"リンゴ抽出物を有効成分とするプロテアソーム活性化剤。リンゴ抽出物が、リンゴ由来のポリフェノールを含む、請求項1に記載のプロテアソーム活性化剤。リンゴ抽出物が、リンゴ幼果の抽出物である請求項1または2記載のプロテアソーム活性化剤。リンゴ抽出物を有効成分とする酸化カルボニルタンパク抑制剤。リンゴ抽出物が、リンゴ由来のポリフェノールを含む、請求項4に記載の酸化カルボニルタンパク抑制剤。リンゴ抽出物が、リンゴ幼果の抽出物である請求項4または5記載の酸化カルボニルタンパク抑制剤。本発明は、異常タンパクを除去するプロテアソームを活性化するプロテアソーム活性化剤を提供することを目的とする。リンゴ抽出物に着目して試験した結果、リンゴポリフェノールにプロテアソーム活性化作用及び酸化カルボニルタンパク抑制作用があることを知見したことに基づき、本発明を提案する。すなわち、本発明は、1リンゴ抽出物を有効成分とするプロテアソーム活性化剤。2リンゴ抽出物が、リンゴ由来のポリフェノールを含む、1に記載のプロテアソーム活性化剤。3リンゴ抽出物が、リンゴ幼果の抽出物である1または2に記載のプロテアソーム活性化剤。4リンゴ抽出物を有効成分とする酸化カルボニルタンパク抑制剤。5リンゴ抽出物が、リンゴ由来のポリフェノールを含む、4に記載の酸化カルボニルタンパク抑制剤。6リンゴ抽出物が、リンゴ幼果の抽出物である4または5に記載の酸化カルボニルタンパク抑制剤。本発明は、プロテアソーム活性を増強し、さらに、酸化カルボニルタンパクの生成を抑制する剤である。本発明のリンゴ抽出物は、紫外線に暴露されるとプロテアソームを活性化し、また、酸化カルボニルタンパク質の生成を抑制することから、紫外線暴露により生じた異常タンパク質が蓄積することにより生じる白内障、皮膚がん、皮膚におけるしわやしみなどの予防又は改善することができる。本発明のプロテアソーム活性化剤及び酸化カルボニルタンパク抑制剤は、リンゴ抽出物を有効成分とし、前記リンゴ抽出物が、リンゴ果実の抽出物であることが好ましい。特に、リンゴ幼果抽出物に含まれるポリフェノールを、主成分とすることが好ましい。リンゴ抽出物には、ポリフェノール、有機酸、アミノ酸などが含まれることが知られている。リンゴ抽出物は、血管機能改善作用を高めることが可能なBNP調節剤として該抽出物を有効成分として含有してなるBNP調節剤、血行促進剤特開2007-008837号公報、特開2006-265220号公報や飲料特開2004-305087号公報、化粧料配合剤特開2001-187724号公報、消臭剤成分特開平11-319051号公報、香料成分特開平08-023939号公報などに用いられることが知られている。しかしながら、リンゴ抽出物およびリンゴ由来のポリフェノールについて、プロテアソーム活性化機能があることは知られていない。以下に、本発明のプロテアソーム活性化剤について、詳細に説明する。本発明のプロテアソーム活性化剤は、ポリユビキチン化異常タンパク質を分解する酵素であるプロテアソームの活性化剤であって、リンゴ抽出物を有効成分とすることを特徴とする。リンゴ抽出物において、リンゴMaluspumilaの品種は、例えば、ふじ、国光、王林、紅玉、ジョナゴールド、デリシャス、さんさ、千秋などが挙げられ、特に制限されない。リンゴの抽出部位は、特に制限されず、例えば、果実、葉、幹、花などが挙げられ、好ましくは、果実である。前記果実は、例えば、未熟果幼果でも良く、完熟果でも良く、特に制限されない。抽出に用いる前記果実の部位は、特に制限されず、例えば、全果、果肉、果皮、種などが挙げられる。リンゴ抽出物は、これらの部位を、単独で、または2種以上組み合わせて抽出しても良い。リンゴ抽出物を抽出する方法は、特に制限されず、従来公知の方法を採用できる。抽出方法の具体例としては、例えば、以下のようであっても良い。まず、リンゴの全果を、水洗後、グラインダーなどにより粉砕する。この粉砕物を、ペクチナーゼ処理に供し、遠心分離後、抽出溶媒により分配ろ過して、リンゴ抽出物を調製しても良い。前記ペクチナーゼ処理としては、特に制限されないが、例えば、20~60°Cの温度条件化で、ペクチナーゼを10~50ppm添加して行っても良い。抽出溶媒としては、特に制限されないが、例えば、ヘキサン、クロロホルムなどの有機溶媒が挙げられる。本発明において、リンゴ抽出物は、例えば、市販のリンゴ抽出物を用いても良く、リンゴ果実から抽出して調製しても良く、特に制限されない。本発明のプロテアソーム活性化剤及び酸化カルボニルタンパク抑制剤は、リンゴ由来のポリフェノールを含むリンゴ抽出物が好ましい。ポリフェノールの分画方法は、特に制限されず、従来公知の方法を採用できる。ポリフェノールは、例えば、リンゴ抽出物をカラムに通液後、カラムの吸着物を溶出し、この溶出画分を減圧留去濃縮して分画しても良い。また、さらに、この濃縮液に粉末助剤を添加し、凍結乾燥または噴霧乾燥して、ポリフェノール粉末を調製しても良い。本発明において、ポリフェノールは、例えば、市販のリンゴ由来のポリフェノール含有物を用いても良く、リンゴ果実から抽出および分画して調製しても良く、特に制限されない。本発明のプロテアソーム活性化剤は、紫外線暴露により発生した活性酸素により産生された細胞内の変性タンパク質異常タンパク質を分解するプロテアーゼを活性化し、紫外線暴露による細胞傷害を抑制することにより、白内障、皮膚癌、皮膚におけるしわやしみなどの様々な疾患を予防及び改善することができる。また、酸化カルボニルタンパク抑制剤は、紫外線照射による酸化カルボニルタンパク質の生成を抑制することができる。1試料及び正常ヒト皮膚線維芽細胞の培養リンゴ抽出物試料リンゴ抽出物としては、アップルフェノンSHアサヒフードアンドヘルスケア、総ポリフェノールUV法98以上Appl’in清田産業、総ポリフェノールUV法80以上ポマクティブHFVユニテックフーズ、総ポリフェノールUV法90以上をサンプルとし、5ウシ胎児血清FBS及び1ジメチルスルホキシドDMSO含有ダルベッコ改変イーグル培地DMEM、GIBCO社製に添加し、評価検体であるリンゴ抽出物含有液を作製した。[正常ヒト皮膚線維芽細胞の培養]新生児由来正常ヒト皮膚線維芽細胞NHFB、三光純薬を線維芽細胞用培地FBM、三光純薬で37°C-5CO2インキュベーターにて培養した。FBMにヒト線維芽細胞増殖因子1μg/ml、インシュリン5mg/ml、ゲンタマイシン50μg/ml、アンフォテリシンB50μg/mlを添加して継代培養に用いた。本実験には集団倍加数populationdoublinglevel:PDLがPDL20~40の若い細胞を紫外線B波照射の試験に使用し、PDL40~60の老化した細胞を紫外線A波照射の試験に使用した。トリプシン処理で剥がした線維芽細胞の細胞数をコールターカウンターで計測し、200000cellsmlの細胞密度になるように調整した。2細胞培養と紫外線照射[リンゴ抽出物含有液の紫外線B波傷害]PDL20~40の若い細胞を6ウェル平底プレートに105個/ウェルの細胞密度で播種し、24時間培養した。紫外線照射前に、前記リンゴ抽出物含有液の最終濃度が10μgmlとなるように添加し、24h培養した。培養液を廃棄し、細胞をHank’s-液ハンクス緩衝塩類溶液、Ca2、Mg2非含有で洗浄後、再度Hank’s-液を添加し、プレートに蓋をしない状態でUVBを2.5Wm2で3分間照射した50mJ/cm2。対照として、UVBを照射しない群の細胞も作製した。照射終了後、直ちにHank’s-液を評価検体であるリンゴ抽出物を10μgml含有する5FBS及び1DMSO含有DMEMに置換し、24h培養した。[リンゴ抽出物含有液の紫外線A波傷害]PDL40~60の老化した細胞を6ウェル平底プレートに105個/ウェルの細胞密度で播種し、24時間培養した。紫外線照射前に、前記リンゴ抽出物含有液の最終濃度が10μgmlとなるように添加し、24h培養した。培養液を廃棄し、細胞をHank’s-液で洗浄後、再度Hank’s-液を添加し、プレートに蓋をしない状態でUVAを30Wm2で1.5時間照射した15J/cm2。対照として、UVAを照射しない群の細胞も作製した。照射終了後、直ちにHank’s液を評価検体であるリンゴ抽出物を10μgml含有する5FBS及び1DMSO含有DMEMに置換し、24h培養した。以後のプロテアソーム活性測定操作は紫外線B波および紫外線A波を照射した試験で共通している。3細胞懸濁液回収、プロテアソーム活性溶液調整、タンパク濃度の測定培養液を除去しPBS-で各ウェルを洗浄後、各ウェルにトリプシンEDTASigmaを800μl添加し、37°Cで5分間処理して線維芽細胞をディッシュ底面から剥離させ、10FBS含有DMEM15mlでトリプシン反応を終止した。溶液と一部底着したままの細胞についてはスクレーパー処理で細胞を15ml容遠沈管に回収した。1,500rpm5minの条件で遠沈して培養液を除去、PBS-で洗浄し再び1,500rpm5minの条件で遠沈してDMEM中の色素フェノールレッドを完全に除去した。この細胞塊をホモジナイズBuffer300μlに懸濁させた。その後、氷冷中でホモジナイズ処理UD-201超音波破砕装置、TOMY製を使用、条件はOUTPUT1、DUTY40、15secを2setした。ホモジナイズ溶液を1.5ml容エッペンチューブに全量移し、15000rpmで10min遠心分離して上清をプロテアソーム活性溶液として回収した。このプロテアソーム活性溶液について、Bradford法に準拠してBSAウシ血清アルブミン、SIGMA社製換算で全タンパク量を求めた。発色試薬はBio-Radproteinassay脱イオン水で5倍希釈を用いた。平板96ウェルプレートに、プロテアソーム活性溶液/BSA溶媒:ホモジナイズBuffer10μlBio-Radproteinassay脱イオン水で5倍希釈200μlを加えて10min室温にてプレートごとに撹拌反応した。吸光度590nmをプレートリーダーで計測し、BSA溶液で作成した検量線について全タンパク濃度を求めた。4プロテアソーム活性の測定トリプシン様プロテアソーム活性測定用基質Boc-Leu-Arg-Arg-MCAt-ブチルオキシカルボニル-L-ロイシル-L-アルギニル-L-アルギニル-4-メチル-クマリル-7-アミドペプチド研究所、キモトリプシン様プロテアソーム活性測定用基質Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCAキモトリプシン様プロテアソーム活性を測定するための基質として、サクシニル-L-ロイシル-L-ロイシル-L-バリル-L-チロシル-4-メチル-クマリル-7-アミドペプチド研究所ペプチド研究所、をそれぞれ10mM溶媒、DMSOで調整し、30μlずつを分注して-20°C冷凍保存した。使用時に解凍し600μlの反応液で希釈して使用した。蛍光分析用平板96ウェルプレートに以下の溶液をそれぞれ加えた。1基質ペプチドトリプシン様/キモトリプシン様10.5μl蛍光分析時の基質ペプチド濃度23.8μM2反応液100mMトリス塩酸、1mMDTT、5mMMgCl2、pH8.025μl310mMATP含有ホモジナイズBuffer19.5μl蛍光分析時のATP濃度は0.975mM4プロテアソーム活性サンプルcelllysate20μl37°Cで1h撹拌反応した。反応終了後に、510SDS反応停止液25μl6100mMトリス塩酸pH9.0100μl全量200μlwellとして、プロテアソームによって基質ペプチドから遊離した7-アミノ-4-メチルクマリンMCA由来の蛍光強度励起波長Ex380nm、蛍光波長Em440nmを測定した。5データ処理蛍光強度/タンパク濃度で算出されるプロテアソーム活性について、UV-のコントロール群を基準1.00とし、平均値で他の各群と比較した。遊離した7-アミノ-4-メチルクマリンの蛍光強度を励起波長Ex380nm、吸収波長Em440nmで測定した。結果はリンゴ抽出物含有液を各濃度で処理した3試料の測定値から、平均±標準偏差を計算し、グラフ化した。統計解析は多重比較検討としてDunnetttestvsUVAorUVBコントロール群p0.01p0.05を行った。また、p値が0.05<p<0.1を有意傾向として表記した。[紫外線B波照射時のプロテアソーム活性]PDL26の若い状態の線維芽細胞を用いて、リンゴ抽出物のプロテアソーム活性化評価を行った。試験群1紫外線B波非照射コントロール群試験群2紫外線B波照射コントロール群試験群3紫外線B波照射10μg/mlアップルフェノンSH添加試験群4紫外線B波照射10μg/mlAppl’in添加試験群5紫外線B波照射10μg/mlポマクティブHFV添加図1に紫外線B波照射時のトリプシン様プロテアソーム活性を、表1にDunnetttestの結果を示す。紫外線B波照射条件時のトリプシン様活性では、試験群2の紫外線B波照射群が試験群1の紫外線B波未照射群p値0.0465に対してプロテアソーム活性が低下していた。また、試験群4p値0.0256および試験群5p値0.0169が、試験群2に対して有意にプロテアソームが活性化したことから、リンゴ抽出物であるAppl’in及びポマクティブHFVは、若い状態の線維芽細胞のトリプシン様プロテアソームを活性化することが分かった。図2に紫外線B照射時のキモトリプシン様プロテアソーム活性を、表2にDunnetttestの結果を示す。紫外線B照射時のキモトリプシン様活性では、試験群2の紫外線B波照射群が試験群1の紫外線B波未照射群p値0.000734に対してプロテアソーム活性が低下していた。また、試験群3p値0.000739、試験群4p値0.0000255および試験群5p値0.0000511のいずれもが試験群2の紫外線B波照射群に対して有意にプロテアソームが活性化したことから、リンゴ抽出物であるアップルフェノンSH、Appl’in及びポマクティブHFVは、若い状態の線維芽細胞のキモトリプシン様プロテアソームを活性化することが分かった。[紫外線A波照射時のプロテアソーム活性]PDL50の老化した状態の線維芽細胞を用いて、リンゴ抽出物のプロテアソーム活性化評価を行った。試験群1紫外線A波非照射コントロール群試験群2紫外線A波照射コントロール群試験群3紫外線A波照射10μg/mlアップルフェノンSH添加試験群4紫外線A波照射10μg/mlAppl’in添加試験群5紫外線A波照射10μg/mlポマクティブHFV添加図3に紫外線A照射時のトリプシン様プロテアソーム活性を、表3にDunnetttestの結果を示す。紫外線A波照射条件時のトリプシン様活性では、試験群2の紫外線A波照射群が試験群1の紫外線A波未照射群p値0.0137に対してプロテアソーム活性が低下していた。また、試験群3は試験群2の紫外線A波照射群に対して有意p値0.0347にプロテアソ-ム活性が上がった。また、試験群4は有意傾向p=0.0937でプロテアソームが活性化した。このことから、リンゴ抽出物であるアップルフェノンSH、Appl’inは、老化した状態の線維芽細胞のトリプシン様プロテアソームを活性化することが分かった。図4に紫外線A照射時のキモトリプシン様プロテアソーム活性を、表4にDunnetttestの結果を示す。紫外線A照射時のキモトリプシン様活性では、試験群2の紫外線A波照射群が試験群1の紫外線A波未照射群p値0.0681、有意傾向に対してプロテアソーム活性が低下していた。また、試験群3は試験群2の紫外線A波照射群に対して有意p値0.00370にプロテアソ-ム活性が上がった。また、試験群4も有意p=0.0120でプロテアソームが活性化した。このことから、リンゴ抽出物であるアップルフェノンSH、Appl’inは、老化した状態の線維芽細胞のキモトリプシン様プロテアソームを活性化することが分かった。以上の結果から、リンゴ抽出物には線維芽細胞の状態若い或いは老化を問わず、細胞内のプロテアソームを活性化させるという顕著な機能を有することが分かった。[酸化カルボニルタンパクの測定]1タンパク濃度0.1~0.4μg/μlの範囲で凍結保存していた線維芽細胞由来のサンプルを自然解凍後にトリクロロ酢酸TCA処理してタンパク沈殿し、20μgタンパク重量に相当するサンプルを用意した。そのサンプルについて、カルボニル化蛋白質測定キット日研ザイル製で酸化カルボニルタンパク量を定量した。具体的には、前処理したサンプル、スタンダード、コントロール、各200μlをウェルに分注し、プレートをシールして、4°C一晩反応させた。EIAバッファー300μlウェルにて5回洗浄後に、全てのウェルに希釈済みブロッキング試薬を250μlウェル分注し、室温にて30分インキュベート後にEIAバッファー300μlウェルにて5回洗浄、そして、ビオチン標識抗DNP抗体を200μl分注し、37°Cにて1時間インキュベートした。EIAバッファー300μlウェルにて5回洗浄、希釈済みHRP標識ストレプトアビジンを200μl分注し、室温にて1時間インキュベートした。EIAバッファー300μlウェルにて5回洗浄、発色液を200μlウェル分注し、室温にて各ウェルでの反応時間が5分になるよう調整し、反応停止液を100μlウェル分注し、反応を停止させた。マイクロプレートリーダーで450nmの吸光度を測定した。2データ処理反応生成物であるp-ニトロアニリン由来の吸光度450nmを測定し、カルボニル化蛋白質測定キットに付属している標準カルボニルタンパクで作成した検量線に対する各サンプルのカルボニル化タンパクを測定した。紫外線A波照射時のAppl’in添加による酸化カルボニル抑制PDL50の老化した状態の線維芽細胞を用いて評価した。試験群1紫外線A波非照射コントロール群試験群2紫外線A波照射コントロール群試験群3紫外線A波照射10μg/mlAppl’in添加図5に紫外線A照射時の酸化カルボニル量を、表5にDunnetttestの結果を示す。紫外線A照射時の酸化カルボニル量は、試験群2の紫外線A波照射群が試験群1の紫外線A波未照射群p値0.000645に対して増加していた。また、試験群3の10μg/mlAppl’in添加群が試験群2の紫外線A波照射群に対して有意p値0.00720に酸化カルボニルを抑制していた。紫外線B波照射時のAppl’in添加による酸化カルボニル抑制PDL26の若い状態の線維芽細胞を用いて評価した。試験群1紫外線B波非照射コントロール群試験群2紫外線B波照射コントロール群試験群3紫外線B波照射10μg/mlAppl’in添加図6に紫外線B照射時の酸化カルボニル量を、表6にDunnetttestの結果を示す。紫外線B照射時の酸化カルボニル量は、試験群2の紫外線B波照射群が試験群1の紫外線B波未照射群p値0.000214に対して増加していた。また、試験群3の10μg/mlAppl’in添加群が試験群2の紫外線B波照射群に対して有意p値0.00192に酸化カルボニルを抑制していた。紫外線A照射時におけるポマクティブHFVの酸化カルボニルタンパク抑制PDL54の老化した線維芽細胞を用いて評価した。試験群1紫外線A波非照射コントロール群試験群2紫外線A波照射コントロール群試験群3紫外線A波照射10μg/mlポマクティブHFV添加図7に紫外線A波照射時の酸化カルボニル量を、表7にDunnetttestの結果を示す。紫外線A照射時の酸化カルボニル量は、試験群2の紫外線A波照射群が試験群1の紫外線A波未照射群p値0.00230に対して増加していた。また、試験群3の10μg/mlポマクティブHFV添加群が試験群2の紫外線A波照射群に対して有意p値0.00151に酸化カルボニルを抑制していた。紫外線B照射時におけるポマクティブHFVの酸化カルボニルタンパク抑制PDL27の若い線維芽細胞を用いて評価した。試験群1紫外線B波非照射コントロール群試験群2紫外線B波照射コントロール群試験群3紫外線B波照射10μg/mlポマクティブHFV添加図8に紫外線B波照射時の酸化カルボニル量を、表8にDunnetttestの結果を示す。紫外線B照射時の酸化カルボニル量は、試験群2の紫外線B波照射群が試験群1の紫外線B波未照射群p値0.000139に対して増加していた。また、試験群3の10μg/mlポマクティブHFV添加群が試験群2の紫外線B波照射群に対して有意p値0.00193に酸化カルボニルを抑制していた。以上の結果から、リンゴ抽出物であるAppl’inやポマクティブHFVは、線維芽細胞の状態若い或いは老化を問わず、いずれも紫外線惹起性の酸化カルボニルタンパクを抑制除去する効果に優れていることが分かった。[光老化動物による試験]紫外線AUVA波および紫外線BUVB波をヘアレスマウスに照射させてシワを形成させる試験系によりポマクティブHFVのシワの抑制および皮膚老化抑制効果について確認試験を行った。導入時6週齢のヘアレスマウスHos:HR-1雌を用いて試験を行った。1試験対象物の調製および投与ヘアレスマウスの群分けは投与開始日に、一般状態が良好な動物を体重により、群間での差が無いように1群6匹に振り分けた。なお、各々の個体は1ゲージ群で飼育とした。マウス用飼料MFオリエンタルバイオサービス製に、それぞれポマクティブHFVを均一に混合処理し、自由摂取させた。投与群と配合成分の一覧を表9に示す。混餌飼料の投与は動物搬入直後から解剖18時間前までとした。2UV照射UV照射は、動物を専用のケージに移し、1群ずつUVB20mJ/cm2およびUVA10J/cm2を照射した。照射は週三回とし、このサイクルを10週間繰り返した。3解剖各群、本飼育期間終了翌日より18時間絶食させた後、氷冷したAvertin2,2,2-トリブロモエタノール0.5mg/kgBWを腹腔内投与して麻酔した。その後、皮膚背部の尾付け根より首に向かい2cm、腰椎から右側に05cm部位範囲で反射型レプリカ有アサヒバイオメッド製を採取した。次いで開腹し解剖を行った。皮膚組織はメタカン固定液メタノール:クロロホルム:酢酸=6:3:1v/v/vで浸潤、パラフィン包埋処理し、組織染色実験時に5μmの厚さでスライドガラスに貼付した。4皮膚形態観察シワ体積率計測皮膚表面部の写真撮影と採取したレプリカの判定を行った。シワ形成度合を指標としてASA-03RXD有アサヒバイオメッド製を用いてシワ体積率を算出した。紫外線照射第4週目頃よりUV照射動物において、頭部の皮膚の軽度褐色化や頸部のしわの深さならびに後肢背部のしわがUV非照射動物に比較して目立つようになった。解剖時の外観観察では、UV照射動物で顔、頸部および後肢背部のしわが明瞭に確認されたが、UV照射においても高濃度0.06、中濃度0.012および低濃度0.006ポマクティブHFVを摂取したマウスではその症状は軽度であり、特に高濃度摂取動物のしわの深度が浅く、肉眼的にはしわの程度が皆無であった。また、ポマクティブHFV摂取動物は、コントロール群に比較して皮膚にしっとり感があり、特に高濃度摂取群でその症状は顕著に感じられた。表10に結果を示すが、紫外線照射により明確なシワの形成が認められた。特に、同一線量の紫外線照射条件下で混餌群ではポマクティブHFVの濃度依存的にシワ抑制効果が有意に認められた。特に0.06および0.012混餌で有意にシワ体積率を抑制した。5マウス肝臓のプロテアソーム活性測定試料の調整上記の解剖で得たマウス肝臓を100mgから200mgの範囲で湿重量を秤量し、以下の条件でホモジナイズした。ホモジナイズ条件肝臓:50mMTris塩酸緩衝液pH7.5,グリセロール、DTT、MgCl2含有=1:3w/vホモジナイザーUD-201超音波破砕装置、TOMY製を使用、条件はOUTPUT2、DUTY40、30secを2set。試験溶液の調整このホモジネートを遠心分離10,000g、30分間、4°Cして上澄み画分を採取し、これを再度遠心分離20,000g、30分間、4°Cし、得られた上澄み画分をプロテアソーム活性測定試験溶液とした。タンパク質量の測定Bradford法に準拠してBSA換算で全タンパク量を求めた。発色試薬はBio-Radproteinassayバイオラッド社を用いた。平板96ウェルプレートに、プロテアソーム活性測定溶液1μl、ホモジナイズ緩衝液9μl、Bio-Radproteinassay脱イオン水で5倍希釈200μlを加えて10min室温にて撹拌して反応させた。次いで590nmの吸光度を、プレートリーダーを用いて測定した。次いで得られた吸光度からBSA溶液で作成した検量線を用いて全タンパク質濃度0.7~1.5μgμlの範囲を求めた。プロテアソーム活性の測定トリプシン様プロテアソーム活性測定用基質Boc-Leu-Arg-Arg-MCAペプチド研究所キモトリプシン様プロテアソーム活性測定用基質Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCAペプチド研究所をそれぞれ10mM溶媒;DMSOに調整し、30μlずつを分注して-20°C冷凍保存し、使用時に解凍し600μlの反応液で希釈して使用した。蛍光分析用平板96ウェルプレートに以下の溶液をそれぞれ加えた。1基質ペプチドトリプシン様/キモトリプシン様105μl蛍光分析時の基質ペプチド濃度238μM2反応液100mMトリス塩酸、1mMDTT、5mMMgCl2、pH8025μl310mMATP含有ホモジナイズBuffer195μl蛍光分析時のATP濃度は0975mM4ホモジナイズBuffer15μl5マウス肝臓プロテアソーム活性サンプル5μl37°C30分間撹拌反応。反応終了後に、610SDS反応停止液25μl7100mMトリス塩酸pH90100μl1ウエル当たり全量200μlとして37°C30分間インキュベートし、基質ペプチドから遊離したMCA由来の蛍光強度Ex380nm、Em440nmを測定し、プロテアソーム活性を求めた。データ処理蛍光強度/タンパク濃度で算出されるプロテアソーム活性値を、紫外線非照射動物UV-を対照1.00として活性値をもとめ、各動物個体の活性値を平均して、試験群の値として表した。測定結果測定結果を表11、表12及び図9、図10、に示す。以上の試験結果から以下のことが明らかになった。すなわち、A.コントロール食群では、紫外線照射の有無でマウス肝臓のプロテアソーム活性に有意な差は無かった。B.トリプシン様活性は、ポマクティブHFV0.06p=0.0108混餌群で有意な活性上昇が確認された。C.キモトリプシン様活性は、ポマクティブHFV0.012p=0.0132および0.06p=0.00000160混餌群で有意な活性上昇が確認された。D.従ってポマクティブHFV投与によりマウス肝臓におけるプロテアソーム活性化効果が確認できた。すなわち、本発明により肝臓のプロテアソームが活性化され、異常タンパク質を除去する機能が高まり、種々の疾病予防に寄与する事が可能となった。6マウス皮膚のプロテアソーム活性の測定測定試料の調整次のホモジナイズ条件で背部ヒフ試料をホモジナイズ処理した。ホモジナイズ条件背部皮膚前足周縁:50mMTris塩酸緩衝液pH7.5、グリセロール、DTT、MgCl2含有=1:3w/vホモジナイザーを使用して試料調製したUD-201超音波破砕装置、TOMY製を使用、条件はOUTPUT5SDS反応停止液25μl6100mMトリス塩酸pH90100μl1ウエル当たり全量200μlとして37°C30分間インキュベートし、基質ペプチドから遊離したMCA由来の蛍光強度Ex380nm、Em440nmを測定し、プロテアソーム活性を求めた。データ処理蛍光強度/タンパク濃度で算出されるプロテアソーム活性を、紫外線非照射動物UV-を対照1.00としてもとめ、各動物個体の活性値の平均値を試験群の値として表した。測定結果測定結果を表13、表14及び図11、図12に示す。以上の試験結果から次の点が明らかとなった。A.コントロール食群において、紫外線照射の有無でマウス皮膚のプロテアソーム活性に有意な差は無かったが紫外線照射群の皮膚でプロテアソーム活性が低下する傾向が認められた。B.トリプシン様活性はポマクティブHFV0.06混餌群p=0.0153で有意な活性上昇が確認された。C.キモトリプシン様活性において、ポマクティブHFV0.06混餌群p=0.0103で有意な活性上昇が確認された。D.以上の結果からポマクティブHFV投与によるマウス皮膚におけるプロテアソーム活性化作用が証明された。従って、本発明により皮膚の異常タンパク質を除去する機能が高まり、種々の疾病予防に寄与する事が期待できる。7マウス皮膚の酸化カルボニルタンパクの抑制効果の確認プロテアソーム活性化によって酸化タンパク質の一種であるカルボニル化タンパク質の抑制を確認した。上記3で得たメタカン固定液浸潤してパラフィン包埋した5μmマウス皮膚切片を、免疫組織染色の手法を用いて評価した。抗体等の試薬はカルボニル化タンパク質免疫組織染色キット株式会社シマ研究所を用いた。脱パラフィン処理、親水化は公知の方法に基づいて実施した。それぞれの皮膚切片サンプルに対し本キットに付属のDNPH溶液を室温で30分間反応させた。DNPHは2,4-ジニトロフェニルヒドラジンの略語である。DNPH反応終了後、2塩酸を5分間、80エタノールを5分間、100エタノールを5分間、50エタノール/50酢酸を5分間、80エタノールを1分間、蒸留水で1分間順次洗浄した。常温下03過酸化水素含有メタノールで30分反応させて内因性ペルオキシダーゼを阻害した。水洗、10mMPBS洗浄後、ブロッキング液2BSAPBS‐2ヤギ血清を30分間ブロッキング反応、ブロッキング終了後にPBS-で5分間3回洗浄し、1次抗体本キット付属のウサギ抗DNPポリクローナル抗体の100倍希釈、希釈液はブロッキング溶液を1時間室温で反応させた。PBS-で2回洗浄し、ビオチン化二次抗体ビオチン化抗ウサギ免疫グロブリンG;DAKO製を200倍希釈したものを30分間室温で反応させた。PBS-で2回洗浄し、ABC試薬アビジン-ビオチン複合体ABCHRP;Dako製を30分間室温にて反応させた。PBS-で2回洗浄し、発色試薬としてDAB33ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド:DAKO製を用いて4分常温下で反応させた。水洗後、脱水、封入処理を行い、酸化カルボニル化タンパク質の病理組織標本を得た。得られた病理組織標本を顕微鏡で染色状況を観察し、DAB発色の程度をスコア評価スコア0→酸化カルボニル無し、スコア1→酸化カルボニル僅かに形成、スコア2→酸化カルボニル形成、スコア3→酸化カルボニルが非常に多いし、各群の平均値から酸化カルボニルタンパクの形成および抑制を評価した。上記組織標本は、酸化カルボニル化タンパク質の存在量に応じて、着色度合いが高まる。着色度合いに基づく評価結果を表15、図13に示す。また、各試験群の動物の評価スコアの病理組織を図14に示す。酸化カルボニル化タンパク質が多いものほど病理組織が濃く着色されていることが明らかである。染色標本の評価に基づく多重検定により、紫外線照射群では明確に酸化カルボニルタンパクが増加しており、試験群3から試験群5におけるポマクティブHFV摂取群では濃度依存的にマウス皮膚の酸化カルボニルタンパクの抑制が確認された。"