末端から数えてZ位置においてy個の二重結合を含む脂肪酸ACPアシルキャリアタンパク質CoA補酵素AFA脂肪酸FAMフルオレセインFAS脂肪酸合成酵素FAME脂肪酸メチルエステルKASIIbケトアシルACPシンターゼIIMUFA一価不飽和脂肪酸WT野生型III用語脂肪酸:本明細書で使用する場合、用語脂肪酸は、長い鎖長および短い鎖長の両方の脂肪酸が知られているが、種々の鎖長、例えば、約C12-C22、の長鎖脂肪族酸アルカン酸を指す。脂肪酸の構造は、表記、xyΔzで表される:ここでxは、特定の脂肪酸中の炭素C原子の総数であり、yはその酸のカルボキシル末端から数えてZの位置にある炭素鎖中の二重結合の数である。代謝経路:用語代謝経路は、代謝産物の形成、または別の代謝経路の開始のいずれかを達成するための、酵素によって触媒されて、細胞内で発生する一連の化学反応を指す。代謝経路は、複数または多数の工程を含むことがあり、特定の反応基質に対して異なる代謝経路と競合する可能性がある。同様に、1つの代謝経路の生成物はまだ別の代謝経路の基質となることがある。代謝工学:本発明の目的のために、代謝工学は、細胞内で作動可能な総代謝経路の全体的な体系の中で所望の正確な化学構造を有する生成物への初期の物質のステップバイステップの変更が達成されるように、細胞内の1つまたは複数の代謝経路を改変するための戦略の合理的な設計を指す。デサチュラーゼ:本明細書で用いる用語デサチュラーゼは、目的の脂肪酸または前駆体を生成するために、1つ以上の脂肪酸を不飽和するすなわち、二重結合を導入することができるポリペプチドを指す。植物可溶性脂肪酸デサチュラーゼ酵素が、飽和アシルACP基質に位置特異的に二重結合を導入するかもしれない。アシルCoAデサチュラーゼは、飽和脂肪酸アシルCoA基質に位置特異的に二重結合を導入する。反応は不飽和化アーキテクチャの中核をなす4ヘリックスバンドルによって協調された二電子減少二鉄中心twoelectronreduceddiironcenterによる酸素分子の活性化を伴う。いくつかの実施形態で特に興味深いのは、アシルCoAデルタ9デサチュラーゼである。デルタ9-1801ACPデサチュラーゼは、膜の流動性を維持するためにすべての植物によって必要とされる。この酵素は、主にステアロイルACPを不飽和化するが、それはまた、パルミトイルACPに対して少しの程度にtoaminorextentアクティブになっている。バリアントデサチュラーゼ:本明細書で用いる用語バリアントデサチュラーゼは、異常なunusual脂肪酸を生成する際の役割と一致する特定の活性プロファイルを示すデサチュラーゼを包含している。バリアントデサチュラーゼは、生物から単離され得るか、指向化進化プログラムを介して操作され得るか、または1つ以上の特徴付けされたデサチュラーゼからの保存されたアミノ酸を組み込んだ合成デサチュラーゼとして操作され得る。子孫植物:本発明の目的のために、子孫植物は、植物の育種方法によって得ることができる任意の植物や、そこから得られた植物材料をいう。植物育種方法は、当技術分野において周知であり、自然交配、人工繁殖、DNAの分子マーカー分析を伴う選抜育種、遺伝子組換え、および商業繁殖を含んでいる。植物材料:本明細書で用いる用語植物材料は、植物から得られる任意の細胞または組織を指す。核酸分子:RNAのセンスおよびアンチセンス鎖の両方、cDNA、ゲノムDNA、および上記のものの合成形態や混合ポリマーを含むことができるヌクレオチドのポリマー形態。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、またはヌクレオチドのいずれかのタイプの改変された形態を指す。本明細書で使用される核酸分子は、核酸およびポリヌクレオチドと同義である。この用語は、DNAの一本鎖および二本鎖形態を含む。核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド、ならびに天然およびまたは非天然のヌクレオチド結合によって一緒に連結された改変されたヌクレオチドのいずれかまたは両方を含むことができる。核酸分子は、当業者によって容易に理解されるように、化学的もしくは生化学的に改変することができ、または非天然または誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むことができる。このような改変としては、例えば、ラベル、メチル化、天然に存在するヌクレオチドの1以上のヌクレオチドのアナログでの置換、ヌクレオチド間改変、例えば、非帯電結合例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど、荷電結合例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど、ペンダント部分例えば、ペプチド、インターカレーター例えば、アクリジン、ソラレンなど、キレート剤、アルキル化剤、および改変された結合例えば、αアノマー核酸などが含まれる。用語核酸分子はまた、一本鎖、二本鎖、部分的に二重鎖、三重鎖、ヘアピン、円形および南京錠型コンフォメーションをなどの任意の位相幾何学的コンフォメーションを含む。作動可能に連結された:第1の核酸配列が第2の核酸配列と機能的な関係にあるとき、第1の核酸配列は第2の核酸配列と作動可能に連結されている。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼすならば、プロモーターはコード配列に作動可能に連結されている。組換えにより産生された場合、作動可能に連結された核酸配列は一般的に連続しており、2つのタンパク質コード領域を結合する必要がある場合、同じリーディングフレーム内にある。しかし、核酸は、作動可能に連結されるためには連続している必要はない。調節エレメント:本明細書で用いる用語調節エレメントは、遺伝子調節活性を有する核酸分子を指す。すなわち、作動可能に連結された転写可能な核酸分子の転写または翻訳に影響を与える能力を有するものである。例えば、プロモーター、リーダー、イントロン、および転写終結領域などの調節エレメントは、生きた細胞内の遺伝子の全体的発現において不可欠な役割を果たす遺伝子調節活性を有する非コーディング核酸分子である。植物内で機能する単離された調節エレメントは、それ故、分子工学の技術により植物の表現型を改変するために有用である。調節エレメントによって、特定の遺伝子がいつそしてどのようなレベルで発現したか否かを決定する一連のヌクレオチドを意図している。調節DNA配列は、特に調節タンパク質または他のタンパク質と相互作用する。本明細書で使用する用語遺伝子調節活性は、作動可能に連結された核酸分子の転写または翻訳に影響を及ぼすことができる核酸分子を指す。遺伝子調節活性を有する単離された核酸分子は、作動可能に連結された核酸分子の、時間的または空間的な発現を提供したり、発現レベルおよび発現率を調節したりすることができる。遺伝子調節活性を有する単離された核酸分子は、プロモーター、イントロン、リーダー、または3転写終結領域を含んでもよい。プロモーター:本明細書で用いられる用語プロモーターは、RNAポリメラーゼIIまたは作動可能に連結された遺伝子の転写を開始する転写因子転写を制御するトランス作用タンパク質因子などの他のタンパク質との結合および認識に関与している核酸分子を指す。プロモーターは、自身が作動可能に連結された遺伝子の転写に影響を及ぼすシスエレメントまたはエンハンサードメインなどのサブエレメントを含む場合がある。植物プロモーターは、植物細胞中で機能している天然または非天然プロモーターである。植物プロモーターは、作動可能に連結された遺伝子または遺伝子の発現を調節するための5調節エレメントとして使用することができる。植物プロモーターは、その時間的、空間的、または発生発現パターンによって定義され得る。本明細書に記載の核酸分子は、プロモーターを含む核酸配列を含んでもよい。配列同一性:2つの核酸またはポリペプチド配列の文脈で本明細書において使用される用語配列同一性または同一性は、指定された比較ウインドウに対して最大の一致のために整列させた場合、同じである2つの配列における残基を指すことができる。配列同一性の割合がタンパク質に関連して使用される場合、同一でない残基位置は、多くの場合、アミノ酸残基が、類似の化学特性例えば、電荷、疎水性、または立体効果を有する他のアミノ酸残基に置換され、したがって、分子の機能的特性を変更しない、保存的アミノ酸置換によって異なることが認識されている。したがって、配列が保存的置換によって異なる場合、配列同一性は、非同一の残基の部位での置換の保存的性質を修正するために上向きに調整することができる。このような保存的置換によって異なる配列は配列類似性sequencesimilarityまたは類似性similarityを有すると言われている。この調整を行うための技術は、当業者に周知である。典型的には、このような技術は、保存的置換を完全なミスマッチではなく、部分的ミスマッチとしてスコア付けすることを含み、それによってパーセント配列同一性を増加させる。たとえば、同一のアミノ酸は、0と1の間のスコアが与えられ、非保存的置換が0のスコアを与えた場合には、保存的置換は、0と1の間のスコアが付与される。保存的置換のスコアリングは、例えば、プログラムのPCGENEIntelligenetics、カリフォルニア州マウンテンビューに実装されているように計算することができる。本明細書で用いられる用語配列同一性の割合は、比較ウインドウを介して2つの最適に整列された配列を比較することによって決定された値を意味することができる。但し、比較ウインドウにおける配列の一部は、2つの配列の最適なアラインメントについて参照配列付加または欠失を含まないものと比較して、付加または欠失すなわち、ギャップを含むことができる。パーセンテージは、マッチした位置の数を得るために両方の配列中に同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が発生した位置の数を決定し、比較ウインドウ内の位置の総数でマッチした位置の数を分割し、結果を100で乗算して配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出される。アミノ酸配列の類似の位置:核酸およびアミノ酸配列は、以下の段落に記載される方法によって整列alignさせることができる。整列させた場合、1つの配列中の位置は、その位置がコンセンサス配列内で同一である場合に、整列させた配列の位置と類似の位置である。比較のために配列を整列させるための方法は、当技術分野で周知である。様々なプログラムや整列アルゴリズムが以下の文献に記載されている。SmithandWatermanAdvAPPLMath24821981NeedlemanandWunschJMolBIOL484431970PearsonandLipmanProcNATLACADSciUSA8524441988HiggnsandSharpGene73237441988HigginsandSharpCABIOS515131989CorpetetalNucleicAcidsResearch1610881108901988huangetalComputerApplicationsintheBiosciences8155651992PearsonetalMethodsinMolucularBiology24307311994TatianaetalFEMSMicrobiolLett174247501990AltschuletalJMolBIOL215403101990配列アライメント手法および相同性の計算の詳細な検討。国立バイオテクノロジー情報センターNCBIの基本的なローカル配列検索ツールBLASTは、配列解析プログラムとの接続で使用するために、インターネットblastncbinlmnihgovBlastcgiで提供されている。例えば、BLASTPおよびBLASTN。このプログラムを用いて配列同一性を決定する方法の説明は、blastncbinlmnihgovBlastcgiCMDWebPAGETYPEBlastDocsでNCBIを介してインターネット上で利用可能である。アミノ酸配列の比較には、BLASTプログラムbl2seqのBlast2配列機能がデフォルトのパラメータを使用して採用されている。特定のパラメータは、例えば、マッチのためのミスマッチや報酬のためにペナルティを提供するために、当業者の裁量の範囲内で調整することができる。形質転換された:本明細書で使用する用語形質転換されたとは、構築物constructのような外来核酸分子を導入された細胞、組織、器官、または生物を指す。導入された核酸分子は、レシピエントの細胞、組織、器官、または生物に、導入されたポリヌクレオチド分子がその後の子孫に継承されるように、ゲノムDNAに組み込まれてもよい。トランスジェニックまたは形質転換された細胞または生物はまた、その細胞または生物の子孫、および例えば、異種交配における親としてそのようなトランスジェニック植物を用いた繁殖プログラムから生成され、外来核酸分子の存在に起因する変化した表現型を示す子孫もまた含む。IV宿主細胞、組織、または生物において飽和脂肪酸を減少させることへの代謝工学的アプローチA概要本発明の一実施形態は、植物の種子の中の特定のアシルCoA優先性例えば、パルミチン酸又はステアリン酸を有するデルタ9デサチュラーゼを導入することを含む。デルタ9デサチュラーゼの特定のアシルCoA優先性は、ある特定の飽和脂肪酸プール例えば、一価不飽和の生成物への変換のためのパルミチン酸のターゲティングを可能にする。アシルCoAデルタ9デサチュラーゼは、それらが正常に感知できる程度にまで植物系で生産されていないことから、植物の飽和脂肪酸含量を低下させるために選択した。Bポリペプチド本発明のいくつかの実施形態に係るポリペプチドは、配列番号:12、配列番号:13、配列番号:14、配列番号:50、配列番号:52、配列番号:72、および配列番号:73からなる群から選択される配列と整列したときに増加する割合の同一性を示すアミノ酸配列を含む。これらおよび他の実施形態内の特定のアミノ酸配列は、例えば、上記配列と少なくとも約70、約75、約80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100同一性を有する配列を含んでもよい。多くの実施形態では、上記の配列と整列された場合、上記の配列同一性を有するアミノ酸配列は、酵素δ9-180ACPデサチュラーゼ活性を有するペプチドまたはそのようなペプチドの一部をコードする。C核酸いくつかの実施形態は、上記のポリペプチドをコードする核酸分子を含む。例えば、いくつかの実施形態では、核酸配列は、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:15、配列番号:16、配列番号:17、配列番号:44、配列番号:45、配列番号:48、および配列番号:49からなる群から選択される配列と整列するときのパーセント同一性の増加を示す。これらおよび他の実施形態における特定の核酸配列は、例えば、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列11、配列番号:15、配列番号:16、配列番号:17、配列番号:44、配列番号:45、配列番号:48、および配列番号:49から成る群から選択される配列と、少なくとも約60、約65、約70、約75、約80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100の同一性を有する配列を含むことができる。これは、核酸分子は、例えば、コドンの縮重に応じて許容される塩基置換を導入することによって、実質的にコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変えずに変更できることは、当業者によって理解される。いくつかの実施形態において、本発明の核酸分子は、遺伝子調節エレメント例えば、プロモーターを含む。プロモーターは、ベクター構築物が挿入される細胞の種類に基づいて選択することができる。細菌、酵母、植物で機能するプロモーターは、当技術分野で周知である。プロモーターはまた、それぞれの制御の特徴に基づいて選択することができる。そのような特徴の例としては、転写活性の増強、誘導性、組織特異性、および発達段階特異性を含む。植物では、誘導可能であり、ウイルスまたは合成起源の、時間的に恒常的に活性調節や空間的規制であるプロモーターが記載されている。例えば、Poszkowskietal1989EMBOJ32719Odelletal1985Nature313810およびChauetal1989Science24417481を参照。有用な誘導性プロモーターとしては、例えば、プロモーターは、薬害軽減剤置換ベンゼンスルホンアミド系除草剤の適用によって誘導されるサリチル酸又はポリアクリル酸によって誘導されるプロモーター、熱ショックプロモーター、ホウレンソウ硝酸レダクターゼ転写可能な核酸分子配列に由来する硝酸塩誘導性プロモーター、ホルモン誘導性プロモーター、およびRuBPカルボキシラーゼとLHCPファミリーの小サブユニットに関連付けられた光誘導性プロモーターが含まれる。組織特異的、発生学的に調節されているプロモーターの例としては、bコングリシニン7Saプロモーターおよび種子特異的プロモーターを含む。種子色素体における優先性発現に有用な植物機能プロモーターとしては、油糧種子における脂肪酸生合成に関与するタンパク質に由来するもの、および植物貯蔵タンパク質に由来するものを含む。このようなプロモーターの例としては、ファゼオリン、ナピン、ゼイン、大豆トリプシンインヒビター、ACP、ステアロイルACPデサチュラーゼ、およびオレオなど転写可能な核酸分子配列からの5調節領域を含む。別の例示的な組織特異的プロモーターは、種子組織に特異的なレクチンプロモーターである。その他の有用なプロモーターには、Agrobacteriumtumefaciensの腫瘍誘発プラスミドに運ばれるノパリンシンターゼ、マンノピンシンターゼ、及びオクトピンシンターゼプロモーター;カリフラワーモザイクウイルスCaMVの19Sおよび35Sプロモーター;強化CaMV35Sプロモーター;ゴマノハグサモザイクウィルスFigwortMosaicVirus35Sプロモーター;リブロース15ビスリン酸カルボキシラーゼssRUBISCOの小サブユニット由来の光誘導性プロモーター;タバコ由来のEIF4AプロモーターMandeletal1995PlantMolBiol299951004トウモロコシスクロース合成酵素トウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼIトウモロコシライト収穫複合体compolexトウモロコシ熱ショックタンパク質シロイヌナズナ由来のキチナーゼプロモーターLTP脂質転送蛋白プロモーターペチュニアカルコンイソメラーゼ;豆グリシンリッチタンパク質1ポテトパタチンユビキチンプロモーター;およびアクチンプロモーターが含まれる。有用なプロモーターは、好ましくは、種子選択的、組織選択的、または誘導可能である。種子特異的調節は、例えば、EP0255378に記載されている。異種遺伝子の高い発現を得るために、例えば、それがより効率的に発現宿主細胞例えば、植物細胞、例えば、キャノーラ、米、タバコ、トウモロコシ、ワタ、ダイズ内で発現されるように、遺伝子複数可を再設計することが好ましい場合がある。したがって、植物発現用のデルタ9デサチュラーゼをコードする遺伝子の設計における任意の付加的なステップすなわち、1つ以上の遺伝子調節エレメントの提供に加えては、最適な発現のための異種遺伝子のタンパク質コード領域の再構築である。特定の実施形態では、天然に存在する異種遺伝子配列で形質転換したキャノーラ植物細胞またはシロイヌナズナ植物細胞よりも遺伝子組換えキャノーラ植物細胞またはシロイヌナズナ植物細胞で発現レベルを大きくするすなわち、より多くのタンパク質を産生するために最適化されて再設計された遺伝子が含まれる。遺伝子コードの冗長性縮退すなわち、いくつかのアミノ酸が複数のコドンによって指定されるによって与えられる可塑性のために、様々な生物や生物のクラス内のゲノムの進化は、同義のコドン異なる使用法をもたらしている。このコドンバイアスがタンパク質コード領域の平均塩基組成に反映される。例えば、比較的低いGCの含有量を有するゲノムを有する生物は、同義コドンの3番目の位置にAまたはTを有するより多くのコドンを利用しているのに対し、より高いGCの含有量を有するものは、第3の位置にGまたはCを有するより多くのコドンを利用している。さらに、mRNA内のマイナーコドンの存在が、特にマイナーコドンに対応する荷電したtRNAの相対的な存在量が低い場合は、そのmRNAの絶対的な翻訳率を下げる可能性があると考えられる。この推論の延長は、個々のマイナーコドンによる翻訳率の減少が、複数のマイナーコドンに対して、少なくとも相加的であるだろうということである。したがって、特定の発現宿主においてマイナーコドンの高い相対含量を有するmRNAは、相応に低い翻訳率を有するであろう。この率は、それに対応した低レベルのコード化タンパク質に反映され得る。キャノーラやシロイヌナズナまたは米、タバコ、トウモロコシ、綿、または大豆など他の植物での発現のためにデルタ9デサチュラーゼをコードする最適化された遺伝子を操作するにおいて、将来の宿主植物のコドンバイアスが決定されている場合、それは助けになる。複数の一般的に利用可能なDNA配列データベースが存在し、当業者は植物ゲノムのコドンの分布または様々な植物遺伝子のタンパク質コード領域に関する情報を見つけることができる。コドンバイアスは、発現宿主例えば、キャノーラやシロイヌナズナなどの植物が、そのタンパク質のアミノ酸をコードするために使用するコドンの統計的な分布である。コドンバイアスは、単一のコドンが全てのアミノ酸のコドンに対して相対的に使用される頻度として計算することができる。あるいは、コドンバイアスは、単一コドンがそのアミノ酸同義コドンについての他のすべてのコドンに対して、特定のアミノ酸をコードするために使用される頻度として算出することができる。デルタ9デサチュラーゼ遺伝子の植物発現のための最適化コード領域を設計する際には、植物によって好まれるプライマリ第一の選択コドンが決定されるべきであり、複数の選択肢が存在する場合は、第二、第三、第四などの優先コドンの選択肢も決定されるべきである。次いで、デルタ9デサチュラーゼ遺伝子をコードする新たなDNA配列が設計され得、この新しいDNA配列は、アミノ酸配列内の各位置のアミノ酸を指定する宿主に好ましい第一の好ましい、第二優先、第三優先、または第四優先などコドンの発現を置換することによって天然のDNA配列デサチュラーゼをコードするとは異なる。次いで、その新しい配列は、その変更によって作製された可能性のある制限酵素部位について分析される。同定された推定の制限部位は、制限部位を除去するための次に優先されるコドンでこれらのコドンを置換することによりさらに改変されている。異種配列の転写または翻訳に影響を及ぼす可能性のある配列内の他の部位は、エクソン:イントロン接合5または3、ポリA付加シグナル、およびまたはRNAポリメラーゼ終結シグナルである。配列をさらに分析し、TAやCGダブレットの頻度を減らすように変更することができる。これらのダブレットに加えて、同じである約6個以上のGまたはCヌクレオチドを有する配列ブロックはまた、配列の転写または翻訳に悪影響を及ぼす可能性がある。したがって、これらのブロックは、第一または第二の選択肢等のコドンを次に優先される選択のコドンと置換することにより有利に改変される。上記の方法は、当業者が、遺伝子が最適に植物中で発現されるように、特定の植物に異質な遺伝子群を変更することを可能にする。この方法は、更に、PCT出願WO9713402に示されている。したがって、いくつかの実施形態の不飽和化酵素遺伝子と機能的に同等の最適化された合成遺伝子は、植物を含む宿主を形質転換するために用いることができる。合成遺伝子の生産に関するその他のガイダンスについては、例えば、米国特許5380831に記載されている。一旦、植物に最適化されたDNA配列が紙上でまたはinsilicoで設計されたら、実際のDNA分子が設計された配列に正確に順番に対応して実験室で合成することができる。そのような合成DNA分子は、クローニングされ、そうでなければ、天然または天然の供給源から得られたかのように正確に操作されることができる。D植物材料の遺伝子形質転換のための方法いくつかの実施形態は、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:15、配列番号:16、配列番号:17、配列番号:44、配列番号:45、配列番号:48、および配列番号:49からなる群から選択される配列に対して少なくとも60同一である核酸配列を含む1つまたは複数の核酸分子を含む形質転換細胞を製造する方法に関する。このような核酸分子はまた、例えば、プロモーターなどの非コーディング調節エレメントを含むことができる。他の配列もまた、非コーディング調節エレメントおよび転写可能な核酸分子の配列と共に細胞に導入することができる。これらの他の配列は、3転写ターミネーター、3ポリアデニル化シグナル、他の非翻訳配列、トランジット、または標的配列、選択マーカー、エンハンサー、およびオペレーターを含むことができる。形質転換の方法は一般的には、適当な宿主細胞を選択する工程、組換えベクターで宿主細胞を形質転換する工程、および形質転換された宿主細胞を得る工程を含む。細胞へDNAの導入のための技術は、当業者に周知である。これらの方法は、一般的に5つのカテゴリに分類することができる:1化学的方法GrahamandVanderEbVirology545369ZatloukaletalAnnNYAcadSci66013653;2物理的方法、例えば、マイクロインジェクションCell2247988、エレクトロポレーションBiochimBiophysResCommun1075847FrommetalProcNatlAcadSciUSA8258248USPatent5384253、および粒子加速MethodsCellBiol4335365FynanetalProcNatlAcadSciUSA901147882;3ウイルスベクターClinPerinatol2015568LuetalJExpMed178208996EglitisandAndersonBiotechniques660814;4受容体媒介のメカニズムHumGenTher314754WagneretalProcNatlAcadSciUSA896099103;5、アグロバクテリウムのような細菌の媒介メカニズム。あるいは、核酸は、直接植物の生殖器官を注入することにより、花粉の中に導入することができる。ZhouetalMethodsinEnzymology101433HessInternRevCytol107367LuoetalPlantMolBiolReporter6165PenaetalNature325274。その他の形質転換方法としては、例えば、米国特許5508184に示されるプロトプラスト形質転換が含まれる。核酸分子はまた、未熟胚に注入してもよい。NeuhausetalTheorApplGenet7530。植物細胞の形質転換のための最も一般的に使用される方法は、次のとおりである:アグロバクテリウム媒介DNA転移プロセスFraleyetalProcNatlAcadSciUSA804803米国特許5824877、米国特許5591616、米国特許5981840、及び米国特許6384301に示されるおよびバイオリスティックまたは微粒子銃媒介プロセスすなわち、遺伝子銃例えば、米国特許5550318、米国特許5538880、米国特許6160208、米国特許6399861、および米国特許6403865。典型的には、核の形質転換が望ましいが、葉緑体またはアミロプラストなどの色素体を特異的に形質転換することが望ましい場合には、植物の色素体は、例えば、シロイヌナズナ、タバコ、ジャガイモ、そしてアブラナの種などの特定の植物種において所望の核酸分子のマイクロプロジェクタ媒介送達を利用して形質転換することができる。アグロバクテリウム媒介形質転換は、アグロバクテリウム属に属する遺伝子操作された土壌細菌の使用によって達成される。いくつかのアグロバクテリウム属は、遺伝子操作して多くの植物種へのDNAの任意の部分を運ぶようにすることができるTDNAと呼ばれる特定のDNAの転移を仲介する。TDNAを媒介発病pathogensisのプロセスをマーキングする主要なイベントは、次のとおりである。病原性遺伝子の誘導、およびTDNAのプロセッシングと転移。このプロセスは、多くのレビューの対象となっている。例えば、ReamAnnRevPhytopathol27583618HowardandCitovskyBioassays121038KadoCritRevPlantSci10132ZambryskiAnnualRevPlantPhysiolPlantMolBiol4346590GelvininTransgenicPlantsKungandWuedsAcademicPressSanDiegoCApp4987BinnsandHowitzInBactericalPathogenesisofPlantsandAnimalsDangedBerlinSpringerVerlagpp11938HooykaasandBeijersbergenAnnRevPhytopathol3215779LesslandLankaCell773214およびZupanandZambryskiAnnualRevPhytopathol27583618を参照。形質転換の手法にかかわらず、形質転換された植物細胞について選択するかまたはスコア化するために、細胞内に導入されたDNAは、再生可能な植物組織内で機能して、植物組織に、もし抵抗性を与えなければ毒性化合物であるものに対する抵抗性を与える化合物を産生する遺伝子が含まれる場合がある。選択マーカー、スクリーニングマーカー、またはスコアマーカーとして使用するための目的の遺伝子は、βグルクロニダーゼGUS、緑色蛍光タンパク質GFP、ルシフェラーゼ、および抗生物質または除草剤耐性遺伝子を含むがこれらに限定されない。抗生物質耐性遺伝子の例としては、ペニシリン、カナマイシンおよびネオマイシン、G418、ブレオマイシン、メトトレキサートおよびトリメトプリム、クロラムフェニコール、およびテトラサイクリンに対する耐性を付与する遺伝子を含む。例えば、グリホセート耐性を除草剤耐性遺伝子により付与することができる。DellaCioppaetal1987BioTechnology557984。他の選択デバイス、例えば、限定はしないが、ホスフィノトリシン、ビアラホス、正の選択メカニズムJoersbroら1998MolBreed41117に対する耐性、などもまた実装することができ、本発明の実施形態の範囲内にあると考えられる。選択またはスクリーニングによって同定され、再生をサポートする適切な培地で培養された、形質転換された細胞は、その後、植物にまで成熟させ得る。本明細書中に開示された方法は、任意の形質転換可能な植物の細胞や組織で使用され得る。形質転換可能な細胞及び組織は、本明細書で使用する場合、更に増殖して植物を生じさせることが可能である細胞または組織を含むが、これらに限定されない。当業者は、多数の植物細胞または組織が外来DNAを挿入した後と適切な培養条件で、植物細胞または組織が分化した植物体を形成することができるような形質転換可能であることを認識している。これらの目的のための適切な組織としては、未熟胚、タツナミソウ属scutellar組織、懸濁培養細胞、未熟花序、茎頂分裂組織、リンパ節の外植片、カルス組織、胚軸組織、子葉、根や葉を含めることができるが、これらに限定されない。形質転換植物プロトプラストまたは外植片からの植物の再生、発育、栽培は、当該技術分野で公知である。WeissbachandWeissbachMethodsforPlantMolecularBiologyAcademicPressIncSanDiegoCAHorschetalScience227122931。この再生と成長のプロセスは、形質転換された細胞を選択する工程、それらの細胞を胚発生から根ざしたrooted幼植物の段階を通じての通常の段階を経て培養する工程を典型的に含む。トランスジェニック胚および種子も同様に再生成される。この方法では、形質転換体は、首尾良く形質転換細胞を選択し、植物のシュートshootの再生を誘導する選択培地の存在下で一般的に培養される。FraleyetalProcNatlAcadSciUSA804803。これらのシュートは、通常、2~4ヶ月以内に得られる。得られたトランスジェニック根ざしたシュートは、その後土壌などの適切な植物成長培地に植えられる。選択剤への暴露を生き残る細胞、またはスクリーニングアッセイで陽性獲得された細胞は、植物の再生を支持する培地で培養することができる。シュートは次に選択剤と細菌の増殖を防ぐために抗生物質を含有する適切な根誘導培地に移すことができる。シュートの多くは根を発達させる。そして、これらは根の継続的な発達を可能にする土壌または他の培地に移植される。方法は、上記のように、一般的に使用される特定の植物株によって異なり、そのため方法論の子細は、当業者の裁量の範囲内にある。再生されたトランスジェニック植物は、ホモ接合性トランスジェニック植物を提供するために、自家受粉され得る。あるいは、再生されたトランスジェニック植物から得られた花粉は、非トランスジェニック植物、好ましくは、農学的に重要な種の近交系と交配することができる。逆に、非トランスジェニック植物からの花粉を、再生するトランスジェニック植物を受粉するために用いることができる。トランスジェニック植物は、その子孫に変換された核酸配列を一緒に渡すことができる。トランスジェニック植物は、形質転換された核酸配列に対して、好ましくはホモ接合体であり、その子孫の際のすべてに、有性生殖の結果としてその配列を伝達する。子孫は、トランスジェニック植物によって生成された種子から成長させることができる。これらの付加的な植物は、その後、植物の真の繁殖ラインを生成するために、自家受粉してもよい。これらの植物からの子孫が、とりわけ、遺伝子発現のために評価されることができる。遺伝子発現は、ウェスタンブロッティング、ノーザンブロッティング、免疫沈降、及びELISA酵素結合免疫吸着アッセイなどのいくつかの一般的な方法によって検出することができる。形質転換植物はまた、導入したDNAの存在、および発現レベル、およびまたは本発明の核酸分子およびアミノ酸分子によって付与された脂肪酸プロフィールのために分析することができる。当業者は、形質転換植物の分析のために利用できる多くの方法を認識している。例えば、植物の分析のための方法としては、サザンブロットまたはノーザンブロット、PCRベースのアプローチ、生化学分析、表現型のスクリーニング方法、フィールド評価、及び免疫アッセイが含まれるが、これらに限定されない。特に双子葉植物を形質転換するための方法は、当業者に周知である。これらの方法を用いた形質転換および植物体再生が、以下を含む多数の作物:シロイヌナズナ属のメンバー、綿花チョウ目害虫抵抗性ワタ、ダイズGlycinemax、落花生ラッカセイArachishypogaea、アブラナ属のメンバーについて記載されているが、これらに限定されない。主にアグロバクテリウムツメファシエンスAgrobacteriumtumefaciensの使用による双子葉植物の形質転換の方法およびトランスジェニック植物を得るための方法が、綿米国特許第5004863、米国特許5159135、米国特許5518908、大豆米国特許5569834、米国特許5416011McCabeetalBiotechnology6923ChristouetalPlantPhysiol876714。アブラナ米国特許5463174、ピーナッツChengetalPlantCellRep156537McKentlyetalPlantCellRep14699703、パパイヤ、およびエンドウGrantetalPlantCellRep152548ついて公表されている。単子葉植物を形質転換するための方法もまた、当該分野で周知である。これらの方法を用いた形質転換および植物体再生は、以下を含む多数の作物について記載されているが、これらに限定されない:大麦オオムギvulgaraeトウモロコシZeamays;オート麦エンバク;カモガヤオーチャード;イネOryzaインディカとジャポニカ品種を含むイネ;ソルガムモロコシ;サトウキビサトウキビ種;トールフェスクオニウシノケグサ芝草の種例えば、Agrostis根生目Agrostisstolonifera、ケンタッキーブルーグラスPoapratensis、Stenotaphrumsecundatum、小麦コムギおよびアルファルファアルファルファ。多数の形質転換の方法論が、任意の数の関心の対象作物ために、安定したトランスジェニック植物の生産のために使用され、変更され得ることが、当業者には明らかである。任意の植物が本明細書中に開示された方法で使用するために選択され得る。本発明に係る改変のための好ましい植物としては、例えば、限定されないが、油糧種子植物、シロイヌナズナ、ルリヂサBoragoSPP、キャノーラアブラナ属菌、ヒマシトウゴマ、カカオ豆テオブロマカカオ、トウモロコシZeamays、ワタワタ属、ハマナ属、クフェア属、亜麻アマ属属、LesquerellaおよびLimnanthes属、Linola、キンレンカノウゼンハレン属、マツヨイグサ属、オリーブOleaの属、パームアブラヤシ属属、落花生ラッカセイ属、菜種、紅花ベニバナ属、ダイズGlycineおよび総社属、ヒマワリヒマワリ属、タバコニコチアナ属、ハグマ属、コムギTriticum属、オオムギオオムギ属、イネOryza属、燕麦カラスムギ属、ソルガムモロコシ属、およびライムギライムギ属やイネ科の他のメンバーが含まれる。多数の形質転換の方法論が、関心の対象作物は、任意の数から安定したトランスジェニック植物の生産のために使用され、変更され得ることは、当業者には明らかである。Eトランスジェニック種子いくつかの実施形態では、トランスジェニック種子は、配列番号:12、配列番号:13、配列番号:14、配列番号:50、配列番号:51、配列番号:52、配列番号:72、および配列番号:73からなる群から選択される配列と少なくとも80同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドデルタ9デサチュラーゼを含んでもよい。これらおよび他の態様において、トランスジェニック種子は、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:15、配列番号:16、配列番号:17、配列番号:44、配列番号:45、配列番号:48、および配列番号:49からなる群から選択される配列に対して少なくとも60同一である核酸配列を含んでもよい。特定の実施態様において、トランスジェニック種子は、飽和脂肪酸例えば、パルミチン脂肪酸及び又はステアリン脂肪酸レベルの低下を示すことができる。種子は、肥沃なトランスジェニック植物から収穫することができ、上述したように少なくとも1つの核酸配列、および場合によって少なくとも1つの付加的な対象の遺伝子または核酸構築物を含むハイブリッド植物系統を含む形質転換植物の子孫世代を成長させるために使用することができる。以下の実施例は、ある特定の特徴およびまたは実施形態を説明するために提供されている。これらの実施例が、記載された特定の機能または形態に本発明を限定するものと解釈されるべきではない。実施例I:ole1欠損酵母におけるアシルCoAデルタ9デサチュラーゼのクローニングおよび機能解析イネいもち病菌アシルCoAデルタ9デサチュラーゼのクローニングイネいもち病菌アシルCoAデルタ9デサチュラーゼ遺伝子MgD9DSは、仮想タンパク質として当初注釈付きの公開されているNCBIBroad研究所の配列であって、SセレビシエアシルCoAデルタ9デサチュラーゼすなわち、OLE1にヌクレオチドレベルで554の同一性を有する配列に基づいてプライマーを用いてゲノムDNAから単離された。フォワードおよびリバースプライマー長さはそれぞれ41塩基対が、設計された。フォワードプライマーMgD9F配列番号:1は、5末端にEcoRI部位が含まれていた。リバースプライマーMg9DR配列番号:2は、3つのリーディングフレームおよび末端XhoI部位の各々に終止コドンを含んでいた。MgD9DS遺伝子は、製造業者のプロトコルに従ってタカラEZTaq登録商標PCRキットタカラバイオ株式会社滋賀県大津市、日本を用いてPCR増幅した。増幅条件は、94°Cで1分の後、94°Cで30秒間、60°Cで60秒間、および72°Cで90秒間の伸長の30サイクルであった。最後の伸長ステップを72°Cで10分間行った。予想された1425塩基対のPCR産物をアガロースゲルから切り出し、メーカーの推奨に従ってモンタージュMontageスピンカラムミリポア、バーリントン、マサチューセッツ州を用いて精製した。精製断片をpCR登録商標21TOPO登録商標クローニングベクターInvitrogen、Carlsbad、CAの中にクローン化した。TOPO反応は、サプライヤーの条件でケミカルコンピトップ10大腸菌細胞に形質転換した。推定クローンを含む細菌コロニーを単離した。ミニプラスミドプレップを、マシュレナーゲルMachereyNagelNucleospinDNA単離キットマシュレナーゲル、ノイマンネアンダーシュトラーセ、デューレン、ドイツで行いpreformed、DNAをEcoRIおよびXhoI制限酵素で消化した。予想される1425bpのMgD9DS遺伝子断片を含む陽性クローンを同定した。ヌクレオチド配列は、配列決定反応を介して得られた。PCR増幅断片の配列を配列番号:3として記載した。配列解析はMgD9DS遺伝子の5末端に位置する小さな90bpのイントロンを明らかにした。イントロンはスプライスオーバーラップ伸長PCRを用いて除去した。得られたPCRアンプリコンをゲル精製し、pCR登録商標21TOPO登録商標クローニングベクターにクローニングし、トップ10大腸菌細胞に形質転換した。いくつかのクローンを、単一の形質転換体のコロニーからの精製DNAの制限酵素分解物の分析によって同定した。これらのクローンをイントロンMgD9DSクローンの存在を確認するために配列決定した。得られた配列は、配列番号:4として記載されている。イントロン有りおよび無しのMgD9DS遺伝子を、各々酵母発現ベクターへのEcoRIXhoI断片としてサブクローニングした。この酵母発現ベクターは、Scerevisiaeデルタ9デサチュラーゼプロモーターおよびデルタ9デサチュラーゼ3UTRターミネーターに隣接したアスペルギルスニデュランスAspergillusnidulansデルタ9デサチュラーゼAnD9DS遺伝子を含んでいる。アスペルギルスニデュランスデルタ9デサチュラーゼ遺伝子を、MgD9DS遺伝子含有フラグメントまたはイントロン無しMgD9DS遺伝子含有フラグメントのいずれかと交換したEcoRIXhoIフラグメント上に切り出した。MgD9DS遺伝子1つはイントロンを有するもの、および1つはイントロンのないものを含む二つのクローンは、Sセレビシエの形質転換のために進められたadvanced。Tween登録商標80を含む酵母ペプトンデキストロースYPD培地上で維持されているデルタ9デサチュラーゼ欠損Scerevisiae株OFY093を、アルカリカチオン酵母形質転換キットQbiogene、モントリオール、カナダを用いて形質転換した。補完菌株をTween登録商標80一価不飽和脂肪酸補充剤またはウラシルSCURA及び寒天を含むドロップアウトベースを含まない培地での増殖により同定した。補完株を選択培地上で3回単一コロニー精製した。補完株を、さらにデルタ9デサチュラーゼ遺伝子のPCR増幅およびPCR産物の配列決定により確認した。また、MgD9DSクローンを含む株をYPDTween登録商標80培地で少なくとも3回継代し、次いでTween登録商標80マイナスのDOBASCURA培地へパッチングすることにより、脂肪酸およびウラシル依存に戻した。イントロン含有MgD9DSコーディング配列の発現は失敗し、これはイントロンが酵母機構によってスプライシングされなかったことを示す。イントロン無しMgD9DSコーディング配列を含有する酵母株の基質特異性を、さらにFAME分析によって特徴付けた。レプトスファエリアノドルムLeptosphaerianodorumアシルCoAデルタ9デサチュラーゼのクローニング二つレプトスファエリアノドルムLeptosphaerianodorumEST配列それぞれ1246および429塩基対を、SセレビシエアシルCoAデルタ9デサチュラーゼOLE1と配列同一性の高いレベルそれぞれ540および542を共有するものとしてBLASTN検索を使用して、LnodorumのESTのコレクションから同定した。アラインメントすると、これらの配列は互いに646同一であった。これは、2つの別個のレプトスファエリアノドルムLeptosphaerianodorumアシルCoAデルタ9デサチュラーゼの存在を示唆する。LnD9DS1遺伝子配列番号:5を、1246bpの遺伝子プローブを用いてLnodorumcDNAライブラリーをスクリーニングすることによって単離した。この遺伝子の配列が得られ、コード配列を単離した。LnD9DS2遺伝子の配列全体を、429bpのEST配列を使用して公開されているブロード研究所のレプトスファエリアノドルムLeptosphaerianodorumのゲノム配列をまずBLAST検索することによって単離した。この検索では、SupercontigLn14を、429塩基対の断片に対して100の相同性homologyを有する遺伝子を含むものとして同定し、その遺伝子を仮想タンパク質をコードするものとして注釈した。次に、LnD9DS2遺伝子を、Ln14supercontig配列に基づいてPCRプライマーを用いてレプトスファエリアノドルムLeptosphaerianodorumcDNAライブラリーからクローニングした。使用したプライマー配列はLnd9FAD2F配列番号:6およびLnd9FAD2R配列番号:7であった。フォワードプライマーは、5BamHI部位に設計されており、リバースプライマーは、3つのリーディングフレームと端末のNcoI部位に停止コドンを含んでいた。レプトスファエリアノドルムLeptosphaerianodorumcDNAライブラリーのアリコートをPCR反応のための鋳型DNA400ngを提供するために、110に希釈した。PCR増幅は、タカラEZのTaq商標PCRキットを用いて、94°Cで1分間の後、94°Cで30秒間、60°Cで60秒間、および72°Cで90秒間の伸長の30サイクルの推奨される増幅条件で行った。最後の伸長ステップを72°Cで10分間行った。予想された1370塩基対の産物をアガロースゲルから切り出し、メーカーの推奨に従ってモンタージュスピンカラムを用いて精製した。精製断片をpCR登録商標21TOPO登録商標クローニングベクターにクローニングした。ライゲーション反応は、製造業者の推奨プロトコルに従って化学的にコンピテントであるトップ10大腸菌細胞に形質転換した。推定クローンを含むコロニーを単離した。プラスミドミニプレップをマシュレナーゲルNucleospinカラムで行いpreformed、DNAをBamHI及びNcoI制限酵素で消化した。推定LnD9DS2クローンを同定し、配列決定した。配列決定の際、LnD9DS2配列番号:8のクローンを仮想タンパク質配列と比較することによって確認した。LnD9DS2の配列における保存的な変化が確認された。コドンTGCシステインは、塩基位置271におけるチミジンへのアデニンの置換によってAGCセリンに変更され、そのコドンは公開されている配列のアミノ酸89に翻訳された。これは保存的な変更であり、システインは複数の糸状菌の間で高度に保存されたアミノ酸であることが判明しなかったので、補正は試行されなかった。それぞれ配列番号:5および8のLnD9DS1およびLnD9DS2遺伝子を、酵母発現ベクターにクローニングした。LnD9DS1またはLnD9DS2コード配列のいずれかを含むクローンを制限酵素分析およびDNA配列決定によって確認した。Tween登録商標80を含まないYPD培地上に維持されたデルタ9デサチュラーゼ欠損Scerevisiae株OFY093を、Qbiogeneからのアルカリカチオン酵母形質転換キットを用いて形質転換した。補完株はTween登録商標80一価不飽和脂肪酸補充剤またはウラシルDOBASCURAを含んでいなかった培地での増殖により同定された。補完株を選択培地上で3回単一コロニー精製した。補完株はさらにデルタ9デサチュラーゼ遺伝子のPCR増幅およびPCR産物の塩基配列決定により確認した。また、LnD9DS2クローンを含む菌株を、YPDTween登録商標80培地上の各菌株を少なくとも3回継代し、その後、Tween登録商標80を含まないDOBASCURA培地へパッチングすることによって、脂肪酸およびウラシル依存に戻した。LnD9DS1またはLnD9DS2コード配列のいずれかを含有する酵母株の基質特異性は、さらにFAME分析によって特徴付けられた。HzD9DS遺伝子でのデルタ9デサチュラーゼ欠損Scerevisiaeのクローニングとその形質転換オオタバコガトウモロコシアシルCoAデルタ9デサチュラーゼHzD9DSRosenfieldetalInsectBiochemMolBiol3194964においてHzPGDS2として識別されているをコードする植物に最適化された合成遺伝子をDASPICO89後述からBamHIXhoI断片上に切り出し、モンタージュスピンカラムを用いてゲル精製した。この断片を、前述した酵母発現ベクターの対応する制限酵素部位にライゲーションし、大腸菌株DH5aへ標準的な分子生物学技術とサプライヤーのプロトコルインビトロジェン、Carlsbad、CAを用いて形質転換した。制限分析及びDNA配列決定に続いて、HzD9DS遺伝子を含むクローンを、デルタ9デサチュラーゼ欠損Scerevisiae株OFY093への形質転換のために選択した。Tween登録商標80を含むYPD培地上で維持されたOFY093株を、Qbiogeneからのアルカリカチオン酵母形質転換キットを用いて形質転換した。補完株はトゥイーンを登録商標80脂肪酸補充剤およびウラシルDOBASCURAが含まれていなかった培地での増殖により同定した。推定補完株を選択培地上で3回単一コロニー精製した。補完菌株を以下によってさらに確認した:iQbiogene酵母プラスミド精製キットを用いたプラスミドDNAの抽出に続いて、HzD9DS遺伝子特異的プライマーを用いたPCR増幅;iiHzD9DS遺伝子特異的PCR産物の配列決定、およびiiiの復帰:YPDのTween登録商標80培地での少なくとも3回の継代の後、Tween登録商標80培地マイナスのDOBASCURAへのパッチングによる脂肪酸およびURA3依存性への戻し。1つの確認された補完HzD9DS酵母株の基質特異性が、さらにFAMEの分析によって特徴付けられた。OLE1欠損酵母株で発現されたLnD9DS1、LnD9DS2、MgD9DS、およびHzD9DSの分析上記のように、3つの例示的なアシルCoAデルタ9デサチュラーゼD9DS遺伝子は、植物病原性真菌、イネいもち病菌MgD9DS、およびレプトスファエリアノドルムLeptosphaerianodorumLnD9DS1とLnD9DS2からクローニングされた。これらの遺伝子およびそのコードされたタンパク質は、これまでに特徴付けされていない。アシルCoAデルタ9デサチュラーゼは、コエンザイムAの飽和14、16、および18炭素脂肪酸アシルチオエステルの炭素原子9と10の間のシス二重結合の形成を触媒し、その結果、それぞれミリストレイン酸141、パルミトレイン酸161、またはオレイン酸181を産生する。生物特異的な生物学に関連した影響は、同じ生物学的コンテキスト内で異なる真菌アシルCoAデルタ9デサチュラーゼ遺伝子を発現することによって解消される。それ故に、真菌アシルCoAデルタ9デサチュラーゼ遺伝子の発現が、パルミトイルステアロイルCoAデサチュラーゼOLE1欠損OFY093酵母菌株内の内在ole1遺伝子プロモーターを用いて駆動された。したがって、このシステムにおける脂肪酸基質特異性に観察された相違は、特定の真菌デルタ9補完Sセレビシエ株で発現デサチュラーゼに起因するものである。補完OYF093系統で発現されたMgD9DS、LnD9DS1、およびLnD9DS2のCoAデサチュラーゼの基質特異性を特徴付けし、WO1999050430に記載されるAnD9DSsdeAで補完されたOFY093と比較した。AnD9DS遺伝子その発現がOLE1遺伝子プロモーターによって駆動されるを含む酵母発現構築物を、SセレビシエOFY093株に形質転換し、上記のプロトコルを用いて発現させた。補完Sセレビシエ株は、24時間30°Cで脂肪酸の補充のない最少培地で増殖させた。定量的FAMEの分析をた洗浄し凍結乾燥した細胞ペレット上で行った。この分析の結果を表1に示す。LnD9DS2は、C14:1とC16:1の形成を促進するのに対し、LnD9DS1およびMgD9DSは、酵母脂肪酸組成分析におけるC16:118:1の脂肪酸の比率によって示されるように、C18:1に対する優先性を有する。新規なデサチュラーゼを、さらに同じ組換え発現環境に移した天然のSセレビシエステアロイルCoAデルタ9デサチュラーゼOLE1と比較した。WO2000011012に記載されたScerevisiaeからヌクレオチド配列を含有する酵母発現ベクターを構築した。天然のSセレビシエステアロイルCoAデルタ9デサチュラーゼを含む酵母発現構築物を、上記のプロトコルを用いて、SセレビシエOFY093株に形質転換し、発現させた。昆虫種からの別の非真菌アシルCoAデルタ9デサチュラーゼである、オオタバコガゼアHzD9DSも、これらの実験で評価した。MgD9DS、LnD9DS2、およびHzD9DS遺伝子の1つを含む補完Sセレビシエ株は、ドロップアウトブロスSCURAで増殖させた。コントロール菌株、pDAB467EV1前述の酵母の形質転換方法論によってOFY093に形質転換したpDAB467BNを、DOBSCURATween登録商標80で増殖させ、親デルタ9デサチュラーゼ欠損Scerevisiae株である、OFY093を、DOBSCAATween登録商標80で増殖させた。培養物に15寒天を含む同じ培地の新鮮な画線streakプレートからの細胞のループを播種した。菌株を24時間30°Cで増殖させた。培養物を10分間6000rpmで遠心した。ペレットを、水で洗浄し、10分間6000rpmで再び遠心分離し、その後FAMEの分析を行うまで、20°Cで凍結した。発現培養物の3つのセットを分析した。凍結乾燥酵母ペレットを10wvのNaOHを含むメタノールで鹸化した。非けん化性の脂質汚染物質ステロールをヘキサンで除去した。メタノール画分を、H2SO4の添加により酸性化し、プロトン化された脂肪酸をヘキサンで抽出した。単離したヘキサン画分を乾燥し、脂肪酸を30分間80°Cで05NMeOHClでメチル化した。生じたFAMEを、内部標準としてウンデカン酸メチルエステルを含むヘキサンで抽出した。FAME抽出物を、SGEオースティン、テキサス州からのキャピラリーカラムBPX7015mx025x025mmを搭載したHP6890ガスクロマトグラフFlameイオン化検出器サンタクララ、カリフォルニア州を用いて分析した。FAMEを、キャリアガスとしてヘリウムを使用して温度勾配で分離した。各FAME種は、保持時間によって識別され、較正標準として、MatreyaLLCプレザントギャップ、ペンシルバニア州からのFAME菜種油基準ミックスを注入することにより定量した。表2は、様々な例示的なアシルCoAデルタ9デサチュラーゼを発現するole1欠損OFY093酵母細胞の脂肪酸組成FAMEとしてを示す。全ての株は良く育ち、外因的MUFAs一価不飽和脂肪酸についての要件なしに導入デサチュラーゼによって完全補完された。これらのデータは、補完酵母株の脂肪酸組成が導入した遺伝子に応じて変化することを示す。LnD9DS2はHzD9DSおよびole1と同様C16:1を比較的多量生成するのに対して、AnD9DSおよびMgD9DSはC18:1の比較的高い量を生成する。鎖長に基づく変換の差分レベルは、C14、C16、またはC18の各脂肪酸の鎖長についての総脂肪酸に対するMUFAの割合を計算することによってさらに示すことができる。これらのデータは、LnD9DS2およびHzD9DSについてのC16:1への、ならびにAnD9DSおよびMgD9DSについてのC18:1への比較的高い変換率を示す。表3.下の4つの行が追加されたタージトール、不飽和脂肪酸、またはTween登録商標を補完したコントロールサンプルを表している。JMP統計ソフトウェアスイートSASインスティチュート社、ケアリー、ノースカロライナ州で行わテューキークレーマーテストTukeyKramerTestを介して決定されたように、異なる文字を含むサンプルは、大きく異なっている。真菌のアシルCoAデサチュラーゼの系統発生複数の真菌アシルCoAデルタ9デサチュラーゼのアミノ酸配列の系統解析は、LnD9DS2が180優先性デルタ9デサチュラーゼと異なっていることを示唆している。従って、本発明者らは、18:0優先性デルタ9デサチュラーゼまたはLnD9DS2と密接に関連付けられた他の真菌デルタ9デサチュラーゼの特徴付けにより、種々の180または160活性を有するデサチュラーゼを同定し得るという仮説を立てた。本発明者らの仮説は、より密接にLnD9DS2に関連付けられている真菌デルタ9デサチュラーゼは、16:0活性を増加しているだろうと予測している。公的なDNA配列データベースブロード研究所、NCBIなどの検索では、イネいもち病菌またはレプトスファエリアノドルムLeptosphaerianodorumでデルタ9デサチュラーゼとして特に注釈を付けられたいかなる遺伝子配列も同定しなかった。本開示の範囲内で同定されたブロード研究所配列のアミノ酸配列のピーファムPfam分析は、これらのタンパク質が、他の真菌アシルCoAデルタ9デサチュラーゼでも見出されるシトクロムB5およびデサチュラーゼモチーフを含むことを示す。しかし、それらのタンパク質は、これまでにアシルCoAデルタ9デサチュラーゼとして同定されていない。本発明者らは、酵母における相補性、反転の研究reversalstudies、DNA配列分析により、これらのタンパク質のこの機能を実証した。いくつかの真菌デサチュラーゼ遺伝子配列の関係は、MEGAソフトウェアパッケージを介して近隣結合法を用いて系統的に解析した。TamuraetalMolBiolandEvolution2415969。図1は、真菌デサチュラーゼ配列のこの系統解析を示す。これらの配列は、AnD9DSsdeAアミノ酸配列を用いたNCBIの配列データベースのBLASTN検索によって回収した。LnD9DS1およびMgD9DSは、LnD9DS2に比べて、互いにより高いレベルの配列同一性を共有している。さらに、LnD9DS1、LnD9DS2、MgD9DSのClustalWのアライメントは、LnD9DS1およびMgD9DSからのLnD9DS2の分岐divergenceを示す。図2。LnD9DS1およびMgD9DSの塩基配列は、より高い数の共通の塩基対を共有する。表4および図3はさらに、新たに同定されたタンパク質である、LnD9DS1、LnD9DS2、およびMgD9DS、ならびにAnD9DSおよび酵母デサチュラーゼ、ScOLE1の系統関係を示す。LnD9DS1、MgD9DS、およびAnD9DSsdeAのアミノ酸配列は、LnD9DS2に比べてお互いに大きな割合の同一性を共有している。アミノ酸同一性の保存は、本発明者らが180アシルCoAに対する基質特異性は、LnD9DS1、MgD9DS、およびAnD9DSsdeA間で共有され保存された配列に依存していることを予測することを可能にする。比較では、LnD9DS2のアシルCoA基質特異性は、その分岐したdivergentアミノ酸配列の結果として、160に対して優先性である。実施例2:イネいもち病菌、オオタバコガトウモロコシ、およびレプトスファエリアノドルムLeptosphaerianodorumからの最適化されたデルタ9デサチュラーゼ遺伝子の設計および合成キャノーラにおける真菌デルタ9デサチュラーゼ遺伝子の高い発現を得るためには、それらがより効率的に異種遺伝子を含むトランスジェニックキャノーラ細胞で発現されるように、これらの遺伝子を設計した。配列番号:9、配列番号:10および配列番号:11としてそれぞれ本明細書に開示される、天然のいもちMagnaporthegrisea、オオタバコガトウモロコシ、およびレプトスファエリアノドルムLeptosphaerianodorumデルタ9デサチュラーゼコード領域のDNA配列の広範な分析により、最適な植物発現、ならびにそのような最適な植物発現用の非最適コドン組成に対して有害であると考えられるいくつかの配列モチーフの存在が明らかになった。デルタ9デサチュラーゼのタンパク質をコードする最適化された遺伝子を設計するために、本発明者らは、配列の変更が翻訳を妨げず、またはmRNAの不安定性を生じない、性質がより植物のような具体的には、よりキャノーラ様のDNA配列をinsilicoで作成した。デルタ9デサチュラーゼをコードする植物に最適化された遺伝子を設計するために、DNA配列を、特定の宿主植物すなわち、キャノーラについてタンパク質コード配列からコンパイルされたコドンバイアステーブルcodonbiastableから確立された冗長な遺伝子コードを利用して、タンパク質デサチュラーゼのアミノ酸配列をコードするように設計した。キャノーラのための好ましいコドンの使用状況を表5に示す。セイヨウアブラナのコーディング領域に見られるように、表5の列CとGは、各アミノ酸の同義コドンの分布そのアミノ酸の全てのコドンの使用に対するでを示す。これは、いくつかのアミノ酸のためのいくつかの同義コドンが植物遺伝子例えば、キャノーラでCGGで稀にしか検出されなかったことは明らかである。それはいずれかの植物型の遺伝子に関連するアミノ酸をコードする時間の約10以下で表される場合、コドンはめったに使用されないと考えられた表5の列DとHのDNUで示す。アミノ酸の残りのコドン選択の分布のバランスを取るために、各コドンの加重平均表現は次の式を用いて算出した:C1の加重平均1C1C2C3等×C1×100、ここで、C1は、問題のコドンであり、C2、C3、等は、表5の残りの同義コドンのセイヨウアブラナについての値の平均値を表している関連コドンの平均値が列CおよびGから取得される。0001各コドンの加重平均値は、表5の列DとHに与えられている。それぞれ配列番号:12、配列番号:13、および配列番号:14のイネいもち病菌Mangnaporthegrisea、オオタバコガトウモロコシ、及びレプトスファエリアノドルムLeptosphaerianodorumデルタ9デサチュラーゼのアミノ酸配列を本質的にコードする新しいDNA配列が、キャノーラ遺伝子において見いだされた頻繁に使用されるコドンの第一及び第二の選択肢のコドン分布を用いて、キャノーラにおける最適発現ために設計された。新たなDNA配列は、タンパク質アミノ酸配列内各位置での適切なアミノ酸を指定するための、植物優先性すなわち、第1優先、第2優先、第3優先、または第四優先のコドンの置換によってデルタ9デサチュラーゼのタンパク質をコードする天然のDNA配列とは異なる。植物に最適化されたDNA配列の設計を、表5の列DおよびHから構築したキャノーラコドンバイアステーブルを使用して、配列番号:12、配列番号:13、および配列番号:14のタンパク質配列の逆翻訳によって開始した。次いで、初期配列をコドン変化を補償する全体の加重平均コドン表現を維持しながらことによって改変して、制限酵素認識部位を除去し、安定性の高い鎖内の二次構造を削除し、そして植物におけるクローニング操作または操作遺伝子の発現に有害かもしれない他の配列を除去した。次いで、DNA配列を、その改変によって作成されたかもしれない制限酵素認識部位のために再分析した。次いで、識別された部位を、第一、第二、第三、または第四選択肢の好ましいコドンに、関連するコドンを置換することによってさらに改変した。その改変された配列をさらに分析し、さらに、TAとCGダブレットの頻度を低減するように、そしてTGとCTダブレットの頻度を増加するように改変した。これらのダブレットに加えて、約6を超える連続するGCまたはATの残基を有する配列を、他の好ましいコドンと第一または第二の選択肢等のコドンを置換することによって改変した。めったに使われないコドンは、遺伝子設計においてかなりの程度に含めなかったし、コドン組成それ自体例えば、制限酵素認識部位の追加または削除とは異なる設計基準に対応するためにのみ必要に応じて使用した。このプロセスによって設計された代表的な合成キャノーラ最適化デサチュラーゼDNA配列を、配列番号:15、配列番号:16、および配列番号:17に記載した。配列番号:1517で表される得られたDNA配列は、高度のコドン多様性および望ましい塩基組成を有する。さらに、これらの配列は、戦略的に配置された制限酵素認識部位を含み、および遺伝子の転写、または産物のmRNAの翻訳を妨害する可能性がある配列を含まない。表68は、天然の遺伝子、および植物に最適化されたバージョンに見出されるデルタ9デサチュラーゼタンパク質のコード領域のコドン組成の比較を提示し、表5の列D及びHから計算された植物のために最適化された配列についての推奨コドン組成に対して両方を比較する。配列番号:15、配列番号:16、および配列番号:17を含むDNA断片の合成は、商業的な供給業者PicoScript、ヒューストン、TX、およびブルーヘロンバイオテクノロジー、Bothell、ワシントン州によって行われた。これらのキャノーラに最適化された配列は、バージョン2v2として分類された。次いで、下記の実施例に記載のように、合成DNA断片を発現ベクターにクローニングし、アグロバクテリウムおよびキャノーラに形質転換した。実施例3:プラスミドの構築以下のプラスミドは、標準的な分子生物学的技術を用いて構築した。植物の転写単位目的の遺伝子に連結されたプロモーターから構成され、3UTRによって終了するまたはPTUを含むポリヌクレオチド断片を構築し、バイナリーベクターのTストランド領域内で、付加的な植物の転写ユニットと組み合わせた。pDAB7318の説明:pDAB7318図6、配列番号:58を、標準的な分子生物学的技術を用いて構築した。このプラスミドは2つのデサチュラーゼPTUの配列を含んでいる。第1のデサチュラーゼPTUは、インゲンマメのゼオリンプロモーターPvPhasプロモーターv2配列番号67Genbank:J01263、インゲンマメの5非翻訳領域PvPhasの5UTR配列番号:68Genbank登録:J01263、AnD9DSv3の遺伝子配列番号:49、インゲンマメ3非翻訳領域PvPhasの3UTRV1配列番号:69Genbank登録:J01263、およびインゲンマメのマトリックス結合領域PvPhas3MARV2配列番号:70、Genbank登録:J01263の配列を含む。第2のデサチュラーゼPTUは、PvPhasプロモーターV2、PvPhas5UTR、LnD9DS2V2配列番号:17、およびアグロバクテリウムツメファシエンスORF233非翻訳領域AtuORF233UTR配列番号:71HuangetalJBacteriol172181422を含む。デサチュラーゼPTUs内のエレメントは、追加の短い介在配列によって接続されている。2つのデサチュラーゼPTU配列は、アグロバクテリウム形質転換プラスミドへのこれらPTUの発現カセットの転移を容易にするために使用されるInvitrogen社のGateway登録商標組換え部位に隣接している。さらに、そのプラスミドは、複製起点、およびカナマイシン選択マーカーを含んでいる。pDAB7319の説明:pDAB7319図7、配列番号:60を、pDAB7318とpDAB7309との間のGateway登録商標組換えを介して構築した図5配列番号:53。このプラスミドは、前述のpDAB7318の説明に記載した2つのデサチュラーゼPTUの配列を含む。これらPTUsは、植物形質転換バイナリーベクターpDAB7309のT鎖DNAボーダー領域内の頭部から尾部の向きHeadtotailorientationを向いていた。このバイナリーベクターは、キャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーターCsVMVプロモーターv2;VerdagueretalPlantMolBiol31112939、ホスアセチルトランスフェラーゼPATV5;WohllebenetalGene702537、およびアグロバクテリウムツメファシエンスORF13非翻訳領域3UTRV4AtuORF1;Huangetal前出で構成されるホスアセチルトランスフェラーゼPTUを、タバコRB7マトリックス結合領域RB7MARv2Genbank:U67919、オーバードライブToroetalProcNatlAcadSciUSA85855862、およびTストランド境界配列TDNAのボーダーおよびTDNAボーダーBGardneretalScience2317257およびPCTInternationalPatentPublicationNoWO2001025459A1のような他の調節エレメントに加えて含んでいる。上記のPTUsを含むプラスミドを単離し、制限酵素消化およびDNA配列決定によって確認した。pDAB7320の説明:pDAB7320図8、配列番号:55を、標準的な分子生物学的技術を用いて構築した。このプラスミドは、1つのデサチュラーゼPTUの配列を含む。デサチュラーゼPTUは、PvPhasプロモーターV2、PvPhas5UTR、LnD9DS2V2配列番号:17、およびAtuORF233UTRを含む。デサチュラーゼPTUs内のエレメントは、追加の短い介在配列によって接続されている。デサチュラーゼPTUの配列も、アグロバクテリウム形質転換プラスミドへの転移を容易にするためにインビトロジェン社のGateway登録商標組換え部位に隣接している。さらに、そのプラスミドは複製起点およびカナマイシン選択マーカーを含んでいる。pDAB7321の説明:pDAB7321図9、配列番号:61をpDAB7320とpDAB7309との間のGateway登録商標組換えを介して構築した。このプラスミドは、前述のpDAB7319の説明に記載したデサチュラーゼPTUの配列を含む。このPTUは、植物形質転換バイナリーベクターpDAB7309のT鎖DNAボーダー領域内で頭部から尾部への向きheadtotailorientationを向いていた。このバイナリーベクターは、ホスアセチルトランスフェラーゼPTU:CsVMVプロモーターV2;PATV5;およびAtuORF13UTRv4、さらに、オーバードライブおよびTストランド境界配列TDNAのボーダーAおよびTDNAボーダーBのような他の調節エレメントを含む。上記のPTUを含むプラスミドを単離し、制限酵素消化およびDNA配列決定によって確認した。pDAB7323の説明:pDAB7323図10、配列番号:56を、標準的な分子生物学的技術を用いて構築した。このプラスミドは2つのデサチュラーゼPTUの配列を含んでいる。第1のデサチュラーゼPTUは、PvPhasプロモーターV2、PvPhas5UTR、AnD9DSV3配列番号:47、PvPhas3UTR、およびPvPhas3MARV2を含む。第2のデサチュラーゼPTUは、PvPhasプロモーターV2、PvPhas5UTR、HzD9DSV2配列番号:16、およびAtuORF233UTRを含む。デサチュラーゼPTUs内のエレメントは、追加の短い介在配列によって接続されている。2つのデサチュラーゼPTUの配列は、プラスミドアグロバクテリウム形質転換への転移を促進するために、Invitrogen社のGateway登録商標組換え部位が隣接している。さらに、プラスミドは複製起点およびカナマイシン選択マーカーを含んでいる。pDAB7324の説明:pDAB7324図11、配列番号:62を、pDAB7323とpDAB7309との間のGateway登録商標組換えを介して構築した。このプラスミドは、前述のpDAB7323の説明に記載した2つのデサチュラーゼPTU配列を含む。これらPTUsは、植物形質転換バイナリーベクターpDAB7309のT鎖DNAボーダー領域内で頭部から尾部の向きを向いていた。このバイナリーベクターは、ホスアセチルトランスフェラーゼPTU:CsVMVプロモーターv2;PATV5;およびAtuORF13UTRv4、さらに、オーバードライブおよびTスタンドボーダー配列TDNAボーダーAおよびTDNAボーダーBのような他の調節エレメントを含んでいる。上記のPTUsを含むプラスミドを単離し、制限酵素消化およびDNA配列決定によって確認した。pDAB7325の説明:pDAB7325図12、配列番号:57を、標準的な分子生物学的技術を用いて構築した。このプラスミドは、1つのデサチュラーゼPTUの配列を含む。このデサチュラーゼPTUは、PvPhasプロモーターV2、PvPhas5UTR、HzD9DSV2配列番号:16、およびAtuORF233UTRを含む。デサチュラーゼPTU内のエレメントは、追加の短い介在配列によって接続され、デサチュラーゼPTUの配列は、アグロバクテリウム形質転換プラスミドへの転移を容易にするために、Invitrogen社のGateway登録商標組換え部位に隣接している。さらに、プラスミドは複製起点およびカナマイシン選択マーカーを含んでいる。pDAB7326の説明:pDAB7326図13、配列番号:63を、pDAB7325とpDAB7309との間のGateway登録商標組換えを介して構築した。このプラスミドは、前項pDAB7325の説明に定めるデサチュラーゼPTUの配列を含む。PTUは、植物形質転換のバイナリーベクターpDAB7309のT鎖DNAボーダー領域内で頭部から尾部への向きheadtotailorientationを向いていた。このバイナリーベクターにはホスアセチルトランスフェラーゼPTUCsVMVプロモーターv2PATV5、およびAtuORF13UTRv4、さらに、オーバードライブおよびTスタンドボーダー配列TDNAのボーダーAおよびTDNAボーダーBのような他の調節エレメントが含まれている。上記のPTUを含むプラスミドを単離し、制限酵素消化およびDNA配列決定によって確認した。pDAB7327の説明:pDAB7327図14、配列番号:58を、標準的な分子生物学的技術を用いて構築した。このプラスミドは、1つのデサチュラーゼPTUの配列を含む。デサチュラーゼPTUはPvPhasプロモーターV2、PvPhas5UTR、AnD9DSv3の遺伝子配列番号:49、およびAtuORF233UTRを含む。デサチュラーゼPTU内のエレメントは、追加の短い介在配列によって接続されている。デサチュラーゼPTUの配列は、アグロバクテリウム形質転換プラスミドへの転移を容易にするために、インビトロジェン社のGateway登録商標組換え部位に隣接している。さらに、プラスミドは複製起点およびカナマイシン選択マーカーを含んでいる。pDAB7328の説明:pDAB7328図15、配列番号:64をpDAB7327とpDAB7309との間のGateway登録商標組換えを介して構築した。このプラスミドは、前項pDAB7327の説明に定めるデサチュラーゼPTUの配列を含む。このPTUは植物形質転換のバイナリーベクターpDAB7309のT鎖DNAボーダー領域内で頭部から尾部への向きheadtotailorientationを向いていた。このバイナリーベクターには、ホスアセチルトランスフェラーゼPTU:CsVMVプロモーターv2;PATv5、およびAtuORF13UTRv4、さらに、オーバードライブおよびTスタンドボーダー配列TDNAのボーダーAおよびTDNAボーダーBのような他の調節エレメントが含まれている。上記のPTUを含むプラスミドを単離し、制限酵素消化およびDNA配列決定によって確認した。pDAB7329の説明:pDAB7329図16、配列番号:59を、標準的な分子生物学的技術を用いて構築した。このプラスミドは、PvPhasプロモーターv2、PvPhas5UTR、MgD9DSv2配列番号:15、およびAtuORF233UTRを含む1つのデサチュラーゼPTUの配列を含む。このデサチュラーゼPTU内のエレメントは、追加の短い介在配列によって接続されている。デサチュラーゼPTUの配列は、アグロバクテリウム形質転換プラスミドへの転移を容易にするために、InvitrogenのGateway登録商標組換え部位に隣接している。さらに、プラスミドは複製起点およびカナマイシン選択マーカーを含んでいる。pDAB7330の説明:pDAB7330図17、配列番号:65をpDAB7329とpDAB7309との間のGateway登録商標組換えを介して構築した。このプラスミドは、前項pDAB7325の説明に定めるデサチュラーゼPTUの配列を含む。このPTUは、植物形質転換のバイナリーベクターpDAB7309のT鎖DNAボーダー領域内で頭部から尾部への向きheadtotailorientationを向いていた。このバイナリーベクターには、ホスアセチルトランスフェラーゼPTU:CsVMVプロモーターv2、PATv5およびAtuORF13UTRv4、さらに、オーバードライブおよびTスタンドボーダー配列TDNAのボーダーAおよびTDNAボーダーBのような他の調節エレメントが含まれている。上記のPTUを含むプラスミドを単離し、制限酵素消化およびDNA配列決定によって確認した。pDAB7331の説明:上記に加えて、デサチュラーゼPTUを含んでいなかったコントロールプラスミドを構築した配列番号:66。図18。この構築物は、pDAB7309に記載されている他の調節エレメントに加えて、唯一ホスアセチルトランスフェラーゼPTUを含んでいた。実施例4:アグロバクテリウム形質転換エレクトロコンピテントなelectrocompetentアグロバクテリウム細胞表9を、ヴァイゲルおよびグレーズブルック2002WeigelandGlazebrookHowtoTransformArabidopsisCh5inArabidopsisColdSpringHarborLaboratoryPressColdSpringHarborNYからのプロトコルを用いて調製した。コンピテントなアグロバクテリウム細胞50μLを氷上で解凍し、バイナリベクタープラスミドDNAの300-400ngを使用して形質転換した。細胞ミックスは、あらかじめ冷却したエレクトロポレーションキュベット02cmおよびバイオラッドジーンパルサー登録商標エレクトロヘラクレス、CAを、次の条件:電圧:25kVで、パルスの長さ:5ミリ秒、静電容量出力25μF、抵抗200Ωの下で用いて、DNAの存在下でエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、YEP液体培地broth酵母エキス10gL、ペプトン10gL、およびNaCl5gLの1mLを各キュベットに添加し、細胞YEP懸濁液を15mLの培養管に移した。細胞を、28°Cで4時間穏やかに攪拌しながらインキュベートした後、培養を表9に応じて適切に選択してYEP寒天上に播種した。プレートを28°Cで24日間インキュベートし、コロニーを選択し、抗生物質選択を含んだ新鮮なYEP寒天プレート上に画線し、1~3日間28°Cでインキュベートした。コロニーを、Ketolactoseテストを使用してアグロバクテリウムとして検証し、Ketolactose陽性コロニーを、さらに単コロニー分離の二つの経路を用いて単離した。単コロニー分離が完了した後に、最終的なパッチプレートはコロニーでできていた。アグロバクテリウムのコロニー検証:制限消化分析を、ベクター特異的制限酵素消化酵素を使用して無傷のプラスミドの存在を確認するために使用した。マシュレナーゲルNucleoBond登録商標プラスミドDNAキットを造業者の推奨プロトコルに従って使用して、選択された形質転換アグロバクテリウムのコロニーからプラスミドDNAを精製した。アグロバクテリウム形質転換に使用されたバイナリーベクターからのプラスミドDNAをコントロールとして含めた。4つの別々の消化反応を、075-1μgのDNAを使用して実行した。反応は1~2時間で進行させた後、アガロースゲル電気泳動およびエチジウムブロマイド染色により分析した。全ての酵素の消化産物がコントロールプラスミドと同一であり、予想されたバンドのサイズと一致していたコロニーを選択した。Aツメファシエンス菌株LBA404インビトロジェンカールスバッド、カリフォルニア州を、シロイヌナズナの形質転換に用い、Aツメファシエンス菌株Z707Sヘップバーンら1985J大将Microbiol。13129619をキャノーラの形質転換に使用した。実施例5:シロイヌナズナのアグロバクテリウム媒介形質転換シロイヌナズナ形質転換:シロイヌナズナを、CloughおよびBent1998PlantJ16735743の方法に基づいてフローラルディップ法を用いて形質転換した。選択されたアグロバクテリウムのコロニーを用いて、選択のための適切な抗生物質を含む一つ以上の30mLのYEP培地の予備培養precultureを播種した。培養を、220rpmで一定に撹拌しながら28°Cで一晩インキュベートした。それぞれの予備培養を、選択のための抗生物質を含むYEP培地の2つの500mLの培養液を播種するために使用し、培養を一定に撹拌しながら28°Cで一晩インキュベートした。次に、細胞を播種した。約8700gで室温で10分間遠心し、得られた上清を捨てた。細胞ペレットを、12xMurashigeおよびSkoogの塩GamborgB5ビタミン、10wvスクロース、0044μMのベンジルアミノプリンDMSO中の1mgmLのストックを10μLリットルおよび300リットルμLのSilwet登録商標L77を含む500ml浸透培地中に穏やかに再懸濁した。約1ヶ月齢の植物を、最新の花序を水中に沈めるように注意して、15秒間培地に浸漬した。その後、植物をそれらの両側に敷設し、透明または不透明で24時間覆い、その後、水で洗浄し、直立に配置した。植物を16時間の明8時間の暗の光周期で、22°Cで増殖させた。約4週間浸漬した後、種子を植物から採取した。シロイヌナズナの成長条件:収穫したばかりの種子を、乾燥剤の存在下で室温で7日間乾燥させた。乾燥させた後、種子を01アガロースSigmaChemicalCoセントルイス、MO溶液に懸濁した。懸濁した種子を、休眠要件を完了し、同期種子発芽層別化を確実にするために、2日間4°Cで保存した。サンシャインミックスLP5SunGroHorticultureIncBellevueWAを細かいバーミキュライトで覆い、ウェットまでHoaglanのソリューションで半ば灌漑したsubirrigated。土壌ミックスを24時間排水した。成層した種子をバーミキュライトに播種し、湿度ドームKORD製品、Bramalea、カナダ、オンタリオ州で7日間覆った。種子が発芽し、植物は、一定温度22°Cおよび湿度4050下、120150μmolm2secの光強度で、長日条件下16時間明8時間暗、ConvironコントローラモデルCMP4030およびCMP3244、ControlledEnvironmentsLimited、ウィニペグ、マニトバ州、カナダ内で生育させた。植物は、最初はHoaglanの溶液を用いて、その後脱イオン水で水やりされ、土壌を湿った状態しかしウェットではなくに維持された。種子の収穫に近づいている収穫前1~2週間植物は、乾燥させた。T1の形質転換植物の選択:T1種子を105×21発芽トレイTOPlasticsIncクリアウォーター、ミネソタに上記の通りに播種し、記載された条件の下で成長させた。ドームは播種56日後に取り除いた。播種5日後に、そして再度播種10日後に、苗に、DeVilbiss圧縮空気スプレーチップを使用して10ミリリットルトレイ703Lhaの噴霧量で除草剤グルホシネートリバティーの020溶液を噴霧し、適用あたり280グラムヘクタールのグルホシネートの有効率を送達した。グルホシネート除草剤溶液10mlを、各トレイに噴霧するために20mLのシンチレーションバイアルに分注した。スプレーは、水平と垂直の適用パターンを使用して送達した。各スプレーの後、除草剤名、適用レート、および適用日を記載したスプレーラベルを、各選択トレイに追加した。2回目のスプレーの4~7日後に、除草剤耐性植物を同定し、サンシャインミックスLP5を用いて調製したポットに移植した。移植された植物を、上記の成長条件で温室内に置いた。移植後6~8週間で、各植物から種子を採取し、一意の識別番号をつけ別々に保存した。実施例7:キャノーラのアグロバクテリウム媒介形質転換アグロバクテリウムの準備:pDAB7319、pDAB7321、pDAB7324、pDAB7326、pDAB7328、pDAB7330またはpDAB7331のいずれかを含有するアグロバクテリウム株を用いて、ストレプトマイシン100mgmLおよびスペクチノマイシン50mgmLを含有するYEPバクトペプトン200gLプレートおよび酵母抽出物100gLプレートに画線し、28°Cで2日間インキュベートした。2日間の画線プレートのループを、滅菌500mLのバッフルフラスコs中、ストレプトマイシン100mgmlおよびスペクチノマイシン50mgmlを含む150mLの改変YEP液に播種し、28°C、200rpmで振盪した。培養物を、キャノーラ胚軸の形質転換を行う前に、M培地LS塩3グルコース、改変B5ビタミン、1μMのカイネチン、1μMの24D、pH58に再懸濁し、適切な密度50クレット単位に希釈した。キャノーラの形質転換:種子の発芽:キャノーラの種子品種Nexera710を、10クロロックスで10分間の表面滅菌し、滅菌蒸留水で鋼ストレーナーで3回リンスした。種子は、発芽するために、PhytatraysPhytatrayあたり25種子に含まれた12MSキャノーラ培地12MS、2ショ糖、08寒天植えられた。トレイを、25°Cに設定された成長管理体制、16時間明8時間暗の光周期で環境成長チャンバーパーシバルサイエンティフィック社は、ペリー、アイオワ州内に置き、5日間発芽させた。前処理:5日目、~3mmの下胚軸片を無菌的に摘出し、根とシュートの切片を廃棄した胚軸の乾燥を、切除処理中に滅菌ミリQ水10mLにそれらを置くことによって阻止した。22-23°Cおよび16時間明8時間暗の光周期に設定成長管理体制での環境成長チャンバー内における3日間の前処理のために、胚軸切片を、カルス誘導培地MSK1D1MS;1mgLのカイネチン、1mgLの24D、3ショ糖、07Phytagar上の滅菌濾紙上に水平に置いた。アグロバクテリウムとの共培養:アグロバクテリウム処理の前日に、適切な抗生物質を含むYEP培地のフラスコを播種した。胚軸切片を、ろ紙から、乾燥から胚軸切片を防ぐために、液体M培地10mLを含む空の100×25mmペトリ皿に移した。スパチュラを、切片をすくって移動するためにこの段階で使用した。液体のM培地をピペットで除去し、アグロバクテリウム懸濁液40mLをシャーレアグロバクテリウム溶液40mLを含む500の切片に添加した。切片を、胚軸がアグロバクテリウム溶液に浸漬したままになるように、ペトリ皿を周期的に回旋しながら30分間処理した。処理期間の終わりには、アグロバクテリウム溶液アグロバクテリウム溶液が完全にアグロバクテリウムの増殖を防ぐために除去されたを廃棄ビーカーにピペットで入れ、オートクレーブ滅菌し、廃棄した。処理された胚軸は切片が乾燥しないように注意し、慎重に、濾紙でMSK1D1を含む元のプレートにピンセットで移して戻した。胚軸切片を、コントロール切片とともに、減光強度下アルミ箔でプレートを覆うことによりで環境成長チャンバーに戻し、処理された胚は3日間アグロバクテリウムと共存培養した。選択培地上でカルス誘導:共培養の3日後、胚軸切片をカルス誘導培地MSK1D1H1MS1mgLのカイネチン、1mgLの24D、05gLMES、5mgLのAgNO3、300mgLのTimentin、200mgLのカルベニシリン、1mgLのHerbiace、3ショ糖、07Phytagar上にピンセットを使用して個別に移した。胚軸切片を、培地上に固定したが、培地に埋め込まなかった。選択とシュート再生:カルス誘導培地で7日後、callusing胚軸切片を、MSB3Z1H1MS3mgLのBAP、1mgLのゼアチン、05gLのMESを、5mgLでAgNO3、300mgLでTimentin、200mgLのカルベニシリン、1mgLのHerbiace、3ショ糖、07Phytagarで選択して、シュート再生培地1に移した。14日後、シュートを有する胚軸を、MSB3Z1H3MS3mgLのBAP、1mgLのゼアチン、05gLMES、5mgLのAgNO3、300mgLのTimentin、200mgLのカルベニシリン、3mgLのHerbiace登録商標3ショ糖、07Phytagarでの増加した選択により、再生培地2に移した。シュートの伸長:14日後、シュートを有する切片をシュート伸長培地MSMESH5MS300mgLのTimentin、5mgLのHerbiace登録商標2ショ糖、07TC寒天に移した。すでに伸長したシュートを単離し、MSMESH5に移した。14日後、最初のラウンドで伸長していなかった残りのシュートを、MSMESH5上に配置し、同じ組成の新鮮な選択培地に移した。この段階で、すべての残りの胚軸切片を廃棄した。2週間後MSB3Z1H3培地で伸長させたシュートを単離し、MSMESH5培地に移した。MSMESH5上の最初のラウンドで伸長していなかった残りのシュートを単離し、同じ組成の新鮮な選択培地に移した。この段階で、残りのすべての胚軸切片を廃棄した。ルート誘導:14日後に、ルート誘導のためシュートは培地MSMESTMS;07TC寒天、05gLのMES、300mgLのTimentin、2スクロースに移した。MSMEST媒体上での最初の移動で根付かなかったシュートは、根付いた植物が得られるまでMSMEST媒体上の第二または第三サイクルのために移した。MSMEST媒体上での最初の移動で、伸長/根付かなかったシュートは、根付いた植物が得られるまでMSMEST媒体上の第二または第三サイクルのために移した。MSMESH5またはMSMEST上で根付き、PCR陽性であった植物を、土壌への移植のために移した。硬化後、T0キャノーラ植物をさらに、導入遺伝子PTUのカセットを含んでいたイベントについて分析した。その後、植物を温室に移し、成熟まで成長させ、そして種子を追加的な分析のために採取した。実施例8:T1シロイヌナズナ葉組織およびT0キャノーラ葉組織のDNA分析T0キャノーラ植物およびT1シロイヌナズナ植物を、PTUの発現カセットを含んでいた植物を同定するために分析した。Invader登録商標アッセイを、推定的に形質転換した植物のサンプルを最初にスクリーニングするために行い、patPTUの単一のコピーが含まれていたイベントを識別した。単一コピーのイベントとして同定されたイベントを保存し、さらにPCRによるデサチュラーゼPTUsの存在について分析した。デサチュラーゼの発現カセットPTUsについてPCR陽性であったイベントを、さらにサザンブロット分析により分析した。サザンブロット分析を、植物を形質転換するために使用されるバイナリーベクターからの遺伝子発現カセットPTUsを植物が含むことを確認するために完了した。PTUsすべてを含む単一コピーのイベントを、さらに進めるために選択した。DNAの単離:全ゲノムDNAgDNAをQIAGEN社のDNeasy登録商標96プラントキットQiagen、バレンシア、CAを用いて凍結乾燥した葉組織から抽出した。次いで、このgDNAを、PCRおよびコピー数についてInvader登録商標アッセイに使用するために、10ngLキャノーラまたは07ngmLシロイヌナズナまで希釈した。Invader登録商標分析:選択マーカーpatのコピー数解析を、Invader登録商標アッセイThirdWaveTechnologies、マディソン、WIを使用して完了した。ゲノムDNAを、製造業者の推奨プロトコルに従って、10分間95°Cで変性し、氷上で冷却し、オリゴヌクレオチドプローブ、蛍光共鳴エネルギー移動FRETが可能な色素分子、および切断cleavase酵素を含有する試薬のマスターミックスと混合した。反応には、内部リファレンス遺伝子に対するプローブが含まれていた。1deoxyxylulose5リン酸メラーゼDXR1遺伝子をシロイヌナズナInvader登録商標アッセイ反応に対する内部参照遺伝子として使用し、高移動度群蛋白質遺伝子HMGaを、キャノーラInvader登録商標アッセイ反応の内部参照遺伝子として用いた。また、プレートは、1コピー、2コピー、4コピーの基準だけでなく、野生型のコントロールサンプルおよびサンプルが格納されていないブランクのウェルを含んでいた。全体の反応は、15時間、63°Cでのサーモサイクラーでのインキュベーション前にミネラルオイルを重層した。得られた反応物を蛍光プレートリーダーSynergy商標2、バイオテックインスツルメンツ、Winooski、バーモント州で読み取った。読みを、FAMλ485-528nmおよびREDλ560-620nmの両方のチャネルについて収集した。これらから、各チャネルごとに折り返しゼロつまり背景は、テンプレートなしの生の信号によってサンプルの生の信号を割り算することによって、それぞれのサンプルについて測定した。このデータから、標準曲線を構築し、最高の適合を線形回帰分析によって決定した。その後、この適合から同定されたパラメータを使用して、見かけ上のpatのコピー数を、各試料について決定した。PCR解析:PCR解析を、各植物の転写単位を増幅するプライマーを用いて完了した。これらのプライマーは、プロモーターファゼオリンおよび3UTRファゼオリンまたはORF23に位置していた。これらの同じプライマーセットを、キャノーラとシロイヌナズナの両方のPCR分析のために使用した。pDAB7319イベントおよびpDAB7324イベントのPCR分析のために、プライマーMAS414配列番号:18およびMAS415配列番号:19を最初のPTUを増幅するために使用した。このPTUはゼオリンプロモーター、アスペルギルスニデュランスからのアシルCoAデルタ9デサチュラーゼ遺伝子AnD9DSv3;配列番号:49の機能的等価物、およびファゼオリン3UTRターミネーターで構成されていた。構築物pDAB7319中での第2PTUのPCR増幅のために、プライマーMAS415およびMAS413配列番号:20を使用した。このPTUは、ゼオリンプロモーター、レプトスファエリアノドルムLeptosphaerianodorumLnD9DS2v2;配列番号:17からのアシルCoAデルタ9デサチュラーゼ遺伝子の機能的等価物、およびORF233UTRで構成されている。MAS415およびMAS413プライマーペアもpDAB7324ゼオリンプロモーター、オオタバコガゼアアシルCoAデルタ9デサチュラーゼ遺伝子V2HzD9DSv2;配列番号:16、およびORF233UTRで形質転換することによって生成された第2のPTUイベントを増幅するために使用した。また、MAS415およびMAS413プライマー対を、構築物pDAB7321およびpDAB7326中でPTUsを増幅するために使用した。PCR反応を、20ngのゲノムDNA、5ユニットのExTaqタカラ、1x反応バッファ、02μMの各dNTP、および08μMの各プライマーを使用して25μLの容量で行った。増幅反応を、DNAEngineTetrad登録商標2サーマルサイクラーBioRad社、ヘラクレス、カリフォルニア州で行った。以下のサイクリング条件を、プライマーMAS413およびMAS415のために使用した:94°Cで3分間;その後、94°Cで30秒、63°Cで30秒、および72°Cで3分間を35サイクル;ならびに72°Cで10分間の最終的な伸長。プライマーMAS414およびMAS415に使われたサイクリング条件は、アニーリング温度が63°Cから60°Cに低減したことが唯一の違いで、それ以外同じであった。反応生成物を、1アガロースゲルで泳動し、エチジウムブロマイドで染色し、GelDoc商標上で可視化した。サザンブロット分析:サザンブロット分析を使用して、キャノーライベントの統合パターンを確立した。これらの実験から、キャノーラゲノム内デサチュラーゼ導入遺伝子の統合および整合性を実証したデータが生成された。選択したイベントが、植物形質転換のために使用されるバイナリーベクターからのデサチュラーゼ導入遺伝子の単一コピーを含む、全長の、単純な統合イベントとして特徴付けられた。詳細サザンブロット分析を、デサチュラーゼ遺伝子に特異的なプローブおよびプラスミド内に位置する部位で切断する記述的制限酵素を用いて行った。これらの消化物は、プラスミドに対して内部的なハイブリダイズフラグメント、またはキャノーラのゲノムDNAボーダー断片のプラスミドとの接合部にまたがるフラグメントを生成した。制限酵素およびプローブの組み合わせについてサザンハイブリダイゼーションから示された分子の大きさは、イベントごとに固有であった。これらの分析はまた、T鎖DNAの再編成なしにキャノーラゲノムDNAにプラスミド断片が挿入されたことを示した。サザンブロット分析のために、100mgの凍結乾燥されたキャノーラ葉の組織を、PlantMiniKitQiagenを用いて抽出した。サンプルあたり5マイクログラム5μgのgDNAを、SpeIおよびPacI制限エンドヌクレアーゼNewEnglandBiolabsIpswichMAで同時に消化して、目的のPTU、およびまたは選択マーカーPATのいずれかを含む断片を得、コピー数を決定した。消化したDNAを08アガロースゲル上で分離した。簡単に言えば、DNA断片の電気泳動分離および可視化に続いて、ゲルを約20分間025NHClで脱プリン化した後、約30分間変性溶液に曝した後、中和溶液に少なくとも30分間曝した。サザントランスファーを、10×SSCとともにウィッキングシステムを使用して、ナイロン膜ミリポア、バーリントン、マサチューセッツ州の上で一晩行った。トランスファー後、膜を2×SSC溶液で洗浄し、DNAをUV架橋により膜に結合させた。このプロセスにより、ハイブリダイゼーションのための準備ができたサザンブロット膜が生成された。プローブを生成し、PCR断片をプラスミドDNAから増幅し、QIAquick登録商標ゲル抽出キットQiagenを用いてゲル抽出により精製した。LnD9DSプローブを作製するために使用したプライマーは、arw008配列番号:21およびarw009配列番号:22であった。HzD9プローブを作製するために使用したプライマーはarw010配列番号:23およびarw011配列番号:24:であった。すべての3つの反応のためのPCR条件は、63°Cのアニーリング温度および1分間の伸長時間での35サイクルで構成されていた。PCR断片を、PrimeIt登録商標RmTランダムプライマーラベリングキットStratagene、ラホーヤ、カリフォルニア州を用いて、32Pで標識した。ハイブリダイゼーション工程を、約65°Cで一晩ハイブリダイゼーションオーブン内で行った。ナイロンメンブレンブロットをすすぎ、ブロットを蛍光画像画面上に一晩露出し、Storm商標860スキャナMolecularDynamics、カリフォルニア州サニーベールでスキャンした。実施例9:アシルCoAデルタ9デサチュラーゼを含有するトランスジェニックシロイヌナズナの種子の脂肪酸組成シロイヌナズナ植物を、LnD9DS2v2pDAB7321;配列番号:61、HzD9DSv2pDAB7326;配列番号:63またはMgD9DSv2pDAB7330;配列番号:65用の遺伝子を含むアグロバクテリウムベクターで形質転換した。植物もAnD9DS遺伝子pDAB7328配列番号:64を含むベクターで形質転換した。選択マーカーpat遺伝子pDAB7331、配列番号:66のみを含む空のベクターを、陰性コントロールとして用いた。形質転換もまた、ステアロイル優先性デサチュラーゼAnD9DSを、LnD9DS2pDAB7319配列番号:60またはHzD9DSpDAB7324;SEQIDNO:62のいずれかのパルミトイル優先性デサチュラーゼと組み合わせて、2つのデサチュラーゼを組み合わせて用いて行った。すべての場合において、デサチュラーゼ遺伝子は、種子特異的PvPhasプロモーター米国特許5504200によって駆動された。バルクT2種子は、Invader登録商標アッセイの分析によってpat遺伝子、およびPCR分析によってデサチュラーゼPTUを含むことが確認された除草剤耐性のT1植物から収穫した。種子サンプルを、スチールボールとボールミルを用いて代用としてヘプタン含有トリヘプタデカノインtriheptadecanoinNuChekprep、エリシアン、ミネソタ州中でホモジナイズした。均質化に先立って、MeOH中新たに調製した025MのMeONaシグマの溶液を試料に添加した。反応を、軽度の熱40°Cの下で、一定に振盪しながら実施した。反応を、メチル化サロゲートの回収により検証した。FAMEの抽出を3回繰り返した後、すべてのヘプタン層を、分析前にプールした。抽出の完全性を、4回目の抽出誘導体化においてFAMEの存在を確認することにより検証した。その結果得られるFAMEを、SGEからのキャピラリーカラムBPXスイッチ7015m×025mm×025mmを用いてGCFIDによって分析した。各FAMEを保持時間によって識別し、較正標準として、Matreya、LLCPleasantGap、ペンシルバニア州からの菜種油基準ミックスを注入することにより定量した。トランスジェニックイベントからのT2種子のFAME分析は、デサチュラーゼのそれぞれの発現が、イベントの各セットの平均飽和脂肪酸含有量から決定される、種子の総飽和脂肪酸含量を減らすことに重大な影響を有することを示した。表10および図19。この表および次の表では、JMP登録商標統計ソフトウェアパッケージSASインスティチュート社、ケアリー、ノースカロライナ州で行わたテューキークレーマーTukeyKramerのHSD検定を用いて決定されたように、同じ文字で接続されていない値は、大きく異なっている。LnD9DS2またはHzD9DSとAnD9DSとの組み合わせが、最も低い平均総飽和脂肪酸含量を生じた。すべてのデサチュラーゼは、シロイヌナズナ種子中の全飽和脂肪酸含量を低下させているが、酵母の実験から予測されるように、それらは、パルミチン酸及びステアリン酸脂肪酸の含有量に異なる効果を有していた。表11および図20は、イベントの各セットの平均パルミチン酸含有量を示す。表12および図21は、イベントの各セットについての、T2種子の平均ステアリン酸含量を示す。AnD9DSおよびMgD9DSは、LnD9DS2およびHzD9DSよりもステアリン酸含量に大きな影響を及ぼした。逆に、LnD9DS2およびHzD9DSは、AnD9DSおよびMgD9DSよりもパルミチン酸含量に大きな影響を及ぼした。デサチュラーゼの組み合わせは脂肪酸の両方に大きな影響を与える。これらの結果はまた、パルミチン酸のデルタ9不飽和化の主要な生成物であるパルミトレイン酸の種子中含有量を増加させることに対するデサチュラーゼの効果において観察された。表13および図22。位置とコピー数の影響により、分析されたイベント全体で飽和脂肪酸含量に対するデサチュラーゼの効果にばらつきが予想された。最小限の総飽和脂肪酸含量5最下位のイベントの平均を有するイベントの完全な脂肪酸プロフィールの比較は、野生型およびコントロール形質転換植物からの種子のプロファイルと一緒に表14に示されている。飽和パルミチン酸およびステアリン脂肪酸の含有量を低減し、一価不飽和脂肪酸の含有量パルミトレイン酸とオレイン酸を増加させることに加えて、デサチュラーゼの存在はまた、種子中のアラキジン酸C20:0の量を低下させた。これはおそらく、この脂肪酸がステアリン酸とパルミチン酸の伸長に由来するためである。C20:1D9のようにエイコセン酸における付随上昇C20:1がないので、導入デサチュラーゼによるC20:0の直接的な不飽和化もなかったようであった。実施例10:デルタ9デサチュラーゼ抗体調製抗体などの診断ツールは、植物においてトランスジェニックデルタ9デサチュラーゼのタンパク質の発現を特徴付けるために望ましい。アシルCoAデルタ9デサチュラーゼは、膜結合タンパク質であるため、大腸菌で過剰発現ルーチンは困難である。しかし、抗体は、タンパク質の膜貫通ドメインのいずれも含んでいない各デルタ9デサチュラーゼタンパク質のC末端断片の過剰発現によって首尾良く生成された。ポリメラーゼ連鎖反応:PCRプライマーは各デサチュラーゼの等価C末端断片を増幅するように設計された。3プライマーは、C末端6×Hisタグを有するタンパク質の断片をコードするように設計された。NdeI及びBamHI制限部位は、クローニングを容易にするために、それぞれ5および3プライマーに組み込まれた。プライマー配列は以下の表15に記載される通りである。予想される増幅産物は、LnD9DS2についての659bp、MgD9DSについての683bp、およびHzD9DSについての335bpであった。PCR反応を、サプライヤーの条件を使用してタカラExTaq商標PCRキットClontech社、マウンテンビュー、カリフォルニア州を用いて行った。全PCR反応容量は50μlであった。各反応は、200ngのプラスミドDNAおよび各プライマー50pmolを含んでいた。DNAは、94°Cで1分間、続いて94°Cで30秒間、60°Cで1分間、72°Cで30秒間の30サイクルで変性させた。最終伸長を10分間72°Cで行った。各PCR産物を、滅菌075アガロースゲル上で2つのウェルにまたがって行い、DNAをモンタージュスピンカラムを用いてゲル精製し、15μLのTE緩衝液に溶出した。TOPOクローニング:精製したC末端断片を、TOPO登録商標pCR登録商標21ベクターインビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州にTAクローニングし、製造業者のプロトコルInvitrogen社に従って、トップ10大腸菌細胞に形質転換した。形質転換は選択され、プラスミドDNAをNucleoSpin登録商標カラムマシュレナーゲル社株式会社、デューレン、ドイツを用いて精製した。3マイクロリットル3μLのDNAを、37°Cで90分間、20μLの全容積でNdeIおよびBamHIで消化し、08アガロースゲルにかけた。それぞれのケースでは、遺伝子特異的断片プラス39キロバイトTOPO登録商標ベクターのバンドが見えた。3個の陽性クローンがそれぞれクローニングされた遺伝子のために選ばれ、増幅されたPCR断片にエラーが無かったことを確認するために配列決定した。MgD9DSクローンのそれぞれには、塩基対45でサイレント点突然変異が含まれており、公表されている配列とPCRのテンプレートとの間の一塩基多型、またはサイレントPCRのエラーのいずれかを示している。変異はサイレントであったので、補正の必要はなく、1つのクローンをサブクローニングのために選択した。デルタ9デサチュラーゼC末端断片発現プラスミドの作製:PCR増幅デルタ9デサチュラーゼ断片をNdeIおよびBamHI制限酵素で消化し、pET30b発現ベクター内の対応する制限部位にライゲーションした。クローニングステップは、全長タンパク質の精製を容易にするために、C末端6×Hisタグを構成する15個のC末端アミノ酸の添加をもたらした。これらの付加的なアミノ酸は、タンパク質の発現に影響を与えないことが予想された。陽性クローンを得られたことを、制限酵素消化およびシークエンシング反応を介して確認した。大腸菌でのデルタ9デサチュラーゼC末端ペプチド断片の発現:デルタ9デサチュラーゼpET30b発現プラスミドを、メーカーの推奨するプロトコルノバゲン、マディソン、WIに従って、BL21DE3大腸菌細胞に形質転換した。細胞を、カナマイシン50μgmLのとグルコース125Mを含むLAプレート上にプレートした。プレートを37°Cで一晩インキュベートした。細胞の完全なループをプレートから掻き取り、イソプロピルPDチオガラクトシド075mMインデューサーとともに250mLのLB及びカナマイシン50μgmLを含む500mlフラスコに播種した。三つの誘導条件を試験した。培養を、次のように異なる温度で誘導し、異なる時期に収穫した:28°Cで一晩~18時間、16°Cで一晩、または37°Cで4時間。細胞は250mLのボトル中での15分間6000rpmでの遠心分離によって回収した後、20°Cで凍結した。デルタ9デサチュラーゼC末端ペプチド断片のタンパク質精製:250mLの培養液からの細胞ペレットを10グリセロールおよび05mLのプロテアーゼインヒビターカクテルシグマ、セントルイス、MOを含む50mLの冷リン酸緩衝化生理食塩水PBS中で手持ち式ホモジナイザーを使用して解凍し、再懸濁した。細胞をBransonModel450Sonifierダンブリー、コネチカット州を用いて約10分間氷上で破壊した。封入体を、15分間、10000×gでの遠心分離によってペレット化し、ブラッドフォードタンパク質アッセイによって測定されたを、上清のタンパク質濃度がベースラインに達するまで、05トリトンX100を含むPBSで2~3回抽出した。回収された封入体は、約1時間室温で撹拌しながら6M尿素及び5mMのDTTを含むPBS溶液に可溶化した。可溶化されたタンパク質を、15分間、30000xgでの遠心分離により不溶性の物質から分離し、保持された上清を5mLのNiアフィニティーカラムGEHealthcare、HiTrapキレート、Piscataway、NJにかけた。金属樹脂に結合したC末端のデルタ9デサチュラーゼペプチドのヒスチジンタグ、および各断片を、Akta登録商標エクスプローラ100GEヘルスケア、Piscataway、NJを用いて、50-200mMイミダゾール勾配で溶出した。画分各3mLを採取し、溶出ピークをSDSPAGEで分析した。C末端デルタ9デサチュラーゼペプチドを含有する画分をプールし、5mL未満の容量にAmicon登録商標ウルトラ10000MWCOフィルター装置ミリポア、ビレリカ、MAを用いて濃縮した。その後、タンパク質試料を、HiLoad商標XK1660Superdex商標200サイズ排除カラムGEHealthcare、Piscataway、NJに注入し、20mMトリスHCl、150mMのNAC1、及び1mMのDTT中の6M尿素で平衡化した。純粋なC末端デルタ9デサチュラーゼペプチドを含むピーク画分4mLずつを保存しSDSPAGE分析及び他の生化学的特性の評価により検証した後、抗体産生のために使用した。LnD9DS2ペプチドについて27kDa、HzD9DSペプチドについて15kDa、MgD9DSペプチドについて28kDaの予想サイズを有するペプチドが産生された。誘導条件は、SDSPAGEゲルのクマシーブルー染色による可視化のための十分なタンパク質を産生した。ポリクローナル抗体作製:契約サービスStrategicBioSolutions、ニューアーク、デラウェア州により、3つのC末端デルタ9デサチュラーゼペプチドの各々に対するウサギの抗体を産生した。彼らの標準的な手順に従って、3つのタンパク質断片のそれぞれについて力価の高いELISAを使用して検証抗血清を得た。各精製C末端デルタ9デサチュラーゼペプチドを、20mMトリスHCl、150mMのNAC1、1mMのDTTバッファで、および23Mの最終濃度の尿素で希釈し、タンパク質を溶液中に維持した。約10mgのタンパク質を、ポリクローナル抗体の生成のためにStrategicBioSolutionsに送った。二羽の兎を各免疫原のために選択し、標準的なプロトコル70日予防接種を用いた。TiterMax登録商標ゴールドと呼ばれる新たなアジュバントを、エマルションの調製のために購入した。予防接種時に、プロトコルの終わりにELISA滴定も抗体産生の成功を確保するために行った。抗血清は、2つの別々の時点:1つを標準的な2月のプロシージャから、及び他の1つを放血から、採取した。ウサギ血清から総IgGを単離するためには、約20~30mLの高力価の抗血清を5mLのアルカリトレラントプロテインAカラムGEヘルスケア、たHiTrap商標MabSelectSuRe商標、カタログ番号11003494に適用した。PBS緩衝液での標準洗浄後、結合したIgGを、01Mクエン酸ナトリウム、03MNAC1、pH33に短い時間暴露することにより樹脂から溶出し、2MトリスHCl、pH9の緩衝液の110量を各画分へ追加することで直ちに中和した。アフィニティーカラムを、IgGのクロスコンタミネーションを避けるために、標準のクリーニングインプレイスCIPの手順に従って、05NNaOHで処理することによって消毒した。各サンプルから最終的に回収したIgGを、50容量の4°CのPBSで一晩透析し、そしてタンパク質濃度を、BSA標準ピアース、23208をprodを使用して、Bradfordアッセイによって決定した。1mLずつ個別のチューブに移し、80°Cで保存した。これらの抗体は、トランスジェニック植物材料でのデサチュラーゼタンパク質の発現を測定するために使用された診断ツールである。抗体は、低飽和脂肪酸油の表現型の変化およびデルタ9デサチュラーゼのタンパク質の発現レベルの間の相関関係を開発するために使用された。実施例11:T2シロイヌナズナ種子におけるアシルCoAデルタ9デサチュラーゼタンパク質のレベルデルタ9デサチュラーゼのポリペプチドを、ウェスタンブロット法により成熟トランスジェニック種子サンプルで検出した。種子を分析のために、Kleco商標BeadBeaterGarciaMachine、ヴァイセーリア、カリフォルニア州においてステンレススチール製ビーズを用いて乾燥した種子を分解することによって調製した。抽出緩衝液50mMトリス、10mMのEDTA、2SDSを添加し、サンプルチューブを30分間静かに振盪した。サンプルを3000RCFで15分間遠心分離した。その後、上清を回収し、分析のために使用した。種子抽出物中の総可溶性タンパク質の量を、LowryアッセイBioRad、Hercules、カリフォルニア州によって決定した。サンプルを、155mgmLの総可溶性タンパク質に正規化し、レーン当たり20μgの全可溶性タンパク質の標準ロードのために、40mMのDTTを含むLDSサンプルバッファーInvitrogen、Carlsbad、CAを中で調製した。サンプルを、412BisTrisゲルInvitrogen社で電気泳動し、ニトロセルロース膜に移した。ブロットをブロッキングバッファーでブロックし、4つの異なるデルタ9デサチュラーゼポリペプチドAnD9DS、LnD9DS2、HzD9DS、およびMgD9DS実施例10参照に対する抗体でプローブした。すべての場合において、ポリクローナル抗体を、上記のように個別のデサチュラーゼのHisタグ精製C末端ペプチド断片に対してウサギにおいて開発した。精製されたC末端断片を、ウェスタンブロットの定量化のための基準抗原として用いた。抗ウサギ蛍光標識二次抗体ヤギ抗ウサギAF633Invitrogenを検出のめに使用した。ブロットを、Typhoon商標TrioPlus蛍光イメージャーGEヘルスケアで可視化した。標準曲線は二次曲線フィッティングを使用して生成し、線形回帰が発現を定量するために使用した。特定の抗血清でプローブしたときに、シロイヌナズナのイベントからの成熟したT2種子からの抽出物のSDSPAGEウェスタンブロットは、適切なサイズのバンドを示した。これらのバンドを、特定の基準抗原に対して定量した。適切な抗血清を用いたシロイヌナズナのT2種子抽出物の定量的ウェスタンブロッティングにより、平均で63ngLnD9DS2総蛋白mgtp最大228ngmgtpが、成熟した種子で検出され、HzD9DSについては34ngmgtp最大100ngmgのtpが検出されたことが示された。MgD9DSについては、平均58ngmgtp最大1179ngmgtpが、T2種子で検出された。AnD9DSイベントについては、平均625ngmgtp最大15μgmgtpが、成熟T2種子で検出された。したがって、AnD9DSに対して、10-18倍少ないパルミトイル優先性デサチュラーゼであるLnD9DS2およびHzD9DSが、トランスジェニック種子中で発現した。したがって、これらのデサチュラーゼの発現をより高いレベルにすることにより、飽和脂肪酸、特にパルミチン酸のさらなる低減が駆動される。実施例12:キャノーラにおけるデルタ9デサチュラーゼ遺伝子の発現一連のトランスジェニックキャノーライベントを、pDAB7321配列番号:61およびpDAB7326配列番号:63種子特異PvPhasプロモーターによって駆動されるそれぞれLnD9DS2とHzD9DSの遺伝子を含むを用いて実施した形質転換から得た。LnD9DS2遺伝子を含む39個のpDAB7321イベントを、ゲノムDNAのPCR解析により同定し、温室内で生育させて、T1種子を生産した。同様に、80個のpDAB7326イベントがHzD9DS遺伝子を有することが確認され、T1種子を生産した。キャノーラもpDAB7319配列番号:60またはpDAB7324配列番号:62で形質転換し、これらはLnD9DS2またはHzD9DS遺伝子と結合したAnD9DS遺伝子全てPvPhasプロモーターによって駆動されるを含んでいる。44および76個のイベントをそれぞれ回収し、PCR分析によって両方のデサチュラーゼ遺伝子を含んでいることを確認し、温室内で生育させ、T1種子を生産した。pDAB7321LnD9DS2v2またはpDAB7326HzD9DSv2で形質転換されたイベントからのT1種子サンプルのFAMEの分析では、形質転換されていないキャノーラ植物又は空のベクターコントロールで形質転換された植物に対して、飽和脂肪酸濃度の有意な減少を示さなかった。T1種子のウェスタンブロットは、検出可能なレベルのデルタ9デサチュラーゼタンパク質を示さなかった。また、LnD9DS2またはHzD9DSについての検出可能なタンパク質は、AnD9DSタンパク質が容易に検出される可能性があるのに対し、pDAB7319AnD9DSv3およびLnD9DS2v2またはpDAB7324AnD9DSv3およびHzD9DSv2で形質転換された植物からのT1種子では検出されなかった。これらのイベントでは、飽和脂肪酸の減少がコントロール植物に対して観察されたが、これはAnD9DSの発現に起因するものであった。デルタ9デサチュラーゼ遺伝子の相対的なmRNAレベルを評価するために、全RNAをダブルデサチュラーゼ構築物pDAB7319とpDAB7324で形質転換したイベントからの発達中のキャノーラ種から抽出し、定量的リアルタイムPCRで解析した。種子を、いくつかのキャノーラ植物から、受粉の20、25、29、32、39、または41日後にドライアイス上で収穫し、80°Cで保存した。全RNAを、製造業者の推奨プロトコルに従って、PlantRNeasy登録商標RNA抽出キットQiagenを用いて、50mgのプールされた冷凍の種子から調製した。抽出したRNAを、製造業者の推奨プロトコルに従って定量RTPCR用のSuperScript登録商標IIIファーストストランド合成スーパーミックスInvitrogenを用いてcDNA合成のための鋳型として使用した。RTPCRアッセイを、ロシュアッセイデザインセンターロシュダイアグノスティックス、インディアナ州インディアナポリスを使用して、標的とするデサチュラーゼに対して設計した。アッセイに使用したプライマーは、表16に記載されている。標的アッセイは、FAM標識UPLプローブRocheDiagnosticsを用いた。これらのアッセイは、統合型DNA技術によって合成されたテキサスレッド標識キャノーラアクチン参照アッセイで二重の反応で実行された。RTPCR反応は、ライトサイクラー登録商標480IIリアルタイムPCRサーマルサイクラーロシュ上で実行された。標的UPLアッセイのためのデータを、533nmの発光フィルターおよび483nmの励起信号を使用して収集した。アクチン参照アッセイのためのデータを、610nmのフィルターおよび558nmの励起信号を使用して収集した。サイクルタイム値および標的基準比率が、LC480IIソフトウェアのAdvanced相対定量分析のワークフローを使用して自動的に計算された。各サンプル内のデサチュラーゼ転写レベルの相対的な蓄積は標準ΔΔCt法Rocheを用いて算出した。pDAB7319AnD9DSv3およびLnD9DS2v2およびpDAB7324AnD9DSv3およびHzD9DSv2からの各キャノーラ種子サンプルについて、HzD9DSまたはLnD9DS2の導入遺伝子の転写産物の蓄積は、同じイベントでAnD9DSの転写よりも有意に低かった。転写産物の蓄積における観察された差は、3倍以下と20倍以下の間で変化した。図23。したがって、HzD9DSおよびLnD9DS2の不十分な発現は、これらの遺伝子に起因するポリペプチドの検出の欠如および表現型の非存在を説明する可能性がある。実施例13:代替プロモーターによるデルタ9デサチュラーゼPTUsの発現LnD9DS2、HzD9DS、およびMgD9DSタンパク質をコードする遺伝子群を発現するために付加的な転写調節領域を使用することにより、キャノーラ内でこれらのデルタ9デサチュラーゼの含有量をさらに増大させ得る。発達の初期に、より長い期間にわたって発現する転写調節領域の同定と利用により、種子開発の初期段階で異種遺伝子の堅牢な種子特異的転写を促進することにより、キャノーラ種子内で異種デルタ9デサチュラーゼのレベルを向上させることができる。このような転写調節領域の例としては、LfKCS3プロモーター米国特許7253337およびFAE1プロモーター米国特許6784342が含まれるが、これらに限定されない。これらのプロモーターは、プラスミドpDAB7319;pDAB7321pDAB7324pDAB7326pDAB7328およびpDAB7330に以前に記載されているような遺伝子との作動可能な連結を通じて、例えば、LnD9DS2、HzD9DS、およびMgD9DS発現カセットの発現を駆動するために、単独で、または組み合わせて使用されている。プラスミド内の転写調節領域を交換する方法は、当該技術分野において周知である。このように、PvPhasプロモーターを含むポリヌクレオチドフラグメントは、pDAB7319、pDAB7321、pDAB7324、pDAB7326、pDAB7328、またはpDAB7330またはpDAB7319、pDAB7321、pDAB7324、pDAB7326、pDAB7328、またはpDAB7330を構築するために使用される先述のプラスミドから削除され、LfKCS3またはFAE1プロモーター領域のいずれかと置き換えられる。新しく構築されたプラスミドは、前の実施例で説明された手順にしたがって、安定した植物をキャノーラ変換するために使用される。トランスジェニックキャノーラ植物が単離され、分子的に特徴付けされる。結果として得られるデルタ9デサチュラーゼの蓄積が決定され、デルタ9デサチュラーゼを堅牢にrobustly発現するキャノーラ植物が同定される。デルタ9デサチュラーゼの発現増加のための転写調節領域のさらなる改変には、表17に記載された配列のいずれかにより、既存のKozak配列を置換することが含まれる。デルタ9デサチュラーゼの開始部位の上流の代替Kozak配列の操作は、標準的な分子生物学技術を使用して完了する。合成ポリヌクレオチドの断片を合成し、当該技術分野において周知の技術を用いて上流のデルタ9デサチュラーゼのコード配列のクローンを作製する。開始コドンの状況は、導入遺伝子の発現レベルに強い影響を有する。表17にリストされているものにKozak配列を変更すると、異種のデルタ9デサチュラーゼの発現レベルを増加させる。実施例14:オオタバコガトウモロコシとレプトスファエリアノドルムLeptosphaerianodorumからデルタ9デサチュラーゼ遺伝子の設計および合成植物における異種遺伝子の発現の高いレベルを得るためには、実施例2に記載されたコドン最適化戦略が変更され、そしてHzD9DSおよびLnD9DS2用の異種遺伝子タンパク質をコードする領域は、新しい設計のプロトコルを使用して再操作された。コドンの選択は、将来の宿主植物のコドンバイアスを計算していたテーブルを使用して行われ、それはこの場合にはキャノーラであった。デルタ9デサチュラーゼ遺伝子の植物発現をコードする領域を設計する際に、植物によって優先される主要な第1の選択コドンを決定し、約95の時間で使用した。第二の選択コドンは、約5の頻度で、控えめに使用された。したがって、新たなDNA配列は各デルタ9デサチュラーゼのアミノ酸配列をコードするように設計され、ここで、新しいDNA配列は適切なアミノ酸をアミノ酸配列内の各位置で指定する植物による第1優先と第2優先のコドンの置換によって天然のデルタ9デサチュラーゼ遺伝子とは異なっていた。その後、新しい配列は、その改変によって作成された可能性のある制限酵素部位を分析された。識別された制限酵素部位は、第1または第2の選択肢の優先性コドンによってコドンを置換することにより除去した。目的の遺伝子の転写または翻訳に影響を及ぼす可能性がある配列内の他の部位では、具体的に非常に安定したステムループ構造がまた削除された。キャノーラの遺伝コードからの好ましいコドン選択肢第1及び第2の選択肢の選択は、キャノーラについてのタンパク質コード配列からコンパイルされたコドンバイアス表から決定した。表18および19には、天然の遺伝子というラベルの列は、セイヨウアブラナキャノーラのコード領域で見つかった、各アミノ酸の同義コドンの分布そのアミノ酸の全てのコドンの使用に対するを提示する。M病菌、Hゼア、およびLnodorumデルタ9デサチュラーゼのアミノ酸配列を本質的にコードする新しいDNA配列は、キャノーラ遺伝子で見いだされた第1および第2の選択肢コドンの好ましいコドンの分布を用いて、キャノーラにおける最適な発現のために設計された。植物に最適化されたDNA配列の設計は、構築されたキャノーラコドンバイアス表を使用して、配列番号:12M病菌、配列番号:13Hゼア、および配列番号:14Lnodorumのタンパク質配列の逆翻訳をすることによって開始された。PlntOpt遺伝子というラベルの列が、好ましいコドンおよびそれらがデルタ9デサチュラーゼ遺伝子の設計に組み込まれた頻度を示す。SEQIDNO:44および配列番号:45は、それぞれ、新しいキャノーラ最適化されたLnD9DS2およびHzD9DSデサチュラーゼのヌクレオチド配列を示す。これらの新しいキャノーラ最適化された配列は、LnD9DS2v3およびHzD9DSv3として標示した。配列番号:44および配列番号:45を含むDNA断片の合成は、PicoScriptとブルーヘロンバイオテクノロジーによって行われた。次いで、合成DNAを発現ベクターにクローニングし、上述した実施例で説明したように、実質的キャノーラに形質転換した。実施例15:植物におけるアシルCoAデサチュラーゼポリペプチドの蓄積を増加させるためのNおよびC末端の改変小胞体ERにおける膜結合蛋白質の蓄積と安定性は、それらのN末端とC末端のアミノ酸配列モチーフおよび改変の影響を受けることがある。RavidおよびHochstrasserNatRevMolCellBiol967990。特に、NおよびC末端のモチーフおよび改変は、菌類および植物ならびに動物の脂質デサチュラーゼの蓄積および安定性を調節することが示されている。McCartneyetalPlantJ3715673MziautetalProcNatlAcadSciUSA9788838。FAD2またはFAD3のN末端へのMycまたはhemagglutinHAエピトープタグのいずれかの追加は、有意に酵母内でのこれらの酵素の定常状態レベルを向上させる。O’QuinetalApplMicrobiolBiotechnol8311725。従って、本発明のデルタ9デサチュラーゼのN末端へのこれら、または類似のエピトープの添加を、植物におけるポリペプチドの発現を増加させるために利用する。Mycタグ配列番号:46またはHAタグ配列番号:47をコードするポリヌクレオチドリンカーは、デルタ9デサチュラーゼ例えば、HzD9DS、MgD9DS、AnD9DS、LnD9DS1、LnD9DS2コーディング配列の5末端内に連続したオープンリーディングフレームとしてクローニングされる。得られるコード配列を、実施例3に記載のクローニング戦略を用いて植物発現プラスミド内にクローニングする。新しく構築されたプラスミドを、シロイヌナズナおよびまたはキャノーラ植物細胞、材料、または組織に安定に形質転換するために使用する。トランスジェニック植物を、形質転換植物細胞、材料、または組織から再生する。トランスジェニック植物を単離し、分子的に特徴づける。トランスジェニック植物の種子における得られるデルタ9デサチュラーゼの蓄積が決定され、ポリペプチドデルタ9デサチュラーゼを堅牢に発現する植物を特定する。シロイヌナズナおよびキャノーラにおけるAnD9DSの発現からの証拠実施例11および12は、HzD9DSとLnD9DS2と比較して、この特定の不飽和化酵素の発現の有意に高いレベルを示す。したがって、AnD9DSのコアデサチュラーゼドメイン膜貫通セグメントおよび保存された触媒のヒスチジン残基を含むの外側に位置するN及びC末端のすべてまたは一部は、低い発現のデサチュラーゼにおける等価な残基を交換し、その発現を増加させるために使用することができる。従って、AnD9DSのN末端残基1-68およびC末端残基281-455それぞれ、配列番号:72および配列番号:73の全部又は一部は、LnD9DS2配列番号:14の68個のN末端残基1-68および168個のC末端残基281-449、およびまたはHzD9DS配列番号:13の76個のN末端残基176及び60個のC末端残基293-353の全部または一部を置き換えるために使用される。得られるコード配列は、実施例3に記載のクローニング戦略を用いて植物発現プラスミド内にクローニングする。新しく構築されたプラスミドを、シロイヌナズナおよびまたはキャノーラ植物細胞、材料、または組織を安定に形質転換するために使用する。トランスジェニック植物を、形質転換植物細胞、材料、または組織から再生する。トランスジェニック植物を単離し、分子的に特徴づける。トランスジェニック植物の種子において得られるデルタ9デサチュラーゼの蓄積が決定され、改変HzD9DSまたは改変LnD9DS2ポリペプチドを堅牢に発現する植物を特定する。実施例16:植物内でのアシルCoAデサチュラーゼのmRNAの発現を増強するための改変mRNAの発現が安定化し、mRNAの蓄積を増加させる遺伝子エレメントを組み込むことによって向上させることができることは当該技術分野で公知である。HzD9DsまたはLnD9DS2コーディング配列の近接への、5および3非翻訳領域例えば、タバコオスモチン5および3UTR配列Liuら2003NatBiotechnol2112228、およびタバコモザイクウイルスのΩ配列GallieetalNucleicAcidsRes158693711、またはイントロンKozieletalPlantMolBiol32393405の組み込みは、上記の遺伝子エレメントを欠いている同じコード配列の発現と比較した場合の導入遺伝子の発現レベルを増加させるために使用されている。デサチュラーゼPTU内にこれらの遺伝子エレメントを1以上加えることは、当技術分野で周知の方法に従って行われる。5非翻訳領域、3非翻訳領域、およびまたはイントロンを含むポリヌクレオチド断片が、植物発現プラスミド例えば、pDAB7319、pDAB7321、pDAB7324、pDAB7326、pDAB7328、pDAB7330、またはpDAB7319、pDAB7321、pDAB7324、pDAB7326、pDAB7328、もしくはpDAB7330を構築するために使用された前出のプラスミドに標準的なクローニング方法を介して追加される。新しく構築されたプラスミドを、シロイヌナズナおよびまたはキャノーラ植物細胞、材料、または組織を安定に形質転換するために使用する。トランスジェニック植物を、形質転換植物細胞、材料、または組織から再生する。トランスジェニック植物を単離し、分子的に特徴づける。トランスジェニック植物の種子において得られるデルタ9デサチュラーゼの蓄積が決定され、HzD9DSまたはLnD9DS2ポリペプチドを堅牢に発現する植物を特定する。さらに、OLE1のような酵母デサチュラーゼ遺伝子は高度に制御されていることが、当該技術分野で公知である。膜貫通領域をコードし、シトクロムb5ドメインの一部である配列の欠失は、OLE1の転写物の安定性を低減する。VemulaetalJBiolChem2784526979。OLE1内でのこれらの配列の存在はmRNAの安定化配列として作用する。したがって、LnD9DS2またはHzD9DSコード配列への膜貫通領域およびシトクロムb5ドメインをコードするOLE1配列の取り込みを、コード配列のmRNA転写物の安定性を高めるために利用されることにより、より高いレベルの発現をもたらし、その後のLnD9DS2またはHzD9DSポリペプチドの増加をもたらす。OLE1の膜貫通領域およびシトクロムb5ドメイン配列を含むキメラLnD9DS2またはHzD9DSコード配列を、当技術分野で公知の方法を使用して構築する。このように生成されたコード配列を、植物発現プラスミドに組み込み例えば、上記の実施例で説明したように、アグロバクテリウム菌による植物の形質転換を経由してトランスジェニック植物を生成するために使用する。トランスジェニック植物は、単離され、特徴付けられる。得られるデルタ9デサチュラーゼの蓄積が決定され、デルタ9デサチュラーゼを堅牢に発現する植物が特定される。実施例17代替的な3非翻訳領域ターミネーターの使用植物内のデルタ9デサチュラーゼの安定な発現のために利用可能な3UTRターミネーターの数が限られていることにより、通常、アグロバクテリウムのORF23の3UTRターミネーターAtuORF233UTRが、転写を終結するために使用される。最近、他の3UTRターミネーターがシロイヌナズナで転写リードスルーを終結することにおいてより効果的であることが示された。したがって、インゲンマメファゼオリン3UTRteminator配列番号:69を、上流遺伝子の転写リードスルーを減らし、それによって転写干渉を低減するために、インゲンマメのゼオリンプロモーターと組み合わせて使用する。インゲンマメファゼオリン3UTRターミネーターPvPhas3UTRv1が、LnD9DS2v2の発現カセット内、および以前にプラスミドpDAB7321およびpDAB7326において記載されたHzD9DSv2の発現カセット内に組み込まれた。当業者に周知である方法に従って、PvPhas3UTRv1を含むポリヌクレオチドフラグメントを、LnD9DS2v2の遺伝子の下流に配置し、バイナリープラスミドpDAB110110図4a;配列番号:74を作成する。PvPhas3UTRv1を含むポリヌクレオチドフラグメントはまた、HzD9DSv2の遺伝子の下流に配置し、バイナリープラスミドpDAB110112図4b配列番号:75を作成する。得られたバイナリープラスミドを、制限酵素消化および配列決定によって確認した。新しく構築されたプラスミドは、シロイヌナズナおよびまたはキャノーラ植物細胞、材料、または組織を安定に形質転換するために、それぞれ使用される。トランスジェニック植物を、形質転換植物細胞、材料、または組織から再生する。トランスジェニック植物を単離し、分子的に特徴づける。トランスジェニック植物の種子において得られるデルタ9デサチュラーゼの蓄積が決定され、HzD9DSまたはLnD9DS2ポリペプチドを堅牢に発現する植物を特定する。