"明細書中に記載の発明。したがって、改善された分泌速度および/または改善された活性の発現VKDタンパク質を宿主生物で得ることにおいて、発現特に、VKDタンパク質の組換え発現を安定化させることへの強い需要が存在する。それゆえ、VKORC1の同時発現を介する特に、組換えVKDタンパク質発現の生産性を改善するために、新規の系および方法を提供することが本発明の目的である。発明の要旨本発明は、ビタミンKレダクターゼ複合体サブユニット1VKORC1またはその機能的に活性な誘導体をコードする組換え核酸およびビタミンK依存性VKDタンパク質またはその機能的に活性な誘導体をコードする組換え核酸を含む宿主生物に関し、この組換えVKORC1および組換えVKDタンパク質の両方は、この宿主生物内で発現される。さらに、本発明は、VKORC1またはその機能的に活性な誘導体をコードする組換え核酸、およびVKDタンパク質またはその機能的に活性な誘導体をコードする組換え核酸を含む細胞を含む細胞培養系ここで、この組換えVKORC1および組換えVKDタンパク質の両方は、この細胞内で発現される、組換え的にVKORC1を同時発現させることによる、宿主生物における組換えVKDタンパク質発現またはその機能的に活性な誘導体の生産性を改善するための方法、ならびに、組換えVKD発現の生産性を改善するための、宿主生物または細胞培養系におけるVKORC1の組換え発現の使用に関する。本発明は例えば、以下の項目を提供する:項目1ビタミンKレダクターゼ複合体サブユニット1VKORC1またはその機能的に活性な誘導体をコードする組換え核酸、およびビタミンK依存性VKDタンパク質またはその機能的に活性な誘導体をコードする組換え核酸を含む宿主生物であって、ここで、該組換えVKORC1および該組換えVKDタンパク質の両方は、該宿主生物内で発現される、宿主生物。項目2項目1に記載の宿主生物であって、前記組換えVKORC1をコードする核酸または前記組換えVKDタンパク質をコードする核酸のいずれか、あるいはそれらの両方が、誘導性発現、一過性発現および恒久性発現からなる群より選択される発現様式を介して発現される、宿主生物。項目3哺乳動物細胞である、項目1または2に記載の宿主生物。項目4前記哺乳動物細胞が、CHO細胞およびHEK293細胞からなる群より選択される哺乳動物細胞株に由来する細胞である、項目3に記載の宿主生物。項目5前記組換えVKDタンパク質が、凝血原血液因子またはその機能的に活性な誘導体である、項目1~4のいずれか一項に記載の宿主生物。項目6前記凝血原血液因子が、第II因子、第VII因子、第IX因子および第X因子からなる群より選択される、項目5に記載の宿主生物。項目7前記凝血原血液因子がヒト第IX因子である、項目6に記載の宿主生物。項目8ビタミンKレダクターゼ複合体サブユニット1VKORC1またはその機能的に活性な誘導体をコードする組換え核酸およびビタミンK依存性VKDタンパク質またはその機能的に活性な誘導体をコードする組換え核酸を含む細胞を含む細胞培養系であって、該組換えVKORC1および該VKDタンパク質の両方が該細胞内で発現される、細胞培養系。項目9前記培養された細胞が哺乳動物細胞である、項目8に記載の細胞培養系。項目10前記哺乳動物細胞が、CHO細胞およびHEK293細胞からなる群より選択される、項目9に記載の細胞培養系。項目11前記組換えVKDタンパク質が凝血原血液因子またはその機能的に活性な誘導体である、項目8~10に記載の細胞培養系。項目12前記凝血原血液因子が、第II因子、第VII因子、第IX因子および第X因子からなる群より選択される、項目11に記載の細胞培養系。項目13前記凝血原血液因子がヒト第IX因子である、項目12に記載の細胞培養系。項目14宿主生物における組換えビタミンK依存性VKDタンパク質発現またはその機能的に活性な誘導体の生産性を改善するための方法であって、a宿主生物を提供する工程;bVKDタンパク質またはその機能的に活性な誘導体をコードする組換え核酸を工程aの宿主生物へ挿入する工程;cビタミンKレダクターゼ複合体サブユニット1VKORC1またはその機能的に活性な誘導体をコードする組換え核酸を工程aの宿主生物へ挿入する工程;ならびにd工程bおよびcの組換え核酸を発現させる工程、を包含する、方法。項目15宿主生物における組換えビタミンK依存性VKDタンパク質発現またはその機能的に活性な誘導体の生産性を改善するための方法であって、aVKDタンパク質またはその機能的に活性な誘導体をコードする組換え核酸を有する宿主生物を提供する工程であって、該組換え核酸は、該宿主生物のゲノムに組み込まれている、工程;bビタミンKレダクターゼ複合体サブユニット1VKORC1またはその機能的に活性な誘導体をコードする組換え核酸を工程aの宿主生物に挿入する工程;ならびにc工程aおよびbの核酸を発現させる工程、を包含する、方法。項目16前記VKDタンパク質またはその機能的に活性な誘導体をコードする組換え核酸が安定に発現される、項目15に記載の方法。項目17宿主生物における組換えビタミンK依存性VKDタンパク質発現またはその機能的に活性な誘導体の生産性を改善するための方法であって、aビタミンKレダクターゼ複合体サブユニット1VKORC1またはその機能的に活性な誘導体をコードする組換え核酸を有する宿主生物を提供する工程であって、該組換え核酸は、該宿主生物のゲノムに組み込まれている、工程;bVKDタンパク質またはその機能的に活性な誘導体をコードする組換え核酸を工程aの宿主生物に挿入する工程;ならびにc工程aおよびbの核酸を発現させる工程、を包含する、方法。項目18前記VKORC1またはその機能的に活性な誘導体をコードする組換え核酸が安定に発現される、項目17に記載の方法。項目19組換えビタミンK依存性VKDタンパク質であって、ビタミンKレダクターゼ複合体サブユニット1VKORC1またはその機能的に活性な誘導体をコードする組換え核酸および該組換えVKDタンパク質またはその機能的に活性な誘導体をコードする組換え核酸を宿主生物に挿入する工程、該核酸を発現させる工程、ならびに該組換えVKDタンパク質を回収する工程によって取得可能である、組換えビタミンK依存性VKDタンパク質。発明の詳細な説明本発明の一局面は、ビタミンKレダクターゼ複合体サブユニット1VKORC1またはその機能的に活性な誘導体をコードする組換え核酸およびビタミンK依存性VKDタンパク質またはその機能的に活性な誘導体をコードする組換え核酸を含む宿主生物に関し、この組換えVKORC1タンパク質および組換えVKDタンパク質の両方は、上記宿主生物内で発現される。本明細書で使用される用語機能的に活性な誘導体とは、それぞれVKORC1タンパク質およびVKDタンパク質と実質的に同一な生物学的機能を有する、任意のポリペプチドを意味する。機能的に活性な誘導体のポリペプチド配列は、アミノ酸の欠失、付加および/または置換を含み得、このアミノ酸の不在、存在および/または置換は、それぞれ、このポリペプチドの活性にいかなる実質的な負の影響も有さない例えば、タンパク質の生物学的活性に寄与しない、ポリペプチド配列の部分に位置するアミノ酸。上記ポリペプチドの生物学的活性を変更しない、それぞれのポリペプチド配列の小規模なアミノ酸の欠失、付加および/または置換はまた、機能的に活性な誘導体として本発明の適用に包含される。以下で、表現組換えVKORC1またはその機能的に活性な誘導体および組換えVKDタンパク質またはその機能的に活性な誘導体はまた、それぞれrVKORC1およびrVKDタンパク質として示される。本発明の組換え核酸は、組換え核酸の産生に関して当該分野で公知の任意の方法例えば、組換えDNA技術、RNAの逆転写および/またはDNAの増幅を介してか、あるいは細菌の複製bacterialreproductionを介してによって取得され得る。本発明の宿主生物は、生物学的に活性なrVKORC1タンパク質および生物学的に活性なrVKDタンパク質を発現することができる、任意の宿主生物組換え宿主生物を含むから取得され得る。特に、本発明の宿主生物は、薬理学的に活性なrVKDタンパク質を産生することによって特徴付けられる、真核生物の宿主生物多細胞生物を含むであり得る。本発明の一実施形態において、上記宿主生物は、哺乳動物細胞例えば、CHO細胞、HEK293細胞、NSO細胞、Sp20細胞、Perc.6細胞、SkHep細胞、HepG2細胞、BHK細胞、HeLa細胞、Vero細胞およびCOS細胞からなる群より選択される哺乳動物細胞株に由来する細胞である。本発明の具体例において、この宿主生物は、CHO細胞またはHEK293細胞に由来する細胞である。本発明の一実施形態において、本発明の宿主生物に含まれるrVKORC-1をコードする核酸もしくはrVKDタンパク質をコードする核酸のいずれか、またはその両方は、誘導性発現、一過性発現および恒久性発現からなる群より選択される発現様式によって発現される。当該分野で公知であるか、または市販されている任意の発現系が、VKORC1および/またはVKDタンパク質をコードする組換え核酸の発現に使用され得る適切かつ好ましく制御可能なプロモーター、エンハンサーなどのような制御系の使用を含む。本発明の宿主生物の好ましい実施形態において、VKORC1をコードする組換え核酸もしくはVKDタンパク質をコードする組換え核酸のいずれか、またはその両方は、本発明の宿主生物の遺伝子材料に安定に組み込まれる。本発明の宿主生物は、rVKDタンパク質、例えば、血液因子bloodfactorまたはその機能的に活性な誘導体、好ましくは、ヒト凝血原血液因子procoagulantbloodfactorまたは抗凝固血液因子anticoagulantbloodfactorあるいはそれらの機能的に活性な誘導体の改善された発現のために使用され得る。本発明の好ましい実施形態において、このrVKDタンパク質は、出血障害の処置に使用され得る、薬理学的に受容可能なヒト凝血原血液因子procoagulantbloodfactorである。本発明の一実施例として、rVKDタンパク質は、凝血原血液因子第II因子、第VII因子、第IX因子好ましくは、ヒト第IX因子および第X因子を含むまたは抗凝固血液因子プロテインC、プロテインSおよびプロテインZを含むである。本発明にしたがって、宿主生物は、VKORC1をコードする組換え核酸およびVKDタンパク質をコードする組換え核酸を含み、rVKORC1およびrVKDタンパク質の両方は、上記宿主生物内で発現され、そして組換えVKDタンパク質発現の生産性が実質的に改善される。本明細書で使用される用語組換えVKDタンパク質発現の生産性が実質的に改善されるとは、rVKORC1を同時に発現しない宿主生物内でのrVKDタンパク質の発現と比較した場合、組換え発現されたVKDタンパク質またはその機能的に活性な誘導体の量、分泌速度、活性および/または安定性が実施的に増大されることを意味する。組換えVKDタンパク質発現の生産性の改善は、当該分野で公知の任意の方法例えば、培養培地からの単離、もしくは宿主生物を回収することによる単離、および、例えば、発現されたタンパク質の電気泳動、クロマトグラフィもしくは免疫吸着による分析が挙げられるによって決定され得る。本発明の好ましい実施形態において、rVKDタンパク質の発現は、任意の公知の酵素イムノアッセイ例えば、酵素結合免疫吸着測定法ELISAによって検出される。あるいは、rVKDタンパク質の完全性および活性は、活性化部分トロンボプラスチン時間activatedpartialthromboplastintimeAPTTを測定することにより、評価され得る。本発明の別の局面は、VKORC1をコードする組換え核酸およびVKDタンパク質をコードする組換え核酸を含む細胞培養系に関し、rVKORC1およびrVKDタンパク質の両方が、上記細胞内で発現される。本発明の細胞培養系は、生物学的に活性なrVKORC1タンパク質および生物学的に活性なrVKDタンパク質を発現することができる細胞を含む、任意の細胞培養系を含み得る。適切な細胞の例は、上記に列挙されている。好ましい実施形態において、本発明の細胞培養系は、1つ以上の薬理学的に活性なrVKDタンパク質を産生することにより特徴付けられる真核細胞系である。本発明の一実施形態において、本発明の細胞培養系は、上記で定義される宿主生物を含む。本発明の細胞培養系内の細胞を培養する連続様式またはバッチ様式で細胞を培養することを含むための、培地、試薬および条件に対する具体的な限定は存在しない。本発明の一実施形態において、細胞は、血清を含まない条件または血清およびタンパク質を含まない条件下で培養される。本発明のさらなる実施形態において、VKORC1またはVKDタンパク質をコードする組換え核酸を含む細胞が、例えば、選択培地を使用することによって選択的に増殖される条件が使用される。所望のrVKDタンパク質このタンパク質は、選択された宿主生物の細胞により発現され、そして使用されるトランスフェクション/ベクター系に依存して、細胞内に含まれるか、細胞を培養するための培地に分泌されるは、当該分野で公知の方法を使用して、細胞培養系から単離/回収され得る。本発明のさらなる局面は、宿主生物内で発現される組換えVKDタンパク質の比活性を改善するための方法を提供し、この方法は、a宿主生物を提供する工程;bVKDタンパク質またはその機能的に活性な誘導体をコードする組換え核酸を工程aの宿主生物に挿入する工程;cVKORC1をコードする組換え核酸を工程aの宿主生物に挿入する工程;ならびにd工程bおよび工程cの組換え核酸を発現させる工程、を包含する。本発明の一実施形態において、VKORC1またはVKDタンパク質をコードする組換え核酸は、同時トランスフェクションによって宿主生物に同時に挿入される。あるいは、この組換え核酸は、続くトランスフェクションによって宿主生物に続いて挿入される。本発明にしたがって使用される組換え核酸は、宿主生物へのトランスフェクションに適する任意の形態および系プラスミドベクターおよびウイルスベクターを含むに含まれ得る。それぞれVKORC1およびVKDタンパク質をコードする組換え核酸は、一つのベクター分子内に両方とも存在しても、それぞれ一つのベクター分子に存在してもよく、この2つの異なるベクター分子は、同一でも異なっていてもよい。組換え核酸のトランスフェクションは、使用されるトランスフェクション系に依存し、宿主生物例えば、真核細胞などをトランスフェクトするための、当該分野で公知の任意の方法または市販されている方法エレクトロポレーション、沈殿またはマイクロインジェクションが挙げられるによって実行され得る。本発明の別の局面は、宿主生物における組換えVKDタンパク質発現の生産性を改善するための方法を提供し、この方法は、aVKDタンパク質をコードする組換え核酸を有する宿主生物を提供する工程であって、この組換え核酸は、その遺伝子材料好ましくは、そのゲノムに組み込まれている、工程;bVKORC1をコードする組換え核酸を工程aの宿主生物に挿入する工程;ならびに、c工程aおよびbの核酸を発現させる工程、を包含する。本発明の好ましい実施形態において、VKDタンパク質をコードする組換え核酸は、安定に発現される。本発明のさらなる局面は、宿主生物における組換えVKDタンパク質発現の生産性を改善するための方法を提供し、この方法は、aVKORC1をコードする組換え核酸を有する宿主生物を提供する工程であって、この組換え核酸は、その宿主生物のゲノムに組み込まれている、工程;bVKDタンパク質をコードする組換え核酸を工程aの宿主生物に挿入する工程;ならびにc工程aおよびbの核酸を発現させる工程、を包含する。本発明の好ましい実施形態において、VKORC1をコードする組換え核酸が安定に発現される。本発明にしたがって、上記で定義した宿主生物または上記で定義した細胞培養系は、rVKORC-1の同時発現によって、組換えVKDタンパク質発現の生産性を驚異的に改善するために使用され得る。本発明のさらなる目的は、rVKDタンパク質を提供し、このタンパク質は、VKORC1をコードする組換え核酸およびこのrVKDタンパク質をコードする組換え核酸を挿入する工程、この核酸を発現させる工程、そしてこのrVKDタンパク質を回収する工程によって取得可能である。本発明を、以下の実施例においてさらに説明するが、それに対しいかなる限定もしない。実施例1:rFIX産生HEK293由来細胞株およびCHO由来細胞株におけるrVKORC1の一過性トランスフェクションおよび同時発現強力なウイルスプロモーターの制御下にあるヒト第IX因子FIXをコードするDNA配列を含む発現プラスミドを、適切なトランスフェクション法により哺乳動物宿主細胞株へ導入し、それらのゲノムへ安定に組み込まれたこの導入された配列を有する細胞を得ることによって、組換え第IX因子rFIXの発現を達成する。このプラスミドはまた、適切な耐性遺伝子を送達することによって選択可能なマーカー薬物に対する耐性を付与する。ヌクレオチド新規合成経路の酵素の欠陥のために、培地中のヌクレオチド前駆体の存在下でのみ増殖することができるCHO細胞の場合、この酵素ジヒドロ葉酸レダクターゼDHFRの発現が必要とされる。このことは、メトトレキサートMTXの濃度を徐々に増大させることによって、FIX遺伝子の同時増幅を可能し、細胞のゲノム内でのDHFRをコードする遺伝子およびrFIXをコードする遺伝子の両方のコピー数の増大をもたらす。この目的のために、CHO由来細胞クローンをまた、ヌクレオチドおよびヌクレオチド前駆体を欠く選択培地により増殖させる必要がある。ヒトrFIX産生細胞を同定するために、トランスフェクションおよび培地への選択薬物の添加の後、単一細胞由来のクローンを単離することを可能にするために、細胞懸濁物を希釈する。単離後、これらの細胞クローンを、酵素結合免疫吸着測定法ELISA技術により細胞培養上清のrFIX含量を測定することを可能にする集密度まで培養する。この目的のために、これらの細胞を、rFIXを分泌する細胞の同定を確実にするために、いかなる増殖を促進するウシ胎仔血清もその成分も存在しない条件下で増殖させる必要がある。完全に機能的なrFIXタンパク質を確実にするために、ビタミンKを添加する。上清を、24時間後に回収し、rFIX特異的ELISA技術により分析する。さらに、タンパク質の完全性および活性を、活性化部分トロンボプラスチン時間APTTを測定することにより評価する。rVKORC1の同時発現は、rFIX発現のために予め選択されている細胞株を使用して、一過性発現技術によって達成される。rVKORC-1cDNAを含む発現プラスミドを、さらなるクローン選択を行わずに、これらの細胞にトランスフェクトする。上清を、トランスフェクトされた細胞のプール全体から収集し、そしてrFIX含量および活性を、ネガティブコントロールと比較し、rVKORC-1活性の効果を評価するために、特異的なrFIX分泌速度について正規化する。材料および方法発現ベクター発現ベクターを、標準的なクローニング技術にしたがってクローニングする。簡潔に述べると、マウスDHFRを含むベクターpAdD26SVA-3Scahill,S.J.,Devos,R.,Vander,H.J.およびFiers,W.1983ExpressionandcharacterizationoftheproductofahumanimmuneinterferoncDNAgeneinChinesehamsterovarycells.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A,80,4654-4658;ベクターは、Dr.Hauser,GBFGermanyにより供与されたのPstl1.5kbpフラグメントを、pSVβベクターClontech,PaloAlto,CASV40エンハンサー、初期プロモーターおよびイントロンを提供する、NotI消化によりβ-ガラクトシダーゼ遺伝子を除去し、ポリリンカーを挿入したに挿入することにより、pSV-DHFRを作製する。このベクターをまた、EcoRI/HindIIIフラグメントをphβAPr-1-βgalこれもまた、Dr.Hauserにより供与されたのEcoRI/Hindlllフラグメントと交換することによりヒトアクチンプロモーターおよびイントロンを含むphactを作製するために使用している。ala148多型McGraw,R.A.,Davis,L.M.,Noyes,CM.,Lundblad,R.L.,Roberts,H.R.,Graham,J.B.およびStafford,D.W.1985EvidenceforaprevalentdimorphismintheactivationpeptideofhumancoagulationfactorIX.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A,82,2847-2851を有する野生型ヒトFIXcDNAを含むphact-FIXを、pFIX-bluescriptこれは、無作為に選択されたrandomlyprimedヒト肝臓cDNAライブラリ由来のヒトFIXをpBluescriptStratagene,LaJoIIa,CAに挿入することによって作製したをEcoRI消化し、生じたフラグメントをEcoRIで部分的に消化したphactに挿入することにより作製する。ベクターpCMV-FIX-neoを、ベクターpFIX-bluescriptのEcoRIフラグメントをpCMVβClontechβ-galcDNAを除去しておくに挿入することにより作製する。このベクター内で、alaに対するコドンを、天然に存在する多型ala148をthr148に変更するPCRを介する部位特異的変異誘発によってthrに交換する。PCR産物を、再度、同一のベクターに再挿入する。このベクターのEcoRIフラグメントを、pcDNA3.1Invitrogen,Carlsbad,CAにクローニングし、pCMV-FIX-neoを得る。ベクターpCMV-VKORC1-EDHproを、PCRのための鋳型としてベクターpCEP4-VKORC1Prof.Oldenburgにより供与された、説明については、Rostら、2004を参照のことを使用することによって作製する。rVKORC1cDNAを含むPCR産物を、pCMV-EDHproベクターHerlitschka,S.E.,Falkner,F.G.,Schlokat,U.およびDorner,F.1996Overexpressionofhumanprothrombininpermanentcelllinesusingadominantselection/amplificationfusionmarker.ProteinExpr.Purif.,8,358-364にクローニングする。細胞培養およびトランスフェクションCHODUKX/DXB11細胞を、ColumbiaUniversityNewYork,NYから取得し、5ウシ胎仔血清PAA,Linz,Austria、デオキシアデノシンdesoxy-adenosine、アデノシンおよびチミジン全てSigma,St.Louis,MO製およびL-グルタミンInvitrogenおよびペニシリン/ストレプトマイシンInvitrogenを補充したDMEM/Ham’sF121:1混合物Invitrogen中で増殖させる。HEK293細胞ATCCNo.CRL-1573を、5ウシ胎仔血清およびL-グルタミンおよびペニシリン/ストレプトマイシンを補充したDMEM/Ham’sF121:1混合物中で増殖させる。安定なトランスフェクションのために、リン酸カルシウム共沈殿co-precipitation法を使用する。CHOrFIX細胞を、線状化したlinearizedプラスミドphact-FIXおよびpSV-DHFRでの同時トランスフェクションならびにヒポキサンチン、グリシンおよびチミジンInvitrogenを含まない、5透析済みFBSPAAを補充したDMEM/Ham’sF121:1混合物での選択によって作製する。遺伝子増幅のために、MTXEbewe,Unterach,Austriaを、10nMから始めて200nMまでの段階的に増やした濃度で加える。HEK293細胞を、線状化したプラスミドpCMV-FIX-neoでトランスフェクトし、500μg/mlG418Invitrogenを含む培地で選択する。細胞クローンを、手動で、またはフローサイトメトリー細胞選別技術を使用してのいずれかで限界希釈クローニング技術により単離する。細胞培養上清へのFIX分泌を、増殖培地を、10μg/mlビタミンK1Sigmaを補充した血清非含有培地に交換することにより検出する。上清を収集し、FIX濃度を、ELISAおよび凝固アッセイ活性化部分トロンボプラスチン時間、APTTによって決定する。特異的な分泌速度の算出のために、細胞数を、CASYcellcounterScharfeSystems,Reutlingen,Germanyを使用して計数する。一過性の同時発現実験のために、線状化していないプラスミドpCMV-VKORC1-EDHProを、Lipofectamine2000試薬Invitrogenを使用して処理する。rVKORC-1cDNAを含まない同一のベクターをネガティブコントロールとして使用する。分析法ELISAを、一次抗体として1:40000希釈のポリクローナルウサギ抗ヒトFIXAccurateChemical,Westbury,NYおよび検出抗体としてポリクローナルヤギ抗ヒトFIX西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体を使用して実行する。標準として、ヒト血漿由来FIXEnzymeResearchLaboratories,S.Lafayette,INを使用する。APTTを、FIXサンプルをFIX欠乏血漿plamaに希釈することにより、STACompactautomatedcoagulometerDiagnosticaStago,Asnieres,Franceを使用して決定する。凝固に関する全ての試薬を、Baxter,Vienna,Austriaから購入する。結果2つの安定なrFIX産生細胞株1つはCHO由来および1つはHEK293由来を、ヒトVKORC1をコードするcDNAを保持する発現ベクターpCMV-VKORC1-EDHproでの一過性トランスフェクションに供する。コントロールとして、空ベクターpCMV-EDHproおよび安定なrFIX発現細胞株を使用する。一過性トランスフェクションの後、細胞を血清含有培地中で一晩置く。細胞をPBSで洗浄し、血清非含有培地中で24時間培養し、その後、上清を回収する。rFIX発現および培地へのrFIXの分泌を、抗原レベルまたは凝固活性を測定する免疫化学診断法および凝固診断法によってモニタリングする。細胞の生産性への効果を推定するために、分泌速度を、細胞数および24時間あたりの産物濃度に基づいて算出する図1~図4。rVKORC-1トランスフェクション後に、rFIXを発現するHEK293細胞は、空ベクターコントロールと比較して、特異的な分泌速度に平均2.7倍の増大、そしてrFIX濃度に2.9倍の増大を示す。これらの値は、APTT測定に基づく。ELISA値は、濃度に2.0倍の増大、そして特異的な生産性に1.8倍の増大を示す。CHO由来rFIX産生細胞株に関して、ELISA力価に1.5倍の増大、そしてELISAに基づく特異的な分泌速度に1.2倍の増大が観察される。APTTから算出した分泌速度は1.4倍高く、APTTから測定したFIX濃度は1.7倍高い。これらの値から、異なる細胞型の両方に関し、主に、より高い細胞の特異的なrFIX分泌速度に起因して、rVKORC1の存在下で、より高いrFIX産物濃度を達成することができると結論付けることができる。完全にγ-カルボキシル化されたrFIX分子のより高い分泌速度についての理由は、この翻訳後修飾に対する細胞の品質制御機構であり得るLin,PJ.,Straight,D.L.およびStafford,D.W.2004BindingofthefactorIXgamma-carboxyglutamicaciddomaintothevitaminK-dependentgamma-glutamylcarboxylaseactivesiteinducesanallostericeffectthatmayensureprocessivecarboxylationandregulatethereleaseofcarboxylatedproduct.J.Biol.Chem.,279,6560-6566。両方の細胞株の場合において、ELISA値よりも、APTT値のより大きな増大は、より良好なFIX凝固活性を示す。CHO細胞よりも、HEK293由来細胞における、rFIX同時発現に対するrVKORC-1のより強力な効果は、より高い細胞のrFIX生産性によって説明され得る。一過性VKORC1トランスフェクションの前に、APTT値に関する生産性において、293由来クローンは、CHOクローンよりも3.5倍高いが、ELISA値に関する生産性については5倍高い。このことは、より高い生産性に起因して、293由来細胞における、より低い程度の翻訳後プロセシングを示す。したがって、rVKORC-1同時発現によってγ-カルボキシル化能力を修復した場合に、活性なrFIXアイソフォームのより高い収量が、この細胞株で見出される。実施例2:組換えヒト凝固因子VIIrFVIIを安定に発現するCHO由来哺乳動物細胞株およびHEK293由来哺乳動物細胞株における、組換えヒトVKORC1の一過性の同時発現rFVIIの活性および/または分泌速度に対するrVKORC-1のあらゆる影響を、ヒト組換え凝固因子VIIrFVII産生細胞における一過性の同時発現によって研究することができる。したがって、rFVIIを産生する細胞集団の大部分はまた、短期間、VKORC1を同時発現する。この期間の間、分泌されたrFVIIをサンプリングし、特徴付け、空ベクターコントロールで並行してトランスフェクトした同一の細胞株により分泌されたrFVIIと比較することができる。哺乳動物細胞におけるrFVIIの安定な発現を、ヒトrFVIIcDNAおよび選択耐性遺伝子を含むプラスミドベクターをトランスフェクトし、続いて産生クローンを選択することにより、達成することができる。実施例1に列挙された同一の宿主細胞株を、rFVIIの安定な発現に使用することができる。遺伝子選択および遺伝子増幅手順、ならびに産生クローンのスクリーニングは、同様に実施すべきである。その後、ヒトVKORC1cDNAを保持する発現ベクターを、実施例1に記載されるものと同様な方法で、一過的にトランスフェクトし、組換えVKORC1rVKORC1の同時発現を達成することができる。材料および方法発現ベクターヒトrFVII遺伝子情報を含む発現ベクターを、鋳型としてのワクシニア発現ベクターpselp/huFVIIHimlyら、1998のような適切な供給源からPCRによりヒトFVIIcDNAを単離することによって、構築することができる。このPCR産物を、制限部位を介して、サイトメガロウイルスCMVに由来するような強力なウイルスプロモーターおよびネオマイシン耐性遺伝子またはハイグロマイシン耐性遺伝子のようなさらなる抗生物質選択マーカーを提供する哺乳動物発現ベクター例えば、pcDNA3.1/hygまたはpcDNA3.1/neoInvitrogen,Carlsbad,CAに挿入することができる。CHO-DHFR-発現系での安定な遺伝子発現のために、実施例1に記載されるpSV-DHFRのようなさらなるプラスミドを使用して、DHFR含有細胞クローンの選択およびMTX遺伝子増幅を可能にする。実施例1に記載されるベクターpCMV-VKORC1-EDHproを、rVKORC1の一過性発現に使用することができる。細胞培養およびトランスフェクション実施例1に記載されるものと同一の、細胞株および培養プロトコールを使用することができる。安定なトランスフェクト体transfectantを作製するために、リン酸カルシウム共沈殿法を使用することができる。トランスフェクション前に、プラスミドを、制限酵素消化によって線状化しなければならない。FVIIcDNAを含む哺乳動物発現ベクターを、CHO宿主細胞株またはHEK293宿主細胞株の安定なトランスフェクションに使用することができる。CHODUKXDXB11細胞は、pSV-DHFRで同時トランスフェクトしなければならない。ハイグロマイシンBを、選択薬剤として使用する場合、HEK293由来トランスフェクト体を選択するためにその濃度は、培地中100μg/mLでなければならず、CHOトランスフェクト体の場合には、250μg/mLでなければならない。ネオマイシン耐性を選択マーカーとして使用する場合、G418の濃度は、各々の細胞型に対して実施例1に記載されるように調整しなければならない。一過性トランスフェクションのプロトコールは、実施例1に記載されるように、LipofectamineTM2000試薬の使用を包含する。適切なネガティブコントロールとrVKORC-1を一過的に発現する細胞との比較を可能にするために、ベクターpCMV-VKORC1-EDHproおよびVKORC1cDNA配列を含まない同一のベクターを、数回の重複試験好ましくは、6ウェルプレートにおいて、並行してトランスフェクトしなければならない。同一の集団から取得された細胞を、1ウェルあたり等量の細胞密度で分配する。集密になったら、全てのトランスフェクションを同時に行う。細胞培養上清へのrFVIIの分泌は、増殖培地を、0.1~10μg/mLに及ぶ種々のビタミンK1濃度で補充した血清非含有培地に交換することにより検出することができる。上清を24時間後に収集することができ、rFVII濃度を、以下に記載される適切な方法によって決定することができる。特異的なrFVII分泌速度の算出のために、例えば、CASYcellcounterScharfeSystems,Reutlingen,Germanyまたはトリパンブルー排除法を使用することによって、細胞を計数しなければならない。分析アッセイrFVII産生クローンをスクリーニングするために、そしてFVII活性と抗原レベルとを関連付けるために、以下のアッセイが適切である。FVII活性を、プロトロンビン凝固時間prothrombinclottingtimePTとして凝固アッセイによってか。または色素形成性FXa基質の変換によって定量される凝固因子XaFXaの生成量として色素形成アッセイ欧州薬局方EuropeanPharmacopeia5,2005に従うによって測定することができる。FVII抗原レベルは、適切な抗体の対例えば、捕捉のための、1:3000希釈したアフィニティ精製ポリクローナルヒツジ抗ヒトFVII抗血清AffinityBiologicals,Ancaster,Canada、および検出のための、ポリクローナルヒツジ抗ヒトFVII西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体Cedarlane,Ontario,Canada;1:2000希釈を使用し、続いて、光度測定photometric検出のための適切な色素形成試薬を添加する、ELISAを使用して決定することができる。全てのアッセイに対して、血漿由来のFVII調製物国際FVII標準97/592と比較してアッセイするを、標準物質として使用しなければならない。相対的な比凝固活性specificclottingactivityを、活性値に対して測定した抗原の比を算出し、これらを内部でか、または血漿由来のFVII調製物の値と比較することによって推定することができる。分泌された総rFVIIの一部としてFVIIaレベルを推定するために、以下のアッセイを使用することができる:Staclot登録商標アッセイDiagnosticaStago,Asnieres,Franceは、選択的にFVIIaのプロトロンビン凝固時間を測定するのに適しているMorrisseyら、1993。FVIIaレベルは、国際FVIIa標準89/688と比較してアッセイしなければならない。結果安定なrFVII産生CHO由来細胞株を、VKORC1をコードする発現ベクターpCMV-VKORC1-EDHproでの一過性トランスフェクションに供する。コントロールとして、VKORC1をコードするcDNAを含まない空ベクターpCMV-EDHproを使用することができる。1ウェルあたり1×106細胞の細胞濃度で、細胞を6ウェルプレートに播種する。集密になったら、一過性トランスフェクション手順を二連で実行する。一晩のインキュベーション後、細胞を、いかなるビタミンK1も含まない血清非含有培地でインキュベートし、FBS供給由来の細胞内部のビタミンK1レザバを枯渇させる。24時間後、培地を、0μg/mL~5μg/mLの範囲に及ぶ種々の濃度のビタミンK1を含む血清非含有培地に交換する。さらなる分析のために、上清を収集する。24時間あたりの生産性を、ELISAおよび一段階の凝固アッセイによって測定されるrFVII抗原および活性の濃度値から決定する。FVII比凝固活性を、1μg抗原あたりのFVII凝固単位clotting-unitとして算出する。rFVIIa~rFVIIaの自己賦活の程度を推定するために、Staclot登録商標アッセイを使用することができる。図6A、6Bおよび6Cに、これらの実験の結果を示す。両方のベクター構築物での一過性トランスフェクションの後、rFVII発現レベルを、ELISA図6AおよびFVII凝固図6Bによって決定する。この細胞株によって産生されるrFVIIaは、著しい量ではないので、rFVII活性は、rFVII生産性と相関し得る。培地中にビタミンK1が存在しない場合、細胞の生産性および産生されたrFVIIの比活性は、rVKORC1を同時発現させてもさせなくても著しく低い。rVKORC1の同時発現の場合、rFVIIの生産性は、凝固およびELISAの両方で測定される場合、0.1μg/mL~空ベクターでのコントロールトランスフェクションの4倍の値で回復する。rVKORC1同時発現は、ビタミンK1濃度に拘らず、細胞培養培地に添加されるビタミンK1の使用法を改善する。概して、rFVII-生産性2つの異なる方法によって決定されるは、rVKORC1同時発現を伴う全てのビタミンK1濃度において、コントロールの最大4倍である。産生された1μgrFVIIあたりの凝固単位として表現される比活性は、0μg/mLのビタミンK1において、著しくより低い値を示し、rVKORC1の有無で有意な違いを示さない。同様な実験において、一過性のrVKORC-1同時発現後にrFVIIを安定に発現するCHO由来細胞株とHEK293由来細胞株とを比較した場合、両方の場合におけるコントロールトランスフェクションのように、有意により高い生産性が見出され得る図7。この実験において、0.5μg/mLのビタミンK1を使用する。凝固およびELISAの両方で測定されるように、CHO-rFVII細胞に関して、rVKORC-1を同時発現させたrFVII発現レベルは、コントロールよりも2.5倍高いことが見出され得る。γ-カルボキシル化は、この反応に必要とされる還元型ビタミンK形態が十分な量で利用可能ではない場合、rFVIIの生産性に対する律速工程ratelimitingstepであることが結論付けられ得る。推定上の細胞制御機構は、細胞内の不完全なγ-カルボキシル化を伴うrFVII分子を保持するLinら、2004。一過性のrVKORC-1同時発現は、完全なγ-カルボキシル化を確実にする還元型ビタミンK形態のより良好な供給を提供することにより、広範囲のビタミンK1濃度でrFVII生産性を改善する。これらの知見は、また、哺乳動物細胞において、γ-カルボキシラーゼの同時発現が組み替えヒト第IX因子の生産性の低下をもたらすという以前の研究Hallgrenら、2002に従う。細胞代謝内での、VKORC1について現在までに既知の唯一の機能は、ビタミンK-2,3エポキシドの、γ-カルボキシル化反応に必要とされるそのヒドロキノン形態への還元である。たとえ哺乳動物細胞株それ自体が良好に機能するγ-カルボキシル化機構を保持しているとしても、rVKORC1同時発現が完全なγ-カルボキシル化された品質の所望のrFVIIタンパク質を保証することが結論付けられ得る。実施例3:非ウイルス性遺伝子トランスフェクション後の、CHO由来細胞株内でのrVKORC1およびrFVIIの安定なバイシストロン性同時発現rFVII産生のための安定な哺乳動物細胞株を作製することの範囲内の、γ-カルボキシル化に対するrVKORC1同時発現のあらゆる効果を利用するために、バイシストロン性発現系を使用することができる。このような系を使用して、単一の発現ベクターの送達後に、真核細胞における2つのタンパク質の同時発現を達成することができる。さらに、2つのタンパク質を、同時に同一のmRNA分子から翻訳させる。このことは、発現ベクター構築物の、2つの導入遺伝子をコードするcDNAの間にウイルス性遺伝子エレメントこれは、内部リボソームエントリー配列internalribosomeentrysequenceIRESと呼ばれるを導入することによって可能になるMountfordおよびSmith、1995。このDNAベクター構築物これは、宿主細胞の染色体に安定に組み込まれているからのmRNAの転写後、2つのリボソームが、プロセシングされたmRNAに結合することができ、両方のポリペプチド鎖を同時に伸長させることができる。哺乳動物発現のためのエレメント例えば、強力なウイルスプロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびクローン選択を可能にする耐性遺伝子を提供するように、ベクターを構築しなければならない。所望のタンパク質をコードする両方のcDNAを、それらの間にIRES配列を有するように、ベクターにクローニングする。rFVII発現とバイシストロン性のrFVIIおよびrVKORC1の同時発現とを比較するために、rFVIIcDNAのみを保持する同一の宿主ベクターに厳密に由来するコントロール発現ベクターを構築することができる。これらの2つのベクターを、同一の宿主細胞株例えば、CHO-DHFR-細胞株であるCHODUXKDXB11に並行してトランスフェクトすることができる。この細胞株は、遺伝子増幅によりタンパク質発現レベルを増大させる機会を提供する。このことは、DHFR遺伝子を保持するプラスミドの同時トランスフェクションおよび実施例1に記載される継代培養sub-cultivationの間に薬物MTXのレベルを増大させることによって達成することができる。この発現および同時増幅co-amplification系において、同時発現ベクターとモノシストロン性monocistronicrFVIIベクターとを比較することにより、ヘルパータンパク質helperproteinとしてのrVKORC-1の存在の有無で、rFVII発現レベルおよび活性に対する遺伝子増幅の効果を観察することができる。rFVII産生クローンの選択および産生されたrFVIIの特徴付けは、実施例2で説明したように達成することができる。2つの発現系を比較する場合にクローン特異的な偏りを回避するために、同一の方法論でスクリーニングした多数のクローンを特徴付けなければならない。材料および方法発現ベクタープラスミドベクター構築物これらは、実施例2で説明される同一の宿主ベクターに由来するを標準的なクローニング技術によって構築することができる。ベクターpCMV-rFVIIの構築を実施例2に記載されるようにして達成することができ、類似のベクターpCMV-rFVII-lRES-VKORC1を、以下のようにして構築することができる:ヒトFVIIcDNAを、実施例2で使用したものと同一の供給源からPCRによって増幅することができる。IRESエレメントを、供給源ベクターplRES2-EGFPClontech,PaloAlto,CAから単離することができ、そしてVKORC1cDNAを、実施例1に記載されるものと同一の供給源ベクターpCEP4-VKORC1からクローニングすることができる。これら3つのエレメント全てを、pCMV-rFVIIの構築実施例2を参照のことに使用したものと同一の宿主ベクターにクローニングすることができる。詳細には、付加されたKozak配列およびEcoRI制限部位を有するFVIIcDNAのPCR産物を、適切な制限部位を介した切断を可能にするために中間体ベクター例えば、pBluescript;Stratagene,LaJoIIa,CAにクローニングすることができる。FVIIcDNAを含むこの中間体のHindlll/BamHIフラグメントを、pcDNA3.1/HygInvitrogenにクローニングすることができる。この中間体構築物は、BamHIおよびXholで消化することができ、一回のライゲーション反応で、VKORC1cDNA鋳型pCEP4-VKORC1から得るならびに5’端および3’端にBstXIとXhoI部位とを有するPCR産物とともに、pIRES2-EGFP由来のBamHI/BstXIフラグメントIRESを含むを同時に挿入することを可能にし、pCMV-rFVII-IRES-VKORC1を取得することができる。CHO-DHFR-発現系での遺伝子発現および増幅を可能にするために、実施例1に記載される第二の選択プラスミドpSV-DHFRを使用することができる。細胞培養およびトランスフェクションCHO-DHFR-宿主細胞株、ならびに、実施例1に記載されるものと同一の材料およびトランスフェクションプロトコールおよび培養プロトコールを、所望のrFVII産生クローンを作製および選択するために使用することができる。MTXによる遺伝子増幅を同様に達成することができる。分析アッセイrFVIIまたは活性および濃度についてクローンおよび上清を特徴付け、細胞特異的な生産性を決定するために、実施例2に記載されるものと同一のアッセイを使用することができる。FVIIa活性を同様にモニタリングする必要がある。ノーザンブロットこの技術を使用して、導入した遺伝子の転写をmRNAレベルで特異的に検出し、正確なmRNAサイズを確認することができる。細胞集団から単離および調製された細胞の総RNAを、アガロースゲル上で分離し、ナイロンメンブレンにブロットすることができる。DIG標識プローブのハイブリダイゼーション、そしてハイブリダイズしたプローブへ結合した後のアルカリホスファターゼ標識抗DIG抗体Roche,Basel,SwitzerlandによるX線フィルムへの化学発光を現像することにより、特異的なRNA配列を検出することができる。標的mRNAレベルrVKORC1およびrFVIIは、ハウスキーピング遺伝子例えば、ハムスターグリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼGAPDHと比較しなければならない。結果CHO-DHFR-発現系に由来する安定な細胞クローンを作製し、そして、ELISA技術およびプロトロンビン時間PT凝固技術によってrFVII生産性をアッセイすることができる。発現プラスミドpCMV-rFVII-IRES-VKORC1またはpCMV-rFVIIを、リン酸カルシウム共沈殿技術によって選択プラスミドpSV-DHFRと同時にトランスフェクトすることができ、クローンを、ヒポキサンチン、グリシンおよびチミジンを欠く選択培地への曝露expositionおよび抗生物質による選択への曝露によって取得することができる。単一の細胞由来のクローンを、限界希釈クローニングの後にスクリーニングし、MTX濃度を増加させながら数回継代培養して、遺伝子増幅を達成する。サブクローニング工程毎に、クローンを最大320nMのMTX濃度へ曝す。サブクローニングの全ラウンドroundから、全部でpCMV-rFVIIトランスフェクション由来の133クローンおよびrVKORC-1同時発現構築物でのトランスフェクション由来の83クローンを、増殖させ、詳細に特徴付ける。細胞培養上清に関して、rFVII濃度をELISAによって決定することができ、rFVIIおよびrFVIIa活性をPT凝固アッセイによって並行して測定する。不自然に高い特異的なFVII凝固値FVII-clottingvalueを避けるために、rFVIIのうち10未満がFVIIaに活性化されたクローンのみを特徴付けに関して考慮するデータは示していない。発現レベルを、24時間、106細胞あたりのngとしてELISA濃度の値から算出する。FVII比凝固活性を、1μgあたりの凝固単位として算出する。図8において、ELISAを基にした特異的な生産性の値を、rFVIIのみを発現するクローン図8A、およびrFVII-rVKORC1同時発現クローン図8Bに関してそれぞれMTX濃度に対してプロットする。両方の株において、MTXレベルと発現レベルとの間の関連性を見ることができる。rFVIIのみのクローンについて、MTX無しでの初期クローンは、匹敵するか、または幾分より高いレベルで始まる。特に、MTXが20nMの低い開始レベルから40nMに増加する場合、rFVII-rVKORC1同時発現クローンについて、より急激な共動性の発現レベルの増大を明確に見ることができる図8Bに対して、図8A。80nMのMTXにおいて、全てのrFVII-rVKORC1同時発現クローンは、初期クローンの2~80倍のrFVIIを発現するのに対し、rFVIIのみのクローンに関して、依然として、一部のクローンが、初期クローンと同様な発現レベルを有することが見出される。20nMより上では、全てのMTXレベルにおいて、rFVIIのみのクローンよりもrFVII-rVKORC1内でより良好な産生クローンが見出される。遺伝子増幅後のより良好なrFVII産生クローンの発現レベルは、特にMTX増大の最初のラウンドにおいて、rVKORC1同時発現により2倍になることが見出され得る。FVII比凝固活性に関して、全てのこれらのクローンについて計算した値を生産性に対してプロットし、タンパク質の機能性を比較することができる。図9において、両方の株を比較することにより、同様な生産性の範囲においておよそ等しい活性値であり、より高い生産性において両方とも全体的に減少することが示される。rFVII-rVKORC1同時発現クローンは、2倍超の生産性を有することが見出されるので、一日、106細胞あたり、4μgより高い範囲の活性値を比較することができない。rFVII-rVKORC1クローンにおけるこの発現レベルより高く、血漿由来のFVIIに類似する一定の活性値1μgあたり2Uを維持し得るMoorら、1995。単一のバイシストロン性mRNArFVIIおよびrVKORC1をコードする配列を含むの転写をもたらす、IRESエレメントを含むベクター構築物の機能性および機能的なゲノム組み込みを、特にVKORC1特異的なアッセイを利用することができない場合には、ノーザンブロット技術により実証することができる。図10は、ノーザンブロットを示し、ここでは、CHO由来のトランスフェクト体またはコントロール細胞の全mRNAを細胞溶解後に単離し、そして電気泳動で分離した後にナイロンメンブレン上にブロットした。このメンブレンを、ヒトVKORC1、ヒトFVII、および参照遺伝子ハムスターGAPDHに特異的なDIG標識DNAプローブで3回連続してハイブリダイズさせた。プローブを、DIG特異的標識抗体で検出する。サンプルは、:トランスフェクトさせていないCHO-DHFR-細胞、rFVIIのみを発現する1つのCHO由来クローン、実施例3に記載される、rFVIIをコードするベクターおよびrVKORC1をコードするベクターで連続的にトランスフェクトした2つのクローン、ならびに、バイシストロン性rFVIIおよびrVKORC1の同時発現を有する3つのクローンである。rFVII-IRES-rVKORC1構築物についての約2.4kbのサイズ、rFVII構築物についての1.4kbのサイズ、rVKORC1mRNAについての0.5kbのサイズ、およびGAPDHコントロールmRNAについての1.0kbのサイズを有するmRNA転写物は、全3つのプローブを用いて検出することができる。GAPDHは、全てのクローンで見出されるが、rVKORC1およびrFVIIは、それぞれの細胞株において、トランスフェクトされたプラスミドベクターにしたがって存在する。まとめると、rVKORC1の安定なバイシストロン性同時発現は、特に、遺伝子増幅を適用する場合に、哺乳動物細胞においてrFVIIの生産性を増大させる効果を有する。遺伝子導入後のrFVII高生産クローンの収量は、rVKORC1同時発現によってより高い。スクリーニングしたクローンの半数において、2倍超の発現レベルを、同じMTX濃度レベルにおいて達成することができる。タンパク質活性を、高い細胞タンパク質分泌レベルにおいて維持することができる。両方の効果は、γ-カルボキシル化反応に必要とされる還元型ビタミンK形態の十分な供給これは、完全にカルボキシル化されたタンパク質を適時に放出することを確実にするために、高いタンパク質分泌レベルにおいて、高い代謝回転速で生じる必要があるによって説明され得る。実施例4:CHOまたはHEK293哺乳動物細胞における2つの連続的な非ウイルス性トランスフェクション後の、rFVIIおよびrVKORC1の安定な同時発現哺乳動物細胞培養物におけるrFVII組換え発現に対する、ヘルパータンパク質としてのrVKORC1の効果を確認するために、別のアプローチを使用して、rFVIIととものrVKORC-1の同時発現を達成することができる。二回目のトランスフェクション後に、安定なrFVIIおよびrVKORC-1同時発現を示すクローンを選択するためのストラテジーを使用することができる。安定なトランスフェクション後に、rFVII発現に関して選択されているクローンに対し、ヒトVKORC1をコードする別のプラスミドベクターで二回目のトランスフェクションを行うことができる。第二の耐性マーカーを導入して、別の抗生物質への耐性によって選択工程を確実にすることができる。適切なコントロールとして、VKORC1cDNAを含まない同一のベクターを、同一の細胞集団に並行してトランスフェクトすることができる。これらのトランスフェクションから、安定なクローンを、クローニング工程内で2種類の抗生物質を用いての同時選択後に単離することができ、実施例2および3に記載されるように特徴付けることができる。これらの新規に単離されたクローンの比較は、rVKORC-1同時発現がrFVII生産性および活性に与える効果について結論付けることを可能にするはずである。材料および方法発現ベクターrFVIIを産生するクローンを作製するために、実施例2に列挙されるものと同一の発現ベクターおよびrFVIIcDNAの供給源を使用することができる。CHO-DHFR-系のために、さらなる選択プラスミドpSV-DHFRを使用することができる。二回目のトランスフェクション後に、rVKORC1同時発現を達成するために、ヒトVKORC1および一回目のトランスフェクションで使用したものとは異なる抗生物質選択マーカーをコードするベクターを採用することができる。このベクターを、実施例1に記載されるものと同一の鋳型から生成されたPCR産物をpcDNA3.1ベースのベクターInvitrogenに挿入することによって構築することができる。この場合において、挿入しなかった同一のpcDNA3.1ベクターを、二回目のコントロールトランスフェクションに使用すべきである。あるいは、実施例1に記載されるベクターpCMV-VKORC1-EDHproを、同一のトランスフェクションのための発現ベクターとして使用することができる。コントロールプラスミドとして、空ベクターpCMV-EDHpro出典は、実施例1を参照のことを使用することができる。細胞培養およびトランスフェクション実施例1で使用したものと同一の細胞株CHOおよびHEK293を使用して、rFVIIを産生する安定な細胞株を生成することができる。それにしたがって、全ての細胞培養培地、トランスフェクションプロトコールおよび培養プロトコールを使用することができる。これらの細胞株において、rVKORC-1の安定な同時発現を達成するために、リン酸カルシウム共沈殿を使用する二回目のトランスフェクションを使用することができる。rFVIIおよびrVKORC-1を同時発現するクローンを取得するために、さらなる抗生物質性選択薬物を使用する別のクローニング工程が必要とされる。分析アッセイ濃度および活性の測定について、実施例2および3に記載されるものと同一のアッセイを使用して、rFVII発現を確認することができる。mRNAレベルでのrVKORC1の転写は、実施例3に記載されるように、ノーザンブロット技術により示すことができる。結果rFVIIの発現に対するrVKORC-1ヘルパータンパク質の効果を示すために、2つの引き続くトランスフェクションおよびクローニングのラウンドのアプローチを使用することができる。最初のラウンドにおいて、rFVIIを発現する細胞クローンを、安定なトランスフェクションおよび抗生物質選択の後に、適切なスクリーニング技術によって単離することができる。これらのクローンのうちの1つを増殖させ、ヒトVKORC1をコードするプラスミドまたは空のコントロールプラスミドでの二回目のトランスフェクションに使用することができる。別の選択マーカーを導入することができる。再度、第二の抗生物質性選択薬物を培地に添加したこれによりトランスフェクトされていない細胞を枯渇することを確実にする後、適切な技術によって、クローンをrFVII発現についてスクリーニングすることができる。rVKORC-1トランスフェクションまたはコントロールトランスフェクションに由来するクローンを、rFVII生産性または活性に関して比較することができる。空のコントロールベクターは、rFVII発現に影響する同一の培養条件特に、二重の抗生物質選択に曝されているクローンの比較を確実にする。代表的に、首尾よくトランスフェクトされた細胞に由来する全てのクローンから、それらのrFVII生産性にしたがって、少数のクローンを選択し、さらなる特徴付けのために増殖される。この特徴付けは、抗原ELISA技術ならびにrFVIIおよびrFVIIa凝固活性の測定による分泌されたrFVII濃度の決定を含む。rVKORC-1およびrFVIIの同時発現を、図10、レーン3および4において、2つのCHO由来クローンについて示されるように、ノーザンブロット技術によってmRNAレベルで確認することができる。図11において、培養上清のELISA力価に基づく特異的な生産性の値を、一連の選択されたクローンこれらは、CHO由来rFVII産生細胞株図11AおよびHEK293由来rFVII産生細胞株図11BのrVKORC1の二回目のトランスフェクションまたはコントロールトランスフェクションに由来するについて示す。両方の細胞型において、rVKORC1トランスフェクションに由来するクローンが、コントロールトランスフェクションに由来するクローンよりも多くのrFVIIを産生することが示され得る。全ての生産性のメジアン値は、両方の場合において、rVKORC1クローンについて約2倍高い。図12Aおよび12Bにおいて、1マイクログラムELISAあたりのFVII凝固単位として示されるrFVII比凝固活性を、二回目のトランスフェクションの後の両方の細胞型に由来するクローンについて示す。比活性算出のために、rFVIIaへの大量のrFVII活性化を有するクローンこれはFVIIa特異的凝固アッセイにより測定することができるは考慮すべきではない。FVII凝固単位あたり、10のFVIIa凝固単位の値は、rFVIIaへ活性化される顕著な量のrFVIIを産生するクローンを排除するために選択され得る。したがって、図11に比べ図12にはより少ないクローンが示される。FVII比凝固活性における差は、rVKORC1同時発現ではなく、発現レベルと相関し得る。しかしながら、CHO由来クローンの場合に、同様な発現レベルを有するクローンは、rVKORC1同時発現の存在下でより高い活性を示す。CHO由来細胞クローンおよびHEK293由来細胞クローンの両方の生産性に関して、rVKORC1同時発現が、コントロールと比較して2倍の平均値の改善をもたらすことが結論付けられ得る。さらに、rFVII活性はまた、γ-カルボキシル化に加えて、細胞の代謝性タンパク質分泌および修飾能力によって影響される他の要因によって影響されることが結論付けられ得る。生産性および活性の値は、実施例2および3に記載されるrFVII/rVKORC1同時発現実験の結果と一致する。参考文献のリスト"