"核酸配列を決定する方法であって、a前記核酸配列に相当する二本鎖核酸分子を、該分子に物理的力をかけることによって変性させる工程;b一本鎖核酸分子を得る工程;c前記二本鎖核酸分子を、前記一本鎖核酸分子の存在下で復元する工程;およびd前記二本鎖核酸の復元の遮断を検出する工程を含んでなる、方法。前記二本鎖核酸分子がヘアピンである、請求項1に記載の方法。前記二本鎖核酸の一方の鎖の少なくとも1つの塩基が表面に直接的または間接的に結合され、前記二本鎖核酸の他方の鎖の少なくとも1つの塩基が可動表面に結合される、請求項1または2に記載の方法。前記二本鎖核酸が、工程aにおいて支持体を引き離すことによって変性される、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。支持体を引き離すことによって、前記二本鎖分子に15pN以上、好ましくは17pN以上、より好ましくは18pN以上の物理的力がかけられる、請求項4に記載の方法。変性した二本鎖核酸が、工程cにおいて支持体を一緒にすることによって復元される、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。前記二本鎖分子にかけられる力が、支持体を一緒にすることによって12pN以下、好ましくは11pN以下、より好ましくは10pN以下に低減される、請求項6に記載の方法。支持体に結合されていない前記二本鎖核酸の末端が、共有結合的にまたは非共有結合的に互いに連結される、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。工程a~dが数回繰り返される測定値を蓄積し、シグナル/ノイズ比を高めるために、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。工程dの検出が、前記二本鎖核酸分子の、支持体に結合されている二末端間の距離zを測定することを含んでなる、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。前記二本鎖核酸分子が変性された際に、前記二本鎖核酸分子の、支持体に結合されている二末端間の距離zhighを測定するさらなる工程を含んでなる、請求項10に記載の方法。zとzhighを比較する工程、および遮断位置を決定する工程をさらに含んでなる、請求項11に記載の方法。前記遮断の持続時間を測定するさらなる工程を含んでなる、請求項1~12のいずれか一項に記載の方法。前記遮断の持続時間を参照値と比較するさらなる工程を含んでなる、請求項13に記載の方法。前記一本鎖核酸分子がnマーの一本鎖核酸分子のライブラリーから選択され、該ライブラリーが、あり得る総ての組合せのn-2またはn-3個のヌクレオチドとそれぞれ連結された、あり得る総ての組合せのジまたはトリヌクレオチドからなり、nは整数、好ましくは30以下である、請求項1~14のいずれか一項に記載の方法。前記ジまたはトリヌクレオチドが前記一本鎖核酸分子の中央に位置する、請求項15に記載の方法。前記ジまたはトリヌクレオチドが前記一本鎖核酸分子の中央をはずれて位置する、請求項15に記載の方法。前記二本鎖核酸中の、4つの塩基、アデニン、シトシン、グアニンおよびチミジンのうち少なくとも1つの各存在が特定の拡大タグで置換され、前記拡大タグがオリゴヌクレオチドである、請求項1~14のいずれか一項に記載の方法。前記一本鎖核酸が前記拡大タグのうち1つに相補的なオリゴヌクレオチドである、請求項18に記載の方法。前記二本鎖核酸分子上の前記一本鎖核酸の各遮断位置を決定するさらなる工程を含んでなる、請求項18または19に記載の方法。工程a~dと前記二本鎖核酸分子上の一本鎖核酸の各遮断位置を決定するさらなる工程が、前記拡大タグに相補的な各オリゴヌクレオチドを用いて連続的に繰り返される、請求項18~20のいずれか一項に記載の方法。i上流一本鎖核酸プライマーに、隣接するハイブリダイズした一本鎖核酸を連結する工程、およびiiα前記二本鎖核酸を、前記の連結されたプライマーの存在下で変性させ、復元すること、およびβ前記復元の遮断を検出することによって前記プライマーの伸長をモニタリングする工程をさらに含んでなる、請求項1~14のいずれか一項に記載の方法。工程i~iiが異なる一本鎖核酸を用いて繰り返される、請求項22に記載の方法。前記一本鎖核酸分子がnマーの一本鎖核酸分子のライブラリーから選択され、該ライブラリーが、あり得る総ての組合せのn-2個のヌクレオチドと3’末端において連結された、あり得る総ての組合せのジヌクレオチドからなり、nは整数、好ましくは20以下である、請求項22または23に記載の方法。新たに合成された鎖が放出または解離される、請求項22~24のいずれか一項に記載の方法。請求項22~25に記載の工程が、請求項22のプライマーに関してヌクレオチド1個分上流または下流にシフトしたプライマーを用いて繰り返される、核酸配列の決定方法。実験例DNAの調製未知の配列であり数十~数千の間の塩基対からなるサイズの二本鎖dsDNA断片を、一方の先端においてDNAループに連結する。そのもう一方の先端をdsDNA断片に連結すれば、その2つの鎖を異なるコーティングの表面に結合させることができる。例えば、一方の鎖の遊離3’末端をビオチンで標識してストレプトアビジンでコーティングしたビーズに結合させ、反対の鎖の5’末端はジゴキシゲニンで標識して抗Dig抗体でコーティングした表面に結合させることができる。この末端標識は、例えばビオチンまたはdig修飾ヌクレオチドを付加するためのターミナルトランスフェラーゼの使用、または適切に標識されたオリゴヌクレオチドを用いるハイブリダイゼーションなど、当業者に公知の様々な方法で行うことができる。フォースストレッチング機器このDNA構築物を、それが、その標識された例えば、ビオチン一方の末端が結合する適当なビーズ例えば、ストレプトアビジンでコーティングしたものの溶液中で数分間インキュベートする。このビーズは、後に操作のために光ピンセットが使用されるならば透明であってよく、操作のために磁気トラップまたはピンセットが使用される場合は磁性ビーズであってよい。ビーズ-DNAアセンブリを、例えば分子のもう一方の標識末端と結合するようにその表面が処理された例えば、DNAのDig標識末端に結合させるための抗Digでコーティングされた表面流体チャンバー中に注入する。このようにしてビーズはDNA-ヘアピンを介して表面に固定される図1a参照。次に、ビーズと表面との距離を当業者に公知の様々な手段でモニタリングするが、例えば、それらの距離を推定するために、カメラでのそれらの画像の回折環を使用することができ、あるいはエバネッセントモードで照射された場合にそれらが散乱する光の強度または蛍光の放出を用いてそれらの距離を測定してもよい。あるいは、固定表面上のセンサーまでのそれらの距離を推定するために、それらが発生させる磁界を測定することができる例えばGMRまたはHallセンサーなどの磁気センサーを使用。ビーズに固定されているDNA分子を表面へ引き寄せるために、様々な技術が記載されている。好ましい実施態様では、上記のように、DNAヘアピンにより表面に固定された超常磁性ビーズを引き寄せるために磁気トラップを使用する。この構成においては、固定されたビーズに一定の力を加えるために、サンプルの上に配置した小さな磁石が使用され、その位置は<1nmの精度で決定することができる引張力および流体力学的抗力による消散に依存する。この一連の実験では、米国特許第7,052,650号および同第7,244,391号に記載の機器を用いた。さらに、特に断りのない限り、本明細書で報告した実験は、25mMTrispH7.5、150mMKAc、10mMMgCl2、0.2BSA中で行った。どの場合においても、連結しているヘアピンは、約16pNよりも大きい力でビーズを引っ張ることにより、機械的に完全に開くことができる。分子にかける張力を約11pNより小さくすると、ヘアピンが自発的に再び閉じさせることができる開いている状態の移行はヒステリシス的ではあるが可逆的である。もし、開いている状態の時に、溶液中の一部の分子例えば、タンパク質、またはDNA、RNA、LNAもしくはPNAの相補的オリゴヌクレオチドと延長された一本鎖ssDNAと結合していれば、力が11pNよりも小さくなった場合に、これらの分子はヘアピンの再閉を一時的に遮断する。アッセイの原理は2つの力の間の切り替えであり、大きい方のF0penはヘアピンを開き、小さい方のFtestは、再び閉じ、一時的遮断の際の分子の伸長の測定を可能にするために用いられる。遮断位置は、完全伸長と遮断状態の間の直線関係により、配列に関連づける。精度を最も良くするためには、完全伸長は、好ましくは、テスト張力Ftestで測定する。これは、力がFopenからFtestへ低減されたところで、一瞬でリフォールディングされるようにヘアピンループを設計することによって達成される。オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション位置は、塩基対の分解能により測定することができるこれらの再閉の停止のうちの1つの期間におけるDNA分子の伸長ビーズと表面との距離を測定することにより、遮断の位置をナノメーター精度で決定することが可能である1nmはssDNAにおいて10pNの力の下で2つのヌクレオチド1bpにわたる距離に相当する。開いている構造は、塩基対に対する伸長の最大比を示すdsDNAにおいてその比はわずか0.34nm/bpである。この測定の精度は、2つのノイズの関与により限定される:測定方法の精度;ビーズのブラウン運動。ビーズの垂直位置を測定するために様々な技術を使用することができる。最も単純なものは、ビデオ顕微鏡によるものである米国特許第7,052,650号および同第7,244,391号。この方法を用いて得られた図1の結果では、標準的な分解能は平均して1秒あたり1nmに達している。良好な分解能を備えた他の方法としては、例えば分解能0.1nmに達するPSDセンサーを用いるレーザー照射、およびエバネッセント波照射760576102003、LiuetalBiophysJ96381038212009が示されている。分解能における固有の制限は、ssDNA分子を引き寄せるビーズのブラウン搖動によりもたらされる。<x2>=4kBTΔf6πηr/k2ssDNAF、式中、kssDNAFはssDNA分子の剛性、kBはボルツマン定数、Tは絶対温度、ηは水の粘度、rはビーズの半径、Δfは測定の周波数帯域である。kssDNAF=10pN=0.05/NbN/m、式中、NbはssDNAの塩基の数である。84bpのヘアピンに対して、これは平均して1秒間に0.04nmのノイズをもたらすΔf=lHz。図1におけるより大きなノイズσ約1nmは、本質的に測定装置によるものであり、固有の搖動によるものではない。固有のブラウンノイズはヘアピンのサイズとともに増大し、例えば、1200bpのヘアピンは1秒間に平均して0.6nmのノイズをもたらす。ハイブリダイゼーションの品質は遮断時間の平均値により評価される遮断強度は、遮断確率Pblock=遮断を示すサイクル数/全サイクル数と平均遮断時間τblockの2つのパラメーターによって特徴付けることができる。Pblockはkonとオリゴヌクレオチド濃度に依存するが、τblockはkoffにのみ依存し、ここで、konとkoffはそれぞれ結合反応定数と解離反応定数である。図2では、オリゴヌクレオチド長および力による典型的なτblockの変動を表す。一塩基誤対合はτblockに、オリゴヌクレオチド長を少なくともヌクレオチド1個分低減することおよび遮断時間を5分の1にすることに相当する劇的な影響を示す。実際、τblockおよび従ってkoffは、オリゴヌクレオチド濃度に依存しないことから測定が簡単である図3。しかしながら、konも測定可能である。平均遮断時間はオリゴヌクレオチド配列に依存するが、ヘアピン上のその位置には依存しない。ヘアピン上の2つの特定の位置が一致する配列を検討したところ、両遮断とも遮断時間は同じであるが、大きく異なる位置に見られる。1つの突然変異が遮断時間に劇的な影響を示す図4に示されるように、ヘアピンと完全な一致を形成する12塩基のオリゴは、1つの誤対合を持つ同じオリゴに比べ、大きく異なる遮断時間を示す。図4では、種々のオリゴについて、力に対する遮断時間を示す。力が大きくなるほど、遮断時間が長くなる。突然変異がまさに最初のヌクレオチドか最後のヌクレオチドにあれば、その遮断時間に対する影響は最小の5分の1となる。予想されたように、この低下は誤対合の性質に依存し、一般に、ATに対する誤対合は遮断時間を20分の1にするが、GCの誤対合は60分の1にする。遮断時間は、誤対合がオリゴの中央にある場合に劇的に短くなる図4に見て取れるように、オリゴヌクレオチドの中央における誤対合は、力が最大の時にのみ見られる極めて短い遮断を生じる。このような誤対合から生じる遮断時間の短縮は、同じ力条件で100分の1を切る。遮断時間は温度およびバッファー条件に依存する図5aに見られるように、温度が高くなるほど、遮断時間は著しく短縮される。また、バッファー条件も遮断時間を調節し、マグネシウム、ベタインおよび塩化テトラメチルアンモニウムTMACはモル濃度で用いるは、これらの実験で用いたバッファー25mMTrispH7.5、150mMKAc、10mMMgCl2、0.2BSAに比べて遮断時間を著しく延長する。これらの化合物はGC対よりもAT対を強くするので、これらの対の間の強度の差を小さくする。RNAまたはLNAオリゴヌクレオチドを用いると遮断時間が延長されるRNAおよびLNAオリゴヌクレオチドは、DNAオリゴヌクレオチドよりもssDNAと強いハイブリッドを形成する。同じ標的配列では、遮断時間は、DNAオリゴヌクレオチドに比べてRNAオリゴヌクレオチドでは2倍になる。LNAヌクレオチドはさらに劇的な影響を示し、1個のヌクレオチドがDNAからLNAへ変わると、そのオリゴヌクレオチド全体の遮断時間が2倍になる。3つの塩基がDNAからLNAへ変わると、遮断時間は5倍になる。総てのヌクレオチドがDNAからLNAへ変わると、10の塩基LNAオリゴヌクレオチドの遮断時間が1時間を超えるといった劇的な影響が出る。オリゴヌクレオチドのサイズをLNA6塩基まで小さくすると、1秒という妥当な遮断時間が得られる。DNAオリゴヌクレオチドの場合では、これらの選択的オリゴヌクレオチドLNAまたはRNAの1つによる遮断の平均時間を測定することにより、それが相補的オリゴヌクレオチドとの完全なハイブリダイゼーションによるものであるかどうか、また、そうでなければ誤対合がどこにあるか例えば、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの中央かその一方の末端付近かといった、その性質を決定することができる。検出可能なオリゴヌクレオチドの長さ遮断時間はオリゴヌクレオチド長に指数関数的に依存することから、このパラメーターは大きく変えることができない。オリゴヌクレオチドが小さすぎると室温で8塩基より小さい、遮断時間が短すぎて検出することができない。オリゴが大きすぎると室温で12塩基より大きい、遮断時間が長すぎるようになる。酵素がハイブリッドを安定化し得るNTPを含まずにgp43DNAポリメラーゼを添加すると、オリゴヌクレオチドの遮断時間が長くなる。これはハイブリダイズしたプライマーがポリメラーゼの基質であるためであると思われる。gp43ポリメラーゼはオリゴの遮断時間を10倍にする。ハイブリダイゼーションパラメーターの概要オリゴの長さは重要なパラメーターであり、室温で実用的な遮断時間を有するオリゴヌクレオチドの長さは8~12塩基まで様々である。同じ分子に対して一連の開/再閉実験を容易に行い、開状態期においてオリゴヌクレオチドとDNAの対合により再閉する際の平均遮断時間を測定することができる。この時間はオリゴヌクレオチドのサイズ、再閉の際にかけられた力、温度およびイオン濃度に依存する。対合した断片が誤対合を示せば、遮断時間は有意に少なくとも10分の1、かつ、定量可能に短くなる。従って、機械的開/再閉技術により、既知のオリゴヌクレオチド配列と未知配列のDNA断片の間の対合の位置および安定性を即、プローブすることができる図1cおよび図2参照。これらの知見は、DNA配列決定および診断における適用の種々の実装形態を示唆する。ハイブリダイゼーションの機械的検出による診断および配列決定種々のオリゴヌクレオチド流体チャンバーに連続的に導入するを有する表面を、ビーズに固定されているDNAヘアピンでプローブすることにより、既知配列上にあり得る突然変異の存在を決定することプローブオリゴヌクレオチドとの誤対合が起こり、再閉中の停止が短くなる、または分子上の既知プローブの位置を決定することにより未知のDNAの配列決定を行うことが可能となる図6参照。別の態様では、配列決定される核酸が、ハイブリダイズプローブの位置の決定を増進するために拡大タグの使用によって再設計される。図7に報告されている実験では、特定の塩基、アデニン、シトシン、グアニンおよびチミンの全存在がそれぞれ対応する拡大タグこの場合には8マーのオリゴヌクレオチドで置換された。図7に示されるように、遮断位置は、その配列から予想される位置と完全に一致する。"