制御性T細胞活性を変化させる蠕虫性寄生虫調製物をスクリーニングする方法であって、前記方法が、a蠕虫性寄生虫調製物を得るステップ、b前記蠕虫性寄生虫調製物を標的と接触させるステップ、およびc前記接触後の前記標的における制御性T細胞活性のための内部マーカーのレベルを測定するステップを含み、ここで前記接触後の前記内部マーカーの前記レベルの変化が制御性T細胞活性を変化させる前記蠕虫性寄生虫調製物の指標となる方法。前記内部マーカーが転写因子である、請求項1に記載の方法。前記転写因子がScurfin、Smad7、Gata3、またはTbetTbx21である、請求項2に記載の方法。前記転写因子の前記レベルがそのタンパク質またはmRNAレベルで測定される、請求項2に記載の方法。制御性T細胞活性を変化させる蠕虫性寄生虫調製物をスクリーニングする方法であって、前記方法が、a蠕虫性寄生虫調製物を得るステップ、b前記蠕虫性寄生虫調製物を標的と接触させるステップ、およびc前記接触後の前記標的における制御性T細胞のための細胞表面マーカーのレベルを測定するステップを含み、ここで前記接触後の前記細胞表面マーカーの前記レベルの変化が制御性T細胞活性を変化させる前記蠕虫性寄生虫調製物の指標となる方法。前記細胞表面マーカーがCD4、CD45RBlo、CD45Rc、細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4CTLA4、Ox40、41BB、CD25、CD103、CD62L、αEβインテグリン、潜伏関連ペプチドLAPまたはグルココルチコイド誘導性TNF受容体ファミリー関連タンパク質GITR、ケモカイン受容体CCR5、TIST2からなる群より選択される、請求項5に記載の方法。前記表面マーカーの前記レベルがそのタンパク質またはmRNAレベルで測定される、請求項6に記載の方法。Th1またはTh2関連疾患を有する動物を、制御性T細胞活性を変化させる蠕虫性寄生虫調製物の前記動物への投与によって治療する方法。動物における自己免疫疾患またはアレルギー疾患に対する蠕虫性寄生虫調製物の治療効果を測定する方法であって、a蠕虫性寄生虫調製物もしくはその画分を含む組成物を前記動物に投与すること、およびb前記投与後の前記動物において制御性T細胞活性のレベルを測定することを含み、ここで前記投与後の前記制御性T細胞活性の前記レベルの増加が前記蠕虫性寄生虫調製物の治療効果の指標となる方法。前記制御性T細胞活性が制御性T細胞マーカーのレベルの測定によって測定される、請求項9に記載の方法。前記制御性T細胞マーカーが内部マーカーである、請求項10に記載の方法。前記内部マーカーがScurfin、Smad7、Gata3、またはTbetTbx21である、請求項11に記載の方法。前記制御性T細胞マーカーが細胞表面マーカーである、請求項10に記載の方法。前記細胞表面マーカーがCD4、CD45RBlo、CD45Rc、細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4CTLA4、Ox40、41BB、CD25、CD103、CD62L、αEβインテグリン、潜伏関連ペプチドLAPまたはグルココルチコイド誘導性TNF受容体ファミリー関連タンパク質GITR、ケモカイン受容体CCR5、TIST2からなる群より選択される、請求項13に記載の方法。前記制御性T細胞マーカーが分泌マーカーである、請求項10に記載の方法。前記分泌マーカーがIL4、IL13、IL5、IL10またはTGFβ、PgE2である、請求項15に記載の方法。<発明の詳細な説明>本発明は制御性T細胞活性を変化させる寄生虫調製物をスクリーニングする方法を含む。本明細書において用いられる場合、蠕虫性寄生虫調製物という用語は、寄生虫全体、寄生虫抽出物、寄生虫卵子、寄生虫卵子抽出物、寄生虫卵、寄生虫卵抽出物、寄生虫幼虫、寄生虫幼虫抽出物、寄生虫セルカリアおよび寄生虫セルカリア抽出物の任意の1つを含むが、それらに限定されない。寄生虫調製物はまた、寄生虫およびその抽出物に由来する単離されたタンパク質、ポリヌクレオチド、糖質または脂質でありうる。本明細書において用いられる場合、特定病原体を含まないという用語は、その動物が標的動物またはヒトにおいて疾患の原因となり得る特定の病原微生物を含まないことが知られている場合に、本発明における使用のために飼育された動物に対して適用された。病原体を含まない動物を飼育する方法は当技術分野において知られており、例えば、httpwwwctsaorguploadpublicationCTSA_116631681202959092495pdfで入手可能なBrownら、ABibliographyontheCultureandMaintenanceSpecificPathogenFreeOrganisms参照により本明細書に組み入れられるに従った参考文献を参照せよ。Brownらは、異なる家畜および実験動物をSPF環境で飼育するための参考文献、ならびに建築設計および管理における手順および必要条件を提供する。また、SPFの手順およびいくつかの懸念される潜在的なヒトウイルス性および細菌性病原体のリストについては、MMichaelSwindleJInvestSurg92672711996、参照により本明細書に組み入れられるを参照せよ。本明細書において用いられる場合、制御性T細胞という用語は、ナイーブT細胞と比較して、少なくとも2倍に増加した例えば、3倍、4倍、5倍、6倍、8倍、10倍もしくはそれ以上のIL10およびまたはTGFβを分泌するリンパ球集団を指す。IL10またはTGFβ分泌の測定は当技術分野において知られている。例えば、それは、細胞をinvitroにおいて24もしくは48時間、抗CD3のようなT細胞刺激物質の存在下または非存在下で培養し、その後、培養上清をこれらのサイトカインについてサイトカイン特異的ELISAを用いてアッセイすることにより測定されうる。加えて、本発明の制御性T細胞はまた、他の種類のT細胞例えば、ナイーブT細胞と比較して、高レベルのFoxP3転写産物を特徴とする。高レベルのFoxP3転写産物とは、他の種類のT細胞と比較して少なくとも4倍に増加したレベルを指す。FoxP3は、例えば、HoriSTNomuraおよびSSakaguchi2003ControlofregulatoryTcelldevelopmentbythetranscriptionfactorFoxp3Science29910571061に記載されるような、PCRプライマーCCCAGGAAAGACAGCAACCTT、TTCTCACAACCAGGCCACTTG配列番号1、および標識プローブ6FAMATCCTACCCACTGCTGGCAAATGGAGTCTAMRA配列番号2を用いたリアルタイムPCRまたは定量PCRの使用によって検出可能である。値は、ハウスキーピング遺伝子であるHPRT発現に対して標準化される。あるいは、FoxP3タンパク質産物であるScurfinは、例えば、ヤギ抗FoxP3FoxP3ポリクローナル抗体カタログ番号ab2481NovusBiologicalsLittletonCOを用いて、当技術分野において知られているようなウェスタンブロッティング解析によって検出され得る。状況に応じて、制御性T細胞はまた、他の種類のT細胞例えば、ナイーブT細胞と比較してずっと少ない、すなわち、少なくとも2倍、好ましくは3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、10倍またはそれ以下のIFNγを産生しうる。また状況に応じて、制御性T細胞はまた、IL10およびまたはTGFβを発現するがIFNγをほとんどもしくはまったく発現しないT細胞を検出するための、細胞質内流量解析の使用によっても検出され得る。本明細書の下記に記載されるような更なる任意のマーカーもまた、制御性T細胞または制御性T細胞の活性の検出のために使用されうる。本明細書において用いられる場合、ナイーブT細胞という用語は、骨髄において免疫系の新しい細胞の産生から生じるT細胞を指す。ナイーブT細胞は、以前に免疫系が処理したことがない抗原を含む新たに遭遇した病原体に応答する。ナイーブT細胞は、当技術分野において既知の方法によって同定されうる概説として、例えば、Toughら、1999ImmunolRev1703947Itanoら、2003NatImmunol47339Berardら、2002Immunology10612738参照。本明細書において用いられる場合、制御性T細胞活性を変化させる寄生虫調製物という用語は、寄生虫調製物と接触していない標的における制御性T細胞活性と比較して、標的との接触で、標的における制御性T細胞の活性を少なくとも40、例えば、50、80、100、2倍、4倍、6倍、8倍、10倍、またはそれ以上にまで変化させる寄生虫調製物を指す。制御性T細胞の活性は、制御性T細胞の内部マーカー例えば、FoxP3mRNAもしくはそのタンパク質産物Scurfin、Smad7、Gata3、またはTbetTbx21などの転写因子、あるいは制御性T細胞の表面マーカー例えば、CD4、CD45RBlo、CD45Rc、細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4CTLA4、Ox40、41BB、CD25、CD103、CD62L、αEβインテグリン、潜伏関連ペプチドLAPまたはグルココルチコイド誘導性TNF受容体ファミリー関連タンパク質GITR、実験的アレルギー性脳炎EAE、ケモカイン受容体CCR5、TIST2、あるいは分泌マーカー例えば、IL4、IL13、IL5、IL10、TGFβのレベルを観察することによって測定されうる。制御性T細胞活性の増加は、制御性T細胞のマーカーのレベルにおける少なくとも40、例えば、50、80、100、2倍、4倍、6倍、8倍、10倍、またはそれ以上までの増加例えば、FoxP3、Ox40、41BB、CD4、CTLA4、CD25、CD103、CD62L、αEβインテグリン、LAP、GITR、EAE、CCR5、TIST2、IL10、TGFβまたは減少例えば、D45Rcによって示され、当技術分野において既知の方法に従って、本明細書に記載されるように測定されうる。好ましくは、制御性T細胞活性を変化させる寄生虫調製物は、本明細書の上記に記載される2つ以上のマーカーのレベルを変化させる。本明細書において用いられる場合、制御性T細胞マーカーのレベルという用語は、例えば、マイクログラムまたはモル濃度の量で測定される、標的における特定の制御性T細胞マーカーの量を指す。通常、制御性T細胞マーカーはタンパク質であり、その量はタンパク質定量のために当技術分野において既知の任意の方法、例えば、ELISA、ウェスタンブロット、免疫沈降、ラジオイムノアッセイ、またはFACS解析例えば、Innisら、AcademicPressIncMolecularCloningALaboratoryManualおよびCurrentProtocolsinMolecularBiologyAcademicPressIncMolecularCloningALaboratoryManualおよびCurrentProtocolsinMolecularBiology9004。しかし、IBDは、同様の民族的起源を有するGrossmanAFiremanZLilosPらEpidemiologyofulcerativecolitisintheJewishpopulationofcentralIsrael19701980HepatoGastroenterology1989361937イスラエルのユダヤ人集団ではそれほど見られないFiremanZGrossmanALilosPらEpidemiologyofCrohnsdiseaseintheJewishpopulationofcentralIsrael19701980AmJGastro1989842558。双生児研究は、少なくともCDについて遺伝的素因の証拠を示すHalfvarsonJBodinLTyskCらInflammatoryboweldiseaseinaSwedishtwincohortalongtermfollowupofconcordanceandclinicalcharacteristicsGastroenterology2003124176773。細菌の生成物ムラミルジペプチドを感知する細胞内タンパク質である、CARD15NOD2における遺伝子欠損InoharaMOguraYFontalbaAらHostrecognitionofbacterialmuramyldipeptidemediatedthroughNOD2implicationsforCrohnsdiseaseJBiolChem2003GirardinSEBonecaIGVialaJらNod2isageneralsensorofpeptidoglycanthroughmuramyldipeptidedetectionJBiolChem2003によって、CDにより罹りやすくなる人々もいる。様々な他の遺伝子変化がIBDの危険因子として提唱されている。しかし、遺伝的素因は疾患の発生率の急激な増加を説明しない。例えばElliotらに報告されたような、いくつかの慢性的腸炎の動物モデルがあるTheAutoimmuneDiseases第三版、NRRoseおよびIRMacKay編AcademicPressSanDiegoCAにおける、Elliottら、1998InflammatoryBowelDiseaseandCeliacDisease。重要な進歩は、遺伝子操作による遺伝子の欠失を有するマウスの中にIBDと同様の慢性的腸炎を発症し得るものがあるという最近の発見であるElsonら、1995Gastroenterology1091344を参照せよ。これらは、中でもIL2、IL10、MHCクラスIIまたはTCR遺伝子に標的化された欠失を有する突然変異マウスを含む。いくつかのモデルを用いて、Bergら、1996JofClinInvestigation981010Ludvikssonら、1997JofImmunol158104、およびMombaertsら、1993Cell75274は、免疫系自体の調節異常が腸管障害を媒介し得ることを示した。これらのモデルのいくつかの粘膜炎症は、多量のIFNγおよびTNFαを産生し、Th1型サイトカインの過剰産生が疾患の病因の基礎をなす1つの共通機序であることを示唆している。またTh1回路の遮断は炎症を妨げる。CDはTh1応答である。従って、これらのモデルは、このヒト疾患過程の免疫病理学について直接的な関係を有するかもしれない。B関節リウマチRARAは持続的な炎症性滑膜炎を特徴とする慢性疾患であり、通常、対称に分布する末梢関節に関わる。この炎症は骨浸食、軟骨損傷および関節破壊を引き起こし得る。それは人口の約1の疾患である。その有病率は加齢に伴って増加し、女性は男性より高い頻度で罹患する。RAの拡大はCD4Th1細胞による免疫を介した事象である。Cインスリン依存性、若年性糖尿病DM1型1型DMは、通常早期成人期に発症し、血糖の増加に応答したインスリン産生の不能に起因する疾患である。この持続的な高血糖および適切なグルコース代謝の不能は、ひいては目、腎臓、心臓および他の器官に損傷を与える代謝障害を引き起こす。非経口的なインスリンの摂取は、部分的にこれらの代謝障害を制御し得る。1型DMは、インスリンを産生する膵臓ベータ細胞に対する自己免疫性攻撃に起因する。活性化されたマクロファージおよび細胞傷害性T細胞は、膵臓ベータ細胞を取り囲み、破壊する。遺伝的感受性およびあまり明確に定義されていない環境事象が疾患過程の引き金となる。D紅斑性狼瘡LELEは、早期から中期成人期の女性において最も頻度の高い全身性自己免疫疾患である。組織の損傷は自己抗体および過敏な制御性T細胞によって引き起こされる。異常な免疫応答は、病因となる自己抗体および免疫複合体の持続的な産生を可能にする。これが筋骨格系、皮膚、血液、腎臓系および他の系の損傷を引き起こす。異常な免疫応答は、おそらく複数の遺伝的要因および環境要因の相互作用に依存する。Eサルコイドーシスサルコイドーシスは原因不明の肺および他の器官の慢性肉芽腫症である。ほとんどの患者は20~40歳の間である。最も頻繁に見られる症状は息切れである。疾患は、おそらくは限られた数の抗原に対する、過剰なTh1型の細胞性免疫応答に起因する。サルコイドーシスは世界中で発現し、すべての人種を苦しめている。しかし、特定の民族および人種集団の間で、サルコイドーシスの有病率に著しい多様性がある。例えば、この疾患はポーランド、東南アジアおよびインドでは稀である。F多発性硬化症MSMSは、局所脱髄および脳の瘢痕化を引き起こす、慢性再発性、多発性の中枢神経系の炎症性疾患である。それは約350000人のアメリカ人に影響を及ぼすよく見られる疾患であり、早期から中期成人期の間に発症する。MSは、少なくとも部分的にTh1細胞によって媒介される自己免疫疾患である。MSの損傷は、活性化されたT細胞およびマクロファージを含む遅延型過敏反応によって誘導されるものと似ている。それは温帯気候の疾患であり、赤道からの距離とともに有病率が増加する。<Th2関連疾患>Th2関連疾患は以下の群の疾患、すなわちアレルギー性疾患および癌を含む。遺伝的な素因のある個体は、その個体が暴露される様々な環境要因に由来する抗原に敏感になるアレルギー体質を持つことがよく知られている。アレルギー反応は、以前に感作された個体が同一のまたは相同のアレルゲンに再暴露された場合に起こる。アレルギー反応は、花粉症、鼻結膜炎、鼻炎および喘息から、例えばハナバチもしくはスズメバチに刺されることまたは虫刺されへの応答による全身性アナフィラキシーおよび死亡に及ぶ。その反応は迅速であり、草、木、雑草、昆虫、ハウスダストダニ、食物、薬物、化学物質および香料に由来する化合物などの様々なアトピー性アレルゲンによって起こり得る。アレルギー性疾患の群は、花粉症、鼻結膜炎、鼻炎および喘息を含む。アレルギー反応を起こす最も一般的なアレルゲンは、木、草、ハーブ、菌類、ハウスダストダニ、貯蔵庫ダニ、ゴキブリ、ならびに動物の毛、羽、およびふけなどに由来する吸入アレルゲンを含む。木、草およびハーブ由来の重要な花粉アレルゲンは、カバノキBetula、ハンノキAlnus、ハシバミCorylus、シデCarpinusおよびオリーブOleaなどを含むブナ目、モクセイ目ならびにマツ目の分類目、Lolium、Phleum、Poa、Cynodon、DactylisおよびSecale属のイネ科植物などを含むイネ目、AmbrosiaおよびArtemisia属のハーブなどを含むキク目ならびにイラクサ目に由来するものなどである。菌類由来の重要な吸入アレルゲンは、AlternariaおよびCladosporium属に由来するものなどである。他の重要な吸入アレルゲンは、Dermatophagoides属のハウスダストダニ、Lepidoglyphysdestructor属の貯蔵庫ダニに由来するもの、ゴキブリに由来するもの、ならびにネコ、イヌ、ウマ、ウシなどの哺乳動物、およびトリに由来するものである。また、ハナバチ、カリバチ、およびアリを含む膜翅目の分類目に由来するものなどの昆虫に刺されるまたは咬まれることによるアレルギー反応も、一般的に観察される。特異的なアレルゲン成分は当業者に知られており、例えば、ブナ目のBetv1Bverrucosaカバノキ、Alng1Alnusglutinosaハンノキ、Cora1CorylusavelanaハシバミおよびCarb1Carpinusbetulusシデを含む。他には、最も一般的なものを挙げると、Cryj1マツ目、Amba1および2、Artv1キク目、Parj1イラクサ目、Olee1モクセイ目、Avee1、Cynd1、Dacg1、Fesp1、Holl1、Lolp1および5、Pasn1、Phip1および5、Poap1、2および5、Secc1および5、ならびにSorh1様々な植物花粉、Alta1およびChah1菌類、Derf1および2、Derp1および2それぞれ、ハウスダストダニ、DfarinaeおよびDpteronyssinus、Lepd1、Blag1および2、Pera1それぞれ、ゴキブリ、BlatellagermanicaおよびPeriplanetaamericana、Feld1ネコ、Canf1イヌ、Equc1、2および3ウマ、Apism1および2ミツバチ、Vesg1、2および5、Pola1、2および5すべてのカリバチ、ならびにSoli1、2、3および4ハリアリである。A喘息多くの人々において、喘息は、動物のふけ、花粉、またはチリダニおよびゴキブリの老廃物などの、通常空気から吸い込まれる物質に対するアレルギー反応であると考えられる。これらの物質の総称であるアレルゲンとは、アレルギー反応を誘発するすべてのものを指す。ある人々は特定のアレルゲンに反応する遺伝的素因を有する。1998年には、推定1700万人のアメリカ人、すなわち人口の64パーセントが喘息に罹っていた。子供は、喘息に罹っているアメリカ人のうち480万人を占めている。動物モデルならびにヒト喘息の病理学における臨床情報の両方から得られた実験情報および臨床情報は、この疾患の病理学においてTh2細胞を示唆する。<Th1およびTh2による癌>通常、癌細胞は癌細胞によって特異的に発現される抗原に対する免疫応答を引き起こしうる。Th1およびTh2の両方の免疫応答は組織の細胞傷害性除去を引き起こす強力な炎症反応を促進しうるため、Th1またはTh2免疫応答の調節は癌の治療に使用されうる。本発明の組成物によって治療され得る癌は、組織発生学的に、癌腫および腺癌を含む悪性上皮性腫瘍として、ならびに、脂肪肉腫、線維肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、神経膠腫、神経芽細胞腫、髄芽腫、悪性黒色腫、悪性髄膜腫、様々な白血病、様々な骨髄増殖性疾患、様々なリンパ腫ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫、血管肉腫、カポジ肉腫、リンパ管肉腫、悪性奇形腫、未分化胚細胞腫、精上皮腫、および絨毛癌を含む悪性非上皮性腫瘍として分類され得る。癌腫および腺癌は最も多く癌による死亡の約90を占める、従って、本発明によって治療予防するための興味深い標的疾患である。最も重要な癌腫および腺癌は、気道特に気管支、胸、結腸直腸および胃の癌腫および腺癌である。しかしまた、前立腺、卵巣、リンパ組織および骨髄、子宮、膵臓、食道、膀胱、ならびに腎臓の癌腫および腺癌も多数の死の原因となり、従って興味深い。癌疾患の群は更に、セザリー症候群、皮膚T細胞性リンパ腫、肝臓癌および肺癌を含む。<Th1またはTh2関連疾患における制御性T細胞>制御性T細胞は、末梢寛容を誘導し、粘膜反応性を制限し得るMcGuirkPMillsKHPathogenspecificregulatoryTcellsprovokeashiftintheTh1Th2paradigminimmunitytoinfectiousdiseasesTrendsImmunol2002234505。様々な動物モデルにおいて、いくつかの制御性T細胞表現型が報告されている。制御性T細胞は様々なマーカーを発現し、異なる疾患に関与することが示唆されている例えば、FieldACLCaccavelliMFBlochおよびBBellon2003RegulatoryCD8TcellscontrolneonataltolerancetoaTh2mediatedautoimmunityJournalofImmunology17025082515vonHerrathMGHarrisonLCAntigeninducedregulatoryTcellsinautoimmunityNatRevImmunol2003Mar322332FrancoisBachJRegulatoryTcellsunderscrutinyNatRevImmunol2003Mar318998CurottodeLafailleMALafailleJJCD4regulatoryTcellsinautoimmunityandallergyCurrOpinImmunol2002Dec147718McGuirkPMillsKHPathogenspecificregulatoryTcellsprovokeashiftintheTh1Th2paradigminimmunitytoinfectiousdiseasesTrendsImmunol2002Sep234505TungKSAgersborgSSAlardPGarzaKMLouYHRegulatoryTcellendogenousantigenandneonatalenvironmentinthepreventionandinductionofautoimmunediseaseImmunolRev2001Aug18213548ReadSPowrieFCD4regulatoryTcellsCurrOpinImmunol2001Dec136449YsselHLecartSPeneJRegulatoryTcellsandallergicasthmaMicrobesInfect2001Sep3899904を参照せよ。いくつかの系では、それらはCD25ShevachEM2002CD4CD25suppressorTcellsmorequestionsthananswersNatureReviewsImmunology2389400、CD45RBAnnackerOおよびFPowrie2002HomeostasisofintestinalimmuneregulationMicrobesInfection4567574、およびCTLA4ReadSVMalmstromおよびFPowrie2000CytotoxicTlymphocyteassociatedantigen4playsanessentialroleinthefunctionofCD25CD4regulatorycellsthatcontrolintestinalinflammationJExpMed192295302のような表面分子の差次的発現によって区別される。この細胞表面タンパク質発現のパターンは、それらが感作されたエフェクター状態またはメモリー状態にありうることを示唆する。これらの制御性細胞は、IL10およびTGFβの産生を介してそれらの作用のいくつかを媒介しうる。高レベルのIL10およびTGFβを産生するアネルギー性の制御性T細胞Tr1が記載される。Th3と呼ばれる別の細胞は、主としてTGFβの産生を介して実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘発を抑制する。また他のものは、可溶性のIL10またはTGFβに依存しないが、代わりにそれらの表面に、TGFβ前駆体ペプチドのアミノ末端ドメインである潜伏関連ペプチドを発現するOidaTZhangXGotoMらCD4CD25TcellsthatexpresslatencyassociatedpeptideonthesurfacesuppressCD4CD45RBhighinducedcolitisbyaTGFbetadependentmechanismJImmunol2003170251622。制御性T細胞についての内部細胞マーカーもまた報告されているSchubertLAJefferyEZhangYRamsdellFZieglerSFScurfinactsasarepressoroftranscriptionandregulatesTcellactivationJBiolChem2001Oct5276376729。すべての参考文献は参照により本明細書に組み入れられる。CD4、CD45highT細胞によって再構成されたRagマウスは、重度の大腸炎を発症し得、それはCD4、CD45lowT細胞の共移植によって回避され得るAnnackerOPowrieFHomeostasisofintestinalimmuneregulationMicrobesInfection2002456774。TGFβおよびIL10は、制御過程においてこれらのサイトカインの役割を示唆している保護のために必要とされる。<本発明の蠕虫性寄生虫調製物>蠕虫は、種に応じて、宿主の腸管腔、血流または筋肉のような部位に生息する寄生動物寄生虫である。これらの生物は世界人口の13以上に感染している。蠕虫感染は、温暖な気候で生活する貧弱な公衆衛生にさらされた子供において最も一般的である。これらの生物の感染形は、汚染された土壌、食物または水との接触を介して拡大する。1940年代以前には、米国の多くの子供および大人は蠕虫を保有していた。寄生虫保有は、南部の農村地域および主要都市の貧困集団において特に多く見られたElliottDEUrbanJFJrArgoCKらDoesthefailuretoacquirehelminthicparasitespredisposetoCrohnsdiseaseFASEBJ200014184855。米国および欧州では、蠕虫感染は徐々に減少している。それらは、発展途上国からの最近の移住者SalasSDHeifetzRBarrettConnorEIntestinalparasitesinCentralAmericanimmigrantsintheUnitedStatesArchInternMed199015015146およびインディアン保留地のような米国の十分なサービスを受けていない地域で生活する経済的に不利な人々HealyGRGleasonNNBokatRらPrevalenceofascariasisandamebiasisinCherokeeIndianschoolchildrenPublicHealthRep19698490714において見いだされる。蠕虫の有病率は、温暖な気候ならびに、過密状態、貧弱な公衆衛生および、不潔な食糧供給にさらされた人々において最も高い。炎症性腸疾患IBD、関節リウマチおよび自己免疫疾患は、これらの同じ地域においては稀である。ヒトの消化管にしばしば生息する線虫は、Ascarislumbricoides、Enterobiusvermicularis蟯虫、Trichuristrichiura鞭虫、AncylostomaduodenaleおよびNecatoramericanus鉤虫、ならびにStrongyloidesstercoralisである。Trichinellaspiralisは小腸に短期間寄生する。扁形動物は吸虫および条虫を含む。ヒトの腸に存在する最も一般的な成体の吸虫は、Fasciolopsis、EchinostomaおよびHeterophyesの種である。胆管系で生活するものは、Clonorchissinensis、Opisthorchisviverriniおよびfelineus、ならびにFasciolahepaticaを含む。Schistosomaは静脈系に生息するが、いくつかの種は腸壁を介した卵の通過によって慢性的に消化管に影響を及ぼす。一般的にヒトに感染している成体の条虫は、Diphyllobothriumの種広節裂頭条虫、Taeniasaginata無鉤条虫、Taeniasolium有鉤条虫およびHymenolepsisnana小形条虫である。宿主は、感染形の寄生虫に汚染された土壌、食物または水との接触を介して、様々な種の蠕虫に感染する。子供は、土壌と密に接触し、次善の衛生習慣しかないため、最も高頻度で蠕虫感染を有する。蠕虫は腸内のTh2応答を誘発し、それは寄生虫の排除を引き起こすか、または感染の規模を制限し得る。非工業国に住むほとんどの子供は、これらの寄生虫を有する。多くの種の蠕虫は、消化管、胆道系または腸間膜静脈内で何年も生存し、毎日何千もの卵を産んでいる。従って、幼少期から、これらの寄生虫およびまたはそれらの卵子は、何年も腸管粘膜表面を曝す分子を放出して、Th2型炎症を誘発している。A生存生物ワクチン生存能力のある蠕虫性寄生生物は、成分ワクチンと比較して相対的に長い持続性のために、最も強い粘膜の条件付けを与えうる。生存能力のある生物は、蠕虫に応じて、卵、幼虫、セルカリア、または被嚢幼虫のいずれかの形態で投与され得る。ヒトおよび準備用動物に感染し得る蠕虫が利用されうる。準備用動物は蠕虫による高い開通性を可能にするための操作を必要としうる。このような操作は、グルココルチコイドまたはアザチオプリンのような免疫抑制性の薬剤、抗ヒスタミン剤、抗サイトカイン、または組換えサイトカインのようなTh2作用を妨げる薬剤、および抗コリン作用薬または鎮静剤のような腸運動に影響を及ぼす薬剤による処理を含み得る。動物の飼料は粗繊維含量を減らすように変更されるであろう。動物は、ラット、ブタ、ハムスター、トリまたは他の準備用動物でありうる。準備用動物は、当技術分野において既知の方法に従って、特定病原体を含まないSPF例えば、特定のヒト病原体を含まない環境において飼育される。それらは、ヒトの細菌性、マイコバクテリア性、およびウイルス性病原体を含まないことを確実にするために検査される。動物をSPF環境で飼育する方法およびその利点は、当技術分野において、例えば、MMichaelSwindleJInvestSurg92672711996、参照により本明細書に組み入れられるによって記載される。Swindleもまた、対象となるいくつかの可能性のあるヒトのウイルス性および細菌性病原体を記載する。従って、特定のヒト病原体を含まない環境で飼育された動物に由来する寄生虫調製物は、これらのヒト病原体を含まず、それ自体は任意のSPF環境で飼育された動物から調製された寄生虫調製物とは特許性が異なる。卵いくつかの腸管寄生蠕虫は生存能力のある卵の摂取によって獲得される。蠕虫はSPF準備用動物、例えば、SPFブタにおいて維持される。卵を採取するために、動物に粗繊維の少ない特別食を与える。動物に経口下剤を与えて、排便を促進する。便を回収し、酵素的に消化して、卵を遊離させる。卵を液化した便から密度勾配での浮遊、スクリーンろ過、Visserろ過、または遠心水簸によって単離する。卵の保存は使用される蠕虫によって異なる。乾燥に耐性のある蠕虫の卵は、乾燥され、不活性物質と混合され、腸溶カプセルに組み込まれ、冷蔵される。乾燥に感受性の蠕虫の卵は、液体培地中での冷蔵によって、または抗凍結剤の添加および液体窒素での冷凍によって保存される。生存能力のある卵は、洗浄され、送達の場所で、冷却したラクトースを含まないプディングまたは他のベヒクルと混合される。グリセロールベースの抗凍結剤で保存された卵は洗浄を必要としないかもしれない。有効な投与量を決定するために、各ロットの卵の孵化率を検査する。各ロットの卵は、細菌性およびウイルス性病原体がないことを検査される。幼虫いくつかの蠕虫鉤虫などは、それらがヒトに感染できるようになる前に土壌成熟期を必要とする。これらのもの由来の卵は、胚を成熟させるために、または卵が孵化して幼虫形態を呈するために最適な条件下で培養されるであろう。患者は、生存能力のある幼虫の皮下注射または経口摂取によって接種され得る。セルカリアいくつかの蠕虫は、中間宿主を利用する複雑な生活環を有する。中間宿主は、ヒトに感染できる形態を排出する。セルカリアは、カタツムリのような中間宿主によって排出される吸虫性蠕虫すなわち吸虫の形態である。SPF条件で飼育された感染カタツムリからセルカリアを単離する。セルカリアを洗浄する。これらは抗凍結剤の添加および液体窒素での冷凍によって保存されうる。解凍したまたは新鮮なセルカリアは、洗浄され、患者に接種するために皮下注射される。各ロットのサンプルは、病原体がないことについて検査され、および有効な投与量を決定するために検査される。被嚢幼虫いくつかの蠕虫例えば条虫は中間宿主において被嚢幼虫または嚢尾虫を形成する。ヒトへの感染を起こすのは被嚢幼虫形である。被嚢幼虫は、例えば、SPF条件で生育した家畜または魚類または植物のような中間宿主から取り出される。嚢胞は、残存する宿主組織を含まないように洗浄される。嚢胞は、抗凍結剤の添加および液体窒素での冷凍によって保存されうる。嚢胞は、解凍され、または新鮮なものが使用され、洗浄され、送達の場所で、冷却したラクトースを含まないプディングもしくは他のベヒクルと混合され、個体に投与される。各ロットのサンプルは、病原体がないことについて検査され、および有効な投与量を決定するために検査される。B非生存成分ワクチン蠕虫性寄生虫の非生存成分は、Th1を介した病変を予防するために、免疫応答の十分なTh2条件付けをもたらす。非生存成分は、卵、幼虫または成虫に由来する。生存能力のない無傷の住血吸虫の卵は、強力なTh2応答を引き起こす。卵はSPF条件下で飼育された準備用動物ハムスターなどの肝臓から単離される。卵は、本来CokerおよびLichtenberg1956ProceedingsoftheSocForExpBiolMed92780によって記載されたものを改変した方法によって単離される。その改変は、インキュベーションのために17生理食塩水の代わりにグルコースを含むリン酸緩衝生理食塩水を使用すること、および自己分解的消化時間の減少を伴う洗浄ステップからなる。これらの変更は生存能力のある卵の単離を向上させる。その方法は以下の通りである。ゴールデンハムスターを1000~1500匹のセルカリアで感染させる。その感染を成熟させる6~7週間。動物から肝臓を摘出し、5グルコース、100Umlペニシリンおよび100mgmlストレプトマイシンを含む600mOsmの滅菌したリン酸緩衝生理食塩水に浸す。肝臓を24時間室温で自己消化させる。肝臓を低速で3分間、冷却したワーリングブレンダーでパルスホモジナイズする。ホモジネートをコラゲナーゼ2mgmlおよびトリプシン2mgmlとともに32°Cで1時間インキュベーションする。ホモジネートを50および80~100メッシュ篩によってろ過し、組織塊および残渣を除去する。325メッシュ篩を通過させることによって、ろ液から卵を回収する。卵はそのスクリーンを通過しない。卵をスクリーンから50mlポリプロピレン遠心管に洗い流す。5グルコースを含む滅菌したリン酸緩衝生理食塩水中での低速400xg遠心分離のくり返しによって、卵を洗浄する。卵はいずれのコラーゲン残渣も含まないはずである。卵の一部を1mlのセドウィックチェンバーSedwickchamber中で数えて、全卵数を測定する。単離した卵を生理食塩水に懸濁し、抗凍結剤を含まずに液体窒素で急速冷凍する。これによって卵は死滅する。強力なTh2応答を誘導するために、解凍した卵を、皮下、筋肉内もしくは静脈内、またはTh1炎症部位に注射する。他の蠕虫由来の卵もまた利用されうる。寄生虫卵から単離されたタンパク質、脂質、または糖質を用いる成分ワクチンもまた使用されうる。例としては住血吸虫可溶性卵抗原SEAがある。住血吸虫卵抗原を調製する方法は、以前にBorosおよびWarren1970JofExperimentalMed132488によって記載されており、下記に簡潔に示される。洗浄した卵をリン酸緩衝生理食塩水に50000卵mlで再懸濁する。これをガラス製組織ホモジナイザーに移す。卵を氷上でホモジナイズする。すべての卵殻が破壊されミラシジウムが破砕されたことを保証するために、一部5mlを顕微鏡観察のために取り出す。ホモジネートを超遠心管に移す。100000xgで2時間、4°Cで遠心分離する。水溶性画分SEAを回収し、タンパク質含量を測定する。SEAを少量ずつ等分して70°Cで保存する。この方法は、最も強力にTh2条件付けを促進する寄生虫卵産物を単離するための、すなわち、最適な有効濃度100μgSEAまたは10000卵子動物を達成するための改変を必要とするかもしれない。卵または可溶性卵成分は、Th2応答を開始するために、または以前に生存能力のある蠕虫への感染によって開始されたTh2応答を増強するために使用される。卵または卵成分は、病原体および内毒素がないことを確認するために検査される。成分ワクチンはまた、蠕虫性寄生虫の幼虫および成虫からも作製され得る。幼虫または寄生虫は、SPF条件で飼育された準備用動物から単離される。生存能力のない無傷の生物、または蠕虫から単離されたタンパク質、脂質、もしくは糖質を用いるワクチンは、蠕虫の卵について前述されたものと同様の方法で調製および利用される。例えば、Williamsら、1994LeukocytesofpatientswithSchistosomamansonirespondwithaTh2patternofacytokineproductiontomitogenoreggantigensbutwithaTh0patterntowormantigensJInfectDis170946XuAmanoら、1993HelperTcellsubsetsforimmunoglobulinAresponsesoralimmunizationwithtetanustoxoidandcholeratoxinasadjuvantselectivelyinducesTh2cellsinmucosaassociatedtissuesJExpMed1781309Ausielloら、2000CellmediatedimmunityandantibodyresponsestoBordetellapertussisantigensinchildrenwithahistoryofpertussisinfectionandinrecipientsofanacellularpertussisvaccineJinfectDis1811989に記載されるような、当技術分野において既知の方法に従った、蠕虫性寄生虫の画分または副画分を含むワクチン、ならびに蠕虫性寄生虫に由来する単離されたタンパク質、ポリヌクレオチド、糖質、脂質等を含むワクチンもまた、本発明に含まれる。例えば、画分または副画分は、Thaumaturgoら2001PreliminaryAnalysisofSm14inDistinctFactionsofSchistosomamansoniAdultWormExtractMemInstOswaldoCruzvol96supplVol96Suppl7983その全体が参照により本明細書に組み入れられるに記載された方法に従って調製されうる。この方法では、Smansoni寄生虫は、感染45日後にヘパリン添加生理食塩水085NaCl溶液を用いた逆行性灌流によって得られPellegrinoおよびSiqueira1956TecnicadeperfusaoparacolheitadeSchistosomamansoniemcobaiasexperimentalmenteinfectadasRevBrasMalDTrop8589597、様々な抽出物の調製に用いられた。成虫由来抽出物SEの調製寄生虫をPBSで洗浄した。その後、生きている寄生虫を室温28°C~30°Cで新しいPBSリン酸緩衝生理食塩水中に2~3時間置いておき、20°Cで冷凍した。解凍後、寄生虫のPBS懸濁液1g寄生虫10mlPBSをワイヤーメッシュでろ過し、10000gで1時間、4°Cで遠心分離したTendlerおよびScapin1981SchistosomamansoniantigenicextractsobtainedbydifferentextractionproceduresMemInstOswaldoCruz76103109Tendlerら1982ImmunogeneandprotectiveactivityofanextractofSchistosomamansoniMemInstOswaldoCruz77275283。SEのタンパク質含量をローリー法Lowryら1951によって評価し、1mgmlを含むストックバッチstockbatchesを20°Cで保存した。灌流後直ちに分離した寄生虫を用いて、オスおよびメスの抽出物を同一の方法に従って調製した。成虫由来抽出物の迅速に放出される画分SEiの調製SEiの調製はSEの最初のステップに相当した。すなわち、SEについて記載したように灌流した後、生きている寄生虫を室温28°C~30°Cで2~3時間、PBS中でインキュベーションした。その後、成虫をインキュベーション溶液SEiからワイヤーメッシュ内にろ過した。SE2の調製SE初期調製物から残された成虫を、PBS中で1週間1g寄生虫10mlPBS再び冷凍保存した20°C。解凍後、PBS懸濁液をワイヤーメッシュでろ過し、10000gで1時間、4°Cで遠心分離した。寄生虫抗原はまた、Thaumaturgoら上述の図1に記載された図23として再現されたように抽出され得る。あるいは、寄生虫抗原は、Deelderら1980ApplicabilityofdifferentantigenpreparationsintheenzymelinkedimmunosorbentassayforschistosomiasismansoniAmJTropMedHyg29401410に記載されるように調製されうる。例えば、抗原は、それぞれの生活環段階の緩衝生理食塩水ホモジネートからの可溶性上清液として調製されるSWAPから調製されうるGoesら1989ProductionandcharacterizationofhumanmonoclonalantibodiesagainstSchistosomamansoniParasiteImmunol11695711。SWAPは、以前に記載されたようにHirschおよびGoes1996CharacterizationoffractionatedSchistosomamansonisolubleadultwormantigensthatelicithumancellproliferationandgranulomaformationinvitroParasitology112529535、FPLC高速タンパク質液体クロマトグラフィーにおいて陰イオン交換クロマトグラフィーによって分画された。簡潔には、20mMTrisHClpH96を用いて、0、100、280、450、600および750mMでの勾配保留間隔によって中断される最大1MNaClまでの多段階の漸増勾配で、タンパク質を溶出した。流出画分を凍結乾燥によって濃縮した。濃縮した物質を015Mリン酸緩衝生理食塩水PBS、pH74で透析し、ろ過滅菌し、70°Cで保存した。タンパク質含量をブラッドフォードマイクロアッセイに従って測定したBradford1976ArapidandsensitivemethodforthequantificationofmicrogramquantitiesofproteinutilizingtheprincipleofproteindyebindingAnalytBiochem72248254その全体が参照により本明細書に組み入れられる。10SDSPAGEドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動により還元条件下で分離されたLaemmli1970CleavageofstructuralproteinsduringtheassemblyoftheheadofbacteriophageT4Nature227680685その全体が参照により本明細書に組み入れられる6画分の解析は、多数のタンパク質バンドを示し、画分IIIは高分子量97および160KDa、中間分子量52および56KDaならびに低分子量28および36KDaのタンパク質を含んでいた。この画分はPIIIと呼ばれ、様々な免疫アッセイに用いられた。脂質もまた、当技術分野において、例えば、vanderKleijらに記載されるように調製されうる1999RecognitionofSchistosomeGlycolipidsbyImmunoglobulinEPossibleRoleinImmunityInfectionandImmunity6759465950その全体が参照により本明細書に組み入れられる。1つの実施形態では、Smansoni成虫12g湿重量および卵16g湿重量の脂質が、BlighおよびDyerに記載された方法によって抽出された1959ArapidmethodoftotallipidextractionandpurificationCanJBiochemPhysiol37911917。有機相をロータリーエバポレーターによって乾燥させ、10mlのクロロホルムに溶解し、ヒドロキシル型に変換された陰イオン交換TEAEセルロースServaHeidelbergGermanyの20mlカラムにアプライした。Rouserらによって記載されたように、脂質を溶出した1969DiethylaminoethylandtriethylaminoethylcellulosecolumnchromatographicproceduresforphospholipidsglycolipidsandpigmentsMethodsEnzymol14272317。このプロトコールによると、画分は以下の脂質を含む。すなわち、画分1、コレステロール、グリセリド、および他の中性脂質画分2、セレブロシド、グリセロールジグリセリド、ホスファチジルコリン、およびスフィンゴミエリン画分3、セラミドポリヘキソシド画分4、無機物質画分5、ホスファチジルエタノールアミンおよび遊離脂肪酸画分6、ホスファチジルセリン画分7、なし洗浄ステップならびに画分8、ホスファチジン酸、カルジオリピン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、および他の酸性脂質である。画分2および3における糖脂質の存在を、HPTLCプレートでの脂質画分のオルシノール染色によって確認した1956QuantitativeestimationofcerebrosidesinnervoustissueJNeurochem14253。C蠕虫生物の維持蠕虫は、SPF条件で飼育された中間宿主および準備用動物を循環する。蠕虫個体群のサンプルは、感染率、繁殖力、および駆虫薬に対する感受性などの表現型の安定性を確実にするために検査される。<投与量、投与法および医薬製剤>治療を必要とする個体は、選択された寄生虫の天然の生活環に応じて、経口または非経口で寄生虫の感染形卵、セルカリアもしくは幼虫を投与される。別法として、TH2応答を誘導するために、可溶性の寄生虫または卵の抽出物が経口または非経口で投与され得る。腸および肝臓の蠕虫および住血吸虫に関して、それらは、接種の約30~60日後に便中に現れる卵を産生し始める。便中の卵の定量は、感染の妥当性および強度の評価をするのに十分であることを示す。便の一部をショ糖浮遊法によって処理し、各検体中の全卵数を測定する。ショ糖溶液での浮遊は、KoontzおよびWeinstock1996GastroenterologyClinicsofNAmerica25435によって報告されるように、正確な計数のために便から卵を単離するのにしばしば用いられる方法である。本発明の蠕虫性寄生虫化合物は、任意の便利な方法での投与のために製剤化されでもよく、従って、本発明はその範囲内に、ヒトにおける使用に適した本発明の蠕虫性寄生虫化合物を含む医薬組成物を含む。このような組成物は、任意の必要な医薬担体または賦形剤を用いて従来の方法での使用に供されうる。本発明の蠕虫性寄生虫化合物は、注射用に、従って、ワクチン用途に製剤化されでもよく、必要であれば防腐剤を添加した、アンプルでの単位投与剤型、または複数回投与容器で提供されうる。組成物はまた、油性もしくは水性ベヒクルの懸濁液、溶液、または乳液のような形態を取ってもよく、懸濁化剤、安定化剤、およびまたは分散剤などの製剤化物質を含みうる。あるいは、蠕虫性寄生虫は、粉末形態であってよく、または使用前に、例えば滅菌した発熱物質を含まない水などの適切なベヒクルによって再構成されうる。必要に応じて、このような粉末製剤は、粉末が水で再構成され、その結果生じる水性製剤のpHが生理学的に許容されうることを確実にするために、適切な非毒性基剤を含みうる。蠕虫性寄生虫化合物はまた、例えばカカオ脂または他のグリセリドなどの従来の坐薬基剤を含む坐薬として製剤化されうる。蠕虫性寄生虫化合物はまた、従来の充填剤、担体、および賦形剤とともに経口投与のために製剤化されうる。それを必要とする個体に投与される寄生虫の量は、自己免疫疾患を予防または治療するために十分な量である。この量は、治療または予防される疾患、および蠕虫性寄生虫、それが無傷で、または卵、幼虫、抽出物もしくはセルカリアとして投与されるかどうかに応じて変化しうる。一般的に、寄生虫が本明細書において議論されるすべての自己免疫疾患に対して投与される場合、その量は約50~約50000の範囲である。より詳細には、この量は約500~約5000の範囲でありうる。卵が利用される場合には、約500~約5000が、本明細書に開示される自己免疫疾患を治療するために利用されうる。抽出物が投与される場合には、約100μg~約10000μgが、自己免疫疾患を治療するために利用される。幼虫およびセルカリアが投与される場合には、投与量は、それぞれの場合において約500~約5000の範囲でありうる。予防またはワクチン用途のためには、寄生虫の量は500~5000でありうる。寄生虫調製物の投与量は、Th1、Th2または制御性細胞の応答を測定することによって測定されうる。あるいは、投与量は、当技術分野において知られているか、もしくは本明細書に記載されるような特定の疾患の病変または症状を評価することによって測定されうる。ATh1およびTh2応答の測定本発明の効果を示すために、Th1およびTh2応答が区別されうる。Metawaliら、1996JofImmunol1574546は、マウスにおいて、組織学的解析ならびにサイトカインおよび免疫グロブリンプロフィールの解析によってTh1応答をTh2応答と区別することが可能であることを示した。更に、Sandorら、1990JofExpMed1712171は、Fcg3およびMHCクラスII分子の細胞表面での発現が区別を可能にすることを示した。この方法では、粘膜炎症、好酸球増多および肥満細胞症の程度を測定するために、小腸および大腸が組織学的に検査される。後者の細胞型はTh2応答の指標となる。腸間膜リンパ節MLNおよび脾臓は、マイクロウェルプレートでのinvitro培養のために単細胞懸濁液に分離され得る。完全RPMI培地中の細胞1~2x106ウェルを、寄生虫抗原もしくは抗CD3の存在下または非存在下で最大72時間まで培養し、その後、その上清をサイトカインおよび免疫グロブリンについてアッセイする。IFNγ、TNFαおよびIgG2aはTh1応答を特徴付けるが、一方、IL4、IL5、IgEおよびIgG1はTh2反応の特徴を表す。また、血清もサイトカインおよび免疫グロブリンプ濃度についてアッセイされ得る。更に、分散された炎症性白血球は、フローサイトメトリーによって、マクロファージ上でのFcγ3発現Th1およびB細胞上でのMHCクラスII発現Th2について検査される。対照は、寄生虫の宿主ではない、適切な、年齢を適合させた同腹子マウス由来の血清、MLNおよび脾臓を含む。同様の解析はヒトのTh1とTh2応答を区別することができる。炎症の部位および末梢血液細胞からの炎症組織、単離された白血球が検査される。白血球は、invitroにおいて単独で、またはサイトカイン放出を刺激するための寄生虫抗原もしくは分裂促進剤の存在下で培養される。IgG2はIgG2aの代わりになる。B制御性T細胞活性の測定invitro培養物または動物から制御性T細胞を単離する方法は、当技術分野において知られており、例えば、McGuirkPMillsKHPathogenspecificregulatoryTcellsprovokeashiftintheTh1Th2paradigminimmunitytoinfectiousdiseasesTrendsImmunol2002234505FieldACLCaccavelliMFBlochおよびBBellon2003RegulatoryCD8TcellscontrolneonataltolerancetoaTh2mediatedautoimmunityJournalofImmunology17025082515vonHerrathMGHarrisonLCAntigeninducedregulatoryTcellsinautoimmunityNatRevImmunol2003Mar322332FrancoisBachJRegulatoryTcellsunderscrutinyNatRevImmunol2003Mar318998CurottodeLafailleMALafailleJJCD4regulatoryTcellsinautoimmunityandallergyCurrOpinImmunol2002Dec147718McGuirkPMillsKHPathogenspecificregulatoryTcellsprovokeashiftintheTh1Th2paradigminimmunitytoinfectiousdiseasesTrendsImmunol2002Sep234505TungKSAgersborgSSAlardPGarzaKMLouYHRegulatoryTcellendogenousantigenandneonatalenvironmentinthepreventionandinductionofautoimmunediseaseImmunolRev2001Aug18213548ReadSPowrieFCD4regulatoryTcellsCurrOpinImmunol2001Dec136449YsselHLecartSPeneJRegulatoryTcellsandallergicasthmaMicrobesInfect2001Sep3899904ShevachEM2002CD4CD25suppressorTcellsmorequestionsthananswersNatureReviewsImmunology2389400AnnackerOおよびFPowrie2002HomeostasisofintestinalimmuneregulationMicrobesInfection4567574ReadSVMalmstromおよびFPowrie2000CytotoxicTlymphocyteassociatedantigen4playsanessentialroleinthefunctionofCD25CD4regulatorycellsthatcontrolintestinalinflammationJExpMed192295302に記載される通りである。制御性T細胞の応答または活性は、本明細書に記載されるような内部マーカー、細胞表面マーカー、または分泌マーカーによって測定されうる。制御性T細胞のための有用な内部マーカーは、Scurfin、Smad7、Gata3、TbetTbx21などの転写因子を含むが、それらに限定されない。制御性T細胞のための有用な表面マーカーは、CD4、CD45RBlo、CD45Rc、細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4CTLA4、CD25、CD103、Ox40、41BB、CD62L、αEβインテグリン、潜伏関連ペプチドLAPまたはグルココルチコイド誘導性TNF受容体ファミリー関連タンパク質GITR、ケモカイン受容体CCR5、TIST2を含むが、それらに限定されない。制御性T細胞のための有用な分泌マーカーは、IL5、IL10およびTGFβを含むが、それらに限定されない。Cマーカーの量をinvitroにおいて測定する方法の非限定的な例フローサイトメトリーによるサイトカイン検出RPMI完全培地中の脾細胞、MLNまたは腸の炎症細胞を、24ウェルの組織培養プレートに2x106細胞ウェルで播種する。細胞を4~6時間、抗CD3または適切な抗原の存在下または非存在下で、10μgmlのブレフェルジンAとともに培養する。ブレフェルジンはタンパク質のエキソサイトーシスを妨げ、サイトカインの細胞内での蓄積を促進する。細胞質サイトカインの検出のために、細胞を室温で5分間、2パラホルムアルデヒドで固定し、続いて細胞のサブタイプを区別するために表面染色する。細胞を洗浄し、50μlのPBS02サポニンおよび1μg抗サイトカイン抗体に再懸濁し、室温で20分間インキュベーションする。次に、細胞をサポニンで2回洗浄し、PBSFCSに再懸濁する。細胞を同一のアイソタイプおよびサイトカイン特異性の過剰な非共役性抗体を用いて前もってブロッキングすることにより、または、細胞を組換えサイトカインの存在下でインキュベーションすることにより、サイトカイン抗体染色の特異性を確認する。フィコエリトリンPE標識された無関係の抗体対照もまた、バックグラウンド染色を評価するために含まれる。細胞はフローサイトメトリーを用いて解析される。ELISAELISAは、マイクロタイタープレート中で培養され、上述のように操作された細胞からの細胞上清におけるサイトカインおよび抗体濃度を測定する。多くのこれらのアッセイは既に本発明者らの研究室で使用可能である。サイトカインは、2つのモノクローナル抗体mAbを用いて、二部位サンドイッチELISAでアッセイされる。抗サイトカインmAbは、アンモニウム沈殿によって、抗体を分泌しているハイブリドーマクローンの上清から精製される。マイクロタイタープレートを、Tween20を含む50μlのPBSPBST中1μgmlのコーティング抗体によってコーティングし、4°Cで一晩インキュベーションする。その後、ウェルに150μlのPBS中10FCSを添加し、37°Cで30分間インキュベーションすることによってブロッキングする。標準は、組換えサイトカイン、または住血吸虫症感染マウス由来の分裂促進剤活性化脾臓細胞もしくは抗原活性化脾臓細胞からのサイトカインを含んでいる上清を含む。サンプルおよび標準希釈物を、10FCSを含むRPMI完全RPMI中で別の96ウェル平底マイクロタイタープレートにおいて調製し、50μlの量を、PBSTで3回洗浄したELISAプレートに移す。サンプルをアッセイプレートにおいて1時間37°Cでインキュベーションする。適切なmAbはビオチンにコンジュゲートされる。PBSTで3回洗浄した後、各ウェルに50μlの1BSAPBST中05μgmlの抗体ビオチンコンジュゲートを加える。プレートを室温で1時間インキュベーションし、その後、PBSTで3回洗浄する。ストレプトアビジンホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート75μlを、1BSAPBST中1μgmlで添加し、室温で1時間インキュベーションする。プレートを新しいPBSTで10回洗浄し、44mMNa2HPO4、28mMクエン酸、および0003H2O2中、100μlの1mgmlの基質22アジノ3エチルベンズチアゾリンスルホン酸を加える。有色生成物を、マルチスキャンマイクロプレートリーダーを用いて、490nmの参照波長とともに405nmの波長で測定する。免疫グロブリンは、抗アイソタイプ特異的ELISAを用いて定量される。アフィニティー精製されたヤギ抗IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgAおよびIgEを捕捉抗体として使用し、軟質ポリビニルマイクロタイターディッシュに10μgmlで吸着させる。培養上清の添加、インキュベーション、洗浄の後、適切なアイソタイプのアルカリホスファターゼコンジュゲートヤギ抗免疫グロブリンを用いて、プレートに結合した全マウス免疫グロブリンを検出する。標準曲線は精製された免疫グロブリンを用いて作製される。寄生虫抗原特異的抗体を測定するために、可溶性抗原をビオチン化し、結合したマウス免疫グロブリンを検出するために使用する。プレートをELISAリーダーにおいて410nmで解析し、全免疫グロブリンの濃度を標準曲線および最良適合解析ソフトウェアを用いて測定する。可溶性寄生虫抗原は正確な定量を可能にする定義された抗原ではないため、抗原特異的抗体濃度はOD測定値と相対的に比較される。ELISPOTアッセイELISPOTアッセイは、ポリクローナル抗体またはサイトカインのいずれかを分泌しているリンパ球を計数するために確立される。96ウェルのニトロセルロース支持マイクロタイタープレートを、PBST中1μgmlの抗免疫グロブリンまたは抗サイトカイン抗体のいずれかによって、4°Cで一晩コーティングする。その後、プレートを10FCSを含むPBSでブロッキングし、PBSTで十分に洗浄する。5x104細胞ウェルから始まる単細胞懸濁液の希釈系列を、プレート上で5時間37°Cで、加湿した5CO2雰囲気下でインキュベーションする。プレートをPBSTで洗浄し、ビオチン化抗免疫グロブリンまたは抗サイトカイン抗体を4°Cで一晩重層する。次に、プレートを洗浄し、ストレプトアビジングルコースオキシダーゼコンジュゲートで2時間処理し、再度洗浄する。単一細胞によって分泌された抗体またはサイトカインを基質によって可視化する。比色反応を洗浄によって30分後に停止し、スポットを30X倍率で数える。10~50スポットウェルを生じる細胞の希釈物を、サンプル当たりの分泌細胞の総数を計算するために使用する。対照は、不適切なヤギ抗体もしくは不適切な抗原でコーティングされたウェル、またはコーティングされないままのウェルを含む。ウェルをコーティングするために可溶性抗原を用いたアッセイの改変は、寄生虫抗原特異的な免疫グロブリン分泌B細胞の定量をも可能にする。簡潔には、例えば、プレートを025μgウェルの成虫TMuris抗原または適切な無関係の対照抗原でコーティングする。洗浄後に細胞をウェルに添加する。適切なインキュベーションの後、プレートを再度洗浄し、上述のように処理する。D疾患病変の評価自己免疫疾患の存在およびその治癒または改善の証拠は、治療の必要性を決定するために、および治療過程を観察するために必要とされる。以下の方法は、注目される疾患の臨床パラメータを測定するために利用される。1炎症性腸疾患炎症の評価マウスでは、疾患の臨床所見は、体重減少、下痢、直腸脱および腸の炎症の組織学的徴候を含む。従って、これらのパラメータの改善は、疾患の改善を意味すると思われる。動物モデルにおいて腸の炎症を評価するために、組織を摘出し、スイスロールのように巻きSwissrolled、標準的な方法に従ってパラフィン包埋する。切片をヘマトキシリンおよびエオジンで染色する。大腸の炎症の程度は、本発明者らの通常の標準化方法を用いて、1人の病理学者による盲検で0~4まで半定量的に評価される。すなわち、0炎症なし、1低レベルの炎症、2中間レベルの炎症、3壁肥厚を伴う高レベルの炎症、ならびに4貫壁性浸潤、および壁肥厚を伴う杯細胞の喪失。肥満細胞を数えるために、個々のマウスからの腸組織サンプルをスイスロール法Swissrolltechniqueによって処理し、カルノア固定液で固定し、パラフィン包埋して、アルシアンブルーおよびサフラニンによる染色のために処理する。与えられた切片の隣接した50視野を、固有層および筋層中の粘膜肥満細胞について検査する。肥満細胞は、それらの特徴的なアルシアンブルーによる細胞内顆粒染色によって同定される。すべてのサンプルは盲検で評価される。ヒトでの疾患活動性は、様々な臨床的基準、実験室での基準および組織学的基準を用いて観察される。下痢および腹痛の頻度のような臨床パラメータを観察する、いくつかの十分に確立されたIBD疾患活動性の指標がある。クローン病の評価のための1つの特に有用な指標は、クローン病活動性指数、すなわちCDAIであるBestら、1976Gastroenterology70439。CDAIは、疾患活動性に関連する8つの変数を取り入れ、最新のクローン病の治療薬の研究に用いられている。それは、液状または非常に軟らかい便の回数、腹痛または腹部の痙攣の重症度、一般的な健康、疾患の腸管外の徴候の存在、腹部腫瘤の有無、抗下痢薬の使用、ヘマトクリット、および体重を含む。複合スコアは0~約600の範囲である。150以下のスコアは寛解を示し、450以上のスコアは重度の疾患を示す。検査済みの、認められた、疾患特異的な生活の質アンケートもまた、治療の進行を評価するために治療前後に施行されうる。アービン炎症性腸疾患アンケートは、32項目のアンケートであるIrvineら、1996TheShortInflammatoryBowelDiseaseQuestionnaireaqualityoflifeinstrumehtforcommunityphysiciansmanaginginflammatoryboweldiseaseCCRPTInvestigatorsCanadianCrohhsRelapsePreventionTrialAmJGastroenterol19969115718。それは、腸機能例えば軟便および腹痛、全身症状疲労および睡眠パターンの変化、社会的機能仕事への参加および社交行事を取り消す必要性ならびに情動状態怒り、憂うつ、または苛立ちに関する生活の質を評価する。スコアは32~224の範囲であり、高スコアはより良い生活の質を示す。寛解期の患者は通常170以上のスコアである。腸疾患活動性の内視鏡、x線および組織学的評価もまた、評価のために使用されうる。C反応性タンパク質レベルおよび血球沈降速度もまた、炎症の全身性指標として観察されうる。2関節リウマチ炎症の評価コラーゲン誘発関節炎のマウスでは、マウスは1日おきに検査され、それらの足は以下のようにスコアされる。すなわち、0正常1紅斑および足首の関節またはつま先に限局した軽度の腫れ2紅斑および足首から中足部まで拡大した軽度の腫れ3紅斑および足首から中足関節まで拡大した重度の腫れならびに4関節腫脹を伴う強直性変形である。これらの4つのパラメータは、関節炎の関節における組織学的変化と相関し得る。治療の成功は、組織学上の改善とともに関節炎スコアの減少をもたらすAnthonyDDHaqqiTMCollageninducedarthritisinmiceananimalmodeltostudythepathogenesisofrheumatoidarthritisClinicalExperimentalRheumatology1724041999。プリスタン誘発関節炎では、関節は腫れを検出するためにマイクロメータで測定されうる。ヒトでは、RAは、関節腫脹、紅斑、運動制限および痛みの測定によってスコアされる。あるいは、サイトカインおよび炎症性タンパク質濃度について、ならびに白血球の組成および機能について、当技術分野において既知の方法に従って、滑液が解析されうる。滑膜生検は、当技術分野において既知の方法による組織学的解析のための組織を提供するFelsonDTAndersonJJBoersMBombardierCFurstDGoldsmithCKatzLMLightfootRJrPaulusHStrandVらAmericanCollegeofRheumatologyPreliminarydefinitionofimprovementinrheumatoidarthritisArthritisRheumatism38727351995SchiffMArationalefortheuseofsummarymeasurementsfortheassessmentoftheeffectsofrheumatoidarthritistherapiesClinicalTherapeutics2599310012003。3狼瘡炎症の評価免疫系の正常な発達および機能は、アポトーシスと呼ばれる過程による望ましくない細胞の除去に大いに依存する。特異的な細胞表面分子およびそれらの受容体を介した細胞間相互作用はしばしば、この過程を誘導する。このような系の1つは、FASおよびFASリガンドと呼ばれる。FASLPRまたはFASリガンドGLDのいずれかに欠損のあるマウスは、狼瘡のような自己免疫疾患を発症するReillyCMGilkesonGSUseofgeneticknockoutstomodulatediseaseexpressioninamurinemodeloflupusMRLlprmiceImmunologicResearch25143532002。LPRまたはGLDマウスの集団は、特定病原体を含まない条件下のマイクロアイソレーターケージで維持される。これらのマウスは自然に自己免疫を発症し得るが、人為的な誘発後はより予測可能になる。疾患を誘発するために、8週齢のマウスにプリスタンのような薬剤を注射する。2ヶ月以内に、マウスは自己免疫疾患になる。マウスおよびヒトの両方において疾患の誘発および改善を判定するために有用な、多くの臨床的、組織学的ならびに免疫学的基準は、当技術分野においてよく知られているSatohMRichardsHBShaheenVMYoshidaHShawMNaimJOWooleyPHReevesWHWidespreadsusceptibilityamonginbredmousestrainstotheinductionoflupusautoantibodiesbypristaneClinicalExperimentalImmunology1213994052000。4若年性インスリン依存性糖尿病1型炎症の評価NODマウスは、膵臓β細胞の自己免疫性破壊によりヒトと同様の1型糖尿病を発症する。当技術分野において既知の方法に従った臨床的、生化学的、免疫学的および組織学的検査は、マウスにおける疾患の誘発および改善の評価を可能にする例えば、AdoriniLGregoriSHarrisonLCUnderstandingautoimmunediabetesinsightsfrommousemodelsTrendsinMolecularMedicine83182002を参照せよ。5サルコイドーシス炎症の評価肺の炎症のビーズ塞栓モデルにおいて、抗原すなわちTh1またはTh2はセファロースビーズと結合され、それは尾静脈内への注射によってマウスの肺を閉塞する。その動物は通常、結合抗原に事前に感作される。宿主の免疫系は、障害を起こすビーズに対して活発な免疫応答を開始する。数週間持続し得るこれらの局所性炎症反応は、組織学的にサイズについて検査され得る。また、それらは組織から分離され、細胞組成およびサイトカイン産生について研究され得る。更に、肺門リンパ節および脾臓は、容易に実験のために利用できる。例えば、KunkelSLLukacsNWStrieterRMChensueSWAnimalmodelsofgranulomatousinflammationSeminarsinRespiratoryInfections1322181998を参照せよ。ヒトの疾患であるサルコイドーシスは、通常は肺に関与する。サルコイドーシスおよび疾患の範囲の判定は、当技術分野において既知の方法によって行われうる。肺機能検査は、肺のコンプライアンスおよび機能を評価し得る。また、気管支洗浄は、炎症過程の間に気管支樹に浸潤した炎症細胞を得る。これらの細胞は、組成および機能について研究され得る。肺浸潤および肺門リンパ節腫脹はサルコイドーシスの特徴である。従って、定期的な胸部x線またはCTスキャンは、疾患活動性の評価を支援し得る。当技術分野において既知の方法によるアンジオテンシン変換酵素活性の測定のような血清検査は、疾患の範囲および活動性を評価するために使用され得る。例えば、HunninghakeGWCostabelUAndoMBaughmanRCordierJFduBoisREklundAKitaichiMLynchJRizzatoGRoseCSelroosOSemenzatoGSharmaOPATSERSWASOGstatementonsarcoidosisAmericanThoracicSocietyEuropeanRespiratorySocietyWorldAssociationofSarcoidosisandotherGranulomatousDisordersSarcoidosisVasculitisDiffuseLungDiseases16149731999を参照せよ。6多発性硬化症炎症の評価実験的自己免疫性脳脊髄炎は、感受性マウスにおいて適切な感作ミエリン抗原の反復注射によって誘発される。マウスは以下の基準に従って臨床的に評価される。すなわち、0疾患なし1尾の弛緩2後肢衰弱3後肢麻痺4後肢麻痺および前肢麻痺または衰弱5瀕死である。組織学的解析のために、脊髄および脳を摘出し、ホルマリンで固定する。パラフィン包埋切片を染色し、光学顕微鏡下で検査する。分散させた脾細胞および他の部位からの細胞は、上記に概説されたようにinvitroにおいて研究され得る。これらのパラメータは、疾患の改善または回復の測定を支援し得る例えば、SewellDianeZingQingEmilyReinkeDavidElliottJoelWeinstockMatyasSandorandZsuzsaFabryImmunomodulationofexperimentalautoimmuneencephalomyelitisbyhelminthovaimmunizationInternationalImmunol1559692003。ヒトでは、MS疾患活動性は、神経学的徴候および症状の進行および一時的な改善の観察によって評価される。最も広く用いられる結果測定は、総合障害度ExpandedDisabilityStatusScaleと呼ばれる。当技術分野において既知の方法によって解析される脳脊髄液のタンパク質組成および細胞含量もまた、疾患活動性を観察するために使用されうる。更に、連続的なMRI研究は、新たなガドリニウム増強脳病変を示すMcDonaldWICompstonAEdanGGoodkinDHartungHPLublinFDMcFarlandHFPatyDWPolmanCHReingoldSCSandbergWollheimMSibleyWThompsonAvandenNoortSWeinshenkerBYWolinskyJSRecommendeddiagnosticcriteriaformultiplesclerosisGuidelinesfromtheInternationalPanelontheDiagnosisofMultipleSclerosisAnnNeurol5012172001PoserCMPatyDWScheinbergLらNewDiagnosticCriteriaForMultipleSclerosisGuidelinesForResearchProtocolsAnnNeurol198313227231。統計的方法いくつかのデータは、平均値がゼロとは有意に異なるかどうかを決定するために、1標本t検定によって解析される。対応のあるt検定は、群平均間の違いを解析するために用いられる。分散分析およびダネットt検定は、多数の比較データを解析するために用いられる。<本発明に有用な動物モデル>以下の表1は、本発明に有用な動物モデルの非限定的な例を説明する。更なる非限定的な例は、例えば、CurrentProtocolsinImmunology2001JohnEColiganAdaMKruisbeekDavidHMarguliesEthanMShevachWarrenStrober編、JohnWileySons出版に記載されるように、当技術分野において見いだされうる。本発明は、以下の材料および方法を用いる以下の非限定的な実施例によって説明される。以下で引用されるそれぞれの参考文献の開示全体は、参照により本明細書に組み入れられる。実施例1一般的な方法動物129SVIL10突然変異マウスの集団、および適切な対照動物を維持し、標準的な方法に従って特定病原体を含まない環境を維持する施設において飼育する。寄生虫の維持、動物の感染、住血吸虫卵の調製Tmurisの維持および感染のために用いられる方法は、ElseおよびWakelin1990Parasitologyvol100part3479に記載された通りである。住血吸虫卵を、住血吸虫感染ハムスターの肝臓から採集し、Elliott1996MethodsACompaniontoMethodsinEnzymology9255に記載されるように保存した。5匹の感染ハムスターから約2x106の卵が採集される。Tsuis卵の調製Tsuis卵の調製および採集において、以下の方法が用いられた。Tsuis卵の実験的接種に暴露した後7~8週間のブタの大腸からTsuis成虫を単離した。成虫をinvitroで培養することにより幼虫形成卵を得て、その後、培地から遠心分離によって分離された排出卵を22°Cで5~6週間バブリングしながら02二クロム酸カリウム溶液中に置き、感染型初期幼虫を得た。卵を1200xgで10分間の遠心分離によって滅菌水で2回洗浄し、数を数え、2500の計算された用量に基づいて必要量の生理食塩水に再懸濁した。これらの卵を被検体での使用のために保存した。卵は冷蔵庫で少なくとも1年間安定である。感染力を保証するために、本発明者らは、感染後の便への卵の出現について患者を観察した。便中の卵の数は、寄生の強度に比例する。また、本発明者らは、持続的な感染力を保証するために、時々、ブタを保存した卵で感染させる。Maviumへの感染106コロニー形成単位CFUのMycobacteriumaviumATCC25291を腹腔内に注射することにより、マウスを感染させた。感染60日目に、数匹のマウスにはまた、35匹のSmansoniセルカリアを与え、二重感染を誘導した。住血吸虫感染および卵子の単離いくつかの実験には、8~9週間Smansoniに感染したマウス18~20gを使用した。マウスを、皮下投与によってプエルトリコ系統由来の40匹のセルカリアに感染させた。肉芽腫の分離および分散肉芽腫は、天然の卵の蓄積のために、住血吸虫感染マウスにおいて形成され、それは感染の6週目から始まる。Maviumもまた肉芽腫を誘導する。本発明者らは、記載されたようにElliott1996上述感染マウスから分離された肝臓の肉芽腫を研究する。肉芽腫を分散させ、単細胞懸濁液を調製した。分離した肉芽腫を、5mgmlコラゲナーゼを含むRPMI培地中で、35分間37°Cの水浴振盪機において振盪した。残りの肉芽腫を1mlの注射器によって吸い上げ、吹き出させて、更に分散させた。その結果生じた細胞懸濁液をガーゼを通してろ過し、3回洗浄した。細胞の生存率をEosinY排除法によって測定した。この方法は、保存された表面分子の発現を示す高収量の生存能力のある炎症細胞をもたらした。脾臓およびMLNの分散脾細胞およびMLNは、引き裂いてステンレス製メッシュを通して組織を洗浄することによって分散される。混入しているRBCをH2Oで溶血させ、細胞を使用前にRPMIで3回洗浄した。TNBS大腸炎の誘発大腸炎は、Neurathら、1995JExpMed1821281に記載されるように、トリニトロベンゼンスルホン酸TNBSの直腸注入により誘発された。簡潔には、対照または寄生虫暴露BALBcマウスを30時間絶食させ、その後メトキシフルランで麻酔した。12mmのカテーテルを4cm大腸内に前進させ、01mlのTNBS溶液50エタノール中5mgmlTNBSSigmaを注入した。動物を尾で3分間吊り下げて、大腸粘膜への均一な接触を確保した。粘膜炎症の評価腸の炎症を評価するために、表示された時点で組織を摘出し、スイスロールのように巻き、標準的な方法に従ってパラフィンに包埋した。切片をヘマトキシリンおよびエオジンで染色した。大腸の炎症の程度は、本発明者らの通常の標準化方法を用いて、1人の病理学者による盲検で0~4まで半定量的に評価された19。0炎症なし、1低レベルの炎症、2中間レベルの炎症、3壁肥厚を伴う高レベルの炎症、4貫壁性浸潤、杯細胞の喪失、壁肥厚。細胞の単離およびT細胞の濃縮Th1、Th2および制御性T細胞は、例えば、CurrentProtocolsinImmunology2001JohnEColiganAdaMKruisbeekDavidHMarguliesEthanMShevachWarrenStrober編、JohnWileySons出版に記載されるような、当技術分野において既知の方法によって単離されうる。1つの実施形態では、MLNの単細胞懸濁液は、RPMI1640培地GIBCOGrandIslandNY中で穏やかに引き裂くことによって調製された。その細胞を短時間蒸留水に再懸濁し、RBCを溶血した。その後、MLNを多量のRPMIで3回洗浄した。消化管LPMCは下記のように単離された。腸組織をRPMIで十分に洗浄し、すべての目に見えるパイエル板をはさみで除去した。その腸を縦方向に開き、5mm片に切断し、その後、上皮内リンパ球および上皮細胞を遊離させるために、カルシウムおよびマグネシウムを含まないハンクス液中の05mMEDTAで、20分間37°Cで振盪しながらインキュベーションした。十分な洗浄の後、これをくり返した。その後、組織を、10FCS、25mMHEPESバッファー、2mMLグルタミン、5x105Mβメルカプトエタノール、1mMピルビン酸ナトリウム、100Umlペニシリン、5mgmlゲンタマイシン、および100mgmlストレプトマイシンすべてGIBCO、ならびに1mgmlコラゲナーゼSigmaCO130を含む20mlRPMI中で20分間37°Cでインキュベーションした。インキュベーションの最後に、1mlの注射器を用いて、組織に更なる機械的破砕を加えた。残渣を除去するために、LPMC調製物を、事前に湿らせて漏斗に重ねたガーゼを通してRPMIで洗浄した。その後、LPMCを1回洗浄し、10ml注射器に穏やかに充填し事前に湿らせた2cmのナイロンウールカラムを通して篩過した。洗浄後、細胞最大2x107までを3070勾配を有するパーコールのカラムに重層した。細胞を室温で20分間2200xGで回転させた。3070の界面から回収されたLPMCを洗浄し、使用するまで氷上に維持した。細胞の生存率はEosinY排除法による測定では90であった。細胞移植実験のために、製造メーカーによって記載されたように、抗体コート高密度粒子を用いるSpinSep濃縮法を用いた陰性選択によって1703117032StemCellTechnologiesVancouverCanada、MLNT細胞を単離した。それぞれの分離後、フローサイトメトリーを使用して、ThyT細胞の適切な回収率および純度98を確認した。細胞移植MLN細胞を、2週間Hpolygyrusに感染させたIL10マウスから、または週齢を適合させたこのような感染のない健康なIL10マウスから単離した。その後、これらの分画していない分散させたMLN細胞2x107細胞マウスまたはMLNT細胞5x106細胞マウスを、ピロキシカム処理の中止後2日の大腸炎IL10マウスにip注射によって移植した。14日後に大腸炎を評価した。<制御性T細胞の調製のための更なる方法>本発明のいくつかの実施形態では、制御性T細胞は、例えば、米国特許出願第20030170648号、20030157057号、20030133936号、20030064067号、20030049696号、20020182730号、20020090724号、20020090357号その全体が参照により本明細書に組み入れられるに記載されるような、当技術分野において既知の方法に従った更なる解析のために、培養細胞または動物から調製されうる。細胞源として有用なinvivoでの細胞集団の源は、末梢血、白血球分離血液製剤、血液成分分離血液製剤、末梢リンパ節、消化管関連リンパ系組織、脾臓、胸腺、臍帯血、腸間膜リンパ節、肝臓、免疫学的損傷部位、例えば滑液、膵臓、脳脊髄液、腫瘍サンプル等を含むが、それらに限定されない。ドナーは好ましくはヒトであり、胎児、新生児、子供、成人であり得、正常、罹患、または対象となる疾患に感受性でありうる。例えば、本発明の制御性T細胞は細胞表面マーカーの発現に基づき濃縮され得る。1つの実施形態では、細胞はCD4およびCD25の発現に対して陽性選択され、CD45RAの欠如に対して陰性選択され得る。任意選択で、Treg細胞の亜集団を更に分離するために、CD69、CCR6、CD30、CTLA4、CD62L、CD45RB、およびCD45ROを含む他のマーカーが使用され得る。その方法は、他の細胞特異的マーカーに対する陽性選択による細胞単離のための更なる濃縮もしくは精製の方法またはステップを含み得る。別の実施形態では、制御性T細胞は、CD4CD25および任意でCD45RAであるという特性を有する細胞について濃縮する技術によって、細胞の複合混合物から分離される。組織から細胞を単離するために、適切な溶液が分散または懸濁のために使用されうる。このような溶液は通常、低濃度の、一般的には5~25mMの許容されうるバッファーとともに、ウシ胎仔血清、BSA、正常ヤギ血清、または他の天然由来の因子が都合よく添加された、平衡塩類溶液、例えば生理食塩水、PBS、ハンクス平衡塩類溶液等である。都合の良いバッファーは、HEPES、リン酸バッファー、乳酸バッファー等を含む。別の実施形態では、制御性T細胞集団の分離は、十分に純粋な集団を提供するために、その後、アフィニティー分離を用いる。アフィニティー分離のための技術は、抗体コート磁気ビーズを用いる磁気分離法、アフィニティークロマトグラフィー、モノクローナル抗体と結合したもしくはモノクローナル抗体と連結して使用される例えば補体および細胞毒素などの細胞毒性物質、ならびに、例えばプレートなどの固体マトリックスに結合された抗体とのパニング、または他の都合の良い技術を含みうる。正確な分離を提供する技術は蛍光活性化細胞選別装置を含み、それは複数のカラーチャネル、低角度および鈍感な光散乱検出チャネル、インピーダンスチャネル等の、様々な程度の精巧さを有することができる。細胞は、死細胞と関連する色素ヨウ化プロピジウム、LDSを用いることによって死細胞と選別されうる。選択された細胞の生存率に過度の害を及ぼさない任意の技術が使用されうる。アフィニティー試薬は上記の細胞表面分子に対する特異的受容体またはリガンドでありうる。抗体試薬に加えて、ペプチドMHC抗原およびT細胞受容体の対、ペプチドリガンドおよび受容体、エフェクターおよび受容体分子等が使用されうる。抗体およびT細胞受容体はモノクローナルまたはポリクローナルであってもよく、トランスジェニック動物、免疫動物、不死化されたヒトまたは動物のB細胞、抗体またはT細胞受容体をコードするDNAベクターでトランスフェクトされた細胞等によって産生されうる。抗体の作製、および特異的結合因子として使用するためのそれらの適合性の詳細は、当業者によく知られている。特に関心を持たれるのは、アフィニティー試薬としての抗体の使用である。都合の良いことに、これらの抗体は、分離に使用するための標識とコンジュゲートされる。標識は、直接分離を可能にする磁気ビーズ、担体に結合されたアビジンまたはストレプトアビジンによって分離できるビオチン、蛍光活性化細胞選別装置とともに使用され得る蛍光色素等を含み、特定の細胞型の分離を簡略化することを可能にする。用途を見いだす蛍光色素は、例えばフィコエリトリンおよびアロフィコシアニンなどのフィコビリタンパク質、フルオレセインならびにテキサスレッドを含む。それぞれのマーカーに対して独立の選別を可能にするために、しばしばそれぞれの抗体は異なる蛍光色素によって標識される。1つの実施形態では、抗体は細胞の懸濁液に添加され、利用可能な細胞表面抗原と結合するのに十分な期間インキュベーションされる。インキュベーションは、通常少なくとも約5分であり、通常約30分以下である。分離の効率が抗体の不足によって制限されないように、すなわち、飽和量の抗体を用いて、反応混合物において十分な濃度の抗体を含むことが望ましい。その適切な濃度は滴定によっても決定され得る。細胞を分離する培地は、細胞の生存を維持する任意の培地である。好ましい培地は01~05BSAを含むリン酸緩衝生理食塩水である。様々な培地が市販されており、細胞の性質に応じて使用され、それらはしばしばウシ胎仔血清、BSA、HSA等を添加された、ダルベッコ改変イーグル培地dMEM、ハンクス平衡塩類溶液HBSS、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水dPBS、RPMI、イスコフ培地、5mMEDTAを含むPBS等を含む。細胞の染色強度は、レーザーが定量的なレベルの蛍光色素を検出するフローサイトメトリーによって測定され得るそれは抗体によって結合された細胞表面抗原の量に比例する。フローサイトメトリーまたはFACSはまた、抗体染色の強度、ならびに細胞サイズおよび光散乱などの他のパラメータに基づいて細胞集団を分離するために使用され得る。染色の絶対値は、特定の蛍光色素および抗体調製によって異なるかもしれないが、データは対照に対して標準化され得る。標識された細胞はその後、CD4およびCD25の発現に応じて分離される。分離された細胞は、通常回収チューブの底に血清の緩衝材を含む、細胞の生存を維持する任意の適切な培地中に回収されうる。様々な培地が市販されており、細胞の性質に応じて使用され、それらはしばしばウシ胎仔血清を添加された、dMEM、HBSS、dPBS、RPMI、イスコフ培地等を含む。ヒトTreg活性を高度に濃縮した組成物は、このような方法で獲得されうる。対象集団は、約70またはそれ以上の細胞組成物、通常は約90またはそれ以上の細胞組成物であり、約95またはそれ以上の細胞組成物でありうる。濃縮された細胞集団は直ちに使用されうる。細胞はまた冷凍することもでき、分離処置の前に細胞を冷凍することが好ましいが、液体窒素温度で冷凍されて長期間保存されてもよく、解凍して再利用することが可能である。細胞は通常、培地、グルコース等とともにDMSOおよびまたはFCS中で保存される。解凍したら直ちに、細胞は、成長因子、抗原、刺激、樹状細胞等の使用によって増殖および分化のために展開されうる。細胞培養サイトカイン分析のために、細胞を48時間96ウェルマイクロタイタープレートCorningCambridgeMA中で、200μlの培地とともに5x105細胞ウェル37°Cで培養した。培地は、10FCS、25mMHEPESバッファー、2mMLグルタミン、5x105Mβメルカプトエタノール、1mMピルビン酸ナトリウム、100Umlペニシリン、5mgmlゲンタマイシン、および100mgmlストレプトマイシンすべてGIBCOを含むRPMIであった。ほとんどの実験において、細胞は単独で、またはそれぞれ1μgmlで抗CD32C11ATCCおよび抗CD28mAbPharminogenSanDiegoCAとともに培養された。単離したT細胞を、事前に抗CD3および抗CD28mAbによって一晩コーティングしたウェルで培養した。IL12分析のためには、ColeyPharmaceuticalGroupWellesleyMAによって提供され、産生を刺激するために06μgmlで用いられる2つ下線の免疫活性化CpGモチーフ1314を含む合成ホスホロチオエート骨格オリゴヌクレオチドODN1826TCCATGACGTTCCTGACGTT配列番号3とともに、細胞を培養した。マウスサイトカインについてのELISAELISAは上記のVI項に記載されるように行われた。実施例2SmansoniへのTh2応答は、関連のない細菌性Th1誘導性抗原への進行中のTh1応答をダウンレギュレートするTh細胞の免疫応答がTh1またはTh2パターンへと二極化し得ることは、十分に証明されている。この二極化は、Th1細胞からのIFNγがTh2細胞の増殖を阻害する一方で、Th2細胞からのIL4およびIL10がTh1細胞の増殖を阻害するために起こる。以下の実験は、住血吸虫症が、確立されたマイコバクテリア感染へのマウスTh1応答を変化させることを実証した。マウスをMaviumおよびSmansoniに重感染させ、これらの明らかに異なるTh1およびTh2炎症性刺激に対する宿主の応答を評価した。BALBcAnNマウスは、Mavium106CFUを注射した場合、慢性的なMavium感染を発症する。マイコバクテリア感染の確立の60日後に、マウスをSmansoni40セルカリアに感染させた。60日後、マウスを屠殺した。対照群は、Maviumのみに120日間、またはSmansoniのみに60日間感染したマウスを含んだ。これらの動物由来の分散させた脾細胞または単離した肉芽腫細胞を、invitroで4x105細胞ウェル48時間、最適濃度で使用される住血吸虫卵抗原SEA、強力なTh2抗原またはマイコバクテリア抗原精製タンパク質誘導体PPD、強力なTh1誘導性抗原の存在下または非存在下で培養した。インキュベーション後、サイトカインまたは免疫グロブリン産生について、ELISAを用いて上清をアッセイした。図1~3のデータは、3回の個別の実験の平均値SDである。Maviumのみに感染したマウスからの脾細胞は、PPDTh1抗原による刺激後、多量のIFNγを分泌した。非感染対照マウスからの脾臓細胞は何も産生しなかった。最も重要なことに、IFNγは、同時に感染させたマウスからの脾臓細胞培養物では検出されなかったMavium単独感染対同時感染、P001、図1。可溶性住血吸虫卵抗原SEA、Th2抗原は、Smansoni感染動物の脾細胞からのIL4およびIL5放出のみを促進した。単独でMaviumに感染したマウスは、PPDもしくはSEAに応答してIL4またはIL5を産生しなかった。しかし、重感染した動物からの脾細胞は、PPD刺激後、いくらかのIL4を分泌した図1。MaviumもしくはSmansoniに感染したマウスの肝臓から、または同時感染を有する動物から、肉芽腫を分離した。同時感染した動物は、住血吸虫卵およびマイコバクテリアの両方を含み、組織学的実験で容易に認められる肝臓肉芽腫を発症する。これらの動物からの分散させた肉芽腫細胞を、invitroで48時間、最適濃度で使用されるSEAもしくはPPDの存在下または非存在下で培養した。Maviumのみに感染したマウスからの肉芽腫細胞は、PPDによる刺激後、多量のIFNγを分泌した。同時感染したマウスからの肉芽腫細胞培養物では、IFNγは検出されなかったMavium単独対その他、P001図2。SEAはSmansoni感染動物の肉芽腫細胞からのIL4放出を促進した。SEAはいずれの場合にもIFNγ分泌を促進しなかった。単独でMaviumに感染したマウスは、PPDに応答してIL4を産生しなかった。しかし、重感染した動物からの肉芽腫細胞は、PPD刺激後、いくらかのIL4を分泌した図2。Th1応答はIgG2a産生を促進するが、一方、Th2反応はIgG1およびIgEを向上させる。図3は、Maviumに感染したマウスが高い血清IgG2aレベルを有することを示す。しかし、重感染動物は正常の血清IgG2a濃度を有するが、IgG1およびIgEレベルの増加を示す。これらのデータを総合すると、蠕虫感染へのTh2応答は、Maviumのような強力なTh1誘導性生物への進行中の宿主応答であってもダウンレギュレートできることを示す。実施例3腸管寄生蠕虫への感染またはそれらの卵子への暴露は、マウスのTNBS誘導性大腸炎におけるTh1型の消化管炎症を軽減する50エタノール中のTNBSの直腸注入は、マウスにおいてクローン病と共通した特徴を有する大腸炎を引き起こす。大腸の炎症は、IFNγmRNA発現の上昇を伴うCD4T細胞の浸潤を特徴とする。TNBS処理マウスからの固有層T細胞は、対照からのT細胞より50倍多いIFNγを分泌し、5倍少ないIL4を分泌するNeurathら、1995、上述。固有層単核細胞は、対照マウスからの細胞より30倍多いTNFαを分泌するNeurathら、1997EurJImmunol271743。重要なことには、TNBS大腸炎は抗IL12Neurathら、1995、上述、抗TNFαNeurathら、1997、上述、またはrIL10Duchmannら、1996EurJImmunol26934を用いた治療によって予防または改善され得る。TNBS誘導性大腸炎はまた、事前のハプテンへの経口暴露によってもElsonら、1996JImmunol1572174、おそらく粘膜IL4、IL10およびTGFβ応答の増加によってNeurathら、1996JExpMed1832605予防され得る。BALBcマウスを用いたTNBS大腸炎モデルが確立される。50エタノール中のTNBS01mlの5mgmlストックの直腸投与は、これらの動物に再現性良く大腸炎を引き起こす。後述されるそれぞれのTNBS実験のために、寄生虫暴露動物および対照動物は、同一のTNBS調製物を同じ日に、処理群を知らない同じ手技者によって投与された。A住血吸虫症はTNBS処理マウスのMLNおよび脾臓細胞からのIFNγ放出を阻害する。住血吸虫感染がTNBS処理動物大腸炎モデルマウスにおけるTh1応答を変化させるかどうかを研究した。マウスをsc注射によって35匹のSmansoniセルカリアに感染させた。寄生虫は感染の開始後約6週間で成熟し、産卵し始める。2週間後感染の8週目に、マウスをTNBSで処理した。T細胞刺激抗CD3に応答してIFNγを産生するMLNおよび脾臓細胞の能力を、数日後に検査した。表2に示されるように、天然の住血吸虫感染は、TNBS処理マウスの腸間膜リンパ節MLNおよび脾臓細胞からのIFNγ放出を強力に阻害する。B住血吸虫卵への暴露はTNBS処理マウスのMLNおよび脾臓細胞からのIFNγ放出を阻害する。住血吸虫症では、Th2応答を引き起こすのは、成虫よりもむしろ寄生虫卵への暴露である。住血吸虫感染は、寄生虫が成熟し産卵し始めるまでは、強力なTh2応答を引き起こさないGrzychら、1991JImmunol1461322。自然感染を伴わずに無傷の住血吸虫卵に暴露されたマウスは、強力なTh2応答を示すOswaldら、1994JImmunol1531707。これらの観察は、自然感染を伴わない住血吸虫卵への暴露がTh2応答を誘導しTh1応答を抑制しうることを示唆する。住血吸虫卵への事前の暴露が、成虫による感染を必要とせずにTh1応答を阻害するかどうかを調べるために、マウスに、2回、104個の住血吸虫卵をTNBSによる直腸投与の14日前および4日前に、腹腔内ip注射によって接種した。これらの時間は、天然の感染において起こる持続的な産卵を模して選択された。寄生虫卵に暴露されないがTNBSで処理されたマウスを対照とした。卵は事前に冷凍され、注射時には生存能力を持たなかった。今回も、T細胞刺激抗CD3に応答してIFNγを産生するMLNおよび脾臓細胞の能力を、TNBS注入の数日後に検査した。天然の住血吸虫感染と同様に表1、ipによる卵暴露は、表3に示されるように、TNBS処理マウスのMLNおよび脾臓T細胞からのIFNγ産生を阻害した。C住血吸虫卵への暴露はTNBS誘導性大腸炎からマウスを保護する。粘膜のTh1応答の発生を阻害することは、TNBS誘導性大腸炎を軽減し得る。住血吸虫卵への事前の暴露は、MLNおよび脾臓T細胞によるTh1サイトカイン分泌を阻害する。住血吸虫卵のip注射がTNBS誘導性大腸炎を阻害するかどうかを調べるために、卵を上述のように注射し、続いてTNBS処理を行った。卵処理は、3回の個別の実験において、対照群での601627から卵暴露マウスでの22627へと、累積死亡率を劇的に減少させた。腸の炎症は、上記の一般的な方法に詳述されたように4点制でスコアされた。生き残ったマウスにおいて、卵処理は腸の炎症を、対照群での31±05平均±SDから卵暴露マウスでの13±03まで軽減したp005、図4。次の実験は、群間での最大の差異がTNBS処理後3日で明白になることを示した。TNBS注入の14日後に行われた他の実験は、卵暴露が持続的な保護を与えることを示した。これらのデータは、住血吸虫卵が粘膜のTh1応答を阻害することによって致死的な大腸炎の発症からマウスを保護することを示唆する。D腸管寄生蠕虫は宿主のTh2応答を誘導する。Smansoni以外の蠕虫性寄生虫が宿主のTh1応答を調節できるかどうかが調べられた。腸内線虫に対する防御免疫の発現はCD4T細胞依存性である。マウスはTh2応答を増加させることによって寄生虫を駆除し、または感染を制限する。寄生虫の駆除は、腸の好酸球増多だけに依存するのではなく、粘膜の肥満細胞症だけに依存するのでもないと思われる。抗IL4または抗IL4受容体遮断mAbによる処理は寄生虫の保持を促進するElseら、1994JExpMed179347ので、IL4は寄生虫の駆除に重要な役割を有するのかもしれない。反対に、IL4による処理は寄生虫の除去を促進する図4。Tmurisはマウス宿主の大腸に生息する。それは、Trichuristrichiuraという、それらの生息中にほぼ10億人の人々によって媒介される寄生虫と近縁であるGrencisら、1996GastroenterologyClinicsofNorthAmerica25579。卵の摂取が感染を開始する。卵は盲腸上皮を貫通する幼虫を放出する。それらはその後、成虫へと成熟する。その寄生虫は、我々が感染の強度を制御することが可能な宿主内では複製しないBancroftら、1994EurJImmunol243113。Tmurisは腸のTh1応答性をダウンレギュレートするために使用された。Tmuris感染は、生存能力のある幼虫を含む250個の幼虫形成卵の経口投与によって確立される。BALBcマウスはTmurisを寄生させ、感染の4週間以内に寄生虫を自然に駆除することができる。Tmuris感染マウスまたは偽感染マウスを、感染開始の4週間後にTNBSの直腸注入によって処理した。Tmurisによる事前感染は、2回の個別の実験において、偽感染群での58712から寄生虫暴露群での21314へと、累積死亡率を減少させた。更に、事前にTmurisに感染したマウスは、偽感染マウス313±063、p005と比較してTNBS大腸炎の軽減092±05、平均±SDを呈する。これらのデータは、腸内寄生虫Tmurisへの事前暴露が重度のTh1媒介性大腸炎の発症からマウスを保護することを示す。実施例4IL10遺伝子破壊は、宿主寄生虫相互作用を有意に変化させない。IL10は、マクロファージの活性化およびアクセサリー細胞の機能を抑制する重要な免疫調節サイトカインであるMooreら、1993AnnRevImmunol11165。標的化遺伝子破壊によってIL10を欠損させたマウスIL10は、結腸細菌叢に影響される慢性腸炎を発症するKuhnら、1993Cell75263。腸の炎症は抗IFNγ抗体による治療によって軽減され、その大腸炎は結腸内容物に対する過度のTh1応答に起因することを示しているBergら、1996JClinInvest981010。これらのマウスは、クローン病のそれと類似した自然発症大腸炎のための優れたモデルとして役立つ。この実施例では、129およびC57Bl6バックグラウンドのIL10マウスが用いられた。AIL10マウスは寄生虫へのTh2応答を増加させることができる。腸内線虫Nbrasiliensisに感染したマウスは、IL4、IL5およびIL10の産生を伴う寄生虫に対するTh2型炎症を発現する。NbrasiliensisはIL10マウスに感染し、適切な腸のTh2応答を活性化することができるKuhnら、1993、上述。それらがTH2応答を増加させるかどうかを調べるために、IL10マウスをSmansoniに感染させた。表4は、Smansoniに8週間感染したIL10遺伝子破壊マウスからの脾細胞が、住血吸虫卵抗原SEAまたは抗CD3による刺激によって多量のIL4を分泌することを示す。これらのマウスにおける住血吸虫卵を包囲する肉芽腫は、通常の高い割合45~50の好酸球を含み、IL4およびIL5を産生する。このように、それらは効果的なTh2応答を示す。これらのデータは、Smansoniのような蠕虫性寄生虫への暴露がIL10の非存在下においても強力なTh2応答を誘導することを示す。B蠕虫のTh2条件付けはIL10マウスにおける粘膜炎症の自然発症を阻害する。IL10欠損マウスは蠕虫性寄生虫を寄生させ、強力なTh2応答を誘導することができた。IL10マウスはTh2応答を発現でき、腸内寄生虫を寄生させることができるため、それらは自然発症の大腸炎または持続的な大腸炎に対する寄生虫暴露の効果を研究するための優れたモデルとして役立つ。IL10は重要な抗炎症性サイトカインである。この必須の免疫調節回路の破壊は、寄生虫による粘膜のTh2条件付けを妨げる可能性がある。現在の証拠は、Tmurisへの感染がIL10マウスにおいて発症する自然発症大腸炎を妨げることを示唆する。Tmuris感染または偽感染を受けた動物6週齢を6週間後に屠殺した。Tmuris感染または偽感染したIL10マウスの大腸の炎症を、上記の一般的な方法に詳述されたように4点制でスコアした。Tmurisによる事前の感染は、腸の炎症を、偽感染群での30±03平均±SEから寄生虫暴露IL10マウスでの22±01p005へと軽減した。これらのデータは、蠕虫性寄生虫への事前暴露がIL10欠損マウスにおける自然発症大腸炎を軽減することを実証する。実施例6Trichurissuisによる腸管感染はクローン病の患者における疾患活動性をダウンレギュレートする。クローン病の患者をTrichurissuisに感染させ、疾患活動性の改善を評価する。ブタの鞭虫であるTsuisは、発展途上国において一般的なヒトの腸管寄生蠕虫であるTtrichiuraの近縁種である。この鞭虫は治療のための潜在的因子である。天然のヒト寄生虫であるTrichuristrichiuraは、粘膜への付着によって大腸に存在する非常に小さい生物である。通常の感染はたいてい、宿主に症状を引き起こさず、健康上の問題を起こさない。これは世界中で感染した何百万の人々の場合であるが、少数派では、重度の感染は、下痢、出血および鉄欠乏性貧血を引き起こす。その寄生虫の生活環は宿主が自己感染しないようになっていることが興味深い。卵は感染型になるための成熟に土壌相を必要とし、その後、個体への寄生負荷を増やすために再摂取されなければならない。従って、土壌中の卵が摂取されない限り、Ttrichiura感染は宿主内で増加しない。その病因は3日間メベンダゾールを用いて容易かつ効果的に治療される。ヒトの鞭虫は宿主を感染させるために使用され、クローン病における免疫の作用を改変するための実験薬として検討されるかもしれない。しかし、Trichuristrichiuraは宿主に潜在的な健康上の問題をもたらす。ヒトは唯一の自然宿主であるため、実験的用途のための卵は、他のヒトから採集しなければならず、他のヒト感染症を実験の被験者に伝染させる可能性を生じる。従って、近縁動物の寄生虫が使用された。ブタの鞭虫Trichurissuisは、症状や疾患、共に感染する疾患または公衆衛生被害を起こすことなく、ヒト宿主を一次的に感染させる潜在能力を有する。ブタの鞭虫はヒトに感染する種の近縁種である。2つの生物は同じ科であり、形態的に類似しているが、それらは異なる種に属し、形態学的、発生学的および臨床的に区別され得る。ブタの鞭虫の卵は少し大きく、異なる形の棘を有し、卵から成虫への発達速度はTrichuristrichiuraより遅いBeer1976ResVetSci2047。重要なことに、本発明者らは感染性の寄生虫卵をSPF動物から得ることができる。感染性のTsuis卵の供給は上述のように調製された。腸内病原体例えばShigella、Salmonella、Campylobacter、Yersinia、および病原性Ecoliならびにウイルス例えばCMV、HSV、VZV、アデノウイルスおよびエンテロウイルスによる汚染のないことを確認するために、卵を検査した。進行性の薬物治療抵抗性クローン病の2人の患者をTsuisに感染させた。彼らは、この生物に起因する症状をほとんどまたはまったく伴わずに寄生虫を許容した。表5は、患者の感染の実現後に、両参加者のCDAI値、下痢、および炎症の指標が低下したことを示す。この結果は、蠕虫がクローン病を含むがそれに限定されない異常な免疫応答を調節するために有用であることを示唆する。実施例7炎症性腸疾患の予防および治療におけるHpolygyrus炎症性疾患に対する防御を誘導した寄生虫における制御性T細胞の役割を研究するために、更なる実験を行った。実験にはマウス腸管寄生蠕虫Hpolygyrusが用いられた。Hpolygyrusは、回腸末端もしくは大腸に炎症または損傷を引き起こすことなく、宿主の十二指腸に生息する。アルコール中のTNBSは、マウスの直腸内に注入された場合、大腸炎を誘発する。図5は、この生物がTNBS誘導性大腸炎からマウスを保護することを示す。感染は200匹の生存能力のある幼虫の経口投与によって確立された。マウスは感染開始後約2週間で寄生虫を駆除する。Hpolygyrus感染または偽感染マウスを、寄生虫感染の開始の4週間後に01mlのTNBS50エタノール中5mgmlの直腸注入によって処理した。大腸炎の誘発の3日後に、染色した組織切片で炎症を評価した。蠕虫感染が、IFNγ、TNFαおよびIL12のようなTh1サイトカインの腸内産生を制限することによって、TNBS誘導性IBDからマウスを保護するかどうかを検査するために、実験を行った。図6および7は、IBDのない健康なWTマウスのHpolygyrusへの暴露が、遠位腸粘膜のIFNγおよびIL12産生の能力を低下させることを示す。IL10、TGFβおよびPgE2のような制御性サイトカインは、Th1細胞機能を制限することができる。Hpolygyrusが腸粘膜内でのこれらの制御性サイトカインの産生を促進するかどうかを測定した。図8は、この寄生虫が粘膜のIL10産生を誘導することを示す。IL10は、TNFα、IL6およびIL12のような一連の前炎症性メディエーターをダウンレギュレートする。従って、腸粘膜で産生されたIL10がTh1細胞機能を制限すると仮定することは妥当である。図9は、Hpolygyrusを用いたマウスからのLPMCが、阻害性の抗IL10RmAbとともに培養された場合、実質的により多くのIFNγを産生することを示し、この仮説を支持している。疾患から保護することができる潜在的に重要な免疫調節サイトカインは、プロスタグランジンE2PgE2、IL4、IL5、IL13およびTGFβを含む。図10~12は、蠕虫が腸粘膜において防御性サイトカインE2PgE2、IL4、IL5、IL13およびTGFβの産生を誘導することを示す。T細胞は腸粘膜でのIFNγの主要な供給源である図13。IFNγはTNBS大腸炎の誘発に重要である。腸管寄生蠕虫は、粘膜の免疫反応を局所的に制御するために腸に移動するMLN中の制御性T細胞を誘導する。実験は、未処理の非感染WTマウスからのLPMCが、寄生虫感染マウスからのMLNT細胞の移植後、IFNγを産生する能力の低下を呈することを示した図14。いくつかの実験では、MLN制御性T細胞サブセットが腸固有層に入り、続いて制御性サイトカインを産生したかどうかを決定する養子免疫伝達実験のために、緑色蛍光タンパク質GFPトランスジェニックマウスを使用した。図15に見られるように、Hpolygyrusを有するGFPマウスからの推定MLN制御性T細胞は、健康なWTレシピエントの腸粘膜に入る。この実験は、どのようにして蠕虫が疾患から保護するかを示す。臨床試験において、蠕虫感染が活動性IBDを改善することが発見された。どのようにしてHpolygyrusによる感染が進行性のマウス大腸炎を逆転させるかもまた、検査された。IL10マウスは、動物が年を取るにつれて徐々に悪化する慢性のTh1大腸炎を発症する。しかし、ほとんどの自然発症疾患のIBDモデルに当てはまるように、SPF施設のIL10マウスはわずか数ヶ月後に様々な表現型の大腸炎を発症する。それを実験のためにより有用になるように、IBDモデルを改良した。5週齢のIL10マウスを2週間NSAIDピロキシカムで飼育することは、薬剤を止めた後でも無期限に持続する重度のTh1大腸炎を誘発することが発見された。炎症はマウス間で高度に予測可能であり、均一な重症度の大腸およびTIを有する図16。WTマウスはピロキシカム処理による大腸炎を発症しない。IL10マウスのHpolygyrusによる感染は、以前に確立された大腸炎を解消させることが発見された図17。5週齢のC57BL6IL10マウスにピロキシカム80mg250g飼料を与えた。2週間後、ピロキシカムを中止した。この時点で、すべてのマウスは大腸炎であった。ピロキシカムを中止して2日後に、数匹のマウスを胃への強制投与によって200匹のHpolygyrusに感染させ、一方、他のマウスに偽処理を行った。感染の2週間後、大腸炎スコアは、対照での36±04SEから感染マウスでの055±05p0001へと低下した。確立された大腸炎のHpolygyrusによる治癒は、LPMCのサイトカイン産生の変化に関連する。未処理のピロキシカムなしのマウスから、または大腸炎の偽感染マウスから単離されたLPMCは、抗CD3抗CD28による刺激に応じて多量のIFNγを放出し図18、CpGオリゴヌクレオチド06μg1826mlによる刺激に応じてIL12を放出する。ピロキシカム処理したHpolygyrus感染IL10マウスからのLPMCは、高感度の30pgmlELISAによって検出可能なIFNγをほとんどまたはまったく産生せず、IL12の放出の抑制を示す図18。未処理または大腸炎のIL10マウスからのLPMCは、IL4を産生せず、IL13をほとんど産生しない図19。対照的に、Hpolygyrus感染マウスからのLPMCは、いくらかのIL4および多量のIL13を産生する。蠕虫感染は大腸の炎症を逆転させるが、LPMCサイトカインプロフィールは、単に未処理のIL10マウスのそれに戻るわけではない。むしろ、感染は、大腸炎の治癒に関連する新たなサイトカインプロフィールをもたらす。Hpolygyrus感染はIL10マウスのLPMCでの調節回路を活性化する。大腸炎のIL10マウスからのIFNγを産生しているLPMCとHpolygyrus感染マウスからのLPMCとの11の混合は、IFNγ産生を阻害された共培養物をもたらす。Hpolygyrusは十二指腸に生息するが、大腸炎を逆転させ、遠位のLPMCサイトカインプロフィールを変化させる調節回路を開始する。蠕虫感染は、Hpolygyrus感染マウスのMLNT細胞区画内に存在する循環制御性細胞を誘導または活性化することが示された。Hpolygyrus感染IL10マウスからの20x106MLN細胞または5x106MLNT細胞の、確立されたIL10大腸炎を有する動物への移植は、炎症の解消をもたらす図20。Scurfinはfoxp3遺伝子によってコードされる転写因子であり、制御性T細胞の増殖または活性に重要である。Foxp3転写産物は、リアルタイムRTPCRによって定量されるように、寄生虫のないIL10マウスと比較してHpolygyrus感染マウスのMLNにおいて増加する図21。1回1回のPCRサイクル閾値の減少は、HPRTmRNAに対して標準化された2倍のFoxp3含量に相当する。蠕虫感染は、MLN細胞において3~5倍のFoxp3発現の増加を引き起こす。Foxp3はまた、寄生虫のない対照と比較して、Hpolygyrus感染IL10マウスのLPMCにおいても増加する3倍。制御性T細胞のみが、Foxp3を発現することが知られているHoriSTNomuraおよびSSakaguchi2003ControlofregulatoryTcelldevelopmentbythetranscriptionfactorFoxp3Science29910571061。MLNおよびLPMCにおけるFoxp3発現の増加は、蠕虫が、確立された大腸炎の解消を指揮する制御性T細胞を誘導するという仮説を支持する。他の免疫調節因子の転写産物は、Hpolygyrusへの感染によって変化する。Smad7はTGFβシグナル伝達を遮断する転写因子である。Hpolygyrusへの感染は、リアルタイムRTPCRによって測定されるように、MLN細胞のSmad7発現を45倍減少させる図22。Smad7転写産物はまた、LPMCにおいても減少する。Smad7の減少は、細胞が免疫調節性TGFβに対してより応答性になることを可能にする。更に、Smad7発現の減少は、複数の調節機構がおそらくIL10大腸炎を解消するために機能していることを示す。Smad7のためのプライマーおよびプローブは、TCCTGCTGTGCAAAGTGTTC配列番号4、GAGTAAGGAGGAGGGGGAGA配列番号5、およびFAMTTGATCTTCCCGTAAGATTCACAGCAACATAMRA配列番号6である。Foxp3およびSmad7mRNAの発現は、HPRTに対して標準化される。HPRTのためのプライマーおよびプローブは、TGAAGAGCTACTGTAATGATCAGTCAAC配列番号7、GCAAGCTTGCAACCTTAACCAT配列番号8、およびTETTGCTTTCCCTGGTTAAGCAGTACAGCCCTAMRA配列番号9である。<他の実施形態>上述の実施例は、本発明の作出および実施において、本発明者らによって行われ、企図された実験の実例を説明する。これらの実施例は、本発明の実施方法を知らせるため、およびその有用性を証明するための両方の目的を果たす技術の開示を含むと考えられる。本明細書において開示される技術および実施形態は単に好ましい実施形態であり、一般的に多数の同等の方法および技術が同様の結果を得るために使用されうることは、当業者によって認識されるであろう。本明細書の上記に特定された参考文献はすべて、それらが、本発明の1以上の実施形態の実施に重要でありうる組成物およびまたは方法の基礎を記載し、説明し、提供し、それを可能にする範囲で、ここで明確に参照により本明細書に組み入れられる。