アグロバクテリウム法を用いたニホンナシの形質転換方法であって、導入遺伝子を含むTDNAを保持するアグロバクテリウムの存在下でニホンナシ由来植物細胞又は植物体部分を超音波処理し、さらに該植物細胞又は植物体部分を、カルシウムイオンキレート剤を含み、かつカルシウムイオンを除いた共存培地を用いて該アグロバクテリウムと共存培養することを特徴とする、方法。共存培地が、MS培地又は希釈無機塩濃度を有するMS培地を基本培地として調製したものである、請求項1記載の方法。カルシウムイオンキレート剤がエチレングリコールビスβアミノエチルエーテルNNNN四酢酸である、請求項1又は2記載の方法。前記植物細胞又は植物体部分が子葉由来のものである、請求項1~3のいずれか1項記載の方法。本発明は、ニホンナシの形質転換法を提供することを課題とする。本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、ニホンナシ由来の細胞をカルシウム不含でEGTAを含有する共存培地を使用してアグロバクテリウムと共存培養し、かつ超音波処理を施すことにより、ニホンナシについて高効率で安定した形質転換を実現することができることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下を包含する。アグロバクテリウム法を用いたニホンナシの形質転換方法であって、導入遺伝子を含むTDNAを保持するアグロバクテリウムの存在下でニホンナシ由来植物細胞又は植物体部分を超音波処理し、さらに該植物細胞又は植物体部分を、カルシウムイオンキレート剤を含み、かつカルシウムイオンを除いた共存培地を用いて該アグロバクテリウムと共存培養することを特徴とする、方法。ここで共存培地は、MS培地又は希釈無機塩濃度を有するMS培地を基本培地として調製したものであることが好ましい。この方法の好ましい態様では、カルシウムイオンキレート剤はエチレングリコールビスβアミノエチルエーテルNNNN四酢酸である。この方法では、子葉由来の、ニホンナシ由来植物細胞又は植物体部分を用いることも好ましい。本発明を用いれば、ニホンナシの安定な形質転換体を作製することができる。以下、本発明を詳細に説明する。本発明は、アグロバクテリウム法に基づくニホンナシの形質転換法に関する。本発明では、ニホンナシにアグロバクテリウム法を適用する際、アグロバクテリウム存在下で超音波処理を行い、さらに、カルシウムイオンを除き、かつカルシウムイオンのキレート剤好ましくはEGTAを含めた共存培地共存培養培地を用いて共存培養するという複合的な改良を施すことにより、ニホンナシへのアグロバクテリウムの感染効率を大幅に増加させ、ニホンナシの形質転換を可能にするものである。アグロバクテリウム法は、植物細胞への遺伝子導入のために一般的に用いられている形質転換法であり、アグロバクテリウムが自らの有する遺伝子をTDNAとして感染した植物体のゲノムに組み込むことができる性質を利用したものである。アグロバクテリウム法では、アグロバクテリウムを感染させた植物細胞又は植物組織において、そのアグロバクテリウムが持つプラスミドベクター又はそのゲノム中に保持された、RB右ボーダー配列とLB左ボーダー配列で挟まれたDNA領域が切り離され、TDNAとして植物細胞のゲノム中に高頻度に組み込まれる。RBは、TDNAがアグロバクテリウムから植物ゲノム内へと伝達される際、伝達の開始点として機能する25塩基の配列であり、LBは、TDNAがアグロバクテリウムから植物ゲノムへと伝達される際、伝達の終止点として機能する25塩基の配列である。植物ゲノムに導入される際のTDNAの左端がLB、右端がRBとなる。アグロバクテリウム法は、アグロバクテリウムが感染可能な植物に対して広く適用することができる。本発明では、ニホンナシPyruspyrifoliaNakaiをアグロバクテリウム法による形質転換の対象とする。本発明においてニホンナシは、ニホンナシと他のナシ属種限定するものではないが、例えば、マメナシPyruscalleryanaDecne、マンシュウマメナシPyrusbetulaefoliaBunge、チュウゴクナシPyrusussuriensisMaxim、セイヨウナシPyruscommunisLなどとの雑種も包含しうる。ニホンナシの例としては、限定するものではないが、二宮、なつしずく、幸水、伯帝竜、安下庄支那梨、晩三吉、豊水、二十世紀、新高、あきづき、王秋等の任意の栽培品種が挙げられる。本発明の方法では、ニホンナシに導入すべき目的の遺伝子導入遺伝子を含むTDNAを保持するアグロバクテリウムを、感染に使用する。本発明においてTDNAとは、RBとLBを両端とし、その間に、いわゆる発現カセットすなわち、プロモーター及びターミネーターの制御下に遺伝子を配置した核酸構築物を含むDNAである。TDNAは、1つ又は2つ以上の発現カセットを含んでよい。TDNAは、ニホンナシに導入すべき遺伝子導入遺伝子を含む発現カセットに加えて、薬剤耐性遺伝子例えば、カナマイシン耐性遺伝子NptII、ハイグロマイシン耐性遺伝子等を始めとする選択マーカー遺伝子及び/又はGUS遺伝子やGFP遺伝子等のレポーター遺伝子を含む発現カセットを含むことも好ましい。TDNA中の発現カセットは、任意の構成的プロモーター又は一過性プロモーター好ましくは、植物細胞で遺伝子発現を誘導可能な植物機能性プロモーター、又は大腸菌等の細菌若しくは真菌で遺伝子発現を誘導可能な細菌機能性プロモーター若しくは真菌機能性プロモーター、又は広宿主域プロモーターを含んでよく、例えば構成的植物機能性プロモーターとしては、カリフラワーモザイクウイルスCaMV35SプロモーターOdellJTetalNature313810812、アグロバクテリウムTiプラスミド由来ノパリンシンターゼ遺伝子のプロモーターPnos、トウモロコシ由来ユビキチン遺伝子のプロモーター、イネ由来のアクチン遺伝子のプロモーター、キャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター、タバコPR1aプロモーター、シロイヌナズナPR1プロモーター等が挙げられる。同様にTDNA中の発現カセットは、任意のターミネーター、好ましくは植物細胞で機能性の植物機能性ターミネーターを含んでよく、例えば、ノパリンシンターゼNOS遺伝子ターミネーターを含んでもよい。導入遺伝子を含むTDNAを保持するアグロバクテリウムの作製は、常法により行うことができる。例えば導入遺伝子は、アグロバクテリウムのTDNA上に保持させることができる中間ベクター法。この場合、TDNAはアグロバクテリウムが有するTiプラスミド中に含まれうる。Tiプラスミドを保持するアグロバクテリウムに、導入遺伝子を組み込んだ中間ベクターをヘルパープラスミドを用いて導入し、相同組換えによりTiプラスミド中のTDNA上に導入遺伝子を組み込ませ、TDNA上に導入遺伝子が組み込まれたTiプラスミドを保持するアグロバクテリウムを選抜することにより、導入遺伝子を含むTDNAを保持するアグロバクテリウムを作製することができる。このようなアグロバクテリウムを用いる遺伝子導入法である中間ベクター法の詳細は、例えばDeBlockMetalEMBOJ316811689に開示されている。一方、アグロバクテリウムを用いる別の遺伝子導入法であるバイナリーベクター法では、バイナリーベクターのTDNAに導入遺伝子を挿入し、それを、Tiプラスミドを欠損したアグロバクテリウムに、ヘルパープラスミドを用いて導入することにより、導入遺伝子を含むTDNAを保持するアグロバクテリウムを作製することができる。バイナリーベクター法の詳細は、例えばdeFramondAetalBioTechnology1262269、HoekcmaAeta1Nature303179180、DeblaereRetalMethodsinEnzymol153277292、RogersSGetalMethodsinEnzymol153253277等に記載されている。あるいは導入遺伝子を含むTDNAを、アグロバクテリウムのゲノム染色体中に保持させてもよい。この方法は、例えばOltmannsHetalPlantPhysiol15211581166に従って実施することができる。導入遺伝子を含むTDNAを保持するアグロバクテリウムを、ニホンナシ由来植物細胞又は植物体部分に感染させることによって、TDNA上の導入遺伝子を植物ゲノム中に組み込ませることができる。これによりニホンナシの形質転換体を作製できる。本発明においてアグロバクテリウム感染に供する植物細胞又は植物体部分は、ニホンナシから採取及び/又は調製された任意の植物細胞又は植物体部分であってよい。ここでニホンナシ由来植物細胞は、ニホンナシの任意の植物器官又は植物組織例えば、葉、茎、根、花序、果実、種子、腋芽、胚、花粉、子葉、分裂組織等から単離した細胞、その培養細胞、又はそこから調製したプロトプラスト若しくはカルスであってもよい。またニホンナシ由来植物体部分は、ニホンナシから採取された植物体部分植物体の一部、例えば葉、茎、根、花序、果実、種子、腋芽、胚、花粉、若しくは子葉等の任意の植物器官又はその一部である植物組織例えば分裂組織等であってもよいし、植物体から単離されていない植物体の一部分をなお構成している植物器官又は植物組織であってもよい。ニホンナシ由来植物体部分は、例えば、種子から採取した子葉好ましくは胚軸部を除いたもの又はその一部切片等であることも好ましい。ニホンナシ由来植物体部分は、ニホンナシ植物体から切り取られ、培地に置床された外植片例えば、シュート、リーフディスク等であってもよい。アグロバクテリウムのニホンナシ植物細胞又は植物体部分への感染は、基本的には、植物細胞又は植物体部分にアグロバクテリウムを接種した後、共存培養を行うことによって引き起こすことができる。これらの処理は、無菌条件下で行うことが好ましい。植物細胞又は植物体部分へのアグロバクテリウムの接種は、通常は、培養したアグロバクテリウムの菌液を植物細胞又は植物体部分と接触させることによって行えばよい。具体的には、アグロバクテリウム菌液中に植物細胞又は植物体部分を浸漬してもよいし、植物細胞又は植物体部分にアグロバクテリウム菌液を添加又は塗布してもよい。アグロバクテリウム菌液の調製は、常法により行えばよい。例えばアグロバクテリウムをYEP培地又はYEB培地等に植菌して28°Cで一晩~24時間培養することにより菌液を調製できる。このように培養したアグロバクテリウムを遠心してペレット化し、それをカルシウムイオンを除去した培養培地例えば、110MSCa63シュクロース36グルコース10mMMES2モルホリノエタンスルホン酸001プルロニックF68100μMアセトシリンゴンに懸濁した液をアグロバクテリウム菌液として用いることも好ましい。本発明の方法では、植物細胞又は植物体部分にアグロバクテリウムを接種した後、そのアグロバクテリウムの存在下でニホンナシ由来植物細胞又は植物体部分に対して超音波処理を行う。超音波処理は、限定するものではないが、例えば、発振周波数20~50KHz、好ましくは30~40KHz、より好ましくは38KHzを用いて行うことができる。超音波処理は、通常は10秒以上、好ましくは10秒~30秒、より好ましくは15秒~25秒、例えば20秒にわたって行う。超音波処理は、例えば、市販の超音波洗浄器を使用して実施することができる。本発明の方法では、アグロバクテリウムの接種後のニホンナシ由来植物細胞又は植物体部分を、好ましくは上記超音波処理後、カルシウムイオンキレート剤を加えかつカルシウムイオンを除くように改変した共存培地を用いて、該アグロバクテリウムと共存培養する。共存培地とは、アグロバクテリウム法で共存培養のために使用されうる共存培地共存培養培地を意味する。共存培地は、植物組織培養培地を基本培地として調製することができる。共存培地を調製するための基本培地となる植物組織培養培地は、無機塩類ビタミン類、アミノ酸類等を含むである。基本培地としては、MS培地MurashigeSkoog培地、N6培地、L6培地、SB培地、R2培地、Tuleeke培地、SH培地、Knop培地、TukeyCox培地、ガンボーグB5培地、Nitsch培地、White培地、LP培地、及びKNUDSONC培地等、並びにそれらの培地について無機塩濃度を希釈例えば12~120に希釈した培地希釈無機塩濃度を有する培地が挙げられるが、これらに限定されるものではない。共存培地を調製するための基本培地としては、MS培地又はその希釈無機塩濃度を有するMS培地例えば、MS無機塩を12濃度に希釈した12MS培地、MS無機塩を14濃度に希釈した14MS培地、MS無機塩濃度を110濃度に希釈した110MS培地などがより好ましい。共存培地は、このような基本培地に、炭素原シュクロース、グルコースなど、植物成長促進剤として機能するサイトカイニン類やオーキシン類のような植物ホルモン例えば、ベンジルアデニンBA、チジアズロンTDZ、ナフタレン酢酸NAA、インドール酢酸IBA、アセトシリンゴン等のフェノール類や界面活性剤、固体化するための寒天等のアグロバクテリウム法で共存培地に一般的に配合される成分を適宜選択して添加することにより調製することができる。基本培地として調製するとは、基本培地として用いられる培地の組成に、必要に応じてこれらの追加的な培地成分を加えることにより培地共存培地を調製することを意味する。本発明では、共存培養に用いる共存培地に、カルシウムイオンキレート剤、例えばエチレングリコールビスβアミノエチルエーテルNNNN四酢酸EGTA、エチレンジアミンNNNN四酢酸二ナトリウム塩二水和物EDTA、12ビスエタンNNNN四酢酸BAPTA、12ビスエタンNNNN四酢酸テトラアセトキシメチルエステルMAPTAM等を、含有させる。カルシウムイオンキレート剤例えばEGTAは、限定するものではないが、01~100mM、例えば1~50mMの濃度で共存培地に含有させることが好ましい。カルシウムイオンキレート剤に代えて、又はそれに加えて、カルシウムキレート剤と同等の効果を持つカルシウムチャネル阻害剤ベラパミル、ジルチアゼム、HATPアーゼ阻害剤バナジン酸、カルモジュリン阻害剤W7、プロテインキナーゼ阻害剤スタウロスポリン等を利用することもできる。本発明では、さらに、共存培養に用いる共存培地について、カルシウムイオンをその組成から除く共存培地にカルシウムイオンを含まない。共存培地の調製に用いる基本培地は無機塩類を含むため、無機塩類中のカルシウムイオンを排除することにより、カルシウムイオンを除いた共存培地の調製が可能になる。カルシウムイオンの除去は、例えば、無機塩類中の塩化カルシウム等、カルシウムイオンを含んだ塩を加えずに培地を作成することによって行うことができる。本発明の方法では、上記のような所定の共存培地を用いて、超音波処理したニホンナシ由来植物細胞又は植物体部分とアグロバクテリウムとの共存培養を行う。共存培養の条件は当業者であれば適宜調整することができるが、例えば、18~28°C、好ましくは24~27°C、より好ましくは26°Cの温度条件下で共存培養を行うことができる。共存培養は暗黒下で実施することがより好ましい。共存培養は、限定するものではないが、例えば1~10日間、好ましくは3~7日間、より好ましくは4~6日間かけて行えばよい。従来、形質転換が困難なセイヨウオトギリソウにおいて、アグロバクテリウム感染に対して植物側がオキシダティブバーストと呼ばれる一種の酸化反応等に基づく防御反応を起こしている可能性が示唆されているFranklinGetalPlanta22714011408。本発明では、共存培地中に含有させるカルシウムイオンキレート剤EGTA等により、カルシウムイオンの細胞内流入を抑制し、ニホンナシのアグロバクテリウム感染に対するこのオキシダティブバースト等の防御反応を抑制することができる。さらに、共存培地からカルシウムイオンを除くことによっても、カルシウムイオンの細胞内流入を抑制し、オキシダティブバースト等の防御反応を抑制する。この結果、アグロバクテリウムの感染効率が顕著に増加し、形質転換が誘導される。共存培養完了後、ニホンナシ由来植物細胞又は植物体部分を、培養培地で洗浄し、次いで再分化培地を用いた継代培養により再分化させ、植物体へと育成することが好ましい。再分化培地での培養は、限定するものではないが、例えば18°C~28°C、暗黒条件下で行うことが好ましい。再分化培地としては、MS培地等の植物培養培地に、植物ホルモン限定するものではないが、NAAやBA、TDZ等、アグロバクテリウム殺菌用の抗生物質カルベシリン、クラホラン等及び形質転換体を選択するための抗生物質カナマイシン、ハイグロマイシン等を添加した培地を用いることができる。このようにして得られる再分化個体について、形質転換によって生じる形質例えば、蛍光を確認し、その形質が認められた割合を算出することにより形質転換率を決定することもできる。本発明における再分化個体は、再分化植物体、不定芽組織、不定根、及び移植したそれら組織から派生した組織等を包含する。本発明の形質転換方法によれば、例えば共存培養開始から2週間後の形質転換率を、平均値で40以上、より好ましくは60以上、さらに好ましくは75以上、特に好ましくは85以上とすることができる。本発明の形質転換方法では、例えば共存培養開始から2週間後の形質転換率が、EGTA無添加かつカルシウム含有培地を用いた超音波非処理の場合と比較して、好ましくは15倍以上、より好ましくは3倍以上、さらに好ましくは5倍以上、なお好ましくは10倍以上、特に好ましくは25倍以上に増大することが好ましい。また本発明の形質転換方法では、形質転換体をより長期例えば、5ヶ月以上にわたってより高率で維持することが可能になる。本発明の方法によれば、超音波処理とカルシウムイオンの細胞内流入抑制に基づき、ニホンナシの形質転換体の作製が可能になる。本発明はまた、このような本発明に係る形質転換方法によって得られるニホンナシ形質転換体ニホンナシの形質転換植物体、形質転換細胞、並びに形質転換植物体部分及び組織を包含するも提供する。以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。1.アグロバクテリウムの調製カナマイシン耐性遺伝子NPTIIとGFP遺伝子緑色蛍光タンパク質コード遺伝子を含有する核酸構築物発現カセット;図1を含むバイナリーベクターpBIN19sgfpChiuWLetalCurrentBiol6325330、HeimRetalNature373663664をアグロバクテリウムLBA4404株OomsGetalPlasmid71529に導入して、ニホンナシ形質転換に用いるアグロバクテリウムGFPLBA4404を作製した。またカナマイシン耐性遺伝子NPTII及びハイグロマイシン耐性遺伝子並びに35Sプロモーターにヒマのカタラーゼ遺伝子イントロンをつなげたβグルクロニダーゼ遺伝子GUSを含有するベクターpIG121OhtaSetalPlantCellPhysiol31805813をアグロバクテリウムLBA4404株に導入して、アグロバクテリウムpIG121LBA4404を作製した。アグロバクテリウムpIG121LBA4404又はGFPLBA4404は、50μgmlカナマイシン、50μgmlリファンピシン、300μgmlストレプトマイシンを含んだ3mlYEB培地で28°Cにて140rpmで一晩培養した。培養したアグロバクテリウムの菌液を室温で6000rpmで遠心し、上清を取り除いた。得られたアグロバクテリウムのペレットを、培地110MSCa63シュクロース36グルコース10mMMES2モルホリノエタンスルホン酸001プルロニックF68100μMアセトシリンゴンpH54又はpH58へ再懸濁し、アグロバクテリウムの濃度を108cfumlに調製した。このアグロバクテリウム懸濁液を、感染に用いた。2.培養茎切片でのアグロバクテリウム感染効率に対するEGTAの効果ニホンナシPyruspyrifoliaNakaiの栽培品種晩三吉について、寒天培地[MS培地MurashigeTandSkoogFPhysiolPlant154734971962;硝酸カリウム1900mgL、硝酸アンモニウム1650mgL、リン酸二水素カリウム170mgL、硫酸マグネシウム七水和物370mgL、塩化カルシウム二水和物440mgL、ホウ酸62mgL、硫酸マンガン一水和物169mgL、硫酸亜鉛七水和物86mgL、モリブデン酸ナトリウム二水和物025mgL、硫酸銅五水和物0025mgL、塩化コバルト六水和物0025mgL、ヨウ化カリウム083mgL、ミオイノシトール100mgL、グリシン2mgL、ニコチン酸05mgL、塩酸ピリドキシン05mgL、塩酸チアミン01mgL、エチレンジアミンNNNN四酢酸二ナトリウム塩二水和物373mgL、硫酸第一鉄七水和物278mgL、シュクロース30gL01μMNAAナフタレン酢酸10μMBAベンジルアデニン1μMGA3ジベレリン酸085寒天pH58]での培養によりシュートを形成させた。このシュートから葉を切り外し、茎部分を3~5mmの長さで切り出した。切り出した茎切片は、切り出し用培地110MSCa63シュクロース36グルコース10mMMES2モルホリノエタンスルホン酸pH58に浸漬した。またコントロールとして、セイヨウナシPyruscommunisLの栽培品種ラフランス及びバートレットからも、同様にして培養茎切片を調製した。このようにして調製した培養茎切片を、上記で調製したアグロバクテリウム懸濁液pIG121LBA4404に浸漬した。このアグロバクテリウム感染処理後、培養茎切片をアグロバクテリウム懸濁液から取り出し、3シュクロース10mMMES100μMアセトシリンゴン5μMNAA10μMBA085寒天を添加した、110MS培地、110MSCa培地、110MSEGTA培地、又は110MSCaEGTA培地に移植し、26°Cの暗黒下で5日間共存培養した。なお実施例で使用した110MS培地の組成は以下の通り:硝酸カリウム190mgL、硝酸アンモニウム165mgL、リン酸二水素カリウム17mgL、硫酸マグネシウム七水和物37mgL、塩化カルシウム二水和物44mgL、ホウ酸062mgL、硫酸マンガン一水和物169mgL、硫酸亜鉛七水和物086mgL、モリブデン酸ナトリウム二水和物0025mgL、硫酸銅五水和物00025mgL、塩化コバルト六水和物00025mgL、ヨウ化カリウム0083mgL、ミオイノシトール10mgL、グリシン02mgL、ニコチン酸005mgL、塩酸ピリドキシン005mgL、塩酸チアミン001mgL、エチレンジアミンNNNN四酢酸二ナトリウム塩二水和物373mgL、硫酸第一鉄七水和物278mgLpH58。また110MSCa培地の組成は以下の通り:硝酸カリウム190mgL、硝酸アンモニウム165mgL、リン酸二水素カリウム17mgL、硫酸マグネシウム七水和物37mgL、ホウ酸062mgL、硫酸マンガン一水和物169mgL、硫酸亜鉛七水和物086mgL、モリブデン酸ナトリウム二水和物0025mgL、硫酸銅五水和物00025mgL、塩化コバルト六水和物00025mgL、ヨウ化カリウム0083mgL、ミオイノシトール10mgL、グリシン02mgL、ニコチン酸005mgL、塩酸ピリドキシン005mgL、塩酸チアミン001mgL、エチレンジアミンNNNN四酢酸二ナトリウム塩二水和物373mgL、硫酸第一鉄七水和物278mgLpH58。なお、110MS培地からカルシウムイオンを除いたこの110MSCa培地は、無機塩類中の塩化カルシウム二水和物を加えずに培地を作成することにより調製した。110MSEGTA培地の組成は以下の通り:硝酸カリウム190mgL、硝酸アンモニウム165mgL、リン酸二水素カリウム17mgL、硫酸マグネシウム七水和物37mgL、塩化カルシウム二水和物44mgL、ホウ酸062mgL、硫酸マンガン一水和物169mgL、硫酸亜鉛七水和物086mgL、モリブデン酸ナトリウム二水和物0025mgL、硫酸銅五水和物00025mgL、塩化コバルト六水和物00025mgL、ヨウ化カリウム0083mgL、ミオイノシトール10mgL、グリシン02mgL、ニコチン酸005mgL、塩酸ピリドキシン005mgL、塩酸チアミン001mgL、エチレンジアミンNNNN四酢酸二ナトリウム塩二水和物373mgL、硫酸第一鉄七水和物278mgL、EGTA10mMpH58。110MSCaEGTA培地の組成は以下の通り:硝酸カリウム190mgL、硝酸アンモニウム165mgL、リン酸二水素カリウム17mgL、硫酸マグネシウム七水和物37mgL、ホウ酸062mgL、硫酸マンガン一水和物169mgL、硫酸亜鉛七水和物086mgL、モリブデン酸ナトリウム二水和物0025mgL、硫酸銅五水和物00025mgL、塩化コバルト六水和物00025mgL、ヨウ化カリウム0083mgL、ミオイノシトール10mgL、グリシン02mgL、ニコチン酸005mgL、塩酸ピリドキシン005mgL、塩酸チアミン001mgL、エチレンジアミンNNNN四酢酸二ナトリウム塩二水和物373mgL、硫酸第一鉄七水和物278mgL、EGTA10mMpH58。次いで組織化学解析としてGUSアッセイを行った。まず、抽出緩衝液50mMリン酸ナトリウムバッファーpH7010mMエチレンジアミンNNNN四酢酸二ナトリウム塩二水和物01TritonX10001ラウロイルサルコシン酸ナトリウム10mM2メルカプトエタノール中に、アグロバクテリウムとの共存培養後の培養茎切片を浸漬し、37°Cで1時間インキュベートした。その後、終濃度約1mMになるように発色基質原液XGluc5ブロモ4クロロ3インドリルβDグルクロニドを加えた上記抽出緩衝液に液交換し、37°Cで1~2日間さらにインキュベートした。その後、葉緑素を脱色するために70エタノールで培養茎切片を処理して脱色した。このGUSアッセイの結果、セイヨウナシのラフランス及びバートレットでは110MSEGTA培地、ニホンナシの晩三吉では110MSCaEGTA培地での共存培養の場合に、青い染色が示された。共存培養EGTAの添加によりアグロバクテリウム感染効率が顕著に増加することが示された。3.子葉のアグロバクテリウム感染効率に対する各種処理の効果ニホンナシの5つの栽培品種について、アグロバクテリウム感染効率に対する、EGTAエチレングリコールビスβアミノエチルエーテルNNNN四酢酸の共存培地への添加の効果、及びアグロバクテリウム感染処理時の超音波処理SAATの効果を以下のようにして調べた。共存培地として110MS培地又は110MSCa培地を使用し、10mMEGTAを添加した試験区と添加しない試験区を設けた。まずニホンナシPyruspyrifoliaNakaiの5つの栽培品種二宮、なつしずく、幸水、伯帝竜、安下庄支那梨;二宮はニホンナシとセイヨウナシとの雑種について子葉の調製を行った。各品種のナシの完熟種子を、01ハイドロキシキノリンで表面殺菌し、4°Cで保存しておいた。この完熟種子を、80エタノールで30秒処理した後、Tween20を数滴加えた次亜塩素酸ナトリウム溶液有効塩素約1で20分処理して滅菌した。その後滅菌水で種子を2回すすいだ。その後、種子から種皮、胚軸、及び子葉のうち胚軸に近い13の部分を取り除き、2枚ある子葉を1枚ずつに分け、1枚の子葉をさらに主脈に沿って2分割したものを1つの外植片とした。得られた外植片は切り出し用培地110MSCa63シュクロース36グルコース10mMMES2モルホリノエタンスルホン酸pH58に浸漬した。切り出し用培地から取り出した外植片子葉の一部を、上記で調製したアグロバクテリウム懸濁液に浸漬した。一部の外植片については、この段階で、超音波処理SAAT処理を施した。超音波処理は、iuchi超音波洗浄器US2発振周波数38KHzを使用して20秒間にわたって行った。次いでアグロバクテリウム懸濁液GFPLBA4404株中で15分間培養することにより、アグロバクテリウム感染処理を実施した。外植片をアグロバクテリウム懸濁液から取り出し、余分な菌液を滅菌濾紙で吸い取った後、それを3シュクロース10mMMES100μMアセトシリンゴン5μMNAA10μMBA又は10μMTDZ085寒天を添加した、110MS培地、110MSCa培地、110MSEGTA培地、又は110MSCaEGTAいずれもpH58培地に移植し、26°Cの暗黒下で5日間共存培養した。共存培養後、400μgmlクラホランを含むMS液体培地で外植片を洗浄した。その後、外植片を、再分化培地MS培地5μMNAA10μMBA又は10μMTDZ5μgmlカナマイシン200μgmlクラホラン085寒天にて、26°C、暗黒条件下で培養することにより、選抜及び再分化を誘導した。1ヶ月毎に1度、同組成の新しい再分化培地に継代した。得られる再分化個体について、再分化個体のLeicaMZFLIII実体蛍光顕微鏡48040nm励起フィルター、50nmバリアーフィルターを用いて、GFP蛍光を観察した。共存培地として110MSCa培地を使用した共存培養開始から2週間後、GFP蛍光が認められた再分化個体再分化植物体、不定芽組織、不定根、及び植えた組織から派生した組織を含むの割合を処理ごとに比較した結果を表1に示す。表1に示すように、EGTA添加及び超音波処理SAATのいずれも行っていない試験区では34、EGTA添加のみ行った試験区では44の再分化個体でGFP蛍光が認められた。また超音波処理SAATのみ行った試験区では64の再分化個体でGFP蛍光が認められ、EGTA添加及び超音波処理SAATの両方を行った試験区では70もの再分化個体でGFP蛍光が認められた。ここで、GFP蛍光が認められた割合は、アグロバクテリウムが感染し、形質転換が成立又は細胞内で導入遺伝子が発現した割合を示している。EGTAを添加し、カルシウムイオンを除いた植物組織培養培地中で植物組織片とアグロバクテリウムとの共存培養を行い、超音波処理SAATを施すことにより、アグロバクテリウム感染効率を顕著に増加させることができ、形質転換体の作製が可能になることが示された。さらに、比較のため、110MS培地を共存培地として用いた場合の共存培養開始の2週間後の再分化個体について、GFP蛍光が認められた割合も調べた。一例として安下庄支那梨についての結果を表2に示す。表2に示すように、EGTA添加及び超音波処理SAATのいずれも行っていない試験区では3、EGTA添加のみ行った試験区では10の再分化個体でGFP蛍光が認められた。また超音波処理SAATのみ行った試験区では22の再分化個体でGFP蛍光が認められ、EGTA添加及び超音波処理SAATの両方を行った試験区では36の再分化個体でGFP蛍光が認められた。これらの値は110MSCa培地を用いた場合表1よりも明らかに低かった。一方、共存培地として110MSCa培地を使用した感染開始から約5ヶ月後、GFP蛍光が認められた再分化個体の割合は、表3のとおりであった。表3に示すように、EGTA添加及び超音波処理SAATのいずれも行っていない試験区では17、EGTA添加のみ行った試験区では28の再分化個体でGFP蛍光が認められた。また超音波処理SAATのみ行った試験区では43の再分化個体でGFP蛍光が認められ、EGTA添加及び超音波処理SAATの両方を行った試験区では47もの再分化個体でGFP蛍光が認められた。外植片などの植物体部分について、アグロバクテリウム菌液中で超音波処理SAATを行い、かつ、EGTAを含有させカルシウムイオンを除いた共存培地中でアグロバクテリウムとの共存培養を行うことにより、アグロバクテリウム感染効率を顕著に増加させることができ、さらに、5ヶ月以上という長期間にわたって形質転換体を比較的高率で維持できることが示された。この結果をEGTA添加の有無、SAAT処理の有無で大きく分類すると、共存培養の5ヶ月後の、GFP蛍光を示した再分化個体は、EGTA添加試験区では122324377、EGTA無添加試験区では39122320、SAAT処理試験区では109238458、SAAT無処理試験区では52208250であった。EGTA添加、及び超音波処理による、アグロバクテリウム感染効率の増加効果が示された。4.子葉のアグロバクテリウム感染効率上記でGFP蛍光を示した再分化個体不定芽を、培地MS培地01μMNAA25~10μMBA085寒天pH585μgmlカナマイシン200μgmlクラホランにて16時間明期、8時間暗黒の日長で培養することにより、植物体への生育を促した。SAAT処理を行った後110MSCa培地10mMEGTA3シュクロース10mMMES100μMアセトシリンゴン5μMNAA10μMBA085寒天pH58の共存培地上で培養した外植片の中から、GFP蛍光を示したニホンナシ品種:安下庄支那梨の不定芽1個体を得た図2。この不定芽個体において、GFP蛍光が各発生段階を通じて検出された図2A~C。その培養葉よりゲノミックDNAをDNeasyplantminikitキアゲンを用いて抽出した。コントロールとして、圃場で生育させた非形質転換体の葉からゲノミックDNAをQIAGENGenomictipキアゲンを用いて抽出した。抽出方法はマニュアルに従った。得られたゲノミックDNAを鋳型として、GFP遺伝子を含む核酸構築物TDNAのニホンナシゲノム中への組み込みをPCRにより確認した。PCR用には、まずプライマーセットAとして、35Sプロモーター領域中に設計されたプライマー5GATGTGATATCTCCACTGACGTAAG3;配列番号1とNOSターミネーター中に設計されたプライマー5GTATAATTGCGGGACTCTAAT3;配列番号2を用いた。PCRのサイクル条件は、95°C5分を1サイクル、94°C1分、55°C1分、及び72°C15分を30サイクル、72°C7分を1サイクルで行った。このPCRにより、35SgfpNos遺伝子部分約1kbを増幅した。さらに、GFP遺伝子内に設計されたプライマーセットB5AGCTGACCCTGAAGTTCATC3配列番号3及び5GTGTTCTGCTGGTAGTGGTC3配列番号4を使用し、94°C5分を1サイクル、94°C1分、60°C1分、及び72°C2分を35サイクル、72°C7分を1サイクルで行うPCRにより、両プライマーで挟まれるGFP遺伝子部分約400bpを増幅した。形質転換体由来ゲノミックDNAから、GFP遺伝子を挟むように設計された35Sプロモーター領域中のプライマーとNOSターミネーター中のプライマーのプライマーセットにより、目的のサイズ約10kbの増幅産物が得られたことが示された図3A。またGFP遺伝子内に設計されたプライマーセットにより、形質転換体由来ゲノミックDNAから、目的のサイズ約04kbの増幅産物が得られたことが示された図3B。さらに、DIGDNALabelingKitRoche、及びGFP遺伝子内に設計したプローブを用いてゲノミックサザン解析を行った。まずゲノミックDNAをDraIで消化し、ナイロンメンブレンHybondN、アマシャムに転写した。プローブとしては、GFP遺伝子内に設計したプロモーター5AGCTGACCCTGAAGTTCATC3配列番号3及び5GTGTTCTGCTGGTAGTGGTC3配列番号4を用いて得られた増幅産物約400bpをDIGPCRでラベルしたものを用いた。ゲノミックサザン解析における、GFP遺伝子断片のプローブによるゲノミックDNA断片の検出結果から、ニホンナシ形質転換体におけるゲノミックDNAへの3コピーのGFP遺伝子の導入が確認できた図4。以上の結果から、得られた不定芽が、ゲノム中にGFP遺伝子を含む核酸構築物が組み込まれた形質転換体であることを確認できた。この不定芽は、MS培地01μMNAA25~10μMBA085寒天pH58の培地で増殖させることができ、芽接ぎを行うことにより鉢上げすることができた。したがって本願発明の方法を用いれば、ニホンナシについて目的の遺伝子をゲノム中に組み込んだ安定な形質転換体を作製できることが示された。