"蛋白質を発現させるための発現ベクターであって、遺伝子発現制御部位、並びに、その下流に該蛋白質をコードする遺伝子、更に下流に内部リボソーム結合部位、および更に下流にグルタミン合成酵素をコードする遺伝子を含んでなる、発現ベクター。該遺伝子発現制御部位が、サイトメガロウイルス由来のプロモーター、SV40初期プロモーター、伸長因子1プロモーターからなる群から選択されるものである、請求項1の発現ベクター。該内部リボソーム結合部位が、ピコルナウイルス科のウイルス、口蹄疫ウイルス、A型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、コロナウイルス、ウシ腸内ウイルス、サイラーのネズミ脳脊髄炎ウイルス、コクサッキーB型ウイルス、ヒト免疫グロブリン重鎖結合蛋白質遺伝子、ショウジョウバエアンテナペディア遺伝子、ショウジョウバエウルトラビトラックス遺伝子からなる群から選択されるウイルスまたは遺伝子の5’非翻訳領域に由来するものである、請求項1または2の発現ベクター。該内部リボソーム結合部位が、ピコルナウイルス科のウイルスの5’非翻訳領域に由来するものである、請求項1または2の発現ベクター。該内部リボソーム結合部位が、マウス脳心筋炎ウイルスの5’非翻訳領域に由来するものである、請求項1または2の発現ベクター。該内部リボソーム結合部位が、野生型の内部リボソーム結合部位の塩基配列に、1又は2以上の変異を加えたものである、請求項1ないし5のいずれかの発現ベクター。該内部リボソーム結合部位に開始コドンが複数存在し、そのうちの一部のものが破壊されてなる、請求項6の発現ベクター。該内部リボソーム結合部位が、配列番号1の塩基配列を含むものである、請求項5の発現ベクター。該内部リボソーム結合部位が、配列番号2の塩基配列を含むものである、請求項5の発現ベクター。該内部リボソーム結合部位が、配列番号3の塩基配列を含むものである、請求項5の発現ベクター。該内部リボソーム結合部位が、配列番号4の塩基配列を含むものである、請求項5の発現ベクター。該内部リボソーム結合部位が、配列番号5の塩基配列を含むものである、請求項5の発現ベクター。該内部リボソーム結合部位が、配列番号6の塩基配列を含むものである、請求項5の発現ベクター。蛋白質をコードする該遺伝子と該内部リボソーム結合部位との間の領域又はグルタミン合成酵素をコードする該遺伝子の下流の領域において、該内部リボソーム結合部位とは別に、内部リボソーム結合部位及びその下流に薬剤耐性遺伝子を更に含んでなる、請求項1ないし13のいずれかの発現ベクター。該遺伝子発現制御部位とは別に、遺伝子発現制御部位及びその下流に薬剤耐性遺伝子を更に含んでなる、請求項1ないし13のいずれかの発現ベクター。該薬剤耐性遺伝子が、ピューロマイシンまたはネオマイシン耐性遺伝子である、請求項14又は15の発現ベクター。蛋白質をコードする該遺伝子が、ヒト由来の遺伝子である請求項1ないし16のいずれかの発現ベクター。ヒト由来の該遺伝子が、リソソーム酵素、組織プラスミノーゲンアクチベーターtPA、血液凝固因子、エリスロポエチン、インターフェロン、トロンボモジュリン、卵胞刺激ホルモン、顆粒球コロニー刺激因子GCSF、および抗体をコードする遺伝子からなる群から選択されるものである、請求項17の発現ベクター。ヒト由来の該遺伝子が、リソソーム酵素をコードする遺伝子である、請求項17の発現ベクター。該リソソーム酵素が、αガラクトシダーゼA、イズロン酸2スルファターゼ、グルコセレブロシダーゼ、ガルスルファーゼ、αLイズロニダーゼ、酸性αグルコシダーゼからなる群から選択されるものである、請求項19の発現ベクター。ヒト由来の該遺伝子が、エリスロポエチンをコードする遺伝子である請求項17の発現ベクター。請求項1ないし21のいずれかの発現ベクターで形質転換された哺乳動物細胞。該哺乳動物細胞が、CHO細胞である請求項22の細胞。請求項1ないし21のいずれかの発現ベクターを、哺乳動物細胞に導入するステップと、該発現ベクターが導入された哺乳動物細胞を、グルタミン合成酵素阻害剤の存在下又はグルタミン合成酵素阻害剤及び薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤の存在下、選択培養するステップとを含む、該蛋白質をコードする遺伝子を発現する形質転換細胞の製造方法。組換え体蛋白質を哺乳動物細胞内で効率よく発現させるための新規発現ベクター、該ベクターで形質転換された哺乳動物細胞、及び該哺乳動物細胞の製造方法を提供することを目的とする。上記目的に向けた研究において、本発明者らは、遺伝子発現制御部位、並びに、その下流にヒトグルコセレブロシダーゼ等の所望の蛋白質をコードする遺伝子、更に下流に内部リボソーム結合部位、及び更に下流にグルタミン合成酵素をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターを用いて、哺乳動物細胞を形質転換させることにより、該蛋白質をコードする遺伝子を高レベルで発現させることができることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は以下を提供する。[1]蛋白質を発現させるための発現ベクターであって、遺伝子発現制御部位、並びに、その下流に該蛋白質をコードする遺伝子、更に下流に内部リボソーム結合部位、および更に下流にグルタミン合成酵素をコードする遺伝子を含んでなる、発現ベクター、[2]該遺伝子発現制御部位が、サイトメガロウイルス由来のプロモーター、SV40初期プロモーター、伸長因子1プロモーターからなる群から選択されるものである、上記[1]の発現ベクター、[3]該内部リボソーム結合部位が、ピコルナウイルス科のウイルス、口蹄疫ウイルス、A型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、コロナウイルス、ウシ腸内ウイルス、サイラーのネズミ脳脊髄炎ウイルス、コクサッキーB型ウイルス、ヒト免疫グロブリン重鎖結合蛋白質遺伝子、ショウジョウバエアンテナペディア遺伝子、ショウジョウバエウルトラビトラックス遺伝子からなる群から選択されるウイルスまたは遺伝子の5’非翻訳領域に由来するものである、上記[1]または[2]の発現ベクター、[4]該内部リボソーム結合部位が、ピコルナウイルス科のウイルスの5’非翻訳領域に由来するものである、上記[1]または[2]の発現ベクター。[5]該内部リボソーム結合部位が、マウス脳心筋炎ウイルスの5’非翻訳領域に由来するものである、上記[1]または[2]の発現ベクター、[6]該内部リボソーム結合部位が、野生型の内部リボソーム結合部位の塩基配列に、1又は2以上の変異を加えたものである、上記[1]ないし[5]のいずれかの発現ベクター、[7]該内部リボソーム結合部位に開始コドンが複数存在し、そのうちの一部のものが破壊されてなる、上記[6]の発現ベクター、[8]該内部リボソーム結合部位が、配列番号1の塩基配列を含むものである、上記[5]の発現ベクター、[9]該内部リボソーム結合部位が、配列番号2の塩基配列を含むものである、上記[5]の発現ベクター、[10]該内部リボソーム結合部位が、配列番号3の塩基配列を含むものである、上記[5]の発現ベクター、[11]該内部リボソーム結合部位が、配列番号4の塩基配列を含むものである、上記[5]の発現ベクター、[12]該内部リボソーム結合部位が、配列番号5の塩基配列を含むものである、上記[5]の発現ベクター、[13]該内部リボソーム結合部位が、配列番号6の塩基配列を含むものである、上記[5]の発現ベクター、[14]蛋白質をコードする該遺伝子と該内部リボソーム結合部位との間の領域又はグルタミン合成酵素をコードする該遺伝子の下流の領域において、該内部リボソーム結合部位とは別に、内部リボソーム結合部位及びその下流に薬剤耐性遺伝子を更に含んでなる、上記[1]ないし[13]のいずれかの発現ベクター、[15]該遺伝子発現制御部位とは別に、遺伝子発現制御部位及びその下流に薬剤耐性遺伝子を更に含んでなる、上記[1]ないし[13]のいずれかの発現ベクター、[16]該薬剤耐性遺伝子が、ピューロマイシンまたはネオマイシン耐性遺伝子である、上記[14]又は上記[15]の発現ベクター、[17]蛋白質をコードする該遺伝子が、ヒト由来の遺伝子である上記[1]ないし[16]のいずれかの発現ベクター、[18]ヒト由来の該遺伝子が、リソソーム酵素、組織プラスミノーゲンアクチベーターtPA、血液凝固因子、エリスロポエチン、インターフェロン、トロンボモジュリン、卵胞刺激ホルモン、顆粒球コロニー刺激因子GCSF、および抗体をコードする遺伝子からなる群から選択されるものである、上記[17]の発現ベクター、[19]ヒト由来の該遺伝子が、リソソーム酵素をコードする遺伝子である、上記[17]の発現ベクター、[20]該リソソーム酵素が、αガラクトシダーゼA、イズロン酸2スルファターゼ、グルコセレブロシダーゼ、ガルスルファーゼ、αLイズロニダーゼ、酸性αグルコシダーゼからなる群から選択されるものである、上記[19]の発現ベクター、[21]ヒト由来の該遺伝子が、エリスロポエチンをコードする遺伝子である上記[17]の発現ベクター、[22]上記[1]ないし[21]のいずれかの発現ベクターで形質転換された哺乳動物細胞、[23]該哺乳動物細胞が、CHO細胞である上記[22]の細胞、[24]上記[1]ないし[21]のいずれかの発現ベクターを、哺乳動物細胞に導入するステップと、該発現ベクターが導入された哺乳動物細胞を、グルタミン合成酵素阻害剤の存在下又はグルタミン合成酵素阻害剤及び薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤の存在下、選択培養するステップとを含む、該蛋白質をコードする遺伝子を発現する形質転換細胞の製造方法。本発明によれば、哺乳動物細胞内で、所望の組換え体蛋白質を効率よく発現させるための、発現ベクターを得ることができる。該発現ベクターを哺乳動物細胞に導入し、次いで選択培養することにより、該組換え体蛋白質を効率よく生産する形質転換細胞を得ることができる。こうして得た形質転換細胞を用いれば、該組換え体蛋白質の製造コストを大幅に低減することができる。本発明において、遺伝子発現制御部位とは、その下流に存在する遺伝子の転写の頻度を調節することができるDNA上の領域のことであり、一般にプロモーター又はプロモーター遺伝子と称されるものである。遺伝子発現制御部位は、生体内で発現する遺伝子のほぼ全ての上流側に存在し、その転写の頻度を調節するものであり、その塩基配列は多様である。本発明において用いることのできる遺伝子発現制御部位は、その下流に組み込んだ遺伝子の転写を、哺乳動物細胞内において強力に誘導することができるものである限り特に限定はないが、好ましくはサイトメガロウイルスSMV由来のプロモーター、SV40初期プロモーター等のウイルス由来のプロモーター、及び伸長因子1αプロモーターなどである。本発明において、内部リボソーム結合部位とは、mRNA鎖の内部に存在する、リボソームが直接結合し且つキャップ構造非依存性に翻訳を開始し得る領域構造、又は転写されることにより該領域を生じるDNA鎖の領域構造である。また、本発明において、内部リボソーム結合部位をコードする遺伝子とは、転写されることにより該領域を生じるDNA鎖の領域構造である。内部リボソーム結合部位は、一般に、IRESinternalribosomeentrysiteと称され、ピコルナウイルス科のウイルスポリオウイルス、ライノウイルス、マウス脳心筋炎ウイルスなど、口蹄疫ウイルス、A型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、コロナウイルス、ウシ腸内ウイルス、サイラーのネズミ脳脊髄炎ウイルス、、コクサッキーB型ウイルス等のウイルスの5’非翻訳領域、ヒト免疫グロブリン重鎖結合蛋白質、ショウジョウバエアンテナペディア、ショウジョウバエウルトラビトラックス等の遺伝子の5’非翻訳領域に見出されている。ピコルナウイルスの場合、そのIRESは、mRNAの5’非翻訳領域に存在する約450bpから成る領域である。ここでウイルスの5’非翻訳領域とは、ウイルスのmRNAの5’非翻訳領域、又は転写されることにより該領域を生じるDNA鎖の領域構造である。本発明において、内部リボソーム結合部位は、哺乳動物細胞内、特にチャイニーズハムスターの卵巣に由来する細胞CHO細胞内で、内部リボソーム結合部位として機能するものである限り特に限定はなく、いずれのものをも使用することができる。それらのうち、好ましくはウイルスの5’非翻訳領域に由来する内部リボソーム結合部位、より好ましくはピコルナウイルス科のウイルスの5’非翻訳領域に由来する内部リボソーム結合部位、更に好ましくはマウス脳心筋炎ウイルスの5’非翻訳領域に由来する内部リボソーム結合部位が挙げられる。本発明において、内部リボソーム結合部位は、野生型の塩基配列を有するものをそのまま使用することができる。また、これら野生型の内部リボソーム結合部位の塩基配列に、1又は2以上の変異例えば、置換、欠損、又は/及び挿入などをいう。を加えた変異型の内部リボソーム結合部位も、哺乳動物細胞内特にCHO細胞内で内部リボソーム結合部位として機能するものである限り、いずれのものをも使用することができる。また、2以上の内部リボソーム結合部位を融合させたキメラ型の内部リボソーム結合部位も、使用することができる。また、本発明においては、内部リボソーム結合部位の制御下にグルタミン合成酵素をコードする遺伝子GS遺伝子を配置することにより,GS遺伝子の発現量を調節することができる。かかる調節により、GS遺伝子の発現量を、選択培養において十分な選択圧が得られる一定の範囲の量に調節すれば、後述するように、組換え体蛋白質を高レベルで発現する哺乳動物細胞を選択することが可能となる。GS遺伝子の発現量を調節する場合、種々の内部リボソーム結合部位の中から、GS遺伝子の発現量をより増加させる又はより減少させる内部リボソーム結合部位を、適宜選択して使用することにより、当該目的を達成することができる。また、内部リボソーム結合部位に変異を加えることによって、当該目的を達成することもできる。この場合において、当該変異を加える場所等に特に限定はなく、内部リボソーム結合部位の下流に存在するGS遺伝子の発現量を、一定の範囲の量に調節することができる限り如何なるものでもよい。例えば、GS遺伝子の発現量を減少させる目的で変異を加える場合、野生型の内部リボソーム結合部位に存在する翻訳開始点として使用し得る複数の開始コドンATGがターゲットとなり得る。例えば、これら開始コドンを、変異によって破壊することにより、これら開始コドンに対してインフレームに組み込まれたGS遺伝子の発現量を減少させることができる。ここに、破壊とは、ある遺伝子配列に変異を加えることにより、当該遺伝子配列が本来有する機能を発揮させないようにすることをいう。例えば、野生型のマウス脳心筋炎ウイルスの内部リボソーム結合部位の3末端には、3つの開始コドンATGが存在しており、その配列を配列番号15ATGataatATGgccacaaccATG3:開始コドンは、明示のため、大文字で表した。で示す。この内部リボソーム結合部位の下流に存在するGS遺伝子の発現量を減少させる場合、変異を加えて破壊する開始コドンは、好ましくは5’側から2番目及び3番目の開始コドンであり、より好ましくは2番目の開始コドンである。したがって、このような変異を加えた内部リボソーム結合部位としては、例えば、その3末端が配列番号25atgataatnnngccacaaccnnn3:nは任意の塩基若しくは配列番号325atgataannnngccacaaccnnn3:nは任意の塩基の塩基配列であるもの、又は配列番号35atgataatnnngccacaaccatg3:nは任意の塩基若しくは配列番号335atgataannnngccacaaccatg3:nは任意の塩基の塩基配列であるものが挙げられる。より具体的には、その3’末端が配列番号45atgataagcttgccacaaccatg3;の塩基配列である内部リボソーム結合部位であり、変異により5側から2番目の開始コドンが破壊されたものである。更に詳しくは、野生型のマウス脳心筋炎ウイルスの内部リボソーム結合部位は、配列番号55cccccccccctctccctcccccccccctaacgttactggccgaagccgcttggaataaggccggtgtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgccgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacctggccctgtcttcttgacgagcattcctaggggtctttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaagcttcttgaagacaaacaacgtctgtagcgaccctttgcaggcagcggaaccccccacctggcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacgtgtataagatacacctgcaaaggcggcacaaccccagtgccacgttgtgagttggatagttgtggaaagagtcaaatggctctcctcaagcgtattcaacaaggggctgaaggatgcccagaaggtaccccattgtatgggatctgatctggggcctcggtgcacatgctttacatgtgtttagtcgaggttaaaaaaacgtctaggccccccgaaccacggggacgtggttttcctttgaaaaacacgatgataatatggccacaaccatg3の塩基配列を含むものである。また、該塩基配列に変異を加えたものとしては、配列番号65cccccccccctctccctcccccccccctaacgttactggccgaagccgcttggaataaggccggtgtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgccgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacctggccctgtcttcttgacgagcattcctaggggtctttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaagcttcttgaagacaaacaacgtctgtagcgaccctttgcaggcagcggaaccccccacctggcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacgtgtataagatacacctgcaaaggcggcacaaccccagtgccacgttgtgagttggatagttgtggaaagagtcaaatggctctcctcaagcgtattcaacaaggggctgaaggatgcccagaaggtaccccattgtatgggatctgatctggggcctcggtgcacatgctttacatgtgtttagtcgaggttaaaaaaacgtctaggccccccgaaccacggggacgtggttttcctttgaaaaacacgatgataagcttgccacaaccatg3の塩基配列が挙げられる。また、野生型及び/又は変異型の内部リボソーム結合部位の下流に存在するGS遺伝子の発現量を、別の方法で調節することもできる。例えば、GS遺伝子の発現量を減少させる場合、これら内部リボソーム結合部位の開始コドンに対してアウトオブフレームにGS遺伝子を組み込むことや、内部リボソーム結合部位とその下流に存在するGS遺伝子との間に、転写若しくは翻訳を阻害する塩基配列を導入することによっても、該遺伝子の発現量を減少させることができる。転写を阻害する塩基配列は、内部リボソーム結合部位の下流に組み込んだGS遺伝子の転写を阻害するものであれば特に限定はないが、例えば、ポリメラーゼ付加シグナル5’aataaa3’等がある。また、翻訳を阻害する塩基配列は、内部リボソーム結合部位の下流に組み込んだ該遺伝子の翻訳を阻害するものであれば特に限定はないが、例えば、リーディングスルーを誘導するストップコドン等、正しい翻訳を妨げるもの等がある。本発明において、グルタミン合成酵素というときは、グルタミン酸とアンモニアからグルタミンを合成することができるものである限り特に限定はなく、哺乳動物、爬虫類、鳥類、両生類、麟翅目Lepidopteraに属するカイコBombyxmori、夜盗蛾Spodopterafrugiperda、シャクトリムシGeometridae等、双翅目Dipteraに属するショウジョウバエDrosophila等の昆虫、原核生物、線虫、酵母、放線菌、糸状菌、子嚢菌、坦子菌及び植物由来を含め如何なる生物由来のものでもよいが、好ましくは哺乳動物のものであり、ヒト又はチャイニーズハムスター由来のもの特に、CHO細胞由来のものが好適に使用できる。また、グルタミン合成酵素阻害剤というときは、上記グルタミン合成酵素の活性を阻害することができるものである限り特に限定はなく、いずれのものも用いることができるが、好ましくはメチオニンスルホキシミンMSXが挙げられる。本発明においては、発現ベクターに、GS遺伝子に加えて、追加の選択マーカー遺伝子を導入することができる。該追加の選択マーカー遺伝子は、発現ベクターが導入された哺乳動物細胞に薬剤耐性を付与することができる遺伝子薬剤耐性遺伝子である。本発明において、薬剤耐性遺伝子として使用できる遺伝子は、哺乳動物細胞に薬剤耐性を付与することのできる遺伝子である限り特に限定はないが、好ましくは、細胞にピューロマイシン、ハイグロマイシン、ブラストサイジン、ネオマイシン等の薬剤に対する耐性を付与することのできる遺伝子である。ここにおいて、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ブラストサイジン、ネオマイシン等の薬剤は、それぞれ、薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤である。これらの薬剤耐性遺伝子のうち、より好ましくは、ピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子が挙げられる。本発明において、薬剤耐性遺伝子は、組換え体蛋白質が制御を受ける遺伝子発現制御部位とは別の遺伝子発現制御部位第2の遺伝子発現制御部位を設けて、その下流に組み込むことにより、発現量を制御することができる。この場合、該第2の遺伝子発現制御部位は、薬剤耐性遺伝子の発現量を、選択培養において十分な選択圧が得られる一定の範囲の量に調節できるものが用いられる。即ち、薬剤耐性遺伝子の発現量を比較的抑制することにより、発現ベクターで形質転換された哺乳動物細胞の薬剤に対する感受性を高めることができ、これにより、所望の蛋白質をコードする遺伝子を高レベルに発現して、該組換え体蛋白質を高レベルに生産する哺乳動物細胞の選択が可能となる。また、本発明において、薬剤耐性遺伝子は、その上流に第2の内部リボソーム結合部位を介して、組換え体蛋白質をコードする遺伝子と内部リボソーム結合部位との間の領域又はGS遺伝子の下流の領域に、組み込むことができる。これにより、薬剤耐性遺伝子の発現量を、第2の内部リボソーム結合部位により制御することができる。この場合、第2の内部リボソーム結合部位として、GS遺伝子の上流の内部リボソーム結合部位と同一のものを使用してもよく、また別のものを使用してもよい。また、第2の内部リボソーム結合部位は、上記の種々の内部リボソーム結合部位から任意に選択し得る。第2のリボソーム結合部位に関しても、上述と同様に、適当なものを選択したりあるいは変異を加えたりすることなどにより、薬剤耐性遺伝子の発現量を調節することができる。本発明において、発現ベクターに組み込まれる組換え体蛋白質をコードする遺伝子の動物種は、ヒトを含む哺乳動物由来のものを含め、特に限定はない。例えば、該遺伝子は、本発明のベクターを医療用医薬品の製造に使用するときは、概ねヒト由来のものとなり、家畜用の医薬品の製造に使用するときも、概ね治療対象とする家畜由来の遺伝子のものとなる。また、該所望の蛋白質をコードする遺伝子の種類にも特に限定はないが、好ましくは、αガラクトシダーゼA、イズロン酸2スルファターゼ、グルコセレブロシダーゼ、ガルスルファーゼ、αLイズロニダーゼ、酸性αグルコシダーゼ等のリソソーム酵素、組織プラスミノーゲンアクチベーターtPA、血液凝固第VII因子、血液凝固第VIII因子、血液凝固第IX因子等の血液凝固因子、エリスロポエチン、インターフェロン、トロンボモジュリン、卵胞刺激ホルモン、顆粒球コロニー刺激因子GCSF、又は各種抗体医薬をコードする遺伝子であり、より好ましくはリソソーム酵素及びエリスロポエチンをコードする遺伝子であり、更に好ましくはグルコセレブロシダーゼ及びエリスロポエチンをコードする遺伝子である。本発明において、発現ベクターが導入される哺乳動物細胞は、目的の組換え体蛋白質が発現できるものである限り特に限定はないが、生体から取り出した臓器、筋組織、皮膚組織、結合組織、神経組織、血液、骨髄等から採取された細胞の初代培養細胞、継代培養細胞、及び継代培養しても形質が安定であるように株化された細胞のいずれであってもよい。また、細胞は正常細胞、癌化細胞のいずれであってもよい。特に好適に使用できる細胞は、チャイニーズハムスターの卵巣に由来するCHO細胞、ヒトの繊維芽細胞及びアフリカミドリザルの腎線維芽細胞に由来するCOS細胞である。本発明において、発現ベクターの哺乳動物細胞への導入は、哺乳動物細胞内において組換え体蛋白質をコードする遺伝子が発現されるようにする目的で行うものであり、この目的が達成できる限り如何なる方法を用いてもよい。発現ベクターは、通常環状のプラスミドであるが、これは、環状のままであっても、又は制限酵素で切断して直線状にしてからであっても、細胞に導入することができる。発現ベクターが導入された哺乳動物細胞発現ベクター導入細胞は、グルタミン合成酵素阻害剤例えば、MSXなどを添加したグルタミン不含又は低グルタミン培地該当する場合には、更に薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤例えば、抗生物質などを添加した培地中で培養され、細胞内でGS遺伝子該当する場合には、更に薬剤耐性遺伝子いわゆる選択マーカーが発現する細胞のみ選択される。これを選択培養といい、このとき使用される培地を選択培地という。選択培養においては、発現する選択マーカーの量が添加されるGS阻害剤又は薬剤の量等に比して多過ぎる場合には、十分な選択圧がかからず、組換え体蛋白質の発現量の相対的に多い発現ベクター導入細胞を得ることができない一方、発現する選択マーカーの量が極端に少なすぎる場合には、細胞が死滅するか十分に増殖することができず、やはり発現量の相対的に多い発現ベクター導入細胞を得ることができない。しかし、発現する選択マーカーの量を、一定の範囲の量に調節することにより、GS阻害剤や薬剤に対する感受性を高め十分な選択圧を得ることができるようにすれば、以下に述べるが如きに、組換え体蛋白質の発現量が相対的に多い発現ベクター導入細胞を得ることができる。すわなち、発現する選択マーカーの量を、選択培養において十分な選択圧を得ることができるように、一定の範囲の量に調節した上で、選択培地中に添加されるGS阻害剤の濃度該当する場合には、更に薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤の濃度を段階的に上昇させることにより、選択マーカーの発現量がより多い発現ベクター導入細胞を選択することができる。これは、選択培養の過程で、発現ベクター導入細胞のゲノム中に組み込まれた選択マーカーの数が重複により増加し、選択マーカーの発現量が相対的に増加した発現ベクター導入細胞のみが選択的に増殖することなどに起因する。このとき、発現ベクターに組み込んだ組換え体蛋白質をコードする遺伝子のコピー数も増加するので、該遺伝子の発現量も増加する。従って、発現ベクター導入細胞をこのように選択培養することにより、所望の組換え体蛋白質の発現量が相対的に多い発現ベクター導入細胞を選択することができる。本明細書においては、このように選択された発現ベクター導入細胞を、形質転換細胞という。本発明において、選択マーカーとして、GS遺伝子に加え薬剤耐性遺伝子を更に組み込んだ発現ベクターを哺乳動物細胞に導入する場合には、GS遺伝子のみを組み込んだ場合に比して、更に発現量が多い形質転換細胞を選択することができる。本発明において、選択培地中に添加されるGS阻害剤又は薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤の濃度を段階的に上昇させる場合において、その最大濃度は、例えば、GS阻害剤がメチオニンスルホキシミンの場合、好ましくは100~1000μMであり、より好ましくは200~500μMであり、更に好ましくは約300μMである。あるいは、薬剤がピューロマイシンの場合、その最大濃度は、好ましくは3~30μMであり、より好ましくは5~20μMであり、更に好ましくは約10μMである。以下、実施例を参照して本発明を更に詳細に説明するが、本発明が実施例に限定されることは意図しない。pEneoベクター及びpEhygrベクターの構築pEFmycnucベクターインビトロジェン社を,KpnIとNcoIで消化し,EF1プロモーター及びその第一イントロンを含む領域を切り出し,これをT4DNAポリメラーゼで平滑末端化処理した。pCIneoインビトロジェン社を,BglII及びEcoRIで消化して,CMVのエンハンサー/プロモーター及びイントロンを含む領域を切除した後に,T4DNAポリメラーゼで平滑末端化処理した。これに,上記のEF1αプロモーター及びその第一イントロンを含む領域を挿入して,pEneoベクターを構築した図1-1及び図1-2。pEneoベクターを,SfiI及びBstXIで消化し,ネオマイシン耐性遺伝子を含む約1kbpの領域を切除した図2-1。pcDNA31Hygroインビトロジェン社を鋳型にしてプライマーHygSfi5’及びプライマーHygBstX3’5’aaccatcgtgatgggtgctattcctttgc3’;配列番号8を用いて,PCR反応によりハイグロマイシン遺伝子を増幅した図2-2。増幅したハイグロマイシン遺伝子を,SfiI及びBstXIで消化し,上記のpEneoベクターに挿入して,pEhygrベクターを構築した図2-3。pEIRESGSpuroの構築発現ベクターpPGKIHMiyaharaMetalJBiolChem275613618を制限酵素XhoI及びBamHIで消化し、マウス脳心筋炎ウイルスEMCVに由来する内部リボソーム結合部位IRES、ハイグロマイシン耐性遺伝子及びマウスホスホグリセリン酸キナーゼのポリアデニル化領域を含む塩基配列IRESHygrmPGKpA5’CTCGAGgaattcactccttcaggtgcaggcttgcctatcagaaggtggtggctggtgtggccaactggctcacaaataccactgagatcgacggtatcgataagcttgatatcgaattcCGCCCCCCCCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAACCatgaaaaagcctgaactcaccgcgacgtctgtcgagaagtttctgatcgaaaagttcgacagcgtctccgacctgatgcagctctcggagggcgaagaatctcgtgctttcagcttcgatgtaggagggcgtggatatgtcctgcgggtaaatagctgcgccgatggtttctacaaagatcgttatgttcatcggcactttgcatcggccgcgctcccgattccggaagtgcttgacattggggaattcagcgagagcctgacctattgcatctcccgccgtgcacagggtgtcacgttgcaagacctgcctgaaaccgaactgcccgctgttctgcagccggtcgcggaggccatggatgcgatcgctgcggccgatcttagccagacgagcgggttcggcccattcggaccgcaaggaatcggtcaatacactacgtggcgtgatttcatatgcgcgattgctgatccccatgtgtatcactggcaaactgtgatggacgacaccgtcagtgcgtccgtcgcgcaggctctcgatgagctgatgctttgggccgaggactgccccgaagtccggcacctcgtgcacgcggatttcggctccaacaatgtcctgacggacaatggccgcataacagcggtcattgactggagcgaggcgatgttcggggattcccaatacgaggtcgccaacatcttcttctggaggccgtggttggcttgtatggagcagcagacgcgctacttcgagcggaggcatccggagcttgcaggatcgccgcggctccgggcgtatatgctccgcattggtcttgaccaactctatcagagcttggttgacggcaatttcgatgatgcagcttgggcgcagggtcgatgcgacgcaatcgtccgatccggagccgggactgtcgggcgtacacaaatcgcccgcagaagcgcggccgtctggaccgatggctgtgtagaagtactcgccgatagtggaaaccgacgccccagcactcgtccgagggcaaaggaatagTCGAGaaattgatgatctattaagcaataaagacgtccactaaaatggaagtttttcctgtcatactttgttaagaagggtgagaacagagtacctacattttgaatggaaggattggagctacgggggtgggggtggggtgggattagataaatgcctgctctttactgaaggctctttactattgctttatgataatgtttcatagttggatatcataatttaaacaagcaaaaccaaattaagggccagctcattcctccactcacgatctatagatccactagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagcGGATCC3’;配列番号9。5’端の大文字で示された配列CTCGAGがXhoIサイト、その次に大文字で示されたCGCから始まる配列及びそれに続く小文字3文字atgからなる領域がマウス脳心筋炎ウイルスの5’非翻訳領域に由来する内部リボソーム結合部位を含む塩基配列、該atgから始まる小文字で示された領域がハイグロマイシン耐性遺伝子をコードする塩基配列、その次の小文字で示されたaaaから始まる領域がマウスホスホグリセリン酸キナーゼのポリアデニル化領域を含む塩基配列、及び、3’端の大文字で示された配列GGATCCがBamHIサイトである。のDNA断片を切り出したなお、Hygr遺伝子に対応するアミノ酸配列は、配列番号10で示されたものである。。このDNA断片をpBluescriptSKStratagene社のXhoIとBamHI間に挿入し、これをpBSKIRESHygrmPGKpAとした図3-1。pBSKを鋳型としてプライマーIRES5’5’caactcgagcggccgccccccccccctctccctcccccccccctaacgttact3’;配列番号11及びプライマーIRES3’5’caagaagcttccagaggaactg3’;配列番号12を用いてPCRによりEMCVのIRESの一部を含むDNA断片を増幅させた。このDNA断片を制限酵素XhoI及びHindIIIで消化し、pBSKのXhoIとHindIII間に挿入し、これをpBSKとした図3-2。pBSKNotIIRESHygromPGKpAを制限酵素NotI及びBamHIで消化し、pEhygrベクターのNotIとBamHI間に挿入し、これをプラスミドpEIRESHygrとした図3-3。発現ベクターpPGKIHを鋳型としてプライマーmPGKP5’5’gcgagatcttaccgggtaggggaggcgctt3’;配列番号13及びプライマーmPGKP3’5’gaggaattcgatgatcggtcgaaaggcccg3’;配列番号14を用いてPCRによりmPGKのプロモーター領域mPGKp含む塩基配列5’GCGagatctTACCGGGTAGGGGAGGCGCTTTTCCCAAGGCAGTCTGGAGCATGCGCTTTAGCAGCCCCGCTGGGCACTTGGCGCTACACAAGTGGCCTCTGGCCTCGCACACATTCCACATCCACCGGTAGGCGCCAACCGGCTCCGTTCTTTGGTGGCCCCTTCGCGCCACCTTCTACTCCTCCCCTAGTCAGGAAGTTCCCCCCCGCCCCGCAGCTCGCGTCGTGCAGGACGTGACAAATGGAAGTAGCACGTCTCACTAGTCTCGTGCAGATGGACAGCACCGCTGAGCAATGGAAGCGGGTAGGCCTTTGGGGCAGCGGCCAATAGCAGCTTTGCTCCTTCGCTTTCTGGGCTCAGAGGCTGGGAAGGGGTGGGTCCGGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGGCGGGCGCCCGAAGGTCCTCCGGAGGCCCGGCATTCTGCACGCTTCAAAAGCGCACGTCTGCCGCGCTGTTCTCCTCTTCCTCATCTCCGGGCCTTTCGACCgatcatcGAATTCctc3’;配列番号15。5’末端から最初に小文字で示された配列agatctがBglIIサイト、これに続く大文字で示されたTACから始まる配列がマウスホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子のプロモーター領域を含む塩基配列、及び、その次に大文字で示された配列GAATTCがEcoRIサイトである。のDNA断片を増幅させた。このDNA断片を制限酵素BglII及びEcoRIで消化し、pCIneoPromega社のBglIIとEcoRI間に挿入し、これをpPGKneoとした図3-4。pEIRESHygrを制限酵素NotI及びBamHIで消化してDNA断片IRESHygrを切り出し、pPGKneoのNotIとBamHI間に挿入し、これをpPGKIRESHygrとした図3-5。CHOK1細胞からcDNAを調製し、これを鋳型としてプライマーGS5’5’aatatggccacaaccatggcgacctcagcaagttcc3’;配列番号16及びプライマーGS3’5’ggaggatccctcgagttagtttttgtattggaagggct3’;配列番号17を用いてPCRによりGS遺伝子を含むDNA断片を増幅させた。このDNA断片を制限酵素BalI及びBamHIで消化し、pPGKIRESHygrのBalIとBamHI間に挿入し、これをpPGKIRESGSΔpolyAとした図3-6。pCAGIPuroMiyaharaMetalJBiolChem275613618を鋳型としてプライマーpuro5’5’gcttaagatgaccgagtacaagcccacg3’;配列番号18及びプライマーpuro3’5’cccatcgtgatggtcaggcaccgggcttgc3’;配列番号19を用いてPCRによりピューロマイシン耐性遺伝子puro遺伝子を含む塩基配列5’GcttaagATGACCGAGTACAAGCCCACGGTGCGCCTCGCCACCCGCGACGACGTCCCCAGGGCCGTACGCACCCTCGCCGCCGCGTTCGCCGACTACCCCGCCACGCGCCACACCGTCGATCCGGACCGCCACATCGAGCGGGTCACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCTCACGCGCGTCGGGCTCGACATCGGCAAGGTGTGGGTCGCGGACGACGGCGCCGCGGTGGCGGTCTGGACCACGCCGGAGAGCGTCGAAGCGGGGGCGGTGTTCGCCGAGATCGGCCCGCGCATGGCCGAGTTGAGCGGTTCCCGGCTGGCCGCGCAGCAACAGATGGAAGGCCTCCTGGCGCCGCACCGGCCCAAGGAGCCCGCGTGGTTCCTGGCCACCGTCGGCGTCTCGCCCGACCACCAGGGCAAGGGTCTGGGCAGCGCCGTCGTGCTCCCCGGAGTGGAGGCGGCCGAGCGCGCCGGGGTGCCCGCCTTCCTGGAGACCTCCGCGCCCCGCAACCTCCCCTTCTACGAGCGGCTCGGCTTCACCGTCACCGCCGACGTCGAGGTGCCCGAAGGACCGCGCACCTGGTGCATGACCCGCAAGCCCGGTGCCTGAccatcacgatggG3’;配列番号20。5’端から最初に小文字で示された配列cttaagがAflIIサイト、これに続く大文字で示されたATGから始まる配列がピューロマイシン耐性遺伝子puro遺伝子をコードする塩基配列、及び、その次の小文字で示された配列がBstXIサイトである。のDNA断片を増幅させたなお、puro遺伝子に対応するアミノ酸配列は、配列番号21で示されたものである。。このDNA断片を制限酵素AflII及びBstXIで消化し、発現ベクターpEneoのAflIIとBstXI間に挿入し、これをpEpuroとした図3-7。pEpuroを鋳型としてプライマーSV40polyA5’5’caacaagcggccgccctcgagttccctttagtgagggttaatgc3’;配列番号22及びプライマーSV40polyA3’5’cccctgaacctgaaacataaaatg3’;配列番号23を用いてPCRによりSV40後期ポリアデニル化領域を含むDNA断片を増幅させた。このDNA断片を制限酵素NotI及びHpaIで消化し、発現ベクターpEpuroのNotIとHpaI間に挿入し、これをpEpuroXhoIとした図3-8。pPGKIRESGSΔpolyAを制限酵素NotI及びXhoIで消化し、IRESGS領域を含むDNA断片を切り出し、これを発現ベクターpEpuroXhoIのNotIとXhoI間に挿入し、これをpEIRESGSpuroとした図3-9。pEmIRESGSpuroの構築発現ベクターpEIRESGSpuroを鋳型としてプライマーmIRESGS5’5’acacgatgataagcttgccacaacc3’;配列番号24及びプライマーmIRESGS3’5’ctccacgatatccctgccata3’;配列番号25を用いてPCRによりEMCVのIRESからGSにかけての領域を増幅させ、EMCVのIRESの5’側から2番目に位置する開始コドンATGに変異を加えて破壊したDNA断片を増幅させた。発現ベクターpEIRESGSpuroを鋳型として、このDNA断片と上記のプライマーIRES5’を用いてPCRによりIRESからGSにかけての領域を含むDNA断片を増幅させた。このDNA断片を制限酵素NotI及びPstIで消化し、切り出されたDNA断片を、発現ベクターpEIRESGSpuroのNotIとPstI間に挿入し、これをpEmIRESGSpuroとした図4。pEmIRESGSの構築発現ベクターpEneoを鋳型としてプライマーSV40polyA5’25’actaactcgagttccctttagtg3’;配列番号26及びプライマーSV40polyA3’25’aacggatccttatcggattttaccac3’;配列番号27を用いてPCRによりSV40polyA領域を含むDNA断片を増幅させた。このDNA断片を制限酵素XhoI及びBamHIで消化し、pEmIRESGSpuroのXhoIとBamHI間に挿入し、これをpEmIRESGSとした図5。ヒトグルコセレブロシダーゼhGBA発現ベクターの構築ヒト肝臓QuickClonecDNAClontech社を鋳型としてプライマーhGBA5’5’gcaatacgcgtccgccaccatggagttttcaagtccttccagagagg3’;配列番号28及びプライマーhGBA3’5’ggacgcggccgcgagctctcactggcgacgccacaggtagg3’;配列番号29を用いてPCRによりヒトグルコセレブロシダーゼ遺伝子hGBA遺伝子を含むDNA断片を増幅させた。このDNA断片を制限酵素MluI及びNotIで消化し、pEIRESGSpuro、pEmIRESGS及びpEmIRESGSpuroのMluIとNotI間に挿入し、それぞれGBA発現ベクターpEIRESGSpuroを鋳型としてプライマーhEPO5’5’aagacgcgtcgccaccatgggggtgcacgaatgtcctgc3’;配列番号30及びプライマーhEPO3’5’aagagcggccgctcatctgtcccctgtcctgcagg3’;配列番号31を用いてPCRによりhEPO遺伝子を含むDNA断片を増幅させた。このDNA断片を制限酵素MluI及びNotIで消化し、pEIRESGSpuro及びpEmIRESGSpuroのMluIとNotI間に挿入し、それぞれhEPO発現ベクターpEIRESGSpuro、pEmIRESGS及びpEmIRESGSpuro、pEmIRESGSpuro及びpEmIRESGSpuroに記載された方法を参考にして実施した。リン酸4メチルウンベリフェリル4MUF、SigmaChemicalCo製を希釈用緩衝液0125ナトリウム-タウロコレート、015TritonX100、01ウシ血清アルブミンを含む100mMリン酸カリウム緩衝液pH596に溶解した後、段階希釈して、2001005025125625及び3125mM濃度の標準溶液を作製した。4メチルウンベリフェリルβDグルコピラノシドSigmaChemicalCo製を、4mMの濃度となるように希釈用緩衝液に溶解し、これを基質溶液とした。検体は、必要に応じて、測定前に希釈用緩衝液を用いて希釈した。フルオロプレートF96に、4MUF標準溶液又は検体を10μLずつ加えた後、基質溶液を70μL加えて混合した。37°Cで1時間反応させた後、反応停止液として、50mMグリシンNaOH緩衝液pH106を200μLずつ各ウェルに加えた後、フルオロプレートリーダーを用いて、励起波長355nm、検出波長460nmの条件にて蛍光強度を測定した。4MUF標準溶液の蛍光強度から検量線を描き、各検体の蛍光強度を検量線に内挿して、活性nmolhmLを算出した。ELISA法によるhEPOの定量組換え体hEPOを用いて免疫したウサギの血液から、常法によりウサギ抗hEPO抗体溶液を得た。なお、組換え体hEPOは、国際公開公報に記載された方法を参考にして作成した。ウサギ抗hEPO抗体溶液を96ウェルプレートに100μLずつ加え、4°Cで1時間静置して抗体をプレートに固定させた。液を捨てた後、0075Tween20を含む1BSA/TBS-T液Tris:0005M、NaCl:0138M、KCl:00027M、pH80をプレートに100μLずつ加え、4°Cで1時間静置してプレートをブロッキングした。液を捨て、プレートを0075Tween20を含むTBS-T液で3回洗浄した後、適当な濃度に希釈した検体をプレートに100μLずつ加え、37°Cで1時間静置した。このとき、ローリーLowry法により定量した自家製造のhEPOを希釈して1~16ng/mLの濃度としたものを標準溶液として、検体と同様にプレートに加えて静置した。液を捨て、プレートを前記と同様にして洗浄後、HRP標識したマウス抗hEPOモノクロナール抗体RD社製を2次抗体としてプレートに100μLずつ加え、37°Cで1時間静置した。プレートを前記と同様にして洗浄後、HRP基質プロメガ社を加え、37°Cで15分間静置した後、塩酸を加えて反応を停止した。マイクロウエルプレートリーダーで450nmにおける吸光度を測定して、標準溶液の吸光度との比較から検体中のhEPO濃度を求めた。結果上記のとおり、遺伝子発現制御部位として伸長因子1αプロモーターEF1p、蛋白質をコードする遺伝子としてヒトグルコセレブロシダーゼhGBA遺伝子、内部リボソーム結合部位として配列番号4に示す塩基配列を含む変異型マウス脳心筋炎ウイルス由来の内部リボソーム結合部位EMCVmIRES、及びグルタミン合成酵素をコードする遺伝子GS遺伝子をこの順で組み込んだ発現ベクターであるpEmIRESGSGBAを導入したCHO細胞を、選択培地で培養して、培地中のhGBAの活性を測定するとともに、細胞密度を測定した。実験は独立して4回バルク1~4行った。細胞密度は、4回とも培養7日目にはほぼ25×106個mLに達した図6-1。一方、培地中のhGBA活性は、バルク2では培養10日目に30μmolhmLに達し図6-2、pEmIRESGSGBAを用いてCHO細胞を形質転換することにより、hGBAを高レベルで発現する細胞が得られることがわかった。但し、バルク1及び3では、培地中のhGBAの活性は極めて低く、pEmIRESGSGBAを用いた場合、選択培地で培養後の細胞に、hGBAの発現量の低い細胞がかなりの割合で含まれることが示唆された。次いで、遺伝子発現制御部位としてEF1p、蛋白質をコードする遺伝子としてhGBA遺伝子、内部リボソーム結合部位として配列番号1に示す塩基配列を含む野生型マウス脳心筋炎ウイルス由来の内部リボソーム結合部位EMCVIRES、及びGS遺伝子をこの順で組み込み、更に薬剤耐性遺伝子としてピューロマイシン耐性遺伝子puro遺伝子を組み込んだ発現ベクターであるpEIRESGSpuroGBAを導入したCHO細胞を、選択培地で培養して、培地中のhGBAの活性を測定するとともに、細胞密度を測定した。実験は独立して3回バルク1~3行った。細胞密度は、3回とも培養7日目にはほぼ3~4×106個mLに達し、特にバルク3では、4×106個mLを超えていた図7-1右側。一方、培地中のhGBA活性は、3回とも培養10日目に5~10μmolhmLに達し図7-2右側、pEIRESGSpuroGBAを用いてCHO細胞を形質転換することにより、hGBAを高レベルで発現する細胞が得られることがわかった。次いで、遺伝子発現制御部位としてEF1p、蛋白質をコードする遺伝子としてhGBA遺伝子、内部リボソーム結合部位としてEMCVmIRES、及びGS遺伝子をこの順で組み込み、更に薬剤耐性遺伝子としてpuro遺伝子を組み込んだ発現ベクターであるpEmIRESGSpuroGBAを導入したCHO細胞を、選択培地で培養して、培地中のhGBAの活性を測定するとともに、細胞密度を測定した。実験は独立して3回バルク1~3行った。細胞密度は、3回とも培養7日目にはほぼ2~3×106個mLに達した図7-1左側。一方、培地中のhGBA活性は、3回とも培養10日目に15~25μmolhmLに達し図7-2左側、その発現量は、pEIRESGSpuroGBAを用いて形質転換させたCHO細胞のhGBAの発現量と比較しても顕著に高く、pEmIRESGSpuroGBAを用いてCHO細胞を形質転換することにより、hGBAを極めて高レベルで発現する細胞が得られることがわかった。特にバルク3では、培養12日目にhGBAの活性が35μmolhmLを超え、極めて高レベルのhGBAの発現を示した。次いで、遺伝子発現制御部位としてEF1p、蛋白質をコードする遺伝子としてヒトエリスロポエチン遺伝子hEPO遺伝子、内部リボソーム結合部位としてEMCVIRES、及びGS遺伝子をこの順で組み込み、更に薬剤耐性遺伝子としてpuro遺伝子を組み込んだ発現ベクターであるpEIRESGSpuroEPOを導入したCHO細胞を、選択培地で培養して、培地中のhEPOの濃度を測定するとともに、細胞密度を測定した。実験は独立して2回バルク1~2行った。細胞密度は、2回とも培養7日目にはほぼ2~3×106個mLに達した図8-1右側。一方、培地中のhEPO濃度は、培養7日目にhEPOの活性が8~18μgmLに達し図8-2右側、pEIRESGSpuroEPOを用いてCHO細胞を形質転換することにより、hEPOを高レベルで発現する細胞が得られることがわかった。次いで、遺伝子発現制御部位としてEF1p、蛋白質をコードする遺伝子としてhEPO遺伝子、内部リボソーム結合部位としてEMCVmIRES、及びGS遺伝子をこの順で組み込み、更に薬剤耐性遺伝子としてpuro遺伝子を組み込んだ発現ベクターであるpEmIRESGSpuroEPOを導入した哺乳動物細胞を、選択培地で培養して、培地中のhEPOの濃度を測定するとともに、細胞密度を測定した。実験は独立して2回バルク1~2行った。細胞密度は、2回とも培養7日目にはほぼ25~3×106個mLに達した図8-1左側。一方、培地中のhGBA濃度は、2回とも培養7日目にhEPOの活性が約63μgmLに達し図8-2左側、その発現量は、pEIRESGSpuroEPOを用いて形質転換させたCHO細胞のhGBAの発現量と比較しても顕著に高く、pEmIRESGSpuroEPOを用いてCHO細胞を形質転換することにより、hEPOを極めて高レベルで発現する細胞を得られることがわかった。これらの結果は、遺伝子発現制御部位の下流に、所望の蛋白質をコードする遺伝子、及び配列番号1又は4の塩基配列を有する内部リボソーム結合部位、及びグルタミン合成酵素をこの順で組み込んだ発現ベクター、又は遺伝子発現制御部位の下流に、所望の蛋白質をコードする遺伝子、配列番号1又は4の塩基配列を有する内部リボソーム結合部位、グルタミン合成酵素をこの順で組み込み更に薬剤耐性遺伝子を組み込んだ発現ベクターが、これらの蛋白質をコードする遺伝子を、高レベルで発現させることができる発現ベクターであることを示す。特に、伸長因子1αプロモーターの下流に、蛋白質をコードする遺伝子、配列番号4の塩基配列を有する内部リボソーム結合部位及びグルタミン合成酵素をこの順で組み込み、更に薬剤耐性遺伝子としてピューロマイシン耐性遺伝子を組み込んだ発現ベクターが、該蛋白質をコードする該遺伝子を高レベルで発現させることができる発現ベクターであることを示す。"