"ビスレチノイド媒介性黄斑変性症に罹患している哺乳動物におけるビスレチノイド媒介性黄斑変性症の処置方法であって、有効量の、の構造を有する化合物またはそのエステルもしくは薬学的に許容できる塩を前記哺乳動物へ投与することを含む方法。前記量が、前記哺乳動物においてRBP4の血清濃度を低下させるのに有効である、請求項1に記載の方法。前記量が、前記哺乳動物においてリポフスチン中のビスレチノイドの網膜濃度を低下させるのに有効である、請求項1または2に記載の方法。前記ビスレチノイドがA2Eである、請求項3に記載の方法。前記ビスレチノイドがイソA2Eである、請求項3に記載の方法。前記ビスレチノイドがA2-DHP-PEである、請求項3に記載の方法。前記ビスレチノイドがatRALジ-PEである、請求項3に記載の方法。前記ビスレチノイド媒介性黄斑変性症が加齢性黄斑変性症である、請求項1~7のいずれかに記載の方法。前記ビスレチノイド媒介性黄斑変性症がシュタルガルト病である、請求項1~7のいずれかに記載の方法。前記ビスレチノイド媒介性黄斑変性症が網膜色素上皮へのリポフスチン沈着物の蓄積を含む、請求項1~7のいずれかに記載の方法。分子がレチノール誘導性RBP4-TTR相互作用のアンタゴニストであるかどうかを決定する方法であって、前記方法が、iドナーまたはアクセプターフルオロフォアで標識されたRBP4を、ドナーまたはアクセプターフルオロフォアで標識されたTTRおよびレチノールとともにインキュベートすること、ここでRBP4がドナーフルオロフォアで標識される場合は、TTRはアクセプターフルオロフォアで標識され、RBP4がアクセプターフルオロフォアで標識される場合は、TTRはアクセプターフルオロフォアで標識される、iiエネルギー供給源によって前記ドナーフルオロフォアが励起された際に、iの混合物中の前記ドナーフルオロフォアについての蛍光波長と前記アクセプターフルオロフォアについての蛍光波長との比を決定すること、iii前記分子を、iの前記フルオロフォア標識されたRBP4、フルオロフォア標識されたTTRおよびレチノールと共にインキュベートすること、ivエネルギー供給源によって前記ドナーフルオロフォアが励起された際に、iiiの混合物中の前記ドナーフルオロフォアについての蛍光波長と前記アクセプターフルオロフォアについての蛍光波長との比を決定すること、vステップivの蛍光比がステップiiの蛍光比未満であるかどうかを決定することを含み、ここでステップii未満であるステップivの蛍光比が、前記分子がレチノール誘導性RBP4-TTR相互作用のアンタゴニストであることを示す、方法。細胞のビスレチノイドリポフスチンレベルを前記分子が低下させるかどうかを決定することをさらに含む、請求項11に記載の方法。前記細胞が網膜色素上皮細胞である、請求項12に記載の方法。[実施例]例1レチノール誘導性RBP4-TTR相互作用のアンタゴニストに対するTR-FRETアッセイTR-FRET時間分解蛍光共鳴エネルギー転移は、タンパク質-タンパク質相互作用に影響を及ぼす化合物の特徴づけに使用することができるアッセイ形式である31~33。TR-FRETのHTRF均一時間分解蛍光変形型は、Eu3クリプテートの使用により光捕獲が向上したため、最も進んだものである。レチノール存在下では、RBP4-TTR相互作用は、668/620蛍光シグナルの増大する比として記録され得るFRETを誘導する。所望のRBP4アンタゴニストの結合によって、レチノールが移動させられ、RBP4-TTR相互作用の妨害が誘導され、その結果FRETシグナルが減少する図7。発明者らは、E.coliで発現させたMBPで標識のRBP4およびEu3クリプテートで直接標識された市販品として入手可能なTTRを用いるアッセイを開発した。MBP-RBP4およびEu3K-TTRに加えて、検出用試薬の抗MBP-d2が混合物中に存在した。アッセイをアゴニストモードで最初に最適化した。アッセイの感度およびダイナミックレンジは、RBP4、TTRおよび検出試薬濃度について最高モードとした。RBP4-TTR相互作用を促進するオールトランスレチノールの最適濃度を決定するために、発明者らは、化合物1およびフェンレチニドの滴定に加えてレチノール滴定のエイトポイント滴定を行った図8。発明者らは、オールトランスレチノールが用量依存的様式でRBP4-TTR相互作用を促進することを示し図8、EC50は約1.2μMであった。予想通り、RBP4アンタゴニスト化合物1およびフェンレチニドは、RBP4-TTR相互作用を誘導しなかった図8。レチノールがマイクロモル濃度で血清中に存在することを考え、およびレチノール滴定の結果を考慮して、発明者らは、1~10μM範囲内の固定濃度のレチノールを試験することによって、および40μMの飽和濃度のアンタゴニストフェンレチニドおよび化合物1を用いて、アッセイをアンタゴニストモードに変えた。アッセイの感度およびダイナミックレンジに関する、アンタゴニストモードでの最適レチノール濃度は、4.5~6.5μMの範囲にあることが判明した。発明者らは、化合物1およびフェンレチニドの滴定をレチノール存在下で行い、一次アッセイにおける本発明者らの出発化合物を特徴づけ、このアッセイがRBP4アンタゴニストの特徴づけに適することを証明した図8。2つの化合物、すなわち化合物1およびフェンレチニドは、μMの範囲内のEC50化合物1については2.2μM、フェンレチニドについては17.3μMで、レチノール誘導性RBP4-TTR相互作用を拮抗した。例2哺乳動物モデルにおける化合物1の有効性野生型およびAbca4-/-マウスで化合物1の有効性を試験した。Abca4-/-マウスモデルは、RPEにおいてリポフスチンの促進的な蓄積を呈し、リポフスチン蓄積を減少させる薬物のための前臨床での有効性のモデルと考えられる。化合物1を30mg/kgで3週間経口投与した。処置した動物において、約70の血清RBP4レベルの低下があった図11。さらに発明者らは、処置したマウスにおいて、A2E/イソA2Eのレベルが約50低下したことを発見した図12。A2-DHP-PEおよびatRALジ-PEのレベルも低下した。こうした前臨床有効性データは、化合物1が乾性AMDおよびシュタルガルト病に対する有望な低分子治療薬であることを示す。組織抽出およびビスレチノイドのHPLC分析Rpe65-Leu450についてホモ接合型であるAbca4/Abcrヌル変異体マウスアルビノを繁殖させ、遺伝子型を同定し、飼育した。マウスの後部眼杯Posterioreyecupおよびヒトドナーの眼から回収されたRPE/脈絡膜NationalDiseaseResearchInterchange、PhiladelphiaPAをガラスの組織グラインダーを用いてリン酸緩衝食塩水PBS中でホモジナイズし、クロロホルム/メタノール2:1中で抽出する。続いて、コットンを通して抽出物を濾過し、0.1TFAAldrichChemicalCompany、Milwaukee、WI入りのメタノールを用いて逆相カートリッジC8Sep-Pak、Milliporeを通過させる。アルゴンガス下で溶媒を蒸発させた後、抽出物を0.1TFA含有50メタノール性クロロホルムに溶解する。2695セパレーションモジュール、2996フォトダイオードアレイ検出器、2475マルチλ蛍光検出器およびEmpower登録商標ソフトウェアによるオペレーティングを備えたAllianceシステムWaters,Corp、Milford、MAを用いてHPLC分析を行う。Atlantis登録商標dC18カラム3μm、4.6×150mm、Waters、USAおよびDeltaPak登録商標C4カラム5μm、3.9×150mm、Waters、USAを用いる。0.1TFAを有する水およびアセトニトリルのグラジエントFisher、FairLawn、NJを移動相に用いる。詳細を図の説明文に示す。HPLC定量化をEmpower登録商標ソフトウェアを用いて行い、ピーク面積を決定する。フォトダイオードアレイによる検出は、430および490nmにセットする。マウスの眼あたりのモル量を、既知の濃度の精製された外部標準から作製した検量線を用いて、およびHPLC注入量10μL対総抽出量の比に対して標準化することによって、決定する。考察視覚サイクルの薬理学的阻害のための薬物標的としての血清RBP4網膜における視覚サイクルおよびA2E産生の速度は、血清からRPEへのオールトランスレチノールの流入に依存するため図4、血清レチノールの部分的な薬理学的ダウンレギュレーションが乾性AMD処置の標的分野に相当してもよいことが示唆されている11。血清レチノールは、レチノール結合タンパク質RBP4に結合しており、RBP4とトランスチレチンとの三次複合体TTRとして、循環において維持されている図5。TTRと相互作用しないと、RBP4-レチノール複合体は、糸球体濾過により循環から急速に除去される。さらに、RBP4-TTR-レチノール複合体の形成は、血清から網膜への、受容体媒介性のオールトランスレチノールの取り込みに必要とされる。RBP4は、視覚サイクルおよびA2E形成の間接的な薬理学的阻害のための魅力的な薬物標的に相当する。RBP4のレチノール結合部位は、RBP4-TTR相互作用を媒介する界面に対して立体的に近位である。RBP4への結合に関して血清レチノールと競合すると同時にRBP4-TTR相互作用をブロックするレチノールアンタゴニストは、血清RBP4およびレチノールレベルをおそらく低下させ、これは、網膜へのレチノールの取り込みを低下させることにつながるであろう。その結果が、それに続くA2E合成の低下をともなう視覚サイクルの抑制であろう。癌治療薬と以前には考えられていたフェンレチニドと呼ばれる合成レチノイド[N-4-ヒドロキシ-フェニルレチンアミド、4HRP]29は、RBP4に結合し、RBP4からオールトランスレチノールを移動させ13、RBP4-TTR相互作用を乱す13、14ことが判明した。フェンレチニドは、血清RBP4およびレチノールを減少させる15、眼のオールトランスレチノールの取り込みを抑制し、視覚サイクルを減速する11ことが示された。重要なことに、フェンレチニドの投与は、過剰にビスレチノイドを蓄積する動物モデルであるAbca4-/-マウスにおいて、A2E産生を低下させた11。フェンレチニドを用いた前臨床実験によって、RBP4が乾性AMDの薬物標的として確証された。しかし、フェンレチニドは非選択的であり、有毒性である。RBP4へのレチノール結合のアンタゴニストとしてのその活性と無関係に、フェンレチニドは、網膜色素上皮細胞20を含めた多くの細胞型において、アポトーシスの極めて強い活性誘導物質である16~19。フェンレチニドの有害作用は、核内受容体RARのリガンドとしてのその作用によって媒介されることが示唆されている21~24。さらに他のレチノイドと類似して、フェンレチニドは催奇性である。眼用使用の低分子化合物1またはそのエステルもしくは塩が本明細書に開示される。化合物1、すなわち24-2-トリフルオロメチルフェニルピペリジン-1-カルボキサミド安息香酸は、非レチノイドRBP4アンタゴニストである。化合物1は、もともと抗糖尿病剤として開発された12。しかし、マウス糖尿病モデルにおいて、その投与はインスリン感受性を改善しなかった。参考文献1PetrukhinKNewtherapeutictargetsinatrophicagerelatedmaculardegenerationExpertOpinTherTargets2007116256392CDeloriDGGogerandCKDoreyAgerelatedaccumulationandspatialdistributionoflipofuscininRPEofnormalsubjectsInvestigativeOphthalmologyandVisualScience42pp185518663FCDeloriRPElipofuscininageingandagerelatedmaculardegenerationInGCoscasandFCPiccolinoEditorsRetinalPigmentEpitheliumandMacularDiseasevol62KluwerAcademicPublishersDordrechtTheNetherlandspp37454CKDoreyGWuDEbensteinAGarsdandJJWeiterCelllossintheagingretinaRelationshiptolipofuscinaccumulationandmaculardegenerationInvestigativeOphthalmologyandVisualScience30pp169116995LFeeneyBurnsESHilderbrandandSEldridgeAginghumanRPEmorphometricanalysisofmacularequatorialandperipheralcellsInvestigativeOphthalmologyandVisualScience25pp1952006FGHolzCBellmanSStaudtFSchuttandHEVolckerFundusautofluorescenceanddevelopmentofgeographicatrophyinagerelatedmaculardegenerationInvestigativeOphthalmologyandVisualScience42pp105110567FGHolzCBellmannMMargaritidisFSchuttTPOttoandHEVolckerPatternsofincreasedinvivofundusautofluorescenceinthejunctionalzoneofgeographicatrophyoftheretinalpigmentepitheliumassociatedwithagerelatedmaculardegenerationGraefe’sArchiveforClinicalandExperimentalOphthalmology237pp1451527AvonRuckmannFWFitzkeandACBirdFundusautofluorescenceinagerelatedmaculardiseaseimagedwithalaserscanningophthalmoscopeInvestigativeOphthalmologyandVisualScience38pp4784869FGHolzCBellmanSStaudtFSchuttandHEVolckerFundusautofluorescenceanddevelopmentofgeographicatrophyinagerelatedmaculardegenerationInvestigativeOphthalmologyandVisualScience42pp1051105610SparrowJRFishkinNZhouJCaiBJangYPKraneSItagakiYNakanishiKA2EabyproductofthevisualcycleVisionRes2003Dec4329839011RaduRAHanYBuiTVNusinowitzSBokDLichterJWidderKTravisGHMataNLReductionsinserumvitaminAarrestaccumulationoftoxicretinalfluorophoresapotentialtherapyfortreatmentoflipofuscinbasedretinaldiseasesInvestOphthalmolVisSci2005Dec46439340112MotaniAWangZConnMSieglerKZhangYLiuQJohnstoneSXuHThibaultSWangYFanPConnorsRLeHXuGWalkerNShanBCowardPIdentificationandcharacterizationofanonretinoidligandforretinolbindingprotein4whichlowersserumretinolbindingprotein4levelsinvivoJBiolChem2009Mar2028476738013BerniRFormelliFInvitrointeractionoffenretinidewithplasmaretinolbindingproteinanditsfunctionalconsequencesFEBSLett1992Aug1030843514SchafferEMRitterSJSmithJENretinamideinducesretinolbindingproteinsecretionfromliverandaccumulationinthekidneysinratsJNutr1993Sep123149750315AdamsWRSmithJEGreenMHEffectsofNretinamideonvitaminAmetabolisminratsProcSocExpBiolMed1995Feb2081788516PuduvalliVKSaitoYXuRKouraklisGPLevinVAKyritsisAPFenretinideactivatescaspasesandinducesapoptosisingliomasClinCancerRes1999Aug52230517HolmesWFSopranoDRSopranoKJSyntheticretinoidsasinducersofapoptosisinovariancarcinomacelllinesJCellPhysiol2004Jun1993172918SimeoneAMEkmekciogluSBroemelingLDGrimmEATariAMAnovelmechanismbywhichNretinamideinhibitsbreastcancercellgrowththeproductionofnitricoxideMolCancerTher2002Oct110091719FontanaJARishiAKClassicalandnovelretinoidstheirtargetsincancertherapyLeukemia2002Apr164637220SamuelWKuttyRKNagineniSVijayasarathyCChandraratnaRAWiggertBNretinamideinducesapoptosisinhumanretinalpigmentepithelialcellsretinoicacidreceptorsregulateapoptosisreactiveoxygenspeciesgenerationandtheexpressionofhemeoxygenase1andGadd153JCellPhysiol2006Dec2098546521FontanaJARishiAKClassicalandnovelretinoidstheirtargetsincancertherapyLeukemia2002Apr164637222SamuelWKuttyRKNagineniSVijayasarathyCChandraratnaRAWiggertBNretinamideinducesapoptosisinhumanretinalpigmentepithelialcellsretinoicacidreceptorsregulateapoptosisreactiveoxygenspeciesgenerationandtheexpressionofhemeoxygenase1andGadd153JCellPhysiol2006Dec2098546523SabichiALXuHFischerSZouCYangXSteeleVEKelloffGJLotanRCliffordJLRetinoidreceptordependentandindependentbiologicalactivitiesofnovelfenretinideanaloguesandmetabolitesClinCancerRes2003Oct1946061324CliffordJLMenterDGWangMLotanRLippmanSMRetinoidreceptordependentandindependenteffectsofNretinamideinF9embryonalcarcinomacellsCancerRes1999Jan15914825GollapalliDRRandoRRThespecificbindingofretinoicacidtoRPE65andapproachestothetreatmentofmaculardegenerationProcNatlAcadSciUSA2004Jul610110030526MaitiPKongJKimSRSparrowJRAllikmetsRRandoRRSmallmoleculeRPE65antagonistslimitthevisualcycleandpreventlipofuscinformationBiochemistry2006Jan24458526027RaduRAMataNLNusinowitzSLiuXSievingPATravisGHTreatmentwithisotretinoininhibitslipofuscinaccumulationinamousemodelofrecessiveStargardtsmaculardegenerationProcNatlAcadSciUSA2003Apr151004742728MonacoHLRizziMCodaAStructureofacomplexoftwoplasmaproteinstransthyretinandretinolbindingproteinScience1995May1926810394129BonanniBLazzeroniMVeronesiUSyntheticretinoidfenretinideinbreastcancerchemopreventionExpertRevAnticancerTher2007Apr74233230SunnessJSMargalitESrikumaranDApplegateCATianYPerryDHawkinsBSBresslerNMThelongtermnaturalhistoryofgeographicatrophyfromagerelatedmaculardegenerationenlargementofatrophyandimplicationsforinterventionalclinicaltrialsOphthalmology2007Feb114271731GlickmanJFetalAcomparisonofALPHAScreenTRFRETandTRFasassaymethodsforFXRnuclearreceptorsJBiomolScreening2002731032FujimuraTetalUniquepropertiesofcoactivatorrecruitmentcausedbydifferentialbindingofFK614anantidiabeticagenttoPPARgammaBiolPharmBull20062942342933ZhouGetalNuclearreceptorshavedistinctaffinitiesfocoactivatorscharacterizationbyFRETMolEndocrinol1998121594160534CoganUKopelmanMMokadySShinitzkyMBindingaffinitiesofretinolandrelatedcompoundstoretinolbindingproteinsEurJBiochem1976May176571835DecensiATorrisiRPolizziAGesiRBrezzoVRolandoMRondaninaGOrengoMAFormelliFCostaAEffectofthesyntheticretinoidfenretinideondarkadaptationandtheocularsurfaceJNatlCancerInst1994Jan19861051036ConleyBOShaughnessyJPrindivilleSLawrenceJChowCJonesEMerinoMJKaiserKupferMICarusoRCPodgorMGoldspielBVenzonDDanforthDWuSNooneMGoldsteinJCowanKHZujewskiJPilottrialofthesafetytolerabilityandretinoidlevelsofNretinamideincombinationwithtamoxifeninpatientsathighriskfordevelopinginvasivebreastcancerJClinOncol2000Jan182758337FainGLLismanJEPhotoreceptordegenerationinvitaminAdeprivationandretinitispigmentosatheequivalentlighthypothesisExpEyeRes1993Sep573354038MakimuraHWeiJDolanLoobySERicchiutiVGrinspoonSRetinolBindingProteinLevelsareIncreasedinAssociationwithGonadotropinLevelsinHealthyWomenMetabolism2009April5847948739YangQGrahamTEModyNPreitnerFPeroniODZabolotnyJMKotaniKQuadroLKahnBBSerumretinolbindingprotein4contributestoinsulinresistanceinobesityandtype2diabetesNature2005Jul214363566240KimSRJangYPJockuschSFishkinNETurroNJSparrowJRThealltransretinaldimerseriesoflipofuscinpigmentsinretinalpigmentepithelialcellsinarecessiveStargardtdiseasemodelPNASDecember42007Vol104No4919273841WuYFishkinNEPandeAPandeJSparrowRJNovelLipofuscinBisretinoidsProminentinHumanRetinaandinaModelofRecessiveStargardtDiseaseJournalofBiologicalChemistryJuly242009Vol284No302015520166"