"治療を必要とするヒトにおいてV600変異を示す黒色腫を治療する方法であって、前記黒色腫がNRASQ61変異、NRASA146変異、MEK1K59欠失、またはMEK1P387変異のうち少なくとも1つを示すかどうかを決定すること、および前記黒色腫がNRASQ61変異、NRASA146変異、MEK1K59欠失、またはMEK1P387変異のうち少なくとも1つを示す場合に、PI3K阻害剤およびMEK阻害剤の組合せ、またはBRAF阻害剤およびMEK阻害剤の組合せのうち少なくとも1つの有効量を前記ヒトに投与することを含んでなる、方法。治療を必要とするヒトにおいてV600変異を示す黒色腫を治療する方法であって、前記黒色腫がNRASQ61変異、NRASA146変異、MEK1K59欠失、またはMEK1P387変異のうち少なくとも1つを示すかどうかを決定すること、および前記黒色腫がNRASQ61変異、NRASA146変異、MEK1K59欠失、またはMEK1P387変異のうち少なくとも1つを示す場合に、PI3K阻害剤およびMEK阻害剤の組合せ、またはBRAF阻害剤およびMEK阻害剤の組合せ、またはBRAF阻害剤およびPI3K阻害剤の組合せのうち少なくとも1つの有効量を前記ヒトに投与することを含んでなる、方法。治療を必要とするヒトにおいてV600変異を示す黒色腫を治療する方法であって、前記黒色腫がNRASQ61変異、NRASA146変異、MEK1K59欠失、またはMEK1P387変異のうち少なくとも1つを示すかどうかを決定すること、および前記黒色腫がNRASQ61変異、NRASA146変異、MEK1K59欠失、またはMEK1P387変異のうち少なくとも1つを示す場合に、PI3K阻害剤およびMEK阻害剤の組合せ、またはBRAF阻害剤およびMEK阻害剤の組合せ、またはBRAF阻害剤およびPI3K阻害剤の組合せ、またはBRAF阻害剤およびMEK阻害剤およびPI3K阻害剤の組合せのうち少なくとも1つの有効量を前記ヒトに投与することを含んでなる、方法。治療を必要とするヒトにおいてV600変異を示す黒色腫を治療する方法であって、前記黒色腫がNRASQ61変異、NRASA146変異、MEK1K59欠失、MEK1P387変異、MEK1Q56P変異、MEK1C121変異、MEK1P124変異またはMEK1F129変異のうち少なくとも1つを示すかどうかを決定すること、および前記黒色腫がNRASQ61変異、NRASA146変異、MEK1K59欠失、MEK1P387変異、MEK1Q56変異、MEK1C121変異、MEK1P124変異またはMEK1F129変異のうち少なくとも1つを示す場合に、PI3K阻害剤およびMEK阻害剤の組合せ、またはBRAF阻害剤およびMEK阻害剤の組合せ、またはBRAF阻害剤およびPI3K阻害剤の組合せ、またはBRAF阻害剤およびMEK阻害剤およびPI3K阻害剤の組合せのうち少なくとも1つの有効量を前記ヒトに投与することを含んでなる、方法。前記黒色腫がV600EおよびV600Kから選択されるV600変異を示す、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。前記黒色腫がNRASQ61R、NRASQ61K変異、NRASQ61H変異、NRASQ61L変異、NRASQ61N変異、NRASQ61E変異、NRASQ61P変異、NRASA146T変異、NRASA146P変異、NRASA146V変異、MEK1K59欠失、MEK1P387L変異、MEK1Q56P変異、MEK1C121S変異、MEK1P124L変異、またはMEK1F129L変異のうち少なくとも1つを示す、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。BRAF阻害剤が式:を有する化合物、またはその薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物である、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。BRAF阻害剤が式:を有する化合物PLX4032、またはその薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物である、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。MEK阻害剤が式:を有する化合物、またはその薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物である、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。PI3K阻害剤が式:を有する化合物、またはその薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物である、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。実験方法化学薬品および試薬リン酸化AKTT308、リン酸化AKTS473、AKT、ERK、リン酸化S6PS235/236、S6P、サイクリンD1、リン酸化MEK1/2S217/S221、MEK1/2、MEK1、MEK2および開裂PARPに対する抗体はCellSignalingから購入した。GAPDH、RAF-1、BRAFおよびARAFに対する一次抗体はSantaCruzBiotechnologyから購入した。二リン酸化ERK1/2T202/Y204に対する抗体はSigmaから購入し、p27kip1に対する抗体はEpitomicsから購入した。抗マウスIRDYE商標800CW抗体はLI-CORBiosciencesから購入した。抗ウサギALEXAFLUOR商標680抗体はInvitrogenから購入した。化合物A、化合物B、化合物CおよびPLX403220は、GlaxoSmithKlineResearchLabsで合成されたものであり、それらの構造を図7に示す。細胞株A375細胞株ATCCから入手から、BRAF阻害剤に対する感受性の増大に基づいて、クローン分離株以下A375F11と称するを得た。A375F11細胞を漸増濃度の化合物Aに曝露させ、1.26μMまたは1.6μMの終濃度で維持した。化合物Aの存在下で増殖するように選択されたこれらのA375F11細胞の混合集団から単細胞クローンとして12R5-3、12R8-1、12R8-3、16R5-5、16R6-2、16R6-3および16R6-4が得られた。総ての細胞を、10ウシ胎児血清FBSを含有するRPMI1640培地で増殖させた。YUSIT1黒色腫細胞はYaleDermatologyCellCultureFacilityから入手した。BRAF阻害剤である化合物Aに対する感受性の増大に基づいて、合計13種のYUSIT1化合物A耐性クローンが得られた。具体的には、YUSIT1細胞を漸増濃度の化合物Aに曝露させ、化合物A0.1マイクロモル/Lの終濃度で維持した。化合物Aの存在下で増殖することができた集団からの限界希釈により、単細胞クローン、例えば、YUSIT1-B5、YUSIT1-B11、YUSIT1-B31クローンが単離された。A375F11細胞と同じ培地で細胞を増殖させた。PCRおよび配列解析Promega社製Maxwell16CellDNAPurificationKitPromega,MadisonWIを使用して、gDNA単離物を調製した。gDNAPCRプライマーは総てIDTIntegratedDNATechnologiesInc,Coralville,Iowaに発注した。PCRプライマーにはM13ユニバーサルシーケンシングプライマー配列を付加した。Roche社製FastPCRDNAPolymeraseROCHE,Indianapolis,INを使用して、PCR反応を実施した。95°Cで20秒間、60°Cで30秒間および72°Cで45秒間の35サイクルと、その後に72°Cで7分の伸長を行って、DNAを増幅させた。細胞株サンプルに対して使用する前に、総てのgDNAプライマーをPromega社製HumanGenomicDNAPromega,MadisonWIにおいて試験したQC。Agencourt社製AmPureAgencourtBioscienceCorporation,Beverly,MAを使用して、PCR産物を精製した。AB社製v3.1BigDye-TerminatorcyclesequencingkitAppliedBiosystems,FosterCity,CAを用いて、精製されたPCR産物の直接配列決定を行い、Agencourt社製CleanSeqAgencourtBioscienceCorporation,Beverly,MAを使用して、シーケンシング反応液を精製した。GeneticAnalyzer3730XLAppliedBiosystems,FosterCity,CAを使用して、シーケンシング反応液を解析した。総ての配列結果データを集積し、CodonCodeAlignerCodonCodeCorporation,Dedham,MAを使用して解析した。プライマー配列は以下の通りである。各プライマーのテールにはM13ユニバーサルプライマーが付加されている。テール部分は小文字であるシーケンシングのために使用される。b表示のプライマーは、指定のエキソンを増幅させるために使用される代替プライマーである。ヒト神経芽腫RASウイルス癌遺伝子ホモログNRAScDNAのクローニングおよびFLAGタグ標識ヒトNRAS-WTをPCR増幅するために使用されるプライマーを、公開されているヒト5’および3’UTR配列NM_002524.3のUTRフランキング領域に基づいて設計した。プライマーNRASfornest5’-ATGACTGAGTACAAACTGGTG3’配列番号107およびNRASrevNEST5’-TTACATCACCACACATGGCAATC-3’配列番号108を使用して、全長ORFを増幅させた。得られたORFをpCRBLUNTベクターInvitrogen,Carlsbad,CAにTOPOクローニングし、二本鎖配列を確認した。このプラスミドを、NRAS-WTFLAGタグ標識反応および突然変異誘発反応の鋳型として使用した。プライマーNRASflagtag5’caccATGGATTACAAGGATGACGACGATAAGGGAatgactgagtacaaactggtggtgg-3’配列番号109およびNRASrevNEST5’TTACATCACCACACATGGCAATC-3’配列番号110を使用して、5’FLAGタグを組み込んだ。ヒト骨髄cDNAMarathonReady,Clontech,Mountainview,CAを鋳型として使用し、総てのPCR反応でPhusionポリメラーゼNewEnglandBioLabs,Ipswich,MAを使用した。一次反応およびネスト反応は、販売者の使用説明書に従い、次のパラメーターを使用して実施した:MJResearch社製PTC200サーモサイクラーにおいて、1kbにつき、98°Cで10秒間、55°Cで30秒間および72°Cで15秒間として29サイクルと、その後、最後に72°Cで10分の伸長を行った。FLAGタグ付加物は59°Cでアニーリングされた。得られたORFをpcDNA3.1DInvitrogenにTOPOクローニングし、二本鎖配列を確認した。突然変異誘発NRAS:Q61K、Q61RおよびA146TヒトNRASの全長ORFNM_002524.3を前記のように調製し、突然変異誘発反応およびFLAGタグ標識反応で鋳型として使用した。PCR増幅にはPfuUltraポリメラーゼStratagene,SantaClara,CAを使用した。反応は、95°Cで30秒間、60°Cで60秒間および72°Cで14分間の16サイクルを行い、4°Cに保った。突然変異誘発を完了させた後、各反応物にDpNI酵素を加え、形質転換の前に37°Cでのインキュベーションを完了させた。クローンを配列決定し、所望の変異を確認した。配列解析に続いて、プラスミド調製物を準備し、5’FLAGタグを前記のように組み込んだ。得られたORFをpcDNA3.1DInvitrogenにTOPOクローニングし、二本鎖配列を確認した。突然変異誘発プライマー:BacMAMプラスミドの構築EcoRIおよびBamHIを有するヒトMEK1のコード領域をPCR増幅させ、PCR産物をEcoRIおよびBamHIで消化した。このPCR産物を、EcoRIおよびBamHIで消化したpFNcmvNAベクターにクローニングした1。得られたpFNcmvNA-ヒトMEK1プラスミドに、QuickChangeLighting部位特異的突然変異誘発AgilentTechnologiesによって、使用プライマーを用い、以下の位置に変異誘発した。BacMamの作製BacMamウイルスを、基本的には、LifeTechnologiesのBac-to-Bacシステムwww.invitrogen.comに基づいた記載の通りに作製した1。簡単に述べると、pFNcmvNA-ヒトMEK1およびpFNcmvNA-ヒトMEK2ならびにそれらの変異誘導体をDH10Bac細胞に形質転換した。得られた組換えバクミドDNAを使用して、Sf9細胞にトランスフェクトした。3~4日後、BacMamのP0バッチを回収し、それらを使用して、Sf9細胞を感染させ、P1バッチのBacMamを作製した。RAS活性化アッセイ:RASActivationELISAMilliporeを使用して、活性型RASの量を決定した。簡単に述べると、マグネシウム溶解バッファーに溶解させた100μgの総タンパク質を、RAF-1-RBDでコーティングしたグルタチオンプレートに加えた。抗Ras抗体を使用した化学発光により、捕捉されたRASをプレートリーダーで検出した。活性型RASを化学発光シグナルとして、タンパク質を添加していない対照の減算後に任意単位AUで記録した。クローニングアッセイ:10FBS含有RPMI培地において6ウェルディッシュBDFalconに1ウェル当たり5Kで細胞を播種した。翌日、細胞を10FBS含有RPMI培地中の指定の化合物で処理した。14日のアッセイ期間中に一度、化合物処理液を交換した。14日後、培地を除去し、0.5メチレンブルー/50エタノール溶液で少なくとも30分間細胞を染色した。染色液を除去し、蒸留水によりプレートをすすぎ、風乾した。フラットベッドスキャナーHPを使用して、染色した6ウェルプレートの完全画像をJPEGファイルとして取り込んだ。細胞増殖阻害アッセイおよび組合せデータの解析細胞播種の前に、化合物、例えば、化合物Aを用いずに、総ての細胞を最低72時間培養した。細胞は、10FBS含有RPMI培地の96ウェル組織培養プレートNUNC136102において、1ウェル当たり1,000細胞で全細胞をアッセイした。播種のおよそ24時間後に、化合物または一定モル比の2種の薬剤の組合せ、例えば、10:1比の化合物Aと化合物B、の10FBS含有RPMI培地による10の3倍連続希釈液に細胞を曝露した。化合物の存在下で3日間細胞をインキュベートした。製造業者のプロトコールに従ってCellTiterGlo商標Promegaを加えることによりATPレベルを決定した。簡単に述べると、各プレートにCellTiterGlo商標を加え、30分間インキュベートし、その後、SpectraMaxLプレートリーダーにおいて0.5秒の積算時間で発光シグナルを読み取った。化合物または化合物組合せでの3日間の処理後、ビヒクルDMSOで処理した細胞とCellTiterGlo商標シグナルを比較して、細胞増殖の阻害を評価した。細胞増殖は、ビヒクルDMSO処理した対照ウェルとの相対値として計算した。対照の細胞増殖の50を阻害する化合物の濃度IC50は、次式、y=AB-A/1C/x^D式中、Aは最小反応yminであり、Bは最大反応ymaxであり、Cは曲線の変曲点EC50であり、Dはヒル係数であるの非線形回帰を用いて、y=ビヒクル対照の50のときに補間された。逆補間されたIC50値と、ChouandTalalayによって導き出された相互に非排他的な式:CI=Da/IC50aDb/IC50bDa×Db/IC50a×IC50b式中、IC50aは化合物AのIC50であり;IC50bは化合物BのIC50であり;Daは、細胞増殖の50を阻害した、化合物Bと組み合わせた化合物Aの濃度であり;Dbは、細胞増殖の50を阻害した、化合物Aと組み合わせた化合物Bの濃度であるを用いて計算された組合せ指数CIを使用して、効力に対する組合せ効果を評価した。一般に、CI値<0.9、0.9~1.1の間、または>1.1はそれぞれ、相乗作用、相加作用および拮抗作用を示す。一般に、CI数が小さくなるほど、相乗作用の強さは高まる。反応スケールに対する組合せ効果は、PetersonandNovickおよびPetersonPetersonandNovick2007Peterson2010により詳細に記載されている非線形調合の概念に基づき、ExcessOverHighestSingleAgentEOHSAにより定量した。EOHSA値は、組み合わせた場合の成分用量レベルでの最良の単剤に比べて、組合せによってもたらされる改善本明細書では、パーセンテージポイントpptの差の増加と定義される。単剤処置および組合せ処理では、一定用量比の化合物に細胞を曝露し、用量反応曲線を実験データに当てはめ、回帰モデルを使用して解析した。用量反応曲線に沿ったIC50の特定の総用量レベルにおいて、EOHSAの統計的推論を行うために用量組合せIC50に対応するを決定した。より具体的には、用量d1の薬物1と用量d2の薬物2を必要とする組合せ薬物実験では、その組合せでの平均応答が、用量d1の薬物1または用量d2の薬物2に対する平均応答よりも優れているならば、すなわち、総用量=d1d2は正のEOHSA値を有すると言える。A375細胞のトランスフェクションリポフェクタミン2000Invitrogenを用いて、A375細胞を指定のNRAS構築物でトランスフェクトした。0.1μM化合物Aを用いて安定な単細胞トランスフェクタントを選択し、クローニングシリンダーを用いて単離した。G418を用いて選択する場合、ベクターであるNRAS野生型およびNRAS変異型プラスミドのA375へのトランスフェクション後にコロニーが観察された。トランスフェクトされたクローンを、10FBSおよび0.1μM化合物Aを含有するRPMI1640培地で維持し、増殖実験およびウエスタンブロット実験では化合物Aを用いずに播種した。小ヘアピンRNAshRNAを介する、NRASのノックダウンA375にNRASを標的とするshRNAを発現するレンチウイルスTRCN0000300442またはSigmaAldrich社St.Louis製の非標的化対照SHC002Vで形質導入した。shRNAレンチウイルスが安定に組み込まれた細胞を、ピューロマイシンを用いて選択し、クローニングシリンダーを用いて単細胞クローンを単離した。安定に組み込まれたクローンを、後の実験のためにピューロマイシン中で維持した。siRNAを介するノックダウンRNAiMAXInvitrogenを使用して、MAP2K1D-003571-01、D-003571-04およびD-003571-05、MAP2K2D-003573-01およびD-003573-02のシングルオリゴsiRNADharmaconおよび非標的化対照D-001210-02およびD-001210-05の指定細胞へのリバーストランスフェクションを、48時間おいて2回行った。2回目のトランスフェクションの1日後、増殖およびタンパク質抽出のためにそれらの細胞を播種した。播種の24時間後にタンパク質を抽出した。タンパク質に対して前記のようにウエスタンブロット解析を行った。72時間後の相対的細胞増殖をCellTiterGlo商標により決定した。A375細胞のBacMAM形質導入MEK1cDNAを使用してBacMAM構築物を作製し、部位特異的突然変異誘発法を用いて、MEK1に変異誘発した。BacMAMウイルス粒子は、補足の方法に記載の通りに調製した。A375細胞に指定のBacMAMウイルスで形質導入した。形質導入の48時間後、後の増殖および前記のウエスタンブロット解析のために細胞を播種した。化合物BMEK1モデルの構築Maestroのタンパク質調製ウィザードSchrodinger,LLCを使用したモデル構築のために、結晶構造3EQG23を調製した。水素を付加し、二重結合を割り当て、一部の水を削除し、H結合を割り当て、最後に、ImprefおよびOPLS2005力場を使用して、その構造のエネルギーの最小化を行った。このステップでは重原子収束閾値0.15オングストロームを使用した。その構造において小分子化合物Bをアロステリック阻害剤と手動で大まかに調製し、その後、この、他の阻害剤を除去した。MaestroによるMacromodelと、OPLS2005力場を使用して、タンパク質を固定された状態に保つことにより、化合物BMek1複合体のエネルギーを最小化した。化合物Bのアセチル化アニリノ部分は、さらなる精密化が必要であると思われ、Macromodelを使用したコンフォメーション探索を行った。最後に、Macromodelを使用して、リガンドと、距離が7オングストロームまでの非主鎖原子とのエネルギーの最小化を行った。モデルの目視検査では、化合物BのアセチルNHと隣接するアルギニンとの間に1つだけ潜在的に疑わしい相互作用が示された。しかしながら、阻害剤のこの部分はフレキシブルなPループ中にあり、溶媒に露出してもいるので、そのモデルは例示目的にかなっていると判断した。DNA解析Affymetrix社製GenomeWideHumanSNPArray6.0チップでのSNP解析により、化合物Aに対する耐性を獲得したクローンは、状態による同一性およびArrayStudioOmicsoftにおける適正な計算による同一性によって判定した場合に95を超える類似性を有することから、それらがA375から誘導されたことが確認された。Affymetrix発現解析化合物Aおよび化合物B単独、ならびに相互に組み合わせた場合の24時間の化合物処理後のA375との比較のために16R6-4を選択した。各クローンまたは各クローン処理には、2つまたは3つの独立したサンプルを使用した。RNAおよびcDNAを調製し、ResponseGeneticsInc.LosAngeles,CAで、Affymetrix社製HG-U133Plus2アレイを使用して、スタンダードAffymetrixプロトコールに従って、マイクロアレイ解析を行った。MAS5によりRNAマイクロアレイシグナルを正規化した。ArrayStudioOmicsoftを使用して、QCおよびデータ解析を行った。MADスコア<-5のサンプルは以降の解析から除外した。p値<0.05および>2倍変化値で一元配置ANOVAを適用することにより、差次的に発現されている遺伝子を同定した。カットオフ判定基準を満たしたが平均強度が100未満であったプローブセットは除外した。結果A375F11黒色腫細胞A375F11細胞を漸増濃度の化合物Aへ曝露した後、化合物Aに対する耐性を獲得したA375F11黒色腫細胞から誘導された10系統を単離した。BRAF、NRASおよびMAP2K1MEK1について、ゲノムDNAを配列決定した。表1に示されるように、総てのクローンは、親A375F11細胞で認められるBRAFV600Eのホモ接合変異を保有していた。BRAFV600Eの他、化合物A耐性黒色腫細胞は、MEK1K59欠失12R5-1および12R5-5、NRASQ61RもしくはA146T12R9、12R5-5、12R5-3、12R8-1またはNRASQ61Kおよび/もしくはA146TとMEK1P387S16R6-3、15R5-5、16R6-2および16R6-4の両方、の異型接合変異も有している。具体的には、12R5-1および12R5-5細胞は、MEK1においてリジン59欠失Het59delKをもたらす、MAP2K1遺伝子の175-177ヌクレオチドにおけるAAGの欠失Het175-177delAAGを有し;12R5-3、12R8-1および12R8-3系統は、アミノ酸146のアラニンのトレオニンへの変化をもたらすNRASG436AA146Tの異型接合変異を有し;16R6-3細胞は、NRASG436AA146Tと、アミノ酸387のプロリンのセリンへの変化をもたらすMAP2K1C1159TP387P/Sの両方の異型接合変異を有し;12R9系統は、アミノ酸61のグルタミンのアルギニンへの変化をもたらすNRASA182GQ61Rの異型接合変異を有し;16R5-5および16R6-2系統は、アミノ酸61のグルタミンのリジンへの変化をもたらすNRASC181AQ61Kと、MAP2K1C1159/TP387Sの異型接合変異を有し;16R6-4細胞は、NRASC181AQ61K、NRASG436AA146TおよびMAP2K1C1159/TP387Sの異型接合変異を有する。配列決定により、これらのクローンは、付加的なBRAF変異を導入することなくホモ接合性BRAFV600E変異を保有していることが確認された。加えて、KRAS、HRAS、ARAF、CRAFまたはPTENにおいても突然変異は確認されなかった。総てのクローンは、A375親系統由来の、I220の同義MEK2多型を保有した。上のデータは、MEK1K59欠失、NRASQ61K/Rおよび/もしくはA146T変異、またはNRASQ61Kおよび/もしくはA146TとMEK1P387Sの両方の変異が、BRAFV600変異型黒色腫における、BRAF阻害剤である化合物Aに対する耐性と関係していることを示している。BRAFV600E変異を含む化合物A獲得耐性細胞においてNRASQ61および/またはA146T変異が検出されたことは、注目すべきであり、予想外であった。さらに、図3にて示されるように、BRAFV600E変異とQ61Kおよび/またはA146TのNRAS変異を有する耐性細胞16R6-4、12R5-3および12R8-1は、これらのNRAS変異のない黒色腫細胞A375F11細胞と比較して、RASGTPase活性が増加していた。RASGTPアーゼ活性の増加は、NRAS変異によるものと考えられる。例えば、NRASQ61変異は、Rasタンパク質をGTP結合状態に固定し、その下流エフェクターの活性化が後に続くことによりNRAS活性を増加させることが報告されている。化合物Aに対する耐性を獲得したA375F11クローンにおいて、細胞増殖阻害に対する化合物A、化合物Bまたはそれらの組合せの効果を判定した表2および図4。野生型NRASおよびMEK1を有するA375F11BRAFV600E変異細胞は、単剤としての、および、組み合わせた場合の化合物Aまたは化合物Bによる細胞増殖阻害に対して感受性が高かった。これに対して、BRAFV600E変異株、MEK159delK変異を有する12R5-1および12R5-5、NRASA146T変異を有する12R5-3、12R8-1および12R8-3、NRASA146TおよびMEK1P387Sの両方を有する16R6-3株、NRASQ61Rを有する12R9、NRASQ61/KおよびMEK1P387Sを有する16R5-5および16R6-2、ならびにNRASQ61/K、NRASA146TおよびMEK1P387S変異を有する16R6-4は、BRAF阻害剤である化合物Aに対して耐性でありIC50>10μM、MEK阻害剤である化合物Bに対して感受性の低下を示した。しかしながら、NRASもしくはMEK1変異のいずれか、またはNRASおよびMEK1変異の両方を有するこれらのBRAFV600E変異株は、化合物Aおよび化合物Bの組合せに対して感受性であり、IC50は、化合物Aについては0.178~0.392μMの範囲であり、化合物Bについては0.018~0.039μMの範囲であった。10:1モル比での化合物Aと化合物Bの組合せでは、EOSHAによって示されるように細胞増殖阻害の増強を示した。同様に、表3および図5に示されるように、化合物AであるBRAF阻害剤に対する耐性と、MEK159delK;NRASA146;またはNRASQ61Kおよび/もしくはA146およびMEK1P387の同時突然変異のそれぞれを有するBRAFV600E変異型黒色腫細胞は、化合物BのMEK阻害剤と化合物CのPI3K阻害剤の組合せに対して感受性であった。化合物Bと化合物Cの組合せではIC50は0.013~0.043μMの範囲であった。化合物Bと化合物Cの等モルの組合せでは、示されているような同時突然変異を有する総ての黒色腫細胞において、CI値は0.25~0.67の間で相乗的であり、かつ/またはEOHSA値≧10pptで細胞増殖阻害を増強した。細胞増殖アッセイにより、A375クローンは化合物Aに対して耐性であるIC50>10μmol/Lことが示された図7。さらに、A375クローンは、別のBRAF阻害剤であるPLX4032に対しても耐性でありIC50>10μmol/L、データは示されていない、MEK阻害剤である化合物Bに対する感受性については親A375細胞に比べて10分の1以下となった図8。YUSIT1クローンYUSIT1細胞から誘導された、BRAFV600K変異を有する複数のクローンを、0.1μmol/Lの化合物Aの存在下での増殖能力に基づいて選択した。YUSIT1クローンは、親YUSIT1細胞に比べて、化合物Aに対する感受性が38分の1以下となったことを示しIC50>0.5μmol/L、化合物Bに対する感受性が3分の1~7分の1となったことを示したIC50s、0.002~0.005μmol/L図9。YUSIT1から誘導された耐性クローンは、A375から誘導されたものと同様に、調べた3種のクローンのうち3種においてNRASQ61Kを獲得していた。これらのクローンはBRAFV600KおよびMEK2E27Kを保有していた。図34に示されるように、化合物Aに対する耐性を獲得したYUSIT1クローンは、化合物Bに対する感受性の低下を示し、化合物Cに対しても同様の感受性を示した。YUSIT1クローンでは、化合物Aと化合物Bの組合せはやや相乗的からほぼ相加的であり組合せ指数CIは0.8~0.92、効力は若干増強した図9。YUSIT1クローンでは、化合物Aと化合物Cの組合せは相乗的からほぼ相加的であった。同様に、YUSIT1耐性クローンでは、化合物Bと化合物Cの組合せは相乗的~ほぼ相加的であった。どちらの組合せも最も有効な単剤の効力より若干大きかった。化合物Aで処理した獲得耐性クローンにおけるMAPキナーゼシグナル伝達の向上4種の代表的なA375クローンを化合物Aで処理し、ウエスタンブロットによって、親クローンとの比較によりシグナル伝達の影響について分析した図10。化合物Aの不在下では、A375および耐性クローンの両方が、MEK、ERKおよびS6リボゾームタンパク質S6Pの高レベルのリン酸化を示し、低レベルのT308リン酸化AKTを示した。ARAF、BRAFおよびCRAFタンパク質レベルは耐性クローンと親細胞との間では類似していた図7、データは示されていない。A375細胞では、化合物AによってMEK、ERKおよびS6Pのリン酸化は75を超える強い阻害を受け、サイクリンD1タンパク質レベルは65を超える減少を示した図10。化合物Aでの処理を受けた耐性クローンでは、これらの影響は減少した。例えば、MEKリン酸化は30~70減少し、一方、ERKおよびS6Pリン酸化の減少はそれぞれ、50未満、25未満であった。親系統とは異なり、化合物A処理を受けたクローンでは、サイクリンD1タンパク質レベルは依然として高かった。NRAS変異が化合物Aに対する耐性に介在する次に、NRASA146T12R5-3および12R8-1またはNRASQ61KおよびNRASA146T16R6-4を有する3種の代表的なクローンにおいて、観察されたNRAS変異についての化合物Aおよび化合物B感受性に対する影響を評価した。これらのクローンでは、活性型RASレベルは、親の場合に比べて2.5~7倍増加した図3、データは示されていない。12R5-3NRASA146Tおよび16R6-4NRASQ61KおよびNRASA146Tの両方において、化合物Aは、BRAFV600Eを有するCRAFの共沈を増加させた図11。16R6-4では、shRNAによるNRASの安定した減少により、化合物A図12および化合物B図13に対する感受性、ならびにMEKおよびERKのリン酸化を減少させる化合物Aの能力図14が一部回復した。化合物Aおよび化合物Bに対する感受性の一部回復は、NRASの安定したノックダウンを受けた12R5-3および12R8-1でも観察されたデータは示されていない。NRASQ61KまたはNRASA146T変異が化合物Aに対する耐性を増大させることをさらに確認するために、これらの突然変異とネオマイシン耐性遺伝子をコードするプラスミドをA375細胞にトランスフェクトした。G418を用いた選択では、変異NRASを発現しないクローンが作出されたデータは示されていない。しかしながら、低用量の化合物A0.1μMを用いた選択による場合には、変異NRASを発現するクローンが得られた。化合物Aを用いて選択した場合、モックまたは野生型NRASトランスフェクションではコロニーを形成することができなかった。変異NRASを発現するクローンは、化合物A図15および化合物B図16による細胞増殖阻害に対して非感受性であり、化合物A処理後のMEK、ERKおよびS6Pリン酸化ならびにサイクリンD1タンパク質の減少もなかった図17。MEK変異が化合物Aに対する耐性を付与する次に、化合物A耐性クローンに見られるK59delおよびP387SMEK変異がMEKを活性化し、化合物Aおよび化合物Bに対する耐性を増大し得るかどうかを検討した。K59は、MEKのコアキナーゼドメインの前の負の調節ヘリックスに隣接して存在する。ヘリックスAはMEK1の不活性型コンフォメーションを安定化させるという仮説がある。このコンフォメーションは、図18に示す化合物Bのようなアロステリック阻害剤と結合するコンフォメーションと同じであるかまたは類似している。MEK1Q56Pなどの、この調節ヘリックスにおける突然変異は、非リン酸化MEK1を活性化し、BRAF阻害剤およびMEK阻害剤に対する感受性を低下させることが示されている。P387は、MEK1の負の調節に関与するT386に隣接して、特定の立体構造を持たないMEK1のC末端に存在する。図19、図32、ならびに図20、図35および図36に示されるように、A375細胞においてMEK1K59del、MEK1Q56P、MEK1C121S、MEK1P124LおよびMEK1F129Lが発現されたことにより、増殖を阻害する化合物Aの能力は、モックおよび野生型MEK1IC50=0.030μMおよび0.028μMと比べて低下したそれぞれ、IC50=0.179μM、≧0.420μM、≧0.330μM、0.084μMおよび0.140μM。MEK1K59del、MEK1Q56P、MEK1C121S、MEK1P124LおよびMEK1F129Lの発現により、化合物Bに対する感受性は低下した図20。増殖データと一致して、化合物Aでの処理後にERKリン酸化が維持されたのはMEK1Q56PおよびMEK1K59delだけであった図21。同様に、MEK1Q56PおよびMEK1K59delを発現する細胞では、p27kip1の誘導はなかった。S6Pリン酸化の阻害の欠如はMEK1Q56Pにおいて最も顕著であったが、MEK1K59delではなお認められた。MEK1Q56PおよびMEK1K59delの両方が、ERKの基底リン酸化の増加を示した。本発明者らのA375クローンにおける化合物A耐性に寄与するMEK変異を確認するために、12R5-1および12R5-5において、低分子干渉RNAsiRNAを使用して、MEK1をノックダウンさせた。化合物の不在下で、12R5-1では細胞増殖が75を超える減少、12R5-5では60を超える減少を示し、これらのクローンはMEK1ダウンレギュレーションに対して感受性が強く、MEK1依存を示した図22、図23。MEK2ノックダウンによる増殖への影響はなかった。化合物A獲得耐性黒色腫細胞は化合物Aおよび化合物Bの組合せに対して感受性である耐性クローンでは化合物Aを受けてERKリン酸化が維持されることが示されたため、BRAFおよびMEKの複合阻害によってこの耐性を克服することができるかどうかを検証した。化合物Aおよび化合物Bの一定モル比10:1での組合せでは、NRASまたはMEK1変異とは関係なく、総ての獲得耐性クローンにおいて増殖阻害が増強された図8。化合物Aの単剤活性がないことから組合せ指数を計算することはできなかったが、excessoverhighestsingleagentEOSHAによって、化合物B単独と比べた場合に、IC50において細胞増殖阻害の19~50増強という利益が示された図8および図24。化合物Aおよび化合物Bの組合せでの同様の利益が、NRASQ61KおよびNRASA146Tを安定に発現し図25、またはMEK1K59delおよびMEK1Q56Pで形質導入し、またはMEK1K59del、MEK1Q56P、MEK1C121S、MEK1P124LおよびMEK1F129Lで形質導入した図26、図32A375細胞においても認められた。獲得したNRAS変異を有する総てのクローンでは、1マイクロモルの化合物Aによって化合物Bに対する感受性がほぼ回復した図27。しかしながら、クローン16R6-4NRASQ61KおよびNRASA146Tおよび12R5-5MEK1K59delでは、同様の投与で、化合物Bに対する感受性の一部しか回復しなかった。獲得耐性クローンを用いた拡大増殖アッセイでは、1μM化合物Aと0.01μM化合物Bとの組合せによって、NRAS変異株クローンにおいて細胞増殖の>90が阻害された図28。NRAS変異株クローンにおける増殖阻害はMEK1K59delクローンの場合においてより顕著であり、MEK1K59delクローンで同様の効果を観察するにはより高い濃度の化合物Bが必要であった。化合物Aと化合物Bの組合せをさらに特徴付けるために、RAF-MEK-ERK経路に対するこの組合せの影響を調べた。図29に示されるように、単剤の化合物Aまたは化合物Bは、A375においてERKおよびS6Pリン酸化を効果的に減少させた。これらの阻害剤は、サイクリンD1を減少させ、p27kip1を増加させるのに十分なものであった。組み合わせた場合、ERKおよびS6Pリン酸化はさらに減少したが、一方、サイクリンD1またはp27kip1タンパク質レベルは向上をほとんど示さなかった。獲得耐性クローンの代表的なサブセットにおいて、化合物A単独では、ERKまたはS6Pリン酸化、あるいはサイクリンD1およびp27kip1タンパク質レベルに対してほとんど影響はなかった。化合物B単独では、ERKのリン酸化が減少した。組み合わせた場合、NRAS変異株クローンにおけるERKリン酸化レベルは、化合物Aで処置したA375で観察されるレベルまで減少した。MEK1K59delクローンでは、この組合せ処理によるERKリン酸化に対する影響は減少した。加えて、クローンへの組合せ投与によって、サイクリンD1は減少し、p27kip1は増加したが、化合物Aで処理したA375と同じ程度までではなかった。組合せ処理したクローンでは種々の程度でS6Pリン酸化の減少が観察された。A375および耐性クローンの両方において、AKTリン酸化はわずかに減少したかまたは変化しなかった。化合物Aと化合物Bの組合せによって、化合物Aに対する耐性を獲得したクローンのシグナル伝達および増殖が減少したことから、16R6-4クローンNRASQ61KおよびNRASA146T、MEK1P387Sにおけるこの組合せの全体的な遺伝子調節効果を評価した。16R6-4細胞において認められた耐性と一致して、化合物A処理によって、代謝PHGDH、PCK2、ASNSおよび小分子輸送SLC1A4、CHAC1に関連しているごく少数の遺伝子が改変された。化合物Aに化合物Bを加えることで、遺伝子発現は、この組合せで処理したA375細胞において見られた変化と実質的に共通するように改変された図9、データは示されていない。上記のマイクロアレイ解析を使用して判定した場合、耐性クローンではその組合せによって、細胞増殖および生存に関連する遺伝子例えば、CCND1、CDC25A、PCNA、MYC、MCL1が、親細胞の化合物Aまたは化合物B処理と同様にダウンレギュレートされたデータは示されていない。アポトーシスと関係がある転写物例えば、BIK、CASP1、CARD6は、その組合せで処理した耐性クローンにおいてアップレギュレートされたが、いずれかの単剤で処理した親細胞の場合と同じ程度までではなかった。16R6-4およびA375の両方においてその組合せにより、MEK-ERKシグナル伝達に依存する転写物例えば、DUSP4,DUSP5、DUSP7、ETV1、ETV4、FOXC2、SPRY2および代替経路に関連するアップレギュレートされた転写例えば、RAB26、RHOB、SNAI2は減少した。これらのデータは、化合物Aと化合物Bの組合せが、親におけるRAFまたはMEK阻害と関連する遺伝子発現をほぼ回復させ、顕著な細胞増殖阻害をもたらすことを示している。MAPK経路およびPI3K/mTOR経路の両方を阻害することによって、化合物Aに対する耐性を獲得したクローンにおける細胞増殖阻害は増強される。化合物Aと化合物Bの組合せは、耐性クローンの増殖を著しく阻害したが、残るS6Pリン酸化はそれらのクローンにおいて存続した。S6Pリン酸化はPI3K/mTOR経路の活性化によって誘導され得るため、化合物Aまたは化合物Bと化合物Cとの組合せ。化合物Cに対して低い感受性を示した総てのクローンを評価した図8。代表的な耐性クローンの化合物C処理では、AKTリン酸化は減少し、S6Pリン酸化はわずかに減少した図30。化合物Aまたは化合物Bと化合物Cとを合わせることにより、S6Pリン酸化およびサイクリンD1タンパク質はさらに減少した。MEKおよびERKのリン酸化は、化合物Aまたは化合物B単独での処理の場合と類似していた。16R6-4などの一部のクローンでは、化合物Cと化合物Aまたは化合物Bとの組合せによってアポトーシスの指標であるPARPの断片化が増加した。12R5-1などの他のクローンは高い基礎レベルのPARP断片化を示した。化合物Aと化合物Cとを合わせることにより、NRAS変異を有するクローン7種のうち5種と、2種のMEK1K59delクローンにおいて細胞増殖阻害が増強されたEOSHA>10ppt図8。化合物Bと化合物Cの組合せは、クローン9種のうち8種において相乗的でありCI<0.8、9種総てのクローンにおいて、NRASまたはMEK1変異状態に関係なく、細胞増殖阻害を増強したEOSHA>20ppt図8。長期増殖アッセイにより、化合物Aまたは化合物Bと化合物Cとの組合せによる増殖阻害の増強を確認した図31。一般に、耐性クローンは、使用した濃度で化合物Cと化合物Bを組み合わせた場合、細胞増殖阻害に対する感受性はより高かった。しかしながら、1μmol/Lの化合物Aと0.03μmol/Lの化合物Cの場合ではかなりの活性が認められた。化合物Aを化合物Cと組み合わせた場合の増殖抑制効果は、化合物Aと化合物Bの組合せ、ならびに化合物Bと化合物Cの組合せの場合に認められるほど強力ではなかった。これらの組合せについては、NRAS変異を有するYUSIT1クローンにおいても同様の利益が認められた図9。"