"2種以上の外表面タンパク質COspCタイプのループ5領域またはアルファヘリックス5領域、または両者からのエピトープを含むキメラ組換えタンパク質。5乃至13種のOspCタイプからのエピトープを含む請求項1記載のキメラ組換えタンパク質。5種のOspCタイプからのエピトープを含む請求項1記載のキメラ組換えタンパク質。6種のOspCタイプからのエピトープを含む請求項1記載のキメラ組換えタンパク質。7種のOspCタイプからのエピトープを含む請求項1記載のキメラ組換えタンパク質。8種のOspCタイプからのエピトープを含む請求項1記載のキメラ組換えタンパク質。9種のOspCタイプからのエピトープを含む請求項1記載のキメラ組換えタンパク質。13種のOspCタイプからのエピトープを含む請求項1記載のキメラ組換えタンパク質。前記OspCタイプをSmar、PLi、H13、PFiM、SL10、PMit、PKi、Pbes、HT22、Pko、PLj7、VS461、DK15、HT25、A、72a、F、E、M、D、U、I、L、H、Szid、PHez、PWa、B、K、N、CおよびTから構成される群から選択した請求項1記載のキメラ組換えタンパク質。前記キメラタンパク質が、配列番号250、配列番号251、配列番号252、配列番号253、配列番号254、配列番号255、配列番号256、配列番号257、配列番号258、配列番号259、配列番号260、配列番号261、配列番号262、配列番号263、配列番号264、配列番号265、配列番号266および配列番号267から成る群から選んだ配列番号のアミノ酸配列と少なくとも95、96、97、98もしくはそれ以上の同一性または完全な100同一性を有するアミノ酸配列を有する請求項1記載のキメラ組換えタンパク質。前記OspCタイプの少なくとも一つがヒトにおける侵襲性ボレリアBorrelia感染に関連している請求項1記載のキメラ組換えタンパク質。前記OspCタイプの各々がヒトにおける侵襲性ボレリアBorrelia感染と関連している請求項1記載のキメラ組換えタンパク質。ボレリアに対する免疫応答を必要としている個体においてそれを惹起するための方法であって、前記個体に対して2種以上の互いに異なる外表面タンパク質COspCタイプのループ5領域またはアルファヘリックス5領域、または両者からのエピトープを含むキメラ組換えタンパク質を供給する過程を含む方法。前記キメラ組換えタンパク質が5乃至13種のOspCタイプからのエピトープを含む請求項13記載の方法。前記OspCタイプをSmar、PLi、H13、PFiM、SL10、PMit、PKi、Pbes、HT22、Pko、PLj7、VS461、DK15、HT25、A、72a、F、E、M、D、U、I、L、H、Szid、PHez、PWa、B、K、N、CおよびTから構成される群から選択した請求項13記載の方法。前記キメラタンパク質が、配列番号250、配列番号251、配列番号252、配列番号253、配列番号254、配列番号255、配列番号256、配列番号257、配列番号258、配列番号259、配列番号260、配列番号261、配列番号262、配列番号263、配列番号264、配列番号265、配列番号266および配列番号267から成る群から選んだ配列番号のアミノ酸配列と少なくとも95、96、97、98もしくはそれ以上の同一性または完全な100同一性を有するアミノ酸配列を有する請求項13記載の方法。前記OspCタイプの少なくとも一つがヒトにおける侵襲性ボレリアBorrelia感染に関連している請求項13記載の方法。前記OspCタイプの各々がヒトにおける侵襲性ボレリアBorrelia感染に関連している請求項13記載の方法。個体がボレリアに暴露したかまたはボレリアに感染したかまたはその両者であるかどうかを確認するための方法であって、前記個体から生体サンプルを得る過程と、前記生体サンプルを少なくとも1種の組換えキメラタンパク質、すなわち2種以上の外表面タンパク質COspCタイプのループ5領域またはアルファヘリックス5領域、または両者からのエピトープを含む少なくとも1種の組換えキメラタンパク質に暴露させる過程と、前記生体サンプル中における抗体が前記少なくとも1種の組換えキメラタンパク質に結合するかどうかを決定する過程とを含み、抗体結合検出がボレリアに対する過去の暴露または感染を表す方法。前記キメラ組換えタンパク質が5乃至13種のOspCタイプからのエピトープを含む請求項19記載の方法。前記OspCタイプをSmar、PLi、H13、PFiM、SL10、PMit、PKi、Pbes、HT22、Pko、PLj7、VS461、DK15、HT25、A、72a、F、E、M、D、U、I、L、H、Szid、PHez、PWa、B、K、N、CおよびTから構成される群から選択した請求項19記載の方法。前記キメラタンパク質が、配列番号250、配列番号251、配列番号252、配列番号253、配列番号254、配列番号255、配列番号256、配列番号257、配列番号258、配列番号259、配列番号260、配列番号261、配列番号262、配列番号263、配列番号264、配列番号265、配列番号266および配列番号267から成る群から選んだ配列番号のアミノ酸配列と少なくとも95、96、97、98もしくはそれ以上の同一性または完全な100同一性を有するアミノ酸配列を有する請求項19記載の方法。前記OspCタイプの少なくとも一つがヒトにおける侵襲性ボレリアBorrelia感染に関連している請求項19記載の方法。前記OspCタイプの各々がヒトにおける侵襲性ボレリアBorrelia感染に関連している請求項19記載の方法。2種以上の外表面タンパク質COspCタイプのループ5領域またはアルファヘリックス5領域または両者からのエピトープを含むキメラ組換えタンパク質に対する抗体。前記キメラ組換えタンパク質が5乃至13種のOspCタイプからのエピトープを含む請求項25記載の抗体。前記OspCタイプをSmar、PLi、H13、PFiM、SL10、PMit、PKi、Pbes、HT22、Pko、PLj7、VS461、DK15、HT25、A、72a、F、E、M、D、U、I、L、H、Szid、PHez、PWa、B、K、N、CおよびTから構成される群から選択した請求項25記載の抗体。前記キメラタンパク質が、配列番号250、配列番号251、配列番号252、配列番号253、配列番号254、配列番号255、配列番号256、配列番号257、配列番号258、配列番号259、配列番号260、配列番号261、配列番号262、配列番号263、配列番号264、配列番号265、配列番号266および配列番号267から成る群から選んだ配列番号のアミノ酸配列と少なくとも95、96、97、98もしくはそれ以上の同一性または完全な100同一性を有するアミノ酸配列を有する請求項25記載の抗体。前記OspCタイプの少なくとも一つがヒトにおける侵襲性ボレリアBorrelia感染に関連している請求項25記載の抗体。前記OspCタイプの各々がヒトにおける侵襲性ボレリアBorrelia感染に関連している請求項25記載の抗体。ボレリアスピロヘータに対して殺菌性である請求項25記載の抗体。キメラ組換えタンパク質の免疫原性カクテルであって、前記カクテル中の各キメラ組換えタンパク質が2種以上の外表面タンパク質COspCタイプのループ5領域またはアルファヘリックス5領域または両者からのエピトープを含む免疫原性カクテル。前記キメラ組換えタンパク質の各々が6乃至13種の前記OspCタイプからのエピトープを含む請求項32記載の免疫原性カクテル。前記先行技術はこれまで、ライム病の予防用および/または治療用の複数OspCタイプに対する広い防御を付与するワクチンを提供できなかった。本発明は、ライム病のためのワクチンおよび診断薬としての用途のためのキメラ多価組換えタンパク質を提供する。本発明は、一部ではあるが、数種の異なるOspC系統発生群タイプ由来の新規防御性エピトープの発見と特性解析に基づいており、それらのそれぞれは、哺乳類例ヒトライム病感染に関係している。これらのエピトープの同定が、異なるOspC感染性タイプからの複数エピトープを含むキメラタンパク質またはタンパク質の構築を可能とした。従って、このキメラ組換えタンパク質は、ワクチンとして使用すると、それらOspCタイプを発現し哺乳類ライム病に関連する複数のボレリア株に対する広い防御を惹起する。さらに、前記キメラタンパク質は、前記エピトープに対する抗体を有する個体を識別し、従って、ある個体がライム病の原因となる物質に暴露したかまたは感染したかどうかを決定するための診断手段として有用である。本発明のいくつかの態様において、前記エピトープは、B細胞エピトープであるかおよび/または免疫優性エピトープである。本発明の目的は、2種以上の外表面タンパク質COspCタイプのループ5領域またはアルファヘリックス5領域から、または両者からのエピトープを含むキメラ組換えタンパク質を提供することである。1態様において、前記OspCタイプは、Smar、PLi、H13、PFiM、SL10、PMit、PKi、Pbes、HT22、Pko、PLj7、VS461、DK15、HT25、A、72a、F、E、M、D、U、I、L、H、Szid、PHez、PWa、B、K、N、CおよびTから構成される群から選択される。いくつかの態様において、前記キメラ組換えタンパク質は、配列番号250、同251、同252、同253、同254、同255、同256、同257、同258、同259、同260、同261、同262、同263、同264、同265、同266および同267から成る群から選んだアミノ酸配列を有している。いくつかの態様において、前記OspCタイプは、侵襲性ボレリア感染と関連している。本発明はさらに、その必要がある個体においてボレリアに対する免疫応答を惹起する方法を提供する。前記方法は、前記個体に対して2種以上の外表面タンパク質COspCタイプのループ5領域またはアルファヘリックス5領域からのまたは両者からのエピトープを含むキメラ組換えタンパク質を投与する段階を含む。本発明の1態様において、前記OspCタイプは、Smar、PLi、H13、PFiM、SL10、PMit、PKi、Pbes、HT22、Pko、PLj7、VS461、DK15、HT25、A、72a、F、E、M、D、U、I、L、H、Szid、PHez、PWa、B、K、N、CおよびTから構成される群から選択される。本発明のいくつかの態様において、前記キメラタンパク質は、配列番号250、同251、同252、同253、同254、同255、同256、同257、同258、同259、同260、同261、同262、同263、同264、同265、同266および同267から成る群から選んだアミノ酸配列を有する。また、いくつかの態様において、前記OspCタイプは、侵襲性ボレリア感染と関連している。本発明はさらに、ある個体がボレリアに暴露したかまたは感染したかどうかを確認する方法を提供する。前記方法は、1前記個体から生体サンプルを得ること;2前記生体サンプルを少なくとも1種の組換えキメラタンパク質、すなわち2種以上の外表面タンパク質COspCタイプのループ5領域またはアルファヘリックス5領域からのまたは両者からのエピトープを含む少なくとも1種の組換えキメラタンパク質に暴露させること;および3前記生体サンプル中の抗体が前記少なくとも1種のキメラタンパク質に結合するかどうかを決定することを含み、抗体結合の検出がボレリアに対する過去の暴露または感染を表す。本発明の1態様において、前記OspCタイプは、Smar、PLi、H13、PFiM、SL10、PMit、PKi、Pbes、HT22、Pko、PLj7、VS461、DK15、HT25、A、72a、F、E、M、D、U、I、L、H、Szid、PHez、PWa、B、K、N、CおよびTから構成される群から選択される。本発明のいくつかの態様において、前記キメラタンパク質は、OspCタイプA、B、KおよびDからのエピトープを含む。本発明の別の態様において、前記キメラ組換えタンパク質は、配列番号250、同252、同253、同254、同255、同256、同257、同258、同259、同260、同261、同262、同263、同264、同265、同266および同267から成る群から選んだアミノ酸配列を有する。本発明のいくつかの態様において、前記OspCタイプは、侵襲性ボレリア感染と関連している。本発明はさらに、2種以上の外表面タンパク質COspCタイプのループ5領域またはアルファヘリックス5領域からのまたは両者からのエピトープを含むキメラ組換えタンパク質に対する抗体を提供する。本発明の1態様において、前記OspCタイプは、Smar、PLi、H13、PFiM、SL10、PMit、PKi、Pbes、HT22、Pko、PLj7、VS461、DK15、HT25、A、72a、F、E、M、D、U、I、L、H、Szid、PHez、PWa、B、K、N、CおよびTから構成される群から選択される。本発明のいくつかの態様において、前記キメラタンパク質は、配列番号250、同251、同252、同253、同254、同255、同256、同257、同258、同259、同260、同261、同262、同263、同264、同265、同266および同267から成る群から選んだアミノ酸配列を有する。この発明のいくつかの態様において、前記OspCタイプは、侵襲性ボレリア感染と関連している。前記抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルのいずれであってもよい。本発明の1態様において、前記抗体は、ボレリアスピロヘータに対して殺菌性である。本発明は、さらにキメラ組換えタンパク質の免疫原性カクテルを提供する。前記カクテルにおける各キメラ組換えタンパク質は、2種以上の外表面タンパク質COspCタイプのループ5領域またはアルファヘリックス5領域からの、または両者からのエピトープを含む。ヒトライム病の予防手段および診断手段として使用できるキメラ組換えタンパク質を提供する。本発明は、ヒトライム病感染に関連するOspCタイプの新規防御性、タイプ特異的エピトープの同定と特性解析に基づいている。この新規エピトープは、OspCのカルボキシル末端の半分にある2個のドメイン領域内部に局在している。いずれのドメインも、これまで、免疫原性が高いとして同定されたことはなかった。第1のドメイン本文で、アルファヘリックス5領域/ドメインまたはアルファ5領域/ドメインまたはヘリックス5領域/ドメインと称するは、残基160と200の間に局在し、ループ6の一部、アルファヘリックス5および非構造化C末端ドメインを含む二次的構造要素を含有しているKumaranら、2001。第2のドメイン本文でループ5領域/ドメインは、残基131と159の間に局在し、アルファヘリックス3の一部、ループ5およびアルファヘリックス4を含む二次構造要素を含有しているKumaranら、2001。これらの領域のそれぞれは、本発明の実施で使用できる少なくとも1個のエピトープを含んでいる。これらの2個のドメインからのエピトープ、またはこれらの2個の領域内部からの抗原性ペプチドまたはポリペプチドは、本発明の実施において単独でまたは好適にはあるキメラ免疫原中の他のエピトープと組み合わせて使用することができる。本発明のいくつかの態様において、前記エピトープは、免疫優性エピトープである。通常は、前記エピトープはB細胞エピトープであるが、T細胞エピトープも排除するものではない。前記新規エピトープの発見およびこのエピトープの異なるOspCタイプへのマッピングにより、多数のOspCタイプからの複数の線状、タイプ特異的免疫優性エピトープを含む多価キメラタンパク質の構築が可能となった。ワクチンとして使用すると、前記の多価ポリバレント組換えキメラタンパク質は、前記のキメラタンパク質におけるそれらに対応するOspCタイプを発現するボレリアスピロヘータによる感染に対して、すなわち極めて感染性の高いそれらのボレリアによる感染に対して広い防御を惹起する。さらに、前記キメラタンパク質は、前記キメラタンパク質に含まれるエピトープに対する抗体を有する個体を同定し、かつある個体がライム病の原因物質に暴露したかおよび/または感染したかどうかを決定する診断手段として有用である。本発明の理解を容易にするため、下記の定義を示す:抗原:ある抗体によって結合された実体を称しかつ前記抗体の産生を誘発する実体を称するために歴史的に使用されてきた用語。さらに現在の用途では、抗原の意味を、抗体によって結合された実体に限定しており、一方単語免疫原は、抗体産生を誘発する実体のために用いられている。本文で検討した実体は免疫原性でありかつ抗原性である場合、免疫原または抗原のいずれかとしてそれに言及するのは、通常は、その意図した用途に従って行われるであろう。用語抗原、免疫原およびエピトープは、この明細書では相互変換可能な形で用いる。B細胞エピトープ:B細胞レセプターによって認識され、分泌された抗体によって結合できる抗原上の特異的化学ドメイン。この用語は、抗原決定基と相互交換可能である。免疫優性エピトープ:主要なあるいは非常に強力な免疫応答を誘発する分子上のエピトープ。線状エピトープ:ペプチド結合によって結合されたアミノ酸の単一の、中断されていない連続的鎖を含むエピトープで、ペプチドあるいはポリペプチドを形成する。このようなエピトープは、その一次構造によってすなわち前記鎖中のアミノ酸の線状配列によって記述できる。立体構造的エピトープ:アミノ酸の切断されていない線状配列の部分ではないが前記タンパク質の二次、三次および/または四次相互作用により前記エピトープ中において他の残基に近接させてある少なくともいくつかのアミノ酸で構成されるエピトープ。このような残基は、一次配列に関して前記エピトープ中の他の残基から離れて局在できるが、タンパク質折り畳みにより前記立体構造的エピトープ中で他の残基の近くに空間的に局在できる。ループ5領域/ドメイン:図23に示したタイプAOspC配列の残基131から159と並ぶ残基を含むOspCの領域。前記領域に含まれる株B31OspC二次構造要素は、アルファヘリックス3、ループ5、およびアルファヘリックス4の部分であり、Kumaranら2001が定義している。アルファヘリックス5領域/ドメイン:図23に示した株B31OspCタイプA配列のアミノ酸160乃至200と並ぶ残基と図23に示さなかった前記タンパク質のC末端部分B31配列のアミノ酸201-220を含むOspCの領域。この領域に含まれる株B31OspC二次構造要素は、ループ6の部分、アルファヘリックス5、および構造化されていないC末端ドメインであり、Kumaranら2001が定義している。タンパク質:ペプチド結合によって共有結合された約100個以上のアミノ酸の線状配列。ポリペプチド:ペプチド結合によって共有結合された約20個から約100個のアミノ酸の線状配列。ペプチド:ペプチド結合によって共有結合された約20個以下のアミノ酸の線状配列。用語タンパク質、ポリペプチドおよびペプチドは、本文で相互交換可能に使用してある。キメラタンパク質:その一次配列が、天然の単一分子でともに出現することはない複数ペプチド、ポリペプチド、および/またはタンパク質配列を含む組換えタンパク質。キメラタンパク質の価数例多価またはポリバレントとは、前記キメラワクシノーゲンに含まれるOspCタイプ特異的エピトープ保有ポリペプチドの数を称する。たとえば、二価キメラは、タイプAのアルファヘリックス5およびタイプBのアルファヘリックス5から構成されるか、またはタイプAのアルファヘリックス5およびタイプAのループ5から構成される。各ポリペプチドエピトープ保有領域中には、複数の明確なエピトープがあることもある。元々のすなわち天然すなわち野生型配列:ペプチド、ポリペプチド、タンパク質または核酸の天然に見られる配列。組換えペプチド、ポリペプチド、タンパク質または核酸:クローニング、ポリメラーゼチェーンリアクションPCR等のような分子生物学技術を用いて産生させたかおよび/または操作されたペプチド、ポリペプチド、タンパク質または核酸。タイプ特異的:単一系統発生群に主に関連。侵襲性感染:OspCタンパク質は、OspCタイプを有するボレリアがヒト感染時にダニ咬み傷による当初の接種部位を取り囲む皮膚以外の位置例血漿、脳脊髄液等から単離されたならば、侵襲性感染に関連すると言われる。本発明はしたがって、前記のループ5および/またはアルファヘリックス5領域からの複数の線状エピトープを含む組換えキメラタンパク質を提供し、それらのうちの少なくとも2個は侵襲性感染に関連する互いに異なるOspCタイプからである。好適には、約2乃至約20、および好適には約5乃至約13の互いに異なるOspCタイプを表わす抗原性エピトープが、単一のキメラタンパク質に含まれる。いくつかの実施の態様では、前記キメラ組換えタンパク質は5つのOspCタイプ、6つのOspCタイプ、7つのOspCタイプ、8つのOspCタイプ、9つのOspCタイプ、または13個のOspCタイプからのエピトープを含む。通常は前記エピトープの少なくとも2個は、一次配列が互いに異なりかつ異なるOspCタイプから派生しているが、あるキメラに単一タイプのエピトープの複数コピーを含むことまたは同一OspCタイプの元来の配列に基づくかあるいはそれに由来する数種の配列を含むことも可能である。あるキメラにおける線状エピトープの総数はやや変動することもあるが、一般的に、その範囲は約10乃至30であろう。本発明の1態様において、免疫優性エピトープは、OspCタイプ、Smar、PLi、H13、PFiM、SL10、PMit、PKi、Pbes、HT22、Pko、PLj7、VS461、DK15、HT25、A、72a、F、E、M、D、U、I、L、H、Szid、PHez、PWa、B、K、N、CおよびTの2種以上から選択される。1態様において、前記キメラタンパク質は4価で、タイプA、B、KおよびD由来のエピトープを含む。別の態様において、前記キメラタンパク質は8価であり、OspCタイプE、N、I、C、A、B、KおよびDからのエピトープを含む。しかし、当業者は、OspCタイプの他の組み合わせからのエピトープも、結果として生成したキメラが適切な免疫応答を産生しおよび/またはライム病防止においてワクチンとして有効である限りにおいて、同様に使用できることを理解するであろう。他の適切な組み合わせの例は、この明細書で開示する多数の実施の態様に示されるとおり、1A、B、K、D、E、N、C;2I、C、A、B、K、D;および3C、A、B、K、Dを含むがそれらに限定されない。いくつかの態様において、前記キメラタンパク質は、配列番号250、同251、同252、同253、同254、同255、同256、同257、同258、同259、同260、同261、同262、同263、同264、同265、同266および同267から成る群から選んだアミノ酸配列を含み、またはこれら配列番号250乃至267に現れるアミノ酸配列の任意の一つと少なくとも95、96、97、98、99またはそれ以上の同一性を備えるアミノ酸配列を含む。他の態様においては、前記キメラ組換えタンパク質の中の前記OspCタイプの少なくとも1個は、ヒトにおける侵襲性ボレリア感染と関連している。本発明は、これらキメラ組換えタンパク質を用いてボレリアに対する免疫反応をその免疫を必要とする個体内に惹起させる方法をさらに含む。さらに他の態様において、本発明はある個体がボレリアに暴露したかまたは感染したかを確認する診断方法を提供する。この方法は、1その個体から生体サンプルを得る過程と、2その生体サンプルを少なくとも一つの本明細書記載のキメラ組換えタンパク質に暴露する過程と、3前記生体サンプルの中の抗体が少なくとも一つのキメラタンパク質に結合するか否かを判定する過程とを含む。抗体の結合が検出されれば、それがボレリアへの暴露または感染を表す。さらに他の態様においては、本発明は、本明細書記載のキメラ組換えタンパク質に対する抗体、および前記キメラ組換えタンパク質を含む免疫原性カクテルを提供する。いくつかの態様においては、ループ5およびアルファヘリックス5領域は両者とも含まれるであろう。例えば、E、N、I、C、A、B、K、D構築体は、OspCタイプE、N、I、C、A、B、KおよびDのそれぞれのループ5およびヘリックス5領域を両者ともに含むこともできる。しかし、これは常にそうであるとは限らない。例えば、タイプAのループ5領域とE、N、I、C、B、KおよびDのアルファヘリックス5領域が含まれることもある;または、各OspCタイプのループ5領域のみが含まれることもある;またはアルファヘリックス5領域のみが含まれることもある;または他の組み合わせが含まれることもある例タイプE、N、IおよびCのループ5領域とタイプA、B、K、Dのアルファヘリックス5領域。多くのこのような組み合わせを当業者は思い付くであろうし、そのような変形したものも包含することを意図している。さらに、あるキメラ内部のエピトープの直線的順序も変動し得る。一般的に、アミノからカルボキシル末端までの順序は、ループ5領域、アルファヘリックス5領域、ループ5領域、アルファヘリックス5領域...等であろう。例えば、E、N、I、C、A、B、K、D構築体の場合、好適な順序は、前記キメラの長さに沿ってEタイプループ5領域、Eタイプアルファヘリックス5領域;Nタイプループ5領域、Nタイプアルファヘリックス5領域;Iタイプループ5領域、Iタイプアルファヘリックス5領域...等であり、異なるOspCタイプおよび/または異なるドメインは任意に中性リンカー配列によって分離されている。しかし、この順序は、例えば前記キメラに含ませるために選択した要素に応じて変えることもできる。OspCタイプおよびドメインのいかなる順序も、結果として生成したキメラが適切な免疫応答を産生しおよび/またはライム病予防におけるワクチンとして有効であること、または診断に有効に使用できる限りにおいて、使用することができる。例示的キメラ配列の例は、図25A-Jに示される。ボレリア数株からのOspCのタンパク質およびDNAアクセス番号に対する重要なキーを図26に表形式で示した。前記キメラタンパク質に含まれるアミノ酸配列は、アルファヘリックス5および/またはループ5領域またはそれらの抗原性断片を含むことができる。抗原性断片とは、感染時に認識される少なくとも1個の線状エピトープを含む一次OspC配列のセグメントを意味する。このようなエピトープは、OspCの組換えタンパク質サブユニット中で発現すると、細胞表面で発現した野生型タンパク質の結合に類似した方法で感染誘発抗体を結合する能力を保持する。それぞれの抗原性断片は、1個を超える明白なエピトープを含むことがあるであろう。当業者は、あるエピトープに対する抗体の親和性すなわち結合力の測定がやや不正確であること、およびこの親和性/結合力は、免疫応答時に例えばアフィニティ成熟/体細胞の超変異により有意に変化しうることを理解するであろう。しかし、一般的に、前記キメラタンパク質に対する抗体結合の親和性/結合力は、天然の未変化アルファ5またはループ5によって発揮される親和性よりも、少なくとも約50、好適には約60、さらに好適には約70、はるかに好適には約80、最も好適には約90-100またはそれ以上の範囲にある。一般的に、前記キメラタンパク質に含まれる抗原性配列は、アミノ酸約20乃至約100個、好適には約30乃至約70個を含むであろうし、前記キメラタンパク質それ自体は、アミノ酸を総計約160乃至約800個、好適には約240乃至約560個を含むであろう。さらに、前記の抗原性配列は、本文でエピトープと称されることがあるが、それらが完全な天然エピトープを含んでも含まなくてもよく、ただし、それらが本文に記載の抗体結合特性を有する限りにおいてである。これとは別に、適切な抗原断片または抗原性配列またはエピトープは、あるキメラタンパク質に取り込まれた時、前記キメラタンパク質を投与した宿主における前記エピトープに対する適当な抗体産生を惹起できる能力によって識別することもできる。当業者は、抗体力価定義が変わりうることを理解するであろう。本文で、力価とは、試験タンパク質100ngを塗布したELISAウェル上における利用可能な結合部位の半分を結合するであろう抗血清の逆希釈度であると理解される。一般的に、適切な抗体産生は、約100乃至約100,000の範囲、好適には約10,000乃至約100,000の範囲にある抗体力価を特徴とする。これとは別に、特に診断アッセイにおいて、前記力価は、バックグランドの結合レベルの約3倍はなくてはならない。例えば、陽性とみなすためには、試験における反応性が未感染個体の血清中で検出された反応性を少なくとも3倍は超えていなければならない。好適には、前記抗体応答は防御性で、すなわち、ワクチン無接種の宿主に比較して、後でボレリアに暴露するワクチン接種宿主における疾患症状の発現を防止するかまたは低減する。本発明によるひとつの例示的キメラタンパク質のアミノ酸配列を、図9Bに示している。この例示的態様において、前記キメラは、タイプAOspCからのループ5領域アミノ酸配列とOspCタイプB、KおよびDのアルファヘリックス5領域配列を含む。この場合、前記のタイプAOspC配列は、株LDP56からであり、ヌクレオチドアクセス番号はEF053513でありタンパク質アクセス番号はABK41054である;前記タイプBOspCは、株LDP73からであり、ヌクレオチドアクセス番号はEF053525でありかつタンパク質アクセス番号はABK41066である;タイプKOspCは、株LDP89からであり、ヌクレオチドアクセス番号はEF053523であり、タンパク質アクセス番号はABK41064である;および前記タイプDOspCは株LDP116からであり、ヌクレオチドアクセス番号はEF053527であり、かつタンパク質アクセス番号はABK41068である。当業者は、多くのボレリア株からのOspCが公知であるかまたは発見でき、本発明の実施に使用できることを理解するであろう。例示したキメラタンパク質構成の配列は本明細書に開示した配列番号に示してある。当業者は、本発明のいくつかの態様において、本発明のキメラタンパク質に含ませるために選択したアミノ酸配列が、直接、OspCタンパク質の元来のすなわち天然の配列の一次アミノ酸配列に対応するが、それが必ずしもそうでない場合もあることを理解するであろう。本発明のキメラタンパク質に含まれるエピトープのアミノ酸配列は、少し変化させることができ、それでもなお、本発明における使用に適しているであろう。例えば、ある保存的アミノ酸置換も、エピトープの免疫応答惹起能力に有害な影響を及ぼすことなく、行うことができるであろう。当業者は、例えば陽電荷アミノ酸を別の陽電荷アミノ酸に置換すること;陰電荷アミノ酸を別の陰電荷アミノ酸と置換すること;疎水性アミノ酸を別の疎水性アミノ酸と置換することなど、このような保存的置換の性質を理解するであろう。このような置換または本発明のキメラタンパク質に含まれるエピトープの配列を変化させることは、結果として生成したエピトープが適切な免疫応答を惹起する機能を有している限りにおいて、本発明に包含されるとみなされる。さらに、本発明のキメラタンパク質に含まれるアミノ酸配列は、全長天然エピトープまたはエピトープ含有ドメインを包含する必要はない。当業者は、エピトープであることが公知であるかまたはエピトープを含むことが公知であるアミノ酸配列の切断形態も、さまざまな理由から本発明における使用に好適であることを理解するであろう。このように置換されているかまたはそうでない場合には変化させてあるアミノ酸配列は、本文で、元来の野生型すなわち天然配列に基づくかあるいは由来すると称される。一般的に、線状エピトープを誘導したかまたは線状エピトープを基づかせたOspCタンパク質は、天然に出現するOspCタンパク質である。これらの天然OspCタンパク質は、これとは別に、天然すなわち野生型タンパク質と称される。一次配列に対するこのような変更は、さまざまな理由のいずれのためにも導入でき、例えば、プロテアーゼ切断部位の削減または導入、溶解度の上昇または低下、折り畳み、イオン性相互作用、塩ブリッジ等のような分子内あるいは分子間相互作用を促進するかまたは低下させるなどの理由からであり、それらは、そうでない場合には、キメラの長さ方向に沿ってそれぞれのエピトープの提示とアクセス可能性を妨害することもある。このような変化は全て、エピトープが派生したもとのOspCタイプに対する防御性抗体反応を惹起するべく結果として生成したアミノ酸配列が機能する限りにおいて、本発明に包含されるとみなされる。一般的に、このような置換した配列は、天然タンパク質中の対応配列と少なくとも約50同一であろうし、前記野生型配列と好適には約60乃至70、さらに好適には70乃至80、または80乃至90同一であろうし、好適には、約95乃至100同一であろう。本発明のいくつかの態様において、前記キメラワクシノーゲン中のそれぞれの線状エピトープは、性質が幾分なりとも中性である介在配列によって互いに分離されており、すなわち、それらは、ボレリアに対してそれ自体の中でおよびそれ自体の力で免疫応答を惹起するのではない。このような配列は、あるキメラのエピトープの間に存在することもあれば存在しないこともある。もし存在するならば、それらは、例えば、前記エピトープの分離に役立ち、前記エピトープの互いからの立体的単離に寄与する。これとは別に、このような配列は、組換え処理操作例えばクローニング操作の単なるアーティファクトであることもある。このような配列は、典型的には、リンカーまたはスペースペプチドとして公知であり、それらの多くの例が、当業者に公知である。例えば、Crasto、C.J.およびJ.A.Feng.2000.LINKER:融合タンパク質のためのリンカー配列産生プログラムを参照。非構造化リンカーを記載した参考書であるプロテインエンジニアリングProteinEngineering135:309-312。構造化例ヘリカル配列リンカーは、また、例えば、その二次構造を有することが公知の既存の配列を用いてまたは前記リンカー設計のための基本的公知の生化学的原則を用いても、設計できる。さらに、他の要素も、前記キメラタンパク質中には存在でき、例えば、リーダー配列すなわちタンパク質の精製または検出を促進する前記タンパク質にタグを付ける配列であり、その例は、ヒスチジンタグ、検出タグ例S-タグ、またはFlag-タグ、公知のT細胞エピトープ含有配列のような他の抗原性アミノ酸配列およびタンパク質安定化モチーフ等が含まれるがそれらに限定されない。さらに、前記キメラタンパク質は、例えば、アミド化、スルホニル化、脂質化、または当業者に公知の他の技術によって化学的に修飾することもできる。本発明はさらに、本発明のキメラタンパク質をコードする核酸配列を提供する。このような核酸には、DNA、RNA、およびそれらのハイブリッド等が含まれる。さらに、本発明は、このようなコードする配列を含むか宿しているベクターを包含する。適切なベクターの例には、プラスミド、コスミド、ウイルスに基づくベクター、発現ベクター等が含まれるが、それらに限定されない。好適な態様において、前記ベクターは、プラスミド発現ベクターであろう。本発明のキメラタンパク質は、いかなる適切な方法でも産生させることができ、それらの多くは、当業者に公知である。例えば、前記タンパク質は、化学的に合成できるか、または、組換えDNA技術を例菌細胞中において、細胞培養物哺乳類、酵母または昆虫細胞中において、植物類または植物細胞中において、または細胞非含有原核または真核細胞に基づく発現系中において、他のインビトロ系によって、等用いて産生させることができる。本発明はまた、特にライム病ライムボレリオシスLymeborreliosisとして出現した時においてボレリア感染を防止するかまたは処置するワクチンとして利用することもできる免疫応答惹起における使用のための組成物を提供する。免疫応答を惹起するとは、抗原投与が特異的抗体の合成を起こすか上記の力価でおよび/または細胞性増殖を起こすことを意味しており、それらは、3Hチミジン取り込みによって測定される。ワクチンとは、ワクチン無接種例添加物のみ対照生物に比較して、免疫応答を惹起し、その結果、ボレリアによるチャレンジに対して防御し、全体的にまたは部分的にボレリア感染に関連した症状すなわち、ライム病の症状を防止するかまたは停止させる。前記組成物は、本文に述べたような1種以上の実質的に精製された組換えキメラタンパク質および薬理学的に適切な担体を含む。前記組成物中の複数のキメラタンパク質は、同一であっても異なってもよく、すなわち、前記組成物は、異なるキメラのカクテルであってもよく、または、ある組成物は、単一タイプのキメラを含む。ワクチンとしての用途のための上記組成物の調製は、当業者に周知である。典型的には、液状溶液または懸濁液のいずれかとし調製されるが、錠剤、丸剤および粉末剤等のような固体形状も考慮される。投与前液体中における溶液または懸濁液に適した固体形状も同様に調製できる。前記調製物はまた、懸濁化することもできる。上記活性成分は、薬学的に許容できかつ前記活性成分と相溶性の賦形剤と混合することもできる。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等、またはそれらの組み合わせである。さらに、前記組成物は、湿潤化また懸濁化剤、pH緩衝剤等のような少量の補助物質を含むことができる。本発明のワクチン調製物はさらに、アジュバントを含むことができ、その適切な例は、セピックSeppic、クイルQuilA、アルヒドロゲルAlhydrogel等を含むがそれらに限定されない。もし前記組成物の経口形態を投与することを望むならば、さまざまな粘稠剤、芳香剤、希釈剤、懸濁剤、分散補助剤または結合剤等を添加できる。本発明の組成物は、前記組成物を投与に適した形状で提供するためにこのような付加的成分のいずれも含むことができる。前記処方における最終的なキメラタンパク質の量は、変えることができる。しかし、一般的に、前記製剤中における量は、約0.01-99重量/容量である。前記方法は、薬理学的に許容できる担体中にキメラ組換えタンパク質を含む組成物を哺乳類に投与することを必要とする。本発明のワクチン調製物は、当業者に周知の多くの適切な手段のいずれによっても投与でき、注入によって、吸入によって、経口によって、経鼻的に、前記キメラタンパク質を含有する食品摂取によって等のような手段を含むがそれらに限定されない。好適な態様において、投与様式は、皮下または筋肉内である。さらに、前記組成物は、免疫系をブーストする物質、化学療法剤等のような他の治療手段と連携させて投与することもできる。本発明は、ボレリアに対する免疫応答を惹起しかつ哺乳類においてボレリア感染に対してワクチン接種する方法類を提供する。1態様において、前記哺乳類はヒトである。しかし、当業者は、このようなワクチン接種が同様に望ましい他の哺乳類も存在することを理解するであろうし、例えば、前記調製物は、また、獣医学目的のために使用することもできる。例には、イヌ、ネコ等のようなコンパニオンペット類;家畜、ウマ、牡牛、ヒツジ、ブタ、ヤギ等のような食料源となりかつ労働およびレクリエーション用にもなる動物;ボレリアの貯蔵場所として作用する野生動物例マウス、シカさえも含むがそれらに限定されない。本発明はまた、診断薬および本発明のキメラタンパク質内部に含まれるエピトープに対する抗体を有するヒトを識別するために前記診断薬を用いる方法を提供する。ボレリア暴露の疑いがあるかまたはボレリア暴露のリスクのある個体例ヒト、シカ、またはボレリアスピロヘータによる感染の疑いのある他の哺乳類から得た生体サンプルを、本発明のキメラタンパク質に接触させる。公知の方法論を用いて、前記キメラタンパク質と前記生体サンプル中の抗体の間における結合反応の有無を、検出する。陽性の結果結合が起こり、したがって、抗体が存在するは、前記個体がボレリアに暴露したことがあるかおよび/または感染していることを示唆する。この関係からして、分析目標に応じて、OspCタイプの問題のいずれのサブセットに対しても特異的なキメラが構築でき、すなわち、あらゆる可能なOspCタイプは、前記診断薬キメラに含まれることもあるし含まれないこともある。さらに、本発明の診断薬の様相は、臨床的使用または家庭での使用に限定されず、例えば、ダニ類から単離されたボレリアスピロヘータを同定し、OspCタイプの地理的分布を調べること、等、研究手段として実験室での用途に対しても貴重なものであろう。本発明は、本文に開示したエピトープおよび/またはキメラタンパク質に対する抗体も包含する。このような抗体は、ポリクローナル、モノクローナルまたはキメラであってもよく、当業者に公知のいかなる方法でも産生させることができる。本発明の好適な態様において、前記抗体は殺菌性であり殺ボレリア性、すなわち、前記抗体に対してボレリアスピロヘータを暴露させて前記スピロヘータを死滅させる。このような抗体は、例えば、ボレリアに対する過去の暴露を診断するための検出試薬類として、ボレリア研究のためのキット中試薬として、ボレリア感染を処置するため等、さまざまに使用できる。実施例下記の実施例は、本発明のさまざまな態様を例示するために提供するが、いかなる意味でも限定するものとみなすべきではない。侵襲性ヒトライム病単離物中におけるOspCタイプ多様性の実証とOspC抗体応答の特異性を定義するこれまで特性解析されていないエピトープの同定はじめにライム病は、ボレリアブルグドルフェリBorreliaburgdorferi、ボレリアガリニイB.gariniiまたはボレリアアフゼリイB.afzeliiに感染したイクソデスIxodesダニ類による咬み傷を通じてヒトに伝染する。外表面タンパク質COspCは、伝染過程に関連しかつおそらく哺乳類における初期感染の確立にも関与する重要な毒性因子と考えられているGrimmら、2004;Parlら、2004;Schwanら、1995。OspCは、約22kDaの表面露出性のプラスミドにコードされた可変リポタンパク質であるFuchsら、1992;Marconiら、1993;Sadzieneら、1993。結晶構造は、3種のOspCタンパク質について明らかになっているEickenら、2001;Kumaranら、2001。前記タンパク質は大部分がヘリカルであり、5個のアルファへリックスが可変性のループで連結されている。前記ループは、リガンド結合ドメインを形成すると仮説を立てられてきたEickenら、2001;Kumaranら、2001。証拠は、OspCがスピロへータのダニ中腸からの転移を唾液腺中の未同定レセプターに結合するアドヒシンとして作用することによって促進するかもしれないことを示唆しているPalら、2004。OspCのオルソログが再燃性発熱群の数種で同定され、このOspC関連タンパク質が他のボレリア種においても同様の役割を果たしている可能性を示唆しているMarconiら、1993;Margolisら、1994。OspC発現は環境的に制御されており、ダニ摂食により誘発され、OspCは、哺乳類における初期感染時の主要抗原であるAlversonら、2003;Schwanら、1998;Stevensonら、1995。転写は、RpoN/S制御ネットワークによって少なくとも部分的には制御されているHubnerら、2001。伝播時および初期感染時におけるOspC発現の一時的性質の正確な詳細については、互いに矛盾する報告があることに留意せねばならないOhnishiら、2001;Schwanら、1995。OspCは、有意な遺伝的および抗原性多様性を示すTheisenら、1995;Theisenら、1993。OspC系統発生群21種以下OspCと称するの輪郭が述べられているSeinostら、1999;Wangら、1999。OspCタイプは、文字命名AからUで区別している。前記データベース中にある数百のOspCアミノ酸配列の分析は、OspCタイプでの多様性が30と高く、ひとつのタイプ内では一般的に6未満である。Seinostらは、OspCタイプA、B、IおよびKとヒトにおける侵襲性感染との間の相関を仮説として提示しているSeinostら、1999。Lagalらはまた、一重鎖立体構造多形分析によって明らかになった特定のospC変異体は、侵襲性ヒト感染と相関すると報告したLagalら、2003。しかし、Alghaferiおよび共同研究者らによる最近の研究では、この相関の強さを問題にしているAlghaferiら、2005。OspCタイプすなわち配列および宿主―病原体相互作用の機能に及ぼす影響は、研究の重要かつ豊穣な領域を示している。OspCは、ライム病ワクチン開発での使用で研究されてきたBockenstedtら、1997;Gilmoreら、2003;Gilmoreら、1999a;Probertら、1994;Theisenら、1993;Wilskeら、1996。しかし、OspC変異とOspCの抗原性構造についての知識が限定されていることが、こうした努力を複雑にしてきた。OspCは防御性能力を有してはいるが、同一株に対してのみであるBockenstedtら、1997;Gilmoreら、1999;Gilmoreら、1999b;ProbertおよびLeFebvre、1994;Wilskeら、1996。このことは、前記防御性エピトープが、配列が極めて可変性である前記タンパク質の領域内部に属することを示唆している。本研究の目標は、幾重にも重なるものであった。最初に、OspCタイプと侵襲性感染の間の推定上の相関を評価することを、メリーランド州の一定の患者群から回収した侵襲性および非侵襲性単離物のOspCタイプを決定することによって、行った。第2に、OspCに対する抗体応答をさらに理解するための試みの中で、前記応答がタイプ特異的であるかどうか決定しようとした。最後に、OspCの抗原性構造の明確化を、マウスにおいて感染時の抗体応答を惹起するエピトープを同定することによって、行った。本文に示したデータは、侵襲性感染に関連したOspCタイプの数が過去に前提していたよりも大きいことを示唆しているSeinostら、1999。さらに、我々は、これまで特性解析されていないエピトープを2種同定し、OspCに対する抗体応答がタイプ特異的であるようだということを明らかにした。これらの分析は、ライム病病因論におけるOspCの役割についての我々の理解を深めかつOspCに基づくワクチンの構築を促進する重要な情報を提供する。実験操作菌単離物、感染血清の培養および産生メリーランド州ヒト患者から回収したライム病単離物を、これらの分析で使用した表1。患者は、本研究前にインフォームドコンセントを提出し、JohnHopkinsMedicineInstitutionalReviewBoardにより承認された。スピロヘータは、33°CにおいてBSK-H完全培地Sigmaで培養し、暗視野顕微鏡法でモニタリングし、遠心分離により採取した。クローン群は、先に記載されているようにサブサーフェィスプレーティングによって一部の単離物のために作製したSungら、2000。各コロニーのospCタイプを決定するため、下記に述べるようにospC遺伝子をPCR増幅させ、配列決定し、比較配列分析を行った。公知タイプのOspCタンパク質を発現するクローン群シリーズに対する抗血清を産生させるため、スピロヘータ103を、リン酸緩衝生理食塩水PBSで洗浄し、C3H-HeJマウスに針を接種した皮下、肩甲骨の間;JacksonLabs。前記マウスの感染は、先に記載されているようにZhangら、2005flaB遺伝子を標的とするプライマーを用いて接種第2または4週後に耳穿孔生検物のリアルタイムPCRによって、確認した。血液は各マウスから尾部の切断により第0、2、4および8週時点で採取し、感染血清を採取した。これらの分析で使用した付加的抗血清と感染血清は先に記載されているMcDowellら、2002。DNA単離、OspCタイピングおよびコンピュータ利用の構造解析前記OspCタイプを決定するため、総DNAを先に記載されているように各株から単離しMarconiら、2003、OspC20LICおよびOspC210-LICプライマーによるPCRのためのテンプレートとして用いた表2。PCRは、下記のサイクル条件下でエクスパンドハイフィデリティExpandHighFidelityポリメラーゼRocheを用いて行った:初期変性は94°Cで2分間;94°Cで15秒、50°Cで30秒、68°Cで60秒を10サイクル;94°Cで15秒、50°Cで30秒、68°Cで60秒に、最終20サイクル目のそれぞれに5秒追加する;最終伸長は68°Cで7分間。キアクイックQiaQuickPCR精製キットQiagenを用いて増幅物を回収し、T4DNAポリメラーゼで処理し一重鎖オーバーハング類を産生させ、pET-32Ek/LICベクターNovagen中にアニーリングさせ大腸菌E.coliNovaBlueDE3細胞Novagen中に形質転換した。これらの操作のための方法は、前記製造業者の説明に従って進めた。コロニーをアンピシリン耐性について選択し50μgml-1、PCRによってospCインサートをスクリーニングした。選択したコロニーをLB培地Fisherに移し、振動させながら300rpm37°Cで培養し、キアフィルターミディプラスミドアイソレーションキットQiaFilterMidiPlasmidIsolationKitsQiagenを用いてプラスミドを単離した。ospCインサートを、作業毎の料金支払いという方式で配列決定したMWGBiotech。決定した配列を、デフォルトパラメータ類によるClustalX35を用いて、翻訳し並べた。OspCタイプを決定するため、隣接する結合ツリーを作成し、ブーツストラップ値を計算した1000回試行。結果として生成した系統発生図を、N-Jプロッターで見えるようにした、前記データベースで利用可能な追加のOspC配列もこの分析に含めた。OspCの構造モデルを、NCBI分子モデルデータベースファイル類1GGQ、1F1M、および1G5Z4、15およびncbi.nlm.nih.gov/Structure/CN3D/cn3d.shtmlで入手可能なソフトウェアCN3Dを用いて作成した。組換えタンパク質の作成全長OspCおよび短く切断したOspCを作成するため、ボレリアブルグドルフェリB.burgdorferiB31MIのタイプAospC配列Fraserら、1997に基づき、プライマーを設計した。前記プライマーは、リガーゼ非依存性クローニングLICかつ発現ベクターであるpET-32Ek/LICベクターNovagen中へのアニーリングを可能とするテイル配列を有している。全てのLIC操作は、先に記載されているようにしたHovisら、2004。全構築体の配列を確認するため、組換えプラスミドを、QiaFilterMidiPlasmid精製キットQiagenを用いて大腸菌E.coliNovaBlueDE3から精製し、その挿入物を配列決定したMWGBiotech。SDS-PAGEおよびイムノブロット分析タンパク質は、先に記載されているように、SDS-PAGEにより12.5クライテリオンプレキャストゲルCriterionPrecastGelsBiorad中で分離し、かつ、PVDF膜Millipore上でイムノブロッティングしたRobertsら、2002。組換えタンパク質の発現はS-Protein西洋わさびパーオキシダーゼHRP結合物Novagenを用いて確認した。この発現によって、本研究で用いた全ての組換えタンパク質の保有N末端S-タグ融合物を検出する。このHRP結合S-タンパク質を、希釈度1:10,000で用いた。イムノブロット分析のため、感染マウスから採取した血清を1:1000の希釈度で用いた。HRP結合ヤギ抗マウスIgGは、二次Pierceとして作用し、希釈度1:10,000で用いた。全般的イムノブロット方法は、先に記載されている通りであったMettsら、2003。結果メリーランド州のヒトライム病患者から回収した単離物のospCタイピング分析ospCは、メリーランド州ヒトライム病患者から回収した分析単離物のそれぞれから増幅し、成功した。各増幅物の配列を決定し、比較配列分析を行ってOspCタイプを決定した図1。An=6、Bn=1、Cn=1、Dn=1、Hn=2,Kn=4,およびNn=3を含むいくつかの互いに異なるOspCタイプの代表的なものを同定した。OspCタイプA、B、IおよびKのみがヒトにおける侵襲性感染に関連していると過去に報告されているSeinostら、1999。本研究では、血液、臓器または脳脊髄液から回収したものとして侵襲性単離物を定義し、一方、非侵襲性単離物は、皮膚から回収されたものであるが他の体部位には見られないものであったSeinostら、1999。しかし、ここで、OspCタイプC、DおよびNを発現するいくつかの単離物が血液中からLDP84、LDP63、LDP116およびLDP120または脳脊髄液からLDC83回収され、従って、侵襲性であることが明らかとなっている。この観察は、特定のOspCタイプと侵襲性感染との相関が厳密なものではないかもしれないこと、および、この相関の強さを再評価する必要があることを示唆している。マウス感染時におけるOspCに対する抗体応答のタイプ特異性の分析感染時においてOspCに対して惹起された抗体応答がタイプ特異的であるかどうかを決定するため、タイプA、B、C、D、H、KおよびN組換えOspCタンパク質を、試験抗原としての用途のために作製した。この組換えタンパク質をイムノブロッティングし、前記A、BまたはDOspCタイプのボレリアブルグドルフェリB.burgdorferi単離物に感染したマウス上記で決定から採取した血清でスクリーニングした図2。大腸菌E.coli中における前記組換えタンパク質の発現とタンパク質が等量負荷されていることを、N末端融合におけるS-タグを認識するHRP結合S-タンパク質によりイムノブロットをスクリーニングすることによって確認した。感染第2週に採取した抗ボレリアブルグドルフェリB.burgdorferiB31MI抗血清タイプAOspCでスクリーニングすると、強い反応性が、このタイプAタンパク質でのみ検出された。OspCに対する強くかつ早期のIgG応答は、これまでの報告と一致しているTheisenら、1995;Wilskeら、1993。感染第8週に採取した血清もまた、主にタイプAOspCと反応したが、他のOspCタイプとの弱い交差免疫反応性が観察された。LDP116およびLDP73それぞれ、OspCタイプDおよびD単離物に感染したマウスにおけるOspCに対するAb応答もまた、タイプ特異的であった。OspCに対する抗体応答にはかなりの程度のタイプ特異性があること、および、この特異性は、インビボ免疫優性エピトープが前記タンパク質のタイプ特異的ドメインに局在していることを意味していると結論できる。マウスにおいて感染時に抗体応答を惹起するOspC線状エピトープの局在感染時に抗体応答を惹起するタイプAOspC線状エピトープを同定するため、数種の組換えOspC断片を産生させ、α-B.burgdorferiB31MI感染血清第8週によりスクリーニングした図3。B31MIは、OspCタイプA産生株である。前記組換えタンパク質の発現は、HRP結合S-タンパク質によるイムノブロッティングにより確認した。OspCの線状エピトープを局在化させるため、前記OspC断片のイムノブロットを感染血清でスクリーニングした。1種以上のエピトープを含有する2個のドメインを局在化し、そのうちのひとつは、アルファへリックス5の残基168と203の間のタンパク質のC末端半分の内部にあり、もうひとつは、ヘリックス3とループ5の残基136と150の間にある以後、それぞれ、アルファ5およびループ5エピトープと称する。これらのエピトープは、過去に文献で特性解析されていない。ospC配列分析とOspC構造のコンピュータモデリング前記ループ5およびアルファ5エピトープが空間的に前記OspCタンパク質のどこにあるかを決定するため、X線結晶解析により決定した座標軸Eickenら、2001;Kumaranら、2001を評価し、リボンおよびスペースフィルモデルを、タイプAOspCの単量体およびまたは2量体形状について作成したデータは示さず。タイプIおよびEOspCタンパク質の単量体形状もまた、モデル化した。これらの解析で、ループ5エピトープがタイプA、EおよびIOspCタンパク質の単量体および二量体形状の両者の上で表面露出していることが明らかになった。もともとのX線結晶解析において、N-およびC末端の両者の一部は、前記組換えタンパク質の一部でないかあるいはモデル化できなかった。いずれにしても、決定した構造は、N-およびC末端の両者ともに互いに近接し存在していることおよび細胞膜に近いことを示唆している。タイプ内レベルでループ5およびアルファ5エピトープ内部における配列変動を評価するため、227個のOspC配列を並べた。これらの分析で、ループ5およびアルファ5エピトープ両者ともにタイプ間レベルでは極めて可変性であるが、あるタイプの内部では非常によく保存されていることが明らかになった。図4は、表形式で各OspCタイプについてループ5およびアルファ5ドメイン配列を示し、各特定配列が解析したOspC配列中に検出される頻度を示している。タイプ内レベルでのループ5の保存についての証拠として、57種のタイプAループ5エピトープの比較を行い、53種が残基1個または2個でのみ異なる中心から離れた配列と同一であることが明らかとなった。同様の観察が、アルファ5エピトープについて指摘された。43種のタイプAOspC配列のうち、42種が残基168と203の間で同一であった。多くの場合、前記データベースで利用可能な配列が部分的でかつ変動する量のC末端を欠いているので、より少ないアルファ5エピトープ配列を分析したことに留意されたい。ループ5エピトープに対する抗体応答がマウス個体に独自のものではないことの実証ループ5のタイプ内保存とその実質的に短い長さから考えると、ループ5エピトープはキメラOspCループ5に基づくワクシノーゲンの開発における用途のための優れた候補であるかもしれない。ループ5エピトープに対する抗体応答が感染時に普遍的に起こり、あるマウス個体に独自のものではなかったことを確認するため、ループ5を含有する130-150断片のイムノブロットをタイプAOspC産生株B31MI、LDP56および5A4に感染した数匹の追加マウスからの血清でスクリーニングした。全ての場合において、このエピトープを認識する抗体が検出された図5。ループ5に対する応答はLDP56感染マウス2からの感染血清で弱かったが、より長く暴露させると、ループ5がこの動物で抗原性であることが明確になった。このことは、これらのエピトープに載せられた免疫応答が動物個体に独自のものではないことを明らかに示し、さらに、ワクチン開発におけるその用途可能性についての裏づけを与える。考察OspCは、ライム病病因に対する重要な寄与因子として明らかに確立されているGrimmら、2004;Palら、2004;Schwanら、1995。中腸から唾液腺までのライム病スピロヘータの移動時にそれが重要な役割を果たすことについて強力な証拠があるPalら、2004。さらに、感染初期においてそれが選択的に発現され、免疫優性抗原でありFingerleら、1995;Schwanら、1998;Wilskeら、1993、また他者によってライム病単離物の伝播能力において重要な決定因子であると仮説されているSeinostら、1999。本研究の目標は、OspCタイプと侵襲性感染の間の潜在的相関を試験すること、OspCに対する抗体応答がタイプ特異的であるかどうかを決定すること、および感染時に提示される線状エピトープの局在化によってOspCの抗原性構造を明確にすることであった。OspCの配列分析は、21種の明白なOspCタイプの輪郭を叙述しSeinostら、1999、さらにこれらのうちの4種のみタイプA,B、IおよびKがヒトにおける侵襲性感染に関係していると仮定されたSeinostら、1999。しかし、最近の研究では、この推定上の相関に疑問がもたれているAlghaferiら、2005。これをさらに解明するため、メリーランド州ヒトライム病患者から回収した侵襲性および非侵襲性ライム病単離物のOspCタイプを決定した。これを達成するため、全長ospC遺伝子をPCRで増幅し、配列決定しかつ比較配列分析を行った。これらの分析では、この患者群における侵襲性ヒト感染に関連したOspCタイプにはタイプC,DおよびNが含まれることを明らかにした。タイプIOspC産生株は侵襲性ヒト感染に関連した主要タイプであると示唆されているSeinostら、1999が、メリーランド州患者群で同定された侵襲性単離物のいずれもタイプIospCを保有していなかった。同様に、Alghaferiらはまた、タイプIOspC産生株を検出しなかったAlghaferiら、2005。まとめると、これらの2種の研究では、グレーターバルチモア地区において18個の侵襲性単離物を同定し、下記の内訳を有していた:A、n=5;B、n=2;C、n=1;D、n=1;H、n=1;K、n=3およびN、n=7。従って、この地理的領域では、OspCタイプAおよびN産生侵襲性単離物が主であるらしい。これらのデータは、4種のOspCタイプのみがヒトにおける侵襲性感染に関連しているという仮説に異を唱えるものである。異なる地理的領域からのより大きな患者集団から回収した単離物のさらなる分析が、OspCタイプ-侵襲性感染相関の有効性をさらに評価するために、またある定めた地理的領域における特定OspCタイプの優勢度に差異があるかどうかを決定するために、必要であろう。明白なOspCタイプの明示と関連させたOspCのワクチン接種により提供される防御の変動Seinostら、1999は、抗体応答がタイプ特異的であるかもしれない可能性を高めている。この仮説は、OspCによるワクチン接種が同一株に対してのみ防御することが分かったという事実によって裏付けられているBockenstadtら、1997;Gilmoreら、1999a;ProbertおよびLeFebvre、1994。この報告までは、感染時におけるOspCに対する抗体応答のタイプ特異性が直接評価されたことはなかった。これを解明するため、タイプA、B、C、D、H、KおよびNの全長組換えOspCタンパク質シリーズを、公知のOspCタイプを発現するクローン群でマウス中に産生された感染血清でスクリーニングした。感染血清の使用は、インビボにおいて前記菌で特異的に提示されるエピトープに対する抗体応答に焦点を合わせて評価することを可能にするので、重要である。これらの分析は、OspCのNおよびC末ドメイン内部で配列保存が強いにもかかわらず、分析したOspCタイプに対する抗体応答がタイプ特異的であることを明らかにした。例えば、タイプAまたはD株に感染したマウスからの血清は、他のOspCタイプとはほとんどまたは全く交差免疫反応性がなくタイプ特異的に免疫反応性であった。21種のOspCタイプ全てに対する抗体応答を分析したわけではないが、上記に示したデータは、前記の保存ドメインは免疫優性ではないこと、および感染時に前記菌によって提示されたOspCの線状エピトープが前記タンパク質の可変領域すなわち、タイプ特異的ドメインに含まれることを示唆している。OspCのエピトープを局在化するかまたは同定することを探求した研究はこれまでわずかしか公表されていない。線状構造および立体構造のエピトープの両者が同定されている。GilmoreとMbowは、残基6個の短いリーダー配列を越えた独立したN末欠損と残基13個のC末切断物が、モノクローナル抗体B5の結合を完全に破壊することを明らかにしたGilmoreら、1995a;Gilmore,1998。このことから、B5モノクローナル抗体が立体構造的に定義されたエピトープを認識すると結論されたGilmoreら、1999b。この立体構造的に明確にされたエピトープ内部の抗体認識部位を含む残基の詳細は同定されなかった。モノクローナル抗体B5で観察されたものと対照的に、細胞結合天然OspCのポリクローナル抗体応答の解析は、OspCの最後の10個のC末残基またはN末の伸長領域の欠損が、感染時に惹起されたIgGによるOspC認識を完全に破壊しないことを明らかにした。結果におけるこうした差異は、おそらく、ポリクローナル抗体対モノクローナル抗体上での中心点を反映しているのであろう。このデータは、立体構造エピトープの存在を確かに排除しないが、OspCにも同様に線状エピトープがあることを明らかに示している。Mathiesonらは先の研究で、OspCにおける線状エピトープについて報告しているMathiesonら、1998。彼らは、OspCのC末残基7個が欧州での神経系ボレリア症患者から採取した血清中IgMにより認識される線状エピトープを構成することを見出した。IgM結合はこの報告で評価されていないが、OspCのC末残基10個の欠損がIgG結合を完全に破壊しなかった。感染誘発IgGにより認識されるエピトープは、前記タンパク質中の数箇所の部位に局在するようである。しかし、このことは、C末エピトープが存在しないかあるいは感染時に惹起された抗体によって認識されないことを示唆するものではなく、むしろ、OspC中のどこかほかに局在する付加的エピトープがあることを示唆している。より短いOspC断片のイムノブロット分析により、OspCエピトープのより詳細な局在化が可能となった。OspCの抗原性領域は、2個の領域に局在化された。ひとつは残基136-150にわたり、もうひとつは、残基168乃至210にわたる。X線回折分析による座標を用いて作成した構造モデルでは、ループ5と命名した表面露出ループ内部に主に、残基136-150を配置しているKumaranら、2001。ループ5はOspCの単量体および二量体モデルの両者において表面露出しており、顕著な曲部の内部に位置している。組換えOspCが実際には二量体を形成していることが明らかになっている一方、天然のOspCがインビボで二量体またはそれより大きいオリゴマー類を形成しているかどうかはまだ決定されていない。OspCの二量体モデルは、30を超えて前記タンパク質を含む有意な埋没した界面を示唆している。この程度に埋没した界面は、前記単量体間の緊密な相互作用を示唆しており、前記タンパク質の二量体形状が生物学的に活性な形状であることを示唆するものであると考えられるKumaranら、2001;Eickenら、2001;Zuckertら、2001。OspC二量体において、ループ5内部の残基は、推定上の立体構造規定リガンド結合ポケットの一部であると予測され、それは、生物学的に重要であるかもしれない。この荷電ポケットは、グルタミン酸およびアスパラギン酸残基のようなカルボニル基を含むアミノ酸によって内側を覆われている。結晶構造が、タイプA、IKumaranら、2001およびEEickenら、2001の3種のOspCタンパク質について決定されている。これらのタンパク質の全てにおいて、この推定結合ポケットの溶媒構造は、驚くほど良好に保存されている。感染血清中において抗体に対するループ5のアクセス可能性は、このドメインが表面露出されかつ潜在的にリガンド結合に利用できるかも知れないという仮説を裏付ける。ループ5と前記推定上のリガンド結合ポケットの強いタイプ間構造保存にもかかわらず、このドメインの配列は、前記のタイプ間レベルにおいて極めて可変である。残基168乃至210にわたるアルファ5ドメインの配列もまた、このタイプ間レベルで可変であるが、ただし、最後の残基20個では極めてよく保存されており、例外とする。タイプ内レベルで十分な保存が存在するかどうかを決定し、一連のタイプ特異的エピトープから構成されるキメラOspCワクチンの構築を可能とするために、OspC配列を並べ、ツリー図を作成した。これらの分析により、前記OspCタイプは、配列227種について決定されたデータを示さず。ループ5とアルファ5エピトープの両者ともに、タイプ内レベルでよく保存されていることがわかった。例えば、タイプAOspCタンパク質のループ5エピトープは、配列57個のうちの54で同じであり、一方、アルファ5エピトープはタイプA配列43個のうちの42で保存されていた。他のOspCタイプにおいてもこれらのドメインがかなりよく保存されていることも同様に判明し、タイプCからタイプI、M、NおよびOは、ループ5およびアルファ5エピトープ内部で絶対的なタイプ内保存を示した。本研究は、侵襲性単離物中においてこれまで認識されていたよりもかなりOspC多様性があることを明らかにしている。本研究はまた、マウスにおけるOspCに対する抗体応答が極めてタイプ特異的でありこれまで特性解析されていないループ5およびアルファ5エピトープによって定義されることを明らかにしている。初期の研究と本明細書に示したデータは、単一のOspCタンパク質では多様な株に対する防御を伝えないであろうということを示しているBockenstedtら、1997。ひとつの可能なワクチン接種手法は、組換えキメラOspCワクシノーゲンの開発において本レポートで同定したエピトープを活用することである。ループ5エピトープまたはループ5とアルファ5エピトープの併用は、それらがヒトで一貫して抗原性であることが判明すれば、大きな見込みを与えるかも知れない。これらのエピトープは長さが比較的短く、線状でかつタイプ内レベルで高度に保存されている。これらの特徴に鑑み、極めて多様なライム病単離物に対する防御を伝播することができるループ5-アルファ5キメラワクシノーゲンを構築することが技術的に可能であることを当然示している。タイプAOspCループ5ドメインに対するヒトにおける抗体応答の分析とライム病ワクチン開発におけるループ5エピトープの潜在的用途の評価ライム病スピロヘータの外表面タンパク質COspCは、ダニ摂食で発現しかつ初期感染時に発現する22kDaの免疫優性Fuchsら、1992抗原であるSchwanら、1995。OspCに対する強度の抗体応答が自然感染時には発動されるが、この応答は、OspC産生が感染確立後まもなく停止するので細菌撲滅には至らないSchwanら、1995。OspCは、重要な毒性因子としておよびライム病ワクチン開発のための強力な候補として出現した。しかし、OspCに基づくワクチンを開発する努力は、株中でのその不均一性により妨害されたTheisenら、1993;Wilskeら、1996;Wilskeら、1993。OspCによるワクチン接種は高い防御性応答を惹起するが、多くの研究では、株特異的防御のみを報告しているBockenstedtら、1997;Gilmoreら、1996;Mbowら、n1999;Probertら、1997;Rousselleら、1998;Scheiblhoferら、2003。最近の分析で、OspCの抗原性構造についての理解と株特異的防御の基礎についての意義深い洞察が得られた。21種のOspCタイプはAからUと命名され、明らかにされたLagalら、2003;Seinostら、1999;Wangら、1999。特異的OspCタイプを産生するボレリアブルグドルフェリBorreliaburgdorferiのクローン群でマウスを感染させることによって、初期感染時の前記抗体応答が主にOspCタイプ特異的であることが明らかになった実施例1参照。このことは、初期感染時に提示された主なエピトープがOspCのタイプ特異的ドメイン内部に存在する可能性を示唆している。初期の研究では前記21種のOspCタイプのうち4種のみが侵襲性感染と関連していると示唆しているSeinostら、1999一方、最近の研究では、追加のOspCタイプを産生する単離物もまた侵襲性感染を確立できることを明らかにしたAlghaferiら、2005;実施例1。しかし、タイプAOspCは、ヒトで侵襲性感染を起こす株中で優勢であるようである。タイプAOspCのエピトープマッピング分析により、マウスで応答を惹起する前記優性線状エピトープのひとつが前記ループ5ドメイン内部に存在することが、明らかになった実施例1参照。前記ループ5ドメインはタイプ間レベルで高度に可変であるが、ある一定のタイプの配列内部で保存されている実施例1参照。我々は、本研究で、前記エピトープの位置をさらに正確にし、未変性菌上でのその表面露出を実証し、それが殺菌性抗体を惹起することを明確にする。OspCの免疫優性エピトープを定義しようとする多くの研究が、マウスで行われているBockenstedtら、1997;Gilmore、1996;Mbowら、1999;Probertら、1994。しかし、いくつかのエピトープに対する抗体応答は、ヒト対マウスおよび他の哺乳類で異なっていることが明らかとなったLovrichら、2005。本研究の第一の目的は、OspCの前記ループ5ドメインがヒトにおいて感染時に惹起された抗体によって認識されるかどうかを決定することであった。理想的には、これらの分析は、タイプA産生株のクローン群に感染した個体から採取した血清で行われるであろう。個体が不均一または均一群に感染しているかどうかを絶対的に確実に決定することはできないので、我々は、タイプA特異的配列に対して応答を示す患者血清を識別することにした。これを成し遂げるため、遊走性紅斑初期ライム病患者から採取した血清サンプルパネルを、酵素結合イムノソルベントアッセイELISAによってスクリーニングした。組換えタイプr-タイプAOspCおよびr-タイプAOspCサブフラグメント含有ループ5残基130乃至150を用いて、96ウェルプレートを塗布したr-タンパク質250ng/ウェル;0.1MNa2HPO4;4°Cで一晩。前記プレートをブロックしリン酸緩衝生理食塩水、0.5Tweeen20中10乾燥無脂乳、;37°Cで2時間、洗浄し、ヒトライム病患者血清1:400に希釈を各ウェルに添加した37°C;1時間。供給者Sigmaの指示に従い、西洋わさびパーオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトイムノグロブリンGIgG;Sigma1:40,000希釈物の50lを添加し1時間;37°C、TMB基質3,3,5,5-テトラメチルベンチジンを添加した。450nmにおける光学密度値を、プレートリーダーを用いて決定した。さらに追加ウェルにウシ血清アルブミンを塗布し、陰性対照として使用した。アッセイは全て三重に行った。A450平均値を標準偏差とともに示した。図6に示したように、血清サンプル数個は、全長タイプAOspCとループ5断片の両者に対して強いIgG応答を有していることがわかった。血清サンプル8と44は、ループ5断片と最大強度の免疫反応性を示し、従って、さらに分析するために選択した。前記ループ5ドメイン内部の感染誘発抗体により認識される残基をさらに正確に画定するため、PepSpotアレイを患者8と44の血清でスクリーニングし、さらに、タイプAOspC産生株B31MIのクローン群に感染したマウスの血清でスクリーニングした実施例1参照。前記PepSpotアレイは、Whatman50セルロース膜にスポットしたタイプAOspCのループ5ドメインをカバーする12個乃至13個の残基重複ペプチド2個のアミノ酸段階から構成されていた150nmol/cm2;JPTPeptideTechnologiesGmBH、Berlin、Germany。前記PepSpot膜をブロックしトリス緩衝生理食塩水-0.5Tween20中5乾燥無脂乳、洗浄し、マウスおよびヒト血清サンプルブロック溶液でそれぞれ、1:1,000および1:400に希釈でスクリーニングし、種特異的抗IgG抗血清で抗体結合を検出した。免疫反応ドメインを構成する前記特異的残基はマウスとヒトでわずかに異なるが、主要エピトープは、残基130乃至146内部に局在している図7。タイプAOspC配列中において、この領域は、アルファヘリックス3のC末領域とループ5のN末部分を包含している。OspCの結晶構造は、空間的には、ループ5を前記タンパク質のある顕著な曲部に配置しているEickenら、2005;Kumaranら、2001;図24。このループは、潜在的リガンド結合ポケットの部分として仮定されているKumaranら、2001。ループ5が細胞表面に現れておりかつインビトロで増殖中のスピロヘータ中で抗体にアクセス可能であるかを決定するため、蛍光免疫アッセイIFAsを、抗ループ5抗血清を用いて実施した。ボレリアブルグドルフェリB.burgdorferiB31MIタイプAOspC、ボレリアパルケリB.parkeriおよびSタグr-タイプAループ5の全細胞溶解物によるイムノブロット分析は、前記ループ5抗血清が特異的であることを実証し、IFAsに対するこの抗血清の適切性を確立した。IFAにより分析した前記株は、ボレリアブルグドルフェリB.burgdorferiB31MIタイプAOspCおよびLDP74タイプKOspCから構成されていた。前記スピロヘータを33°Cで増殖させ、37°Cに3日間移し、OspC発現を刺激した。IFAsは、透過性を高めた細胞アセトン固定、透過性を高めていない細胞風乾、および先に記載Robertsら、2002した標準的方法により、実施した。このスライドを、マウスループ5抗血清、マウス前免疫血清またはウサギ-フラゲリン抗血清の1:1,000希釈物によりスクリーニングした。検出は、AlexaFluor568-結合ヤギα-マウスIgGまたはAlexaFluor488結合ヤギα-ウサギIgGブロック緩衝液中10μgml-1を用いて、行った。スライドを、適切な場合にはローダミンまたはフルオレセインフィルターセットを用いてオリンパスBX51蛍光顕微鏡で、または、暗視野顕微鏡によって肉眼で見えるようにし、またオリンパスMagnaFIREカメラを用いて写真撮影した。IFAによって観察された標識化は極めて特異的で、イムノブロット分析と一致していた;タイプA産生単離物を表面標識し、一方、ボレリアブルグドルフェリB.burgdorferiLDP74タイプKOspCは、標識しなかったデータを示さず。さらに、高温でのOspCの上方制御と一致して、IFAsが、33°Cで増殖させた細胞よりも37°Cで増殖したスピロヘータの表面標識が顕著に高いことを明らかにした。内膜にアンカーしたペリプラズムタンパク質を認識する前記のα-FlaB抗血清は、透過性を高めていない細胞を標識しなかったが、アセトンで透過性を高めた細胞を容易に標識したデータを示さず。この制御は、前記ループ5が実際には表面に露出していることおよびIFAで用いた実験条件は細胞一体性を破壊せず、それによって、前記菌の表面に天然には提示されないエピトープを人工的に露出することを明確にした。細胞表面でOspCに効率的に結合するループ5抗血清の能力は、前記相互作用が殺菌性であるかもしれない可能性を高め、そのことは、全長OspCに対する抗体についても実証されているBockenstedtら、1997;Ikushimaら、2000;Jobeら、2003;Lovrichら、2005;Rousselleら、1998。ループ5標的抗体も同様に殺菌活性を示すかどうかを決定するため、33°Cまたは37°Cに移した温度で培養したボレリアブルグドルフェリB.burgdorferi単離物B31MIとLDP74により殺アッセイを行った。前記スピロヘータは遠心分離によって採取し、洗浄し、500l当たり5×105細胞に調節しBSK-H培地中において、12.5μlを、無菌の0.65ml容量のミクロ遠心管中に入れた。次に、熱不活性化56°C;30分ループ5血清10μlを、モルモット補体7.5μl;SigmaChemical,St.Louise、Mo.とともにあるいはそれなしで添加し、前記成分を33または37°Cで8時間混合しインキュベーションした。総計70μlのH2Oを添加し、スピロヘータをLive/DeadBacLight染色MolecularProbes,Eigene,Oreg.で製造業者の取扱説明に従い染色した。簡単に述べると、前記細胞に2種の染色液;SYTO9およびプロピジウムアイオダイドを添加する。これらの色素は、生きている菌すなわち、未変性膜を有すると変成を受けた膜を有する菌とを区別できる。生きている菌はSYTO9による染色により緑色の蛍光を発し、一方、死んでいるかまたは傷害を受けた菌はプロピジウムアイオダイドによる染色によって赤色蛍光を発する。前免疫熱不活性化血清補体ありまたはなし処理で観察された膜破壊を伴う細胞の基準値は、25であった。対照的に、前記α-ループ5抗血清に暴露した細胞の約70が膜破壊を示した。殺菌活性は補体依存性であることがわかった。抗ループ5抗体処理によりここで観察された泡状化効果は他の抗OspC抗体で報告されているものと一致しているBockenstedtら、1997;Escuderoら、1997。また、高温でのOspCの上方制御と一致して、死細胞の百分率は、33°Cで増殖させた菌よりも37°Cで増殖させたスピロヘータ中で一貫して高かったデータを示さず。提示されたデータから、抗ループ5抗体が殺菌性であることが明白である。論文数編が、ライム病ワクチン開発を明確に強く正当化する強い理由を概括的に述べているHansonおよびEdelman,2004でレビューされている。しかし、現時点では、ワクチンは全く市販されていない。防御性の広いライム病ワクチンを開発しようとして、Baxterは、14種の互いに異なる全長r-OspCタンパク質のワクチンカクテルを作製する戦略を追及したHansonおよびEdelman,2004。しかし、前記カクテルは、反応原性が容認できないとされた。この反応原性は、前記カクテル中の各OspCタイプタンパク質の独自の防御性エピトープに対する十分な応答を惹起するために大量のタンパク質を必要とした結果、生じたものであるのかもしれない。複数の全長タンパク質を用いるカクテルワクチンについての潜在的問題は、保存された、無関連の非防御性エピトープに対する抗体応答が間違って出される可能性があることである。主要OspCタイプのそれぞれの天然提示免疫優性線状エピトープから構成されたキメラ、r-ワクシノーゲンの開発を通してこの問題を克服することが可能である。この一般的概念は、異なる感染時期に発現したタンパク質由来のエピトープを用いてマラリアワクチンを開発しようとする試みの中にその起源を有しているHansonおよびEdelman,2004。同じ概念が、A群連鎖球菌のための六価Mタンパク質ワクチンの開発に応用されDale,1999、さらに数種のそれ以外の病原体に対するワクチン開発にも応用され、すばらしい成功を収めたAptaら、2006;Caro-Aguilarら、2005;Fanら、2005;Horvathら、2005;Kotloffら、2005;McNeilら、2005;Wangら、2005。OspCの物理的および抗原性構造への新たな洞察を通じて、有効な、r-多価キメラOspCワクチンの開発が今や可能とみられる。この新しく同定されたループ5ドメインは、このようなワクチンに取り入れるのに適しており、理想的である。OspCに基づく4価の組換えキメラワクシノーゲンの開発ライム病は、北アメリカおよびヨーロッパで最もよく見られる節足動物伝播疾患である。現在では、ヒトで使用するための市販のワクチンは全くない。外表面タンパク質COspCは抗原性特性および発現特性を有し、そのために魅力的なワクチン候補となっている;しかし、配列不均一性がそのワクシノーゲンとしての使用を妨げてきた。配列分析を通じて、21種の明確に画定されたOspC系統発生群すなわちタイプAからUと命名が同定された。本研究は、組換え4価のキメラワクシノーゲンの開発において、ヒトおよびマウス感染時に先に同定ずみのタイプAOspC線状エピトープとともにOspCタイプB、KおよびDにより提示された線状エピトープのマッピングとこれらのエピトープの活用を報告した。前記構築体はマウスにおいて非常に免疫原性で、誘発された抗体は、インビトロ培養スピロヘータを表面標識した。ワクチン接種により、前記構築体に取り込まれたOspCタイプのそれぞれを発現する株に対して補体依存性の殺菌性抗体を誘発したことは重要である。これらの結果は、有効で防御性の広い多価OspC利用のライム病ワクチンが組換えキメラタンパク質として産生できることを示唆している。材料および方法ボレリアブルグドルフェリBorreliaburgdorferi単離物および培養ボレリアブルグドルフェリBorreliaburgdorferi単離物B31MIタイプAOspC、LDP73タイプB、LDP116タイプDおよびLDP74タイプKのクローン群実施例1参照を、先に記載されているようにサブサーフェィスプレーティングによって得たSungら、2000。それぞれのクローンのOspCタイプは、PCR増幅TaqPolymerase、PromegaおよびOspCのDNA配列決定により決定し、系統発生的分析によりタイプを振り分けた実施例1参照。スピロヘータは、完全BSK-H培地Sigma中で先に述べたように33または37°Cで培養した。リガーゼ非依存性クローニングと組換えr-OspCタンパク質の産生全長タイプB、KおよびDのOspCと切断物および断片シリーズとを、各単離物からの対応の遺伝子のPCR増幅によって産生させた。前記プライマーは5 ́オーバーハングを有するように設計し、pET-32Ek/LICベクター中においてリガーゼ非依存性クローニングLICを行った表3実施例1。全てのLIC方法は、基本的に製造業者Novagenの説明書どおりに行った。簡単に述べると、一重鎖テイルの増幅および再生後、増幅物をpET-32Ek/LICベクターでアニーリングし、NovaBlueDE3大腸菌E.coli細胞中に形質転換しそこで増殖させた。前記プラスミドを回収し、挿入物の配列をDNA配列決定によって確認した。タンパク質精製のため、精製したプラスミドを用いて大腸菌E.coliBL21DE3細胞を形質転換し、対数増殖期に培養物にIPTG1mMを添加後3時間インキュベーションし、タンパク質発現を誘発した。pET-32Ek/LCベクターからの発現によって付加されたN末融合物は、Trx-タグ、S-タグ、およびヘキサヒスチジンHis-tagモチーフを含んでいる。His-tagを活用し、ニッケルアフィニティクロマトグラフィにより前記r-タンパク質の精製を行った。簡単に述べると、細胞を融解させ、核酸および細胞壁ペプチドグリカンをそれぞれ、ベンゾナーゼヌクレアーゼとr-リゾチームによって分解した。製造業者Novagenの説明書どおりに、可溶性タンパク質を遠心分離16000×gで15分間によって透明にし、固定ニッケルカラムに流し、洗浄し、溶出させた。溶出されたタンパク質を、リン酸緩衝生理食塩水PBS;pH7.4で10kDa分子量のカットオフ膜Slid-a-lyzer、Pierceに対して十分に透析し、最終タンパク質濃度は、BCAアッセイPierceによって定量し、前記調製物の純度は、SDS-PAGEによって評価した。イムノブロット分析:OspCタイプB、DおよびKのエピトープマッピング感染時関連エピトープのマッピングを可能とするため、C3H/HeJマウスをOspCタイプB、KまたはDを発現するクローン群のスピロヘータ104で感染させ、血液を尾部出血によって第2週、第4週、第6週、第8週および第12週に採取した。これらの血清を用いて、実施例1に記載のように精製したOspCタンパク質および切断物をスクリーニングした。r-タンパク質は、SDS-PAGEに供し、PVDFに移し、前記のタイプ特異的マウス感染血清第6週に採取の1:1000希釈物によってスクリーニングした。同様に、前記r-タンパク質は、OspCタイプB、KまたはDを発現するボレリアブルグドルフェリB.burgdorferi株AllenSteere博士が親切に供与してくれたへの感染が既知である患者からの血清1:400でスクリーニングした。適切なIgG特異的西洋わさびパーオキシザーゼHRP結合ニ次抗体を用い、結果を化学発光によって視覚化した。4価のキメラワクシノーゲンの構築と発現タイプAのループ5領域aa131から149までとタイプBaa160-201、Kaa161-201およびDaa161-201のアルファヘリックス5領域を、前記の4価試験ワクシノーゲン中に取り込ませるために選択した。各エピトープ含有領域を、上述のr-プラスミドと表4に列挙したプライマーからPCRで増幅した。PCR条件は標準的であり、当初の2分間は94°Cにおける変性段階で、その後、94°Cにおける変性を15秒間、50°Cにおけるプライマーアニーリングを30秒間、および伸長を72°Cで60秒間を35サイクル行い、最終伸長は72°Cで7分間とした。プライマーは、ベクター特異的LICテイルで設計するかまたは5 ́オーバーハングとしての構造化されていないプロテアーゼ耐性リンカー配列で設計した図9ACrastoおよびFeng,2000。全ての増幅物はTAE緩衝液を用いたアガロースゲル中での電気泳動で分析し、ゲル精製したQiaQuickGelExtraction,Qiagen。精製した産物をそれ以後のPCRでテンプレートとして用いた。第2回目に、タイプAループ5およびタイプBアルファヘリックス5の増幅物を、テンプレートとして結合した。変性後、前記増幅物を、重複伸長を可能とするそれらの相補性リンカー配列によりアニーリングし、その後の増幅では、前方タイプAループ5および逆タイプBアルファヘリックス5プライマーを用いて行った。タイプKおよびDアルファヘリックス5配列を同様に前記構築体に付加したが、最初の10サイクルの後アニーリング温度を60°Cに高め、アニーリング特異性を高めた。最終産物を、N末ヘキサヒスチジンタグ融合物をコードするpEt-46Ek/LIC発現ベクターNovagenにアニーリングし、NovaBlueDE3大腸菌E.coliを形質転換した。ワクシノーゲン配列は、精製したプラスミドのDNA配列決定によって確認した。タンパク質発現と精製は、上記のようにして完了した。4価のABKDキメラワクシノーゲンによるマウスの免疫6週齢の雄性C3H/HeJ系統マウス12匹を、完全フロインドアジュバントCFAに1:1比で懸濁した前記キメラワクシノーゲン50μgで免疫した。このワクシノーゲンを総量200μl、腹腔内および皮下デポーに分けて投与した。対照マウス3匹には、CFA中PBSの偽ワクチンを投与した。第2および第4週において、マウスにフロインドの不完全アジュバント中タンパク質50μgをブースターした。偽免疫マウスには、アジュバント中PBSを投与した。マウスは全て、第1回注入前および第6週時点で尾部に切り傷を付けて出血させた。ABKDキメラワクシノーゲンの免疫原性の評価前記ワクシノーゲンの免疫原性は、イムノブロット分析とELISAによって評価した。イムノブロットは、上記のようにして生じさせスクリーニングした。各精製r-タンパク質OspCタイプA、B、K、Dおよびキメラワクシノーゲンの1μgを、イムノブロットにより分析した。ボレリアブルグドルフェリB.burgdorferi由来の無関連Hisタグ付きタンパク質であるr-BBN39偽推理タンパク質ファミリ163が、陰性対照として作用した。等量のタンパク質が負荷されたことを確認するため、1つのブロットは、抗HisタグモノクローナルAbmAb1:2000;Novagenによりスクリーニングした。ワクチン接種に対する応答を評価するため、前記マウス抗ABKD抗血清の1:500希釈物により同等のブロットをスクリーニングした。HRP結合ヤギ抗マウスIgG1:40000希釈は二次抗体として作用し、結合を化学発光によって視覚化した。ELISA分析は、ウェル1個当たり炭酸緩衝液pH9.6;4°Cで16時間中100ngのワクチン構築体またはr-OspCタイプA、B、KまたはDを塗布した96ウェルプレートCostar3590;Corningを用いて実施した。前記プレートをブロックし0.2Tween-20を有するPBS中1BSAPBS-T;2時間、PBS-Tにより3回洗浄し、系列希釈した抗ABKD抗血清100μl;1:50乃至1:109350を二重プレートのウェルに添加した1時間。HRP結合ヤギ抗マウスIgG1:20000は二次抗体として作用し、ABTSは発色原基質として作用した。吸光度を、反応速度が直線状である間に、ELISAプレートリーダーELx808;Biotekで405nmにおいて読み取った。力価は、吸光度曲線に対してパラメータ4個による対数式によるシグモイド曲線SigmaPlotに適合させることおよび最大吸光度プラトーの50に対応する希釈度逆数を計算することによって、計算した。抗ABKD抗体応答の免疫グロブリンイソタイププロフィール特性抗ABKD抗体応答のイソタイププロフィールは、キメラ構築体100ngをウェル1個当たり二重ELISAプレートに塗布することによって評価した。前記プレートを、上記のように洗浄し、ブロックした。ワクチン接種マウス12匹から採取した抗ABKD抗血清は、二重に分析した100μL;1:10000;1時間。結合したワクシノーゲン特異的Igは、イソタイプ特異的ビオチン化二次抗体とインキュベーションする1時間;マウスイソタイピングキット;Zymedことによって、検出した。結合したビオチン化抗体は、HRP結合ストレプトアビジン30分と前記発色原基質ABTSにより検出した。インキュベーションは全て室温で完了した。間接的免疫蛍光アッセイIFA前記ABKDキメラワクシノーゲンに取り込まれたエピトープがインビトロ培養ボレリアブルグドルフェリB.bourgdorferiの表面に提示されるかどうかを決定するため、IFAアッセイを実行した。OspC産生を最大にするため、タイプA、B、KまたはDOspCを産生するクローン群の培養物を33から37°Cに温度移動させた。密度の濃い約107-108細胞mL-1培養物5mLからスピロヘータを遠心分離7000×g、15分間によって採取し、PBSで3回洗浄し、PBS5mL中に再度懸濁し、100μLを、装填したスライドSuperfrostPlus,FisherScientific上の2cm2エリアに展開した。スライド1セットを風乾し、もうひとつのセットは、アセトン固定した。前記スライド類をブロックし1時間;PBS-T中3BSA、次に抗ABKD抗血清の前免疫血清の1:100希釈物またはウサギ抗フラゲリン抗血清の1:1000希釈物によりスクリーニングした1時間。結合した抗体をAlexafluor568結合ヤギ抗マウスIgGまたはAlexafluor488結合ヤギ抗ウサギIgG10μgmL-1ブロッキングバッファーにより検出した。スライドをPBS-T中で各段階の間に3回洗浄し、全てのインキュベーションを室温において暗所湿潤チェンバー中で1時間行った。スライドをFluoromount-GElectronMicroscopySciencesで据え付け、適切な場合にはローダミンまたはフルオレセインフィルターセットを用いてOlympusBX51蛍光顕微鏡上で視覚化するかまたは暗視野顕微鏡によって視覚化し、OlympusMagnaFireデジタルカメラを用いて写真撮影した。殺菌活性の評価ボレリアブルグドルフェリB.burgdorferiを死滅させる抗ABKD抗血清の能力を、インビトロで評価した。上述のように33から37°Cに温度移動させたスピロヘータを、BSK-H培地で3回洗浄し、細胞密度を約106細胞mL-1に調整した。細胞8μLを、モルモット補体Sigma8μLと各試験血清4μL56°Cで熱不活性化;30分と混合した。対照は、補体を含まず熱不活性化抗ABKD抗血清を含むか、補体のみを含むか、熱不活性化前免疫血清プールを補体とともに含んでいた。反応容量総計は、必要に応じてBSK-H培地を添加して20μLとし、サンプルを37°Cで18時間インキュベーションした。死滅はBacLightLIVE/DEADアッセイMolecularProbesを用いて評価し、フルオレセインおよびローダミンフィルターセットを備えたOlympusBX51蛍光顕微鏡を用いて5つの高電力視野において生および死/傷害細胞の手動による計数を行った。結果マウスおよびヒトで感染時に提示されたOspCタイプB、DおよびKのエピトープの同定OspCタイプA,B、C,D、H,I,K,およびNが、侵襲性感染を有すると決定された患者から今日まで回収されてきているSeinostら、1999;実施例1;Alghaferiら、2005。これらのOspCタイプのうちの4種A,B、KおよびDを選択し、多価キメラOspCワクチンの用途という概念の検証を確立した。感染時に提示された前記エピトープはタイプAOspCについてのみ同定されていたので、本研究での第一段階は、OspCタイプB、KおよびDの感染関連エピトープを同定することであった。これを成し遂げるため、各タイプの切断物および断片のイムノブロットを、ボレリアブルグドルフェリB.burgdorferiのクローン群で感染したマウスから得た血清でスクリーニングするかOspCタイプB、KおよびDまたはOspCタイプB、KまたはDを産生するボレリアブルグドルフェリB.burgdorferi株に少なくとも部分的には感染していることが決定しているヒトライム病患者からの血清でスクリーニングした私信、AllenSteere博士およびKathrynJones。第6週におけるマウス中での抗体応答は、タイプ特異的であった;しかし、ヒト血清の一部はタイプ間で交差免疫反応性を示しデータを示さず、このことは、これらの患者が混合スピロヘータ群におそらく感染したことを示唆している。OspCタイプBについて、マウス感染血清について前記エピトープはアルファヘリックス5aa175と200の間に局在していた。ヒト感染血清は同様に局在している断片aa164-185と反応し、タイプBのアルファヘリックス5領域が抗原性であることを示唆している。タイプKOspCにおいて、エピトープは、前記マウスでaa148と160の間にマッピングされ、ヒトではアルファヘリックス5領域aa160と175の間にマッピングされた。OspCタイプDエピトープはマウスおよびヒトでアルファヘリックス5領域aa167と180の間にマッピングされたが、ヒト血清で認識される複数の追加エピトープもあった。これらのデータは、OspCタイプB、KおよびDのアルファヘリックス5領域が前記4価のABKDワクシノーゲン構築体に取り込むための適切な選択であることを示唆している。4価のキメラOspCワクシノーゲンの構築、発現および精製タイプB、KおよびDについて上に定義したアルファヘリックス5エピトープおよび先の研究実施例1で明確にしたタイプAループ5エピトープを用いて、多価キメラr-ワクシノーゲンを産生させたが、それは4種のエピトープ含有領域から構成されている。前記エピトープを短く、構造化されていないプロテアーゼ耐性リンカー配列によって結合した図9B。組換えワクシノーゲンは、長さがアミノ酸169個であり、分子量18.0kDaで、等電点6.49である。その構造は、主にヘリカルであることGasteigerら、2005;Knellerら、1990および高い安定係数を有していることGuruprasadら、1990が予測されている。PBSによる透析の後、組換えワクシノーゲンの沈降がややあった;しかし、約500μgmL-1は可溶性のままであり、この可溶性タンパク質を全実験で用いた。SDS-PAGEによる精製ワクシノーゲンタンパク質の分析で、単一バンド18kDa分子量が明らかになり、夾雑タンパク質は皆無であった。マウスにおけるABKDキメラワクシノーゲンの免疫原性ABKDキメラワクシノーゲンおよびその個々の成分エピトープに対する抗体応答を評価するため、フロインドアジュバント中ワクシノーゲンをC3H/HeJマウスに投与した。血清をワクチン接種n=12および偽PBSアジュバント免疫マウスn=3から採取し、ABKDキメラワクシノーゲンおよびタイプA、BおよびKの全長r-OspCタンパク質との反応性を評価した。ウェスタンブロット分析は、抗ABKD抗血清がワクシノーゲンタンパク質およびタイプA、BおよびKのr-OspCと強く反応することを明らかにした。対比的に、前記キメラ構築体のC末OspCタイプDエピトープとの反応性は実質的により弱かった図10。陰性対照タンパク質r-BBN39との反応はいずれの血清にもなく、偽ワクチン接種マウスの血清は前記タンパク質のいずれとも反応しなかった。定量的ELISAに基づく血清反応性の力価検定は、ABKDキメラワクシノーゲンタンパク質に対して高力価のIgG応答を明らかにし、平均力価は27,800であった図11A。タイプ特異的エピトープに対する反応性の力価検定は、固定全長r-OspCタンパク質との結合を評価することによって行った。前記それぞれのエピトープに対する抗体力価における有意な差が観察された図11B。エピトープ特異的力価が前記ワクシノーゲンのC末端に対して近くなるとともに低下することは注目に値する。抗ABKD抗血清の免疫グロブリンイソタイププロフィール免疫グロブリンイソタイププロフィールは、ワクチン特異的抗体の潜在的エフェクター機能の評価に重要である。前記ABKDキメラワクシノーゲンによって誘発された免疫グロブリン重鎖クラススイッチングを評価するため、イソタイププロフィールをELISAによって決定した。優勢なイソタイプはIgG1であり、IgG2aおよびIgG2bのレベルはわずかに低かった。前記第6週の血清は、限定されたレベルのみのIgM,IgG3またはIgAを示した図12。間接的免疫蛍光アッセイ前記ABKDキメラワクシノーゲンの各エピトープに対して惹起された抗体のボレリア細胞表面でOspCに結合する能力は、間接的免疫蛍光顕微鏡法によって評価した。特異的表面標識が、タイプA、B、KおよびDのOspCを産生する細胞で観察されたデータを示さず。蛍光シグナルの強度はタイプ特異的力価と一致しており、最も強度の高い蛍光は、OspCタイプAまたはBを保有する細胞で観察された。タイプKまたはDを保有する細胞の蛍光は強度がより低く、染色はパッチ状であり、前記細胞に斑点のある外観を付与した。マッチさせた前免疫血清でプローブした細胞では、全く反応性が見られなかった。空気固定細胞に対する抗フラゲニン抗体の表面標識の欠如は、前記細胞の外表面が未変性であり前記の検出されたエピトープが前記細胞表面で天然に提示されることを確認するために役立った。予測通り、アセトンで透過性をあげた細胞は抗フラゲニン抗体で標識されたデータを示さず。ABKDキメラワクシノーゲンによるワクチン接種が殺菌性抗体を誘発することの実証抗ABKD抗血清の殺菌活性をLIVE/DEADBacLightアッセイを用いて評価したTilyら、2001;Ledinら、2005;Eliasら、2000;Montgomaeryら、2006;Eliasら、2002;Shinら、2004。殺菌活性は、前記キメラワクチン構築体に含めた全タイプのOspCを保有する株に対して検出された。抗ABKD抗血清とともにインキュベーションし、有意な細胞凝集を誘発させた。生および死細胞両者ともに前記凝集物内部に存在していた。細胞を凝集物内部で計数することはもともと難しいので、生および死細胞の百分率を、凝集していない遊離細胞のみを計数することによって、求めた。4種のOspCタイプ全てのために、殺菌アッセイに用いた培養物中の死細胞のバックグランドレベルは約20-30であった。死細胞のこのバックグランドレベルは、OspC発現を上方制御するために培養物を33から37°Cに移した後で、我々の研究室で一貫して観察された。殺菌アッセイにおいて、死滅は補体依存性に出現し、死細胞の百分率はバックグランドレベルから56乃至90に有意に増加する。全ての場合において、死細胞の数は、前記対照のいずれかで観察された死細胞の数の少なくとも2倍であった。補体のみでは、死滅を惹起しなかった。プールした前免疫血清により惹起された殺菌活性は全くなく、前記ワクシノーゲンに対する特異的免疫応答が殺菌活性に必要であることを示唆している。考察いくつかの研究は、ライム病スピロヘータのOspCの潜在的ワクシノーゲンとしての潜在的用途を探求している。OspCによるワクチン接種は防御性の抗体応答を惹起したが、防御は、主に株特異的であると報告されているGilmoreら、1996;Scheiblhoferら、2003;Wallichら、2001;Brownら、2005;ProbertおよびLeFebvre、1994;Gilmoreら、2003。複数のOspCタンパク質のカクテルを用いてより広い防御を惹起しようとする試みは成功しなかった。Baxterは、14種の互いに異なる全長OspC変異体から構成されるOspCカクテルを試験した;しかし、それらは、各変異体の独自ドメインに対して十分な抗体力価を惹起できなかった-もし広い防御を伝達しようとするならばこれは必須である。さらに、容認できない反応原性も報告されていたHansonら、2004。カクテルワクチンについての一般的問題は、感染時に天然には提示されずかつ防御性抗体を惹起しないエピトープに対する抗体応答が潜在的に誤って指示されることである。キメラワクチンの産生は、r-タンパク質の単純カクテルを用いて遭遇する問題を回避できる別の手法を提供する。一連の免疫優性エピトープから構成されるキメラワクチンは、マラリアHansonら、2004;Caro-Aguilarら、2005;、A群連鎖球菌McNeilら、2005;Daleら、2005;Huら、2002;Dale,1999;Kotloffら、2005;Horvathら、2005および数種のウイルスAptら、2006;FanおよびMei、2005;Wangら、2005;Boucheら、2005に対するワクチンの開発で探求されてきた。もし多価OspCワクチンが広く防御性であらねばならないとするならば、前記ワクシノーゲン中に十分なアレイのエピトープを取り込ませて多様な株に対しての防御性応答を惹起させることが必要であろう。このようなワクシノーゲンの構築により前進する能力が、AからUと命名した21種の明確なOspCタイプを明確にした系統発生分析によって非常に高められSeinostら、1999、そのうちサブセット1個のみがヒトにおける侵襲性感染と相関していたSeinostら、1999;実施例1;Alghaferiら、n2005。OspCのエピトープ構造の詳細な理解がキメラワクシノーゲンの開発には必要である。OspCエピトープ位置についてはいくつか過去に報告されているGilmoreら、1996;Jobeら、2003;Lovrichら、2005。2件の研究では、殺菌性抗体惹起に関与しているエピトープがOspCのC末ドメイン内部に存在することを報告しているJobeら、2003;Lovrichら、2005;しかし、このドメインは実質的に保存されているので、前記C末に対する抗体が広く防御性でない理由は明確ではない。Matheisenらは、また、前記C末端が前記抗体応答の主な標的であると示唆し、欧州における神経ボレリア症患者の血清と全長OspCとの反応性が、アミノ酸10個のC末切断形との反応性よりも高いことを記載しているMathiesenら、1998。このことから、彼らは、C末エピトープがあるに違いないと結論する一方、前記試験抗原は未知のタイプの単一OspC変異体で構成されていたので、前記C末端がより広い範囲を認識することは、このドメインがより高く保存されているからにちがいなく、このC末端が免疫優性であることを必ずしも示唆していないと結論した。Gilmoreらは変性させたものではなく非変性のr-OspCによりマウスを免疫すると、相同性単離物によるチャレンジに対して防御を付与することを明らかにしGilmoreら、1996;GilmoreおよびMbow,1999、防御性エピトープが立体構造的に明確にできるかもしれないことを示唆している。別の分析で、Gilmoreらは、単一OspCタイプタイプA由来の限られた数のOspC切断物の受動免疫を付与する抗OspCモノクローナル抗体との免疫反応性を分析したGilmoreおよびMbow,1999。N末端またはC末端のいずれかの欠損は、mAbによる前記r-タンパク質の検出を排除し、さらに立体構造的または不連続エピトープの存在を示唆している。mAbにより認識されるエピトープが免疫優性で自然感染時に関連しているかどうかまたは前記の異なるOspCタイプ間で保存されているかどうかは、明らかでない。タイプAOspCの線状免疫優性エピトープが最近マッピングされループ5およびアルファヘリックス5領域内部に存在していることがわかった実施例1。前記タイプAループ5エピトープを含むr-タンパク質は、マウスで殺菌性抗体を惹起し、それぞれのタイプ特異的エピトープがワクチン開発で活用できる可能性がでてきた実施例2参照。この報告では、初期感染時に提示されるOspCタイプB、KおよびDのエピトープをマッピングし、これらのエピトープに基づく4価のキメラワクシノーゲンを構築した。このABKDキメラワクシノーゲンは、マウスで非常に免疫原性があり、細胞表面でOspCを結合し補体依存性にタイプA、B、KおよびDOspCを産生する株を有効に死滅させる抗体を惹起した。4価のキメラ試験ワクシノーゲンを開発しようとする我々の努力の第一段階は、マウスおよびヒトにおいて感染時に提示されるOspCタイプB、KおよびDの線状エピトープを同定することであった。これらの分析は、基本的に、タイプAOspCのループ5およびアルファヘリックス5エピトープを同定した実施例1に記載のようにして行った。簡単に述べると、タイプB、KおよびDOspC切断物および断片の大きなパネルをクローン単離物に感染したマウスからおよび対応するOspCタイプを発現する株に少なくとも部分的に感染したヒトからの血清によりスクリーニングした。詳細なエピトープマッピングは、実験的に感染したマウスからの血清を用いて可能であった;しかし、自然感染ヒトにおいて、抗体応答は、より広いエピトープアレイに対してであった。これは驚くべきことではなく、おそらく、初期感染時に菌細胞表面に正常では提示されないOspCエピトープに対する抗体応答が拡大したことを反映している。新しいエピトープのいくつかはOspCの保存ドメイン例アルファヘリックス1に由来しているであろうが、この新しいエピトープは菌細胞死と膜からのOspC放出によりアクセス可能となるのであろう。このことは、エピトープマッピングにおいてヒト血清サンプルの使用を必要とする但し書き;すなわち、感染の正確な期間は通常わからず感染群のクローン性が疑わしいという但し書きを示しているWangら、1999;Ruzic-Sabljicら、2006;Hofmeisterら、1999;Guttmanら、1996;Rijpkemaら、1997。いずれにしても、前記ヒト血清サンプルの分析から、アルファヘリックス5領域内部のエピトープが感染時、OspCタイプA、B、KまたはDを産生する株によって認識されることは明白である。さらに、いくつかの異なるOspCタイプ産生株中でアルファヘリックス5に対する応答が一貫していることは、このOspCドメインの機能的関連性を示唆するものであろう。アルファヘリックス5およびループ5領域配列はOspCタイプ間で可変であるものの、これらの領域は各タイプ内部で非常によく保存されている実施例1参照。このことは、キメラワクチンという文脈で、限られた数のOspCエピトープのみが広い防御を実行するために必要なのであろうということを示唆している。広く防御性のあるワクシノーゲンの開発における第一段階として、タイプAループ5エピトープおよびOspCタイプB、KおよびDからのアルファヘリックス5エピトープを、試験ワクシノーゲンの開発に用いた。これらのエピトープを含む領域を、リンカー配列をコードするように設計したプライマーによりPCRで増幅した。このことにより前記キメラ構築体の創生においてPCR重複伸長の使用が可能となり、短くて構造化されておらずプロテアーゼ耐性のアミノ酸配列により前記エピトープを分離する手段を提供したCrastoおよびFeng,2000。実験的OspCに基づく4価のABKDキメラワクシノーゲンを本研究で開発し、それは、試験マウス全てで一定した高力価のIgG抗体応答を惹起したn=12。さらに、前記ワクシノーゲンは、各取り込みエピトープに対して抗体を惹起した。前記エピトープ特異的力価は前記構築体内部におけるエピトープ位置により影響を受けるようであることは関心の集まるところである。N末エピトープタイプAのループ5からC末エピトープタイプDのアルファヘリックス5まで力価が漸次低下していった。C末端エピトープに対して力価の低下という現象はまた、溶連菌M-タンパク質に基づくキメラワクチンの初期研究で報告されたDaleら、1993;Daleら、1996。力価に対する位置特異的効果の土台は明白ではないが、C末端構造のインビボ分解または変化によるのかも知れないDaleら、1999。ボレリア感染に対する防御のために必要なThサイトカイン応答と関連するイムノグロブリンイソタイプパターンは完全に解明されたわけではないがKraiczyら、2000;Widheら、2004;Keane-Myersら、1995;Keane-Myersら、1996;Keane-MyersおよびNickell,1995、このパターンを決定することは、ワクシノーゲン開発において重要な段階であり前記ワクシノーゲンのさまざまな構築物の潜在的防御能力に関する重要な情報が提供できるであろう。前記応答のイソタイププロフィールは、ELISAによって決定し、混合Th1およびTh2サイトカイン応答に関連した重鎖Igイソタイプが観察された。本研究で注目したクラススイッチングは、前記ワクシノーゲンに取り込ませた限定したT細胞エピトープが存在しなくても、適切なT細胞ヘルプを意味している。マウスH2Ak/H2EkおよびヒトHLA-DRB1タイプIIMHCサブセットのための予想ペプチド結合アルゴリズムを用いたワクシノーゲン配列分析は、全ての利用可能な対立遺伝子に結合すると予測された前記ワクシノーゲン中の潜在的T細胞エピトープを暴露したRammenseeら、1999;Zhangら、2005。前記予測された結合ペプチドのひとつはLANSVKELTで、それは、前記構築体内部で3回繰り返しされており、この繰り返しが、Th応答惹起に際し重要であるのかもしれないJiangら、1999;Ahlborgら、1998;Kjerrulfら、1997;Theisenら、2000。潜在的T細胞エピトープの分析は網羅的ではなかったが、前記予測は、前記キメラワクシノーゲンがマウスにおいてTリンパ球ヘルプを惹起できることを示唆する我々のデータの裏づけとなる。さらに、そのことは、この構築体が乱雑なT細胞エピトープ配列を取り込む必要がなくヒトにおいてそうする可能性があるかもしれないことを意味している。このイソタイププロフィールの産生においてフロインドアジュバントの重要性は公知ではないが、前記応答とイソタイププロフィールは、ヒトでの使用に適したミョウバンまたは他のアジュバントの文脈において評価する必要があるであろうtenHagenら、1993;Lindblad,2004;PetrovskyおよびAguilar,2004;Brewerら、1999;McNeelaおよびMills,2001。さらに、前記キメラワクシノーゲンのエピトープ順序または構造の改変により、免疫応答を追跡してインビボ防御を最大にする機構が提供できるであろうTongrenら、2005;Caiら、n2004。ワクチン開発の観点から前記ワクシノーゲンに対する前記応答が生産的であるためには、惹起された抗体が未変化のボレリアブルグドルフェリB.burgdorferi細胞の表面に結合でき菌死滅を起こすことができなければならない。IFA分析は、OspCタイプA、B、KおよびDを産生する株の細胞表面が強く標識されることを明らかにした。タイプDエピトープに対する抗体力価はより多くのN末エピトープに対して惹起された力価よりも確かに有意に低いとはいうものの、タイプDを産生する株の表面標識は簡単に明らかになった。OspCタイプ培養物のそれぞれにおける細胞サブセットは、抗ABKD抗血清で標識されないことが観察され、そのことは、それらの細胞がOspCを発現していなかったことを意味している。しかし、インビボにおいて、全てとはいわないまでもほとんどの細胞がダニから哺乳類への伝染時および初期哺乳類感染時にOspCを発現していることが実証されているGilmoreら、2001;Zhongら、1997。殺細胞を行う抗ABKD抗体の能力も、評価した。ワクチン接種マウス由来血清は、補体依存性にタイプA、B、KおよびDOspCタンパク質を発現するスピロヘータを効率的に死滅させた。前記OspCタイプの全てで100未満の死滅であったが、このことは、ある群の細胞におけるインビトロOspC発現の不均一性の関数であるようで、それは、インビボで十分に説明されてきた現象であるSchwanら、1995;SchwanおよびPiesman,2000;Huら、1996。この実施例では、新規r-キメラ多価OspCに基づくライム病ワクシノーゲンの構築と概念の検証を記載している。エピトープに基づくr-キメラタンパク質の使用により、同一構築体中で複数のOspCタイプを網羅できるようになり、関連のないタンパク質ドメインに対して間違って誘導された免疫応答という潜在的問題を回避する。活発な感染時に認識される線状エピトープのマッピングは、キメラワクチン開発の重大な要件であり、このことは、ヒトにおける侵襲性感染に関連した4種のOspCタイプについて完了し、成功した。前記ワクシノーゲンに含ませたエピトープは、ボレリア細胞表面でOspCを結合できかつ補体媒介菌死滅を行うタイプ特異的IgG抗体を惹起した。キメラ多価ライム病ワクチンの免疫原性向上を意図した変異体に対する免疫応答本研究で我々は、前記構築体の溶解度を向上させ、エピトープ配置、エピトープ反復および推定C末安定化タグを含ませることの免疫応答に及ぼす潜在的インパクトを評価することを目指した。これらの分析では、防御性の広いOspCワクチンのためおよび一般的キメラワクチンの構築のためのデザイン戦略について新しい洞察を示す。材料および方法組換えOspCの発現と精製タイプA、B、KおよびDの組換え全長OspCタンパク質を、先に記載したようにして作製した実施例1および2を参照。簡単に述べると、ボレリアブルグドルフェリB.burgdorferi単離物B31MIタイプAOspC、LDP73タイプB、LDP74タイプKおよびLDP116タイプDのクローン群からのospC遺伝子を、5 ́オーバーハングを有するプライマーを用いてPCRで増幅させ、pET-32Ek/LICベクターNovagen中でリガーゼ非依存性クローニングLICを行った実施例1。一重鎖テイルの増幅と再生の後、増幅物をpET-32Ek/LICベクターにアニーリングし、それをNovaBlueDE3大腸菌E.coli細胞に形質転換し増殖させた。挿入配列をDNA配列決定MWG-Biotechにより確認した後、タンパク質発現をIPTG1mMにより誘発させた。タンパク質は、pET-32Ek/LIC発現タグでコードされたヘキザヒスチジンモチーフを用いてニッケルアフィニティクロマトグラフィにより精製したNovagen。イミダゾール溶出タンパク質を、リン酸緩衝生理食塩水PBS;pH7.4により10kDa分子量カットオフ膜Slid-a-lyzer,Pierceに対して十分に透析し、タンパク質濃度をBCAアッセイPierceにより定量し、SDS-PAGEにより前記調製物の純度を評価した。ABKDワクチン変異体の構築、発現および精製前記ワクチン構築体での特異的エピトープに対するIgG力価低下の潜在的メカニズムを探求しその解決策を調べるため、原ワクチンの複数変異体を構築した。ワクチン変異体は全て、先に記載のABKDワクシノーゲン実施例3の配列に基づいており、同一エピトープ含有配列を含んでいる。これらには、タイプAのループ5領域アミノ酸aa131から149までおよびタイプBaa160-201、Kaa161-201およびDaa161-201のアルファヘリックス5領域を含んでいた図13挿入図。このABKDppaおよびABKDggは、それぞれ、原ABKD構築体のC末端にPro-Pro―AlaまたはGly―Glyモチーフを付加した。これらの構築体の両者はともに、前記元来のABKD構築体を、前記の適切なアミノ酸をコードする5 ́オーバーハングにより前記モチーフを付加する逆プライマー表5を用いて増幅させることによって作製した図13A。他のワクチン変異体は、元来のABKDワクシノーゲン構築に使用したそれらと類似の重複アニーリングと伸長技術によって作製した実施例3。前記ABKDD構築体は、非構造化プロテアーゼ耐性リンカーをコードする3 ́テイル配列を有する逆プライマーを用いて前記ABKD構築体を再度増幅させることによって、作製した。これによって、PCR産物を、5 ́末端の相補性リンカーをコードする配列により増幅させておいたタイプDOspCエピトープ含有配列にアニーリングさせ、その後アニーリングした構築体の重複伸長と増幅を行うことができた図13B。このADBK構築体は、別々に増幅させたタイプAおよびDエピトープを含有する領域を互いにアニーリングさせ、次に、原ABKD構築体から増幅させたタイプBおよびKヘリックス5エピトープ領域で増幅させ、作製した図13C。ADBKD構築体は、ABKDおよびADBK配列からの増幅物をアニーリングさせることによって作製した図13D。全ての場合において、前記PCR増幅は、94°C、2分間の最初の変性段階の後94°C15秒の変性、50°C30秒のプライマーアニーリングおよび72°C60秒の伸長を35サイクル、最後に72°Cにおける伸長を7分間用いるGoTagGreenPromegaにより完了した。これらのワクシノーゲン構築に使用したプライマー全てを、表5に示した。全てのPCR産物は、その後のPCR反応においてテンプレートとして使用する前にゲル精製したQiagen。最終増幅物は、リガーゼ非依存性クローニングによって前記のpET-46Ek/LICベクターにアニーリングし、NovablueDE3大腸菌E.coli細胞に形質転換した。コロニーは、T7プライマーを用いて挿入物をスクリーニングし、プラスミドを回収しQiafilterMidi、Qiagen、DNA配列決定により前記挿入物を確認した。組換えタンパク質が発現し上記のようにして精製した。精製後、ワクチンタンパク質を、PBSpH7.4または100mMリン酸塩、100mMNaCl、50mMアルギニン、50mMグルタミン酸を含有するpH8の緩衝液Arg/Glu緩衝液を3回交換しながら10kDa分子量カットオフ膜Slide-a-Lyzer,Pierceに対して透析したGolovanovら、2004。前記構築体の純度は、SDS-PAGEによって評価した。ワクチン変異体によるマウスの免疫6週齢の雄性C3H/HeJマウスを前記6種のワクシノーゲン変異体のそれぞれで免疫したマウス3匹/構築体。前記変異体の免疫原性は互いに匹敵するものであったので、前記タンパク質をモルベースで投与し、ワクシノーゲンマス1単位当たりのエピトープの数の差を補償するのが望ましかった。各マウスに対して、免疫1回当たり約2.8ナノモルのタンパク質を投与したが、それは、構築体ABKD,ABKDppa,ABKDggおよびADBKの50μgまたは構築体ABKDDおよびADBKDの62.5μgとなる。マウスは、完全フロインドアジュバント中ワクチンで免疫し、次に、第2週および第4週においてフロインドの不完全アジュバントをブーストした。第1回免疫の前および第6週において、尾部切傷により全マウスから血清を採取した。総計およびエピトープ特異的抗体力価に及ぼすアジュバントの効果を決定するため、またイソタイププロフィールに及ぼすアジュバントの効果を決定するため、マウス6匹/アジュバントを、上記のようにフロインドアジュバント中に懸濁したかまたはミョウバンImjectAlum,Pierce上に吸着させたABKDワクシノーゲンにより免疫し、血清を第6週に尾部切傷によって採取した。ワクチン変異体によって誘発されたエピトープ特異的IgG力価の評価各ワクシノーゲンの免疫原性はウェスタンブロットおよびELISAの両者によって評価した。ウェスタンブロットのため、タイプA、B、K、Dのr-OspCを還元性サンプル緩衝液中1レーン当たり500ngで載せ、12.5SDS―PAGEゲルCriterion,Biorad中で電気泳動し、PVDFImmobilon-P、Milliporeにエレクトロブロットした。このブロットを、0.2Tween-20を有するリン酸緩衝生理食塩水PBS-T中1BSAでブロックした。前記ブロットを、PBS-T中各抗血清の1:2500希釈物で1時間プローブし、次に3回洗浄した。等量のタンパク質が確実に載せられたことを確認するため、ブロット1個は、抗Hisタグモノクローナル抗体1:2000;Novagenによりスクリーニングした。二次検出は、パーオキシダーゼ結合ヤギ-抗マウスIgGの1:40000希釈物および化学発光SuperSignalPico,Pierceによって行った。定量的分析のため、OspCタイプ特異的IgG力価は、ELISA分析によって決定した。タイプA、B、K、またはDのr-OspCを、96ウェルプレートCostar3590;Corning上に炭酸緩衝液中pH9.6100ng/ウェルで4°Cにおいて16時間塗布しておいた。前記プレートをブロックし0.2Tween-20を有するPBSPBS-T中1BSA;2時間、PBS-Tで3回洗浄し、系列希釈した抗ワクシノーゲン抗血清100μLを二重プレートのウェルに添加した1時間。HRP結合ヤギ-抗マウスIgG1:20000は、二次抗体として作用し、ABTSは、発色原基質として作用した。吸光度を、反応速度が直線状である間にELISAプレートリーダーELx808;Biotekにより405nmで読み取り、力価は、パラメータ4個の対数式により吸光度曲線にシグモイド曲線を合わせて計算したSigmaPlot。力価は、最大吸光度プラトーの50に対応する希釈度の逆数として報告する。エピトープ特異的イムノグロブリンイソタイププロフィールの決定ABKD、ABKDD、およびADBKDワクチン変異体構築体に対する抗体応答のイソタイププロフィールは、ELISAによって評価した。96ウェルプレートに、タイプA、B、KおよびDのr-OspCを100ng/ウェルで塗布した。このプレートを上記のようにしてブロックし洗浄した。抗ワクシノーゲン抗血清を前記プレートに添加し、二重に分析した100μL;1:10000;1時間。結合したエピトープ特異的Igを、イソタイプ特異的ビオチン化二次抗体とインキュベーションして、検出した1時間;マウスイソタイピングキット;Zymed。前記の二次抗体は、パーオキシダーゼ結合ストレプトアビジン30分と発色原基質ABTSにより検出した。インキュベーションは全て、室温で完了した。ワクチン特異的Tリンパ球によるIFN-γおよびIL-4産生の決定免疫マウス由来の脾臓細胞のサイトカイン応答を、Abuodehら1999の方法を変形したものを用いてワクシノーゲンによりインビトロで再刺激し評価した。ワクチン接種マウスは、CO2麻酔によって安楽死させ、脾臓を無菌的に取り出しRPMI培地Sigmaに入れた。各ワクチン構築体により免疫したマウス3匹からの脾臓をまとめ、ゲージNo.22の針を用いて脾臓カプセル中にRPMIを繰り返し注入することで細胞を採取した。細胞懸濁液を50mLの遠心管に移し、細胞を200×gで5分間採取した。赤血球は、8.3mg/mL塩化アンモニウムR-7757、Sigma3mLに1分間暴露させ融解させた。次に、この塩化アンモニウムをRPMISigma20mLで希釈し、細胞を遠心分離し3回洗浄した。細胞を10FCS,100μgmL-1ストレプトマイシン、100UmL-1ペニシリン、2.5μgmL-1アンホテリシンBを含むRPMI10mL中に再懸濁した。細胞をトリパンブルーで染色し生存を評価し、血球計で計数し、細胞懸濁液全てを107細胞mL-1に調整した。細胞を107細胞/ウェルで24ウェルプレートCostar3526中にアリコットとして入れた12ウェル/ワクシノーゲンタイプ。3重ウェルを5または10μgmL-1の免疫ワクシノーゲンで刺激した。対照は、無関連タンパク質であるウシ血清アルブミン10μgmL-1で刺激した3重ウェルと無刺激ウェルタンパク質なしを含んでいた。全プレートを37°C、5CO2で96時間インキュベーションし、次に、上清を採取し-80°Cで凍結し、サイトカインのELISA定量を待った。Th1/Th2サイトカインIFN-γおよびIL-4のレベルを定量するため、ELISAに基づくアッセイELISA-Max;Biolegendを製造業者の説明に従い用いた。簡単に述べると、捕捉抗体を96ウェルELISAプレートに塗布し、プレートをブロックし、各培養上清100μLを二重に、前記プレート中で2時間インキュベーションした。IL―4検出のため、未希釈培養上清を用い、一方IFN-γのため、前記上清を希釈せずおよびPBSで1:20に希釈して試験した。標準曲線は、公知濃度の各サイトカインを含むサンプルを用いて、作成した。結合サイトカインの検出は、ビオチン化二次抗体と次にHRP結合ストレプトアビジンにより行い、比色検出は、TMB基質を用いて行った。結果変異体ワクチン構築体の構築、発現および精製5 ́オーバーハングを有するプライマーならびに重複アニーリングおよび伸長PCR技術を用いて、元来のABKDワクチンの変異体5種を作製した図13。前記構築体の全てのDNA配列を確認した。前記ワクシノーゲンの選択した物理化学的性質を表6に示したGasteigerら、2005。ニッケルクロマトグラフィによる組換えワクシノーゲンの精製後、PBS透析中に有意な割合のr-タンパク質が沈降することがわかった。このことは、ABKDワクシノーゲンの最初の報告でも注目されていた実施例3。分子量の大きい構築体ABKDDおよびADBKDはPBS中溶解度が高いが、r-タンパク質沈降は、さらに有意であった。そうした理由のため、改良透析緩衝液Arg/Glu緩衝液をGolovanovらの研究2004に基づき開発した。前記緩衝液のpHは、PBSのそれpH7.4からpH8.0まで高め、緩衝液pHとr-タンパク質のpIとの間の差異を高めたpI6.49または6.85。さらに、塩濃度は、150mMから100mMまで低下させ、50mMアルギニンと50mMグルタミン酸を添加した。この緩衝液を用いると、前記r-タンパク質のいずれの沈降も全く見られず、可溶性タンパク質濃度の顕著な上昇があった。SDS-PAGEによって視覚化されたように、前記r-タンパク質は純粋で、分解産物を全く含んでいなかった図14。ワクチン変異体の免疫原性ABKDワクチン変異体の相対的免疫原性を評価するため、マウスをフロインドアジュバント中前記変異体のそれぞれで免疫した。前記血清のエピトープ特異的反応性はウェスタンブロットにより評価した。このウェスタンブロットでは、前記血清を用いて前記4種のタイプのそれぞれのPVDF-固定r-OspCをプローブした。前記タンパク質が前記ブロット上に等量ずつ載せられたことを、タグ特異的マウス-a-Hisタグモノクローナル抗体との反応性によって評価し、確認した。免疫マウスからの血清は、r-OspCタンパク質のそれぞれとの反応性レベルにおいてワクシノーゲン依存性差異を明確にした図15A。ABKDppaおよびABKDgg変異体によりワクチン接種したマウスにおいてタイプDヘリックス5エピトープとの反応性低下があり、ADBK変異体との反応性低下が最も顕著であった。定量的にこうした変動を評価するため、前記構築体中に含まれるOspCタイプ特異的エピトープのそれぞれとのIgG反応性の力価検定は、ELISAによって、再度固定化抗原として前記4種のタイプのそれぞれの全長r-OspCを用いて行った。前記力価は、主に、定性的ウェスタンブロット知見によく類似しており、それぞれのエピトープに対する免疫血清の反応性にワクチン特異的差異があることを実証した図15B。最も顕著な差異は、タイプDエピトープとの反応性で見られ、特に低い力価は、ABKDppa,ABKDggおよびADBK変異体について観察された。ワクチン変異体特異的イムノグロブリンのイソタイププロフィール変異体ワクシノーゲンにより誘発された免疫応答をより詳細に理解するため、エピトープ特異的力価によって決定された最大ワクチン強度の前記3種の変異体ABKD、ABKDD、ADBKDについてエピトープ特異的イムノグロブリンイソタイププロフィールを完成した。一般的に、前記抗原特異的イムノグロブリン中にIgG1、少量のIgG2aおよびIgG2b、および非常に少量のIgG3またはIgMが優勢であったが、このパターンは先に記載されている実施例3図16。全てのエピトープおよび全てのワクチン変異体について、Igイソタイプのパターンは類似であるが、ただひとつ例外がある。ABKDまたはADBKD変異体で免疫したマウスよりもABKDDで免疫したマウスにおいて、タイプKおよびDエピトープ特異的IgG2aおよびIgG2bのより強い反応性があった。ワクチン特異的Tリンパ球によるTh1/Th2サイトカイン産生ABKDワクシノーゲン中における変異によって誘発されたサイトカイン環境およびTh1/Th2バランスの潜在的インパクトを評価するため、マウス脾臓細胞をインビトロで、マウスを免疫した前記ワクシノーゲンで再刺激した。IFN-γの誘発レベルにおいて、異なる免疫をしたマウス間で顕著な差が観察された。全てのワクチン変異体は、培養上清中におけるIFN-γのレベル上昇と関連していた。ただし、ADBKおよびADBKDは、他のワクシノーゲンによって誘発されたものよりも2乃至3倍高いレベルであった図17。全ての場合において、両者は抗原誘発IFN-γの5μgmL-1および10μgmL-1濃度で、レベルは0.5乃至8.6ng/mLの範囲であった。無刺激脾臓細胞またはウシ血清アルブミンで刺激した脾臓細胞からの細胞培養上清は、全て、このアッセイの検出限界である15.6pg/mL未満のIFN-γを有していた。ワクチン刺激または対照培養上清のいずれにおいても、IL-4は検出されず、この濃度が本アッセイの検出限界2.0pg/mL未満であることを示唆している。抗体力価およびイソタイププロフィールに及ぼすアジュバントタイプの効果前記ワクシノーゲンに対する応答に及ぼすアジュバントタイプの効果を決定するため、マウスを、フロインドアジュバントに懸濁したかまたはアルミニウムに吸着させたABKDタンパク質で免疫した。ワクシノーゲン全体に対するIgG力価および各成分エピトープに対するIgG力価は、アルミニウムアジュバントで免疫したマウスでわずかに低かったが、前記応答の全般的パターンは前記2種のアジュバントで同様であった図18A。IgG1のレベルが類似していたにもかかわらず、ミョウバンで免疫したマウスは、ワクシノーゲン特異的IgG3,IgG2aおよびIgG2bで低下していた図18B。エピトープ特異的イソタイププロフィールは、ワクシノーゲン全体を用いて見られたプロフィールと非常に類似していたデータを示さず。考察複数B細胞エピトープを含有するキメラタンパク質の使用は、ワクチン開発において、全タンパク質多価ワクシノーゲンおよびペプチド結合物類に対して大きな利点を有している。防御性エピトープ配列のみを含ませると、親分子中またはペプチド担体上の無関連エピトープに対する応答が間違って誘導される可能性を低下させる。このことは、OspCによるのと同様に、前記組換えワクシノーゲン中で免疫優性である大きな保存ドメインがあるが、感染時に前記菌によって提示されないならば、重要である実施例1;Kumaranら、2001;Eickenら、2001。このようなエピトープは、防御性免疫応答の産生に関連していない。しかし、新規タンパク質の創生には、エピトープを妨害するかまたはタンパク質安定性と溶解度に影響を及ぼすことができる分子間および分子内相互作用を考慮することが必要である。この実施例において、我々は、OspCに基づく組換え、多価キメラライム病ワクシノーゲンの研究を拡大した。原ABKDワクチンはマウスで極めて免疫原性であり、誘発されたIgGは、菌細胞表面で天然のOspCを結合し補体依存性死滅を惹起した実施例3。こうした成功にもかかわらず、前記ABKD構築体は、改良を要する2つの要因を有しており、それは、r-タンパク質産生を妨害し保存安定性に影響を及ぼしうるPBS中における溶解度不良と、前記タンパク質中におけるそれぞれのエピトープに対するIgG力価における差異である。具体的には、前記エピトープと前記ワクチンC末端との近さに関連して、力価は減少した。本研究の目標は、ワクシノーゲン溶解度を高めること、かつ、エピトープ配置、エピトープ繰り返しおよび全体としておよびエピトープ特異的免疫応答を高めるための安定化モチーフの含有の点で異なっている改良ワクシノーゲンを使用することであった。先の研究では、PBS透析後の組換えワクシノーゲンの有意な沈降が注目された実施例3。この溶解度不良はワクシノーゲン産生を限定したばかりでなくワクチン免疫原性にも影響を及ぼしたであろう。PBS透析後のABKD構築体の最大濃度は0.5mg/mLであり、はるかに小さいことが多かった。OspC結晶構造は、ヘリックス5エピトープ領域が天然OspCタンパク質中の単量体内4-ヘリカルバンドルに関与していることを示唆しているKumaranら、2001;Eickenら、2001。このことは、ワクシノーゲンタンパク質内部およびその間で露出した疎水性ヘリカル面で相互作用があることにつながり、それが、次に沈降につながっているのかもしれない。透析緩衝液に対してArgとGluを添加することが、前記組換えワクシノーゲンタンパク質の全ての溶解度を4乃至100倍だけ高めることがわかった表7。この溶解度上昇の基になったのは、ArgとGluが、ArgとGluの側鎖の脂肪族部分と相互作用することによって、露出した対立荷電の残基および疎水性残基の両者と相互作用するからであろうGolovanovら、2004。Arg/Glu緩衝液中で透析したABKD構築体で免疫したマウスは、PBSに対して透析したABKDワクシノーゲンで免疫したそれらよりも顕著に高い力価を有していた実施例3。Arg/Glu緩衝液は、より有効な折り畳みパターンを起こすかあるいは分子間または分子内相互作用をより低下させるかし、それによって、B細胞レセプターに対してエピトープの接近を良好とするであろう。r-タンパク質へArgまたはGluが吸着されても、エピトープ認識を阻害しなかった。前記Arg/Glu緩衝液は、インビトロでプロテアーゼの活性に対して保護することが報告されているGolovanovら、2004。PBS―またはArg/Glu透析サンプルのいずれでもタンパク質分解性の明確な分解はないが、タンパク質分解性切断に対するインビボ保護を、排除できない。ArgおよびGluを含む緩衝液に対する透析は、有意な分子間相互作用を有する他の新規キメラタンパク質に適用できる有用な手段であるのかも知れない。免疫応答不良とC末エピトープ位置との関連は、先に、キメラ溶連菌Mタンパク質ワクシノーゲン中で報告されており、おそらく、前記C末端と関連した構造的問題によりまたはカルボキシペプチダーゼによるタンパク質加水分解酵素による分解によるのかも知れないDaleら、1993;Daleら、1996;Daleら、1999。数多くの方法が、プロテアーゼ活性からペプチドおよび組換えタンパク質を保護するために提案されており、C末端のアミド化またはPEG化、前記アミノN末端のアセチル化、および保護製アミノ酸モチーフの添加などが含まれるBrickerhoffら、1999;Powellら、1992;Leeら、2005;Alvarezら、2004;Kawarasakiら、2003;Walkerら、2003。アミノ酸モチーフは、カルボキシペプチダーゼの作用を阻害することによってタンパク質のC末端を安定化させることも報告されている;しかし、保護するそれらの能力は、数種のタンパク質でしか評価されていない。2種の安定化モチーフが、ABKDワクシノーゲンに対する抗体応答を増強するそれらの能力について評価されている。2個の中性、親水性Gly残基の添加は、それぞれ疎水性および塩基性C末アミノ酸に対して特異性を有するカルボキシペプチダーゼCおよびDの活性を低下させることができるAlvarezら、2004;Kawarasakiら、2003;Remingtonおよびbredam、1994。Pro-Pro-Alaモチーフの添加は、近接した、大きなプロリン残基を介してのカルボキシペプチダーゼ進行を立体的に阻害できるかもしれないWalkerら、2003。ABKDキメラワクシノーゲンに対する抗体応答に及ぼすこれらのモチーフの添加のインパクトを評価するため、マウスをABKDggまたはABKDppa構築体によって免疫した。いずれの場合も、前記血清は、無修飾ABKD構築体により免疫したものに比較して、1種以上のエピトープに対して小さな平均IgG力価を有していた。ABKDppa構築体は、タイプD特異的IgGの力価低下を示したが、ただし、このことは主に通常の分布から外れたものがひとつあったことに起因していた。前記ABKDgg構築体は、タイプKおよびDエピトープに対して力価低下を示した。IgG力価に基づき、これらのモチーフのいずれの使用にも全く利点がなかった。プロテアーゼ保護によるいかなる利点もArg/Glu緩衝液によって付与された類似の保護によって隠蔽された可能性もあるが、C末エピトープに対する力価の低下は、これらのモチーフが当然耐性を付与するはずのカルボキシペプチダーゼ類の作用に媒介されていないようであるGolovanovら、2004。C末エピトープに対する免疫応答不良に関与する可能性のある構造因子を調べるため、数種の追加構築体を新たに作製した。前記のキメラ溶連菌ワクチンにおいて、C末端でN末エピトープを反復させると、前者のC末エピトープを保護したが、そのメカニズムは不明であるDaleら、1999;Daleら、2005;Huら、2002;McNeilら、2005。その成功に基づき、ABKDワクシノーゲンの類似変異体を開発した。ABKDD構築体を作製し、タイプDエピトープに対する応答が第2のC末タイプDエピトープによって保護できるかどうかを評価した。前記力価低下が主にC末エピトープ位置によるのかどうかを評価するため、タイプDエピトープをN末に2番目に近い位置ADBKに移動させた。最後に、ADBKD構築体を用いて、反復C末エピトープによる保護を評価し、ABKDDにより、特異的免疫応答に及ぼす繰り返しエピトープの効果を評価した。ABKDDワクシノーゲンにおけるエピトープ反復は、タイプD特異的IgG力価を倍増したが、同時に、隣接するタイプKエピトープに対する力価低下を起こした。タイプDエピトープをADBK構築体中でよりN末寄りの位置に配置した時、タイプD特異的IgG力価が有意に減少した。さらに、ADBK構築体中におけるC末タイプKエピトープに対する反応性はABKD中におけるそれをしのぎ、向上した。C末タイプDエピトープADBKDを添加しても、このタイプK特異的力価は向上しなかった;しかし、それは、タイプDエピトープに対する力価の倍増というわけではないが有意な向上をもたらした。これらの結果は、タイプDエピトープのC末位置が内部位置よりも好適であること、および、追加の保護性C末エピトープによるC末エピトープの明白な保護はないことを示唆している。このワクシノーゲン中におけるエピトープ特異的力価の一次決定因子は、C末端にそれが近接していることではなく、前記キメラタンパク質の3次構造による可能性が高い。ワクシノーゲン誘発Igイソタイプは、インビボ保護有効性に因果関係を有しているのかもしれない。前記エピトープまたはそれらの順序を改変させることによって、イソタイププロフィールを改変しTongrenら、2005、従って抗体エフェクター機能を改変することも可能である。エピトープ特異的イソタイププロフィールを測定するため、最も見込みのあるワクシノーゲンABKD、ABKDD、ADBKDに対する抗血清をタイプA、B、KまたはDの固定r-OspCに結合させ、この結合した抗体をイソタイプ特異的抗血清で検出した。ABKDワクシノーゲンについて先に報告しているように実施例3、有力なイソタイプはIgG1であり、前記構築体に応じてややより低いレベルのIgG2aおよびIgG2bがあり、IgMおよびIgG3は低レベルであった。前記エピトープ特異的Igイソタイププロフィールは、ABKDおよびADBKD抗血清で類似しており、IgG2aおよびIgG2bレベルがN末からC末エピトープに向かって低下しており、総IgG力価を模倣していた。前記のABKDDは、タイプK特異的総IgG力価はより低いにもかかわらず、前記エピトープ全てで一定レベルのIgG2aおよびIgG2bを有していた。ABKDワクシノーゲンは、補体依存性殺菌性抗体を惹起する実施例3。マウスにおいて、IgG1は補体を活性化せずDanglら、1988;MileticおよびFrank、1995、前記主要な誘発イソタイプが保護性でないかもしれないことを示唆している。OspA特異的IgG1は補体非依存性メカニズムによって殺ボレリア性であると報告されているMunsonら、2000が、ABKDワクシノーゲン誘発抗体による菌死滅は補体依存性である実施例3。惹起されたイソタイププロフィールは、ライム病研究のための標準的動物モデルであるC3H/HeJマウスの使用により影響を受けることもある。C3H/HeJ系統マウスとBALB/c系統マウスの間の体液性免疫の差が、ボレリアブルグドルフェリB.burgdorferi感染時に注目されており、特に総IgGレベルにおいて、また特にIgG2aレベルにおいて注目されてきており、両者ともにC3H/HeJマウスでより高いYangら、1992;Keane-MyersおよびNickell、1995。さらに、C3H/HeJ系統マウスはTLR-4を欠失しており、ボレリアがリポ多糖を産生しないので、このことはワクチン接種によるかまたは感染時におけるライム病防御にとって重大であるとは予測されていないTakayamaら、1987;Bartholdら、1990。一般的に体液性ボレリア殺菌活性が補体依存性であるので、Th1サイトカイン応答の惹起は、多くの細菌疾患でそうであるように、有効であるかもしれないSpellbergおよびEdwards,2001でレビュー。活発な感染時、Thサイトカインは、ライム病およびその続発症の発生と消散に密接に関わっている。いくつかの研究では、IL-4はボレリア殺菌抗体応答の発生に重大なサイトカインではないとしておりMunsonら、2000;Potterら、2000;Christieら、2000;Satoskarら、2000-64、Th1タイプ応答が防御に関連しているかもしれないことを黙示している。さらに、IFN-γ分泌Th1細胞がライム病関連心臓炎の消散を促進するBockenstedtら、2001;Kelleherら、1998。それとは逆に、関節炎の重篤度と皮膚スピロヘータの量が感染時r-IL-4の投与により低下し、α-IL-4抗体投与により増加するKeane-MyersおよびNickell、1995;Keane-Myersら、1996。IFN-γの産生は、自然感染時において慢性ライム病の発生に関連しておりWidheら、2004、さらに、ライム関節炎において関節腫脹の程度にも関連しているGrossら、1998。IFN-γはまた、インビトロリンパ節培養物から誘発された殺ボレリア性の抗OspA抗体の産生阻害にも関連していたMunsonら、2002。ワクチン接種により誘発されたThサイトカイン環境を調べるため、マウス脾臓細胞をインビトロでワクシノーゲンにより再刺激し、Th1IFN-γおよびTh2IL-4サイトカインをELISAにより定量した。IFN-γは、ワクシノーゲンで再刺激した細胞の上清で検出されたが、構築体に応じて濃度は異なっていた。対比的に、IL-4は、脾臓細胞上清のいずれでも検出されなかった。ABKD、ABKDppaおよびABKDD構築体はすべて、同様のIFN-γ濃度を有していた。ADBKDは、およそ2倍のIFN-γ濃度を有し、ADBKははるかに高いレベルを有していた。再刺激細胞上清中IFN-γレベルと総エピトープ特異的血清IgG力価またはイソタイププロフィールには明白な相関はなかった。サイトカインおよび関連するIgイソタイププロフィールは、免疫アジュバントの選択により変化させることができた。フロインドの完全アジュバントは、Th1サイトカイン応答と関連づけられておりCribbsら、2003;ShibakiおよびKatz、2002、IgG2aレベルを高めるかもしれない。ヒト用に現在唯一容認されているアジュバントは、ミョウバンで、それは、Th2サイトカインの分泌を高めることが既知であるCribbsら、2003;Brewerら、1999;Lindblad,2004;PetrovskyおよびAguilar、2004。ミョウバンで免疫したマウスにおいて、前記ワクシノーゲンとその成分エピトープに対するIgG力価の予測された通りの中程度の低下が、フロインドのアジュバントと比較して注目された。さらに、IgG1に比較してIgG3、IgG2a、およびIgG2bイソタイプが比例して大きく減少した。このことは、このアジュバントによりTh1サイトカイン応答が低下するものと予測されたことと一致している。しかし、前記ワクシノーゲンは、補体固定の可能な抗体を実際に惹起し続け、前記構築体に対するかなりの変化またはアジュバントの修飾が有効応答に必要でないかもしれないことを示唆している。我々はこの実施例で、潜在的キメラ多価ライム病ワクシノーゲンに対する改変を検討したが、それらは、誘発された体液性免疫応答を最適化することを意図していた。前記構築体の免疫原性の有意な改善は、Arg/Glu緩衝液に対しての透析によりその溶解度を高めることによって、行った。このことは、タンパク質相互作用を低下させ、インビボでのエピトープ露出を高くしたTheisenら、2000。プロテアーゼ防御性のC末モチーフの添加あるいは防御性C末エピトープの添加はいずれも、前記ワクシノーゲンに対する免疫応答を改善しなかった。エピトープを再度並べ替えることにより、移動させたエピトープに対する免疫応答が実質的に低下することになった。このワクチン構築体中の成分エピトープに対する免疫応答の差異は、前記タンパク質のプロテアーゼ消化に対する耐性よりもむしろ、前記タンパク質の構造に主に依存しているようである。さらに、あるワクシノーゲンによって惹起されたThサイトカインおよびIgGイソタイプはキメラ構築体の構造によっておよびアジュバント製剤によって改変できることについて証拠がある。本研究では、キメラワクシノーゲンに対する次善の免疫応答の基盤およびそれらの応答を改善できる方法に関しての重要な情報をもたらす。利用可能なOspC配列の分析による防御性の広い多価キメラライム病ワクチンの可能性の実証防御性の広いキメラ構築体のさらなる開発を促進するため、我々はデータベースで利用可能なOspC配列の系統発生的分析を行った。分析したOspCのセグメントは、残基20から200B31MI配列のための番号付けを使用までにわたっていた。前記データベースにおけるより短い配列はこれらの分析から除外し、ボレリア株の280種からの配列を残し、分析に使用した。各配列のOspCタイプ命名は、アラインメントPAM40スコアリングマトリックスおよびペア規模での同一性マトリックス分析により決定した。先の研究と同じく、95以上の配列同一性を示す配列は、同じOspCタイプに属するとみなしたAttieら、2006;Wangら、1999図19。配列比較物の明白な二項分布が観察され、互いに異なるOspCタイプ配列の間での平均配列同一性は65で、タイプ内では>97同一であった。Wangら1999によって記述された21のタイプの他に、さらにクラスター17種も明らかになった。我々は、3配列未満しか含まないクラスターにはOspCタイプ命名を割り当てなかった。新しいOspCタイプの命名に際して、我々は既存のOspCタイプ命名AからUWangら、1999までを維持することを選択し、追加のタイプは各クラスター内部に含まれるプロトタイプ株に基づいて命名した。分析した配列280のうち、202はOspCタイプに振り分けられ、それらの全てがライム病の原因となっている種由来であった。OspCタイプに振り分けなかった配列78種は、ライム病の原因となっているスピロヘータ51単離物および他のボレリア種27種の両者を含んでいた。各OspC配列を得た単離物の地理的および生物学的起源を、表の形式で図20に示した。ボレリアブルグドルフェリB.burgdorferi単離物の大半は北アメリカ由来であり80、ヨーロッパ16およびアジア4由来のものの数は少なかった。ボレリアブルグドルフェリB.burgdorferiOspC配列の53、ボレリアアフゼリB.afzeliiOspC配列の48およびボレリアガリニイB.gariniiOspC配列の79は、ヒトから採取した単離物に起源を有していた。ヒト単離物由来のボレリアガリニイB.gariniiOspC配列が主に脳脊髄液CFS由来68であり、一方、ボレリアアフゼリB.afzelii単離物は主に皮膚由来83であった。対比的に、ボレリアブルグドルフェリB.burgdorferi由来のOspC配列は、ヒト皮膚51、血漿30およびCFS19から回収した単離物由来であった。これらの知見は、これらの生物が原因の疾病の公知パターンと一致し、本報告で評価したOspC配列のサンプルが、ライム病スピロヘータの真の集団を表すことを示唆している。さらに系統発生分析を進めるため、分析した配列セットを、同一配列を排除して74にまで減らした。次に、これらの配列を並べて、ブーツストラッピング付きのPhylipv.3.66系統発生パッケージを用いて分析したn=1000。距離は、DayhoffPAMマトリックスを用いて20から200、20から130および131から200にわたる領域について計算し、隣接部結合によってツリーを新たに作製した。ボレリアヘルムシイB.hermsiiOspCオーソログVmp33配列は、外集団として作用したMargolisら、1994。コンセンサスツリーを、多数決原理によって作成したグループに含めるため、カットオフを50とした。DayhoffPAMモデルによる最尤法によって、このコンセンサスツリーについて距離を再計算した図21。OspCの20-200aaセグメントで作製したコンセンサスツリーは、末端節部で十分にサポートされており、決定した全てのOspCタイプは予想通りのクラスタリングであった。より奥深くの分枝のいくつかについてはこのブーツストラップ分析でサポートが十分ではなかったが図21A、前記配列での伸長同一領域がそれらの系統発生分化をわずかにしているので、このことは予測されないことではない。OspCの20-200および20-130アミノ酸セグメントを用いて作製したコンセンサスツリーは、主に種同一性に基づき類似の系統発生クラスタリングを示した図21A,21B。しかし、アミノ酸131-200を用いて作製したコンセンサスツリー図21Cは、ブーツストラップ分析でのサポートが十分でなく有意に異なるクラスタリングパターンをもたらした。この観察は、ospC遺伝子の短いセグメント間での組換えが、異なるOspCタイプの株で起こったという仮説と一致している。OspCタイプの間でのOspCの短いセグメントの組換えの証拠は、具体的配列で見ることができる。例えば、ボレリアアフゼリB.afzeliiOspCタイプPLj7の配列は、Pkiクラスターを形成するボレリアガリニイB.gariniiOspC配列で見られたものと同一の領域を、アミノ酸20-130ドメイン内部に有している。PLj7の131-200領域では、超可変ループ5およびループ6領域が、ボレリアブルグドルフェリB.burgdorferiOspCタイプのそれぞれFおよびMに見られるものと同じモチーフを有している。組換えについての上記以外の証拠は、SimPlotv.3.5.1を用いたブーツスキャニングから生じていたLoleら、1999。ブーツスキャニングにおいて、潜在的組換えを、スライディングウィンドウベースウィンドウ40、ベースステップインターバル10内部の配列セグメントの系統発生ツリーを作製するKimuraモデル、Ts/Tv比=2.0、隣接部結合ことによって評価する。ツリーをブーツストラップさせn=100、そのウィンドウ内部での配列分類をサポートする順序変更ずみのツリーの数を報告する。組換えの証拠は、通常は、順序変更ずみのツリーの>70が一つのウィンドウ内部に配列をまとめてクラスタリングするとき根拠ありとみなす。上記タイプにおいて図22もそれ以外の多数のOspCタイプデータを示さずにおいても、組換え可能性の証拠が見出された。OspC可変性が超変異によるよりはむしろ既存のOspCタイプ相互間での交換によって起こることの証拠は、防御性の広いワクシノーゲンに取り入れるために必要なOspCタイプ特異的エピトープの絶対数に限りがあることの証拠である。現在マッピングされている線状エピトープは全てOspCのC末領域aa131-200内に含まれるので、キメラワクシノーゲンに必要なエピトープの理論数を明確にすることが可能である。この領域を前記の74種の代表的配列中で調べることによって、独自のエピトープ含有領域の数を、同一であるかまたはアミノ酸1つだけの変化を含む配列の排除により、34に減らすことができる図22。いくつかのエピトープは2種以上のOspCタイプに対して防御を伝達できるかもしれないので、この数はさらにエピトープマッピングによって限定することができる。必要エピトープ数をさらに少なくすることは、ヒト疾患、さらに具体的には侵襲性ヒト疾患に関連したOspCタイプのみを考慮することによってもできるであろう実施例1参照。OspCエピトープサブセットに対するワクチン接種の理論的問題は、前記ワクシノーゲンに含まれないタイプに対する選択を誘導する潜在的可能性で、それらの稀な対立遺伝子を保有する群の分画を増大させることになることである。しかし、ヒトは偶然の宿主であるに過ぎないので、ワクチン接種がダニベクターまたは哺乳類保菌者中において特異的OspCタイプを発現する株の群分布を有意に変える可能性はないであろう。要約すると、広範囲にわたるOspCデータベースの性質のために徹底した分析が実施でき、新規OspCタイプを明確にしかつそれらの単離頻度とヒト疾患との関連に関する情報を提供できた。上記データは、防御性の広いキメラワクシノーゲンに取り込ませるために必要なOspCエピトープ含有配列の数が限定されていることおよびキメラワクシノーゲンの開発が可能であることを示唆している。8価のキメラの構築8価の構築体ENICABKD本明細書では例えば実施例7に示すとおり構築体A8.1とも呼ぶを下記に示し、この構築体のいくつかの性質を、PROTPARAMプログラムによって計算し示した。Lと命名したセグメントは、リンカー配列である。RSは、前記構築体作製に使用した制限部位の位置を示している。その表示において、TAGはタンパク質のアミノ末端へのヒスチジンタグを表し、RSは制限部位を担うDNA配列でコードされるアミノ酸配列を表し、それら配列は前記タンパク質において基本的にリンカーとして機能し、L例えば、L1、L2,L3、L6、L7、L8など、リンカー配列、すなわちタイプ特異型配列を結合させるのに用いる、例えば非構築リンカー配列であるところのリンカー配列を表す。A8.1アミノ酸の数:384分子量:41263.7理論的等電点:6.52アミノ酸組成:AlaA5113.3ArgR20.5AsnN205.2AspD256.5CysC00.0GlnQ51.3GluE4210.9GlyG215.5HisH123.1IleI71.8LeuL4612.0LysK6216.1MetM71.8PheF71.8ProP51.3SerS277.0ThrT266.8TrpW00.0TyrY00.0ValV194.9陰電荷残基AspGluの総数:67陽電荷残基ArgLysの総数:64原子組成:炭素C1787水素H2983窒素N501酸素O597イオウS7式:C1787H2983N501O597S7総原子数:5875推定半減期:検討した配列のN末端は、AAlaである。推定半減期:4.4時間インビトロでの哺乳類赤血球。>20時間インビボでの酵母。>10時間インビボでの大腸菌。不安定性係数:不安定性係数IIはコンピュータ計算で12.58である。このことは、前記タンパク質を安定として分類する。脂肪族係数:81.46ヒドロパティのグランドアベレッジGRAVY:-0.668試験哺乳類に投与すると、このキメラタンパク質構築体は、顕著な免疫応答を惹起することが判明し、ライム病発生から保護する。早期診断用およびワクチン抗体用薬剤の構築いくつかのキメラタンパク質が、ライム病を対象とする診断法およびワクチン候補の開発に有望であることを示した。早期検出例えば約3週間以内が重要である。すなわち、この疫病の症状は早い段階では治療がより容易であり、回復不能な慢性の病変がまだ生じておらず予防可能であるからである。しかし、診断方法は、例えば6週間以内またはそれよりも長い期間以内に必要に応じて用いることができる。ワクチンは予防薬として、または治療薬として投与できる。概括的にいうと、上記タンパク質は、いくつかの互いに異なるボレリア系統タイプからの外表面タンパク質OspCまたは外表面タンパク質AOspAの全長および/または抗原性断片の連鎖によって形成されるキメラ構築体である。上記A8.1構築体を用いて得られるデータの例を図27に示す。この図に示したデータは、実験で感染させたイヌのモデルにおいて感染後初期の段階で血清変換が検出可能であることを実証している。上記OspCタイプの大部分を全体として発現するスピロヘータを含むことが予め確認されていた野生のダニでイヌを感染させた。この評価分析は、OspCに基づくライム病診断の感度を左右するOspC血清特異的IgG抗体の広範囲のアレイをキメラタンパク質が検出できることを実証した。また、感染後初期の段階でのOspC血清変換の検出を実証した。感染初期においてOspCはボレリア細胞表面で優位的に発現するタンパク質であるから、血清変換の早期検出において他の潜在的診断用抗体よりも格段に有利である。同じ理由で、ワクチン抗体としての潜在力も著しい。A9シリーズのタンパク質も、診断用評価分析のベースとして、またはワクチンとして、用いることができる。これらA9タンパク質は、ボレリアブルグドルフェリの北米株に優位的に見られるOspC系統タイプからの抗原性断片を含む。A9.1、A9.2およびA9.3ワクチンタンパク質の各々は同じOspCタイプからの配列を含むが、タンパク質の中に集められた正確な下位断片およびそれら断片の配置順序において互いに異なる。A9.1はループ5乃至へリックス5からの配列と、図示のタイプの各々についてのネイティブな介在配列とを含む。図28AはOspCタンパク質のエピトープの概括的な位置、および構築体A9.1のエピトープの配置、すなわちパターンを示す。図28Bは、A9.1における正確なパターンを示す。A9.1において、N-末端およびC-末端は冗長な配列を除外するために切断してあり、多様なタイプのエピトープは結合配列なしに結合し、保存したC-末端モチーフを端部に示してある。この実施例で述べたA10、A11およびA12を含むA系列全部において、エピトープはボレリアブルグドルフェリのタイプA、B、C、D、E、F、H、I、K、M、N、TおよびUのエピトープを含む。構築体A9.1配列番号250構築体A9.1については、アミノ酸の数は569であり、分子量は60657.2であり、pIの理論値は6.35である。構築体A9.2の配列を下に示しここで、Lpはループを表し、Hxはヘリックスを表す、その概要を図29Aに示す。この構築体では、N-末端およびC-末端は、冗長な配列の除外のために切断してあり、種々のタイプのエピトープは結合配列なしに結合し、介在配列ヘリックス4およびループ6はなく、保存C端末モチーフはある。この構築体では、エピトープの順序はA9.1上記説明参照の場合と同じである。構築体A9.2配列番号251A9.2についてはアミノ酸の数は431であり、分子量は46088.0であり、pIの理論値は5.85である。構築体A9.3の配列を下に示すここで、Lpはループを表し、Hxはヘリックスを表す、その概要を図30Aに示す。この構築体において、N-末端およびC-末端は冗長な配列を除去するために切断してあり、種々のタイプのエピトープは結合配列なしに結合し、中間の介在配列ヘリックス4およびループ6はなく、保存C-末端モチーフはある。この構築体では、エピトープの順序はA9.1およびA9.2のそれとは異なっており、ヘリックス-ヘリックス-ループ-ループの順になっている。このタンパク質は前記ヘリックスの疎水性の表面を互いに向きあわせにし、それらの面が互いに結合したヘリックスの間に向くように設計されている。理論による拘束がなければ、上記構成は、ヘリックス5エピトープの向きを元々のOspCの中で見られるものと同じ向きに合わせるようにするものとみられる。構築体A9.3配列番号252A9.3についてはアミノ酸の数は432であり、分子量は46201.2であり、pIの理論値は5.85である。A9シリーズのほかに、北米ではあまり見かけないもののヨーロッパおよびアジアで多くみられるボレリアOspCタイプをカバーする、上記と同様の構築体タンパク質を開発した。これらのOspCタイプの多くは、ボレリアガリニイBorreliagariniiまたはボレリアアフゼリイBorreliaafzeliiで見出されている。これらのタンパク質をB9シリーズおよびC9シリーズと呼ぶ。B9シリーズについては、B.ガリニイタイプPwa、Pli、Pbes、Pki、PfiM、H13、SmarおよびHT22からのエピトープが含まれる次に述べるいくつかの例外がある。C9系列については、B.アフゼリイタイプPko、PLj7、pHez、Pmit、Szid、VS461、HT25およびDK15からのエピトープが含まれる次に述べるいくつかの例外がある。B9.1およびC9.1はループ5およびヘリックス5並びに図示のタイプA9.1について上に述べたとおり、また図28CおよびDに示したとおりからの中途の配列を含む。構築体B9.2およびC9.2は、エピトープを含むA9.2について上に述べたとおり、また図28BおよびCに示したとおり。ただし、H13ヘリックス5はPkiヘリックス5と同じであって除外されすなわち、その配列は1回だけ現れる、DK15ヘリックス5はVS461ヘリックス5と同じであって、その配列も1回だけ現れる。また、C末端モチーフは現れない。構築体B9.3およびC9.3は、エピトープを含むA9.3について上に述べたとおり、また図30BおよびCに示したとおり。ただし、H13ヘリックスはPkiの場合と同じであって除外されておりすなわち、上記配列は1回だけ現れる、DK15ヘリックスはVS461ヘリックスと同じであって、この場合も上記配列は1回だけ現れる。また、C-末端モチーフは現れない。構築体B9.1配列番号253構築体B9.1については、アミノ酸の数は503であり、分子量は53102.4であり、pIの理論値は7.16である。構築体B9.2配列番号254構築体B9.2については、アミノ酸の数は381であり、分子量は39928.6であり、pIの理論値は5.27である。構築体B9.3配列番号255構築体B9.3については、アミノ酸の数は382であり、分子量は40056.8であり、pIの理論値は5.93である。構築体C9.1配列番号256構築体C9.1については、アミノ酸の数は512であり、分子量は54372.0であり、pIの理論値は8.14である。構築体C9.2配列番号257構築体C9.2については、アミノ酸の数は383であり、分子量は40492.5であり、pIの理論値は6.45である。構築体C9.3配列番号258構築体C9.3については、アミノ酸の数は383であり、分子量は40622.6であり、pIの理論値は6.10である。A10、A11およびA12系列のタンパク質も、ワクチン用および/または診断用抗原として次のとおり発生させた。A10CF配列番号259構築体A10CFについては、アミノ酸の数は823であり、分子量は87013.4であり、pIの理論値は6.28である。また、推定半減期考慮対象の配列のN末端はSSerであるは1.9時間哺乳類網状赤血球、インビトロで>20時間酵素、インビボ、および>10時間である大腸菌、インビボ。不安定指数IIの計算値は17.53である。上記の結果、このタンパク質は安定なものに分類される。また脂肪族指数は86.18であり、水治療法適合性の平均値は-0.487である。A11配列番号260構築体A11については、アミノ酸の数は335であり、分子量は35688.4であり、pIの理論値は5.87である。また、半減期の推算値考慮対象のN末端はSSerは1.9時間哺乳類網状赤血球、インビトロで>20時間酵母、インビボ、>10時間大腸菌、インビボである。不安定指数IIの計算値は17.08である。上述の計算の結果、このタンパク質は安定なものに分類される。また、脂肪族指数は84.57であり、水治療法適合性の平均値GRAVYは-0.478である。A12配列番号261構築体A12については、アミノ酸の数は298であり、分子量は31637.7であり、pIの理論値は7.19である。また、半減期の推算値考慮対象のN末端AAlaは4.4時間哺乳類赤血球、インビトロであり、>20時間酵母、インビボ、および>10時間大腸菌、インビボである。不安定指数IIの計算値は17.99であり、この結果、このタンパク質は安定なものに分類される。脂肪族指数は82.99であり、水治療法適合性GRAVYの平均値は-0.573である。A12A配列番号262構築体A12Aについては、アミノ酸の数は451であり、分子量は48061.1であり、pIの理論値は7.19であり、半減期の推算値考慮対象のN末端はAAlaは4.4時間哺乳類網状赤血球、インビトロ、>20時間酵素、インビボ、および>10時間大腸菌、インビボ。不安定指数IIの計算値は16.121であり、上述の結果、このタンパク質は安定なものに分類される。脂肪族指数は81.84であり、水治療法適合性の平均値GRAVYは-0.579である。A12CF配列番号263構築体A12CFについては、アミノ酸の数は488であり、分子量は51342.9であり、pIの理論値は7.18であり、半減期の推算値考慮対象の配列のN末端はAAlaは4.4時間哺乳類網状赤血球、インビトロ、>20時間酵素、インビボ、および>10時間大腸菌、インビボ。不安定指数IIの計算値は17.56であり、上述の数値の結果、このタンパク質は安定なものに分類される。脂肪族指数は87.30であり、水治療法適合性の平均値GRAVYは-0.492である。診断用抗原として使えるキメラタンパク質の上記以外の例、すなわちLDX1、LDX2、LDX3およびLDX4を下に示す。これらの配列はワクチン組成物の中でも用いることができる。これらの配列において、ECRはエピトープ含有領域を表す。ECRはループ5を含みからヘリックス5を含むまでの領域を含み、表示したタイプからのC-末端モチーフをも含む。LDX1配列番号264LDX2配列番号265LDX3配列番号266LDX4配列番号267イヌにおけるキメラA12CFタンパク質への免疫応答の評価分析生後およそ2ヶ月の健康でライム病ワクチン未投与の10匹のイヌをこの実験に用いた。一方のグループ5匹については、頚部/肩後部のうなじに0.063PBSの1ml投与量を皮下注射で0日目および21日目に投与した。他のグループ5匹についても、薬剤RehydragelLVで補助薬付きとしたキメラA12CFタンパク質1ml投与量を上記と同様のやり方で0日目および21日目に投与した。0日目、21日目、42日目および63日目に血清を採取し、ELISAおよび/またはウェスタンブロットでA12CFキメラタンパク質への抗体について分析した。食塩の投与を受けたイヌは、実験期間中を通じて、OspCへの抗体について血清学的に陰性であり、滴定量41.00日目、54.121日目、58.742日目、および71.463日目を示した。しかし、RehydragelLVをアジュバントとするA12CFタンパク質を受けたイヌはこのタンパク質に対して強い血清反応を示し、滴定量77.60日目、540.621日目、16333.042日目、および8650.263日目を示した。本発明をその好適な実施の態様の観点から記載してきたが、当業者は本発明が付属の請求の範囲の真意と範囲内で変更を加えて実施できることを理解するであろう。したがって、本発明は、上記に述べたような態様だけに限定されず、本文に示した説明の真意と範囲内の全ての変更とその均等物も含むべきである。"