"フザリン酸を含む培地中でヒト神経前駆細胞を培養することを含むヒト神経前駆細胞のドーパミン性ニューロンへの分化方法。前記培地が、ジブチリル環状アデノシンモノホスフェートdb-cAMP、フォルスコリン、B27、ソニックヘッジホッグSHH及び線維芽細胞増殖因子-8FGF8を含むドーパミン性ニューロン分化用培地に、フザリン酸を加えて調製されることを特徴とする請求項1に記載の分化方法。前記培地が、フザリン酸、db-cAMP、フォルスコリン及びB27を含むNB培地であることを特徴とする請求項1に記載の分化方法。前記培地が、50μMないし4mMのフザリン酸、50μMないし4mMのdb-cAMP、5ないし20μMのフォルスコリン及び0.5ないし5重量のB27を含むNB培地であることを特徴とする請求項3に記載の分化方法。前記培地が、100μMのフザリン酸、100μMのdb-cAMP、10μMのフォルスコリン及び2重量のB27を含むNB培地であることを特徴とする請求項3に記載の分化方法。前記培養が2ないし10の酸素分圧を有する低酸素条件で行われることを特徴とする請求項1ないし5のいずれか1項に記載の分化方法。フザリン酸、db-cAMP、フォルスコリン及びB27を含むNB培地である、ヒト神経前駆細胞のドーパミン性ニューロンへの分化用培地。50μMないし4mMのフザリン酸、50μMないし4mMのdb-cAMP、5ないし20μMのフォルスコリン及び0.5ないし5重量のB27を含むNB培地であることを特徴とする請求項7に記載の分化用培地。100μMのフザリン酸、100μMのdb-cAMP、10μMのフォルスコリン及び2重量のB27を含むNB培地であることを特徴とする請求項8に記載の分化用培地。本発明は、ヒト神経前駆細胞hNPCsを高い分化効率でドーパミン性ニューロンに分化させる方法、及び前記分化に有用な培地を提供する。特に、本発明は、分化誘導剤としてフザリン酸を使用してhNPCsをドーパミン性ニューロンに分化させる方法、及び前記分化に有用な培地を提供する。従って、新規の分化誘導剤を含む培地中で、ヒト神経前駆細胞をドーパミン性ニューロンに分化させる方法を提供することが本発明の目的である。また、ヒト神経前駆細胞をドーパミン性ニューロンに分化させるのに有用な分化用培地を提供することが本発明の他の目的である。本発明の一態様によって、フザリン酸を含む培地中でヒト神経前駆細胞を培養することを含む、ヒト神経前駆細胞のドーパミン性ニューロンへの分化方法が提供される。本発明の分化方法において、前記培地は、ジブチリル環状アデノシンモノホスフェートdb-cAMP:dibutyrylcyclicadenosinemonophosphate、フォルスコリン、B27、ソニックヘッジホッグSHH及び線維芽細胞増殖因子-8FGF8を含むドーパミン性ニューロン分化用培地に、フザリン酸を加えて調製してもよい。あるいは、本発明の分化方法において、前記培地は、フザリン酸、db-cAMP、フォルスコリン及びB27を含むNB培地であってよく、望ましくは、50μMないし4mMのフザリン酸、50μMないし4mMのdb-cAMP、5ないし20μMのフォルスコリン及び0.5ないし5重量のB27を含むNB培地であってもよい。さらに望ましくは、前記培地は、100μMのフザリン酸、100μMのdb-cAMP、10μMのフォルスコリン及び2重量のB27を含むNB培地であってもよい。本発明の分化方法において、前記培養は、2ないし10の酸素分圧を有する低酸素条件で行ってもよい。本発明の他の態様によって、ヒト神経前駆細胞のドーパミン性ニューロンへの分化用培地として、フザリン酸、db-cAMP、フォルスコリン及びB27を含むNB培地である分化用培地が提供される。前記分化用培地は、50μMないし4mMのフザリン酸、50μMないし4mMのdb-cAMP、5ないし20μMのフォルスコリン及び0.5ないし5重量のB27を含むNB培地であってよく、望ましくは、100μMのフザリン酸、100μMのdb-cAMP、10μMのフォルスコリン及び2重量のB27を含むNB培地であってもよい。フザリン酸存在下でヒト神経前駆細胞を培養することによって、ドーパミン性ニューロンへの分化が著しく増加することが本発明によって発見された。特に、本発明の分化方法は、高価な分化誘導剤として使用が制限されるSHH及びFGF8の代わりに、低廉なフザリン酸を使用して、ヒト神経前駆細胞をドーパミン性ニューロンに分化させることができるので、経済的である。また、本発明の分化方法は、従来の分化方法では不十分であった分化効率を著しく改善させることができる。従って、本発明の分化方法は、パーキンソン病を含む神経損傷治療のためのドーパミン性ニューロンの製造に適用される。本発明は、フザリン酸を含む培地中でヒト神経前駆細胞を培養することを含む、ヒト神経前駆細胞のドーパミン性ニューロンへの分化方法を提供する。前記ヒト神経前駆細胞は、以前に報告された方法、例えば、Storchetal.2001;及びMilosevicetal.2006,2007に記述された方法によって得ることができる。本明細書で、ヒト神経前駆細胞というのは、ヒトの体内から分離された生体外exvivo細胞、すなわち、ヒトの体内から分離された後、通常の細胞培養によって増殖するヒト神経前駆細胞を意味する。前記ヒト神経前駆細胞は、幹細胞特性を有し、ニューロン、アストロサイトastrocyte、希突起神経膠細胞oligodendrocyteなどに分化する。本発明による分化方法は、フザリン酸を分化誘導剤として含む培地を使用して遂行される。前記フザリン酸は、化学名が5-ブチルピコリン酸5-butylpicolinicacidであって、下記化学式1の化学構造を有する。フザリン酸は、公知の物質であり、公知の方法によって製造することも商業的に購入することもできる例えば、SigmaAldrichなど。本発明の分化方法において、前記培地は、従来のドーパミン性ニューロン分化用培地にフザリン酸を加えて調製してもよい。例えば、前記培地は、ジブチリル環状アデノシンモノホスフェートdb-cAMP:dibutyrylcyclicadenosinemonophosphate、フォルスコリン、B27、SHHソニックヘッジホッグ及びFGF8線維芽細胞増殖因子-8を含む従来のドーパミン性ニューロン分化用培地に、フザリン酸を加えて調製してもよい。このとき、フザリン酸は、50μMないし4mMの濃度で加えられてもよい。前記db-cAMP、フォルスコリン、B27、SHH、FGF8は、いずれも一般的に使用される物質であり、商業的に購入することができる。例えば、db-cAMP及びフォルスコリンは、Sigma社から購入することができ、B27は、GIBCO社から購入することができ商品名:B-27minus-AOsupplement、SHH及びFGF8は、それぞれRDsystem社及びPeproTech社から購入することができる。一実施形態において、従来のドーパミン性ニューロン分化用培地にフザリン酸を加えて調製した培地は、50μMないし4mMのdb-cAMP、5μMないし20μMのフォルスコリン、0.5ないし5のB27、25ng/mlないし500ng/mlのSHH、10ng/mlないし200ng/mlのFGF8及び50μMないし4mMのフザリン酸を含むNB培地Neurobasalmediaであってもよい。この基本培地、すなわち、NB培地は、Invitrogen社などから購入することができる。望ましくは、本発明の分化方法に使用される培地は、使用が制限される高価なSHH及びFGF8を除いた培地である。驚くべきことに、SHH及びFGF8を含まずフザリン酸のみを含む培地によるドーパミン性ニューロンへの分化効率は、SHH、FGF8及びフザリン酸をすべて含む培地より高いことが本発明によって発見された。従って、本発明の分化方法において、前記培地は、フザリン酸、db-cAMP、フォルスコリン及びB27を含むNB培地であってよく、望ましくは、50μMないし4mMのフザリン酸、50μMないし4mMのdb-cAMP、5ないし20μMのフォルスコリン及び0.5ないし5重量のB27を含むNB培地であってもよい。さらに望ましくは、前記培地は、50μMないし1mMのフザリン酸、50μMないし1mMのdb-cAMP、5ないし15μMのフォルスコリン及び0.5ないし3重量のB27を含むNB培地であってもよい。一実施形態において、前記培地は、およそ100μMのフザリン酸、およそ100μMのdb-cAMP、およそ10μMのフォルスコリン及びおよそ2重量のB27を含むNB培地であってもよい。また、前記培地は、必要によって、ゲンタマイシンなどの抗生物質、またはL-グルタミンなどのアミノ酸を追加で含んでもよい。もちろん、前記抗生物質及びアミノ酸は、他の適切な物質で代替してもよい。本発明の分化方法において、前記培養は、従来の方法で使用される培養条件下で行うことができる。例えば、前記培養は、37°Cで7ないし14日、望ましくは、およそ7日間行われてもよい。低酸素分圧条件すなわち、低酸素条件下で培養することによって有意に高い分化効率を達成できることが本発明によって明らかになった。従って、本発明の分化方法において、前記培養は、2ないし10の酸素分圧を有する低酸素条件で行うことが望ましい。本発明の分化方法によって得られたドーパミン性ニューロンは、通常の方法で回収することができる。例えば、AccutasePAA社などの酵素を使用して細胞を分離した後、得られた細胞を1,000rpmで、およそ5分間遠心分離して上澄み液を取り除くことにより、分化した細胞を回収することができる。本発明はまた、ヒト神経前駆細胞のドーパミン性ニューロンへの分化用培地として、フザリン酸、db-cAMP、フォルスコリン及びB27を含むNB培地である分化用培地を提供する。前記分化用培地は、上述した通り、従来のドーパミン性ニューロン分化用培地にフザリン酸を加えて調製してもよい。上述した通り、前記分化用培地は、望ましくは、50μMないし4mMのフザリン酸、50μMないし4mMのdb-cAMP、5ないし20μMのフォルスコリン及び0.5ないし5重量のB27を含むNB培地であってよく、さらに望ましくは、50μMないし1mMのフザリン酸、50μMないし1mMのdb-cAMP、5ないし15μMのフォルスコリン及び0.5ないし3重量のB27を含むNB培地であってもよい。最も望ましくは、前記培地は、およそ100μMのフザリン酸、およそ100μMのdb-cAMP、およそ10μMのフォルスコリン及びおよそ2重量のB27を含むNB培地であってもよい。また、前記培地は、必要によって、ゲンタマイシンなどの抗生物質、またはL-グルタミンなどのアミノ酸を追加で含んでもよい。もちろん、前記抗生物質及びアミノ酸は、他の適切な物質で代替してもよい。以下、本発明について実施例によりさらに詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、説明のためだけに提供されるものであり、よって本発明はそれらによって限定されるものではない。1.材料及び試験方法1ヒト神経前駆細胞hNPCsの分離母体の子宮筋無力症uterineatoniesによって流産したおよそ14週齢の胎児から、ヒト神経前駆細胞を分離した。前記胎児サンプルは、事前に胎児の親からインフォームドコンセントinformedconsentを得た上で取得した。サンプルの収集及び研究目的のためのその使用は、チャCHA病院の倫理委員会から承認を受けた。Storchetal.2001及びMilosevicetal.2006,2007などに開示された方法によって、ヒト神経前駆細胞を分離した。14週齢の胎児の脳組織から中脳腹側部の組織ventralmidbraintissueを分離した後、0.1mg/mlのパパイン及び100μg/mlのDNaseを含む溶液中で、37°Cでおよそ30分間処理して、単一細胞に分散した懸濁液を得た。前記懸濁液を、リン酸緩衝食塩水PBSで洗浄し、50μg/mlのアンチパイン中で、37°Cで30分間インキュベーションした。15μg/mlのポリ-L-オルニチン及び4μg/mlのフィブロネクチンでコーティングした培養皿に、得られたヒト神経前駆細胞hNPCsを30,000cells/cm2の密度で単層になるよう播種して培養した。2分化及び分離ドーパミン性ニューロンへの分化は別段の記載がない限り、以下の方法で行った。hNPCsを、15μg/mlのポリ-L-オルニチン及び4μg/mlのフィブロネクチンでコーティングした培養皿に、30,000cells/cm2の密度で播種し、2日または3日経過したところで、細胞を2のB-27minus-AOsupplementGIBCO社、10μMのフォルスコリン、1mMのdb-cAMP及び1mMのフザリン酸などの分化誘導剤を含むNB培地中で、37°Cで7日間培養した。分化した細胞、すなわち、ドーパミン性ニューロンは、次のようにして回収した:培養皿から培地を取り除き、細胞を緩衝液で洗浄した後、AccutasePAA社で30分間処理して、細胞を分離した。細胞を再び緩衝液で洗浄した後、1,000rpmでおよそ5分間遠心分離した。上澄み液を取り除いて、分化したドーパミン性ニューロンを回収した。3RNA抽出、逆転写及び定量的リアルタイムPCR全細胞RNAは、トリゾール及びクロロホルムを使用してhNPCsから抽出した。500ngの全RNAから、RNASuperscriptIIRTase、Oligo-dTプライマー、DTT及びdNTPsを使用し、製造元のプロトコールに従ってcDNAを合成した。PCRは、1μlのcDNA及び1μlの10pMプライマーを含む最終容積20μl中、SYBR-Greenmixtureを使用して遂行した。内部コントロールとしてRPL22を使用して、TH、DAT、GFAP、Nurr1、Tuj1及びLmx1aの発現を分析した。定量的リアルタイムPCRは、LightCyclerSystemを使用して遂行した。蛍光染色剤であるSYBRGreenの二本鎖DNAとの結合量を測定することによって、増幅をモニタリングして分析した。標的DNAは、95°Cで10秒、60°Cで10秒、72°Cで20秒の条件で、全40サイクルを遂行して増幅した。最終伸長extensionは、72°Cで10分間行った。結果は、比較Ct法により、遺伝子RPL22に対して相対的に示した。前記PCRに使用したプライマーは、次の表1の通りである。4免疫細胞化学immunocytochemistryhNPCsをPBSで3回洗浄し、4パラホルムアルデヒドを含むPBSで10分間処理して固定した。細胞をPBSで3回洗浄した後、3正常ヤギ血清、0.2トリトンX-100及び1BSAを含むPBSと室温で1時間反応させてブロッキングした。細胞を一次抗体、すなわち、抗THrabbitanti-TH、Pelfreez、抗Tuj1mouseanti-Tuj1Millipore、CA、USA、抗ネスチンrabbitanti-nestin、COVANCE、CA、USA、抗GFAP、抗Ki67、抗O4、抗Sox2、抗VMAT2、抗Pitx3、抗DAT、抗Nurr1、抗NeuN、抗GIRK2、抗Cal28K、抗グルタミン酸、抗GABA、抗ChAT、及び抗5-HTrabbitanti-5-HT、ImmunoStarと共に、4°Cで一晩中インキュベーションした後、PBSで3回洗浄した。次いで、細胞を二次抗体、すなわち、抗マウスAlexaFluorTM488、抗マウスAlexaFluorTM594、抗ウサギAlexaFluorTM488及び抗ウサギAlexaFluorTM594と共に、室温で60分間インキュベーションした後、DAPI4’,6-diamidino-2-phenylindoleで染色counterstainingした。5免疫ブロッティングimmunoblottingタンパク質は、プロテアーゼインヒビターPIRocheMolecularBiochemicalsを含むRIPA緩衝液[10mMHEPES-KOHpH7.9、10mMKCl、1.5mMMgCl2、0.1NP-40]で抽出した。BCA法Pierceにより、タンパク質濃度を測定した。タンパク質を、SDS-10ポリアクリルアミドゲル上で分離した後、PVDF膜に転写した。前記膜を、5スキムミルクskimmilkを含むTBS-T緩衝液を用いて室温で2時間ブロッキングした後、一次抗体、すなわち、抗THrabbitanti-TH、Pelfreez、1:1000、抗Tuj1rabbitanti-Tuj1COVANCE、1:5000、抗ネスチンrabbitanti-Nestin、Abcam、1:1000、抗Sox2、抗Bcl2、抗PCNA、抗VMAT2、抗Pitx3、抗DAT、抗Nurr1、及び抗アクチンrabbitanti-Actin、SantaCruz、1:5000と共に、4°Cで一晩中インキュベーションした。前記膜は、HRPhorseradishperoxidaseが結合conjugationした抗マウス及び抗ウサギの二次抗体と共に、1時間室温でインキュベーションした後、化学発光ウェスタンブロット検出試薬chemiluminescencewesternblotdetectionreagentsと反応させた。2.結果及び考察1分化条件培地条件の評価Neurobasal培地[differentiationmediumDMcontrol]にインターロイキン1β、db-cAMP及びフザリン酸Fusを多様な濃度及び組み合わせで加えて得られた培地中で、hNPCsをドーパミン性ニューロンに分化させた。ドーパミン性ニューロンのマーカーであるTH、及び神経マーカーであるTuj1を、DAPI染色を介して測定した図1。図1の結果から、db-cAMP及びフザリン酸を含む培地を使用した場合、TH及びTuj1の発現レベルが最も高い、すなわち、分化効率が最も高いことが分かる。また、db-cAMP及びフザリン酸をそれぞれ100μMの濃度で使用した場合、最も高い分化効率が得られることが分かる。DMEM/F121:1Glutamax培地中でhNPCsを増殖させた後、2のB-27minus-AOsupplementGIBCO社、10μMのフォルスコリン及び1mMのdb-cAMPを含み、かつフザリン酸100μMを含むまたは含まないNeurobasalNB培地中でニューロンに分化させた。分化誘導後、TH及びTuj1の発現レベルを測定した図2。免疫細胞化学分析及びRT-PCR分析の結果を図3に示す。図2及び図3の結果から、フザリン酸を添加した場合、ドーパミン性ニューロンのマーカーであるTHが、著しく高く発現していることが分かる。また、フザリン酸を添加すると、神経マーカーであるTuj1の発現もまた増加した。使用が制限される高価な分化誘導剤SHH及びFGF8に対する代替可能性を評価するために、DMEM/F121:1Glutamax培地中でhNPCsを増殖させた。2のB27、200ng/mlのSHH、25ng/mlのFGF8、10μMのフォルスコリン、100μMのフザリン酸及び100μMのdb-cAMPを使用して、NeurobasalNB培地Invitrogen社中で分化を誘導した後、THの発現レベルを測定した図4。図4の結果から、SHH及びFGF8の代わりにフザリン酸で処理した場合に、細胞は最も効果的にドーパミン性ニューロンに分化することが分かる。また、SHH及びFGF8に追加でフザリン酸を加えた場合にも、ドーパミン性ニューロンへの分化が増加した。従って、前記図1ないし図4の結果から、フザリン酸を含む培地中でhNPCsの分化を誘導することにより、ドーパミン性ニューロンへの有意に高い分化効率を達成することが可能であることが分かる。2分化条件培養条件の評価DMEM/F121:1Glutamax培地中でhNPCsを増殖させた後、2のB27、10μMのフォルスコリン、100μMのフザリン酸及び100μMのdb-cAMPを含むNeurobasalNB培地Invitrogen社中、低酸素条件3の酸素分圧下または正常酸素条件21の酸素分圧下で分化させた。分化誘導後、THの発現レベルを測定した図5。図5の結果から、細胞は、低酸素条件において、正常酸素条件より効率的にドーパミン性ニューロンに分化することが分かる。3フザリン酸の神経保護効果の分析1-メチル-4-フェニルピリジウムMPP:1-methyl-4-phenylpyridiumは、ドーパミン性ニューロンに対して細胞毒性を示すことが知られている。従って、MPP存在下における分化誘導により、分化過程でのフザリン酸の機能を評価した図6。図6の結果から、フザリン酸を含む培地で分化を誘導した方が、MPP処理下でも、THを発現する細胞が多く生存していることが分かる。また、神経マーカーであるTuj1も相対的に多く発現していた。これらの結果から、フザリン酸は神経保護活性を有し、その結果、THを発現する細胞の生存に影響を及ぼし、相対的により多くのドーパミン性ニューロンを生存させるということが示唆される。4分化/増殖の評価DMEM/F121:1Glutamax培地中でhNPCsを増殖させた後、2日に1回培地を替えつつ、3の酸素分圧の条件下で連続的に継代培養した。初期継代第7継代、中間継代第11継代、後期継代第17継代で得られたhNPCsを、2のB27、10μMのフォルスコリン、100μMのフザリン酸及び100μMのdb-cAMPを含むNB培地Invitrogen社中、3の酸素分圧の条件下で7日間培養して分化させた。初期継代第7継代、中間継代第11継代、後期継代第17継代で得られたそれぞれの細胞増殖細胞及び分化細胞におけるTH及びTuj1の発現レベルを測定した図7。免疫細胞化学法により、細胞でのTH発現レベルを測定した図8。また、免疫細胞化学法により、ネスチン神経幹細胞マーカー、Ki67増殖性細胞マーカー及びTuj1神経マーカーの発現レベルを測定した図9。本発明によって分化した細胞中のTH陽性細胞数は、非分化誘導細胞すなわち、増殖細胞中のそれに比べて20以上増加した。分化効率は、継代回数の増加と共に、およそ30まで上昇した図7のA参照。また、分化後のTuj1陽性細胞数も、分化前のおよそ10から、40ないし45まで増加し、これは、後期継代でも変わらなかった図7のB参照。前記結果は、TH陽性細胞に対する免疫細胞化学分析の結果とも一致しており、分化効率は、継代が後期になるにつれて上昇した図8参照。分化後のネスチン及びki67の発現は減少したが、一方でTuj1発現は増加した図9参照。このような結果は、分化が進行するにつれて、増殖する細胞が幹細胞特性を徐々に失い、成熟したニューロンに分化することを示している。また、初期継代第7継代のhNPCに対して行った蛍光活性化細胞選別分析FACSanalysisの結果、神経幹細胞の表面マーカー、すなわち、CD15,184及び133は分化後、分化前より有意に減少した図10参照。このような結果は、細胞が幹細胞の特性を失い、分化細胞に変化していることを示す。また、RT-PCR分析の結果、継代回数の増加と共に、ドーパミン性ニューロンのマーカーであるTHの発現は正常に維持されたが、神経マーカーであるTuj1の発現は増加し、神経幹細胞マーカーであるネスチン、sox2、musashi1の発現は減少した図11のA参照。ウェスタンブロット分析の結果、継代回数の増加と共に、THの発現は正常に維持されたが、Tuj1の発現は増加し、ネスチン、sox2の発現は減少した図11のB参照。これは、RT-PCR分析の結果と同様であった。また、Bcl2抗アポトーシスマーカー及びPCNA増殖マーカーも減少した図11のB参照。従って、前記図7ないし図11の結果から、後期継代まで細胞を培養した後、前記分化培地で分化させた場合、初期継代の細胞と同様の分化効率で分化が誘導されることが分かる。5分化したドーパミン性ニューロンの特性分析hNPCsを、2のB27、10μMのフォルスコリン、100μMのフザリン酸及び100μMのdb-cAMPを含むNB培地Invitrogen社中、3の酸素分圧の条件で14日間培養して分化させた。得られた細胞におけるTHの発現及び成熟したドーパミン性ニューロンのマーカーNeuN、VMAT2、Nurr1及びPitx3の発現を、免疫細胞化学法で測定した図12のA。TH発現細胞のタイプA9タイプまたはA10タイプを確認するために、Girk2及びcal28Kの発現を、免疫細胞化学法で測定した図12のB。Girk2及びTHが同時に発現している場合、細胞はA9タイプと見なされる。cal28K及びTHが同時に発現している場合、細胞はA10タイプと見なされる。図12の結果から、本発明の分化方法によって得られたドーパミン性ニューロンは、A9タイプの成熟したドーパミン性ニューロンであることが分かる。また、RT-PCR分析の結果、THと共に、VMAT2、Pitx3、DAT、Nurr1などの成熟ドーパミン性ニューロンのマーカーは分化後、分化前-より著しく増加した図13のA。ウェスタンブロット分析において、THと共に、VMAT2、Pitx3、DAT、Nurr1などの成熟ドーパミン性ニューロンのマーカーは分化後、分化前-より著しく増加した図13のB。このような結果は、免疫細胞化学分析の結果とも一致した図13のC。成熟ドーパミン性ニューロンのマーカーは、分化誘導後7日から14日の間に顕著に増加することを免疫細胞化学法により確認した。また、他のサブタイプsubtypeのニューロンへの分化を確認するために、グルタミン酸、GABA、ChAT及びセロトニンの発現を、免疫細胞化学法で測定した図14。図14の結果から、他のサブタイプのニューロンは、ドーパミン性ニューロンより発現が有意に少ないことが分かる。"