"バチルス属微生物由来のヘム還元酵素を含む還元剤。前記ヘムがメトミオグロビンのヘムであることを特徴とする、請求項1に記載の還元剤。前記ヘムがメトヘモグロビンのヘムであることを特徴とする、請求項1に記載の還元剤。バチルス属微生物の菌体破砕物からなることを特徴とする、請求項1~3のいずれか一項に記載の還元剤。前記バチルス属微生物がバチルスズブチリス、バチルスアミロリケファシエンス、納豆菌、バチルススリンギエンシス及びバチルスミコイデスからなる群より選択される微生物である、請求項1~4のいずれか一項に記載の還元剤。前記ヘム還元酵素がデヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ又はニトロレダクターゼである、請求項1に記載の還元剤。前記ヘム還元酵素として、デヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ及びニトロレダクターゼを含む、請求項1に記載の還元剤。前記デヒドロリポイルデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列が配列番号3のアミノ酸配列を含み、前記ニトロレダクターゼのアミノ酸配列が配列番号12のアミノ酸配列を含む、請求項6又は7に記載の還元剤。前記デヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ及び前記ニトロレダクターゼがリコンビナントタンパク質である、請求項6~8のいずれか一項に記載の還元剤。請求項1~9のいずれか一項に記載の還元剤からなる色調改善剤。請求項1~9のいずれか一項に記載の還元剤と、ミオグロビンのヘム基中の鉄を亜鉛に置換する作用を示す物質を組み合わせてなる色調改善剤。前記物質がフェロケラターゼである、請求項11に記載の色調改善剤。食肉又は食肉加工品の色調の改善用である、請求項10~12のいずれか一項に記載の色調改善剤。デヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ及び/又はニトロレダクターゼを含む、食肉又は食肉加工品用の色調改善剤。発色作用、発色促進作用及び/又は退色防止作用により色調を改善する、請求項10~14のいずれか一項に記載の色調改善剤。請求項1~9のいずれか一項に記載の還元剤を含むことを特徴とする医薬。経口投与製剤である、請求項16に記載の医薬。非経口投与製剤である、請求項16に記載の医薬。以下のステップ1及び2を含む還元剤の製造法:1ヘム還元酵素を産生するバチルス属微生物を、該酵素が産生される条件下で培養するステップ;2培養産物から前記酵素を回収するステップ。前記ステップ2が以下のステップからなる、請求項19に記載の製造法:2-1培養産物から菌体を収集するステップ;2-2菌体破砕物を調製するステップ。前記ヘムがメトミオグロビンのヘムであることを特徴とする、請求項19又は20に記載の製造法。前記ヘムがメトヘモグロビンのヘムであることを特徴とする、請求項19又は20に記載の製造法。前記バチルス属微生物がバチルスズブチリス、バチルスアミロリケファシエンス、納豆菌、バチルススリンギエンシス及びバチルスミコイデスからなる群より選択される微生物である、請求項19~22のいずれか一項に記載の製造法。請求項10~15のいずれか一項に記載の色調改善剤を食肉又は食肉加工品に作用させることを特徴とする色調改善方法。バチルスズブチリス、バチルスアミロリケファシエンス、納豆菌、バチルススリンギエンシス及びバチルスミコイデスからなる群より選択されるバチルス属微生物の菌体破砕物を食肉又は食肉加工品に作用させることを特徴とする色調改善方法。請求項1~9のいずれか一項に記載の還元剤を用いた、血行障害、低酸素症若しくは血中酸素減少状態、これらの一つ以上の病態ないし症状を伴う疾患、又はこれらの一つ以上の病態ないし症状に起因する疾病の予防または治療方法。本発明は食肉又は食肉加工品の色調改善に効果的な還元剤及びその用途亜硝酸塩などの発色剤を用いない色調改善方法などを提供することを課題とする。本発明者らは食肉の色調を改善する物質を見出すべく、バチルス属の微生物を中心にスクリーニングを実施した。スクリーニングの結果、食肉発色効果の高い物質を産生する微生物株が特定された。更に検討を進めた結果、有用性が高いと期待される当該物質はメトミオグロビンに対して還元活性を示すことが明らかとなった。即ち、バチルス属の微生物がメトミオグロビン還元活性により食肉の発色を促す物質を産生することを見出した。当該物質はヘムに対して還元作用を示すものであり、食肉の発色に限らず、ヘム又はヘム蛋白質の還元が有効ないし必要な他の用途においても利用され得る。例えば、メトミオグロビンと類似した構造を有するメトヘモグロビン等を還元する目的で当該物質を利用することが可能である。更なる検討の結果、バチルス属微生物由来の上記物質還元作用を示す物質がデヒドロリポイルデヒドロゲナーゼとニトロレダクターゼであることが判明した。本発明は上記成果に基づいて完成されたものであり、以下の通りである。[1]バチルス属微生物由来のヘム還元酵素を含む還元剤。[2]前記ヘムがメトミオグロビンのヘムであることを特徴とする、[1]に記載の還元剤。[3]前記ヘムがメトヘモグロビンのヘムであることを特徴とする、[1]に記載の還元剤。[4]バチルス属微生物の菌体破砕物からなることを特徴とする、[1]~[3]のいずれか一項に記載の還元剤。[5]前記バチルス属微生物がバチルスズブチリス、バチルスアミロリケファシエンス、納豆菌、バチルススリンギエンシス及びバチルスミコイデスからなる群より選択される微生物である、[1]~[4]のいずれか一項に記載の還元剤。[6]前記ヘム還元酵素がデヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ又はニトロレダクターゼである、[1]に記載の還元剤。[7]前記ヘム還元酵素として、デヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ及びニトロレダクターゼを含む、[1]に記載の還元剤。[8]前記デヒドロリポイルデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列が配列番号3のアミノ酸配列を含み、前記ニトロレダクターゼのアミノ酸配列が配列番号12のアミノ酸配列を含む、[6]又は[7]に記載の還元剤。[9]前記デヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ及び前記ニトロレダクターゼがリコンビナントタンパク質である、[6]~[8]のいずれか一項に記載の還元剤。[10][1]~[9]のいずれか一項に記載の還元剤からなる色調改善剤。[11][1]~[9]のいずれか一項に記載の還元剤と、ミオグロビンのヘム基中の鉄を亜鉛に置換する作用を示す物質を組み合わせてなる色調改善剤。[12]前記物質がフェロケラターゼである、[11]に記載の色調改善剤。[13]食肉又は食肉加工品の色調の改善用である、[10]~[12]のいずれか一項に記載の色調改善剤。[14]デヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ及び/又はニトロレダクターゼを含む、食肉又は食肉加工品用の色調改善剤。[15]発色作用、発色促進作用及び/又は退色防止作用により色調を改善する、[10]~[14]のいずれか一項に記載の色調改善剤。[16][1]~[9]のいずれか一項に記載の還元剤を含むことを特徴とする医薬。[17]経口投与製剤である、[16]に記載の医薬。[18]非経口投与製剤である、[16]に記載の医薬。[19]以下のステップ1及び2を含む還元剤の製造法:1ヘム還元酵素を産生するバチルス属微生物を、該酵素が産生される条件下で培養するステップ;2培養産物から前記酵素を回収するステップ。[20]前記ステップ2が以下のステップからなる、[19]に記載の製造法:2-1培養産物から菌体を収集するステップ;2-2菌体破砕物を調製するステップ。[21]前記ヘムがメトミオグロビンのヘムであることを特徴とする、[19]又は[20]に記載の製造法。[22]前記ヘムがメトヘモグロビンのヘムであることを特徴とする、[19]又は[20]に記載の製造法。[23]前記バチルス属微生物がバチルスズブチリス、バチルスアミロリケファシエンス、納豆菌、バチルススリンギエンシス及びバチルスミコイデスからなる群より選択される微生物である、[19]~[22]に記載の製造法。[24][10]~[15]のいずれか一項に記載の色調改善剤を食肉又は食肉加工品に作用させることを特徴とする色調改善方法。[25]バチルスズブチリス、バチルスアミロリケファシエンス、納豆菌、バチルススリンギエンシス及びバチルスミコイデスからなる群より選択されるバチルス属微生物の菌体破砕物を食肉又は食肉加工品に作用させることを特徴とする色調改善方法。[26][1]~[9]のいずれか一項に記載の還元剤を用いた、血行障害、低酸素症若しくは血中酸素減少状態、これらの一つ以上の病態ないし症状を伴う疾患、又はこれらの一つ以上の病態ないし症状に起因する疾病の予防または治療方法。用語本明細書においてヘムとは、鉄原子とポルフィリンから構成される錯体鉄ポルフィリン錯体をいう。ヘム蛋白質とはヘムを含む蛋白質の総称である。また、ヘム還元酵素とは、ヘム中の鉄原子に対して還元活性を示す蛋白質のことをいう。当該活性の強さ程度は特に限定されない。典型的には、ヘム還元酵素は、ヘム蛋白質のメト化合物を還元する活性を示す。この活性に注目した場合、ヘム還元酵素をヘム蛋白質還元酵素と呼ぶこともできる。本明細書においてメトミオグロビン還元酵素とは、ミオグロビン誘導体であるメトミオグロビンを還元する活性を示すタンパク質のことをいう。当該活性の強さ程度は特に限定されない。従って、他の酵素活性の方が優位であっても、メトミオグロビンに対する還元活性を示す限り、本明細書におけるメトミオグロビン還元酵素に該当する。本明細書において色調改善剤とは、金属ポルフィリン錯体がその形成に関与する色調の改善に用いられる物質又は組成物をいう。金属ポルフィリン錯体としては銅ポルフィリン錯体、コバルトポリフィリン錯体、鉄ポリフィリン錯体等が存在するが、当該ポルフィリン錯体中の金属が還元されうる状態のものであれば特に制限されない。好ましい金属ポルフィリン錯体としては鉄ポリフィリン錯体が挙げられ、当該鉄ポリフィリン錯体を含む組成物としてはヘム蛋白質が挙げられる。ヘム蛋白質を多く含む組成物として食肉又は食肉加工品を挙げることができる。本発明の色調改善剤は発色作用、発色促進作用及び/又は退色防止作用により、対象の色調を改善する。例えば、本発明の色調改善剤は、金属ポルフィリン錯体中の金属を還元することで色調を改善し得る。或いは、金属ポルフィリン錯体からなる色素の酸化を防止することで当該色素の色調を維持し、もって色調を改善し得る。本発明の色調改善剤が適用される好ましい対象は食肉又は食肉加工品である。即ち、好ましい一態様では、本発明の色調改善剤は食肉又は食肉加工品の発色、色調維持、又は退色防止に利用される。尚、食肉の発色とは食肉又は食肉加工品に特有の赤い色調が発現することをいう。1.バチルスBacillus属由来の還元剤本発明の第1の局面は還元剤に関する。本発明の還元剤はバチルス属が産生するヘム還元酵素を有効成分とする。後述の実施例に示す通り、本発明者らによる大規模なスクリーニングの結果、バチルス属微生物である、バチルスズブチリスBacillussubtilis、バチルスアミロリケファシエンスBacillusamiloliquefaciens、納豆菌Bacillusnatto、バチルススリンギエンシスBacillusthuringiensis及びバチルスミコイデスBacillusmycoidesが、メトミオグロビン還元活性に優れたポリペプチドを産生することが明らかとなった。この知見に基づき本発明の好ましい一態様では、これらの微生物のいずれかが産生するメトミオグロビン還元酵素が用いられる。尚、これらの微生物は例えば公共の保存機関NBRC独立行政法人製品評価技術基盤機構生物遺伝資源部門、JCM理化学研究所バイオリソースセンター、ATCCAmericanTypeCultureCollection等から入手することができる。納豆菌については市販されており、容易に入手可能である。また宮城野納豆菌製造所から入手することも可能である。本発明の還元剤は、有効成分ポリペプチドの他、賦形剤、緩衝剤、懸濁剤、安定剤、pH調整剤、保存剤、防腐剤、香料、増粘剤、油脂、光沢剤、結着剤、結着補強剤、乳化安定剤、生理食塩水などを含有していてもよい。賦形剤としてはデンプン、デキストリン、マルトース、トレハロース、乳糖、Dグルコース、ソルビトール、Dマンニトール、白糖、グリセロール等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、アスコルビン酸等を用いることができる。pH調製剤としてはイタコン酸、コハク酸、酒石酸、フマル酸、クエン酸、リンゴ酸、アジピン酸、グルコン酸、ピロリン酸、酢酸、乳酸、α-ケトグルタル酸、フィチン酸等の有機酸又は有機酸塩;炭酸等の無機酸又は無機酸塩;アスパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ酸;アルギニン、リジン、ヒスチジン等の塩基性アミノ酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としてはエタノール、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等を用いることができる。香料としてはジャコウ、シベット、カストリウム、アンバーグリス等の動物性香料;アニス精油、アンゲリカ精油、イランイラン精油、イリス精油、ウイキョウ精油、オレンジ精油、カナンガ精油、カラウェー精油、カルダモン精油、グアヤクウッド精油、クミン精油、黒文字精油、ケイ皮精油、シナモン精油、ゲラニウム精油、コパイババルサム精油、コリアンデル精油、シソ精油、シダーウッド精油、シトロネラ精油、ジャスミン精油、ジンジャーグラス精油、杉精油、スペアミント精油、西洋ハッカ精油、大茴香精油、チュベローズ精油、丁字精油、橙花精油、冬緑精油、トルーバルサム精油、バチュリー精油、バラ精油、パルマローザ精油、桧精油、ヒバ精油、白檀精油、プチグレン精油、ベイ精油、ベチバ精油、ベルガモット精油、ペルーバルサム精油、ボアドローズ精油、芳樟精油、マンダリン精油、ユーカリ精油、ライム精油、ラベンダー精油、リナロエ精油、レモングラス精油、レモン精油、ローズマリー精油、和種ハッカ精油等の植物性香料;その他合成香料等を用いることができる。増粘剤としては、天然高分子またはデンプン系もしくはセルロース系天然高分子誘導体等を用いることができる。天然高分子としては、例えば、フコイダン、カラギーナン等の海藻抽出物、グァーガム等の種子粘出物、アラビアガム等の樹脂様粘着物、またはキサンタンガム等の微生物産生粘着物質等を挙げることができる。デンプン系もしくはセルロース系天然高分子誘導体としては、例えば、リン酸デンプン等のデンプン系またはメチルセルロースなどのセルロース系の天然高分子誘導体が挙げられる。油脂としては、例えば、アボガド油、アマニ油、アーモンド油、ウイキョウ油、エゴマ油、オリーブ油、オレンジ油、オレンジラファー油、カカオ脂、カミツレ油、カロット油、キューカンバー油、ココナッツ油、ゴマ油、コメ油、サフラワー油、シア脂、液状シア脂、大豆油、ツバキ油、トウモロコシ油、ナタネ油、パーシック油、ヒマシ油、ヒマワリ油、葡萄種子油、綿実油、落花生油、タートル油、ミンク油、卵黄油、パーム油、パーム核油、モクロウ、ヤシ油、牛脂、豚脂等を用いることができる。また、これらの油脂に水素添加、分別、エステル交換等の処理をして改質された油脂も利用できる。光沢剤として、ミツロウ、カルナバロウ、鯨ロウ、ラノリン、液状ラノリン、還元ラノリン、硬質ラノリン、カンデリラロウ、モンタンロウ、セラックロウ、ライスワックス、スクワレン、スクワラン、プリスタン等のロウ類植物性、動物性を問わない。;流動パラフィン、ワセリン、パラフィン、オゾケライド、セレシン、マイクロクリスタンワックス等の鉱物油を用いることができる。結着剤としては大豆蛋白質、卵蛋白質、乳蛋白質、血液蛋白質、カゼイン、デンプン、トランスグルタミナーゼ等を用いることができる。結着補強剤としては重合リン酸塩等を用いることができる。乳化安定剤としてはカゼインナトリウム等を用いることができる。その他添加物として、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、12ヒドロキシステアリン酸、ウンデシレン酸、トール油、ラノリン脂肪酸等の天然脂肪酸;イソノナン酸、カプロン酸、2エチルブタン酸、イソペンタン酸、2メチルペンタン酸、2エチルヘキサン酸、イソペンタン酸等の合成脂肪酸等の脂肪酸を含有しても良い。一態様において本発明の還元剤は、本発明に係るポリペプチドを産生する微生物の菌体破砕物で構成される。即ち、この態様の還元剤は所定の微生物の菌体破砕物を含むことになる。菌体破砕液通常は微生物の培養、集菌及び菌体破砕からなる一連の工程によって得られるをそのまま菌体破砕物として用いることができる。一方、菌体破砕液を更なる処理精製処理、凍結処理、乾燥処理、他の成分の添加などに供した後に菌体破砕物として用いることもできる。本発明者らの検討によって、バチルス属微生物由来の有効成分還元作用を示し、特に食肉の色調改善に有効な物質がデヒドロリポイルデヒドロゲナーゼDLDとニトロレダクターゼyodCであることが判明した後述の実施例を参照。そこで本発明の一態様として、ヘム還元酵素としてバチルス属微生物由来のデヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ又はニトロレダクターゼを含む還元剤が提供される。好ましい一態様では、デヒドロリポイルデヒドロゲナーゼとニトロレダクターゼの両方が含まれる。尚、デヒドロリポイルデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列を配列番号3に示す。同様にニトロレダクターゼのアミノ酸配列を配列番号12に示す。上記の通り、有効なヘム還元酵素が特定され、且つそのアミノ酸配列が同定されたことから、遺伝子工学的に調製した酵素を利用することが可能となった。そこで、本発明の一態様では遺伝子工学的に調製した酵素、即ちリコンビナントタンパク質からなるヘム還元酵素が用いられる。具体的には、リコンビナントデヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ及び/又はリコンビナントニトロレダクターゼを有効成分とした還元剤が提供される。尚、リコンビナントタンパク質とは、遺伝子組み換え技術によって人工的に作製されたタンパク質のことをいう。2.還元剤の用途本発明の第2の局面は本発明の還元剤の用途に関する。本発明が提供する用途は色調の改善及びその他の用途に大別される。特に前者の用途、即ち色調改善剤としての利用が重要である。その色調の形成に金属ポルフィリン錯体が関与しているものが、本発明による色調改善の対象となる。好ましい対象として食肉及び食肉加工品が挙げられる。食肉の色調は肉中に存在するミオグロビン誘導体の割合を反映する。上記の通り、本発明の還元剤はヘム還元酵素好ましくはメトミオグロビン還元酵素を有効成分とする。従って、本発明の還元剤を食肉に作用させると、食肉中のメトミオグロビンが還元され、還元型ミオグロビンが生成する。還元型ミオグロビンは酸素化によって鮮赤色の色調を示すオキシミオグロビンに変換される。本発明の還元剤を作用させると、食肉又は食肉加工品中のメトミオグロビン量が低減し、併せてオキシミオグロビンが生成する結果、色調が改善する。また、還元型ミオグロビンまたはオキシミオグロビンの酸化が防止され、その結果として食肉の退色を防止できるという効果も期待できる。このように、本発明の還元剤によれば、発色のみならず色調維持、つまり退色防止の効果も発揮され得る。退色防止効果が奏される際の作用対象は金属ポルフィリン錯体であり、当該錯体中の金属が酸化されうるものであれば特に制限されない。好ましい金属ポルフィリン錯体は鉄ポルフィリン錯体である。従って、退色防止効果を期待する場合の好ましい対象は、鉄ポルフィリン錯体を含有するヘム蛋白質である。最も好ましい対象は、還元型ミオグロビンまたはオキシミオグロビン、並びにこれらミオグロビン2種還元型ミオグロビン、オキシミオグロビンの何れか/もしくは双方を含む食肉又は食肉加工品である。本発明の還元剤を食肉又は食肉加工品の色調改善に利用する場合即ち、本発明の還元剤を色調改善剤として用いた色調改善方法には、本発明の還元剤で食肉又は食肉加工品を処理することになる。処理条件は原則、還元剤を構成するメトミオグロビン還元酵素が良好に作用する条件好ましくは至適条件とすればよい。好ましい処理条件は、処理対象の食肉又は食肉加工品を用いた予備実験によって容易に特定ないし設定可能である。以下、処理方法の具体例菌体破砕液を食肉の色調改善に利用する場合を示す。まず、所定の微生物メトミオグロビン還元酵素を産生するバチルス属微生物の菌体破砕液を用意し、pHを55付近に調整する。これは肉中のpHを再現するためである。続いて、4°Cにおいて食肉と接触させる。接触方法としては一般的に、ブロック肉では懸濁液を注射してタンブリングする、ミンチ肉では懸濁液を混合する等の方法がある。適した接触方法を行うことによって、懸濁液が食肉全体に浸透する。処理温度については、発色は40°C付近でも可能だが、食肉の品質を考慮すると4°C又は4°C付近で行うのが好ましい。処理対象の食肉の種類は制限されない。上記の通り、食肉の色調は肉中に存在するミオグロビン誘導体の割合を反映する。本発明の還元剤は食肉中のミオグロビン誘導体の割合に影響を与え、発色を促進する。従って、ミオグロビンを含む食肉又は食肉加工品全般に本発明を適用可能である。具体的には、豚肉、牛肉、鶏肉等の畜肉又はこれらの加工品、或いはマグロ、カツオ、シャケ等の魚肉又はこれらの加工品を処理対象にすることができる。但し、赤色を呈している食肉が好ましい処理対象といえる。処理対象の一つである食肉加工食品は、食肉を原料として製造される食品であれば特に限定されない。食肉加工品として例えば生ハム、ソーセージ、ロースハムが挙げられる。処理対象である食肉または食肉加工食品の形状についても特に制限はない。ブロック肉、ミンチ肉等、用途に合わせて適宜選択することができる。本発明の一態様では、本発明の還元剤と、ミオグロビンのヘム基中の鉄を亜鉛に置換する作用を示す物質以下、鉄亜鉛置換物質と呼ぶを併用する。このように本発明の還元剤と作用の異なる物質を併用すれば、複合的な効果により色調が一層改善される。特に、良好な色調の維持退色防止にもつながる。鉄亜鉛置換物質として例えばフェロケラターゼを用いることができる詳しくは特開2006-61016号公報を参照。フェロケラターゼは動物組織特に内蔵、植物組織キノコ類、モヤシ、エンドウ豆等、酵母パン酵母、ビール酵母、清酒酵母、ワイン酵母、焼酎酵母等、細菌等に存在している。これらの天然物から抽出したフェロケラターゼを用いることができる。また、ミトコンドリア画分にはフェロケラターゼが多く含まれていることから、特にミトコンドリア画分を用いるとよい。鉄亜鉛置換物質としてサッカロミセス属酵母ビール酵母、パン酵母、清酒酵母、焼酎酵母などを用いることもできる詳しくは特開2005-87058号公報を参照。この態様の特徴は、本発明の還元剤と鉄亜鉛置換物質を組み合わせて用いることである。典型的には、本発明の還元剤と鉄亜鉛置換物質とを混合した配合剤として本発明の色調改善剤が提供されることになる。一方、例えば、本発明の還元剤第1構成要素と、鉄亜鉛置換物質を含む剤第2構成要素とからなるキットの形態で本発明の色調改善剤を提供することもできる。この場合、処理対象食肉又は食肉加工品を第1構成要素及び第2構成要素で同時又は別々に処理することになる。ここでの同時は厳密な同時性を要求するものではない。従って、両要素を混合した後に使用する等、両要素の使用が時間差のない条件下で実施される場合は勿論のこと、片方の使用後、速やかに他方を使用する等、両要素の使用が実質的な時間差のない条件下で実施される場合もここでの同時の概念に含まれる。本発明の還元剤を色調改善剤に利用する場合、有効成分ポリペプチドと上記添加物賦形剤、緩衝剤、懸濁剤、安定剤、pH調整剤、保存剤、防腐剤、香料、増粘剤、油脂、光沢剤、結着剤、結着補強剤、乳化安定剤、生理食塩水等の他、調味料、香辛料、マスキング剤、軟化剤等を用いることにしてもよい。調味料としては、醤油、味噌、酢、酒、味醂、塩、カツオやコンブ等のだし、肉エキス、野菜エキス等を用いることができる。香辛料としては、胡椒、ローレル、タイム、クローブ、オレガノ、八角、山椒、セージ、パセリ、ナツメグ、マスタード、ジンジャー、シナモン、バジル、パプリカ、ローズマリー、スペアミント、レモングラス、タラゴン、チャービル、カルダモン、クミン、コリアンダー、ディル、フェンネル、マジョラム、オールスパイス等を用いることができる。マスキング剤としては、スクロース、サイクロデキストリン等の糖類;クローブ、オールスパイス、ローリエ、シナモン、ナツメグ等のハーブ類等を用いることができる。軟化剤としては、プロテアーゼ、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、ブロメライン、フィシン等の蛋白質分解酵素等を用いることができる。本発明の還元剤は食肉以外の分野でも利用できる。ミオグロビン以外のヘムタンパク例えばヘモグロビンを含む組成物の還元又は酸化防止退色防止を含むを目的として本発明の還元剤を用いてもよい。本発明の還元剤にはヘモグロビン濃度の測定やヘモグロビン血症の治療への適用も期待できる。即ち、本発明の還元剤は試薬や医薬の有効成分としても有用である。現在、血中のヘモグロビン濃度の測定方法としてシアンメトヘモグロビン法が頻用されている。この方法ではメトヘモグロビンにフェリシアン化カリウムとシアン化カリウムの混合物を作用させてシアンメトヘモグロビンとした上で比色定量法により測定する。本発明の還元剤を用いれば、当該方法に代わる方法として、血中などのメトヘモグロビン量又は総ヘモグロビン量を測定可能である。メトヘモグロビン血症は、何らかの原因でメトヘモグロビンが体内に過剰に蓄積されることで体内が酸素欠乏状態となり発症する。メトヘモグロビン血症に対する治療方法としてはメチレンブルーの静脈注射が最も効果的とされる。但し、シアン中毒を併発している場合にはシアン中毒を促進させてしまうためメチレンブルーは使用できない。その他の治療方法としてアスコルビン酸の経口投与、静脈注射リボフラビンと併用して投与することもできる。があるが、いずれの方法も効果は大きくない。本発明の還元剤はこれら従来の治療法に代わる新たな治療戦略を提供し得る。本発明の還元剤を用いた治療法は、メチレンブルーを使用できない患者シアン中毒を併発する者などに対しても適用可能である。また、メチレンブルーはグルコース6リン酸脱水素酵素G6PD欠損者には効果がない。G6PD欠損症のようなペントースリン酸経路に異常が見られる患者は、このアプローチに応答せず、緊急の交換輸血を受けなくてはならない。G6PD欠損症は世界的に最も一般的な障害の1つである。米国黒人男性の実に約10が罹患している。また、アフリカ人および地中海沿岸居住者にも多くの罹患者を認める。したがって、相当数の被験者に酸化的薬物誘発性メトヘモグロビン血症の危険性がある。かかる患者へのメチレンブルー自体の投与は無効であり彼等のG6PD欠損症が、NADPH不足を引き起こすため、逆効果の可能性でさえ存在する。本発明の還元剤には同患者への効果も期待できる。本発明の還元剤は心拍数、血圧、心拍出量の異常による心臓の負担の軽減および各組織の代謝の亢進等の薬理作用並びに生理作用を発揮し得る。本発明の還元剤を含む医薬には、例えば、各組織の酸素要求量の高い生理条件下、例えば激しい労働や運動等の環境において、生体の耐久力を増進する耐久力増進剤としての用途も期待できる。さらに、心不全、心筋症、心筋炎、心筋梗塞、心膜炎、心筋周膜炎perimyocarditis、一過性虚血発作、冠状動脈性心臓病、左-右脈路シャントをもつ先天性異常vitia、ファロー四徴症/五徴症、アイゼンメンゲル症候群、ショック、抹消の虚血、動脈閉塞性疾患AOD、抹消AODpAOD、頚動脈狭窄、腎動脈狭窄、脳における微小循環器障害細動脈硬化、脳内出血、脳の静脈血栓および頭蓋内静脈洞血栓症、血管異形成、くも膜下出血、血管性痴呆、ビスヴァンガーBiswanger症、皮質下動脈硬化性脳症、塞栓症を伴う多発皮質梗塞、血管炎、糖尿病性網膜症、種々の原因による貧血anaemiaの予後再生不良性貧血、骨髄異形成症候群、真性赤血球増加症、巨赤芽球性貧血、鉄欠乏性貧血、腎性貧血、球状赤血球症spHaerocytosis、溶血性haemolytic貧血など、サラセミアthalassaemia、異常ヘモグロビン症、グルコース6リン酸デヒドロゲナーゼ欠乏症、輸血罹患、アカゲザルRhesus不適合性、マラリア、弁膜形成valvuloplasty、急性出血後貧血、脾機能亢進症候群、肺線維症、気腫、肺水腫oedema:ARDS、IRDSまたは再発性肺気腫、熱傷、狭心症、冬眠等の虚血性疾患等、血行障害、低酸素症若しくは血中酸素減少状態の予防又は治療、又はこれらの病態ないし症状を伴うかこれらの病態ないし症状に起因する疾病の予防又は治療に本発明の医薬を適用してもよい。虚血組織に酸素を供給して虚血性の細胞損傷を防止するために、虚血性事象の発生前、発生中、及び/又は発生後に本発明の医薬を投与することも可能である。本発明の医薬投与と併せて、血管作動性酸素運搬体を投与することにしてもよい。例えば外科的な脈管再生、移植、急性心筋梗塞、血管形成術によって引き起こされる急性虚血、並びにそれに続く再灌流およびフリーラジカル放出のために、本発明の医薬と血管作動性キャリアをガス状の一酸化窒素と組み合わせ、又はガス状の一酸化窒素を適用した後に本発明の医薬と血管作動性キャリアを哺乳動物に投与し所期の治療効果を発揮させるようにしてもよい。本明細書に記載の方法によって治療される哺乳動物は治療前に虚血性心疾患を有していてもよく、急性の虚血性病態を患っていてもよく、或いは臓器に血管痙攣を示していてもよい。循環系の一部分または全体を通しての赤血球流量低下、貧血および脳卒中を含む、様々な原因の結果として生じる脊椎動物内の低酸素組織を治療するため本発明の医薬を用いることもできる。また、脊椎動物内の組織の酸素欠乏を防止することを目的として、予防的に本発明の医薬を用いても良い。さらには、部分的動脈閉塞または微小循環における部分的遮断から生じた低酸素症を治療または予防する目的で本発明の医薬を適用することも可能である。ヘモグロビンの投与に関しては米国特許出願第08/409,337号明細書が参考になる。本発明の医薬の投与量、投与期間は特に制限されない。投与形態、年齢、体重、症状等に応じて適宜選択できる。本発明の医薬の投与対象は制限されない。投与対象として、ヒトの他、ヒト以外の哺乳動物ペット動物、家畜、実験動物を含む。具体的には例えばサル、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、サル、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、馬、ニワトリ、羊、鯨、イルカ、イヌ、ネコ等を挙げることができる。治療対象は、本発明の医薬の投与前、投与中、及び/又は投与後において、正常血液量であっても、血液量過多であっても、或いは血液量過少であってよい。本発明の医薬の投与形態は特に制限されない。経口あるいは非経口のいずれの投与方法によっても投与することができる。本明細書で用いる非経口による投与は特に限定はしないが、例えば、静脈内、筋内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経皮気管内、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、髄腔内、及び胸骨内注射並びに注入を挙げることができる。好ましい投与方法として静脈内注射が用いられる。経口投与に適する製剤の例としては、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、液剤、及びシロップ剤等を挙げることができる。非経口投与に適する製剤としては、例えば、注射剤、坐剤、吸入剤、貼付剤等を挙げることができる。本発明の医薬は、薬理学的、製剤学的に許容しうる添加物を必要により加えて製造してもよい。薬理学的、製剤学的に許容しうる添加物の例としては、例えば、賦形剤、崩壊剤ないし崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、基剤、溶解剤ないし溶解補助剤、等張化剤、pH調節剤、安定化剤、噴射剤、及び粘着剤等を挙げることができる。経口投与、あるいは非経口投与に適する製剤には、ブドウ糖、乳糖、Dソルビトール、Dマンニトール、デンプン、カオリン、キシリトール、デキストリン、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、ヒドロキシプロピルセルロース、又は結晶セルロース等の賦形剤;カルボキシメチルセルロース、デンプン、又はカルボキシメチルセルロースカルシウム等の崩壊剤又は崩壊補助剤;ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、又はゼラチン等の結合剤;軽質無水ケイ酸、合成ケイ酸アルミニウム、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム又はタルク等の滑沢剤;ヒドロキシプロピルメチルセルロース、白糖、ポリエチレングリコール又は酸化チタン等のコーティング剤;ワセリン、流動パラフィン、ポリエチレングリコール、ゼラチン、カオリン、グリセリン、精製水、又はハードファット等の基剤;フロン,ジエチルエーテル、又は圧縮ガス等の噴射剤;ポリアクリル酸ナトリウム、ポリビニルアルコール、メチルセルロース、ポリイソブチレン、ポリブテン等の粘着剤;木綿布又はプラスチックシート等の基布等の製剤用添加物等を添加することができる。注射用に適する製剤には、注射用蒸留水、生理食塩水、プロピレングリコール等の水性あるいは用時溶解型注射剤を構成しうる溶解剤又は溶解補助剤;ブドウ糖、塩化ナトリウム、Dマンニトール、グリセリン等の等張化剤;有機酸イタコン酸、コハク酸、酒石酸、フマル酸、クエン酸、リンゴ酸、アジピン酸、グルコン酸、ピロリン酸、乳酸、α-ケトグルタル酸、フィチン酸等又はこれら有機酸の塩、無機酸炭酸等又はこれら無機酸の塩、酸性アミノ酸アスパラギン酸、グルタミン酸等、塩基性アミノ酸アルギニン、リジン、ヒスチジン等等のpH調整剤;リドカイン等の無痛化剤等の添加物を添加してもよい。本発明の医薬の典型的な作用対象の一つはヘモグロビンであるが、ここでのヘモグロビンは特に限定されない。天然であるヘモグロビン、遺伝子操作によって修飾されたヘモグロビン、分子内もしくは分子間架橋、重合、または化学基の付加などの化学反応によって修飾されたヘモグロビンであってもよい。本発明の医薬は、上記ヘモグロビン以外のヘム蛋白質にも応用できる。また、上記ヘム蛋白質と構造が類似する金属ポルフィリン錯体にも応用できる。3.還元剤の製造法本発明の更なる局面は本発明の還元剤の製造法を提供する。本発明の製造法ではヘム還元酵素、好ましくはメトミオグロビン還元酵素を産生するバチルス属微生物を、該酵素が産生される条件下で培養するステップステップ及び培養産物から前記酵素を回収するステップステップが行われる。ステップのバチルス属微生物としてバチルスズブチリス、バチルスアミロリケファシエンス、納豆菌、バチルススリンギエンシス、バチルスミコイデスからなる群より選択されるいずれかの微生物を用いるとよい。培養法及び培養条件は目的の酵素が産生されるものである限り特に限定されない。即ち、ヘム還元活性を示すポリペプチドが産生されることを条件として、使用する微生物の培養に適合した方法や培養条件を適宜設定できる。以下、培養条件として培地、培養温度及び培養時間を例示する。培地としては、使用する微生物が生育可能な培地が採用される。例えば、アラビノース、キシロース、グルコース、フルクトース、ガラクトース、シュクロース、ゲンチオビオース、可溶性デンプン、グリセリン、デキストリン、糖蜜、有機酸等の炭素源、更に硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、あるいは、コーングルテンミール、大豆粉、カザミノ酸、コーヒー粕、綿実油粕、ペプトン、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、ふすま、肉エキス等の窒素源、更にカリウム塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、鉄塩、亜鉛塩等の無機塩を添加したものを用いることができる。使用する微生物の生育を促進するためにビタミン、アミノ酸などを培地に添加してもよい。培地のpHは例えば約3~8、好ましくは約5~7程度に調整し、培養温度は通常約10~50°C、好ましくは約25~35°C程度で、1~15日間、好ましくは3~7日間程度好気的条件下で培養する。培養法としては例えば静置培養、振盪培養法、ジャーファーメンターによる好気的深部培養法が利用できる。以上の条件で培養した後、培養産物から目的の酵素を回収するステップ。典型的には、培養産物から菌体を収集する操作ステップ2-1の後、菌体破砕物を調製するステップ2-2。菌体の収集には遠心処理、フィルターろ過などを利用できる。固体培地を使用した場合など、菌体以外の固体成分を含む場合には予め当該固体成分を除去しておくとよい。菌体破砕物の調製にはフレンチプレスやダイノミル等を利用した機械的破砕処理、超音波処理、凍結破砕処理などを利用できる。後に行われる凍結処理、乾燥処理、凍結乾燥処理などの際に菌体の破砕が生じる場合には、菌体破砕専用の工程を設けなくても良い。調製した菌体破砕物はそのまま即ち、特別の処理を施すことなく又は追加の処理を経た後、本発明の還元剤として利用される。ここでの追加の処理の例は濃縮限外ろ過膜による濃縮など、精製塩析、各種クロマトグラフィーなど、他の成分の添加、希釈及び乾燥である。追加の処理として、二以上の処理を行うことにしてもよい。最終的な形態は液体状であっても固体状粉体状を含むであってもよい。食肉の色調を改善する物質を見出すべく、バチルス属の微生物を中心にスクリーニングを実施した。以下では、スクリーニングの結果から有用性が高いと期待された微生物株に関する実験の結果を示す。1.バチルスズブチリス、バチルスアミロリケファシエンス、納豆菌、バチルススリンゲンシス、バチルスミコイデスの凍結乾燥粉末の調製表1に示す液体培地10mLを試験管に分注し、120°C、20分間滅菌した。前培養として前記試験管にバチルスズブチリス、バチルスアミロリケファシエンス、納豆菌、バチルススリンゲンシスBacillusthuringiensisNBRC13865株、バチルスミコイデスBacillusmycoidesIAM1190株をそれぞれ1エーゼ接種し、30°C、300rpmで一晩振とう培養した。次に、表1に示す液体培地100mLを300mL容三角フラスコに分注し、120°C、20分間滅菌し、本培養培地とした。本培養として前述の前培養液1mLを接種し、30°C、200rpmで一晩振とう培養した。本培養液を5000rpm、5分、遠心分離し、菌体を得た。得られた菌体を30mLの20mMリン酸バッファーpH75で1回洗浄し、30mLの20mMリン酸バッファーpH75に懸濁した。得られた懸濁液を40°Cで24時間凍結した。続いて凍結乾燥20°C、24時間を行い、凍結乾燥粉末を得た凍結乾燥処理により菌体は破砕される。2.食肉発色試験1前記凍結乾燥粉末01gを05Mリン酸バッファーpH5550μLで溶解した。続いて豚もも肉ミンチ2gに、前述の粉末溶解液、4ミオグロビン50μLを混ぜ合わせ、脱気密封し、4°Cで17時間放置した。肉の赤色の変化発色度を視覚的に観察した。対照試験として粉末溶解液を加えないものと、粉末溶解液を10分間煮沸処理したものについても同様の試験を行った。その結果を表2に示す。尚、ピキアファリノサの凍結乾燥粉末溶解液で処理した場合の結果未処理のデータのみも併せて示す。:強く発色、:発色、-:発色せず以上のように、供試菌株バチルスズブチリス、バチルスアミロリケファシエンス、納豆菌、バチルススリンゲンシス、バチルスミコイデスの凍結乾燥粉末に食肉発色効果を認めた。バチルスズブチリス及び納豆菌の効果は特に高い。尚、培養後の菌体をフレンチプレスで破砕して得たサンプルについても同様の食肉発色効果を確認したデータ示さず。3.食肉発色試験2前記凍結粉末バチルスズブチリスの菌体破砕物10mgを05Mリン酸バッファーpH55100μLで溶解した。その溶解液に豚もも肉ミンチ凍乾粉末10mg、4ミオグロビン30μL、02MNADH30μL、滅菌水400μLを添加して、室温で30分放置した。続いて反応液を15000rpm、15分、遠心分離し、上清を回収した。得られた上清の波長700nmから400nmの吸収スペクトルを、分光光度計を用いて測定した。対照試験として粉末溶解液を10分間煮沸処理したものについても同様の試験を行った。その結果を図1に示す。結果から明らかなように、未処理サンプルは545nmと580nmに吸収極大を有し、赤色を呈していることが分かる。4.食肉発色試験33.に示した方法に従って、1.で調製した各凍結乾燥粉末用いて食肉発色試験を行った。コントロールとして粉末溶解液を加えないものについても同様の試験を行った。各サンプルの波長580nmにおける吸光度を図2に示す。試験した全てのサンプルで5日後もコントロールよりも強く発色していることが分かる。5.メトミオグロビン還元酵素活性の測定法メトミオグロビン還元酵素活性は以下の通り測定した。まず、1.で調製した各凍結乾燥粉末を水で10mgmLに溶解し、酵素溶液とした。続いて01Mリン酸バッファーpH55200μLに01ミオグロビン100μLと酵素溶液150μLを添加し、30°C、5分間プレインキュベートした。そして1mMNADH50μLを添加して、波長406nmにおける吸光度の変化を5分間測定した。活性はユニットで示した。本条件下で1分間に1μM相当のメトミオグロビンを還元させる酵素量を1Uとした。尚、比較のため、ピキアファリノサの凍結乾燥粉末についても酵素活性を調べた。測定結果を図3に示す。食肉発色効果を示した凍結乾燥粉末はいずれも高いメトミオグロビン還元酵素活性を示した。この結果より、供試菌株バチルスズブチリス、バチルスアミロリケファシエンス、納豆菌、バチルススリンゲンシス、バチルスミコイデスがメトミオグロビン還元酵素を産生すること、及び発色効果が当該酵素の作用によるものであることが示唆された。6.メトミオグロビン還元酵素の精製メトミオグロビン還元酵素は以下の通り精製した。1.で培養して得られたバチルスズブチリス菌体をフレンチプレスにて破砕し遠心後、上清を硫安で塩析した。30飽和で処理して上清をとり70飽和で処理して遠心した後、沈殿物を回収した。これを20mMKPBpH60溶液に溶解させ透析したものを硫安塩析サンプルとした。得られた硫安塩析サンプル5mLを、以下の条件のDEAEクロマトグラフィーGEHealthcareに供した。その結果、タンパク収率は454であった。DEAEクロマトグラフィー条件担体:DEAEHPチャージ:硫安塩析サンプルBufA:20mMKPBBufB:20mMKPB1MNaCl流速:5mL分分画:5mLプログラム:BufA洗浄8cv、BufB10洗浄8cv、BufB勾配3025cv、BufB1008cv上記DEAEクロマトグラフィーで得られた溶出パターン及びメトミオグロビン還元酵素活性を図4に示す。なお、活性はメトミオグロビンの吸収極大であるA406の減少を確認した。図4の画分のうち特に活性の高かったDEAEFrNo6163を、以下の条件のハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーhydroxyapatitecolumnにかけて各々を精製した。ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーによるDEAEFrNo6163のタンパク収率は985であった。ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー条件担体:ハイドロキシアパタイトチャージ:DEAE精製FrNo6163BufA:5mMKPB03MNaClBufB:400mMKPB03MNaCl流速:1mL分分画:4mLプログラム:BufA洗浄7cv、BufB勾配10020cv、BufB10010cvDEAEFrNo6163をハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーに供して得られた溶出パターン及びメトミオグロビン還元酵素活性を図5に示す。図5のうち特に比活性の高かったハイアパFrNo19を20mMKPBで透析後、以下の条件のゲルろ過クロマトグラフィーgelfiltrationcolumnに供した。ゲルろ過クロマトグラフィー条件担体:Superdex200チャージ:ハイアパFr19BufA:20mMKPB流速:1mLmin分画:5mLハイアパFrNo19をゲルろ過クロマトグラフィーに供して得られた溶出パターン及びメトミオグロビン還元酵素活性を図6に示す。さらに、図6のうち特に比活性の高かったゲルろ過FrNo1315を含むゲルろ過FrNo1216をSDSPAGEに供し、バンドを確認した図7:ゲルろ過FrNo1216。図7のゲルろ過FrNo1315について、シングルバンドが得られた。上記精製工程DEAEクロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーで得られた各々の画分について、比活性を図8に示した。DEAEFrNo6163はゲルろ過までして比活性が約207倍まで向上した。7.メトミオグロビン還元酵素のアミノ酸配列特定図7のSDSPAGEで得られたシングルバンドについてPDVF膜に転写しポンソー試薬で染色後、切り出しを行い、N末端アミノ酸配列解析をプロテインシークエンサーにて行った。その結果、N末端アミノ酸配列がVVGDFPIETDTLVIG配列番号1であることが見出された。さらに、当該アミノ酸配列をもとにBLAST内のバチルスズブチリスデータベースから該当遺伝子を検索した。その結果、デヒドロリポイルデヒドロゲナーゼDehydrolipoyldehydrogenase、以下DLDとする。をコードするpdhD配列番号2と100の相同性を有することが見出された。尚、DLDのアミノ酸配列を配列番号3に示す。8.DLDによる食肉発色試験精製したDLDについて食肉発色試験を行った。精製したDLDの凍結粉末サンプルを使用し、食肉サンプルを以下の通り調製し表3、4°Cで一晩保存した後、比較した図9、図10。図9には、酵素量の異なる食肉サンプル食肉サンプル1~4を並べて示した。このようにDLDが食肉の色調改善に寄与していることがわかる。図10はNADHの有無による食肉の色調を比較したものである左から凍結粉末なし食肉サンプル1、NADH有り食肉サンプル2、NADH無し食肉サンプル5。NADHが無くとも十分に発色できていることが確認された。食肉中にNADHが十分に含まれているためであると考えられる。9.DLDの酵素学的性質本酵素と高い親和性をもつフェリシアン化カリウムを基質として用い、諸性質を検討した。まずはDLDの基質反応性を確認した。酵素添加量を15μLとし基質濃度終濃度を00250050075010150203040506070810125151752025となるように、測定時間30秒間で、レイトアッセイRateassayを行ったpH60。フェリシアン化カリウムのモル吸光係数は102×103とし、速度の単位はμM分を用いた。結果を図11、図12に示す。図11の基質飽和曲線の立ち上がりからsv~sプロットを作成し、速度パラメーターKineticparameterを算出したKm019、Vmax262。比較として、フェリシアン化カリウムと親和性の高い他起源のDiapholaseのKm値を表4に示す。表4より、バチルスズブチリスから得られたDLDは、Ckluyveri由来のDLDよりもフェリシアン化カリウムに対して親和性が高いことがわかる。DLDの至適pHを次の通り測定した。05Mの各pHバッファークエン酸バッファーpH=30~60、リン酸カリウムバッファーKPBpH=60~80、Tris塩酸バッファーpH=80~100を10倍希釈50mMしたものを50μL、4mMフェリシアン化カリウム溶液を10倍希釈400μMしたものを50μL、酵素サンプル50μL、MiliQ水250μLを用いて30°Cで5分間インキュベートした後、1mMNADH溶液を100μL添加し、A420の吸光度の変化を確認した。結果を図13に示す。続いてDLDのpH安定性を次の通り検討した。酵素サンプル20μL、20mMの各pHバッファークエン酸バッファーpH=30~60、リン酸カリウムバッファーKPBpH=60~80、Tris塩酸バッファーpH=80~100180μLを混合し、30分間放置し反応させたものをpH処理サンプル液とした。こうして得られたpH処理サンプル液150μL、05Mクエン酸バッファーpH=60100μL、MilliQ水100μLを混合し氷中にて一晩保存した。こうして得られた保存液350μLに4mMのフェリシアン化カリウム50μLを添加し30°Cで5分間インキュベートした後、1mMのNADH溶液を100μL添加し、A420の吸光度の変化を1秒毎に30秒間測定したなおpH処理していないサンプルを活性100とした。結果を図14に示す。低pH側での安定性は十分ではなかったものの、肉中のpHがpH5~6であるので、肉中でも活性を十分有すると思われる。DLDの至適温度を次の通り測定した。05Mクエン酸バッファー50μL、2mMフェリシアン化カリウム50μL、MilliQ水100μL及び1mMNADH100μLを混合し、各温度で5分間プレインキュベートしたものに酵素サンプル200μLを添加しA420の吸光度の変化を5分間測定することで反応を確認した。結果を図15に示す。このことから、至適温度は40°Cであり、50°Cで失活することが確認できた。さらに熱安定性について次の通り測定した。酵素サンプルを予め各温度30°C、40°C、60°Cで30分間処理したものを氷冷し、処理サンプルを調製した。この処理サンプル30μLに05Mクエン酸バッファーpH6050μL、2mMフェリシアン化カリウム50μL及びMilliQ水270μLを加えて30°Cで5分間インキュベートした後、1mMのNADH溶液を100μL添加し、A420の吸光度の変化を1秒間隔にて30秒間計測した。図16の結果より、60°Cでも高い残存活性があることを確認できた。続いてNADHとNADPHへの反応性を比較した。05MKPB50μL、精製DLD100μL及び01Mb100μLを混合した後、MilliQ水で400μLとし、30°Cで5分間プレインキュベートした。その後、1mMのNaDH又はNADPHを50μL添加し、A406を5分間モニターした。NADHの相対活性を100とした場合の反応性を図17に示す。DLDはNADPHに対する反応性が低いことがわかる。また、金属塩金属カチオンがDLDの活性に対して与える影響を検証した。500mMKPB100μL、01Mb200μL、精製DLD150μL、100mMカチオンCaCl2、MgCl2、FeCl3、SnCl2、CuSO4、FeCl2、MnSO4、CdCl2、ZnCl2、NaCl、KCl、SDS、EDTA10μL及び1mMNADH100μLを混合し、これに1mLとなるまで精製水を加えたものを試料とし、相対活性を求めた。Ca、Mg2及びKで活性の向上が見られた図18。10.DLDの大量発現系バチルスズブチリスよりDLD遺伝子を取得し、大腸菌にて大量発現系を構築すべく検討を行った。10-1.バチルスズブチリス7417株からのゲノム抽出バチルスズブチリス7417株からのゲノム抽出は次の通り行った。バチルスズブチリス7417株を05ペプトン、10酵母エキス、10グルコースを含む液体培地pH65に接種し、30°C、300rpmにて一晩振とう培養した。得られた培養物からQIAquickTMGelExtractionTestKitQIAGEN社製を用いてゲノムDNAの抽出を行った。10-2.PCRによるDLD遺伝子の増幅PCRによるDLD遺伝子増幅は次の通り行った。10×バッファー5μL、dTNP4μL、バチルスズブチリスのゲノム1μL、以下の10μMプライマー2種各5μL、EXTaqDNApolymeraseタカラバイオ社製01μLを混合し、これに精製水を加えて50μLとした。なお、プライマーの組み合わせとしては2パターンパターン1、パターン2用意した。PCR反応は2ステップで行った。まずステップ1として98°Cで30秒間、熱変性させた。続いてステップ2として下記サイクル熱変性:98°C10秒間、アニーリング:46°C30秒間、伸長反応:72°C90秒間を25サイクル行い、PCR産物を得た。プライマーの配列パターン1DLDNde1FW:GGCGTAATCATATGGTAGTAGGAG配列番号4DLDBamH1RV:GATAGGATCCTTATTTTACGATG配列番号5パターン2DLDNde1FW:GGCGTAATCATATGGTAGTAGGAG配列番号6DLDBamH1HistagRV:GATAGGATCCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTTTACGATG配列番号710-3.DLD遺伝子のTAクローニング続いてDLD遺伝子のTAクローニングを次の通り行った。PCRで得られたPCR産物3μLに、2×Liationバッファー5μL、pGEMTeasyベクター1μL、T4リガーゼ1μLを添加し4°Cで一晩反応させた後、これをコンピテントセルDH5αに全量添加し、42°Cで30秒間ヒートショックをかけて2分間氷冷した。これにSOC培地150μLを添加し、37°Cで20分間インキュベートした。そして全量をLBAmp培地プレートで培養し、コロニーを得た。10-4.DLDの形質転換続いてDLDを次の通りベクターにクローニングした。TAクローニングによって得られた培養物をGenEluteTMplasmidMiniprepKitSIGMA社製を用いてプラスミド抽出を行った。得られたプラスミド抽出物に10×バッファー、NdeIを添加し37°Cで2時間処理した。さらにこれにBamHI1μLを添加し、37°Cで1時間処理したものを挿入遺伝子とした。一方、pET20bベクターについてもBamHI1μLを添加し、37°Cで1時間処理したものを準備した。Histagの有無によるDLDの酵素活性を確認するために、それぞれ下記の通り試料を調製し単位はμL、16°Cで30分間インキュベートした。その後、全量をコンピテントセルDH5αに添加し氷上で1時間溶解したものをヒートショックにかけ42°C、30秒間、SOC培地を添加し37°Cで20分間インキュベートし、LBamp培地にプレートした。10-5.形質転換体の酵素活性測定上記の通り得られた形質転換体の活性測定を次の通り行った。DLDHistagpET20bBL21の5コロニーとDLDHistagpET20bBL21の4コロニーをとりLBAmp培地にて30°Cで一晩振とう培養した前培養。この前培養液60μLを3mLのLBAmp培地に植菌し37°Cで一晩振とう培養した本培養。OD600=04~05になったら、IPTGを終濃度01mMになるよう加え、30°Cで4時間振とう培養した。こうして得られた菌体を集菌し、50mMTrisHClpH=70に懸濁させた。これをビーズショッカーMULTIBEADSSHOCKER、安井器械社製にて破砕し遠心した後、上清をサンプルとした。酵素反応メトミオグロビン還元反応を次の通り行った。上記方法で得られた酵素サンプル50μLに、05MKPBバッファーpH=55、01メトミオグロビン溶液50μLを添加し、これに対し225μLになるまで精製水を加えた。そして、1mMNADH溶液25μLを加え反応を開始し、A406の吸光度の変化を10分間確認した。同時にタンパク量についてもBradford法で定量した。結果を図19、図20に示す。図19はHistagなし、図20はHistagありの形質転換体のメトミオグロビン還元活性を示したものである。比較のためにpET20bの空ベクター、IPTGベクターデータについても示した。いずれも空ベクターに比べ、10倍以上のメトミオグロビン還元活性を示した。また図19と図20を比較してわかるとおり、IPTGによる制御はかかっていないものと思われる。11.リコンビナントDLDの食肉発色活性上記により得られたリコンビナントDLDをビーズ破砕し、以下の条件でNiSepharoseカラムにて精製して、20mMKPBで透析した。これを凍結乾燥したものをサンプルとして用い食肉発色試験1、食肉発色試験2を行った。クロマトグラフィー条件担体:NiSepharoseサンプル:破砕上清約20mLBindBuf:20mMKPB03MNaClEluteBuf:20mMKPB03MNaCl04Mイミダゾール流速:チャージ5mL分その他10mL分分画:10mLプログラム:BindBuf洗浄6cv、EluteBuf10洗浄10cv、EluteBuf10020cv勾配、EluteBuf洗浄10cv食肉発色試験1では、豚ミンチ肉2gに40mgmLのミオグロビンSIGMA社製375μL、05MのKPB375μL、20mMNADH375μL、凍結粉末品酵素サンプル66mgを加え、4°Cで一晩反応させた。また、比較のため、凍結粉末がないものネガティブコントロールを調製した。結果を図21に示す。左がネガティブコントロール、右が凍結粉末有りの食肉である。色調の変化を目視だけでなく画像のRGB値からも検証したが、リコンビナントDLDにより食肉の色調がより赤みがかったことがわかる。食肉発色試験2では、豚ミンチ肉2gに05MのKPB375μL、40mgmLのミオグロビンSIGMA社製375μL、20mMNADH375μL、サンプル精製DLDのみ60mg、食添亜硝酸Naのみ048mg、精製DLD亜硝酸Na及び、にグルコン酸Znを加えたもの、なしを加え、4°Cで一晩反応させた図22。さらに、これらに65°Cで85分間加熱処理したものを図23に示す。これら図22、図23のサンプルについても目視だけでなく画像のRGB値からの検証を行った。図21の加熱処理なしの食肉の色調について以下説明する。DLDを加えたものサンプルとサンプルに良好な赤の色調が見られた。とりわけDLDと亜硝酸ナトリウムを加えたサンプルの色調が良好であった。亜硝酸ナトリウムとグルコン酸亜鉛を加えたサンプルでは褐色となった。亜硝酸ナトリウムのみを加えたサンプルは、無添加のサンプルと同様の色調が見られた。図22の加熱処理後の食肉の色調について以下説明する。亜硝酸ナトリウムを加えたものサンプル、サンプル、サンプルに良好な赤の色調白桃色が見られた。とりわけDLDと亜硝酸ナトリウムを加えたサンプルは、赤みが強調され良好な色調を示した。DLDのみを加えたサンプルは無添加のサンプルに比べれば赤みが残っているものの、サンプル~サンプルと比べると褐色がかなり進んでいるようであった。12.食肉発色酵素の精製バチルスズブチリス菌体由来の食肉発色酵素のうち、DLD以外の食肉発色酵素について精製を行った。精製工程はDEAEクロマト前半ピーク図4のDEAEFrNo2735を出発材料にして、フェニルクロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、Cuアフィニティークロマトグラフィーを行った。DEAE前半Fraction図4のDEAEFrNo273510mLを以下の条件のフェニルクロマトグラフィーPhenylcolumnGEHealthcareに供した。上記フェニルクロマトグラフィーで得られた溶出パターン及びメトミオグロビン還元酵素活性を図24に示す。これらフラクションのうち、特に活性の高かったフェニルFrNo2631を5mMKPBで透析して、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーに供した。フェニルクロマトグラフィー条件担体:PhenylHPサンプル:DEAE前半FrUF10mLBufA:20mMKPB30飽和硫安BufB:20mMKPB流速:5mL分分画:5mLプログラム:BufA洗浄5cv、BufB勾配10020cv、BufB100洗浄5cv上記フェニルクロマトグラフィーで得られたフェニルFrNo2631を以下の条件のハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーに供した。上記ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーで得られた溶出パターン及びメトミオグロビン還元酵素活性を図25に示す。ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー条件担体:ハイドロキシアパタイトチャージ:フェニル精製FrNo2631BufA:5mMKPB03MNaClBufB:400mMKPB03MNaCl流速:2mL分分画:5mLプログラム:BufA洗浄5cv、BufB勾配10025cv、BufB1006cv上記ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーで得られたフラクションのうち、特に活性の高かったハイアパFrNo16を20mMKPB03MNaClで透析して、以下の条件のCuアフィニティカラムに供しCuアフィニティークロマトグラフィーを行った。Cuアフィニティークロマトグラフィーで得られた溶出パターン及びメトミオグロビン還元酵素活性を図26に示す。Cuアフィニティークロマトグラフィーで得られたこれらのフラクションのうち、特に活性の高かったCuFrNo1013についてSDSPAGEを行った。結果を図27に示す。Cuアフィニティークロマトグラフィー条件担体:Cu2HPチャージ:ハイアパFr16BufA:20mMKPB03MNaClBufB:20mMKPB03MNaCl04Mイミダゾール流速:1mL分分画:2mLプログラム:BufA洗浄6cv、BufB勾配1020cv、BufB洗浄10cv図27は上記ハイドロキシアパタイトクロマトクラフィーで得られたハイアパFrNo1317、及びCuアフィニティークロマトグラフィーで得られたCuFrNo815についてSDSPAGEを行ったものである。このうち、Cuアフィニティークロマトグラフィーで得られたCuFrNo10に2つのメインバンドを確認できたため、上述の方法によりN末端アミノ酸配列解析を行ったところ、分子量の大きいほうのタンパク質はMGNTRKKVSVI配列番号8、分子量の小さいほうのタンパク質はMTNTLDVLKA配列番号9であった。N末端アミノ酸配列をもとに分子量の大きいほうのタンパク質のBLASTサーチを行ったところ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼMalatedehydrogenase:MDHをコードするmdh配列番号10と100の相同性を示した。また分子量の小さいほうのタンパク質については推定NADHニトロレダクターゼPutativeNADHnitroreductase:yodCをコードするyodC配列番号11と100の相同性を示した。尚、yodCのアミノ酸配列を配列番号12に示す。CuFrNo13については分子量よりDehydrolipoyldehydrogenaseと同一であると推測した。16.食肉発色酵素MDH、yodCの大量発現系構築バチルスズブチリスと納豆菌から遺伝子を取得し、MDHとyodCの大量発現系を構築した。バチルスズブチリスと納豆菌の遺伝子情報からプライマーを作成しPCRにかけて該当遺伝子の切り出しを行った。ベクターにpET20b、宿主にBL21を用い、各酵素のC末端に6×Histagを付加して発現させた。発現確認培養は次の通り行った。各酵素MDH又はyodCHistagpET20bBL21のコロニーをとり、30°C、300rpmで一晩振とう培養した前培養。この前培養液の2当量を10mLのLBAmp培地に植菌し、ODが約05~07になったらIPTGを終濃度05mMになるよう加え、37°C300rpmで4時間振とう培養した。こうして得られた菌体を集菌し、50mMTrisHClpH=70に懸濁させた。これをビーズ破砕し遠心した後、上清をサンプルとした。上記で得られたサンプルの活性確認を行った。酵素サンプル150μLに01wwメトミオグロビン50μL、05MKPBを加え、これに1mMNADH25μLを加え反応を開始し、A406の吸光度の変化を10分間確認した。図28より、yodCについては活性を確認できたものの、MDHについては活性を確認できなかった。そこで発現の有無を確認するためSDSPAGEによりバンドを確認した図29。MDHとyodC共に該当サイズに濃いバンドを確認できた。17.精製した食肉発色酵素MDH、yodCの発色試験上述の方法で得られたリコンビナントyodCバチルスズブチリスとMDHバチルスズブチリスを下記条件でNiSepharoseカラムにて精製し、20mMKPBで透析した。透析したサンプルを凍結乾燥し、リコンビナントyodCとMDHの酵素粉末を得た。クロマトグラフィー条件担体:NiSepharoseサンプル:破砕上清約20mLBindBuf:20mMKPB03MNaClEluteBuf:20mMKPB03MNaCl04Mイミダゾール流速:チャージ5mL分その他10mL分分画:10mLプログラム:BindBuf洗浄6cv、EluteBuf10洗浄10cv、EluteBuf10020cv勾配、EluteBuf洗浄10cv得られた酵素粉末を用いて以下の通り食肉発色試験を行った。食肉発色試験では、豚ミンチ肉2gに40mgmLのミオグロビンSIGMA社製375μL、05MのKPB375μL、20mMNADH375μL、サンプルコントロール無添加、yodC、ボイルしたyodC、MDH、ボイルしたMDHを加え、4°Cで一晩反応させた。なお、熱処理で失活を確認するためサンプル及びサンプルを用意した。結果を図30に示す。yodCには食肉発色効果が認められたものの、MDHについては全く認められなかった。18.yodCの酵素学的性質検討yodCの酵素学的性質を検討した。DLDと同様に至適pH図31、pH安定性図32、至適温度図33、熱安定性図34、NADPHへの反応性図35、金属塩金属カチオンが活性に与える影響図36を調べた。至適pHについてはDLDと同様にpH60付近であるため食肉アプリケーション上支障はないものと思われる。また幅広いpH条件で安定であった。至適温度を考えても、20°C付近という低温条件下でよく作用することから食肉アプリケーション上好ましいといえる。熱安定性試験においても40°Cまで活性を維持することを確認できた。補酵素特異性試験においてはNADHを用いた場合よりもNADPHを用いた場合で良好な活性が得られた。金属カチオンについてはMg、Na又はKを加えた場合に酵素活性の向上が見られた。さらに、基質反応性についても検証した。DLDと同条件で、フェリシアン化カリウムへの反応性、さらにはミオグロビンへの反応性について調べた。DLDの結果を併せて各々図37、図38に示す。DLDと比べ、フェリシアン化カリウムに対しては約26倍、ミオグロビンに対しては約22倍の反応性を示した。"