インフルエンザウイルスによって感染され得、そして無血清培地の懸濁物における増殖に適合する、MDCK細胞。前記細胞が細胞株MDCK33016DSMACC2219である、請求項1に記載の細胞。細胞培養におけるインフルエンザウイルスの複製のための方法であって、以下:i懸濁物中の無血清培地において、請求項1~2のいずれか1項に記載の細胞を増殖させる;ii該細胞をインフルエンザウイルスに感染させる;iii感染直前、感染と同時、または感染直後に細胞懸濁物にプロテアーゼを添加し、赤血球凝集素[HA0]の前駆体タンパク質を切断する;およびivさらなる培養期の後、該細胞中で複製した該インフルエンザウイルスを単離する;ことを特徴とする、方法。前記細胞の培養が灌流系において行われる、請求項3に記載の方法。前記細胞の培養がバッチ法において行われる、請求項3に記載の方法。工程iの培養培地のpHが6.6~7.8の範囲である、請求項3~5のいずれか1項に記載の方法。前記培養培地のpHが6.8~7.3の範囲である、請求項6に記載の方法。前記インフルエンザウイルスでの感染が、前記細胞培養が約8~25×105細胞/mlバッチ法または約5~20×106細胞/ml灌流法の細胞密度に達する場合に生じる、請求項3~7のいずれか1項に記載の方法。インフルエンザウイルスでの前記細胞の感染が、約0.001~10のm.o.i.感染の多重度で生じる、請求項3~8のいずれか1項に記載の方法。前記感染が約0.002~0.5のm.o.i.で生じる、請求項9に記載の方法。前記プロテアーゼがセリンプロテアーゼである、請求項3~10のいずれか1項に記載の方法。前記セリンプロテアーゼがトリプシンである、請求項11に記載の方法。トリプシンが前記培養培地において1~200μg/mlの最終濃度まで添加される、請求項12に記載の方法。前記培養培地中のトリプシンの最終濃度が5~50μg/mlの範囲である、請求項13に記載の方法。前記感染細胞が2~10日間培養される、請求項3~14のいずれか1項に記載の方法。前記感染細胞が3~7日間培養される、請求項15に記載の方法。前記感染細胞が30°C~36°Cで培養される、請求項3~16のいずれか1項に記載の方法。前記感染細胞が32°Cから34°Cで培養される、請求項17に記載の方法。前記複製したウイルスの採取および単離が、感染後2~10日に行われる、請求項3~18のいずれか1項に記載の方法。前記ウイルスの採取および単離が、感染後3~7日に行われる、請求項19に記載の方法。ワクチンの製造方法であって、i請求項3~20のいずれか1項に従って、インフルエンザウイルスが増殖および単離される;ならびに、ii工程iのインフルエンザウイルスを、ワクチンに処方する;ことを特徴とする、方法。請求項21に記載の方法であって、工程iiにおいて、前記インフルエンザウイルスが、インタクトなウイルス粒子としてワクチンに処方されることを特徴とする、方法。前記インタクトなウイルス粒子が生弱毒化ウイルスである、請求項22に記載の方法。請求項21に記載の方法であって、工程iiにおいて、前記インフルエンザウイルスの単離されたウイルス成分が、ワクチンに処方されることを特徴とする、方法。請求項24に記載の方法であって、前記単離されたウイルス成分が、単離されたインフルエンザウイルスタンパク質であることを特徴とする、方法。請求項21~25のいずれか1項に記載の方法であって、前記ワクチンがアジュバントを含む、方法。従って、本発明は、入手可能な細胞を作製し、そして細胞培養における簡単かつ経済的なインフルエンザウイルスの複製を可能にする方法の目的に基づく。この目的は、特許の請求の範囲に示された実施態様の限定によって達成される。従って、本発明は、インフルエンザウイルスにより感染され、そして無血清培地における懸濁物中の増殖に適応され得る動物細胞に関する。この型の細胞の補助により、単純かつ経済的な様式において細胞培養中でインフルエンザウイルスを複製させることが可能であることが見出された。本発明の細胞の使用により、一方では血清を除去するための感染の前の培地の交換が省略され得、他方ではプロテアーゼの添加が感染と同時に行われ得る。従って、全体でインフルエンザウイルスでの感染のための1回の培養容器の開放のみが必要であり、これによって細胞培養物の汚染の危険が非常に減少する。培地の交換、感染および引き続くプロテアーゼ添加に伴う努力の出費はさらに減少する。さらなる利点は、培地の消費が有意に減少することである。1.インフルエンザウイルスによって感染され得、そして無血清培地の懸濁物における増殖に適合する、動物細胞。2.前記細胞が脊椎動物起源である、項目1に記載の細胞。3.前記細胞が哺乳動物起源である、項目2に記載の細胞。4.前記細胞が腎臓細胞由来である、項目1~3のいずれか1つに記載の細胞。5.前記細胞がMDCK細胞ATCCCCL34MDCK由来である、項目4に記載の細胞。6.前記細胞が細胞株MDCK33016DSMACC2219である、項目5に記載の細胞。7.細胞培養におけるインフルエンザウイルスの複製のための方法であって、i懸濁物中の無血清培地において、項目1~6のいずれか1つに記載の細胞を増殖させる工程;ii該細胞をインフルエンザウイルスに感染させる工程;iii感染直前、感染と同時、または感染直後に細胞懸濁物にプロテアーゼを添加し、赤血球凝集素HA0の前駆体タンパク質を切断する工程;およびivさらなる培養期の後、該細胞中で複製した該インフルエンザウイルスを単離する工程;を含む、方法。8.前記細胞の培養が灌流系において行われる、項目7に記載の方法。9.前記細胞の培養がバッチ法において行われる、項目7に記載の方法。10.工程iの培養培地のpHが66~78の範囲である、項目7~9のいずれか1つに記載の方法。11.前記培養培地のpHが68~73の範囲である、項目10に記載の方法。12.前記インフルエンザウイルスでの感染が、前記細胞培養が約8~25×105細胞mlバッチ法または約5~20×106細胞ml灌流法の細胞密度に達する場合に生じる、項目7~11のいずれか1つに記載の方法。13.インフルエンザウイルスでの前記細胞の感染が、前記細胞培養が約0001~10のmoi感染の多重度で生じる、項目7~12のいずれか1つに記載の方法。14.前記感染が約0002~05のmoiで生じる、項目13に記載の方法。15.前記プロテアーゼがセリンプロテアーゼである、項目7~14のいずれか1つに記載の方法。16.前記セリンプロテアーゼがトリプシンである、項目15に記載の方法。17.トリプシンが前記培養培地において1~200μgmlの最終濃度まで添加される、項目16に記載の方法。18.前記培養培地中のトリプシンの最終濃度が5~50μgmlの範囲である、項目17に記載の方法。19.前記感染細胞が2~10日間培養される、項目7~18のいずれか1つに記載の方法。20.前記感染細胞が3~7日間培養される、項目19に記載の方法。21.前記感染細胞が30°C~36°Cで培養される、項目7~20のいずれか1つに記載の方法。22.前記感染細胞が32°Cから34°Cで培養される、項目21に記載の方法。23.前記複製したウイルスの採取および単離が、感染後2~10日に行われる、項目7~22のいずれか1つに記載の方法。24.前記複製したウイルスの採取および単離が、感染後3~7日に行われる、項目23に記載の方法。25.項目7~24のいずれか1つに記載の方法によって入手可能な、インフルエンザウイルス。26.適切である場合に免疫応答を増大させる物質と組合せて、項目25に記載のインフルエンザウイルスを含む、ワクチン。27.前記インフルエンザウイルスがインタクトなウイルス粒子として存在する、項目26に記載のワクチン。28.前記インフルエンザウイルスが弱毒化ウイルスとして存在する、項目26に記載のワクチン。29.前記インフルエンザウイルスが崩壊したウイルス粒子として存在する、項目26に記載のワクチン。30.適切である場合に免疫応答を増大させる物質と組合せて、項目25に記載のインフルエンザウイルスの構成成分を含む、ワクチン。31.前記ワクチンが前記インフルエンザウイルスの単離されたタンパク質を含む、項目30に記載のワクチン。32.項目25に記載のインフルエンザウイルスまたはそのようなウイルスの構成成分を含む、診断用組成物。本発明によって、入手可能な細胞を作製し、そして細胞培養における簡単かつ経済的なインフルエンザウイルスの複製を可能にする方法が提供された。本発明の細胞は、好ましくは脊椎動物細胞例えば、トリ細胞、特に雌鳥胚細胞である。特に好ましい実施態様において、本発明の細胞は哺乳動物細胞例えば、ハムスター、ウシ、サル、またはイヌ由来、詳細にはこれら由来の腎臓細胞または細胞株である。これらは、好ましくはMDCK細胞由来の細胞であり、そして特に好ましくは、MDCK33016細胞株の細胞である。この細胞株は、特許手続のための微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約の規定に基づき、国際寄託部署として承認されているブルンスウィックドイツ連邦共和国のGermanCollectionofMicroorganismsに、受託番号DSMACC2219の下1995年6月7日に寄託された。細胞株MDCK33016は、継代ならびに無血清培地における懸濁物中で増殖する能力および種々のウイルス例えば、オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、ラブドウイルス、およびフラビウイルスを複製する能力に関しての選択により、細胞株MDCKに由来する。これらの特性を考慮して、この細胞は、単純かつ費用効果的方法により、細胞培養中でのインフルエンザウイルスの経済的な複製のために適切である。従って、本発明はまた、細胞培養におけるインフルエンザウイルスの複製のための方法に関し、ここで本発明の細胞が使用され、詳細には方法は以下の工程を含む:上記の本発明の細胞を懸濁物中で無血清培地において増殖させる工程;インフルエンザウイルスで細胞を感染させる工程;感染の少し前、同時、または少し後にプロテアーゼを添加する工程;および感染細胞をさらに培養し、そして複製インフルエンザウイルスを単離する工程。本発明の細胞は、当業者に公知の種々の無血清培地例えば、Iscove培地、ultraCHO培地、EXCELLにおける方法の過程において培養され得る。あるいは、複製のための細胞はまた、通常の血清含有培地例えば、05~10、好ましくは15~5のウシ胎児血清を有するMEMまたはDMEM培地またはタンパク質非含有培地例えば、PFCHO中で培養され得る。本発明の方法の過程において用いられ得る適切な培養容器は、当業者に公知の全ての容器例えば、スピナーボトル、ローラーボトル、または発酵槽などである。インフルエンザウイルスでの感染前の細胞の増殖のための温度は、好ましくは37°Cである。細胞の増殖のための培養工程は、方法の好ましい実施態様において、灌流系例えば、当業者に公知の細胞貯留系例えば、遠心分離、濾過、スピンフィルターなどを用いる攪拌容器発酵槽においてにおいて行われる。この場合には細胞を、好ましくは2~18日間、特に好ましくは3~11日間増殖させる。培地の交換はこの過程において行われ、発酵槽容量を1日当たり0から、約1~3まで増大させる。この様式において、細胞を、非常に高い細胞密度まで、好ましくは約2×107細胞mlまで増殖させる。灌流系における培養の間の灌流速度は、細胞計数、グルコース、グルタミン、またはラクトースの培地中の含有量、および当業者に公知の他のパラメータの両方を介して調節され得る。インフルエンザウイルスでの感染のために、約85~99、好ましくは93~97の発酵槽容量が細胞とともにさらなる発酵槽に移される。第1の発酵槽に残っている細胞は、次いで培地と混合され、そして灌流系においてさらに複製され得る。この様式において、ウイルス複製のための連続的細胞培養が可能である。灌流系の代わりに、本発明の方法の工程における細胞はまた、好ましくは、バッチプロセスにおいて培養され得る。本発明の細胞は、ここで約8~25×105細胞mlの細胞密度まで、20~30時間の生成時間で37°Cにて増殖される。本発明の方法の好ましい実施態様において、工程に使用される培養培地のpHは、培養の間に調節され、そしてこれはpH66~pH78の範囲、好ましくはpH68~pH73の範囲である。さらに、pO2値は、方法のこの工程において、好都合に調節され、好ましくは25と95との間、特に35と60空気飽和に基づくとの間である。本発明に従って、懸濁物において培養された細胞の感染は、好ましくはバッチ工程における細胞が約8~25×105細胞ml、または灌流系において約5~20×106細胞mlの細胞密度に達したときに行われる。さらに好ましい実施態様において、インフルエンザウイルスでの細胞の感染は、好ましくは約00001~10、好ましくは、0002~05のmoi多重感染度で行われる。赤血球凝集素の前駆体タンパク質HA0の切断、従って細胞へのウイルスの吸着をもたらすプロテアーゼの添加は、本発明に従い、インフルエンザウイルスでの細胞の感染の少し前、同時、または少し後に行われ得る。添加が感染と同時に行われる場合、プロテアーゼは感染されるべき細胞培養に直接または例えば、ウイルス接種と一緒に濃縮物として添加され得る。血清含有培地が培養に使用される場合、これはプロテアーゼ添加の前に除去されるべきである。プロテアーゼは好ましくはセリンプロテアーゼ、そして特に好ましくはトリプシンである。好ましい実施態様において、トリプシンは、培養培地の1~200μgml、好ましくは5~50μgml、そして特に好ましくは5~30μgmlの最終濃度で、感染されるべき細胞培養物に添加される。本発明の方法の工程による感染細胞のさらなる培養の間に、バッチプロセスの場合にはトリプシンの新たな添加によって、または灌流系の場合にはトリプシン溶液の持続的または断続的添加によって、トリプシン再活性化が行われ得る。後者の場合、トリプシン濃度は、好ましくは1μgmlから80μgmlの範囲である。感染の後、感染細胞培養物はウイルスを複製するために、詳細には最大細胞障害効果、または最大量のウイルス抗原が検出され得るまで、さらに培養される。好ましくは、2~10日間、特に3~7日間、細胞の培養が行われる。次いで、培養は、好ましくは灌流系またはバッチプロセスにおいて行われ得る。さらに好ましい実施態様において、インフルエンザウイルスでの感染の後、細胞は、30~36°C、そして特に好ましくは32°C~34°Cの温度で培養される。感染細胞の37°C以下の温度、特に上記の温度範囲での培養は、37°Cでの細胞培養において複製したインフルエンザウイルスと比較して、不活性化された後にワクチンとしてかなり高い効率を有するインフルエンザウイルスの産生を導く。インフルエンザウイルスでの感染の後の細胞の培養工程は、次いで好ましくは調節されたpHおよびpO2で行われる。この場合、pHは好ましくは66~78、特に好ましくは68~72の範囲であり、そしてpO2は好ましくは25~150、好ましくは30~75、そして特に好ましくは35~60空気飽和に基づくの範囲である。方法の工程による細胞の培養またはウイルス複製の間、抗原収率を最適化するために、細胞培養培地の新たに調製された培地、培地濃縮物または定義された成分例えば、アミノ酸、ビタミン、脂質画分、リン酸などとの置換もまた可能である。インフルエンザウイルスでの感染の後に、細胞は、培地または培地濃縮物のさらなる添加により、数日間でゆっくりと希釈されるか、または約1~3から、0発酵槽容量/日に減少する培地または培地濃縮物でのさらなる灌流の間インキュベートされるかのいずれかであり得る。この場合には、次いで、灌流速度は、細胞計数、グルコース、グルタミン、ラクテートまたはラクテートデヒドロゲナーゼの培地中の含有量、および当業者に公知の他のパラメータによって調節され得る。灌流系とフィードバッチプロセスとの組合せもさらに可能である。このプロセスの好ましい実施態様において、複製されたインフルエンザウイルスの採取および単離は、感染から2~10日後、好ましくは3~7日後に行われる。これを行うために、例えば、細胞または細胞残基は、当業者に公知の方法の手段例えば、分離器またはフィルターによりにより、培養培地から分離される。これに続いて、培養培地中に存在するインフルエンザウイルスの濃縮が、当業者に公知の方法例えば、勾配遠心分離、濾過、沈殿などのようなにより行われる。本発明は、本発明の方法により入手可能なインフルエンザウイルスにさらに関する。これは、ヒトまたは動物への投与のためのワクチンとして、公知の方法により処方され得る。ワクチンとして得られたインフルエンザウイルスの免疫原性または効力は、当業者に公知の方法例えば、負荷実験において付与される保護により、または中和抗体の抗体力価としてにより決定され得る。産生されるウイルスまたは抗原の量の決定は、例えば、当業者に公知の方法による赤血球凝集素の量の決定により行われ得る。例えば、切断赤血球凝集素は種々の種の赤血球例えば、雌鳥赤血球に結合することが知られている。これは、産生されたウイルスまたは形成された抗原の単純かつ迅速な定量を可能にする。従って、本発明はまた、本発明の方法から得られ得るインフルエンザウイルスを含むワクチンに関する。この型のワクチンは、ワクチンに通常の添加剤、詳細には免疫応答を増大する物質すなわち、いわゆるアジュバント、例えば種々の金属の水酸化物、細菌細胞壁の構成物、油、またはサポニン、およびより通常の薬学的に許容可能な賦形剤を含む。ウイルスは、インタクトなウイルス粒子として、より詳細には生弱毒化ウイルスとしてワクチン中に存在し得る。この目的のために、ウイルス濃縮物は所望の力価に調整され、そして凍結乾燥されるか、液体形態において安定化される。さらなる実施例において、本発明のワクチンは、崩壊すなわち、不活性化された、またはインタクトだが不活性化されたウイルスを含み得る。この目的のために、ウイルスの感染性は、化学的および/または物理的方法例えば、界面活性剤またはホルムアルデヒドによるにより破壊される。次いで、ワクチンは、抗原の所望の量に調整され、そして可能なアジュバントの混合の後または可能なワクチン処方の後、例えば、リポソーム、ミクロスフェアまたは徐放処方物として調剤される。さらに好ましい実施態様において、本発明のワクチンは最後にサブユニットワクチンすなわち、定義された、単離ウイルス構成物、好ましくはインフルエンザウイルスの単離されたタンパク質を含み得るとして存在し得る。これらの成分は、当業者に公知の方法によりインフルエンザウイルスから単離され得る。さらに、本発明の方法から得られたインフルエンザウイルスは、診断目的のために使用され得る。従って、本発明はまた、適切な場合にはこの分野で通常の添加剤および適切な検出剤と組み合わせた、本発明のインフルエンザウイルスまたはこのようなウイルスの構成物を含む診断組成物に関する。実施例は、本発明を例示する。実施例1懸濁物中での増殖に適応しており、そしてインフルエンザウイルスにより感染され得る細胞株の調製懸濁培養における増殖に適切であり、そしてインフルエンザウイルスにより感染され得る細胞株を、MDCK細胞ATCCCCL34MDCKから開始して選択した。この細胞は、研究室において少数回の継代のみにより、または数ヶ月かけて増殖させておいた。この選択を、16rpm付着性増殖細胞を有するローラーボトルについての習慣的な約3rpmの代わりで回転したローラーボトルにおける細胞の増殖により実施した。培地中に懸濁して存在する細胞の数回の継代後、懸濁物中で増殖している細胞株を得た。これらの細胞株にインフルエンザウイルスを感染させ、そしてこの株をどの株が最大のウイルス収量を生じるかについて選択した。16rpmでの最初の継代の間の懸濁物中での細胞の増殖速度の増加は、当業者に公知の選択系例えば、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン、またはアラノシンおよびアデニンを個々にまたは組み合わせての添加により1~3回の継代にわたって達成される。懸濁物中で増殖している細胞の選択はまた、当業者に公知の他の撹拌細胞培養系例えば、撹拌フラスコにおいて可能である。あるいは、高度にウイルスを複製する細胞クローンを、細胞懸濁物としての選択の前に、マイクロタイタープレートにおける細胞クローニングにより確立し得る。この方法において、付着しながら増殖する開始細胞トリプシン処理後を、約25細胞/mlの濃度に血清含有培地で希釈し、そして各100μlのこの細胞懸濁物をマイクロタイタープレートのウェルに添加する。2~4日齢同種細胞培養物からの100μlの滅菌濾過培地馴化培地を各ウェルに添加する場合、非常に低い細胞密度で接種した細胞の増殖の可能性が増加する。光学顕微鏡での検査により1個の細胞のみを含むウェルを選択する;次いで、それから得られた細胞ローンをより大きな細胞培養容器に継代する。最初の細胞継代の後の選択培地例えば、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン、またはアラノシンおよびアデニンを個々にまたは組み合わせての添加は、1~3継代にわたって、細胞クローンのより大きな識別性を導く。このようにして得られる細胞クローンを、それらの特異的ウイルス複製に関して選択し、次いで懸濁細胞として選択した。無血清培地中での増殖に適応している細胞の選択をまた、当業者に公知の方法により実施し得る。懸濁物中での増殖に適応しており、そしてインフルエンザウイルスにより感染され得る細胞の例は、細胞株MDCK33016DSMACC2219およびMDCK13016である。これらの特性は以下の実施例に記載される。実施例2細胞株MDCK33016におけるインフルエンザウイルスの複製細胞株MDCK33016DSMACC2219;MDCK細胞培養から選択圧により得たを、16rpmで回転するローラーボトルにおいて週に2回、1:8~1:12の分割割合で、Iscove培地中で37°Cで増殖させた。移してから4日後、約70×105~10×105細胞/mlの細胞数を達成した。この4日齢の細胞培養物のインフルエンザウイルス株APR834moi=01での感染と同時に、細胞培養物をトリプシン25μgmlの最終濃度で処理し、そして37°Cでさらに培養し、そしてウイルス複製を3日間にわたって決定した表I。示した比は、1:X希釈のウイルス収集物が依然として血球凝集特性を有することを意味する。血球凝集特性は、例えば、MayerらVirologischeArbeitsmethodenVirologicalWorkingMethods第1巻260~261頁またはGristDiagnosticMethodsinClinicalVirology72~75頁に記載のように決定し得る。実施例3スピナボトル中の細胞株MDCK13016におけるインフルエンザウイルスの複製細胞株MDCK13016を、スピナボトル50rpm中で週に2回、1:6~1:10の分割割合で、Iscove培地において37°Cで複製させた。移してから4日後、約80×105細胞/mlの細胞数を達成した。この4日齢の細胞培養物の種々のインフルエンザウイルス株APR834moi約01での感染と同時に、細胞培養物をトリプシン25μgmlの最終濃度で処理し、そして33°Cでさらにインキュベートし、そしてウイルス複製を6日間にわたって決定した表II。実施例4ローラーボトル中での細胞株MDCK33016における種々のインフルエンザ株の複製細胞株MDCK33016DSMACC2219を、16rpmで回転するローラーボトルにおいて週に2回、1:8~1:12の分割割合で、Iscove培地中で37°Cで複製させた。移してから4日後、約70×105~10×105細胞/mlの細胞数を達成した。この4日齢の細胞培養物の種々のインフルエンザウイルス株moi約01での感染と同時に、細胞培養物をトリプシン25μgmlの最終濃度で処理し、そして33°Cでさらにインキュベートし、そしてウイルス複製を感染5日後に決定した表III。実施例5発酵槽中のMDCK33016細胞における種々のインフルエンザ株の複製細胞株MDCK33016DSMACC2219を、1×105細胞mlの細胞播種物を用いて、撹拌した容器発酵槽作業容量8l中のIscoveの培地に播種した。37°Cのインキュベーション温度、50±10の調節されたpO2および71±02の調節されたpHで、細胞を、7×105細胞mlの細胞密度に4日以内で増殖させた。8mlのウイルスストック溶液APR834またはASingapore686またはAShanghai1187またはABeijing187またはBMassachusetts71またはBYamagata1688またはBPanama4590のいずれか、および同時に16mlの125強度トリプシン溶液の溶液をこれらの細胞に添加し、そして播種した細胞培養物を33°Cでさらにインキュベートした。ウイルス複製を、6日にわたって決定した表IV。実施例6ウイルス感染における感染用量moiの影響細胞株MDCK13016選択圧によりMDCK細胞培養から得られたを、16rpmで回転させたローラーボトル内で週に2回の18~112の分割割合でultraCHO培地において37°Cで増殖させた。転移の4日後、約70×105~10×105細胞mlの細胞計数を達成した。抗原の産生および感染性における感染用量moiの影響を調査した。現在4日齢の細胞培養物のインフルエンザウイルス株APR834moi=05およびmoi=0005での感染と同時に、細胞培養物をトリプシン25μgml最終濃度で処理し、そして37°Cでさらにインキュベートし、そしてウイルス複製を3日にわたって測定した表V。CCID50の決定は、この場合には、例えば、Paul、ZellundGewebekulturCellandtissueculturep395に記載されるような方法に従って、実行され得る。実施例7ウイルス複製における培地置換の影響細胞株MDCK33016DSMACC2219を、16rpmで回転させたローラーボトル内で週に2回の18~112の分割割合でIscoveの培地に37°Cで増殖させた。転移の4日後、約70×105~10×105細胞mlの細胞計数を達成した。抗原の産生および感染性における培地置換の影響を調査した。現在4日齢の細胞培養物を、インフルエンザウイルス株APR834moi=005で感染させ、トリプシン添加ローラーボトル中で20μgmlの最終濃度を、ウイルス播種物をトリプシンストック溶液と混合することによって実行した。細胞培養物を、培地の添加により処理し、そして33°Cでさらにインキュベートし、そしてウイルス複製を5日にわたって測定した表VI。実施例8発酵槽中のMDCK33016細胞におけるインフルエンザウイルスの複製およびウイルスの獲得細胞株MDCK33016ACC2219を、撹拌した容器培養槽作業容量10lに05×105細胞mlの細胞播種物でIscoveの培地に播種した。37°Cのインキュベーション温度、55±10調節されたpO2および71±02調節されたpHで、細胞を4日以内に7×105細胞mlの細胞密度に増殖させた。01mlのウイルスストック溶液ASingapore686moi約00015、そして同時に16mlの125強度のトリプシン溶液を、これらの細胞に添加し、そして播種した細胞培養物を、さらに33°Cでインキュベートした。ウイルス複製を5日後に測定し、そしてウイルスを収集した。細胞および細胞残留物を、接線流動濾過045μmの孔サイズを有する、SarcotonMiniMicrosartModule;製造業者の指示に従う濾過手順により除去し、抗原HAとして測定されるの損失は、濾過において検出されなかった。ウイルス物質を、新たな接線流動濾過100000NMWS見かけの分子量分離限界を有するSartoconMiniUltrasartModule;製造業者の指示による濾過手順によって、95lから600mlに濃縮した。濃縮における抗原の量は、5120HA単位開始256HA単位;濃縮因子20であり、一方、濃縮における感染性は、92log10CCID50開始時89log10CCID50濃縮因子16であり;抗原の損失および感染性は、100000NMWS濾過の後の濾過液において測定され、1未満であった。実施例9灌流発酵槽中のMDCK33016細胞におけるインフルエンザウイルスの複製16×108細胞の細胞株MDCK33016DSMACC2219を、BiostatMDの反応容器BraunBiotechIntMelsungenGermany中の2000mlの有効容量のUltraCHO培地に懸濁し08×105細胞ml、そして上昇性の流速ホース通気による酸素の流入酸素調節40±10pO2;pH調節pH≦72;スピンフィルターによる細胞保持>95を用いて灌流操作において37°Cで増殖させた。生存細胞計数は、11日以内に175×105細胞mlまで200倍に増大した表VIIIa。この細胞培養物の1990mlを第2の灌流発酵槽作業容量5lに移し、一方、残りの細胞を培地で再び2000mlにし、そして細胞増殖を灌流操作で再び行った。第2の灌流発酵槽ウイルス感染中で、細胞を、トリプシン10μgml最終濃度の同時添加を用いてインフルエンザウイルス株APR834に感染させmoi=001、そして1時間インキュベートした。次いで、発酵槽を、灌流操作pO240±10およびpH≦72でさらにインキュベートした。感染後の最初の日に、インキュベーションを37°Cで実行し、そして灌流した細胞培養物上清におけるウイルス収集物を廃棄した。感染後の2日目から、ウイルス複製を33°Cで実行し、そして2発酵槽容量日の灌流速度を、7日以内に0まで減らした。ウイルス複製に必要とされるトリプシンは、UltraCHO培地中に存在し、これは、10μgmlの濃度で灌流に使用した。ウイルス収集物=灌流した細胞培養物上清を4°Cで回収し、そして7日にわたり、ウイルス複製を、抗原の量として測定した表VIIIb。実施例10実験用インフルエンザワクチンの調製実験用ワクチンを、実施例237°Cで複製させたAPR8実施例2:ワクチンAおよび実施例433°Cで複製させたAPR8に由来するインフルエンザウイルスAPR834から調製した。細胞培養培地中のインフルエンザウイルスを、低速遠心分離2000g、20min、4°Cによって細胞および細胞フラグメントから分離し、そしてショ糖勾配遠心分離10~50wtwtの直線状ショ糖勾配、30000g、2h、4°Cによって精製した。インフルエンザウイルス含有バンドを入手し、PBSで110に希釈し、そして20000rpmで沈殿させ、そして沈殿物をPBS容量:最初の細胞培養培地の50中に取り出した。インフルエンザウイルスを、ホルムアルデヒドで不活化した24時間の間隔で35強度ホルムアルデヒド溶液の0025の2回の添加、撹拌しながら20°Cでのインキュベーション。10匹のNMRIマウスの各々18~20gの重量に、皮下注射により0日目および28日目に各々03mlのこれらの不活化実験用ワクチンとともにインキュベートした。接種後の2および4週間、ならびにさらにワクチン再接種後の1および2週間に、血液を動物から採取して、APR834に対する中和抗体の力価を測定した。保護割合を決定するために、マウスを、ワクチン再接種実験の開始後6週間後に1000LD50致死量の50の鼻腔内投与によって2週間曝露した。実験の結果を表IXに編集した。これらの実験は、細胞培養において37°Cで複製した、高い抗原収量HA力価を伴うインフルエンザウイルスが、マウスにおいて低い中和抗体力価のみを誘導し、そしてかろうじて保護を提供し、一方、細胞培養において33°Cで複製した、同様に高い抗原収量HA力価を伴うインフルエンザウイルスは、マウスにおいて非常に高い中和抗体力価を誘導し、そして非常に良好な保護に至ったことを確証する。