タンパク質の凍結乾燥化形態の熱処理によるウイルス不活性化工程を包含する、寒冷沈降性タンパク質を得るための方法であって、該タンパク質を凍結乾燥化形態へ変換する前に、該タンパク質へ、アルギニン、少なくとも1つの疎水性アミノ酸およびクエン酸三ナトリウムの混合物を含む安定化および可溶化製剤を添加する初期工程を包含することを特徴とする、方法。前記製剤が、アルギニン、少なくとも1つの疎水性アミノ酸およびクエン酸三ナトリウムの前記混合物から構成されることを特徴とする、請求項1に記載の方法。前記アルギニンが25~50g/lの濃度で存在することを特徴とする、請求項1または2に記載の方法。前記アルギニンの濃度が35~45g/lであることを特徴とする、請求項3に記載の方法。前記クエン酸三ナトリウムが0.5~約12g/lの濃度で存在することを特徴とする、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。前記疎水性アミノ酸がロイシン、イソロイシンまたはそれらの混合物であることを特徴とする、請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。前記ロイシン、イソロイシンまたはそれらの混合物が、5~15g/lの濃度で存在することを特徴とする、請求項6に記載の方法。前記ロイシンまたはイソロイシンあるいはそれらの混合物の濃度が、9~11g/lであることを特徴とする、請求項6または7に記載の方法。グリシンおよび/またはリシンが前記製剤に添加されていることを特徴とする、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。グリシンおよびリシンが、各々、1~5g/lの濃度で存在することを特徴とする、請求項9に記載の方法。グリシンおよびリシンのこれらの濃度の各々が、1.5~2.5g/lであることを特徴とする、請求項10に記載の方法。前記凍結乾燥が、-40°C~-30°Cの温度で48時間行われることを特徴とする、請求項1~11のいずれか1項に記載の方法。前記ウイルス不活性化の熱処理が、80°C~90°Cの温度で72時間行われることを特徴とする、請求項1~12のいずれか1項に記載の方法。前記寒冷沈降性タンパク質の液体組成物への安定化および可溶化製剤の添加前に、ウイルス不活性化ならびに/あるいは溶媒-洗浄剤によるおよび/または35nmのフィルターにおけるナノ濾過による該液体組成物からの除去のうち少なくとも1つの追加の工程を更に包含することを特徴とする、請求項1~13のいずれか1項に記載の方法。全ての寒冷沈降性タンパク質に適用可能であることを特徴とする、請求項1~14のいずれか1項に記載の方法。第VIII因子、フォンビルブラント因子、第XIII因子、フィブリノーゲンおよびフィブロネクチンから選択されるタンパク質の少なくとも1つに適用可能であることを特徴とする、請求項1~15のいずれか1項に記載の方法。請求項1~16のいずれか1項に記載の方法によって導入された安定化および可溶化製剤を含む少なくとも1つの寒冷沈降性タンパク質の濃縮物。治療的使用に意図される請求項17に記載の濃縮物。80°C~90°Cの温度での熱処理および再溶解後、得られる溶液が、0.20±0.02μmの多孔性を有するフィルターにおいて約2ml/cm2の濾過性を有することを特徴とする、請求項17または18に記載の凍結乾燥化フィブリノーゲン濃縮物。アルギニン、少なくとも1つの疎水性アミノ酸およびクエン酸三ナトリウムの混合物を含むことを特徴とする、凍結乾燥およびウイルス不活性化の熱処理へ供されるように意図される寒冷沈降性タンパク質のための安定化および可溶化製剤。アルギニン、少なくとも1つの疎水性アミノ酸およびクエン酸三ナトリウムの前記混合物から構成されることを特徴とする、請求項20に記載の安定化および可溶化製剤。従って、凝固および止血を担ういくつかのタンパク質特に、寒冷沈降性タンパク質の医療的必要性を考慮して、本出願人は、寒冷沈降性タンパク質の液体組成物へ添加されると、一方で、その凍結乾燥の間および後、全ての考慮される問題の活性タンパク質に、そして他方で、ウイルス破壊に必要な熱的衝撃に対して、十分な保護を付与し、そして、同時にinthetime、これらのタンパク質の凍結乾燥化形態の再可溶化の短縮された時間を可能にする、治療的使用と適合性の、単純な、炭水化物フリーかつトリス緩衝液フリーの組成物を開発することを試みた。この目的のために、寒冷沈降性タンパク質の液体組成物へのアルギニンの添加が、凍結乾燥の間および後に保護的効果を提供すると共に、それらの凍結乾燥化形態の溶解を可能にするが、ウイルスの不活性化の熱処理に対するそれらの安定性を確実にしないことを考慮して、本出願人は、アルギニンへのその添加が熱変性に対する保護を提供する、単独または混合物の、種々の化合物を検査した。従って、本出願人は、驚くべきことに、アルギニン非常に親水性のアミノ酸へ、KyteらJMolBiol1571051321982に従う最も疎水性の酸から好ましくは選択される少なくとも1つの疎水性アミノ酸とクエン酸三ナトリウムとを添加することが、ウイルス不活性化の熱処理後の凍結乾燥化形態の可溶化の顕著な改善と共に、凍結乾燥の間および後の寒冷沈降性タンパク質の安定化を可能にすることを見出した。従って、本発明は、タンパク質の凍結乾燥化形態の熱処理によるウイルス不活性化工程を包含する、寒冷沈降性cryoprecipitableタンパク質を得るための方法であって、該タンパク質を凍結乾燥化形態へ変換する前に、該タンパク質へ、アルギニン、少なくとも1つの疎水性アミノ酸およびクエン酸三ナトリウムの混合物を含む安定化および可溶化製剤stabilizingandsolubilizingformulationを添加する初期工程を包含することを特徴とする方法に関する。従って、本発明の方法における安定化および可溶化製剤の添加は、凍結乾燥およびウイルス不活性化の熱処理後、該最後の1つが厳しいとしても、血漿から得られる寒冷沈降性タンパク質の生物学的活性の満足ゆくレベルを維持することを可能にし、そして、短縮された再溶解時間を可能にすると共に、凍結乾燥化形態の再構成された溶液の透明性を保存する。その上、この製剤は、かなりの時間の節約を伴う、容易性、普遍性および工業規模での容易な実施という利点を有する。好ましくは、本発明の方法において使用される安定化および可溶化製剤は、前記アルギニン、少なくとも1つの疎水性アミノ酸およびクエン酸三ナトリウムの比類のない混合物から構成される。これら3つの化合物からもっぱら構成されるこのような製剤は、最小であるが有効な数の添加物の存在のおかげで、特に、工業規模における製造の減少された時間および費用を伴うという利点を示す。任意の疎水性アミノ酸前述のKyteらに従う、例えば、バリンおよびフェニルアラニンが、本発明の枠内において好適であるが、有利な選択はロイシン、イソロイシンまたはそれらの混合物である。安定化および可溶化製剤はまた、一方で、上述の処理前に寒冷沈降性タンパク質の液体組成物のpHを調節することを可能にし、そして、他方で、その保護効果を増大させることを可能にするクエン酸三ナトリウムを含有する但し、濃度が調節される。最後に、グリシンおよび/またはリシンが、該安定化および可溶化製剤に更に添加され得る。また、必要であれば、当該分野において公知の安定化添加剤stabilizingadditivesが添加され得る。本発明の文脈において、問題の3成分の混合物を含む安定化および可溶化製剤は、寒冷沈降性タンパク質の液体組成物へ添加され得るか、あるいは、寒冷沈降性タンパク質が、問題の3成分の混合物を含む該製剤の水溶液に溶解され得る。該安定化製剤のために考慮される種々の添加剤の濃度は、期待される安定化効果を得る目的をもって当業者によって選択される。有利には、寒冷沈降性タンパク質の液体組成物1リットル当たりの各添加剤の濃度は、以下である:-アルギニン、25~50g/lそして好ましくは35~45g/l米国特許5399670を参照;-クエン酸三ナトリウム、0.5~約12g/l;-ロイシン、イソロイシンおよびそれらの混合物、5~15g/l、そして好ましくは9~11g/l;ならびに-グリシンおよび/またはリシン、各々、1~5g/l、そして好ましくは1.5~2.5g/l。本発明の枠内において、タンパク質の予め凍結された液体組成物の凍結乾燥は、当業者に公知の実施条件に従って、現在の装置を使用しての従来の方法に従って行われる。有利には、凍結乾燥は、-40°C~-30°Cの温度で約48時間行われる。ウイルス不活性化の熱処理は、ウイルスを効果的に不活性化するような様式で行われる。それは、好ましくは、80°C~90°Cの温度で72時間行われる。ウイルス不活性化の熱処理は、ウイルスフリー凍結乾燥化プロダクトを得ることを可能にするが、該方法は、ウイルスの全体のおよび完全な不活性化および除去を最終的に確実にするために、寒冷沈降性タンパク質の液体組成物への安定化および可溶化製剤の添加の工程の前に、少なくとも1つの追加のウイルス不活性化ならびに/あるいは溶媒洗浄剤および/またはナノ濾過例えば、35nmのフィルターにおけるによる該液体組成物の除去工程を包含し得る。従って、該方法の実施は、凍結乾燥化およびウイルス不活性化寒冷沈降性タンパク質へと導き、これは、液体の薬学的に適合性の媒体例えば、注射用精製水中に一旦再構成されると、患者へ直接注射され得る。この寒冷沈降性タンパク質の治療品質は、該安定化および可溶化製剤のおかげで得られ、これは、全ての上述の処理特に、ウイルス不活性化および除去処理の使用を可能にすると共に、これらの処理された寒冷沈降性タンパク質の生物学的活性および該凍結乾燥化形態の溶解特性が維持される。本発明の方法に従って使用される安定化および可溶化製剤は、当業者に公知の血漿分別法によって得られる、寒冷沈降性タンパク質例えば、第VIII因子、フォンビルブラント因子、第XIII因子、フィブリノーゲンおよびフィブロネクチンに適用する。該安定化および可溶化製剤はまた、WickerhauserらVoxSang3518311978によって記載されるような、トリス緩衝液における可溶化/抽出およびアルミナゲルにおける吸着によって例えば得られる、半精製タンパク質の種々の濃縮物に適用する。第VIII因子およびフォンビルブラント因子に富む、このようにして得られる濃縮物は、特許EP0094611に開示される条件下で加熱され得る。この製剤はまた、凝固因子の各々に富む精製タンパク質またはフラクション例えば、例えば特許EP0359593に開示されているクロマトグラフィー方法の実施後に特に得られるものの安定化および可溶化に好適であり、その後凍結乾燥されそしてウイルス不活性化の熱処理に供される。その上、この製剤は、KislerらVoxSang71962414424によって記載されるような、冷アルコール沈降反応coldalcoholprecipitationによって血漿の寒冷沈降物からまたは血漿から得られる精製フィブリノーゲンの安定化に好適である。本発明の文脈において、当業者に公知の任意の分別技術による寒冷沈降物からのフィブリノーゲンの精製の間、その治療的活性に損傷を与えない、低含有量の第XIII因子FXIIIが常に伴うことに注意すべきである。この方法は、特に有利であり、何故ならば、それが、全ての寒冷沈降性タンパク質、あるいはそれから、そして特に、第VIII因子、フォンビルブラント因子、第XIII因子、フィブリノーゲンおよびフィブロネクチンから選択される少なくとも1つのタンパク質に適用され得るためである。本発明はまた、本発明の方法に従って安定化および可溶化製剤を含む、特に治療的使用のための、少なくとも1つの寒冷沈降性タンパク質の濃縮物に関する。最後に、本発明は、アルギニン、少なくとも1つの疎水性アミノ酸およびクエン酸三ナトリウムの混合物を含む、凍結乾燥およびウイルス不活性化の熱処理へ供されるように意図された寒冷沈降性タンパク質のための安定化および可溶化製剤に関する。好ましくは、該安定化および可溶化製剤は、アルギニン、少なくとも1つの疎水性アミノ酸およびクエン酸三ナトリウムの混合物から構成される。以下の実施例は、その範囲を限定することなく、本発明を示す。実施例1大部分について第VIII因子、フォンビルブラント因子、第XIII因子、フィブリノーゲンおよびフィブロネクチンからなる寒冷沈降物を、表1に与えられる化合物の混合物を含む本発明の安定化および可溶化製剤溶液A中に再溶解させた。タンパク質の濃度は約15g/lである。該混合物の均質化後、このようにして得られる溶液を、0.45μmのフィルターで濾過し、そして5mlを採取してそしてバイアルに入れる。その後、該溶液を、-30°Cで48時間、凍結乾燥に供する。それを、前者のものと同一の寒冷沈降物[しかし、これは、それぞれトリス2.4g/l、クエン酸三ナトリウム5.88g/lおよびNaCl1.16g/lの混合物を含む標準製剤溶液B中に再溶解させた]を含む参照溶液を用いて、同様に処理する。凍結乾燥に続いて、両方の得られた凍結乾燥化寒冷沈降物即ち、一方は、本発明の製剤を含み、そして他方は、標準製剤を含むを、注射用の精製水5mlに再溶解させるそれぞれ、溶液A’および溶液B’と呼ぶ。次いで、得られた凍結乾燥化形態の可溶化と共に、凍結乾燥間、全体としての考慮されるタンパク質を保護または安定化する標準製剤の能力および本発明のそれを評価するために、実験を行った。その目的のために、当業者に公知の方法によって、種々のタンパク質の活性および量と共に、以下の3つのパラメータを、各溶液A’およびB’について評価する:再溶解前の凍結乾燥化形態の外観、注射用の精製水中における凍結乾燥化形態の再溶解時間、およびこのようにして得られる溶液の濁度。種々の測定結果を表2に示し、表中、容積の単位は、注射用の精製水5mlで再構成された凍結乾燥化プロダクトの溶液に関する。得られた結果は、まず第一に、寒冷沈降性タンパク質への本発明の製剤溶液Aの添加は、標準製剤溶液Bと比較して、凍結乾燥化形態の再溶解時間を顕著に減少させる約40ことを可能にすることを示している。また、製剤Aは、濁度のよりよい結果をもたらし、このことは、溶液Bと比較して、水に不溶性の分解産物の減少された存在を示唆していることが言及される。両方の場合において、溶液AおよびBは、凍結乾燥後、考慮されるタンパク質の同一の量および活性を全体で回復させる。実施例2上述の寒冷沈降物からの凍結乾燥化タンパク質の両方即ち、一方は、本発明の製剤を含み、そして他方は標準製剤を含むを、80°Cで72時間、乾燥加熱する。本発明の製剤溶液Aを含む寒冷沈降物の加熱された凍結乾燥化タンパク質を、注射用の精製水5mlにおいて再構成する溶液A。標準製剤溶液Bを含む寒冷沈降物の加熱された凍結乾燥化タンパク質は、再溶解できないことが言及される。この再溶解の不可能性は、加熱変性されたそして不溶性のタンパク質の存在によって説明され得、これは、溶液Bは、熱処理の間これらのタンパク質を安定化しないことの指標である。しかし、実施例1のそれらの凍結乾燥化形態を用いて行われたウイルス不活性化の熱処理後も、考慮されるタンパク質の全体を安定化および可溶化する、本発明の製剤の能力を評価するために、実施例1におけるように、同一の実験を行う。測定の種々の結果を表3に示し、表中、容積の単位は、精製された注射用水5mlで再構成された凍結乾燥化プロダクトの溶液に関する。それぞれ表1および2から引き出される溶液A’およびAについて得られた測定結果の比較は、驚くべきことに、溶液A本発明の製剤は、それらの生物学的機能の顕著な損失無しに、凍結乾燥後に得られるものと比較して、熱処理されたタンパク質の再溶解に必要な時間を非常に大きく減少約50させることを可能にすることを示している。実施例3Kistlerらの方法によって寒冷沈降物から単離および精製されたフィブリノーゲンのバッチを、クエン酸三ナトリウム2.5g/l、リシン2g/lおよびグリシン2g/lの混合物から構成されるコントロール製剤溶液C中に、15g/lの割合で溶解させた。フィブリノーゲンの濃縮溶液をこのようにして得る。種々のアミノ酸をこの溶液へ添加して、加熱の前および後の凍結乾燥化フィブリノーゲンの再溶解時間に対するそれらの影響を研究する。アミノ酸の得られる溶液および濃度を、表4に示す。その後、種々の溶液溶液C~C5を濾過し、そして各溶液10mlを、実施例1に従う凍結乾燥および熱処理に供する。それぞれの凍結乾燥化プロダクトを、注射用の精製水10mlに溶解し、そして該凍結乾燥化プロダクトの完全な再溶解に必要な時間を測定する。結果を表5に示す。結果は、本発明の溶液C5が、最短時間の再溶解を生じさせることを示している。また、添加されるアミノ酸の性質に依存して、考慮されるフィブリノーゲン溶液が凍結乾燥および該乾燥形態の加熱の間安定化される能力を示すために、前述の再構成された溶液の濁度測定を行った。表6は、凍結乾燥された溶液C~C5の加熱前および加熱後の濁度の測定値を示している。結果は、疑いの余地無く、本発明の製剤溶液C5が、加熱の前および後で、再構成された溶液の濁度の最小の差異をもたらすことを示しており、それは、その増加が42.9である溶液Cと比較して、たった8.2増加した。実施例4フィブリノーゲンの他のバッチを含有する、実施例3からの溶液C、C3およびC5を、凍結乾燥し、そして80°Cで72時間加熱する。その後、対応の凍結乾燥化形態を、注射用精製水10mlに溶解し、そして、当業者に公知の方法によって、以下のパラメータを測定する:再溶解時間、不溶性マルチマーmultimersの量、濁度および再構成された溶液の濾過性filterability。特に濾過性は、タンパク質本ケースにおいてはフィブリノーゲンの変性度degreeofdenaturationを評価することを可能にするが、粒子、フィブリルfibrilsまたはマルチマーの量に比例し得る変性の因子を規定することは可能にしない。同様に、マルチマー含有量はまた、フィブリノーゲンの変性度に比例し、そして電気泳動SDSPageによって測定される。濾過性分析は、試験される溶液を10ml含有する注射器を使用して、該溶液の滅菌を確実にするために十分な多孔性を有するフィルター即ち、0.20±0.02μmのものでありそして25mm直径のものによって回収され濾過された溶液の容積の測定からなる。回収され濾過された容積は、分解産物による該フィルターの詰まりの重要性を表している。従って、回収される容積が多いほど、フィブリノーゲンの分解はより低い。種々の測定結果を、表7に示す。4つの上記で分析されたパラメータは、本発明の製剤溶液C5が、加熱されたフィブリノーゲンの凍結乾燥化形態の安定化および再溶解に特に好適であることを示唆している。再構成された凍結乾燥化フィブリノーゲンは、約2ml/cm2のフィルターの表面に関連する濾過性を有している。熱処理の厳しい条件下でさえ、フィブリノーゲンに関しての本発明に従う溶液C5の安定化および可溶化力を実証するために、フィブリノーゲンの種々のバッチを含有する溶液C3およびC5を、凍結乾燥し、そして90°Cで72時間加熱した。上記の4つのパラメータの検査に加えて、フィブリノーゲンの分解産物degradationproductsoffibrinogen;DPFの量の測定からなる追加の分析を行った。この実施例の枠内において、DPFμ/mlは、フィブリノーゲンの変性時に生成される種々のサイズのペプチドである。この値が高いほど、その分解が高く、そして例えば血餅clotsを形成しやすくなる。種々の測定結果を、表8に示す。上記の結果は、非常に厳しい加熱条件にもかかわらず、本発明の製剤溶液C5が、凍結乾燥および90°Cで72時間の熱処理後、依然として、フィブリノーゲンの保護を与えそして可溶化を可能にすることを実証しており、これは、検査されたパラメータの良好な値で示されている。再構成されたフィブリノーゲンの凍結乾燥化形態はまた、約2ml/cm2のフィルターの表面に関連する濾過性を有している。実施例5この実施例は、凍結乾燥されそして80°Cで72時間加熱されるように意図されるフィブリノーゲン溶液の安定化および可溶化に対する、本発明の製剤溶液A中に含有されるクエン酸三ナトリウムの濃度の影響に関する。寒冷沈降物から得られるフィブリノーゲンのバッチを、溶液Aここで、クエン酸三ナトリウムの濃度は、溶液ごとに異なった中において15g/lの割合で可溶化しそして均質化した。それぞれ0.5g/l、1g/l、2g/lおよび11.2g/lのクエン酸三ナトリウムを含有する、それぞれ溶液A1、A2、A3およびA4という4つの溶液が得られた。その後、これらの溶液を実施例1に記載のように濾過し、そして各溶液5mlを採取してそしてバイアルに入れた。フィブリノーゲンを含有する上記4つの溶液を、実施例1に記載される凍結乾燥および熱処理に供した。その後、一方で、4つの非加熱の凍結乾燥化フィブリノーゲンを、そして他方で、加熱したものを、注射用精製水5mlに再溶解し、上記4つの溶液A1、A2、A3およびA4を作製した。いずれの前処理にも供されていない溶液コントロール溶液に対応すると比較しての、凍結乾燥の間フィブリノーゲンを保護しそして該凍結乾燥化形態の加熱後それを可溶化させる能力に対する、本発明の製剤中のクエン酸三ナトリウムの濃度の影響を評価するために、実験を行った。その目的のために、当業者に公知の方法によって、以下のパラメータを、各溶液A1、A2、A3およびA4について測定する:注射用精製水中における凍結乾燥化形態の再溶解時間、このようにして得られる溶液の濁度、不溶性マルチマーの量、フィブリノーゲンの重量および凝固性フィブリノーゲンの量。種々の測定結果を表9に示し、表中、容積の単位は、注射用精製水5mlで再構成された凍結乾燥化プロダクトの溶液に関する。得られた結果は、本発明の上記製剤の1つにおけるクエン酸三ナトリウムの0.5~約12g/lの値の範囲において選択される濃度は、コントロール溶液と比較して、凍結乾燥および熱処理の間のフィブリノーゲンの満足いく安定化を可能にするだけでなく、乾燥加熱されたフィブリノーゲンと比較して、凍結乾燥されたフィブリノーゲンの再溶解の全体的に同一の時間を維持することを可能にすることを示している。実施例6この実施例は、一方で凍結乾燥される、そして他方で80°Cで72時間加熱される、フィブリノーゲン溶液中に含有される第XIII因子の安定化に対する、本発明に従う製剤溶液A中に含有されるクエン酸三ナトリウムの濃度の影響に関する。寒冷沈降物から得られたこれら2つのタンパク質を、それぞれ2.5g/l溶液Aおよび11.2g/l溶液A4のクエン酸三ナトリウムを含有する本発明実施例1に従う2つの製剤中において、15g/lの割合で再溶解しフィブリノーゲン第XIII因子、そして均質化した。凍結乾燥前に、溶液AおよびA4を、実施例1に記載の処理に供した。フィブリノーゲンおよび第XIII因子の凍結乾燥化形態の両方一方で加熱せず、そして他方で加熱したを、その後、注射用精製水5mlに再溶解して、上記溶液AおよびA4の両方を作製した。伝統的な分析方法によって、IU/ml注射用精製水で表されるFXIIIおよびIU/mlで表されるFXIII-抗原の活性、ならびにFXIII:FXIII-抗原の活性の割合Rと呼ぶを測定した。種々の測定結果を、表10に示す。結果は、熱処理されなかった凍結乾燥化形態と比較して、熱処理された場合の各凍結乾燥化形態について、割合Rの僅かな減少を示している。更に、割合Rの減少は、該クエン酸塩含有量が高い場合ほど、より重要性が低いことが言及される。更には、この表は、1つの溶液のクエン酸塩の濃度が他のものと比較して増加する場合この場合、溶液AおよびA4、およびこれらが凍結乾燥される場合、割合Rもまた増加することを表している。同一の現象が、凍結乾燥化形態が加熱される場合に言及される。従って、クエン酸塩の濃度は、FXIIIの安定化に影響を与え、これはまた、種々の活性の値によって実証される。実施例7この実施例において、実施例5に従って調製された4つの溶液を、凍結乾燥および熱処理80°Cで72時間後に再構成する。以下の表11は、IU/ml注射用精製水で表されるFXIII活性およびIU/mlで表されるFXIII-抗原、ならびに活性FXIII:FXIII-抗原の割合Rと呼ぶの測定値を示しており、溶液中のクエン酸塩濃度の変化に依存している。得られた結果は、本発明の製剤中のクエン酸三ナトリウムの濃度が高いほど、FXIIIの分解が低いということを示している。