標的指向リガンド薬物動態調節剤標的指向部分に共有結合されているRNA干渉ポリヌクレオチドを含む、インビボでオリゴヌクレオチドを細胞に送達するための組成物。RNA干渉ポリヌクレオチドが、標的指向リガンド薬物動態調節剤標的指向部分に生理的に不安定な連結を介して共有結合されている、請求項1記載の組成物。薬物動態調節剤が、16個以上の炭素原子を有する疎水性基からなる、請求項1記載の組成物。薬物動態調節剤が、16~20個の炭素原子を有する疎水性基からなる、請求項3記載の組成物。薬物動態調節剤が、パルミトイル、ヘキサデカ8エノイル、オレイル、オクタデカ912ジエノイル、ジオクタノイル、およびC16C20アシルからなる群より選択される、請求項3記載の組成物。薬物動態調節剤がコレステロールからなる、請求項3記載の組成物。標的指向リガンドが細胞受容体リガンドからなる、請求項1記載の組成物。細胞受容体リガンドがアシアロ糖タンパク質受容体標的指向部分を含む、請求項7記載の組成物。アシアロ糖タンパク質受容体標的指向部分が、ガラクトース、ガラクトサミン、Nホルミルガラクトサミン、Nアセチルガラクトサミン、Nプロピオニルガラクトサミン、Nnブタノイルガラクトサミン、およびNイソブタノイルガラクトサミンからなる群より選択される、請求項8記載の組成物。アシアロ糖タンパク質受容体標的指向部分がガラクトースクラスターを含む、請求項8記載の組成物。ガラクトースクラスターがNアセチルガラクトサミン三量体からなる、請求項10記載の組成物。細胞受容体リガンドが葉酸を含む、請求項7記載の組成物。ポリヌクレオチド送達ポリマーをさらに含む、請求項1記載の組成物。ポリヌクレオチド送達ポリマーが、可逆的に修飾された膜活性ポリアミンを含む、請求項13記載の組成物。RNA干渉ポリヌクレオチドが、DNA、RNA、dsRNA、RNA干渉ポリヌクレオチド、siRNA、およびmiRNAからなる群より選択される、請求項1記載の組成物。ASGPr標的指向部分薬物動態調節剤標的指向部分に共有結合されているポリヌクレオチドを含む、インビボで該ポリヌクレオチドを肝細胞に送達するための組成物。ASGPr標的指向部分が、ガラクトース、ガラクトサミン、Nホルミルガラクトサミン、Nアセチルガラクトサミン、Nプロピオニルガラクトサミン、Nnブタノイルガラクトサミン、Nイソブタノイルガラクトサミン、ガラクトースクラスター、およびNアセチルガラクトサミン三量体からなる群より選択される、請求項16記載の組成物。薬物動態調節剤が、16個以上の炭素原子を有する疎水性基、16~20個の炭素原子を有する疎水性基、パルミトイル、ヘキサデカ8エノイル、オレイル、オクタデカ912ジエノイル、ジオクタノイル、およびC16C20アシル、ならびにコレステロールからなる群より選択される、請求項16記載の組成物。ASGPr標的指向部分薬物動態調節剤標的指向部分がポリヌクレオチドに生理的に不安定な連結を介して連結されている、請求項16記載の組成物。ASGPr標的指向部分および薬物動態調節剤がポリヌクレオチドに骨格分子を介して連結されている、請求項16記載の組成物。発明の詳細な説明本明細書において記載するのは、改善されたRNA干渉ポリヌクレオチド標的指向部分である。本発明のポリヌクレオチド標的指向部分は、薬物動態調節剤と組み合わせた標的指向リガンドを含む。好ましい態様において、標的指向リガンドおよび薬物動態調節剤を互いに共有結合し、次いでsiRNAに共有結合する。好ましい態様において、siRNAへの連結は生理的に不安定な共有結合による。好ましい態様において、発明者らは、疎水性基からなる薬物動態調節剤を記載する。より具体的には、薬物動態調節剤は16個以上の炭素原子を有する疎水性基からなる。例示的な適切な疎水性基は、コレステロール、パルミトイル、ヘキサデカ8エノイル、オレイル、オクタデカ912ジエノイル、ジオクタノイル、およびC16~C20アシルを含む群より選択してもよい。16個未満の炭素原子を有する疎水性基はポリヌクレオチド標的指向を増強する上で有効性が低い。ポリヌクレオチド標的指向部分として有用な薬物動態調節剤は、それぞれ直鎖、分枝、または環式でありうる、コレステロール、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、アラルケニル基、およびアラルキニル基からなる群より選択してもよい。薬物動態調節剤は好ましくは、炭素および水素原子だけを含む炭化水素である。しかし、疎水性を維持する置換またはヘテロ原子、例えばフッ素は許容されうる。標的指向リガンドおよび薬物動態調節剤を骨格分子を通じて連結し、標的指向リガンド薬物動態調節剤標的指向部分を生成する。標的指向部分骨格は、標的指向リガンドの薬物動態調節剤への連結を可能にし、さらにRNAiポリヌクレオチドへの結合を可能にする、任意の小分子でありうる。例示的な骨格はリジンまたはオルニチンである。リジンまたはオルニチン分子は、これらを通じて標的指向リガンドと薬物動態調節剤とが結合しうる2つのアミン基およびこれを通じてRNAiポリヌクレオチドへの結合が作成されうるカルボキシル基を含む。例えば、ガラクトースクラスターおよびsiRNAポリヌクレオチドに共有結合しうる薬物動態調節剤を合成することも可能である。インビボでRNA干渉RNAiポリヌクレオチドを哺乳動物の標的細胞に送達するための改善された方法を本明細書において記載する。従来、ポリヌクレオチドのインビボ送達はポリヌクレオチドの送達媒体との物理的結合を必要とした。ポリヌクレオチドは、ポリカチオン核酸複合体のように送達媒体と静電的に結合されているか、リポソームおよび安定な核酸脂質粒子SNALPのように送達媒体によって封入されているか、またはDynamicPolyConjugateRozemaetal2007のように送達媒体に共有結合されているかのいずれかであった。驚くべきことに、発明者らは、適当なRNAiポリヌクレオチド結合体分子および適当な標的指向送達ポリマーを用いることにより、RNAiポリヌクレオチドを送達ポリマーから分離し、なおポリヌクレオチドの効率的な肝実質細胞送達を達成することができることを見いだした。ポリヌクレオチドの送達ペプチドからの分離は、製剤、合成、および製造における利点を提供する。aポリヌクレオチドとポリマーが、共有結合または電荷電荷相互作用のいずれかにより結合されているという必要条件を取り除くことにより、ポリマーおよびポリヌクレオチドの濃度およびそれらの間の比は、結合した複合体の溶解性または複合体を製造する能力ではなく、成分の溶解性によってのみ制限される。溶解性の上昇によりポリヌクレオチドまたは送達ポリマー濃度の上昇と、したがって用量の上昇を可能にする。bポリヌクレオチドおよび送達ポリマーを投与の前の任意の時点で混合してもよく、または別々に投与してもよい。したがって、分離により成分を溶液または乾燥状態のいずれかで別々に保存することが可能となる。cより大きい、本質的に不安定な非共有結合送達システムに比べて、より小さい、より安定な製剤が可能である。dマスクした送達ポリマーの製造は、共有結合した負に荷電したポリヌクレオチド非存在下または負に荷電したポリヌクレオチドを共有結合する必要性なしで、より容易である。e製造は、ポリヌクレオチドの送達ポリマーとの物理的結合非存在下で単純化され、より少ない段階を必要とする。本発明は、下記の一般構造の結合体送達システムを含む:xPyプラスNT、式中、NはRNAiポリヌクレオチドであり、Tは標的指向リガンド薬物動態調節剤ポリヌクレオチド標的指向部分であり、Pは膜活性ポリアミンであり、かつマスキング剤M1は、マレアマート連結などの生理的に可逆的な連結Lを介してPに共有結合されている、標的指向部分肝臓への送達のためにアシアロ糖タンパク質受容体に対する親和性を有する、ガラクトースまたはガラクトース誘導体などを含む。Lの切断はポリアミンP上の非修飾アミンを復旧する。マスキング剤M2は任意である。存在する場合、M2は、マレアマート連結などの生理的に可逆的な連結Lを介してPに共有結合されている、親水性立体安定化部分である。xおよびyはそれぞれ整数である。その非修飾状態で、Pは膜活性ポリアミンである。ポリヌクレオチドのインビボ送達に適した膜活性ポリアミンは当技術分野において述べられている。送達ポリマーxPyは膜活性ではない。M1および任意にM2の結合によるPアミンの可逆的修飾は、Pの膜活性を可逆的に阻害または不活化し、Pの正味の正電荷を低減する。十分なマスキング剤をPに結合して、ポリマーの膜活性を阻害する。xyは、任意のマスキング剤非存在下でのP上のアミンの量により判定して、ポリアミンP上のアミンの50よりも大きい、より好ましくは60よりも大きい、より好ましくは70よりも大きい値を有する。Pがメリチンなどの膜活性ペプチドの場合、xyは、任意のマスキング剤非存在下でのP上のアミンの量により判定して、ポリアミンP上のアミンの80よりも大きい、より好ましくは90よりも大きい値を有する。可逆的連結Lの切断後、非修飾アミンが復旧し、それによりPをその非修飾、膜活性状態に戻す。可逆的連結Lの可逆的結合は、切断が所望の組織、臓器、または細胞下部位に存在するものなどの、所望の生理的条件において起こるように選択する。好ましい可逆的連結はpHに不安定な連結である。xPy、ASGPrを標的とする可逆的にマスクした膜活性ポリマーマスクしたポリマー、およびTN、ポリヌクレオチド結合体を別々に合成または製造する。TもNもP、L、M1またはM2に直接または間接的に共有結合されていない。ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド結合体のマスクした、またはマスクしていないポリマーとの静電的また疎水性結合は、ポリヌクレオチドのインビボ肝送達に必要とされていない。マスクしたポリマーおよびポリヌクレオチド結合体は同じ容器または別々の容器で供給することができる。これらは投与の前に混合してもよく、同時投与してもよく、または逐次投与してもよい。ポリマー本発明のポリマーは両親媒性膜活性ポリアミンである。ポリマーはモノマーと呼ばれるより小さい単位を繰り返し結合することにより構築される分子である。ポリマーは単一のモノマーを用いるホモポリマーでもありえ、またはポリマーは複数の異なるモノマーを用いるコポリマーもしくはヘテロポリマーでもありうる。ポリマーの主鎖は、その結合がポリマー長の伸長のために必要とされる原子からなる。ポリマーの側鎖は、その結合がポリマー長の伸長のために必要とされない原子からなる。より具体的には、本発明のポリマーは両親媒性膜活性ランダムコポリマーである。ランダムコポリマーのモノマーは規定された、または主鎖に沿った配列を持たず、例えば、AxByまたはAxByCzと書く。そのようなポリマーの一般的組成はインプットモノマーの比を反映する。しかし、1つのモノマーのもう1つのモノマーに対する正確な比は鎖間で異なる。モノマーの分布も1つのポリマーの長さに沿って異なりうる。同様に、モノマーの化学的性質がそのランダムコポリマーへの組み込み率およびそのポリマー内の分布に影響することもある。ランダムポリマーにおけるモノマーの比はモノマーのインプット比に依存するが、インプット比は組み込まれたモノマーの比に正確にマッチしないこともある。両親媒性両親媒性amphipathic、または両親媒性amphiphilicポリマーは当技術分野において周知で、認められており、親水性極性、水溶性および疎水性非極性、親油性、水不溶性基または部分の両方を有する。親水性基は、質的な用語で、化学部分が水を好むことを示す。典型的には、そのような化学基は水溶性であり、水との水素結合供与体または受容体である。親水性基は荷電または非荷電でありうる。荷電基は正に荷電アニオンもしくは負に荷電カチオンまたは両方両性イオンでありうる。親水性基の例には、以下の化学部分が含まれる:炭化水素、ポリオキシエチレン、特定のペプチド、オリゴヌクレオチド、アミン、アミド、アルコキシアミド、カルボン酸、硫黄、およびヒドロキシル。疎水性基は、質的な用語で、化学部分が水を避けることを示す。典型的には、そのような化学基は水溶性ではなく、水素結合を形成しない傾向にある。親油性基は脂肪、油、脂質、および非極性溶媒に溶解し、水素結合を形成する能力はほとんど、またはまったくない。複数の炭素原子を含む炭化水素、特定の置換炭化水素、コレステロール、およびコレステロール誘導体は疎水性基および化合物の例である。両親媒性ポリマーに関して、本明細書において用いられる部分とは、一つの共有結合が切断され、水素で置換されたときに誘導される分子と定義される。例えば、ブチルアミンにおいて、炭素と窒素との間の結合の切断、および水素による置換は、アンモニア親水性およびブタン疎水性を生じる。14ジアミノブタンが窒素炭素結合で切断され、水素で置換されると、得られる分子はここでもアンモニア2×およびブタンである。しかし、14ジアミノブタンは、疎水性部分の生成が2つの結合の切断を必要とするため、両親媒性とは考えられない。本明細書において用いられる表面活性ポリマーは、水の表面張力およびまたは他の相との界面張力を低下させ、したがって、液体蒸気界面で積極的に吸着される。表面活性の性質は通常は、物質の分子が両親媒性amphipathicまたは両親媒性amphiphilicであるという事実による。膜活性本明細書において用いられる膜活性ポリマーは、生体膜に対して以下の効果の1つまたは複数を誘導することができる、表面活性、両親媒性ポリマーである:非膜透過性分子が細胞に侵入する、もしくは膜を通過することを可能にする、膜の変化もしくは破壊、膜における孔形成、膜の分裂、または膜の破壊もしくは溶解。本明細書において用いられる膜、または細胞膜は、脂質二重層を含む。膜の変化または破壊は、以下の検定の少なくとも1つにおいてポリマーの活性により機能的に規定することができる:赤血球溶解溶血、リポソーム漏出、リポソーム融合、細胞融合、細胞溶解、およびエンドソーム放出。細胞膜の溶解を引き起こしうる膜活性ポリマーは、膜溶解性ポリマーとも呼ぶ。原形質膜よりもエンドソームまたはリソソームの破壊を優先的に引き起こすポリマーはエンドソーム溶解性と考えられる。膜活性ポリマーの細胞膜に対する効果は一時的でありうる。膜活性ポリマーは、膜に対する親和性を有し、二重層構造の変性または変形を引き起こす。膜活性ポリマーは合成または非天然両親媒性ポリマーでありうる。本明細書において用いられる膜活性ポリマーは、HIVTATタンパク質由来のアルギニンを多く含むペプチド、アンテナペディアペプチド、VP22ペプチド、トランスポータン、アルギニンを多く含む人工ペプチド、小さいグアニジニウムを多く含む人工ポリマーなどの化合物によって表される、細胞透過性ペプチドまたはポリマーと呼ばれるポリマーのクラスとは異なる。細胞透過性化合物は、見かけ上エンドサイトーシスを必要とすることなく、また膜の完全性を妨害することなく、いくつかの分子を、脂質二重層の一方の側から脂質二重層の他の側へと膜を通過して輸送するようであるが、それらのメカニズムは不明である。ポリヌクレオチドの細胞への送達は、膜に孔を形成する、またはエンドソームもしくはリソソーム小胞を破壊し、それにより小胞の内容物を細胞質中に放出させることを含む、原形質膜または内部の小胞膜エンドソームまたはリソソームなどを破壊または不安定化する、膜活性ポリマーによって仲介される。エンドソーム溶解性エンドソーム溶解性ポリマーは、pHの変化に反応して、エンドソームの破壊もしくは溶解を引き起こす、またはポリヌクレオチドもしくはタンパク質などの通常は細胞膜不透過性の化合物の、エンドソームもしくはリソソームなどの細胞内部の膜封入小胞からの放出を提供することができるポリマーである。エンドソーム溶解性ポリマーは、生理的に適切なpH範囲通常はpH55~8にわたって、それらの物理化学的性質のシフトを起こす。このシフトは、電荷、疎水性、または親水性におけるシフトの結果としての、ポリマーの溶解性または他の化合物もしくは膜と相互作用する能力における変化でありうる。例示的エンドソーム溶解性ポリマーは、pHに不安定な基または結合を有する。したがって、マスキング剤がpHに不安定な結合を介してポリマーに結合している、可逆的にマスクした膜活性ポリマーは、エンドソーム溶解性ポリマーであると考えることができる。メリチンは、天然のハチ毒中にみられる小さい両親媒性膜活性ペプチドである。メリチンは生体原料から単離することもでき、または合成品であってもよい。合成ポリマーは人による化学的プロセスによって調合または製造され、天然の生体プロセスによって生成されるものではない。本明細書において用いられるメリチンは、例えば、以下の種の毒液中で見いだすことができるメリチンファミリーの天然ハチ毒ペプチドを含む:セイヨウミツバチApismellifera、トウヨウミツバチApiscerana、クロスズメバチの一種Vespulamaculifrons、スズメバチの一種Vespamagnifica、スズメバチの一種Vespavelutinanigrithorax、アシナガバチの一種PolistesspHQL2001、コミツバチApisflorae、オオミツバチApisdorsata、トウヨウミツバチApisceranacerana、アシナガバチPolisteshebraeus。本明細書において用いられるメリチンは、天然メリチンペプチドと同一、または類似のアミノ酸配列を有する合成ペプチドも含む。具体的には、メリチンアミノ酸配列は表1に示すものを含む。合成メリチンペプチドは、天然のL型アミノ酸または鏡像異性のD型アミノ酸インベルソinversoを含むことができる。しかし、メリチンペプチドは基本的に全L型または全D型アミノ酸のいずれかを含むべきである。メリチンアミノ酸配列は逆にすることもできるレトロretro。レトロメリチンはL型アミノ酸またはD型アミノ酸レトロインベルソを有しうる。2つのメリチンペプチドを共有結合してメリチン二量体を生成することもできる。メリチンは、ペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかに結合された修飾基を有しうる。しかし、本明細書において用いられるメリチンは、互いに、またはもう一つのポリマーもしくは骨格に共有結合された、3つ以上のメリチンペプチドを含む鎖またはポリマーを含まない。疎水性基は好ましくは炭素および水素原子だけを含む炭化水素である。しかし、疎水性を維持し、例えば、フッ素を含む非極性置換または非極性ヘテロ原子が認められることもある。この用語は脂肪族基、芳香族基、アシル基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、アラルケニル基、およびアラルキニル基を含み、これらはそれぞれ直鎖、分枝、または環状であってもよい。疎水性基なる用語は、ステロール、ステロイド、コレステロール、ならびにステロイドおよびコレステロール誘導体も含む。本明細書において用いられる低級疎水性モノマーまたは基は、2から6個の炭素原子を有する疎水性基を含む。本明細書において用いられる中級疎水性モノマーまたは基は、7から11個の炭素原子を有する疎水性基を含む。本明細書において用いられる高級疎水性モノマーまたは基は、12から36個またはそれ以上の炭素原子を有する疎水性基を含む。アミン基の疎水性基に対する比は、膜破壊活性を有する水溶性ポリマーを生成するように選択する。本発明の好ましい膜活性ポリマーは、≧1mgml、≧5mgml、≧10mgml、≧15mgml、≧20mgml、≧25mgml、および≧30mgmlで水溶性である。本発明の好ましい膜活性ポリマーは、表面活性である。本発明の膜活性ポリマーは、好ましくは約3kDaから約300kDaのサイズ範囲である。ポリマーは両親媒性であるため、水性溶液中で自己会合し、臨界会合濃度は≦1mgmlである。一つの態様において、膜活性ポリアミンターポリマーのモノマー組み込み比は約4~8アミンモノマー:3~5低級疎水性モノマー:1高級疎水性モノマーである。もう一つの態様において、膜活性ポリアミンのモノマー組み込み比は約54~75アミンモノマー:3~35低級疎水性モノマー:1高級疎水性モノマーである。もう一つの態様において、膜活性ポリアミンのモノマー組み込み比は約6アミンモノマー対約3低級疎水性モノマー対約1高級疎水性モノマーである。一つの態様において、疎水性モノマーの疎水性基はアルキル基からなる。一つの態様において、アミン低級疎水性基コポリマーを、約4~8アミンモノマー:約3~5低級アルキルモノマーの供給比でモノマーを用いて合成する。もう一つの態様において、アミン低級疎水性基コポリマーを、約15アミンモノマー:4低級疎水性基モノマーの供給比でモノマーを用いて合成することができる。一つの態様において、アミン低級疎水性基高級疎水性基ターポリマーを、約4~8アミンモノマー:約3~5低級アルキルモノマー:1高級アルキルモノマーの供給比でモノマーを用いて合成する。もう一つの態様において、アミン低級疎水性基高級疎水性基ターポリマーを、約15アミンモノマー:4低級疎水性基モノマー:1高級疎水性基モノマーの供給比でモノマーを用いて合成することができる。一つの態様において、特に適切な膜活性ポリアミンは、アミン含有モノマー、ブチル含有モノマーおよび高級疎水性基含有モノマーを有するコポリマーを含み、ここで高級疎水性基は12~18個の炭素原子を含む。特に適切な膜活性ポリアミンは、ポリランダムターポリマーまたはポリランダムターポリマーを含む。マスキング本発明の送達ポリマーは、可逆的修飾が膜活性を阻害し、ポリアミンを中和して正電荷を低減し、ほぼ中性電荷のポリマーを生成し、細胞型特異的標的指向を提供し、かつポリマーの非特異的相互作用を阻害する、可逆的に修飾した両親媒性膜活性ポリアミンを含む。ポリアミンはポリアミン上のアミンの可逆的修飾を通じて可逆的に修飾する。本発明の膜活性ポリアミンは、形質膜またはリソソームエンドサイトーシス膜を破壊することが可能である。この膜活性はポリヌクレオチドの細胞送達にとって必須の特徴である。しかし、ポリマーをインビボで投与すると、膜活性は毒性につながる。ポリアミンはインビボで多くのアニオン成分とも容易に相互作用し、望まれない生体破壊につながる。したがって、ポリアミンの膜活性の可逆的マスキングはインビボでの使用のために必須である。このマスキングは、マスキング剤を膜活性ポリアミンに可逆的に結合して、可逆的にマスクした膜活性ポリマー、すなわち送達ポリマーを生成することにより達成される。膜活性の阻害に加えて、マスキング剤はポリマーを非特異的相互作用から遮蔽し、血清相互作用を低減し、循環時間を増大させ、かつ細胞特異的相互作用、すなわち標的指向を提供する。全般的に、マスキング剤がポリマーの膜活性を阻害し、ポリマーを非特異的相互作用から遮蔽し血清相互作用を低減し、循環時間を増大させ、かつインビボでの肝実質細胞標的指向を提供することは、マスキング剤の必須の特徴である。膜活性ポリアミンは非修飾マスクしていない状態で膜活性であり、修飾マスクした状態で膜活性ではない不活性化。所望のレベルの不活化を達成するのに十分な数のマスキング剤をポリマーに連結する。マスキング剤の結合によるポリマーの所望のレベルの修飾は、適当なポリマー活性検定を用いて容易に判定される。例えば、ポリマーが所定の検定において膜活性を有するならば、その検定において膜活性の所望のレベルの阻害を達成するのに十分なレベルのマスキング剤をポリマーに連結する。マスキングは、いかなるマスキング剤も非存在下で、ポリマー上のアミンの定量により判定して、ポリマー上のアミン基の≧50、≧60、≧70、または≧80の修飾を必要とする。マスキング剤のポリマーへの結合がポリマーの正電荷を低減し、したがってより中性の送達ポリマーを生成することも、マスキング剤の好ましい特徴である。マスクしたポリマーが水溶性を保持していることが望ましい。本明細書において用いられる膜活性ポリアミンは、修飾ポリマーが膜活性を示さず、インビボで細胞特異的すなわち、肝実質細胞標的指向を示す場合、マスクされている。膜活性ポリアミンは、マスキング剤をポリマーに連結している結合の切断がポリマー上のアミンを復旧させ、それにより膜活性を復旧させる場合、可逆的にマスクされている。マスキング剤が膜活性ポリアミンに生理的に可逆的な結合を通じて共有結合していることも、もう一つの必須の特徴である。生理的に可逆的な連結または結合を用いることにより、マスキング剤をインビボでポリマーから切断し、それによりポリマーのマスクを除去し、マスクしていないポリマーの活性を復旧することができる。適当な可逆的連結を選択することにより、所望の細胞型または細胞部位に送達または標的指向させられた後に膜活性ポリマーの活性を復旧する結合体を生成することが可能である。連結の可逆性は、膜活性ポリマーの選択的活性化を提供する。可逆的共有結合は、生理的に不安定な結合、細胞生理的に不安定な結合、pHに不安定な結合、pHに非常に不安定な結合、およびpHに極度に不安定な結合からなる群より選択されうる、可逆的または不安定な結合を含む。本発明の好ましいマスキング剤は、水溶液中でポリマーを修飾ポリマーと可逆的結合を形成することができる。好ましいアミン反応性基は二置換無水マレイン酸を含む。好ましいマスキング剤は下記の構造で表される:式中、R1はメチルCH3基、エチルCH2CH3基、またはプロピルCH2CH2CH3基などのアルキル基であり置換アルキル無水マレイン酸を形成する、かつR2は標的指向リガンドまたは立体安定化部分を含む。一つの態様において、標的指向リガンドはASGPr標的指向部分を含む。別の態様において、立体安定化部分はPEGを含む。膜活性ポリアミンは、過剰のマスキング剤存在下でマスキング剤に結合することができる。過剰のマスキング剤は送達ポリマーの投与前に結合送達ポリマーから除去してもよい。立体安定化部分本明細書において用いられる立体安定化部分は、立体安定化部分を含まないポリマーに比べて、それが結合しているポリマーの分子内または分子間相互作用を防止または阻害する、非イオン性親水性ポリマー天然、合成、または非天然のいずれかである。立体安定化部分は、それが結合しているポリマーが静電相互作用に参加することを妨害する。静電相互作用は、正電荷と負電荷との間の引力による、複数の物質の非共有結合である。立体安定化部分は血液成分との相互作用を阻害し、したがって細網内皮系によるオプソニン作用、食作用、および取り込みを阻害することができる。したがって、立体安定化部分は、それらが結合している分子の循環時間を延長することができる。立体安定化部分はポリマーの凝集も阻害しうる。好ましい立体安定化部分はポリエチレングリコールPEGまたはPEG誘導体である。本明細書において用いられる好ましいPEGは、約1~500のエチレングリコールモノマー、2~20のエチレングリコールモノマー、5~15のエチレングリコールモノマー、または約10のエチレングリコールモノマーを有しうる。本明細書において用いられる好ましいPEGは、約85~20000ダルトンDa、約200~1000Da、約200~750Da、または約550Daの分子量平均も有しうる。本明細書において用いられる立体安定化部分は水溶液中で、立体安定化部分を含まないポリマーに比べて、それが結合しているポリマーの分子内または分子間相互作用を防止または阻害する。リガンド標的指向基、または標的指向リガンドは、ポリマーまたは化合物を標的細胞もしくは組織、または特定の細胞型に標的指向させる、または送達するために用いる。標的指向基は分子の標的細胞との結合を増強する。したがって、標的指向基はそれらが結合している結合体の薬物動態または生体内分布特性を増強して、結合体の細胞分布および細胞取り込みを改善しうる。1つまたは複数の標的指向基を膜活性ポリマーに、直接またはスペーサーによる連結を介してのいずれかで連結することができる。標的指向リガンドなどの標的指向基の細胞または細胞受容体への結合はエンドサイトーシスを開始しうる。標的指向基は一価、二価、三価、四価でありえ、またはそれ以上の結合価を有しうる。標的指向基は、細胞表面分子に親和性を有する化合物、細胞受容体リガンド、ならびに細胞表面分子に親和性を有する抗体、抗体断片、および抗体様物質を含む群より選択してもよい。好ましい標的指向基は、細胞受容体リガンドを含む。薬物および遺伝子に細胞および特定の細胞受容体を標的とさせるために、様々なリガンドが用いられてきた。細胞受容体リガンドは、炭水化物、グリカン、糖質ガラクトース、ガラクトース誘導体、マンノース、およびマンノース誘導体を含むが、それらに限定されるわけではない、ビタミン、葉酸、ビオチン、アプタマー、およびペプチドRGD含有ペプチド、インスリン、EGF、およびトランスフェリンを含むが、それらに限定されるわけではないを含む群より選択してもよい。標的指向基の例には、アシアロ糖タンパク質またはガラクトース残基を用いることにより、アシアロ糖タンパク質受容体を標的とするものが含まれる。例えば、肝臓の肝実質細胞はASGP受容体を含む。したがって、肝実質細胞を標的とするためにガラクトース含有標的指向基を用いてもよい。ガラクトース含有標的指向基には、ガラクトース、Nアセチルガラクトサミン、オリゴ糖、および糖類クラスターTyrGluGlu3、リジン系ガラクトースクラスター、およびコラン系ガラクトースクラスターなどが含まれるが、それらに限定されるわけではない。さらに適切な結合体には、アシアロ糖タンパク質受容体ASGPR上で見いだされる炭水化物認識ドメインCRDに結合しうるオリゴ糖が含まれうる。オリゴ糖およびまたは炭水化物複合体を含む結合体部分の例は、米国特許第6525031号に提供されている。ASGPr標的指向部分標的指向部分または基は、それらが結合している結合体の薬物動態または生体分布特性を増強して、結合体の細胞特異的分布および細胞特異的取り込みを改善する。ガラクトースおよびガラクトース誘導体は、肝実質細胞表面上で発現されるアシアロ糖タンパク質受容体ASGPrへのそれらの結合を通じて、インビボで分子を肝実質細胞へと標的指向させるために用いられてきた。本明細書において用いられるASGPr標的指向部分は、ガラクトースおよびガラクトースと等しいか、またはそれよりも大きいASGPrへの親和性を有するガラクトース誘導体を含む。ガラクトース標的指向部分のASGPrへの結合は、送達ポリマーの肝実質細胞への細胞特異的標的指向および送達ポリマーの肝実質細胞へのエンドサイトーシスを促進する。ASGPr標的指向部分は、ラクトース、ガラクトース、NアセチルガラクトサミンGalNAc、ガラクトサミン、Nホルミルガラクトサミン、Nアセチルガラクトサミン、Nプロピオニルガラクトサミン、Nnブタノイルガラクトサミン、およびNイソブタノイルガラクトサミンからなる群より選択されてもよいIobstSTandDrickamerKJBC19962716686。ASGPr標的指向部分はモノマー例えば、1つのガラクトサミンを有するまたはマルチマー例えば、複数のガラクトサミンを有するの部分でありうる。いくつかの態様において、ガラクトース標的指向部分を、下記の構造で例示するとおり、PEGリンカーを通じてアミン反応性基に連結する:式中、nは1から19の間の整数である。一つの態様において、膜活性ポリアミンを、ASGPr標的指向部分マスキング剤のポリアミン上のアミンの≧50、≧60、≧70、または≧80への結合により可逆的にマスクする。もう一つの態様において、膜活性ポリアミンを、ASGPr標的指向部分マスキング剤およびPEGマスキング剤のポリアミン上のアミンの≧50、≧60、≧70、または≧80への結合により可逆的にマスクする。もう一つの態様において、ASGPr標的指向部分マスキング剤は、PEGリンカーを介してアミン反応性基に連結されたASGPr標的指向部分を含む。ASGPr標的指向部分マスキング剤およびPEGマスキング剤の両方による膜活性ポリアミンマスキングのために、PEG対ASGPr標的指向部分の比は約0~4:1、より好ましくは約05~2:1である。もう一つの態様において、約1のガラクトース誘導体マスキング剤に対して約13~2のPEGマスキング剤がある。表面電荷ゼータ電位は、懸濁液中の粒子が示す物理的性質であり、表面電荷に密接に関連している。水性媒質中で、試料のpHはゼータ電位に影響をおよぼす最も重要な因子の1つである。電荷が塩基酸のプロトン化脱プロトン化に基づいている場合、電荷はpHに依存する。したがって、ゼータ電位の値が意味を持つためには、溶液の状態、特にpHを含まなければならない。典型的な粒子について、ゼータ電位の大きさはコロイド系の潜在的安定性の指標となる。懸濁液中のすべての粒子が大きい負または正のゼータ電位を有する場合、これらは互いに反発する傾向があり、粒子が一緒になる傾向はないであろう。しかし、粒子が低いゼータ電位値を有する場合、粒子が一緒になって凝集するのを防ぐ力はないであろう。典型的な粒子の安定懸濁液と不安定懸濁液との間の一般的境界線は、一般には30または30mVのいずれかとされる。30mVよりも正または30mVよりも負のゼータ電位を有する粒子は通常は安定と考えられる。記載の発明の送達ポリマーは、生理的塩およびpH8で20mVから20mVのゼータ電位を示すが、水溶液中でコロイドとして安定であり、凝集しない。膜活性ポリアミンの正電荷、またはゼータ電位は、マスキング剤での修飾により低下する。ポリマー電荷、特に正電荷は、血清成分または非標的細胞と望まれない相互作用を引き起こしうる。正の表面電荷は、ポリマーの負に荷電した細胞膜との相互作用を増強することにより、膜活性においても役割を果たす。したがって、インビボでのポリヌクレオチドの送達のために、ほぼ中性の正味の電荷またはゼータ電位を有する送達ポリマーが好ましい。本発明の送達ポリマー、ASGPr標的指向部分マスキング剤および立体安定化部分マスキング剤の可逆的結合によりマスクした膜活性ポリアミンは、ほぼ中性の見かけの表面電荷を有し、血清中で安定である。より具体的には、本発明の送達ポリマーは、pH8で測定して30から30mVの間、20から20mVの間、10から10mVの間、または5から5mVの間のゼータ電位を有する。pH7では、結合体の正味の電荷はpH8よりも正であると予想される。正味の電荷、または表面電荷は、インビボ適用のための重要な因子である。不安定な連結連結またはリンカーは、関心対象の1つの化学基または区分を関心対象のもう一つの化学基または区分に、1つまたは複数の共有結合を介して連結する、2つの原子間の接続である。例えば、連結はマスキング剤をポリマーに接続することができる。連結の形成は2つの別々の分子を1つの分子に接続することもあり、または同じ分子内の2つの原子を接続することもある。連結は中性電荷でもよく、または正もしくは負の電荷を有していてもよい。可逆的または不安定な連結は可逆的または不安定な結合を含む。連結は任意に2つのつなぎ合わせた原子間の距離を延ばすスペーサーを含んでいてもよい。スペーサーは連結に柔軟性およびまたは長さをさらに加えうる。スペーサーには、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、アラルケニル基、アラルキニル基が含まれるが、それらに限定されるわけではなく;これらはそれぞれ1つまたは複数のヘテロ原子、複素環、アミノ酸、ヌクレオチド、および糖類を含みうる。スペーサー基は当技術分野において周知で、前述のリストは本発明の範囲を制限する意図はない。可逆的または不安定な結合は、同じ分子内の他の共有結合を分解または切断しない条件下で選択的に分解または切断されうる、水素原子への共有結合以外の共有結合である。より具体的には、可逆的または不安定な結合は、適切な条件下で同じ分子内の他の不安定でない共有結合よりも安定性が低い熱力学的に、またはより速やかに分解される動力学的に共有結合である。分子内の不安定な結合の切断は、2つの分子の生成を引き起こしうる。当業者にとって、結合の切断または不安定性は一般には結合切断の半減期t12結合の半分が切断するのに要する時間によって議論される。したがって、可逆的または不安定な結合は、分子内の他の結合よりも速やかに選択的に切断されうる結合を含む。適切な条件は不安定な結合の型によって決まり、有機化学において周知である。不安定な結合はpH、酸化もしくは還元条件もしくは物質、温度、塩濃度、酵素の存在ヌクレアーゼ、およびプロテアーゼを含むエステラーゼなど、または添加した物質の存在に対して感受性でありうる。例えば、pH上昇または低下はpHに不安定な結合に対する適切な条件である。不安定な基が変換を起こす速度は、不安定な基を含む分子の化学成分を変えることによって制御することができる。例えば、不安定な基の近くに特定の化学部分例えば、電子受容体または供与体を付加することで、化学変換が起こる特定の条件例えば、pHに影響をおよぼしうる。本明細書において用いられる生理的に不安定な結合は、哺乳動物の体内で通常遭遇する条件、または遭遇するものに類似の条件下で切断可能な不安定な結合である。生理的に不安定な連結基は、特定の生理的条件にある場合に化学変換例えば、切断を起こすように選択される。本明細書において用いられる細胞生理的に不安定な結合は、哺乳動物の細胞内条件下で切断可能な不安定な結合である。哺乳動物の細胞内条件には、哺乳動物の細胞において見られる、または遭遇するものに類似の、pH、温度、酸化または還元条件または物質、および塩濃度などの化学的条件が含まれる。哺乳動物の細胞内条件には、タンパク質分解または加水分解酵素などの、哺乳動物の細胞において通常存在する酵素活性の存在も含まれる。細胞生理的に不安定な結合は、薬学的に許容される外因性物質の投与に反応して切断されてもよい。半減期が45分未満で適切な条件下で切断される生理的に不安定な結合は、非常に不安定であると考えられる。半減期が15分未満で適切な条件下で切断される生理的に不安定な結合は、極度に不安定であると考えられる。化学変換不安定な結合の切断は、薬学的に許容される物質の細胞への添加によって開始されてもよく、または不安定な結合を含む分子が適切な細胞内およびまたは細胞外環境に到達した場合に自然に起こってもよい。例えば、pHに不安定な結合は、分子が酸性化されたエンドソームに入ると切断されうる。したがって、pHに不安定な結合はエンドソームで切断可能な結合であると考えられる。酵素切断可能結合は、エンドソームもしくはリソソームまたは細胞質に存在するものなどの酵素に曝露された場合に切断されうる。ジスルフィド結合は、分子が細胞質のより還元性の環境に入った場合に切断されうる。したがって、ジスルフィドは細胞質で切断可能な結合であると考えられる。本明細書において用いられるpHに不安定な結合は、酸性条件pH<7下で選択的に分解される不安定な結合である。細胞エンドソームおよびリソソームは7未満のpHを有するため、そのような結合はエンドソームで不安定な結合と呼んでもよい。pHに不安定ななる用語は、pHに不安定、pHに非常に不安定、およびpHに極度に不安定な結合を含む。無水物のアミンとの反応はアミドおよび酸を生成する。多くの無水物にとって、逆反応無水物およびアミンの生成は非常に遅く、エネルギー的に好ましくない。しかし、無水物が環状無水物である場合、アミンとの反応はアミド酸、すなわちアミドおよび酸が同じ分子内にある分子を生じる。同じ分子内に両方の反応性基アミドおよびカルボン酸が存在することで、逆反応が加速される。特に、一級アミンの無水マレイン酸および無水マレイン酸誘導体との生成物であるマレアミド酸は、その非環式類縁体よりも1×109から1×1013倍速くアミンおよび無水物に逆戻りするKirby1980。アミドおよび酸を生成するアミンの無水物との反応アミド酸を生成するアミンの環状無水物との反応アミンおよび無水物を生成するアミド酸の切断はpH依存的で、酸性pHで大幅に加速される。このpH依存的反応性を利用して可逆的なpHに不安定な結合およびリンカーを生成することができる。シスアコニット酸はそのようなpH感受性リンカー分子として用いられてきた。γカルボキシラートをまず分子にカップリングさせる。第二段階で、αまたはβカルボキシラートのいずれかを第二の分子にカップリングさせて、2つの分子のpH感受性カップリングを生成する。このリンカーのpH5での切断の半減期は8から24時間の間である。無水シスアコニット酸および無水マレイン酸の構造切断が起こるpHを、不安定な部分に化学的成分を付加することにより制御する。マレアミド酸のアミンおよび無水マレイン酸への変換の速度は、無水マレイン酸系の置換R2およびR3に強く依存する。R2がメチルである場合、変換の速度はR2およびR3が水素である場合よりも50倍速い。R2およびR3の両方にアルキル置換がある場合例えば、23ジメチル無水マレイン酸、速度の上昇は劇的であり、非置換無水マレイン酸よりも10000倍速い。アミンの23ジメチル無水マレイン酸による修飾から生成されたマレアマート結合は、pH5で4から10分の間の半減期で切断されて無水物およびアミンを復旧する。R2およびR3が水素よりも大きい基である場合、アミド酸のアミンおよび無水物への変換は、R2およびまたはR3が水素である場合よりも速いと予測される。pHに非常に不安定な結合:pHに非常に不安定な結合は45分未満のpH5での切断の半減期を有する。pHに非常に不安定な結合の構築は化学の技術分野において周知である。pHに極度に不安定な結合:pHに極度に不安定な結合は15分未満のpH5での切断の半減期を有する。pHに極度に不安定な結合の構築は化学の技術分野において周知である。二置換環状無水物は、マスキング剤の本発明の膜活性ポリアミンへの結合のために特に有用である。これらは生理的にpHに不安定な連結を提供し、容易にアミンを修飾し、かつ細胞エンドソームおよびリソソームで見られる低いpHでの切断によってこれらのアミンを復旧する。第二に、アミンとの反応によって作成されるαまたはβカルボン酸基は、ポリマーに対して予想される負電荷の約120しか寄与しないようであるRozemaetalBioconjugateChemistry2003。したがって、ポリアミンの二置換無水マレイン酸による修飾は、高い負電荷を有するポリマーを作成するよりもむしろ、ポリアミンの正電荷を効果的に中和する。インビボ送達のためにはほぼ中性のポリマーが好ましい。天然ポリマーは天然に見いだしうるポリマーである。例にはポリヌクレオチド、タンパク質、コラーゲン、および多糖デンプン、セルロース、グリコサミノグリカン、キチン、寒天、アガロースが含まれる。天然ポリマーは生物原料から単離することもでき、または合成によるものでもよい。合成ポリマーは人による化学的プロセスにより調合または製造され、天然の生物学的プロセスによって作成されるのではない。非天然ポリマーは、天然動物または植物の材料またはモノマーアミノ酸、ヌクレオチド、および糖類などから作成されない合成ポリマーである。ポリマーは完全または部分的に天然、合成、または非天然であってもよい。RNAiポリヌクレオチド結合体発明者らは、RNAiポリヌクレオチドの標的指向リガンド薬物動態調節剤標的指向部分への結合、およびRNAiポリヌクレオチド結合体の前述の送達ポリマーとの同時投与は、インビボでのRNAiポリヌクレオチドの改善された送達を提供することを見いだした。機能的送達とは、RNAiポリヌクレオチドが細胞に送達され、予期される生物活性である遺伝子発現の配列特異的阻害を有することを意味する。哺乳動物の脈管構造に投与された、ポリヌクレオチドを含む多くの分子は、通常は肝臓によって体から排出される。ポリヌクレオチドが体からの除去のために分解またはそれ以外に処理され、ポリヌクレオチドが遺伝子発現の配列特異的阻害を引き起こさない、肝臓によるポリヌクレオチドのクリアランスは、機能的送達とは考えない。RNAiポリヌクレオチド結合体を、RNAiポリヌクレオチドを標的指向リガンド薬物動態調節剤標的指向部分に共有結合することにより生成する。ポリヌクレオチドは、それが反応性基Aを含むように合成または修飾してもよい。標的指向部分は、それが反応性基Bを含むように合成または修飾してもよい。反応性基AおよびBは、それらが当技術分野において公知の方法を用いて共有結合を介して連結されうるように選択する。標的指向部分は、RNAiポリヌクレオチドの3または5末端に連結してもよい。siRNAポリヌクレオチドに対し、標的指向部分はセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれに連結してもよいが、センス鎖が好ましい。いくつかの態様において、siRNAを標的指向部分に、一級アミン基などの反応性基Aを含む短いアルキル鎖を介して結合する。次いで、反応性基Aを、標的指向部分上のカルボキシル基などの反応性基Bにカップリングする。肝臓中の肝実質細胞の標的指向に関して、好ましい標的指向リガンドはガラクトースクラスターである。ガラクトースクラスターは、2から4つの末端ガラクトース誘導体を有する分子を含む。本明細書において用いられるガラクトース誘導体なる用語は、ガラクトースおよびアシアロ糖タンパク質受容体に対してガラクトースと同等またはそれよりも大きい親和性を有するガラクトースの誘導体の両方を含む。末端ガラクトース誘導体を分子に、そのC1炭素を通じて結合する。アシアロ糖タンパク質受容体ASGPrは肝実質細胞に特有で、分枝ガラクトース末端糖タンパク質に結合する。好ましいガラクトースクラスターは、それぞれアシアロ糖タンパク質受容体に親和性を有する3つの末端ガラクトサミンまたはガラクトサミン誘導体を有する。より好ましいガラクトースクラスターは、3つの末端Nアセチルガラクトサミンを有する。当技術分野において一般的な他の用語には、三分岐ガラクトース、三価ガラクトースおよびガラクトーストリマーが含まれる。三分岐ガラクトース誘導体クラスターはASGPrに、二分岐または単鎖ガラクトース誘導体構造よりも大きい親和性で結合するBaenzigerandFiete1980Cell22611620;Connollyetal1982JBiolChem257939945。nMの親和性を達成するには多価が必要とされる。アシアロ糖タンパク質受容体に親和性を有する1つのガラクトース誘導体の結合は、送達ポリマーと同時投与した場合に、インビボでのRNAiポリヌクレオチドの肝実質細胞への機能的送達を可能にしない。ガラクトースクラスターはそれぞれ中心の分枝点に連結している3つのガラクトース誘導体を含む。ガラクトース誘導体を中心分枝点に糖のC1炭素を通じて結合する。ガラクトース誘導体を好ましくは分枝点にリンカーまたはスペーサーを介して連結する。好ましいスペーサーは柔軟な親水性スペーサーである米国特許第5885968号;BiessenetalJMedChem1995Vol39p15381546。好ましい柔軟な親水性スペーサーはPEGスペーサーである。好ましいPEGスペーサーはPEG3スペーサーである。分枝点は、3つのガラクトース誘導体の結合を可能にし、分枝点のRNAiポリヌクレオチドへの結合をさらに可能にする、任意の低分子である。例示的分枝点基はジリシンである。ジリシン分子は、それを通じて3つのガラクトース誘導体が結合する3つのアミン基、およびそれを通じてジリシンがRNAiポリヌクレオチドに結合しうるカルボキシル反応性基を含む。分枝点のRNAiポリヌクレオチドへの結合は、リンカーまたはスペーサーを通じて起こりうる。好ましいスペーサーは柔軟な親水性スペーサーである。好ましい柔軟な親水性スペーサーはPEGスペーサーである。好ましいPEGスペーサーはPEG3スペーサー3つのエチレン単位である。ガラクトースクラスターは当技術分野において公知の方法を用いてRNAiポリヌクレオチドの3または5末端に結合してもよい。siRNAなどの2つの鎖を有するRNAiポリヌクレオチドに対し、ガラクトースクラスターはいずれの鎖に結合してもよい。好ましいガラクトース誘導体はNアセチルガラクトサミンGalNAcである。アシアロ糖タンパク質受容体に親和性を有する他の糖類は、ガラクトース、ガラクトサミン、Nホルミルガラクトサミン、Nアセチルガラクトサミン、Nプロピオニルガラクトサミン、Nnブタノイルガラクトサミン、およびNイソブタノイルガラクトサミンを含むリストから選択されてもよい。多くのガラクトース誘導体のアシアロ糖タンパク質受容体に対する親和性は研究されており例えば、IobstSTandDrickamerKJBC19962716686参照、または当技術分野において典型的な方法を用いて容易に判定される。ガラクトースクラスターの一態様分枝点と核酸との間にPEGスペーサーを有するガラクトースクラスターポリヌクレオチドポリヌクレオチド、または核酸もしくはポリ核酸なる用語は、少なくとも2つのヌクレオチドを含むポリマーを意味する当技術分野の用語である。ヌクレオチドはポリヌクレオチドポリマーのモノマー単位である。120未満のモノマー単位を有するポリヌクレオチドはオリゴヌクレオチドと呼ぶことが多い。天然核酸はデオキシリボースまたはリボースリン酸骨格を有する。非天然または合成ポリヌクレオチドは、インビトロまたは無細胞系で重合されるポリヌクレオチドで、天然リボースまたはデオキシリボースリン酸骨格と同じまたは類似の塩基を含むが、異なる型の骨格を含みうる。ポリヌクレオチドは任意の当技術分野において公知の技術を用いて合成することができる。当技術分野において公知のポリヌクレオチド骨格には、PNAペプチド核酸、ホスホロチオアート、ホスホロジアミダート、モルホリノ、および天然核酸のリン酸骨格の他の変種が含まれる。塩基にはプリンおよびピリミジンが含まれ、これらにはさらに天然化合物アデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシル、イノシン、および天然類縁体が含まれる。プリンおよびピリミジンの合成誘導体には、アミン、アルコール、チオール、カルボキシラート、およびハロゲン化アルキルなどであるが、それらに限定されるわけではない、ヌクレオチド上に新しい反応性基を配置する修飾が含まれるが、それらに限定されるわけではない。塩基なる用語は、DNAおよびRNAの任意の公知の塩基類縁体を含む。ポリヌクレオチドはリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、合成ヌクレオチド、または任意の適切な組み合わせを含んでいてもよい。ポリヌクレオチドはインビトロで重合してもよく、組換えでもよく、キメラ配列、またはこれらの基の誘導体を含む。ポリヌクレオチドは5末端、3末端、または5および3両末端に末端キャップ部分を含んでいてもよい。キャップ部分は、逆方向デオキシ脱塩基部分、逆方向デオキシチミジン部分、チミジン部分、または3グリセリル修飾でありうるが、それらに限定されるわけではない。RNA干渉RNAiポリヌクレオチドは、配列特異的様式で導入遺伝子のメッセンジャーRNAmRNA転写物を分解またはその翻訳を阻害するための、哺乳動物細胞のRNA干渉経路機構との相互作用を通じてRNA干渉を誘導することができる分子である。2つの主なRNAiポリヌクレオチドは低分子または短い干渉RNAsiRNAおよびマイクロRNAmiRNAである。RNAiポリヌクレオチドは、siRNA、マイクロRNA、二本鎖RNAdsRNA、短鎖ヘアピンRNAshRNA、およびRNA干渉を誘導しうるRNAをコードする発現カセットを含む群より選択されうる。siRNAは、典型的には15~50塩基対、好ましくは21~25塩基対を含み、細胞内で発現された標的遺伝子またはRNAにおけるコード配列と同じ完全に相補的またはほぼ同じ部分的に相補的ヌクレオチド配列を有する、二本鎖構造を含む。siRNAはジヌクレオチド3オーバーハングを有していてもよい。siRNAは2つのアニールしたポリヌクレオチドまたはヘアピン構造を形成する1つのポリヌクレオチドからなっていてもよい。本発明のsiRNA分子はセンス領域およびアンチセンス領域を含む。一つの態様において、結合体のsiRNAは2つのオリゴヌクレオチド断片から構築され、ここで1つの断片はsiRNA分子のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列を含み、第二の断片はsiRNA分子のセンス領域のヌクレオチド配列を含む。もう一つの態様において、センス鎖はアンチセンス鎖に、ポリヌクレオチドリンカーまたは非ヌクレオチドリンカーなどのリンカー分子を介して接続される。マイクロRNAランダムコポリマーAアミン含有モノマーの組み込みのためのビニルエーテルモノマー2ビニルオキシエチルフタルイミドを、2クロロエチルビニルエーテル25g、024mol;CAS110758およびフタルイミドカリウム25g、0135mol;CAS1074824を100°CのNNジメチルホルムアミドDMF、75ml中、相転移触媒として臭化テトラnブチルアンモニウム05g;CAS1643192を用いて反応させることにより調製した。この溶液を6時間加熱し、次いで水中で粉砕し、ろ過した。次いで、この固体をメタノールから2回再結晶して、白色結晶を得た。B水溶性、両親媒性、膜活性ポリポリアミンターポリマーの合成Xmolアミン保護ビニルエーテル例えば、2ビニルオキシエチルフタルイミドを乾燥器で乾燥した丸底フラスコの窒素雰囲気下、無水ジクロロメタン中に加える。この溶液にYmol低級疎水性基例えば、プロピル、ブチルビニルエーテルおよび任意にZmol高級疎水性基例えば、ドデシル、オクタデシルビニルエーテルを加える図1。溶液を50から78°Cの浴に入れ、2ビニルオキシエチルフタルイミドを沈澱させる。この溶液に10molBF32を加え、50から78°Cで2~3時間反応を進行させる。メタノール中の水酸化アンモニウム溶液を加えて重合を停止する。ポリマーを減圧下で乾燥し、次いで14ジオキサンメタノール21に加える。フタルイミドに対し20mol当量のヒドラジンを加えて、アミンから保護基を除去する。溶液を3時間還流し、次いで減圧下で乾燥する。得られた固体を05molLHClに溶解し、15分間還流してポリマーの塩酸塩を生成し、蒸留水で希釈し、さらに1時間還流する。次いで、溶液をNaOHで中和し、室温RTまで冷却し、分子セルロースチューブに移し、蒸留水に対して透析し、凍結乾燥する。ポリマーをサイズ排除または他のクロマトグラフィを用いてさらに精製することもできる。ポリマーの分子量を、分析用サイズ排除クロマトグラフィおよび多角光散乱によるサイズ排除クロマトグラフィSECMALSを含む、標準的手順によりカラムを用いて推定する。CDW1360の合成アミンブチルオクタデシルポリターポリマーを、2ビニルオキシエチルフタルイミド5g、2302mmol、ブチルビニルエーテル0665g、658mmol、およびオクタデシルビニルエーテル0488g、164mmolモノマーから合成した。2ビニルオキシエチルフタルイミドを、磁気撹拌子を含む乾燥器で乾燥した200mL丸底フラスコのアルゴン雰囲気下、36mLの無水ジクロロメタン中に加えた。この溶液にブチルビニルエーテルおよびnオクタデシルビニルエーテルを加えた。モノマーを室温RTで完全に溶解し、澄明な均質溶液を得た。次いで、澄明溶液を含む反応容器を、ACS等級の変性アルコールおよびエチレングリコールの1:1溶液にドライアイスを加えて作った50°Cの浴に入れ、フタルイミドモノマーの目に見える沈澱を形成させた。約15分間冷却した後、BF320058g、0411mmolを加えて、重合反応を開始した。フタルイミドモノマーは重合開始後に溶解した。50°Cで3時間反応を進行させた。メタノール中1水酸化アンモニウム5mLを加えて重合を停止した。次いで、溶媒をロータリーエバポレーションで除去した。次いで、ポリマーを30mLの14ジオキサンメタノール21に溶解した。この溶液にヒドラジン0147g、46mmolを加え、混合物を3時間加熱還流した。次いで、溶媒をロータリーエバポレーションで除去し、次いで得られた固体を20mLの05molLHClに加え、15分間還流し、20mLの蒸留水で希釈し、さらに1時間還流した。次いで、この溶液をNaOHで中和し、RTまで冷却し、分子量3500のセルロースチューブに移し、蒸留水に対して24時間2×20L透析し、凍結乾燥した。示したビニルエーテルモノマーを含むポリマーを記載しているが、本発明はこれらの特定のモノマーに制限されることはない。D水溶性、両親媒性、膜活性ポリポリアミンターポリマーの合成ポリおよびポリヘテロポリマーを一般的なフリーラジカル反応スキームを用いて合成してもよい本明細書において用いられるポリポリアミンはポリポリアミン属の亜属である:式中、Rは独立に水素またはメチル基であり、Xはポリマー中に所望の比で存在する所望のモノマー側基である。ポリマー合成のために、適切なモノマーには下記が含まれるが、それらに限定されるわけではない:BOC保護アミン含有モノマーM:式中、n=1~4であり、BOC保護基の除去により一級アミンが生じる。低級疎水性基モノマーN:式中、n=1~5であり、1つまたは複数の炭素は不飽和であってもよい。高級疎水性基モノマーO:式中、n=8~24であり、1つまたは複数の炭素は不飽和であってもよい。前述のモノマーを用いて、以下の組成の膜活性ヘテロポリマーを合成することができる:Mは50~90molでありえ;Nは10~50molでありえ;Oは0~10molでありうる。E水溶性、両親媒性、膜活性ポリポリアミンターポリマーの合成R、R、およびRは独立に水素またはメチルでありx=2、3、または4でありy=0、1、2、3、4、または5[メチルC1~ヘキシルC6]でありz=≧8の整数[デシルC10またはそれ以上]でありa、b、およびdはポリマーが所望の比の前述のモノマーを有するように選択した整数である。Xmolアミン保護アクリラートモノマー、Ymol低級疎水性基アクリラートモノマー、および任意にZmol高級疎水性基アクリラートモノマーを、撹拌子を備えた反応チューブに加える。適切な溶媒例えば、アセトニトリルまたはジオキサンと、続いて適切な触媒例えば、AIBNを加え、反応混合物をN2でパージする。次いで、反応チューブに栓をし、油浴に移し、重合させるのに十分な時間例えば、3時間加熱する例えば、60°C。粗製ポリマーを、BOC保護基の除去の前に、透析、カラムクロマトグラフィ、および沈澱を含むが、それらに限定されるわけではない、適切な手段によって精製してもよい。BOC保護基を、氷酢酸中、2MHClとの反応により除去する。BOC保護基の除去によりポリマー一級アミンおよび水溶性膜活性ポリポリアミンを得る。次いで、ポリマーを、透析、カラムクロマトグラフィ、および沈澱を含むが、それらに限定されるわけではない、適切な手段によって精製してもよい。Ant4091132328、Ant40911352の合成22アゾビスAIBN、ラジカル開始剤、アセトニトリル、およびジオキサンはSigmaAldrichから購入した。アクリラートおよびメタクリラートモノマーをろ過して阻害剤を除去した。31プロパノールTCIを塩化アクリロイルCAS814686と反応させて、BOCアミノプロピルアクリラートBAPAを生成した。撹拌子を備えた2L丸底フラスコ中、2エタノール211g、2029mmolを350mLのジクロロメタンに溶解した。別の1Lフラスコ中、無水BOC366g、1691mmolを660mLのジクロロメタンに溶解した。2L丸底フラスコに滴加漏斗を取り付け、無水BOC溶液をフラスコに6時間かけて加えた。反応混合物を終夜撹拌した。2L分液漏斗中、生成物を各300mlの10クエン酸、10K2CO3、飽和NaHCO3、および飽和NaClで洗浄した。生成物であるBOC保護2エタノールをNa2SO4で乾燥し、重力ろ過し、ロータリーエバポレーションおよび高減圧を用いてDCMを蒸発させた。撹拌子を備え、アルゴンを流した、500ml丸底フラスコ中、BOC保護2エタノール27836g、1358mmolと、続いて240mLの無水ジクロロメタンを加えた。ジイソプロピルエチルアミン355ml、2037mmolを加え、系をドライアイスアセトン浴に入れた。塩化アクリロイル121ml、1494mmolを10mlのジクロロメタンを用いて希釈し、アルゴンを流した系に滴加した。系をアルゴン雰囲気下に維持し、室温に戻して、終夜撹拌した。生成物を各100mlのdH2O、10クエン酸、10K2CO3、飽和NaHCO3、および飽和NaClで洗浄した。生成物であるBOCアミノエチルエトキシアクリラートBAEEAをNa2SO4で乾燥し、重力ろ過し、ロータリーエバポレーションを用いてDCMを蒸発させた。直径75cmのカラムを用い、29cmのシリカでのカラムクロマトグラフィにより生成物を精製した。用いた溶媒系はヘキサン中30酢酸エチルであった。Rf:030。分画を集め、溶媒をロータリーエバポレーションおよび高減圧を用いて除去した。BAEEAを収率74で得た。BAEEAをフリーザーで保存した。ポリマー4091132328:70BAPA、25メタクリル酸ブチルCAS97881、5メタクリル酸オクタデシルCAS4813574、3AIBN触媒モル供給比合計00139molBAPA9739mmolA、メタクリル酸ブチル3478mmolB、およびメタクリル酸オクタデシル06957mmolDを、撹拌子を備えた20mL反応チューブに加えた。アセトニトリル16mlと、続いてAIBN04174mmolを加えた。2回の反応を並行して行うために、前述の段階を繰り返した。反応混合物をN2で30分間パージした。次いで、反応チューブに栓をし、油浴に移し、60°Cで3時間加熱した。チューブを取り出し、内容物を合わせた。粗製ポリマーを脱イオン水中で沈澱させ、ニートトリフルオロ酢酸40mlと15時間反応させて、BOC保護基を除去し、一級アミンおよび水溶性膜活性ポリポリアミンを生成した。200mLの脱イオンH2OdH2Oを反応混合物に加え、溶液を3500MWカットオフセルロースチューブに移し、高塩に対して24時間と、次いでdH2Oに対して18時間透析した。内容物を蒸発乾固し、100mLのdH2Oに溶解し、凍結乾燥した。乾燥したポリマーを50MeOH100mMギ酸アンモニウム02ギ酸溶液に25mgmlで溶解した。粗製ポリマー溶液250mg、10mlの3回の注入分を、S200セファクリル担体で、XK5030cmカラムを50ml分の流速で用いて精製した。カラムを充填し、製造者の指示に従って用いた。GEHealthcare、説明書56113082Al、52208600AH。ポリマー溶出はShimadzuRID10A屈折率コレクターを用いて検出した。23分から28分までの分画を集め、各注入ごとに合わせた。溶媒を蒸発させ、精製したポリマーを2回凍結乾燥した。ポリマーAnt40911352:80BAEEA、15メタクリル酸ブチル、5アクリル酸オクタデシル、3AIBN触媒モル供給比合計0013913molBAEEAA1113mmol、メタクリル酸ブチルB2086mmol、およびアクリル酸オクタデシルD06957mmolを、撹拌子を備えた20mL反応チューブに加えた。ジオキサン16mlと、続いてAIBN04174mmolを加えた。2回の反応を並行して行うために、前述の段階を繰り返した。反応混合物をN2で30分間パージした。次いで、反応チューブに栓をし、油浴に移し、60°Cで3時間加熱した。チューブを取り出し、内容物を合わせた。ジオキサンをロータリーエバポレーションおよび高減圧により蒸発させ、粗製ポリマーを898ジクロロメタン10テトラヒドロフラン02トリエチルアミン溶液に70mgmlで溶解した。粗製ポリマー溶液700mg、10mlの3回の注入分を、Jordigelジビニルベンゼン104Åカラム内径:22mm、長さ:500mmを50ml分の流速で用いて精製した。ポリマー溶出はShimadzuRID10A屈折率コレクターを用いて検出した。1507分~1713分の分画を集めて合わせた。溶媒をロータリーエバポレーションにより蒸発させた。約10mgのポリマーを05mLの898ジクロロメタン、10テトラヒドロフラン、02トリエチルアミンに溶解した。分子量および多分散性PDIを、Jordi5μ78×300MixedBedLSDVBカラムを用い、ShimadzuProminenceHPLCに連結したWyattHelosII多角光散乱検出器を用いて測定した。分子量172000およびPDI126を得た。精製したBOC保護ポリマーをニートトリフルオロ酢酸7mlと15時間または氷酢酸中2MHClと05時間反応させて、BOC保護基を除去し、アミンを生成した。40mLのdH2Oを反応混合物に加え、溶液を3500MWカットオフセルロースチューブに移し、高塩に対して24時間と、次いでdH2Oに対して18時間透析した。内容物を蒸発乾固し、20~30mLのdH2Oに溶解し、2回凍結乾燥した。ポリマー溶液を2~8°Cで保存した。アミンをポリマーの骨格に連結する炭素原子の数およびリンカーが分枝しているかどうかは、アミンのpKaおよびアミン付近の立体効果に影響をおよぼす。例えば、前述のポリマーについて、エチルアミンは約81のpKaを有し、プロピルアミンは約93のpKaを有し、ペンチルアミンは約102のpKaを有する。アミンのpKaまたはアミン付近の立体効果は、アミンに結合しているマスキング基の不安定性に影響をおよぼす。無水マレイン酸のアミンへの可逆的結合について、アミン結果のより高いpKaはアミンからの無水物のより遅い放出速度である。同様に、イソプロピルリンカーによるなどの、アミン付近の立体障害増大は、アミンのpKaを増大させうる。ポリマーLau41305381719:80BAPA、20メタクリル酸エチルCAS97632、アミンモノマー、低級疎水性基モノマー、および高級疎水性基オクタデシル基から合成した同様のポリマーも、記載する発明の実施において有効であると予想される。ポリマー特徴付け実施例2DW1360の特徴付けA両親媒性分析16ジフェニル135ヘキサトリエンDPH、Invitrogen蛍光λex=350nm;λem=452nmは疎水性環境で増強される。この蛍光を用いてDW1360ポリマーを分析した。05μM最終濃度DPHを05mLの50mMHEPES緩衝液、pH80中10μgのDW1360に加えた。次いで、DPHの蛍光を測定することにより、溶液を疎水性環境におけるDPH蓄積について試験した。結合体存在下でのDPH蛍光の増大は、ポリマーによる疎水性環境の形成を示す。B分子量ポリマー分子量質量MWを、バッチモードでのoptilabrEXと一緒にWyattDawnHeleosIIで分析して求めた。ポリマーを様々な濃度で適切な溶媒に加え、それぞれをWyattシステムにロードした。次いで、Astraソフトウェアで濃度の関数としての屈折率の変化を計算しdndc、これをZimmプロットで用いてMWを計算した。精製したDW1360について求めた平均分子量は4000~6000Daであった。精製したアクリラートポリマーの平均分子量は約100~120kDaであった。C分粒およびゼータ電位ポリマーのゼータ電位をMalvernZetasizerナノシリーズNanoZS機器を用いて測定した。CDMマスクポリマーのゼータ電位は0から30mVの間で変動し、0から20mVの間がより多かった。ゼータ電位は残留HEPESでpH8に緩衝化した等張グルコース中で測定した。pH7では、結合体はアミンの一部のプロトン化によりいくらかの正電荷を獲得すると予想される。DCDM試薬修飾後の結合体中のアミン基の定量DW1360ポリマーを前述のとおりに合成し、続いて14重量当量のHEPES塩基および7重量当量のCDMNAGとCDMPEGとの重量比2:1の混合物平均11単位で処理した。1時間後、無水マレイン酸誘導体処理した結合体のアミン含量を、100mMNaHCO3中のトリニトロベンゼンスルホン酸TNBSで処理することにより測定した。マレイン酸修飾していない結合体に対して規準化すると、修飾アミンの量は全体の約75であると定量された。この修飾の程度は加える無水マレイン酸の量を変えるか、または反応条件を変更することで変動しうる。Eリポソーム溶解10mgの卵ホスファチジルコリンを、100mMカルボキシフルオレセインCFおよび10mMHEPES、pH75を含む緩衝液1mLで水和した。次いで、リポソームを孔径100nmのポリカーボネートフィルターNucleoporePleasantonCAを通して押し出した。捕捉されていないCFを、Sepharose4B200を用い、pH8の10mMHEPESおよび01molLNaClで溶出するサイズ排除クロマトグラフィにより除去した。一定量200μLのCFロードリポソームを等張緩衝液18mLに加えた。小胞懸濁液に025μgのポリマーを加えた30分後、蛍光λex=488、λem=540を測定した。各実験終了時に、1TritonX100溶液40μlを加えて小胞を破壊し、最大溶解を判定した。実施例3メリチン両親媒性ポリマーペプチド表1メリチンペプチドは高い膜活性を示すことを示した。nd-判定していない。a-ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンb-CDM、CDMgal、もしくはCDMPEGまたはその組み合わせによる修飾は膜活性を阻害する。マスキング剤実施例4マスキング剤A2プロピオン酸3メチル無水マレイン酸マスキング剤前駆体カルボキシジメチル無水マレイン酸またはCDMの合成無水テトラヒドロフラン50mL中の水素化ナトリウム058g、25mmolの懸濁液に2ホスホノプロピオン酸トリエチル71g、30mmolを加えた。水素ガスの発生停止後、無水テトラヒドロフラン10mL中の2オキソグルタル酸ジメチル35g、20mmolを加え、30分間撹拌した。次いで、水10mLを加え、テトラヒドロフランをロータリーエバポレーションにより除去した。得られた固体と水との混合物をエチルエーテル3×50mLで抽出した。エーテル抽出物を合わせ、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮して、淡黄色油状物を得た。油状物をシリカゲルクロマトグラフィで、エーテル:ヘキサン=2:1で溶出して精製し、4g収率82の純粋なトリエステルを得た。次いで、このトリエステルを、水酸化カリウム45g5当量を含む水およびエタノールの5050混合物50mLに溶解することにより、2プロピオン酸3メチル無水マレイン酸を生成した。この溶液を1時間加熱還流した。次いで、エタノールをロータリーエバポレーションにより除去し、溶液を塩酸でpH2まで酸性化した。次いで、この水溶液を酢酸エチル200mLで抽出し、分離し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮して、白色固体を得た。次いで、この固体をジクロロメタンおよびヘキサンから再結晶して、2g収率80の2プロピオン酸3メチル無水マレイン酸を得た。CDMを塩化オキサリルによりその酸塩化物に変換し、続いてチオール、エステル、またはアミンおよびピリジンを加えることにより、CDMからチオエステル、エステル、およびアミドを合成してもよい。CDMおよびその誘導体は、標的指向リガンド、立体安定化部分、荷電基、および他の反応性基で、当技術分野において標準の方法により、容易に修飾される。得られた分子を用いて、アミンを可逆的に修飾することができる。マスキング剤をCDMの修飾により合成して、好ましくは電荷中性物質を生成する:式中、R1はASGPr標的指向リガンドまたは立体安定化部分例えば、PEGである。BASGPr標的指向基を含むマスキング剤最も広く研究された肝実質細胞標的指向リガンドはガラクトースに基づいており、これは肝実質細胞上のアシアロ糖タンパク質受容体ASGPrによって結合される。ガラクトースまたはガラクトース誘導体の結合は、オリゴ糖のキトサン、ポリスチレン誘導体、およびポリアクリルアミドHPMAを含む、少数の水溶性が高く、非荷電のポリマーの肝実質細胞標的指向を促進することが明らかにされている。ASGPr標的指向基は、ラクトース、すなわちガラクトースグルコース二糖を用い、グルコース残基の修飾を介して、容易に生成される。ラクトビオン酸LBA、グルコースが酸化されてグルオン酸となっている、ラクトース誘導体は、標準のアミドカップリング技術を用いて、無水マレイン酸に容易に組み込まれる。C立体安定化部分CDMPEGおよび標的指向基CDMNAGNアセチルガラクトサミン合成塩化メチレン50mL中のCDM300mg、016mmolの溶液に塩化オキサリル2g、10重量当量およびジメチルホルムアミド5μlを加えた。反応を終夜進行させ、その後過剰の塩化オキサリルおよび塩化メチレンをロータリーエバポレーションにより除去して、CDM酸塩化物を得た。酸塩化物を塩化メチレン1mLに溶解した。この溶液に、塩化メチレン10mL中の、CDMPEGについてはポリエチレングリコールモノメチルエーテルMW平均550またはCDMNAGについてはエトキシ22デオキシβDガラクトピラノシドすなわち、アミノビスエトキシルエチルNAG11モル当量、およびピリジン200μl、15当量を加えた。次いで、溶液を15時間撹拌した。次いで、溶媒を除去し、得られた固体を水5mLに溶解し、01TFA水アセトニトリル勾配を用いての逆相HPLCにより精製した。好ましくは、5から20のエチレン単位を含むPEGを二置換無水マレイン酸に結合する。より好ましくは、10~14のエチレン単位を含むPEGを二置換無水マレイン酸に結合する。PEGは様々な長さのものであってもよく、5~20または10~14エチレン単位の平均長を有する。または、PEGは、例えば、ちょうど11または13のエチレン単位を有する、単分散、均一または離散型であってもよい。上に示すとおり、PEGスペーサーは無水物基とASGPr標的指向基との間に位置してもよい。好ましいPEGスペーサーは1~10のエチレン単位を含む。可逆的ポリマー修飾実施例5膜活性ポリアミンの可逆的修飾マスキング;すなわち、膜活性ポリマーのCDMNAGまたはCDMNAGプラスCDMPEGの混合物による修飾等張グルコース中の膜活性ポリアミン例えば、前述のDW1360xmgの溶液にHEPES遊離塩基14xmgと、続いてCDMNAG7xmgまたはCDMNAG23xmgおよびCDMPEG46xmgの混合物のいずれか、合計7xの二置換無水マレイン酸マスキング剤を加えた。次いで、動物への投与の前に、溶液を室温で少なくとも30分間インキュベートした。CDMNAGまたはCDMPEGのポリアミンとの反応により下記を得た:式中、Rはポリマーであり、R1はASGPr標的指向部分または立体安定化部分を含む。無水物とポリマーアミンとの間の反応において生じた無水物カルボキシルは、予想された電荷の約120を示したRozemaetalBioconjugateChemistry2003。したがって、膜活性ポリマーは、高度に負に荷電したポリアニオンに変換されるのではなく、有効に中和される。実施例6CDMNAGによるメリチンの可逆的修飾マスキング修飾の前に、5×mgのCDMNAGを氷酢酸の01水溶液から凍結乾燥した。乾燥したNAG誘導体に、02×mLの等張グルコースおよび10×mgのHEPES遊離塩基中の×mgのメリチンの溶液を加えた。CDMNAGが完全に溶解した後、動物への投与前に溶液を室温で少なくとも30分間インキュベートした。CDMNAGのペプチドとの反応により下記を得た:式中、Rはメリチンであり、R1はASGPr標的指向部分NAGを含む。無水物とポリマーアミンとの間の反応中に生じた無水物カルボキシルは、予想される電荷の約120を示すRozemaetalBioconjugateChemistry2003。したがって、膜活性ポリマーは、高度に負に荷電したポリアニオンに変換されるのではなく、有効に中和される。siRNA結合体実施例7GalNAcクラスターの合成A22エトキシエトキシ酢酸ベンジルエステルの合成22エトキシエタノール622g、414mmolをアルゴン雰囲気下で無水DMF875mLに溶解し、0°Cに冷却した。NaH121g、277mmol、鉱油中55を注意深く加え、氷浴を取り除き、撹拌を80°Cで1時間続けた。反応混合物を周囲温度まで冷却し、ブロモ酢酸1898g、137mmolをDMF溶液20mLとして滴加漏斗より加えて処理した。75°Cでさらに30分後、ブロモメチルベンゼン2336g、137mmolをニートで加え、エステル化を30分間進行させた。冷却し、砕氷上に注意深く加え、酢酸エチルで抽出し、水で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、すべての溶媒を蒸発させた後、フラッシュクロマトグラフィSiO2、酢酸エチルヘプタン=82により、641gの表題化合物を黄色油状物で得た。MS2992MH。B酢酸6アセトキシ5アセトキシメチル2メチル5677aテトラヒドロ3aHピラノ32dオキサゾル7イルエステル市販の酢酸45ジセトキシ6アセトキシメチル3アセチルアミノテトラヒドロピラン2イルエステル100g、26mmolを無水CH2Cl2116mLに溶解し、トリメチルシリルトリフラート1427g、64mmolで処理した。反応を45°Cで終夜進行させた。0°Cまで冷却した後、トリエチルアミン488mL、35mmolを加え、混合物をCH2Cl2で希釈し、NaHCO3溶液および水で洗浄した。Na2SO4で乾燥し、溶媒を蒸発させて、103gの表題化合物を褐色油状物で得、これをそれ以上精製せずに次の段階で用いた。MS3300MH。C45ジアセトキシ6アセトキシメチル3アセチルアミノテトラヒドロピラン2イルオキシエトキシエトキシエトキシ酢酸ベンジルエステル上で調製した酢酸6アセトキシ5アセトキシメチル2メチル5677aテトラヒドロ3aHピラノ32dオキサゾル7イルエステル103g、26mmolおよび22エトキシエトキシ酢酸ベンジルエステル862g、29mmolを520mLのCH2Cl2中で混合し、4オングストロームモレキュラーシーブス63gで処理した。1時間後、トリメチルシリルトリフラート613g、28mmolを加えた。反応混合物を周囲温度で週末の間撹拌した。トリエチルアミン521mL、37mmolを加え、モレキュラーシーブスをろ去し、ろ液をCH2Cl2で希釈し、NaHCO3溶液および水で洗浄した。Na2SO4で乾燥し、溶媒を蒸発させた後、フラッシュクロマトグラフィSiO2、酢酸エチルAcOHMeOH水=60332により、157gの表題化合物を褐色油状物で得た。MS6266MH。D45ジアセトキシ6アセトキシメチル3アセチルアミノテトラヒドロピラン2イルオキシエトキシエトキシエトキシ酢酸上で調製した45ジアセトキシ6アセトキシメチル3アセチルアミノテトラヒドロピラン2イルオキシエトキシエトキシエトキシ酢酸ベンジルエステル157g、25mmolを酢酸エチル525mLに溶解し、16gのPdC10で、1atmのH2雰囲気下、周囲温度で3時間水素添加した。セライトを通してろ過し、溶媒を蒸発させた後、フラッシュクロマトグラフィSiO2、CH2Cl2MeOH=8020により、607gの表題化合物を褐色ゴムで得た。MS5365MH。E酢酸エステル保護したGalNAcクラスターベンジルエステル上で調製した45ジアセトキシ6アセトキシメチル3アセチルアミノテトラヒドロピラン2イルオキシエトキシエトキシエトキシ酢酸2820g、5246mmolおよび6アミノ226ジアミノヘキサノイルアミノヘキサン酸ベンジルエステル塩酸塩調製は下記参照、0829g、1749mmolをCH2Cl232mLおよびDMF32mLの混合物に溶解し、ヒューニッヒ塩基2096mL、1225mmol、1ヒドロキシ7アザベンゾトリアゾール0714g、5248mmolおよび13エチルカルボジイミド塩酸塩1006g、5248mmolで逐次処理し、周囲温度で終夜撹拌した。すべての揮発性物質を減圧iv下で除去し、粗製反応混合物を調製用HPLC38回、Gemini、5μ、C18で精製し、凍結乾燥後に1650gの表題生成物を白色粉末で得た。MS19458MNa。F酢酸エステル保護したGalNAcクラスター遊離酸糖ヒドロキシル保護13アセトアミド45ジアセトキシ6テトラヒドロ2Hピラン2イルオキシ203アセトアミド45ジアセトキシ6テトラヒドロ2Hピラン2イルオキシ11オキソ369トリオキサ12アザヘキサデカン16イル173アセトアミド45ジアセトキシ6テトラヒドロ2Hピラン2イルオキシエトキシエトキシエトキシアセトアミド1118ジオキソ369トリオキサ1219ジアザヘニコサン21酸上で調製したGalNAcクラスターベンジルエステル0674g、0350mmolをMeOH50mLに溶解し、0065gのPdC10で、1atmのH2雰囲気下、周囲温度で4時間水素添加した。セライトを通してろ過し、溶媒を蒸発させて、0620gの表題化合物を白色泡状物で得た。MS19170M2H2。実施例8ガラクトースクラスター分枝点、6アミノ226ジアミノヘキサノイルアミノヘキサン酸ベンジルエステル塩酸塩の合成A6tertブトキシカルボニルアミノ2ヘキサン酸ベンジルエステル6tertブトキシカルボニルアミノ2ヘキサン酸500g、1067mmolおよびフェニルメタノール2305g、2134mmolをCH2Cl225mLに溶解し、Nヒドロキシベンゾトリアゾール1933g、1174mmol、1エチル3カルボジイミド塩酸塩EDC、2250g、1174mmol、およびエチルジイソプロピルアミン2137mL、1249mmolで逐次処理した。90分間撹拌した後、揮発性物質を減圧下、周囲温度で除去し、残渣を酢酸エチルに溶解し、水、NH4Cl溶液および食塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、蒸発させた。次いで、粗製混合物をエタノール20mLに溶解し、水10mLを加えて生成物を沈澱させた。ろ過し、乾燥して、5669gの表題化合物を得、これをエタノールヘキサンから再結晶して、427gの純粋なベンジルエステルを得た。MS5592MH。B226ビスtertブトキシカルボニルアミノヘキサノイルアミノ6tertブトキシカルボニルアミノヘキサン酸ベンジルエステル上で調製した6tertブトキシカルボニルアミノ2ヘキサン酸ベンジルエステル4270g、7643mmolをTHF15mLに溶解し、ジエチルアミン15mLで処理した。周囲温度で4時間後、MSおよびTLCは出発原料がないことを示した。溶媒を蒸発させ、トルエンと共沸乾燥して、402gの遊離アミンを得、これを次の段階で直接用いた。市販の26ビスtertブトキシカルボニルアミノヘキサン酸3177g、917mmolをCH2Cl213mLに溶解し、0°Cでエチルジイソプロピルアミン471mL、275mmol、O1133テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラートTPTU、2725g、9172mmolで処理した。15分後、上で調製したアミンの最小限のCH2Cl2溶液およびエチルジイソプロピルアミン157mL12当量で、反応を周囲温度で2時間進行させた。すべての揮発性物質を減圧下で除去し、残渣を酢酸エチルに溶解し、NaHCO3溶液、NH4Cl溶液および水で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、蒸発させた。フラッシュクロマトグラフィSiO2、ヘプタン酢酸エチル=46と、続いてヘプタン最少量の酢酸エチルからの結晶化により、4516gの表題化合物を白色固体で得た。MS6654MH。C6アミノ226ジアミノヘキサノイルアミノヘキサン酸ベンジルエステル3塩酸塩上で調製した226ビスtertブトキシカルボニルアミノヘキサノイルアミノ6tertブトキシカルボニルアミノヘキサン酸ベンジルエステル4516、6793mmolをジオキサン中4molLHClに溶解した。数分後、ガスが発生し、沈澱が生じた。周囲温度で3時間後、反応混合物を注意深く蒸発させ、徹底的に乾燥して、381gの表題化合物をオフホワイト泡状物で得、これをそれ以上精製せずに上の実施例7EGalNAcクラスターベンジルエステルで用いた。MS3653MH。実施例9ポリヌクレオチド標的指向部分ポリヌクレオチド標的指向部分を、GalNAcクラスターおよび薬物動態調節剤のリジンまたはオルニチン骨格分子上のアミンへの結合により作成した。次いで、骨格上のカルボキシル基は、siRNAなどのRNAiポリヌクレオチドへの共有結合のために利用可能であった。実施例10GalNAcクラスターパルミトイル標的指向部分A26ヘキサデカノイルアミノヘキサン酸ベンジルエステル市販のFmocLysOH0899g、1481mmolを15mLのCH2C12に懸濁し、ベンジルアルコール0320g、0305mL、296mmol、2当量、ヒドロキシベンゾトリアゾルHOBT、0268g、163mmol、11当量、l3エチルカルボジイミドHClEDC、0312g、163mmol、11当量、およびNエチルジイソプロピルアミン0224g、0297mL、1733mmol、117当量で逐次処理した。次いで、黄色溶液を2時間撹拌した。砕氷NH4Cl溶液上に注ぎ、酢酸エチルで抽出し、水で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、すべての溶媒を蒸発させた後、フラッシュクロマトグラフィSiO2、酢酸エチルヘプタン=11により0692gの表題化合物をオフホワイト固体で得た。MS6976MH。B2アミノ6ヘキサデカノイルアミノヘキサン酸ベンジルエステル上で調製した26ヘキサデカノイルアミノヘキサン酸ベンジルエステル0692g、0993mmolを15mLのTHFに溶解し、19mLのジエチルアミン約18当量で処理した。周囲温度で3時間後、すべての揮発性物質を減圧下で除去し、粗製反応混合物をフラッシュクロマトグラフィSiO2、CH2Cl2MeOH10で精製して、0355gの表題化合物を白色固体で得た。MS4753MH。上で調製したGalNAcクラスター遊離酸実施例7F13アセトアミド45ジアセトキシ6テトラヒドロ2Hピラン2イルオキシ203アセトアミド45ジアセトキシ6テトラヒドロ2Hピラン2イルオキシ11オキソ369トリオキサ12アザヘキサデカン16イル173アセトアミド45ジアセトキシ6テトラヒドロ2Hピラン2イルオキシエトキシエトキシエトキシアセトアミド1118ジオキソ369トリオキサ1219ジアザヘニコサン21酸0185g、0101mmolを20mLのCH2Cl2に溶解し、1ヒドロキシ7アザベンゾトリアゾールHOAt、0014g、0101mmol、1当量、13エチルカルボジイミドHClEDC、0019g、0101mmol、1当量、およびNエチルジイソプロピルアミン0013g、0017mL、0101mmol、1当量で逐次処理した。周囲温度で15分間撹拌した後、最少量のCH2Cl2に溶解した2アミノ6ヘキサデカノイルアミノヘキサン酸ベンジルエステル0048g、0101mmol、1当量を加え、反応を2時間進行させた。次いで、溶媒を蒸発させ、粗製混合物をフラッシュクロマトグラフィSiO2、CH2Cl2MeOH7~>10で精製して、0133gの表題化合物を白色泡状物で得た。MS11671M2Na22。上で調製したベンジルエステル0130g、0057mmolを5mLのMeOHに溶解し、0024gのPdC10で、1atmのH2雰囲気下、周囲温度で3時間水素添加した。セライトを通してろ過し、溶媒を蒸発させて、0123gの表題化合物を無色油状物で得た。MS22210MNa。実施例11オルニチンリンカーを有するGalNAcクラスターパルミトイルC16の合成実施例10と類似であるが、FmocLysOHの代わりにFmocLOrnOHを用い、白色泡状物として調製。MS10931M2H22。実施例12GalNAcクラスターヘキサデカ8エノイルC16の合成A26ヘキサデカ8エノイルアミノヘキサン酸2トリメチルシラニルエチルエステルFmocLysヘキサデカ8エノイルOH0500g、0827mmolを15mLのCH2Cl2に懸濁し、2エタノール0196g、0236mL、165mmol、2当量、1ヒドロキシ7アザベンゾトリアゾールHOAt、0123g、0909mmol、11当量、13エチルカルボジイミドHClEDC、0174g、0909mmol、11当量、およびNエチルジイソプロピルアミン0125g、0164mL、0967mmol、117当量で逐次処理した。次いで、黄色溶液を週末の間撹拌した。砕氷HCl溶液上に注ぎ、酢酸エチルで抽出し、水で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、すべての溶媒を蒸発させた後、フラッシュクロマトグラフィSiO2、CH2Cl2MeOH=91で精製し、AcOEtヘプタンから結晶化して、0488gの表題化合物をオフホワイト半固体で得た。MS7056MH。B2アミノ6ヘキサデカ8エノイルアミノヘキサン酸2トリメチルシラニルエチルエステル上で調製した26ヘキサデカ8エノイルアミノヘキサン酸2トリメチルシラニルエチルエステル0488g、0690mmolを15mLのTHFに溶解し、135mLのジエチルアミン約18当量で処理した。周囲温度で3時間後、すべての揮発性物質を減圧下で除去し、粗製反応混合物をフラッシュクロマトグラフィSiO2、CH2Cl2MeOH10で精製して、0259gの表題化合物を黄色油状物で得た。MS4836MH。CGalNacクラスターヘキサデカ8エノイルC16上記化合物を、2アミノ6ヘキサデカ8エノイルアミノヘキサン酸2トリメチルシラニルエチルエステルを用い、保護基を以下のとおりに切断して、前述のとおりに調製した:終わりから2番目の段階の後、得られた2トリメチルシラニルエチルエステル245mg、0107mmol、100当量を無水THF5mLと混合して無色溶液を得た。フッ化テトラブチルアンモニウム三水和物168mg、0533mmol、500当量を0°Cで加え、反応混合物をフリーザーに終夜保存した。砕氷上に注ぎ、酢酸エチルで抽出し、水で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、すべての溶媒を蒸発させて、粘稠油状物を得た。アセトニトリルおよび水に溶解し、凍結乾燥して、最終的に0120gの表題化合物を白色固体で得た。MS11215M2Na22。実施例13GalNAcクラスターオレイルC18の合成上記実施例と類似であるが、2アミノ6ヘキサデカ8エノイルアミノヘキサン酸2トリメチルシラニルエチルエステルの代わりに2エチル2アミノ6オレアミドヘキサノアートを用い、オフホワイト泡状物として調製。MS11136M2H22。実施例14GalNAcクラスターオクタデカ912ジエノイルC18の合成上記実施例と類似であるが、2アミノ6ヘキサデカ8エノイルアミノヘキサン酸2トリメチルシラニルエチルエステルの代わりに2エチル2アミノ6オクタデカ912ジエンアミドヘキサノアートを用い、黄色の凍結乾燥固体として調製。MS113455M2Na22。実施例15GalNAcクラスターオクタノイルC8の合成。前述のとおりであるが、FmocLysOHの代わりにFmocLysOHを用い、淡黄色泡状物として調製。MS10445M2H22。実施例16GalNAcクラスタードデカノイルC12の合成前述のとおりであるが、FmocLysOHの代わりにFmocLysOHを用い、淡黄色泡状物として調製。MS216604MNa。実施例17GalNAcクラスターC20アシルの合成前述のとおりであるが、FmocLysOHの代わりにFmocLysOHを用い、淡黄色泡状物として調製。MS115058M2Na22。実施例18GalNAcクラスターC24アシルの合成を、前述のとおりであるが、FmocLysOHの代わりにFmocLysOHを用い、淡黄色泡状物として調製した。MS231224MH。実施例19GalNAcクラスタージオクタノイル2×C8の合成A626ビスtertブトキシカルボニルアミノヘキサノイルアミノ2ヘキサン酸丸底フラスコ内で、FmocLysOH1393g378mmol、100当量をCH2Cl216mLに溶解して淡黄色溶液を得た。ヒューニッヒ塩基1955g、257mL、151mmol、400当量およびトリメチルクロロシラン0863g、100mL、794mmol、210当量を加え、反応混合物を20分間撹拌した。第二の丸底フラスコ内で、BocLysOH131g、378mmol、100当量をDMF16mLに溶解して無色溶液を得た。ヒューニッヒ塩基0587mg、077mL、454mmol、120当量およびTPTU[125700712]1123g、378mmol、100当量を加え、反応混合物を15分間撹拌した。次いで、対応するシリルエステルモノシリルアミンを含む第一のフラスコからの溶液を加え、反応混合物をさらに2時間撹拌した。混合物を砕氷NH4Cl上に注ぎ、AcOEtで2回抽出し、H2Oおよび食塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、蒸発乾固させた。フラッシュクロマトグラフィSiO2CH2Cl2中8MeOHにより、2324gの表題化合物をオフホワイト泡状物で得た。MS6975MH、7194MNa。B626ビスtertブトキシカルボニルアミノヘキサノイルアミノ2ヘキサン酸ベンジルエステル上で調製した626ビスtertブトキシカルボニルアミノヘキサノイルアミノ2ヘキサン酸232g、333mmol、100当量およびフェニルメタノール0720g、666mmol、200当量を30mLのCH2Cl2に溶解し、1ヒドロキシ7アザベンゾトリアゾールHOAt、0498g、366mmol、110当量、1エチル3カルボジイミド塩酸塩EDC、0702g、366mmol、110当量、およびエチルジイソプロピルアミン0503g、066mL、390mmol、117当量で逐次処理した。120分間撹拌した後、揮発性物質を減圧下で除去した。続くフラッシュクロマトグラフィCH2Cl2中8MeOHにより、2573gの表題化合物を淡黄色ろう状固体で得た。MS7875MH。C626ジアミノヘキサノイルアミノ2ヘキサン酸ベンジルエステル上で調製した626ビスtertブトキシカルボニルアミノヘキサノイルアミノ2ヘキサン酸ベンジルエステル塩酸塩として、0613g、0779mmol、100当量をジオキサン4mLに溶解し、389mLのジオキサン中4MHCl10当量で処理した。3時間後、MSは出発原料がないことを示した。すべての揮発性物質を減圧下で除去し、0519gの表題化合物を塩酸塩で得、これをそれ以上精製せずに次の段階で用いた。MS5873MH。D626ビスオクタノイルアミノヘキサノイルアミノ2ヘキサン酸ベンジルエステル上で調製した626ジアミノヘキサノイルアミノ2ヘキサン酸ベンジルエステル0519g、0771mmol、100当量およびカプリル酸0234g、1619mmol、210当量を12mLのCH2Cl2に溶解し、1ヒドロキシ7アザベンゾトリアゾールHOAt、0220g、1619mmol、210当量、1エチル3カルボジイミド塩酸塩EDC、0310g、1619mmol、210当量、およびエチルジイソプロピルアミン0498g、0666mL、3855mmol、500当量で逐次処理した。180分間撹拌した後、混合物を砕氷上に注ぎ、AcOEtで2回抽出し、水で洗浄し、MgSO4で乾燥し、蒸発乾固させた。AcOEtヘキサンから結晶化して、0453gの表題化合物を白色固体で得た。MS8398MH、8618MNa。E2アミノ626ビスオクタノイルアミノヘキサノイルアミノヘキサン酸ベンジルエステル上で調製した626ビスオクタノイルアミノヘキサノイルアミノ2ヘキサン酸ベンジルエステル0450g、0536mmolを22mLのTHFに懸濁し、22mLのジエチルアミン約40当量で処理した。周囲温度で24時間激しく撹拌した後、すべての揮発性物質を減圧下で除去し、粗製反応生成物をEtOEtで2回粉砕して、0258gの表題化合物を白色固体で得た。MS6175MH。FGalNAcクラスタージオクタノイル2×C8前述のとおりであるが、2アミノ6ヘキサデカノイルアミノヘキサン酸ベンジルエステルの代わりに2アミノ626ビスオクタノイルアミノヘキサノイルアミノヘキサン酸ベンジルエステルを用い、白色泡状物として調製。MS234219MH。実施例20ポリヌクレオチド標的指向部分siRNA合成A材料無水メタノールMeOH、ナトリウムメチラート、AmberliteIR120、硫酸ナトリウム、無水NNジメチルホルムアミドDMF、無水ジクロロメタンDCM、NNジシクロヘキシルカルボジイミドDCC、NヒドロキシスクシンイミドNHS、NNジイソプロピルエチルアミンDIPEAおよび酢酸ナトリウム溶液3M、pH52はSigmaAldrichChemieGmbHTaufkirchen、ドイツから購入した。RPHPLC用の酢酸トリエチルアンモニウムTEAA緩衝液20M、pH70およびアセトニトリルACNHPLC品質はBiosolveValkenswaard、オランダから購入した。エタノールEtOHpaはMerckDarmstadt、ドイツから購入した。OptilabHFMembraPure、ドイツシステムから精製した水を用いた。ResourceRPC3mLカラム10×064cm;粒径15μmはGEHealthcareFreiburg、ドイツから購入した。HPLC精製はAKTAExplorer100GEHealthcareを用いて実施した。BGalNAcクラスターsiRNA結合体の合成化合物1150mg;0082mmolを無水MeOH55mlに溶解し、ナトリウムメチラート42μLを加えたMeOH中25溶液。混合物をアルゴン雰囲気下、室温で2時間撹拌した。同量のメタノールと、カチオン交換樹脂のAmberliteIR120を分割して加え、pH約70とした。Amberliteをろ過により除去し、溶液をNa2SO4で乾燥し、溶媒を減圧下で除去した。化合物2を白色泡状物として定量的収率で得た。TLCSiO2、DCMMeOH5:101CH3COOH:Rf2=003;検出のために、MeOH中の硫酸の溶液5を用い、続いて加熱した。ESIMS、直接注入、負モード;MH1計算値:14527;MH1測定値:14525。化合物220mg;0014mmolをピリジンおよびジクロロメタンと同時蒸発させた。残渣を無水DMF09mlに溶解し、アルゴン雰囲気下で撹拌しながらDMF中のNヒドロキシスクシンイミドの溶液16mg;0014mmolを加えた。0°CでDMF中のDCCの溶液32mg;0016mmolをゆっくり加えた。反応混合物を室温まで加温し、終夜撹拌した。化合物3をそれ以上精製せずにC6アミノリンカーを有するRNAへの結合に用いた、化合物4。BGalNAcクラスターPKRNA結合体の合成化合物1で表される一般構造の化合物を無水MeOHに溶解し、ナトリウムメチラート9当量を加えたMeOH中25溶液。混合物をアルゴン雰囲気下、室温で2時間撹拌した。反応混合物をメタノールで希釈し、続いてカチオン交換樹脂AmberliteIR120を分割して加え、pH約70とした。Amberliteをろ過により除去し、溶液をNa2SO4で乾燥し、溶媒を減圧下で除去した。化合物2で表される一般構造の化合物を白色泡状物として定量的収率で得た。次の段階で、化合物2で表される一般構造の化合物をNHS生成により活性化した。化合物2をピリジンおよびジクロロメタンと同時蒸発させた。残渣を無水DMFに溶解し、アルゴン雰囲気下で撹拌しながらDMF中のNヒドロキシスクシンイミドの溶液10当量を加えた。0°CでDMF中のDCCの溶液11当量をゆっくり加えた。反応混合物を室温まで加温し、終夜撹拌し続けた。得られた化合物3で表される一般構造の活性化化合物をそれ以上精製せずにRNAへの結合に用いた。ポリヌクレオチド標的指向部分をRNAの5末端に炭素6個を含むアミノリンカーを介して結合した化合物4で表される。Cアミノ修飾RNAの合成センス鎖の5末端にC6アミノリンカーを有するRNAを、AKTAOligopilot100GEHealthcare、Freiburg、ドイツおよび固体支持体として細孔制御ガラスcontrolledporeglassPrimeSynthesisAstonPAUSAを用い、1215μmolの規模で、固相上、標準のホスホラミダイト化学により産生した。2Oメチルヌクレオチドを含むRNAを、対応するホスホラミダイト、2OメチルホスホラミダイトおよびTFAヘキシルアミノリンカーアミダイトSigmaAldrich、SAFC、Hamburg、ドイツを用いて生成した。切断および脱保護ならびに精製を、当技術分野において公知の方法により達成したWincottFetalNAR19952314267784。アミノ修飾RNAをアニオン交換HPLCにより特徴付け純度:961、同一性をESIMSにより確認したMH1計算値:69374;MH1測定値:69390。配列:;u、c:対応する塩基の2Oメチルヌクレオチド、s:ホスホロチオアート。DGalNAcクラスターRNA結合体化合物4の合成5末端にC6アミノリンカーを有するRNA254μmolを凍結乾燥し、250μLのホウ酸ナトリウム緩衝液01Mホウ酸ナトリウム、pH85、01MKClおよび11mLDMSOに溶解した。8μLのDIPEAを加えた後、RNA溶液を持続的に撹拌しながら、これにDMF中の化合物3の溶液理論的には0014mmolをゆっくり加えた。反応混合物を35°Cで終夜撹拌した。反応をRPHPLCResourceRPC3mL、緩衝液:A:水中100mMTEAA、B:95ACN中100mMTEAA、勾配:20CVで5Bから22Bを用いてモニターした。20°CでEtOH中の酢酸ナトリウム3Mを用いてRNAを沈澱させた後、RNA結合体を前述の条件を用いて精製した。純粋な分画を集め、所望の結合体、化合物4を酢酸ナトリウムEtOHを用いて沈澱させた。化合物4を収率59で単離した150μmol。化合物4の純度をアニオン交換HPLCで分析し純度:917、同一性をESIMSにより確認したMH1計算値:83744;MH1測定値:83765。EGalNAcクラスターPKRNA結合体化合物4の一般合成5末端にC6アミノリンカーを有するRNAを凍結乾燥し、ホウ酸ナトリウム緩衝液01Mホウ酸ナトリウム、pH85、01MKClおよびDMSOの比率1:4の混合物に溶解した。DIPEAを加えた後、RNA溶液を持続的に撹拌しながら、これにDMF中の化合物3の溶液6当量をゆっくり加えた。反応混合物を35°Cで終夜撹拌した。反応をRPHPLCResourceRPC3mL、緩衝液:A:水中100mMTEAA、B:95ACN中100mMTEAA、勾配:20CVで5Bから70Bを用いてモニターした。20°CでEtOH中の酢酸ナトリウム3M、pH52を用いてRNAを沈澱させた後、RNA結合体を前述の条件を用いて精製した。純粋な分画を集め、一般構造4の所望の結合体を酢酸ナトリウムEtOHを用いて沈澱させて、純粋なRNA結合体を得た。FsiRNAのアニーリングRNAセンス鎖を有する化合物4を2Oメチル修飾アンチセンスRNA鎖とアニールさせた:アンチセンス配列:。アポリポタンパク質BmRNAに向けたsiRNA結合体を、アニーリング緩衝液20mMリン酸ナトリウム、pH68;100mM塩化ナトリウム中の相補鎖の等モル溶液を混合し、85~90°Cの水浴中で3分間加熱し、3~4時間の間に室温まで冷却することにより生成した。二重鎖形成を、未変性ゲル電気泳動により確認した。インビボsiRNA送達実施例21インビボでのRNAiポリヌクレオチドの投与、および肝実質細胞への送達RNAiポリヌクレオチド結合体およびマスクしたポリマーを前述のとおりに合成した。6から8週齢のマウスC57BL6またはICR系統、それぞれ約18~20gをHarlanSpragueDawleyIndianapolisINから入手した。マウスを注入前に少なくとも2日間収容した。給餌はHarlanTekladRodentDietHarlanMadisonWIで適宜行った。RNAiポリヌクレオチド結合体およびマスクしたポリマーを前述のとおりに合成した。マウスに送達ポリマーの溶液02mLおよびsiRNA結合体02mLを尾静脈に注入した。ポリマーおよびsiRNAの同時注入のために、注入前にsiRNA結合体を修飾ポリマーに加え、全量04mlを注入した。組成物は生理的条件において可溶性かつ非凝集性であった。ポリマーおよびsiRNAを別々に注入するために、ポリマーを製剤溶液02mL中で注入し、siRNAを等張グルコース02mL中で注入した。溶液を尾静脈内への点滴により注入した。他の血管への注入、例えば、眼窩後注入も等しく有効であった。血清ApoBレベル判定マウスを4時間ラットの場合は16時間絶食させた後、顎下出血により血清を採取した。血清ApoBタンパク質レベルを標準のサンドイッチELISA法により求めた。簡単に言うと、ポリクローナルヤギ抗マウスApoB抗体およびウサギ抗マウスApoB抗体BiodesignInternationalを、それぞれ捕捉および検出抗体として用いた。HRP結合ヤギ抗ウサギIgG抗体Sigmaを後で適用し、ApoB抗体複合体を結合した。次いで、テトラメチルベンジジンTMB、Sigma発色の吸光度をTecanSafire2オーストリア、欧州マイクロプレート読み取り器により450nmで測定した。血漿第VII因子F7活性測定マウスからの血漿試料を、標準の手順に従い、0109molLクエン酸ナトリウム抗凝固剤1体積を含むマイクロ遠沈管中に顎下出血により血液9体積を採取して調製した。血漿中のF7活性を、BIOPHENVIIキットHyphenBioMedAniaraMasonOHを製造者の推奨に従って用いる発色法により測定する。発色の吸光度をTecanSafire2マイクロプレート読み取り器を用いて405nmで測定した。実施例22siRNAは以下の配列を有していた:apoBsiRNA:第VII因子siRNA小文字=2OCH3置換s=ホスホロチオアート連結ヌクレオチドの後のf=2F置換ヌクレオチドの前のd=2デオキシガラクトースクラスターPK標的指向siRNA実施例23siRNAガラクトースクラスター薬物動態調節剤結合体をマスクしたDW1360送達ポリマーと同時投与して用いる、インビボでのsiRNAの肝実質細胞への送達siRNAおよび送達ポリマーを、示した用量のsiRNAおよびポリマーを用い、前述のとおりに調製し、投与した。AsiRNA結合体およびマスクしたLau41305381719送達ポリマーの同時投与Lau41305381719を7重量当量のCDMPEG:CDMNAG2:1で修飾した。完全2FMeO安定化第VII因子siRNAをGalNAc3パルミトイル標的指向部分または他の示した標的指向部分に結合した。siRNA結合体およびLau41305381719送達ポリマーの、20gのICRマウスn=3への同時投与は、血清第VII因子タンパク質レベルの低下を引き起こし、siRNAの肝実質細胞への送達および第VII因子遺伝子発現の阻害を示していた。効率的な送達は、送達ポリマーおよびRNAiポリヌクレオチドへの標的指向部分結合の両方を必要とした表2。非結合siRNAでは有意なノックダウンは観察されなかった。同時投与した送達ポリマー非存在下では標的遺伝子ノックダウンは観察されなかった。GalNAc3パルミトイル標的指向リガンドは、GalNAc3標的指向部分またはコレステロールポリヌクレオチド標的指向部分に比べて、siRNAの肝細胞への送達改善を提供した。表2siRNAGalNAcクラスター結合体プラス送達ポリマー注入後のインビボでの標的遺伝子のノックダウン、ポリマー用量の効果a動物体重1キログラムあたりのsiRNAまたはポリマーmgbタンパク質相対BsiRNA結合体およびマスクしたメリチン送達ペプチドの同時投与Tyrメリチンを5重量当量のCDMNAGで修飾した。完全2FMeO安定化第VII因子siRNAをGalNAc3パルミトイル標的指向部分または他の示した標的指向部分に結合した。siRNA結合体およびTyrメリチン送達ペプチドの、20gのICRマウスn=3への同時投与は、血清第VII因子タンパク質レベルの低下を引き起こし、siRNAの肝実質細胞への送達および第VII因子遺伝子発現の阻害を示していた。効率的な送達は、送達ペプチドおよびRNAiポリヌクレオチドへの標的指向部分結合の両方を必要とした表3。非結合siRNAでは有意なノックダウンは観察されなかった。同時投与した送達ポリマー非存在下では標的遺伝子ノックダウンは観察されなかった。GalNAc3パルミトイル標的指向リガンドは、コレステロールポリヌクレオチド標的指向部分に比べて、siRNAの肝細胞への送達改善を提供した。表3siRNAGalNAcクラスター結合体プラス送達ポリマー注入後のインビボでの標的遺伝子のノックダウン、ポリマー用量の効果a動物体重1キログラムあたりのsiRNAまたはペプチドmgbタンパク質相対CマスクしたDW1360送達ポリマーと同時送達した場合のsiRNAガラクトースクラスター薬物動態調節剤結合体の送達に対する疎水性基サイズの効果DW1360を7重量当量のCDMPEG:CDMNAG2:1で修飾した。完全2FMeO安定化apoBsiRNAを示した疎水性PK基を有するGalNAc3PK標的指向部分に結合した。siRNA結合体およびDW1360送達ペプチドの、20gのICRマウスn=3への同時投与は、血清ApoBタンパク質レベルの低下を引き起こし、siRNAの肝実質細胞への送達およびApoB遺伝子発現の阻害を示していた。効率的な送達は、送達ペプチドおよびRNAiポリヌクレオチドへの標的指向部分結合の両方を必要とした表4。炭素原子16~20個のPK基15~19個の炭素原子疎水性基を有するポリヌクレオチド標的指向リガンドで、最適な送達が観察された。表4siRNAGalNAcクラスター結合体プラス送達ポリマー注入後のインビボでの標的遺伝子のノックダウン、ポリマー用量の効果a動物体重1キログラムあたりのsiRNAまたはポリマーmgbタンパク質相対実施例24インビボで投与したsiRNAGalNAcクラスターPKの生体内分布様々な疎水性側鎖を含む6つの異なるGalNAcクラスターPK標的指向部分を、ApoBに向けたsiRNAに共有結合した。これらの結合体を雄Wistarラットに25mgkgの用量で静脈内静脈内ボーラス投与した表5。血液試料を異なる動物から投与後5、15、30、60、90、120、240および360分の時点で採取した各時点でn=2。採血直後にEDTA血漿を生成し、これを続いてプロテイナーゼKEpicentreBiotechnologies、米国で処理した。肝臓および脾臓組織試料500mgを、屠殺した動物n=2から投与後15および6時間の時点で回収した。凍結組織片を粉砕して微粉を得た。各組織の一定量を秤量し、LysisMixturePanomics、米国、プロテイナーゼKEpicentreBiotechnologies、米国およびSONOPULSHD2070Bandelin、ドイツ超音波ホモジナイザーを用いてホモジナイズした。得られた最終組織溶解物は約50mgmLの濃度を有していた。血漿および組織試料中のsiRNA濃度を、独占権下にあるオリゴヌクレオチド検出法を用いて判定した。簡単に言うと、siRNA定量は、相補的な蛍光Atto425標識PNAプローブとsiRNA二重鎖のアンチセンス鎖とのハイブリダイゼーションおよびAEXHPLC分離に基づいていた。定量は、対応する非結合ApoB二重鎖の一連の希釈液から生成した外部較正曲線に対する蛍光検出によって行った。この二重鎖は、PK実験で試験したすべての結合体に共通の同一のアンチセンス鎖で構成されていた。血漿試料02~2μLおよび組織試料約1mgをHPLC装置に注入した。肝臓について組織の結果を表5に示す。肝臓において、PK調節剤を欠くさらなる疎水性鎖なし標的指向部分を有するsiRNAで最低濃度が見られた。標的指向部分上に疎水性側鎖PK調節剤を有するすべての結合体で、肝臓におけるsiRNA濃度はより高かった。15時間後の最高濃度は、GalNAcクラスターに加えて2つのオクタノイル側鎖を有する標的指向部分で見られた。投与の6時間後、GalNAcクラスターに加えてC20アシル側鎖を有する標的指向部分は最も高い肝臓濃度を示した。したがって、疎水性側鎖が標的指向部分に組み込まれている場合、GalNAc結合siRNAの肝臓取り込みは、PK特性を調節することによって高めることができる。具体的なメカニズムは不明であるが、PK調節剤が血漿タンパク質結合の増大と、したがって循環時間の延長を引き起こすことが可能である。次いで、循環時間の延長は組織標的指向の増大をもたらした。反対に、PK調節剤非存在下では、siRNAは腎ろ過によって循環からより速やかに排出された。分布特性は部分的には側鎖の疎水性と相関しうる。PK調節剤なし、およびC8PK調節剤は、循環からより速やかに排出され、最も低い肝臓を標的とする分布を有し、最小の標的遺伝子ノックダウンを示した。これに対し、16~20個の炭素原子を有するPK調節剤の存在は、循環からの排出がより遅く、より高い肝臓を標的とする分布を有し、標的遺伝子ノックダウンの増大を示した図7。表5投与15時間後の肝臓中のsiRNAa注入の15時間後実施例25薬物動態調節剤の使用による腫瘍標的指向の増大siRNAを葉酸もしくはコレステロールのいずれか単独または葉酸コレステロール薬物動態調節剤に結合した。5mgのsiRNAをKB異種移植マウスに注入した。次いで、腫瘍を分離し、siRNAの存在について検定した。注入の2時間後、葉酸コレステロール薬物動態調節剤に結合したsiRNA>500nggでは、葉酸またはコレステロールのいずれか単独に結合したsiRNA100ngg未満に比べて、腫瘍中に有意に多くのsiRNAが認められた。注入の6時間後、差はさらに顕著で、約500nggと<50nggであった。KB異種移植モデル:KB細胞はATCCから入手し、10FBSを補足したGIBCOInvitrogenからの葉酸を含まないRPMI1640培地27016中で成長させた。KB細胞は、宿主マウスへの注入前に葉酸を含まない培地中で2週間培養すべきである。AthymicNudeFoxnlnuFoxChaseNudeはHarlanlaboratoryから入手した。マウスに葉酸を含まない飼料DYET17772、DyetsInc、Bethlehem、PA18017からを腫瘍接種の2~3週間前からと、接種後与えた。コンフルエント以下のKB細胞をトリプシン処理し、PBSで洗浄し、PBS中に100万100μlで懸濁した。100~200万個の細胞を左側腹下に皮下注入し、腫瘍成長を1週間に2回デジタルキャリパーでモニターした。腫瘍が5~8mmの間のサイズになり、したがって十分に血管新生化していると予測されれば典型的には7~10日、マウスにsiRNAを注入した。siRNA定量:組織試料を凍結状態で微粉砕し、15~25mgの凍結粉末をヌクレアーゼを含まない水中で1:3希釈したLysisSolutionPanomicsAffymetrix1mLに懸濁した。試料を超音波スティックで超音波処理し、続いてプロテイナーゼKPanomicsAffymetrixにより65°Cで30分間処理した。プロテイナーゼK処理後、20μLの3MKClを200μLの組織超音波処理物に加えてSDSを沈澱させた。試料を氷上に10分間置き、続いて4°C、4000rcfで15分間遠心分離した。siRNA定量のために上清を回収した。上清100μLをアンチセンス鎖を標的とする10μMAtto610PNAプローブ溶液5μLと混合した。ハイブリダイゼーション緩衝液50mMトリスCl、pH80を加えて最終量200μLとした。試料をサーマルサイクラー中95°Cで15分間インキュベートし、次いで温度を50°Cまで下げ、さらに15分間インキュベートすることによりハイブリダイズさせた。較正曲線を同じ条件下で一連のsiRNA希釈液から生成し、次いですべての試料をHPLCオートサンプラーに入れた。試料を100μLの量で50°Cに加熱したDionexDNAPacPA1004×250mmカラムに注入した。試料を二成分勾配を用い、1mL分の流速で溶離した。緩衝液A:lOmMトリス、30ACN、lOOmMNaCl、pH7。緩衝液B:lOmMトリス、30ACN、900mMNaCl、pH7。試料を島津RFlOAxl蛍光検出器励起:436nm、発光:484nmを用いて分析した。