"対象の虚血を診断する方法であって、a前記対象から得られる生物学的試料中の、表2のリストから選択される、アルブミン結合タンパク質/ペプチド複合体ABPPCを含む少なくとも1つのバイオマーカーのレベルを決定すること、およびb前記生物学的試料中の決定されたレベルを正常対象集団における対照レベルに対して定量し、対照レベルと比較したレベルの増加または減少が虚血を示すことを含む、方法。診断アッセイである、請求項1に記載の方法。予後診断またはモニタリングアッセイである、請求項1に記載の方法。虚血が、心筋虚血、臓器虚血、腎虚血および脳虚血からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。前記ABPPCが、アネキシンA2、プラコグロビンおよびセルピンB3からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。前記対象試料が、血液、血漿または体液に由来する、請求項1に記載の方法。前記バイオマーカーが、質量分析法を使用して検出される、請求項1に記載の方法。前記バイオマーカーが、SEC、HPLC、アフィニティクロマトグラフィー、ゲル方法および/またはイムノアッセイを使用して検出される、請求項1に記載の方法。前記対象が哺乳動物である、請求項1に記載の方法。前記対象がヒトである、請求項9に記載の方法。診断または予後診断キットであって、生物学的試料中のアルブミンを特異的に捕捉または富化する抗体または化学的部分;表2のリストから選択されるアルブミンに結合した1つ以上の特定の修飾または非修飾タンパク質またはペプチドに対する二次抗体または化学的部分;および結合した二次抗体の量の検出および/または定量のための少なくとも1つの成分を含むキット。複数の二次抗体を含む、請求項11に記載のキット。表2のリストから選択されるタンパク質またはタンパク質断片に対する少なくとも1つの抗体;および質量分析標識された内部タンパク質標準を含む質量分析キット。血清または血漿からアルブミンを単離するための利用可能な2つの主な方法:親和性ベースのたとえば、抗体、Cibacronブルーおよび化学物質ベースの方法たとえば、NaCl/EtOHFu,Q.、Garnham,C.P.、Elliott,S.T.、Bovenkamp,D.E.ら、Proteomics2005、5、2656~2664.Colantonio,D.A.、Dunkinson,C.、Bovenkamp,D.E.、VanEyk,J.E.、Proteomics2005、5、3831~3835.TCA/アセトンChen,Y.Y.、Lin,S.Y.、Yeh,Y.Y.、Hsiao,H.H.ら、Electrophoresis2005、26、2117~2127がある。親和性ベースの方法の多くが比較されており、アルブミンを効率的に除去することが示されているZolotarjova,N.、Martosella,J.、Nicol,G.、Bailey,J.ら、Proteomics2005、5、3304~3313;Bjorhall,K.、Miliotis,T.、Davidsson,P.、Proteomics2005、5、307~317;Chromy,B.A.、Gonzales,A.D.、Perkins,J.、Choi,M.W.ら、J.ProteomeRes.2004、3、1120~1127。しかしながら、これらの方法は、LCカラムの場合、タンパク質/ペプチドのリガンドおよびカラム材料に対する非特異的結合ならびに実験間のキャリーオーバーに対して弱いZolotarjova,N.、Martosella,J.、Nicol,G.、Bailey,J.ら、Proteomics2005、5、3304~3313;Colantonio,D.A.、Dunkinson,C.、Bovenkamp,D.E.、VanEyk,J.E.、Proteomics2005、5、3831~3835;Bjorhall,K.、Miliotis,T.、Davidsson,P.、Proteomics2005、5、307~317;Chromy,B.A.、Gonzales,A.D.、Perkins,J.、Choi,M.W.ら、J.ProteomeRes.2004、3、1120~1127;Steel,L.F.、Trotter,M.G.、Nakajima,P.B.、Mattu,T.S.ら、Mol.Cell.Proteomics2003、2、262~270;Stanley,B.A.、Gundry,R.L.、Cotter,R.J.、VanEyk,J.E.、Dis.Markers2004、20、167~178。代替として、アルブミンは、1940年代からNaCl/EtOH沈殿を使用して精製されておりCohn,E.J.、Strong,L.E.、Hughes,W.L.、Mulford,D.J.ら、J.Am.Chem.Soc.1946,68,459~475、この方法は、医薬品グレードのアルブミンを単離するために常法として使用されている。最近、このプロセスが、アルブミンの効率的な精製および除去のために必要とされるステップを最小化するために、プロテオミクス分野で最適化されたがFu,Q.、Garnham,C.P.、Elliott,S.T.、Bovenkamp,D.E.ら、Proteomics2005、5、2656~2664、他のタンパク質の同時精製は依然として問題になり得る。例1コホート:ヒト血清を、待機的な血管形成術PTCAを受けている患者から得た。血清を、手順の全体にわたって様々な時点で大腿動脈から取り出した。患者試料を、心臓トロポニンIcTnIの非存在または存在にそれぞれ基づいて非罹患対照または罹患心筋梗塞、MIに分類した。分析のために、各群から3つの時点、T0-ベースライン、T7-PTCA後1時間、およびT8-PTCA後24時間を選んだ。材料:すべての試薬および溶媒は、利用可能な最高グレードであった。サイズ排除標準はすべて、SigmaAldrichから購入し、少なくとも90純粋であった。サイズ排除クロマトグラフィー:ヒト血清アルブミンHSAを、NaCl/EtOH溶媒系を使用して非HSA関連タンパク質を沈殿させ、HSAおよびその関連タンパク質/ペプチドは上清中にとどまる化学的枯渇によって、血清試料から除去した。次いでHSAを含有する上清を、BioSep-SEC-S2000300×7.8mmカラムPhenomenex、Torrance、CA、米国を使用してProteomeLabPF2DHPLCシステムBeckmanCoulter、Fullerton、CA、米国において実施される非変性サイズ排除クロマトグラフィーSECに供した。移動相は、50mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH6.8であり、これをアイソクラティックで0.25mL/minの流速で流した。各試料について、200μgの全タンパク質をSECカラム上に2回ロードし、両方のランの画分を合わせた。画分を0.5分毎に回収し、関連タンパク質/ペプチドが結合しているHSAを含有する画分を集め、10分間にわたって2分間の画分プールずつ一緒にプールした画分はA→Eとラベルした。次いで画分AおよびBを合わせて画分ABとし、これにより、各試料について4つの全プールSEC画分が存在した。各プールした画分AB、C、DおよびEについての全タンパク質濃度を、製造業者のプロトコールに従ってマイクロBCAアッセイキットSigmaAldrich、St.Louis、MO、米国を使用して決定した。6つの分子量標準もまた、同じ実験条件を使用して流したアスペルギルスオリゼAspergillusoryzae由来β-ガラクトシダーゼ116.3kDa、ヒト血清アルブミン67kDa、ニワトリのオボアルブミン45kDa、ウシ赤血球由来炭酸脱水酵素30kDa、ウマ心臓由来ミオグロビン16.7kDaおよびウシ酸化インスリンβ-鎖3.5kDa。1-DSDS-PAGEおよびトリプシン消化:次いで、各画分プールの375ナノグラムの全タンパク質を凍結乾燥し、タンパク質を、20mMDTT:4×Invitrogenローディング緩衝液の3:1混合物中に再懸濁した。次いで試料を95°Cで5分間沸騰させ、Invitrogen4~12Bis-Trisゲル上にロードした。ゲルを、1×MESランニング緩衝液中で、140Vで20分間、次いで200Vで追跡色素がゲルの底部に到達するまで流した。Shevchenkoらのプロトコールに従ってゲルを銀染色したShevchenkoらAnalyticalChemistry1996、68:850~858。アルブミンおよびアルブミン二量体に対応するバンドをゲルから切り取り、廃棄した。次いで、各レーンの残っているゲルを2.0mLエッペンドルフチューブ中に入れ、トリプシンで消化した。質量分析:各プールした画分について、製造業者のプロトコールに従ってOmixC18ZipTipsVarian、SantaClara、CA、米国を使用してペプチド溶液を脱塩し、30μlの70アセトニトリルMeCN、0.1ギ酸FAで溶出した。LC-MS/MS分析の前に、2マイクロリットルの画分ABおよびCを合わせ、2μlの画分DおよびEを合わせた。各組合せの2つのテクニカルレプリケートを、ナノエレクトロスプレーイオン源を備えたLTQ-Orbitrap質量分析計Thermo、Waltham、MA、米国に接続されたAgilent1200ナノ-LCシステムAgilent、SantaClara、CA、米国において分析した。ペプチドを、移動相Aが水中0.1v/vギ酸であり、移動相Bが水中90アセトニトリル、0.1ギ酸であるC18RP-HPLCカラム5μm、200ÅMagicC18を自己充填した75μm×10cm;MichromBioResources、Auburn、CA、米国において、300nl/minの流速で分離した。直線勾配は、40分間で10~45のBとした。各MS1スキャンの後に、7つの最も豊富なプレカーサーイオンの衝突誘起解離CID、LTQ部分において取得したを24秒間の動的排除で行った。MS1シグナルが1000カウントを超える場合のみ、MS2スキャンを開始した。MS1では、500msの最大時間にわたって2×105イオンをOrbitrap中に蓄積し、60,000FWHM375~2000m/zの分解能でスキャンした。MS2スペクトル衝突誘起解離CIDを介したを、LTQにおいて通常のスキャンモードで、104イオンの標的設定および30msの蓄積時間で取得した。正規化された衝突エネルギーは、35に設定し、各スペクトルについて1つのマイクロスキャンを取得した。ヒト血清アルブミンおよびウシ膵臓トリプシンペプチドに対応する134m/z値の排除リストを以前のMSランに基づいて作成し、これによりこれらの値がMS2分析のために選択されることを排除した。データベース検索。生のMSデータをInternationalProteinIndexヒトv.3.62データベースに対して検索し、これは、Sorcerer2商標-SEQUEST登録商標Sage-NResearch、Milpitas、CA、米国を使用して実施し、検索後分析は、Scaffold3ProteomeSoftware,Inc.、Portland、OR、米国を使用して実施した。すべての生データピーク抽出は、Sorcerer2-SEQUESTデフォルト設定を使用して実施した。データベース検索パラメータは以下の通りであった:切断失敗が最大で2回までのトリプシンLysまたはArgの後での半酵素消化;400~4500amuのモノアイソトピックプレカーサー質量範囲;メチオニンの示差的な酸化およびシステインの静的なカルボアミドメチル化は許容された。ペプチド質量許容誤差は50ppmに設定し、断片質量タイプはモノアイソトピックに設定し、修飾の最大数はペプチド1つ当たり4個に設定した。可能にした高度な検索オプションは、以下を含んでいた:1.5のXCorrスコアカットオフ;1.003355amuの質量シフトを使用した同位体チェック;最終的なスコアリングのために上位2000の予備段階の結果を保持しておく;結果ファイルで最大200個までのペプチドの結果を表示する;結果ファイルで最大5個までの完全なタンパク質の説明を表示する;結果ファイルで最大1個までの二重測定タンパク質参照を表示する。エラー率偽発見率およびタンパク質確率pはScaffoldによって計算した。各試料についての各AB-CおよびD-E二重測定の生データを、単一のデータベース検索に組み合わせた。結果待機的な血管形成術PTCAを受けている6人の患者3対照、3罹患の血清を、上述した通り3つの時点で集めた。これらの試料のそれぞれのABPPCを、サイズ排除クロマトグラフィーSEC、1-D電気泳動およびLC-MS/MSによって分析した。分子量標準を、ABPPC試料の分析の前にSECカラム上に流し、クロマトグラムを図1に示している。各ABPPC試料についてのサイズ排除クロマトグラムを、図2に示している。図2のSECクロマトグラムを見ると、ABPPCが個体間で実際に異なることが明白であり、これは、患者間でABPPCの生物学的変動が存在することを示す。加えて、ABPPCはまた、一部の患者についての22分から28分の間の小さいピークの変化によって分かるように、患者内でも変化している。SEC画分についての1-DEゲルプロファイルもまた、特に、それぞれ22.5~26および26.5~28分の間に集めたABおよびC画分において、患者間で異なる図3。これらの画分は、図1において示されているように、66kDaより大きいMW範囲で溶出する小さいピークに対応する。SECのこの領域は、ABPPCの大部分が位置している可能性が最も高く、そのためこのことは、個体間で生物学的変動が存在するというさらなる証拠である。SECクロマトグラムのいくつかにおいて見られる45~50分の間の大きいピークMW標準のクロマトグラムから決定される約3,500DaのMWに対応するはまだ特定されていない。44~50分の範囲の画分を集め、これらのプールした画分はBCA方法によってアッセイした場合595nmの吸光度を報告したが、1-DESDS-PAGEは、銀染色した場合この画分についてバンドを示さなかった結果は示さず。加えて、これらの画分のトリプシン消化およびLC-MS/MS分析は、ヒトタンパク質またはペプチドの存在を示さなかった。各画分についてゲル片アルブミンを引いたものをトリプシンで消化し、LC-MS/MSによって分析した。ヒトIPIデータベースの検索は、試料全体にわたって分布している187の全タンパク質を返した。これらのタンパク質の大部分は、疾患2のPTCA後24時間の試料にのみ存在していた。ゼロのスペクトルカウントを報告したタンパク質は、0.5の値を任意に割り当てた。データ分析のために、各群の患者についてすべての3つの時点で各タンパク質について平均スペクトルカウントを使用した。次いで、対照群における各タンパク質についての平均スペクトルカウントのlog10を計算し、罹患群における各タンパク質についての平均スペクトルカウントのlog10に対して、時点1および8についてプロットしたそれぞれ図4aおよび4b。上部の赤色破線より上にあるタンパク質は、罹患群において上昇するタンパク質であり、下部の赤色破線より下にあるタンパク質は、対照群において上昇するタンパク質である。2つの赤色破線の間にあるタンパク質は、2つの群間で顕著に異ならないが、この領域にあるタンパク質はさらなる評価において依然として興味深いものである可能性がある。図4Aを見ると、破線の外側にあるタンパク質は多くなく、このことは、これがベースライン時点であるため予期することができる。しかしながら、図4bを見ると、破線の外側のタンパク質の数は劇的に増加する。非常に興味深いタンパク質と考えられる、時点8で罹患群において増加する3つのタンパク質が存在し、それらはタンパク質7、8および31であり、これは、それぞれアネキシンA2、プラコグロビンおよびセルピンB3に対応する。これらのタンパク質は、表1においてボールド体である。時点8で罹患群において減少するタンパク質もまた興味深いタンパク質であり、それらは表1においてイタリック体である。ボールド体またはイタリック体でないタンパク質は、さらなる調査から排除されず、重要である可能性がある。特に、タンパク質1、3および6は、それらが血清中で遊離していることが分かったため興味深く、これらのタンパク質について、ならびに列挙されている他のタンパク質のいずれかについて、遊離対結合の比が疾患プロセスを示す可能性がある。最終的に、補遺の表において列挙されているいずれかのタンパク質は、潜在的な臨床用途を有し得るタンパク質である可能性がある。非常に興味深い3つのタンパク質は、それらが既知の疾患に関与しており、時点8で罹患患者において上昇するため、特に興味を引く。プラコグロビンは、それが、中間フィラメントを原形質膜にアンカーしている主要な細胞内接着ジャンクションであるデスモソームの成分であるため興味を引くGreenらNatureReviewsMolecularCellBiology2000、1:208~216。心臓のデスモソームタンパク質をコードしている遺伝子中の突然変異は、不整脈を伴う右心室異形成症/心筋症ARVD/C、特定の電気的、機能的および構造的な右心室の異常の存在によって臨床的に、および線維または線維脂肪組織による心筋細胞の置換によって組織学的に定義される遺伝性の心疾患を有する患者に多いBassoら、Lancet2009、373:1289~1300;McKennaら、BritishHeartJournal1994、71:215~218。過去10年間にわたる取り組みは、ARVCが、デスモソーム内で見出される重要な構造タンパク質をコードする遺伝子中の突然変異によって頻繁に引き起こされる常染色体優性の形質であることを示しているAwadら、NatClinPractCardiovascMed2008、5:258~267。最近の取り組みは、デスモソームタンパク質をコードしている遺伝子中の突然変異はまた、拡張型心筋症患者にも多いことを示しているElliottら、CirculationCardiovascularGenetics2010、3:314~322。罹患患者においてABPPCに結合しているプラコグロビンの量の増加が観察されるという事実は、これらの患者においてデスモソームの分解が存在すること、したがって心筋内の細胞間相互作用の構造完全性の喪失を示し、このことは、この群における患者は上昇したレベルのcTnIを示しているため、非常にもっともらしい。アルブミンは、分解されたデスモソームから放出されるこれらのタンパク質を結合するためのスポンジとして機能し得る。そうであるなら、また、これらのならびに他のデスモソームタンパク質、たとえば、プラコフィリン、デスモグレインおよびデスモコリンそのすべてはABPPCにおいて提示されるが心筋虚血の結果としてABPPCにおいて上昇するなら、それらがまた、他の心臓障害を有する患者についてもABPPCにおいて上昇し、心血管医学において強力なバイオマーカーとして使用することできることは当然考えられる。セルピンB3は、TGF-βのそのモジュレーションTuratoら、LaboratoryInvestigation2010、90:1016~1023によって、扁平上皮癌細胞の生存Ahmedら、BiochemBiophysResCommun2009、378:821~825および慢性肝臓疾患に関与するペプチダーゼ阻害剤である。アネキシンA2は、細胞増殖の制御においておよびシグナル伝達経路において役割を果たすカルシウム依存性リン脂質結合タンパク質のファミリーであるアネキシンファミリーのメンバーである。アネキシンは、小胞のトラフィッキングおよび組織化、エキソおよびエンドサイトーシスを含む様々な細胞プロセスに、ならびにカルシウムイオンチャネル形成に関わることが示されておりGerkeら、NatRevMolCellBiol2005、6:449~461、アネキシンA2は、肝細胞腫瘍の示差的な診断マーカーとして提案されているJiら、InterJMolMed2009、24:765~771;Longrichら、PatholResPract2010、ArticleinPressdoi:10.1016/j.prp.2010.09.007。疾患におけるこれらのタンパク質の遊離形態の潜在的重要性により、それらがABPPCにおいて観察されるという事実は非常に興味を引くものであり、これらのタンパク質のABPPCに結合している形態またはABPPCにおいて観察されるタンパク質のいずれかは、大きな診断の潜在能力を有し得る。"