有限寿命の細胞を不死化する方法であって、i有限寿命の細胞を準備する工程と、ii前記細胞に、以下のカテゴリー:aBMPシグナル伝達の活性化を促進する遺伝子若しくは遺伝子産物、又はその機能的置換体、b多能性の維持に関与する遺伝子若しくは遺伝子産物、又はその機能的置換体、又は、c細胞周期の進行を促進する遺伝子若しくは遺伝子産物、又はその機能的置換体、のうち少なくとも2つのカテゴリーの各々からの少なくとも1つの遺伝子、遺伝子産物又はその機能的置換体、及び任意で形質導入細胞の選択を促進する1つ又は複数の遺伝子又は遺伝子産物を供給する工程と、を含む、有限寿命の細胞を不死化する方法。前記BMPシグナル伝達の活性化を促進する遺伝子又は遺伝子産物が、DNA結合阻害因子Idファミリーのメンバーであり、該IdファミリーメンバーがId1、Id2、Id3及びId4からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。前記多能性の維持に関与する遺伝子又は遺伝子産物が、その標的遺伝子複数の場合もありが多能性の維持に関与し、Nanog、Sox1、Sox2、Sox3、Klf1、Klf2、Klf4、Klf5、Esrrb、Dppa4、Dppa2、Sall4、Oct3/4及びUtf1からなる群から選択される転写調節因子である、請求項1又は2に記載の方法。前記多能性の維持に関与する遺伝子又は遺伝子産物がLin28、miR290クラスター、Ecat1、Dppa5、ERas、Ecat8、Gdf3、Tcl1及びDppa3からなる群から選択される、請求項1又は2に記載の方法。前記細胞周期の進行を促進する遺伝子が腫瘍抑制因子p53、p21、pRB、p16Ink4a、p19ARF、p14ARF又はp27のうち少なくとも1つの不活性化を介して作用する、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。前記細胞周期の進行を促進する遺伝子が細胞起源又はウイルス起源である、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。前記細胞起源の細胞周期の進行を促進する遺伝子がFos、Jun、Myc、n-myc、h-ras、raf、k-ras、RhoA、Rac1、Rac2、Rac3、Myb、βカテニン、Lmo2、Mdm2、Pim1、Pim2、Yap1、Gli1、Gli2、Gli3、E2F1、E2F2、E2F3、サイクリンA、サイクリンb、サイクリンd、Suz12、Tbx2、Tbx3、Ezh2、Bmi1、Cbx7及びRexからなる群から選択され、又は該選択がFos、Myc、RhoA、Myb、βカテニン、Lmo2、Yap1、Suz12、Ezh2、Bmi1及び/又はRexからである、又はFos、Myc及び/又はEzh2からである、請求項6に記載の方法。前記細胞起源の細胞周期の進行を促進する遺伝子がE7、Core、E1a、E1b、E6、vGPCR及び/又はSv40ラージT抗原からなる群から選択され、又は該選択がE7、Core、E6及び/又はSv40ラージT抗原からである、又はE7及びcoreからである、請求項6に記載の方法。Bcl-2、Bcl-Xl、HoxB4、Tlx1、HoxA9、Hoxb8、Stat3及びZFP217からなる群から選択される1つ又は複数の更なる遺伝子が前記細胞において発現され、又は該選択がBcl-2、HoxA9及び/又はZFP217からである、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。前記細胞周期の進行を促進する遺伝子又は遺伝子産物がFos、E7、core、Ezh2及びMycからなる群から選択され、前記多能性の維持に関与する遺伝子又は遺伝子産物がNanog及びKlf4からなる群から選択され、前記IdファミリーメンバーがId1、Id2、Id3及びId4からなる群から選択される、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。前記有限寿命の細胞が、特定の遺伝的背景を有する個体又は個体群に由来し、該特定の遺伝的背景が少なくとも1つの突然変異、欠失、重複、SNP関連変異及び/又は染色体異常によって野生型と異なる、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。工程iiの後に、不死化細胞において増殖を終了若しくは遅延させる、老化を誘導する、及び/又は分化を誘導する任意の工程iiiを更に含む、請求項1~11のいずれか一項に記載の方法。前記遺伝子の前記供給が細胞型特異的及び/又は調節性である、請求項1~12のいずれか一項に記載の方法。前記遺伝子又は遺伝子産物を、工程iの有限寿命の細胞のサブセットのみで供給し、及び/又は該遺伝子を該細胞のサブセットのみで発現させる、請求項1~13のいずれか一項に記載の方法。請求項1~14のいずれか一項に記載の方法を用いて産生可能な細胞又は細胞株。少なくとも1つの遺伝子に操作可能に連結した発現制御配列を含む少なくとも1つの発現カセットを含むベクター、又は各々が少なくとも1つの遺伝子に操作可能に連結した発現制御配列を含む少なくとも1つの発現カセットを含むベクターセットであって、各々が以下のカテゴリー:aBMPシグナル伝達の活性化を促進する遺伝子若しくは遺伝子産物、又はその機能的置換体、b多能性の維持に関与する遺伝子又はその機能的置換体、又は、c細胞周期の進行を促進する遺伝子又はその機能的置換体、のうち1つから選択される少なくとも2つの遺伝子、及び任意で形質導入細胞の選択を促進する1つ又は複数の遺伝子又は遺伝子産物の発現を指向する、ベクター又はベクターセット。前記細胞周期の進行を促進する遺伝子がE7、Fos、Jun、Myc、n-myc、h-ras、raf、k-ras、RhoA、Rac1、Rac2、Rac3、Myb、βカテニン、Core、Lmo2、E1a、E1b、E6、vGPCR、Sv40ラージT抗原、Mdm2、Pim1、Pim2、Yap1、Gli1、Gli2、Gli3、E2F1、E2F2、E2F3、サイクリンA、サイクリンb、サイクリンd、Suz12、Tbx2、Tbx3、Ezh2、Bmi1、Cbx7及びRexからなる群から選択され、又は該選択がE7、Fos、Myc、RhoA、Myb、βカテニン、Core、Lmo2、E6、Sv40ラージT抗原、Yap1、Suz12、Ezh2、Bmi1及び/又はRexからであり、又はFos、Core、Myc、E7及び/又はEzh2からであり、前記多能性の維持に関与する遺伝子がNanog、Sox1、Sox2、Sox3、Klf1、Klf2、Klf4、Klf5、Esrrb、Lin28、miR290クラスター、Ecat1、Dppa5、ERas、Ecat8、Gdf3、Dppa4、Dppa2、Sall4、Oct3/4、Utf1、Tcl1及びDppa3からなる群から選択され、又は該選択がNanog、Klf4、Sox2からであり、又はNanog及び/又はKlf4からである、及び/又は前記BMPシグナル伝達の活性化を促進するId遺伝子又は遺伝子産物がId1、Id2、Id3及びId4からなる群から選択され、任意でBcl-2、Bcl-Xl、HoxB4、Tlx1、vGPCR、HoxA9、Hoxb8、Stat3及びZFP217からなる群から選択される1つ又は複数の更なる遺伝子を含み、又は該選択がBcl-2、HoxA9及び/又はZFP217からである、請求項16に記載のベクター又はベクターセット。細胞アッセイ、3d細胞培養モデルの確立、組織工学、1つ若しくは複数の異なる細胞株の細胞を用いた共培養、及び/又は細胞カプセル化のための請求項15に記載の細胞若しくは細胞株、又は16若しくは17に記載のベクター若しくはベクターセットの使用。変性疾患、臓器若しくは細胞の損傷/機能不全、免疫系に関連する病態、がん、心理的病態、又は代謝性疾患、例えば肥満の治療又は予防に使用される、請求項15に記載の細胞若しくは細胞株、又は16若しくは17に記載のベクター若しくはベクターセット。このため、当該技術分野においては、様々な初代細胞から細胞株を産生する、種及び細胞型に依存しない方法が依然として必要とされている。本発明は、有限寿命の細胞を不死化する方法であって、i有限寿命の細胞を準備する工程と、ii上記細胞に、以下のカテゴリー:aBMPシグナル伝達の活性化を促進する遺伝子若しくは遺伝子産物、又はその機能的置換体、b多能性の維持に関与する遺伝子若しくは遺伝子産物、又はその機能的置換体、又は、c細胞周期の進行を促進する遺伝子若しくは遺伝子産物、又はその機能的置換体、のうち少なくとも2つのカテゴリーの各々からの少なくとも1つの遺伝子、遺伝子産物又はその機能的置換体、及び任意で形質導入細胞の選択を促進する1つ又は複数の遺伝子又は遺伝子産物を供給する工程と、を含む、有限寿命の細胞を不死化する方法に関する。本発明は、この方法を用いて産生可能な細胞又は細胞株にも関する。更に、本発明は、少なくとも1つの遺伝子に操作可能に連結した発現制御配列を含む少なくとも1つの発現カセットを含むベクター、又は各々が少なくとも1つの遺伝子に操作可能に連結した発現制御配列を含む少なくとも1つの発現カセットを含むベクターセットであって、各々が以下のカテゴリー:aBMPシグナル伝達の活性化を促進する遺伝子若しくは遺伝子産物、又はその機能的置換体、b多能性の維持に関与する遺伝子又はその機能的置換体、又は、c細胞周期の進行を促進する遺伝子又はその機能的置換体、のうち1つから選択される少なくとも2つの遺伝子、及び任意で形質導入細胞の選択を促進する1つ又は複数の遺伝子又は遺伝子産物の発現を指向する、ベクター又はベクターセットに関する。本発明は、細胞アッセイ、例えば化合物に対する細胞の応答の試験、3d細胞培養モデルの確立、組織工学、1つ若しくは複数の異なる細胞株の細胞を用いた共培養、及び/又は細胞カプセル化のための上記の細胞若しくは細胞株、又は上記のベクター若しくはベクターセットの使用にも関する。さらに、本発明は、変性疾患、臓器若しくは細胞の損傷/機能不全、感染性疾患、免疫系に関連する病態、がん、心理的病態、又は肥満の治療又は予防に使用される、上記の細胞若しくは細胞株、又は上記のベクター若しくはベクターセットに関する。この発明の概要は必ずしも本発明の特徴を全て記載しているわけではない。添付の図面は本発明を単に説明するものであり、添付の特許請求の範囲により示されるような本発明の範囲を限定するものとは決して解釈されないものとする。本発明を以下で詳細に説明する前に、本発明は本明細書に記載の特定の方法論、プロトコル及び試薬に限定されないなぜなら、これらの方法論、プロトコル及び試薬は変化し得るものであるためであることを理解するべきである。本明細書で用いられる専門用語は特定の実施形態を説明するためのものにすぎず、本発明の範囲を限定することは意図されず、該範囲は添付の特許請求の範囲でのみ限定されることも理解すべきである。他に特に規定されない限り、本明細書で用いられる技術用語及び科学用語は全て、当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有する。好ましくは、本明細書で用いられる用語は、AmultilingualglossaryofbiotechnologicaltermsIUPACRecommendationsLeuenbergerHGWNagelBandKoelblH編1995HelveticaChimicaActaCH4010BaselSwitzerlandで記載されるように定義される。幾つかの文献が本明細書の本文全体を通して引用されている。本明細書で引用される文献全ての特許、特許出願、科学刊行物、製造業者の仕様書、取扱説明書、GenBankアクセッション番号配列寄託書等を含むの各々は、上記又は下記に関わらず、引用することによりその全体が本明細書の一部をなすものとする。本明細書のいずれの記載も、本発明が先行発明のためにかかる開示に先行する権利がないことを承認するものとしては解釈されない。以下で本発明の要素を説明する。これらの要素を特定の実施形態とともに挙げるが、付加的な実施形態を作り出すために任意の様式で及び任意の数で該要素を組み合わせることができることを理解すべきである。様々に記載された実施例及び好ましい実施形態は、本発明を明示的に記載された実施形態のみに限定するものとは解釈されるべきではない。本記載は明示的に記載された実施形態を任意の数の開示された及び/又は好ましい要素と組み合わせる実施形態を支持及び包含するものと理解されるべきである。さらに、本願において記載されたあらゆる要素の任意の並べ替え及び組合せは、文脈上他の意味を示していない限り、本願の記載により開示されているとみなすものとする。本明細書及び添付の特許請求の範囲を通じて、文脈上他の意味に解する必要がある場合を除き、含むcompriseという言葉、及びその変化形variationssuchascomprisesandcomprisingは、記載の整数若しくは工程、又は整数若しくは工程の群を包含する意図はあるが、任意の他の整数若しくは工程、又は整数若しくは工程の群を排除する意図はないと理解される。本明細書及び添付の特許請求の範囲に使用される場合、数量を特定していない単数形thesingularformsaanandtheは、文脈上他に明確に示されていない限り複数の対象を含む。本発明は、有限寿命の細胞を不死化する方法であって、i有限寿命の細胞を準備する工程と、ii上記細胞に、以下のカテゴリー:aBMPシグナル伝達の活性化を促進する遺伝子若しくは遺伝子産物、又はその機能的置換体、b多能性の維持に関与する遺伝子若しくは遺伝子産物、又はその機能的置換体、又は、c細胞周期の進行を促進する遺伝子若しくは遺伝子産物、又はその機能的置換体、のうち少なくとも2つのカテゴリーの各々からの少なくとも1つの遺伝子、遺伝子産物又はその機能的置換体、及び任意で形質導入細胞の選択を促進する1つ又は複数の遺伝子又は遺伝子産物を供給する工程と、を含む、有限寿命の細胞を不死化する方法に関する。好ましい実施形態では、上記方法は工程iiの後に、不死化細胞において増殖を終了若しくは遅延させる、老化を誘導する、及び/又は分化を誘導する任意の工程iiiを更に含む。好ましくは、これは例えばcreリコンビナーゼのようなDNAリコンビナーゼSalmonetalMolTher2000Oct240414、又は例えばTetON商標系若しくはTetOFF商標系のようにテトラサイクリンによってオンオフを切り替えることができるプロモーター系を用いる上記遺伝子若しくは遺伝子産物、又はその機能的等価物の部分的又は完全なサイレンシング、不活性化及び/又は除去によって達成される。有限寿命の細胞という用語は非分裂細胞、すなわち一生の間に分裂しない細胞、及び/又はゆっくりと分裂する細胞、すなわちそれらの起源の生物において、細胞分裂によって他の細胞を産生するという主な若しくは唯一の目的を有しない細胞、及び/又は老化する細胞、すなわち組織からの単離後に限られた数の細胞分裂を経て、分裂を停止する初代細胞、及び/又はアポトーシスを起こす細胞、すなわち組織からの単離の直後にアポトーシスを起こすか、若しくは組織からの単離の後に限られた数の細胞分裂を経て、アポトーシスを起こす初代細胞を指す。したがって、この用語には胚性幹細胞は含まれない。好ましい実施形態では、この用語は外胚葉系、内胚葉系又は中胚葉系に由来する細胞を指す。上記細胞は、成長停止細胞例えば細胞周期の様々な段階、すなわちG0、G1、S、G2、前期、前中期及び中期で進行を阻止された細胞、非増殖細胞、有糸分裂後細胞又は非有糸分裂細胞、静止細胞、良性細胞、老化細胞、invitroで分化した胚性幹細胞、invitroで分化した人工多能性幹細胞、最終分化した細胞、好ましくは初代細胞であり得る。好ましい細胞は脂肪細胞、成体幹細胞、星状細胞、B細胞、心筋細胞、軟骨細胞、角膜上皮細胞、樹状細胞、内分泌細胞、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、グリア細胞、顆粒球、造血細胞、造血幹細胞、肝細胞、ケラチノサイト、腸上皮細胞、肝臓細胞、I型肺上皮細胞、II型肺上皮細胞、リンパ球、マクロファージ、乳房上皮細胞、メラニン細胞、メサンギウム細胞、間葉系幹細胞、筋細胞、筋芽細胞、ナチュラルキラー細胞、神経細胞、神経幹細胞、好中球、骨芽細胞、膵β細胞、周皮細胞、前脂肪細胞、前駆細胞、前立腺上皮細胞、腎上皮細胞、腎近位尿細管細胞、網膜色素上皮細胞、セルトリ細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、幹細胞、間質細胞、T細胞、及び上記細胞型のサブセットからなる群から選択される細胞である。上記細胞は非哺乳動物細胞例えば魚類又は鳥類に由来する又は哺乳動物細胞例えばマウス、ラット、サル、ブタ、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ヤギに由来する、好ましくはヒト細胞である。本発明の好ましい態様では、上記有限寿命の細胞は、例えば疾患に関連し、治療に対して特異的な応答をもたらすことが知られる特定の遺伝的背景を有する個体又は個体群に由来し、該特定の遺伝的背景は好ましくは少なくとも1つの突然変異、欠失、重複、SNP関連変異及び/又は染色体異常によって野生型と異なる。言及した機構の1つによって変化し得る遺伝子には、薬物代謝に関連する遺伝子がある。これには、例えばアイソフォームCYP2D6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP1A1、CYP3A4、CYP3A5、CYP2A6、CYP2B6、CYP2E1のようなシトクロムP450酵素の種々のアイソフォームが含まれる。他の可能性のある疾患遺伝子は、アデノシン三リン酸ATP結合カセットABCファミリーのトランスポータのような薬物輸送に関与する遺伝子である。全部で48個の既知のABC遺伝子が存在し、最も知られるものは、ABCB1P糖タンパク質、多剤耐性MDR1、ABCC1MRP1、ABCG2BCRP、MXR、ABCP、及びABCC2MRP2である。加えて、有機アニオン輸送タンパク質OATP、例えばOATP1B1及びOATP1B3のような取込みトランスポータの機能を、上述の機構により変化させることができる。遺伝的背景へのかかる依存は、例えばチオプリンs-メチルトランスフェラーゼTPMT、N-アセチルトランスフェラーゼ2NAT2、UDPグルクロノシルトランスフェラーゼ1ファミリーポリペプチドA1UGT1A1、及びメチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼMTHFR、エステラーゼ、チオールメチルトランスフェラーゼ、カテコール-O-メチルトランスフェラーゼCOMT、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、ヒスタミンメチルトランスフェラーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、アルデヒドヒドロゲナーゼ、モノアミンオキシダーゼB、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、トリメチルアミンN-オキシダーゼ、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼのような薬物代謝に関与する他の遺伝子においても知られている。さらに、治療応答も遺伝子型特異的であり得る。このことは、例えばGプロテイン共役受容体、イオンチャネル、キナーゼ又は酵素のような疾患関連の標的遺伝子の発現を、例えば単一ヌクレオチド多型のような突然変異により調整することができることによるものである。例としてはアルツハイマー病があり、アポリポタンパク質EAPOEの変異体がアルツハイマー病を発症するリスクを決定する。APOE-4対立遺伝子がアルツハイマー病を発症するリスクに関連するのに対し、APOE-2対立遺伝子はアルツハイマー病になるのを防ぐとされる。別の例はアンジオテンシンI変換酵素ACEであり、これは降圧薬として現在使用されているACE阻害因子ファミリーの薬物カプトプリル、エナラプリルの標的である。これらのACE関連の多型変異体は、高血圧、アテローム性動脈硬化、脳卒中、左室肥大、心筋梗塞に対する感受性、糖尿病性腎症、アルツハイマー病のような徴候に関連付けられている。また喘息では、遺伝子型による影響を受ける幾つかの薬物応答経路が特定されている。その中には、グルココルチコイド受容体ベクロメタゾン、β2-アドレナリン受容体アルブテロール、5-リポキシゲナーゼ酵素ジレウトン、システインロイコトリエン1受容体拮抗薬ザフィルルカスト又はムスカリン受容体3イプラトロピウムを標的とする薬物がある。がんにおいて、チオプリンメチルトランスフェラーゼTPMT又はジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼのような幾つかの遺伝子は抗がん剤の代謝に関与する。がんは或る生物が所与の遺伝子の異なる遺伝的変異体を保有する可能性があることも明らかにする。がん細胞を非悪性細胞と比較することで、これらの差が明らかになる。かかる差を標的療法に利用することができ、かかる遺伝的変異体の例はヒト上皮成長因子受容体2、融合タンパク質BCR-ABL、BRCA1、BRCA2又はK-rasである。細胞を不死化するという用語は、例えばその起源の生物内で、又は単離し、細胞培養物中に維持する場合に、1つ又は複数の細胞にその天然の、すなわち本来の増殖能を超える程度まで分裂又は増殖する能力を与えることを指す。好ましい実施形態では、上記細胞は無制限に分裂又は増殖する能力を獲得する。不死化細胞という用語は、不死化後の細胞、すなわち本発明の方法によって不死化されているが、増殖を終了又は減速させ、及び/又は上記方法の上述した任意の工程iiiに従って老化及び/又は分化を誘導した細胞も含む。したがって、細胞を不死化するという用語の代わりに、細胞を増加させるという用語が代替的に使用される場合もある。本発明の意味の範囲内の不死化細胞は形質転換細胞ではない、すなわち腫瘍形成性ではない。不死化細胞は好ましくは非腫瘍形成性であり、非腫瘍形成性細胞は好ましくは以下の特徴の少なくとも1つ、2つ又は3つ全てを示す細胞である:i軟寒天中で成長しない、ii接触阻害を示さない、及び/又はiiiSCIDマウス、RAG2γcマウス若しくはヌードマウスのような免疫不全マウスにおいて腫瘍成長を引き起こさない。より好ましくは、上記不死化細胞は、不死化細胞の元となる上記有限寿命の細胞の分化特異的な生理的特性を本質的に保持する。分化特異的な生理的特性を本質的に保持するとは、細胞又は細胞株が、不死化細胞を用いた調査の対象である有限寿命の細胞の少なくとも1つの特性を保持することを意味する。主に、このことは有限寿命の細胞の主要機能複数の場合もありに関連する。上記特性は細胞型に明らかに依存し、以下の非限定的な例は別にして、当業者は当該技術分野において既知の細胞特性を検査する方法を参照するしかない。元となる内皮細胞の少なくとも1つの特性を保持する不死化した内皮細胞株は、起源originator細胞すなわち有限寿命の細胞と比較して、以下のマーカー:CD31Pecam-1、Tie2、VEGFR1、VEGFR2CD309、CD105、フォンヴィレブランド因子、及び凝固第VIII因子、好ましくはCD31、CD105の1つ又は複数の発現を特徴とし得る。さらに、内皮細胞はCD54ICAM1、CD62EE-セレクチン及びCD106VCAMの誘導性発現を特徴とし得る。この誘導は例えばTNFαによって達成することができる。内皮細胞株は、内皮型NO合成酵素eNOSの活性を検出するか、低比重リポタンパク質のアセチル化形態acLDLの取込みを検出するか、又は細胞株が細胞外マトリックス例えばマトリゲル上に管様構造を形成することを実証する機能アッセイによっても特性化することができる。加えて、内皮細胞株は例えば免疫不全マウスへの移植後の血管形成を特徴とし得る。不死化した軟骨細胞株は、転写因子Sox9又はSox10の発現を特徴とし得る。加えて、この軟骨細胞株は、例えば種々のコラーゲンコラーゲンI、コラーゲンII、コラーゲンX、プロテオグリカン、又はコンドロイチン4-硫酸sulfatのような細胞外タンパク質の産生を特徴とし得る。不死化した上皮細胞株、例えば肺、ケラチノサイト、腸又は腎臓の上皮細胞は、50Ω/cm2を超える値の経上皮電気抵抗TEERを発生することにより機能的に特徴付けることができる。加えて又は代替的に、上皮細胞は、それぞれの上皮細胞の単層を介した物質の透過性をアッセイすることにより機能的に特徴付けることができる。加えて又は代替的に、上皮細胞は、例えばp糖タンパク質、多剤耐性遺伝子1aMdr1a、多剤耐性関連タンパク質MRP1、MRP2、MRP4、MRP5、又はATP結合カセットサブファミリーGメンバー2ABCG2のような排出系トランスポータによっても特徴付けることができる。神経細胞株は、βIII-チューブリン、チロシンヒドロキシラーゼ、芳香族L-アミノ酸デカルボキシラーゼAADC、ドーパミントランスポータDAT、コリンO-アセチルトランスフェラーゼChAT、LIMホメオボックス転写因子1、βLMX1B、及び微小管関連タンパク質2MAP2の発現により特徴付けることができる。神経細胞は、活動電位を測定することによっても特徴付けることができる。確立された心筋細胞株は、自発的な拍動によって機能的に特徴付けることができる。加えて、これらは、トロポニンTタイプ2心臓TnTc、筋細胞エンハンサー因子2CMEF2C、ミオシン、軽鎖7、調節MYL2A、ミオシン、重鎖7、心筋、βMYH7、又はNK2転写因子関連、遺伝子座5NKX2.5も発現する。確立された肝細胞は、アルブミン、αフェトプロテインAFP、肝細胞核因子4、αHNF4a、サイトケラチン18CK18、Sox17、CCAAT/エンハンサー結合タンパク質C/EPBa、α-1-抗トリプシン、又はMrp2の発現により特徴付けることができる。加えて、肝細胞の細胞株は、薬物代謝シトクロムp450、例えばCYP1A2、CYP2A6、CYP2C19、CYP2D6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP3A4、又はCYP2E1の1つによる薬物代謝の第I相成分及び薬物代謝例えばUDP-グルクロノシルトランスフェラーゼ、グルタチオンS-トランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼ、N-アセチルトランスフェラーゼ、又はアミノ酸N-アシルトランスフェラーゼによる薬物代謝の第II相成分の活性、又はATP結合カセット、サブファミリーBMDR/TAP、メンバー11ABCB11による胆汁流出exportを測定することにより機能的に特徴付けることができる。膵β細胞から確立された細胞株は、ISLLIMホメオボックス1Isl-1、Pax6、Nkx6.1、Pdx-1、プロホルモンコンバーターゼ1/3、又はプロホルモンコンバーターゼ2の発現により特徴付けることができる。これらは、グルコースに応じたインスリンの分泌により機能的に特徴付けることができる。Tリンパ球細胞株は、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、又はT細胞受容体の発現により特徴付けることができる。これらは、パーフォリン、グランザイム、及びグラニュリシンのような細胞毒素の放出を測定することにより機能的に特徴付けることができる。Bリンパ球細胞株は、CD19、CD20、又はIL7受容体の発現により特徴付けることができる。加えて、これらは、抗体の産生により機能的に特徴付けることができる。間葉系幹細胞から確立された細胞株は、CD73、CD105、又はCD271の発現により特徴付けることができる。これらは、骨芽細胞、脂肪細胞、又は軟骨細胞へと分化するそれらの能力により機能的に特徴付けることができる。造血正:hematopoietic幹細胞又は造血前駆細胞から確立された細胞株は、c-kit、Scal、CD34、CD150、CD48、又はCD244の発現により特徴付けることができる。これらは、骨髄細胞単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球/血小板、又は樹状細胞、及びリンパ球系細胞T細胞、B細胞、又はNK細胞のような全ての種の血液細胞型に分化するそれらの能力により機能的に特徴付けることができる。加えて、これらは、invitroでコロニーを形成するそれらの能力CFU、すなわちコロニー形成単位により機能的に特徴付けることができる。これらは、X線照射又は宿主骨髄を破壊する他の処理、例えばシクロホスファミドによる処理後に個体例えばマウスをレスキューするrescueそれらの能力によっても特徴付けることができる。したがって、本発明は、本発明の方法により産生可能な細胞又は細胞株にも関する。好ましくは、上記細胞は、以下のカテゴリー:aBMPシグナル伝達の活性化を促進する遺伝子若しくは遺伝子産物、又はその機能的置換体、b多能性の維持に関与する遺伝子若しくは遺伝子産物、又はその機能的置換体、又は、c細胞周期の進行を促進する遺伝子若しくは遺伝子産物、又はその機能的置換体、のうち少なくとも2つのカテゴリーの各々からの少なくとも1つの遺伝子、遺伝子産物又はその機能的置換体、及び任意で形質導入細胞の選択を促進する1つ又は複数の遺伝子又は遺伝子産物を含む。本発明は、少なくとも1つの遺伝子に操作可能に連結した発現制御配列を含む少なくとも1つの発現カセットを含むベクター、又は各々が少なくとも1つの遺伝子に操作可能に連結した発現制御配列を含む少なくとも1つの発現カセットを含むベクターセットであって、各々が以下のカテゴリー:aBMPシグナル伝達の活性化を促進する遺伝子若しくは遺伝子産物、又はその機能的置換体、b多能性の維持に関与する遺伝子又はその機能的置換体、又は、c細胞周期の進行を促進する遺伝子又はその機能的置換体、のうち1つから選択される少なくとも2つの遺伝子、及び任意で形質導入細胞の選択を促進する1つ又は複数の遺伝子又は遺伝子産物の発現を指向する、ベクター又はベクターセットにも関する。操作可能に連結したという用語は、組換え遺伝子又はコード配列と1つ又は複数の発現制御配列とが、細胞に導入した場合に核酸配列の発現が可能となるように接続していることを意味し、この場合、発現の時間及び量は発現制御配列によって決まる。発現カセットという用語は、組換え遺伝子又はコード配列を発現することが可能なヌクレオチド配列を指す。発現カセットは、細胞内で遺伝子若しくはコード配列によってコードされるタンパク質産物の発現が達成されるか、又はRNA分子、例えばmiRNAのような調節因子として作用するRNA分子の発現が達成されるように、1つ又は複数の組換え遺伝子又はコード配列に操作可能に連結した1つ又は複数の発現制御配列を含む。好ましくは、上記のカテゴリーの各々から選択される少なくとも2つ又は3つの遺伝子が1つのベクター上に、好ましくは1つの発現制御配列の制御下で含まれる。後者の実施形態では、少なくとも2つ又は3つの遺伝子が1つのmRNAとして転写されるが、別々に翻訳されることが好ましい。これは、いわゆる内部リボソーム侵入部位IRESの導入によって達成することができる。様々な実施形態において、上記ベクターはウイルスベクター、好ましくはレトロウイルスベクター、より好ましくはレンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター若しくはアデノ随伴ウイルスベクター;非ウイルスベクター、好ましくはプラスミド、細菌人工染色体若しくはコスミド;及び/又はエピソームベクター、ミニサークル、若しくは非組込み型nonintegratingレトロウイルスベクター若しくはレンチウイルスベクターのような非組込み型ベクターである。更なる実施形態では、上記発現カセットは、それに含まれる遺伝子の除去、調節又はサイレンシングを可能にする系を含む。かかる系の例は、creリコンビナーゼSalmonetalMolTher2000Oct240414、Flpリコンビナーゼ、Phi31インテグラーゼ、メガヌクレアーゼ若しくは改変ジンクフィンガーヌクレアーゼのようなDNA修飾酵素の使用、又はTet系、T-Rex系、AIR系、エリスロマイシン系、PIP系、Rheoswitch系、クメートcumate系、クーママイシン系、NICE系のような転写調節系の使用である。発現カセットを含むベクターは、当該技術分野で既知の形質導入法、例えばエレクトロポレーション、リン酸カルシウムトランスフェクション若しくはリポフェクション、又はウイルスベクターによる細胞感染等によって達成され得るプラスミド形質導入によって細胞に導入することができる。発現カセットは染色体内に組み込まれていても、組み込まれていなくてもよく、又は染色体外にextrachromosomally例えばミニサークルとして、若しくは例えばエプスタインバーウイルス核抗原EBNA若しくはSV40ラージT抗原によって維持され得る他のエピソーム形態で存在していてもよい。別の例は、アデノウイルスのようなウイルスによって送達される染色体外の発現カセットの送達である。上述した方法、それを用いて産生される細胞又は細胞株、及び上記ベクター又はベクターセットのいずれに関しても、上記遺伝子又は遺伝子産物は、一実施形態では細胞の遺伝子又は遺伝子産物である。また、少なくとも1つの遺伝子、遺伝子産物又はその機能的置換体がカテゴリーaのものであることが好ましい、すなわちカテゴリーaとカテゴリーbとの組合せ及びカテゴリーaとカテゴリーcとの組合せが特に好ましい。少なくとも1つの遺伝子、遺伝子産物又はその機能的置換体が、カテゴリーa、カテゴリーb及びカテゴリーcの各々から選択されることが更に好ましい。BMPシグナル伝達の活性化を促進する遺伝子という用語は、例えばBMPR-IAALK3及びBMPR-IBALK6が属する、BMP受容体I型BMPR-Iを介したシグナル伝達を誘導する遺伝子産物をコードする遺伝子を指す。これらの受容体は、例えばBMP2又はBMP4のような内因性リガンドを介して活性化することができる。BMPR-I受容体の下流シグナル伝達は、R-SMADタンパク質を活性化する。SMAD1、SMAD5及びSMAD8は、共通パートナーSMADco-SMAD;SMAD4と複合体を形成するBMPシグナル伝達のR-SMADである。このR-SMADとco-SMADとの複合体は、続いて核内に移行して、標的遺伝子の転写を調節するMiyazonoetalJBiochem2010Jan1473551。したがって、BMPシグナル伝達の活性化を促進する遺伝子産物という用語はコードされるタンパク質を指す。かかる遺伝子の好ましい例は、ヘリックスループヘリックスHLHドメインを含有するが、基本的ドメインを含有しない転写調節因子であるDNA結合阻害因子Idファミリーメンバーをコードする。これらのタンパク質は、したがってドミナントネガティブヘリックスループヘリックスタンパク質である。BMPシグナル伝達の活性化を促進する遺伝子との関連で、その機能的置換体という用語は、BMP2、BMP4、ALK3、ALK6、SMAD1、SMAD5、SMAD8をコードする遺伝子を指す。好ましくは、Id遺伝子又はIdタンパク質の機能的置換体という用語は、Id遺伝子ファミリーメンバーの発現を調節する遺伝子又はコードされるタンパク質である。上記Idファミリーメンバーは好ましくはId1、Id2、Id3及びId4からなる群から選択される。Id遺伝子ファミリーメンバーの機能的置換体は、好ましくは1つ又は複数のId遺伝子ファミリーメンバーを上方調節する遺伝子である。Idファミリーメンバーは、例えばβカテニン/T細胞因子TCFシグナル伝達経路、骨形成タンパク質BMPシグナル伝達、Erk/MAPKシグナル伝達経路、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質mTOR経路、線維芽細胞成長因子FGF-2シグナル伝達、JAK2-STAT5シグナル伝達、アクチビン、HiF-1、h-ras、Sp1、AP-1、E2F1、Pax3、Pax7、n-Myc又はc-Mycに関与する遺伝子によって上方調節される。加えて、Id遺伝子ファミリーメンバーは突然変異p53経路によって上方調節される。多能性の維持に関与する遺伝子という用語は、i多能性回路pluripotencycircuitLohetalCellCycle2008Apr1788591Molecularframeworkunderlyingpluripotency及び/又はii体細胞の再プログラム化MaheraliandHochedlingerCellStemCell2008Dec43595605Guidelinesandtechniquesforthegenerationofinducedpluripotentstemcellsに関与する遺伝子産物をコードする遺伝子を指す。したがって、多能性の維持に関与する遺伝子産物という用語はコードされるタンパク質を指す。好ましい実施形態では、多能性の維持に関与する上記遺伝子又は遺伝子産物は、Nanog、Sox1、Sox2、Sox3、Klf1、Klf2、Klf4、Klf5、Esrrb、Lin28、miR290クラスター、Ecat1、Dppa5、ERas、Ecat8、Gdf3、Dppa4、Dppa2、Sall4、Oct3/4、Utf1、Tcl1及びDppa3からなる群から選択される。かかる遺伝子産物の好ましい例は、その標的遺伝子が多能性の維持に関与する転写調節因子である。この群の好ましいメンバーは、Nanog、Sox1、Sox2、Sox3、Klf1、Klf2、Klf4、Klf5、Esrrb、Dppa4、Dppa2、Sall4、Oct3/4及びUtf1を含む。その選択がNanog、Klf4及び/又はSox2、より好ましくはNanog;Sox2;又はNanog及びSox2を含むことが好ましい。代替的には、Klf4が特に好ましい。細胞周期の進行を促進する遺伝子産物という用語は、細胞周期の相:G1/G0期、S期、G2期及びM期の1つの進行を促進する遺伝子を指すTheCell2ndeditionAMolecularApproachbyGeoffreyMCooperBostonUniversitySunderlandSinauerAssociates2000。好ましくは、かかる遺伝子は腫瘍抑制遺伝子p53、p21、pRB、p16Ink4a、p19ARF、p14ARF若しくはp27、又はコードされるタンパク質の少なくとも1つの不活性化を介して作用する遺伝子産物をコードする。好ましくは、細胞周期の進行を促進する上記遺伝子又は遺伝子産物は、直接的又は間接的に少なくとも1つのサイクリンを活性化するか、又はその抑制を阻害する。好ましい実施形態では、細胞周期の進行を促進する遺伝子は細胞起源又はウイルス起源である。細胞起源の細胞周期の進行を促進する遺伝子の好ましい例は、Fos、Jun、Myc、n-myc、h-ras、raf、k-ras、RhoA、Rac1、Rac2、Rac3、Myb、βカテニン、Lmo2、Mdm2、Pim1、Pim2、Yap1、Gli1、Gli2、Gli3、E2F1、E2F2、E2F3、サイクリンA、サイクリンb、サイクリンd、Suz12、Tbx2、Tbx3、Ezh2、Bmi1、Cbx7及びRexからなる群から選択され、上記選択は、好ましくはFos、Myc、RhoA、Myb、βカテニン、Lmo2、Yap1、Suz12、Ezh2、Bmi1、及び/又はRex、より好ましくはFos、Myc、及び/又はEzh2を含む。ウイルス起源の細胞周期の進行を促進する遺伝子の好ましい例は、E7、Core、E1a、E1b、E6、vGPCR、Sv40ラージT抗原からなる群から選択され、上記選択は、好ましくはE7、Core、E6及び/又はSv40ラージT抗原、より好ましくはE7及びcoreを含む。各々の場合において、言及されるタンパク質がウイルスタンパク質、例えばE7又はSv40ラージT抗原ではない限りは、指定の遺伝子それぞれの哺乳動物、より好ましくはヒト、類人猿又は齧歯動物のホモログを使用するのが好ましい。カテゴリーa、b及び/又はcによる遺伝子のそれぞれの能力を保持する指定の遺伝子の変異体が含まれ、それぞれの遺伝子によってコードされるタンパク質は、以下の表1に示されるそれぞれの遺伝子によってコードされるヒト、マウス又はウイルスのタンパク質と、少なくとも70、75、80、81、82、83、84、85、86、87、88、98、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99又は更には100のアミノ酸同一性を共有する。好ましくは、同一性のレベルをそれぞれの参照タンパク質の全長にわたって決定した。特に好ましい実施形態において、上記細胞周期の進行を促進する遺伝子又は遺伝子産物は、Fos、E7、Ezh2、及びMycからなる群から選択され、最も好ましくはMycであり、多能性の維持に関与する上記遺伝子又は遺伝子産物は、Nanog及びSox2からなる群から選択され、上記IdファミリーメンバーはId1、Id2、Id3、及びId4からなる群から選択される。別の実施形態において、Bcl-2、Bcl-Xl、HoxB4、Tlx1、vGPCR、HoxA9、Hoxb8、Stat3、ZFP217からなる群から選択される1つ又は複数の更なる遺伝子は上記細胞において発現され、上記選択は、好ましくはBcl-2、HoxA9、及び/又はZFP217を含む。特に、好ましい組合せは、aId1、Id2、Id3若しくはId4、好ましくはId2、bNanog、及びcEZH2;又はaId1、Id2、Id3若しくはId4、好ましくはId2、bNanog、及びcFos;aId1、Id2、Id3若しくはId4、好ましくはId2、bNanog、及びcMyc;aId1、Id2、Id3若しくはId4、好ましくはId2、bNanog、及びcE7;aId1、Id2、Id3若しくはId4、好ましくはId2、bSox2、及びcEZH2;又はaId1、Id2、Id3若しくはId4、好ましくはId2、bSox2、及びcFos;aId1、Id2、Id3若しくはId4、好ましくはId2、bSox2、及びcMyc;aId1、Id2、Id3若しくはId4、好ましくはId2、bSox2、及びcE7;aId1、Id2、Id3若しくはId4、好ましくはId2、bKlf4、及びcEZH2;又はaId1、Id2、Id3若しくはId4、好ましくはId2、bKlf4、及びcFos;aId1、Id2、Id3若しくはId4、好ましくはId2、bKlf4、及びcMyc;aId1、Id2、Id3若しくはId4、好ましくはId2、bKlf4、及びcE7を少なくとも含む。カテゴリーa、b及び/又はcの更に好ましい遺伝子組合せは、以下の遺伝子の組合せを含むか又はそれらからなる:iId2、Fos、TAg、Id3、E7、Bcl2、Core、Id1、Myc、Lmo2、Yap1、Nanog、Sox2、Ezh2、及びRex;iiId3、E7、Core、Id1、Myc、Lmo2、Yap1、Nanog、Ezh2、及びRex;iiicore、Id1、Lmo2、及びNanog;ivRhoA、及びEzh2;vId2、Fos、Id3、E7、core、Id1、及びMyc;viE7、及びMyc;viiMyb、E7、HoxA9、Core、及びMyc;viiId2、Fos、βcat、TAg、Id3、E7、E6、HoxA9、Bmi1、core、Klf4、Id1、Myc、Lmo2、及びNanogviiiSox2、RhoA、Ezh2、及びRex;ixId2、Fos、Id3、core、Klf4、Id1、Nanog、Ezh2、及びId4;xId2、Fos、及びId3;xiKlf4、Id1、Lmo2、Yap1、及びNanog;xiiSox2、Ezh2、Rex;xiiiId2、Fos、Myb、Id3、E7、Id1、Myc、Nanog、Ezh2、及びRex;xivFos、Id3、Bmi1、Yap1、及びNanog;xvId2、Fos、及びId3;xviSuz12、Id4、及びRex;xviiId2、Fos、βcat、TAg、E7、E6、Id1、及びMyc;xviiiId2、Fos、Id1、及びMyc;xixId2、Id1、及びMyc;xxId2、Fos、及びId1;xxiFos、Id1、及びMyc;xxiiId2、Fos、Myc;xxiiiId2、Fos、Myb、Id3、及びBcl2;xxivId2、Fos、Id3、HoxA9、Id1、Nanog、及びEzh2;xxvId1、Id3、Fos、Ezh2、及びNanog;xxviE7、HoxA9、Sox2、及びEzh2;xxviiId1、Id3、Fos、TAg、E7、HoxA9、Nanog、Sox2、及びEzh2;xxviiiTAg、Id3、E7、E6、Lmo2、Nanog、Ezh2、及びZFP217;xxxixId2、TAg、E7、及びMyc;xxxFos、βcat、TAg、E7、Id1、及びMyc;xxxiId2、Fos、TAg、E7、及びMyc;xxxiiId2、Fos、Id3、E7、core、Klf4、Id1、Lmo2、Nanog、Sox2、及びEzh2;xxxiiiFos、Nanog、及びEzh2;xxxivId2、Fos、TAg、Id3、core、Id1、Lmo2、及びNanog;xxxvId3、E7、Id1、Lmo2、Yap1、Nanog、及びEzh2;xxxviId2、Fos、Id1、及びEzh2;xxxviiId2、Fos、E7、core、Lmo2、及びNanog;xxxviiiId2、Fos、βcat、Id3、E7、Id1、Lmo2、及びEzh2;xxxixId2、E7、Nanog、及びEzh2;xlId2、Myb、Id3、E7、E6、Myc、Yap1、Nanog、及びEzh2;xliId2、Fos、Id3、E7、E6、core、Id1、Lmo2、Yap1、Nanog、Sox2、及びEzh2;xliiId2、Fos、E7、Id1、Lmo2、Yap1、Nanog、及びSox2;xliiiE7、E6、Bmi1、Id1、Myc、Lmo2、Yap1、Nanog、及びSox2;xlivId2、E7、Myc、Nanog、Sox2、及びEzh2;xlvId2、Fos、Id3、E7、E6、Bcl2、HoxA9、Bmi1、Klf4、Id1、Myc、Nanog、Sox2、Ezh2、及びGli1xlviFos、Id3、E7、Id1、Nanog、及びSox2xlviiId2、Fos、Id3、E7、HoxA9、Id1、Myc、Nanog、Sox2、Ezh2、及びGli1xlviiiId3、HoxA9、Myc、及びcorexlixMyb、Id3、core、及びMyclId3、Myc、Bcl2、Bmi1、及びHoxA9liPymT、Bcl2、Myc、Id3、及びHoxA9liiPymT、Myc、core、及びβcatliiiId1、及びMyclivId2、及びMyclvId3、及びMyclviId4、及びMyclviiβcat、及びMyclviiiβcat、及びPymT、Myclixβcat、及びMyc、Bmi1lxMyc、BcL2、及びβcatlxiMyc、HoxA9、及びID3lxiiβcat、及びMyclxiiicore、Myc、及びID3。lxivId3、core、Lmo2、及びEzh2lxvId3、E7、E6、Yap1、及びNanoglxviMyc、Klf4lxviiFos、E7、Klf4、Lmo2lxviiiTAg、Klf4lxixTAg、core、Klf4lxxId3、Klf4、Id4lxxiFos、E7、Klf4lxxiiFos、E7、Klf4、ID4lxxiiiTAg、corelxxivID2、ID3、corelxxvBcl2、core、Myc、RexlxxviId3、Bcl2、core、MyclxxviiTAg、Myb、ID3、core、MyclxxviiiID2、Bcl2、core、MyclxxixTAg、ID3、Bcl2、core、RexlxxxTAg、E6、Bcl2、core、ID4、RexlxxxiTAg、ID3、Bcl2、core、Myc、Rex所与の遺伝子又は遺伝子産物の機能的置換体とは、とりわけ所与の遺伝子又は遺伝子産物に拮抗する別の遺伝子又は遺伝子産物のノックダウン又はノックアウトを指す。遺伝子又は遺伝子産物のノックアウトは、当該技術分野で既知の好適な全ての方法、例えばジンクフィンガー法又は相同組換えによって達成することができる。遺伝子又は遺伝子産物のノックダウンは、例えばRNAi例えばsiRNA、shRNA又はアンチセンスオリゴヌクレオチド、miRNA法、モルホリノ、リボザイム及びタンパク質競合によって達成することができる。好ましくは、タンパク質競合は、所与の遺伝子若しくは遺伝子産物に拮抗する遺伝子若しくは遺伝子産物に特異的に結合する抗体を用いて、又は所与の遺伝子若しくは遺伝子産物に拮抗する遺伝子若しくは遺伝子産物のドミナントネガティブ突然変異体によって達成される。所与の遺伝子又は遺伝子産物の機能的置換体は、化学物質、例えばカテゴリーa、カテゴリーb若しくはカテゴリーcの1つに分類される遺伝子の活性化をもたらすか、又はカテゴリーa、カテゴリーb及び/又はカテゴリーcの所与の遺伝子若しくは遺伝子産物に拮抗する遺伝子若しくは遺伝子産物を阻害若しくは下方調節する低分子量分子の付加によっても達成することができる。形質導入細胞の選択を促進する遺伝子又は遺伝子産物は、細胞の生存及び/又は分裂に有害な環境における細胞の生存及び/又は分裂を促進するもの、又は細胞の同定及び/又は分離を促進するものであり得る。好ましくは、形質導入細胞の選択を促進する上記任意の遺伝子又は遺伝子産物は、抗生物質例えばクロラムフェニコール、ブラストサイジンS、ピューロマイシン、ヒスチジノール、ハイグロマイシンB、ネオマイシン、ゼオシン、ブレオマイシン、蛍光マーカー例えば緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、HcRed1のような長波長赤色蛍光タンパク質、表面マーカー例えば切断型CD34、低親和性神経成長因子受容体、及び遺伝的にコードされたタグ例えばビオチンタグ、halotag、snaptag、又は非蛍光性分子を蛍光性分子に変換する酵素例えばβ-ガラクトシダーゼからなる群から選択される。概して、上述の全ての遺伝子の発現は構成的、調節性及び/又は誘導性である。この発現は、例えば当該技術分野で既知の適切なプロモーターを用いて調節することができる。構成的発現については、ハウスキーピング遺伝子の既知のプロモーター、又は構成的ウイルスプロモーターが特に好適である。例としては構成的ウイルスCMV、SV40、RSV、MLV及びSFFVプロモーターが挙げられる。構成的哺乳動物プロモーターの例はPGKプロモーター、ユビキチンプロモーター及びEF1αプロモーターである。調節性プロモーター又は誘導性プロモーターそのうち数百種が同様に当業者に既知であるは、好ましくは物理的因子例えば光、温度等又は生物学的/化学的因子タンパク質、化合物等によって誘導される。例えば、調節性/誘導性発現については、転写調節系、例えばtet調節系をベースとする転写調節系を用いることができる。tet調節系は当該技術分野で既知であり、例えばCorbelSYetalに記載されている。典型的には、tet系に適切なリガンドとして分子テトラサイクリン又はドキソサイクリンが使用される。他の転写系としては、AIR系、エリスロマイシン系、PIP系、Rheoswitch系、クメート系、クーママイシン系、NICE系及びT-Rex系が挙げられるが、これらに限定されない。この調節アプローチの付加的な変形形態は、小分子の結合時の二量化及び/又は核内移行を媒介するドメインとの転写活性化因子の融合である。その例はラパマイシン調節系、ビオチンの融合、又は転写活性化因子とのステロイド結合ドメインの融合である。発現の調節のための他の系はDNA修飾酵素の使用に依存する。かかる状況では、発現カセットにそれぞれのDNA修飾酵素の認識部位が隣接する。かかる目的で使用することのできる酵素としては、例えばcreリコンビナーゼ、Flpリコンビナーゼ、Phi31インテグラーゼ、メガヌクレアーゼ又は改変ジンクフィンガーヌクレアーゼが挙げられる。発現を調節するための別の系は、小分子への結合を促進するドメインとのそれぞれの遺伝子の融合である。このアプローチの例はエストロゲン結合ドメインである。不死化遺伝子の機能を調節するための別の方法は組換えタンパク質の制御分解である。この状況では、不安定化ドメインを組換え遺伝子と融合させる。かかる構築物を哺乳動物細胞に導入した場合、遺伝子は発現するが、タンパク質は急速に分解される。また、不安定化ドメインを安定化させる小分子の付加は、それぞれの組換えタンパク質の安定化をもたらす。タンパク質レベルでのこの調節を可能にする幾つかの系が、例えばIwamotoetalChemBiol2010Sep24179818andBanaszynskietalCell2006Sep81269951004に記載されている。調節性又は誘導性の遺伝子発現は、本発明の方法の上述した任意の工程iiiに特に有用である。遺伝子発現は細胞型特異的であってもよく、これは細胞型特異的なプロモーター若しくは細胞型特異的なエンハンサー、又はプロモーター及びエンハンサーの両方の組合せ、例えば心筋細胞のαMHCプロモーター若しくはMyh6プロモーター、内皮細胞のtie2プロモーター若しくはICAM2プロモーター、樹状細胞のCD11cプロモーター、肝細胞のアルブミンプロモーター若しくはα1アンチトリプシンプロモーター若しくはαフェトプロテインプロモーター、腸上皮細胞のvilinプロモーター若しくはサイトケラチン18プロモーター、神経細胞のtauプロモーター若しくはネスチンプロモーター、又は膵β細胞のインスリンプロモーターによって達成することができる。好ましい実施形態では、上記遺伝子、遺伝子産物又は機能的等価物は、i工程の有限寿命の細胞のサブセットのみで供給され、及び/又はii上記細胞のサブセットのみで発現される。ここで、上記遺伝子、遺伝子産物又は機能的等価物を供給する細胞のサブセットは、同じものが発現又は産生される細胞のサブセットよりも大きくてもよい。この実施形態の利点の1つは、例えば細胞数が少な過ぎるために他の細胞から分離されておらず、及び/又は分離可能でない特定の正:particular細胞型を不死化することができることである。このタイプの細胞は他の細胞に物理的に接着しているか分離が不便、困難又は不可能となる、又は既知の細胞分離手段が細胞に到達しにくい。この実施形態の根底にある原理は、1つ又は複数の他の細胞型のうち1つの細胞型が他の細胞よりも速く分裂し、したがって上記他の細胞を打ち負かすかoutcompetes、又は上記他の細胞より成長し、不死化の前には不便、困難又は不可能であった可能性がある、その単離が促進される。本発明は、細胞アッセイ、例えば化合物に対する細胞の応答の試験、3d細胞培養モデルの確立、組織工学、1つ若しくは複数の異なる細胞株の細胞を用いた共培養、及び/又は細胞カプセル化、すなわちi免疫抑制を要することなく移植同種移植又は異種移植を可能にし得る、又はii例えば急性肝不全に応答した解毒を可能にする、又はiii糖尿病のような疾患における代謝を可能にする人工半透膜による免疫拒絶からの移植細胞の保護のための本発明の細胞若しくは細胞株、又はベクター若しくはベクターセットの使用に更に関する。本発明は、変性疾患、臓器若しくは細胞の損傷/機能不全例えば筋萎縮性側索硬化症ALS、アルツハイマー病、パーキンソン病、多系統萎縮症、ニューマンピック病、アテローム性動脈硬化症、進行性核上麻痺、がん、テイサックス病、糖尿病、心疾患、円錐角膜、炎症性腸疾患IBD、前立腺炎、変形性関節症、骨粗鬆症、関節リウマチ、ハンチントン病、肝硬変正:LiverCirrhosis、加齢性黄斑変性症、急性肝不全、認知症、脳卒中、慢性閉塞性肺疾患COPD、骨損傷、貧血、喘息、高血圧、癲癇、慢性疼痛、炎症性疾患例えばB型肝炎、C型肝炎、HIV、インフルエンザ、免疫系に関連する病態例えば移植片対宿主反応、アレルギー、全身性エリテマトーデス、敗血症、多発性硬化症、乾癬、がん、心理的病態例えばトラウマ、うつ病、統合失調症、又は肥満の治療又は予防に使用される本発明の細胞若しくは細胞株、又はベクター若しくはベクターセットにも関する。以下の例は例示のみを目的とし、上記の本発明を何ら限定するものではない。実施例1:不死化遺伝子の同定本発明の技術の目的は、生物学的に関連した哺乳動物細胞を無制限な数で提供することである。現行の細胞株確立プロセスの制限を解決するために、哺乳動物細胞の不死化を誘導することのできる33個の異なる遺伝子を同定した。この遺伝子セットには、ウイルスがん遺伝子、哺乳動物がん遺伝子、腫瘍細胞において過剰発現される遺伝子、及び分化を阻害する遺伝子が含まれる。採用した不死化遺伝子を表1に挙げる。表1には本明細書で使用される略語を示す。加えて、NCBIデータベースから引用した正式な遺伝子名、遺伝子ID及び遺伝子記号、並びに遺伝子が由来する種/生物を記載する。採用した細胞遺伝子はヒト又はマウスのいずれかに由来するものであった。しかしながら、他の種に由来するホモログも本発明に使用することができる。表1採用した遺伝子の概要C型肝炎正:Hepatitisウイルスのコアタンパク質については、遺伝子Idは存在しない。HCVコアタンパク質は複数の遺伝子からなるmRNAから切断され、採用される遺伝子は、NCBI参照配列NP_751919.1に相当する。実施例2:初代細胞における不死化遺伝子の組換え発現初代細胞の不死化を達成するためには、初代哺乳動物細胞において不死化遺伝子を組換え発現しなくてはならない。この目的で、不死化遺伝子の組換え発現を可能にする任意の遺伝子又はタンパク質の形質導入法を用いることができる。さらに、不死化遺伝子の発現を誘導することが可能な任意の遺伝子発現カセット宿主細胞ゲノムに組み込まれるか否かを問わないを用いることができる。以下の実施例では、初代細胞に形質導入するためにレンチウイルス粒子を使用し、不死化遺伝子の発現を駆動するためにSV40プロモーターを使用した。使用したレンチウイルスベクターは第三世代自己不活性化レンチウイルスベクターである。続いてこれらのレンチウイルスプラスミドにおいてウイルス配列を減少させた。このベクター生成では、アクセサリー遺伝子vpr、nev、rev及びgag/polを欠失させるだけでなく、ウイルスプロモーター/エンハンサー配列が欠失するようにウイルスLTRを修飾する。さらに、5’LTRには、wtHIVプロモーターの代わりにRSVプロモーターが含まれる。力価を増大させるために、付加的なエレメント1中央ポリプリントラクトcppt及び2B型肝炎ウイルスに由来する翻訳後調節エレメントPREをレンチウイルスベクターに組み入れた。これらのエレメントは発現カセットの5’側cppt及び3’側PREに配置された。発現カセットは、SV40プロモーターと、単独選択カセットを有しない又は選択マーカーネオマイシンとの組合せ選択カセットを有するでの不死化遺伝子複数の場合もありとを含むものであった。後者の場合、ネオマイシンの転写が内部リボソーム侵入部位Polio-IRESを介して開始した。発現カセットの3’側にB型肝炎ウイルス転写後調節エレメントPREが位置する。使用した種々のベクター構成の概略図を図1に示す。以下の遺伝子を、選択カセットを用いずに形質導入した:PymT;HoxA9;Bmi1;Id3;Myb;core;Klf4;Oct3/4;Rex1;Bcl2。以下の遺伝子を、選択カセットを用いて形質導入した:Myc;β-cat;Id1;TAg;Fos;E2f1;Jun;Ns1;Sox2;Id2;Lmo2;Nanog;Nfe2l2;Yap1;E7;E6;Gli1;Suz12;Ezh2;Zfp217;RhoA;v-Myc;Id4。肝細胞特異的アルブミンプロモーターをコードする発現カセットを、同様に自己不活性化レンチウイルス骨格に組み込んだ。この発現カセットはマウスアルブミンエンハンサー及びプロモーター領域と、続いてレポーター遺伝子である高感度緑色蛍光タンパク質と、ウッドチャック肝炎ウイルスに由来する翻訳後調節エレメントWPREとからなる。ウイルス粒子の産生のために、4つの異なるプラスミドのリン酸カルシウム沈殿をベースとする一過性トランスフェクションプロトコルを使用した。レンチウイルス粒子の産生は、ViraPower商標LentiviralExpressionSystemInvitrogenのレンチウイルスヘルパープラスミドを用いて、HEK293T細胞において行った。トランスフェクションの前日に、HEK293T細胞を1cm2当たり約20000細胞の細胞密度でプレーティングした。リン酸カルシウム沈殿のために、ヘルパー機能をコードする4つのプラスミドgag/polpLP1、revpLP2及びVSVgpVSVg表面タンパク質を、運搬プラスミド上述の発現構築物のリストを参照されたいの1つとともに混合した。面積140cm2の培養皿のトランスフェクションのために、以下の量の種々のプラスミドを使用した:14μgのpLP1gag/pol、4.6μgのpLP2rev;7.8μgのpLP/VSVgVSVg、20μgの運搬プラスミド不死化遺伝子を保有する発現構築物又はアルブミンレポーター構築物。種々のプラスミドを500μlの250mMCaCl2溶液に再懸濁した後、この混合物を500μlのHEBS溶液に連続ボルテックス下で滴加し、その後室温で10分間維持して沈殿させた。この懸濁液をHEK293T細胞の培養培地に添加した。翌日、培地を吸引し、15mlの新鮮培地を添加した。24時間後、レンチウイルス粒子を含有する上清を回収した。2回目の産生のために、再び15mlの新鮮培地を産生細胞に添加し、24時間後にレンチウイルス粒子を含有する上清を回収した。レンチウイルス含有上清を0.45μmのフィルターで濾過して細胞残屑を除去し、使用時まで-70°Cで保管した。それぞれのレンチウイルスの力価をNiH3T3細胞を用いて評価した。12ウェルプレートで滴定を行った。この目的で、50000個の細胞を感染前日にプレーティングした。感染当日に培地を吸引し、ウイルス含有上清を細胞に12時間添加した。総感染容量は400μlであり、4つの異なる濃度のウイルス含有上清を使用した1μl、4μl、40μl、400μl。加えて、ポリブレンを感染に8μg/mlの最終濃度で添加した。発現構築物に応じて、感染したNiH3T3細胞をG418耐性選択カセットを有する、又はPCRによって形質導入/組込み選択カセットを有しないについて滴定した。G418耐性についての滴定は、感染の2日後に1mg/mlのG418を含有する培地を用いて開始した。2週間の選択後、細胞のコンフルエンシーをスコアリングした。更なる実験では、コンフルエントなプレートを生じたウイルスストックのみを400μl、40μl及び4μlのHEK293細胞培養上清の希釈液で使用した。選択カセットを有しない発現構築物の形質導入/組込みについての滴定は、感染したNiH3T3細胞のゲノムDNAのPCRによって行った。この目的で、感染したNiH3T3細胞のゲノムDNAを感染の2日後に単離し、PCRによって不死化遺伝子の組込みについてアッセイした。DNA単離及びPCRの詳細については下記に示す。更なる実験では、不死化遺伝子の組込みを示したウイルスストックのみをHEK293細胞培養上清の1μlの希釈液で使用した。哺乳動物細胞系の確立のために、種々の不死化遺伝子を保有するレンチウイルスを混合した。この目的で、十分な力価を有するウイルスストックを予混合した。これらのマスターミックスを使用時まで-70°C、1mlアリコートで保管した。特に他に指定のない限り、以下のマスターミックスを調製し、感染のために使用した:All-全ての不死化遺伝子表1に挙げられるを含めた;MBG-TAg、E6、E7及びMycを除く全ての不死化遺伝子表1に挙げられる;1~10-Id2、Fos、NS1、Jun、E2F1、βCat、Myb、Id3、Bcl2、HoxA9;11~20-Bmi1、PymT、Core、Oct3、Klf4、Id1、Lmo2、Nfe2L2、Yap1、Nanog;21~29-Sox2、RhoA、Ezh2、Gli1、v-Myc、Suz12、ZFP217、Id4、Rex。実施例3:哺乳動物細胞系の確立記載の技術はドナーの種、細胞型、遺伝子型、又はドナーの年齢とは独立して新規の哺乳動物細胞株の確立を可能にする。この目的で、対象の初代細胞に33個の不死化遺伝子の全セット、又は好適な不死化遺伝子のより小さなサブセットを形質導入することができる。以下の実施例では、この技術の有用性を種々の種マウス、ウシ、ヒト、種々の細胞型線維芽細胞、骨髄間質細胞、マクロファージ、内皮細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、ケラチノサイト、肺上皮細胞、角膜上皮細胞、肝細胞、種々の遺伝子型線維芽細胞、骨髄間質細胞、並びに幼体ヒト臍帯内皮細胞及びケラチノサイト及び成体ヒト成体ケラチノサイト、ヒト成体微小血管内皮細胞に由来する新規の哺乳動物細胞株の確立によって証明した。しかしながら、本発明の技術は言及した例に限定されず、任意の細胞型及び任意の哺乳動物種の細胞に適用することができる。また、試験したものと同等の機能を有する種々の遺伝子を使用することができる。全ての初代細胞又は初代細胞株は5CO2の湿潤雰囲気下、37°Cで維持した。以下の初代細胞型を不死化手順に使用した:初代ヒト包皮線維芽細胞FS4GuptaetalProcNatlAcadSciUSA1979Oct76481721及びhDP単離についてはMujajSetalTissueEngPartA2010Apr16140720に詳述されている;ヒト成体皮膚線維芽細胞PromocellGmbH;MxLuc2bacトランスジェニックマウス成体耳線維芽細胞PulvereretalJVirol2010Sep84862638;単離についてはMayetal2005Oct1712099110に詳述されている;ヒト臍帯静脈内皮細胞HUVEC、ProVitroGmbH製、ヒト皮膚微小血管内皮細胞HMVEC、ProVitroGmbH製;ヒト表皮成体ケラチノサイトProVitroGmbH製及びヒト包皮ケラチノサイト単離についてはAasenandBelmonteNatProtoc2010537182に記載されている;ウシマクロファージ単離についてはWerlingetalImmunology2004Jan1114152に記載されている;成体ヒト骨芽細胞単離についてはHernandezetalArthritisRheum2008Jun581696700に詳述されている;成体ヒト軟骨細胞単離についてはFayetalArthritisResTher20068R189に詳述されている;成体ヒト肺上皮細胞単離についてはElbertetal1999PharmRes1999May166018に詳述されている、成体ヒト骨髄間質細胞単離についてはZhangetalAnnHematol1999Jul7830514に詳述されている、角膜上皮細胞CellSystemsGmbH製、成体マウス肝細胞単離についてはHaridassetalAmJPathol2009Oct175148392に詳述されている。線維芽細胞、骨髄間質細胞、ウシマクロファージ及び骨芽細胞は10ウシ胎仔血清、2mMグルタミン、0.1mM非必須アミノ酸、0.1mMβ-メルカプトエタノール及び100Uのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシンを添加したIMDM中で培養した。肝細胞は10ウシ胎仔血清、2mMグルタミン、100Uのペニシリン及び100μg/mlのストレプトマイシンを添加したDMEM基本培地中で培養した。軟骨細胞及び角膜上皮細胞は、HamF12とDMEM基本培地との1対1混合物中で培養した。この混合物には10のウシ胎仔血清、2mMグルタミン、0.1mM非必須アミノ酸、0.1mMβ-メルカプトエタノール及び100Uのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシンを添加した。成人肺上皮細胞は、SAGMSingleQuotKitLonzaを添加したSABM基本培地中で培養した。ケラチノサイトは、DermaLife商標基本培地と添加物LifeFactorsK、CellSystemsGmbHとを含むDermaLifeKCellCultureMediumKit中で培養した。HUVECは、EGM-MVsinglequotsLonzaを添加した内皮細胞基本培地EBMLonza中で培養した。HMVECは、EGM-2MVsinglequotsLonzaを添加した内皮細胞基本培地EBM-2Lonza中で培養した。内皮細胞は、ゼラチンコート組織培養フラスコ内で培養した。この目的で、細胞培養プレートを37°Cで30分間、0.1HUVEC又は1HMVECのゼラチン溶液で被覆した。ゼラチンを吸引し、内皮細胞をプレーティングした。ケラチノサイトは通常の組織培養フラスコ、又はコラーゲンIでコーティングしたフラスコ内で培養した。不死化のために、初代細胞を6ウェルプレートに播種し、それぞれのウイルスの組合せに感染させたマスターミックス又は規定の感染。細胞を感染当日に80コンフルエンシーに達するまでプレーティングした。感染のために、培養培地を吸引し、1mlのレンチウイルスマスターミックス及び200μlのそれぞれの培養培地を細胞に添加した。10個未満の不死化遺伝子による感染の場合、100μlの各々のレンチウイルスストックを使用し、感染容量はそれぞれの培養培地を用いて1mlに設定した。肝細胞の場合、感染混合物は、500μlのレンチウイルス不死化マスターミックス及び500μlのアルブミンeGFPレポーターレンチウイルス、並びに200μlの培養培地からなるものであった。全ての感染について、ポリブレンを8μg/mlという最終濃度で添加した。初代細胞を湿潤雰囲気、37°Cで8時間~12時間感染させた。いずれの場合も、初代細胞が死crisisに陥る時点を決定するために非感染対照を加えた。細胞株の確立のために以下の2つの戦略を使用した。感染した細胞を0.4mg/mlのG418を用いて選択するか、又は不死化遺伝子の発現によるそれらの成長利点について選択した。FS4細胞について両方の戦略を比較したが、確立された細胞株の増殖パターン及び組み込まれた不死化遺伝子のパターンに関して同様の結果が得られた。したがって、初代細胞が確実に増殖すると判断される場合例えば線維芽細胞、内皮細胞には選択戦略を適用したが、初代細胞が増殖しないか、又は僅かにしか増殖しない場合例えば角膜上皮細胞、成体皮膚ケラチノサイトには選択圧を加えなかった。細胞株の確立のために、G418耐性又は増殖利点とは独立して、コロニーをプールし、更に増加させた。細胞株の確立のために、細胞をコンフルエンシーに達するまで継代した。不死化プロセスの開始時に、細胞を1対3の比率で分割した。細胞が確実な増殖挙動を取った後プレーティング後3日以内にコンフルエンシーに達したことを意味する、分割比を細胞型に応じて1対5又は1対10に調整した。種々のヒト初代細胞の不死化の結果を図2に示す。指定のヒト初代細胞を感染させ、増加させた。幾つかの確立された細胞株の累積集団倍加数を示す。実施例4:不死化に関与する遺伝子の同定次の工程では、初代細胞の不死化に関与する遺伝子を同定した。この目的で、不死化細胞株のゲノム中に存在する遺伝子を検出するPCR戦略を開発した。不死化遺伝子又はより良好には遺伝子の組合せが感染細胞に与えられるという選択的利点のために、ゲノムDNAを単離する前に長い増加期間を選択した30を超える累積集団倍加数。これにより、検出される遺伝子が実際に不死化に関与することが確実となるはずである。ゲノムDNAを以下の手順で単離した。細胞をPBSで2回洗浄し、1ウェル当たり500μl6ウェルの溶解バッファー10mMTrispH7.5、10mMEDTA、10mMNaCl、0.5ドデシル硫酸ナトリウム、及び1mg/mlのプロテイナーゼK新たに添加を添加した。溶解した細胞を1.5ml容プラスチックチューブに移し、60°Cで一晩インキュベートした。翌日、75mM酢酸ナトリウムエタノール中を添加した1ml。チューブを室温で2時間インキュベートした後、ゲノムDNAペレットが見えるように、ゆっくりと転倒させた。次いで、DNA溶液を5000rpmで5分間、卓上遠心分離機で遠心分離した。その後上清を捨て、ペレットを70エタノールで2回洗浄した。最後の洗浄の後、ペレットを乾燥させ、30μl~50μlのTE10mMTrispH7.5、10mMEDTA、又は代替的にはH2Oに溶解し、4°Cで保管した。不死化遺伝子を検出するPCR戦略の概略図を図1に示す。両方のプライマーが、レンチウイルスカセットによって形質導入される発現カセット内に結合する。5’プライマーはSV40プロモーター内に配置され、3’プライマーはそれぞれの不死化遺伝子に特異的である表2。表2:不死化遺伝子の検出に使用されるプライマーのリストPCRは、Mango-TaqPolymeraseKitBiolineを用いて行った。アニーリング温度は58°C、伸長時間は30秒間とした。PCRに続いて、94°Cで1分間の変性工程30サイクル反復するを行った。鋳型として、感染細胞のゲノムDNAを0.1μg使用した。各遺伝子を別個のPCRで分析した。PCRを1アガロースゲルで分析し、遺伝子を非存在又は存在としてスコアリングした。これらの分析の結果を、ヒートマップにまとめた図3。この不死化のヒートマップでは、指定の細胞型の不死化をもたらした感染を示す。縦列は感染に使用した遺伝子を示す。永久細胞株が確立された後にゲノムDNAを単離した感染後に少なくとも30という集団倍加数。PCR分析を用いて、不死化細胞株に組み込まれる遺伝子を決定した。不死化のデジタルマップを作成するために、検出された遺伝子を1と表示し、存在しない遺伝子を0に指定する。灰色の欄は、それぞれの感染に使用しなかった遺伝子を表す。種々の細胞型、様々な種に由来する細胞、種々のドナーに由来する細胞、並びに幼若細胞及び成体細胞をこの分析に用いた図3。線維芽細胞株をマウス及びヒト起源から確立した。ヒト細胞については、包皮線維芽細胞幼若及び皮膚線維芽細胞成体を使用した。加えて、2人の異なるドナーd1及びd2に由来する包皮線維芽細胞を使用した。ヒト内皮細胞株をヒト臍帯静脈内皮細胞内皮細胞-幼若及びヒト微小血管内皮細胞endo細胞-成体から確立した。加えて、ヒト角膜上皮細胞cor、成体ad及び幼若包皮由来のヒトケラチノサイトヒトkera、5人の異なるドナーに由来するヒト骨髄間質細胞stro、ヒト肺上皮細胞肺、ウシマクロファージma、ヒト骨芽細胞ヒトost及びヒト軟骨細胞chondroを確立した。ヒートマップの結果から、それぞれの遺伝子の頻度を算出した。これは種々の不死化遺伝子をランク付けるために行った。この目的で、遺伝子が使用された感染の数を検出数で除算した。このランク付けを全ての細胞型について行い、また別個に線維芽細胞の感染のみについても行った。0.5以上の頻度を示す遺伝子をストライプで強調する表3。表3:確立された細胞株における遺伝子の頻度1inf.=感染;2det.=検出された;3fre.=頻度ランク付けによって、i新規の哺乳動物細胞株の確立に特に好適な遺伝子セットこれらの遺伝子はId2;Fos、βcat;TAg、Myb;Id3;E7;E6;Bcl2;HoxA9;Bmi1;core;Klf4;Id1;Myc;Lmo2;Yap1;Nanog;Sox2;RhoA;Ezh2;Gli1;Suz12;ZFP217、Id4;Rexであり、中でも、aId1、Id2及びId3はId遺伝子ファミリー正:familyメンバーであり、bNanog、Sox2及びKlf4は多能性の維持に関与する遺伝子であり、cE7、Fos、Myc、βcat、RhoA、Myb、Core、Lmo2、E6、Sv40ラージT抗原、Yap1、Gli1、Suz12、Ezh2、Bmi1及びRexは細胞周期の進行を促進する遺伝子であり、これらの遺伝子を同じカテゴリーの他の遺伝子すなわち、これらのリストに挙げられていないもの、例えば他の種に由来するホモログ、又は同じ遺伝子ファミリーに由来する他の遺伝子に置き換えることができると考えるのは妥当である;ii0.5以上の頻度を示し、したがって感染の50超で不死化に関与する不死化遺伝子のコアセットが同定される。重要なことには、この遺伝子のコアセットは細胞型に応じて変化し得る。これは、線維芽細胞及び肝細胞の不死化のランク付けを全ての不死化と比較することで明らかである。この遺伝子のコアセットは、Id2;Fos;TAg;Id3;E7;core;Id1;Myc;Lmo2;Nanog;Ezh2;Rexである。この技術の重要な特徴は、その優れた効率である。種々の初代細胞から確立された全ての細胞株は最初の試行で、1回の感染サイクルのみによって確立された。それぞれの細胞株の生成に必要とされる時間が細胞型に依存することに留意することが重要である。データから、より幼若な細胞例えばHUVEC又はより大きい固有の増殖能を有する細胞例えば骨芽細胞、線維芽細胞が、60日以内に30という累積集団倍加数に達するのに対し、成体の個体から単離された細胞例えばHMVEC又は高度に分化した細胞例えば角膜上皮細胞が、30という累積集団倍加数に達するのにより長い期間約80日間~90日間を必要とすると結論付けることができる表4。表4:新規の細胞株の生成に必要とされる時間マウス成体耳線維芽細胞は、累積PDL30まで増加しなかった。それらは、それぞれの模擬感染対照が5継代後に約10という累積PDLで増殖を停止し、感染したMAEFが累積PDL25まで確実な増殖を示したために不死であると判断された別の重要な態様は、それぞれの細胞株を不死化する遺伝子の単一の可能な組合せだけでなく、様々な異なる組合せが初代細胞の不死化について同定されたことである。これらの組合せの幾つかの例を表5に挙げる。表5:不死化をもたらす遺伝子の組合せ原則として、細胞の不死化に好適な遺伝子の組合せは、各々大半がId遺伝子ファミリーメンバー、多能性の維持に関与する遺伝子及び細胞周期の進行を促進する遺伝子を含むことが表5から明らかである。したがって、或る特定の個々の遺伝子ではなく、これらのカテゴリーの遺伝子が細胞の不死化に必要とされることが予測される。したがって、遺伝子は同じカテゴリーの他の遺伝子と置き換えることが可能である。Id遺伝子ファミリーの好適な遺伝子は、Id1、Id2、Id3、及びId4であり、多能性の維持に関与する好適な遺伝子は、Nanog、Sox1、Sox2、Sox3、Klf1、Klf2、Klf4、Klf5、Esrrb、Lin28、miR290クラスター、Ecat1、Dppa5、ERas、Ecat8、Gdf3、Dppa4、Dppa2、Sall4、Oct3/4、Utf1、Tcl1、Dppa3であり、細胞周期の進行を促進する好適な遺伝子は、E7、Fos、Jun、Myc、n-myc、h-ras、raf、k-ras、RhoA、Rac1、Rac2、Rac3、Myb、βカテニン、Core、Lmo2、E1a、E1b、E6、Sv40ラージT抗原、Mdm2、Pim1、Pim2、Yap1、Gli1、Gli2、Gli3、E2F1、E2F2、E2F3、サイクリンA、サイクリンb、サイクリンd、Suz12、Tbx2、Tbx3、Ezh2、Bmi1、Cbx7及びRexである。これらのカテゴリーのいずれにも分類されない不死化に有用な遺伝子は、Bcl-2、Bcl-Xl、HoxB4、Tlx1、vGPCR、HoxA9、Hoxb8、Stat3、ZFP217である。これらの遺伝子を用いて、遺伝子カテゴリーの上述の組合せを補完することができる。この技術の特徴は、デザイナー細胞株を確立するために使用することができる。これは不死化遺伝子の全組合せが、それぞれの細胞株に僅かに異なる特性を与えるためである。この特徴を用いて、例えば特別な表面コーティングでの増殖に最適化された、又は特別な培養培地中での増殖に最適化された細胞株を確立することができる。内皮細胞について、記載の技術のこの特徴を、遺伝子の組合せを同定し、それにより内皮細胞の全ての機能及び特徴を保持する細胞株を同定するために使用したデータについては図6、図7、図8を参照されたい。それぞれの遺伝子を同定するために、この技術を用いて1回目の感染で不死化をもたらす遺伝子を同定した。2回目の感染では、これらの遺伝子又は遺伝子のサブセットを不死化に使用した。重要なことには、得られた細胞株をそれらの内皮特異的な機能及び特徴に関して分析した。最も有望な細胞株から、不死化遺伝子の組合せを、HUVECを再度不死化する3回目の感染に使用した不死化遺伝子の種々の組合せの概要については図4を参照されたい。この感染の段階の全ての組合せが所望の特性を示し、その例を図6、図7及び図8に示す。実施例5:確立された細胞株の生物学的関連性の決定細胞株の最も重要な特性はその生理であり、細胞がinvivoで示すその生理に可能な限り厳密に似るべきである。したがって、確立された細胞株をそれらの生物学的関連性について試験した。不死化が多くの場合、細胞シグナル伝達経路を妨げることが知られている。一例として、インターフェロンシグナル伝達を調査した。種々のインターフェロンα又はインターフェロンβのようなI型インターフェロンは、ウイルス、細菌又は寄生生物のような病原体に応答して誘導される分泌タンパク質である。I型インターフェロンは、自己分泌的に分泌細胞に対する又は周囲分泌的に隣接細胞に対する作用する。インターフェロンはインターフェロン受容体に結合し、Stat1/Stat2及びIRF9からなる三量体複合体による下流シグナル伝達を誘導する。この複合体は核内に移行してインターフェロン誘導性遺伝子のプロモーターに結合し、それによりそれらの発現を活性化する。これまでに、およそ2000個のインターフェロン誘導性遺伝子が同定されている。十分に特性化されているインターフェロン誘導性遺伝子はMX2遺伝子である。したがって、インターフェロンシグナル伝達の活性化は、レポーター遺伝子ルシフェラーゼの発現を駆動するMx2-プロモーターからなるレポーター系を用いて、間接的に測定することができる。かかる遺伝子レポーター構築物を利用してレポーターマウスを生成した。このマウスはインターフェロン、また種々のウイルスに応答してルシフェラーゼレポーター遺伝子の強い誘導を示す。重要なことには、誘導因子の非存在下でのレポータータンパク質の発現は、ほとんど検出可能ではないPulvereretal2010JVirol2010Sep84862638。初代細胞をこのマウスから単離し、インターフェロンを用いて及び用いずに処理した場合に、同じ誘導プロファイルが観察される。しかしながら、これらの初代細胞に由来する細胞株を、SV40ラージT抗原を用いた不死化のような従来の方法によって確立する場合、発現特徴は強く影響を受ける図5。SV40ラージT抗原を用いて不死化した細胞株は、誘導因子インターフェロンの非存在下でレポータールシフェラーゼのより高い基本的発現を示す。インターフェロンを添加すると、ルシフェラーゼの発現は増大する。しかしながら、誘導係数は初代細胞と比較してはるかに小さい図5。このことは、従来の不死化がインターフェロンシグナル伝達を強く妨げることを証明している。したがって、invivo状況と同等の特性を示す新規の細胞株を確立するために、本明細書に記載の技術を適用した。生成した種々の細胞株を、インターフェロンの存在下及び非存在下でのレポーター遺伝子ルシフェラーゼの発現について試験した。インターフェロン処理時に強く誘導可能なルシフェラーゼ発現がインターフェロンの非存在下で低いことを特徴とする、invivo状況と同様のインターフェロン系の誘導特徴を示す幾つかの細胞株が確立された図5。種々の細胞株及び初代細胞の誘導係数の比較によって、インターフェロンシグナル伝達が従来の不死化Sv40ラージT抗原を用いるによって確立された細胞株では変化するが、初代細胞及び本明細書に記載の技術を用いて生成した細胞株では影響を受けないことが実証される図5。内皮細胞は血管の内側を覆うline特殊化細胞である。内皮細胞は、表面マーカーCD31、CD309、Tie1又はTie2のようなマーカータンパク質を利用して包括的に特性化することができる。本明細書に記載の技術を用いて確立された内皮細胞株を、これらのマーカーの発現について分析した。この分析では、確立された細胞株がそれぞれのマーカーの同様の発現パターンを示すか否かを決定するために初代細胞も含めた図6。結果から、確立された内皮細胞株が初代細胞、すなわちinvivo状況と同様であることが実証される。内皮細胞の機能には、血圧、血液凝固及び炎症過程の制御がある。これは主に、物質、小分子、細菌、また免疫細胞の通過を制限するそれらのバリア機能によって媒介される。感染又は炎症の部位から、内皮を活性化するTNF-αのような炎症性サイトカインが分泌される。この活性化は或る特定の表面分子の上方調節につながり、免疫細胞の結合、最終的には内皮細胞層を通る免疫細胞の移動を促進する。このプロセスに関与する表面分子は、CD54ICAM1、CD62EE-セレクチン及びCD106VCAMである。したがって、確立された内皮細胞株を、これらの表面分子の発現についてTNF-αの非存在下及び存在下で分析した。比較として、初代細胞をこの分析に含めた。この分析から、炎症性サイトカインの非存在下では表面分子はほとんど検出不可能であり、TNF-αによる刺激がそれぞれの表面分子の増加をもたらすことが明らかとなった図7。初代細胞から得られた結果と、確立された細胞株から得られた結果とを比較することによって、全細胞集団がTNF-αに対して一様に反応することではなく、内皮細胞のサブセットが活性化されることから、両方の細胞系が同様に振る舞うことが明らかとなる図7。また、血管形成と呼ばれるプロセスである新たな血管の発生、二次メッセンジャーである一酸化窒素の産生、又はアセチル化低比重リポタンパク質の取込みのような内皮細胞の他の機能を、invitroアッセイによって決定することができる。これらのアッセイを、確立された内皮細胞株及び初代細胞に対して行った。種々のアッセイから、確立された内皮細胞株が正常な内皮の全ての機能を保持することが実証される図8。表面マーカーの分析のために、内皮細胞をトリプシン/EDTAによって解離させた後、特異的内皮細胞マーカー:CD31;Tie1;Tie2;CD309;CD54;CD62e;CD106に対するモノクローナル抗体とともにインキュベートした。細胞をPBS中の2ウシ胎仔血清中、室温で30分間、蛍光標識した初代抗体CD31、CD309、CD54;CD62e、CD106とともにインキュベートした。抗体の濃度はメーカーの使用説明書に従って使用した。非標識初代抗体Tie1、Tie2については、細胞を最初のインキュベーション室温で30分間後にPBSで洗浄し、続いて蛍光標識した二次抗体とともに室温で30分間、再度インキュベートした。その後、細胞をPBS中の2ウシ胎仔血清で洗浄し、遠心分離し、最後に細胞ペレットをPBS中の2ウシ胎仔血清に再懸濁し、フローサイトメトリーによって分析した。acLDLの取込みのために、細胞を37°Cで4時間、4μg/mlのacLDLBodipyFITCMolecularProbesで標識したとともに培養した。インキュベーション後、細胞をPBSで2回洗浄し、トリプシン/EDTAによって解離させ、遠心分離した。細胞ペレットを再懸濁し、フローサイトメトリーによって分析した。eNos合成酵素の活性の決定のために、細胞を室温で30分間、DAF-2DA1μMとともにインキュベートした。その後、細胞をPBSで2回洗浄し、トリプシン/EDTAによって解離させ、遠心分離した。細胞ペレットを再懸濁し、フローサイトメトリーによって分析した。フローサイトメトリーによる分析については、SSC/FSCドットブロットを適用して細胞残屑FSC<200を排除した。残りのゲート細胞gatedcellsをそれぞれの蛍光シグナルについて分析し、ヒストグラムとしてプロットした。標準的なマトリゲルアッセイによってinvitro血管形成をモニタリングした。マトリゲルは、主成分がラミニンであるEngelbert-Holm-Swarm腫瘍細胞のマトリックスに富んだ産物である。マトリゲルアッセイのために、96ウェルを37°Cで30分間、マトリゲルでコーティングした。1ウェル当たり4×104個の細胞を播種し、一晩培養した。管構造形成を顕微分析によって評価した。初代細胞は種々の細胞型からなる組織から単離される。そのため、新たに単離された初代細胞の培養物は細胞型に関して不均一であることが非常に多い。特定の細胞型の不死化が望まれる場合、かかる細胞型混合物は不死化を困難とする。これは、異なる細胞型が異なる増殖能を有するという事実に起因する。加えて、不死化及び形質導入の効率は異なる細胞型間で大きく異なる。そのため、組織から直接単離した初代細胞に対して行われる不死化によって、形質導入が容易であり、最も強い増殖を示す細胞起源に由来する細胞株が選択的に確立される。ほとんどの組織で、この細胞型は線維芽細胞である。細胞型混合物に由来する特定の細胞型の不死化を促進するために、本明細書に記載の技術を、レポーター遺伝子の発現を駆動する細胞型特異的なプロモーターと組み合わせることができる。この目的で、HaridassetalAmJPathol2009Oct175148392に詳述されるように、初代マウス肝細胞を肝臓組織から単離した。単離後、この細胞型混合物を一晩培養し、その後感染を行った。レンチウイルス不死化ミックスに加えて、肝細胞特異的なアルブミンプロモーターからのレポーター遺伝子eGFPの発現を駆動するレンチウイルスを含めた。実施例3に記載の細胞株が確立された。重要なことには、アルブミンによって駆動されるeGFPは、実験全体にわたって肝細胞株と非肝細胞株とを区別することを可能にする。この目的で、それぞれの細胞株を蛍光顕微鏡法又はフローサイトメトリーによって分析した。フローサイトメトリー分析については、細胞をPBSで洗浄し、トリプシン/EDTAによって解離させ、遠心分離した後、細胞ペレットを再懸濁した。フローサイトメトリーによる分析では、SSC/FSCドットブロットを適用して細胞残屑FSC<200を排除した。残りのゲート細胞をeGFP蛍光シグナルについて分析し、ヒストグラムとしてプロットした。蛍光顕微鏡分析については、細胞を組織培養プレートにプレーティングし、eGFP可視化用のOmegaOptical製のフィルターセットを備える蛍光顕微鏡ZeissAxiovert135TVを用いて分析した。