アミノ酸配列F1およびF2を含む融合タンパク質であって、F1は第1のfHbpアミノ酸配列のN末端断片であり;F2は第2のfHbpアミノ酸配列のC末端断片であり;前記第1および第2のfHbpアミノ酸配列は異なるfHbpファミリー由来であり、断片F1とF2は両方とも少なくとも長さが10アミノ酸であり、両fHbpファミリーに対する抗体を誘発することができる前記融合タンパク質。H因子結合を阻止する少なくとも1つの突然変異を有する、請求項1に記載の融合タンパク質。H因子結合を阻止する突然変異がfhbpファミリーAのGlu217;ファミリーAのGluThr238;fhbpファミリーBのGlu218;およびfhbpファミリーBのGlu239のいずれかの1以上を置換するステップを含むものである、請求項2に記載の融合タンパク質。置換は前記アミノ酸をアラニンで置換えることである、請求項3に記載の融合タンパク質。前記融合タンパク質がfHbpファミリーBからのN末端F1断片およびfHbpファミリーAからのC末端F2断片を含むものである、先行する請求項のいずれか1項に記載の融合タンパク質。融合タンパク質のファミリーB部分がGly121とLys122の両方を含む、請求項5に記載の融合タンパク質。融合タンパク質のファミリーA部分が次のアミノ酸:Ala173;Ser215、Lys179およびGlu191の1以上または全てを含むものである、先行する請求項のいずれか1項に記載の融合タンパク質。ファミリーBfHbpタンパク質の残基1~残基135、または残基1~残基136、または残基1~残基137、または残基1~残基138、または残基1~残基139ファミリーBfHbpタンパク質の残基1~135~139を含むF1配列、ならびにファミリーAfHbpタンパク質の残基136~残基254、または残基137~残基254、または残基138~残基254、または残基139~残基254、または残基140~残基254ファミリーAfHbpタンパク質の残基136~140~254を含むF2配列を含むものである融合タンパク質であって、前記融合タンパク質はファミリーAfHbpタンパク質の残基136~140~254からの10以上の隣接アミノ酸残基と融合したファミリーBfHbpタンパク質の残基1~135139からの10以上の隣接アミノ酸残基を有するか、またはかかる融合タンパク質と少なくとも80配列同一性を有するタンパク質である、請求項5~7のいずれか1項に記載の融合タンパク質。F1ファミリーB配列が以下のMC58配列配列番号7:の一部分、または前記配列と80以上の同一性を有するポリペプチドである、先行する請求項のいずれか1項に記載の融合タンパク質。F2ファミリーA配列が以下の菌株8047配列配列番号9:の一部分、または前記配列と80以上の同一性を有するポリペプチドである、先行する請求項のいずれか1項に記載の融合タンパク質。本明細書に開示した融合タンパク質A配列番号20、B配列番号22、C配列番号24、D、E配列番号26またはFの配列を有する融合タンパク質。先行する請求項のいずれか1項に記載の融合タンパク質を含むものである単離された外膜小胞OMV。融合タンパク質が脂質化されている、請求項12に記載の単離されたOMV。先行する請求項のいずれか1項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。請求項1~11のいずれか1項に記載の融合タンパク質、または請求項14に記載のポリヌクレオチド、または請求項12もしくは13に記載の単離された外膜小胞、ならびに製薬上許容される賦形剤を含むものである医薬組成物。請求項1~11のいずれか1項に記載の融合タンパク質、または請求項14に記載のポリヌクレオチド、または請求項12もしくは13に記載の単離された外膜小胞、および製薬上許容される賦形剤を含むものである、好適にはナイセリア菌感染もしくは疾患の治療もしくは予防のためのワクチン。請求項16に記載のワクチンの保護用量をそれを必要とする宿主に投与するステップを含むものであるナイセリア菌感染もしくは疾患の治療もしくは予防の方法。ナイセリア菌感染もしくは疾患の治療もしくは予防のための、請求項1~11のいずれか1項に記載の融合タンパク質、または請求項14に記載のポリヌクレオチド、または請求項12もしくは13に記載の単離された外膜小胞。ナイセリア菌感染もしくは疾患の治療もしくは予防のための医薬品の製造における、請求項1~11のいずれか1項に記載の融合タンパク質、または請求項14に記載のポリヌクレオチド、または請求項12~13に記載の単離された外膜小胞の使用。ナイセリア菌が髄膜炎菌である、請求項17~19のいずれか1項に記載の方法、融合タンパク質または使用。請求項14のポリヌクレオチドの細胞またはinvivo系における発現を含むものである、請求項1~11、18または20のいずれか1項に記載の融合タンパク質の製造方法。融合タンパク質を外膜小胞において発現するステップを含むものである、請求項1~11、18または20のいずれか1項に記載の融合タンパク質の製造方法。外膜小胞を0~05界面活性剤、任意にデオキシコール酸のDOCを用いて抽出する、請求項22に記載の製造方法。融合タンパク質を髄膜炎菌L2免疫型に対する抗体を誘発できる第2の抗原と組み合わせるまたは製剤するものであって、第2の抗原は任意にL2LOS、TdfI、Hap、HsfおよびTdfHから選択されるかまたは2以上の前記抗原、例えば、L2LOSとTdfI、L2LOSとHap、L2LOSとHsf、TdfIとHap、TdfIとHsf、HapとHsf、TdfIとHapとHsf、L2LOSとTdfIとHap、L2LOSとTdfIとHsf、およびL2LOSとHapとHsfの組み合わせからなる群より選択される、請求項1~23のいずれか1項に記載の融合タンパク質、OMV、組成、ワクチン、方法または使用。前記融合タンパク質および第2の抗原がナイセリア菌感染または疾患の治療または予防用、例えば、髄膜炎菌L2免疫型感染および疾患の治療または予防用である、請求項24に記載の融合タンパク質、OMV、組成、ワクチン、方法または使用。前記第2の抗原が髄膜炎菌L2菌株でない菌株由来である、請求項24または25に記載の融合タンパク質、OMV、組成、ワクチン、方法または使用。融合タンパク質をST269クローン複合体に対する抗体を誘発できる第2の抗原と組み合わせるまたは製剤するものであって、第2の抗原は任意にTdfI、Hap、HsfおよびTdfHから選択されるかまたは2以上の前記抗原、例えば、TdfIとHap、TdfIとHsf、HapとHsf、TdfIとHapとHsfの組み合わせからなる群より選択される、請求項1~26のいずれか1項に記載の融合タンパク質、OMV、組成、ワクチン、方法または使用。融合タンパク質および第2の抗原は髄膜炎菌感染または疾患の治療または予防用、例えば、髄膜炎菌ST269クローン複合体感染または疾患の治療または予防用である、請求項27に記載の融合タンパク質、OMV、組成、ワクチン、方法または使用。前記第2の抗原が髄膜炎菌ST269菌株でない菌株由来である、請求項27または28に記載の融合タンパク質、OMV、組成、ワクチン、方法または使用。融合タンパク質をST11クローン複合体に対する抗体を誘発できる第2の抗原と組み合わせるまたは製剤するものであって、第2の抗原は任意にL2LOS、TdfI、Hap、HsfおよびTdfHから選択されるかまたは2以上の前記抗原、例えば、L2LOSとTdfI、L2LOSとHap、L2LOSとHsf、TdfIとHap、TdfIとHsf、HapとHsf、TdfIとHapとHsf、L2LOSとTdfIとHap、L2LOSとTdfIとHsf、およびL2LOSとHapとHsfの組み合わせからなる群より選択される、請求項1~29のいずれか1項に記載の融合タンパク質、OMV、組成、ワクチン、方法または使用。前記融合タンパク質および第2の抗原は髄膜炎菌感染または疾患の治療または予防用、例えば、髄膜炎菌ST11クローン複合体感染または疾患の治療または予防用である、請求項30に記載の融合タンパク質、OMV、組成、ワクチン、方法または使用。前記第2の抗原が髄膜炎菌ST11菌株でない菌株由来である、請求項30または31に記載の融合タンパク質、OMV、組成、ワクチン、方法または使用。前記融合タンパク質をNadAと組み合わせるまたは製剤する、請求項1~32のいずれか1項に記載の融合タンパク質、OMV、組成、ワクチン、方法または使用。前記融合タンパク質をLipo28と組み合わせるまたは製剤する、請求項1~33のいずれか1項に記載の融合タンパク質、OMV、組成、ワクチン、方法または使用。本発明は、キメラfHbpタンパク質および前記タンパク質を含む組成物を提供する。本発明はアミノ酸配列F1およびF2を含む融合タンパク質であって、F1は第1のfHbpアミノ酸配列のN末端断片であり;F2は第2のfHbpアミノ酸配列のC末端断片であり;前記第1と第2のfHbpアミノ酸配列は異なるfHbpファミリー由来であり、F1とF2は両方とも長さが少なくとも10個のアミノ酸であり;かつ両方のfHbpファミリーに対する抗体を誘発することができるものである、前記融合タンパク質に関する。他の態様において、本発明は本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。さらなる態様において、本発明は本発明のポリ核酸を含有する組換え宿主細胞に関する。さらなる態様において、本発明は本明細書に開示した融合タンパク質を含む単離された外膜小胞に関する。他の態様において、本発明は本明細書に開示した融合タンパク質を外膜小胞に発現させるステップを含むものである、融合タンパク質を製造する方法に関する。他の態様において、本発明は融合タンパク質を製造する方法であって、本発明のポリ核酸を含有する組換え宿主細胞をキメラfHbpの発現に好適な条件下で培養するステップ;およびそのキメラfHbpを単離するステップを含むものである、前記方法に関する。他の態様において、本発明は本発明の融合タンパク質および製薬上許容される賦形剤を含むものである医薬組成物に関する。他の態様において、本発明は本発明の融合タンパク質および製薬上許容される賦形剤を含むものであるワクチンに関する。他の態様において、本発明は髄膜炎菌感染または疾患を治療または予防する方法であって、それを必要とする宿主に本発明のワクチンの保護用量を投与するステップを含むものである前記方法に関する。他の態様において、本発明は髄膜炎菌感染または疾患を治療または予防するための本発明の融合タンパク質、および髄膜炎菌感染または疾患を治療または予防するための医薬の製造における本発明の融合タンパク質の使用に関する。配列識別子次の配列識別子が配列表に含まれ、本明細書全体で記載される:配列番号1ファミリーBfHbpタンパク質の成熟配列のアミノ酸残基1~137。配列番号2ファミリーAfHbpタンパク質の成熟配列のアミノ酸残基136~254。配列番号3領域113~135にわたるファミリーA由来のコンセンサス配列配列番号4領域113~135にわたるファミリーB由来のコンセンサス配列配列番号5ファミリーAを示す位置242~246内のアミノ酸配列番号6ファミリーBを示す位置242~246内のアミノ酸配列番号7菌株MC58由来の成熟ファミリーBfHbp配列配列番号8菌株MC58由来の成熟ファミリーBfHbp配列に対する核酸配列配列番号9菌株8047由来の成熟ファミリーAfHbp配列配列番号10菌株8047由来の成熟ファミリーAfHbp配列に対する核酸配列配列番号11全長ファミリーBfHbp配列のアミノ酸66~72配列番号12ヒスチジンアフィニティタグの配列配列番号13ファミリーAとBにおいて同一であるペプチドGEHTファミリーAの8047とファミリーB成熟配列のMC58におけるaa残基136~139配列番号14ヒスチジンタグをもつ菌株8047由来の全長fHbp配列のアミノ酸27~273LVL489配列番号15LVL489に対する核酸配列配列番号16ヒスチジンタグをもつ菌株MC58由来の全長fHbp配列のアミノ酸73~320LVL490配列番号17LVL490に対する核酸配列配列番号18融合タンパク質LVL491のアミノ酸配列配列番号19LVL491に対する核酸配列配列番号20融合タンパク質ALVL511のアミノ酸配列配列番号21融合タンパク質Aに対する核酸配列配列番号22融合タンパク質BLVL512のアミノ酸配列配列番号23融合タンパク質Bに対する核酸配列配列番号24融合タンパク質CLVL513のアミノ酸配列配列番号25融合タンパク質Cに対する核酸配列配列番号26融合タンパク質ELVL514のアミノ酸配列配列番号27融合タンパク質Eに対する核酸配列詳細な説明本発明は一般にキメラfHbpタンパク質に関する。用語キメラfHbpタンパク質およびfHbp融合タンパク質は本明細書において互換的に使用され、本明細書で開示した色々なfHbpファミリー由来の領域を含むタンパク質を言及することができる。本発明はfHbpタンパク質AおよびBの2つのファミリーを特定し、髄膜炎菌感染または疾患に対して保護を与える2つのファミリー由来の配列をもつキメラfHbp融合タンパク質の構築を可能にする。第1の態様において、本発明は、アミノ酸配列F1およびF2を含む融合タンパク質であって、F1は第1のfHbpアミノ酸配列のN末端断片でありかつF2は第2のfHbpアミノ酸配列のC末端断片である前記融合タンパク質に関する。一態様において、この融合タンパク質はfHbpファミリーB由来のF1N末端断片およびfHbpファミリーA由来のF2C末端断片を含む。F1断片はfHbpのN末端部分由来のいずれか10個の隣接アミノ酸好適にはfHbpの残基1~139由来であって、疑義を避けるために言えば、必ずしもfHbpのアミノ酸1~10を含まないを含有しうる。同様に、F2断片はfHbpのC末端部分由来のいずれか10個の隣接アミノ酸好適にはfHbpの残基139から出発するものであって、疑義を避けるために言えば、必ずしもfHbpの最後の10アミノ酸を含まないを含有しうる。一態様において、F1とF2は長さが少なくとも10アミノ酸であるが、好適には20アミノ酸、好適には30アミノ酸、好適には40アミノ酸、好適には50アミノ酸、好適には60アミノ酸、好適には70アミノ酸、好適には80アミノ酸、好適には90アミノ酸、好適には100アミノ酸、好適には110アミノ酸、好適には120アミノ酸を含むものであり、好適にはfHbpタンパク質のアミノ酸配列から、連続して取ったものである。一態様において、第1と第2のfHbpファミリー配列の間のアラインメントを考えた場合、F1とF2断片は重複する配列を含まない。一態様において、融合タンパク質F1F2は少なくとも200アミノ酸、好適には少なくとも210、少なくとも220、少なくとも230、少なくとも240、少なくとも250アミノ酸の組み合わせた長さを有し、一態様においては、254アミノ酸の全長FHBPタンパク質である。本発明のいずれかの融合タンパク質の2つの部分、F1とF2は直接連結されている必要はなく、F1とF2の間にリンカーを含んでもよい。しかし、一態様において、F1とF2は直接連結されている。場合によっては、融合タンパク質は付加、置換または欠失を有してもよい。一態様において、配列のF1とF2部分の両方が免疫原性のエピトープを含む。一態様において、配列のF1とF2部分はファミリーAとファミリーBfHbpタンパク質に対する抗体を作製するのに好適なエピトープを含有する。F1とF2は、好適には天然のfHBP配列から、好適にはナイセリア菌から、好適には髄膜炎菌から選択された断片である。一態様において、N末端断片はfHbpファミリーBタンパク質の成熟配列の140個のN末端アミノ酸、好適にはfHbpタンパク質の成熟配列のN末端の135、136、137、138または139個のアミノ酸の全てまたは部分と同一、また部分であってもよい。ファミリーB菌株のアミノ酸番号付けは一般に、下記のMC58を参照して与えられる。他のファミリーメンバーにおける同等の位置はこの配列とのアラインメントにより容易に特定することができる。ファミリーBfHbpタンパク質の成熟配列のアミノ酸残基1~137は全長ファミリーBfHbp配列のアミノ酸残基66~202を表す。好適な断片はファミリーBfHbpタンパク質の成熟配列のアミノ酸残基、1~135、1~136、1~137、1~138および1~139、8~135、8~136、8~137、8~138または8~139である。成熟配列の残基1~137は次の配列番号1に示したファミリーBの菌株MC58またはファミリーBの他の菌株の同等領域により表される。配列番号1CSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGE一態様においては、F1N末端断片の成熟配列の第1の7個のアミノ酸の1個以上をヒスチジンタグ、または他のアフィニティタグにより置き換えて精製を促進する。さらなる態様においては、ヒスチジンタグ、または他のアフィニティタグを成熟タンパク質のN末端に加えて精製を促進する。一態様においては、C末端断片はファミリーAfHbpタンパク質の成熟fHbp配列のアミノ酸130~254、好適には、成熟配列のアミノ酸136~254、137~254、138~254、139~254または140~254と同等、またはその部分である。ファミリーA菌株のアミノ酸番号付けは一般に、ファミリー8047配列を参照して与えられる。他のファミリーメンバーにおける同等の位置はこの配列とのアラインメントにより容易に特定することができる。ファミリーAfHbpタンパク質の成熟配列のアミノ酸残基136~254は全長ファミリーAfHbp配列のアミノ酸残基155~273を表す。いくつかの好適な断片はファミリーAfHbpタンパク質の成熟配列のアミノ酸残基136~254、137254、138~254、139~254または140~254である。成熟配列の残基136~254は、次の配列番号2に示したファミリーAの菌株8047またはファミリーAの他の菌株の同等領域により表される。配列番号2GEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQアミノ酸残基GEHT配列番号13はファミリーAとBファミリーAの8047とファミリーBのMC58におけるaa残基136~139の間で保存されていて、それ故に両方のファミリーからのアミノ酸配列に含まれうる。本発明の融合タンパク質はまた、かかる融合タンパク質との少なくとも80、好適には少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、またはそれ以上の配列同一性およびfHbpAおよびB菌株に対する免疫原性を有するタンパク質であってもよい。本明細書ではfHbpタンパク質を2つのファミリー、AとBに規定する。一態様において、ファミリー分類はSequenceDiversityoftheFactorHBindingProteinVaccineCandidateinEpidemiologicallyRelevantStrainsofSerogroupBNeisseriameningitides血清群B髄膜炎菌の疫学的関連菌株におけるH因子結合タンパク質ワクチン候補の配列多様性theJournalofinfectiousdiseases2009vol200no3pp379389に開示されている。一態様においては、ファミリー同一性を成熟配列の領域136~254にわたって評価する。一態様において、同じファミリーのタンパク質は、成熟タンパク質のアミノ酸136から始まりC末端に至るfHbpの配列に基づいて>80同一性を有する。一態様において、異なるファミリーのタンパク質は、成熟タンパク質のアミノ酸136から始まりC末端に至るfHbpの配列に基づいて50~75同一性を有する。一態様においては、ファミリー同一性は成熟配列の領域113~135にわたって評価する。一態様において、同じファミリーのタンパク質はfHbpの成熟アミノ酸配列の領域113~135に基づいて>69同一性を有する。一態様において、異なるファミリーのタンパク質は、fHbpの成熟アミノ酸配列の領域113~135に基づいて<20同一性を有する。一態様において、ファミリーAとBは1以上の次のアミノ酸の存在により識別することができる。一態様において、ファミリーAとBは領域113~135からの次のコンセンサス配列を含む:A:KINNPDKDSLINRSFLVSGLG配列番号3B:QQDESMVAKRFIGDI配列番号4ファミリーB配列の一例配列番号7は菌株MC58である:この配列内で潜在的に重要な配列として特定したアミノ酸には次が含まれる:Gly121およびLys122:MAbJAR3と5の結合にとって必須である残基。ペプチドGlu146→Arg149およびArg204:MAb502の結合にとって必須である残基。残基Pro145、Phe227、Gly228、Lys230およびGlu233:MAb502認識に潜在的に小さい役割を果たしうる。Glu218およびGlu239:H因子結合に関わる。対応する核酸配列配列番号8ファミリーBの他の種の例には、菌株H4476、M982、M060240006、03s0408が含まれ、そして他の例は当業者に周知であろう。ファミリーA配列配列番号9の一例は菌株8047である:この配列内で潜在的に重要な配列として特定されたアミノ酸には次が含まれる:Ala173:MAbJAR11の結合にとって必須である残基Lys179およびGlu191:MAbJAR10の結合にとって必須である残基Ser215:MAbJAR13の結合にとって必須である残基Glu217およびGlu238:H因子結合に関わる。註:いくつかの菌株において、第2のグルタミン酸はThr238により置き換えることができる菌株8047の例。これらの菌株はまたH因子と結合することができる。対応する核酸配列配列番号10:ファミリーAの他の種の例には、菌株M1239、M981、M08240117、M97252153が含まれ、その他の例は当業者に周知でありうる。融合タンパク質は好適には、本明細書に記載の両方のファミリーメンバーに対する抗体を誘発することができる。一態様において、融合タンパク質は、好適には、ファミリーAまたはファミリーBfHbp分子を発現する髄膜炎菌による感染に応答して、中和化抗体を誘発することができる。好適にはこのキメラタンパク質は、有効用量を投与すると、ナイセリア菌感染に対する保護免疫応答、より好適には、髄膜炎菌血清群B感染に対する保護を誘発する。一態様において、この融合タンパク質はナイセリア菌全長fHbpタンパク質に対して作製される抗体、または哺乳動物宿主のナイセリア菌による感染により作製される抗体について免疫学的に反応性がある。一態様において、キメラタンパク質はfHbpAまたはfHbpBのいずれかを発現する菌株の補体死滅に介在する細菌抗体の生産を誘発することができる。一態様において、本発明の融合タンパク質はH因子結合を阻止する突然変異を少なくとも1つ有する。一態様において、その突然変異は欠失、挿入または置換である。H因子結合は、例えば、表面ELISAまたは共鳴により試験したヒトH因子結合であってもよいMCSchneideretal2009NeisseriameningitidisrecruitsfactorHusingproteinmimicryofhostcarbohydrates髄膜炎菌は宿主糖類のタンパク質模倣を利用してH因子を補充するNatureLettersを参照。一態様において、H因子結合を阻止する突然変異はC末端のF2断片fHbpのアミノ酸136~254から内に含有される。一態様において、H因子結合を阻止する突然変異はfHbpにおける少なくとも1つのGluのAlaへの置換を含む。さらなる態様において、H因子結合を阻止する突然変異は、F2断片内に含有される次の残基の1以上の置換fHbp結合を阻止するためを含む:fHbpファミリーAのGlu217、GluThr238;およびfHbpファミリーBのGlu218、Glu239。一態様において、1以上の残基をアラニンに突然変異させる。H因子結合はELISAにより試験することができる。例えば、fHbpポリペプチドキメラまたは非キメラをマイクロプレートにコーティングしてもよい。飽和と洗浄の後に、精製ヒトfHまたは組換えヒトfHをマイクロウエル中でインキュベートすると、ヒトfHに対するウサギ抗体の付加および引き続いてのペルオキシダーゼと結合した抗ウサギIgGとのインキュベーションを介してfHbpとの結合が現れる洗浄後。F1断片がファミリーB由来である一態様において、F1断片は位置121にGlyおよび位置122にLysを含む番号は参照ファミリーB菌株としてMC58菌株に基づく。一態様において、融合タンパク質は抗体JAR3またはJAR5と結合することができる。F2断片がファミリーA由来である一態様において、F2断片は次のアミノ酸:Ala173;Ser215;Lys179およびGlu191の1以上または全てを含み番号は参照ファミリーA菌株として8047菌株に基づく、そして一態様においてはLys179とGlu191の両方を含む。一態様において、融合タンパク質は抗体JAR10、JAR11、JAR13の1以上と結合することができる。F2断片がファミリーA由来である一態様において、融合タンパク質は、天然アミノ酸を置換える次のアミノ酸:Ala217、任意にAla位置238、Glu146、位置146に挿入されたGly、このグルタミンの後にその後の番号は野生型8047配列に対して1だけシフトされる、Gly148、Arg149およびArg204の1以上または全てを含むように構築される番号は参照ファミリーA菌株として8047菌株に基づく。一態様において、融合タンパク質はMAb502と結合することができる。F2断片がファミリーA由来である一態様において、断片はpro145、phe227、gly228、lys230およびglu233の1以上のまたは全てを含んでもよい。一態様において、融合タンパク質はMAb502と結合することができる。以上に述べた抗体は次の文献に言及されており、本明細書にその全てが参照により組み込まれる:PTBeerninkandDMGranoff2008BactericidalantibodyinducedbymeningococcalsrecombinantchimericfactorHbindingproteinvaccines髄膜炎菌組換えキメラH因子結合タンパク質ワクチンにより誘発される殺菌性抗体InfImmvol76p25682575;PTBeerninketal2008FineantigenicspecificityandcooperativebactericidalactivityofmonoclonalantibodiesdirectedatthemeningococcalvaccinecandidateFactorHbindingproteinInfImmvol76p42324240;MScarsellietal2009EpitopemappingofabactericidalmonoclonalantibodyagainstthefactorHbindingproteinofNeisseriameningitidis髄膜炎菌のH因子結合タンパク質に対する殺菌性モノクローナル抗体のエピトープマッピングJMolBiolvol386p97108。一態様において、fHbpにはかかる文献のいずれかにおいて免疫原性に関係があると開示されたアミノ酸が含まれる。一態様において、1以上の上に規定したアミノ酸改変を含む開示のキメラタンパク質は、これらの改変のないキメラタンパク質と比較して、fHbpを発現する菌株に対する殺菌力価の増加を示す。一態様において、本発明の融合タンパク質は成熟ファミリーBfHbpタンパク質由来の残基1~135、1~136、1~137、1~138または1~139および成熟ファミリーAfHbpタンパク質の残基136~254、137~254、138~254、139~254または140~254を含み、そしてH因子と結合することはできない。一態様において、本発明の融合タンパク質は成熟ファミリーBfHbpタンパク質由来の残基8~135、8~136、8~137、8~138または8~139、任意にヒスチジンタグ、および成熟ファミリーAfHbpタンパク質の残基136~254、137~254、138~254、139~254または140~254を含み、そしてH因子と結合することはできない。一態様において、成熟ファミリーBfHbpタンパク質由来の最初の7個のアミノ酸の1個以上が存在せず、そして精製を促進するためにヒスチジンタグまたは他のアフィニティタグにより置換えることができる。かかる場合には、融合タンパク質のファミリーBfHbp部分は成熟配列の残基2、3、4、5、6または7から出発する。一態様において、融合ポリペプチドは、例えば、MC58配列を有するファミリーBfHbpタンパク質由来の残基1~135、残基1~137;または残基1~139、および、例えば、菌株8047の配列を有するファミリーAfHbpタンパク質の残基136~254;138~254;または140~254を含み、融合タンパク質は、天然アミノ酸を置換える次のアミノ酸:Ala217、任意にAla位置238、Glu146、位置146に挿入されたGly、このグルタミンの後にその後の番号は野生型8047配列に対して1だけシフトされる、菌株MC58由来のファミリーB成熟タンパク質配列のGly148、Arg149およびArg204を含むように構築される。これらのアミノ酸は後に例示した構築物Cに見いだされる。一態様において、融合ポリペプチドはさらにPro145、Phe227、Gly228、Lys230およびGlu233の1以上または全てを含む。これらのアミノ酸は後に例示した構築物Eに見いだされる。一態様において、融合タンパク質は本明細書でLVL491配列番号18と記載した融合タンパク質である。一態様において、この融合ポリペプチドは本明細書で開示した融合タンパク質A、B、C、D、EまたはFから、特に融合タンパク質A配列番号20、B配列番号22、C配列番号24、およびE配列番号26から選択される。本発明の融合タンパク質を髄膜炎菌由来の他の抗原と組み合わせて用いることができる。いずれか特定の抗原に対する言及または請求は、前記抗原の全ての欠失、挿入および置換突然変異体、または本明細書に記載の前記抗原の他の特定の変異体、または前記抗原がポリペプチドである場合そのポリペプチドと少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも96、少なくとも97、少なくとも98、少なくとも99同一性を有するポリペプチドを含むものである。いくつかの態様において、この節で記載した抗原またはポリペプチドは免疫原性である。好適な抗原は、アドヘシン、自己輸送体タンパク質、毒素、内在性外膜タンパク質およびFeまたはZn金属イオン獲得タンパク質を含むタンパク質のカテゴリーから選択することができる。一態様において、本発明は少なくともまたは正確に2、3、4、5、6、7、8、9または10種の異なるナイセリア菌抗原を含む免疫原性組成物を提供する。もっとも好適には、これらの抗原は次から選択されるタンパク質の少なくとも2、3、4または5つのグループから選択される:ナイセリア菌アドヘシンFhaB、NspAPilC、Hsf、Hap、MafA、MafB、Omp26、NMB0315、NMB0995、NMB1119およびNadAからなる群より選択される;ナイセリア菌自己輸送体Hsf、Hap、IgAプロテアーゼ、AspA、およびNadAからなる群より選択される;ナイセリア菌毒素FrpA、FrpC、FrpAC、VapD、NMADPRTおよびLPS免疫型L2およびLPS免疫型L3のいずれかまたは両方からなる群より選択される;ナイセリア菌Fe獲得タンパク質TbpA、TbpB、LbpA、LbpB、HpuA、HpuB、Lipo28GNA2132、Sibp、NMB0293、FbpA、Bcp、BfrA、BfrBおよびP2086XthAからなる群より選択されるまたはナイセリア菌Zn獲得タンパク質TdfINMB0964など;ナイセリア菌の膜関連タンパク質、好適には、外膜タンパク質、特に内在性外膜タンパク質PilQ、OMP85、FhaC、NspA、TbpA、LbpA、TspA、TspB、TdfH、PorB、MItA、HpuB、HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpAGNA1946、NMB1124、NMB1162、NMB1220、NMB1313、NMB1953、HtrA、およびPldAOmplAからなる群より選択される。本発明の抗原は全て単離されたものであり、これらが人手により改変されていることを意味する。一態様において、これらはある程度、最も好適には他成分と組み合わせる前の本発明の免疫原性組成物は40、50、60、70、80、90、95または99以上の純度である。タンパク質を本明細書で具体的に述べる場合、それは生来の全長タンパク質へおよびその自然変異体すなわち、ナイセリア菌、好適には、髄膜炎菌株から得られる生来のタンパク質への言及であるが、また、これらの抗原性断片特にサブユニットワクチンの文脈におけるも包含しうる。これらは、タンパク質のアミノ酸配列から、隣接して採取した少なくとも15個のアミノ酸、好適には少なくとも20個のアミノ酸、少なくとも30個のアミノ酸、少なくとも40個のアミノ酸または少なくとも50個のアミノ酸を含有するもしくは含むしばしば具体的に本明細書で記載した断片である。抗原性断片はまた、免疫原性断片であってもよい。さらに想定していることとして、タンパク質およびタンパク質配列への言及は本明細書において、前記タンパク質配列由来の、または前記タンパク質のアミノ酸配列由来の7、10、12、15、20、30、40または50個またはそれ以上の隣接アミノ酸を含む免疫原性断片を包含するポリペプチドを含むものである場合によっては、前記免疫原性断片は、もし必要であれば、タンパク質担体とカップリングしている場合、前記タンパク質もしくは前記タンパク質配列を認識しうる免疫応答を誘発することができる。さらに抗原性断片は、ナイセリア菌全長タンパク質に対して作製される抗体にまたは哺乳動物の宿主のナイセリア菌の感染により作製される抗体と免疫学的反応性のある断片を表す。抗原性断片はまた、有効用量を投与するとナイセリア菌感染に対する保護免疫応答を誘発する断片も含み、さらに好適には、前記断片は髄膜炎菌および/または淋菌感染に対して保護作用があり、最も好適には髄膜炎菌血清群Bの感染に対して保護作用がある。前記抗原性断片にはまた、ナイセリア菌タンパク質の組換え融合タンパク質、またはその断片が含まれる。これらは色々なナイセリア菌タンパク質またはそれらの断片を同じポリペプチドに組み合わせることができる。あるいは、本発明はまた、ナイセリア菌タンパク質またはそれらの断片の個々の融合タンパク質を、異種配列、例えば、T細胞エピトープまたは精製タグの提供体、例えば:pガラクトシダーゼ、グルタチオンSトランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質GFP、エピトープタグ、例えばFLAG、mycタグ、ポリヒスチジン、またはウイルス表面タンパク質、例えばインフルエンザウイルス赤血球凝集素、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、CRM197との融合タンパク質として含むものである。本発明の抗原のNMB参照番号はwwwneisseriaorgから利用し得る配列参照番号を意味する。以上に述べた5つのクラスのタンパク質はWO2004014418本明細書にその全てが参照により組み込まれるに含まれる。1アドヘシン:アドヘシンには、FhaBW09802547、NadAJExpMed1951445;NMB1994、NhhAとしても知られるHsfNMB0992W09931132、HapNMB1985WO9955873、NspAW09629412、MafANMB0652およびMafBNMB0643;NatureBiotech20914921、Omp26NMB0181、NMB0315、NMB0995、NMB1119およびPilCMolMicrobiol199723879892が含まれる。これらはナイセリア菌の宿主細胞表面との結合に関わるタンパク質である。Hsfは自己輸送体タンパク質でもあるアドヘシンの一例である。本発明の免疫原性組成物は、それ故に、Hsfと他の自己輸送体タンパク質との組み合わせを含んでもよく、その場合、Hsfはアドヘシンとしての能力に寄与する。これらのアドヘシンは髄膜炎菌または淋菌または他のナイセリア菌株由来であってもよい。本発明はまた、ナイセリア菌由来の他のアドヘシンも含む。FhaB:この抗原はW09802547に配列番号38ヌクレオチド3083~9025と記載されており、NMB0497も参照されたい。本発明者らは、FhaBが単独で、および特に本発明の他の抗原とともに、抗付着性抗体を誘導するのに有効であることを見出した。全長FhaBを用いてもよいが、本発明者らは特にC末端切断体が、驚くべきことに、少なくとも有効である、好適には、交差菌株効果の点でより有効であることを見出した。かかる末端切断体はまた、有利なことに、クローニングがはるかに容易であることが示されている。本発明のFhaB末端切断体は、典型的にはFhaB分子のN末端の3分の2に対応し、好適にはその新しいC末端は位置1200~1600に、より好適には位置1300~1500に、そして最も好適には位置1430~1440に位置する。具体的な実施形態は1433または1436にC末端を有する。従って、本発明のかかるFhaB末端切断体およびかかる末端切断体を含むワクチンは本発明の独立した態様であり、ならびに本発明の組み合わせ免疫原性組成物の成分である。このN末端も10、20、30、40または50個までのアミノ酸が末端切断されうる。2自己輸送体タンパク質:自己輸送体タンパク質は典型的には、シグナル配列、パッセンジャードメイン、および外膜との付着のためのアンカードメインから構成される。自己輸送体タンパク質の例には、HsfW09931132NMB0992、HMW、HiavanUlsenetalImmnolMedMicrobiol200132;5364、HapNMB1985W09955873;vanUlsenetalImmnolMedMicrobiol2001325364、UspA、UspA2、NadANMB1994ComanduccietalJExpMed2002195;14451454、AspAInfectionandImmunity20027044474461NMB1029、Aida1様タンパク質、SSh2およびTshが含まれる。NadAJExpMed2002195:1445は自己輸送体タンパク質の他の例であるとともにアドヘシンである。本発明の免疫原性組成物はそれ故に、NadAとアドヘシンの組み合わせを含んでもよく、その場合、NadAは自己輸送体タンパク質としての能力に寄与する。これらのタンパク質は、髄膜炎菌または淋菌または他のナイセリア菌株由来であってもよい。本発明はまた、ナイセリア菌由来の他の自己輸送体タンパク質を含む。Hsf:Hsfは自己輸送体タンパク質に共通の構造を有する。例えば、髄膜炎菌株H4476由来のHsfは、アミノ酸1~51からなるシグナル配列、表面に曝されかつ可変領域アミノ酸52~106、121~124、191~210および230~234を含有する成熟タンパク質のアミノ末端の頭部領域アミノ酸52~479、頸部領域アミノ酸480509、疎水性αへリックス領域アミノ酸518~529ならびに4つの膜貫通鎖が外膜に架かるアンカードメインアミノ酸539~591から構成される。全長Hsfを本発明の免疫原性組成物に用いることはできるが、ワクチンのタイプに応じて様々なHsf末端切断体および欠失体を好適に用いることもできる。Hsfをサブユニットワクチンに用いる場合、可溶性パッセンジャードメインの部分;例えば、アミノ酸52~479の完全ドメイン、最も好適にはその保存部分、例えば、特にアミノ酸134~479の有利な配列を用いることができる。Hsfの好適な形態を末端切断してWO0155182に開示されるタンパク質の可変域を欠失させてもよい。好適な変異体はWO0155182に規定された1、2、3、4、または5つの可変域の欠失を含むであろう。前記配列および下記配列は1、3、5、7、10または15個以下のアミノ酸だけ、NまたはC末端のいずれかまたは両方において伸長または末端切断してもよい。Hsfの好適な断片は、従って、好適にはアミノ酸52~473を含有するHsfの全頭部領域を含む。Hsfのさらなる好適な断片にはアミノ酸配列:52~62、76~93、116~134、147~157、157~175、199~211、230~252、252~270、284~306、328~338、362~391、408~418、430~440および469~479の1以上を含む表面が曝された頭部領域が含まれる。Hsfは外膜小胞調製物中に存在する場合、これを全長タンパク質としてまたはアミノ酸1~51と134~591の融合体から構成される変異体アミノ酸配列134~C末端の成熟外膜タンパク質を生じるとして発現させることができる。Hsfの好適な形態を末端切断してWO0155182に開示したタンパク質の可変域を欠失させてもよい。好適な変異体はWO0155182に規定した1、2、3、4、または5つの可変域の欠失を含みうる。一態様においては、第1および第2可変域を欠失させる。好適な変異体はアミノ酸配列52~237または54~237由来の残基を欠失しうるし、さらに好適にはアミノ酸52~133または55~133由来の残基を欠失しうる。成熟タンパク質はシグナルペプチドを欠くであろう。Hap:髄膜炎菌由来のHap様タンパク質のコンピューター分析は少なくとも3つの構造ドメインを示す。菌株H4476由来のHap様配列を参照して考えると、アミノ酸1~42を含むドメイン1は自己輸送体ファミリーの特徴であるsec依存性シグナルペプチドをコードし、アミノ酸43~950を含むドメイン2は表面に曝されて免疫系に接近可能なパッセンジャードメインをコードし、残基951~C末端1457を含むドメイン3は集合してバレル様構造に組み立てられ外膜内に繋ぎ止められると思われるβ鎖をコードすると予想される。ドメイン2は表面に曝され、よく保存され試験した全菌株で80超、かつ大腸菌のサブユニット抗原として生産されうるので、興味深いワクチン候補を代表する。ドメイン2および3は表面に曝され、よく保存されていると思われるのでPizzaetalScience28718161820、これらは興味深いワクチン候補を代表する。ドメイン2はパッセンジャードメインとして公知である。本発明の免疫原性組成物は、好適には、OMV調製物中に結合された全長Hapタンパク質を含んでもよい。本発明の免疫原性組成物はまた、菌株H4476においてアミノ酸残基43~950、または残基43~1178由来のN末端断片から構成されるHapのパッセンジャードメインを含んでもよい。Hapのこの断片は、特に本発明の組成物のサブユニットで有利に使用しうる。Hapのパッセンジャードメインに対する前記配列はNまたはC末端のいずれかまたは両方で1、3、5、7、10、15、20、25、または30個以下のアミノ酸だけ伸長または末端切断することができる。3鉄および亜鉛獲得タンパク質これらのタンパク質には、TdfIDoveJetalMicrobiol2003andTurnerPCetalMicrobiol2001全てを参照に加える、TbpANMB0461W09203467、US5912336、W09306861およびEP586266、TbpBNMB0460W09306861およびEP586266、LbpANMB1540MedMicrobiol321117、LbpBNMB1541WO9909176、HpuAU731122MolMicrobiol199723737749、HpuBNC0031161MolMicrobiol199723737749P2086XthANMB0399としても公知13InternationalPathogenicNeisseriaConference2002、FbpANMB0634、FbpB、BfrANMB1207、BfrBNMB1206、Lipo28GNA2132NMB2132としても公知、SibpNMB1882、HmbR、HemH、BcpNMB0750、鉄ABC輸送体ペルメアーゼタンパク質TettelinetalScience287180918152000、鉄ABC輸送体周辺質TettelinetalScience287180918152000、TonB依存性受容体NMB0964およびNMB0293TettelinetalScience287180918152000およびトランスフェリン結合タンパク質関係タンパク質TettelinetalScience287180918152000が含まれる。これらのタンパク質は髄膜炎菌、淋菌または他のナイセリア菌株から誘導することができる。本発明はまた、ナイセリア菌由来の他の金属イオン獲得タンパク質も含むものである。TbpA:TbpAはTbpBと相互作用してナイセリア菌の外膜上にタンパク質複合体を形成し、これがトランスフェリンと結合する。構造的に、TbpAは、短い細胞内ループおよびより長い細胞外ループにより連結された複数の膜貫通βストランド、TonBボックスおよびプラグドメインと共に、細胞内N末端ドメインを含有する。それぞれ高分子量と低分子量を有するTbpBの2つのファミリーが識別されている。高分子量と低分子量型のTbpBは、相同性に基づいて識別可能であるTbpAの色々なファミリーと結合する。類似分子量であるにも関わらず、これらは、高分子量または低分子量の型のTbpBと結合するので、高分子量および低分子量ファミリーとして知られているRokbietalFEMSMicrobiolLett100;511993。用語TbpA高およびTbpA低を用いてこれらの2つの型のTbpAを表し、またTbpBについても同様に表される。本発明の免疫原性組成物は、髄膜炎菌の血清群A、B、C、YおよびW135由来のTbpAおよびTbpB、ならびに淋菌を含む他の細菌由来の鉄獲得タンパク質を含みうる。トランスフェリン結合タンパク質TbpAおよびTbpBはまた、それぞれTbp1およびTbp2とも呼ばれるCornelissenetalInfectionandImmunity658221997。TbpAはいくつかの異なる領域を含有する。例えば、髄膜炎菌株H4476由来のTbpAの場合、アミノ末端の186個のアミノ酸は内部球状ドメインを形成し、22個のβストランドは膜に架かってβバレル構造を形成する。これらは短い細胞内ループと大きい細胞外ループにより連結されている。細胞外ループ2、3および5は最高の配列可変度を有し、ループ5は表面に曝される。ループ5と4はリガンド結合に関わる。好適なTbpAの断片は、TbpAの細胞外ループを含む。髄膜炎菌株H4476由来のTbpAの配列を用いると、これらのループはアミノ酸200~202がループlに、アミノ酸226~303がループ2に、アミノ酸348~395がループ3に、アミノ酸438~471がループ4に、アミノ酸512~576がループ5に、アミノ酸609~625がループ6に、アミノ酸661~671がループ7に、アミノ酸707~723がループ8に、アミノ酸769~790がループ9に、アミノ酸814~844がループ10に、そしてアミノ酸872~903がループ11に対応する。配列アライメント後の他のTbpタンパク質における対応配列も好適な断片を構成しうる。最も好適な断片にはTbpのループ2、ループ3、ループ4またはループ5を構成するアミノ酸配列が含まれるであろう。本発明の免疫原性組成物がTbpAを含む場合、TbpA高とTbpA低の両方を含むのが好ましい。TbpAは好適には外膜小胞OMVワクチンで提供されるが、サブユニットワクチンの一部分であってもよい。例えば、本発明の免疫原性組成物中に導入しうる単離された鉄獲得タンパク質は当技術分野で周知であるWO0025811。これらを細菌宿主において発現させ、界面活性剤例えば、2Elugentを用いて抽出し、アフィニティクロマトグラフィによりまたは当技術分野で周知の標準クロマトグラフィ技法を用いて精製することができるOakhilletalBiochemJ2002364;6136。TbpAをOMVワクチンで提供する場合、その発現を本明細書で考察した遺伝的技法によりアップレギュレーションしてもよいし、または好適には以下に記載の鉄制限条件下の親菌株の増殖によりアップレギュレーションすることもできる。このプロセスはまた、様々な鉄調節タンパク質、特に免疫優性になりうるFrpBのアップレギュレーションももたらしうる、それ故に、下記のように、かかるタンパク質特にFrpBの発現をダウンレギュレーションおよび、好適にはコードする遺伝子を除去して、本発明の免疫原性組成物が広範囲のナイセリア菌株中に存在する抗原に対する免疫応答を誘発することを確実にすることが有利である。TbpA高とTbpA低の両方が免疫原性組成物中に存在することは可能であり、これは2つの菌株由来のOMVを組み合わせることにより好適に達成される。4毒素:毒素にはFrpANMB0585;NMB1405、FrpAC以下の定義を参照、FrpCNMB1415;NMB1405W09201460、NMADPRTNMB134313thInternationalPathogenicNeisseriaConference2002Masignanietalpl35、VapDNMB1753、リポ多糖LPS;リポオリゴ糖またはLOSとも呼ばれる免疫型L2およびLPS免疫型L3が含まれる。FrpAとFrpCはこれら2種のタンパク質の間で保存される領域を含有し、このタンパク質の好適な断片はこの保存された、好適にはFrpACの配列のアミノ酸227~1004を含む断片を含有するポリペプチドであろう。これらの抗原は髄膜炎菌または淋菌または他のナイセリア菌株由来であってもよい。本発明はまたナイセリア菌由来の他の毒素も含む。代わりの実施形態において、毒素は毒性の調節に関わる抗原、例えば、リポ多糖の合成に機能するOstAを含みうる。FrpAおよびFrpC:髄膜炎菌は鉄制限時に分泌されるFrpAおよびFrpCと呼ばれる2種のRTXタンパク質をコードするThompsonetalJBacteriol175811818ThompsonetalInfectImmun6129062911。RTX反復配列毒素タンパク質ファミリーは一般に、そのC末端近くにコンセンサス:LeuXaaGlyGlyXaaGlyAsnAspAspXaaLXGGXGNDDXによる一連の9個のアミノ酸の反復配列を有する。大腸菌HlyAにおける反復配列はCa2結合の部位であると考えられる。菌株FAM20で特徴付けられた髄膜炎菌のFrpAおよびFrpCタンパク質は、その中央部およびC末端において広範なアミノ酸類似性を共有するが、N末端においてはもし有っても非常に限られた類似性しかない。さらに、FrpAとFrpC間に保存された領域は、9個のアミノ酸モチーフの反復FrpAでは13回そしてFrpCでは43回に因るいくらかの多形性を示す。本発明の免疫原性組成物は全長FrpAおよび/またはFrpCまたは、好適には、FrpAとFrpC間に保存された配列を含む断片を含んでもよい。保存された配列は9個のアミノ酸の反復配列単位から形成される。本発明の免疫原性組成物は好適には、3回を超える反復、10回を超える反復、13回を超える、20回を超える反復または23回を超える反復を含みうる。かかる末端切断体は、かかる抗原を含む全長分子およびワクチンを超える有利な特性を有し、本発明の独立した態様を形成するとともに、本発明の免疫原性組成物に組み込まれる。FrpAとFrpC間で保存された配列はFrpACと記され、FrpAまたはFrpCが本発明の免疫原性組成物の構成要素を形成する場合、FrpACを有利に用いることができる。FrpA配列のアミノ酸277~1004は好適な保存領域である。前記配列はNまたはC末端のいずれかまたは両方において1、3、5、7、10、15、20、25、または30個以下のアミノ酸だけ伸長または末端切断することができる。LPS:LPSリポ多糖、LOSリポオリゴ糖としても知られるはナイセリア菌の外膜上の内毒素である。LPSの多糖部分が細菌性抗体を誘発することは公知である。LPSのオリゴ糖部分内の不均一性は異なるナイセリア菌株間の構造的および抗原的多様性を生じるGriffissetalInfImmun19875517921800。これを用いて髄膜炎菌株は12種の免疫型に区分されているScholtanetalJMedMicrobiol199441236243。免疫型L3、L7、およびL9は免疫学的および構造的に類似しまたは同じですらあり、それ故にL3、7、9または、本明細書の目的に対する属名としてはL3と名付けられる。髄膜炎菌LPSL3、7、9L3、L2およびL5はシアル酸付加により、またはシチジン5モノホスフェートNアセチルノイラミン酸の付加により改変することができる。L2、L4およびL6LPSは免疫学的に区別しうるが、これらは構造的に類似しており、本明細書中でL2に言及する場合、場合によっては、本発明の範囲内で、L4またはL6のいずれかを置換えることができる。LPS構造および不均一性のさらなる説明は、MPJenningsetalMicrobiology199914530133021およびMolMicrobiology200243:93143を参照されたい。LPS好適には髄膜炎菌LPSが本発明のワクチンに含まれる場合、好適にはかつ有利には、免疫型L2とL3のいずれかまたは両方が存在する。LPSは好適には外膜小胞OMV:本明細書では用語ブレブおよび外膜小胞を互換的に用いるに提示される好適にはその場合、小胞は低パーセント、より好適には0~05、002~04、004~03、006~02、008~015または01の界面活性剤、最も好適にはオキシコール酸DOCで抽出される、しかしまた、サブユニットワクチンの一部であってもよい。LPSは当技術分野で周知の手順を用いて単離することができ、それには、熱水フェノール操作WesphalandJannMethCarboChem583911965が含まれる。また、Galanosetal1969EurJBiochem9245249、およびWuetal1987AnalBioChem160281289も参照されたい。LPSはそのままでまたはT細胞エピトープの供給源、例えば、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、CRM197またはOMV外膜タンパク質と結合して用いてもよい。単離されたLOSを結合する技法も公知である例えば、参照により本明細書に組み込まれるEP941738を参照されたい。LOS特に本発明のLOSがブレブ製剤中に存在する場合、LOSを、好適には、insituで、LOSの結合を可能にする方法により、ブレブ調製物上に同様に存在する1以上の外膜タンパク質例えば、髄膜炎菌のPorAまたはPorBと結合する。このプロセスは、ブレブ製剤内においてLOS抗原の安定性および/または免疫原性T細胞ヘルプを提供するおよび/または抗原性を増進し、従って髄膜炎菌外膜の表面上の自然環境におけるLOSのようにその最も保護的なコンフォーメーションにおいてT依存性オリゴ糖免疫源に対するT細胞ヘルプを与えうる。さらに、ブレブ内のLOSの結合はLOSの解毒をもたらすことができるリピドA部分が外膜中に安定して埋められ、利用されて毒性を生じることをより少なくする。従って、本明細書で記載した解毒方法、すなわちブレブをhtrBまたはmsbB突然変異体から単離するか、またはポリミキシンB[脂質に高アフィニティである分子]と機能的に同等な無毒ペプチドを組成物に加えることによる解毒方法ポリミキシンBと機能的に同等な無毒ペプチド、特に、ペプチドSAEP22つのシステインがジスルフィド架橋を形成する配列KTKCKFLKKCの使用についてのさらなる詳細はWO9314115、WO9503327、VelucchietalJEndotoxinRes4112、およびEP976402を参照されたいは必要としないであろうしかし、さらなる安全のためにこれを組み合わせて加えてもよい。従って、本発明者らが見出したのは、ブレブ中に存在するLOSがブレブ内方式で、同じくブレブ中に存在する外膜タンパク質と結合しているブレブを含む組成物は、ブレブが由来する生物により引き起された疾患の治療または予防のためのワクチンを形成することができ、その場合、かかるワクチンは実質的に無毒でありかつその生来の環境においてLOSに対するT依存性細菌応答を誘導することができるということである。本発明は、それ故に、さらに、ブレブ内LOSが結合した髄膜炎菌ブレブ調製物を提供する。かかるブレブ調製物を、問題の細菌から単離しWO0109350を参照、次いで公知の結合化学で処理してLOSのオリゴ糖部分の基例えば、NH2またはCOOHをブレブ外膜タンパク質の基例えば、NH2またはCOOHと連結することができる。グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、またはグルタルアルデヒド/ホルムアルデヒド混合物を用いる架橋技法を用いることができる、しかし一態様においては、もっと選択的な化学、例えば、EDACまたはEDAC/NHSJVStarosRWWrightandDMSwingleEnhancementbyNhydroxysuccinimideofwatersolublecarbodiimidemediatedcouplingreactionsNヒドロキシスクシンイミドによる水溶性カルボジイミド介在カップリング反応の促進Analyticalchemistry156220222;およびBioconjugatesTechniquesGregTHermansonppl73176を用いる。LOSとタンパク質分子の間を共有結合で連結する他の結合化学または処理で使用しうるものはEP941738に記載されている。一態様においては、ブレブ調製物を莢膜多糖の非存在のもとで結合する。ブレブを天然にまたは下記の突然変異を介して莢膜多糖を生産しない菌株から単離してもよく、またはほとんど、好適には全ての、夾雑する莢膜多糖を除去して精製してもよい。この方法では、ブレブ内のLOS結合反応がはるかに効率的である。一態様においては、ブレブ中に存在するLOSの10、20、30、40、50、60、70、80、90、または95超は架橋/結合している。ブレブ内の結合は、好適には、次のプロセスステップの1、2または全3ステップを組み込むべきである:結合pHはpH70を超えるべきであり、好適にはpH75以上最も好適にはpH9未満で;反応中、1~5、好適には2~4、最も好適にはおよそ3スクロースの条件を維持すべきであり;結合反応においてNaClは最小化し、好適には01M、005M、001M、0005M、0001M、そして最も好適には全く非存在にすべきである。全てのこれらのプロセス特性は、結合プロセスを通して、溶液中でブレブが安定に維持されることを確実にする。EDACNHS結合プロセスはブレブ内の結合用に好適なプロセスである。EDAC/NHSは、過度に高く架橋して濾過性に悪影響を与えがちなホルムアルデヒドにとって好ましい。EDACはカルボン酸例えば、LOSにおけるKDOと反応して活性のあるエステル中間体を作る。アミン求核試薬外膜タンパク質、例えば、PorB中のリシンなどの存在のもとで、アミド結合が形成されてイソ尿素副産物を放出する。しかし、EDACが介在する反応の効率はスルホNHSエステル中間体の形成を通して促進することができる。スルホNElSエステルは水溶液中で、EDAC単独のカルボン酸との反応から形成される活性エステルより長く残存する。従って、この2段プロセスを用いて、より高い収率のアミド結合形成が実現される。EDAC/NHS結合は、JVStarosRWWrightandDMSwingleEnhancementbyNhydroxysuccinimideofwatersolublecarbodiimidemediatedcouplingreactionsNヒドロキシスクシンイミドによる水溶性カルボジイミド介在カップリング反応の促進Analyticalchemistry156220222;およびBioconjugatesTechniquesGregTHermansonppl73176において考察されている。一態様においては、001~5mgEDACmgブレブ、さらに好適には005~1mgEDACmgブレブを用いる。用いるEDACは、サンプル中に存在するLOSの量に依存し、その量は、順に、ブレブを抽出するために用いるデオキシコール酸DOCに依存する。低いDOC例えば、01では高い量のEDAClmgmg以上を用いるが、より高いDOC例えば、05では過度のブレブ間の架橋を避けるために、より低い量のEDAC0025~0lmgmgを用いる。本発明の好ましいプロセスは、それ故に、ブレブ内に結合したLOS好適には髄膜炎菌のを生産するプロセスであって、pH70~pH90好適にはおよそpH75のpHにおいて、1~5好適にはおよそ3スクロース中でEDACNHSの存在のもとで、場合によっては、実質的にNaClを欠く条件において前記の通りブレブを結合するステップ、および結合したブレブを反応混合物から単離するステップを含む前記プロセスである。反応混合物のウェスタン分離ゲル上で抗LOS例えば、抗L2または抗L3mAbを用いて反応を追跡し、反応時間が経るにつれて、ブレブ中の大部分のLOSについてLOS分子量が増加するのを示すことができる。99ブレブの収率をかかる技法を用いて回収することができる。EDACが優れたブレブ内の架橋剤であるとわかったのは、これがLOSをOMPとT依存性免疫原性の改良に十分な程度に架橋するが、濾過性、凝集およびブレブ間架橋が問題になるほど高い程度まで架橋しない点にあった。作製されたブレブの形態は結合していないブレブのそれに類似する電子顕微鏡による。さらに、前記プロトコルは過度に高い架橋が起こるこれはブレブの表面上に自然に存在する保護性OMP、例えば、TbpAまたはHsfの免疫原性を低下しうることを回避した。ブレブが由来する髄膜炎菌株は、莢膜多糖を生産できない突然変異菌株例えば、以下に記載の突然変異菌株、特にsiaDであることが好ましい。また髄膜炎菌性疾患に対して有効な免疫原性組成物は、L2とL3LOSが両方ともブレブ外膜タンパク質と結合しているL2およびL3ブレブを含むことも好ましい。さらに、ブレブ内結合したブレブ内のLOS構造がlgtB髄膜炎菌株由来のものと一致していることが好ましい下記の通り。最も好適には、免疫原性組成物は莢膜多糖を生産できない突然変異体髄膜炎菌株由来でありかつlgtBであるブレブ内結合したブレブであって:莢膜多糖を生産できない突然変異体髄膜炎菌株由来のL2およびL3ブレブを含むか;lgtBである突然変異体髄膜炎菌株由来であるL2およびL3ブレブを含むか;または、最も好適には、莢膜多糖を生産できない突然変異体髄膜炎菌株由来のL2およびL3ブレブを含みかつlgtBである前記ブレブを含むものである。本発明に用いることができる典型的なL3髄膜炎菌株はH4476menB菌株である。典型的なL2菌株はB16B6menB菌株または39EC型髄膜炎菌株である。先に説明したように、本発明のブレブは結合の作用によりある程度解毒されていてさらに解毒する必要はないが、さらなる安全のために、例えば、htrBまたはmsbBである髄膜炎菌株由来のブレブを用いるか、またはポリミキシンB[リピドAに高アフィニティをもつ分子]と機能的に等価の無毒ペプチド好適にはSEAP2をブレブ組成物に加えるさらなる解毒方法先に記載の通りを用いてもよい。以上の方法で、髄膜炎菌性ブレブおよびブレブを含む免疫原性組成物であって、重要な抗原として、実質的に無毒であり、自己免疫問題が無く、T依存性特性を有し、その自然環境に存在し、そしてL2L3組成物の場合に髄膜炎菌株の90超に対する細菌抗体応答を誘発できるLOSを有する前記免疫原性組成物が提供される。一態様において、ブレブ内のLOS結合プロセスは次のステップの1、2または3つ全てを組み込むべきである:結合pHはpH70超、好適にはpH75以上最も好適にはpH9でであり;反応中、1~5、好適には2~4、最も好適にはおよそ3スクロースの条件を維持すべきであり;結合反応においてNaClは最小化、好適には01M、005M、001M、0005M、0001M、そして最も好適には全く非存在にすべきである。全てのこれらのプロセス特性は、結合プロセスを通して、溶液中でブレブが安定に維持されることを確実にする。様々な技法および化学により、LOSをブレブ内で外膜タンパク質に結合させることはできるが、EDACNHS結合プロセスがブレブ内結合用の好ましいプロセスである。EDAC/NHSは、過度に高く架橋して濾過性に悪影響を与えがちなホルムアルデヒドにとって好ましい。EDACはカルボン酸と反応して活性のあるエステル中間体を作る。アミン求核試薬の存在のもとで、アミド結合が形成されてイソ尿素副産物を放出する。しかし、EDACが介在する反応の効率はスルホNHSエステル中間体の形成を通して促進することができる。スルホNElSエステルは水溶液中で、EDAC単独のカルボン酸との反応から形成される活性エステルより長く残存する。従って、この2段プロセスを用いて、より高い収率のアミド結合形成が実現されるEDAC/NHS結合は、JVStarosRWWrightandDMSwingleEnhancementbyNhydroxysuccinimideofwatersolublecarbodiimidemediatedcouplingreactionsNヒドロキシスクシンイミドによる水溶性カルボジイミド介在カップリング反応の促進Analyticalchemistry156220222;およびBioconjugatesTechniquesGregTHermansonppl73176において考察されている。5内在性外膜タンパク質他のカテゴリーのナイセリア菌タンパク質もまた、本発明のナイセリア菌ワクチンに封入するものの候補でありうるのであって、驚くべきほど有効なやり方で他の抗原と組み合わせることができる。膜結合タンパク質、特に内在性膜タンパク質、そして最も有利には、外膜タンパク質、とりわけ内在性外膜タンパク質を本発明の組成物に用いることができる。かかるタンパク質の一例はナイセリア菌ホスホリパーゼ外膜タンパク質である、OmpIANMB0464WOOO15801として公知のPIDAである。さらなる例はTspANMB0341InfectImmun199967;35333541およびTspBT細胞刺激性タンパク質WO0003003;NMB1548NMB1628またはNMB1747である。さらなる例には、PilQNMB1812W09961620、OMP85D15としても知られるNMB0182WO0023593、NspAU52066W09629412、FhaCNMB0496またはNMB1780、PorBNMB2039MolBiolEvol12;3633701995、HpuBNC0031161、TdfHNMB1497Microbiology200114712771290、OstANMB0280、MItAGNA33およびLipo30としても知られるNMB0033、HtrANMB0532;WO9955872、HimDNMB1302、HisDNMB1581、GNA1870NMB1870、HlpANMB1946、NMB1124、NMB1162、NMB1220、NMB1313、NMB1953、HtrA、TbpANMB0461W09203467およびTdfINMB0964先の鉄および亜鉛獲得タンパク質の項も参照およびLbpANMB1541が含まれる。OMP85:本発明の免疫原性組成物は全長OMP85を、好適にはOMV調製物の一部分として、含んでもよい。OMP85の断片も本発明の免疫原性組成物に用いることができ、特に、アミノ酸残基1~475または50~475から成るOMP85の表面が曝されたドメインを本発明の免疫原性組成物のサブユニット成分中に組み込むのが好適である。OMP85の表面が曝されたドメインに対する前記配列は、NまたはC末端のいずれかまたは両方で1、3、5、7、10、15、20、25、または30個以下のアミノ酸だけ伸長または末端切断することができる。OMP85断片からシグナル配列を省くことが好ましい。OstA:OstAはリポt多糖の合成に機能し、そして毒性の調節因子であると考えることができる。あるいは、毒素のカテゴリーが毒性ならびに毒素の調節因子を含むと拡大された場合、OstAは毒素のカテゴリーに含まれうる。他の態様において、本発明は本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。ポリヌクレオチドは一般に、ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを意味し、これらは未改変のRNAまたはDNAまたは改変されたRNAまたはDNAであってもよい。ポリヌクレオチドには、限定されるものでないが、1本鎖および2本鎖のDNA、1本鎖および2本鎖の領域の混合物であるDNA、1本鎖および2本鎖のRNA、1本鎖および2本鎖の領域の混合物であるRNA、1本鎖または、より典型的には、2本鎖であってもよいDNAおよびRNAまたは1本鎖および2本鎖の領域の混合物を含むハイブリッド分子が含まれる。さらに、ポリヌクレオチドはRNAまたはDNAまたはRNAとDNAの両方を含む3本鎖領域を意味する。用語ポリヌクレオチドにはまた、安定性または他の理由のために、1以上の改変された塩基および改変された主鎖をもつDNAまたはRNAが含まれる。改変された塩基には、例えば、トリチル化塩基および異常な塩基、例えばイノシンが含まれる。DNAおよびRNAには色々な改変がなされている:従って、ポリヌクレオチドは、典型的には自然に見出される化学的、酵素的、または代謝的に改変されたポリヌクレオチドの形態、ならびにウイルスおよび細胞に特徴的なDNAおよびRNAの形態を包含する。ポリヌクレオチドはまた、オリゴヌクレオチドと呼ぶことが多い比較的短いポリヌクレオチドも包含する。本発明の他の態様は1以上のポリヌクレオチドを含む免疫学的/ワクチン製剤に関する。かかる技法は当技術分野で公知であり、例えば、WolffetalScience24714658を参照されたい。かかるワクチンは、先に記載した本発明のタンパク質組み合わせに対応する複数のタンパク質をコードする1以上のポリヌクレオチドを含む。かかるポリヌクレオチドからのタンパク質の発現は、哺乳動物細胞内の発現を駆動することができる真核生物プロモーターの制御下にありうる。ポリヌクレオチドはさらに他の抗原をコードする配列を含んでもよい。発現を駆動しうる真核生物プロモーターの例には、アデノウイルスプロモーター、レトロウイルスプロモーターを含むウイルス由来のウイルスプロモーターが含まれる。あるいは、哺乳動物プロモーターを用いて発現を駆動することができる。さらなる態様において、本発明は、本発明のポリ核酸を含有する組換え宿主細胞、ならびに、キメラタンパク質を発現する、かかるタンパク質を単離する、および膜小胞内でタンパク質を生産する方法に関する。好適な方法は当技術分野で周知であり、例えば、本明細書に参照により組み込まれるWO2009114485に開示されている。例えば、一態様において、本発明は融合タンパク質を製造する方法であって、本発明のポリ核酸を含有する組換え宿主細胞をキメラfHBPの発現に好適な条件下で培養するステップ;およびキメラfHBPを単離するステップを含むものである前記方法に関する。さらなる態様において、本発明はブレブまたは外膜小胞において融合タンパク質を発現することに関する。例えば、キメラfHBPは、組換えおよび非組換え法例えば、化学合成を含む好適な方法により生産することができる。キメラfHBPを組換え技法を用いて生産する場合、その方法は、好適な構築物および原核生物または真核細胞であってもよい好適な宿主細胞、通常は細菌または酵母宿主細胞、さらに通常は細菌細胞に関わりうる。遺伝材料を宿主細胞中に導入する方法には、例えば、形質転換、エレクトロポレーション、結合、リン酸カルシウム法などが含まれる。導入する方法は、導入されるキメラfHBPをコードする核酸の安定した発現を得るように選択することができる。キメラfHBPをコードする核酸は遺伝性エピソームエレメント例えば、プラスミドとして提供してもよくまたはゲノムとして組み込んでもよい。キメラfHBPをコードする核酸を伝達する好適なベクターは組成が色々でありうる。組込みベクターは条件的に複製型または自殺プラスミド、バクテリオファージなどであってよい。構築物は様々なエレメントを含みうるのであって、それらのエレメントには例えば、プロモーター、選択可能な遺伝マーカー抗生物質、例えば、カナマイシン、エリスロマイシン、クロラムフェニコールまたはゲンタマイシンに対する耐性を与える遺伝子、複製起点宿主細胞における複製を促進するために、例えば、細菌の宿主細胞などが含まれる。ベクターの選択は様々な因子、例えば、そこで増殖を所望する細胞のタイプおよび増殖の目的に依存しうる。大量の所望のDNA配列を増幅して作るためには、ある特定のベクターが有用である。他のベクターは培養中の細胞における発現に好適である。さらに他のベクターが、全動物の細胞における導入と発現に好適である。適当なベクターの選択は当分野の技術に包含される。多くのかかるベクターが市販されている。一実施形態において、ベクターはエピソームプラスミドに基づく発現ベクターであって、このベクターは選択可能な薬物耐性マーカーと色々な宿主細胞において例えば、大腸菌および髄膜炎菌の両方において自律複製を可能にするエレメントを含有する。かかるシャトルベクターの一例はプラスミドpFPIOであるPagottoetalGene20002441319。構築物は、例えば、目的のポリヌクレオチドを構築物主鎖中に、典型的にはDNAリガーゼ結合により、ベクター中の切断された制限酵素部位に挿入することにより調製することができる。あるいは、所望のヌクレオチド配列を相同組換えまたは部位指定組換えにより挿入することができる。典型的には、相同組換えは、相同性領域を所望のヌクレオチド配列に隣接してベクターに結合することにより実施し、一方、部位指定組換えは、部位指定組換えを促進する配列例えば、crelox、att部位などの使用を通して実施することができる。かかる配列を含有する核酸は、例えば、オリゴヌクレオチドのライゲーションによるか、または相同性領域と所望のヌクレオチド配列の一部分の両方を含むプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応により加えることができる。ベクターは宿主細胞における染色体外維持を提供することができるかまたは宿主細胞ゲノム中への組込みを提供することができる。ベクターは当業者に周知の多数の文献に十分記載されていて、それには、例えば、ShortProtocolsinMolecularBiologyFAusubeletaledsWileySonsが含まれる。ベクターはキメラfHBPをコードする核酸の発現を提供することができ、目的の核酸の増殖を提供することができ、または両方ができる。用いることができる例示のベクターには、限定されるものでないが、組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNAまたはコスミドDNA由来のものが含まれる。例えば、プラスミドベクター、例えば、pBR322、pUC1918、pUC118、119およびM13mpシリーズのベクターを用いることができる。pET21も利用できる発現ベクターである。バクテリオファージベクターはλgtlO、λgtll、λgtl8~23、λZAPRおよびEMBLシリーズのバクテリオファージベクターを含みうる。利用できるさらなるベクターには、限定されるものでないが、pJB8、pCV103、pCV107、pCV108、pTM、pMCS、pNNL、pHSG274、COS202、COS203、pWE15、pWE16およびcharomid9シリーズのベクターが含まれる。目的のキメラfHBPを発現するために、発現カセットを使用してもよい。従って、本発明は目的の核酸を含む組換え発現ベクターを提供する。発現ベクターは転写および翻訳調節配列を提供し、機能的に連結されたコード領域の誘導的または構成的発現を可能にし、ここで前記コード領域は転写制御のもとで転写開始および停止域、ならびに翻訳開始および停止域と機能的に連結されている。これらの制御領域は、キメラfHBPが由来するfHBPに生来のものであってもよく、または外因性供給源由来のものであってもよい。一般に、転写および翻訳調節配列は、限定されるものでないが、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始および停止配列、翻訳開始および停止配列、ならびにエンハンサーまたはアクチベーター配列を含みうる。プロモーターは構成的または誘導的のいずれであってもよく、そして強力な構成的プロモーター例えば、T7などであってもよい。発現ベクターは一般に、目的のタンパク質をコードする核酸配列を挿入するために、プロモーター配列近くに位置する好都合な制限酵素切断部位を有する。発現宿主で機能する選択マーカーが存在して、ベクターを含有する細胞の選択を容易にしてもよい。さらに、発現構築物は追加のエレメントを含んでもよい。例えば、発現ベクターは1つまたは2つの複製系を有してもよく、こうして生物において、例えば、哺乳動物または昆虫細胞においては発現のためにまた原核性宿主においてはクローニングおよび増幅のために維持されることを可能にする。さらに発現構築物は、形質転換した宿主細胞の選択を可能にする選択マーカー遺伝子を含有してもよい。選択遺伝子は当技術分野で周知であり、用いる宿主細胞によって変わりうる。本発明のキメラfHBPはさらなるエレメント、例えば、検出可能な標識、例えば、放射性標識、蛍光標識、ビオチン標識、免疫学的検出可能な標識例えば、HAタグ、ポリヒスチジンタグなどを含んでもよい。さらなるキメラfHBPのエレメント例えば、ビオチンタグ、免疫学的検出可能なタグを与えて、様々な方法例えば、アフィニティ捕獲などを通して単離を促進してもよい。任意に、キメラfHBPを共有結合または非共有結合を介して支持体上に固定してもよい。キメラfHBPの単離と精製は当技術分野で公知の方法により実施することができる。例えば、キメラfHBPは、キメラfHBPを発現する遺伝的に改変された細胞の溶菌液からまたは合成反応混合物から、免疫アフィニティ精製によって単離することができ、この方法は、一般に、サンプルを抗キメラfHBP抗体例えば、抗キメラfHBPmAb、例えばJAR5mAbまたは本明細書に記載した他の適当なJARmAbと接触させるステップ、洗浄して非特異的に結合した材料を除去するステップ、および結合したキメラfHBPを特異的に溶出するステップに関わる。単離したキメラfHBPは、透析およびタンパク質精製法で通常用いられる他の方法により精製することができる。一実施形態においては、キメラfHBPを金属キレートクロマトグラフィ法を用いて単離することができる。多数の好適な宿主細胞のいずれかをキメラfHBPの生産に用いることができる。一般に、本明細書に記載のキメラfHBPは、通常の技法によって、原核生物または真核生物、通常は細菌、さらに通常は大腸菌またはナイセリア菌例えば、髄膜炎菌に発現することができる。従って、本発明はさらにキメラfHBPをコードする核酸を含有する遺伝的に改変された宿主細胞を提供する。キメラfHBPを生産大規模生産を含むする宿主細胞は、利用しうる変種のいずれから選択してもよい。発現のための例示の宿主細胞は、原核または真核生物、単細胞生物、例えば、細菌例えば、大腸菌株、酵母例えば、Scerevisiae、Pichia種などのものを含み、そして高等生物、例えば、昆虫、脊椎動物、特に哺乳動物、例えば、CHO、HEKなどに元来、由来する宿主細胞を含みうる。一般に、細菌の宿主細胞および酵母がキメラfHBP生産用に特に興味をもたれている。キメラfHBPは実質的に純粋にまたは実質的に単離された形態すなわち、実質的に他のナイセリア菌または宿主細胞ポリペプチドを含まない形態または実質的に単離された形態で調製することができる。ある特定の実施形態において、キメラfHBPは、存在しうる他成分例えば、他のポリペプチドまたは他の宿主細胞成分と比較してそのポリペプチドが濃縮された組成で存在する。精製キメラfHBPはそのポリペプチドが、他の発現されるポリペプチドを実質的に含まない、例えば、発現される他のポリペプチドが90未満、通常は60そしてさらに通常は50未満である組成で存在するように提供することができる。キメラfHBPを膜小胞で提供する場合以下でさらに詳しく考察するように、ナイセリア菌宿主細胞はキメラfHBPを発現するように遺伝的に改変される。ナイセリア種菌株の変種のいずれかを改変してキメラfHBPを生産し、そして、任意に、改変して他の目的の抗原、例えばPorA本明細書に開示した方法で用いることができるを生産することができる。ナイセリア菌株の遺伝的改変と所望のポリペプチドの発現を提供する方法およびベクターは当技術分野で公知である。例示のベクターおよび方法はWO0209746およびODwyerらInfectImmun2004;72:651180に記載されている。強力なプロモーター、特に構成的で強力なプロモーターは特に有利である。例示のプロモーターにはporA、porB、lbpB、tbpB、pi10、hpuAB、lgtF、opa、pi10、1st、hpuAB、およびrmpのプロモーターが含まれる。病原性ナイセリア菌種、特にヒトに対して病原性の菌株由来のまたはヒトに対して病原性または共生性の菌株由来の病原性ナイセリア菌種または菌株は膜小胞生産における使用に特に興味深い。例示のナイセリア菌種には、Nmeningitidis髄膜炎菌、Nflavescens、Ngonorrhoeae淋菌、Nlactamica、Npolysaccharea、Ncinerea、Nmucosa、Nsubflava、Nsicca、Nelongataなどが含まれる。さらなる情報は、WO2009114485に記載されている。本発明の免疫原性組成物またはワクチンはサブユニット組成物であってもよい。サブユニット組成物は、その成分が少なくとも50、好適には少なくとも60、70、80、90純度まで単離され精製されている組成物である。本発明の免疫原性サブユニット組成物は好適には、次のリストから選択される本発明の融合タンパク質および他の1もしくは2種の抗原を含む:TdfI、TdfH、FhaB、PilC、Hsf、Hap、NadA、OMP85、IgAプロテアーゼ、AspA、AspAのパッセンジャードメイン、Hsfのパッセンジャードメイン、Hapのパッセンジャードメイン、FrpA、FrpC、TbpA、TbpB、LbpA、LbpB、HpuA、HpuB、TspA、TspB、PIdA、PilQ、FhaC、NspA、およびLPS免疫型L2およびLPS免疫型L3のいずれかもしくは両方。サブユニット組成物は水溶液であってもよい。この組成物は、抗原の疎水性部分を可溶化するために、界面活性剤、好適には非イオン、双性イオンまたはイオン界面活性剤を含んでもよい。この組成物はリポソーム構造を形成しうる脂質を含んで、脂質膜に架かる構造によって抗原の提示を可能にすることができる。髄膜炎菌血清群BmenBは、工業規模での製造を可能にするのに十分な量の外膜ブレブを排泄する。外膜小胞はまた、細菌細胞の界面活性剤抽出プロセスを介して調製することもできる例えば、EP11243を参照。本発明の免疫原性組成物はまた、遺伝子組換えまたは他の方法鉄のもとおよび/または亜鉛のもとでの枯渇条件の増殖を含むのいずれかによりアップレギュレーションされている少なくとも2種の抗原を有する外膜小胞調製物を含んでもよい。かかる外膜小胞調製物でアップレギュレーションされうる抗原の例には、TdfI、TdfH、NspA、Hsf、Hap、OMP85、TbpA高、TbpA低、LbpA、TbpB、LbpB、PilQ、AspA、PorB、HpuB、P2086、NMADPRT、MafA、MafBおよびPIdAが含まれる。かかる調製物はまた、任意に、LPS免疫型L2およびLPS免疫型L3のいずれかまたは両方を含みうる。ナイセリア菌株からのブレブ調製物の製造は当業者に周知のいずれかの方法により達成することができる。一態様においては、EP301992、US5597572、EP11243またはUS4271147、FrederiksonらNIPHAnnals1991、14:6780、ZollingerらJClinInvest1979、63:836848、SaundersらInfectImmun1999、67:113119、DrabickらVaccine2000、18:160172またはWO0109350実施例8に開示された方法を用いる。一般に、OMVを界面活性剤、好適にはデオキシコール酸によって抽出し、そして核酸を任意に酵素を使って除去する。精製は超遠心分離により、任意に次いで、サイズ排除クロマトグラフィにより達成する。もし2種以上の異なる本発明のブレブが含まれれば、それらを1つの容器内で組み合わせて本発明の多価調製物を作製するもし異なる本発明のブレブが別の容器内の別の組成物であっても、同時に[同じ通院時に]投与されれば、調製物は多価とみなされる。OMV調製物は通常、02μMフィルターを介する濾過により滅菌し、好適には、ブレブ調製物を安定化することが公知であるスクロース溶液例えば、3中で貯蔵する。外膜小胞調製物内のタンパク質のアップレギュレーションは、遺伝子の余分なコピーを、OMV調製物が由来するナイセリア菌中に挿入することにより達成することができる。あるいは、OMV調製物が由来するナイセリア菌株において、遺伝子のプロモーターをより強力なプロモーターに交換してもよい。かかる技法はWO0109350に記載されている。タンパク質のアップレギュレーションはOMV中に存在するタンパク質レベルを、未改変の髄膜炎菌例えば菌株H4476に由来するOMV中に存在するタンパク質レベルより高くする。一態様において、そのレベルは15、2、3、4、5、7、10または20倍高くなろう。LPSをOMV中の追加抗原にしようとする場合、好適には、高レベルの結合LPSを保存する一方、特に有毒で結合の乏しいLPSを除去するために、低濃度の抽出界面活性剤例えば、デオキシコール酸またはDOCを用いるプロトコルをOMV調製法で使用することができる。用いるDOCの濃度は、好適には0~05DOC、002~04DOC、004~03DOC、さらに好適には006~02DOCまたは008~015DOC、最も好適にはおよそまたは正確に01DOCである。さらに一般に、OMVは低濃度の抽出界面活性剤例えば、デオキシコール酸またはDOCを用いることにより得てもよい。用いるDOCの濃度は、好適には、0~05DOC、002~04DOC、004~03DOCmoresuitably006~02DOCまたは008~015DOC、最も好適にはおよそまたは正確に01DOCである。一態様において、OMVは界面活性剤抽出を使わずに、好適には、fHbpなどの抗原を過剰発現して得た生来のOMVを含む。より強力なプロモーター配列は、目的の抗原をコードする遺伝子に対する転写を増加する調節制御エレメントを意味する。発現のアップレギュレーションとは、非改変すなわち、天然のブレブの発現と比較して、目的の抗原の発現を増進するいずれかの手段を意味する。アップレギュレーションの量は目的の特定の抗原に応じて変わりうるが、そのブレブの完全性を破壊しうる量を超えないものと理解される。抗原のアップレギュレーションは非改変ブレブの発現より少なくとも10高い発現を意味する。一態様において、発現は50高い。さらに好適には、発現は少なくとも100高い2倍。最も好適には、発現は3、4、57、10、20倍高い。あるいはまたはさらに、特にTbpA、TbpB、LbpAおよびLbpBの場合、発現のアップレギュレーションは発現が代謝性または栄養性変化に条件付けられないことを意味しうる。一態様においては、鉄制限条件例えば、鉄キレート剤の存在でで増殖した細菌から誘導されたブレブの発現レベルを評価する。ふたたび、意味を明確にするために言えば、用語前記抗原をより少なく生産するように細菌株を遺伝子操作するまたはダウンレギュレーションは、非改変すなわち、天然ブレブと比較して、好適には、欠失により、発現が非改変ブレブのそれより少なくとも10低くなるように、目的の抗原の発現または機能的遺伝子産物の発現を低下するいずれかの手段を意味する。一態様において、発現は50低く、最も好適には、完全に存在しない。もしダウンレギュレーションしたタンパク質が酵素または機能性タンパク質であれば、ダウンレギュレーションは1以上の突然変異を導入することにより達成され、酵素または機能的活性の10、20、50、80または好適には100低下をもたらしうる。ナイセリア菌タンパク質の発現をモジュレートするのに必要な遺伝子操作ステップは当業者に公知の様々な方法で行うことができる。例えば、配列例えば、プロモーターまたはオープンリードフレームを挿入することができるしまたプロモーター/遺伝子をトランスポゾン挿入の技法により破壊することができる。例えば、遺伝子の発現をアップレギュレーションするために、強力なプロモーターをトランスポゾンを介して遺伝子の開始子ドンの2kb上流までにさらに好適には200~600bp上流に、最も好適にはおよそ400bp上流に挿入することができる。点突然変異または欠失も利用することができる特に遺伝子の発現のダウンレギュレーションに。しかし、かかる方法はまったく不安定または不確実であり、それ故に、遺伝子操作ステップは好適には相同組換え事象を介して行う。一態様において、この事象は細菌染色体上の少なくとも30個のヌクレオチドの配列1つの組換え遺伝子領域と菌株内の形質転換されたベクター上の少なくとも30ヌクレオチドの配列第2の組換え遺伝子領域との間で起こる。一態様において、これらの領域は40~1000ヌクレオチド、さらに好適には100~800ヌクレオチド、最も好適には500ヌクレオチドである。これらの組換え遺伝子領域は、高度にストリンジェントな条件下でお互いにハイブリダイズしうるのに十分な程度に類似していなければならない。本明細書で記載した遺伝子改変事象を行うために用いる方法例えば、組換え事象による遺伝子のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションおよびさらなる遺伝子発現のナイセリア菌ゲノムへの導入はWO0109350に記載されている。ナイセリア菌に組込むことができる典型的で強力なプロモーターはporA、porB、IgtF、Opa、p110、lst、およびhpuABである。PorAおよびPorBは構成的で強力なプロモーターとして好適である。PorBプロモーター活性がporBの開始コドンの1~250上流のヌクレオチドに対応する断片に含まれることは確立されている。鉄制限培地における増殖による抗原の発現のアップレギュレーション本発明の外膜小胞調製物中のいくつかの抗原のアップレギュレーションは、好適には、鉄制限条件下で増殖したナイセリア菌の親菌株由来の外膜小胞を単離することにより達成される。培地の鉄濃度が低いと、TbpA、TbpB、LbpA、LbpB、HpuA、HpuBおよびP2086を含む鉄獲得に関わるタンパク質の発現の増加をもたらしうる。それによりこれらのタンパク質の発現はアップレギュレーションされるので、例えば、強力プロモーターの挿入またはその遺伝子の追加コピーの挿入によって関わる遺伝子を組換え改変する必要はない。本発明はまた、前記遺伝子も組換え改変された場合の、鉄制限培地における増殖による鉄獲得タンパク質のアップレギュレーションも包含する。鉄制限は鉄キレート剤の培地への付加により実施する。好適な鉄キレート剤には、22ジピリジル、EDDHAエチレンジアミンジoヒドロキシルフェニル酢酸およびデスフェラルDesferalデフェリオキサミンメシレート、Sigmaが含まれる。デスフェラルは好適な鉄キレート剤であり、培地に10~100pM、好適には25~75μM、より好適には50~70μM、最も好適には60μMの濃度で加えられる。培地の鉄含量は、主として、酵母エキスおよびダイズペプトン成分に由来し、存在量はバッチによって異なりうる。従って、鉄獲得タンパク質のアップレギュレーションを達成するために最適なデスフェラルの濃度は、培地のバッチによって異なりうる。当業者は最適濃度を容易に決定しうるであろう。基本的には、所望の鉄調節タンパク質の発現をアップレギュレーションするのに十分であるが、該細菌の増殖に悪影響を及ぼさない程度の量の鉄キレート剤を培地に加えるべきである。一態様においては、本発明の外膜小胞を得るために、鉄制限条件下の増殖による鉄獲得タンパク質のアップレギュレーションを他の抗原の組換えアップレギュレーションと組み合わせる。一態様においては、亜鉛制限を用いて、例えば、TdfIの発現を増加することができる。これは、例えば、Zn2濃度が低い、すなわち5、4、3、2、1、09、08、07、06、05、04、03、02、01、005または001μMフリーZn2のもとでの培地例えば、ICPMSによって約169μMZn2を有するRoswellParkMemorialInstitute培地1640RPMIを用いるか、または例えば、公知の亜鉛キレート剤、例えば、TPENNNNNテトラキスエチレンジアミンを用いて培地中のZn2を除去するNMB0964の発現が最大になるように十分に培地に加えるべきであることによって、達成することができる。合成培地、例えば、CatlinまたはCatlin適合化培地も用いてもよいNutritionalprofilesofNeisseriagonorrhoeaeNeisseriameningitidisandNeisserialactamicainchemicallydefinedmediaandtheuseofgrowthrequirementsforgonococcaltyping化学的に規定した培地における淋菌、髄膜炎菌、およびナイセリアラクタミカ菌の栄養プロファイルならびに淋菌分類のための増殖要件の使用CatlinBWJInfectDis1973Aug12817894。Zn2の低い特定の培養条件で、またはNMB0964を過剰発現するかもしくはZurが介在する亜鉛抑制機構を除去するように遺伝子操作した突然変異体髄膜炎菌株から調製したOMVワクチンはNMB0964に富むものであって、かかるOMVはこれらの方法で調製しなかったOMVと比較して良好な殺菌抗体応答を誘発する。可変性かつ非保護性の免疫優性抗原のダウンレギュレーション/除去多くの表面抗原は細菌株間で可変性であって、その結果、密接に関係する菌株の限られたセットに対してのみ保護性がある。本発明の一態様は、他のタンパク質が低下したまたは、好適には、可変性表面タンパク質をコードする遺伝子が欠失した本発明の外膜小胞を包含する。かかる欠失のある細菌株が生産するブレブは、ワクチンで投与されると、ワクチン被接種者の免疫系に対する保存タンパク質外膜に保持されたの作用による影響がより高いので、様々な菌株に対する交差反応性の潜在能力がより強力である。本発明のブレブ免疫原性組成物においてダウンレギュレーションしうるナイセリア菌のかかる可変性抗原の例にはPorA、PorB、Opaが含まれる。ダウンレギュレーションまたはスイッチオフしてもよい他のタイプの遺伝子はinvivoでその細菌により容易にスイッチオン発現またはオフできる遺伝子である。かかる遺伝子によりコードされる外膜タンパク質は常に細菌上に存在するのでなく、ブレブ調製物中のかかるタンパク質の存在はまた、前記の理由によりワクチンの有効性にとって有害でもありうる。ダウンレギュレーションまたは欠失の好適な例はナイセリア菌のOpcタンパク質である。感染生物は容易にOpcになりうるので、Opcを含有するブレブワクチンにより誘導される抗Opc免疫は、限られた保護能力しか有しないであろう。例えば、これらの可変性または非保護性遺伝子の発現をダウンレギュレーションするかまたは一定期間スイッチオフしてもよい。これはブレブの外表面上に少量存在する、より良好な抗原に免疫系を集中させる利点を有する。ダウンレギュレーションはまた、前記外膜タンパク質の表面に曝された可変性免疫優性ループが改変または欠失されて、生じる外膜タンパク質の免疫優性をより低下させうることを意味する。発現のダウンレギュレーションに関する方法はWO0109350に開示されている。本発明のブレブ免疫原性組成物でダウンレギュレーションされるタンパク質の好適な組合わせには、PorAおよびOpA;PorAおよびOpC;OpAおよびOpC;PorAおよびOpAおよびOpCが含まれる。4つの異なるOpa遺伝子が髄膜炎菌のゲノム中に存在することは公知でありAhoetal1991MolMicrobiol5142937、それ故にOpaの発現がダウンレギュレーションされると言った場合、好適には髄膜炎菌中に存在する1、2、3または好適には4つ全ての遺伝子がダウンレギュレーションされることを意味する。かかるダウンレギュレーションはWO0109350に記載されたように遺伝子操作で行うか、またはOpa遺伝子座からの発現が無いかまたは低い、容易に見出せる天然の安定した髄膜炎菌株を捜すことにより行うことができる。かかる菌株は、Poolmanetal1985JMedMicro19203209に記載の技法を用いて見出すことができ、この場合、OpAである細胞はOpaを発現する細胞と異なる表現型を有し、これはプレート上または顕微鏡下で外観を観察して判断することができる。いったん見付かると、Opaの欠如を確立する発酵実験後の細胞内容物のウェスタンブロットを実施することによりその菌株が安定してOpaであることを示すことができる。外膜小胞におけるいくつかの抗原のアップレギュレーションを鉄制限条件下の増殖により達成する場合、可変性タンパク質FrpBMicrobiology14232693274JBacteriol18128952901もアップレギュレーションされうる。本発明者らは、これらの環境のもとでは、W00109350に記載したように全タンパク質の発現をダウンレギュレーションすることにより、またはFrpBの可変域を欠失させることによりFrpBの発現をダウンレギュレーションするのが有利であることを見出した。これは、免疫原性組成物により誘発される免疫応答が広範囲の菌株に存在する抗原を指向することを確実にする。FrpBのダウンレギュレーションは好適には、本発明のブレブ免疫原性組成物中のPorAおよびOpA;PorAおよびOpC;OpAおよびOpC;PorAおよびOpAおよびOpCのダウンレギュレーションと組み合わせる。本発明の代わりの実施形態においては、鉄制限条件下で増殖しなかったナイセリア菌株から調製した外膜小胞中のFrpBをダウンレギュレーションする。本発明の免疫原性組成物中のブレブは、WO0109350に開示されたLPSを解毒する方法を介して解毒することができる。特に、本発明のLPSを解毒する方法は、WO0109350に開示されたhtrBおよび/またはmsbB酵素のダウンレギュレーション/欠失に関わる。ナイセリア菌のmsbBおよびhtrB遺伝子はそれぞれlpxL1およびlpxL2とも呼ばれWO0026384、これらの遺伝子の欠失突然変異は、表現型において、1つの二級アシル基を欠くmsbB突然変異体LOS、および両方の二級アシル基を欠くhtrB突然変異体LOSにより特徴付けられる。W09314155およびWO9503327は、本発明の組成物で用いることができるポリマイシンBの機能的等価体である無毒性ペプチドを記載している。かかる方法は、好適には、低レベルのDOC、好適には0~03DOC、さらに好適には005~02DOC、最も好適には、およそまたは正確に01DOCに関わるブレブ抽出の方法と組み合わせる。LPSを解毒するさらなる方法には、ブレブ調製物に、先に記載したポリミキシンBの機能的等価体である無毒性ペプチド好適にはSAEP2を加える方法が含まれる。交差反応性多糖:被包性グラム陰性細菌からの細菌外膜ブレブの単離は、しばしば、莢膜多糖の同時精製をもたらす。いくつかの例では、多糖は他のブレブ成分により与えられる免疫応答を増進しうるので、この夾雑材料は有用であることを示しうる。しかし他の例では、細菌のブレブ調製物中に夾雑する多糖材料の存在は、ワクチン中のブレブの使用に有害であることを示しうる。例えば、少なくとも髄膜炎菌の場合、血清群B莢膜多糖は保護免疫を与えずかつヒトにおいて有害な自己免疫応答誘発に感受性であることが示されている。従って、遺伝子操作で作ったブレブ生産用の細菌株から本発明の外膜小胞を単離して、莢膜多糖を含まぬようにしてもよい。そうするとブレブはヒトにおける使用に好適になりうる。かかるブレブ調製物の特に好適な例は莢膜多糖を欠く髄膜炎菌血清群B由来のものである。これは、莢膜生合成および/または搬出に必要な遺伝子が損なわれている改変ブレブ生産菌株を用いることにより達成することができる。莢膜多糖生合成または搬出をコードする遺伝子の不活化は、制御領域、コード領域のいずれかまたは両方を突然変異点突然変異、欠失または挿入する好適には前記の相同組換え技法を用いてことによるか、またはかかる遺伝子の酵素機能を低下するいずれか他の方法により達成することができる。さらに、莢膜の生合成遺伝子の不活化はまた、アンチセンス過剰発現またはトランスポゾン突然変異誘発により達成することもできる。好ましい方法は多糖生合成および搬出のために必要な髄膜炎菌cps遺伝子のいくつかまたは全ての欠失である。この目的については、置換プラスミドpMF121Froshetal1990MolMicrobiol412151218に記載を用いてcpsCADgalE遺伝子クラスターを除去する突然変異を送達することができる。WO0109350は、プラスミドpMF121Froschetal1990を用いて莢膜多糖を欠く髄膜炎菌B株を構築したことを開示している。このプラスミドは、グループB多糖BPSの生合成経路およびエリスロマイシン耐性遺伝子をコードする遺伝子座の隣接領域を含有する。BPSの欠失はグループB莢膜多糖の発現の喪失ならびにガラクトース欠乏LPSの合成に導くgalEの活性コピーの欠失をもたらした。L3またはL2LPSに対する抗体の安全性は、ヒトスフィンゴ糖脂質に存在するラクトNネオテトラオースオリゴ糖基Galβl4GlcNAcβl3Galβl4Glcβlに類似した構造の存在によって疑問視されている。多数の人がL3LPSの残量を含有するデオキシコール酸抽出小胞ワクチンを用いて安全にワクチン接種を受けているGBjuneetalLancet33810931096;GVGSierraetalNIPHann14195210としても、LOS糖類の末端部分の欠失は、ヒト組織の表面に存在する構造とのいずれかの交差反応を阻止するのに有利である。好ましい実施形態において、lgtB遺伝子の不活化は末端ガラクトース残基およびシアル酸が存在しない中間体LPS構造この突然変異はL2およびL3LOSに4GlcNAcpl3Galpl4Glcpl構造を残すをもたらす。かかる中間体はL3およびL2LPS菌株において得ることができよう。代わりの、それより好ましくないLPSの短いバージョンはIgtE遺伝子を遮断することによって得ることができる。さらなる代わりのバージョンは、galE突然変異の使用CloningandmolecularanalysisofthegalEgeneofNeisseriameningitidisanditsroleinlipopolysaccharidebiosynthesis髄膜炎菌のgalE遺伝子のクローニングと分子分析およびリポ多糖生合成におけるその役割JenningsMPvanderLeyPWilksKEMaskellDJPoolmanJTMoxonERMolMicrobiol1993Oct103619であって、莢膜不在菌株と短α鎖をもつLOSlgtE突然変異としてを得ることである。さらなる代わりのそれより好ましくないLPSのバージョンはIgtA遺伝子を遮断することによって得ることができる。もしかかるlgtA突然変異を選択するのであれば、lgtC発現も遮断して非免疫原性のLI免疫型が形成されるのを阻止するのが好ましい。LgtB突然変異体は最も好ましい、というのは、本発明者らはこれが安全問題を解決するために最適な末端切断である一方、細菌抗体応答をなお誘発しうるLPS保護オリゴ糖エピトープを保持することを見出したからである。それ故に、精製されたまたは単離されたブレブ中にL2またはL3調製物または髄膜炎菌ブレブ調製物をさらに含む本発明の免疫原性組成物は一般に、好適には遺伝子のスイッチオフにより、最も好適にはプロモーターおよび/または遺伝子のオープンリードフレームの全てもしくは一部分を除去することにより、遺伝子操作によってlgtB、lgtAまたはlgtE遺伝子からの機能性遺伝子産物の発現を永久にダウンレギュレーションしたナイセリア菌株好適には髄膜炎菌株から有利に誘導される。前記の本発明の免疫原性組成物を髄膜炎菌B菌株から誘導する場合、さらに莢膜多糖ヒト様の糖構造も含有するも除去することが好ましい。多くの遺伝子をスイッチオフしてこれを達成することはできるが、本発明者らは有利には、ブレブ生産菌株を、好適には遺伝子のスイッチオフにより、最も好適にはプロモーターおよび/または遺伝子のオープンリードフレームの全てもしくは一部分を除去することにより、遺伝子操作によってsiaD遺伝子からの機能性遺伝子産物の発現を永久にダウンレギュレーションするすなわち、α28ポリシアリルトランスフェラーゼ活性をダウンレギュレーションすることが好ましいことを示した。かかる不活化はWO0109350に記載されている。このsiaDsynDとしても知られる突然変異は、莢膜多糖からヒト類似エピトープの除去をもたらすことができる多くの突然変異の中でも最も有利なものである、何故なら、これはLOSの保護エピトープの生合成に影響を与えない単独の突然変異の1つであって、従って、究極的にLOSを保護抗原として用いることを目的とし、細菌の増殖に最小限の影響しか与えないプロセスにおいて有利であるからである。本発明の好ましい態様は、それ故に、IgtEsiaD、lgtAsiaDまたは、好適には、lgtBsiaD髄膜炎菌B突然変異体菌株から誘導される前記ブレブ免疫原性調製物である。この菌株自体が本発明のさらなる態様である。siaD突然変異は以上の理由で好ましいが、髄膜炎菌B莢膜多糖合成をスイッチオフする他の突然変異を用いることもできる。従ってブレブ生産菌株を、好適には遺伝子のスイッチオフにより、最も好適にはプロモーターおよび/または遺伝子のオープンリードフレームの全てもしくは一部分を除去することにより、遺伝子操作によって次の遺伝子:ctrA、ctrB、ctrC、ctrD、synAsynXおよびsiaAと等価、synBsiaBと等価またはsynCsiaCと等価遺伝子の1以上からの機能性遺伝子産物の発現を永久にダウンレギュレーションすることができる。lgtE突然変異をこれらの突然変異の1以上と組み合わせてもよい。一態様においては、lgtB突然変異をこれらの突然変異の1以上と組み合わせてもよい。本発明のさらなる態様は、それ故に、髄膜炎菌Bのかかる組み合わせた突然変異体菌株から誘導される前記のブレブ免疫原性調製物である。この菌株自体が本発明のさらなる態様である。lgtBおよびlgtEを含む様々なlgt遺伝子を含有するナイセリア菌の遺伝子座およびその配列は当技術分野で公知であるMPJenningsetalMicrobiology199914530133021およびその引用文献、ならびにJExpMed180218121901994を参照。全長非末端切断型LOSを最終産物に用いる場合、LOSをシアル酸付加しないことが所望されるかかるLOSは、同じくシアル酸付加されてない最も危険な侵襲性髄膜炎菌B菌株に対する免疫応答を生じるので。かかる場合、synAsynXおよびsiaAと等価、synBsiaBと等価またはsynCsiaCと等価遺伝子を除去した莢膜不在菌株を用いると、かかる突然変異はmenBLOSのシアル酸付加を不能にするので有利である。ブレブ調製物、特に、低DOC濃度で抽出した調製物においては、LPSを本発明の免疫原性組成物中の抗原として用いることができる。しかし、ヒト様ラクトNネオテトラオース構造を除去するために、lgtE、lgtA特にlgtCとの組み合わせて、または、好適には、lgtB遺伝子/遺伝子産物の酵素機能をダウンレギュレーション/欠失/不活化することが有利である。galE突然変異も用いて莢膜不在菌株と短α鎖をもつLOSlgtE突然変異の様にの両方を得ることができる。LPSオリゴ糖構造を生合成するためのlgt遺伝子を含むナイセリア菌遺伝子座およびその配列は当技術分野で公知であるJenningsetalMicrobiology199914530133021およびその引用文献、およびJExpMed180218121901994。lgtBまたは機能性の遺伝子産物のダウンレギュレーション/欠失は、これがLPS保護エピトープを無傷のまま残すので好ましい。本発明の髄膜炎菌血清群Bブレブ調製物において、siaDおよびlgtBの両方のダウンレギュレーション/欠失は好ましく髄膜炎菌Bブレブ生産菌株におけるlgtBと、ctrA、ctrB、ctrC、ctrD、synAsynXおよびsiaAと等価、synBsiaBと等価またはsynCsiaCと等価のいずれかとの組み合わせも用いることができる、最適な安全性を持ち、LPS保護エピトープを保持するブレブ調製物をもたらす。本発明のさらなる態様は、それ故に、かかる髄膜炎菌Bの突然変異菌株の組み合わせから誘導される前記ブレブ免疫原性調製物である。前記菌株自体も本発明のさらなる態様である。本発明の免疫原性組成物は少なくとも、1、2、3、4または5つの異なる外膜小胞調製物を含む。2つ以上のOMV調製物が含まれる場合、本発明の少なくとも1つの抗原は各OMVにおいてアップレギュレーションされている。かかるOMV調製物は同じ種および血清群のナイセリア菌株から、または好適には、異なるクラス、血清群、血清型、サブ血清型または免疫型のナイセリア菌株から誘導することができる。例えば、免疫原性組成物は、免疫型L2のLPSを含有する1以上の外膜小胞調製物および免疫型L3のLPSを含有する1以上の外膜小胞調製物を含んでもよい。L2またはL3OMV調製物は好適にはLPSオリゴ糖合成遺伝子座において最小限の相可変性を有する安定な菌株から誘導する。本発明の免疫原性組成物はまた、サブユニット組成物と外膜小胞の両方を含んでもよい。その溶解度の故にサブユニット組成物に封入するのに特に好適であるいくつかの抗原がある。かかるタンパク質の例には、TdfI、FhaB、NspA、Hsfのパッセンジャードメイン、Hapのパッセンジャードメイン、AspAのパッセンジャードメイン、AspA、OMP85、FrpA、FrpC、TbpB、LbpB、PilQが含まれる。外膜小胞調製物は、組換えにより外膜小胞においてアップレギュレーションされている次のリスト:NspA、Hsf、Hap、OMP85、TbpA高、TbpA低、LbpA、TbpB、LbpB、NadA、TspA、TspB、PilC、PilQ、TdfH、PorB、HpuB、P2086、NMADPRT、MafA、MafBおよびPldAから選択される少なくとも1つの異なる抗原を有し;そして任意に、LPS免疫型L2およびLPS免疫型L3のいずれかまたは両方を含みうる。本発明の他の態様は、それから本発明の外膜小胞任意に、前記のように、遺伝子組換えでアップレギュレーションされた少なくとも2種の本発明のタンパク質を有する外膜小胞を誘導することができる、遺伝子操作されたナイセリア菌株である。かるナイセリア菌株は髄膜炎菌または淋菌であってもよい。この菌株はまた、LgtB、LgtE、SiaD、OpC、OpA、PorA、FrpB、msbBおよびHtrBの1、2、3、4、5、6、7または8種の発現を含む他のナイセリア菌タンパク質の発現をダウンレギュレーションするように、遺伝子操作先に記載したされていてもよい。ダウンレギュレーションのための好適な組み合わせには、少なくともLgtBおよびSiaDのダウンレギュレーション好適には欠失、少なくともPorAおよびOpCのダウンレギュレーション、少なくともPorAおよびOpAのダウンレギュレーションならびに少なくともPorA、OpAおよびOpCのダウンレギュレーションが含まれる。galE突然変異を用いて莢膜不在菌株および短α鎖をもつLOSlgtE突然変異のようにの両方を得ることもできる。ブレブ生産に関する前記の開示によって、本発明のさらなる態様は本発明の免疫原性組成物またはワクチンを作る方法を含む。これらには、本発明のキメラタンパク質を、本発明のナイセリア菌由来のブレブの形態で存在しうるナイセリア菌から単離した抗原またはタンパク質と一緒に混合して本発明の免疫原性組成物を作るステップ、ならびに、この本発明の免疫原性組成物を製薬上許容される担体と組み合わせるステップを含むものである本発明のワクチンを作る方法が含まれる。また本発明には、ナイセリア菌培養物からキメラタンパク質を含む外膜小胞を単離するステップを含むものである本発明の免疫原性組成物を作る方法が含まれる。かかる方法は少なくとも2つの外膜小胞調製物を混合するさらなるステップを含みうるのであって、一態様においては、少なくとも1つの外膜小胞調製物は免疫型L2のLPSを含有しそして少なくとも1つの外膜小胞調製物は免疫型L3のLPSを含有する。本発明にはまた、外膜小胞を0~05DOCの濃度で抽出することにより単離するかかる方法が含まれる。LPS含量を最小限にするためには03~05DOCの濃度を用いる。LPSを抗原として保存するOMV調製物においては、0~03、好適には005~02、最も好適には約01のDOC濃度を抽出に用いる。本発明の免疫原性組成物はさらに細菌の莢膜多糖またはオリゴ糖を含んでもよい。莢膜多糖またはオリゴ糖は、髄膜炎菌血清群A、C、Y、および/またはW135、インフルエンザb型菌、肺炎球菌、連鎖球菌群A、連鎖球菌群B、黄色ブドウ球菌および表皮ブドウ球菌の1以上から誘導しうる。本発明のさらなる態様は、本発明の抗原組成物と、ウイルスまたはグラム陽性菌に関連する病状を含むある特定の病状に対して有利に用いられる他の抗原とを含むワクチンの組み合わせである。1つの組み合わせでは、本発明の抗原性組成物を、単味のまたはタンパク質担体と結合していてもよい次の髄膜炎菌莢膜多糖またはオリゴ糖:A、C、YまたはW135の1、2、3または、好適には、4つ全てと共に製剤する。一態様においては、本発明の免疫原性組成物をAおよびC;またはC;またはCおよびYと共に製剤する。髄膜炎菌、好適には血清群B由来のタンパク質を含有するかかるワクチンは包括的髄膜炎菌ワクチンとして用いることができる。さらなる実施形態において、好適には、単味のまたは結合した髄膜炎菌の莢膜多糖またはオリゴ糖A、C、YまたはW135の1、2、3もしくは4つ全て前記の通りと共に製剤した本発明の抗原性組成物を、結合したインフルエンザb型菌莢膜多糖またはオリゴ糖および/または1種以上の単味のまたは結合した肺炎球菌性の莢膜多糖またはオリゴ糖と共に製剤する。任意に、ワクチンはまた、肺炎球菌感染に対して宿主を保護できる1種以上のタンパク質抗原を含んでもよい。かかるワクチンは包括的髄膜炎ワクチンとして有利に用いることができる。なおさらなる実施形態においては、本発明の免疫原性組成物を、髄膜炎菌、インフルエンザb型菌、肺炎球菌、連鎖球菌群A、連鎖球菌群B、黄色ブドウ球菌または表皮ブドウ球菌の1つ以上から誘導された莢膜多糖またはオリゴ糖と共に製剤する。肺炎球菌の莢膜多糖抗原は、好適には、血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23Fおよび33Fから最も好適には血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19Fおよび23Fから選択される。さらなる実施形態はインフルエンザ菌のPRP莢膜多糖を含有しうる。さらなる実施形態は黄色ブドウ球菌の5型、8型または336型莢膜多糖を含有しうる。さらなる実施形態は表皮ブドウ球菌のI型、II型またはIII型莢膜多糖を含有しうる。さらなる実施形態は連鎖球菌B群のla型、Ic型、II型、III型莢膜多糖を含有しうる。さらなる実施形態は連鎖球菌A群の莢膜多糖を含有し、好適にはさらに少なくとも1つのMタンパク質、そしてさらに好適には複数の型のMタンパク質を含みうる。かかる本発明の莢膜多糖は、担体タンパク質、例えば、破傷風トキソイド断片C、ジフテリアトキソイド、CRM197、ニューモリシン、タンパク質DUS6342224と結合していてもまたはしていなくてもよい。多糖結合は公知のカップリング技法により調製することができる。例えば、多糖をチオエーテル結合を介してカップリングしてもよい。この結合法は、多糖を1シアノ4ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレートCDAPにより活性化してシアネートエステルを形成することに依る。こうして活性化多糖を直接またはスペーサー基を介して担体タンパク質上のアミノ基とカップリングさせることができる。一態様においては、シアネートエステルをヘキサンジアミンとカップリングして、このアミノ誘導体化した多糖を、チオエーテル結合の形成に関わるヘテロ連結化学を用いて、担体タンパク質と結合する。かかる結合体はPCT公開出願W09315760UniformedServicesUniversityに記載されている。結合体はまた、US4365170JenningsおよびUS4673574Andersonに記載の直接還元アミノ化法により調製することができる。他の方法は、EP0161188、EP208375およびEP0477508に記載されている。さらなる方法は、アジピン酸ヒドラジドADHで誘導体化した臭化シアン活性化多糖のカルボジイミド縮合によるタンパク質担体とのカップリングに関わるChuCetalInfectImmunity1983245256。オリゴ糖が含まれる場合、これらが結合しているのが好適である。好適な肺炎球菌のタンパク質抗原は、肺炎球菌の外側表面に曝された肺炎球菌の生活環の少なくとも一部において宿主の免疫系により認識されうる肺炎球菌のタンパク質であるか、または肺炎球菌により分泌または放出されたタンパク質である。最も好適には、前記タンパク質は肺炎球菌の毒素、アドヘシン、2成分シグナルトランスデューサー、またはリポタンパク質、またはそれらの断片である。特に好適なタンパク質には、限定されるものでないが、ニューモリシン好適には化学処理または突然変異により解毒されたもの[MitchelletalNucleicAcidsRes1990Jul11184010ComparisonofpneumolysingenesandproteinsfromStreptococcuspneumoniaetypes1and2肺炎球菌1型と2型からのニューモリシン遺伝子とタンパク質の比較、MitchelletalBiochimBiophysActa1989Jan2310076772ExpressionofthepneumolysingeneinEscherichiacolirapidpurificationandbiologicalproperties大腸菌におけるニューモリシン遺伝子の発現:迅速な精製と生物学的特性、WO9605859、WO9006951、WO9903884];PspAおよびその膜貫通欠失変異体US5804193Brilesら;PspCおよびその膜貫通欠失変異体WO9709994Brilesetal;PsaAおよびその膜貫通欠失変異体BerryPatonInfectImmun1996Dec64525562SequenceheterogeneityofPsaAa37kilodaltonputativeadhesinessentialforvirulenceofStreptococcuspneumoniaePsaAの配列異質性、肺炎連鎖球菌の病原性に必須な37kDa推定アドヘシン;肺炎球菌のコリン結合タンパク質およびその膜貫通欠失変異体;CbpAおよびその膜貫通欠失変異体WO9741151;WO9951266;グリセルアルデヒド3ホスフェートデヒドロゲナーゼInfectImmun199664:3544;HSP70WO9640928;PcpASanchezBeatoetalFEMSMicrobiolLett199816420714;M様タンパク質、EP0837130およびアドヘシン18627、EP0834568が含まれる。さらなる肺炎球菌のタンパク質抗原は、WO9818931に開示されたもの、特にWO9818930およびPCTUS9930390に選択されたものである。本発明の免疫原性組成物/ワクチンはまた、任意に、他のグラム陰性菌、例えば、カタル球菌Moraxellacatarrhalisまたはインフルエンザ菌から作られた外膜小胞調製物を含んでもよい。本発明の免疫原性組成物はさらに、カタル球菌由来のOMV調製物を含んでもよい。遺伝子操作したOMV調製物は、WO0109350に記載の通りカタル球菌から誘導することができる。アップレギュレーションには次の保護抗原をコードする遺伝子の1つ以上が好適である:OMP106WO9741731およびWO9634960、HasRPCTEP9903824、PilQPCTEP9903823、OMP85PCTEP0001468、lipo06GB99179772、lipolOGB99182081、lipollGB99183022、lipol8GB99180382、P6PCTEP9903038、ompCD、CopBHelminenMEetalInfectImmun6120032010、D15PCTEP9903822、OmplAlPCTEP9906781、Hly3PCTEP9903257、LbpAおよびLbpBWO9855606、TbpAおよびTbpBWO9713785およびWO9732980、OmpE、UspAlおよびUspA2WO9303761、ならびにOmp21。これらはまた、他のグラム陰性菌中に非相同的に導入することができる。次の遺伝子の1以上はダウンレギュレーションが好適である:CopB、OMP106、OmpBl、TbpA、TbpB、LbpA、およびLbpB。次の遺伝子の1以上はダウンレギュレーションが好ましい:htrB、msbBおよびlpxK。次の遺伝子の1以上はアップレギュレーションが好ましい:pmrA、pmrB、pmrE、およびpmrF。本発明の免疫原性組成物はさらにインフルエンザ菌由来のOMV調製物を含んでもよい。遺伝子操作したOMV調製物はWO0109350に記載の通りインフルエンザ菌から誘導することができる。次の遺伝子保護抗原をコードするの1以上のアップレギュレーションが好ましい:D15WO9412641、P6EP281673、TbpAW09640929;W09513370、TbpBW09640929;W09513370、P2、P5WO9426304、OMP26WO9701638、HMW1、HMW2、HMW3、HMW4、Hia、Hsf、Hap、Hin47、およびHifピリンをアップレギュレーションするには、このオペロン内の全ての遺伝子をアップレギュレーションすべきである。これらはまた、非相同的に他のグラム陰性菌中に導入しうる遺伝子としても好ましい。次の遺伝子の1以上はダウンレギュレーションが好ましい:P2、P5、Hif、IgAlプロテアーゼ、HgpA、HgpB、HMW1、HMW2、Hxu、htrB、msbBおよびlpxK。次の遺伝子の1以上はアップレギュレーションが好ましい:pmrA、pmrB、pmrE、およびpmrF。本発明の免疫原性組成物/ワクチンはまた、任意に、ジフテリア、破傷風および百日咳菌感染の1以上に対する保護を与える抗原を含むことができる。百日咳成分は、PT、FHAおよび69kDaのペルタクチンからの少なくとも1つの抗原好適には2または3つ全てを含有する死滅全細胞細胞百日咳菌Pwまたは無細胞百日咳菌Paであってもよい。典型的には、ジフテリアおよび破傷風に対する保護を与える抗原はジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドでありうる。トキソイドは化学的に不活化した毒素または点突然変異の導入により不活化した毒素であってもよい。免疫原性組成物/ワクチンはまた、任意に、型決定できないインフルエンザ菌、RSVに対して宿主を保護しうる1以上の抗原および/またはインフルエンザウイルスに対して宿主を保護しうる1以上の抗原を含む。かかるワクチンは包括的中耳炎ワクチンとして有利に用いることができる。好ましい型決定できないインフルエンザ菌タンパク質抗原には、フィンブリンFimbrinタンパク質米国特許第5766608号およびそれからのペプチドを含む融合体例えば、LB1融合体米国特許第5843464号OhioStateResearchFoundation、OMP26、P6、タンパク質D、TbpA、TbpB、Hia、Hmwl、Hmw2、Hap、およびD15が含まれる。好ましいインフルエンザウイルス抗原には、卵またはMDCK細胞、またはVero細胞または全fluビロソーム内で増殖した全ウイルス、生ウイルスまたは不活化ウイルス、スプリットインフルエンザウイルスRGluckVaccine199210915920に記載またはそれらの精製または組換えタンパク質、例えば、HA、NP、NA、またはMタンパク質、またはそれらの組み合わせが含まれる。好ましいRSV呼吸器合胞体ウイルス抗原には、F糖タンパク質、G糖タンパク質、HNタンパク質、Mタンパク質またはそれらの誘導体が含まれる。本発明の免疫原性組成物は、カタル球菌のタンパク質、例えば、TbpAW09713785;W09952947、TbpBW09713785;W09952947;MathersetalFEMSImmunolMedMicrobiol199719231236;MyersetalInfectImmun19986641834192、LbpA、LbpBDuetalInfectImmun199866;36563665、UspAl、UspA2AebietalInfectImmun199765;43674377、OMP106US6214981、TonB依存性受容体WO0078968、CopBSethietalInfectImmun19976536663671、およびHasR受容体WO0078968;インフルエンザ菌のタンパク質、例えば、HMWStGemeetalInfectImmun199866;364368、HiaStGemeetalJBacteriol2000182;60056013、TbplW09640929;W09513370、Tbp2W09640929;W09513370;GrayOwenetalInfectImmun199563;12011210、LbpA、LbpBSchryversetal198929:121130、HasR、TonB依存性受容体FleishmannetalScience1995269;496512が含まれる]、ヘモグロビン結合タンパク質[HhuACopeetalInfectImmun200068;40924101、HgpAMaciveretalInfectImmun199664;37033712、HgbA、HgbBおよびHgbCJinetalInfectImmun199664;31343141、HxuACopeetalMolMicrobiol199413;863873、HxuCCopeetalInfectImmun20016923532363;髄膜炎菌由来のタンパク質、例えば、Tbpl、Tbp2、FbpA、FbpB、BfrA、BfrBTettelinetalScience2000287;18091815、LbpA、LbpBおよびHmbRを含みうる。本発明の一態様においては、キメラタンパク質を第2の抗原と組み合わせて髄膜炎菌L2免疫型に対する抗体応答を生じることができる免疫原性組成物を提供する。一態様において、その免疫原性組成物は全てのL1~L12免疫型に対して保護性がある。一態様において、第2の抗原はL2LOS、TdfI、Hap、Hsf、TdfHから選択される。一態様において、第2の抗原はTdfIである。髄膜炎菌L2免疫型に対して抗体応答を生じることができる抗原はいずれかの好適な抗原、好適にはL2血清型による感染によって引き起こされる感染または疾患を保護または改善する免疫応答を生じることができる抗原でありうる。第2の抗原は全長野生型タンパク質であってもよく、またはその免疫原性変異体、例えば、欠失、付加または置換突然変異体、またはその野生型タンパク質と少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90または少なくとも95同一性を有するポリペプチド、またはその抗原の10、20、30、40、50個またはそれ以上の隣接アミノ酸を有するポリペプチドであってもよい。一態様において、抗原は髄膜炎菌L2免疫型および/または髄膜炎菌ST11クローン複合体その多くはL2免疫型であるの>50、>60、>70、>80、>90、さらに好適には髄膜炎菌L2免疫型および/または髄膜炎菌ST11クローン複合体の実質的に全てによりコードされるかまたは発現される抗原であって、さらに好適には、この発現は所与の国または領域で循環中の菌株について決定されるものである。一態様において、抗原はL2LOS、TdfI、Hap、Hsfまたはそれらの2種以上の抗原の組み合わせから選択される。これらの抗原をさらに詳しく以下に考察する。本発明の一態様においては、キメラタンパク質をST269クローン複合体に対して有効な第2の抗原と組み合わせる。一態様においては、ST269クローン複合体に対して有効な抗原はTdfI、Hap、Hsf、TdfHまたはそれらの2種以上の抗原の組み合わせから選択される。これらの抗原をさらに詳しく以下に考察する。第2の抗原は全長野生型タンパク質であってもよく、またはその免疫原性変異体、例えば、欠失、付加または置換突然変異体、または野生型タンパク質と少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90または少なくとも95同一性を有するポリペプチド、またはその抗原の10、20、30、40、50個またはそれ以上の隣接アミノ酸を有するポリペプチドであってもよい。Hsf:Hsfは自己輸送体タンパク質に共通する構造を有する。例えば、髄膜炎菌株H4476由来のHsfは、アミノ酸1~51で作られたシグナル配列、表面に曝されかつ可変域アミノ酸52~106、121~124、191~210および230~234を含有する成熟タンパク質のアミノ末端の頭部領域アミノ酸52~479、頸部領域アミノ酸480~509、疎水性αヘリックス領域アミノ酸518~529、ならびに4つの膜貫通鎖が外膜に架かるアンカードメインアミノ酸539591から構成される。好適には、全長Hsfを本発明の免疫原性組成物に用いる。また、ワクチンの型に応じて様々なHsf末端切断体および欠失体も用いることができる。Hsfをサブユニットワクチンに用いる場合、可溶性パッセンジャードメインの部分;例えば、アミノ酸52~479の完全ドメイン、最も好適にはその保存部分、例えば特に有利な配列のアミノ酸134~479を用いることが好ましい。Hsfの好ましい形態はWO0155182に開示されたタンパク質の可変域を欠失するために末端切断してもよい。好適な変異体はWO0155182に定義された1、2、3、4、または5つの可変域の欠失を含みうる。前記および後記の配列は、1、3、5、7、10または15個以下のアミノ酸だけ、NまたはC末端のいずれかまたは両方において伸長または末端切断することができる。好適なHsfの断片は、それ故に、Hsfの完全な頭部領域、好適にはアミノ酸52~473を含有する。Hsfのさらなる好ましい断片には、次の配列の1以上を含む表面に曝された頭部領域が含まれる;52~62、76~93、116~134、147~157、157~175、199~211、230~252、252~270、284~306、328~338、362~391、408~418、430~440および469~479。Hsfが外膜小胞調製物に存在する場合、これは全長タンパク質として、または好適にはアミノ酸1~51と134~591の融合体から作られる有利な変異体アミノ酸配列134~C末端の成熟外膜タンパク質を生じるとして発現されうる。Hsfの好ましい形態は、WO0155182に開示されたタンパク質の可変域を欠失するように末端切断されていてもよい。好ましい変異体はWO0155182に定義された1、2、3、4、または5つの可変域の欠失を含みうる。一態様において、第1および第2可変域が欠失されている。好適な変異体はアミノ酸配列52~237または54~237の間の残基を欠失しうるし、さらに好適にはアミノ酸52~133または55~133の間の残基を欠失しうる。成熟タンパク質はシグナルペプチドを欠きうる。Hap:髄膜炎菌からのHap様タンパク質のコンピューター分析は少なくとも3つの構造ドメインを示す。参照配列として、菌株H4476からのHap様配列を考えると、ドメイン1はアミノ酸1~42を含み、自己輸送体ファミリーの特徴であるsec依存性シグナルペプチドをコードし、ドメイン2はアミノ酸43~950を含み、表面が曝されかつ免疫系に接近可能と思われるパッセンジャードメインをコードし、ドメイン3は残基951~C末端1457を含み、バレル構造中に組込まれかつ外膜中に繋ぎ止められるアンカーされると思われるβ鎖をコードする。ドメイン2は表面に曝され、よく保存され試験した全ての菌株中の80超そして大腸菌においてサブユニット抗原として生産しうると思われるので、これは興味深いワクチン候補を代表する。ドメイン2および3は表面に曝されいると思われ、よく保存されているのでPizzaetalScience28718161820、これらは興味深いワクチン候補を代表する。ドメイン2はパッセンジャードメインとして公知である。本発明の免疫原性組成物は、好適には、OMV中に組込まれた、全長Hapタンパク質を含みうる。本発明の免疫原性組成物はまた、菌株H4476においてアミノ酸残基43~950から構成されるHapのパッセンジャードメインを含みうる。Hapのこの断片は、本発明のサブユニット組成物に用いると有利でありうる。Hapのパッセンジャーについての前記配列は1、3、5、7、10、15、20、25、または30個以下のアミノ酸だけ、NまたはC末端のいずれかまたは両方において伸長または末端切断してもよい。TdfI:ナイセリア菌抗原NMB0964NMB番号はwwwneisseriaorgから利用しうる髄膜炎菌B群ゲノム配列を意味する[菌株Z2491の髄膜炎菌グループAゲノムにおけるNMA1161として、およびWO0055327におけるBASB082として、およびZnuDとして公知]はナイセリア菌全体に保存される抗原であって或る範囲のナイセリア菌株に対する細菌抗体を誘発することができる。この抗原は細菌においてZn2受容体として機能し、そしてその発現は培地中のZn2のレベルにより調節される。本明細書における用語TdfIまたはNMB0964ポリペプチドは、一般に、ナイセリア菌株由来のTdfI遺伝子によりコードされたナイセリア菌TdfIポリペプチドを含むこのタンパク質はナイセリア菌株の間でよく保存されているので、当業者は特定のナイセリア菌株の同一性を容易に識別することができる。この用語はそれ故に、NMA1161配列、およびWO0055327のBASB082ポリペプチド配列およびBASB082ポリペプチドに関する本発明の全てのポリペプチドを含む。例えば、本発明のTdfINMB0964ポリペプチドは、WO0055327の配列番号2、または前記配列番号2と70、80、90または95超の配列同一性をもつポリペプチド、または前記配列番号2からの7、10、12、15または20個またはそれを超えるの隣接アミノ酸の免疫原性断片特に、必要であれば、タンパク質担体とカップリングした時に前記配列番号2を認識できる免疫応答を誘発することができる前記免疫原性断片を含むポリペプチドを包含する。特に好ましいNMB0964免疫原性断片の実施形態は、いずれか所与のNMB0964配列に適用した図7の位相幾何学図に示した細胞外ループ配列である。特に、第9細胞外ループが提供されるここで2つのCys残基は任意にジスルフィド結合しているかまたはしていない。前記NMB0964免疫原性の断片ポリペプチド配列は、WO0055327の配列番号2からの図7に定義した前記細胞外ループ配列と70、80、90または95を超える配列同一性を有しうるか、またはWO0055327の配列番号2からの図7に定義した前記細胞外ループ配列からの7、10、12、15または20個またはそれを超えるの隣接アミノ酸の免疫原性断片特に、必要であればタンパク質担体とカップリングした場合WO0055327の前記配列番号2を認識できる免疫応答を誘発することができる前記免疫原性断片を含むポリペプチドであってもよく、そして本発明のNMB0964ポリペプチドとして提供される。前記NMB0964免疫原性の断片ポリペプチド配列は、図7に与えた第3の細胞外ループ配列ここで、任意に、2つのCys残基は保存されるべきであり、かつジスルフィド結合していてもいなくてもよいからの配列と70、80、90または95、99または100を超える配列同一性を有しうるか、または前記細胞外ループ配列からの7、10、12、15または20個またはそれを超えるの隣接アミノ酸の免疫原性断片特に、必要に応じてタンパク質担体とカップリングした場合WO0055327の前記配列番号2を認識できる免疫応答を誘発することができる前記免疫原性断片を含むポリペプチドであってもよく、そして本発明のNMB0964ポリペプチドとして提供される。一実施形態において、このNMB0964免疫原性の断片ポリペプチドは全長NMB0964成熟配列またはシグナルを伴う配列ポリペプチドではない。一態様においては、NMB0964をサブユニットワクチン手法の単離抗原として用いることができる。他の態様においては、NMB0964抗原を、被験者に投与すると抗NMB0964抗体を誘発する小胞の生産を提供するのに十分なレベルのNMB0964ポリペプチドを生産するナイセリア種細菌Neisseriaspeciesbacteriumから調製した単離された外膜小胞;および製薬上許容される賦形剤の形態で用いることができる。これはNMB0964ポリペプチド生産を遺伝的に改変したナイセリア種細菌によって達成することができるのであって、その遺伝的改変は、例えば:ZurリプレッサーNMB1266培地中のZn2の存在でNMB0964の発現をスイッチオフするタンパク質の機能性発現を破壊すること;NMB0964プロモーターをZurと結合しないもの、特に内因性NMB0964プロモーターより強いプロモーター、例えばlacプロモーターと置換えることにより;または、Zn2濃度の低いすなわち5、4、3、2、1、09、08、07、06、05、04、03、02、01、005または001μM未満のフリーZn2培地、例えば、ICPMSによりおよそ169μMZn2を有するRoswellParkMemorialInstitute培地1640RPMIの使用、または、例えば、公知の亜鉛キレート剤、例えばTPENNNNNテトラキスエチレンジアミンを用いる培地のZn2の除去NMB0964の発現を最大化するように培地に十分加えるべきであるを介して行われる。ナイセリア種細菌を、例えば、siaD遺伝子の機能性発現の破壊を通して莢膜多糖を枯渇させてもよい。msbBおよび/またはhtrB遺伝子の機能性発現を破壊して外膜小胞中のLOSを解毒してもよい。1以上の次の遺伝子:PorA、PorB、OpA、OpC、PilC、またはFrpBの発現を破壊してもよい。lgtB遺伝子の機能性発現を破壊してもよい。かかる破壊はWO0109350およびWO2004014417に記載されている。ナイセリア種細菌は免疫型L2またはL3であってもよい。ナイセリア菌株から外膜小胞ミクロ小胞またはブレブとしても知られるを調製または単離する方法は当技術分野で周知であり、WO0109350およびWO2004014417に、そして以下にも記載されている。典型的には、外膜小胞を、界面活性剤なしで、または0~05、002~04、004~03、006~02、または008~015界面活性剤を用いてのいずれか、例えばデオキシコール酸、例えば、およそまたは正確に01デオキシコール酸を用いて抽出することにより単離する。Zn2の低い特定の培養条件において調製した、または、NMB0964を過剰発現するようにもしくはZurを介して亜鉛抑制機構を除去するように遺伝子操作して作った突然変異体髄膜炎菌株から調製したOMVワクチンはNMB0964が濃厚であり、従って、かかるOMVはこれらの方法で調製しなかったOMVと比較して優れた細菌抗体応答を誘発することができる。一態様において、本発明は、被験者に投与すると抗NMB0964抗体を誘発する小胞の生産を提供するのに十分なNMB0964ポリペプチドのレベルを生産するナイセリア種細菌から調製した単離された外膜小胞を含む免疫原性組成物;および製薬上許容される賦形剤を含むものである免疫原性組成物に関する。NMB0964ポリペプチドはナイセリア種細菌にとって内因性であってもよい。ナイセリア種細菌は、外因性NMB0964ポリペプチドをコードする核酸を含有するように遺伝的に改変してもよい。NMB0964ポリペプチドは内因性プロモーターをもつNMB0964遺伝子から発現することができる。ナイセリア種細菌はNMB0964ポリペプチド生産を遺伝的に改変することができる。ナイセリア種細菌はZurリプレッサーNMB1266の機能性発現の破壊を通して遺伝的に改変することができる。ナイセリア種細菌を遺伝的に改変して異種プロモーターからNMB0964ポリペプチドを発現させることができる。一態様において、この異種プロモーターはZurリプレッサーと結合しない。一態様において、この異種プロモーターはナイセリア種細菌において、NMB0964遺伝子の非抑制型内因性プロモーターより強力なプロモーターである。一態様において、この異種プロモーターはIPTG誘導性lacプロモーターである。一態様において、ナイセリア種細菌により生産されるNMB0964ポリペプチドのレベルはトリプシンソイブロスTSBで増殖した髄膜炎菌株H4476により作られたものより高い。一態様において、ナイセリア種細菌により生産されるNMB0964ポリペプチドのレベルはRoswellParkMemorialInstitute培地1640RPMIで作られるものと同じかまたはそれより高い。一態様において、ナイセリア種細菌により生産されるNMB0964ポリペプチドのレベルは、RoswellParkMemorialInstitute培地1640RPMIで1μMTPENNNNNテトラキスエチレンジアミンを用いて増殖した髄膜炎菌株H4476により作られるものと同じかまたはそれより高い。一態様において、ナイセリア種細菌により生産されるNMB0964ポリペプチドのレベルは、髄膜炎菌株H4476により、5、4、3、2、1、09、08、07、06、05、04、03、02、01、005または001μMより低いフリーZn2を有する培地において作られるものと同じかまたはそれより高い。一態様において、ナイセリア種細菌は髄膜炎菌、または髄膜炎菌血清群Bである。一態様において、ナイセリア種細菌は莢膜多糖を欠く。一態様において、ナイセリア種細菌はsiaD遺伝子の機能性発現の破壊を通して莢膜多糖を欠く。一態様において、ナイセリア種細菌はmsbBおよび/またはhtrB遺伝子の機能性発現が破壊されている。一態様において、ナイセリア種細菌は次の遺伝子:PorA、PorB、OpA、OpC、PilC、またはFrpBの1以上の発現が破壊されている。一態様において、ナイセリア種細菌はlgtB遺伝子の機能性発現が破壊されている。一態様において、ナイセリア種細菌は免疫型L2またはL3である。一態様においては、外膜小胞を0~05、002~04、004~03、006~02、または008~015界面活性剤、例えばデオキシコール酸、例えば、およそまたは正確に01デオキシコール酸を用いて抽出することにより単離する。本発明は、免疫原性組成物を生産する方法であって、被験者に投与すると抗NMB0964抗体を誘発する外膜小胞の生産を提供するのに十分なレベルのNMB0964ポリペプチドを生産するナイセリア種細菌を培養するステップ;培養した細菌から外膜小胞を調製するステップ;および外膜小胞を製薬上許容される賦形剤と組み合わせてfHbpポリペプチドとの組み合わせで被験者に投与するのに好適な免疫原性組成物を生産するステップを含むものである前記方法に関する。一態様において、NMB0964ポリペプチドはナイセリア種細菌に内因性である。一態様においては、ナイセリア種細菌は遺伝的に改変されていて外因性NMB0964ポリペプチドをコードする核酸を含有する。一態様においては、NMB0964ポリペプチドは内因性プロモーターをもつNMB0964遺伝子から発現される。一態様において、ナイセリア種細菌はNMB0964ポリペプチド生産において遺伝的に改変されている。一態様において、ナイセリア種細菌はZurリプレッサーの機能性発現の破壊を通して遺伝的に改変されているNMB1266。一態様においては、ナイセリア種細菌を遺伝的に改変して異種プロモーターからのNMB0964ポリペプチドの発現を提供する。一態様において、異種プロモーターはZurリプレッサーと結合しない。一態様において、異種プロモーターはナイセリア種細菌において、NMB0964遺伝子の非抑制型内因性プロモーターより強力なプロモーターである。一態様において、異種プロモーターはIPTG誘導性lacプロモーターである。一態様において、ナイセリア種細菌により生産されるNMB0964ポリペプチドのレベルは、トリプシンソイブロスTSB中で増殖した髄膜炎菌株H4476により作られるレベルより高い。一態様において、ナイセリア種細菌により生産されるNMB0964ポリペプチドのレベルは、RoswellParkMemorialInstitute培地1640RPMIで増殖した髄膜炎菌株H4476により作られるレベルと同じかまたはそれより高い。一態様において、ナイセリア種細菌により生産されるNMB0964ポリペプチドのレベルは、1μMTPENNNNNテトラキス2ピリジルメチルエチレンジアミンを伴うRoswellParkMemorialInstitute培地1640RPMIで増殖した髄膜炎菌株H4476により作られるレベルと同じかまたはそれより高い。一態様において、ナイセリア種細菌により生産されるNMB0964ポリペプチドのレベルは、5、4、3、2、1、09、08、07、06、05、04、03、02、01、005または001μM未満のフリーZn2を有する培地中の髄膜炎菌株H4476により作られるレベルと同じかまたはそれより高い。一態様において、ナイセリア種細菌の培養は、5、4、3、2、1、09、08、07、06、05、04、03、02、01、005または001μM未満のフリーZn2を有する培地で行われる。一態様においては、ナイセリア種細菌の培養をZn2キレート剤を含む培地にて行う。一態様において、Zn2キレート剤は培地に001~100、01~10、03~5、または05~1μMの濃度で存在する。一態様において、培地に存在するZn2キレート剤はTPENであり、好適には1~25μMの範囲の濃度、好適には5μM、10μM、15μM、20μMまたは25μMの濃度で存在する。一態様において、外膜小胞を調製するステップは、0~05、002~04、004~03、006~02、または008~015の界面活性剤、例えばデオキシコール酸、例えば、およそまたは正確に05または01デオキシコール酸を用いて抽出することにより行う。一態様において、外膜小胞を調製するステップは、界面活性剤を用いることなく行う。一態様においては、fHbpポリペプチドを、次の配列:RDQYGLPAHSHEYDDCHADIIWQKSLINKRYLQLYPHLLTEEDIDYDNPGLSCGFHDDDNAHAHTHSと50、60、70、80、90、95、99以上、または100配列同一性を共有するペプチド配列、または前記配列からの7、10、12、15または20個またはそれ以上の隣接アミノ酸の免疫原性断片を含む場合によっては、ここで、前記ペプチド配列もしくは前記免疫原性の断片はもし必要であればタンパク質担体とカップリングして、WO0055327の配列番号2を認識できる免疫応答を誘発することができるポリペプチド、ならびに、製薬上許容される担体と組み合わせる。一態様においては、2つのCys残基がポリペプチドに存在し、そしてジスルフィド連結されていてもよい。一態様において、ポリペプチドは全長成熟NMB0964ポリペプチドでないか、または無傷のシグナル配列をもつ全長成熟NMB0964ポリペプチドでない。LPSリポ多糖、LOSまたはリポオリゴ糖としても知られるはナイセリア菌の外膜上の内毒素である。LPSの多糖部分が細菌抗体を誘発することは公知である。LOSの構造および機能は、VerheulMicrobiologicalreviewsMarch1993Vol57no1p3449に記載されている。LPSのオリゴ糖部分内の不均一性は色々なナイセリア菌株間の構造および抗原的多様性を生じるGriffissetalInfImmun19875517921800。これが髄膜炎菌株をL2免疫型に区分するのに使われているScholtanetalJMedMicrobiol199441236243。免疫型L3、L7、およびL9は免疫学的にまた構造的に類似しておりあるいは同じですらあるそれ故にL3、7、9または本明細書の目的に対しては同族的にL3と呼んでいる。髄膜炎菌のLPSL3、7、9L3、L2およびL5はシアル酸付加により、またはシチジン5一リン酸Nアセチルノイラミン酸の付加により改変することができる。LPS構造および不均一性のさらなる説明については、MPJenningsetalMicrobiology199914530133021およびMolMicrobiol20024393143を参照されたい。L2LOSはL2免疫型を規定し、従って、fHbp系ワクチンを補充する潜在的抗原である。L2LOSは好適にはナイセリア菌L2免疫型を死滅させることができる抗体を作製する。一態様において、本明細書のL2LOSに対する言及はL3V菌株を含む。L2LOSは外膜小胞OMV中に存在しうる好適には、前記小胞を低パーセントの界面活性剤、より好適には0~05、002~04、004~03、006~02、008~015または01、最も好適にはデオキシコール酸DOCを用いて抽出するが、サブユニットワクチンの部分であってもよい。LOSは単味で、またはT細胞エピトープの供給源、例えば、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、CRM197またはOMV外膜タンパク質と結合して用いることができる。L2LOSを解毒してもよい。かかる態様の全ての詳細を、以下にさらに詳しく、LOSの選択と調製に関連して記載する。LPS、好適には髄膜炎菌のLPSが本発明のワクチンに含まれる場合、好適には、免疫型L2およびL3のいずれかまたは両方が存在する。一態様において、第2の抗原は内部コアのHepII上の位置6に少なくともPEAを有する髄膜炎菌LPSであって、このHepII上に第2のPEAまたはグルコースを伴うかまたは伴わない。抗原の組み合わせが本明細書に開示されている場合、これらの抗原は同時に、例えば、混合物で、または同時に、または併用して送達されてもよく、またキットの成分であってもよい。一態様において、本発明はまた、融合タンパク質を製薬上許容される賦形剤との組み合わせで含む医薬組成物に関する。好適な賦形剤は当技術分野で周知である。好適な賦形剤は、典型的には、大きい、徐々に代謝される高分子、例えば、タンパク質、糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、アミノ酸ポリマー、アミノ酸コポリマー、スクロースPaolettietal2001Vaccine192118、トレハロースWO0056365、ラクトースおよび脂質凝集物例えば、油滴またはリポソームである。当業者はかかる担体を周知している。ワクチンはまた希釈剤、例えば、水、生理食塩水、グリセロール、などを含有する。さらに、助剤、例えば、湿潤または乳濁化剤、pH緩衝剤などが存在してもよい。無菌で発熱物質を含まないリン酸緩衝化生理食塩水が典型的な担体である。製薬上許容される賦形剤の徹底した考察は、Gennaro2000RemingtonTheScienceandPracticeofPharmacy20suptheditionISBN0683306472に記載されている。本発明の好ましい実施形態は、本明細書で開示した融合タンパク質または他の免疫原性組成物の、製薬上許容される賦形剤または担体も含んでよいワクチンでの製剤である。ワクチン調製は、一般に、VaccineDesignThesubunitandadjuvantapproachサブユニットとアジュバント手法PlenumPressNewYorkに記載されている。有効なワクチンの開発は、有効な免疫応答がワクチン接種した個人に誘発されたかどうかを確立する信頼できる試験を必要とする。髄膜炎については、血清殺菌活性SBA試験法を用いて、ワクチンに封入するのに好適な抗原を決定することができ、好適には、SBAの4倍増加を保護の代理指標として受け入れることができる。従って、SBAの4倍増加を誘発しうる用量を保護用量または有効量として受け入れることができる。特に、本発明のワクチンまたは免疫原性組成物は、その組成物中に、記載した単離および/または精製抗原のそれぞれの001、002、003、004、005、006、007、008、009、01、02、03、04、05、06、07、08、09、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10μgまたはそれ以上のヒト用量を含みうる。本発明の医薬組成物またはワクチンはまた、アジュバントを含んでもよい。好適なアジュバントには、アルミニウム塩、例えば水酸化アルミニウムゲルミョウバンまたはリン酸アルミニウムが含まれるが、またカルシウムの塩特に炭酸カルシウム、鉄または亜鉛の塩であってもよく、またはアシル化チロシン、またはアシル化糖類、カチオンまたはアニオンとして誘導体化された多糖類、またはポリホスファゼン類の不溶懸濁液であってもよい。利用できる好適なThlアジュバント系には、モノホスホリルリピドA、特に3デOアシル化モノホスホリルリピドA、およびモノホスホリルリピドA、好適には3デOアシル化モノホスホリルリピドA3DMPLのアルミニウム塩好適にはリン酸アルミニウムとの組み合わせが含まれる。増強系は、モノホスホリルリピドAとサポニン誘導体の組み合わせ、特にWO9400153に開示されたQS21と3DMPLの組み合わせ、または、W09633739に開示されたQS21をコレステロールによってクエンチした低反応原性組成に関わる。水中油乳濁液中のQS213DMPLおよびトコフェロールに関わる特に強力なアジュバント製剤はW09517210に記載され、好ましい製剤である。ワクチンはサポニン、さらに好適にはQS21を含んでもよい。ワクチンはまた、水中油乳濁液およびトコフェロールを含んでもよい。オリゴヌクレオチドを含有する非メチル化CpGWO9602555もまた、TH1応答の好ましいインデューサーであり、本発明における使用に好適である。本発明の他の態様はナイセリア菌感染の予防または治療に用いるための免疫グロブリンを調製する方法であって、受給者を本発明のワクチンを用いて免疫感作するステップおよび免疫グロブリンを受給者から単離するステップを含むものである前記方法である。この方法により調製される免疫グロブリンは本発明のさらなる態様である。本発明の免疫グロブリンおよび製薬上許容される担体を含む医薬組成物は本発明のさらなる態様であって、この態様はナイセリア菌疾患を治療または予防するための医薬品の製造に用いることができる。患者に有効量の本発明の医薬調製物を投与するステップを含むものである、ナイセリア菌感染を治療または予防する方法は本発明のさらなる態様である。ポリクローナル抗体生産のための接種材料は、典型的には、抗原性組成物を生理学的に許容される希釈剤、例えば生理食塩水またはヒト使用に好適な他のアジュバントに希釈して水性組成物を形成することにより調製する。接種材料の免疫刺激量を哺乳動物に投与し、次いで接種した哺乳動物を、保護抗体を誘発するのに十分な時間、維持する。抗体を、アフィニティクロマトグラフィなどの周知の技法により所望の程度まで単離することができるHarlowandLaneAntibodiesalaboratorymanual1988。抗体は様々な通常用いる動物、例えば、ヤギ、霊長類、ロバ、ブタ、ウマ、モルモット、ラットまたはヒトからの抗血清調製物を含みうる。動物から採血して血清を回収する。本発明によって生産される免疫グロブリンには全抗体、抗体断片またはサブフラグメントが含まれる。抗体はいずれかのクラスの全免疫グロブリン、例えば、IgG、IgM、IgA、IgDまたはIgE、本発明の2種以上の抗原に二重特異性をもつキメラ抗体またはハイブリッド抗体であってもよい。これらはまた、フラグメント、例えば、F2、Fab、Fab、Fvなどであってもよく、ハイブリッドフラグメントを含む。免疫グロブリンはまた、特異的抗原と結合して複合体を形成することにより抗体のように作用する天然、合成または遺伝子操作で作られたタンパク質も含む。特異的なワクチンからのチャレンジに応答して生産される免疫グロブリンの供給源となる受給者に、本発明のワクチンを投与することができる。このように処置した被験者が提供する血漿から、過免疫グロブリンが通常の血漿分画手法を介して得られる。ナイセリア菌感染に対する耐性を与えるかまたはナイセリア菌感染を治療するために、耐性過免疫グロブリンを他の被験者に投与しうる。幼児、免疫無防備状態の個体におけるナイセリア菌疾患の治療もしくは予防に、または治療が必要であるがその個体にワクチン接種に応答して抗体を生産する時間が無い場合、本発明の過免疫グロブリンは特に有用である。本発明のさらなる態様は、本発明の免疫原性組成物の少なくとも2つの構成成分に対して反応性のさらなるモノクローナル抗体またはそれらのフラグメント;好適にはヒトもしくはヒト化したの2つ以上を含む医薬組成物であって、グラム陰性菌、好適にはナイセリア菌、より好適には髄膜炎菌または淋菌そして最も好適には髄膜炎菌血清群Bによる感染を治療または予防するために用いることができる前記免疫原性組成物である。かかる医薬組成物は、いずれかのクラスの全免疫グロブリン、例えば、IgG、IgM、IgA、IgDまたはIgE、本発明の2種以上の抗原に二重特異性をもつキメラ抗体またはハイブリッド抗体であってもよいモノクローナル抗体を含む。これらはまた、フラグメント、例えば、F2、Fab、Fab、Fvなどであってもよく、ハイブリッドフラグメントを含む。モノクローナル抗体を作る方法は当技術分野で周知であり、脾細胞の骨髄腫細胞との融合体KohlerandMilstein1975Nature256495AntibodiesalaboratorymanualHarlowandLane1988を含みうる。あるいは、モノクローナルFvフラグメントは好適なファージディスプレイライブラリーをスクリーニングすることにより得ることができるVaughanTJetal1998NatureBiotechnology16535。モノクローナル抗体は公知の方法によるヒト化または部分ヒト化したものであってもよい。本発明の他の態様は、ナイセリア菌疾患の治療または予防のための方法であって、本発明のワクチンの保護用量または有効量をそれを必要とする宿主に投与するステップを含むものである前記方法に関わる。本発明はまた、ナイセリア菌感染または疾患を治療または予防するための医薬の調製における本発明の融合ポリペプチドの使用、ならびに、髄膜炎菌感染または疾患を治療または予防するための本明細書に記載した融合タンパク質を含む。一態様において、予防はmenB感染および/または疾患に対する予防である。宿主は好適にはヒト宿主である。本発明のワクチン調製物を用いて、前記ワクチンを全身または粘膜経路を介して投与する手段により感染に感受性の哺乳動物を保護または治療することができる。これらの投与は、筋肉内、腹腔内、皮内または皮下経路を介する注入;または粘膜を介する経口/食事、呼吸器、尿生殖器路への投与を含みうる。従って、本発明の一態様は、グラム陰性菌の感染により引き起される疾患に対するヒト宿主を免疫感作する方法であって、宿主に本発明の調製物の免疫保護用量を投与するステップを含むものである前記方法である。各ワクチン用量中の抗原の量は、典型的なワクチンの有意な、有害な副作用無しに免疫保護応答を誘発する量として選択される。かかる量は、用いる具体的な免疫源および提示する方法に応じて変わりうる。一般に、各用量は1~100pg、好適には5~50pg、そして最も典型的には5~25pgのタンパク質抗原またはOMV調製物を含みうると予想される。特別なワクチンに対する最適な量は、被験者における適当な免疫応答の観察に関わる標準研究により確かめることができる。最初のワクチン接種後、十分な間隔を置いて、被験者は1回または数回の追加免疫を受けることができる。本発明のワクチンは、好適な免疫保護を与えかつ無毒であって小児期または青年期に対する使用に好適である。小児期の使用は4歳未満の幼児における使用を意味する。免疫保護は、先に記載のSBAおよび/または動物保護モデルおよび/または接着阻止試験法に満足に適合することを意味する。無毒は、公知のLALおよび発熱性試験法により測定したワクチンの内毒素活性を満足するレベルを超えないことを意味する。ワクチンの効力は様々な試験法を通して試験することができる。動物モデルの保護試験法は当技術分野で周知である。さらに、血清殺菌試験法SBAは、髄膜炎菌ワクチンの効力を見積るための最も通常認められる免疫学的マーカーであるPerkinsetalJInfectDis1998177683691。かかる相乗的応答は、各抗原によって別々に誘発されるSBAより少なくとも50、2倍、3倍、好適には4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍そして最も好適には10倍高い抗原の組み合わせにより誘発されるSBAによって特徴付けることができる。一態様においては、SBAを抗原が誘導された同種菌株に対して、および、好適にはまた、異種菌株のパネルに対しても測定する代表的なパネルについては以下を参照されたい:例えば、A4クラスターに属するBZ10;ET37複合体に属するB16B6;H4476、NZ12498、および760676、ET37複合体に属するB16B6、およびET5複合体に属するH4476、または同じETクラスターに属する他の任意の菌株。例えばET5複合体に属する髄膜炎菌CU385B4P115から製造されたまたはそれに由来する、異種殺菌活性を有する抗原またはブレブ調製物を試験するために、かかる菌株を使用することが可能である。使用しうるもう1つのサンプル株は系統3流行性クローン例えば、NZ124B4P174由来である。もう1つのET37株はNGP165である。SBA活性の測定方法は当技術分野において公知である。例えば、使用しうる方法はWO9909176の実施例10Cに記載されている。一般には、被験株の培養物を好ましくは、鉄キレート剤、例えばEDDAの増殖培地への添加による鉄枯渇条件にて、または亜鉛キレート剤、例えばTPENを増殖培地、例えばMH寒天への添加による亜鉛枯渇の条件にて対数増殖期まで増殖させる。約20000CFUmlに調節された試験用細胞懸濁液を得るために、これを、BSAを含有する培地例えば、03BSAを含有するハンクス培地に懸濁させることが可能である。被験血清の2倍連続希釈液好ましくは、56°Cで30分間熱不活化されたもの[例えば、50μlウェルの容量中]と20000CFUml被験髄膜炎菌株懸濁液[例えば、25μlウェル体積の]とを混合することにより、一連の反応混合物を調製することができる。反応バイアルをインキュベート例えば、37°Cで15分間し、振とう例えば、210rpmしなければならない。最終反応混合物[例えば、100μl容量]は更に、補体源[例えば、25最終容量の予備試験された子ウサギ血清]を含有し、それを前記のとおりに[例えば、37°Cで60分間]インキュベートする。この試験法には無菌ポリスチレンU底96ウェルマイクロタイタープレートを使用することができる。アリコート[例えば、10μl]を、マルチチャンネルピペットを使用して各ウェルから採取し、ミュラーヒントンMuellerHinton寒天プレート好適には、1Isovitalexおよび1熱不活化ウマ血清を含有する上に滴下し、インキュベートする例えば、5CO2中、37°Cで18時間。一態様においては、個々のコロニーをアリコート当たり80CFUまで数えることができる。次の3つの試験サンプルを対照として用いることができる:バッファー細菌補体;バッファー細菌不活化補体;血清細菌不活化補体。SBA力価は、データを処理して回帰計算により50の細胞死に対応する希釈の測定値を与えるプログラムを用いて、簡単に計算することができる。あるいは、相乗的応答を、抗原の組み合わせの動物保護試験法における効力により特徴付けることができる。例えば、実施例12または13に記載の試験法を用いることができる。一態様においては、抗原の組み合わせにより保護された動物数は、抗原を単独で用いるのと比較して、特に準最適用量の抗原において有意に改善される。淋菌による感染の予防に対して好成績のワクチンは次の要素の2以上を必要としうる:補体が介在する淋菌死滅を促進するためおよび/または白血球、例えば多形核白血球による食作用および細菌死滅を増強するためおよび/または淋菌の宿主組織への付着を阻止する血清および/または粘膜の抗体の生産。細胞が介在する免疫応答の誘導も保護に参加しうる。本発明のブレブ淋菌ワクチン調製物の効力の改善は他の文献に記載された、血清および/または抗付着性を有する粘膜抗体、および/またはオプソニン化特性および/または殺菌活性に対して誘導される免疫応答を分析することにより評価することができるMcChesneyDetalInfectImmun3610061982;BoslegoJetalEfficacytrialofapurifiedgonococclpilusvaccine精製淋菌線毛ワクチンの効力試験inProgramandAbstractsofthe24thInterscienceConferenceonAntimicrobialAgentsandChemotherapyWashingtonAmericanSocietyforMicrobiology1984;SiegelMetalJInfectDis1453001982delaPasMicrobiology141913201995。淋菌による生殖器感染のマウスモデルが最近記載されているPlanteMJInfectDis182848552000。本発明のブレブ淋菌ワクチンの効率の改善はまた、この感染のマウスモデルにおける淋菌によるコロニー形成を阻止または低下させる能力により評価することができよう。あるいは、接着阻止試験法における抗原の組み合わせの効力により相乗応答を特徴付けることができる。一態様において、抗原の組み合わせに対して生起される抗血清により誘発される阻止の程度は、単独の抗原に対して生起される抗血清を用いた場合と比較して、特に準最適用量において有意に改善される。特許出願および許可された特許を含む本出願における全ての参照の教示は、本明細書にその全てが参照により組み込まれる。本出願が優先権を主張する特許出願は、参照により本明細書にその全てが公開および参照のために本明細書に記載した方法で組み込まれるものである。疑義を避けるために記すと、本発明者らは本明細書の用語含む‘comprising’、‘comprise’および‘comprises’を任意に用語から成る‘consistingof’、‘consistof’、および‘consistsof’と、それぞれ、いずれの場合にも置換えうると意図している。本明細書および請求項において用いる、用語含むcomprisingおよびそのいずれかの形、例えば、compriseおよびcomprises、有するhavingおよびそのいずれかの形、例えば、haveおよびhas、含むincludingおよびそのいずれかの形、例えば、includesおよびincludeまたは含有するcontainingおよびそのいずれかの形、例えば、containsおよびcontainはすべてを包括的または末尾が開放的であって、追加の、挙げてないエレメントまたは方法のステップを排除するものではない。本発明のワクチン組成物に関する本明細書の実施形態はまた、本発明の免疫原性組成物に関する実施形態に適用可能であり、そして、逆も真である。全ての数値における用語約aboutまたはおよそaroundは5の変動を容認する、すなわち、約125の値は119~131の間を意味しうる。用語1つのaまたはanの使用は、請求項および/または明細書において用語含むcomprisingと関連して用いられる場合、1oneを意味しうるが、これはまた、1以上、少なくとも1、および1または1を超えるの意味と一致する。請求項における用語またはorの使用は、代わりのものだけまたは代わりのものがお互いに排他的であることを意味すると明示されなければ、および/またはandorを意味するために使われるが、本発明は代わりのものだけならびにおよび/またはandorを意味するという定義を支持する。本出願全体を通して、用語約aboutを用いて、値はその値を測定するために使われた測定誤差の固有の変動または研究対象の間に存在する変動を含むことを示す。本明細書で使用する用語またはその組み合わせは、この用語に先行する掲げられたアイテムの全ての順列と組み合わせを意味する。例えばA、B、C、またはその組み合わせは、A、B、C、AB、AC、BC、またはABCの少なくとも1つを含み、そしてもし順序が特別な文脈において重要であれば、BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC、またはCABも含むことを意図する。この例で続けると、明らかに含まれるのは、1以上のアイテムまたは用語の反復を含有する組み合わせ、例えば、BB、AAA、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABBなどである。当業者は、文脈からそうでないことが明らかでなければ、典型的にはいずれの組み合わせにおいてもアイテムまたは用語の数に制限がないことを理解するであろう。本明細書でのブレブ、小胞および外膜小胞への言及はまた、当業者に公知の全ての単離膜由来のタンパク質産物、例えば、ブレブ、マイクロ小胞、OMV、OMPC外膜タンパク質複合体、またはゴースト膜membraneghostなどへの言及であることを意図する。本明細書での全ての事例における保護のためおよび治療のためへの言及はそれぞれ、明白には代わりに予防における使用のためまたは治療における使用のためと書くことができる。本明細書で開示したおよび請求した組成物および/または方法の全ては、本開示の教示のもとで、無駄な実験なしに作りかつ実施することができる。本発明の組成物と方法は特別な実施形態を用いて記載されているが、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載された方法のステップまたは一連の複数のステップにおける組成物および/または方法に変法を適用できることは当業者に明らかであろう。当業者に明らかな全てのかかる類似した置換および改変は、添付した請求項により規定される本発明の精神、範囲および概念内にあるとみなされる。本明細書に記載した特定の実施形態は説明の方法として示されたのであって本発明を限定するものでないことは理解されよう。本発明の主な特徴は、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な実施形態において使うことができる。当業者は、通常の研究を用いて、本明細書に記載の具体的な手順との多数の等価物を確認することができるであろう。かかる等価物は、本発明の範囲内にありかつ本発明の請求の範囲内にあると考えられる。本明細書で記載した全ての出版物と特許出願は、本発明が関わる当業者の技術レベルを示すものである。あたかもそれぞれの個々の出版物と特許出願を具体的にかつ個々に参照により組み入れると示したのと同じ程度に、全ての出版物と特許出願は本明細書に参照により組み入れられる。実施例本発明をさらに、次の限定するものでない実施例を参照して記載する。融合タンパク質の製造1fHbp由来の色々な融合タンパク質を大腸菌株に発現させた。表12宿主菌株:T7ExpresscompetentEcolT7発現用コンピテント大腸菌NEBカタログ番号C2566H:増強されたBL21派生株;lacオペロン中にT7RNAポリメラーゼが組み込まれている~λプロファージ無し;LonおよびOmpTプロテアーゼ欠損株;ファージT1耐性株fhuA2;メチル化DNAMcrA、McrBC、EcoBrm、Mrrを制限しない;B菌株;動物産物を含まない。遺伝形質:fhuA2lacZT7gene1lonompTgalsulA11R2dcmRendA1Δ114IS10:。3組換えタンパク質:本明細書に例示した融合体のファミリーB部分は全長MC58配列のアミノ酸位置73から出発し、その全長配列自体はアミノ酸66にて出発する成熟配列を含む。7個のN末端アミノ酸CSSGGGG配列番号11をMHHHHHH配列番号12により置換えて精製を可能にする。もし全長MC58タンパク質配列の番号を、全長配列の残基200が成熟MC58配列の残基135に対応することを考慮すれば、融合体のMC58部分は残基200...DIAにて完了する。本明細書に例示した融合体の8047部分は全長273アミノ酸8047タンパク質配列の残基155GEH...にて始まる。ペプチドGEHT残基155~158:配列番号13はファミリーAとBにおいて同一であり、2つの部分間の継手はGly残基である。全長配列の残基155は成熟配列の136に対応する。表2配列アラインメントについては図1および2を参照されたい。4組換えタンパク質の発現:41形質転換大腸菌T7ExpressのプラスミドDNAによる形質転換を標準方法により、CaCl2処理した細胞を用いて行ったHanahanD≪PlasmidtransformationbySimanisSimanisによるプラスミド形質転換≫InGloverDMDNAcloningIRLPressLondonp109135。A:NEBカタログ番号:C2566HB:BBLSelectAPSLBブロスベース、BDMDUSAカタログ番号:292438;寒天、LaboratoireMATQCCanadaカタログ番号:AP0108C:SigmaONCanadaカタログ番号:K400042培養大腸菌T7Express形質転換51節からのプラスミドを接種したコンフルエント寒天プレートを剥ぎ取り、培地に再懸濁し、そしてこれを用いて800mlのLBブロスBD±1wvグルコースLaboratoireMAT、カタログ番号:GR0101抗生物質51節に記載の通りを接種し、OD600nm01~02を得た。培養を37°Cにて、250RPMでOD600nmおよそ08までインキュベートした。この時点で、1mlの各培養を採集し、14000RPMにて5分間遠心分離し、そして上清/ペレットを20°Cにて別々に凍結した。43誘導およそ08のOD600nmにて、培養T7Expressを冷却20°C、20分間した後、1mMイソプロピルβD1チオガラクトピラノシドIPTG;EMDChemicalsInc、カタログ番号:5815を加えることにより組換えタンパク質の発現を誘導し、そして一晩22°C、250RPMにてインキュベートした。44誘導後のサンプル調製一晩誘導した後およそ16時間、OD600nmを誘導後に評価し、培養を14000RPMにて5分間遠心分離し、そして上清/ペレットを20°Cにて別々に凍結した。5精製:細菌ペレットを、500mMNaClおよびプロテアーゼインヒビターCompleteRocheの混合物を含有する20mMビシンバッファーpH80に再懸濁した。細菌をConstantSystem11KW2X30000PSIを用いて溶菌した。可溶上清および不溶ペレット成分を遠心分離により20000gで20分間、4°Cにて分離した。6Hisタグ付きタンパク質を生来の条件のもと、IMAC上でProfinia標準プロトコル流量:2mlminを用いて精製した。可溶成分を、細菌再懸濁に用いたのと同じバッファーにより予め平衡化した5mlHisトラップカラムBioRadに加えた。カラムに添加した後、そのカラムを同じバッファーにより洗浄した。本発明者らは2回目の洗浄に500mMNaCl、10mMイミダゾールを含有する20mMビシンバッファーpH80を用いた。溶出は、500mMNaClおよび250mMイミダゾールを含有する20mMビシンバッファーpH80を用いて実施した。タンパク質はPBS1XpH74を用いて透析し、そして投与量はBioRadのDCProteinAssayを用いて決定した。SDSPage:ゲル:NuPAGE4~12BisTrisゲル10mmX15ウエルInvitrogenカタログ番号:NP0323BOX。サンプル、バッファーおよび泳動条件はメーカーInvitrogenの推奨する条件下で行った。ウェスタンブロット:バッファーの調製および泳動条件はメーカーInvitrogenの推奨する条件下で行った。膜を30分間、37°C、60RPMにて、3ミルクPBS1X新鮮溶液を用いてブロックした。ブロックするインキュベーションの後、α6XHisタグAbCam、カタログ番号:ab9108100またはαfHbpA200802032poolg2、180608D42から成り、それぞれ3ミルクPBS1Xの新鮮溶液に1:1000または1:400にて希釈した一次抗体を1時間37°C、60RPMで加えた。その後、膜を、3回、5分間室温にて002Tween20/PBS1Xを用いて洗浄した。二次抗体は、3ミルク/PBS1X新鮮溶液中のヤギ抗ウサギアルカリホスファターゼJacksonlaboratoryカタログ番号:111055144を希釈1:14000で、またはヤギアルカリホスファターゼ抗IgGIgMHLマウスJacksonlaboratoryカタログ番号:115055068を希釈1:6000で用いて、加えた。膜を1時間、37oC、60RPMでインキュベートした。その後、膜を3回、5分間室温にて002Tween20PBS1Xを用いて洗浄した後、膜をメーカーの推奨する条件下でアルカリホスファターゼ基質SigmaFastNBTBCIPカタログ番号:B565525TABに曝した。融合タンパク質Aこの融合体はファミリーBMC58成熟タンパク質配列残基1~残基135の一部とファミリーA8047成熟タンパク質配列残基136~残基254の一部を含む。この融合体において、MCSchneiderらによってタンパク質のH因子結合に関わると同定された2残基Glu217およびThr238をアラニンに突然変異させた。核酸配列におけるこれらの突然変異は次の通りである:コドンGAAnT649、Glu217はコドンGCAAla217に突然変異した。コドンACCnT712、Thr238はコドンGCCAla238に突然変異した。この融合体の配列-配列番号20長さ:254aaは次の通りである:下線を引いた配列は菌株MC58由来のファミリーB配列である。融合体の他の配列は菌株8047由来のファミリーA配列である。対応する核酸配列配列番号21:図3は融合体Aの潜在的構造を示す。融合タンパク質B配列番号22および23Glu238はH因子と結合できる全ての菌株において保存されてないので、この残基はこの結合にとって潜在的に必須ではない。そこで、融合タンパク質Bを提案した。この融合体は、アミノ酸Glu217全ての菌株で保存され、H因子結合に関わる確率が非常に高いだけをAla217に変異させた融合体Aに基づくものである。図4は融合体Bの潜在的構造を示す。融合タンパク質C融合体Aに基づくものであり、さらにいくつかの突然変異を含むこの融合体は、融合体AとBで失われたファミリーBMAb502エピトープを回復するために導入した。ファミリーB成熟タンパク質配列の残基Glu146~Arg149およびArg204はMAb502を認識する重要な残基であると同定した。残基Gly147は既にfHbpファミリーA成熟タンパク質配列中に存在する。fHbpファミリーAタンパク質配列のアミノ酸Asp146、Lys148およびSer203を、Glu146、Arg149およびArg204によりそれぞれ置換えた。さらに、グリシンを位置147に導入した。核酸配列における突然変異:Asp146→Glu146:GAC→GAAnT436Gly147の付加:GGCnT439Lys148→Arg149:AAA→AGGnT445Ser203→Arg204:TCA→CGTnT610。融合体の配列長さ:255aa配列番号24:対応する核酸配列配列番号25:図5は融合体Cの潜在的構造を示す。提案した融合タンパク質D融合タンパク質Dは融合体Cに基づくものであり、ここでは、H因子結合に関わるアミノ酸Glu218だけをAla218に突然変異した。融合タンパク質Eこの融合体は融合タンパク質Cに基づく。潜在的にMAb502認識に関わるいくつかのさらなる残基を同定した。ファミリーB成熟タンパク質配列には、Pro145、Phe227、Gly228、Lys230およびGlu233が存在する。これらの残基の役割を試験するために、融合体Eを提案した。融合体Eはこれらの残基を挿入した融合体Cである。これらの興味深い残基を融合体中に回復するためには、単独のコドン突然変異を融合タンパク質C構築物上で行わなければならない:ファミリーA成熟タンパク質配列菌株8047におけるArg230をLys230に突然変異しなければならない。融合体配列番号26長さ:255aaの配列:核酸配列における突然変異:Arg230→Lys230:CGC→AAAnT688対応する核酸配列配列番号27:図6は融合体Eの潜在構造を示す。提案した融合タンパク質Fこれは融合体Eに基づくものであって、H因子結合に関わるアミノ酸Glu218だけがAla218に突然変異している。L2髄膜炎菌株は、L3様の内部コアを含有するLOSを生産する菌株より低いレベルのfHbpを発現する方法抗原調製物組換えfHBP変異体vAおよびBをIPTG誘導後のBL21DE3大腸菌で生産し、IMACカラムを用いて精製した。fhbp配列は菌株MC58fHBPBおよび2996fHBPAから誘導した。遺伝子を、リーダー配列に対応するヌクレオチド配列が無くかつC末端にHisタグをもつpET24bプラスミドにクローニングした。組換えnadAをBL21大腸菌でも生産し、その配列は菌株2996から誘導した。動物取扱手続き:30OF1マウスのグループを3回、筋肉内IM経路により、第0、21および28日にAl3上に吸着させた精製組換えタンパク質を用いて免疫感作した。第42日に、血液サンプルを採取して血清を得た。マウス血清は実験20080232から得た。全細胞調製物を用いるウェスタンブロット髄膜炎菌株を一晩MH、寒天プレート上で37°C5CO2にて培養した。これらを4時間、MH寒天プレート上で20μMTPEN亜鉛キレート剤と共に37°C5CO2にて継代培養した。不活化は、寒天プレートから収穫した細胞をPBSPMSF200μMアジド02ONで37°Cにてインキュベートすることにより実施した。不活化した細胞を次いでPBSで洗浄し、20°Cにて凍結した。10μgの細胞調製物をウエル当たりに加え、タンパク質を還元条件下で12ゲルNovexを用いて分離し、次いでそのタンパク質をニトロセルロース膜上に移した。非特異的結合部位をブロックした後、膜を2時間、fHBPA、fHBPBまたはNadAのいずれかで免疫感作したマウスの血清混合物と共にインキュベートした。TdfIを検出するために、膜を抗TdfIウサギ血清または4種の抗TdfIMabの混合物のいずれかとインキュベートした。洗浄後、膜を抗マウスIgビオチン化抗体Amershamとインキュベートした。抗体の結合をストレプトアビジンペルオキシダーゼ結合Amershamを用いて検出した。各菌株について、fHBP、TdfIおよびNadAの発現レベルをウェスタンブロットにより評価した。発現レベルを次の通り採点した:高い発現レベル、;中間の発現レベル、;低い発現レベル、および非検出の発現図8に例示。fhbp対立遺伝子の同定ほとんどの菌株について、Beerninckと共同研究者が2006に記載したPCRタイピングにより、fHbp対立遺伝子を測定した。いくつかの菌株については、完全なfhbp遺伝子座を、粗MenB溶菌液からPCRによりプライマーを用いて増幅した。PCR断片を次いで高純度PCR精製キットRocheで精製し、Sanger法により配列決定した。Fletcheretal2004に記載のLasergeneMegAlignClustalXソフトウエアを用いて、ファミリーAおよびB参照配列それぞれ2996およびMC58と比較した後に、配列タイプファミリーAまたはBを推定した。LOS内部コア組成物次の規則を用いてlpt3、lpt6、lot3oac1およびlgtG遺伝子の存在/機能性を分析した後に、LOS内部コア組成物を推定した:もしlot3oac1が存在しかつインフェーズであれば、GlcNAcはOアセチル化されている、もしlgtGが存在しかつインフェーズであれば、グルコースはHepIIの位置3に結合している、もしlpt6が存在すれば、PEAはHepIIの位置6に連結している、もしlpt3が存在しかつlgtGが不在またはアウトフェーズであれば、PEAはHepIIの位置3に結合している、もしlpt3が存在しかつlgtGがインフェーズであれば、PEAはHepIIの位置3に結合している、もしlpt3が不在であれば、PEAはHepIIの位置3に結合してない。次の命名法を用いて、色々な内部コア構造を特徴付けた:L3=HepIIの位置3上の1つのPEA、内部コアGlcNAc上のさらなるアセチルを伴うかまたは伴わない。かかる内部コアは次のLOS免疫型:L1、L3、L7、L8と関連する。L2=HepIIの位置6上の1つのPEAおよび位置3上の1つのグルコースならびに内部コアGlcNAc上の1つのさらなるアセチル。L3v=位置3および6上のHepII上の2つのPEAならびに一般に内部コアGlcNAc上の1つのさらなるアセチル。L5=HepIIの位置3上の1つのグルコースならびに内部コアGlcNAc上の1つのさらなるアセチルLX=HepIIの位置3および6上にPEAまたはグルコースが無く、そして内部コアGlcNAc上の1つのさらなるアセチル。結果155菌株のLOS内部コアを分子的方法により分類した以下の表1。これらの菌株は、英国n53、ドイツn40およびスペインn47において最近2004年以後単離されたかまたは5つの異なる国々の患者n15から2002年前に単離された疾患単離物から無作為に選択した。140の細菌の単離物のうち、大部分の菌株はL3内部コアを生産した66~94。L2内部コアは英国とドイツの菌株の2および25でそれぞれ観察される一方、スペインの菌株の17超で見出される。155臨床単離物のうち、52菌株をfHBPおよびNadA遺伝子出現、対立遺伝子およびfHBP、NadA、TdfI発現について分析した。これらの52菌株は次のように選択した:2002年より前に単離された15菌株、無作為に選択した最近の単離物英国、ドイツおよびスペインおよび全て最近のL2以下の表2。fhbp遺伝子は52菌株全てに存在し、菌株の623252は対立遺伝子Bを所持し、382052は対立遺伝子Aを所持した。fhbpB対立遺伝子はL3およびL2菌株の682131および60915にそれぞれ検出されるので、LOS型とfhbp対立遺伝子の間に関連は見られない。fHBPはfhbpA対立遺伝子およびfhbpB対立遺伝子を所持する菌株の50および62においてそれぞれよく発現されるまたはので、fHBP対立遺伝子とfHBP発現の間に関連は見られない。しかし、L3菌株のわずか19631が低いかまたは不検出レベルのfHBPを生産する一方、L2菌株の931415についてfHBPの低い/ゼロ発現が観察された。さらに、L2免疫型の菌株の多くはまた、ST11クローン複合体であることが見出された。nadA遺伝子は分析した菌株の442352に存在するが、菌株のわずか251352がウェスタンブロットにより検出可能量のNadAを発現する。fHBP発現とは対照的に、LOS内部コアとNadAの発現の間に関係はない。実に、わずかL3菌株の16およびL2菌株の27がNadAの検出可能量を生産する。fHBPを発現しないまたは発現レベルの低い52菌株の22菌株のうち、わずか4菌株が検出可能なレベルのNadAを発現する。TdfIの発現を、TdfIに対する4種のモノクローナル抗体および/または組換えTdfIで免疫化したウサギからのポリクローナル血清の混合物を用いて分析した。試験した51菌株のうち、94は検出可能量のTdfI4851を発現する。低いまたは不検出レベルのfHBPを発現する22菌株のうち、1つを除く全てがTdfIを生産する。この菌株はnadA遺伝子を所持しない。結論この結果が示唆するのは、L2菌株はL3内部コアLOSを発現する菌株より有意に低いレベルのfHBPを生産する傾向を持つことである。この観察はとりわけ、L2菌株が最近の臨床単離物の17であるスペインのような国々において、fHBPだけに基づくMenBワクチンに対して論議を起こす。さらに、試験したスペインのL2菌株は全て検出可能な量のNadAを発現しない。不検出または低いレベルのfHBPを発現する22菌株のうちわずか4菌株が検出可能なレベルのNadAを発現する一方、1つを除く全てがTdfIを生産する。表1:155侵襲性menB菌株の内部コア型決定最近単離された140菌株を含む表2:分析した52菌株の特徴:LOS内部コアタイプ、fhpb対立遺伝子遺伝子、fHBPの発現レベル、nadA遺伝子の存在、NadAの発現レベル、TdfIの発現Mabおよび/またはウサギ血清を用いてTdfIの付加による、fHBP系ワクチンの効力の改善方法抗原調製物組換えfHBP変異体vAおよびBをIPTG誘導後のBL21DE3大腸菌で生産し、IMACカラムを用いて精製した。fHbp配列は菌株MC58fHBPBおよび2996fHBPAから誘導した。遺伝子を、リーダー配列に対応するヌクレオチド配列が無くかつC末端にHisタグをもつpET24bプラスミドにクローニングした。動物取扱手続き:10~30マウスのグループを3回、筋肉内1M経路により第0、21および28日に免疫化した。各注入物は5μgのタンパク質に規準化しかつAS04アジュバント系AIP043Oデスアシル4モノホスホリルリピドAまたはAl3上に吸着された一価fHBPワクチンfHBPAまたはfHBPBまたは二価fHbpABワクチンのいずれかと共に製剤したOMV抗原を含有した。第42日に、血清用の血液サンプルを採取した。マウス血清は実験20040652、20070371および20080083由来であった。全細胞調製物を用いるウェスタンブロット髄膜炎菌を一晩、MH寒天プレートで37°C5CO2にて培養した。これらを4時間MH寒天プレート上で20μMTPEN亜鉛キレート剤と共に37°C5CO2で継代培養した。不活化は寒天プレートから収穫した細胞をPBSPMSF200μMアジド02ON37°Cにて行った。不活化した細胞を次いでPBS中で洗浄しそして20°Cにて凍結した。ウエル当たり10μgの細胞調製物を加え、タンパク質を還元条件下で12ゲルNovexを用いて分離し、次いでタンパク質を10μgの細胞調製物上に移した。非特異的結合部位をブロックした後、膜を2時間、TdfIに対するモノクローナル抗体と共にまたはfHBPAもしくはfHBPB血清で免疫化したマウスから採取した血清の混合物と共にインキュベートした。洗浄後、膜を抗マウスIgビオチン化抗体Amershamとインキュベートした。抗体の結合をストレプトアビジンペルオキシダーゼ結合Amershamを用いて検出した。各菌株について、fHBPの発現レベルをウェスタンブロットにより評価した。発現レベルを次の通り採点した:高い発現レベル、;中間の発現レベル、;低い発現レベル、および非検出の発現。SBA髄膜炎菌を一晩、ペトリ皿で37°C5CO2にて培養した。これらを4時間、ペトリ皿で20μMTPEN亜鉛キレート剤を伴うかまたは伴わずに37°C5CO2で継代培養した。血清サンプルプールした血清を40分間56°Cにて不活化し、次いでPBSグルコース01中に110または150希釈し、次いで平底マイクロプレート中の25μLの体積に2倍希釈した。次いで25μLの細菌混合物PBSグルコース01に希釈して1ウエル当たり100~150CFUを得たおよび子ウサギ補体マイクロウエル中の最終濃度:125vvを血清希釈物に加えた。37°Cにて振とうのもとで75分間のインキュベーションの後、2層の寒天09をウエルに加えた。マイクロプレートを一晩35または37°CCO2にてインキュベートした。CFUを数え、死滅パーセントを計算した。SBA力価は死滅の50を与える希釈である。fhbp対立遺伝子の同定:完全なfhbp遺伝子座を粗MenB溶菌液からPCRによりプライマーを用いて増幅した。PCR断片を次いで高純度PCR精製キットRocheで精製し、Sanger法により配列決定した。LasergeneMegAlignClustalXソフトウエアを用いて変異体1、2および3参照配列と比較した後に、配列タイプ変異体1、2または3を推定した。結果色々な髄膜炎菌株を、SBAにて、一価fHbpワクチンfHbpAまたはfHbpBまたは二価fHbpワクチンfHbpABで免疫化したマウスからの血清を用いて試験した。これらの菌株を、ウェスタンブロットによりおよびそのfHbp対立遺伝子により測定したfHbpの発現レベルに基づいて選択した。それらの結果以下の表3は、fHbpBで免疫化したマウスからの血清はfHbpAタンパク質を生産する菌株に対して殺菌性がないそしてこの逆も観察されたので、fHbpが交差保護fHbp応答を誘発できないことを明らかに示す。fHBPAとfHBPBを用いて免疫化したマウスからの血清は、fHbpAまたはfHbpBタンパク質を発現する菌株の補体死滅を媒介する能力のある殺菌性抗体の生産を誘発した。さらに、標的化したSBA菌株によるfHbpの発現レベルは殺菌力価にも影響を与えた:fHbp発現レベルが低いほど、殺菌力価は低い。これらの結果は、低いまたは非検出のfHbpレベルしか生産しない菌株に対して保護するために、fHbpに基づくワクチンを他の抗原を加えることにより改善する必要性を明らかにする。表3:異なるfHBPタンパク質を異なるレベルで発現する一連の髄膜炎菌に対する抗fHBPマウス血清の血清殺菌力価マウスを、共通のバックグランドporAKO、galELOSおよび莢膜不在を有する組換えH4476菌株から得た異なるOMV調製物で免疫化した。異なる調製物はTdfIおよびfHbpのレベルにより差別化した。対照OMVCtrlOMVは検出可能量のTdfIおよびfHbpを有しなかった。TdfIOMVをTdfIを過発現する菌株から生産し、そしてTdfIfHBPOMVをTdfIとfHbpの両方を過発現する菌株から発現した。その血清を、色々なレベルのTdfIを発現する一連のH4476菌株を用いてSBAで分析した。野生型WT菌株は検出可能量のTdfIを発現しない一方、pTacプロモーター下のTdfI遺伝子を含有するpfP10プラスミドにより形質転換した組換えH4476菌株は、ITPGIPTGの存在のもとで高レベルのTdfIを生産した以下の表4。対照調製物CtrlOMVにより免疫化したマウスからの血清は殺菌性がなかった。高い量のTdfIを発現する菌株IPTGだけが補体の存在のもとで抗TdfI抗体により死滅した。対照的に、TdfIfHbpOMV調製物により免疫化したマウスからの血清は2つのH4476菌株の補体死滅に抗fHbp抗体の存在を介して媒介し、そして観察されるように、殺菌力価と標的化菌株により生産されたTdfIのレベルの間には相関があった以下の表4。表4:異なるレベルのTdfIを生産する異なるH44176菌株WT=野生型;またはIPTG=誘導を介してTdfIを過発現する菌株に対する血清殺菌力価TdfIの付加による、fHBPに基づくワクチン効力の改善方法抗原調製物外膜小胞OMVを、色々な組換えH4476菌株porAKO、莢膜マイナス、galELOSおよび色々な外膜タンパク質を過発現するから古典的05DOC抽出物を用いて生産した。組換えfHBP変異体vAおよびBをIPTG誘導後のBL21DE3大腸菌で生産し、IMACカラムを用いて精製した。fhbp配列を菌株MC58fHBPBおよび2996fHBPAから誘導した。遺伝子をリーダー配列に対応するヌクレオチド配列が無くかつC末端にHisタグをもつpET24bプラスミドにクローニングした。動物取扱手続き:10~30マウスのグループを3回、筋肉内1M経路により第0、21および28日に免疫化した。各注入物はAl3上に吸着された5μgの一価のfHBPワクチンを含有した。第42日に、血清用の血液サンプルを採取した。マウス血清は実験20080790および20090265由来であった。10モルモットのグループを3回、筋肉内1M経路により第0、14および28日に免疫化した。各注入物は10μgのタンパク質に規準化しかつAlP04と共に製剤したOMV抗原を含有した。第42日に、血清用の血液サンプルを採取した。モルモット血清は実験20090266由来であった。SBA髄膜炎菌を一晩、ペトリ皿で37°C5CO2にて培養した。これらを4時間、ペトリ皿で20μMTPEN亜鉛キレート剤を伴うかまたは伴わずに37°C5CO2で継代培養した。血清サンプルプールした血清を40分間56°Cにて不活化し、次いでPBSグルコース01中に110または150希釈し、次いで平底マイクロプレート中の25μLの体積に2倍希釈した。次いで寒天プレートからまたは細胞接触後の、25μLの細菌混合物PBSグルコース01に希釈して1ウエル当たりおよそ100~150CFUを得たおよび子ウサギ補体マイクロウエル中の最終濃度:125vvを血清希釈物に加えた。37°Cにて振とうのもとで75分間のインキュベーションの後、2層の寒天09をウエルに加えた。マイクロプレートを一晩35または37°CCO2にてインキュベートした。CFUを数え、死滅パーセントを計算した。SBA力価は死滅の50を与える希釈である。結果抗fHbpB血清をSBAでfHbpファミリーBを発現する菌株について試験する一方、抗fHbpA血清をSBAでファミリーAからのfHbpを発現する菌株に対して用いた。TdfIを過発現する菌株から生産されるOMVブレブで免疫化したモルモットからの血清をfHbpBとfHbpA菌株の両方に対して試験した。抗TdfIおよび抗fHbp血清を単独で試験するかまたは混合した後にTPENの存在または非存在におけるSBAを実施した一連の16菌株をSBAに使用した。これらのうちで、5~7菌株は抗fHbp抗体により死滅したSBA培養条件におけるTPENの非存在もしくは存在に応じてSBA力価>128。TPENの非存在では、わずか3菌株がTdfIブレブで免疫化したモルモット由来の血清により死滅した一方、TPENの存在では12菌株が死滅した。抗fHbpと抗TdfIブレブ血清を混合すると、SBA力価が改善される一般的傾向があり、少なくとも抗fHBpと抗TdfIブレブ血清殺菌活性の相加効果を示している。表5子ウサギ血清を補体源として用いる、19種の髄膜炎菌株に対する色々なワクチン組成物のSBAでの保護効果。結果を死滅菌株のパーセントとして表現した力価≧1128。二価15LOSOMVワクチン、二価fHBP、ならびにfHbpGNA1870、NadA、GNA2132Lipo28、GNA1030、GNA2091を含む五価サブユニットワクチンにより誘発される菌株適用範囲の比較。表6aそれぞれのLOSタイプを発現する試験菌株の数bそれぞれのLOSタイプについてSBAで試験した菌株により示された血清群同じ結果であるが、さらに詳しく記載すると:表7ST269クローン複合体に与える、fHbpに対する抗体の効果。方法抗原調製物組換えfHBP変異体vAおよびBをIPTG誘導後のBL21DE3大腸菌で生産し、IMACカラムを用いて精製した。fhbp配列は菌株MC58fHBPBおよび2996fHBPAから誘導した。遺伝子をリーダー配列に対応するヌクレオチド配列が無くかつC末端にHisタグをもつpET24bプラスミドにクローニングした。動物取扱手続き:10~30マウスのグループを3回、筋肉内1M経路により第0、21および28日に免疫化した。各注入物はAl3上に吸着された5μgの一価のfHBPワクチンを含有した。第42日に、血清用の血液サンプルを採取した。マウス血清は実験20080790および20090265由来のものであった。10匹のモルモットを3回、筋肉内1M経路により第0、14および28日に免疫化した。各注入物は10μgのタンパク質に規準化しかつAlP04と共に製剤したOMV抗原を含有した。第42日に、血清用の血液サンプルを採取した。モルモット血清は実験20090266由来のものであった。SBA髄膜炎菌を一晩、ペトリ皿で37°C5CO2にて培養した。これらを4時間、ペトリ皿で20μMTPEN亜鉛キレート剤を伴うかまたは伴わずに37°C5CO2で継代培養した。血清サンプルプールした血清を40分間56°Cにて不活化し、次いでPBSグルコース01中に110または150希釈し、次いで平底マイクロプレート中の25μLの体積に2倍希釈した。次いで寒天プレートからまたは細胞接触後の25μLの細菌混合物PBSグルコース01に希釈して1ウエル当たりおよそ100~150CFUを得たおよび子ウサギ補体マイクロウエル中の最終濃度:125vvを血清希釈物に加えた。37°Cにて振とうのもとで75分間のインキュベーションの後、2層の寒天09をウエルに加えた。マイクロプレートを一晩35または37°CCO2にてインキュベートした。CFUを数え、死滅パーセントを計算した。SBA力価は死滅の50を与える希釈である。クローン複合体ST269からの2種の菌株:M01240013およびM01240101を用いた。両菌株は英国で2001年に単離されたものである。結果抗fHbpB血清をSBAでfHbpファミリーBを発現する菌株M01240101について試験する一方、抗fHbpA血清をSBAでファミリーAからのfHbpを発現する菌株M01240013に対して用いた。SBAはTPENの非存在または存在のもとで実施した。わずか1つの菌株菌株M01240101が抗fHbp抗体により補体の存在のもとで死滅した。第2の菌株、M01240013は抗fHbp抗体により死滅しない。観察では、細菌培養条件TPENの非存在または存在はSBA力価に影響を与えない。表1:子ウサギ補体の存在のもとでの抗fHbp抗体の殺菌力価結論抗fHbp抗体は単独でM01240013菌株クローン複合体ST269由来を有効に死滅することができなかった。キメラfHBPタンパク質の免疫原性方法抗原調製物fH結合部位の突然変異を伴う/伴わないキメラfHBPタンパク質を前記実施例実施例1~7に記載の通り調製した。動物取扱手続き:20マウスのグループを3回、筋肉内1M経路により第0、21および35日に免疫化した。各注入物はAl3上に吸着された5μgのキメラfHbpタンパク質を含有した。第49日に、血清用の血液サンプルを採取した。マウス血清は実験20090833由来のものであった。rSBA髄膜炎菌を一晩、ペトリ皿で37°C5CO2にて培養した。これらを4時間、ペトリ皿で37°C5CO2にて継代培養した。血清サンプル個々の血清を40分間56°Cにて不活化し、次いでPBSグルコース01中に150希釈し、次いで平底マイクロプレート中の25μLの体積に2倍希釈8xした。次いで寒天プレート培養からの、25μLの細菌混合物PBSグルコース01に希釈して1ウエル当たりおよそ50~250CFUを得たおよび子ウサギ補体マイクロウエル中の最終濃度:125vvを血清希釈物に加えた。37°Cにて振とうのもとで75分間のインキュベーション後、2層の寒天09をウエルに加えた。マイクロプレートを一晩33°CCO2にてインキュベートした。CFUを数え、死滅パーセントを計算した。SBA力価は死滅の50を与える希釈である。個々の血清を分析し、幾何平均力価を計算した。幾何平均計算に当たって、第1希釈に対する死滅が50未満の死滅である場合、力価を50に設定し、もし死滅が最後の希釈において50より高ければ、力価を25600に設定した。結果血清をrSBAで、fHbpファミリーBH4476またはfHbpファミリーAS3446を発現する菌株について試験した以下の表を参照。組換えfHbpBによる免疫化は、H4476菌株fHbpファミリーBの補体死滅を媒介できる殺菌抗体の生産を誘発したが、S3446菌株fHbpファミリーAではそうでなかった応答した菌株のパーセントはそれぞれ100および10。組換えfHbpAはS3446菌株に対して低い殺菌性抗体応答を、そしてH4476菌株に対して非常に低い応答しか誘発しなかった。キメラfHBPfH結合部位突然変異有りまたは無しで免疫化した動物は、H4476とS3446菌株の両方に対して殺菌性応答を誘発することができたH4476およびS3446それぞれに対して100および90までの応答菌株。最良の応答は構築物LVL5112つのアミノ酸突然変異が達成した。表1:子ウサギ補体の存在のもとでの抗キメラfHBP抗体の殺菌力価結論抗キメラfHBP抗体は、両方のファミリーAおよびB由来の菌株の死滅に有効であった。この能力はfH結合部位の突然変異によって変わらない。Hap本明細書ではMapとも呼ぶの免疫原性方法抗原調製物Map生来の切断されたMapを、H4476cps菌株の発酵後に得た上清から精製した。2ロットを生産し、第2ロットはH4476cpsを過発現するMapから得た[H4476由来の全map遺伝子をPCRにより増幅し、Mapの発現を制御するlacIQ遺伝子およびタンデムlactacプロモーターを含有するpFP10由来のナイセリア菌複製プラスミドPagottoetalPlasmid4324342000にクローニングすることにより実施した]。Mapを濃縮し、クロマトグラフィにより精製した。組換えMapN端末aa431178を大腸菌における細胞質の発現により生産した。fHbp組換えfHBP変異体vAおよびBをIPTG誘導後のBL21DE3大腸菌で生産し、IMACカラムを用いて精製した。fHbp配列は菌株MC58fHbpBおよび2996fHbpAから誘導した。遺伝子をリーダー配列に対応する遺伝子が無くかつC末端にHisタグをもつpET24bプラスミドにクローニングした。動物取扱手続きMap10~25マウスのグループを3回、筋肉内1M経路により第0、14および28日に免疫化した。各注入物はスペコールspecolを用いて製剤した10μgの生来の切断されたHapまたは5μgのrecN末端Hapを含有した。第42日に、血清用の血液サンプルを採取した。マウス血清は実験20090608、20100463、20100708由来のものであった。6~10モルモットのグループを3回、筋肉内1M経路により第0、14および28日に免疫化した。各注入物はスペコールspecolと製剤した10μgのタンパク質を含有した。第42日に、血清用の血液サンプルを採取した。モルモット血清は実験20090619、20100464、20100711由来のものであった。fHbp10~30マウスのグループを3回、筋肉内1M経路により第0、21および28日に免疫化した。各注入物はAl3上に吸着された5μgの一価のfHBPワクチンを含有した。第42日に、血清用の血液サンプルを採取した。マウス血清は実験20080790および20090265由来のものであった。6~10モルモットのグループを3回、筋肉内1M経路により第0、14および28日に免疫化した。各注入物はAl3上に吸着された5μgの一価のfHbpワクチンを含有した。第42日に、血清用の血液サンプルを採取した。血清は実験20090200g3または20100464g10由来のものであった。SBA髄膜炎菌を一晩、ペトリ皿で37°C5CO2にて培養した。これらを4時間、ペトリ皿で20μMTPEN亜鉛キレート剤と共に37°C5CO2で継代培養した。血清サンプルプールした血清を40分間56°Cにて不活化し、次いでPBSグルコース01中に150希釈し、次いで平底マイクロプレート中の25μLの体積に2倍希釈した。次いで25μLの寒天プレート培養からまたは細胞接触後の細菌混合物PBSグルコース01に希釈して1ウエル当たりおよそ50~250CFUを得たおよび子ウサギ補体マイクロウエル中の最終濃度:125vvを血清希釈物に加えた。37°Cにて振とうのもとで75分間のインキュベーションの後、2層の寒天09をウエルに加えた。マイクロプレートを一晩33°CCO2にてインキュベートした。CFUを数え、死滅パーセントを計算した。SBA力価は死滅の50を与える希釈である。MapKO菌株構築髄膜炎菌増殖および形質転換手続きは先に記載の通り実施したWeynantsetal2009。菌株17540はJulioVasquezCNMMadridSpain、菌株M01240355およびNZ98254はRBorrowHPAManchesterUKからの贈物であった。H4476hap遺伝子のユニークなPstI部位中に挿入されたカナマイシン耐性カセットを含むmaphapkanRプラスミドvanUlsenetal2003はTommassen教授の好意の贈物であった。カナマイシン耐性コロニーを、煮沸した細菌溶菌液でのPCRによりhap遺伝子の不活化についてスクリーニングした。補体感受性の変化を避けるために、全クローンについてトリシンゲルおよび銀染色によりLOSの完全性を点検した。GeneticallymodifiedL37andL2lipooligosaccharidesfromNeisseriameningitidisserogroupBconferabroadcrossbactericidalresponse遺伝子操作で改変した髄膜炎菌血清群BからのL3、7およびL2リポオリゴ糖は広範な交差殺菌性応答を与えるWeynantsVDenouelPDevosNJanssensDFeronCGorajKMominPMonnomDTansCVandercammenAWautersFPoolmanJTInfectImmun2009May;77:208493。ANeisserialautotransporterNalPmodulatingtheprocessingofotherautotransporters他の自己輸送体のプロセシングをモジュレートするナイセリア菌自己輸送体NalPvanUlsenPvanAlphenL10HoveJFransenFvanderLeyPTommassenJMolMicrobiol2003Nov50。結果Mapに対する相同性に基づいて選択した色々な髄膜炎菌を、スペコールspecolを製剤した生来の切断されたMapまたは組換えN末端Mapで免疫化したマウスおよびモルモットからの血清を用いてSBAで試験した。結果以下の表1が示すように、H4476と最低の相同性をもつ菌株M06240336が死滅するので、Mapは交差保護殺菌応答を誘発する。1722菌株は、モルモットから得た抗生来の切断されたMap抗体によって死滅した。これらの17菌株のうちの6菌株は抗fHbp抗体によって死滅しない。類似したMap配列を共有する菌株が死滅したりM06240336または死滅しないM06240877という事実により示唆されるように、Mapの発現レベルの相違がいくつかの菌株が死滅しないことの説明でありうる。Mapが殺菌抗体の標的であることを確認するために、ΔMap菌株NZ98254、M05240355、SP17540を殺菌の試験法に用いた以下の表2。かかるSBA条件においては、死滅のないことを観察した。これらの結果はMapが交差殺菌性抗体を誘発する主要抗原であることを確証する。表1:子ウサギ補体の存在のもとでの抗Map抗体の殺菌力価表2:MapKO菌株に対する抗Map抗体の力価結論Mapは交差殺菌活性を誘発し、クローン複合体ST269例えば、M01240013菌株からの菌株およびL2免疫型例えば、SP17540菌株からの菌株を含む抗fHbpによって死滅しない菌株の効果的な死滅をもたらす。この結果は、MapとfHbpに基づくワクチンがfHbpに基づくワクチンより優れた菌株範囲をカバーしうることを示唆する。Hsf本明細書ではMsfとも呼ぶは野生型菌株に対する殺菌抗体を誘発する方法抗原調製物OMV外膜小胞OMVを、色々な組換えH4476菌株porAKO、莢膜マイナス、galELOSおよびMsfおよび/またはZnuDタンパク質を過発現するから古典的05DOC抽出物を用いて生産した。fHbp組換えfHBP変異体vAおよびBをIPTG誘導後のBL21DE3大腸菌で生産し、IMACカラムを用いて精製した。fhbp配列は菌株MC58fHBPBおよび2996fHBPAから誘導した。遺伝子をリーダー配列に対応するヌクレオチド配列が無くかつC末端にHisタグをもつpET24bプラスミドにクローニングした。mAbmAbHsfcross5は骨髄腫細胞と免疫化BALBcマウスから採取したリンパ球Bとの融合体から得たものであって、前記免疫化マウスは、RIMMSと名付けられた反復、多部位免疫化計画を用いて、組換えH4476菌株porAKO、莢膜不在、Msf過発現、M010240101から由来のOMV20μgで免疫化したものである。動物取扱手続き:OMV10モルモットのグループを3回、筋肉内1M経路により第0、14および28日に免疫化した。各注入物は10μgのタンパク質に規準化しかつAlPO4と共に製剤したOMV抗原を含有した。第42日に、血清用の血液サンプルを採取した。血清は実験20090266由来のものであった。fHbp6~10モルモットのグループを3回、筋肉内1M経路により第0、14および28日に免疫化した。各注入物はAl3上に吸着された10μgの一価fHbpワクチンを含有した。第42日に、血清用の血液サンプルを採取した。血清は実験20090200g3または20100464g10由来のものであった。SBA髄膜炎菌を一晩、ペトリ皿で37°C5CO2にて培養した。これらを4時間、ペトリ皿でに37°C5CO2で継代培養した。血清サンプルプールした血清を40分間56°Cにて不活化し、次いでPBSグルコース01中に150希釈し、次いで平底マイクロプレート中の25μLの体積に2倍希釈した。次いで25μLの寒天プレート培養からの細菌混合物PBSグルコース01に希釈して1ウエル当たりおよそ50~250CFUを得たおよび子ウサギ補体マイクロウエル中の最終濃度:125vvを血清希釈物に加えた。37°Cにて振とうのもとで75分間のインキュベーションの後、2層の寒天09をウエルに加えた。マイクロプレートを一晩33°CCO2にてインキュベートした。CFUを数え、死滅パーセントを計算した。SBA力価は死滅の50を与える希釈である。MsfHsfKO菌株構築髄膜炎菌B菌株17567JVasquezCNMMadridSpainより増殖と形質転換手順は先に記載のように実施したWeynantsetal2009。msfhsfCmRプラスミドを次の通り構築した。概略を述べると、1531bphsf遺伝子の5’隣接領域、1775bphsfコード配列および1465bp3’隣接領域に対応する4771bpのDNA断片を、H4476ゲノムDNAから、プライマーHsfセンスCGCAATAAATGGGGTTGTCAATAATTGTおよびHsfリバースAGTCAAGGCGCACGCTGTCGGCATを用いてPCR増幅し、そしてpGEMTEasyベクターにクローニングした。プラスミドを次いでプライマーHSF5’ci2gaagatctgccgtctgaaacccgtaccgatgcggaaggctataおよびHSF3’ci2gaagatctttcagacggcgataaagtcctgccgcgttgtgtttcを用いてサークルPCR突然変異誘発で処理し、hsf遺伝子を除去し、取込み配列を挿入し、そして抗生物質耐性遺伝子のクローニングを容易にするBglII制限部位を挿入した。CmR遺伝子をpCMCプラスミドWeynantsetal2009からプライマーBAD20tcccccgggagatctcactagtattaccctgttatcccおよびプライマーCAM3’Bgl2agatctgccgctaactataacggtccを用いて増幅した。この断片をサークルPCR産物中のBglII制限部位の後にクローニングし、プラスミドpRIT15456を得た。クロラムフェニコール耐性コロニーを、煮沸した細菌溶菌液でのPCRによりmsfhsf遺伝子の不活化についてスクリーニングした。Msf発現の非存在をさらにウェスタンブロットにより確認した。補体感受性の変化を避けるために、全クローンについてトリシンゲルおよび銀染色によりLOSの完全性も点検した。GeneticallymodifiedL37andL2lipooligosaccharidesfromNeisseriameningitidisserogroupBconferabroadcrossbactericidalresponse遺伝的に改変された髄膜炎菌血清群BからのL3、7およびL2リポオリゴ糖は広範な交差殺菌性応答を与えるWeynantsVDenouelPDevosNJanssensDFeronCGorajKMominPMonnomDTansCVandercammenAWautersFPoolmanJTInfectImmun2009May;77:208493。結果野生型菌株に対して殺菌抗体を誘発するMsfの潜在能力を評価するために、高レベルのMsf発現を有するウェスタンブロットの結果菌株SP17567を選択した。Msfに対する血清またはMsfZnuDOMVおよび対照ブレブ抗原過発現が無いかまたはZnuDだけの過発現を血清殺菌試験法で試験した。Msfに対して特異的なモノクローナル抗体も試験した。以下の表1の結果は、対照ブレブと比較して、Msf過発現ブレブについては少なくとも20倍の殺菌活性の増加を示す。高い殺菌力価はMsd特異的mAbについても観察される。ただ組換えfHbpは、試験検出限界付近の低い殺菌応答しか誘発しない。Msfが殺菌抗体の主な標的であることを確認するために、ΔMsfSP17567菌株を殺菌試験法に用いた。かかるSBA条件においては、死滅は観察されなかった。これらの結果は、抗原としてのMsfは高レベルのMsfを発現する野生型菌株の死滅を誘発できることを確認する。表1:菌株SP17567野生型およびMsfKOに対する殺菌力価結論抗Msf抗体は、抗fHbp抗体による死滅が難しい野生型菌株の死滅に介在しうる。これは、fHbpに基づくワクチンへのMsfの付加がMenBワクチンの保護範囲を増強しうることを示唆する。TdfI本明細書ではZnuDとも呼ぶを過発現するブレブに対する抗体の、L2菌株に対する効果方法抗原調製物外膜小胞OMVを、組換えH4476菌株porAKO、莢膜マイナス、galELOSならびにZnuDおよびMsfタンパク質を過発現するから古典的05DOC抽出物を用いて生産した。動物取扱手続き:OMV26~30マウスのグループを3回、筋肉内1M経路により第0、21および28日に免疫化した。10モルモットのグループを3回、筋肉内1M経路により第0、14および28日に免疫化した。各注入物は5マウスまたは10μgGPのタンパク質に規準化しかつAlS04と共に製剤したOMV抗原を含有した。第42日に、血清用の血液サンプルを採取した。マウスとモルモット血清はそれぞれ実験20090265、20100463および20090266、20100464由来のものであった。fHbp20マウスのグループを3回、筋肉内1M経路により第0、21および35日に免疫化した。各注入物はAl3上に吸着された5μgの一価fHbpワクチンfHbpAまたはfHbpBを含有した。第49日に、血清用の血液サンプルを採取した。マウス血清は実験20090833由来であった。SBA髄膜炎菌を一晩、ペトリ皿で37°C5CO2にて培養した。これらを4時間、ペトリ皿上で20μMTPEN亜鉛キレート剤を伴ってまたは伴わずに37°C5CO2にて継代培養した。血清サンプルプールした血清を40分間56°Cにて不活化し、次いでPBSグルコース01中に150希釈し、次いで平底マイクロプレート中の25μLの体積に2倍希釈した。次いで25μLの寒天プレート培養からの細菌混合物PBSグルコース01に希釈して1ウエル当たりおよそ50~250CFUを得たおよび子ウサギ補体マイクロウエル中の最終濃度:125vvを血清希釈物に加えた。37°Cにて振とうのもとで75分間のインキュベーションの後、2層の寒天09をウエルに加えた。マイクロプレートを一晩33°CCO2にてインキュベートした。CFUを数え、死滅パーセントを計算した。SBA力価は死滅の50を与える希釈である。ZnuDKOSP17540菌株構築髄膜炎菌増殖および形質転換手続きは先に記載の通り実施したWeynantsetal2009。必要な場合、20mMTPENエチレンジアミンを培地に加えることにより、ZnuD発現を誘導した。菌株17540はJulioVasquezCNMMadridSpainよりの贈物であった。znuDkanRプラスミドはTommassen教授の好意の贈物であって、Storketal2010に記載されている。カナマイシン耐性コロニーを、煮沸した細菌溶菌液でのPCRによりznuD遺伝子の部分的欠失についてスクリーニングした。ZnuD不活化を、TPENの存在のもとでの増殖後の全細胞溶菌液についてのウェスタンブロットによりさらに確認した。補体感受性の変化を避けるために、全クローンについてトリシンゲルおよび銀染色によりLOSの完全性を点検した。GeneticallymodifiedL37andL2lipooligosaccharidesfromNeisseriameningitidisserogroupBconferabroadcrossbactericidalresponse遺伝的に改変された髄膜炎菌血清群BからのL3、7およびL2リポオリゴ糖は広範な交差殺菌性応答を与えるWeynantsVDenouelPDevosNJanssensDFeronCGorajKMominPMonnomDTansCVandercammenAWautersFPoolmanJTInfectImmun2009May77208493。AnoutermembranereceptorofNeisseriameningitidisinvolvedinzincacquisitionwithvaccinepotentialワクチン潜在能力をもつ亜鉛獲得に関わる髄膜炎菌の外膜受容体StorkMBosMPJongeriusIdeKokNSchildersIWeynantsVEPoolmanJTTommassenJPLoSPathog2010Jul1;6:e1000969。結果L2免疫型からの3菌株およびクローン複合体STllをrSBAに用いた。これらの菌株は抗fHbp抗体および補体により死滅しない表1。ZnuD抗体の殺菌潜在能力の評価はinvivo条件の様な亜鉛制限増殖培地を介して実施した。これは、MH寒天プレート中で20μMのTPENを用いて達成した。TPEN条件下の殺菌試験法で試験したマウス抗ZnuDOMV血清は、試験した3つの菌株の死滅を実証した。類似した結果がモルモット由来の血清で観察された。培地にTPENが非存在であると、菌株は抗ZnuD抗体により死滅しなかった。ZnuDが殺菌抗体の主な標的であることを確認するために、ΔZnuDSP17540菌株をTPENによる殺菌試験法に用いた。かかるSBA条件のもとで、死滅は観察されなかった。これらの結果は、ZnuDが菌株SP17540に対する殺菌抗体の主な標的であることを実証する。表1:L2菌株に対する抗OMVの殺菌力価考察と結論先の実験実施例10を参照において、2つのL2菌株760676とM050240072は抗ZnuD抗体によって死滅しなかったことに注目すべきである。繰り返した実験この実施例で示したでは、これらの2つの菌株は抗ZnuD抗体によって死滅する。SBAを実施するために行った培養物で、ZnuDの発現が体系的に点検されなかったので、前シリーズの実験実施例10で示したにおいてZnuDが菌株760676およびM050240072により発現されなかったと考えられる。発現の非存在についての1つの可能性がある説明は、使用したTPENプレートが古過ぎて亜鉛の効率的なキレート化が起こらなかったことである。WTL2菌株ならびにSP17540znuDKO菌株を用いて得た新しい結果は、ZnuDOMVに過発現されたが抗fHbpにより死滅しなかったL2免疫型由来の菌株の効果的な死滅をもたらすことを確証する。このデータは、fHbpと追加の抗原ZnuDのようなに基づくワクチンがfHbp単独に基づくワクチンと比較して対象菌株範囲を改善しうることを支持する。