"RAF阻害剤と第二の阻害剤とを用いた併用療法での治療によって利益を得る可能性が高い癌を有する被験者を同定する方法であって、該方法は:a被験者から得られた癌細胞中のMAP3K8TPL2/COT、RAF1CRAF、CRKLCrkL、FGRFgr、PRKCEPrkce、PRKCHPrkch、ERBB2ErbB2、AXLAxl、または、PAK3Pak3からなる群より選択される1種またはそれより多くの標的キナーゼの遺伝子コピー数、mRNAもしくはタンパク質レベルまたはリン酸化を分析し、遺伝子コピー数、mRNAもしくはタンパク質レベルまたはリン酸化を、癌を有さない被験者から得られた細胞中の標的キナーゼの遺伝子コピー数、mRNAもしくはタンパク質レベルまたはリン酸化と比較すること;および、b癌を有さない被験者からの細胞と比較した、癌細胞中の標的キナーゼの遺伝子コピー数の増加、または、mRNA発現の変化、または、タンパク質の過剰発現もしくはリン酸化を、その癌を有する併用療法での治療によって利益を得る可能性が高い被験者と相関付けること、を含む、上記方法。c癌細胞から得られた核酸サンプルを、約アミノ酸位置600に突然変異を有するB-RAFポリペプチドをコードする核酸分子中の突然変異の存在について分析すること、および、d該突然変異のB-RAFポリペプチドをコードする核酸分子中における存在を、併用療法での治療によって利益を得る可能性が高い被験者と相関付けること、をさらに含む、請求項1に記載の方法。B-RAFをコードする核酸分子中の約アミノ酸位置600にバリンからグルタミン酸への突然変異V600Eの存在を、併用療法での治療によって利益を得る可能性が高い被験者と相関付けることを含む、請求項1に記載の方法。MAP3K8TPL/COTの遺伝子コピー数、mRNAまたはタンパク質レベルを分析することを含む、請求項1に記載の方法。アミノ酸S338におけるC-RAFのリン酸化を分析することを含む、請求項1に記載の方法。前記第二の阻害剤は、MEK阻害剤、CRAF阻害剤、CrkL阻害剤、または、TPL2/COT阻害剤である、請求項1に記載の方法。前記RAF阻害剤は、B-RAF阻害剤、または、pan-RAF阻害剤である、請求項1に記載の方法。前記RAF阻害剤は、RAF265、ソラフェニブ、SB590885、PLX4720、PLX4032、GDC-0879、および、ZM336372からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。前記被験者は、RAF阻害剤に対する先天的な耐性を有するか、または、RAF阻害剤に対する耐性を発生させる可能性が高い、請求項1に記載の方法。前記癌は、黒色腫、乳癌、結腸直腸癌、神経膠腫、肺癌、卵巣癌、肉腫、および、甲状腺癌からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。前記癌は、黒色腫である、請求項10に記載の方法。癌治療を必要とする被験者において癌を治療する方法であって、該方法は、被験者に、有効量のRAF阻害剤と有効量の第二の阻害剤とを投与することを含み、ここで第二の阻害剤は、MEK阻害剤、または、MAP3K8TPL2/COT阻害剤である、上記方法。前記被験者は、B-RAFに突然変異を含む癌細胞を有する、請求項12に記載の方法。前記被験者は、B-RAFV600E突然変異を含む癌細胞を有する、請求項12に記載の方法。被験者から得られた癌細胞中のMAP3K8TPL2/COT、RAF1CRAF、CRKLCrkL、FGRFgr、PRKCEPrkce、PRKCHPrkch、ERBB2ErbB2、AXLAxl、または、PAK3Pak3からなる群より選択される1種またはそれより多くの標的キナーゼの遺伝子コピー数、mRNAもしくはタンパク質レベルまたはリン酸化を分析し、その遺伝子コピー数、mRNAもしくはタンパク質レベルまたはリン酸化を、癌を有さない被験者から得られた細胞中の標的キナーゼの遺伝子コピー数、mRNAもしくはタンパク質レベルまたはリン酸化と比較すること;および、癌細胞中の標的キナーゼの遺伝子コピー数の増加、または、mRNA発現の変化、または、タンパク質の過剰発現もしくはリン酸化を示す被験者の中で、有効量のRAF阻害剤と有効量の第二の阻害剤とを被験者に投与すること、をさらに含む、請求項12に記載の方法。前記RAF阻害剤は、RAF265、ソラフェニブ、SB590885、PLX4720、PLX4032、GDC-0879、および、ZM336372からなる群より選択される、請求項12に記載の方法。前記MEK阻害剤は、CI-1040/PD184352、AZD6244、PD318088、PD98059、PD334581、RDEA119、6-メトキシ-7-3-モルホリン-4-イル-プロポキシ-4-4-フェノキシ-フェニルアミノ-キノリン-3-カルボニトリル、および、4-[3-クロロ-4-1-メチル-1H-イミダゾール-2-イルスルファニル-フェニルアミノ]-6-メトキシ-7-3-モルホリン-4-イル-プロポキシ-キノリン-3-カルボニトリルからなる群より選択される、請求項12に記載の方法。前記被験者は、RAF阻害剤に対する先天的な耐性を有するか、または、RAF阻害剤に対する耐性を発生させる可能性が高い、請求項12に記載の方法。前記癌は、黒色腫、乳癌、結腸直腸癌、神経膠腫、肺癌、卵巣癌、肉腫、および、甲状腺癌からなる群より選択される、請求項12に記載の方法。前記癌は、黒色腫である、請求項12に記載の方法。前記被験者は、MEK阻害剤に対する先天的な耐性を有するか、または、MEK阻害剤に対する耐性を発生させる可能性が高い、請求項12に記載の方法。前記第二の阻害剤は、MAP3K8TPL2/COT阻害剤である、請求項12に記載の方法。第一の阻害剤に対する耐性を付与する標的キナーゼを同定する方法であって:第一の阻害剤に対する感受性を有する細胞を培養すること;細胞培養物で複数のキナーゼORFクローンを発現させること、ここで、それぞれの細胞培養物が異なるキナーゼORFクローンを発現する;それぞれの細胞培養物を上記阻害剤に晒すこと;上記阻害剤に晒した後にコントロール細胞培養物よりも高い生存率を有する細胞培養物を同定することにより、第一の阻害剤に対する耐性を付与する1種またはそれより多くのキナーゼORFクローンを同定すること、を含む、上記方法。前記培養細胞は、RAF阻害剤に対する感受性を有する、請求項23に記載の方法。前記培養細胞は、MEK阻害剤に対する感受性を有する、請求項23に記載の方法。前記培養細胞は、B-RAF突然変異を含む、請求項23に記載の方法。前記培養細胞は、B-RAFV600E突然変異を含む、請求項26に記載の方法。前記培養細胞は、黒色腫細胞株を含む、請求項23に記載の方法。レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクター中の複数のキナーゼORFクローンを提供することを含む、請求項23に記載の方法。0036本発明は、癌治療における治療剤に対する耐性の発達、および、癌治療に対する耐性を与える標的の同定に関する。本発明はまた、有効な長期的な治療方策を容易にするための並行使用できる薬剤標的の同定、および、このような治療によって利益を得ると予想される患者の同定にも関する。いくつかの実施態様において、本発明は、キナーゼに関し、具体的にはMAPキナーゼ経路の構成要素に関する。[0037]本発明の実施において、特に他の指定がない限り、従来の分子生物学、免疫学、微生物学、細胞生物学および組換えDNA技術が用いられると予想され、これらの技術は当業界の技術の範囲内である。例えば、SambrookFritschandManiatisMOLECULARCLONINGALABORATORYMANUALCURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGYMETHODSINENZYMOLOGYシリーズPCR2APRACTICALAPPROACHANTIBODIESALABORATORYMANUALandANIMALCELLCULTUREDNACloningAPracticalApproachvolIIIOligonucleotideSynthesisNucleicAcidHybridizationTranscriptionandTranslationFundamentalVirology2ndEditionvolIIIを参照。0038分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼMAPKカスケードは、増殖因子、サイトカインおよび癌原遺伝子などの多様な細胞外の刺激に応答してシグナル伝達を調節する重要な細胞内シグナル伝達経路である。この経路を活性化すると、転写因子の活性化および遺伝子発現の変化が起り、最終的に細胞増殖、細胞周期調節、細胞生存、血管新生および細胞移動などの細胞機能における変化が起る。典型的なMAPKシグナル伝達は細胞表面上のチロシンキナーゼ受容体によって始動するが、インテグリン、ヘテロ三量体Gタンパク質およびサイトカイン受容体などのその他多くの細胞表面分子が、MAPKカスケードを活性化することができる。0039例えばチロシンキナーゼ受容体などの細胞表面の受容体に結合するリガンドは、典型的には受容体のリン酸化を引き起こす。アダプタータンパク質Grb2は活性化された受容体のリン酸化された細胞内ドメインに結合し、この結合により、SOS-IやCDC25などのグアニンヌクレオチド交換因子が細胞膜に補充される。これらのグアニンヌクレオチド交換因子はGTPアーゼRasと相互作用し、それらを活性化させる。一般的なRasアイソフォームとしては、K-Ras、N-Ras、H-Rasなどが挙げられる。Ras活性化後、Rasとの相互作用を介して細胞膜にセリン/スレオニンキナーゼRaf例えばA-Raf、B-RafまたはRaf-1が補充される。続いてRafはリン酸化される。Rafは、217位および221位における2つのセリン残基をリン酸化することにより直接的にMEKlおよびMEK2を活性化する。活性化後、MEKlおよびMEK2は、セリン/スレオニンキナーゼErklおよびErk2のチロシンTyr-185およびスレオニンThr-183残基をリン酸化し、その結果としてErkが活性化される。活性化されたErkは、サイトゾル中の様々な標的を調節したり、細胞核に移動させたりして、そこで遺伝子発現を調節する様々な転写因子をリン酸化する。Erkキナーゼは様々な標的を有しており、このような標的としては、EIk-I、c-Etsl、c-Ets2、p90RSKl、MNKl、MNK2、MSKl、MSK2およびTOBが挙げられる。前述の経路はMAPKシグナル伝達の典型的な例であるが、MAPK経路とその他のシグナル伝達カスケードとの間にかなりの混線がみられる。0040MAPKシグナル伝達における異常は、癌生物学において重要な役割がある。多くの癌でRas発現の変化は共通しており、Rasにおける突然変異の活性化も確認されている。このような突然変異は全ての癌の30に見出されており、特に膵臓癌90および結腸癌50でよくみられる。加えて、Raf突然変異の活性化は、黒色腫および卵巣癌でも確認されている。最も一般的な突然変異であるBRAFV600Eは、下流のMAPキナーゼ経路の構造的な活性化を引き起こし、これは、黒色腫細胞の増殖、軟寒天での増殖、および、腫瘍の異種移植片形成に必要である。ヒト癌におけるMAPKの過剰な活性化の明確な役割に基づいて、特定の阻害剤でMAPK経路の構成要素を標的化することは、癌治療の有望なアプローチである。しかしながら、患者は、先天的な耐性を有する場合もあるし、または、これらの有望な治療剤に対する耐性を獲得する場合もある。以下で、標的キナーゼ、診断剤および/または予後マーカーの同定、ならびにこのような先天的または後天的な耐性を有する患者のための治療法を説明する。0041ハイスループットの機能的なスクリーニング分析0042いくつかの形態において、本発明は、ハイスループットスクリーニング分析を用いて臨床的に有効な治療剤に対する耐性を生じさせることができる標的を同定する方法に関する。いくつかの実施態様において、本方法は、オープンリーディングフレームORFベースの、治療剤に対する耐性を発生させるキナーゼに関する機能的なスクリーニングを含む可能性がある。本方法は、腫瘍形成性の突然変異を有することがわかっているキナーゼを含む細胞株を提供することを含み得る。キナーゼORFのライブラリーは、それぞれライブラリーからの異なるORFを発現する複数のクローンをさらに評価できるように細胞株で個々に発現されたものでもよい。それぞれのクローンを、1細胞株中で既知のキナーゼの阻害剤に晒し、2阻害剤を使用しない細胞株中でのORF発現を基準として増殖の変化についてモニターしてもよい。ORF発現単独よりも正または負の増殖のいずれかの増殖作用を有する全てのクローンを除去する。続いて残りの異なるキナーゼを発現するクローンをそれぞれ、コントロールと処理済クローンとの生存率について比較し、ポジティブコントロールに標準化する。阻害剤での処理後の細胞生存率の増加によって、耐性を与えるORFが同定され、すなわちそれにより、追加の阻害剤を用いた治療のための標的キナーゼが同定される。いくつかの実施態様において、標準化平均からの2つの標準偏差より上位にスコア付けされたクローンは標的キナーゼである可能性があり、追加の阻害剤を用いた治療が被験者にとって有益であることを示す。0043一例として、これらに限定されないが、図5にB-RAF阻害に対する耐性を駆動させるキナーゼに関するハイスループットの機能的なスクリーニング分析の略図を示す。クローニングされた約600種のコレクションと配列が確認されたORFを集めたところ、全ての注釈がつけられたキナーゼセンターフォーキャンサーシステムバイオロジーBroadInstituteKinaseORFCollection、図1a、1b、表3の約75を占めていた。公共的に利用可能なコレクションは、すぐに様々な最終目的のための様々な発現ベクターに移すことができる。キナーゼORFコレクションを発現させるために、当業者によく知られたあらゆるタイプの発現ベクターを用いることができる。一例として、これらに限定されないが、キナーゼコレクションを発現させるために、哺乳動物細胞において高タイターのウイルスの生産および活発なORF発現が可能な、選択可能なエピトープ-タグを有するレンチウイルス発現ベクターを作製することができるpLX-BLAST-V5、図6a。0044RAF阻害を回避することができるキナーゼを同定するために、配列させたキナーゼORFコレクションを、RAFキナーゼ阻害剤PLX4720に対して感受性を有するB-RAFV600E悪性黒色腫細胞株のA375で安定して発現させてもよい図1a、1bおよび6c、表3。1μMのPLX4720で処理したORF発現細胞のクローンを、未処理細胞と比較した生存率に関してスクリーニングし、分析特異的なポジティブコントロール、MEK1S218/222DMEK1DDに標準化する表4。基準の生存率または増殖と比較して変化があったORFは解析から除去される。第二の阻害剤に関して耐性を付与する標的キナーゼを同定するために、標準化平均からの2つの標準偏差を上回るとスコア付けされたクローンをさらに評価してもよい。いくつかの実施態様において、標的キナーゼをコードする遺伝子は、MAP3K8TPL2/COT、RAF1CRAF、CRKLCrkL、FGRFgr、PRKCEPrkce、PRKCHPrkch、ERBB2ErbB2、AXLAxl、またはPAK3Pak3であり得る。いくつかの実施態様において、標的キナーゼをコードする遺伝子は、MAPK経路活性化因子であり得る。いくつかの実施態様において、標的キナーゼをコードする遺伝子は、直接MEKをリン酸化して活性化するMAP3キナーゼであり得る。いくつかの実施態様において、標的キナーゼをコードする遺伝子は、黒色腫において増幅されリン酸化されるアダプタータンパク質をコードしているものでもよい。0045その他の実施態様において、ORFコレクションは、例えば約600のアミノ酸位置におけるその他の突然変異例えばV600K、V600DおよびV600Rなどの、B-RAFに異なる突然変異を有する細胞株で安定して発現させることもできる。追加のB-RAF突然変異としては、DaviesetalNature4179499542002の表1で説明されている突然変異が挙げられる。これらに限定されないが、PLX4032;GDC-0879;RAF265;ソラフェニブ;SB590855、および/または、ZM336372などのその他のRAFキナーゼ阻害剤に対して感受性を有する細胞株を用いてもよい。いくつかの実施態様において、ORFコレクションは、MEK阻害剤に対する感受性を有する細胞株で安定して発現させることができる。MEK阻害剤の例としては、これらに限定されないが、AZD6244;CI-1040;PD184352;PD318088、PD98059、PD334581、RDEA119、6-メトキシ-7-3-モルホリン-4-イル-プロポキシ-4-4-フェノキシ-フェニルアミノ-キノリン-3-カルボニトリルおよび4-[3-クロロ-4-1-メチル-1H-イミダゾール-2-イルスルファニル-フェニルアミノ]-6-メトキシ-7-3-モルホリン-4-イル-プロポキシ-キノリン-3-カルボニトリルが挙げられる。以下で追加のRAFおよびMEK阻害剤を説明する。一例として、これらに限定されないが、典型的なRAF阻害剤としては表1に示されるものが挙げられ、典型的なMEK阻害剤としては表2に示されるものが挙げられる。0048標的化療法に対する先天的および後天的な抵抗性に関する診断/予後マーカー0049いくつかの形態において、本発明は、サンプル例えば癌患者由来の生体サンプル中の1種またはそれより多くの診断または予後マーカーの存在を検出する方法に関する。当業者によく知られた様々なスクリーニング方法を用いて、例えばDNA、RNAおよびタンパク質検出などの、サンプル中のマーカーの存在の検出が可能である。以下で説明される技術を用いて、患者から得られたサンプル中の標的キナーゼの存在または非存在を決定することができる。いくつかの実施態様において、患者は、例えばB-RAF阻害剤またはMEK阻害剤などのキナーゼを標的とする治療剤に対する先天的または後天的な耐性を有する可能性がある。例えば、患者は、B-RAF阻害剤のPLX4720、および/または、PLX4032に対する先天的または後天的な耐性を有する可能性がある。いくつかの実施態様において、患者は、MEK阻害剤のAZD6244に対する先天的または後天的な耐性を有する可能性がある。患者における1種またはそれより多くの標的キナーゼマーカーを同定することは、医師がその患者のための治療プロトコールを決定する手助けになる。例えば、1種またはそれより多くの標的キナーゼマーカーを有する患者の場合、医師は、以下でより詳細に説明されているような併用療法で患者を治療してもよい。0050いくつかの実施態様において、このような標的キナーゼとしては、これらに限定されないが、MAP3K8TPL2/COT、RAF1CRAF、CRKLCrkL、FGRFgr、PRKCEPrkce、PRKCHPrkch、ERBB2ErbB2、AXLAxl、またはPAK3Pak3が挙げられる。これらのマーカーは、標的キナーゼに関する遺伝子コピー数の増加、タンパク質発現の増加、1種またはそれより多くのMAPキナーゼ経路の構成要素のリン酸化、mRNA発現の変化などであり得る。0051一例として、これらに限定されないが、B-RAFに腫瘍形成性の突然変異を有する患者における活性化された標的キナーゼの同定は、患者に応じた治療プロトコールを特徴付けるために有用である可能性がある。例えばB-RAFV600E突然変異を有する患者において、RAF阻害剤単独で治療する場合、その患者が、所定期間の後にその治療に対して耐性を獲得する危険が比較的高いことを示す可能性がある。腫瘍形成性の突然変異を有する患者において、活性化された標的キナーゼがその患者で同定された場合、それは、治療プロトコールに第二の阻害剤を含める必要があることを示す可能性がある。0052活性化された標的キナーゼの同定としては、標的キナーゼの遺伝子コピー数の解析および標的キナーゼのコピー数の増加の同定がある。例えばMAP3K8のコピー数の増加は、特にその患者がB-RAFV600E突然変異も有する場合、その患者は先天的な耐性を有するか、または後天的な耐性を獲得したことを示す。0053いくつかの実施態様において、活性化された標的キナーゼの同定としては、標的キナーゼおよび/またはMAPキナーゼ経路の構成要素のリン酸化の解析がある。例えばS338におけるC-RAFのリン酸化は、特にその患者がB-RAFV600E突然変異も有する場合、その患者が先天的な耐性を有するか、または後天的な耐性を獲得したことを示す。いくつかの実施態様において、MEK/ERKリン酸化の増加の同定は、患者が先天的な耐性を有するか、または後天的な耐性を獲得したことを示す可能性がある。B-RAFV600E突然変異を有する患者におけるCOTタンパク質発現の増加によって、RAF阻害およびMEK阻害に対する耐性を予想できる可能性がある。0054活性化された標的キナーゼの同定としては、標的キナーゼのmRNA発現の解析がある。例えば、第一のキナーゼ阻害剤での最初の治療後のCOTのmRNA発現が増加していれば、その患者は、耐性を有するか、または耐性を獲得していることを示す。いくつかの実施態様において、第一のキナーゼ阻害剤は、RAF阻害剤またはMEK阻害剤であり得る。0055治療方法0056様々な実施態様において、本発明は、癌を有する患者を治療する方法を提供する。本方法は、概して、第一の阻害剤と第二の阻害剤との投与を含む。一方の阻害剤は、RAF阻害剤であってもよい。RAF阻害剤は、pan-RAF阻害剤であってもよいし、または、選択的なRAF阻害剤であってもよい。pan-RAF阻害剤としては、これらに限定されないが、RAF265、ソラフェニブ、またはSB590885が挙げられる。いくつかの実施態様において、RAF阻害剤は、B-RAF阻害剤である。いくつかの実施態様において、選択的なRAF阻害剤は、PLX4720、PLX4032、またはGDC-0879-Aである。一方の阻害剤は、MEK阻害剤表2の典型的なMEK阻害剤の説明を参照であってもよい。一方の阻害剤は、COT阻害剤であってもよい。COT阻害剤の例としては、これらに限定されないが、以下で説明されているようなshRNA阻害剤、または、低分子物質のCOT阻害剤、4-3-クロロ-4-フルオロフェニルアミノ-6-ピリジン-3-イル-メチルアミノ-3-シアノ-[1,7]-ナフチリジンEMD;TPL2阻害剤I;カタログ番号616373、PubChem番号:9549300が挙げられる。本発明の阻害剤は、1種またはそれより多くの標的キナーゼ、例えばMAP3K8TPL2/COT、RAF1CRAF、CRKLCrkL、FGRFgr、PRKCEPrkce、PRKCHPrkch、ERBB2ErbB2、AXLAxl、またはPAK3Pak3、または、その他のMAPキナーゼ経路の標的を阻害する。0057いくつかの実施態様において、有効量のRAF阻害剤と有効量のMAP3K8TPL2/COT阻害剤とを含む、癌の併用療法が提供される。また本発明において、有効量のRAF阻害剤と有効量のMEK阻害剤とを含む、癌の併用療法も提供される。それ以外の併用療法は、有効量のRAF阻害剤と、1またはそれより多くの以下:MAP3K8TPL2/COT、RAF1CRAF、CRKLCrkL、FGRFgr、PRKCEPrkce、PRKCHPrkch、ERBB2ErbB2、AXLAxl、またはPAK3Pak3によってコードされた遺伝子、mRNAまたはタンパク質を標的とする有効量の第二の阻害剤とを含む。本併用療法は、B-RAF突然変異細胞を含む癌を有する患者、具体的にはB-RAFV600E突然変異細胞を含む癌を有する患者を治療するのに適している。本発明はさらに、有効量のRAF阻害剤と有効量のMEK阻害剤とを含む癌の併用療法を提供し、ここで癌を有する被験者は、MAP3K8TPL2/COT発現または遺伝子コピー数が変化した細胞を含む。いくつかの実施態様において、MEK阻害剤は、CI-1040/PD184352またはAZD6244である。0058本明細書で示されるMEK阻害剤の例としては、これらに限定されないが、CI-1040、AZD6244、PD318088、PD98059、PD334581、RDEA119、6-メトキシ-7-3-モルホリン-4-イル-プロポキシ-4-4-フェノキシ-フェニルアミノ-キノリン-3-カルボニトリルまたは4-[3-クロロ-4-1-メチル-1H-イミダゾール-2-イルスルファニル-フェニルアミノ]-6-メトキシ-7-3-モルホリン-4-イル-プロポキシ-キノリン-3-カルボニトリル、ロシュRoche化合物RG7420、またはそれらの組み合わせが挙げられる。また当業界でよく知られている追加のMEK阻害剤を使用してもよい。0059前述の形態の代表的な実施態様において、本明細書で示されるRAF阻害剤は、PLX4720、PLX4032、BAY43-9006ソラフェニブ、ZM336372、RAF265、AAL-881、LBT-613、またはCJS352NVP-AAL881-NX以降、AAL881と称するであり、NVP-LBT613-AG-8LBT613は、イソキノリン化合物ノバルティスマサチューセッツ州ケンブリッジである。併用療法に有用な追加の典型的なRAF阻害剤としては、pan-RAF阻害剤、B-RAF阻害剤、A-RAF阻害剤、および、RAF-1阻害剤が挙げられる。代表的な実施態様において、併用療法に有用なRAF阻害剤としては、PLX4720、PLX4032、BAY43-9006ソラフェニブ、ZM336372、RAF265、AAL-881、LBT-613、および、CJS352が挙げられる。典型的なRAF阻害剤としてはさらに、PCT公報番号WO/2008/028141その全内容は、参照により本明細書に組み入れられるに記載の化合物も挙げられる。典型的なRAF阻害剤としてはさらに、PCT公報番号WO/2006/024836に記載されているキナゾリノン誘導体、および、PCT公報番号WO/2008/020203に記載されているピリジニルキナゾリンアミン誘導体これらの内容は参照により本明細書に組み入れられるも挙げられる。0060このような組み合わせの投与は、これらの組み合わせを一つの製剤または1回投与量で投与すること、これらの組み合わせの個々の薬剤を別々ではなく同時に投与すること、または、これらの組み合わせの個々の薬剤をあらゆる適切な経路で連続的にを投与すること、を含む。このような組み合わせの個々の薬剤の用量は、その組み合わせの一方の薬剤の投与を、その組み合わせの他方の薬剤と比較して回数を多くしなければならない場合がある。それゆえに、適切な投与を可能にするために、薬剤の組み合わせを含む1種またはそれより多くの投薬形態を含むパッケージ化された医薬品、および、薬剤の組み合わせの一方を含むが、組み合わせの他方の薬剤は含まない1種またはそれより多くの投薬形態を含むパッケージ化された医薬品を提供してもよい。0061薬剤は、1種またはそれより多くの非対称元素、例えばステレオジエン中心またはステレオジエン軸stereogenicaxes、例えば不斉炭素原子を含んでいてもよく、それによりその化合物は様々な立体異性体で存在することができる。このような化合物としては、例えばラセミ化合物または光学的に活性な形態が挙げられる。2種またはそれより多くの非対称元素を有する化合物の場合、そのような化合物はさらに、ジアステレオ異性体の混合物である可能性もある。不斉中心を有する化合物の場合、当然のことながら、あらゆる光学異性体およびそれらの混合物が包含される。加えて、炭素-炭素二重結合を有する化合物は、Z型およびE型で存在する可能性があり、そのような化合物の全ての異性体が本発明に含まれる。このような状況において、単一種のエナンチオマー光学的に活性な形態は、不斉合成、光学的に純粋な前駆体からの合成、または、ラセミ化合物の分解から得ることができる。またラセミ化合物の分解は、例えば分解試薬の存在下における結晶化、または、例えばキラルHPLCカラムを用いたクロマトグラフィーなどの従来の方法によっても達成することができる。0062他の規定または文章による明確な指定が特にない限り、本発明の併用療法において有用な化合物について述べられる場合、化合物の遊離塩基に加えて、その化合物全ての医薬的に許容される塩も包含される。好ましい塩は、塩酸塩である。0063用語医薬的に許容される塩は、親化合物の非毒性の酸または塩基付加塩を作製することにより親化合物を改変した、開示された化合物の誘導体を含み、さらに、このような化合物およびこのような塩の水和物などの医薬的に許容される溶媒和物も意味する。医薬的に許容される塩の例としては、これらに限定されないが、例えばアミンなどの塩基性残基の無機または有機酸付加塩;例えばカルボン酸などの酸性残基のアルカリまたは有機付加塩;など、および、前述の塩の1種またはそれより多くを含む組み合わせ、が挙げられる。医薬的に許容される塩としては、例えば非毒性の無機酸または有機酸から形成された親化合物の非毒性塩および第四アンモニウム塩が挙げられる。例えば、非毒性の酸性塩としては、例えば塩化水素酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸および硝酸などの無機酸から誘導された塩が挙げられ;その他の許容できる無機塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩およびセシウム塩などの金属塩;および、例えばカルシウム塩およびマグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩;および、前述の塩の1種またはそれより多くを含む組み合わせ、が挙げられる。0064医薬的に許容される有機塩としては、例えば酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パモ酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、メシル酸、エシル酸、ベシル酸、スルファニル酸、2-アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタン二スルホン酸、シュウ酸、イセチオン酸、HOOCCH2nCOOH式中nは、0~4であるなどの有機酸から製造された塩;有機アミン塩、例えば、トリエチルアミン塩、ピリジン塩、ピコリン塩、エタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、N,N’-ジベンジルエチレンジアミン塩;ならびに、アミノ酸性塩、例えばアルギン酸塩、アスパラギン酸塩、および、グルタミン酸塩、および、前述の塩の1種またはそれより多くを含む組み合わせ、が挙げられる。0065物質の組み合わせ例えばMEKとRAF阻害剤、または、RAFとCOT阻害剤、または、RAFと、MAP3K8TPL2/COT、RAF1CRAF、CRKLCrkL、FGRFgr、PRKCEPrkce、PRKCHPrkch、ERBB2ErbB2、AXLAxl、または、PAK3Pak3を標的とする阻害剤の有効量は、このような組み合わせで治療した障害の基準の臨床的に識別可能な徴候および症状からの識別可能な改善を提供するのに十分な量である。0066上記医薬品は、経口投与してもよいし、またはその他の形態で例えば直腸に投与してもよいし、または非経口の注射剤で投与してもよい。経口用投薬形態は、経口投与用に処方された、または、経口投与を目的とする1回投与量を含むものを意味する。経口用投薬形態は、例えば単回投与での投与用にパッケージ化されたマイクロカプセルまたはマイクロタブレットのような、複数のサブユニットを含むものでもよいし、または、そうでないものもあり得る。0067上記医薬品は、様々な形態で放出させることができる。放出しやすい形態は、瞬間放出、即時放出、制御放出および持続放出性の形態などを意味する。0068瞬間放出は、例えば、より迅速に溶解するように活性物質の正常な結晶形を改変することによって、活性物質が急速に溶解するように設計された投薬形態などを意味する。0069即時放出型は、例えば、投与後2時間以内に、好ましくは投与後1時間以内に、活性物質の約50より多くまたはそれに等しい量、または、より好ましくは活性物質の約75の量が放出される、従来の形態または非放出調節形態などを意味する。0070持続放出性または徐放性は、定常状態で投与した後、少なくとも約8時間、好ましくは少なくとも約12時間、より好ましくは約24時間、血中例えば血漿濃度が治療効果のある範囲内に、ただし毒性レベルより低く維持されるような速度で活性物質が放出されることを含む。用語定常状態は、所定の活性物質または活性物質の組み合わせの血漿濃度に到達させ、それを、その後の活性物質の投与によって、所定の活性物質の有効な治療的に有効な最低限のレベルよりも高く、かつ、所定の活性物質が毒性を示す最低限の血漿濃度よりも低いレベルに維持することを意味する。0071用語~を治療する、治療した、~を治療することまたは治療は、本明細書において、被験者において病気の症状の少なくとも1つを軽減する、減少させる、または緩和することを意味するものとして用いられる。例えば、治療は、疾患の1種または数種の症状の減少のこともあるし、または、疾患例えば癌などの完全な根絶のこともある。本発明の趣旨の範囲内で、用語~を治療するはまた、発病を止めること、発病を遅延させることすなわち、病気の臨床症状が現れる前の期間を遅延させること、および/または、病気を進行または悪化させる危険を減少させることも意味する。用語予防するは、本明細書において、被験者において病気の進行または持続または悪化を、必要に応じて予防する、遅延させる、または、治療する、または、これらの全てを意味するものとして用いられる。本発明の趣旨の範囲内で、病気は、癌に関連するものである。0072用語被験者または患者は、例えば、癌または直接的または間接的に癌に関連するあらゆる疾患に罹っている、またはそれらに苦しむ動物を意味することとする。被験者の例としては、哺乳動物、例えば、ヒト、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、マウス、ウサギ、ラット、および、ヒト以外のトランスジェニック動物が挙げられる。ある種の実施態様において、被験者はヒトであり、例えば、癌に罹っている、癌に罹る危険性がある、または、癌に罹っている可能性のあるヒトである。0073用語約またはおよそは通常、示された値または範囲の20以内、より好ましくは10以内、および、最も好ましくは5以内を意味する。あるいは、特に生物系において、用語約は、ほぼ対数すなわち、一桁の規模の範囲内を意味し、好ましくは、示された値の2倍以内を意味する。0074本発明を説明する文脈における特に以下の請求項に関する用語aおよびanおよびthe、ならびに類似の指示語の使用は、本明細書において特に他の指定がない限り、または文脈から明らかに矛盾していない限り、単数形と複数形の両方を包含するものと解釈される。用語~を含む、~を有する、~が挙げられる、および~を含むは、特に他の規定がない限りオープンエンドのすなわちこれらに限定されないが、~が挙げられるを意味する用語と解釈される。本明細書における値の範囲の詳述は、本明細書において特に他の指定がない限り、その範囲内に含まれる別々の値それぞれを個々に述べるための簡略的な表現方法として利用されているだけであって、別々の値はそれぞれ、本明細書において個々に列挙されたのものとして明細書に包含される。0075上記で述べたように、一形態において、本発明は、被験者において、癌の症状の少なくとも1つを治療する、それらの発症を予防する、止める、遅延させる、および/または、それらの症状を進行または悪化させる危険を減少するのに有用な複合薬を提供し、本発明は、被験者に、有効量のRAF阻害剤と有効量のMAP3K8TPL2/COT阻害剤、または、有効量のRAF阻害剤と有効量のMEK阻害剤、または、有効量のRAF阻害剤と、MAP3K8TPL2/COT、RAF1CRAF、CRKLCrkL、FGRFgr、PRKCEPrkce、PRKCHPrkch、ERBB2ErbB2、AXLAxl、または、PAK3Pak3を標的とする有効量の第二の阻害剤を含む併用療法剤を投与することを含む。好ましくは、これらの阻害剤は、組み合わされた場合に有益な作用を提供するような治療上有効な投与量で投与される。これらの投与は、同時でもよいし、または連続でもよい。0076用語癌は、本明細書において、あらゆる固形腫瘍および血液学的な悪性疾患などを含む様々な腫瘍を意味するものとして用いられる。このような腫瘍の例としては、これらに限定されないが、白血病、リンパ腫、骨髄腫、癌腫、転移性癌、肉腫、腺腫、神経系癌、および、尿生殖器癌が挙げられる。代表的な実施態様において、前述の方法は、成人および小児の急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、AIDS関連の癌、肛門癌、虫垂癌、星状細胞腫、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨肉腫、線維性組織球腫、脳腫瘍、脳幹グリオーマ、小脳星状細胞腫、悪性神経膠腫、脳室上皮腫、髄芽細胞腫、テント上原始神経外胚葉腫瘍、視床下部膠腫、乳癌、男性乳癌、気管支腺腫、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、原発不明癌、中枢神経系リンパ腫、小脳星状細胞腫、悪性神経膠腫、子宮頚癌、小児癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、結腸直腸癌、皮膚T細胞リンパ腫、子宮内膜癌、脳室上皮腫、食道癌、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝臓外胆管癌、眼内黒色腫、網膜芽腫、胆嚢癌、胃癌、消化管間質腫瘍、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛性腫瘍、神経膠腫、ヘアリーセル白血病、頭頸部癌、肝細胞癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、視床下部および視覚路の神経膠腫、眼内黒色腫、島細胞腫、カポジ肉腫、腎臓癌、腎細胞癌、喉頭癌、口唇および口腔癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、中枢神経系原発リンパ腫、ワルデンストレームのマクログロブリン血症、悪性線維性組織球腫、髄芽細胞腫、黒色腫、メルケル細胞癌、悪性中皮腫、頸部扁平上皮癌、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性疾患、慢性骨髄増殖性疾患、鼻腔および副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、口腔咽頭癌、卵巣癌、膵臓癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、松果体芽細胞腫およびテント上原始神経外胚葉腫瘍、下垂体癌、形質細胞腫、胸膜肺芽腫、前立腺癌、直腸癌、横紋筋肉腫、唾液腺癌、軟部組織肉腫、子宮肉腫、セザール症候群、非黒色腫皮膚癌、小腸癌、扁平上皮癌、頸部扁平上皮癌、テント上原始神経外胚葉腫瘍、睾丸癌、咽喉癌、胸腺腫および胸腺癌、甲状腺癌、移行細胞癌、絨毛性腫瘍、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、および、ウィルムス腫瘍の治療において有用である。0077具体的には、癌は、B-RAF遺伝子における突然変異に関連する癌である。このような癌としては、黒色腫、乳癌、結腸直腸癌、神経膠腫、肺癌、卵巣癌、肉腫、および、甲状腺癌が挙げられる。0078具体的な実施態様において、本明細書で示される治療的組み合わせは、被験者における中度から重度の癌の治療に効果的である。0079投与量0080癌治療のための薬剤の組み合わせの最適な用量は、既知の方法を用いて被験者ごとに経験的に決定することができ、このような用量は、例えば薬剤の活性;被験者の年齢、体重、全体的な健康状態、性別および食物;投与時間および経路;および被験者が受けているその他の薬物療法などの様々な要素によって様々であると予想される。当業界でよく知られた慣例的な試験および手順を用いて最適な投与量を確立してもよい。0081単一の投薬形態を生産するためのキャリアー材料と組み合わせることができる薬剤の組み合わせの量は、治療を受ける個体と具体的な投与様式に応じて様々であると予想される。いくつかの実施態様において、本明細書で説明されているような薬剤の組み合わせを含む1回投与量は、組み合わせに含まれる各薬剤が一般的に単独で投与される場合に投与される量を含むと予想される。0082当業界において通常の技術を有する医師または獣医師であれば、必要な医薬組成物の有効量を容易に決定して処方することができる。例えば、医師または獣医師は、医薬組成物中に用いられる本発明の化合物の用量を望ましい治療効果を達成するために必要なレベルよりも低いレベルで開始し、望ましい作用が達成されるまで次第に用量を増加させてもよい。0083本発明の化合物の適切な1日用量は、一般的に、治療効果を生じさせるのに有効な最も低い用量に相当する化合物の量と予想される。このような有効量は、一般的に上述の要素によって様々であり、当業界において能力を有する者によって容易に決定されると予想される。0084一般的に、本発明の化合物の患者の治療上有効な用量、は、指定された鎮静作用を目的として用いられる場合、約0.0001~約1000mg/キログラム体重/日、より好ましくは約0.01~約50mg/kg/日の範囲と予想される。0085必要に応じて、活性化合物の有効な1日用量の投与は、2回分、3回分、4回分、5回分、6回分またはそれより多くの用量に分けて別々に投与してもよく、これは、一日あたり適切なインターバルで、任意に1回投与量でなされてもよい。0086医薬製剤および投与経路0087本発明において、癌例えば黒色腫を治療するための物質の組み合わせを含む医薬製剤が提供される。本医薬製剤はさらに、キャリアーもしくは賦形剤、安定剤、矯味矯臭剤および/または着色剤を含んでいてもよい。0088本発明において、薬剤の組み合わせを含む医薬製剤が提供され、このような組み合わせは、例えば、以下の2タイプの薬剤:1RAF阻害剤、および/または、RAF阻害剤の薬理学的に活性な代謝産物、塩、溶媒和物およびラセミ化合物と、2MAP3K8TPL2/COT阻害剤、および/または、COT阻害剤の薬理学的に活性な代謝産物、塩、溶媒和物およびラセミ化合物との組み合わせであってもよい。その他の実施態様において、薬剤の組み合わせは、BRAF突然変異細胞を含む、または、MAP3K8TPL2/COTを過剰発現する細胞を含む被験者に提供することができ、ここで上記組み合わせは、1RAF阻害剤、および/または、RAF阻害剤の薬理学的に活性な代謝産物、塩、溶媒和物およびラセミ化合物と、2MEK阻害剤、および/または、MEK阻害剤の薬理学的に活性な代謝産物、塩、溶媒和物およびラセミ化合物とを含む。0089薬剤の組み合わせは、当業者によく知られた様々な投与経路を用いて投与してもよい。薬剤の組み合わせは、ヒトおよびその他の動物に、要求に応じて従来の非毒性の医薬的に許容されるキャリアー、アジュバントおよび基材を含む投与単位の製剤で、経口的に、非経口的に、舌下に、エアロゾルまたは吸入スプレーによって、直腸に、嚢内に、膣内に、腹腔内に、頬内に、または、局所的に投与してもよい。また局所投与は、例えば経皮パッチまたはイオン泳動装置などの経皮投与の使用を含む場合もある。本明細書で用いられる非経口という用語は、皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨内注射または点滴技術を含む。0090製剤化の方法は当業界公知であり、例えば、RemingtonTheScienceandPracticeofPharmacyマックパブリッシング社ペンシルバニア州イーストン第19版で開示されている。本発明で使用するのに適した医薬組成物は、滅菌された非発熱性の溶液または懸濁液、コーティングカプセル、坐剤、凍結乾燥粉末、経皮パッチの形態であってもよいし、または当業界でよく知られているその他の形態であてもよい。0091注射製剤、例えば滅菌された注射可能な水性または油性懸濁液は、よく知られた技術に従って適切な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を用いて配合することもできる。また滅菌注射製剤は、非毒性の非経口的に許容できる希釈剤または溶媒中の滅菌注射用溶液、懸濁液またはエマルジョンであってもよく、例えば1,3プロパンジオールまたは1,3ブタンジオールの溶液である。使用が可能な許容できる基材および溶媒のなかでも特に、水、リンゲル液、米国薬局方グレードの等張塩化ナトリウム溶液が挙げられる。加えて、滅菌された不揮発性油も溶媒または懸濁媒として一般的に用いられる。この目的のために、合成モノまたはジグリセリドなどのあらゆる低刺激性の不揮発性油を用いることができる。加えて、例えばオレイン酸のような脂肪酸も注射製剤の製造において使用される。注射製剤は、例えば細菌を捕獲するフィルターによるろ過によって滅菌してもよいし、または、使用前に滅菌水またはその他の滅菌された注射用媒体に溶解または分散させることができる滅菌固体組成物の形態で滅菌剤を取り入れることによって滅菌してもよい。0092薬物の作用を延長させるために、しばしば皮下または筋肉内注射からの薬物の吸収を遅らせることが望ましい。これは、水溶性が低い結晶質または無定形材料の液状の懸濁液の使用によって達成される場合もある。続いて薬物の吸収速度はその溶解速度に依存しており、この溶解速度は、結晶サイズと結晶性形状に依存する場合がある。あるいは、非経口投与された薬物製剤の遅延吸収は、薬物を油性基剤に溶解または懸濁することによって達成される場合がある。注射用のデポー剤は、ポリラクチドポリグリコリドのような生分解性ポリマー中に薬物をマイクロカプセル化できるマトリックスを形成することによって製造することもできる。薬物とポリマーとの比率と用いられる具体的なポリマーの性質に応じて、薬物の放出速度を制御することができる。その他の生分解性ポリマーの例としては、ポリオルトエステル、および、ポリ無水物が挙げられる。また注射用のデポー剤は、体の組織に適合するリポソームまたはマイクロエマルジョン中に薬物を取り込むことによっても製造が可能である。0093直腸または膣内投与のための組成物は、好ましくは坐剤であり、これは、本発明の化合物を、周囲温度で固体だが体温で液状になるため、直腸または膣内で溶融し活性化合物を放出する適切な刺激の少ない賦形剤またはキャリアー、例えばカカオバター、ポリエチレングリコール、または、坐剤用ワックスと混合することによって製造することができる。0094経口投与のための固形の投薬形態としては、カプセル、錠剤、丸剤、粉末、および、顆粒が挙げられる。このような固形の投薬形態において、活性化合物は、少なくとも1種の不活性な医薬的に許容される賦形剤またはキャリアー、例えばクエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウム、および/または、a充填剤または増量剤、例えばスターチ、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、および、ケイ酸、b結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、および、アカシア、c潤滑剤、例えばグリセロール、d崩壊剤、例えば寒天、炭酸カルシウム、ポテトスターチまたはタピオカスターチ、アルギン酸、ある種のケイ酸塩、および、炭酸ナトリウム、e溶解遅延剤、例えばパラフィン、f吸収促進剤、例えば第四級アンモニウム化合物、g湿潤剤、例えばアセチルアルコール、および、モノステアリン酸グリセロール、h吸収剤、例えばカオリン、および、ベントナイト粘土、および、i潤滑剤、例えばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、および、それらの混合物と混合される。カプセル、錠剤および丸剤の場合、その投薬形態は緩衝剤を含んでいてもよい。0095また似たようなタイプの固体組成物が、ラクトースまたは乳糖、加えて高分子量ポリエチレングリコールなどのような賦形剤を用いたソフトおよびハード充填ゼラチンカプセル中の充填物としても使用できる。0096錠剤、糖衣錠、カプセル、丸剤および顆粒の固形の投薬形態は、コーティングおよびシェル、例えば腸溶コーティングや、医薬製剤の製造分野においてよく知られているその他のコーティングを用いて製造することができる。このような投薬形態は、任意に不透明化剤を含んでいてもよく、さらに、任意に遅延するような様式で、活性成分のみを放出させる、または、腸管の特定の部分に選択的に放出させる組成物に含まれていてもよい。用いられる可能性がある埋め込み式の組成物の例としては、高分子物質およびワックスが挙げられる。0097活性化合物は、1種またはそれより多くの上述したような賦形剤でマイクロカプセル化された形態であってもよい。錠剤、糖衣錠、カプセル、丸剤および顆粒の固形の投薬形態は、コーティングおよびシェル、例えば腸溶コーティング、放出制御コーティングや、医薬製剤の製造分野においてよく知られているその他のコーティングを用いて製造することができる。このような固形の投薬形態において、活性化合物は、少なくとも1種の不活性希釈剤、例えばスクロース、ラクトース、または、スターチと混合してもよい。またこのような投薬形態は、通常の実施と同様に、不活性希釈剤以外の追加の物質を含んでいてもよく、このような物質としては、例えば錠剤形成のための潤滑剤、および、その他の錠剤形成を補助する物質、例えばステアリン酸マグネシウム、および、微結晶性セルロースが挙げられる。カプセル、錠剤および丸剤の場合、その投薬形態は緩衝剤を含んでいてもよい。これらは任意に不透明化剤を含んでいてもよく、さらに、任意に遅延するような様式で、活性成分のみを放出させる、または、腸管の特定の部分に選択的に放出させる組成物に含まれていてもよい。用いられる可能性がある埋め込み式の組成物の例としては、高分子物質およびワックスが挙げられる。0098経口投与のための液状の投薬形態としては、医薬的に許容されるエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ、および、エリキシルが挙げられる。活性化合物に加えて、液状の投薬形態は、当業界において一般的に使用されている不活性希釈剤を含んでいてもよく、このような不活性希釈剤としては、例えば、水またはその他の溶媒、可溶化剤、および、乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、EtOAc、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、1,3ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油具体的には、綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、および、ゴマ油、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、および、ソルビタン脂肪酸エステル、ならびにそれらの混合物が挙げられる。経口用組成物はさらに、不活性希釈剤の他にも、アジュバント、例えば湿潤剤、乳化および懸濁化剤、甘味剤、矯味矯臭剤、および、着香料を含んでいてもよい。0099本発明の化合物の局所または経皮投与のための投薬形態としては、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、粉末、溶液、スプレー、吸入剤、または、パッチが挙げられる。活性成分は、滅菌条件下で医薬的に許容されるキャリアー、必要に応じてあらゆる保存剤または緩衝液と混合される。また眼用製剤、点耳剤なども本発明の範囲内であると考えられる。00100軟膏、ペースト、クリームおよびゲルは、本発明の活性化合物に加えて、例えば動物および植物性脂肪、油、ワックス、パラフィン、スターチ、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルク、および、酸化亜鉛、または、それらの混合物などの賦形剤を含んでいてもよい。00101本発明の組成物はまた、液体エアロゾルまたは吸入用の乾燥粉末として送達するために製剤化することもできる。液体エアロゾル製剤は、大部分が終末細気管支および呼吸細気管支に送達できるような粒度に霧状にされる。00102本発明のエアロゾル化された製剤は、例えばジェット、振動式多孔質プレート、または、超音波ネブライザーのようなエアロゾル形成装置を用いて送達することができ、好ましくは、主として1~5mの平均質量中央径を有するエアロゾル粒子が形成されるように選択される。さらにこのような製剤は、平衡化された浸透圧モル濃度のイオン強度と塩化物濃度を有することが好ましく、さらに感染部位に有効量の本発明の化合物を送達することができるエアロゾル化可能な体積が最も小さいことが好ましい。加えて、エアロゾル化された製剤は、気道の機能を損なわず、さらに望ましくない副作用を引き起こさないことが好ましい。00103本発明のエアロゾル製剤の投与に適したエアロゾル化装置としては、例えば、本発明の製剤を大部分が15mからのサイズ範囲のエアロゾルの粒度に霧状にすることができる、ジェット、振動式多孔質プレート、超音波ネブライザー、および、エネルギー供給式の乾燥粉末吸入器が挙げられる。本願において、大部分とは、生成した全エアロゾル粒子の少なくとも70、好ましくは90より多くが15mの範囲内であることを意味する。ジェット式ネブライザーは、空気圧によって作動し、溶液をエアロゾルの液滴に細分化することができる。振動式多孔質プレート型ネブライザーは、多孔質プレートを迅速に振動させることによって生成した超音波による吸い出しを利用して、溶媒液滴を多孔質プレートを通過して押し出すように作動する。超音波ネブライザーは、液体を小さいエアロゾル液滴にせん断する圧電結晶によって作動する。様々な適切な装置が利用可能であり、このような装置としては、例えば、エアロネブAERONEBおよびエアロドースAERODOSE振動式多孔質プレート型ネブライザーエアロジェン社AeroGenIncカリフォルニア州サニーベール、サイドストリームSIDESTREAMネブライザーメディックエイド社イングランドウェストサセックス州、パリLCPARILCおよびパリLCスターPARILCSTARジェット式ネブライザーPARIレスピレイタリーイクイップメント社バージニア州リッチモンド、および、エアロソニックAEROSONICデビルビスメディツィニッシェプロデュクテドイツ社GmbHドイツ国ハイデン、および、ウルトラエアULTRAAIREオムロンヘルスケア社イリノイ州ヴァーノンヒルズ超音波ネブライザーが挙げられる。00104また本発明の化合物は、局所用の粉末およびスプレーとして使用するために製剤化することもでき、このような製剤は、本発明の化合物に加えて、賦形剤、例えばラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム、および、ポリアミド粉末、または、これらの物質の混合物を含んでいてもよい。スプレーはさらに、一般的な噴射剤、例えばクロロフルオロヒドロカーボンを含んでいてもよい。00105経皮パッチは、体への化合物の制御された送達を提供するというさらなる利点を有する。このような投薬形態は、適切な媒体に化合物を溶解または分配させることによって作製することができる。また吸収促進剤も、化合物の皮膚を通過する流動を高めるために使用することができる。その速度は、速度を制御する膜を提供すること、または、化合物を高分子マトリックスまたはゲル中に分散させることによって制御することができる。さらに本発明の化合物は、リポソームの形態で投与することもできる。当業界でよく知られているように、リポソームは、一般的にはリン脂質またはその他の脂質物質から誘導される。リポソームは、水性媒体中に分散された単層または多層状の水和した液晶によって形成される。リポソームを形成することができるあらゆる非毒性で、生理学的に許容でき、かつ代謝可能な脂質を使用することができる。本発明のリポソームの形態の組成物は、本発明の化合物に加えて、安定剤、保存剤、賦形剤などを含んでいてもよい。好ましい脂質はリン脂質、および、ホスファチジルコリンレシチンであり、これらは天然のものでもよいし、および、合成されたものでもよい。リポソームの形成方法は当業界でよく知られている。例えば、PrescottMethodsinCellBiology第XIV巻アカデミックプレスAcademicPressニューヨーク1976p33etseqを参照。00106実施例00107実施例1:ORFベースの機能的なスクリーニングによるB-RAF阻害に対する耐性のドライバーとしての特異的なキナーゼの同定00108RAF阻害を回避することができるキナーゼを同定するために、注釈がつけられたキナーゼセンターフォーキャンサーシステムバイオロジーCCSB/ブロードインスティテュートキナーゼORFコレクションの約75を代表する597種の配列が確認されたキナーゼORFクローンを構築し、RAFキナーゼ阻害剤PLX4720に対して感受性を有するB-RAFV600E悪性黒色腫細胞株のA375で安定して発現させた図1a、1b、表3、P.6c。1μMのPLX4720で処理したORF発現細胞を未処理細胞と比較した生存率に関してスクリーニングし、分析特異的なポジティブコントロール、MEK1S218/222DMEK1DDに標準化した。、固有のキナーゼ活性がない。COTおよびC-RAFは、複数のB-RAFV600E細胞株においてPLX4720に対する感受性を減少させており図1c、これらのキナーゼのRAF阻害に対する耐性に介在する能力を立証した。A375およびSKMEL28における二次スクリーニングによって、マルチポイントのPLX4720濃度スケールにわたり上位9種の候補ORFの順序を決めた図1d。00109興味深いことに、上位2種の確認済みのキナーゼはいずれも、様々な状況でMEK/ERKシグナル伝達を活性化することがわかっているSer/ThrMAPキナーゼキナーゼキナーゼMAP3Kである。B-RAFと同様に、C-RAFは、正規のMAPKカスケードにおけるMAP3Kであり、これは、以前からpan-RAF阻害剤を用いたインビトロでの段階的な選択に伴う耐性に関与してきた。COTヒトMAP3K8遺伝子のタンパク質産物は、MAP3Kとして最もよく特徴付けられており、これは、炎症を起こした細胞におけるNFKBシグナル伝達下流に存在する;しかしながら、ヒト癌におけるその機能的な重要性はこれまで解明されていなかった。00110実施例2:MAPK経路の活性化によるB-RAF阻害に対する耐性00111これらの遺伝子の過剰発現がMAPK経路を活性化するのに十分かどうかも試験した。ベースライン時に、COT発現は、MEK1DDと同様の方法でERKリン酸化を増加させ、これはMAPキナーゼ経路の活性化と一致する図2aおよび10。野生型COTまたはC-RAFの過剰発現によって、PLX4720の存在下で構造的なERKおよびMEKのリン酸化が生じたが、それに対してキナーゼを無効にした誘導体は効果がなかった図2aおよび11。従って、COTおよびC-RAFは、主としてMAPKシグナル伝達の再活性化によってRAF阻害に対する耐性を駆動させる。特筆すべきことに、最初のスクリーニングからの9種の候補ORFのなかでも、部分集合3は、RAF阻害の後、持続的なERK/MEKリン酸化を示さなかったが、これはMAPK経路とは無関係の薬物感受性の変化であることを示唆している図12。00112実施例3:C-RAFの活性化およびB-RAFとのヘテロ二量体化00113C-RAFの活性化およびB-RAFとのヘテロ二量体化は、B-RAF阻害に対する細胞性反応の重要な構成要素を構成する。A375細胞において、内因性C-RAF:B-RAFヘテロ二量体は、測定可能であり、かつPLX4720での処理による誘導によって生じる図13。しかしながら、S338における内因性C-RAFリン酸化C-RAF活性化に必要な事象は低いままであった図13。それに対して、異所性発現されたC-RAFはS338でリン酸化され図13、そのPLX4720耐性表現型は、持続的なMEK/ERK活性化に付随していた図2aおよび13。さらに、高活性C-RAFトランケーション突然変異体C-RAFW22の異所性発現は、PLX4720耐性およびERK活性化の媒介において野生型C-RAFよりも高い有効性を示し図14、さらに、C-RAFの高い活性がこの薬剤に対する耐性を誘導することも示した。このモデルと一致して、NRASおよびKRASの腫瘍形成性の対立遺伝子は、A375細胞においてPLX4720耐性を付与し図2b、薬物処理によって持続的なC-RAFS338およびERKリン酸化を起こした図2c。従って、C-RAF活性化をもたらす遺伝子変化例えば腫瘍形成性のRAS突然変異は、B-RAFV600E突然変異とは互いに両立しない傾向があるが、このような共に発生する現象は、後天性のB-RAF阻害に対する耐性に関して好ましい。00114実施例4:黒色腫におけるCOT発現の調査00115これまでにC-RAFは黒色腫とMAPKの経路の依存性と関連しているとされていたが、HatzivassiliouGetalNatureHeidornSJetalCell140209221PoulikakosPIetalNature、COTはいまだ黒色腫関連キナーゼであるとは説明されていない。00116黒色腫におけるCOTの役割を調査し、そのヒトメラニン細胞における発現を試験した。不死化一次メラニン細胞B-RAF野生型はCOTを発現したが図2d、異所性B-RAFV600E発現はCOTのmRNAレベルを減少させ図15、COTタンパク質を検出不可能にした図2d。逆に言えば、A375細胞で異所性発現されたCOTだけが弱くしか検出できなかったことに対して図2a、2e、内因性B-RAFV600EのshRNA介在欠損は、B-RAFノックダウンの程度と相関するCOTタンパク質レベルの増加を引き起こした図2e。さらに、COTを発現するA375細胞をPLX4720で処理したところ、COTタンパク質の用量依存性の増加が起こり図2a異所性COTのmRNAレベルに影響は及ばなかった図15。腫瘍形成性のB-RAFは、主にタンパク質安定性を変化させることによってCOT発現を相殺し図2a、d、eおよび15、B-RAF阻害は、処理中にCOTを発現する細胞の成長を促進する。特筆すべきことに、C-RAFもB-RAFも、単独でも組み合わせでも、PLX4720の存在下でさえもCOT発現に付随するERKリン酸化に必要ではない図2e、2fおよび図16。示した通り、COT発現は、RAFとは無関係の方式でMAPキナーゼ経路の活性化を誘導するのに十分である。00117実施例5:COT発現は、癌細胞株においてB-RAF阻害に対する耐性を予想する00118B-RAFV600Eバックグラウンドにおいて高いCOTを発現する細胞株がPLX4720処理に対する新規の耐性を示すかどうかを試験した。このような例を同定するために、細胞株のパネルを、B-RAFV600E突然変異に付随するMAP3K8/COTコピー数増加の証拠に関してスクリーニングした。コピー数の解析と突然変異プロファイリングを受けた534種の細胞株のうち、38種の細胞株7.1にB-RAFV600E突然変異が含まれていた。このサブグループ内で、2種の細胞株、OUMS-23結腸癌およびRPMI-7951黒色腫はさらにMAP3K8/COT遺伝子座を範囲に含む染色体のコピー数増加の証拠図3aおよび17と強いCOTタンパク質発現図3bおよび18も示した。さらに短時間で培養された黒色腫のパネルもCOTタンパク質発現に関してスクリーニングした。これらの細胞株のうち1種M307、最初の病気が安定化した後にアロステリックMEK阻害に対する耐性を発生させたB-RAFV600E腫瘍から誘導された短時間の培養物がCOTを発現した図3c。3種全ての細胞株がPLX4720処理に対して反応がなく、8~10μMの範囲のGI50値を示し図3d、さらにB-RAF阻害に際して持続的なERKリン酸化を示す図3e、3f。OUMS-23およびRPMI-7951は、MAPK経路阻害剤に感受性のある細胞株である;従って、これらの結果は、COTは、RAF阻害に対する新規の耐性を付与することB-RAFV600E黒色腫の約10で観察された現象を実証するものである。00119実施例6:RAF阻害剤で治療した患者におけるCOT発現00120転移性のB-RAFV600E黒色腫を有する3人の患者から生検材料を得ることによって臨床的なRAF阻害剤PLX4032に対する耐性に関するCOT発現を試験した。いずれのケースも、処理前および処理中前処理および処理中;図3g、表6に採取した病巣を適合させた凍結生検材料からなり;加えて、1つのサンプルは、同じ再発した腫瘍部位再発後;図3gからの2種の独立した生検試料を含む。上記で示した実験モデルと一致して、定量リアルタイムRT-PCRqRT/PCR解析から、3つのケースのうち2つにおいて、PLX4032処理と同時にCOTのmRNA発現が増加したことが解明された。再発性の標本において、その前処理および処理中の同等な比較対象と比べてCOTのmRNAレベルはさらに増加した図3g、患者番号1。追加の再発性悪性黒色腫の生検適合なしは、RAF阻害剤耐性のCOT増幅細胞株で観察されたレベルと同等の高いCOTのmRNA発現を示した図19。この標本も、加えて適合させた正常な皮膚、または、B-RAFV600E細胞株に比べて、強いMAPK経路活性化、高いB-RAF、C-RAFおよびCOT発現を示した図19。この腫瘍の配列解析研究から、BRAF、NRAS、または、KRASに追加の突然変異は存在しないことが解明されたデータ示さず。これらの解析によって、PLX4032耐性悪性黒色腫においてCOT依存性メカニズムが作用しているという臨床的な証拠が示された。00121実施例7:MEK/ERKリン酸化のCOT調節00122自然に高いCOT発現を示すB-RAFV600E細胞においてCOTが活発にMEK/ERKリン酸化を調節するかどうかを、RPMI-7951細胞にCOTを標的とするshRNAコンストラクトを導入することによって試験した。COT欠損によってRPMI-7951の生存率が低下し図20、ERKリン酸化が減少した図3h;従って、COTキナーゼ活性を標的化することによって、COT過剰発現または増幅を示す癌細胞においてMEK/ERKリン酸化が抑制される。加えて、B-RAF阻害剤PLX4720の存在下でCOTキナーゼ活性を標的化することによって、MEK/IRKリン酸化が抑制される図3h。低分子物質COTキナーゼ阻害剤ワイス,アボットWyethAbbot化合物番号9549300でのRPMI-7951細胞の処理によってHirataKetalBiolPharmBull33133137LeeKMetalCancerRes6980438049、用量依存性のMEKおよびERKリン酸化の抑制が起こり、これは、これらの細胞においてCOTがMEK/ERK活性化に寄与することを示す追加の証拠となる図3i。00123実施例8:COTを発現するB-RAFV600E細胞株は、アロステリックMEK阻害剤に対する耐性を示す00124COTを発現する癌細胞が標的のCOTまたはRAF下流においてMAPK経路阻害に対する感受性を有したままかどうかを解析した。OUMS-23およびRPMI-7951細胞株をMEK1/2阻害剤CI-1040に対する感受性について調べた。いずれの細胞株もMEK阻害に対する反応を示さず図4a、1μMのCI-1040の存在かでも持続的なERKリン酸化を示した図4b。またA375およびSKMEL28細胞における異所性COT発現もMEK阻害剤CI-1040およびAZD6244に対する感受性が減少しており、これは、この表現型を誘導するのにCOT発現単独で十分であることを示唆している図4c、4dおよび21。薬理学的なMEK阻害剤で観察された結果と同様に、A375細胞において、MEK1/2ノックダウンによりCOT介在ERKリン酸化がほんのわずかに抑制された図22。これらのデータから、COTは、MEKとは独立したメカニズムとMEK依存性のメカニズムとを介してERKを活性化することが実証された。さらに、組換えCOTおよびERK1を用いたインビトロでのキナーゼ分析を行ったところ、組換えCOTはインビトロでERK1のpThr202/Tyr204リン酸化を誘導することが実証された図22。従って、COT発現は、MEKとは独立した方式でERK活性化の効能を高める。00125実施例9:細胞増殖を抑制するためのコンビナトリアルMAPK経路阻害00126図23で示されるように、RAFおよびMEK阻害剤の併用は、単一の薬剤に対する耐性を無効にする可能性がある。組み合わされたRAF/MEK阻害がCOTによって生じる耐性を回避するかどうかを試験した。異所性COT発現の設定で、併用されたAZD6244またはCI-1040とPLX470それぞれ1μMに曝露したところ、単一の薬剤PLX4720を用いた場合よりも効果的に細胞増殖およびpERK発現が減少し、これは10μMの濃度でさえも同様であった図4e、4fおよび23。これらのデータから、B-RAFV600E腫瘍細胞におけるこの経路の重要性が認められ、さらに、二重のB-RAF/MEK阻害はRAF阻害剤に対する耐性を回避するのに役立つことが実証された。00127方法00128センターフォーキャンサーシステムバイオロジーCCSB/ブロードインスティテュートキナーゼオープンリーディングフレームコレクション00129pDONR-223エントリーベクターインビトロジェンInvitrogen中の597種のキナーゼORFのライブラリーを構築した。個々のクローンの末端を両方向のベクター特異的なプライマーを用いて配列解析した。報告されている配列から実質的に異なっている配列を有するクローンを除外した。エントリークローンおよび配列はアドジェンAddgenehttpwwwaddgeneorghumankinasesから入手した。複数の源からキナーゼORFをから構築した;ORFeome5.1コレクションhttphorfdbdfciharvardeduから、337種のキナーゼを単一のクローンとして単離し、正常なヒト組織のRNAアンビオンAmbionから逆転写とそれに続くPCR増幅によりゲートウェイGateway配列インビトロジェンを付加することによって、183種のキナーゼをクローニングし、ハーバードインスティテュートオブプロテオミクスHarvardInstituteofProteomicsHIPによって提供されるテンプレートから64種のキナーゼをクローニングし、さらに、13種のキナーゼを、共同研究している研究所から得られたテンプレートからのゲートウェイシステムにクローニングした。pLKO.1主鎖からゲートウェイ適合性レンチウイルスベクターpLX-Blast-V5を作製した。製造元インビトロジェンのプロトコールに従って、LRクロナーゼを用いた酵素的組換え反応を行い、597種のキナーゼをpLX-Blast-V5に導入した。00130ハイスループットのORFスクリーニング00131384ウェルのマイクロタイタープレートウェルあたり500細胞でA375黒色腫細胞を平板培養した。次の日、細胞を8μg/mlポリブレンの存在下でレンチウイルスによってパッケージ化されたキナーゼORFライブラリーにスピン感染させた。感染の48時間後、培地を、標準増殖培地2連、1μMのPLX4720を含む培地2連、2タイムポイント、または、10μg/mlブラスチシジンを含む媒体2連で交換した。4日後および6日後、セルタイター-GloプロメガPromegaを用いて製造元の説明書に従って細胞増殖を分析した。全ての実験を2回行った。00132候補の耐性ORFの同定[00133]測定したままの発光値をマイクロソフトエクセルにインポートした。ブラスチシジン選択細胞において2連で得られた結果を平均した測定したままの発光値の選択されていない細胞に対するパーセンテージを得ることによって感染効率を決定した。0.70より低い感染効率を有するORFを次の解析から除外し、同時に2連の結果間に15,000よりも大きい測定したままの発光単位の標準偏差を有する全てのORFも除外した。発現が増殖に影響を与えるORFを同定するために、我々は個々のORFの2連の結果を平均した測定したままの発光値を、全てのコントロール処理細胞の平均および標準偏差とz-スコアまたは標準スコア以下に示すによって比較した:式中、x=所定のORFの平均の測定したままの発光値、μ=全てのORFの平均の測定したままの発光値、および、σ=全てのウェルの測定したままの発光値の標準偏差である。z-スコア>2または<-2のあらゆるORFはそれぞれ増殖に影響を及ぼすものと注釈をつけ、最終的な解析から除外した。増殖の差を、PLX47201μM処理細胞における2連の結果を平均した測定したままの発光値を未処理細胞と比較したパーセンテージによって決定した。その後、増殖の差を、PLX4720耐性、MEK1S218/222DMEK1DDについてポジティブコントロールに標準化したMEK1DDの増殖の差は1.0であった。それぞれ個々のORFのMEK1DDで標準化した増殖の差を、2連の実験で、各実験ごとに2つのタイムポイントを設けて4日目および6日目平均化した。続いて、平均のMEK1DDで標準化した増殖の差について上述したようにしてz-スコアを作製した。>2より大きいz-スコアを有するORFをヒットとみなし、続く二次スクリーニングで追加実験した。00134ORFおよびshRNA発現00135pLX-Blast-V5レンチウイルス由来、または、pWZL-Blast、pBABE-Puro、または、pBABE-ゼオシンレトロウイルス由来発現プラスミドからORFを発現させた。レンチウイルス導入のために、293T細胞を1μgのpLX-Blast-V5-ORF、または、pLKO.1-shRNA、900ngΔ8.9gag、pol、および、100ngのVSV-Gで6μlのフージーンFugene6トランスフェクション試薬ロシュRocheを用いてトランスフェクションした。トランスフェクションから72時間後にウイルス上清を回収した。6ウェルプレート中で、5μg/mlのポリブレンの存在下で、哺乳動物細胞に1:10~1:20希釈でウイルスを感染させ、37°C、2250RPMで1時間遠心分離した。感染の24時間後、ブラスチシジンpLX-Blast-V5、10μg/ml、または、ピューロマイシンpLKO.1、0.75μg/mlを添加し、細胞を48時間選択した。レトロウイルス生産のために、293Tを上述のようにして1μgのレトロウイルス由来プラスミド-ORF、1μgのpCL-AMPHO、および、100ngのVSV-Gでトランスフェクションした。5μg/mlポリブレン中で、細胞をレトロウイルスを含む上清で1:2希釈で一晩感染させ、続いて培地を増殖培地に交換した。感染をもう一度繰り返し合計2回、続いて上述のように選択した。00136二次スクリーニング00137A3751.5×103およびSKMEL28細胞3×103を96ウェルプレートに植え付け18時間そのままにした。8μg/mlポリブレンの存在下でORFを発現するレンチウイルスを1:10希釈で添加し、2250RPM、37°Cで1時間遠心分離した。遠心分離後、ウイルスを含む培地を通常の増殖培地に交換し、そのまま18時間インキュベートした。感染の24時間後、DMSO1:1000、または、10×PLX4720DMSO溶液を最終濃度100、10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001、または、0.00001μMになるように添加した。PLX4720添加の4日後、WST-1ロシュを製造元の推奨に従って用いて細胞生存率を分析した。00138細胞株および試薬00139A375、SKMEL28、SKMEL30、COLO-679、WM451lu、SKMEL5、Malme3M、SKMEL30、WM3627、WM1976、WM3163、WM3130、WM3629、WM3453、WM3682およびWM3702を全てRPMIセルグロCellgro、10FBSおよび1ペニシリン/ストレプトマイシン中で増殖させた。M307を1mMのピルビン酸ナトリウムが補充されたRPMIセルグロ、10FBSおよび1ペニシリン/ストレプトマイシン中で増殖させた。293TおよびOUMS-23を、DMEMセルグロ、10FBSおよび1ペニシリン/ストレプトマイシン中で増殖させた。RPMI-7951細胞ATCCを、MEMセルグロ、10FBSおよび1ペニシリン/ストレプトマイシン中で増殖させた。野生型初代メラニン細胞を、HAM-F10セルグロ、10FBSおよび1ペニシリン/ストレプトマイシン中で増殖させた。B-RAFV600Eを発現する初代メラニン細胞を、TIVA培地[HAM-F-10セルグロ、7FBS、1ペニシリン/ストレプトマイシン、2mMのグルタミンセルグロ、100uMIBMX、50ng/mlのTPA、1mMのdbcAMPシグマSigmaおよび1μMバナジン酸ナトリウム]中で増殖させた。CI-1040PubChem番号:6918454を、シャンハイレッチェンインターナショナルトレーディング社ShanghaiLechenInternationalTradingCoから購入し、AZD6244PubChem番号:10127622を、セレックケミカルズSelleckChemicalsから購入し、PLX4720PubChem番号:24180719を、シマンシスSymansisから購入した。RAF265PubChem番号:11656518は、ノバルティスファーマ社NovartisPharmaAGより寛大にも提供頂いた。特に他の指定がない限り、全ての薬物処理は16時間で行った。活性化された対立遺伝子NRASおよびKRASは前述した通りである。LundbergASetalOncogene2145774586。00140薬理学的な増殖阻害分析00141全ての黒色腫細胞株について培養細胞を96ウェルプレートに植え付けウェルあたり3,000細胞;A375について1,500細胞を植え付けた。植え付けて24時間後、関連化合物の連続希釈駅をDMSOで製造し、細胞に添加し、最終的な薬物濃度を100μM~1×105μMの範囲にしたDMSOの最終的な体積は1以下であった。薬物添加後96時間、細胞をインキュベートした。WST1生存率分析ロシュを用いて細胞生存率を測定した。バックグラウンドを差し引いた後、生存率をコントロール未処理細胞のパーセンテージとして計算した。各細胞株および複合薬ごとに最低でも6連の反復実験を行った。増殖-阻害分析からのデータをS字型の用量-応答を示す非線形回帰曲線のフィッティングを用いてモデル化した。これらの曲線を表示し、ウィンドウズ登録商標用のグラフパッドプリズムGraphPadPrism5グラフパッドGraphPadを用いてGI50を作製した。10μMで、または、それより上で50阻害ポイントを横切るS字型の応答曲線は、>10μMと注釈がつけられたGI50値を有する。単回投与の研究のために、指定された薬物の単回投与特に他の規定がない限り1μMを用いて同じプロトコールを行った。00142免疫ブロットおよび免疫沈降00143細胞を氷冷PBSで2回洗浄し、2×プロテアーゼ阻害剤ロシュおよび1×ホスファターゼ阻害剤カクテルIおよびIIカルバイオケムCalBiochemを含む1NP-40緩衝液[150mMのNaCl、50mMのトリスpH7.5、2mMのEDTApH8、25mMのNaFおよび1NP-40]中で溶解させた。溶解産物を定量しブラッドフォード分析、標準化し、体積を減らし、変性させ95°Cおよび10トリス/グリシンゲルインビトロジェン上でのSDSゲル電気泳動で分解した。タンパク質をPVDFメンブレンに移し、pERK1/2T202/Y204、pMEK1/2S217/221、MEK1/2、MEK1、MEK2、C-RAFウサギ宿主、pC-RAFpS338セルシグナリングテクノロジーCellSignalingTechnology;1:1,000、V5-HRPインビトロジェン;1:5,000、COT1:500、B-RAF1:2,000、アクチン1:1,000、アクチン-HRP1:1,000;サンタクルーズSantaCruz、C-RAFマウス宿主;1:1,000;BDトランスダクションラボBDTransductionLabs、ビンキュリンシグマSigma;1:20,000、AXL1:500;RDシステムズRDSystemsを認識する一次抗体でプロービングした。適切な二次抗体抗ウサギ、抗マウスIgG、HRP結合型;1:1,000希釈、セルシグナリングテクノロジー、または、抗ヤギIgG、HRP結合型;1:1,000希釈;サンタクルーズとインキュベートした後、化学発光ピアースPierceを用いてタンパク質を検出した。上述のようにして、C-RAF1:50;セルシグナリングテクノロジーを認識する抗体を用いて、全タンパク質1μg/μlの濃度で1NP-40溶解緩衝液中で4°Cで一晩免疫沈降を行った。抗体:抗原複合体を4°Cで2時間かけてプロテインAアガロース25μL、50スラリー;ピアースに結合させた。ビーズを遠心分離し、溶解緩衝液で3回洗浄し、溶出させ2倍濃縮したサンプル緩衝液中で変性させた95°Cインビトロジェン。上述のようにして免疫ブロットを行った。発光によるタンパク質の定量化をNIHイメージJNIHImageJを用いて行った。00144腫瘍および適合する正常な皮膚からの溶解産物を、上述のように、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含むRIPA[50mMのトリスpH7.4、150mMのNaCl、1mMのEDTA、0.1SDS、1.0NaDOC、1.0トリトンTritonX-100、25mMのNaF、1mMのNA3VO4]中で組織を機械的にホモジナイズすることによって作製した。それに続く標準化および免疫ブロットを上述したように行った。00145生検で得られた黒色腫の腫瘍材料00146生検で得られた腫瘍材料は、インフォームドコンセントのもとに得られ、プロトコール02~017対のサンプル、マサチューセッツ総合病院MassachusettsGeneralHospital、および、07~087対のないサンプル、ダナファーバー癌研究所Dana-FarberCancerInstituteで特徴付けられた廃棄され身元をわからなくした組織からなる。対の試料について、PLX4032処理開始の10~14日後に処理中サンプルを回収した表6。00147COTキナーゼ活性の阻害00148付着性のRPMI-7951細胞を1×PBSで2回洗浄し、血清非含有の増殖培地中で一晩インキュベートした。その後、4-3-クロロ-4-フルオロフェニルアミノ-6-ピリジン-3-イル-メチルアミノ-3-シアノ-[1,7]-ナフチリジンEMD;TPL2阻害剤I;カタログ番号:616373、PubChem番号:9549300を指定された濃度でDMSOに懸濁し、これを細胞に添加して1時間そのままにし、その後上述のようにしてタンパク質抽出物を作製した。00149定量RT-PCR00150細胞株と新たに凍結した腫瘍からRNイージーRNeasyキットキアゲンQiagenを用いてmRNAを抽出した。それに続き、トータルmRNAを用いて、細胞株および対になっていない腫瘍サンプルにはスーパースクリプトIIIファーストストランド合成スーパーミックスSuperScriptIIIFirst-StrandSynthesisSuperMixインビトロジェンを用いて、さらに、対になった凍結腫瘍サンプルにはスーパースクリプトVILOcDNA合成キットインビトロジェンを用いて逆転写を行った。定量PCRのために、SYBRグリーンPCRマスターミックスSYBRGreenPCRMasterMixおよび遺伝子特異的なプライマーを用いて、3連で、ABI7300リアルタイムPCRシステムを用いて、5μlのRT反応を行った。検出に用いられたプライマーは以下に示す通りである:00151インビトロでのキナーゼ分析00152インビトロでのキナーゼ分析をこれまでに述べられたようにしてそれぞれ1μgのCOTアミノ酸30~397RDシステムズ、および、不活性ERK1ミリポアMilliporeを用いて行った。00153細胞生存率の分析00154付着性のRPMI-7951細胞をCOTまたはルシフェラーゼに対してshRNAを発現するウイルスで上述のようにして感染させた。選択後、細胞を4連で24ウェルプレート上で平板培養した1.5×105細胞/ウェル。生存可能な細胞を、VI-セル細胞生存率分析装置VI-CELLCellViabilityAnalyzerを製造元の説明書に従って用いてトリパンブルー色素排除試験法で計数した。4連の細胞数を平均し、コントロールshRNAの細胞数に標準化した。00155ガン細胞株百科事典TheCancerCellLineEncyclopedia;CCLE00156ガン細胞株百科事典CCLEプロジェクトは、ブロードインスティテュート、ノバルティスバイオメディカル研究所NovartisInstitutesforBiomedicalResearchNIBR、および、ノバルティス研究財団ゲノミクス研究所GenomicsInstituteoftheNovartisResearchFoundationGNFの共同制作であり、これは、個々の薬理学的な脆弱性をゲノムパターンにリンクさせ、細胞株の総合的なゲノミクスを癌患者の層別化に翻訳する総合的なコンピューター解析を開発するために、ヒト癌モデルの大型パネルの詳細な遺伝学的および薬理学的な特徴付けを行うためのものである。この研究で用いられる染色体コピー数および遺伝子発現データは、オンラインでhttpwwwbroadinstituteorgcgibincancerdatasetscgiで利用可能である。00157癌細胞株の発現プロファイリング00158ジーンチップGeneChipヒトゲノムU133と、2.0アフィメトリックスAffymetrix発現アレイアフィメトリックスとを用いてオリゴヌクレオチドマイクロアレイ解析を行った。サンプルを、発現マイクロアレイで使用するためにアフィメトリックスのプロトコールに従って標識して断片化したcRNAに変換した。00159用いられたshRNAコンストラクトpLKO.100160用いられるshRNAコンストラクトを製造するためのDNA配列を以下に示す:00161本明細書で示される定義および開示が、参照により本明細書に組み入れられる全てのものより優位である。本明細書において本発明をそれらの好ましい実施態様と共に説明したが、当業者であれば当然のことながら、添付の請求項で定義される本発明の本質および範囲から逸脱しない限り、具体的に説明されていない付加、改変、置換および欠失も可能である。従って、前述の詳細な説明は、限定ではなく説明とみなされ、当然のことながら本発明の本質および範囲を定義するのは、以下の請求項全ての等価体を含むであるとする。"