"明細書中に記載の発明。発明の要旨本発明者らは、細胞培養培地中の可溶性フリンが、フリンによって天然でプロセシングされ非特異的に切断されないタンパク質を生じ得ることを見出した。例えば、ネイティブ第VIII因子は、フリンによって天然でプロセシングされないが、第VIII因子は、例えば、細胞培養培地中で長時間フリンに曝露された場合に、可溶性フリンによる誤ったプロセシングに対する標的となり得る。このことは、このような細胞培養培地中の構造的にインタクトな第VIII因子タンパク質の収率の減少を導く。このことは、第VIII因子を、フリンの天然の基質例えば、フォンビルブラント因子と共に同時発現させた場合か、またはフリンによって天然でプロセシングされる組換えタンパク質を、長時間フリンに対して曝露して、その結果、さらに、誤った部位が切断される場合に当てはまり得る。本発明は、改変されたフリンポリペプチドの使用によって、細胞培養物中のタンパク質の非特異的切断を減少または阻害する。この改変されたフリンポリペプチドは、タンパク質分解活性を有するが、宿主細胞により培養培地中に分泌されないか、または野生型フリンの分泌と比較して減少した量で分泌される。このようなフリンポリペプチドは、大量に細胞内で発現された場合でさえ、宿主細胞に対して毒性ではないことが、見出されている。従って、本発明は、野生型フリンと比較して、ホモBドメインと膜貫通ドメインとの間すなわち、図1および2に示されるアミノ酸配列に従うと、アミノ酸Ala557とLeu713との間で改変されたアミノ酸配列を有するフリンポリペプチドを提供する。このような改変されたアミノ酸配列を有するフリンポリペプチドは、天然のすなわち、野生型のフリンと類似のタンパク質分解活性を有するが、このようなフリンポリペプチドを発現している宿主細胞によって、天然のフリンと比較して実質的に減少した量で培養培地中に分泌されるということは、驚くべき知見であった。本発明によるフリンポリペプチドが、細胞への実質的な毒性なしに、この細胞内で大量に発現され得ることは、本発明の別の局面である。なおさらなる局面において、改変されたフリンタンパク質の生理学的な切断の性質はなお存在するが、培地中に存在するフリンが少ないか、または培地中にフリンが存在しないために、細胞培養培地中の分泌されたタンパク質または細胞外に局在するタンパク質の偶発的な切断が、非常に減少される。さらに、本発明のフリンポリペプチドのさらなる利点は、フリン依存性タンパク質のタンパク質分解プロセシングは、細胞内で起こり得るが、フリンによるタンパク質の非特異的プロセシングは、これが完全に排除されない場合でも少なくとも減少され得るということである。従って、細胞培養の馴化培地中の可溶性フリンにタンパク質が暴露される場合に生じ得る、タンパク質の非特異的切断が、本発明によるフリンポリペプチドによって回避される。別の局面において、本発明は、本発明によるフリンポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを提供する。なお別の局面において、本発明は、本発明によるフリンポリペプチドを生成するための方法、本発明によるフリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む組換えベクター、このようなベクターを含む宿主細胞、および本発明のフリンポリペプチドを含む調製物を提供する。本発明は、例えば、以下の項目を提供する:項目1アミノ酸を含むフリンポリペプチドであって、該アミノ酸は、野生型フリンのアミノ酸配列と比較して、改変を含む配列を有し、ここで、該改変が、野生型フリンのアミノ酸Ala557とLeu713との間に存在している、フリンポリペプチド。項目2前記改変が、野生型フリンのアミノ酸Ala557とLeu713との間にループ構造またはα-ヘリックス構造の形成を生じる、項目1に記載のフリンポリペプチド。項目3前記改変がアミノ酸577と713との間である、項目1に記載のフリンポリペプチド。項目4前記改変が5~30個のアミノ酸の置換である、項目1に記載のフリンポリペプチド。項目5前記改変が、変異フリンポリペプチドにヘリックス構造またはループ構造の形成を生じる10個以上のアミノ酸の置換である、項目1に記載のフリンポリペプチド。項目6前記改変が、アラニンA、ロイシンL、フェニルアラニンF、トリプトファンW、メチオニンM、ヒスチジンH、グルタミンQ、およびバリンVからなる群より選択されるアミノ酸の付加または置換を含む、項目1に記載のフリンポリペプチド。項目7前記改変が、セリンS、イソロイシンI、トレオニンT、グルタミン酸E、アスパラギン酸D、リジンK、アルギニンR、グリシンG、チロシンY、システインC、アスパラギンN、グルタミンQ、プロリンP、およびヒドロキシプロリンからなる群より選択されるアミノ酸の付加または置換を含む、項目1に記載のフリンポリペプチド。項目8アミノ酸578~711が欠失している、項目1に記載のフリンポリペプチド。項目9アミノ酸577と713との間のアミノ酸が、配列AEMWHQAMEVを含むアミノ酸で置換されている、項目1に記載のフリンポリペプチド。項目10アミノ酸577と713との間のアミノ酸が、配列GSPNSQPYDGを含むアミノ酸で置換されている、項目1に記載のフリンポリペプチド。項目11前記改変がArg683においてである、項目1に記載のフリンポリペプチド。項目12項目1に記載のフリンポリペプチドをコードする、組換えDNA分子。項目13前記フリンポリペプチドの発現を可能にする異種性発現コントロール配列に作動可能に連結されている項目12に記載のDNA分子を含む、組換え発現ベクター。項目14項目13に記載の組換えDNA発現ベクターを含む、宿主細胞。項目15少なくとも1つの組換え発現される前駆体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、項目14に記載の宿主細胞であって、ここで該ポリペプチドが、コードされるフリンポリペプチドに対する基質である、宿主細胞。項目16項目1に記載のフリンポリペプチドを産生するための方法であって、該方法は、以下:a発現ベクターを含む宿主細胞を栄養培地中で増殖させる工程であり、該発現ベクターは、転写の方向に順番に、以下:該宿主細胞において機能的である、転写調節領域および翻訳開始領域、項目1に記載の変異フリンポリペプチドをコードするDNA配列、ならびに、該宿主細胞において機能的な翻訳終止領域および転写終止領域、を含み、ここで、該DNA配列の発現は、該開始領域および終止領域によって調節される、工程;bタンパク分解活性を有するフリンポリペプチドの分泌速度を測定する工程;ならびに、c減少した分泌を示すフリンポリペプチドを単離する工程、を包含する、方法。項目17項目1に記載のフリンポリペプチドを含有する、薬学的調製物。発明の詳細な説明フリンポリペプチド本発明は、ヒトフリンこのアミノ酸配列は、図1に示されているのような野生型哺乳動物フリンのアミノ酸配列と比較して、アミノ酸Ala557とLeu713との間で改変されたアミノ酸配列を有するフリンポリペプチドを含む。本開示の目的のために、フリンポリペプチドは、タンパク質分解活性を有する野生型哺乳動物フリンタンパク質のアミノ酸配列の少なくとも一部を含むポリペプチドをいう。好ましい実施形態において、本発明によるフリンポリペプチドの改変は、アミノ酸Ala557とLeu713との間に位置する。代替的な実施形態において、この改変はArg683においてである。なお別の実施形態において、アミノ酸Gly577とHis712との間が欠失される。本開示において、用語改変された改変したおよび改変は、フリンポリペプチドのアミノ酸配列に関して、1以上のアミノ酸の付加、欠失または置換を意味する。このような改変は、例えば、指向された変異誘発もしくはPCR、または生じるポリペプチドのアミノ酸配列における変化を指向する目的でDNA配列を特異的に変化するために適切である、当該分野において公知の遺伝子工学の他の方法によって実施され得るCurrentProtocolsinMolecularBiology,vol.1,ch.8Ausubeletal.eds.,J.WileyandSons,1989Supp.1990-93;ProteinEngineeringOxenderFoxeds.,A.Liss,Inc.,1987。本発明の改変は、ホモBドメインと膜貫通ドメインとの間の領域内すなわち、フリン分子のアミノ酸Ala557とLeu713との間の領域である。好ましくは、本発明のフリンポリペプチドは、ループまたはαヘリックス構造を作製するアミノ酸置換および/または付加を有する。ポリペプチドにおいてアミノ酸がいくつかの異なる二次構造すなわち、ヘリックス構造またはループ構造を形成し得ることは、先行技術から周知であるLehningerA.,Biochemie,VCH,1985,pp.102-107;KarlsonP.etal.,KurzesLehrbuchderBiochemie,GeorgThiemeVerlag,1994,pp.29-32。これらの構造は、例えば、αヘリックスまたはループを形成する特定のアミノ酸を選択し、それにより生じるポリペプチド内のαヘリックスまたはループのような構造を発生することによって生成され得るRostB.andSanderC.,Proc.Natl.Acad.Sci.,1993,pp.7558-7562,RostB.andSanderC.,1994,Proteins:Structure,FunctionandGenetics,19,pp.55-72。さらに、KyteJ.andDoolittleR.1983,J.Mol.Biol.,157,pp.105-132に従って、このようなアミノ酸は、これらのヒドロパシー値に基づいて選択され得る。これは、ネガティブヒドロパシー値を示すアミノ酸はこれらの側鎖が水性溶媒に接近し得る親水性であるが、ポジティブヒドロパシー値を示すアミノ酸はタンパク質内部に含まれる傾向のある疎水性アミノ酸であるという知識の観点からである。さらに、非常に高いポジティブヒドロパシー値またはネガティブヒドロパシー値を示すアミノ酸は、種々のプロテアーゼについて好ましい標的であることが公知である。従って、好ましい実施形態において、いくつかのアミノ酸好ましくは、5と30との間、より好ましくは、10と20との間の挿入が存在する。これは、本発明の改変されたフリンポリペプチドにおいてループ構造またはヘリックス構造を生成する。代替の実施形態において、アミノ酸の挿入は、ヘリックス構造を生じる。このような実施形態において、アミノ酸は、好ましくは、アラニンA、ロイシンL、フェニルアラニンF、トリプトファンW、メチオニンM、ヒスチジンH、グルタミンQ、バリンVおよびグルタミン酸Eからなる群より選択される。例えば、アミノ酸558~738、好ましくはアミノ酸578~711は、アミノ酸配列EAMHA配列番号1、AWFQW配列番号2またはAQMWHEAMEFWAMQFEAMHA配列番号3によって置換される。好ましい実施形態において、フリンポリペプチドのアミノ酸578~711は、アミノ酸配列AEMWHQAMEV配列番号4によって置換される。なお別の実施形態において、アミノ酸挿入は、ループ構造を形成し、ここで、このアミノ酸は、好ましくはセリンS、イソロイシンI、スレオニンT、グルタミン酸E、アスパラギン酸D、リジンK、アルギニンR、グリシンG、チロシンY、システインC、アスパラギンN、プロリンP、グルタミンQおよびヒドロキシプロリンからなる群より選択される。例えば、アミノ酸558~738、好ましくは、アミノ酸578~711は、アミノ酸配列SYNPG、SYQPDまたはGSPYQTNGPSによって置換される。好ましい実施形態において、フリンポリペプチドのアミノ酸578~711は、アミノ酸配列GSPNSQPYDG配列番号5によって置換される。ループ構造またはヘリックス構造を形成するためのアミノ酸の選択は、当業者に周知であるLehningerA.,Biochemie,VCH,1985,pp.102-107。代替の実施形態において、フリン配列のアミノ酸位683のアルギニンは、任意のアミノ酸、好ましくはリジン、グルタミン酸またはイソロイシンによって置換され得る。核酸およびベクター本発明の別の実施形態は、本発明のフリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。このようなポリヌクレオチドに使用される核酸は、DNAおよび/またはRNAであり得る。全長フリンポリヌクレオチド、およびタンパク質分解活性を有するフリンポリペプチドをコードするこの任意の誘導体は、本発明のフリンポリペプチドの構築のための出発物質として使用され得る。ネイティブなヒトフリンをコードするcDNA配列は、vandenOuweland,A.M.W.etal.NucleicAcidRes.,1990,183,p.664およびFullerR.S.etal.Science,1989,246:482によって公表された。このようなフリンポリヌクレオチドは、任意の哺乳動物種、好ましくは、ヒト供給源、ブタ供給源またはウシ供給源由来であり得る。ポリヌクレオチドは、上記DNAまたはRNAの異種性発現のために適切なエレメントを提供するベクターによって発現される。発現ベクターは、例えば、宿主細胞において機能的な転写調節領域および翻訳開始領域、本発明のフリンポリヌクレオチドをコードするDNA配列、ならびに上記宿主細胞において機能的な翻訳終止領域および転写終止領域を含む。ここで、上記核酸配列の発現は、上記開始領域および終止領域によって調節される。発現ベクターはまた、上記DNAまたはRNAの複製についてのエレメントを含み得る。発現ベクターは、DNAベクターまたはRNAベクターであり得る。DNAクローニングベクターおよび発現ベクターの例は、以下である:pBSSKIIShort,J.M.,Fernandez,J.M.,Sorge,J.A.andHuse,W.D.LambdaZAP,1988,NucleicAcidsResearch1615,7583-7600;Alting.Mees,M.A.,andShort,J.M.,1989,NucleicAcidsResearch1722,9494、pBPV、pSVL、pCMV、pRc/RSV、筋原性ベクター系WO93/09236またはウイルス系例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルスまたはバキュロウイルス由来のベクター。RNA発現ベクターの例は、レトロウイルスまたはフラビウイルスのようなRNAウイルス由来のベクターである。いくつかの場合において、フリンポリペプチドに対してタンパク質前駆体を発現する遺伝子の複数のコピーまたはその逆のコピーを有することが望ましい。これは、従来技術に十分に記載される様式で達成され得る。あるいは、異なる転写開始速度または異なるプロモーターを有する2つの転写調節領域を使用して、本発明に従うフリンポリペプチド、または前駆体ポリペプチドおよび/もしくはフリンによってタンパク質分解処理されないさらなるポリペプチドのいずれかの増大した発現を提供する。本発明に従う改変されたフリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを使用して、宿主細胞を形質転換し、次いでこのポリペプチドを産生し得る。この形質転換した宿主細胞を、細胞培養系中で増殖して、インビトロでこのポリペプチドを産生し得る。遺伝子治療におけるいくつかの特定の適用について、すなわち、核酸自体が、哺乳動物の器官に注射される場合、この核酸、DNAおよびRNAは、化学的に改変され得る。この化学的改変は、例えば、骨格または末端を安定化することによって、ヌクレアーゼ消化から核酸を保護する改変であり得る。本発明のフリンポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターは、宿主細胞にインビトロで予め形質転換することなく、哺乳動物にさらに投与され得る。このタイプの遺伝子治療の実際の背景は、いくつかの特許出願例えば、WO90/11092に開示される。この核酸を含む発現ベクターは、適切なキャリア例えば、生理学的緩衝溶液と混合され、そして器官好ましくは、哺乳動物の骨格筋、皮膚または肝臓に注射される。宿主細胞本発明に従う改変されたフリンポリペプチドは、好ましくは、組換え発現によって産生される。これは、当該分野で公知の発現系例えば、永久細胞株またはウイルス発現系を用いる遺伝子操作によって調製され得る。永久細胞株は、例えば、vero、MRC5、CHO、BHK、293、HEK293、Sk-Hep1、肝臓細胞、腎臓細胞、線維芽細胞、ケラチノサイトまたは筋芽細胞、肝細胞または幹細胞例えば、造血幹細胞の宿主細胞ゲノムに、異種DNAを安定に組み込むことによって、または例えば、パピローマウイルス由来のエピソームベクターによって、調製される。あるいは、内在性フリン活性を有さない細胞株が使用され得るMoehringJ.M.およびMoehringT.J.,Infect.Immun.,41,1983,998~1009頁。例えば、CHO-RPE40またはFD11-CHO細胞が使用され得る。ここで、本発明のトランスフェクトされたフリンのタンパク質分解活性は、内在性フリンのバックグラウンド活性を回避して、容易に測定され得る。ウイルス発現系例えば、ワクシニアウイルス系、バキュロウイルス系またはレトロウイルス系もまた用いられ得る。vero、MRC5、CHO、BHK、293、Sk-Hep1、腺、肝臓または腎臓の細胞が、細胞株として、一般的に使用される。真核生物発現系例えば、酵母、内在性腺例えば、トランスジェニック動物の腺、およびトランスジェニック動物もまた、本発明に従うフリンポリペプチドの発現のために使用され得る。組換えタンパク質の発現について、CHO-DHFR細胞が、特に有用であることが判明しているUrlaubら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,第77巻、4216~4220頁、1980。本発明に従うフリンポリペプチドは、適切なプロモーターの制御下で、それぞれの発現系において発現される。真核生物における発現について、公知のプロモーター例えば、SV40、CMV、RSV、HSV、EBV、β-アクチン、hGHまたは誘導性プロモーター例えば、hspまたはメタロチオネインプロモーターが適切である。好ましい実施形態において、本発明は、本発明に従うフリンポリペプチドおよび前駆体ポリペプチドを生成するための方法を提供する。好ましくは、このフリンポリペプチドは、フォンビルブラント因子タンパク質および/または第VIII因子タンパク質と同時発現される。さらなる局面において、本発明は、本発明に従うフリンポリペプチドを生成するための方法を提供する。この方法は、栄養培地中で、発現ベクターを含む宿主細胞を増殖させる工程を包含し、この発現ベクターは、宿主細胞において機能的な転写調節領域および翻訳開始領域、本発明のフリンポリペプチドをコードするDNA配列、ならびにこの宿主細胞において機能的な翻訳終止領域および転写終止領域を、転写の方向で含む。このDNA配列の発現は、この開始領域および終止領域によって調節される。この方法は、タンパク質分解活性を有する発現されたフリンポリペプチドの分泌速度を測定する工程、および野生型フリンを発現する宿主細胞と比較して減少した分泌を示すフリンポリペプチドを発現する宿主細胞を単離する工程をさらに包含する。薬学的調製物本発明に従うフリンポリペプチドは、本発明に従う改変されたフリンポリペプチドを、一成分調製物として有するか、または多成分系として他の成分と組み合わせて有する薬学的調製物として提供され得る。特定の実施形態において、本発明のフリンポリペプチドは、プロタンパク質例えば、フォンビルブラント因子と合わされ得る。特異的活性本発明の1つの局面によると、本発明のフリンポリペプチドは、野生型フリンタンパク質例えば、野生型ヒトフリンのタンパク質分解活性と比較して、少なくとも50、好ましくは少なくとも100のフリンタンパク質分解活性を有する。タンパク質分解活性の評価は、任意の適切な試験によって例えば、フリンが特異的である二塩基性切断部位からなる蛍光発生性基質を使用することによって行われ得るPreiningerA.ら、1999,SchlokatU.ら、1996,Biotechnol.Appl.Biochem.,第24巻、257~267頁。あるいは、タンパク質分解活性はまた、プロタンパク質例えば、プロrvWFと共にフリンを十分な時間インキュベートすることによって測定され得る。プロrvWFのプロセシングの程度は、ウエスタンブロッドによって分析され得る。分泌速度この分泌速度は、所定の時間内で細胞培養培地中に蓄積する、分泌したフリンポリペプチド流出フリンの量として規定され得る。本発明に従う改変されたフリンポリペプチドの分泌速度の減少は、野生型配列を有する、組換え発現されたフリン例えば、野生型ヒトフリンまたは膜貫通領域および/もしくは細胞質領域を欠くフリンの分泌速度と比較して、少なくとも25、好ましくは、少なくとも50、より好ましくは、少なくとも90、最も好ましくは、少なくとも100である。例えば、この分泌速度は、抗フリン抗体との免疫反応性によって測定され得る。適切な抗体は、フリンの触媒ドメインに対して指向され得るPreiningerら、1999。単離方法本発明に従うフリンポリペプチドを、溶解によって細胞から単離し、そして従来の方法によって、必要に応じて、プロテアーゼインヒビターの存在下でさらに精製し得る。この精製は、当該分野で公知のクロマトグラフィー方法、好ましくは、フリンポリペプチドに対する抗体を使用する、アフィニティークロマトグラフィーによって、またはHis-Tag基にフリンポリペプチドを連結し、そしてNi2-NTAアガロース上にタンパク質を選択的に結合することによって、なされ得るPreiningerら、1999。野生型フリンと比較して本発明のフリンポリペプチドのタンパク質分解特性が、実質的に変更されていないという事実に起因して、野生型フリンによって処理されるタンパク質もまた、本発明のフリンポリペプチドによって処理され得る。すなわち、対のアミノ酸残基を有するタンパク質は、基質として役立ち得る。本発明の使用のための前駆体分子の例としては、以下が挙げられ得るが、これらに限定されない:フォンビルブラント因子、第XI因子、プロテインC、プロテインS、プロトロンビン、第X因子、第VII因子、トランスホーミング増殖因子TFFβおよびそれらのスーパーファミリーアクチビンおよびインヒビンを含む、骨形態形成タンパク質BMP、インスリン、レラキシン、増殖因子様血小板由来増殖因子PDGF、神経発育因子NGF、およびウイルスポリペプチドサイトメガロウイルスCMV由来のポリペプチドを含む、ヒト免疫不全ウイルスならびに単純疱疹ウイルス。本発明は、続いて記載される実施例において例示される。当業者の範囲内の改変は、本発明の範囲内にあると考えられるべきである。他に規定されない限り、本明細書で使用される全ての技術的な用語および科学的な用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書中に記載される材料と類似または等価な任意の方法および材料は、本発明の実施または処理の際に使用され得るが、好ましい方法および材料が、ここに記載される。以下の実施例は、本発明を例示するが、いずれの方法においても本範囲を限定するものではない。実施例1.フリンR683Aの構築683位にある天然アルギニンの代わりにアミノ酸アラニンを含む、全長フリン変異体R683Aを、伸長したオーバーラッププライマーを用いるPCRベースのアプローチを使用して、構築したHoら、1989、Gene、77、51~59頁。最初に、2種の標準的なPCR反応を、鋳型としてプラスミドpCMVフリンwtフリン野生型cDNAを含むおよび以下のプライマー対を使用して実施した:49535’GGGGGATCCCTCTGGCGAGTGG3’配列番号6および52105’CGGGGACTCTGCGCTGCTCTG3’配列番号7または52095’CAGAGCAGCGCAGAGTCCCCG3’配列番号8および49545’GGGGGATCCCCGCGGCCTAGG3’配列番号9。ここで、5210および5209は、変異を誘導する相補的に伸長される内部プライマーであり、そして4953および4954は、BamHI制限部位を含む外部プライマーである。第二のPCRラウンドにおいて、最初のPCR反応の2種の精製された増幅産物を、2種の外部プライマー4953および4954の存在下でオーバーラップ伸長のために合わせた。最後の精製されたPCR産物を、BamHIで消化し、そしてプラスミドpCMV-フリンwt中の野生型BamHIフラグメントを置換するために使用した。2.フリン欠失変異体のへリックス10、ループ10およびΔ578-711の構築フリン発現構築物のへリックス1010個の螺旋構造の残基によって置換Sなれたアミノ酸残基578-711の欠失を含む、ループ1010個のループ構造の残基によって置換されたアミノ酸残基578-711の欠失を含むおよびΔ578-711アミノ酸残基578-711の欠失を含むを、逆PCRによって産生した。このために、野生型フリンの内部の1176bpBamHIフラグメントを、ベクターpBSSKIIStratageneのBamHI部位にサブクローングした。得られたプラスミドpBS/fur1176を、個々の構築物の逆PCR反応のための鋳型として使用した。へリックス10およびループ10の場合において、特定のセンスプライマーおよび逆方向プライマーの各々は、それらの5’末端に、5個の螺旋構造アミノ酸またはループ構造アミノ酸をコードする、さらなる15個のオーバーハングヌクレオチドを含んだ。以下のプライマーセットを使用した:へリックス10について:センスプライマー56995’CAGGCCATGGAGGTGCACCTGCCTGAGGTGGTGGCCGGCCTCAGC3’配列番号10および逆方向プライマー57005’GTGCCACATCTCGGCCCCCTCAGGGGCGGTGCCATAGAGTACGAG3’配列番号11、ループ10について:センスプライマー57015’CAGCCCTACGACGGCCACCTGCCTGAGGTGGTGGCCGGCCTCAGC3’配列番号12および逆方向プライマー57025’GCTGTTGGGGCTGCCCCCCTCAGGGGCGGTGCCATAGAGTACGAG3’配列番号13、ならびにΔ578-711について:センスプライマー57235’CACCTGCCTGAGGTGGTGGCC3’配列番号14および逆方向プライマー57245’CCCCTCAGGGGCGGTGCCATA3’配列番号15。得られたPCRフラグメントを精製し、T4ポリヌクレオチドキナーゼNewEnglandBiolabsで処理し、T4DNAリガーゼRocheで再連結し、そしてE.coli株XL1BlueMRF’Stratagene中に形質転換した。導入された改変を含む、ポジティブクローンを、配列決定により選択し、そして変異したBamHIフラグメントを、pCMV-フリンwt中のwt1176bpBamHIフラグメントを置換するために使用した。一般に、標的配列の増幅は、市販の10×PCR緩衝液および2.5UVentR登録商標DNAポリメラーゼNewEnglandBiolabs中の30pMolの各プライマー、200μMの各dNTP、2mMのMgSO4を含む、全容積100μlの10~20ngの鋳型DNAを使用する、30サイクルのPCRを、55°Cでのアニーリングおよび72°Cでの伸長温度で慣用的に実施した。PCRフラグメントを、QIAEXIIGelExtractionKitQiagenを使用して、供給者の指示書に従って精製した。フリン欠失改変体Δ578-711中へのへリックス10の挿入は、アミノ酸配列AEMWHQAMEV配列番号4を含む。フリン欠失改変体Δ578-711中へのループ10の挿入は、アミノ酸配列GSPNSQPYDG配列番号5を含む。3.トランスフェクション、細胞培養およびタンパク質収集フリン構築物は、293HEK細胞ヒト胚性腎臓線維芽細胞;ATCCCRL1573およびFD11-CHO-rvWF細胞FD11-CHOは、フリン欠損細胞であるにおいて一過性発現された。10ウシ胎仔血清完全培地を補充したDMEM/HamのF121:1培地LifeTechnologiesにおいて、細胞を増殖させた。トランスフェクションのために、細胞を5cm培養ディッシュCostar上で50~75のコンフルエンシーまで増殖させ、そして以前に記載Fischerら、1994のように、リン酸カルシウム共沈によってトランスフェクトした。一過性トランスフェクションを、20μgの発現プラスミドを用いて実行した。無血清完全培地をコンフルエンシー一般的に、トランスフェクションの48時間後のトランスフェクトされた細胞に適用し、それらをPBSCa2およびMg2を含まない、LifeTechnologiesで2回洗浄した後に、組換えタンパク質を収集した。馴化培地を収集し、そして遠心分離によって浄化した。接着細胞を、トリプシン処理し、PBSで洗浄し、そして細胞の総数を、30μmキャピラリーを使用して、CASYカウンターScharfeSystems、Germanyによって決定した。細胞抽出物を、その細胞を5×107細胞/mlの濃度の溶解緩衝液20mMTris-HCl、pH7.5、150mMNaCl、1mMEDTAおよび0.5Triton登録商標X-100を含有するで溶解させることによって調製した。30分間4°Cでのインキュベーションの後に、溶解物を、15分間、10,000×g、4°Cで遠心分離することによって浄化した。4.ウェスタンブロットサンプルを還元し、そして変性させ、4スタッキング/8または10分離ゲル上でのSDS-PAGEによって分離し、そして記載されるようにSchlokatら、1996、ウェスタンブロッティングによって視覚化した。FD11-CHO-rvWFの一過性トランスフェクションから誘導される馴化培地は、充填の前に、speed-vac遠心分離によって20倍に濃縮された。溶解物を、7.5×10細胞等量で、SDS-PAGE上にスロット毎に適用した。フリン分子の検出のために、フリンの触媒ドメインに指向するマウスモノクローナル抗体MON-148Alexisおよび第2抗体としての抗マウスIgGヤギ血清Sigmaに結合したアルカリホスファターゼを、使用した。組換えvWFを、ウサギ抗vWF抗血清DAKOおよび第2抗体としての抗ウサギIgGヤギ血清Promegaに結合したアルカリホスファターゼを使用して視覚化した。図3は、一過性トランスフェクトされたFD11-CHO-rvWF細胞の馴化培地における流出フリンの量を示す。馴化培地を、20倍に濃縮し、そして4スタッキング/10分離SDS-PAGEゲルに適用し、変性させた。ウェスタンブロットを、MON-148およびAP結合抗マウスIgG抗体で視覚化した。コントロールとして、pCMVベクター、野生型フリンポリペプチドおよびΔ577G-4xG-10xHを使用した。フリン構築物Δ577G-4xG-10xHを、Preiningerら1999に従って調製した。図は、明かに、本発明に従うフリン構築物が、いかなる流出も示さないすなわち、培地への分子の分泌速度が、野生型配列を有するrフリンまたは膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを欠くフリンと比較して実質的に減少することを示す。5.馴化培地におけるインビトロフリン活性の分析流出フリン分子の機能的活性を、以前に記載されたSchlokatら、1996ように、螢光原基質によって決定した。6.細胞内rフリン活性の証拠フリン変異体R683Aまたは野生型フリンを安定に発現するFD11-CHO-rvWF細胞を、20μgフリン発現プラスミドおよび1μgの選択プラスミドpCMV-hygハイグロマイシンBRocheに対する耐性を媒介するを使用して同時トランスフェクションによって確立した。耐性クローンを、トランスフェクションの2週間後に単離し、そして選択圧下でサブクローニングすることによって安定化した。3つのFD11-CHO-rvWF/R683Aクローンクローン1、2、および3分泌されるrフリンの量で異なり、結果として種々の程度のrvWF前駆体プロセシングを示すを選択した。細胞内フリン活性を、rvWF前駆体プロセシングの程度と24時間にわたるFD11-CHO-rvWF/R683A馴化培地存在とを相関させることによって実証した。コントロールとして、FD11-CHO-rvWF/フリンwtおよびFD11-CHO-rvWF細胞を使用した。細胞を、コンフルエンシーになるまで6ウェルディッシュ1ウェル/タイムポイントで増殖させ、そしてPBSで2回洗浄し、その後、無血清培地を、4時間、8時間、16時間および24時間に適用した。馴化培地を遠心分離によって浄化し、そして流出rフリンの検出のために20倍に濃縮した。rvWF前駆体プロセシングの評価をウェスタンブロットによって行った。図4は、一過性トランスフェクトされたFD11-CHO-rvWF細胞におけるrvWF前駆体のプロセシングを示す。100ngrvWFをレーンごとに適用した。プローブを還元し、変性し、そして4スタッキング/5分離SDS-PAGEゲルに適用した。ウェスタンブロットを、ポリクローナルウサギ抗vWFおよびAP結合抗ウサギIgG抗体を用いて展開した。細胞は一過性トランスフェクトされたのみであったが、R683A、Helix10、Loop10およびΔ578-711フリン構築物は、タンパク質分解活性を明示した。用語、一過性トランスフェクトされたとは、遺伝的に不均一な混合細胞集団を反映する。トランスフェクション効率に依存して、細胞のうちのいくつかのみがトランスフェクトされる。図5図5A~5Cを含むは、一過性トランスフェクトされたHEK293細胞におけるフリン発現を示す:図5Aは、一過性トランスフェクトされたHEK293細胞の馴化培地における流出フリンを示す。15μlの馴化培地をスロット毎に適用した。プローブを還元し、変性し、そして4スタッキング/10分離SDS-PAGEゲルに適用した。ウェスタンブロットを、MON-148およびAP結合抗マウスIgG抗体を用いて展開した。図5Bは、HEK293溶解物における細胞内rフリンの測定を示す。7.5×10e5細胞等量をスロット毎に適用した。図5Cは、馴化培地および螢光原基質を使用するインビトロアッセイの結果を示す。図5Aは、特異的抗体によって検出可能な培地における分泌されたフリンポリペプチドの量が、非常に減少することを示す。これは、図5Cに示されるインビトロ活性測定によって確認された。図5Bのデータは、フリンポリペプチドが細胞内に位置することを示す。図6は、フリン構築物R683Aの細胞内タンパク質分解活性を示す。馴化培地におけるrvWF前駆体タンパク質プロセシングの程度および流出rフリンの存在を比較する。この図は、流出フリンが培地において検出されないとしても、vWFタンパク質の有意なタンパク質分解プロセシングが生じることを示す。これは、このフリンポリペプチドが、培地に分泌されなくても、タンパク質分解的に活性であることを示す。上側のレーンは、vWFウェスタンブロットであり、ここで、100ngrvWFは、レーン毎に適用される。ポジティブコントロールとして、CHO-rvWFを使用した。下側のレーンは、馴化培地のフリンウェスタンブロットである。この物質は、レーン毎に20倍に濃縮される。ポジティブコントロールとして、流出野生型rvWFを使用した。"