"抗癌活性を備えた抽出物であって、グラプトペタルム属またはイワベンケイ属、エケベリア属の植物からジメチルスルホキシドDMSOで抽出されたことを特徴とする、抽出物。前記植物が、オボロヅキまたはイワベンケイであることを特徴とする、請求項1に記載の抽出物。前記抽出物が、肝臓癌に治療効果を有することを特徴とする、請求項1に記載の抽出物。前記抽出物が、肝細胞癌HCCに治療効果を有することを特徴とする、請求項1に記載の抽出物。治療に有効な量の請求項1の抽出物を含むことを特徴とする、組成物。癌の予防または治療の方法であって、必要とする患者に治療に有効な量の請求項1の抽出物を投与することを含むことを特徴とする、方法。前記癌が肝臓癌であることを特徴とする、請求項6に記載の方法。前記肝臓癌が肝細胞癌HCCであることを特徴とする、請求項6に記載の方法。グラプトペタルム属、イワベンケイ属、エケベリア属から構成される群より選択された植物からの豊富な抗癌成分を含む画分であって、前記植物をジメチルスルホキシドDMSOで抽出した後、クロマトグラフィーで単離してHH-F3と呼ばれる画分を取得することにより調製されることを特徴とする、画分。前記画分が、癌細胞における細胞毒性の発生と、AURKA、AURKB、FLJ10540発現の下方制御の効果を有することを特徴とする、請求項9に記載の画分。SephadexLH-20カラムがクロマトグラフィーに使用されることを特徴とする、請求項9に記載の画分。前記植物がオボロヅキまたはイワベンケイであることを特徴とする、請求項9に記載の画分。前記画分が、肝臓癌に治療効果を有することを特徴とする、請求項9に記載の画分。前記画分が、肝細胞癌HCCに治療効果を有することを特徴とする、請求項9に記載の画分。治療に有効な量の請求項9の画分と、製薬上許容できる担体を含むことを特徴とする、医薬組成物。癌の予防または治療の方法であって、必要とする患者に治療に有効な量の請求項9の画分を投与することを含むことを特徴とする、方法。前記癌が肝臓癌であることを特徴とする、請求項16に記載の方法。前記肝臓癌が肝細胞癌HCCであることを特徴とする、請求項16に記載の方法。化合物であって、以下の式Iの構造を備え、式中、R’のうち1つがH、またはプロシアニジンPC単位であり、その他がOHまたはプロデルフィニジンPD単位であり、nが21~38までの数字であり、PC単位:PD単位が1:20以下であることを特徴とする、化合物。前記化合物が、グラプトペタルム属、イワベンケイ属、エケベリア属から構成される群より選択された植物の抽出物から単離されることを特徴とする、請求項19に記載の化合物。前記化合物が、オボロヅキまたはイワベンケイから単離されることを特徴とする、請求項19に記載の化合物。治療に有効な量の請求項19の化合物と、製薬上許容できる担体を含むことを特徴とする、医薬組成物。抗癌活性を有することを特徴とする、請求項22に記載の医薬組成物。癌の予防または治療に用いる医薬組成物であって、治療有効量の請求項19の化合物と、製薬上許容できる担体を含むことを特徴とする、医薬組成物。前記癌が肝臓癌であることを特徴とする、請求項24に記載の医薬組成物。前記肝臓癌が肝細胞癌HCCであることを特徴とする、請求項25に記載の医薬組成物。癌の予防または治療の方法であって、必要とする患者に治療に有効な量の請求項19の化合物を投与することを含むことを特徴とする、方法。前記癌が肝臓癌であることを特徴とする、請求項27に記載の方法。前記肝臓癌が肝細胞癌HCCであることを特徴とする、請求項28に記載の方法。線維症の予防または治療の方法であって、必要とする患者に治療に有効な量の請求項19の化合物を投与することを含むことを特徴とする、方法。前記線維症が肝線維症であることを特徴とする、請求項30に記載の方法。発明の概要本発明は植物、特にグラプトペタルム属Graptopetalumsp.の植物から単離された新規抽出物及びその画分、新規化合物に関するものである。また本発明は、新規抽出物または新規化合物を使用した癌、特に肝細胞癌HCCの治療向けの新たな方法を提供する。一側面によれば、本発明はグラプトペタルム属Graptopetalumsp.、イワベンケイ属Rhodiolasp.、エケベリア属Echeveriasp.から構成される群より選択された植物からジメチルスルホキシドDMSOで抽出された、抗癌活性を備えた抽出物を提供する。本発明は予期せずしてDMSO抽出物に抗癌活性があることを発見した。本発明の一実施形態において、前記植物はオボロヅキGraptopetalumparaguayenseまたはイワベンケイRhodiolaroseaである。本発明の一実施例において、前記抽出物は植物を30DMSOで抽出して得られる。別の一側面によれば、本発明はグラプトペタルム属Graptopetalumsp.、イワベンケイ属Rhodiolasp.、エケベリア属Echeveriasp.から構成される群より選択された植物、特にオボロヅキまたはイワベンケイから得た豊富な抗癌成分を含む画分を提供する。この画分はジメチルスルホキシドDMSOで前記植物を抽出した後、クロマトグラフィーで単離して、細胞毒性作用と、癌細胞中のAURKA、AURKB、FLJ10540の発現を下方制御する効果を備えたHH-F3と呼ばれる画分を得ることで調製される。本発明の一実施形態において、SephadexLH-20カラムがクロマトグラフィーカラムに使用される。本発明によると、本発明による前記画分は高い細胞毒性作用を備え、Huh7及びHepG2細胞中におけるAURKA、AURKB、FLJ10540の発現の下方制御に有効である。HH-F3画分の機構解明において、HH-F3画分がHCCのアポトーシスを誘発したことが分かった。つまり、HH-F3画分には癌細胞、特にHCCの治療効果があることが示された。さらに別の一側面によれば、本発明は以下の式Iの構造を備え、式中、Rのうち1つがH、またはプロシアニジンPCであり、その他がOHまたはプロデルフィニジンPD単位であり、nが21~38までの数字であり、PC単位:PD単位<1:20である、化合物を提供する。前記プロシアニジンPC単位の構造が、であり、前記プロデルフィニジンPDの構造が、である。本発明によると、前記式Iの化合物は、グラプトペタルム属Graptopetalumsp.、イワベンケイ属Rhodiolasp.、またはエケベリア属Echeveriasp.から構成される群より選択された植物から単離することができる。本発明の一実施形態において、前記化合物はオボロヅキまたはイワベンケイの画分から精製される。式Iの化合物は3,4,5-トリヒドロキシベンジル部分が豊富で、抗癌活性を備えていることが分かった。さらに別の一側面によれば、本発明は本発明の抽出物、画分、または化合物、及び製薬上許容できる担体を含む組成物または医薬組成物を提供する。さらに、前記医薬組成物は肝臓癌、特にHCCなどの癌の予防または治療において有効な抗癌活性を備えている。さらに別の一側面によれば、本発明は癌、特にHCCの治療用薬剤の調製における、本発明の抽出物、画分、または式Iで表される化合物の使用を提供する。さらに別の一側面によれば、本発明は、本発明の抽出物、画分、または化合物の治療に有効な量を必要とする患者に投与することを含む、癌の予防または治療方法を提供する。本発明の一実施例において、前記癌はHCCである。図面の簡単な説明本発明の上述の概要と、以下に述べる詳細な説明は、付属の図面と共に参照することでより良く理解されるであろう。本発明を例示する目的のため、図面には現時点で好ましい実施形態が示されている。ただし、本発明は図面に示される実施形態に限定されないと理解されるべきである。図面において:発明の説明異なる定義がなされていない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者が通常理解するものと同じ意味を有する。本明細書において使用されるある、その等の単数形には、文脈上明らかに単数である場合を除いて、複数の指示対象も含まれる。即ち、例えばある試料asampleと言う場合には、こうした試料及び当業者に公知のその等価物が複数ある場合も含まれる。本発明は、グラプトペタルム属、イワベンケイ属、またはエケベリア属から構成される群より選択された植物をDMSOで抽出して調製した新規抽出物GP抽出物というを提供する。本発明は予期せずしてGP抽出物に抗癌活性があることを発見した。本発明によると、前記抽出物はこの技術において一般的に用いられる、または標準的な方法を用い、前記植物をジメチルスルホキシドDMSOで抽出して調製することができる。本発明の一実施例において、植物の葉を磨砕凍結乾燥して粉末状とし、DMSO、好ましくは30のDMSOとボルテックスで撹拌vortexedした。DMSOでの抽出前にメタノールMeOHでの抽出が含まれてもよい。グラプトペタルム属Graptopetalumという用語は、グラプトペタル属のあらゆる植物、その一部あるいは複数の部分を指す。2つ以上のグラプトペタル属の種、またはその一部の組み合わせも含まれる。グラプトペタルム属は好ましくはオボロヅキGraptopetalumparaguayenseである。本明細書で使用するイワベンケイ属Rhodiolaという用語は、イワベンケイ属のあらゆる植物、その一部あるいは複数の部分を指す。2つ以上のイワベンケイ属の種、またはその一部の組み合わせも含まれる。イワベンケイ属は好ましくはイワベンケイRhodiolaroseaである。本明細書で使用するエケベリア属Echeveriaという用語は、エケベリア属のあらゆる植物、その一部あるいは複数の部分を指す。2つ以上のエケベリア属の種、またはその一部の組み合わせも含まれる。エケベリア属は好ましくは養老Echeveriapeacockiiである。本発明の好ましい一実施例において、前記植物はオボロヅキまたはイワベンケイである。本明細書で使用する抽出物という用語は、抽出される物質を溶媒に浸漬するか、または溶媒と混合して得られた溶液を指す。本発明において、抽出物はDMSO抽出物である。本発明は、豊富な抗癌成分を含むグラプトペタルム属、イワベンケイ属、エケベリア属から構成される群より選択される植物からの画分も提供する。前記画分はジメチルスルホキシドDMSOで前記植物を抽出し、その後クロマトグラフィーで単離してHH-F3と呼ばれる画分を得ることで調製される。本発明の一実施例において、前記植物はオボロヅキまたはイワベンケイである。前記画分はDMSOで前記植物を抽出し、クロマトグラフィーで単離して、HH-F3と呼ばれる画分が得られる。本発明の一実施例において、SephadexLH-20カラムがクロマトグラフィーに使用される。前記画分は細胞毒性を生じる効果と、癌細胞、特にHuh7細胞やHepG2細胞などのHCC細胞株においてAURKA、AURKB、FLJ10540の発現を下方制御する効果を有することが分かった。HH-F3画分の機構解明を行い、それによるとHH-F3画分がHCCのアポトーシスを誘発したことが示された。したがって、HH-F3画分は癌、特にHCCなど肝臓癌の予防または治療用の治療剤となり得る。本発明の一実施例により、HH-F3画分から透析によってHH-F3aと呼ばれる細画分が取得された。その後、HH-F3a画分から既知のプロアントシアニジン化合物とは異なる活性化合物が単離された。取得された前記化合物は、3,4,5-トリヒドロキシベンジル部分において豊富にプロアントシアニジンプロアントシアニジンを含有する。前記化合物は次の式Iの構造で示される。式中、Rのうち1つがH、またはプロシアニジンPC単位であり、その他がOHまたはプロデルフィニジンPD単位であり、nが21~38までの数字であり、PC単位:PD単位<1:20である。前記プロシアニジンPC単位の構造が、であり、前記プロデルフィニジンPDの構造が、である。したがって、本発明は抗癌活性を有することが実証されている式Iの化合物を提供する。本発明の一実施例において、式Iの前記化合物は、グラプトペタルム属、イワベンケイ属またはエケベリア属の植物からDMSOでDMSO抽出物を抽出して取得することができる。ウェスタンブロットによるAURKAの下方制御の解析を使用してDMSO抽出物を選択し、透析と更なる精製によりHH-F3aと呼ばれる細画分を得る。本発明は、治療有効量の本発明の抽出物、画分または式Iの化合物と、製薬上許容できる担体を含む、医薬組成物を提供する。本明細書で使用する治療有効量という用語は、治療の意図する目的を達するに足る薬剤の量を指す。例えば、HCCの治療に有効なグラプトペタルム属の量は、HCC細胞を殺すに足る量である。特定の薬剤の治療に有効な量は、薬剤の性質、投与経路、薬剤を受け入れる動物の種及び大きさ、投与の目的などの要因によって異なる。個別案における治療に有効な量は、本発明の開示及び分野において確立された方法に基づき当業者が経験的に判断することができる。本発明の医薬組成物は、非経口または経口投与を含むがこれらに限定されない、適切な経路で投与することができる。非経口投与向けの医薬組成物には、溶液、懸濁液、乳剤、及び使用直前に溶媒に溶解または懸濁される固形注射用組成物が含まれる。注射剤は1つ以上の活性成分を希釈剤で溶解、懸濁、または乳化させて調製することができる。前記希釈剤の例としては、注射用蒸留水、生理食塩水、植物油、アルコール、及びそれらの組み合わせが挙げられる。さらに、前記注射剤は安定剤、可溶化剤、懸濁剤、乳化剤、緩和剤、緩衝化剤、保存料などを含むことができる。前記注射剤は最終製剤手順において滅菌されるか、または滅菌手順によって調製される。本発明の医薬組成物は、例えば凍結乾燥により、滅菌固形製剤として調製することもでき、滅菌後、または使用直前に滅菌注射用水またはその他滅菌希釈剤に溶解させて使用することができる。本発明によると、前記組成物は経口経路で投与してもよく、その場合前記組成物は固形または液体の形態とすることができる。固形組成物は錠剤、丸剤、カプセル剤、分散性粉末剤、顆粒剤などを含む。また、前記経口組成物は口腔に付着されるうがい薬及び舌下錠も含む。カプセル剤は硬質カプセルと軟質カプセルを含む。経口用途のこれら固形組成物において、1つ以上の活性化合物が単独で、または希釈剤、結合剤、崩壊剤、潤滑剤、安定剤、可溶化剤と混合して従来の製剤に調製される。必要時、そのような製剤はコーティング剤で剤皮を施すか、2層以上のコーティング層で剤皮を施すことができる。一方、経口投与向けの液体組成物は、薬学的に許容可能な水溶液、懸濁液、乳濁液、シロップ、エリキシル剤などを含む。そのような組成物において、一般的な希釈剤精製水、エタノール、それらの混合物など中で1つ以上の活性化合物が溶解、懸濁または乳化される。そのような希釈剤のほか、前記組成物は湿潤剤、懸濁剤、乳化剤、甘味剤、香味剤、香料、保存料、緩衝化剤などなどを含むこともできる。実施例中で本発明の抽出物、画分または化合物、あるいはその医薬組成物がHCC細胞においてアポトーシスを引き起こしたことが確認されており、それらが抗癌活性を備え、癌、特にHCCの予防または治療に用いることができることが示唆されている。また一方で、線維症、特に肝線維症の治療に有効であることが示唆されている。したがって、本発明は癌、特にHCCの治療用薬剤の調製における、本発明の抽出物、画分、または式Iで表される化合物の使用を提供する。また、本発明は、必要とする患者に、治療に有効な量の本発明の抽出物、画分または化合物を投与することを含む、癌または線維症、特にHCC及び肝線維症の予防または治療方法を提供する。以下の実施例は、本発明を例示しているが、本発明の範囲を限定するものと解釈されてはならない。実施例実施例1:GPまたはイワベンケイからの抽出及び精製オボロヅキGPというの葉を磨砕し、-20°Cで凍結乾燥して粉末とした後、抽出の前に防湿室内において25°Cで保管した。最初に、1.5gのGP粉末を10mlの100メタノールMeOHと共に5分間ボルテックスで撹拌し、その後1500gで5分間遠心分離した。上清を除去した後、10mlのH2O、100アセトン、100メタノール、100エタノール、70エタノール、50エタノール、100DMSO、30DMSOを各ペレットに添加して各抽出物の再懸濁を行った。懸濁物を5分間ボルテックスで撹拌して混合し、1500gで5分間、2回遠心分離した後、再度9300gで5分間遠心分離し、0.45μmフィルタを使用して層流により室温でろ過した。30DMSOの上清は、SephadexLH-20カラムにより4つの画分F1~F4に分画されるか、-20°Cで150mg/mlの原液30DMSOGP抽出物というとして保管された。GP抽出物またはHH-F3画分は、活性化合物を取得するため、透析膜MWCO12-14,000SpectrumLaboratories、RanchoDominguez、CAにより水に対して透析された。ウェスタンブロットによるAURKA、AURKB、FLJ10540のタンパク質レベル解析を使用してHH-F3画分と呼ばれる活性分子を解析した。加えて、HH-F3画分をさらにHPLCと1H-NMRスペクトル及び13C-NMRスペクトルにより解析し、活性分子の構造を識別した。同様に、イワベンケイRSという植物を凍結乾燥して粉末とした後、抽出の前に防湿室内において25°Cで保管した。1.5gのRS粉末を10mlのH2Oに溶解させ、1500gで5分間遠心分離した後、0.45μmフィルタを使用して層流により室温でろ過した。試料は150mg/mlの原液として-20°Cで保管された。本発明のHH-F3画分の化学分析によると、1H-NMRスペクトル及び13C-NMRスペクトルにおける大量の芳香族シグナルから、その主要成分がポリフェノール化合物であることが識別された。HH-F3画分中の主要な化合物は、凍結乾燥後のその特有のピンク色と、部分的に分銀色の金属様の光沢という特徴から、タンニンであることが識別された。濃縮タンニン定量の比色分析法OD500でのモニタリング時標準としてカテキンを使用によって判定されたHH-F3画分のタンニン総含量は約68であった。HH-F3画分のHPLCフィンガープリント図1によると、化合物の2群A群とB群はHH-F3画分において異なる分子量の範囲を有することが示され、かつB群では1つの主成分と1つの微量成分が検出された。プロアントシアニジンに富んだ高分子量の画分、HH-F3a出発原料HH-F3の量と比較して収率71.9が透析を使用してHH-F3画分から調製された。簡単に説明すると、HH-F3112.1mgを透析膜MWCO12-14,000により水に対して透析し、内膜画分HH-F3A、80.6mgと外膜画分7.4mgを得た。この画分が活性化合物を含み、これはウェスタンブロットによるAURKAの消失を測定することで判定された図6D。HH-F3aのプロアントシアニジン画分の主要骨格はプロアントシアニジンポリマーであると判定され以下を参照、平均分子量mMW、平均重合度mDP、PC:PD率及び立体化学シス:トランスを含むその生理化学的特性を表1に示す。mMWとmDPは、分解された末端と伸長したモノマーの比率を分析することで判定される。さらに、調製手順を簡潔にするため、GP抽出物を水に対して直接透析する別の方法方法IIが実施され、方法IIにより調製された化合物の生理化学的データも表1に示す。表1に示された生理化学的特性によると、方法IIにより調製された画分は方法IHH-F3aの調製に使用した方法によるそれと同じであることが示唆されている。HH-F3aの予測構造:プロデルフィニジン比率が高い>95重合性プロアントシアニジン21<n<38。GP由来の重合性化合物はこれまで報告されていないため、別の貴重なイワベンケイ属Crassulaceousの薬草、イワベンケイRhodiolaroseaゴールデンルート由来のポリフェノール化合物がHH-F3aの構造識別の参照化合物として使用される。イワベンケイは重合性プロアントシアニジンPACを有することが報告されている。HH-F3a画分における主要化合物の構造はイワベンケイのプロアントシアニジン化合物と非常に類似している表2参照が、プロシアニジン単位PC単位に対するシグナルはマイナー<5で、これは13CNMRスペクトルδC114ppm、B環C-2’及びC-5’では検出不能であった。さらに、PAC化合物はヴィティスヴェニフェラVitisviniferaなど多くの一般的なブドウ品種でよく見受けられる。したがって、ヴィティスヴェニフェラ由来のPACも比較に用いられる。表2にイワベンケイとヴィティスヴェニフェラ一般的なブドウ品種由来のプロアントシアニジンポリマーの生理化学的特性を示す。表2のデータと比較して、HH-F3a画分のプロアントシアニジン化合物は、PD対PCの比率が2.5倍以内、イワベンケイのmDPとmMWの3.0倍、ヴィティスヴェニフェラのmDPの30~80倍、mMWの1.1~4.9倍、3-O-ガロイルの4.7~41.3倍それぞれ高かった。知り得る限りにおいて、GP由来のプロアントシアニジン化合物が単離されたことはなく、同じ生理化学的特性を持つプロアントシアニジン化合物はこれまで報告されていない。この証拠は、HH-F3a画分中のプロアントシアニジン化合物が新規化合物であることを示唆しており、それは3,4,5-トリヒドロキシベンジル部分PD単位のB環と没食子酸を含むに富んでおり、イワベンケイにおいて見られるものと非常に類似しているが、ブドウの皮と種に見られるものよりずっと高い。実施例3:実施例の効果1.生存試験細胞を24ウェルプレートに植え4,000~5,000細胞/ウェル、一夜培養した後、30DMSOGP抽出物またはHH-F3画分で0、24、48、または72時間処理した。処理後、細胞を1xPBS137mMNaCl、2.7mMKCl、10mMNa2HPO4、2mMKH2PO4で軽く3回洗浄し、その後0.5μg/mlの3-4,5-ジメチルチアゾール-2-イル-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミドMTTで2時間培養した。培地を除去し、濃い青色の結晶を室温で10分間100DMSOに溶解させた。ELISAリーダーにより570nmでOD値を測定した。2.ウェスタンブロットすべての試料を95°Cで10分間加熱することにより変性させ、8または10のSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動SDS-PAGEにより濃縮ゲルと分離ゲルそれぞれ80Vと100Vで分離させた。SDS-PAGEの後、Bio-Rad転写システムを使用してタンパク質をポリフッ化ビニリデンPVDF膜に転写した。タンパク質の転写後、膜をポンソーSで染色し、タンパク質転写の効率と均一性を確認した。室温において30分間5無脂肪脱脂粉乳BDで膜をブロックした後、一次抗体と4°Cで一夜培養した。その後1xトリス緩衝生理食塩水Tween-20TBSTで3回各回10分間膜を洗浄し、膜を二次抗体と2時間培養した後、1xTBSTで3回各回10分間膜を洗浄した。HRP基質過酸化物溶液/ルミノール試薬ImmobilonTMウエスタン化学発光基質、ミリポア;1:1の割合で混合を添加して二次抗体のシグナルを可視化し、富士フイルムLAS4000ルミノイメージアナライザーで検出した。3.細胞計数細胞を12ウェルプレートに10,000~30,000細胞/ウェル一夜植えた後、HH-F3画分で0、24、48、または72時間処理した。細胞をトリプシン処理してから0.4トリパンブルーと混合した後、カウントした。4.細胞周期解析及びフローサイトメトリー細胞をトリプシン処理して1xPBSで3回洗浄した後、800gで5分間遠心分離した。続いて、PBSに溶解した70エタノールに細胞を再懸濁し、-20°Cで16時間以上維持した。800gで5分間遠心分離した後、100μg/mlのリボヌクレアーゼASigma-Aldrichを含む冷PBSに細胞ペレットを20分間再懸濁した。その後細胞を20μg/mlのヨウ化プロピジウムPI、Sigma-Aldrichで20~30分間染色し、DNA含量をBDFACSCantoで測定してFlowJoソフトウェアで解析した。5.ミトコンドリア膜電位試験CaymanChemical社より購入したヨウ化5,5’,6,6’-テトラクロロ-1,1’,3,3’-テトラエチルベンゾイミダゾールカルボシアニンJC-1を使用してミトコンドリア膜電位の解析を行った。培養した細胞を7000細胞/ウェルの密度で96ウェルブラックプレートに植え、一夜培養した後、HH-F3画分有りまたは無しで48時間処理した。JC-1染色溶液を各ウェルに添加して37°Cの暗所において15~30分間軽く混合した。プレートを室温において400gで5分間遠心分離し、上清を除去した。その後、各ウェルにJC-1アッセイ緩衝液を添加してから、室温において400gで5分間遠心分離した後、上清を除去した。最後に、各ウェルにJC-1アッセイ緩衝液を添加して蛍光プレートリーダーを使用し、解析した。6.ROSレベルの測定超酸化物ラジカルO2-の細胞内産生をハイドロエチジン蛍光色素AATBioquest,Inc.で評価した。細胞はHH-F3画分有りまたは無しで48時間処理された。ハイドロエチジン10μmを各ウェルに添加して37°Cの暗所において30~60分間軽く混合した。細胞の蛍光を波長520nm励起と610nm蛍光でモニタリングした。細胞内過酸化物レベルはジクロロフルオレセインDCFHジアセタートMarkerGeneTechnologies,Inc.で判定した。HH-F3画分での48時間の処理後、培地をアスピレーションして細胞をPBSで2回洗浄した。続いて、37°Cの暗所において無血清培地で細胞をDCFHと最終濃度20μMで30~60分間培養した。細胞を再度PBSで洗浄し、200μlの培地に保持した。細胞の蛍光を波長485nm励起と528nm蛍光でモニタリングした。7.動物及び試験環境試験期間開始時点で6週齢の雄ウィスター系白Wistaralbinoラット150~180g120匹が使用された。研究期間中、動物はすべて標準食物と水を自由摂食し、疾病誘発の7日前に順化した。試験方法ラットは正常群N=10、ジエチルニトロサミンDEN群N=30、低用量GP群N=30、高用量GP群N=30に無作為に分割された。さらに追加の5匹のラットをHH-F3処理群として含めた。正常群を除くすべての群において、ラットは毎日唯一の飲用水源として100ppmv/vのDENSigma-Aldrich、米国ミズーリ州セントルイス水溶液を63日間飲用し、64日目からさらに14日間水道水を供給した。DEN溶液は毎週調製され、それまでの用量に対する反応としての動物の体重増減に基づき個別の用量で調製された。42日目以降目に見える肝臓腫瘍が記録され、63日目以降には肝線維症が観察された。試験期間中、動物は毎週体重測定を行って体重の増加を計算し、水消費量も毎週計測された。低用量群のラットには1匹当たり0.6g、高用量群のラットには1匹当たり1.8gの凍結乾燥したGP粉末がそれぞれ42日目から3週間にわたって毎日与えられた。採取手順及び肝臓の形態学的評価すべての動物は84日目に安楽死された。動物は一夜の絶食後、CO2吸入によって犠牲死された。ラットの犠牲死後、体、肝臓、脾臓の重量を測定し、正中開腹による解剖の後、器官の状況が記録された。迅速にすべての肝葉を採取し、各時間点で肝臓表面の状態、肝臓病巣、持続性結節PN、または癌の進行具合を徹底的に検査した。その後、肝臓を5mmの切片にカットした。すべての肝臓表面上及び5mmの切片内の肉眼で確認できる結節をカウントし、その数量と大きさを判定した。腫瘍量の評価DENが与えられた動物における腫瘍形成の過程を確立するため、すべての肝葉が迅速に採取され、かつすべての肝臓表面上及び5mmの切片内の肉眼で確認できる結節をカウントし、その数量と大きさを判定した。腫瘍量は各動物の直径が3mmを超える全腫瘍結節の体積合計を計算し、群を比較することで判定された。胆汁流速動物を犠牲死させる前に80mg/kgのケタミンによる深麻酔後、胆汁流速が測定された。胆汁流速の測定には、総胆管内にPE10シリコンチューブを配置してから、計算用ポリエチレンチューブに接続した。チューブ内の胆汁流量を5分間隔で測定した。組織病理学的評価血液排出後、腫瘍を含む約5mm厚の組織片を各肝葉から取り出した。5μm厚の切片を切り出してヘマトキシリンエオジンで染色し、公開されている診断基準を使用して組織病理学的分析を行った。α-平滑筋アクチンα-SMA免疫組織化学染色肝臓試料をホルマリンで固定し、パラフィンで包埋した後、5μmの切片を切り出した。切片は脱パラフィン処理と再水和後、0.03の過酸化水素で10分間処理し、内在性ペルオキシダーゼ活性を失活させた。続いてPBSで2回洗浄した後、切片をマウス抗ヒトα-SMAモノクローナル抗体1:50希釈、DakoCytomation、デンマークと室温で1時間培養した。α-SMA染色のため、切片を洗浄し、二次抗体、ウサギ抗マウスIgG1:200希釈と室温でさらに1時間培養した。切片は同様に形成された。染色後、切片をヘマトキシリンで対比染色して顕微鏡で検査した。デジタルカメラシステムHC-2500FujiPhotoFilm、AdobePhotoshopバージョン5.0J、Image-ProPlusバージョン3.0.1Jを使用してα-SMA陽性区域肝臓切片のmm2/cm2の割合を測定した。肝臓中のヒドロキシプロリン含量試験肝臓試料の重量を計測し、20mgの冷凍試料を20mlの6NHCl中で加水分解して慎重に磨砕した。さらに、1mgの組織に6NHClを加え、総量を30mlとした。HCl中で磨砕された組織を120°Cで16時間加水分解した。しばらく氷の上で冷却した後、8000gで10分間遠心分離し、上清を除去して新しいチューブに入れ替えた。蒸発で失われた体積を水で補充した。等しい体積の6NNaOHを加えて混合し、リトマス紙を使用して溶液をpH4~9に調整した。40μlの中和後の試料溶液を96ウェルのELISAプレートに加え、5mlの7クロラミンTSigma-Aldrichと20mlの酢酸/クエン酸緩衝液を含む溶液を使用して酸化した。その後、150mlのエールリッヒ試薬を添加した。最終混合物を60°Cで35分間培養した後、室温でさらに10分間培養し、その後560nmで吸光値を測定した。100、80、60、40、20、0mg/mlの標準4-ヒドロキシ-L-プロリンSigma-Aldrichを含有する標準溶液を同様に処理した。この範囲r=0.99で標準曲線は線形であった。肝臓ヒドロキシプロリンレベルの値はヒドロキシプロリンmg/肝湿重量gとして表された。すべての試験は3回繰り返して実施された。酸化ストレスの免疫細胞化学分析ニトロブルーテトラゾリウムNBT、Sigma-Aldrich潅流法を使用して肝臓におけるデノボROS産生部位を特定した。NBT潅流肝臓を取り除き、亜鉛/ホルマリン溶液中で固定し、ホルマザン沈殿物の組織検査を行った。AdobePhotoshop7.0.1画像ソフトウェア分析を使用して青色NBT沈殿物の密度を判定した。結果Huh7細胞及びMahlavu細胞における異なるGP調製物の効果GPの潜在的生物活性を試験するため、水抽出物、ブタノール抽出物、アセトン抽出物、メタノール抽出物、100エタノール抽出物、70エタノール抽出物、50エタノール抽出物、100DMSO抽出物、30DMSO抽出物を含む抽出物の異なる調製物を調製し、ヒトHCC細胞の処理に使用した。図1に示すように、GP抽出物の異なる調製物によって生じた成長抑制効果を剤量依存的方法で評価した。MTT試験結果によると、30DMSO抽出物がHuh7細胞図2AとMahlavu図2B細胞の生存性を大幅に抑制することが示された。GPが間期と有糸分裂中の両方で活性化した肝星細胞とHCC細胞株におけるAURKA、AURKB、FLJ10540タンパク質発現レベルを低下させたAURKA、AURKB、FLJ10540は癌遺伝子であり、HCC中で過剰に発現される。このため、GP抽出物の異なる調製物がヒトHCC細胞株中のこれら癌タンパクを抑制するかを試験した。結果、GP抽出物方法の段落で説明されるように、100メタノールから取得した後、30DMSOで抽出、ここでは30DMSOGP抽出物というが、活性化された肝星細胞HSC-T6においてFlj10540とAurkbのタンパク質発現レベルを抑制し図3A、かつHCC細胞HepG2とHuh7におけるFLJ10540、AURKA、AURKBのタンパク質発現レベルが抑制された図3Bことが分かった。AURKAとFLJ10540両方の発現レベルは間期より中期の間より高い。次に、GPがHCC細胞において有糸分裂中にこれら2つのタンパク質の発現を抑制するかを調査した。Huh7細胞とHepG2細胞を50~75μg/mlのノコダゾールで18時間処理し、続いてノコダゾールを洗浄せずに30DMSOGP抽出物で3時間処理した。これまでの発見と同様に、AURKA、AURKB、FLJ10540が有糸分裂中高い発現を示した。AURKA、AURKB、FLJ10540のタンパク質発現レベルは間期と中期の両方の間減少した図3Cが、PIN1、HURP、PLKを含め検査した他の有糸分裂タンパク質において大幅な変化は観察されなかったデータは未提示。30DMSOGP抽出物HH-F3画分のみHCC細胞株におけるAURKAタンパク質発現を抑制したが、異なる溶剤から調製されたその他抽出物は抑制しなかったヒトHCCHuh7細胞を500μg/mlのGP抽出物の異なる調製物で48時間処理した。30DMSO抽出物はこれら細胞においてAURKAのタンパク質発現レベルを大幅に抑制した図4A。対照的に、水またはブタノールから得たGP抽出物は、3時間の処理後、HepG2細胞におけるAURKAまたはAURKBのタンパク質発現レベルを抑制しなかった図4B。AURKAとFLJ10540はHCCにおいて過剰発現されるため、GPがHCC細胞の成長に影響を有するかを検査した。その結果、30DMSOGP抽出物が50の細胞生存率抑制濃度IC50でHuh7細胞とMahlavu細胞の細胞毒性を引き起こすことが分かり、IC50値はそれぞれ48時間の処理後約500μg/mlと250μg/mlであった図5。HH-F3がHCC細胞株におけるAURKAタンパク質発現を抑制した30DMSOGP抽出物が活性化された肝星細胞と肝癌細胞においてAURKA及びFLJ10540のタンパク質発現レベルを抑制し図2、GP中の活性分子を生成するためにこの試験を使用できることが示唆された。SephadexLH-20カラムを使用して、30DMSOGP抽出物から4画分を取得した図6A。3時間の処理後ウェスタンブロットで分析したところ第3画分HH-F3というのみHepG2細胞においてAURKAとAURKBの発現を抑制したが、一方でその他の画分HH-F1、HH-F2、HH-F4はAURKAとAURKBタンパク質発現を抑制しなかった図6B。総合すると、30DMSOから調製されたGP抽出物とHH-F3画分は、3時間の処理後HepG2細胞におけるAURKAとAURKBのタンパク質発現レベルを抑制した図6B及び図6C。さらに、HH-F3画分から透析を使用してHH-F3aと呼ばれる活性細画分を出発原料HH-F3と比較して71.9の収率で取得した。このHH-F3a画分には、HH-F3b画分にはないが活性化合物が含有され、これはウェスタンブロットによりAURKAの消失を測定することで判定された図6D。HH-F3画分はHSC-T6細胞とHCC細胞株において細胞生存率を減少する細胞生存率におけるHH-F3画分の効果を調査するため、Huh7、Mahlavu、PLC5、HSC-T6細胞を濃度5、25、50、75、100μg/mlのHH-F3画分で24、48、72時間処理した。MTT試験での検査によると、これら試験細胞タイプの生存率は、HH-F3処理の結果抑制された。Huh7、Mahlavu、PLC5、HSC-T6細胞におけるHH-F3画分での処理のIC50値は72時間でそれぞれ約50、37.5、75、20μg/mlであった図7A~図7D。この発見をさらに確認するため、細胞生存率をHuh7、Mahlavu、PLC5細胞のトリパンブルー染色で検査した。HH-F3画分処理の24、48、72時間後、濃度5、25、50、75、100μg/mlで、時間及び剤量依存的な細胞生存率の減少が示された図7E~図7G。総合すると、30DMSOGP抽出物とHH-F3画分のいずれもHCC細胞株と活性肝星状細胞の細胞生存率を抑制することができる。次に、Huh7、Mahlavu、PLC5、HSC-T6細胞を25、50、75μg/mlのHH-F3画分で3時間処理した。HH-F3画分は試験した3つすべてのHCC細胞株とHSC-T6細胞において、AURKA及びFLJ10540の両方の発現を抑制した図8Aと図8B。このHH-F3画分の抑制効果が転写レベルで発生したのか否かを調査するため、FLJ10540とオーロラキナーゼファミリーAURKA、AURKB、AURKCの遺伝子発現レベルの変化を検査した。HepG2細胞を50μg/mlのHH-F3画分で6時間処理した後、マイクロアレイU133Aチップ、Affymetrixで遺伝子発現レベルを解析し、ウェスタンブロットでタンパク質レベルを解析した。対照群と比較して、HH-F3画分での処理後、タンパク質レベルが低下したにも関わらず、前述の特定の遺伝子発現レベルにおいて変化はなかったデータ未提示。このため、HH-F3画分は恐らく転写レベルではなくタンパク質レベルでHCC細胞の成長を調整すると考えられる。HH-F3画分がHCC細胞株においてアポトーシスによる細胞死をもたらすHCC細胞の細胞周期プロファイルにおけるHH-F3画分の効果について、ヨウ化プロピジウムPI染色を使用し、抽出物を解析した。Huh7細胞とMahlavu細胞を5、25、50μg/mlのHH-F3で48時間処理した。図8Aに示すように、HH-F3画分はHuh7細胞とMahlavu細胞の細胞周期進行を阻害した。50μg/mlのHH-F3画分による48時間の処理後、Huh7のsub-G1細胞群の増加は22であり、Mahlavu細胞では26であった。HH-F3画分はMahlavu細胞においてHuh7細胞よりも大きなsub-G1細胞群の増加を生み出しており、これは前述した細胞毒性効果図9Aと一致している。次にHuh7細胞とMahlavu細胞におけるHH-F3画分のアポトーシス細胞死誘発能力を検査した。濃度5、25、50μg/mlでの24時間と48時間の処理後、開裂カスパーゼ-3と開裂PARPのタンパク質発現レベルは剤量依存的に増加した。同じ濃度下で、HH-F3画分もアポトーシス分子FASの上方制御と、BCL2及びBCL-XLの下方制御を生じた図9C。これらのデータは、HH-F3画分がカスパーゼ依存的なアポトーシス細胞死を誘発することを示している図9B。HH-F3画分がHCC細胞株においてミトコンドリア膜電位を減少させ、ROSを増加させる活性酸素ROSとミトコンドリアは、生理的条件及び病理学的条件のいずれにおいてもアポトーシス誘導において重要な役割を果たす。次にHH-F3画分が外因性経路または内因性経路を介してアポトーシスを引き起こすかを調査した。内因性経路の指標の1つであるミトコンドリア膜電位がHCC細胞で変化されるかを試験した。Huh7細胞とMahlavu細胞を5、25、50μg/mlのHH-F3画分で処理し、48時間の処理後細胞のミトコンドリア膜電位を検査した。対照群と比較して、アポトーシス細胞の数が増加した。これは、HH-F3画分での処理後膜電位がHuh7細胞とMahlavu細胞で減少したミトコンドリア膜電位ΔΨの結果図10Aと一致している。いくつかの報告において、ROSはΔΨの損失後のみ産生されることが示されている。ROSは超酸化物陰イオン、過酸化水素、ヒドロキシルラジカルを含み、これらすべてが酸素から派生している。ROSは光合成と酸素呼吸中の電子伝達プロセスの結果として産生され、正常な細胞機能に必要な生理濃度で、細胞内シグナリングと酸化還元調節に関与する。過剰なレベルのROSは酸化ストレスを引き起こし、これは脂質、タンパク質及びDNAの酸化を引き起こすため、細胞にとって潜在的に有害である。HH-F3画分でHCC細胞を刺激することでROSの産生に変化が生じるか否かを試験した。O2-の細胞内産生をハイドロエチジン蛍光色素で評価し、細胞内過酸化物のレベルをDCFHジアセタートで判定した。HH-F3画分で細胞を処理した後、HCC細胞における細胞内過酸化物図10Cと図10D及び超酸化物図10Eと図10Fの細胞産生が増加した。これは、HH-F3画分が内在性経路を介してアポトーシスを引き起こすことを示唆している。HH-F3画分がAktのリン酸化を減少させ、PTENの発現を増強する例えばAKT経路など一部の細胞増殖経路はアポトーシスの抑制とHCCにおける異常に関連がある。HH-F3がHCC細胞に細胞毒性を引き起こしたため、HH-F3がHCC細胞における細胞増殖経路に影響するかを調査した。Huh7細胞を5、25、50μg/mlの濃度のHH-F3で48時間それぞれ処理した。Huh7細胞では、HH-F3の処理下でAKTのSer473リン酸化が下方制御されたが、トータルのAKTタンパク質は影響されなかった図11。興味深いことに、HH-F3はPI3k/AKT依存シグナリング負の調節因子であるホスファターゼテンシンホモログPTENのタンパク質レベルを活性化した。これらの結果は、HH-F3が細胞増殖のAKTシグナル伝達経路を調節し、細胞アポトーシスを誘発する可能性を示唆している。GP抽出物が肝硬変動物の胆汁排出を増加させた肝臓機能を反映する胆汁流速の測定図12A、肝硬変に関連する門脈圧亢進症の指標である脾臓重量/体重の比率の定量化図12B、及びDENにより誘発されるα-SMA発現の解析図12Dによって肝硬変も評価した。すべてのデータが高用量GPによる処理後、肝硬変の状態の改善を示し、胆汁流量の増加、脾臓サイズの減少、α-SMA区域の割合の大幅な減少を示した。GP抽出物とHH-F3が硬変した肝臓におけるヒドロキシプロリン含量を減少した肝臓のヒドロキシプロリン含量レベルを測定することで肝線維症を判定した。DEN誘発動物においてヒドロキシプロリンレベルの大幅な増加が観察された143±30μg/g。対照的に、低用量GP、高用量GPまたはHH-F3での処理後、ヒドロキシプロリン含量はそれぞれ98±18μg/gP<0.05DEN群と比較、70±10μg/gP<0.05、72±8.2μg/gP<0.05であった図12C。GP抽出物とHH-F3が酸化ストレスを減少したNBTNitrotetrazoliumbluechlorideは超酸化物に曝露されると不溶性の青色ホルマザン誘導体に還元される染色剤であり、青色沈殿物は組織中の超酸化物の存在を示す組織学的マーカーとして光学顕微鏡検査により判別できる。10倍視野下で最も濃い染色区域を観察してNBT集合密度を判定した。DEN誘発動物においてNBT集合の大幅な増加が観察された23±3。対照的に、低用量GP、高用量GPまたはHH-F3での処理後、NBT集合密度はそれぞれ13±4P<0.05DEN群と比較、4.2±0.6P<0.005、6.2±2.1P<0.05であった図12E。これらの結果は、DENによって誘発される酸化ストレスがGP抽出物とHH-F3の処理によって減少される可能性を示唆している。GP抽出物とHH-F3が腫瘍量を減少した犠牲死させた動物から取得した肝臓を5mmの切片にスライスした。直径3mmを超える目に見える腫瘍結節すべての数をカウントし、大きさを測定した。腫瘍量は腫瘍結節の体積合計で表されている。目に見える腫瘍がDEN誘発動物において観察された腫瘍量2350±905mm3。対照的に、低用量GP、高用量GPまたはHH-F3での処理後、肝臓における腫瘍量はそれぞれ110±105mm3P<0.005DEN群と比較、23±31mm3P<0.005、86±12P<0.05であった図12F。肝臓の代表的な写真にはラットの硬変した肝臓に複数の肝臓腫瘍が見られた。これらの動物では表面の肉芽形成と境界に起伏のある複数の肝臓腫瘍の形成が観察され、低用量GP、高用量GPまたはHH-F3での処理後、目に見える腫瘍の数と起伏のある肝臓表面が改善された。イワベンケイ抽出物の試験も実施し、それらがHCC細胞株の細胞生存率を抑制し、AURKAタンパク質発現を下方制御することが分かった図13。本発明が属する技術分野における当業者が、更なる例示の必要なく、ここにおける説明に基づいて本発明をその最大限の範囲で利用することができると確信される。したがって、提示した説明及び請求の範囲は本発明の範囲を限定するものではなく、例示を目的としたものであると理解されるべきである。"