"下記式1で表される、アルキレンジアミンで架橋されたヒアルロン酸のヒドロゲルを含むことを特徴とする組織増大用充填組成物:[HA]m-CO-NH-R1-NH-CO-[HA]n1式中、HAはカルボキシル基一つを除いたヒアルロン酸またはその塩を示し、R1は、置換されていないC3-C10アルキレン基、または、ヒドロキシ、C1-C6アルキルもしくはC1-C6アルコキシで置換されたC3-C10アルキレン基を示し、m及びnは、それぞれ10,000~4,000,000の整数である。未修飾ヒアルロン酸を更に含む請求項1に記載の組成物。リドカインを更に含む請求項2に記載の組成物。前記ヒアルロン酸の分子量が20,000ダルトン~4,000,000ダルトンである請求項1~3のいずれか1項に記載の組成物。前記アルキレンジアミンが、ヘキサメチレンジアミンである請求項1~3のいずれか1項に記載の組成物。前記アルキレンジアミンで架橋されたヒアルロン酸が、pH5.5~6.5で、カルボキシル基活性化剤とペプチド結合促進剤との存在下、ヒアルロン酸と、置換されていないC3-C10アルキレンジアミン化合物、または、ヒドロキシ、C1-C6アルキルもしくはC1-C6アルコキシで置換されたC3-C10アルキレンジアミン化合物とを反応させることにより製造されたものである請求項1~3のいずれか1項に記載の組成物。前記架橋ヒドロゲルの架橋率が5~35である請求項1~3のいずれか1項に記載の組成物。前記アルキレンジアミンで架橋されたヒアルロン酸のヒドロゲルが、組成物全重量に対して1~3w/w含まれている請求項1~3のいずれか1項に記載の組成物。皮膚のシワを除去または改善するためのものである請求項1~3のいずれか1項に記載の組成物。頬、唇、胸及び尻から選択される身体部位の容積を増大するためのものである請求項1~3のいずれか1項に記載の組成物。請求項1に記載の組成物を製造するための方法であって、1カルボキシル基活性化剤とペプチド結合促進剤との存在下、ヒアルロン酸と、置換されていないC3-C10アルキレンジアミン化合物、または、ヒドロキシ、C1-C6アルキルもしくはC1-C6アルコキシで置換されたC3-C10アルキレンジアミン化合物とを反応させることにより、アルキレンジアミンで架橋されたヒアルロン酸のヒドロゲルを調製する工程;2調製されたヒドロゲルを均質化する工程;及び3未反応物を除去する工程;を含むことを特徴とする方法。カルボキシル基活性化剤とペプチド結合促進剤を水に溶解し、30分以内にヒアルロン酸とアルキレンジアミン化合物の混合物に添加する請求項11に記載の方法。前記第1工程において、30°C~50°Cで9時間以上撹拌することなく放置することにより、アルキレンジアミンで架橋されたヒアルロン酸のヒドロゲルが調製される請求項11に記載の方法。pH5.5~6.5で、アルキレンジアミンで架橋されたヒアルロン酸のヒドロゲルが調製される請求項11に記載の方法。下記式1で表される、アルキレンジアミンで架橋されたヒアルロン酸のヒドロゲルを含むことを特徴とする組織増大用充填剤:[HA]m-CO-NH-R1-NH-CO-[HA]n1式中、HAはカルボキシル基一つを除いたヒアルロン酸またはその塩を示し、R1は、置換されていないC3-C10アルキレン基、または、ヒドロキシ、C1-C6アルキルもしくはC1-C6アルコキシで置換されたC3-C10アルキレン基を示し、m及びnは、それぞれ10,000~4,000,000の整数である。前記アルキレンジアミンで架橋されたヒアルロン酸が、カルボキシル基活性化剤とペプチド結合促進剤との存在下、ヒアルロン酸と、置換されていないC3-C10アルキレンジアミン化合物、または、ヒドロキシ、C1-C6アルキルもしくはC1-C6アルコキシで置換されたC3-C10アルキレンジアミン化合物とを反応させることにより製造されたものである請求項15に記載の組織増大用充填剤。前記アルキレンジアミンがヘキサメチレンジアミンである請求項15に記載の組織増大用充填剤。前記ヒアルロン酸の分子量が10,000ダルトン~4,000,000ダルトンである請求項15に記載の組織増大用充填剤。前記架橋ヒドロゲルの架橋率が5~35である請求項15~18のいずれか1項に記載の組織増大用充填剤。皮膚のシワを除去または改善するためのものである請求項15~18のいずれか1項に記載の組織増大用充填剤。頬、唇、胸及び尻から選択される身体部位の容積を増大するためのものである請求項15~18のいずれか1項に記載の組織増大用充填剤。本発明は、前述のような従来技術の問題点を解決するためのものであり、優れた組織修正用充填剤として使用できるように、生体内持続性と生体適合性に優れ、滅菌後にも粘弾性などの物性を良好に示すものであり、容易に注射剤に充填され、生体組織に投与することが可能な架橋結合されたヒアルロン酸ヒドロゲルを含む組成物と、その製造方法を提供することを目的とする。上記課題を解決するための本発明は、下記式1で表される、アルキレンジアミンで架橋されたヒアルロン酸のヒドロゲルを含む組織増大用充填組成物を提供する。[HA]m-CO-NH-R1-NH-CO-[HA]n1式中、HAはカルボキシル基一つを除いたヒアルロン酸またはその塩を示し、R1は、置換されていないC3-C10アルキレン基、または、ヒドロキシ、C1-C6アルキルもしくはC1-C6アルコキシで置換されたC3-C10アルキレン基を示し、m及びnは、それぞれ10,000~4,000,000の整数であり、好ましくは20,000~3,000,000である。好ましくは、アルキレンジアミンで架橋されたヒアルロン酸のヒドロゲルは、組成物全重量に対して1~3w/w含まれる。好ましくは、本発明に係る組成物は、未修飾例えば、非架橋ヒアルロン酸を更に含む。また、本発明組成物は、シリンジに充填することができ、押出圧力が減ぜられていることにより組織へ容易に注入することができる。好ましくは、未修飾ヒアルロン酸は、組成物全重量に対して0.05~1w/w含まれる。好ましくは、本発明に係る組成物は、滅菌後の弾性低下が防止されており、且つ局所麻酔効果を発現するために、アルキレンジアミンで架橋されたヒアルロン酸のヒドロゲルと未修飾ヒアルロン酸に加え、リドカインを更に含む。好ましくは、上記リドカインは、組成物全重量に対して0.1~0.4w/w含まれる。本発明組成物の残部は、水や生理食塩水など、薬学上許容される担体からなる。本発明の組成物において、ヒアルロン酸の分子量としては、20,000ダルトン~4,000,000ダルトンが好ましい。本発明の組成物において、アルキレンジアミンは、好適にはヘキサメチレンジアミンである。本発明の組成物において、アルキレンジアミンで架橋されたヒアルロン酸のヒドロゲルとしては、pH5.5~6.5で、カルボキシル基活性化剤とペプチド結合促進剤との存在下、ヒアルロン酸と、置換されていないC3-C10アルキレンジアミン化合物、または、ヒドロキシ、C1-C6アルキルもしくはC1-C6アルコキシで置換されたC3-C10アルキレンジアミン化合物とを反応させることにより製造されたものが好ましい。本発明の組成物において、アルキレンジアミンで架橋されたヒアルロン酸のヒドロゲルの架橋率としては、5~35が好ましいTNBSアッセイによる。本願明細書で、増大の語は、組織容積の増加例えば、組織の拡張及び/又は組織機能の向上を意味する。従って、本発明の組織増大用充填剤は、軟部組織の容積の増大または組織機能を向上することにより医学的または美容的に使用でき、特に皮膚のシワを除去または改善するか;頬、唇、胸、尻などの身体部位の容積を増大するために使用できる。また、本願明細書において、ヒアルロン酸の語は、ヒアルロン酸自体はもちろん、ヒアルロン酸の塩及び誘導体をも含む意味である。従って、以下で使われるヒアルロン酸水溶液の語は、ヒアルロン酸の水溶液、ヒアルロン酸塩の水溶液、及びこれらの混合物水溶液の全てを含む。また、本発明は、上記本発明に係る組成物を製造するための方法であって、1カルボキシル基活性化剤とペプチド結合促進剤との存在下、ヒアルロン酸と、置換されていないC3-C10アルキレンジアミン化合物、または、ヒドロキシ、C1-C6アルキルもしくはC1-C6アルコキシで置換されたC3-C10アルキレンジアミン化合物とを反応させることにより、アルキレンジアミンで架橋されたヒアルロン酸のヒドロゲルを調製する工程;2調製されたヒドロゲルを均質化する工程;及び3未反応物を除去する工程;を含むことを特徴とする方法を提供する。好ましくは、本発明方法は、カルボキシル基活性化剤とペプチド結合促進剤を水に溶解し、30分内にヒアルロン酸とアルキレンジアミン化合物の混合物に添加することによって、滅菌後にも弾性係数などの物性に優れたアルキレンジアミンで架橋されたヒアルロン酸のヒドロゲルを製造することができる。好ましくは、本発明方法は、ヒアルロン酸とアルキレンジアミンを十分かつ完全に架橋するために、30°C~50°Cで9時間以上撹拌することなく放置することにより、滅菌後にも弾性係数などの物性に優れたアルキレンジアミンで架橋されたヒアルロン酸のヒドロゲルを製造することができる。好ましくは、本発明方法は、pH5.5~6.5で、アルキレンジアミンで架橋されたヒアルロン酸のヒドロゲルを調製することによって、少量の架橋剤アルキレンジアミン及び触媒カルボキシル基活性化剤とペプチド結合促進剤を用いて、滅菌後にも弾性係数などの物性に優れ、且つ生体適合性の高い、アルキレンジアミンで架橋されたヒアルロン酸のヒドロゲルを製造することができる。好ましくは、本発明方法は、製造されたヒドロゲルを篩にかけて、均質なサイズと狭い粒子分布を有する均質化されたヒドロゲルを得ることによって、滅菌後にも比較的低い押出圧力を示し、容易に注射器に充填でき、組織内へ注入可能な組成物を製造することができる。好ましくは、本発明方法では、C1-C6アルコール水溶液で沈殿させ、リン酸緩衝食塩水PBSまたは塩化ナトリウムバッファーで洗浄することによって、短い時間内に、アルキレンジアミン、カルボキシル基活性化剤とペプチド結合促進剤などの未反応物質を容易に除去することができる。本発明に係るアルキレンジアミンで架橋されたヒアルロン酸のヒドロゲルを用いた組成物は、組織の増大に必要な物性に優れ、生体内での優れた持続性により、その交換回数を低減することができるという有利な効果を示す。また、未修飾ヒアルロン酸及び局所麻酔剤を更に含む組成物は、上記効果の外にも、弾性係数の低下など滅菌後において組織増大に必要な物性の劣化が起らないことから、容易に滅菌して使用することができ、また、押出圧力が低減されていることから、容易に注射器に充填して組織に注入することができるという利点がある。以下では、アルキレンジアミンで架橋されたヒアルロン酸のヒドロゲル、これを含む組成物及びその製法を具体的に説明する。1アルキレンジアミンで架橋されたヒアルロン酸のヒドロゲルの製造アルキレンジアミンで架橋されたヒアルロン酸のヒドロゲルは、カルボキシル基活性化剤とペプチド結合促進剤との存在下に、ヒアルロン酸をアルキレンジアミン化合物と反応させることにより製造される。用いられるヒアルロン酸HAの分子量は、10,000~4,000,000ダルトン、より好ましくは、20,000~3,000,000ダルトンである。製造される架橋ヒドロゲルの分解率は、HAの分子量または濃度を調節することにより調節することができる。通常、HAの初期濃度が高いほど製造される架橋ヒドロゲルの架橋率が高く、これに伴い、架橋ヒドロゲルは低い生体内分解率を示す。HAは、好ましくは、1~3.5w/wの濃度、より好ましくは、3w/wの濃度で使用する。当該濃度が1w/w未満の場合には、所望の程度の生体分解率を得ることが困難であり、3.5w/wを超える場合には、製造されたヒドロゲルが乾燥して壊れ易くなる。アルキレンジアミン化合物は、置換されていないか、或いは、ヒドロキシ、C1-C6アルキルまたはC1-C6アルコキシで置換されたC3-C10アルキレンジアミン化合物であり、好ましくは、C3-C7アルキレンジアミン、より好ましくは、C4-C6アルキレンジアミン、最も好ましくは、C6アルキレンジアミンヘキサメチレンジアミンである。アルキレンジアミン化合物は、ヒアルロン酸の繰り返し単位に対して、3.5~80モル、好ましくは10~30モル、最も好ましくは10~25モルで使用する。カルボキシル基活性化剤としては、1-エチル-3-3-ジメチルアミノプロピルカルボジイミドEDCのような1-アルキル-3-3-ジメチルアミノプロピルカルボジイミド;1-エチル-3-3-トリメチルアンモニオプロピルカルボジイミドETCのような1-アルキル-3-3-トリメチルアンモニオプロピルカルボジイミド;1-シクロヘキシル-3-2-モルホリノエチルカルボジイミドCMCのような1-シクロアルキル-3-2-モルホリノエチルカルボジイミドなどの水溶性カルボジイミドのカルボジイミドを使用する。より好ましくは、1-エチル-3-3-ジメチルアミノプロピルカルボジイミドEDCを使用する。カルボキシル基活性化剤は、ヒアルロン酸1モルに対して、モル比で1~5倍使用することが好ましい。ペプチド結合促進剤としては、例えば、1-ヒドロキシベンゾトリアゾールHOBt、3,4-ジヒドロ-3-ヒドロキシ-4-オキソ-1,2,3-ベンゾトリアジンHOOBt、1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾールHOAt、スルホ-N-ヒドロキシスルホスクシンイミドSulfo-NHS、O-1H-ベンゾトリアゾール-1-イル-N,N,N,N-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレートTBTUを使用する。好ましくは、1-ヒドロキシベンゾトリアゾールHOBtを使用する。ペプチド結合促進剤は、ヒアルロン酸1モルに対して、モル比で1~5倍使用することが好ましい。好ましくは、アルキレンジアミン化合物としてヘキサメチレンジアミンHMDAを用いて製造したヒアルロン酸-ヘキサメチレンジアミン架橋体を図1に示す。図1で示されるように、カルボキシル基活性化剤とペプチド結合促進剤との存在下に、ヒアルロン酸のカルボキシル基とアルキレンジアミン化合物のアミン基がアミド結合により架橋されていることが分かる。架橋結合は分子内または分子間で起こる。ヒアルロン酸のカルボキシル基は、ヒアルロン酸分解酵素であるヒアルロニダーゼによるヒアルロン酸の認識に関与する重要な基である。本発明に係るアルキレンジアミンで架橋されたヒアルロン酸のヒドロゲルでは、ヒアルロン酸のカルボキシル基が架橋に用いられることによって、生体内に投与された後、分解酵素によるヒアルロン酸分解が最小化し、生体持続性が増大される。また、カルボキシル基の-電荷は、組織の増大に大きく寄与するヒドロゲルの膨潤性などの物性に影響を及ぼす。上記架橋反応は、通常、水中で行われる。ヒアルロン酸、アルキレンジアミン化合物、カルボキシル基活性化剤及びペプチド結合促進剤は、それぞれ水に溶解して混合してもよいし、ヒアルロン酸及びアルキレンジアミン化合物を溶解した溶液と、カルボキシル基活性化剤とペプチド結合促進剤を溶解した溶液を混合してもよい。特に、カルボキシル基活性化剤として用いられるEDCの場合、弱酸性条件でN-エチル-N-3-ジメチルアミノプロピルウレアEDUに変わり得る。その結果、EDCを水に溶解して、架橋されるべきヒアルロン酸とアルキレンジアミンの混合物への添加が遅れると、製造された架橋ヒドロゲルの物性、特に滅菌後における組成物の弾性係数が低くなる等、物性が劣化され得る。好ましくは、溶解から添加時までに必要とされる時間は、10~30分以内、より好ましくは10~20分以内である。また、反応温度は、30~50°C、好ましくは43~45°Cに維持することができる。前記温度においてヒドロゲル化反応が効率的に進行し、通常30分内にヒドロゲルが形成される。また、前記温度で少なくとも9時間維持することにより、良好な粘弾性を有するヒドロゲルを製造できる。この際、撹拌なしで放置することが好ましい。追加反応時間が増加するに伴い、粘弾性などの物性が増加する。しかし、9時間以上では製造されたヒドロゲルの粘弾性などの物性にはほとんど変化が見られない。また、製造された架橋ヒドロゲルの架橋率は、製造時におけるpHによって変わり得、また、それにより物性が変わることがある。pHはNaOH水溶液を反応溶液に添加して調整することができる。好ましくは5.5~6.5、より好ましくは6.0~6.3である。特に、pHを5.5~6.5に調整することによって、たとえ比較的少量の架橋剤例えばヘキサメチレンジアミン及び反応触媒例えば、EDCのようなカルボキシル基活性化剤とHOBtのようなペプチド結合促進剤を使用した場合であっても、優れた粘弾性などの物性を有し、滅菌後にも粘弾性などの物理化学的性質の変化のない、アルキレンジアミンで架橋されたヒアルロン酸のヒドロゲルを製造することができる。pHが5.5未満の酸性環境で製造されたヒドロゲルは、比較的低い弾性係数Gを示し、滅菌時、弾性が更に低下され得る。2ヒドロゲルの均質化製造されたヒドロゲルは篩にかけるか、ホモジェナイザーを用いて均質な粒子形態になる。特に、篩にかけて均質化することが好ましく、狭い粒子分布と低い押出圧力を有するヒドロゲルを得ることができる。3未反応物質の除去架橋反応の後、未反応物質は、PBS中、24時間~3日間透析膜を用いて透析するか、エタノール水溶液及び/又はバッファーを用いて、検出限界2ppm未満まで除去することができる。ただし、HOBtのような促進剤は、有機溶媒によく溶ける傾向があるので、透析膜とPBSを利用する透析法によってはよく精製できないが、エタノール水溶液及び/又はバッファーを利用して容易に検出限界未満まで除去することができる。この際、バッファーとしては、好ましくはPBS溶液または塩化ナトリウムNaCl溶液を使用する。より好ましくは、塩化ナトリウムNaCl溶液を使用する。用いられるNaClの濃度が高いほど精製が容易である。NaClの濃度は、好ましくは0.5~1.5、最も好ましくは、1~1.3である。また、エタノール水溶液、例えば80エタノール水溶液を添加する場合、ヒドロゲル粒子が沈澱物として形成され、この過程で、未反応物質が容易に除去される。沈澱されたヒドロゲルは、窒素ガスで乾燥して粉末化でき、粉末になったヒドロゲルは、生理学的に適した水溶液で再水和することができる。この際、生理学的に適した水溶液としてはPBSまたは生理食塩水が好ましく、ヒアルロン酸-アルキルジアミン架橋体ヒドロゲル粉末に対して20~30倍体積比の割合の生理学的に許容される水溶液で再水和して、使用することができる。本発明に係るヒアルロン酸-アルキレンジアミン架橋体のヒドロゲルは、5~35の架橋率を有し、好ましくは10~20の架橋率を有する。架橋率が5未満の場合には、ヒアルロン酸内架橋結合に関与しない未反応COOH基の割合の増加によって、ヒアルロン酸の分解酵素であるヒアルロニダーゼhyaluronidaseにより容易に分解されるので、所望の程度の生体内持続性を得ることは困難である。架橋率が35を超える場合には、組織増大に有用な程度の膨潤性及び粘弾性を示すことは困難であり、生体内分解後の残余架橋剤の高含量によって炎症反応などを起こす可能性が大きくなる等、生体適合性が低い。また、ヒドロゲルの架橋率が低い場合、滅菌後における粘弾性などの物性が劣化され得る。本発明に係るヒアルロン酸-アルキレンジアミン架橋体の架橋率は、全体ヒアルロン酸含量に対し、架橋に関与したヒアルロン酸含量の百分率を意味するものである。当該架橋率は、架橋剤として用いられるアルキレンジアミンのヒアルロン酸全体に対する使用割合を調節するか、製造時におけるpHを調節するなどして、調節することができる。架橋率の測定は、当業界で公知の方法、例えば、NMR分析及びTNBSアッセイHabeeb,AFSA,Determinationoffreeaminogroupsinproteinsbytrinitrobenzenesulfonicacid.Anal.Biochem.,1966,14:pp.328333参照により容易に行うことができる。上記の本発明に係るヒアルロン酸-アルキレンジアミン架橋体からなるヒドロゲルは、ジビニルスルホンDVSを架橋剤として用いたHA-DVS架橋体ヒドロゲルに比べて顕著に低い分解率を示し、アジピン酸ジヒドラジドADHを架橋剤として用いたHA-ADH架橋体ヒドロゲルに比べて約2倍の膨潤性を示す。本発明に係る組織増大用充填組成物は、好ましくは、上記のアルキレンジアミンで架橋されたヒアルロン酸のヒドロゲルを、組成物全重量に対して1~3w/w、好ましくは1.8~2.4w/w含む。当該ヒドロゲルの含量が1w/w未満の場合、製造される組成物が所望の程度の生体内持続性と押出圧力を有することができないことがあり、3w/wを超えた場合、組成物の押出圧力が過度に高くなり、組織への注入が難しくなることある。一方、本発明の組成物は、アルキレンジアミンで架橋されたヒアルロン酸のヒドロゲルに加え、未修飾の即ち、架橋されていないヒアルロン酸を更に含んでいてもよい。未修飾HAは、通常、ヒアルロン酸-アルキレンジアミン架橋体のヒドロゲルの製造時に使用したものと同じヒアルロン酸である。未修飾HAは、潤滑剤として作用して、組成物の押出圧力を低減することによって、注射器に充填し、低い圧力で組成物を組織内へ注入することができる。好ましくは、未修飾ヒアルロン酸は、組成物全重量に対して0.05~1w/w、より好ましくは0.1~0.4w/wで含まれる。未修飾ヒアルロン酸の含量が0.05w/w未満の場合、所望の程度まで押出圧力を低減するのが難しくなり得、1w/wを超えた場合、押出圧力が過度に低くなり、一度の圧力負荷でも組成物が継続して少しずつ押し出されることになる可能性があり、また、滅菌後における弾性係数が過度に低くなる等、物性が劣化され得る。また、本発明の組成物は、アルキレンジアミンで架橋されたヒアルロン酸のヒドロゲル及び未修飾ヒアルロン酸に加え、リドカインのような局所麻酔剤を更に含み、麻酔効果とともに、滅菌後においてより良い物性を示すことができる。アルキレンジアミンで架橋されたヒアルロン酸のヒドロゲルに未修飾HAを混合する場合、組成物の押出圧力は低くなるが、滅菌後における組成物の弾性係数Gも未混合ヒドロゲルを含まないヒドロゲルの弾性係数より低くなる。しかし、リドカインを混合する場合、組成物の押出圧力には何ら影響はなく、単に、滅菌後における弾性係数が1.28倍以上増加した。即ち、本発明に係るアルキレンジアミンで架橋されたヒアルロン酸のヒドロゲルに未修飾HAを混合することによって、組成物の押出圧力を低下させることができ、また、リドカインを混合することによって、未修飾ヒアルロン酸による滅菌後の弾性低下を防止することができる。リドカインは、組成物全重量に対して、好ましくは0.1~0.4w/w、より好ましくは0.2~0.3w/wで含まれる。当該含量が0.1w/w未満の場合、所望の程度に未修飾ヒアルロン酸による滅菌後弾性低下を相殺することができなくなり得、また、0.4w/wを超えた場合、過度に組織を麻酔させ、不快感が誘発され得る。組成物の残部は、水、生理食塩水など薬学的に許容されるキャリアからなる。実施例1:本発明に係るヒアルロン酸-ヘキサメチレンジアミンHA-HMDA架橋体のヒドロゲルの製造分子量約230kDaのヒアルロン酸HA,LifecoreCore社製を1w/wの濃度で蒸留水に完全に溶解した後、HAのカルボキシル基との反応により架橋するためにヘキサメチレンジアミンHMDAを添加した。HMDAは、HAの繰り返し単位の72モルで添加した。カルボキシル基の活性化剤である1-エチル-3-3-ジメチルアミノプロピルカルボジイミドEDCと1-ヒドロキシベンゾトリアゾールHOBtを、HAの繰り返し単位の1.4倍の量で蒸留水に溶解した後、前記HAとHMDAの混合液に添加した。HA-HMDA架橋体の完全な架橋反応のために、前記混合溶液を37°Cで1時間反応させた。溶液のpHは5.0~5.5であった。その後、製造されたHA-HMDAヒドロゲルを予め洗浄した透析膜7kDaの分子量カット-オフで密封し、0.01MPBSリン酸緩衝液,pH7.4で24時間透析して、残留EDC、HOBt及びHMDAを除去した。製造されたHA-HMDAヒドロゲルの架橋度は8~9であった。実施例1-1分子量約230kDaのヒアルロン酸HA,LifecoreCore社製を1w/wの濃度で蒸留水に完全に溶解した後、HAのカルボキシル基との反応により架橋するためにヘキサメチレンジアミンHMDAを添加した。HMDAは、HAの繰り返し単位の72モルで添加した。カルボキシル基の活性化剤である1-エチル-3-3-ジメチルアミノプロピルカルボジイミドEDCと1-ヒドロキシベンゾトリアゾールHOBtを、HAの繰り返し単位の1.4倍の量で蒸留水に溶解した後、前記HAとHMDAの混合液に添加した。HA-HMDA架橋体の完全な架橋反応のために、前記混合溶液を37°Cで1時間反応させた。溶液のpHは5.0~5.5であった。製造されたHA-HMDAヒドロゲルを一次的に粉砕した後、200μm細孔径の篩にかけて、均質なヒドロゲルを得た。80エタノールを加え、沈殿物としてヒドロゲル粉末を取得し、100倍体積量の1.3NaCl溶液を加え、1時間撹拌した。また、80エタノールを再度加えて沈澱を得、100エタノールに10分間入れた後、40°Cで12時間減圧乾燥して残留EDC、HOBt及びHMDAを除去した。製造されたHA-HMDAヒドロゲルの架橋度は8~9であった。実施例1-2HMDAをHAの繰り返し単位の25モル添加したことを除いては、実施例1-1と同様にして、HA-HMDAヒドロゲルを製造した。製造されたHA-HMDAヒドロゲルの架橋度は6~7であった。実施例2:本発明に係るヒアルロン酸-ヘキサメチレンジアミンHA-HMDA架橋体のヒドロゲルの製造分子量が約1,000kDaのヒアルロン酸HA,LifecoreCore社製を1w/wの濃度で用い、溶液のpHを5.5~5.9にしたことを除いては、実施例1と同様にして、HA-HMDAヒドロゲルを製造した。製造されたHA-HMDAヒドロゲルの架橋度は11~13であった。実施例3:本発明に係るヒアルロン酸-ヘキサメチレンジアミンHA-HMDA架橋体のヒドロゲルの製造分子量が約1,000kDaのヒアルロン酸HA,LifecoreCore社製を1.5w/wの濃度で用い、HMDAをHAの繰り返し単位の25モル添加したことを除いては、実施例1と同様にして、HA-HMDAヒドロゲルを製造した。製造されたヒドロゲルのpHは5.0~5.5であった。製造されたHA-HMDAヒドロゲルの架橋度は11~13であった。実施例4:本発明に係るヒアルロン酸-ヘキサメチレンジアミンHA-HMDA架橋体のヒドロゲルの製造分子量1,000kDaのヒアルロン酸HA,LifecoreCore社製を3w/wの濃度で蒸留水に完全に溶解した後、HAのカルボキシル基との反応により架橋するためにヘキサメチレンジアミンHMDAを添加した。HMDAは、HAの繰り返し単位の20モルで添加した。0.25NNaOH水溶液を添加して、pHを6.0~6.5に調整した。カルボキシル基の活性化剤である1-エチル-3-3-ジメチルアミノプロピルカルボジイミドEDCと1-ヒドロキシベンゾトリアゾールHOBtを、HAの繰り返し単位の10倍の量で蒸留水に溶解した後、前記HAとHMDA水溶液の混合液に添加した。0.25NNaOH水溶液を添加して、pHを6.0~6.5に調整した。HA-HMDA架橋体の完全な架橋反応のために、前記混合溶液を45°Cで1時間反応させた。その後、製造されたHA-HMDAヒドロゲルを予め洗浄した透析膜7kDaの分子量カット-オフで密封し、0.01MPBSリン酸緩衝液,pH7.4で24時間透析して、残留EDC、HOBt及びHMDAを除去した。製造されたHA-HMDAヒドロゲルの架橋度は10~14であった。実施例4-1分子量1,000kDaのヒアルロン酸HA,LifecoreCore社製を3w/wの濃度で蒸留水に完全に溶解した後、HAのカルボキシル基との反応で架橋するためにヘキサメチレンジアミンHMDAを添加した。HMDAは、HAの繰り返し単位の20モルで添加した。0.25NNaOH水溶液を添加し、pHを6.0~6.5に調整した。カルボキシル基の活性化剤である1-エチル-3-3-ジメチルアミノプロピルカルボジイミドEDCと1-ヒドロキシベンゾトリアゾールHOBtを、HAの繰り返し単位の1.0倍の量で蒸留水に溶解し、前記HAとHMDAの混合液に添加した。当該混合液を45°Cで30分間撹拌した後、撹拌せず45°Cで10時間放置し、HA-HMDA架橋体が完全に架橋されるようにした。製造されたHA-HMDAヒドロゲルを一次的に粉砕した後、200μm細孔径の篩にかけ均質なヒドロゲルを得た。80エタノールを加え、沈澱物としてヒドロゲル粉末を取得し、100倍体積量の1.3NaCl溶液を加え、1時間撹拌した。また80エタノールを更に加えて沈澱を得て、得られたヒドロゲル沈澱物を100エタノールに添加して10分間後、40°Cで12時間減圧乾燥して、残留したEDC、HOBt及びHMDAを除去した。LC分析の結果、未反応原料は検出限界である2ppm未満にコントロールされていることを確認した。製造されたHA-HMDAヒドロゲルの架橋度は10~14であった。実施例4-2~4-41-エチル-3-3-ジメチルアミノプロピルカルボジイミドEDCと1-ヒドロキシベンゾトリアゾールHOBtをそれぞれ蒸留水に添加し、30分、40分、60分間撹拌した後、HAとHMDAの混合液に添加したことを除いては、実施例4-1と同様にして、HA-HMDAヒドロゲルを製造した。実施例4-5~4-8混合溶液を撹拌することなく、45°Cで、3、5、7、9時間放置することを除いては、実施例4-1と同様にして、HA-HMDAヒドロゲルを製造した。実施例4-9篩にかける代わりに、ホモジェナイザーT-18basic,IKAを用い、8、000rpmで5分間ヒドロゲルを均質化したことを除いては、実施例4-1と同様にしてHA-HMDAヒドロゲルを製造した。実施例4-10製造されたHA-HMDAヒドロゲルを透析膜7kDaの分子量カット-オフで密封し、PBSpH7.4で24時間透析したことを除いては実施例4-1と同様にして、HA-HMDAヒドロゲルを製造した。実施例5:本発明に係るヒアルロン酸-ヘキサメチレンジアミンHA-HMDA架橋体のヒドロゲルの製造分子量が約1,000kDaのヒアルロン酸を3w/wの濃度で用い、HMDAの添加量をHAの繰り返し単位の20モルとしたことと、0.25NNaOH溶液を添加してpHを5.5~5.9に調整したことを除いては、実施例4と同様にして、HA-HMDAヒドロゲルを製造した。製造されたHA-HMDAヒドロゲルの架橋度は10~12であった。実施例6:本発明に係るヒアルロン酸-ヘキサメチレンジアミンHA-HMDA架橋体のヒドロゲルの製造分子量が約1,000kDaのヒアルロン酸を3w/wの濃度で用い、HMDAをHAの繰り返し単位の10モルの添加量で使用したことを除いては実施例4と同様にして、HA-HMDAヒドロゲルを製造した。製造されたHA-HMDAヒドロゲルの架橋度は5~7であった。実施例7:本発明に係るヒアルロン酸-ヘキサメチレンジアミンHA-HMDA架橋体のヒドロゲルの製造分子量が約1,000kDaのヒアルロン酸を3w/wの濃度で用い、HMDAをHAの繰り返し単位の40モルの添加量で使用したことを除いては実施例4と同様にして、HA-HMDAヒドロゲルを製造した。製造されたHA-HMDAヒドロゲルの架橋度は32~35であった。実施例8:本発明に係るヒアルロン酸-ヘキサメチレンジアミンHA-HMDA架橋ヒドロゲル組成物実施例4-1の方法によって製造及び乾燥されたヒアルロン酸-アルキレンジアミンヒドロゲル粉末20mgを1mLのPBSpH7.4に溶解した後、5時間撹拌して、本発明のヒドロゲルを含有する組成物を得た。実施例9:本発明に係るヒアルロン酸-ヘキサメチレンジアミンHA-HMDA架橋ヒドロゲル組成物実施例4-1の方法によって製造及び乾燥されたヒアルロン酸-アルキレンジアミンヒドロゲル粉末18mgに、分子量1,000kDaのヒアルロン酸HA2mgを加えた。得られた混合物を1mLのPBSpH7.4に溶解した後、5時間撹拌して、本発明に係るヒドロゲルと未修飾ヒアルロン酸を含有する組成物を得た。実施例10:本発明に係るヒアルロン酸-ヘキサメチレンジアミンHA-HMDA架橋ヒドロゲル組成物実施例4-1の方法によって製造及び乾燥されたヒアルロン酸-アルキレンジアミンヒドロゲル粉末16mgに、分子量1,000kDaのヒアルロン酸HA4mgを加えた。得られた混合物を1mLのPBSpH7.4に溶解した後、5時間撹拌して、本発明に係るヒドロゲルと未修飾ヒアルロン酸を含有する組成物を得た。実施例11:本発明に係るヒアルロン酸-ヘキサメチレンジアミンHA-HMDA架橋ヒドロゲル組成物実施例4-1の方法によって製造及び乾燥されたヒアルロン酸-アルキレンジアミンヒドロゲル粉末18mgに、分子量1,000kDaのヒアルロン酸HA2mg及びリドカイン3mgを加えた。得られた混合物を1mLのPBSpH7.4に溶解した後、5時間撹拌して、本発明のヒドロゲル、未修飾ヒアルロン酸及びリドカインを含有する組成物を得た。実施例12:本発明に係るヒアルロン酸-ヘキサメチレンジアミンHA-HMDA架橋ヒドロゲル組成物実施例4-1の方法によって製造及び乾燥されたヒアルロン酸-アルキレンジアミンヒドロゲル粉末16mgに、分子量1、000kDaのヒアルロン酸HA4mg及びリドカイン3mgを加えた。得られた混合物を1mLのPBSpH7.4に混合した後、5時間撹拌して、本発明のヒドロゲル、未修飾ヒアルロン酸及びリドカインを含有する組成物を得た。比較例1:アジピン酸ジヒドラジドADHを架橋剤として用いたヒアルロン酸-アジピン酸ジヒドラジドHA-ADH架橋ヒドロゲルの製造HahnらHahnSKetal.,Int.J.Biol.Macromol.,2007;40;pp.374380の方法に従って、分子量約234kDのヒアルロン酸HA,LifecoreCore社製100mgを水20mLに溶解し、5mg/mLのHA水溶液を調製した。前記HA水溶液に、HAに対するモル比で40倍過量のアジピン酸ジヒドラジドADH粉末1.736gを添加し、10分間かけて完全に溶解した。得られたHA/ADH混合水溶液のpHを、1NHCl水溶液で4.8に調整した後、30分間十分に撹拌した。そこに、HAのカルボキシル基を活性化させるために、よく撹拌しながら、モル比で4倍過量の1-エチル-3-3-ジメチルアミノプロピルカルボジイミドEDC,0.191g粉末を加えた。当該水溶液に1NHCl水溶液を加えて、pHを4.8に保持しながら2時間反応させた。2時間後に、1N水酸化ナトリウム水溶液を加えてpHを7.0に上げて、反応を停止した。得られた生成物の粘性と不純物結合していないADHを低減するために、生成物を予め洗浄した透析膜7kDaの分子量カット-オフに入れ、100mMNaCl水溶液で60時間透析した。その後、25エタノールと蒸留水でそれぞれ透析を繰り返した。透析の後、水溶液を3日間凍結乾燥して、HA-ADH誘導体を得た。上記の方法で得られたHA-ADHを0.01MPBSpH7.4に2時間かけて溶解した。ヒドラジドに特異的な架橋剤であるビス[スルホスクシンイミジル]スベラートBS3をPBSに溶解し、HA-ADH溶液に加えた。この際、BS3の添加量は、HA-ADHのヒドラジドの20モルに相当する量であった。上記の水溶液を完全に混合した後、架橋反応を完全にするために37°Cで1時間反応させて、HA-ADH架橋ヒドロゲルを製造した。比較例2:ジビニルスルホンDVSを架橋剤として用いたヒアルロン酸-ジビニルスルホンHA-DVS架橋ヒドロゲルの製造OhらOhEJetal.,J.Biomed.Mater.ResA.,2008;86;pp.685693の方法に従って、分子量約230kDaのヒアルロン酸HA,LifecoreCore社製68mgを0.2N水酸化ナトリウム水溶液pH131.68mLに溶解した。完全に溶解した後、HAのヒドロキシル基との反応で架橋するために、ジビニルスルホンDVSを加えた。この際、ヒアルロン酸のヒドロキシル基と添加されたDVSのモル比は1:1であった。前記溶液を37°Cで1時間反応させて、HA-DVSヒドロゲルを製造した。製造されたヒドロゲルを予め洗浄した透析膜7kDaの分子量カット-オフで密封し、PBSで24時間透析して、イオンNaとOHを、透析膜を通して拡散放出し、密封されているHA-DVS架橋体を中和した。比較例3:ヒアルロン酸-ヘキサメチレンジアミンHA-HMDA架橋ヒドロゲルの製造分子量が約1,000kDaのヒアルロン酸を3w/wの濃度で用い、HMDAをHAの繰り返し単位の5モルの添加量で添加したことを除いては、実施例4と同様にして、HA-HMDAヒドロゲルを製造した。製造されたHA-HMDAヒドロゲルの架橋度は2~4であり、粘弾性が低過ぎて皮膚充填剤としての使用は困難であった。比較例4:ヒアルロン酸-ヘキサメチレンジアミンHA-HMDA架橋ヒドロゲルの製造分子量が約1,000kDaのヒアルロン酸を3.3w/wの濃度で用い、HMDAをHAの繰り返し単位の50モルの添加量で添加したことを除いては、実施例4と同様にして、HA-HMDAヒドロゲルを製造した。製造されたHA-HMDAヒドロゲルの架橋度は40~45であり、乾燥し過ぎて壊れ易いため、皮膚充填剤としての使用は困難であった。試験例1:ヒアルロン酸架橋ヒドロゲルの分解及び膨潤性に関するinvitro試験本発明に係るヒアルロン酸架橋ヒドロゲルの生体内持続性を予測するために、実施例1と比較例1及び2のヒアルロン酸架橋ヒドロゲルに対して、ヒアルロン酸分解酵素による分解試験を行った。実施例1と比較例1及び2のヒアルロン酸架橋ヒドロゲルを各バイアルに同じ質量で入れた。ヒアルロン酸分解酵素Streptomyceshyalurolyticus由来のヒアルロニダーゼ,Sigma-Aldrich社製50Uを含む0.2MPBSpH6.2を加えた。この混合物を、37°Cで、あらかじめ定めておいたとおり48時間反応させた。その後、上清を完全に除去し、残留するヒアルロン酸架橋体の質量を測定した。架橋体の分解程度は、残留する架橋体と本来の架橋体の質量比率で算出した。時間経過に伴う分解率を表1に示す。表1に示されるように、比較例2のHA-DVS架橋体は約25時間内に完全に分解されるのに対して、本発明に係るヒアルロン酸-アルキレンジアミン架橋ヒドロゲルは40時間後でも部分的に分解されたのみであった。かかる結果より、本発明に係るヒアルロン酸-アルキレンジアミン架橋ヒドロゲルは、市販のヒドロゲルよりも優れた生体内持続性を有していることを確認することができた。また、本発明に係るヒアルロン酸-アルキレンジアミン架橋ヒドロゲルは、同様の分解率を示す比較例1のHA-ADH架橋体に比べて、2倍以上の高い膨張率を示すことを確認することができた。かかる結果より、本発明に係るヒアルロン酸-アルキレンジアミン架橋ヒドロゲルは、高い生体内持続性と膨潤性を示す優れた組織増大用充填剤であることを確認することができた。試験例2:ヒアルロン酸架橋ヒドロゲルの分解に関するinvitro試験本発明に係るヒアルロン酸架橋ヒドロゲルの生体内持続性を予測するために、実施例1~実施例7のヒアルロン酸架橋ヒドロゲルに対して、ヒアルロン酸分解酵素による分解試験を遂行した。IbrahimaらPolymerDegradationandStability2007;92:pp.915919の方法に従って、invitro分解実験を行った。実施例1~7のヒアルロン酸架橋ヒドロゲルを各バイアルに同じ質量入れた。ヒアルロン酸分解酵素Streptomyceshyalurolyticus由来のヒアルロニダーゼ,Sigma-Aldrich社6080Uを含む0.2MPBSpH7.4をバイアルに添加した。この混合物を37°Cで2時間反応させた。酵素反応を止めるために、0.8Mホウ酸カリウムpH9.1を添加した後、100°Cで3分間加熱した。分解産物であるN-アセチルグルコサミンNAGの量を測定するために、エールリッヒ試薬をReissigらJBiol.Chem;1955;217:pp.959996の方法に従って調製した。この試薬を前記バイアルに添加した後、37°Cで20分間反応させた。遠心分離後、上清を採取し、分解された架橋体中のNAGの量を吸光度585nmでUVにより測定した。架橋体の分解程度は、実施例6の分解率を100として、残りの実施例の分解率を下記表2に示す。表2で示されるように、HAの分子量、初期濃度及びpHによって架橋率が影響を受けていることが分かった。HAの初期濃度が高いほど、架橋率の高い架橋体が製造された。添加された架橋剤の量が多くても、pHによって架橋率が同程度であるか、更に低い場合も観察された。また、架橋率が高いほど分解率が低いことが分かった。前記結果に基づき、所望の物性のヒドロゲルを製造できることが分かった。試験例3:ヒアルロン酸架橋ヒドロゲルの濃度による分解率、押出圧力及び弾性係数に関する試験本試験は、本発明のヒアルロン酸架橋ヒドロゲルを含む組成物の最適のヒドロゲル製造濃度を確認するために行った。実施例4-1のヒアルロン酸架橋ヒドロゲルを、それぞれ1、1.5、2、2.4の濃度でPBSpH7.4に溶解した後、5時間撹拌した。これら溶液を注射器に充填し、121°C、1.5atmで20分間滅菌した。後、この滅菌組成物に対して、ヒアルロン酸分解酵素に対する分解率、押出圧力及び弾性係数Gを測定した。表3で示されるように、ヒアルロン酸架橋ヒドロゲルの濃度の増加によって、滅菌後の押出圧力も増加された。ヒドロゲル濃度が2.0及び2.4の場合、弾性係数Gは、機器の10偏差を考慮すればほとんど同じであり、分解率も等しかった。ヒドロゲル濃度が2.4の場合、製造された後、滅菌されたヒドロゲルの押出圧力が2.0の場合より1.3倍程度高かった。従って、ヒドロゲルの適正濃度は2.0として選択されることができ、これに基づき、所望の組成物の組み合わせを製造することができる。試験例4:ヒアルロン酸架橋ヒドロゲルを含む組成物の滅菌後の押出圧力と平均粒径本発明のヒアルロン酸架橋ヒドロゲルを含む組成物の注射器及び注射針に応じた押出圧力を予測するために、本試験を行った。実施例4~9のヒドロゲル18mgと分子量1,000kDaのヒアルロン酸HA2mgをPBSpH7.41mLに溶解した後、5時間撹拌した組成物、及び、実施例8~12の撹拌された組成物を、3mLシリンジに同質量で充填した後、湿式滅菌121°C,1.5atm,20分した。滅菌された各組成物に対して平均粒径と押出圧力を測定した。結果を下記表4に示す。平均粒径及び分布の測定にはマラバーンマスタサイザー2000MalvernInstruments社製,Worcestershire,英国を使用し、分散溶媒として0.9NaCl溶液を用いた。押出圧力は、27ゲージ及び30ゲージ針を取り付け、EZ-SSHIMADZU装置を使用して、1mm/minの一定の速度で6mmまで測定した。表4で示されるように、未修飾HAの組成比率によって押出圧力が影響を受けた。即ち、組成物内における未修飾HAの含量が高くなると、未修飾HAが潤滑剤として作用し、押出圧力が低減された。用いた針のゲージに従って、3mLシリンジの場合、30ゲージと27ゲージの差は約1.6倍であった。一方、リドカインの添加は、押出圧力にほとんど影響を及ぼさなかった。組成物内未修飾HAの含量が高い実施例10及び12の場合、圧力負荷を停止した後にも、組成物が継続的に流れ出る現象が観察された。また、篩にかけずにホモジェナイザー均質器で均質化した実施例4~9の組成物の場合、篩にかけて均質化した場合に比べて押出圧力が高かった。ホモジェナイザーで均質化する場合、粒子分布の広いヒドロゲルが得られた。このような不規則な大きさのヒドロゲル粒子によって押出圧力が高まるものと考えられた。試験例5:ヒアルロン酸架橋ヒドロゲルを含む組成物の滅菌後の弾性係数本発明のヒアルロン酸架橋ヒドロゲルを含む組成物の滅菌後物性変化を観察するために、本試験を行った。実施例4~9のヒドロゲル粉末18mgと分子量1,000kDaのヒアルロン酸HA2mgを1mLのPBSpH7.4に溶解した後、5時間撹拌した組成物、及び、実施例8~12の撹拌された組成物を3mLシリンジに同質量で充填した後、湿式滅菌121°C,1.5atm,20分した。滅菌された各組成物に対して、GhoshらBiomacromolecules,2005;6:pp.28572865の方法に従って、レオロジー特性試験を行った。AR2000応力制御式レオメータT.A.Instruments社製,USAと4-cm,2°-円錐平板ジオメトリーを利用して、1張力と振動モードで0.1~20Hzまで測定した。3Hzで測定された弾性係数G値を下記表5に示す。機器の偏差は±10であり、試験は25°Cで行った。表5で示されるように、未修飾HAの組成比率によって弾性係数が影響を受けた。潤滑剤の役割を果たす未修飾HAの濃度が高くなると、滅菌後においても弾性係数の低い組成物が製造された。リドカインが追加的に添加された場合、HAのみが添加された場合に比べて、滅菌された組成物の弾性係数が25.6程度増加した。一方、ホモジェナイザーで均質化した場合実施例4~9、篩にかけて均質化した場合に比べて弾性係数が多少4.9減少した。図2に実施例8、実施例9、実施例11の滅菌された組成物の0.1~20Hzの弾性係数を示す。試験例6:ヒアルロン酸架橋ヒドロゲルの製造方法に応じた物性の試験弾性係数:G本発明に係るヒアルロン酸架橋ヒドロゲルの製造方法に応じた物性弾性係数:Gを確認するために、実施例4-1~4-4の組成物に対して、滅菌後の弾性係数を測定した。実施例4-1~4-4のヒドロゲルは、それぞれ反応触媒であるEDC/HOBtの撹拌時間が20、30、40、60分と異なっている。製造された各ヒドロゲル粉末をPBSpH7.4に20mg/mLの濃度で加え、5時間撹拌した後、3mLのシリンジに入れて、湿式滅菌121°C,1.5atm,20分した。AR2000応力制御式レオメータT.A.Instruments社製,USAと4-cm,2°-円錐平板ジオメトリーを利用して、1張力と振動モードで0.1~20Hzまで測定した。3Hzで測定された弾性係数G値を表6に示す。機器の偏差は±10であり、試験は25°Cで行った。表6で示されるように、ヒアルロン酸架橋ヒドロゲルの製造はEDC/EDUの溶解から反応へ投入するまでの時間に影響を受けていることが分かった。20~30分内に反応触媒の溶解から投入までを完了して製造されたヒアルロン酸架橋ヒドロゲルは、滅菌後、同様の弾性係数を示した。その反面、溶解から投入まで40分以上かけて製造されたヒアルロン酸架橋ヒドロゲルは、滅菌後の物性が低下した。60分以上かかった場合、滅菌後の弾性係数がほとんど水と同様である低水準のヒドロゲルが製造された。これらの結果から、ヒアルロン酸-アルキレンジアミン架橋ヒドロゲルの製造時、EDC/HOBtの溶解から投入までの時間が非常に重要な要素であることが分かる。試験例7:製造方法に応じた、ヒアルロン酸架橋ヒドロゲルの物性試験弾性係数:G本発明に係るヒアルロン酸架橋ヒドロゲルの製造方法に応じた物性変化弾性係数:Gを確認するために、実施例4-1、4-5~4-8の組成物に対して、滅菌後の弾性係数を測定した。実施例4-1、4-5~4-8のヒドロゲルは、ヒアルロン酸架橋体の完全な架橋反応のために、追加放置時間をそれぞれ3、5、7、9、12時間にした。製造された各ヒドロゲル粉末をPBSpH7.4に20mg/mLの濃度で加え、5時間撹拌した後、3mLのシリンジに入れて、湿式滅菌121°C,1.5Atm,20分した。AR2000応力制御式レオメータT.A.Instruments社製,USAと4-cm,2°-円錐平板ジオメトリーを利用して、1張力と振動モードで0.1~20Hzまで測定した。3Hzで測定された弾性係数G値を表7に示す。機器による偏差は±10であり、実験は25°Cで行った。表7で示されるように、放置時間が増加するほど、組成物の滅菌後における弾性係数が増加しており、9時間以上の場合、ほとんど同様の弾性係数を示していることが分かる。この結果から、前記温度で9時間以上放置した場合、架橋反応が完全かつ十分に進行することによって、滅菌後にも良好な弾性係数を有するヒドロゲルが製造されることを確認することができた。前記結果から、ヒアルロン酸-アルキレンジアミン架橋体の製造時、完全な架橋反応のために一定時間以上放置することが重要であることが分かる。試験例8:ヒアルロン酸架橋ヒドロゲルの精製方法に依存した未反応物の除去本発明に係るヒアルロン酸架橋ヒドロゲルの製造方法に依存した未反応物の除去の差を確認するために、実施例4-1及び4-10で製造されたヒアルロン酸架橋ヒドロゲルに対して、残余未反応物を液体クロマトグラフィーにて分析した。サンプルをヒアルロン酸分解酵素Haseで処理して分解した。HMDAの未反応物は、C18-カラム、移動相としてACN/0.1TFA、およびUV検出器を使用して定量した。EDC及びHOBtの未反応物は、GPCカラム、移動相として20mMリン酸ナトリウムpH7.6、およびUV検出器を使用して分析した。HMDAとEDCの場合、透析膜を利用して未反応物を除去して得た実施例4-10のヒドロゲルや、エタノール及びバッファーを利用して除去した実施例4-1のヒドロゲルで、未反応物は検出限界2ppm未満にコントロールされていることが確認された。しかし、HOBtの場合は、実施例4-1のヒドロゲルでは検出限界である2ppm未満であったが、透析膜を利用して未反応物を除去して得た実施例4-10の場合、約10倍も多いHOBtが検出された。これは、HOBtが有機溶媒により容易に溶解する傾向があり、透析によってはうまく精製されないためと考えられる。試験例9:本発明に係るヒアルロン酸架橋ヒドロゲル組成物のinvitro分解程度と物性Gによる持続効果に関する試験本発明のヒアルロン酸架橋ヒドロゲルを含む滅菌組成物のヒアルロン酸分解酵素に対する感受性を、G値に関連して、市販の組織増大用充填剤であるRestylane登録商標リドカインと比較して評価した。G値に関連した経時的な分解程度を観察するために、本発明に係る実施例11の滅菌された組成物とRestylane登録商標リドカインを1.5mL試験管に800μLずつ分注した。ヒアルロン酸分解酵素Hase,BovineTestes,Sigma-Aldrich社製を2mg/mLの濃度2000UでPBSpH7.4に溶解した後、15μLずつの当該酵素溶液を各試験管に分注した。37°Cで各所定時間反応させた後、3Hzで弾性係数Gを測定した。弾性係数Gの変化を図3に示す。Restylane登録商標リドカインは、3Hzで620Paの初期弾性係数を示し、実施例11の滅菌された組成物は3Hzで410Paの初期弾性係数を示した。弾性係数の変化は、25時間かけて確認した。図3で示されるように、Restylane登録商標リドカインの場合は、初期弾性係数Gは高いが、3時間までに極めて急激にヒアルロン酸分解酵素により分解され、非常に低い弾性係数を示した。それに対して実施例11の滅菌組成物は、25時間までも分解に対する安定性を示した。また、架橋されたヒアルロン酸HAの分解は、初期弾性係数Gと無関係であることが確認された。試験例10:本発明に係るヒアルロン酸架橋ヒドロゲルの組織増大シワ改善効果と生体適合性に関する試験本発明に係るヒアルロン酸架橋ヒドロゲルの組織増大効果と生体適合性を、市販の組織増大シワ改善用充填剤であるRestylane登録商標と比較して評価した。組織増大シワ改善効果FujimuraらFujimuraTetal.,J.Dermatol.Sci.,2000;24;pp.105111の方法に従って、誘発されたシワの表面積を測定するために、6週齢の雌性無毛マウスtypeSKH,Jung-AngLabAnimal社製,韓国の背部に矩形1.5×1.5cm2の刺青をし、0.2μgのカルシトリオールエタノール中を1日に1回ずつ週6回、4週間にわたり塗布し、人為的にシワを誘発した。シワ誘発剤の塗布を中止してから3日後、本発明のヒアルロン酸架橋ヒドロゲルと対照である市販品Restylane登録商標を、前記シワが誘発された矩形刺青内に皮下投与した。本発明のヒアルロン酸架橋ヒドロゲルとしては、実施例2、3、4及び5のヒアルロン酸架橋ヒドロゲルを、ホモジェナイザーT-18basic,IKA,東京,日本により8,000rpmで5分間均質化した後、各ヒドロゲル0.4mLを、シワ誘発マウスの背部皮下層の刺青された矩形内に30ゲージ注射針を用いて注入した。陽性対照として、Restylane登録商標製造元:Q-MedAB;20mg/mL0.4mLを30-ゲージ注射針を用いて注入した。シワ改善の程度を分析するために、同じ距離と照明で写真撮影をした後、イメージ分析器Artimage2softwareを使用してシワが改善された面積の平均値を算出した。対照群及び試験群として、それぞれ3匹ずつを用いた。それぞれのシワ改善面積を計算して平均した。シワ改善程度を評価するために、11週間にわたり1週に1回イメージ分析器を使用して、マウスの刺青された矩形の表面積を分析した。経時的なシワ改善面積を表8に示す。表8に示されるように、陽性対照群としてシワ誘発後にRestylane登録商標で処理した群と、実施例2と3のHA-HMDA架橋ヒドロゲルで処理した群は、シワ誘発後、何も処置しない陰性対照群に比べて優れたシワ改善効果を示した。4週までは、Restylane登録商標と実施例2及び3のHA-HMDAヒドロゲルで処置した全ての群では、同等のシワ改善効果が見られた。しかし、4週以降には、本発明のHA-HMDA架橋ヒドロゲルを投与した群で、Restylane登録商標を投与した陽性対照群に比べて、経時的により高いシワ改善効果が見られた。また、本発明の実施例4及び実施例5のHA-HMDA架橋ヒドロゲルも、実施例2及び実施例3のヒドロゲルと同等程度のシワ改善効果を示した。図4は、サンプルの投与から11週後に、陰性対照群であるシワ誘発群無毛マウス、陽性対照群であるRestylane登録商標処置無毛マウス、及び実施例4と5のHA-HMDAヒドロゲルで処置した無毛マウスの表皮の状態を示した写真である。表8と図4で示されているように、本発明のHA-HMDAヒドロゲルを含む組成物は、Restylane登録商標より優れたシワ改善効果を示した。生体適合性組織学的検査は、ヒアルロン酸架橋ヒドロゲル投与から12週後に、ヘマトキシリン-エオシンHE染色を用いて行った。各マウスから皮膚サンプルを取り、10v/v緩衝ホルムアルデヒドで固定し、エタノールで脱水した後、パラフィンに埋設してサンプルを作製し、これらを4μmに薄く切断し、HEで染色した。染色されたサンプルを光学顕微鏡を使用して撮影した結果を図5に示す。図5で示されるように、実施例のヒドロゲルを投与したマウスは、シワを誘発しない対照群マウスと同様に何の炎症反応を示さなかったHEの場合、ヘマトキシリンは炎症反応時青色に染色され、エオシンはヘマトキシリンとは対照的に赤く染色される。一方、シワ誘発陰性対照群5Bを正常群5Aと比較すると、シワ誘発に伴う皮膚損傷により表皮Eが扁平になり、真皮Dが太くなり、荒くなったことを確認することができる。それに対して、実施例2及び3のHA-HMDA架橋ヒドロゲルで処置した場合図5D及び図5E、表皮、真皮、そして皮下で明確な改善効果が観察されており、表皮は正常群マウスの表皮と同様に変化した。真皮の場合、シワ誘発陰性対照群及びRestylane登録商標処置陽性対照群は、一部炎症反応を示したが、本発明ヒドロゲル処置群は、正常群マウスと同様に溶血も炎症反応も観察されず、真皮組織が再生されていた。再生された真皮の厚さは、Restylane登録商標を投与した陽性対照群及びシワ非誘発対照群と同等であった。以上のような真皮厚さの増大は、組織増大に效果的に寄与する。皮下組織においても、シワ誘発陰性対照群、およびRestylane登録商標処置陽性対照群では、その皮下組織の内腔が目立つように膨張されたのに対して、実施例3のHA-HMDA架橋ヒドロゲルを注入し、再生された皮下組織の内腔は、シワを誘発しない対照群の皮下組織の内腔とほとんど同じ形態に再生された。試験例10-1本発明に係るヒアルロン酸架橋ヒドロゲル組成物の組織増大効果と生体適合性を、市販の組織増大シワ改善用充填剤であるRestylane登録商標リドカインと比較して評価した。組織増大シワ改善効果FujimuraらFujimuraTetal.,J.Dermatol.Sci.,2000;24;pp.105111の方法に従って、6週齢の雌性無毛マウスtypeSKH,Jung-AngLabAnimal社製,韓国の背部に、シワが誘発された表面積を測定するために、矩形1.5×1.5cm2の刺青をし、0.2μgのカルシトリオールエタノール中を1日に1回ずつ週6回、4週間にわたり塗布し、人為的にシワを誘発させた。シワ誘発剤の塗布を中止してから3日後に、3mLシリンジと27ゲージ針を使って、実施例11のヒアルロン酸架橋ヒドロゲル0.4mLをシワが誘発されたマウスの背部皮下層の刺青された矩形内に注入した。陽性対照群として、Restylane登録商標リドカイン製造元:Q-MedAB;20mg/ml0.4mLを、27-ゲージ注射針を使って注入した。正常群、陰性/陽性対照群及び試験群として、マウスをそれぞれ7匹ずつ用いた。13週間観察後、シリコン系再生樹脂Silflo,FlexicoDevelopment社製,英国を用いて、シワが形成された背部皮膚部分のレプリカを作製し、イメージ分析器VisiolineSV650,CKElectronics社製,ドイツを使用して、シワの改善面積を測定及び計算し、平均を算出した。マウス背部の刺青された矩形部分のレプリカのイメージを図6に示す。図6で示されるように、実施例11のHA-HMDA架橋ヒドロゲルを含む滅菌組成物で処置されたマウスは、シワ誘発後、無処置マウスBに比べて、優れたシワ改善効果を示した。このような優れた組織増大シワ改善効果は、本発明に係るHA-HMDA架橋ヒドロゲルを含む滅菌組成物の優れた膨潤性と、優れた真皮及び皮下再生効果に起因するものと考えられる。また、Visioline登録商標を利用して上記のレプリカを分析することにより得られたシワ面積の結果を図7に示す。図6及び図7で示されるように、本発明に係るHA-HMDAヒドロゲルを含む滅菌組成物で処置された無毛マウスは、ほとんど正常群と同じ程度まで、背部表皮のシワが顕著に改善され、Restylane登録商標リドカインに比べ、非常に優れたシワ改善効果を示していることが分かる。生体適合性組織学的試験は、ヒアルロン酸架橋ヒドロゲルの投与から14週後に、ヘマトキシリン-エオシンHE染色を利用して行った。各マウスから皮膚サンプルを取得し、10v/v緩衝ホルムアルデヒドで固定し、エタノールで脱水し、パラフィンに埋設して試料を作製し、これらを4μmに薄く切断し、HEで染色した。染色された試料を、光学顕微鏡を使用して撮影した結果を図8に示す。実施例11の滅菌されたヒドロゲル組成物を投与されたマウスは、シワを誘発されてない対照群マウスと同様に、何の炎症反応も示さなかったHEの場合、ヘマトキシリンは炎症反応時青色に染色され、エオシンはヘマトキシリンとは対照的に赤く染色される。一方、シワ誘発陰性対照群Bを正常群Aと比較すると、シワの誘発に伴う皮膚損傷により表皮Eが扁平になり、また、真皮Dが厚くなり、荒くなっていることが分かる。それに対して、本発明に係るHA-HMDA架橋ヒドロゲルを含む滅菌組成物で処置した場合D、表皮、真皮、そして皮下で明確な改善効果が観察されており、表皮は正常群の表皮と同様の程度まで変化した。真皮の場合、シワ誘発陰性対照群及びRestylane登録商標リドカイン投与陽性対照群では、一部で炎症反応が見られたが、本発明のヒドロゲルで処置した群では、正常群と同様にシワも溶血または炎症反応も観察されなかった。再生された真皮の厚さは、Restylane登録商標リドカインを投与した陽性対照群及び正常群と同等であった。以上のような真皮厚さの増大は、組織増大に效果的に寄与する。皮下組織については、シワ誘発陰性対照群とRestylane登録商標リドカインで処置された陽性対照群では、その皮下組織の内腔が目立つように膨張したのに対して、実施例11の滅菌組成物の注入により再生された皮下組織の内腔は、正常群の皮下組織内腔とほとんど同じ形態にまで再生された。以上の結果から、本発明に係るアルキレンジアミンで架橋されたヒアルロン酸のヒドロゲル及び滅菌されたヒドロゲルは、非常に優れた生体適合性を有しており、また、適切な膨潤性と真皮及び皮下組織の再生により優れた組織増大効果シワ改善効果を示し、さらに、市販の組織増大用充填剤に比べて、生体内においてより長く持続するので、組織増大用充填剤として效果的に使用できることが分かる。"