"耳鳴の治療または予防に使用するための、塩素イオン共輸送体ナトリウムカリウム塩素イオン共輸送体1NKCC1を調節する化合物。NKCC1に拮抗する、請求項1に記載の使用するための化合物。NKCC1の活性および/または発現を減少させるまたは抑制させることによって、NKCC1の機能に拮抗する、請求項1または2に記載の使用するための化合物。KCC2の活性および/または発現がNKCC1の拮抗作用によって増加する、請求項1~3の何れか一項に記載の使用するための化合物。NKCC1の活性および/または発現を減少させ、かつ、KCC2の活性および/または発現を増加させる、請求項3に記載の使用するための化合物。チアジドおよびスルホンアミドからなる群より選ばれる、請求項1~5の何れか一項に記載の使用するための化合物。アセタゾールアミド、アゾセミド、ブメタニド、クロルタリドン、クロパミド、フロセミド、ヒドロクロロチアジドHCT、HCTZ、HZT、インダパミド、メフルシド、メトラゾン、ピレタニド、トリパミドキシパミド、ジクロルフェナミドDCP、ドルゾラミド、エトキスゾラミド、スルチアム、およびゾニサミド、ならびにそれらの類似体からなる群より選ばれるスルホンアミドである、請求項1~6の何れか一項に記載の使用するための化合物。上記スルホンアミド化合物は利尿化合物であり、好ましくはブメタニド、フロセミド、ピレタニド、アゾセミド、およびトルセミド、ならびにそれらの類似体からなる群より選ばれる、請求項1~7の何れか一項に記載の使用するための化合物。利尿化合物は、以下のi~vからなる群より選ばれる、請求項1~8の何れか一項に記載の使用するための化合物;iブメタニド、ブメタニドアルデヒド、ブメタニドメチルエステル、ブメタニドシアノメチルエステル、ブメタニドエチルエステル、ブメタニドイソアミルエステル、ブメタニドオクチルエステル、ブメタニドベンジルエステル、ブメタニドジベンジルアミド、ブメタニドジエチルアミド、ブメタニドモルフォリノエチルエステル、ブメタニド-3-ジメチルアミノプロピルエステル、ブメタニド-N,N-ジエチルグリコールアミドエステル、ブメタニド-N,N-ジメチルグリコールアミドエステル、ブメタニドピバキセチルエステル、ブメタニドプロパキセチルエステル、ブメタニドメトキシポリエチレンオキシn-1-エチルエステル、ブメタニドベンジルトリメチルアンモニウム塩およびブメタニドセチルトリメチルアンモニウム塩、ブメタニド[-C=O-SH]チオ酸、ブメタニド-S-メチルチオエステル、ブメタニド-S-シアノメチルチオエステル、ブメタニド-S-エチルチオエステル、ブメタニド-S-イソアミルチオエステル、ブメタニド-S-オクチルチオエステル、ブメタニド-S-ベンジルチオエステル、ブメタニド-S-モルフォリノエチルチオエステル、ブメタニド-S-[3-ジメチルアミノプロピル]チオエステル、ブメタニド-S-N,N-ジエチルグリコールアミドチオエステル、ブメタニド-S-N,N-ジメチルグリコールアミドチオエステル、ブメタニド-S-ピバキセチルチオエステル、ブメタニド-S-プロパキセチルチオエステル、ブメタニドS-[メトキシポリエチレンオキシn-1-エチル]チオエステル、ブメタニド[-C=O-S-]ベンジルトリメチル-アンモニウムチオ酸塩およびブメタニド[-C=O-S-]セチルトリメチルアンモニウムチオ酸塩、準安定性ブメタニド[-C=S-OH]チオ酸、ブメタニド-O-メチルチオエステル、ブメタニド-O-シアノメチルチオエステル、ブメタニド-O-エチルチオエステル、ブメタニド-O-イソアミルチオエステル、ブメタニド-O-オクチルチオエステル、ブメタニド-O-ベンジルチオエステル、ブメタニド-O-モルフォリノエチルチオエステル、ブメタニド-O-[3-ジメチルアミノプロピル]チオエステル、ブメタニド-O-N,N-ジエチルグリコールアミドチオエステル、ブメタニド-O-N,N-ジメチルグリコールアミドチオエステル、ブメタニド-O-ピバキセチルチオエステル、ブメタニド-O-プロパキセチルチオエステル、ブメタニド-O-[メトキシポリエチレンオキシn-1-エチル]チオエステル、ブメタニド[-C=S-O-]ベンジルトリメチル-アンモニウムチオ酸塩およびブメタニド[-C=S-O-]セチルトリメチルアンモニウムチオ酸塩、ブメタニドチオアルデヒド、ブメタニド[-C=S-SH]ジチオ酸、ブメタニドメチルジチオエステル、ブメタニドシアノメチルジチオエステル、ブメタニドエチルジチオエステル、ブメタニドイソアミルジチオエステル、ブメタニドオクチルジチオエステル、ブメタニドベンジルジチオエステル、ブメタニドジベンジルチオアミド、ブメタニドジエチルチオアミド、ブメタニドモルフォリノエチルジチオエステル、ブメタニド-3-ジメチルアミノプロピルジチオエステル、ブメタニド-N,N-ジエチルグリコールアミドジチオエステル、ブメタニド-N,N-ジメチルグリコールアミドジチオエステル、ブメタニドピバキセチルジチオエステル、ブメタニドプロパキセチルジチオエステル、ブメタニドメトキシポリエチレンオキシn-1-エチルジチオエステル、ブメタニドベンジルトリメチルアンモニウムジチオ酸塩およびブメタニドセチルトリメチルアンモニウムジチオ酸塩、ならびにiiフロセミド、フロセミドアルデヒド、フロセミドメチルエステル、フロセミドシアノメチルエステル、フロセミドエチルエステル、フロセミドイソアミルエステル、フロセミドオクチルエステル、フロセミドベンジルエステル、フロセミドモルフォリノエチルエステル、フロセミド-3-ジメチルアミノプロピルエステル、フロセミド-N,N-ジエチルグリコールアミドエステル、フロセミド-N,N-ジメチルグリコールアミドエステル、フロセミドピバキセチルエステル、フロセミドプロパキセチルエステル、フロセミドメトキシポリエチレンオキシn-1-エチルエステル、フロセミドベンジルトリメチルアンモニウム酸塩およびフロセミドセチルトリメチルアンモニウム酸塩。特定の実施形態において、当該化合物はフロセミドではない。本発明のさらなる実施形態において、式IVの化合物は、フロセミド[-C=O-SH]チオ酸、フロセミド-S-メチルチオエステル、フロセミド-S-シアノメチルチオエステル、フロセミド-S-エチルチオエステル、フロセミド-S-イソアミルチオエステル、フロセミド-S-オクチルチオエステル、フロセミド-S-ベンジルチオエステル、フロセミド-S-モルフォリノエチルチオエステル、フロセミド-S-[3-ジメチルアミノプロピル]チオエステル、フロセミド-S-N,N-ジエチルグリコールアミドチオエステル、フロセミド-S-N,N-ジメチルグリコールアミドチオエステル、フロセミド-S-ピバキセチルチオエステル、フロセミド-S-プロパキセチルチオエステル、フロセミド-S-[メトキシポリエチレンオキシn-1-エチル]チオエステル、フロセミド[-C=O-S-]ベンジルトリメチルアンモニウムチオ酸塩およびフロセミド[-C=O-S-]セチルトリメチルアンモニウムチオ酸塩、準安定性フロセミド[-C=S-OH]チオ酸、フロセミド-O-メチルチオエステル、フロセミド-O-シアノメチルチオエステル、フロセミド-O-エチルチオエステル、フロセミド-O-イソアミルチオエステル、フロセミド-O-オクチルチオエステル、フロセミド-O-ベンジルチオエステル、フロセミド-O-モルフォリノエチルチオエステル、フロセミド-O-[3-ジメチルアミノプロピル]チオエステル、フロセミド-O-N,N-ジエチルグリコールアミドチオエステル、フロセミド-O-N,N-ジメチルグリコールアミドチオエステル、フロセミド-O-ピバキセチルチオエステル、フロセミド-O-プロパキセチルチオエステル、フロセミド-O-[メトキシポリエチレンオキシn-1-エチル]チオエステル、フロセミド[-C=S-O-]ベンジルトリメチル-アンモニウムチオ酸塩およびフロセミド[-C=S-O-]セチルトリメチルアンモニウムチオ酸塩、フロセミドチオアルデヒド、フロセミド[-C=S-SH]ジチオ酸、フロセミドメチルジチオエステル、フロセミドシアノメチルジチオエステル、フロセミドエチルジチオエステル、フロセミドイソアミルジチオエステル、フロセミドオクチルジチオエステル、フロセミドベンジルジチオエステル、フロセミドジベンジルチオアミド、フロセミドジエチルチオアミド、フロセミドモルフォリノエチルジチオエステル、フロセミド-3-ジメチルアミノ[rho]ロピルジチオエステル、フロセミド-N,N-ジエチルグリコールアミドジチオエステル、フロセミド-N,N-ジメチルグリコールアミドジチオエステル、フロセミドピバキセチルジチオエステル、フロセミドプロパキセチルジチオエステル、フロセミドメトキシポリエチレンオキシn-1-エチルジチオエステル、フロセミドベンジルトリメチルアンモニウムジチオ酸塩およびフロセミドセチルトリメチルアンモニウムジチオ酸塩であってよい、ならびにiiiピレタニド、ピレタニドアルデヒドピレタニドメチルエステル、ピレタニドシアノメチルエステル、ピレタニドエチルエステル、ピレタニドイソアミルエステル、ピレタニドオクチルエステル、ピレタニドベンジルエステル、ピレタニドジベンジルアミド、ピレタニドジエチルアミド、ピレタニドモルフォリノエチルエステル、ピレタニド-3-ジメチルアミノプロピルエステル、ピレタニド-N,N-ジエチルグリコールアミドエステル、ピレタニドジメチルグリコールアミドエステル、ピレタニドピバキセチルエステル、ピレタニドプロパキセチルエステル、ピレタニドメトキシポリエチレンオキシn-1-エチルエステル、ピレタニドベンジルトリメチルアンモニウム塩およびピレタニドセチルトリメチルアンモニウム塩。特定の実施形態において、当該化合物はピレチニド、ピレタニド[-C=O-SH]チオ酸、ピレタニド-S-メチルチオエステル、ピレタニド-S-シアノメチルチオエステル、ピレタニド-S-エチルチオエステル、ピレタニド-S-イソアミルチオエステル、ピレタニド-S-オクチルチオエステル、ピレタニド-S-ベンジルチオエステル、ピレタニド-S-モルフォリノエチルチオエステル、ピレタニド-S-[3-ジメチルアミノプロピル]チオエステル、ピレタニド-S-N,N-ジエチルグリコールアミドチオエステル、ピレタニド-S-N,N-ジメチルグリコールアミドチオエステル、ピレタニド-S-ピバキセチルチオエステル、ピレタニド-S-プロパキセチルチオエステル、ピレタニド-S-[メトキシポリエチレンオキシn-1-エチル]チオエステル、ピレタニド[-C=O-S-]ベンジルトリメチルアンモニウムチオ酸塩およびピレタニド[-C=O-S-]セチルトリメチルアンモニウムチオ酸塩、準安定性ピレタニド[-C=S-OH]チオ酸、ピレタニド-O-メチルチオエステル、ピレタニド-O-シアノメチルチオエステル、ピレタニド-O-エチルチオエステル、ピレタニド-O-イソアミルチオエステル、ピレタニド-O-オクチルチオエステル、ピレタニド-O-ベンジルチオエステル、ピレタニド-O-モルフォリノエチルチオエステル、ピレタニド-O-[3-ジメチルアミノプロピル]チオエステル、ピレタニド-O-N,N-ジエチルグリコールアミドチオエステル、ピレタニド、O-N,N-ジメチルグリコールアミドチオエステル、ピレタニド-O-ピバキセチルチオエステル、ピレタニド-O-プロパキセチルチオエステル、ピレタニド-O-[メトキシポリエチレンオキシn-1-エチル]チオエステル、ピレタニド[-C=S-O-]ベンジルトリメチルアンモニウムチオ酸塩およびピレタニド[-C=S-O-]セチルトリメチルアンモニウムチオ酸塩、ピレタニドチオアルデヒド、ピレタニド[-C=S-SH]ジチオ酸、ピレタニドメチルジチオエステル、ピレタニドシアノメチルジチオエステル、ピレタニドエチルジチオエステル、ピレタニドイソアミルジチオエステル、ピレタニドオクチルジチオエステル、ピレタニドベンジルジチオエステル、ピレタニドジベンジルチオアミド、ピレタニドジエチルチオアミド、ピレタニドモルフォリノエチルジチオエステル、ピレタニド-3-ジメチルアミノプロピルジチオエステル、ピレタニド-N,N-ジエチルグリコールアミドジチオエステル、ピレタニド-N,N-ジメチルグリコールアミドジチオエステル、ピレタニドピバキセチルジチオエステル、ピレタニドプロパキセチルジチオエステル、ピレタニドメトキシポリエチレンオキシn-1-エチルジチオエステル、ピレタニドベンジルトリメチルアンモニウムジチオ酸塩およびピレタニドセチルトリメチルアンモニウムジチオ酸塩ではない、ならびにivテトラゾリル-置換アゾセミド、特にはメトキシメチルテトラゾリル-置換アゾセミド、メチルチオメチルテトラゾリル-置換アゾセミドおよびN-mPEG350-テトラゾリル-置換アゾセミド、アゾセミドベンジルトリメチルアンモニウム塩および/またはアゾセミドセチルトリメチルアンモニウム塩、ならびにvピリジン-置換トルセミド第四級アンモニウム塩またはそれに相当する分子内塩双性イオン、特にはメトキシメチルピリジニウムトルセミド塩、メチルチオメチルピリジニウムトルセミド塩およびN-mPEG350-ピリジニウムトルセミド塩。上記チアジド化合物は、ベンドロフルメチアジド、ベンズチアジド、クロロチアジド、ヒドロクロロチアジド、ヒドロフルメチアジド、メチルクロチアジド、ポリチアジド、トリクロロ-メチアジド、クロルタリドン、インダパミド、メトラゾン、およびキネサゾンならびにそれらの類似体からなる群より選ばれる、請求項1~6の何れか一項に記載の使用するための化合物。1つ以上のカルボニックアンヒドラーゼ阻害剤、特にはアセタゾマリド、ジクロルフェナミド、ドルゾラミド、ブリンゾラミド、および/またはメタゾラミドと組み合わせて用いられる、請求項1~10の何れか一項に記載の使用するための化合物。NKCC1の活性に拮抗する抗体、抗体フラグメントもしくはヒト化抗体、または、NKCC1発現を減少させる、siRNA、shRNAおよびアンチセンスRNAからなる群より選ばれるRNAである、請求項1~5の何れか一項に記載の使用するための化合物。CCC-相互作用タンパク質CIP1、CCC-相互作用タンパク質CIP1由来の機能ペプチド、N-エチルマレイミドNEM、およびスタウロスポリンから選ばれる、請求項1~5の何れか一項に記載の使用するための化合物。同時のまたは時間をずらした療法プロトコルにおける共治療プロトコルにおいて、1つ以上のGABA作動性作用物質および/または1つ以上のグリシン作用物質と組み合わせて用いられる、請求項1~13の何れか一項に記載の使用するための化合物。請求項1~14の何れか一項に記載の塩素イオン共輸送体NKCC1を調節する化合物を含有する医薬組成物。1つ以上のカルボニックアンヒドラーゼ阻害剤および/またはGABA作動性作用物質および/またはグリシン作用物質をさらに含有する、請求項15に記載の医薬組成物。液状、半液状、または粘質状の形態において、好ましくはゲル様状態において提供される、請求項15または16に記載の医薬組成物。好ましくは生物分解性ポリマー、好ましくはヒアルロン酸/ヒアルロン酸塩、レシチンゲル、ポリアラニン誘導体、プルロニック、ポリエチレングリコール、ポロキサマ、キトサン、キシログルカン、コラーゲン、フィブリン、ポリエステル、ポリラクチド、ポリグリコリドまたはそれらの共重合体PLGA、スクロース酢酸イソ酪酸エステル、およびグリセロールモノオレートからなる群より選ばれる生物分解性ポリマー、を含有する、請求項15~17の何れか一項に記載の医薬組成物。耳鳴の治療または予防に使用するための、請求項15~18の何れか一項に記載の医薬組成物。局所的に投与される、耳鳴の治療または予防に使用するための請求項19に記載の医薬組成物。中内耳の境界面に投与される、好ましくは正円窓膜および/または卵円窓膜に投与される、耳鳴の治療または予防に使用するための請求項20に記載の医薬組成物。治療に効果的な量の請求項1~14の何れか一項に記載された1つ以上の塩素イオン共輸送体を調節する化合物または請求項15~21の何れか一項に記載された医薬組成物を投与する工程を含む耳鳴の治療方法。カルボニックアンヒドラーゼ阻害剤および/またはGABA作動性作用物質および/またはグリシン作用物質を同時に投与する工程をさらに含む、請求項22に記載の耳鳴の治療方法。投与は全身的または局所的に行われる、好ましくは耳の上または中へ局所的に行われる、請求項22または23に記載の耳鳴の治療方法。1つ以上の塩素イオン輸送体を調節することができる化合物を同定およびキャラクタリゼーションするためのスクリーニング方法であって、a当該1つ以上の塩素イオン輸送体を安定して発現する細胞を用意する工程、b試験化合物を当該細胞に添加する工程、c輸送体カチオンを添加する工程、およびd細胞膜を横切る当該カチオンの輸送を測定する工程による、スクリーニング方法。i1つ以上の輸送体を異種発現する細胞を提供する工程、ii輸送体カチオンに結合する蛍光色素をさらに添加する工程、ならびにiiiカチオンの輸送の初速度を測定する工程およびiv別の輸送体の輸送体活性への干渉をブロックする工程:のうちの1つ以上の工程を行う、請求項25に記載のスクリーニング方法。上記1つ以上の塩素イオン輸送体は、NKCC1およびKCC2から選ばれる、請求項25または26に記載のスクリーニング方法。実施例<実施例1>目的ループ利尿薬フロセミドは耳鳴の可逆性の治療薬として提案されてきた。フロセミドは蝸牛内の電位を低下させることによって聴神経の炎症を和らげるとの仮定が立てられてきたRiseyetal1995。しかしながら、同時に、フロセミドの副作用として耳鳴があることも知られている。本発明者らは、耳鳴に対する新規な薬物療法の開発の出発点を特定するために、耳鳴を誘発しやすい蝸牛への損傷後、蝸牛内の塩素イオン共輸送体の発現が変化するのかどうか、そして、もし変化するのであればどのように変化するのかを解明しようと努めた。材料および方法消音ブースにおいて、麻酔を投与した13匹のメスの成体ウィスターラットの耳内に、SPL強度120dB、周波数10kHzの音を2時間継続的に曝露した。この曝露はラットに耳鳴を誘発させやすい例えば、Tanetal2007。この聴覚刺激は、上記動物の頭の高さで出るように調整した。麻酔を投与した4匹のコントロール動物を、スピーカーを切った状態で消音ブースに同じ時間置いた。14日後、音に対する曝露または偽曝露を行った動物を殺した。蝸牛を採取し、2パラホルムアルデヒドPFA、125mMスクロース100mMのリン酸緩衝食塩水PBS,pH7.4に溶解に2時間浸漬することで固定した。これらの蝸牛はRapidBoneDecalcifierEurobio社,LesUlisCedex,フランス中で脱灰したのち、25スクロースを含むハンクス緩衝食塩水中で一晩インキュベートした。翌日、蝸牛をO.C.T.コンパウンドMilesLaboratories,Elkhart,Ind,社,アメリカに包埋した。使用前に、insituハイブリダイゼーションおよび免疫組織化学のために、組織サンプルを10μmの厚さにおいて凍結切片にし、SuperFrost登録商標/plus顕微鏡スライドに載せて、-20°Cで保管した。免疫組織化学のために、スライドを室温で30分間乾燥させた。その後、スライドをPBS0.1トリトンを用いて3分間透過化処理し、PBSで洗浄して、1BSA/PBSでブロッキングした。スライドを、0.5BSA/PBSで希釈した一次抗体KCC21:150、UpstateBiotechnology社,ハンブルク,ドイツと共に一晩インキュベートした。翌日、スライドをPBSで洗浄し、二次抗体Cy3-抗ウサギ、JacksonImmunoResearch社,サフォーク,イギリスと共に1時間インキュベートした。スライドを再度洗浄し、DAPIを含むVectashieldVectorLaboratories社,バーリンゲーム,カリフォルニア州,アメリカに載せた。スライドを、オリンパスAX70顕微鏡を用いて観察した。insituハイブリダイゼーションのために、スライドを、アルカリフォスファターゼと共役させた抗ジゴキシゲニンン抗体1:750、Roche社,マンハイム,ドイツと共にインキュベートした。その後、ニトロブルーテトラゾリウム塩と5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルリン酸ナトリウムSigma社,ミュンヘン,ドイツとを含む基質溶液中で切片を発色させた。切片を異なる時間枠で観察し、基質が発色生成物になる様子をモニターした。コントロールおよび曝露動物からの切片も同時に停止し、スライドに載せて、オリンパスAX70顕微鏡を用いて観察した。ウェスタンブロット分析のために、XCellSureLockMiniCellおよびNuPageNovex4-12Bis-TrisGelInvitrogen社,カールスルーエ,ドイツを用いたSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動製造元の指示通りに用いたによって、ラットの蝸牛および脳組織由来のタンパク質を分離させた。免疫ブロッティングのために、XcellIIBlotModuleInvitrogen社を用いて、タンパク質1レーンあたり40μgをポリフッ化ビニリデン転写膜上に転写した。KCC2抗体Blaesseetal2006;HGNothwang氏およびEFriauf氏の御厚意により提供を、適切な希釈液中、4°Cで一晩プレインキュベートした。EnhancedChemiluminescencePlusWesternBlottingDetectionReagentAmershamBiosciences社,フライブルク,ドイツを用いて、結合した抗体を可視化した。定量化のために、Cell^FソフトウェアOlympus社,ハンブルク,ドイツを用いて、濃度測定分析を行った。コントロールのバンドの強さと、曝露組織のバンドの強さを測定し、互いに比較した。結果耳鳴を誘発しやすい過度の騒音に曝露された動物は、曝露から14日後、明らかなKCC2の下方制御を示した図1a。免疫組織化学は、曝露されていないコントロール動物と比較して、内有毛細胞におけるKCC2タンパク質の発現が著しく減少したことを示した。また、insituハイブリダイゼーションによって、騒音に曝露された蝸牛の螺旋神経節ニューロンにおいて、曝露されていない蝸牛と比べると、明らかなKCC2mRNAの下方制御が示された。ウェスタンブロット分析によって、図1bに示すように、騒音に曝露された動物の蝸牛組織におけるKCC2タンパク質が、コントロール動物と比較して、明確に下方制御7.8倍現象されることが示された。この実験の結果は、聴覚外傷などによる蝸牛への損傷に伴い、KCC2の発現が下方制御させることを初めて示すものであった。この実験の結果に対し、この下方制御が失聴に関連するのか、耳鳴に関連するのか、または両方に関連するのかについての解明が残る。したがって、さらなる解明を行うために、実施例2を設定した。<実施例2>目的第2の実験のねらいは、最初の実験で認められたKCC2の下方制御が失聴の病態生理に関連するのか、耳鳴の病態生理に関連するのか、または両方の病態生理に関連するかどうかを分析することである。この下方制御は、フロセミドによる耳鳴の誘発が一般的に推測されているような蝸牛内電位の緩和例えば、Riseyetal1995に関連することよりも、むしろフロセミドがKCC2に及ぼす公知の効果に関連することの示唆となり得るものである。この目的のため、Ruttigeretal2003に記載されている行動モデルを用いて、耳鳴を有する動物と耳鳴がない動物とを識別した。材料および方法36匹のメスの成体ウィスターラットを、一定の音が発生している際は液体給餌器に積極的にアクセスするよう条件付けチャンバ内で訓練を行った。無音の間は報酬を与えなかった。条件付けは、動物が無音の期間よりも音が存在する期間に報酬用の給餌器にアクセスするようになったところで完了した。0日目、条件付けをされたラットに麻酔を投与し、消音ボックスにおいて、SPL強度120dB、周波数10kHzの音を、ラットの耳内に1時間A群;n=18または1.5時間B群;n=18継続的に曝露した。音響刺激は動物の頭の高さで出るように調整された。全ての動物を耳鳴行動に応じてグループ分した。A群においては、5匹が耳鳴の症状を示し、10匹が耳鳴の症状がなく、3匹が死亡した。一方、B群においては、5匹が耳鳴を発症し、12匹が耳鳴の症状がなく、1匹が死亡した。A群の動物を音響曝露または偽曝露から6日後に殺し、B群の動物を音響曝露または偽曝露から30日後に殺した。組織の調製、免疫組織化学、およびinsituハイブリダイゼーションを、実施例1に記載のものと同様に行った。内有毛細胞のリボンシナプスの計数を行った。切片を、落射蛍光照明倍率100×、NA=1.35と電動Z軸とを装備したオリンパスAX70顕微鏡を用いて観察した。CCDカメラおよび画像ソフトウェアCell^FOSISGmbH社,ミュンスター,ドイツを用いて、画像を取得した。蝸牛の凍結切片上でオトフェルリンおよびCtBP2/RIBEYEの免疫陽性スポットの計数は、Z軸に沿った画像のスタックZ軸スタックにおいて、IHCの核の全体およびそれを超える範囲を対象とし、距離8μmにわたって画像化することによって行った。通常Z軸スタックは1層あたり0.276μmの増分30層で構成されており、各層について、蛍光色素ごとの画像を取得した。Z軸スタックは、最隣接アルゴリズムを用いたCell^F’sRIDEモジュールOSISGmbH社,ミュンスター,ドイツを用いて3次元のデコンヴォルーションを行った。結果A群およびB群の何れにおいても、騒音曝露から6日後および30日後には、耳鳴の行動相関を示す動物において、耳鳴行動を示さない動物と比べて、KCC2の発現が著しく下方制御された図2aに示されるとおり。免疫組織化学は、耳鳴症状のない動物と比べて、耳鳴症状のある動物の内有毛細胞におけるKCC2タンパク質の発現が明らかに低下していることを示す。insituハイブリダイゼーションにおいてもまた、耳鳴症状のない蝸牛に比べて、耳鳴症状のある動物の螺旋神経節ニューロンにおけるKCC2mRNAの下方制御が明らかになった。さらに、耳鳴症状のない動物に比べて、聴力に障害を受けた耳鳴症状を有する動物のIHCリボンは、中回転および基底回転において大幅に減少した動物数n=4、二元ANOVAに関してp<0.001、試験後のスチューデントのt検定両側検定に関してp<0.02、何れもα=0.05図2b参照。結論として、実施例2から得られた結果は、騒音障害に伴う内有毛細胞および螺旋神経節ニューロンにおけるKCC2の下方制御は、失聴に何ら関連がなく、むしろ耳鳴の病理生態学に固有であることを初めて示した。この発見は、NKCC1およびKCC2に作用するフロセミドなどの利尿剤による耳鳴の誘発は、KCC2阻害の結果である可能性が高く、一方で上記利尿剤の反対の効果は、典型的には異なる濃度でのNKCC1拮抗によるものであることを示唆している。結果として、細胞内のCl-レベルを低下させるために、耳鳴治療の戦略は、NKCC1の下方制御からなる。<実施例3>目的第3の実験のねらいは、耳鳴を誘発する騒音外傷を受けた後の蝸牛細胞内の塩素イオンレベルに対する薬理学的調節が耳鳴を抑制できるかどうかを分析することである。ブメタニドは、KCC2に比べてNKCC1に対してかなり高い親和性を有するPayneetal2003ため、本発明のこれまでの発見を鑑みると、NKCC1に対する阻害効果がKCC2に対するあらゆる望ましくない阻害効果よりも優位となることから、ブメタニドの投与によって細胞内のCl-レベルが低下することを考慮にいれるべきである。材料および方法20匹のメスの成体ウィスターラットに、これまでの実施例と同様に麻酔を投与した。まず、聴性脳幹反応ABRの測定を行った。実施例2と同様に、ラットに、消音ブースにおいて、SPL強度120dB、周波数10kHzの音を15時間継続的に曝露しA群;n=10、また同様の設定で偽曝露B群;n=10を行った。騒音外傷後直ちに、動物に対し2通り、すなわち人工外リンパ液APまたはブメタニドSigmaB3023Lot027Ko988の何れかで処理した。APは、Guittonetal2003140mMNaCl、4mMKCl、2mMCaCl2、2mMMMgCl2、10mMグルコース、10mMHEPESに従って調製した。ブメタニド300μMは、50mgのブメタニド粉末を6.87mlのAPに希釈し、この20mMのストック溶液を1:66になるようにAPストック溶液を15.15μL、およびAPを984.85μLに希釈して調製した。A群およびB群から5匹ずつ計10匹にAPを与え、A群およびB群から5匹ずつ計10匹にブメタニドを与えた。局所処理投与のために、耳の後ろの毛を除去し、耳後法で骨胞を露出させた。正円窓窩のちょうど上側の骨胞に、小さな穴を注意深く開けた直径0.6~1mm。粘膜を切開し、正円窓周辺の領域の分泌液を注意深く乾燥させた。上記穴を通じて、小さなゲル泡ペレットGelitaTampon;Braun社,メルスンゲン,ドイツを正円窓窩に挿入した。ゲルローダーチップを備えた精密ピペットを用いてブメタニド溶液5~8μlまたはAPを上記ゲル泡につけて、ゲルの下に気泡が入るのを避けた。外観検査では、正円窓窩が完全に充填され、ゲルで覆われていることが示された。耳骨胞の穴はその後筋肉組織で外から覆われ、傷口は手術用の糸Vicryl,JohnsonJohnson社,ノルダーシュテト,ドイツで縫合された。手術後、ラットの覚醒時まで体温を制御し保温した。ABR測定のために、麻酔薬としてドミトールのみを与えた。手術の15分前、フェンタニルを追加で皮下投与s.c.した。手術後、リマダイルを鎮痛剤として皮下投与した。動物を数時間睡眠状態に置いた後、ドミトールの効果は、皮下投与されたアンチセダンによって拮抗された。QiagenRneasyMiniKitQiagen社,ヒルデン,ドイツを用いて、全RNAを前述のとおり単離したTanetal2007。簡潔に述べると、β-メルカプトエタノールと混合した溶解物バッファを用いて組織を溶解した。凍結融解の工程を3回行ったのち、サンプルを遠心分離し、上清を洗浄用バッファを用いたさらなる洗浄工程のために残した。RNAを、40μlのRNaseフリー水で溶離させた。SensiscriptRTKitQuiagen社を用いて、全RNAを前述のとおりcDNAに転写したTanetal2007。簡潔に述べると、50ngのRNAを、RNaseフリー水およびOligodT15Primerと共に、65°Cで10分間インキュベートした。RNAsinおよびSensiscriptを添加したのち、酵素サンプルを37°Cで1時間インキュベートした。リアルタイムPCR反応については、1ウェルあたり、12.5μlのサイバーグリーンQuantiFastSybrGreen,Qiagen社、1μlのPrimerMix、7.5μlのddH2O、および4μlのcDNAを用いた。全てのサンプルは、ネガティブコントロールcDNA非添加と同様、用いた各プライマーについて、3回試験した。ハウスキーピング遺伝子として、18SrRNAおよびβ-アクチンを用いた。免疫組織化学を上述のとおり行い、実験2と同様、内有毛細胞のリボンシナプスの計数を行った。前述のとおり、麻酔を投与した動物においてABRを記録したKnipperetal2000、Schimmangetal2003。端的にいえば、動物の耳、頭頂部および背中の皮下に設置した銀線電極を用いて、フリーフィールドでのクリック音100μsおよび純音3ms、1ms勾配の音響刺激に対する電気脳幹反応を記録した。増幅後100,000倍、与えられた各音圧5dB刻みでSPL0~100dBにおける反復回数64~256の平均シグナルを求めた。閾値は、騒音レベルとは視覚的に明らかに異なる電位を発生させた最も低い音圧によって決定した。ABRの測定の時点は、それぞれ、騒音直前、偽外傷、処理直後、処理後1日、2日、7日、および15日とした。結果偽曝露された耳B群において、APまたはブメタニドのどちらで処理されたかにかかわらず、処理後15日経過した蝸牛組織サンプルからのKCC2のリアルタイムPCRに違いはみられなかった。しかしながら、騒音に曝露された耳A群において、偽曝露のみと比較して統計的に有意なKCC2の下方制御が、APで処理した耳においてみられたスチューデントのt検定両側検定においてp<0.05が、ブメタニドで処理した耳ではみられなかった。騒音に曝露され、ブメタニドで処理した耳におけるKCC2の発現は、偽曝露された耳におけるレベルと類似していたが、騒音に曝露され、APで処理した耳とは統計学的に有意に異なっていたp<0.01図3a参照。驚くことに、内有毛細胞のリボンシナプスの計数を行った際にも同様の結果が認められた図3b参照。APで処理した耳のうち、騒音に曝露された耳の蝸牛の中回転および基底回転において、偽曝露動物と比べて有意なリボン数の減少がみられたp<0.01。反対に、騒音に曝露され、ブメタニドが投与された耳における減少は、偽曝露動物との比較において有意ではなかった。しかしながら、騒音に曝露されAPで処理した耳と、騒音に曝露されブメタニドで処理した耳とでは、リボンの数に有意な差があったp<0.02。頂回転の内有毛細胞は、高周波の外傷に対してほとんど影響を受けないため、頂回転ではそれほど大きな変化は示されなかった。要約すると、これらの結果は、内有毛細胞における細胞内Cl-濃度の薬理学的調節は実行可能であり、しかも、内有毛細胞におけるKCC2発現の上方制御は、NKCC1を阻害することによって達成することができることを、初めて示すものである。このような阻害は、NKCC1拮抗物質によって発揮されるが、NKCC1拮抗物質はKCC2活性または発現の増加に対しては直接的な効果を発揮しない。むしろ、当該効果は、NKCC1阻害によって仲介され、それによってKCC2活性または発現に影響を及ぼすすなわち、増加。NKCC1阻害剤ブメタニドの適用は内有毛細胞のリボンの喪失の低減という結果をもたらした。耳鳴の存在についてのバイオマーカーとして、この結果は、この治療戦略によって耳鳴の緩和および抑制が見込めることを示している。"