aサイクリンキナーゼp16INK4a又はp21CIPKIPのタンパク質インヒビターの機能配列、及び輸送配列を含む、キメラペプチドであって、該機能配列と該輸送配列が、基Xにより連結されており、Xが1~50個のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を表す、前記キメラペプチド;b5フルオロウラシル、エトポシドを含む群から選択される治療的活性物質;c医薬として許容し得る担体:を含有する、癌を含む高増殖性疾患の治療のための、抗増殖活性及び細胞傷害活性を有する医薬組成物。前記癌が、結腸直腸癌、腎臓癌、肺癌、乳癌、膀胱癌、膵臓癌、子宮癌、前立腺癌、胃癌及び卵巣癌を含む群から選択されることを特徴とする、請求項1記載の医薬組成物。前記キメラペプチドが、長さ20個のアミノ酸のサイクリンキナーゼp16INK4aのタンパク質インヒビターの機能配列及び長さ16個のアミノ酸のタンパク質Antpの輸送配列を含むことを特徴とする、請求項1記載の医薬組成物。前記キメラペプチドが、長さ20個のアミノ酸のサイクリンキナーゼp16INK4aのタンパク質インヒビターの機能配列及び長さ11個のアミノ酸のタンパク質Tatの輸送配列を含むことを特徴とする、請求項1記載の医薬組成物。前記キメラペプチドが、長さ8個のアミノ酸のサイクリンキナーゼp21CIPKIPのタンパク質インヒビターの機能配列及び長さ11個のアミノ酸のタンパク質Tatの輸送配列を含むことを特徴とする、請求項1記載の医薬組成物。前記キメラペプチドが、配列番号3のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項1記載の医薬組成物。前記キメラペプチドが、配列番号4のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項1記載の医薬組成物。前記キメラペプチドが、配列番号7のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項1記載の医薬組成物。前記組成物が、最大400mgkgまでの量の該キメラペプチドを含有することを特徴とする、請求項1記載の医薬組成物。癌治療のための医薬品の製造のための、請求項1記載の医薬組成物の使用。前記癌が、結腸直腸癌、腎臓癌、肺癌、乳癌、膀胱癌、膵臓癌、子宮癌、前立腺癌、胃癌及び卵巣癌を含む群から選択される、請求項11記載の使用。請求項1記載の医薬組成物を治療上許容し得る投与量で、そのような治療を必要とする哺乳動物へ投与することを含む、癌を治療する方法。前記癌が、結腸直腸癌、腎臓癌、肺癌、乳癌、膀胱癌、膵臓癌、子宮癌、前立腺癌、胃癌及び卵巣癌を含む群から選択される、請求項13記載の方法。本発明者らは、異なるインターナリゼーション可能な配列及びサイクリンキナーゼの阻害に寄与する機能性基を含む6種のキメラペプチドの特性を研究した。インターナリゼーション可能なベクターとして、本発明者らは、タンパク質アンテナペディアの配列及びインターナリゼーション可能な配列Tatを使用した。アンテナペディアは、ミバエドロソフィラメラノガステルにおいて触覚形成の形態形成機能を発揮する。これは、HIVウイルスが引き起こすAIDSにおいてトランスアクチベーター機能を発揮するタンパク質である。機能性基として、本発明者らは、サイクリンDキナーゼインヒビターであるタンパク質p16INK4aの配列及びサイクリンキナーゼインヒビターp21の機能断片と高度な相同性を有するPVKRRLDL配列を調べた。これらの配列のほとんどは、固相合成により入手し、1つの配列は、遺伝子操作により入手する。このペプチドは、文献によるといかなる機能も有さない、アンテナペディアタンパク質の44個のアミノ酸の挿入断片に起因した輸送機能を有する比較的長い断片により特徴付けられる。大腸菌において発現されるタンパク質の最小サイズに関する実践上の制約の結果、このペプチド配列長を増大する必要がある。試験した細胞内ペプチドの主張された効果はサイクリンキナーゼの阻害であるので、本発明者らは、92位でチロシンがアラニンにより置換されたタンパク質p16INK4aのアナログ配列を含む対照ペプチドを合成した。Ferouseらによる先行する研究が、91位又は92位のアミノ酸の置換は、p16INK4a配列に特徴的であるこのペプチドの阻害機能の喪失を生じることを示していたので、この置換を選択した。本発明の目的のひとつは、機能性基の位置及びペプチドサイズのそれらの生物活性に対する影響を調べることであった。この目的のために、3種のpAntpp16ペプチドを合成した。ペプチドpAntpp16は、機能性基p16INK4aの位置を特徴とし:ペプチド1-p16INK4aは、分子のC末端に位置し、ペプチド2-p16INK4aは、N末端に位置し、これらのペプチドは固相合成により入手する。遺伝子操作により作製したキメラペプチドpAntpp16において、機能性基p16INK4aは、N末端に位置するが、44個のアミノ酸の挿入断片を有する。加えて、本試験は、p16及びp16細胞培養物を含んだ。使用した細胞株におけるp16及びp53遺伝子発現は、表2に示している。細胞傷害効果は、p16発現とは無関係であった。ペプチドの細胞への浸透を記録し、且つ蓄積の動態を調べるために、本発明者らは、蛍光標識フルオレセインイソチオシアネートに複合された同一のキメラ配列を使用した。FITC分子のポリペプチド産物への封入は、その物理化学特性の実質的変化及び生理活性の喪失につながることが多いので、リジン分子を、単独のFITC分子を保持する当初の配列へ、N末端で追加した。蛍光顕微鏡法は、試験したペプチドは、細胞へ結合し、且つ細胞株Raji、Jurkatt、A549、HEK293及びヒト末梢血リンパ球へ浸透することを示した。本発明者らは、フローサイトメトリーにより、ペプチドの細胞への結合、及び細胞内のペプチドの蓄積を示すトリパンブルーによる蛍光消光作用の不在を示した。細胞内のペプチド蓄積に関する最も客観的なデータは、レーザー走査型顕微鏡法を用い入手した。フルオレセインイソチオシアネートで標識したタンパク質は、09NaClに溶解した。A549、HEK293細胞株を、滅菌スライド上で増殖させ、且つ顕微鏡接眼レンズの直接下側の特別なチャンバー内に配置した。次に培地を、被験タンパク質を含む培地により交換した。該タンパク質による飽和を、経時的に観察した。加えて本発明者らは、該ペプチドの局在化を決定するために、細胞の層毎の走査を行った。この倍率で得られた画像の解析は、細胞中のpAntpp16タンパク質の予めの位置を明らかにしなかった。明らかに該タンパク質は、細胞コンパートメント内に均一に分布している。該タンパク質の細胞への浸透は、十分迅速である。15分間インキュベーションすると直ちに、細胞内空間内のその比較的均一な分布を観察することができる。ヒト末梢血リンパ球及びリンパ球細胞株におけるペプチド浸透速度を、フローサイトメトリー法を用い概算した。この方法は、本発明者らが経時的に大きい細胞濃度を調べることを可能にし、且つ被験ペプチドの浸透速度の概算に便利である。本発明者らは、pH75及びpH60でのタンパク質p16pAntpFITCの影響下でのリンパ球の蛍光を測定した。この方法の原理は、より低いFITC蛍光量子は、より酸性のpHを持つ溶液中で生じることを基にしている。この測定速度は十分に速いので、細胞内のpHは変化することはできない。リンパ球は、ペプチドと一緒に1~15分間インキュベーションし、その後20倍容量のpH60及びpH75のリン酸緩衝液をそれらに直ちに添加した。これにより本発明者らは、蛍光強度の差異を概算した。大半の測定において、蛍光強度は、15分間のインキュベーション後には有意に変化しなかった。従って15分間のインキュベーション後、該ペプチドは、細胞内に完全に浸透したと推定することができる。細胞内部のペプチドの蓄積速度を試験するために、本発明者らは、フローサイトメトリー法を使用した。この目的のために、FITC標識されたペプチドを、フローサイトメーター測定チューブに直接注入し、これは本発明者らが細胞蛍光の動態を記録することを可能にした。本発明者らは、フィコール勾配で単離した健常ドナー由来の血液白血球の単核画分を調べた。本発明者らは、短い遅滞相の後、正常なリンパ球の細胞内の該ペプチドの迅速な蓄積が存在することを認めることができた。最終濃度には、~1分に等しいの時間で到達する。図3は、単に細胞中のキメラタンパク質の蓄積のキネティックスを反映している曲線のフラグメントを示している。このキネティックス曲線は、下記のタイプの検出力関数により最も良く説明され:C=定数1-定数2×t2定数3これは回帰係数を反映している。ペプチド蓄積の同様のキネティックスを、悪性リンパ腫の細胞について入手した。モデルとして、本発明者らは、Jurkat細胞株及びバーキットB細胞リンパ腫を起源とするRaji細胞株を試験した。図4は、Jurkat細胞におけるFITC標識されたペプチド蓄積の動態を示している。上記図は、腫瘍細胞中のペプチド浸透も高速であることを示している。最高濃度までの時間は、1分間未満である。この蓄積のキネティックスは、室温で調べた。試験したペプチドのクラスの浸透のメカニズムは今のところ不明であることは強調されるべきである。しかしこの蓄積は、5°Cであっても同等に有効であることが示されている。これは、細胞内のエネルギー消費とは無関係であり、細胞受容体により媒介されず、且つこれは、貪食作用経路及び飲作用経路を使用しない。本発明者らは、異なる温度でのインターナリゼーション可能な断片を含む合成ペプチドの蓄積の事実も確認した。本発明者らは同じく、細胞内に蓄積されたペプチドの量のその細胞外濃度への依存性も調べた。図5及び図6は、細胞外濃度に依存する細胞蛍光強度の変動を示す。図6は、同じデータを示し、細胞外濃度、対、細胞内濃度の比は線形であるという事実を図示している。調べたペプチドは、細胞膜を両方向に横断することができるので、蓄積された細胞ペプチドは、細胞外濃度が低下するにつれて細胞を離れることができるということを推定することができる。細胞からのペプチド排出プロセスの研究は、別の試験の主題であろう。従って、本実験の結果として、インターナリゼーション可能な断片及びタンパク質r16GMK4a断片を含むキメラペプチドの蓄積のキネティックスは、C=定数1定数2×t2のタイプの検出力依存性を有することが示された。同じく、正常細胞及び腫瘍細胞における該ペプチドの蓄積動態及び細胞内分布は、蓄積の性質及び速度が異ならないことも示される。サイクリンキナーゼのタンパク質インヒビターを基にしたキメラペプチド構築に関する基本的条件のひとつは、特異的ペプチド断片の証明された阻害特性の存在であった。従って本研究において本発明者らは、そのような配列が説明されているタンパク質p16INK4a及びr21CIRKIPの断片を比較した。遺伝子産物p16及びp21は、サイクリンとサイクリン依存性キナーゼの間の複合体形成のインヒビターであり、従って細胞周期の調節因子である。従って機能性基p16及びp21を持つ外因性キメラペプチドの機能の研究は、増殖活性の試験、及びインターナリゼーションされたペプチドとのインキュベーション時の培養物中のアポトーシスレベルの試験に焦点をあてている。細胞株との実験において、本発明者らは、細胞周期相に従い細胞の分布を評価し、且つ増殖指数を算出した。解析のために、本発明者らは、ソフトウェアFloMax20のビルトイン選択肢及びソフトウェアModfitLT30を使用した。本発明者らはまた、DNAヒストグラム上のプレG1低二倍体ピークのサイズを基に、アポトーシスへ進入した細胞の割合の決定も実行した。実験は、Raji、Jurkatt、A549、HEK293、MCF7細胞株のG1S期で同期した細胞株、及び非同期細胞株の両方で行った。調べたペプチド配列全てに関与するいくつかの予備実験では、100μMに達するペプチドの最適濃度を設定し、これは可能性のある薬物濃度約400mgkgを示唆している。しかし安定した抗増殖効果が、試験した全ての細胞株において濃度40μMで既に認められ、これは該薬物の濃度を増加することにより有意に変化しない。生存細胞数は、50以下には減少しない。所定の濃度及びインキュベーション時間24時間でのアポトーシス性粒子の数は、約40であり、且つ濃度を最大50μMまで上昇させた場合、60に増加する。図10及び図11は、抗増殖効果及び細胞傷害効果は、濃度依存性であることを示している。最大5μMの低い濃度で、該薬物の効果は非常に低いが、前述のように、該ペプチドは細胞外濃度01μMで細胞に浸透することができる。従って選択された濃度は40μMと等しく、これは前記必要要件を満たし、調べたペプチド全てについて適しているであろう。ペプチド効果の試験を、移植可能な細胞培養物について行った。特異的細胞内調節因子の発現の変化を試験するため、及び本実験の可視化を向上するために、細胞を予め同期した。同期方法に応じて、細胞培養物を、細胞周期のG0G1期、S期及びG2M期に捕捉する。図12は、異なる細胞周期相における細胞の分布が、G0\G1期で同期された培養物中で同期ブロックの離脱後どのように変化するかを示している。0時に、ほとんどの細胞は、G0\G1期にあり、S期及びG2\M期は各々15及び8であり、その後本発明者らは、G0\G1期の減少と、同時のS期の成長を認めることができ、一定時間経過後に、C2\M期の細胞の割合は増加し始める。同期ブロックの脱出の特徴は、全ての調べた細胞培養物について定型的であり、全ての被験細胞の倍加時間は約24時間であったことも注記されるべきである。得られた結果の評価の第一段階で、本発明者らは、異なる活性中心-p16INK4a及びr21CIRKIPを有するインターナリゼーション可能なキメラペプチドの効果を調べた。試験したキメラペプチドは、同期ブロック除去の時点で添加した。細胞周期分析は、ブロックの除去後、2時間毎に24時間行った。これらのペプチドの抗増殖活性の試験において、本発明者らは、p16INK4a活性中心を持つペプチドは、細胞周期のG0G1期における細胞の停止を引き起こすことを確立した。この効果は、培地枯渇法による同期法を用い、G0期において同期した細胞培養物においてより明確に認められる。同期ブロックの除去後の最初の細胞分裂の期間のみ記録している。図13は、対照において、増加したS期が同期因子の離脱後4時間で認められること、及び減少したG0G1期が認められることを示している。p16活性中心を持つキメラペプチドの添加後、G0G1期の減少及びS期の増加は対照よりも遅く起こり、G0G1期はインキュベーション後6時間で減少し始め、目視できるS期の増加はインキュベーション後8時間で認めることができる。キメラペプチドp21CIPKIPの試験において、対照試料におけるG0G1期の変化は、該ペプチドを持つ試料のものと異ならないが、対照試料中のS期のレベルは既にインキュベーションの10時間後には減少し始め、14時間のインキュベーションで平均45であるのに対し、被験試料中の高レベルのS期が、インキュベーションの14時間にわたり存在し続けることがわかった。該ペプチド試料中のG2M期レベルは、平均18~20時間のインキュベーション後に、及び対照試料において10~12時間後に、最大値に到達する。従って、活性中心p21CIPKIPを持つペプチドの主要な抗増殖効果は、S期からG2M期への細胞の移行の停止であると結論付けることができる。p16INK4a断片を含むキメラペプチドの場合のように、Tatp21ペプチドにより誘導された効果をより良く例示するために、本発明者らは、減らした培地におけるG0期での同期を選択した。図13及び図14に認められるように、ある時点で、本発明者らは、対照試料と実験試料における細胞周期相の間の最大差を決定することができる。被験ペプチドに関して、最大差の時間は、同期ブロックの除去後8~12時間であった。細胞内の該ペプチドの蓄積が細胞外培地への該ペプチドの添加後最初の数分以内に起こるとするならば、この観察された効果は、宿主細胞ゲノムに対する該キメラペプチドの活性中心の衝撃点に起因するものであると推定することは可能である。p16活性中心を持つペプチドに関して、最大差は、8~10時間のインキュベーション時点で認められ、p21活性中心を持つペプチドに関しては10~12時間で認められた。恐らく、この小さい差異は、前述のように、p16は、G1-S期移行の停止を引き起こし、及びp21は、S-G2M期移行を停止するという事実に起因する。抗癌剤開発の主要な傾向のひとつは、腫瘍細胞においてアポトーシスを選択的に誘導することができる薬物の検索である。アポトーシスは、遺伝子制御されたプロセスである。数多くの研究が、アポトーシスへの細胞移行の、細胞増殖相の経過中の制御ポイントのひとつを超えることの不能との関係を示している。本発明者らは、調べたキメラペプチドは、様々な細胞株においてアポトーシスの活性化が可能であることを示した。活性部位の構造に左右される細胞傷害効果の差異を調べる一方で、本発明者らは、タンパク質p16INK4aの機能配列を含むキメラペプチドは、配列p21CIPKIPを含むペプチドと比べ、より顕著な細胞傷害効果を有することを認めた。Tatp21ペプチド及びTatp16と一緒のpAntpp16ペプチドをアポトーシスの平均値について比較する場合、対照試料とTatp21ペプチドを含む試料の間に有意差は存在しないことがわかった。アポトーシスレベルの分析はペプチドとのインキュベーション時間に左右されるので、p16INK4a活性中心を持つペプチドに関して、本発明者らは、インキュベーション時間への、アポトーシスレベルの依存性を確立した。p21断片を持つキメラペプチドの場合、この依存性は認められていない。図17に認められるように、p16断片を含むペプチドの試験におけるアポトーシスレベルは、8~10時間のインキュベーションで最大値を有し、従ってこれにより引き起こされたG1-S期移行の停止と同時期に起こる。本発明者らは、2種類のペプチド輸送体Tat及びpAntpを試験した。これらのベクターの構造及び特徴は、背景の項で考察している。本発明者らは、p16INK4a活性中心を有し、且つ異なる種類のベクターTat及びpAntpを有するキメラペプチドを調べた。ベクターの種類の細胞増殖プロセスに対する影響を調べる一方で、調べたTatpl6及びpAntppl6は、同じ細胞周期相に影響を及ぼし、G1-S期移行の停止を引き起こすことがわかった。図18に認められるように、細胞周期相における細胞数の依存性のプロットは、p16断片を保持する2種類のペプチドベクターについて見た目は類似している。被験ペプチドを添加せずに同期した細胞培養物である対照試料において、G0G1期の細胞数は、同期ブロックの除去後2時間と早くに減少し始め、且つ10時間後、本発明者らは、G0G1期の細胞の最低数を記録した。対照試料中のS期は、同期ブロック除去後4~6時間で増加し始め、12時間後に最大に到達する。キメラペプチドを含む試料において、図18に認められるように、G0G1期停止が存在する。従って、pAntpp16ペプチドと一緒にインキュベーションした場合、G0G1期レベルは、6~8時間のインキュベーション後減少し始め、14時間後に最低レベルに到達するのに対し、S期のレベルは10時間のインキュベーション後増加し始める。キメラペプチドTatp16の場合、S期の増加及びG0G1期の減少における明らかな移行は存在しない。G0G1期は、対照試料におけるG0G1期と同時に減少し始めるが、そのレベルは、対照よりもよりゆっくりと減少する。Tatp16被験ペプチドを含む試料におけるS期は、12時間のインキュベーション後増加し始め、且つペプチドとの14時間のインキュベーション後最大となる。対照試料において、最大S期は、同期ブロックの除去後12時間で検出される。pAntpp16及びTatp16は、同じ細胞増殖の遅延を誘導し、対照試料と被験試料の最大差は、約12時間のインキュベーションに相当する。対照群におけるこの時間間隔は、G1-S期の移行を反映している。従って、本発明者らは、p16INK4a活性中心を持つキメラペプチドの場合、そのベクター構造は、ペプチドの抗増殖効果に影響を及ぼさないと推定することができる。ペプチドベクター構造の細胞傷害効果に対する効果を評価する場合、本発明者らは、pAntpp16キメラペプチドの場合、試料中のアポトーシスレベルは、Tatp16ペプチドとのインキュベーションよりもより高いことを認めた。キメラペプチドの培養物への添加により誘導可能なアポトーシスは、細胞株及び対照試料におけるアポトーシスに依存している。細胞株A549及びMCF7において、対照試料中のアポトーシスレベルは5レベルであるのに対し、キメラペプチドAntpp16とのインキュベーションは、これを平均25まで増加した。Raji株、Jurkat株の対照試料において、アポトーシスレベルは12であったが、該ペプチドを含む試料において、これは35であった。HEK293細胞株において、対照試料中のアポトーシスは、最高レベルを有し約20であり、HEK293細胞株のAntpp16キメラペプチドとの24時間のインキュベーション時に、アポトーシスは60まで増加する。ペプチドの濃度は、40μMであった。Y軸-アポトーシス性粒子の割合。図20及び図21は、pAntpp16及びTatp16の両方は、対照試料中よりもより多くの数の細胞のアポトーシスを誘導することを示している。これらのペプチドを含む試料における最大アポトーシスレベルは、24時間のインキュベーション後に認められたが、そのアポトーシスレベルは、インキュベーション時間に応じて増加するにもかかわらず、アポトーシス性粒子の数の増加は均等には起こらないことが認められた。試料のペプチドとのインキュベーション時間に依存しているアポトーシスレベルの変化の試験において、本発明者らは、アポトーシス体の形成増加により特徴付けられる時間間隔を検出した。従って同期した細胞培養物HEK293のキメラペプチドpAntpp16とのインキュベーション時に、アポトーシス増加を伴う時点は、2時間及び10時間のインキュベーションであるのに対し、ペプチドTatp16とのインキュベーション時には、そのような時点は、6時間及び16時間のインキュベーションである。アポトーシス増加を伴うこれらの時間間隔の存在は、試験した全ての培養物について特徴的であり、且つこれらの腫瘍細胞培養物の高アポトーシスは、ほぼ同じ時間間隔で配置され、及びアポトーシスレベルが異なる。A-同期ブロックの除去後、及び被験ペプチドの添加後、G0G1期で同期されたHEK293細胞株。B-同期ブロックの除去後、及び試験されるべきペプチドの添加後、G0G1期で同期されたA549細胞株。X軸-インキュベーション時間。Y軸-アポトーシス性粒子の数、。本発明者らは、p16INK4a活性中心及びpAntpベクターを含むキメラペプチドの3つの型を使用した。これらのキメラペプチドは、分子のNC末端に対する活性中心の位置、及び遺伝子操作法により作製されたペプチド3について44個のアミノ酸の挿入断片の存在が異なる。これらのペプチドの特性の試験において、本発明者らはまた、同期及び非同期細胞培養物も調べた。同期された培養物において、該ペプチドは、同期ブロック除去の時点で添加し、非同期においては、単層密度が~50で添加した。ペプチドpAntpp16INK4aに関する細胞周期相に従う細胞分布の変化を反映している結果を、図22及び図23に示している。図26に認められるように、対照ペプチドpAntpzamの同期及び非同期細胞への添加時には、被験試料中の細胞周期相の変化は、対照と異ならない。断片p16INK4aを含むキメラペプチドの添加も、予想された細胞分裂阻害効果を誘導することに失敗している。同期及び非同期の両培養物について、細胞周期相に従う細胞分布は、対照と比べて異ならない。しかしペプチド2及びペプチド3の添加は、S期における細胞数の顕著な減少を引き起こすのに対し、G01期における増加も引き起こす。この傾向は、同期された培養物に関する実験においてより顕著である。細胞株A549について実行した実験は、被験ペプチド全てについて同様の細胞周期の変化を明らかにした。これらの結果は、キメラペプチドpAntpp16INK4aは、細胞に対する抗増殖効果を有さないことを指摘している。同時にキメラペプチドpAntpp16INK4aの添加は、細胞に対する抗増殖効果を有し、且つG1期における細胞の増加につながっている。キメラペプチド1の添加後細胞分裂阻害効果が存在しないことは、恐らく該キメラペプチドのN末端のインターナリゼーション可能な配列pAntpの位置に起因する該ペプチド分子の高次構造変化によるものであろう。本発明者らは、研究の次の局面において、ペプチドベクターpAntpを持つキメラ被験ペプチドにより発揮される細胞傷害効果の依存性を評価した。アポトーシスレベルを決定する実験は、細胞株A549、HEK293及びMCF7について実行した。細胞を、10FSBを含有するDMEM培地において標準技術により培養した。これらの細胞の一部は、予め、二重チミジンブロック法及び培地枯渇による同期法を用い同期させた。キメラ被験ペプチドpAntpp16を、培養培地に添加した。陰性対照として、本発明者らは、ペプチドpAntpzamにより処理した細胞を使用した。図24、図25からわかるように、アポトーシスレベルは、対照ペプチドpAntpzamの添加により影響を受けないが、pAntpp16の添加は、アポトーシスに進入した細胞の数を顕著に増加する。これにより、細胞型により左右される効果の大きさの差異は、明らかにならなかった。HEK293細胞株におけるアポトーシスレベルへのペプチドpAntpp16の1及び2の効果の比較を、図26に示している。図26は、pAntpp16濃度からのアポトーシス体の数の検出力依存性を示している。キメラペプチドの添加下でのアポトーシスレベルの比較は、ペプチド2の添加の場合のアポトーシスレベルが、キメラペプチド1による実験におけるアポトーシスレベルよりもほぼ2倍高いことを示した。より顕著な細胞傷害効果が、同期した培養物について認められた。従って、断片p16INK4aを含むキメラペプチドpAntpの1及び2は、細胞培養物に対し顕著な細胞傷害効果を有することがわかった。キメラペプチドpAntpp16の1及び2の細胞傷害効果及び細胞分裂阻害効果を比較する場合、キメラペプチド中のインターナリゼーション可能な配列pAntpの位置のC末端からN末端への変化は、細胞分裂阻害効果の消失及び細胞傷害効果の低下につながると結論づけることができる。本試験の目的のひとつは、被験ペプチドの抗増殖効果が、それらの構造内のサイクリンキナーゼインヒビターの断片による特異的作用に関連していることを証明することであった。文献は、サイクリン依存性キナーゼのリン酸化機能についてそのようなペプチドの阻害特性の保持を説明しているが、これらのデータは、細胞抽出物から得られたものである。本発明者らは、対応するタンパク質インヒビターp21及びp16INK4a由来の配列を阻害することを含む、被験ペプチドに対するサイクリンDキナーゼの分子標的であるpRBのリン酸化レベルの変化の試験を実行した。細胞自身のp16INK4aの活性化は、pRbのリン酸化の阻害につながる。リン酸化不良であるpRbの蓄積は、E2F1の阻害に繋がり、且つサイクリンA及びBの発現を減少し、これは細胞周期中断の重要な機構のひとつである。p16の活性は、リン酸化されたpRbの量に関して測定することができる。フローサイトメトリー法は、pRb生成物がリン酸化不良である状態にある細胞を可視化することができる。蛍光標識した抗体は、リン酸化不良であるpRbと反応する。図27のAは、非特異的蛍光を除外するように指定されたアイソタイプ対照を示し、Bは、一部のpRb細胞がリン酸化不良である状態にある対照試料を示す。リン酸化不良であるpRbの量を決定するために、本発明者らは、同期ブロックの除去後に培地枯渇法により同期した細胞培養物へのキメラ被験ペプチドの添加、及び2時間毎の細胞の収集による一連の実験を実行した。各プレートからの細胞の一部を固定し、更に細胞周期相を規定し、且つ一部は、材料及び方法に記載した手順により固定し、リン酸化不良であるpRbの量を決定した。同じく、同期した細胞であるがペプチドを添加していない試料を、陰性対照として使用した。キメラペプチドの細胞培養物への添加は、pRbのリン酸化を阻害し、且つ培養物中のその最高レベルを低下することが示されている。図28からわかるように、リン酸化不良であるpRbの初期レベルは、対照試料と被験試料においてほぼ同じであるが、キメラペプチドを添加しない試料において同期ブロックの除去後、そのレベルは上昇し始め、ある時点までに、細胞株に応じた最高値に到達し、その後下降し始める。キメラペプチドを含む試料において、リン酸化不良であるpRbのレベルは、より遅く増加し始め、8時間のインキュベーション後にそのピークに到達し、そのためこの値は対照試料中よりもより低い。pPBのリン酸化は、サイクリンA及びB発現の活性化の、並びに細胞周期のG1期からS期への細胞移行の開始段階であることがわかっている。定量的PCR法を使用し、Tatr16ペプチドに曝露した場合のサイクリンBのmRNA発現レベルを調べた。この目的のために、Tatp16キメラペプチドを濃度40μmolで添加した、同期した培養物に関する実験時に、本発明者らは、RNA抽出のための試料からの細胞の並行選択を行ったが一方、これらの細胞の一部は細胞周期相の決定のために役立てた。RNA単離及び定量的PCR反応設定に関与した材料の更なる処理は、プロトコールに従い実行した。図29は、定量的PCR法により得られたサイクリンBmRNAの量の変化を示し、これは、サイクリンBの発現レベルの変化を反映している。これはまた、フローサイトメトリーにより得られた細胞周期のG2M期の細胞数の変化を示している。図29から、キメラペプチドTatp16は、サイクリンBの発現を阻害し、従ってS-G2期移行を停止することを理解することができる。図14Bに示された結果から、対照試料中のG2期の細胞数は、12時間のインキュベーション時にその最高を有するのに対し、該ペプチドを含む試料については、G2期の増加は、16時間のインキュベーション後にのみ生じることがわかる。図Aは、サイクリンBの発現レベルの変化を示し、同じく対照は、12時間で最高を有し、これはG2期における細胞の最高と同時に起こることがわかる。Tatp16ペプチドを含む試料において、発現レベルは、16時間のインキュベーション後に増加する。ペプチドの添加は、サイクリンB発現の遅延を生じる。従って、観察された細胞傷害効果は、pPBのリン酸化プロセスに対する影響、及び結果としてのサイクリン発現の阻害に対する影響に起因するものであることが確認された。臨床実践において、化学療法薬としての細胞分裂阻害は、癌治療において一般的に使用されている。それらの効果は、それらの影響下にある細胞は、特定の細胞周期相に捕捉され、且つその周期相における細胞傷害活性を持つ薬物の投与との組合せは、非常に多数の細胞の死滅を可能にするという事実を基にしている。本キメラ被験ペプチドは、細胞分裂阻害活性及び細胞傷害活性を明らかにしている。更に細胞分裂阻害活性は、特異的であり、且つ細胞のゲノムに対する該ペプチドの直接効果の結果である。しかし先に示したように、該キメラペプチドの細胞培養物に対する効果は、治療上重大な結果を提供するには十分ではない。結果として、インターナリゼーションされたペプチドと化学療法薬の組合せ効果を試験することが提唱された。本発明者らは、臨床実践において使用される細胞周期に影響を及ぼす下記の化学療法薬を調べた:細胞周期のG2M期停止を引き起こすタキソール、S期停止を引き起こすエトポシド、及びG0G1期停止を引き起こす5フルオロウラシル。化学療法薬とキメラペプチドの組合せ作用に関する最も情報に富む結果は、ペプチドpAntpp16により得られた。細胞株HEK293及びA549に関する予備実験において、本発明者らは、各被験薬物に特異的な相における細胞周期停止の予想される効果を認め、且つ最適濃度を選択し、このことは、細胞の全体の破壊を引き起こすことなく該効果を得ることを可能にした。全ての薬物に関して、この濃度は100nMであった。前記化学療法薬とキメラペプチドpAntpp16の組合せ効果の研究において、細胞分裂阻害効果の増強が、5フルオロウラシル及びエトポシド製剤について認められ:各々、G0G1期及びS期を増加する。細胞のタキソールとpAntpp16との同時インキュベーション時に、本発明者らは、タキソールを含む試料と比べG2M期の減少、G0G1期の増加、及び増強された細胞傷害効果を認めた。図30は、化学療法薬と被験ペプチドの組合せ作用の細胞周期相における変化を示している。化学療法とキメラ被験ペプチドの組合せ使用は、細胞傷害効果を増強したことも示された。細胞の化学療法用薬物及びキメラペプチドとのインキュベーション時には、化学療法薬によってのみ治療した試料におけるアポトーシスレベルと比べ、アポトーシスレベルの上昇が存在する。本発明者らは同じく、細胞死のレベルも検出し、これはGoryaevチャンバーを用い試料中の生存細胞の量を基に算出した。死滅した細胞のレベルは、化学療法用薬物及び被験ペプチドと一緒にインキュベーションした試料において増加する。図31は、化学療法薬とpAntpp16キメラペプチドの組合せ使用の細胞傷害効果の結果を示している。化学療法薬と被験ペプチドpAntpp16の組合せ効果の試験において、被験化学療法用薬物の細胞傷害活性の有意な増強が存在することがわかった。組合せた細胞傷害効果は、化学療法の細胞傷害効果の性質と直接相関している。無胸腺マウスを、インターナリゼーション可能なキメラペプチドP16Antpの抗腫瘍活性の研究に、使用した。このマウスには、ヒト腫瘍細胞培養物であるA549株及びHCT116株を、マウス1匹につき細胞約100万個の量で移植した。マウス39匹に、A549細胞を移植し、そのうちの20匹のマウスは対照群を形成し、後にプラセボを受け取った。10匹のマウスは、第1の処置群を構成した。これらには、触手可能な腫瘍の形成後、被験ペプチド投与量01mgを腫瘍へ直接注射した。9匹のマウスは、第2の実験群であり、これらも同じく、移植4日目に腫瘍部位の形成後に、腫瘍内部へと該ペプチド02mgを注射した。実験群のペプチドは、2日に1回注射した。実験は、24日間続けた。実験群において、本発明者らは、減少した腫瘍成長を認め、且つ該ペプチド投与開始後6日目に、実験群において、対照群と比べ腫瘍容積の有意な減少を認めることができた。実験は、24日間続けた。本発明者らは、この期間中に、実験群において該キメラペプチドの10回の注射を行った。対照群においては、実験24日目の、マウスの平均腫瘍容積は9524mm3であり、マウス1匹が死亡した。第1の実験群において、平均腫瘍容積は3929mm3であり、マウス1匹が死亡した。第2の実験群において、平均腫瘍容積は5751mm3であったが、死亡した動物はいなかった。移植したヒト培養物HCT116をマウスへ投与した場合にも、動物を2群に分けた:被験ペプチドを連続投与されない10匹のマウスの対照群、及び腫瘍部位への投与量01mgのキメラ被験ペプチドp16Antpにより処置された試験群。実験は28日間続け、11回のペプチド注射を試験群に行い、1回目の注射は、腫瘍細胞移植後6日目に行った。HCT116細胞の腫瘍小結節は、大きいサイズ及び潰瘍の存在により特徴付けられる。対照群において、実験の28日目に、平均腫瘍容積は679mm3に達し、この実験中にマウス3匹が死亡した。試験群において、より遅い速度の腫瘍成長が認められ、この実験の28日目の平均腫瘍容積は2254mm3であり、実験群の死亡した動物の数は2匹であった。図32は、被験ペプチドの7回の注射後の異なる群由来のマウスの対を示している。実験群において腫瘍小結節の有意な縮退が認められる。従ってキメラペプチドp16Antpの局所投与は、ヒト腫瘍の実験モデルの有意な成長阻害につながる。本発明者らは、インターナリゼーション可能な断片Antp及びサイクリンキナーゼインヒビターp16INK4aの機能断片を含むキメラペプチドの抗腫瘍活性を調べた。固相合成法を用い、ペプチドp16Antpの150mgを合成した。ヒト腫瘍に対する効果を試験するために、本発明者らは、短期培養物法を使用した。短期培養物は、手術標本から入手した。該培養物の調製のための領域の採取は、手術後できるだけ早く、病理学者の参加の上で実行した。摘出した組織部分は、平均15cm3と測定した。該組織を、機械的に粉砕させ、細胞懸濁液を、5FBSを含有するRPMI培地中に配置した。37°C及び5CO2で24時間インキュベーションした後、培地を、キメラペプチド含有する培地と交換するか、又はこれをタキソール濃度100nM又は500nMと交換し、多くの実験についてペプチドとタキソールの両方を含有していた。対照試料において、培地は、新鮮な培地と交換した。記録した最初の時点は、0時であった。インキュベーションは、37°C及び5CO2で24時間行い、多くの実験についてインキュベーション時間は24時間及び48時間であった。結果は、アネキシンVPIによる試料の二重染色を用いるフローサイトメトリー及びPIによる固定された材料の染色により評価した。本発明者らは、アネキシンVについて陽性の粒子のレベル、アネキシンVPI二重標識について陽性の粒子のレベル、PI取込みが可能な非固定試料中の粒子の量、細胞周期相における細胞の分布、サブ二倍体ピークのレベルを評価した。上皮細胞のアポトーシスを検出するために、本発明者らは、サイトケラチンFITCPI抗体の二重染色を用いた。合計126の組織試料を分析した:その中の63は、病理組織試料であった。63の病理標本のうち、悪性腫瘍発生の47の腫瘍を調べた。本発明者らは同じく、線維腺腫組織試料、更には単純乳管過形成を伴う乳房組織試料7を試験した。これらのアポトーシスレベルを、濃度40μMのペプチドの添加後24時間及び48時間で分析した。本実験の一部は、腫瘍細胞に対する、従来の化学療法用薬物とペプチドp16Antpの組合せた細胞傷害効果を調べるために実行した。ペプチドpl6Antp細胞傷害活性に関する結果のまとめを、表3に示している。これらの結果の分析は、ペプチドp16Antpの細胞傷害効果に最も感受性のある癌型は、腎臓癌、乳癌、胃癌、及び膀胱癌であることを示している。膀胱癌の短期培養物は、非常に高いレベルの自発的アポトーシスを特徴としていることは注意すべきである。該ペプチドの添加は、このレベルをわずかに増加させるが、この事実は、該結果を代表的ではないとしている。乳房組織の線維腺腫の試料を調べた。低レベルの自発的アポトーシスを有するこれらの細胞の短期培養物において、p16ペプチドは、有意な細胞傷害効果を有し、且つ24時間後に、平均レベル382から最大80へと、顕著なアポトーシスを誘導した。余り顕著でない細胞傷害効果が、単純乳管過形成の兆候を示す乳癌細胞について認められた。これらの結果は、異常な乳房組織における自発的アポトーシスのレベルに対する増殖活性の比の研究に関する該著者により得られたデータと一致している。自発的増殖のアポトーシスに対する比は、線維腺腫組織について最高であり、乳癌細胞が二位であり、これに単純乳管過形成及び正常乳房組織が続くことが示された。増殖のインヒビターを含むペプチドの細胞傷害効果に対する細胞の感受性を決定する要因のひとつが、細胞分裂の活性である場合、このペプチドp16Antpに対する線維腺腫細胞の感受性は、極めて道理にかなっている。乳房組織における良性増殖プロセスの感受性の観察された効果は、それらの治療に関する有望さであるであろう。移植可能な固形癌の治療に関する該ペプチドの局所投与の結果は、乳房組織の良性増殖プロセスの領域に局所的に投与された場合の、それらの有効性を示唆している。得られた結果は、ペプチドp16Antpに感受性のあるヒト腫瘍の範囲を明らかにしている。乳癌、結腸直腸癌、胃癌、膀胱癌、腎臓癌のようなそのような位置は、本被験ペプチドの細胞傷害作用の更なる研究に関する標的として有望であることがわかった。入手可能な文献においては、該ペプチドの分析したヒト腫瘍に対する効果に関するデータはないので、これらの結果は新規である。