組み換えマイコバクテリウム細胞であって、a免疫応答を誘導することが可能なドメイン、および、bファゴリソソームエスケープドメインを含む融合ポリペプチドをコードする組み換え核酸分子を含み、Th17免疫応答を生じさせるためのワクチンとしての使用のための、細胞。請求項1に記載の細胞であって、ウレアーゼ欠損の細胞である、細胞。請求項1または2に記載の細胞であって、組み換えM.bovis細胞、特にDanish株の亜種Prague由来の組み換えM.bovis細胞である、細胞。請求項1~3のいずれか一項に記載の細胞であって、ここで、前記の免疫応答を誘導することが可能なドメインは、M.bovisまたはM.tuberculosis由来の免疫原性ペプチドまたはポリペプチドから選択されることを特徴とする、細胞。請求項1~4のいずれか一項に記載の細胞であって、哺乳類、例えばヒト対象でのTh17免疫応答を生じさせるための、細胞。請求項1~5のいずれか一項に記載の細胞であって、マイコバクテリウム未投与の対象またはマイコバクテリウム曝露に前曝露された対象でのTh17免疫応答を生じさせるための、細胞。請求項1~6のいずれか一項に記載の細胞であって、i結核、ii膀胱がん、iii自己免疫疾患、および、ivハンセン病から選択される疾患に対するワクチンでの使用のための、細胞。請求項1~7のいずれか一項に記載の細胞であって、Th17およびTh1免疫応答を生じさせるためのワクチンとしての使用のための、細胞。Th17免疫応答を、それを必要としている対象で生じさせるための方法であって、前記対象に、a免疫応答を誘導することが可能なドメイン、および、bファゴリソソームエスケープドメインを含む融合ポリペプチドをコードする組み換え核酸分子を投与するステップを含む、方法。本研究では、rBCGおよびpBCGが、顕著なTh1免疫応答を誘導し、一方で、rBCGのみが誘導するのは、加えて、重大なTh17応答であることが示される。rBCGワクチン接種されたマウスのMTB感染時に、抗原特異的Tリンパ球の肺への早期の動員も観察された。これらのT細胞は、再刺激後に、大量のTh1サイトカインを産生した。rBCGの優れた防御の有効性は、見かけ上、IL17に依存した。pBCGではなくrBCGワクチン接種後の亢進されたIL17産生は、第I相臨床試験中に、健常ボランティアでも検出された。本発明者らの知見は、TBおよび他の疾患に対する改良されたワクチン接種の戦略のためのマーカーとしての、一般的な免疫学的経路を同定する。本発明の要旨は、組み換えマイコバクテリウム細胞であって、a免疫応答を誘導することが可能なドメイン、および、bファゴリソソームエスケープドメインを含む融合ポリペプチドをコードする組み換え核酸分子を含み、Th17免疫応答を生じさせるためのワクチンとしての使用のための、細胞である。本発明のさらなる態様は、Th17免疫応答を、それを必要としている対象で生じさせるための方法であって、前記対象に、a免疫応答を誘導することが可能なドメイン、および、bファゴリソソームエスケープドメインを含む融合ポリペプチドをコードする組み換え核酸分子を投与するステップを含む、方法である。好ましい実施態様では、ワクチンは、a免疫応答を誘導することが可能なドメイン、および、bファゴリソソームエスケープドメインを含む、融合ポリペプチドをコードする、組み換え核酸分子を含む、組み換えマイコバクテリウムの生細胞である。免疫応答を誘導することが可能なドメインは、好ましくは、病原体またはその免疫原性フラグメント由来の免疫原性ペプチドまたはポリペプチドである。さらなる実施態様では、ワクチンは、不活化された病原体細胞全体または細胞画分に基づくワクチンである。マイコバクテリウム細胞は、好ましくはM.bovis細胞、M.tuberculosis細胞、特に、弱毒化M.tuberculosis細胞または他のマイコバクテリア、例えばM.microti、M.smegmatis、M.canettii、M.marinumまたはM.fortuitumである。さらに好ましくは、細胞は、組み換えM.bovisBCG細胞、特に、Danish株の亜種Prague43由来の組み換えM.bovis細胞である。特に好ましい実施態様では、ワクチンは、組み換えウレアーゼ欠損マイコバクテリウム細胞である。特に好ましい実施態様では、例えば、選択マーカー遺伝子によって破壊されたureC遺伝子を含む自殺ベクターsuicidevectorを構築して、そのベクターで標的細胞を形質転換し、そして、ウレアーゼ陰性の表現型を有する選択マーカー陽性の細胞をスクリーニングすることによって、マイコバクテリウム細胞のureC配列が不活化されるΔUrec。最も好ましくは、細胞は、rBCGΔUrec::Hly::Hygとして特徴付けられる、組み換えBCGの、Danish株の亜型Pragueである。免疫応答を誘導することが可能なドメインは、好ましくは、M.bovis、M.tuberculosis、またはM.leprae由来の免疫原性ペプチドまたはポリペプチド、または、少なくとも6、好ましくは少なくとも8アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも9アミノ酸、そして例えば、最大で20アミノ酸までの長さを有する、それらの免疫原性フラグメントから選択される。適切な抗原に関する具体例は、M.tuberculosis由来のAg85Bp30、M.bovisBCG由来のAg85Bα-抗原、M.tuberculosis由来のAg85A、および、M.tuberculosis由来のESAT-6、およびそれらのフラグメントである。他の実施態様では、免疫応答を誘導することが可能なドメインは、非マイコバクテリウムのポリペプチドから選択される。本発明のワクチンは、哺乳類、例えばヒト対象でのTh17免疫応答を生じさせるために適切である。ワクチンは、好ましくは、ヒト対象に、約1~10×105、好ましくは約2~8×105細胞の用量で投与される。ワクチンは、好ましくは単回投与として、例えば注射によって投与される。皮下注射が好ましい。さらにアジュバントを含まないワクチンを投与することが好ましい。ワクチンは、好ましくはハンセン病または結核のようなマイコバクテリア感染、特に肺のマイコバクテリア感染、さらに特に肺の結核に対するワクチンである。さらに、ワクチンは、膀胱がん、または自己免疫疾患、例えば神経皮膚炎または乾癬のような自己免疫皮膚疾患に対するワクチンであってよい。ワクチンは、マイコバクテリウム未投与の対象、例えば、予め免疫原性マイコバクテリウム曝露に曝されていないヒト、または予めマイコバクテリウムに基づくワクチン、例えばBCGで免疫されていないヒトにおいて、Th17免疫応答を生じさせるためであってよい。そのような対象の例は、例えば、結核のようなマイコバクテリア感染の流行地域における、例えば、新生児もしくは例えば8才までの子供、または非感染地域における危険性のある者である。あるいは、ワクチンは、対象、例えば予め免疫原性マイコバクテリウム曝露に曝されているヒト、または予めBCGで免疫されているヒトに、投与されてよい。特に好ましい実施態様では、ワクチンは、Th17とTh1の免疫応答の組み合わせを生じさせるために用いられる。本発明によれば、Th17免疫応答は、ワクチン接種された対象で生じる。Th17免疫応答の判定は、好ましくは、前記対象由来の生物学的サンプル中で行われ、ここで前記サンプルは、免疫細胞、特にT細胞および/またはNK細胞、さらに特に、CD4T細胞のような抗原特異的T細胞を含む。サンプルは、体液または組織サンプル、例えば血液、血清または血漿サンプル、または、肺または脾臓由来のサンプルであってよい。サンプルを採取する方法は、当技術分野でよく知られている。Th17免疫応答の判定のために、分析される対象におけるサンプル中に存在する免疫細胞を、免疫原で再刺激して、前記細胞からのサイトカイン発現を判定することが好ましい。分析されるべき細胞は、好ましくは抗原特異的T細胞、さらに好ましくはCD4T細胞である。再刺激のための免疫原は、その有効性が判定されるべきワクチン中に存在する免疫原に対応する。免疫原は、ワクチン中に存在する形態と同一の形態または異なる形態のいずれかで存在してよい。例えば、ワクチンが免疫原性ポリペプチドを含む場合は、再刺激のステップでの免疫原は、その免疫原性フラグメントを含んでよく、また逆の場合も同様である。好ましくは、再刺激のステップに用いられる免疫原は、精製されたポリペプチドまたはペプチドである。結核ワクチン、特に、上述の結核生ワクチンの有効性を試験するために、免疫原は、有利に、例えば、マイコバクテリアのグリセロール抽出物またはAg85AおよびAg85BであるPPD精製されたタンパク質誘導体から選択されるマイコバクテリアの抗原、ならびに、他のマイコバクテリアの抗原およびそれらの免疫原性フラグメント上述のようなであってよい。本発明による、Th17応答の判定は、表面マーカー、および、前記細胞中に存在し、および/または、前記細胞により分泌されるサイトカインを用いて、Th17応答と関連する細胞、例えばIL-17を産生する細胞を判定するステップを含んでよい。表面マーカーの例は、CD4、CD8、IL-23R、CCR4および/またはCCR6である。そのような細胞中に存在し、および/またはそのような細胞により分泌されるサイトカインの例は、IL-17、IL-21、IL-22、IL-23、IFN-γおよびそれらの組み合わせである。好ましくは、サイトカインは、IL-17である。そのような細胞は、細胞学的方法によって、例えば、蛍光基などの標識を有し得る、細胞表面マーカーおよび/またはサイトカインに特異的な抗体のような免疫学的検出試薬を用いた細胞ソーティング技術によって、判定されてよい。さらに好ましくは、Th17免疫応答と関連する細胞は、例えば、IL-17を産生し、場合により分泌するCD4T細胞である。さらなる実施態様では、Th17免疫応答の判定は、Th17免疫応答と関係がある細胞から分泌されるサイトカイン、例えばIL-17を判定するステップを含む。サイトカインは、適切な抗体、例えばIL-17に対する抗体を用いた免疫学的方法により、判定されてよい。好ましい実施態様では、Th17とTh1免疫応答の組み合わせが生じる。Th1免疫応答は、表面マーカー、および、前記細胞中に存在するおよび/または前記細胞から分泌されるサイトカインを用いて、Th1応答と関連する細胞を判定することにより、判定されてよい。表面マーカーの例は、CD4、CD8、CCR5およびCD62lowである。そのような細胞中に存在するおよび/またはそのような細胞から分泌されるサイトカインの例は、IFN-γ、IL-22、およびIL-23、およびそれらの組み合わせである。そのような細胞は、細胞学的方法によって、例えば、蛍光基などの標識を保持していてもよい免疫学的検出試薬例えば、細胞表面マーカーおよび/またはサイトカインに特異的な抗体を用いた細胞ソーティング技術によって、判定されてよい。さらなる実施態様では、Th1免疫応答の判定は、Th1免疫応答と関係がある細胞から分泌されるサイトカイン、例えばIFN-γ、IL-22および/またはIL-23を判定するステップを含む。サイトカインは、適切な抗体、例えばIFN-γ、IL-22および/またはIL-23に対する抗体を用いた免疫学的方法により、判定されてよい。好ましくは、Th17および場合によりTh1免疫応答は、ワクチン接種後の適切な時に判定される。例えば、免疫応答は、ワクチン接種後20-50日、特に25-35日に判定されてよい。さらに、本発明は、以下の図および実施例により、より詳細に説明される。[材料および方法][マウス]雌BALB/cマウスは、ベルリンのBundesinstitutfurRisikobewertungBfRで繁殖された。マウスは、実験の開始時に6~8週齢であり、特定病原体不在SPFの状態に維持された。動物実験は、LandesamtfurGesundheitundSozialesLAGeSo、ベルリン、ドイツの承認を得て行われた。[細菌]用いられたMTBH37RvおよびpBCG株とrBCG株は、以前に記載された12。細菌は、グリセロール、0.05Tween80とADCが補充されたMiddlebrook7H9ブロス中で培養された。中間対数Mid-logarithmicの培養物が回収されて、使用するまで-80°Cで保存された。全ての保存は、使用の前に滴定された。単細胞の細菌懸濁液が、27Gニードルを有するシリンジを通した繰り返しの移行により得られた。[ワクチン接種およびMTB感染]pBCGまたはrBCG106CFUは、尾の基部にごく接近して皮下投与s.c.された。MTBでのマウスの吸入感染が、Glas-Col吸入チャレンジシステムを用いて行われた。細菌負荷は、PBS0.5v/vTween80中での、無菌的に除去された臓器の機械的破砕およびOADCが補充されたMiddlebrook7H11寒天プレート上に段階希釈でプレーティングすることにより、評価された。3週間後、MTBコロニーが数えられた。結果の統計的有意性は、GraphPadPrism5.0を用いて、ノンパラメトリックデータに関する両側P値でのマンホイットニー検定により判定された。[細胞単離、刺激およびフローサイトメトリー]細胞は、以前に記載されるとおりに42、精製された。実験グループは、5マウスからなる。2つの脾臓または肺がプールされて、1つのサンプルが個々に処理されて、後に続く刺激のために、5マウスのグループあたり3つのサンプルをもたらした。細胞は、多重分析によるサイトカイン分析のために50μg/mlのPPDSSI、コペンハーゲン、デンマークで20時間、または、細胞内サイトカイン染色ICSのために25μg/mlのブレフェルジンAの存在下で6時間、刺激された。以下の抗体が用いられた:CD4RM4-5、IFNγXMG-1.2、IL2JES6-5H4、Ly6G/CRB6-8C5、CD11bM1/70、γδ-TCRGL-3、FoxP3染色セットおよびCD49bcloneDX5、全てeBioscience。CD8αYTS169、TNF-αXT22、CD16/CD322.4G2、F4/80CI:A3-1およびCD11cN418は、ハイブリドーマ上清から精製されて、自家でinhouse蛍光標識された。IL-17TC11-18H10はBDBiosciencesから取得された。細胞は、FACSCantoIIまたはLSRIIフローサイトメーターおよびFACSDivaソフトウェアBDBiosciencesを用いて分析された。サイトカインは、メーカーの使用説明書にしたがって、Bio-Radからの、Bio-PlexMouseTh1/Th2、IL17およびIL6ビーズに基づくイムノアッセイを用いて測定された。IL21およびIL22は、RDsystemsからのELISAによって測定された。ヒトIL17は、MilliporeからのMilliplex42-plexアッセイで検出された。[腹腔洗浄]pBCGまたはrBCGは、中間対数の培養物から新しく調製された。細菌はPBSで3回洗浄されて、濃度が、580nmでの光学濃度を測定することにより判定された。106CFUの投与が、腹腔内に行われた。動員された細胞は、5時間または6日後に、5mlのPBSの注射により腹膜腔から得られて、フローサイトメトリーにより分析された。洗浄液中のサイトカインおよびケモカインは、Bio-RadからのBio-PlexMouseCytokine23-plexキットを用いて判定された。[結果][rBCGおよびpBCGワクチン接種後のTh1/Th17応答]TBワクチンの有効性に関連のある免疫のメカニズムを解明する試みにおいて、本発明者らは、マウスにおけるrBCGおよびpBCGに対する免疫応答を比較した。rBCGの優れた防御の有効性は、当初は、経静脈i.v.免疫付与後に判定された12。ここで、本発明者らは、rBCGの皮下s.c.投与が、匹敵するレベルの防御を誘導し、pBCGよりも優れた有効性を保持したことを示す図1A。次に、本発明者らは、rBCGまたはpBCGでの皮下s.c.ワクチン接種後83日の、マウスの肺および脾臓における長期のメモリー応答を分析した。細胞は、PPDで再刺激されて、上清が、サイトカインに関する多重分析により分析された。rBCGでの免疫付与は、pBCGと比較して、有意により高い、肺から単離された細胞によるサイトカイン産生を誘導した図2A。これらは、IFNγ、IL2、IL6、およびGM-CSFを含んだ。対照的に、タイプ2サイトカインIL4、IL5およびIL10は、バックグラウンドのレベルを超えては増加しなかったデータ示さず。興味深いことに、およそ3倍高いIL17濃度が、rBCGワクチン接種されたマウス由来の肺細胞により産生された。感染されていないマウスの肺からは、ほんの少しの細胞しか単離され得なかったことに留意されたい。その結果として、全体のサイトカイン濃度は、ウェルあたり10倍高い細胞密度を刺激のために用いることができた脾臓よりも低かった図2B。脾臓では、IL2、IL6、IFNγおよびGM-CSFの同程度の濃度により示されるように、両方のワクチンが同様に強いTh1応答を誘導した。しかしながら、rBCGワクチン接種されたマウス由来の脾臓細胞は、PPDでの再刺激の際に、pBCGワクチン接種された動物と比較して、有意に、より多いIL17を産生した。このように、pBCGではなくrBCGでの免疫付与は、肺および脾臓での同時かつ強いTh1およびTh17応答を誘導し、それは長期間持続した。[rBCGワクチン接種されたマウスにおける、毒性MTBでの感染時の、MTB特異的なT細胞の促進された動員]Th17細胞は、改良された免疫監視に関係している13。本発明者らは、ワクチン接種された動物における、毒性MTBでのエアロゾル感染時の、感染後7日の肺および脾臓での、抗原特異的なT細胞の応答を比較した。rBCGワクチン接種されたマウス由来の肺細胞による、際立ったIFNγ、IL17、IL2およびGM-CSF産生が、PPD図3AまたはAg85Aペプチドデータ示さずでの再刺激後20時間に検出された。対照的に、これらのサイトカインは、pBCGワクチン接種されたマウス由来の細胞からは、ほとんど分泌されなかった。MTBで感染された、ワクチン接種されていない動物では、サイトカイン産生は検出限界よりも下であり、MTB特異的なT細胞は、MTB感染後3週間前は現れないという以前の報告13と一致した。タイプ2サイトカインIL4、IL5およびIL10は検出されず、TNFα、IL12p70およびIL6は、MTBチャレンジ後の、この早い時点において、かろうじてバックグラウンドレベルよりも上なだけであったデータ示さず。本発明者らは、MTB感染後7日に、フローサイトメトリーによって、肺のT細胞によるサイトカイン産生を判定した図3B。細胞はPPDで6時間刺激されて、IL2、IL17、IFNγおよびTNFαに関する細胞内サイトカイン染色が続いた。ワクチン接種されていないコントロールでは、少ない割合のCD4T細胞が、IL2、TNFαまたはIFNγを産生した。ワクチン接種されたマウスでは、CD4T細胞は、IL2、IFNγ、TNFαおよびIL17をも、分泌した。単一のサイトカインを産生する細胞の頻度は、有意ではないが、rBCGグループにおいて最も高かった。ワクチン接種された動物において、本発明者らは、防御免疫に関与する多機能T細胞14を検出した。多重のサイトカインを産生するT細胞は、主に、IL2TNFαの二重プロデューサーであり、rBCGワクチン接種時に有意に増加した。三重プロデューサー細胞は、ほぼ例外なくIL2IFNγTNFαであり、pBCGワクチン接種されたマウスと比較して、rBCGにおいてわずかに増加した。また、IL2TNFαIFNγIL17四重陽性細胞は、非常に低い頻度であるが、rBCGグループにおいてのみ現れた。原理上、脾臓のT細胞は、肺のT細胞と同様のサイトカインパターンを産生した図4。IL2とGM-CSFの産生は、pBCGグループと比較して、rBCGワクチン接種された動物において、有意により高く、ワクチン接種されていないコントロールでは、少ない割合のCD4T細胞がIFNγを産生したとしても、ワクチン接種されていないコントロールでは、検出レベルより低かった。要するに、pBCGまたはrBCGのいずれかでのワクチン接種は、pBCGグループと比較して、rBCGワクチン接種されたマウスにおいて、より高い頻度の単一または多重プロデューサーでIFNγおよびTNFαを分泌するCD4T細胞を誘導した。持続的感染p.i.7日目に、CD4T細胞は、主要なサイトカインプロデューサーであった。;CD8サイトカインプロデューサーは、同様のパターンであるが、肺図6および脾臓図7において、より低い頻度で検出された。有意により高い頻度の、TNFαを単一に産生するCD8T細胞が、rBCGグループに検出されたことは、留意することである。差示的なサイトカイン産生およびプロデューサー細胞の頻度は、肺および脾臓での同等のコロニー形成単位CFU数により確認されるように図1B、感染後の、この早い時点での異なる細菌負荷のせいではなかった。Treg細胞の合計数は、2つのワクチン接種されたグループにおいて同程度に、感染時に増加した図5。[rBCGでのワクチン接種は、持続的な感染の間、強力な免疫応答を与える]本発明者らは、肺の細菌負荷がpBCGグループと比較してrBCGで免疫付与された動物においておよそ10倍低く、そしてワクチン接種されていないコントロールグループと比較して100倍低い場合の、持続的感染p.i.90日のMTB特異的な免疫応答を分析した。ワクチン接種されたマウスおよび未処理のコントロールの肺由来の細胞は、PPDで20時間、再刺激されて、サイトカイン濃度が多重分析により測定された図8A。再刺激時に検出されたサイトカインは、主にタイプ1であった。しかしながら、本発明者らは、持続的な感染の間、ワクチン接種されたグループ間で、IFNγまたはIL17に違いは検出することができなかった。対照的に、IL2、IL6、GM-CSFおよびTNFαの量は、rBCGワクチン接種されたマウスにおいて、より高かった。全てのグループにおいて、IL4およびIL5は、検出限界よりも低く、いくらかのIL12p70およびIL10が測定されたデータ示さず。さらに、多色フローサイトメトリーによる肺細胞の分析は、持続的な感染の間にサイトカインを産生するCD4T細胞を、主に、明らかにした図8B。IFNγのみを分泌するCD4T細胞は、全てのグループにおいて同様の頻度で検出された。その上、ワクチン接種時にIL2、IFNγ、TNFαまたはIL17を異なる組み合わせで産生するCD4T細胞が検出され得た。興味深いことに、応答性CD4T細胞の頻度は、上清中のIL2およびTNFαの、より高い濃度にもかかわらず、rBCGおよびpBCGワクチン接種の間で有意に異ならなかった。本発明者らは、両方のワクチンが、持続的なMTB感染の間に、rBCG誘導されたT細胞がより強力なサイトカインプロデューサーになるのに伴って肺における抗原特異的CD4T細胞の頻度を増加させたことを推測する。CD8T細胞は、ほぼ例外なく、全てのグループにおいて同等の頻度でIFNγを分泌し、一方で、有意に、より高い単一のTNFαを産生するCD8T細胞がrBCGグループにおいて検出された。多機能CD8T細胞は、かろうじてバックグラウンドよりも上に現れた図9。[ワクチン接種はIL22産生を生じさせるが、IL21産生を生じさせない]Th17細胞は、IL2115およびIL2216のような、さらなるエフェクターサイトカインを産生することができる。IL22を産生する細胞は、TB患者で同定されているが、これらはIL17を産生する細胞17とは異なるようである。本発明者らは、ワクチン接種されてその後にMTB感染されたマウス由来の脾臓または肺細胞のPPDでの刺激後に、IL21を検出しなかった図10A。IL22は、rBCGで免疫付与されたマウスにおいて、PPDで20時間刺激された脾細胞により、亢進された濃度で産生されたが図10B、MTBでの感染後早期には、さらに増加しなかった。肺細胞によるIL22産生は、rBCGワクチン接種されたグループでのみ観測され、エアロゾルMTB感染後に減少した。[腹腔内rBCGは、有意にAPCの集団を変化させることなく、γδT細胞およびNK細胞の増加した動員を生じさせる]本発明者らは、rBCGでの免疫付与後の、潜在する選択的なTh17細胞の誘導のメカニズムを明らかにしたかった。この目的を達成するために、rBCGおよびpBCGが、腹腔内i.p.投与されて、投与後5時間または6日に移民細胞immigrantcellが腹膜腔から単離されて、そしてフローサイトメトリーにより分析された図11A。好中球Gr1HI、CD11bHI、MHCII-、CD11c-として定義されるは、急速に腹膜腔に入り、そして、pBCGおよびrBCGグループにおいて同程度に、持続的感染p.i.6日の時点で亢進されたままであった。常在性の腹膜のマクロファージCD11bHI、F4/80HI、Gr1-、MHCIIHI、CD11c-として定義されるおよび樹状細胞CD11c、CD11bLO、Gr1-の頻度は、低い割合で変化されないままであった。要するに、rBCGおよびpBCGグループの間で、有意差は検出されなかった。ワクチン接種後5時間に回収された腹膜細胞は、αCD3/αCD28抗体でのポリクローナル刺激図11Bにさらされた。CD4T細胞およびNK細胞の頻度は、IFNγおよびIL17産生と同じように、全てのグループ間で同等であった。投与後6日に、これらの細胞は数値的に増加して、rBCGグループにおいて最高頻度に到達した図11C。PPDが、6日の時点での細胞の再刺激のために用いられた。CD4T細胞は、はっきり認識できるほどの量のIFNγまたはIL17を産生せず、一方で、相当な割合のNK細胞が、rBCG投与後にIFNγを産生した。γδT細胞は、TBでの早期のIL17の主要な原因として同定された18。有意ではないが、増加した割合の、IFNγを産生するγδT細胞が、rBCGでの注射後5時間に確認された。この細胞集団は、さらに増加して、そして、著しくより高い頻度の、IL17を産生するγδT細胞が、注射後6日にrBCGグループで検出された。CD8T細胞は、いずれのグループにおいても、腹膜で検出されなかった。本発明者らは、腹膜腔中に存在するサイトカインおよびケモカインを、腹腔洗浄液の多重分析により分析した図11D。MCP-1、MIP1α、G-CSFおよびKCは、注射の際に急激に増加した;エオタキシンのレベルは変化しないままであり、IL12p40は6日後に、より高い濃度で検出された。IL12p70、IFNγ、IL1a、IL2、IL3、IL4、IL5、IL10、IL17、GM-CSF、およびTNFαの濃度は、検出限界よりも低く、一方で、IL1β、IL6、IL9、IL13、MIP1βおよびRANTESは測定され得たが、産生はrBCGとpBCGとの間で同等であった。このように、rBCGおよびpBCGは、APCの動員、および、投与部位でのケモカインおよびサイトカインの同程度の産生を誘導した。興味深いことに、IL17を分泌するγδT細胞およびIFNγを産生するNK細胞の割合は、rBCG投与後に最も大量であった。[rBCGでのワクチン接種は、ヒトにおいて、IL17を産生する細胞を産生する]最後に、本発明者らは、rBCGワクチン接種された研究被験者においてIL17産生が増加されるかどうかを調べるために、第I相臨床試験のヒト健常ボランティア由来のPBMCを分析した。ボランティア由来の血液が、rBCGまたはpBCGでの免疫付与後29日に採取されて、PBMCが単離されて凍結された。PBMCは、解凍されて一晩休まされて、20時間のPPDでの再刺激がその後に続いた。サイトカイン産生は、多重分析により分析された。IL17産生は、rBCGで免疫付与された研究被験者由来のPBMCにおいてのみ検出された図12。制限された数のサンプルが利用可能であったことに留意されたい。[考察]防御の免疫マーカーの同定は、新規のTBワクチンの合理的デザインに極めて重要である。これらのマーカーは、また、TBワクチン有効性試験での臨床転帰のエンドポイントを予測するための代替マーカーの定義のための基礎を確立することができ、そしてこのように、現在のワクチン候補者の改良のためのガイドラインを提供する。マクロファージの抗マイコバクテリア能力を活性化する、IFNγ21およびTNFα22を含む、主要なサイトカインの重要性、および、メモリー細胞の増殖におけるIL2の必要性23が良く実証されて、そしてこのように、一般に、TBワクチン試験をモニターするために用いられる。ワクチンの有効性のバイオマーカーを同定するための試みにおいて、本発明者らは、その親株であるpBCGよりも優れた防御を与えることが証明されたrBCGによって誘導される長期のメモリー免疫応答を比較した。応答は、量的および質的の両方で異なった。本発明者らは、肺において、rBCGでのワクチン接種に続いて、タイプ1サイトカインおよびIL17の増加した存在量を検出した図2A。肺での、ワクチン誘導された免疫応答の分析は、臨床試験に照らして、明らかに実行不可能である。したがって、本発明者らは、全身性の長期のメモリー応答図2Bも分析した。興味深いことに、同等の濃度のタイプ1指向性のサイトカインが、pBCGおよびrBCGグループで検出された。対照的に、脾細胞によるIL17産生は、rBCGワクチン接種時に有意に亢進した。このように、本発明者らは、IFNγまたはIL2よりむしろ、IL17が、rBCGにより誘導される、優れた防御のマーカーとして適格であると結論付ける。Th17細胞は、IL17に応答して動員される最初の細胞のうちの一つである好中球を引き付けて、活性化することにより、抗菌の防御に寄与する24。IL17は、初期のMTB感染の間は不必要であるが25、26、メモリー応答において重要性を得る13ことが示されている。加えて、CCR6は、好中球により産生されるCCL20に対する受容体であり29、そして、CCL20-CCR6は、TBの免疫病原性に関与している30ので、ヒトTh17細胞上のCCR6の発現に関する最近の報告27、28は、ポジティブフィードバックループを指摘する。このように、Th17細胞は、細菌が存在する部位への、抗原特異的なメモリーT細胞の促進された動員を促すことができた。MTBでのエアロゾル感染後7日の、ワクチン誘導された免疫応答を分析することにより、本発明者らは、rBCGでのワクチン接種は、実際に、細菌の複製の部位への、エフェクター細胞の促進された動員をもたらすことを示す。本発明者らは、抗原特異的なCD4T細胞の増加した頻度および肺図3および脾臓細胞図4によるIL2、IL17、IFNγおよびGM-CSFの亢進された産生を確認した。IL2、IFNγおよびTNFαを共に産生する多機能CD4T細胞は、当初、Leishmaniamajorに対して14、そして後に、MTBに対しても31、成功したワクチン接種戦略に関与した。最近になって、これらの多機能CD4T細胞は、臨床のTBワクチン試験においても検出された32、33。本発明者らは、rBCGとpBCGのワクチン接種と後に続く感染時に、多機能CD4T細胞を検出した図3and4;しかしながら、二重および三重のプロデューサーにおけるサイトカインの構成IL2、IL17、IFNγおよびTNFαは、実験および個々の動物間で、かなり変化した。もし、多機能細胞が、真の、防御の関連要因であるならば、rBCGグループにおいて、より高いそれらの全体の頻度は、それらの構成よりむしろ、最も関連があるように思われる。rBCGはなぜTh17応答を誘導したのだろうかrBCGおよびpBCGでの免疫付与は、APCおよびケモカインとサイトカインのプロデューサーの動員を、同程度に生じさせた。興味深いことに、IL17を分泌するγδT細胞とIFNγを産生するNK細胞の割合は、rBCGワクチン接種後に極めて高かった。これは、IL17はγδT細胞34、18およびNKT細胞35によって、急速に産生されることができることを示している報告と一致する。NK細胞は、これもrBCGでのワクチン接種時に増加したものであり、早期のIFNγの重要な原因である。本発明者らは、rBCGから遊離された異なる分子構成要素が、感染されたマクロファージの細胞基質中に存在することをすでに示している12。Nod-2は重要な細胞質PRRであり、そしてそれの関与は、Th17メモリーT細胞応答の発生に関連している19。細菌の感染中に誘導されるアポトーシスは、Th17細胞を誘導する36。本発明者らは、rBCGが、pBCGに比較して増加したアポトーシスを誘導し12、さらに、Th17細胞の増加した発生に寄与することができたという証拠を得た。インフラマソームの活性化もまた、IL1βの産生を経由したTh17メモリー応答に寄与することができた37。例えば、NLRP3は、ATPレベルでの変化を通じて、リステリオリシンの存在を感知することが見出されている38。このように、rBCGワクチン接種時のTh17細胞の誘導は、細胞内刺激と増加したアポトーシスの複雑な相互作用を必要とするのかもしれない。Th17細胞は、成功したワクチン接種に対して有用であるよりむしろ、コラーゲン誘導の関節炎39、EAE40、39およびアレルギー性気道過敏症41、39のような炎症性および自己免疫性疾患に役立つと考えられる。この病原の役割は、通常、深刻なIL21仲介の炎症性応答の発生に関連する。本発明者らは、いずれの実験においても、決して、ワクチン接種および後に続くMTB感染後に、バックグラウンドレベルより上のIL21を検出しなかった図10A。加えて、本発明者らは、rBCGでのワクチン接種時にも、またはMTB感染後最大で200日までの肺においても、決して、注射の部位において自己免疫または過剰な炎症の兆候を観察しなかった。マウスでの実験的TB由来のデータとヒトデータを比較する最初の試みでは、本発明者らは、rBCGおよびpBCGでの第I相臨床試験由来の冷凍PBMCのサイトカインプロファイルを分析した。制限された数のサンプルにおいて、本発明者らは、rBCGワクチン接種後にIL17産生を検出したが、pBCGワクチン接種後では検出しなかった。Th17細胞は、MTB感染されたヒトの末梢血中に検出された17。最近になって、IL17を産生するCD4T細胞は、Ag85Aを発現する改良されたワクシニアウイルスAnkaraからなるTBワクチン候補でワクチン接種された青年において、報告されている33。応答はワクチン接種後7~28日にピークになり、そしてその後減少した。これは、rBCGグループにおいて、ワクチン接種後29日に亢進されたIL17産生を示す、本発明者らのデータと一致する図12。このように、TBワクチン試験における、防御の関連要因として、IL17を提案したい。要するに、本発明者らは、rBCGでのワクチン接種は、Th17細胞の選択的な産生をもたらし、おそらく、Nod-2による細菌の構成要素の細胞内認識に依存することを示す。これらのTh17細胞は、次々に、抗原特異的T細胞の、肺への動員を促進する。最終的に、この現象のカスケードは、MTBの早期の抑制をもたらし、したがって、pBCGと比較して、rBCGによる優れた防御をもたらす。本発明者らは、成功を果たした第I相臨床試験での、rBCGワクチン接種されたボランティア由来のPBMCによってのみ、IL17産生を検出する。IL17は、抗原特異的T細胞の、MTB複製部位への、促進された動員に役立つようなので、さらなるTBワクチンは、バランスのとれたTh1およびTh17応答を同時に誘導する目的に合わせられるべきである。[参考文献]