"ウイルスゲノムが:a転写を制御するプロモーターと機能的に結合した治療用製品をコードする第1の転写単位、該第1の転写単位はアブレーション認識部位を含有する;およびbプロモーターと機能的に結合したアブレーション認識部位に特異的なアブレーターをコードする第2の転写単位、ここで、転写および/もしくはアブレーション活性は薬理学的作用物質により制御されるを含んでなるヒト患者における使用に適当な複製欠損ウイルス組成物。該第1の転写単位が1つより多くのアブレーション認識部位を含有する、請求項1に記載の複製欠損ウイルス組成物。ゲノムが1つより多くのアブレーション認識部位を含んでなり、該1つより多くのアブレーション認識部位が第1のアブレーション認識部位および該第1のアブレーション認識部位と異なる第2のアブレーション認識部位を含んでなり、該ウイルスが第1のアブレーション認識部位に特異的な第1のアブレーターおよび第2の認識部位に特異的な第2のアブレーターをさらに含んでなる、請求項1に記載の複製欠損ウイルス組成物。アブレーターの転写が調節可能な系により制御される請求項1の複製欠損ウイルス組成物。調節可能な系がtet-オン/オフ系、tetR-KRAB系、ミフェプリストンRU486調節可能な系、タモキシフェン依存的な調節可能な系、ラパマイシンで調節可能な系もしくはエクジソンに基づく調節可能な系から選択される請求項4の複製欠損ウイルス組成物。アブレーターが、第1の転写単位中のアブレーション認識部位に結合しそしてDNAを切除するかもしくは取り除くエンドヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、メガヌクレアーゼもしくはジンクフィンガーエンドヌクレアーゼおよび第1の転写単位のRNA転写産物を取り除くかもしくは第1の転写単位のRNA転写産物の翻訳を抑制する干渉RNA、リボザイムもしくはアンチセンスよりなる群から選択される、請求項1~5のいずれかの複製欠損ウイルス組成物。アブレーターがCreであり、そしてアブレーション認識部位がloxPであるか、もしくはアブレーターがFLPであり、そしてアブレーション認識部位がFRTである、請求項1の複製欠損ウイルス組成物。アブレーターがキメラの改変されたエンドヌクレアーゼであり、ここで、ウイルス組成物がi第1の薬理学的作用物質の結合ドメインに融合したエンドヌクレアーゼのDNA結合ドメインを含んでなる第1の配列を含んでなり;そしてここで、ウイルス組成物がii第1の薬理学的作用物質の結合ドメインに融合したエンドヌクレアーゼのヌクレアーゼ切断ドメインをコードする第2の配列をさらに含んでなり、ここで、第1の配列iおよび第2の配列iiが各々その発現を制御する少なくとも1つのプロモーターと機能的に結合している、請求項1に記載の複製欠損ウイルス組成物。キメラの改変されたエンドヌクレアーゼが第2の転写単位中の単一の2シストロン性オープンリーディングフレーム内に含有され、該転写単位がiとiiの間にリンカーをさらに含んでなる、請求項8に記載の複製欠損ウイルス組成物。配列iおよび/もしくは配列iiが誘導性プロモーターを有する、請求項8に記載の複製欠損ウイルス。キメラの改変されたエンドヌクレアーゼが別個のオープンリーディングフレーム内に含有される、請求項8に記載の複製欠損ウイルス組成物。第1の配列および第2の配列の各々が構成的プロモーターの制御下にあり、そしてアブレーターが第1の薬理学的作用物質により生物活性化される、請求項8に記載の複製欠損ウイルス組成物。アブレーターのコーディング配列が、アブレーターコーディング配列の5’もしくは3’に位置する核局在化シグナルをさらに含んでなる、請求項1~12のいずれかに記載の複製欠損ウイルス組成物。DNA結合ドメインがジンクフィンガー、ヘリックス-ターン-ヘリックス、HMG-ボックス、Statタンパク質、B3、ヘリックス-ループ-ヘリックス、ウィングドヘリックス-ターン-ヘリックス、ロイシンジッパー、ウィングドヘリックス、POUドメインおよびホメオドメインよりなる群から選択される、請求項8~13のいずれか1項に記載の複製欠損ウイルス組成物。エンドヌクレアーゼがII型制限エンドヌクレアーゼ、イントロンエンドヌクレアーゼ、およびセリンもしくはチロシンリコンビナーゼよりなる群から選択される、請求項8~13のいずれかに記載の複製欠損ウイルス組成物。該アブレーターがキメラのFokI酵素である、請求項15に記載の複製欠損ウイルス組成物。ウイルスゲノムが、アブレーターの誘導性プロモーターを調節する転写因子の二量化可能なドメインを各々コードする、第3および第4の転写単位をさらに含んでなり、ここで:c第3の転写単位が、第1のプロモーターと機能的に結合した薬理学的作用物質の結合ドメインに融合した転写因子のDNA結合ドメインをコードし;そしてd第4の転写単位が、第2のプロモーターと機能的に結合した薬理学的作用物質の結合ドメインに融合した転写因子の活性化ドメインをコードする請求項1~5のいずれか1項の複製欠損ウイルス組成物。cの第1のプロモーターおよびdの第2のプロモーターが構成的プロモーターおよび誘導性プロモーターから独立して選択される、請求項17の複製欠損ウイルス組成物。第1および第2のプロモーターが両方とも構成的プロモーターであり、そして薬理学的作用物質が転写因子のドメインを二量化する二量化剤である、請求項18の複製欠損ウイルス組成物。第1のプロモーターおよび第2のプロモーターの一方が誘導性プロモーターである、請求項18の複製欠損ウイルス組成物。第3および第4の転写単位がIRESもしくはフューリン-2Aを含有する2シストロン性単位である請求項17~20のいずれかの複製欠損ウイルス組成物。薬理学的作用物質がラパマイシンもしくはラパログである請求項1~21のいずれかの複製欠損ウイルス組成物。ウイルスがAAVである請求項1~22のいずれか1項の複製欠損ウイルス組成物。AAVがAAV1、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9およびrh10よりなる群から選択される請求項1~23のいずれか1項の複製欠損ウイルス組成物。治療用製品がHIV感染性を中和する抗体もしくは抗体フラグメント、可溶性血管内皮成長因子受容体-lsFlt-l、第VIII因子、第IX因子、インシュリン様成長因子IGF、肝細胞成長因子HGF、ヘムオキシゲナーゼ-lHO-1または神経成長因子NGFである請求項1~24のいずれか1項の複製欠損ウイルス組成物。第1の転写単位および第2の転写単位が組成物中の異なるウイルスストック上にある請求項1~25のいずれか1項の複製欠損ウイルス組成物。第1の転写単位および第2の転写単位が第1のウイルスストック中にあり、そして第2のウイルスストックが第2のアブレーター1つもしくは複数を含んでなる請求項1~25のいずれか1項の複製欠損ウイルス組成物。a第1の転写単位が、転写を制御するプロモーターと機能的に結合した治療用製品をコードし、該第1の転写単位が少なくとも1つのアブレーション認識部位を含有し;そしてb第2の転写単位が、薬理学的作用物質に反応して転写を誘導するプロモーターと機能的に結合した少なくとも1つのアブレーション認識部位に特異的なアブレーターをコードするウイルスゲノムのパッケージングシグナルが隣接する第1および第2の転写単位を含んでなる組換えDNA構築物。転写単位に隣接するパッケージングシグナルがAAV5’逆方向末端反復ITRおよびAAV3’ITRである請求項28のDNA構築物。AAVITRがAAV1、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9もしくはrh10ITRである請求項29のDNA構築物。第1の転写単位にAAVITRが隣接し、そして第2、第3および第4の転写単位にAAVITRが隣接する請求項28のDNA構築物。転写単位が2つもしくはそれ以上のDNA構築物中に含まれる請求項28のDNA構築物。治療用製品がHIV感染性を中和する抗体もしくは抗体フラグメント、可溶性血管内皮成長因子受容体-lsFlt-l、第VIII因子、第IX因子、インシュリン様成長因子IGF、肝細胞成長因子HGF、ヘムオキシゲナーゼ-lHO-1または神経成長因子NGFである請求項28~32のいずれか1項のDNA構築物。治療用製品の転写を制御するプロモーターが構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、細胞特異的プロモーター、誘導性プロモーターもしくは生理学的刺激に反応するプロモーターである請求項33のDNA構築物。治療用製品がVEGFアンタゴニストである、請求項1~27のいずれか1項の複製欠損ウイルス組成物の有効量を投与することを含んでなる、ヒト患者における加齢性黄斑変性症を処置する方法。治療用製品が第VIII因子である、請求項1~27のいずれか1項の複製欠損ウイルス組成物の有効量を投与することを含んでなる、ヒト患者における血友病Aを処置する方法。治療用製品が第IX因子である、請求項1~27のいずれか1項の複製欠損ウイルス組成物の有効量を投与することを含んでなる、ヒト患者における血友病Bを処置する方法。治療用製品がインシュリン様成長因子もしくは肝細胞成長因子である、請求項1~27のいずれか1項の複製欠損ウイルス組成物の有効量を投与することを含んでなる、ヒト患者における鬱血性心不全を処置する方法。治療用製品が神経成長因子である、請求項1~27のいずれか1項の複製欠損ウイルス組成物の有効量を投与することを含んでなる、ヒト患者における中枢神経系疾患を処置する方法。治療用製品がHIVに対する中和抗体である、請求項1~27のいずれか1項の複製欠損ウイルス組成物の有効量を投与することを含んでなる、ヒト患者におけるHIV感染を処置する方法。複製欠損ウイルスがAAV1、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9およびrh10よりなる群から選択される請求項36~40のいずれか1項の方法。導入遺伝子産物の送達を制御することにおいて使用する、請求項1~27のいずれか1項に記載の複製欠損ウイルス。治療用製品がVEGFアンタゴニスト、第IX因子、第VIII因子、インシュリン様成長因子、肝細胞成長因子、神経成長因子およびHIVに対する中和抗体よりなる群から選択される、請求項42に記載の複製欠損ウイルス。請求項1~27のいずれか1項に記載の複製欠損ウイルスもしくは請求項28~34のいずれか1項に記載のDNA構築物を含んでなる遺伝子操作されている細胞。細胞が植物、細菌もしくは非ヒト哺乳類細胞から選択される、請求項43に記載の遺伝子操作されている細胞。a患者から得られる組織サンプルにおける治療用製品の発現を検出すること、およびb該患者における治療用製品の存在と関連する副作用を検出することを含んでなり、ここで、該患者における治療用製品の存在と関連する副作用の検出が、アブレーターの発現を誘導する薬理学的作用物質を投与する必要性を示す、治療用製品およびアブレーターをコードする請求項1~27のいずれか1項の複製欠損ウイルスを受けた患者に治療用製品を取り除くために薬理学的作用物質をいつ投与するかを決定する方法。該患者から得られる組織サンプルにおける治療用製品の存在と関連する毒性の生化学マーカーのレベルを検出することを含んでなり、ここで、毒性を表す該マーカーのレベルはアブレーターの発現を誘導する薬理学的作用物質を投与する必要性を示す、治療用製品およびアブレーターをコードする請求項1~27のいずれか1項の複製欠損ウイルス組成物を受けた患者に治療用製品を取り除くために薬理学的作用物質をいつ投与するかを決定する方法。アブレーターの発現を誘導する薬理学的作用物質での処置の後に患者からの組織サンプルにおける治療遺伝子産物をコードするDNA、そのRNA転写産物もしくはそのコードタンパク質の存在を決定することをさらに含んでなり、ここで、治療遺伝子産物をコードするDNA、そのRNA転写産物もしくはそのコードタンパク質の存在は、アブレーターの発現を誘導する薬理学的作用物質での反復処置の必要性を示す、請求項46もしくは47の方法。6.実施例1:スケールでのatscale組換えAAVベクターの製造本実施例は、哺乳類細胞のポリエチレンイミンPEI媒介トランスフェクションおよび濃縮した培養上清のヨージキサノール勾配遠心分離に基づく高収率の組換えAAV製造方法を記述する。新規の方法で製造されるAAVベクターは、小規模の塩化セシウムCsCl勾配精製ベクターと比較した場合にインビトロおよびインビボの両方において同等のもしくはより良い形質導入を示す。さらに、記述されるヨージキサノール勾配精製方法は空キャプシドから機能性ベクター粒子を効果的に分離する前臨床研究中の毒性および望ましくない免疫反応を減らすための望ましい特性。6.1.導入近年、臨床遺伝子治療用途のための組換えアデノ随伴ウイルスrAAVベクターの使用は増えており、そして前臨床および臨床試験の両方において関連毒性がほとんどなくそして優れた全体的安全性プロフィールを有する動物モデルにおけるrAAVベクターからの長期導入遺伝子発現の実証によるところが大きいSnyderandFlotte2002;Mossetal.2004;WarringtonandHerzog2006;Maguireetal.2008;MuellerandFlotte2008;Brantlyetal.2009。最も初期のAAV遺伝子治療研究は血清型2AAV2ベクターで行われたが、より効率の良い遺伝子送達および異なる組織特異性を有する他のAAV血清型に基づくベクター系が現在ヒト試験中であり、そしてそれらの使用は増加すると思われるBrantlyetal.2009;Neinhuis2009。遺伝子治療薬の開発および最終的マーケティングの主要な要求は、十分な規模で遺伝子送達ベクターを製造できることである。過去において、この要求はrAAVベクターの成功した応用への障壁であったが、最近になって臨床用途のための大規模製造に適合するいくつかの革新的な製造系が開発されている。これらの新規の系は、rAAVゲノムおよびトランスに作用するヘルパー機能を産生細胞に送達するためにアデノウイルス、ヘルペスウイルスおよびバキュロウイルスハイブリッドを使用し、そして最近概説されているClementetal.2009;Viragetal.2009;Zhangetal.2009。rAAVハイブリッドウイルス感染による産生細胞系への必要とされる遺伝要素の導入の容易さは、効率の良いrAAVベクター製造および重要なことにはバイオリアクターへの方法のスケールアップを可能にする。これらの系は最終的な臨床候補ベクターに特に適しているが、各ベクターにハイブリッドウイルスを作る必要性のために、それらは導入遺伝子およびベクター血清型のいくつかの組み合わせを評価する必要があり得る初期開発および前臨床研究にはあまり適していない。多くの前臨床のrAAVに基づく遺伝子治療研究がマウスにおいて行われているが、より大型の動物において得られる結果は実際の臨床結果をより予測すると考えられることが多い。大型動物研究はより高いrAAVベクター用量を必要とし、そしてこれらの要求を満たすために、時間のかかる中間体製造の必要のないスケールで様々な試験ベクターを迅速に製造することができる汎用的製造系が必要とされる。HEK293細胞へのAAVベクターゲノム、AAVキャプシド遺伝子およびトランスに作用するヘルパー遺伝子を含有するプラスミドDNAのリン酸カルシウム共沈殿による一過性トランスフェクション三重トランスフェクションとして知られている方法は、研究所においてrAAVを製造するための長年にわたり標準的な方法であったGrimmetal.1998;Matsushitaetal.1998;Salvettietal.1998;Xiaoetal.1998。トランスフェクションに基づく方法は全てのrAAV製造技術の中で依然として最も汎用的であり、そして異なるrAAVベクターの同時製造を可能にする。しかしながら、三重トランスフェクションは、懸濁培養系との適合性がないために大規模rAAV製造にとって理想的と一般に考えられていない。しかしながら、最近、トランスフェクション試薬としてポリエチレンイミンPEIを使用するいくつかの有望な結果は、リットル当たり1~3x1013ベクター粒子の未精製収量を有する哺乳類細胞懸濁培養におけるrAAV2ベクターの製造を示しており、これらは接着形態培養皿上に単層として培養した細胞トランスフェクション系からの収量に匹敵するDurocheretal.2007;Hildingeretal.2007。PEIに基づくトランスフェクションの利点は、通常のリン酸カルシウム媒介トランスフェクションで典型的に必要とされる培地交換の必要なしに無血清培地中でもそれを実施できることであるDurocheretal.2007。これらの特徴は、より低価格ならびにプリオンおよび他の外来因子の存在のような動物由来の血清に関する懸念の除去になる。rAAVベクター製造のスケールアップのさらなる障害は、ベクターの下流処理中に生じる。小規模で、rAAVベクター精製に使用する最も一般的な方法は、複数回の一晩の塩化セシウムCsCl勾配遠心分離を伴うZolotukhinetal.1999。この精製方法は標準的な実験室設備で容易に行うことができ、一般に高収量であり、そして注意深く行う場合に妥当な純度のベクターを生成せしめる。しかしながら、この技術の欠点は、第1に、CsClへの長期暴露がrAAVベクターの効能を落とすと報告されていることZolotukhinetal.1999;Auricchioetal.2001;Brumentetal.2002、そして第2に、勾配が細胞溶解物の限られたローディング容量を有し、それは今度はrAAV精製スケールアップを制限し得ることである。代わりの勾配媒質、ヨージキサノールもまたrAAVベクターを精製するために用いられているHermensetal.1999;Zolotukhinetal.1999。この等張媒質は最初は冠動脈造影中に使用する造影剤として開発され、そして低い関連毒性および相対不活性は安全性およびベクター効能の観点の両方からCsClより勝っているZolotukhinetal.1999。しかしながら、ヨージキサノールはrAAV製造培養細胞溶解物のローディング容量、従ってrAAV精製の拡張性が限られるという点においてCsClと同じ欠点を共有する。これらの勾配特異的制約を克服するために、研究者等はスケールでAAVを精製するためにイオン交換クロマトグラフィーそして最近では単一ドメイン重鎖抗体フラグメントを用いるアフィニティー精製に関心を寄せているAuricchioetal.2001;Brumentetal.2002;Kaludovetal.2002;Zolotukhinetal.2002;Davidoffetal.2004;Smithetal.2009。これらの技術はAAV収量、拡張性および純度を高める。しかしながら、クロマトグラフィーに基づく技術を用いて完全に機能性のベクター粒子から一般に分離されない、空キャプシドのようなベクター関連不純物が残る。空および完全なベクター粒子のイオン交換に基づく分離を開発するためにAAV2ベクターを用いていくらかの進歩がなされているがQuetal.2007;Okadaetal.2009、CsCl勾配遠心分離はrAAVベクター調製物から空粒子を除くための依然として最も良く特性化された方法である。最近、AAV2と対照的に、大部分の他のAAV血清型はリン酸カルシウムでトランスフェクションされた製造培養の培地中に主に放出され、そして細胞溶解物に保持されないことが認められたVandenbergheetal.2010。この分配は細胞溶解なしに起こるので、製造培養培地はrAAVベクターの比較的純粋な供給源であると、そしてより低レベルの細胞混入物はローディング容量および精製勾配の分離を改善し得ると結論付けられた。本実施例に記述されるのは、PEIトランスフェクションおよび上清採取に基づく、大型動物研究に適当なスケーリングしたscaledrAAV製造方法である。該方法は高収量であり、異なる血清型および導入遺伝子でのベクターの製造に汎用性があり、そして十分に簡単であるので最低限の専門的技術および設備で大部分の研究室において行うことができる。さらに、本実施例は空粒子からのゲノム含有ベクターの分離のためのヨージキサノール勾配の使用を示す。6.2.材料および方法6.2.1.細胞培養後期継代HEK293細胞培養物を10ウシ胎仔血清FBS;HyclonelaboratoriesInc,SouthLogan,UTを加えたDMEMMediatechInc,Manassas,VA中15cmプレート上で維持した。細胞を週に2回継代してそれらを指数増殖期において維持した。小規模トランスフェクションには、1x106のHEK293細胞を6ウェルプレートのウェル当たりに蒔き、そして1.5x107細胞を15cmディッシュに蒔いた。大規模製造には、トランスフェクションの4日前に16枚のコンフルエントな15cmプレートからのHEK293細胞を1リットルのDMEM/10FBSを含有する2つの10層細胞スタックCorningInc.,Corning,NYに分けた。トランスフェクションの前日に、2つの細胞スタックをトリプシン処理し、そして細胞を200mLの培地に再懸濁した。細胞塊を沈降させ、その後で6細胞スタックの各々に6.3x108細胞を平板培養した。トランスフェクションの前に細胞を24時間接着させた。細胞スタックのコンフルエンシーは、顕微鏡ステージ上に細胞スタックを収容するために位相差ハードウェアがそれから取り除かれているDiaphot倒立顕微鏡NikonCorp.を用いてモニターした。6.2.2.プラスミド全てのトランスフェクションに使用したプラスミドは下記の通りであった:1AAV2ITRが隣接するeGFP発現カセットを含有する、シスプラスミドpENNAAVCMVeGFP.RBGAAVシスとも呼ばれる;2AAV2rep遺伝子およびそれぞれAAV1、6、7、8からのキャプシドタンパク質遺伝子を含有する、トランスプラスミドpAAV2/1、pAAV2/6、pAAV2/7、pAAV2/8およびpAAV2/9AAVトランスとも呼ばれる;ならびに3アデノウイルスヘルパープラスミドpAdΔF6。15~50mgロットの>90スーパーコイル状プラスミドを入手しPuresynInc.,Malvern,PA、そして全てのトランスフェクションに使用した。6.2.3.リン酸カルシウムトランスフェクション小規模リン酸カルシウムトランスフェクションは、前述の通りGaoetal.2002AAVシス、AAVトランスおよびアデノウイルスヘルパープラスミドの三重トランスフェクションにより行った。簡潔に言えば、トランスフェクションの2時間前に6ウェルプレート中の85~90コンフルエントなHEK293単層上の培地をDMEM/10FBSに変えた。2:1:1の比率のプラスミドウェル当たり1.73μgのアデノウイルスヘルパー/0.86μgのシス/0.86μgのトランスをリン酸カルシウムで沈殿させ、そしてプレートに滴下して加えた。トランスフェクションを37°Cで24時間インキュベーションし、この時点で培地をDMEM/10FBSに再び変えた。培養物を感染後72時間までさらにインキュベーションし、その後で細胞および培地を別個に採取した。細胞スタックの大規模トランスフェクションには、プラスミド比率を一定に保つが、全ての試薬量を630倍増加した。トランスフェクション混合物を1LのDMEM/10FBSに直接加え、そしてこの混合物を用いて細胞スタック中の培地を置換した。培地をトランスフェクション後24時間で変えた。細胞および培地を直接もしくは500mMのNaClの存在下で2時間さらにインキュベーションした後のいずれかでトランスフェクション後72時間もしくは120時間後に採取した。細胞に存在するベクターを定量しなければならない場合、細胞をトリプシン処理により遊離させ、そして3回の凍結/融解サイクルにより溶解物を生成せしめた。6.2.4.小規模ベクター調製40枚の15cmプレートをリン酸カルシウム法によりトランスフェクションし、そしてトランスフェクション後72時間で3連続サイクルの凍結/融解-80°C/37°Cで細胞溶解物を調製した。細胞溶解物を2回の塩化セシウムCsCl遠心分離で精製し、そしてウルトラ15遠心濃縮器装置Amicon;MilliporeCorp.,BedfordMAを用いて純粋な勾配画分を濃縮しそして脱塩した。6.2.5.小規模ポリエチレンイミントランスフェクション6ウェルプレート中のHEK293細胞のポリエチレンイミンPEIに基づく三重トランスフェクションには、同じプラスミド量をリン酸カルシウムトランスフェクションについて記載の通り使用した。PEI-maxPolysciencesInc.,Warrington,PAを水中1mg/mLで溶解し、そしてpHを7.1に調整した。トランスフェクションするDNAのμg当たり2μgのPEIを使用した。PEIおよびDNAを各々100μLの無血清DMEMに加え、そして2つの溶液を合わせ、そしてボルテックスすることにより混合した。室温で15分のインキュベーション後に、混合物を1.2mLの無血清培地に加え、そしてウェル中の培地を置換するために使用した。さらなる培地交換は実施しなかった。15cmプレートには、プラスミド比率を一定に保つが、使用するプラスミドおよび他の試薬の量を15倍増やした。6.2.6.大規模ポリエチレンイミントランスフェクション大規模なPEIに基づくトランスフェクションをHEK293細胞の75コンフルエントな単層を含有する10層細胞スタックにおいて行った。2:1:1の比率のプラスミド細胞スタック当たり1092μgのアデノウイルスヘルパー/546μgのシス/546μgのトランスを使用した。PEI-max:DNA比を2:1重量/重量で維持した。各細胞スタックには、無血清DMEMを含有する別個のチューブにプラスミド混物およびPEIを各々加えた54mLの総容量。チューブをボルテックスすることにより混合し、そして室温で15分間インキュベーションし、そしてその後で抗生物質を含有する1リットルの無血清DMEMに混合物を加えた。スタック中の培養培地をデカンテーションし、DMEM/PEI/DNA混合物で置換し、そしてスタックを標準的な5CO2、37°Cインキュベーター中でインキュベーションした。トランスフェクション後72時間で、500mLの新しい無血清DMEMを加え、そしてインキュベーションをトランスフェクション後120時間まで続けた。この時点で、ベンゾナーゼEMDChemicals,Gibbstown,NJを25ユニット/mLの最終濃度まで培養上清に加え、そしてスタックを2時間再インキュベーションした。NaClを500mMまで加え、そしてインキュベーションをさらに2時間再開し、その後で培養培地を採取したこの時点で、培養培地は下流原料と呼ばれた。細胞関連ベクターを定量しなければならない場合、細胞をトリプシン処理により遊離させ、そして3回の連続凍結/融解サイクル-80°C/37°Cにより溶解物を生成せしめた。6.2.7.下流処理6つの細胞スタックからの10リットルの原料培養培地を10リットルのアレグロ培地バッグPallCorp.,FortWashington,NY中に0.5μmProfileIIデプスdepthフィルターPallCorp.,FortWashington,NYを通して清澄化した。清澄化した原料を次に特注の1/4IDチューブおよびポートを有するNovaset-LSLVHホルダーTangenXTechnologyCorp.,Shrewsbury,MAおよび100kDaMWCOHyStream膜を有する0.1m2Sius-LS使い捨てTFFスクリーンチャンネルカセットTangenXTechnologyCorp.,Shrewsbury,MAを用いて接線流濾過により濃縮した。10~12psiの膜間圧を工程を通して維持して85mLまでの125倍濃縮を製造業者の推奨に従って行った。各ランの後にTFFフィルターを捨て、そしてラン間で系を0.2NNaOHで洗浄した。濃縮原料を10,500xgおよび15°Cで20分間遠心分離により再清澄化し、そして上清を新しいチューブに注意深く取り除いた。6つのヨージキサノール段階勾配を下記の通りいくらかの改変を有してZoltukininetal.Zolotukhinetal.1999の方法に従って形成した:10mM塩化マグネシウムおよび25mMカリウムを含有するPBS中の次第に濃いヨージキサノールOptiprep;SigmaChemicalCo.,StLouis,MO溶液を40mLのクイックシール遠心管BeckmanInstrumentsInc.,PaloAlto,CA中に連続して下に置いた。勾配の段階は4mLの15、9mLの25、9mLの40そして5mLの54ヨージキサノールであった。14mLの清澄化した原料を次に勾配上に重ね、そしてチューブを密封した。チューブを18°Cで70TiローターBeckmanInstrumentsInc.,PaloAlto,CA中350,000xgで70分間遠心分離し、そしてチューブの底から約1cmで水平に挿入した18ゲージ針を通して勾配を分画した。画分をUV透過96ウェルプレートCorningInc.,Corning,NYに水で20倍希釈し、そして吸光度を340nmで測定した。OD340の読み取りにおけるスパイクは主要な混入タンパク質バンドの存在を示し、そしてこのスパイクより下の全ての画分を集めそしてプールした。全ての6つの勾配からのプールした画分を合わせ、10容量の最終調合バッファーPBS/35mMNaClに対して限外濾過し、そして100kDaMWCOHystreamスクリーンチャンネル膜を有する0.01m2使い捨てSiusTFFカセットTangenXTechnologyCorp.,Shrewsbury,MAおよびCentramateLVカセットホルダーPallCorp.,FortWashington,NYを用いて製造業者の説明書に従って接線流濾過により約10mLまで4倍濃縮した。10の膜間圧を工程を通して維持した。装置のホールドアップ容量を最短の白金硬化シリコーンチューブ1.66mmの内径,Masterflex;ColePalmerInstrumentCo.,VernonHills,ILを用いて低く保った。さらに、表面へのベクターの結合を最小限に抑えるために全ての湿潤性部分を0.1PluronicF68InvitrogenCorp.,Carlsbad,CAで2時間前処理した。各ランの後にTFFフィルターを捨て、そしてラン間で系を0.2NNaOHで洗浄した。限外濾過し、濃縮した生成物にグリセロールを最終5まで加え、そして調製物を等分し、-80°Cで保存した。6.2.8.ベクター特性化導入遺伝子カセットにおいてコードされるポリアデニル化シグナルに対するプライマーおよびプローブを用いて、DNアーゼI耐性ベクターゲノムをTaqManPCR増幅AppliedBiosystemsInc.,FosterCity,CAにより滴定した。勾配画分および最終ベクターロットの純度をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動SDSPAGEにより評価し、そしてSYPROルビー染色InvitrogenCorp.,Carlsbad,CAおよびUV励起を用いてDNAを可視化した。染色したゲル上で可視の非ベクター不純物に対する純度をGenetoolsソフトウェアSyngene,Frederick,MDを用いて決定した。ベクター調製物の空粒子含量をネガティブ染色および電子顕微鏡検査により評価した。銅グリッドフォルムバー/薄カーボン膜で被覆した400メッシュ;ElectronMicroscopySciences,Hatfield,PAを1アルシアンブルーElectronMicroscopySciences,Hatfield,PAで前処理し、そして5μlのベクター調製物をのせた。次にグリッドを洗浄し、1酢酸ウラニルElectronMicroscopySciences,Hatfield,PAで染色し、そしてPhilipsCM100透過型電子顕微鏡を用いて観察した。空:完全粒子比を電子顕微鏡写真の直接計数により決定した。6.2.9.相対的ベクター効能評価初期継代HEK293細胞を96ウェルプレートにおいて80のコンフルエンシーまで平板培養し、そして野生型アデノウイルス5型MOI:400の存在下で10,000のMOIでAAVベクターに感染させた。感染後48時間で、GFP蛍光画像をデジタル的に撮り、そして蛍光強度を前述の通りWangetal.2010ImageJソフトウェアRasband,19997-2006,NationalInstitutesofhealth,Bethesda,MD,http://rsb.info.nih.gov/ij/を用いて定量した。形質導入のインビボ分析のために、C57BL6マウスに1x1011ゲノムコピーのAAVベクターをi.v.注射した。動物を注射後9日で解剖し、肝臓を薄片にし、そして前述の通りWangetal.2010GFP蛍光を撮像し、そして蛍光強度をImageJソフトウェアを用いて定量した。6.3.rAAV製造用のトランスフェクション試薬の比較の結果小規模でrAAVベクターを製造するための標準的な上流方法全収量:約1~2x1013ゲノムコピーGCは、40枚の15cm組織培養プレート中のHEK293細胞のリン酸カルシウム媒介三重トランスフェクションに基づく。この方法は細胞ペレットおよび培養培地の両方において優れた力価で様々なAAV血清型のベクターを再現性良く生成するがVandenbergheetal.2010、それは技術的に面倒であり、動物血清の存在を必要とし、そして2回の培地交換を伴う。スケーリングしたrAAV製造には、ポリエチレンイミンPEIのようなあまり複雑でなく、より強力なトランスフェクション剤が好都合であり得ると結論付けられた。リン酸カルシウムもしくはPEI媒介三重トランスフェクションのいずれかの後のeGFP発現カセットを保有するrAAV7ベクターrAAV7-eGFPの生産は、6ウェルプレートHEK293製造培養の細胞および培地の両方におけるDNアーゼ耐性ベクターゲノムのqPCRにより定量した図1A~1D。リン酸カルシウムでトランスフェクションした細胞におけるeGFP導入遺伝子のより強い発現にもかかわらず、いずれのトランスフェクション方法でも、rAAV7-eGFP生産は同様なレベルで細胞および培養培地間で均等に分配することが見出された。これらの結果は、製造培養における導入遺伝子発現レベルがrAAV製造収量の予測とならないこと、そしてrAAV7-eGFPはトランスフェクション技術にかかわらず同様なレベルで培養培地に放出されることを示す。6.3.1.1.培養培地へのrAAV放出への血清型および塩添加の影響PEI三重トランスフェクション後の培養培地へのrAAV7-eGFPの放出を立証し、すぐ次の目標は他のAAV血清型で同様な放出を示すことであった。さらに、目標は細胞と関連したままである45の検出可能なベクター図1A~Dを培養培地に移動できるかどうかを見ることであった。標準的な72時間とは対照的に、PEIトランスフェクション後120時間まで採取を延ばすことにより、培養培地中の全ベクターは倍になることが見出されたデータは示されない。この戦略を適応して、15cmプレートのHEK293細胞をPEIを用いて三重トランスフェクションした。5つの異なるAAV血清型キャプシド遺伝子をコードするトランスプラスミドが様々なトランスフェクション混合物に含まれ、そして120時間のインキュベーション後に、即座にもしくは500mMNaClの添加後2時間のいずれかで培養培地および細胞を採取した。次に、細胞溶解物および培養培地中のキャプシド封入されたAAVゲノムをqPCRにより定量した図2。試験した5つのAAV血清型の各々は、61.5~86.3の間の総GC収率のレベルで塩添加なしに5日のインキュベーション後に上清に放出された。この結果は、トランスフェクション後の増加したインキュベーション時間が培養培地中のAAVベクターのより高い力価をもたらすという初期開発ラン中の結果を裏付けた。塩を有する製造培養のインキュベーションは、おそらく細胞ストレスにより媒介される機序によって、上清へのAAV2の放出を引き起こすことが示されているAtkinsonetal.2005。ここで行われた高塩インキュベーションは、培養培地へのAAV6およびAAV9ベクターのさらに約20のGC放出をもたらしたが、他の血清型ではほとんど変化を引き出さなかった。6.3.1.2.rAAV7ベクター収量へのスケールアップの影響本研究の目標は、大型動物前臨床研究を支援するために標準的な装置を用いて大部分の研究所において行うことができるスケーリングしたAAV製造系を開発することであった。従って、PEIに基づくトランスフェクションをスケールアップするためにCorning10層細胞スタックを、このタイプの組織培養容器は標準的な研究室インキュベーターにより収容することができるので選択した。最初に、単一の10層細胞スタックに単層が翌日に75コンフルエントになるように6.3x108のHEK293細胞を蒔いた。トランスフェクションの前に底のHEK293単層のコンフルエンシーを評価するために、細胞スタックを収容できるように位相差ハードウェアを取り除くことにより標準的な研究室顕微鏡を適用した。1つの細胞スタックにAAV7-eGFPベクターを製造するための関連プラスミドをリン酸カルシウムもしくはPEIのいずれかを用いて三重トランスフェクションし材料および方法を参照、そして次に細胞および培地の両方におけるDNアーゼ耐性ベクターゲノムの定量の前に感染後120時間までインキュベーションした。PEIトランスフェクション細胞スタックからの細胞当たりの収量は、6ウェルおよび15cmプレートにおいて以前に得られたものと同様であった図1A~D、図2。本実験における培養培地からの総収量は、細胞スタック当たり2.2x1013GCであった。リン酸カルシウムトランスフェクションスタックは、プレートにおいて以前に認められたものより細胞当たりかなり低いベクター収量をもたらし、そしてこの影響は細胞スタックの中央領域へのCO2の拡散の欠如に起因し得る。10層細胞スタックトランスフェクション結果に基づき、PEIをスケーリングした方法のさらなる開発のためにトランスフェクション試薬として選択した。6.3.1.3.rAAV7-eGFP製造培養培地の下流処理スケーリングした製造方法を開発する目標は、任意のAAVベクターを一般的方法により精製することができるように柔軟性を維持することであった。密度およびサイズに基づく混入物質からのベクターの分離は、多数のベクター血清型に適用することができる精製方法である。従って、培養培地中のrAAVベクターを、ヨージキサノール密度勾配上での精製を可能にするために十分に少ない容量まで接線流濾過TFFにより濃縮した。0.5μmデプスフィルターを通した製造培養培地の事前清澄化を行って細胞残屑および剥離細胞を取り除きそしてTFF膜の目詰まりを防いだ。次に、工程を通して10~12psiの膜間圧を保ちながら、使い捨ての100kDaカットオフスクリーンチャンネルTFF膜を用いて130倍濃縮を行った。膜の使い捨てできることは、ラン間で汚れを除きde-foulそして洗浄する必要を省き、従って、方法の再現性を増加させた。製造培養培地をヌクレアーゼベンゾナーゼで処理して混入プラスミドおよび細胞DNAを分解し、そして処理中にそれ自体へのWrightetal.2005そして混入タンパク質へのベクターの凝集を最低限に抑えるために濃縮の前に500mM塩を加えた。後で、これら2つの処理はヨージキサノール勾配からの回収を増加すると決定されたデータは示されない。フルスケールパイロットランの下流工程および性能の開発中に、濃縮工程のために任意の時点でベクターの有意な損失は認められなかった以下の表3を参照。AAVベクターのヨージキサノール勾配精製は詳細に記述されておりZolotukhinetal.1999、そしてここで使用する段階勾配はこの研究から適用される。勾配層の容量は、混入物質からのベクターのより良い分離を得るために改変した材料および方法を参照。1つの細胞スタックの製造培養培地からの濃縮AAV7-eGFPベクターを含有する14ミリリットルのTFFリテンテートretentateを27mLのヨージキサノール段階勾配上にのせ、そして350,000xgで1時間遠心分離にかけた。次に、チューブの底から勾配を分画し、そして画分275μlをそれぞれqPCR、340nmでの光学密度Schroderetal.1997およびSDS-PAGEを用いてベクター含量、ヨージキサノール濃度およびベクター純度について分析した。1つのそのような勾配の代表的なプロフィールを図3に示す。減少するOD340の読み取りにより示されるヨージキサノール濃度の直線勾配は、画分22まで認められた。この時点の後、読み取りは増加し図3A、そしてSDS-PAGEにより図3Bそして勾配に存在する薄いバンドの形態において裸眼により可視化される混入タンパク質のスパイクに対応した。OD340のスパイクはこの波長でのタンパク質およびヨージキサノールの重複する吸光度に起因すると思われ、そしてこの現象は混入タンパク質バンドの出現を検出する正確なそして再現性のある方法を提供した。ベクターゲノムのピークは、混入する細胞タンパク質バンド画分23~28の開始のすぐ下、1.31g/mL~1.23g/mLのOD340推定ヨージキサノール濃度で画分12~22の間の勾配の底3分の1に対して認められた図3A。このピークは、混入する細胞タンパク質のないAAVキャプシドタンパク質の存在により判断した場合に純粋なベクター粒子を含有する画分と一致した図3B。約50のベクターゲノムは混入するタンパク質と常に共に移動し、そして異なるヨージキサノール濃度、回転時間、塩濃度および洗剤を用いてそのように行う試みにもかかわらず分離することができなかったデータは示されない。SDS-PAGEゲル上に各画分の等しいゲノムコピー1010GCをのせたことにもかかわらず、画分26、27および28はより高いレベルのキャプシドタンパク質VP1、2および3を含有した図3B。この結果は、関連するもしくはパッケージングされたゲノムのない空キャプシドもしくはキャプシド集合中間体のいずれかのこれらの画分における存在を示唆した。ヨージキサノール勾配は、完全なおよび空のrAAV粒子を分離することができると結論付けられる以前に公式に示されていない結果。6.3.1.4.大規模パイロット製造ラン回収および収率上記の開発研究は、PEIトランスフェクションおよびヨージキサノール勾配精製の組み合わせを用いて単一の細胞スタックから高い力価で純粋なrAAV7ベクターを製造し得ることを示す。製造方法を特性化しそして再現性および他のAAV血清型への適用性を示すために、各々6細胞スタックを用いる、フルスケールパイロット製造ランを開始した。各ランの目標は、1014GCを上回る最終精製ベクターを製造することであり;用いる最終方法を以下の表4に要約し、そして材料および方法において十分に詳述する。rAAV8-eGFPおよびrAAV9-eGFPの各々3回のランをrAAV6-eGFPの2回のランと一緒に行った。工程中、サンプルを様々な段階で採取して下記の通り全体を通したベクター損失を評価した:1ベンゾナーゼ/0.5M塩での培養培地の処理および清澄化の後に原料サンプルを採取し;2TFF濃縮の後にリテンテートサンプルを採取し;3勾配採取および画分プールの後にヨージキサノール勾配画分サンプルを採取し;そして4バッファー交換および第2のTFF工程による最終濃縮後に最終生成物サンプルを採取した。様々なランのこれらの段階の各々でのキャプシド封入されたベクターゲノムコピーの回収を表3に記載する。原料中のrAAV8およびrAAV9ベクターの平均回収は9.0x1014GCであり、一方、rAAV6ベクターでは平均回収は6.7x1013GCであった。rAAV6ベクターの同様な低い収率は開発中のトランスフェクションにおいて見られ図2、そしてまた標準的な小規模AAV製造工程においても常に認められる。10Lから85mLへの原料の125倍濃縮表3:TFFIリテンテートは、損失が機械的故障のためであった1例を除いてベクターの損失をもたらさなかった。数例において、濃縮すると収率の明らかな増加があったが、これはqPCR反応の阻害を克服するために必要であった、リテンテートの過剰希釈により引き起こされる誤差のためであった。開発ラン中の場合のように、AAV8およびAAV9ベクターでは原料の35~50の間の回収でパイロットヨージキサノール精製ラン中にベクターの損失があった。より多くの損失が精製中にAAV6ベクターで見られた原料の80~85。最終濃縮およびバッファー交換は、おそらく出発材料のより低い力価そしてそれ故にTFF装置の表面に吸収されるベクターのより大きい割合のために、AAV6ベクターでこれは最も顕著であったが、さらなる損失をもたらした。機械的損失が生じたランを除いて、AAV8およびAAV9ベクターの平均全工程収量は2.2x1014GC原料の約26であった。6.3.1.5.大規模製造ロットの特性化パイロットランにおいて製造したベクターロットをSDS-PAGE分析によりキャプシドタンパク質純度についてそして電子顕微鏡検査により空粒子含量について特性化した。rAAV8およびrAAV9大規模製造ロットの各々においてAAVキャプシドタンパク質VP1、2および3に加えてほんの数本のマイナーバンドのみがSDS-PAGE分析により視覚化され、そして概算純度は1例を除いて90を上回った図4。これらの結果は、85を上回るベクター純度が日常的に得られる標準的な小規模工程と比べて遜色がなかった。大規模製造ロットの空粒子含量の概算は、電子顕微鏡写真上でネガティブ染色されたベクター粒子の直接観察により決定した図5A~G。空粒子は、ネガティブ染色を排除する完全な粒子と比較してキャプシドの電子密度の高い中心領域によりこれらの画像上で識別される。パイロット製造ロットの空粒子含量は0.4~5の間であった。未精製調製物において、空:完全比率は30:1と高い可能性がありSommeretal.2003、従って、これらの結果は、ヨージキサノール勾配が空および完全rAAV粒子を分離できるという結論を裏付ける。任意のrAAV製造ロットの必須の品質は、細胞において興味のある遺伝子を送達しそして発現するベクターの能力である。小規模工程により製造されるベクターに対するrAAV8およびrAAV9大規模製造ロットの効能は、インビトロにおいてeGFP発現によりそしてIV注射後のC57BL/6マウス肝臓において評価したそれぞれ、図6A~Gおよび図7A~G。インビトロおよびインビボ分析の両方により、新規製造方法により製造される全てのrAAV8およびrAAV9ベクターは、標準的な小規模方法により製造される同一のベクターと比較した場合に等しいかもしくはより高い効能3.5倍までを示した。rAAV6ベクター収率は常に低かったが、それにもかかわらず大規模製造ロットは小規模で製造されるrAAV6-eGFPと比較して2倍の形質導入改善を示した。6.4.説明臨床遺伝子治療用のrAAVベクターの需要は拡大し続け、そして該分野における現在の進歩が加速するにつれて、後期臨床試験において使用する大量のベクターが必要とされ得る。並行して、研究者がヒトにおける臨床結果の改善予測のために大型動物データにますます依存するにつれて前臨床研究の複雑な要求を満たすベクターに対する拡大する需要は増すと思われる。後期臨床試験に入れるために十分な収率でrAAVベクターを製造するいくつかの新規方法は、産業および学術機関の両方において開発研究所から製造スイートproductionsuitesに現在移っているClementetal.2009;Viragetal.2009;Zhangetal.2009。しかしながら、これらの方法はハイブリッドウイルスおよびパッケージング細胞系のような中間体の時間のかかる構築を伴うことが多く、従って、導入遺伝子およびAAV血清型のいくつかの組み合わせが厳密な時系列下で試験されなければならないことが多い前臨床環境に適していない。さらに、前臨床研究の大部分は、多数の大規模製造工程において使用される高度技術装置を利用できることが限定され得る学術機関において行われる。前臨床研究グループのベクター要求を支援するために、標準的なAAV研究所において任意の所望のrAAV生成物を迅速に作製する柔軟性および簡単さを保持しながら大型動物研究用に十分なベクターを生成するスケーリングした製造方法が開発された。本実施例に記述される製造方法はPEI三重トランスフェクションに基づき、これは異なるAAV血清型/導入遺伝子の組み合わせの迅速なそして容易な置換のような、トランスフェクションに基づく製造技術のいくつかの特有の性質の保持を可能にする。新規方法の顕著な特徴は、ベクターの大部分が産生細胞からよりむしろ培養培地から採取することができ、従って、細胞溶解物に存在する細胞混入物質の大部分が回避されることである。上流工程は非常に効率が良く、そして6細胞スタックの細胞当たり2x105GCまで、もしくはロット当たり1x1015GCをもたらす図2;表3。下流工程用のヨージキサノール勾配遠心分離の選択は、全ての血清型の一般的な精製方法の維持に役立つ。ヨージキサノールの等張で比較的不活性の性質は、ベクター効能Zolotukhinetal.1999および全体的な製品安全性を維持することに関して有益であると判明している。ヨージキサノール段階勾配に濃縮した製造培養培地を適用することにより、非常に純粋なそして強力なrAAVベクターが単一の1時間の遠心分離工程において許容しうる収率で得られた。全工程は迅速であり合計7日、表4、そして費用効率が高い。AAV8およびAAV9ベクターの平均総収量は、26の全工程回収で、2.2x1014GCであった。現在のフォーマットにおいて、細胞はトランスフェクションの前に10ウシ胎仔血清中で培養されるので製造方法は部分的に無血清である。しかしながら、293細胞用に市販されている動物性製品を含まない培地を用いて、安全規制に従って該方法を完全に無血清に適用することができる。同様に、全ての容器は密封されそして操作はバイオセイフティーキャビネット内で行われるので、該方法はcGMP適合性である。従って、前臨床研究に対するその有用性に加えて、該方法はまたベクター要求が低い初期臨床試験における使用にも、そして低いベクター用量が予測される遺伝性網膜疾患の処置のようなある種の適応症にも適用できる。上流工程の開発中に、様々な血清型のrAAVがリン酸カルシウムおよびPEIでトランスフェクションした培養の両方において上清に放出され図1A~D、そして明らかな細胞病変なしに起こるようである。使用するトランスフェクション技術は培養培地に放出されるベクターの量に大して影響しなかったが、トランスフェクション後のインキュベーション期間を延ばすことにより放出の実質的な増加がもたらされた。さらに、トランスフェクション後に連日培地を採取しそして置換する場合、培養培地中のrAAV7ベクターの回収は一定のままであったデータは示されない。この結果は、工程へのかん流培養技術の導入が上流収量をなおさらに増加し得ることを示唆する。本実施例に報告される実験において、接着性HEK293細胞培養は簡単便利という理由で使用されたが、懸濁培養中でのrAAVの製造におけるPEIトランスフェクションの最近報告された使用を考慮するとDurocheretal.2007;Hildingeretal.2007、この上流工程はまたバイオリアクターに適用することもできる。そのような方法の利点は、前臨床および臨床ベクター製造の両方に同じ上流工程を使用できることであり、これは規制の観点から望ましい。大部分のAAV血清型を製造培養培地から効率よく採取できる本実施例における実証図2;Vandenbergheetal.2010は、新規方法が大部分のAAVベクターに広く適用可能であることを示す。しかしながら、いくつかのAAV血清型には、改変が必要とされる。例えば、rAAV2は細胞中にほとんど保持されVandenbergheetal.2010、そして培養培地へのこの血清型の放出は最適化される必要がある。rAAV6ベクターは、PEI三重トランスフェクション後に細胞もしくは培養培地のいずれにおいても効率よく生産されず図2;表1、そして標準的なリン酸カルシウムトランスフェクションおよびCsCl勾配精製により高い力価で再現性良く製造されなかった。イオン交換、疎水性相互作用もしくはアフィニティーカラムクロマトグラフィーは、大量の培養培地からのAAVベクターの捕獲のための最適な方法である。これらの方法は、各AAV血清型に特異的に開発されなければならないことが多く、従って、前臨床ベクター製造には、多数の血清型に対応する一般的な精製方法がより良い解決策である。本実施例に記載のTFF濃縮/ヨージキサノール勾配法はrAAV精製の一般的な下流方法であり、そしてここに提示する研究において、純粋なそして空粒子を比較的含まないベクターピークをもたらした図4および図5A~G。本実施例は、初めて、完全なrAAV粒子から空のものを分離するヨージキサノール勾配精製方法の能力を公式に示している。本実施例に記載の方法により製造されるrAAV8およびrAAV9ベクターの効能は、通常の小規模製造方法により製造される同一のベクターよりわずかに優れているとまではいかないとしても少なくとも同等であるとインビトロおよびインビボ形質導入アッセイの両方で本明細書において示された図6A~Gおよび図7A~G。結論として、本実施例に提示される大規模rAAVベクター製造方法は、前臨床試験に関与するAAV遺伝子治療研究所の要求に応じ、そして柔軟性のあるベクター製造の前臨床要求を包含する、これらの研究の大部分の要求を満たすと予測される。このAAV製造方法は、例えば試薬の簡単さ、工程速度およびベクター特異的不純物の除去の利点を保持しながら、臨床用途にrAAVベクターを供給するためにスケールアップする潜在能力を有する。6.5.参考文献Atkinson,M.A.,Fung,V.P.,Wilkins,P.C.,Takeya,R.,K,Reynolds,T.C.,andAranha,I.L.2005.MethodsforgeneratinghightiterhelperfreepreparationsofreleaserecombinantAAVvectors.米国公開特許出願第2005/0266567号.Auricchio,A.,Hildinger,M.,O’Connor,E.,Gao,G.P.,andWilson,J.M.2001,Isolationofhighlyinfectiousandpureadeno-associatedvirustype2vectorswithasinglestepgravity-flowcolumn.HumGeneTher121:71-76.Brantly,M.L.,Chulay,J.D.,Wang,L.,Mueller,C.,Humphries,M.,Spencer,L.T.,Rouhani,F.,Conlon,T.J.,Calcedo,R.,Betts,M.R.2009.SustainedtransgeneexpressiondespiteTlymphocyteresponsesinaclinicaltrialofrAAV1-AATgenetherapy.ProcNatlAcadSciUSA10638:16363-16368.Brument,N.,Morenweiser,R.,Blouin,V.,Toublanc,E.,Raimbaud,1.,Cherel,Y.,Folliot,S.,Gaden,F.,Boulanger,P.,Kroner-Lux,G2002.Aversatileandscalabletwo-stepion-exchangechromatographyprocessforthepurificationofrecombinantadeno-associatedvirusserotypes-2and-5.MolTher65:678-686.Clement,N.,Knop,D.R.,andByrne,B.J.2009.Large-scaleadeno-associatedviralvectorproductionusingaherpesvirus-basedsystemenablesmanufacturingforclinicalstudies.HumGeneTher208:796-806.Davidoff,A.M.,Ng,C.Y.,Sleep,S.,Gray,J.,Azam,S.,Zhao,Y.,McIntosh,J.H.,Karimipoor,M.,andNathwani,A.C.2004.Purificationofrecombinantadeno-associatedvirustype8vectorbyionexchangechromatographygeneratesclinicalgradevectorstock.JVirolMethods1212:209-215.Durocher,Y.,Pham,P.L.,St-Laurent,G.,Jacob,D.,Cass,B.,Chahal,P.,Lau,C.J.,Nalbantoglu,J.,andKamen,A.2007.Scalableserum-freeproductionofrecombinantadeno-associatedvirustype2bytransfectionof293suspensioncells.JVirolMethods1441-2:32-40.Gao,G.P.,Alvira,M.R.,Wang,L.,Calcedo,R.,Johnston,J.,andWilson,J.M.2002.Noveladeno-associatedvirusesfromrhesusmonkeysasvectorsforhumangenetherapy.P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o,V.A.,Phillipsberg,T.,Muzyczka,N.,Hauswirth,W.W.2002.Productionandpurificationofserotype1,2,and5recombinantadeno-associatedviralvectors.Methods282:158-167.7.実施例2:AAVベクターのセシウム精製本実施例は、トランスフェクションした細胞ペレットからのAAVベクターの塩化セシウムCsCl精製の新規方法を記述する。1日目-ペレット処理およびCsCl回転1溶解物調製-80°Cフリーザーから細胞を37°Cで15分間融解する。40プレートの細胞についてそして20mLの最終容量用に細胞ペレットを~20mLの再懸濁バッファー150mMTris、pH8.0、2mMMgClに再懸濁し、そして氷上に置く。3回凍結/融解するドライアイスおよびエタノール浴/37°C水浴。調製物当たり100μLのベンゾナーゼ250U/mLを加え、そして穏やかに逆さにし、サンプルを37°Cで20分間インキュベーションし、5分毎にチューブを逆さにする。6mLの5MNaClを加えて最終塩濃度を1Mにする。混合する。Sorval遠心分離機において4°Cで8,000rpmで15分間回転させる。注記:Sorvalがきれいであることを確認する。遠心分離後に、さらに進める前に70でチューブを滅菌する。上清を新しいチューブに移す。Sorvalにおいて4°Cで8,000rpmで15分間再び回転させる。注記:Sorvalがきれいであることを確認する。遠心分離後に、さらに進める前に70でチューブを滅菌する。1.8mLの10OGPを0.5の最終濃度になるように加え、そして反転により穏やかに混合する。2塩化セシウム段階勾配精製各調製用に、BeckmanSW-28チューブウルトラクリアチューブを使用しないにおいて7.5mLの1.5g/mLCsClおよび15mLの1.3g/mLCsClからなる2つの2リットル勾配を準備する。より密度が低いCsClを最初にのせ、そして次により重いCsClを底にのせる。15mLのサンプルを各勾配の最上部に加える。勾配を乱さないようにチューブの側面にサンプルをゆっくりと加える。チューブにロットを付ける。15°Cで25,000rpmで最低20時間回転させる。2日目-第1のCsCl回転からAAVバンドを集め、そして第2のCsCl回転をセットする1CsCl回転からバンドを集める勾配を乱さないように注意して、バケットから遠心管AおよびBを注意深く取り出す。第1のチューブAをチューブホルダー上に固定する。2つの1/16インチオス型ルアーFisherNC9507090を装着したあらかじめ滅菌した2ftの長さのタイゴン-シリコーンチューブ1.6mmの内径;FisherNC9422080を取り、そしてルアーに18G1針を挿入する。18G1針の1つをできるだけ底近くに直角にチューブに通しベベルを上に向けて、そしてマスターフレックスポンプのイージーロードローラー中にチューブを固定する。速度を~1mL/分まで穏やかに上げる。最初の4.5mLを15mLファルコンチューブに集め、そして次に96ウェルプレートに画分250μLを集め始めるチューブAから。48画分を集める。20の漂白溶液を含有するビーカーに勾配の残りを流し、そして針/チューブアセンブリを廃棄する。2つの1/16インチオス型ルアーFisherNC9507090を装着した別のあらかじめ滅菌した2ftの長さのタイゴン-シリコーンチューブ1.6mmの内径;FisherNC9422080を取り、そして第2のチューブからチューブBから画分を集めるためにルアーに18G1針を挿入する。チューブBについて全採取を繰り返す。使用後に針/チューブアセンブリを廃棄する。2屈折率RIを読み取るマルチチャンネルピペッターを用いて、最初に96ウェルプレートAから集めた48の各画分の10μLを新しいプレートに移し1~48とラベルを付ける、そしてバイオセイフティーキャビネットに画分の残りを置いておく。各画分の5μLを取り、そして屈折計を用いてRIを読み取る。AAVを含有する画分は、1.3740~1.3660の屈折率を有するはずである。RIを1.3650まで読み取り、そして次に1.3740~1.3660の範囲のRIを有する画分をバイオセイフティーキャピネットにおいてプールする。チューブ1および2に属する96ウェルプレートの両方をプールした後に全容量を測定する。さらに加えるいくらかのスペースがまだある場合、1.375のRIを有するウェルから加える。第2の96ウェルプレートチューブBからにこの工程を繰り返す。3第2の勾配をのせるチューブAおよびBからの各勾配からの全プール容量は5~6mLのはずである。50mLファルコンチューブに2つの勾配採取をプールし、そしてCsClの1.41g/mL溶液で容量を13mLにする。ピペットでよく混合する。10mLシリンジおよび18G針を用いて、プールした第1の勾配採取を13mLの密封可能な遠心管に加える。溶液は、気泡なしにチューブの首上の線まで加えるべきである。ポータブルシーラー、金属チューブキャップおよびヒートシンクを用いてチューブを密封する。漏れを調べるためにチューブを押しつぶし、そして次に適切なバランスでTi70.1ローター中に置く。ローターキャップおよび蓋を挿入し、そして次に60,000rpm、15°Cで20時間回転させる。3日目-第2のCsCl回転からAAVバンドを集め、そして脱塩する。1CsCl回転からバンドを集める勾配を乱さないように注意して、バケットから遠心管を注意深く取り出す。チューブをチューブホルダー上に固定する。この時点でチューブのほぼ中ほどにボトム照明bottomillumination後に単一バンドが見えるはずである。2つの1/16インチオス型ルアーFisherNC9507090を装着したあらかじめ滅菌した2ftの長さのタイゴン-シリコーンチューブ1.6mmの内径;FisherNC9422080を取り、そしてルアーに18G1針を挿入する。調製物当たり1つの長さのチューブを使用する。18G1針の1つをできるだけ底近くに直角にチューブに通しベベルを上に向けて、そしてマスターフレックスポンプのイージーロードローラー中にチューブを固定する。第2の18G針を最上部で再びチューブに通す。速度を~1mL/分まで穏やかに上げ、そして次に96ウェルプレートに画分250μLを集め始める。全勾配を集める~45画分。2屈折率RIを読み取る:マルチチャンネルピペッターを用いて、各画分の10μLを新しいプレートに移し、そしてバイオセイフティーキャビネット中に画分の残りを置いておく。各画分の5μLを取り、そして屈折計を用いてRIを読み取る。AAVを含有する画分は、1.3750~1.3660の屈折率を有するはずである。RIを1.3650まで読み取り、そして次に1.3750~1.3660の範囲のRIを有する画分をプールする。3脱塩:AmiconUltra-I5遠心濃縮器この方法において、ベクターをPBSで希釈し、そして100kDaMWCOフィルター装置を通して低速で回転させた。AAV粒子の高分子量~5000kDaのために、ベクターは膜により保持され、そして塩は通過する。ベクターは膜上に蓄積することができ、従って、最終段階ですすぎが必要とされる。50mLのPBS35mMNaClを50mLチューブに等分する。上記の段階2からのプール画分をPBS35mMNaClで15mLの総容量に希釈する。穏やかに混合し、そしてAmiconフィルター装置に加える。卓上Sorvall遠心機において2,000~4,000rpmで2分間回転させる。ベクターが膜上に乾燥しないように常に液面をフィルター表面の最上部より上~1.8mLに保つことは重要であるので、サンプルの流速を決定するために最初はより低速の回転を試みることが推奨される。目標は、リテンテートの容量を~1.8mLまで減らすことである。これを成し遂げるために追加の短い回転が必要とされ得る。容量が所望のものより少なくなる場合、それをPBS35mMNaClで1.8mLまで戻す。さらに13.2mLのPBS35mMNaClを加え、装置に残るリテンテートとピペットで混合し、そして上記の回転工程を繰り返す。あらかじめ等分した50mLのPBS35mMNaClが全て装置を通して回転して落とされるまでこの工程を続ける。全表面に対して繰り返しピペッティングすることにより最終リテンテート~1.8mLで膜をすすぐ。1mLおよび200μLのエッペンドルフチップを用いて適当な大きさの滅菌遠心管にリテンテートを回収する200μLチップは1mLのチップには届かない装置の底の最終リテンテート用である。最低100μLのPBS35mMNaClを用いて膜を2回すすぎ、そしてそれを最終リテンテートと一緒にプールする。正確な容量を決定し、そしてグリセロールを5まで加える。5x25μlアリコート、保管用に1x100μL、そして残りを105μLアリコートに等分する。-80°Cで即座に凍結させる。rAAV精製において使用する試薬再懸濁バッファー1[50mMTrispH8.0、2mMMgCl]:50mLlMTrispH8.0、2mL/MMgCl2948mLまでMQ水、フィルター滅菌。1.5g/mLCsCl溶液:675gのCsClを650mLのPBSに溶解し、そして最終容量を1000mLに調整する。密度を調べるために1mLの溶液を秤量する。溶液をフィルター滅菌する。1.3g/mLCsCl溶液:405gのCsClを906mLのPBSに溶解し、そして1000mLに最終容量を調整する。密度を調べるために1mLの溶液を秤量する。溶液をフィルター滅菌する。10W/Vオクチル-PD-グルコピラノシドOGPSigma,08001-10G:milliQ水で10グラムを100mLにする。溶液をフィルター滅菌する。最終調合バッファー:PBS35mMNaCl。1リットルの滅菌PBSに、7.05mLの滅菌5MNaClを加える。滅菌グリセロール:100mLガラス瓶にグリセロールを等分する。液体サイクルでonliquidcycle20分間オートクレーブにかける。8.実施例3:PITAAAVベクターの製造用のDNA構築物本発明は、Creリコンビナーゼの発現を誘導する転写因子ドメインを二量化するために、ラパマイシンを用いるアブレーター発現の厳密な調節;および細胞におけるCre認識部位loxPを含有する導入遺伝子の成功した誘導性アブレーションを示す、実施例3~5により例示される。アブレーターの発現の厳密な調節は、動物モデルにおいて示される。下記のものはDNA構築物の例であり、DNA構築物および本発明のPITA系に従って使用する複製欠損AAVベクターを作製するためのそれらの使用は、以下の実施例において説明される。8.1.二量化可能な転写因子ドメイン単位およびアブレーション単位をコードする構築物図8A-B~図12Bは、二量化可能な転写因子ドメイン単位およびアブレーション単位をコードするAAVベクターを作製するために使用することができる以下のDNA構築物の略図である:1pAAV.CMV.TF.FRB-IRES-1xFKBP.Cre図8A-B;2pAAV.CMV.TF.FRB-T2A-2xFKBP.Cre図9A-B;3pAAV.CMVI73.TF.FRB-T2A-3xFKBP.Cre図10A-B;および4pAAV.CMV.TF.FRB-T2A-2xFKBP.ISce-I図11A-B。DNA構築物に含まれる様々なドメインの記述は下記の通りである:ITR:AAV血清型2の逆方向末端反復168bp。[配列番号:26]CMV:エンハンサーを含む;全長サイトメガロウイルスCMVプロモーター。[配列番号27]CMV173bp:エンハンサーを含まない、最小CMVプロモーター。[配列番号:28]FRB-TA融合:二量化剤結合ドメインおよび転写因子の活性化ドメインの融合900bp、配列番号:29。タンパク質は、配列番号:30として本明細書において提供される。FRBフラグメントは、FRAPmTOR[ラパマイシンの哺乳類標的]としても知られている、FKBPラパマイシン関連タンパク質、細胞増殖および分裂を制御するホスホイノシチド3-キナーゼホモログのアミノ酸2021~2113に対応する。FRAP配列は、ある種の非免疫抑制性ラパマイシンアナログラパログの使用を可能にするために単一の点突然変異Thr2098LeuFRAPLを含む。FRAPはラパマイシンもしくはそのアナログおよびFKBPに結合し、そして転写活性化因子としてヒトNF-KBp65の一部190アミノ酸に融合している。ZFHD-FKBP融合:DNA結合ドメインおよび1コピーの二量化剤結合ドメイン1xFKBP;732bp、2コピーの薬剤結合ドメイン2xFKBP;1059bpもしくは33xFKBP;1389bpコピーの薬剤結合ドメインの融合。イムノフィリンFKBPFK506-結合タンパク質は、免疫抑制薬FK506およびラパマイシンの細胞内受容体として働く豊富な12kDa細胞質タンパク質である。ZFHDは、ジンクフィンガー対およびホメオドメインからなるDNA結合ドメインである。両方の融合タンパク質は、5’末端にヒトc-MycからのN末端核局在化配列を含有する。配列番号:45を参照。T2A:自己切断ペプチド2A54bp配列番号:31。Z8I:ヒトインターロイキン-2lL-2遺伝子からの最小プロモーターが続くZFHDの8コピーの結合部位Z8配列番号:32。例えば、プロモーター、例えばIL-2からの最小プロモーターが続くZFHDの1~約20コピーの結合部位を含有する、このプロモーターのバリアントを使用することができる。Cre:Creリコンビナーゼ。Creは、バクテリオファージP1から単離されたI型トポイソメラーゼである。Creは、2つのloxP部位間のDNAにおける部位特異的組換えを媒介して欠失もしくは遺伝子変換をもたらす1029bp、配列番号:33。I-SceI:メガヌクレアーゼの大きいクラスであるイントロンエンドヌレアーゼもしくはホーミングエンドヌクレアーゼのメンバー708bp、配列番号:34。それらは、細菌および植物において見られるイントロンのような可動遺伝要素によりコードされる。I-SceIは、イントロンホーミング過程に関与する酵母エンドヌクレアーゼである。I-SceIは、哺乳類ゲノムにおけるまれな配列、特定の非対称の18bp配列を認識し、そして二本鎖切断をもたらす。Jasin,M.1996TrendsGenet.,12,224-228を参照。hGHポリA:ヒトGHからの最小ポリアデニル化シグナル配列番号:35。IRES:ECMV脳心筋炎ウイルスからの内部リボソーム侵入部位配列配列番号:36。8.2.導入遺伝子単位をコードする構築物図12A-Bおよび図13A-Bは、CreリコンビナーゼのloxP認識部位が隣接する導入遺伝子をコードするAAVベクターを作製するための以下のDNA構築物の略図である:1pENN.CMV.Pl.loxP.Luc.SV40図12A-B;および2pENN.CMV.Pl.sce.Luc.SV40図13A-B。構築部の様々なドメインの記述は下記の通りである:ITR:AAV血清型2の逆方向末端反復配列番号:26。CMV:前初期遺伝子発現を調節するサイトメガロウイルスCMVプロモーターおよびエンハンサー832bp、配列番号:27。loxP:Creの認識配列。それは、方向性を与える8bp領域に隣接する2つの13bp逆方向反復を含んでなる34bp配列である34bp、配列番号:37。Ffルシフェラーゼ:ホタルルシフェラーゼ1656bp、配列番号:38。SV40:後期ポリアデニル化シグナル239bp、配列番号:39。I-SceI部位:SceI認識部位18bp、配列番号:25。8.3.導入遺伝子単位および二量化可能な転写因子ドメイン単位をコードする構築物図14は、導入遺伝子単位および二量化可能な転写因子ドメイン単位を含有するAAVベクターを作製するためのDNA構築物の略図である。このプラスミドは、アンピシリン耐性遺伝子、AAV5’ITR、転写因子TFドメイン単位、CMVプロモーター、FRBFRAPmTOR[ラパマイシンの哺乳類標的]としても知られている、FKBPラマパイシン関連タンパク質、細胞増殖および分裂を制御するホスホイノシチド3-キナーゼホモログのアミノ酸2021~2113、T2A自己切断ドメイン、FKBPドメイン、およびヒト成長ホルモンポリA部位を含有するAAVプラスミドバックボーン上に、CMVプロモーター、loxP部位、インターフェロンアルファコーディング配列およびSV40ポリA部位を提供する。アブレーション単位cre発現カセットは、別個の構築物上に位置することができる。この戦略は、上流のCMVプロモーターから導かれるcreの任意の潜在的なバックグラウンドレベル発現を最小限に抑えることができる。9.実施例4:PITA用のインビトロモデル本実施例は、AAVベクター中に設計されたDNA要素単位が細胞における導入遺伝子の厳密に制御された誘導性アブレーションを成功裏に成し遂げることを示す。特に、本実施例は、導入遺伝子単位ルシフェラーゼを発現しそしてloxp部位を含有する、アブレーション単位Creを発現するおよび二量化可能な転写因子ドメイン単位を含有する構築物でトランスフェクションした細胞の二量化剤ラパマイシン処理の際にルシフェラーゼ導入遺伝子発現を取り除くことができることを示す。ヒト胎児腎臓線維芽細胞293細胞を12ウェルプレート上にまいた。本明細書の9.1節に記載の様々なDNA構築物での細胞のトランスフェクションは、Invitrogenから購入したリポフェクトアミン2000を用いて細胞密度が90のコンフルエンシーに到達した翌日に実施した。トランスフェクションの内部コントロールとして働くように高感度緑色蛍光タンパク質EGFPをコードするベクターを各ウェルに全DNAの10で加えた。DMEMに懸濁したDNAをリポフェクトアミン2000と混合してDNA-脂質複合体を形成し、そしてInvitrogenCorporationにより提供される説明書に従ってトランスフェクションのために293細胞に加えた。トランスフェクション後6時間で、ウェルの半分を50nMの最終濃度でラパマイシンで処理した。培養培地10FBSを補足したDMEMを新しいラパマイシンと共に毎日置き換えた。トランスフェクション後48および72時間で、細胞をPBSで1回洗浄し、そして次にウェルからこすり取り、Promegaから購入したルシフェラーゼアッセイキット中に供給される溶解バッファーに再懸濁した。細胞懸濁液をボルテックスにかけ、そして残屑を遠沈した。10μLの溶解物を100μLの基質と混合することによりルシフェラーゼ活性を決定し、そして秒当たりの発光を照度計から読み取った。9.1.構築物その大部分は8節、実施例3に記述される、以下の構築物を感染性の複製欠損AAVベクターを作製するために使用した:1.CMVプロモーターを含有しそして導入遺伝子を含まない、コントロールとしてのpENN.AAV.CMV.RBG2.pENN.CMV.Pl.loxP.Luc.SV40図12A-B/pENN.AAV.CMV.RBGCMVプロモーターそして導入遺伝子なし3.pENN.CMV.Pl.loxP.Luc.SV40図12A-B/pAAV.TF.CMV.FRB-T2A-2xFKBP.Cre図9A-B4.pENN.CMV.Pl.loxP.Luc.SV40図12A-B/pAAV.TF.CMV.FRB-IRES-FKBP.Cre図8A-B5.pENN.CMV.Pl.loxP.Luc.SV40図12A-B/pAAV.CMVI73.FRB-T2A-3xFKBP.Cre図10A-B6.構成的プロモーターからCre遺伝子を発現する、pENN.CMV.PI.loxP.Luc.SV40図12A-B/pENN.AAV.CMV.PI.Cre.RBG9.2.結果48時間での結果を図15Aに示し、そして72時間での結果を図15Bに示す。Creが構成的に発現されるコントロール処置6において、ルシフェラーゼ発現は、loxP部位のないルシフェラーゼのコントロール発現処置2、ルシフェラーゼ構築物でトランスフェクションした細胞と比較してラパマイシンとは関係なく取り除かれた。対照的に、ルシフェラーゼ構築物に隣接するloxPに加えてPITA系の制御下でcreを保有する構築物の1つを受けている細胞において処置3、4および5、レポーター遺伝子発現のレベルは二量化剤、ラパマイシンの不在下でコントロールに匹敵し、ほとんどもしくは全くcre発現が誘導されないことを示す。しかしながら、ラパマイシンでの処理による誘導の際に、PITA制御cre構築物を受けている細胞におけるレポーター遺伝子発現のレベルはコントロール処置2と比較して有意に減少しており、cre発現が活性化されたことを示す。これらの結果は、アブレーターの発現が二量化剤、ラパマイシンにより特異的に調節されることを裏付ける。10.実施例5:二量化剤誘導系のインビボモデル本実施例は、本明細書に記載の二量化剤誘導系により調節される肝臓特異的プロモーターを用いる導入遺伝子発現の厳密な組織特異的制御を示す。これらのデータは、PITA系におけるアブレーターの厳密な調節のモデルとして役立つ。3匹のマウスの4グループは、それぞれ、3x1010、1x1011および3x1011粒子のウイルスの用量で2シストロン性レポーター遺伝子GFP-ルシフェラーゼをコードするAAVベクターのIV注射を受けた:グループ1G1、G2およびG3は、ユビキタスな構成的CMVプロモーターの制御下でGFPルシフェラーゼを発現するAAVベクターを受けたDNA構築物の略図は図16Aを参照。グループ2G4、G5およびG6は、以下の2つのAAVベクター:1CMVプロモーターにより導かれる二量化可能な転写因子ドメイン単位p65活性化ドメインと融合したFRBおよび3コピーのFKBPと融合したDNA結合ドメインZFHDを発現するAAVベクター図9Bに示されるDNA構築物;および2二量化したTFにより誘導されるプロモーターにより導かれるGFP-ルシフェラーゼを発現するAAVベクターDNA構築物の略図は図19Cを参照の共注射を受けた。グループ3G7、G8およびG9は、肝臓構成的プロモーター、TBGの制御下でGFP-ルシフェラーゼを発現するAAVベクターを受けたDNA構築物の略図は図16Cを参照。グループ4G10、G11、G12は、以下の2つのAAVベクター:1TBGプロモーターにより導かれる二量化可能な転写因子ドメイン単位p65活性化ドメインと融合したFRBおよび3コピーのFKBPと融合したDNA結合ドメインZFHDを発現するAAVベクター;および2二量化したTFにより誘導されるプロモーターにより導かれるGFP-ルシフェラーゼを発現するAAVベクターDNA構築物の略図は図16Dを参照の共注射を受けた。ウイルス投与後約2週で、マウスに2mg/kgの用量で二量化剤、ラパマイシンのIP注射を与えた。翌日開始してルシフェラーゼ発現をXenogen画像解析によりモニターした。ラパマイシン注射後約24時間で、マウスにルシフェラーゼの基質、ルシフェリンをIP注射し、次に造影のために麻酔をかけた。3x1011粒子のウイルスを受けたマウスは、ルシフェリン注射後30分で画像を撮った図17A-D。GFP-ルシフェラーゼを保有するベクターを受けたグループ1マウスでは、CMVプロモーターにより導かれる発現、ルシフェラーゼ発現は様々な組織において、そして主に肺、肝臓および筋肉において認められた図17A参照。対照的に、ルシフェラーゼ発現は、TBGプロモーターにより発現が制御されるルシフェラーゼベクターを受けたグループ3マウスにおいて肝臓に限定された図17B参照。グループ2マウスにおいて、ルシフェラーゼ発現のレベルは、誘導前のレベルと比較して2logより多く上昇しており、そして発現は主に肝臓および筋肉においてである図17C参照。グループ4マウスにおいて、誘導前と比較して、100倍より多いルシフェラーゼ発現が誘導されそして肝臓に限定された図17D参照。1x1011粒子のウイルスを受けたマウスは、高用量群のものと同様であるが、誘導の際により低いレベルの発現で、そして主に肝臓における結果を示す図18A-Dを参照。結論:1.二量化剤誘導系は、ベースラインに対して2logより多いルシフェラーゼ発現のピークレベルを有して強力であり、そして1週以内にベースライン近くまで戻る示されない。2.肝臓は、ウイルスをIVで与えた場合に感染を受ける最も効率の良い組織である。3.肝臓はまた、二量化剤誘導系が働くために重要である2つのウイルスで共形質導入される最も効率の良い組織でもある。4.CMVプロモーターにより制御される転写因子発現を有するその二量化剤誘導系により調節されるルシフェラーゼ発現は、調節なしのCMVプロモーター由来の発現よりマウス肝臓において有意に高い。これは、誘導性プロモーターがCMVプロモーターと比較していったんそれが活性化されると肝臓においてより強力なプロモーターであることを示した。5.ルシフェラーゼ発現は、誘導性TBGプロモーター系を保有するベクターを受けているマウスにおいてラパマイシンによる誘導の際に肝臓において特異的に検出された。肝臓特異的な調節可能なベクターにより媒介されるルシフェラーゼ発現はラパマイシンによる誘導に完全に依存的であり、そしてルシフェラーゼ発現のピークレベルはTBGプロモーターの制御下のものに匹敵する。本研究は、肝臓特異的な二量化剤誘導系のAAV媒介遺伝子送達により肝臓特異的遺伝子調節を行うことができることを裏付けた。11.実施例6:加齢性黄斑変性症AMD治療のためのPITAモノクローナル抗体の硝子体内投与は、患者の亜集団において疾病進行を遅らせそして視力を改善するためのAMDの有効な治療であると判明している。しかしながら、この方法の重大な制約は、反復硝子体内注射の必要性である。遺伝子治療は長期補正を提供する可能性を有し、そして単回注射は治療効果を得るために十分なはずである。図19A~Cは、抗VEGF抗体アバスチン重鎖アバスチンHおよびアバスチン軽鎖アバスチンL;図19Bおよび19Cもしくは可溶性VEGF受容体sFlt-1;図19AのようなVEGFアンタゴニストを含んでなる導入遺伝子単位を含有する、AMDを処置するためのPITADNA構築物を示す。これらのDNA構築物を含んでなるベクターは、0.1~10mg/kgの用量で網膜下注射によって送達することができる。導入遺伝子発現のアブレーションは、長期抗VEGF治療の悪影響が認められる場合に経口二量化剤投与により行うことができる。12.実施例7:肝臓代謝疾患治療のためのPITAPITAは、C型肝炎および血友病のような肝臓代謝疾患を処置するために潜在的に有用である。図20Aは、第IX因子を含んでなる導入遺伝子単位を含有する、血友病Aおよび/もしくはBを処置するためのPITA構築物を示す。第VIII因子もまた、それぞれ血友病AおよびBの処置のために送達することができるそれぞれ、血友病AおよびBのために第VIIIおよびIX因子。治療は、阻害剤形成が起こる場合に患者において取り除くことができる。図20Bは、HCVのIRESを標的とするshRNAの送達のためのPITA構築物を示す。この構築物を含んでなるベクターは、3x1012GC/kgの用量で門静脈の腸間膜支流を介して注射することができる。shRNAの発現は、RNA干渉の非特異的毒性が生じるかもしくは治療がもはや必要とされない場合に取り除くことができる。13.実施例8:心臓疾患治療のためのPITAPITAは、鬱血性心不全CHFおよび心筋梗塞MIが包含されるがこれらに限定されるものではない心臓疾患用途に利用することができる。CHFの処置は、図21Aおよび21Bに示される構築物を用いるインシュリン様成長因子IGFもしくは肝細胞成長因子HGFの送達を含むことができる。心筋梗塞の処置には、MIの初期段階における遺伝子の送達は、虚血の悪影響から心臓を保護することができるが、もはや必要とされない場合に治療のアブレーションを可能にする。この方法の治療遺伝子には、虚血性損傷の程度を限定するように働くことができるヘムオキシゲナーゼ-1HO-1が包含される。心臓へのベクター媒介遺伝子送達の送達方法には、経皮、血管内、筋肉内および心臓肺バイパス技術が包含される。ヒトには、最適なベクター媒介遺伝子送達プロトコルは冠状動脈もしくは前心静脈への逆行もしくは順行トランス冠状動脈送達を利用すると思われる。14.実施例9:中枢神経系CNS疾患治療のためのPITA中枢神経系におけるPITAの適用の魅力的な候補には、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症ALS、ハンチントン病および眼疾患の処置のための神経栄養因子が包含される。図22は、神経成長因子NGFを含んでなる導入遺伝子単位を含有する、アルツハイマー病を処置するためのPITA構築物を示す。NGFのAAVベクター媒介遺伝子送達は、アルツハイマー病の処置のためにCeregeneにより実施される第1相臨床試験において現在研究されている。NGFは、神経変性疾患の動物モデルにおいてコリン作動性細胞消失を減らすことにおいて有効であることが示されておりそしてAD患者において記憶および認知能力の喪失を防ぐことにおいて有効であり得る、神経栄養因子である。該方法の送達方法は、マイネルト基底核NBMを含有する脳の基底前脳領域を標的とする両側定位固定注射からなる。処置を止める必要をもたらす副作用の可能性のために、PITAを含むように構築物をさらに改変することが必要とされる。てんかんの処置のための中枢神経系におけるPITAの適用もまた、発作に関する問題がいったん解消されるようになると遺伝子発現を取り除く可能性のためにならびに薬剤治療に反応せずそして外科的に処置することが難しいてんかんの処置に利用可用な限られた代替法のために有用であり得る。これらの場合において、特に、治療遺伝子を発現するベクターの定位固定注射を伴う送達方法は、代わりの外科的処置よりはるかに低侵襲性である。遺伝子発現の候補には、ガラニン、神経ペプチドYNPYおよびグリア細胞系由来神経栄養因子、GDNFを包含することができ、これらはてんかんの動物モデルにおいて治療効果を有することが示されている。他の適用には、アルツハイマー病に神経成長因子NGFをそしてパーキンソン病に芳香族L-アミノ酸デカルボキシラーゼADCCを送達することが包含される。15.実施例10:HIV治療のためのPITAHIVに対する自然に誘導される中和抗体は、長期感染患者の血清において同定されている。AAVにより送達される中和抗体の効率の悪い誘導しかし十分なレベルをもたらしている、能動的ワクチン法の代わりとして、PITAは受動免疫治療用の抗HIV中和抗体を送達するために有望な方法である。図23を参照。構築物設計は、AMD治療のためのアバスチン遺伝子送達と同様である図19Bおよび19Cを参照。肝臓特異的プロモーターTBGにより調節される抗体をコードする構築物を含んでなるベクターは、3x1012GC/kgの用量で肝臓に注射することができる。あるいはまた、抗体発現を導くユビキタスなCB7プロモーターを保有する構築物を含んでなるベクターは、大腿四頭筋および二頭筋に20回までの注射にわたって5x1012GC/mLの用量で筋肉内注射により送達することができる。治療は、それがもはや必要とされない場合にもしくは抗薬剤抗体の誘導のために毒性が生じる場合に取り除くことができる。16.実施例11:以下の実施例において記述するDNA構築物は、本発明の複製欠損AAVウイルスおよびウイルス組成物を製造するために用いることができる。様々なエンドヌクレアーゼをコードするオープンリーディングフレームはコドン最適化され、そしてGeneArtによりデノボ合成された。アブレーター発現および標的プラスミドは、標準的な分子生物学クローニング技術を用いて作製した。トランスフェクションは、リポフェクトアミンTM2000トランスフェクション試薬LifeTechnologiesを用いてHEK293細胞において行った。全てのトランスフェクションは、トランスフェクション試薬プロトコルにおいて定義した通りの最適なトランスフェクション条件を用いて行った。簡潔に言えば、200~250ngのプラスミドDNAトランスフェクションコントロールプラスミドを除くをリポフェクトアミンと複合体形成させ、そして96ウェルプレート中の細胞に加えた。DNA量は、試験プラスミドと同じプロモーターを含有する関係のないプラスミドでの補完により全ての条件にわたって一定であった。トランスフェクション試薬プロトコル通りトランスフェクション複合体を細胞と4~6時間インキュベーションし、その後でFBS補足培地を加えた。トランスフェクションした細胞を37°Cで24~72時間インキュベーションした。インキュベーション後に、BioTekClarityプレートリーダー上でPromegaデュアルルシフェラーゼ検出キットを製造業者の説明書に従って用いて細胞をレポーター遺伝子発現についてアッセイし、そしてウミシイタケルシフェラーゼをトランスフェクション効率を制御するために使用した。全てのサンプルは四重反復で行い、そして平均の標準誤差を計算した。A.野生型FokIの共発現は、FokIタンパク質の送達より効果的に導入遺伝子の発現を取り除くFokI酵素のアミノ酸配列は配列番号:12に提供され、ここで、アミノ酸1~387はDNA結合ドメインであり、アミノ酸387~584は触媒ドメインである。コドン最適化したFokI配列は配列番号:1に提供される。図25は、野生型FokIがHEK293細胞への共トランスフェクション後にルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を効果的に取り除いたことを例示し図25A棒2、一方、FokIタンパク質を細胞に送達した場合には部分的なアブレーションのみが認められた図25A、棒3。用量依存的実験において、FokI発現ベクターはジンクフィンガーDNA結合ドメインZFHDに融合したFokI触媒ドメインを含有した。963bpであるこの構築物は配列番号:21に提供され、そして塩基対1~366bpZFHD、367~372bpリンカーおよび373~963bpFokI触媒ドメインからなる。得られる発現産物はアミノ酸1~122ZFHDを含んでなり、アミノ酸123~124はリンカーであり、そしてアミノ酸125~321はFokI触媒ドメインからである。図25Bは、FokIの濃度を増加することによりLucレポーターの用量依存的アブレーションがもたらされたことを例示する。ルシフェラーゼは多数の天然のFokI部位を含有するので、この例示において導入遺伝子を含有する転写単位中にアブレーション部位を設計する必要はなかった。これは、細胞への送達用の導入遺伝子を含有する転写単位中の特定のアブレーション部位に向けられるトランスフェクションしたFokI酵素を用いるPITA系の使用への裏付けを提供する。B.ジンクフィンガー-ホメオドメインによりDNA上の非コグネイト認識部位に繋留されるキメラの改変されたFokIはLucレポーター遺伝子の発現を効果的に取り除く本実施例におけるプラスミド構築物は、FokI触媒ドメイン全長タンパク質のアミノ酸387~584に対応する198アミノ酸配列番号:14非繋留FokIもしくは上記のA部分に記載の通りの963bpのZFHD-FokI触媒ドメイン繋留FokIのいずれかを含有する。最高濃度でさえ、DNAに繋留されないFokIの触媒ドメインは、Lucレポーター遺伝子の発現に効果を有さない図26A。ZFHDとの融合を介してDNAに繋留されるキメラの改変されたFokIは、増加する濃度のZF-HD-FokI発現プラスミドをHEK293細胞に共トランスフェクションした場合に用量依存的にルシフェラーゼレポーターの発現を効果的に取り除いた図26B。これは、PITA系および細胞への送達用の導入遺伝子を含有する転写単位中の特定のアブレーション部位に向けられるキメラ酵素により提供される追加の安全要素の使用を裏付ける。C.キメラのFokIのDNA結合特異性は異種DNA結合ドメインの様々な種類との融合により再現性良く変えることができ、そして標的導入遺伝子のアブレーションは異種NLSの付加によりさらに改善することができる本実施例は、ジンクフィンガーホメオドメインZFHDがキメラの改変された酵素により媒介されるアブレーションの特異性を改変するために適当な唯一のドメインではないことを例示する。FokIは、HTHDNA結合ドメインをFokI触媒ドメインに融合した場合に用量依存的にルシフェラーゼレポーターの発現を効果的に取り除いた図27A。別個の実験において図27B、HTH-FokIの活性は、HTH-FokIコーディング配列のN末端に異種NLSを付加することによりさらに改善された。HTH-FokI触媒ドメイン配列番号:5は、Ginセリンリコンビナーゼからの1~171bpHTH、リンカーbp172~177およびコドンを最適化したFokI由来のFokI触媒ドメイン178~768bpからなる。得られるキメラ酵素配列番号:6は、GinからのHTHのaa1~57、リンカーaa58~59およびFokI触媒ドメインアミノ酸60~256を含有する。図27A~27Bは、キメラのFokIのDNA結合特異性を別の種類の異種DNA結合ドメインとの融合により再現性良く変更できそして標的導入遺伝子のアブレーションが異種核局在化シグナルNLSの付加によりさらに改善できることを例示する棒グラフである。図27Aは、HTH融合によってDNAに繋留されたFokIをコードする発現プラスミドの増加する濃度とpCMV.Luciferaseの共トランスフェクションの結果を例示する6.25、12.5、25、50および100ng。最初の棒は、50ngのpCMV.Luciferaseのみを示すコントロールである。図27BそのN末端にNLSをさらに有する、HTH-FokI融合をコードする発現プラスミドの増加する濃度とpCMV.Luciferase。17.実施例12:ここで例示されないが、他のキメラ酵素が本明細書に記載の技術を用いて作製されている:SV40T-Agの核局在化シグナル1~24bpおよびGin、セリンリコンビナーゼからのHTH25~192bpを含む、SV40T-AgNLS-Ginからのヘリックス-ターン-ヘリックスHTH192bp、配列番号:7を含有するAAVプラスミド。得られる酵素配列番号:8において、アミノ酸1~8はSV40T-AgNLSからであり、そしてアミノ酸9~64はGinからのHTHである;SV40T-AgNLSbp1~24、GinからのHTHbp25~192、リンカーbp193~198およびFokIの触媒ドメインbp199~789含む、SV40T-AgNLS-HTH-FokI触媒ドメイン789bp、配列番号:9を含有するAAVプラスミド。得られるキメラ酵素配列番号:10において、アミノ酸1~8はSV40T-AgNLSからであり、アミノ酸9~64はGinからのHTHであり、アミノ酸65~66はリンカー残基であり、そしてアミノ酸67~263はFokI触媒ドメインである。SV40T-AgNLSbp1~24、ジンクフィンガーホメオドメインbp25~387、リンカーbp388~393およびFokI触媒ドメインbp394~984を含む、SV40T-AgNLS-ZFHD-FokI触媒ドメイン984bpを含有するAAVプラスミドを作製した配列番号:23。得られるキメラ酵素配列番号:21、328aaにおいて、アミノ酸1~8はSV40T-AgNLSであり、アミノ酸9~129はZFHDであり、アミノ酸130~131はリンカー残基であり、そしてアミノ酸132~138はFokI触媒ドメインである。これらおよび他の構築物は、ウイルス組成物およびPITA系用に本発明の方法に従ってウイルスを製造するために用いることができる。18.実施例13:HIVの処置における複製欠損AAVウイルス組成物の使用本組成物は、HIVの処置における安全機序として潜在的に使用することができる。最近、エイズへの進行なしに数十年にわたってHIV状態を維持する個体、長期非進行者からの広範に中和する抗体が、いくつかの研究グループにより同定されている。HIVに対する中和抗体HIVNAbの全てのコーディング領域が、AAVの逆方向末端反復ITRの間に置かれる。構築物の全サイズが4.7kb未満2つのITRを含むである場合、それらはAAVキャプシドにパッケージングされる。選択するAAV血清型キャプシドは、遺伝子発現のレベル、送達の方法および必要とされる注射部位からの生体内分布の程度によって決まる。さらに、HIVNAbの発現に使用する構成的プロモーターおよび潜在的に1つの小分子の場合における誘導系の部分は、標的とする組織タイプによって決まる。潜在的臨床研究の以下の実施例において、選択するベクター血清型は、肝臓特異的プロモーターTBGの利用を可能にする静脈内注射により投与されるAAV8である。HIV患者において、これらのHIV中和抗体の1つもしくはそれ以上を発現するAAVベクターの投与は、1つもしくはそれ以上の広範HIVNAbの長期の高レベル発現をもたらし、そしてウイルス量を減らし、HIVの獲得を潜在的に防ぐ。この場合、個体は5x1012ゲノムコピー/各ベクターのキログラムの用量で2つのAAVベクターの静脈内注射を受ける。2つのAAVベクターに含まれるのは、構成的プロモーターの制御下のHIV中和抗体であり、ベクターの投与後に発現が迅速に起こることを可能にする。A.ヘテロ二量体および2つの小分子HIVNAbに対する潜在的毒性の最初の兆候の後、誘導系の成分、この場合、FKBPに連結されたDNA結合ドメインおよびエンドヌクレアーゼ酵素の触媒ドメインに連結されたFRAPLの発現を誘導するために第1の小分子薬剤が投与される。これは、HIVNAbに対するさらなる毒性が生じる場合に系を作用のために準備することを可能にする。毒性レベルが上昇し続ける場合、エンドヌクレアーゼ活性の開始は、活性酵素の形成およびHIVNAb遺伝子発現のアブレーションをもたらす第2の小分子薬剤の投与により誘導される。B.ヘテロ二量体および1つの小分子また構成的発現の制御下であるのは、ラパマイシン誘導系の要素、FKBPおよびFRAPLである。AAVベクターの投与後に、患者は数年間にわたって一定の間隔で綿密にモニターされる。HIVNAbに対する毒性が生じる場合、ラパマイシンもしくはラパログの送達が実行される。反復投与まで増やす可能性を有してまず最初に1mg/kgのラパマイシン/ラパログのIV投与が、HIV抗体の発現を取り除くために与えられる。毒性およびHIV抗体レベルは、HIVNAbの発現が検出できないレベルに到達するまで綿密にモニターされる。従って、HIVNAbの遺伝子発現のアブレーションは、克服できない毒性が生じる場合に遺伝子発現を取り除くための安全スイッチを提供する。本明細書において引用される全ての公開、特許および特許出願、ならびに優先出願米国特許出願第61/318,755号および配列表は、各個々の公開もしくは特許出願が引用することにより組み込まれると明確にそして個々に示されるように引用することによりそれらの全部が本明細書に組み込まれる。前述の発明は理解を明らかにする目的のために例示および実施例としていくらか詳細に記述されているが、添付の請求項の精神もしくは範囲から逸脱せずにある種の変更および改変をそれに行うことができることは本発明の教示を考慮すると当業者に容易に明らかである。"