"i配列番号1、配列番号2及び配列番号3の配列により構成される群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域、及びヌクレオチド配列の配列番号7によってコードされる軽鎖可変領域、又はiiアミノ酸配列の配列番号4、配列番号5及び配列番号6により構成される群から選択される重鎖可変領域、及びアミノ酸配列の配列番号8を有する軽鎖可変領域を含む組換え抗体。アミノ酸残基K101、R103、E105及びY25が抗体-抗原相互作用の基盤であるヒト血管内皮増殖因子AVEGF-Aにおける機能性エピトープを同定する組換え抗体。iヌクレオチド配列の配列番号1によってコードされる重鎖可変領域、及びヌクレオチド配列の配列番号7によってコードされる軽鎖可変領域、又はiiアミノ酸配列の配列番号4からなる重鎖可変領域、及びアミノ酸配列の配列番号8からなる軽鎖可変領域を含む、請求項2に記載の組換え抗体。異なるアイソフォームのヒトVEGF-Aのinvitro刺激効果、及びinvivo血管新生促進効果に干渉する、請求項1~3に記載の組換え抗体。単鎖FvscFv型の抗体断片である、請求項1~4に記載の組換え抗体。i配列番号9、配列番号11及び配列番号13により構成されるヌクレオチド配列の群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされ、又はii配列番号10、配列番号12及び配列番号14により構成される群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項5に記載の組換え抗体。Fab型の抗体断片である、請求項1~4に記載の組換え抗体。i配列番号15と配列番号16、配列番号19と配列番号20、及び配列番号23と配列番号24により構成される群から選択されるヌクレオチド配列の対によりそれらの2本の鎖に関してコードされ、又はii配列番号17と配列番号18、配列番号21と配列番号22、及び配列番号25と配列番号26により構成される群から選択されるアミノ酸配列の対によりそれらの2本の鎖に関して構成される、請求項7に記載の組換え抗体。scFv2-Fc型であり、scFv断片がスペーサーにより、そのタンパク質型で別の同一ポリペプチド鎖と共有結合して二量体分子を形成するヒト免疫グロブリンのヒンジ、CH2及びCH3定常ドメインと連結している、請求項1~4に記載の組換え抗体。ヌクレオチド配列の配列番号27、配列番号29及び配列番号31により構成される群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされ、又はii配列番号28、配列番号30及び配列番号32により構成される群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項9に記載の組換え抗体。ヒト免疫グロブリンのFc定常ドメインがIgG1、IgG2、IgG3又はIgG4型である、請求項9に記載の組換え抗体。重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列の配列番号1、配列番号2又は配列番号3、及び軽鎖可変領域をコードする配列番号7が、1つは重鎖可変領域、次にヒトIgG1免疫グロブリンの定常ドメインCH1、ヒンジ、CH2及びCH3として、もう1つは軽鎖可変領域、次にヒトCκ又はCλ定常ドメインとして、2本のポリペプチド鎖をコードする配列中に含まれる、請求項1から4までのいずれか一項に記載の組換え抗体。ヒト免疫グロブリンの定常ドメインがIgG2、IgG3又はIgG4型である、請求項12に記載の組換え抗体。請求項1~4に記載の組換え抗体の同等な変異体である組換え抗体。放射性同位体、化学的作用物質、又は生物的作用物質とさらにコンジュゲートしている、前出請求項のいずれか一項に記載の組換え抗体。組換え細菌又は哺乳動物細胞において産生される、請求項1~14に記載の組換え抗体。請求項1~14に記載の組換え抗体をコードするベクターであって、組換えDNA遺伝子操作によって得られ、宿主細胞中に組み込むことができるプラスミド又は配列である、上記ベクター。請求項1~14に記載の組換え抗体を含む医薬組成物。徐放可能であることで特徴付けられる、請求項18に記載の医薬組成物。悪性腫瘍及びその転移、急性及び慢性炎症過程、自己免疫過程、並びに加齢黄斑変性などの目の疾患などの、血管新生の増大を伴う実体の免疫療法用の医薬品を製造するための、請求項1~14に記載の組換え抗体の使用。イメージング技術による悪性腫瘍及びその転移のinvivo診断用の放射性医薬品を製造するための、請求項1~14に記載の組換え抗体の使用。現在、ヒトVEGFの影響を中和し、過剰な血管新生を発症する実体の治療において使用することができる新たな抗体の開発は、関心の対象であり続けている。本発明は、ヒトVEGF-Aを特異的に認識する新たなヒト組換え抗体を提供するので、本発明は前述の問題を解決する。本発明中に記載する様々な組換え抗体は、2H1scFv抗体断片由来の類似分子と比較すると、優れた免疫化学的、生物学的、及び治療性能を示す。このような抗体を開発するため、scFv抗体断片2H1のVL及びVH可変領域の相補性決定領域3CDR3において突然変異を実施した。線維状ファージディスプレイ技術を使用したヒトVEGF-Aのより良い認識のために選択した新たな突然変異可変領域を、遺伝子工学的技術を使用し組み合わせて、望ましく向上した新規の免疫化学的及び生物学的特性を有する新たな抗体結合部位を得た。この作業のため、scFv抗体断片2H1をコードする遺伝子の配列の分析を最初に行い、これによって、VL及びVHCDR3はV、D及び/又はJヒト原型生殖系列遺伝子領域に関してほとんど変化がなかったことを示した。この発見は、抗原に対する2H1の低い親和性を説明した。2H1scFv抗体断片のVL8アミノ酸残基及びVH7アミノ酸残基領域のCDR3ドメインをコードする遺伝子配列のみを対象とする、特定突然変異誘発戦略を次いで設計した。Parsimonius突然変異誘発技術略してPMBalint、R.yLarrickJ.W.1993.Gene、137:109~118頁を使用して突然変異を誘導した。PMでは、突然変異用の配列の分析を行い、抗体結合部位の特徴を変える可能性がある最小限の変更を、公のデータベースで利用可能な公知の免疫グロブリン配列に関する既存の情報を考慮してコンピュータにより行う。縮重合成オリゴヌクレオチド及びポリメラーゼ連鎖反応PCRを使用すると、PMは非常に短い時間で、望ましい遺伝子領域に関する数百万の新たな突然変異をもたらす。PMは2H1scFv抗体断片のVL及びVH領域のCDR3ドメインに独立に適用し、適切なファージミドベクターにおける新たな可変領域のクローニングを使用して、前述のアミノ酸配列中の結合部位が突然変異している、2つの大きなscFv抗体断片ライブラリーを生成した約5×108個体例1。1と称するライブラリーでは、CDR3中で突然変異した数百万の新たなVH領域と関係がある、原型2H1scFv抗体断片VL領域が保存されていた。2と称するライブラリーでは、CDR3中で突然変異した数百万の新たなVL領域と関係がある、原型2H1scFv抗体断片VH領域が保存されていた。2つのライブラリーを表す新たなscFv抗体断片を提示するファージを、増大させた濃度の可溶性2H1scFvを同時に使用して、ヒトVEGF-Aに対して選択し、VEGF-Aに対してより高い親和性を有する新たなscFv抗体断片の単離を助けた例2。2つのライブラリーそれぞれから選択したscFv断片の新たなクローンで始めて、それらのVEGF-Aの相対的認識の実験測定を、ファージでまた提示された2H1scFvに関してELISAにより行った例2。これらの実験は、どの突然変異VL及びVH可変領域が、新たな断片に優れた抗原認識特性及び親和性をもたらしたかを示した。同定した新たな可変領域を配列決定して、新たなCDR3のヌクレオチド組成を決定した。ライブラリー1から選択した最良scFv抗体断片由来のVH領域の新たなCDR3ドメインの場合、これら全てのドメインが、それらの間でも、2H1scFv抗体断片の原型VHに対しても、異なるアミノ酸配列を有していた例2、表2。最良抗原認識性を有するscFv抗体断片を3F3、3E3及び4D8と称し、新たなVH領域を含有する。3F3scFvは、本発明者らによりH6と称されるVHを含有する塩基配列に関して配列番号1及びアミノ酸推定配列に関して配列番号4。3E3scFvは、本発明者らによりH5と称されるVHを含有する塩基配列に関して配列番号2及びアミノ酸推定配列に関して配列番号5。4D8scFvは、本発明者らによりH7と称されるVHを含有する塩基配列に関して配列番号3及び推定アミノ酸配列に関して配列番号6。ライブラリー2から選択した最良scFv抗体断片由来のVL領域の新たなCDR3ドメインの場合例2、表3、本発明者らは、新たなscFv抗体断片の突然変異は、原型ドメインに関して幾つかの位置に集中していたことを確認した。ヒトVEGFの最良認識性を有する4つのscFv断片の3つにおいて、8つのCDR3残基の7つが保存されており、位置5の1残基はある場合から他の場合に変化したアミノ酸であった。この分析の結果は、結合部位と抗原の間の接触が増大する可能性は、この特定位置5に追加的置換を作製することにより、さらに調べることができることを示した。この最良結合群の典型的なVLCDR3を基礎とし、ファージにおいて提示された新たなscFv抗体断片を次いで構築し、この場合第5アミノ酸をコードするCDR3ヌクレオチドを置換してアミノ酸P、E又はDを生成した。このように生成した新たなVL領域クローンはそれぞれL1、L2、及びL3と称した。これらの置換から、アミノ酸Dを含んでいた置換は、他の2つの新たな突然変異体、全ての先例VL突然変異体、及び当然ながら、原型2H1scFvに対して、最良抗原認識性を有するファージディスプレイscFv抗体断片を結果として与えた置換であった例3、表4。抗原認識特性を増大し続けるために、本発明者らは次いで、ライブラリー1由来の最良として同定したVH領域H6、H5及びH7と、新たなL3VL領域塩基に関して配列番号7及び推定アミノ酸配列に関して配列番号8を組み合わせた。ファージにおいてL3H6、L3H5及びL3H7と称されるこれら3つの新たなscFv抗体断片が提示された後、2H1scFv抗体断片、並びにライブラリー1及び2から選択した他のファージディスプレイscFvに関して、VEGF-Aに対する親和性の比較を実施した例4、表V。この試験は、ファージにおいて提示された3つの新たなscFv抗体断片L3H6、L3H5及びL3H7は、全ての他のscFvより優れていることを示した。これら3つの中で、L3H6は阻害アッセイにおいてより良いIC50を示す抗体断片であり、アッセイ中により多量の可溶性2H1scFv断片を加えて、ヒトVEGFとL3H6の平均的結合を阻害することが必要であることを示す。本発明の異なる実施形態では、可変領域H6配列番号1、H5配列番号2、H7配列番号3及びL3配列番号7をコードする遺伝子を使用して、異なる型の組換え抗体:ascFvL3H6、scFvL3H5及びscFvL3H7と称される可溶性scFv断片、bFabL3H6、FabL3H5及びFabL3H7と称される可溶性Fab断片、並びにc二価抗体型分子scFv2-FcL3H6、scFv2-FcL3H5及びscFv2-FcL3H7を産生した。組換え抗体断片scFvL3H6、scFvL3H5及びscFvL3H7を産生するため、VH領域H6配列番号1、H5配列番号2、及びH7配列番号3をコードする遺伝子を、pACR.1ベクターを使用して、VH-リンカー-VLの順に、リンカーセグメントにより空間を開けてVL領域L3配列番号7と組み合わせた例5。pACR.1ベクターは、細菌周辺質に対する組換えタンパク質の発現用に設計され、分子のC末端に、分析目的のタグとして有用なc-mycペプチドドメイン、次に金属イオンアフィニティークロマトグラフィー略してIMACを使用した精製を容易にするための6ヒスチジンドメインを付加するPorathJ.1992.Prot.Expr.Purif.3:263~281頁。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動略してSDS-PAGEにおいて約29kDaの見かけの分子量を有する、抗体断片scFvL3H6塩基配列に関して配列番号9及びアミノ酸配列に関して配列番号10、scFvL3H5塩基配列に関して配列番号11及びアミノ酸配列に関して配列番号12、及びscFvL3H7塩基配列に関して配列番号13及びアミノ酸配列に関して配列番号14は形質転換細菌の培養培地から回収することができ、IMACを使用して容易に精製される。Fab組換え抗体断片FabL3H6、FabL3H5及びFabL3H7を産生するため、可変領域H6配列番号1、H5配列番号2、H7配列番号3及びL3配列番号7中に含有される配列をコードする遺伝子を、pFabHum-1ベクターでクローニングした例9。pFabHum-1プラスミドは、細菌周辺質に対するヒト免疫グロブリンCH1及びCλ定常領域を有するFab断片の発現用に構築された、バイシストロン性ベクターである。このベクターは、6ヒスチジン及びc-mycドメインをクローニング分子のC末端に加える。このプラスミドでは、H6、H5又はH7領域を遺伝的に定常CH1領域に結合させ、一方L3は定常Cλ領域に結合させ、結果としてFab抗体断片アミノ酸配列の配列番号17及び配列番号18をコードするヌクレオチド配列の配列番号15及び配列番号16を有するFabL3H6、アミノ酸配列の配列番号21及び配列番号22をコードするヌクレオチド配列の配列番号19及び配列番号20を有するFabL3H5、及びアミノ酸配列の配列番号25及び配列番号26をコードするヌクレオチド配列の配列番号23及び配列番号24を有するFabL3H7をもたらした。抗体断片FabL3H6、FabL3H5及びFabL3H7を大腸菌Escherichiacoliにおいて発現させ、IMACを使用して形質転換細菌の培養培地からIMACによって精製し、非変性条件下で、SDS-PAGEにおいて約50kDaの見かけの分子量を有する。二価組換え抗体scFv2-FcL3H6、scFv2-FcL3H5及びscFv2-FcL3H7は、それぞれの場合10アミノ酸リンカーをコードする3’配列、次にヒトIgG1免疫グロブリンのヒンジ、CH2及びCH3ドメインをコードするヌクレオチド配列と結合した、抗体断片scFvL3H6、L3H5及びL3H7の配列を包含する。前述の抗体は、pVSJG-HucFcベクターで、前述のscFv断片をコードする遺伝子のPCR産物のクローニングによって得た例10。pVSJG-HucFcベクターは、哺乳動物細胞中での、ヒトIgG1型免疫グロブリンFcと結合した2つの同一scFvを包含する抗体型の分子の発現用に設計されている。分子scFv2-FcL3H6ヌクレオチド配列に関して配列番号27及びアミノ酸配列に関して配列番号28、scFv2-FcL3H5ヌクレオチド配列に関して配列番号29及びアミノ酸配列に関して配列番号30、及びscFv2-FcL3H7ヌクレオチド配列に関して配列番号31及びアミノ酸配列に関して配列番号32が、対応するプラスミドでトランスフェクトしたCHO細胞の上清中で生成した。プロテインA又はプロテインGアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製したscFv2-Fc分子は、SDS-PAGEにおいて100kDaと120kDaの間の見かけの分子量を示す。本発明の目的である組換え抗体は、2H1scFv抗体断片の原型可変領域由来のものを含めて、ヒトVEGF-Aを認識又は中和する他の抗体及び抗体断片に対して新規である。これは、a本発明の目的である組換え抗体が、それらの可変領域CDR3中に新規なDNA配列を有するからである。このため本発明の目的である組換え抗体は、ハイブリドーマ由来の抗体Kim、KJ.etal.1992.GrowthFactors7:53~64頁;Muller、Y.etal.1997.ProcNatlAcadSciUSA94:7192~7197頁;Asano、M.etal.1998.Hybridoma17:185~190頁;Schaeppi、JM.etal.1999.JCancerResClinOncol125:336~342頁;Brekken、RA.etal.2000.CancerRes60:5117~5124頁;Brekken、RA.andThorpe、PE.2001.JControlledRelease74:173~181頁、又は別のウイルスによるヒト細胞の形質転換によって得られた抗体US5730977、遺伝子操作による既存の抗体の改変Jayson、G.etal.2002.JNCI94:1484~1493頁;Ferrara、N.etal.2005.BiochemBiophysResComun333:328~335頁、及びヒト抗体断片ライブラリー由来の抗体Vitaliti、A.etal.2000.CancerRes60:4311~4314頁;Fuh、G.etal.2006.JBiolChem281:6625~6631頁などの、他の著者によって報告されたVEGF-Aに対する他の抗体とは異なるものとなる。2H1scFv抗体断片WO2008/052489A1のVL及びVH領域に関して、本発明中に記載する抗体はまた異なる。VH領域H6配列番号4、H5配列番号5及びH7配列番号6は、2H1に対して全7個のCDR3アミノ酸が異なる。VL領域L3配列番号8は、2H1に対して8個のCDR3アミノ酸の3個が異なる。b本発明の目的である組換え抗体が、他のライブラリーFuhG.etal.2006.J.BiolChem281:6625~6631頁から得たヒトFab抗体断片のものと異なる、及びベバシズマブのそれとも異なる、ヒトVEGF-Aに対する免疫化学的特異性を有するからである。本発明中に記載する抗体と異なり、ベバシズマブはマウスVEGFを認識することができない。さらに、ベバシズマブは低減したVEGF-Aを同定し、一方で本発明中に記載する抗体はそれができない。本発明の例6、7及び9では、どのようにして新たな組換え抗体が、2H1scFv抗体断片、及び2H1由来の組換え抗体WO2008/052489A1に対して、ヒトVEGF-Aの異なる優れた認識性をさらに有するかを記載する。c抗体断片scFvL3H6及びそれに由来する組換え抗体FabL3H6及びscFv2-Fc-L3H6は、ヒトVEGF-Aにおいて、ヒトVEGF-Aの影響を中和する他の抗体により同定される他の全てと異なる、機能性エピトープを認識するからであるMuller、Y.etal.1997.PNASUSA94:7192~7197頁;Muller、AY.etal.1998.Structure6:1153~1167頁;Schaeppi、JM.etal.1999.JCancerResClinOncol125:336~342頁;Brekken、RA.etal.2000.CancerRes60:5117~5124頁;Fuh、G.etal.2006.JBiolChem281:6625~6631頁;WO2005012359;WO2008/052489A1。本発明中に記載する新たな組換え抗体scFvL3H6、FabL3H6及びscFv2-Fc-L3H6によりヒトVEGF-Aにおいて定義される新たな機能性エピトープは、重要なアミノ酸として、残基K101、R103、E105及びY25を有する例11。これらのアミノ酸が置換される場合、本発明中に記載する抗体の認識は激しく影響を受ける。本発明中に記載する新たな組換え抗体は、可溶性ヒトVEGF-A、固体表面に吸着したヒトVEGF-A、又はこの因子を生成するヒト細胞と結合した若しくはその近辺のヒトVEGF-Aと結合することができ、特に後者では、ヌード無胸腺マウスで増殖するヒト腫瘍中に存在する細胞である。本発明中に記載する新たな組換え抗体は、ヒトVEGF-Aアイソフォーム121及び165、同定済みマウスVEGFを特異的に認識し、VEGFR1受容体ではなく、VEGFR2受容体とVEGF-Aの相互作用を遮断する。後者2つの特性によって、本発明中に記載する新たな組換え抗体と、ベバシズマブ及びラニビズマブを区別する。本発明中に記載する新たな組換え抗体は、例8中に示すように、2H1scFv抗体断片由来の組換え抗体より、ヒトVEGF-Aに対して高い親和性を有する。結果として、これらの新たな抗体は、aVEGFとVEGFR2の結合の遮断例7、bヒトVEGF-Aの刺激下での、培養中内皮細胞の増殖の阻害例12、cVEGFを含有するマトリゲルペレットによって誘導されるマウスにおける皮下血管新生の阻害例13、及びヌードマウスに移植したヒト腫瘍の増殖の阻害例14を測定する試験において、scFv2H1及び2H1由来の抗体に対して優れた性能を有する。本発明中で利用する専門用語の定義抗原結合部位この用語は、抗原又はその一部分と特異的に相互作用する抗体の一部分を記載する。抗体結合部位は主に、2つの抗体可変領域、軽鎖VL及び重鎖VH可変領域によって形成される。抗体結合部位は、可変領域の非共有結合性相互作用によって形成される。抗体結合部位は、特異的抗原結合性に干渉しないペプチドと2つの可変領域の連結によって、人為的に安定化させることが可能である。これはscFv型の断片の場合である。本来、抗体結合部位は可変領域の非共有結合性相互作用によって構築され、CH1及びCLκ又はλ定常ドメインの非共有結合性相互作用、及びCL中に存在するシステインと抗体重鎖のヒンジ領域中に位置する別のシステインの間で確立したジスルフィド結合によって補強される。完全天然抗体は、2つ以上の同一抗原結合部位を有する。組換え抗体この用語は、1つ又は複数の抗原結合部位により抗原を特異的に認識する、組換えDNA技術又は人為的遺伝子合成によって合成型で完全又は部分的に生成される免疫グロブリン又はその一部分を記載するGavilondo、J.yLarrick.J.W.2000.Biotechniques29:128~136頁。組換え抗体の例は、その中で遺伝子操作を使用して、一種から得た可変領域遺伝子又はその一部分と別種の免疫グロブリン定常領域を結合させた、いわゆるキメラ及びヒト化抗体である。組換え抗体の中で、本発明者らは、遺伝子操作によって生成する、1つ又は複数の抗原結合部位を包含する抗体断片も見出すことができる。組換え抗体断片の例は、iVL、VH、CL及びCH1免疫グロブリンドメインを含むFab断片、iiVH及びCH1ドメインからなるFd断片、iii単一抗体のVL及びVHからなるFv断片、iv所与の抗体のVH及びVLドメインを異なる順序VH-VL又はVL-VHで、2つの可変領域の結合を可能にするペプチドリンカーと組み合わせて、抗原結合部位を形成するscFv断片Birdetal.1988.Science242:423~426頁;Hustonetal.1988.PNASUSA85:5879~5883頁、vscFvと同様の形式で、ただし1つの同一分子のVH及びVLドメインを結合部位に構築できない短鎖ペプチドリンカーを用いて構築される多価又は多重特異性断片であるダイアボディ、後者は2つ以上のscFvの結合によって作製され、それによって多価性を与えなければならないWO94/13804;HolligerPetal.1993.PNASUSA90:6444~6448頁、vidAbWardSEetal.1989.Nature341:544~546頁、単離CDR、Fab’2断片、ナノボディ、及び二重特異性scFv二量体PCT/US92/09965;HolligerPyWinterG.1993.CurrentOpinionBiotechnol.4:446~449頁;deHaard、Hetal.1998.Adv.DrugDeliveryRev.31:5~31頁などの他の断片である。scFv及びFabなどの幾つかの型の断片は、抗体ライブラリーから得ることができ、この場合、一種の可変領域の大きな合成又は天然遺伝子レパートリーを、ランダムに組み合わせて可変領域の特定の結合を生成し、次いでそれらは線維状ファージの表面に抗体断片として提示される。さらに考えられる組換え抗体は、抗体断片を抗体定常領域に構築する遺伝子操作によって生じる、抗体型分子である。例えば、免疫グロブリンFcのヒンジ、CH2、CH3及び時折CH4ドメインにより形成される領域にscFvを接合させることによって、本明細書ではscFv2-Fcと称する二価抗体型分子を構築することができる。その構築に関与する部分、及びグリコシル化の存在に応じて、前記分子は免疫グロブリンFcと関係がある全てのエフェクター機能を示すことができる。適切な宿主中での発現後、scFv2-Fc分子は、2つの同一scFvによって表される2つの結合部位を有する。最後に、組換え抗体は、1つの供給源即ちscFv又はFabから得た軽鎖及び重鎖の可変領域を、ヒト免疫グロブリンの定常領域、例えば重鎖可変領域に関してCH1、ヒンジ、CH2、CH3及び時折CH4、及び軽鎖可変領域に関してCκ又はCλに構築する分子でもある。抗体の同等な変異体抗体の同等な変異体は、抗原を特異的に認識し、それ、及びその生物学的特性に対して影響を与える能力を保持する、抗体可変領域の正確な配列の結合及び操作に由来するポリペプチド分子である。これらのポリペプチド分子は、その中でVLドメインがリンカー及びVHscFvドメインの前に位置する、又は現況技術で知られている他のリンカーセグメントが利用される、又はFab’2、Fabc、Facb、二量体、三量体又は四量体scFv断片として生成されるような、他の組換え抗体断片の型をとることができるWinterG、MilsteinC.1991.Nature349:293~299頁;WO94/13804;deHaard、Hetal.1998.Adv.DrugDeliveryRev.31:5~31頁。また、免疫グロブリン由来配列の付加によって多価分子が生成するときBestagnoMetal.2001.Biochemistry40:10686~10692頁。その可変領域の正確な配列が二重抗体、又は完全サイズの抗体の型に含有され、ヒト免疫グロブリン又は多種由来の定常ドメインと結合するとき、抗体の同等な変異体がまた生成される。全てのこれらの遺伝子工学的操作は、当技術分野の当業者には知られている。抗体の同等な変異体、その中で可変領域のCDR配列を外来免疫グロブリンフレームワーク中に人為的に置く、いわゆるCDR移植によって生成する分子又は変異体も考えられ、この操作が原型抗原を認識し生物学的及び生化学的影響を誘発する能力に影響を与えることはない。抗体又はその変異体の特異性抗体又はその断片が、その特異的結合対抗原と異なる他の分子と有意に結合しない状況を指す。この用語は、抗原結合部位が幾つかの関連又は無関連抗原中に現れる特定エピトープに特異的である場合にも適用可能であり、この場合抗体結合部位は、前述のエピトープを有する幾つかの抗原を同定することができる。エピトープ。機能性エピトープ抗原が大きい場合、抗体はエピトープと称される抗原の特定部分に専ら結合することができる。抗原がタンパク質である場合、抗体結合部位によって認識されるエピトープは直鎖状アミノ酸配列により形成されてよく、又は高次構造的、即ち抗体結合部位と相互作用する抗原中のアミノ酸がタンパク質の三次構造において構造上近似していてよいが、その一次構造は必ずしも配列状ではない。タンパク質の場合、所与のエピトープは本来不連続であり、非共有結合により抗体のアミノ酸と相互作用する一群の特異的アミノ酸によって画定する。機能性エピトープは、抗原中の特異的アミノ酸の置換により実験によって決定されるエピトープであり、抗体認識の消失に対する影響又はその変異体のそれは免疫化学的方法によって評価する。本発明中に記載する新たな抗体は、レーザー光凝固により目の損傷を引き起こす非ヒト霊長類実験モデルにおいて、脈絡膜血管新生を予防するのに有用である例16。VEGFとVEGFR2受容体の間の相互作用を遮断するので、本発明中に記載する新たな抗体は、活性化内皮細胞及びそれらの骨髄前駆体が増殖する能力、並びに異なる疾患において病理学的に形成される新たな血管の生理的安定性の維持に影響を与える。この遮断は、ヒトVEGFに関して記載する他の生物学的機能、例えば免疫応答の負の制御剤としてのその役割にも影響を与え得るChouaibSetal.1997.ImmunologyToday18:493~497頁。異常又は過剰な血管新生と共に進行する疾患の新規な治療手順の開発に関して、本発明中に記載する新たな組換え抗体が有用である後者の疾患、その中で本発明者らは以下のものを見出すことができる:a癌、原発性固形腫瘍及びその転移を意味する。これらの治療が見込まれる疾患には、類表皮腫瘍、扁平頭頸部腫瘍、結腸直腸腫瘍、前立腺癌、乳房腫瘍、肺小細胞及び非小細胞癌、膵臓腫瘍、甲状腺癌、卵巣癌、肝臓腫瘍、カポジ肉腫、中枢神経系新生物神経芽細胞腫、血管芽細胞腫、髄膜腫、及び脳転移、メラノーマ、腎臓及び胃腸癌、横紋筋肉腫、神経膠芽細胞腫及び平滑筋肉腫があるが、これらだけには限られない。本発明中に記載する組換え抗体scFv2-FcL3H6、scFv2-FcL3H5及びscFv2-FcL3H7は、ヌードマウスに移植したヒト腫瘍の増殖に対する影響を示した例14。本発明中に記載する組換え抗体は、ヒトVEGF-Aの新規なエピトープ認識を有するので、これらは、ヒトVEGF-AとそのVEGFR2受容体の結合に干渉するその方法が、他の抗体及び抗血管新生分子と異なり、これが異なるinvivo治療効果をもたらす可能性がある。同じ抗原に対して産生されるが、異なるエピトープを認識するか又は異なる親和性を有する抗体を用いて、癌を有するヒトにおける付帯的影響の低減を含めて、異なるinvivo治療効果をもたらすことができることは、十分文書化されているAllanD.G.P.2005.TheOncologist10:760~761頁;Boland、W.KyBebb、G.2009.ExpertOpin.Biol.Ther.99:1~8頁。b湿潤型加齢黄斑変性、血管新生緑内障、並びに糖尿病性網膜症及び新生児網膜症などの目の疾患。本発明中に記載するscFvL3H6及びscFv2-FcL3H6分子は、非ヒト霊長類実験モデルにおけるレーザー熱傷によって誘導される、脈絡膜血管新生に対する予防及び治療効果を示し例16、加齢黄斑変性AMDGaudreault、J.etal.2005.InvestOphthalmolVisualSci46:726~733頁;Costa、RAetal.2006.InvestigOphthalmolVisualSci47:4569~4578頁、及び同様の病的基礎を共有する他の目の疾患の治療に関する、この抗体の有用性を示した。c喘息、呼吸窮迫、子宮内膜症、並びにアテローム性動脈硬化症及び組織浮腫のような慢性及び急性炎症過程。d肝炎及びカポジ肉腫のような感染性疾患。e糖尿病、乾癬、関節リウマチ及び甲状腺炎のような自己免疫疾患。f臓器移植片拒絶、血管腫、及び血管線維腫などの、他の幾つかの疾患及び状態。本発明中に記載する組換え抗体は、ヒトVEGF-Aとのその結合と異なる機能特性を原型分子に与え得る、酵素又はその断片、生物反応修飾物質BRM、毒素若しくは薬剤、又は放射性同位体に、結合又はコンジュゲートさせることが可能である。本発明中に記載するscFvL3H6分子を放射標識して、ヒト腫瘍を有する無胸腺ヌードマウスに注射した例15。分子は腫瘍内に留まり、注射後3日でさえ解剖学的領域内に存在し続けることが実証された。このように、他の治療作用物質に結合した本発明中に記載する組換え抗体は、医薬品又は医薬組成物としてのそれらの投与を包含する治療法の基礎となり得る。治療用放射性核種、毒素、薬剤又はBRMと化学的又は遺伝的に結合した抗体を、腫瘍及びそのすぐ近辺であってよい異常なヒトVEGF-A濃度を有する解剖学的領域と結合した要素の治療効果を標的化することができ、治療効果を発揮することができる。投与するための量、頻度及び治療間隔は、疾患の性質及び重症度に依存し、これらの決定は、当技術分野で既に知られていることに基礎を置く専門家及び医者の責任である。本発明の別の態様は、血管新生を阻害することができそれと関連する病状の治療に使用することができる医薬組成物を生成するための、記載する組換え抗体の使用である。このような治療は、有効量の記載する分子を人間に投与することを包含する。本発明中に記載する組換え抗体を用いて生成する組成物は、個別又は他の治療剤と組み合わせて投与することができ、これは同時又は逐次的であり、これらはいずれも治療する疾患に依存する。医薬組成物は、活性成分以外に、薬学的に許容される賦形剤、バッファー、安定化剤又は担体、及び当業者によく知られている他の物質を包含する。これらの物質は毒性ではなく、活性成分の有効性に干渉せず、それらの性質は投与経路に依存し、これは経口、粘膜、又は非経口、例えば静脈内注射によるものである。特定の実施形態では、本発明中の組成物は、本発明の組換え抗体、及び組成物中の他の活性成分を徐放するための組成物である。本発明中に記載する組換え抗体、又はその同等な変異体は、コード核酸の発現によって産生される。結果として、記載する組換え抗体のいずれかをコードする核酸配列、並びに前記核酸の発現に関する手順も本発明の一部である。好ましい実施形態では、核酸は、配列番号9、配列番号11、配列番号13それぞれscFvL3H6、scFvL3H5及びscFvL3H7、配列番号15、配列番号16、配列番号19、配列番号20、配列番号23、配列番号24FabL3H6、FabL3H5及びFabL3H7、それぞれ個別鎖、配列番号27、配列番号29、配列番号31それぞれscFv2-FcL3H6、scFv2-FcL3H5及びscFv2-FcL3H7で例示される塩基配列を、独占的にではなく優先的にコードする。本発明中に記載する分子、又はその同等な変異体の組換え発現用に、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、ポリアデニル化配列を含めた必要な制御配列、マーカー遺伝子及び他の考えられる関連物質を含有する、適切なベクターを構築又は選択することができる。ベクターはプラスミドであってよい。例1突然変異可変領域を含有するscFv抗体断片ファージディスプレイライブラリーの構築aポリメラーゼ連鎖反応PCRによる突然変異可変領域の調製それぞれ2H1scFv抗体断片WO2008/052489A1のVH及びVLドメインのCDR3に相当する、配列LVVRDTE及びLLSYSGARを、突然変異誘発の標的として使用した。一組の合成オリゴヌクレオチド表1を、Parsimonius突然変異誘発PM、Balint、R.andLarrick、J.W.1993.Gene、137:109~118頁の原理に従い設計した。2ステップのPCR手順を実施した。第一のPCRステップでは、突然変異scFvVL領域用にプライマーVL-B及びVL、並びにプライマーVH-B及びVHを使用して突然変異scFvVH領域を生成し増幅した表1参照。製造者の説明書に従い、野生型2H1scFv抗体断片遺伝子2H1-Fと称される;WO2008/052489A1を有するファージミドベクターpHG-1mRojas、G.etal.2004.J.Immunol.Meth.293:71~83頁を、いずれの場合も鋳型DNAとして、及びKOD耐熱性酵素Novagenを使用した。この第一のPCRでは、20増幅サイクルを実施した。後に反応混合物を、QIAQuickカラムQiagenを使用してアガロースゲルから独立に精製し、水に溶出させた。DNA濃度は、DNA標準NEBを使用して電気泳動により推定した。次いで、第二のPCRステップを、VH領域増幅用にプライマーVH-B及びVH-F、並びにVL領域増幅用にプライマーVL-B及びVL-Fを使用して実施した表1参照。いずれの場合も、各第一PCR反応からの10ngの精製DNAを使用した。同じ耐熱性酵素Novagenを製造者の説明書に従い使用し、15増幅サイクルを実施した。後に反応混合物を、QIAQuickカラムQiagenを使用してアガロースゲルから独立に精製し、水に溶出させた。DNA濃度は、DNA標準NEBを使用して電気泳動により推定した。bファージミドベクターにおけるPCR突然変異可変領域のクローニング。2H1-Fベクターと突然変異VH領域から精製したDNA産物のサンプルをSfiI及びApaLIFermentas及びNEBで消化し、QIAQuickカラムQiagenを使用しアガロースゲルから精製し、T4DNAリガーゼNEBを使用してそれぞれ1:1.5で連結させた。連結産物はQIAQuickカラムQiagenを使用して精製し、水に溶出させた。同様に、2H1-Fベクターと突然変異VL領域から精製したDNA産物をSalI及びNotIFermentas及びNEBで消化し、前に記載したように精製し連結させた。XL1-BlueMRF’エレクトロコンピテントセル1×109/μg、Stratageneを、それぞれに関して50の異なる反応において各連結で独立に形質転換し、さらに大皿中に2xYT/アンピシリンで独立に播種し、37°Cで24時間インキュベートした。ライブラリーサイズを計算するための参照プレートは、両ライブラリーが約5×108のメンバーを含有していたことを示す。突然変異CDR3VH領域を含有し2H1scFv由来の野生型VLを維持するライブラリーはライブラリー1と称し、一方で、突然変異CDR3VL領域及び2H1scFv由来の野生型VHを有するライブラリーはライブラリー2と称した。c突然変異可変領域を含有するライブラリーからのDNA精製細菌コロニーをプレートからかき取り、それらの起源に従いプールし、細胞はペレット状にした。高純度DNAは、製造者の説明書に従い、MaxiPrepキットQiagenを使用して細胞ペレットから得た。例2突然変異重鎖及び軽鎖可変領域を有し、ヒトVEGFに対する親和性がより高い、ファージ上で提示されるscFv抗体断片の選択。突然変異可変領域ライブラリーのDNAを使用して、TG1大腸菌細胞を独立にエレクトロポレーション処理し、次いでそれらにヘルパーファージM13K07を感染させてファージを生成した。ファージは精製し、選択実験に使用するまで-20°Cでアリコートに保存した。選択用に、各ライブラリーの2×1012個のファージを、50μg/mlの可溶性scFv2H1WO2008/052489A1を含むPBS-4スキムミルクに希釈し、後者はscFv2H1より高いヒトVEGF-Aに対する高親和性でファージにおけるscFvの単離を助けた。これらの混合物はヒトGST-VEGFhumanoMorera、Yetal.2006.Biotechnol.Appl.Biochem.44:45~53頁と共に5時間独立にインキュベートし、MaxisorpイムノチューブNunc中に固定した。イムノチューブは16時間の間4°Cにおいて10μg/mLのタンパク質、PBS中で事前にコーティングし、次いでPBS-4スキムミルクでブロッキングした。非結合ファージは、PBS-0.1Tweenを使用した20回の洗浄、次にさらに2回のPBS洗浄によって除去した。次いで、結合ファージは10分間100mmol/Lトリエチルアミン溶液を用いて溶出させ、0.5mol/LトリスpH7.5を用いてすぐに中和した。溶出ファージは大腸菌TG1細胞において増殖させ、別の選択サイクル用の出発物質として使用した。この手順は同様の条件下で2回繰り返した。第一及び第二選択サイクルから溶出したファージを使用して、播種したTG1細胞に感染させた。ランダムに選択した代表細菌コロニーを単離し、感染させて、96ウエルプレートスケールでファージを生成したMarks、J.etal.1991、J.Molec.Biol.222:581~587頁。GST-VEGFと結合する、それらのタンパク質IIIにおいてscFvを提示するこれらのファージクローンの能力を、ELISAによって評価した。Maxisorp96ウエルプレートNuncを10μg/mLのヒトGST-VEGFでコーティングし、次いで22°Cにおいて1時間の間PBS-4スキムミルクでブロッキングし、次にPBS-0.1Tween20溶液で数回洗浄した。結合ファージは、22°Cにおいて1時間、ペルオキシダーゼとコンジュゲートした抗M13抗体Amersham-Pharmaciaを用いて検出した。数回洗浄した後、反応物を基質溶液で発色させた。吸光度はマイクロプレートリーダーにおいて492nmで測定した。ELISAにおいて高い吸光度値をもたらした、各ライブラリーから単離した広範囲のクローンサンプル19以上を独立に処理して、scFvをコードするヌクレオチド配列を得たMacrogen、Korea。表2は、ライブラリー1から単離したクローン由来の重鎖VH可変領域CDR3の、ヌクレオチド配列から推定したアミノ酸配列を示す。得られた全ての配列19が異なっていた。同じ表中、それぞれのファージに関して、IC50値は、ELISA中のファージとVEGFでコーティングした固相の結合を阻害するのに必要な、可溶性scFv2H1断片の濃度を記載する。このため、Maxisorp96ウエルプレートNuncを10μg/mLのGST-VEGFでコーティングし、次にPBS-4スキムミルクでブロッキングした。評価用の各クローンからの同量のファージを可溶性scFv2H1の連続希釈液と混合し、22°Cにおいて1時間プレート内でインキュベートした。PBS-0.1Tween20で数回洗浄した後、VEGF結合ファージは、22°Cにおいて1時間、ペルオキシダーゼAmersham-Pharmaciaとコンジュゲートした抗M13抗体を使用して検出した。数回洗浄した後、反応物を基質溶液で発色させた。吸光度はマイクロプレートリーダーにおいて492nmで読み取った。可溶性scFv2H1の濃度に対して得た吸光度値をプロットし、ファージディスプレイscFvと固定VEGFの結合の50を遮断するのに必要な濃度IC50をμg/mlで計算した。この値は、抗原に対する異なるクローンの親和性の相対指標である。高いIC50値は高い親和性に対応する。表2は、比較目的で、原型ファージディスプレイscFv2H1に関するIC50値をさらに示す。重鎖中に突然変異CDR3配列を有するファージディスプレイscFvの新たなクローンの中で、3F3、3E3及び4D8と称するクローンがヒトVEGFに対する最高の相対親和性を有していた。これらの値は、原型ファージディスプレイscFv2H1に関して得た値より6倍~10倍高い。これらのクローンのVH配列は、H6塩基配列に関して配列番号1及び推定アミノ酸配列に関して配列番号4、H5塩基配列に関して配列番号2及び推定アミノ酸配列に関して配列番号5、及びH7塩基配列に関して配列番号3及び推定アミノ酸配列に関して配列番号6と称した。表3は、ライブラリー2から単離したクローン由来の軽鎖可変領域VLの、CDR3ヌクレオチド配列から推定したアミノ酸配列を示す。21クローンの配列分析によって、13個が異なり、5、3及び3クローンにグループ分けされる3反復パターンがそれぞれ見られたことが明らかになった。表3はIC50値をさらに示し、ヒトVEGFでコーティングした固体表面とファージの結合を前に記載したELISA試験において阻害するのに必要な、原型可溶性scFv2H1の濃度を記載する。この表は、比較目的で、原型ファージディスプレイscFv2H1に関するIC50値を示す。最高IC50値は1B1、1H2、2F6及び1H3と称するクローンに対応する。これらの値は、原型ファージディスプレイscFv2H1に関して得た値より23倍~30倍高い。例3軽鎖可変領域CDR3の新たな突然変異。例2の2つの表中に報告した配列及びIC50値を考慮して、VLCDR3において抗原に対する相対親和性をさらに増大するための、考えられる新たな突然変異の分析を行った。4つの最良IC50クローンの3つにおけるその保存、及びこの配列の第5位における突然変異の集中のため、配列RLSYxLARが保護されると決定した。この位置における突然変異に関して考えられた新たなアミノ酸は、これら特定残基の特性、及びこれらが他のクローンにおいてこの位置に現れたかどうかを考慮して、P、D又はEであった。例1a中に記載したPCRと類似した2ステップのPCRを使用し、鋳型としてクローン2F6由来のDNA及びプライマーとして合成オリゴヌクレオチドを使用して、これらの新たな突然変異体を作製した。新たな断片のクローニングのため、ファージミドベクター2H1-F及び新たなPCRバンドの逐次消化を、例1b中に記載した手順と同様の手順で行った。3つの新たな組換えベクターを独立に形質転換し、それぞれの形質転換を表す5つのコロニーを選択した。DNAをそれぞれのサンプルから精製し、望ましい突然変異の存在を確認した。高純度DNAを得て、大腸菌TG1細胞を独立にエレクトロポレーション処理するために使用し、次いでそれらにM13ヘルパーファージを感染させた。生じたファージは精製し、この同じ実施例で前に記載したように、IC50値を決定するために試験した。この同じ実施例で前に使用したのと同様のELISA試験において決定した、ヒトVEGFでコーティングした固相とファージの結合の50を阻害するのに必要な原型可溶性scFv2H1の濃度を記載するIC50値を、それぞれの新たなファージクローンに関して表4中に示す。原型ファージディスプレイscFv2H1に関する値も比較目的で含める。他の以前に記載したクローンも示す。最高IC50値は新たなクローンL3に対応し、それは原型ファージディスプレイscFv2H1の値より73倍高い。例4ヒトVEGFに対する親和性が高い突然変異VHとVL可変領域を組み合わせたscFv抗体断片の構築。制限消化及びクローニング手順を前に記載したように実施し、クローンL3からのVLコード遺伝子同様にL3と称する、ヌクレオチド配列に関して配列番号7及び推定アミノ酸配列に関して配列番号8と、例2中で既に述べた重鎖:H6ヌクレオチド配列に関して配列番号1及び推定アミノ酸配列に関して配列番号4、H5ヌクレオチド配列に関して配列番号2及び推定アミノ酸配列に関して配列番号5、及びH7ヌクレオチド配列に関して配列番号3及び推定アミノ酸配列に関して配列番号6をコードする遺伝子を組み合わせた、3個の新たな抗体断片を得た。XL1-BlueMRF’エレクトロコンピテントセルを、これら3つの新たな組換えプラスミドで独立に形質転換し、各々からの5つの独立コロニーを採取し、増殖させてDNAを得た。正確な配列を確認した後、これらのプラスミドを使用してTG1大腸菌細胞を独立にエレクトロポレーション処理し、次いでそれらにヘルパーファージM13K07を感染させてファージを生成した。例2中に記載したように、ファージを精製し、これらを使用してELISAにおいてIC50を評価した。表5は、前に記載したように、ELISAにおけるファージとVEGFでコーティングした固相の結合を阻害するのに必要な可溶性scFv2H1抗体断片の濃度を記載する、それぞれの新たなファージクローンに関するIC50値を示す。高いIC50値、及びしたがってより良い抗原認識性は新たなクローンL3H6に対応する。例5抗体断片scFvL3H6、scFvL3H5及びscFvL3H7の細菌における発現及び精製。apACR.1ベクターでの抗体断片scFvL3H6、scFvL3H5及びscFvL3H7のクローニングベクターpACR.1は、大腸菌周辺質に対する抗体断片の発現用に設計したプラスミドである図1。ベクターpACR.1は、主なエレメントとして、LacZプロモーター、シグナルペプチド、断片コード遺伝子の挿入用のNcoI及びNotI制限部位、c-mycペプチドをコードするドメイン、及び6ヒスチジンをコードする配列を有し、後者はIMAC精製用である。ディスプレイscFv抗体断片L3H6、L3H5及びL3H7をコードするファージミドに対応するDNAは、3つの個別PCR反応用の鋳型として使用した。これらの手順はProofStartStratagene酵素を使用し、製造者の説明書に従い実施した。表6中の合成オリゴヌクレオチドはプライマーとして使用した。予想サイズ700bpのバンドを3回の増幅から得て、これらはQIAquickゲル抽出キットQIAGENを使用して1アガロースゲルから精製した。異なるDNAをNcoI及びNotIPromega制限酵素を用いて消化し、連結用に再度精製した。pACR.1ベクターを同様に消化及び再精製し、消化したバンドは、T4DNAリガーゼPromegaを使用してベクターに独立に連結させた。連結反応産物を使用して、エレクトロポレーションにより大腸菌コンピテントセルXL-1Blue;Stratageneを形質転換した。形質転換細胞は固体選択培地に播種し、37°Cで増殖させた。使用した方法は広く知られているSambrook、FritschyManiatis.1989MolecularCloning、ALaboratoryManual、SecondEdition。プラスミドDNAを異なる形質転換のコロニーから精製しQIAGENDNAプラスミドMiniPrepキット、制限酵素消化により挿入された遺伝子に関して調べ、形質転換当たり数個のコロニーのプラスミドは、pACR.1ベクタークローニング領域の外側とハイブリダイズするプライマーを使用して自動DNA配列決定に施した。コンセンサス配列は、scFvL3H6に関して配列番号9、scFvL3H5に関して配列番号11及びscFvL3H7に関して配列番号13であった。これらの配列は、VH-リンカー-VL-cmyc-ヒスチジンをコードする断片として記載する。これらの構築物を表すプラスミドは、pACR.1-scFvL3H6、pACR.1-scFvL3H5及びpACR.1-scFvL3H7と称した。b大腸菌におけるscFvL3H6、scFvL3H5及びscFvL3H7の発現並びに精製BL21大腸菌コンピテントセルをプラスミドpACR.1-scFvL3H6、pACR.1-scFvL3H5及びpACR.1-scFvL3H7で形質転換した。形質転換体は選択固体培地に播種し、37°Cで16時間増殖させた。それぞれの構築物を表すコロニーは液体培地で増殖させ、600nmで、1mMのイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシドIPTGを培地に加え、1に等しいODを12時間で誘導した。細胞は遠心分離し、培養上清はカップリングバッファーNaH2PO450mM、300mMNaCl、pH7~8で透析し、アガロース-NTAQIAGENに直接独立に施した。イミダゾール10mMによる洗浄で汚染物質を除去した後、結合したタンパク質を250mMのイミダゾールで溶出させた。得られた分画は12SDS-PAGE及びウエスタンブロットによって評価し、後者では、これらのタンパク質が有するc-myc由来ペプチドを認識する、ペルオキシダーゼとコンジュゲートした9E10モノクローナル抗体を使用した。図2は、抗体断片scFvL3H6の場合の、これらの手順の結果を例示する。図2A、レーン2は、29kDa付近に移動する抗体断片を含有する高純度の溶出物を示す。図2Bは、精製タンパク質が、9E10モノクローナル抗体によって免疫化学的に認識されることを示す。例6scFv2H1と比較した、scFvL3H6、scFvL3H5及びscFvL3H7抗体断片による異なるVEGF変異体の免疫化学的認識の、ELISAによる特徴付け。Nunc96ウエルMaxisorpイムノプレートを、4°Cで16時間PBS中1μg/mlの濃度で、ヒトVEGF-Aのアイソフォーム121及び165Peprotech、マウスVEGFPeprotech及びP64K-VEGFKDR-Morera、Y、etal.2008.Angiogenesis114:381~393頁でコーティングした。P64K-VEGFKDR-は、VEGFR2受容体KDRとのその相互作用を低減するために残基82、84及び86を突然変異させた、ヒトVEGFを表す大腸菌において生成した組換えタンパク質である。PBS-スキムミルク4でプレートをブロッキングした後、PBS-スキムミルク4に希釈したscFvL3H6、L3H5、L3H7及び2H1抗体断片を10μg/mLの濃度で加え、22°Cで1時間インキュベートした。数回洗浄した後、ペルオキシダーゼとコンジュゲートした9E10モノクローナル抗体を加えて1時間おいた。洗浄後、固相と結合した断片を、基質溶液を加えることにより検出した。吸光度はマイクロプレートリーダーにおいて492nmで読み取った。無関連抗HBsAgscFvは陰性対照として使用したAyala、M.etal.1995.Biotechniques18:832~842頁。表7は、抗体断片scFvL3H6、scFvL3H5及びscFvL3H7はscFv2H1に対して異なる認識パターンを有し、陰性対照によって生じた参照として解釈する3ウエルの平均より高い吸光度値を492nmでもたらすことを示す。これはヒト抗原に対するより高い親和性を示す。例7抗体断片scFvL3H6、scFvL3H5、scFvL3H7及びscFv2H1によるVEGF受容体相互作用の遮断。ELISA競合システムを使用して、本発明者らは、ヒトVEGF受容体とVEGF組換え受容体VEGFR2KDRとVEGFR1FLT-1の間の相互作用を遮断する、精製抗体断片scFvL3H6、scFvL3H5、scFvL3H7及びscFv2H1の能力を評価した。これらのアッセイは、増大させた濃度の断片を加えることによる、固体表面に吸着した可溶性受容体KDR-Fc及びFLT-1-FcとヒトVEGF-Aの結合の阻害に基づいた。Nunc96ウエルMaxisorpプレートを、4°Cで16時間PBS中1μg/mlの濃度で、ヒトVEGF-Aのアイソフォーム121Peprotechでコーティングした。プレートはブロッキングし、洗浄し、増大させた濃度70μg/mLまでの精製抗体断片scFvL3H6、scFvL3H5、scFvL3H7及びscFv2H1、又はPBS-lecheal4、並びに0.5μg/mLの可溶性受容体KDR-FcRD若しくはFLT-1-FcRDと共にウエルをインキュベートした。無関連抗HBsAgscFvは陰性対照として使用しAyala、M.etal.1995.Biotechniques18:832~842頁、Fab断片ルセンティス登録商標ラニビズマブは阻害対照として使用した。固相中でヒトVEGF-Aと結合したKDR-Fc又はFLT-1-Fc可溶性受容体は、ペルオキシダーゼとコンジュゲートした抗ヒトIgG抗体Sigmaを用いて検出した。KDR-FcVEGFR2の場合、図3A中に示すように、抗体断片scFvL3H6、scFvL3H5及びscFvL3H7は、明らかな用量依存形式で、固相に結合したヒトVEGF-Aと受容体の結合を遮断する。抗体断片scFvL3H6、scFvL3H5及びscFvL3H7に関する阻害値は、参照scFv2H1抗体断片に関して同じ実験中で観察した値よりはるかに高い。FLT-1-FcVEGFR1の場合、図3B中に示すように、抗体断片scFvL3H6、scFvL3H5、scFvL3H7及びscFv2H1はヒトVEGF-Aと受容体の結合を遮断せず、一方ラニビズマブは遮断する。例8ヒトVEGFに対する抗体断片scFvL3H6、scFvL3H5、scFvL3H7及びscFv2H1の親和性測定。ヒトVEGFに対する抗体断片scFvL3H6、scFvL3H5、scFvL3H7及びscFv2H1の結合親和性を、BIAcore-XBIAcore、Swedenを使用して測定した。CM5センサーチップは、製造者の説明書に従い、N-エチル-N’-3-ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩EDC及びN-ヒドロキシスクシンイミドNHSを使用して、ヒトVEGFの共有結合を介して活性化した。ヒトVEGFのアイソフォーム165PeproTechは10mmol/l酢酸ナトリウムバッファーpH5.5中に5μg/mlまで希釈し、5μl/分の流量で注入して約290応答単位の結合タンパク質を得た。動態測定用に、精製断片scFvL3H6、scFvL3H5、scFvL3H7及びscFv2H1の調製物の連続希釈液を、25°Cにおいて25μl/分の流量で、HBSバッファー10mmol/lのHEPES、150mmol/lのNaCl、3mmol/lのEDTA、0,005のP20界面活性剤、pH7.4中に注入した。動態パラメーター及び平衡解離定数KDを、BIAEvaluation3.2ソフトウェアを使用して計算した。結合データは、包括的にLangmuirの1:1結合モデルに調整した。得られたKDは表8中に示す。これらの結果は、抗体断片scFvL3H6、scFvL3H5及びscFvL3H7は、抗体断片scFv2H1より5倍~20倍高い親和性でヒトVEGF-Aを認識することを実証する。例9抗体断片FabL3H6、FabL3H5及びFabL3H7の生成及び特徴付け。apFabHum-1ベクターでのクローニング及び配列決定図4は、形質転換大腸菌の周辺質及び培養培地における可溶性Fab抗体断片の生成に使用した、プラスミドpFabHum-1の概略図である。このベクターは、LacZプロモーター、RBS、SP配列、軽鎖可変領域に関するクローニング部位SalI及びAvrII、及びヒト免疫グロブリンCλドメインをコードする配列、次に別のRBS、SP、及び重鎖可変領域に関するクローニング部位ApaLI及びBstEII、次にヒトIgG1Fcヒンジ領域の第一システインを含めるために延長させたヒト免疫グロブリンCH1ドメインをコードする配列を有する。ベクター中に供給される重鎖可変領域-CH1は、いずれもC末端において、IMAC精製用に6ヒスチジンドメイン、及び分析目的でc-mycペプチドに関して発現させる。抗体断片scFvL3H6、scFvL3H5及びscFvL3H7をコードするファージミドDNAを、ApaLI及びBstEII酵素で最初に消化して対応するVH領域を得た。1.5アガロースにおけるゲルサイズを確認した後、3つのVHをpFabHum-1において別々にクローニングし、同じ酵素で事前に消化した。制限酵素解析によりクローニングを確認した後、pFab-RVH6、pFab-RVH5及びpFab-RVH7と称する中間体プラスミドを複製し、精製し、SalI及びAvrII酵素を用いた新たな消化を施した。1.5アガロースにおけるゲルサイズを確認した後、抗体断片scFvL3H6をコードするファージミドをSalI及びAvrII酵素で消化し特有VL領域L3を得て、次いでこれを消化プラスミドpFab-RVH6、pFab-RVH5及びpFab-RVH7においてクローニングした。制限酵素解析によりクローニングを確認した後、pFabL3H6、pFabL3H5及びpFabL3H7と称する3つの生成したプラスミドを複製し、精製し、自動DNA配列決定に施した。抗体断片FabL3H6、FabL3H5及びFabL3H7を構成する重鎖中に6ヒスチジン及びc-mycドメインがない2つの成熟タンパク質鎖をコードするDNA配列は、それぞれ配列番号15と配列番号16、配列番号19と配列番号20、及び配列番号23と配列番号24に相当する。これらのFab抗体断片の推定アミノ酸配列は、それぞれ配列番号17と配列番号18、配列番号21と配列番号22、及び配列番号25と配列番号26において記載する。b大腸菌におけるFabL3H6、FabL3H5及びFabL3H7の発現並びに精製BL21大腸菌コンピテントセルをpFabL3H6、pFabL3H5及びpFabL3H7で形質転換した。形質転換体は選択固体培地に播種し、37°Cで16時間増殖させた。それぞれの構築物を表すコロニーは液体培地で増殖させ、600nmで、IPTGを培地に加えることにより、1に等しいODをFab発現に関して誘導した。細胞は遠心分離し、培養上清はカップリングバッファーで透析し、アガロース-NTAQIAGENに直接独立に施した。洗浄で汚染物質を除去した後、結合したタンパク質を250mMのイミダゾールで溶出させた。2つの条件を電気泳動試験に利用した。第一例では、β-メルカプトエタノールを含む電気泳動バッファー中でサンプルをインキュベートして還元をもたらした。第二例では、β-メルカプトエタノールは使用しなかった。図5Aは、還元サンプル及び発色用抗c-myc9E10抗体に関する精製及びウエスタンブロットの結果を示す。SDS-PAGEでは、約28~30KDaでFabの両鎖を見ることができるレーン2。ウエスタンブロットでは、それがc-mycを含有するため、Fabの重鎖のみを検出するレーン3。図5B中では、還元していないサンプルを見ることができる。SDS-PAGEは、9E10コンジュゲートモノクローナル抗体を使用してウエスタンブロットにおいて認識されるレーン2、約50kDaを有するFabに相当するバンドを示すレーン1。c抗体断片FabL3H6、FabL3H5及びFabL3H7に関する、ELISAにおけるヒトVEGFの認識の特徴付け精製抗体断片FabL3H6、FabL3H5及びFabL3H7を、参照Fab2H1-32WO2008/052489A1を使用して、ELISAにおけるヒトVEGF-Aの認識に関して評価した。Nunc96ウエルMaxisorpイムノプレートを、4°Cで16時間PBS中1μg/mlの濃度で、ヒトVEGF-Aのアイソフォーム121及び165Peprotech、マウスVEGFPeprotech及びP64K-VEGFKDR-Morera、Y、etal.2008.Angiogenesis114:381~393頁でコーティングした。PBS-スキムミルク4でプレートをブロッキングした後、PBS-スキムミルク4に希釈したFab抗体断片を10μg/mLの濃度で加え、22°Cで1時間インキュベートした。数回洗浄した後、ペルオキシダーゼとコンジュゲートした9E10モノクローナル抗体を加えて1時間おいた。洗浄後、固相と結合した断片を、基質溶液を加えることにより検出した。吸光度はマイクロプレートリーダーにおいて492nmで読み取った。抗ヒトEGF受容体抗体ニモツズマブの酵素による消化から誘導した無関連FabもhR3と称したBoland、W.KyBebb、G.2009.ExpertOpin.Biol.Ther.99:1~8頁。表9は、抗体断片FabL3H6、FabL3H5及びFabL3H7はFab2H1-32のそれと異なる認識パターンを有し、陰性対照によって生じた吸光度値を参照とする492nm;3ウエルの平均より高い吸光度値を示し、これらはいずれもヒト抗原に対して良い親和性を示すことを実証する。例10二量体分子scFv2-FcL3H6、scFv2-FcL3H5及びscFv2-FcL3H7の作製及び認識の特徴付け。a抗体様分子scFv2-FcL3H6、scFv2-FcL3H5及びscFv2-FcL3H7を産生するトランスフェクトーマの作製抗体様分子scFv2-FcL3H6、scFv2-FcL3H5及びscFv2-FcL3H7を得るために、鋳型としてプラスミドpACR.1-scFvL3H6、pACR.1-scFvL3H5及びpACR.1-scFvL3H7、並びに表10中に示す合成オリゴヌクレオチドを使用してPCRを実施して、これらの抗体断片をコードするDNA配列を改変し、後のクローニングに適合させた。この手順は、製造者の説明書に従いKODDNAポリメラーゼNovagenを用いて実施した。PCR増幅したDNA配列はpVSJG-HucFcベクターにクローニングした。このベクター図6Aは、ネズミモノクローナル抗体由来の重鎖シグナルペプチド、次にヒトIgG1免疫グロブリン由来のヒンジ、CH2及びCH3ドメインをコードしスペーサーとして働く10アミノ酸のコンセンサス配列により隔てられたscFvコード配列をこの順に含有するポリペプチド鎖の、哺乳動物細胞中での発現用に設計した。シグナルペプチドが原因で、このポリペプチド鎖は、ヒンジ領域内の共有ジスルフィド結合の形成及びCH2とCH3ドメインの相補的結合を介して二量体が起こる、小胞体を対象とする。ヒンジ、CH2及びCH3ドメインはヒト免疫グロブリンFc領域を形成し、それはそのN末端により2つの同一scFvと結合し二価抗体様分子を生成する図6B。PCR増幅した断片はAflII及びXbaI制限酵素で消化し、pVSJG-HucFcベクターに独立にクローニングした。自動DNA配列決定によってクローン産物の同一性を確認した。生成した3つの成熟タンパク質scFv2-FcL3H6、scFv2-FcL3H5及びscFv2-FcL3H7をコードするヌクレオチド配列はそれぞれ配列番号27、配列番号29、配列番号31で記載し、一方で推定アミノ酸配列はそれぞれ配列番号28、配列番号30、配列番号32で記載する。プラスミドpVSJG-HucFcL3H6、pVSJG-HucFcL3H5及びpVSJG-HucFcL3H7は、PureYieldPlasmidMidiprepキットPromegaを使用してエンドトキシンを含まない条件下で精製した。CHO細胞EACCカタログ番号85050302は、SuperFectQIAGENを使用してこれらのプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクトーマは、耐性マーカーとしてG418を含有する培地中で選択した。G418と共に増殖させたトランスフェクトーマコロニーから得た細胞培養上清は、ELISAによって評価した。Maxisorp96ウエルプレートNuncはヒトVEGF121Peprotechでコーティングした。PBS-2スキムミルクに希釈した上清をプレートに加え、scFv2-Fc抗VEGF分子はペルオキシダーゼとコンジュゲートした抗ヒトFc抗体Sigmaで検出した。ELISAにより検出されたscFv2-Fc抗VEGF分子の高い分泌レベルを有するトランスフェクトーマ細胞コロニーは、G418を含有する培地中での限界希釈によって繰り返しクローニングし、ELISAによりその分泌能力を常に試験した。少なくとも2連続クローニング後、3つの安定クローン産生抗体様分子を得て、scFv2-FcL3H6、scFv2-FcL3H5及びscFv2-FcL3H7と称した。bscFv2-FcL3H6、scFv2-FcL3H5及びscFv2-FcL3H7分子の精製、及びELISAによるヒトVEGFとの結合活性の評価scFv2-FcL3H6、scFv2-FcL3H5及びscFv2-FcL3H7分子を産生したトランスフェクトーマクローンを、162cm2フラスコ中、0.5ウシ胎児血清を含有する培地中で培養した。高い細胞密度を得た後、上清を回収し、0.1Mのリン酸ナトリウムバッファー、pH7.0中に1:1希釈し、次いでscFv2-Fc分子を、プロテインAセファロースファストフロー4Amershamを使用したアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。異なるscFv2-Fc分子を0.2Mのグリシンバッファー、pH4.0で独立に溶出させ、1Mのトリス、pH10.0ですぐに中和した。PBSで透析した後、280nmでの吸光度測定によりタンパク質濃度を計算した。純度は12SDS-PAGEにより推定した。精製分子のサンプルは、非精製上清と比較して、a中に記載したのと同様にELISAにより試験し、ヒトVEGF-Aに対する適切な認識活性を示した。例11scFvL3H6、scFvL3H5及びscFvL3H7抗体断片によって認識されるヒトVEGFにおける機能性エピトープの同定。ヒトVEGF121を入手し提示するため、突然変異体を最初に選択し、分子の三次元構造分析PDB:1FLT、他の抗体による認識が報告された領域の位置、及びヒトVEGFとネズミVEGFの間の差に基づいて残基を突然変異させた。突然変異させた残基は表11中に示す。突然変異は、N-及びC-末端コード配列とヒトVEGF121をハイブリダイズさせる合成オリゴヌクレオチド表12を使用したPCRにより、及び望ましい突然変異を導入した特異的領域において生成した。2ステップのPCRを実施して、鋳型としてヒトVEGF121、及びKODDNAポリメラーゼ酵素Novagenを含有するプラスミドpVEGFOjalvo、A.G.etal.2003.ElectronicJ.Biotechnol.6、208~222頁を使用し突然変異体を導入した。第一のステップでは、末端と相補的なオリゴヌクレオチドVEGF-FOR又はVEGF-BACKを使用し、耐熱性ポリメラーゼ酵素の製造者の説明書に従い、15サイクルの反応中で、突然変異体当たりで対応するM-BACK又はM-FORとの反応により対形成させた。第二のPCRでは、ステップ1からの2つの前反応の混合物を、各突然変異体に関する鋳型として使用した。突然変異体M-BACK又はM-FORを導入するために利用したオリゴヌクレオチドは1:100に希釈し、末端と相補的なオリゴヌクレオチドVEGF-FOR又はVEGF-BACKと一緒に使用した。DNA増幅断片はQIAquickカラムQiagenを使用して独立に精製し、次いで4時間ApaLIとNot-IHFNEBで二重消化した。QIAquickカラムQiagenで反応混合物を精製し水に溶出させた後、消化したDNA断片は、同じ酵素で事前に消化したpHG-1mベクターRojas、G.etal.2004.J.Immunol.Meth.293:71~83頁でクローニングし、1時間ホスファターゼNEBで処理し、同じカラムを使用してアガロースゲルから精製した。pHG-1mベクター中のクローン遺伝子は、タンパク質III融合体として線維状ファージの表面上に提示される。1:5のベクター:バンド比及びT4リガーゼNEBを、16°Cで12時間連結反応において使用した。TOP10F1’細胞Invitrogenを突然変異体による各連結で独立に形質転換し、アンピシリンを含有する選択LB培地に播種し、37°Cで24時間インキュベートした。5個のコロニーを各突然変異体から選択し、5ml培養物中で増殖させ、プラスミドMiniprepキットQiagenを使用してプラスミドを精製した。DNAは配列決定し、望ましい突然変異体の存在を確認した。ファージ発現試験に十分な物質を得た。TG1大腸菌コンピテントセルを、各突然変異体をコードするファージミドで独立に形質転換した。野生型WTVEGF及び無関連NRタンパク質をコードするファージミドも、この実験における対照として含めた。形質転換細胞はM13K07に感染させてファージを生成した。ファージは精製し、これらをELISA中で使用して異なる抗VEGF抗体:ベバシズマブ、ウサギポリクローナル抗体pAb及びscFvL3H6抗体断片による互いの認識を評価した。96ウエルプレートを、4°Cにおいて16時間の間PBS中10μg/mLで、これらの抗体でコーティングした。PBS-4スキムミルクでブロッキングした後、ファージ上で提示された突然変異体又は野生型VEGFをプレートに加え、1時間の間インキュベートした。プレートはPBS-0.1Tween20溶液で洗浄し、結合ファージは、1時間、ペルオキシダーゼとコンジュゲートした抗M13抗体Amersham-Pharmaciaを用いて検出した。プレートは再度洗浄し、反応混合物は基質溶液で発色させた。20分後、反応は1MのH2SO4で停止させ、吸光度はマイクロプレートリーダーにおいて492nmで測定した。表13は、ファージにおいて提示された異なる突然変異体、WT-VEGF又はNRタンパク質に対するそれぞれの抗VEGF抗体に関する、3ウエルからの平均吸光度値で表した免疫反応性を示す。表13中、突然変異体M2R56E及びM10R56Aはグレーのセルで強調し、これらは試験した3つの抗体による認識の障害を引き起こす。このアミノ酸が、ヒトVEGF並びにPLGF及びPDGFなどの他のファミリーのメンバーの構造完全性において、重要な役割を果たすことは知られているKeyt、B.A.etal.1996.J.Biol.Chem.271:5638~5646頁。これらの突然変異体は、分子の全体構造の障害に関する実験において、内部対照として使用した。同じ表13中で、突然変異体:M11K101R、M22E103A、M23R105A及びM24Y25Aに相当するデータを、太字及びイタリックで強調する。これらの突然変異体はscFvL3H6抗体断片による認識に顕著に影響を与え、一方、同じ実験で使用した、ウサギで得た抗VEGFポリクローナル抗体又はヒト化治療用抗体ベバシズマブによる認識は影響を受けなかった。これらの結果は、本発明中に記載するscFvL3H6抗体断片及びそれに由来する他の組換え抗体FabL3H6及びscFv2-Fc-L3H6によって画定するヒトVEGFにおける新たな機能性エピトープは、重要なアミノ酸として残基K101、R103、E105及びY25を正確に有することを示す。図7は、PyMolソフトウェアを使用して得た、ヒトVEGF-Aホモ二量体における表面残基の概略図を示す。この図中では、2つのホモ二量体の1つにおけるアミノ酸K101、R103、E105及びY25をダークグレーで強調し、これらは本発明中に記載する新たな組換え抗体による抗原認識に重要である。PyMolソフトウェアを使用して得たヒトVEGF-Aホモ二量体のグラフ図は、アミノ酸K101、R103、E105及びY25が、優れた溶媒露出性を有する分子領域中の高次構造クラスターを画定することを示す。例12ヒトVEGFで刺激したヒト臍帯静脈内皮細胞HuVECのモデルにおける、ヒトVEGFを認識する異なる組換え抗体のinvitro抗増殖効果の評価。分子scFvL3H6、scFvL3H5、scFvL3H7、scFv2-FcL3H6、scFv2-FcL3H5及びscFv2-FcL3H7のinvitro抗増殖効果を、ヒトVEGFで刺激したヒト臍帯静脈内皮細胞HuVECのモデルにおいて決定した。抗体scFv2H1及びscFv2-Fc2H1-8.2WO2008/052489A1は参照として使用し、scFv抗HBsAgAyala、M.etal.1995.Biotechniques18:832~842頁及びニモツズマブCenterforMolecularImmunology、Havanaは陰性対照として使用した。阻害対照として、可溶性KDR-Fca1μg/mLSigmaを利用した。簡単に言うと、3,000のHuVEC細胞PromoCellGmbHを、1v/vウシ胎児血清Gibcoを補充したRPMI1640培地において、1ゼラチンSigmaを事前にコーティングした96ウエル培養プレートCostarのウエル毎に播種し、72時間の間5CO2において37°Cで増殖させた。わずか10ng/mLのヒトVEGF-APeprotech;100として任意に定義した増殖対照、又は10ng/mLのヒトVEGF-A及び40μg/mLのscFv断片、若しくは10μg/mLの二価分子で細胞を刺激した。実験の最後に、0.5クリスタルバイオレット、20メタノール中で細胞を染色した。プレートは水で洗浄し空気中で乾燥させた。染色液はエタノール、0.1Mクエン酸ナトリウムの1:1溶液で溶出させ、吸光度はマイクロプレートリーダーにおいて562nmで読み取った。基底細胞増殖の吸光度の値を100と考えた。試験した分子の各々の影響から誘導した吸光度データは、最大増殖対照に対する百分率として推測した。100に対するこれらの増殖値は、ヒトVEGFで刺激したHuVEC細胞の増殖を阻害する所与の分子の能力を示す。分子scFvL3H6、scFvL3H5及びscFvL3H7に関する図8A、及び8BscFv2-FcL3H6、scFv2-FcL3H5及びscFv2-FcL3H7中に示すように、本発明の目的である組換え抗体は、利用した用量でHuVEC細胞の増殖を阻害する。それぞれの型の組換え抗体scFv又は二価分子によって生じた阻害は、同量で抗体断片scFv2H1又は二価分子scFv2-Fc2H18.2によって生じた阻害より優れている。一般に二価分子は、細胞受容体へのVEGFのアクセスを遮断する際により有効であり、結果として、より低い用量でHuVEC細胞の増殖を阻害する。例13マウス皮下マトリゲルペレットモデルにおける、ヒトVEGFを認識する異なる組換え抗体のinvivo抗血管新生効果の評価。二価分子scFv2-FcL3H6、scFv2-FcL3H5及びscFv2-FcL3H7のinvivo抗血管新生効果を、Passanitietal.によって記載された実験モデルにおいて試験したPassanitiAetal.1992.LabInvest.67:519~28頁。比較用に、二価抗体型分子scFv2-Fc2H18.2WO2008/052489A1を使用した。このモデルでは、血管新生が、血管新生促進因子の存在下での、C57Bl/6マウスCENPALAB、Habanaへの細胞外マトリックスタンパク質の抽出物マトリゲル、BectonDickinsonの皮下接種によって誘導される。動物は10匹のグループに分け、200ngのヒトVEGFPeprotech、無関連抗体CB-Hep.1、抗HBsAg、HeberBiotec、Havana、又は阻害対照として10μgのKDR-FcSigmaを含めた100μgの試験分子を含有する500μLのマトリゲルを腹部領域に皮下注射した。6日後に動物を屠殺し、マトリゲルペレットを抽出し、各々のヘモグロビン含有量を、製造者の説明書に従い、Drabkinの試薬キットSigmaを使用したDrabkinの方法により決定した。分子scFv2-FcL3H6、scFv2-FcL3H5及びscFv2-FcL3H72は、マトリゲルペレットにおいてヒトVEGFによって誘導される血管新生を有意に阻害しp<0.001、これはヘモグロビン含有量の低下と相関がある。図9中で見ることができるように、得られた阻害値は、組換え抗体scFv2-Fc2H18.2によって生じた阻害値より3倍高い。例14A673ヒト腫瘍横紋筋肉腫細胞を異種移植したヌードマウスにおける、組換え抗体scFv2-FcL3H6、scFv2-FcL3H5及びscFv2-FcL3H7のinvivo抗腫瘍効果の評価。腫瘍及び幾つかの腫瘍間質細胞により誘導される血管新生は、腫瘍増殖及び播種に必要不可欠である。この血管新生促進効果の主なメディエーターは、これらの細胞要素によって生成されるVEGFである。このため、抗血管新生物質のアッセイに使用するモデルは、動物における腫瘍増殖の阻害のモデルである。本特許中に記載する新たな抗体はヒトVEGFを好ましいことに同定するので、ヒト腫瘍細胞を同系無胸腺マウスヌードマウス;nu/nuに接種する腫瘍増殖モデルをマウスにおいて実施する。この実験中、本発明者らは、8~10週齢の、BALB/c系統CENPALAB、Havanaの5群の5nu/nu無胸腺マウスを使用した。治療群に、組換え抗体scFv2-FcL3H6、scFv2-FcL3H5及びscFv2-FcL3H7、参照として組換え分子scFv2-Fc2H1-8.2WO2008/052489A1、及び陰性対照として抗HBsAgCB-Hep.1ネズミモノクローナル抗体HeberBiotec、Habanaを、いずれも2.5mg/kg、PBSpH7.2中の用量で分配した。マウスには、右背面領域に1.5×107個のヒトA673腫瘍細胞ATCC、CRL1598を皮下注射した。この多量の細胞接種原を、使用治療用量と共に利用して、異なる試験抗体の抗腫瘍効果の差をすぐに実証した。腫瘍が200mm3の体積に達したとき、マウスを5匹の5群にランダムに分けて、各実験群に関して示すように治療を開始した。投与は3週間の間2日毎に、200μLの体積で腹腔内に行った。腫瘍増殖のフォローアップは、デジタルカリパーを使用し最長長さ、及び最狭幅腫瘍径を測定して行った。腫瘍体積は、腫瘍体積mm3=0.52×長さmm×幅2mmとして計算した。観察期間中の腫瘍体積は、一元配置ANOVAstadigraph及びボンフェローニ事後検定を使用して比較した。一定治療期間後、動物を屠殺し、腫瘍は外科手術によって除去し、ヘマトキシリン及びエオシンを使用して組織学的に分析した。図10中に示すように、scFv2-FcL3H6、scFv2-FcL3H5及びscFv2-FcL3H7を接種した全ての動物が、陰性対照に対して、腫瘍増殖のほぼ完全な制御を示した。この図は、本発明の目的である新たな組換え抗体は、組換え抗体scFv2-Fc2H18.2に対して性能が優れていたことも示す。組織学的分析は、scFv2-FcL3H6、scFv2-FcL3H5及びscFv2-FcL3H7で治療した動物の腫瘍には、血管密度の有意な減少、血管径の減少、腫瘍細胞アポトーシスの増大、及び有糸分裂数の減少があったことを示した。例15横紋筋肉腫系A673のヒト腫瘍細胞を接種したヌードマウスにおいて、腫瘍領域中に選択的に存在する131I-放射標識scFvL3H6断片の能力。A673細胞の腫瘍増殖に対応する領域に存在するscFvL3H6断片の能力を決定するため、この断片、及び陰性対照ネズミ抗B型肝炎表面抗原scFv;scFv-Hep.1;Ayala、M.etal.1995.Biotechniques18:832~842頁を、それぞれ1.51MBq/5μg及び1.55MBq/5μgの最終比活性でIodogen手順FrakerPJ、SpeckJCJr.1978.BiochemBiophysResComm80:849~857頁を使用して、131IAmersham、UKで標識した。放射標識産物を薄層クロマトグラフィーで分析して、タンパク質への取り込みを検出し、それぞれ93と95の放射活性の値を報告した。それらの対応する抗原ヒトVEGF及びHBsAgを検出する放射標識産物の能力を、ポリスチレン製イムノチューブをアイソフォーム121のヒト組換えVEGF5μg/mL;Peprotech、又は組換えHBsAg5μg/mL;HeberBiotec、Havanaでコーティングしたシステムで試験し、次いでそれらをブロッキングし、対応する比活性の放射標識断片のサンプルと接触させて置き、理論上固相に捕捉され得る量に調節した。インキュベーション及び洗浄後、本発明者らは、固相は87.3及び84.5の放射活性でそれぞれscFvL3H6及びscFv-Hep.1と結合することができたことを決定し、放射標識手順は重要なことに断片の生物学的活性を変えなかったことを示した。生体内分布を試験するため、本発明者らは30匹のnu/nuマウスを使用した。動物には、右背面領域にA673培養系の5×106個のヒト腫瘍細胞を皮下注射した。腫瘍が約300mm3の体積に達したとき、動物は5匹の動物の6グループにランダムに分け、治療を開始した。放射標識品15匹にscFvL3H6及び15匹にscFvHep.1をマウスの尾静脈に注射し、それぞれの物品に関して24、48、及び72時間後に5匹のグループにおいて屠殺した。腫瘍、脾臓、肝臓、腎臓、腸、筋肉、骨髄及び血液を、外科手術又はサンプリングによって除去した。放射活性の蓄積は、組織1グラム当たりの注射量の百分率として表した。較正は標準注射量サンプルを使用して行った。放射活性はシンチレーションガンマカウンターを使用して測定した。表14は、これらの組織で行った測定から計算した腫瘍:血液放射活性比を示す。この実験は、24時間と72時間の間に、非特異的scFvHep.1断片と異なり、scFvL3H6断片が腫瘍組織内に優先的に局在することを示す。放射標識scFvL3H6の特異的沈着は、注射の48時間後に、腫瘍と異なる他の組織内で見られなかった。5匹のマウスから回収した組織から誘導した平均値から、それぞれの比を計算した。これらの結果は、scFvL3H6は局所高濃度のヒトVEGFが存在する解剖領域に特異的に局在することができ、したがって、放射性同位体又は最終的に薬剤若しくは毒素などの異なる治療用品を、この領域に特異的に運ぶのに有用であることを示唆する。例16scFvL3H6断片及び二価分子scFv2-FcL3H6を使用した、非ヒト霊長類における実験的脈絡膜血管新生CNVの予防。実験的脈絡膜血管新生CNVのモデルとして、本発明者らは、Krzystoliketal.KrzystolikM.G、etal.2006.ActaOphthalmol120:338~346頁によって報告されたモデルを利用した。6匹のカニクイザルMacacafascicularis、CENPALAB、Havanaを、動物試験実施適正基準に従い維持し操作した。動物には、ケタミン塩酸塩、マレイン酸アセプロマジン、及び硫酸アトロピンの筋肉内注射を用いる全手順のため麻酔をかけた。プロパラカイン塩酸塩を用いた局所麻酔も使用した。除核及び安楽死前の麻酔は静脈内ナトリウムペントバルビタールで行った。アルゴンレーザー照射を使用して黄斑においてCNV膜を誘導し、50μmと100μmの間の適用地点で、水疱及びわずかな出血をもたらす手順を確実にした。写真撮影及び蛍光血管造影法を使用して、病巣の拡大及び特徴を検出し測定した。動物の目は、異なる日時、断片及びプラシーボ及びレーザー照射手順の適用前後、並びに実験の最後で調べ、除核及び動物屠殺で終わらせた。動物は、試験した分子:scFvL3H6抗体断片又は免疫グロブリン型scFv2-FcL3H6の二価分子に応じて、3匹の2グループに分けた。それぞれの動物の右目には、硝子体内注射により、グループに応じて300μgのscFvL3H6又はscFv2-FcL3H6を含む50μLPBSを与え、一方左目には媒体のみを注射した。目にはレーザー治療前に2回注射した第0日と第14日。第21日に、CNVの誘導のため全ての目にレーザー治療を施した。それぞれの目に2日間、特定製品又は媒体を用いた注射を繰り返した。レーザー誘導後3週第42日で、動物に硝子体内注射し、今回はグループに応じていずれもscFvL3H6断片又はscFv2-FcL3H6分子を用い、第56日に同様の最終注射で終わらせた。治療の第I段階第42日より前に、試験は、それぞれの対照の目と比較して、scFvL3H6又はscFv2-FcL3H6を投与した目におけるグレード4の病巣の発症の減少を示し、これらはいずれも分子がCNVの予防において役立つことを示唆する。治療の第2段階に、全ての目にscFvL3H6又はscFv2-FcL3H6を与えたとき、本発明者らはグレード4の病巣の減少を検出し、これは断片及び二価分子が樹立した病巣にも有効であることを示唆する。"