"正常細胞に比べて癌細胞で発現が低下しているマイクロRNAの標的配列を、ウイルス増殖に関るB5R遺伝子の3’非翻訳領域に挿入したワクシニアウイルスであって、前記癌細胞内で特異的に増殖し、癌細胞を特異的に破壊する腫瘍溶解性を有するマイクロRNA制御型ワクシニアウイルス。正常細胞で発現するマイクロRNAによって、B5R遺伝子の発現が抑制され、正常細胞での増殖性が低下している、請求項1記載のマイクロRNA制御型ワクシニアウイルス。B5R遺伝子を部分的に又は完全に欠失した弱毒化ワクシニアウイルスに、3’非翻訳領域にマイクロRNAの標的配列を挿入したB5R遺伝子を導入した、請求項1又は2に記載のマイクロRNA制御型ワクシニアウイルス。ワクシニアウイルスが、LC16株又はLC16mO株である、請求項1又は2に記載のマイクロRNA制御型ワクシニアウイルス。ワクシニアウイルスが、B5R遺伝子を部分的に欠失したLC16m8株又はB5R遺伝子を完全に欠失したm8Δ株である、請求項3記載のマイクロRNA制御型ワクシニアウイルス。正常細胞に比べて癌細胞で発現が低下しているマイクロRNAが、let-7a配列番号1、let-7b配列番号2、let-7c配列番号3、let-7d配列番号4、let-7e配列番号5、let-7f配列番号6、miR-9配列番号7、miR-15a配列番号8、miR-16-1配列番号9、miR-21配列番号10、miR-20a配列番号11、miR-26a配列番号12、miR-27b配列番号13、miR-29a配列番号14、miR-29b配列番号15、miR-29c配列番号16、miR-30a配列番号17、miR-30d配列番号18、miR-32配列番号19、miR-33a配列番号20、miR-34a配列番号21、miR-92a配列番号22、miR-95配列番号23、miR-101配列番号24、miR-122配列番号25、miR-124配列番号26、miR-125a配列番号27、miR-125b配列番号28、miR-126配列番号29、miR-127配列番号30、miR-128配列番号31、miR-133b配列番号32、miR-139-5p配列番号33、miR-140配列番号34、miR-141配列番号35、miR-142配列番号36、miR-143配列番号37、miR-144配列番号38、miR-145配列番号39、miR-155配列番号40、miR-181a配列番号41、miR-181b配列番号42、miR-181c配列番号43、miR-192配列番号44、miR-195配列番号45、miR-198配列番号46、miR-199a配列番号47、miR-199b-5p配列番号48、miR-200a配列番号49、miR-203配列番号50、miR-204配列番号51、miR-205配列番号52、miR-217配列番号53、miR-218配列番号54、miR-219-5p配列番号55、miR-220a配列番号56、miR-220b配列番号57、miR-220c配列番号58、miR-222配列番号59、miR-223配列番号60、miR-224配列番号61、miR-345配列番号62、及びmiR-375配列番号63からなる群から選択される、請求項1~5のいずれか1項に記載のマイクロRNA制御型ワクシニアウイルス。癌細胞において欠損した場合にはその機能欠損が補償され得るが、正常細胞では機能欠損が補償されない遺伝子の1つ又は複数を欠損させた、請求項1~6のいずれか1項に記載のマイクロRNA制御型ワクシニアウイルス。少なくともチミジンキナーゼ遺伝子を欠損させた、請求項7記載のマイクロRNA制御型ワクシニアウイルス。さらに、赤血球凝集素HA遺伝子を欠損させた、請求項8記載のマイクロRNA制御型ワクシニアウイルス。さらに、Fフラグメントを欠損させた、請求項9記載のマイクロRNA制御型ワクシニアウイルス。さらに、VGF遺伝子を欠損させた、請求項8記載のマイクロRNA制御型ワクシニアウイルス。請求項1~11のいずれか1項に記載のマイクロRNA制御型ワクシニアウイルスを含む癌治療のための医薬組成物。請求項1~12のいずれか1項に記載のマイクロRNA制御型ワクシニアウイルスに外来DNAを導入した、マイクロRNA制御型ワクシニアウイルスベクター。外来DNAがマーカーDNA、細胞毒性効果若しくは免疫賦活効果を有する治療用遺伝子、又は癌、ウイルス、細菌若しくは原虫の抗原をコードするDNAである、請求項13記載のマイクロRNA制御型ワクシニアウイルスベクター。請求項13又は14に記載のマイクロRNA制御型ワクシニアウイルスベクターを含む癌治療のための、又は癌、ウイルス、細菌若しくは原虫に対するワクチンとして使用するための医薬組成物。請求項1~11のいずれか1項に記載のマイクロRNA制御型ワクシニアウイルスの癌患者における癌治療効果を評価する方法であって、i前記癌患者より採取した癌細胞及び正常細胞に前記マイクロRNA制御型ワクシニアウイルスを接触させる工程、及びii癌細胞及び正常細胞におけるマイクロRNA制御型ワクシニアウイルスの増殖を測定する工程を含み、前記マイクロRNA制御型ワクシニアウイルスが癌細胞で増殖し、正常細胞で増殖しない場合に、癌治療効果があると判断する方法。マイクロRNA制御型ワクシニアウイルスがB5R遺伝子とマーカー遺伝子の融合遺伝子を有し、マーカーの発現により、癌治療効果を評価する、請求項16記載の方法。以下、本発明を詳細に説明する。本発明のワクシニアウイルスを製造するためのワクシニアウイルスの株は限定されないが、リスターLister株、リスター株から確立されたLC16株、LC16mO株、LC16m8株橋爪壮、臨床とウイルスvol.3,No.3,269,1975等、NYBH株等の株、Wyeth株、コペンハーゲン株等が挙げられる。LC16mO株は、Lister株からLC16株を経て作出された株であり、LC16m8株は、さらにLC16mO株から作出された株である蛋白質核酸酵素Vol.48No.122003,p.1693-1700。ヒトに投与する場合の安全性が確立されているという点で、本発明において用いるワクシニアウイルスは弱毒化され、病原性を有していないものが好ましい。このような弱毒化された株として、B5R遺伝子を部分的に又は完全に欠失した株が挙げられる。B5R遺伝子は、ワクシニアウイルスのエンベロープに存在するタンパク質をコードしており、B5R遺伝子産物は、ウイルスの感染増殖に関与している。B5R遺伝子産物は感染細胞表面及びウイルスのエンベロープに存在し、隣接の細胞、あるいは宿主体内の他の部位にウイルスが感染伝播するときに、感染効率を高める働きをし、ウイルスのプラークサイズ及び宿主域にも関与している。B5R遺伝子を欠失させると、動物細胞に感染させた場合のプラークサイズが小さくなり、ポックサイズも小さくなる。また、皮膚増殖能が低下し、皮膚病原性が低下する。B5R遺伝子が部分的に又は完全に欠失したワクシニアウイルスは、B5R遺伝子の遺伝子産物がその正常機能を有さず、皮膚増殖性も小さく、ヒトに投与した場合でも副作用を起こさない。B5R遺伝子を欠失している弱毒化株として、例えば上記のLC16m8株からB5R遺伝子を完全に欠失させて確立されたm8Δ株LC16m8Δ株とも呼ぶ、が挙げられる。また、LC16mO株からB5R遺伝子を完全に欠失して確立されたmOΔ株LCmOΔ株とも呼ぶを用いることもできる。これらのB5R遺伝子を部分的に又は完全に欠失した弱毒されたワクシニアウイルス株は国際公開第WO2005/054451号国際公開パンフレットに記載されており、その記載に基づいて入手することができる。ワクシニアウイルスがB5R遺伝子を部分的に又は完全に欠失し、B5Rタンパク質の機能が欠失しているかどうかは、例えば、RK13細胞に感染させたときに形成されるプラークサイズ、ポックサイズ、Vero細胞でのウイルス増殖性、ウサギにおける皮膚病原性等を指標に判断することができる。また、ワクシニアウイルスの遺伝子配列を調べてもよい。本発明において用いるワクシニアウイルスは、B5R遺伝子を癌細胞中で発現させ、B5Rタンパク質の作用により、癌細胞の傷害をもたらす。従って、本発明において用いるワクシニアウイルスは完全なB5R遺伝子を保持している必要性がある。上記のようにB5R遺伝子を有しておらず、弱毒化され安全性が確立されているワクシニアウイルスを用いる場合、該B5R遺伝子を欠失したワクシニアウイルスにあらためて完全なB5R遺伝子を導入する。B5R遺伝子を部分的に又は完全に欠失したワクシニアウイルスを用いる場合、該ワクシニアウイルスゲノムに、非翻訳領域特に3’非翻訳領域を含むB5R遺伝子を挿入して、本発明のワクシニアウイルス製造の材料として用いればよい。B5R遺伝子のワクシニアウイルスへの挿入は如何なる方法で行ってもよいが、例えば公知の相同組換え法により行うことができる。また、この場合のB5R遺伝子を挿入する位置は、もともとB5R遺伝子が存在していたB4R遺伝子とB6R遺伝子の間でもよいし、ワクシニアウイルスのゲノムの任意の部位であってもよい。さらに、あらかじめ、3’非翻訳領域に標的配列を挿入したB5R遺伝子をDNAコンストラクトとして構築し、それをワクシニアウイルスに導入してもよい。配列番号87にワクシニアウイルスゲノムのB4R遺伝子、B5R遺伝子及びB6R遺伝子配列を含む部分の配列を示す。配列番号87の1780番目のaから2733番目のaがB5Rタンパク質をコードするorf部分を示し、この停止コドンの下流に3’非翻訳領域が存在する。相同組換えとは、細胞内で2つのDNA分子が同じ塩基配列を介して相互に組換えを起こす現象で、ワクシニアウイルスのような巨大なゲノムDNAを持つウイルスの組換えにしばしば用いられる方法である。まず、標的とするワクシニアウイルス遺伝子部位の配列を中央で分断する形で、B5R遺伝子を連結したプラスミドこれをトランスファーベクターというを構築し、これを、ワクシニアウイルスを感染させた細胞に導入してやると、ウイルス複製の過程で裸になったウイルスDNAとトランスファーベクター上の同じ配列部分との間で入れ換えが起こり、挟み込まれたB5R遺伝子がウイルスゲノム中に組み込まれる。このとき用いる細胞としては、BSC-1細胞、HTK-143細胞、Hep2細胞、MDCK細胞、Vero細胞、HeLa細胞、CV1細胞、COS細胞、RK13細胞、BHK-21細胞、初代ウサギ腎臓細胞等ワクシニアウイルスが感染し得る細胞を用い得る。また、ベクターの細胞への導入は、リン酸カルシウム法、カチオニックリボゾーム法、エレクトロポレーション法等の公知の方法で行えばよい。マイクロRNAmiRNAは、19~23塩基からなる低分子RNAであり、多くの場合、特定の遺伝子のメッセンジャーRNAmRNAの3’非翻訳領域に存在する標的部位に結合し、そのmRNAの翻訳を阻害するか、又はそのmRNAを分解することによりタンパク質の発現を抑制する。この際、標的部位の標的配列は、miRNAの配列と完全に又は部分的に相補的な配列を含んでいるので、miRNAが標的配列に結合し、特定の遺伝子の発現を制御する。本発明においては、正常細胞に比べて癌細胞で発現が低下しているmiRNAを利用する。用いるワクシニアウイルスのB5R遺伝子の3’非翻訳領域に正常細胞に比べて癌細胞で発現が低下しているmiRNAの標的配列を挿入する。正常細胞では前記miRNAが標的配列に結合し、B5R遺伝子の発現が抑制されるので、ワクシニアウイルスは正常細胞には病原性を示さない。一方、癌細胞においては前記miRNAの発現が低下しているので、標的配列にmiRNAが結合せず、B5R遺伝子の発現は抑制されず、産生される。このため、癌細胞においては、B5Rタンパク質が正常に機能し、ワクシニアウイルスが癌細胞特異的に増殖し、癌細胞を破壊し傷害をもたらす。すなわち、本発明のワクシニアウイルスは癌細胞特異的な腫瘍溶解性を有する。正常細胞に比べて癌細胞で発現が低下しているmiRNAは限定されず、現在知られているmiRNAも今後見いだされるであろうmiRNAもすべて包含する。miRNAの配列や由来は、miRNAに関するデータベース、例えばmiRBasesequencedatabasehttp://microrna.sanger.ac.uk/sequences/index.shtmlを検索して確認することができる。また、実験医学、Vol.27,No.85月号2009,p.1188-1193及びp.1218-1222;YongSunLeeandAnindyaDutta,′′MicroRNAsinCancer′′,Anun.Rev.Pathol.Mech,DIs,2009.4:199-227;CarloM.Croce,NATUREREVIEWS,Volume10,October2009,704-714等に記載の癌細胞でダウンレギュレートされているmiRNAを選択することができる。正常細胞に比べて癌細胞で発現が低下しているヒト由来のmiRNAの例として、以下のものが挙げられ、miRNA名及び各miRNAの成熟miRNAの配列を示す。下記の配列は5’→3’で示してある。let-7alet-7blet-7clet-7dlet-7elet-7fmiR-9miR-15amiR-16-1miR-21miR-20amiR-26amiR-27bmiR-29amiR-29bmiR-29cmiR-30amiR-30dmiR-32miR-33amiR-34amiR-92amiR-95miR-101miR-122miR-124miR-125amiR-125bmiR-126miR-127miR-128miR-133bmiR-139-5pmiR-140miR-141miR-142miR-143miR-144miR-145miR-155miR-181amiR-181bmiR-181cmiR-192miR-195miR-198miR-199amiR-199b-5pmiR-200amiR-203miR-204miR-205miR-217miR-218miR-219-5pmiR-220amiR-220bmiR-220cmiR-222miR-223miR-224miR-345miR-375また、癌の種類により、発現が低下しているmiRNAに違いがあり、例えば、脳腫瘍ではmiR-128,miR-181等、乳癌ではlet-7,miR-15a,miR-16,miR-125a,miR-125b,miR-127,miR145,miR-204等、肺癌ではlet-7,miR-9,miR-26a,miR-27b,miR-29b,miR32,miR-33,miR-30a,miR-95,miR-101,miR-124,miR-125a,miR-126,miR-140,miR-143,miR-145,miR-198,miR-192,miR-199b,miR-218,miR-219,miR-220,miR-224,miR-203,miR-205等、食道癌ではmiR-203,miR-205等、胃癌ではlet-7等、結腸直腸癌ではlet-7,miR-34,miR-127,miR-133b,miR-143,miR-145等、肝細胞癌ではlet-7,miR-101,miR122,miR125a,miR-195,miR-199a,miR200a等、膵臓癌ではmiR-139,miR-142,miR-345,miR-375等、前立腺癌ではmiR-15a,miR-16,miR-143,miR-145,miR-218等、子宮頸癌ではmiR-143,miR-145等、B-CCLB細胞慢性リンパ球性白血病ではmiR-15a,miR-16,miR-143,miR-145,miR-192,miR-220等の発現が正常細胞に比べて低下している。従って、本発明のワクシニアウイルスを特定の癌種の治療に用いる場合は、上記の特定の癌種で特に発現がダウンレギュレートされているmiRNAを用いることもできる。ただし、必ずしも各々のmiRNAが上記の特定の癌のみにおいてダウンレギュレートされているのではなく、程度の差こそあれ、あるmiRNAは種々の癌種の細胞でダウンレギュレートされている。従って、いずれのmiRNAも癌種を問わずに癌の治療に利用することができる。上記のmiRNAの中でも、let-7aは、肺癌、膵臓癌、メラノーマなどの臨床検体で発現が低下しており、現行の治療法に極めて高い抵抗性を示す難治性悪性腫瘍に対する新規治療法の確立に貢献する点で好ましい。また、正常細胞に比べて癌細胞での発現低下が著しいmiR-15、miR-16、miR-143、miR-145などのmiRNAも好適に利用することができる。miRNAは3’非翻訳領域にmiRNAの配列と部分的に又は完全に相補的な配列を含むmRNAに結合して、そのmRNAの翻訳を阻害、又はmRNAを分解することによって、特定の遺伝子発現を抑制する。従って、本発明においては、上記miRNAの標的配列をワクシニアウイルスのB5R遺伝子の3’非翻訳領域3’-UTRにmiRNAの結合部位として挿入する。挿入する位置は限定されず、3’非翻訳領域の両末端を含む3’末端領域中ならばどの部位でもよく、例えば、B5Rタンパク質のorfの停止コドンの直後に挿入すればよい。配列番号87に示す塩基配列中、1780番目のaから2733番目のaがB5Rタンパク質のorfをコードする塩基配列であり、miRNAの標的配列をorfの停止コドンより後の部分に挿入すればよい。標的配列は、miRNA配列の一部配列又は全配列に対する相補配列からなり、塩基長は7~25塩基長、好ましくは15~25塩基長、さらに好ましくは19~23塩基長である。好ましくは、各々のmiRNA配列に対して完全相補配列からなる。但し、miRNAとハイブリダイズする限り、1~数個、例えば、1~3個、1若しくは2個、あるいは1個のミスマッチがあってもよい。この場合のハイブリダイズする条件は、本発明のワクシニアウイルスを生体内に投与して医薬として用いる場合は、生体内の条件であり、本発明のワクシニアウイルスを試薬としてinvitroで用いる場合は、中度のストリンジェントな条件又は高度なストリンジェントな条件であり、このような条件として、例えば、400mMNaCl、40mMPIPESpH6.4、1mMEDTA、50°Cから70°Cで12~16時間でのハイブリダイズ条件が挙げられる。また、本発明のmiRNAの完全相補配列と標的配列は、BLAST[J.Mol.Biol.,215,403-4101990]、FASTA[Methods.Enzymol.,183,63-981990]等の当業者に公知の相同性検索プログラムをデフォルト初期設定のパラメータを用いて算出される数値で95以上、好ましくは96、97、98又は99以上の配列同一性を有する。また、完全相補配列の一端又は両端に1~数個、例えば、1~3個、1若しくは2個、あるいは1個の塩基が付加されていてもよい。miRNAは、DNAから転写されたmRNAに結合するので、ワクシニアウイルスのB5R遺伝子の3’非翻訳領域に挿入する標的配列は、miRNA配列に対して逆相補の関係にあるチミンTを含むDNA配列であり、逆相補の関係にあるDNA配列をワクシニアウイルスのB5R遺伝子の3’非翻訳領域に挿入すればよい。例えば、miRNAとして5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-3’配列番号1であるlet-7aを利用する場合、ワクシニアウイルスのB5R遺伝子の3’非翻訳領域に5’-AACTATACAACCTACTACCTCA-3’配列番号64からなる標的配列を挿入すればよい。当業者ならば、ワクシニアウイルスのB5R遺伝子の3’非翻訳領域に挿入すべき結合部位の配列を適宜設定することができる。標的配列は、ワクシニアウイルスのB5R遺伝子の3’非翻訳領域に少なくとも1つあればよい。また、複数の標的配列の繰り返し配列であってもよい。複数の繰り返し配列である場合、繰り返しの数は、2~20個、好ましくは2~10個、より好ましくは2~5個、さらに好ましくは2~4個である。さらに、同一のmiRNAに対する標的配列ばかりでなく、異なるmiRNAに対する複数の標的配列が挿入されていてもよい。この際、miRNA配列と配列の間には、スペーサー配列を挿入してもよい、スペーサー配列の長さ、塩基は限定されないが、例えば、3~10塩基、好ましくは3~5塩基長の塩基配列を挿入すればよい。本発明は、癌細胞で正常細胞に比べて発現が低下しているmiRNAを利用するが、患者によって、特定のmiRNAのダウンレギュレーションの程度が異なる場合がある。また、癌種によっても特定のmiRNAのダウンレギュレーションの程度が異なる場合がある。あらかじめ、患者ごとに癌細胞で特にダウンレギュレートされているmiRNAを選択し、或いは特定の癌種で特にダウンレギュレートされているmiRNAを選択することにより、患者ごとに、又は癌種ごとにより特異的に効果的な治療を行うことが可能である。本発明の、B5R遺伝子の3’非翻訳領域にmiRNAの標的配列を結合部位として含むワクシニアウイルスをmiRNA制御型ワクシニアウイルス又はmiRNA制御増殖型ワクシニアウイルスと呼ぶ。本発明のmiRNA制御型ワクシニアウイルスは癌治療のために用いることができる。すなわち、本発明はmiRNA制御型ワクシニアウイルスを含む癌治療用の医薬組成物を包含する。対象とする癌は限定されず、例えば発生臓器別に分類した場合、皮膚癌、胃癌、肺癌、肝臓癌、結腸癌、膵臓癌、肛門直腸癌、食道癌、子宮癌、乳癌、膀胱癌、前立腺癌、食道癌、卵巣癌、脳神経腫瘍、リンパ腫白血病、骨骨肉腫、平滑筋腫、横紋筋腫等あらゆる癌種が対象となる。本発明のmiRNA制御型ワクシニアウイルスを含む癌治療用医薬組成物は、医薬的に有効量の本発明のワクシニアウイルスワクチンを有効成分として含んでおり、無菌の水性又は非水性の溶液、懸濁液、又はエマルションの形態であってもよい。さらに、塩、緩衝剤、アジュバント等の医薬的に許容できる希釈剤、助剤、担体等を含んでいてもよい。投与は種々の非経口経路、例えば、皮下経路、静脈内経路、皮内経路、筋肉内経路、腹腔内経路、鼻内経路、経皮経路によればよい。有効投与量は被験体の年齢、性別、健康、及び体重等により適宜決定することができる。例えば、限定されないが、ヒト成人に対して、投与当たり約102~1010プラーク形成単位PFU、好ましくは105~106プラーク形成単位PFUである。さらに、本発明のmiRNA制御型ワクシニアウイルスは、外来遺伝子外来DNA又は外来ポリヌクレオチドを含んでいてもよい。外来遺伝子外来DNA又は外来ポリヌクレオチドとしては、マーカー遺伝子、細胞毒性や免疫賦活効果を有する産物をコードする治療用遺伝子が挙げられ、さらに、癌、ウイルス、細菌、原虫等のタンパク質抗原をコードするDNAが挙げられる。マーカー遺伝子はレポーター遺伝子ともいい、ルシフェラーゼLUC遺伝子、緑色蛍光タンパク質Greenfluorescentprotein;GFP等の蛍光タンパク質遺伝子、赤色蛍光タンパク質DsRed等の蛍光タンパク質遺伝子、βグルクロニダーゼGUS遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼCAT遺伝子、β-ガラクトシダーゼLacZ遺伝子等が挙げられる。本発明において、これらの外来遺伝子を含むmiRNA制御型ワクシニアウイルスをmiRNA制御型ワクシニアウイルスベクターということもできる。これらのマーカー遺伝子をB5R遺伝子のプロモーターの制御下に挿入した場合、すなわちB5R遺伝子とマーカー遺伝子の融合遺伝子として挿入したmiRNA制御型ワクシニアウイルスは、miRNA制御の評価のために用いることができる。すなわち、特定のmiRNAの標的配列を挿入し、特定の癌細胞に感染させる。用いたmiRNAがワクシニアウイルスの増殖制御に有効な場合、すなわち、用いたmiRNAが癌細胞において発現が低下している場合、前記癌細胞中でB5R遺伝子と共にマーカー遺伝子が発現するので、蛍光タンパク質等のマーカー遺伝子産物が細胞中で産生される。マーカーを測定することにより用いたmiRNAの有効性を評価することが可能になる。本発明は、マーカー遺伝子を含むmiRNA制御型ワクシニアウイルスを用いてmiRNAを評価する系及び評価する方法を包含する。例えば、特定の癌患者に適したmiRNAを選択しようとする場合、該患者から癌細胞及び正常細胞を採取し、両細胞に、それぞれ種々のmiRNAの標的配列を含むmiRNA制御型ワクシニアウイルスを感染させ、ワクシニアウイルスが癌細胞で増殖し、正常細胞で増殖しなくなるmiRNAを選択すればよい。治療用遺伝子は、癌や感染症等の特定の疾患の治療に用い得る遺伝子であり、p53、Rb等の腫瘍抑制遺伝子、インターロイキン1IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、α-インターフェロン、β-インターフェロン、γ-インターフェロン、アンジオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、METH-1、METH-2、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、腫瘍壊死因子等の生理活性物質をコードする遺伝子等が挙げられる。外来遺伝子外来DNAとしてウイルス、細菌、原虫及び癌等の抗原をコードするDNAを導入することにより、外来遺伝子を導入したワクシニアウイルスベクターを種々のウイルス、細菌、原虫及び癌に対するワクチンとして用いることができる。例えば、ヒト免疫不全ウイルス、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、ミコバクテリア、マラリア原虫、重症急性呼吸器症候群SARS=サーズウイルス等の感染防御抗原中和抗原、あるいは癌抗原をコードする遺伝子を導入すればよい。これらの外来遺伝子は、例えば、相同組換えの手法を用いることにより導入することができる。相同組換えは上述の方法で行えばよい。例えば、導入したい部位のDNA配列中に導入すべき外来遺伝子を連結したプラスミドトランスファーベクターを作製し、これを、ワクシニアウイルスを感染させた細胞の中に導入すればよい。トランスファーベクターとして、例えばpSFJ1-10、pSFJ2-16、pMM4、pGS20、pSC11、pMJ601、p2001、pBCB01-3,06、pTKgpt-F1-3s、pTM1、pTM3、pPR34,35、pgpt-ATA18-2、pHES1-3等を用いることができる。外来遺伝子の導入領域は、ワクシニアウイルスの生活環に必須でない遺伝子中が好ましい。あるいは、例えば、癌細胞においては、外来遺伝子の挿入により機能が欠損した場合であっても、癌細胞が豊富に有する酵素等によりその機能欠損が補償され得るが正常細胞では機能欠損が補償されない遺伝子や特定の領域中に挿入しても良い。この場合、本発明のmiRNA制御型ワクシニアウイルスは癌細胞中では増殖することができ、miRNAの作用により癌細胞を破壊し傷害をもたらすが、正常細胞では増殖することができず、正常細胞を破壊し、傷害をもたらすことはない。このような遺伝子として、例えば赤血球凝集素HA遺伝子;チミジンキナーゼTK遺伝子;Fフラグメント;F3遺伝子;VGF遺伝子米国特許出願公開第2003/0031681号明細書;出血領域又はA型封入体領域米国特許第6,596,279号明細書;HindIIIF、F13L若しくはHindIIIM領域米国特許第6,548,068号明細書;A33R、A34R若しくはA36R遺伝子Katzetal.,J.Virology77:12266-122752003;SalF7L遺伝子Mooreetal.,EMBOJ.199211:1973-1980;N1L遺伝子Kotwaletal.,Virology1989171:579-58;M1遺伝子Childetal.,Virology,1990174:625-629;HR、HindIII-MK、HindIII-MKF、HindIII-CNM、RR若しくはBamF領域Leeetal.,JVirol.199266:2617-2630;C21L遺伝子Isaacsetal.,ProcNatlAcadSciUSA.199289:628-632等が挙げられる。これらの遺伝子の中でも、TK遺伝子、HA遺伝子、Fフラグメント、VGF遺伝子が好ましい。例えば、TK遺伝子が機能を失うと、正常細胞におけるワクシニアウイルスの増殖能が低下する。一方、癌細胞にはこの遺伝子の機能を補う酵素が豊富に存在するため癌細胞では増殖能は低下しない。正常細胞において増殖能が低下することは正常細胞に対する病原性が低下することを意味し、すなわち、生体に適用した場合の安全性が向上する。ワクシニアウイルスを感染させる細胞としては、Vero細胞、HeLa細胞、CV1細胞、COS細胞、RK13細胞、BHK-21細胞、初代ウサギ腎細胞、BSC-1細胞、HTK-143細胞、Hep2細胞、MDCK細胞等、ワクシニアウイルスが感染し得る細胞を用い得る。また、本発明のmiRNA制御型ワクシニアウイルスにおいて上記の癌細胞が豊富に有する酵素等によりその機能欠損が補償され得るが正常細胞では機能欠損が補償されない遺伝子の機能を失わせてもよい。このような遺伝子の正常な機能を失わせることにより、miRNA制御型ワクシニアウイルスは癌細胞中で増殖しmiRNAの作用により癌細胞を破壊し傷害をもたらすが、正常細胞では増殖することができず、正常細胞を破壊し、傷害をもたらすことはない。ここで、遺伝子の正常な機能を失わせるとは、該遺伝子が発現しないか、あるいは発現してもその発現タンパク質が正常な機能を保持していないことをいい、遺伝子を欠損させるともいう。遺伝子の正常な機能を失わせるためには、上記のように該遺伝子中に外来遺伝子を挿入してもよく、また、遺伝子を部分的に欠失させても、完全に欠失させてもよい。外来遺伝子の挿入や遺伝子の欠失は例えば相同組換えにより行うことができる。癌細胞が豊富に有する酵素等によりその機能欠損が補償され得るが正常細胞では機能欠損が補償されない遺伝子としては、上記の遺伝子が挙げられ、この中でも、TK遺伝子、HA遺伝子、Fフラグメント、VGF遺伝子が好ましい。これらの遺伝子の1つ又は複数を欠損させればよい。この中でもTK遺伝子を欠損させた場合、正常組織におけるウイルス増殖が抑制され、マイクロRNA制御増殖型ワクシニアウイルスの治療指数が高まり、好ましい。さらに、TK遺伝子に加えてHA遺伝子及びFフラグメントを欠損させてもよく、あるいはTK遺伝子に加えてVGF遺伝子を欠損させてもよい。また、外来遺伝子を導入する際、外来遺伝子の上流に適当なプロモーターを機能し得る形で連結させるのが望ましい。プロモーターは、限定はないが、上述のPSFJ1-10や、PSFJ2-16、p7.5Kプロモーター、p11Kプロモーター、T7.10プロモーター、CPXプロモーター、HFプロモーター、H6プロモーター、T7ハイブリッドプロモーター等を用いることができる。本発明のワクシニアウイルスベクターに外来遺伝子を導入する方法は、組換えワクシニアウイルスベクターを構築する公知の方法により行うことができ、例えば別冊実験医学ザプロトコールシリーズ遺伝子導入発現解析実験法斎藤泉他編集、羊土社1997年9月1日発行、あるいは、D.M.Glover他編、加藤郁之進監訳DNAクローニング4-哺乳類のシステム-第2版TaKaRa、EMBOJournal1987年6巻p.3379-3384等の記載に従えばよい。本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。次に、本発明を実施例により具体的に説明する。参考例1弱毒化ワクシニアウイルスの抗癌効果腫瘍溶解性と安全性ルシフェラーゼを恒常的に発現するヒト膵癌BxPC-3Luc細胞5×106個をSCIDマウスの腹腔内に投与し、腹膜播種マウスモデルを作成した。BxPC-3Luc細胞投与4日目に、ルシフェリン溶液15mg/mLinPBSを10μL/gで腹膜播種マウスモデルの腹腔内に投与し、癌細胞で発現するルシフェラーゼによる発光をIVISTMimagingsystemXenogen社によって非侵襲的にモニターした図1;治療前。次に、BxPC-3Luc細胞投与7日目に、107プラーク形成単位plaqueformingunit;pfuのLC16mO株Lister株からLC16m8株を分離する過程の中間株であり、特徴的性質としては中枢神経病原性が減弱している、またはLC16m8ΔLC16m8株の遺伝的安定性を向上させた組換えウイルスであり、ワクチンとして副作用無くヒトに使用された実績を持つC16m8株と同様の特性を示すを腹膜播種マウスモデルの腹腔内に投与した。ウイルスによる抗癌効果を判定するため、BxPC-3Luc細胞投与18日目、及び29日目に、マウス体内の癌細胞を上述のようにモニターした図1;治療後。その結果、ウイルスを投与していない模擬対照群Mockでは、時間経過に伴って移植した癌細胞の増殖が確認された。それに対し、LC16mO投与群では、強力な抗腫瘍効果を示した。LC16m8Δ投与群では、一時的に抗腫瘍効果を示したが、29日目では移植した癌細胞の再増殖が確認された。同時に、治療に伴うウイルスによる副作用を投与後の体重変化により評価した結果、LC16mO投与マウスは全身でのウイルス増殖による発痘を伴う急激な体重減少によって、全てのマウスが21日から28日目の間に死亡した。その一方、LC16m8Δ投与群では模擬対照群と同様に全く副作用は見られなかった図2。以上より、LC16m8Δは非常に安全性の高い腫瘍溶解性ウイルスになり得るが、それ自体の抗癌効果は完全に癌細胞を死滅させるには不十分であると示唆された。参考例2ヒト腫瘍細胞における弱毒化ワクシニアウイルスのB5R発現とウイルス増殖性LC16mO株のゲノムDNAを鋳型として、2つのプライマー5’-TCGGAAGCAGTCGCAAACAAC-3’配列番号65と5’-ATACCATCGTCGTTAAAAGCGC-3’配列番号66によって、B4RからB5R、そしてB6Rまでの遺伝子領域を増幅し、TAベクターpCRIIInvitrogenにクローニングし、pB5Rを構築した。組換えウイルスLC16m8Δ-B5R図3の回収のため、6wellディッシュに80コンフルエントに培養されたRK13細胞にワクシニアウイルスLC16m8ΔをMOI=0.02~0.1で感染させ、室温で1時間吸着後、FuGENEHDRocheと混合したトランスファーベクタープラスミドDNApB5Rをマニュアルに従って細胞に添加して取り込ませ、37°Cにて2~5日間培養した。細胞を凍結融解後、ソニケーション処理し、ほぼコンフルエントになったRK13細胞に適当に希釈して接種し、0.8メチルセルロースを含むEagleMEM,5FBS培地を加え、37°Cで2~5日間培養した。培地を除き、ラージプラークをチップの先で掻き取り、Opti-MEM培地Invitrogenに浮遊させた。RK13細胞にてさらに3回以上この操作を繰り返し、プラーク純化した。プラーク純化後に採取したプラークの浮遊液をソニケーション後、その200μLを15,000rpm、30分間遠心し、沈査に50μLの滅菌蒸留水または10mMTris-HClPH7.5を添加した。30秒間ソニケーション後、95°Cで10分間加熱してゲノムDNAを抽出し、PCRによるスクリーニングに供した。2つのプライマー5’-cgtataatacgttggtctat-3’配列番号67と5’-gatcgtgccaatagtagtta-3’配列番号68によってPCRを行い、所定の大きさのPCRプロダクトが検出されたクローンについて、PCRプロダクトの塩基配列をダイレクトシーケンスにより確認した。塩基配列に問題が無いウイルスクローンを選択し、RK13細胞にて大量培養した後、RK13細胞にてウイルス力価を測定し、実験に供した。図3に示すウイルスゲノムを持つ各ウイルスの腫瘍溶解性を検討するため、96wellで培養したヒト癌細胞株肺癌A549細胞、膵癌BxPC-3PancI細胞、結腸癌Caco-2細胞、子宮頚癌HeLa細胞、咽頭癌HEp-2細胞、乳癌MDA-MB-231細胞、神経芽腫SK-N-AS細胞にMOI=0.5で感染させ、37°Cで5日間培養後、CellTiter96RAQueousOneSolutionCellProliferationAssayPromegaによって、そのマニュアルに従い生細胞数を測定した図4。その結果、B5Rを発現するLC16mO株と組換えLC16m8Δ-B5Rは、全ての癌細胞に対して同等の腫瘍溶解性を示し、模擬対照群の生細胞数を100とした時、約60~95の細胞を死滅させた。一方、B5Rを発現しないLC16m8Δは、一部の細胞株で腫瘍溶解性を示したが、0~50の細胞を死滅させるにとどまった。これらの結果より、ワクシニアウイルスが腫瘍細胞に感染後、増殖しながら死滅させるという腫瘍溶解性は、B5Rの発現によって劇的に増強されることが示された。癌細胞のみを特異的に破壊するマイクロRNA制御増殖型ワクシニアウイルス図5の構築B5R遺伝子の3’UTRにNheIとAgeIの制限酵素配列を挿入するため、pB5Rプラスミドを鋳型に各2つのプライマー5’-CAAACTCTCGAAAGACGT-3’配列番号69と5’-gcaccggtgctagcTTACGGTAGCAATTTATGGAA-3’配列番号70、又は5’-ccgctagcaccggtATATAAATCCGTTAAAATAATTAAT-3’配列番号71と5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’M13reverseprimer配列番号72によって、2種類のDNA断片を増幅した。前者のPCR産物を制限酵素HpaIとNheIで、後者のPCR産物を制限酵素NheIとHindIIで切断した。この2種類のDNA断片を、制限酵素HpaIとHindIIで切断したpB5Rにクローニングし、pTN-B5Rを構築した。pTN-B5Rプラスミドを鋳型として、2つのプライマー5’-caaaatattttcgttgcgaaga-3’配列番号73と5’-CACCATGGGTAGCAATTTATGGAACT-3’配列番号74によって、終止コドンを除去したB5Rを増幅した。又、pEGFP-N1Clontechプラスミドを鋳型として、2つのプライマー5’-GCGGCCGGACCGGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGA-3’配列番号75と5’-gcgctagcTTACTTGTACAGCTCGTCCA-3’配列番号76によって、NheI制限酵素配列を付加したEGFP緑色蛍光蛋白遺伝子を増幅した。前者のPCR産物を制限酵素HpaIとNcoIで、後者のPCR産物を制限酵素NcoIとNheIで切断した。この2種類のDNA断片を、制限酵素HpaIとNheIで切断したpTN-B5Rにクローニングし、pTN-B5Rgfpを構築した。22塩基のlet7aマイクロRNAの標的配列を2回繰り返して挿入するため、2つの合成DNA5’-ctagcAACTATACAACCTACTACCTCAcgatAACTATACAACCTACTACCTCAcgcgta-3’配列番号77と5’-ccggtacgcgTGAGGTAGTAGGTTGTATAGTTatcgTGAGGTAGTAGGTTGTATAGTTg-3’配列番号78をアニールした。それを制限酵素NheIとAgeIで切断したpTN-B5R又はpTN-B5Rgfpにクローニングし、pTN-B5R-let7ax2、又はpTN-B5Rgfp-let7ax2を構築した。同様な方法で、変異を加えた22塩基のlet7aマイクロRNAの標的配列を2回繰り返して挿入する場合は、5’-ctagcAATTACACGACTTATTATTTGAcgatAATTACACGACTTATTATTTGAcgcgta-3’配列番号79と5’-ccggtacgcgTCAAATAATAAGTCGTGTAATTatcgTCAAATAATAAGTCGTGTAATTg-3’配列番号80の2つの合成DNAを使用し、pTN-B5R-let7amutx2、又はpTN-B5Rgfp-let7amutx2を構築した。さらに、2つの合成DNA5’-cgcgtAACTATACAACCTACTACCTCAtcacAACTATACAACCTACTACCTCA-3’配列番号81と5’-ccggTGAGGTAGTAGGTTGTATAGTTgtgaTGAGGTAGTAGGTTGTATAGTTa-3’配列番号82をアニールしたDNA断片を、制限酵素MluIとAgeIで切断したpTN-B5R-let7ax2又はpTN-B5Rgfp-let7ax2にクローニングし、4回繰り返してlet7aマイクロRNAの標的配列をもつpTN-B5R-let7a、又はpTN-B5Rgfp-let7aを構築した。同様な方法で、変異を加えた標的配列を挿入する場合は、5’-cgcgtAATTACACGACTTATTATTTGAtcacAATTACACGACTTATTATTTGA-3’配列番号83と5’-ccggTCAAATAATAAGTCGTGTAATTgtgaTCAAATAATAAGTCGTGTAATTa-3’配列番号84の2つの合成DNAを使用し、pTN-B5-let7amut、又はpTN-B5Rgfp-let7amutを構築した。各組換えウイルス図7は、参考例2で記述した方法と同様に、pTN-B5R、pTN-B5R-let7a、またはpTN-B5R-let7amut、pTN-B5Rgfp、pTN-B5Rgfp-let7a、又はpTN-B5Rgfp-let7amutのトランスファーベクターを用いて作出し、ラージプラーク、又はEGFPの発現を目安にプラーク純化した後、PCRとダイレクトシーケンスにより確認した。塩基配列に問題が無いウイルスクローンを選択し、RK13細胞にて大量培養した後、RK13細胞にてウイルス力価を測定し、実験に供した。マイクロRNA制御増殖型ワクシニアウイルスの迅速簡便な評価システムの確立ヒト腫瘍細胞より、mirVanamiRNAIsolationkitAppliedBiosystemsによって、そのマニュアルに従いsmallRNAを含むトータルRNAを回収した。10ngの各回収RNAを用いて、TaqMan登録商標MicroRNAAssaysAppliedBiosystemsによって、そのマニュアルに従い各腫瘍細胞のlet7aマイクロRNAProductID;000377をTaqMan法で定量した。内在性コントロールには、RNU6BProductID;001093を使用した。let7aマイクロRNAの相対発現量は、HeLa細胞を基準に比較Ct法を用いて算出した。その結果、HeLa細胞に対して、A549細胞では約60、BxPC-3細胞では約50、PancI細胞では約45の発現低下が観察された。一方、NHLF正常ヒト肺線維芽細胞では、Hela細胞に対して、1.5倍の発現が観察された図6。図7に示すウイルスゲノムを持つ各マイクロRNA制御増殖型ワクシニアウイルスを24wellで培養した各癌細胞にMOI=0.1で感染させ、37°Cで3日間培養後、蛍光顕微鏡オリンパスで生細胞のまま明視野観察と蛍光観察した。その結果、let7aマイクロRNAの発現が低下しているA549、BxPC-3、PancI細胞では、EGFP融合B5R、EGFP融合B5Rの3’UTRにlet7a標的配列、又はEGFP融合B5Rの3’UTRに変異let7a標的配列を挿入したいずれのウイルスでも、同程度の細胞変性が観察され、その変性細胞ではEGFPの発現が確認された。一方、let7aマイクロRNAの発現が高いHeLa及びNHLF細胞では、LC16m8Δ-B5Rgfplet7aによる細胞変性、及びEGFPの発現が観察されなかった図8。さらに、それぞれの感染細胞を回収し、凍結融解後、ソニケーションし、遠心2,000rpm、5分間後の上清をウイルス液として回収した。各ウイルス液1mlのウイルス力価をRK13細胞にて測定した。その結果、A549、PancI細胞では、LC16m8Δ-B5Rgfp、LC16m8Δ-B5Rgfplet7a、LC16m8Δ-B5Rgfplet7amutは同等に増殖しており、それはLC16m8Δよりも高く、LC16mOの増殖にほぼ匹敵していた。一方、HeLa及びNHLF細胞において、LC16m8Δ-B5Rgfplet7aの増殖はLC16m8Δと同等で、他のウイルスに比べて劇的に低下していた図9。これらの結果より、マイクロRNA制御型ウイルスでは、細胞内のマイクロRNA制御機構による遺伝子発現調節と同調して、そのマイクロRNAが発現する細胞においてはB5Rの発現が抑制されるが、そのマイクロRNAの発現が低下している細胞においてはB5Rが発現し、細胞変性と効率の良いウイルス増殖を示した。又、B5R遺伝子にEGFP遺伝子を融合させて発現させることによって、蛍光顕微鏡下で生細胞のまま、容易にB5Rの発現を観察することが可能となり、let7a以外の他のマイクロRNA制御型ウイルスの簡便迅速な評価系として有益となる。外来遺伝子を発現するマイクロRNA制御増殖型ワクシニアウイルスの構築赤血球凝集素HA遺伝子に挿入された2種類の外来遺伝子ホタルルシフェラーゼ遺伝子とEGFP遺伝子を発現する組換えウイルスを構築するため、pGL4.20プラスミドPromegaを鋳型に2つのプライマー5’-GCGGCCGGACCGGCCACCATGGAAGATGCCAAAAA-3’配列番号85と5’-ATGGCCGGCCTTACACGGCGATCTTGCCGC-3’配列番号86によって、両末端にSfiIとFseI制限酵素配列を付加したルシフェラーゼ遺伝子を増幅した。このPCR産物を制限酵素SfiIとFseIで切断し、pVNC110SuzukiHetal.,Vaccine.200911;277:966-971の同じ制限酵素部位にクローニングし、pVNC110-Lucを構築した。pEGFP-N1プラスミドから制限酵素SmaIとNotIの切断によって獲得したEGFP遺伝子断片を、pIRESClontechの同じ制限酵素部位にクローニングし、pIRES-EGFPを構築した。そして、pIRES-EGFPから制限酵素MluIとNotIの切断によって獲得したIRES-EGFP遺伝子断片を、T4DNAポリメラーゼでその両末端を平滑化した。この平滑化遺伝子断片を、pVNC110-Lucの制限酵素FseI処理後に平滑化した部位にクローニングし、pVNC110-Luc/IRES/EGFPを構築した。各組換えウイルス図10は、参考例2で記述した方法と同様に、RK13細胞にワクシニアウイルスLC16mO株、LC16m8Δ、参考例2で作出したLC16m8Δ-B5R、実施例1で作出したLC16m8Δ-B5Rlet7a、又はLC16m8Δ-B5Rlet7amutを感染させ、トランスファーベクタープラスミドDNAのpVNC110-Luc/IRES/EGFPを細胞に取り込ませることによって作出し、プラークの大きさ、又はEGFPの発現を目安にプラーク純化した後、PCRとダイレクトシーケンスにより確認した。塩基配列に問題が無いウイルスクローンを選択し、RK13細胞にて大量培養した後、RK13細胞にてウイルス力価を測定し、実験に供した。外来遺伝子を発現するマイクロRNA制御増殖型ワクシニアウイルスの特性図10に示すウイルスゲノムを持つ各マイクロRNA制御増殖型ワクシニアウイルスを96wellで培養した各癌細胞にMOI=0.5で感染させ、37°Cで5日間培養後、参考例2で記述した方法によって生細胞数を測定した図11。その結果、let7a標的配列を挿入したLC16m8Δ-B5Rlet7a/LGのlet7a高発現Hela細胞おける殺細胞効果は、B5R遺伝子欠失LC16m8Δと同等で、B5Rを挿入したLC16m8Δ-B5R/LGや変異let7a標的配列を挿入したLC16m8Δ-B5Rlet7amut/LGと比較して顕著に低下した。それに対し、let7aの発現が低下しているA549、及びBxPC-3細胞では、LC16m8Δ-B5R/LGやLC16m8Δ-B5Rlet7amut/LGと同等で強力な殺細胞効果が見られた。以上より、外来遺伝子を発現するマイクロRNA制御増殖型ワクシニアウイルスにおいても、そのマイクロRNAが発現する細胞においてはB5Rの発現が抑制されるが、そのマイクロRNAの発現が低下している細胞においてはB5Rが発現し、効率の良いウイルス増殖による殺細胞効果を示した。さらに、このマイクロRNA制御ウイルスが、マウス体内においても機能するかどうかを検討した。Let7aは、全てのマウス正常組織において高発現しているので、LC16m8Δ-B5Rlet7a/LGはマウス体内で増殖できないと予想される。107pfuの各ルシフェラーゼ発現ウイルスをSCIDマウスに腹腔内投与した各群3匹。参考例1で記述したように、3日、9日、16日後にルシフェリンを投与し、ウイルスが感染、増殖した細胞におけるルシフェラーゼ発現を非侵襲的にモニターし図12A、数値化した図12B。その結果、ウイルス投与3日後では、全てのウイルス投与群において腹腔内での発現が確認され、それを数値化し2要因の分散分析two-wayANOVAによって統計解析したところ、全てのウイルス間で有意な差はなかった。それに対し投与9日、16日後では、LC16m8Δ-B5Rlet7a/LGの増殖は、B5R遺伝子欠失LC16m8△/LGと同様に著しく低下していたが、LC16mO/LGとLC16m8Δ-B5Rlet7amut/LGの増殖は、時間経過に伴って投与部位の腹腔内だけではなく全身に広がり、主に尾、手足、口腔で見られる発痘と一致していた図12A。同様の統計解析の結果、投与後16日のLC16m8Δ-B5Rlet7a/LGのウイルス増殖は、LC16mO/LGとLC16m8Δ-B5Rlet7amut/LGに対して有意な差が確認されたが、LC16m8Δに対しては有意な差がなかった図12B。これより、外来遺伝子発現マイクロRNA制御増殖型ウイルスは、let7aの制御によって、免疫欠損SCIDマウスの正常組織においても、その増殖性が著しく低下することを確認した。次に、108pfuの各ルシフェラーゼ発現ウイルスをC57BL/6マウスに腹腔内投与した各群3匹。参考例1で記述したように、1日、4日、10日後にルシフェリンを投与し、ウイルスが感染、増殖した細胞におけるルシフェラーゼ発現を非侵襲的にモニターした図16。その結果、LC16m8Δ-B5Rlet7a/LGの増殖は、ウイルス投与1日後でさえ、腹腔内での発現はわずかであり、4日後には確認できなくなった。それに対し、LC16mO/LGとLC16m8Δ-B5Rlet7amut/LGの増殖は、ウイルス投与1日後は腹腔内での強い発現が確認され、4日後には投与部位の腹腔内だけではなく全身に広がり、主に尾、手足、口腔で見られた。但し、10日後では、LC16mO/LGとLC16m8Δ-B5Rlet7amut/LGウイルス投与群においても、それらの発現はわずかになった。これより、外来遺伝子発現マイクロRNA制御増殖型ウイルスは、let7aの制御によって、免疫が機能するC57BL/6マウスの正常組織においては、感染後24時間以内に、その増殖性が極めて著しく低下し、体内から排除されることを確認した。外来遺伝子を発現するマイクロRNA制御増殖型ワクシニアウイルスの抗癌効果と安全性5x106個のBxPC3、又はA549を免疫不全ヌードマウスの右腹側の皮下に移植し、その腫瘍塊が約100mm3皮膚を介して腫瘍塊の長径Lと短径Wをノギスで測定し、腫瘍体積Vを計算式V=LW2/2により算出した大きさに到達した時を0日とした。107pfuの各ウイルスを腫瘍内に0日、3日、及び6日目と合計3回投与した各群5匹。その結果、LC16mO/LG、LC16m8Δ-B5Rlet7a/LG、又はLC16m8Δ-B5Rlet7amut/LGは、BxPC3担癌マウスにおいて強力な抗癌作用を示し、ウイルス投与無の模擬対照群と比べて、21~35日後の腫瘍体積において非常に有意な差があることがtwo-wayANOVA統計解析によって確認された図13A。LC16m8Δ群では、模擬対照群と比べて、32~35日後の腫瘍体積において非常に有意な差があることが確認されたが、治療56日後までに全てのマウスで腫瘍体積が2500mm3に到達したため安楽死された。一方LC16mO/LG、又はLC16m8Δ-B5Rlet7amut/LG投与マウスでは、治療59日後までに全身での発痘を伴う急激な体重減少によって全てのマウスが死亡、又は安楽死された。それらに対しLC16m8Δ-B5Rlet7a/LGは、他群と比べて生存率における非常に有意な差がLog-rank検定によって確認され、治療59日後で100のマウスが生存しており、その5匹中4匹のマウスにおいて完全な腫瘍の消失が観察された図13B。同様にA549担癌マウスにおいても、LC16m8Δ-B5Rlet7a/LG投与群では、完全に腫瘍が消失したマウスはいなかったものの、副作用無く強力な抗癌作用を示した図14AとB。模擬対照群と比べて、全てのウイルス投与群で生存率における有意な差がLog-rank検定によって確認された。しかしながら、LC16m8Δ群では、治療56日後までに全てのマウスで腫瘍体積が2500mm3に到達したため安楽死された。LC16mO/LG、及びLC16m8Δ-B5Rlet7amut/LG群では、治療49日後までに全身での発痘を伴う急激な体重減少によって全てのマウスが死亡、又は安楽死された。次に、BxPC3担癌マウスにおいて治療27日、52日後にルシフェリンを投与することによって、実施例4で記述したように、マウス体内でのウイルス増殖を非侵襲的にモニターした。その結果、LC16mO/LGとLC16m8Δ-B5Rlet7amut/LGの投与マウスでは、治療27日後に全身の正常組織でウイルス増殖が見られ、52日後と時間経過に従ってウイルス増殖は増加し、それに伴う急激な体重減少が確認された。それに対しLC16m8Δ-B5Rlet7a/LGの投与マウスでは、治療27日後のウイルス増殖は移植した腫瘍塊のみに限局し、完全に腫瘍が消失したマウスを含め、正常組織におけるウイルス増殖は見られず、52日後の腫瘍が消失したマウスではそのウイルス増殖も消失していた図15。一方、BxPC-3細胞5x106個をSCIDマウスの腹腔内に投与し、その7日後に107pfuの各ウイルスを腹腔内に投与した各群10匹。その結果、LC16mO/LG、又はLC16m8Δ-B5Rlet7amut/LG投与マウスでは、ウイルス投与無の模擬対照群マウスが腫瘍によって死亡、又は安楽死されるよりも早く、治療24~43日後までに全身での発痘を伴う急激な体重減少によって全てのマウスが死亡、又は安楽死された。それに対しLC16m8Δ-B5Rlet7a/LGは、LC16mO/LG、又はLC16m8Δ-B5Rlet7amut/LG投与マウスと比べて生存率における非常に有意な差がLog-rank検定によって確認されたが、最終的にはLC16mO/LG、又はLC16m8Δ-B5Rlet7amut/LG投与マウスで見られた同様のウイルス毒性によって全てのマウスが死亡、又は安楽死された。図17。LC16m8Δ-B5Rlet7a/LGは、赤血球凝集素HA遺伝子に2種類の外来遺伝子ホタルルシフェラーゼ遺伝子とEGFP遺伝子が挿入されている。そこで、チミジンキナーゼTK遺伝子に2種類の外来遺伝子を挿入することによって、組換えTK欠失let7a制御ウイルスLC16m8Δ-B5Rlet7a/LGTK-を作製した。最初に、LC16mO株のゲノムDNAを鋳型として、2つのプライマー5’-cgCAGCTGAGCTTTTGCGATCAATAAATG-3’配列番号88と5’-TTCAGCTGAATATGAAGGAGCAA-3’配列番号89によって、TK遺伝子領域を増幅した。そのPCR産物を制限酵素PvuIIで切断し、それをpUC19ベクターの同じ制限酵素部位にクローニングし、pTKを構築した。さらに、2つの合成DNA5’-aattgcatgcgtcgacattaatGGCCGGACCGGCCttcgaag-3’配列番号90と5’-aattcttcgaaGGCCGGTCCGGCCattaatgtcgacgcatgc-3’配列番号91をアニールし、それを制限酵素EcoRIで切断したpTKにクローニングし、pTK-MSCを構築した。合成ワクシニアウイルスプロモーターHammondetal.,JournalofVirologicalMethods.199766:135-138を挿入するため、2つの合成DNA5’-TCGAaattggatcagcttttttttttttttttttggcatataaataaggtcgaGGTACCaaaaattgaaaaactattctaatttattgcacGGCCGGAC-3’配列番号92と5’-CGGCCgtgcaataaattagaatagtttttcaatttttGGTACCtcgaccttatttatatgccaaaaaaaaaaaaaaaaaagctgatccaatt-3’配列番号93をアニールし、それを制限酵素SfiIとSalIで切断したpTK-MSCにクローニングし、pTK-SP-MSCを構築した。pVNC110-Luc/IRES/EGFPプラスミドから制限酵素SfiIとEcoRIの切断によって獲得したLuc/IRES/EGFP遺伝子断片を、pTK-SP-MSCの同じ制限酵素部位にクローニングし、pTK-SP-LGを構築した。各組換えウイルス図18は、参考例2で記述した方法を若干変更して、143細胞にワクシニアウイルス実施例1で作出したLC16m8Δ-B5Rlet7a、又はLC16m8Δ-B5Rlet7amutを感染させ、25μg/mlBUdRブロモデオキシウリディンの存在下でトランスファーベクタープラスミドDNAのpTK-SP-LGを細胞に取り込ませることによって作出し、EGFPの発現を目安にプラーク純化した後、PCRとダイレクトシーケンスにより確認した。塩基配列に問題が無いウイルスクローンを選択し、RK13細胞にて大量培養した後、RK13細胞にてウイルス力価を測定し、実験に供した。上述のように、BxPC-3細胞5x106個をSCIDマウスの腹腔内に投与し、その7日後に107pfuの各ウイルスを腹腔内に投与した各群5匹。その結果、LC16m8Δ-B5Rlet7a/LGTK-は、ウイルス投与無の模擬対照群マウス、及びLC16m8Δ-B5Rlet7a/LG投与マウスと比べて生存率における非常に有意な差がLog-rank検定によって確認され、ウイルス毒性による副作用も見られなかった図19。次に、29日後にルシフェリンを投与することによって、実施例4で記述したように、マウス体内でのウイルス増殖を非侵襲的にモニターした。その結果、LC16m8Δ-B5Rlet7a/LGとLC16m8Δ-B5Rlet7amut/LGTK-の投与マウスでは、正常組織におけるウイルス増殖が見られたが、LC16m8Δ-B5Rlet7a/LGTK-では、腹腔内の腫瘍のみに限局し、正常組織におけるウイルス増殖は見られなかった図20。これより、HA遺伝子に比べてTK遺伝子への外来遺伝子挿入は、マイクロRNA制御増殖型ワクシニアウイルスの治療指数を高めた。以上の結果より、担癌マウスモデルにおいて、マイクロRNA制御増殖型ワクシニアウイルスは強力な腫瘍溶解性による抗腫瘍効果と高い安全性を兼ね備えたウイルスであることが確認された。"