i第1の発現カセットがレンチウイルスのgagおよびpol遺伝子をそして第2の発現カセットがレンチウイルスのrevおよび選択マーカーをコードする2つの発現カセットを含むAAVITRに隣接した組込みカセットを含有するバキュロウイルスの主鎖を含むハイブリッドベクター;およびiiプロモーターの調節下にあるAAVrepオープンリードフレームORFを含有する発現プラスミドから成る、レンチウイルスの構造および調節タンパク質を安定して発現する系。ハイブリッドベクターの2つの発現カセットがテールツーテール配向でありかつそれぞれが構成的プロモーターおよびポリAにより駆動される、請求項1に記載の系。プロモーターがCMV、CMVIE、PGK、SV40、eF1α、SFFVおよびRSVから選択される、請求項1または2に記載の系。プロモーターがCMVIEプロモーターである、請求項1~3のいずれか1項に記載の系。選択マーカーがハイグロマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ゼオマイシン耐性遺伝子から選択される、請求項1~4のいずれか1項に記載の系。選択マーカーがハイグロマイシン耐性遺伝子である、請求項5に記載の系。選択マーカーが内部リボソーム侵入部位IRES下流にクローニングされる、請求項1~6のいずれか1項に記載の系。repタンパク質がrep78である、請求項1~7のいずれか1項に記載の系。第1の発現カセットがレンチウイルスのgagおよびpol遺伝子をコードしそして第2の発現カセットがレンチウイルスのrevおよび選択マーカーをコードする2つの発現カセットを含む、AAVITRに隣接した組込みカセットの少なくとも1つのコピーを安定してそのゲノム中に組み込んで含有することで特徴付けられる、安定してレンチウイルスのgagpolおよびrevを発現する細胞から成る半安定なレンチウイルスのパッケージング細胞株。細胞がHEK293、HEK293T、HEK293SF、TE671、HT1080またはHeLaから選択されるヒト細胞株である、請求項9に記載の半安定レンチウイルスのパッケージング細胞株。2つの発現カセットがテールツーテール配向でありかつそれぞれが構成的プロモーターおよびポリAにより駆動される、請求項9または10のいずれか1項に記載の半安定レンチウイルスのパッケージング細胞株。プロモーターがCMV、CMVIE、PGK、SV40、eF11α、SFFVおよびRSVから選択される、請求項9または11のいずれか1項に記載の半安定レンチウイルスのパッケージング細胞株。プロモーターがCMVIEプロモーターである、請求項12に記載の半安定レンチウイルスのパッケージング細胞株。選択マーカーがハイグロマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ゼオマイシン耐性遺伝子から選択される、請求項9~13のいずれか1項に記載の半安定レンチウイルスのパッケージング細胞株。選択マーカーがハイグロマイシン耐性遺伝子である、請求項14に記載の半安定レンチウイルスのパッケージング細胞株。選択マーカーが内部リボソーム侵入部位IRES下流にクローニングされている、請求項9~15のいずれか1項に記載の半安定レンチウイルスのパッケージング細胞株。i請求項9~16いずれか1項に記載の半安定パッケージング細胞株を培養するステップ、ii半安定パッケージング細胞株にenv遺伝子を挿入するステップ、およびiii半安定パッケージング細胞株に導入ベクターを挿入するステップを含むレンチウイルスベクター産生する方法。env遺伝子がVSVGenv、MLV4070env、RD114env、キメラエンベロープタンパク質RD114TR、キメラエンベロープタンパク質RD114pro、バキュロウイルスGP64envまたはGALVenvまたはそれらの誘導体から選択される、請求項17に記載の方法。env遺伝子が、キメラエンベロープタンパク質RD114TRをコードする遺伝子である、請求項17または18に記載の方法。本発明はレンチウイルスベクターLV産生の分野に関する。いくつかの遺伝子治療の臨床試験がLVを遺伝子送達ビヒクルとして使って進行中である。全てのこれらの試験において、LV産生はまだ一過性プロトコルに基づいている。本発明はHIV1系パッケージング細胞株を作製する新しい戦略を提供する。かかる戦略は、AAV逆方向末端反復配列ITRに隣接した組込みカセットを含有するバキュロウイルス主鎖を含むハイブリッドベクター、いわゆるバキュロAAVハイブリッド系の、repタンパク質をコードするプラスミドと組み合わせての使用に基づく。この系は構造および調節HIV1タンパク質gagpolおよびrevの安定な組込みを得ることを可能にする。本発明の系は、a2つの発現カセット、すなわち、レンチウイルスのgagおよびpol遺伝子をコードするものと他のレンチウイルスのrevおよび選択マーカーをコードするものを含有することを特徴とするバキュロAAVハイブリッドベクター、および、brepタンパク質をコードするプラスミドを含む。提起した系は、宿主細胞をかかるレンチウイルスタンパク質で安定してかつ効果的に遺伝子操作するために、構造および調節HIV1タンパク質を送達する新しくかつ有利な道を表す。この系を用いて半安定なLV産生に用いる構造および調節HIV1タンパク質gagpolおよびrevだけを含む第1の中間体を得た、またはこれを出発点として用いて、任意に、調節タンパク質tatと目的のエンベロープタンパク質を含むかまたはエンベロープタンパク質だけを含む、第2および第3世代パッケージング細胞株、ならびに導入ベクターも含むプロデューサー細胞株を得た。第1中間体はHIV1gagpolおよびrev遺伝子をトリシストロンの立体配置で発現する2コピーの組換えバキュロAAVパッケージング構築物を運ぶ。かかる中間体はPK7と呼ばれて、実施例におけるPK7を意味する。ITR介在型AAVベクター組込みに必要であることが公知のAAVrep78タンパク質の一過性発現により、バキュロAAVパッケージングベクターのゲノム組込みを促進した[14]。かかる第1中間体は1年間の培養に対して驚くべき遺伝安定性を有することを示し、これは残存する遺伝エレメントの一過性トランスフェクション後の機能的LVの連続産生を証明した。さらに、かかる細胞においてサイレンシング現象は観察されなかった。さらに、非コード遺伝子内の転写活性領域中の2つの直列に組み込まれたパッケージングAAVの組込み部位を正確にマッピングすることにより、本発明者らは、そのmRNAがLVにそして究極的には宿主細胞に組み込まれうる危険遺伝子の活性化の可能性に対する安全性の論拠を与えた。レンチウイルスのgagpolおよびrevの安定な発現のためのハイブリッドバキュロAAVベクターの使用に基づいて開発したパッケージング系をMolPackと呼ぶ。本発明で使用する発現系は有利なことに、わずか1回のトランスフェクションとクローニングで、構造gagpolおよび調節revHIVタンパク質の安定かつ安全な導入を可能にする。現在臨床試験で使われているLVの産生は未だに全ての必要なタンパク質の一過性トランスフェクションに基づく。対照的に、本発明の発現系で得られる中間体は安定であり、サイレンシング現象を示さず、LVの半安定産生を開発することを可能にし、経済的視点から大きい利点がある。実際、半安定産生では、最終産物を得るために必要なトランスフェクトすべき構築物の数が少なくて済む。さらに、注目すべきは、本発明の半安定産生を用いると、一過的にLVを産生する場合と比較しうる力価を有するLVを得るのに、一過性トランスフェクションによる産生で使うDNA量のわずか3分の1で十分であることが見出された。さらに、トランスフェクトする構築物の数が減ずると、RCLの形成を伴う組換え事象の可能性が減少し、従ってレンチウイルス粒子産生をより安全なものにする。それ故に、本発明の発現系、半安定パッケージング細胞株および産生方法は、現在臨床試験で応用されるツールおよび方法と比較して非常に有利である。発明の表明本発明の第1の態様によれば、i第1の発現カセットがレンチウイルスのgagおよびpol遺伝子をコードしかつ第2の発現カセットがレンチウイルスのrevおよび選択マーカーをコードする2つの発現カセットを含むAAVITRに隣接した組込みカセットを含有するバキュロウイルス主鎖を含むハイブリッドベクター;およびiiプロモーターの調節下にあるAAVRepオープンリードフレームORFを含有する発現プラスミドから成るレンチウイルスの構造および調節タンパク質を安定発現する系が提供される。好ましくは、ハイブリッドベクターの2つの発現カセットはテールツーテールtailtotail配向であり、それぞれが構成的プロモーターおよびポリAにより駆動され、好ましくは、プロモーターはCMV、CMVIE、PGK、SV40、eF1α、SFFVおよびRSVから選択され、より好ましくは、プロモーターはCMVIEプロモーターである。好ましくは、選択マーカーはハイグロマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、またはゼオマイシン耐性遺伝子から選択され、より好ましくは選択マーカーはハイグロマイシン耐性遺伝子である。さらに好ましくは、選択マーカーは内部リボソーム侵入部位IRESの下流にクローニングされる。本発明の他の態様によれば、レンチウイルスのgagpolおよびrevを安定して発現する細胞から成る半安定レンチウイルスパッケージング細胞株であって、かかる細胞はそのゲノム中に安定して組み込まれた少なくとも1コピーのAAVITRに隣接した組込みカセットを含有し、この組込みカセットは第1の発現カセットがレンチウイルスのgagおよびpol遺伝子をコードしかつ第2の発現カセットがレンチウイルスのrevおよび選択マーカーをコードする2つの発現カセットを含むことを特徴とする、前記細胞株が提供される。好ましくは、細胞は好ましくはHEK293、HEK293T、HEK293SF、TE671、HT1080またはHeLaから選択されるヒト細胞株、より好ましくは細胞株はHEK293Tである。好ましくは、2つの発現カセットはテールツーテール配向であり、それぞれが構成的プロモーターおよびポリAにより駆動され、好ましくは、プロモーターはCMVCMVIE、PGK、SV40、eF1α、SFFVおよびRSVから選択され、より好ましくは、構成的プロモーターはCMVIEプロモーターである。好ましくは、選択マーカーはハイグロマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、またはゼオマイシン耐性遺伝子から選択され、より好ましくは選択マーカーはハイグロマイシン耐性遺伝子である。より好ましくは、選択マーカーはIRESの下流にクローニングされる。好ましくはAAVrepタンパク質はrep78またはrep68から選択される。より好ましくはrepタンパク質はrep78である。他の態様によれば、レンチウイルスベクターを産生する方法であって、iレンチウイルスのgag、polおよびrevを安定して発現する細胞から成る半安定レンチウイルスのパッケージング細胞株を培養するステップであって、かかる細胞は、安定してゲノム中に組込まれたAAVITRに隣接した2つの発現カセットを含む組込みカセットの少なくとも1つのコピーを含有し、第1の発現カセットはレンチウイルスのgagおよびpol遺伝子をコードしかつ第2の発現カセットはレンチウイルスのrevおよび選択マーカーをコードすることを特徴とする前記ステップ;ii半安定パッケージング細胞株にenv遺伝子を挿入するステップ;iii半安定パッケージング細胞株に導入ベクターを挿入するステップを含むものである前記方法が提供される。好ましくは、2つの発現カセットはテールツーテールtailtotail配向であり、それぞれが構成的プロモーターおよびポリAにより駆動され、好ましくは、プロモーターはCMV、CMVIE、PGK、SV40、eF1α、SFFVおよびRSVから選択され、より好ましくは、構成的プロモーターはCMVIEプロモーターである。好ましくは、選択マーカーはハイグロマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ゼオマイシン耐性遺伝子から選択され;好ましくは選択マーカーはハイグロマイシン耐性遺伝子であり、より好ましくは。IRESの下流にクローニングされる。エンベロープタンパク質は宿主細胞に、AAVベクター、レトロウイルスベクター、安定なプラスミド組込みまたは相同組換えを用いて挿入することができる。好ましくは、env遺伝子はプラスミドを用いて一過性トランスフェクションにより挿入される。好ましくは、env遺伝子はVSVGenv、MLV4070env、RD114env、キメラエンベロープタンパク質RD114TR、キメラエンベロープタンパク質RD114pro、バキュロウイルスGP64envまたはGALVenvまたはそれらの誘導体から選択され、より好ましくはRD114TRをコードするenv遺伝子である。好ましくは、導入ベクターはSINレンチウイルスベクターを用いて挿入される。発明の詳細な説明本発明の好ましい特徴および実施形態の詳細な説明を非限定の例を用いて説明しよう。当業者は、特に断らない限り、化学、分子生物学、微生物学、組換えDNAおよび免疫学の通常の技法を使うことにより本発明を実施に移すことができる。全てのかかる技法は、出版されている文献に開示されかつ説明されている。例えば、JSambrookEFFritschandTManiatis1989MolecularCloningALaboratoryManualSecondEditionBooks13ColdSpringHarborLaboratoryPress;AusubelFMetal;CurrentProtocolsinImmunologych12JohnWileySonsNewYorkNY;BRoeJCrabtreeandAKahn1996DNAIsolationandSequencingEssentialTechniquesJohnWileySonsJMPolakandJamesODMcGee1990InSituHybridizationPrinciplesandPracticeOxfordUniversityPress;MJGait1984OligonucleotideSynthesisAPracticalApproachIrIPress;および、DMJLilleyandJEDahlberg1992MethodsofEnzymologyDNAStructurePartASynthesisandPhysicalAnalysisofDNAMethodsinEnzymologyAcademicPressを参照されたい。全てのこれらの出版物は参照により組み込まれる。バキュロAAVハイブリッド系本発明はHIV1に基づくパッケージング細胞株を作製する新しい戦略を提供する。LV用の産生系の最適化は、LV技法に基づく遺伝子治療薬開発のために解決を要する重要な課題である。この技法を用いる臨床試験数が増加するにも関わらず、LVはかかる試験においてなお一過性トランスフェクションプロトコルを用いて作製されている。この方法では、LVの作製は未だに非常に高価でありかつ多数の患者向けには不満足である。この理由で、LV用の安定パッケージング細胞株を開発する多くの努力がなされてきた。安定なレンチウイルスパッケージング細胞株の開発における重要な課題の1つは宿主細胞を遺伝子操作するための正しいビヒクルの選定である。多くの場合、宿主細胞はプラスミドを用いて遺伝子操作で作られてきたが、かかる場合、ゲノム不安定性および遺伝子サイレンシング現象も観察されている。他の2例ではgagpolおよびrev遺伝子を安定して組み込むために、レトロウイルスベクターが使われている。今まで開発された安定パッケージング細胞株はいずれも臨床試験に用いられていない。本発明の戦略は、レンチウイルスの構造および調節HIVタンパク質を安定して発現する系であって、第1の発現カセットはレンチウイルスのgagおよびpol遺伝子をコードしそして第2の発現カセットはレンチウイルスのrevおよび選択マーカーをコードする2つの発現カセットを含む、AAVITRに隣接した組込みカセットを含有するバキュロウイルスの主鎖を含むハイブリッドベクターと一緒に、プロモーターの調節下にあるAAVrepORFを含有する発現プラスミドから成る前記系の使用に基づくものである。バキュロウイルスの主鎖の存在は、いくつかの異なるタンパク質をコードする2つの発現カセットを含む大きくかつ複雑な組込みカセットの宿主であることを可能にする。得られるバキュロAAVパッケージングベクターは、わずか1回の感染処置を介して安定かつ効果的にLVを産生するために必要とするウイルスタンパク質を用いて宿主細胞を遺伝子操作することを可能にする。バキュロAAVパッケージングベクターのゲノム組込みはAAVrepタンパク質の一過性発現により得た。この系により、非コード域の遺伝子間転写活性領域におけるAAVベクターの組込みが得られ、従って、そのmRNAがLVに、究極的には、宿主標的細胞に組込まれうる危険遺伝子の活性化を排除することができる。提示した系は、構造および調節レンチウイルスタンパク質を用いて宿主細胞を安定してかつ効果的に遺伝子操作する新しいかつ先進的な方法である。好ましい実施形態において、バキュロAAVパッケージング構築物に含まれる2つの発現カセットはテールツーテール配向であり、それぞれが構成的プロモーターおよびポリAにより駆動され、好ましくは、プロモーターはCMV、CMVIE、PGK、SV40、eF1α、SFFVおよびRSVから選択され、より好ましくは、プロモーターはCMVIEプロモーターである。本発明の好ましい態様によれば、AAVパッケージングベクターに含まれる選択マーカーはハイグロマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、またはゼオマイシン耐性遺伝子から選択され、好ましくは、マーカーはハイグロマイシン耐性遺伝子であり、より好ましくは、選択マーカーはIRESの下流にクローニングされる。バキュロAAVパッケージングベクターのゲノム組込みは、ITR介在型AAVベクター組込み用のAAVrepタンパク質の一過性発現により得た。好ましい実施形態においては、repタンパク質はrep78またはrep68から選択される。より好ましくは、タンパク質はrep78である。この系を用いて、HIV1タンパク質gagpolおよびrevを安定して発現するように遺伝子操作された細胞を得ることが可能であった、そしてかかる細胞を本発明者らはこれを半安定パッケージング細胞と呼ぶ。特に、本発明は、かかる遺伝子操作が行われた細胞およびそれらの半安定なLV産生のための使用を開示しかつ請求の範囲とする。半安定パッケージング細胞株本発明の半安定パッケージング細胞株は、HIV1gagpolおよびrev遺伝子を発現する組換えバキュロAAVパッケージング構築物の少なくとも1つのコピーを運ぶ宿主細胞から成る。バキュロAAVパッケージングベクターのゲノム組込みは、ITR介在型AAVベクター組込みを得る目的でAAVrepタンパク質の一過性発現により得ている。好ましくは、2つの発現カセットはテールツーテール配向であり、それぞれが構成的プロモーターおよびポリAにより駆動され;、好ましくは、プロモーターはCMV、CMVIE、PGK、SV40、eF1α、SFFVおよびRSVから選択される。より好ましくは、構成的プロモーターはCMVIEプロモーターである。本発明の好ましい態様によれば、選択マーカーはハイグロマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、またはゼオマイシン耐性遺伝子から選択され;好ましくは選択マーカーはハイグロマイシン耐性遺伝子であり、より好ましくは、選択マーカーはIRESの下流にクローニングされる。好ましくは、AAVrepタンパク質はrep78またはrep68から選択される。より好ましくはrepタンパク質はrep78である。半安定パッケージング細胞株を得るために遺伝子操作することができる宿主細胞は、HEK293、HEK293T、HEK293SF、TE671、HT1080またはHeLaから選択されるヒト細胞株であり、より好ましくは細胞株はHEK293Tである。かかる半安定なパッケージング細胞株は、半安定産生系において色々なenvおよび色々な導入ベクターを用いて潜在的に多様なLVを産出するのに好適である。これは、コスト削減を可能にするので、LVのより有効な産生に大きい利点を表し、これはgagpolおよびrevをコードするGMPグレードのプラスミドDNAを用いる必要がなく、一過性トランスフェクション中のプラスミド間の組換え事象に二次的に付随するRCL形成のリスクを減ずる。半安定パッケージング細胞株は多目的に使用できるツールであり、LVを産生するために臨床試験で現在使われている他のツールより安全性および経済性の点で優れている。本発明の半安定なパッケージング細胞株は、1年間の培養に対して驚くべき遺伝安定性を有することを示し、これは残りの遺伝エレメントの一過性トランスフェクション後の機能的LVの連続産生を証明した。さらに、非サイレンシング現象が実際に観察され、この中間体を用いて得たLVの力価と感染性の両方が1年間影響されないで残った。かかるデータは選択圧力の存在または非存在の両方で確認された。注目すべきこととして、文献においてAAVITR介在型カセットの組込み安定性に関する比較しうるデータは見当たらない。唯一の関連情報は、野生型AAV血清2型AAV2で感染したヒト骨髄由来の繊維芽細胞様細胞株RuddlesDetroit6cellsは潜伏状態で少なくとも47および118継代の間、ウイルス配列を維持したことである。実施例に示したように、本発明の半安定なパッケージング細胞株は少なくとも102継代の間、生存した。それ故に、本発明はLVを産生する方法であって、i前記の半安定パッケージング細胞株を培養するステップ、ii半安定パッケージング細胞株にenv遺伝子を挿入するステップ、iii半安定パッケージング細胞株に導入ベクターを挿入するステップを含む前記方法を提供する。エンベロープタンパク質はAAVベクター、レトロウイルスベクター、安定なプラスミド組込みまたは相同組換えを用いて宿主細胞中に挿入してもよい。好ましくはenv遺伝子は、プラスミドを用いて一過性トランスフェクションにより挿入する。好ましくはenv遺伝子はVSVGenv、MLV4070env、RD114env、キメラエンベロープタンパク質RD114TR、キメラエンベロープタンパク質RD114pro、バキュロウイルスGP64envまたはGALVenvまたはそれらの誘導体から選択される。より好ましくは、本発明はRD114の細胞質テールtailをMLVエンベロープの細胞質テールにより置換えたキメラエンベロープタンパク質RD114TRenvを用いてもよい。好ましくは、導入ベクターをSINLVを用いて挿入する。本発明の半安定パッケージング細胞株は、感染性の意味で一過性トランスフェクションにより産生したものと定性的に等しいLVを産生することができる。LVの半安定産生の応用について考慮すべき非常に重要な事象は、半安定パッケージング細胞株が容易にトランスフェクトされる能力を失わなかったことである。実際、PK7細胞は親細胞株HEK293Tと同じレベルでトランスフェクトされる。この特性は、遺伝子改変およびパッケージング構築物によるHEK293細胞のクローニング後に失われるのが全く普通である。逆に、本発明で使われるgagpolおよびrevの安定な組込みのための発現系は半安定パッケージング細胞株のトランスフェクション能力に対して何の問題も生じない。さらに、半安定パッケージング細胞株およびLVを産生する方法におけるその使用は生産コストにとって大きい利点を有する。特に、わずか3つのさらなる構築物、例えばプラスミドそれぞれ、tat、envおよび導入ベクターが第2世代LVの産生に、または2つの構築物それぞれ、envおよび導入ベクターが第3世代LVの産生に必要である。逆に、現在臨床試験に使われるGMPの方法は、本発明の半安定パッケージング細胞株で用いるものに加えて、gagpolおよびrevをそれぞれコードする2つのさらなる構築物が必要である。さらに、本発明の方法およびツールでトランスフェクトする構築物の数が少ないことも、上記のLVの安全性に追加される利点である。さらにまた、本発明の半安定産生を用いると、一過性トランスフェクションによる産生で使うDNAの総量のわずか3分の1で、一過的に産生したレンチウイルスの力価と比較しうる力価を有するレンチウイルスを十分に得られることも明らかになった。それ故に、本発明の発現系、半安定パッケージング細胞株および産生方法は、現在臨床において施用されているツールおよび方法と比較して非常に有利である。実施例一般的方法プラスミド野生型HIV1gag、polおよびrev遺伝子を、pCG719pKLgagpol以後、簡略化のためにCMVGPRと呼ぶ図1a、模式図9およびpCG720pKrev以後、CMVRevと呼ぶ図1a、模式図5プラスミドからそれぞれMluINarIおよびMluINotI消化により切除した25。そのウイルス遺伝子を2つの異なる発現カセット各カセットはCMVIEプロモーターにより駆動され、polyA配列を運ぶに入れて、GatewaypENTRTM4シャトルベクターInvitrogen、Co、Carlsbad、CA中にテールツーテール配向で挿入した。第1のカセットはgagとpol遺伝子を発現するが、第2のカセットはrev遺伝子と選択マーカーハイグロマイシン耐性hygro遺伝子を発現し;hygroはIRESの下流にクローニングしてバイシストロンbicistronic翻訳を可能にした。2つの発現ユニットを感染性AAVゲノムを運ぶ組換えpSUB201プラスミドのXbaI部位中に導入した17。得られる5ITRCMVgagpolpolyApolyAhygroIRESrevCMVITR3カセットを次いで切除し、GatewaypENTRTM4シャトルベクターInvitrogenCoCarlsbadCA中に挿入した。組換えハイブリッドバキュロAAVパッケージングベクターバキュロAAVGPR図1a、模式図1を、2つのカセットを含有するpENTRTM4シャトルエントリーベクターとBaculoDirect直鎖DNABaculoDirectTMバキュロウイルス発現系InvitrogenCoとの間のバクテリオファージλ部位特異的組換え系を用いて得た。相同組換え中に、BaculoDNAのポリヘドリン遺伝子はその際、GPR二重カセットで置換えられた。pABCMVrep78発現プラスミドCMVAAVrep78は、Recchiaetal200418に記載の発現ベクターpABS43のCMVIEプロモーター下のAAVrep78ORFをクローニングすることにより得た図1a、模式図4。pMDGプラスミドCMVVSVG19は小胞性口内炎エンベロープ糖タンパク質VSVGをコードする図1a、模式図6。第3世代導入ベクター、pCCLsinPPThPGKeGFPWPREAmpSINeGFP20は構成的プロモーターhPGK下のeGFP遺伝子図1a、模式図2を発現する。抗HIV1Chim3トランスジーンを発現する第2世代PΔNChim3導入ベクターはPorcelliniら200920102122に記載されている図1a、模式図3。pCMVRD114TRCMVRD114TR図1a、模式図7プラスミドは、ネコ内因性レトロウイルスRD114エンベロープの細胞外および膜貫通ドメインならびにAMLVenv4070Aの細胞質テールTRから作られたキメラRD114TRエンベロープをコードする23。第2世代パッケージングpCMVΔR874CMVGPRT構築物図1a、模式図8はHIV1gag、pol、revおよびtat遺伝子をコードする19。細胞SpodopterafrugiperdaSf9昆虫細胞InvitrogenCoは10FCSEuroCloneLtd、UKおよびペニシリンストレプトマイシンとグルタミンPSGの組み合わせを補充したTC100培地InvitrogenCoの懸濁液中で27°CにてCO2の非存在のもとで増殖した。ヒト胎児腎293THEK293T細胞およびその誘導体クローンPK7は10FCSおよびPSGを補充したDulbecco改変Eagle培地DMEMで増殖した。CEMA301およびSupT1Tリンパ芽球腫細胞は10FCSおよびPSGを補充したRPMI1640中で増殖した。CD34造血幹細胞HSCおよび新生児白血球は臍帯血UCBからFicollHypaque勾配遠心分離LymphoprepNycomedPharmaASOsloNorwayで精製した。勾配分離の後、回収したUCB単核細胞環から、CD34マイクロビーズキットおよびMiniMACS分離カラムMiltenyiBiotecSunnyvaleCAを用いてポジティブ選択により、CD34HSCを単離した。CD34細胞純度92はFACS分析FACSCaliburBDBioscienceSanJoseCAおよびFlowJoソフトウエアTreeStarIncAshlandORにより、抗CD34PEAbBDPharmingenTMSanDiegoCAを用いて確立した。CD34細胞はヒト幹細胞因子hSCF100ngmlRDSystemsMinneapolisMN、hFlt3L100ngmlPeprotechRockyHillNJ、hIL620ngmlRDSystemsおよびヒトトロンボポエチンhTpo20ngmlPeprotechを含有する20血清Iscove改変Dulbecco培地IMDMで24時間、前刺激し、形質導入の間、同じ培地中で維持した。新生児白血球は48時間、RPMI中の可溶性抗ヒトCD330ngmlOrthocloneOKT3JanssenCilagUKおよび組換えヒトIL2rhIL250UmlChironEmeryvilleCAで刺激し、次いで、10FCS、PSG、およびrhIL2を補充したRPMI中に保った。バキュロウイルス産生とHEK293T細胞のバキュロGPR感染組換えハイブリッドバキュロAAVGPRDNAゲノムを運ぶバキュロウイルスをGateway登録商標適合化バキュロウイルスDNAシステムInvitrogen、Coを用いてBaculoDirect法に従い作製した。組換えバキュロウイルス力価をプラークアッセイにより評価すると、Sf9細胞中の3継代のウイルス増幅後に1×1011pfumlに対応した。15×106HEK293T細胞を4μgのAAVrep78発現プラスミドでトランスフェクトし、24時間後に組換えバキュロAAVGPRに1000のMOIにて感染することによりPK7クローンを得た。細胞をハイグロマイシン無しで4日間維持し、次いで5×105細胞を、ハイグロマイシン100μgmlの連続希釈濃度の存在する22枚の10cmディッシュに播いた。22枚のディッシュをELISAによるp24gag産生についてスクリーニングした。細胞を37×104細胞ディッシュで播いたわずか1枚のディッシュが上清中に十分なp24gagを放出した。このディッシュは40コロニーを含有し、それらを全て拾い上げてスクリーニングした。そのうちの、p24gag産生に対してポジティブの評価を得た3コロニーをさらに特徴付けた。レンチウイルスベクターLV産生と力価測定HEK293T細胞から産生される偽型LVは、次のプラスミド:パッケージング構築物CMVGPR第3世代またはCMVGPRT第2世代、VSVGまたはRD114TRエンベロープ構築物、および第3世代SINeGFP24または第2世代PΔNChim3導入ベクター21の一過性共トランスフェクションにより得た。パッケージング:エンベロープ:導入ベクターの比は、特に断らない限り、65:35:10μgDNAであった。PK7クローンからのLVはenv発現プラスミドと導入ベクターを共トランスフェクトすることにより作製した。一過性トランスフェクションは標準Caリン酸法またはFugene6登録商標系を用いて製造業者の取扱説明書RocheDiagnosticsCorporationIndianapolisINに従って実施し、類似の結果を得た。上清をトランスフェクション後48時間に収穫し、045μmフィルターを通して濾過した。力価を、SupT1、CEMA301、一次活性化末梢血液単核細胞PBMCおよび臍帯血由来のCD34HSCについて、実験の型に応じて計算した。概要を説明すると、SupT1と一次活性化末梢血液単核細胞細胞はポリブレン8μgmlSigmaAldrichStLouisMOの存在のもとで2サイクルのスピノキュレーション1240×g、1時間により形質導入し、一晩静置して相を分離し;CD34HSCは24時間レトロネクチンをコーティングしたプレートTakaraBio、Otsu、Japan上でポリブレン無しで形質導入した。形質導入効率はeGFP発現SINeGFPのフローサイトメトリー分析FACSCaliburBDBioscienceSanJoseCAまたはPorcellinietal2009および20102122に記載のFlowJoソフトウエアTreeStarIncAshlandORを用いるΔLNFGR発現PΔNChim3によってモニターした。5~20ポジティブ細胞の範囲の形質導入値だけを用いて、次式:TU細胞数×GFP100volsupmlでに従って各LV調製物の力価を計算した。サザンブロットアッセイゲノムDNAgDNAをQIAampMiniキットQIAGENGmbH、Germanyにより製造業者の取扱説明書に従って単離した。バキュロウイルスDNAをウイルス粒子からQIAampDNAマイクロキットQIAGENにより抽出した。示した制限酵素を用いて一晩消化後、10μgのgDNAを08アガロースゲルに流し、サザンキャピラリートランスファーによりナイロン膜上にブロットしDuralonStratageneTXUSA、次いでPerfectHybPLUSハイブリダイゼーションバッファー中の1×106dpmmlの32Pランダムプライムド標識した600bpCMVまたは11kbGPRカセットとハイブリダイズさせた。分析用PCR分析AAVRep78プラスミドの残りの組込みのスクリーニングに対するPCR分析を300ngのゲノムDNAについて、プライマーのセット:AAVRep78フォワード:5CGGGCTGCTGGCCCACCAGG3;AAVRep78リバース:5ATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTG3を次のPCR条件:98°Cにて7分間、30サイクルの94°Cにて30秒間、66°Cにて30秒間、および72°Cにて15分間で用いることにより、実施した。2つのGPRカセットの配向を確立するためにPCR分析を300nggDNAについて、プライマーのセット:revフォワード:5CTTGAGGAGGTCTTCGTCGC3;βグロビンリバース:5CCCTGTTACTTCTCCCCTTCC3;revネスト化フォワード:5TGTCTCCGCTTCTTCCTGCC3;βグロビンネスト化リバース:5TTAACCATAGAAAAGAAGGGG3を次の条件:98°Cにて2分間、35サイクルの94°Cにて30秒間、52°Cにて30秒間、および72°Cにて15分間で用いることにより実施した。p24gagELISA培養上清中の物理的LV産生をAllianceHIV1p24抗原ELISAキットPerkinElmerLifeandAnalyticalSciencesIncWalthamMAにより製造業者取扱説明書に従い、1pgp24gagが1×104物理的粒子に対応すると仮定して測定した。ウェスタンブロット分析PK7細胞から誘導した全細胞および核抽出物ならびに単離された細胞を含まないVLPまたはLV由来のウイルスタンパク質を先に記載のように調製した2122。タンパク質をSDSPAGEによりサイズ分画し、HybondECLニトロセルロース膜GEHealthcare、LifeSciences、UKLtd、UKにエレクトロブロットした。膜を5低脂肪ドライミルクでブロックし、次いで適当な一次Abとインキュベートした。AIDS患者から得た抗HIV1血清を1:2000希釈で用い;HIV1revMoAbRev6sc69730SCruzBiotechnologyIncSCruzCAを1:200希釈で用いた。Ab結合を強化化学発光系ECLECLAmershamにより、製造業者の取扱説明書に従って可視化した。リアルタイムTaqManPCRによるLVDNAコピー数の定量組込まれたGPRベクターのコピー数を定量TaqManPCRにより、ABIPrism7900FAST計器AppliedBiosystemsFosterCityCAを用いて確立し、SDS23ソフトウエアAppliedBiosystemsにより分析した。ゲノムDNAgDNAを、次のプライマーとgag遺伝子から誘導したプローブを用いて増幅した:フォワード:5ACATCAAGCAGCCATGCAAAT3;リバース:5ATCTGGCCTGGTGCAATAGG3;プローブ:FAM5CATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGAタグA3TAMRA。PCR条件は次の通りであった:2分間50°Cにておよび5分間95°Cにて、次いで40サイクルの15秒間95°Cにておよび15秒間60°Cにて01°Cサイクルの増分で。ライゲーション介在型LMPCR6ゲノムDNAをPK7細胞からQIAampDNAMiniキットQIAGENにより製造業者の取扱説明書に従って抽出し、そしてBglIIおよびBamHIを用いて37°Cにて一晩消化した。5GATC3粘着末端と適合しうるアダプター76bpオリゴヌクレオチドリンカーのライゲーションを標準条件で実施した。LMPCRは次のネスト化プライマーのカップルを用いて行った:ITRフォワード:16s:5GTAGCATGGCGGGTTAATCA3、および17sロングネスト化:5TTAACTACAAGGAACCCCタグTGATGG3;リンカーリバースプライマー:リンカー1:5GTAATACGACTCACTATAGGGC3およびリンカー2ネスト化:5AGGGCTCCGCTTAAGGGAC3。リンカー配列は5GATCGTCCCTTAAGCGGAGCCCTAタグTGAGTCGTATTACCAGGGAATTCGCCTCGGGATATCACTCAGCATAATG3に対応する。2ラウンドのLMPCRをAmpliTaqGoldDNAポリメラーゼAppliedBiosystemsを用いて行い、それぞれ30サイクルから成った95°Cにて30秒間、52°Cにて30秒間、72°Cにて2分間。PCRアンプリコンをTOPO登録商標クローニングキットInvitrogen、Coを用いてクローニングし、そしておよそ100~200bpのインサートを運ぶプラスミドコロニーを選択し、配列決定を行った。配列相同性はBLASTサーチ、NCBIにより同定した。蛍光insituハイブリダイゼーションFISH分裂中期染色体はPK7細胞をコルヒチン10μgmlSigmaC9754で37°Cにて2時間処理することによって得た。リン酸バッファー生理食塩水PBSで洗浄した後、細胞を低浸透圧溶液75mMKCl中に室温にて6分間保持し、メタノール/酢酸3:1で4回洗浄して固定し、次いで清浄なガラススライド上に延ばした。細胞遺伝子サンプルを70ホルムアミド溶液中で2分間72°Cにて変性し、冷温の70、85、および95エタノールの連続洗浄により脱水し次いで空気乾燥した。特異的プローブを次の通り調製した:GPRカセットを含有する13kbプラスミドDNAはランダムプライムドDNA標識キットRocheAppliedScience、Indianapolis、INを用いてSpectrumOrangeTMdUTPVysis、Inc、DownersGrove、ILで標識したが、ヒトhox4遺伝子を含有する対照30kbコスミドDNAはFISHBrightTM核酸標識キットKreatechBiotechnology、Amsterdam、TheNetherlandsを用いて標識した。ハイブリダイゼーションは、5ngμlの各プローブを含む250μlの50ホルムアミド、2×SSC、および10硫酸デキストランおよび50ngμlのヒトC0T1DNAハイブリダイゼーションバッファーInvitrogenをインキュベートすることにより実施した。サンプルを変性したプローブで10分間75°Cにてコートし、Parafilm登録商標Mで覆い、そして一晩37°Cにて加湿室でインキュベートした。サンプルを1回、04×SSC中で、pH=7、72°Cにて2分間;1回、4×00025Tween20を含有するSSC中で、pH=7、RTにて30秒間;ならびに2回、PBS1×RTにて1分間洗浄した。スライドを002μgμlの496ジアミジノ2フェニルインドールDAPISigmaで対比染色した。可視化と写真撮影はNikon80i正立顕微鏡NikonInstrumentsSpA、Italyで、FITCおよびスペクトルオレンジ色スペクトルオレンジ色フィルター照明を用いて行った。画像はGenikonソフトウエアNikonで処理した。第1中間体PK7クローンの作製第2または第3世代LVの連続産生用のRDMolPackパッケージング細胞株を得るために、いくつかのHEK293T由来の中間体クローンを得た。最初のものは、PK7と名付けられ、組換えハイブリッドバキュロAAVベクターrhバキュロAAVGPR図1a、模式図1を使ってHIV1gag、polおよびrev遺伝子を安定して組み込むことにより得た。この送達系は、一過性で与えられるAAVrep78タンパク質のインテグラーゼ活性を利用し、AAVITR隣接組込みカセットを切除してヒト染色体中に組み込む図1b。rhバキュロAAVベクターはBaculoDirectLinearDNAとITR隣接GPRカセットを含有するGateway登録商標pENTRTM4エントリープラスミドの間の相同組換えにより作製した図1a、模式図1。Sf9昆虫細胞における3サイクルp3の組換えバキュロウイルス増幅の後、ハイブリッドバキュロAAVDNAの力価と潜在的組換え事象をプラークアッセイおよびウイルスのゲノムDNAサザンブロットによりそれぞれチェックした。p3における力価は6×1010pfumlに対応し、サザンブロット分析は単一の鋭いバンドを現し、ウイルス増幅プロセス中に組換え事象が無いことを示した図3。次に、AAVRep78プラスミドトランスフェクションおよびrhバキュロAAV感染の用量および時間ならびに感染したHEK293T細胞のクローニング条件を注意深く規定した図1c。実際、これらの実験設定の選択は結果的に重要であった。このように広範囲の条件を試験した後に、最終的に確立したのは、単一用量のAAVrep78プラスミドDNAをトランスフェクトしてから24時間後における1000のMOIでのバキュロAAV感染が最良の実験設計に対応することであった。さらに、22枚の90mmペトリディッシュに配給した合計5×105細胞の播種、すなわち、各ディッシュに異なる濃度で播いてかつ播種から4日後にハイグロマイシン100μgmlを加えて播くことが最大数の細胞クローンを得る最良の条件であった。数えた360クローンのうちわずかに3クローン、PK7、PK17およびPK18が100pgmlの設定閾値を上回った。クローンのサザンブロット分析は、各クローンが2コピーの正しいサイズのベクターを含有することを明らかにした図2a。残りのAAVRep78プラスミドDNAの組込みの可能性を排除するためにrep78特異的PCRをPK7gDNAについて行い、ポジティブシグナルを検出しなかった図3b。GPRカセットから発現されたHIV1タンパク質発現パターンを3つのPKクローンおよび培地に放出されるそれらに整合するウイルス様粒子VLPのウェスタンブロットによりモニターした。全てのウイルスタンパク質は適当に処理され、サイズが正しく、そして正しい相対比率であった図2b。SupT1細胞について、VSVGプラスミドおよび第3世代導入ベクターSINeGFP表1で共トランスフェクトした後の3つのクローンから産生したLVの効力を計算することにより、将来役立つPKクローンを選択した。注目すべきは、一過性トランスフェクションにより産生された対照HEK293TLVの力価はPK7およびPK18LVより5倍以上高かったが、その感染性はPKLVとほとんど同一であり、PKクローンは、品質の視点で通常の方法により産生したものと比較しうることである表1。PK7とPK18LVの効力は類似しているが、形態学、増殖、生存率およびp24gag産生値の評点がPK18クローンより優れているPK7クローンをさらなる遺伝子操作の対象に選定した表1。次に、PK7クローン中のITR隣接カセットの組込みを定量LMPCR、TaqManPCR図2cおよびFISH技法図2dにより徹底的に特徴付けた。組込み部位を正確にマッピングするために、染色体2、2q321図2cにおける分断点にスポットライトを当てたLMPCR研究を行った。この結果を、アーム長とセントロメア位置に基づいて染色体2中に単一スポットを当てた特異的GPRプローブとのinsituハイブリダイゼーションにより確認した図2d。この位置付けを確認するために、染色体2q312中にマッピングすることが公知であるHOX4プローブを用いた。HEK293T細胞は三倍体であり、HOX4は正しく全ての3つの染色体2中に検出された図2d。最後に、定量TaqManPCRによって2つのコピーが組込まれたこと、および、適当なプライマーの設計をしたネスト化PCRによって2つのコピーが縦列配向、テールツーヘッドであることが確認された。テールツーヘッド配向は、野生型AAVおよびほとんどのrAAVベクターコンカタマーの宿主細胞ゲノム中への組込みに対して観察される自然な立体配置である16。テールツーヘッド接合点を包含するアンプリコンの配列分析は、303bpの第1カセットの3CMVプロモーターと共に第1および第2カセットのITRおよび第2カセットの全5CMVプロモーターが喪失したことを明らかにした図2e、赤色ボックス。このベクター-細胞の組換え事象の大部分は実際にはベクターのITR配列内で起こる。この再配列はPK7細胞に第2カセットのgagpol遺伝子の転写欠如および恐らく第1カセットのrevおよびhygro遺伝子の転写欠如を生じさせる。しかし、記載に値するのは、欠失されたCMVプロモーターの残された285bp領域模式図の中央の灰色三角形はなお、1つもしくは2つのrevおよびhygro遺伝子の転写を駆動するのに十分なTATAボックスを含有しうることである。結論として、PK7は2つの組込まれたカセットを含有し、これらが共同で1つのgagpol遺伝子および1つもしくは2つのrevおよびhygro遺伝子を転写する。PK7クローンの長期にわたる安定性を実証するために、細胞をハイグロマイシンの存在または非存在で420細胞倍加に対応する350日間培養し、そして細胞当たり基準でのp24gag産生を測定した表2。ハイグロマイシンの存在のもとでの平均産生は1534±847SDngp24gag1×106細胞に対応するが、抗生物質の非存在のもとでは670±351SDngp24gag1×106細胞である表2。この相違はおそらくハイグロマイシン薬物圧がhygro耐性遺伝子およびそれによりクロマチンの転写も同様にonに保つという事から導かれるようである。これはgagpol遺伝子のより高い転写を好都合にしうる。PK7クローンから作製されるVLPが100の倍加後にでも機能的であるかどうかを評価するために、PK7細胞にp60およびp102にてVSVGエンベロープとSINeGFP導入ベクターを共トランスフェクトし、そしてLV効力を計算した。注目すべきは、選択薬物の存在および非存在共に、産生されたLVの力価と感染性はかかる時間の延長後でもなお通常のレベルを維持した表2。これらのデータは薬物圧の存在または非存在に関わらず、GPRカセットの遺伝子不安定性を実証し、将来の特徴付け試験におけるハイグロマイシンの使用を回避することを容認した。AAVITR介在型カセットの組込み安定性に関する比較しうるデータは文献に見当たらない。唯一の関連情報は、野生型AAV血清2型AVV2に感染したヒト骨髄由来の繊維芽細胞様細胞株RuddlesDetroit6細胞が少なくとも47継代および118継代の間、潜伏状態でウイルス配列を維持したことである22、23。注目すべきこととして、PK7細胞は少なくとも102継代の間生存した。半安定LV産生のためのPK7の使用PK7クローンからの半安定LV産生がHEK293T細胞からの一過性LV産生のそれと全体に比較し得るかどうかをよく確立するために、両方の細胞型を、同じ量の必要なプラスミドによりトランスフェクトし、異なる標的細胞に対するトランスフェクションのパーセントおよびそれらのそれぞれのLVの効力を測定した表3。この条件において、HEK293T細胞での11回の実験のトランスフェクションのパーセントの平均値は9054±36SEMであり、そしてPK7細胞での12回の実験のそれは91±53SEMであり、PK7細胞がその高いレベルのトランスフェクション能力を維持することを示した。そこで、LV力価を、本発明者らの標準参照細胞型としてのSupT1細胞、靭帯血液由来のCD34HSC、および抗CD3IL2活性化靭帯血単核細胞表3でTlymphと記した表3において計算した。とりわけ、PK7細胞から作製された第3世代LV、SINeGFPの感染性は、力価をSupT1およびCD34細胞についてそれぞれ計算した場合、対照LVより約1log低くかつほとんど等しかったが、活性化Tリンパ球についてはハーフlog高かった。PK7細胞から作製された第2世代LV、PΔNChim3の感染性は、力価をSupT1およびCD34またはCEMA301細胞について計算した場合、対照LVのそれとほとんど等しかった。総括すると、これらの知見はPK7クローンが一過的に共トランスフェクトしたHEK293T細胞により産生されたものと定性的に等しいLVを産生することを示す。LVの半安定産生におけるPK7の応用について考慮すべき非常に重要な事象は、PK7クローンが容易にトランスフェクトされる能力を失わなかったことである。この特性は、遺伝子改変およびパッケージング構築物によるHEK293細胞のクローニング後に失われるのが全く普通である。力価測定実験を実施してPK7細胞から最適なLVを産生するために用いるエンベローププラスミドおよび導入ベクターの総DNAの用量を確立した。注目すべきは、SupT1およびCEMA301細胞株の両方において、DNAの標準量1mgで産生されるLVの力価と比較しうる力価を持つLVを作製するのにDNAの総量の3分の103mg以下でも十分であることが確立された。それ故に、LVの半安定産生用のPK7をHEK293T細胞の代わりに用いると、GMPグレードのプラスミドDNAの高いコストを劇的に削減しうる。参考文献