"細胞または細胞様材料または非ヒト胎仔を凍結する方法であって、a生物学的に受容可能な液体希釈物の層を容器中にて凍結させる工程;b凍結した上記希釈物の上に、上記細胞または細胞様材料または非ヒト胎仔の溶液の形態の層を添加する工程であって、上記溶液の媒体が、少なくとも1つの凍結防止性の因子を好適な濃度にて含んでいる、工程;およびc工程bにて得られた生成物を凍結させて、上記細胞または細胞様材料または非ヒト胎仔の凍結した溶液を表面上に有する二重層の凍結物を得る工程を包含しているか、あるいはa細胞または細胞様材料または非ヒト胎仔の溶液の形態の層を容器中にて凍結させる工程であって、上記溶液の媒体が、少なくとも1つの凍結防止性の因子を好適な濃度にて含んでいる、工程;b凍結した上記溶液の上に、生物学的に受容可能な液体希釈物の層を添加する工程;および、c工程bにて得られた生成物を凍結して、凍結した上記希釈物を表面上に有する二重層の凍結物を得る工程を包含している、方法。前記細胞または細胞様材料または非ヒト胎仔の前記溶液の前記層の容積が、前記液体希釈物の層の容積の半分以下である、請求項1に記載の方法。c前記二重層の凍結物の表面上の、前記細胞または細胞様材料または非ヒト胎仔の凍結した前記溶液の上に、低酸素の生物学的に受容可能な液体希釈物の層を添加する工程;および、d工程cにて得られた生成物を凍結させて、三重層の凍結物を得る工程を包含している、請求項1または2に記載の方法。前記低酸素の生物学的に受容可能な液体希釈物が、無酸素の生物学的に受容可能な液体希釈物である、請求項3に記載の方法。前記生物学的に受容可能な液体希釈物が、細胞培養の完全培地である、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。前記細胞培養の完全培地が、抗生物質および血清の少なくとも1つが補完されている、請求項5に記載の方法。低温貯蔵用の前記因子が、DMSO、グリセロール、ポリビニル-ピロリドン、エチレングリコール、メタノール、メチルアセトアミドおよび糖類からなる群より選択される、請求項1~6のいずれか1項に記載の方法。前記細胞が微生物である、請求項1~7のいずれか1項に記載の方法。前記細胞が植物細胞である、請求項1~7のいずれか1項に記載の方法。前記細胞が動物細胞である、請求項1~7のいずれか1項に記載の方法。前記動物細胞が、腫瘍細胞系、不死化細胞系、連続細胞系、遺伝的に改変された細胞系、分裂停止細胞、幹細胞、誘導された多機能性幹細胞および単離された初代細胞からなる群より選択される、請求項10に記載の方法。前記単離された初代細胞が、上皮細胞、内皮細胞、間葉細胞および造血細胞からなる群より選択される、請求項11に記載の方法。前記動物細胞が哺乳動物細胞である、請求項10~12のいずれか1項に記載の方法。前記動物細胞が卵母細胞または精子である、請求項13に記載の方法。前記容器が、マルチウエルプレートのウエル、バイアル、ストロー、培養容器、フラスコまたはディッシュである、請求項1~14のいずれか1項に記載の方法。請求項1に記載された、二重層の凍結物。請求項3に記載された、三重層の凍結物。請求項1に記載された二重層の凍結物のいずれかを含んでいる、容器。請求項3に記載された三重層の凍結物を含んでいる、容器。96ウエルのマイクロプレートのウエルである、請求項18または19に記載の容器。384ウエルのマイクロプレートのウエルである、請求項18または19に記載の容器。1536ウエルのマイクロプレートのウエルである、請求項18または19に記載の容器。請求項1~15のいずれか1項に記載の方法による、二重層の凍結物および三重層の凍結物の少なくとも1つを含んでいる、即時使用可能なHTS型マルチウエルプレート。[実施例1.大腸癌細胞HT29に対する二層細胞凍結融解方法]10のFCSGibco、100μg/mLのペニシリンおよび100IU/mLのストレプトマイシンを補完したエンドトキシンフリーのMcCoy’s5Aの完全培養培地にて培養したHT29細胞ATCC、LGCStandardsを、80コンフルエンシーまでフラスコ中にて培養し、次いで収集した。0.05のEDTAを含んでいる5mLのPBSを用いて、細胞を2分間インキュベートすることによって収集を行い、0.1のトリプシンおよび0.05のEDTAを含んでいる5mLのPBS中にて、さらに5分間インキュベーションすることによって、最終的に脱離させた。細胞を、400×Gで5分間遠心分離した。次いで、80のMcCoy’s、10のFCS、10のDMSOAppliChemの凍結培地中に50μLあたり80,000個のHT29細胞を含んでいる、合計4.8mLの溶液を4°Cにて調製し細胞の密度を血球計算機によって測定した。、いわゆる凍結溶液を作製した。さらに、100μLの完全培養培地を96ウエルプレートの各ウエルに分散し、-80°Cまで下げて凍結させた。一旦凍結させたら、上記プレートを回収し、50μL/ウエルの上記凍結溶液を、すでに凍結した完全培養培地を100μL含んでいる各ウエルの上に添加した。上記プレートを10分間ドライアイス雰囲気下にて保存し、次いで-80°Cの冷凍庫へ移動し、5日間にわたって保存した。ネガティブコントロールとして、50μLあたり80,000個のHT29細胞の別の溶液を、96ウエルプレートとともに凍結バイアル中にて凍結させ、次いで、バイアルコントロールとして用いるために-80°Cの冷凍庫へ移した。5日後、凍結した上記96ウエルプレートを37°CのCO2インキュベータへ移した。同時に、穏やかに振盪する37°Cの清浄な水槽中にて、上記バイアルコントロールを迅速に融解した。50μL/ウエルの上記バイアルコントロールを、100μL/ウエルの加温された完全培養培地を含んでいる別の96ウエルプレート上に蒔いた。融解の1時間後に、全てのプレートからの記培地を、予め加温しておいた新鮮な完全培養培地と取り換えた。24時間のインキュベート後の細胞全てに対して、MTTアッセイSigma-Aldrichを行った。上記MTTアッセイは実験室での検査であり、ホルマザンに対するMTTを減少させる酵素の活性を測定するための標準的な比色分析アッセイである。生細胞中において、黄色のMTT3-4,5-ジメチルチアゾール-2-イル-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド、テトラゾールが、紫色のホルマザンに還元される。5mg/mLのPBS1×を用いてMTT溶液ストックを調製した。100μL/ウエルのMTT実験溶液培養培地中にて1:100を、予め融解した細胞上に添加し、CO2インキュベータ内にてインキュベートした。3時間後、吸引によって、上記MTTを上記プレートウエルから除去し、紫色の不溶性のホルマザン生成物を着色された溶液に変化させるために、200μL/ウエルのDMSOを添加した。分光光度計MultiskanAscent、ThermoLabsystemsにて540nmで、この溶液の吸光度を測定した。参照用の標準曲線を作成した図2。HT29細胞を最初に0.05のEDTA中にて2分間インキュベートした。0.1のトリプシンおよび0.05のEDTA中にてさらに5分間インキュベートすることによって、最終的な分離を行った。細胞を、400×Gで5分間遠心分離した。血球計算機を用いて細胞数を数えることによって、細胞の密度を測定した。96ウエルプレートのウエルにて、希釈物のシリーズを作製した。細胞数は、200μLの容積中にて1250~160000個の範囲であった。細胞が適切に付着するや否や、上述したように上記MTTアッセイを行った。[実施例2.マウスの線維芽細胞NIH3T3に対する二層細胞凍結融解方法]10のFCS、100μg/mLのペニシリンおよび100IU/mLのストレプトマイシンを補完したエンドトキシンフリーのDMEM培地Sigma-Aldrichにて培養したNIH3T3細胞ATCC、LGCStandardsを、80コンフルエンシーまでフラスコ中にて培養し、次いで収集した。0.05のEDTAを有する5mLのPBS中にて、細胞を2分間インキュベートすることによって収集を行い、0.1のトリプシンおよび0.05のEDTA中にて、さらに5分間インキュベーションすることによって、最終的に脱離させた。細胞を、400×Gで5分間遠心分離した。次いで、80のDMEM、10のFCS、10のDMSOAppliChemの凍結培地中に50μLあたり80,000個のNIH3T3細胞を含んでいる、合計4.8mLの溶液を4°Cにて調製し細胞の密度を血球計算機によって測定した。、いわゆる凍結溶液を作製した。さらに、100μLの完全培養培地を96ウエルプレートの各ウエルに分散し、-80°Cまで下げて凍結させた。一旦凍結させたら、上記プレートを回収し、50μL/ウエルの上記凍結溶液を、すでに凍結した完全培養培地を100μL含んでいる各ウエルの上に添加した。上記プレートを10分間ドライアイス雰囲気下にて保存し、次いで-80°Cの冷凍庫へ移動し、5日間にわたって保存した。ネガティブコントロールとして、50μLあたり80,000個のHT29細胞の別の溶液を、96ウエルプレートとともに凍結バイアル中にて凍結させ、次いで、バイアルコントロールとして用いるために-80°Cの冷凍庫へ移した。5日後、凍結した上記96ウエルプレートを37°CのCO2インキュベータへ移した。同時に、穏やかに振盪する37°Cの清浄な水槽中にて、上記バイアルコントロールを迅速に融解した。50μL/ウエルの上記バイアルコントロールを、100μL/ウエルの加温された完全培養培地を含んでいる別の96ウエルプレート上に蒔いた。融解の1時間後に、全てのプレートからの上記培地を、予め加温しておいた新鮮な完全培養培地と取り換えた。24時間のインキュベート後の細胞全てに対して、MTTアッセイSigma-Aldrichを行った。5mg/mLのPBS1×を用いてMTT溶液ストックを調製した。100μL/ウエルのMTT実験溶液培養培地中にて1:100を、予め融解した細胞上に添加し、CO2インキュベータ内にてインキュベートした。3時間後、吸引によって、上記MTTを上記プレートウエルから除去し、紫色の不溶性のホルマザン生成物を着色された溶液に変化させるために、200μL/ウエルのDMSOを添加した。分光光度計MultiskanAscent、ThermoLabsystemsにて540nmで、この溶液の吸光度を測定した。参照用の標準曲線を作成した図4。NIH3T3細胞を最初に0.05のEDTA中にて2分間インキュベートした。0.1のトリプシンおよび0.05のEDTA中にてさらに5分間インキュベートすることによって、最終的な分離を行った。細胞を、400×Gで5分間遠心分離した。血球計算機を用いて細胞数を数えることによって、細胞の密度を測定した。96ウエルプレートのウエルにて、希釈物のシリーズを作製した。細胞数は、200μLの容積中にて1,250~160,000個の範囲であった。細胞が適切に付着するやいなや、上述したように上記MTTアッセイを行った。[実施例3.細胞傷害試験]Balb3T3ATCC、LGCStandardsの線維芽細胞および平滑筋の大動脈細胞SMAC、SpragueDawleyラットから新鮮に分離した、HarlanLaboratoriesの初代細胞を、10のFCS、100μg/mLのペニシリンおよび100IU/mLのストレプトマイシンSigma-Aldrichを補完したエンドトキシンフリーのDMEMSigma-Aldrichからなる完全培養培地中にて培養した。SMAC細胞を、1匹のオスのラットの大動脈から分離した:ラットの左心室から腸骨の分岐までの大動脈を注意して切り取り、コラゲナーゼII型Worthingtonを用いて上記組織を酵素的に消化することによって細胞を分離した。低温にて保存するまでの間、得られた細胞を12日間にわたって増殖させた。両方の細胞型を、80コンフルエンシーまでフラスコ中にて培養し、次いで収集した。0.05のEDTAを含んでいる5mLのPBS中にて、細胞を2分間インキュベートすることによって収集を行い、0.1のトリプシンおよび0.05のEDTA中にて、さらに5分間インキュベーションすることによって、最終的に脱離させた。細胞を、400×Gで5分間遠心分離した。次いで、80、10のFCS、10のDMSOAppliChemの凍結培地中に50μLあたり50,000個の細胞を含んでいる、合計4.8mLの溶液を4°Cにて調製し細胞の密度を血球計算機によって測定した。、いわゆる凍結溶液を作製した。さらに、100μLの完全培養培地を96ウエルプレートの各ウエルに分散し、-80°Cまで下げて凍結させた。一旦凍結させたら、上記プレートを回収し、50μL/ウエルの上記凍結溶液を、すでに凍結した完全培養培地を100μL含んでいる各ウエルの上に添加した。上記プレートを10分間ドライアイス雰囲気下にて保存し、次いで-80°Cの冷凍庫へ移動した。5日後、凍結した上記96ウエルプレートを37°CのCO2インキュベータへ移した。融解の1時間後に、全てのプレートからの上記培地を、予め加温しておいた新鮮な完全培養培地と取り換えた。融解から24時間にわたって、20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mLおよび100μg/mLの5-フルオロウラシル、ならびに、0.62μM、1.25μM、2.5μMおよび5μMのタモキシフェンをそれぞれ用いて、Balb3T3細胞およびSMAC細胞の両方の細胞型をインキュベートした。コントロール細胞は基本培地を受け、コントロール-FBS細胞は完全培地を受けた。実験を3連にて行った。24時間後、MTTアッセイを行い、細胞傷害性を吸光度の値に従って算出した。5mg/mLのPBS1×を用いてMTT溶液ストックを調製した。次いで、100μL/ウエルのMTT実験溶液培養培地中にて1:100を、予め融解したプレートに添加し、CO2インキュベータ内にて3時間にわたってインキュベートした。上記MTTを上記プレートウエルから除去し、紫色の不溶性のホルマザン生成物を着色された溶液に変化させるために、200μL/ウエルのDMSOを添加した。分光光度計MultiskanAscent、ThermoLabsystemsにて540nmで、この溶液の吸光度を測定した。図1は、96ウエルプレートの1つのウエルにおける2工程の凍結プロセスAおよびB、および、引き続く融解プロセスCおよびDを示し、プレートが通常の細胞インキュベータ内で融解されると自動的に細胞が播種されるメカニズムを示す。HT29の検量線を示す。fx=357415x-30210;R2=0.98。HT29細胞におけるバイアビリティーを示す。コントロールバイアルからの細胞に対して、多層を凍結融解する方法の細胞の生存数が、明らかに増加していることを示す。NIH3T3の検量線を示す。fx=422129x-24554、R2=0.96。NIH3T3細胞のバイアビリティーを示す。多層を凍結融解する方法の24時間のインキュベーションの後の細胞の生存数が、コントロールバイアルの細胞と比較してわずかに増加していることを示す。5-フルオロウラシル処理に対するBALB3T3細胞の濃度依存的な細胞傷害性反応を示す。タモキシフェン処理に対するBALB3T3細胞の濃度依存的な細胞傷害性反応を示す。5-フルオロウラシル処理に対するSmac細胞の濃度依存的な細胞傷害性反応を示す。タモキシフェン処理に対するSmac細胞の濃度依存的な細胞傷害性反応を示す。"