"配列番号1に記載の天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体-1TNFRIポリペプチドのアミノ酸配列において、92位、95位、97位、及び98位の4個のアミノ酸残基と、68位、161位、200位及び207位のうちから選ばれるいずれか一つのアミノ酸残基から構成された5個のアミノ酸の修飾を含むアミノ酸配列;配列番号1に記載の天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体-1ポリペプチドのアミノ酸配列の41位~211位からなるアミノ酸配列TNFRI171において、92位、95位、97位及び98位の4個のアミノ酸残基と、68位、161位、200位及び207位のうちから選ばれるいずれか一つのアミノ酸残基から構成された5個のアミノ酸の修飾を含むアミノ酸配列;配列番号1に記載の天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体-1ポリペプチドのアミノ酸配列の41位~166位からなるアミノ酸配列TNFRI126において、92位、95位、97位及び98位の4個のアミノ酸残基と、68位または161位のうちから選ばれるいずれか一つのアミノ酸残基から構成された5個のアミノ酸の修飾を含むアミノ酸配列;及び配列番号1に記載の天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体-1ポリペプチドのアミノ酸配列の41位~145位からなるアミノ酸配列TNFRI105において、68位、92位、95位、97位及び98位のアミノ酸残基から構成された5個のアミノ酸の修飾を含むアミノ酸配列;からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む、修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体-1ポリペプチドまたはその断片。配列番号1に記載の天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体-1ポリペプチドのアミノ酸配列において、68位、92位、95位、97位及び98位のアミノ酸残基の5個のアミノ酸の修飾を含むアミノ酸配列;配列番号1に記載の天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体-1ポリペプチドのアミノ酸配列の41番~211番からなるアミノ酸配列において、68位、92位、95位、97位及び98位のアミノ酸残基の5個のアミノ酸の修飾を含むアミノ酸配列;及び配列番号1に記載の天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体-1ポリペプチドのアミノ酸配列の41番~166番からなるアミノ酸配列において、68位、92位、95位、97位及び98位のアミノ酸残基の5個のアミノ酸の修飾を含むアミノ酸配列;からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項1に記載の修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体-1ポリペプチドまたはその断片。配列番号1に記載の天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体-1ポリペプチドのアミノ酸配列において、161位及び207位のうちから選ばれるいずれか一つのアミノ酸残基のアミノ酸の修飾をさらに含むアミノ酸配列;配列番号1に記載の天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体-1ポリペプチドのアミノ酸配列の41番~211番からなるアミノ酸配列において、161位及び207位のうちから選ばれるいずれか一つのアミノ酸残基のアミノ酸の修飾をさらに含むアミノ酸配列;及び配列番号1に記載の天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体-1ポリペプチドのアミノ酸配列の41番~166番からなるアミノ酸配列において、161位のアミノ酸残基のアミノ酸の修飾をさらに含むアミノ酸配列;からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項2に記載の修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体-1ポリペプチドまたはその断片。68位のLはVで置換され、92位のSはI、L、F、M、W、Q、T、Y、K、H、E、A、V、P、NまたはRで置換され、95位のHはFで置換され、97位のRはP、LまたはIで置換され、98位のHはAまたはGで置換され、161位のKはQまたはNで置換され、200位のEはQで置換され、207位のDはNで置換されることを特徴とする請求項1に記載の修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体-1ポリペプチドまたはその断片。92位のSはI、MまたはHで置換され、97位のRはPで置換されることを特徴とする請求項4に記載の修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体-1ポリペプチドまたはその断片。配列番号1に記載の天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体-1ポリペプチドのアミノ酸配列において、93位のアミノ酸残基のアミノ酸修飾をさらに含み、93位のEはPで置換されたアミノ酸配列;配列番号1に記載の天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体-1ポリペプチドのアミノ酸配列の41番~211番からなるアミノ酸配列において、93位のアミノ酸残基のアミノ酸修飾をさらに含み、93位のEはPで置換されたアミノ酸配列;配列番号1に記載の天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体-1ポリペプチドのアミノ酸配列の41番~166番からなるアミノ酸配列において、93位のアミノ酸残基のアミノ酸修飾をさらに含み、93位のEはPで置換されたアミノ酸配列;及び配列番号1に記載の天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体-1ポリペプチドのアミノ酸配列の41番~145番からなるアミノ酸配列において、93位のアミノ酸残基のアミノ酸修飾をさらに含み、93位のEはPで置換されたアミノ酸配列からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項1に記載の修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体-1ポリペプチドまたはその断片。L68V/S92I/H95F/R97P/H98A、L68V/S92M/H95F/R97P/H98A、L68V/S92H/H95F/R97P/H98A、L68V/S92I/H95F/R97P/H98G及びL68V/S92M/H95F/R97P/H98Gからなる群から選ばれるアミノ酸修飾を含むことを特徴とする請求項1に記載の修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体-1ポリペプチドまたはその断片。L68V/S92I/H95F/R97P/H98A/K161Q、L68V/S92I/H95F/R97P/H98A/K161N、L68V/S92I/H95F/R97P/H98A/D207N、L68V/S92M/H95F/R97P/H98A/K161Q、L68V/S92M/H95F/R97P/H98A/K161N、L68V/S92M/H95F/R97P/H98A/D207N、L68V/S92H/H95F/R97P/H98A/K161Q、L68V/S92H/H95F/R97P/H98A/K161N、L68V/S92H/H95F/R97P/H98A/D207N、L68V/S92I/H95F/R97P/H98G/K161Q及びL68V/S92M/H95F/R97P/H98G/K161Nからなる群から選ばれるアミノ酸修飾を含むことを特徴とする請求項3に記載の修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体-1ポリペプチドまたはその断片。L68V/S92I/E93P/H95F/R97P/H98Gのアミノ酸修飾を含むことを特徴とする請求項6に記載の修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体-1ポリペプチドまたはその断片。配列番号6、11、16、21、22、28-39、44、49、54、55、61-72、75、78、81、82、及び86-98からなる群から選ばれるいずれか一つで表わされるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項1に記載の修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体-1ポリペプチドまたはその断片。請求項1~10のいずれか一項に記載の修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体-1ポリペプチドまたはその断片の2つまたは3つ以上が共有結合によって連結された、修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体-1ポリペプチドまたはその断片の複合体。修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体-1ポリペプチドまたはその断片は、加えて、糖化、アシル化acylation、メチル化methylation、リン酸化phosphorylation、ハシル化hasylation、カルバミル化carbamylation、硫酸化sulfation、プレニル化prenylation、酸化oxidation、グアニジル化guanidination、アミジン化amidination、カルバミル化carbamylation、トリニトロフェニル化trinitrophenylation、ニトロ化nitration、またはペグ化PEGylationされることを特徴とする請求項1~10のいずれか一項に記載の修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体-1ポリペプチドまたはその断片。請求項1~10のいずれか一項に記載の修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体-1ポリペプチドまたはその断片をコードする塩基配列を含む遺伝子。大腸菌内における発現に適するようにコドンが操作された配列番号5の塩基配列に基づいて製造されることを特徴とする請求項13に記載の遺伝子。請求項13に記載の遺伝子を含むベクター。請求項15に記載のベクターで形質転換された細胞。前記細胞は、大腸菌であることを特徴とする請求項16に記載の細胞。請求項1~10のいずれか一項に記載の修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体-1ポリペプチドまたはその断片を含む医薬製剤。請求項1~10のいずれか一項に記載の修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体-1ポリペプチドまたはその断片を含む、成人呼吸窮迫症候群、食欲不振、癌、慢性疲労症候群、移植片対宿主拒否反応、痛覚過敏、炎症性腸疾患、神経炎症性疾患、脳虚血を含む虚血性/再潅流傷害、各々神経変性の原因となり得る外傷、癲癇、出血又は発作の結果としての脳損傷、糖尿病、多発性硬化症、眼病、疼痛、膵炎、肺線維症、リウマチ性関節炎、骨関節炎、若年性リウマチ性関節炎、血清反応陰性多発性関節炎、強直性脊髄炎、ライター症候群及び反応性関節炎、乾癬性関節炎、腸疾患性関節炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、強皮症、全身性硬化症、血管炎、脳血管炎、シェーグレン症候群、リウマチ熱、多発性軟骨炎及び多発性筋痛、リウマチ性及び巨細胞性動脈炎、敗血性ショック、放射線療法の副作用、全身性紅斑性狼瘡、側頭下顎関節疾患、甲状腺炎及び組織移植からなる群から選ばれるTNF媒介疾病の予防または治療用医薬組成物。請求項13に記載の遺伝子またはこれを含むベクターを含む、成人呼吸窮迫症候群、食欲不振、癌、慢性疲労症候群、移植片対宿主拒否反応、痛覚過敏、炎症性腸疾患、神経炎症性疾患、脳虚血を含む虚血性/再潅流傷害、各々神経変性の原因となり得る外傷、癲癇、出血又は発作の結果としての脳損傷、糖尿病、多発性硬化症、眼病、疼痛、膵炎、肺線維症、リウマチ性関節炎、骨関節炎、若年性リウマチ性関節炎、血清反応陰性多発性関節炎、強直性脊髄炎、ライター症候群及び反応性関節炎、乾癬性関節炎、腸疾患性関節炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、強皮症、全身性硬化症、血管炎、脳血管炎、シェーグレン症候群、リウマチ熱、多発性軟骨炎及び多発性筋痛、リウマチ性及び巨細胞性動脈炎、敗血性ショック、放射線療法の副作用、全身性紅斑性狼瘡、側頭下顎関節疾患、甲状腺炎及び組織移植からなる群から選ばれるTNF媒介疾病の予防または治療用医薬組成物。請求項19に記載の医薬組成物を対象に投与することを含むTNF媒介疾病の予防または治療方法。請求項20に記載の医薬組成物を対象に投与することを含むTNF媒介疾病の予防または治療方法。請求項13に記載の遺伝子またはこれを含むベクターを含む、請求項1~10のいずれか一項に記載の修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体-1ポリペプチドまたはその断片の製造方法。本発明は、生体内invivoまたは生体外exvivoでTNFに対する向上した結合力を有しながら、胃腸管、細胞質及び血液中に存在するタンパク質分解酵素に対する向上した抵抗性を有する修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体-1TNFRIポリペプチドまたはその断片を提供することを目的とする。特に定義しない限り、下記の用語は、本発明の詳細な説明及び特許請求の範囲で以下に定義された意味を有するものとする。本発明で定義されたヒト腫瘍壊死因子受容体-1、またはヒト腫瘍壊死因子受容体-1ポリペプチド以下、TNFRIまたはTNFRIポリペプチドは、ヒト由来で、455個のアミノ酸で構成され、TNFと結合するポリペプチドのことをいう。本発明で定義されたヒト腫瘍壊死因子受容体-1断片、またはヒト腫瘍壊死因子受容体-1ポリペプチド断片以下、TNFRI断片またはTNFRIポリペプチド断片は、全長TNFRIの配列と互いに対応するアミノ酸の配列が100一致し、一つ以上のアミノ酸残基が欠失しているTNFRIの一部分である。欠失したアミノ酸残基は、N末端、C末端または内部を含む、ポリペプチド内のいずれかの箇所でよい。この断片は、全長TNFRIと一つ以上の生物学的特性を共有する。断片の代表例は、TNFRIのN末端41番目のアミノ酸から105個または126個または171個のアミノ酸を有するもので、これらはそれぞれ、本願においてTNFRI105、TNFRI126、TNFRI171と命名する。本発明で定義されたTNFRI突然変異体、TNFRI断片突然変異体または修飾されたTNFRIポリペプチド、修飾されたTNFRIポリペプチド断片は、下記に定義されるように、天然または組換え細胞から分離されたTNFRIまたはTNFRI断片と100未満の配列同一性を有するTNFRIまたはTNFRI断片のことを指す。一般に、TNFRI変異体は、野生型または天然型TNFRIまたはTNFRI断片と約70以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。配列同一性は、好ましくは約75以上でよく、80以上、約85以上、約90以上の順にさらに好ましく、最も好ましくは約95以上でよい。本発明で定義された四重変異体は、ヒト腫瘍壊死因子受容体-1またはヒト腫瘍壊死因子受容体-1断片のアミノ酸配列において4箇所に突然変異が生じた変異体のことをいう。本発明で定義された五重変異体は、ヒト腫瘍壊死因子受容体-1またはヒト腫瘍壊死因子受容体-1断片のアミノ酸配列において5箇所に突然変異が生じた変異体のことをいう。本発明で定義された六重変異体は、ヒト腫瘍壊死因子受容体-1またはヒト腫瘍壊死因子受容体-1断片のアミノ酸配列において6箇所に突然変異が生じた変異体のことをいう。本発明で定義された七重変異体は、ヒト腫瘍壊死因子受容体-1またはヒト腫瘍壊死因子受容体-1断片のアミノ酸配列において7箇所に突然変異が生じた変異体のことをいう。本発明で定義されたTNFRImは、TNFRIのアミノ酸配列のうち、N末端の41番目のアミノ酸からm個のアミノ酸配列からなるTNFRI断片のことをいう。例えば、TNFRI105断片は、TNFRIN末端41番目のアミノ酸から105個のアミノ酸配列を有するTNFRI断片である。他の例として、TNFRI126は、TNFRIN末端41番目のアミノ酸から126個のアミノ酸からなるTNFRI断片である。本発明で定義されたMet-TNFRImは、大腸菌でTNFRIを発現させるために、N末端に、TNFRIアミノ酸配列にないメチオニンMethionineが添加されたN末端41番アミノ酸からm個のアミノ酸個数を有するTNFRI断片のことをいう。本願で提供されるアミノ酸の様々な配列内に存在するアミノ酸は、それらの公知の三文字表記または一文字表記によって表下される。様々な核酸断片内に存在するヌクレオチドは、当該分野において日常的に用いられる標準単一文字命名法で命名される。本発明で定義されたxAzは、アミノ酸配列においてA番目のアミノ酸xがzに置換されたものを意味する。例えば、K48Qは、48番のアミノ酸のリシンLysがグルタミンGlnに置換されたものを意味する。本発明は、生体内invivo及び/または生体外exvivoでTNFとの向上した結合力を有しながら、タンパク質分解酵素に対する向上した抵抗性を有する修飾されたTNFRIポリペプチドまたはその断片、及びその製造方法、並びにそれらの用途に関するものである。本発明者らは、TNFに対する結合力が向上し、生体内及び/または生体外で安全性の増大したTNFRI変異体を開発するために鋭意研究した結果、TNFRI内のTNFと結合することが予想される個所のアミノ酸のうち特定の位置の4以上のアミノ酸が置換されたTNFRI変異体が修飾されていないTNFRIに比べてTNFに対する増加した結合力を示すことを確認した。但し、これらの結合力が向上した変異体がタンパク質分解酵素に容易に分解されるため、タンパク質分解酵素に対する抵抗性のためのさらなる修飾を選別して付加して天然型TNFRIに比べて同等以上のタンパク質分解酵素に対する抵抗性を有する変異体を選別して本発明を完成するに至った。したがって、本発明は、天然型TNFRI断片のアミノ酸配列のうち、特定位置の5以上のアミノ酸を置換することによってTNFとの結合力が向上し、タンパク質分解酵素に対する抵抗性を有する修飾されたTNFRIポリペプチドまたはその断片を提供する。本発明の修飾されたTNFRIポリペプチドまたはその断片は、TNFと安定的に結合することにより効果的にTNFの作用を抑え、糖鎖を含まなくとも活性を示すことから、動物細胞の他、微生物細胞においても容易に生成することができる。本発明についてより詳細に説明すると、下記の通りである。本発明は、配列番号1に記載の天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体-1TNFRIポリペプチドのアミノ酸配列またはその機能的に活性である断片のアミノ酸配列において、92位、95位、97位、及び98位の4個のアミノ酸残基と、68位、161位、200位及び207位のうちから選ばれるいずれか一つのアミノ酸残基から構成された5個のアミノ酸の修飾を含み、天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体-1TNFRIポリペプチドと比べて、TNFとの結合力が向上し、タンパク質分解酵素に対する抵抗性が同等であるか、あるいは、それ以上に増加した、修飾されたTNFRIポリペプチドまたはその断片を提供する。本発明は、また、配列番号1に記載の天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体-1TNFRIポリペプチドのアミノ酸配列またはその機能的に活性である断片のアミノ酸配列において、92位、95位、97位及び98位の4個のアミノ酸残基と、68位、161位、200位及び207位のうちから選ばれるいずれか一つのアミノ酸残基から構成された5個のアミノ酸の修飾にさらに93位のアミノ酸残基のアミノ酸の修飾を含む、修飾されたTNFRIポリペプチドまたはその断片を提供する。好ましくは、本発明は、配列番号1に記載の天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体-1TNFRIポリペプチドのアミノ酸配列またはその機能的に活性である断片のアミノ酸配列において、68位、92位、95位、97位及び98位のアミノ酸の修飾を含む、修飾されたTNFRIポリペプチドまたはその断片を提供する。さらに、本発明は、配列番号1に記載の天然型ヒト腫瘍壊死受容体-1TNFRIポリペプチドのアミノ酸配列またはその機能的に活性である断片のアミノ酸配列において、68位、92位、95位、97位及び98位に161位または207位のアミノ酸の修飾をさらに含む、修飾されたTNFRIポリペプチドまたはその断片を提供する。本発明は、また、配列番号1に記載の天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体-1TNFRIポリペプチドのアミノ酸配列またはその機能的に活性である断片のアミノ酸配列において、92位、95位、97位及び98位の4個のアミノ酸残基と、68位、161位、200位及び207位のうちから選ばれる2つのアミノ酸残基から構成された6個のアミノ酸の修飾を含む、修飾されたTNFRIポリペプチドまたはその断片を提供する。上記アミノ酸修飾は、修飾されていない天然型TNFRIポリペプチドまたはその断片に比べて、TNFとの増加した結合力を持たせると同時に、タンパク質分解酵素に対する抵抗性を維持または増加させるための修飾であり、代表的には、アミノ酸の置換である。しかしながら、増加された結合力を提供し、タンパク質分解酵素に対する抵抗性を維持または増加させる限り、タンパク質翻訳後修飾のような上記位置のアミノ酸に対する他の化学的な修飾、例えば、炭水化物部位による糖化、アシル化acylation例、アセチル化acetylationまたはサクシニル化succinylation、メチル化methylation、リン酸化phosphorylation、ハシル化hasylation、カルバミル化carbamylation、硫酸化sulfation、プレニル化prenylation、酸化oxidation、グアニジル化guanidination、アミジン化amidination、カルバミル化carbamylation例、カルバモイル化carbamoylation、トリニトロフェニル化trinitrophenylation、ニトロ化nitration、ペグ化PEGylationなどを排除しない。前記アミノ酸修飾がアミノ酸置換である場合、配列番号1に記載の天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体-1TNFRIポリペプチドのアミノ酸配列またはその機能的に活性である断片のアミノ酸配列において、68位のLはVで置換され、92位のSはI、L、F、M、W、Q、T、Y、K、H、E、A、V、P、NまたはRで置換され、93位のEはPで置換され、95位のHはFで置換され、97位のRはP、LまたはIで置換され、98位のHはAまたはGで置換され、161位のKはQまたはNで置換され、200位のEはQで置換され、207位のDはNで置換される。好ましくは、前記92位のSはI、MまたはHで置換され、97位のRはPで置換される。より好ましくは、本発明は、配列番号1に記載の天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体-1TNFRIポリペプチドのアミノ酸配列またはその機能的に活性である断片のアミノ酸配列において、L68V/S92I/H95F/R97P/H98A、L68V/S92M/H95F/R97P/H98A、L68V/S92H/H95F/R97P/H98A、L68V/S92I/H95F/R97P/H98G、L68V/S92M/H95F/R97P/H98G、L68V/S92I/H95F/R97P/H98A/K161Q、L68V/S92I/H95F/R97P/H98A/K161N、L68V/S92I/H95F/R97P/H98A/D207N、L68V/S92M/H95F/R97P/H98A/K161Q、L68V/S92M/H95F/R97P/H98A/K161N、L68V/S92M/H95F/R97P/H98A/D207N、L68V/S92H/H95F/R97P/H98A/K161Q、L68V/S92H/H95F/R97P/H98A/K161N、L68V/S92H/H95F/R97P/H98A/D207N、L68V/S92I/H95F/R97P/H98G/K161Q及びL68V/S92M/H95F/R97P/H98G/K161Nからなる群から選ばれるアミノ酸修飾を含む、修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体-1ポリペプチドまたはその断片を提供する。上記配列番号1として記載される天然型ヒトTNFRIポリペプチドの機能的に活性である断片は、天然型ヒトTNFRIポリペプチドと実質的に同等の効果を示す、天然型ヒトTNFRIポリペプチドの一部分を意味する。本願では、特に、配列番号1として記載される天然型ヒトTNFRIのアミノ酸配列の41番~211番からなるアミノ酸配列配列番号2;TNFRI171、配列番号1として記載される天然型ヒトTNFRIのアミノ酸配列の41番~166番からなるアミノ酸配列配列番号3;TNFRI126、配列番号1として記載される天然型ヒトTNFRIのアミノ酸配列の41番~145番からなるアミノ酸配列配列番号4;TNFRI105が用いられる。参考までに、ヒトTNFRIポリペプチド配列番号1の59番~143番のアミノ酸からなる断片だけでTNFRIの生物学的な活性が現れるということは当分野において周知である米国特許第6,989,147号など。上記修飾されたTNFRIポリペプチドの断片は、修飾されたTNFRIポリペプチドと実質的に同等の効果を示し、当業者により容易に製造可能な修飾されたTNFRIポリペプチドの一部分を意味する。そのため、本発明のTNFとの結合力が向上し、タンパク質分解酵素に対する抵抗性が同等であるか、あるいは、向上した修飾されたTNFRIポリペプチドまたはその断片の範ちゅうには、以下に記述されるものが含まれる。本発明は、配列番号1に記載の天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体-1ポリペプチドのアミノ酸配列の41番~211番からなるアミノ酸配列において、68位のLはVで置換され、92位のSはI、L、F、M、W、Q、T、Y、K、H、E、A、V、P、NまたはRで置換され、95位のHはFで置換され、97位のRはP、LまたはIで置換され、98位のHはAまたはGで置換された、修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体-1ポリペプチドまたはその断片を提供する。より好ましくは、配列番号1に記載の天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体-1ポリペプチドのアミノ酸配列の41番~211番からなるアミノ酸配列において、L68V/S92I/H95F/R97P/H98A、L68V/S92M/H95F/R97P/H98A、L68V/S92H/H95F/R97P/H98A、L68V/S92I/H95F/R97P/H98G及びL68V/S92M/H95F/R97P/H98Gからなる群から選ばれるアミノ酸修飾を含む修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体-1ポリペプチドまたはその断片を提供する。また、本発明は、配列番号1に記載の天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体-1ポリペプチドのアミノ酸配列の41番~211番からなるアミノ酸配列において、上述の修飾にさらに161位または207位のアミノ酸の修飾を含み、ここで、161位のKはQまたはNで置換され、207位のDはNで置換された、修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体-1ポリペプチドまたはその断片を提供する。このような本発明の修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体-1ポリペプチドまたはその断片は、L68V/S92I/H95F/R97P/H98A/K161Q、L68V/S92I/H95F/R97P/H98A/K161N、L68V/S92I/H95F/R97P/H98A/D207N、L68V/S92M/H95F/R97P/H98A/K161Q、L68V/S92M/H95F/R97P/H98A/K161N、L68V/S92M/H95F/R97P/H98A/D207N、L68V/S92H/H95F/R97P/H98A/K161Q、L68V/S92H/H95F/R97P/H98A/K161N、L68V/S92H/H95F/R97P/H98A/D207N、L68V/S92I/H95F/R97P/H98G/K161Q及びL68V/S92M/H95F/R97P/H98G/K161Nからなる群から選ばれるアミノ酸修飾を含む。本発明は、配列番号1に記載の天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体-1ポリペプチドのアミノ酸配列の41番~166番からなるアミノ酸配列において、68位のLはVで置換され、92位のSはI、L、F、M、W、Q、T、Y、K、H、E、A、V、P、NまたはRで置換され、95位のHはFで置換され、97位のRはP、LまたはIで置換され、98位のHはAまたはGで置換された、修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体-1ポリペプチドまたはその断片を提供する。より好ましくは、配列番号1に記載の天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体-1ポリペプチドのアミノ酸配列の41番~166番からなるアミノ酸配列において、L68V/S92I/H95F/R97P/H98A、L68V/S92M/H95F/R97P/H98A、L68V/S92H/H95F/R97P/H98A、L68V/S92I/H95F/R97P/H98G及びL68V/S92M/H95F/R97P/H98Gからなる群から選ばれるアミノ酸修飾を含む修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体-1ポリペプチドまたはその断片を提供する。さらに、本発明は、配列番号1に記載の天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体-1ポリペプチドのアミノ酸配列の41番~166番からなるアミノ酸配列において、上述の修飾にさらに161位のアミノ酸の修飾を含み、ここで、161位のKはQまたはNで置換された、修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体-1ポリペプチドまたはその断片を提供する。このような本発明の修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体-1ポリペプチドまたはその断片は、L68V/S92I/H95F/R97P/H98A/K161Q、L68V/S92I/H95F/R97P/H98A/K161N、L68V/S92M/H95F/R97P/H98A/K161Q、L68V/S92M/H95F/R97P/H98A/K161N、L68V/S92H/H95F/R97P/H98A/K161Q、L68V/S92H/H95F/R97P/H98A/K161N、L68V/S92I/H95F/R97P/H98G/K161Q及びL68V/S92M/H95F/R97P/H98G/K161Nからなる群から選ばれるアミノ酸修飾を含む。本発明は、配列番号1に記載の天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体-1ポリペプチドのアミノ酸配列の41番~145番からなるアミノ酸配列において、68位のLはVで置換され、92位のSはI、L、F、M、W、Q、T、Y、K、H、E、A、V、P、NまたはRで置換され、95位のHはFで置換され、97位のRはP、LまたはIで置換され、98位のHはAまたはGで置換された、修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体-1ポリペプチドまたはその断片を提供する。より好ましくは、配列番号1に記載の天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体-1ポリペプチドのアミノ酸配列の41番~145番からなるアミノ酸配列において、L68V/S92I/H95F/R97P/H98A、L68V/S92M/H95F/R97P/H98A、L68V/S92H/H95F/R97P/H98A、L68V/S92I/H95F/R97P/H98G及びL68V/S92M/H95F/R97P/H98Gからなる群から選ばれるアミノ酸修飾を含む修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体-1ポリペプチドまたはその断片を提供する。本発明は、また、配列番号1として記載される天然型ヒトTNFRIのアミノ酸配列を有するポリペプチドと90以上、95以上、96以上、97以上、98以上または99以上の相同性を有する他の変異体において、アミノ酸の68位、92位、95位、97位及び98位に対応する位置においてアミノ酸修飾を含む、修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体-1ポリペプチドまたはその断片を提供する。これは、配列番号1として記載されたアミノ酸配列の68位に対応するL位がVで置換され、92位に対応するS位がI、L、F、M、W、Q、T、Y、K、H、E、A、V、P、NまたはRで置換され、95位に対応するH位がFで置換され、97位に対応するR位がP、LまたはIで置換され、98位に対応するH位がAまたはGで置換されたアミノ酸配列を含む、修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体-1ポリペプチドまたはその断片である。前記修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体-1ポリペプチドまたはその断片は、配列番号1において161位に対応するK位がQまたはNで置換されるか、あるいは、207位に対応するD位がNで置換されるさらなるアミノ酸修飾を含むことができる。本発明は、また、配列番号1として記載されるアミノ酸配列を有するTNFRIポリペプチドと実質的に同じポリペプチドにおいて、上述したアミノ酸修飾またはそれに対応する修飾を含む修飾されたTNFRIポリペプチドまたはその断片を提供する。上記の配列番号1として記載されるアミノ酸配列を有するTNFRIポリペプチドと実質的に同じポリペプチドとは、TNFRIの本質的な活性を害さない数と種類のアミノ酸修飾、すなわち、アミノ酸置換、欠失、付加またはその他の修飾を含むポリペプチドを意味する。具体的には、本発明は、配列番号1として記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと90以上、95以上、96以上、97以上、98以上、または99以上の相同性を有する変異体において上述のアミノ酸修飾に対応する修飾を含む、修飾されたTNFRIポリペプチドまたはその断片を提供する。上述の変異体は、配列番号1として記載された配列を有するポリペプチドと、本願において言及されるアミノ酸修飾を除けば、90以上、95以上、96以上、97以上、98以上、または99以上の配列相同性を有するもので、ヒトTNFRIポリペプチドの対立遺伝子型変異体同種型、組織特異的な同種型及びそれらの対立遺伝子型変異体、一つ以上のアミノ酸突然変異、置換、欠失、挿入または追加を有している合成変異体、核酸を翻訳することによって製造された合成分子、ヒト及び非ヒト組織及び細胞から抽出したタンパク質、キメラTNFRIポリペプチド及びその修飾された形態を含むことができる。上述の対応する修飾とは、異なる同種型であるポリペプチド同士間に比較される残基の修飾を意味する。すなわち、配列番号1として記載される天然型ヒトTNFRIポリペプチドのアミノ酸配列と配列アラインメントsequencealignment時に、機能的に不変であると把握される残基を有する位置における、本発明の結合力向上及びタンパク質分解酵素に対する抵抗性の維持/向上のためのアミノ酸修飾に対応する修飾を意味する。当業界における熟練者であれば、それらのポリペプチドから対応する残基の修飾を容易に把握することができる。例えば、当業者は、保存的で且つ同一のアミノ酸残基をガイドとして用いてTNFRIポリペプチドの配列を整列することによって、対応する残基を同定することができる。本発明は、好ましくは、配列番号6、11、16、21、22、28-39、44、49、54、55、61-72、75、78、81、82、86-98で表わされるアミノ酸配列を含む修飾されたTNFRIポリペプチドまたはその断片を提供する。上記の本発明の修飾されたTNFRIポリペプチドまたはその断片は、上記アミノ酸修飾に加えて、タンパク質翻訳後修飾のような他の化学的な修飾、例えば、炭水化物部位による糖化、アシル化acylation例、アセチル化acetylationまたはサクシニル化succinylation、メチル化methylation、リン酸化phosphorylation、ハシル化hasylation、カルバミル化carbamylation、硫酸化sulfation、プレニル化prenylation、酸化oxidation、グアニジル化guanidination、アミジン化amidination、カルバミル化carbamylation例、カルバモイル化carbamoylation、トリニトロフェニル化trinitrophenylation、ニトロ化nitration、ペグ化PEGylationを、タンパク質分解酵素に対する抵抗性の増加、免疫原性の減少、または生物学的活性の維持または増加のために含むことができる。本発明は、また、上述の修飾されたヒトTNFRIポリペプチドまたはその断片を2つ以上含む多量体ポリペプチドまたは、ポリペプチド複合体ともいうを含む。本発明は、また、上記の修飾されたTNFRIポリペプチドまたはその断片をコードする塩基配列を含む遺伝子を提供する。本発明のTNFRIポリペプチドまたはその断片をコードする遺伝子は、大腸菌内発現を最適化するために操作された遺伝子を含む。ヒトと大腸菌の遺伝子コドンが異なるため、ヒト遺伝子を大腸菌で発現させる場合に、発現収率が低い。そこで、本発明では、ヒトTNFRI遺伝子に基づいて大腸菌発現に適合するように操作された遺伝子、例えば配列番号5のTNFRI遺伝子を用いることができる。該遺伝子は、大腸菌発現ベクター例えば、pET44aNovagen、Cat.No:71122-3に挿入してコドンなしの大腸菌細胞例:BL21DE3で発現時に、ヒトTNFRI遺伝子よりも高い発現量を示す。そのため、該遺伝子を用いてTNFRI断片及びTNFRI変異体を大腸菌内で効果的に産生することができる。本発明は、また、上記修飾された遺伝子を含むベクターを提供する。本発明で遺伝子導入のために使用可能なベクターは、当業界に公知のベクターを用いることができ、好ましくは、図1の切断地図を有するベクターを用いることができる。本発明は、また、上記ベクターで形質転換された細胞微生物または動物細胞を提供する。本発明で、ベクターの形質転換のために使用可能な微生物または動物細胞は、当業界で用いられる形質転換のための公知の微生物または動物細胞とすればよく、好ましくは、大腸菌細胞、CHO細胞、HEK293細胞などを用いることができ、より好ましくは、大腸菌である細胞例えば、E.coliBL21DE3を用いることができる。本発明は、大腸菌を用いたTNFRIの製造方法を提供する。TNFRIは、動物細胞を用いて産生可能であるBernie等、TheJournalofPharmacologyandExperimentalTherapeutics.301:418-4262002;Scallon等、Cytokine.7:759-7701995。TNFRIを大腸菌で発現させる場合に、構造的に活性を持たない封入体inclusionbodyの形態で発現するから、活性を有するタンパク質へのリフォールディングrefolding過程が要求されるSilvia等、AnalyticalBiochemistry230:85-901995;Karin等、Cytokine.7:26-381995。そのため、本発明の修飾されたTNFRIポリペプチドまたはその断片は大腸菌で封入体の形態で発現させ、これをリフォールディング過程を通じて活性を有するTNFRIにした後、これをゲルろ過クロマトグラフィ方法などで精製して得ることができる。また、本発明のTNFRIポリペプチド断片または修飾されたTNFRIポリペプチドまたはその断片は、親水性の融合タンパク質をつけて発現する方法、低い温度で培養する方法などを用いて大腸菌で封入体の形態ではなく可溶性タンパク質の形態とすることができる。例えば、親水性のNusAタンパク質をTNFRIタンパク質のN末端に結合させることによって、大腸菌で可溶性のタンパク質としてTNFRIを製造することができる。また、本発明は、上記遺伝子を適当なベクターに導入し、このベクターで宿主細胞を形質転換し、これにより得られた形質転換体を培地で培養してTNFRIポリペプチドまたはその断片を得る、TNFRIポリペプチドまたはその断片の製造方法を提供する。本発明は、また、TNFにより媒介される疾病や内科症状以下、TNF媒介疾病という。に対する治療方法を提供する。TNF媒介疾病、それに伴う後遺症及びその関連症状の例は、次の通りである:成人呼吸窮迫症候群;食欲不振;癌例えば白血病;慢性疲労症候群;移植片対宿主拒否反応;痛覚過敏;炎症性腸疾患;神経炎症性疾患;脳虚血を含む虚血性/再潅流傷害;各々神経変性の原因となり得る外傷、癲癇、出血又は発作の結果としての脳損傷;糖尿病例えば若年性1型糖尿病;多発性硬化症;眼病;疼痛;膵炎;肺線維症;リウマチ性疾患例えばリウマチ性関節炎、骨関節炎、若年性リウマチ性関節炎、血清反応陰性多発性関節炎、強直性脊髄炎、ライター症候群及び反応性関節炎、乾癬性関節炎、腸疾患性関節炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、強皮症、全身性硬化症、血管炎、脳血管炎、シェーグレン症候群、リウマチ熱、多発性軟骨炎及びリウマチ性多発性筋痛及び巨細胞性動脈炎;敗血性ショック;放射線療法の副作用;全身性紅斑性狼瘡;側頭下顎関節疾患;甲状腺炎及び組織移植。このようなTNF媒介疾病は、当分野において周知である。本発明は、また、上記の修飾されたTNFRIポリペプチドまたはその断片を含むリウマチ性関節炎またはTNF媒介疾病の予防または治療用医薬組成物を提供する。本発明は、また、上記の修飾されたTNFRIポリペプチドまたはその断片をコードする遺伝子、該遺伝子を含むベクターまたは該ベクターで形質転換された微生物または動物細胞を含むリウマチ性関節炎またはTNF媒介疾病の予防または治療用医薬組成物を提供する。本発明は、また、前記TNF媒介疾病の予防または治療用組成物を対象体に投与することを含むリウマチ関節炎またはTNF媒介疾病の予防または治療方法を提供する。本発明の医薬組成物は、経口、舌下、直腸、皮膚、皮下、筋肉、腹腔、静脈、動脈などで投与することができる。この医薬組成物は、目的とする純度を有するTNFRI変異体を、薬剤学的に許容される担体、賦形剤または安定化剤と混合することによって貯蔵または投与用に製造することができる。これらの物質は、使用する投与量及び濃度において服用者に毒性がないものであり、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩及び他の有機酸塩のような緩衝剤;アスコルビン酸のような酸化防止剤;ポリアルギニン;タンパク質例えば、血清アルブミン、ゲラチンまたは免疫グロブリン;低分子量約10個未満の残基を有するペプチド;ポリビニルピロリドンのような親水性重合体;グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニンのようなアミノ酸;グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む、単糖類、二糖類、およびセルロースまたはその誘導体を含むその他の炭水化物;EDTAのようなキレート剤;マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール;ナトリウムのような塩形成対イオン;および/または、Tween、プルロニックPluronics、またはポリエチレングリコールPEGのような非イオン界面活性剤を含む。本発明の医薬組成物は、注射用滅菌組成物の形態で当業界における通常の方法により製造することができる。この注射用滅菌組成物は、賦形剤、例えば、水またはごま油、落花生油または綿実油のような天然植物性オイル、またはオレイン酸エチルのような合成脂肪賦形剤中の活性化合物の溶液または懸濁液を含むことができる。該注射用滅菌組成物には、さらに緩衝剤、防腐剤、酸化防止剤などを、当業界で通常的に用いる様態で混入することができる。本発明の修飾されたTNFRIポリペプチドまたはその断片、またはこれをコードする遺伝子または該遺伝子を含むベクター、該ベクターで形質転換された微生物または動物細胞は、上記TNF媒介疾患の治療的に有効な量で医薬組成物中に含まれる。上記の治療的に有効な量は、研究者、獣医師、医師またはその他臨床医により考えられる動物またはヒトにおいて生物学的または医学的反応を誘導する活性成分または薬学的組成物の量を意味するもので、これは、治療される疾患または障害の症状緩和を誘導する量を含む。本発明の有効成分に対する治療上有効投与量及び投与回数は、所望の効果によって変わることは当業者には自明である。そのため、投与される最適の投与量は、当業者が容易に決定することができ、疾患の種類、疾患の重症度、組成物に含まれている有効成分及び他の成分の含量、剤形の種類、及び患者の年齢、体重、一般健康状態、性別及び食餌、投与時間、投与経路及び組成物の排出率、治療期間、同時使用される薬物をはじめとする様々な因子によって調節することができる。例えば、成人に対して、本発明のTNFRI変異体を1日1回投与時に、0.01~1,000mg/体重kg、好ましくは、0.1~100mg/体重kgの用量で投与することが好ましい。また、本発明の修飾されたTNFRIポリペプチドまたはその断片は、他の療法に対する付加物として投与されてもよく、治療される適応症indicationに適する他の医薬組成物と併用して投与することができる。本発明の修飾されたTNFRIポリペプチドまたはその断片は、1または2以上の公知のまたは新規の抗炎症性薬物のうちの任意の薬物と別個にまたは併用して投与することができる。かかる薬物に該当する化合物に関する情報は、TheMerck,ManualofDiagnosisandTherapy,SixteenthEdition,Merck,SharpDohmeResearchLaboratories,MerckCo.,Rahway、NJ1992、及びPharmaprojects、ピージェイビーパブリケーションリミッテッドから見つけることができる。上記併用使用の一例として、本発明のTNFRIポリペプチドまたはその断片は、リウマチ性疾病[例えば、ライム病、若年性リウマチ性関節炎、骨関節炎、乾癬性関節炎、リウマチ性関節炎及び黄色ブドウ球菌誘導性敗血性関節炎]のような急性及び慢性炎症を含む、TNF媒介疾病の治療のために、非ステロイド性、抗炎症性薬物non-steroidalanti-flammatorydrugs,NSAIDsとして分類される炎症調節のための第一選択薬と共に用いることができる。上記併用使用の他の例として、本発明の修飾されたTNFRIポリペプチドまたはその断片は、上記TNF媒介疾病及び多発性硬化症治療のために、一つ以上の遅効性抗リウマチ性薬物slow-actingantirheumaticdrug,SAARDsまたは疾病抗リウマチ性薬物disease-modifyingdrug,DMdrug,DMARDs、その薬物前駆体エステルまたは薬剤学的に許容される塩のいずれかと共に使用することができる。上記併用使用の他の例として、本発明のTNFRIポリペプチドまたはその断片は、上記のTNF媒介疾病の治療のために、一つ以上のCOX2阻害剤、その薬物前駆体エステルまたは薬剤学的に許容される塩のいずれかと共に使用することができる。本発明のTNFRIポリペプチドまたはその断片は、上記のTNF媒介疾病の治療のために、一つ以上の抗菌薬、薬物前駆体エステル、または薬剤学的に許容される塩のいずれかと共に使用することができる。本発明のTNFRIポリペプチドまたはその断片は、上記のTNF媒介疾病の治療のために、一つ以上の次の化合物のいずれかと共に使用することができる:顆粒球菌体刺激因子タリドミド、テニダブ、チアパパント、ニメスリド、パナビア、ロリプラム、サルファサラジンsulfasalazine;バルサラジドbalsalazide;オルサラジンolsalazine;メサラジンmesalazine;プレドニソロンprednisolone;ブデソニドbudesonide;メチルプレドニソロンmethylprednisolone;ヒドロコルチゾンhydrocortisone;メトトレキサートmethotrexate;シクロスポリンcyclosporin;ペプチドT;1R,3S-シス-1-[9-2,6-ジアミノプリニル]-3-ヒドロキシ-4-シクロペンテンヒドロクロリド、1R,3R-トランス-1-[9-2,6-ジアミノプリン]-3-アセトキシシクロペンタン、1R,3R-トランス-1-[9-アデニル]-3-アジドシクロペンタンヒドロクロリド、及び1R,3R-トランス-1-[6-ヒドロキシ-プリン-9-イル]-3-アジドシクロペンタン。本発明の修飾されたTNFRIポリペプチドまたはその断片は、上記のTNF媒介疾病の治療のために、一つ以上の付加的TNF阻害剤と共に使用することができる。TNF阻害剤は、TNFの生体内合成または細胞外放出を遮断する化合物及びタンパク質であり、次のものを含む:抗TNF抗体[例えば、MAK195FFab抗体Holleretal.1993,1stInternationalSymposiumonCytokinesinBoneMarrowTransplantation,147;CDP571抗TNFモノクロナール抗体Rankinetal.1995,BritishJournalofRheumatology,34:334-342;BAYX1351マウスの抗腫瘍壊死因子モノクロナール抗体Kieftetal.1995,7thEuropeanCongressofClinicalMicrobiologyandInfectiousDiseases,9;CenTNFcA2抗TNFモノクロナール抗体Elliottetal.1994,Lancet,344:1125-1127andElliottetal.1994、Lancet、344:1105-1110]。本発明は、また、上記の修飾されたTNFRIポリペプチドまたはその断片を含む医薬製剤を提供する。好ましくは、本発明の医薬製剤は、薬剤学的に許容される賦形剤をさらに含む。本発明の医薬製剤は、経口剤、吸入剤、注射剤、粘膜投与製剤、及び外用剤からなる群から選ばれる医薬製剤でよい。本発明の医薬製剤は、薬剤的に許容可能な希釈剤、保存剤、溶解剤、乳化剤、アジュバントまたは運搬体などを治療に効果的な量で含む。また、本発明の医薬製剤は、当業界で用いられる通常の緩衝溶液例えば、トリス緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、界面活性剤例えば、Tween80、抗酸化剤例えば、アスコルビン酸、メタスルファイトナトリウム、保存剤例えば、チメロサール、ベンジルアルコール、そしてバルク希釈剤例えば、乳糖、マンニトールのような添加剤を含むことができる。これらの添加剤は、ポリ乳酸、ポリグリコール酸リポソームなどのポリマー組成物を用いて粒子性物質として提供することができる。また、本発明の医薬製剤は、循環系内の持続性増加のために、ヒアルロン酸を含むことができる。本発明の医薬製剤は、選択的に薬剤学的運搬体、賦形物、あるいは培地として薬剤学的に許容される液体、半固体、あるいは固体希釈物を含むことができる。これらの物質にはポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、澱粉類、砂糖、デキストロース、アカシアガム、カルシウムリン酸塩、ミネラルオイル、ココアバター、及びテオブロマオイルなどを含むことができ、これに限定されない。本発明の医薬製剤は、また、胃腸管環境、そして腸内における生物学的な活性を有する物質の分泌から保護されるようにする安定した添加物質を含む。本発明の医薬製剤は、公知の技術、例えば、混合、溶解、顆粒化、ドラジェ化dragee-making、研和levigating、乳化、カプセル化、封入entrappingまたは錠剤化工程を用いて製造される。本発明の医薬製剤は、液体例:懸濁液、エリキシル及び/または溶液、または固体例:粉末、錠剤及び/またはカプセル形態であり、デポdepot形態に剤形化することができる。該デポ製剤は、非デポ製剤よりも一般的に長時間作用性である。該デポ製剤は、適切な重合体または疎水性物質例:適切なオイルのうちエマルジョンまたはイオン交換樹脂または難溶性誘導体例えば難溶性塩を用いて製造する。また、本発明の医薬製剤は、リポソーム及びエマルジョンのような送達システムを含む。特定送達システムは、疎水性化合物を含む製剤を含めて特定医薬製剤を製造するのに有用であり、ジメチルスルホキシドのような有機溶媒を用いることができる。本発明の他の様態として、本発明の医薬製剤は、医薬製剤を特定組織や細胞類型に送達するように考案された一つ以上の組織特異的送達分子を含む。例えば、特定の様態において、医薬製剤は、組織特異的抗体で被覆されたリポソームを含む。好ましくは、本発明の医薬製剤は、固体形態の経口投与製剤にすることができる。固体投与形態は、錠剤、カプセル、丸薬、トローチ、ペレットなどの形態を含む。リポソームやプロテイノイドカプセル化も、本発明の組成物を製剤化するのに用いることができる。これらのリポソームは、ホスファチジルコリンPC、ホスファチジルエタノールアミンPE、ホスファチジン酸PA、ホスファチジルイノシトールPI、及びスフィンゴミエリンSMのようなリン脂質、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリヒドロキシプロピルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリエチレングリコール、及びポリアスパラギン酸塩アミドのような親水性ポリマーで製造することができる。一方、本発明の医薬製剤中に含まれた修飾されたTNFRIポリペプチドまたはその断片は、必要によっては、経口投与を効果的にするために化学的に修飾することができる。一般に、化学的な修飾は、TNFRI変異体ポリペプチド内に1または2以上の残基をつけることに相当する。ここで、残基は、タンパク質分解酵素に抵抗性を持たせる物質、または、胃腸管から血流中への吸収を助ける物質でよい。好ましくは、上記化学的修飾のための残基は、本発明の医薬製剤の全体的な安定性を増加させることで、人体内で循環時間を増加させる化学的修飾のための残基でよい。これら残基の例は、ポリエチレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールとの共同複合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン及びポリポリプロリンなどでよい。使用可能な他のポリマーには、ポリ-1,3-ジオキサン及びポリ-1,3,6-チオキソケインなどがある。最も好ましくは、ポリエチレングリコール残基ペグ化が用いられる。本発明の経口投与用形態の医薬製剤の吸収率を増加させるための運搬体として、ソジウムN-8-[2-ヒドロオキシベンゾイル]アミノカプリレートSNACのような修飾されたアリファティックアミノ酸の塩を用いることができる。本発明の医薬製剤は、顆粒や粒子の大きさが約1mmのペレット形態の多重微粒子状に製剤化することができる。この場合、製剤は、カプセル形態でもよく、多重微粒子状の製剤は、粉末、軽く押された充填物、あるいは錠剤などの形態でもよい。また、該製剤は圧縮によって製造されてもよい。本発明の医薬製剤は、また、発色剤や香辛料をさらに含み、例えば、リポソームやミクロスフェアカプセルの形態に製剤化することができる。また、本発明の医薬製剤内有効成分である修飾されたTNFRIポリペプチドまたはその断片の吸収を増加させるために、脂肪酸、オレイン酸、リノレン酸などのような添加剤を用いることができる。一方、本発明の医薬製剤は、放出制御性製剤でよい。このような製剤内有効成分である修飾されたTNFRIポリペプチドまたはその断片は、非活性の担体に含まれて、拡散あるいは溶解の機序によって制御されて放出される。また、この放出制御性製剤は、徐々に分解される担体、例えば、アルギン酸、多糖類などを含むことができる。該放出制御性製剤の他の形態には、OROS治療システムOsmoticReleaseOraldeliverySystem、アルジャ社製に基づく形態でよい。この放出制御性製剤は、半透過性膜内に本発明の有効成分であるTNFRI変異体が充填され、その内部に水が流入することで当該有効成分を一つの小さい孔を通して浸透圧効果にてはみ出させる。また、本発明の放出制御性製剤は、腸溶性コーティング物質でコーティングすることによって、遅延された薬物放出効果を示すことができる。本発明の医薬製剤はまた、フィルムでコーティングされた錠剤の形態でよく、このフィルムコーティングに用いられる物質には、次の2群がある。第一の群は、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキセチルセルロース、メチルヒドロキシル-エチルセルロース、ヒドロキシルプロピルセルロース、ヒドロキシプロピル-メチルセルロース、ソジウムカルボキシ-メチルセルロース、プロビドンそしてポリエチレングリコールなどのような非腸溶性物質であり、第二の群は、フタル酸のエステルのような腸溶性物質である。具体的には、腸溶性物質には、腸溶性高分子、すなわち、腸溶性セルロース誘導体、腸溶性アクリル酸系共重合体、腸溶性マレイン酸系共重合体、腸溶性ポリビニル誘導体、及びこれらの混合物からなる群から選ばれるいずれかが用いられる。腸溶性セルロース誘導体は、ヒプロメロースアセテートスクシネート、ヒプロメロースフタレート、ヒドロキシメチルエチルセルロースフタレート、セルロースアセテートフタレート、セルロースアセテートスクシネート、セルロースアセテートマレート、セルロースベンゾエートフタレート、セルロースプロピオネートフタレート、メチルセルロースフタレート、カルボキシメチルエチルセルロース及びエチルヒドロキシエチルセルロースフタレートから選ばれる1または2以上の腸溶性アクリル酸系共重合体は、スチレン-アクリル酸共重合体、アクリル酸メチル-アクリル酸共重合体、アクリル酸メチルメタクリル酸共重合体、アクリル酸ブチル-スチレン-アクリル酸共重合体、メタクリル酸-メタクリル酸メチル共重合体例えば、オイドラギットL100、オイドラギットS、デグザ社製、メタクリル酸アクリル酸エチル共重合体例えば、オイドラギットL100-55、デグザ社製、及びアクリル酸メチル-メタクリル酸-アクリル酸オクチル共重合体から選ばれる1または2以上の腸溶性マレイン酸系共重合体は、酢酸ビニル-マレイン酸無水物共重合体、スチレン-マレイン酸無水物共重合体、スチレン-マレイン酸モノエステル共重合体、ビニルメチルエーテル-マレイン酸無水物共重合体、エチレン-マレイン酸無水物共重合体、ビニルブチルエーテル-マレイン酸無水物共重合体、アクリロニトリル-アクリル酸メチルマレイン酸無水物共重合体、及びアクリル酸ブチル-スチレン-マレイン酸無水物共重合体から選ばれる1または2以上、または上記腸溶性ポリビニル誘導体は、ポリビニルアルコールフタレート、ポリビニルアセタールフタレート、ポリビニルブチレートフタレート、及びポリビニルアセトアセタールフタレートから選ばれる1または2以上である。上記コーティング物質の混合物が最適のフィルムコーティングのために用いられてもよい。フィルムコーティングは、ファンコーターpancoater、流動層造粒機または圧縮コーティング機で行うことができる。本発明の放出制御性医薬製剤は、また、持続放出のために、成形品、例えばフィルムまたはマイクロカプセル形態の半透過性固相疎水性重合体マトリックス内に、本発明の修飾されたTNFRIポリペプチドまたはその断片を含むことができる。この持続放出のためのマトリックスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル[例:Langer等、J.Biomed.Mater.Res.,15:167-277,1981及びLanger,Chem.Tech.,12:98-105,1982に記載されたポリ2-ヒドロキシエチルメタクリレートまたはポリビニルアルコール]、ポリ乳酸米国特許第3773919号、ヨーロッパ特許第58,481号、L-グルタミン酸及びガンマエチル-L-グルタメートの共重合体Sidman等、Biopolymers,22:547-556,1983、非分解性エチレン-ビニルアセテート上記のLanger等の文献、分解性乳酸-グリコール酸共重合体例:リュープロンデポLupronDepot商標乳酸-グリコール酸共重合体および酢酸ロイプロリドからなる注射用ミクロスフェア及びポリ-D---3-ヒドロキシ酪酸ヨーロッパ特許第133988号を含む。カプセル化したタンパク質が長期間体内に滞留すると、37°Cで湿気に露出された結果、変性または凝集することがあり、その結果、生物学的活性の損失、免疫原性の変化を招くことがある。そのため、関連メカニズムに基づいて公知の方法を用いてタンパク質安定化を達成することができる。例えば、凝集メカニズムがジスルフィド交換を通じた分子間S-S結合を形成するものと知られた場合、スルフヒドリル残基を変性し、酸性溶液から凍結乾燥し、水分含量を調節し、適当な添加剤を使用し、特定重合体マトリックス組成物を開発することによって安定化させることができる。本発明は、また、本発明のTNFRI変異体、及びこれを含む医薬製剤の使用方法を提供する。当該医薬製剤は、注射、経口投与、鼻腔内投与、経皮投与、または他の方法を用いた投与が可能である。該方法には、静脈内intravenous、真皮内intradermal、筋肉内intramuscular、乳房内intramammary、腹腔内intraperitoneal、髄腔内intrathecal、眼内intraocular、肺内intrapulmonaryあるいは皮下注射subcutaneousinjection、舌下sublingual、肛門anal、膣vaginal、外科的注入surgicalimplantationなどがある。この治療は、単回投与または一定期間にわたる反復投与でよい。また、本発明の医薬製剤は、肺を通した送達方法によって伝えられてもよい。本発明の医薬製剤は、ほ乳動物の肺を通して息をする間に送達され、それは肺の上皮細胞を通りながら血流中に吸収される。肺を通した薬物の送達のために考案された様々な機械的装置を、本発明の医薬製剤の肺を通した送達のために用いることができる。これらは、ネブライザー、目盛り付き用量吸入器、及び粉吸入器などを含め、当業界で市販されている種々の機器を含む。本発明の医薬製剤は、これらの装置への適用を最適化するために適切に製剤化することができる。一般に、それぞれの製剤は、適用された装置の形態によって特異的であり、場合によって、希釈剤、アジュバント、または運搬体にさらに推進剤を適切に併用することができる。肺を通した送達のための本発明の医薬製剤は、粒子性物質とすることが好ましく、それの平均粒径は、約10μm以下である。最も好ましくは、0.5~5μmにし、遠くの肺まで効果的に送達されるようにする。肺を通した送達のための本発明の医薬製剤は、また、運搬体として、トレハロース、マンニトール、キシリトール、スクロース、ラクトース及びソルビトールのような炭水化物を含むことができる。上記製剤には、ジパルミトイルホスファチジルコリンDipalmitoylphosphatidylcholine、DPPC、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンDioleoylphoshatidylethanolamine、DOPE、ジステアロイルホスファチジルコリンDistearoylphosphatidylcholine、DSPC及びジオレオイルホスファチジルコリンDioleoylphosphatidylcholine、DOPCなどをさらに挙げることができる。なお、当該製剤は、天然または合成界面活性剤を含むことができる。該製剤は、なお、ポリエチレングリコール環状デキストランのようなデキストラン胆汁酸と他の関連した誘導体、及び緩衝溶液の製剤として用いられるアミノ酸をさらに含むことができる。また、本発明の医薬製剤の肺を通した送達のために、リポソーム、マイクロカプセルまたはミクロスフェア、包接錯体または運搬体の他の形態が用いられてもよい。本発明の医薬製剤をネブライザーを用いて肺に送達する場合に、ジェットまたは超音波を共に使用することができる。ネブライザーに適用するための本発明の医薬製剤は、溶液1mL当たり約0.1~500mgのTNFRI変異体を含む。また、このネブライザー用製剤は、緩衝溶液と単糖類を含み、これらは、例えば、タンパク質安定化及び浸透圧安定に寄与する。なお、当該ネブライザー用製剤は、エアロゾルの形成において溶液の原子化に起因するタンパク質の凝集を誘発する表面を減らす目的で界面活性剤を含むことができる。目盛り付き用量吸入器のための本発明の医薬製剤は、一般に、本発明のTNFRI変異体を含む組成物を細かい粉にして、界面活性剤の補助下に推進剤に混合した形態である。該推進剤は、クロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボン、あるいはジクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール、及び1,1,1,2-テトラフルオロエタンのようなヒドロカーボン、またはこれらの組み合わせでよい。上記使用可能な適切な界面活性剤は、ソルビタントリオレート及び大豆レシチンを含む。オレイン酸も同様、界面活性剤に用いることができる。粉吸入器から放出される本発明の医薬製剤は、本発明のTNFRI変異体を含む組成物を含む細かい乾燥粉状にし、ラクトース、ソルビトール、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはキシリトールのような希釈剤を含むことができる。これらは、粉状の製剤を機器装置から分散させることを促すことができる。なお、本発明の医薬製剤は、鼻腔を通した送達のための製剤でもよい。鼻を通した送達は、タンパク質治療剤が鼻に入ってきた後に直ちに血流中に入るようにし、肺に治療剤が積もることを防ぐ。鼻腔を通した送達のための本発明の医薬製剤は、デキストランまたは環状デキストランなどを含む。本発明の医薬製剤は、その他の粘膜組織を通して伝えられるための製剤でもよい。本発明の医薬製剤の投与用量は、上述した疾病を治療する方法について医師により薬物の効果を変形させるような要因、例えば、年齢、状態、体重、性別、食餌、ある感染による重症度、投与時点などのその他臨床学的な条件による要因に基づいて決定しなければならない。本発明の医薬製剤は、単回または継続的投与が可能である。ただし、初回投与後に一定の循環系濃度を維持させるために継続的な投与をすることが好ましい。効果的な投与用量及び方法は、当業界で公知の一般技術に基づいて最適化すればよく、反復投与回数は、各患者の薬動学的な因子と投与経路によって可変でよい。なお、投与用量、用法及び投与回数は、投与された薬物の物理的な状態、安全性、生体内放出速度、生体内除去率などに基づいて最適化することができる。また、投与経路に基づく適切な投与用量を、体重、体表面積、臓器の大きさによって計算することができる。適切な用量は、適切な用量-反応資料と血中濃度の資料と共に判断して確定しなければならない。最終の投与法は医師により決定されるが、医師は、薬物の比活性、患者の重症度、薬物に対する患者の反応程度、年齢、調子、体重、性別、食餌及びその他臨床学的な要因を考慮して処方しなければならない。研究が進行されるにつれて、種々の疾病及び条件に対応する適切な投与用量と処方期間に関するより多くの情報が出現すると予想される。本発明の修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体-1ポリペプチドまたはその断片は、天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体-1ポリペプチドまたはその断片と比べて増加されたTNFに対する結合力を示す。また、天然型ヒト腫瘍壊死因子受容体-1ポリペプチドまたはその断片に比べて維持/増加されたタンパク質分解酵素に対する抵抗性を有するため、生体内において増加された半減期を示し、注射剤または経口剤として投与時に、改善された生体利用率及び吸収率を示す。よって、効果的にTNFの作用を阻害する持続型注射剤及び経口用タンパク質製剤として有用することができる。本発明の利点及び特徴、並びにそれらを達成する方法は、後述する実施例から明確になるであろう。ただし、本発明は、以下に開示される実施例に限定されない。本発明の修飾されたTNFRIポリペプチドまたはその断片を製造するために、既に誘電体が公開されているヒトTNFRI誘電体情報を用いた。[製造例1]TNFRI断片遺伝子及び発現ベクターの製作1TNFRI171断片遺伝子の製作ヒトTNFRIは4個の細胞外ドメインを有しており、そのうち、TNFRIの3つのドメインTNFRI126だけでもTNF-αに対する結合が可能であり、それ以上の欠損が存在してもTNF-αとの結合に影響がないと報告されている。そこで、配列番号1として記載されたヒトTNFRIポリペプチドの41番から171個のアミノ酸を有するTNFRI171、ヒトTNFRIの41番から126個のアミノ酸を有するTNFRI126、41番から105個のアミノ酸を有するTNFRI105を、本発明の変異体を製造するための候補ペプチドとして選定した。このような変異体を産生するために、TNFRI171の塩基配列を、大腸菌内発現に容易となるように、大腸菌に合うコドンを用いて修飾した配列番号5。これを、PCR方法を用いる遺伝子合成方法で作製した。上記合成された遺伝子配列を、pGEM-TPromega、Cat.No:A1380ベクターに挿入するために、1μLのpGEM-Tベクターに前記合成された遺伝子3μLを添加し、1μLリガーゼNEB、Cat.No:M2200Sとライゲーション溶液2xligationbufferを入れた後、常温で10分間反応させた。反応溶液2μLを取ってXL1-blueコンピテント細胞competentcellRBC、Cat.No:RH119-J80に入れ、37°Cで2分間熱衝撃heatshockを加えて形質転換した後、アンピシリンの含まれているLB固体培地で静置培養してコロニーを得た。このコロニーを、アンピシリンの含まれているLB液体培地で培養した後、プラスミドを分離し、PCRを用いてddNTPに蛍光物質を標識する方式で遺伝子配列を確認したソルジェント、韓国。この遺伝子をpGEM-TNFRI171と命名した。以下では、TNFRI126、TNFRI105遺伝子は、先に得られたpGEM-TNFRI171遺伝子を用いてPCR方法で得た。2TNFRI発現ベクターの製作:TNFRI105、TNFRI126及びTNFRI171発現ベクターの製作大腸菌におけるMet-TNFRIMetで始まるTNFRIタンパク質の発現のために商業的に利用可能なpET44aベクターNovagen,Cat.No:71122-3を用いて発現ベクターを構築した。具体的に、Met-TNFRI105遺伝子配列番号100は、前記製作されたpGEM-TNFRI171プラスミドを鋳型にPCRを行って得た。このとき、pET44aベクターへのクローニングのために、5’末端にNdeI、3’末端にHindIII制限酵素認識位置を添加した。PCR増幅に用いられたプライマーの塩基配列は、下記の通りである。正方向プライマー5’acatatggatagcgtgtgcccgc3’逆方向プライマー5’taagcttattaattaaaacactggaac3’PCRは、95°Cにおける5分間の1次変性、95°Cにおける1分間の2次変性、60°Cにおける40秒間のプライマー接合、72°Cにおける1分間の伸長反応のうち、2次変性から伸長反応までを25回繰り返し行った後、最終酵素反応を72°Cにおいて10分間行って反応を終了した。増幅された遺伝子とpET44aベクターに制限酵素NdeI、HindIIIを添加して37°Cにおいて3時間反応させた。制限酵素を処理した後、1アガロスゲル電気泳動を行って当該サイズのDNAバンドをかみそりで切り出してDNA抽出キットGeneAll,Cat.No:102-102を用いて抽出した。50ngのpET44aベクターと200ngのMet-TNFRI105遺伝子を添加し、1μLリガーゼNEB,Cat.No:M2200Sとライゲーション溶液2xligationbufferを入れ、最終的に滅菌された蒸留水を入れて20μLにし、反応物を常温下で10分間反応させた。反応液2μLを取ってXL1-blueコンピテント細胞に入れ、37°Cで2分間熱衝撃を加えて形質変換した後、アンピシリンの含まれているLB固体培地で静置培養してコロニーを得た。このコロニーを、アンピシリンの含まれているLB液体培地で培養した後、プラスミドを分離し、遺伝子配列分析により遺伝子配列を確認した。上記の過程を経て得たプラスミドをpET44a-Met-TNFRI105と命名した図1。Met-TNFRI126遺伝子配列番号101は、前記製作されたpGEM-TNFRI171プラスミドを鋳型にPCRを行った後に確保した。このとき、pET44aベクターへのクローニングのために、5’末端にNdeI、3’末端にBamHI制限酵素認識位置を添加した。PCR増幅に用いられたプライマーは、下記の通りである。正方向プライマー5’acatatggatagcgtgtgcccgc3’逆方向プライマー5’cggatccttaacaaactgtattctgcttc3’PCR反応は、上記のMet-TNFRI105遺伝子確保と同様であり、制限酵素としてNdeI、BamHIを用いた以外は、大腸菌発現ベクターの製作は、Met-TNFRI105発現ベクターの製作と同様に行われた。コロニー培養を通じてクローニングされたプラスミドをpET44a-Met-TNFRI126プラスミドと命名し、クローニングの完了は、コロニーからプラスミドを分離して遺伝子配列分析により決定した図1。Met-TNFRI171遺伝子配列番号102は、pGEM-TNFRI171プラスミドを鋳型にPCRを行った後に確保した。このとき、pET44aベクターへのクローニングのために、5’末端にNdeI、3’末端にBamHI制限酵素認識位置を添加した。PCR増幅に用いられたプライマーは、下記の通りである。正方向プライマー5’acatatggatagcgtgtgcccgc3’逆方向プライマー5’cggatccttatgtggtgcctgagtcctc3’PCR反応及び大腸菌発現ベクターの製作は、上記のMet-TNFRI126遺伝子確保と同様である。コロニー培養を通じてクローニングされたプラスミドをpET44a-Met-TNFRI171プラスミドと命名し、クローニングの完了は、コロニーからプラスミドを分離して遺伝子配列分析により決定した図1。[製造例2]TNF-αに対する結合力が向上したTNFRI断片変異体の製造1TNFRI変異体の設計TNFRI105、TNFRI126、TNFRI171に適用するアミノ酸修飾の一覧を表1に示す。配列番号1に記載の天然型ヒトTNFRIのアミノ酸配列を用いて、TNF-αとTNFRIとの結合に関与すると認められるTNFRIアミノ酸の位置を分析した。これにより決定されたTNFRIの各アミノ酸の結合力を高めるために他のアミノ酸で置換した。上記表1の1番~30番に記載のアミノ酸修飾をTNFRI105、TNFRI126、TNFRI171にそれぞれ導入した変異体をTNFRI105-A1~TNFRI105-A30、TNFRI126-A1~TNFRI126-A30、TNFRI171-A1~TNFRI171-A30と命名した。前記名称のうち、Aは、結合力Affinity増加変異体の候補を意味する。例えば、TNFRI105-A1は、TNFRI105断片における結合力増加変異体候補1番を意味する。2TNFRI変異体をコードするDNAの製造位置特異的なTNFRI変異体を製作するために、位置指定突然変異体の製作site-directedmutagenesis方法によってTNFRI変異体を製作した。表1に記載の30個のアミノ酸修飾を含むTNFRI変異体の製作に用いたプライマーを下記表2に示す。具体的には、前記TNFRI先に製作されたpET44a-Met-TNFRI105またはpET44a-Met-TNFRI126またはpET44a-Met-TNFRI171プラスミドを鋳型に下記表2のプライマーの各対を20pmoleになるように蒸留水に溶かした後に、Pfuポリメラーゼを用いたPCR反応を行って位置指定突然変異体を製作した。先に製作されたpET44a-Met-TNFRI105またはpET44a-Met-TNFRI126またはpET44a-Met-TNFRI171プラスミドを鋳型に、TNFRI105-A1、TNFRI-126-A1、TNFRI-171-A1及びTNFRI105-A30、TNFRI-126-A30、TNFRI-171-A30をコードするプラスミドを製作するために、表2のA30、A1に該当するプライマーを用いてそれぞれ増幅反応を行ったそれぞれpET-TNFRI105_A1、pET-TNFRI-126_A1、pET-TNFRI-171_A1及びpET-TNFRI105_A30、pET-TNFRI126_A30、pET-TNFRI171_A30という。次いで、下記表2に示すように、このようにして製作されたプラスミドを鋳型に、pET-TNFRI_A2~pET-TNFRI_A29を製作した。増幅反応に用いられた溶液の構成は、下記の通りである。それぞれの鋳型プラスミドDNA1.0μL、20pmoleN-プライマー1.0μL、20pmoleC-プライマー1.0μL、2XPrimeSTARPCRbuffer25.0μL、200uMdNTP4.0μL、PrimeSTARHSDNApolymeraseTakara,Cat.No:R044A0.5μLと17.5μLの蒸留水を入れて50.0μLの反応溶液を作成した。PCRは、98°Cにおける5分間の1次変性、98°Cにおける30秒間の2次変性、55°Cにおける30秒間のプライマー接合、72°Cにおける9分間の伸長反応のうち、2次変性から伸長反応までを17回繰り返し行った後に、最終酵素反応を72°C10分行って反応を終了した。PCR産物は、DpnI酵素で37°Cにおいて2時間処理して大腸菌由来のDNAを分解し、PCRによって増幅されたDNAを確保した。DNA溶液2μLを取ってXL1-blueコンピテント細胞RBC,Cat.No:RH119-J80に入れ、42°Cで1分間熱衝撃を加えて形質転換し、アンピシリンの含まれているLB固体培地で静置培養してコロニーを得た。このコロニーを、アンピシリンの含まれているLB液体培地で培養した後、プラスミドを分離し、塩基配列の分析により位置特異的TNFRI変異体の完成を確認した。3大腸菌で生物学的活性を示すMet-TNFRI及びMet-TNFRI変異体の産生イMet-TNFRI及びMet-TNFRI変異体の発現上記製作したプラスミド溶液1μLを取ってBL21StarDE3Invitrogen,Cat.No:C6010-03コンピテント細胞に入れ、42°Cで1分間熱衝撃を加えて形質転換し、アンピシリンの含まれているLB固体培地で静置培養してコロニーを得た。発現ベクターを含んでいる大腸菌BL21StarDE3を、100μg/mL濃度のアンピシリンの入っている5mLYP培地yeastextract:Merck,Cat.No:103753,peptone:BD,Cat.No:243620,NaCl:Merck,Cat.No:1064049025に接種して37°Cで16時間通気培養した。培養された培地は、100μg/mLアンピシリンの入っている250mLYP培地を有する1Lフラスコに600nmにおける吸光度が0.1になるように接種した。37°Cで培養して600nmにおける吸光度が3~4であるときに、最終濃度が1.0mM濃度になるようにIPTGを添加して発現を誘導した。発現誘導後、37°Cで3時間さらに通気培養を続けた後、細胞を6,000rpmで20分間遠心分離して細胞を収集した。ロ未溶解Met-TNFRI及びMet-TNFRI変異体の回収収集した細胞を再懸濁溶液50mMトリス、0.5mMEDTApH8.5で再懸濁させた。懸濁された細胞は、ソニケーターSonics,Cat.No:VCX750を用いて破砕した。細胞破砕後、8000xg、10°C、30分の条件下で遠心分離し、上澄み液を捨て、沈殿されたペレットを洗浄溶液150mMトリス、10mMEDTA、0.5トリトンX-100TritonX-100pH8.0で懸濁させ、8000xg、10°C、20分の条件下で遠心分離した。上澄み液を捨て、ペレットを再懸濁溶液で再懸濁させ、8000xg、10°C、20分の条件下で遠心分離した。前記洗浄されたペレットは、直ちに用いるか、あるいは、-80°Cで凍結保存した。ハMet-TNFRI及びMet-TNFRI変異体の可溶化及びリフォールディング上記のようにして得たペレットに6mL変性溶液6~8Mヨウ素Ureaまたは6~8M塩化グアニジンGuanidine-HCl、10mMジチオトレイトールDTT、2.0mMEDTA、0.2MNaClを添加して溶解した。溶解後、0.45umシリンジフィルターを用いて未溶解ペレットを除去した。可溶化させたペレット溶液をリフォールディング溶液50mMトリス、1.0mMEDTA、0.5ML-アルギニン、6.0mMGSH、4.0mMGSSG、240mMNaCl、10mMKClpH9.0に20倍希釈して4°Cで12~24時間ゆっくり攪拌しながらリフォールディングを誘導した。ニリフォールディングされたMet-TNFRI及びMet-TNFRI変異体の精製リフォールディングされたMet-TNFRI及びMet-TNFRI変異体を精製するために、リフォールディング溶液を3kDのアミコンウルトラAmiconUltraMillipore,Cat.No:UFC900324を用いて20倍濃縮した。濃縮後、Superdex75prepgradeGEレジンをXK25/70GE,Cat.No:19-0146-01カラムに詰め込んだゲルろ過クロマトグラフィを用いて精製した。具体的に、リフォールディングされた試料をカラムにアプライする前に、4~5カラム体積の平衡化溶液50mMソジウムホスファート、100mMNaClpH7.0を用いてカラムを平衡化させた。カラムに2mL試料をアプライした後、5mL/分の流速で平衡化溶液を流しながら5mLずつ分画して試料を採取した。採取した試料をSDS-PAGEで分析した後、90以上の純度を示す分画のみを取った。上記の過程を通じて、純粋なMet-TNFRI105、Met-TNFRI126、Met-TNFRI171、Met-TNFRI105変異体と、Met-TNFRI126変異体及びMet-TNFRI171変異体を精製した図2。[実験例1]リガンドTNF-αに対するMet-TNFRIの結合力の確認精製して得た純度90以上の純度を有するMet-TNFRI及びMet-TNFRI変異体の濃度をブラッドフォード方法を用いて定量し、ELISA分析法を用いてTNF-αに対する結合力を確認した。96ウェルプレートに、TNFRI190配列番号1のTNFRIの22番のアミノ酸~211番のアミノ酸までの190個のアミノ酸からなるタンパク質、RD社製、CatNo:636-R1-025-CF100μLを、1μg/mLの濃度で分注した後、4°Cで16時間固定化した。洗浄溶液0.05Tween-20,PBS,pH7.4300μLで3回各ウェルを洗浄した後、ブロッキング溶液5脱脂乳、PBS,pH7.4300μLを各ウェルに入れ、室温下で2時間反応させた。次いで、洗浄は、上記の方法と同様にして行った。分析しようとする試料を500nM、125nM、31nM、7.8nM、1.9nM、0.48nM、0.12nM、0.03nMで製造した後、各ウェルに100μLずつデュプリケート分注した。試料の分注された各ウェルに50ng/mLのTNF-αを100μLずつ入れ、室温下で2時間反応させた。洗浄溶液で洗浄した後、100μg/mLのTNF-α抗体溶液を1/1000に希釈した後、各ウェルに100μLずつ入れ、室温下で2時間反応させた。洗浄溶液で洗浄した後、基質溶液を各ウェルに100μLずつ入れ、室温下で15分間反応させ、基質溶液である3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジンRnD,Cat.No:DY999を100μL注入した後、常温下で15分間反応させ、1.0M硫酸溶液サムジョン、Cat.No:S212950μLを注入して反応を中止した。450nm、540nmのVmax読取機MD、型番:VersaMaxを用いて吸光度を読み取った。Met-TNFRI及びMet-TNFRI変異体の結合力は、濃度による吸光度の変化を通じて確認した。TNF-αに対するTNFRIの結合力は、濃度による吸光度の変化を通じてIC50値を測定して決定した。これを用いて、天然型TNFRI対比の相対的な結合力を確認した。その結果を下記表3に示す。なお、代表液な変異体TNFRI126-A30、TNFRI171-A30に対する結果を図3に示す。一方、図3に示すように、TNFRI126とTNFRI171は、実質的に同じ効果を示すということを確認することができる。また、下記表3から明らかなように、本発明のTNFRI変異体は、天然型TNFRIと比べて、最大1400の向上した結合力を示す。[実験例2]TNF-α細胞毒性中和試験を通じたMet-TNFRI及びMet-TNFRI変異体の生物学的活性の確認精製されたMet-TNFRI及びMet-TNFRI変異体は、ブラッドフォード方法を用いて定量し、所定の濃度のTNF-αに感受性を有するWEHI細胞ATCC,Cat.No:CRL-2148に処理して細胞毒性効果から保護される度合いを測定することにより活性を確認した。具体的に、WEHIATCC,Cat.No:CRL-2148細胞を5牛胎児血清とペニシリン50U/mL、ストレプトマイシン50mg/mLを含むRPMI培地内に2×105細胞/mLの濃度で浮遊させた。この細胞浮遊液100μLを96ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに移し、5CO2、37°Cで24時間培養した。各ウェルにアクチノマイシン-Dを含む培地を用いて、70pg/mL濃度のTNF-αを100μLずつ加えた。PBS溶液を用いて100μg/mLの各変異体試料を3.0nMから0.18pMに希釈した後、TNF-αの付加された各ウェルに加えた。このとき、エンブレルAmgen、成分名:エタネルセプトは3.0nMから0.04pMに、天然型TNFRIは200nMから12pMに処理した。WEHI細胞を5CO2、37°Cで24時間培養した。培養後、MTT細胞増殖分析キットRoche,Cat.No:11455007001にあるMTT試薬を各ウェル当たりに添加し、さらに4~6時間培養した。可溶化試薬を各ウェル当たりに添加した後、24時間培養して紫色のホルマザン溶解を確認し、570nmのVmax読取機を用いて吸光度を読み取った。Met-TNFRI及びMet-TNFRI変異体の活性と各変異体の活性は、濃度による吸光度の変化を通じてND50値を測定し、これを用いて天然型TNFRI対比の相対的な活性を確認した。その結果を下記表4に示す。なお、代表的な変異体TNFRI126-A30、TNFRI171-A2、TNFRI171-A9、TNFRI171-A21、TNFRI171-A22及びTNFRI171-A30に対する結果を図4に示す。一方、図4Aに示すように、TNFRI126とTNFRI171は、実質的に同じ効果を示すということを確認することができる。また、Met-TNFRI及びMet-TNFRI変異体は、TNF-α細胞毒性中和試験の結果、天然型TNFRIと比較したときに、TNFRI171-A2、TNFRI171-A21、TNFRI171-A22は200倍以上の生物学的活性を有することを確認した表4。これにより、TNFRI変異体のTNF-αに対する結合力が増加する場合に、細胞毒性中和力が増大するということを確認することができた。[実験例3]Met-TNFRI及びMet-TNFRI変異体のタンパク質分解酵素に対する抵抗性の確認Met-TNFRI及びMet-TNFRI変異体のタンパク質分解酵素に対する抵抗性は、純粋に分離された精製液の全体のタンパク質濃度を測定して、豚のパンクレアチンを総タンパク質純粋に分離されたTNFRI精製液の総タンパク質をブラッドフォード法によって定量した値量の40になるように処理し、タンパク質分解酵素に対する抵抗性を確認するために、パンクレアチンSigma,Cat.No:P7545処理による各変異体の半減期を決定した後、Met-TNFRI対比の半減期を測定した。具体的に、ブラッドフォード方法で定量されたMet-TNFRIと各変異体の濃度をPBS溶液を用いて100μg/mLの濃度に調整した後、250μLのタンパク質試料を500μLの遠心分離チューブに用意した。パンクレアチン10μgの含まれている0.1Mソジウムホスファート30μLを試料に添加して37°Cで反応させた。反応後、0分後、5分後、10分後、15分後、20分後、30分後、40分後、60分後に30μLの試料を取って5μLタンパク質分解酵素阻害剤Roche,Cat.No:11836170001の入っている270μLの5BSA溶液に入れて混合した後、液体窒素に保管した。実験の終わった試料は、ELISA定量方法RnD,Cat.No:DY225により未切断量を分析してMet-TNFRI変異体の半減期を求めた。Met-TNFRIの半減期を基準としたときの各変異体の相対的な半減期を百分率で表示した表3及び表4。結合力の向上したMet-TNFRI変異体は、天然型Met-TNFRIよりもタンパク質分解酵素に容易に分解されることが確認された。[製造例3]タンパク質分解酵素に対する抵抗性が増加した変異体の選別1TNFRI変異体の設計タンパク質分解酵素に抵抗性を有する変異体を設計した。突然変異位置決定は、TNFRI171アミノ酸配列について、下記の表1に表示された胃腸管、細胞及び血液中に存在する代表的なタンパク質分解酵素10種に対する切断位置を、ExpasyExpertProteinAnalysisSystemから提供するpeptidecutterhttp://www.Expasy.org/tools/peptidecutter/プログラムを用いて推定し、推定された切断部位のアミノ酸を、構造的変化が少ないと共にタンパク質分解酵素により切断されないアミノ酸に置換した。置換されるアミノ酸の決定は、PAM250マトリックスmatrixを用いた。PAM250マトリックスには、それぞれのアミノ酸に対して正数、0、負数の値を有する19種の対応アミノ酸を参照して、タンパク質分解酵素により切断されないと共に正数または0の値を有するアミノ酸を、置換するアミノ酸と決定した。上記の方法によって設計されたTNFRI変異体の一覧は、下記表6に示す。下記の実施例と関連して、上記表のxは、変異体番号R1番~R76番について108、126または171であり、変異体番号R77番~R84番について126または171であり、変異体番号R85番~R92番について171である。前記名称のうち、Rは、タンパク質分解酵素に対する抵抗性増加変異体の候補を意味する。例えば、TNFRIx-R1は、TNFRIx断片におけるタンパク質分解酵素に対する抵抗性増加変異体の候補1を意味する。2TNFRI108遺伝子及び発現ベクターの製造大腸菌で可溶性のTNFRI108タンパク質を発現するために、NusA遺伝子を含む商業的に利用可能なpET44aベクターNovagen、Cat.No:71122-3を用いて発現ベクターを構築した。具体的に、TNFRI108遺伝子は、上記[製造例1]で作製されたpGEM-TNFRI171プラスミドを鋳型に下記プライマーを用いてPCRを行って得た。この時、pET44aベクターへのクローニングのために、5’末端にSmaI、3’末端にHindIII制限酵素認識部位を付加した。正方向プライマー5’ccccggggcgatgacgatgacaaagatagcgtgtgcccg3’逆方向プライマー5’taagcttattacagggagcaattaaaacactgg3’PCRは、前記[製造例1]の2と同じ条件下で行った。増幅された遺伝子2μLを用いてメーカーで提示した方法によってpcDNA3.3TOPOTAベクターInvitrogen、Cat.No:K8300-01に挿入した。反応溶液2μLを取ってXL1-blueコンピテント細胞competentcellRBC、Cat.No:RH119-J80に入れ、42°Cで1分間熱衝撃heatshockを加えて形質転換し、アンピシリンの含まれているLB固体培地で静置培養してコロニーを得た。このコロニーをアンピシリンの含まれているLB液体培地で培養した後、プラスミドを分離し、ddNTPに蛍光物質を標識する方式で遺伝子配列を確認しソルジェント、韓国、pcDNA3.3-TNFRI108と命名した。上記作製されたpcDNA3.3-TNFRI108ベクターとpET44aベクターにそれぞれ制限酵素SmaI、HindIIIを添加し、37°Cで3時間反応させた。制限酵素処理後に1アガロースゲル電気泳動を行って該当の大きさのDNAバンドをかみそりで切り取り、DNA抽出キットGeneAll、Cat.No:102-102を用いて抽出した。抽出したpET44aベクターとTNFRI108遺伝子DNAは、リガーゼNEB、Cat.No:M2200Sを用いて連結反応をさせた。反応溶液2μLを取ってXL1-blueコンピテント細胞competentcellRBC、Cat.No:RH119-J80に入れて37°Cで2分間熱衝撃heatshockを加えて形質転換し、アンピシリンの含まれているLB固体培地で静置培養してコロニーを得た。このコロニーをアンピシリンの含まれているLB液体培地で培養した後プラスミドを分離して、TNFRI108大腸菌発現ベクターを作製した図5。作製されたTNFRI108大腸菌発現ベクターはpET44a-NusA-TNFRI108プラスミドと命名した。3TNFRI108単一変異体をコードするDNAの製造位置特異的TNFRI108単一変異体を作製するために位置指定突然変異体作製site-directedmutagenesis方法によりTNFRI108単一変異体を作製した。TNFRI108単一変異体の作製に用いたプライマーを、下記表7に示す。前記pET44a-NusA-TNFRI108プラスミドを鋳型に、下記表7のR1~R76番変異体に該当するプライマー各対を用いた以外は、前記[製造例2]の2に記載の方法と同様にしてTNFRI108単一変異体をコードするDNAを製作及び確認した。4TNFRI108及びTNFRI108変異体の発現上記作製したプラスミド溶液1μLを取ってBL21StarDE3Invitrogen、Cat.No:C6010-03コンピテント細胞に入れ、42°Cで1分間熱衝撃heatshockを加えて形質転換し、アンピシリンの含まれているLB固体培地で静置培養してコロニーを得た。pET44a-NusA-TNFRI108及びTNFRI108変異体ベクターを含んでいる大腸菌BL21StarDE3を、100μg/mL濃度のアンピシリンの入っている5mLLB液体培地BD、Cat.No:244620に接種して37°Cで16時間通気培養した。培養液を100μg/mLアンピシリンの入っている50mL培地に接種して600nmの吸光度が0.6~0.8になるまで培養し、最終濃度が1.0mM濃度になるようにIPTGSigma、Cat.No:I9003を添加して発現を誘導した。発現誘導後、37°Cで3時間通気培養を続けた。培養細胞を5,000rpmで20分間遠心分離して細胞を収集した。5TNFRI108及びTNFRI108変異体の精製上記収集した細胞を細胞破砕後に上層液を回収し、金属親和クロマトグラフィで1次精製後に疎水性クロマトグラフィで2次精製して、純度90以上の試料を得た。具体的に、上記収集した細胞を、600nm吸光度が10になるように再懸濁溶液25mMトリス溶液pH8.5で再懸濁した。再懸濁した試料をソニケーターSonicatorSonics、Cat.No:VCX750を用いて細胞破砕して、12,000rpmで20分間遠心分離して上層液を回収した。96ウェルフィルタプレートPall、CatNo:PN5065に300μLハイパーセルレジンPall、CatNo:20093-010をロードし、4カラム体積の蒸溜水洗浄後に、2カラム体積の0.1MNiCl2を付加してニッケルイオンをレジンに結合させた。2カラム体積の蒸溜水を流した後、平衡化溶液25mMトリス、0.1MNaClpH8.5で6カラム体積で洗浄した。2カラム体積の試料を付加した後、4カラム体積の平衡化溶液を用いて結合していない試料を除去した。10カラム体積の洗浄溶液25mMトリス、0.1MNaCl、50mMイミダゾールImidazolepH8.5で洗浄し、カラムに結合しているTNFRI108を回収するために、2カラム体積の溶出溶液25mMトリス、0.1MNaCl、250mMイミダゾールpH8.5で溶出した。金属親和クロマトグラフィで溶出されたタンパク質溶液に400mM濃度になるように1.0M硫酸アンモニウムNH42SO4溶液を添加した。96ウェルフィルタプレートに300μLのフェニルセファロースレジンGE、Cat.No:17-108201をロードし、6カラム体積の平衡化溶液20mMリン酸ナトリウムNa2PO4、400mM硫酸アンモニウムpH7.0を流した。金属親和クロマトグラフィ溶出液をカラムに付加し、2カラム体積の平衡化溶液を流して、結合していないタンパク質を除去した。10カラム体積の洗浄溶液20mMリン酸ナトリウムNa2PO4、160mM硫酸アンモニウムpH7.0で洗浄して、6カラム体積の溶出溶液20mMリン酸ナトリウムpH7.0で溶出した。溶出された試料を100μg/mL以上の濃度に濃縮した後、ブラッドフォード法を用いて定量した。精製した全ての試料は、SDS-PAGE分析を用いて純度を確認した図6。[実験例4]TNFRI108及びTNFRI108変異体のタンパク質分解酵素に対する抵抗性の確認前記製作されたTNFRI108及びTNFRI108変異体のタンパク質分解酵素に対する抵抗性は、純粋分離された精製液の全体タンパク質濃度を測定して、豚のパンクレアチンを総タンパク質純粋分離したTNFRI108精製液の総タンパク質をブラッドフォード法により定量した値量の24になるように処理し、TNFRI108断片及びTNFRI108断片変異体の半減期half-lifeを調べることで、TNFRI108ポリペプチド断片に比べてタンパク質分解酵素に抵抗性を有するTNFRI108断片変異体を確認することができた。タンパク質分解酵素に抵抗性を有する変異体TNFRI108を同定するために、パンクレアチンSigma、Cat.No:P7545処理による各変異体の半減期を決定した後、TNFRI108に比べて半減期の増加した変異体を選別する方法を用いた。代表的なTNFRI108-R14、TNFRI108-R64、TNFRI108-R68変異体のパンクレアチン処理に対する抵抗性増加結果は、図7に示す。250μLのタンパク質試料を用い、6μgのパンクレアチンを用いた以外は、前記[実験例3]に記載の方法と同様にして行い、その結果を表8に示す。6Met-TNFRI126及びMet-TNFRI126変異体を発現する発現ベクターの製造前記TNFRI108を用いて確認された単一変異体のタンパク質分解酵素に対する抵抗性をMet-TNFRI126及びMet-TNFRI126変異体で確認した。このために、TNFRI108-R7、TNFRI108-R8、TNFRI108-R9、TNFRI108-R10、TNFRI108-R14、TNFRI108-R64、TNFRI108-R65、TNFRI108-R68、TNFRI108-R73、TNFRI108-R74を選択してMet-TNFRI126の形態で産生してタンパク質分解酵素に対する抵抗性を確認した。前記[製造例1]で製作したpET44a-Met-TNFRI126プラスミドを鋳型に、上記表7のR7、R8、R9、R10、R14、R64、R65、R68、R73、R74番の変異体に該当するプライマー各対を用いた以外は、[製造例2]の2に記載の方法と同様にして、Met-TNFRI126及びMet-TNFRI126変異体プラスミドを製作し、位置特異的なTNFRI変異体の完成を確認した。7Met-TNFRI126及びMet-TNFRI126変異体の産生及び精製上記製作されたプラスミド溶液1μLを用いて、前記[製造例2]の3に記載の方法と同様にしてMet-TNFRI126とMet-TNFRI126変異体を産生及び精製した。[実験例5]Met-TNFRI126及びMet-TNFRI126変異体のタンパク質分解酵素に対する抵抗性の確認TNFRI108に代えてMet-TNFRI126及びMet-TNFRI126変異体を用いる以外は、上記の実験例4と同じ方法を用いてタンパク質分解酵素に対する抵抗性を評価した表9。TNFRI108においてタンパク質分解酵素に対する抵抗性の高い変異体R14、R64、R68、R73、R74は、依然として高いタンパク質分解酵素に対する抵抗性を示したし、TNFR108において低く測定された変異体R9、R10は、低いタンパク質分解酵素に対する抵抗性を示した。8Met-TNFRI171及びMet-TNFRI171変異体を発現する発現ベクターの製造[製造例3]の1表6に設計された単一変異体のうち、TNFRIの4番目のドメインに存在する単一変異体をMet-TNFRI171として産生し、評価を行った。そのために、大腸菌でMet-TNFRI171及びMet-TNFRI171変異体を発現する発現ベクターを作製した。Met-TNFRI171変異体は、前記[製造例1]で製作したpET44a-Met-TNFRI171プラスミドを鋳型に、下記表10の変異体に該当するプライマーを用いてPCR反応を行って作製した。前記[製造例1]で製作したpET44a-Met-TNFRI171プラスミドを鋳型に、下記表10のプライマー各対を用いた以外は、[製造例2]の2に記載の方法と同様にしてMet-TNFRI171及びMet-TNFRI171変異体プラスミドを製作し、位置特異的なTNFRI変異体の完成を確認した。9Met-TNFRI171及びMet-TNFRI171変異体の産生及び精製前記製作したプラスミド溶液1μLを用いて、前記[製造例2]の3に記載の方法と同様にしてMet-TNFRI171とMet-TNFRI171変異体を産生及び精製した。[実験例6]Met-TNFRI171及びMet-TNFRI171変異体のタンパク質分解酵素に対する抵抗性の確認TNFRI108に代えてMet-TNFRI171及びMet-TNFRI171変異体を用いる以外は上記の[実験例3]と同じ方法を用いてタンパク質分解酵素に対する抵抗性を評価した表11。代表として、Met-TNFRI171-R83、Met-TNFRI171-R84、Met-TNFRI171-R92変異体のパンクレアチン処理に対する抵抗性増加結果を、図8に示す。[実施例1]TNF-αに対する増加された結合力とタンパク質分解酵素に対する抵抗性を併せ持つ変異体Superleadの製作1Superlead変異体の設計前記[製造例2]でTNF-αに対する結合力が向上した変異体は、タンパク質分解酵素に容易に分解されることを確認した。これらのタンパク質分解酵素に対する抵抗性を向上させるために、前記[製造例3]で確認されたタンパク質分解酵素に対する抵抗性の向上のための修飾と、前記[製造例2]で確認された結合力の向上のための修飾とを組み合わせる方法により、下記表12~14に示すように、TNFRIの長さによるSuperlead変異体を製作した。前記修飾を適用したTNFRI171、TNFRI126、TNFRI105変異体ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号6~99に示す。2TNFRI変異体をコードするDNAの製造変異体を製作するために位置指定突然変異体の製作方法によってTNFRI変異体を製作した。表12~14に記載のアミノ酸修飾を含むTNFRI変異体の製作に用いたプライマーを下記表15に示す。表15に示すプライマーを用いた以外は、前記[製造例2]の2と同じ方法で行った。3大腸菌で生物学的活性を示すMet-TNFRI及びMet-TNFRI変異体の産生上記製作したMet-TNFRI及びMet-TNFRI変異体を前記[製造例2]の3の方法により産生及び精製した。[実験例7]リガンドTNF-αに対するMet-TNFRI変異体の結合力の確認実験例1]と同じ方法を用いて、TNF-αに対するMet-TNFRI変異体の結合力を評価した表16~表18。[実験例8]Met-TNFRI及びMet-TNFRI変異体のタンパク質分解酵素に対する抵抗性の確認前記[実験例3]と同じ方法を用いて、タンパク質分解酵素に対する抵抗性を評価した表16~表18。代表的に、TNFRI171-S31、TNFRI171-S47、TNFRI171-S53、TNFRI171-S63変異体のパンクレアチン処理に対する抵抗性の増加結果を図9に示す。対照群として、TNFRI171断片を用いた。[実験例9]カラギーナン誘導足浮腫を起こしたマウスにおけるTNFRI171変異体8種S54、S62、A2、A9、S36、S57、S58、S63の効力試験この実験は、変異体の効力を生体内で確認するために行った実験であり、変異体のうち抵抗性及び/または結合力に優れた8種に対してカラギーナン誘導足浮腫を起こしたマウスに皮下投与した後に、足浮腫の大きさ及び足のIL-6の量を測定して生体内効力を確認した。8種のTNFRI171変異体TNFRI171-S54、TNFRI171-S62、TNFRI171-A2、TNFRI171-A9、TNFRI171-S36、TNFRI171-S57、TNFRI171-S58、TNFRI171-S63、野生型WT、TNFRI171断片、ビヒクル50mMNaPO4、100mMNaCl、pH7.0及びエンブレルWyethを、エンブレルは0.5mg/mLの濃度に、WT及び各候補物質を0.25mg/mLの濃度で調製した。5週齢のICRマウス20~25gを株オリエントバイオCRJから供給されて京畿バイオセンター動物室で約7日間適応させて用いた。なお、水及び飼料は自由に摂取させ、温度23±2°C、湿度55±5及び明暗周期12時間は自動的に調節されるようにした。各群ごとに5匹で実験を行った。浮腫を起こすための起炎剤としてラムダ-カラギーナンSigmaを蒸留水に1の濃度で溶かして調製した。調製したカラギーナン溶液50μLを、微細注射器fine-needlesyringe;BDを用いて、右側足裏に投与した。薬物の投与は、各薬物のPK特性に合わせて行った。半減期が長いエンブレルの場合に、カラギーナン投与2時間前に投与したし、変異体8種、WT及びビヒクルの場合に、カラギーナン投与30分前に投与した。薬物の投与は、首部位への皮下投与Subcutaneousinjection,SCで行い、エンブレルは5mg/kg/10mL、WT及び候補物質は2.5mg/kg/10mLの容量で投与した。カラギーナンの投与前、カラギーナンの投与後の1時間、2時間、3時間、4時間後に、浮腫測定機UgoBasileを用いて、右足の体積を測定した。測定する前に、右足首側に油性ペンで印を付け、測定する度に相違が出ることを防いだ。4時間目に浮腫を測定し、全ての動物をCO2で安楽死させた後、浮腫を起こした右側足を採取して分析時まで超低温冷凍庫Deepfreezer,Thermoに-70°Cの状態で保管した。浮腫を起こした足組織のIL-6を測定するために組織を解凍して、手術用ハサミを用いて細かく切り、500μLのPBSを入れ、ホモジナイザーで粉砕した後、遠心分離機を用いて、10000rpmで5分間分離した後、上澄み液を取り、タンパク質定量用100μLとIL-6測定用200μLをそれぞれ分けて超低温冷凍庫に-70°Cの状態で保管した。タンパク質の定量は、ブラッドフォード法で行い、IL-6は、ELISAキットコマバイオテック社製のマニュアルに従い測定し、濃度は、タンパク質の量で補正した。IL-6のグラフは、ビヒクル群の濃度を100に換算して示す。その結果を図10に示す。図10Aの結果から明らかなように、カラギーナンを足裏に投与してから2時間後に、S63とエンブレル群を除く全ての群は、ビヒクル投与群に比べて有意に足裏の浮腫が減少していることを確認した。カラギーナンを足裏に投与してから4時間後に、全ての群は、ビヒクル投与群に比べて有意にP<0.01足裏の浮腫が減少していることを確認した。図10Bに示すように、カラギーナンを足裏に投与してから4時間後に足組織を採取して炎症媒サイトカインであるIL-6を測定したところ、全ての群は、ビヒクル投与群に比べて有意にP<0.01IL-6の増加が抑えられていることを確認した。なお、S54、S62、S36、S57、S58、S63群は、エンブレル群に比べて、有意にIL-6の増加が抑えられており、特に、S58は、IL-6の増加が強く抑えられていたP<0.01。[実験例10]カラギーナン誘導足浮腫を起こしたマウスにおけるTNFRI171変異体TNFRI171-S63と野生型TNFRI171断片との効力比較試験TNFRI171変異体のうち、物性及び生体内試験結果を見て1種TNFRI171-S63を選択して、ビヒクル50mMNaPO4,100mMNaCl,pH7.0及びエンブレルWyeth,WTTNFRI171断片とともに調製した。WT及び変異体TNFRI171-S63は、0.25mg/mL、0.5mg/mLの濃度で調製し、エンブレルは、0.5mg/mLの濃度で調製した。前記[実験例9]と同じ方法を用いて、足の浮腫の大きさとIL-6の量を測定して、生体内効力を評価した。その結果を図11に示す。図11Aの結果から明らかなように、カラギーナンを足裏に投与してから2時間後に、TNFRI171-S63の5mg/kg投与群は、ビヒクル投与群に比べて有意に足裏の浮腫が減少していることを確認した。カラギーナンを足裏に投与してから4時間後に、エンブレルと変異体TNFRI171-S63の5mg/kgを投与した群は、ビヒクルに比べて、有意に足の浮腫が抑えられていた。変異体TNFRI171-S63の5mg/kg投与群は、陽性対照群であるエンブレル5mg/kg投与群よりもさらに浮腫を抑えていた図11A。図11Bに示すように、カラギーナンを足裏に投与してから4時間後に足組織を採取して炎症媒介サイトカインであるIL-6を測定したところ、WT2.5mg/kg群を除く全ての群が、ビヒクル投与群に比べて有意にP<0.01IL-6の増加が抑えられていることを確認した図11B。特に、変異体TNFRI171-S63の2.5mg/kg投与群、5mg/kg投与群は、エンブレル5mg/kg投与群よりもIL-6の増加がさらに強く抑えられていた。なお、WTとエンブレルの場合に、同じ濃度でIL-6をほとんど同様に減少させた。結論的に、変異体TNFRI171-S63は、WTやエンブレルよりも浮腫の増加及びIL-6の増加を抑える能力に優れている。"