"対象の網膜色素上皮におけるTTRの発現を低下させるための方法であって、十分な量のdsRNAを前記対象の網膜に投与することを含み、前記dsRNAは、AD-18324またはAD-18534またはAD-23043である、方法。前記dsRNAは、コレステロール分子にコンジュゲートされる、請求項1に記載の方法。前記対象は、ヒトである、請求項1に記載の方法。前記対象は、TTR関連眼アミロイドーシスの治療を必要とするヒトである、請求項3に記載の方法。前記対象は、V30MTTR遺伝子を含むヒトである、請求項3に記載の方法。前記dsRNAは、AD-18324である、請求項3に記載の方法。TTRの発現が、網膜色素上皮RPEにおいて低下される、請求項3に記載の方法。TTRmRNAの発現が、対照と比較して、少なくとも40または少なくとも60低下される、請求項3に記載の方法。投与が、IL-6またはTNF-αレベルによって測定された場合、炎症反応をもたらさない、請求項3に記載の方法。前記対象は、ダークアグーチDarkAgoutiDAラットである、請求項1に記載の方法。前記dsRNAは、AD-18534である、請求項10に記載の方法。TTRの発現が、網膜色素上皮RPEにおいて低下される、請求項10に記載の方法。TTRmRNAの発現が、対照と比較して、少なくとも60低下される、請求項10に記載の方法。投与が、IL-6またはTNF-αレベルによって測定された場合、炎症反応をもたらさない、請求項10に記載の方法。前記対象は、ヒトATTRのV30M遺伝子を有するトランスジェニックラットである、請求項1に記載の方法。前記dsRNAは、AD-18324である、請求項15に記載の方法。TTRの発現が、網膜色素上皮RPEにおいて低下される、請求項15に記載の方法。TTRmRNAの発現が、対照と比較して、少なくとも60低下される、請求項15に記載の方法。投与が、IL-6またはTNF-αレベルによって測定された場合、炎症反応をもたらさない、請求項15に記載の方法。TTR関連眼アミロイドーシスの治療、予防、または管理する方法であって、そのような治療、予防、または管理を必要とする患者に、治療上または予防上有効量のAD-18324を、前記患者の網膜に投与することを含む、方法。TTR関連眼アミロイドーシスに罹患している、またはTTR関連眼アミロイドーシスを発症する危険性があると診断されたヒトを同定することと、前記ヒトに、治療上もしくは予防上有効量のAD-18324を前記ヒトの網膜に投与することと、を含む、ヒトを治療する方法。網膜上皮細胞におけるTTRの発現を阻害するための方法であって、aAD-18324またはAD-18534であるdsRNAを、前記網膜上皮細胞に導入すること、およびbステップaで産生された細胞を、TTR遺伝子のmRNA転写物の分解を得るために十分な時間維持し、それによって、前記細胞内の前記TTR遺伝子の発現を阻害することを含む、方法。前記dsRNAは、AD-18324である、請求項22に記載の方法。前記網膜上皮細胞は、ヒト網膜色素上皮トランスジェニック細胞である、請求項22に記載の方法。TTRの発現が、少なくとも10、40、または少なくとも60阻害される、請求項22に記載の方法。前記dsRNAの導入が、IL-6またはTNF-αレベルによって測定された場合、炎症反応をもたらさない、請求項22に記載の方法。本発明は、十分な量の二本鎖リボ核酸dsRNAを対象の網膜に投与することによって、対象の網膜色素上皮RPEにおけるトランスチレチンTTRの発現を低下させるための方法を提供する。幾つかの実施形態において、dsRNAは、AD-18324またはAD-18534である。dsRNAは、例えば、コレステロールにコンジュゲートconjugateさせることができる。一実施形態において、対象は、ヒトである。別の実施形態において、対象は、TTR関連眼アミロイドーシスの治療を必要とするヒトである。また別の実施形態において、dsRNAは、AD-18324である。関連実施形態において、本方法は、RPEにおけるTTRの発現の低下をもたらす。別の関連実施形態において、本方法は、対照と比較して少なくとも40または少なくとも60の、TTRのmRNA発現の低下をもたらす。他の実施形態において、dsRNAの投与は、ヒトにおいて、IL-6またはTNF-αレベルによって測定される場合、炎症反応をもたらさない。別の実施形態において、対象は、TTR関連眼アミロイドーシスの治療を必要とするATTRアミロイド生成性トランスチレチンのV30M遺伝子を有するヒトである。一実施形態において、ATTRのV30M対象に投与されるdsRNAは、AD-18324である。関連実施形態において、本方法は、網膜色素上皮におけるV30MのTTRの発現の低下をもたらす。別の実施形態において、本方法は、対照と比較して、少なくとも60のV30MのTTRのmRNAの発現の低下をもたらす。他の実施形態において、dsRNAの投与は、ATTRのV30M遺伝子を有するヒトにおいて、IL-6またはTNF-αレベルによって測定される炎症反応をもたらさない。別の実施形態において、対象は、ダークアグーチDarkAgoutiDAラットである。一実施形態において、DAラットに投与されるdsRNAは、AD-18534である。別の実施形態において、本方法は、網膜色素上皮におけるTTRの発現の低下をもたらす。また別の実施形態において、本方法は、対照と比較して、少なくとも60のTTRのmRNAの発現の低下をもたらす。別の実施形態において、dsRNAの投与は、DAラットにおいて、IL-6またはTNF-αレベルによって測定される炎症反応をもたらさない。幾つかの実施形態において、対象は、ヒトATTRアミロイド生成性トランスチレチンのV30M遺伝子を有するトランスジェニックラットである。一実施形態において、ATTRのV30Mトランスジェニックラットに投与されるdsRNAは、AD-18324である。関連実施形態において、本方法は、網膜色素上皮におけるTTRの発現の低下をもたらす。別の実施形態において、本方法は、対照と比較して、少なくとも60のTTRのmRNAの発現の低下をもたらす。他の実施形態において、dsRNAの投与は、ATTRV30MTgラットにおいて、IL-6またはTNF-αレベルによって測定される場合、炎症反応をもたらさない。一実施形態において、本発明は、TTR関連眼アミロイドーシスを治療、予防、または管理を必要とする患者に、治療上または予防上有効量のAD-18324を、該患者の網膜に投与することによって、TTR関連眼アミロイドーシスを治療、予防、または管理するための方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、ヒトを治療する方法を提供し、本方法は、TTR関連眼アミロイドーシスに罹患している、またはTTR関連眼アミロイドーシスを発症する危険性があると診断されるヒトを同定することと、該ヒトに、治療上もしくは予防上有効量のAD-18324を該ヒトの網膜に投与することと、を含む。関連実施形態において、本発明は、網膜上皮細胞内のTTRの発現を阻害するための方法を含み、本方法は、aAD-18324またはAD-18534であるdsRNAを該網膜上皮細胞に導入することと、bステップaにおいて産生された該細胞を、TTR遺伝子のmRNA転写物の分解を得るために十分な時間維持し、それによって、該細胞内の該TTR遺伝子の発現を阻害することと、を含む。一実施形態において、本方法において投与されるdsRNAは、AD-18324である。幾つかの実施形態において、網膜上皮細胞は、ヒト網膜色素上皮トランスジェニック細胞である。別の実施形態において、本方法は、少なくとも10、40、または少なくとも60のTTRの発現の阻害をもたらす。関連実施形態において、該網膜上皮細胞への該dsRNAの導入は、IL-6またはTNF-αレベルによって測定される場合、炎症反応をもたらさない。本発明の1つ以上の実施形態の詳細は、以下の説明に説明される。本発明の他の特長、目的、利点は、説明および図面から、および特許請求の範囲から明らかとなる。発明の詳細な説明本発明は、dsRNA、およびdsRNAがTTR遺伝子を標的とする、細胞または哺乳動物における、TTR遺伝子の発現を阻害するためのdsRNAを使用する方法を提供する。本発明はまた、TTR遺伝子の発現によって引き起こされる、哺乳動物における、TTRアミロイドーシス等の病態および疾患を治療するための、組成物および方法も提供する。dsRNAは、RNA干渉RNAiとして知られる過程を通じてmRNAの配列に特異的な分解を導く。本明細書で取り上げられる組成物のdsRNAは、30ヌクレオチド長未満、一般に、19~24ヌクレオチド長である、領域を有するRNA鎖アンチセンス鎖を含み、TTR遺伝子のmRNA転写物の少なくとも一部に実質的に相補的である。これらのdsRNAの使用は、哺乳動物における、TTRの発現に関連する病理学に関係している遺伝子のmRNAの標的化分解を可能にする。特に、TTRのdsRNAの非常に低い投薬量は、特異的かつ効率的にRNAiを媒介することができ、TTR遺伝子の発現の著しい阻害をもたらす。細胞に基づくアッセイを用いて、本発明者は、TTRを標的とするdsRNAが、RNAiを特異的かつ効率的に媒介することができ、TTR遺伝子の発現の著しい阻害をもたらす事を実証した。したがって、これらのdsRNAを含む方法および組成物は、肝臓疾患またはTTRアミロイドーシス、例えば、FAPの治療において等、TTRを下方調節することによって媒介され得る病理過程を治療するのに有用である。TTRのdsRNAを含有する方法および組成物は、TTRアミロイドーシス等のTTRの発現によって媒介される病理過程を治療するのに有用である。1つの実施形態において、TTRの発現によって媒介される障害を治療する方法には、TTRを標的とした、治療上有効な量のdsRNAを、かかる処置を必要とするヒトに投与することが含まれる。1つの実施形態において、dsRNAは、約0.01、0.1、0.5、1.0、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25mg/kgで、ヒトに投与される。以下の詳細な説明は、TTR遺伝子の発現を阻害するための、dsRNAを含有する組成物の作製方法および使用方法、ならびにこの遺伝子の発現によって引き起こされる疾患および障害を治療するための、組成物および方法を開示する。本発明で取り上げられる医薬組成物は、薬剤として許容される担体と共に、30ヌクレオチド長未満、一般に19~24ヌクレオチド長であり、TTR遺伝子のRNA転写物の少なくとも一部に実質的に相補的である、相補性の領域を含むアンチセンス鎖を有するdsRNAを含む。また、本発明で取り上げられる医薬組成物は、30ヌクレオチド長未満、一般に19~24ヌクレオチド長であり、TTR遺伝子のRNA転写物の少なくとも一部に実質的に相補的である、相補性の領域を有するアンチセンス鎖を有するdsRNAも含む。dsRNAのセンス鎖は、本明細書に開示されるセンス鎖のいずれかの15、16、17、18、19、20、21個、またはそれ以上の連続するヌクレオチドを含むことができる。dsRNAのアンチセンス鎖は、本明細書に開示されるアンチセンス鎖のいずれかの15、16、17、18、19、20、21個、またはそれ以上の連続するヌクレオチドを含むことができる。1つの実施形態において、dsRNAは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個、またはそれ以上の修飾ヌクレオチドを含むことができる。1つの実施形態において、修飾ヌクレオチドは、2′-O-メチル修飾ヌクレオチド、5′-ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、および/またはコレステリル誘導体基またはドデカン酸ビスデシルアミド基に結合される末端ヌクレオチドを含むことができる。1つの実施形態において、修飾ヌクレオチドは、2′-デオキシ-2′-フルオロ修飾ヌクレオチド、2′-デオキシ-修飾ヌクレオチド、ロックされたヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、2′-アミノ-修飾ヌクレオチド、2′-アルキル-修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデート、および/またはヌクレオチドを有する非天然塩基を含むことができる。1つの実施形態において、dsRNAの該相補性の領域は、少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21個、またはそれ以上のヌクレオチド長である。1つの実施形態において、該相補性の領域は、配列番号169の10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21個、またはそれ以上の連続するヌクレオチドを含む。1つの実施形態において、dsRNAのそれぞれの鎖は、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30個、またはそれ以上のヌクレオチド長である。1つの実施形態において、該dsRNAは、表3A、3B、4、6A、6B、7、および16から選択される、センス鎖、または10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、もしくは21個のそのヌクレオチドフラグメント、ならびに表3A、3B、4、6A、6B、7、および16から選択される、アンチセンス鎖、または10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、もしくは21個のそのヌクレオチドフラグメントを含む。1つの実施形態において、細胞へのdsRNAの投与は、リアルタイムPCRアッセイによって測定した場合、TTRのmRNAの発現の約40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、95もしくはそれ以上の阻害をもたらす。1つの実施形態において、細胞へのdsRNAの投与は、リアルタイムPCRアッセイによって測定した場合、TTRのmRNAの発現の約40~45、45~50、50~55、55~60、60~65、65~70、70~75、75~80、80~85、85~90、90~95、もしくはそれ以上の阻害をもたらす。1つの実施形態において、細胞へのdsRNAの投与は、分岐DNAアッセイによって測定した場合、TTRのmRNAの発現の約40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、95、もしくはそれ以上の阻害をもたらす。1つの実施形態において、細胞へのdsRNAの投与は、分岐DNAアッセイによって測定した場合、TTRのmRNAの発現の約40~45、45~50、50~55、55~60、60~65、65~70、70~75、75~80、80~85、85~90、90~95、もしくはそれ以上の阻害をもたらす。1つの実施形態において、dsRNAは、0.01pM、0.1pM、1pM、5pM、10pM、100pM、または1000pM未満のIC50を有する。1つの実施形態において、dsRNAは、約0.01、0.1、1、5、または10mg/kgのED50を有する。1つの実施形態において、dsRNAの投与は、カニクイザルにおける、TTRのmRNAを約40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、95、またはそれ以上低下させることができる。1つの実施形態において、dsRNAの投与は、肝臓TTRのmRNAレベルを、約40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、95、もしくはそれ以上、または血清TTRのタンパク質レベルを、約40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、95、もしくはそれ以上低下させる。1つの実施形態において、dsRNAの投与は、肝臓TTRのmRNAレベル、および/または血清TTRのタンパク質レベルを最長1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25日、もしくはそれ以上の日数、低下させる。1つの実施形態において、dsRNAは、LNP製剤に製剤化され、PBC対照群と比較して、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、もしくは1mg/kgの用量で、TTRのmRNAレベルを、約40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、95、もしくはそれ以上低下させる。1つの実施形態において、dsRNAは、LNP製剤に製剤化され、ウエスタンブロットによって測定した場合、PBC対照群と比較して、TTRのタンパク質レベルを、約40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、95、もしくはそれ以上低下させる。1つの実施形態において、dsRNAは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25mg/kgで、それを必要とする対象に投与する時、処置してから最長1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、もしくは25日目まで、血清TTRのタンパク質レベルを抑制する。したがって、幾つかの態様において、TTRのdsRNAおよび薬剤として許容される担体を含有する医薬組成物、TTR遺伝子の発現を阻害するために組成物を使用する方法、およびTTR遺伝子の発現によって引き起こされる疾患を治療するために医薬組成物を使用する方法が、本発明で取り上げられる。I.定義便宜上、本明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲で使用される、特定の用語および語句の意味を以下に提供する。本明細書の他の部分の用語の用法と、本項で提供されるその定義との間に明らかな相違がある場合、本項の定義が優先される。G、C、A、およびUのそれぞれは、一般に、塩基としてそれぞれグアニン、シトシン、アデニン、およびウラシルを含有するヌクレオチドを表す。TおよびdTは、本明細書で交換可能に使用され、核酸塩基がチミン、例えば、デオキシリボチミンdeoxyribothymineである、デオキシリボヌクレオチドを指す。しかしながら、リボヌクレオチドまたはヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドという用語は、以下でさらに詳述する修飾ヌクレオチド、または代替の置換部分も指すことができることが理解されよう。当業者は、グアニン、シトシン、アデニン、およびウラシルが、かかる置換部分を担持するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対形成性を実質的に変化させることなく、他の部分によって置換可能であることを十分認識している。例えば、限定されないが、その塩基としてイノシンを含むヌクレオチドは、アデニン、シトシン、またはウラシルを含有するヌクレオチドと塩基対を形成することができる。したがって、ウラシル、グアニン、またはアデニンを含有するヌクレオチドは、本発明のヌクレオチド配列において、例えば、イノシンを含有するヌクレオチドと置換され得る。かかる置換部分を含む配列は、本発明の実施形態である。本明細書で使用される、トランスチレチンTTRとは、細胞内の遺伝子を指す。TTRはまた、ATTR、HsT2651、PALB、プレアルブミン、TBPA、およびトランスチレチンプレアルブミン、アミロイドーシスI型としても知られている。ヒトTTRのmRNA転写物の配列は、NM_000371で見出され得る。マウスTTRのmRNAの配列は、NM_013697.2で見出され得、ラットTTRのmRNA配列は、NM_012681.1で見出され得る。本明細書で使用される、標的配列は、一次転写産物のRNAプロセシングの産物であるmRNAを含む、TTR遺伝子の転写の間に形成される、mRNA分子のヌクレオチド配列の連続する部分を指す。本明細書で使用される、配列を含む鎖という用語は、標準的なヌクレオチド命名法を使用して言及される配列によって説明される、ヌクレオチド鎖を含む、オリゴヌクレオチドを指す。本明細書で使用される場合、別途記載のない限り、第2のヌクレオチド配列に関連して第1のヌクレオチド配列を説明するために使用される時の相補的という用語は、当業者には理解されるように、特定の条件下で、第2のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドとハイブリダイズして二重鎖構造を形成する、第1のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドの能力を指す。かかる条件は、例えば、ストリンジェントな条件であり得、ストリンジェントな条件は、400mMNaCl、40mMPIPESpH6.4、1mMEDTA、12~16時間50°Cもしくは70°C、その後の洗浄を含み得る。生物内で遭遇され得る、生理的に適切な条件等の他の条件を適用することができる。当業者は、ハイブリダイズされたヌクレオチドの最終的な用途に応じて、2つの配列の相補性の試験に最も適切な、一連の条件を決定することができよう。これには、第1および第2のヌクレオチド配列の全長にわたる、第2のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドに対する、第1のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドの塩基対形成が含まれる。かかる配列は、本明細書において、互いに対して完全に相補的と呼ぶことができる。しかし、本明細書において、第1の配列が第2の配列に対して実質的に相補的であると言われる場合、2つの配列は完全に相補的であり得るか、あるいはそれらの最終的な用途に最も適した条件下でハイブリダイズする能力を保持しながら、ハイブリダイズ時に、1個以上であるが、一般に4、3、または2個を超えないミスマッチ塩基対を形成してもよい。しかし、2つのオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズ時に1つ以上の単鎖のオーバーハングを形成するように設計される場合、かかるオーバーハングは、相補性の決定に関してミスマッチとは見なされないものとする。例えば、21ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドと、23ヌクレオチド長の別のオリゴヌクレオチドとを含むdsRNAであって、より長いオリゴヌクレオチドが、より短いオリゴヌクレオチドに完全に相補的である21ヌクレオチドの配列を含むdsRNAは、本明細書に記載の目的上、やはり完全に相補的であるとして言及され得る。また、本明細書で使用される、相補的な配列は、それらのハイブリダイズ能に関する上記の要件が満たされる限り、非ワトソンクリック塩基対、および/または非天然および修飾ヌクレオチドから形成される塩基対を含み得るか、または完全にそれらから形成され得る。かかる非ワトソンクリック塩基対には、G-UゆらぎWobbleまたはフーグスティーンHoogstein型塩基対が含まれるが、これらに限定されない。本明細書における相補的、完全に相補的、および実質的に相補的という用語は、これらが使用される文脈から理解されるように、dsRNAのセンス鎖とアンチセンス鎖との間、またはdsRNAのアンチセンス鎖と標的配列との間の塩基一致に対して使用され得る。本明細書で使用される、メッセンジャーRNAmRNAの少なくとも一部に実質的に相補的であるポリヌクレオチドは、5′UTR、オープンリーディングフレームORF、または3′UTRを含む、目的のmRNA例えば、TTRをコードするmRNAの連続する部分に実質的に相補的である、ポリヌクレオチドを指す。例えば、ポリヌクレオチドは、配列が、TTRをコードするmRNAの中断されていない部分に実質的に相補的である場合、TTRのmRNAの少なくとも一部に相補的である。本明細書で使用される、二本鎖RNAまたはdsRNAという用語は、2つの逆平行な、上記で定義されるように実質的に相補的な核酸鎖を含む二重鎖構造を有する、リボ核酸分子の複合体を指す。一般に、各鎖のヌクレオチドの大半はリボヌクレオチドであるが、本明細書で詳細に説明されるように、それぞれもしくは両方の鎖は、少なくとも1個の非リボヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチドおよび/または修飾ヌクレオチドも含み得る。加えて、本明細書で使用されるdsRNAは、複数のヌクレオチドでの大幅な修飾を含み、本明細書で開示されるか、または当該技術分野において既知であるあらゆる種類の修飾を含む、リボヌクレオチドへの化学修飾を含み得る。siRNA型分子内で使用される、このようないずれの修飾も、本明細書および特許請求の範囲の目的上、dsRNAによって包含される。二重鎖構造を形成する2本の鎖は、より長い1つのRNA分子の異なる部分であってもよく、あるいはそれらは別個のRNA分子であってもよい。2本の鎖がより長い1つの分子の一部であり、したがって二重鎖構造を形成する1本の鎖の3′末端とそれぞれのもう一方の鎖の5′末端との間の中断されていないヌクレオチド鎖によって接続される場合、接続するRNA鎖は、ヘアピンループと称される。2本の鎖が、二重鎖構造を形成する1本の鎖の3′末端とそれぞれのもう一方の鎖の5′末端との間の、中断されていないヌクレオチド鎖以外の手段によって共有結合的に接続される場合、該接続構造は、リンカーと称される。該RNA鎖は、同一または異なる数のヌクレオチドを有し得る。塩基対の最大数は、二重鎖内に存在するいずれかのオーバーハングを差し引いた、dsRNAの最も短い鎖内のヌクレオチド数である。二重鎖構造に加えて、dsRNAは、1つ以上のヌクレオチドオーバーハングを含み得る。また、siRNAという用語は、上に記載の通り、dsRNAを指すように本明細書に使用される。本明細書で使用される、ヌクレオチドオーバーハングとは、不対ヌクレオチド、またはdsRNAの1本の鎖の3′末端がもう一方の鎖の5′末端を越えて延びるか、またはその逆である時に、dsRNAの二重鎖構造から突出するヌクレオチドを指す。平滑または平滑末端は、dsRNAのその末端に不対ヌクレオチドがない、すなわち、ヌクレオチドオーバーハングがないことを意味する。平滑末端のdsRNAは、その長さ全体にわたって二本鎖であるdsRNAであり、すなわち、該分子のいずれの末端にもヌクレオチドオーバーハングがない。アンチセンス鎖という用語は、標的配列に実質的に相補的である領域を含む、dsRNAの鎖を指す。本明細書で使用される、相補性の領域という用語は、配列、例えば本明細書において定義される標的配列に実質的に相補的である、アンチセンス鎖の領域を指す。相補性の領域が標的配列に完全に相補的ではない場合、該ミスマッチは、該末端領域内に最も許容され、存在する場合、一般に、末端領域内、例えば、5′および/または3′末端の6、5、4、3、もしくは2ヌクレオチド内にある。本明細書で使用される、センス鎖という用語は、アンチセンス鎖の領域に実質的に相補的である領域を含む、dsRNAの鎖を指す。本明細書で使用される、SNALPという用語は、安定な核酸脂質粒子を指す。SNALPは、dsRNA、またはdsRNAが転写されるプラスミド等の核酸を含む、少量の水性内部をコーティングする、脂質の小胞を表す。SNALPは、例えば、米国特許出願公開第20060240093号、第20070135372号、および2008年4月15日に出願の第USSN61/045,228号に説明されている。これらの出願は、参照により本明細書に組み込まれる。dsRNAについて言及する際、細胞への導入とは、当業者には理解されるように、細胞への取り込みまたは吸収を促進することを意味する。dsRNAの吸収または取り込みは、自発的な拡散過程もしくは活性な細胞過程を通じて、または補助的な薬剤もしくは装置によって発生し得る。この用語の意味は、インビトロでの細胞に限定されず、dsRNAは、生命体の一部である細胞に導入することもできる。そのような場合、細胞への導入は、該生物への送達を含む。例えば、インビボ送達については、dsRNAを組織部位に注射するか、または全身投与することができる。細胞へのインビトロでの導入には、電気穿孔法およびリポフェクション法等の当該技術分野において既知の方法が含まれる。さらなるアプローチは、本明細書に説明されているか、または当該技術分野において既知である。発現停止させるsilence、~の発現を阻害する、~の発現を下方制御する、および~の発現を抑制する等の用語は、それらがTTR遺伝子について言及する限り、本明細書において、第1の細胞もしくは細胞群と実質的に同一であるが、TTR遺伝子の発現が阻害されるように処置されていない第2の細胞もしくは細胞群対照細胞と比較して、TTR遺伝子が転写され、TTR遺伝子の発現が阻害されるように処置された第1の細胞もしくは細胞群から単離され得るmRNAの量の低下によって表した場合、TTR遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制を指す。阻害の程度は、通常、以下で表される。[{対象細胞中のmRNA-処理細胞中のmRNA}/対象細胞中のmRNA]100代替として、阻害の程度は、TTR遺伝子の発現に機能的に結び付けられるパラメータ、例えば細胞によって分泌されるTTR遺伝子によってコードされるタンパク質の量、または特定の表現型、例えばアポトーシスを提示する細胞の数の低下に関して与えられてもよい。原則的に、TTR遺伝子の発現停止は、構成的に、またはゲノム工学によってのいずれか、ならびに任意の適切なアッセイによって、該標的を発現する任意の細胞において決定することができる。しかし、あるdsRNAが特定の程度、TTR遺伝子の発現を阻害し、したがって本発明に包含されるかどうかを決定するために参照が必要とされる場合、以下の実施例で提供されるアッセイが、かかる参照の役割を果たす。例えば、特定の場合において、TTR遺伝子の発現は、本発明で取り上げられる二本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって、少なくとも約5、10、15、20、25、30、35、40、45、または50抑制される。幾つかの実施形態において、TTR遺伝子は、本発明で取り上げられる二本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって、少なくとも約60、70、または80抑制される。幾つかの実施形態において、TTR遺伝子は、本発明で取り上げられる二本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって、少なくとも約85、90、または95抑制される。TTRの発現の文脈において本明細書で使用される、治療する、治療等の用語は、TTRの発現によって媒介される病理過程の軽減または緩和を指す。本発明の文脈において、本明細書で以下に列挙される他の病態のうちのいずれかに関連する限りTTRの発現によって媒介される病理過程以外、治療する、治療等の用語は、かかる病態に関連する少なくとも1つの症状の軽減もしくは緩和、またはFAP等のTTRアミロイドーシスの進行の遅延等の、かかる病態の進行の遅延もしくは逆行を意味する。TTRアミロイドーシスの症状には、神経障害例えば、知覚障害、遠位部の感覚鈍麻、自律性神経障害例えば、胃潰瘍または起立性低血圧症等の胃腸障害、運動神経障害、発作、認知症、ミエロパシー、多発性神経障害、手根管症候群、自律神経不全症、心筋症、硝子体混濁、腎不全、腎症、実質的に減少したmBMI修正ボディーマスインデックス、脳神経障害、および角膜格子状変性が含まれる。本明細書で使用される、治療上有効な量および予防上有効な量という句は、TTRの発現によって媒介される病理過程の処置、阻止、もしくは管理、またはTTRの発現によって媒介される病理過程の明らかな症状において、治療的有用性を提供する量を指す。治療上有効である具体的な量は、普通の開業医が容易に決定することができ、例えば、TTRの発現によって媒介される病理過程の種類、患者の病歴および年齢、TTRの発現によって媒介される病理過程のステージ、ならびに他のTTRの発現によって媒介される病理過程に抗する薬剤の投与等の、当該技術分野において既知の因子に依存して異なり得る。本明細書で使用される、医薬組成物は、薬理学上有効な量のdsRNAと、薬剤として許容される担体とを含む。本明細書で使用される、薬理学上有効な量、治療上有効な量、または単に有効量は、目的とする薬理学的、治療的、または阻止的結果を産生するのに効果的なRNAの量を指す。例えば、ある臨床的治療が、疾患または障害に関連する測定可能なパラメータにおいて、少なくとも25の低下がある時に有効であると見なされる場合、該疾患または障害を治療するための薬物の治療上有効な量は、該パラメータにおける少なくとも25の低下をもたらすために必要な量である。例えば、TTRを標的とするdsRNAの治療上有効な量は、TTRの血清レベルを少なくとも25低下させることができる。別の例において、TTRを標的とするdsRNAの治療上有効な量は、肝機能または腎機能を少なくとも25向上させることができる。薬剤として許容される担体という用語は、治療薬を投与するための担体を指す。かかる担体には、生理食塩水、緩衝食塩水、ブドウ糖、水、グリセロール、エタノール、およびこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。該用語は、明確に、細胞培養基を除く。経口投与される薬物について、薬剤として許容される担体には、不活性希釈剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、甘味剤、香味剤、着色剤、および防腐剤等の薬剤として許容される賦形剤が含まれるが、これらに限定されない。好適な不活性希釈剤には、炭酸ナトリウムおよびカルシウム、リン酸ナトリウムおよびカルシウム、ならびにラクトースが含まれ、コーンスターチおよびアルギン酸が好適な崩壊剤である。結合剤にはデンプンおよびゼラチンを含むことができ、一方滑沢剤が存在する場合は、概してステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルクであろう。所望の場合、錠剤をモノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリル等の材料でコーティングして、消化管内での吸収を遅らせることができる。本明細書で使用される、形質転換細胞は、ベクターが導入されて、そこからdsRNA分子を発現することができる細胞である。II.二本鎖リボ核酸dsRNA本明細書でより詳細に記載されるように、本発明は、細胞または哺乳動物内、例えば、アミロイドーシスに罹患しているヒトのTTR遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸dsRNA分子を提供し、該dsRNAは、TTR遺伝子の発現において形成されるmRNAの少なくとも一部に相補的である相補性の領域を有する、アンチセンス鎖を含み、該相補性の領域は、30ヌクレオチド長未満、一般に19~24ヌクレオチド長であり、該dsRNAは、該TTR遺伝子を発現する細胞と接触すると、例えば、PCRまたは分枝DNAbDNAベースの方法によって、またはウエスタンブロット等によるタンパク質ベースの方法によってアッセイした場合、該TTR遺伝子の発現を少なくとも30阻害する。TTR遺伝子の発現は、以下の実施例で説明されるようにアッセイによって測定したとき、少なくとも30軽減され得る。例えば、Hep3B細胞等の細胞培養内のTTR遺伝子の発現は、bDNAまたはTaqManアッセイ等によってTTRのmRNAレベルを測定することによって、またはELISAアッセイ等によってタンパク質レベルを測定することによってアッセイされ得る。本発明のdsRNAは、1以上の単鎖ヌクレオチドオーバーハングをさらに含み得る。該dsRNAは、以下でさらに説明されるように、当該技術分野において既知の標準的な方法、例えば、Biosearch,AppliedBiosystems,Inc.から市販されるもの等の自動DNA合成装置の使用によって、合成することができる。該dsRNAは、ハイブリダイズして二重鎖構造を形成するのに十分相補的である、2本のRNA鎖を含む。該dsRNAの1本の鎖アンチセンス鎖は、TTR遺伝子の発現の間に形成されたmRNAの配列から派生した標的配列に実質的に相補的であり、一般に完全に相補的である、相補性の領域を含み、もう一方の鎖センス鎖は、アンチセンス鎖に相補的である領域を含み、その結果、2本の鎖は、好適な条件下で組み合わされると、ハイブリダイズして二重鎖構造を形成する。一般に、二重鎖構造は、15~30、または25~30、または18~25、または19~24、または19~21、または19、20もしくは21塩基対長である。一実施形態において、二重鎖は19塩基対長である。別の実施形態において、二重鎖は21塩基対長である。2本の異なるsiRNAを組み合わせて使用する場合、二重鎖の長さは同一であってもよく、または異なってもよい。本発明のdsRNAのそれぞれの鎖は、一般に15~30、または18~25、または18、19、20、21、22、23、24、もしくは25ヌクレオチド長である。他の実施形態において、それぞれの鎖は25~30ヌクレオチド長である。二重鎖のそれぞれの鎖は、同一長さであってもよく、または異なる長さであってもよい。2本の異なるsiRNAを組み合わせて使用する場合、各siRNAのそれぞれの鎖の長さは、同一であってもよく、または異なってもよい。本発明のdsRNAは、1個以上のヌクレオチドの1つ以上の単鎖のオーバーハングを含むことができる。一実施形態において、該dsRNAの少なくとも一端は、1~4、一般には1または2個のヌクレオチドの、単鎖のヌクレオチドオーバーハングを有する。別の実施形態において、該dsRNAのアンチセンス鎖は、センス鎖の3′末端および5′末端のそれぞれに、1~10個のヌクレオチドのオーバーハングを有する。さらなる実施形態において、該dsRNAのセンス鎖は、アンチセンス鎖の3′末端および5′末端のそれぞれに、1~10個のヌクレオチドのオーバーハングを有する。少なくとも1つのヌクレオチドオーバーハングを有するdsRNAは、平滑末端の対応物より予想外に優れた阻害特性を有し得る。幾つかの実施形態において、1つのみのヌクレオチドオーバーハングの存在により、その全体的な安定性に影響を及ぼすことなく、dsRNAの干渉活性が強化される。1つのみのオーバーハングを有するdsRNAは、インビボ、ならびに種々の細胞、細胞培養基、血液、および血清内で特に安定および効果的であることが判明している。一般に、単鎖のオーバーハングは、アンチセンス鎖の3′末端、または代替として、センス鎖の3′末端に位置する。該dsRNAは、一般にアンチセンス鎖の5′末端に位置する、平滑末端も有し得る。かかるdsRNAは改善された安定性および阻害活性を有し得、したがって、低投薬量、すなわち、1日当たり受容者の体重1kgにつき5mg未満の投与を可能にする。一般に、該dsRNAのアンチセンス鎖は、3′末端にヌクレオチドオーバーハングを有し、5′末端は平滑である。別の実施形態において、オーバーハング内のヌクレオチドのうちの1つ以上が、ヌクレオシドチオリン酸と置換される。一実施形態において、TTR遺伝子はヒトTTR遺伝子である。特定の実施形態において、該dsRNAのセンス鎖は、表3A、3B、4、6A、6B、または7からのセンス配列のうちの1つであり、該アンチセンス鎖は、表3A、3B、4、6A、6B、または7からのセンス配列のうちの1つである。表3A、3B、4、6A、6B、または7に提供される標的配列のいずれかの箇所を標的とする代替のアンチセンス剤を、標的配列および隣接するTTR配列を使用して、容易に決定することができる。当業者は、20~23個だが、特に21個の塩基対の二重鎖構造を有するdsRNAが、RNA干渉の誘発に特に効果的であると認められていることをよく認識しているElbashiretal.,EMBO2001,20:6877-6888。しかし、他方、より短いもしくはより長いdsRNAが、同様に効果的であり得ることを見出している。上記の実施形態において、表3A、3B、4、6A、6B、または7に提供されるオリゴヌクレオチド配列の性質のために、本発明で取り上げられるdsRNAは、本明細書に記載の長さの少なくとも1本の鎖を含むことができる。一端または両端のわずかな数のヌクレオチドを差し引いた、表3A、3B、4、6A、6B、または7の配列のうちの1つを有するより短いdsRNAが、上記のdsRNAと比較して、同様に効果的であり得ることは、妥当に予想され得る。したがって、表3、4、6、または7の配列のうちの1つからの、少なくとも15、16、17、18、19、20個、またはそれ以上の連続するヌクレオチドの部分的配列を有するdsRNAは、本明細書で以下に記載されるアッセイにおいて、TTR遺伝子の発現を阻害するそれらの能力が、完全な配列を含むdsRNAと阻害の5、10、15、20、25、もしくは30以下の異なるdsRNAが、本発明によって意図される。さらに、所望のTTR標的配列内で切断するdsRNAを、対応するTTRアンチセンス配列および相補的なセンス配列を用いて容易に作製することができる。加えて、表3A、3B、4、6A、6B、または7に提供されるdsRNAは、RNAiに基づく切断の影響を受けやすい、TTR内の部位を同定する。したがって、本発明は、本発明の薬剤のうちの1つによって標的とされる配列内を標的とする、dsRNAをさらに特徴とする。本明細書で使用される、第2のdsRNAは、第2のdsRNAが、第1のdsRNAのアンチセンス鎖に相補的であるmRNA内のいずれかの箇所でメッセージを切断する場合、第1のdsRNAの配列内を標的とすると言われる。かかる第2のdsRNAは、一般に、TTR遺伝子内の選択した配列に隣接する領域から取られたさらなるヌクレオチド配列に連結される、表3A、3B、4、6A、6B、または7に提供される配列のうちの1つからの少なくとも15個の連続するヌクレオチドからなる。RNA標的の切断は、ゲル電気泳動、および必要であれば、当該技術分野において既知の関連する核酸ハイブリダイゼーション技法によって、日常的に検出することができる。dsRNAの標的mRNAにおける切断部位は、一般に、当業者に既知の方法、例えば、Soutscheketal.,Nature;2004,Vol.432,pp.173-178に記載の5′-RACE法全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれるを用いて決定することができる。1つの実施形態において、Soutschekらによって記載の5′-RACE法を用いて、ALN-18328が、配列番号1331NM_000371.3の636位のグアニンヌクレオチドと配列番号1331の637位のアデニンヌクレオチドとの間で、TTRのmRNAを切断することが確認された。1つの実施形態において、ALN-18328が、配列番号1331の637位のアデニンヌクレオチドと配列番号1331の638位のグアニンヌクレオチドとの間で、TTRのmRNAを切断しないことが確認された。本発明で取り上げられるdsRNAは、標的配列との1つ以上のミスマッチを含有してもよい。一実施形態において、本発明で取り上げられるdsRNAは、3つ以下のミスマッチを含有する。dsRNAのアンチセンス鎖が標的配列とのミスマッチを含有する場合、ミスマッチの範囲が、相補性の領域の中心に位置しないことが好ましい。該dsRNAのアンチセンス鎖が標的配列とのミスマッチを含有する場合、ミスマッチは、いずれかの末端から5ヌクレオチド、例えば、相補性の領域の5′もしくは3′末端のいずれかから5、4、3、2、もしくは1ヌクレオチドに制限されることが好ましい。例えば、TTR遺伝子の領域に相補的である23ヌクレオチドのdsRNA鎖について、該dsRNAは、一般には、中央の13個のヌクレオチド内にはいかなるミスマッチも含有しない。本発明内で記載される方法を使用して、標的配列とのミスマッチを含有するdsRNAが、TTR遺伝子の発現の阻害に効果的であるかどうかを判定することができる。TTR遺伝子の発現の阻害における、ミスマッチを有するdsRNAの有効性を考慮することは、特にTTR遺伝子内の特定の相補性の領域が、集団内に多型の配列多様性を有することが既知である場合、重要である。修飾また別の実施形態において、該dsRNAは、安定性を増加させるために化学修飾される。本発明で取り上げられる核酸は、Currentprotocolsinnucleicacidchemistry、Beaucage,S.L.etal.Eds.,JohnWileySons,Inc.,NewYork,NY,USAに記載されるもの等の、当該技術分野において十分確立された方法によって、合成および/または修飾することができ、該文献は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明において有用であるdsRNA化合物の具体例には、修飾された骨格を含むか、または天然のヌクレオシド間結合を含まないdsRNAが含まれる。本明細書で定義されるように、修飾された骨格を有するdsRNAには、該骨格にリン原子を保持するもの、および該骨格にリン原子を有しないものが含まれる。本明細書の目的上、また当該技術分野において時折言及されるように、それらのヌクレオシド間骨格にリン原子を有しない修飾されたdsRNAも、オリゴヌクレオシドであると見なすことができる。修飾されたdsRNA骨格には、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、3′-アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、3′-アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびに正常な3′-5′結合を有するボラノホスフェート、2′-5′結合したこれらの類似体、そしてヌクレオシド単位の隣接する対が3′-5′から5′-3′へ、または2′-5′から5′-2′へ結合する、逆向きの極性を有するものが含まれる。また、種々の塩、混合塩、および遊離酸形態も含まれる。上記のリン含有結合の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第3,687,808号、第4,469,863号、第4,476,301号、第5,023,243号、第5,177,195号、第5,188,897号、第5,264,423号、第5,276,019号、第5,278,302号、第5,286,717号、第5,321,131号、第5,399,676号、第5,405,939号、第5,453,496号、第5,455,233号、第5,466,677号、第5,476,925号、第5,519,126号、第5,536,821号、第5,541,316号、第5,550,111号、第5,563,253号、第5,571,799号、第5,587,361号、および第5,625,050号が含まれるが、これらに限定されず、当該特許のそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる。その中にリン原子を含まない、修飾されたdsRNA骨格は、単鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合されたヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または1個以上の単鎖ヘテロ原子もしくは複素環式ヌクレオシド間結合によって形成される骨格を有する。これらには、モルホリノ結合ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成された、シロキサン骨格、硫化物、スルホキシド、およびスルホン骨格、ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファミン酸骨格、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格、スルホネートおよびスルホンアミド骨格、アミド骨格、ならびにN、O、S、およびCH2を混合した構成成分を有する他のもの、を有するものが含まれる。上記オリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第5,034,506号、第5,166,315号、第5,185,444号、第5,214,134号、第5,216,141号、第5,235,033号、第5,64,562号、第5,264,564号、第5,405,938号、第5,434,257号、第5,466,677号、第5,470,967号、第5,489,677号、第5,541,307号、第5,561,225号、第5,596,086号、第5,602,240号、第5,608,046号、第5,610,289号、第5,618,704号、第5,623,070号、第5,663,312号、第5,633,360号、第5,677,437号、および第5,677,439号が含まれるが、これらに限定されず、当該特許のそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる。他の好適なdsRNA模倣体において、ヌクレオチド単位の糖およびヌクレオシド間結合の両方、すなわち、骨格が、新規の基で置換される。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とハイブリダイズするために維持される。優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているそのようなオリゴマー化合物の1つであるdsRNA模倣体は、ペプチド核酸PNAと称される。PNA化合物では、dsRNAの糖骨格が、アミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格で置換される。核酸塩基は保持され、該骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接または間接的に結合される。PNA化合物の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第5,539,082号、第5,714,331号、および第5,719,262号が含まれるが、これらに限定されず、当該特許のそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる。PNA化合物のさらなる教示は、Nielsenetal.,Science,1991,254,1497-1500に見出すことができる。本発明の他の実施形態は、ホスホロチオエート骨格を有するdsRNA、およびヘテロ原子骨格を有するオリゴヌクレオシドであり、特に上述の米国特許第5,489,677号の--CH2--NH--CH2--、--CH2--NCH3--O--CH2--[メチレンメチルイミノまたはMMI骨格として知られる]、--CH2--O--NCH3--CH2--、--CH2--NCH3--NCH3--CH2--、および--NCH3--CH2--CH2--[式中、天然のホスホジエステル骨格は、--O--P--O--CH2-として表される]、および上述の米国特許第5,602,240号のアミド骨格である。また、上述の米国特許第5,034,506号のモルホリノ骨格構造を有するdsRNAも好ましい。また、修飾されたdsRNAは、1つ以上の置換糖部分も含有することができる。好ましいdsRNAは、2′位に、OH;F;O-、S-、もしくはN-アルキル;O-、S-、もしくはN-アルケニル;O-、S-、もしくはN-アルキニル;またはO-アルキル-O-アルキルのうちの1つを含み、ここで、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換もしくは非置換のC1~C10アルキルまたはC2~C10アルケニルおよびアルキニルであり得る。O[CH2nO]mCH3、OCH2nOCH3、OCH2nNH2、OCH2nCH3、OCH2nONH2、およびOCH2nON[CH2nCH3]2が特に好ましく、式中、nおよびmは1~約10である。他の好ましいdsRNAは、2′位に、C1~C10低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、O-アルカリル、もしくはO-アラルキル、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、RNA切断基、レポーター基、介入物、dsRNAの薬物動態特性を改善するための基、またはdsRNAの薬力学的特性を改善するための基、ならびに類似した特性を有する他の置換基のうちの1つを含む。好ましい修飾には、2′-メトキシエトキシ2′-O--CH2CH2OCH3であって、2′-O-2-メトキシエチルまたは2′-MOEとしても知られるMartinetal.,Helv.Chim.Acta,1995,78,486-504すなわち、アルコキシ-アルコキシ基が含まれる。好ましいさらなる修飾には、本明細書において以下の実施例に記載される、2′-DMAOEとしても知られる、2′-ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、OCH22ONCH32基、ならびに、同様に、本明細書において以下の実施例に記載される、2′-ジメチルアミノエトキシエトキシ当該技術分野で2′-O-ジメチルアミノエトキシエチルもしくは2′-DMAEOEとしても知られる、すなわち、2′-O--CH2--O--CH2--NCH22が含まれる。他の好ましい修飾には、2′-メトキシ2′-OCH3、2′-アミノプロポキシ2′-OCH2CH2CH2NH2、および2′-フルオロ2′-Fが含まれる。同様の修飾を、dsRNAの他の位置、特に3′末端ヌクレオチドもしくは2′-5′結合dsRNA内の糖の3′位、および5′末端ヌクレオチドの5′位で作製することもできる。また、dsRNAは、ペントフラノシル糖の代わりに、シクロブチル部分等の糖模倣体を有してもよい。かかる修飾糖構造の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第4,981,957号、第5,118,800号、第5,319,080号、第5,359,044号、第5,393,878号、第5,446,137号、第5,466,786号、第5,514,785号、第5,519,134号、第5,567,811号、第5,576,427号、第5,591,722号、第5,597,909号、第5,610,300号、第5,627,053号、第5,639,873号、第5,646,265号、第5,658,873号、第5,670,633号、および第5,700,920号が含まれるが、これらに限定されず、当該特許のうちのあるものは本出願によって共同所有され、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。dsRNAは、核酸塩基当該技術分野ではしばしば単に塩基と称される修飾または置換をも含み得る。本明細書で使用される、非修飾もしくは天然の核酸塩基には、プリン塩基、アデニンAおよびグアニンG、ならびにピリミジン塩基、チミンT、シトシンC、およびウラシルUが含まれる。修飾された核酸塩基には、5-メチルシトシン5-me-C、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの6-メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの2-プロピルおよび他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミンおよび2-チオシトシン、5-ハロウラシルおよびシトシン、5-プロピニルウラシルおよびシトシン、6-アゾのウラシル、シトシンおよびチミン、5-ウラシルシュードウラシル、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシルおよび他の8-置換アデニンおよびグアニン、5-ハロ、特に5-ブロモ、5-トリフルオロメチルおよび他の5-置換ウラシルおよびシトシン、7-メチルグアニンおよび7-メチルアデニン、8-アザグアニンおよび8-アザアデニン、7-デアザグアニンおよび7-デアザアデニン、ならびに3-デアザグアニンおよび3-デアザアデニン等の、他の合成および天然の核酸塩基が含まれる。さらなる核酸塩基には、米国特許第3,687,808号で開示されるもの、TheConciseEncyclopediaOfPolymerScienceAndEngineering,pages858-859,Kroschwitz,J.L,ed.JohnWileySons,1990で開示されるもの、Englischetal.,AngewandteChemie,InternationalEdition,1991,30,613で開示されるもの、およびSanghvi,YS.,Chapter15,DsRNAResearchandApplications,pages289-302,Crooke,S.T.andLebleu,B.,Ed.,CRCPress,1993で開示されるものが含まれる。これらの核酸塩基のうちの特定のものは、本発明で取り上げられるオリゴマー化合物の結合親和性を高めるために、特に有用である。これらには、2-アミノプロピルアデニン、5-プロピニルウラシル、および5-プロピニルシトシンを含む、5-置換ピリミジン、6-アザピリミジン、ならびにN-2、N-6、およびO-6置換プリンが含まれる。5-メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性を0.6~1.2°C増加させることが示されていてSanghvi,Y.S.,Crooke,S.T.andLebleu,B.,Eds.,DsRNAResearchandApplications,CRCPress,BocaRaton,1993,pp.276-278、例示的な塩基置換であり、2′-O-メトキシエチル糖修飾と組み合わされると、さらに特に好ましい。上記の修飾された核酸塩基の特定のもの、ならびに他の修飾された核酸塩基の調製を教示する代表的な米国特許には、上記の米国特許第3,687,808号、ならびに米国特許第4,845,205号、第5,130,30号、第5,134,066号、第5,175,273号、第5,367,066号、第5,432,272号、第5,457,187号、第5,459,255号、第5,484,908号、第5,502,177号、第5,525,711号、第5,552,540号、第5,587,469号、第5,594,121号、第5,596,091号、第5,614,617号、および第5,681,941号が含まれるが、これらに限定されず、当該特許のそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれ、米国特許第5,750,692号も、参照により本明細書に組み込まれる。コンジュゲートconjugate本発明のdsRNAの別の修飾は、該dsRNAの活性、細胞分布、または細胞取り込みを亢進させる、1つ以上の部分またはコンジュゲートの該dsRNAへの化学的結合を含む。かかる部分には、コレステロール部分Letsingeretal.,Proc.Natl.Acid.Sci.USA,1989,86:6553-6556、コール酸Manoharanetal.,Biorg.Med.Chem.Let.,1994,4:1053-1060、チオエーテル、例えば、ベリル-S-トリチルチオールManoharanetal.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660:306-309、Manoharanetal.,Biorg.Med.Chem.Let.,1993,3:2765-2770、チオコレステロールOberhauseretal.,Nucl.AcidsRes.,1992,20:533-538、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基Saison-Behmoarasetal.,EMBOJ,1991,10:1111-1118、Kabanovetal.,FEBSLett.,1990,259:327-330、Svinarchuketal.,Biochimie,1993,75:49-54、リン脂質、例えば、ジ-ヘキサデシル-rac-グリセロールもしくはトリエチル-アンモニウム1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-HホスホネートManoharanetal.,TetrahedronLett.,1995,36:3651-3654、Sheaetal.,Nucl.AcidsRes.,1990,18:3777-3783、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖Manoharanetal.,NucleosidesNucleotides,1995,14:969-973、またはアダマンタン酢酸Manoharanetal.,TetrahedronLett.,1995,36:3651-3654、パルミチル部分Mishraetal.,Biochim.Biophys.Acta,1995,1264:229-237、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ-カルボニルオキシコレステロール部分Crookeetal.,J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277:923-937等の脂質部分が含まれるが、これらに限定されない。かかるdsRNAコンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第4,828,979号、第4,948,882号、第5,218,105号、第5,525,465号、第5,541,313号、第5,545,730号、第5,552,538号、第5,578,717号、第5,580,731号、第5,591,584号、第5,109,124号、第5,118,802号、第5,138,045号、第5,414,077号、第5,486,603号、第5,512,439号、第5,578,718号、第5,608,046号、第4,587,044号、第4,605,735号、第4,667,025号、第4,762,779号、第4,789,737号、第4,824,941号、第4,835,263号、第4,876,335号、第4,904,582号、第4,958,013号、第5,082,830号、第5,112,963号、第5,214,136号、第5,082,830号、第5,112,963号、第5,214,136号、第5,245,022号、第5,254,469号、第5,258,506号、第5,262,536号、第5,272,250号、第5,292,873号、第5,317,098号、第5,371,241号、第5,391,723号、第5,416,203号、第5,451,463号、第5,510,475号、第5,512,667号、第5,514,785号、第5,565,552号、第5,567,810号、第5,574,142号、第5,585,481号、第5,587,371号、第5,595,726号、第5,597,696号、第5,599,923号、第5,599,928号、および第5,688,941号が含まれるが、これらに限定されず、当該特許のそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる。ある化合物の全ての位置が均一に修飾されている必要はなく、実際、前述の修飾のうちの1つ以上を単一化合物に、あるいはさらにはdsRNA内の単一ヌクレオシドに組み込むことができる。また、本発明は、キメラ化合物であるdsRNA化合物も含む。本発明の文脈において、キメラchimericdsRNA化合物またはキメラchimeraは、dsRNA化合物であり、特に2つ以上の化学的にはっきりと異なる領域を含有し、それぞれ、少なくとも1つのモノマー単位、すなわち、dsRNA化合物の場合のヌクレオチドからなる、dsRNAである。これらのdsRNAは、典型的には、該dsRNAは、ヌクレアーゼ分解に対する耐性の増加、細胞取り込みの増加、および/または標的核酸に対する結合親和性の増加を該dsRNAに付与するように、修飾される、少なくとも1つの領域を含有する。dsRNAのさらなる領域は、RNA:DNAまたはRNA:RNAハイブリッドを切断することができる酵素に対する基質としての役割を果たすことができる。一例として、RNアーゼHは、RNA:DNA二重鎖のRNA鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。RNアーゼHの活性化は、したがって、RNA標的の切断をもたらし、それにより遺伝子発現のdsRNA阻害の効率を大きく亢進させる。それ故、キメラdsRNAが使用される場合、同一標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシdsRNAと比較して、しばしばより短いdsRNAによって匹敵する結果を得ることができる。特定の場合において、該dsRNAは、非リガンド基によって修飾されてもよい。多くの非リガンド分子が、dsRNAの活性、細胞分布、または細胞取り込みを亢進させるためにdsRNAにコンジュゲートされており、かかるコンジュゲーションconjugationを行うための手順は、科学文献で入手可能である。かかる非リガンド部分には、コレステロールLetsingeretal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86:6553、コール酸Manoharanetal.,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1994,4:1053、チオエーテル、例えば、ヘキシル-S-トリチルチオールManoharanetal.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660:306、Manoharanetal.,Bioorg.Med.Chem.Let.,1993,3:2765、チオコレステロールOberhauseretal.,Nucl.AcidsRes.,1992,20:533、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基Saison-Behmoarasetal.,EMBOJ.,1991,10:111、Kabanovetal.,FEBSLett.,1990,259:327、Svinarchuketal.,Biochimie,1993,75:49、リン脂質、例えば、ジ-ヘキサデシル-rac-グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-H-ホスホネートManoharanetal.,TetrahedronLett.,1995,36:3651、Sheaetal.,Nucl.AcidsRes.,1990,18:3777、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖Manoharanetal.,NucleosidesNucleotides,1995,14:969、またはアダマンタン酢酸Manoharanetal.,TetrahedronLett.,1995,36:3651、パルミチル部分Mishraetal.,Biochim.Biophys.Acta,1995,1264:229、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステロール部分Crookeetal.,J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277:923等の脂質部分が含まれている。かかるdsRNAコンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許は、上に列記されている。典型的なコンジュゲーションプロトコルは、配列の1つ以上の位置にアミノリンカーを有するdsRNAの合成を含む。次いで、アミノ基を、適切なカップリングもしくは活性化試薬を使用して、コンジュゲートされる分子と反応させる。コンジュゲーション反応は、依然として固体支持体に結合されたdsRNAを用いて、または溶液相中でのdsRNAの切断後のいずれかに実行することができる。典型的には、HPLCによってdsRNAコンジュゲートを精製して、純粋なコンジュゲートが得られる。ベクターによりコードされるdsRNA別の態様では、TTRのdsRNA分子が、DNAもしくはRNAベクターに挿入された転写単位から発現される例えばCouture,A,etal.,TIG.1996,12:5-10、Skillern,Aらの国際PCT公開WO第00/22113号、Conradの国際PCT公開WO第00/22114号、およびConradの米国特許第6,054,299号を参照されたい。これらの導入遺伝子は、線状構築物、環状プラスミド、またはウイルスベクターとして導入することができ、宿主ゲノムに統合される導入遺伝子として導入されて、受け継がれ得る。また、導入遺伝子は、染色体外プラスミドとして受け継がれるのを可能にするように、構築することもできるGassmann,etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA199592:1292。dsRNAの個々の鎖を、2つの個別の発現ベクター上のプロモーターを用いて転写し、標的細胞に同時トランスフェクションすることができる。あるいは、dsRNAのそれぞれ個々の鎖を、いずれも同一発現プラスミド上に位置するプロモーターを用いて転写してもよい。一実施形態において、dsRNAは、dsRNAがステムアンドループ構造を有するように、リンカーポリヌクレオチド配列によって接合される逆方向反復として発現される。組換えdsRNA発現ベクターは、一般に、DNAプラスミドまたはウイルスベクターである。dsRNAを発現するウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス概説として、Muzyczka,etal.,Curr.TopicsMicro.Immunol.1992158:97-129を参照、アデノウイルス例えば、Berkner,etal.,BioTechniques19986:616、Rosenfeldetal.1991,Science252:431-434、およびRosenfeldetal.1992、Cell68:143-155を参照、またはアルファウイルス、ならびに当該技術分野において既知の他のものに基づいて構築することができるが、これらに限定されない。種々の遺伝子を、上皮細胞を含む多くの異なる細胞型にインビトロおよび/またはインビボで導入するために、レトロウイルスが使用されている例えば、Eglitis,etal.,Science1985230:1395-1398、DanosandMulligan,Proc.Natl.Acad.Sci.USA199885:6460-6464、Wilsonetal.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:3014-3018、Armentanoetal.,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:61416145、Huberetal.,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:8039-8043、Ferryetal.,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:8377-8381、Chowdhuryetal.,1991,Science254:1802-1805、vanBeusechem.etal.,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:7640-19、Kayetal.,1992,HumanGeneTherapy3:641-647、Daietal.,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10892-10895、Hwuetal.,1993,J.Immunol.150:4104-4115、米国特許第4,868,116号、米国特許第4,980,286号、PCT出願WO第89/07136号、PCT出願WO第89/02468号、PCT出願WO第89/05345号、およびPCT出願WO第92/07573号を参照。細胞のゲノムに挿入された遺伝子を形質導入して発現することができる組換えレトロウイルスベクターは、組換えレトロウイルスゲノムを、PA317およびPsi-CRIP等の好適なパッケージング細胞系にトランスフェクションすることによって、産生することができるCometteetal.,1991,HumanGeneTherapy2:5-10、Coneetal.,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6349。感受性宿主例えば、ラット、ハムスター、イヌ、およびチンパンジー内の多岐にわたる細胞および組織を感染させるために、組換えアデノウイルスベクターを使用することができHsuetal.,1992,J.InfectiousDisease,166:769、これは、感染に有糸分裂的に活性な細胞を必要としない利点も有する。発現されるdsRNA分子のコード配列を受け入れることができる任意のウイルスベクターを使用することができ、例としては、アデノウイルスAV、アデノ随伴ウイルスAAV、レトロウイルス例えば、レンチウイルスLV、ラブドウイルス、マウス白血病ウイルス、ヘルペスウイルス等に由来するベクターである。ウイルスベクターの指向性は、エンベロープタンパク質もしくは他のウイルスからの他の表面抗原を用いて該ベクターをシュードタイピングすることにより、または異なるウイルスのキャプシドタンパク質を適宜置換することによって、修正することができる。例えば、本発明で取り上げられるレンチウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルスVSV、狂犬病、エボラ、モコラ等からの表面タンパク質でシュードタイピングすることができる。本発明で取り上げられるAAVベクターは、ベクターが異なるキャプシドタンパク質の血清型を発現するように操作することにより、異なる細胞を標的とするようにすることができる。例えば、血清型2のゲノム上に血清型2のキャプシドを発現するAAVベクターは、AAV2/2と称される。AAV2/2ベクター内のこの血清型2のキャプシド遺伝子を、血清型5のキャプシド遺伝子と置換して、AAV2/5ベクターを産生することができる。異なるキャプシドタンパク質血清型を発現するAAVベクターを構築するための技法は、当該技術分野の技能内であり、例えば、RabinowitzJEetal.2002,JVirol76:791-801を参照されたく、その開示全体が、参照により本明細書に組み込まれる。本発明における使用に好適な組換えウイルスベクターの選択、dsRNAの発現のために核酸配列を該ベクターに挿入するための方法、および該ウイルスベクターを対象となる細胞に送達する方法は、当該技術分野の技能内である。例えば、DornburgR1995,GeneTherap.2:301-310、EglitisMA1988,Biotechniques6:608-614、MillerAD1990,HumGeneTherap.1:5-14、AndersonWF1998,Nature392:25-30、およびRubinsonDAetal.,Nat.Genet.33:401-406を参照されたく、それらの開示全体が、参照により本明細書に組み込まれる。ウイルスベクターは、AVおよびAAVに由来し得る。一実施形態において、本発明で取り上げられるdsRNAは、例えば、U6もしくはH1RNAプロモーター、またはサイトメガロウイルスCMVプロモーターのいずれかを有する組換えAAVベクターから、2つの別個の相補的な単鎖RNA分子として発現される。本発明のdsRNAを発現するために好適なAVベクター、組換えAVベクターを構築するための方法、該ベクターを標的細胞に送達するための方法は、XiaHetal.2002,Nat.Biotech.20:1006-1010に記載されている。本発明で取り上げられるdsRNAを発現するために好適なAAVベクター、組換えAVベクターを構築するための方法、該ベクターを標的細胞に送達するための方法は、SamulskiRetal.1987,J.Virol.61:3096-3101、FisherKJetal.1996,J.Virol,70:520-532、SamulskiRetal.1989,J.Virol.63:3822-3826、米国特許第5,252,479号、米国特許第5,139,941号、国際特許出願WO第94/13788号、および国際特許出願WO第93/24641号に記載され、それらの開示全体が、参照により本明細書に組み込まれる。本発明で取り上げられるDNAプラスミドもしくはウイルスベクターのいずれか内でdsRNAの発現を駆動するプロモーターは、真核生物RNAポリメラーゼI例えばリボソームRNAプロモーター、RNAポリメラーゼII例えばCMV初期プロモーター、もしくはアクチンプロモーター、もしくはU1snRNAプロモーター、または一般にRNAポリメラーゼIIIプロモーター例えばU6snRNAもしくは7SKRNAプロモーター、あるいは原核生物プロモーター、例えば、発現プラスミドもT7プロモーターからの転写に必要なT7RNAポリメラーゼをコードするという条件で、T7プロモーターであり得る。該プロモーターは、膵臓への導入遺伝子の発現を導くこともできる例えば、theinsulinregulatorysequenceforpancreasBucchinietal.,1986,Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:2511-2515を参照。さらに、導入遺伝子の発現は、、例えば、特定の生理的調節因子、例えば、循環ブドウ糖レベル、またはホルモンに感受性である調節配列等の、誘発可能な調節配列および発現系を使用することによって、正確に調節することができるDochertyetal.,1994,FASEBJ.8:20-24。細胞または哺乳動物内の導入遺伝子の発現を制御するために好適である、かかる誘発可能な発現系には、エクジソン、エストロゲン、プロゲステロン、テトラサイクリン、二量化の化学誘発物質、およびイソプロピル-ベータ-D1-チオガラクトピラノシドEPTGによる調節が含まれる。当業者は、dsRNA導入遺伝子の目的とする用途に基づいて、適切な調節/プロモーター配列を選択することができよう。一般に、dsRNA分子を発現することができる組換えベクターは、以下に記載するように送達され、標的細胞内に生き残る。代替として、dsRNA分子の一過性発現を提供するウイルスベクターを使用することができる。かかるベクターは、必要に応じて繰り返し投与することができる。発現すると、dsRNAは標的RNAに結合し、その機能または発現を調節する。dsRNAを発現するベクターの送達は、静脈内もしくは筋肉内投与等によって全身的、患者から外植された標的細胞に投与後、該患者へ再導入することによって、または所望の標的細胞への導入を可能にする任意の他の手段等によって、であり得る。dsRNA発現DNAプラスミドは、典型的には、カチオン性脂質担体例えばオリゴフェクタミンOligofectamine、または非カチオン性脂質に基づく担体例えばTransit-TKO商標との複合体として、標的細胞にトランスフェクションされる。1週間以上の期間にわたって、単一のTTR遺伝子の異なる領域または複数のTTR遺伝子を標的とする、dsRNAによって媒介されるノックダウンのための複数回の脂質のトランスフェクションもまた、本発明によって企図される。ベクターの宿主細胞への導入の成功は、種々の既知の方法を使用して監視することができる。例えば、一過性トランスフェクションは、緑色蛍光タンパク質GFP等の蛍光マーカー等のレポーターを用いて示すことができる。エクスビボ細胞の安定なトランスフェクションは、トランスフェクション細胞に、ハイグロマイシンB耐性等の、特定の環境因子例えば、抗生物質および薬物に対する耐性を提供するマーカーを使用して、保証することができる。また、TTRに特異的なdsRNA分子は、ベクターに挿入して、ヒト患者に対する遺伝子療法ベクターとして使用することもできる。遺伝子療法ベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与米国特許第5,328,470号を参照、または定位固定注射例えば、Chenetal.1994Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:3054-3057を参照によって、対象に送達することができる。遺伝子療法ベクターの医薬調製物は、許容される希釈剤中の遺伝子療法ベクターを含んでもよく、または遺伝子送達媒体が中に埋め込まれる徐放性マトリックスを含んでもよい。代替として、組換え細胞、例えば、レトロウイルスベクターから、完全な遺伝子送達ベクターを無傷で産生することができる場合、医薬調製物は、遺伝子送達系を産生する1つ以上の細胞を含んでもよい。III.dsRNAを含有する医薬組成物一実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるdsRNAと、薬剤として許容される担体とを含有する医薬組成物を提供する。該dsRNAを含有する医薬組成物は、TTRの発現によって媒介される病理過程等の、TTR遺伝子の発現もしくは活性に関連する疾患もしくは障害の治療に有用である。かかる医薬組成物は、送達様式に基づいて製剤化される。一例は、眼への直接送達用に製剤化される組成物である。別の例は、非経口投与を介して、例えば、静脈IV送達による全身投与用に製剤化される組成物である。別の例は、例えば、持続ポンプ注入等による脳への注入によって、脳実質への直接送達用に製剤化される組成物である。本明細書で取り上げられる医薬組成物は、TTR遺伝子の発現を阻害するために十分な投薬量で投与される。一般に、dsRNAの好適な用量は、1日当たり受容者の体重1キログラムにつき0.00001~200.0ミリグラムの範囲、一般には、1日当たり体重1キログラムにつき1~50mgの範囲であろう。幾つかの実施形態において、該投薬量は、siRNAが、眼に投与されるとき、体重に対応しない。該投薬量は、例えば、75kgの人に対して25μg、例えば、0.3μg/kgであり得る。他の投薬量は、0.01、0.03、0.05、0.07、0.1、0.3、0.5、0.7、1.0、3.0、5.0、7.0、10.0、30.0、50.0、70.0、または100.0μg/kgを含む。例えば、該dsRNAは、単回用量当たり0.0059mg/kg、0.01mg/kg、0.0295mg/kg、0.05mg/kg、0.0590mg/kg、0.163mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.543mg/kg、0.5900mg/kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg、1mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.628mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、5.0mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、または50mg/kgで投与することができる。一実施形態において、該投薬量は、0.01~0.2mg/kgである。例えば、該dsRNAは、0.01mg/kg、0.02mg/kg、0.03mg/kg、0.04mg/kg、0.05mg/kg、0.06mg/kg、0.07mg/kg、0.08mg/kg、0.09mg/kg、0.10mg/kg、0.11mg/kg、0.12mg/kg、0.13mg/kg、0.14mg/kg、0.15mg/kg、0.16mg/kg、0.17mg/kg、0.18mg/kg、0.19mg/kg、または0.20mg/kgの用量で投与することができる。一実施形態において、該投薬量は、0.005mg/kg~1.628mg/kgである。例えば、該dsRNAは、0.0059mg/kg、0.0295mg/kg、0.0590mg/kg、0.163mg/kg、0.543mg/kg、0.5900mg/kg、または1.628mg/kgの用量で投与することができる。一実施形態において、該投薬量は、0.2mg/kg~1.5mg/kgである。例えば、該dsRNAは、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg、1mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、または1.5mg/kgの用量で投与することができる。dsRNAは、0.03mg/kg、または0.03、0.1、0.2、もしくは0.4mg/kgの用量で投与することができる。該医薬組成物は、1日1回投与することができ、あるいは、該dsRNAは、1日にわたって適切な間隔で、2、3、またはそれ以上の分割用量sub-doseとして、さらに、持続注入または放出制御製剤による送達を用いて投与されてもよい。その場合、各分割用量に含有されるdsRNAは、1日当たりの総投薬量を達成するように、対応してより小さくなければならない。投薬量単位は、例えば、数日間にわたって該dsRNAの持続放出を提供する、従来の持続放出製剤を使用して、数日間にわたる送達用に配合することができる。持続放出製剤は当該技術分野において周知であり、本発明の薬剤を用いて使用され得る部位等の特定の部位での薬剤の送達に特に有用である。本実施形態では、投薬量単位は、対応する複数の1日量を含む。TTRレベルに対する単回用量の効果は長く続き、その結果、その後の用量は、3、4、もしくは5日の間隔より多くなく、または1、2、3、もしくは4週間の間隔より多くなく、または5、6、7、8、9、もしくは10週間の間隔より多くない量で投与される。当業者には、限定されないが、疾患もしくは障害の重症度、以前の処置、総体的な健康、および/または対象の年齢、ならびに存在する他の疾患を含む特定の因子が、対象を効果的に処置するために必要とされる投薬量およびタイミングに影響を及ぼし得ることが理解されよう。さらに、治療上有効な量の組成物を用いた対象の治療には、単回処置または一連の治療が含まれ得る。本発明により包含される個々のdsRNAに対する効果的な投薬量およびインビボ半減期の推定は、従来の方法を使用して、または本明細書のいずれかの箇所で記載される適切な動物モデルを使用したインビボ試験に基づいて、行うことができる。マウス遺伝学における進歩によって、TTRの発現によって媒介される病理過程等の種々のヒト疾患の研究用に、多くのマウスモデルが生成されている。かかるモデルは、dsRNAのインビボ試験、ならびに治療上有効な用量を決定するために使用される。好適なマウスモデルは、例えば、ヒトTTRを発現するプラスミドを含有するマウスである。別の好適なマウスモデルは、ヒトTTRを発現する導入遺伝子を保有するトランスジェニックマウスである。細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータを、ヒトにおける使用のための一連の投薬量の処方決定に使用することができる。本発明で取り上げられる組成物の投薬量は、一般に、ほとんどまたは全く毒性のないED50を含む循環濃度の範囲内にある。投薬量は、用いられる剤形および利用される投与経路に依存して、この範囲内で異なり得る。本発明で取り上げられる方法において使用されるいずれの化合物についても、治療上有効な用量は、まず細胞培養アッセイから推定することができる。用量は、動物モデルにおいて、細胞培養において決定される、IC50すなわち、症状の半値阻害を達成する試験化合物の濃度を含む、化合物、または適切な場合は、標的配列のポリペプチド産物の循環血漿濃度範囲例えば、該ポリペプチドの濃度の低下を達成するを達成するように、処方決定することができる。かかる情報を使用して、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。本発明で取り上げられるdsRNAは、標的遺伝子の発現によって媒介される病理過程の処置に効果的な他の既知の薬剤と組み合わせて投与することができる。いずれの場合においても、投与する医師は、当該技術分野において既知であるか、または本明細書に記載される、標準的な有効性の測定値を使用して得られた結果に基づいて、dsRNA投与の量およびタイミングを調整することができる。投与本発明はまた、本発明で取り上げられるdsRNA化合物を含む医薬組成物および製剤も含む。本発明の医薬組成物は、局所的または全身的な処置が所望されるか、および処置される範囲に依存して、多くの方法で投与することができる。投与は、局所的、噴霧器によってを含む、例えば、粉末もしくは噴霧剤の吸入もしくは吹送による経肺、気管内、鼻腔内、表皮および経皮、経口もしくは非経口であり得る。非経口投与には、静脈内、動脈内、皮下、腔内、もしくは筋肉内注射もしくは注入、または頭蓋内、例えば、実質内、くも膜下腔内、もしくは脳室内投与が含まれる。該dsRNAは、肝臓例えば、肝臓の肝細胞等の特定の組織を標的とする様態で送達することができる。dsRNAは、眼等の特定の組織を標的とする様態で送達することができる。眼への送達の様式は、眼球後方、皮下瞼、結膜下、眼球鞘下、前房、または硝子体注射または内部注射もしくは注入を含む。本発明は、脳に直接注射することによって送達することができる医薬組成物が含まれる。該注射は、脳の特定領域例えば、黒質、皮質、海馬、線条体、もしくは淡蒼球への定位固定注射によるものであり得、該dsRNAは、中枢神経系への複数領域例えば、脳、および/または脊髄への複数領域に送達され得る。該dsRNAは、脳の拡散領域に送達例えば、脳の皮質への拡散送達され得る。一実施形態において、TTRを標的とするdsRNAは、カニューレ、または例えば、脳等の組織例えば、脳の黒質、皮質、海馬、線条体、もしくは淡蒼球内に埋め込まれた一端を有する他の送達デバイスを経由して送達され得る。該カニューレは、該dsRNA組成物の貯蔵容器に接続することができる。流入または送達は、ポンプ、例えば、Alzetポンプ等の浸透圧ポンプもしくはミニポンプによって媒介され得るDurect,Cupertino,CA。一実施形態において、ポンプおよび貯蔵容器は、組織から離れたエリア、例えば腹部内に埋め込まれ、送達は、ポンプまたは貯蔵所から放出部位に誘導する導管によって達成される。該dsRNA組成物の脳への注入は、数時間にわたって、または数日間、例えば、1、2、3、5、もしくは7日間、もしくはそれ以上であり得る。脳への送達用のデバイスは、例えば、米国特許第6,093,180号、および第5,814,014号に記載されている。局所投与用の医薬組成物および製剤には、経皮パッチ、軟膏、ローション、グリーム、ゲル、ドロップ剤、坐薬、スプレー、液体、および粉末が含まれ得る。従来の医薬用担体、水性、粉末、もしくは油性基剤、増粘剤等が必要であるか、または望ましくあり得る。被覆したコンドーム、手袋等も有用であり得る。好適な局所製剤には、本発明で取り上げられるdsRNAが、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤、および界面活性剤等の局所送達剤と混合されるものが含まれる。好適な脂質およびリポソームには、中性例えば、ジオレオイルホスファチジルDOPEエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンDMPC、ジステアロイルホスファチジルコリン、陰性例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロールDMPG、ならびにカチオン性例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピルDOTAP、およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミンDOTMAが含まれる。本発明で取り上げられるdsRNAは、リポソーム内にカプセル化されてもよく、あるいはそれ、特にカチオン性リポソームと複合体を形成してもよい。代替として、dsRNAは、脂質、特にカチオン性脂質と複合されてもよい。好適な脂肪酸およびエステルには、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸、トリカプリン酸、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル1-モノカプリン酸、1-ドデシルアザシクロヘプタン-2-オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはC1~10アルキルエステル例えば、ミリスチン酸イソプロピルIPM、モノグリセリド、ジグリセリド、あるいはその薬剤として許容される塩が含まれるが、これらに限定されない。局所製剤は、米国特許第6,747,014号に詳細に記載され、当該特許は、参照により本明細書に組み込まれる。コレステロールコンジュゲートsiRNAは、本明細書に記載されるコレステロールおよびビタミンE等のリガンドにコンジュゲートされ得る。他のコンジュゲートは、当業者に公知の類似の方法によってオリゴヌクレオチドに結合することができることが理解され、そのような方法は、米国公開第2005/0107325号、第2005/0164235号、第2005/0256069号、および第2008/0108801号に見いだされ得、これらは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。リポソーム製剤薬物の製剤化用に研究されて、使用されているマイクロエマルジョンの他に、組織立った多くの界面活性剤の構造がある。これらには、単層、ミセル、二重層、および小胞が含まれる。リポソーム等の小胞は、薬物送達の観点からの、それらが提示する特異性および作用の持続時間から、大きな関心を集めている。本発明において使用される、リポソームという用語は、球状の1つまたは複数の二重層に配置された両親媒性脂質の小胞を意味する。リポソームは、親油性材料および水性の内部から形成される膜を有する、単層状または多層状の小胞である。水性部分が、送達される組成物を含有する。カチオン性リポソームは、細胞壁に融合することができる利点を有する。非カチオン性のリポソームは、細胞壁とさほど効率的に融合することはできないが、マクロファージによってインビボで取り込まれる。哺乳動物の無傷の皮膚を横断するために、脂質小胞は、好適な経皮勾配の影響下、それぞれ50nm未満の直径を有する、一連の微細孔を通過しなければならない。したがって、高度に変形可能で、そのような微細孔を通過することができるリポソームを使用することが望ましい。リポソームのさらなる利点には、天然のリン脂質から得られたリポソームは、生体適合性および生分解性であること、リポソームは、広範な水溶性および脂溶性の薬物を組み込むことができること、リポソームは、それらの内部区画でカプセル化された薬物を、代謝および分解から保護できること、が含まれるRosoff,inPharmaceuticalDosageForms,Lieberman,RiegerandBankerEds.,1988,MarcelDekker,Inc.,NewYork,N.Y.,volume1,p.245。リポソーム製剤の調製において考慮すべき重要な事項は、脂質の表面電荷、小胞の大きさ、およびリポソームの水性容積である。リポソームは、作用部位への活性成分の移送および送達に有用である。リポソーム膜は、構造的に生体膜と同様であるため、リポソームが組織に適用されると、リポソームは細胞膜との融合を開始し、リポソームと細胞との融合が進行するに従って、リポソームの内容物が細胞内へ出て、そこで活性薬剤が作用し得る。リポソーム製剤は、多くの薬物のための送達様式として、広範な調査の焦点となっている。局所投与について、リポソームが他の製剤に勝る幾つかの利点を提示するという証拠が増えつつある。かかる利点には、投与された薬物の高度な体内吸収に関連する副作用の減少、投与された薬物の所望の標的での蓄積の増加、ならびに親水性および疎水性の両方の多岐にわたる薬物を皮膚へ投与する能力が含まれる。幾つかの報告は、高分子量のDNAを含む薬剤を皮膚へ送達するリポソームの能力について詳述している。鎮痛剤、抗体、ホルモン、および高分子量のDNAを含む化合物が、皮膚に投与されている。大半の適用が、表皮上層の標的化をもたらした。リポソームは、広義の2つのクラスに分類される。カチオン性リポソームは、負に荷電したDNA分子と相互に作用し、安定な複合体を形成する、正に荷電したリポソームである。正に荷電したDNA/リポソーム複合体は、負に荷電した細胞表面に結合し、エンドソーム内に取り入れられる。エンドソーム内の酸性pHにより、リポソームが破裂し、その内容物を細胞の細胞質内に放出するWangetal.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,1987,147,980-985。pH感受性であるか、または負に荷電したリポソームは、DNAと複合するのではなく、それを捕捉する。DNAおよび脂質は共に同様に荷電されているため、複合体形成ではなく反発が生じる。それでもなお、DNAの一部は、これらのリポソームの水性内部内に捕捉される。チミジンキナーゼ遺伝子をコードするDNAを培養下の細胞単層へ送達するために、pH感受性リポソームが使用されている。外因性遺伝子の発現が、標的細胞中で検出されたZhouetal.,JournalofControlledRelease,1992,19,269-274。リポソーム組成物の1つの主要な種類には、天然由来のホスファチジルコリン以外のリン脂質が含まれる。例えば、中性のリポソーム組成物は、ジミリストイルホスファチジルコリンDMPC、またはジパルミトイルホスファチジルコリンDPPCから形成することができる。アニオン性のリポソーム組成物は、一般にジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成され、一方、アニオン性の膜融合性リポソームは、主にジオレオイルホスファチジルエタノールアミンDOPEから形成される。リポソーム組成物の別の種類は、例えば、大豆ホスファチジルコリン、および卵ホスファチジルコリン等のホスファチジルコリンPCから形成される。別の種類は、リン脂質、および/またはホスファチジルコリン、および/またはコレステロールの混合物から形成される。幾つかの研究が、リポソーム製剤の皮膚への局所送達を評価している。インターフェロンを含有するリポソームのモルモット皮膚への適用は、皮膚ヘルペス炎の軽減をもたらし、一方、他の手段例えば、溶液またはエマルジョンとしてを介したインターフェロンの送達は効果がなかったWeineretal.,JournalofDrugTargeting,1992,2,405-410。さらに、さらなる研究は、リポソーム製剤の一部として投与されたインターフェロンの、水性系を使用するインターフェロンの投与に対する有効性を試験し、リポソーム製剤は水溶性投与より優れていると結論付けたduPlessisetal.,AntiviralResearch,1992,18,259-265。また、非イオン性のリポソーム系は、特に非イオン性界面活性剤およびコレステロールを含む系における、薬物の皮膚への送達の実用性を決定するために調べられている。Novasome商標Iジラウリン酸グリセリル/コレステロール/ポリオキシエチレン-10-ステアリルエーテルおよびNovasome商標IIジステアリン酸グリセリル/コレステロール/ポリオキシエチレン-10-ステアリルエーテルを含む非イオン性のリポソーム製剤が、シクロスポリンAをマウス皮膚の真皮に送達するために使用された。結果は、かかる非イオン性のリポソーム系が、皮膚の異なる層へのシクロスポリンAの沈着の促進に効果的であることを示したHuetal.S.T.P.Pharma.Sci.,1994,4,6,466。また、リポソームには、立体的に安定化されたリポソームが含まれ、該用語は、本明細書で使用される場合、1つ以上の特定化された脂質を含むリポソームを指し、リポソームに組み込まれると、かかる特定化された脂質を欠くリポソームと比較して、循環寿命の向上をもたらす。立体的に安定化されたリポソームの例は、リポソームの小胞を形成する脂質部分の一部が、AモノシアロガングリオシドGM1等の1つ以上の糖脂質を含むか、またはBポリエチレングリコールPEG部分等の1つ以上の親水性ポリマーで誘導体化されるものである。いずれの特定の理論にも束縛されるものではないが、少なくともガングリオシド、スフィンゴミエリン、またはPEG誘導体化脂質を含有する立体的に安定化されたリポソームについて、これらの立体的に安定化されたリポソームの循環半減期の増加は、細網内皮系RESの細胞内への取り込みの減少に由来すると、当該技術分野では考えられているAllenetal.,FEBSLetters,1987,223,42、Wuetal.,CancerResearch,1993,53,3765。1つ以上の糖脂質を含む種々のリポソームが当該技術分野において既知である。PapahadjopoulosらAnn.N.Y.Acad.Sci.,1987,507,64は、モノシアロガングリオシドGM1、ガラクトセレブロシド硫酸、およびホスファチジルイノシトールの、リポソームの血中半減期を改善する能力について報告した。これらの所見は、GabizonらProc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1988,85,6949によって詳しく説明されている。共にAllenらによる、米国特許第4,837,028号および国際公開WO第88/04924号は、1スフィンゴミエリン、および2ガングリオシドGM1もしくはガラクトセレブロシド硫酸エステルを含むリポソームを開示している。米国特許第5,543,152号Webbらは、スフィンゴミエリンを含むリポソームを開示している。1,2-sn-ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームは、国際公開WO第97/13499号Limらに開示されている。1つ以上の親水性ポリマーによって誘導体化された脂質を含む多くのリポソーム、およびその調製方法は、当該技術分野において既知である。SunamotoらBull.Chem.Soc.Jpn.,1980,53,2778は、PEG部分を含有する非イオン性界面活性剤、2C1215Gを含むリポソームについて記載している。IllumらFEBSLett.,1984,167,79は、ポリスチレン粒子のポリマーグリコールによる親水性コーティングが、血中半減期の著しい増加をもたらすことを指摘している。ポリアルキレングリコール例えば、PEGのカルボン酸基の結合によって修飾された合成リン脂質が、Sears米国特許第4,426,330号、および第4,534,899号によって記載されている。KlibanovらFEBSLett.,1990,268,235は、PEGまたはステアリン酸PEGによって誘導体化されたホスファチジルエタノールアミンPEを含むリポソームが、血中循環半減期の著しい増加を有することを示す実験について記載している。BlumeらBiochimicaetBiophysicaActa,1990,1029,91は、このような観察を、他のPEG誘導体化リン脂質、例えば、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンDSPEとPEGとの組み合わせから形成されるDSPE-PEGに広げた。外部表面に共有結合されたPEG部分を有するリポソームが、欧州特許EP第0445131B1号および国際公開WO第90/04384号Fisherに記載されている。PEGによって誘導体化された1~20モルパーセントのPEを含有するリポソーム組成物、およびその使用方法が、Woodleら米国特許第5,013,556号、および第5,356,633号、ならびにMartinら米国特許第5,213,804号および欧州特許EP第0496813B1号によって記載されている。他の多くの脂質-ポリマーコンジュゲートを含むリポソームが、国際公開WO第91/05545号および米国特許第5,225,212号共にMartinらによる、ならびに国際公開WO第94/20073号Zalipskyらに開示されている。PEG修飾セラミド脂質を含むリポソームが、国際公開WO第96/10391号Choiらに記載されている。米国特許第5,540,935号Miyazakiらおよび米国特許第5,556,948号Tagawaらは、表面に官能基部分をさらに誘導体化することができるPEG含有リポソームについて記載している。核酸を含む多くのリポソームが当該技術分野において既知である。Thierryらによる国際公開WO第96/40062号は、高分子量の核酸をリポソーム中にカプセル化するための方法を開示している。Tagawaらによる米国特許第5,264,221号は、タンパク質結合リポソームを開示し、かかるリポソームの内容物にはdsRNAが含まれ得ると主張している。Rahmanらによる米国特許第5,665,710号は、オリゴデオキシヌクレオチドをリポソーム中にカプセル化する特定の方法について記載している。Loveらによる国際公開WO第97/04787号は、raf遺伝子を標的とするdsRNAを含むリポソームを開示している。トランスファーソームはさらに別の種類のリポソームであり、薬物送達媒体の興味を引く候補者である、高度に変形可能な脂質凝集物である。トランスファーソームは脂質小滴として記載されてもよく、これは、高度に変形可能であるため、この小滴より小さな孔に容易に浸透することができる。トランスファーソームは、それらが使用される環境に適合可能であり、例えば、自己最適性皮膚の孔の形状に適合する、自己修復性であり、しばしば断片化されることなく標的に到達し、しばしば自己負荷性self-loadingである。トランスファーソームを作製するために、標準的なリポソーム組成物に対して、表面エッジアクチベータsurfaceedge-activator、通常界面活性剤を添加することができる。トランスファーソームは、血清アルブミンを皮膚へ送達するために使用されている。血清アルブミンのトランスファーソームによって媒介される送達は、血清アルブミンを含有する溶液の皮下注射と同様に効果的であることが示されている。界面活性剤は、エマルジョンマイクロエマルジョンを含むおよびリポソーム等の製剤中に幅広い用途を見出す。天然および合成の両方の、多くの異なる種類の界面活性剤の性質を分類および順位付ける最も一般的な方法は、親水性/親油性バランスHLBの使用によるものである。親水性基頭部基としても知られるの性質が、製剤に使用される異なる界面活性剤を分類するための最も有用な手段を提供するRieger,inPharmaceuticalDosageForms,MarcelDekker,Inc.,NewYork,N.Y.,1988,p.285。界面活性剤分子がイオン化されていない場合、これは、非イオン性界面活性剤として分類される。非イオン性界面活性剤は、医薬品および化粧品に幅広い用途を見出し、広範なpH値にわたって使用可能である。一般に、それらのHLB値は、その構造に依存して、2~約18の範囲である。非イオン性界面活性剤には、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル、およびエトキシ化エステル等の非イオン性エステルが含まれる。脂肪アルコールエトキシ化物ethoxylate、プロポキシ化propoxylatedアルコール、およびエトキシ化/プロポキシ化ブロックポリマー等の非イオン性アルカノールアミドおよびエーテルも、このクラスに含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤が、非イオン性界面活性剤のクラスのうちで最も一般的な構成物質である。界面活性剤分子が水中に溶解または分散された時に負の電荷を保有する場合、その界面活性剤は、アニオン性として分類される。アニオン性界面活性剤には、石鹸等のカルボン酸塩、アシルラクチレートlactylate、アミノ酸のアシルアミド、アルキル硫酸塩およびエトキシ化アルキル硫酸塩等の硫酸のエステル、アルキルベンゼンスルホネート、アシルイセチオネートisethionate、アシルタウレートtaurate、およびスルホコハク酸塩等のスルホネート、ならびにリン酸塩が含まれる。アニオン性界面活性剤のクラスのうちで最も重要な構成物質は、アルキル硫酸塩および石鹸である。界面活性剤分子が正の荷電を保有する場合、それが水中に溶解または分散されると、その界面活性剤はカチオン性として分類される。カチオン性界面活性剤には、第四アンモニウム塩およびエトキシ化アミンが含まれる。第四アンモニウム塩がこのクラスで最も使用される構成物質である。界面活性剤分子が正または負の電荷のいずれをも保有する能力を有する場合、その界面活性剤は、両性として分類される。両性界面活性剤には、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、N-アルキルベタイン、およびフォスファチドが含まれる。薬品、製剤、およびエマルジョン中の界面活性剤の使用が概説されているRieger,inPharmaceuticalDosageForms,MarcelDekker,Inc.,NewYork,N.Y.,1988,p.285。核酸脂質粒子一実施形態において、本発明で取り上げられるTTRのdsRNAは、脂質製剤中に完全にカプセル化されて、SPLP、pSPLP、SNALP、または他の核酸脂質粒子を形成する。本明細書で使用される、SNALPという用語は、SPLPを含む安定な核酸脂質粒子を指す。本明細書で使用される、SPLPという用語は、脂質小胞内にカプセル化されたプラスミドDNAを含む核酸脂質粒子を指す。SNALPおよびSPLPは、典型的には、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、および粒子の凝集を阻止する脂質例えば、PEG脂質コンジュゲートを含有する。SNALPおよびSPLPは、静脈内i.v.注射後に長時間の循環寿命を呈し、遠位の部位例えば、投与部位から物理的に離れた部位に蓄積するため、全身適用に非常に有用である。SPLPには、pSPLPが含まれ、これには、PCT公開WO第00/03683号に記載されるカプセル化された縮合剤と核酸との複合体が含まれる。本発明の粒子は、典型的には約50nm~約150nm、より典型的には約60nm~約130nm、より典型的には約70nm~約110nm、最も典型的には約70~約90nmの平均直径を有し、実質的に無毒である。さらに、該核酸は、本発明の核酸脂質粒子中に存在する場合、水溶液中でヌクレアーゼによる分解に抵抗性である。核酸脂質粒子およびその調製方法は、例えば、米国特許第5,976,567号、第5,981,501号、第6,534,484号、第6,586,410号、第6,815,432号、およびPCT公開WO第96/40964号に開示されている。一実施形態において、脂質の薬物に対する比率質量/質量比率例えば、脂質のdsRNAに対する比率は、約1:1~約50:1、約1:1~約25:1、約3:1~約15:1、約4:1~約10:1、約5:1~約9:1、または約6:1~約9:1の範囲内であろう。幾つかの実施形態において、脂質のdsRNAに対する比率は、約1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、または11:1であり得る。一般に、核酸脂質粒子は、緩衝液、例えば、投与用のPBS中に懸濁される。一実施形態において、脂質を製剤化したsiRNAのpHは、6.8~7.8、例えば、7.3または7.4である。オスモル濃度は、例えば、250~350mOsm/kg、例えば、約300、例えば、298、299、300、301、302、303、304、または305であり得る。カチオン性脂質は、例えば、N,N-ジオレイル-N,N-ジメチルアンモニウムクロライドDODAC、N,N-ジステアリル-N,N-ジメチルアンモニウムブロミドDDAB、N-I-2,3-ジオレオイルオキシプロピル-N,N,N-トリメチルクロライドDOTAP、N-I-2,3-ジオレイルオキシプロピル-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロライドDOTMA、N,N-ジメチル-2,3-ジオレイルオキシプロピルアミンDODMA、1,2-ジリノレイルオキシDiLinoleyloxy-N,N-ジメチルアミノプロパンDLinDMA、1,2-ジリノレニルオキシDilinolenyloxy-N,N-ジメチルアミノプロパンDLenDMA、1,2-ジリノレイルカルバモイルオキシDilinoleylcarbamoyloxy-3-ジメチルアミノプロパンDLin-C-DAP、1,2-ジリノレイオキシDilinoleyoxy-3-ジメチルアミノアセトキシプロパンDLin-DAC、1,2-ジリノレイオキシ-3-モルホリノプロパンDLin-MA、1,2-ジリノレオイル-3-ジメチルアミノプロパンDLinDAP、1,2-ジリノレイルチオDilinoleylthio-3-ジメチルアミノプロパンDLin-S-DMA、1-リノレオイル-2-リノレイルオキシlinoleyloxy-3-ジメチルアミノプロパンDLin-2-DMAP、1,2-ジリノレイルオキシ-3-トリメチルアミノプロパンクロライド塩DLin-TMA.Cl、1,2-ジリノレオイル-3-トリメチルアミノプロパンクロライド塩DLin-TAP.Cl、1,2-ジリノレイルオキシ-3-N-メチルピペラジノプロパンDLin-MPZ、または3-N,N-ジリノレイルアミノDioleylamino-1,2-プロパンジオールDLinAP、3-N,N-ジオレイルアミノ-1,2-プロパンジオpropanedioDOAP、1,2-ジリノレイルオキソDilinoleyloxo-3-2-N,N-ジメチルアミノエトキシプロパンDLin-EG-DMA、1,2-ジリノレニルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパンDLinDMA、2,2-ジリノレイルDilinoleyl-4-ジメチルアミノメチル-[1,3]-ジオキソランDLin-K-DMA、またはそれらの類似体、3aR,5s,6aS-N,N-ジメチル-2,2-ジ9Z,12Z-オクタデカ-9,12-ジエニルテトラヒドロ-3aH-シクロペンタ[d][1,3]ジオキソール-5-アミンALN100、6Z,9Z,28Z,31Z-ヘプタトリアコンタ-6,9,28,31-テトラエン-19-イル4-ジメチルアミノブタノエートMC3、1,1′-2-4-2-2-ビス2-ヒドロキシドデシルアミノエチル2-ヒドロキシドデシルアミノエチルピペラジン-1-イルエチルアザネジイルジドデカン-2-オールTechG1、あるいはそれらの混合物であり得る。カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約20モル~約50モル、または約40モルからなり得る。非カチオン性脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリンDSPC、ジオレオイルホスファチジルコリンDOPC、ジパルミトイルホスファチジルコリンDPPC、ジオレオイルホスファチジルグリセロールDOPG、ジパルミトイルホスファチジルグリセロールDPPG、ジオレオイル-ホスファチジルエタノールアミンDOPE、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリンPOPC、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミンPOPE、ジオレオイル-ホスファチジルエタノールアミン4-N-マレイミドメチル-シクロヘキサン-1-カルボキシレートDOPE-mal、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンDPPE、ジミリストイルホスホエタノールアミンDMPE、ジステアロイル-ホスファチジル-エタノールアミンDSPE、16-O-モノメチルPE、16-O-ジメチルPE、18-1-トランスPE、1-ステアロイル-2-オレオイル-ホスファチジエタノールアミンSOPE、コレステロール、またはそれらの混合物を含むが、これらに限定されない、アニオン性脂質または中性脂質であり得る。非カチオン性脂質は、コレステロールが含まれる場合、粒子中に存在する総脂質の約5モル~約90モル、約10モル、または約58モルであり得る。粒子の凝集を阻害するコンジュゲートされた脂質は、例えば、制限されないが、PEG-ジアシルグリセロールDAG、PEG-ジアルキルオキシプロピルDAA、PEG-リン脂質、PEG-セラミドCer、またはそれらの混合物を含む、ポリエチレングリコールPEG-脂質であり得る。PEG-DAAコンジュゲートは、例えば、PEG-ジラウリルオキシプロピルCi2、PEG-ジミリスチルオキシプロピルCi4、PEG-ジパルミチルオキシプロピルCi6、またはPEG-ジステアリルオキシプロピルC18であり得る。PEGコンジュゲートの他の例には、PEG-cDMAN-[メトキシポリエチレングリコール2000カルバミル]-1,2-ジミリスチルオキシプロピルdimyristyloxlpropyl-3-アミン、mPEG2000-DMGmPEG-ジミリスチルグリコール2,000の平均分子量を有する、およびPEG-C-DOMGR-3-[ω-メトキシ-ポリエチレングリコール2000カルバモイル]-1,2-ジミリスチルオキシプロピル-3-アミンが含まれる。粒子の凝集を阻止する共役された脂質は、粒子中に存在する総脂質の0モル~約20モル、または約1.0、1.1、1.2、0.13、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、または2モルであり得る。幾つかの実施形態において、該核酸脂質粒子には、例えば、粒子中に存在する総脂質の約10モル~約60モル、または約48モルのコレステロールがさらに含まれる。一実施形態において、脂質siRNAナノ粒子を調製するために、化合物、2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノエチル-[1,3]-ジオキソランを使用することができる。2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノエチル-[1,3]-ジオキソランの合成については、2008年10月23日出願の米国仮特許出願第61/107,998号に記載され、当該特許は、参照により本明細書に組み込まれる。例えば、脂質siRNA粒子には、40の2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノエチル-[1,3]-ジオキソラン、10のDSPC、40のコレステロール、10のPEG-C-DOMGモルパーセントが含まれ、粒径63.0±20nmおよび0.027のsiRNA/脂質比である。さらに別の実施形態において、脂質siRNA粒子を調製するために、化合物、1,1′-2-4-2-2-ビス2-ヒドロキシドデシルアミノエチル2-ヒドロキシドデシルアミノエチルピペラジン-1-イルエチルアザネジイルジドデカン-2-オールTechG1を使用することができる。例えば、dsRNAは、50:10:38.5:1.5のモル比で、Tech-G1、ジステアロイルホスファチジルコリンDSPC、コレステロール、およびmPEG2000-DMGを含む脂質製剤に、7:1wt:wtの総脂質のsiRNAに対する比率で、製剤化され得る。LNP01一実施形態において、脂質様lipidoidND98-4HClMW1487式1、コレステロールSigma-Aldrich、およびPEG-CeramideC16AvantiPolarLipidsを使用して、脂質siRNAナノ粒子すなわち、LNP01粒子を調製することができる。それぞれエタノール中の原液を、ND98、133mg/mL;コレステロール、25mg/mL、PEG-CeramideC16、100mg/mLのように調製することができる。次いで、ND98、コレステロール、およびPEG-CeramideC16の原液を、例えば、42:48:10のモル比に混合することができる。混合された脂質溶液は、最終エタノール濃度が約35~45、および最終酢酸ナトリウム濃度が約100~300mMになるように、例えば、酢酸ナトリウムpH5中のsiRNA水溶液と混合することができる。脂質siRNAナノ粒子は、典型的には、混合時に自然発生的に形成される。所望の粒径分布に依存して、得られたナノ粒子混合物は、例えば、LipexExtruderNorthernLipids,Inc等のサーモバレル押出機thermobarrelextruderを使用して、ポリカーボネート膜例えば、100nmカットオフを通して押し出すことができる。場合によっては、押出ステップは割愛されてもよい。エタノール除去および同時の緩衝液交換は、例えば、透析または接線流濾過によって達成することができる。緩衝液は、例えば、約pH7、例えば、約pH6.9、約pH7.0、約pH7.1、約pH7.2、約pH7.3、または約pH7.4のリン酸緩衝食塩水PBSと交換することができる。LNP01製剤については、例えば、国際出願公開WO第2008/042973号に記載されており、当該出願は、参照により本明細書に組み込まれる。さらなる例示的な脂質siRNA製剤は、以下の通りである。LNP09製剤およびXTCを含む製剤は、例えば、2009年9月3日出願の米国仮出願第61/239,686号に記載されており、当該出願は、参照により本明細書に組み込まれる。LNP11製剤およびMC3を含む製剤は、例えば、2009年9月22日出願の米国仮出願第61/244,834号に記載されており、当該出願は、参照により本明細書に組み込まれる。LNP12製剤およびTechG1を含む製剤は、例えば、2009年5月5日出願の米国仮出願第61/175,770号に記載されており、当該出願は、参照により本明細書に組み込まれる。標準的な方法、または押出を伴わない方法のうちのいずれかによって調製された製剤を同様の様態で特徴付けることができる。例えば製剤は、典型的には、目視検査によって特徴付けられる。それらは、凝集物または沈降物のない、白っぽい半透明の溶液であるべきである。脂質ナノ粒子の粒径および粒径分布は、例えば、MalvernZetasizerNanoZSMalvernUSAを使用して、光散乱によって測定することができる。粒子は、40~100nm等の約20~300nmの粒径であるべきである。粒径分布は、単峰型であるべきである。製剤中、ならびに捕捉された画分中の総siRNA濃度は、色素排除アッセイを使用して推定される。製剤化されたsiRNAの試料を、製剤を分裂させる界面活性剤、例えば、0.5のTriton-X100の存在または不在下、RibogreenMolecularProbes等のRNAに結合する色素を用いてインキュベートすることができる。製剤中の総siRNAは、標準曲線に対する、該界面活性剤を含有する試料からのシグナルによって決定することができる。捕捉された画分を、総siRNA含有量からsiRNAを含まない含有量界面活性剤の不在下のシグナルによって測定されるを差し引くことによって決定する。捕捉されたsiRNAのパーセントは、典型的には85超である。SNALP製剤については、粒径は、少なくとも30nm、少なくとも40nm、少なくとも50nm、少なくとも60nm、少なくとも70nm、少なくとも80nm、少なくとも90nm、少なくとも100nm、少なくとも110nm、および少なくとも120nmである。好適な範囲は、典型的には少なくとも約50nm~少なくとも約110nm、少なくとも約60nm~少なくとも約100nm、または少なくとも約80nm~少なくとも約90nmである。経口投与用の組成物および製剤には、粉末もしくは顆粒、微粒子、ナノ粒子、水もしくは疎水性媒体中の懸濁液もしくは溶液、カプセル、ゲルカプセル、サシェット、錠剤、またはミニタブレットが含まれる。増粘剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤、または結合剤が望ましくあり得る。幾つかの実施形態において、経口製剤とは、本発明で取り上げられるdsRNAが、1つ以上の浸透促進剤、界面活性剤、およびキレート化剤と併用して投与されるものである。好適な界面活性剤には、脂肪酸および/またはそのエステルもしくは塩、胆汁酸および/またはその塩が含まれる。好適な胆汁酸/塩には、ケノデオキシコール酸CDCAおよびウルソデオキシケノデオキシコール酸UDCA、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸glucholicacid、グリコール酸glycholicacid、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロ-24,25-ジヒドロ-フシジン酸ナトリウム、ならびにグリコジヒドロフシジン酸ナトリウムが含まれる。好適な脂肪酸には、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸、トリカプリン酸、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル1-モノカプリン酸、1-ドデシルアザシクロヘプタン-2-オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはモノグリセリド、ジグリセリド、もしくはその薬剤として許容される塩例えば、ナトリウムが含まれる。幾つかの実施形態において、浸透促進剤の組み合わせが使用され、例えば、胆汁酸/塩と組み合わせた脂肪酸/塩が挙げられる。例示的な1つの組み合わせは、ラウリン酸、カプリン酸、およびUDCAのナトリウム塩である。さらなる浸透促進剤には、ポリオキシエチレン-9-ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン-20-セチルエーテルが含まれる。本発明で取り上げられるdsRNAは、噴霧乾燥粒子を含む顆粒形態で経口的に送達されるか、または微小もしくはナノ粒子を形成するように複合されてもよい。dsRNA複合剤には、ポリ-アミノ酸類;ポリイミン類;ポリアクリレート類;ポリアルキルアクリレート類、ポリオキセタン類、ポリアルキルシアノアクリレート類;カチオン化ゼラチン類、アルブミン類、デンプン類、アクリレート類、ポリエチレングリコール類PEG、およびデンプン類;ポリアルキルシアノアクリレート類;DEAE誘導体化ポリイミン類、ポルランpollulan類、セルロース類、およびデンプン類が含まれる。好適な複合剤には、キトサン、N-トリメチルキトサン、ポリ-L-リジン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノメチルエチレンPTDAE、ポリアミノスチレン例えば、p-アミノ、ポリメチルシアノアクリレート、ポリエチルシアノアクリレート、ポリブチルシアノアクリレート、ポリイソブチルシアノアクリレート、ポリイソヘキシルシアノアクリレート、DEAE-メタクリレート、DEAE-ヘキシルアクリレート、DEAE-アクリルアミド、DEAE-アルブミンおよびDEAE-デキストラン、ポリメチルアクリレート、ポリヘキシルアクリレート、ポリD,L-乳酸、ポリDL-乳酸-co-グリコール酸PLGA、アルギン酸塩、ならびにポリエチレングリコールPEGが含まれる。dsRNA用の経口製剤およびそれらの調製は、米国特許第6,887,906号、米国特許公開第20030027780号、および米国特許第6,747,014号に詳細に記載され、これらはそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。非経口、実質内脳内への、くも膜下腔内、脳室内、または肝内投与用の組成物および製剤には、滅菌水溶液が含まれてもよく、これも、限定されないが、浸透促進剤、担体化合物、および他の薬剤として許容される担体もしくは賦形剤等の緩衝液、希釈剤、および他の好適な添加剤を含有し得る。本発明の医薬組成物には、溶液、エマルジョン、およびリポソームを含有する製剤が含まれるが、これらに限定されない。これらの組成物は、予め形成された液体、自己乳化型固体および、自己乳化型半固体を含む種々の構成成分から生成することができるが、これらに限定されない。肝臓癌等の肝障害を処置する際に肝臓を標的とする製剤が特に好ましい。本発明の医薬製剤は、簡便に単位剤形で提示することができ、医薬産業において周知である従来の技法によって、調製することができる。かかる技法には、活性成分を1つもしくは複数の医薬用担体または1つもしくは複数の賦形剤と合わせるステップが含まれる。一般に、該製剤は、活性成分を液体担体もしくは微粉化した固体担体、あるいはその両方と均一かつ密接に関連させ、次いで必要であれば該産物を成形することによって調製される。本発明の組成物は、限定されないが、錠剤、カプセル、ゲルカプセル、液体シロップ、軟質ゲル、坐薬、および浣腸等の考えられる多くの剤形のうちのいずれかに製剤化することができる。また、本発明の組成物は、水性、疎水性、または混合媒体中の懸濁液として製剤化することもできる。水性懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および/またはデキストランを含む、懸濁液の粘度を増加させる物質をさらに含有することができる。また、懸濁液は、安定剤も含有することができる。エマルジョン本発明の組成物は、エマルジョンとして調製および製剤化することができる。エマルジョンは、典型的には、1つの液体が、通常直径0.1μmを超える液滴の形態の別の液体中に分散された多相系であるIdson,inPharmaceuticalDosageForms,Lieberman,RiegerandBankerEds.,1988,MarcelDekker,Inc.,NewYork,N.Y.,volume1,p.199、Rosoff,inPharmaceuticalDosageForms,Lieberman,RiegerandBankerEds.,1988,MarcelDekker,Inc.,NewYork,N.Y.,Volume1,p.245、BlockinPharmaceuticalDosageForms,Lieberman,RiegerandBankerEds.,1988,MarcelDekker,Inc.,NewYork,N.Y.,volume2,p.335、Higuchietal.,inRemington′sPharmaceuticalSciences,MackPublishingCo.,Easton,Pa.,1985,p.301。エマルジョンは、しばしば、互いに密接に混合および分散される、2つの非混合性の液相を含む二相系である。一般に、エマルジョンは、油中水w/o型または水中油o/w型のいずれかの種類であり得る。水相が、大部分を占める油相中に微細に分割されて、微小液滴として分散される場合、得られる組成物は、油中水w/o型エマルジョンと称される。あるいは、油相が、大部分を占める水相中に微細に分割されて、微小液滴として分散される場合、得られる組成物は、水中油o/w型エマルジョンと称される。エマルジョンは、分散相に加えてさらなる構成成分と、水相または油相のいずれか中の溶液として、またはそれ自体別個の相として存在し得る、活性薬物とを含有することができる。また、乳化剤、安定剤、染料、および抗酸化剤等の医薬用賦形剤が、必要に応じてエマルジョン中に存在してもよい。また、医薬用エマルジョンは、例えば、油中水中油o/w/o型および水中油中水w/o/w型エマルジョンの場合等の、2つを超える相を含む、多重エマルジョンであってもよい。このような複合製剤は、しばしば、単純な二元エマルジョンは提供しない、特定の利点を提供する。o/w型エマルジョンの個々の油滴が小さな水滴を囲む多重エマルジョンは、w/o/w型エマルジョンを構成する。同様に、油の連続相中で安定化された水の小球内に囲まれた油滴の系は、o/w/o型エマルジョンを提供する。エマルジョンは、熱力学的安定性によってほとんどまたは全く特徴付けられない。しばしば、エマルジョンの分散相または不連続相が、外相または連続相中に良好に分散され、乳化剤の手段または製剤の粘度によってこの形態が維持される。エマルジョンの相のいずれも、エマルジョン型軟膏基剤およびクリームの場合のように、半固体または固体であり得る。エマルジョンを安定化する他の手段は、エマルジョンのいずれかの相に組み込むことができる乳化剤の使用を必要とする。乳化剤は、大きく、合成界面活性剤、天然に存在する乳化剤、吸収基剤、および微細に分散された固体の4つのカテゴリーに分類することができるIdson,inPharmaceuticalDosageForms,Lieberman,RiegerandBankerEds.,1988,MarcelDekker,Inc.,NewYork,N.Y.,volume1,p.199。合成界面活性剤は、表面活性剤としても知られ、エマルジョン製剤における広範な適用性が見出されており、文献で概説されているRieger,inPharmaceuticalDosageForms,Lieberman,RiegerandBankerEds.,1988,MarcelDekker,Inc.,NewYork,N.Y.,volume1,p.285、Idson,inPharmaceuticalDosageForms,Lieberman,RiegerandBankerEds.,MarcelDekker,Inc.,NewYork,N.Y.,1988,volume1,p.199。界面活性剤は、典型的には両親媒性であり、親水性および疎水性の部分を含む。界面活性剤の、親水性の疎水性に対する比率は、親水性/親油性バランスHLBと称されており、製剤の調製時の界面活性剤の分類および選択における、貴重なツールである。界面活性剤は、親水性基の性質に基づいて、非イオン性、アニオン性、カチオン性、および両性の異なるクラスに分類することができるRieger,inPharmaceuticalDosageForms,Lieberman,RiegerandBankerEds.,1988,MarcelDekker,Inc.,NewYork,N.Y.,volume1,p.285。エマルジョン製剤に使用される天然乳化剤には、ラノリン、蜜蝋、フォスファチド類、レシチン、およびアカシアが含まれる。吸収基剤は、水を吸収してw/o型エマルジョンを形成するが、依然として無水ラノリンおよび親水性ペトロラタム等のそれらの半固体の稠度を保持することができる、親水性を有する。微細に分割された固体も、特に界面活性剤と組み合わせて、また粘性の調製物中で、良好な乳化剤として使用されている。これらには、極性の無機固体、例えば、重金属水酸化物、非膨張性粘土、例えば、ベントナイト、アタパルジャイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、コロイド性ケイ酸アルミニウムおよびコロイド性ケイ酸アルミニウムマグネシウム、顔料、ならびに非極性固体、例えば、炭素もしくはトリステアリン酸グリセリルが含まれる。また、多岐にわたる非乳化材料もエマルジョン製剤に含まれ、エマルジョンの性質に寄与する。これらには、脂肪、油、ワックス、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪エステル、湿潤剤、親水性コロイド、防腐剤、および抗酸化剤が含まれるBlock,inPharmaceuticalDosageForms,Lieberman,RiegerandBankerEds.,1988,MarcelDekker,Inc.,NewYork,N.Y.,volume1,p.335、Idson,inPharmaceuticalDosageForms,Lieberman,RiegerandBankerEds.,1988,MarcelDekker,Inc.,NewYork,N.Y.,volume1,p.199。親水性コロイドまたは親水コロイドには、多糖類例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、カラゲニン、グアーガム、カラヤガム、およびトラガカント、セルロース誘導体例えば、カルボキシメチルセルロースおよびカルボキシプロピルセルロース、および合成ポリマー例えば、カルボマー、セルロースエーテル、およびカルボキシビニルポリマー等の、天然に存在するガムおよび合成ポリマーが含まれる。これらは、水中で分散または膨張して、分散相の液滴の周りに強い界面薄膜を形成し、外相の粘度を増加させることによってエマルジョンを安定化させる、コロイド溶液を形成する。エマルジョンは、しばしば、微生物の成長を容易に支持することができる炭水化物、タンパク質、ステロール、およびフォスファチド等の多くの成分を含有するため、これらの製剤には、しばしば防腐剤が組み込まれる。エマルジョン製剤に含まれる一般的に使用される防腐剤には、メチルパラベン、プロピルパラベン、第四アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、p-ヒドロキシ安息香酸のエステル、およびホウ酸が含まれる。また、製剤の劣化を阻止するために、抗酸化剤も一般的にエマルジョン製剤に添加される。使用される抗酸化剤は、フリーラジカルスカベンジャー、例えば、トコフェロール、アルキルガレート、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、または還元剤、例えば、アスコルビン酸およびメタ重亜硫酸ナトリウム、ならびに抗酸化剤シナージスト、例えば、クエン酸、酒石酸、およびレシチンであり得る。皮膚、経口、および非経口経路を介するエマルジョン製剤の適用、ならびにそれらを製造するための方法は、文献で概説されているIdson,inPharmaceuticalDosageForms,Lieberman,RiegerandBankerEds.,1988,MarcelDekker,Inc.,NewYork,N.Y.,volume1,p.199。経口送達用のエマルジョン製剤は、製剤化の容易さ、ならびに吸収および生物学的利用能の見地からの有効性から、非常に広範に使用されているRosoff,inPharmaceuticalDosageForms,Lieberman,RiegerandBankerEds.,1988,MarcelDekker,Inc.,NewYork,N.Y.,volume1,p.245、Idson,inPharmaceuticalDosageForms,Lieberman,RiegerandBankerEds.,1988,MarcelDekker,Inc.,NewYork,N.Y.,volume1,p.199。鉱油基材の緩下剤、油溶性ビタミン、および高脂肪栄養調製物が、o/w型エマルジョンとして一般的に経口投与されている材料に含まれる。本発明の一実施形態において、dsRNAおよび核酸の組成物が、マイクロエマルジョンとして製剤化される。マイクロエマルジョンは、水、油、および単一の、光学的に等方性かつ熱力学的に安定な液体溶液である両親媒性物質の系として定義することができるRosoff,inPharmaceuticalDosageForms,Lieberman,RiegerandBankerEds.,1988,MarcelDekker,Inc.,NewYork,N.Y.,volume1,p.245。典型的には、マイクロエマルジョンは、まず油を界面活性剤水溶液中に分散し、次に十分な量の第4の構成成分、一般には中間鎖長のアルコールを添加して透明な系を形成することによって調製される、系である。したがって、マイクロエマルジョンは、表面活性分子の界面薄膜によって安定化される、2つの非混和液の熱力学的に安定で等方的な、透明の分散物質としても記載されているLeungandShah,in:ControlledReleaseofDrugs:PolymersandAggregateSystems,Rosoff,M.,Ed.,1989,VCHPublishers,NewYork,pages185-215。マイクロエマルジョンは、一般的に、油、水、界面活性剤、共界面活性剤、および電解質を含む、3~5つの構成成分の組み合わせを通じて調製される。マイクロエマルジョンが油中水w/o型、または水中油o/w型であるかは、使用される油および界面活性剤の性質、ならびに界面活性剤分子の極性頭部および炭化水素尾部の構造および幾何学的な畳み込みに依存するSchott,inRemington′sPharmaceuticalSciences,MackPublishingCo.,Easton,Pa.,1985,p.271。相図を利用する現象論的手法が広範に研究されており、マイクロエマルジョンを製剤化する方法についての包括的な知識を当業者にもたらしているRosoff,inPharmaceuticalDosageForms,Lieberman,RiegerandBankerEds.,1988,MarcelDekker,Inc.,NewYork,N.Y.,volume1,p.245、Block,inPharmaceuticalDosageForms,Lieberman,RiegerandBankerEds.,1988,MarcelDekker,Inc.,NewYork,N.Y.,volume1,p.335。従来のエマルジョンと比較して、マイクロエマルジョンは、自然発生的に形成される熱力学的に安定な液滴の製剤において、不水溶性薬物を可溶化する利点を提示する。マイクロエマルジョンの調製に使用される界面活性剤には、単独、または共界面活性剤と組み合わせた、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Brij96、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、テトラグリセロールモノラウレートML310、テトラグリセロールモノオレエートMO310、ヘキサグリセロールモノオレエートPO310、ヘキサグリセロールペンタオレエートPO500、デカグリセロールモノカプレートMCA750、デカグリセロールモノオレエートMO750、デカグリセロールセクイオレエートsequioleateSO750、デカグリセロールデカオレエートDAO750が含まれるが、これらに限定されない。共界面活性剤は、通常、エタノール、1-プロパノール、および1-ブタノール等の短鎖アルコールであるが、界面活性剤の薄膜中に浸透し、その結果、界面活性剤分子の間に生成される空隙のために不規則な薄膜を形成することによって、界面流動性を増加させる役目を果たす。しかしながら、マイクロエマルジョンは、共界面活性剤の使用を伴わずに調製することができ、アルコールを含まない自己乳化型のマイクロエマルジョン系が、当該技術分野において既知である。水相は、典型的には、水、該薬物の水溶液、グリセロール、PEG300、PEG400、ポリグリセロール、プロピレングリコール、およびエチレングリコールの誘導体であり得るが、これらに限定されない。油相には、Captex300、Captex355、CapmulMCM、脂肪酸エステル、中鎖C8~C12のモノ、ジ、およびトリ-グリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪アルコール、ポリ糖化polyglycolizedグリセリド、飽和ポリ糖化C8~C10グリセリド、植物油、ならびにシリコーンオイル等の材料が含まれ得るが、これらに限定されない。マイクロエマルジョンは、薬物の可溶化および薬物吸収の亢進の見地から、特に興味深い。ペプチドを含む薬物の経口での生物学的利用能を亢進させるために、脂質基剤のマイクロエマルジョンo/w型およびw/o型の両方が提案されているConstantinidesetal.,PharmaceuticalResearch,1994,11,1385-1390、Ritschel,Meth.Find.Exp.Clin.Pharmacol.,1993,13,205。マイクロエマルジョンは、改善された薬物の可溶化、酵素的加水分解からの薬物の保護、界面活性剤が誘発する膜流動性および透過性における変化による薬物吸収の潜在的な亢進、調製の容易さ、固形剤形を超える経口投与の容易さ、改善された臨床的効力、および低減した毒性の利点を提供するConstantinidesetal.,PharmaceuticalResearch,1994,11,1385、Hoetal.,J.Pharm.Sci.,1996,85,138-143。しばしば、マイクロエマルジョンは、その構成成分が周囲温度で引き合わされると、自然発生的に形成され得る。これは、熱不安定性の薬物、ペプチド、またはdsRNAを製剤化する際に特に有利であり得る。また、マイクロエマルジョンは、化粧用途および医薬用途の双方における活性構成成分の経皮送達に効果的である。本発明のマイクロエマルジョン組成物および製剤は、消化管からのdsRNAおよび核酸の向上された体内吸収を促進し、dsRNAおよび核酸の局所的な細胞取り込みを改善することが期待される。また、本発明のマイクロエマルジョンは、製剤の特性を改善し、本発明のdsRNAおよび核酸の吸収を亢進させるための、モノステアリン酸ソルビタンGrill3、Labrasol、および浸透促進剤等のさらなる構成成分および添加剤を含有することができる。本発明のマイクロエマルジョンに使用される浸透促進剤は、界面活性剤、脂肪酸、胆汁塩、キレート剤、および非キレート非界面活性剤の、5つの大きなカテゴリーのうちの1つに属するものとして分類することができるLeeetal.,CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems,1991,p.92。これらのクラスのそれぞれが、上述されている。浸透促進剤一実施形態において、本発明は、核酸、特にdsRNAの、動物の皮膚への効率的な送達を達成させるために、種々の浸透促進剤を用いる。ほとんどの薬物は、イオン化および非イオン化の両方の形態で溶液中に存在する。しかしながら、通常脂溶性または親油性の薬物のみが、容易に細胞膜を横断する。横断される膜が浸透促進剤で処理されている場合、非親油性薬物でさえも、細胞膜を横断し得ることが発見されている。非親油性薬物の細胞膜を横断する拡散の補助に加えて、浸透促進剤は、親油性薬物の透過性も亢進する。浸透促進剤は、界面活性剤、脂肪酸、胆汁塩、キレート剤、および非キレート非界面活性剤の、5つの大きなカテゴリーのうちの1つに属するものとして分類することができるLeeetal.,CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems,1991,p.92。浸透促進剤の前述のクラスのそれぞれについて、以下により詳細に記載する。界面活性剤:本発明に関連して、界面活性剤または表面活性剤とは、水溶液中に溶解されると、溶液の表面張力または該水溶液と別の液体との間の界面張力を減少させ、粘膜を通るdsRNAの吸収が亢進されるという結果をもたらす、化学物質である。胆汁塩および脂肪酸に加えて、これらの浸透促進剤には、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン-9-ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン-20-セチルエーテルLeeetal.,CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems,1991,p.92、ならびにFC-43等のペルフルオロ化合物エマルジョンが含まれるTakahashietal.,J.Pharm.Pharmacol.,1988,40,252。脂肪酸:浸透促進剤として作用する種々の脂肪酸およびそれらの誘導体には、例えば、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸n-デカン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸、トリカプリン酸、モノオレイン1-モノオレオイル-rac-グリセロール、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール1-モノカプリン酸、1-ドデシルアザシクロヘプタン-2-オン、アシルカルニチン、アシルコリン、それらのC1-10アルキルエステル例えば、メチル、イソプロピル、およびt-ブチル、ならびにそれらのモノおよびジ-グリセリドすなわち、オレイン酸塩、ラウリン酸塩、カプリン酸塩、ミリスチン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、リノール酸塩等が含まれるLeeetal.,CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarryierSystems,1991,p.92、Muranishi,CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems,1990,7,1-33、ElHaririetal.,J.Pharm.Pharmacol.,1992,44,651-654。胆汁塩:胆汁の生理学的役割には、脂質および脂溶性ビタミンの分散および吸収の促進が含まれるBrunton,Chapter38in:GoodmanGilman′sThePharmacologicalBasisofTherapeutics,9thEd.,Hardmanetal.Eds.,McGraw-Hill,NewYork,1996,pp.934-935。種々の天然胆汁塩、およびそれらの合成誘導体は、浸透促進剤として作用する。したがって、胆汁塩という用語には、胆汁の天然に存在する構成成分のうちのいずれも、ならびにそれらの合成誘導体のうちのいずれもが含まれる。好適な胆汁塩には、例えば、コール酸もしくはその薬剤として許容されるナトリウム塩、コール酸ナトリウム、デヒドロコール酸デヒドロコール酸ナトリウム、デオキシコール酸デオキシコール酸ナトリウム、グルコール酸グルコール酸ナトリウムsodiumglucholate、グリコール酸グリココール酸ナトリウム、グリコデオキシコール酸グリコデオキシコール酸ナトリウム、タウロコール酸タウロコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸タウロデオキシコール酸ナトリウム、ケノデオキシコール酸ケノデオキシコール酸ナトリウム、ウルソデオキシコール酸UDCA、タウロ-24,25-ジヒドロ-フシジン酸ナトリウムSTDHF、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウム、およびポリオキシエチレン-9-ラウリルエーテルPOEが含まれるLeeetal.,CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems,1991,page92;Swinyard,Chapter39In:Remington′sPharmaceuticalSciences,18thEd.,Gennaro,ed.,MackPublishingCo.,Easton,Pa.,1990,pages782-783、Muranishi,CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems,1990,7,1-33、Yamamotoetal.,J.Pharm.Exp.Ther.,1992,263,25、Yamashitaetal.,J.Pharm.Sci.,1990,79,579-583。キレート剤:本発明に関連して使用されるキレート剤は、金属イオンとの複合体を形成することによって溶液から金属イオンを除去し、粘膜を通るdsRNAの吸収の亢進という結果をもたらす化合物として、定義することができる。本発明における浸透促進剤としての使用に関して、ほとんどの特徴付けられたDNAヌクレアーゼは触媒作用に二価金属イオンを必要とすることから、キレート剤によって阻害されるため、キレート剤は、DNアーゼ阻害剤としても機能するさらなる利点を有するJarrett,J.Chromatogr.,1993,618,315-339。好適なキレート剤には、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウムEDTA、クエン酸、サリチル酸塩例えば、サリチル酸ナトリウム、5-メトキシサリチル酸塩、およびホモバニレートhomovanilate、コラーゲンのN-アシル誘導体、ラウレス-9、およびベータ-ジケトンのN-アミノアシル誘導体エナミンが含まれるが、これらに限定されないLeeetal.,CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems,1991,page92、Muranishi,CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems,1990,7,1-33、Buuretal.,J.ControlRel.,1990,14,43-51。非キレート非界面活性剤:本明細書で使用される、非キレート非界面活性剤の浸透促進化合物は、キレート剤または界面活性剤としてわずかな活性しか示さないが、それにもかかわらず消化器粘膜を通じてのdsRNAの吸収を亢進する化合物として、定義することができるMuranishi,CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems,1990,7,1-33。このクラスの浸透促進剤には、例えば、不飽和環状尿素、1-アルキル-および1-アルケニルアザシクロ-アルカノン誘導体Leeetal.,CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems,1991,page92、ならびにジクロフェナクナトリウム、インドメタシン、およびフェニルブタゾン等の非ステロイド性抗炎症薬Yamashitaetal.,J.Pharm.Pharmacol.,1987,39,621-626が含まれる。担体また、本発明の特定の組成物には、製剤中に担体化合物が組み込まれる。本明細書で使用される、担体化合物または担体は、不活性すなわち、それ自体生物活性を有さないであるが、例えば、生物活性のある核酸の分解、または循環からのその除去の促進によって、生物活性を有する核酸の生物学的利用能を減少させるインビボ過程によって、核酸として認識される、核酸、またはその類似体を指すことができる。核酸と担体化合物との同時投与は、典型的には後者の物質を過剰に伴い、おそらく共通の受容体に対する担体化合物と核酸との間の競合により、肝臓、腎臓、または他の循環外の貯蔵所で回収される核酸の量の著しい減少をもたらし得る。例えば、肝組織中の部分的ホスホロチオエートdsRNAの回収は、それがポリイノシン酸、硫酸デキストラン、ポリシチジン酸polycytidicacid、または4′-アセトアミド-4イソチオシアノ-スチルベン-2,2′-ジスルホン酸と同時投与される場合、減少され得るMiyaoetal.,DsRNARes.Dev.,1995,5,115-121、Takakuraetal.,DsRNANucl.AcidDrugDev.,1996,6,177-183。賦形剤担体化合物とは対照的に、医薬用担体または賦形剤は、1つ以上の核酸を動物に送達するための、薬剤として許容される溶媒、懸濁剤、または任意の他の薬理学的に不活性な媒体である。賦形剤は液体または固体であり得、核酸および所定の医薬組成物の他の構成成分と組み合わされた時に、所望の用量、軟度等を提供するように、計画された投与の様態を念頭において選択される。典型的な医薬用担体には、結合剤例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース等、充填剤例えば、ラクトースおよび他の糖、微結晶性セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート、またはリン酸水素カルシウム等、滑沢剤例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、金属ステアリン酸塩、硬化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム等、崩壊剤例えば、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウム等、ならびに湿潤剤例えば、ラウリル硫酸ナトリウム等が含まれるが、これらに限定されない。また、核酸と有害に反応しない、経口non-parenteral投与に好適な薬剤として許容される有機または無機賦形剤を、本発明の組成物を製剤化するために使用することができる。好適な薬剤として許容される担体には、水、塩類溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等が含まれるが、これらに限定されない。核酸の局所投与用の製剤には、滅菌および非滅菌水溶液、アルコール等の一般的な溶媒中の非水溶液、または液体もしくは固形の油基剤中の核酸の溶液が含まれ得る。該溶液は、緩衝液、希釈剤、および他の好適な添加剤も含有し得る。核酸と有害に反応しない、経口non-parenteral投与に好適な薬剤として許容される有機または無機賦形剤を使用することができる。好適な薬剤として許容される賦形剤には、水、塩類溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等が含まれるが、これらに限定されない。他の構成成分本発明の組成物は、医薬組成物中に従来認められる他の補助的な構成成分を、それらの当該技術分野において確立された使用量レベルで、さらに含有することができる。したがって、例えば、本組成物は、さらに、例えば、鎮痒薬、収斂薬、局所麻酔薬、または抗炎症薬等の、適合性の、薬剤として活性な材料を含有してもよく、あるいは、染料、香味剤、防腐剤、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤、および安定剤等の、本発明の組成物の種々の剤形に物理的に製剤化するために有用な、さらなる材料を含有してもよい。しかし、かかる材料は、添加された時に、本発明の組成物の構成成分の生物活性を過度に妨げてはならない。該製剤を滅菌し、所望される場合、補助的な薬剤、例えば、該製剤の1つまたは複数の核酸と有害に相互作用しない滑沢剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼすための塩、緩衝液、着色物質、香味物質、および/または芳香物質等と混合してもよい。水性懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および/またはデキストランを含む、懸濁液の粘度を増加させる物質を含有することができる。また、懸濁液は、安定剤も含有することができる。幾つかの実施形態において、本発明で取り上げられる医薬組成物には、a1つ以上のdsRNA化合物およびb非RNAi機序によって機能する1つ以上の抗サイトカイン生物剤が含まれる。かかる生物学の例には、IL1β例えばアンキンラ、IL6トシリズマブ、またはTNFエタネルセプト、インフリキシマブ、アドリムマブ、もしくはセルトリズマブを標的とする生物学が含まれる。かかる化合物の毒性および治療効果は、例えば、LD50集団の50に致死的な用量、およびED50集団の50に治療上有効な用量を決定するための、細胞培養物または実験動物における標準的な医薬的手順によって決定することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、LD50/ED50比として表すことができる。高い治療指数を呈する化合物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータを、ヒトにおける使用のための一連の投薬量の処方決定に使用することができる。本発明で取り上げられる組成物の投薬量は、一般に、ほとんどまたは全く毒性のないED50を含む循環濃度の範囲内にある。投薬量は、用いられる剤形および利用される投与経路に依存して、この範囲内で異なり得る。本発明で取り上げられる方法において使用されるいずれの化合物についても、治療上有効な用量は、まず細胞培養アッセイから推定することができる。用量は、動物モデルにおいて、細胞培養において決定される、IC50すなわち、症状の半値阻害を達成する試験化合物の濃度を含む、化合物、または適切な場合は、標的配列のポリペプチド産物の循環血漿濃度範囲例えば、該ポリペプチドの濃度の低下を達成するを達成するように、処方決定することができる。かかる情報を使用して、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。それらの投与に加えて、上述のように、本発明で取り上げられるdsRNAは、TTRの発現によって媒介される病理過程の処置に効果的な他の既知の薬剤と組み合わせて投与することができる。いずれの場合においても、投与する医師は、当該技術分野において既知であるか、または本明細書に記載される、標準的な有効性の測定値を使用して得られた結果に基づいて、dsRNA投与の量およびタイミングを調整することができる。TTR遺伝子の発現によって引き起こされる眼疾患を治療するための方法本発明は、特に、TTR関連眼アミロイドーシスの治療のための、TTRを標的とするdsRNAの使用に関する。本発明は、これは、TTR関連眼アミロイドーシスの治療、予防、または管理を必要とする患者に、治療上または予防上有効量のAD-18324を、該患者の網膜に投与することによって、TTR関連眼アミロイドーシスの治療、予防、または管理する方法を特徴とする。一実施形態において、本方法は、TTR関連眼アミロイドーシスに罹患している、またはTTR関連眼アミロイドーシスを発症する危険性があると診断されるヒトを特定し、該ヒトに、治療上もしくは予防上有効量のAD-18324を該ヒトの網膜に投与することによって、ヒトを治療することを含む。本発明はまた、AD-18324またはAD-18534であるdsRNAを網膜上皮細胞に導入し、TTR遺伝子のmRNA転写物の分解を得るために十分な時間、前述のステップにおいて産生された細胞を維持し、それによって、細胞内のTTR遺伝子の発現を阻害することによって、TTR関連眼アミロイドーシスに罹患しているヒトを治療する方法も含む。幾つかの実施形態において、本発明のTTRのsiRNAは、トランスチレチンTTR関連の家族性アミロイド多発性神経障害FAP患者、ならびに硝子体混濁および緑内障等の眼症状発現の治療の方法において使用される。網膜色素上皮RPEによって合成されたアミロイド生成性トランスチレチンATTRが、眼アミロイドーシスの進行において重要な役割を果たすことを当業者により理解されよう。RPE細胞を軽減させ、ガラス体中のアミロイドの沈着の進行を妨げ、これにより、RPE中のATTRの発現の効果的な抑制を示す、汎網膜レーザー光凝固術が、眼アミロイドーシスの新規の療法になり得ることを、前述の研究は、示している例えば、Kawaji,T.,etal.,Ophthalmology2010117:552-555。本明細書に開示されるTTRのsiRNAのいずれかの投与は、例えば、眼アミロイドーシス等のTTR関連FAPの眼症状発現の治療に使用することができる。dsRNAは、眼等の特定の組織を標的とする様式で送達することができる。眼への送達の様式は、眼球後方、皮下瞼、結膜下、眼球鞘下、前房、または硝子体注射または内部注射もしくは注入を含む。眼送達用の特定の製剤には、点眼剤または軟膏が含まれる。dsRNAおよびさらなる治療薬は、同様の併用で、例えば、非経口で投与することができるか、またはさらなる治療薬は、別個の組成物の一部として、または本明細書に記載の別の方法によって投与することができる。本発明は、TTRアミロイドーシス、例えば、FAP等のTTRの発現によって媒介される疾患または障害を有する患者に、TTRを標的とするdsRNAを投与する方法を取り上げる。該dsRNAの投与は、例えば、FAPに罹患している患者において、末梢神経系の機能を安定させ、向上させることができる。患者は、治療量のdsRNA、例えば、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg、1.5mg/kg、2.0mg/kg、または2.5mg/kgのdsRNAを投与することができる。該dsRNAは、一定期間、例えば、5分間、10分間、15分間、20分間、25分間、60分間、120分間、または180分間にわたって投与することができる。例えば、定期的に、例えば、1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、またはそれ以上の期間、隔週ですなわち、2週間ごとに、反復投与される。初期治療レジメン後、該治療は、より低い頻度で、投与することができる。例えば、隔週で3ヶ月間、投与した後、6ヶ月間、またはそれ以上の期間、1ヶ月に1回、反復投与することができる。該dsRNAの投与は、患者における血液中または尿のTTRレベルを、少なくとも20、25、30、40、50、60、70、80、または90もしくはそれ以上軽減することができる。総量の該dsRNAを投与する前に、患者は、総量の5用量等の少量の用量を投与し、アレルギー反応または肝機能の変化等の副作用を監視することができる。例えば、肝機能の変化に対して監視される患者において、LFT肝機能検査の変化の低い発生率例えば、LFTの10~20発生率は、許容される例えば、可逆的な、ALTアラニンアミノトランスフェラーゼおよび/またはASTアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼレベルの3倍の増加。多くのTTR関連の疾病および障害は、遺伝性である。したがって、TTRのdsRNAを必要とする患者は、家族歴を得ることによって特定することができる。医者、看護師、または家族等のヘルスケア提供者は、TTRのdsRNAを処方する、または投与する前に家族歴を得ることができる。DNAテストもはまた、TTRのdsRNAを患者に投与する前に、TTR遺伝子の変異を同定するために、該患者に実施され得る。該患者は、TTRのdsRNAを受ける前に実施される生検を有し得る。該生検は、例えば、胃粘膜、末梢神経、皮膚、腹部脂肪、肝臓、もしくは腎臓等の組織上にあり得、該生検は、TTRによって媒介される障害を示す、アミロイド斑を示し得る。アミロイド斑を確認すると、患者は、TTRのdsRNAが投与される。TTR遺伝子の発現を阻害するための方法さらに別の態様において、本発明は、哺乳動物における、TTR遺伝子の発現を阻害するための方法を提供する。該方法は、標的TTR遺伝子の発現が停止されるように、本発明で取り上げられる組成物を該哺乳動物に投与することを含む。処置される生物がヒト等の哺乳動物である場合、本組成物は、頭蓋内例えば脳室内、脳実質内、およびくも膜下腔、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、気道噴霧剤、経鼻、直腸、ならびに局所口腔および舌下を含む投与を含む、経口または非経口の経路を含むが、これらに限定されない、当該技術分野において既知の任意の手段によって投与することができる。ある実施形態において、本組成物は、静脈内注入もしくは注射によって投与される。別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての専門用語および化学用語は、本発明が属する分野における当業者によって一般的に理解されるものと同一の意味を有する。本発明で取り上げられるdsRNAおよび方法の実践または試験に際して、本明細書に記載されるものと同様または等価の方法および材料を使用することができるが、好適な方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。矛盾する場合は、定義を含み、本明細書が優先される。さらに、材料、方法、および例は例示に過ぎず、限定するものではない。実施例1:dsRNA合成試薬の供給源試薬の供給源が本明細書に具体的に与えられていない場合、かかる試薬は、分子生物学の用途に標準的な質/純度で、分子生物学用の試薬の任意の供給業者から得ることができる。siRNA合成Expedite8909合成機AppliedBiosystems、AppleraDeutschlandGmbH、Darmstadt,Germany、および固体支持体として制御細孔ガラスCPG、500Å、ProligoBiochemieGmbHHamburg,Germanyを使用して、1μモルの規模で固相合成によって単鎖RNAを生成した。RNAおよび2′-O-メチルヌクレオチドを含有するRNAを、対応するホスホラミダイトおよび2′-O-メチルホスホラミダイトProligoBiochemieGmbHHamburg,Germanyをそれぞれ用いて、固相合成によって生成した。これらの構成要素を、Currentprotocolsinnucleicacidchemistry,Beaucage,S.L.etal.Edrs.,JohnWileySons,Inc.,NewYork,NY,USAに記載されるような、標準的なヌクレオシドホスホラミダイト化学反応を用いて、オリゴリボヌクレオチド鎖の配列内の選択された部位に組み込んだ。ヨウ素酸化剤溶液を、アセトニトリル1中のBeaucage試薬ChruachemLtdGlasgow,UKの溶液と置き換えて、ホスホロチオエート結合を導入した。さらなる補助試薬をMallinckrodtBakerGriesheim,Germanyから入手した。確立された手順に従い、陰イオン交換HPLCによって、粗オリゴリボヌクレオチドの脱保護および精製を行った。収量および濃度を、分光光度計DU640B、BeckmanCoulterGmbH、Unterschleissheim,Germanyを使用した、260nmの波長でのそれぞれのRNAの溶液のUV吸収によって判定した。アニーリング緩衝液20mMリン酸ナトリウムpH6.8、100mM塩化ナトリウム中で相補鎖の等モル溶液を混合し、3分間85~90°Cの湯浴中で加熱し、3~4時間かけて室温まで冷却することによって、二本鎖RNAを生成した。アニールされたRNA溶液は、使用するまで-20°Cで保管した。3′-コレステロールにコンジュゲートしたsiRNA本明細書で-Chol-3′と称されるの合成には、RNA合成のために適切に改質された固体支持体が使用された。改質された固体支持体は、以下のように調製した。ジエチル-2-アザブタン-1,4-ジカルボキシレートAA水酸化ナトリウムの4.7Mの水溶液50mLを、水50mL中のグリシンエチル塩酸塩32.19g、0.23モルの、撹拌して氷冷した溶液に添加した。次いで、エチルアクリレート23.1g、0.23モルを添加し、混合物を、反応の完了がTLCによって確認されるまで、室温で撹拌した。19時間後、該溶液をジクロロメタン3×100mLで分配した。有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、蒸発させた。残渣を蒸留して、AA28.8g、61を得た。3-{エトキシカルボニルメチル-[6-9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニル-アミノ-ヘキサノイル]-アミノ}-プロピオン酸エチルエステルABFmoc-6-アミノ-ヘキサン酸9.12g、25.83ミリモルをジクロロメタン50mLに溶解し、氷冷した。ジイソプロピルカルボジイミド3.25g、3.99mL、25.83ミリモルを該溶液に0°Cで添加した。その後、ジエチル-アザブタン-1,4-ジカルボキシレート5g、24.6ミリモル、およびジメチルアミノピリジン0.305g、2.5ミリモルを添加した。該溶液が室温になるようにし、さらに6時間撹拌した。反応の完了をTLCで確認した。反応混合物を真空下で濃縮し、酢酸エチルを添加して、ジイソプロピル尿素を沈殿させた。この懸濁液を濾過した。濾液を5塩酸水溶液、5飽和重炭酸ナトリウム、および水で洗浄した。合わせた有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させて濃縮し、粗生成物を得て、カラムクロマトグラフィー50EtOAC/ヘキサンで精製し、11.87g88のABを得た。3-[6-アミノ-ヘキサノイル-エトキシカルボニルメチル-アミノ]-プロピオン酸エチルエステルAC3-{エトキシカルボニルメチル-[6-9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ-ヘキサノイル]-アミノ}-プロピオン酸エチルエステルAB11.5g、21.3ミリモルを、0°Cのジメチルホルムアミド中の20ピペリジンに溶解した。この溶液を1時間撹拌し続けた。反応混合物を真空下で濃縮し、残渣に水を添加し、酢酸エチルで生成物を抽出した。この粗生成物をその塩酸塩に変換することによって精製した。3-{6-[17-1,5-ジメチル-ヘキシル-10,13-ジメチル-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-テトラデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イルオキシカルボニルアミノ]-ヘキサノイル}エトキシカルボニルメチル-アミノ-プロピオン酸エチルエステルAD3-[6-アミノ-ヘキサノイル-エトキシカルボニルメチル-アミノ]-プロピオン酸エチルエステルAC4.7g、14.8ミリモルの塩酸塩をジクロロメタンに溶解した。この懸濁液を氷上で0°Cに冷却した。この懸濁液にジイソプロピルエチルアミン3.87g、5.2mL、30ミリモルを添加した。得られた溶液に、コレステリルクロロホルメート6.675g、14.8ミリモルを添加した。反応混合物を終夜撹拌した。反応混合物をジクロロメタンで希釈し、10塩酸で洗浄した。生成物をフラッシュクロマトグラフィーで精製した10.3g、92。1-{6-[17-1,5-ジメチル-ヘキシル-10,13-ジメチル-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-テトラデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イルオキシカルボニルアミノ]-ヘキサノイル}-4-オキソ-ピロリジン-3-カルボン酸エチルエステルAEカリウムt-ブトキシド1.1g、9.8ミリモルを30mLの乾燥トルエンでスラリーにした。この混合物を氷上で0°Cに冷却し、5g6.6ミリモルのジエステルADを20分以内のうちに、撹拌しながらゆっくりと添加した。添加の間、温度は5°C未満に維持した。撹拌を0°Cで30分間継続し、1mLの氷酢酸、その直後に40mLの水中の4gのNaH2PO4H2Oを添加した。得られた混合物を2回、それぞれ100mLのジクロロメタンで抽出し、合わせた有機抽出物を2回、それぞれ10mLのリン酸緩衝液で洗浄し、乾燥させ、蒸発乾固させた。残渣を60mLのトルエンに溶解し、0°Cに冷却し、それぞれ50mLの、pH9.5の冷炭酸塩緩衝液で3回抽出した。水性抽出液をリン酸でpH3に調整し、それぞれ40mLのクロロホルムで5回抽出し、合わせて乾燥させ、蒸発乾固させた。残渣を25酢酸エチル/ヘキサンを使用して、カラムクロマトグラフィーで精製し、1.9gのb-ケトエステルを得た39。[6-3-ヒドロキシ-4-ヒドロキシメチル-ピロリジン-1-イル-6-オキソ-ヘキシル]-カルバミン酸17-1,5-ジメチル-ヘキシル-10,13-ジメチル-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-テトラデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イルエステルAFメタノール2mLを、b-ケトエステルAE1.5g、2.2ミリモルと、テトラヒドロフラン10mL中の水素化ホウ素ナトリウム0.226g、6ミリモルとの還流混合物に、1時間かけて滴下した。撹拌を還流温度で1時間継続した。室温に冷却後、1NのHCl12.5mLを添加し、混合物を酢酸エチルで抽出した3×40mL。合わせた酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真空下で濃縮して生成物を得て、カラムクロマトグラフィー10MeOH/CHCl3で精製した89。6-{3-[ビス-4-メトキシ-フェニル-フェニル-メトキシメチル]-4-ヒドロキシ-ピロリジン-1-イル}-6-オキソ-ヘキシル-カルバミン酸17-1,5-ジメチル-ヘキシル-10,13-ジメチル-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-テトラデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イルエステルAGジオールAF1.25g、1.994ミリモルを、真空内でピリジン2×5mLを用いて蒸発乾固した。無水ピリジン10mLおよび4,4′-ジメトキシトリチルクロリド0.724g、2.13ミリモルを撹拌しながら添加した。反応は、終夜室温で行われた。メタノールを添加して反応を停止させた。反応混合物を真空下で濃縮し、残渣にジクロロメタン50mLを添加した。この有機層を1Mの飽和重炭酸ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。トルエンを蒸発させて残渣のピリジンを除去した。この粗生成物をカラムクロマトグラフィー2MeOH/クロロホルム、5MeOH/CHCl3中Rf=0.5で精製した1.75g、95。コハク酸モノ-4-[ビス-4-メトキシ-フェニル-フェニル-メトキシメチル]-1-{6-[17-1,5-ジメチル-ヘキシル-10,13-ジメチル2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-テトラデカヒドロ-1Hシクロペンタ[a]フェナントレン-3-イルオキシカルボニルアミノ]-ヘキサノイル}-ピロリジン-3-イルエステルAH化合物AG1.0g、1.05ミリモルを無水コハク酸0.150g、1.5ミリモルおよびDMAP0.073g、0.6ミリモルと混合し、終夜40°Cの真空内で乾燥させた。該混合物を無水ジクロロエタン3mLに溶解し、トリエチルアミン0.318g、0.440mL、3.15ミリモルを添加し、この溶液をアルゴン雰囲気下で16時間、室温で撹拌した。次いで、これをジクロロメタン40mLで希釈し、氷冷クエン酸水溶液5重量、30mLおよび水2×20mLで洗浄した。該有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮乾固した。残渣をそのまま次のステップに使用した。コレステロール誘導体化CPGAIコハク酸AH0.254g、0.242ミリモルを、ジクロロメタン/アセトニトリル3:2、3mLの混合物に溶解した。その溶液に、アセトニトリル1.25mL中のDMAP0.0296g、0.242ミリモル、アセトニトリル/ジクロロエタン3:1、1.25mL中の2,2′-ジチオ-ビス5-ニトロピリジン0.075g、0.242ミリモルを順次添加した。得られた溶液に、アセトニトリル0.6mL中のトリフェニルホスフィン0.064g、0.242ミリモルを添加した。反応混合物の色が鮮やかな橙色に変わった。この溶液を、手首動作式振盪機wrist-actionshakerを使用して短く撹拌した5分。長鎖アルキルアミン-CPGLCAA-CPG1.5g、61mMを添加した。懸濁液を2時間撹拌した。焼結漏斗を通してCPGを濾過し、アセトニトリル、ジクロロメタン、およびエーテルで順次洗浄した。無水酢酸/ピリジンを使用して未反応のアミノ基を遮蔽した。達成されたCPGの装填を、UV測定値を取ることによって測定した37mM/g。5′-12-ドデカン酸ビスデシルアミドbisdecylamide基本明細書で5′-C32-と称されるまたは5′-コレステリル誘導体基本明細書で5′-Chol-と称されるを担持するsiRNAの合成は、コレステリル誘導体について、酸化ステップが、核酸オリゴマーの5′末端にホスホロチオエート結合を導入するために、Beaucage試薬を使用して行われたことを除いて、国際公開WO第2004/065601号に記載されるように行った。核酸配列を、標準的なヌクレオチド命名法、具体的には、表1の略語を使用して、以下に示す。表1:略核酸配列に使用されるヌクレオチドモノマーの略語の説明。これらのモノマーは、オリゴヌクレオチドが存在する場合、5′-3′-ホスホジエステル結合によって相互に結合することが理解されよう。共役したsiRNAコレステロールおよびビタミンE等のリガンドに共役されたsiRNAの調製を、スキーム1および2に示す。実施例2ATTRのsiRNA設計転写物siRNA設計は、ヒト記号TTRおよびラット記号Ttrからの遺伝子トランスチレチンを標的とするsiRNAを同定するように行われた。該設計は、NCBIRefseq収集からのTTRの転写物NM_000371.2配列番号1329ヒトおよびNM_012681.1配列番号1330ラットを使用した。それらのそれぞれのTTR遺伝子に100同一性がある、siRNA二重鎖を設計した。siRNA設計および特異性の予測全ての可能な19塩基merの予測された特異性を、それぞれの配列に対して決定した。TTRのsiRNAを、FASTAアルゴリズムを用いて、ヒトおよびラットのトランスクリプトームNCBIRefseqセット内のNM_およびXM_の記録のセットとして定義されるに対する包括的検索において使用した。次いで、PythonスクリプトオフターゲットFasta.pyを使用して、整列を解析し、siRNAと任意の潜在的オフターゲット転写物との間のミスマッチの位置および数に基づいてスコアを得た。該オフターゲットスコアは、分子の5′末端から2~9位での、siRNAの播種領域の差異を強調するように重み付けする。該オフターゲットスコアは、以下のとおり算出される。オリゴと転写物との間のミスマッチに、ペナルティーを課す。オリゴの2~9位での、播種領域のミスマッチには、2.8のペナルティーを課し、推定切断部位10および11のミスマッチには、1.2のペナルティーを課し、12~19位でのミスマッチには、1のペナルティーを課す。1位でのミスマッチは、考慮されない。次いで、それぞれのオリゴ転写物対のオフターゲットスコアが、ミスマッチのペナルティーを合計することによって計算される。次いで、全てのオリゴ転写物対からの最小オフターゲットスコアを決定し、オリゴのその後の分類に使用する。両方のsiRNA鎖を、算出したスコアに従って、特異性のカテゴリーに割り当てた。3を超えるスコアは、高度の特異性があり、3に等しいスコアは、特異性があり、2.2~2.8のスコアは、中程度の特異性があると見なす。どのオリゴが合成されるべきか選択するときに、アンチセンス鎖のオフターゲットスコアを、降順に並べ、ヒトからの最良の144個最小オフターゲットスコアオリゴ対、およびラットからの最良の26個の対を選択した。siRNAの配列選択ヒトTTRに由来する合計140個のセンスおよび140個のアンチセンスのsiRNAオリゴを合成し、二重鎖に形成した。ラットTTRに由来する合計26個のセンスおよび26個のアンチセンスのsiRNAオリゴを合成し、二重鎖に形成した。二重鎖を、表2~4ヒトTTRおよび表5~7ラットTTRに示す。TTR配列の合成1μモルの規模で、MerMade192合成機において、TTR配列を合成した。配列表の全ての配列については、エンドライト化学反応を以下の詳細のように適用した。センス鎖内の全てのピリミジンシトシンおよびウリジンは、対応する2′-O-メチル塩基2′O-メチルCおよび2′-O-メチルUと置換された。アンチセンス鎖では、リボAヌクレオシドに隣接する5′位に向かってピリミジンは、それらの対応する2-O-メチルヌクレオシドと置換された。センスおよびアンチセンス配列の両方の3′末端で、2つの塩基dTdTの拡張を導入した。配列ファイルをテキストファイルに変換し、MerMade192合成ソフトウェアにおける負荷に対して互換性を保つようにした。TTR配列の合成は、ホスホラミダイト化学反応を用いて、固定支持されたオリゴヌクレオチド合成を使用した。96ウェルプレート中の1umの規模で、上記の配列の合成を行った。アミダイト溶液を、0.1M濃度で調製し、エチルチオテトラゾールアセトニトリル中0.6Mを活性剤として使用した。合成した配列を切断し、第1のステップにおいてメチルアミン、および第2のステップにおいて、トリエチルアミン3HFを用いて、96ウェルプレート中に脱保護した。このようにして得られた粗配列を、アセトンとエタノールの混合液を用いて、沈殿させ、ペレットを、0.5M酢酸ナトリウム緩衝液中に再懸濁させた。それぞれの配列からの試料を、LC-MSによって分析し、得られる大量データにより配列の同一性を確認した。試料の選択されたセットはまた、IEXクロマトグラフィーによっても分析した。過程における次のステップは、精製であった。全ての配列は、Source15Qカラムを用いて、AKTAexplorer精製システムにおいて精製した。完全長配列に対応する単一ピークを、溶離液中に収集し、続いて、イオン交換クロマトグラフィーによって純度について分析した。AKTA精製機を用いて、SephadexG25カラム上に精製された配列を、脱塩した。脱塩したTTR配列を、濃度および純度について分析した。次いで、TTR-dsRNAを形成するために、単鎖をアニールした。実施例2BmRNA抑制に対するTTRのsiRNAのインビトロスクリーニングdsRNAを標的とするヒトTTR表2について、TTRのmRNAを定量化するために、qPCRリアルタイムPCRおよびbDNA分岐DNAアッセイを用いて、HepG2およびHep3B細胞内の内因性TTRの発現の阻害のアッセイを行った。dsRNAを標的とする齧歯類TTR表5を合成し、bDNAアッセイを用いて、H.4.II.E細胞内の内因性TTRの発現の阻害のアッセイを行った。単回用量アッセイからの結果は、IC50を計算するための用量反応実験用のTTRのdsRNA二重鎖のサブセットを選択するために使用した。IC50の結果は、さらなる試験用のTTRのdsRNAを選択するために使用した。細胞培養およびトランスフェクション:肝細胞株のHepG2、Hep3B、およびH.4.II.E細胞ATCC、Manassas,VAを、トリプシン処理によりプレートから放出される前に、10FBS、ストレプトマイシン、およびグルタミンATCCで補完されるダルベッコ改変イーグル培地ATCC中の5CO2の雰囲気下で、37°Cでほぼコンフルエントまで増殖した。また、H.4.II.E細胞も、イーグル最小必須培地中で増殖した。逆転写は、10μLのOpti-MEMに加えて、ウェル当たり0.2μLのLipofectamineRNAiMaxInvitrogen,CarlsbadCA.cat13778-150と一緒に、96ウェルプレート中に5μLのOpti-MEMをウェル当たり5μLのsiRNA二重鎖に添加することによって行われ、室温で15分間インキュベートした。次いで、4×104HepG2、2×104Hep3B、または2×104H.4.II.E細胞を含有する、抗生物質を含有しない、80μLの完全成長培地を添加した。RNA精製前に、細胞を、24時間インキュベートした。10nMの最終2倍濃度で単回用量実験を行い、10、1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001、0.00005、0.00001nMで用量反応実験を行った。MagMAX-96総RNA単離キットAppliedBiosystems,FosterCityCA,部品番号:AM1830を用いた総RNA単離:細胞は、採集され、140μLの溶解/結合溶液中で溶解され、次いで、EppendorfThermomixerを用いて850rpmで1分間混合した混合速度は、過程を通して同一であった。20マイクロリットルの磁気ビーズを、細胞溶解物に添加し、5分間混合した。磁気ビーズは、磁気スタンドを用いて捕捉し、ビーズを妨害することなく、浮遊物を除去した。浮遊物を除去した後、磁気ビーズを洗浄液1イソプロパノールを添加で洗浄し、1分間混合した。ビーズを再度捕捉し、浮遊物を除去した。次いで、ビーズを150μLの洗浄液2エタノールを添加で洗浄し、捕捉し、浮遊物を除去した。次いで、50μLのDNアーゼ混合物MagMaxturboDNaseBufferおよびTurboDNaseをビーズに添加し、それらを10~15分間混合した。混合後、100μLのRNA再生溶液を添加し、3分間混合した。浮遊物を除去し、磁気ビーズを150μLの洗浄液2で再度洗浄し、1分間混合し、浮遊物を完全に除去した。磁気ビーズを2分間混合し、RNAを50μLの水で溶離する前に乾燥させた。ABI高性能cDNA逆転写キットAppliedBiosystems,FosterCity,CA,Cat4368813を用いたcDNA合成:2μLの10×緩衝液、0.8μLの25×dNTP、2μLのランダムプライマー、1μLの逆転写酵素、1μLのRNase阻害剤、および反応当たり3.2μLのH2Oのマスターミックスを、10μLの総RNAに添加した。ステップ:25°Cで10分間、37°Cで120分間、85°Cで5秒間、4°Cで保持を通して、Bio-RadC-1000またはS-1000のサーマルサイクラーHercules,CAを用いて、cDNAを生成した。リアルタイムPCR法:2μLのcDNAを、MicroAmpOptical96ウェルプレートAppliedBiosystemscat4326659中のウェル当たり1μLの18STaqManプローブAppliedBiosystemsCat4319413E、1μLのTTRTaqManプローブAppliedBiosystemscatHS00174914M1、および10μLのTaqManUniversalPCRMasterMixAppliedBiosystemsCat4324018のマスターミックスを添加した。ΔΔCtRQアッセイを用いて、ABI7000PrismまたはABI7900HTリアルタイムPCRシステムAppliedBiosystemsにおいて、リアルタイムPCRを行った。全ての反応を、3重に行った。ΔΔCt法を用いて、リアルタイムデータを分析し、倍率変化を計算するために、10nMBlockIT蛍光オリゴInvitrogenCat2013または10nMAD-1955非哺乳動物のルシフェラーゼ遺伝子を標的とする対照二重鎖でトランスフェクションした細胞から行われたアッセイにたいして正規化した。分岐DNAアッセイ-QuantiGene1.0Panomics,Fremont,CA.cat:QG0004-齧歯類特異的な二重鎖をスクリーニングするために使用H.4.II.E細胞ATCCを、10nMsiRNAでトランスフェクションした。培地を除去した後、H.4.II.Eを、100uLの希釈した溶解混合物1容量の溶解混合物、2容量のヌクレアーゼを含有しない水、および20mg/mLの最終濃度に対して1mL当たり10uLのプロテイナーゼKの混合物で溶解し、次いで、65°Cで35分間インキュベートした。次いで、80μLの作業プローブセットTTRまたはGAPDHプローブの混合物および20uLの細胞溶解物を捕捉プレートに添加した。捕捉プレートを、53°C±1°Cで終夜約16~20時間インキュベートした。捕捉プレートは、1×洗浄緩衝液ヌクレアーゼを含有しない水、緩衝液の構成成分1、および洗浄緩衝液の構成成分2の混合物で3回洗浄し、次いで、1000rpmで1分間遠心分離を行うことによって乾燥させた。100μLの増幅作業用試薬を捕捉プレートに添加し、次いで、これを密閉し、46°C±1°Cで1時間インキュベートした。洗浄および乾燥ステップを、1時間インキュベートした後に繰り返し、100μLの標識溶液試薬を添加した。次いで該プレートを洗浄し、乾燥させ、100μLの基質ラウリル硫酸リチウムと基質溶液の混合物を添加した。捕捉プレートを46°C±1°Cで30分間インキュベーター中に入れた。次いで、捕捉プレートをインキュベーターから取り出し、室温で30分間インキュベートした。最終的に、VictorLuminometerPerkinElmer,Waltham,MAを用いて、捕捉プレートを読み取った。分岐DNAアッセイ-QuantiGene2.0Panomicscat:QS0011:全ての他の二重鎖をスクリーニングするために使用提示された用量で、24時間インキュベートした後、培地を取り出し、細胞を、100uLの溶解混合物1容量の溶解混合物、2容量のヌクレアーゼを含有しない水、および20mg/mLの最終濃度に対して10uLのプロテイナーゼK/mLの混合物中で溶解し、次いで、65°Cで35分間インキュベートした。次いで、20μLの作業プローブセット遺伝子標的用のTTRプローブおよび内因性対照用のGAPDHおよび80μLの細胞溶解物を捕捉プレートに添加した。捕捉プレートを55°C±1°Cで約16~20時間インキュベートした。翌日、該捕捉プレートを、1×洗浄緩衝液ヌクレアーゼを含有しない水、緩衝液の構成成分1、および洗浄緩衝液の構成成分2で3回洗浄し、次いで、240gで1分間遠心分離を行うことによって乾燥させた。100μLの事前増幅作業試薬を捕捉プレートに添加し、これをアルミホイルで密閉し、55°C±1°Cで1時間インキュベートした。1時間インキュベートした後、洗浄ステップを繰り返し、次いで、100μLの増幅作業試薬を添加した。1時間後、洗浄および乾燥ステップを繰り返し、100μLの標識プローブを添加した。捕捉プレートを、50°C±1°Cで1時間インキュベートした。次いで、該プレートを1×洗浄緩衝液で洗浄し、乾燥させ、次いで、100μLの基質を捕捉プレートに添加した。5~15分間インキュベートした後、SpectraMaxLuminometerMolecularDevices,Sunnyvale,CAを用いて、捕捉プレートを読み取った。bDNAデータ分析bDNAデータは、iそれぞれの3重の試料から平均バックグラウンドを減算し、ii得られる3重のGAPDH対照プローブおよびTTR実験プローブ値を平均し、次いで、iii比:実験プローブ-バックグラウンド/対照プローブ-バックグラウンドを得ることによって分析された。結果TTR-dsRNATTRのsiRNAにおける単回用量およびIC50の結果の概要を、下表8に示す。単回用量の結果は、HepG2細胞においてアッセイした、対照に対するTTRのmRNAの割合として表す。IC50は、表示されるように、HepG2および/またはHep3B細胞において決定した。5つのTTR-dsRNAAD-18258、AD-18274、AD-18324、AD-18328、およびAD-18339に対するIC50を特定するために使用された用量反応データを、下表9に詳細に示す。全て5つのsiRNAが、pM単位のIC50を有することが確認された。表8中のdsRNAに対するIC50データは、下表9に表したデータの要約である。齧歯類特異的なTTR-dsRNATTRのsiRNAに対する単回用量の結果の概要を、下表10に表す。単回用量の結果は、対照に対するTTRのmRNAの割合として表し、10nMで齧歯類特異的なTTRのsiRNAをトランスフェクションした後、ラットH.4.II.E細胞においてアッセイした。これらの結果は、幾つかの齧歯類特異的なTTRのsiRNAが、インビトロで内因性ラットTTRのmRNAを抑制するのに効果的であることを示す。実施例3TNF-αおよびIFN-αの分泌の誘発に対するTTRのsiRNAのインビトロアッセイ免疫刺激に対する潜在性を評価するために、TNF-αおよびIFN-αの分泌の誘発に対するTTRのsiRNAを、インビトロでアッセイした。ヒトPBMCは、標準フィコールハイパックFicoll-Hypaque密度遠心分離によって、健常なドナーから得た新たに回収したバフィーコートResearchBloodComponents,Inc.,Boston,MAから単離された。新たに単離された細胞1×105/ウェル/100μLを、96ウェルプレートに播種し、10加熱不活性化したウシ胎仔血清および1抗生物質/抗真菌Invitrogenで補完されるRPMI1640GlutaMax培地Invitrogenで培養した。DOTAPトランスフェクション試薬RocheAppliedScienceを用いて、siRNAをPBMCにトランスフェクションした。DOTAPは、まず、siRNAを含有する等容量のOpti-MEMと混合する前に、5分間Opti-MEMInvitrogen中で希釈した。製造業者の取扱説明書によって規定されるように、siRNA/DOTAP複合体をインキュベートし、続いて、PBMC50μL/ウェルに添加し、次いで、これを24時間培養した。陽性および陰性対照siRNAを、全てのアッセイに含んだ。AD-5048を、陽性対照siRNAとして使用した。AD-5048は、ヒトアポリポタンパク質BSoutscheketal.,2004を標的とする配列に対応し、このアッセイにおいて、IFN-αおよびTNF-αの両方の分泌を引き起こす。このアッセイにおいて、IFN-αおよびTNF-αの分泌を引き起こさない、AD-1955を、陰性対照siRNAとして使用した。全てのsiRNAを、133nMの最終濃度で使用した。RNAのトランスフェクション試薬に対する比は、DOTAPの1μg当たり16.5pモルであった。両方ともBenderMedSystemsVienna,AustriaからのIFN-αBMS216INSTおよびTNF-αBMS223INST用の市販のELISAキットを用いて、培養浮遊物中のサイトカインを、検出し、定量化した。TTRのsiRNAのサイトカイン誘発は、陽性対照siRNAAD-5048に対する、産生したIFN-αまたはTNF-αの割合として表される。多くのTTRのsiRNAに対するIFN-αおよびTNF-αの刺激結果を、図14重のウェル±標準偏差の平均および下表11AD-5048と比較した割合に表す。TTRのsiRNAは、培養したヒトPBMCによる誘発した有意なTNF-αまたはIFN-αの分泌は、評価されなかった。5つのTTR標的化リードdsRNATTRのsiRNAを、ヒト肝細胞株HepG2およびHep3Bにおいて、および免疫刺激活性の不在下で、pM範囲のIC50に基づいて選択した。いずれのミスマッチもない二重鎖は、オリゴとmRNAとの間でミスマッチがある二重鎖よりも標的転写物の有意なノックダウンを達成する可能性が高い。交差種毒物学的データのより良好な翻訳を可能にし、ヒト患者に対して広範な適用性を有するために、ラット、カニクイザル、およびヒトからのオーソロガス遺伝子において100同一性を有し、既知の多型を有する領域を標的としない、二重鎖が、一般に好ましい。5つのリード化合物は、pM範囲の肝細胞株におけるIC50に基づいて、免疫刺激活性の不在下で、ヒトTTR転写物への特異性、および二重鎖によって標的とされるmRNAの領域内で、既知の多型変異の不在下で選択された。TTRの場合は、ヒト、ラット、およびカニクイザルにおいて、完全な同一性がある、19塩基オリゴは見出されなかった。これらのデータの概要を、表12に表し、これにはまた、二重鎖および交差種反応性によって標的とされる領域内の既知のTTR変異の情報も含まれる。実施例4トランスジェニックマウスにおける、LNP01-18324、LNP01-18328、およびLNP01-18246による肝臓TTRのmRNAおよび血漿TTRタンパク質のインビボの低下2つのTTRのsiRNAであるAD-18324およびAD-18328を、インビボ評価のために選択した。これらの二重鎖は、肝細胞株例えば、HepG2における、インビボで有力な用量依存的な発現停止を示した。図2Aおよび図2Bは、AD-18324図2AまたはAD-18328図2Bでトランスフェクションした後の、HepG2細胞内の用量反応を示し、ここで、該用量は、x軸上にnMで表し、反応は、y軸上に、対照と比較した、画分TTRのmRNAの残存として表す。HepG2細胞では、AD-18324およびAD-18328のIC50は、それぞれ、2pMおよび3pMであると確認された。両方のリードdsRNA候補に対するTTR標的部位は、TTRのmRNAの3′非翻訳領域、文献で報告された変異がない領域内にある。表からの2つのリード候補のそれぞれの鎖の配列を、以下に再現する。鎖:s=センス、as=アンチセンス位置:NM_000371.2の転写物における5′位の塩基加えて、齧歯類交差反応性TTRのdsRNA、AD-18246をインビボでさらなる評価のために選択した。AD-18246は、オープンリーディングフレームの88位で開始する配列を標的とし、ここに、文献中に報告された3つの変異がある。HepG2細胞内のAD-18246に対する用量反応曲線を図3に示す。AD-18246は、実質的には、AD-18324およびAD-18328よりも有力ではなく、AD-18246のIC50は、265pMであると決定した。AD-18324、AD-18328、およびAD-18246を、LNP01に製剤化した後、トランスジェニックマウスに投与した。3~5月齢のH129-mTTR-KO/iNOS-KO/hTTRのトランスジェニックマウスマウストランスチレチンのノックアウト/誘導一酸化窒素シンターゼノックアウト/ヒトのトランスチレチントランスジェニックに、siRNAのAD-18324およびAD-18328に対して、1.0mg/kg、3.0mg/kg、または6.0mg/kgで、siRNAのAD-18246に対して、3.0mg/kgで、およびsiRNAのAD-1955に対して、6.0mg/kgの濃度で、尾静脈を介して、200μLのLNP01に製剤化したトランスチレチンに特異的なsiRNAAD-18324、AD-18328、またはAD-18246、非哺乳動物のルシフェラーゼ遺伝子を標的とするLNP01に製剤化した対照siRNAAD-1955、またはPBSを静脈内IV投与した。LNP01は、ND98、コレステロール、およびPEG-CeramideC16からなる脂質様製剤である。約40時間後、マウスに、200μLのケタミンで麻酔をかけ、次いで、右側の尾動脈を切断することによって採血した。全血は単離され、血漿は単離され、アッセイするまで-80°Cで保存された。肝組織は、収集され、急速冷凍され、処理するまで-80°Cで保存された。処置の有効性は、i投薬から48時間後、肝臓におけるTTRのmRNAの測定、ならびにii前採血および投薬から48時間後、血漿中のTTRタンパク質の測定によって評価された。TTR肝臓のmRNAレベルは、分岐DNAアッセイ-QuantiGene2.0Panomicscat:QS0011を利用してアッセイされた。簡潔に言えば、マウス肝臓の試料を粉砕し、組織溶解物を調製した。肝臓溶解混合物1容量の溶解混合物、2容量のヌクレアーゼを含有しない水、および20mg/mLの最終濃度に対して10uLのプロテイナーゼK/mLの混合物を、65°Cで35分間インキュベートした。次いで、20μLの作業プローブセット遺伝子標的用のTTRプローブおよび内因性対照用のGAPDHおよび80μLの細胞溶解物を捕捉プレートに添加した。捕捉プレートを55°C±1°C約16~20時間インキュベートした。翌日、該捕捉プレートを、1×洗浄緩衝液ヌクレアーゼを含有しない水、緩衝液の構成成分1、および洗浄緩衝液の構成成分2で3回洗浄し、次いで、240gで1分間遠心分離を行うことによって乾燥させた。100uLの事前増幅作業試薬を捕捉プレートに添加し、これをアルミホイルで密閉し、55°C±1°Cで1時間インキュベートした。1時間インキュベートした後、洗浄ステップを繰り返し、次いで、100μLの増幅作業試薬を添加した。1時間後、洗浄および乾燥ステップを繰り返し、100μLの標識プローブを添加した。捕捉プレートを、50°C±1°Cで1時間インキュベートした。次いで、該プレートを1×洗浄緩衝液で洗浄し、乾燥させ、100μLの基質を捕捉プレートに添加した。5~15分間インキュベートした後、SpectraMaxLuminometerを用いて、捕捉プレートを読み取った。bDNAデータは、それぞれの3重の試料から平均バックグラウンドを減算し、得られる3重のGAPDH対照プローブおよびTTR実験プローブ値を平均し、次いで、比:実験プローブ-バックグラウンド/対照プローブ-バックグラウンドをコンピュータで計算することによって分析された。TTR血漿中レベルは、製造業者のガイドラインに従って、市販のキットのAssayMaxヒトプレアルブミンELISAキットAssayPro,St.Charles,MO,CatalogEP3010-1を利用して、アッセイした。簡潔に言えば、マウス血漿は、1×混合希釈液中で1:10,000に希釈し、標準キットと共に前被覆されたプレートに添加し、室温で2時間インキュベートし、続いて、キットの洗浄緩衝液で5回洗浄した。50マイクロリットルのビオチン化プレアルブミン抗体を、それぞれのウェルに添加し、室温で1時間インキュベートし、続いて、洗浄緩衝液で5回洗浄した。50マイクロリットルのストレプトアビジン-ペルオキシダーゼコンジュゲートを、それぞれのウェルに添加し、室温で30分間インキュベートし、続いて、前述のように洗浄した。50μL/ウェルの停止溶液を添加することによって反応の停止を伴い、50μL/ウェルの発色基質を添加し、室温で10分間インキュベートすることによって、反応を生じさせた。450nmでの吸光度を、マイクロプレートリーダーMolecularDevices,Sunnyvale,CA上でを読み取り、データを、Softmax4.6ソフトウェアパッケージMolecularDevicesを利用して分析した。LNP01-18324およびLNP01-18328は、IVボーラス投与を伴う用量依存的な様式で、肝臓TTRのmRNA図4Aおよび血漿TTRタンパク質図4Bレベルを低下することが見出された。LNP01-18328のmRNAED50は、約1mg/kgであると決定され、一方、LNP01-18324のED50は、約2mg/kgであることが確認された。6mg/kgでの対照のLNP01-1955が、PBS群と比較して、肝臓TTRのmRNAレベルに有意に影響を及ぼさなかったため、LNP01-18324およびLNP01-18328の効果は特異的であった。LNP01-18324およびLNP01-18328は、PBS群と比較して、TTRのmRNAレベルにおけるものと同様の効力を有する、血漿TTRタンパク質レベルを低下させた。3mg/kgで、LNP01-18246は、3mg/kgのLNP01-18324またはLNP01-18328よりも少ない程度で肝臓TTRのmRNAレベルを低下させた。これらの結果は、IVボーラスにより投与された、LNP01-18324およびLNP01-18328が、実質的には、トランスジェニックマウス肝臓によって発現されたヒトTTRのmRNAを低下させ、血中循環中のヒトTTRタンパク質の低下をもたらすことを実証する。実施例5SNALP-18324およびSNALP-18328による非ヒト霊長類の肝臓中の野生型TTRのmRNAのインビボの低下非ヒト霊長類における、肝臓TTRのmRNAレベルのTTRsiRNAのAD-18324およびAD-18328の有効性を評価するために、該siRNAは、SNALPに製剤化され、15分間のIV注入によって投与された。カニクイザルMacacafascicularis2~5kg、1群当たり3匹の動物に、SNALP-183240.3、1.0、もしくは3.0mg/kg、SNALP-183280.3、1、もしくは3mg/kg、またはSNALP-19553mg/kg、非哺乳動物のルシフェラーゼ遺伝子を標的とする、陰性対照siRNAAD-1955を有するを15分間のIV注入で投与した。投薬から48時間後、サルに、ペントバルビタールナトリウムで麻酔をかけ、失血させた。TTRのmRNA決定に対する肝組織は、収集され、急速冷凍され、処理するまで-80°Cで保存された。特注の分岐DNAアッセイを利用して、およびQuantiGene1.0技術を利用して、肝臓中のTTRのmRNAレベルを、アッセイした。簡潔に言えば、サル肝臓の試料を粉砕し、組織溶解物を調製した。肝臓溶解混合物1容量の溶解混合物、2容量のヌクレアーゼを含有しない水、および20mg/mLの最終濃度に対して10uLのプロテイナーゼK/mLの混合物を、65°Cで35分間インキュベートした。次いで、20μLの作業プローブセット遺伝子標的用のTTRプローブおよび内因性対照用のGAPDHおよび80μLの細胞溶解物を捕捉プレートに添加した。捕捉プレートを55°C±1°Cで約16~20時間インキュベートした。翌日、該捕捉プレートを、1×洗浄緩衝液ヌクレアーゼを含有しない水、緩衝液の構成成分1、および洗浄緩衝液の構成成分2で3回洗浄し、次いで、240gで1分間遠心分離を行うことによって乾燥させた。100μLの事前増幅作業試薬を捕捉プレートに添加し、これをアルミホイルで密閉し、55°C±1°Cで1時間インキュベートした。1時間インキュベートした後、洗浄ステップを繰り返し、次いで、100μLの増幅作業試薬を添加した。1時間後、洗浄および乾燥ステップを繰り返し、100μLの標識プローブを添加した。捕捉プレートを、50°C±1°Cで1時間インキュベートした。次いで、該プレートを1×洗浄緩衝液で洗浄し、乾燥させ、次いで、100μLの基質を捕捉プレートに添加した。5~15分間インキュベートした後、SpectraMaxLuminometerを用いて、捕捉プレートを読み取った。bDNAデータは、iそれぞれの3重の試料から平均バックグラウンドを減算し、ii得られるGAPDH対照プローブおよびTTR実験プローブ値を平均し、次いで、iii比:実験プローブ-バックグラウンド/対照プローブ-バックグラウンドを得ることによって分析された。結果を図5に示す。SNALP-18324およびSNALP-18328は、陰性対照SNALP-1955と比較して、用量依存的な様式で、肝臓中のTTRのmRNAレベルを低下させた。SNALP-18328およびSNALP-18324のmRNAED50は、それぞれ、約0.3および約1mg/kgであると決定した。これらの結果は、SNALP-18324およびSNALP-18328が、IV注入による投与時に、非ヒト霊長類肝臓中の野生型TTRのmRNAを抑制するのに効果的であることを実証する。実施例6トランスジェニックマウスにおける、SNALP-18328による変異V30MTTRのmRNAおよびタンパク質のインビボの低下肝臓中の変異V30MTTRのmRNAおよび血清中の変異V30MTTRタンパク質における、TTRのsiRNAAD-18328の有効性を評価するために、AD-18328を、SNALPに製剤化し、V30MhTTRトランスジェニックマウスに、IVボーラスにより投与した。8~12週齢のV30MhTTRトランスジェニックマウス5匹の動物/群に、200μLのSNALP-183280.03、0.3、もしくは3mg/kg、SNALP-19553mg/kg、非哺乳動物のルシフェラーゼ遺伝子を標的とする、陰性対照siRNAAD-1955を有する、またはPBSを静脈内IV投与した。使用したマウスは、InstituteofMolecularandCellularBiology,Porto,PortugalからのMusmusculus株H129-hTTRKOであった。簡潔に言えば、hTTRH129トランスジェニックマウスを、H129内因性TTRKOマウスヌルマウスTTRのバックグラウンドにおいて、H129-hTTRトランスジェニックマウスを生成するためのヌルマウスMaeda,S.,2003,UseofgeneticallyalteredmicetostudytheroleofserumamyloidPcomponentinamyloiddeposition.AmyloidSuppl.1,17-20.と交配した。注射してから48時間後、全て5つの処置群の動物に、致死量のケタミン/キシラジンを与えた。血清試料は、収集し、分析するまで-80°Cで保存された。肝組織は、収集され、急速冷凍され、処理するまで-80°Cで保存された。TTRのmRNA定量化のために、冷凍の肝組織を粉末に粉砕し、溶解物を調製した。分岐DNAアッセイQuantiGeneReagentSystem,Panomics,Fremont,CAを用いることによって、GAPDHのmRNAレベルと比較したTTRのmRNAレベルを、溶解物中で決定した。簡潔に言えば、製造業者の取扱説明書に従って、組織試料の溶解物中のmRNAレベルを定量化するために、QuantiGeneアッセイGenospectraを使用した。TTRのmRNAの平均レベルを、それぞれの試料に対するGAPDHのmRNAの平均レベルに対して正規化した。次いで、正規化した値の群平均を、PBS処置群に対する平均値に対してさらに正規化し、TTRのmRNAの発現の相対レベルを得た。TTRタンパク質の定量化については、製造業者のプロトコルに従って、AssayProSt.Charles,MOのAssaymaxPreAlbuminELISAキットを用いて、血清をアッセイした。肝臓mRNAおよび血清タンパク質における結果を、それぞれ、図6Aおよび図6Bに示す。SNALP-18328で処置したV30MhTTRトランスジェニックマウスは、PBS対照群と比較して、肝臓TTRのmRNAレベルにおいて、用量依存的、かつ有意な低下があり、SNALP-18328の3mg/kgで、97p<0.001の最大低下率、およびSNALP-18328の約0.15mg/kgで、50低下ED50に達した。血清TTRタンパク質はまた、SNALP-18328の3mg/kgで、投薬前のレベルと比較して血清TTRタンパク質の99p<0.01の最大低下率を有する、用量依存的な様式で抑制され、これは、TTRのmRNAレベルの低下と一致した。3mg/kgでのSNALP-1955は、PBSと比較して、TTRのmRNAあるいはタンパク質レベルのいずれかにおいて統計的に有意な効果がなかった。これらの結果は、IV投与した時、SNALP-18328が、トランスジェニックマウス肝臓中の変異V30MTTRのmRNAを抑制するのに活性があり、血中循環中の変異V30MTTRタンパク質の低下をもたらすことを実証する。実施例7トランスジェニックマウスにおける、SNALP-18328によるTTRのmRNおよびタンパク質抑制の持続性SNALP-18328によるTTRのmRNAおよびタンパク質抑制の持続性を評価するために、AD-18328をSNALPに製剤化し、V30MhTTRトランスジェニックマウスにIVボーラス投与した。投薬後の種々の時点で、肝臓TTRのmRNAレベルおよび血清TTRのタンパク質レベルを定量化した。8~12週齢のV30MhTTRトランスジェニックマウス4匹の動物/群に、200μLのSNALP-183281mg/kg、またはSNALP-19551mg/kg、非哺乳動物のルシフェラーゼ遺伝子を標的とする、陰性対照siRNAAD-1955を有するを静脈内IV投与した。使用したマウスは、InstituteofMolecularandCellularBiology,Porto,PortugalからのMusmusculus株H129-hTTRKOであった。簡潔に言えば、hTTRH129トランスジェニックマウスを、H129内因性TTRKOマウスヌルマウスTTRのバックグラウンドにおいて、H129-hTTRトランスジェニックマウスを生成するためのヌルマウスMaeda,S.,2003,UseofgeneticallyalteredmicetostudytheroleofserumamyloidPcomponentinamyloiddeposition.AmyloidSuppl.1,17-20と交配した。投薬から3日目、8日目、15日目、または22日目に、両方の処置群の動物は、致死量のケタミン/キシラジンを与えられた。血清試料は、収集し、分析するまで-80°Cで保存された。肝組織は、収集され、急速冷凍され、処理するまで-80°Cで保存された。TTRのmRNA定量化のために、冷凍の肝組織を粉末に粉砕し、溶解物を調製した。分岐DNAアッセイQuantiGeneReagentSystem,Panomics,Fremont,CAを用いることによって、GAPDHのmRNAレベルと比較したTTRのmRNAレベルを、溶解物中で決定した。簡潔に言えば、製造業者の取扱説明書に従って、組織試料の溶解物中のmRNAレベルを定量化するために、QuantiGeneアッセイGenospectraを使用した。TTRのmRNAの平均レベルを、それぞれの試料に対するGAPDHのmRNAの平均レベルに対して正規化した。次いで、正規化した値の群平均を、PBS処置群に対する平均値に対してさらに正規化し、TTRのmRNAの発現の相対レベルを得た。TTRタンパク質の定量化については、製造業者のプロトコルに従って、AssayProSt.Charles,MOのAssaymaxPreAlbuminELISAキットを用いて、血清をアッセイした。肝臓mRNAおよび血清タンパク質における結果を、それぞれ、図7Aおよび図7Bに示す。hTTRV30Mトランスジェニックマウスにおいて、SNALP-18328の単回IVボーラス投与は、肝臓中のTTRのmRNAレベルおよび血清中のTTRタンパク質レベルの持続的な阻害をもたらした。対照群1mg/mLSNALP-1955と比較して、1mg/kgでのSNALP-18328の単回IV投与は、投薬から3日目、8日目、15日目、および22日目の相対的TTRのmRNAレベルを、それぞれ、96p<0.001、90p<0.001、82p<0.001、および73p<0.001で有意に低下させ、研究の終了時投薬から22日目に、基線レベルに戻らなかった。タンパク質レベルはまた、投薬から3日目で、SNALP-1955と比較して97p<0.001の血清TTRの最大の低下を伴い減少した。投薬から8日目、15日目、および22日目で、TTRタンパク質レベルは、SNALP-1955と比較して、それぞれ、72p<0.05、32p<0.05、および40p<0.001で抑制された。これらの結果は、SNALP-18328の単回IV投与は、V30MhTTRトランスジェニックマウスにおいて、標的肝臓mRNAおよび血清タンパク質レベルの持続的な抑制を生じ、投薬から22日目で、肝臓TTRのmRNAおよび血清TTRタンパク質の有意な低下を得ることを実証する。実施例8非ヒト霊長類における、SNALP-18328による血清TTRタンパク質および肝臓mRNA抑制の持続性SNALP-18328による血清TTRタンパク質抑制の持続性を評価するために、AD-18328をSNALPに製剤化し、非ヒト霊長類にIV注入により投与した。投薬後の種々の時点で、血清TTRのタンパク質レベルを定量化した。カニクイザルMacacafascicularisSNALP-18328群用のn=5匹の動物/群およびSNALP-1955群およびPBS群用のn=3匹の動物/群に、SNALP-183280.3、1、もしくは3mg/kg、SNALP-19553mg/kg、非哺乳動物のルシフェラーゼ遺伝子を標的とする、陰性対照siRNAAD-1955を有する、またはPBSを15分間のIV注入で投与した。投与期の0日目、1日目、2日目、3日目、4日目、5日目、7日目、10日目、および14日目で、血清試料は、収集され、分析まで-80°Cで保存された。ウエスタンブロット分析を使用して、血清試料中のTTRタンパク質レベルを評価した。それぞれの群からの血清試料は、プールされ、Laemmli試料緩衝液を用いて1:1に希釈したβ-メルカプトエタノールを1:20の希釈で添加した。該試料を95°Cで10分間加熱した。12.5μLのそれぞれの試料を、10~20CriterionBiorad,Hercules,CA調製用ゲルのそれぞれのレーンに装填し、120Vで1.5時間、SDS-PAGEにより分離し、次いで、15Vで1時間、セミドライシステムを用いて、ニトロセルロース膜に移した。1×PBSを用いて1:1に希釈したLiCORLincoln,NEブロッキング緩衝液中で、該膜を、終夜4°Cでブロックした。まず、ロッカーrocker上で室温で1時間、LiCORブロッキング緩衝液/PBS中で1:1000に希釈した希釈液で、該ブロットを、一次抗体SantaCruzSantaCruz,CAからのヤギ抗TTRでプローブした。ブロットは、PBS0.2Tween20を用いて4回洗浄した洗浄当たり10分間。蛍光標識二次抗体InvitrogenCarlsbad,CAからの抗ヤギ680nmを、LiCORブロッキング緩衝液/PBS中で1:10,000の希釈液で添加し、該ブロットを室温で1時間インキュベートした。インキュベートした後、ブロットを、PBS0.2Tween20で4回洗浄し、続いて、1ラPBSで1回洗浄した。Li-COR社のOdysseyInfraredImagingSystemを使用して、タンパク質バンドを検出した。TTRモノマーは、15kDaで移動する。結果を図8に示す。血清TTRのタンパク質レベルは、投薬前0日目のレベルと比較した場合、1または3mg/kgのSNALP-18328で用量依存的な低下を示した。SNALP-18328の単回IV投与後の、抑制の持続性は、1または3mg/kgのSNALP-18328での処置から少なくとも14日間である。これらの結果は、SNALP-18328の単回IV投与は、非ヒト霊長類カニクイザルMacacafascicularisにおいて、血中循環中のTTRタンパク質の持続的な抑制を生じ、投薬から14日目で、TTRタンパク質の有意な低下を得ることを実証する。SNALP-18328による肝臓TTRのmRNA抑制の持続性を評価するために、AD-18328をSNALPALN-TTR01に製剤化し、非ヒト霊長類に単回IV注入により投与した。肝臓mRNAレベルは、投与後3日目または30日目に、本明細書に記載されるとおりに測定した。これらの結果を、図20に示し、野生型TTRのmRNAのALN-TTR01の抑制が、非ヒト霊長類において、投薬量1.0および3.0mg/kgに対して3日後、ならびに10mg/kgの用量で30日間、持続性があることを実証する。実施例9トランスジェニックマウスにおける、SNALP-18328による末梢組織中の変異V30MTTRのインビボの低下予防有効性末梢組織中のTTRの低下におけるSNALP-18328ALN-TTR01の有効性を評価するために、hTTRV30M/HSF-1ノックアウトマウスを、TTRに対する免疫組織化学染色で評価した。2月齢のhTTRV30M/HSF-1ノックアウトマウスMaeda,S.,2003,UseofgeneticallyalteredmicetostudytheroleofserumamyloidPcomponentinamyloiddeposition.AmyloidSuppl.1,17-20に、0日目、14日目、28日目、および42日目での合計4回の投薬のために、2週間に1回の3mg/kgのSNALP-1832812匹の動物、3mg/kgのSNALP-1955非哺乳動物のルシフェラーゼ遺伝子を標的とする対照siRNAAD-1955を有する、4匹の動物、またはPBS4匹の動物をIVボーラス投与した。複数の末梢組織中のTTR肝臓mRNAレベルおよびTTR免疫活性は、56日目の、第1の投薬から8週間で評価された。マウスに、1mg/kgのメデトミジンで麻酔をかけ、致死量のケタミンを与えた。対象となる組織および臓器を収集した。免疫組織化学のために、食道E、胃S、腸十二指腸I1および結腸I4、神経N、ならびに後根神経節Dを、中性緩衝ホルマリン中で固定し、パラフィンで包埋した。TTR検出のために、ウサギ抗ヒトTTR一次抗体1:1000、DAKO,Denmark、および抗ウサギビオチン共役二次抗体1:20Sigma,USAを、TTRタンパク質に染色するために、extravidin標識体1:20,Sigma,USAが続いた。反応は、3-アミノ-9-エチルカルバゾール、AECSigma,USAを用いて生じさせた。基質の反応色によって占められる領域を測定し、総画像領域に対してのこの値を正規化する、Scionimagequantプログラムを用いて、免疫組織化学スライドの半定量分析を行った。占領領域の割合の平均値は、対応する標準偏差と共に表示する。それぞれの動物組織を、4つの異なる領域において評価した。胃および腸の副交感神経節中のヒトTTRの存在は、一次抗体としてウサギ抗ヒトTTR1:1000,DAKO,Denmarkおよびマウス抗PGP9.51:40,Serotec,USAで染色する二重免疫蛍光によって検査され、二次抗体は、それぞれ、抗ウサギAlexaFluor488Molecularprobes,UKおよびヤギ抗マウスAlexaFluor568Molecularprobes,UKであった。スライドは、vectashieldVectorと共に実装され、FITCおよびローダミン用のフィルターを装備するZeissCellObserverSystem顕微鏡CarlZeiss,Germany中で可視化された。結果を図9に図示する。PBSおよびSNALP-1955で処置した動物と比較して、SNALP-18328で処置した動物は、検査した全ての組織食道E、胃S、腸十二指腸I1および結腸I4、神経N、ならびに後根神経節Dにおいて、TTRの免疫活性の有意な低下を得た。これらの結果は、hTTRV30M/HSF-1ノックアウトマウスへのSNALP-18328投与は、食道、胃、腸十二指腸および結腸、神経、および後根神経節を含む、末梢組織および臓器において、TTRタンパク質の沈着の有意な低下を生じることを実証する。治療有効性ALN-TTR01を、成熟hTTRV30M/HSF-1ノックアウトマウスに投与して、変異ヒトTTRの沈着の回帰におけるTTRのsiRNA治療の効果を判定した。21月齢の動物群hTTRV30M/HSF-1ノックアウトマウスに、0日目、14日目、28日目、14日目、56日目、および70日目に、3mg/kgの用量で、ALN-TTR01または対照siRNAをIVボーラス投与した。77日目に、マウスに麻酔をかけ、組織を採取し、TTRの沈着物を、本明細書に記載のScionimagequantプログラムを用いて、免疫組織化学染色スライドの半定量分析によってアッセイした。食道、結腸、胃、坐骨神経、および後根神経節を検査し、これらの結果を、この動物モデルにおいて、歴史的データと比較し、これにより、この歳で組織中に存在するTTRの沈着とTTRの線維の両方を実証した。結果を図21のグラフに示す。結果は、TTRのsiRNAによる治療が、V30MhTTR組織沈着が存在する90を超える回帰をもたらすことを実証する。実施例10XTC-SNALP-18328による非ヒト霊長類の肝臓中の野生型TTRのmRNAのインビボの低下非ヒト霊長類において、siRNAの送達についての新規の脂質ナノ粒子製剤XTC-SNALPの有効性を評価するために、TTRのsiRNAAD-18328を、XTC-SNALPXTC-SNALP-18328に製剤化し、15分間のIV注入により投与し、肝臓TTRのmRNAを定量化した。カニクイザルMacacafascicularisに、XTC-SNALP-183280.03、0.1、0.3、または1mg/kgまたはXTC-SNALP-19551mg/kg、非哺乳動物のルシフェラーゼ遺伝子を標的とする対照siRNAAD-1955を有するを15分間のIV注入で投与した。投薬から48時間後、サルに、ペントバルビタールナトリウムで麻酔をかけ、失血させた。TTRのmRNA決定に対する肝組織は、収集され、急速冷凍され、処理するまで-80°Cで保存された。肝組織中のTTRのmRNAの定量化のために使用される方法は、上記の実施例5に記載されるものと同様であった。結果を図10に示す。XTC-SNALP-18328は、陰性対照XTC-SNALP-1955と比較して、用量依存的様式で、肝臓中のTTRのmRNAレベルを低下させた。mRNAED50は、約0.1mg/kgXTC-SNALP-18328であると決定した。これらの結果は、XTC-SNALP-18328が、IV注入による投与時に、非ヒト霊長類肝臓中の野生型TTRのmRNAを抑制するのに効果的であることを実証する。実施例11LNP09-18328およびLNP11-18328による非ヒト霊長類肝臓中の野生型TTRのmRNAのインビボの低下非ヒト霊長類において、siRNAの送達のために、2つの新規の脂質ナノ粒子製剤のLNP09およびLNP11の有効性を評価するために、TTRのsiRNAAD-18328を、LNP09LNP09-18328またはLNP11LNP11-18328に製剤化し、15分間のIV注入により投与し、肝臓TTRのmRNAおよび血清TTRのタンパク質レベルをアッセイした。カニクイザルMacacafascicularisに、LNP09-183280.03、0.1、もしくは0.3mg/kg、LNP11-183280.03、0.1、もしくは0.3mg/kg、またはPBSを、15分間のIV注入により投与した。肝臓生検試料は、投薬から48時間後に収集され、急速冷凍され、処理するまで-80°Cで保存された。血清は、投薬する前採血前、および投薬から1日目、2日目、4日目、7日目、14日目、21日目、および28日目に、収集され、処理するまで-80°Cで保存された。肝組織および血清TTRタンパク質の評価におけるTTRのmRNAの定量化に使用された方法は、上記の実施例5および8に記載のものと同様であった。結果は、mRNAについては、図11A、およびタンパク質については、図11Bおよび図11Cに示す。LNP09-18328およびLNP11-18328で処置した動物は、肝臓中のTTRのmRNAレベルの用量依存的な低下を示し、PBS対照と比較して、0.3mg/kgで、約85LNP09-18328および約90LNP11-18328のmRNAの最大低下率に達した。mRNAED50は、LNP09-18328およびLNP11-18328の両方において、約0.02mg/kgであると決定した。投薬から7日目で、血清試料もまた、PBS対照レベルと比較して、0.1および0.3mg/kgのLNP09-18328およびLNP11-18328に対して、TTRタンパク質の用量依存的な低下を示した。図11Cは、LNP09-18328の0.3mg/kgの用量を有するTTRタンパク質レベルの減少が、PBS対照群と比較して、および採血前の試料と比較して、投薬から少なくとも28日間にわたって存続することを示す。これらの結果は、LNP09-18328およびLNP11-18328が、IV注入による投与時に、非ヒト霊長類肝臓中の野生型TTRのmRNAおよび血中循環中の野生型TTRタンパク質を抑制するのに効果的であることを実証する。さらになお、LN09-18328による抑制は、持続し、IV注入から少なくとも28日間存続する。実施例12LNP12-18328による非ヒト霊長類の野生型TTRのmRNAのインビボの低下LNP12を製剤化したAD-18328を、非ヒト霊長類に投与して、この製剤の有効性を評価した。LNP12-18328製剤は、JeffsらJeffsLB,etal.2004AScalable,Extrusion-FreeMethodforEfficientLiposomalEncapsulationofPlasmidDNA.PharmRes22:362-372から編集されている方法を用いて調製した。簡潔に言えば、Tech-G1上述の、ジステアロイルホスファチジルコリンDSPC、コレステロール、およびmPEG2000-DMGを、50:10:38.5:1.5のモル比で90のエタノール中で可溶化した。siRNAを、0.4mg/mLの濃度で、10mMクエン酸塩、pH3緩衝液中で可溶化した。エタノール脂質溶液およびsiRNA水溶液は、等価低積流量で複式ポンプヘッドを備えた蠕動ポンプによって汲み上げられ、T分岐において混合された。脂質は、7:1wt:wtの総脂質のsiRNAに対する比率で、siRNAと組み合わされた。自然発生的に形成されたLNP12-18328製剤を、PBS155mMNaCl、3mMNa2HPO4、1mMKH2PO4、pH7.5に対して透析して、エタノールを除去し、緩衝液交換した。この製剤は、約90パーセントのsiRNA封入効率を有する平均粒子直径80nmを得た。カニクイザルn=3/群は、橈側皮静脈による15分間の静脈内注入5mL/kgとして、PBS、あるいは0.03、0.1、もしくは0.3mg/kgのLNP12-18328のいずれかを与えた。肝生検は、投与してから48時間後、動物から採取した。GAPDHのmRNAレベルに対するTTRのmRNAレベルを、本明細書に記載される肝臓試料中で判定した。図19に示すように、野生型トランスチレチンTTR遺伝子の高いレベルの特異的なノックダウンが、わずか0.03mg/kgの用量で観察された。これにより、LNP12製剤が、いかなる前述の肝臓への送達システムによって必要とされるものよりも数桁低い用量で、遺伝子の発現停止を促進することが実証された。実施例13TTRが並べられた配列の合成AD-18328の標的領域付近でTTR遺伝子を標的とされる、TTR二重鎖並べられたtiled二重鎖のセットを設計し、これは、NM_000371.3のヌクレオチド628で開始するヒトTTR遺伝子を標的とする。下の実施例では、転写物上のsiRNAの5′位の塩基を示す番号付けは、NM_000371.3図12、配列番号1331に基づく。上記の実施例では、ヒトsiRNAを標的とするsiRNAの番号付けは、NM_000371.2図13Aに基づく。NM_000371.3は、図14に示すように、NM_000371.2と比較して、110塩基まで5′UTRの配列を延在する。したがって、一例として、AD-18328の開始位置は、NM_000371.3上の628およびNM_000371.2上の518である図14。1μモルの規模で、MerMade192合成機において、TTRが並べられた配列を合成した。配列表の全ての配列については、エンドライト化学反応を以下の詳細のように適用した。センス鎖内の全てのピリミジンシトシンおよびウリジンは、2′-O-メチル塩基2′O-メチルCおよび2′-O-メチルUを含有した。アンチセンス鎖では、リボAヌクレオシドに隣接する5′位に向かってピリミジンは、それらの対応する2-O-メチルヌクレオシドと置換された。センスおよびアンチセンス配列の両方の3′末端で、2つの塩基dTdTの拡張を導入した。配列ファイルをテキストファイルに変換し、MerMade192合成ソフトウェアにおける負荷に対して互換性を保つようにした。合成、切断、および脱保護:TTR配列の合成は、ホスホラミダイト化学反応を用いて、固定支持されたオリゴヌクレオチド合成を使用した。96ウェルプレート中の1umの規模で、配列の合成を行った。アミダイト溶液を、0.1M濃度で調製し、エチルチオテトラゾールアセトニトリル中0.6Mを活性剤として使用した。合成した配列を切断し、第1のステップにおいてメチルアミン、および第2のステップにおいて、フッ化物試薬を用いて、96ウェルプレート中に脱保護した。粗配列は、アセトン:エタノール80:20の混合液を用いて、沈殿させ、ペレットを、0.2M酢酸ナトリウム緩衝液中に再懸濁させた。それぞれの配列からの試料を、定量化のための紫外線の同一性を確認するために、LC-MSによって、および純度を決定するために、IEXクロマトグラフィーによって選択された試料のセットを分析した。精製および脱塩:TTRが並べられた配列は、Source15Qカラムを用いて、AKTAexplorer精製システムにおいて精製した。65°Cのカラム温度を精製中維持した。試料の注射および収集を、96ウェル1.8mLの深いウェルプレート中で行った。完全長配列に対応する単一ピークを、溶離液中に収集した。AKTA精製器を用いて、SephadexG25カラム上に精製された配列を、脱塩した。濃度A260での紫外線測定によっておよび純度イオン交換HPLCによってのために、脱塩したTTR配列を、分析した。次いで、アニーリングのために単鎖を提出した。TTRの単鎖および二重鎖:TTRが並べられた二重鎖および対応する単鎖センスおよびアンチセンスの詳細な表を、下表表13に示す。実施例14TTRが並べられたsiRNAのインビトロスクリーニングTTRが並べられた二重鎖を、リアルタイムPCRアッセイを用いて、内因性TTRの発現の阻害のために、Hep3B細胞内でアッセイした。細胞培養およびトランスフェクション:Hep3B細胞ATCC、Manassas,VAを、トリプシン処理によりプレートから放出される前に、10FBS、ストレプトマイシン、およびグルタミンATCCで補完されるイーグル最小必須培地EMEM、ATCC中の5CO2の雰囲気下で、37°Cでほぼコンフルエントまで増殖した。96ウェルプレートの個々のウェル中に、5μLのOpti-MEMを5μLのそれぞれのsiRNAに添加することによって、逆転写を実行した。これに、10μLのOpti-MEMに加えて、0.2μLのLipofectamineRNAiMaxInvitrogen,CarlsbadCA.カタログ番号13778-150を、ウェルごとに添加し、混合物を室温で15分間インキュベートした。次いで、上記のものであるが、2.0×104Hep3B細胞を含有する抗生物質を含有しない、80μLの完全成長培地を添加した。RNA精製前に、細胞を、24時間インキュベートした。0.1または10nMの最終2重濃度で実験を行った。MagMAX-96総RNA単離キットAppliedBiosystems,FosterCityCA,部品番号:AM1830を用いた総RNA単離:細胞は、採集され、140μLの溶解/結合溶液中で溶解され、次いで、EppendorfThermomixerを用いて850rpmで1分間混合した混合速度は、過程を通して同一であった。20マイクロリットルの電磁ビーズおよび溶解/結合エンハンサーの混合物を、細胞溶解物に添加し、5分間混合した。磁気ビーズは、磁気スタンドを用いて捕捉し、ビーズを妨害することなく、浮遊物を除去した。浮遊物を除去した後、磁気ビーズを洗浄液1イソプロパノールを添加で洗浄し、1分間混合した。ビーズを再度捕捉し、浮遊物を除去した。次いで、ビーズを150μLの洗浄液2エタノールを添加で洗浄し、捕捉し、浮遊物を除去した。次いで、50μLのDNアーゼ混合物MagMaxturboDNaseBufferおよびTurboDNaseをビーズに添加し、それらを10~15分間混合した。混合後、100μLのRNA再生溶液を添加し、3分間混合した。浮遊物を除去し、磁気ビーズを150μLの洗浄液2で再度洗浄し、1分間混合し、浮遊物を完全に除去した。磁気ビーズを2分間混合し、RNAを50μLの水で溶離する前に乾燥させた。ABI高性能cDNA逆転写キットAppliedBiosystems,FosterCity,CA,Cat4368813を用いたcDNA合成:2μLの10×緩衝液、0.8μLの25×dNTP、2μLのランダムプライマー、1μLの逆転写酵素、1μLのRNase阻害剤、および反応当たり3.2μLのH2Oのマスターミックスを、10μLの総RNAに添加した。以下のステップを通して、Bio-RadC-1000またはS-1000のサーマルサイクラーHercules,CAを用いて、cDNAを生成した。25°Cで10分間、37°Cで120分間、85°Cで5秒間、4°Cで保持。リアルタイムPCR:2μLのcDNAを、LightCycler480384ウェルプレートRochecat0472974001中のウェル当たり、0.5μLのGAPDHTaqManプローブAppliedBiosystemsCat4326317E、0.5μLのTTRTaqManプローブAppliedBiosystemscatHS00174914M1、および10μLのRocheProbesMasterMixRocheCat04887301001を含有するマスターミックスに添加した。LightCycler480リアルタイムPCR機械Rocheにおいて、リアルタイムPCRを行った。それぞれの二重鎖を、2つの独立したトランスフェクションにおいて試験し、それぞれのトランスフェクションを二重でアッセイした。ΔΔCt法を用いて、リアルタイムデータを分析した。それぞれの試料を、GAPDHの発現に対して正規化し、非標的二重鎖AD-1955でトランスフェクションした細胞と比較してノックダウンを評価した。表14は、siRNAを用いた、TTRのノックダウンを示す。データは、AD-1955で標的とされた細胞に対して、メッセージの残存する割合として表される。AD-18328の標的近くのTTRを標的とする、多数ではあるが、全てではない並べられたTTR-dsRNAは、0.1nMで、Hep3B細胞にトランスフェクションされる場合、TTRのmRNA少なくとも70低下した。実施例15Sprague-Dawleyラットにおいて、SNALP-18534の単回静脈内投与の有効性における注入期間の評価目的Sprague-Dawleyラットにおいて、肝臓TTRのmRNAレベルにおけるSNALP-18534の単回IV注入の有効性における注入期間の効果を決定すること。上表からのAD-18534のセンス鎖およびアンチセンス鎖の配列を、以下に再現する。研究材料試験物質SNALP-18534は、標的組織に送達するために、安定な核酸脂質粒子SNALPに製剤化される、齧歯類TTRのmRNAAD-18534を標的とするsiRNAからなる。SNALP製剤脂質粒子は、新規のアミノ脂質DLinDMA、PEG化脂質mPEG2000-C-DMA、中性脂質DPPC、およびコレステロールからなる。SNALP製剤中の脂質:核酸の比は、約5.8:1w:wである。SNALP-1955は、SNALP-18534として同一の脂質粒子で製剤化される、非哺乳動物のルシフェラーゼmRNAを標的とするsiRNAを含有し、非薬理学的に活性な対照としての役割を果たす。用量レベルは、siRNA含有量の重量に基づいて、mg/kgとして表す。研究設計手順動物および試験物質の投与:研究は、Sprague-Dawleyラットの9つの群4匹の雄/群からなった。動物は、研究前の少なくとも2日間の順応期間が与えられ、全ての動物は、投薬開始時、7週齢であった。投与された用量は、1日目の投薬前に収集された体重データに基づいて計算された。試験および対照物質は、BaxterAS40A注射器ポンプに27Gテルモ翼状針を介して接続されたBaxter注射部位の隔膜で密閉された24G3/4のカニューレを用いて、尾静脈を介して、単回15分間、1時間、2時間、または3時間のIV注入として投与された。投与容量は、3mL/kgであり、注入速度は、12mL/kg/時であり、動物は、投薬中、ケージ中で自由に行動していた。ラットは、9つの処置群に分割され、表16に示されるように、SNALP-18534、SNALP-1955、またはPBSの単回IV注入で投与した。組織収集およびRNA単離:0日目に、イソフルレン吸入で動物に麻酔をかけ、投薬前の血液試料を、retro-orbitalbleedにより血清分離管に収集した。4°Cで遠心分離を行う前に、室温で約30分間、血液試料を凝固させた。次いで、血清試料は、分析が行われるまで、-80°Cで保存された。3日目に、全ての9つの処置群の動物に、致死量のケタミン/キシラジンを与えた。後大静脈を介して血清分離管に血液を収集し、次いで、4°Cで遠心分離を行う前に、室温で約30分間、凝固させた。血清試料は、分析が行われるまで、-80°Cで保存された。肝組織は、収穫され、ドライアイス上で瞬間凍結された。凍結された肝組織は、粉砕され、組織溶解物は、肝臓mRNAの定量化のために調製された。TTRのmRNAの定量化:分岐DNAアッセイQuantiGeneReagentSystem,Panomics,Fremont,CAを用いることによって、GAPDHのmRNAレベルと比較したTTRのmRNAレベルを、溶解物中で決定した。簡潔に言えば、製造業者の取扱説明書に従って、組織試料の溶解物中のmRNAレベルを定量化するために、QuantiGeneアッセイGenospectraを使用した。TTRのmRNAの平均レベルを、それぞれの試料に対するGAPDHのmRNAの平均レベルに対して正規化した。TTRのmRNAの発現の相対レベルを得るために、15分間、1時間、および2時間の注入時間でのSNALP-1955およびSNALP-18534処置群に対する群平均値は、次いで、15分間の注入時間でのPBS処置群に対する平均値に対して正規化され、一方、3時間の注入時間でのSNALP-1955およびSNALP-18534処置群に対する群平均値は、次いで、3時間の注入時間でのPBS処置群に対する平均値に対して正規化された。結果図16に示されるように、15分間~3時間の異なる注入時間での1mg/kgSNALP-18534の単回IV注入は、投薬から2日後に測定された肝臓TTRのmRNAレベルに匹敵する阻害をもたらす。1mg/kgSNALP-18534の単回IV注入はまた、SNALP-1955対照と比較した場合、15分間の単回IV注入から29日間にわたって持続的なTTRの下方調節を示したデータは示さず。PBS処置群と比較して、1mg/kgにて、SNALP-18534の単回15分間、1時間、2時間、または3時間のIV注入は、相対TTRのmRNAの発現レベルを、それぞれ、94p<0.001、94p<0.001、92p<0.001、および93p<0.001有意に低下させた。SNALP-18534活性の特異性は、同一の用量レベルで、1時間、2時間、または3時間のIV注入でのSNALP-1955投与による有意な標的阻害の欠如により実証される。結論本研究は、15分間から最長3時間の異なる注入時間が、肝臓中のTTRのmRNAレベルの低下により評価されるように、ラットにおいて、1mg/kgSNALP-18534の単回IV投与の有効性に影響を及ぼさないことを実証する。実施例16LNP07-18534およびLNP08-18534によるラット肝臓中の野生型TTRのmRNAのインビボの低下ラットにおいて、siRNAの送達のための2つの新規の脂質ナノ粒子製剤のLNP07およびLNP08の有効性を評価するために、齧歯類特異的なTTRのsiRNA、AD-18534が、LNP07LNP07-18534またはLNP08LNP08-18534に製剤化され、15分間のIV注入により投与され、肝臓TTRのmRNAが定量化された。Sprague-Dawleyラット群当たり4匹の動物に、LNP07-185340.03、0.1、0.3、もしくは1mg/kg、LNP08-185340.01、0.03、もしくは0.1mg/kg、または非哺乳動物のルシフェラーゼ遺伝子を標的とする陰性対照siRNAAD-1955を含有するLNP07-19551mg/kgもしくはLNP08-19550.1mg/kgの15分間のIV注入により投与された。48時間後、動物に麻酔をかけ、肝組織は、収集され、急速冷凍され、処理するまで-80°Cで保存された。TTRのmRNA定量化のために、冷凍の肝組織を粉末に粉砕し、溶解物を調製した。分岐DNAアッセイQuantiGeneReagentSystem,Panomics,Fremont,CAを用いることによって、GAPDHのmRNAレベルと比較したTTRのmRNAレベルを、溶解物中で決定した。簡潔に言えば、製造業者の取扱説明書に従って、組織試料の溶解物中のmRNAレベルを定量化するために、QuantiGeneアッセイGenospectraを使用した。TTRのmRNAの平均レベルを、それぞれの試料に対するGAPDHのmRNAの平均レベルに対して正規化した。次いで、正規化した値の群平均を、PBS処置群に対する平均値に対してさらに正規化し、TTRのmRNAの発現の相対レベルを得た。結果を図17に示す。LNP07-18534は、用量依存的な様式で、肝臓中のTTRのmRNAレベルを低下させ、1mg/kgでTTRのmRNAの94抑制を得た。1mg/kgで陰性対照LNP07-1955が、PBS対照と比較して、TTRのmRNAレベルに大きな影響を及ぼさなかったため、効果は、特異的であった。mRNAED50は、約0.05mg/kgのLNP07-18534であることが確認された。LNP08-18534は、用量依存的な様式で、肝臓中のTTRのmRNAレベルを低下させ、0.1mg/kgでTTRのmRNAの86抑制を得た。0.1mg/kgで陰性対照LNP08-1955が、PBS対照と比較して、TTRのmRNAレベルに大きな影響を及ぼさなかったため、効果は、特異的であった。mRNAED50は、約0.02mg/kgのLNP08-18534であることが確認された。これらの結果は、LNP07-18534およびLNP08-18534が、IV注入により投与された場合、ラット肝臓中の野生型TTRのmRNAを抑制するのに効果的であり、LNP07およびLNP08が、肝臓にsiRNAを送達するために効果的な製剤であることを実証する。実施例17Sprague-Dawleyラットにおいて、LNP09-18534またはLNP11-18534の単回静脈内投与によるTTR肝臓のmRNAの低下目的:内因性野生型肝臓TTRのmRNAレベルを低下させることに対する、Sprague-Dawleyラットにおける、齧歯類TTR特異的なsiRNAのAD-18534の送達のための2つの新規の脂質ナノ粒子LNP製剤の有効性を評価すること。ラットに、0.01、0.03、0.1、もしくは0.3mg/kgのLNP09-18534、LNP11-18534、またはリン酸緩衝食塩水PBSのいずれかで15分間の注入を介して静脈内に投与し、TTR肝臓のmRNAレベルを、処置から48時間後にアッセイした。材料および方法:LNP09製剤:XTC/DSPC/Chol/PEG2000-C14=50/10/38.5/1.5モル、脂質:siRNA約11:1。LNP11製剤:MC3/DSPC/Chol/PEG2000-C14=50/10/38.5/1.5モル、脂質:siRNA約11.1:1。組織収集およびRNA単離:3日目に、全ての処置群の動物に、致死量のケタミン/キシラジンを与えた。後大静脈を介して血清分離管に血液を収集し、次いで、4°Cで遠心分離を行う前に、室温で約30分間、凝固させた。血清試料は、分析が行われるまで、-80°Cで保存された。肝組織は、収穫され、ドライアイス上で瞬間凍結された。凍結された肝組織は、粉砕され、組織溶解物は、肝臓mRNAの定量化のために調製された。TTRのmRNAの定量化:分岐DNAアッセイQuantiGeneReagentSystem,Panomics,Fremont,CAを用いることによって、GAPDHのmRNAレベルと比較したTTRのmRNAレベルを、溶解物中で決定した。簡潔に言えば、製造業者の取扱説明書に従って、組織試料の溶解物中のmRNAレベルを定量化するために、QuantiGeneアッセイGenospectraを使用した。TTRのmRNAの平均レベルを、それぞれの試料に対するGAPDHのmRNAの平均レベルに対して正規化した。次いで、群平均値は、PBS処置群に対する平均値に対して正規化され、TTRのmRNAの発現の相対レベルを得た。結果:図18に示されるように、PBS処置動物と比較して、LNP09-18534およびLNP11-18534で処置した動物は、肝臓中のTTRのmRNAレベルの有意な用量依存的な低下を有し、PBC対照群と比較して、0.3mg/kgで、LNP09およびLNP11製剤化群の両方に対して、約90のmRNAの最大低下率に達し、用量は、LNP11-18534の0.03mg/kg未満で、LNP09-18534の0.1mg/kg未満で、50低下ED50に達した。結論本研究は、Sprague-Dawleyラットにおいて、LNP09-18534またはLNP11-18534の単回15分間のIV注入が、肝臓TTRのmRNAの用量依存的な低下をもたらすことを実証する。これらのデータは、内因性に発現した野生型TTRmRNAを、LNP11-18534およびLNP09-18534についてそれぞれ0.03mg/kg未満および0.1mg/kg未満のED50レベルで低下させる、LNP09-18534およびLNP11-18534の有効性を実証する。実施例18動物における毒性に対するアッセイALN-TTR01は、非GLPおよびGLP条件下で、安全性および毒物学のアッセイを行った。ALN-TTR01は、SNALP製剤DLinDMA/DPPC/コレステロール/PEG2000-cDMA57.1/7.1/34.4/1.4脂質:siRNA約7中のsiRNAAD-18328である。アッセイは、カニクイザル1、3、および10mg/kgおよびSprague-Dawleyラット0.3、1、3、および6mg/kgにおいて行われた。ラットにおいて1mg/kg以下で、NHPにおいて3mg/kg以下でALN-TTR01の毒性は見出されなかった。データは示さず。実施例19薬物製品ALN-TTR01薬物製品ALNTTR01Injectionは、等張リン酸緩衝生理食塩水中の脂質賦形剤安定核酸脂質粒子[SNALP]と称されるを含むsiRNAALN-18328の白色からオフホワイト色の均質な滅菌脂質懸濁液である。ALNTTR01の組成物は、下表に示される。脂質賦形剤は、下表に示される分子量および構造を有する。a別名:mPEG2000-C-DMAALNTTR01薬物製品は、5.5mLの充填量を有する10mLのガラス製バイアル中に包装されるバイアル当たり11mgのALN-18328。容器の閉鎖システムは、USP/EPのI型ホウケイ酸塩ガラス製バイアル、テフロン表面加工ブチルゴム栓、およびアルミニウム製フリップオフキャップからなる。薬物製品は、5±3°Cで保管される。薬物製品の安定性は、最長24ヶ月間アッセイされ、以下の基準を用いて判定される。外観:白色からオフホワイト色、均質な乳白色の液体、異物なしpH:6.8~7.8オスモル濃度:250~350mOsm/kg脂質:siRNA比:5.6~8.4mg/mg粒径Z-平均:60~120nm<0.15.実施例20ARPE19細胞におけるAD-18324によるインビトロでのヒトTTRのmRNAの発現の低下インビトロでのTTRのmRNAの発現におけるTTRのsiRNAの効果を判定するために、siRNAAD-18324およびAD-18534が、ヒト網膜色素上皮ARPE-19細胞において試験された。AD-18324は、ヒトTTRのsiRNAの二重鎖であり、AD-18534は、ラットTTRのsiRNAの二重鎖である。AD-18534およびAD-18324のセンスおよびアンチセンス鎖の配列を、以下に再現する。対照siRNAは、LUC遺伝子を標的とするAD-1955であった。ARPE-19細胞は、Lipofectamin2000Invitrogenを用いて、siRNAでトランスフェクションした。この方法の幾つかの実施形態において、コレステロールまたはアテロコラーゲンを含む、他のトランスフェクション剤を用いることができる。24時間インキュベーション後、50~60コンフルエントのARPE-19細胞は、製造業者の取扱説明書に従って、AD-18534またはAD-18324により一過性にトランスフェクションした。総RNAは、トランスフェクションの開始から48時間後、リアルタイム定量PCR法のために単離された。ARPE-19細胞は、1nM、10nM、もしくは50nMのAD-18534で、または1nM、10nM、もしくは50nMのAD-18324で投与された。TTRのmRNAの発現は、リアルタイム定量PCR法によって測定された。総RNAは、RNeasyMiniKitQiagenを用いることによってトランスフェクションした細胞から単離された。総RNA0.5μgは、製造業者のプロトコルに従って、ExScriptRT試薬TakaraBioInc.を用いることによってcDNAに逆転写させた。それぞれのPCR法は、SYBRPremixDimerEraserTakaraBioInc.を用いて、LightCyclerSystemにおいて、2μLのcDNAおよび0.2μmol/Lのそれぞれのプライマーを用いて実施された。以下のプライマーが使用された:ヒトTTR順方向:5′-CATTCTTGGCAGGATGGCTTC-3′配列番号1415、逆方向:5′-CTCCCAGGTGTCATCAGCAG-3′配列番号1416。ヒトTTRのmRNAの発現は、ARPE-19細胞におけるヒトGAPDHの発現レベルと比較して算出された。ヒトTTRのmRNAの発現は、用量依存性様式で、AD-18324によって著しく低下した。結果を図22に示す。1nM用量のAD-18324は、対照siRNA群と比較して、ヒトTTRのmRNAの相対的発現の少なくとも10低下をもたらした。10nM用量のAD-18324は、対照siRNA群と比較して、ヒトTTRのmRNAの相対的発現の少なくとも40低下をもたらした。50nM用量のAD-18324は、対照siRNA群と比較して、ヒトTTRのmRNAの相対的発現の少なくとも60低下をもたらした。AD-18534は、それぞれの用量で、ヒトTTRの相対的発現において顕著な低下を生じなかった。対照と比較して、Il-6またはTNF-αレベルにおける効果がなかった。これらの結果は、AD-18324が、用量依存性様式で、ヒト網膜色素上皮ARPE-19細胞において、ヒトTTRのmRNAの発現を阻害するするのに有効であり、炎症反応を生じないことを実証する。実施例21ダークアグーチDAラットにおけるAD-18534による内因性ラットTTRのmRNAの発現のインビボの低下内因性ラットTTRのmRNAの発現におけるラットTTRのsiRNAの効果を判定するために、二重鎖AD-18534が、ダークアグーチDAラットにおいて、インビボで試験された。AD-18534のセンスおよびアンチセンス鎖の配列は、上述される。DAラットは、AD-18534をそれらの硝子体腔中に注射した。成熟ラットを、ジエチルエーテル吸入によって麻酔した。瞳孔を拡張するために、1~2滴の1のトロピカミドをラットの眼に適用した。Hamiltonシリンジおよび33ゲージの針を用いて、siRNAの硝子体内注射を実施した。注射した体積は、硝子体体積が、できる限り正常に近い状態であるように、5μLであった。24時間後、ラットは、ジエチルエーテル吸入によって殺処分され、眼は、その後の解離のために採取された。眼は、角膜および水晶体を別々にして、後嚢カップに入れた。RPE-脈絡膜-強膜の複合体を、分析用の後嚢カップから網膜を除去することによって単離した。他の方法を用いて、siRNA送達を最適化することができ、これには、用量の量または用量の時期を変更することが含まれる。幾つかの実施形態において、注射方法は、結膜下腔または網膜下を含む、眼の別の部分で起こる場合がある。他の実施形態において、注射した生理食塩水またはsiRNAの量は、増加させてもよい。ラットのTTRのmRNAの発現は、リアルタイム定量PCR法qPCRによって測定された。総RNAは、RNeasyMiniKitQiagenを用いることによってそれぞれのRPE-脈絡膜-強膜の複合体から単離された。総RNAは、ExScriptRT試薬TakaraBioInc.を用いることによってcDNAに逆転写させた。それぞれのPCR法は、SYBRPremixDimerEraserTakaraBioInc.を用いて、LightCyclerSystemにおいて行われた。以下のプライマーが使用された:ラットTTR順方向:5′-TGCCTCGCTGGACTGATATTTG-3′配列番号1417;逆方向:5′-TTGAACACTTTCACGGCCACA-3′配列番号1418。ラットTTRのmRNAの発現は、ラットGAPDHの発現レベルと比較して算出された。図23は、対照siRNA、生理食塩水、または非処置を投与されたDAラットと比較して、AD-18534を注射した後のDAラットにおける、内因性ラットTTRのmRNAの発現の阻害を示すp<0.01。AD-18354で処置したDAラットは、対照siRNA群および生理食塩水対照群と比較して、内因性ラットTTRのmRNAの発現において、少なくとも60低下を示したp<0.01。これらの結果は、AD-18354が、DAラットの網膜色素上皮細胞において、内因性ラットTTRのmRNAの発現を抑制するのに活性があることを実証する。実施例22ATTRV30MトランスジェニックTgラットにおける、AD-18324によるATTRのmRNAの発現のインビボの低下ヒト変異体V30MATTRのmRNAの発現におけるTTRのsiRNAのAD-18324の効果を評価するために、AD-18324は、ATTRのV30MトランスジェニックTgラットの網膜色素上皮細胞において、インビボで試験された。ヒトATTRのV30M遺伝子を保有するトランスジェニックラットは、それらの硝子体腔中に、AD-18324を注射した。Hamiltonシリンジおよび33ゲージの針を用いて、AD-18324のsiRNAの硝子体内注射を実施した。24時間後、ATTRのV30MTgラットは、ジエチルエーテル吸入によって殺処分され、眼は、その後の解離のために採取された。眼は、角膜および水晶体を別々にして、後嚢カップに入れた。ATTRのmRNAの発現におけるAD-18324の効果を評価するために、網膜を後嚢カップから取り出すことによって、RPE-脈絡膜-強膜の複合体を単離した。AD-18324のsiRNAを、33ゲージの針を用いて、硝子体腔中に、注射した。24時間後、網膜色素上皮を単離して、ATTRのmRNAの発現におけるAD-18324の効果を評価した。ATTRのmRNAの発現は、リアルタイムPCR法によって測定された。総RNAは、ExScriptRT試薬TakaraBioInc.を用いることによってcDNAに逆転写させた。それぞれのPCR法は、PremixExTaqTakaraBioInc.を用いて、LightCyclerSystemにおいて行われた。以下のプライマーが使用された:ヒトTTR順方向:5′-GCCGTGCATGTGTTCAGA-3′配列番号1419、逆方向:5′-GCTCTCCAGACTCACTGGTTTT-3′配列番号1420。プローブが、UniversalProbeLibraryプローブ番号66、RocheDiagnosticsによって提供された。ATTRのmRNAの発現は、ATTRのV30MTgラットにおけるラットGAPDHの発現と比較して算出された。図24は、対照siRNA群、生理食塩水群、および非処置群と比較した、ATTRのV30MTgラットのRPE細胞におけるATTRのmRNAの発現の有意な低下を示す。ATTRのmRNAの発現は、非処置群と比較して、少なくとも60低下した。ウエスタンブロット分析を用いて、ATTRタンパク質の発現を評価した。ラットから等量の水性の体液タンパク質を、12のSDS-PAGEによって分画し、ニトロセルロース膜Bio-RadLaboratoriesに移した。膜を、2.5の無脂肪乳でブロックし、ウサギポリクローナル抗TTRであった一次抗体希釈1:1000、Dakoで、4°Cで終夜インキュベートし、続いて、二次反応として、西洋ワサビペルオキシダーゼ共役したヤギ抗ウサギ免疫グロブリン抗体希釈1:1000、Dakoで、室温で1時間インキュベートした。免疫複合体は、ECLウエスタンブロット検出システムGEHealthcareBio-Scienceを用いて可視化した。結果を図25に示す。ATTRタンパク質の発現は、対照siRNAの注射後、ATTRタンパク質の発現と比較して、AD-18324により有意に低下した。これらの結果は、ATTRのV30MTgラットにおけるAD-18324の硝子体内注射が、ヒトTTRのmRNAおよびRPEにおけるタンパク質の発現を有意に低下させることを実証する。実施例23コレステロールとコンジュゲートしたAD-18534を用いたダークアグーチDAラットにおける内因性ラットTTRのmRNAの発現のインビボの低下内因性ラットTTRのmRNAの発現におけるコレステロールとコンジュゲートしたラットTTRのsiRNAの効果を判定するために、二重鎖AD-23043が、ダークアグーチDAラットにおいて、インビボで試験された。AD-23043は、以下の配列を有するコレステロールとコンジュゲートしたsiRNAである。DAラットは、AD-23043をそれらの硝子体腔中に注射された。成熟ラットを、ジエチルエーテル吸入によって麻酔した。瞳孔を拡張するために、1~2滴の1のトロピカミドをラットの眼に適用した。Hamiltonシリンジおよび33ゲージの針を用いて、siRNA5μgの硝子体内注射を実施した。注射した体積は、硝子体体積が、できる限り正常に近い状態であるように、5μLであった。14日または21日後、ラットは、ジエチルエーテル吸入によって殺処分され、眼は、その後の解離のために採取された。眼は、角膜および水晶体を別々にして、後嚢カップに入れた。RPE-脈絡膜-強膜の複合体を、分析用の後嚢カップから網膜を除去することによって単離した。ラットのTTRのmRNAの発現は、リアルタイム定量PCR法qPCRによって測定された。総RNAは、RNeasyMiniKitQiagenを用いることによってそれぞれのRPE-脈絡膜-強膜の複合体から単離された。総RNAは、ExScriptRT試薬TakaraBioInc.を用いることによってcDNAに逆転写させた。それぞれのPCR法は、SYBRPremixDimerEraserTakaraBioInc.を用いて、LightCyclerSystemにおいて行われた。以下のプライマーが使用された:ラットTTR順方向:5′-TGCCTCGCTGGACTGATATTTG-3′配列番号1424;逆方向:5′-TTGAACACTTTCACGGCCACA-3′配列番号1423。ラットTTRのmRNAの発現は、ラットGAPDHの発現レベルと比較して算出された。結果を図26および図27に示す。ラットTTRを標的とするコレステロール共役したsiRNAは、対照siRNAと比較して、内因性ラットTTRの発現を約40低下させた。実施例24ヒトにおける眼アミロイドーシスの処置ヒトにおける眼アミロイドーシスの治療のために、本発明において使用された医薬組成物は、処置の侵襲性に依存して、および局所的または全身的治療が望ましいかどうかに基づいて、多くの方法において投与することができる。好ましい初期治療は、点眼、軟膏、経口投与、または注入によって実施することができる。非経口投与には、皮下眼瞼、結膜下注射、テノン嚢下注射、球後注射、前房注射、硝子体注射、または眼血管注射が含まれる。"