"パラポックスウイルス、および狂犬病ウイルス由来の異種DNAを含む、組換えパラポックスウイルス。パラポックスウイルスがヒツジパラポックスウイルスORFVである、請求項1に記載の組換えパラポックスウイルス。パラポックスウイルスがヒツジパラポックスウイルスD1701株である、請求項2に記載の組換えパラポックスウイルス。異種DNAが狂犬病ウイルスのGタンパク質をコードする遺伝子またはそのフラグメントを含む、請求項1に記載の組換えパラポックスウイルス。異種DNAが、SEQIDNO:4、またはSEQIDNO:4に対して少なくとも約98の同一性を有する配列を含む、請求項1に記載の組換えパラポックスウイルス。異種DNAが、ヒツジパラポックスウイルスD1701株のHindIIIフラグメントH/H内に挿入されている、請求項1に記載の組換えパラポックスウイルス。異種DNAが、ヒツジパラポックスウイルスD1701株のHindIIIフラグメントH/H内のVEGFコード配列または隣接する非コード配列内に挿入されている、請求項6に記載の組換えパラポックスウイルス。パラポックスウイルスがヒツジパラポックスウイルスD1701-V-RabGである、請求項1に記載のパラポックスウイルス。請求項1に記載の組換えパラポックスウイルスを作製する方法であって、異種DNAをパラポックスウイルスのゲノムに挿入することを含む方法。パラポックスウイルスがヒツジパラポックスウイルスである、請求項9に記載の方法。パラポックスウイルスがヒツジパラポックスウイルスD1701株である、請求項10に記載の方法。異種DNAが狂犬病ウイルスのGタンパク質をコードする遺伝子またはそのフラグメントを含む、請求項9に記載の方法。異種DNAが、SEQIDNO:4、またはSEQIDNO:4に対して少なくとも約98の同一性を有する配列を含む、請求項9に記載の方法。組換えパラポックスウイルスがヒツジパラポックスウイルスD1701-V-RabGである、請求項9に記載の方法。請求項1~8のいずれか1項に記載の組換えパラポックスウイルス、およびキャリヤーを含む、免疫原組成物。請求項15に記載の免疫原組成物を調製する方法であって、組換えパラポックスウイルスをキャリヤーと組み合わせることを含む方法。動物において狂犬病ウイルスに対する免疫応答を誘導する方法であって、その動物に免疫学的有効量の請求項15に記載の免疫原組成物を投与することを含む方法。免疫応答が抗-Gタンパク質血清抗体の誘導である、請求項17に記載の方法。抗-Gタンパク質特異的防御免疫応答が誘導される、請求項17に記載の方法。誘導により0.5国際単位/mlを超える抗体価が得られる、請求項19に記載の方法。動物において狂犬病ウイルスに対する免疫応答を誘導するための医薬の調製における、請求項1~8のいずれか1項に記載の組換えパラポックスウイルスの使用。感染動物をワクチン接種動物から判別するためのアッセイにおける、請求項1~8のいずれか1項に記載の組換えパラポックスウイルスの使用。本明細書中で別に定義しない限り、本発明に関して用いる科学用語および技術用語は当業者が一般に理解している意味をもつはずである。さらに、状況により別の要求がなされない限り、単数形の用語は複数を含み、複数形の用語は単数を含む。以下の定義は本発明の態様の記載に用いる用語に適用できる。それらは、本明細書に援用した各参考文献それぞれに矛盾する定義が含まれればそれらに代わるものである。約またはほぼは、測定可能な変数に関して用いる場合、その変数の指示した数値、およびその変数の指示した数値の実験誤差内たとえば、平均の95信頼区間内または指示した数値の10パーセント以内いずれか大きい方にあるすべての数値を表わす;ただし、約を週の時間間隔に関して用いる場合、約3週は17~25日であり、約2~約4週は10~40日である。本明細書中で用いるアジュバントは、免疫応答の非特異的刺激物質として作用するいずれかの物質を表わす。アジュバントの詳細な記載については後記を参照。本明細書中で用いる用語動物または動物対象は、狂犬病感染を受けやすいいずれかの動物を含み、これには家畜化されたものと野生の両方の哺乳動物が含まれる。本明細書中で用いる抗体は、起源、調製方法または他の特性に関係なく、抗原結合部位を含むいずれかのポリペプチドである。それは、免疫グロブリン分子またはそのフラグメントであって、抗原に対する免疫応答の結果としてその抗原に特異的に結合するものを表わす。免疫グロブリンは、定常部および可変部をもつ軽および重ポリペプチド鎖から構成される血清タンパク質であり、定常部の組成に基づいてクラス分けされるたとえば、IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgM。特定の抗原に特異的である抗体とは、その抗体の可変部が特異的抗原だけを認識して結合することを示す。抗体は、ポリクローナル混合物またはモノクローナル抗体であってもよい。抗体は、天然源または組換え源からの無傷の免疫グロブリンであってもよく、あるいは無傷の免疫グロブリンの免疫反応性部分であってもよい。抗体は抗原結合タンパク質と言い換えることができ、これには抗体フラグメントが含まれるが、これらに限定されない。本明細書中で用いる用語抗原または免疫原は、対象に曝露した際にその抗原に対して特異的な免疫応答を誘導するであろう1以上のエピトープ線状、コンホメーショナル、または両方を含む分子を表わす。用語抗原は、弱毒化、不活性化または修飾した生存状態の細菌、ウイルス、真菌、寄生生物または他の微生物を表わすことができる。本明細書中で用いる用語抗原は、自然界でその抗原が随伴する全生物体から分離および孤立化したサブユニット抗原をも表わすことができる。抗原という用語は、抗体、たとえば抗イディオタイプ抗体またはそのフラグメント、および抗原または抗原決定基エピトープを模倣することができる合成ペプチドミモトープをも表わすことができる。用語抗原は、たとえばDNA免疫化適用に際してインビボで抗原または抗原決定基を発現するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをも表わすことができる。緩衝液は、他の化学物質の濃度の変化を阻止する化学的系を意味する;たとえば、プロトンのドナーおよびアクセプターの系は、水素イオン濃度pHの著しい変化を阻止する緩衝液として作用する。緩衝液の他の例は、弱酸とそれの塩共役塩基または塩基とそれの塩共役酸の混合物を含有する溶液である。本明細書中で用いる用語細胞系または宿主細胞は、その中でウイルスを複製または維持できる原核細胞または真核細胞を意味する。細胞性免疫応答または細胞仲介免疫応答は、Tリンパ球もしくは他の白血球または両方により仲介されるものであり、活性化したT細胞、白血球または両方により産生されるサイトカイン、ケモカインおよびこれらに類する分子の産生を含む。保存的置換は、当技術分野で定義され、当業者に既知であり、残基をそれらに関連する物理的特性に従って分類するものと認識されている。本明細書中で用いる用語培養物は、他の種またはタイプの不存在下で増殖している細胞または微生物の集団を意味する。本明細書中で用いる用語DIVAは、感染動物をワクチン接種動物から判別することを意味する。用量は、対象に投与するワクチンまたは免疫原組成物を表わす。第1用量または初回抗原刺激ワクチンは、0日目に投与するそのような組成物の用量を表わす。第2用量または第3用量または年用量は、第1用量に続いて投与するそのような組成物の量を表わし、それは第1用量と同一のワクチンまたは免疫原組成物であってもよく、同一でなくてもよい。エピトープは、T細胞受容体または特異的抗体に結合する、抗原の特異的部位であり、一般に約3個のアミノ酸残基から約20個のアミノ酸残基までを含む。賦形剤は、ワクチンまたは免疫原組成物のいずれかの成分であって、抗原ではないものを表わす。フラグメントは、タンパク質または遺伝子のトランケートした部分を表わす。機能性フラグメントおよび生物活性フラグメントは、全長のタンパク質または遺伝子の生物学的特性を保持しているフラグメントを表わす。免疫原活性フラグメントは、免疫応答を誘発するフラグメントを表わす。本明細書中で用いる用語Gタンパク質は、狂犬病ウイルスの外面を覆う糖タンパク質突起中のタンパク質を表わす。本明細書中で用いる用語異種は、異なる種または株に由来することを意味する。本明細書中で用いる用語同種は、同じ種または株に由来することを意味する。相同性または相同性パーセントは、配列をアラインさせ、必要ならば最大の配列同一性を達成するためにギャップを導入し、かついずれかの保存的置換を配列同一性の一部として考慮した後に、比較配列中の残基と同一である、候補配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸残基のパーセントを表わす。体液性免疫応答は、少なくとも一部が抗体により仲介されるものを表わす。同一性または同一性パーセントは、両配列をアラインさせ、必要ならば最大の配列同一性を達成するためにギャップを導入した後に、いずれかの保存的置換を配列同一性の一部として考慮せずに、比較配列中の残基と同一である、候補配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸残基のパーセントを表わす。対象における免疫応答は、抗原に対する体液性免疫応答、細胞性免疫応答、または体液性と細胞性の免疫応答の発生を表わす。免疫原応答は、診断目的または他の検査のために十分であればよく、あるいは病原体感染により引き起こされる疾患の徴候または症状その健康に対する有害作用または合併症を含むを阻止するのに適切であればよい。免疫応答は、通常は当技術分野で既知の標準的なイムノアッセイ法および中和アッセイ法を用いて判定できる。本明細書中で用いる免疫原性のまたは免疫原性は、ある抗原に対して特異的に向けられた免疫応答を誘発する能力を表わす。本明細書中で用いる用語免疫原組成物または免疫原として有効な量または免疫応答を発生させるのに有効な量は、単独でまたは医薬的に許容できるキャリヤーと共に動物に投与した際に、免疫系が認識して特異的免疫応答を発生させることができるすなわち、免疫原活性をもつ組成物または抗原を表わす。本明細書中で用いる分離されたは、それの自然環境から分離されて、単独で、または異種宿主細胞または染色体もしくはベクターたとえば、プラスミド、ファージなど中にあることを意味する。分離された細菌、分離された嫌気性細菌、分離された細菌株、分離されたウイルス、分離されたウイルス株などは、細菌またはウイルスが、たとえばそれの自然環境から分離された際に実質的に他の微生物を含まない組成物、たとえば培養中のものを表わす。分離されたは、いずれか特に定めた物質、たとえばポリヌクレオチドまたはポリペプチドを記載する際に用いる場合、その物質-たとえばポリペプチドまたは核酸-が通常みられる元の細胞環境から分離された物質を表わす。したがって、例示にすぎないが、本明細書中で用いる場合、本発明のポリヌクレオチドで構築した組換え細胞系は分離された核酸を利用する。あるいは、特定のタンパク質または特異的な免疫原フラグメントをワクチンまたは他の組成物として権利請求または使用する場合、それは同定され、分離され、かつ自然界で存在する可能性がある状態と比較してある程度は精製されているので、分離されているとみなされる。そのタンパク質またはその特異的な免疫原フラグメントが、その抗原を産生する組換え細菌または真核細胞発現ベクターにおいて産生されるならば、それは分離されたタンパク質または核酸として存在するとみなされる。たとえば、ポリヌクレオチドを用いて構築された組換え細胞系は分離された核酸を利用する。医薬は、疾患の予防、治癒もしくは改善、またはある生理的状態もしくは発症の予防に有用な、いずれかの作用薬を表わす。用語感染多重度MOIは、細胞当たりの生物数の比率を表わし、それはその感染に使用する予定の接種量の詳細を示す。本明細書中で用いる用語パラポックスウイルス、パラポックスウイルス株は、ポックスウイルス科、パラポックスウイルス属に属するウイルスを表わす。本明細書中で用いる用語ヒツジパラポックスウイルスおよびパラポックスウイルスORFVは、ポックスウイルス科、パラポックスウイルス属、ヒツジパラポックスウイルス種に属するウイルスを表わす。これらのウイルスは、接触伝染性膿疱ウイルス、接触伝染性膿疱性皮膚炎ウイルス、またはオルフウイルス羊鵞口瘡ウイルスとも呼ばれる。それらは、それらを他のポックスウイルスと区別する独特のらせんコートを備えている。用語ヒツジパラポックスウイルスD1701株は、USPatent6365393本明細書に援用するに記載されるウイルスを表わす。ヒツジパラポックスウイルスD1701-V株は、ヒツジパラポックスウイルスD1701株をサル細胞系Veroに適応させたものを表わす。非経口投与は、消化管を含まない経路を介して、または経路により、ワクチンなどの物質を対象の体内へ導入することを表わす。非経口投与には、皮下、筋肉内、経皮、皮内、腹腔内、眼内、および静脈内投与が含まれる。本明細書中で用いる用語病原体または病原性微生物は、宿主動物に疾患、疾病、または異常な状態を誘発または発生させる能力をもつ微生物-たとえば狂犬病ウイルス-を意味する。医薬的に許容できるは、適正な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応などなしに対象の組織と接触させて使用するのに適し、妥当な損益比に相応し、かつそれらの目的用途に有効である物質を表わす。本明細書中で用いる用語ポックスウイルスは、ポックスウイルス科に属するウイルスを表わす。これらのウイルスは、卵形のかなり大きな二本鎖DNAウイルスである。本明細書中で用いる用語ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド分子は、鎖状に共有結合したヌクレオチドモノマーから構成される有機ポリマー分子を意味する。DNAデオキシリボ核酸およびRNAリボ核酸は異なる生物学的機能をもつポリヌクレオチドの例である。本明細書中で用いる用語阻止する、阻止すること阻止などは、微生物の複製を阻害し、微生物の伝播を阻害し、または微生物がそれの宿主内に定着するのを阻害することを意味する。本明細書中で用いるこれらの用語などは、感染症の1以上の徴候または症状の阻害または遮断も意味することができる。微生物負荷が軽減すれば、その処置は治療とみなされる。本明細書中でワクチンまたは他の組成物に関して用いる防御、防御することなどは、ワクチンまたは組成物中に用いた抗原単数または複数が由来する微生物により引き起こされる疾患の症状をそのワクチンまたは組成物が阻止または軽減することを意味する。用語防御、防御することなどは、ワクチンまたは組成物を用いて、対象に既に存在する疾患またはその疾患の1以上の症状を療法処置できることをも意味する。用語狂犬病ウイルスは、ラブドウイルス科のメンバーであるニューロトロピックリッサウイルスを表わす。それは、それの外面に糖タンパク質の突起をもつ一本鎖マイナスセンスRNAウイルスである。組換えPPVまたは組換えPPVは、それらのゲノム中に挿入および/または欠失をもつPPVである。それらの挿入および欠失は、分子生物学的方法を用いて作製される。種相同体には、2以上の異なる種にみられる遺伝子であって、実質的なポリヌクレオチド配列相同性をもち、かつ同一または類似の生物学的機能および/または特性をもつものが含まれる。好ましくは、種相同性を示すポリヌクレオチド配列は、たとえば本明細書に記載する中等度の緊縮条件下でハイブリダイズし、かつ同一または類似の生物活性および/または特性をもつであろう。他の観点において、種相同性を示すポリヌクレオチドは、約60を超える配列相同性、約70を超える配列相同性、約80を超える配列相同性、約90を超える配列相同性、約95を超える配列相同性、約96を超える配列相同性、約97を超える配列相同性、約98を超える配列相同性、約99を超える配列相同性をもつであろう。用語特異的結合、特異的に結合するなどは、2以上の分子が生理的またはアッセイ条件下で測定できる選択的な複合体を形成することと定義される。抗体または他の阻害薬は、適切に選択した条件下でそのような結合が実質的に阻害されず、一方では同時に非特異的結合が阻害されれば、あるタンパク質に特異的に結合すると言われる。特異的結合は、その化合物またはタンパク質に対して高い親和性を特徴とし、かつ選択的である。非特異的結合は、通常は低い親和性をもつ。たとえばIgG抗体における結合は、一般に少なくとも約10-7M以上、たとえば少なくとも約10-8M以上、または少なくとも約10-9M以上、または少なくとも約10-10以上、または少なくとも約10-11M以上、または少なくとも約10-12M以上の親和性を特徴とする。この用語は、たとえばある抗原結合ドメインが多数の抗原により保有されない特定のエピトープに対して特異的である場合にも適用でき、その場合はその抗原結合ドメインを保有する抗体は一般に他の抗原を結合しないであろう。本明細書中で用いる特異的免疫原フラグメントは、配列の一部分であってその配列に対して特異的な抗体またはT細胞により認識される部分を表わす。対象は、狂犬病感染を受けやすいいずれかの動物を表わし、これには家畜化されたものと野生の両方の哺乳動物が含まれる。本明細書中で用いる実質的に同一は、少なくとも約90、少なくとも約95、少なくとも約96、少なくとも約97、少なくとも約98、または少なくとも約99の配列同一度を表わす。本明細書中で用いる療法有効量は、抗原またはワクチンまたは組成物が投与される対象たとえばイヌにおいて免疫応答を誘導するであろう抗原またはワクチンまたは組成物の量であって、ウイルス、細菌、寄生体または真菌などの病原体の感染により引き起こされる疾患の徴候または症状その健康に対する有害作用または合併症を含むを阻止または軽減するのに適切な量を表わす。体液性免疫もしくは細胞仲介性免疫、または体液性と細胞仲介性の両方の免疫を誘導することができる。抗原、ワクチンまたは組成物に対する動物の免疫原応答は、抗体価の測定、リンパ球増殖アッセイによって間接的に、または野生型株で攻撃した後の徴候および症状のモニタリングによって直接的に、評価することができる。ワクチンまたは組成物により与えられる防御免疫は、シェッディングした攻撃生物の減少、ならびに/あるいは死亡率、罹患率、体温などの臨床徴候の低下、ならびに対象の全般的な身体状態、健康状態および性能により評価することができる。ワクチンまたは組成物の療法有効量は、用いる個々の免疫原または対象の状態に応じて異なる可能性があり、当業者が決定できる。本明細書中で用いる用語治療する、治療することまたは治療などは、微生物による感染症を軽減または排除することを意味する。これらの用語などは、微生物の複製を低下させること、微生物の伝播を低下させること、または微生物がそれの宿主内に定着する能力を低下させることを意味することもできる。本明細書中で用いるこれらの用語などは、微生物による感染症の1以上の徴候もしくは症状を軽減、改善もしくは排除すること、または微生物による感染症からの回復を促進することを意味することもできる。本明細書中で用いる用語ワクチン接種するおよびワクチン接種することなどは、ワクチンまたは免疫原組成物を動物に投与することを意味する。本明細書中で用いる用語ワクチンおよびワクチン組成物は、感染症を阻止もしくは軽減する組成物、または感染症の1以上の徴候もしくは症状を阻止もしくは軽減する組成物を意味する。病原体に対するワクチン組成物の防御効果は、普通は対象において免疫応答を誘導することにより達成される。一般に、感染症の発症の終止もしくは低下、徴候もしくは症状の改善、または感染対象からの微生物の排除の促進が、ワクチン組成物の防御効果の指標である。本発明のワクチン組成物は、狂犬病ウイルスにより引き起こされる感染症に対して防御効果をもたらす。本明細書中で用いる用語変異体は、特定のタンパク質および/または遺伝子の配列の誘導体を表わし、その際、誘導された配列は変異による相異以外は本質的にその特定の配列と同じである。そのような相異は自然に発生するか、または合成もしくは遺伝により形成される可能性がある。ベクターまたはベクターウイルスは、異種DNAの挿入に適したPPVであり、それは挿入したDNAを細胞内または生物内へ輸送することができ、かつ適切な場合にはその異種DNAを発現させることができる。本明細書中で用いる用語獣医学的に許容できるキャリヤーは、適正な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応などなしに動物の組織と接触させて使用するのに適し、妥当な損益比に相応し、かつそれらの目的用途に有効である物質を表わす。以下の記載は当業者が本発明を実施するのを補助するために提示される。ただし、当業者は本明細書中で考察する態様を本発明の知見の精神および範囲から逸脱することなく改変および変更することができるので、この記載は本発明を不当に限定すると解釈すべきではない。ウイルス、免疫原組成物、およびワクチン本発明は、狂犬病ウイルス由来の異種DNAを含む組換えパラポックスウイルスの作製のための、パラポックスウイルスの使用を包含する。1態様において、狂犬病ウイルス由来の異種DNAを含む組換えパラポックスウイルスの作製のために、ヒツジパラポックスウイルスPPVOを使用する。他の態様において、ヒツジパラポックスウイルスD1701株を使用する。さらに他の態様において、ヒツジパラポックスウイルスD1701-V株を使用する。パラポックスウイルスに挿入される遺伝子配列は、狂犬病ウイルス由来の異種DNAを含む。1態様において、異種DNAは、狂犬病ウイルスのGタンパク質をコードする遺伝子またはそのフラグメントを含む。1態様において、異種DNAは、SEQIDNO:4、またはSEQIDNO:4に対して少なくとも約98の同一性を有するポリヌクレオチド分子を含む。この遺伝子の構造はさらに、たとえばAnilionisetalNature294275278により示されている。挿入配列は1588ntのサイズである。挿入配列の完全配列SEQIDNO:4を図4に示す。それは狂犬病ウイルスのG遺伝子の全長コード領域1575nt制限酵素分析BamHIおよびEcoRI用のリンカー配列としての5’末端側の7ntおよび3’末端側の6ntを含む。ポリヌクレオチドの配列が分かれば、そのポリヌクレオチドのあらゆる可能なフラグメントを容易に得ることができる。したがって本発明は、Gタンパク質のフラグメントを提供する。1態様において、機能性フラグメントが提供される。他の態様において、生物活性フラグメントが提供される。フラグメントは常法によって、たとえば濾過またはクロマトグラフィーによって精製できる。フラグメントは、当業者に既知の方法による組換えによって調製できる。組換えパラポックスウイルスの作製に際して、異種DNAをヒツジパラポックスウイルスD1701株のHindIIIフラグメントH/H内に挿入する。他の態様において、異種DNAをヒツジパラポックスウイルスD1701株のHindIIIフラグメントH/H内のVEGFコード配列または隣接する非コード配列内に挿入する。異種DNAをパラポックスウイルスに挿入するために用いられる方法は標準法であり、当業者に既知である。それらはUSPatent6365393に記載されている。1態様において、狂犬病ウイルス由来の異種DNAを含む組換えパラポックスウイルスはヒツジパラポックスウイルスD1701-V-RabGである。1態様において、狂犬病ウイルス由来の異種DNAを含む組換えパラポックスウイルスはD1701-VrVRabGK-UC1002であり、それは特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づいて、TheAmericanTypeCultureCollection、ManassasVA20108USAにATCC登録商標特許寄託番号PTA-11662で寄託されている。プラスミドpdV-RabG7.692ntの配列はSEQIDNO:5であり、それは配列表に示されている。本発明はまた、本明細書に記載する配列に対して少なくとも99、少なくとも98、少なくとも97、少なくとも96、少なくとも95、少なくとも93、少なくとも90、少なくとも85、少なくとも80、少なくとも75、少なくとも70、少なくとも65、少なくとも60、少なくとも55、少なくとも50の同一性および/または相同性をもつポリヌクレオチド配列を包含する。本発明はまた、本明細書に記載するSEQIDNOのいずれか1つの非コード鎖または相補配列に中等度ないし高度の緊縮条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列、およびその種相同体を包含する。高度の緊縮条件の例には、0.2×SSC/0.1SDSを含む65°C~75°Cの緩衝液中での最終洗浄が含まれ、一方、中等度の緊縮条件の例には、2×SSC/0.1SDSを含む35°C~45°Cの緩衝液中での最終洗浄が含まれる。温度および緩衝液または塩濃度の変更によって同等の緊縮性を達成できることは当技術分野で理解されている;AusubeletalProtocolsinMolecularBiologyJohnWileySonspp6036410に記載。組換えPPVを細胞、細胞系および宿主細胞内で増殖させることができる。それらの細胞、細胞系または宿主細胞は、たとえば哺乳動物細胞および哺乳動物以外の細胞であってもよいが、これらに限定されない。PPVを増殖させることができる細胞、細胞系および宿主細胞は当業者に既知であり、容易に入手できる。1態様において、Vero細胞が用いられる。他の態様において、ウシ腎細胞またはヒツジ精巣細胞を使用する。組換えPPVを、免疫原組成物またはワクチンに使用する前にさらに弱毒化または不活性化することができる。弱毒化および不活性化の方法は当業者に周知である。弱毒化のための方法には、適切な細胞系での細胞培養における連続継代、紫外線照射、および化学的変異形成が含まれるが、それらに限定されない。不活性化のための方法には、ホルマリン、ベータプロプリオラクトンBPLもしくはバイナリーエチレンイミンBEIによる処理、または当業者に既知である他の方法が含まれるが、それらに限定されない。ホルマリンによる不活性化は、ウイルス懸濁液を37ホルムアルデヒドと混合して最終ホルムアルデヒド濃度0.05にすることにより実施できる。このウイルス-ホルムアルデヒド混合物を、室温で約24時間の定速撹拌により混合する。不活性化されたウイルス混合物を次いで適切な細胞系での増殖についてアッセイすることにより、残留する生存ウイルスを検査する。BEIによる不活性化は、本発明のウイルス懸濁液を0.1MBEI2-ブロモ-エチルアミン,0.175NNaOH中と混合して最終BEI濃度1mMにすることにより実施できる。このウイルス-BEI混合物を室温で約48時間の定速撹拌により混合し、続いて1.0Mチオ硫酸ナトリウムを最終濃度0.1mMになるように添加する。混合をさらに2時間続ける。不活性化されたウイルス混合物を次いで適切な細胞系での増殖についてアッセイすることにより、残留する生存ウイルスを検査する。組換えPPVは免疫原組成物およびワクチンに使用できる。免疫原組成物およびワクチンは、場合により1種類以上の獣医学的に許容できるキャリヤーを含有することができ、それには医薬用のビヒクル、賦形剤または媒体として作用する液体、半固体または固体希釈剤が含まれる。本明細書中で用いる獣医学的に許容できるキャリヤーには、あらゆる溶剤、分散媒体、コーティング、アジュバント、安定剤、希釈剤、保存剤、抗細菌薬および抗真菌薬、等張化剤、吸着遅延剤などが含まれる。希釈剤には水、生理食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロールなどを含めることができる。等張化剤には、特に当業者に既知の塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトールおよび乳糖を含めることができる。安定剤には、特に当業者に既知のアルブミンが含まれる。保存剤には、特に当業者に既知のメルチオレートが含まれる。アジュバントには特に当業者に既知である下記のものが含まれるが、それらに限定されない:RIBIアジュバント系RibiInc.、ミョウバン、水酸化アルミニウムゲル、水中油型乳剤、油中水型乳剤、たとえば完全および不完全フロイントアジュバント、ブロックコポリマーCytRx,ジョージア州アトランタ、SAF-MChiron,カリフォルニア州エメリービル、AMPHIGEN登録商標アジュバント、サポニン、QuilA、QS-21CambridgeBiotechInc.,マサチュセッツ州ケンブリッジ、GPI-0100GalenicaPharmaceuticals,Inc.,アラバマ州バーミンガムまたは他のサポニン画分、モノホスホリルリピドA、アブリジンAvridine脂質-アミンアジュバント、大腸菌由来の熱不安定エンテロトキシン組換え体その他、コレラ毒素、またはムラミルジペプチド。本発明に関して有用なアジュバントおよび添加剤の量および濃度は当業者が容易に決定できる。1態様において、本発明は、約50μgから約2000μgまでのアジュバントを含む免疫原組成物およびワクチンを考慮する。他の態様において、アジュバントは約100μgから約1500μgまで、または約250μgから約1000μgまで、または約350μgから約750μgまでの量で含有される。他の態様において、アジュバントは約500μg/2ml免疫原組成物およびワクチン用量の量で含有される。免疫原組成物およびワクチンは、抗生物質を含有してもよい。そのような抗生物質には、アミノグリコシド類、カルバペネム類、セファロスポリン類、糖ペプチド類、マクロライド類、ペニシリン類、ポリペプチド類、キノロン類、スルホンアミド類、およびテトラサイクリン類のクラスのものが含まれるが、これらに限定されない。1態様において、本発明は、約1μg/mlから約60μg/mlまでの抗生物質を含む免疫原組成物およびワクチンを考慮する。他の態様において、免疫原組成物およびワクチンは、約5μg/mlから約55μg/mlまでの抗生物質、または約10μg/mlから約50μg/mlまでの抗生物質、または約15μg/mlから約45μg/mlまでの抗生物質、または約20μg/mlから約40μg/mlまでの抗生物質、または約25μg/mlから約35μg/mlまでの抗生物質を含む。さらに他の態様において、免疫原組成物およびワクチンは約30μg/ml未満の抗生物質を含む。免疫原組成物およびワクチンは、組換えPPVのほかに他の抗原を含んでもよい。抗原は不活性化された微生物の全製剤もしくは部分製剤の形態、または遺伝子工学的技術もしくは化学合成により得られた抗原性分子の形態であってもよい。本発明に従って用いるのに適した他の抗原には、病原性細菌または病原性ウイルスに由来するものが含まれるが、これらに限定されない。イヌの場合、組換え狂犬病免疫原組成物およびワクチンは、場合により1以上の追加のイヌ抗原、たとえば下記のものとの混合物を含有してもよい:エールリキアカニス、イヌパルボウイルスCPV、イヌジステンパー、イヌパラインフルエンザウイルスCPI、イヌアデノウイルスII型CAV-2、イヌアデノウイルスCDV、イヌコロナウイルスCCV、レプトスピライクテロヘモラギアLI、レプトスピラカニコラLC、レプトスピラグリポチホサLG、レプトスピラポモナLP、ボレリアブルグドルフェリなど。抗原の1組合わせは、イヌパルボウイルス、イヌジステンパーウイルス、イヌアデノウイルス、およびイヌパラインフルエンザウイルスの分離株を含み、コロナウイルスおよびレプトスピラ出現しつつある血清型レプトスピラグリポチホサおよびレプトスピラポモナを含むを含むかまたは含まない。ネコの場合、組換え狂犬病免疫原組成物およびワクチンは、場合により1以上の追加のネコ抗原、たとえば下記のものとの混合物を含有してもよい:ネコカリチウイルスFCV、クラミドフィラフェリスFCPとしても知られている、ネコ白血病ウイルスFeLV、ネコ汎白血球減少ウイルスFPV、ネコ鼻腔気管炎ウイルスFVR、ネコ免疫不全ウイルスFIV、ネコ感染性腹膜炎ウイルスFIPV、バルトネラヘンゼレたとえば、猫ひっかき病など。ウマの場合、組換え狂犬病免疫原組成物およびワクチンは、場合により1以上の追加のウマ抗原、たとえば下記のものとの混合物を含有してもよい:ウマインフルエンザウイルス、ウマヘルペスウイルス1および4、ウマアルテリウイルス、西ナイルウイルス、ウマロタウイルス、ストレプトコッカスエクイ、破傷風トキソイドなど。本明細書に記載する免疫原組成物およびワクチンを動物に投与して、RVに対する有効な免疫応答を誘導することができる。したがって、RVに対する有効な免疫応答を刺激する方法であって、狂犬病ウイルス由来の異種DNAを含む組換えパラポックスウイルスを含む、療法有効量の免疫原組成物またはワクチンを投与することを含む方法を本明細書に記載する。この方法により、抗-Gタンパク質血清抗体が生成する。本明細書に記載する免疫原組成物およびワクチンを動物に投与して、動物を狂犬病に対してワクチン接種することができる。この免疫原組成物およびワクチンを動物に投与して、動物の狂犬病を予防または治療することができる。したがって、動物を狂犬病に対してワクチン接種し、および狂犬病を予防または治療する方法であって、狂犬病ウイルス由来の異種DNAを含む組換えパラポックスウイルスを含む、療法有効量の免疫原組成物またはワクチンを投与することを含む方法を本明細書に記載する。投与の形態、用量、経路免疫原組成物およびワクチンは、投与経路に応じて多様な形態で調製できる。たとえば、免疫原組成物およびワクチンは注射用として適した無菌水性液剤または分散液剤の形態で調製でき、あるいは凍結乾燥法を用いて凍結乾燥形態で調製できる。凍結乾燥した免疫原組成物およびワクチンは、一般に約4°Cに保持され、安定化溶液、たとえば生理食塩水および/またはHEPES中に再構成することができる。あるいは、免疫原組成物およびワクチンは凍結乾燥により保存できる。免疫原組成物およびワクチンは、懸濁液剤または乳剤としても調製できる。免疫原組成物およびワクチンは、療法有効量の前記の組換えPPVを含有する。精製したウイルスをそのまま免疫原組成物またはワクチン中に使用でき、あるいはさらに弱毒化または不活性化することができる。一般に、免疫原組成物またはワクチンは約1×102~約1×1012PFU、または約1×103~約1×1011PFU、または約1×104~約1×1010PFU、または約1×105~約1×109PFU、または約1×106~約1×108PFUを含有する。免疫原組成物またはワクチン中の防御効果を与えるのに有効な厳密なウイルス量は、当業者が決定できる。免疫原組成物およびワクチンは一般に、約0.5ml~約5mlの容量の獣医学的に許容できるキャリヤーを含む。他の態様において、キャリヤーの容量は約1ml~約4ml、または約2ml~約3mlである。他の態様において、キャリヤーの容量は約1mlであり、または約2mlであり、または約3mlであり、または約5mlである。免疫原組成物およびワクチン中に使用するのに適した獣医学的に許容できるキャリヤーは、本明細書に記載するいずれかのキャリヤーであってよい。投与前にウイルスを弱毒化または不活性化する必要があるかどうかは当業者が容易に判定できる。他の態様において、組換えPPVをさらに弱毒化せずにそのまま動物に投与できる。ウイルスの療法有効量は、動物の状態および感染症の程度を含めた幾つかの要因のいずれかに応じて異なる可能性があり、当業者が決定できる。本発明の方法に従って、単回量を動物に投与してもよく、あるいは約2週から約10週までの間隔をおいて2回以上の接種を行なってもよい。追加免疫計画が必要になる可能性があり、投与計画は最適免疫化が得られるように調整することができる。最適な投与計画は当業者が容易に決定できる。免疫原組成物およびワクチンを血流中、筋肉内、または内臓内へ直接投与することができる。非経口投与に適した手段には、静脈内、動脈内、腹腔内、くも膜下、脳室内、尿道内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内および皮下が含まれる。非経口投与に適した器具には、針マイクロニードルを含む注射器、無針注射器、および注入法が含まれる。非経口配合物は一般に水性液剤であり、賦形剤、たとえば塩類、炭水化物および緩衝剤好ましくは、約3から約9まで、または約4から約8まで、または約5から約7.5まで、または約6から約7.5まで、または約7から約7.5までのpHにするを含有することができるが、ある用途については、それらを無菌非水性液剤として、または発熱物質を含まない無菌水など適切なビヒクルと併せて使用する乾燥形態として配合する方が適切である可能性がある。無菌条件下での非経口配合物の調製、たとえば凍結乾燥によるものは、当業者に周知の標準的な製薬技術を用いて達成できる。本明細書に記載する組換えパラポックスウイルスならびに免疫原組成物およびワクチンは、動物を狂犬病に対してワクチン接種するための医薬の調製に使用できる。本発明は、動物に存在するパラポックスウイルスの起源を判定する方法を提供する。DIVAワクチン-感染動物をワクチン接種動物から判別できるもの-を用いるワクチン接種は、動物に存在するパラポックスウイルスの起源を判定する手段を提供する。この区別は、種々の診断法のいずれかにより達成でき、それにはELISA、ウェスタンブロット法およびPCRが含まれるが、これらに限定されない。これらおよび他の方法は当業者に容易に認識され、既知である。本明細書に記載するパラポックスウイルスは、それらのゲノム組成および発現するタンパク質の両方において、野生型株から区別できる。そのような区別により、ワクチン接種動物と感染動物を識別できる。たとえば、特定の試験室検査でパラポックスウイルスについて陽性の検査結果を示す動物が、野生型パラポックスウイルス株を保有するか、あるいは先にワクチン接種により得られた組換え産生パラポックスウイルスを保有するかについて、判定を行なうことができる。判定を行なうためには多様なアッセイ法を使用できる。たとえば、パラポックスウイルスについて陽性の検査結果を示す動物からウイルスを分離し、核酸に基づくアッセイ法を用いて、先のワクチン接種の指標となるパラポックスウイルスゲノムの存在を判定することができる。核酸に基づくアッセイ法には、サザンブロットまたはノーザンブロット分析、PCR、および配列決定法が含まれる。あるいは、タンパク質に基づくアッセイ法を採用できる。タンパク質に基づくアッセイ法では、パラポックスウイルスについて陽性の検査結果を示す動物から感染が疑われる細胞または組織を分離することができる。そのような細胞または組織から細胞抽出物を調製し、そしてウイルスタンパク質に対する適切な抗体であって先にワクチン接種した組換え産生パラポックスウイルスまたは野生型パラポックスウイルスのいずれかの存在を区別同定できる抗体を用いて、たとえばウェスタンブロット法を行なうことができる。動物に誘導される免疫応答の程度および性質は、多様な手法を用いて評価できる。たとえば、接種動物から血清を採集し、パラポックスウイルスに特異的な抗体の存在または不存在を、たとえば一般的なELISAで検査する。リンパ組織における応答性細胞傷害性Tリンパ球CTLの検出は、細胞性免疫応答の誘導の指標としてのT細胞増殖などのアッセイにより達成できる。関連技術は当技術分野で、たとえばColiganetalCurrentProtocolsinImmunologyJohnWileySonsIncに十分に記載されている。組換えヒツジパラポックスウイルスD1701-V-RabGは、DIVAアッセイに使用できる。1態様において、それは感染動物をワクチン接種動物から判別する狂犬病N遺伝子またはタンパク質の検出のためのアッセイに使用できる。他の態様において、それは感染動物をワクチン接種動物から判別する狂犬病P遺伝子またはタンパク質の検出のためのアッセイに使用できる。さらに他の態様において、それは感染動物をワクチン接種動物から判別する狂犬病L遺伝子またはタンパク質の検出のためのアッセイに使用できる。さらに他の態様において、それは感染動物をワクチン接種動物から判別する狂犬病M遺伝子またはタンパク質の検出のためのアッセイに使用できる。本発明を説明のための、限定ではない実施例によってさらに記載する。RVのGタンパク質をコードする遺伝子を含む組換えヒツジパラポックスウイルスを作製した。Gタンパク質の発現を、組換えウイルスのRVに対する免疫刺激特性および防御特性として評価した。実施例1狂犬病Gタンパク質を発現する組換えウイルスD1701-V-RabGの作製RVのGタンパク質をコードする遺伝子を含む、組換え作製によるヒツジパラポックスウイルスを作製した。Gタンパク質の発現を評価し、かつRVに対する組換えウイルスの免疫刺激および防御特性を評価した。伝達プラスミドの構築組換えヒツジパラポックスウイルスD1701-V-RabGの作製のために、ヒツジパラポックスウイルスPPVOベクター系を用いた。狂犬病ウイルスGタンパク質遺伝子は化学合成されBlueHeronBiotech;米国、pUCプラスミド中において提供されている。完全G遺伝子を1.582bpのサイズのBamHI-EcoRIDNAフラグメントとしてアガロースゲル0,8w/v電気泳動によって分離し、QiaexIIゲル抽出キットQiagen;ドイツによって精製した。プラスミドpdV-Rec1をBamHIおよびEcoRIで二重消化してライゲーションに用いた迅速ライゲーションキット,Promega;ドイツ。大腸菌DH5αF’Invitrogen,ThermoFisherScientific;ドイツを形質転換した後、挿入配列陽性コロニーをプラスミドDNAのEcoRI-BamHI制限消化により選択した。その結果、伝達プラスミドpdV-RabG図1が得られ、これをQiagenPlasmidMaxiKitQiagen;ドイツで調製し、DNA配列決定に用いた。このために、pdV-Rec1中の挿入部位の上流に位置するプライマーORF32NSEQIDNO:1;5’-GCGCGCTGCGGGTGCGCTACCAATTCGCGC-3’および挿入部位の下流に位置するプライマーORF31NSEQIDNO:2;5’-GCATCCCGTTACCACCGGAGACCGACGCTCCC-3’、ならびに内部G遺伝子特異的プライマーRabG-FSEQIDNO:6;5’-GGAGTCTCTCGTTATCATATCTC-3’およびRabG-RSEQIDNO:7;5’-CTAAACAAGGTGCTCAATTTCGT-3’をそれぞれ用いた。これにより、挿入G遺伝子の完全配列SEQIDNO:4を決定することができた。Bluo-Gal染色による組換え体の選択Vero細胞106個に0.1MOI感染多重度のlacZ発現ウイルスD1701-VrVを感染させ、2時間後に2μgのpdV-RabGプラスミドDNAを、製造業者AmaxaNucleofector,Lonza;ドイツの推奨に従ってnucleofectionによりトランスフェクションした。ウイルス溶解物を3~4日後に収穫し、6ウェルプレートFisherScientific;ドイツ内でVero細胞における力価判定に用いた。プラークが目視できる状態になった時点で、記載に従ってアガロース含有Bluo-Galをオーバーレイした。白色の外観をもつウイルスプラークを採取し、単一プラーク溶出物4°Cで一夜、リン酸緩衝化生理食塩水PBS中を、48ウェルプレートの単一ウェル内のVero細胞1×105個の同時感染に用いた。プラーク-PCRによる組換え体の選択各ウイルスプラーク分離物からのDNAの分離を、Pasamontesetalの改変により実施した。ウイルス溶解物0.2mlを、3回、凍結-70°Cおよび融解37°Cし、氷上で3回、20~30秒間、音波処理した音波水浴。フェノールおよびクロロホルムで抽出した後、エタノール沈殿の前に10μgの酵母tRNAまたは3μlのGlycoBlueAmbion;ドイツを添加した。DNAペレットを70v/vエタノールで2回洗浄し、乾燥させた後に14μlの二回蒸留水に溶解した。RabG特異的PCRのために、4μlのDNAを氷上で、4.0pmolのRabG-FSEQIDNO:6および4.0pmolRabG-RSEQIDNO:7プライマーならびに5μlのReddyMix2×PCRAbgene,ThermoFisherScientific;ドイツからなるプライマーミックス1μlと混合した。PCRをTrioThermoblockBiometra;ドイツ内で下記のインキュベーションにより実施した:98°Cで2分間、続いて40サイクルを96°Cで1分間、60°Cで30秒間、72°Cで30秒間、そして最終延長工程を72°Cで2分間。PCR生成物を水平1w/vアガロース-臭化エチジウム0.3マイクログラム/mlゲルで分離した。433bpのサイズのG遺伝子特異的PCRフラグメントを示すプラーク分離物からのウイルス溶解物を希釈し、前記に従って少なくとも3回、Bluo-Galアガロースオーバーレイを用いてさらにプラーク精製した。最後に、G遺伝子について陽性である組換えウイルスプラーク分離物のDNAを、LacZ遺伝子特異的PCRで、4μlのDNA、3.95pmolのプライマーlacZ-FSEQIDNO:8;5’-CGATACTGTCGTCGTCCCCTCAA-3’、および4.13pmolのプライマーlacZ-RSEQIDNO:9;5’-CAACTCGCCGCACATCTGAACT-3’により検査した。5μlのAccuPrimeSuperMixIIInvitrogen,FisherScientific;ドイツを添加した後、PCRを下記の加熱により実施した:98°Cで2分間、続いて40サイクルを96°Cで1分間、62°Cで30秒間および68°Cで90秒間、最終延長工程を68°Cで2分間。PCR生成物の分離を前記に従って実施した。508bpのサイズのLacZ遺伝子特異的フラグメントの不存在は、対応する組換えウイルスプラーク分離物が3ラウンドのプラーク精製後にLacZ発現性の親ウイルスD1701-VrVを含まないことを証明した。D1701-V-RabGの高力価ウイルス原液の調製後、ウイルスDNAを下記に従って調製し、RabG-PCRおよびLacZ-PCRにおける検査に用いた。組換えウイルスプラークの免疫組織学的染色IPMA挿入した外来遺伝子の発現成功を、まずIPMAによりアッセイした;これは、24ウェルプレート内でVero細胞において力価判定する、組換えウイルスプラークの免疫組織学的染色を伴う。ウイルスプラークが出現した後、各ウェルから培地を吸引し、層流フード内でプレートを約10分間開いたままにすることにより細胞を乾燥させた。その後、氷冷した無水メタノールにより-20°Cで15~20分間、細胞を固定した。氷冷したPBS中1v/vウシ胎仔血清FCSで2回洗浄した後、10v/vFCS含有PBSにより室温RTで90分間、細胞をブロックした。室温で60分間、Gタンパク質特異的マウスモノクローナル抗体G559と共にインキュベートした後、PBS中1FCSFLI-Tuebingen;ドイツに1:200希釈した。PBS-T0.05v/vのTween-20を含有するPBSで3回洗浄した後、ペルオキシダーゼカップリングした抗マウス二次抗体Jackson-ImmunoRes.,DIANOVA;ドイツを1:2000希釈して添加し、室温で60分間インキュベートした。PBS-TおよびPBSで徹底的に洗浄した後、基質VectorNovaRed,Axxora;ドイツを製造業者の推奨に従って赤褐色の陽性染色が目視できるようになるまで添加した。陰性対照として、非感染細胞およびD-1701-VrVまたはD-1701-Vに感染させた細胞をインキュベートした。ウイルスプラークおよび感染細胞は、狂犬病Gタンパク質について強い陽性がみられた。実施例2D1701-V-RabGの特性分析ウイルス原液の調製高力価組換えウイルス原液を得るために、10~20個のT150培養フラスコGreiner;ドイツにMOI0.5で同時感染させた。3日後、約80の細胞病原作用CPEがみられ、すべてのフラスコの細胞および上清を収穫および採集して遠心13,000rpm、4°Cで2時間に用いた。上清を慎重に除去し、ウイルスペレットを4°Cで一夜、1~2mlのPBSに溶解した。このウイルス懸濁液を氷上での音波処理Soniccelldisruptor,Branson;ドイツにより、10秒間の3パルス100W各パルス間に10秒間の中断を用いて完全分散させ、続いて遠心500~700×g,10分間,4°Cして細胞屑を除去した。上清を氷上に貯蔵し、一方、細胞ペレットを1.0mlのPBSに再懸濁し、氷上で音波処理した20秒間を2回、その間に10秒間の中断を伴い、次いで30秒間を1回。低速遠心の後、上清を第1上清と合わせ、部分量に分割し、力価判定し、-70°Cに貯蔵した。ウイルスDNAの特性分析Vero細胞にMOI0.5で感染させ、2~3日後に約80のCPEトリプシン処理および4°Cで短時間の低速遠心により収穫した。MasterPureDNAIsolationKitEpicentreBiotechnology,BiozymScientific;ドイツを用い、製造業者のプロトコルに従ってDNAを分離した。G遺伝子が適正な遺伝子座に挿入されたことを確認するために、2μgのDNAを制限酵素消化し、0.8w/vアガロースゲルで分離し、サザンブロットハイブリダイゼーションのためにナイロン膜GEHealthcare;ドイツへ移した。狂犬病ウイルス特異的プローブRabg-F/-RPCRの生成物をゲル分離し、RediPrimeGEHealthcare;ドイツを用いて放射性標識した32P-dCTP,MPBiomedicals;ドイツ。次いでこれをサザンブロットハイブリダイゼーションに用いた;0.5w/vの脱脂粉乳、1.0w/vのドデシル硫酸ナトリウムSDSおよび0.5mg/mlの変性ウシ胸腺DNAKT-DNA,Sigma;ドイツを含有する4×SSPE1×=0.18MNaCl,10mMPP,1mMEDTA,pH7.4中、50°Cの条件下で実施。X線KodakX-Omat;ドイツ照射した後、0.4NNaOH中45°Cで30~60分間のインキュベーション、続いて100°Cで0.1×SSC、0.5SDS、0.2MTris-HClpH7.4中における短時間のインキュベーションにより、プローブをフィルターから分離した。2回目のハイブリダイゼーションには、D1701-VのvegF-E遺伝子座を含むHindIIIフラグメントHを記載に従って用いた。サザンブロット法の結果により、G遺伝子がD1701-VrVのゲノム内へ適正に挿入されたことが確認された。G遺伝子特異的RNAの検出Vero細胞にMOI3~5で感染させ、感染後p.i.の種々の時点でSurePrepTotalRNAExtractionKitFisherScientific;ドイツを用いて総RNAを分離した。さらに、シトシンアラビノシドAraC;0.04mg/ml,Sigma;ドイツまたはシクロヘキシミドCHX,0.1mg/ml,Serva;ドイツの存在下で感染させた細胞からRNAを抽出して、挿入G遺伝子の早期発現を検査した。対照として、非感染細胞からRNAを分離した。ホルムアルデヒドを含有する変性1アガロースゲルでRNAを分離し、記載に従ってナイロン膜へ移した。放射性標識した狂犬病GPCRRabG-F/-RフラグメントをハイブリダイゼーションプローブとしてUltraHyb溶液Ambion;ドイツ中、42°Cで用いた。それらの結果により、狂犬病G遺伝子はORFVの早期vegF-Eプロモーターの制御下で調節されているためきわめて早期に発現されることが証明された。免疫蛍光法によるGタンパク質の検出免疫蛍光法のために、Vero細胞1×105個/mlに4チャンバースライドBDFalcon;ドイツ内においてMOI0.1または3.0で感染させた。感染後の種々の時点で、細胞を培地で洗浄し、メタノールを含まない3.7v/vホルムアルデヒドPierce,ThermoFisherScientific;ドイツにより37°Cで15分間固定した。PBSで3回の洗浄後、細胞を0.2v/vTritonX-100で37°C、5分間の処理によって透過性にした。PBS洗浄後、細胞をPBS中5FCSにより37°Cで30~40分間ブロックした。Gタンパク質検出のために、細胞を37°Cで1時間、1FCS含有PBS中に1:1000希釈したマウスモノクローナル抗体G559FLI;ドイツ、チュービンゲンと共にインキュベートした。PBS中で5回の洗浄後、スライドを暗所において37°Cで30分間、PBS中に1:1000希釈した二次抗マウスAlexa-555抗体MolecularProbes;ドイツと共にインキュベートした。ORFV感染後、後期の細胞検出を、Dr.RudigerRauePfizer,英国により提供されたORFV特異的ウサギ抗血清PAS2274の使用により実施した。血清を1FCS含有PBS中に1:1000希釈し、二次抗体である抗ウサギAlexa-488を1:1000の希釈度で用いた。Phalloidin-647により製造業者Biotium;ドイツの指示に従ってアクチン染色を実施し、続いて0.04μg/mlのDAPI4’,6-ジアミジン-2’-フェニルインドール二塩酸塩;RocheMolecularBiochemicals;ドイツにより室温で暗所において20~30分間、核の染色を実施した。PBS中で徹底的に洗浄した後、スライドをMowiol-DABCOで包埋し、ZeissApoTomeでAxiovisionソフトウェアを用いて蛍光イメージングを実施した。それらの結果により、D1701-V-RabG感染後、早期感染後4時間目および後期感染後24時間目の強いGタンパク質発現が明らかに証明された。後期感染した細胞は、抗血清PAS2274で特異的染色することによってさらに同定できる。さらに、蛍光染色はGタンパク質の表面発現の証拠を示した。染色の特異性を非感染細胞の使用により調べた。ウェスタンブロット法によるGタンパク質の検出Vero細胞3×105個にMOI1.0で同時感染させ、37°C、5CO2雰囲気でインキュベートした。感染後の種々の時点で細胞プラス上清を収穫し、遠心し8,900×g,10分間,4°C、細胞沈降物を1.0mlのPBSで3回洗浄し、1v/vのTritonX-100を含有する0.15mlのPBSに再懸濁した。氷上で30分後、細胞溶解物を15.000×g、4°Cで15分間遠心し、上清をSDS-PAGEポリアクリルアミドゲル電気泳動のために保存した。このために、3部の溶解物を1部の4×DualColorタンパク質装填用緩衝液Fermentas;ドイツと混合し、5分間煮沸し、音波処理し、約10μgのタンパク質をSDS-PAGEにより、8w/vProSieve50ゲルをTris-Tricine-SDS流動用緩衝液と共に用いて推奨に従って分離したFMCBioproducts,Biozym;ドイツ。PrestainedProteinLadderFermentas;ドイツを分子量マーカーとして用いた。電気泳動の後、タンパク質をPVDF膜に製造業者の指示に従って移したPierce,ThermoFisherScientific;ドイツ。膜を3×RotiblockRoth;ドイツ中、室温で3時間ブロックした後、狂犬病ウイルスGタンパク質のC末端に対して特異的なウサギ抗ペプチド抗血清好意的にDr.K.-K.Conzelmannにより提供,Max-von-PettenkoferInstitute;ドイツ、ミューニッヒを、1×RotiBlock中に1:10,000希釈して用いた。4°Cで一夜のインキュベーション後、膜をTBS-T0.05v/vのTween-20を含むTris緩衝化生理食塩水中で5回、徹底的に洗浄し、ペルオキシダーゼカップリングした抗ウサギ抗体1:20,000;Jackson-ImmunoRes.,Dianova;ドイツと共に室温で1時間インキュベートした。TBS-T洗浄後、ECL基質を推奨に従って用いたImmobilonWestern,Millipore;ドイツ。反応したタンパク質を化学発光X線フィルムCL-XPosure,Pierce,ThermoFisherScientific;ドイツの使用により検出した。予想した分子量58~60kDaの狂犬病ウイルスGタンパク質の発現が、感染後種々の時点で確認された。実施例3D1701-V-RabGでマウスを免疫化した後の特異的免疫応答の誘導用量依存性の抗G血清抗体誘導Gタンパク質は防御免疫応答について最も重要な抗原であるとみなすことができ、誘導されたウイルス中和血清抗体SNTの程度を狂犬病ウイルス攻撃感染に対する防御と相関させることができる。OIEWorldOrganizationofAnimalHealthおよびWHOWorldHealthOrganizationによれば、0.5~1.0IU/ml国際単位を超える抗体価のSNTの存在は防御性があるとみなされる。したがって、Gタンパク質特異的SNT抗体の誘導を、D1701-V-RabGでマウスを初回免疫化した後、1日目から14日目まで測定した。FLIで繁殖させた6~8週齢のC57/BL6マウスグループ当たりn=6または7を、0.1mlの指示したPFUプラーク形成単位のD1701-V-RabG各後足の大腿につき0.05mlで筋肉内免疫化した。個々の血清試料を毎日採取し、記載に従って迅速蛍光焦点抑制試験法RFFITでのSNT測定に用いた。要約すると、RPMI培地中の系列5培血清希釈液を調製し、0.05mlの各希釈液を96ウェルプレートのウェル内で0.05mlの狂犬病ウイルスCVS11株ロットno.47,1,7×105PFU/mlと混合した二重試験法で。37°Cおよび5CO2で90分間のインキュベーション後、0.1mlのBHK21細胞懸濁液1×106個/mlを各ウェルに添加し、混合し、37°C、5CO2で24時間インキュベートした。PBSおよび予冷した80v/vアセトンで培養プレートのウェルを洗浄した後、細胞を新鮮な80v/vアセトン中、4°Cでさらに30分間、固定した。アセトンを除去し、風乾した後、0.05mlのFITC抗狂犬病モノクローナルグロブリンCentocor;米国を37°Cで30分間添加して、狂犬病ウイルス感染細胞を染色した。PBSで1回、二回蒸留水で1回、洗浄した後、蛍光顕微鏡検査によりウイルス感染をモニターした。感染細胞数を50のまで減少させた血清希釈液を陽性として読み取った。血清の力価をIU/mlとして表記し、陽性WHO基準血清と比較した。図2は、マウスを指示したPFUのD1701-V-RabG組換えウイルスで筋肉内単回免疫化した後のSNTの発生を証明する。免疫化後の指示した日dにFFITにより血清を検査した。図2Dにみられるように、低用量104PFU免疫化ですら、8日目までに平均SNT5.5IU/mlを生じ、免疫化後14日目まで増加して約13IU/mlになった。106または107PFUを免疫化に用いると図2Aおよび2B、1週間後までにそれぞれ平均SNT約10~20IU/mlが誘導され、それは初回免疫化後14日目に約約50IU/mlまで増加した。107PFUのD1701-V-RabGを用いると、免疫化後4日目までに防御血清抗体価0.6~3.0IU/mlが検出され、それはより低い試験免疫化用量では達成されなかった図2。他のマウス実験データを示していないは、106または107PFUのいずれかの組換えウイルスを用いた追加免疫化が初回免疫化106または107PFUで後14日目のSNTをわずかに増加させるにすぎないことを証明した。まとめると、これらの結果は、種々の用量のD1701-V-RabGでマウスを免疫化した後の第1週中に防御SNT抗体価の誘導に成功したことを証明する。実施例4D1701-V-RabGにより仲介されるマウスの防御免疫応答D1701-V-RabGの防御能の評価を、OIEの推奨に従って種々の免疫化マウスC57/BL6の攻撃感染により実施した。6~8週齢で、マウスグループ当たりn=11または12を、指示したPFUのD1701-V-RabGで前記に従って免疫化した。非免疫化対照マウスn=15にはPBSを注射した。免疫化の3週間後、すべての動物をビルレント狂犬病ウイルスCVS株0.03ml,4.8×105PFUを含有で頭蓋内攻撃した。攻撃感染後21日目まで毎日、動物を観察した。重篤な神経症状に罹患した瀕死の動物は安楽死させた。図3に示すように、107PFUのD1701-V-RabGによる単回筋肉内免疫化は、高用量の頭蓋内適用した攻撃ウイルスに対してマウスを完全に防御した11/11。そのグループの1匹の免疫化動物が12日目に死亡したが、これは攻撃した狂犬病ウイルス感染によるものではなかった。したがって、その動物をデータ分析から除外した。10培少ない量106PFUのD1701-V-RabGを含有する単回量の適用は、なお73の防御を達成した8/11の生存動物。免疫化用量をさらに減少させると防御率は58105PFU;7/12、または27104PFU;3/11に低下し、これに対し対照免疫化マウスn=15は攻撃感染後6~9日目の間に死亡した図3。実施例5防御免疫に対するT細胞の役割以下の実験は、組換えD1701-V-RabGによる防御免疫の誘導に対するT細胞CD4-、CD8-、またはCD4/8-陽性細胞の寄与をマウスにおいて調べた。図5Aに示すように、107PFUのD1701-V-RabGによる免疫化0日目の直前および直後すなわち、-1、0、1および5日目に、CD4-またはCD8-T細胞に対する抗血清をマウスのグループ図中に示した動物数nに腹腔内投与して、インビボで各T細胞集団を枯渇させた。その後、15日目にすべての動物を500LD50用量のビルレントRV株CVSで脳内攻撃した。図5Aに示すように、CD4-陽性T細胞を枯渇させた動物は非免疫化対照動物に対するものと類似の応答によって分かるように、一般に防御されなかった。図5Bにみられるように、動物のグループを0日目にD1701-V-RabGで免疫化し、次いで、15日目のビルレントRV株CVSによる攻撃感染の直前および直後に、すなわち13攻撃感染の2日前、15、19、および23日目に、CD4-および/またはCD8-T細胞をインビボ枯渇させた。得られた結果は、D1701-V-RabGによる抗狂犬病ウイルス免疫応答の初回刺激に成功した後では、14日後のT細胞枯渇は、T細胞集団をインビボ枯渇させた動物の75~90パーセントが攻撃を受けても生存したという点で防御に対して有害に作用しないことを証明する。結論として、これらの結果は、CD4-陽性T細胞抗G抗体産生に必要なヘルパーT細胞の可能性が最も高いが、組換えD1701-V-RabGにより誘導される防御免疫の主要な決定因子であることを示す。実施例6被曝後ワクチン接種療法ワクチンとしての組換えD1701-V-RabGの有効性をマウスにおいて検査した。このために、動物のグループに107PFUのD1701-V-RabGを0、1、および4日目に筋肉内i.m.ワクチン接種した。マウスを1×106PFUのビルレントRV株CVSで0日目に攻撃した。図6に示すように、免疫化グループの1匹以外のすべてのマウスが狂犬病に対して防御された。ビルレントRV株CVSに対する種々の被曝後免疫化計画を調べるために、マウスにおいて追加実験を実施した。図7において、灰色四角はマウスにD1701-V-RabGをワクチン接種した日を示す。結果生存動物をこの図にまとめる。それらの結果は、マウスの療法ワクチンとしてのD1701-V-RabGの能力を証明する。図7にみられるように、攻撃日とその翌日に投与した二重ワクチン接種は80の防御を仲介し、少なくとも60の動物が末梢RV攻撃感染後3日目に開始した1日1回で4回の免疫化により防御された。実施例7:種々の免疫化経路により誘導された免疫応答マウスを1×106PFUのD1701-V-RabGで下記の投与経路により免疫化した:鞘膜内i.vag.、乱刺法、腹腔内i.p.、皮内i.d.、鼻腔内i.n.、皮下s.c.、筋肉内i.m.、および静脈内i.v.。免疫化後6日目灰色棒および13日目黒色棒に誘導された血清抗体応答血清中和抗体、またはSNTとして測定を図8に示す。免疫化の14日後に動物に100LD50のビルレントRV株CVSを脳内感染させ、生存率を計算した。これらの結果は、最高SNT力価IU/mlとして示すが静脈内、腹腔内および筋肉内ワクチン接種により誘導されたことを示し、これによりそれぞれ86、100および78の最良防御率も得られた。"