"以下の4種の乳酸菌:ラクトバチルスプランタルムLactobacillusplantarumDSM23755、ラクトバチルスプランタルムLactobacillusplantarumDSM23756、ラクトバチルスファーメンツムLactobacillusfermentumDSM23757、及びラクトバチルスラムノススLactobacillusrhamnosusDSM23758の混合物を用いた大豆醗酵によるイソフラボン-アグリコン、エクオール、及びルナシンを含む醗酵大豆ベース混合物の調製方法。以下の工程:a該4種のラクトバチルスプランタルムLactobacillusplantarumDSM23755、ラクトバチルスプランタルムLactobacillusplantarumDSM23756、ラクトバチルスファーメンツムLactobacillusfermentumDSM23757、及びラクトバチルスラムノススLactobacillusrhamnosusDSM23758乳酸菌を培養増殖させること、b該乳酸菌の水性懸濁液で大豆ベース基質をインキュベートすること、c30~37°C、好ましくは30°Cで、48~96時間、好ましくは96時間インキュベートすることを含む又はからなる、請求項1に記載の方法。基質が全基質体積の1~4の量の乳酸菌の水性懸濁液で接種され、該水性懸濁液がどの株についても約log9.0ufc/mlの細胞密度を有するものである、請求項2に記載の方法。大豆ベース基質が、大豆粉、好ましくは生物学的大豆粉、豆乳からなる群から選ばれる、請求項2に記載の方法。乳酸菌細胞を除去するためにブロス培養の遠心分離の工程dをさらに含む、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。ブロス培養の遠心分離が10,000xgで15分間4°Cで行われる、請求項5に記載の方法。工程dで得られた上清、又は工程cで得られた培養物の乾燥又は凍結乾燥による脱水の工程eをさらに含む、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。請求項1~4及び7のいずれか一項に定義される方法により得られ得る、イソフラボン-アグリコン、エクオール、及びルナシンを含む、醗酵豆乳ベース混合物。請求項8に定義された混合物を、一つ以上の薬学的に若しくは化粧品的に許容可能な賦形剤及び/又はアジュバントとともに含む又はからなる医薬又は化粧品組成物。そのままで、又は一つ以上の賦形剤及び/又はアジュバントと組み合わせて、食物インテグレーターとして使用するための、請求項8に記載の混合物。皮膚又は腸壁の障害又は疾患の治療に使用するための請求項8に記載の混合物又は請求項9に記載の組成物。化粧品使用のための請求項8に記載の混合物又は請求項9に記載の組成物。脱毛の治療のための請求項12に記載の使用のための混合物。脱毛症又は休止期脱毛の治療に使用するための請求項8に記載の混合物又は請求項9に記載の組成物。以下の4種の乳酸菌ラクトバチルスプランタルムLactobacillusplantarumDSM23755、ラクトバチルスプランタルムLactobacillusplantarumDSM23756、ラクトバチルスファーメンツムLactobacillusfermentumDSM23757、及びラクトバチルスラムノススLactobacillusrhamnosusDSM23758の混合物。ラクトバチルスプランタルムLactobacillusplantarumDSM23755乳酸菌。ラクトバチルスプランタルムLactobacillusplantarumDSM23756乳酸菌。ラクトバチルスファーメンツムLactobacillusfermentumDSM23757乳酸菌。ラクトバチルスラムノススLactobacillusrhamnosusDSM23758乳酸菌。しかし、これらの研究においていくつかの制限が明らかとなった。i極めて数の限られたバクテリアバイオタイプ/種しか考察されてきていない。ii醗酵過程に使われるバクテリアはもっぱらヒトの糞便材料に由来している。iii極めて限られた数の発酵用基質しか考察されておらず、そのうちのいずれも大豆の生物学的な粉の使用に関連してはいなかった。iv調製物はイソフラボン/アグリコン又はエクオールにのみ基づいており、エクオール製造の場合は最大濃度は0.521mg/100mlであるTsangalisetal.,2002.β-グルコシダーゼ産生ビフィズス菌による豆乳におけるイソフラボンフィトエストロゲンの酵素的変換Enzymatictransformationofisoflavonephytoestrogensinsoymilkbyβ-glucosidaseproducingbifidobacteria.FoodRes.Int.Sci.67:3104-3113;v調製物の生物学的効率、特に皮膚の保護については試験研究がされていない;及びviイソフラボンアグリコン、エクオール、及びルナシンを含む配合調製物については研究がなされていない。ルナシンは大豆で初めて同定された生物活性ペプチド43個のアミノ酸残基、分子量約5400DaでありGalvezetal.,2001.脱アセチル化ヒストンに結合し、アセチル化を阻害する大豆ペプチドルナシンの化学予防特性ChemopreventivepropertyofasoybeanpeptideLunasinthatbindstodeacetylatedhistonesandinhibitsacetylation.CancerRes.61:7473-7478、引き続いてオオムギJeongetal.2002.オオムギルナシンはras誘発コロニー形成を抑制し、哺乳類細胞におけるコアヒストンアセチル化を阻害するBarleylunasinsuppressesras-inducedcolonyformationandinhibitscorehistoneacetylationinmammaliancells.J.Agric.FoodChem.50:5903-5908、小麦Jeongetal.2007.小麦由来の癌予防性ペプチドルナシンはコアヒストンアセチル化を阻害するThecancerpreventivepeptidelunasinfromwheatinhibitscorehistoneacetylation.CancerLett.255:42-48、アマランスSilva-Sanchezetal.,2008.アマランスAmaranthushypochondriacus種子における生物活性ペプチドBioactivepeptidesinamaranthAmaranthushypochondriacusseed.J.Agric.FoodChem.56:1233-1240においても見出された生物活性ペプチドである。大豆におけるルナシンの濃度は栽培品種、培養土壌内微気象雰囲気、及び穀物が収穫後に受けてきた技術的過程によって変わり得る。ルナシンはLoda栽培品種において非常に高濃度約11mg/gで見出され、他の大豆変種では例えばImariではルナシン含量は5~6mg/gを超えないWangetal.2008.大豆タンパク質由来ペプチドの分析、栽培品種、環境条件、及び大豆及び大豆製品におけるルナシン濃度の処理の効果Analysisofsoybeanproteinderivedpeptidesandtheeffectofcultivar,environmentalconditions,andprocessingoflunasinconcentrationinsoybeanandsoyproducts.J.AOACIntern.91:936-944。ルナシンはポリペプチド鎖のC末端に9個のアスパルギン酸残基を含む。この組成はアセチル化が低減したクロマチン領域への親和性の上昇に有利に働き、この領域にはペプチドが結合し、そのためにアセチル化-脱アセチル化の動力学を阻害し、それ故、腫瘍発生において腫瘍抑制剤として作用する。ルナシンがras遺伝子により誘発された細胞増殖の阻害により、及びH3ヒストンのアセチル化阻害により、腫瘍発生現象に対する予防効果を発揮し得ることも報告されているJeongetal.,2003.大豆から単離されたルナシンのキャラクタリゼーションCharacterizationoflunasinisolatedfromsoybean.JAgricFoodChem.51:7901-7906。文献データから、今までのところ、乳酸菌を使った醗酵過程による大豆誘導体のためのルナシン富化を考察した研究はないことが明らかである。上記の報告された考察に基づき、いくつかの要素は著名な革新的特質を示しているようである:i大豆ベースの基質、できれば生物学的起源のものを用いること。ii糞便起源ではなく食品マトリックスから単離された乳酸菌を使用すること。iiiイソフラボン-アグリコン、エクオール及びルナシンのようなより高い数の機能分子を含む製剤の処方に有利に働くように適合したバイオテクノロジーの過程を最適化すること。ivインビトロ及びエクスビボアッセイを用いて、皮膚及びヒト腸細胞保護に関し、特に炎症状態の阻害とバリア機能維持に関し、結果的な調製物の効果を実証すること。本発明の著者らはここに、イソフラボン、アグリコン、エクオール、及びルナシンについて富化した醗酵大豆ベースの混合物を提供するのにふさわしい新しい方法を開発した。本発明による混合物は糞便起源ではない、専ら食品マトリックス由来の乳酸菌の特定の混合物を用いた大豆の醗酵によって得られる。本発明による混合物は、イソフラボン-アグリコン、エクオール、及びルナシン、特にルナシンの高い含量により、皮膚及びヒト腸細胞保護のための特別な有効性を、特に炎症状態の防止及びバリア機能維持に関して示した。本発明の著者らはここに以下の点を考察する:ip-ニトロフェニル-β-D-グルコピラノシドpNPGについてβ-グルコシダーゼ活性に従い専ら食品マトリックス由来の103種の単離された乳酸菌を選択することにより、4種の乳酸菌、即ちL.plantarumDPPMA24W2010年7月8日にDSMZに寄託DSM番号23756及びDPPMASL332010年7月8日にDSMZに寄託DSM番号23755、L.fermentumDPPMA1142010年7月8日にDSMZに寄託DSM番号23757、及びL.rhamnosusDPPMAAZ12010年7月8日にDSMZに寄託DSM番号23758を選択し、大豆粉ベースの基質の醗酵のための混合スターターとして用いることができた。ii14種の異なる大豆ベースの基質を用いることにより、混合スターターを用いる醗酵のための生物学的大豆粉に基づいた最適の調製物として選択することができた。iii生物学的大豆粉基質の醗酵過程の最適化により、1.45mg/100ml57.0μMのダイゼイン、3.9mg/100ml140.3μMのゲニステイン、0.58mg/100ml20.4μMのグリシテイン、0.9mg/100ml37.3μMのエクオール、及び8.4mg/100mlのルナシンを含む製剤の処方が可能になった。iv上記の機能的化合物に基づく製剤は皮膚上皮に対して保護効果を示し、炎症状態の阻害及び腸細胞のバリア機能に対して積極的な効果を示す。本発明による乳酸菌はラクトバチルス種に属し、中部及び南イタリアにおいてパン製造に用いられる天然酵母及びプーリア地方のペコリーノタイプの熟成されたパスタフィラータチーズから単離されている。一般にこのような食品マトリックスから単離された乳酸菌は、ヒトや動物の胃腸管にコロニーを形成する微生物とそうかけ離れていない代謝的及び環境的適応特性を示す。L.plantarumDPPMA24W2010年7月8日にDSMZに寄託DSM番号23756及びL.plantarumDPPMASL332010年7月8日にDSMZに寄託DSM番号23755、L.fermentumDPPMA1142010年7月8日にDSMZに寄託DSM番号23757及びL.rhamnosusDPPMAAZ12010年7月8日にDSMZに寄託DSM番号23758が選択され使用された。好ましくは生物学的起源の様々な大豆粉ベースの基質について当該4種の乳酸菌による30~37°Cで48~96時間の醗酵が関与するバイオテクノロジー的プロトコルを標準化し最適化した。醗酵過程の最後に培養基から遠心分離により、そして上清を乾燥若しくは凍結乾燥による脱水過程に付すことにより細胞を除去することも又は除去しないこともできる。以下に生物学的大豆ベース製剤の醗酵のためのバイオテクノロジー的プロトコルを記載する。様々な豆乳製剤の醗酵の結果として、3.9~57.0μMのダイゼイン、7.8~140.3μMのゲニステイン、6.7~20.4μMのグリシテイン、7.6~37.3μMnエクオール、及び約8.4mg/100mlのルナシンの合成が得られた。上記の報告された濃度の上限は生物学的大豆粉由来の豆乳の醗酵に関するものである。可能な処方の一つに従えば、生物学的大豆由来の醗酵製品の適用により、i上皮を保護し、そのバリア機能を増大させ、iiγ-インターフェロンIFN-γとリポポリサッカライドLPSによる誘発の後のCaco-2/TC7細胞の炎症状態を阻害し、iii経上皮電気抵抗TEER試験により示されるようなバリア機能を刺激し、及びivインターロイキン-IL-8の合成を阻害するのに適していることが示された。微生物学的クロマトグラフィー技術とインビトロ、並びに及びエクスビボの細胞培養物についてのアッセイを用いた補完的分析により示された様に、本発明により食品マトリックスから単離され、従来の研究では使用されなかった乳酸菌種からなる混合スターターによる大豆生物学的粉の醗酵により、i従来の研究では見られなかったアグリコン、エクオール、及びルナシンの同時合成、及びii炎症状態に対する保護効果を可能にし、上皮とヒト腸細胞のバリア機能を増大する。それ故、以下の4種の乳酸菌:LactobacillusplantaruDSM23755、LactobacillusplantarumDSM23756、LactobacillusfermentumDSM23757、及びLactobacillusrhamnosusDSM23758の混合物を用いた大豆醗酵による、イソフラボン-アグリコン、エクオール、及びルナシンを含む、醗酵大豆ベース混合物の調製方法は、本発明の特異的な目的である。本発明の方法により得られた混合物は、イソフラボン-アグリコン、ルナシン、及びエクオールが富加された混合物であり、本発明とは異なる乳酸菌を用いた方法により得られた公知の混合物に比較して、これらの化合物をより多い割合で含んでいる。本発明による方法は、以下の工程を含むか、又はからなる:a該4種の乳酸菌LactobacillusplantarumDSM23755、LactobacillusplantarumDSM23756、LactobacillusfermentumDSM23757、及びLactobacillusrhamnosusDSM23758を培養増殖させる工程;b該乳酸菌の水性懸濁液で大豆ベース基質をインキュベートする工程;好ましくは、基質は全基質体積の1~4の量の乳酸菌の水性懸濁液でインキュベートされ、該水性懸濁液は各バイオタイプについて約log9.0ufc/mlの細胞密度を有している;c30~37°C、好ましくは30°Cで、48~96時間、好ましくは96時間インキュベートする工程。使用に適した大豆ベースの基質は、例えば、大豆粉、好ましくは生物学的大豆粉、豆乳、及び本願に従って報告されている他の商業的処方である。本発明による方法はさらに、d乳酸菌から細胞を分離するためにブロス培養物を遠心分離する工程を含む。特に、ブロス培養液の遠心分離は10,000xgで15分間4°Cで行うことができる。本発明による方法はさらに、e工程dで得られた上清を乾燥又は凍結乾燥により脱水する工程を含むことができる。一態様に従えば、処方は工程dを省いた生存可能で生きている乳酸菌を含むことができる。組成物の調製は、脱水過程の最後に、状況に応じて経口又は局所使用に適した剤形の製剤を得るために、適切な賦形剤を添加した処方を包含することができる。乳酸菌の除去の工程dなしで上記のように定義された方法に従って得られ得る醗酵大豆に基づく、イソフラボン-アグリコン、エクオール、及びルナシンを含む混合物もまた本発明の目的である。該混合物はそれ故に上記の本発明の乳酸菌を含んでいる。報告されているように、本発明による混合物は、イソフラボン-アグリコン、エクオール、及びルナシンを富化した混合物であり、即ち、本発明とは異なる乳酸菌を用いた方法により得られた公知の混合物よりも高い割合でこれらの化合物を含んでいる。本発明はさらに、上で定義した混合物を、1種以上の薬学的に又は化粧品学的に許容可能な賦形剤及び/又はアジュバントとともに含む、又はからなる医薬又は化粧品組成物に関する。更なる態様によれば、本発明による混合物は食品インテグレーターとして使用することができる。例えば、混合物は伝統的な食品、例えばパン又はパスタ製品のためにも使用することができる。さらに、本発明による混合物又は組成物は皮膚又は腸の障害又は疾患の治療に用いることができる。特に、該混合物又は組成物は皮膚バリア機能の変化に対して、例えば感受性皮膚、乾燥皮膚、乾癬、アトピー皮膚炎、脂漏性皮膚炎、ふけ、刺激性皮膚炎、湿疹皮膚炎、接触皮膚炎、潰瘍、にきび、皮膚老化の予防と治療のために用いることができる。さらに、本発明による混合物及び組成物は、腸のバリア機能が変化した場合、例えばセリアック病、食物不寛容、クローン病の治療又は予防に用いることができる。本発明による混合物又は組成物は化粧品分野で、例えば脱毛の治療に、又は脱毛症又は休止期脱毛の治療のために医療分野で用いることができる。特に、本発明による混合物又は組成物は局所的に、例えばクリーム、ローション、ペースト、軟膏、ゲル、溶液、エマルジョン、懸濁液、又は全身的に、例えば経口的に、例えばバイアル、チュアブル錠、ピル、サシェット等により投与することができる。もちろん、乳酸菌の除去工程dを含む本発明の方法により得られる混合物、又は該混合物を含む医薬若しくは化粧品組成物はまた、上記の報告された適応症に有利に用いることができるが、それは該物が、本発明とは異なる乳酸菌を用いた方法により得られる公知の混合物よりも高い割合でイソフラボン-アグリコン、エクオール、及びルナシンを含んでいるためである。さらに、以下の4種の乳酸菌LactobacillusplantarumDSM23755、LactobacillusplantarumDSM23756、LactobacillusfermentumDSM23757、及びLactobacillusrhamnosusDSM23758の混合物も本発明の目的である。最後に、LactobacillusplantarumDSM23755又はLactobacillusplantarumDSM23756又はLactobacillusfermentumDSM23757又はLactobacillusrhamnosusDSM23758も本発明の目的である。実施例1:食物マトリックスから単離された乳酸菌の103種のバイオタイプのβ-グルコシダーゼ活性Lactobacillusalimentarius10N、2B、5A、Lactobacillusbrevis5Z、DPPMA869、LactobacilluscaseiLC10、Lactobacilluscaseisubsp.casei2047、2756、2763、2766、Lactobacilluscaseisubsp.pseudoplantarum2742、2745、2749、2750、Lactobacilluscurvatus13H5、14H10、1Hd、2042、2081、2768、2770、2771、2775、SAL23、SAL35、Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus11842、B15Z、LactobacillusfermentumDPPMA114、D13、LactobacillusgasseriB30W、Lactobacillushelveticus15009、B26W、PR4、Lactobacillushilgardii51B、Lactobacillusparalimentarius15α、15β、16R、8D、DPPMA238、Lactobacillusparacasei12H8、1Hb、B14F5、B18S、B25F3、PF6、B61F5、LactobacilluspacarbuckneriB10F5、B48F3、B48F5、B9F5t、BF1、BF2、Lactobacillusparaplantarum4DE、DPPMA667、Lactobacilluspentosus8CF、12H5、12H6、Lactobacillusplantarum14H4、17N、19A、1A7、2A、30、3DM、4H1、4H10、DB200、DPPMASL33、DPPMA24W、Lactobacillusrhamnosus11、19、DPPMAAZ1、DPPMAAZ21、Lactobacillussakei9I、SAL1、SAL18、Lactobacillusrossiae10A、15R、3D、5C1、5α、CF51、CI35、CR20、E18、Lactobacillussanfranciscensis16α、A17、BB12、DE9、E19、H10、Lactococcuslactissubsp.lactis10γ、PediococcuspentosaceusC16F5、C25F3、C30F5t、C6F5、C7F3、C9F5t、C29F5、及びWeissellacibaria10XA16、3XA4、5S、5XF12種に属する乳酸菌の103種のバイオタイプを本研究に用いた。すべてのバイオタイプはtheCollezionediColturedelDipartimentodiProtezionedellePianteeMicrobiologiaApplicatadell’UniversitadegliStudidiBariに属し、あらかじめ食物マトリックスパン製造及びチーズのための天然酵母から単離された。乳酸菌のバイオタイプは30又は37°Cで24時間MRS培地Oxoid,Basingstoke,UnitedKingdomで30°Cで24時間増殖させた。細胞を24時間培養し、遠心分離4°Cで15分間10,000xgで収集し、リン酸緩衝液50mM、pH7で2回洗浄し、水中にlog9.0ufc/mlの細胞密度で再懸濁させたものを、β-グルコシダーゼ活性アッセイに用いた。β-グルコシダーゼ活性はp-ニトロフェノール-β-グルコピラノシドpNPG基質SigmaAldrichChemicalCorporate,St.Louis,Missouri,USAから遊離されたp-ニトロフェノールとして定量された。リン酸緩衝液0.5M、pH7.5中の900μlのpNPG最終濃度と100μlの細胞懸濁液をアッセイに用いた。混合物を40°Cでインキュベートし、反応を95°Cで5分間の熱処理によりブロックした。吸光度を410nmで測定した。β-グルコシダーゼ活性の1単位Uを、p-ニトロフェノールの1nmol/分がアッセイ条件下で遊離されるのに必要な酵素の量として定義したDeAngelisetal.,2005.LactobacillussanfranciscensisCB1由来の細胞内ファミリー3β-グルコシダーゼの精製とキャラクタリゼーションPurificationandcharacterizationofanintracellularfamily3β-glucosidasefromLactobacillussanfranciscensisCB1.Ital.J.FoodSci.17:131-142。実施例2:豆乳の調製と醗酵生物学的大豆有機農業大豆、OFSECorNaturaSi,Verona,Italy、大豆タンパク質単離物SPISuproSoja80Aptonia,Villeneuved’Ascq,France及び様々な市販大豆粉調製物CargillTexturizingSolutionsSoyProtein,Gent,Belgiumを豆乳の製造に用いた。OFSは洗浄して蒸留水中に一晩静置した。湿潤して膨潤した大豆を手で皮を剥き、温水約90°Cで1:10の比で希釈し、PBI国際ホモジナイザーミラノ、イタリアで均一化した。均一化は10,000xgで2分間行い、次いで1分休止し、再び14,000xgで2分間行った。懸濁液を遠心分離し7,000xg、10分、4°C、豆乳を0.22μm孔径フィルターMilliporeCorporation,Bedfordで滅菌濾過した。pHは6.2であった。SPIを蒸留水40°C、0.4:10の比で蒸留し、約55°Cで30分間攪拌下120rpmで熱処理した。室温で冷却後、pHをNaOH5MTsangalisetal.2002を用いて6.7に調整した。滅菌をオートクレーブ中で121°Cで15分間行った。市販の大豆粉調製物を、Chunetal.Chunetal.,2007.乳酸菌での醗酵による豆乳中イソフラボングルコシドのアグリコンへの変換ConversionofisoflavoneglucosidetoaglyconesinsoymilkbyfermentationwithlacticacidbacteriaJ.FoodSci.72:39-44に記載の方法により、蒸留水40°Cで1:10の比で希釈した。pHは約6.3であった。滅菌はオートクレーブ中121°Cで15分間行った。様々な豆乳タイプをβ-グルコシダーゼ活性に基づいて選択した4種の乳酸菌の混合細胞懸濁液で接種した1~4、v/v。各4種の乳酸菌バイオタイプの初期細胞密度はlog7.0ufc/mlであった。醗酵は30°Cで96時間攪拌下120rpmで行った。ヒト腸細胞アッセイについては、豆乳を凍結乾燥し、DMEM培養液に再懸濁し、滅菌濾過した。実施例3:乳酸菌のモニタリング、イソフラボン-アグリコン、エクオール、及びルナシンの決定様々な豆乳タイプの醗酵の間、混合スターターとして使用した乳酸菌DPPMASL33に対応するLactobacillusplantarumDSM23755、DPPMA24Wに対応するLactobacillusplantarumDSM23756、DPPMA114に対応するLactobacillusfermentumDSM23757、及びDPPMAAZ1に対応するLactobacillusrhamnosusDSM23758のモニタリングは、RAPD-PCR法を用いて行った。二つのプライマーInvitrogen、ミラノ、イタリアを、任意に選択された配列P75’AGCAGCGTGG3’配列番号:1及びM13,5’GAGGGTGGCGGTTCT3’配列番号:2とともに、プラスミドと染色体バクテリアDNAの様々な領域をランダムに増幅しながらDeAngelisetal.,2001.表現型、遺伝子型及び細胞壁タンパク質分析に基づく雌羊イタリアチーズ由来の非スターター乳酸菌NSLABのキャラクタリゼーションCharacterizationofnon-starterlacticacidbacteriaNSLABfromewes’Italiancheesesbasedonphenotypic,genotypicandcell-wallproteinanalyses.Appl.Environ.Microbiol.67:2011-2020;RossettieGiraffa,2005.M13により生成したRAPD-PCR指紋データベースによる乳製品乳酸菌の迅速な同定RapididentificationofdairylacticacidbacteriabyM13-generated,RAPD-PCRfingerprintdatabases.J.Microbiol.Met.63:135-144、タイピングに用いた。醗酵豆乳試料からのイソフラボン-アグリコン及びエクオールの抽出をOtienoandShahOtienoandShah,2007.様々な濃度の外因性の、及びプレバイオティック由来の内因性のβ-グルコシダーゼを用いた豆乳におけるイソフラボンの変換の変化の比較Acomparisonofchangesinthetransformationofisoflavonesinsoymilkusingvaryingconcentrationsofexogenousandprebiotic-derivedendogenousβ-glucosidases.J.Appl.Microbiol.103:601-612に記載された方法に従って行った。化合物の決定のためのHPLCクロマトグラフィー分析をMaubachetal.Maubachetal.,2003.高速液体クロマトグラフィーによるヒト乳房組織及び生物学的流体における大豆由来植物エストロゲンの定量Quantitationofsoy-derivedphytoestrogensinhumanbreasttissueandbiologicalfluidsbyhigh-performanceliquidchromatography.J.Chromatogr.784:137-144により記載された方法に従って行った。醗酵前に又は醗酵の間に生物学的大豆粉由来の豆乳中のルナシンの決定は、C18XterraWatersカラムと214nmUV検出器を備えたAKTAPurifiersystemGEHealthcareを用い、5ACN0.05TFA溶離液A及びACN0.05TFA溶離液Bからなる混合溶媒で溶出するHPLCクロマトグラフィーにより行ったWangetal.2008.大豆タンパク質由来ペプチドの分析及び栽培品種、環境条件の効果、並びに大豆及び大豆製品中のルナシン濃度の処理Analysisofsoybeanproteinderivedpeptidesandtheeffectofcultivar,environmentalconditions,andprocessingoflunasinconcentrationinsoybeanandsoyproducts.J.AOACIntern.91:936-944。合成ルナシンを標準として用いたEZBiolabInc.,Carmel,IN,USA。実施例4:再構成上皮及びTEER測定経上皮電気抵抗についての試験ヒト再構成上皮SkinEthic登録商標再構成ヒト上皮は、多重層としてヒト上皮の正常ケラチノサイト角化細胞からなる。それは、化学的に規定された培地MCDM153中、ウシ胎児血清を添加せずに、不活性な多孔性ポリカーボネート支持体上の気液界面で17日間、ヒトケラチノサイトの培養後、完全に分化した上皮である。この成長段階で、形態的な分析により、生存する多層化した上皮と、10を超える数の緻密細胞層からなる角質層が示された。ヒト再構成上皮SkinEthic登録商標を先に記載された手順に従って用いたDiCagnoetal.,2009.ラクトバチルスプランタルムDSMZ19463によるγ-アミノ酪酸GABAの合成:機能的ブドウの飲料及び皮膚科学的応用Synthesisofγ-aminobutyricacidGABAbyLactobacillusplantarumDSMZ19463:functionalgrapemustbeverageanddermatologicalapplication.ApplBiotechnolMicrobiolDOI:10.1007/s00253-009-23704。Millicell-ERS電圧電流計Millipore,Billerica,MAを用いてTEER測定を実行した。測定はオームxcm2で表現した。実施例5:Caco-2/TC7細胞での試験ヒト起源Caco-2細胞クローンTC7を、ウシ胎児血清10を添加し、必須でないアミノ酸1、ゲンタマイシン/ストレプトマイシン50μg/ml、グルタミン2mM及び4-2-ヒドロキシエチル-1-ピペラジニル-エタンスルホン酸1を添加したダルベッコDMEM培地で培養したDiCagnoetal.,2010.サワードウのラクトバチルスプランタルムDC400における菌体密度感知機構:他の乳酸菌との共培養下でのプランタリシンAPlnAの誘導、並びにPlnAのバクテリア及びCaco-2細胞への効果QuorumsensinginsourdoughLactobacillusplantarumDC400:inductionofplantaricinAPlnAunderco-cultivationwithotherlacticacidbacteriaandeffectofPlnAonbacterialandCaco-2cells.Proteomicsinpress。細胞生存率はニュートラルレッド色素の取り込みアッセイにより決定したBallsetal.,1987.毒性学における評価代替方法へのアプローチApproachestovalidationalternativemethodsintoxicology.In:GoldberA.M.Ed.N.Y.AcademicPresspp.45-58。様々な調製物で24~72時間の処理の後、細胞をPBS緩衝液で洗浄し、37°Cで4時間ニュートラルレッド溶液33mg/lとともにインキュベートした。次いで、細胞を再度PBS緩衝液で洗浄し、溶菌溶液1酢酸を含む水中50エタノールで処理した。プレートの読み取りをNovapathreaderBiorad,Hercules,CADiCagnoetal.,2010を用いて行った。Caco-2/TC7細胞からの酸化窒素放出NOを酸化生成物、即ち亜硝酸及び硝酸塩を測定することにより決定した。様々な調製物とのインキュベーションの後、細胞培養物の上清を同体積のGriess試薬0.5MHCl中1、p/v、スルファニル酸、及び0.1、p/v、N-1-ナフチルエチレンジアミン塩酸塩と混合した。室温で30分のインキュベーションの後、540nmでの吸光度を測定し、亜硝酸塩濃度を亜硝酸ナトリウムで作成した標準曲線を参照して決定した。TEER測定のためCaco-2/TC7細胞を、24セルとポリエチレンフィルター孔径0.4μmを有するマイクロプレート容器内に接種した7.5x104細胞/ml。処理の前に細胞を37°Cで21日間インキュベートした。様々な調製物での処理を18、24及び48時間行った。次いで細胞層の積層をTEER測定により決定した。放出されたインターロイキン-8IL-8の測定のため、Caco-2/TC7細胞を予めインターロイキン-1βでインキュベートし24時間、次いで様々な調製物でさらに24時間刺激した。前炎症性IL-8の合成をELISAアッセイにより決定したBenderMedSystems。定量はキットの指示に従って標準曲線を用いて行った。結果1β-グルコシダーゼ活性に基づく乳酸菌の選択予備的に、食物マトリクスから単離された乳酸菌の103種のバイオタイプのβ-グルコシダーゼ活性をpNPG合成基質で試験した。活性は0から202.3Uまで変化した図1。L.alimentarius、L.brevis、L.casei、L.delbrueckiisubsp.bulgaricus、L.helveticus、L.hilgardiii、L.paralimentarius、L.paraplantarum、L.pentosus、L.sanfranciscensis、Lc.lactissubsp.lactis、L.parabuchnerieW.cibaria種にほぼ属する48種のバイオタイプは、β-グルコシダーゼ活性を示さなかった。活性平均値は3Uであり、25°と75°データパーセンタイルに対応する値は0及び45.5Uであった。乳酸菌の様々な種に対応する25種のバイオタイプは55Uより高いβ-グルコシダーゼ活性を示した。L.plantarumDPPMA24W、L.fermentumDPPMA114、L.rhamnosusDPPMAAZ1、及びL.plantarumDPPMASL33はより高い活性を示したそれぞれ、202.35±7.08、163.15±6.52、146.60±5.84、及び144.34±7.19U。これらのバイオタイプのβ-グルコシダーゼ活性の値はボックスプロットのエラーバーの外に出ていた。これらの結果に基づいて4種の乳酸菌を選択し、様々な豆乳タイプの醗酵に用いるための混合スターターの配合のために用いた。2豆乳の醗酵と機能性化合物の合成豆乳の調製に用いる様々な大豆粉タイプの化学組成、タンパク質分散性指数及び粒径を表1に報告する。表1は、DPPMASL33に対応するLactobacillusplantarumDSM23755、DPPMA24Wに対応するLactobacillusplantarumDSM23756、DPPMA114に対応するLactobacillusfermentumDSM23757、及びDPPMAAZ1に対応するLactobacillusrhamnosusDSM23758を含む選択された混合スターターによる機能性化合物製造に用いる14種の大豆粉の化学組成、タンパク質分散性及び粒径を示す。14種の豆乳タイプをL.plantarumDPPMA24W、及びDPPMASL33、L.fermentumDPPMA114、及びL.rhamnosusDPPMAAZ1を含む選択された混合スターターを用いて醗酵させた。すべての基質を乳酸化のプロセスに付した図2A。96時間の醗酵後、ΔpH値は、Provasoy68288及び低脂肪大豆粉から得られた豆乳タイプについてそれぞれ、0.59±0.06から1.19±0.09に変化した。ΔpH平均値は0.03であり、25°と75°データパーセンタイル値に対応する範囲は0.79と1.01であった。醗酵の後、すべての豆乳タイプについてのpH値は5.1~5.3の範囲であった。乳酸菌はすべての豆乳タイプの醗酵の間増殖した図2B。Δlogufc/ml値は高脂肪から低脂肪大豆粉までの豆乳タイプについてそれぞれ、0.99±0.29から1.61±0.30まで変化した。細胞密度増大の平均値は1.31Δlogufcmlで、log8.31ufcmlの細胞密度絶対値に対応していた。25°と75°パーセンタイルデータ値に対応する範囲は1.21と1.43であった。乳酸菌の増殖は24~36時間のインキュベーションにより終了した。RAPD-PCRタイピングにより、混合スターターに用いた乳酸菌のすべての4種類のバイオタイプは同様の細胞密度にまで、様々な豆乳タイプ上で増殖した。様々な豆乳タイプでの共役イソフラボンの初期濃度は、ダイジンdaidzin、ゲニスチンgenistin、及びグリシチンglycitinについてそれぞれ、142.3±12.5から171.5±10.8mMまで、102.2±8.6から123.0±11.3mMまで、10.5±1.1から18.0±0.9mMまで変化した。これとは対照的に、低濃度0から7.8±0.5μMまでのアグリコンが様々な豆乳タイプで観察された表2。表2は、選択した混合スターターを用いて14種の様々な粉タイプから得られた豆乳の醗酵の間のイソフラボン-アグリコンダイゼイン、ゲニステイン、及びグリシチンとエクオールの濃度μMを示す。データは3つの三重の実験の平均値である。表296時間の醗酵の間、様々な豆乳タイプについて合成したイソフラボン-アグリコン及びエクオールの濃度μM高脂肪大豆粉から得られた豆乳は例外として、アグリコンの濃度はすべての豆乳タイプのインキュベーションの間増加した。96時間のインキュベーションの後、OFS豆乳57.0±4,0μM、1.45mg/100mlに対応において、次いでProlia6823850.7±2.1μM及びProlia6823746.4±1.7μMにより最も高いダイゼインの濃度が観察された。また、ゲニステインの最終的な最高濃度は上記の3つの豆乳タイプOFS、Prolia68238及び68237についてそれぞれ、140.3±9.4-3.9mg/100ml、102.9±6.4、及び94.0±5.3μMであった。他のアグリコンに比べて、グリシテイン濃度はすべての豆乳タイプにおいて低かった。Prolia68237及び68238、及びOFS豆乳タイプにおけるグリシテインの最高濃度はそれぞれ、23.9±2.4、22.5±1.3、及び20.4±1.0μM-0.58mg/100mlであった。生物学的大豆粉OFSから製造された豆乳の場合は、共役イソフラボンの対応アグリコンへの変換率は、ダイジンdaidzinからダイゼインdaidzein、ゲニスチンgenistinからゲニステインgenistein、及びグリシチンglycitinからグリシテインglyciteinまでについて、0.72、0.85、及び0.98であった。アグリコンの濃度はインキュベーションの間増大したが、24時間後、すべての3つの共役イソフラボンの加水分解速度は1.0~0.95の範囲であった。インキュベーションの前、エクオールの存在は豆乳のどのタイプにも検出されなかった表2。様々な豆乳タイプが醗酵過程の間エクオールを合成することができなかった。インキュベーションの96時間後、エクオールの最も高い濃度はProlia68238及び68237の豆乳タイプでそれぞれ20.0±1.1及び18.5±0.9μM、とりわけOFS豆乳で決定された37.3±1.5μM、0.9mg/100mlに対応。ダイゼインの同時合成により、そのエクオールに対する変換速度を決定することはできなかった。イソフラボン-アグリコンで豆乳を富化するために、ヒト糞便材料から単離された、プロバイオティックの可能性のあるバクテリアの使用を様々な研究が考察してきたChunetal.,2007.乳酸菌での醗酵による豆乳中のイソフラボングルコシドのアグリコンへの変換Conversionofisoflavoneglucosidetoaglyconesinsoymilkbyfermentationwithlacticacidbacteria.J.FoodSci.72:39-44;Donkor及びShah2008.豆乳中のLactobacillusacidophilus、Bifidobacteriumlactis及びLactobacilluscaseiによるβ-グルコシダーゼの産生及びイソフラボンフィトエストロゲンの加水分解Productionofβ-glucosidaseandhydrolysisofisoflavonephytoestrogensbyLactobacillusacidophilus,BifidobacteriumlactisandLactobacilluscaseiinsoymilk.J.FoodSci.73:15-20;Pham及びShah2007.脱脂粉乳で補充された豆乳におけるBifidobacteriumanimalisによるイソフラボングルコシドの生物変換BiotransformationofisoflavoneglycosidesbyBifidobacteriumanimalisinsoymilksupplementedwithskimmilkpowder.J.FoodSci.72:316-324;Tsangalisetal.,2002;Tsangalisetal.,2004;Weietal.,2007.醗酵豆乳におけるイソフラボンアグリコンを製造するためのラクトバチルス及びビフィドバクテリウムの使用UsingLactobacillusandBifidobacteriumtoproducttheisoflavonealgyconesinfermentedsoymilk.Int.J.FoodMicrobiol.117:120-124。使用した微生物はもっぱらビフィドバクテリア又は様々な種に属する様々な乳酸菌であった。本発明は、L.plantarumDPPMA24W及びDPPMASL33、L.fermentumDPPMA114、及びL.rhamnosusDPPMAAZ1に対応する4種の新しいバイオタイプを選択するもので、これらは従来イソフラボン-アグリコン及びエクオールの合成には使用されたことがない。豆乳の醗酵の間におけるエクオールの合成を考察した研究も非常に数が限られている。エクオールはビフィドバクテリアで醗酵された豆乳で合成されたTsangalisetal.,2002.β-グルコシダーゼ産生ビフィドバクテリアによる豆乳中でのイソフラボンフィトエストロゲンの酵素的変換Enzymatictransformationofisoflavonephytoestrogensinsoymilkbyβ-glucosidaseproducingbifidobacteria.FoodRes.Int.Sci.67:3104-3113。醗酵の24時間後、Bifidobacteriumpseudolongum及びBifidobacteriumlongumバイオタイプを用いて得られた0.338及び0.433mg/100mlの産生と比較して、エクオールの最も高い濃度0.521mg/100mlはBifidobacteriumanimalisにより合成された。この研究に従い選択された混合スターターで醗酵したOFS豆乳はより高い濃度のエクオール、即ち0.9mg/100mlに対応する37.3μMを含んでいた。以前報告された結果に基づけば、生物学的大豆粉OFSから生産された豆乳はイソフラボン-アグリコン及びエクオールの合成のための最良の基質と考えられた。我々の知る限りでは、今までにイソフラボン-アグリコン及びエクオールの合成のために生物学的培養大豆粉から得られた豆乳の使用を考察した研究はなかった。それ故、HPLC法を用いてルナシンの濃度を定量したWangetal.2008.大豆タンパク質由来のペプチドの分析、及び栽培品種、環境条件、及び大豆及び大豆生産物におけるルナシン濃度のプロセッシングの効果Analysisofsoybeanproteinderivedpeptidesandtheeffectofcultivar,environmentalconditions,andprocessingoflunasinconcentrationinsoybeanandsoyproducts.J.AOACIntern.91:936-944。インキュベーション前、ルナシン濃度は約3.2mg/100mlであった図3。醗酵の間、選択された混合スターターはルナシンの定常的な増加に有利に働き、インキュベーションの96時間の終わりには約8.4mg/100mlであった。我々の知る限り、乳酸菌で醗酵された豆乳からなる同じ調製物でイソフラボン-アグリコン、エクオール、及びルナシンの同時合成を考察した研究は今まではなかった。この生物活性ペプチドルナシンの生理学的効果は広く文献に記録されているJeongetal.,2003.大豆から単離されたルナシンのキャラクタリゼーションCharacterizationoflunasinisolatedfromsoybean.JAgricFoodChem.51:7901-7906;Jeongetal.2007.小麦由来の癌予防ペプチドルナシンはコアヒストンアセチル化を阻害する。Thecancerpreventivepeptidelunasinfromwheatinhibitscorehistoneacetylation.CancerLett.255:42-48。これまでの結果に基づいて、醗酵OFS豆乳を皮膚保護のアッセイ及びヒト腸細胞に用いた。3再構成上皮での試験とTEER測定経上皮電気抵抗生物学的大豆粉から得られ選択した混合スターターで醗酵したOFS豆乳をヒト再構成上皮をSkinEthic登録商標モデルに従い処理するためにエクオールの最終濃度10μMで使用した。このモデルは科学コミュニティで広く実験され受け入れられているDiCagnoetal.,2009.LactobacillusplantarumDSMZ19463によるγ-アミノ酪酸GABAの合成:機能的グレープは飲料及び皮膚科学的適用Synthesisofγ-aminobutyricacidGABAbyLactobacillusplantarumDSMZ19463:functionalgrapemustbeverageanddermatologicalapplication.ApplBiotechnolMicrobiolDOI:10.1007/s00253-009-23704。24時間の処理のあと、TEER測定を行った。このタイプの分析は国際的な科学コミュニティで広く受け入れられており、角質層の完全性やバリア機能を参照して組織の腐食能力を評価する。特にこの検出により、角質層レベルでのコンパクトなラメラ状構造の存在、完全緊密接合integraltightjunctions及び上皮厚さについての情報を得ることができる。これらの要素が全体として効率的なバリア機能を定義する。図4は醗酵OFS豆乳の存在下でTEER値の顕著な増加P<0.05を示しており、これは皮膚レベルでの分子の保護作用を実証している。同様の結果が化学的に合成されたエクオールとルナシンの混合物で得られた。現時点での知識によれば、これはイソフラボン-アグリコン、エクオール、及びルナシンを含む豆乳に基づく調製物が皮膚バリア機能の刺激を示す最初の応用例である。4Caco-2/TC7細胞での試験生物学的豆乳粉OFSから製造された豆乳に含まれるイソフラボン-アグリコンの免疫調整特性を試験する目的で、ニュートラルレッドNR取り込みアッセイを用いた、5~100μMの濃度での標準化合物エクオール、ダイゼイン、ゲニステイン、及びグリシテインによるCaco-2/TC7細胞に対する細胞毒性をまず評価した。ゲニステイン、グリシテイン、及びエクオールはメタノールとDMSO陰性対照に類似した振る舞いを示したが、細胞増殖には有意には影響しなかった。72時間の処理の後、ダイゼインは100μMより高い濃度で細胞増殖を顕著に阻害したp<0.03。予備的に、Caco-2/TC7細胞を24時間、OFS醗酵豆乳で10μMの濃度で処理し、10μMのエクオール最終濃度に希釈し、又は醗酵させていない豆乳で処理した。これらの化合物又は調製物はNO放出の誘発を示さなかったが、これは陰性対照、即ちメタノールとDMSOに類似した振る舞いを示した図5。引き続いて、Caco-2/TC7細胞を24時間当たりINF-γ1000U/ml及びLPS100ng/mlで刺激した。この処理はNO放出を有意に増加させP<0.05、従って陰性対照、ダイゼインで又は醗酵させていないOFS豆乳で予防的に処理したCaco-2/TC7細胞の炎症状態を刺激した。これとは対照的に、エクオール又は醗酵OFS豆乳での処理はNO放出を顕著に阻害したそれぞれP<0.002及びP<0.007。NO放出のかなりの阻害がゲニステインとグリシテインでの処理でも観察されたP<0.05。予備的に、試験で用いたイソフラボン-アグリコンの濃度10μMが毒性ではないことが示されているので、Caco-2/TC7細胞の死はNO放出と干渉したのではないことは確かである。この研究の培養条件下では、Caco-2/TC7細胞は緊密な細胞間接合を含む腸細胞の形態学的及び機能的特徴を展開し、その完全性はTEER定量により測定される。予備的に、TEERは標準化合物10-100μM、醗酵され、10μMのエクオール濃度に希釈されたOFS豆乳の存在下で定量され、又は醗酵していないOFS豆乳の存在下で定量された。100μM1000U/mlの濃度でのエクオール化合物を例外として、72hのインキュベーションの間のTEERへの効果は観察されなかった。Caco-2/TC7細胞のIFN-γ1000U/mlでの処理はTEER値の顕著な減少P<0.003に有利に働いた図6。IFN-γで刺激されたCaco-2/TC7細胞が醗酵OFS豆乳でも処理されていると、INF-γの負の効果が顕著に低減したP<0.007。醗酵させていない豆乳の存在下では無視できる程度の効果しか観察されなかった。ゲニステイン、グリシテイン、及びとりわけエクオールは醗酵OFS豆乳に類似した傾向を示した。ダイゼインはIFN-γにより引き起こされた負の効果と干渉しなかった。インターロイキン-8IL-8はC-X-Cケモカインファミリーのメンバーであり、好中球細胞の活性化に基本的な役割を果たしており、これにより炎症反応を開始する。Caco-2/TC7細胞をインターロイキン-1β2ng/mlでの処理にも付すと、IL-8合成の意味の或る増加P<0.001が観察された図7。インターロイキン-1βで刺激したCaco-2/TC7細胞をエクオールとダイゼインでの処理に付すと、IL-8合成の意味のある増加P<0.005が観察された。IL-8合成の最も高い阻害P<0.001は醗酵OFS豆乳での処理により観察された。対照的に、ゲニステイン、グリシテイン、又は醗酵OFS豆乳での処理ではIL-8合成の減少は見られなかったP<0.10。報告された結果は、醗酵OFS豆乳によるヒト腸細胞のバリア機能への抗炎症性及び刺激効果が主としてエクオールといくつかのイソフラボン-アグリコンの存在の結果であるということを明確に示している。ルナシンによる追加効果も可能である。5ダイゼイン、ゲニステイン、グリシテイン、エクオール、及びルナシンの合成のためのバイオテクノロジー的プロトコルの開発と皮膚科学分野でのその使用本文の他の箇所で先に概略を述べたように、イソフラボン-アグリコンダイゼイン、ゲニステイン、及びグリシテイン、エクオール、及びルナシンの合成のためのバイオテクノロジー的プロトコル、並びに皮膚科学分野でのその使用を開発した。当該方法は以下を含む:aMRS培地上での純粋培養におけるL.plantarumDPPMA24W及びDPPMASL33,L.fermentumDPPMA114及びL.rhamnosusDPPMAAZ1の培養;b様々な豆乳タイプ、好ましくは農業生物学的方法に従い栽培され、実験室で皮をむいた大豆粉から調製された滅菌豆乳での細胞懸濁液の収集、洗浄及び接種;c選択された混合スターターによる48~96時間、好ましくは96時間、30~37°C、好ましくは30°Cでの豆乳の醗酵;d遠心分離による細胞の分離。方法変更に従って、その調製物は乳酸菌細胞を含んでいてもよい;e乾燥又は凍結乾燥プロセスによる調製物の脱水;f場合に応じて経口又は局所投与による使用にふさわしい形態を得るために適切な賦形剤の添加による組成物の調製。実施例6:ルナシンを含むバイオマスとルナシンを含まないバイオマスの毛髪成長の刺激に対するインビトロ評価毛髪成長のプロモータとしてルナシンを含むバイオマスBLをルナシンを含まないバイオマスBと比べたインビトロ研究材料と方法皮膚乳頭細胞DPCを2mMのL-グルタミン、1xの抗真菌性かつ抗生剤的溶液1000ug/ml硫酸ストレプトマイシン、1000単位/mlペニシリンG、及び2.5μg/mlアンフォテリシンB及び10ウシ胎仔血清を含む培地Dulbeccoの変性Eagle培地、DMEMで培養した。合流して細胞を24時間血清なしでDMEM中で培養し、次いで様々な濃度のルナシンを含むか若しくは含まないバイオマスで処理した。細胞増殖はMTT法で定量したMosmann,1983。DPCを96穴プレート104細胞/穴に蒔種し、アッセイすべき物質を添加しながら24時間インキュベートした。吸光度をELISAリーダーで570nmで測定した。さらにウェスタンブロットをBc12について実行した。Tris-HCl50mM、pH7.4、EDTA2mM、リュプチンleuptin100μg/ml、及び100NaClmMを含む緩衝液を用いてタンパク質を抽出した。50μgのタンパク質を載せてSDS-PAGEにより分離した。Bcl-2、Bax及びアクチンに対するモノクローナル抗体を1:500に希釈し、抗原-抗体複合体をECLシステムを用いて検出し、結果を画像濃度測定Bio-RadGS-700を用いて分析した。結果と議論試験した濃度0.01~0.5μMの範囲内で、ルナシンを含むバイオマスはインビトロでのDPC増殖の増大を用量依存的に誘発するp<0.05図1。ルナシンを含むバイオマスの効果は、ルナシンを含まないバイオマスとは異なり、Bcl-2タンパク質発現の増加を誘発し、Baxタンパク質発現の減少を誘発する図2。これらの結果は、ルナシンを含むバイオマスがDPC上でのその増殖及び抗細胞死効果による毛髪成長を刺激することを示唆し、それ故、毛髪の成長期を拡大することができる。"