"化合物のレパートリーを製造するための方法であって、aマイクロカプセル内に一次化合物のセット2つ以上をコンパートメント化するステップであって、マイクロカプセルのある割合が、前記セットの各々の代表である化合物1つ以上の複数のコピーを含むようにし、前記化合物1つ以上が、一次化合物のセットのサブセットを形成する、ステップと;b異なるセットに由来する一次化合物の間の化学反応によりマイクロカプセル中に二次化合物を形成するステップと;を含む、方法。一次化合物のサブセットが、一次化合物のセットの10以下を構成する、請求項1に記載の方法。一次化合物のサブセットが、一次化合物のセットの1以下を構成する、請求項2に記載の方法。一次化合物のサブセットが、単一の化合物である、請求項3に記載の方法。ステップaにおけるコンパートメント当たりの異なる一次化合物の最頻数が、ステップbにおいて二次化合物を形成する一次化合物の数と等しくなる、請求項1~4のいずれかに記載の方法。ステップaが、一次化合物を含む個別のエマルジョンコンパートメントを形成するステップと、エマルジョンコンパートメントを混合して、一次化合物のエマルジョン化されたセットを形成するステップであって、任意の1つのマイクロカプセルにおいて、一次化合物のセットのサブセットが複数のコピーで示される、ステップとを含む、請求項1~5のいずれかに記載の方法。ステップaが、a任意の1つのマイクロビーズ上において、一次化合物のセットのサブセット1つのみが示されるように、マイクロビーズに一次化合物のセットを結合させるステップと、b任意の1つのマイクロカプセルにおいて、一次化合物のセットのサブセットが複数のコピーで示されるように、マイクロカプセル内にマイクロビーズをコンパートメント化するステップと;を含む、請求項1~6のいずれかに記載の方法。一次化合物の少なくとも1つのセットが、異なる化合物のレパートリーを含む、請求項1~7のいずれかに記載の方法。一次化合物のセットの1つが、単一の化合物からなる、請求項1~8のいずれかに記載の方法。化合物が、非共有結合的にビーズに結合している、請求項7に記載の方法。化合物が、共有結合的にビーズに結合している、請求項7に記載の方法。化合物が、可逆的な物理的または化学的な機序によりマイクロビーズに結合している、請求項10または11に記載の方法。化合物が、光化学的に切断され得るリンカーによりマイクロビーズに結合している、請求項11に記載の方法。共に反応して、標的に結合するか標的の活性をモジュレートすることができる二次化合物を形成する一次化合物を識別するための方法であって、aマイクロカプセル内に一次化合物のセット2つ以上をコンパートメント化するステップであって、マイクロカプセルのある割合が、化合物2つ以上を含むようにする、ステップと;b異なるセットに由来する一次化合物の間の化学反応によりマイクロカプセル中に二次化合物を形成するステップと;c反応して、標的に結合するか標的の活性をモジュレートする二次化合物を形成する一次化合物のサブセットを識別するステップと;を含む、方法。標的に結合するか標的の活性をモジュレートする能力が増強されている化合物を合成するための方法であって、a本発明の第2の態様のステップcにおいて識別された一次化合物のサブセットをマイクロカプセル内にコンパートメント化するステップであって、任意選択的に一次化合物の別のセットをコンパートメント化するステップと;b異なるセットに由来する一次化合物の間の化学反応によりマイクロカプセル中に二次化合物を形成するステップと;c反応して、標的に結合するか標的その活性をモジュレートする二次化合物を形成する一次化合物のサブセットを識別するステップと;を含む、方法。最初のサイクルの後に、ステップaが、ステップcで識別された一次化合物のサブセットをマイクロカプセル内にコンパートメント化するステップ、および、任意選択的に、化合物の別のセットをコンパートメント化するステップを含むように、ステップa~cが反復的に繰り返される、請求項15に記載の方法。標的に結合するか標的の活性をモジュレートする個々の化合物を識別するための方法であって、a本発明の第2または第3の態様のステップcにおいて識別された一次化合物および一次化合物の別のセットをマイクロカプセル内にコンパートメント化するステップと;b異なるセットに由来する一次化合物の間の化学反応によりマイクロカプセル中に二次化合物を形成するステップと;c反応して、標的に結合するか標的の活性をモジュレートする二次化合物を形成する一次化合物のサブセットを識別するステップと;を含む、方法。標的の活性が結合活性である、請求項14~17のいずれかに記載の方法。標的の活性が触媒活性である、請求項14~17のいずれかに記載の方法。二次化合物が標的と反応して反応産物を生成する、請求項14~19のいずれかに記載の方法。標的が化合物と共にマイクロカプセル内にコンパートメント化される、請求項14~20のいずれかに記載の方法。スカフォールド分子が化合物と共にマイクロカプセルにコンパートメント化される、請求項14~21のいずれかに記載の方法。化合物がビーズに結合されており、ステップcにおいて、反応して、標的に結合するか標的の活性をモジュレートする二次化合物を形成する一次化合物の識別が容易となるように、ステップaにおいて一次分子がビーズから放出され、コンパートメント内の他のビーズと反応する、請求項14または22のいずれかに記載の方法。所望の活性を有する化合物が、マイクロカプセルまたはマイクロビーズの識別、分類または選択を可能にする、マイクロカプセルまたはマイクロビーズの変化をもたらす、請求項14~23のいずれかに記載の方法。マイクロカプセルまたはマイクロビーズの単離が可能となるように、マイクロカプセル内の化合物の活性が、直接または間接的にマイクロカプセルまたはマイクロビーズの修飾をもたらす、請求項24に記載の方法。一次化合物および標的がマイクロビーズに結合しており、標的がリガンドであり、マイクロビーズの単離が可能となるように、マイクロカプセル内の二次化合物が、直接または間接的に前記リガンドに結合する、請求項21に記載の方法。マイクロビーズがアフィニティー精製により単離される、請求項25または26に記載の方法。基質がマイクロカプセル内に存在し、マイクロカプセル内の化合物の所望の活性が、直接または間接的に生成物への前記基質の変換の調節をもたらす、請求項14~28のいずれかに記載の方法。基質が、標的の触媒活性により生成物に変換される、請求項28に記載の方法。基質および生成物が、異なる光学特性を有する、請求項28または29に記載の方法。基質および生成物が、異なる蛍光特性を有する、請求項30に記載の方法。一次化合物および基質がマイクロビーズに結合しており、マイクロカプセル内の二次化合物の所望の活性が、直接または間接的にマイクロビーズの部分として残存する生成物への前記基質の変換の調節をもたらし、その識別および任意選択的に単離を可能にする、請求項28~31のいずれかに記載の方法。生成物および任意選択的に未反応の基質が、その後マイクロカプセル内のマイクロビーズと複合体化する、請求項28~32のいずれかに記載の方法。所望の活性が、生成物への基質の変換を増強する、請求項28~33のいずれかに記載の方法。所望の活性が、生成物への基質の変換を抑制する、請求項28~34のいずれかに記載の方法。所望の活性を有する化合物が、マイクロカプセルの識別、分類または選択を可能にするマイクロカプセルの変化をもたらす、請求項1~35のいずれかに記載の方法。マイクロカプセル内の標的の修飾が、マイクロカプセルの光学特性の変化を誘導する、請求項1~36のいずれかに記載の方法。マイクロビーズの修飾が、その光学特性の変化を誘導するように、マイクロカプセルの外部においてそれを更に修飾可能とする、請求項24に記載の方法。マイクロビーズの光学特性の変化が、マイクロビーズへの特徴的な光学特性を有する化合物の結合によるものである、請求項24に記載の方法。マイクロビーズの光学特性の変化が、化合物への特徴的な光学特性を有する標的の結合によるものである、請求項24に記載の方法。マイクロビーズの光学特性の変化が、標的に結合した際の化合物の光学特性の変化によるものである、請求項24に記載の方法。マイクロビーズの光学特性の変化が、化合物に結合した際の標的の光学特性の変化によるものである、請求項24に記載の方法。マイクロビーズの光学特性の変化が、結合している標的および化合物の両方の光学特性の変化によるものである、請求項24に記載の方法。化合物が標的の変化をもたらすように作用し、マイクロビーズの光学特性の変化が、標的および化合物の標的への作用の生成物の異なる光学特性によるものである、請求項24に記載の方法。化合物は、光学特性を改変することなく標的の変化をもたらすよう作用するが、標的ではなく作用の生成物のみがマイクロビーズと結合または反応し、これによりマイクロビーズの光学特性を変化させる、請求項24に記載の方法。別の試薬が、マイクロビーズに結合した調節された反応の基質ではなく生成物に特異的に結合または特異的に反応し、これにより、マイクロビーズの光学特性を改変する、請求項24に記載の方法。別の試薬が、マイクロビーズに結合した調節された反応の生成物ではなく基質に特異的に結合または特異的に反応し、これにより、マイクロビーズの光学特性を改変する、請求項24に記載の方法。マイクロカプセル内の化合物が、マイクロカプセルの光学特性の差により識別される、請求項24に記載の方法。マイクロカプセルの光学特性の差が、蛍光の差である、請求項48に記載の方法。マイクロカプセルの蛍光の差が、量子ドットの存在によるものである、請求項49に記載の方法。化合物が、異なる濃度で異なるマイクロカプセル内に存在する、請求項1~50のいずれかに記載の方法。マイクロカプセル内の化合物の濃度が、マイクロカプセルの光学特性の差により識別される、請求項51に記載の方法。マイクロカプセルの光学特性の差が、蛍光の差である、請求項52に記載の方法。マイクロカプセルの蛍光の差が、量子ドットの存在によるものである、請求項53に記載の方法。マイクロビーズ上の化合物が、マイクロビーズの光学特性の差により識別される、請求項24に記載の方法。マイクロビーズの光学特性の差が、蛍光の差である、請求項55に記載の方法。マイクロビーズの蛍光の差が、量子ドットの存在によるものである、請求項56に記載の方法。化合物の第2の活性が、第1の活性から生じるものとは異なるマイクロビーズまたはマイクロカプセルの変化をもたらす、請求項1~57のいずれかに記載の方法。第2の活性から生じる変化を用いて、マイクロビーズまたはマイクロカプセルを積極的に選択する、請求項58に記載の方法。第2の活性から生じる変化を用いて、マイクロビーズまたはマイクロカプセルを消極的に選択する、請求項58に記載の方法。反応の特異性を向上させるために、消極的な選択を積極的な選択と組み合わせる、請求項60に記載の方法。向上した反応特異性が、結合特異性の向上である、請求項61に記載の方法。向上した反応特異性が、標的に対する位置選択性および/または立体選択性の向上である、請求項61に記載の方法。化合物の活性により直接または間接的に修飾されたマイクロビーズが、更にチラミドシグナル増幅TSA商標;NENにより修飾され、その結果として直接または間接的に前記マイクロビーズの光学特性の変化がもたらされ、これによりその識別および任意選択的に単離が可能となる、請求項24に記載の方法。化合物が低分子量化合物である、請求項1~64のいずれかに記載の方法。各マイクロビーズが、それに結合した単一化合物の複数の分子を有する、請求項1~65のいずれかに記載の方法。マイクロカプセル化が、油中水エマルジョンを形成することにより達成される、請求項1~66のいずれかに記載の方法。油中水エマルジョンが、微小流体システムを用いて作成される、請求項67に記載の方法。エマルジョンが、不混和性液体の共流動ストリーム内の水性液滴の破壊により形成される、請求項68に記載の方法。微小流体チャンネル内の油のストリーム内に分散した水性微小液滴の層流により、マイクロカプセルが分析のために輸送される、請求項68または69に記載の方法。マイクロカプセルが、微小流体チャンネル内の油のストリーム内に分散した水性微小液滴のものである、請求項70に記載の方法。マイクロカプセル内の化合物が、微小流体チャンネル内の他の微小液滴に対するマイクロカプセルの相対的位置により識別される、請求項71に記載の方法。マイクロカプセル内の化合物の濃度が、微小流体チャンネル内の他の微小液滴に対するマイクロカプセルの相対的位置により識別される、請求項71に記載の方法。マイクロカプセル内の標的が、微小流体チャンネル内の他の微小液滴に対するマイクロカプセルの相対的位置により識別される、請求項71に記載の方法。識別されたマイクロカプセルが、微小流体装置を用いて分類される、請求項1~74のいずれかに記載の方法。マイクロカプセル化が、フッ化炭素または過フッ化炭素の連続相とのエマルジョンを形成することにより達成される、請求項67に記載の方法。マイクロカプセル化が、フッ化炭素または過フッ化炭素の連続相および非水性の非連続相とのエマルジョンを形成することにより達成される、請求項76に記載の方法。マイクロカプセル化が、フッ化炭素または過フッ化炭素の連続相および水性の非連続相とのエマルジョンを形成することにより達成される、請求項76に記載の方法。フッ化炭素が、パーフルオロオクチルブロミドまたはパーフルオロオクチルエタンである、請求項76~78のいずれかに記載の方法。エマルジョンが、F-アルキルジモルホリノホスフェートを用いて形成される、請求項78に記載の方法。F-アルキルジモルホリノホスフェートが、一般式CnF2n1CmH2mOPO[NCH2CH22O]2を有する、請求項80に記載の方法。F-アルキルジモルホリノホスフェートが、C8F17C11H22OPO[NCH2CH22O]2である、請求項81に記載の方法。マイクロカプセルが、その蛍光の変化の検出により識別および任意選択的に分類される、請求項24に記載の方法。蛍光の変化が、蛍光共鳴エネルギー転移FRETによるものである、請求項83に記載の方法。マイクロカプセルの識別が、フローサイトメトリーにより行われる、求項83に記載の方法。マイクロカプセルの分類が、蛍光活性化細胞ソーターFACSを用いて実施される、請求項83に記載の方法。マイクロカプセルが、油中水エマルジョンの水中油中水エマルジョンへの変換の後に、蛍光活性化細胞ソーターFACSを用いて分類される、請求項86に記載の方法。マイクロビーズが、非磁性、磁性または常磁性である、請求項7に記載の方法。マイクロビーズが、その蛍光の変化の検出により識別および任意選択的に分類される、請求項24に記載の方法。マイクロビーズの識別が、フローサイトメトリーにより行われる、請求項89に記載の方法。マイクロビーズの分類が、蛍光活性化細胞ソーターFACSを用いて実施される、請求項90に記載の方法。蛍光の変化が、蛍光共鳴エネルギー転移FRETによるものである、請求項89に記載の方法。マイクロカプセルの内部環境が、油相に試薬1つ以上を添加することにより修飾される、請求項1~92のいずれかに記載の方法。一次化合物が異なる光学特性を有するビーズにカップリングされている、請求項7に記載の方法。ビーズが異なる蛍光特性を有する、請求項94に記載の方法。ビーズの異なる光学特性が、蛍光色素2つ以上の異なる水準でのビーズへの取り込みによるものである、請求項95に記載の方法。ビーズの異なる光学特性が、異なる発光スペクトルを有する量子ドットの異なる数量での取り込みによるものである、請求項94に記載の方法。ビーズに結合している化合物が、ビーズの異なる光学特性を用いて識別される、請求項94に記載の方法。単離されたビーズ上の化合物が、ビーズから化合物を放出させ、直接分析することにより識別される、請求項7に記載の方法。単離されたビーズ上の化合物が、質量スペクトル分析により識別される、請求項99記載の方法。請求項1~100のいずれかに記載の方法により単離された物。一次化合物の反応により生成した二次化合物を単離するステップを更に含む、請求項1~100のいずれかに記載の方法。二次化合物1つ以上を製造するステップを更に含む、請求項1~100および102のいずれかに記載の方法。化合物および標的が、後に融合される異なるマイクロカプセル内に当初存在する、請求項13~35のいずれかに記載の方法。化合物の異なるサブセットを含有するマイクロカプセルが融合される、請求項1~100および102~104のいずれかに記載の方法。化合物を含有するマイクロカプセルを分割させて、マイクロカプセル2つ以上を生成させる、請求項1~100および102~105のいずれかに記載の方法。標的を含有するマイクロカプセルを分割させて、マイクロカプセル2つ以上を生成させる、請求項1~100および102~106のいずれかに記載の方法。細胞がマイクロカプセル内に存在する、請求項1~100および102~107のいずれかに記載の方法。化合物が、細胞内で標的の活性をモジュレートする、請求項1~100および102~108のいずれかに記載の方法。化合物が、細胞の活性をモジュレートする、請求項1~100および102~109のいずれかに記載の方法。[定義]マイクロカプセルという用語は本明細書においては、当分野で通常用いられており、さらに後述する意味に従う。しかしながら本質的にはマイクロカプセルは、所望の活性を有する分子の識別を可能にする本明細書に記載の分子機序における成分の交換をその輪郭となる境界が制限している人工のコンパートメントである。輪郭となる境界は好ましくはマイクロカプセルの内容物を完全に封入するものである。好ましくは、本発明の方法において使用するマイクロカプセルは極めて多数量で製造可能であり、これにより化合物のライブラリをコンパートメント化できる。任意選択的に、化合物をマイクロビーズに結合できる。本明細書において使用されるマイクロカプセルはその内部において混合および分類が可能であり、これにより本発明の方法の高スループット能を促進する。固体表面上の液滴およびマルチウェルプレートのアレイは本明細書においてはマイクロカプセルとは定義しない。マイクロカプセルのある割合化合物2つ以上またはマイクロビーズ2つ以上を含むものとして定義されるとは、該当するマイクロカプセルの任意の部分該マイクロカプセルの全てを包含するである。好ましくは、これはその少なくとも25、好ましくは50、より好ましくは60、70、80、90または95である。マイクロビーズという用語は本明細書においては、当分野で通常用いられており、さらに後述する意味に従う。マイクロビーズはまた、マイクロスフェア、ラテックス粒子、ビーズまたはミニビーズとして当業者に知られているものであり、20nm~1mmの直径のものが入手可能であり、種々の材料、例えばシリカおよび種々の重合体、共重合体および3元重合体から製造できる。高度に均一の誘導体化されたおよび誘導体化されていない非磁性および常磁性のマイクロビーズビーズは多くの販売元より入手できる。マイクロビーズは、マイクロカプセルへ分配することにより本発明に従ってコンパートメント化できる。例えば、好ましい態様において、マイクロビーズを水/油混合物中に入れ、乳化して、本発明のマイクロカプセルを含む油中水エマルジョンを形成できる。マイクロビーズの濃度を調節して、各マイクロカプセル内に出現する平均のマイクロビーズ数を制御することができる。化合物という用語は本明細書においては当分野で通常用いられている意味に従う。化合物という用語は、その最も広い意味において、即ち、所定の割合で元素2つ以上を含む物質分子および超分子複合体を含むとして使用される。この定義には医薬品の大部分を構成する小分子典型的には<500ダルトンも包含される。しかしながら、定義はまたより大型の分子、例えば重合体、例えばポリペプチド、核酸および炭水化物およびその超分子複合体も包含する。一次化合物という用語は本明細書においてはマイクロカプセルにコンパートメント化された化合物またはビーズにカップリングされた化合物を指す。二次化合物という用語は本明細書においては、任意選択的にマイクロビーズからの、少なくとも1つの一次化合物の放出の後にマイクロカプセル内の一次化合物2つ以上の間の反応により形成された化合物を指す。好ましくは、全ての一次分子がマイクロビーズから放出される。二次化合物は一次化合物間の共有結合または非共有結合の結果として生じることができる。スカフォールドという用語は本明細書においては当分野で通常用いられている意味に従う。即ちコンビナトリアルライブラリの全てのメンバーに共通の分子のコア部分である。任意選択的に、二次化合物はスカフォールドを含んでよい。化合物のレパートリーとは多様な化合物の群であり、これはまた化合物のライブラリとも称することができる。化合物のレパートリーは当分野で知られた任意の手段、例えばコンビナトリアル化学、化合物進化により生成させるか、または、SigmaAldrichDiscoveryPartnersInternationalMaybridgeおよびTriposのような市販元より購入してよい。レパートリーは、好ましくは少なくとも102、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011以上の異なる化合物を含み、これは構造または機能において関係していても無関係でもよい。化合物の1つのセットとは、化合物のレパートリー、またはレパートリーの任意の部分例えば単一の化合物種であってよい。本発明は、共に反応する化合物の2つ以上のセットの使用を意図している。セットは単一のレパートリーまたは複数の異なるレパートリーに由来してよい。マイクロビーズへの化合物の結合を行うリンカーの切断により化合物をマイクロビーズから放出させることができる。マイクロビーズからの化合物の放出により化合物はより自由にマイクロカプセルの他の内容物と相互作用ができるようになり、その内部の反応に関与できるようになり、任意選択的に他の試薬と組み合わさって新しい化合物、複合体、分子または超分子複合体を形成できるようになる。リンカーの切断は任意の手段により実施でき、マイクロカプセルを用いることなく実施できる光化学的切断が好ましい。光化学的に切断できるリンカーは当分野で知られており、さらに後述する通りである。本明細書においては、標的とは任意の化合物、分子または超分子複合体である。典型的な標的は医療上の意味を有する標的を包含し、例えば薬剤標的、例えば受容体、例えばGタンパク質結合受容体およびホルモン受容体;シグナリング経路に関与する転写因子、プロテインキナーゼおよびホスファターゼ;微生物に特異的な遺伝子産物、例えば細胞壁成分、レプリカーゼおよび他の酵素;工業的に関連のある標的、例えば食品産業において使用される酵素、研究または生産目的の試薬等を包含する。活性とは、本明細書においては、標的の活性のモジュレーションに関連して言及する場合は、標的の任意の活性、または、標的により影響される分子の活性であることができ、これは本明細書において試験する化合物により直接または間接的にモジュレートすることができる。標的の活性は、任意の測定可能な生物学的または化学的な活性、例えば結合活性、酵素活性、第3の酵素または他の分子に対する活性化または抑制の活性、疾患を誘発するか代謝または他の機能に影響する能力等であってよい。本明細書において言及する活性化および抑制とは、所望の活性を1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、100倍以上の増大または低減を指す。モジュレーションが不活性化である場合は、不活性化は実質的に完全な不活性化である。更にまた所望の活性は純粋に結合活性であってよく、これには結合する標的の活性のモジュレーションが関与してもしなくてもよい。本明細書において低分子量または小分子と定義される化合物は医薬品分野において小分子と一般的に称される分子である。このような化合物はポリペプチドおよび他の大型分子複合体よりも小型であり、患者および他の対象に容易に投与でき、消化されるものである。小分子薬剤は経口投与または筋肉内注射用に好適に製剤できる。例えば小分子は2000ダルトン以下;好ましくは1000ダルトン以下;好ましくは250~750ダルトン;およびより好ましくは500ダルトン未満の分子量を有することができる。選択可能な変化とは、測定可能であり、当該変化を引き起こす化合物を識別または単離するために利用可能である任意の変化である。選択は、任意選択的に他の試薬と複合体化された際に、マイクロカプセル、マイクロビーズまたは化合物自体のレベルで起こってよい。特に好ましい実施形態は光学的検出であり、その場合、選択可能な変化は光学特性の変化であり、これは例えばFACS装置において検出および利用でき、これにより所望の変化を表すマイクロカプセルまたはマイクロビーズを分離できる。本明細書においては光学特性の変化は電磁放射の吸収または放射の任意の変化、例えば吸光度、ルミネセンス、燐光または蛍光の変化を指す。このような特性の全てが光学的という用語に包含される。マイクロカプセルまたはマイクロビーズは、例えばルミネセンス、蛍光または燐光活性化分類により識別され、任意選択的に分類される。好ましい実施形態においては、フローサイトメトリーを用いてマイクロカプセルまたはマイクロビーズを識別し、任意選択的に分類する。種々の光学特性を分析のためおよび分類をトリガーするために使用でき、例えば光散乱および蛍光分極が挙げられる。高度に好ましい実施形態においては、マイクロカプセルまたはマイクロビーズは、蛍光活性化細胞ソーターFACSを用いて分析され、任意選択的に分類される。マイクロカプセル中またはビーズ上の化合物は当業者がよく知る種々の手法、例えば質量スペクトル分析、化学的タグ付けまたは光学的タグ付けにより識別できる。[一般的方法]特段の記載が無い限り、本明細書において使用する全ての技術的および専門的な用語は本分野例えば細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技術および生化学の当業者が一般的に理解している意味と同様の意味を有する。分子、遺伝および生化学的方法一般的には、引用により本明細書に組み込まれるSambrooketalMolecularCloningALaboratoryManual2dedColdSpringHarborLaboratoryPressColdSpringHarborNYおよびAusbeletalShortProtocolsinMolecularBiology4thEdJohnWileySonsInc参照および化学的方法には、標準的な技術が使用される。更にまた、HarlowLaneALaboratoryManualColdSpringHarborNYも標準的な免疫学的技術について参照される。A一般的説明本発明のマイクロカプセルは、本発明が機能するために適切な物理学的特性を必要とする。まず、複数のマイクロカプセル間で化合物および標的が拡散しないようにするためには、各マイクロカプセルの内容物を周囲のマイクロカプセルの内容物から隔離することにより、実験期間中を通じてマイクロカプセル間での化合物および標的の交換を皆無または極僅かとしなければならない。第2に本発明の方法では、マイクロカプセル当たり限られた数量のみビーズが存在しなければならない。これにより化合物および標的が他のビーズから隔離されることになる。第3にマイクロカプセルの形成および組成は標的の活性を低減させてはならない。結果として、使用する任意のマイクロカプセル化系はこれらの3つの条件を満足しなければならない。適切な系は当業者に明らかなとおり、本発明の各用途における条件の厳密な性質により変動する。広範な種類のマイクロカプセル化の操作法が使用可能であり、本発明に従って使用するマイクロカプセルを産生するために使用してよい。実際、200を超えるマイクロカプセル化方法が文献に記載されている。これらには膜エンベロープ水性ベシクル、例えば脂質ベシクルリポソームおよび非イオン系界面活性剤ベシクルが包含される。これらは非共有結合的に組み立てられた分子の単一または複数の二重層の閉じた膜カプセルであり、各二重層は水性のコンパートメントによりその近隣から分離されている。リポソームの場合は、膜は脂質分子からなり;これらは通常はリン脂質であるが、コレステロールのようなステロールも膜内に取り込んでよい。種々の酵素触媒性化学的反応、例えばRNAおよびDNA重合をリポソーム内で実施できる。膜エンベロープベシクル系の場合は、水相の大部分がベシクル外部にあり、従って非コンパートメント化されている。反応がマイクロカプセル内に限定されるためには、この連続の水相を除去するか、または、その内部の生物学的な系を抑制または破壊しなければならない。酵素触媒性化学反応はまた、種々の他の方法により産生されたマイクロカプセル内でも実証されている。多くの酵素はAOT-イソオクタン-水系のように逆ミセル溶液中で活性である。マイクロカプセルはまた界面重合および界面複合体形成により産生させることができる。この種のマイクロカプセルは剛性で非透過性の膜または半透過性の膜を有することができる。硝酸セルロース膜、ポリアミド膜および脂質-ポリアミド膜を境界とする半透過性のマイクロカプセルは全て、多酵素系を含む生化学的反応を支援できる。極めて穏やかな条件下で形成できるアルギネート/ポリリジンマイクロカプセルもまた極めて生体適合性が高いことがわかっており、例えば生細胞および組織のカプセル化の有効な方法を与える。エマルジョンのようなコロイド系における水性の環境の相分配に基づく非膜マイクロカプセル化系も使用してよい。好ましくは本発明のマイクロカプセルはエマルジョン、即ち、顕微鏡的またはコロイドサイズの液滴として相の一方が他方の内部に分散している2つの不混和性の液相の不均質な系から形成する。エマルジョンは、不混和性の液体の任意の適当な組み合わせから製造することができる。好ましくは本発明のエマルジョンは微細分割液滴の形態で存在する相分散した内部または不連続の相としての水生化学的成分を含有およびこれらの液滴が懸濁しているマトリックス非分散の連続または外部の相としての疎水性の不混和性液体油を有する。このようなエマルジョンを油中水W/Oと称する。これは生化学的成分を含有する全水相が個別の液滴内層内にコンパートメント化されているという利点を有する。疎水性の油である外層は一般的には生化学的成分は含まず、従って不活性である。エマルジョンは界面活性剤1つ以上を添加することにより安定化する。これらの界面活性剤は乳化剤と称され、水/油界面に作用して相の分離を防止または少なくとも遅延する。多くの油状物および多くの乳化剤を油中水エマルジョンの産生のために使用でき、最近の集計では16000を超える界面活性剤が存在し、その多くは乳化剤として使用されている。適当な油は軽質白色鉱物油およびデカンを包含する。適当な界面活性剤は、非イオン系界面活性剤、例えばソルビタンモノオレエート80ICI、ソルビタンモノステアレート60ICI、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート80ICIおよびオクチルフェノキシエトキシエタノール;イオン系界面活性剤、例えばコール酸ナトリウムおよびタウロコール酸ナトリウムおよびデオキシコール酸ナトリウム;化学的に負活性なシリコーン系の界面活性剤、例えばポリシロキサン-ポリセチル-ポリエチレングリコール共重合体セチルジメチコンコポリオールEM90Glodschmidt;およびコレステロールを包含する。フッ化炭素または過フッ化炭素連続相を有するエマルジョンは特に好ましい。例えば、安定なパーフルオロオクチルブロミド中水およびパーフルオロオクチルエタン中水のエマルジョンは界面活性剤としてF-アルキルジモルホリノホスフェートを用いながら形成できる。非フッ化化合物は本質的にはフッ化炭素および過フッ化炭素中に不溶性であり、小型薬剤様分子典型的には<500DaおよびLogP<5はフッ化炭素中水および過フッ化炭素中水のエマルジョンの水性マイクロカプセル中極めて効果的にコンパートメント化され、マイクロカプセル間の交換は殆どまたは全くない。好ましくは、化合物は非水性有機性溶媒を含むマイクロカプセル内にコンパートメント化できる。非フッ化有機溶媒は本質的にはフッ化炭素および過フッ化炭素には不溶性および不混和性であり、フッ化炭素または過フッ化炭素の連続相およびジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、トルエン、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテルおよびエタノールのような非水性溶媒から形成される不連続の相の形成を可能にする。非水性の溶媒を含むマイクロカプセル中に二次化合物を形成する能力は、実施できる化学反応およびそれにおいて合成できる二次分子のレパートリーを大きく拡張する。合成有機化学の大部分はジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、トルエン、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテルおよびエタノールを含む有機溶媒中で行われる。有機分子は有機溶媒中の溶解性がより高い。静電的相互作用は有機溶媒中で増強低誘電率のためされるのに対し、それらは水性の溶媒中では溶媒和して反応性が低下する。例えば、現代の有機化学の大部分がカルボニル化学に関する反応、例えば金属エノレートの使用を採用している。同様に他の有機金属相互作用の数も増大している。これらの反応は無水溶媒中の不活性雰囲気下で行われる場合が多いそうしなければ水により試薬がクエンチングされる。Suzuki反応およびHeck反応を含む、パラジウム触媒を使用する多くの反応がある。エマルジョンの形成は一般的に相を強制的に共存させるための機械的エネルギーの適用を必要とする。これを行うための種々の機械的装置、例えば攪拌器磁気攪拌子、プロペラおよびタービン攪拌器、パドル装置およびウイスク、ホモゲナイザー例えばローターステーターホモゲナイザー、高圧弁ホモゲナイザーおよびジェットホモゲナイザー、コロイドミル、超音波および膜乳化装置を利用した種々の方法がある。複雑な生化学的過程、特に遺伝子の転写および翻訳もまた油中水エマルジョン中に形成される水性マイクロカプセル内で活性である。これにより、油中水エマルジョン内のコンパートメント化が遺伝子の選択に使用可能となり、遺伝子はエマルジョンマイクロカプセル内で転写および翻訳され、それらがコードするタンパク質の結合または触媒活性により選択される。これはエマルジョン内に形成された水性マイクロカプセルが一般的に安定であり、マイクロカプセル間での核酸、タンパク質または酵素触媒反応の生成物の交換があったとしても極僅かであるために可能となった。数千リットルの工業的規模までの容量のエマルジョンを形成する技術も存在する。好ましいマイクロカプセルサイズは本発明に従って実施するべき任意の個々のスクリーニング方法の厳密な条件に応じて変動する。全ての場合において、化合物および標的の活性の特性を測定するためには、化合物ライブラリと試験の感度との間には最適なバランスが存在する。エマルジョンマイクロカプセルのサイズは、スクリーニング系の条件に応じてエマルジョンを形成するために使用されるエマルジョン条件を単に調節することにより変化させてよい。究極的な制約要因はマイクロカプセルのサイズ、即ち単位容量当たり可能なマイクロカプセル数であることから、マイクロカプセルサイズが大きくなるほど、所与の化合物ライブラリをカプセル化するために必要となる容量は大きくなる。油中水エマルジョンは外部連続水相を有する水中油中水のダブルエマルジョンを形成するために再乳化できる。これらのダブルエマルジョンを分析し、任意選択的にフローサイトメーターを用いて分類することができる。高度に単分散されたマイクロカプセルは微小流体技術を用いて製造できる。例えば、3未満の多分散性を有する油中水エマルジョンは油中の共流動ストリームの液滴破壊により形成することができる。微小流体システムはまた、微小流体チャンネル内の油のストリーム中に分散した水性微小液滴の層流のために使用できる。これによりフロー分析のための微小流体装置の構築、および、任意選択的に微小液滴のフロー分類が可能となる。マイクロカプセルは好ましくは融合するか分割する。例えば微小流体システムを用いて水性微小液滴を融合および分割させることができる。マイクロカプセルの融合により試薬の混合が可能となる。例えば標的を含有するマイクロカプセルと化合物を含有するマイクロカプセルの融合は標的と化合物の反応を開始させる。マイクロカプセルのスプリッティングにより、単一のマイクロカプセルをより小さいマイクロカプセル2個以上に分割させる。例えば化合物を含有する単一のマイクロカプセルを複数のマイクロカプセルに分割し、これをその後異なる標的を含有する異なるマイクロカプセルに各々融合させる。標的を含有する単一のマイクロカプセルはまた複数のマイクロカプセルに分割し、これをその後異なる化合物または異なる濃度の化合物を含有する異なるマイクロカプセルと各々融合させることができる。マイクロカプセルは例えば蛍光色素を取り込むことにより光学的にタグ付けできる。好ましい形態においては、マイクロカプセルは量子ドットを取り込むことにより光学的にタグ付けされ、10濃度の6色の量子ドットは106マイクロカプセルのコード化を可能とする。微小流体チャンネル内を秩序のある順序で流動するマイクロカプセルは、マイクロカプセルのストリームにおけるその順序によりコード化完全または部分的できる位置コード化。マイクロスフェア、ラテックス粒子、ビーズまたはミニビーズとして当業者に知られているマイクロビーズは20nm~1mmの直径のものが入手可能であり、種々の材料、例えばシリカおよび種々の重合体、共重合体および3元重合体、例えばポリスチレンPS、ポリメチルメタクリレートPMMA、ポリビニルトルエンPVT、スチレン/ブタジエンS/B共重合体およびスチレン/ビニルトルエンS/VT共重合体から製造できる。これらは広範な種類の機能表面基、即ちアルデヒド、脂肪族アミン、アミド、芳香族アミン、カルボン酸、クロロメチル、エポキシ、ヒドラジド、ヒドロキシル、スルホネートおよびトシルにより付与される疎水性表面例えばプレーンポリスチレンから極めて親水性の表面まで、種々の表面化学のものが入手可能である。官能基はマイクロビーズ表面への化合物の安定または過逆的な結合のための広範な共有結合反応を可能とする。マイクロビーズは例えば蛍光色素を取り込むことにより光学的にタグ付けできる。例えば、厳密な比率の赤色>650nmおよびオレンジ色585nmの蛍光色素による標識のため、各々が独特のスペクトルアドレスを有する100種の異なるビーズのセットを形成し、106ビーズ以下のセットを10強度6色の量子ドットを取り込むことによりコード化できる。化合物を当業者のよく知る種々の手段により共有結合的または非共有結合的にマイクロビーズに連結できる。好ましくは、化合物は切断可能なリンカーを介して結合する。このような種々のリンカーは当業者が知る通りであり、例えば光化学的に切断できるリンカーおよびpHの変更により例えばイミンおよびアシルヒドラゾン、酸化還元特性を調節することにより例えばジスルフィドまたは外部触媒を用いながら例えば交差複分解およびアミド転換制御することができる可逆共有結合が挙げられる。本発明の方法は化合物のプールライブラリまたはレパートリー中で標的の活性を所望の方法でモジュレートする化合物の識別を可能とする。高度に好ましい用途においては、本発明の方法は化合物のライブラリのスクリーニングのために有用である。従って本発明は化合物を化合物のライブラリから識別する本発明の前記の態様に従った方法を提供する。本発明により識別される化合物は好ましくは薬理学的または産業上の利益を有し、例えば診断および治療用途のために適する細胞シグナル伝達機序のような生物学的系の活性化剤または抑制剤を包含する。従って好ましい態様において本発明は臨床上または産業上有用な物の発見を可能にする。本発明の別の態様において、本発明の方法により単離される物が提供される。適当なカプセル化条件の選択が望ましい。スクリーニングすべき化合物ライブラリの複雑度およびサイズに応じて、マイクロカプセル当たり1つまたは1つ未満の二次化合物が形成されるようにカプセル化の操作法を設定することが有利である。これにより分割力が最大となる。しかしながらライブラリがより大きいおよび/またはより複雑である場合は、これは非現実的であり;数種の二次化合物を共に形成し、本発明の方法の反復適用に依存して所望の化合物を識別することが好ましい。カプセル化の操作法の組み合わせを用いて所望の化合物を識別してよい。理論的な研究によれば、化合物の数量が多いほど所望の特性を有する化合物が生成されやすいことを示しているこのことがどのように抗体のレパートリーに適用されるかの説明を参照。また実際には、より大きいファージ-抗体レパートリーは確実により小さいレパートリーよりも良好な結合親和性を有するより多くの抗体をもたらすことが確認されている。まれな変異体が形成され識別を可能とするには、大型のライブラリのサイズが望ましい。即ち、至適に小型であるマイクロカプセルの使用が有利である。これまで、1nl容量のスポットの二次元のマイクロアレイを用いて単一の実験においてスクリーニングできる化合物の最大のレパートリーは~103であった。本発明を用いれば、2.6mmのマイクロカプセル直径において、3次元の分散体を形成することにより、少なくとも1011のレパートリーサイズを20mlエマルジョン中1ml水相を用いてスクリーニングできる。上記した化合物または化合物でコーティングされたマイクロビーズのほかに、本発明のマイクロカプセルはスクリーニング過程を起こすために必要な別の成分を含む。それらは標的および適当な緩衝液を含む。適当な緩衝液は生物学的系の所望の成分の全てが活性となるようなものであり、従って、各々の特定の反応系の条件により異なる。生物学的および/または化学的反応に適する緩衝液は当分野で知られており、その処方はSambrookandRussell2001のような種々の実験テキストに記載されている。系の別の成分は標的の活性を試験するために必要なものを包含する。それらは例えば標的により触媒される反応の基質およびコファクター、および、標的に結合するリガンドを含む。それらはまた標的の活性の検出を可能にする標的の活性にカップリングされた反応の他の触媒酵素を含む、基質およびコファクターを含む。Bスクリーニング操作法標的に結合するか標的の活性をモジュレートする化合物をスクリーニングするためには、標的を化合物または化合物コーティングマイクロビーズ1つ以上と共にマイクロカプセル内にコンパートメント化する。好ましくは、各マイクロカプセルは単一の種類のみの二次化合物であるがそのコピーの多くを含有する。好ましくは、各マイクロビーズは単一の種類のみの化合物であるがそのコピーの多くによりコーティングされる。好ましくは、化合物は切断可能なリンカーを介してマイクロビーズに連結され、それらはコンパートメント中のマイクロビーズから放出されるようになる。好ましくは、各マイクロカプセルまたはマイクロビーズは光学的にタグ付けされることによりマイクロビーズに結合しているマイクロカプセル内に含有される化合物の識別を可能にする。i結合に関するスクリーニング化合物は標的への結合について直接スクリーニングできる。本実施形態においては、化合物がマイクロビーズに結合し、標的への親和性を有する場合には、それは標的に結合する。反応の終了時に、全マイクロカプセルを合わせ、全てのマイクロビーズを1つの環境内に共にプールする。標的に特異的に結合するか、または特異的に反応する分子を用いながらアフィニティー精製により所望の結合を示す化合物を担持するマイクロビーズを選択できる。別の実施形態においては、標的を当業者の知る種々の手段によりマイクロビーズに結合できる。スクリーニングすべき化合物は共通の特徴、即ちタグを含有する。化合物はマイクロビーズから放出され、化合物が標的に対する親和性を有する場合にそれに結合する。反応終了時に、全マイクロカプセルを合わせ、全マイクロビーズを1つの環境内に共にプールする。タグに特異的に結合するか、または特異的に反応する分子を用いながらアフィニティー精製により所望の結合を示す化合物を担持するマイクロビーズを選択できる。別の実施形態においては、標的に結合する化合物が例えば別の結合相手からのリガンドを単に隠すだけであることに基づき、マイクロビーズをスクリーニングしてよい。この偶発性において、マイクロビーズはアフィニティー精製工程中に保持されるよりはむしろ選択的に溶出される一方、他のマイクロビーズは結合される。親和性による分類は結合が起こる条件における結合対の2メンバーの存在に依存している。この目的のために任意の結合対を使用してよい。本明細書において用いられるように、結合対という用語は相互に結合することができる分子の任意の対を指す。本発明において使用してよい結合対の例は抗原と抗原に結合できる抗体またはそのフラグメント、ビオチン-アビジン/ストレプトアビジン対、カルシウム依存性結合ポリペプチドおよびそのリガンド例えばカルモジュリンとカルモジュリン結合ペプチド;組み立てられてロイシンジッパーを形成するポリペプチドの対、ヒスチジン典型的にはヘキサヒスチジンペプチドとキレート化Cu2、Zn2およびNi2例えばNi-NTA;、RNA結合とDNA結合タンパク質、例えば亜鉛フィンガーモチーフを含有するものおよびDNAメチルトランスフェラーゼとそれらの核酸結合部位を包含する。別の実施形態においては、化合物はマイクロカプセルまたはマイクロビーズの光学特性の変化を用いて標的への結合についてスクリーニングできる。標的への化合物の結合の後のマイクロカプセルまたはマイクロビーズの光学特性の変化は以下に記載するものを含む種々の方法で誘導することができる。1化合物自体が特徴的な光学特性を有してもよい。例えばそれは蛍光である。2化合物の光学特性が標的への結合により修飾されてもよい。例えば、化合物の蛍光が結合によりクエンチングされるか増強される。3標的の光学特性が化合物への結合により修飾されてもよい。例えば、標的の蛍光が結合によりクエンチングされるか増強される。4標的および化合物の両方の光学特性が結合により修飾されてもよい。例えば標的から化合物またはその逆の蛍光共鳴エネルギー転移FRETが生じ、ドナーの吸収波長における励起があればアクセプター発光波長における発光が生じる。本発明によると、所望の活性を有する化合物がマイクロカプセルの光学特性の変化を誘導し、これにより、当該化合物を含有するマイクロカプセルおよびそこに含有されるマイクロビーズの識別および任意選択的に分類が可能となる方法が提供される。別の実施形態においては、本発明によると、共通のコンパートメント1つ以上内にマイクロカプセルをプールした後にマイクロビーズを分析する方法が提供される。本実施形態においては所望の活性を有する化合物はそれを担持するそして同じマイクロカプセル内に存在するマイクロビーズの光学特性を修飾してその識別および任意選択的に分類を可能にする。本実施形態においては、標的への化合物の結合は必ずしも光学特性の変化を直接誘導する必要は無い。本実施形態において、マイクロビーズに結合した化合物が標的に対する親和性を有する場合は、それは標的に結合する。反応終了時、全マイクロカプセルを合わせ、全マイクロビーズを1つの環境内に共にプールする。所望の結合を示す化合物を担持するマイクロビーズは、標的と特異的に結合するか、または特異的に反応する試薬を添加し、これにより、識別を可能にするマイクロビーズの光学特性の変化を誘導することにより識別できる。例えば、蛍光標識抗標的抗体を用いるか、または、抗標的抗体、次いで第1のものに結合する第2の蛍光標識抗体を使用できる。別の実施形態においては、標的を当業者の知る種々の手段によりマイクロビーズに結合できる。スクリーニングすべき化合物は共通の特徴、即ちタグを含有する。化合物はマイクロビーズから放出され、化合物が標的に対する親和性を有する場合にそれに結合する。反応終了時に全マイクロカプセルを合わせ、全マイクロビーズを1つの環境内に共にプールする。所望の結合を示す化合物を担持するマイクロビーズは、タグと特異的に結合するか、または特異的に反応する試薬を添加し、これにより、識別を可能にするマイクロビーズの光学特性の変化を誘導することにより識別できる。例えば、蛍光標識抗タグ抗体を用いるか、または、抗タグ抗体、次いで第1のものに結合する第2の蛍光標識抗体を使用できる。別の実施形態においては、リガンドに結合する遺伝子産物が、例えばマイクロビーズの光学特性を修飾する可能性がある別の結合相手からリガンドを単に隠すことに基づいて識別してよい。この場合未修飾の光学特性を有するマイクロビーズが選択されるであろう。マイクロビーズを蛍光性とするために、蛍光をチラミドシグナル増幅TSAの増幅を用いて増強することができる。これは、マイクロビーズに結合し、フルオレセイン-チラミンから遊離のラジカル形態その後局所的にマイクロビーズと反応するへの変換を触媒するパーオキシダーゼ別の化合物に連結を使用する。TSAを実施する方法は当分野で知られており、キットがNENより販売されている。TSAは、マイクロビーズの蛍光の直接の増大をもたらすか、または、第2の蛍光分子またはその1つ以上が蛍光性である分子の配列が結合するマイクロビーズにリガンドが結合するように設定される。ii結合の調節のためのスクリーニング別の実施形態においては、本発明は生化学的過程を調節する作用を有する化合物をスクリーニングするために使用できる。化合物が標的の結合特性を活性化する場合、活性化される標的に対するリガンドを当業者の知る種々の手段によりマイクロビーズに結合できる。反応終了時に全マイクロカプセルを合わせ、全マイクロビーズを1つの環境内に共にプールする。所望の結合を示す化合物を担持するマイクロビーズは、標的と特異的に結合するか、または特異的に反応する分子を用いたアフィニティー精製により選択できる。別の実施形態においては、化合物が標的の結合活性を抑制することに基づいてマイクロビーズをスクリーニングしてよい。この偶発性において、マイクロビーズはアフィニティー精製工程中に保持されるよりはむしろ選択的に溶出される一方、他のマイクロビーズは結合される。別の実施形態において、化合物はマイクロカプセルまたはマイクロビーズの光学特性の変化を用いて標的の結合特性をモジュレートする能力についてスクリーニングできる。リガンドへの標的の結合の後のマイクロカプセルまたはマイクロビーズの光学特性の変化は以下に記載するものを含む種々の方法で誘導することができる。1リガンド自体が特徴的な光学特性を有してもよい。例えばそれは蛍光である。2リガンドの光学特性が標的への結合により修飾されてもよい。例えば、リガンドの蛍光が結合によりクエンチングされるか増強される。3標的の光学特性がリガンドへの結合により修飾されてもよい。例えば、標的の蛍光が結合によりクエンチングされるか増強される。4標的およびリガンドの両方の光学特性が結合により修飾されてもよい。例えば標的からリガンドまたはその逆の蛍光共鳴エネルギー転移FRETが生じ、ドナーの吸収波長における励起があればアクセプター発光波長における発光が生じる。本発明によると、所望の活性を有する化合物がマイクロカプセルの光学特性の変化を誘導し、これにより、化合物を含有するマイクロカプセルおよびそこに含有されるマイクロビーズの識別および任意選択的に分類が可能となる方法が提供される。別の実施形態においては、本発明によると、共通のコンパートメント1つ以上内にマイクロカプセルをプールした後にマイクロビーズを分析する方法が提供される。本実施形態においては所望の活性を有する化合物は、それを担持するそして同じマイクロカプセル内に存在するマイクロビーズの光学特性を修飾してその識別および任意選択的に分類を可能にする。本実施形態においては、リガンドへの標的の結合は必ずしも光学特性の変化を直接誘導する必要は無い。本実施形態において、マイクロビーズに結合したリガンドが標的に対する親和性を有する場合は、それは標的に結合する。反応終了時、全マイクロカプセルを合わせ、全マイクロビーズを1つの環境内に共にプールする。結合活性をモジュレートする化合物を担持するマイクロビーズは、標的と特異的に結合するか、または特異的に反応する試薬を添加し、これにより、識別を可能にするマイクロビーズの光学特性の変化を誘導することにより識別できる。例えば、蛍光標識抗標的抗体を用いるか、または、抗標的抗体、次いで第1のものに結合する第2の蛍光標識抗体を使用する。別の実施形態においては、標的を当業者の知る種々の手段によりマイクロビーズに結合できる。スクリーニングすべきリガンドは共通の特徴、即ちタグを含有する。反応終了時に全マイクロカプセルを合わせ、全マイクロビーズを1つの環境内に共にプールする。結合をモジュレートする化合物を担持するマイクロビーズは、タグと特異的に結合するか、または特異的に反応する試薬を添加し、これにより、識別を可能にするマイクロビーズの光学特性の変化を誘導することにより識別できる。例えば、蛍光標識抗タグ抗体を用いるか、または、抗タグ抗体、次いで第1のものに結合する第2の蛍光標識抗体を使用する。上記した通り、蛍光はチラミドシグナル増幅TSAの増幅を用いて増強されることによりマイクロビーズを蛍光性とする。iii触媒作用の調節のスクリーニング別の実施形態において、本発明によると、所望の活性を有する化合物がマイクロカプセルの光学特性の変化を誘導し、これにより、化合物を含有するマイクロカプセルおよび任意選択的にそこに含有されるマイクロビーズの識別および任意選択的に分類が可能となる方法が提供される。マイクロカプセルの光学特性は、a異なる光学特性を有する調節された反応の基質および生成物多くの蛍光発生酵素基質は例えばHaugland1996およびwwwprobescomより入手可能である、例えばグリコシダーゼ、ホスファターゼ、ペプチダーゼおよびプロテアーゼの基質、またはbマイクロカプセル内の調節された反応の生成物または基質と特異的に結合または反応し、これにより、その識別を可能とするように、マイクロカプセルの光学特性の変化を誘導する試薬の存在、の何れによっても修飾できる。標的の活性をモジュレートするものを得るために化合物のライブラリをスクリーニングするための広範な試験法は、光学特性の変化を検出することに基づいており、本発明に従って化合物をスクリーニングするために使用できる。このような試験は当業者に周知である例えばHaugland1996およびwwwprobescom参照。あるいは、選択は同じマイクロカプセル内で起こるその後の反応に第1の反応をカップリングすることにより間接的に実施してよい。これを行うには2通りの一般的な方法がある。第1に第1の反応の生成物を、第1の反応の基質とは反応しない分子と反応させるか結合させる。第2に、カップリングされた反応は第1の反応の生成物の存在下にのみ進行するようにする。その後、調節化合物は、第2の反応の生成物または基質の特性により識別できる。あるいは、選択すべき反応の生成物は第2の酵素触媒反応の基質またはコファクターであってよい。第2の反応を触媒する酵素はマイクロカプセル化よりも前に反応混合物に取り込ませることができる。第1の反応が進行する場合のみ、カップリングされた酵素は識別可能な生成物を生成することになる。カップリングのこの概念は前の反応の生成物を基質として各々が使用する複数の酵素を取り込むために調整することができる。これにより固定化された基質とは反応しない酵素の調節物質の選択が可能になる。1つの反応の生成物が選択可能な生成物をもたらす第2の反応または反応のシリーズのための触媒またはコファクターである場合、シグナル増幅により増強された感度を得るように設計することもできる。更にまた、酵素カスケード系は酵素の活性化物質の生産または酵素阻害剤の破壊に基づくこともできる。カップリングはまた、同じ生成物を生成する酵素の全体の群に対して共通のスクリーニング系を使用でき、複雑な多工程の化学的変換および経路の調節の選択を可能にするという利点も有する。別の実施形態においては、標的そのものが酵素である場合、または、標的が酵素的である生化学的過程を調節する場合、各マイクロカプセルにあのマイクロビーズは酵素的反応のための基質でコーティングしてよい。調節化合物は、基質が生成物に変換される程度を決定する。反応終了時、触媒された反応の生成物にマイクロビーズを物理的に連結する。マイクロカプセルを合わせて反応体をプールすると活性化化合物でコーティングされたマイクロビーズは生成物に特異的な任意の性質により識別できる。阻害剤が望まれる場合は、調節された反応の基質に特異的な化学的特性があるものを選択できる。更にまた、基質はマイクロビーズに結合しないことが望ましい場合もある。この場合、基質は光活性化のような自体の活性化のための別の工程を要する不活性のタグを含有するであろう例えばケージ化ビオチン類縁体。基質から生成物への変換の後、タグは活性化され、タグ付けされた基質および/または生成物はマイクロビーズに結合したタグ結合分子例えばアビジンまたはストレプトアビジンに結合する。従って、タグを介して核酸に結合した生成物に対する基質の比は溶液中の基質および生成物の比を反映するものとなる。ケージ化ビオチンでタグ付けされた基質はマイクロカプセル中のコンパートメント化に基づく操作法を用いたホスホトリエステラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子の選択のために使用されている。ホスホトリエステラーゼ基質は活性酵素分子を含有するマイクロカプセル内の溶液中で加水分解され、反応が終了した後、ケージング基を放射線照射により放出させ、酵素をコードする遺伝子が結合したマイクロビーズにビオチン部分を介して生成物が結合できるようにされている。マイクロビーズおよびマイクロカプセル内の内容物が混合された後、適宜生成物または基質に対して特異的に結合する分子例えば抗体を用いたアフィニティー精製により調節物質でコーティングされたマイクロビーズを選択できる。別の実施形態においては、本発明によると、共通のコンパートメント1つ以上内にマイクロカプセルをプールした後にマイクロビーズを分析する方法が提供される。調節化合物でコーティングしたマイクロビーズはマイクロビーズの光学特性の変化を用いて識別できる。生成物または基質が結合したマイクロビーズの光学特性は、1例えば下記の理由により、基質-マイクロビーズ複合体では検出されない特徴的な光学特性を有する生成物-マイクロビーズ複合体;a異なる光学特性を有する基質および生成物多くの蛍光発生酵素基質は例えばHaugland1996およびwwwprobescomより入手可能である、例えばグリコシダーゼ、ホスファターゼ、ペプチダーゼおよびプロテアーゼの基質、または、b同じ光学特性を有する基質および生成物、ただし、基質ではなく生成物のみがマイクロビーズと結合または反応するもの;2生成物または基質と特異的に結合または反応し、これにより、その識別を可能とするマイクロビーズの光学特性の変化を誘導する試薬の添加これらの試薬はマイクロカプセルの破壊およびマイクロビーズのプールの前または後に添加できる。その試薬は、a基質および生成物の両方がマイクロビーズに結合する場合は、基質ではなく生成物のみまたはその逆に特異的に結合または特異的に反応するか、または、b基質ではなく生成物のみがマイクロビーズに結合または反応するまたはその逆場合に、任意選択的に基質および生成物の両方に結合する;の何れによっても修飾できる。このシナリオにおいて、基質または基質の1つはマイクロビーズには連結されていないが分子タグ例えばビオチン、DIGまたはDNPまたは蛍光基を有する各マイクロカプセル内に存在できる。調節された酵素が基質を生成物に変換する場合、生成物はタグを保有し、その後生成物特異的抗体によりマイクロカプセル内で捕獲される。全ての反応が停止しマイクロカプセルが合わせられた時点で、これらのマイクロビーズはタグ付けされ、例えばタグが蛍光基である場合は、変化した光学特性を既に有してもよい。あるいは、タグ付けされたマイクロビーズの光学特性の変化はタグ例えば蛍光標識アビジン/ストレプトアビジン、蛍光性の抗タグ抗体または第2の蛍光標識抗体により検出できる非蛍光の抗タグ抗体に結合する蛍光標識されたリガンドを添加することにより誘導できる。iv化合物の特異性/選択性のスクリーニング特定の標的に対する特異性または選択性を有するが他のものに対しては有さない化合物は、1つの基質を用いた反応の調節に関する積極的スクリーンまたは別の基質との反応の調節に関する消極的スクリーンを実施することにより特異的に識別できる。例えば、2種の異なる標的酵素に特異的な2種の基質を各々異なる蛍光発生部分で標識する。各標的酵素は異なる蛍光スペクトルを有する生成物の生成を触媒し、2種の標的に対する化合物の特異性に応じてマイクロカプセルの異なる光学特性をもたらす。v細胞を使用するスクリーニング現在の薬剤発見の状況においては、有効化された組み換え標的がインビトロの高スループットスクリーニングHTS試験の根拠を形成している。しかしながら単離されたタンパク質は複雑な生物学的系の代表とはみなされず;従って、細胞に基づく系は、インタクトな生物学的系において化合物の活性のより高い信頼性をもたらす。薬剤に関する広範な細胞系試験が当業者に知られている。細胞は、油中水エマルジョンの水性微小液滴のようなマイクロカプセル内にコンパートメント化できる。標的に対する化合物の作用は、化合物と共にマイクロカプセル内に細胞をコンパートメント化すること、および、適切な細胞系試験を用いて細胞に対して所望の作用を有する化合物を含有するコンパートメントを識別することにより測定することができる。フッ化炭素中水のエマルジョンの使用は特に好ましく、フッ化炭素の高い気体溶解能が呼吸ガスの交換を支援でき、細胞培養系に有利であることが報告されている。viフローサイトメトリー本発明の好ましい実施形態においては、マイクロカプセルまたはマイクロビーズをフローサイトメトリーにより分析および任意選択的に分類する。マイクロカプセルの多くのフォーマットをフローサイトメトリーを用いておよび任意選択的に直接分類できる。マイクロカプセルの一部のフォーマットは分析または分類の前にマイクロカプセルを別途処理することを必要とする場合がある。例えば油中水エマルジョンはフローサイトメトリーによる分析を容易にするために水中油中水のダブルエマルジョンに変換できる。多重エマルジョンは単純な一次油中水または水中油エマルジョンを再乳化して水中油中水または油中水中油エマルジョンとすることにより製造される。高度に単分散したマイクロカプセルは微小流体技術を用いて製造できる。例えば多分散度3未満の油中水エマルジョンは、油の共流動ストリーム内の液滴の破壊により産生できる。微小流体システムはまた微小流体チャンネル内の油のストリーム中に分散された水性の微小液滴の層流のためにも使用できる。これにより微小液滴の流動の分析および任意選択的に流動の分類のための微小流体装置の構築が可能となる。種々の光学特性を分析のため、および、分類をトリガーするために使用でき、例えば光散乱および蛍光分極が挙げられる。高度に好ましい実施形態においては、マイクロカプセルまたはマイクロビーズの光学特性の差は蛍光の差であり、必要に応じて、マイクロカプセルまたはマイクロビーズは蛍光活性化細胞ソーターまたは同様の装置を用いて分類する。フローサイトメトリーは下記の一連の利点を有する。1信頼できる製造元の市販の蛍光活性化細胞分類装置により100000マイクロカプセルまたはマイクロビーズs1までの分析および分類が可能である。2各マイクロカプセルまたはマイクロビーズから生じる蛍光シグナルは存在する蛍光分子の数に厳格に対応している。マイクロカプセルまたはマイクロビーズ当たり僅か数百の蛍光分子でも定量的に検出できる。3蛍光検出器のダイナミックレンジが広い典型的には4対数単位ことにより、分類の操作法の厳密性を容易に設定でき、これにより、原料プールから至適数量のマイクロカプセルまたはマイクロビーズを回収できるゲートは蛍光の僅かな差を有するマイクロカプセルまたはマイクロビーズを分離するか、蛍光の大きな差を有するマイクロカプセルまたはマイクロビーズを分離するのみとするか、実施する選択に応じて設定できる。4市販の蛍光活性化細胞分類装置は複数の波長において同時に励起および検出を実施でき、これにより、2~13またはそれ以上の蛍光マーカーによるマイクロカプセルまたはマイクロビーズの標識をモニタリングすることにより積極的および消極的な選択を同時に実施でき、例えば2種の交互の標的に対する基質を異なる蛍光タグで標識する場合、マイクロカプセルまたはマイクロビーズは調節される標的に応じて異なる蛍光団で標識できる。マイクロカプセルまたはマイクロビーズを光学的にタグ付けする場合は、フローサイトメトリーを用いてマイクロカプセル内に存在するまたはマイクロビーズ上にコーティングされた化合物を識別することもできる後述を参照。光学的タグ付けはマイクロカプセル内の化合物の濃度1段階より多い濃度を単一の実験で使用する場合またはマイクロビーズ上にコーティングされた化合物の分子の数1段階より多いコーティング密度を単一の実験で使用する場合を識別するためにも使用できる。更にまた、光学的タグ付けは、マイクロカプセル内の標的を識別するためにも使用できる1種より多い標的を単一の実験で使用する場合。この分析はマイクロビーズを含有するマイクロカプセルの分類の後、または、マイクロビーズの分類の後に、活性の測定と同時に実施できる。viiマイクロカプセルの識別および分類本発明は、使用する分類技術により可能となるインタクトのマイクロカプセルの識別および任意選択的に分類を提供する。マイクロカプセルは、所望の化合物により誘導される変化がマイクロカプセルの表面で発生または顕在化するか、または、マイクロカプセルの外部から検出される場合に、そのまま識別され、任意選択的に分類することができる。変化は、化合物の直接の作用によるか、または、うち1つ以上が所望の活性を有する化合物を使用する一連の反応が変化をもたらすような間接的なものにより、誘導されてよい。例えば、マイクロカプセルが膜マイクロカプセルである場合、標的を含む生化学的系の化合物がその表面にディスプレイされ、これによりマイクロカプセル内のマイクロビーズ上の化合物により調節される生化学的系の変化を検出できる試薬に接触可能となるようにマイクロカプセルを構成させてよい。しかしながら本発明の好ましい態様においては、マイクロカプセルの識別および任意選択的に分類は、マイクロカプセルの光学特性、例えばその吸収または発光の特性の変化、例えばマイクロカプセルに伴う吸光度、ルミネセンス、燐光または蛍光の変化をもたらす反応から生じるマイクロカプセルの光学特性の改変に依存している。このような特性の全ては光学的という用語に包含される。そのような場合、マイクロカプセルは識別され、任意選択的にルミネセンス、蛍光または燐光により活性化された分類により分類できる。高度に好ましい実施形態においては、フローサイトメトリーを用いることにより、マイクロカプセル内の蛍光分子の生成をもたらす所望の活性を有する化合物を含有するマイクロカプセルを分析および任意選択的に分類する。別の実施形態においては、マイクロカプセルの蛍光の変化は、それが識別されれば、コンパートメント内のマイクロビーズの修飾をトリガーするのに用いられる。本発明の好ましい態様において、マイクロカプセルの識別はマイクロカプセル内部のルミネセンス、燐光または蛍光をもたらす反応から生じるマイクロカプセルの光学特性の変化に依存している。マイクロカプセル内のマイクロビーズの修飾は、ルミネセンス、燐光または蛍光の識別によりトリガーされる。例えば、ルミネセンス、燐光または蛍光の識別はマイクロビーズまたはそれに結合している分子の修飾をもたらす光子または他の粒子または波動に対するコンパートメントの衝突をトリガーすることができる。同様の操作法が細胞の急速分類に関して以前に記載されている。マイクロビーズの修飾は、例えばマイクロビーズへの光不安定性保護基でケージ化された分子タグのカップリングから生じるものであってよく、適切な波長の光子との衝突はケージの除去をもたらす。その後、全てのマイクロカプセルを合わせ、マイクロビーズを1つの環境内に共にプールする。所望の活性を示す化合物でコーティングされたマイクロビーズはタグに特異的に結合するか特異的に反応する分子を用いてアフィニティー精製により選択できる。C化合物ライブラリi一次化合物のライブラリライブラリは種々の市販の原料から得ることができる。ライブラリ内の化合物は当業者の周知の種々の方法により製造できる。任意選択的に、化合物ライブラリは空間的に分割されたパラレル合成を用いた、または、スプリット合成を用いたコンビナトリアル合成により製造でき、任意選択的に1ビーズ1化合物のライブラリを生成させる。任意選択的に、化合物はビーズ上で合成できる。これらのビーズは直接マイクロカプセル内にコンパートメント化するかコンパートメント化の前に化合物を放出させることができる。好ましくは、化合物の僅か1種のみであるが、その複数のコピーを各マイクロカプセル内に存在させる。任意選択的に、化合物は当業者の知る種々の手段により共有結合的に、または、非共有結合的にマイクロビーズに連結できる。マイクロビーズは広範な種類の機能表面基、即ちアルデヒド、脂肪族アミン、アミド、芳香族アミン、カルボン酸、クロロメチル、エポキシ、ヒドラジド、ヒドロキシル、スルホネートおよびトシルにより付与される疎水性表面例えばプレーンポリスチレンから極めて親水性の表面まで、種々の表面化学のものが入手可能である。官能基はマイクロビーズ表面への化合物の安定または過逆的な結合のための当業者の周知の広範な共有結合反応を可能とする。好ましくは化合物は切断可能なリンカーを介してマイクロビーズに結合する。このような種々のリンカーは当業者の知る通りであり、例えば光化学的に切断できるリンカー、および、pHの変更により例えばイミンおよびアシルヒドラゾン、酸化還元特性を調節することにより例えばジスルフィドまたは外部触媒を用いながら例えば交差複分解およびアミド転換制御することができる可逆共有結合が挙げられる。好ましくは、化合物の僅か1種のみであるが、その複数のコピーを各ビーズ内に結合させる。ii二次化合物ライブラリ二次化合物ライブラリはマイクロカプセル内の一次化合物間の反応により産生される。二次化合物は当業者の周知の種々の2成分および多成分の反応により産生できる。2成分反応により二次化合物ライブラリを形成するためには、多くのコンパートメントが化合物2つ以上を含有するように、マイクロカプセル内に化合物2セットをコンパートメント化する。好ましくは、マイクロカプセル当たりの化合物の最頻数は2である。好ましくは、マイクロカプセルは化合物の各セットに由来する化合物の少なくとも1種を含有する。好ましくは、マイクロカプセルは化合物の各セットに由来する化合物1種を含有する。二次化合物は異なるセットに由来する一次化合物の間の化学反応により形成される。二次化合物は一次化合物の間の共有結合または非共有結合反応の結果であってよい。当業者の知る種々の化学的方法が2成分反応における二次化合物の形成に適している。例えばpHの変更により例えばイミンおよびアシルヒドラゾン、酸化還元特性を調節することにより例えばジスルフィドまたは外部触媒を用いながら例えば交差複分解およびアミド転換制御することができる可逆共有結合を用いることができる。別の実施形態においては、方法は3成分、4成分およびより高次の多成分の反応を用いて二次化合物ライブラリを生成できる。3、4またはそれ以上のセットの化合物適宜をマイクロカプセル内にコンパートメント化する。化合物は多くのコンパートメント化が複数の化合物を含有するようにマイクロカプセル内にコンパートメント化する。好ましくは、マイクロカプセル当たりの化合物の最頻数は反応における成分の数と等しい。好ましくは、マイクロカプセルは化合物の各セットに由来する化合物の少なくとも1種を含有する。好ましくは、マイクロカプセルは化合物の各セットに由来する化合物1種を含有する。二次化合物は異なるセットに由来する一次化合物の間の化学反応により形成される。二次化合物は一次化合物の間の共有結合または非共有結合反応の結果であってよい。適当な多成分反応の例はStrecker、Hantzsch、Biginelli、Mannich、Passerini、BuchererBergsおよびPausonKhandの3成分反応およびUgiの4成分反応である。二次化合物ライブラリは全ての二次化合物に共通であるスカフォールド分子を用いて構築してもよい。このスカフォールド分子は他の一次化合物と共にマイクロカプセル内にコンパートメント化してよい。別の実施形態において、2成分反応により二次化合物ライブラリを形成するためには、化合物2セットをマイクロビーズに結合することにより、好ましくは、マイクロビーズ当たり僅か1種の分子のみを得る。多くのコンパートメントが2以上のマイクロビーズを含有するようにマイクロカプセル内にマイクロビーズをコンパートメント化する。好ましくは、、マイクロカプセル当たりのビーズの最頻数は2である。2セットの少なくとも1つを含む化合物をマイクロビーズから放出する。二次化合物は異なるセットの一次化合物間の化学反応により形成される。二次化合物は一次化合物の間の共有結合または非共有結合反応の結果であってよい。別の実施形態においては、方法は3成分、4成分およびより高次の多成分の反応を用いて二次化合物ライブラリを産生できる。3、4またはそれ以上のセットの化合物適宜をマイクロビーズに結合することにより、好ましくはマイクロビーズ当たり単一の種類の分子のみを得る。マイクロビーズは多くのコンパートメント化が複数のマイクロビーズを含有するようにマイクロカプセル内にコンパートメント化する。好ましくは、マイクロカプセル当たりのビーズの最頻数は反応における成分の数と等しい。セットの全てまたは1つの何れかを含む化合物がマイクロビーズから放出される。二次化合物は異なるセットに由来する一次化合物の間の化学反応により形成される。二次化合物は一次化合物の間の共有結合または非共有結合反応の結果であってよい。好ましくは、二次化合物を形成するために用いられるものと同じ可逆的共有結合を用いてマイクロビーズに一次化合物をカップリングできる。二次化合物ライブラリは、二次化合物の全てに共通のスカフォールド分子を用いて構築される。このスカフォールド分子はマイクロビーズと共にマイクロカプセル内にコンパートメント化してよい。D化合物の識別マイクロカプセル内またはマイクロビーズ上の化合物は種々の方法で識別できる。識別されたマイクロカプセルを分類例えば蛍光活性化細胞ソーター:FACSを使用する場合、化合物は例えば質量スペクトル分析による直接の分析により識別できる。選択例えばアフィニティー精製によるまたは分類例えばFACSを使用の結果として単離されたビーズに結合したままで化合物が残存する場合、それらはまた例えば質量スペクトル分析による直接の分析により識別できる。マイクロカプセルまたはビーズは当業者の周知の種々の手段によりタグ付けでき、そのタグを用いてビーズに結合した化合物を識別する。化合物をコード化する化学的、スペクトル分析的、電子的および物理的な方法は全て使用してよい。好ましい実施形態においては、マイクロカプセルまたはビーズは異なる光学特性を有し、これにより光学的にコード化される。好ましい実施形態においては、コード化は異なる蛍光特性を有するマイクロカプセルまたはビーズに基づく。高度に好ましい実施形態においては、マイクロカプセルまたはビーズはマイクロカプセルまたはビーズ内に異なる濃度で存在する蛍光量子ドットを用いてコード化される。微小流体チャンネル内を順序だった配列として流動しているマイクロカプセルはまたマイクロカプセルのストリーム内のその配列によりコード化全体的または部分的できる位置コード化。好ましくは、各化合物は異なる濃度典型的にはmM~nMの範囲の濃度で異なるマイクロカプセル内に存在することにより、用量応答曲線の作成を可能とする。これは、例えば阻害化合物の阻害定数Kiの測定を可能にする。マイクロカプセル内の化合物の濃度は例えば上記したマイクロカプセルまたはマイクロビーズの光学的コード化または位置コード化により測定できる。E標的の識別好ましくは、各マイクロカプセルが同じ標的の複数のコピーを含有するように複数の異なる標的をマイクロカプセル内にコンパートメント化できる。例えば複数のプロテインキナーゼ、または単一の標的の複数の多形変異体をコンパートメント化することにより化合物の特異性を測定可能にできる。マイクロカプセル内の標的の特性は、例えば上記したマイクロカプセルまたはマイクロビーズの光学的コード化または位置コード化により測定できる。別の様式において表現すれば、a多くのコンパートメント化が一次化合物2つ以上を含むように標的と共にマイクロカプセル内に一次化合物のセット2つ以上をコンパートメント化するステップ;b異なるセットに由来する一次化合物の間の化学反応によりマイクロカプセル中に二次化合物を形成するステップ;および、c反応して標的に結合するか標的の活性をモジュレートする二次化合物を形成する一次化合物のサブセットを識別するステップ;を含む、生化学的系の標的成分に結合するか、または標的の活性をモジュレートする化合物の合成および識別のための方法が提供される。更にまた、1マイクロビーズ上に一次化合物2セット以上を結合させるステップ;2多くのコンパートメントがマイクロビーズ2つ以上を含有するように標的と共にマイクロカプセル内にマイクロビーズをコンパートメント化するステップ;3マイクロビーズから一次化合物を放出させるステップ;4異なるセットに由来する一次化合物の間の化学反応によりマイクロカプセル中に二次化合物を形成するステップ;および、5反応して標的に結合するか標的の活性をモジュレートする二次化合物を形成する一次化合物のサブセットを識別するステップ;を含む、生化学的系の標的成分に結合するか、または標的の活性をモジュレートする化合物の合成および識別のための方法が提供される。一次化合物が同じコンパートメント内の他の一次化合物のみならずコンパートメント内の他のマイクロビーズとも反応する場合、共に反応して二次化合物を形成する一次化合物は選択または分類の結果として単離されたマイクロビーズ上に存在する化合物の直接の分析により識別できる。例えば、コンパートメント内に放出される場合に一次化合物がジスルフィド結合を介してビーズに連結されている場合、一次化合物は二次化合物を形成するために相互に、そして、ビーズ上のスルフィドリル基と反応することになる。従って、ビーズ2個を共コンパートメント化する場合、各ビーズは最終的には共に一次化合物を担持することになる。これらのビーズを単離した後、反応して二次化合物を形成する一次化合物の両者が識別できる。本発明の種々の態様および実施形態を以下の実施例において説明する。詳細の変更は本発明の範囲を逸脱することなく行えるものとする。[実施例1:酵素タンパク質チロシンホスファターゼ1BPTP1Bの阻害剤のスクリーニング]PTP1Bはインスリンおよびレプチンのシグナル伝達の負の調節物質である。インスリンおよびレプチンに対する耐性はII型真性糖尿病および肥満の指標であり、従ってPTP1Bは糖尿病および肥満の治療のための魅力的な薬剤標的である。2種の油中水エマルジョンを以下の通り作成した。デカン中の1w/vSpan60および1w/vコレステロールの溶液は、デカン7.84mlにSpan60を80mg、コレステロールを80mg溶解することにより製造する。デカンを45°Cに加熱し、界面活性剤およびコレステロールの完全な可溶化を可能とする。界面活性剤/デカンの溶液を200μlのバッチに渡り分割し、37°Cのブロックヒーター中に入れる。手操作押し出し装置を製造元の取扱説明書に従って組み立てる。押し出しのためには、平均孔径14μmのシングルの19mmのTrackEtchポリカーボネートフィルターをミニ押出機の内部に装着する。2本の気密性1mlハミルトンシリンジを押し出しに使用する。デカン1mlをにハミルトンシリンジ1本にロードしてシリンジをミニ押出機の一端に置き押出機の他方上の空のハミルトンシリンジ内にフィルターを経由してそれを押し出すことにより、デカン3×1mlで押出機を前洗浄した。第1のエマルジョンは、PTP1B活性に適合した緩衝液25mMHEPES、pH7.4、125mMNaCl、10グリセロール、1mMEDTA中のビス-ジフルオロメチレンホスホネートを有しており公知のPTP1B阻害剤である100μM化合物2図150μl、5mU/mlの標的酵素ヒト組み換えPTP1B、残基1~322;BiomolResearchLaboratoriesInc、蛍光発生PTP1B基質6,8-ジフルオロ-4-メチルウンベリフェリルホスホネートDiFMUPおよび100μMテキサスレッドSigma;励起/発光最大595/615nm;赤色蛍光をハミルトンシリンジの1本に、予備加熱したデカン/界面活性剤混合物を他のハミルトンシリンジにロードすることにより作成する。シリンジを押出機のフィルターホルダーの両側の開口部内に装着する。化合物混合物を強制的にフィルターホルダーを通してデカン/界面活性剤混合物の入った別のシリンジ内に入れ、直接強制的に元のシリンジに戻すことにより、押し出しの1往復を完了する。合計で7.5往復の押し出しを完了する。充填されたシリンジを押出機から取り外し、1.7mlAxygen試験管内にあける。第2の油中水エマルジョンは化合物2の代わりにPTP1B阻害剤ではない化合物である100μMヒドロケイヒ酸を、テキサスレッドの代わりに100μMカルセインSigma;励起/発光最大470/509nm;緑色蛍光を含有する以外は上記エマルジョンと同一に作成する。1:1000~1:1化合物2エマルジョン:ヒドロケイヒ酸エマルジョンの範囲の比で2種のエマルジョンを振とうすることにより混合し、30分間37°Cでインキュベートする。阻害剤は脱ホスホリル化生成物DiFMU;励起/発光最大358/452nm;青色蛍光に変換される非蛍光基質DiFMUPの量を低減する。次に油中水エマルジョンを以下の通り水中油中水ダブルエマルジョンに変換する。押出機上記参照を分解し、石鹸および逆浸透水で十分洗浄し、再度組み立てる。平均孔径8μmのシングルの19mmTrackEtchポリカーボネートフィルターを装着する。押出機をリン酸緩衝食塩水PBS3×1mlで予備洗浄する。0.5w/vTween80を含有するPBS750μlを1mlの気密性ハミルトンシリンジにロードし、押出機に装着する。油中水エマルジョン250μlを別の1mlハミルトンシリンジにロードし、押出機に装着する。エマルジョンを強制的にフィルターを通してPBS/0.5Tween80の入った別のシリンジ内に入れ、即座に強制的に元のシリンジに戻すことにより、押し出しの1サイクルを完了する。合計で4.5サイクルの押し出しを完了する。充填されたシリンジを押出機から取り外し、1.7mlAxygen試験管内にあける。形成された水中油中水のダブルエマルジョンを氷上に置く。次にダブルエマルジョンをMoFloフローサイトメトリーを用いた多色フローサイトメトリーにより分析する。主に、緑色蛍光を示すヒドロケイヒ酸を含有するマイクロカプセルがPTP1BによるDiFMUPの脱ホスホリル化により青色蛍光も示す。主に、赤色蛍光を示す化合物2を含有するマイクロカプセルがPTP1Bの阻害により青色蛍光は殆どまたは全く示さない。[実施例2]2種の水性混合物を氷上反応を防止するためにおいて作成する。第1の混合物はPTP1B活性に適合した緩衝液25mMHEPES、pH7.4、125mMNaCl、10グリセロール、1mMEDTA中のビス-ジフルオロメチレンホスホネートを有しており知られたPTP1B阻害剤である100μM化合物2図1、5mU/mlの標的酵素ヒト組み換えPTP1B、残基1~322;BiomolResearchLaboratoriesInc、蛍光発生PTP1B基質6,8-ジフルオロ-4-メチルウンベリフェリルホスホネートDiFMUPおよび100μMテキサスレッドSigma;励起/発光最大595/615nm;赤色蛍光を含有する。第2の混合物は化合物2の代わりにPTP1B阻害剤ではない化合物である100μMヒドロケイヒ酸を、テキサスレッドの代わりに100μMカルセインSigma;励起/発光最大470/509nm;緑色蛍光を含有する以外は上記と同一に作成する。化合物混合物の各々の50μlを順次、実施例1に記載したとおり作成し37°Cに保持したデカン中1w/vSpan60および1w/vコレステロールの溶液に添加し、その間5mmの分散ツールでUltraTurraxT8ホモゲナイザーを用いながら25000rpmでホモゲナイズする。ホモゲナイズは第2の小分量を添加した後3分間継続する。次に生成した粗野なエマルジョンを実施例1の通り押し出し、微小な油中水エマルジョンを作成し、30分間37°Cでインキュベートする。阻害剤は脱ホスホリル化生成物DiFMU;励起/発光最大358/452nm;青色蛍光に変換される非蛍光基質DiFMUPの量を低減する。次に油中水エマルジョンを水中油中水ダブルエマルジョンに変換し、実施例1に記載の通り多色フローサイトメトリーで分析する。主に、緑色蛍光を示すヒドロケイヒ酸を含有するマイクロカプセルがPTP1BによるDiFMUPの脱ホスホリル化により青色蛍光も示す。主に、赤色蛍光を示す化合物2を含有するマイクロカプセルがPTP1Bの阻害により青色蛍光は殆どまたは全く示さない。[実施例3:化合物ライブラリからのPTP1B阻害剤のスクリーニング]実施例1に記載の通り100種の油中水エマルジョンを氷上反応を防止するためにおいて作成する。第1のエマルジョンは、ビス-ジフルオロメチレンホスホネートを有しており知られたPTP1B阻害剤である100μM化合物2図1、5mU/mlの標的酵素ヒト組み換えPTP1B、残基1~322;BiomolResearchLaboratoriesInc、蛍光発生PTP1B基質6,8-ジフルオロ-4-メチルウンベリフェリルホスホネートDiFMUPおよび発光最大585nm、655nmおよび705nmを有する予備設定された比のQdot商標ストレプトアビジンコンジュゲートの混合物をPTP1B活性に適合した緩衝液25mMHEPES、pH7.4、125mMNaCl、10グリセロール、1mMEDTAに分散することにより作成する。99種の他の油中水エマルジョンは、化合物2の代わりにカルボン酸有機ビルディングブロックライブラリ由来の99種のカルボン酸のうちの1つ、および、発光最大585nm、655nmおよび705nmを有する異なる比のQdot商標ストレプトアビジンコンジュゲートを各々が含有する以外は上記と同一である。全てのエマルジョンにおいて、705nmQdot商標ストレプトアビジンコンジュゲートの濃度は100nMであり、585nmおよび655nmQdot商標ストレプトアビジンコンジュゲートの濃度は0、11、22、33、44、55、66、77、88または100nMの何れかとする。従って、10010×10通りのQdot商標ストレプトアビジンコンジュゲートの濃度があることになり、これにより、705nm、585nmおよび655nmにおける蛍光の蛍光比を測定することにより読み取られる独特の蛍光シグネチャーを各化合物を含有するマイクロカプセルが保有できるようになる。100種のエマルジョンを振とう攪拌により等しい比で混合し、温度を30分間25°Cまで上昇させる。阻害剤は脱ホスホリル化生成物DiFMU;励起/発光最大358/452nm;青色蛍光に変換される非蛍光基質の量を低減する。次に油中水エマルジョンを水中油中水ダブルエマルジョンに変換し、実施例1に記載の通り多色フローサイトメトリーで分析する。化合物2を含有するマイクロカプセルのQdot蛍光シグネチャーのものを除き、主に、全てのマイクロカプセルはPTP1BによるDiFMUPの脱ホスホリル化により青色蛍光を示す。[実施例4:化合物ライブラリからのPTP1B阻害剤のスクリーニング]100種の水性混合物を氷上反応を防止するためにおいて作成する。第1の混合物は、PTP1B活性に適合した緩衝液25mMHEPES、pH7.4、125mMNaCl、10グリセロール、1mMEDTA中のビス-ジフルオロメチレンホスホネートを有しており知られたPTP1B阻害剤である100μM化合物2図1、5mU/mlの標的酵素ヒト組み換えPTP1B、残基1~322;BiomolResearchLaboratoriesInc、蛍光発生PTP1B基質6,8-ジフルオロ-4-メチルウンベリフェリルホスホネートDiFMUPおよび発光最大585nm、655nmおよび705nmを有する予備設定された比のQdot商標ストレプトアビジンコンジュゲートを含有する。99種の他の水性混合物は、化合物2の代わりにカルボン酸有機ビルディングブロックライブラリ由来の99種のカルボン酸のうちの1つ、および、発光最大585nm、655nmおよび705nmを有する異なる比のQdot商標ストレプトアビジンコンジュゲートを各々が含有する以外は上記と同一である。全ての混合物において、705nmQdot商標ストレプトアビジンコンジュゲートの濃度は100nMであり、585nmおよび655nmQdot商標ストレプトアビジンコンジュゲートの濃度は0、11、22、33、44、55、66、77、88または100nMの何れかとする。従って、10010×10通りのQdot商標ストレプトアビジンコンジュゲートの濃度があることになり、これにより、705nm、585nmおよび655nmにおける蛍光の蛍光比を測定することにより読み取られる独特の蛍光シグネチャーを各化合物を含有するマイクロカプセルが保有できるようになる。化合物混合物の各々0.5μlを順次、実施例1に記載したとおり作成し37°Cに保持したデカン中1w/vSpan60および1w/vコレステロールの溶液に添加し、その間5mmの分散ツールでUltraTurraxT8ホモゲナイザーIKAを用いながら25000rpmでホモゲナイズする。ホモゲナイズは第2の小分量を添加した後3分間継続する。次に生成した粗野なエマルジョンを実施例1の通り押し出し、微小な油中水エマルジョンを作成し、30分間37°Cでインキュベートする。阻害剤は脱ホスホリル化生成物DiFMU;励起/発光最大358/452nm;青色蛍光に変換される非蛍光基質DiFMUPの量を低減する。次に油中水エマルジョンを水中油中水ダブルエマルジョンに変換し、実施例1に記載の通り多色フローサイトメトリーで分析する。化合物2を含有するマイクロカプセルのQdot蛍光シグネチャーのものを除き、主に、全てのマイクロカプセルはPTP1BによるDiFMUPの脱ホスホリル化により青色蛍光を示す。[実施例5:微小流体システムにおけるマイクロカプセルを使用したPTP1B阻害剤のスクリーニング]微小チャンネルはポリジメチルシロキサンPDMS中の急速なフォトタイピングを用いて長方形の断面を有するように加工し、SongandIsmagilov2003に記載の通り疎水性を付与する。シリンジポンプを用いて流動を起こしたHarvardApparatusPHD2000Infusionポンプ。水溶液については、取り外し可能な27ゲージ針のついた50μlのハミルトンガスタイトシリンジ1700シリーズ、TLLを30ゲージのテフロン登録商標チューブと共に使用した。キャリア流体に対しては、1mlハミルトンガスタイトシリンジ1700シリーズ、TLLをハミルトンの1ハブを有する30ゲージのテフロン登録商標針と共に使用した。キャリア流体はパーフルオロデカリンPFD中9v/vのC6F11C2H4OHとする。全ての水溶性試薬はPTP1B活性に適合した緩衝液25mMHEPES、pH7.4、125mMNaCl、1mMEDTA中に溶解した。50mU/mlの標的酵素ヒト組み換えPTP1B、残基1~322;BiomolResearchLaboratoriesIncの溶液、および、aビス-ジフルオロメチレンホスホネートを有しており知られたPTP1B阻害剤である100μM化合物2図1またはbPTP1B阻害剤ではない化合物である100μMヒドロケイヒ酸を不活性の中心ストリーム25mMHEPES、pH7.4、125mMNaCl、1mMEDTAを有する2本の層流ストリームとしてのマイクロチャンネル中を流動させることにより、これらを分離し、酵素と化合物が液滴マイクロカプセル形成よりも前に接触することを防止する。これらの3ストリームを連続的に水不混和性のフッ化炭素キャリア流体PFD中9v/vC6F11C2H4OH中に注入する。水溶液用の導入チャンネルは50μm2の広さとし、PFD用チャンネルは28μm幅とする。0.6:0.3、1.0:0.6、12.3:3.7、10:6および20:6を含む種々のPFD/水の計量的流量μ/分を使用でき、得られる流量はそれぞれ10、19、190、190および300mm/秒となる。チャンネルの全幅を占有する水性マイクロカプセルはPFDストリーム中の液滴の破壊により形成する。化合物2またはヒドロケイヒ酸の何れかを含有するマイクロカプセルは、化合物2およびヒドロケイヒ酸を含有するシリンジを用いた注入を切り替えながら行うことにより形成できる。液滴形成地点のすぐ下流のチャンネルは1mmの距離に渡りピーク間の距離50μmで旋廻している。これにより混乱移流によるマイクロカプセルの内容物の急速な混合が起こる。この地点の後、マイクロカプセルは長さ60cmのマイクロチャンネルを経由して1分間まで流動するこれにより阻害剤の結合を可能とする。次にこのマイクロチャンネルを上記した通り形成したPFD中9v/vC6F11C2H4OH中に水性マイクロカプセルを含有する60×50μm2マイクロチャンネルと合流させる。これらのより大きいマイクロカプセルは25mMHEPES、pH7.4、125mMNaCl、1mMEDTA中の蛍光発生PTP1B基質6,8-ジフルオロ-4-メチルウンベリフェリルホスホネートDiFMUPを含有する。マイクロチャンネルの間の注入の後、拡張した主チャンネルは100×50μm2であり、マイクロカプセルはチャンネルをブロックせず、大型のマイクロカプセルDiFMUPを含有が小型のマイクロカプセルPTP1Bおよび化合物を含有と合体するまで異なる速度で移動する。大型および小型のマイクロカプセルの生成の頻度は、各大型マイクロカプセルが融合すべき小型マイクロカプセルを有するように、等しくする。融合したマイクロカプセルは長さ60cmのマイクロチャンネルを経由して2分間まで流動する。DiFMUP励起/発光最大358/452nm;青色蛍光の生成によるマイクロカプセルの蛍光はエピ蛍光顕微鏡を用いて測定する。主に、青色蛍光を示すマイクロカプセルがヒドロケイヒ酸を含有するものであり、化合物2を含有するマイクロカプセルはPTP1Bの阻害により低い蛍光を示す。[実施例6:マイクロビーズへの化合物ライブラリの結合]表面上にカルボキシレート官能基を有する直径5.5μmのポリスチレンマイクロビーズはオレンジ色585nmおよび赤色>650nmの蛍光色素の厳密な比の取り込みの結果として光学的にタグ付けされた形態で市販されている。各々が独特の光学的シグネチャーを有するこのようなビーズ100個のセットを過剰なエチレンジアミンおよびEDC塩酸1-エチル-3-3-ジメチルアミノプロピルカルボジイミドでHermanson1996に記載の通り修飾し、表面に第1アミノ基を形成した。次に上記した通りEDCを用いてアミド結合を形成することにより、光分解性のリンカー4-4-ヒドロキシメチル-2-メトキシ-5-ニトロフェノキシブタン酸をビーズに結合させる。次に、リンカーアルコールと反応させることによりカルボン酸有機ビルディングブロックライブラリ由来の100種の異なるカルボン酸をビーズにカップリングさせてカルボキシレートエステルを形成し、100種の異なる光学的にタグ付けされたビーズの各々が異なるカルボン酸にカップリングし、そして各ビーズがカルボン酸~106分子で誘導体化されるようにする。B100AP354nmUVランプUVPを用いて~5cmの距離から氷上4分間照射することによりカルボン酸としてビーズから化合物を放出させる。[実施例7:マイクロビーズに結合した化合物を用いた酵素タンパク質チロシンホスファターゼ1BPTP1Bの阻害剤のスクリーニング]PTP1Bはインスリンおよびレプチンのシグナル伝達の負の調節物質である。インスリンおよびレプチンに対する耐性はII型真性糖尿病および肥満の指標であり、従ってPTP1Bは糖尿病および肥満の治療のための魅力的な薬剤標的である。表面上にカルボキシレート官能基を有する直径5.5μmのポリスチレンマイクロビーズはオレンジ色585nmおよび赤色>650nmの蛍光色素の厳密な比の取り込みの結果として光学的にタグ付けされた形態で市販されている。まず、マイクロビーズ上のカルボキシレート官能基を実施例6の場合と同様にエチレンジアミンおよびEDCを用いて第1アミンに変換する。次にPTP1Bのホスホペプチド基質であるウンデカペプチドEGFR988998DADEpYLIPQQGをEDCを用いて表面アミノ基を介してマイクロビーズの両方のセットにカップリングさせる。このペプチドはカルボキシレート-O-アリルエステルを用いた側鎖カルボキシレート基上の直角保護を用いてSieberAmide樹脂9-Fmoc-アミノ-キサンテン-3-イルオキシ-Merrifield樹脂上の固相合成により作成する。テトラデカンジ酸からなるリンカーをN末端にカップリングし、1TFAを用いてビーズからペプチドを脱離させ、C末端アミドを有するペプチドを得る。ペプチドをリンカーを介してビーズにカップリングさせEDC使用、ビーズ当たり~105ペプチドを得る。次に実施例6に記載の通り光化学分解性リンカー4-4-ヒドロキシメチル-2-メトキシ-5-ニトロフェノキシブタン酸を結合することにより残余の表面アミノ基を修飾する。次にペプチドの側鎖カルボキシレート上の保護基をPdPh34/CHCl3/HOAc/N-メチルモルホリンを用いて脱離させる。第1のセットのマイクロビーズを知られたPTP1B阻害剤である化合物である3-4-ジフルオロホスホノメチルフェニルプロパン酸化合物1、図1で誘導体化する。第1のセットのビーズとは別の光学的タグを有する第2のセットのビーズはPTP1B阻害剤ではない化合物であるヒドロケイヒ酸で誘導体化する。各々の場合において、実施例6に記載の通り、化合物はリンカーアルコールと反応させることによりカップリングしてカルボキシレートエステルを形成する。各マイクロビーズは~106分子で誘導体化する。次にマイクロビーズを図2に示す方法を用いてスクリーンする。2セットのマイクロビーズを1:100~1:1化合物1ビーズ:ヒドロケイヒ酸ビーズの範囲の比で混合し、合計108マイクロビーズをPTP1B活性に適合した緩衝液25mMHEPES、pH7.4、125mMNaCl、10グリセロール、1mMEDTA中、氷上反応を防止するためで、10nMの濃度の標的酵素ヒト組み換えPTP1B、残基1~322;BiomolResearchLaboratoriesIncと混合する。次にシングルのビーズおよび標的酵素PTP1Bを、油中水エマルジョンを形成やはり氷上することによりマイクロカプセル内に共局在化させる。ビーズの濃度は大部分のマイクロカプセルが1個または0個のビーズを含有するようにする。化合物を光化学的実施例6に記載に放出させ、温度を25°Cに上昇させる。阻害剤は生成物脱ホスホリル化ペプチドに変換される基質の量を低減する。エマルジョンを4°Cに冷却し、GriffithsandTawfik2003に記載の通り破壊して100μMバナジン酸塩中にいれ、反応を停止させる。製造元の取扱説明書に従って緑色530nm蛍光色素フルオレセインイソチオシアネートで標識した抗基質抗ホスホチロシン抗体マウスモノクローナルIgG2bPY20,で標識した後、FACScan、FACScaliburまたはMoFloフローサイトメトリーを用いて3色フローサイトメトリーによりビーズを分析し、阻害の程度およびビーズ上の化合物を同時に測定する。主に、PTP1B阻害剤でコーティングされたマイクロビーズ上のみペプチドの脱ホスホリル化が観察され、他のマイクロビーズでは観察されなかった。[実施例8:マイクロビーズに結合した化合物ライブラリからのPTP1B阻害剤のスクリーニング]表面上にカルボキシレート官能基を有し、各々がオレンジ色585nmおよび赤色>650nmの蛍光色素の厳密な比の取り込みの結果として独特の光学的シグネチャーを有する直径5.5μmのポリスチレンマイクロビーズ100個のセットをPTP1Bのホスホペプチド基質であるウンデカペプチドEGFR988998DADEpYLIPQQGおよび光化学的に切断できるリンカーを介して各々結合した100種の異なるカルボン酸を用いて、実施例7に記載の通り誘導体化する。これらのカルボン酸の1つは知られたPTP1B阻害剤である化合物である3-4-ジフルオロホスホノメチルフェニルプロパン酸化合物1、図1である。他の99種のカルボン酸は実施例6と同様にカルボン酸有機ビルディングブロックライブラリ由来である。次に100ビーズセットの各々の等しい数量を混合し、実施例7に記載の通りスクリーニングする。主に、PTP1B阻害剤の3-4-ジフルオロホスホノメチルフェニルプロパン酸化合物1、図1でコーティングされたマイクロビーズ上のみペプチドの脱ホスホリル化が観察され、他の化合物でコーティングされたマイクロビーズでは観察されなかった。[実施例9:エマルジョンマイクロカプセル中の二次化合物の合成および微小流体システム中のPTP1Bの阻害剤に関するスクリーニング]微小チャンネルはポリジメチルシロキサンPDMS中の急速なフォトタイピングを用いて長方形の断面を有するように加工し、SongandIsmagilov2003に記載の通り疎水性を付与する。シリンジポンプを用いて流動を起こしたHarvardApparatusPHD2000Infusionポンプ。水溶液については、取り外し可能な27ゲージ針のついた50μlのハミルトンガスタイトシリンジ1700シリーズ、TLLを30ゲージのテフロン登録商標チューブと共に使用した。キャリア流体に対しては、1mlハミルトンガスタイトシリンジ1700シリーズ、TLLをハミルトンの1ハブを有する30ゲージのテフロン登録商標針と共に使用した。キャリア流体はパーフルオロデカリンPFD中9v/vのC6F11C2H4OHとする。全ての水溶性試薬はPTP1B活性に適合した緩衝液25mMHEPES、pH7.4、125mMNaCl、1mMEDTA中に溶解した。50mU/mlの標的酵素ヒト組み換えPTP1B、残基1~322;BiomolResearchLaboratoriesIncの溶液、第1アミンである化合物の溶液およびアルデヒドである化合物の溶液を2つの不活性の分離ストリーム25mMHEPES、pH7.4、125mMNaCl、1mMEDTAを有する3本の層流ストリームとしてのマイクロチャンネル中を流動させることにより、酵素と化合物が液滴マイクロカプセル形成よりも前に接触することを防止する。これらの5ストリームを連続的に水不混和性のフッ化炭素キャリア流体PFD中9v/vC6F11C2H4OH中の流れに注入する。アミンおよびアルデヒドはaジフルオロメチレンホスホネート部分図6、化合物AおよびBを含有するか、または、bジフルオロメチレンホスホネート部分を含有しないのいずれかであり得る。水溶液用の導入チャンネルは50μm2の広さとし、PFD用チャンネルは28μm幅とする。0.6:0.3、1.0:0.6、12.3:3.7、10:6および20:6を含む種々のPFD/水の計量的流量μ/分を使用でき、得られる流量はそれぞれ10、19、190、190および300mm/秒となる。チャンネルの全幅を占有する水性マイクロカプセルはPFDストリーム中の液滴の破壊により形成する。ジフルオロメチレンホスホネート部分を有するまたは有さない化合物を含有するマイクロカプセルは、ジフルオロメチレンホスホネート部分を有するまたは有さないアミンまたはアルデヒドを含有するシリンジを用いた注入を切り替えながら行うことにより形成できる。液滴形成地点のすぐ下流のチャンネルは1mmの距離に渡りピーク間の距離50μmで旋廻している。これにより混乱移流によるマイクロカプセルの内容物の急速な混合が起こる。この地点の後、マイクロカプセルは長さ60cmのマイクロチャンネルを経由して1分間まで流動する。これによりアミンとアルデヒドは、シッフ塩基の形成により共に反応し、二次化合物を生成し、阻害剤がPTP1Bに結合できるようにする。次にこのマイクロチャンネルを上記した通り形成したPFD中9v/vC6F11C2H4OH中に水性マイクロカプセルを含有する60×50μm2マイクロチャンネルと合流させる。これらのより大きいマイクロカプセルは25mMHEPES、pH7.4、125mMNaCl、1mMEDTA中の蛍光発生PTP1B基質6,8-ジフルオロ-4-メチルウンベリフェリルホスホネートDiFMUPを含有する。マイクロチャンネルの間の注入の後、拡張した主チャンネルは100×50μm2であり、マイクロカプセルはチャンネルをブロックせず、大型のマイクロカプセルDiFMUPを含有が小型のマイクロカプセルPTP1Bおよび化合物を含有と合体するまで異なる速度で移動できる。大型および小型のマイクロカプセルの生成の頻度は、各大型マイクロカプセルが融合すべき小型マイクロカプセルを有するように、等しくする。融合したマイクロカプセルは長さ60cmのマイクロチャンネルを経由して2分間まで流動する。DiFMU励起/発光最大358/452nm;青色蛍光の生成によるマイクロカプセルの蛍光はエピ蛍光顕微鏡を用いて測定する。主に、アミンおよびアルデヒドの濃度が低い<100μM場合は、PTP1B活性の阻害はジフルオロメチレンホスホネート部分を有するアミン化合物A、図6およびジフルオロメチレンホスホネート部分を有するアルデヒド化合物B、図6の両方を含有するマイクロカプセルにおいて観察されるのみである。これはこれらのマイクロカプセル内に形成されたシッフ塩基化合物C、図6がビス-ジフルオロメチレンホスホネートを含有しており、単一のジフルオロメチレンホスホネート部分を有する分子よりもはるかに強力なPTP1B阻害剤であるためである図1参照。主に、アミンおよびアルデヒドの濃度が高い>100μM場合は、PTP1B活性の阻害はジフルオロメチレンホスホネート部分を有するアミン化合物A、図6またはジフルオロメチレンホスホネート部分を有するアルデヒド化合物B、図6の何れか、または両方を含有するマイクロカプセルにおいて観察されるが、他のマイクロカプセルでは観察されない。これは、単一のジフルオロメチレンホスホネート部分またはビス-ジフルオロメチレンホスホネート化合物C、図6の何れかを有するより高濃度の分子がPTP1Bを阻害できるためである図1参照。[実施例10:エマルジョンマイクロカプセル中の二次化合物の合成およびマイクロビーズに結合した化合物を用いたPTP1Bの阻害剤に関するスクリーニング]表面上にカルボキシレート官能基を有する直径5.5μmのポリスチレンマイクロビーズはオレンジ色585nmおよび赤色>650nmの蛍光色素の厳密な比の取り込みの結果として光学的にタグ付けされた形態で市販されている。まず、マイクロビーズ上のカルボキシレート官能基を実施例6の場合と同様にエチレンジアミンおよびEDCを用いて第1アミンに変換する。次にPTP1Bのホスホペプチド基質であるウンデカペプチドEGFR988998DADEpYLIPQQGをEDCを用いて表面アミノ基を介してマイクロビーズの両方のセットにカップリングさせ、ペプチドの側鎖カルボキシレート上の保護基を実施例7に記載するとおり除去する。第1のセットのマイクロビーズセット1をスクシンイミジルp-ホルミルベンゾエートと反応させることにより表面アミノ基をアルデヒドに変換する。第1のセットのマイクロビーズとは別の光学的タグを有する第2のセットのマイクロビーズセット2は未反応のままとする即ち表面上第1アミンを有する。次に第1のセットのマイクロビーズセット1を表面アルデヒド基との反応を介してジフルオロメチレンホスホネート部分をおよび第1アミンを含有する化合物化合物A、図6と反応させ、シッフ塩基を形成する。第1のセットのビーズとは別の光学的タグを有する第2のセットのマイクロビーズセット2は表面アミン基とのアルデヒドの反応を介してジフルオロメチレンホスホネート部分およびアルデヒドを含有する化合物化合物B、図6と反応させ、シッフ塩基を形成する。シッフ塩基の形成はアルカリpH即ちpH9~10における反応により増強される。種々の密度で化合物をコーティングしたマイクロビーズを生成する。2セットのマイクロビーズをPTP1B活性に適合した緩衝液25mMHEPES、pH7.4、125mMNaCl、10グリセロール、1mMEDTA中、氷上反応を防止するためで10nMの濃度の標的酵素ヒト組み換えPTP1B、残基1~322;BiomolResearchLaboratoriesIncと混合する。ビーズおよび標的酵素PTP1Bは油中水エマルジョンやはり氷上を形成することによりマイクロカプセル内に即座にコンパートメント化される。マイクロビーズの数は一端において大部分のマイクロカプセルが1個または0個のビーズを含み、もう一端においてはマイクロカプセルの大部分がマイクロビーズ2個以上を含むように変動させる。温度を25°Cに上昇させる。シッフ塩基は比較的不安定な可逆性の相互作用であり、中性pHにおいて容易に加水分解され、ビーズから化合物を放出させる。セット1およびセット2の両方に由来するマイクロビーズを含有するマイクロカプセルにおいては、マイクロビーズから放出された化合物は相互に反応することができ、シッフ塩基を形成し、溶液中に新しい分子を生成する。この新しい分子図6、化合物Cはビス-ジフルオロメチレンホスホネート部分を含有し、単一のジフルオロメチレンホスホネート部分を有する化合物よりもPTP1B阻害剤として有意に高い力価を有する図1参照。阻害剤は生成物脱ホスホリル化ペプチドに変換される基質の量を低減する。エマルジョンを4°Cに冷却し、GriffithsandTawfik2003に記載の通り破壊して100μMバナジン酸塩中にいれ、反応を停止させる。製造元の取扱説明書に従って緑色530nm蛍光色素フルオレセインイソチオシアネートで標識した抗基質抗ホスホチロシン抗体マウスモノクローナルIgG2bPY20,で標識した後、FACScan、FACScaliburまたはMoFloフローサイトメトリーを用いて3色フローサイトメトリーによりビーズを分析し、阻害の程度およびビーズ上の化合物を同時に測定する。少ないマイクロビーズ数では、大部分のマイクロカプセルは僅か単一のマイクロビーズを含むか全く含まず、各マイクロカプセル中の溶液内に放出された阻害剤の濃度が有効な阻害のために十分高値である場合に、PTP1B阻害は高密度の阻害剤でコーティングされたビーズ上でのみ検出される。これとは対照的に、ビーズ数がより多ければ、マイクロビーズが低い密度で阻害剤によりコーティングされている場合であっても、僅かな基質が生成物に変換されていれば、多くのマイクロビーズが検出される。これは、セット1およびセット2の各々に由来するマイクロビーズを含有するマイクロカプセル内にビス-ジフルオロメチレンホスホネート部分を含む高力価のPTP1B阻害剤図6、化合物Cが形成されるためである。[実施例11:エマルジョンマイクロカプセル内のライブラリ2500二次化合物の合成およびマイクロビーズに結合した化合物を用いたPTP1B阻害のスクリーニング]表面上にカルボキシレート官能基を有し、各々がオレンジ色585nmおよび赤色>650nmの蛍光色素の厳密な比の取り込みの結果として独特の光学的シグネチャーを有する直径5.5μmのポリスチレンマイクロビーズ100個のセットを実施例6に記載の通り修飾してカルボキシレート官能基を第1アミンに変換し、次に、PTP1Bのホスホペプチド基質であるウンデカペプチドEGFR988998DADEpYLIPQQGで実施例10に記載の通り誘導体化する。最初の50セットのマイクロビーズを実施例10に記載の通り反応させて表面カルボキシル基のある割合をアルデヒドに変換する。第2の50セットのマイクロビーズは未反応のままとする即ち表面上第1アミンを有する。最初の50セットのマイクロビーズを各々、表面アルデヒド基との反応を介して第1アミンを含有する独特の化合物と反応させることによりビーズに化合物を連結させるシッフ塩基を形成する。これらの化合物の1つ化合物A、図6はジフルオロメチレンホスホネート部分を含む。第2のセットのマイクロビーズは各々表面アミン基との反応を介してアルデヒドを含有する独特の化合物と反応させることによりビーズに化合物を連結するシッフ塩基を形成する。これらの化合物の1つ化合物B、図6はジフルオロメチレンホスホネート部分を含む。シッフ塩基の形成はアルカリpH即ちpH9~10における反応により増強される。2セットのマイクロビーズをPTP1B活性に適合した緩衝液25mMHEPES、pH7.4、125mMNaCl、10グリセロール、1mMEDTA中、氷上反応を防止するためで10nMの濃度の標的酵素ヒト組み換えPTP1B、残基1~322;BiomolResearchLaboratoriesIncと混合する。ビーズおよび標的酵素PTP1Bは油中水エマルジョンやはり氷上を形成することによりマイクロカプセル内に即座にコンパートメント化される。マイクロビーズの数はマイクロカプセル当たりのマイクロカプセルの最頻数が2となるようにする。温度を25°Cに上昇させる。シッフ塩基は比較的不安定な可逆性の相互作用であり、中性pHにおいて容易に加水分解され、ビーズから化合物を放出させる。第1の50セットの1つに由来するマイクロビーズおよび第2の50セットの1つに由来するマイクロビーズを含有するマイクロカプセルにおいては、マイクロビーズから放出された化合物は相互に反応することができ、シッフ塩基を形成し、溶液中に新しい分子を生成する。阻害剤は生成物脱ホスホリル化ペプチドに変換される基質の量を低減する。エマルジョンを4°Cに冷却し、GriffithsandTawfik2003に記載の通り破壊して100μMバナジン酸塩中にいれ、反応を停止させる。製造元の取扱説明書に従って緑色530nm蛍光色素フルオレセインイソチオシアネートで標識した抗基質抗ホスホチロシン抗体マウスモノクローナルIgG2bPY20,で標識した後、FACScan、FACScaliburまたはMoFloフローサイトメトリーを用いて3色フローサイトメトリーによりビーズを分析し、阻害の程度およびビーズ上の化合物を同時に測定する。それ自体PTP1B阻害剤であるか、または別の共コンパートメント化されたビーズから放出された別の一次化合物と反応して第2の阻害剤を形成する一次化合物でコーティングされたビーズは僅かな基質が生成物に変換されているため、識別される。僅かな基質が生成物に変換されている識別されたビーズは、ジフルオロメチレンホスホネート部分を含む化合物を担持するものを包含する。マイクロビーズが低い密度で化合物にコーティングされる場合、マイクロカプセル内にジフルオロメチレンホスホネート部分を含有する放出された化合物の濃度はPTP1Bを効率的に阻害するには不十分である実施例7参照。しかしながら、1つが第1のセットの50ビーズに由来し、もう1つが第2のセットの50ビーズに由来する2つのマイクロビーズを含み、各マイクロビーズがジフルオロメチレンホスホネート部分を有する部分を担持しているマイクロカプセルにおいては、放出された分子は生成物へのPTP1B基質の変換を阻害するマイクロカプセル内のビス-ジフルオロメチレンホスホネート部分を含む高力価のPTP1B阻害剤化合物C、図6を形成できる。[実施例12:フッ化炭素中水エマルジョンにおける小型分子のコンパートメント化]95v/vパーフルオロオクチルブロミド、溶液中目的の分子を含有する5v/vリン酸塩緩衝食塩水、および、界面活性剤としての2w/vC8F17C11H22OPO[NCH2CH22O]2F8H11DMPを含有するフッ化炭素中水エマルジョンを14μフィルターを通過させる押し出し15回によるか、または、5mmの分散ツールでUltraTurraxT8ホモゲナイザーIKAを用いながら25000rpmで5分間ホモゲナイズすることにより、本質的にSadtleretal1996に記載の通り形成した。100μm~2mMの濃度で水相中に溶解した一連の小型蛍光分子を含有するエマルジョンを作成した。カルセイン、テキサスレッド、フルオレセイン、クマリン102、7-ヒドロキシクマリン-3-カルボン酸および7-ジエチルアミノ-4-メチルクマリンクマリン1を含むこれらの分子は、分子量203~625DaおよびSRCのLogKowKowWinプログラムを用いて計算した場合に0.49~4.09の範囲のLogP値を有していた。異なる色の蛍光色素を含むエマルジョンを振とう攪拌により混合した。混合されたエマルジョンのエピ蛍光顕微鏡観察によればコンパートメント化が観察された。混合後24時間にはコンパートメント間の交換は観察されなかった図5参照。[参考文献]AdangAEandHermkensPHThecontributionofcombinatorialchemistrytoleadgenerationaninterimanalysisCurrMedChem8985998AndersonJERestrictionendonucleasesandmodificationmethylasesCurrOpStructBiol32430BecherPEmulsionstheoryandpracticeReinholdNewYorkBenitaSMicroencapsulationmethodsandindustrialapplicationsMarcelDekkerNewYorkBernathKHaiMMastrobattistaEGriffithsADMagdassiSandTawfikDSInvitrocompartmentalizationbydoubleemulsionssortingandgeneenrichmentbyfluorescenceactivatedcellsortingAnalBiochem325151157BruRandWaldePProductinhibitionofalphachymotrypsininreversemicellesEurJBiochem19995103BruRandWaldePCatalyticactivityofelastaseinreversemicellesBiochemMolBiolInt31685692BurbaumJMiniaturizationtechnologiesinHTShowfasthowsmallhowsoonDrugDiscovToday3313322CalvertPInkjetprintingformaterialsanddevicesChemMater1332993305ChakrabartiACBreakerRRJoyceGFandDeamerDWProductionofRNAbyapolymeraseproteinencapsulatedwithinphospholipidvesiclesJMolEvol39555559ChangTMRecyclingofNADbymultienzymesystemsimmobilizedbymicroencapsulationinartificialcellsMethodsEnzymol1366782ChangTMSRecentadvancesinartificialcellsbasedonmicroencapsulationInDonbrowMMicrocapsulesandnanoparticlesinmedicineandpharmacyCRCPressBocaRatonFloridapp323339CreaghALPrausnitzJMandBlanchHWStructuralandcatalyticpropertiesofenzymesinreversemicellesEnzymeMicrobTechnol15383392CurranDPStrategylevelseparationsinorganicsynthesisfromplanningtopracticeAngewChemIntEd3711741196CzarnikAWEncodingmethodsforcombinatorialchemistryCurrOpinChemBiol16066DavisSSandWalkerIMMultipleemulsionsastargetabledeliverysystemsMethodsinEnzymology1495164deGansBJDuineveldPCandSchubertUSInkjetprintingofpolymersstateoftheartandfuturedevelopmentsAdvancedmaterials16203213DickinsonEEmulsionsanddropletsizecontrolInWedlockDJControlledparticledropletandbubbleformationButterworthHeinemannOxfordpp191257DoiNandYanagawaHSTABLEproteinDNAfusionsystemforscreeningofcombinatorialproteinlibrariesinvitroFEBSLett457227230DomanTNMcGovernSLWitherbeeBJKastenTPKurumbailRStallingsWCConnollyDTandShoichetBKMoleculardockingandhighthroughputscreeningfornovelinhibitorsofproteintyrosinephosphatase1BJMedChem4522132221FinchCAEncapsulationandcontrolledreleaseSpecPublRSocChem13835FornusekVetvickaCritRevTherDrugCarrierSyst1986213774FuAYChouHPSpenceCArnoldFHandQuakeSRAnintegratedmicrofabricatedcellsorterAnalChem7424512457FultonRJMcDadeRLSmithPLKienkerLJandKettmanJRJrAdvancedmultiplexedanalysiswiththeFlowMetrixsystemClinChem4317491756GhadessyFJOngJLandHolligerPDirectedevolutionofpolymerasefunctionbycompartmentalizedselfreplicationProcNatlAcadSciUSA9845524557GordonKandBalasubramanianSSolidphasechemistrydesignerlinkersforcombinatorialchemistryJChemTechnolBiotechnol74835851GriffithsADWilliamsSCHartleyOTomlinsonIMWaterhousePCrosbyWLKontermannREJonesPTLowNMAllisonTJandetalIsolationofhighaffinityhumanantibodiesdirectlyfromlargesyntheticrepertoiresEmboJ1332453260GriffithsADandTawfikDSDirectedevolutionofanextremelyfastphosphotriesterasebyinvitrocompartmentalizationEmboJ222435GuixeetalLigandinducedconformationaltransitionsinEscherichiacoliphosphofructokinase2evidenceforanallostericsiteforMgATP2Biochemistry1998Sep22371326975HaberJMaslakiewiczPRodakiewiczNJandWaldePActivityandspectroscopicpropertiesofbovinelivercatalaseinsodiumbissulfosuccinateisooctanereversemicellesEurJBiochem217567573HanMGaoXSuJZandNieSQuantumdottaggedmicrobeadsformultiplexedopticalcodingofbiomoleculesNatBiotechnol19631635HanMGaoXSuJZandNieSQuantumdottaggedmicrobeadsformultiplexedopticalcodingofbiomoleculesNatBiotechnol19631635HandenJSHighthroughputscreeningchallengesforthefutureDrugDiscovWorld4750HarderKWOwenPWongLKAebersoldRClarkLewisIandJirikFRCharacterizationandkineticanalysisoftheintracellulardomainofhumanproteintyrosinephosphatasebetausingsyntheticphosphopeptidesBiochemJ298395401HeimRTsienRYEngineeringgreenfluorescentproteinforimprovedbrightnesslongerwavelengthsandfluorescenceresonanceenergytransferCurrBiol1996Feb1617882HergenrotherPJDepewKPandSchreiberSLSmallmoleculemicroarrayscovalentattachmentandscreeningofalcoholcontainingsmallmoleculesonglassslidesJAmChemSoc12278497850HermansonGTBioconjugatetechniquesAcademicPressSanDiegoHildebrandJHandCochranDFRJAmChemSoc7122HochuliEDobeliHandSchacherANewmetalchelateadsorbentselectiveforproteinsandpeptidescontainingneighbouringhistidineresiduesJChromatogr411177184HolmesCPandJonesDGReagentsforcombinatorialcrganicsynthesisdevelopmentofanewonitrobenzylphotolabilelinkerforsolidphasesynthesisJOrgChem6023182319HudlickyMChemistryofOrganicFluorineCompoundsEllisHorwoodNewYorkJohannssonAHeterogeneousenzymeimmunoassaysInPrinciplesandpracticeofimmunoassaysCPPriceandDJNewmanedspp295325JohannssonAandBatesDLAmplificationbysecondenzymesInELISAandothersolidphaseimmunoassaysDMKemenyandSJChallacombeedspp85106JohnsonTOErmolieffJandJirousekMRProteintyrosinephosphatase1BinhibitorsfordiabetesNatureReviewsDrugDiscovery1696709KeijetalCytometry1995Mar11920916KerkerCytometry1983Jul4110KlugAGeneregulatoryproteinsandtheirinteractionwithDNAAnnNYAcadSci758143160KlugAandSchwabeJWProteinmotifs5ZincfingersFasebJ9597604KrafftMPChittofratiAandRiessJGEmulsionsandmicroemulsionswithafluorocarbonphaseCurrOpColloidInterfaceSci8251258KumarAKumarAandKatiyarSSActivityandkineticcharacteristicsofglutathionereductaseinvitroinreversemicellarwaterpoolBiochimBiophysActa99616LeeYFTawfikDSandGriffithsADInvestigatingthetargetrecognitionofDNAcytosine5methyltransferaseHhaIbylibraryselectionusinginvitrocompartmentalisationNucleicAcidsRes3049374944LimFBiomedicalapplicationsofmicroencapsulationCRCPressBocaRatonFloridaLimFandSunAMMicroencapsulatedisletsasbioartificialendocrinepancreasScience210908910LinkDRAnnaSLWeitzDAandStoneHAGeometricallymediatedbreakupofdropsinmicrofluidicdevicesPhysRevLetts92054503LipinskiCALombardoFDominyBWandFeeneyPJExperimentalandcomputationalapproachestoestimatesolubilityandpermeabilityindrugdiscoveryanddevelopmentsettingsAdvDrugDelivRev46326LissantKJEmulsionsandemulsiontechnologyMarcelDekkerNewYorkLissantKJEmulsionsandemulsiontechnologyMarcelDekkerNewYorkLoweKCPerfluorochemicalrespiratorygascarriersbenefitstocellculturesystemsJFluorineChem1181926LuisiPLandBSHActivityandconformationofenzymesinreversemicellarsolutionsMethodsEnzymol136188216LynePDStructurebasedvirtualscreeninganoverviewDrugDiscovToday710471055MackenzieandPinderDevBiolStand19866418193MahajanNPLinderKBerryGGordonGWHeimRHermanBBcl2andBaxinteractionsinmitochondriaprobedwithgreenfluorescentproteinandfluorescenceresonanceenergytransferNatBiotechnol1998Jun1654752MaoQandWaldePSubstrateeffectsontheenzymaticactivityofalphachymotrypsininreversemicellesBiochemBiophysResCommun17811051112MaoQWaldePandLuisiPLKineticbehaviourofalphachymotrypsininreversemicellesAstoppedflowstudyEurJBiochem208165170MasuiandKuramitsuProbingofDNAbindingsitesofEscherichiacoliRecAproteinutilizing1anilinonaphthalene8sulfonicacidBiochemistry1998Sep1371213343McDonaldJCandWhitesidesGMPolyasamaterialforfabricatingmicrofluidicdevicesAccChemRes35491499MengerFMandYamadaKJAmChemSoc10167316734MeylanWMandHowardPHAtomfragmentcontributionmethodforestimatingoctanolwaterpartitioncoefficientsJPharmSci848392MiyawakiALlopisJHeimRMcCafferyJMAdamsJAIkuraMTsienRYFluorescentindicatorsforCa2basedongreenfluorescentproteinsandcalmodulinNature1997Aug283888827MizePDHokeRALinnCPReardonJEandSchulteTHDualenzymecascadeanamplifiedmethodforthedetectionofalkalinephosphataseAnalBiochem179229235MontigianiSNeriGNeriPandNeriDAlaninesubstitutionsincalmodulinbindingpeptidesresultinunexpectedaffinityenhancementJMolBiol258613NewRRCLiposomesapracticalapproachOxfordUniversityPressOxfordNormanMedPhys1980NovDec760915OberholzerTAlbrizioMandLuisiPLPolymerasechainreactioninliposomesChemBiol2677682OberholzerTWickRLuisiPLandBiebricherCKEnzymaticRNAreplicationinselfreproducingvesiclesanapproachtoaminimalcellBiochemBiophysResCommun207250257ObukowiczMGTurnerMAWongEYandTaconWCSecretionandexportofIGF1inEscherichiacolistrainJM101MolGenGenet2151925PerelsonASandOsterGFTheoreticalstudiesofclonalselectionminimalantibodyrepertoiresizeandreliabilityofselfnonselfdiscriminationJTheorBiol81645670PerezGMSanchezFAandGarciaCFApplicationofactivephaseplottothekineticanalysisoflipoxygenaseinreversemicellesBiochemJPirrungMCandHuangCYAgeneralmethodforthespatiallydefinedimmobilizationofbiomoleculesonglasssurfacesusingcagedbiotinBioconjugChem7317321QiandGrabowskiAcidbetaglucosidaseintrinsicfluorescenceandconformationalchangesinducedbyphospholipidsandsaposinCBiochemistry1998Aug18371154454RamstromOandLehnJMDrugdiscoverybydynamiccombinatoriallibrariesNatRevDrugDiscov12636RiessJGFluorousmicroandnanophaseswithabiomedicalperspectiveTetrahedron5841134131RollandJImmunolMethods1985Jan2176110SadtlerVMKrafftMPandRiessJGAchievingstablereversewaterinfluorocarbonemulsionsAngewChemIntEdEngl3519761978SambrookJandRussellDWedsMolecularcloningalaboratorymanualSavageMDMattsonGDesaiSNielanderGWMorgensenSandConklinEJAvidinbiotinchemistryahandbook2ednSchickMJNonionicsurfactantsMarcelDekkerNewYorkScottRLJAmChemSoc704090SeppATawfikDSandGriffithsADMicrobeaddisplaybyinvitrocompartmentalisationselectionforbindingusingflowcytometryFEBSLetters532455458ShapiroHMPracticalFlowCytometry3ednShermanPEmulsionscienceAcademicPressLondonSongHandIsmagilovRFMillisecondkineticsonamicrofluidicchipusingnanolitersofreagentsJAmChemSoc1251461314619SongHTiceJDandIsmagilovRFAmicrofluidicsystemforcontrollingreactionnetworksintimeAngewChemIntEdEngl42767772StofkoHRCarrDWandScottJDAsinglesteppurificationforrecombinantproteinsCharacterizationofamicrotubuleassociatedproteinfragmentwhichassociateswiththetypeIIcAMPdependentproteinkinaseFebsLett302274278StuderAHadidaSFerrittoRKimSYJegerPWipfPandCurranDPFluoroussynthesisafluorousphasestrategyforimprovingseparationefficiencyinorganicsynthesisScience275823826SunAMVasekIandTaiIMicroencapsulationoflivingcellsandtissuesInDonbrowMMicroencapsulationandnanoparticlesinmedicineandpharmacyCRCPressBocaRatonFloridapp315322SundbergSABarrettRWPirrungMLuALKiangsoontraBandHolmesCPSpatiallyaddressableimmobilisationofmacromoleculesonsolidsupportsJAmChemSoc1171205012057TawfikDSandGriffithsADManmadecelllikecompartmentsformolecularevolutionNatBiotechnol16652656ThorsenTRWRArnoldFHandQuakeSRDynamicpatternformationinavesiclegeneratingmicrofluidicdevicePhysRevLetts8641634166TripetBYuLBautistaDLWongWYIrvinRTandHodgesRSEngineeringadenovodesignedcoiledcoilheterodimerizationdomainofftherapiddetectionpurificationandcharacterizationofrecombinantlyexpressedpeptidesandproteinsProteinEng910291042UmbanhowarPBPrasadVandWeitzDAMonodisperseemulsionsgeneratedviadropbreakoffinacoflowingsteamLangmuir16347351vanHalDABouwstraJAandJungingerHENonionicsurfactantvesiclescontainingestradiolfortopicalapplicationInBenitaSMicroencapsulationmethodsandindustrialapplicationsMarcelDekkerNewYorkpp329347VossEWJrKineticmeasurementsofmolecularinteractionsbyspectrofluorometryJMolRecognit1993Jun6518WaldePGotoAMonnardPAWessickenMandLuisiPLOparinsreactionsrevisitedenzymaticsynthesisofpolyinmicellesandselfreproducingvesiclesJAmChemSoc11675417547WaldePHanDandLuisiPLSpectroscopicandkineticstudiesoflipasessolubilizedinreversemicellesBiochemistry3240294034WaldePPengQFadnavisNWBattistelEandLuisiPLStructureandactivityoftrypsininreversemicellesEurJBiochem173401409WhateleyTLMicrocapsulespreparationbyinterfacialpolymerisationandinterfacialcomplexationandtheirapplicationsInBenitaSMicroencapsulationmethodsandindustrialapplicationsMarcelDekkerNewYorkpp349375WickRandLuisiPLEnzymecontainingliposomescanendogenouslyproducemembraneconstitutinglipidsChemBiol3277285ZhangZYThiemeSeflerAMMacleanDMcNamaraDJDobrusinEMSawyerTKandDixonJESubstratespecificityoftheproteintyrosinephosphatasesProcNatlAcadSciUSA9044464450上記した本明細書において言及した全ての出版物および該出版物中に引用されている参考文献は参照により本明細書に組み込まれる。本発明の記載した方法および系の種々の変更および変形は本発明の範囲および精神を逸脱することなく当業者には明らかとなる。本発明は特定の好ましい実施形態との関連において説明してきたが、請求項に記載した本発明はそのような特定の実施形態に限定されない。実際、分子生物学または関連の分野の当業者には自明である本発明の実施のための記載した様式の種々の変更は添付する請求項の範囲内であることを意図するものである。"