"クロメ由来のフロロタンニン類を有効成分とすることを特徴とする紫外線照射障害保護剤。クロメ由来のフロロタンニン類が、クロメのエタノール水溶液抽出物である請求項1に記載の紫外線照射障害保護剤。エタノール水溶液が、エタノール濃度40~80v/vの水溶液である請求項2に記載の紫外線照射障害保護剤。クロメ由来のフロロタンニン類が、クロメのエタノール水溶液抽出物をさらに溶離液としてエタノール水溶液を用いてカラム分画した画分である請求項2または3に記載の紫外線照射障害保護剤。溶離液としてのエタノール水溶液が、エタノール濃度20~60v/vの水溶液である請求項4に記載の紫外線照射障害保護剤。下記化学構造式:から選択されるクロメポリフェノールを含有する請求項1ないし5のいずれかに記載の紫外線照射障害保護剤。皮膚を紫外線照射傷害から保護する機能を有する請求項1から6のいずれかに記載の紫外線照射障害保護剤。皮膚が皮膚繊維芽細胞である請求項7に記載の紫外線照射障害保護剤。請求項1から8のいずれかに記載の紫外線照射障害保護剤を含有することを特徴とする皮膚外用剤。請求項1から8のいずれかに記載の紫外線照射障害保護剤を含有することを特徴とする化粧料。上記化粧料が、日焼け止め材料である請求項10に記載の化粧料。紫外線照射保護作用を有する化合物は従来数多く知られ日焼け止め剤などとして使用されてはいるが、本発明は、天然由来の紫外線照射障害保護作用を有する物質を新たに見出したものであり、クロメ由来のフロロタンニン類を有効成分とする紫外線照射障害保護剤を提供するものである。本発明は以下の1ないし8の紫外線照射障害保護剤を要旨とする。1クロメ由来のフロロタンニン類を有効成分とすることを特徴とする紫外線照射障害保護剤。2クロメ由来のフロロタンニン類が、クロメのエタノール水溶液抽出物である上記1に記載の紫外線照射障害保護剤。3エタノール水溶液が、エタノール濃度40~80v/vの水溶液である上記2に記載の紫外線照射障害保護剤。4クロメ由来のフロロタンニン類が、クロメのエタノール水溶液抽出物をさらに溶離液としてエタノール水溶液を用いてカラム分画した画分である上記2または3に記載の紫外線照射障害保護剤。5溶離液としてのエタノール水溶液が、エタノール濃度20~60v/vの水溶液である上記4に記載の紫外線照射障害保護剤。6下記化学構造式:から選択されるクロメポリフェノールを含有する請求項1ないし5のいずれかに記載の紫外線照射障害保護剤。7皮膚を紫外線照射傷害から保護する機能を有する上記1から6のいずれかに記載の紫外線照射障害保護剤。8皮膚が皮膚繊維芽細胞である上記7に記載の紫外線照射障害保護剤。また、本発明は以下の9の皮膚外用剤および以下の10および11の化粧料を要旨とする。9上記1から8のいずれかに記載の紫外線照射障害保護剤を含有することを特徴とする皮膚外用剤。10上記1から8のいずれかに記載の紫外線照射障害保護剤を含有することを特徴とする化粧料。11上記化粧料が、日焼け止め材料である上記10に記載の化粧料。本発明のクロメ由来のフロロタンニン類を含有する紫外線照射障害保護剤は、紫外線照射障害保護剤として市販の保護剤よりも優れた効果を発揮するものであり、例えば、皮膚に適用することにより紫外線による皮膚や皮膚繊維芽細胞の損傷を保護することが可能となる。本発明は、クロメ由来の抽出物であるフロロタンニン類を有効成分とする紫外線照射障害保護剤に関するものであり、例えば、紫外線による皮膚の傷害や皮膚繊維芽細胞の障害から保護する効果を有するものである。また、本発明の保護剤は、皮膚外用剤としてヒト皮膚の繊維芽細胞の増殖を促進するのに有効であり、創傷治癒剤、化粧品、浴用剤、繊維芽細胞用培地、食品などの構成原料として用いることができる。[紫外線]太陽から照射される紫外線は、人間の健康や環境への影響と観点から、UVA、UVB、UVCと分類されているが、UVCは大気により吸収されて地上には到達しないので、健康上の理由からは主としてUVAおよびUVBからの保護が重要である。これらの紫外線について説明する。UVAは、地表に到達する紫外線のー種であり、波長320~400nmの紫外線を言う。この紫外線は、肌の奥深く真皮まで届き、肌の弾力の低下やしわ、たるみなど皮膚の老化を促進する。また、強い日ざしを浴びた直後に肌が黒くなり、30分から数時間で消える反応即時黒化はUVAが関係している。これは,皮膚の表皮にある淡色のメラニン色素が濃色のメラニン色素に変化して黒くなる現象である。UVBは、地表に到達する紫外線の一種であり、波長290~320nmの紫外線を言う。大部分が表皮で吸収され,短時間で皮膚に炎症赤み,腫れ,皮膚癌などを起こさせる作用がある。炎症が治まると数日して皮膚のメラニン色素が増加して黒く変化する遅延黒化。黒くなった表皮は,約1ケ月で新陳代謝によってはがれて元の肌色に戻るが、繰返しUVBを浴びることによりしわやしみなどの皮膚老化を促進する。また,皮膚癌を誘発することもある。[クロメ]クロメは、こんぶ目こんぶ科かじめ属の褐藻の一種であり、潮下帯付近の岩に付着して生育する海藻である。藻体の大きさは普通40~50cm、時には1m以上にもなり冬場の藻体は食用になる。その形態は、同属のカジメに似ているが、葉状の部分にしわが生じること、全体的に小型であることなどから区別できる。またアラメとは異なり、茎部が二分岐しない。日本近海では本州太平洋岸の中南部から九州にかけて、および瀬戸内海、日本海に分布する。大形で多年生。芽生えはじめの個体は短い茎に単葉である。フロロタンニン類海藻に含有されるフロロタンニン類としては、図1に示す、No.7=エコールeckol、No.3=ダイエコールdieckol、No.2=8,8’-バイエコールbieckol、No.15=6,8’-バイエコールbieckol、No.6=2-フロロエコールphloroeckol、No.5=フロロフコフロエコールAphlorofucofuroeckolA、No.4=ダイオキシノデヒドロエコールdioxinodehydroeckolが知られている。フロロタンニン類の総量は、フロログルシノールphloroglucinolを標準品としたフォーリンチオカルト法FolinCiocalteu法測定波長は720nmにより測定されるポリフェノール総量で示す。クロメからフロロタンニン類の抽出クロメからフロロタンニン類を抽出する方法を以下に説明する。本発明では、人体への影響、食品、医薬品などへの使用を考慮してクロメからフロロタンニン類を抽出するには食品工業で利用されている溶剤であるエタノール水溶液を使用した。抽出試験には、水、エタノール、およびエタノール濃度20~80v/vの水溶液を使用し、原料のクロメと混合後撹拌することにより抽出を促進させた。撹拌時間と総ポリフェノールの抽出量については図3にみられるごとく、撹拌が長時間であるほど抽出量は増加し、24時間後は全量が抽出されると考えられる。抽出用の溶媒のエタノール濃度については、エタノール濃度が40v/v以上でポリフェノールが抽出され、特に好ましくは、エタノール濃度40~80v/vの範囲であり、さらに好ましくはエタノール濃度50~70v/vの範囲を挙げることができる。以後の抽出条件としては主に70v/vEtOH抽出によったが、これは70v/v濃度EtOHの極性がフロロタンニン類の抽出に適した極性であること、高いEtOH濃度により気温が高い時の微生物汚染の危険性を回避できること、抽出後、スチレン-ジビニルベンゼン系合成吸着剤例えば三菱化学株製ダイヤイオンHP20あるいはスチレン系合成吸着剤例えばダウケミカル株製アンバーライトXAD2やアンバーライトXAD4を含むカラムで分画する前処理の濃縮がし易いことによる。抽出におけるクロメと抽出溶媒との比率は、撹拌機、容器の容量などの抽出条件に応じて変えることができるが、1:10の比率によった。抽出温度は高いほど抽出率は向上するが目的物以外の物質が抽出され、抽出液の粘性の増加などを生じることがあるため室温水温20~25°Cでの抽出が好ましい。以下の説明において、エタノールをEtOHと略記し、エタノールv/vの水溶液をv/vEtOHと略記することがある。カラム分画上記の抽出方法によりクロメからのエタノール70v/v、および50v/vによる抽出物をダイヤイオン登録商標HP20三菱化学株製を充填したカラムで分画した。溶離液として、水、20~80v/vのエタノール濃度の水溶液、および100v/vエタノールを使用したところ、総ポリフェノール量は水から60v/vエタノール濃度の分画で多量に溶離された。各濃度で溶出した液をNMRにより分析したところ、各分画の含有組成は次のようになり、フロロタンニン類は20~60v/vのエタノールの分画に溶離することが判明した。各画分の溶出物を次に記載する。水溶出画分:無機塩を除き、ほぼ多糖類である。20v/vEtOH溶出画分:フロロタンニン類が出始める。不飽和脂肪酸の混入が多少認められる。40v/vEtOH溶出画分:フロロタンニン類の排出の主流画分。多少の不飽和脂肪酸の混入が認められる。60v/vEtOH溶出画分:不飽和脂肪酸が主となるが、残余のフロロタンニン類が出切る。フロロタンニン類としての絶対量は20v/vEtOH画分と40v/vEtOH画分を合わせた量の5~10程度と推定される。80v/vEtOH溶出画分:ほぼ不飽和脂肪酸のみで、フロロタンニン類は認められない。100v/vEtOH溶出画分:ほぼ不飽和脂肪酸のみで、フロロタンニン類は認められない。また、これまでの試験の結果,以下の事項についても明らかとなった。1フォーリンチオカルト法FolinCiocalteu法で検出されるが、NMRでフロロタンニン類のピークが認められない画分は、フロロタンニン類とは異なる還元物質が含まれていることが推定される。270v/vEtOHを抽出の基本としているが、抽出EtOHの濃度を比較したところでは50~70v/vEtOHがポリフェノールフロロタンニン類の抽出に適していることが判明した。370v/vEtOH抽出物のカラムでの分画の結果、目的のフロロタンニン類は20v/vEtOH溶出画分~60v/vEtOH溶出画分に高率に溶出されることが判明した。450v/vEtOH抽出物のダイヤイオンHP20カラム分画の結果、目的のフロロタンニン類は20v/vEtOH溶出画分~60v/vEtOH溶出画分に高率に溶出されることが判明した。クロメ分画物のUVA又はUVB照射障害に対する保護効果動物実験本発明のクロメ分画物のUVA照射障害に対する保護効果を実証するために、ヘアレスマウスの皮膚に分画物をUVAの増感剤である8メトキシソラーレンとともに塗布してUVAを照射した。その後の障害の程度を、皮膚厚及び色調により判断したところ、皮膚厚の変化はコントロールエタノール水溶液と比較して大きく減少するとともに、ポジティブコントロール市販の日焼け止め剤と同等の効果が認められた。また、照射72時間後の色調の変化は、本発明のクロメ分画物は、コントロール群よりも変化量が少なく優れた効果を示した。光源をUVBとし、クロメ分画物の濃度を変えて同様の動物実験をしたところ、濃度1~0.25の範囲で皮膚肥厚抑制効果が認められた。20~60v/vエタノール水溶液で溶離したクロメポリフェノールフロロタンニン類を含有する画分にはUVBによる皮膚肥厚の抑制作用が認められ、本発明のクロメ画分は、UVAおよびUVBの照射障害に対する保護効果を示した。UVB照射によるヒト皮膚繊維芽細胞TIG-114の障害に対するクロメ抽出物の効果クロメHP20カラム分画物のUVB防御効果を検討した。ヒト皮膚繊維芽細胞TIG-114にUVBを照射し、培養した後の細胞数を計測して防御効果を判定した結果、20~60v/vEtOHにより溶離した画分にはUVB照射によるヒト皮膚繊維芽細胞障害抑制効果が認められた。上記動物実験および細胞実験の結果より、クロメなどの海藻類から抽出したフロロタンニン類が、皮膚外用剤として、ヒト皮膚の繊維芽細胞の増殖を促進するのに有効であり、創傷治癒剤、化粧品、浴用剤、繊維芽細胞用培地、食品などの構成原料として用いることができる有用な物質であることが判明した。次に、本発明について具体例を挙げて説明するが、本発明が以下の実施例に限定されるものではない。[フロロタンニン類含有抽出物の製造条件および評価方法]以下の実施例におけるクロメからフロロタンニン類の抽出装置および評価方法の概要を示す。1.抽出用装置使用ビーカー:3L直径130mm使用器材:スリーワンモーターBLh300P新東科学を用いて撹拌羽根φ100mm,6枚羽根雪結晶型で撹拌。原料クロメ:熊本県天草漁業協同組合五和支所鬼池地区で養殖しているクロメ2010年収穫品水分含量=9.9、固形分=90.1、ポリフェノール含量対固形分=3.41原料状態=粗粉砕品ガーデンシュレッダーで破砕した状態抽出後の濾過条件=水流式の吸引濾過、150mmφのNo2の濾紙使用1抽出溶媒=EtOH濃度0~100水溶液2クロメ溶媒の比率=1:103抽出条件=7日間静置抽出または1~24時間撹拌4抽出温度=20°C2.評価方法1抽出効率は乾燥重量により判断した。2ポリフェノール含量は、フロログルシノールを標準品としたフォーリンチオカルト法を用い、720nmの測定波長により求めた。3組成の確認は、次の方法でNMR解析によった。1EtOH抽出物を乾燥後、エタノール-水混合液にて溶解。2ロータリーエバボレーターで溶媒留去後、真空にて一晩乾燥。3重水素化メタノールCD3ODに溶解する。4ブルカーバイオスピン株製核磁気共鳴装置BrukerAVANCEIII5001H共鳴周波数=500MHzにより測定した。5各抽出物のNMRチャートについて、次の2つの範囲の積分強度面積強度比により組成を確認した。大量に含まれる多糖類のCHシグナルを100.0とした。この値は、直接化合物群間のモル比や重量比を示すものではないが相対的な量比の目安となる。aδ3.6~4.0ppm多糖類のシグナルbδ5.8~6.9ppmフロロタンニン類の芳香族Hのシグナル[カラムによる分離条件の検討]クロメのエタノール抽出液を濃縮しスチレン-ジビニルベンゼン系合成吸着剤の一例である三菱化学株製ダイヤイオンHP20を充填したカラムに吸着させた後エタノールで分画する条件の概要を示す。1.抽出液の乾燥重量の測定法;抽出液の一部100mlをサンプリングし、その抽出液をロータリーエバボレーターで溶媒留去後、真空ポンプで24時間以上乾燥させて秤量して乾燥重量を求めた。2.ダイヤイオンHP20カラムによる分画;1クロメからのエタノール抽出液を、ダイヤイオンHP20を充填したカラムで分画した。50または70v/vEtOH抽出液をロータリーエバボレーターで濃縮し、その濃縮液をダイヤイオンHP20樹脂で分画するにあたりφ38mm×600mmサイズのカラム樹脂長は110mmを使用した。2乾燥重量は,分画液をロータリーエバボレーターで溶媒留去後、真空ポンプで24時間以上乾燥させて秤量した結果から求めた。3分画には0~100v/vエタノール水溶液を使用した。[抽出時間]本実施例では最適抽出時間を検討した。試料はクロメ200g固形分:180.2gをクロメ:70v/vEtOHの比率=1:10で所定時間撹拌した後の抽出物の乾燥濃度、および抽出物に含まれる総ポリフェノール量を測定した。同時に7日間静置抽出試験を行った。乾燥重量については図2に、総ポリフェノール量については図3に試験結果を示す。その結果、原料のクロメのポリフェノール含量対固形分3.41と比べると、7日間静置条件と24時間撹拌条件でほぼ全量のポリフェノールが抽出されたものと推定される。各抽出物にポリフェノールが含まれていることはNMRで確認できた。撹拌抽出条件としては少なくとも1時間以上,望ましくは3時間以上の抽出時間が必要であることが判明した。[抽出EtOHの濃度]本実施例では、抽出に最適なEtOH濃度を検討した。試料はクロメ200g固形分=180.2gを、クロメ:EtOH溶液の比率=1:10で所定時間撹拌した後の抽出物の乾燥濃度、および抽出物に含まれる総ポリフェノール量を測定した。0v/vEtOH、30v/vEtOHの抽出では、抽出液の粘性が高いため、濾紙による濾過ができなかったが、他の手段による濾過は可能であると判断される。乾燥重量については図4に、総ポリフェノール量については図5に試験結果を示す。図4,5から明らかなように70v/vEtOH抽出よりも50v/vEtOH抽出の方がポリフェノールを多く抽出できた。[ダイヤイオン登録商標HP20カラムによる吸着画分]サンプルクロメからの70v/vEtOH抽出液クロメ216.7g相当固形分=195.2gをロータリーエバポレータで濃縮し、この濃縮液をダイヤイオンHP20カラムに吸着させ、0~100v/vのEtOH水溶液で分画した。各分画の乾燥重量を図6に示す。各分画中の総ポリフェノール量を測定し図7に示す。水溶出画分はポリフェノールの含有比率は低いが乾燥重量が多い配分が多いためポリフェノールの総量は多くなっている。80v/vEtOH溶出画分と100v/vEtOH溶出画分ではフォーリンチオカルト法で少量ポリフェノールが検出されているが、NMRチャート上でフロロタンニン類の芳香族Hのシグナルが認められないことから,別の還元物質が含まれていると推定される。フォーリンチオカルト法で検出されるポリフェノール総量は2.15であり,原料クロメのポリフェノール含量対固形分3.41に比べると約63の回収率である。また、条件検討を行なった6hr撹拌抽出条件での回収率=2.9と比べると約74の回収率である。フロロタンニン類が含まれていると推定される20v/vEtOH溶出画分、40v/vEtOH溶出画分、60v/vEtOH溶出画分のポリフェノール含量を合計すると,2871.5mgで対原料固形分比率は1.47となる。原料クロメのポリフェノール含量対固形分3.41に比べると約43の回収率となる。また、条件検討を行なった6hr撹拌抽出条件での回収率=2.9と比べると約51の回収率である。[ダイヤイオン登録商標HP20カラムにより分画した生成物の組成]クロメを70v/vEtOHで抽出した抽出物を分画した各分画物実施例5の組成をNMRチャートの次のピークで比較、検討した。1δ3.6~4.0ppm:多糖類のCHシグナル2δ5.3~5.5ppm:不飽和脂肪酸のオレフィンHのシグナル3δ5.8~6.9ppm:フロロタンニン類の芳香族Hのシグナル各画分のNMRチャートの解析結果は次の通りである。水溶出画分:無機塩を除き、ほぼ多糖類である。20v/vEtOH溶出画分:フロロタンニン類が出始める。不飽和脂肪酸の混入が多少認められる。40v/vEtOH溶出画分:フロロタンニン類の排出の主流画分。多少の不飽和脂肪酸の混入が認められる。60v/vEtOH溶出画分:不飽和脂肪酸が主となるが、残余のフロロタンニン類が出切る。フロロタンニン類としての絶対量は20v/vEtOH画分と40v/vEtOH画分を合わせた量の5~10程度と推定される。80v/vEtOH溶出画分:ほぼ不飽和脂肪酸のみで、フロロタンニン類は認められない。100v/vEtOH溶出画分:ほぼ不飽和脂肪酸のみで、フロロタンニン類は認められない。実施例5、6と同様の試験を50v/vEtOH抽出物のダイヤイオン登録商標HP20カラム分画物について行ったが、実施例6と同様の結果が得られた。[クロメ分画物のUVA照射障害に対する保護効果の動物試験概要]本実施例では、クロメ70v/vEtOH抽出物をダイヤイオン登録商標HP20カラムにて分画した40v/vEtOH溶出物について、UVA照射短期モデルでUVA照射障害保護効果を確認するための試験条件の概要を示した参考文献:非特許文献1,2。1.試薬検体1クロメ抽出物:乾燥クロメ30kgから70v/vEtOH120Lで7日間静置抽出した抽出物。2クロメ分画物:クロメ抽出物をダイヤイオン登録商標HP20カラムに吸着させた後、40v/vEtOHで溶出させた分画物。3ソラーレン溶液:8-メトキシソラーレン8-MOPS:東京化成工業株製を01でEtOHに溶解。UVAによる障害を増幅する増感剤として用いる。4コントロール溶液:60v/vEtOH。5KP40溶液:40v/vEtOH溶出分画物を2.5になるように60v/vEtOHに溶解する。6サンスクリーン剤:市販日焼け止めSPF25、PA。皮膚に当たる紫外線をブロックする効果がある。ポジティブコントロールとして使用。7UVA:三共電機GL20BLB×5本を平行に並べて照射。2.試験群1コントロール群:コントロール溶液を使用。2ポジティブコントロール群:サンスクリーン剤を使用。3KP40群:KP40溶液を使用。3.試験方法1ヘアレスマウスを18頭用意する。2すべてのマウスに耳パンチでラベルし、背部皮膚厚をマイクロメーターで測定する。3皮膚厚の平均が均等になるように3群に分けるコントロール群ポジティブコントロール群KP-40群4マウスの背中をセロテープ登録商標で5回ゆっくりストリッピングする。5マウスの背部に018MOPEtOHを50microL滴下し、ドライヤーで乾燥させる。645を2度繰り返す。730分後コントロール群マウス背部にハトメ15mm径と朱肉で印をし、印内に60v/vEtOHを25microL滴下して広げ、ドライヤーで乾かす。8ポジティブコントロール群マウスも同様にハトメで印をつけ、中に市販日焼け止めを塗るミクロスパーテル1杯目安。9KP-40群マウスにもハトメで印をし、印内にKP40を25microL滴下して拡げ、ドライヤーで乾かす。10マウス尾部をガムテープでケージに固定し、さらに後肢を含む臀部と前肢を含む後頭部をビニールテープで固定する。プラスチックケージに4頭×3列=12頭並べる。11UVAを2時間照射する。12紫外線照射直後、および20時間後に背部の印内の皮膚厚をマイクロメーターで測定する。134-10を再度行い、今度は4時間照射する。14紫外線照射直後、および20時間後に背部の印内の皮膚厚をマイクロメーターで測定する。4.試験結果KP-40によるUVA照射障害に対する保護効果の動物試験の結果を図8に示す。コントロール群はUVA照射により皮膚厚が増加し、UVA照射による皮膚障害を示した。ポジティブコントロール群は皮膚厚のUVAによる肥厚を抑えることが判明した。KP-40群はポジティブコントロール群よりもさらに強くUVAによる皮膚の肥厚を抑制することが判明した。40v/vEtOH溶出物はNMR分析によりポリフェノールが主成分であることから、UVA照射障害保護効果はクロメポリフェノールフロロタンニン類によるものと推察される。[クロメ分画物のUVB照射障害に対する保護効果の動物試験概要]本実施例では、クロメ70v/vEtOH抽出物をダイヤイオン登録商標HP20カラムにて分画した、40v/vEtOH溶出物について、UVB照射短期モデルでUVB照射障害防護効果を確認するための試験条件の概要を示した参考文献:非特許文献1,2。1.試薬検体1クロメ抽出物:乾燥クロメ30kgから70v/vEtOH120Lで7日間静置抽出した抽出物。2クロメ分画物:クロメ抽出物をダイヤイオン登録商標HP20カラムに吸着させた後、40v/vEtOHで溶出させた分画物。3親水軟膏:局方親水軟膏ホエイニプロファーマ製4コントロール軟膏:水を4倍量の親水軟膏に加えて、乳鉢でよく撹拌した。5KP-40軟膏:40v/vEtOH溶出分画物を10になるように60v/vEtOHに溶解し、4倍量の親水軟膏に加えて,乳鉢でよく撹拌した最終濃度=2KP-40。6サンスクリーン剤:市販日焼け止めSPF25、PA。皮膚に当たる紫外線をブロックする効果がある。ポジティブコントロールとして使用。7UVB:三共電機GL20SE×4本を,SCHOTTWG295相当のガラスフィルターで低波長成分をカットしたものを照射。2.試験群1コントロール群:コントロール軟膏を使用。2ポジティブコントロール群:サンスクリーン剤を使用。3KP40群:KP40軟膏を使用。3.試験方法1へアレスマウスHOS:HR-1メス8週令を18頭用意する。2背部皮膚の色調を分光測色計コニカミノルタCR400で測定し、a値赤色度が均一になるように3群1群6頭に分ける。3各群背部にそれぞれコントロール軟膏、サンスクリーン剤、KP-40軟膏を約10mg/cm2塗布する。4UVBを200mJ/cm2照射する。5照射直後に再度各群の軟膏を塗布する。6照射48時間後,72時間後にマイクロメーターで皮膚厚を計り,浮腫の指標とする。7照射72時間後に分光測色計で背部皮膚3ヶ所の色調を測定し,a値を算出する。4.試験結果KP-40によるUVB照射障害に対する保護効果の動物試験の結果を図9および図10に示す。コントロール群はUVB照射により皮膚厚が増加し、同時に赤みを増し、UVB照射による皮膚障害を示した。ポジティブコントロール群は皮膚厚、色調のいずれもUVBによる障害を抑えることが判明した。KP-40軟膏の2.0濃度群ではポジティブコントロール群と同等の障害抑制効果が認められた。さらにKP-40軟膏の有効成分濃度を、1.0、0.25、0.1、0.025、0.01と変化させてUVB照射による24~72時間後の皮膚肥厚を測定したところ、皮膚厚は全郡ともに照射48時間後に最大値を示した。48時間後の皮膚厚を比較すると、図11に示す如く、KP-40の1群と0.25群に皮膚肥厚抑制作用が認められた。また、通常、UV照射障害保護効果の判断に使用される48時間後の皮膚肥厚を対比すると、20v/vEtOH溶出画分、40v/vEtOH溶出画分、60v/vEtOH溶出画分軟膏群は、UVコントロール群に比べて有意に皮膚厚の上昇浮腫を抑制していることが認められた図12。これらの画分はポリフェノールの含有が認められているところから、UVB照射障害保護効果はクロメポリフェノールフロロタンニン類によるものと推察される。[UVB照射によるヒト皮膚繊維芽細胞TIG-114の障害に対するクロメHP-20分画物の効果]クロメ70v/vEtOH抽出物をHP-20カラムにて分画した各分画物についてヒト繊維芽細胞TIG-114のUVB照射による障害に対する保護効果を検討した参考文献:非特許文献3~5。1.試薬検体1クロメ抽出物:乾燥クロメ30kgから70v/vEtOHで6時間撹拌抽出した抽出物2クロメ分画物:クロメ抽出物からHP-20カラムに吸着させた後、水、20v/vEtOH、40v/vEtOH、60v/vEtOH、80v/vEtOH、100v/vEtOHで溶出させた分画物。3ヒト繊維芽細胞TIG-114:ヒューマンサイエンス研究資源バンクから入手JCRB0534し、10牛胎児血清添加DMEM培地で培養。4UVB:三共電機GL-15SE×3本を平行に並べて照射。2.試験群1コントロール群:クロメ抽出物も分画物も含まないPBS培地に混合。2クロメ分画物群:水、20v/vEtOH、40v/vEtOH、60v/vEtOH分画物は200μg/ml、400μg/mlの濃度で含むPBS培地に混合。80EtOH、100v/vEtOH分画物は100μg/ml、200μg/mlの濃度で含むPBS培地に混合。3.試験方法1細胞濃度を1×105Cellsmlに調節する。296ウエルマイクロブレートに100μl/well10,000cells/wellまく。337°Cで24時間培養する。10牛胎児血清添加DMEM培地4培地を各試験群の検体を含むPBS-培地100μlに交換し,UVBを400mJ/cm2照射する。572時間後に10のCellCountingKit8和光純薬製を加えて37度、5CO2インキュベーターで1.5時間インキュべ-卜し、450nmの吸光度を測定する事により繊維芽細胞の数を測定する。4.結果72時間培養後の細胞数を∪VB-時の細胞数に対する割合UVB/UVB-で表示し図13に結果を示す。クロメのHP-20分画物のうち、20v/vEtOH溶出物、40v/vEtOH溶出物、60v/vEtOH溶出物の低濃度群には∪VB照射によるヒト皮膚繊維芽細胞の障害に対する保護作用が認められた。これらの画分はポリフェノール含量が高い画分であり、また動物試験の結果とも共通する結果が得られた。クロメのダイヤイオンHP20分画物のうち,水溶出物、80v/vEtOH溶出物、100v/vEtOH溶出物には、UVB照射によるヒト皮膚繊維芽細胞の障害に対する保護作用は認められなかった。60v/vEtOH溶出物、80v/vEtOH溶出物、100v/vEtOH溶出物では濃度が高くなると細胞数が減る傾向が認められる。これらの画分には脂肪酸が含まれているので,脂肪酸による細胞障害が発生している可能性がある。[ダイヤイオン登録商標HP20カラムにより分画して得た40v/vEtOH分画物に含まれる化合物単体]クロメ70v/vEtOH抽出物をダイヤイオン登録商標HP20カラムにて分画して得た40v/vEtOH分画物から次の工程で19種類の既知及び新規化合物単体を得た。40v/vEtOH分画物63.4gについてセファデックスLH-20カラムクロマトグラフィーGEヘルスケアジャパン株製,Φ5×22cmを4回に分けて行なった。メタノール,メタノール/イソプロパノール5/1液、4/1液、2/1液、イソプロパノール、酢酸エチル、ジメチルスルホキシドで順次溶出分離し、それぞれ9画分、8画分、8画分、9画分を得た。NMRが類似した第4画分、第4画分、第6画分、第5画分をひとまとめにし5.96g、さらにコスモシール75C18-OPNカラムナカライテクス株製,Φ5×15cmを用いて、ODSシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行なった。メタノール/水が15/85液500mL、2/8液400mL、3/7液400mL、4/6液400mL、5/5液400mL、メタノール400mLにより分離して9画分を得た。得られた第1画分187.6mgを再びコスモシール75C18-OPNカラムΦ2×15cmを用いて、ODSシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行なった。メタノール/水が1/9液60mL、15/85液10mL、3/7液10mL、4/6液30mL、メタノール50mLにより分離して6画分を得た。得られた第2画分23.8mgについて、ユニソンUK-C18カラムインタクト株製、10×250mmを用いた高速液体クロマトグラフィーを実施した。溶媒として水/アセトニトリル85/15液を用い、流速2mL/分で行い、溶出物をUV270nmの吸収で検出した。1回の精製により、8,8’-バイエコール-7-サルフェート88bieckol7sulfate,溶出時間12.8分図1-1のNo.1を10.3g得た。以下に理化学的性質を示す。1分子式:C36H21O21SNa高分解能質量スペクトルHRMS法により測定2分子量:84459ESIMS法により測定したMH-82102963水素核磁気共鳴スペクトル400MHz、溶媒CD3OD:ppm:695s、1H、620s、1H、617s、1H、614s、1H、598d、J=184Hz、2H、597d、J=184Hz、2H、595t、J=184Hz、1H、595t、J=184Hz、1H4炭素核磁気共鳴スペクトル100MHz、溶媒DMSOd6:ppm:1603、1603、15872C、15872C、1513、1472、1460、1457、1443、1440、1418、1417、1414、1410、1371、1369、1266、1240、1233、1231、1225、1225、1099、1053、994、985、981、963、963、949、9392C、9392C5呈色反応:アニスアルデヒド-硫酸に陽性。40エタノール抽出物63.4gについて、セファデックスLH-20カラムクロマトグラフィーΦ5×22cmを4回に分けて行った。メタノール、メタノール/イソプロパノール5/1液、4/1液、2/1液、イソプロパノール、酢酸エチル、ジメチルスルホキシドで順次溶出分離し、それぞれ9画分、8画分、8画分、9画分を得た。NMRが類似した第3画分、第5画分、第5画分、第4画分をひとまとめにし2.15g、さらにコスモシール75C18-OPNカラムΦ4×15cmを用いて、ODSシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行った。メタノール/水が2/8液200mL、25/75液200mL、3/7液200mL、4/6液200mL、5/5液200mL、6/4液200mL、7/3液200mL、メタノール200mLにより分離して13画分を得た。得られた第2画分126.6mgを再びコスモシール75C18-OPNカラムΦ1.5×11.5cmを用いて、ODSシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行なった。メタノール/水が15/85液30mL、2/8液30mL、3/7液30mL、メタノール30mLにより分離して8画分を得た。得られた第7画分48.8mgについて、ユニソンUK-フェニルカラム10×250mmカラムを用いた高速液体クロマトグラフィーを実施した。溶媒として水/アセトニトリル8/2液を用い、流速2mL/分で行い、溶出物をUV270nmの吸収で検出した。1回の精製により、8,8’-バイエコール88bieckol,溶出時間28.8分図1-1のNo.2を33.5mg得た。以下に理化学的性質を示す。1分子式:C36H22O18高分解能質量スペクトルHRMS法により測定2分子量:74255ESIMS法により測定したMH-74107223水素核磁気共鳴スペクトル400MHz、溶媒CD3OD:ppm:619s、2H、614s、2H、598d、J=188Hz、4H、596t、J=188Hz、2H4炭素核磁気共鳴スペクトル100MHz、溶媒DMSOd6:ppm:16042C、15884C、15182C、14592C、14462C、14192C、14132C、13732C、12342C、12312C、12252C、10442C、9822C、9632C、9404C、9392C5呈色反応:アニスアルデヒド-硫酸に陽性。40エタノール抽出物15gについて、セファデックスLH-20Φ5cm×21cmカラムクロマトグラフィーを行なった。メタノール700mL、以降メタノール/2-プロパノールが5/1液560mL、4/1液560mL、2/1液560mL、2-プロパノール560mL、酢酸エチル500mL、ジメチルスルホキシド400mLで順次溶出分離し、7画分を得た。この操作をあと5回繰り返した。第3溶出分画分3gについて、コスモシール75C18-OPNカラムΦ5cm×12cmを用いたODSシリカゲルカラムクロマトグラフィーを実施した。メタノール/水が1/9液250mL、2/8液700mL、3/7液700mL、4/6液300mL、メタノール500mLにより分離して、5画分を得た。メタノール分画468mgにダイエコールdieckol図1-1のNo.3を得た。以下に理化学的性質を示す。1分子式:C36H22O18高分解能質量スペクトルHRMS法により測定2分子量:74255ESI-MS法により測定したMNa=76507043水素核磁気共鳴スペクトル400MHz溶媒CD3OD:ppm:621s、1H、619s、1H、615s、2H、612d、J=29Hz、1H、611d、J=29Hz、1H、604d、J=27Hz、1H、601d、J=27Hz、1H、598s、3H4炭素核磁気共鳴スペクトル125MHz溶媒DMSOd6:ppm:1603、15882C、1559、1542、1530、15112C、1461、1460、1459、1459、1426、1424、1419、1418、1372、1370、1242、1240、1232、1231、1226、1223、1222、985、983、982、980、962、9452C、938、9362C、9355呈色反応:アニスアルデヒド-硫酸に陽性40エタノール抽出物15gについて、セファデックスLH-20カラムクロマトグラフィーΦ5cm×21cmを行なった。メタノール700mL、以降メタノール/2-プロパノールが5/1液560mL、4/1液560mL、2/1液560mL、2-プロパノール560mL、酢酸エチル500mL、ジメチルスルホキシド400mLで順次溶出分離し、7画分を得た。この操作をあと5回繰り返した。第1溶出分画分10gについて、コスモシール75C18-OPNカラムΦ5cm×13cmを用いたODSシリカゲルカラムクロマトグラフィーを実施した。メタノール/水が1/9液650mL、2/8液600mL、3/7液600mL、4/6液600mL、メタノール500mLにより分離して、5画分を得た。得られた第4溶出分画分102mgを更にユニソンUS-C18カラム250×20mmを用いた高速液体クロマトグラフィーにより分離した。溶媒としてアセトニトリル/水=15/85液を用い流速10.0mL/分で行い溶出物をUV270nmの吸収で検出した。精製操作を1回行い、ジオキシノデヒドロエコールdioxinodehydroeckol,溶出時間32.8分図1-1のNo.4を36.8mg得た。以下に理化学的性質を示す。1分子式:C18H10O9高分解能質量スペクトルHRMS法により測定2分子量:37027ESI-MS法により測定したMNa=39302293水素核磁気共鳴スペクトル400MHz溶媒CD3OD:ppm:619s、1H、606d、J=28Hz、1H、605d、J=28Hz、1H、603d、J=28Hz、1H、600d、J=28Hz、1H4炭素核磁気共鳴スペクトル100MHz溶媒DMSOd6:ppm:1533、1530、1461、1459、1421、1417、1401、1372、1316、1259、1227、1225、1223、989、988、976、939、9395呈色反応:アニスアルデヒド-硫酸に陽性。40エタノール抽出物15gについて、セファデックスLH-20カラムクロマトグラフィーΦ5cm×21cmを行なった。メタノール700mL、以降メタノール/2-プロパノールが5/1液560mL、4/1液560mL、2/1液560mL、2-プロパノール560mL、酢酸エチル500mL、ジメチルスルホキシド400mLで順次溶出分離し、7画分を得た。この操作をあと5回繰り返した。第3溶出分画分3gについて、コスモシール75C18-OPNカラムΦ5cm×12cmを用いたODSシリカゲルカラムクロマトグラフィーを実施した。メタノール/水が1/9液250mL、2/8液700mL、3/7液700mL、4/6液300mL、メタノール500mLにより分離して、5画分を得た。得られた第4溶出分画分828mgを更にコスモシール75C18-OPNカラムΦ3cm×13cmによるODSシリカゲルカラムクロマトグラフィーを実施した。メタノール/水が1/9液180mL、2/8液180mL、3/7液420mL、4/6液150mL、5/5液150mL、メタノール500mLにより分離して、6画分を得た。得られた第3溶出画分80mgをユニソンUS-C18カラム250×20mmを用いた高速液体クロマトグラフィーにより分離した。溶媒としてアセトニトリル/水=25/75液を用い流速10.0mL/分で行い溶出物をUV270nmの吸収で検出した。精製操作を1回行ない、フロロフコフロエコール-Aphlorofucofuroeckol-A,溶出時間58.4分図1-1のNo.5を7.9mg得た。以下に理化学的性質を示す。1分子式:C30H18O14高分解能質量スペクトルHRMS法により測定2分子量:60246ESI-MS法により測定したM-H-=60106153水素核磁気共鳴スペクトル500MHz溶媒CD3OD:ppm:668s、1H、645s、1H、631s、1H、601d、J=22Hz、2H、599t、J=22Hz、1H、597t、J=22Hz、1H、593d、J=22Hz、2H4炭素核磁気共鳴スペクトル125MHz溶媒DMSOd6:ppm:1603、1601、15912C、15892C、1509、1505、1496、1470、1466、1448、1421、1369、1341、1265、1227、1226、1202、1035、1033、992、984、966、965、949、9382C、9362C5呈色反応:アニスアルデヒド-硫酸に陽性。40エタノール抽出物15gについて、セファデックスLH-20カラムクロマトグラフィーΦ5cm×21cmを行なった。メタノール700mL、以降メタノール/2-プロパノールが5/1液560mL、4/1液560mL、2/1液560mL、2-プロパノール560mL、酢酸エチル500mL、ジメチルスルホキシド400mLで順次溶出分離し、7画分を得た。この操作をあと5回繰り返した。第1溶出分画分10gについて、コスモシール75C18-OPNカラムΦ5cm×13cmを用いたODSシリカゲルカラムクロマトグラフィーを実施した。メタノール/水が1/9液650mL、2/8液600mL、3/7液600mL、4/6液600mL、メタノール500mLにより分離して、5画分を得た。得られた第1溶出分画分2.9gを更にコスモシール75C18-OPNカラムΦ4cm×12cmによるODSシリカゲルカラムクロマトグラフィーを実施した。水600mL、メタノール/水が1/9液350mL、2/8液350mL、3/7液300mL、5/5液300mL、メタノール300mLにより分離して、6画分を得た。得られた第2溶出分画分565mgを更にコスモシール75C18-OPNカラムΦ3cm×13cmによるODSシリカゲルカラムクロマトグラフィーを実施した。水300mL、メタノール/水が5/95液90mL、1/9液90mL、15/85液90mL、2/8液60mL、3/7液90mL、35/65液90mL、4/6液90mL、2/8液60mLにより分離して、9画分を得た。得られた第2溶出画分122mgをユニソンUS-C18カラム250×20mmを用いた高速液体クロマトグラフィーにより分離した。溶媒としてアセトニトリル/水=15/85液を用い流速9.0mL/分で行い溶出物をUV270nmの吸収で検出した。精製操作を1回行い、2-フロロエコール2-phloroeckol,溶出時間41.6分図1-1のNo.6を37.2mg得た。以下に理化学的性質を示す。1分子式:C24H16O12高分解能質量スペクトルHRMS法により測定2分子量:49638ESI-MS法により測定したMNa=51903743水素核磁気共鳴スペクトル500MHz溶媒CD3OD:ppm:612d、J=22Hz、2H、602t、d=22Hz、1H、601d、J=25Hz、1H、600d、J=25Hz、2H、595s、2H4炭素核磁気共鳴スペクトル100MHz溶媒DMSOd6:ppm:1604、15862C、1547、1530、15102C、1476、1460、1420、1415、1373、1249、1229、1227、1218、987、964、962、9492C、9422C、9395呈色反応:アニスアルデヒド-硫酸に陽性。40エタノール抽出物15gについて、セファデックスLH-20カラムクロマトグラフィーΦ5cm×21cmを行なった。メタノール700mL、以降メタノール/2-プロパノールが5/1液560mL、4/1液560mL、2/1液560mL、2-プロパノール560mL、酢酸エチル500mL、ジメチルスルホキシド400mLで順次溶出分離し、7画分を得た。この操作をあと5回繰り返した。第1溶出分画分10gについて、コスモシール75C18-OPNカラムΦ5cm×13cmを用いたODSシリカゲルカラムクロマトグラフィーを実施した。メタノール/水が1/9液650mL、2/8液600mL、3/7液600mL、4/6液600mL、メタノール500mLにより分離して、5画分を得た。得られた第1溶出分画分2.9gを更にコスモシール75C18-OPNカラムΦ4cm×12cmによるODSシリカゲルカラムクロマトグラフィーを実施した。水600mL、メタノール/水が1/9液350mL、2/8液350mL、3/7液300mL、5/5液300mL、メタノール300mLにより分離して、6画分を得た。得られた第2溶出分画分565mgを更にコスモシール75C18-OPNカラムΦ3cm×13cmによるODSシリカゲルカラムクロマトグラフィーを実施した。水300mL、メタノール/水が5/95液90mL、1/9液90mL、15/85液90mL、2/8液60mL、3/7液90mL、35/65液90mL、4/6液90mL、2/8液60mLにより分離して、9画分を得た。得られた第2溶出画分122mgをユニソンUS-C18カラム250×20mmを用いた高速液体クロマトグラフィーにより分離した。溶媒としてアセトニトリル/水=15/85液を用い流速9.0mL/分で行い溶出物をUV270nmの吸収で検出した。精製操作を1回行い、エコールeckol,溶出時間36.0分図1-1のNo.7を18.0mg得た。以下に理化学的性質を示す。1分子式:C18H12O9高分解能質量スペクトルHRMS法により測定2分子量:37228ESI-MS法により測定したM-H-=37104103水素核磁気共鳴スペクトル500MHz溶媒CD3OD:ppm:620s、1H、601s、2H、600s、3H4炭素核磁気共鳴スペクトル125MHz溶媒DMSOd6:ppm:1605、15892C、1531、1462、1461、1427、1420、1373、1233、1228、1224、986、983、964、940、9392C5呈色反応:アニスアルデヒド-硫酸に陽性。40エタノール抽出物63.4gについて、セファデックスLH-20カラムクロマトグラフィーΦ5cm×22cmを4回に分けて行った。メタノール、メタノール/イソプロパノール5/1液、4/1液、2/1液、イソプロパノール、酢酸エチル、ジメチルスルホキシドで順次溶出分離し、それぞれ9画分、8画分、8画分、9画分を得た。4回目の第2画分3.97gをコスモシール75C18-OPNカラムΦ5cm×11cmを用いて、ODSシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行なった。メタノール/水が1/9液400mL、2/8液300mL、3/7液300mL、4/6液300mL、5/5液240mL、メタノール300mLにより分離して12画分を得た。得られた第2画分105.8mgについて、ユニソンUS-C18カラム20×250mmを用いた高速液体クロマトグラフィーを実施した。溶媒として水/アセトニトリル88/12液を用い、流速10mL/分で行ない、溶出物をUV270nmの吸収で検出した。1回の精製により、フコジフロレトールGfucodiphloretholG,溶出時間15.6分図1-1のNo.8を3.9mg得た。以下に理化学的性質を示す。1分子式:C24H18O12高分解能質量スペクトルHRMS法により測定2分子量:49839ESIMS法により測定したMH-49707263水素核磁気共鳴スペクトル400MHz、溶媒CD3OD:ppm:616d、J=232Hz、1H、610s、2H、606d、J=232Hz、1H、605d、J=276Hz、1H、595s、2H、573d、J=276Hz、1H4炭素核磁気共鳴スペクトル100MHz、溶媒DMSOd6:ppm:1578、1577、1572、15712C、1565、1546、1545、1530、15112C、1503、1233、1219、1016、1010、968、957、9472C、9472C、933、9235呈色反応:アニスアルデヒド-硫酸に陽性。40エタノール抽出物15gについて、セファデックスLH-20カラムクロマトグラフィーΦ5cm×21cmを行なった。メタノール700mL、以降メタノール/2-プロパノールが5/1液560mL、4/1液560mL、2/1液560mL、2-プロパノール560mL、酢酸エチル500mL、ジメチルスルホキシド400mLで順次溶出分離し、7画分を得た。この操作をあと5回繰り返した。第3溶出分画分3gについて、コスモシール75C18-OPNカラムΦ5cm×12cmを用いたODSシリカゲルカラムクロマトグラフィーを実施した。メタノール/水が1/9液250mL、2/8液700mL、3/7液700mL、4/6液300mL、メタノール500mLにより分離して、5画分を得た。得られた第4溶出分画分828mgを更にコスモシール75C18-OPNカラムΦ3cm×13cmによるODSシリカゲルカラムクロマトグラフィーを実施した。メタノール/水が1/9液180mL、2/8液180mL、3/7液420mL、4/6液150mL,5/5液150mL、メタノール500mLにより分離して、6画分を得た。得られた第3溶出分画分80mgをユニソンUS-C18カラム250×20mmを用いた高速液体クロマトグラフィーにより分離した。溶媒としてアセトニトリル/水=25/75液を用い流速10.0mL/分で行い溶出物をUV270nmの吸収で検出した。精製操作を1回行い、フロロフコフロエコール-Bphlorofucofuroeckol-B,溶出時間52.0分図1-2のNo.9を7.9mg得た。以下に理化学的性質を示す。1分子式:C30H18O14高分解能質量スペクトルHRMS法により測定2分子量:60246ESI-MS法により測定したM-H-=60106183水素核磁気共鳴スペクトル500MHz溶媒CD3OD:ppm:671s、1H、642s、1H、621s、1H、602d、J=22Hz、2H、599t、J=22Hz、1H、597t、J=22Hz、1H、592d、J=22Hz、2H4炭素核磁気共鳴スペクトル125MHz溶媒CD3OD:ppm:1620、1618、16022C、16012C、1526、1515、1509、1476、1476、1434、1432、1387、1383、1278、1255、1246、1225、1098、1069、997、993、977、976、9552C、9532C、9265呈色反応:アニスアルデヒド-硫酸に陽性。40エタノール抽出物15gについて、セファデックスLH-20カラムクロマトグラフィーΦ5cm×21cmを行なった。メタノール700mL、以降メタノール/2-プロパノールが5/1液560mL、4/1液560mL、2/1液560mL、2-プロパノール560mL、酢酸エチル500mL、ジメチルスルホキシド400mLで順次溶出分離し、7画分を得た。この操作をあと5回繰り返した。第6溶出分画分725mgについて、コスモシール75C18-OPNカラムΦ3cm×12cmを用いたODSシリカゲルカラムクロマトグラフィーを実施した。メタノール/水が2/8液300mL、3/7液600mL、5/5液360mL、メタノール500mLにより分離して、4画分を得た。得られた第3溶出分画分96mgをユニソンUS-C18カラム250×20mmを用いた高速液体クロマトグラフィーにより分離した。溶媒としてアセトニトリル/水=25/75液を用い流速10.0mL/分で行ない溶出物をUV270nmの吸収で検出した。精製操作を1回行い、No.10化合物名未確定の新規化合物,溶出時間69.6分図1-2のNo.10を18.8mg得た。以下に理化学的性質を示す。1分子式:C48H30O23高分解能質量スペクトルHRMS法により測定2分子量:97474ESI-MS法により測定したMNa=99710773水素核磁気共鳴スペクトル500MHz溶媒CD3OD:ppm:668s、1H、645s、1H、630s、1H、625d、J=23Hz、1H、623d、J=22Hz、1H、617d、J=22Hz、1H、609d、J=28Hz、1H、598s、2H、596t、J=20Hz、1H、595d、J=23Hz、1H、593d、J=20Hz、2H579d、J=28Hz、1H4炭素核磁気共鳴スペクトル125MHz溶媒CD3OD:ppm:1617、16032C、1595、1595、1590、1590、1575、1569、1564、1564、1537、1533、15212C、1518、1516、1511、1481、1476、1457、1442、1380、1351、1276、1250、1249、1243、1242、1223、1052、1052、1026、1024、999、993、987、984、977、976、9642C、960、9532C、952、944、9425呈色反応:アニスアルデヒド-硫酸に陽性。40エタノール抽出物15gについて、セファデックスLH-20カラムクロマトグラフィーΦ5cm×21cmを行なった。メタノール700mL、以降メタノール/2-プロパノールが5/1液560mL、4/1液560mL、2/1液560mL、2-プロパノール560mL、酢酸エチル500mL、ジメチルスルホキシド400mLで順次溶出分離し、7画分を得た。この操作をあと5回繰り返した。第6溶出分画分725mgについて、コスモシール75C18-OPNカラムΦ3cm×12cmを用いたODSシリカゲルカラムクロマトグラフィーを実施した。メタノール/水が2/8液300mL、3/7液600mL、5/5液360mL、メタノール500mLにより分離して、4画分を得た。得られた第3溶出分画分96mgをユニソンUS-C18カラム250×20mmを用いた高速液体クロマトグラフィーにより分離した。溶媒としてアセトニトリル/水=25/75液を用い流速10.0mL/分で行い溶出物をUV270nmの吸収で検出した。精製操作を1回行い、No.11化合物名未確定の新規化合物,溶出時間56.0分図1-2のNo.11を47.3mg得た。以下に理化学的性質を示す。1分子式:C48H30O23高分解能質量スペクトルHRMS法により測定2分子量:97474ESI-MS法により測定したMNa=99710773水素核磁気共鳴スペクトル500MHz溶媒CD3OD:ppm:673s、1H、643s、1H、627d、J=25Hz、1H、625d、J=22Hz、1H、622s、1H、620d、J=22Hz、1H、611d、J=27Hz、1H、605s、2H、596t、J=20Hz、1H、595d、J=25Hz、1H、593d、J=20Hz、2H581d、J=27Hz、1H4炭素核磁気共鳴スペクトル125MHz溶媒CD3OD:ppm:1618、16002C、1596、1595、1591、1589、1574、1568、1565、1563、1537、1526、15212C、1519、1515、1508、1482、1469、1437、1428、1380、1379、1273、1253、1247、12402C、1222、1098、1063、1026、1025、996、995、986、984、977、976、9652C、9532C、951、9432C、9285呈色反応:アニスアルデヒド-硫酸に陽性。40エタノール抽出物63.4gについて、セファデックスLH-20カラムクロマトグラフィーΦ5cm×22cmを4回に分けて行った。メタノール、メタノール/イソプロパノール5/1液、4/1液、2/1液、イソプロパノール、酢酸エチル、ジメチルスルホキシドで順次溶出分離し、それぞれ9画分、8画分、8画分、9画分を得た。1回目の第2画分5.74gをコスモシール75C18-OPNカラムΦ5cm×10cmを用いて、ODSシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行なった。メタノール/水が1/9液300mL、2/8液200mL、3/7液400mL、5/5液400mL、メタノール400mLにより分離して7画分を得た。得られた第1画分932.8mgをコスモシール75C18-OPNカラムΦ3.5×11cmを用いて、ODSシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行なった。メタノール/水が1/9液300mL、13/87液200mL、3/7液100mL、4/6液100mL、メタノール100mLにより分離して7画分を得た。得られた第2画分63.4mgについて、ユニソンUS-C18カラム20×250mmを用いた高速液体クロマトグラフィーを実施した。溶媒として水/アセトニトリル9/1液を用い、流速10mL/分で行ない、溶出物をUV270nmの吸収で検出した。1回の精製により、トリフロレトールATriphloretholA,溶出時間20.4分図1-2のNo.12を3.8mg得た。以下に理化学的性質を示す。1分子式:C18H14O9高分解能質量スペクトルHRMS法により測定2分子量:37430ESIMS法により測定したMH-37305733水素核磁気共鳴スペクトル500MHz、溶媒CD3OD:ppm:610d、J=276Hz、1H、605d、J=213Hz、2H、598t、J=213Hz、1H、594s、2H、580d、J=276Hz、1H4炭素核磁気共鳴スペクトル125MHz、溶媒DMSOd6:ppm:1607、15862C、1545、1542、1530、1511、15112C、1232、1222、961、957、9472C、9402C、9275呈色反応:アニスアルデヒド-硫酸に陽性。40エタノール抽出物63.4gについて、セファデックスLH-20カラムクロマトグラフィーΦ5cm×22cmを4回に分けて行った。メタノール、メタノール/イソプロパノール5/1液、4/1液、2/1液、イソプロパノール、酢酸エチル、ジメチルスルホキシドで順次溶出分離し、それぞれ9画分、8画分、8画分、9画分を得た。3回目の第2画分779.2mgをコスモシール75C18-OPNカラムΦ2.5cm×12cmを用いて、ODSシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行なった。メタノール/水が1/9液200mL、2/8液100mL、3/7液100mL、4/6液100mL、メタノール100mLにより分離して11画分を得た。得られた第9画分93.6mgについて、ユニソンUS-C18カラム10×250mmを用いた高速液体クロマトグラフィーを実施した。溶媒として水/アセトニトリル85/15液を用い、流速2mL/分で行ない、溶出物をUV270nmの吸収で検出した。1回の精製により、ジオキシノデヒドロエコール-11-サルフェートdioxinodehydroeckol11sulfate、溶出時間48.0分図1-2のNo.13を14.0mg得た。以下に理化学的性質を示す。1分子式:C18H9O12SNa高分解能質量スペクトルHRMS法により測定2分子量:47231ESIMS法により測定したMH-44898013水素核磁気共鳴スペクトル400MHz、溶媒CD3OD:ppm:657d、J=268Hz、1H、652d、J=268Hz、1H、621s、1H、605d、J=274Hz、1H、603d、J=274Hz、1H4炭素核磁気共鳴スペクトル125MHz、溶媒DMSOd6:ppm:1530、1490、1459、1454、1416、1413、1401、1372、1313、1259、1252、1226、1224、1041、992、988、979、9395呈色反応:アニスアルデヒド-硫酸に陽性。40エタノール抽出物63.4gについて、セファデックスLH-20カラムクロマトグラフィーΦ5cm×22cmを4回に分けて行った。メタノール、メタノール/イソプロパノール5/1液、4/1液、2/1液、イソプロパノール、酢酸エチル、ジメチルスルホキシドで順次溶出分離し、それぞれ9画分、8画分、8画分、9画分を得た。NMRが類似した第3画分、第5画分、第5画分、第4画分をひとまとめにし2.15g、さらにコスモシール75C18-OPNカラムΦ4cm×15cmを用いて、ODSシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行なった。メタノール/水が2/8液200mL、2.5/7.5液200mL、3/7液200mL、4/6液200mL、5/5液200mL、6/4液200mL、7/3液200mL、メタノール200mLにより分離して13画分を得た。得られた第9画分12.1mgについて、ユニソンUK-フェニルカラム10×250mmを用いた高速液体クロマトグラフィーを実施した。溶媒として水/アセトニトリル7/3液を用い、流速2mL/分で行ない、溶出物をUV270nmの吸収で検出した。1回の精製により、No.14化合物名未確定の新規化合物、溶出時間30.4分図1-2のNo.14を1.6mg得た。以下に理化学的性質を示す。1分子式:C24H14O11高分解能質量スペクトルHRMS法により測定2分子量:47836ESIMS法により測定したMH-47704453水素核磁気共鳴スペクトル400MHz、溶媒CD3OD:ppm:668s、1H、649d、J=188Hz、1H、631d、overlapped、1H、630s、1H、601d、J=207Hz、2H、599t、J=207Hz、1H4炭素核磁気共鳴スペクトル100MHz、溶媒DMSOd6:ppm:1602、15882C、1582、1577、1504、1502、1469、1443、1419、1369、1335、1261、1226、1224、1031、1023、982、980、963、946、9372C、9055呈色反応:アニスアルデヒド-硫酸に陽性。40エタノール抽出物63.4gについて、セファデックスLH-20カラムクロマトグラフィーΦ5cm×22cmを4回に分けて行った。メタノール、メタノール/イソプロパノール5/1液、4/1液、2/1液、イソプロパノール、酢酸エチル、ジメチルスルホキシドで順次溶出分離し、それぞれ9画分、8画分、8画分、9画分を得た。NMRが類似した第3画分、第5画分、第5画分、第4画分をひとまとめにし2.15g、さらにコスモシール75C18-OPNカラムΦ4cm×15cmを用いて、ODSシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行なった。メタノール/水が2/8液200mL、2.5/7.5液200mL、3/7液200mL、4/6液200mL、5/5液200mL、6/4液200mL、7/3液200mL、メタノール200mLにより分離して13画分を得た。得られた第1画分21.3mgについて、ユニソンUK-C18カラム10×250mmを用いた高速液体クロマトグラフィーを実施した。溶媒として水/アセトニトリル85/150.1トリフルオロ酢酸含有液を用い、流速2mL/分で行ない、溶出物をUV270nmの吸収で検出した。1回の精製により、6,8’-バイエコール68bieckol,溶出時間86.4分図1-2のNo.15を4.9mg得た。以下に理化学的性質を示す。1分子式:C36H22O18高分解能質量スペクトルHRMS法により測定2分子量:74255ESIMS法により測定したMH-74107373水素核磁気共鳴スペクトル400MHz、溶媒CD3OD:ppm:621s、1H、619s、1H、612s、2H、598d、overlapped、2H、598d、overlapped、2H、597t、overlapped、1H、597t、overlapped、1H4炭素核磁気共鳴スペクトル100MHz、溶媒DMSOd6:ppm:1604、1604、15872C、15872C、1515、1515、1458、1454、1448、1443、1419、1418、1416、1409、1373、1372、1236、1234、1230、1229、1224、1220、1045、995、982、979、979、963、962、9392C、9372C、9365呈色反応:アニスアルデヒド-硫酸に陽性。40エタノール抽出物63.4gについて、セファデックスLH-20カラムクロマトグラフィーΦ5cm×22cmを4回に分けて行った。メタノール、メタノール/イソプロパノール5/1液、4/1液、2/1液、イソプロパノール、酢酸エチル、ジメチルスルホキシドで順次溶出分離し、それぞれ9画分、8画分、8画分、9画分を得た。NMRが類似した第4画分、第4画分、第6画分、第5画分をひとまとめにし5.96g、さらにコスモシール75C18-OPNカラムΦ5cm×15cmを用いて、ODSシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行なった。メタノール/水が15/85液500mL、2/8液400mL、3/7液400mL、4/6液400mL、5/5液400mL、メタノール400mLにより分離して9画分を得た。得られた第1画分187.6mgを再びコスモシール75C18-OPNカラムΦ2cm×15cmを用いて、ODSシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行なった。メタノール/水が1/9液60mL、15/85液10mL、3/7液10mL、4/6液30mL、メタノール50mLにより分離して6画分を得た。得られた第3画分34.3mgについて、ユニソンUK-C18カラム10×250mmを用いた高速液体クロマトグラフィーを実施した。溶媒として水/アセトニトリル9/1液を用い、流速2mL/分で行ない、溶出物をUV270nmの吸収で検出した。1回の精製により、6,8’-バイエコール-7’-サルフェート68bieckol7’sulfate,溶出時間24.8分図1-2のNo.16を16.2mg得た。以下に理化学的性質を示す。1分子式:C36H21O21SNa高分解能質量スペクトルHRMS法により測定2分子量:84459ESIMS法により測定したMH-82102963水素核磁気共鳴スペクトル400MHz、溶媒CD3OD:ppm:700s、1H、621s、1H、610s、1H、608s、1H、600d、J=207Hz、2H、600d、J=207Hz、2H、596t、J=207Hz、1H、596t、J=207Hz、1H4炭素核磁気共鳴スペクトル125MHz、溶媒DMSOd6ppm:1603、1603、15882C、15872C、1511、1475、1459、1455、1450、1436、1419、1414、1409、1406、1370、1367、1259、1239、1234、1228、1224、1223、1084、993、988、985、984、980、962、961、9382C、9362C5呈色反応:アニスアルデヒド-硫酸に陽性。40エタノール抽出物63.4gについて、セファデックスLH-20カラムクロマトグラフィーΦ5cm×22cmを4回に分けて行った。メタノール、メタノール/イソプロパノール5/1液、4/1液、2/1液、イソプロパノール、酢酸エチル、ジメチルスルホキシドで順次溶出分離し、それぞれ9画分、8画分、8画分、9画分を得た。4回目の第2画分3.97gをコスモシール75C18-OPNカラムΦ5cm×11cmを用いて、ODSシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行なった。メタノール/水が1/9液400mL、2/8液300mL、3/7液300mL、4/6液300mL、5/5液240mL、メタノール300mLにより分離して12画分を得た。得られた第8画分453.2mgを再びコスモシール75C18-OPNカラムΦ3.5cm×13cmを用いて、ODSシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行なった。メタノール/水が15/85液200mL、2/8液200mL、25/75液400mL、3/7液200mL、4/6液200mL、メタノール200mLにより分離して7画分を得た。得られた第5画分60.0mgについて、ユニソンUS-C18カラム20×250mmを用いた高速液体クロマトグラフィーを実施した。溶媒として水/アセトニトリル75/25液を用い、流速10mL/分で行ない、溶出物をUV270nmの吸収で検出した。1回の精製により、No.17化合物名未確定の新規化合物,溶出時間18.0分図1-3のNo.17を20.1mg得た。以下に理化学的性質を示す。1分子式:C36H24O18高分解能質量スペクトルHRMS法により測定2分子量:74456ESIMS法により測定したMNa76708363水素核磁気共鳴スペクトル400MHz、溶媒CD3OD:ppm:624d、J=226Hz、1H、622d、J=226Hz、1H、617s、1H、616d、J=226Hz、1H、609d、J=276Hz、1H、599d、J=276Hz、1H、598s、2H、597d、J=276Hz、1H、592d、J=226Hz、1H、579d、J=276Hz、1H4炭素核磁気共鳴スペクトル125MHz、溶媒CD3ODppm:1596、1595、1592、1591、1575、1569、1566、1565、1547、1539、15232C、1519、1470、1467、1442、1438、1384、1255、1248、1244、1241、1240、1026、1025、996、992、986、984、976、9642C、957、953、944、9435呈色反応:アニスアルデヒド-硫酸に陽性。40エタノール抽出物63.4gについて、セファデックスLH-20カラムクロマトグラフィーΦ5cm×22cmを4回に分けて行った。メタノール、メタノール/イソプロパノール5/1液、4/1液、2/1液、イソプロパノール、酢酸エチル、ジメチルスルホキシドで順次溶出分離し、それぞれ9画分、8画分、8画分、9画分を得た。3回目の第2画分779.2mgをコスモシール75C18-OPNカラムΦ2.5cm×12cmを用いて、ODSシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行なった。メタノール/水が1/9液200mL、2/8液100mL、3/7液100mL、4/6液100mL、メタノール100mLにより分離して11画分を得た。得られた第6画分83.9mgについて、ユニソンUS-C18カラム20×250mmを用いた高速液体クロマトグラフィーを実施した。溶媒としてA:水/アセトニトリル95/5液、B:水/アセトニトリル5/5液、を用い、0-45min;15-60Bにてグラジエント溶出を行なった。流速5mL/分で行ない、溶出物をUV270nmの吸収で検出した。1回の精製により、6,6’-バイエコール66bieckol溶出時間44.0分図1-3のNo.18を10.5mg得た。以下に理化学的性質を示す。1分子式:C36H22O18高分解能質量スペクトルHRMS法により測定2分子量:74255ESIMS法により測定したMH-74107173水素核磁気共鳴スペクトル500MHz、溶媒CD3OD:ppm:618s、2H、612s、2H、602d、J=205Hz、4H、599t、J=205Hz、2H4炭素核磁気共鳴スペクトル100MHz、溶媒DMSOd6:ppm:16042C、15884C、15132C、14542C、14452C、14192C、14142C、13722C、12362C、12272C、12202C、9972C、9792C、9782C、9622C、9374C5呈色反応:アニスアルデヒド-硫酸に陽性。セファデックスLH-20カラムクロマトグラフィー[GEヘルスケアジャパン株製]における分画物からフロログルシノールPhloroglucinol図1-3のNo.19を得た。以下に市販試薬の理化学的性質を示す。試薬名:phloroglucinoldehydrate製造元:東京化成工業株式会社製品番号:P13761分子式:C6H6O32分子量:162143水素核磁気共鳴スペクトル300MHz、溶媒CDCl3DMSOd6:ppm:592s4炭素核磁気共鳴スペクトル60MHz、溶媒CDCl3DMSOd6:ppm:1588、942[UVB照射によるヒト皮膚繊維芽細胞TIG-114の障害に対するクロメHP-20分画物中の各化合物の効果]クロメ70v/vEtOH抽出物をダイヤイオンHP20カラムにて分画して得た40v/vEtOH分画物に含まれる19種類の既知及び新規化合物単体についてヒト繊維芽細胞TIG-114のUVB照射による障害に対する保護効果を検討した参考文献:非特許文献3~5。1.試薬検体1クロメ抽出物:乾燥クロメ30kgから70v/vEtOHで6時間撹拌抽出した抽出物2クロメ分画物:クロメ抽出物からダイヤイオンHP20カラムに吸着させた後、水、20v/vEtOHに続けて40v/vEtOHで溶出させた分画物。3ヒト繊維芽細胞TIG-114:ヒューマンサイエンス研究資源バンクから入手JCRB0534し、10牛胎児血清添加DMEM培地で培養。4UVB:三共電機GL-15SE×3本を平行に並べて照射。2.試験群1コントロール群:クロメ抽出物も分画物も含まないPBS培地に混合。2ポジティブコントロール群:ビタミンCを50μMの濃度で含むPBS培地に混合。3クロメ各化合物群:実施例11で得た19種類の各化合物を50μg/mlの濃度で含むPBS培地に混合。4KP-40分画物群:比較の為に40v/vEtOH分画物を50μg/mlの濃度で含むPBS培地に混合。3.試験方法1細胞濃度を1×105Cellsmlに調節する。296ウエルマイクロブレートに50μl/well5,000cells/wellまく。337°Cで24時間培養する。10牛胎児血清添加DMEM培地4培地を各試験群の検体を含むPBS-培地100μlに交換し,UVBを400mJ/cm2照射する。548時間後に10のCellCountingKit8和光純薬製を加えて37度、5CO2インキュベーターで1.5hrインキュべ-卜し、450nmの吸光度を測定する事により繊維芽細胞の数を測定する。4.結果48時間培養後のサンプル群の細胞の生存率を次の式で求めて図14に結果を示す。細胞生存率=サンプル群の細胞数-コントロール群の細胞数/UV未照射の細胞数-コントロール群の細胞数×100分画物であるKP-40群はポジティブコントロール群であるビタミンC群と同程度の生存率を示した。各化合物のうち,新規化合物であるNo.10と,既知物質であるがクロメでの含有が公知となっていないNo.8のフコジフロレトールGfucodiphloretholG,No.9のフロロフコフロエコールBphlorofucofuroeckol-B,及びクロメでの含有が公知であるNo.4のジオキシノデヒドロエコールdioxinodehydroeckolの4種の化合物にポジティブコントロール群であるビタミンC群よりも細胞生存率が高い傾向が認められた。これらの化合物にはUVB照射障害から細胞を守る効果があると推定される。クロメ分画物のUVB照射障害に対する保護効果の長期塗布動物試験概要]本実施例では、クロメ70v/vEtOH抽出物をダイヤイオンHP20カラムにて分画した40v/vEtOH溶出物について、UVB照射長期モデルでUVB照射障害防護効果を確認するための試験条件の概要を示した参考文献:非特許文献1,2。1.試薬検体1クロメ抽出物:乾燥クロメ30kgから70v/vEtOH120Lで7日間静置抽出した抽出物。2クロメ分画物:クロメ抽出物をダイヤイオンHP20カラムに吸着させた後、40v/vEtOHで溶出させた分画物。3親水軟膏:局方親水軟膏ホエイニプロファーマ製4コントロール軟膏:60v/vEtOHを4倍量の親水軟膏に加えて、乳鉢でよく撹拌した。50.025軟膏:40v/vEtOH溶出分画物を0.125になるように60v/vEtOHに溶解し、4倍量の親水軟膏に加えて,乳鉢でよく撹拌した最終濃度=0.025KP-40。60.25軟膏:40v/vEtOH溶出分画物を1.25になるように60v/vEtOHに溶解し、4倍量の親水軟膏に加えて,乳鉢でよく撹拌した最終濃度=0.25KP-40。7UVB:三共電機GL20SE×5本を,SCHOTTWG295相当のガラスフィルターで低波長成分をカットしたものを照射。2.試験群1UV-コントロール群:コントロール軟膏を使用。UVBの照射は無し。2UVコントロール群:コントロール軟膏を使用。UVBの照射を行なう。30.025KP40群:0.025KP40軟膏を使用。UVB照射を行なう。40.25KP40群:0.25KP40軟膏を使用。UVB照射を行なう。3.試験方法1へアレスマウスHOS:HR-1メス7週令を24頭用意する。23日間の予備飼育後,各群の体重平均が等しくなるように4群に分ける。3各群背部にそれぞれコントロール軟膏、0.025KP-40軟膏,0.25KP-40軟膏を約10mg/cm2塗布する。4UV-コントロール群以外の群について週3回UVBを背部に照射する。照射線量は週ごとに54,108,162,216,216,216mJ/cm2と増加させる。5照射直後に再度各群の軟膏を塗布する。67週間の照射塗布試験後に,各測定を行なう。マイクロメーターで皮膚厚を計り,浮腫の指標とする。分光測定計で背部皮膚3ヶ所の色調を測定し,L値,a値,b値を算出する。皮膚水分量を測定する。経皮水分蒸散量TEWLを測定する。4.試験結果KP-40によるUVB照射障害に対する保護効果の長期塗布動物試験の結果を図15および図16に示す。7週間の照射塗布試験後には、UVコントロール群はUVB照射により皮膚厚が増加し、同時に皮膚水分量が減少してUVB照射による皮膚障害を示した。0.025KP-40軟膏を塗布した群では、7週間のUVB照射による皮膚水分量の減少を有意に抑制した。また、0.25KP-40軟膏を塗布した群では、7週間のUVB照射による皮膚厚の上昇浮腫を有意に抑制していることが認められた。これらの結果から、この軟膏の継続塗布により,日常の紫外線による障害から皮膚を保護する効果が期待される。また、この画分にはポリフェノールの含有が認められているところから、UVB照射障害保護効果はクロメポリフェノールフロロタンニン類によるものと推察される。"