"a配列番号1と少なくとも76の配列同一性のアミノ酸配列を含んでおり、bエフリンB2を特異的に認識し、エフリンB2と特異的に結合することを特徴とする単離されているポリペプチド。上記アミノ酸配列は配列番号1である、請求項1に記載のポリペプチド。抗体である、請求項1または2に記載のポリペプチド。上記抗体はヒト型である、請求項3に記載のポリペプチド。ヒト型の上記抗体のアイソタイプは、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4またはIgAである、請求項4に記載のポリペプチド。シグナルペプチドをさらに含んでいることを特徴とする、請求項1~5のいずれか1項に記載のポリペプチド。上記シグナルペプチドは配列番号6である、請求項6に記載のポリペプチド。少なくとも1つのマーカーをさらに含んでいることを特徴とする、請求項1~7のいずれか1項に記載のポリペプチド。上記マーカーは、c-myc、FLAG、HA、ヒスチジン鎖、GST、ビオチン、VSV-G、HSVtk、V5、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、マルトース結合タンパク質および蛍光タンパク質を含んでいるリストから選択される、請求項8に記載のポリペプチド。上記マーカーは、ヒスチジンの鎖、c-myc、または両方である、請求項9に記載のポリペプチド。上記ポリペプチドの上記アミノ酸配列は配列番号7である、請求項10に記載のポリペプチド。エフリンB2に対する抗体であって、当該抗体のアミノ酸配列は、請求項1~11のいずれか1項に記載のポリペプチドを含んでいる、抗体。請求項1~11のいずれか1項に記載のポリペプチドまたは請求項12に記載の抗体をコードしている、核酸。請求項13に記載の核酸を含んでいる、ベクター。発現ベクターである、請求項14に記載のベクター。請求項14または15に記載のベクターを含んでいる、細胞。原核生物である、請求項16に記載の細胞。真核生物である、請求項16に記載の細胞。哺乳類細胞である、請求項18に記載の細胞。請求項1~11のいずれか1項に記載のポリペプチドまたは請求項12に記載の抗体を得る方法であって、以下の工程:a細胞において請求項15に記載のベクターを発現させること、およびb工程aにおいて発現されたポリペプチドを精製することを包含している、方法。上記細胞は原核生物である、請求項20に記載の方法。上記細胞は真核生物である、請求項20に記載の方法。エフリンB2の検出およびまたは定量化の方法であって、以下の工程:a単離された生物学的サンプルを、請求項1~11のいずれか1項に記載のポリペプチドまたは請求項12に記載の抗体と接触させること、ならびにb工程aにおいて使用されたサンプルにおける、エフリンB2と上記ポリペプチドまたは抗体とによって形成された複合体を検出するか、および/または定量化することを包含している、方法。エフリンB2の発現と関連付けられている疾患を診断する方法であって、以下の工程:a単離された生物学的サンプルを、請求項1~11のいずれか1項に記載のポリペプチドまたは請求項12に記載の抗体と接触させること、b工程aにおいて使用されたサンプルにおける、エフリンB2と上記ポリペプチドまたは抗体とによって形成された複合体を検出するか、および/または定量化すること、c検出されたエフリンB2レベルをコントロールのレベルと比較すること、ならびにdこの比較の結果を、疾患の存在または非存在と関連付けることを包含している、方法。請求項1~11のいずれか1項に記載のポリペプチドまたは請求項12に記載の抗体の、医薬の調製ための、使用。血管新生を阻害するための、請求項25に記載の使用。血管新生と関連している病理学的状態の予防処置または治療処置のための、請求項25または26に記載の使用。腫瘍またはがんの予防処置または治療処置のための、請求項25~27のいずれか1項に記載の使用。上記腫瘍またはがんは固形である、請求項28に記載の使用。上記がんは、膵臓がん、大腸がんまたは肺がんである、請求項29に記載の使用。請求項1~11のいずれか1項に記載のポリペプチド、請求項12に記載の抗体、請求項13に記載の核酸、請求項14もしくは15に記載のベクター、または請求項17~19のいずれか1項に記載の細胞を含んでいる、組成物。薬学的組成物である、請求項31に記載の組成物。薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含んでいることを特徴とする、請求項32に記載の組成物。抗血管新生剤をさらに含んでいることを特徴とする、請求項31または32に記載の組成物。化学療法剤をさらに含んでいることを特徴とする、請求項31または32に記載の組成物。請求項31~35のいずれか1項に記載の組成物の、医薬の調製のための、使用。血管新生を阻害するための、請求項36に記載の使用。血管新生と関連する病理学的状態の予防処置または治療処置のための、請求項36または37に記載の使用。腫瘍またはがんの予防処置または治療処置のための、請求項38に記載の使用。上記腫瘍またはがんは固形である、請求項39に記載の使用。上記がんは、膵臓がん、大腸がんまたは肺がんである、請求項40に記載の使用。実施例本発明は、発明者らによってなされた試験によって以下に例示される。当該試験は、エフリンB2に対する本発明の抗体の特異性、ならびに新たな血管およびリンパ管の形成の阻害におけるそれらの有効性を証明している。実施例1:エフリンB2に対する新規なヒト抗体の同定および性質決定哺乳類細胞において発現され、アフィニティークロマトグラフィーによって精製されたエフリンB2の細胞外ドメインに対する連続的な選択を介して、ファージM13の表面上に発現されたヒト抗体のライブラリから、ELISAによってB2抗原と陽性反応したファージクローンの収集物を得た。これらのクローンを、特異的なプライマーを用いて配列決定し、VH可変性の重鎖およびVL可変性の軽鎖の両方において成熟した異なる配列の4つの短鎖の可変断片scFvと同定し、4つの短鎖の可変断片をA1、B11、E4および2B1と呼ぶ。続いて、選択された各scFvの発現および精製の分析を実施した。この目的のために、アフィニティークロマトグラフィーによる精製を容易にするためのヒスチジンテイルを有している断片をもたらすために、これらを、T7RNAポリメラーゼのプロモータに基づくベクターpET28bにサブクローニングした。組換えベクターを、生成し、EcoliのBL21株DE3に導入して、IPTGを用いて発現を続いて誘導した。周辺質画分を、穏やかな浸透圧ショックによって調製し、SDS-PAGEによるscFvの存在について試験した図1。それから、ニッケルのアフィニティークロマトグラフィーを用いて周辺質画分に存在するscFvの精製を行い、ゲル濾過によってPBSに緩衝液を交換した図2。最大の収率は、クローン2B1その配列は配列番号8であるの場合に得られ、次にクローンB11その配列は配列番号7であるであった。しかし、scFvA1およびE4の発現は、達した量がこれらの抗体のさらなる性質決定を行うには不十分なほど低かった図2。したがって、反応性を分析するために、クローンB11および2B1を選択した。ELISAによる機能的アッセイは、それらの抗体が、それらの標的抗原エフリンB2を特異的に認識するための機能的に活性な形態において発現されることを示した。エフリンB2ファミリーの他の構成要素:市販の組換え形態におけるエフリンB1およびエフリンB3とのB11および2B1の反応性を、エフリンB2との反応性と比較する免疫ブロットウエスタンブロット分析およびELISA分析によって、2つの抗体の特異性を確認した図3。コントロールとして、市販の抗エフリンB2RDを使用した。B11および2B1の両方の抗体はエフリンB2のみを認識し、エフリンB1およびエフリンB3を認識する市販の抗体をはるかに超えた、このタンパク質に対する高い特異性を証明している。これらの結果をELISAによって確認した。ファージライブラリから得られた特異的なエフリンB2抗体由来の短鎖可変断片scFvの選択非免疫化個体に由来する1.5×1010のscFvのヒト抗体のライブラリを用いた、ファージの表面に対するタンパク質ディスプレイ手法ファージディスプレイを使用した。ヒトIgGのFcドメインと融合されたエフリンB2の細胞外ドメインを、ELISAプレート酵素結合免疫吸着検定法、MaxisorpNuncに固定化された抗原として用いて、1回目のパニングを実施した。当該細胞外ドメインは、哺乳類細胞から発現され、精製され、16時間にわたって4°Cにおいて、1μg/ウェル、PBSリン酸緩衝食塩水においてELISAプレートに固定化された。ウェルの3回のPBS洗浄後に、PBSにおける2のミルクを用いたブロッキングステップを、2時間にわたって37°Cにおいて実施し、それから、2時間にわたって37°Cにおいてライブラリをインキュベーションした。非特異的に結合したファージを、PBS-0.1のTweenを用いて連続する洗浄によって除去し、100μlのトリプシンを用いて、抗原特異的なファージを溶出させた。細胞を、対数増殖期600nmOD600の波長における、0.4の吸光度にあるEscherichiacoli株TG1MRCGeneservicesとともに、30分にわたって37°Cにおいて溶出させたファージに感染させた。感染させた細菌を、100μg/mlのアンピシリンおよび1のグルコースを補ったTYEプレートTYE、トリプトン酵母抽出物に播き、16時間にわたって37°Cにおいて培養した。次に、細菌を、15のグリセロールを補った2×TY培地16g/lのトリプトン、10g/lの酵母抽出物および5g/lのNaClを用いてプレートから回収し、希釈した50μlの細菌を、100μg/mlのアンピシリンおよび1のグルコースを補った50mlの2×TY培地に回収し、培養物を、対数増殖期に達するまでインキュベートし、細胞を、2.5×1011のヘルパーファージKM13MRCGeneservicesに感染させた。37°Cにおける30分のインキュベーションの後に、培養物を遠心分離し、ペレットを、100μg/mlのアンピシリン、50μg/lのカナマイシンおよび1のグルコースを補った同容積の2×TY培地に再懸濁させ、30°Cにおいて一晩培養した。各選択から得られたファージを、培養培地から沈殿させた。このために、培養物を15分にわたって3300×gにおいて遠心分離し、10mlのポリエチレングリコール/NaClを加え、40mlの上清を1時間にわたって氷上に放置した。それから、それらを30分にわたって3300×gにおいて遠心分離し、上清を捨てた。沈殿物を、2mlのPBSに再懸濁させ、10分にわたって11000×gにおいて遠心分離した。上清を回収し、ファージを、抗体の親和性を向上させるために使用される抗原の量を低下させる特異点をともなう、上述と同様の次の選択に使用した。第2の選択において結合したファージを、増幅させ、エフリンB2に対する反応性のscFvを有しているファージの濃縮物を得るために、第3の選択に供した。ファージに対するELISA各選択から生成された、エフリンB2の特異的なファージの濃縮の程度を評価するために、ファージに対するELISAを実施した。3μgのエフリン-B2-Fcおよびネガティブコントロールとしての無関係なタンパク質を用いて、16時間にわたって4°C、PBSにおいて、柔軟なELISAプレートFalconBDBiosciencesを被覆した。PBSを用いた数回の洗浄後に、2時間にわたって室温、2のミルクのPBSにおいて、プレートをブロッキングし、1時間にわたる室温、PBS-2のミルクにおける各選択から得られたファージの異なる希釈物とともにインキュベートした。ウェルを、PBS-0.1のTween20を用いてふたたび洗浄し、ペルオキシダーゼHRPと結合したモノクローナル抗-M13抗体1:5000希釈GEHealthcareとともに、1時間にわたって室温においてインキュベートした。PBS-0.1のTween20を用いた4回の洗浄後に、TMB3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジンSigmaを用いて現像した。1Mの硫酸を用いて比色反応を停止させ、吸光度を450nmにおいて測定した。選択した2つのscFvB11および2B1を、種々の手法を用いて性質決定した。まず、固定化したエフリンB2の細胞外ドメインおよび精製したscFvの異なる希釈物を用いた、BiacoreXに対する表面プラズモン共鳴手法によって、エフリンB2に対する抗体の親和性定数を決定した。B11クローンは、最も高い親和性定数110nMを示し、クローン2B1の親和性は、630mMとより低かった図4。それから、エフリンB2の結合について天然の受容体EphB4と競合する抗体の能力を、同じ手法を用いて分析した。この目的のために、EphB4-Fcをチップに固定化し、エフリンB2に対する結合を、異なる濃度のB11または2B1の存在下において測定した。B11の存在は、エフリンB2に対するEphB4の結合を、0.3μMのIC50を有して濃度依存的に抑制し、これは、B11がEphB4受容体の同じ結合部位と競合することを示している。しかし、2B1抗体は遮断作用を示さない図5。モノクローナルのファージのELISA個々のコロニーを、3回目の選択から選び、100μg/mlのアンピシリンおよび1のグルコースを補った、96ウェルプレートSarstedtに入っている100μlの2×TY培地において、撹拌しながら37°Cにおいて一晩培養した。翌日に、培養物を、同じ培地において100倍に希釈し、2時間にわたって37°Cにおいて撹拌しながらインキュベートした。次に、109のKM13ヘルパーファージを有している25μlの培地を加え、1時間にわたって37°Cにおいてインキュベートした。細菌を遠心分離し、細胞ペレットを、50μg/mlのカナマイシンを補った2×TYに再懸濁させ、30°Cにおいて一晩培養した。最後に、培養物を遠心分離し、50μlの上清を、上述した同じ条件におけるELISAのために使用した。配列分析複数のオリゴヌクレオチドすなわち、pelBForwardプライマー5CATAATGAAATACCTATTGCCTA3:配列番号2およびcmycReverseプライマー5CTTATTAGCGTTTGCCATT3:配列番号3を用いたPCRによって、scFv由来のコード配列を増幅させた。複数の酵素使用されなかったオリゴヌクレオチドを除去するための、30分にわたる37°CにおけるExoIUSB、および残ったdNTPを除去するための、15分にわたる80°CにおけるSAPUSBを用いて、PCR産物を処理し、そのような産物を、両方のオリゴヌクレオチドとともに配列決定した。配列を得た後に、互いを比較して、ClustalWプログラムおよび翻訳ツールExPASyProteomicsServerを用いて固有の配列のクローン数を決定した。scFvのpET28bへのサブクローニング精製を容易にするヒスチジンテイルを選択されたscFvに付加するために、ベクターpET28bNovagenにクローニングした。それぞれが、XhoIおよびRcaIの2つの制限酵素部位を含んでいるプライマー、pET28-scFvMehta5’5CAGTCATCATGAAATACCTATTGCCTAC3:配列番号4およびpET28-scFvMehta3’5CACCGGACTCGAGTGCGGCCCCATTCAG3:配列番号5を用いたPCRによって、scFvを増幅させ、続いて、XhoIおよびRcaIと部位適合性のNcoIを用いてあらかじめ消化されているpET28bベクターにクローニングした。挿入物:ベクターのモル比を3:1に設定し、T4リガーゼ酵素Rocheを用いた16°Cにおける一晩のインキュベーションによって、消化された挿入物およびベクターのライゲーションを実施した。Ecoli株DH5aライブラリコンピテント細胞を、ヒートショックによって形質転換し、50μg/mlのカナマイシンを有しているLBAgarLB、溶原性ブロスのプレート上において選択した。各コンストラクトのポジティブコロニーを、カナマイシンを補ったLBに植菌し、37°Cにおいて一晩培養した。WizardキットPromegaを用いて組換えベクターを精製し、DNA配列決定することによって配列を確認した。scFvの発現および精製Ecoli株BL21DE3コンピテント細胞を、ヒートショックによって組換えプラスミドを用いて形質転換した。50μg/mlのカナマイシンを有しているLBプレート上において、形質転換体の細菌を選択した。培養物のOD600が0.6になったときの、1mMの最終濃度のIPTGイソプロピル-β-D-1-チオガラクトピラノシドを用いた誘導によって、scFv発現を実施した。SDSポリアクリルアミドゲルドデシル硫酸ナトリウムによってscFvの発現レベルを分析し、クーマーシーブリリアントブルーを用いて染色した。機能的なscFvは細胞周辺質領域に集中しているので、穏やかな浸透圧ショックによって細菌の外壁を溶解させ、20μg/mlのベンズアミジンSigmaおよび10μg/mlのダイズトリプシン阻害剤Sigmaを補った1/50倍体積のTES緩衝液に、細胞を、再懸濁させ、続いて0.2×TES緩衝液において1.5倍に希釈した。溶菌液を、30分にわたって氷上に放置し、16250×gにおいて10分にわたって遠心分離し、周辺質画分を含んでいる上清を回収した。Ni2HisTrapGEHealthcareのカラムを用いた、固定化金属に対するアフィニティークロマトグラフィーIMACによって、scFvの精製を実施し、続いて、コンピュータAKTAxpressに対してタンデムに連結したゲル濾過HiPrep2610DesaltingGEHealthcareのカラム上において脱塩した。アフィニティーカラムの平衡緩衝液として、20mMのリン酸ナトリウムpH7.4、0.5MのNaCl、20mMのイミダゾールを用い、0.3Mのイミダゾールの濃度を有している平行緩衝液と同じ緩衝液を、溶出緩衝液として用いた。ゲル濾過によってこの緩衝液をPBSに交換した。免疫ブロットウエスタンブロットマウスの組換えタンパク質エフリンB2-Fc、マウスのエフリンB2-FcおよびヒトのエフリンB3-FcRDを、10ゲルのSDSポリアクリルアミドにおける電気泳動によって分離し、ニトロセルロース膜GEHealthcareに転写させた。3のスキムミルク粉末のPBSを用いて1時間にわたって膜をブロッキングした後に、3の粉ミルクのPBSにおいて1.5倍希釈した周辺質画分とともに、16時間にわたって4°Cにおいてインキュベートした。使用した2次抗体は、2時間にわたる室温における1:1000倍希釈のc-MycSigma、および1時間にわたる室温における1:5000倍希釈の抗マウスのペルオキシダーゼ結合物Sigmaであった。ECL試薬ECL、EnhancedChemiluminescenceをともなったインキュベーションによって可視化した。scFvの速度定数の分析scFvの親和性定数を試験するために、BIAcoreX装置BIAcoreを用いた表面プラズモン共鳴の手法を用いた。10μl/分の流量において7分にわたって、1:1の比における0.4MのEDC1-エチル-3--ジメチルアミノプロピル-カルボジイミドおよび0.1MのNHSN-ヒドロキシコハク酸塩を用いたチップのデキストランマトリクスのカルボキシル基の活性化によって、エフリンB2-FcをCM5チップGEHealthcareの表面に共有結合させた。pH4の10mMの酢酸ナトリウムにおいてエフリンB2-Fcタンパク質を10μg/mlまで希釈し、HBS-EP緩衝液10mMのHEPESpH7.4、150mMのNaCl、3mMのEDTA、0.005の界面活性剤P20GEHealthcareにおいて、この溶液の30μlを、10μl/分の流量においてチップ表面上を通過させた。過剰に活性化したエステル基を、7分にわたる10μl/分の流量における1MのエタノールアミンpH8.5の注入によってブロックした。このプロトコルを用いて、約2000応答ユニットRUのエフリンB2を固定化した。scFvの親和性定数を決定するために、増加する順序において異なる濃度の抗体を、30μl/分の流量において継続的に注入した。センサグラムを得た後に、ラングミュアの1:1モデルによる評価プログラムBIAsoftwareを用いて、親和性定数を算出した。EphB4との結合についての、競合の分析表面プラズモン共鳴競合性結合アッセイによって、EphB4受容体に対するエフリンB2の結合を阻害するscFvの能力を分析した。上述した同じプロトコルを用いて、可溶性のEphB4RDをCM5チップGEHealthcareに結合させた。各scFvの希釈系列を、HBS-EP緩衝液における定濃度0.2μMのエフリンB2と混合し、30μlの各混合物をEphB4の被覆チップに対して20μl/分の流量において注入した。EphB4に結合したエフリンB2の相対量は、抗体の対応する濃度に応じて表されている。scFvB11抗エフリンB2を用いたEphB4シグナル伝達の阻害エフリンB2に誘導されるリン酸化を介したEphB4の活性化を遮断する抗エフリンB2scFvの能力を試験するために、細胞アッセイを実施した。当該細胞アッセイでは、エフリンB2を一過性に発現しているHEK293細胞が、高レベルのEphB4および低レベルのエフリンB2を発現することによって特徴づけられているHUVEC細胞を刺激するために使用された。結果を図5に示す。20分にわたる2つの細胞のインキュベーションの後に、HEK293細胞の表面に発現されているエフリンB2は、HUVEC細胞におけるEphb4の効率的なリン酸化を誘導する。しかし、この過程におけるscFvB11の存在は、EphB4のリン酸化のほぼ完全な阻害をもたらし、scFvB11を用いた処理は、細胞間の直接的な接触と関連して、エフリンB2およびその受容体EphB4の間における相互作用を遮断するということを示している。この作用は、scFv2B1を用いた処理を実施したときには、認められなかった。scFv2B1の場合、EphB4のリン酸化レベルは、抗体の非存在下に認められるリン酸化レベルと同等であった。EphB4のリン酸化細胞アッセイ5のウシ胎児血清を補ったRPM1Sigmaにおいて培養したHEK293細胞を、プラスミドpcDNA3-ephrinB2を用いてトランスフェクトした。4.5×106のHEK293細胞を、プラスチックボトルT75Nuncに播種した。翌日に、1mlのOPTIMEM培地Invitrogenにおける20μgのpcDNA3-ephrinB2および60μlのFUGENEトランスフェクション試薬Rocheを有している混合物を調製し、室温において30分にわたってインキュベートした。無血清のOPTIMEM培地Invitrogenを用いて数回にわたって単層の細胞を洗浄し、DNA-FUGENEの混合物を加えた。37°Cおよび5のCO2における5時間にわたるインキュベーションの後に、培地を取り除き、5のウシ胎児血清を含んでいるRPM1を加えた。48時間目に、5mMのEDTA-PBSを用いてトランスフェクションした細胞を惹起させ、5×106細胞をHUVEC細胞とともに、P100プレートFalconに加えた。当該HUVEC細胞は、10のウシ胎児血清を補ったEGMBulletKit培地Lonzaにおいて、20μg/mlのscFv抗エフリンB2の存在下または非存在下でコンフルエントまで培養されていた。37°Cおよび5のCO2における20分にわたるインキュベーションの後に、プロテアーゼ阻害剤カクテルRocheおよびホスファターゼSigmaを補った溶解緩衝液100mMのTrisHClpH8.0、150mMのNaCl、1mMのEDTA、5mMのDTT、0.5のTritonX100を用いて、細胞を溶解させた。16000×gおよび4°Cにおいて25分にわたって溶解物を遠心分離し、それから、EphB4に特異的な抗体RDおよびセファロースに結合されたGタンパク質GEHealthcareを用いて、16時間以上にわたって4°Cにおいてあらかじめ形成された複合体とともに、上清を2時間にわたって4°Cにおいてインキュベートした。最後に、溶解緩衝液を用いて2回にわたって免疫複合体を、洗浄し、7.5のポリアクリルアミドゲルのSDS-PAGEにおいて電気泳動した。リン酸化されたEphB4を免疫ブロットによって検出した。これを実施するために、抗Eph-B4によって免疫沈降され、電気泳動によって分離されたタンパク質を、ニトロセルロース膜HybondCGEHealthcareに転写し、0.05のTween20Sigmaおよび3のPhosphoblocker登録商標ブロッキング試薬CellBiolabsIncを補ったPBSを用いて、1時間にわたって室温においてブロッキングした。それから、ペルオキシダーゼと結合されているモノクローナル抗体4G10抗ホスホチロシンMilliporeの1:2000希釈物とともに、16時間にわたって4°Cにおいて膜をインキュベートした。SuperSignal登録商標WestFemtoSubstrateThermoScientificによる化学発光検出を用いて可視化した。総EphB4の検出のために、同じ膜を、StrongPlusReBlot試薬Chemiconを用いて15分にわたって室温において再生し、0.05のTween20および5のスキムミルクを有しているPBSにおいて1:1000に希釈した抗EphB4抗体とともに、16時間にわたって4°Cにおいてインキュベートした。0.05のTween20を有しているPBSを用いた数回の洗浄後に、ペルオキシダーゼ結合抗ヤギ抗体1:500Dakoとともに、2時間にわたって室温において、膜をインキュベートし、ECLPlus試薬GEHealthcareを用いてバンドを可視化した。実施例2:HUVEC細胞におけるB11および2B1抗体の、インビボにおける抗血管新生活性血管新生能および内皮細胞の遊走に対するB11および2B1抗体の作用を分析した。このために、HUVEC細胞臍静脈内皮細胞を用いた、Matrigelにおける管形成およびインビトロの傷治癒アッセイの実験をそれぞれ行った。Matrigelにおける管形成の実験において、100μg/mlのB11抗体の存在下におけるHUVEC細胞は、抗体なしのコントロールまたは無関係なscFvを用いたコントロールより2倍少ない管を構成する図6ことに加えて、処理の6時間において細管の数が減少しており、単層の細胞としてより多く堆積していることが分かった。これは、上記抗体の存在が管の形成を抑制していることを証明している。B11と比べて低い阻害能コントロールに対して40を有していたが、同様の結果がクローン2B1を用いて得られた。HUVEC細胞の側方への遊走に対する作用を決定するために、遊走を刺激する因子としての血管内皮成長因子VEGFの存在下において、単層の治癒における実験を実施した。傷をつけた24時間後に、過程においてVEGFまたはVEGF無関係なscFvが存在する場合に、60の単層細胞は空いた空間に遊走した。一方で、VEGFおよびB11もしくは2B1を用いて処理された傷には、それぞれ25または30の細胞が定着し、これらのデータは、遊走刺激なしのネガティブコントロールにおいて遊走した細胞の数20に匹敵した。したがって、両方の実験から、エフリンB2に特異的なB11および2B1抗体特に前者は、血管新生能を示し、インビトロにおける内皮細胞の遊走を阻害可能と結論づけられる。マトリゲルにおける柱状構造の形成アッセイMatrigelBDBiosciencesを用いて24ウェルプレートを被覆し、ゲル化のために20分にわたって37°Cにおいてインキュベートした。それから、10のウシ胎児血清を補った1mlの完全培地EGM2bulletKitLonzaにおける5×104のHUVEC細胞を播き、100μg/mlまでの異なる抗体の存在下において、6時間にわたって37°Cにおいてインキュベートした。カメラを備えている顕微鏡Axiovert100Zeissにおいて得られたデジタル画像を解析することによって、6時間目に柱状構造の形成の程度を調べた。インビトロの傷治癒試験インビトロの傷治癒を利用して、細胞遊走アッセイを実施した。0.5のウシ胎児血清を補ったEGM2Lonzaを用いた1時間のインキュベーション後に、24ウェルプレートにおいてコンフルエントまでHUVEC細胞を増殖させ、ピペットのチップを用いて線状のひっかきを作り、その領域の画像を撮影した。遊走刺激剤としての100μg/mlのVEGF血管内皮成長因子および100μg/mlの対応する抗体の存在下または非存在下コントロール条件において、細胞をインキュベートした。上記領域の画像を撮影してから24時間後に、ひっかきを実施した時点から、傷に向かって側方に遊走した細胞をカウントし、遊走した領域のパーセンテージを決定した。実施例3:マトリゲル移植片の血管新生に対するB11および2B1抗体の作用2B1およびB11がインビボの血管新生を直接的に阻害可能であることを証明するために、1群につき6匹の動物を用いて、胸腺欠損のnu/nuヌードマウスにおける、VEGFPeprotechを補ったMatrigel移植片の実験を実施した。取り出した移植片に存在するヘモグロビンの定量、およびCD34の免疫組織染色、これに続くこの血管マーカーのついての陽性領域の算出によって、柱状のネットワーク形成の評価を、対応するMatrigel移植の6日後に実施した。それぞれの抗体を用いた処理を、Matrigelの移植の直後に開始し、300μg/マウスの最終投与量まで隔日に行った。VEGFなしの移植片を、ネガティブコントロールとして使用し、当該移植片は、血管新生をまったく生じなかった図8A。一方で、VEGF移植片、ならびにVEGFおよび無関係なscFvを用いて処理した移植片は、顕著な血管新生を示し、実験のポジティブコントロールとみなされた。抗体B11を用いて処理した動物は、成長因子なしのMatrigelを用いて移植した血管新生と匹敵する、ポジティブコントロールより95低い最小の血管新生を示し、CD34についてポジティブな内皮細胞および移植片におけるヘモグロビンの欠如に反映されている図8B。2B1抗体を用いて処理したマウスの群は、ポジティブコントロールに対して、血管新生の50の阻害を示した。インビボの管形成アッセイ4~6週齢の胸腺欠損のnu/nuマウスCharlesRiverを使用した。コントロール群について、2のイソフルレンを用いて麻酔したマウスに200μlのMatrigelBDBiosciencesを注入した。他の群の動物の上腹部領域に、50ng/mlのVEGFおよび375μg/mlのヘパリンSigmaを補った200μlのMatrigelを注入した。血管内へのscFvを用いた処理を、Matrigel移植の直後に開始し、300μl/マウスの総投与量まで隔日に行った。6日後に移植片を取り出し、新たな血管の形成を、血管のマーカーである抗CD34を用いて染色した組織切片に存在するヘモグロビンの濃度にしたがって決定した。ヘモグロビンを測定するために、Matrigel移植片の各部分を取り、各部分の重量を計り、各部分を300μlの蒸留水においてホモジナイズした。16000×gにおける5分にわたる遠心分離の後に、100μlの上清を取り、TMB基質3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジンSigmaを用いて1:1に希釈した。15分後に、650nmにおける吸光度を測定することによって呈色反応を評価した。最後に、値を移植片の重量に対して標準化した。免疫組織学分析のために、移植片の一部を、10の緩衝化したホルマリンにおいて固定し、パラフィンに包埋し、ミクロトームを用いて2.5μmの厚さに薄片化した。Tris-EDTApH9.0を用いて抗原性不活化処理を実施し、内皮細胞を、1:75に希釈したラットのモノクローナル抗CD34Abcamを用いて標識し、続いて、ペルオキシダーゼを用いて標識した抗ラットの2次抗体BiocareMedicalを用いた。3,3-ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライドプラスDAKOを用いて可視化し、ヘマトキシリンを用いて対比染色した。ポジティブな細胞をAxioVisionsystemZeissによってカウントした。実施例4:B11および2B1抗体は、胸腺欠損マウスにおけるヒト腫瘍の発達を抑制するインビボおよびインビトロにおける血管新生に影響を与えるB11および2B1抗体の証明された能力を考慮して、それらが腫瘍の発達のような、血管新生に強く依存する過程を阻害可能であるか否かを調べた。このために、膵臓がん細胞BxPC3、結腸SW620、および肺H460を用いた3つの異種移植片マウスモデルを使用した。結腸細胞および肺細胞は、発せられる蛍光を分析することによって腫瘍の進行を追跡するための蛍光タンパク質mCherryを恒常的に発現している。B11および2B1の両方の抗体は、採用された3つの細胞株におけるインビトロの細胞生存能力に対して影響を生じないことを、あらかじめ確認された。8匹のマウスの2群に対して、BxPC3細胞を皮下に移植し、腫瘍塊が肉眼によっていったん検出されると、B11および2B1を用いた20mg/kgの総投与量まで隔日の皮下に対する処理、またはネガティブコントロールとしてのPBSを用いた処理を開始した。腫瘍細胞の移植の60日後に、B11抗体を用いて処理したマウスの群が腫瘍サイズの有意な低下コントロール群の平均の腫瘍サイズと比べて70の成長阻害を示したことが、認められた図9。2B1処理マウスは、腫瘍成長の中程度の低下約35を示した。腫瘍成長におけるこの阻害を担っている機序を調べるために、抗体を用いた処理の終了から1日においていくつかの腫瘍を取り出し、活性なカスパーゼ3、Ki67、CD34およびLyve1のそれぞれに対する抗体を用いて、アポトーシスの状態、増殖性、血管新生性およびリンパ管新生性を評価するために、免疫組織学的分析を実施した。B11を用いて処理した腫瘍においてアポトーシスを起こした細胞の数は、コントロールと比べて5倍に増加していた。一方で、2B1を用いて処理した腫瘍およびコントロールの間におけるアポトーシスを起こした細胞の数における差は、有意ではなかった。増殖マーカーKi67について、増殖性は、処理動物およびコントロール動物の間において差異がなく、3つのすべての群において約30のKi67ポジティブ細胞を示した。腫瘍におけるCD34についてポジティブな領域を測定することによって血管の存在について分析したとき、B11を用いて処理した腫瘍において、コントロールに対して80の低下、および2B1を用いて処理した腫瘍において、コントロールに対して55の低下が認められた。最後に、Lyveマーカーによるリンパ管の存在を分析した。B11を用いて処理した腫瘍において、リンパ管をほぼ完全に欠いていると観察された。また、2B1を用いて処理した腫瘍において、リンパ管の数の有意な減少が観察されたが、B11の場合ほど顕著ではなかった。それから、他の異種移植モデルにおけるB11抗の抗血管新生能、抗リンパ管新生能、および腫瘍成長の阻害能を、上述した同じ手順にしたがって調べた。細胞株SW620結腸がんの場合、移植後の23日に腫瘍サイズの90の低下が観察され図11A、肺細胞の場合、65の低下が観察された図11B。それぞれのサイズにおけるこの低下は、腫瘍細胞に存在する蛍光発光mCherryタンパク質の類似の減少を伴って確認された。膵臓がん細胞のモデルにおいて観察されている通り、免疫組織化学的分析によって、B11を用いて処理した腫瘍における血管の数の減少およびリンパ管の非存在が確認された。したがって、エフリンB2に特異的なB11抗体は、強い抗血管新生能および抗リンパ管新生能を有しており、当該抗体を用いて処理した腫瘍の成長の低下または遅延を生じると結論付けられ得る。また、2B1抗体は良好な抗血管新生能および抗リンパ管新生能を有している。異種移植片3種類の異種移植片がある:膵臓がん細胞BxPC3、結腸蛍光タンパク質mCherryを安定して発現しているSW620Clontech、および肺蛍光タンパク質mCherryを安定して発現しているH460。3つの場合のすべてにおいて、同じプロトコルに基本的にしたがった。0.2mlのPBSの体積において百万~5百万の腫瘍細胞を、免疫不全マウスヌードまたはSCID、重症複合免疫不全の横腹の皮下に、肉眼によって腫瘍塊を確認できるまで約30mm3注入した。このときに、2週間にわたってか、または20mg/kgの最終投与量に達するまで隔日における、100~200μlのPBSにおける対応する抗体の尾静脈を介した血管内投与による処理を開始した。コントロール動物は同じガイドラインにしたがってPBSを受けた。1週間に2~3回にわたってキャリパーを用いて腫瘍のサイズを測定し、mCherry蛍光タンパク質によって標識された細胞を用いて移植されたマウスの場合、mCherryタンパク質の発光強度に応じた腫瘍成長を示すために、IVISimagingSystemSpectrum200CaliperLifeSciencesにおいて610nmに対する蛍光発光強度も測定した1秒および1平方センチメートル当たりの光子の数。画像の最終的な処理は、残余のシグナルの減算自己蛍光の排除およびシグナル強度のプロファイルにしたがったカラースケールを包含している。腫瘍が1500~2000mm3の所定のサイズに達したとき、実験動物の使用に関する現行の法律にしたがってCO2を用いた窒息によって動物を屠殺した。ステューデントt検定を用いたパラメータ解析によって腫瘍成長を評価する統計解析を実施した。統計的な有意さの程度をP≦0.05に設定した。組織学的分析異種移植したマウスから得られた腫瘍サンプルを、抗体を用いた処理の終了後の1日に屠殺した動物から摘出した。サンプルを、ホルマリンを用いて固定し、パラフィンに包埋した。各腫瘍から得られた組織学的切片を、ヘマトキシリンおよびエオシンを用いて染色したか、または免疫組織化学的な性質決定のために調製した。ウサギ抗Ki67DAKOのモノクローナル抗体を用いた染色によって、腫瘍細胞の増殖活性を分析し、ウサギのポリクローナル抗活性カスパーゼ3RDを用いて、アポトーシスを起こした細胞を検出し、特異的なラットのモノクローナル抗体Abcamを用いた内皮細胞におけるCD34を染色することによって、新たな血管新生を測定し、ウサギのポリクローナル抗LYVE1Abcamを用いて染色することによって、リンパ管を標識した。3,3-ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライドplusDAKOを用いて、すべての切片を可視化し、ヘマトキシリンを用いて対比染色した。AxioVisionシステムZeissによって、ポジティブな細胞をカウントした。実施例5:インビボにおける腫瘍塊の生体分布および部位動物における抗体の分布を解析し、腫瘍進行の領域における局在を確認するために、腫瘍細胞ここではH460肺がん細胞を用いて異種移植したマウスを、近赤外発光する蛍光色素を標識した抗体AlexaFluor登録商標750MolecularProbesを用いて処理する実験を設計した。腫瘍塊の位置を確かめるために、蛍光タンパク質mCherryを発現している細胞を使用した。胸腺欠損のnu/nuマウスの背側領域の皮下にH460細胞を移植した。腫瘍が約0.3cm3の体積に達したとき、AlexaFluor登録商標750と結合した抗体の15μlを血管内に投与した。投与の0.5、2、6、24および48時間後に、腹側領域および背側領域から画像を撮影した。マウスの腹側画像の調査は、投与の半時間後図12Aから、6時間図12Bにピークを有している腫瘍塊における抗体の位置の確認に役立った。6時間に抗体B11によって発せられている腫瘍における蛍光の強度は、抗体2B1によって示される強度より明らかに優れており、B11が、2B1より効率的に、腫瘍に位置することを示していた。30分後において、膀胱および腎臓におけるシグナルは非常に強く、抗体の腎への急速かつ能動的な排出を示していた。48時間において、シグナルは、これらの領域において自己蛍光と近い値を有して非常に弱く、ほぼすべての抗体が完全に排出されていることを示していた。さらに、動物は、上腹部領域において最初の数時間の間に、肝胆道経路による抗体の一定の除去に起因する蛍光シグナルを示し、この事実は、臓器を分けて分析したときに証明され、6時間において肝臓は約1×108p/s/cm2/sr光子/秒/平方センチメートル/エステルジアンesterdianの蛍光を示すことが分かった。生体分布scFv分布の実験のために、蛍光タンパク質mCherryを安定して発現している肺がん細胞株H460を用いて異種移植されたヌードマウスを使用した。腫瘍における位置を確実に決定するために、蛍光マーカーを有している細胞を使用した。5×106細胞を皮下に注入し、腫瘍塊が約500mm3のサイズに達するまで放置した。同様に、製造者の指示にしたがって、SAIVI商標RapidAntibodyLabelingKitInvitrogenによって蛍光色素AlexaFluor登録商標750にscFvを結合させた。腫瘍が期待されるサイズに達すると、15μgの標識した抗体を各マウスに注入した。インビボ画像化システムIVISSpectrum200CaliperLifeSciencesを用いて、標識したscFvの投与後の0.5、2、6、24および48時間に、749nmに対して蛍光色素を励起しながらインビボ蛍光画像を撮影した。自己蛍光を除いた後に、シグナル強度のプロファイルにしたがったカラースケールを示す処理を行った。選択されたクローンの、Ecoliにおける発現を示す図である。クローン2B1およびB11が大量に精製されていることを示す図である。クローンB11および2B1がより特異的であることを示す図である。Biacore商標によるscFv抗エフリンB2の親和性分析の結果を示す図である。EphB4に対するエフリンB2の結合を遮断する試験の結果を示す図である。マトリゲルにおける内皮細胞HUVECによるインビトロの管状構造形成に対するB11および2B1の阻害作用を示す図である。インビトロの傷治癒アッセイによる細胞の側方遊走の分析結果を示す図である。インビボにおける管状構造形成の阻害作用の分析結果を示す図である。膵臓がん細胞BxPC3を用いて異種移植片され、B11または2B1を用いて処理したマウスにおける腫瘍成長の阻害を示す図である。膵臓がん細胞BxPC3を異種移植し、B11または2B1を用いて処理した腫瘍の組織病理学的な分析結果を示す図である。B11が、大腸がん細胞SW620Aおよび肺がん細胞H460Bを用いて異種移植したマウスにおける腫瘍成長を阻害可能であることを示す図である。B11および2B1の体内分布分析、ならびに腫瘍塊の位置を示す図である。"