"少なくとも第一抗原を含む組成物と、i第二抗原およびii第一抗原と結合することができる抗体を含む組成物との混合物中の第一抗原の抗原含量の測定のための方法であって、A.第一抗原と抗体との間で形成された、混合物中の抗原-抗体複合体を解離する段階、およびB.免疫測定法によって第一抗原の抗原含量を測定する段階を含む方法。第一抗原がPCV-2抗原であり、第二抗原がマイコプラズマハイオニューモニエMycoplasmahyopneumoniae抗原であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。免疫測定法がELISA固相酵素免疫検定法であることを特徴とする、請求項1または2に記載の方法。混合物がそのまますぐに使用できるワクチン製剤であることを特徴とする、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。抗原-抗体複合体を解離するために混合物を酸溶液と共にインキュベートすることを特徴とする、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。酸溶液がクエン酸溶液であることを特徴とする、請求項5に記載の方法。混合物を酸溶液と共に少なくとも8時間インキュベートすることを特徴とする、請求項5または6に記載の方法。酸溶液と混合物との少なくとも25、好ましくは25~75、より好ましくは25~50の比率v/vで混合物をインキュベートすることを特徴とする、請求項5~7のいずれか一項に記載の方法。酸溶液が1.0~3.0のpHを有することを特徴とする、請求項5~8のいずれか一項に記載の方法。少なくともPCV-2抗原を含む組成物とマイコプラズマハイオニューモニエ抗原を含む組成物との混合物中のPCV-2抗原の抗原含量の測定のための方法であって、A.2つの組成物を混合する段階、およびB.免疫測定法によってPCV-2抗原の抗原含量を測定する段階を含み、マイコプラズマハイオニューモニエ抗原を、ブタ血清を含まない培養物から得ることを特徴とする方法。少なくとも第一抗原を含む組成物と第二抗原を含む組成物との混合物中の第一抗原の抗原含量の測定のための方法であって、A.第二抗原と抗体を含む組成物中の、第一抗原と結合することができる抗体から第二抗原を分離する段階、B.第一抗原を含む組成物と第二抗原を混合する段階、およびC.免疫測定法によって混合物中の第一抗原の抗原含量を測定する段階を含む方法。該方法が混合ワクチンの効力試験であることを特徴とする、請求項1~11のいずれか一項に記載の方法。本発明者らは、今や、それぞれ抗原とその他の成分を含む組成物を混合した後、混合ワクチン中の特異抗原と別の成分との間の予想外の相互作用を同定した。驚くべきことに、第一抗原を含む組成物と第二抗原を含む組成物の混合物中の第一抗原の抗原性は、この第一抗原に結合し、それにより抗原-抗体複合体を形成する抗体の存在によって影響を受けること、およびこれらの抗体は第二抗原を含む組成物から生じ得ることが認められた。実施例1および2は、種々の抗原を含む組成物の混合物中では抗原が効率的に検出できないこと、および抗体が、検出すべき抗原を含む組成物とは異なる組成物に由来するそのような混合物中では抗原-抗体複合体が形成され得ることを示す。さらに、抗原-抗体複合体の解離は第一抗原の抗原性の回復をもたらすことが認められた。そのような干渉抗体の存在は、特定の微生物第二抗原を動物に由来する血清の存在下にインビトロで培養する必要があること、および血清を採取するこれらの動物が第一抗原に対する抗体を惹起する微生物に感染していることによって説明され得る。混合物中の第一抗原の抗原性へのこれらの抗体の干渉は、販売用のワクチンバッチを出荷するための効力試験などの、免疫測定法における第一抗原の定量に影響を及ぼす。簡単に述べると、本発明は、少なくとも第一抗原を含む組成物と第二抗原を含む組成物との混合物中の第一抗原の抗原含量を測定するための方法に関する。より詳細には、本発明は、第二抗原を含む組成物が、第一抗原と結合することができる抗体も同時に含む、そのような方法に関する。本発明はまた、少なくとも第一抗原を含む組成物と、i第二抗原およびii第一抗原と結合することができる抗体を含む組成物との混合物中の第一抗原の抗原含量を測定するための方法であって、A.第一抗原と抗体との間で形成された、混合物中の抗原-抗体複合体を解離する段階、およびB.免疫測定法によって第一抗原の抗原含量を測定する段階を含む方法に関する。免疫測定法のデザインは様々であり得、試料中のウイルスまたは細菌抗原を定量するために当分野で一般的に使用される免疫測定法のデザインと同様であり得る。例えば、アッセイは、競合的反応または直接的反応に基づき得る。さらに、プロトコールは、マイクロタイタープレートなどの固体支持体を使用し得る。抗原の検出は、標識した直接的または間接的に、第一抗原に特異的な抗体検出抗体の使用を含み、標識は、酵素、蛍光、化学発光、放射性または染料分子であり得る。検出抗体は、単一特異性ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であり得る。本発明による方法において使用される典型的な免疫測定法は、標準的な実験室テキストブック、例えばAntibodies:ALaboratoryManual,eds.:HarrlowandLane,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1988に記載されている。そのような試験の例は、凝集アッセイ、ELISAおよびAlphaLISAである。抗原は任意の種類の抗原でよいが、好ましくはヒトまたは動物に対して病原性の微生物に由来する。特に、抗原はウイルスまたは細菌に由来する。一般に、抗原という用語は、ヒトまたは動物に投与された場合免疫応答を誘導する、刺激するまたは増強することができる少なくとも1つのエピトープを含む物質の組成物を指す。抗原は、好ましくは不活化または弱毒化形態の、全病原体、病原体の抽出物または病原体の免疫原性タンパク質であり得る。より好ましくは、抗原は、インビトロで培養された細胞において発現され、前記細胞から回収される免疫原性タンパク質である。特に、第一抗原は、特定の動物種において発生率の高い病原体特異的抗体を誘導する自然暴露によってまたはワクチン接種によって病原体の抗原であり得る。例えば、この病原体は、ブタサーコウイルス2型PCV-2、ブタ丹毒菌エリジペロスリックスルジオパシエ、Erysipelothrixrhusiopathiae、ブルータングウイルス、ボーダー病ウイルス、ネオスポラカニウムneosporacanium、シチメンチョウコロナウイルスおよび口蹄疫ウイルスから成る群より選択され得る。特に、第二抗原は、そのインビトロでの培養に関して特定の動物種からの血清に依存する病原体の抗原であり得る。例えば、この病原体は、マイコプラズマ属Mycoplasma、ローソニア属Lawsonia、リーシュマニア属Leishmania、バベシア属Babesia、トキソプラズマ属Toxoplasmaおよびネオスポラ属Neosporaから成る群より選択され得る。本発明による特に好ましい方法では、第一抗原はブタサーコウイルス2型PCV-2抗原、特にPCV-2ORF2抗原である。本発明による方法において使用されるPCV-2ORF2抗原は約30kDaのタンパク質であり、市販のPCV2ワクチン、例えばPorcilis商標PCVIntervet/Schering-PloughAnimalHealth,Netherlands、Ingelvac商標CircoFLEXBoehringerIngelheimVetmedicaInc.,USAおよびSuvaxyn商標PCVFortDodgeAnimalHealth,USAにおいて活性成分として使用される。本発明による方法において使用されるPCV-2ORF2は、例えば、PCV-2ORF2タンパク質をコードする遺伝子で形質転換され、昆虫細胞において該タンパク質を発現する組換えバキュロウイルスに感染させた、インビトロ培養した昆虫細胞から得ることができるFortetal.,Vaccine27,4031-4037,2009;Nawagitguletal.,J.Gen.Virol.81,2281-87,2000およびFachingeretal.,Vaccine26,1488-99,2008。上述した本発明による別の好ましい方法では、第二抗原はマイコプラズマハイオニューモニエMycoplasmahyopneumoniaeM.hyoであり、第二抗原を含む組成物は、血清、特に第一抗原に対する血清抗体であって、かつ第一抗原に結合することができる血清抗体を付加的に含む。本発明による特に好ましい方法では、第一抗原はPCV-2抗原、好ましくはPCV-2ORF2タンパク質であり、第二抗原はM.hyo抗原、好ましくはM.hyoバクテリンである。基本的に、本発明の方法は、分析する抗原の抗原含量を従来の免疫測定法で測定する前に、分析する抗原を含む混合物を前処理することを含む。この前処理は、第一抗原と、この第一抗原と結合することができる抗体との間で形成された抗原-抗体複合体の解離を含む。本発明者らは、そのような解離段階が第一抗原を再び免疫測定法で定量できるようにすることを示した。ヒトおよび動物の健康の両分野で、3以上の異なる抗原を含む混合ワクチンを製造することは一般的である。特に、動物の健康の分野では3~6の異なる抗原を含む混合ワクチンも珍しくない。それゆえ、本発明の方法はまた、種々の抗原を含む3以上の組成物、特に3~6の組成物から成る混合物中の第一抗原の抗原含量を測定することを企図する。上述した本発明による特に適切な方法は、免疫測定法として周知のELISAを含む。上述した本発明による方法において使用される例示的なELISAでは、以下の段階を用いる:-ELISAマイクロタイタープレートのウェルを第一抗原に対する捕捉抗体、好ましくはモノクローナル抗体で被覆する段階、-分析する混合物の試験試料その連続希釈を、標準品その一連の希釈および適切な対照溶液と共に、ウェルにおいてインキュベートする段階、-ウェルを、第一抗原に対する検出抗体、好ましくはモノクローナル抗体と共にインキュベートする段階。検出抗体は、酵素で直接的に、好ましくは間接的に、標識し得る。好ましくは、検出抗体はビオチン化抗体である。-間接標識の場合は、ウェルを、酵素を抗体に結合させる酵素コンジュゲートと共にインキュベートする段階。好ましくは、コンジュゲートはアビジン酵素コンジュゲートである。-酵素基質溶液をウェルに添加し、次いで色素体検出する段階。試験試料中の抗原の量を標準品に対して計算する。より詳細なELISA手順を実施例で説明する。典型的には、本明細書で使用される酵素はホースラディッシュペルオキシダーゼであり、酵素基質はTMB3,3’,5,5’テトラメチルベンジジンである。本発明による方法は、混合ワクチンの製造工程における様々な段階で混合物中の特定の抗原の効力を測定するために使用できる。例えば、本発明の方法は、培養容器から直接採取した、抗原を含む2またはそれ以上の組成物から成る混合物の試料に適用することができる。あるいは、組成物は、例えば遠心分離、ろ過または沈殿によって、さらに精製された形態の抗原を含む。理想的には、ワクチン中の抗原の効力は、その最終的なワクチン製剤中で、すなわちそのすぐに使用できる形態で測定される。すぐに使用できるワクチン製剤は、ワクチンが現場で使用されるのに必要かつ十分なすべての成分および賦形剤を含む。特に、すぐに使用できるワクチンは、2またはそれ以上の抗原、アジュバント、安定剤および防腐剤を含む。それゆえ、上述した本発明による好ましい方法では、混合物はすぐに使用できるワクチン製剤である。上述した本発明による特に好ましい方法では、混合物を酸溶液と共にインキュベートして抗原-抗体複合体を解離する。この前処理段階では、混合物を、PBS緩衝液またはTris-HCl緩衝液などの緩衝液としてであってもよい、酸解離溶液で希釈し、インキュベートして抗原-抗体複合体を解離させる。インキュベーションは、光振とう下に室温で実施し得る。前処理段階後、酸処理した混合物の試料を免疫測定法において、好ましくは酸処理した混合物の試料をELISAプレートに添加し、上述したようにさらに試験することによって分析する。酸溶液の性質は重要ではないことが認められた。実施例は、様々な酸溶液が、同時に抗原の抗原性には影響を及ぼさずに、抗原-抗体複合体を解離できることを示す。上述した本発明によるさらなる好ましい方法では、酸溶液は、酢酸溶液、硫酸溶液、塩酸溶液またはクエン酸溶液であり、好ましくは、酸溶液はクエン酸溶液である。上述した本発明による選択的な方法では、酸溶液は緩衝液である。酸溶液と混合物のインキュベーション時間は、抗原-抗体複合体中の抗原の性質によって異なり得る。好ましくは、インキュベーション時間は、すぐに使用できるワクチンに関して少なくとも8時間、好ましくは8~18時間、より好ましくは16~18時間である。したがって、上述した本発明による別の好ましい方法では、混合物を酸溶液と共に少なくとも8時間インキュベートする。また、酸溶液と混合物との比率v/vが抗原-抗体複合体の解離のレベルに影響を及ぼし得ることも本発明者らによって見出された。酸溶液と混合物との少なくとも25の比率v/vで、特に25~75の比率v/vで、さらに特に25~50の比率v/vで良好な結果が得られた。したがって、上述した本発明による別の好ましい方法では、酸溶液と混合物との少なくとも25、好ましくは25~75、より好ましくは25~50の比率v/vで混合物をインキュベートする。上述した本発明によるさらなる好ましい方法では、酸溶液は1.0~3.0、好ましくは1.5±0.2のpHを有する。上述した本発明による方法では、酸溶液と混合物のインキュベーション後であるが、免疫測定法でのその分析の前に、酸処理した混合物のpHをより中性のpHに、好ましくは5~7に上昇させてもよい。これは、酸処理した混合物に塩基溶液または緩衝液を添加することによって実施できる。このための適切な溶液は、水酸化ナトリウム、リン酸緩衝液またはTris緩衝液である。本発明はまた、少なくともPCV-2抗原を含む組成物とM.hyo抗原を含む組成物との混合物中のPCV-2抗原の抗原含量を測定するための方法であって、A.2つの組成物を混合する段階、およびB.免疫測定法によってPCV-2抗原の抗原含量を測定する段階を含み、M.hyo抗原を、非ブタ血清を含む培養物から得ることを特徴とする方法を対象とする。特に、M.hyo抗原は、ウシ、ウマまたはヒツジ血清を含む培養物から得るAhmadetal.,Aviandiseases32,519-526,1988;Ramirezetal.,178,149-152,2008。さらなる選択的な方法では、第二抗原および第一抗原に対する抗体を含む組成物を、これら2つの成分の分離に供し、その後第二抗原だけを含む組成物を、第一抗原を含む組成物と混合する。続いて、第一抗原の抗原含量を免疫測定法によって測定する。それゆえ、本発明はまた、少なくとも第一抗原を含む組成物と第二抗原を含む組成物との混合物中の第一抗原の抗原含量を測定するための方法であって、A.第二抗原と抗体を含む組成物中の、第一抗原と結合することができる抗体から第二抗原を分離する段階、B.第一抗原を含む組成物と第二抗原を混合する段階、およびC.免疫測定法によって混合物中の第一抗原の抗原含量を測定する段階を含む方法に関する。例えば抗原を培養した培地からの第二抗原の分離は、このために使用できる通常の方法によって実施することができる。例えば、第二抗原が細菌である場合は、これらを15,000×gで10分間の遠心分離によって分離することができる。また、分離は、抗体に対して親和性を示すリガンドで抗体を捕捉し、次いでこれらのリガンド-抗体複合体を第二抗原から分離する免疫除去によって慣例的に実施することも可能である。このために一般的に使用されるリガンドは、プロテインG、プロテインAまたは分離すべき抗体に対する抗体である。通常、これらのリガンドは、抗体からの抗原の分離を容易にする固相例えばセファロース4Bに結合される。それゆえ、この方法の好ましい実施形態では、遠心分離または免疫除去段階によって分離を実施する。この方法のさらなる好ましい実施形態では、本明細書で使用する抗原および適用する免疫測定法は上記で定義したものと同じである。本発明はまた、混合ワクチンの効力試験であることをさらに特徴とする、上述した方法のいずれかを対象とする。ワクチンの効力試験は、適切な実験室試験によってまたは防御免疫を生じさせることを意図した方法でのワクチンの投与を介して得られる適切に制御された臨床データによって指示される、ワクチンの特異的能力または効力を測定するための試験と定義される。そこで、本発明において使用される効力試験は、ワクチンのバッチが重要なアッセイパラメータに適合するか否かを示すデータを提供するための、市販を目的として生産されたワクチンのバッチに関して適用される試験である。本発明による好ましい効力試験では、免疫測定法はELISA上記で概説したであり、重要なアッセイパラメータは、ELISA単位EUで表される混合物中の第一抗原の抗原質量である。EUは抗原の内標準に関連し、抗原の内標準は標的動物における防御免疫に相関する。実施例ELISAにおけるPCV-2抗原の定量へのM.hyo組成物の影響品質管理の手段として、PCV2含有ワクチンの濃度を、PCV2に特異的な2つのモノクローナル抗体に基づくサンドイッチELISAにおいて測定する。しかし、一価ワクチンと比較して、PCV2およびマイコプラズマハイオニューモニエM.hyo製剤を含む二価ワクチンでは予想より明らかに低い濃度が測定された。M.ハイオニューモニエおよびPCV-2抗原を含む混合ワクチンを以下のように生産した:M.ハイオニューモニエ株11をFriisNord.Vet.-Med.,27,337-339,1975によって最初に記述された培地に基づくブロス培地で培養することにより、M.ハイオニューモニエ全細胞抗原を生産する。これは、酵母抽出物、血清ならびにブタおよびウシ起源の様々な抽出物を含む複合培地である。培養の最後に、細菌細胞を不活化し、全培養物を限外ろ過によって少なくとも10倍濃縮して、ワクチンの製剤のために使用した。PCV2ORF2抗原を、昆虫細胞の増殖に適した培地で培養したヨトウガスポドプテラフルギペルダ、SpodopterafrugiperdaSf21細胞におけるバキュロウイルス発現を用いて組換えによって生産した。ウイルス液を採取し、ウイルス粒子を不活化した後、PCV2ORF2抗原を遠心分離によって濃縮し、ワクチン生産に使用した。混合ワクチンを調製するため、これら2つの抗原を混合し、緩衝液で希釈して、油中水型アジュバントXsolveビタミンE酢酸塩/軽質流動パラフィン/Tween80と70/30v/vの比率で混ぜ合わせた。プラセボまたはいくつかのバッチのM.hyo製剤とPCV2製剤との混合からの結果の要約を表1に示す。a参照製剤と試験サンプルの滴定をELISAにより比較してPVC濃度を決定した。この目的を達成するため、96ウェルNuncMaxiSorpプレートをpH9.6の炭酸塩緩衝液で希釈した最適濃度のモノクローナル抗体3/1B4-INTを用いて4°Cで一晩培養し、BSA及びTweenEIA緩衝液を含有するPBSで希釈した参照試料及び試験試料の一連の希釈液を37°Cで1時間培養した。洗浄工程に続いて、EIA緩衝液で希釈した最適濃度のビオチン標識したモノクローナル抗体5/6H12-INTを37°Cで1時間培養した。洗浄工程に続いて、EIA緩衝液で希釈した最適濃度のHRP-標識したアビジンを37°Cで0.5時間培養した。洗浄工程に続いて、最適濃度のTMB基質を15分間培養し、硫酸で培養を止め、ELISA読み取り機で光学密度を測定した。4PL法により濃度を計算した。ELISA単位で数値を表した3回の測定の平均。bM.ハイオニューモニエがない場合に同量のPCVを含有するワクチンと比較した回復率これらの結果は、PCVおよびM.hyoを含むワクチンにおいて、M.hyoが混合ワクチン中のPCV-2抗原の検出可能性に悪影響を及ぼすことならびに回収率の程度31~80が混合したPCV-2製剤とM.hyo製剤の組合せに依存することを示す。抗原-抗体複合体の同定二価PCV-2/M.hyoワクチン中の抗原-抗体複合体をサンドイッチELISAによって明らかにした。PCV-2抗原とポリクローナルブタ抗PCV-2抗体との間の複合体を、マイクロタイタープレートのウェルに被覆したモノクローナル抗PCV-2抗体によって捕捉し、酵素標識抗ブタIgGコンジュゲートを用いて検出する。図1は、PCV-2を含む一価ワクチンおよびPCV-2とM.hyoを含む二価ワクチンの力価を示す。標識モノクローナル抗PCV抗体の代わりに、複合体を酵素標識抗ブタIgGコンジュゲートで検出したことを除き、実施例1で述べたようにELISAを実施した。データの点は3回の平均を示す。結果は、aM.hyo製剤がブタ抗PCV-2抗体を含むことおよびbこれらの抗体がPCV-2と複合体を形成することを明らかにする図1。二価ワクチンにおけるPCV-2の低い検出可能性についての最も考えられる説明は、ブタ抗PCV-2抗体がPCV-2サンドイッチELISAにおいて関連するPCV-2エピトープをブロックすることである。PCV-2抗体は、ワクチンを商業規模で製造するためにM.hyoを培養するのに使用される培地において必要な市販のブタ血清バッチ中に存在することが認められた。M.hyoの阻害作用を無効にする試みM.hyo製剤の阻害作用を無効にする手順を、同じ量のPCV-2を含むがM.hyoを含まない製剤一価ワクチンまたはM.hyoも含む製剤二価ワクチンの2つのワクチン製剤を処理することによって試験した。サンドイッチELISAを、実施例1で述べたように、希釈液中の様々な濃度の試薬SDS、Tween、Triton、デオキシコール酸ナトリウム、尿素の存在下で実施した。さらに、硫酸アンモニウムAS沈殿TritonなしまたはTritonの存在下での上清とペレットおよびサイズ分離分画Tritonの存在下でを検定した。表2の結果は、いずれの処理も一価ワクチンに影響を及ぼさず、M.hyoの阻害作用を無効にしなかったことを示す。ウイルス抗原-抗体複合体への酸処理の影響酸処理の潜在的作用を評価した。ワクチン1容容積を0.1Mクエン酸蒸留水で希釈した49容と混合し、光振とうしながら室温で一晩インキュベートする。開発した標準的な手順を用いて得られた代表的な結果を表3に示す。表3の結果は、M.hyo製剤の阻害作用を酸処理によって無効にできることを明らかにする。細菌抗原-抗体複合体への酸処理の影響細菌抗原-抗体複合体への酸処理の影響を明らかにするため、レプトスピラ症に対するイヌワクチンの成分レプトスピラタラソビLeptospiraetarassoviを、酸処理を伴ってまたは酸処理なしで、L.tarassovi特異的抗体を含む人為的に添加したポリクローナルイヌ血清抗体の存在下および不在下でPCV-2ELISAに相当するサンドイッチELISAにおいて定量した。aタラソビ特異的モノクローナル抗体Aを用いて、実施例1に記載されているように原則的にELISAによりL.タラソビ抗体を定量した。ELISAB.Dによる抗原定量の前に、ポリクローナル抗タラソビ抗体を含むCanine血漿と抗原を培養した。実施例4に記載されているように酸処理を行った。ELISAの結果をコントロール実験Aのとして表した。数値は、繰り返しの平均±Stdである。これらの結果は、ELISAによる細菌ワクチン成分の定量へのイヌ血清抗体の阻害作用を酸処理によって無効にできることを明らかにする。酸処理に影響を及ぼすパラメータ6.1.種々の酸および塩基の能力ワクチン製剤中の抗原含量の測定へのいくつかの酸および塩基の作用を表5に要約する。これらの結果は、M.hyoの阻害作用が使用される酸の種類とは無関係であることを明らかにした。pH13.5の水酸化ナトリウムでの処理は、ELISAによるPCV-2抗原の検出を完全に無効にした。これはおそらくELISAにおいて使用されるモノクローナル抗体によって認識されるPCV-2エピトープの破壊に起因すると考えられる。6.2.酸濃度の影響0.1Mクエン酸と一価または二価ワクチンとの比率v/vを変えることによって酸濃度の影響を試験した図2。図2の結果は、二価ワクチンの低い回収率が≧25の比率での酸処理によって克服できることを明らかにする。6.3.処理時間の影響処理時間の影響を図3に示す。結果は、十分な度合の阻害無効化のためには≧8時間の処理が必要であることを指示する。6.4.pHの影響種々のpHでの酸処理によってpHの影響を評価した図4。これらのデータは、pH≦3での酸処理がM.hyo製剤の阻害作用の有意の無効化をもたらすことを示す。AlphaLISA法によるPCVORF2抗原含量の測定7.1標的:使用した分析方法の影響を評価するため、第二抗原の試料中の抗体によってブロックされる第一抗原の酸による前処理が、第一抗原含量の測定を高感度AlphaLISA法によって行う場合にも必要であるかどうかを試験した。7.2試験材料:注射用蒸留水中の0.1Mおよび0.2Mクエン酸;免疫測定法緩衝液:PBS0.05Tween80;実施例1で述べたのと同じ、PCVORF2に対して特異的なビオチン化マウスモノクローナル抗体:5/6H12-INT;非結合アクセプタービーズAlphaScreen商標、PerkinElmer;ストレプトアビジン被覆ドナービーズAlphaScreen商標、PE;装置:EnVision商標2104マルチラベルリーダーPE7.3試験方法:PCVOrf2およびM.Hyo抗原を含む混合ワクチンの4つの別々のバッチをこれらの試験に使用した。PCV抗原を未処理のまま測定するかまたは、実施例4~6で述べたように、0.1Mまたは0.2Mのいずれかのクエン酸でおよび種々の前希釈液中でプレインキュベートした。その後この抗原を、各5μl試料につき約10,000ELISA単位のPCV-2抗原を含むように免疫測定法緩衝液中に取り、それを384穴プレートのウェルに移して、その後8回の連続段階でアッセイ緩衝液に1:2希釈した。ビオチン化PCV-Moab5/6H12-INTを別途に前希釈し、5μl試料を試験ウェルに添加した。同様に、アクセプタービーズを製造者の指示に従ってPCVOrf2に特異的な第二マウスモノクローナル抗体:Moab3/1B4-INT実施例1参照と結合した。これらを適切に希釈し、20μl試料を試験ウェルに添加した。ウェルこの時点で30μlを保持するを2~8°Cで一晩インキュベートした。次に20μlの前希釈したドナービーズを抑えた照明下で添加し、ウェルを密封して、室温で1時間インキュベートした。プレートを読み取り、結果を、標準的な表計算ソフトを用いて標準的なロジット‐ログ変換および線形回帰計算によって解析した。8までのデータ点が使用できるように、標準試料と最も高い相関を有する曲線の部分を使用した。試験群は以下の通りであった:A:酸で前処理していない、アッセイ緩衝液中の1:5前希釈した混合ワクチン抗原のみ;B:0.1Mクエン酸で前処理した、1:5希釈抗原;C:0.1Mクエン酸で前処理した、1:20希釈抗原;D:0.2Mクエン酸で前処理した、1:5希釈抗原。PCV-2抗原の標準試料は7696ELISA単位/mlの平均値を有しており、試験試料をこれと比較した。7.4結果:全アッセイを二重に実施した;両方の試験の結果の相違は20未満であった。実施した試験の一方からの試料の1つについての典型的な結果を表6に示す:結果は、A群におけるように、酸による前処理なしではPCV-2抗原はほとんど測定することができず、投入量の10だけが回収されることを明らかにした。しかし、クエン酸での前処理により、はるかに多くの投入抗原が測定されB、CおよびD群、それによりD群の条件がここで使用した特定の混合ワクチン抗原に関して最適であった。7.5結論:AlphaLISAと同程度の感度の抗原含量測定法を適用した場合でも、良好な定量的測定を得るためには酸による前処理も必要である。図面の説明図2:a実施例1で述べたようにELISAによって測定した未処理一価ワクチンに基づく回収率。b実施例4で述べた酸処理の間の酸とワクチンとの比率v/v。図3:a実施例1で述べたようにELISAによって測定した単位/ml。図4:a5つの独立したPCVバッチを2つA、Bの独立したM.hyoバッチからの1つと各々混合した。10の製剤すべてを、0.1Mクエン酸もしくは酢酸ナトリウムでpH2、3、4もしくは5に調整した0.1Mクエン酸、または緩衝液C=対照のいずれかで実施例4で述べたように酸処理した。濃度は標準的な処理0.1Mクエン酸、pH1.5によって得られた濃度のパーセンテージとして表している。データは、M.hyoバッチAまたはBのいずれかと組み合わせた5つのPCVバッチの平均±標準偏差として示している。"