タンパク質に対する関心対象の化合物の結合定数を求めるための方法であって、以下の工程を含む方法a高親和性化合物を、関心対象の化合物を透過させる半透膜によって2つのチャンバーが分けられている2チャンバーシステムに添加して、分配平衡に達した後に、一方のチャンバーの中にある関心対象の高親和性化合物の量を求める工程、bシンク化合物を、シンク化合物が膜を透過できない一方のチャンバーに添加して、分配平衡に達した後に、シンク化合物に対する関心対象の化合物の分配係数を求める工程、c非特異的タンパク質を、非特異的タンパク質が膜を透過できない他方のチャンバーに添加して、分配平衡に達した後に、シンク化合物の存在下での非特異的タンパク質に対する関心対象の化合物の分配係数を求める工程、ならびにd工程bおよびcの分配係数を用いて試験化合物の結合定数を求める工程。フィルターが、サイズ選択性の膜である、請求項1記載の方法。シンク化合物がPVPまたはシクロデキストリンである、請求項1または2記載の方法。シンク化合物がPVP25である、請求項1~3のいずれか一項記載の方法。タンパク質が血漿タンパク質である、請求項1~4のいずれか一項記載の方法。血漿タンパク質が血清アルブミンである、請求項5記載の方法。工程a、b、およびcが並行して行われる、請求項1~6のいずれか一項記載の方法。シンク化合物は、非特異的タンパク質に対する高親和性試験物質の親和性を有意に下げる物質である。親和性を有意に下げるとは、シンク化合物の存在下で非特異的タンパク質に結合した試験物質の量と、シンク化合物の非存在下で非特異的タンパク質に結合した試験物質の量の差が統計学的に関連することを意味する。シンク化合物は膜を通過しないが、試験化合物は膜を通過するようにするために、シンク化合物のサイズは、好ましくは、試験化合物のサイズの2倍である。好ましくは、シンク化合物は複合体を形成している作用物質である。より好ましくは、シンク化合物はポリビニルピロリドンであり、最も好ましくは、シンク化合物はポリビニルピロリドンK25である。前述の方法のために、シンク化合物の組み合わせ、例えば、PVPおよびシクロデキストリンを使用することができる。本明細書で使用する高親和性化合物という用語は、生理学的条件下および過剰な血漿タンパク質の存在下で、総量のうち少なくとも95が前記血漿タンパク質と結合する化合物を指す。好ましくは、少なくとも97が結合し、より好ましくは少なくとも98、最も好ましくは少なくとも99が結合型で存在する。生理学的条件はpH70および37°Cと定義される。本発明によれば、高親和性化合物または試験化合物は、好ましくは、薬物である。本明細書で使用する試験物質または試験化合物という用語は、高親和性化合物を指す。結合定数という用語は、平衡状態にある2つの分子間の結合親和性を表す定数を指す。結合定数は、遊離している試験物質と結合している試験物質との平衡状態を表す。本明細書で使用する結合した物質または結合した化合物という用語は、タンパク質またはシンク化合物に結合している物質または化合物を指す。占有率という用語は、結合している試験化合物の割合を指す。言い換えると、占有率は、シンク化合物と平衡状態にある結合した試験化合物の量と、試験化合物の総量との比である。非特異的タンパク質は、特異的タンパク質とは対照的に広範囲の化合物に結合する。非特異的タンパク質は、特に、例えば、血清アルブミンおよびα1酸性糖タンパク質などの血漿タンパク質である。好ましくは、非特異的タンパク質はヒト血清アルブミンである。本発明の方法において用いられる膜は半透膜である。半透膜は、選択された分子種が拡散によって通り抜けることができる膜である。前述のアッセイのための半透膜を、高親和性化合物は通り抜けることができるが、シンク化合物または非特異的タンパク質は通り抜けることができない。好ましくは、半透膜は、サイズ選択性の膜である。半透膜は分子量カットオフによって特徴付けることができる。好ましくは、MWCOはシンク化合物または非特異的タンパク質の分子量の約半分であり、どちらよりも小さい。試験物質の分子量はシンク化合物または非特異的タンパク質の分子量との比が22~27であることも好ましく、どちらよりも小さい。より好ましくは、比は約25である。本発明の方法に適した膜は市販されており、例えば、透析膜である。好ましくは、このアッセイにおいて用いられる非特異的タンパク質の濃度は、インビボでのタンパク質の濃度に相当する。HSAの場合、生理学的濃度は約60mMである。本発明の方法を最適に実施するためのシンク化合物の濃度は、異なる濃度のシンク化合物を用いて本発明の方法を行うことによって求めることができる。アッセイは、2つのチャンバーが半透膜によって分けられた2チャンバーシステムの中で行われる。膜の透過性は、試験物質が膜を透過できるが、シンク化合物も非特異的タンパク質も透過できないように選択される。本発明の方法の測定、、および工程は並行して行われてもよく、連続して行われてもよい。好ましくは、測定は並行して行われる。以下において好ましい態様が説明される。参照実験のために、関心対象の化合物が一方のチャンバーに添加され、分配平衡に達した後に、このシステムにおける化合物の分布が確かめられる。これによって、分配平衡に達した後に、チャンバーの少なくとも1つにおいて化合物の質量が求められる。結合実験1のために、関心対象の化合物およびシンク化合物が、参照実験を実施するのに用いられたものと異なる2チャンバーシステムの中のチャンバーに添加される。結合システムの平衡に達した後に、シンク化合物の無いチャンバーの中にある高親和性化合物の量が測定され、シンク化合物に対する関心対象の化合物の分配係数が求められる。結合実験2のために、関心対象の化合物およびシンク化合物が、参照実験または結合実験を実施するのに用いられたものと異なる2チャンバーシステムの中のチャンバーに添加され、非特異的タンパク質がシンク化合物の無いチャンバーに添加される。平衡に達した後に、シンクチャンバーの中にある遊離試験物質の量が測定され、シンク化合物の存在下での非特異的タンパク質に対する関心対象の化合物の分配係数が求められる。高親和性化合物の結合定数は以下の通りに求められる。試験化合物と非特異的タンパク質との結合は、以下の平衡によって表すことができる可逆プロセスである。P非特異的タンパク質の濃度Tu非特異的タンパク質に結合していない試験化合物の濃度Kp非特異的タンパク質に対する試験化合物の結合定数TP平衡に達した時の、非特異的タンパク質に結合した試験化合物の濃度結合定数Kpは、質量の法則から得られた以下の式を用いて、非結合率fuに変換することができる。fb非特異的タンパク質に結合した試験化合物の割合非特異的タンパク質に対する結合定数は、シンク化合物に対する分配係数と、シンク化合物の存在下での非特異的タンパク質に対する分配係数の組み合わせから計算することができる。KpDCシンクDCp結合研究Iから:mTシンク化合物および非特異的タンパク質の非存在下で平衡状態にある試験化合物の質量mTuシンク化合物の存在下で平衡状態にある、結合していない試験化合物の質量結合研究IIから:TPシンク化合物の存在下で非特異的タンパク質に結合した試験化合物の濃度Tシンクシンク化合物に結合した試験化合物の濃度mTbシンク化合物および非特異的タンパク質を含むシステムの中にある、平衡状態にある非特異的タンパク質に結合した試験化合物の質量mTuシンク化合物および非特異的タンパク質を含むシステムの中にある、平衡状態にある非特異的タンパク質に結合していない試験化合物の質量V全体は、透析チャンバーの中にある総体積である。Vpは、非特異的タンパク質の体積である。Vシンクは、シンク化合物の体積である。体積は、適用された材料の密度および質量から計算することができる。V質量密度遊離した試験物質およびまたは結合した試験物質の量は、分光測定によって分光光度計において直接、またはHPLCシステムにおける分離後に求めることができる。全ての参照実験および結合実験のために、チャンバーシステムは、好ましくは、室温および正常圧力の下でインキュベートされる。平衡の実現を加速するために、チャンバーを振盪してもよい。好ましい態様において、本発明の方法は、複数の2チャンバーシステムを備えるプレートにおいて並行して行われる。これらの並行して行われるアッセイは同一でもよく、異なってもよく、例えば、高親和性化合物の同一性または濃度が異なってもよい。本発明を大まかに説明したが、特定の実施例を参照することによってさらに良く理解されるであろう。以下の図と共に、実施例は例示のためだけに本明細書に収められ、特に定めのない限り限定を目的としない。実施例において言及される市販の試薬は、特に定めのない限り、製造業者の説明書に従って用いられる。実施例1材料および方法11透析チャンバー以下の実験のために、再利用可能な96ウェルMicroEquilibriumdialysisDeviceHTD96チャンバーを使用した。チャンバーシステムは10本のTeflonバーからなり、2本のTeflonバーそれぞれの間に半透膜が配置されて、各ウェルの2つの区画を形成する。組み立てられたTeflonブロックをスチールフレームの中に挿入した。個々のウェル間の封止を確実にするために、これらのバーをスチールプレートを用いて密着させた。このスチールプレートは、8個の円盤ばねによりTeflonバーに反対圧力を加えた。各実験の前に、Teflonバーをエタノールで4回リンスすることによって、きれいにした。12膜MWCO添加物に応じて以下のMWCOを試験した。膜材料AMWCO6~8kDaのHTD96透析膜細片およびMWCO12~14kDaのHTD96透析膜細片上記の膜を脱イオン水で60分間水和した。その後に、膜を20エタノールで20分間処理し、次いで、脱イオン水で2回リンスした。BMWCO1kDaのSpektraPor6およびMWCO35kDaのSpektraPor6重金属の除去EDTAを含む重金属洗浄液1部の洗浄溶液9部のH2O蒸留水1h洗浄し、次いで、H2O蒸留水で5分間洗浄した。スルフィド01の除去硫黄洗浄液AおよびB80°Cで、2部のH2O蒸留水1部の溶液Aを含む溶液を用いて、膜を洗浄した。次いで、膜を、60°Cの熱いH2Oで2分間、洗浄した。次いで、膜を、100部の水および4部の溶液Bを含む溶液で洗浄し、次いで、数分間、蒸留水で洗浄した。あるいは、予め洗浄された膜を使用した。CSpektraPor7MWCO35kDaシクロデキストリンシンク化合物がシンクチャンバーから確実に分離されるようにするために、シクロデキストリンの分子量が、使用した膜のMWCOより大きいことが、シクロデキストリンを使用する条件である。以下のシクロデキストリンを使用した。βヒドロキシプロプキシルシクロデキストリンγシクロデキストリンBポリビニルピロリドンPVPPVP、ポビドン、ポビドナム、Nビニルピロリドンのホモポリマー通常、分子量はK値で表される。分子量は重合度に依存する。分子量約24000のPVP25および分子量約10000のPVP15を用いて、実験を行った。14試験化合物■ワーファリン4ヒドロキシ32Hクロメン2オン■フロセミド5スルファモイル安息香酸■ジクロフェナクフェニル酢酸■ベラパミル52エチルメチルアミノ2ペンタンニトリル■クロルプロマジンNNジメチルプロパン1アミン■カルベジロール2ヒドロキシプロピル2エチルアミン■ナプロキセン2プロパン酸■ピロキシカム8ヒドロキシメチリデン9メチル1010ジオキソ10λ6チア9アザビシクロ440デカ135トリエン7オン■グリベンクラミドスルファモイルフェネチル2メトキシベンザミド15実験手順1膜を調製し、実施例1の透析チャンバーを組み立てる。2タンパク質チャンバーに、最終体積約100~150ulまで緩衝液および他の添加剤を満たす。両側の体積が正確に同じになることが重要である。1チャンバーあたりの体積シンク化合物として純粋なシクロデキストリンを用いた場合、各チャンバーの中の体積は147μlであった。チャンバーの中にシンク化合物としてPVPおよびPVPとシクロデキストリンの組み合わせを用いた場合、体積は100μlであった、PVP254、PVP254βヒドロキシプロピルシクロデキストリン4。緩衝液50mMTAPSOpH74を、NaClを用いて総濃度154mMまで等張にし、添加剤に応じて異なる添加剤を添加した。試験化合物の最終濃度002mM~06mMHSAの最終濃度60mMDMSOの最終濃度6最後に、DMSO保存液を添加する。なぜなら、時間はかかるが、膜が乾燥する危険性があるために、かなり速くチャンバーを満たさなければならないからである。3全てのピペッティング工程を自動化した4蒸発を防ぐために、Teflonアセンブリを接着フィルムで覆った。5チャンバーシステムを1時間振盪し、次いで、一晩インキュベートした。発生した熱によって多量に蒸発する危険性があるために、長時間の振盪を避けなければならない。6平衡に達した後に、シンクチャンバーからの試料、またはタンパク質チャンバーからの試料をハーフエリアUVプレートに移し、分光測定によって分析するか、HPLCによって分析した。16測定データの分析結合研究を用いて、分配係数および結合定数を計算することができる。薬物とHSAとの結合は、以下の式4DuHSADHSAによって表すことができる可逆プロセスである。式中、角括弧は濃度を表すために用いられ、Du、HSA、およびDHSAは、それぞれ、HSAに結合していない薬物、HSA、およびHSAに結合した薬物の濃度である。結合定数KHSAは、質量の法則から得られた以下の式を用いて、非結合率fuに変換することができる。HSAに対する結合定数は、PVPに対する分配係数およびPVPの存在下でのHSAに対する分配係数から計算することができる。KHSADCPVPDCHSA結合研究Iから結合研究IIから式中、DHSAおよびDPVPは、それぞれ、PVPの存在下でHSAに結合した薬物およびPVPに結合した薬物である。V全体は透析チャンバーの中の総体積であり、VHSAおよびVPVPはHSAおよびPVP25の体積であり、密度および秤量した試料から計算することができる。ρHSA14gcm3およびρPVP12gcm3。密度を求めるために、PVPを融解しなければならなかった。空気が入るため、ばらつきがある。従って、本当の密度はBASFからの情報に基づいた。別のシンク化合物と平衡状態にある、結合していない試験化合物結合した試験化合物の濃度を求める場合、前述の式を同様に適用することができる。実施例2βヒドロキシプロピルシクロデキストリンとγシクロデキストリンとの比較結果を表1に示した。10βヒドロキシプロピルシクロデキストリン溶液を用いた場合、試験化合物の30超が結合することができる。γシクロデキストリンに対する親和性は、βヒドロキシプロピルシクロデキストリンに対する親和性よりかなり低い。表1ワーファリンについて測定された添加剤結合レベル実施例3シンク化合物としてβヒドロキシプロピルシクロデキストリンを用いたアッセイ特に言及しない限り、試験条件は前記の通りである。表2試験化合物とβヒドロキシプロピルシクロデキストリンとの平均結合結論試験化合物の分子量が小さいほど、βヒドロキシプロピルシクロデキストリンに対する親和性が大きくなる。実施例4PVP15とPVP25との比較特に言及しない限り、試験条件は前記の通りである。薬物の濃度002~06mMPVP15およびPVP25の量それぞれ40gl表3試験化合物とPVP15およびPVP25との平均結合試験物質のPVP25に対する親和性はPVP15に対する親和性より大きい。従って、PVP25を用いて、以下の実施例の実験を行った。実施例5シンク化合物としてPVP25およびシクロデキストリンの組み合わせを用いたアッセイ結果を図5および図6に示した。βヒドロキシプロピルシクロデキストリンおよびPVP25の使用によって、薬物およびシンク化合物の複合体の方向に平衡が動く量は、PVP25のみの使用より少ない。表4ワーファリンについて測定された添加剤結合レベルの概要実施例6PVP25およびヒト血清アルブミンを用いたアッセイ試験化合物カルベジロールを使用した以外は、実施例5に記載のように同じ試験条件を使用した。結果を図8および図9に示した。HPLC条件HPLCシステムにおいて分析を行った。RPカラムにおいて分離を行った。水と005ギ酸およびアセトニトリルの勾配を用いて、試料を溶出した。勾配条件初期5B、04分95B1分95B11分5B。試験化合物およびPVPを用いた結果を図7に示した。試験化合物、PVP25、およびHSAを用いた結果を図8および図9に示した。実施例7文献値との比較実施例6において求められた、試験化合物の結合レベルを、従来法を用いて求められた値と比較した。結果を表2および図10に示した。表5文献および実施例6に基づく試験化合物の結合レベル