組換えアデノウイルスを作製する方法であって、E1モジュール、E2-L2モジュール、L3-L4モジュール、E3モジュール、およびE4モジュールからなる群から選択される3種以上のアデノウイルス遺伝子モジュールから核酸を構築するステップを含む方法。前記核酸が前記E1モジュールを含む、請求項1に記載の方法。前記核酸が前記E4モジュールをさらに含む、請求項2に記載の方法。前記核酸が、前記E2-L2モジュール、前記L3-L4モジュール、または該E2-L2モジュールと該L3-L4モジュールの両方をさらに含む、請求項2に記載の方法。前記核酸を構築する前に、前記3種以上のアデノウイルス遺伝子モジュールのうちの2種を組み合わせることによってマクロモジュールを形成する、請求項1に記載の方法。前記マクロモジュールがE2-L4マクロモジュールである、請求項5に記載の方法。前記E2-L4マクロモジュール、および前記E1モジュール、前記E3モジュール、または前記E4モジュールから選択される1種または複数種のアデノウイルス遺伝子モジュールから前記核酸を構築するステップを含む、請求項6に記載の方法。前記E1モジュール、前記E2-L2モジュール、前記L3-L4モジュール、前記E3モジュール、および前記E4モジュールから選択される少なくとも4種のアデノウイルス遺伝子モジュールから前記核酸を構築するステップを含む、請求項1に記載の方法。前記E1モジュール、前記E2-L2モジュール、前記L3-L4モジュール、前記E3モジュール、および前記E4モジュールから前記核酸を構築するステップを含む、請求項8に記載の方法。前記核酸が少なくとも12kbである、請求項8に記載の方法。前記核酸が、欠失しているアデノウイルス核酸配列、変異したアデノウイルス核酸配列、異所性のアデノウイルス核酸配列、または非アデノウイルス遺伝子産物をコードする核酸配列を含む、請求項1に記載の方法。前記変異したアデノウイルス核酸配列が、変異したE4-ORF3遺伝子産物をコードする、請求項11に記載の方法。前記変異したアデノウイルス核酸配列が、変異したE1B-55k遺伝子産物をコードする、請求項11に記載の方法。前記変異したアデノウイルス核酸配列が、変異したアデノウイルスの線維遺伝子産物をコードする、請求項11に記載の方法。前記変異したアデノウイルス核酸配列が、変異したウイルスコートタンパク質をコードする、請求項11に記載の方法。前記異所性のアデノウイルス核酸配列が、プロドラッグ変換酵素をコードする、請求項11に記載の方法。前記非アデノウイルス遺伝子産物がレポータータンパク質である、請求項11に記載の方法。前記非アデノウイルス遺伝子産物が標的化タンパク質である、請求項11に記載の方法。前記標的化タンパク質が腫瘍標的化タンパク質または脈管構造標的化タンパク質である、請求項18に記載の方法。前記核酸を転写させ、それにより組換えアデノウイルスを形成するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。前記組換えアデノウイルスが複製コンピテントである、請求項20に記載の方法。前記組換えアデノウイルスが複製インコンピテントである、請求項20に記載の方法。invitroで実施する、請求項1に記載の方法。前記構築するステップが、ハイブリダイゼーションコンピテントなデスティネーションベクターと、1種または複数種のハイブリダイゼーションコンピテントなアデノウイルス遺伝子モジュールとをハイブリダイズさせ、それにより、アデノウイルス遺伝子モジュールベクターを形成するステップを含む、請求項1に記載の方法。前記ハイブリダイゼーションコンピテントなデスティネーションベクターが、iデスティネーションベクターを切断し、それにより線状デスティネーションベクターを形成するステップ、およびii該線状デスティネーションベクターをエキソヌクレアーゼと接触させ、それにより、該ハイブリダイゼーションコンピテントなデスティネーションベクターを形成するステップ、により形成される、請求項24に記載の方法。1種または複数種の前記ハイブリダイゼーションコンピテントなアデノウイルス遺伝子モジュールが、i1種または複数種のエントリーベクターアデノウイルス遺伝子モジュールを含むエントリーベクターをエンドヌクレアーゼと接触させ、それにより、放出された1種または複数種のエントリーベクターアデノウイルス遺伝子モジュールを形成するステップ、およびii該放出された1種または複数種のエントリーベクターアデノウイルス遺伝子モジュールをエキソヌクレアーゼと接触させ、それにより、前記1種または複数種の該ハイブリダイゼーションコンピテントなアデノウイルス遺伝子モジュールを形成するステップ、により形成される、請求項24に記載の方法。構築するステップが、組換えコンピテントなデスティネーションベクターおよび前記アデノウイルス遺伝子モジュールのうちの1種または複数種を含有する1種または複数種の組換えコンピテントなエントリーベクターを、インテグラーゼと接触させ、それにより、アデノウイルス遺伝子モジュールベクターを形成するステップを含む、請求項1に記載の方法。前記アデノウイルス遺伝子モジュールのうちの1種または複数種を含有する前記組換えコンピテントなエントリーベクターが、1種または複数種の組換えコンピテントなアデノウイルス遺伝子モジュールおよび組換えコンピテントなドナーベクターをインテグラーゼと接触させ、それにより、該アデノウイルス遺伝子モジュールのうちの1種または複数種を含有する該組換えコンピテントなエントリーベクターを形成するステップにより形成される、請求項27に記載の方法。構築するステップが、iハイブリダイゼーションコンピテントなデスティネーションベクターとハイブリダイゼーションコンピテントな第1のアデノウイルス遺伝子モジュールとをハイブリダイズさせ、それにより、第1のアデノウイルス遺伝子モジュールベクターを形成するステップ;およびii該第1のアデノウイルス遺伝子モジュールベクターおよび組換えコンピテントな第2のアデノウイルス遺伝子モジュールエントリーベクターをインテグラーゼと接触させ、それにより、第2のアデノウイルス遺伝子モジュールベクターを形成するステップを含む、請求項1に記載の方法。前記第1のアデノウイルス遺伝子モジュールが前記E2-L2モジュール、前記L3-L4モジュール、またはE2-L4マクロモジュールであり、第2のアデノウイルス遺伝子モジュールが前記E1モジュール、前記E3モジュール、または前記E4モジュールである、請求項29に記載の方法。複数の異なるE1モジュール、複数の異なるE2-L2モジュール、複数の異なるL3-L4モジュール、複数の異なるE3モジュール、複数の異なるE4モジュール、または複数の異なるE2-L4マクロモジュールを含むライブラリー。前記複数の異なるE1モジュール、前記複数の異なるE2-L2モジュール、前記複数の異なるL3-L4モジュール、前記複数の異なるE3モジュール、前記複数の異なるE4モジュール、または前記複数の異なるE2-L4マクロモジュールが、複数のアデノウイルスの種由来のアデノウイルス遺伝子モジュールを含む、請求項31に記載のライブラリー。前記複数の異なるE1モジュール、前記複数の異なるE2-L2モジュール、前記複数の異なるL3-L4モジュール、前記複数の異なるE3モジュール、前記複数の異なるE4モジュール、または前記複数の異なるE2-L4マクロモジュールが、2種以上のヒトアデノウイルス血清型由来のアデノウイルス遺伝子モジュールを含む、請求項32に記載のライブラリー。前記複数の異なるE1モジュール、前記複数の異なるE2-L2モジュール、前記複数の異なるL3-L4モジュール、前記複数の異なるE3モジュール、前記複数の異なるE4モジュール、または前記複数の異なるE2-L4マクロモジュールが、欠失しているアデノウイルス核酸配列、置換されたアデノウイルス核酸配列、異所性のアデノウイルス核酸配列、または非アデノウイルス遺伝子産物をコードする核酸配列を含む、請求項31に記載のライブラリー。前記複数の異なるE1モジュール、前記複数の異なるE2-L2モジュール、前記複数の異なるL3-L4モジュール、前記複数の異なるE3モジュール、前記複数の異なるE4モジュール、または前記複数の異なるE2-L4マクロモジュールが組換えコンピテントである、請求項31に記載のライブラリー。前記複数の異なるE1モジュール、前記複数の異なるE2-L2モジュール、前記複数の異なるL3-L4モジュール、前記複数の異なるE3モジュール、前記複数の異なるE4モジュール、または前記複数の異なるE2-L4マクロモジュールがハイブリダイゼーションコンピテントである、請求項31に記載のライブラリー。請求項1から20までのいずれか一項に記載の方法に従って調製したアデノウイルスゲノムライブラリー。本発明者らの最終の目標は、腫瘍選択的溶解性複製を行うだけでなく、何回も繰り返される処置において全身的に投与することができ、肝毒性を回避し、複雑な腫瘍脈管構造を効率的に標的化し、横断し、細胞に異なる受容体を介して感染し、プロドラッグ活性化酵素/毒素の発現を腫瘍内に局在化させることにより腫瘍バイスタンダー効果を生じ、有益な宿主抗腫瘍免疫応答を呼び起こす強力なウイルスがん療法を工学的に作製することである。これらは、ヒトアデノウイルスがマウスにおいて複製することができないことによりさらに複雑になる主要な難題である。これは、異種移植片モデルを超える多くの利点を有する、がんの、免疫コンピテントな遺伝子操作されたマウスモデルGEMMにおいてヒト腫瘍細胞崩壊ウイルスを評価することの妨げになる。ヒトアデノウイルスは52種あり、異なる宿主組織環境に感染し、複製するために高度に特殊化された適応を示す。これらのウイルスの多くは、種々の組織に感染し、CAR以外の細胞受容体に結合する線維タンパク質ならびにE3免疫調節遺伝子の別個のコホートを有する。それらのゲノムを改変するために必要なツールがないので、それらの独特の性質についての広範囲にわたる試験や活用はなされていない。同様に、マウスアデノウイルスMAV-1を含めた、他の種に感染するアデノウイルスもある。本明細書では、当技術分野におけるこれらの問題および他の問題に対する解決法が提供される。一態様では、組換えアデノウイルスを作製するための方法本明細書ではAdsemblyとも称されるが提供される。当該方法は、E1モジュール、E2-L2モジュール、L3-L4モジュール、E3モジュール、E4モジュール、またはアデノウイルスマクロモジュールまたは下記のその変異体から選択される2種以上のアデノウイルス遺伝子モジュールから核酸を構築するステップを含む。別の態様では、複数のアデノウイルス遺伝子モジュールを含むライブラリーが提供される。別の態様では、本明細書において提供される方法を実施するためのキットが提供される。発明の詳細な説明定義核酸とは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよび一本鎖または二本鎖のいずれかの形態のそのポリマー、ならびにその相補物を指す。この用語は、公知のヌクレオチド類似体または修飾された骨格残基または結合linkageを含有する核酸、合成核酸、天然に存在する核酸、天然に存在しない核酸、参照核酸と同様の結合特性を有する核酸、および参照ヌクレオチドと同様に代謝される核酸を包含する。そのような類似体の例としては、限定することなく、ホスホロチオエート、ホスホロアミデートphosphoramidate、メチルホスホネート、キラル-メチルホスホネート、2-O-メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸PNAが挙げられる。別段の指定のない限り、特定の核酸配列は、明確に示される配列だけでなく、保存的に修飾されたそのバリアント例えば、縮重コドン置換および相補配列も暗黙のうちに包含する。詳細には、縮重コドン置換は、1つまたは複数の選択されたまたは全てのコドンの第3位が混合塩基および/またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって実現することができるBatzerら、NucleicAcidRes19巻:5081頁1991年;Ohtsukaら、JBiolChem260巻:2605~2608頁1985年;Rossoliniら、MolCellProbes8巻:91~98頁1994年。核酸という用語は、遺伝子、cDNA、mRNA、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換的に使用される。特定の核酸配列は、スプライスバリアントも暗黙のうちに包含する。同様に、核酸にコードされる特定のタンパク質は、その核酸のスプライスバリアントにコードされる任意のタンパク質を暗黙のうちに包含する。スプライスバリアントは、その名称が示すように、遺伝子の代替スプライシングの産物である。転写後に、最初の核酸転写物は、異なる代替の核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするようにスプライシングされ得る。スプライスバリアントが産生される機構は変動するが、エキソンの代替スプライシングを含む。その同じ核酸から、読み通しread-through転写によって生じる代替のポリペプチドもこの定義に包含される。この定義には、上記スプライス産物の組換え型を含めたスプライシング反応の任意の産物が含まれる。カリウムチャネルスプライスバリアントの例がLeicherら、JBiolChem273巻52号:35095~35101頁1998年において考察されている。所望の治療的な遺伝子のコード配列および制御配列を含有する適切なベクターの構築には、当技術分野においてよく理解されている標準のライゲーション技法および制限技法を用いることができるManiatisら、MolecularCloning:ALaboratoryManual、ColdSpringHarborLaboratory、NewYork1982年を参照されたい。単離されたプラスミド、DNA配列、または合成オリゴヌクレオチドは、所望の形態に切断すること、調整すること、および再ライゲーションすることができる。核酸は、それが別の核酸配列と機能的関係に置かれている場合、作動可能に連結している。例えば、プレ配列または分泌リーダーのためのDNAは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、そのポリペプチドのためのDNAに作動可能に連結している;プロモーターまたはエンハンサーは、それがコード配列の転写に影響を及ぼす場合、その配列に作動可能に連結している;またはリボソーム結合部位は、それが、翻訳が容易になるように位置している場合、コード配列に作動可能に連結している。一般に、作動可能に連結しているとは、連結しているDNA配列が互いに近くにあり、また、分泌リーダーの場合では、近接しており、読み取り相readingphase内にあることを意味する。しかし、エンハンサーは近接している必要はない。連結は、都合のよい制限部位におけるライゲーションによって実現される。そのような部位が存在しない場合は、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを従来の実施に従って使用する。2つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列に関して、同一のまたはパーセント同一性という用語は、BLASTまたはBLAST2.0配列比較アルゴリズムを下記の初期状態のパラメータで用いて、または手動のアラインメントおよび目視検査例えば、NCBIウェブサイトなどを参照されたいによって測定したところ、同じである2つ以上の配列またはサブシーケンス、または同じアミノ酸残基またはヌクレオチドの特定の百分率すなわち、比較ウィンドウまたは示された領域にわたり最大の対応について比較しアラインメントした場合、特定の領域にわたって約60の同一性、好ましくは65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、またはそれよりも高い同一性を有する2つ以上の配列またはサブシーケンスを指す。そのような配列はそこで実質的に同一といわれる。この定義は、試験配列の相補体complimentも指す、またはそれに適用することができる。この定義は、欠失および/または付加を有する配列、ならびに置換を有する配列も包含する。下記の通り、好ましいアルゴリズムはギャップなどを説明することができる。少なくとも約25アミノ酸またはヌクレオチドの長さの領域にわたって同一性が存在することが好ましい、または50~100アミノ酸またはヌクレオチドの長さの領域にわたって同一性が存在することがより好ましい。配列比較のために、一般には、1つの配列が、試験配列を比較するための参照配列として働く。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列をコンピュータに入力し、必要であればサブシーケンス座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。初期状態のプログラムパラメータを使用することができる、あるいは、代替のパラメータを指定することができることが好ましい。次いで上記配列比較アルゴリズムにより、上記プログラムパラメータに基づいて、上記参照配列と比較した上記試験配列についてのパーセント配列同一性が算出される。比較ウィンドウは、本明細書で使用される場合、配列を、同じ数の連続した位置の参照配列と、その2つの配列を最適にアラインメントした後に比較することができる、20から600まで、通常約50~約200、より通常には約100~約150からなる群から選択される連続した位置の数のうちの任意の1つのセグメントを参照することを含む。比較するために配列をアラインメントする方法は当技術分野で周知である。比較するための最適な配列のアラインメントは、例えば、SmithWaterman、AdvApplMath2巻:482頁1981年の局所相同性アルゴリズムlocalhomologyalgorithmによって、NeedlemanWunsch、JMolBiol48巻:443頁1970年の相同性アラインメントアルゴリズムによって、PearsonLipman、ProcNatlAcadSciUSA85巻:2444頁1988年の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行WisconsinGeneticsSoftwarePackage、GeneticsComputerGroup、575ScienceDr.、Madison、WI内のGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTAによって、または手動のアラインメントおよび目視検査例えば、CurrentProtocolsinMolecularBiologyAusubelら編、1995年、追補を参照されたいによって行うことができる。パーセント配列同一性および配列類似性を決定するために適したアルゴリズムの好ましい例は、BLASTアルゴリズムおよびBLAST2.0アルゴリズムであり、これらは、それぞれAltschulら、NucAcidsRes25巻:3389~3402頁1977年およびAltschulら、JMolBiol215巻:403~410頁1990年に記載されている。本発明の核酸およびタンパク質についてのパーセント配列同一性を決定するために、本明細書に記載のパラメータを用いてBLASTおよびBLAST2.0を使用する。BLAST解析を実施するためのソフトウェアは、当技術分野で公知の通り、NationalCenterforBiotechnologyInformationを通じて公的に入手可能である。このアルゴリズムは、最初に、データベース配列内の同じ長さのワードとアラインメントした際にいくらかの正の値の閾値スコアTと一致するか、またはそれを満たすかのいずれかの、クエリ配列内の長さWの短いワードを同定することにより、高スコアの配列対HSPを同定することを伴う。Tは、近傍ワードスコア閾値neighborhoodwordscorethresholdと称されるAltschulら、上記。これらの最初の近傍ワードヒットneighborhoodwordhitは、それらを含むより長いHSPを見つけるための検索を開始するための種としての機能を果たす。累積アラインメントスコアが増加し得る限りは上記ワードヒットを各配列に沿って両方向に伸長させる。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメータM残基の一致する対についてのリワードrewardスコア;常に>0およびNミスマッチ残基についてのペナルティスコア;常に<0を使用して算出する。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスを使用して上記累積スコアを算出する。各方向へのワードヒットの伸長は、上記累積アラインメントスコアが、その最大達成値から数量Xまで低下するとき;上記累積スコアが、1つまたは複数のネガティブスコアリングnegative-scoring残基アラインメントが蓄積したことによってゼロ以下になるとき;または、いずれかの配列の末端に到達するときに停止する。上記BLASTアルゴリズムのパラメータW、T、およびXにより、上記アラインメントの感度およびスピードが決定される。BLASTNプログラムヌクレオチド配列についてでは、初期状態としてワード長W11、期待値E10、M=5、N=-4および両方の鎖の比較を用いる。アミノ酸配列については、BLASTPプログラムで、初期状態としてワード長3、および期待値E10、ならびにBLOSUM62スコアリングマトリックスHenikoffHenikoff、ProcNatlAcadSciUSA89巻:10915頁1989年を参照されたいアラインメントB50、期待値E10、M=5、N=-4、および両方の鎖の比較を用いる。ポリペプチド、ペプチドおよびタンパク質という用語は、本明細書では互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、1つまたは複数のアミノ酸残基が天然に存在するアミノ酸に対応する人工的な化学的模倣物であるアミノ酸のポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸のポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸のポリマーにあてはまる。アミノ酸という用語は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、ならびに上記天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝暗号にコードされるアミノ酸、ならびに後で修飾されたアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタメート、およびO-ホスホセリンである。アミノ酸類似体とは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびR基に結合したα炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。そのような類似体は、修飾されたR基例えば、ノルロイシンまたは修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持する。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能する化合物を指す。アミノ酸は、本明細書ではそれらの一般に公知の3文字記号によってまたはIUPAC-IUBBiochemicalNomenclatureCommissionによって推奨されている1文字記号のいずれかによって称することができる。同様に、ヌクレオチドは、それらの一般に認められている1文字コードによって称することができる。保存的に修飾されたバリアントは、アミノ酸配列と核酸配列の両方にあてはまる。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾されたバリアントとは、同一または基本的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸、または上記核酸が基本的に同一の配列に対するアミノ酸配列をコードしない場合の核酸を指す。遺伝暗号の縮重が原因で、多数の機能的に同一の核酸が任意の所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンGCA、GCC、GCGおよびGCUは全てアミノ酸アラニンをコードする。したがって、コドンによりアラニンが特定される全ての位置で、コードされるポリペプチドを変化させることなく、上記コドンを、記載されているその対応するコドンのいずれかに変更することができる。そのような核酸の変異は、保存的に修飾された変異の1つの種であるサイレント変異である。本明細書におけるポリペプチドをコードする核酸配列の全ても同様に、上記核酸の可能性のあるサイレント変異の全てを説明する。核酸の各コドン普通はメチオニンに対する唯一のコドンであるAUG、および普通はトリプトファンに対する唯一のコドンであるTGGを除いてを改変して機能的に同一の分子をもたらすことができることは、当業者には理解される。したがって、ポリペプチドをコードする核酸のサイレント変異のそれぞれは、記載されている配列のそれぞれに、発現産物に関しては、潜在的に含まれるが、実際のプローブ配列に関しては、そうではない。アミノ酸配列に関して、コードされる配列における単一のアミノ酸または低百分率のアミノ酸を変化させる、付加するまたは欠失させる核酸配列、ペプチド配列、ポリペプチド配列、またはタンパク質配列への個々の置換、欠失または付加は、その変更によりアミノ酸が化学的に同様のアミノ酸で置換される保存的に修飾されたバリアントであることが当業者には理解される。機能的に同様のアミノ酸をもたらす保存置換の表は当技術分野で周知である。そのような保存的に修飾されたバリアントは、本発明の多型バリアント、種間ホモログ、および対立遺伝子に追加され、それを排除するものではない。以下の8群はそれぞれ、互いに保存置換であるアミノ酸を含有する:1アラニンA、グリシンG;2アスパラギン酸D、グルタミン酸E;3アスパラギンN、グルタミンQ;4アルギニンR、リジンK;5イソロイシンI、ロイシンL、メチオニンM、バリンV;6フェニルアラニンF、チロシンY、トリプトファンW;7セリンS、トレオニンT;および8システインC、メチオニンM例えば、Creighton、Proteins1984年を参照されたい。組換えという用語は、例えば、細胞、ウイルス、核酸、タンパク質、またはベクターを参照して使用される場合、その細胞、ウイルス、核酸、タンパク質またはベクターが、異種核酸またはタンパク質の導入またはネイティブな核酸またはタンパク質の変更によって改変されていること、またはその細胞が、そのように改変された細胞に由来する細胞であることを示す。したがって、例えば、組換え細胞は、ネイティブな非組換え形態の細胞においては見いだされない遺伝子を発現する、または別の方法で異常に発現される、低発現である、もしくは全く発現されないネイティブな遺伝子を発現する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件という句は、プローブが、一般には核酸の複合混合物complexmixture中のその標的サブシーケンスとハイブリダイズするが、他の配列とはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる状況では異なる。より長い配列は、特により高い温度でハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションについての広範な手引きは、Tijssen、TechniquesinBiochemistryandMolecularBiologyHybridizationwithNucleicProbes、Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidassays1993年に見いだされる。一般に、ストリンジェントな条件は、定義済みのイオン強度、pHにおける特定の配列についての熱融点Tmよりも約5~10°C低くなるように選択する。上記Tmは、上記標的と相補的な上記プローブの50が平衡状態標的配列が過剰に存在するので、Tmにおいて、上記プローブの50が平衡状態で占有されるでその標的配列とハイブリダイズする温度定義済みのイオン強度、pH、および核酸濃度においてである。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤を添加することによって実現することもできる。選択的ハイブリダイゼーションまたは特異的ハイブリダイゼーションについて、陽性シグナルはバックグラウンドの少なくとも2倍であり、バックグラウンドハイブリダイゼーションの10倍であることが好ましい。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は以下の通りであってよい:50のホルムアミド、5×SSC、および1のSDS、42°Cでインキュベートすること、または、5×SSC、1のSDS、65°Cでインキュベートし、0.2×SSC、および0.1のSDS中、65°Cで洗浄すること。ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一であれば、それでも実質的に同一である。これは、例えば、上記遺伝暗号により許容される最大のコドンの縮重を用いて核酸のコピーを創製する場合に生じる。そのような場合では、上記核酸は、一般には中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。例示的な中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、40のホルムアミド、1MのNaCl、1のSDSの緩衝液中、37°Cでのハイブリダイゼーション、および1×SSC中、45°Cでの洗浄が挙げられる。陽性のハイブリダイゼーションは、バックグラウンドの少なくとも2倍である。同様のストリンジェンシーの条件をもたらすために代替のハイブリダイゼーション条件および洗浄条件を利用することができることは、当業者には容易に理解される。ハイブリダイゼーションのパラメータを決定するための追加の手引きは多数の参照、例えば、CurrentProtocolsinMolecularBiology、Ausubelら編、JohnWileySonsにおいて提供される。PCRに関して、低ストリンジェンシーの増幅のためには約36°Cの温度が典型的であるが、アニーリング温度は、プライマーの長さに応じて約32°Cから48°Cの間で変動し得る。高ストリンジェンシーのPCR増幅のためには、約62°Cの温度が典型的であるが、高ストリンジェンシーのアニーリング温度は、上記プライマーの長さおよび特異性に応じて約50°Cから約65°Cまでの範囲であり得る。高ストリンジェンシーの増幅および低ストリンジェンシーの増幅の両方に対する典型的なサイクル条件は、90°C~95°Cで30秒間~2分間の変性相、30秒間~2分間続くアニーリング相、および約72°Cで1~2分間にわたる伸長相を含む。低ストリンジェンシーの増幅反応および高ストリンジェンシーの増幅反応についてのプロトコールおよび手引きは、例えば、Innisら1990年PCRProtocols、AGuidetoMethodsandApplications、AcademicPressIncNYにおいて提供される。本明細書で使用される場合、がんという用語は、白血病、癌腫および肉腫を含めた、哺乳動物に見いだされる全種類のがん、新生物、または悪性腫瘍を指す。例示的ながんとしては、脳がん、乳がん、子宮頸部がん、結腸がん、頭頸部がん、肝がん、腎がん、肺がん、非小細胞肺がん、黒色腫、中皮腫、卵巣がん、肉腫、胃がん、子宮がんおよび髄芽腫が挙げられる。さらなる例としては、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、卵巣がん、横紋筋肉腫、原発性血小板血症、原発性マクログロブリン血症、原発性脳腫瘍、がん、悪性膵臓インスリノーマinsulanoma、悪性カルチノイド、膀胱がん、前癌皮膚病変、精巣がん、リンパ腫、甲状腺がん、神経芽細胞腫、食道がん、泌尿生殖器がん、悪性高カルシウム血症、子宮体がん、副腎皮質がん、膵内分泌腺および膵外分泌腺の新生物、ならびに前立腺がんが挙げられる。白血病という用語は、広範には造血臓器の進行性の悪性疾患を指し、一般に、血液および骨髄における白血球およびそれらの前駆体の増殖および発生の変形を特徴とする。白血病は、一般に、1疾患の持続時間および特性-急性または慢性;2関与する細胞の種類;骨髄系myeloid骨髄性myelogenous、リンパ系リンパ性、または単球性;および3血液中の異常な細胞の数が増加するか増加しないか-白血病性または無白血病性亜白血病性に基づいて臨床的に分類される。P388白血病モデルは、invivoにおける抗白血病活性を予測するものとして広範に認められている。P388アッセイにおいて試験陽性の化合物は、一般に、処置されている白血病の種類にかかわらずinvivoでいくらかのレベルの抗白血病活性を示すと考えられている。したがって、本発明は、白血病を処置する方法、および好ましくは、急性非リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性顆粒球性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性前骨髄球性白血病、成人T細胞白血病、無白血病性白血病、白血球血症性白血病leukocythemicleukemia、好塩基球性白血病、芽細胞白血病、ウシ白血病、慢性骨髄性白血病、皮膚白血病、胎生細胞性白血病embryonalleukemia、好酸球性白血病、グロス白血病Gross’leukemia、有毛細胞白血病、血球母細胞性白血病hemoblasticleukemia、血球芽細胞性白血病hemocytoblasticleukemia、組織球性白血病histiocyticleukemia、幹細胞性白血病、急性単球性白血病、白血球減少性白血病、リンパ性白血病lymphaticleukemia、リンパ芽球性白血病、リンパ性白血病lymphocyticleukemia、リンパ性白血病lymphogenousleukemia、リンパ性白血病lymphoidleukemia、リンパ肉腫細胞性白血病、肥満細胞性白血病、巨核球性白血病、小骨髄芽球性白血病、単球性白血病、骨髄芽球性白血病、骨髄球性白血病、骨髄顆粒球性白血病myeloidgranulocyticleukemia、骨髄単球性白血病、ネーゲリ白血病Naegelileukemia、形質細胞白血病、多発性骨髄腫、形質細胞性白血病、前骨髄球性白血病、リーダー細胞性白血病、シリング白血病Schilling’sleukemia、幹細胞性白血病、亜白血性白血病、および未分化細胞性白血病undifferentiatedcellleukemiaを処置する方法を包含する。肉腫という用語は、概して、胚の結合組織のような物質でできている腫瘍を指し、一般に、線維状物質または均一な物質に埋め込まれた密に固まったpacked細胞で構成される。抗新生物性チオール結合性ミトコンドリアオキシダントと抗がん剤の組み合わせを用いて処置することができる肉腫としては、軟骨肉腫、線維肉腫、リンパ肉腫、黒色肉腫、粘液肉腫、骨肉腫、アバーネシー肉腫Abemethy’ssarcoma、脂肪肉腫adiposesarcoma、脂肪肉腫liposarcoma、胞状軟部肉腫、エナメル上皮肉腫、ブドウ状肉腫、緑色腫肉腫chloromasarcoma、絨毛癌、胎生期肉腫、ウィルムス腫瘍肉腫Wilms’tumorsarcoma、子宮内膜肉腫、間質肉腫、ユーイング肉腫、筋膜肉腫fascialsarcoma、線維芽細胞肉腫fibroblasticsarcoma、巨細胞肉腫、顆粒球性肉腫、ホジキン肉腫、特発性多発性色素性出血性肉腫idiopathicmultiplepigmentedhemorrhagicsarcoma、B細胞の免疫芽球肉腫、リンパ腫、T細胞の免疫芽球肉腫、イエンセン肉腫Jensen’ssarcoma、カポジ肉腫、クッパー細胞肉腫Kupffercellsarcoma、血管肉腫、白血肉腫、悪性間葉腫malignantmesenchymomasarcoma、傍骨性肉腫parostealsarcoma、網状赤血球肉腫reticulocyticsarcoma、ラウス肉腫、漿液嚢腫性肉腫serocysticsarcoma、滑膜肉腫、および毛細血管拡張性肉腫telangiectalticsarcomaが挙げられる。黒色腫という用語は、皮膚および他の器官のメラニン細胞系から生じる腫瘍を意味すると解釈される。抗新生物性チオール結合性ミトコンドリアオキシダントと抗がん剤の組み合わせを用いて処置することができる黒色腫としては、例えば、末端部黒子黒色腫、無色素性黒色腫、良性若年性黒色腫、クラウドマン黒色腫Cloudman’smelanoma、S91黒色腫、ハーディングパッセー黒色腫、若年性黒色腫、悪性黒子黒色腫、悪性黒色腫、結節性黒色腫、爪下黒色腫subungalmelanoma、および表在拡大型黒色腫が挙げられる。癌腫という用語は、周囲の組織に浸潤し、転移を生じさせる傾向がある、上皮細胞でできている悪性の新しい成長物を指す。抗新生物性チオール結合性ミトコンドリアオキシダントと抗がん剤の組み合わせを用いて処置することができる例示的な癌腫としては、例えば、細葉癌腫acinarcarcinoma、細葉状癌腫acinouscarcinoma、腺嚢癌腫、腺様嚢胞癌腫、腺腫様癌腫carcinomaadenomatosum、副腎皮質癌腫、肺胞癌腫、肺胞細胞癌腫、基底細胞癌腫basalcellcarcinoma、基底細胞癌腫carcinomabasocellulare、類基底細胞癌腫、基底有棘細胞癌腫、細気管支肺胞癌腫、細気管支癌腫、気管支原性癌腫、大脳様癌腫cerebriformcarcinoma、胆管細胞癌腫、絨毛癌腫、膠様癌腫、面皰癌腫、体癌腫corpuscarcinoma、篩状癌腫cribriformcarcinoma、鎧状癌腫carcinomaencuirasse、皮膚癌腫、円柱状癌腫cylindricalcarcinoma、円柱細胞癌腫、腺管癌腫、緻密癌腫carcinomadurum、胎生期癌腫、脳様癌腫、類表皮癌腫epiermoidcarcinoma、上皮腺様癌腫carcinomaepithelialeadenoides、外方増殖性癌腫exophyticcarcinoma、潰瘍癌腫carcinomaexulcere、線維性癌腫carcinomafibrosum、ゼラチン状癌gelatinifornicarcinoma、膠様癌腫gelatinouscarcinoma、巨細胞癌腫giantcellcarcinoma、巨細胞癌腫carcinomagigantocellulare、腺癌glandularcarcinoma、顆粒膜細胞癌腫、毛母癌腫hair-matrixcarcinoma、血液様癌腫hematoidcarcinoma、肝細胞癌腫、ヒュルトレ細胞癌腫、ヒアリン癌腫hyalinecarcinoma、副腎様癌腫hypemephroidcarcinoma、乳児胎生期癌腫infantileembryonalcarcinoma、上皮内癌腫carcinomainsitu、表皮内癌腫、上皮内癌腫intraepithelialcarcinoma、クロンペシェール癌腫Krompecher’scarcinoma、クルチツキー細胞癌腫、大細胞癌腫、レンズ状癌腫lenticularcarcinoma、レンズ状癌腫carcinomalenticulare、脂肪腫性癌腫lipomatouscarcinoma、リンパ上皮癌lymphoepithelialcarcinoma、髄様癌腫carcinomamedullare、髄様癌腫medullarycarcinoma、黒色癌腫、モール癌腫carcinomamolle、粘液性癌腫、粘液分泌性癌腫carcinomamuciparum、粘液細胞癌腫carcinomamucocellulare、粘液性類表皮癌腫、粘液癌腫carcinomamucosum、粘液性癌腫、粘液腫性癌腫carcinomamyxomatodes、鼻咽腔癌腫、燕麦細胞癌腫、骨化性癌腫carcinomaossificans、類骨癌腫osteoidcarcinoma、乳頭状癌腫、門脈周囲性癌腫periportalcarcinoma、前浸潤癌、有棘細胞癌pricklecellcarcinoma、粥状癌腫pultaceouscarcinoma、腎臓の腎細胞癌腫、予備細胞癌腫reservecellcarcinoma、肉腫様癌腫carcinomasarcomatodes、シュナイダー癌schneideriancarcinoma、硬性癌腫、陰嚢癌腫、印環細胞癌腫、単純癌腫carcinomasimplex、小細胞癌腫、ソラノイド癌腫solanoidcarcinoma、球状細胞癌腫spheroidalcellcarcinoma、紡錘体細胞癌腫、海綿様癌腫、扁平上皮癌squamouscarcinoma、扁平上皮癌squamouscellcarcinoma、ストリング癌腫stringcarcinoma、毛細血管拡張性癌腫carcinomatelangiectaticum、毛細血管拡張様癌腫carcinomatelangiectodes、移行上皮癌、結節癌腫carcinomatuberosum、結節癌腫tuberouscarcinoma、疣状癌腫、および絨毛癌腫carcinomavillosumが挙げられる。治療有効用量または量therapeuticallyeffectivedoseoramountとは、本明細書では、それが投与されるものに効果を生じる用量を意味する。その正確な用量および処方は処置の目的に依存し、当業者は公知の技法を使用して確かめることができる例えば、Lieberman、PharmaceuticalDosageForms1~3巻、1992年;Lloyd、TheArtScienceandTechnologyofPharmaceuticalCompounding1999年;Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy、第20版、Gennaro編2003年、およびPickar、DosageCalculations1999年を参照されたい。薬学的に許容される塩または薬学的に許容されるキャリアという用語は、本明細書に記載の化合物に見いだされる特定の置換基に応じて、比較的非毒性の酸または塩基を用いて調製される活性化合物の塩を含むことを意味するする。本発明の化合物が比較的酸性の官能基を有する場合、中性の形態のそのような化合物を十分な量の所望の塩基と、そのままで、または適切な不活性溶媒中で接触させることによって塩基付加塩を得ることができる。薬学的に許容される塩基付加塩の例としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、有機アミノ塩、またはマグネシウム塩、または同様の塩が挙げられる。本発明の化合物が比較的塩基性の官能基を有する場合、中性の形態のそのような化合物を、十分な量の所望の酸と、そのままで、または適切な不活性溶媒中で接触させることによって酸付加塩を得ることができる。薬学的に許容される酸付加塩の例としては、塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、一水素炭酸monohydrogencarbonic、リン酸、一水素リン酸monohydrogenphosphoric、二水素リン酸dihydrogenphosphoric、硫酸、一水素硫酸monohydrogensulfuric、ヨウ化水素酸、または亜リン酸などのような無機酸に由来する酸付加塩、ならびに、酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、マレイン酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、乳酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、p-トリルスルホン酸p-tolylsulfonicacid、クエン酸、酒石酸、およびメタンスルホン酸などのような比較的非毒性の有機酸に由来する塩が挙げられる。アルギン酸塩arginateなどのようなアミノ酸の塩、およびグルクロン酸またはガラクツロン酸galactunoricのような有機酸の塩も包含される例えば、Bergeら、JournalofPharmaceuticalScience66巻:1~19頁1977年を参照されたい。ある特定の本発明の化合物は、その化合物を塩基付加塩または酸付加塩のいずれかに変換することを可能にする塩基性および酸性の官能基を含有する。当業者に公知の他の薬学的に許容されるキャリアは、本発明に適している。詳細な実施形態I.Adsembly法一態様では、組換えアデノウイルスを作製するための方法本明細書ではAdsemblyとも称されるが提供される。当該方法は、E1モジュール、E2-L2モジュール、L3-L4モジュール、E3モジュール、E4モジュール、またはアデノウイルスマクロモジュールまたは下記のその変異体から選択される2種以上のアデノウイルス遺伝子モジュールから核酸を構築するステップを含む。いくつかの実施形態では、当該方法は、E1モジュール、E2-L2モジュール、L3-L4モジュール、E3モジュール、E4モジュールまたはアデノウイルスマクロモジュールから選択される3種、4種または5種のアデノウイルス遺伝子モジュールから核酸を構築するステップを含む。上記核酸は、アデノウイルスゲノム構築物であってよい。アデノウイルスゲノム構築物は、発現されると例えば、哺乳動物の細胞に導入されると、組換えアデノウイルスを形成することができる核酸である。上記核酸は、追加的なウイルス例えば、ヘルパーウイルスと一緒に、発現されると例えば、哺乳動物の細胞に導入されると組換えアデノウイルスを形成することができる部分的なアデノウイルスゲノム構築物であってもよい。そのように形成されたアデノウイルスは、複製し、パッケージングして後代ウイルスを生じさせることができる。したがって、本明細書において提供される方法は、単独で、補完的細胞系中で、またはヘルパーウイルスと一緒に、のいずれかで哺乳動物の細胞にトランスフェクションすると、複製され、パッケージングされて後代ウイルスを生じさせる2つ以上のゲノムのモジュールまたは異種性エレメントから、invitroでアデノウイルスゲノムを構築するステップを含むことができる。ゲノムのモジュールは、進化的に保存された配列、転写単位または機能単位に基づいて選択することができる。いくつかの実施形態では、当該方法は、E1モジュール、E2-L2モジュール、L3-L4モジュール、E3モジュール、およびE4モジュールから選択される3種以上のアデノウイルス遺伝子のモジュールから核酸を構築するステップを含む。生じた核酸本明細書では構築された核酸とも称されるは、構築した後に発現させ例えば、複製、転写、翻訳、およびパッケージング、それにより、組換えアデノウイルスを形成することができる。上記核酸の発現は、invitroで、insituで、細胞内で例えば、上記核酸を細胞にトランスフェクトすることによって、またはinvivoで実施することができる。ある特定の実施形態では、その発現を細胞内で実施し、それにより、ウイルスの産生を導く。アデノウイルス遺伝子モジュールという用語は、本明細書で使用される場合、E1モジュール、E2-L2モジュール、L3-L4モジュール、E3モジュール、E4モジュールまたはそのマクロモジュールを指す。したがって、アデノウイルス遺伝子モジュールは核酸例えば、DNAである。個々のアデノウイルス遺伝子モジュールとは、本明細書で使用される場合、E1モジュール、E2-L2モジュール、L3-L4モジュール、E3モジュール、またはE4モジュールを指す。いくつかの実施形態では、個々のアデノウイルス遺伝子モジュールのうちの1種または複数種を、上記核酸を構築する前に、より小さなサブモジュールから構築することができる。アデノウイルスマクロモジュールは、E1モジュール、E2-L2モジュール、L3-L4モジュール、E3モジュール、E4モジュールのうちの2種、3種または4種の組み合わせである。したがって、上記マクロモジュールは、E1モジュール、E2-L2モジュール、L3-L4モジュール、E3モジュール、E4モジュールのうちの2種、3種または4種を含む核酸例えば、DNAの線状の鎖である。アデノウイルスマクロモジュールという用語は、本明細書で使用される場合、E1-L2マクロモジュールすなわち、E1モジュールおよびE2-L2モジュールを組み合わせて含む核酸;E1-L4マクロモジュールすなわち、E1モジュール、E2-L2モジュールおよびL3-L4モジュールを組み合わせて含む核酸;E1-E3マクロモジュールすなわち、E1モジュール、E2-L2モジュール、L3-L4モジュールおよびE3モジュールを組み合わせて含む核酸;E2-L4マクロモジュールすなわち、E2-L2モジュールおよびL3-L4モジュールを含む核酸、本明細書ではコアマクロモジュールとも称される;E2-E3マクロモジュールすなわち、E2-L2モジュール、L3-L4モジュールおよびE3モジュールを組み合わせて含む核酸;E2-E4マクロモジュールすなわち、E2-L2モジュール、L3-L4モジュール、E3モジュールおよびE4モジュールを組み合わせて含む核酸;L3-E3マクロモジュールすなわち、L3-L4モジュール、およびE3モジュールを組み合わせて含む核酸L3-E4マクロモジュールすなわち、L3-L4モジュール、E3モジュールおよびE4モジュールを組み合わせて含む核酸;およびE3-E4マクロモジュールすなわち、E3モジュールおよびE4モジュールを組み合わせて含む核酸を指す。いくつかの実施形態では、上記アデノウイルスマクロモジュールは、E2-L4マクロモジュールすなわち、コアマクロモジュールまたはE3-E4マクロモジュールである。あるアデノウイルスマクロモジュールを、上記核酸を構築するための2種以上の選択されたアデノウイルスのモジュールの1つとして使用する場合、他の選択されたアデノウイルスのモジュール複数可は、そのアデノウイルスマクロモジュール内に含有される個々のアデノウイルス遺伝子モジュールではない。言い換えれば、個々のアデノウイルス遺伝子モジュールは各々、別々であろうと、マクロモジュール内であろうと、構築される核酸内に1回のみ存在する。例えば、上記核酸を構築するための2種以上の選択されたアデノウイルス遺伝子モジュールのうちの1種がコアマクロモジュールである場合、上記E2-L2モジュールもL3-L4モジュールも、構築される核酸に含まれるための別のモジュールとして選択されない。同様に、3種以上のアデノウイルス遺伝子モジュールを選択する場合、そのアデノウイルスマクロモジュールは、E1-E3マクロモジュールでもE2-E4マクロモジュールでもない。いくつかの実施形態では、上記方法は、iE1モジュール、iiコアマクロモジュール、およびiiiE3モジュール、E4モジュールまたはE3-E4マクロモジュールから選択される3種のアデノウイルス遺伝子モジュールから核酸を構築するステップを含む。当該方法は、E1モジュール、コアマクロモジュール、E3モジュール、およびE4モジュールから選択される4種のアデノウイルス遺伝子モジュールから核酸を構築するステップを含む場合もある。いくつかの実施形態では、上記核酸を構築する前に、1種または複数種のアデノウイルス遺伝子モジュールを組み合わせてマクロモジュールを形成することができる。マクロモジュールを形成する場合、その方法は、マクロモジュールおよびそのマクロモジュールに含まれない1種または複数種の個々のアデノウイルス遺伝子モジュールすなわち、E1モジュール、E2-L2モジュール、L3-L4モジュール、E3モジュール、および/またはE4モジュールから上記核酸を構築するステップを含む。いくつかの実施形態では、上記マクロモジュールはコアマクロモジュールである。したがって、いくつかの実施形態では、上記方法は、上記コアマクロモジュールおよび上記E1モジュール、上記E3モジュール、または上記E4モジュールから選択される1種または複数種のアデノウイルス遺伝子モジュールを使用して上記核酸を構築するステップを含む。アデノウイルスは、核内で複製する、エンベロープを有さない正二十面体のウイルスである。本明細書において提供されるアデノウイルス遺伝子モジュールは、例えば、Davisonら、JournalofGeneralVirology2003年、84巻、28695~2938頁に記載のアデノウイルスゲノムのある特定の位置を指す。いくつかの実施形態では、上記アデノウイルス遺伝子モジュールはヒトアデノウイルスに由来する。図5は、本明細書において提供されるアデノウイルス遺伝子モジュール、ならびに、それらのキロベースkb単位のおおよそのサイズを示すヒトAd5の簡単なマップである。各モジュールは、複数の遺伝子産物および代替の遺伝子スプライシング配置をコードし得る。E1モジュールとは、本明細書で使用される場合、アデノウイルスの逆方向末端反復ITRを含有する核酸である。上記E1モジュールは、構築された上記核酸のタンパク質コード領域に作動可能に連結し得るプロモーターをさらに含んでよい。上記E1モジュールは、一般には、アデノウイルスのE1A領域および/またはE1B領域に由来する。上記ITR領域に加えて、上記E1モジュールは、アデノウイルスゲノムのE1末端から上記ウイルスのポリメラーゼコード領域までに見いだされるウイルス遺伝子のいずれかも含んでよい以下で考察する。例えば、上記E1モジュールは、主要な転写活性化因子であるE1A例えば、pRBファミリーの不活性化因子をコードする、E1B-19K例えば、アポトーシス遮断因子をコードする、E1B55K例えば、p53結合性エクスポーター、mre結合性エクスポーターおよびウイルスmRNAエクスポーターおよび/またはpIX例えば、少数のminor構造タンパク質およびウイルスカプシド上でヘキソンと相互作用するタンパク質をコードするのコード領域をさらに含んでよい。上記E1モジュールの長さはおよそ4kb、3kb、2kbまたは1kbであり得る。いくつかの実施形態では、上記E1モジュールは天然に見いだされるアデノウイルスのE1A領域およびE1B領域とほぼ同じサイズの長さである例えば、図5参照。E2-L2モジュールとは、本明細書で使用される場合、ウイルスDNAポリメラーゼコード領域およびヘキソンタンパク質コード領域のうちの少なくとも1つを含有する核酸である。いくつかの実施形態では、上記E2-L2モジュールは、ウイルスDNA-結合タンパク質コード領域も含む。上記E2-L2モジュールは、一般には、上記アデノウイルスのE2B領域、L1領域および/またはL2領域に由来する。上記E2-L2モジュールは、E2BIVa2例えば、後期転写アクチベーターおよびウイルスカプシドへのウイルスDNAのパッケージングを補助するタンパク質、E2BPol例えば、ウイルスDNAポリメラーゼをコードする、E2BpTP例えば、ウイルスゲノムの末端に結合し、ウイルスの複製およびパッケージングに必要な末端タンパク質をコードする、L152K例えば、カプシドへのウイルスDNAのパッケージングに必要なタンパク質をコードする、L1IIIa例えば、上記カプシドの安定化を補助する少数の構造タンパク質をコードする、L2IIIペントン例えば、上記線維が突出するカプシドの頂点を形成する主要な構造タンパク質をコードする、L2pVII例えば、ヒストンH3との相同性を有し、上記カプシド内のウイルスDNAと会合するコア構造タンパク質をコードする、L2V例えば、上記DNAとウイルスカプシドの間の会合を形成するコア構造タンパク質をコードする、およびL2pX例えば、上記ウイルスゲノムに結合し、それを凝縮するコア構造タンパク質をコードするのコード領域をさらに含んでよい。いくつかの実施形態では、上記E2-L2モジュールは、天然に見いだされるアデノウイルスのE2B領域、L1領域およびL2領域とほぼ同じサイズの長さである例えば、図5参照。L3-L4モジュールとは、本明細書で使用される場合、ウイルスDNAポリメラーゼコード領域およびヘキソンタンパク質コード領域の少なくとも1つを含有する核酸である。いくつかの実施形態では、上記L3-L4モジュールは、ウイルスDNA-結合タンパク質コード領域も含んでよい。いくつかの実施形態では、上記E2-L2モジュールがウイルスDNAポリメラーゼコード領域を含有する場合、上記L3-L4はウイルスDNAコード領域を含有せず、その逆もまた同じである。同様に、上記E2-L2モジュールがヘキソンタンパク質コード領域を含有する場合、上記L3-L4は、ヘキソンタンパク質コード領域を含有しなくてよく、その逆もまた同じである。同様に、上記E2-L2モジュールがウイルスDNA-結合タンパク質コード領域を含有する場合、上記L3-L4は、ウイルスDNA-結合タンパク質コード領域を含有しなくてよく、その逆もまた同じである。言い換えれば、上記ウイルスDNAポリメラーゼコード領域、上記ヘキソンタンパク質コード領域、および上記ウイルスDNA-結合タンパク質コード領域は、一般には、構築されるその核酸内に1回のみ現れる。上記L3-L4モジュールは、L3pVI例えば、その頂点において上記カプシドと上記ウイルスゲノムDNAの間の会合を形成する少数の構造タンパク質をコードする、L3IIヘキソン例えば、上記カプシドの三角形の面を形成する主要な構造タンパク質をコードする、L323K例えば、ウイルスタンパク質を完全なカプシド集合体に加工するウイルスプロテアーゼをコードする、E2ADBP例えば、ウイルスDNAに結合し、複製を容易にするDNA結合タンパク質をコードする、L4100K例えば、細胞タンパク質合成を阻害し、ウイルスの後期タンパク質の翻訳を促進するタンパク質をコードする、L433K例えば、後期ウイルス遺伝子のスプライシングを促進するタンパク質をコードする、1種または複数種の線維タンパク質、およびL422K例えば、後期ウイルス遺伝子発現を促進し、ウイルスDNAのパッケージングを補助するタンパク質をコードするのコード領域も含んでよい。いくつかの実施形態では、上記L3-L4モジュールは天然に見いだされるアデノウイルスのL3領域、E2A領域およびL4領域または天然に見いだされるアデノウイルスのL3領域、E2A領域、L4領域およびL5領域とほぼ同じサイズの長さである例えば、図5参照。コアマクロモジュール本明細書ではE2-L4マクロモジュールとも称されるとは、本明細書で使用される場合、ウイルスDNAポリメラーゼコード領域およびヘキソンタンパク質コード領域の少なくとも1つを含有する核酸を指す。いくつかの実施形態では、上記コアマクロモジュールは、ウイルスDNA-結合タンパク質コード領域も含んでよい。いくつかの実施形態では、上記コアマクロモジュールは上記ウイルスの構造タンパク質の大部分ならびにDNA複製およびパッケージングに必要なウイルスの構造タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、上記コアマクロモジュールは、ウイルスDNAポリメラーゼコード領域、ヘキソンタンパク質コード領域およびウイルスDNAポリメラーゼコード領域を含む。他の実施形態では、上記コアは、L3pVI例えば、その頂点において上記カプシドと上記ウイルスゲノムDNAの間の会合を形成する少数の構造タンパク質をコードする、L3IIヘキソン例えば、上記カプシドの三角形の面を形成する主要な構造タンパク質をコードする、L323K例えば、ウイルスタンパク質を完全なカプシド集合体に加工するウイルスプロテアーゼをコードする、E2ADBP例えば、ウイルスDNAに結合し、複製を容易にするDNA結合タンパク質をコードする、L4100K例えば、細胞タンパク質合成を阻害し、ウイルスの後期タンパク質の翻訳を促進するタンパク質をコードする、L433K例えば、後期ウイルス遺伝子のスプライシングを促進するタンパク質をコードする、およびL422K例えば、後期ウイルス遺伝子発現を促進し、ウイルスDNAのパッケージングを補助するタンパク質をコードする、E2BIVa2例えば、後期転写活性化因子およびウイルスDNAの上記ウイルスカプシドへのパッケージングを補助するタンパク質をコードする、E2BPol例えば、ウイルスDNAポリメラーゼをコードする、E2BpTP例えば、ウイルスゲノムの末端に結合し、ウイルスの複製およびパッケージングに必要な末端タンパク質をコードする、L152K例えば、カプシドへのウイルスDNAのパッケージングに必要なタンパク質をコードする、L1IIIa例えば、上記カプシドの安定化を補助する少数の構造タンパク質をコードする、L2IIIペントン例えば、上記線維が突出する上記カプシドの頂点を形成する主要な構造タンパク質をコードする、L2pVII例えば、ヒストンH3との相同性を有し、上記カプシド内のウイルスDNAと会合するコア構造タンパク質をコードする、L2V例えば、DNAとウイルスカプシドの間の会合を形成するコア構造タンパク質をコードする、1種または複数種の線維タンパク質、およびL2pX例えば、上記ウイルスゲノムに結合し、それを凝縮するコア構造タンパク質をコードするのコード領域も含んでよい。いくつかの実施形態では、上記L3-L4モジュールは、天然に見いだされるアデノウイルスのE2B領域、L1領域、L2領域、L3領域、E2A領域およびL4領域または天然に見いだされるアデノウイルスのE2B領域、L1領域、L2領域、L3領域、E2A領域、L4領域およびL5領域とほぼ同じサイズの長さである例えば、図5参照。上記ウイルスDNAポリメラーゼ遺伝子にコードされるタンパク質は、配列番号32に記載のヒトAd5DNAポリメラーゼのアミノ酸996~1103の少なくとも50個の連続したアミノ酸例えば、全てまたは別の種に由来するそのホモログと少なくとも45例えば、50、60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または100の同一性を共有する配列を含有する図7A~C。上記ヘキソン遺伝子にコードされるタンパク質は、配列番号73に記載のヒトAd5ヘキソンのアミノ酸501~747の少なくとも50個の連続したアミノ酸例えば、全てまたは別の種に由来するそのホモログと少なくとも45例えば、50、60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または100の同一性を共有する配列を含有する図7D~G。上記ウイルスDNA-結合タンパク質遺伝子にコードされるタンパク質は、配列番号103に記載のヒトAd5DNA-結合タンパク質のアミノ酸408~475の少なくとも50個の連続したアミノ酸例えば、全てまたは別の種に由来するそのホモログと少なくとも35例えば、45、50、60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または100の同一性を共有する配列を含有する図7H~I。E4モジュールとは、本明細書で使用される場合、アデノウイルスの逆方向末端反復ITRを含有する核酸である。いくつかの実施形態では、上記E4は、1種または複数種の線維タンパク質のコード領域をさらに含む。上記E4モジュールは、E4orf6/7例えば、ウイルス転写のE2Fトランス活性化を媒介するタンパク質をコードする、E4orf6例えば、ウイルスのDNA合成を促進し、ウイルスの後期mRNAを安定化し輸出し、スプライシングを促進するタンパク質をコードする、E4orf4例えば、ウイルス転写およびスプライシングを制御し、PP2Aを調節するタンパク質をコードする、E4orf3例えば、p53-媒介性転写を遮断し、MRNDNA-修復複合体を妨害し、コンカテマー化concatemerizationを防止するタンパク質をコードする、E4orf2、およびE4orf1例えば、PI3キナーゼを通じたシグナル伝達を促進し、それにより、タンパク質合成および細胞生存を導くタンパク質をコードするのコード領域をさらに含んでよい。いくつかの実施形態では、上記E4モジュールは、天然に見いだされるアデノウイルスのE4領域または天然に見いだされるアデノウイルスのE4領域およびL5領域とほぼ同じサイズの長さである例えば、図5参照。E3モジュールとは、本明細書で使用される場合、1種または複数種の線維タンパク質のコード領域および/またはアデノウイルスの逆方向末端反復ITRを含有する核酸である。いくつかの実施形態では、上記E3モジュールは、pVIIIのタンパク質コード領域の末端からそのゲノムの右側の末端に位置するITRまでの任意の公知のアデノウイルスの配列を含む図5に示されている通り。上記pVIIIコード領域は、配列番号135に記載のヒトAd5pVIIIタンパク質のアミノ酸6~43の少なくとも50個の連続したアミノ酸例えば、全てと少なくとも35例えば、50、60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または100の同一性を共有する配列を含有するタンパク質をコードする任意の遺伝子である図7J。上記E3モジュールは、L4pVIII例えば、少数の構造タンパク質をコードするE312.5K、E3CR1α例えば、アポトーシスをブロックするタンパク質をコードする、E3gp19K例えば、MHC-I抗原提示を阻害する免疫調節タンパク質をコードする、E3ADP例えば、ウイルスを放出するために細胞を効率的に溶解する機能を果たすタンパク質をコードする、E3RIDα例えば、アポトーシス促進性のFasLおよびTRAILを細胞表面から除去する免疫調節タンパク質をコードする、E3RIDβ-例えば、上記アポトーシス促進性のFasLおよびTRAILを細胞表面から除去する免疫調節タンパク質をコードする、E314.7K例えば、アポトーシスをブロックするタンパク質をコードする、およびL5IV線維例えば、ペントンベースから伸長し、受容体の結合性に関与する主要な構造タンパク質をコードするのコード領域をさらに含んでよい。いくつかの実施形態では、上記E3モジュールは天然に見いだされるアデノウイルスのE3領域または天然に見いだされるアデノウイルスのE3領域およびL5領域とほぼ同じサイズの長さである例えば、図5参照。E3-E4マクロモジュールとは、本明細書で使用される場合、アデノウイルスの逆方向末端反復ITRを含む核酸である。E-3-E4マクロモジュールは、pVIIIのタンパク質コード領域の末端からゲノムの右側の末端に位置するITRまでの任意の公知のアデノウイルスの配列をさらに含んでよい図5に示されている通り。上記E3-E4マクロモジュールは、E4orf6/7例えば、ウイルス転写のE2Fトランス活性化を媒介するタンパク質をコードする、E4orf6例えば、ウイルスDNAの合成を促進し、ウイルスの後期mRNAを安定化し輸出し、スプライシングを促進するタンパク質をコードする、E4orf4例えば、ウイルス転写およびスプライシングを制御し、PP2Aを調節するタンパク質をコードする、E4orf3例えば、p53媒介性転写を遮断し、MRNDNA-修復複合体を妨害し、コンカテマー化concatemerizationを防止するタンパク質をコードする、E4orf2、E4orf1例えば、PI3キナーゼを通じたシグナル伝達を促進し、それにより、タンパク質合成および細胞生存を導くタンパク質をコードする、L4pVIII例えば、少数の構造タンパク質をコードするE312.5K、E3CR1α例えば、アポトーシスを遮断するタンパク質をコードする、E3gp19K例えば、MHC-I抗原提示を阻害する免疫調節タンパク質をコードする、E3ADP例えば、ウイルスを放出するために細胞を効率的に溶解する機能を果たすタンパク質をコードする、E3RIDα例えば、上記アポトーシス促進性のFasLおよびTRAILを細胞表面から除去する免疫調節タンパク質をコードする、E3RIDβ-例えば、上記アポトーシス促進性のFasLおよびTRAILを細胞表面から除去する免疫調節タンパク質をコードする、E314.7K例えば、アポトーシスを遮断するタンパク質をコードする、およびL5IV線維例えば、上記ペントンベースから伸長し、受容体の結合に関与する主要な構造タンパク質をコードするのコード領域をさらに含んでよい。いくつかの実施形態では、アデノウイルス遺伝子モジュールのうちの1種または複数種は、上記アデノウイルス遺伝子モジュールが由来する天然の例えば、野生型アデノウイルスに見いだされるモジュールの配列と比較して、1つまたは複数の変異例えば、核酸の置換、付加または欠失を含む。例えば、本明細書において提供される核酸は、十分な数のアデノウイルス遺伝子モジュールを、特定の細胞の状態下で上記核酸を細胞にトランスフェクションすることにより、複製コンピテントなアデノウイルスが形成されるようにコードし得る。上記アデノウイルス遺伝子モジュールのうちの1種または複数種における変異により、生じるアデノウイルスを、一部の細胞例えば、癌細胞などの疾患細胞においては複製されるが、他の細胞例えば、健康な細胞などの非疾患細胞においては複製されないようにすることができる。上記変異は、1種または複数種のタンパク質コード領域の付加例えば、非ウイルスタンパク質コード領域などの1種または複数種の外因性タンパク質コード領域または異種タンパク質コード領域の付加も含んでよい。1種または複数種のタンパク質の付加により、追加的なウイルスの機能性、ウイルスの機能性の損失例えば、複製をもたらすこと、ウイルスを検出する方法例えば、蛍光マーカーをもたらすこと、ウイルスを精製する方法例えば、Hisタグを付けたカプシドタンパク質をもたらすこと、または、後でさらに使用するために単離および/または精製される対象のタンパク質を産生することができるウイルスもたらすことができる。したがって、上記変異により、ウイルスの機能を付加すること、またはウイルスの機能を減じることができる。したがって、本明細書において産生される組換えアデノウイルスは、外因性の例えば、異種性の核酸またはネイティブな核酸配列の変更を導入することによって改変されたアデノウイルスを含む。上記変更は、上記のアデノウイルス遺伝子モジュールのうちの1種または複数種における変異によるもの、またはネイティブなアデノウイルスゲノムに存在するアデノウイルス遺伝子モジュールのうちの1種または複数種の排除によるものであってよい。したがって、いくつかの実施形態では、上記核酸は、変異したアデノウイルス核酸配列を含む。アデノウイルス核酸配列は、天然のアデノウイルスまたはネイティブなアデノウイルス例えば、野生型に見いだされる配列である。上記変異したアデノウイルス核酸配列は、上記のアデノウイルス遺伝子モジュールのうちの1種または複数種における変異、または上記ネイティブなアデノウイルスゲノムに存在するアデノウイルス遺伝子モジュールのうちの1種または複数種の排除により生じ得る。ある特定の実施形態では、上記核酸は、欠失したアデノウイルス核酸配列、異所性のアデノウイルス核酸配列、または外因性例えば、異種性核酸配列例えば、非アデノウイルス遺伝子産物をコードするを含む。上記変異したアデノウイルス核酸配列は、機能性の変更を付与する変異したE4-ORF3遺伝子産物、変異したE1B-55K遺伝子産物、変異したアデノウイルス線維遺伝子産物、変異したウイルスコートタンパク質、プロドラッグ変換酵素、レポータータンパク質、変異したヘキソンタンパク質、pIXと融合したタンパク質、特定の細胞に対して毒性のタンパク質、上記核酸を得る型以外のアデノウイルス由来の完全な線維遺伝子もしくは部分的な線維遺伝子、および/または標的化タンパク質例えば、腫瘍標的化タンパク質または脈管構造標的化タンパク質を含んでよい。いくつかの実施形態では、上記核酸は上記E1モジュールを含む。上記核酸は、上記E1モジュールおよび上記E4モジュールの両方も含んでよい。ある特定の実施形態では、上記核酸は上記E1モジュールおよび上記E2-L2モジュールを含む。上記核酸は、上記E1モジュールおよび上記L3-L4モジュールも含んでよい。上記核酸は、上記E1モジュール、上記E2-L2モジュールおよび上記L3-L4モジュールも含んでよい。いくつかの実施形態では、上記方法は、E1モジュール、コアモジュール、E3モジュール、および/またはその派生体derivationもしくは構成成分から選択される少なくとも3種のアデノウイルス遺伝子モジュールから上記核酸を構築するステップを含む。関連する実施形態では、ヒトAd5の例では、上記方法は、E1モジュール、E2-L2モジュール、L3-L4モジュール、E3モジュール、およびE4モジュールから上記核酸を構築するステップを含む。ある特定の実施形態では、形成される上記核酸は、長さが少なくとも10kb、11kb、12kb、13kb、14kb、15kb、16kb、17kb、18kb、19kb、20kb、21kb、22kb、23kb、24kb、25kb、26kb、27kb、28kb、29kb、30kb、31kb、32kb、33kb、34kb、35kb、36kb、37kb、38kb、39kb、40kb、41kb、42kb、43kb、44kb、45kb、46kb、47kb、48kb、49kb、または50kbである。いくつかの実施形態では、形成される上記核酸は、長さが少なくとも10kb、11kb、12kb、13kb、14kb、15kb、16kb、17kb、18kb、19kb、20kb、21kb、22kbである。いくつかの実施形態では、形成される上記核酸は、長さが少なくとも10kb、11kb、12kb、13kb、14kb、15kbである。いくつかの実施形態では、形成される上記核酸は、長さが少なくとも10kb、11kb、12kbである。いくつかの実施形態では、形成される上記核酸は、長さが少なくとも12kbである。本明細書において提供される方法によって形成される上記核酸は、任意の発現可能な核酸であってよい。上記核酸を発現させてアデノウイルスを産生することができる。上記アデノウイルスは、感染性かつ/または自己複製可能例えば、複製コンピテントであり得る。いくつかの実施形態では、上記核酸はプラスミドである。いくつかの実施形態では、構築するステップは、上記アデノウイルス遺伝子モジュールまたはマクロモジュールを一緒に組み合わせて上記核酸を形成することを含み、ここで、上記アデノウイルスのモジュールまたはマクロモジュールの配向orientationが、細胞に導入した際の複製可能なアデノウイルスを形成する助けとなる例えば、上記細胞における上記ウイルスの発現または形成。したがって、いくつかの実施形態では、上記アデノウイルス遺伝子モジュール例えば、マクロモジュールは、配向特異様式で構築する。例えば、いわゆるゲートウェイ技術および/またはその配列およびライゲーション非依存的クローニング技術SLICを含めた任意の適用可能なクローニング技法を用いることができる。上記ゲートウェイ技術または同様の技術では、部位特異的組換えを用いて、核酸例えば、DNA断片を、1片の核酸から別の核酸に交換する。その最終結果は、デスティネーションベクターまたはプラスミドへの核酸配列の挿入である。これらの技術および方法は、本明細書では、集合的に部位特異的組換え法またはSSR法と称される。SSR法のそのような一適用では、DNA断片をエントリーベクターからデスティネーションベクターに移動させ、その結果、上記デスティネーションベクターの増殖が可能になる図9。エントリーベクターおよびデスティネーションベクターは、一般には、組換え部位を含有する。いくつかの実施形態では、エントリーベクターは組換えコンピテントである。他の実施形態では、エントリーベクターはハイブリダイゼーションコンピテントである。ハイブリダイゼーションコンピテントなエントリーベクターは、1種または複数種のアデノウイルス遺伝子モジュールを含有し得、それが酵素的な制限によってエントリーベクターから放出され得、それにより、上記アデノウイルス遺伝子モジュールが放出される。本明細書では、アデノウイルス遺伝子モジュールをデスティネーションベクターに挿入して上記核酸例えば、核酸プラスミドを形成するように、ゲートウェイ技術を適合させたSSR法が提供される。上記ゲートウェイ技術を用いる一般的な方法は、例えば、Soneら、JBiotechnol2008年9月10日;136巻3~4号:113~21頁;Hartleyら、GenomeRes2000年、10巻、1788~1795頁;およびSasakiら、JBiotechnol2004年、107巻、233~243頁に記載されている。例えば、SSR法を使用する場合、その構築は、組換えコンピテントなrecombinationcompetentデスティネーションベクター例えば、組換え部位核酸配列を含むデスティネーションベクターおよび上記アデノウイルス遺伝子モジュールのうちの1種または複数種を、インテグラーゼ例えば、ラムダファージインテグラーゼ、ラムダファージ切り出し酵素excisionase、または細菌宿主組み込み因子hostintegrationfactorと接触させ、それにより、アデノウイルス遺伝子モジュールベクターを形成することを含む。上記アデノウイルス遺伝子モジュールのうちの1種または複数種は組換えコンピテントなアデノウイルス遺伝子モジュール例えば、組換え部位核酸配列を含むアデノウイルス遺伝子モジュールである。いくつかの実施形態では、1種または複数種の組換えコンピテントなアデノウイルス遺伝子モジュールは、アデノウイルス遺伝子モジュールに組換え部位核酸配列を付加し、それにより、1種または複数種の組換えコンピテントなアデノウイルス遺伝子モジュールを形成することによって形成される。他の実施形態では、1種または複数種の上記組換えコンピテントなアデノウイルス遺伝子モジュールは、組換えコンピテントなエントリーベクターの一部である。いくつかの実施形態では上記アデノウイルス遺伝子モジュールを含有する、上記組換えコンピテントなエントリーベクターは、1種または複数種の組換えコンピテントなアデノウイルス遺伝子モジュールおよび組換えコンピテントなドナーベクターを、インテグラーゼと接触させ、それにより、上記アデノウイルス遺伝子モジュールのうちの1種または複数種を含有する、組換えコンピテントなエントリーベクターを形成することによって形成される。したがって、いくつかの実施形態では、組換えコンピテントなデスティネーションベクターおよび上記アデノウイルス遺伝子モジュールのうちの1種または複数種を含有する、1種または複数種の組換えコンピテントなエントリーベクターをインテグラーゼ活性と接触させ、それにより、アデノウイルス遺伝子モジュールベクターを形成する。図20~21には、ヒトAd5のために開発された、本明細書において提供される方法の実施形態が図示されている。上記構築するステップは、それぞれがアデノウイルス遺伝子モジュールを含有するデスティネーションベクターおよび1種または複数種のエントリーベクターを、ラムダファージインテグラーゼ、ラムダファージ切り出し酵素、または細菌宿主組み込み因子のいずれかの1つまたは複数と組み合わせ、それにより、アデノウイルス遺伝子モジュールベクターを形成するステップを含む。いくつかの実施形態では、上記エントリーベクターは、アデノウイルス遺伝子モジュールに組換え部位を付加し、その後、ドナーベクターおよび、ラムダファージインテグラーゼ、ラムダファージ切り出し酵素、または細菌宿主組み込み因子のいずれかの1つまたは複数と組み合わせ、それにより、アデノウイルス遺伝子モジュールエントリーベクターを形成することにより形成される。デスティネーションベクターは、上記アデノウイルス遺伝子モジュールが接合している核酸、例えば、プラスミドである。その接合は、上記デスティネーションベクター内に含まれることになる例えば、挿入される上記アデノウイルス遺伝子モジュールを含有する1種または複数種のエントリーベクターを交換することによるものであってよい。上記デスティネーションベクターには、上記組換えコンピテントなデスティネーションベクターおよび上記アデノウイルス遺伝子モジュールのうちの1種または複数種を、上記インテグラーゼ例えば、インテグラーゼ、切り出し酵素、および/または宿主組み込み因子と接触させる例えば、組み合わせる前に1種または複数種のアデノウイルス遺伝子モジュールを存在させていてよい。組換え部位核酸配列は、本明細書ではatt部位とも称され、2つの核酸の間のinvitro部位特異的組換えを容易にする核酸配列である。いくつかの実施形態では、上記組換え部位核酸配列の長さはおよそ21bpである。例えば、組換え部位核酸配列は、ゲートウェイリコンビナトリアルシグナル、例えば、図10に示されているものおよび/またはSoneら、JBiotechnol2008年9月10日;136巻3~4号:113~21頁;Hartleyら、GenomeRes2000年、10巻、1788~1795頁;およびSasakiら、JBiotechnol2004年、107巻、233~243頁に記載のものなどであってよい例えば、attB部位、attL部位、attR部位、attP部位、attBr部位、attPr部位など。いくつかの実施形態では、1種または複数種の上記組換えコンピテントなアデノウイルス遺伝子モジュールは、ドナーベクターの一部を形成するまたは、ドナーベクター内に存在する。上記ドナーベクターは、ゲートウェイ技術または同種のクローニング技術と適合するプラスミドであってよい。いくつかの実施形態では、DESTベクターは、異なる対抗選択カセットを含有する。対抗選択カセットは、ある特定の条件下で細菌細胞の成長を妨げる任意のDNA断片である。図22には、本明細書において提供される方法において使用されている種々の対抗選択カセットの効率が記載されている。図19には、マルチサイトゲートウェイ戦略を用いてAd5アデノウイルス遺伝子モジュールを再構築するための元となる計画が詳述されている。この特定の戦略は4種のエントリーベクターを組み合わせることを伴い、エントリーベクターのうちの3種がアデノウイルス遺伝子モジュールであり、4種目が無関係のスタッファーモジュールである。これらの4種のモジュールを組み合わせたら、上記スタッファーモジュールをゲートウェイ反応によって除去して新しいデスティネーションベクターを創製する。最後に、その残りの2種のアデノウイルス遺伝子モジュールを、ゲートウェイ反応によって挿入して完全な上記ウイルスゲノムにする。この元となる計画は、上記Ad5のE1モジュール由来の毒性の問題に加え、ゲートウェイ反応においてよりより大きなアデノウイルス遺伝子モジュールを使用した場合に非効率的であった。組み合わせ方法例えば、SLIC法およびSSR法により、上記モジュールからゲノムがより容易に構築された例えば、実施するステップがより少なく、各ステップの効率がよりよい。上記SLIC技術では、2つの核酸例えば、DNA断片におけるエキソヌクレアーゼにより生成された一本鎖核酸例えば、DNAオーバーハングに依拠することによって一本鎖相同配列をアニーリングすることを用いる図16。したがって、上記SLIC技術では、その挿入される核酸例えば、DNAおよびデスティネーションベクターにおけるエキソヌクレアーゼにより生成された一本鎖核酸例えば、DNAオーバーハングに依拠することによる相同組換えおよび一本鎖アニーリング例えば、ハイブリダイゼーションを用いる。本発明では、アデノウイルス遺伝子モジュールをデスティネーションベクターに挿入して上記核酸例えば、核酸プラスミドを形成するための、SLIC技術を適応させる方法が提供される。このプロセスは、本明細書では、AdSlicまたはAdSlicRとも称することができる。SLIC技術を用いた一般的な方法は、例えば、Liら、NatureMethods2007年、4巻、251~256頁に記載されている。図25には、ヒトAd5のために確立されたAdSlicRの例が図示されている。図26には、上記AdSlicR法における反応の効率が詳述されている。例えば、上記SLIC技術または同様のクローニング技術を用いる場合、その構築するステップは、一本鎖核酸例えば、DNAオーバーハングを有する例えば、各末端にハイブリダイゼーションコンピテントなデスティネーションベクター例えば、デスティネーションベクター例えば、線状ベクターを、上記アデノウイルス遺伝子モジュールのうちの1種または複数種にハイブリダイズ例えば、アニーリングさせ、それにより、アデノウイルス遺伝子モジュールベクターを形成するステップを含む。上記ハイブリダイゼーションコンピテントなデスティネーションベクターは、本明細書では、SLICコンピテントなベクターとも称することができる。上記アデノウイルス遺伝子モジュールのうちの1種または複数種は、ハイブリダイゼーションを容易にする例えば、ストリンジェントな条件下でために上記デスティネーションベクターの一本鎖核酸例えば、DNAオーバーハングに対して十分に相補的な少なくとも1つの一本鎖核酸例えば、DNAオーバーハング例えば、各末端にを有するハイブリダイゼーションコンピテントなアデノウイルス遺伝子モジュール例えば、アデノウイルス遺伝子モジュール例えば、線状のアデノウイルス遺伝子モジュールであってよい。いくつかの実施形態では、上記デスティネーションベクターオーバーハングおよび上記アデノウイルス遺伝子モジュールオーバーハングは、それぞれ長さ約20~25bpである。上記ハイブリダイゼーションコンピテントなデスティネーションベクターは、任意の適切な方法体系を用いて形成することができる。例えば、いくつかの実施形態では、上記デスティネーションベクターが環状例えば、プラスミドである場合、上記デスティネーションベクターを切断し例えば、エンドヌクレアーゼを用いて、それにより、線状デスティネーションベクターを形成する。次いで、上記線状デスティネーションベクターをエキソヌクレアーゼすなわち、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素、例えば、T4DNAポリメラーゼと接触させ、それにより、上記ハイブリダイゼーションコンピテントなデスティネーションベクターを形成する。同様に、上記ハイブリダイゼーションコンピテントなアデノウイルス遺伝子モジュールは、上記アデノウイルス遺伝子モジュールをエキソヌクレアーゼと接触させ例えば、処理し、それにより、ハイブリダイゼーションコンピテントなアデノウイルス遺伝子モジュールを形成することによって形成できる。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションコンピテントなデスティネーションベクターを、上記アデノウイルス遺伝子モジュールのうちの1種または複数種にハイブリダイズさせることは、上記ハイブリダイゼーションコンピテントなデスティネーションベクターおよび上記アデノウイルス遺伝子モジュール複数可をDNAポリメラーゼと組み合わせることを含んでよい。いくつかの実施形態では、上記アデノウイルス遺伝子モジュールが環状である、または環状プラスミド内に含有される場合、上記アデノウイルス遺伝子モジュールを、エキソヌクレアーゼ処理する前にエンドヌクレアーゼ処理することによって線形化する。したがって、いくつかの実施形態では、上記ハイブリダイゼーションコンピテントなアデノウイルス遺伝子モジュールのうちの1種または複数種を、1種または複数種のエントリーベクターアデノウイルス遺伝子モジュールを含むエントリーベクターをエンドヌクレアーゼと接触させ、それにより、放出された上記1種または複数種のエントリーベクターアデノウイルス遺伝子モジュールを形成することによって形成する。放出された1種または複数種のエントリーベクターアデノウイルス遺伝子モジュールをエキソヌクレアーゼと接触させ、それにより、1種または複数種のハイブリダイゼーションコンピテントなアデノウイルス遺伝子モジュールを形成することができる。本明細書で言及されるエントリーベクターアデノウイルス遺伝子モジュールは、エントリーベクターの一部であるアデノウイルス遺伝子モジュールである。本明細書で言及される放出されたエントリーベクターアデノウイルス遺伝子モジュールは、例えば、制限酵素によってエントリーベクターから放出されたアデノウイルス遺伝子モジュールである。いくつかの実施形態では、上記アデノウイルス遺伝子モジュールは、環状ではなく例えば、PCRまたは遺伝子合成によって得られる、エキソヌクレアーゼ処理する前の線形化を必要としない。いくつかの実施形態では、SLICコンピテントなベクターを上記アデノウイルス遺伝子モジュールのうちの1種または複数種にアニーリングさせるステップは、上記SLICコンピテントなベクターおよび上記アデノウイルス遺伝子モジュール複数可をDNAポリメラーゼと組み合わせるステップを含んでよい。いくつかの実施形態では、上記SLICコンピテントなベクターは、SLICコンピテントなアデノウイルス遺伝子モジュールとアニーリングさせる前に1種または複数種のアデノウイルス遺伝子モジュールを含有する。したがって、いくつかの実施形態では、複数のSLIC反応を逐次的に実施して、複数のアデノウイルス遺伝子モジュールを挿入する。いくつかの実施形態では、アデノウイルス遺伝子モジュールを生成するための鋳型として使用する、プラスミド内のアデノウイルスゲノムを得るために、SLICを用いて、プラスミド骨格にアデノウイルスゲノム全体を挿入することができる。いくつかの実施形態では、上記SLICコンピテントなアデノウイルスゲノムは、精製されたウイルスストックから得られる。図30には、そのようなプロセスの実施形態が図示されており、ヒトAd5についての例が提供される。上記アデノウイルス遺伝子モジュールベクターは、少なくとも1種のアデノウイルス遺伝子モジュールを有する核酸である。適切なクローニング技術を用いて、所望の数のアデノウイルス遺伝子モジュールを上記デスティネーションベクターに付加して上記アデノウイルス遺伝子モジュールベクターを形成する。例えば、一度形成したら、上記アデノウイルス遺伝子モジュール例えば、上記アデノウイルス遺伝子モジュールベクターは、上記適切なクローニング技術例えば、ゲートウェイクローニング技術および/またはSLICクローニング技術を用いてさらに改変して、さらなるアデノウイルス遺伝子モジュールを付加し、それにより、上記核酸を形成させ、上記核酸を発現させて例えば、細胞において、アデノウイルス例えば、複製可能なアデノウイルスを形成することができる。したがって、いくつかの実施形態では、第1のアデノウイルス遺伝子モジュールを、上記適切なクローニング技法を用いてさらに改変して、その第2のアデノウイルスのモジュール、第3のアデノウイルスのモジュールおよび/または第4のアデノウイルスのモジュールを形成し、第2のアデノウイルス遺伝子モジュール、第3のアデノウイルス遺伝子モジュールおよび/または第4のアデノウイルス遺伝子モジュールをそれぞれ上記ベクターに付加し、それにより、上記核酸を形成させ、上記核酸を発現させてアデノウイルス例えば、複製可能なアデノウイルスを形成することができる。したがって、いくつかの実施形態では、上記核酸は、アデノウイルス遺伝子モジュールベクターである。実際に、異なるクローニング技術を用いて、上記核酸またはアデノウイルス遺伝子モジュールベクターを構築することができる。いくつかの実施形態では、上記構築は、ハイブリダイゼーションコンピテントなデスティネーションベクターを、第1のアデノウイルス遺伝子モジュールにハイブリダイズ例えば、アニーリングさせ、それにより、第1のアデノウイルス遺伝子モジュールベクターを形成することを含む。上記第1のアデノウイルス遺伝子モジュールは、ハイブリダイゼーションコンピテントなアデノウイルス遺伝子モジュールであってよい。上記第1のアデノウイルス遺伝子モジュールベクターおよび第2のアデノウイルス遺伝子モジュールエントリーベクターを、インテグラーゼ例えば、インテグラーゼ、切り出し酵素、または組込み宿主因子と接触させ例えば、組み合わせ、それにより、第2のアデノウイルス遺伝子モジュールベクターを形成することができる。上記第2のアデノウイルス遺伝子モジュールベクターは、組換えコンピテントな第2のアデノウイルス遺伝子モジュールベクター例えば、デスティネーションベクターであってよく、上記第2のアデノウイルス遺伝子モジュールは、組換えコンピテントな第2のアデノウイルス遺伝子モジュールであってよい。いくつかの実施形態では、上記第1のアデノウイルス遺伝子モジュールは、上記E2-L2モジュール、上記L3-L4モジュール、または上記E2-L4マクロモジュールである。上記第2のアデノウイルス遺伝子モジュールは、上記E1モジュール、上記E3モジュール、または上記E4モジュールであってよい。上記アデノウイルス遺伝子モジュールを構築するための、組み合わせてクローニングする方法の例は図20~21において提供され、そこではSLICとゲートウェイが組み合わされている。他の実施形態では、上記構築は、組換えコンピテントなデスティネーションベクターおよび第1のアデノウイルス遺伝子モジュールを、インテグラーゼ例えば、インテグラーゼ、切り出し酵素、または組込み宿主因子と例えば、その存在下で接触させ例えば、組み合わせ、それにより、第1のアデノウイルス遺伝子モジュールベクターを形成するステップを含む。上記第1のアデノウイルス遺伝子モジュールは、組換えコンピテントな第1のアデノウイルス遺伝子モジュール例えば、エントリーベクターである。上記第1のアデノウイルス遺伝子モジュールベクターを第2のアデノウイルス遺伝子モジュールにハイブリダイズさせ、それにより、第2のアデノウイルス遺伝子モジュールベクターを形成する。上記第1のアデノウイルス遺伝子モジュールベクターは、ハイブリダイゼーションコンピテントなアデノウイルス遺伝子モジュールベクター例えば、デスティネーションベクターである。上記第2のアデノウイルス遺伝子モジュールは、ハイブリダイゼーションコンピテントなアデノウイルス遺伝子モジュール例えば、エントリーベクターである。いくつかの実施形態では、上記第2のアデノウイルス遺伝子モジュールは、上記E2-L2モジュール、上記L3-L4モジュール、または上記E2-L4マクロモジュールである。上記第1のアデノウイルス遺伝子モジュールは、上記E1モジュール、上記E3モジュール、または上記E4モジュールであってよい。いくつかの実施形態では例えば、ヒトAd5の例、上記E2-L2モジュールおよび上記L3-L4モジュールは、それぞれおよそ14kbおよび10kbである。本明細書において提供される発見の1つは、上記E2-L2モジュールおよびL3-L4モジュールのサイズが、いくつかの実施形態では、標準のクローニング技術またはゲートウェイ例えば、マルチサイトゲートウェイクローニング技術を用いて効率的に上記核酸へと構築するためには大きすぎることである。図15に例が提供されている。したがって、いくつかの実施形態では、SLICクローニング技術または同様のクローニング技術を用いて、これらのモジュールをデスティネーションベクター例えば、エントリーベクターに挿入する。例えば、ゲートウェイクローニング技術を用いて、他のアデノウイルス遺伝子モジュールを付加することができる。したがって、いくつかの実施形態では、上記E2-L2モジュールおよび上記L3-L4モジュールを上記核酸に構築する場合、SLICとゲートウェイ例えば、マルチサイトゲートウェイクローニング戦略の組み合わせを用いて上記核酸を構築することが好ましい。SLICとゲートウェイ例えば、マルチサイトゲートウェイクローニング戦略の組み合わせの特定の実施形態は図20~21に記載されている。本明細書において提供される方法の特定の実施形態は、高速かつ効率的なアデノウイルスゲノム構築物の構築を提供する。いくつかの場合では、上記アデノウイルスゲノム構築物は、10時間かかからずに、9時間かかからずに、8時間かかからずに、7時間かかからずに、6時間かかからずに、5時間かかからずに、4時間かかからずに、3時間かかからずに、2時間かかからずに、または1時間かかからずに構築される。さらに、本明細書において提供される方法により、ベクターにアデノウイルス断片を挿入すること、個々のベクターに容易かつ独立した変異誘発を行なうこと、および/または、invitroにおいて多部位特異的に構築することが可能になる。いくつかの実施形態では、上記アデノウイルス遺伝子モジュールの1種または全種を、下記の組換えアデノウイルス遺伝子モジュールのライブラリーから選択することができる。したがって、上記Adsemblyプロセスのある特定の実施形態により、アデノウイルス遺伝子モジュールの最適な組み合わせに基づいてカスタマイズされたアデノウイルスの機能性を高速に最適化することを可能にすることによって、そこでは、多種多様な組換えアデノウイルスを急速かつ効率的に構築することが可能になる。それにより、当該方法により、種々のアデノウイルス血清型由来の部分を混合し、調和させるmatchingことによって新規のアデノウイルス血清型のキメラを創製することができるようになる。これにより、各血清型の独特の性質を与える組み合わせだけでなく、上記血清型の種々の向性の利用、および、優勢な血清型に対する既存の免疫を潜在的に回避するためのそれらの使用が可能になる。本明細書において提供される方法の特定の実施形態は、限られた制限酵素部位クローニング技術に依存することを回避する。当該方法では、アデノウイルス血清型5のみに依存することを回避することも可能にし得る。実際に、ヒトAd5の例では、上記E1モジュール、上記E2-L2モジュール、上記L3-L4モジュール、上記E3モジュール、および上記E4モジュールの5種類全てを使用する場合、変異体の選択肢は、従来公知の方法よりも実質的に増加する。ある特定の実施形態では、本明細書において提供される方法により、上記ゲノム内の化合物の変化を同時に創製することが可能になる。当該方法では、多くの場合、数ヶ月かかり得る、特殊化した細菌株または哺乳動物の細胞培養物例えば、MAGICにおける非効率的な相同組換えのみに依拠する従来公知のゲノム構築を回避することも可能にし得る。さらに、本明細書において提供される方法の特定の実施形態は、一般に利用可能な試薬を用い、特殊化した細菌例えば、ccdB抵抗性細菌を使用しない簡単なプロトコールを提供する。本明細書において提供される方法およびライブラリーの有用性としては、例えば、以下があげられる:1遺伝子機能を解析するためのアデノウイルス遺伝子の変異誘発。2アデノウイルス遺伝子機能が損失することにより、通常の細胞において複製することができなくなるが、それらの機能が補完される腫瘍細胞において選択的な溶解性複製を行う、アデノウイルスの変異体。3複製欠損ベクターまたは複製コンピテントなウイルスいずれかとしての標的化遺伝子の発現。4当該方法により、遺伝子を発現させるための新規の複製欠損アデノウイルスを提供することができる。この目的のために、本明細書の方法を用いて構築されたアデノウイルスを最適化することができる。ヒトAd5の場合では、E1モジュールのライブラリーは、例えば、いくつかのE1A欠失モジュールまたはE1B欠失モジュールを含んでよく、かつ/または、それぞれが、異なる哺乳動物プロモーターを含有し、それにより、その使用者が、対象の遺伝子を発現させるための最良のプロモーターを選択することが可能になる。5上記アデノウイルスゲノムの既存の転写構築様式を利用した多重遺伝子発現。いくつかの実施形態では、上記E1モジュール、上記E2-L2モジュール、上記L3-L4モジュール、上記E3モジュール、および上記E4モジュールのそれぞれを使用する場合、上記E4モジュールにのみその変異が存在しない。上記E1モジュール、上記E2-L2モジュール、上記L3-L4モジュール、上記E3モジュール、上記E4モジュールおよびそのマクロモジュールは、任意の適切なアデノウイルスから任意の適切な方法例えば、PCR技法または遺伝子合成を用いて誘導することができる。例えば、精製したウイルスから得たウイルスゲノムDNAからのPCRを使用することができる図14。図13には、上記ヒトAd5アデノウイルス遺伝子モジュールについて得られたPCR効率が詳述されている。いくつかの実施形態では、上記E1モジュール、上記E2-L2モジュール、上記L3-L4モジュール、上記E3モジュール、および上記E4モジュールの組み合わせが完全な、または実質的に完全なアデノウイルスゲノムを構築する、またはそのマクロモジュールが完全な、または実質的に完全なアデノウイルスゲノムを構築する。本明細書において提供される教義を用いて、当業者は、上記モジュール間の切断部位breakの正確な位置を決定することができる。例えば、バイオインフォマティクスの手法を用いて、組換え部位核酸配列例えば、ゲートウェイ組換えシグナルまたはゲートウェイ組換え部位の最適な挿入部位を決定することができる。いくつかのアデノウイルス血清型をアラインメントすることができ、アデノウイルス遺伝子モジュール間のゲノム領域を保存について分析することができる。いくつかの実施形態では、血清型間のヌクレオチドの保存は回避されるが縮重領域は許容される挿入部位である。例えば、ヒトAd5における組換え部位核酸配列の挿入部位の特定の適切な位置は、図12、図35、図36、図37および図38において矢印で示されている。いくつかの実施形態では、アデノウイルス遺伝子モジュール間の配列は短い場合があり、そのため、配列を重複させることが必要である。図12に例が提供されており、そこでは、上記Ad5線維ポリAと上記E4ポリAの間の配列が短いので、Ad5配列の27bpの重複をattB部位の挿入と一緒に挿入した。いくつかの実施形態では、上記核酸例えば、アデノウイルス遺伝子モジュールベクターは、1つまたは複数の組換え部位核酸配列を含む。図35~39に、組換えアデノウイルス内の、組換え部位核酸配列の核酸配列の位置がその組換えアデノウイルスの成長速度にどのように影響するかについての、決して限定するものではない例が開示されている。したがって、いくつかの実施形態では、1つまたは複数の組換え部位核酸配列例えば、att部位を含む組換えアデノウイルスの成長が、1つまたは複数の組換え部位核酸配列を欠く組換えアデノウイルスよりも遅くなり得る。他の実施形態では、1つまたは複数の組換え部位核酸配列例えば、att部位を含む組換えアデノウイルスは、少なくとも、1つまたは複数の組換え部位核酸配列を欠く組換えアデノウイルスと同じ速さで成長し得る。他の実施形態では、上記核酸例えば、アデノウイルス遺伝子モジュールベクターは、上記E3モジュールと上記E4モジュールの間の組換え部位核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記E3モジュールと上記E4モジュールの間の組換え部位核酸配列は、attB3組換え部位核酸配列である。いくつかの実施形態では、上記核酸例えば、アデノウイルス遺伝子モジュールベクターは、配列番号137に記載のヌクレオチド32904またはそのホモログ内の同等のヌクレオチドの後に組換え部位核酸配列を含む。他の実施形態では、上記核酸例えば、アデノウイルス遺伝子モジュールベクターは、上記E1モジュールと上記E2-L2モジュールの間の組換え部位核酸配列を含む。他の実施形態では、上記核酸例えば、アデノウイルス遺伝子モジュールベクターは、配列番号137に記載のヌクレオチド4035またはそのホモログ内の同等のヌクレオチドの後に組換え部位核酸配列を含む。他の実施形態では、上記核酸例えば、アデノウイルス遺伝子モジュールベクターは、配列番号137に記載のヌクレオチド3608またはそのホモログ内の同等のヌクレオチドの後に組換え部位核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記核酸例えば、アデノウイルス遺伝子モジュールベクターは、上記L3-L4モジュールと上記E3モジュールの間の組換え部位核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記L3-L4モジュールと上記E3モジュールの間の組換え部位核酸配列は、attB5組換え部位核酸配列である。他の実施形態では、上記核酸例えば、アデノウイルス遺伝子モジュールベクターは、上記E1モジュールと上記E2モジュールの間の第1の組換え部位核酸配列、上記L3-L4モジュールと上記E3モジュールの間の第2の組換え部位核酸配列および上記E3モジュールと上記E4モジュールの間の第3の組換え部位核酸配列を含む。他の実施形態では、上記第1の組換え部位核酸配列は、配列番号137に記載のヌクレオチド4035またはそのホモログ内の同等のヌクレオチドの後の核酸に含まれ、上記第3の組換え部位核酸配列は、配列番号137に記載のヌクレオチド32904またはそのホモログ内の同等のヌクレオチドの後の核酸に含まれる。上記Ad5ゲノム配列番号137への4種の挿入を示す、実行した挿入戦略の1つの例が以下に列挙されている。その数字は、上記組換え部位核酸配列を挿入するための挿入部位が位置する、公開された上記Ad5ゲノム配列内のヌクレオチドの位置を示す。下記の実施例では、上記attB配列すなわち、上記組換え部位核酸配列に下線が引かれており、最終の挿入のためのAd5配列内の重複が太字になっている。同様の内容の適切かつ/または同等の挿入部位または相同なウイルス配列は当業者にはすぐに理解される。図21の構築戦略を17回用いて、感染性のヒトAd5ウイルスを得る。図24には、本明細書において提供される方法の効率が詳述されている。4つの別々の場合において、野生型のAdsemblyされたアデノウイルスを細胞にトランスフェクトし、ウイルスを産生させた。さらに、このプロトコールにより、13種の変異体アデノウイルスが生成し、その全てが感染性ウイルスを産生する。図27では、そのトランスフェクションで再構築された野生型Ad5の、単一のプラークとして、および同様に293細胞を通過させた画像が提供される。図20~21および図25の戦略で産生したウイルスを、図28に示されている通り、293細胞における複製の有効性について試験した。別の態様では、本明細書に開示されている方法により作製したアデノウイルスが提供される。いくつかの実施形態では、上記アデノウイルスは複製コンピテントである。別の実施形態では、上記アデノウイルスは複製コンピテントではない。II.アデノウイルス遺伝子モジュールおよびマクロモジュールライブラリー別の態様では、複数のアデノウイルス遺伝子モジュール例えば、マクロモジュールを含むライブラリーが提供される。いくつかの実施形態では、上記ライブラリーは、複数の異なるE1モジュールを含む。他の実施形態では、上記ライブラリーは、複数の異なるE2-L2モジュールを含む。他の実施形態では、上記ライブラリーは、複数の異なるL3-L4モジュールを含む。他の実施形態では、上記ライブラリーは、複数の異なるE3モジュールを含む。他の実施形態では、上記ライブラリーは、複数の異なるE4モジュールを含む。他の実施形態では、上記ライブラリーは、複数の異なるコアマクロモジュールを含む。いくつかの実施形態では、上記の方法に従って上記アデノウイルスゲノムライブラリーを調製する。他の実施形態では、上記ライブラリーは、複数の異なるE1モジュール、複数の異なるE2-L2モジュール、複数の異なるL3-L4モジュール、複数の異なるE3モジュール、複数の異なるE4モジュール、および/または複数の異なるコアマクロモジュールを含む。いくつかの実施形態では、上記ライブラリーは、複数の異なるマクロモジュールを含み、そのマクロモジュールは複数の異なるE1-L2マクロモジュール、複数の異なるE2-L4マクロモジュールすなわち、コアマクロモジュールおよび/または複数の異なるE3-E4マクロモジュールを含む。いくつかの実施形態では、上記複数の異なるアデノウイルス遺伝子モジュールおよび/またはマクロモジュールは、それらが、異なる種類のアデノウイルス例えば、異なる種または異なる血清型に由来するという点で異なる。例えば、いくつかの実施形態では、上記複数の異なるE1モジュール、上記複数の異なるE2-L2モジュール、上記複数の異なるL3-L4モジュール、上記複数の異なるE3モジュール、上記複数の異なるE4モジュール、および/または上記複数の異なるマクロモジュール例えば、コアマクロモジュールは、複数のアデノウイルスの型例えば、2種以上のヒトアデノウイルス血清型由来のアデノウイルス遺伝子モジュールを含む。いくつかの実施形態では、上記複数の異なるアデノウイルス遺伝子モジュールおよび/またはマクロモジュールは、それらが、異なる変異体モジュールまたはマクロモジュール例えば、欠失しているアデノウイルス核酸配列、置換されたアデノウイルス核酸配列、異所性のアデノウイルス核酸配列、または非アデノウイルス遺伝子産物をコードする核酸配列をコードするという点で異なる。例えば、上記ライブラリーは、欠失したアデノウイルス核酸配列、変異したアデノウイルス核酸配列、異所性のアデノウイルス核酸配列、または非アデノウイルス遺伝子産物をコードする核酸配列を含む複数の異なるE1モジュール、複数の異なるE2-L2モジュール、複数の異なるL3-L4モジュール、複数の異なるE3モジュール、複数の異なるE4モジュール、または複数の異なるマクロモジュール例えば、コアマクロモジュールを含んでよい。いくつかの実施形態では、上記複数の異なるアデノウイルス遺伝子モジュールおよび/またはマクロモジュールは組換えコンピテントである例えば、エントリーベクター内に含有される。例えば、上記ライブラリーは、組換えコンピテントである、複数の異なるE1モジュール、複数の異なるE2-L2モジュール、複数の異なるL3-L4モジュール、複数の異なるE3モジュール、複数の異なるE4モジュール、および/または複数の異なるE2-L4マクロモジュールを含んでよい。いくつかの実施形態では、上記複数の異なるアデノウイルス遺伝子モジュールおよび/またはマクロモジュールはハイブリダイゼーションコンピテント例えば、線形化後などのSLICコンピテントである。例えば、いくつかの実施形態では、上記ライブラリーは、ハイブリダイゼーションコンピテントである、複数の異なるE1モジュール、複数の異なるE2-L2モジュール、複数の異なるL3-L4モジュール、複数の異なるE3モジュール、複数の異なるE4モジュール、および/または複数の異なるE2-L4マクロモジュールを含む。本明細書において提供されるライブラリーの部分は、異なる使用者が創製し、異なる使用者間で共有することができる。種々のアデノウイルス遺伝子モジュールを混合し、調和させて、所望の機能性を有するかまたは機能性が欠乏した新規のアデノウイルスの構築物を確立することができる。したがって、本明細書における当該方法およびライブラリーにより、種々のアデノウイルス血清型由来の部分を混合し、調和させることによって新規のアデノウイルス血清型のキメラを創製することができるようになる。アデノウイルス遺伝子モジュールのライブラリーにより、使用者に、その理想的なアデノウイルスベクターを確立するための複数の選択肢がもたらされる。いくつかの実施形態では、アデノウイルス遺伝子モジュールは、細菌に対して毒性であり得る。例えば、図18には、ヒトAd5のE1モジュールの毒性が実証されている。いくつかの実施形態では、アデノウイルス遺伝子モジュールは、より少ないコピー数例えば、p15A複製開始点で維持されるプラスミド内に含有されることを必要とする場合がある。いくつかの実施形態では、アデノウイルス遺伝子モジュールの毒性、サイズ、または他の因子により、SSR法例えば、ゲートウェイ反応におけるそれらの使用が妨げられる可能性がある。例えば、図15には、5種のヒトAd5アデノウイルス遺伝子モジュールについての標準のゲートウェイBP反応効率が詳述されている。いくつかの実施形態では、SSR法例えば、ゲートウェイ反応を用いると効率的でないアデノウイルス遺伝子モジュールを、代替のクローニング方法例えば、SLICによって操作することができる。図17には、エントリーベクターを創製するために、SSR法の代わりにSLICを用いる戦略例えば、ゲートウェイクローニング酵素を用いるが図示されている。III.キット別の態様では、本明細書において提供される方法およびライブラリーにおいて使用するための、E1モジュール、E2-L2モジュール、L3-L4モジュール、E3モジュール、E4モジュール、またはアデノウイルスマクロモジュールまたは下記のその変異体から選択される2種以上のアデノウイルス遺伝子モジュールを含む核酸を含むキットが提供される。上記キットの適切な構成成分は、上のセクションIおよび/またはIIに記載されている組成物および構成成分を含む。例えば、いくつかの実施形態では、キットは、E1モジュール、E2-L2モジュール、L3-L4モジュール、E3モジュール、E4モジュールまたはアデノウイルスマクロモジュールから選択される3種、4種または5種のアデノウイルス遺伝子モジュールを含む核酸を含んでよい。上記核酸は、上記の通り、ベクター例えば、プラスミドの一部を形成し得る例えば、デスティネーションベクターまたはドナーベクター。一部の態様では、本明細書において提供されるキットは、アデノウイルス遺伝子モジュールを有するベクターまたは有さないベクターを含んでよい。上記キットにおいて有用なベクターとしては、1つまたは複数の組換え部位核酸配列および/または一本鎖核酸オーバーハングまたは適切な酵素と接触すると一本鎖核酸オーバーハングを形成することができる核酸配列を挙げることができる。いくつかの実施形態では、上記ベクターは、上記の通り、ハイブリダイゼーションコンピテントなデスティネーションベクター、SLICコンピテントなベクターまたはドナーベクターである。上記ベクターは、1種または複数種のアデノウイルス遺伝子モジュールを含んでよい。いくつかの実施形態では、上記ベクターは、対抗選択カセットを含む。本明細書において提供される方法を実施するためのキットの追加的な構成成分は、Adsembly法およびライブラリーについての本記載を考慮すると容易に明らかになる例えば、エキソヌクレアーゼ、インテグラーゼ、プロモーター配列など。IV.実施例以下の実施例は、例示のために提供されるが、特許請求された発明を限定するものではない。A.ウイルスを構築する方法1.次世代のウイルスベクターおよび、反復溶解がん療法を開発するために化学的性質を組み合わせることおよびウイルスゲノムを組換えること本発明者らは、複数の改変および異種性エレメントを系統的に組み合わせることを可能にする、構成要素の部分からウイルスゲノムを急速に新規に構築するための組換え戦略の使用を開発した。いくつかの適用におけるアデノウイルスベクターの潜在性は、工学的に作製し、複数の遺伝子改変を急速かつ系統的に組み合わせる能力により妨げられている。使用されている主要な方法は、大部分が、そのゲノム内の適切な位置における独特の適切な制限酵素部位の利用可能性に依存し、系統的な使用または正確な化合物の改変を急速な単一のステップで創製することには一般に受け入れられていない。大きなゲノムDNA断片を操作すること、および独特の制限部位が不足していることにより、これは技術的に困難になり、限定される。別の方法には、改変しようとするゲノム領域を伴うより小さなシャトルベクター、および上記ウイルスゲノムを伴うバックボーンベクターを生成することが必要である。これらのベクターに対する主要な律速ステップは組換えであり、哺乳動物の細胞における相同組換えによって非常に低頻度の事象、ランダムな部位で起こり、所望の組換え体を単離するために複数回のプラーク精製を必要とするか、または、特別な細菌株における相同組換えのいずれかによって生じる。これらの方法は限定されている。現行の技術の制限を克服するために、本発明者らは、複合ウイルス変異体を一晩で急速かつ系統的に生成することを可能にする新規のアデノウイルスゲノム構築戦略を開発した。これにより、哺乳動物細胞における非効率的かつ不正確な組換え、利用可能なBACまたはシャトルベクターの必要性、時間がかかり骨の折れるプラーク精製がなくなる。この戦略により、1ウイルス遺伝子に対する複数の変異/改変、2他のウイルスサブタイプ由来の遺伝子、例えば、異なる受容体に結合し血清型を切り換える、ウイルスコートタンパク質、3異所性の遺伝子、例えば、強力な腫瘍バイスタンダー効果を誘導するためのプロドラッグ変換酵素、4invivoにおける画像診断および診断学のための蛍光レポーターまたは蛍光タグの付加、および5invitroにおける定方向のウイルス進化、を含む新規のウイルスゲノムをinvitroにおいて構成要素の部分から急速に構築することができるようになる。さらに、この技術では、天然のウイルス転写構築様式を利用し、これは、ヒトAd5については、36遺伝子スプライスバリアントは含まないをコードし、したがって多タンパク質複合体および全体の経路を構築し、アデノウイルスの感染を介して送達し、共発現させることができる。Ad2/5および現在の方法論の制限を克服するために、本発明者らは、ゲノム構成要素の部分および異種性エレメントから、アデノウイルスゲノムをinvitroで急速に新規に構築することを可能にするAdsembly法を開発した。バイオインフォマティクスの手法を用いて、本発明者らは、異なるアデノウイルスゲノム36~38kbを、進化的に保存された配列、転写モジュールおよび機能的モジュールに基づいて5単位に分割した。これらの5単位はそれぞれ、工学的に作製した変異または異種性エレメントによってその機能および多様性が変更され、異なるアデノウイルス血清型、変異体および種由来の同等の単位を付加することによってさらに拡大したゲノムを確立する部分ライブラリーに適合する区画を含む。独特の性質を有する新しいアデノウイルスを創製するために、上記ライブラリーから上記各単位の各々のうちの1つを選択し、Adsembly例えば、Ad-SlicRを用いてinvitroで完全なゲノムに急速に再構築する。Adsemblyを用いて、多部位特異的組換えによって、トランスフェクションするとプラスミド骨格から自己除去され、複製して新規のウイルスを産生する新規のゲノムを構築することができる。Ad-SlicRは、より強力なウイルス複製必要であればおよび臨床使用のために、挿入された組換え配列を消去するために用いることができる戦略である。本明細書に開示されている戦略では、Ad2/5に対する異なる向性および他の望ましい特性を有する、または機能性が変更されるように遺伝子改変されたヒトおよび/または動物のアデノウイルスから創製されたライブラリーゲノムの基本要素を使用することができる。これを実現するために、ゲートウェイとしても公知の、特異性および効率が改善された改変λファージ部位特異的組換え系を利用する。attB、attP、attL、およびattRと称される4つのクラスの組換え部位が存在し、これらは別個のファージ酵素により組み換えられる。最近、複数のDNA断片を定義済みの順序および配向で同時に組換えることを可能にする新規のatt部位特異性が同定された。本明細書には、新規のウイルスゲノム全体をゲノムの構成要素の部分から構築するための、この系の新規の適用が開示されている。目ざましいことに、この技術により、アデノウイルスベクターの開発および潜在的な適用が改革される。attB部位1~6の番号を付けたの独特の対を組み入れたプライマーのセットを使用して、一致した隣接する群においてウイルスゲノムを増幅する。上記Ad5アデノウイルスゲノムは36kbであり、時間的に初期E転写単位および後期L転写単位に分けられ、それらは36~40遺伝子を共にコードする。野生型Ad5/2、Ad5/2の変異体および異なるアデノウイルスサブタイプまたは動物ウイルスをDNA鋳型として使用する。PCR断片をエントリーベクターへと組み換えて、上記アデノウイルスゲノムの構成エレメントのライブラリーを生成する。デスティネーションベクターへのLR組換えにより、個々のエレメントの複数の順列を、新規のウイルスゲノムへと構築する図1B。これは、デスティネーションベクターの抗生物質耐性に対する陽性選択、および毒性遺伝子であるccdBによってもたらされるE.coliにおける未反応のデスティネーションベクターの陰性選択によって容易になるHartleyら、2000年。断片の数またはサイズにより組換え効率が限定される場合、第2のBP/LR反応においてモジュラーの置き換えまたは完全な構築が起こる中間のデスティネーションベクターを創製する。ウイルスDNA操作のこの急速かつ新規の方法は、DNA組換えの本質的な化学的性質を利用することによって、新規のウイルスの工学的作製を変容させる。追加的な組み合わせ、例えば、CD46細胞受容体に結合し、Ad2/5ウイルスに対して産生される中和抗体から逃れるアデノウイルス34線維を組み込む。2.材料および方法上記の手引きを使用して、以下の参照構成成分を用いて改変アデノウイルスを作製した。ゲートウェイDONRベクターを使用した。ヒトAd5の例では、PCRによって上記E1モジュールを得、SLICを用いてベクターpDONRP1P4に挿入した。attL1組換え部位およびattL4組換え部位を含むpDONRP1P4ベクターの骨格を、PCRを使用して増幅し、SLICによってAd5のE1モジュールと組み合わせた。代替の対抗選択カセットを生成するために、ベクターpDONRP1P4を改変した。attP1組換え部位およびattP4組換え部位を含むこのベクター骨格を、PCRを使用して増幅し、PheSA294G変異およびテトラサイクリン抵抗性カセットpENTRL3-pLac-Tet-L2由来のpLac-Tetカセットと組み合わせて、新しいDONRベクターを創製した。次いで、新しいDONRベクター由来のattR1-PheSA294G-Tetr-attR4断片をPCRによって増幅し、AdsemblyDESTベクターに挿入した。MultiSiteGateway登録商標ProPlus、カタログ番号12537-100;およびSone、TらJBiotechnol2008年9月10日;136巻3~4号:113~21頁を参照されたい。ヒトAd5の例では、E3モジュールをゲートウェイBP反応によってpDONRP5P3rベクターに挿入した。上記E4モジュールをゲートウェイBP反応によってpDONRP3P2ベクターに挿入した。pDONRP5P2ベクター由来のattR5-ccdB-Cmr-attR2断片をPCRによって増幅し、AdsemblyDESTベクターに挿入した。MultiSiteGateway登録商標ProPlus、カタログ番号12537~100;およびSone、TらJBiotechnol2008年9月10日;136巻3~4号:113~21頁を参照されたい。上記AdsemblyDESTベクターのベクター骨格は、3種の異なる供給源由来の部分で構成される。AmprカセットおよびlacZ遺伝子をプラスミドpUC19から増幅した。これを、BioBricksiGEM2007年のパーツ配布の一部である、プラスミドpSB3K5-I52002から入手したp15A複製開始点と組み合わせた。E1毒性を低下させるために、プラスミドをより少ないコピー数10~12で維持するp15Aoriが必要である。最後に、自己除去性ウイルスを創製するために、上記酵素I-SceIに対する哺乳動物発現カセットについて、プラスミドpAdZ5-CV5-E3からPCRを行なった。このカセットを上記ベクターの骨格にクローニングして、p15A-SceIと称されるベクターを創製した。これは、ゲノム構築を開始するために使用するベクターである。ヒトAd5の例では、その遺伝子モジュールは、全て、野生型Ad5ウイルスから精製したDNAまたはプラスミドpAd/CMV/V5/DESTInvitrogenのいずれかから得た。上記DESTベクターに関して、ヒトAd5の例では、上記E2モジュールおよび上記L3モジュールをプラスミドp15A-SceIに3断片SLICによって挿入した。attR5部位およびattR2部位が隣接するccdBおよびChlorrを発現している対抗選択マーカーを、プラスミドpDONRP5P2からPCRによって得た。その第2の対抗選択マーカーPheS-Tetを、ベクターpDONRP1P4PheSA294G-TetからPCRによって得た上記を参照されたい。上記DESTベクターを創製するために上記E2モジュールおよび上記L4モジュールの末端に工学的に作製した独特の制限酵素で切断した後、p15A-SceIE2-L4の右側ccdB/Cmおよび左側PheS/Tetに2つの対抗選択マーカーをSLICによって挿入した。アデノウイルス遺伝子モジュールを含有するマルチサイトゲートウェイエントリーベクターに関して、ヒトAd5の例では、上記E1モジュールをpDONRP1P4にSLICによって挿入した。上記E3モジュールをpDONRP5P3RにゲートウェイBP反応によって挿入した。上記E4モジュールをpDONRP3P2にゲートウェイBP反応によって挿入した。Amprカセット:プラスミドpUC19に関しては、p15Aori:プラスミドpSB3K5-I52002は、BioBricksiGEMの2007年パーツ配布の一部であった。上記アデノウイルス遺伝子モジュールに関しては、Ad5粒子から精製したDNA、またはプラスミドpAd/CMV/V5/DESTInvitrogenのいずれか。DONRベクターpDONRP1P4、P5P2、P5P3R、P3P2は、JonChesnutInvitrogenから入手した。PheS遺伝子は、DH5アルファ細菌ゲノムDNAから得、その後、クイックチェンジによって変異させてPheSA294G変異体を創製した。Tetr遺伝子に関しては、プラスミドpENTRL3-pLac-Tet-L2をJonChesnutInvitrogenから入手した。上記Adsembly法の実施形態に関しては、一般には2つの対抗選択カセットが隣接するコアモジュールを含有する二重DESTベクター20fmolを、遺伝子モジュールを含有する残りのエントリーベクターのそれぞれ10fmolと組み合わせる。Ad5の例では、これは、E2-L3二重DESTベクター20fmolを、E1モジュールエントリーベクター、E3モジュールエントリーベクター、およびE4モジュールエントリーベクターのそれぞれ10fmolと組み合わせることを含む。いくつかの場合では、上記エントリーベクターのうちの1種または複数種の量が増加することにより効率が上昇し得る例えば、Ad5について上記E1モジュールエントリーベクター50fmolを使用する。これらのベクターを、最終の体積10μl中2μlのLRClonaseIIInvitrogenと組み合わせる。その反応物を25°Cで一晩インキュベートする12~16時間。その反応を、プロテイナーゼKInvitrogen1μlを添加することによって停止させ、37°Cで10分インキュベートする。次いで、上記反応物5μlを、ccdB遺伝子産物に対して感受性である高コンピテンス細菌>1×109cfu/μgに形質転換し、YEG-Cl寒天プレートKast、PGene、138巻1994年109~114頁に記載の通り;PheSA294G対抗選択を用いる場合または上記ベクターにおいて使用する対抗選択のための他の適切な培地に播いた。その後、コロニーを単離し、完全なゲノムについてスクリーニングする。PCRに関しては、全てのPCRを、Phusion酵素NEBを使用して実施した。Ad5からアデノウイルス遺伝子ADENOVIRALGENEモジュールを得るためのPCRは、1×HF緩衝液、各dNTP200μM、各プライマー0.5μM、および鋳型10ngを用いて実施した。上記E2-L2モジュールについては、3のDMSOも加えた。鋳型は、プラスミドpAd/PL-DESTInvitrogen;E2-L2モジュール、L3-L4モジュール、およびE4モジュールについてまたはAd5ゲノムDNAE1モジュールおよびE3モジュールについてであった。PCR条件は以下の通りであった。E2-L2およびL3-L4:98°Cで30秒間-98°Cで10秒間、65°Cで30秒間2サイクルごとに温度を1°C低下、72°Cで7分間を10サイクル-98°Cで10秒間、60°Cで30秒間、72°Cで8分間を29サイクル-72°Cで10分間-4°Cで保持。E3:98°Cで30秒間-98°Cで10秒間、70°Cで30秒間サイクルごとに温度を0.5°C低下、72°Cで2分30秒間を10サイクル-98°Cで10秒間、68°Cで30秒間、72°Cで2分30秒間を25サイクル-72°Cで10分間-4°Cで保持。E4:98°Cで30秒間-98°Cで10秒間、63°Cで30秒間サイクルごとに温度を0.5°C低下、72°Cで2分間を6サイクル-98°Cで10秒間、60°Cで30秒間、72°Cで2分間を29サイクル-72°Cで5分間-4°Cで保持。精製されたウイルスからウイルスゲノムDNAを得ることに関して、精製されたウイルス最大100μlを、10mMのトリス、pH8、5mMのEDTA、200mMのNaCl、および0.2のSDSを含有する溶解緩衝液300μlに加える。混合物を60°Cで5分間インキュベートし、その後、プロテイナーゼKストック約20mg/mL5μlを加え、60°Cで1時間さらにインキュベートする。次いで、試料を氷上に5分間置き、その後15K×gで15分間回転させる。上清を取り出し、等体積のイソプロパノールに加え、よく混合し、4°C、15K×gで15分間回転させる。ペレットを70エタノールで洗浄し、4°Cで15分間、再度回転させる。そのペレットを乾燥させ、使用するために再懸濁させる。SLICに関しては、線状の断片を、以下の反応物20μl中、室温で20分間エキソヌクレアーゼ処理する:50mMのトリス、pH8、10mMのMgCl2、50μg/mLのBSA、200mMの尿素、5mMのDTT、および0.5μlのT4DNAポリメラーゼ。その反応を、0.5MのEDTAを1μl添加することによって停止させ、その後75°Cで20分間インキュベートする。次いで、等量のT4処理したDNAを混合して新しいチューブ中の体積をおよそ20μlにする。2断片を組み合わせるSLICのために各反応物10μlを使用する。3断片を組み合わせるSLICのために各反応物7μlを使用する。断片を、10分間65°Cまで加熱することによってアニーリングさせ、その後、その温度を5秒ごとに0.5°C低下させて25°Cに至るまでゆっくり冷却する。アニーリング後、上記反応物5μlを形質転換し、クローンをスクリーニングする。AdSlicRに関しては、Ad5の例について、3断片SLIC反応を、100ngのT4処理したp15A-SceIPCRにより線形化する、ならびに上記E2モジュールおよび上記L3モジュールのそれぞれ300ngそれらのそれぞれのエントリーベクターからPCRによって得られるを使用して実施する。これにより、ベクターp15A-SceIE2-L4が創製される。5μgのp15A-SceIE2-L4をSwaIで切断し、QiagenQiaexIIを使用してゲル精製する。上記E3モジュールおよびE4モジュールを、それらのそれぞれのエントリーベクターからPCRによって得る。線形化されたベクターのそれぞれ450ngおよびPCR産物200ngをT4DNAポリメラーゼで処理し、SLICを、ベクター150~200ngおよび約100ngの各モジュールPCRを用いて通常通り実施する。陽性のクローンを単離した後、新しいベクター5μgをPacIで切断し、ゲル精製し、次いで、新しいSLIC反応物中、E1のPCR産物T4処理した100ngと組み合わせる。これによりゲノム構築が完了し、上記プラスミドについて、ウイルスを再構成するためにトランスフェクトする状態にある。B.改変アデノウイルスアデノウイルスは、遺伝子移入の適用のために頻繁に使用される。例えば、アデノウイルスは、遺伝子治療のために、培養物中の細胞に、invivoで動物組織に、またはinvivoでヒト細胞に、導入遺伝子を送達するために使用される。アデノウイルスのこのような使用における1つの限定因子は遺伝子発現が一過性であることである。アデノウイルスは非組み込み型のウイルスであり、したがって、細胞分裂に際して上記導入遺伝子の発現は失われる。組み込み型の他のウイルスの系、例えば、レトロウイルスおよびレンチウイルスが、これらの同じ遺伝子移入の目的で使用される。しかし、これらの天然で組み込み型であるウイルスは小さく、したがって、発現させることができる導入遺伝子の量が限られ、高力価まで成長させることが難しく、それから複数の導入遺伝子を発現させることが難しく、また、ゲノム内のランダムな位置に組み込まれる。PhiC31インテグラーゼにより、約280bpのattB配列を含有する外来の環状DNAの、宿主細胞の染色体の偽性attP部位として公知の特定の位置への組み込みが媒介され得ることが実証されている。このプロセスは、環状プラスミドDNAを用いて実証されているが、アデノウイルスなどのウイルスを用いては実証されておらず、これはおそらくアデノウイルスゲノムが線状であり、したがって、組み込まれないか、または組み込みにより染色体の破壊が生じることに起因する。ここで本発明者らは、形質導入すると、上記ゲノムの一部がloxP部位のcre媒介性組換えによって環状になり、したがって、PhiC31インテグラーゼ/attBを介した標的化組み込みが可能になるように組換えアデノウイルスゲノムが創製される系を提供する。この技術のために、上記アデノウイルスゲノムをいくつかのやり方で改変する図31~33を参照されたい。まず、複数の導入遺伝子の発現を可能にするために上記E1領域およびE3領域を欠失させる。上記E4領域を、creリコンビナーゼおよび上記PhiC31インテグラーゼを発現しているカセットで置き換える。これらの酵素の発現は、tet反応性プロモーターまたは他の同様の調節可能なエレメントを用いて制御する。そのゲノム内に2つのloxP部位を配置し、1つは上記導入遺伝子が発現するE1領域の左端に、2つ目は線維と上記E4領域の間に配置する。したがって、これらの2つのloxP部位の間にある全てのものが細胞の染色体に挿入される。最後に、PhiC31attB部位を上記E3領域に配置するが、この短い配列の特定の配置は、それが上記loxP部位の間にある限りは、他の位置にあってもよい本実施例では、上記creリコンビナーゼおよびPhiC31インテグラーゼを、上記loxP部位および導入遺伝子を含有する同じアデノウイルスから発現させるが、これらの酵素を別々のウイルスから発現させることもできる。上記アデノウイルスを細胞に形質導入すると、上記creリコンビナーゼおよびPhiC31インテグラーゼが誘導される。creにより、上記アデノウイルスゲノム内のloxP部位の組換えが容易になる。これにより、上記loxP部位の間に位置するDNAの環状化が導かれる。次いで、これにより、上記インテグラーゼが断片内のattB部位を用いて環状の断片を細胞の染色体に組み換えることが可能になる図33参照。その最終結果は、上記アデノウイルスゲノムの選択された部分が、その宿主細胞の染色体に、限られた数の位置の1つにおいて安定に非可逆的に組み込まれることである。この組み込みにより上記導入遺伝子が安定に発現される。そのプロセスにおいて1上記E1領域を欠失させ、2上記ウイルスゲノムの末端を欠失させているので、アデノウイルスが複製または再活性化する危険性はない。これらの領域はどちらも、ウイルスの転写および複製に必要である。既存のレトロウイルス系およびレンチウイルス系に対するこの系の利点としては、1ランダムではなく、ゲノム内の限られた数の位置に組み込まれること、2導入遺伝子を発現させるためのサイズの許容度が増すこと、3線維の改変により、上記アデノウイルスを特定の細胞または組織に再標的化することができること図39~42または他のアデノウイルス血清型および種を使用すること図45、4Adsembly系を用いた操作が容易であること、5高力価のウイルスを産生することが容易であること、および6単一のベクターからの多重遺伝子発現が容易であることが挙げられる。この系は、現在のPhiC31組み込み技術LifeTechnologiesにより、製品のJump-Inとして販売されたよりも、ウイルス媒介性DNA送達の使用により進歩している。既存の技術はプラスミドベースのみであり、したがって、効率的にトランスフェクトまたは電気穿孔することができる細胞に限られる。それに加えて、既存の技術は、特定のトランスジェニックマウスを創製しない限りinvivoにおいて用いることができない。アデノウイルスは、invivoで導入遺伝子を送達するために常套的に使用され、したがって、これにより既存の技術の能力が著しく拡大される。1つの具体化は、力価決定が可能で標的化された特定の組織への改変アデノウイルスの送達による、多重遺伝子発現カセットを用いてのマウスモデルの創製である。別の具体化は、標的化ノックインするためのatt部位を含有するマウス系統である。別の具体化は、iPSについてである。C.Adsemblyを用いた、完全に野生型に近いアデノウイルス5型の創製以下の戦略を用い、Adsemblyを用いて、野生型に近い型versionのAd5を構築した。ゲートウェイ対抗選択カセットが隣接する野生型コア配列を、野生型Ad5のE1モジュール、野生型Ad5のE3モジュール、および野生型Ad5のE4モジュールと混合した図21。完全に構築されたゲノムを含有するクローン単離し、293細胞にトランスフェクトした。7日後にプラークが明らかとなった。そのウイルスを回収し、さらなる293細胞において増大させた。成長分析により、この野生型に近いウイルス真の野生型ウイルスと比較して3種のattB挿入を含有するが真の野生型ウイルスよりもほんのわずかだけ低下した力価まで成長したことが明らかになった図28。D.複製欠損性であり、GFPを発現し、代替の血清型由来の線維タンパク質を含有する変異体Ad5の創製本発明者らは、Adsemblyを用いて変異体Ad5を創製した。上記Ad5のE1モジュールを、そのE1A領域およびE1B領域が欠失し、したがって、この新しいベクターを用いて作製されるウイルスのいずれにも複製欠損するように変化させた。E1AおよびE1Bを除去した後、CMVIEプロモーターおよびGFP遺伝子を含有する哺乳動物の発現カセットを挿入した。上記Ad5のE3モジュールを、上記Ad5の線維遺伝子がAd34由来の線維遺伝子で置き換えられるように変化させた。これらの変異体E1線維モジュールおよびE3-線維モジュールを、標準のAdsembly反応において、野生型Ad5のE4モジュールおよびゲートウェイ対抗選択カセットが隣接する野生型Ad5のコアモジュールと組み合わせた図21。完全に構築されたゲノムである生じたクローンを単離し、293細胞にトランスフェクトした。7日後にプラークが明らかとなった。そのウイルスを回収し、さらなる293細胞において増大させた。このウイルスの成長により、この戦略が、Ad5バックグラウンドにおける1導入遺伝子の発現、2蛍光遺伝子の発現、3複製欠損ウイルスの構築、4キメラアデノウイルスの創製、および5代替の線維の発現のために使用することができることが示される。E.AdSlicRを用いた複製コンピテントなAd5の創製。AdSlicRを用いて、アデノウイルス遺伝子モジュールから野生型Ad5を構築した。野生型E3モジュールおよびE4モジュールは、それらのアデノウイルス遺伝子モジュールベクターからPCRによって得た。これらを、標準のSLIC反応において、SwaIで切断した野生型Ad5のコアモジュールと組み合わせた図25。上記E3モジュールおよびE4モジュールを伴うコアモジュールを首尾よく含有したクローンを単離し、PacIで切断した。次いで、これを、第2のSLIC反応において、アデノウイルス遺伝子モジュールベクターからPCRによって得た野生型Ad5のE1モジュールと組み合わせた。完全に構築されたゲノムを含有するクローンを単離し、293細胞にトランスフェクトした。7日目までにプラークが明らかとなった。生じたウイルスを、さらなる293細胞において増大させた。このウイルスの成長分析により、このウイルスが野生型Ad5と同じ力価まで成長することが明らかになった図28。V.表表1~9には、本明細書において提供される方法を用いて調製したアデノウイルス遺伝子モジュールベクター、デスティネーションベクターおよびエントリーベクターの例が開示されている。