GSK3β阻害剤、ERK脱リン酸化阻害剤、Raf活性化剤、CaMK2阻害剤およびp38阻害剤からなる群より選ばれる少なくとも一つの化合物を含有する心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞増殖剤。前記心筋細胞および心筋前駆細胞がそれぞれヒト心筋細胞およびヒト心筋前駆細胞である、請求項1に記載の心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞増殖剤。前記心筋細胞が、多能性幹細胞を分化誘導して得られる心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞である、請求項1に記載の心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞増殖剤。前記薬剤が、iGSK3β阻害剤、CaMK2阻害剤およびp38阻害剤、もしくは、iiGSK3β阻害剤、ERK活性化剤およびp38阻害剤から成る、請求項1に記載の心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞増殖剤。前記薬剤が、CyclinA2、CyclinD2、CyclinD3、Cdk2およびcdk4の発現を増強させ、Ink4bの発現を減少させる、請求項1に記載の心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞増殖剤。前記GSK3β阻害剤がCHIR99021またはBIOであり、前記ERK脱リン酸化阻害剤がSU1498であり、前記Raf活性化剤がZM336372であり、前記CaMK2阻害剤がKN62またはKN93であり、前記p38阻害剤がSB203580である、請求項1~5のいずれか一項に記載の心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞増殖剤。前記薬剤が、iBIO、SU1498およびSB203580、もしくは、iiBIO、KN93およびSB203580から成る、請求項1~6のいずれか一項に記載の心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞増殖剤。心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞を、GSK3β阻害剤、ERK脱リン酸化阻害剤、Raf活性化剤、CaMK2阻害剤およびp38阻害剤からなる群より選ばれる少なくとも一つの化合物を含有する培地で培養する工程を含む、心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞の増殖方法。前記心筋細胞および心筋前駆細胞がそれぞれヒト心筋細胞およびヒト心筋前駆細胞である、請求項8に記載の方法。前記心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞が、多能性幹細胞を分化誘導して得られる心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞である、請求項8に記載の方法。前記薬剤が、iGSK3β阻害剤、CaMK2阻害剤およびp38阻害剤、もしくは、iiGSK3β阻害剤、ERK活性化剤およびp38阻害剤から成る、請求項8に記載の方法。前記薬剤が、CyclinA2、CyclinD2、CyclinD3、Cdk2およびcdk4の発現を増強させ、Ink4bの発現を減少させる、請求項8に記載の方法。前記GSK3β阻害剤がCHIR99021またはBIOであり、前記Raf活性化剤がZM336372であり、前記ERK活性化剤がSU1498であり、前記CaMK2阻害剤がKN62またはKN93であり、前記p38阻害剤がSB203580である、請求項8~12のいずれか一項に記載の方法。前記薬剤が、iBIO、SU1498およびSB203580、もしくは、iiBIO、KN93およびSB203580から成る、請求項8~13のいずれか一項に記載の方法。以下の工程を含む、心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞増殖剤のスクリーニング方法。1試験物質を、多能性幹細胞を分化誘導して得られた心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞に接触させる工程、2工程1の後に心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞の数を計測する工程、及び3心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞の数が、試験物質と接触させないときの心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞の数よりも大きい場合に、該試験物質を心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞増殖剤として選択する工程。以下の工程を含む、心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞増殖剤のスクリーニング方法。1試験物質を、多能性幹細胞を分化誘導して得られた心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞に接触させる工程、2工程1の後に心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞の数を計測する工程、及び3心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞の数が、心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞増殖能を有する陽性コントロール物質と接触させたときの心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞の数と比べて同等または大きい場合に、該試験物質を心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞増殖剤として選択する工程。前記陽性コントロール物質がGSK3β阻害剤、ERK脱リン酸化阻害剤、Raf活性化剤、CaMK2阻害剤およびp38阻害剤からなる群より選ばれる少なくとも一つの化合物である、請求項16に本発明は心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞を効率よく増殖させるための方法を提供することである。本発明者らはマウスES細胞から分化誘導した心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞の増殖を促進させる薬剤をスクリーニングしたところ、GSK3β阻害剤、ERK脱リン酸化阻害剤およびCaMK2阻害剤により該細胞の増殖が促進されることが明らかとなった。次に本発明者らはこれらの薬剤と同じ効果を有する他の薬剤を調べたところRaf活性化剤およびp38阻害剤も同様に機能することを確認した。さらに本発明者らは、ヒトiPS細胞から分化誘導した心筋前駆細胞または心筋細胞において該薬剤が同様の効果を示すか否かを検討したところ、該薬剤がマウスES細胞由来の細胞と同様にその細胞増殖を促進させることが確認された。本発明はこのような知見に基づき完成するに至ったものである。本発明の一つの態様は、GSK3β阻害剤、ERK脱リン酸化阻害剤、Raf活性化剤、CaMK2阻害剤およびp38阻害剤からなる群より選ばれる少なくとも一つの化合物を含有する心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞増殖剤を提供することである。本発明の他の態様は、前記心筋細胞および心筋前駆細胞がそれぞれヒト心筋細胞およびヒト心筋前駆細胞である、前記心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞増殖剤を提供することである。本発明の他の態様は、前記心筋細胞が、多能性幹細胞を分化誘導して得られる心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞である、前記心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞増殖剤を提供することである。本発明の他の態様は、前記薬剤が、iGSK3β阻害剤、CaMK2阻害剤およびp38阻害剤、もしくは、iiGSK3β阻害剤、ERK活性化剤およびp38阻害剤から成る、前記心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞増殖剤を提供することである。本発明の他の態様は、前記薬剤が、CyclinA2、CyclinD2、CyclinD3、Cdk2およびcdk4の発現を増強させ、Ink4bの発現を減少させる、前記心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞増殖剤を提供することである。本発明の他の態様は、前記GSK3β阻害剤がCHIR99021またはBIOであり、前記ERK脱リン酸化阻害剤がSU1498であり、前記Raf活性化剤がZM336372であり、前記CaMK2阻害剤がKN62またはKN93であり、前記p38阻害剤がSB203580である、前記心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞増殖剤を提供することである。本発明の他の態様は、前記薬剤が、iBIO、SU1498およびSB203580、もしくは、iiBIO、KN93およびSB203580から成る、前記心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞増殖剤を提供することである。本発明の他の態様は、心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞を、GSK3β阻害剤、ERK脱リン酸化阻害剤、Raf活性化剤、CaMK2阻害剤およびp38阻害剤からなる群より選ばれる少なくとも一つの化合物を含有する培地で培養する工程を含む、心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞の増殖方法を提供することである。本発明の他の態様は、前記心筋細胞および心筋前駆細胞がそれぞれヒト心筋細胞およびヒト心筋前駆細胞である、前記方法を提供することである。本発明の他の態様は、前記心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞が、多能性幹細胞を分化誘導して得られる心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞である、前記方法を提供することである。本発明の他の態様は、前記薬剤が、iGSK3β阻害剤、CaMK2阻害剤およびp38阻害剤、もしくは、iiGSK3β阻害剤、ERK活性化剤およびp38阻害剤から成る、前記方法を提供することである。本発明の他の態様は、前記薬剤が、CyclinA2、CyclinD2、CyclinD3、Cdk2およびcdk4の発現を増強させ、Ink4bの発現を減少させる、前記方法を提供することである。本発明の他の態様は、前記GSK3β阻害剤がCHIR99021またはBIOであり、前記Raf活性化剤がZM336372であり、前記ERK活性化剤がSU1498であり、前記CaMK2阻害剤がKN62またはKN93であり、前記p38阻害剤がSB203580である、前記方法を提供することである。本発明の他の態様は、前記薬剤が、iBIO、SU1498およびSB203580、もしくは、iiBIO、KN93およびSB203580から成る、前記方法を提供することである。本発明の他の態様は、以下の工程を含む、心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞増殖剤のスクリーニング方法を提供することである。1試験物質を、多能性幹細胞を分化誘導して得られた心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞に接触させる工程、2工程1の後に心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞の数を計測する工程、及び3心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞の数が、試験物質と接触させないときの心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞の数よりも大きい場合に、該試験物質を心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞増殖剤として選択する工程。本発明の他の態様は、以下の工程を含む、心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞増殖剤のスクリーニング方法を提供することである。1試験物質を、多能性幹細胞を分化誘導して得られた心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞に接触させる工程、2工程1の後に心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞の数を計測する工程、及び3心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞の数が、心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞増殖能を有する陽性コントロール物質と接触させたときの心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞の数と比べて同等または大きい場合に、該試験物質を心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞増殖剤として選択する工程。本発明の他の態様は、前記陽性コントロール物質がGSK3β阻害剤、ERK脱リン酸化阻害剤、Raf活性化剤、CaMK2阻害剤およびp38阻害剤からなる群より選ばれる少なくとも一つの化合物である、前記方法を提供することである。本発明は、GSK3β阻害剤、ERK脱リン酸化阻害剤、Raf活性化剤、CaMK2阻害剤およびまたはp38阻害剤を用いた心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞の増殖方法を提供する。<GSK3β阻害剤>本発明に係るGSK3β阻害剤とは、GSKグリコーゲンシンターゼキナーゼ3β蛋白質のキナーゼ活性例えばβカテニンに対するリン酸化能を阻害する物質として定義され、既に多数のものが知られているが、その具体例としては、インジルビン誘導体であるBIO別名、GSK3βインヒビターIX;6ブロモインジルビン3オキシム、マレイミド誘導体であるSB216763341Hピロール25ジオン、フェニルαブロモメチルケトン化合物であるGSK3βインヒビターVII4ジブロモアセトフェノン、CHIR99021、6[2{[424ジクロロフェニル54メチルイミダゾール2イルピリミジン2イル]アミノ}エチルアミノ]ピリジン3カルボニトリルWO199965897、および、細胞膜透過型のリン酸化ペプチドであるL803mts別名、GSK3βペプチドインヒビター;MyrNGKEAPPAPPQSpPNH2、ならびにこれらの誘導体などが挙げられる。これらの化合物はCalbiochem社、Biomol社やStemgen社等から市販されており、容易に使用することが可能であるが、特にこれらに限定されない。対象細胞へのGSK3β阻害剤の接触は、該阻害物質を適当な濃度で水性もしくは非水性溶媒に溶解し、適した培地例えば、約5~20の胎仔ウシ血清を含む最小必須培地MEM、ダルベッコ改変イーグル培地DMEM、alphaMEM、RPMI1640培地、199培地、F12培地など中に、阻害物質濃度がGSK3βの機能阻害に十分で且つ細胞毒性がみられない範囲となるように該阻害物質溶液を添加して、細胞を一定期間培養することにより実施することができる。阻害物質濃度は用いる阻害物質の種類によって異なるが、例えば、約100nM~約10μMの範囲で適宜選択される。接触期間は対象細胞が増殖するために十分な時間であれば特に制限はないが、例えば、2日から5日の範囲で適宜選択される。<ERK脱リン酸化阻害剤>本発明に係るERK脱リン酸化阻害剤とは、ERKと脱リン酸化酵素との結合を阻害し、ERKの脱リン酸化を阻害する物質として定義され、SU149832アミノカルボニルアクリロニトリルまたはAG129667ジメトキシ3フェニルキノキサリンが例示される。本発明におけるERKは、ERK12が例示される。本剤によってリン酸化が維持されるERKのリン酸化部位としては、例えばJBiolChem2795716に記載の202番目および204番目のチロシンが例示されるがこれに限定されない。これらの化合物はCalbiochem社から市販されており、容易に使用することが可能であるが、特にこれらに限定されない。対象細胞へのERK脱リン酸化阻害剤の接触は、該阻害物質を適当な濃度で水性もしくは非水性溶媒に溶解し、適した培地例えば、約5~20の胎仔ウシ血清を含む最小必須培地MEM、ダルベッコ改変イーグル培地DMEM、alphaMEM、RPMI1640培地、199培地、F12培地など中に、阻害物質濃度がERKの脱リン酸化の阻害に十分で且つ細胞毒性がみられない範囲となるように該阻害物質溶液を添加して、細胞を一定期間培養することにより実施することができる。阻害物質濃度は用いる阻害物質の種類によって異なるが、例えば、約10nM~約10μMの範囲で適宜選択される。接触期間は対象細胞が増殖するために十分な時間であれば特に制限はないが、例えば、2日から5日の範囲で適宜選択される。<Raf活性化剤>本発明に係るRaf活性化剤とは、細胞内のRafを活性化する物質として定義され、ZM3363723N3アミノ4メチルフェニルベンズアミドが例示される。本発明におけるRafは、Raf1が例示される。ZM336372は、Calbiochem社から市販されており、容易に使用することが可能であるが、特にこれに限定されない。対象細胞へのRaf活性化剤の接触は、該活性化物質を適当な濃度で水性もしくは非水性溶媒に溶解し、適した培地例えば、約5~20の胎仔ウシ血清を含む最小必須培地MEM、ダルベッコ改変イーグル培地DMEM、alphaMEM、RPMI1640培地、199培地、F12培地など中に、活性化物質濃度がRafの活性化に十分で且つ細胞毒性がみられない範囲となるように該活性化物質溶液を添加して、細胞を一定期間培養することにより実施することができる。活性化物質濃度は用いる活性化物質の種類によって異なるが、例えば、約10nM~約10μMの範囲で適宜選択される。接触期間は対象細胞が増殖するために十分な時間であれば特に制限はないが、例えば、2日から5日の範囲で適宜選択される。<CaMK2阻害剤>本発明に係るCaMK2阻害剤とは、CaMK2の機能を阻害する物質もしくはCaMK2遺伝子の発現を阻害する物質として定義され、1KN621NOビスNメチルLチロシル4フェニルピペラジンまたはKN932NNアミノNNメチルベンジルアミンに例示される化学的阻害物質、2カルモジュリン結合部位と競合的に作用するドミナントネガティブ変異体例えば、CaMKアミノ酸配列:MHRQEAVDCLKKFNARRKLKGA:SEQIDNo13およびこれをコードする核酸、3CaMK2に対するsiRNA及びshRNA等が例示される。本発明において、好ましいCaMK2のアイソフォームは、Camk2dおよびCamk2gである。例示された化学的阻害物質はCalbiochem社またはWako社から市販されており、容易に使用することが可能であるが、化学的阻害物質は特にこれらに限定されない。CaMK2に対するsiRNA及びshRNAは、CaMK2の配列から、例えば、Ambionが提供するsiRNATargetFinderhttpwwwambioncomjptechlibmiscsiRNAfinderhtmlを利用して容易に設計することができる。好ましいCaMK2に対するsiRNA配列として、配列番号5~12の標的配列が例示される。siRNAは1種を単独で用いても良く、複数種を同時に用いても良い。siRNA及びshRNAを構成するヌクレオチド分子は、天然型のRNAでもよいが、安定性化学的および/または対酵素や比活性mRNAとの親和性を向上させるために、種々の化学修飾を含むことができる。例えば、ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンス核酸を構成する各ヌクレオチドのリン酸残基ホスフェートを、例えば、ホスホロチオエートPS、メチルホスホネート、ホスホロジチオネートなどの化学修飾リン酸残基に置換することができる。また、各ヌクレオチドの糖リボースの2位の水酸基を、ORRは、例えばCH32OMe、CH2CH2OCH32OMOE、CH2CH2NHCNH2、CH2CONHCH3、CH2CH2CN等を示すに置換してもよい。さらに、塩基部分ピリミジン、プリンに化学修飾を施してもよく、例えば、ピリミジン塩基の5位へのメチル基やカチオン性官能基の導入、あるいは2位のカルボニル基のチオカルボニルへの置換などが挙げられる。対象細胞へのCaMK2の化学的阻害物質の接触は、該阻害物質を適当な濃度で水性もしくは非水性溶媒に溶解し、適した培地例えば、約5~20の胎仔ウシ血清を含む最小必須培地MEM、ダルベッコ改変イーグル培地DMEM、alphaMEM、RPMI1640培地、199培地、F12培地など中に、該阻害物質濃度がCaMK2の阻害に十分で且つ細胞毒性がみられない範囲となるように該阻害物質溶液を添加して、細胞を一定期間培養することにより実施することができる。阻害物質濃度は用いる阻害物質の種類によって異なるが、例えば、約10nM~約10μMの範囲で適宜選択される。接触期間は対象細胞が増殖するために十分な時間であれば特に制限はないが、例えば、2日から5日の範囲で適宜選択される。対象細胞へのCaMK2のドミナントネガティブ変異体の接触は、当業者に周知のタンパク質導入方法を用いて実施することができる。そのような方法としては、例えば、タンパク質導入試薬を用いる方法、タンパク質導入ドメインPTD融合タンパク質を用いる方法、マイクロインジェクション法などが挙げられる。タンパク質導入試薬としては、カチオン性脂質をベースとしたBioPOTERProteinDeliveryReagentGeneTherapySystems、ProJectTMProteinTransfectionReagentPIERCE及びProVectinIMGENEX、脂質をベースとしたProfect1TargetingSystems、膜透過性ペプチドをベースとしたPenetrainPeptideQbiogene及びChariotKitActiveMotif等が市販されている。導入はこれらの試薬に添付のプロトコルに従って行うことができる。対象細胞へのCaMK2に対するsiRNAもしくはshRNAは、直接接触させても良く、CaMK2に対するsiRNAもしくはshRNAを発現するベクターを接触させる方法で実施することができる。siRNAもしくはshRNAを発現するベクターは、例えば、polIII系プロモーターと該siRNAもしくは該shRNAを連結させた発現カセットをプラスミドベクターもしくはウィルスベクターへ組み込むことで作製される。siRNA、shRNAまたはこれらを発現するプラスミドベクターは、当業者に周知の導入方法を用いて実施することができる。そのような方法としては、リポソーム法、ポリアミン法、エレクトロポレーション法、ビーズ法等が例示される。リポソーム試薬としては、Lipofectamine2000、OligofectamineInvitrogen、GeneEraserTMsiRNAtransfectionreagentStratagene等が市販されている。導入はこれらの試薬に添付のプロトコルに従って行うことができる。また、ウィルスベクターとしては、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスなどが例示され、当業者に周知の方法で細胞へ導入することができる。<p38阻害物質>本明細書に係るp38阻害物質とは、p38タンパク質の機能を阻害する物質として定義され、例えば、p38の化学的阻害物質、p38のドミナントネガティブ変異体もしくはそれをコードする核酸などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明における、p38の化学的阻害物質としては、SB203580251Hイミダゾール、及びその誘導体、SB2021904251Hイミダゾール及びその誘導体、SB239063trans4451Hイミダゾール1イルシクロヘキサノール及びその誘導体、SB220025及びその誘導体、PD169316、RPR200765A、AMG548、BIRB796、SClO469、SCIO323、VX702、FR167653が例示されるが、これらに限定されない。これらの化合物は市販されており、例えばSB203580、SB202190、SC239063、SB220025およびPD169316についてはCalbiochem社、SClO469およびSCIO323についてはScios社などから入手可能である。また、p38のドミナントネガティブ変異体は、p38のDNA結合領域に位置する180位のスレオニンをアラニンに点変異させたp38T180A、ヒトおよびマウスにおけるp38の182位のチロシンをフェニルアラニンに点変異させたp38Y182Fなどが挙げられる対象細胞へのp38の化学的阻害物質の接触は、該阻害物質を適当な濃度で水性もしくは非水性溶媒に溶解し、適した培地例えば、約5~20の胎仔ウシ血清を含む最小必須培地MEM、ダルベッコ改変イーグル培地DMEM、alphaMEM、RPMI1640培地、199培地、F12培地など中に、該阻害物質濃度がp38の阻害に十分で且つ細胞毒性がみられない範囲となるように該阻害物質溶液を添加して、細胞を一定期間培養することにより実施することができる。阻害物質濃度は用いる阻害物質の種類によって異なるが、例えば、約10nM~約10μMの範囲で適宜選択される。接触期間は対象細胞が増殖するために十分な時間であれば特に制限はないが、例えば、2日から5日の範囲で適宜選択される。対象細胞へのp38のドミナントネガティブ変異体の接触は、上述のCaMK2のドミナントネガティブ変異体と同様の方法を用いて行うことができる。他の態様として、本発明において、上述のGSK3β阻害剤、ERK脱リン酸化阻害剤、Raf活性化剤、CaMK2阻害剤およびp38阻害剤は、CyclinA2、CyclinD2、CyclinD3、Cdk2およびcdk4の発現を増強させ、Ink4bの発現を減少させる薬剤であってもよい。本発明における対象細胞は、心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞であり、好ましくは、多能性幹細胞を分化誘導して得られる心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞が例示される。<多能性幹細胞>本発明で使用可能な多能性幹細胞は、生体に存在するすべての細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞であり、それには、以下のものに限定されないが、例えば胚性幹細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹細胞、精子幹細胞GS細胞、胚性生殖細胞EG細胞、人工多能性幹細胞などが含まれる。好ましい多能性幹細胞は、ES細胞、ntES細胞、およびiPS細胞である。胚性幹細胞ES細胞は、ヒトやマウスなどの哺乳動物の初期胚例えば胚盤胞の内部細胞塊から樹立された、多能性と自己複製による増殖能を有する幹細胞である。ES細胞は、受精卵の8細胞期、桑実胚後の胚である胚盤胞の内部細胞塊に由来する胚由来の幹細胞であり、成体を構成するあらゆる細胞に分化する能力、いわゆる分化多能性と、自己複製による増殖能とを有している。ES細胞は、マウスで1981年に発見されNature292154156、その後、ヒト、サルなどの霊長類でもES細胞株が樹立されたScience28211451147、JAThomsonetalProcNatlAcadSciUSA9278447848、JAThomsonetalBiolReprod55254259およびJAThomsonおよびVSMarshallCurrTopDevBiol38133165。ES細胞は、対象動物の受精卵の胚盤胞から内部細胞塊を取出し、内部細胞塊を線維芽細胞のフィーダー上で培養することによって樹立することができる。また、継代培養による細胞の維持は、白血病抑制因子、塩基性線維芽細胞成長因子などの物質を添加した培地を用いて行うことができる。ヒトおよびサルのES細胞の樹立と維持の方法については、例えばHSuemorietalBiochemBiophysResCommun345926932、MUenoetalProcNatlAcadSciUSA10395549559、HSuemorietalDevDyn222273279およびHKawasakietalProcNatlAcadSciUSA9915801585などに記載されている。ES細胞作製のための培地として、例えば01mM2メルカプトエタノール、01mM非必須アミノ酸、2mMLグルタミン酸、20KSR及び4ngmlbFGFを補充したDMEMF12培地を使用し、37°C、5CO2湿潤雰囲気下でヒトES細胞を維持することができる。また、ES細胞は、3~4日おきに継代する必要があり、このとき、継代は、例えば1mMCaCl2及び20KSRを含有するPBS中の025トリプシン及び01mgmlコラゲナーゼIVを用いて行うことができる。ES細胞の選択は、一般に、アルカリホスファターゼ、Oct34、Nanogなどの遺伝子マーカーの発現を指標にして行うことができる。特に、ヒトES細胞の選択では、OCT34、NANOG、などの遺伝子マーカーの発現をRealTimePCR法で検出したり、細胞表面抗原であるSSEA3、SSEA4、TRA160、TRA181を免疫染色法にて検出することで行うことができるNature444481485。ヒトES細胞株である例えばKhES1、KhES2及びKhES3は、京都大学再生医科学研究所から入手可能である。精子幹細胞精子幹細胞は、精巣由来の多能性幹細胞であり、精子形成のための起源となる細胞である。この細胞は、ES細胞と同様に、種々の系列の細胞に分化誘導可能であり、例えばマウス胚盤胞に移植するとキメラマウスを作出できるなどの性質をもつBiolReprod69612616KShinoharaetalCell11910011012。神経膠細胞系由来神経栄養因子を含む培地で自己複製可能であるし、またES細胞と同様の培養条件下で継代を繰り返すことによって、精子幹細胞を得ることができる実験医学26巻5号41~46頁羊土社。胚性生殖細胞胚性生殖細胞は、胎生期の始原生殖細胞から樹立される、ES細胞と同様な多能性をもつ細胞であり、LIF、bFGF、幹細胞因子などの物質の存在下で始原生殖細胞を培養することによって樹立しうるCell70841847JLResnicketalNature359550551。人工多能性幹細胞人工多能性幹細胞は、ある特定の核初期化物質を、DNAまたはタンパク質の形態で体細胞に導入することまたは薬剤によって当該核初期化物質の内在性のmRNAおよびタンパク質の発現を上昇させることによって作製することができる、ES細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能、を有する体細胞由来の人工の幹細胞であるKTakahashiおよびSYamanakaCell126663676、KTakahashietalCell131861872、JYuetalScience31819171920、MNakagawaetalNatBiotechnol26101106、国際公開WO2007069666および国際公開WO2010068955。核初期化物質は、ES細胞に特異的に発現している遺伝子またはES細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子もしくはその遺伝子産物であればよく、特に限定されないが、例えば、Oct34Klf4Klf1Klf2Klf5Sox2Sox1Sox3Sox15Sox17Sox18cMycLMycNMycTERTSV40LargeTantigenHPV16E6HPV16E7BmilLin28Lin28bNanogEsrrbまたはEsrrgが例示される。これらの初期化物質は、iPS細胞樹立の際には、組み合わされて使用されてもよい。例えば、上記初期化物質を、少なくとも1つ、2つもしくは3つ含む組み合わせであり、好ましくは4つを含む組み合わせである。上記の各核初期化物質のマウスおよびヒトcDNAのヌクレオチド配列並びに当該cDNAにコードされるタンパク質のアミノ酸配列情報は、WO2007069666に記載のNCBIaccessionnumbersを参照すること、またLMyc、Lin28、Lin28b、EsrrbおよびEsrrgのマウスおよびヒトのcDNA配列およびアミノ酸配列情報については、それぞれ下記NCBIaccessionnumbersを参照することにより取得できる。当業者は、当該cDNA配列またはアミノ酸配列情報に基づいて、常法により所望の核初期化物質を調製することができる。遺伝子名マウスヒトLMycNM008506NM001033081Lin28NM145833NM024674Lin28bNM001031772NM001004317EsrrbNM011934NM004452EsrrgNM011935NM001438これらの核初期化物質は、タンパク質の形態で、例えばリポフェクション、細胞膜透過性ペプチドとの結合、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入してもよいし、あるいは、DNAの形態で、例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体などのベクター、リポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入することができる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター以上、Cell126pp6636762006Cell131pp8618722007Science318pp191719202007、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクターProcJpnAcadSerBPhysBiolSci85348622009などが例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体、酵母人工染色体、細菌人工染色体などが含まれる。プラスミドとしては、哺乳動物細胞用プラスミドを使用しうる。ベクターには、核初期化物質が発現可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイトなどの制御配列を含むことができる。使用されるプロモーターとしては、例えばEF1αプロモーター、CAGプロモーター、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMVサイトメガロウイルスプロモーター、RSVラウス肉腫ウイルスプロモーター、MoMuLVモロニーマウス白血病ウイルスLTR、HSVTK単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーターなどが用いられる。なかでも、EF1αプロモーター、CAGプロモーター、MoMuLVLTR、CMVプロモーター、SRαプロモーターなどが挙げられる。さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列、緑色蛍光タンパク質、βグルクロニダーゼ、FLAGなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。また、上記ベクターには、体細胞への導入後、核初期化物質をコードする遺伝子もしくはプロモーターとそれに結合する核初期化物質をコードする遺伝子を共に切除するために、それらの前後にLoxP配列を有してもよい。別の好ましい一実施態様においては、トランスポゾンを用いて染色体に導入遺伝子を組み込んだ後に、プラスミドベクターもしくはアデノウイルスベクターを用いて細胞に転移酵素を作用させ、導入遺伝子を完全に染色体から除去する方法が用いられ得る。好ましいトランスポゾンとしては、例えば、鱗翅目昆虫由来のトランスポゾンであるpiggyBac等が挙げられるKajiKetalNature458771775、WoltjenetalNature458766770、WO2010012077。さらに、ベクターには、染色体への組み込みがなくとも複製されて、エピソーマルに存在するように、リンパ指向性ヘルペスウイルスlymphotrophicherpesvirus、BKウイルスおよび牛乳頭腫Bovinepapillomavirusの起点とその複製に係る配列を含んでいてもよい。例えば、EBNA1およびoriPもしくはLargeTおよびSV40ori配列を含むことが挙げられるWO2009115295、WO2009157201およびWO2009149233。また、複数の核初期化物質を同時に導入するために、ポリシストロニックに発現させる発現ベクターを用いてもよい。ポリシストロニックに発現させるためには、遺伝子をコードする配列の間は、IRESまたは口蹄病ウイルスFMDV2Aコード領域により結合されていてもよいScience3229499532008ならびにWO2009092042およびWO2009152529。核初期化に際して、iPS細胞の誘導効率を高めるために、上記の因子の他に、例えば、ヒストンデアセチラーゼHDAC阻害剤例えば、バルプロ酸795797、トリコスタチンA、酪酸ナトリウム、MC1293、M344等の低分子阻害剤、HDACに対するsiRNAおよびshRNA例、HDAC1siRNASmartpool、HuSH29mershRNAConstructsagainstHDAC1等等の核酸性発現阻害剤など]、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤例えば5’azacytidineNatBiotechnol26795797、G9aヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤[例えば、BIX01294等の低分子阻害剤、G9aに対するsiRNAおよびshRNA例、G9asiRNA等等の核酸性発現阻害剤など]、Lchannelcalciumagonist、p53阻害剤例えばp53に対するsiRNAおよびshRNA、WntSignalingactivator例えばsolubleWnt3aCellStemCell3132135、LIFまたはbFGFなどの増殖因子、ALK5阻害剤例えば、SB431542NatMethods68058、mitogenactivatedproteinkinasesignalling阻害剤、glycogensynthasekinase3阻害剤PloSBiology622372247、miR2913p、miR294、miR295などのmiRNA、等を使用することができる。薬剤によって核初期化物質の内在性のタンパク質の発現を上昇させる方法における薬剤としては、6bromoindirubin3oxime、indirubin5nitro3oxime、valproicacid、2lHpyrazol4yl15naphthyridine、12benzothiazolylethanoneHBr、prostaglandinJ2およびprostaglandinE2等が例示されるWO2010068955。iPS細胞誘導のための培養培地としては、例えば10~15FBSを含有するDMEM、DMEMF12またはDME培地これらの培地にはさらに、LIF、penicillinstreptomycin、puromycin、Lグルタミン、非必須アミノ酸類、βメルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。、bFGFまたはSCFを含有するES細胞培養用培地、例えばマウスES細胞培養用培地または霊長類ES細胞培養用培地例えば霊長類ヒトサルES細胞用培地リプロセル、京都、日本、mTeSR1、などが含まれる。培養法の例としては、たとえば、37°C、5CO2存在下にて、10FBS含有DMEMまたはDMEMF12培地中で体細胞と核初期化物質を接触させ約4~7日間培養し、その後、細胞をフィーダー細胞上にまきなおし、体細胞と核初期化物質の接触から約10日後からbFGF含有霊長類ES細胞培養用培地で培養し、該接触から約30~約45日またはそれ以上ののちにES細胞様コロニーを生じさせることができる。また、iPS細胞の誘導効率を高めるために、510と低い酸素濃度の条件下で培養してもよい。あるいは、その代替培養法として、フィーダー細胞上で10FBS含有DMEM培地これにはさらに、LIF、ペニシリンストレプトマイシン、ピューロマイシン、Lグルタミン、非必須アミノ酸類、βメルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。で培養し、約25~約30日またはそれ以上ののちにES様コロニーを生じさせることができる。上記培養の間には、培養開始2日目以降から毎日1回新鮮な培地と培地交換を行う。また、核初期化に使用する体細胞の細胞数は、限定されないが、培養ディッシュ100cm2あたり約5×103~約5×106細胞の範囲である。マーカー遺伝子として薬剤耐性遺伝子を含む遺伝子を用いた場合は、対応する薬剤を含む培地選択培地で培養を行うことによりマーカー遺伝子発現細胞を選択することができる。またマーカー遺伝子が蛍光タンパク質遺伝子の場合は蛍光顕微鏡で観察することによって、発光酵素遺伝子の場合は発光基質を加えることによって、また発色酵素遺伝子の場合は発色基質を加えることによって、マーカー遺伝子発現細胞を検出することができる。本明細書中で使用する体細胞は、哺乳動物例えば、ヒト、マウス、サル、ブタ、ラット等由来の生殖細胞以外のいかなる細胞であってもよく、例えば、角質化する上皮細胞例、角質化表皮細胞、粘膜上皮細胞例、舌表層の上皮細胞、外分泌腺上皮細胞例、乳腺細胞、ホルモン分泌細胞例、副腎髄質細胞、代謝貯蔵用の細胞例、肝細胞、境界面を構成する内腔上皮細胞例、I型肺胞細胞、内鎖管の内腔上皮細胞例、血管内皮細胞、運搬能をもつ繊毛のある細胞例、気道上皮細胞、細胞外マトリックス分泌用細胞例、線維芽細胞、収縮性細胞例、平滑筋細胞、血液と免疫系の細胞例、Tリンパ球、感覚に関する細胞例、桿細胞、自律神経系ニューロン例、コリン作動性ニューロン、感覚器と末梢ニューロンの支持細胞例、随伴細胞、中枢神経系の神経細胞とグリア細胞例、星状グリア細胞、色素細胞例、網膜色素上皮細胞、およびそれらの前駆細胞等が挙げられる。細胞の分化の程度や細胞を採取する動物の齢などに特に制限はなく、未分化な前駆細胞であっても、最終分化した成熟細胞であっても、同様に本発明における体細胞の起源として使用することができる。ここで未分化な前駆細胞としては、たとえば神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞体性幹細胞が挙げられる。本発明において、体細胞を採取する由来となる哺乳動物個体は特に制限されないが、好ましくはヒトである。核移植により得られたクローン胚由来のES細胞ntES細胞は、核移植技術によって作製されたクローン胚由来のES細胞であり、受精卵由来のES細胞とほぼ同じ特性を有しているTWakayamaetalScience292740743SWakayamaetalBiolReprod72932936JByrneetalNature450497502。すなわち、未受精卵の核を体細胞の核と置換することによって得られたクローン胚由来の胚盤胞の内部細胞塊から樹立されたES細胞がntES細胞である。ntES細胞の作製のためには、核移植技術JBCibellietalNatBiotechnol16642646とES細胞作製技術との組み合わせが利用される実験医学26巻5号47~52頁。核移植においては、哺乳動物の除核した未受精卵に、体細胞の核を注入し、数時間培養することで再プログラム化することができる。融合幹細胞体細胞と卵子もしくはES細胞とを融合させることにより、融合させたES細胞と同様な多能性を有し、さらに体細胞に特有の遺伝子も有する幹細胞であるTadaMetalCurrBiol11155382001CowanCAetalScience2005Aug26309136973。<心筋細胞および心筋前駆細胞の分化誘導法>本発明において、心筋細胞とは、自己拍動の特性を有する心筋の細胞を意味する。また、心筋前駆細胞とは、前記心筋細胞の前駆細胞であって、拍動筋肉と電気伝導組織を形成する心筋細胞および血管平滑筋を生じる能力を有する細胞を意味する。ここで、心筋細胞および心筋前駆細胞は互いに混在していても良く、また、単離されていても良い。心筋細胞および心筋前駆細胞とは、心筋マーカーである心筋トロポニンcTNTまたはtroponinTtype2陽性およびまたはαMHCαmyosinheavychain陽性であることによって特徴づけられる。心筋細胞および心筋前駆細胞の増殖を測定する場合、これらのマーカーのいずれか1つ以上の発現量またはこれらのマーカーのプロモーターに結合されたレポーター遺伝子の発現量を指標とすることができる。ES細胞、iPS細胞などの多能性幹細胞から心筋細胞および心筋前駆細胞への分化誘導に際して、以下の方法を用いることができる。前述のように得られた多能性幹細胞を任意の方法で分離し、コーティング処理された培養皿を用いて接着培養、フィーダー細胞との共培養、および/または浮遊培養を行ってもよい。ここで、分離の方法としては、力学的、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する分離溶液例えば、AccutaseおよびAccumaxが挙げられるまたはコラゲナーゼ活性のみを有する分離液またはEDTA溶液例えば、05mMEDTA溶液を用いても良い。ここで、接着培養においては、コーティング処理された培養皿にて、任意の培地中で培養する。コーティング剤としては、例えば、マトリゲルBD、I型コラーゲン、IV型コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、またはエンタクチン、およびこれらの組み合わせが挙げられる。好ましくは、ゼラチンまたはIV型コラーゲンである。また、共培養に用いられる細胞は、OP9細胞またはEND2細胞MummeryCetalCirculation107273340が例示される。浮遊培養は、細胞接着特性を向上させるための人工的な処理例えば、細胞外マトリクスなどによるコート処理がされていない培養皿、または接着を人工的に抑制するための処理例えば、ポリヒドロキシエチルメタクリレートHEMAによるコート処理がされた培養皿を用いて行うことができる。しかしながら、これらの例には限定されない。他の態様では、浮遊培養と付着培養との組み合わせ法がなされる。好ましくは、浮遊培養の後に付着培養がなされる。本工程における培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えばIMDM培地、Medium199培地、Eagle’sMinimumEssentialMedium培地、αMEM培地、Dulbecco’smodifiedEagle’sMedium培地、Ham’sF12培地、RPMI1640培地、Fischer’s培地、およびこれらの混合培地などが包含される。好ましくは、αMEMまたはDMEMである。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、例えば、アルブミン、トランスフェリン、KnockoutSerumReplacement、B27Supplement、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2メルカプトエタノール、3’チオールグリセロールなどの1つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、Lグルタミン、GlutamaxInvitrogen、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、Dkk1、シクロスポリンAなどの1つ以上の物質も含有しうる。本発明において好ましい増殖因子として、bFGF、アクチビンAおよびBMP4が例示される。好ましい培地として、10FBSを含有するαMEM培地、1~3μgmLのシクロスポリンAおよび10FBSを含有するαMEM培地、ならびに10FBSを含有するDMEM培地が例示される。培養温度は、以下に限定されないが、約30~40°C、好ましくは約37°Cであり、CO2含有空気の雰囲気下で培養が行われ、CO2濃度は、好ましくは約2~5である。培養時間は、心筋トロポニンおよびまたはαMHCが発現するために必要な日数であり、例えば10日から20日間である。好ましい条件として、10FBSを含有するαMEM培地で4日間培養後、Flk1陽性細胞を単離し、3μgmLのシクロスポリンAおよび10FBSを含有するαMEM培地を用いてOP9細胞と6日間共培養する条件、もしくは10FBSを含有するDMEM培地を用いてEND2細胞と16日間共培養する条件が挙げられる。本発明は、心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞増殖剤のスクリーニング方法を提供する。心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞増殖剤は、多能性幹細胞の分化誘導によって得られた心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞を増殖させるために使用でき、また、心筋細胞の欠損によって生じる疾患の治療薬としても使用できる。心筋細胞の欠損によって生じる疾患としては心筋炎や心筋梗塞が例示されるが、これらには限定されない。心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞増殖剤のスクリーニング方法の例としては、以下の工程を含む方法が挙げられる。1-1試験物質を、多能性幹細胞を分化誘導して得られた心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞に接触させる工程、1-2工程1-1の後に心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞の数を計測する工程、及び1-3心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞の数が、試験物質と接触させないときの心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞の数参照の数よりも大きい場合に、該試験物質を心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞増殖剤として選択する工程。多能性幹細胞の分化誘導によって得られた心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞の好ましい例としては、多能性幹細胞を、10FBSを含むαMEMで約4日間、次いで、Flk1陽性細胞を単離し、該Flk1陽性細胞を、OP9細胞の存在下、3μgmLのシクロスポリンAおよび10FBSを含むαMEMを用いて約6日間培養することによって得られた心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞が挙げられる。心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞増殖剤のスクリーニング方法の他の例としては、以下の工程を含む方法が挙げられる。2-1試験物質を、多能性幹細胞を分化誘導して得られた心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞に接触させる工程、2-2工程2-1の後に心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞の数を計測する工程、及び2-3心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞の数が、心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞増殖能を有する陽性コントロール物質と接触させたときの心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞の数参照の数と比べて同等または大きい場合に、該試験物質を心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞増殖剤として選択する工程。数は参照の数と実質的に同等であれば、参照の数と同等と言うことができ、例えば、計測された数と参照の数の違いは約5以内、好ましくは約1以内である。陽性コントロール薬剤の例としては、GSK3β阻害剤、ERK脱リン酸化阻害剤、Raf活性化剤、CaMK2阻害剤およびp38阻害剤が挙げられる。心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞の数は、例えば、顕微鏡下で一定の領域あたりの心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞の数を計測すること、またはフローサイトメーターを用いて一定細胞数当たりの心筋マーカー陽性細胞を計測することにより計測することができる。心筋マーカーの例としては、心筋トロポニン、αMHC、CD166、Nカドヘリン、ならびにVCAM1が挙げられる。本発明のスクリーニング方法においては、任意の試験物質が使用でき、試験物質の例としては、細胞抽出物、細胞培養上清、微生物発酵物、海洋生物由来抽出物、植物抽出物、精製および粗精製タンパク質、ペプチド、非ペプチド化合物、合成低分子化合物、および天然化合物が含まれる。試験物質は、1生物学ライブラリー法、2デコンボリューションを用いた合成ライブラリー法、31ビーズ1化合物ライブラリー法、4アフィニティクロマトグラフィー選択を利用した合成ライブラリー法などの公知のコンビナトリアルライブラリー法の多くの手法を用いて得ることができる。アフィニティクロマトグラフィー選択を利用した合成ライブラリー法の利用はペプチドライブラリーには限定されず、他の手法がペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の低分子化合物ライブラリーAnticancerDrugDes1214567に適用できる。分子ライブラリーの合成法の例が知られているProcNatlAcadSciUSA90690913ErbetalProcNatlAcadSciUSA91114226ZuckermannetalJMedChem37267885ChoetalScience26113035CarelletalAngewChemIntEdEngl332059CarelletalAngewChemIntEdEngl332061GallopetalJMedChem37123351。化合物ライブラリーは、溶液HoughtenBioTechniques1341221、ビーズNature354824、チップNature3645556、細菌、胞子、プラスミドProcNatlAcadSciUSA8918659またはファージScience24938690DevlinScience2494046CwirlaetalProcNatlAcadSciUSA87637882FeliciJMolBiol22230110US2002103360として調製されてもよい。薬剤スクリーニングキット本発明は、心筋細胞およびまたは心筋前駆細胞増殖剤をスクリーニングするためのキットを提供する。該キットは上記細胞、試薬、及び培地を含んでもよい。該キットはさらに、分化誘導プロトコルを記載した文書または仕様説明書を含んでもよい。以下の実施例は本発明を説明するために示し、本発明の範囲を何ら限定するものではない。細胞および培養マウスES細胞は、E14Tg2aの一方のアリルにおいてOct34遺伝子領域へIRESBSDpAをKnockinすることで作製されたES細胞株EB3NiwaHetalNatGenet243726へalphaMHCのプロモーターによりGFPの発現が制御されるベクターを導入したEMG7を用いた。ヒトiPS細胞253G1は、京都大学の山中教授より受領し、従来の方法で培養したNakagawaMetalNatBiotechnol261016。尚、253G1は、理研BRCより入手可能である。心筋細胞への分化誘導方法マウスES細胞株EMG7を01ゼラチンコートディッシュ上で10FBS含有alphaMEM培地を用いて108から110時間培養した。続いて、Flk1陽性細胞をFACSを用いて単離し、OP9細胞上で3μgmlのCyclosporineAを含有する培地10FBS含有alphaMEMを用いて6日間培養して心筋細胞へ分化誘導した。この細胞をFlkd6と称す。ヒトiPS細胞株253G1を用いて、MummeryCetalCirculation107273340に記載の方法により心筋細胞へ分化誘導した。簡潔には、253G1細胞を10FCS含有DMEM培地を用いて16日間END2細胞と共培養することで行った。実施例1心筋細胞増殖促進剤のスクリーニングEMG7から分化誘導した上述のFlkd6からalphaMHCGFPを指標としてFACSで純化した。得られた細胞に282個の候補薬剤を加えて培養し、5日後に、無添加群と比較してalphaMHCGFP陽性細胞数が15倍以上であった薬剤を9種選択した。そのうち作用機序が異なるものを7剤選択した。さらに、これらの7剤のうち添加後のalphaMHCGFP細胞数を有意に増加させる1μMのBIO、5μMのSU1498および5μMのKN93wakoを再選択した図1a。これらの3剤をFlkd6へ添加して2日間培養Flkd62または5日間培養Flkd65した時のalphaMHCGFP陽性細胞数をFACSで測定したところ、特にFlkd65において陽性細胞数の有意な増加が確認された図1b。実施例2心筋細胞増殖促進剤の細胞周期へ与える影響細胞周期へ与える影響を確認するため、ヒストン3のリン酸化pH3M期およびエチニルウリジンEdUS期の陽性細胞数を確認した図2a~d。BIOは添加後早期からS期M期を促進することが確認された。実施例3同じ作用を有する他剤の効果GSK3β阻害剤およびCa2カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ2CaMK2阻害剤について、同様にFlkd65においてその効果を確認したところ、CHIR99021およびKN62においても同様の効果を有することを確認した図3ab。さらに、CaMK2の各サブタイプのsiRNA表1により遺伝子を抑制したところ、Camk2dおよびCamk2gを抑制した時に有意に心筋細胞増殖促進効果が高かった図3c。また、SU1498のメカニズムを確認するため、MEK阻害剤であるPD98059と同時に添加したところその効果がなくなったことから図3d、SU1498はERKのリン酸化を保持することにより心筋細胞の増殖を促進させていると示唆された。これより、Raf活性化剤であるZM336372についても検討したところ、SU1498と同様に心筋細胞増殖促進効果を有していることが確認された図3d。実施例4組み合わせによる効果および細胞周期関連遺伝子の発現についてp38の阻害剤にも心筋細胞の増殖の促進効果が報告されていることからEngelFBetalProcNatlAcadSciUSA1031554651、p38阻害剤であるSB203580を含めて、以下の組み合わせによる効果を検討した。濃度は、実施例1に記載したものと同様である。1BIOSU14982BIOKN933SU1498KN934BIOSU1498KN935SB2035806BIOSU1498SB2035807BIOKN93SB203580いずれの組み合わせも対照である基剤のみを加えた時より、EMG7由来のFlkd65においてalphaMHCGFP陽性細胞数を増加させた。特に、1、2、6および7の組み合わせにおいてその効果が高いことが確認された図4a。続いて、CyclinA2、CyclinB2、CyclinD1、CyclinD2、CyclinD3、Cdk2、cdk4およびInk4bの細胞周期関連遺伝子の発現に与える影響をPCRで確認したところ、BIOSUおよびBIOKN93の組み合わせにおいて、CyclinA2、CyclinD2、CyclinD3、Cdk2およびcdk4において対照と比較して有意にその発現量を上げることが確認された。また逆に、Ink4bの発現を減少させることも確認された図4bからi。実施例5ヒトiPS細胞由来の心筋細胞に対する効果253G1を上述の方法で心筋細胞へ分化し、各薬剤を4日間添加したときのtroponinTtype2cTnT陽性細胞数を検出したところ、BIO、SU1498、BIOSU1498SB203580およびBIOKN93SB203580において対照より比較的多く、特にBIOSU1498SB203580の場合、有意に当該細胞数が多かった図5a。この時のpH3およびEdUの免疫染色の陽性率を検討したところ、EdUの陽性率において、対照113±10に比べて、BIO160±05、SU1498143±04、SB203580146±21、BIOSU1498SB203580199±14およびBIOKN93SB203580163±43と陽性率が高かった図5b。