"配列番号1~5に記載のプロテインAのE、D、A、B及びCドメインから選ばれる少なくとも1つのドメインに由来するアミノ酸配列において、A、B、および、Cドメインの31~37位のアミノ酸残基、Eドメインの29~35位のアミノ酸残基、又はDドメインの34~40位のアミノ酸残基に少なくとも1つのアミノ酸置換変異を導入したアミノ酸配列を有するタンパク質であって、変異導入前のタンパク質と比較して、免疫グロブリンのFab領域に対する親和性が低下していることを特徴とする、免疫グロブリンに親和性を有するタンパク質。変異導入前のドメインに由来するアミノ酸配列が、配列番号1~5に記載のプロテインAのE、D、A、B及びCドメインのアミノ酸配列、又は配列番号6~10に記載のプロテインAのE、D、A、B及びCドメインに由来するアミノ酸配列である、請求項1に記載のタンパク質。変異導入前のドメインに由来するアミノ酸配列が、配列番号5に記載のプロテインAのCドメインのアミノ酸配列、又は配列番号10に記載のプロテインAのCドメインに由来するアミノ酸配列である、請求項1又は2に記載のタンパク質。変異導入前のアミノ酸残基において、各ドメインにおけるCドメインの33位に対応するアミノ酸残基がSer、各ドメインにおけるCドメインの35位に対応するアミノ酸残基がLys、各ドメインにおけるCドメインの36位に対応するアミノ酸残基がAsp、又は各ドメインにおけるCドメインの37位に対応するアミノ酸残基がAspである、請求項1~3のいずれか1項に記載のタンパク質。導入するアミノ酸置換変異が、Cドメインの33位に対応するSerをGlu、Leu又はThrに置換する変異、Cドメインの35位に対応するLysをArgに置換する変異、Cドメインの36位に対応するAspをArg又はIleに置換する変異、又はCドメインの37位に対応するAspをGluに置換する変異である、請求項1~4のいずれか1項に記載のタンパク質。導入するアミノ酸置換変異が、Cドメインの33位に対応するSerをGluに置換する変異である、請求項5に記載のタンパク質。請求項1~6のいずれか1項に記載のタンパク質を2個以上連結した複数ドメインからなるタンパク質。連結するタンパク質が、種類の異なるタンパク質である請求項7に記載のタンパク質。連結するタンパク質の数が2~5個である、請求項7または8に記載の複数ドメインからなるタンパク質。請求項1~9のいずれか1項に記載のタンパク質をコードするDNA。連結されているドメインを構成する塩基配列の配列同一性が90以下であることを特徴とする、請求項10に記載のDNA。請求項10または11に記載のDNAを含むベクター。請求項12に記載のベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体。宿主がグラム陽性菌であることを特徴とする、請求項13に記載の形質転換体。グラム陽性菌がブレビバチルス属細菌であることを特徴とする、請求項14に記載の形質転換体。ブレビバチルス属細菌がブレビバチルスチョウシネンシスであることを特徴とする、請求項15に記載の形質転換体。請求項13~16のいずれか1項に記載の形質転換体、または、請求項10又は11に記載のDNAを用いた無細胞タンパク質合成系を用いる、請求項1~9のいずれか1項に記載のタンパク質の製造方法。形質転換体の細胞内及び/又はペリプラズム領域内にタンパク質を蓄積すること、及び/又は、形質転換体の細胞外にタンパク質を分泌することを特徴とする、請求項17に記載の製造方法。請求項1~9のいずれか1項に記載のタンパク質をアフィニティーリガンドとして、水不溶性基材からなる担体に固定化したことを特徴とする、アフィニティー分離マトリックス。水不溶性基材が、合成高分子又は多糖類からなる請求項19に記載のアフィニティー分離マトリックス。多糖類がセルロースである、請求項20に記載のアフィニティー分離マトリックス。免疫グロブリンのFc領域を含むタンパク質に結合することを特徴とする、請求項19~21のいずれか1項に記載のアフィニティー分離マトリックス。免疫グロブリンのFc領域を含むタンパク質が免疫グロブリンG、または、免疫グロブリンG誘導体のいずれかであることを特徴とする、請求項22に記載のアフィニティー分離マトリックス。免疫グロブリンのFc領域を含むタンパク質の分離における、請求項19~23のいずれか1項に記載のアフィニティー分離マトリックスの使用。免疫グロブリンのFc領域を含むタンパク質の分離が、免疫グロブリンのFab領域のみを含むタンパク質の分離回収を目的とする、請求項24に記載のアフィニティー分離マトリックスの使用。29位以外のアミノ酸への変異導入によって、既存の改変型プロテインAリガンドよりも優れた抗体酸解離特性を有する新規改変プロテインAリガンドを創出することが、本発明が解決しようとする課題である。本発明者らは、29位以外の位置へのアミノ酸置換変異を有する数多くの組み換えプロテインA変異体を分子設計し、タンパク質工学的手法および遺伝子工学的手法を用いて該変異体を形質転換細胞から取得し、該変異体の活性を比較検討することにより、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は、配列番号1~5に記載のプロテインAのE、D、A、B及びCドメインから選ばれる少なくとも1つのドメインに由来するアミノ酸配列において、A、B、および、Cドメインの31~37位のアミノ酸残基、Eドメインの29~35位のアミノ酸残基、又はDドメインの34~40位のアミノ酸残基に、少なくとも1つのアミノ酸置換変異を導入したアミノ酸配列を有するタンパク質であって、変異導入前のタンパク質と比較して、免疫グロブリンのFab領域に対する親和性が低下していることを特徴とする、免疫グロブリンに親和性を有するタンパク質に関する。変異導入前のドメインに由来するアミノ酸配列が、配列番号1~5に記載のプロテインAのE、D、A、B及びCドメインのアミノ酸配列、又は配列番号6~10に記載のプロテインAのE、D、A、B及びCドメインに由来するアミノ酸配列であることが好ましい。変異導入前のドメインに由来するアミノ酸配列が、配列番号5に記載のプロテインAのCドメインのアミノ酸配列、又は配列番号10に記載のプロテインAのCドメインに由来するアミノ酸配列であることが好ましい。変異導入前のアミノ酸残基において、各ドメインにおけるCドメインの33位に対応するアミノ酸残基がSer、各ドメインにおけるCドメインの35位に対応するアミノ酸残基がLys、各ドメインにおけるCドメインの36位に対応するアミノ酸残基がAsp、又は各ドメインにおけるCドメインの37位に対応するアミノ酸残基がAspであることが好ましい。導入するアミノ酸置換変異が、Cドメインの33位に対応するSerをGlu、Leu又はThrに置換する変異、Cドメインの35位に対応するLysをArgに置換する変異、Cドメインの36位に対応するAspをArg又はIleに置換する変異、又はCドメインの37位に対応するAspをGluに置換する変異であることが好ましい。導入するアミノ酸置換変異が、Cドメインの33位に対応するSerをGluに置換する変異であることが好ましい。また、本発明は、前記タンパク質を2個以上連結した複数ドメインからなるタンパク質に関する。連結するタンパク質が、種類の異なるタンパク質であり、連結するタンパク質の数が2~5個であることが好ましい。また、本発明は、前記タンパク質をコードするDNAに関する。前記DNAにおいて、連結されているドメインを構成する塩基配列の配列同一性が90以下であることが好ましい。また、本発明は、前記DNAを含むベクターに関する。また、本発明は、前記ベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体に関する。前記形質転換体において、宿主がグラム陽性菌であることが好ましい。グラム陽性菌がブレビバチルス属細菌であることが好ましく、ブレビバチルス属細菌がブレビバチルスチョウシネンシスであることがより好ましい。また、本発明は、前記形質転換体、または、前記DNAを用いた無細胞タンパク質合成系を用いる、前記タンパク質の製造方法に関する。前記製造方法において、形質転換体の細胞内及び/又はペリプラズム領域内にタンパク質を蓄積すること、及び/又は、形質転換体の細胞外にタンパク質を分泌することが好ましい。また、本発明は、前記タンパク質をアフィニティーリガンドとして、水不溶性基材からなる担体に固定化したことを特徴とする、アフィニティー分離マトリックスに関する。水不溶性基材は合成高分子又は多糖類からなることが好ましく、多糖類はセルロースであることが好ましい。前記アフィニティー分離マトリックスは、免疫グロブリンのFc領域を含むタンパク質に結合することが好ましく、免疫グロブリンG、または、免疫グロブリンG誘導体に結合することがより好ましい。また、本発明は、免疫グロブリンのFc領域を含むタンパク質の分離における、前記アフィニティー分離マトリックスの使用に関する。免疫グロブリンのFc領域を含むタンパク質の分離は、免疫グロブリンのFab領域のみを含むタンパク質の分離回収を目的とすることが好ましい。本発明のタンパク質は、優れた抗体酸解離特性を示す。該タンパク質を担体に固定化したアフィニティー分離マトリックスを用いることにより、抗体の分離精製を改善することが可能となる。本発明のタンパク質は、全てのドメインで保存されているアミノ酸部位に変異が導入されるので、本発明のタンパク質およびアフィニティー分離マトリックスは、E、D、A、B、および、Cドメインのうちいずれのドメインを使用した場合であっても、共通して上述の効果を有する。本発明のタンパク質は、配列番号1~5に記載のプロテインAのE、D、A、BおよびCドメインから選ばれる少なくとも1つのドメインに由来するアミノ酸配列において、全てのドメインで保存されている、A、B、および、Cドメインの31~37位のアミノ酸、Eドメインの29~35位のアミノ酸、またはDドメインの34~40位のアミノ酸に対して、少なくとも1つのアミノ酸置換変異を導入したアミノ酸配列を有し、かつ、該変異を導入する前のアミノ酸配列を有するタンパク質に比べて、免疫グロブリンのFab領域に対する親和性が低下しており、免疫グロブリンに親和性を有することを特徴とする。プロテインAは、免疫グロブリン結合性ドメイン、つまり、免疫グロブリン結合性タンパク質が、5個つながった形で構成されるタンパク質である。プロテインAのE、D、A、B、および、Cドメインは、免疫グロブリンの相補性決定領域CDR以外の領域に結合することができる免疫グロブリン結合性ドメインであり、いずれのドメインも、免疫グロブリンのFc領域、Fab領域、および、Fab領域中の特にFv領域の、各々の領域に対して結合する活性を有する。なお、本発明においてプロテインAの由来は特に限定されないが、スタフィロコッカスStaphylococcusに由来するプロテインAであることが好ましい。タンパク質という用語は、ポリペプチド構造を有するあらゆる分子を含むものであって、断片化された、または、ペプチド結合によって連結されたポリペプチド鎖も、タンパク質という用語に包含される。また、ドメインとは、タンパク質の高次構造上の単位であり、数十から数百のアミノ酸残基配列から構成され、なんらかの物理化学的または生物化学的な機能を発現するに十分なタンパク質の単位をいう。ドメインに由来するアミノ酸配列は、変異を導入する前のアミノ酸配列のことを指し、プロテインAのE、D、A、B、および、Cドメインのいずれかの野生型アミノ酸配列のみに限定されるものではなく、アミノ酸の置換、挿入、欠失、および、化学修飾により部分的に改変されたアミノ酸配列であっても、Fc領域への結合能を有しているタンパク質である限りこれに含まれる。ドメインに由来したアミノ酸配列として、例えば、配列番号1~5に記載のスタフィロコッカスのプロテインAのE、D、A、B、および、Cドメインを構成するアミノ酸配列が挙げられ、さらに、配列番号6~10に記載のプロテインAのE、D、A、B、および、Cドメインを構成するアミノ酸配列が挙げられる。なお、配列番号6~10に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質は、プロテインAのE、D、A、B、および、Cドメイン配列番号1~5に対して、Cドメインの29位に対応するGlyをAlaに置換する変異を導入したアミノ酸配列からなるタンパク質である。また、BドメインにA1VとG29Aという変異を導入したZドメインもFc領域への結合能を有しているので、ドメインに由来するアミノ酸配列に該当する。例えば、変異を導入する前のアミノ酸配列は、化学安定性が高いドメイン、または、その変異体であることが好ましい。アミノ酸置換変異を導入するタンパク質は、プロテインAのE、D、A、B、および、Cドメインのいずれかの野生型アミノ酸配列と、好ましくは85以上、より好ましくは90以上のアミノ酸の配列同一性を有し、Fc領域への結合能を有する。全てのドメインで保存されているアミノ酸残基は、E、D、A、B、および、Cドメインのアミノ酸配列を比較した時に、同じ位置に存在する同じアミノ酸残基を意味する。図1の配列比較表に示すように、A、B、および、Cドメインの26~39位、Eドメインの24~37位、Dドメインの29~42位のアミノ酸残基は、全てのドメインにおいて保存されている。全てのドメインで保存されている具体的なアミノ酸残基としては、例えば、A、B、および、Cドメインの31~37位のアミノ酸、Eドメインの29~35位のアミノ酸、またはDドメインの34~40位のアミノ酸が挙げられる。さらに、Cドメインの33位に対応するSer、Cドメインの35位に対応するLys、Cドメインの36位に対応するAsp、およびCドメインの37位に対応するAspであることが好ましい。特に、Cドメインの33位に対応するSerであることがより好ましいが、これらに限定されるものではない。なお、対応するとは、図1に示すようにプロテインAのE、D、A、B、および、Cドメインをアラインした時に、縦列に同じ位置となることをいう。一般に、アミノ酸配列が高度に保存されている領域はタンパク質の機能に重要な領域であることが多く、そのような領域に変異を導入するとタンパク質の機能が失われることが多い。しかし、前記の領域においてはアミノ酸配列が高度に保存されているにもかかわらず、変異を導入しても、免疫グロブリンのFc領域への結合能に多大な影響を及ぼさずに、免疫グロブリンのFab領域への結合能のみを大幅に低下させることができる。また、変異を導入する前のアミノ酸配列が、化学安定性が高いドメイン、または、その変異体である場合、ドメインを構成するアミノ酸が60アミノ酸程度と少ないために、新たに変異を導入することで、化学安定性が低下することが多いことは、公知の事実である。例えば、Cドメインの30位に対するPheをAlaに置換した変異体は、アルカリに対する化学安定性が大きく低下するLinhultM.他、PROTEINS:Structure,Function,andBioinformatics、2004年、55巻、407-416。しかし、本発明におけるアミノ酸変異は、本来有する化学安定性を維持したままで、上述の効果を発揮することが可能である。アミノ酸置換変異は、元のアミノ酸を削除し、その位置に、種類の異なる別のアミノ酸を追加する変異のことを意味する。追加される別のアミノ酸は特に限定されるものではなく、例えば、天然のタンパク質構成アミノ酸、タンパク質非構成アミノ酸、非天然アミノ酸が挙げられる。この中でも、遺伝子工学的生産の観点から、天然アミノ酸を好適に用いることができる。天然アミノ酸としては、例えば、Ala、Phe、Val、Trp、Leu、Pro、Ile、Met、Gly、Asn、Ser、Gln、Thr、Tyr、Cys、Lys、His、Asp、GluおよびArgが挙げられ、特にGluまたはArgであることが好ましい。アミノ酸置換変異の数は、変異を含むタンパク質の、免疫グロブリンのFab領域に対する親和性が低下し、免疫グロブリン全体に対する親和性が維持されていれば特に限定されないが、変異導入前のタンパク質の立体構造の維持という観点からは、4個以下であることが好ましく、2個以下であることがより好ましい。なお、アミノ酸を置換する変異の表記について、置換位置の番号の前に、野生型、または、非変異型のアミノ酸を付し、置換位置の番号の後に、変異したアミノ酸を付して表記する。例えば、29位のGlyをAlaに置換する変異は、G29Aと記載する。アミノ酸置換変異を、上述の全てのドメインで保存されているアミノ酸部位に導入する場合、導入例としては、例えば、Cドメインの33位に対応するSerをGlu、Leu又はThrに置換する変異、Cドメインの35位に対応するLysをArgに置換する変異、Cドメインの36位に対応するAspをArg又はIleに置換する変異、および、Cドメインの37位に対応するAspをGluに置換する変異が挙げられる。特に、Cドメインの33位に対応するSerをGluに置換する変異であることが好ましいが、これらに限定されるものではない。アミノ酸置換変異を導入して得られるタンパク質は、プロテインAのE、D、A、B、および、Cドメインのいずれかの野生型アミノ酸配列と、好ましくは85以上、より好ましくは90以上のアミノ酸の配列同一性を有し、Fc領域への結合能を有する。本発明のタンパク質は、アミノ酸置換変異が導入された単一のドメインのみからなるタンパク質であってもよいが、前記のタンパク質を2個以上連結して、複数ドメインからなるタンパク質とすることもできる。複数ドメインからなるタンパク質である場合、連結するタンパク質は、同種のドメインに由来するタンパク質ホモダイマー、ホモトリマー等のホモポリマーであってもよいし、種類の異なるドメインに由来するタンパク質ヘテロダイマー、ヘテロトリマー等のヘテロポリマーであってもよい。連結するタンパク質の数は、2個以上であることが好ましく、2~10個であることがより好ましく、2~5個であることがさらに好ましい。複数ドメインからなるタンパク質において、単量体タンパク質同士、単ドメイン同士の連結のされ方としては、リンカーとなるアミノ酸残基を介さずに連結する方法、または、1または複数のアミノ酸残基で連結する方法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。連結するアミノ酸残基数に特に制限は無い。連結様式および連結数は、単量体タンパク質の3次元立体構造を不安定化しないものであれば、特に限定されない。また、前記タンパク質、または前記複数ドメインからなるタンパク質を1つの構成成分として、機能の異なる他のタンパク質と融合されている融合タンパク質も、本発明のタンパク質に含まれる。融合タンパク質の例としては、アルブミンやGSTグルタチオンS-トランスフェラーゼ、MBPマルトース結合タンパク質が融合したタンパク質を例として挙げることができるが、これに限定されるものではない。GST、MBPとの融合タンパク質として発現することにより、タンパク質の精製を容易にすることができる。また、DNAアプタマーなどの核酸、抗生物質などの薬物、PEGポリエチレングリコールなどの高分子が融合されている場合も、本発明と同じ効果を奏するものであれば、本発明のタンパク質に含まれる。本発明は、上述のタンパク質をコードするDNAにも関する。DNAは、それを構成する塩基配列を翻訳したアミノ酸配列が、本発明のタンパク質を構成するものであればよい。そのような塩基配列は、通常用いられる公知の方法、例えば、ポリメラーゼチェーンリアクション以下、PCRと略す法を利用して取得できる。また、公知の化学合成法で合成することも可能であり、さらに、DNAライブラリーから得ることもできる。当該塩基配列は、コドンが縮重コドンで置換されていても良く、翻訳されたときに同一のアミノ酸をコードしている限り、本来の塩基配列と同一である必要性は無い。本発明のDNAは、野生型または変異型のプロテインAのドメインをコードする従来公知のDNAに対して、部位特異的に変異を導入することにより得られる。部位特異的な変異の導入は、以下のように、組み換えDNA技術、PCR法等を用いて行うことができる。組み換えDNA技術による変異の導入は、例えば、本発明のタンパク質をコードする遺伝子中において、変異導入を希望する目的の部位の両側に適当な制限酵素認識配列が存在する場合に、それら制限酵素認識配列部分を前記制限酵素で切断し、変異導入を希望する部位を含む領域を除去した後、化学合成等によって目的の部位のみに変異導入したDNA断片を挿入するカセット変異法によって行うことができる。また、PCRによる部位特異的変異の導入は、例えば、タンパク質をコードする二本鎖プラスミドを鋳型として、および-鎖に相補的な変異を含む2種の合成オリゴプライマーを用いてPCRを行うダブルプライマー法により、行うことができる。また、複数ドメインからなるタンパク質をコードするDNAは、本発明の単量体タンパク質1つのドメインをコードするDNAを、意図する数だけ直列に連結することにより作製することができる。例えば、複数ドメインからなるタンパク質をコードするDNAの連結方法は、DNA配列に適当な制限酵素部位を導入し、制限酵素で断片化した2本鎖DNAをDNAリガーゼで連結することができる。制限酵素部位は1種類でもよいが、複数の異なる種類の制限酵素部位を導入することもできる。或いは、複数ドメインからなるタンパク質をコードするDNAは、プロテインAをコードするDNA例えば、国際公開第06/004067号公報に上記の変異導入法を適用することで作製することも可能である。ここで、複数ドメインからなるタンパク質をコードするDNAにおいて、各々の単量体タンパク質をコードする塩基配列が同一の場合には宿主にて相同組み換えを誘発する可能性があるので、連結されている単量体タンパク質をコードするDNAの塩基配列間の配列同一性が90以下、より好ましくは85以下であることが好ましい。本発明のベクターは、前述したタンパク質または複数ドメインからなるタンパク質をコードする塩基配列、およびその塩基配列に作動可能に連結された宿主で機能しうるプロモーターを含む。通常は、前述したタンパク質をコードするDNAを、ベクターに連結もしくは挿入することにより得ることができる。遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で自律複製可能なものであれば特に限定されず、プラスミドDNAやファージDNAをベクターとして用いることができる。遺伝子を挿入するためのベクターは、例えば、大腸菌を宿主として用いる場合には、pQE系ベクターキアゲン社製、pET系ベクターメルク社製、および、pGEX系ベクターGEヘルスケアジャパン株製のベクターなどが挙げられる。ブレビバチルス属細菌を宿主として用いる場合には、例えば、枯草菌ベクターとして公知であるpUB110、または、pHY500特開平2-31682号公報、pNY700特開平4-278091号公報、pNU211R2L5特開平7-170984号公報、pHT210特開平6-133782号公報、または、大腸菌とブレビバチルス属細菌とのシャトルベクターであるpNCMO2特開2002-238569号公報などを使用することができる。ベクターで宿主を形質転換することにより、形質転換体を得ることができる。宿主としては、特に限定されるものではないが、安価に大量生産する上では、大腸菌、枯草菌、ブレビバチルス属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、ストレプトマイセス属Streptomyces、コリネバクテリウム属Corynebacterium等のバクテリア真正細菌を好適に使用しうる。より好ましくは、枯草菌、ブレビバチルス属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、ストレプトマイセス属Streptomyces、コリネバクテリウム属Corynebacterium等のグラム陽性菌がよい。さらに好ましくは、プロテインAの大量生産への適応例国際公開第06/004067号公報が公知である、ブレビバチルス属細菌がよい。ブレビバチルス属細菌としては、特に限定されないが、例えば、Brevibacillusagri、B.borstelensis、B.brevis、B.centrosporus、B.choshinensis、B.formosus、B.invocatus、B.laterosporus、B.limnophilus、B.parabrevis、B.reuszeri、B.thermoruberが挙げられる。好ましくは、ブレビバチルスブレビス47株JCM6285、ブレビバチルスブレビス47K株FERMBP-2308、ブレビバチルスブレビス47-5Q株JCM8970、ブレビバチルスチョウシネンシスHPD31株FERMBP-1087およびブレビバチルスチョウシネンシスHPD31-OK株FERMBP-4573が挙げられる。生産量の向上などの目的に応じて、上記ブレビバチルス属細菌のプロテアーゼ欠損株、高発現株、または、芽胞形成能欠失株のような変異株または、誘導株を使用しても良い。具体的に挙げれば、ブレビバチルスチョウシネンシスHPD31由来のプロテアーゼ変異株であるブレビバチルスチョウシネンシスHPD31-OK特開平6-296485号公報や、芽胞形成能を有しないブレビバチルスチョウシネンシスHPD31-SP3国際公開第05/045005号公報が使用できる。宿主細胞へのベクターの導入方法としては、例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、アグロバクテリウム感染法、パーティクルガン法、または、ポリエチレングリコール法などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、得られた遺伝子の機能を宿主で発現する方法としては、本発明で得られた遺伝子をゲノム染色体に組み込む方法なども挙げられる。上記の形質転換体、またはDNAを用いた無細胞タンパク質合成系により、タンパク質を製造することができる。形質転換体を用いてタンパク質を製造する場合、形質転換細胞を培地で培養し、培養菌体中菌体ぺリプラズム領域中も含む、または、培養液中菌体外に本発明のタンパク質を生成蓄積させることにより製造することができ、該培養物から所望のタンパク質を採取することができる。形質転換細胞を用いてタンパク質を製造する場合には、形質転換体の細胞内および/またはペリプラズム領域内にタンパク質を蓄積することも可能である。この場合、細胞内に蓄積すると、発現タンパク質の酸化を防ぐことができ、培地成分との副反応もない点で有利であり、ペリプラズム領域内に蓄積すると、細胞内プロテアーゼによる分解を抑えることができる点で有利である。一方、タンパク質を製造する場合に、形質転換体の細胞外にタンパク質を分泌することも可能である。この場合、菌体破砕や抽出の工程が不要となるため、製造コストが抑えられる点で有利である。本発明の形質転換細胞を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。得られた形質転換体の培養に用いる培地は、該タンパク質を高効率、高収量で生産できるものであれば特に制限は無い。具体的には、グルコース、蔗糖、グリセロール、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸などの炭素源や窒素源を使用することが出来る。その他、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マグネシウム塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩等の無機塩類が必要に応じて添加される。栄養要求性の宿主細胞を用いる場合は、生育に要求される栄養物質を添加すればよい。また、必要であればペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、ネオマイシンなどの抗生物質が添加されても良い。さらに、菌体内外に存在する宿主由来のプロテアーゼによる当該目的タンパク質の分解、低分子化を抑えるために、公知の各種プロテアーゼ阻害剤、すなわち、PhenylmethanesulfonylfluoridePMSF、Benzamidine、4-2-aminoethyl-benzenesulfonylfluorideAEBSF、Antipain、Chymostatin、Leupeptin、PepstatinA、Phosphoramidon、Aprotinin、EthylenediaminetetraaceticacidEDTA、および/または、その他市販されているプロテアーゼ阻害剤を適当な濃度で添加しても良い。さらに、本発明のタンパク質を正しくフォールディングさせるために、例えば、GroEL/ES、Hsp70/DnaK、Hsp90、Hsp104/ClpBなどの分子シャペロンを利用しても良い。この場合、例えば、共発現、または、融合タンパク質化などの手法で、本発明のタンパク質と共存させることができる。なお、本発明のタンパク質の正しいフォールディングを目的とする場合には、正しいフォールディングを助長する添加剤を培地中に加える、および、低温にて培養するなどの手法もあるが、これらに限定されるものではない。大腸菌を宿主として得られた形質転換細胞を培養する培地としては、LB培地トリプトン1、酵母エキス0.5、NaCl1、または、2xYT培地トリプトン1.6、酵母エキス1.0、NaCl0.5等が挙げられる。ブレビバチルス属細菌を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、TM培地ペプトン1、肉エキス0.5、酵母エキス0.2、グルコース1、pH7.0、または、2SL培地ペプトン4、酵母エキス0.5、グルコース2、pH7.2等が挙げられる。また、培養温度は、15~42°C、好ましくは20~37°Cで、通気攪拌条件で好気的に数時間~数日培養することにより本発明のタンパク質を、培養細胞内ぺリプラズム領域内を含む、または、培養溶液細胞外に蓄積させて回収する。場合によっては、通気を遮断し嫌気的に培養してもよい。組み換えタンパク質が分泌生産される場合には、培養終了後に、遠心分離、ろ過などの一般的な分離方法で、培養細胞と分泌生産されたタンパク質を含む上清を分離することにより生産された組み換えタンパク質を回収することができる。また、培養細胞内ぺリプラズム領域内を含むに蓄積される場合にも、例えば、培養液から遠心分離、ろ過などの方法により菌体を採取し、次いで、この菌体を超音波破砕法、フレンチプレス法などにより破砕し、および/または、界面活性剤等を添加して可溶化することにより、細胞内に蓄積生産されたタンパク質を回収することができる。本発明のタンパク質を無細胞タンパク質合成系により製造する場合、無細胞タンパク質合成系としては、特に限定されず、例えば、原核細胞由来、植物細胞由来、高等動物細胞由来の合成系などを使用することができる。本発明のタンパク質の精製はアフィニティークロマトグラフィー、陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等を単独でまたは適宜組み合わせることによって行うことができる。得られた精製物質が目的のタンパク質であることの確認は、通常の方法、例えばSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動、N末端アミノ酸配列分析、ウエスタンブロッティング等により行うことができる。上記の方法により生産したタンパク質を、水不溶性の基材からなる担体にアフィニティーリガンドとして固定化して、アフィニティー分離マトリックスを製造することができる。ここで、アフィニティーリガンドとは、抗原と抗体の結合に代表される、特異的な分子間の親和力に基づいて、ある分子の集合から目的の分子を選択的に捕集結合する物質官能基を指す用語であり、本発明においては、免疫グロブリンに対して特異的に結合するタンパク質を指す。本明細書においては、単にリガンドと表記した場合も、アフィニティーリガンドと同意である。本発明に用いる水不溶性の基材からなる担体としては、ガラスビーズ、シリカゲルなどの無機担体、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレンなどの合成高分子や、結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストランなどの多糖類からなる有機担体、さらにはこれらの組み合わせによって得られる有機-有機、有機-無機などの複合担体などが挙げられる。市販品としては、多孔質セルロースゲルであるGCL2000、アリルデキストランとメチレンビスアクリルアミドを共有結合で架橋したSephacrylS-1000、メタクリレート系の担体であるToyopearl、アガロース系の架橋担体であるSepharoseCL4B、および、セルロース系の架橋担体であるCellufineなどを例示することができる。ただし、本発明における水不溶性担体は、例示したこれらの担体のみに限定されるものではない。また、本発明に用いる水不溶性担体は、本アフィニティー分離マトリックスの使用目的および方法からみて、表面積が大きいことが望ましく、適当な大きさの細孔を多数有する多孔質であることが好ましい。担体の形態としては、ビーズ状、モノリス状、繊維状、膜状中空糸を含むなどいずれも可能であり、任意の形態を選ぶことができる。リガンドの固定化方法については、例えば、リガンドに存在するアミノ基、カルボキシル基、または、チオール基を利用した、従来のカップリング法で担体に結合して良い。カップリング法としては、担体を臭化シアン、エピクロロヒドリン、ジグリシジルエーテル、トシルクロライド、トレシルクロライド、ヒドラジン、および、過ヨウ素酸ナトリウムなどと反応させて担体を活性化しあるいは担体表面に反応性官能基を導入し、リガンドとして固定化する化合物とカップリング反応を行い固定化する方法、また、担体とリガンドとして固定化する化合物が存在する系にカルボジイミドのような縮合試薬、または、グルタルアルデヒドのように分子中に複数の官能基を持つ試薬を加えて縮合、架橋することによる固定化方法が挙げられる。また、リガンドと担体の間に複数の原子からなるスペーサー分子を導入しても良いし、担体にリガンドを直接固定化しても良い。したがって、固定化のために、本発明のタンパク質に対して、化学修飾しても良いし、固定化に有用なアミノ酸残基を加えても良い。固定化に有用なアミノ酸としては、側鎖に固定化の化学反応に有用な官能基を有しているアミノ酸が挙げられ、例えば、側鎖にアミノ基を含むLysや、側鎖にチオール基を含むCysが挙げられる。本発明の本質は、本発明においてタンパク質に付与した効果が、該タンパク質をリガンドとして固定化したマトリックスにおいても同様に付与されることにあり、固定化のためにいかように修飾改変しても、本発明の範囲に含まれる。アフィニティー分離マトリックスは、本発明のタンパク質を固定化して得られるので、本発明のタンパク質自体の活性に基づき、免疫グロブリンのFc領域を含むタンパク質に結合することができる。よって、本発明のタンパク質およびアフィニティー分離マトリックスを利用して、免疫グロブリンのFc領域を含むタンパク質をアフィニティーカラムクロマトグラフィ精製法により分離精製することが可能となる。免疫グロブリンのFc領域を含むタンパク質とは、プロテインAが結合するFc領域側の部位を含むタンパク質のことである。ただし、プロテインAが結合できれば、Fc領域を完全に含むタンパク質である必要はない。免疫グロブリンのFc領域を含むタンパク質としては、免疫グロブリンG、または、免疫グロブリンG誘導体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。免疫グロブリンのFc領域を含むタンパク質の具体例として、VH3サブファミリーに属するIgGが挙げられ、特に、VH3サブファミリーに属するヒトIgGモノクローナル抗体が挙げられる。本発明のタンパク質およびアフィニティー分離マトリックスは、VH3サブファミリーに属するIgGのFab領域に対する親和性が、変異を導入する前のタンパク質に比べて低下していることが好ましく、同時に、サブタイプが1、2、および、4であるIgGのFc領域に親和性を有することが好ましい。ヒトのVH生殖細胞遺伝子のほぼ半分がVH3サブファミリーに属し、実際にVH3サブファミリーに属するIgG抗体からなる医薬が市販中開発中である。さらに、抗体精製においてアフィニティー分離マトリックスに使用されるリガンドにVH3サブファミリーに属する免疫グロブリンのFab領域への結合能が残っていることが、抗体の酸解離特性に悪影響を与えることは、すでに文献等によって公知の情報と言えるGhoseS.他、Biotechnologyandbioengineering、2005年、92巻、6号。したがって、本発明のタンパク質およびアフィニティー分離マトリックスは、VH3サブファミリーに属するヒトIgGのFab領域への結合能が低減していることが好ましい。前記免疫グロブリンG誘導体とは、例えば、ヒト免疫グロブリンGの一部のドメインを他生物種の免疫グロブリンGのドメインに置き換えて融合させたキメラ型免疫グロブリンGや、ヒト免疫グロブリンGのCDRComplementarityDeterminigRegions部分を他生物種抗体のCDR部分に置き換えて融合させたヒト型化免疫グロブリンG、Fc領域の糖鎖に分子改変を加えた免疫グロブリンG、ヒト免疫グロブリンGのFv領域とFc領域とを融合させた人工免疫グロブリンGなどの、プロテインAが結合し得る改変型人工タンパク質を総称する名称である。また、結合する領域をFab領域特にFv領域、および、Fc領域、というように広く定義したが、抗体の立体構造はすでに既知であるので、本発明のタンパク質およびアフィニティー分離マトリックスが結合する対象となるタンパク質は、タンパク質工学的にプロテインAが結合する領域の立体構造を保持した上で、Fab領域やFc領域にさらなる改変断片化などが施されたものであってもよい。本発明のアフィニティー分離マトリックスを充填したアフィニティーカラムを使用して免疫グロブリンのFc領域を含むタンパク質を精製する方法は、すでに市販品として存在するプロテインAカラムを用いたアフィニティーカラムクロマトグラフィ精製法に準じる非特許文献3。すなわち、免疫グロブリンのFc領域を含むタンパク質を含有する緩衝液を中性となるように調整した後、該溶液を本発明のアフィニティー分離マトリックスを充填したアフィニティーカラムに通過させ、免疫グロブリンのFc領域を含むタンパク質を吸着させる。次いで、アフィニティーカラムに純粋な緩衝液を適量通過させ、カラム内部を洗浄する。この時点では所望の免疫グロブリンのFc領域を含むタンパク質はカラム内の本発明のアフィニティー分離マトリックスに吸着されている。次いで、適切なpHに調整した酸性緩衝液該マトリックスからの解離を促進する物質を含む場合もあるをカラムに通液し、所望の免疫グロブリンのFc領域を含むタンパク質を溶出することにより、高純度な精製が達成される。本発明のアフィニティー分離マトリックスは、リガンド化合物や担体の基材が完全に機能を損なわない程度の、適当な強酸性、または、強アルカリ性の純粋な緩衝液適当な変性剤、または、有機溶剤を含む溶液の場合もあるを通過させて洗浄することにより、再利用が可能である。本発明のタンパク質およびそれを使用したアフィニティー分離マトリックスは、免疫グロブリンに対する親和性を有し、免疫グロブリンのFab領域に対する親和性は低下するという効果を奏する。一般的には、プロテインAの各々のドメインは、FabFv領域よりもFc領域に対してより強く結合する非特許文献3。したがって、プロテインA、および、各々のドメインの免疫グロブリンに対する親和性は、本質的にはFc領域に対する親和性を指す表現であり、Fab領域に対する結合力のみが変化しても、免疫グロブリンに対する親和性の強さは大きく変化しない。本発明のタンパク質は、プロテインAの免疫グロブリン結合ドメインが有する、Fab領域への2次的な親和性が低下しており、免疫グロブリンとの相互作用における2次的な結合の影響を排除できるという効果を奏する。一方で、Fc領域への親和性は維持されているので、免疫グロブリン全体に対する親和性は維持されている。本発明のタンパク質が有する免疫グロブリンに対する親和性は、ヒト免疫グロブリンG製剤に対する親和性を後述のBiacoreシステムにより測定した時に、親和定数KAが106M-1以上であることが好ましく、107M-1以上であることがより好ましい。本発明のタンパク質およびアフィニティー分離マトリックスの、免疫グロブリンのFc領域を含むタンパク質に対する親和性は、例えば、表面プラズモン共鳴原理を用いたBiacoreシステムGEヘルスケアジャパン株製などのバイオセンサーによって試験することができるが、これに限定されるものではない。測定条件としては、プロテインAが免疫グロブリンのFc領域に結合した時の結合シグナルが検出できる条件であれば良く、温度20~40°C一定温度にて、pH6~8の中性条件にて測定することで簡単に評価することができる。結合相手の免疫グロブリン分子は、Fab領域への結合が検出できれば特に限定はされないが、Fc領域を含む免疫グロブリン分子を用いるとFc領域への結合も検出されるので、Fc領域を除くようにFab領域を断片化した免疫グロブリン分子Fabフラグメント、Fvフラグメントを用いることが好ましい。さらには、Fab領域へのプロテインAの結合がすでに確認されている、VH3サブファミリーに属する免疫グロブリンのFabフラグメントがより好ましい。親和性の違いは、同じ測定条件にて、同じ免疫グロブリン分子に対する結合反応曲線を得て、解析した時に得られる結合パラメータにて、変異を導入する前のタンパク質と変異を導入した後のタンパク質とを比較することで当業者が容易に検証することができる。ここで、親和性の違いを比較する両者の配列は、変異部位以外の配列は同一である必要があり、例えば、変異D36Rの効果を評価する場合に、変異を導入する前のタンパク質のアミノ酸配列がBドメインで、変異を導入した後のタンパク質のアミノ酸配列がCドメインに変異D36Rを導入した配列であれば、その比較は不適切である。結合パラメータとしては、例えば、親和定数KAや解離定数KDを用いることができる永田他著、生体物質相互作用のリアルタイム解析実験法、シュプリンガーフェアラーク東京、1998年、41頁。本発明の各ドメインの変異体とFabの親和定数は、Biacoreシステムを利用して、センサーチップにVH3サブファミリーに属する免疫グロブリンのFabフラグメントを固定化して、温度25°C、pH7.4の条件下にて、各ドメイン変異体を流路添加する実験系で求めることができる。本発明に係る変異を導入した配列を有するタンパク質について、該タンパク質の親和定数KAが、該変異を導入する前の配列を有するタンパク質に比べて、1/2以下に低下したタンパク質を好適に用いることができ、より好ましくは1/5以下、さらにより好ましくは1/10以下に低下したタンパク質を好適に用いることができる。なお、文献によっては親和定数は結合定数と表記されることもあるが、基本的に両者の定義は同じである。29位のGlyをAlaに置換したCドメイン変異体のFabに対するKAが、通常1×104~1×105M-1であるところ、29位のGlyをAlaに置換した変異、および、本発明に係る変異を導入したCドメイン変異体について、KAが1×104M-1未満に低下した該変異体を本発明に好適に用いることができ、KAが0.5×104M-1以下の該変異体をより好適に用いることができる。なお、上記のKAの測定においては、免疫グロブリンGをパパインによってFabフラグメントとFcフラグメントに断片化して得たFab、または、遺伝子工学的な手法によって得られた、免疫グロブリンGのFab領域のみを発現する生産系を用いて調製したFabを使用することができる。本発明のアフィニティー分離マトリックスは、免疫グロブリンのFab領域への結合能が低下しているという性質を有するため、抗体を酸性溶液で溶出する工程において、抗体を解離する特性に優れる。具体的には、より中性側の酸性溶出条件による溶出を可能とすることで、酸性条件下での抗体へのダメージを抑制する効果が得られる。より中性側の酸性溶出条件とは、具体的には、通常の酸性溶出条件であるpH2.0~3.5程度に対し、pH3.0~5.0程度のより中性側の酸性溶出条件のことであり、この条件下で溶出すると、抗体へのダメージが小さいGhoseS.他、Biotechnologyandbioengineering、2005年、92巻、6号。優れた抗体酸解離特性とは、より中性側の酸性溶出条件で解離される、抗体を酸性条件下で溶出させたときの溶出ピークプロファイルがよりシャープである、といった特性を指す。クロマトグラフィーの溶出ピークプロファイルがよりシャープになることで、より少ない容量の溶出液でより高濃度の抗体含有溶出液を回収可能とすることができる。また、本発明のアフィニティー分離マトリックスを用いることにより、Fc領域を含む分子とFab領域のみを含む分子からなる混合物から、Fab領域を素通り画分として容易に分離回収することが可能となる。以下に実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。実施例で取得した各種タンパク質について、ドメインを示すアルファベット-導入した変異野生型ではwildの形で表記する。例えば、プロテインAの野生型CドメインはC-wild、変異G29Aを導入したCドメイン変異体はC-G29Aという形で表記する。2種類の変異を同時に導入した変異体の表記については、スラッシュを用いて併記する。例えば、変異G29A、および、変異S33Eを導入したCドメイン変異体については、C-G29A/S33Eという形で表記する。また、単ドメインを複数連結したタンパク質については、ピリオドをつけて、連結した数にdをつけて併記する。例えば、変異G29A、および、変異S33Eを導入したCドメイン変異体を5連結したタンパク質は、C-G29A/S33E.5dと表記する。[実施例1]C-G29A.5dをコードするDNAの調製C-G29Vを5連結したタンパク質のアミノ酸配列C-G29V.5d、配列番号11から逆翻訳を行い、該タンパク質をコードする塩基配列を設計した。該タンパク質のコドン使用頻度が、ブレビバチルスチョウシネンシスHPD31株で大量に発現している細胞表層タンパク質であるHWPEbisuS.著、J.Bacteriol.、1990年、172号、1312-1320頁のコドン使用頻度に近くなるように、かつ、5個の各ドメイン間での塩基配列の配列同一性が低くなるように考慮して、コドンを分配した。また、5連結ドメインをコードする配列の5’側にPstI、および、3’側にXbaIの制限酵素認識部位を作製した。DNA断片の作製はタカラバイオ社に依頼した。作製したDNA断片の配列を配列番号12に記した。作製したC-G29V.5dをコードするDNA断片をPstIおよびXbaIともにタカラバイオ社製で消化し、アガロースゲル電気泳動で分画、精製した。一方、ブレビバチルス属細菌用のプラスミドベクターであるpNK3262を、PstIおよびXbaIにより消化後、精製回収し、さらに、アルカリフォスファターゼタカラバイオ社製処理により脱リン酸化処理を行った。両者を混合後、LigationHigh東洋紡績社製を用いて連結して、C-G29V.5d発現プラスミドベクターpNK3262-C-G29V.5dを構築した。前記操作により得られたプラスミドベクターを用いて、ブレビバチルスチョウシネンシスFY-1株の形質転換を行った。形質転換は、公知の方法による電気導入法にて実施したBiosci.Biotech.Biochem.、1997年、61号、202-203頁。なお、ブレビバチルスチョウシネンシスFY-1株は、ブレビバチルスチョウシネンシスHPD31-OK株特開平6-296485号公報に変異処理をして得られたPheTyr要求性株である。作製したプラスミドpNK3262-C-G29V.5dから、C-G29V.5dをコードする遺伝子を5分割し、各ドメインのVal-29を含むようにDNA断片を調製した。各ドメインについてN末端側から順に1~5の番号を付与する。ドメイン1はPstIとNarI、ドメイン2はNarIとHindIII、ドメイン3はHindIIIとMluI、ドメイン4はMluIとBglII、ドメイン5はBglIIとXbaINarIのみ東洋紡績社製、他はタカラバイオ社製でそれぞれ消化し、アガロースゲルで分画精製して、各々のDNA断片を取得した。2種のクローニングベクター、pSL301Invitrogen社製、および、pUC19タカラバイオ社製を、各々のドメインをコードするDNA断片に使用したものと同じ2種類の制限酵素で消化し、上記のDNA断片と混合後、LigationHighで連結して、5分割したDNA断片を有するプラスミドを構築した。各々のプラスミドについて、ドメインにつけた番号に対応させ、pUC19-V29-d1、pUC19-V29-d2、pSL301-V29-d3、pSL301-V29-d4、pSL301-V29-d5と表記する。各々のC-G29V.5dコード領域のDNA断片の配列制限酵素認識部位含むを、配列番号13~17に示した。pUC19-V29-d1、pUC19-V29-d2、pSL301-V29-d3、pSL301-V29-d4、pSL301-V29-d5を鋳型として、配列番号18~27のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてクイックチェンジ法を実施し、各ドメインのVal-29がAlaに置換されたC-G29AのDNA断片を含むプラスミドpUC19-A29-d1、pUC19-A29-d2、pSL301-A29-d3、pSL301-A29-d4、pSL301-A29-d5を作製し、5個の断片を順次LigationHighにより連結して、C-G29A.5d配列番号28をコードするDNA断片配列番号29を有する発現プラスミドpNK3262-C-G29A.5dを調製し、FY-1組み換え菌の形質転換を実施した。クイックチェンジ法は、DNAポリメラーゼのPfuTurbo、および、メチル化DNA鋳型DNA切断酵素DpnIともにStratagene社製を用い、Stratagene社のプロトコルに従い実施した。例えば、配列番号13のDNA断片を含むプラスミドpUC19-V29-d1に対して、配列番号18、および、配列番号19の2本の合成DNAプライマーを用いて、クイックチェンジ法を実施し、ドメイン1のVal-29がAlaに置換されたDNA断片を含むプラスミドpUC19-A29-d1を作製した。[実施例2]C-G29A/S33E.5d、C-G29A/D36R.5d、および、C-G29A/K35R/D37E.5dをコードするDNAの調製実施例1で作製した、C-G29AをコードするDNA断片を含む5種のプラスミド、pUC19-A29-d1、pUC19-A29-d2、pSL301-A29-d3、pSL301-A29-d4、pSL301-A29-d5を鋳型として、配列番号30~59のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、実施例1と同様に、クイックチェンジ法を利用した手法にて、C-G29A/S33E、C-G29A/D36R、および、C-G29A/K35R/D37EのDNA断片を含むプラスミドを作製した。そして、各種DNA断片を実施例1に記載の手法で連結し、C-G29A/S33E.5d配列番号60をコードするDNA断片配列番号61を有する発現プラスミドpNK3262-C-G29A/S33E.5d、C-G29A/D36R.5d配列番号62をコードするDNA断片配列番号63を有する発現プラスミドpNK3262-C-G29A/D36R.5d、および、C-G29A/K35R/D37E.5d配列番号64をコードするDNA断片配列番号65を有する発現プラスミドpNK3262-C-G29A/K35R/D37E.5dを、それぞれ調製し、FY-1組み換え菌の形質転換を実施した。なお、C-G29AをコードするDNA断片の連結の際に、制限酵素HindIIIを利用するが、HindIIIの認識配列と変異導入部位が近接しているので、変異未導入のドメイン2をコードするDNA断片と、変異を導入したドメイン3をコードするDNA断片を、HindIII部位で連結したプラスミドを調製した後で、ドメイン2をコードする領域に該当する変異を導入した。また、pNK3262-C-G29A/S33E.5dを鋳型プラスミドとして、配列番号66~67のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、C-G29A/S33E.4d配列番号68をコードするDNA断片配列番号69をPCRにより増幅した。このDNA断片をPstIとXbaIで消化し、同じ酵素で消化したベクターpNK3262に挿入して、発現プラスミドpNK3262-C-G29A/S33E.4dを調製し、FY-1組み換え菌の形質転換を実施した。[実施例3]DNAの配列確認実施例1~2で得られた、各々の発現プラスミドDNA塩基配列の確認は、DNAシークエンサー3130xlGeneticAnalyzerAppliedBiosystems社製を用いて行った。BigDyeTerminatorv.1.1CycleSequencingKitAppliedBiosystems社製を用いて、付属のプロトコルに従い、各々のプラスミドDNAのシークエンシングPCR反応を行い、そのシークエンシング産物を精製し、配列解析に用いた。シークエンシングに用いたオリゴヌクレオチドプライマーの配列については省略する。[実施例4]発現組み換え菌の目的タンパク質発現実施例1~2により得られた、各種ブレビバチルスチョウシネンシスFY-1組み換え菌を、60μg/mLのネオマイシンを含む5mLの3YC培地ポリペプトン3、酵母エキス0.2、グルコース3、硫酸マグネシウム0.01、硫酸鉄0.001、塩化マンガン0.001、塩化亜鉛0.0001にて、30°Cで3日間の振盪培養を行った。培養物を遠心処理して菌体を分離し、得られた培養上清から、SPFastFlowカラムGEヘルスケアジャパン株製を利用した陽イオン交換クロマトグラフィーにて、目的のタンパク質を精製粗精製した。具体的には、酢酸ナトリウムを終濃度50mMになるように添加し、さらに塩酸でpH4.0に調整した培養上清を、陽イオン交換用緩衝液A50mMCH3COOH-CH3COONa,pH4.0にて平衡化したSPFastFlowカラムに添加し、陽イオン交換用緩衝液Aで洗浄後、陽イオン交換緩衝液Aと陽イオン交換緩衝液B50mMCH3COOH-CH3COONa,1MNaCl,pH4.0を利用した塩濃度勾配にて、途中に溶出される目的タンパク質を分取した。次に、DEAEFastFlowカラムGEヘルスケアジャパン株製を利用した陰イオン交換クロマトグラフィーにて、目的のタンパク質を精製した。具体的には、分取した目的タンパク質溶液を、超純水に透析し、陰イオン交換用緩衝液A50mMTris-HCl,pH8.0にて平衡化したDEAEFastFlowカラムに添加し、陰イオン交換用緩衝液Aで洗浄後、陰イオン交換緩衝液Aと陰イオン交換緩衝液B50mMTris-HCl,0.3MNaCl,pH8.0を利用した塩濃度勾配にて、途中に溶出される目的タンパク質を分取した。分取した目的タンパク質溶液を、再び超純水に透析し、目的タンパク質のみを含む水溶液を最終精製サンプルとした。なお、上記のカラムを用いたクロマトグラフィーによるタンパク質精製は、AKTAprimeplusシステムGEヘルスケアジャパン株製を利用して実施した。[実施例5]取得したタンパク質とヒト免疫グロブリンGヒトIgGとの親和性の解析表面プラズモン共鳴を利用したバイオセンサーBiacore3000GEヘルスケアジャパン株製を用いて、実施例4で取得した各種タンパク質の免疫グロブリンとの親和性を解析した。本実施例では、ヒト血漿から分画したヒト免疫グロブリンG製剤以後は、ヒトIgGと記するを利用した。ヒトIgGをセンサーチップに固定化し、各種タンパク質をチップ上に流して、両者の相互作用を検出した。ヒトIgGのセンサーチップCM5への固定化は、N-hydroxysuccinimideNHS、および、N-ethyl-N’-3-dimethylaminopropylcarbodiimidehydrochrorideEDCを用いたアミンカップリング法にて行い、ブロッキングにはEthanolamineを用いたセンサーチップや固定化用試薬は、全てGEヘルスケアジャパン株製。ヒトIgG溶液は、ガンマガードバクスター社製を標準緩衝液20mMNaH2PO4-Na2HPO4、150mMNaCl、pH7.4に1.0mg/mLになるよう溶解して調製した。ヒトIgG溶液を、固定化用緩衝液10mMCH3COOH-CH3COONa、pH4.5で100倍に希釈し、Biacore3000付属のプロトコルに従い、ヒトIgGをセンサーチップへ固定した。また、チップ上の別のフローセルに対して、EDC/NHSにより活性化した後にEthanolamineを固定化する処理を行うことで、ネガティブコントロールとなるリファレンスセルも用意した。各種タンパク質は、ランニング緩衝液20mMNaH2PO4-Na2HPO4、150mMNaCl、0.005P-20、pH7.4を用いて、10~1000nMの範囲で適宜調製し各々について、異なるタンパク質濃度の溶液を3種類調製、各々のタンパク質溶液を、流速20μL/minで30秒間センサーチップに添加した。測定温度25°Cにて、添加時結合相、30秒間、および、添加終了後解離相、60秒間の結合反応曲線を順次観測した。各々の観測終了後に、50mMNaOH15秒間を添加してセンサーチップを再生したセンサーチップ上に残った添加タンパク質の除去が目的であり、固定化したヒトIgGの結合活性がほぼ完全に戻ることを確認した。得られた結合反応曲線リファレンスセルの結合反応曲線を差し引いた結合反応曲線に対して、システム付属ソフトBIAevaluationを用いた1:1の結合モデルによるフィッティング解析を行い、結合速度定数kon、解離速度定数koff、親和定数KA=kon/koff、および、解離定数KD=koff/konを算出した。表1に示すように、各種タンパク質のヒトIgGに対する結合パラメータは、C-G29A.5d比較例1と同程度であった。具体的には、ヒトIgGに対する親和定数KAは、いずれのタンパク質に関しても、5.0×107M-1~5.0×108M-1の範囲に収まった。[実施例6]ヒト化モノクローナル抗体由来Fabフラグメントの調製本発明におけるFab領域への親和性については、免疫グロブリンのFc領域を含まないFabフラグメントを用いて調べた。ヒト化モノクローナルIgG製剤を原料として、これをパパインによって、FabフラグメントとFcフラグメントに断片化し、Fabフラグメントのみを分離精製することで調製した。ヒト化モノクローナルIgG製剤のハーセプチン中外製薬社製を、パパイン消化用緩衝液0.1MAcOH-AcONa、2mMEDTA、1mMシステイン、pH5.5に溶解し、PapainAgarosefrompapayalatexパパイン固定化アガロース、SIGMA社製を添加し、ローテーターで混和させながら、37°Cで約8時間インキュベートした。パパイン固定化アガロースから分離した反応溶液FabフラグメントとFcフラグメントが混在から、ResourceSカラムGEヘルスケアジャパン株製を利用したイオン交換クロマトグラフィーにより、Fabフラグメント以後、モノクローナルIgG-Fabと表記するを分離精製した。具体的には、イオン交換用緩衝液A50mMCH3COOH-CH3COONa,pH4.5で、pH4.5になるよう希釈した反応溶液を、イオン交換用緩衝液Aにて平衡化したResourceSカラムに添加し、イオン交換用緩衝液Aで洗浄後、イオン交換緩衝液Aとイオン交換緩衝液B50mMCH3COOH-CH3COONa,1MNaCl,pH4.5を利用した塩濃度勾配カラムに10カラムボリューム分の緩衝液を通液する際に、緩衝液Bの濃度を0から50に直線的に上げていくにて、途中に溶出されるモノクローナルIgG-Fabを分取した。分取したモノクローナルIgG-Fab溶液を、Superdex7510/300GLカラム平衡化および分離には標準緩衝液を使用を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにて精製し、モノクローナルIgG-Fab溶液を得た。なお、実施例4と同様に、クロマトグラフィーによるタンパク質精製は、AKTAprimeplusシステムを利用して実施した。[実施例7]取得した各種タンパク質のモノクローナルIgG-Fabとの親和性の解析実施例4で取得した各種タンパク質のIgG-Fabとの親和性の解析に関しても、実施例5と同様に、Biacore3000を用いて実施した。実施例6で得たモノクローナルIgG-Fabを、センサーチップCM5に固定化し、実施例4で得た各種タンパク質を、チップ上に流して相互作用を検出した。リファレンスセルには、ヒト血清アルブミンシグマアルドリッチ社製を固定化した。モノクローナルIgG-Fab、および、ヒト血清アルブミンの固定化方法は、実施例5と同様である。測定する各種タンパク質は、ランニング緩衝液20mMNaH2PO4-Na2HPO4、150mMNaCl、0.005P-20、pH7.4を用いて、各々について、4μM、8μM、16μM、32μM場合によって32μMは未調製の異なるタンパク質濃度の溶液を調製し、各々のタンパク質溶液を、流速20μL/minで30秒間センサーチップに添加した。測定温度25°Cにて、添加時結合相、30秒間、および、添加終了後解離相、60秒間の結合反応曲線を順次観測した。各々の観測終了後に、10mMNaOHを30秒間添加して、センサーチップを再生した。解析の方法は、実施例6と同様である。ただし、解析時に結合パラメータの1種であるRmax値は、定数としてフィッティングを行った。Rmax値は、固定化した分子の全てに添加した分子が結合した時のシグナル量であり、同一の分子モノクローナルIgG-Fabを固定化した本実験系では、この値が大きく変わることはあり得ない。しかし、結合シグナルが非常に弱い場合には、Rmaxが極端に小さな値になるような間違ったフィッティングがなされるために、Rmax値を定数としたフィッティングを行った。表2に示すように、各種タンパク質のモノクローナルIgG-Fabに対する結合パラメータは、C-G29A.5d比較例1に比べて有意に低かった。具体的には、モノクローナルIgG-Fabに対する親和定数KAは、いずれのタンパク質に関しても、C-G29A.5dに比べて1/10未満の値を示した。[実施例8]単ドメイン型各種変異体発現用形質転換細胞の調製実施例7で評価した変異に加え、この発明によって見出されたその他の変異について効率的に評価することを目的に、単ドメインレベルで各種変異体を調製した。変異を導入するタンパク質配列として、プロテインAのCドメインに由来するアミノ酸配列配列番号10、C-G29A.1dを選んだ。配列番号70に示したC-G29A.1dをコードするDNA配列を含む、GST融合タンパク質発現ベクターpGEX-6P-1GEヘルスケアジャパン株製を変異導入の鋳型プラスミドとした。鋳型プラスミドの調製方法は、公開特許文献国際公開第2010/110288号公報の記載に準ずる。上記2種類のプラスミドを鋳型として、配列番号71~80のオリゴヌクレオチドプライマーを用い、クイックチェンジ法にて、配列番号81~85に示す各種Cドメイン変異体C-G29A/S33L.1d、C-G29A/S33T.1d、C-G29A/D36I.1d、C-G29A/D36R.1d、C-G29A/D37E.1dをコードする各種発現プラスミドを得た。例えば、配列番号70のDNA配列を含む発現プラスミドpGEX-6P-1-C-G29A.1dを鋳型とし、配列番号71~72のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたクイックチェンジ法によって、配列番号81に示すCドメイン変異体C-G29A/S33L.1dが得られる。得られた発現プラスミドについては、実施例3と同様の手法にて、DNA配列を確認した。また、得られた各種発現プラスミドを用いて、実施例1と同様の手法にて、大腸菌HB101株タカラバイオ社製の形質転換を実施した。[実施例9]単ドメイン型各種変異体の発現精製実施例8で得られた各々の形質転換細胞は、各種変異体をGST融合タンパク質として発現する。これらの形質転換細胞を、アンピシリンを含むLB培地にて、37°Cで終夜培養した。これらの培養液を、2×YT培地アンピシリン含有に接種し、37°Cで約1時間培養した。終濃度0.1mMになるようIPTGイソプロピル1-チオ-β-D-ガラクシドを添加し、さらに、37°Cにて18時間培養した。培養終了後、遠心にて集菌し、EDTA0.5mMを含むPBS緩衝液に再懸濁した。超音波破砕にて細胞を破砕し、遠心分離して上清画分無細胞抽出液と不溶性画分に分画した。GST融合タンパク質を含む各々の無細胞抽出液から、GSTに対して親和性のあるGSTrapFFカラムGEヘルスケアジャパン株製を用いたアフィニティークロマトグラフィーにて、GST融合タンパク質を精製粗精製した。各々の無細胞抽出液をGSTrapFFカラムに添加し、標準緩衝液20mMNaH2PO4-Na2HPO4,150mMNaCl,pH7.4にてカラムを洗浄、続いて溶出用緩衝液50mMTris-HCl、20mMGlutathione、pH8.0にて目的のGST融合タンパク質を溶出した。溶出画分を限外ろ過によって標準緩衝液に置換した溶液を、最終精製サンプルとした。[実施例10]単ドメイン型各種変異体のモノクローナルIgG-Fabとの親和性の解析実施例9で得られた各種単ドメイン型変異体について、実施例7に記載の方法と同様に、モノクローナルIgG-Fabとの親和性をBiacoreにて測定し、各種変異を導入することによるIgG-Fab結合能の変化について解析した。ただし、タンパク質濃度を4μM280nmで同じ吸光度を示す濃度とした各種単ドメイン型変異体のセンサーグラムのみ測定した。得られたIgG-Fab結合センサーグラムを、図2に示した。各種タンパク質のモノクローナルIgG-Fabに対する結合レスポンスは、C-G29A.1d比較例3に比べて、有意に低く、検出できないレベルにまで低下していた。本発明によって得られた変異によって、Fab結合力が低下することを確認できた。なお、結合が検出できないレベルまで低下したので、親和定数の算出は行わなかった。[実施例11]C-G29A/S33E.5dのアルカリ耐性評価実施例4で取得したC-G29A/S33E.5dのアルカリ耐性について、アルカリ性条件下で一定時間インキュベートする処理を行った後の、ヒトIgGに対する結合量の低下度合いヒトIgGに対する残存結合活性を比較することで評価した。C-G29A/S33E.5dについて、アルカリ処理の前後におけるヒトIgGに対する結合量を、Biacore3000を用いて測定した。アルカリ処理に関しては、26.2μMの各種タンパク質10μLに対して、最終濃度が0.5Mとなるように0.625MNaOHを一定量加えて、30°Cにて8時間インキュベートした。その後、0.5MHClあらかじめpHが中性に戻ることを確認した一定容量を各種処理溶液に対して添加することで中和し、ランニング緩衝液20mMNaH2PO4-Na2HPO4、150mMNaCl、0.005P-20、pH7.4により2倍希釈して、アルカリ処理後のC-G29A/S33E.5d溶液を調製した。アルカリ処理前のC-G29A/S33E.5d溶液は、タンパク質濃度、溶液の組成が同じになるように、アルカリ処理時に加えるNaOH溶液、および、中和処理時に加えるHCl溶液を、あらかじめ混合させた溶液を、26.2μMのC-G29A/S33E.5d10μLに対して加えることで、調製した。センサーチップの準備ヒトIgGの固定化など、測定時のランニング緩衝液、測定温度、チップの再生処理に関しては、実施例7と同じである。アルカリ処理前、および、処理後のC-G29A/S33E.5d溶液を、流速20μL/minで150秒間センサーチップに添加した。添加時結合相、150秒間、および、添加終了後解離相、210秒間の結合反応曲線を順次観測した。解析方法は、実施例5と同様であるが、得られた結合パラメータの解釈について補足する。今回の解析方法では、アルカリ処理の前後でタンパク質濃度は同じであるが、ヒトIgGに対して結合活性があるタンパク質濃度は変わる。しかし、濃度を変数としてフィッティングすることは難しいので、濃度は処理前後で一定としてフィッティングを行った。このとき、IgGに対して結合活性があるタンパク質濃度の変化は、最大結合容量を示すパラメータRmaxに反映されるので、C-G29A/S33E.5dのアルカリ処理前のRmaxに対するアルカリ処理後のRmaxの相対値残存IgG結合活性[]を算出し、比較することで、アルカリ耐性の評価を行った。アルカリ処理後の残存IgG結合活性について、C-G29A.5d比較例1が85.4であったのに対し、C-G29A/S33E.5dが85.5であった。本発明の変異は、C-G29Aの優れたアルカリ耐性を損なうことなく効果を発揮することが可能であることを確認した。[実施例12]取得した各種タンパク質リガンドが固定化されたアフィニティー分離マトリックスの調製アフィニティー分離マトリックス1:メタクリレート系ポリマーベース水不溶性基材として、市販の活性化型アフィニティークロマトグラフィー用充填剤TOYOPEARLAF-Formyl-650M東ソー株製を使用した。この充填剤は、メタクリレート系ポリマーをベースとし、タンパク性リガンド固定化用のホルミル基が導入済みである。実施例4で取得したC-G29A/S33E.5dの最終精製サンプルをリガンドとして固定化し、アフィニティー分離マトリックス1を調製した。具体的には、充填剤5mLをグラスフィルター上で、クエン酸緩衝液0.25Mクエン酸三ナトリウム二水和物、pH9.0、NaOHを用いて調整で置換後、遠沈管内で全量を7.5mLとした。これにC-G29A/S33E.5d含有溶液64.6mg/mLを0.64mL加え、ミックスローターAZONE製ミックスローターMR-31-336-05にて、6°Cで4時間振とうした。その後、2.4Mクエン酸水溶液でpH3とし、6°Cで4時間振とうを継続した。続けて、5.5重量濃度のジメチルアミンボラン水溶液和光純薬工業社製を2.8mL加えて、25°C、18時間振とうした。この担体をグラスフィルター上、RO水を用いて、洗浄濾液の電気伝導度が5μS/cm以下になるまで洗浄し、アフィニティー分離マトリックスを調製した。アフィニティー分離マトリックス2:架橋アガロースベース水不溶性基材として、市販の活性化型プレパックカラムHitrapNHSactivatedHP1mLGEヘルスケアジャパン株製を使用した。このカラムは、架橋アガロースをベースとし、タンパク性リガンド固定化用のN-ヒドロキシスクシンイミドNHS基が導入済みである。概ね製品マニュアルに従う形で、実施例4で取得したC-G29A/S33E.4dの最終精製サンプルをリガンドとして固定化し、アフィニティー分離マトリックス2を調製した。具体的には、最終精製サンプルをカップリング緩衝液0.2M炭酸ナトリウム、0.5MNaCl、pH8.3で終濃度約6mg/mLに希釈した溶液を1mL調製した。氷浴で冷やした1mMHClを、流速1mL/minで2mL分流す操作を3回行い、カラム中のイソプロパノールを除去した。その後すぐに、先に調製したサンプル希釈溶液を同じ流速で1mL添加し、カラムの上下に栓をして25°Cで30分間静置することで、取得したタンパク質をカラムに固定化した。その後開栓し、カップリング緩衝液を同じ流速で3mL流して、未反応タンパク質を回収した。その後、ブロッキング用緩衝液0.5Mエタノールアミン、0.5MNaCl、pH8.3を2mL流す操作を3回実施し、洗浄用緩衝液0.1M酢酸、0.5MNaCl、pH4.0を2mL流す操作を3回実施し、最後に標準緩衝液20mMNaH2PO4-Na2HPO4、150mMNaCl、pH7.4を2mL流してアフィニティー分離カラムの作製を完了した。アフィニティー分離マトリックス3:セルロースベース水不溶性基材として、市販のゲル濾過用充填剤セルロファインGCL-2000-mチッソ株製を使用した。この充填剤は、架橋された多孔性セルロースをベースとする。実施例4で取得したC-G29A/S33E.5dの最終精製サンプルをリガンドとして固定化し、アフィニティー分離マトリックス3を調製した。具体的には、充填剤12mLをグラスフィルターTOP社製17G-2上にて、クエン酸緩衝液0.01Mクエン酸三ナトリウム二水和物-クエン酸一水和物、pH3で置換後、遠沈管内で液量を18mLとした。これに0.08gの過ヨウ素酸ナトリウム和光純薬工業社製をRO水に溶解させた水溶液6mLを加え、ミックスローターAZONE製ミックスローターMR-31-336-05にて、6°Cで約30分間振とうした。グラスフィルター上で、十分量のRO水で洗浄し、ホルミル基含有担体を得た。このホルミル基含有担体5mLをグラスフィルター上で、クエン酸緩衝液0.25Mクエン酸三ナトリウム二水和物、pH8.0、NaOHを用いて調整で置換後、遠沈管内で全量を8.5mLとした。C-G29A/S33E.5d含有溶液64.6mg/mLを0.64mL加え、0.4MNaOHでpH12とした後、ミックスローターにて、6°Cで4時間振とうした。その後、2.4Mクエン酸水溶液クエン酸1水和物でpH3とし、6°Cで4時間振とうを継続した。続けて、5.5重量濃度のジメチルアミンボラン水溶液を2.8mL加えて、25°C、18時間振とうした。この担体をグラスフィルター上、RO水を用いて、洗浄濾液の電気伝導度が5μS/cm以下になるまで洗浄し、アフィニティー分離マトリックスを得た。アフィニティー分離マトリックス4:セルロースベース-2水不溶性基材として、結晶性高架橋セルロースチッソ株製、米国公開第0062118号特開2009-242770により得られるゲルを使用した。実施例4で取得したC-G29A/S33E.5dの最終精製サンプルをリガンドとして固定化し、アフィニティー分離マトリックス4を調製した。具体的には、ゲル12mLを、グラスフィルター上にて、クエン酸緩衝液0.01Mクエン酸三ナトリウム二水和物-クエン酸一水和物、pH3で置換後、遠沈管内で液量を18mLとした。これに0.08gの過ヨウ素酸ナトリウムをRO水に溶解させた水溶液6mLを加え、ミックスローターにて、6°Cで約30分間振とうした。このホルミル基含有担体5mLをグラスフィルター上で、クエン酸緩衝液0.25Mクエン酸三ナトリウム二水和物、pH8.0、NaOHを用いて調整で置換後、遠沈管内で全量を8.5mLとした。これに実施例4で取得したC-G29A/S33E.5d含有溶液64.6mg/mLを0.96mL加え、0.4MNaOHでpH12とした後、ミックスローターにて、6°Cで4時間振とうした。その後、2.4Mクエン酸水溶液クエン酸1水和物でpH5とし、6°Cで4時間振とうを継続した。続けて、5.5重量濃度のジメチルアミンボラン水溶液を0.46mL加えて、25°C、18時間振とうした。反応後、反応液の275nm付近の吸収極大の吸光度を測定した結果、C-G29A/S33E.5dの導入量は11mg/mL-gelであり、リガンドの担体への固定化収率は90であった。この担体をグラスフィルター上、RO水を用いて、洗浄濾液の電気伝導度が5μS/cm以下になるまで洗浄し、更に、0.1Mクエン酸水溶液クエン酸一水和物、水酸化ナトリウム硫酸ナトリウム混合水溶液0.05MNaOH、0.5M硫酸ナトリウム、クエン酸緩衝液0.5Mクエン酸三ナトリウム二水和物-クエン酸一水和物、pH6にて順次洗浄した。最終的に、RO水を用いて、洗浄濾液の電気伝導度が5μS/cm以下になるまで洗浄し、アフィニティー分離マトリックスを得た。なお、本アフィニティー分離マトリックス4については、国際公開第2010/064437号に記載の測定に付し、抗体に対する吸着容量、及びリガンド漏出量を測定した。接触時間1.8分、3分の5dBCがそれぞれ33、41mg/mLであり、リガンド漏出量は、溶出IgGに対して30ppmであった。なお、同条件で測定した市販の高架橋アガロース担体MabSelectGEヘルスケアバイオサイエンス社製の5dBCは、それぞれ28、37mg/mLであった。図3に、5dBCをグラフにして比較した図を示した。また、リガンド漏出量については、市販のアフィニティー分離マトリックスについて調査した公知文献が存在するHahnR.他著、J.Chromatogr.A.、2006年、1102巻、224-231頁。このように、本実施例にて得られたアフィニティー分離マトリックス4が、抗体医薬精製プロセスにおいて重要な性能を示すパラメータに関し、充分実用に供するレベルであることが分かった。[実施例13]各種アフィニティー分離マトリックスの抗体酸溶出特性の評価実施例12で調製したアフィニティー分離マトリックス1~4を、エンプティーカラムTricornTM5/50ColumnGEヘルスケアジャパン株製に充填し、クロマトシステムAKTAprimeplusGEヘルスケアジャパン株製に接続して、抗体精製クロマトグラフィーによる抗体酸溶出特性評価を行った。ただし、アフィニティー分離マトリックス2はプレパックカラムなので、そのまま接続可能である。全ての場合において、カラム容量は約1mLとなる。このアフィニティー分離カラムを標準緩衝液20mMNaH2PO4-Na2HPO4、150mMNaCl、pH7.4で平衡化した後に、VH3サブファミリーに属するヒト化モノクローナルIgG製剤のハーセプチンを標準緩衝液で1mg/mLに調製した溶液500μLを、流速2mL/minにて添加した。その後、標準緩衝液を同じ流速で5mL流して洗浄した後に、溶出緩衝液35mMCH3COOH-CH3COONa、pH3.5を同じ流速で5mL流して、280nmの吸光度をモニタリングして得られたIgG溶出ピークのクロマトグラフィープロファイルを確認した。さらに連続して、5mLの標準緩衝液を同じ流速で流した後、強洗浄液0.5MCH3COOH、0.1MNa2SO4、pH2.5を同じ流速で3mL流し、280nmの吸光度をモニタリングして、強制的に分離されたカラム残存IgGのピークを確認した。なお、アフィニティー分離マトリックス2についてのみ、強洗浄液の組成は、20mMCH3COONa-CH3COOH、1MNaClpH3.2とした。アフィニティー分離マトリックス1~3については、pH3.75に調整した溶出緩衝液を用いた、同様の抗体精製クロマトグラフィーによる抗体酸溶出特性評価を行った。アフィニティー分離マトリックス1の抗体酸溶出特性C-G29A/S33E.5d、および、C-G29A.5d比較例1を固定化した各々のアフィニティー分離マトリックス1を用いた、抗体精製クロマトグラフィーの溶出ピークプロファイルを重ねた図を、図4に示した。上の図が溶出pH3.5のときの、下の図が溶出pH3.75のときの、溶出ピークプロファイルである。図4に示す通り、C-G29A/S33E.5dを固定化したマトリックスの溶出ピークプロファイルは、C-G29A.5dの場合に比べて、明確にシャープであることが確認できた。溶出pH3.75のときの溶出ピークプロファイルより、変異導入前のC-G29A.5dは吸着したIgGの回収が困難であったものが、変異導入後のC-G29A/S33E.5dでは吸着したIgGを全て回収できることを確認した。本発明がより中性に近い酸性溶液での抗体回収率を劇的に向上することが可能であることを示した一例と考えられる。アフィニティー分離マトリックス2の抗体酸溶出特性C-G29A/S33E.4d、および、C-G29A.4d比較例2を固定化した各々のアフィニティー分離マトリックス2を用いた、抗体精製クロマトグラフィーの溶出ピークプロファイルを重ねた図を、図5に示した。アフィニティー分離マトリックス1の場合と同様に、C-G29A/S33E.4dを固定化したマトリックスの溶出ピークプロファイルは、C-G29A.4dの場合に比べて、明確にシャープであることが確認できた。本データにより、本発明のタンパク質は、ベースとなる水不溶性基材の種類、基材へのリガンド固定化方法、および、リガンドとなるタンパク質のドメイン数に依らず、効果を奏することが示された。アフィニティー分離マトリックス3の抗体酸溶出特性C-G29A/S33E.5d、および、C-G29A.5d比較例1を固定化した各々のアフィニティー分離マトリックス3を用いた、抗体精製クロマトグラフィーの溶出ピークプロファイルを重ねた図を、図6に示した。C-G29A/S33E.5dを固定化したマトリックスの溶出ピークプロファイルは、C-G29A.5dの場合に比べて、明確にシャープであることが確認できた。本データにより、本発明のタンパク質は、基材として抗体溶出特性溶出の切れに優れた基材と組み合わせることによっても、さらに優れた効果が発揮されることが示された。アフィニティー分離マトリックス4の抗体酸溶出特性C-G29A/S33E.5dを固定化したアフィニティー分離マトリックス4を用いた、抗体精製クロマトグラフィーの溶出ピークプロファイル溶出pH3.5を図7に示した。産業的には、高い抗体結合容量を示すマトリックスへのニーズが高く、リガンド固定化量の増加は、抗体結合容量の向上に有効である。本データにより、本発明は、タンパク質固定化量が高い場合においても、問題なくその効果を奏することが確認された。[比較例1]C-G29A.5dの調製利用実施例1で得られた組み換え菌を用いて、実施例3~5に記載の方法と同様の方法にてC-G29A.5d配列番号28を調製した。ヒトIgG、および、モノクローナルIgG-Fabとの親和性の解析方法についても、実施例5、および、実施例7に記載の方法と同様であり、解析結果については、表1~2に併せて表記した。また、アルカリ耐性についても、実施例11に記載の手法で評価した。加えて、実施例12のアフィニティー分離マトリックス1、3の調製にも、C-G29A.5dを用い、実施例13と同様の手法にて抗体酸溶出特性を評価し、その結果を図4および図6に併せて表記した。なお、アフィニティー分離マトリックス1、3の調製において、用いた溶液のタンパク質濃度は58.2mg/mLであり、用いた量は0.79mLであった。[比較例2]C-G29A.4dの調製利用実施例1で得られた発現プラスミドpNK3262-C-G29A.5dを鋳型とし、配列番号66~67のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、実施例2と同様の手法にて、C-G29A.4dの発現プラスミド、および、その形質転換細胞を得た。実施例3~5に記載の方法と同様の方法にて、C-G29A.4dを調製した。加えて、実施例12のアフィニティー分離マトリックス2の調製にも、C-G29A.4dを用い、実施例13と同様の手法にて抗体酸溶出特性を評価し、その結果を図5に併せて表記した。[比較例3]C-G29A.1dの調製実施例8で用いた鋳型プラスミドを含む形質転換細胞HB101を用いて、実施例9と同様の手法にて、C-G29A.1dを調製し、実施例10と同様の手法にて、モノクローナルIgG-Fabとの親和性を解析した。解析結果については、図2に併せて表記した。"