"細胞破壊および核酸処理を可能にする条件下で直接的にバイサルファイト薬剤で生体サンプルを処理することと;処理サンプルからバイサルファイト薬剤を除去することと;処理サンプル中でターゲット核酸を検出することとを含む、分子検出アッセイ。生体サンプルは、糞便、鼻水、血液、血漿、血清、頬細胞、膿、創傷、濃縮濾液、脳脊髄液、精液、液状化検体細胞診LBC組織、FFPE、レーザ捕獲細胞、培養細胞、ペレット化細胞、細菌培養物、細菌コロニー、ウイルス懸濁液、吸引物、気管支洗浄液、痰サンプル、環境サンプル、環境濃縮物、食品、原料、水サンプル、または水濃縮物から選択される、請求項1に記載のアッセイ。動物における感染症、遺伝的疾患または遺伝的形質を検出するための、請求項1または請求項2に記載のアッセイ。感染症は微生物によって引き起こされる、請求項3に記載のアッセイ。微生物は、細菌、ウイルス、ウイロイド、酵母、菌類、プリオン、寄生虫またはアメーバである、請求項4に記載のアッセイ。遺伝的疾患は、癌、コピー数変異と関連した疾患、遺伝性疾患、環境誘導疾患、発癌因子への暴露によって引き起こされる疾患、ヌクレオチドリピート長の拡大または縮小によって特徴付けられる疾患である、請求項2に記載のアッセイ。バイサルファイト薬剤は、ナトリウムバイサルファイトまたはナトリウムメタバイサルファイトである、請求項1から請求項6の何れか一項に記載のアッセイ。バイサルファイト薬剤は、pH範囲が4.5から5.5である2.5Mから3.5Mの濃度で用いられる、請求項7に記載のアッセイ。バイサルファイト薬剤は、5.0のpHにて3Mの濃度で用いられる、請求項8に記載のアッセイ。処理工程は、1分間から30分間、75°Cから95°Cの間で加熱することを伴う、請求項1から請求項9の何れか一項に記載のアッセイ。サンプルは、10から20分間、80°Cから95°Cの間の温度で加熱される、請求項10に記載のアッセイ。バイサルファイトは、カラムベースの精製、ビーズベースの精製または沈殿によって除去される、請求項1から請求項11の何れか一項に記載のアッセイ。バイサルファイトの除去後、処理サンプルは、pHが少なくとも10である溶出バッファ中に再懸濁される、請求項1から請求項12の何れか一項に記載のアッセイ。溶出バッファは、pHが11.5から12.5までである、請求項13に記載のアッセイ。溶出バッファは、pHが少なくとも12である、請求項14に記載のアッセイ。核酸プライマーまたはプローブを処理サンプルに与えることをさらに有する、請求項1から請求項15の何れか一項に記載のアッセイ。ターゲット核酸分子は増幅によって検出される、請求項16に記載のアッセイ。増幅は、PCR、qPCR、逆転写PCR、デジタルPCR、等温増幅またはシグナル増幅である、請求項17に記載のアッセイ。ターゲット核酸は、処理材料を配列決定することによって検出される、請求項1から請求項18の何れか一項に記載のアッセイ。サンプルの直接的処理のための分子検出アッセイのためのキットであって:バイサルファイト試薬と;核酸溶出および反応試薬と;ターゲット核酸用プライマーと;アッセイを実行するための使用説明書とを含むキット。利点本発明は、先行技術の方法に勝る多くの利点を有しており、以下を含む。a.サンプルの細胞溶解および核酸変換が、同じチューブ内で同時に起こり、完全な溶解および変換が30分未満で達成され得、さらに言えば僅か10から20分で達成され得る。b.糞便材料等のサンプルが、感度を損なうことなく直接的にプロセシングされ得る。c.本発明に基づく試験は、一次患者サンプルに、プロテイナーゼK等の酵素による前処理なしに実行され得るという利点を有する。d.本方法は、現在市場に出ている商用精製キット等の高価な精製法を何ら必要としない。これらの商用キットは、ほんの少し例を挙げれば、血液、糞便、培養細胞、FFPE、細菌、ウイルスおよび寄生虫等のほぼ全てのサンプル型に利用可能である。これらの商用キットは、サンプルを精製するために数千ドルも費やすことがあり、そして2から4時間かかることがある。世界中のほぼ全ての研究所は、現在用いられている分子アッセイにおいて、これらのサンプル精製用キットを、その後の任意の増幅工程の前に用いている。e.バイサルファイトの除去後、サンプルは続いて、熱脱スルホン化等のさらなる処理を何ら必要としない単純な溶出バッファ中に再懸濁され、こうしてプロセスを単純化する。f.本方法は、特殊化されたウイルス精製キットを何ら用いる必要なく、同じチューブ内で同じサンプルからRNAウイルスおよびDNAウイルスの双方を同時に検出することができる。RNAウイルスおよびDNAウイルスの双方は一方が一本鎖であり、もう一方が二本鎖であろうとも、本発明によって等しい効率で溶解され、かつ変換される。g.驚くべきことに、高いpHである溶出バッファは、RNAを分解しない。この発見は、先行技術の教示が、RNAを高い温度および高いpHで処理しないように特に忠告しているので、先行技術において教示されてきたことに反するものである。h.本方法は、類似の条件を用いて全ての細菌型を溶解し、かつ変換することができるので、単一の患者サンプルが、クロストリジウムディフィシル、サルモネラ属、カンピロバクター属および寄生虫等について複数の試験に用いられ得るので、各細菌またはターゲット微生物のための抽出法を別々にするという問題を解消する。i.本方法は、従来の溶解技術に対して耐性のある丈夫な外殻を形成することができる、寄生虫等の溶解させるのが困難なサンプルに適用可能である。従って、結核菌TB従来の溶解技術に対して非常に耐性がある等のターゲット生物は、感度の良い核酸ベースの診断試験が必要とされるので、検出するのに理想的であろう。j.本方法は、C型肝炎ウイルスHCVを、直接的に血清から効率良く溶解し、かつ変換することができ、僅か10コピーのウイルスを用いて、重要なRNAウイルスを非常に低い濃度で検出するという有用性を証明している。k.本方法はまた、現在実行されているような、長時間かかるサンプルプロセシング時間を短くし、かつサンプルが精製されてからバイサルファイト変換されて、再び精製されなければならないという問題を解消する。l.本方法は、患者糞便材料における、結腸直腸癌の高感度検出に適している。このようなサンプルは非侵襲性であり、検出の一次手段として、内視鏡検査への依存を減らすであろう。また、サンプルから結果までが、複雑なサンプルプロセシング手順なしに3時間未満になると予想される。診断のために血清サンプルよりも糞便材料を使用することは、多くの利点を有し、この最上位にあるのは、感度が常に大きな問題となる血清サンプルとは異なり、多数のヒト細胞がサンプル中に存在しやすいことである。サンプル本発明は、糞便、鼻水、血液、血漿、血清、頬細胞、膿、創傷、濃縮濾液、脳脊髄液、精液、液状化検体細胞診LBC組織、FFPE、レーザ捕獲細胞、培養細胞、ペレット化細胞、細菌培養物、細菌コロニー、ウイルス懸濁液、吸引物、気管支洗浄液、痰サンプル、環境サンプル、環境濃縮物、食品、原料、水サンプル、水濃縮物等を含むサンプルをプロセシングするのに適している。サンプル処理HGS本発明に従うサンプルの好ましい処理方法は、以下の通りである。サンプルは、200μlの3M2.5から3.5Mの範囲ナトリウムバイサルファイトpH5.04.5から5.5のpH範囲内に直接入れられて、10から20分間、75°Cから95°Cの間で加熱される。バイサルファイトは、任意の適切な手段によって、処理サンプルから除去される。例は、カラムベースの精製を含み、またはビーズベースの精製が最適であるが、場合によっては単純な沈殿工程で十分なことがある。バイサルファイトの除去後、サンプルは、pHが11.5から12.5の間>pH12が好ましいである溶出バッファ中に再懸濁される。サンプルはこれで、さらなるプロセシングがなくとも、PCR増幅の準備が整う。バイサルファイトの除去バイサルファイト除去は、MethylEasy商標技術HumanGeneticSignatures等の市販の方法によって達成されてよい。手短に言うと、240μlの試薬3がサンプルに加えられて、サンプルが遠心カラムに移される。続いて、カラムは10,000×gで回転されて、バイサルファイトを除去する。続いて、カラムは、洗浄の間10,000×gで回転することで、300μlの試薬4で2回洗浄される。20から50μlの溶出バッファが加えられて、サンプルはきれいなコレクションチューブ内に回転により集められる。サンプルはこれで、PCR増幅の準備が整う。サンプル前処理現行のサンプル前処理は、QiagenIncValencia,CA91355USA、SigmaLifeSciencesStLouis,MO,USA、InvitrogenCorporationCarlsbad,CA92008,USA、およびPromegaCorporationMadison,WI53711USAによって販売される商用キットを伴う。本発明は、以下の方法と比較された。インハウス病院試験便のサンプルが10分間95°Cで加熱されてから希釈され、続いてサンプルはクロストリジウムディフィシルのtcdB遺伝子について増幅された。Qiagen精製QIAampDNAStoolMiniKit50Cat51504。市販の寄生虫試験AusDiagnosticsGastrointestinalParasites5,Cataloguenumber:6502。結果糞便サンプル表1、表2、表3および表4における試験された全糞便サンプルは、以下のように処理された:スワブが糞便材料内に入れられ、続いて、200μlの3MナトリウムバイサルファイトpH5.0を含有するチューブへ移されて混合されてから、15分間95°Cで加熱された。バイサルファイトは、MethylEasy商標法を用いて除去され、サンプルは20から50μlの溶出バッファ中に再懸濁され、続いて標準的な条件を用いて増幅された。表1はインハウス病院試験の結果を示しており、同サンプルがQiagen精製を用いて試験され、そして同サンプルが本発明に従う方法を用いて試験された。結果からわかるように、インハウス病院試験は、7つの偽陰性結果および1つの偽陽性結果をもたらしたEIAおよび培養ならびに市販の分子診断キットによって確かめられたことから、この方法は一次患者サンプル中のクロストリジウムディフィシルの検出に必要とされる感度を有していなかったことを示唆している。Qiagen法を用いて、4サンプルがプロセシングに十分な材料を有しておらず、1サンプルが偽陰性結果を示したEIAによればGDH陽性。これらの結果は、クロストリジウムディフィシルの迅速な診断について、本発明に従う方法HGS法の有用性を証明している。また、限られた容量のサンプルが、HGS法を用いて容易にアッセイされている。また、Qiagen法は、少なくとも2時間のサンプル調製時間を必要とし、予め定めた量の糞便材料を検量しなければならない。表1.クロストリジウムディフィシルの検出のための、インハウス病院試験対Qiagen精製対HGS法の結果。表2.標準的な顕微鏡検査対市販の寄生虫検出キット対HGS法の結果。表2は、標準的な顕微鏡検査、市販の寄生虫試験AusdiagnosticEasy-PlexGastrointestinalparasite5とHGS法との直接比較の結果を示している。結果からわかるように、市販の方法は、ジアルジア属嚢胞を含有するサンプルの多くを溶解させることができない。これは、全てのジアルジア属サンプル、および従来の顕微鏡検査によって見落とされる一部のサンプルをも容易に検出するHGS法と対照的である。また、いくつかのサンプルが寄生虫および細菌の双方を含有したように、HGS方法は細菌および寄生虫の溶解に汎用性があるように見え、結果が後に病院によって確かめられた。表3は、微生物検出のためのHGS法対従来の培養方法の結果を示している。見てわかるように、培養方法は、分子法が検出したカンピロバクター属種を含有する1サンプルを検出できなかった。また、交差反応性がクロストリジウムディフィシルを含有するサンプルで検出されなかった。全ての陽性培養結果はHGS法と一致しており、従来の培養と比較して分子法の感度が良いことを示唆している。さらに、HGS法の結果は、従来の培養方法に必要とされる一晩培養と比較して、僅か3時間で入手可能である。表3.腸内細菌の検出のための従来の培養方法対HGS法の結果処理条件クロストリジウムディフィシルについて陽性の3つ、およびクロストリジウムディフィシルについて陰性の1つの4つの便サンプルが、抽出効率に及ぼす温度および時間の影響を決定するためにアッセイされた。また、抽出コントロール16srDNA遺伝子が、便サンプル内に存在する混合叢に及ぼす条件の影響を決定するために、含められた。FamチャンネルがクロストリジウムディフィシルのtcdA/B遺伝子に特異的であり、Cy5チャンネルが抽出コントロールに特異的である。結果は、図1および表4に示される。表4の結果からわかるように、これらのサンプルの溶解に好ましい温度および時間は、85°Cから95°Cの間で15分間である。全ての陽性サンプルおよび糞便叢が容易に検出された。表4.便サンプルを用いるHGS溶解/変換方法の効率に及ぼす、時間および温度の影響。表5.血清サンプルから直接的にHCVを効率良く検出する方法の能力に及ぼす、溶出バッファpHの影響10μlのHCVAcrometrixが、200μlの3Mナトリウムバイサルファイトに加えられて、5、10または15分間、75°C、75°C、80°Cおよび90°Cにまで加熱された。バイサルファイトが、修正MethylEasy商標法を用いて除去され、サンプルが、20μlの溶出バッファ中に再懸濁され、12μlが逆転写された後、2μlが標準的な条件を用いて増幅された。表5の結果からわかるように、HCVRNAは、試験された最も高い温度である90°Cでの溶解変換に容易に耐えることができる。さらに驚くべきことに、アッセイは高いpHのバッファの存在下でRNAウイルス検出に有効であった。このことは、RNA種がほぼ中性のpHに維持される必要があることを示す公表文献と相容れないものである。表4の結果と組み合わせられたこれらの結果は、15分間の約90°Cの温度が、クロストリジウムディフィシル等の二本鎖DNA含有生物およびHCV等の一本鎖RNAウイルスのための汎用サンプルプロセシング方法で有り得たことを示唆している。また、クロストリジウムディフィシルは芽胞含有生物であるので、これらの結果は、本方法が、丈夫な芽胞をこじ開ける程十分に厳しいが、RNA含有ウイルスが分解されない程十分に穏やかであることを示唆している。ここでも、このようなデータは先行技術によって予測されなかったであろう。PCRAおよびPCRBは、用いたマスターミックスが異なるそれぞれJumpStartSigmaおよびFastStartRoche。血清HCVの希釈液Zeptoometrixが調製された後、各10μlの希釈液が200μlの3Mナトリウムバイサルファイトに加えられて、10分間75°Cにまで加熱された。バイサルファイトが、MethylEasy商標法を用いて除去され、サンプルが、20μlの溶出バッファ中に再懸濁され、12μlが逆転写された後、2μlが標準的な条件を用いて増幅された。表6.血清からの直接的なHCVウイルスの高感度検出。表6からわかるように、血清を直接プロセシングするHGS法を用いる場合、僅か2IUのHCVが、効率良く溶解され得、かつ同時に変換され得る。これらの結果は、プロセスのターゲットとしてRNAウイルスを用いて生み出され得る感度が優れていることを証明している。表7は、同じ抽出条件下でのRNAウイルスおよびDNAウイルス双方の同時溶解/変換を示している。図2は、同じサンプル由来の3つのウイルスの増幅を示している。A.Fam=ノロウイルス一本鎖RNAウイルスB.Hex=アデノウイルス二本鎖DNAウイルスC.Cy5=ロータウイルス一本鎖RNAウイルスノロウイルス、アデノウイルスおよびロータウイルスの質的サンプルが、Zeptometrixから得られた。各ウイルスのサンプル10μlが、3Mナトリウムバイサルファイトに加えられて、サンプルは10、15および20分間90°Cで加熱された。その後、バイサルファイトが、修正MethylEasy商標法を用いて除去され、サンプルが、20μlの溶出バッファ中に再懸濁され、12μlが逆転写された後、2μlが標準的な条件を用いて増幅された。表7からわかるように、90°Cでの15分の加熱後、RNAウイルスおよびDNAウイルスの双方が効率的に溶解され、かつ変換されている。双方のウイルス型が同じ条件下で精製された。これらの結果は、さらに、同じサンプル由来のDNAウイルスおよびRNAウイルス双方の溶解および効率的変換のための汎用サンプル調製方法としてのHGS法の有用性を証明している。ここでも、驚くべきことに、RNAウイルスは、90°Cのサンプル処理および高いpHのバッファに容易に耐えることができる。表7.同じ抽出条件下でのRNAウイルスおよびDNAウイルス双方の同時溶解/変換。糞便サンプルに、Zeptometrixから得られたノロウイルス、アデノウイルスおよびロータウイルスの質的サンプルが混ぜられた。ウイルスのサンプル10μlが、糞便材料内に混ぜられ、サンプルが混合された。スワブが糞便材料内に入れられ、続いて、200μlの3MナトリウムバイサルファイトpH5.0を含有するチューブへ移されてから、15分間95°Cで加熱された。バイサルファイトが、修正MethylEasy商標法を用いて除去され、サンプルが、20μlの溶出バッファ中に再懸濁され、12μlが逆転写された後、2μlが標準的な条件を用いて増幅された。表8.糞便サンプルにウイルスが混ざる影響。表8の結果は、ウイルス粒子が糞便サンプル内に混ぜられて、汎用条件が適用される場合でさえ、DNAウイルスおよびRNAウイルスの双方が有効に溶解され、かつ変換されることを示している。従って、本方法は、注目する任意の微生物について、任意のサンプル型に適用可能なはずである。ヒト細胞本発明が癌等のヒト疾患の検出にも適しているかを決定するために、5μl、10μlおよび20μlの希釈ヒト細胞が、200μlの3Mバイサルファイト中にて、10分または15分間、70°C、80°C、90°Cおよび95°Cでインキュベートされた。サンプルは、バイサルファイト溶液を除去するためにプロセシングされて、50μlのバッファpH12.3中に再懸濁された。続いて、材料2μlが、ヒトβ-グロビン遺伝子特異的プライマーおよびプローブを用いて、増幅された。結果は、表9および図3に示される。表9.ヒトMRC5細胞を用いた、時間/温度の最適化表9からわかるように、前処理なしのヒト細胞の同時溶解および変換にとって好ましい時間および温度は、15分間、90から95°Cの間である。図3は、糞便材料内にヒト細胞を混ぜる影響を示している。図3Aは、3Mバイサルファイト試薬中にて15分間、95°Cで加熱され、続いて高いpHのバッファ12.3中に再懸濁されて、ヒトβ-グロビン遺伝子について増幅されたヒトMRC5細胞を示している。図3Bは、3Mバイサルファイト試薬中にて15分間、95°Cで加熱され、続いて高いpHのバッファ12.3中に再懸濁されて、ヒトβ-グロビン遺伝子について増幅された、糞便材料内に混ぜられた同細胞を示している。結果からわかるように、ヒト細胞は、サンプル前処理もDNA単離も何ら必要とせずに、一次ヒト糞便材料において溶解され、かつ効率的に変換され得る。結果は、ヒト細胞のメチル化プロファイリングが、バイサルファイトに先立つ前処理もサンプル精製も必要とせずに、患者から得られる糞便サンプルに直接的に実行され得ることを示している。従って、本方法は、一次患者材料からの直接的な結腸直腸癌の診断のための非侵襲性の、かつ単純な方法として理想的である。診断試験キット本発明は、診断研究所等において使いやすくできる診断キットの形で提供されてよい。表10および表11は、例えば、微生物用の代表的な試験キットにおいて提供される試薬を示している。キットは使用説明書を含む。チューブ、スワブおよび他の研究所の備品がキット内に提供されない場合があることは、これらの材料が普通、診断研究所において容易に入手可能であるので、いうまでもない。表10.2個のうちのボックス1室温で保存表11.2個のうちのボックス2受取り後直ぐに-20°Cで保存ボックス2は、サンプルがプロセシングされるのとは異なる場所にあるDNAクリーンルームにおいて-20°Cで保存されなければならない。特異的な微生物または遺伝的試験用のキットは、ターゲット核酸分子の増幅を可能にするPCRプライマーを含む。広く記載される本発明の精神または範囲から逸脱しない範囲で、多くの変更および/または修正が具体的な実施形態において示されるような本発明になされてよいことは、当業者によって十分理解されるであろう。従って、本実施形態は、あらゆる点において、制限的なものではなく、説明のためのものであると考えられるべきである。"