組織試料のスペクトル画像を処理するためのファジーC平均法クラスタリングアルゴリズムであって、Kの最適値、およびmを、FCMクラスタ間の冗長性に基づき、自動的にかつ同時に推定するファジーC平均法クラスタリングアルゴリズム。前記冗長性はによって計算され、式中、Rijは冗長性の尺度としての2つのクラスタiおよびjの間の相互相関係数であり、は対についてFCMによって与えられたクラスタiおよびjのメンバーシップ値の間の共分散であり、およびはクラスタiおよびjの前記メンバーシップ値の分散であり、平均はおよびである請求項1に記載のアルゴリズム。前記アルゴリズムは、1結果としてL個の曲線を構成する、前記相関係数のL個の異なる閾値についてmの関数における非冗長クラスタの数を決定するためのクラスタ数を減らす反復プロセスと、2前記L個の曲線からFCMパラメータの最適な推定を行うステップと、3クラスタの前記数の最終的な最適値を確定するステップと、4前記ファジー指数の最適値を計算するステップとを含む請求項2に記載のアルゴリズム。Kおよびmの前記最適値は、データセットを先験的に知らなくても推定される請求項3に記載のアルゴリズム。前記スペクトル画像のそれぞれのスペクトルは、特定のメンバーシップ値を持つクラスタ毎に割り当てられる請求項4に記載のアルゴリズム。病変部の腫瘍不均一性を特徴付けるための方法であって、aマイクロ撮像システムに結合されたFTIRまたはラマンスペクトロメーターによって組織試料上の病変を走査するステップと、b前記病変の一連のデジタル画像のスペクトルを取得し、格納するステップと、cファジーC平均法クラスタリングアルゴリズムによって前記スペクトルをクラスタ化するステップとを含み、前記アルゴリズムは、Kの最適値、およびmを、FCMクラスタ間の冗長性に基づき自動的にかつ同時に推定する方法。前記冗長性はによって計算され、式中、Rijは冗長性の尺度としての2つのクラスタiおよびjの間の相互相関係数であり、は対についてFCMによって与えられたクラスタiおよびjのメンバーシップ値の間の共分散であり、およびはクラスタiおよびjの前記メンバーシップ値の分散であり、平均はおよびである請求項6記載の方法。前記アルゴリズムは、1結果としてL個の曲線を構成する、前記相関係数のL個の異なる閾値についてmの関数における非冗長クラスタの数を決定するためのクラスタ数を減らす反復プロセスと、2前記L個の曲線からFCMパラメータの最適な推定を行うステップと、3クラスタの前記数の最終的な最適値を確定するステップと、4前記ファジー指数の最適値を計算するステップとを含む請求項7に記載の方法。およびの前記最適値は、データセットを先験的に知らなくても推定される請求項8に記載の方法。スペクトル画像のそれぞれのスペクトルは、特定のメンバーシップ値を持つクラスタ毎に割り当てられる請求項9に記載の方法。前記方法は、d前記クラスタメンバーシップ情報をさまざまな腫瘍組織のスペクトルライブラリと比較し、皮膚腫瘍のそれぞれの組織の種類のスペクトルマーカーを識別するステップと、e色をそれぞれの異なるクラスタに割り当てることによって前記スペクトルマーカーをマッピングするステップとをさらに含む請求項6に記載の方法。前記方法は、前記腫瘍組織および腫瘍腫瘍周辺組織の界面を区別する請求項11に記載の方法。前記方法は、腫瘍周辺組織のピクセルのメンバーシップ値の漸進的勾配を明らかにする請求項12に記載の方法。前記腫瘍組織は、皮膚癌の組織である請求項12に記載の方法。前記腫瘍組織は、浸潤性SCCの組織である請求項12に記載の方法。前記腫瘍組織は、表在型BCCの非浸潤性状態の組織である請求項12に記載の方法。前記腫瘍組織は、ボーエン病の組織である請求項12に記載の方法。本発明は、データセットを先験的に知ることなく、Kの最適値、非冗長性FCMクラスタの数、およびファジー指数mを自動的に推定することができる、腫瘍組織のスペクトル画像専用の新規性のあるアルゴリズムを提供する。この革新的アルゴリズムは、FCMクラスタ間の冗長性に基づく。このアルゴリズムは、腫瘍領域を特定し、また腫瘍構造と周辺組織構造との間の移行領域を強調することに特に最適化されている。浸潤性腫瘍では、腫瘍周辺組織のピクセルのメンバーシップ値の漸進的勾配も明らかにされる。本発明は、組織試料のスペクトル画像を処理するためのファジーC平均法クラスタリングアルゴリズムを提供する。このアルゴリズムは、Kの最適値、およびmを、FCMクラスタ間の冗長性に基づき自動的にかつ同時に推定する。本発明は、病変部の腫瘍不均一性を特徴付けるための方法も提供する。本発明によると、この特徴付けは、aマイクロ撮像システムに結合されたFTIRまたはラマンスペクトロメーターによって組織試料上の病変部を走査するステップと、b病変部の一連のデジタル画像のスペクトルを取得し、格納するステップと、cファジーC平均法クラスタリングアルゴリズムによってスペクトルをクラスタ化するステップとによって実行された。さらに、このアルゴリズムは、Kの最適値、およびmを、FCMクラスタ間の冗長性に基づき自動的にかつ同時に推定する。実施例1材料と方法試料調製開発したアルゴリズムを、ホルマリンで固定されたパラフィン包埋ヒト皮膚癌の13の生検、つまり、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、ボーエン病に関して得られたIRデータベース上で適用した。試料は、ランス大学病理学部の腫瘍バンクから入手した。FTIR撮像を行うため、試料を厚さ10ミクロンに薄切りしたスライスを、特に調製することなく、フッ化カルシウム窓の上に載せた。隣接するスライスを切断し、従来の方法の組織検査を行うためにヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。FTIRデータ収集空間分解能が625μm、スペクトル分解能が4cm1であるSpectrumoneFTIRスペクトロメーターに結合されたSpectrumSpotlight300FTIR撮像システムを用いてFTIRハイパースペクトル画像を記録した。このデバイスは、撮像用に窒素冷却水銀カドミウムテルル16ピクセル線検出器を装備した。データセットとも称されるスペクトル画像を、16回の累算を使用して収集した。それぞれの収集の前に、大気環境およびCaF2窓の基準スペクトルを、240回の累算で記録した。この基準スペクトルは、その後、PerkinElmerSpotlightというソフトウェアの内蔵機能によってそれぞれのデータセットから自動的に減算された。それぞれの画像ピクセルは、900から1800cm1までの範囲内に一様に分布する451個の波数上の1つの測定点の吸収度である、IRスペクトルを表した。指紋領域として特徴付けられる、このスペクトル範囲は、実際には、生体試料の最も情報量の多い領域に対応する。データ処理前の化学的脱鑞なしで試料を分析したが、記録されたFTIRハイパースペクトル画像はパラフィンスペクトル寄与分についてデジタル補正されなければならない。この目的のために、拡張乗法信号補正に基づく自動処理をそれぞれの記録されたデータセット上で適用した。対応する分析手法の詳細は、参照により本明細書に組み込まれている、LyE、PiotO、WolthuisR、DurlachA、BernardP、およびManfaitM、で完全に説明された。簡単に言うと、平均スペクトルIは、それぞれのデータセットのすべてのQ個の記録されたスペクトルIqを平均することによって計算されたということである。4次多項式関数Pで光散乱効果をモデル化した。パラフィンのスペクトル変動を考慮するために、干渉行列Mを、パラフィンの平均スペクトルと純パラフィンブロック上で記録されたFTIRスペクトル画像から抽出された最初の9つの主成分とで構成した。それぞれの記録されたスペクトルIqは、以下のように最小二乗法を使用することによってI、P、およびMでフィッティングした。IqαqIβqPγqMeqq1Q残差eqは、フィッティングモデルの精度の推定値を与えるもので、EMSC補正スペクトルを得るために使用される。EMSCベースの前処理を適用した後、パラフィン寄与分を中和して、組織のスペクトル変動のみをデータセット内に保持し、平均スペクトルを中心として補正スペクトルを正規化することができた。EMSCベースの前処理の前後の2つのIRスペクトルが図1に示されている。それに加えて、この前処理により、分析結果から信号対雑音比が劣る外れ値となるスペクトルを捨てることが可能になった。対応するピクセルは、見やすいようにクラスタリング色分け画像で白色にした。実施例2既存のクラスタリング手法による実験クラスタリングの主目的は、スペクトルデータセット間の類似性を見つけ、次いで類似のスペクトルをグループ化してまとめることにより組織切片内の注目領域を明らかにすることである。癌研究では、クラスタリング手法を使用することで、コントラストが高い色分けされた画像を作成し、複雑な組織内の腫瘍領域を特定することが可能になる。クラスタリング手法の詳細は、参照により本明細書に組み込まれているLyE、PiotO、WolthuisR、DurlachA、BernardP、およびManfaitM、およびLaschP、HaenschW、NaumannD、およびDiemMで説明されている。ハードクラスタリングKMクラスタリングは、非階層的分割クラスタリング手法である。KMの目的は、それぞれのスペクトルとスペクトルが影響を受けるクラスタの重心との間の距離測度に基づき目的関数を最小化することであった。このアルゴリズムは、データを反復的に分割してK個の異なるクラスタに分ける。ここで、KMクラスタリングは数回実行され、これにより、安定解に到達することを確実にし、ランダムな初期化の依存性を解消した。この研究では、古典的なユークリッド距離を用いMatlabStatisticsToolboxを使用してKMを適用した。このプロセスは、反復を続けてもスペクトルの再割り当てが行われなくなるまで続けられ、さもなければ104回の反復後に停止した。AHクラスタリングは、階層的分割クラスタリングであり、それぞれの対象はアルゴリズムの開始時の1つのクラスタである。それぞれの反復ステップで、AHは最も類似している2つのクラスタを新しい1つのクラスタに再グループ化する。アルゴリズムは、すべてのスペクトルが1つの単一クラスタに組み合わされたときに停止される。Q個のスペクトルについて、反復回数は、Q1に等しい。AHクラスタリングプロセスは、初期化から独立している。しかし、KMの場合のように、AHクラスタリングでは、クラスタの数Kは、経験的に選択される。KMと比較して、AHクラスタリングは、著しく時間がかかり、またリソースも食う。本発明における大きなデータセット上のAHクラスタリングの計算時間を短縮するために、ここでは、参照により本明細書に組み込まれている、VijayaPA、MurtyMN、SubramanianDKLectureNotesinComputerScience2005、37762005、583~588頁で説明されている、ユークリッド距離およびウォードのアルゴリズムを使用して、KMクラスタリングとAHクラスタリングとを組み合わせた効率的なハイブリッド階層的凝集型クラスタリング法を使用した。KMは、データセットを1000個のクラスタ中心に縮小するために最初に適用された。次いで、これらの1000個のKM重心に対してAHを実行した。FCMクラスタリングFCMクラスタリングは、メンバーシップ値uqkで重み付けされた、クラスタ内誤差の総和として定義された目的関数Jmの最小化に基づく。この目的関数を最小化するクラスタ重心およびメンバーシップ値は、反復最適化手順を使用することによって得られる。重みは、ファジー指数mによって制御される。したがって、ハードクラスタリングとは逆に、FCMでは、それぞれのスペクトルIqcorrを関連付けられているメンバーシップ値uqkが0と1の間で変化するすべてのクラスタkに及ぼすことができ、それぞれのスペクトルに対するK個のクラスタメンバーシップ値の総和は1に等しい、つまり、となる。ここで、MatlabStatisticsToolboxからのFCM機能を適用した。停止基準として、最大500回の反復、および最小量の改善に対する設定105を使用した。しかし、FCMでは、クラスタの数Kおよびファジー指数mを固定することを必要とした。これらのパラメータの選択が不適切だと、データのクラスタリングが解釈不可能になるおそれがある。そのため、これらのデータの最適な推定を行う自動化された方法を開発することが不可欠であった。実施例3FCMパラメータの最適な推定のための冗長性ベースのアルゴリズムの開発この革新的なアルゴリズムは、FCMクラスタ冗長性に基づくものであり、データセットの先験的知識を有することなく最適な対を求めることを目指した。われわれは、ここで、2つのクラスタiおよびjの間の相互相関係数Rijを冗長性の尺度として選択したが、ただし、式中、は、対についてFCMによって与えられるクラスタiおよびjのメンバーシップ値の間の共分散であり、およびは、クラスタiおよびjのメンバーシップ値の分散であり、およびは平均である。RBAは、3つのステップからなる。最初に、クラスタの数を減らす反復プロセスを実行した。このステップについて、集合mm1mnmNに属すファジー指数のN個の異なる値および集合ss1slsLに属すL個の異なる閾値を考察した。mは、古典的な値m2を中心として一様に分布する、ファジー指数mのN個の異なる値からなり、sは、高い相関係数範囲50から95内に一様に分布するL個の異なる閾値からなる。FCMクラスタリングは、m1、sL、およびクラスタの数Kの大きな値、つまり、KKmaxで開始した。一般的な方法では、値の3組に対して、1≦ij≦Kとして相互相関係数Rijを計算した。Rij値の1つが、slより大きい場合、KK1として新しいFCMを実行した。さもなければ、Rijのすべての値が閾値slより小さい場合、非冗長クラスタの数を得た。添字nrは、クラスタの非冗長性を表すために以下で使用される。mの異なる値および固定閾値slに対してこの手順を実行することによって、非冗長クラスタの数の曲線をmの関数として得た。次のmに対するクラスタの数を減らす反復プロセスは、前のmについて推定された非冗長クラスタの数に等しいKの初期値、つまりからリスタートすべきである。しかし、FCMアルゴリズムはランダムに初期化されるので、非冗長クラスタの推定される数は、一方のクラスタリングと他方のクラスタリングとで異なる可能性がある。この可能な変動を考慮するために、次のmに対するKの初期値を前のmに対する非冗長クラスタの数に2を加えた値に、つまり、に設定したが、Kmaxを超えることはない。集合sのすべての値についてこの手順を実行することによって、その結果の曲線が閾値sl毎に得られた。大域的手順が、図2に示されている。第2に、RBAは得られた曲線からクラスタの数の最適な推定である。結果と説明の節に示されているように、これらの曲線は、急激に減少し、の値のところで安定するが、ただし、式中、は推定量を表す。閾値slが何であれ、われわれは、通常、近い値に対し、また多くの場合に同じ値に対して、これらの曲線内に切れ目が現れることを観察した。クラスタの数の最終的な最適値を確定するために多数決アルゴリズムが使用される。最後に、ファジー指数の最適値は、最小値を平均することによって計算され、これらの値に対して曲線はのところに切れ目を示している、つまり、である、ただし、とする。これ以降、これらのRBA最適化パラメータを用いて実行されるFCMクラスタリングは、FCMRBAと定義される。結果および説明FCMRBAクラスタリングは、13のヒト皮膚癌の薄い組織切片上で撮ったEMSC前処理済みFTIRハイパースペクトル画像において評価された。結果をKM、HHAC、および古典的なFCMの結果と比較した。この切片の読み取りを改善するために、浸潤性SCCに対するこれらの比較結果を提示した。それに加えて、FCMRBAクラスタリングデータを、表在型BCCおよびボーエン病の非浸潤状態について与えたが、対応するKM、HHAC、およびFCMの結果は、図3~図6に提示した。ハードクラスタリングの結果腫瘍の輪郭が描かれている研究されたSCC試料のHE染色組織画像は、図7に示されている。このパラフィン包埋組織切片の明確に区別できる組織領域を強調するために、11個のクラスタの経験的選択によりKMクラスタリングを適用した。その結果得られた、それぞれの色が1つのクラスタに関連付けられた色分けされた画像が図7に示されている。KMおよびHHAC画像を対応するHE染色切片と比較することで、クラスタの割り当てを行うことができた。KMクラスタリングについてここで示されているように、腫瘍に属すピクセルをクラスタ1、7、および9にグループ分けし、腫瘍内不均一性を明らかにした。真皮はクラスタ2、3、および6で表し、潰瘍のある表皮はクラスタ4、5、8、10、および11で表した。図7に示されているように、HHACクラスタリングの結果は、KMの結果と極めてよく似ており、HHAC色分け画像を構成するために使用される対応する系統樹は、図7に表されている。これらの結果は、ハードクラスタリングアルゴリズムが、組織構造の情報を取り出し、特に、組織切片内の腫瘍領域を特定することができたことを示している。しかし、クラスタの数の選択は、通常は経験的に解決する難しい問題であった。11個未満のクラスタを選択した場合、クラスタリングアルゴリズムによって識別される組織領域が混合され、腫瘍内不均一性はもう明らかにならなかった。11個を超えるクラスタでは、さらなる解釈可能な情報が得られなかった。さらに、これらのハードクラスタリング法の主要な欠点は、それぞれの個別スペクトルのクラスタメンバーシップグレードが0または1に等しく、このためピクセルメンバーシップの微妙な差異を区別することができないという点である。その結果、これらの手法では、腫瘍の侵潤先進部のところに、または不均一な腫瘍内領域の間に進行性の移行が存在する可能性が高いと考えることはできなかった。古典的なFCMクラスタリング同じデータセット上で最適化パラメータなしでFCMアルゴリズムを使用することによって得られた結果を図8に示す。ファジー指数mは、他のグループの調査結果に応じて、一般に使用されるデフォルト値2に固定された。11個のクラスタを選択したが、これらはハードクラスタリングですでに説明されているようにHEベースの組織の明確な再生を可能にする。それぞれのクラスタを、ただ1つの色分け画像に重ね合わせる代わりに、別の画像内に提示した。実際、重ね合わせ表示により、移行構造の強調表示が難しくなった。図8に提示されているクラスタの視覚的な比較の結果、重要な冗長性が明らかになった。これは、計算された画像の間の相互相関係数Rijによって確認される。実際、クラスタ7および9は、983に等しいRijと、クラスタ5および7は、826に等しいRijと、クラスタ5および11は、786に等しいRijと、最後にクラスタ1および4は、767に等しいRij係数と相関した。研究された皮膚癌の集合に関して収集されたすべてのIRハイパースペクトル画像に関して類似の冗長性が観察されており、それらのうちの2つが図4および図6に示されている。これらの結果から、古典的なFCMは、一方のクラスタと他方のクラスタとで数ピクセルしか異ならない非情報的な冗長画像を形成することが実証された。したがって、生物学的に関連したクラスタリングを得るためにKパラメータとmパラメータの最適な対を選択することが不可欠であった。RBAを使用したFCMパラメータの最適化革新的なアルゴリズムを使用して最適なKパラメータおよびmパラメータの同時決定を実行した。われわれの調査では、値Kmax20、ファジー指数の集合m141525、および閾値の集合s05055095をテストした。閾値slの異なる値に対してこの方法により得られるmの関数として非冗長クラスタの数を表す曲線は、SCC試料について図9に示されている。それぞれの曲線は、曲線がきわめて安定する値に向かって速く減少する傾向があった。これらの閾値に対する値および対応する値は、表1に示されている。そこで、クラスタの最適な数は、多数決アルゴリズムを使用することによって6に等しいものとして推定されている。その結果得られる最適な値は、6について得られたの値の平均として決定され、206に等しかった。開発されたRBAが、研究された皮膚癌の集合に関して収集されたすべてのIRハイパースペクトルデータセット上での適用に成功した。表1クラスタの最適な数およびファジー指数の対応する最適な値。これらのデータは、図9に提示されている曲線からの10個の異なる閾値slについて決定されている。われわれの事例において、FCMクラスタの最適な数Kを決定するために使用される古典的な有効性指数は、標準的な組織病理学と相関しえなかったことについて言及されなければならない。実際、m2で適用される分割係数および分類エントロピーは、異なる組織構造を明らかにすることができなかったK2の異常値を与える。これらのデータは、組織構造の区別に関するわれわれが開発したRBAの関連性を強化した。FCMRBAを使用した皮膚癌の組織病理学的認識ヒト浸潤性皮膚SCCに対するFCMRBAによって生成される画像が図10に示されている。組織画像と比較した後、それぞれの生成されたクラスタを正確な組織構造に割り当て、腫瘍領域、腫瘍周辺領域、真皮、および表皮とした。さらに、FCMRBAは、従来の組織または古典的ハードクラスタリング法によってアクセス可能でない新しい情報を明らかにした。実際、これは、クラスタ1について示されているような腫瘍内およびクラスタ2について示されているような腫瘍周辺領域内の両方のマークされている不均一性の存在を強調した。ハードクラスタリングと比較すると、FCMRBAでは、これらのクラスタのそれぞれの中で、ピクセルのメンバーシップグレード変動に対応するスペクトルの微妙な差異を視覚化することができた。これらのスペクトルの差は、これらの領域内に存在する腫瘍細胞の構造機能の変化を反映する可能性のある組織構造内の分子変化に依存した。興味深いことに、腫瘍周辺領域の3D表現を使用する図11に示されているように、FCMRBAは、ピクセルのメンバーシップ値に漸進的勾配の存在を明らかにした。腫瘍から真皮の方へ向かうにつれ、それぞれのピクセルのメンバーシップ値は次第に大きくなって最大値に到達し、次いで真皮の縁のところで急に減少する。これは、腫瘍とその侵潤先進部との間の緊密な結び付き、および侵潤先進部と周辺真皮との間の驚くほど明快な差を示した。病理学的観点では、腫瘍周辺領域に大きな関心があったが、それは、腫瘍細胞が周囲の正常組織に浸潤する可能性がある腫瘍の侵潤前面を表していたからである。このアプローチは、癌腫から転移への腫瘍進行を探ることに関する大きな可能性を示しており、そのため、腫瘍の攻撃性の初期決定のための魅力的なツールとなりうる。浸潤性皮膚癌のモデルとしてSCC試料を分析した後、表在型BCCおよびボーエン病試料についてFCMRBAの結果を提示したが、両方とも非侵潤性皮膚癌を表している。RBAによるFCMパラメータの最適化は、これらの試料については図12および13に、BCCおよびボーエン病の試料については表2および表3に、それぞれ示されている。表2クラスタの最適な数およびファジー指数の対応する最適な値。これらのデータは、図10に提示されている曲線からの10個の異なる閾値slについて決定されている。表3クラスタの最適な数およびファジー指数の対応する最適な値。これらのデータは、図13に提示されている曲線からの10個の異なる閾値slについて決定されている。図12に示されているように、表在型BCCについて、FCMRBAは、組織構造を分離するために容易に割り当て可能である5つのクラスタを明らかにした、つまり、表皮、真皮、および腫瘍領域である。ハードクラスタリングと比較して、ファジークラスタリングでは、前のSCC試料のクラスタ1についてすでに説明されているように、クラスタ5内の腫瘍内不均一部分を識別した。腫瘍正常な表皮の界面のところで追加の元の情報が証拠となった。実際、腫瘍から表皮への進行性の移行が観察されており、これは、これら2つの領域の間の相互関連性を反映している。これは、BCCが表皮角化細胞の細胞形質転換に由来するという事実によって説明できる。われわれの知る限りにおいて、従来の組織病理学によって識別されない、そのような組織相互依存性は、まだ説明されたことがないことに留意されたい。それに加えて、浸潤性SCCとは反対に、腫瘍真皮の界面は、いかなる中間腫瘍周辺構造も示していないが、むしろ、BCCの非浸潤性表現型を確認する明確な縁の存在を示していた。ボーエン病試料について、FCMRBAは、以下の組織構造に割り当てられた5つのクラスタを明らかにしている、つまり、表皮、真皮、および腫瘍である。クラスタ1および5の視覚的比較分析は、腫瘍が正常な表皮内にきわめて限局されていることを示した。それに加えて、FCMRBAは、腫瘍隣接表皮の界面のところでピクセルのメンバーシップ値の勾配が存在することを明らかにしなかった。SCCおよびBCC研究試料とは反対に、このように相互関連性が存在しないことは、ボーエン病がきわめて限局されている上皮内癌に対応するという事実によるものであった。結論クラスタリング法に関連付けられているスペクトルマイクロ撮像法は、ヒト皮膚癌のパラフィン包埋組織切片の直接的分析の潜在的可能性が大きいことを示した。われわれの結果から、FCMクラスタリングは、古典的なハードクラスタリングよりも強力であり、腫瘍不均一性および侵潤性に関係する生物学的に関連した情報を明らかにすることが実証された。そこで、われわれは、最適なFCMパラメータの同時決定を行う専用オリジナルアルゴリズムを開発した。この新規性のあるデータ処理方法により、FTIRまたはラマンマイクロ撮像機能は、日常的診断医学における用途向けの、観測者内変動性に無関係である、有望なツールとなる。