"基準セロビオヒドロラーゼICBHI触媒ドメインと比較してバリアントCBHI触媒ドメインを含むポリペプチドであって、aトリコデルマリーゼイCBHIのR268に対応するアミノ酸位置における置換R268置換;bトリコデルマリーゼイCBHIのR411に対応するアミノ酸位置における置換R411置換;またはcR268置換とR411置換の両方を含み、その際、置換a、bまたはcが基準CBHI触媒ドメインと比較して生産物阻害を低減させるポリペプチド。R268置換を含む、請求項1に記載のポリペプチド。R268置換基がリジンである、請求項2に記載のポリペプチド。R268置換基がアラニンである、請求項2に記載のポリペプチド。R411置換を含む、請求項1~4のいずれか1項に記載のポリペプチド。R411置換基がリジンである、請求項5に記載のポリペプチド。R411置換基がアラニンである、請求項5に記載のポリペプチド。バリアントCBHI触媒ドメインが、SEQIDNO:2のアミノ酸18-444に対して少なくとも90の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1~7のいずれか1項に記載のポリペプチド。バリアントCBHI触媒ドメインが、SEQIDNO:2のアミノ酸18-444に対して少なくとも95の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項8に記載のポリペプチド。R268および/またはR411置換以外は、バリアントCBHI触媒ドメインがSEQIDNO:2のアミノ酸18-444の配列を含む、請求項9に記載のポリペプチド。バリアントCBHI触媒ドメインが、SEQIDNO:2のタンパク質と比較して下記のアミノ酸置換またはアミノ酸置換対のうちの1つを含む、請求項8~10のいずれか1項に記載のポリペプチド:aR268KおよびR411K;bR268KおよびR411A;cR268AおよびR411K;dR268AおよびR411A;eR268A;fR268K;gR411A;ならびにhR411K。バリアントCBHI触媒ドメインがR268A置換を含まない、請求項8~11のいずれか1項に記載のポリペプチド。そのアミノ酸配列がSEQIDNO:299を含まない、請求項12に記載のポリペプチド。そのアミノ酸配列がSEQIDNO:299からなるものではない、請求項12に記載のポリペプチド。バリアントCBHI触媒ドメインがR411A置換を含まない、請求項8~14のいずれか1項に記載のポリペプチド。そのアミノ酸配列がSEQIDNO:301またはSEQIDNO:300を含まない、請求項15に記載のポリペプチド。そのアミノ酸配列がSEQIDNO:301またはSEQIDNO:300からなるものではない、請求項15に記載のポリペプチド。SEQIDNO:2の位置18-444に対応するアミノ酸配列に対して少なくとも95の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、SEQIDNO:2のタンパク質と比較してR268K置換およびR411A置換を有するポリペプチド。そのアミノ酸配列が、SEQIDNO:2の位置18-444に対応するアミノ酸配列に対して少なくとも97の配列同一性を有する、請求項18に記載のポリペプチド。バリアントCBHI触媒ドメインが、SEQIDNO:1のアミノ酸26-455に対して少なくとも90の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1~7のいずれか1項に記載のポリペプチド。バリアントCBHI触媒ドメインが、SEQIDNO:1のアミノ酸26-455に対して少なくとも95の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項20に記載のポリペプチド。R268および/またはR411置換以外は、バリアントCBHI触媒ドメインがSEQIDNO:1のアミノ酸26-455の配列を含む、請求項21に記載のポリペプチド。バリアントCBHI触媒ドメインが、SEQIDNO:1のタンパク質と比較して下記のアミノ酸置換またはアミノ酸置換対のうちの1つを含む、請求項20~22のいずれか1項に記載のポリペプチド:aR273KおよびR422K;bR273KおよびR422A;cR273AおよびR422K;dR273AおよびR422A;eR273A;fR273K;gR422A;ならびにhR422K。バリアントCBHI触媒ドメインが、SEQIDNO:1のタンパク質と比較してアミノ酸置換R273KおよびR422Kを含む、請求項20~23のいずれか1項に記載のポリペプチド。バリアントCBHI触媒ドメインが、SEQIDNO:1のタンパク質と比較してR273KおよびR422Kの両方の置換を含まない、請求項20~23のいずれか1項に記載のポリペプチド。そのアミノ酸配列がSEQIDNO:301またはSEQIDNO:302を含まない、請求項25に記載のポリペプチド。そのアミノ酸配列がSEQIDNO:301またはSEQIDNO:302からなるものではない、請求項25に記載のポリペプチド。バリアントCBHI触媒ドメインが、SEQIDNO:1~149のいずれかの触媒ドメインのアミノ酸配列に対して少なくとも90または少なくとも95の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1~7のいずれか1項に記載のポリペプチド。バリアントCBHI触媒ドメインがセルロース結合ドメインに作動可能に連結されている、請求項1~28のいずれか1項に記載のポリペプチド。触媒ドメインがリンカーを介してセルロース結合ドメインに作動可能に連結されている、請求項29に記載のポリペプチド。セルロース結合ドメインが触媒ドメインに対してC-末端側にある、請求項29または請求項30に記載のポリペプチド。セルロース結合ドメインが触媒ドメインに対してN-末端側にある、請求項29または請求項30に記載のポリペプチド。成熟ポリペプチドである、請求項1~32のいずれか1項に記載のポリペプチド。シグナル配列をさらに含む、請求項1~32のいずれか1項に記載のポリペプチド。該ポリペプチドに対して、セロビオースが、前記R268置換および/またはR411置換を含まない基準CBHIのIC50の少なくとも2倍のIC50を有する、請求項1~34のいずれか1項に記載のポリペプチド。そのCBHI活性が、R268置換および/またはR411置換を含まない基準CBHIのCBHI活性の少なくとも50である、請求項1~35のいずれか1項に記載のポリペプチド。請求項1~36のいずれか1項に記載のポリペプチドを含む組成物。前記ポリペプチドが前記組成物中の全ポリペプチドの少なくとも1に相当する、請求項37に記載の組成物。前記ポリペプチドが前記組成物中の全ポリペプチドの少なくとも5に相当する、請求項38に記載の組成物。前記ポリペプチドが前記組成物中の全ポリペプチドの少なくとも25に相当する、請求項39に記載の組成物。全セルラーゼである、請求項37~40のいずれか1項に記載の組成物。全セルラーゼが、前記ポリペプチドを組換え発現する宿主細胞により産生される、請求項41に記載の組成物。糸状菌の全セルラーゼである、請求項37~42のいずれか1項に記載の組成物。請求項1~36のいずれか1項に記載のポリペプチドを含む発酵ブロス。糸状菌発酵ブロスである、請求項44に記載の発酵ブロス。無細胞発酵ブロスである、請求項44または請求項45に記載の発酵ブロス。請求項37~43のいずれか1項に記載の組成物または請求項44~46のいずれか1項に記載の発酵ブロスでバイオマスを処理することを含む、バイオマスを糖化するための方法。単糖類を回収することをさらに含む、請求項47に記載の方法。エタノールを製造するための方法であって、a請求項37~43のいずれか1項に記載の組成物または請求項44~46のいずれか1項に記載の発酵ブロスでバイオマスを処理し、これにより単糖類を製造すること;およびb段階aで産生した単糖類の存在下に発酵条件下で発酵微生物を培養し、これによりエタノールを製造することを含む方法。段階aの前に、バイオマスを前処理することをさらに含む、請求項49に記載の方法。前記発酵微生物が細菌または酵母である、請求項49または請求項50に記載の方法。前記発酵微生物が、ザイモモナスモビリス、大腸菌およびクレブシエラオキシトカから選択される細菌である、請求項51に記載の方法。前記発酵微生物が、サッカロミセスセレビシエ、サッカロミセスウバルム、クルイベロミセスフラギリス、クルイベロミセスラクティス、カンジダプソイドトロピカリスおよびパチソレンタンノフィルスから選択される酵母である、請求項51に記載の方法。前記バイオマスが、トウモロコシ葉茎、バガス、モロコシ、ヨシタケ、チカラシバ、ススキ、スギ、麦わら、スイッチグラス、硬材パルプ、軟材パルプ、粉砕サトウキビ、ワセオバナ、またはネピアグラスである、請求項49~53のいずれか1項に記載の方法。請求項1~36のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。請求項55に記載の核酸を含むベクター。複製起点をさらに含む、請求項56に記載のベクター。ヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーター配列をさらに含む、請求項56または請求項57に記載のベクター。プロモーター配列が酵母において作動可能である、請求項58に記載のベクター。プロモーター配列が糸状菌において作動可能である、請求項58に記載のベクター。請求項55に記載の核酸を発現するように操作された組換え細胞。真核細胞である、請求項61に記載の組換え細胞。糸状菌細胞である、請求項62に記載の組換え細胞。糸状菌細胞が、アスペルギルス属、ペニシリウム属、リゾプス属、クリソスポリウム属、ミセリオフトラ属、トリコデルマ属、ヒューミコラ属、アクレモニウム属、またはフザリウム属のものである、請求項63に記載の組換え細胞。糸状菌細胞が、アスペルギルスニガー、アスペルギルスオリゼ、トリコデルマリーゼイ、ペニシリウムクリソゲナム、ミセリオフトラテルモフィラまたはリゾプスオリゼ種のものである、請求項63に記載の組換え細胞。酵母細胞である、請求項62に記載の組換え細胞。サッカロミセス属、クルイベロミセス属、カンジダ属、ピチア属、シゾサッカロミセス属、ハンゼヌラ属、クロッケラ属、シュワニオミセス属、またはヤロウィア属の酵母細胞である、請求項66に記載の組換え細胞。酵母細胞が、サッカロミセスセレビシエ、サッカロミセスブルデリ、サッカロミセスバルネッティ、サッカロミセスエクシグウス、サッカロミセスウバルム、サッカロミセスディアスタティクス、クルイベロミセスラクティス、クルイベロミセスマルキシアヌス、またはクルイベロミセスフラギリス種のものである、請求項67に記載の組換え細胞。サッカロミセスセレビシエ細胞である、請求項68に記載の組換え細胞。請求項56~60のいずれか1項に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。原核細胞である、請求項70に記載の宿主細胞。細菌細胞である、請求項71に記載の宿主細胞。真核細胞である、請求項70に記載の宿主細胞。請求項1~36のいずれか1項に記載のポリペプチドを製造する方法であって、前記ポリペプチドを発現するように操作された組換え細胞を、そのポリペプチドを発現する条件下で培養することを含む方法。ポリペプチドがシグナル配列を含み、そのポリペプチドが組換え細胞から分泌される条件下で組換え細胞を培養する、請求項74に記載の方法。そのポリペプチドを細胞培養物から回収することをさらに含む、請求項75に記載の方法。ポリペプチドを回収することが、細胞および/または細胞屑を遠心除去する段階を含む、請求項76に記載の方法。ポリペプチドを回収することが、細胞および/または細胞屑を濾去する段階を含む、請求項76に記載の方法。生産物耐容性バリアントCBHIポリペプチドを作成するための方法であって、aCBHIコード核酸のヌクレオチド配列を、該核酸がバリアントCBHIポリペプチドをコードするように修飾すること、その際、前記バリアントCBHIポリペプチドは下記のものを含む:iR268置換;iiR411置換;またはiiiR268置換とR411置換の両方;およびb前記バリアントCBHIポリペプチドを発現させることを含み、これにより生産物耐容性バリアントCBHIポリペプチドを作成する方法。生産物耐容性バリアントCBHIポリペプチドをコードする核酸を作成するための方法であって、CBHIコード核酸のヌクレオチド配列を、該核酸がバリアントCBHIポリペプチドをコードするように修飾することを含み、その際、前記バリアントCBHIポリペプチドは下記のものを含み:iR268置換;iiR411置換;またはiiiR268置換とR411置換の両方;これにより生産物耐容性バリアントCBHIポリペプチドをコードする核酸を作成する方法。修飾が部位特異的変異誘発によるものである、請求項79または請求項80に記載の方法。バリアントCBHIポリペプチドがR268置換を含む、請求項79~81のいずれか1項に記載の方法。R268置換基がリジンである、請求項82に記載の方法。R268置換基がアラニンである、請求項2に記載の方法。R411置換を含む、請求項79~84のいずれか1項に記載の方法。R411置換基がリジンである、請求項85に記載の方法。R411置換基がアラニンである、請求項85に記載の方法。0004セロビオヒドロラーゼは、それらの直接生産物であるセロビオースによる阻害を受けやすく、その結果、生産物が蓄積するのに伴って糖化反応の速度が低下する。セルロースを発酵性糖にするのを維持する改善された生産性を備えた、パルプおよび紙、編織物ならびに動物飼料などのセルロース材料処理の関連分野のための、新たな改善されたセロビオヒドロラーゼが必要とされている。3概要0005本発明は、バリアントCBHIポリペプチドに関する。自然界に存在する大部分のCBHIポリペプチドは、トリコデルマリーゼイCBHISEQIDNO:2のR268およびR411に対応する位置にアルギニンをもつ。本発明のバリアントCBHIポリペプチドは一方または両方の位置に置換を含み、その結果、生産物たとえば、セロビオース阻害が低減する。そのようなバリアントを、本明細書中で時に生産物耐容性であると表現する。0006本発明のバリアントCBHIポリペプチドは、最低でも少なくともCBHI触媒ドメインを含み、これはaトリコデルマリーゼイCBHIのR268に対応するアミノ酸位置における置換R268置換;bトリコデルマリーゼイCBHIのR411に対応するアミノ酸位置における置換R411置換;またはcR268置換とR411置換の両方を含む。R268および/またはR411置換を導入できる代表的なCBHIポリペプチドのアミノ酸位置を表1に示し、これらの代表的なCBHIポリペプチド中のR268および/またはR411に対応するアミノ酸位置を表2に示す。0007R268および/またはR411置換は、リジンおよび/またはアラニンを含むことができる。したがって、本発明は、下記のR268および/またはR411置換のアミノ酸置換または対のうちの1つをもつCBHI触媒ドメインを含む、バリアントCBHIポリペプチドを提供する:aR268KおよびR411K;bR268KおよびR411A;cR268AおよびR411K;dR268AおよびR411A;eR268A;fR268K;gR411A;ならびにhR411K。ただし、ある態様において、バリアントCBHIポリペプチドのアミノ酸配列はSEQIDNO:299、SEQIDNO:300、SEQIDNO:301、またはSEQIDNO:302を含まないか、あるいはそれらからなることはない。0008本発明のバリアントCBHIポリペプチドは、一般に表1に例示する基準CBHIのCDに対して少なくとも50の配列同一性をもつアミノ酸配列を含むCDを含む。表1に例示するCBHIポリペプチドのCD部分を表3に示す。バリアントCBHIポリペプチドは、表1に例示するセルロース結合部をもつことができる。表1に例示するCBHIポリペプチドのCD部分を表3に示す。バリアントCBHIポリペプチドは、触媒ドメインCD配列のほかに、セルロース結合ドメインCBD配列をもつことができる。CBDはCDに対してN-またはC-末端側のいずれにあってもよく、CBDとCDは場合によりリンカー配列を介して連結している。0009バリアントCBHIポリペプチドは成熟ポリペプチドであってもよく、あるいはそれらはシグナル配列をさらに含んでもよい。0010バリアントCBHIポリペプチドの他の態様をセクション51に提示する。0011本発明のバリアントCBHIポリペプチドは、一般にセロビオースによる生産物阻害の低減を示す。特定の態様において、本発明のバリアントCBHIポリペプチドに対するセロビオースのIC50は、バリアント中に存在するR268置換および/またはR411置換を含まない基準CBHIに対するセロビオースのIC50の少なくとも1.2倍、少なくとも1.5倍、または少なくとも2倍である。バリアントCBHIポリペプチドの生産物阻害特性の他の態様をセクション51に提示する。0012本発明のバリアントCBHIポリペプチドは、一般にある程度のセロビオヒドロラーゼ活性を保持する。特定の態様において、バリアントCBHIポリペプチドは、バリアント中に存在するR268置換および/またはR411置換を含まない基準CBHIのCBHI活性の少なくとも50を保持する。バリアントCBHIポリペプチドのセロビオヒドロラーゼ活性の他の態様をセクション51に提示する。0013本発明は、バリアントCBHIポリペプチドを含む組成物セルラーゼ組成物、たとえば全セルラーゼ組成物、および発酵ブロスを含むをさらに提供する。バリアントCBHIポリペプチドを含む組成物の他の態様をセクション53に提示する。バリアントCBHIポリペプチドおよびそれらを含む組成物は、特にバイオマスを糖化するためのプロセスに使用できる。糖化反応のさらなる詳細、およびバリアントCBHIポリペプチドの他の用途をセクション54に提示する。0014本発明は、本明細書に記載するバリアントCBHIポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸たとえば、ベクター、およびバリアントCBHIポリペプチドを発現するように操作された組換え細胞をさらに提供する。組換え細胞は、原核細胞たとえば、細菌または真核細胞たとえば、酵母または糸状菌であってもよい。さらに、バリアントCBHIポリペプチドを製造し、場合により回収する方法を提供する。バリアントCBHIポリペプチドの発現および製造に適した組換え発現系の他の態様をセクション52に提示する。データベース。これらのアミノ酸配列は、タンパク質結晶化を促進する変異を含むPDBデータベースからの若干の配列を除いて、大部分が野生型である。0021表2:代表的な基準CBHIポリペプチドにおける、トリコデルマリーゼイCBHIのR268およびR411に対応するアミノ酸位置。データベース識別子は表1についてのものと同様である。0022表3:CBHIポリペプチドドメインのおおよそのアミノ酸位置。使用した略号:SSはシグナル配列である;CDは触媒ドメインである;CBDはセルロース結合ドメインである。データベース識別子は表1のものと同様である。0023表4:表4は、代表的な基準CBHIポリペプチドそれぞれの触媒ドメイン内の、活性部位ループ太字、下線文字で示すおよび触媒残基大部分のCBHIポリペプチドにおいてグルタミン酸太字、二重下線文字で示すを含むセグメントを示す。データベース識別子は表1のものと同様である。0024表5:BD29555のバリアントについてのMULおよびバガスアッセイの結果。NDは測定しなかったことを意味する。±活性/-セロビオース=[セロビオース存在下の活性/セロビオース非存在下の活性]100。活性-/BG=[BG非存在下の活性/BG存在下の活性]100]。0025表6:トリコデルマリーゼイCBHIのバリアントについてのMULおよびバガスアッセイの結果。NDは測定しなかったことを意味する。±活性/-セロビオース=[セロビオース存在下の活性/セロビオース非存在下の活性]100。活性-/BG=[BG非存在下の活性/BG存在下の活性]100。0026表7:非公式配列リスト。SEQIDNO:1-149は代表的な基準CBHIポリペプチドに対応する。SEQIDNO:299は、R268A置換をもつ成熟トリコデルマリーゼイCBHISEQIDNO:2のアミノ酸26-529に対応する。SEQIDNO:300は、R411A置換をもつ成熟トリコデルマリーゼイCBHISEQIDNO:2のアミノ酸26-529に対応する。SEQIDNO:301は、R268K置換およびR411K置換の両方をもつ全長BD29555に対応する。SEQIDNO:302は、R268K置換およびR411K置換の両方をもつ成熟BD29555に対応する。は、R411A置換をもつ成熟トリコデルマリーゼイCBHISEQIDNO:2のアミノ酸26-529に対応する。SEQIDNO:152は、R268K置換およびR411K置換の両方をもつ全長BD29555に対応する。SEQIDNO:153は、R268K置換およびR411K置換の両方をもつ成熟BD29555に対応する。5詳細な説明0027本発明は、バリアントCBHIポリペプチドに関する。自然界に存在する大部分のCBHIポリペプチドは、トリコデルマリーゼイCBHISEQIDNO:2のR268およびR411に対応する位置にアルギニンをもつ。本発明のバリアントCBHIポリペプチドは一方または両方の位置に置換を含み、その結果、生産物たとえば、セロビオース阻害が低減する。以下のサブセクションに、バリアントCBHIポリペプチド、およびそれらの代表的な製造方法、それらを含む代表的なセルラーゼ組成物、ならびにそれらのポリペプチドおよびセルラーゼ組成物の幾つかの産業用途をより詳細に記載する。51バリアントCBHIポリペプチド0028本発明は、生産物阻害を低減させる少なくとも1つのアミノ酸置換を含むバリアントCBHIポリペプチドを提供する。バリアントは、アミノ酸配列中の1または多数の異なる部位の1以上のアミノ酸の置換により基準ポリペプチドと配列が異なるポリペプチドを意味する。代表的な基準CBHIポリペプチドを表1に示す。0029本発明のバリアントCBHIポリペプチドは、基準CBHIポリペプチドと比較して、トリコデルマリーゼイCBHISEQIDNO:2のR268に対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸置換R268置換、bトリコデルマリーゼイCBHIのR411に対応するアミノ酸位置における置換R411置換;またはcR268置換とR411置換の両方をもつ。R268およびR411のナンバリングは、成熟酵素には一般に存在しないシグナル配列を含む全長トリコデルマリーゼイCBHIを基準として行なうことを明記する。成熟トリコデルマリーゼイCBHIたとえば、SEQIDNO:4を参照における対応するナンバリングは、それぞれR251およびR394である。0030したがって、本発明は、トリコデルマリーゼイCBHIのR268およびR411に対応するアミノ酸位置のうち少なくとも1つ、場合によりトリコデルマリーゼイCBHIのR268およびR411に対応するアミノ酸位置の両方、がアルギニンではないバリアントCBHIポリペプチドを提供する。0031表1の基準ポリペプチドにおいてトリコデルマリーゼイCBHIのR268およびR411に対応するアミノ酸位置を表2に示す。他のCBHIポリペプチドにおいてR268およびR411に対応するアミノ酸位置は、それらの配列を配列比較アルゴリズムを用いてトリコデルマリーゼイCBHIと整列させることにより同定できる。比較のための最適な配列アラインメントは、たとえば下記より実施できる:SmithWaterman1981AdvApplMath248289の局所相同性アルゴリズムNeedlemanWunsch1970JMolBiol4844353の相同性アラインメントアルゴリズムPearsonLipman1988ProcNat’lAcadSciUSA85244448の類似性検索法これらのアルゴリズムのコンピューター化実施形態、または視覚判定。0032R268および/またはR411置換は、好ましくはaR268KおよびR411K;bR268KおよびR411A;cR268AおよびR411K;dR268AおよびR411A;eR268A;fR268K;gR411A;ならびにhR411Kから選択される。0033CBHIポリペプチドは、グリコシルヒドロラーゼファミリー7GH7に属する。このファミリーのグリコシルヒドロラーゼ類は、エンドグルカナーゼ類およびセロビオヒドロラーゼ類エキソグルカナーゼ類を含む。セロビオヒドロラーゼ類はセルロース鎖の還元末端から順次作用してセロビオースを生成する。細菌および真菌に由来するセルラーゼ類は特徴的に、触媒ドメインCDのNまたはC-末端側のいずれかにリンカーペプチドを介して連結された小さなセルロース結合ドメインCBDをもつ。CDは活性部位を含み、一方、CBDは酵素をセルロースに結合させることによりセルロースと相互作用する223227Tommeetal1988EurJBiochem170575581。トリコデルマリーゼイCBHIの触媒ドメインの三次元構造は解明されている。CDは、対面充填してβ-サンドイッチを形成した2つのβ-シートからなる。CD中の残りの大部分のアミノ酸は、β-シートを連結するループである。若干のループは伸長し、活性部位の周りで折れ曲がって、約50Åのセルロース結合トンネルを形成している。これに対し、エンドグルカナーゼ類は、トンネルではなく解放された基質結合裂/溝をもつ。一般に、触媒残基はトリコデルマリーゼイCBHIのE229およびE234に対応するグルタミン酸である。0034基準CBHIポリペプチドの活性部位に特徴的なループ活性部位ループGH7ファミリーのエンドグルカナーゼ類には存在しない、および基準CBHIポリペプチドの触媒グルタミン酸残基を表4に示す。本発明のバリアントCBHIポリペプチドは、好ましくは触媒グルタミン酸残基を保持するか、あるいはSEQIDNO:4の場合のように、E234に対応する位置に代わりにグルタミンを含むことができる。ある態様において、バリアントCBHIポリペプチドは、そのバリアントが由来する基準CBHIポリペプチドと対比して、活性部位ループ内に置換を含まないか、あるいは保存的置換のみを含む。0035多くのCBHIポリペプチドがCBDをもたず、種々の基質に対するセルラーゼドメインの活性に関する大部分の研究がCBHIポリペプチドの触媒ドメインについてのみ実施されてきた。セロビオヒドロラーゼ活性をもつCDはパパインによる成熟CBHIの制限タンパク質分解により生成できるので90110を参照、それらはしばしばコアドメインと呼ばれる。したがって、バリアントCBHIはCBHIのCDコアのみを含むことができる。代表的な基準CDは、下記に対応するアミノ酸配列を含む:SEQIDNO1の位置26455、SEQIDNO2の位置18444、SEQIDNO3の位置26455、SEQIDNO4の位置1427、SEQIDNO5の位置24457、SEQIDNO6の位置18448、SEQIDNO7の位置27460、SEQIDNO8の位置27460、SEQIDNO9の位置20449、SEQIDNO10の位置1424、SEQIDNO11の位置18447、SEQIDNO12の位置18434、SEQIDNO13の位置18445、SEQIDNO14の位置19454、SEQIDNO15の位置19443、SEQIDNO16の位置2426、SEQIDNO17の位置23446、SEQIDNO18の位置19449、SEQIDNO19の位置23446、SEQIDNO20の位置19449、SEQIDNO21の位置2416、SEQIDNO22の位置19454、SEQIDNO23の位置19447、SEQIDNO24の位置19447、SEQIDNO25の位置20443、SEQIDNO26の位置18447、SEQIDNO27の位置19442、SEQIDNO28の位置18451、SEQIDNO29の位置23446、SEQIDNO30の位置18444、SEQIDNO31の位置18451、SEQIDNO32の位置18447、SEQIDNO33の位置19449、SEQIDNO34の位置18447、SEQIDNO35の位置26459、SEQIDNO36の位置19450、SEQIDNO37の位置19453、SEQIDNO38の位置18448、SEQIDNO39の位置19443、SEQIDNO40の位置19442、SEQIDNO41の位置18444、SEQIDNO42の位置24457、SEQIDNO43の位置18449、SEQIDNO44の位置19453、SEQIDNO45の位置26456、SEQIDNO46の位置19451、SEQIDNO47の位置18443、SEQIDNO48の位置18448、SEQIDNO49の位置19451、SEQIDNO50の位置18444、SEQIDNO51の位置2419、SEQIDNO52の位置27461、SEQIDNO53の位置21445、SEQIDNO54の位置19449、SEQIDNO55の位置19448、SEQIDNO56の位置18443、SEQIDNO57の位置20443、SEQIDNO58の位置18448、SEQIDNO59の位置18447、SEQIDNO60の位置26455、SEQIDNO61の位置19449、SEQIDNO62の位置19449、SEQIDNO63の位置26460、SEQIDNO64の位置18448、SEQIDNO65の位置19451、SEQIDNO66の位置19447、SEQIDNO67の位置1424、SEQIDNO68の位置19448、SEQIDNO69の位置19443、SEQIDNO70の位置23447、SEQIDNO71の位置17448、SEQIDNO72の位置19449、SEQIDNO73の位置18444、SEQIDNO74の位置23458、SEQIDNO75の位置20452、SEQIDNO76の位置18435、SEQIDNO77の位置18446、SEQIDNO78の位置22457、SEQIDNO79の位置18448、SEQIDNO80の位置1431、SEQIDNO81の位置19453、SEQIDNO82の位置21440、SEQIDNO83の位置19442、SEQIDNO84の位置18448、SEQIDNO85の位置17446、SEQIDNO86の位置18447、SEQIDNO87の位置18443、SEQIDNO88の位置23448、SEQIDNO89の位置18451、SEQIDNO90の位置21447、SEQIDNO91の位置18444、SEQIDNO92の位置19442、SEQIDNO93の位置20436、SEQIDNO94の位置18450、SEQIDNO95の位置22453、SEQIDNO96の位置16472、SEQIDNO97の位置21445、SEQIDNO98の位置19447、SEQIDNO99の位置19450、SEQIDNO100の位置19451、SEQIDNO101の位置18448、SEQIDNO102の位置19442、SEQIDNO103の位置20457、SEQIDNO104の位置19454、SEQIDNO105の位置18440、SEQIDNO106の位置18439、SEQIDNO107の位置27460、SEQIDNO108の位置23446、SEQIDNO109の位置17446、SEQIDNO110の位置21447、SEQIDNO111の位置19447、SEQIDNO112の位置18449、SEQIDNO113の位置22457、SEQIDNO114の位置18445、SEQIDNO115の位置18448、SEQIDNO116の位置18448、SEQIDNO117の位置23435、SEQIDNO118の位置21442、SEQIDNO119の位置23435、SEQIDNO120の位置20445、SEQIDNO121の位置21443、SEQIDNO122の位置20445、SEQIDNO123の位置23443、SEQIDNO124の位置20445、SEQIDNO125の位置21435、SEQIDNO126の位置20437、SEQIDNO127の位置21442、SEQIDNO128の位置23434、SEQIDNO129の位置20444、SEQIDNO130の位置21435、SEQIDNO131の位置20445、SEQIDNO132の位置21446、SEQIDNO133の位置21435、SEQIDNO134の位置22448、SEQIDNO135の位置23433、SEQIDNO136の位置23434、SEQIDNO137の位置23435、SEQIDNO138の位置23435、SEQIDNO139の位置20445、SEQIDNO140の位置20437、SEQIDNO141の位置21435、SEQIDNO142の位置20437、SEQIDNO143の位置21435、SEQIDNO144の位置26435、SEQIDNO145の位置23435、SEQIDNO146の位置24443、SEQIDNO147の位置20445、SEQIDNO148の位置21441、およびSEQIDNO149の位置20437。0036CBDは特に結晶性セルロースの加水分解に関与する。CBDが存在しない場合はセロビオヒドロラーゼが結晶性セルロースを分解する能力は低下することが示されている。本発明のバリアントCBHIポリペプチドは、CBDをさらに含むことができる。代表的なCBDは、下記に対応するアミノ酸配列を含む:SEQIDNO1の位置494529、SEQIDNO2の位置480514、SEQIDNO3の位置494529、SEQIDNO5の位置491526、SEQIDNO6の位置477512、SEQIDNO7の位置497532、SEQIDNO8の位置504539、SEQIDNO13の位置486521、SEQIDNO15の位置556596、SEQIDNO18の位置490525、SEQIDNO20の位置495530、SEQIDNO23の位置471506、SEQIDNO27の位置481516、SEQIDNO30の位置480514、SEQIDNO35の位置495529、SEQIDNO36の位置493528、SEQIDNO38の位置477512、SEQIDNO39の位置547586、SEQIDNO40の位置475510、SEQIDNO41の位置479513、SEQIDNO42の位置506541、SEQIDNO43の位置481516、SEQIDNO45の位置503537、SEQIDNO46の位置488523、SEQIDNO48の位置476511、SEQIDNO49の位置488523、SEQIDNO50の位置479513、SEQIDNO52の位置500535、SEQIDNO55の位置493528、SEQIDNO58の位置479514、SEQIDNO60の位置494529、SEQIDNO61の位置490525、SEQIDNO62の位置497532、SEQIDNO64の位置475510、SEQIDNO65の位置477512、SEQIDNO66の位置486521、SEQIDNO67の位置470505、SEQIDNO68の位置491526、SEQIDNO69の位置476511、SEQIDNO73の位置480514、SEQIDNO74の位置506540、SEQIDNO76の位置471504、SEQIDNO78の位置501536、SEQIDNO79の位置473508、SEQIDNO83の位置481516、SEQIDNO86の位置488523、SEQIDNO92の位置475510、SEQIDNO93の位置468504、SEQIDNO96の位置501536、SEQIDNO98の位置482517、SEQIDNO99の位置481516、SEQIDNO100の位置488523、SEQIDNO101の位置472507、SEQIDNO102の位置481516、SEQIDNO105の位置471505、SEQIDNO106の位置481516、SEQIDNO107の位置495530、SEQIDNO111の位置488523、SEQIDNO112の位置478513、SEQIDNO113の位置501536、SEQIDNO115の位置491526、およびSEQIDNO116の位置503538。0037CDとCBDはしばしばリンカーを介して連結している。代表的なリンカー配列は、下記に対応する:SEQIDNO1の位置456493、SEQIDNO2の位置445479、SEQIDNO3の位置456493、SEQIDNO5の位置458490、SEQIDNO6の位置449476、SEQIDNO7の位置461496、SEQIDNO8の位置461503、SEQIDNO13の位置446485、SEQIDNO15の位置444555、SEQIDNO18の位置450489、SEQIDNO20の位置450494、SEQIDNO23の位置448470、SEQIDNO27の位置443480、SEQIDNO30の位置445479、SEQIDNO35の位置460494、SEQIDNO36の位置451492、SEQIDNO38の位置449476、SEQIDNO39の位置444546、SEQIDNO40の位置443474、SEQIDNO41の位置445478、SEQIDNO42の位置458505、SEQIDNO43の位置450480、SEQIDNO45の位置457502、SEQIDNO46の位置452487、SEQIDNO48の位置449475、SEQIDNO49の位置452487、SEQIDNO50の位置445478、SEQIDNO52の位置462499、SEQIDNO55の位置449492、SEQIDNO58の位置449478、SEQIDNO60の位置456493、SEQIDNO61の位置450489、SEQIDNO62の位置450496、SEQIDNO64の位置449474、SEQIDNO65の位置452476、SEQIDNO66の位置448485、SEQIDNO67の位置425469、SEQIDNO68の位置449490、SEQIDNO69の位置444475、SEQIDNO73の位置445479、SEQIDNO74の位置459505、SEQIDNO76の位置436470、SEQIDNO78の位置458500、SEQIDNO79の位置449472、SEQIDNO83の位置443480、SEQIDNO86の位置448487、SEQIDNO92の位置443474、SEQIDNO93の位置437467、SEQIDNO96の位置473500、SEQIDNO98の位置448481、SEQIDNO99の位置451480、SEQIDNO100の位置452487、SEQIDNO101の位置449471、SEQIDNO102の位置443480、SEQIDNO105の位置441470、SEQIDNO106の位置440480、SEQIDNO107の位置461494、SEQIDNO111の位置448487、SEQIDNO112の位置450478、SEQIDNO113の位置458500、SEQIDNO115の位置449490、およびSEQIDNO116の位置449502。0038CBHIポリペプチドはモジュール状であるので、異なるCBHIポリペプチド、たとえば表1の代表的なCBHIポリペプチドのCBD、CDおよびリンカーは互換的に使用できる。しかし、好ましい態様において、本発明のバリアントCBHIのCBD、CDおよびリンカーは同じポリペプチドに由来する。0039本発明のバリアントCBHIポリペプチドは、好ましくは生産物阻害が少なくとも2倍低減しており、したがってセロビオースは、バリアントCBHIに対して、対応する基準CBHI、たとえばR268置換および/またはR411置換を含まないCBHIのIC50の少なくとも2倍のIC50をもつ。より好ましくは、バリアントCBHIに対するセロビオースのIC50は、対応する基準CBHIのIC50の少なくとも3倍、少なくとも5倍、少なくとも8倍、少なくとも10倍、少なくとも12倍、または少なくとも15倍である。具体的な態様において、バリアントCBHIに対するセロビオースのIC50は、対応する基準CBHIのIC50の2倍から15倍まで、2倍から10倍まで、3倍から10倍まで、5倍から12倍まで、4倍から12倍まで、5倍から10倍まで、5倍から12倍まで、2倍から8倍まで、または8倍から20倍までの範囲である。IC50は、後記の実施例に例示するように、リン酸膨潤セルロースPASCアッセイまたはメチルウンベリフェリルラクトシドMULアッセイ283288で決定できる。0040本発明のバリアントCBHIポリペプチドは、好ましくは対応する基準CBHI、たとえば268置換および/またはR411置換を含まないCBHIのセロビオヒドロラーゼ活性の少なくとも30であるセロビオヒドロラーゼ活性をもつ。より好ましくは、バリアントCBHIのセロビオヒドロラーゼ活性は、対応する基準CBHIのセロビオヒドロラーゼ活性の少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、または少なくとも70である。具体的な態様において、バリアントCBHIのIC50セロビオヒドロラーゼ活性は、対応する基準CBHIのセロビオヒドロラーゼ活性の30から80まで、40から70まで、30から60まで、50から80まで、または60から80までの範囲である。セロビオヒドロラーゼ活性のアッセイは、たとえばBeckeretal2011BiochemJ3561930、およびMitsuishietal1990FEBSLetts275135138に記載されており、そのそれぞれを明示的に本明細書に援用する。単離された可溶性および不溶性の基質を加水分解するCBHIの能力も、Srisodsuketal1997JBiotech574957、およびNidetzkyandClaeyssens1994BiotechBioeng44961966に記載されるアッセイを用いて測定できる。セロビオヒドロラーゼ活性をアッセイするのに有用な基質には、結晶性セルロース、濾紙、リン酸膨潤セルロース、セロオリゴ糖、メチルウンベリフェリルラクトシド、メチルウンベリフェリルセロビオシド、オルトニトロフェニルラクトシド、パラニトロフェニルラクトシド、オルトニトロフェニルセロビオシド、パラニトロフェニルセロビオシドが含まれる。セロビオヒドロラーゼ活性は、基質としてのPASCおよびカルコフロールホワイト検出法を用いるアッセイで測定できる。PASCは、Walseth1952TAPPI35228235およびWood1971BiochemJ121353362に記載されているように調製できる。0041前記のR268および/またはR411置換のほかに、本発明のバリアントCBHIポリペプチドは、好ましくは:表1に例示する基準CBHIのCDすなわち下記に対応するアミノ酸配列を含むCDに対して少なくとも50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくはそれ以上の、または完全な配列同一性をもつアミノ酸配列を含む:SEQIDNO1の位置26455、SEQIDNO2の位置18444、SEQIDNO3の位置26455、SEQIDNO4の位置1427、SEQIDNO5の位置24457、SEQIDNO6の位置18448、SEQIDNO7の位置27460、SEQIDNO8の位置27460、SEQIDNO9の位置20449、SEQIDNO10の位置1424、SEQIDNO11の位置18447、SEQIDNO12の位置18434、SEQIDNO13の位置18445、SEQIDNO14の位置19454、SEQIDNO15の位置19443、SEQIDNO16の位置2426、SEQIDNO17の位置23446、SEQIDNO18の位置19449、SEQIDNO19の位置23446、SEQIDNO20の位置19449、SEQIDNO21の位置2416、SEQIDNO22の位置19454、SEQIDNO23の位置19447、SEQIDNO24の位置19447、SEQIDNO25の位置20443、SEQIDNO26の位置18447、SEQIDNO27の位置19442、SEQIDNO28の位置18451、SEQIDNO29の位置23446、SEQIDNO30の位置18444、SEQIDNO31の位置18451、SEQIDNO32の位置18447、SEQIDNO33の位置19449、SEQIDNO34の位置18447、SEQIDNO35の位置26459、SEQIDNO36の位置19450、SEQIDNO37の位置19453、SEQIDNO38の位置18448、SEQIDNO39の位置19443、SEQIDNO40の位置19442、SEQIDNO41の位置18444、SEQIDNO42の位置24457、SEQIDNO43の位置18449、SEQIDNO44の位置19453、SEQIDNO45の位置26456、SEQIDNO46の位置19451、SEQIDNO47の位置18443、SEQIDNO48の位置18448、SEQIDNO49の位置19451、SEQIDNO50の位置18444、SEQIDNO51の位置2419、SEQIDNO52の位置27461、SEQIDNO53の位置21445、SEQIDNO54の位置19449、SEQIDNO55の位置19448、SEQIDNO56の位置18443、SEQIDNO57の位置20443、SEQIDNO58の位置18448、SEQIDNO59の位置18447、SEQIDNO60の位置26455、SEQIDNO61の位置19449、SEQIDNO62の位置19449、SEQIDNO63の位置26460、SEQIDNO64の位置18448、SEQIDNO65の位置19451、SEQIDNO66の位置19447、SEQIDNO67の位置1424、SEQIDNO68の位置19448、SEQIDNO69の位置19443、SEQIDNO70の位置23447、SEQIDNO71の位置17448、SEQIDNO72の位置19449、SEQIDNO73の位置18444、SEQIDNO74の位置23458、SEQIDNO75の位置20452、SEQIDNO76の位置18435、SEQIDNO77の位置18446、SEQIDNO78の位置22457、SEQIDNO79の位置18448、SEQIDNO80の位置1431、SEQIDNO81の位置19453、SEQIDNO82の位置21440、SEQIDNO83の位置19442、SEQIDNO84の位置18448、SEQIDNO85の位置17446、SEQIDNO86の位置18447、SEQIDNO87の位置18443、SEQIDNO88の位置23448、SEQIDNO89の位置18451、SEQIDNO90の位置21447、SEQIDNO91の位置18444、SEQIDNO92の位置19442、SEQIDNO93の位置20436、SEQIDNO94の位置18450、SEQIDNO95の位置22453、SEQIDNO96の位置16472、SEQIDNO97の位置21445、SEQIDNO98の位置19447、SEQIDNO99の位置19450、SEQIDNO100の位置19451、SEQIDNO101の位置18448、SEQIDNO102の位置19442、SEQIDNO103の位置20457、SEQIDNO104の位置19454、SEQIDNO105の位置18440、SEQIDNO106の位置18439、SEQIDNO107の位置27460、SEQIDNO108の位置23446、SEQIDNO109の位置17446、SEQIDNO110の位置21447、SEQIDNO111の位置19447、SEQIDNO112の位置18449、SEQIDNO113の位置22457、SEQIDNO114の位置18445、SEQIDNO115の位置18448、SEQIDNO116の位置18448、SEQIDNO117の位置23435、SEQIDNO118の位置21442、SEQIDNO119の位置23435、SEQIDNO120の位置20445、SEQIDNO121の位置21443、SEQIDNO122の位置20445、SEQIDNO123の位置23443、SEQIDNO124の位置20445、SEQIDNO125の位置21435、SEQIDNO126の位置20437、SEQIDNO127の位置21442、SEQIDNO128の位置23434、SEQIDNO129の位置20444、SEQIDNO130の位置21435、SEQIDNO131の位置20445、SEQIDNO132の位置21446、SEQIDNO133の位置21435、SEQIDNO134の位置22448、SEQIDNO135の位置23433、SEQIDNO136の位置23434、SEQIDNO137の位置23435、SEQIDNO138の位置23435、SEQIDNO139の位置20445、SEQIDNO140の位置20437、SEQIDNO141の位置21435、SEQIDNO142の位置20437、SEQIDNO143の位置21435、SEQIDNO144の位置26435、SEQIDNO145の位置23435、SEQIDNO146の位置24443、SEQIDNO147の位置20445、SEQIDNO148の位置21441、およびSEQIDNO149の位置20437配列同一性相同性をもつアミノ酸配列を含む:SEQIDNO1の位置26529、SEQIDNO2の位置18514、SEQIDNO3の位置26529、SEQIDNO4の位置1427、SEQIDNO5の位置24526、SEQIDNO6の位置18512、SEQIDNO7の位置27532、SEQIDNO8の位置27539、SEQIDNO9の位置20449、SEQIDNO10の位置1424、SEQIDNO11の位置18447、SEQIDNO12の位置18434、SEQIDNO13の位置18521、SEQIDNO14の位置19454、SEQIDNO15の位置19596、SEQIDNO16の位置2426、SEQIDNO17の位置23446、SEQIDNO18の位置19525、SEQIDNO19の位置23446、SEQIDNO20の位置19530、SEQIDNO21の位置2416、SEQIDNO22の位置19454、SEQIDNO23の位置19506、SEQIDNO24の位置19447、SEQIDNO25の位置20443、SEQIDNO26の位置18447、SEQIDNO27の位置19516、SEQIDNO28の位置18451、SEQIDNO29の位置23446、SEQIDNO30の位置18514、SEQIDNO31の位置18451、SEQIDNO32の位置18447、SEQIDNO33の位置19449、SEQIDNO34の位置18447、SEQIDNO35の位置26529、SEQIDNO36の位置19528、SEQIDNO37の位置19453、SEQIDNO38の位置18512、SEQIDNO39の位置19586、SEQIDNO40の位置19510、SEQIDNO41の位置18513、SEQIDNO42の位置24541、SEQIDNO43の位置18516、SEQIDNO44の位置19453、SEQIDNO45の位置26537、SEQIDNO46の位置19523、SEQIDNO47の位置18443、SEQIDNO48の位置18511、SEQIDNO49の位置19523、SEQIDNO50の位置18513、SEQIDNO51の位置2419、SEQIDNO52の位置27535、SEQIDNO53の位置21445、SEQIDNO54の位置19449、SEQIDNO55の位置19528、SEQIDNO56の位置18443、SEQIDNO57の位置20443、SEQIDNO58の位置18514、SEQIDNO59の位置18447、SEQIDNO60の位置26529、SEQIDNO61の位置19525、SEQIDNO62の位置19532、SEQIDNO63の位置26460、SEQIDNO64の位置18510、SEQIDNO65の位置19512、SEQIDNO66の位置19521、SEQIDNO67の位置1505、SEQIDNO68の位置19526、SEQIDNO69の位置19511、SEQIDNO70の位置23447、SEQIDNO71の位置17448、SEQIDNO72の位置19449、SEQIDNO73の位置18514、SEQIDNO74の位置23540、SEQIDNO75の位置20452、SEQIDNO76の位置18504、SEQIDNO77の位置18446、SEQIDNO78の位置22536、SEQIDNO79の位置18508、SEQIDNO80の位置1431、SEQIDNO81の位置19453、SEQIDNO82の位置21440、SEQIDNO83の位置19516、SEQIDNO84の位置18448、SEQIDNO85の位置17446、SEQIDNO86の位置18523、SEQIDNO87の位置18443、SEQIDNO88の位置23448、SEQIDNO89の位置18451、SEQIDNO90の位置21447、SEQIDNO91の位置18444、SEQIDNO92の位置19510、SEQIDNO93の位置20504、SEQIDNO94の位置18450、SEQIDNO95の位置22453、SEQIDNO96の位置16536、SEQIDNO97の位置21445、SEQIDNO98の位置19517、SEQIDNO99の位置19516、SEQIDNO100の位置19523、SEQIDNO101の位置18507、SEQIDNO102の位置19516、SEQIDNO103の位置20457、SEQIDNO104の位置19454、SEQIDNO105の位置18505、SEQIDNO106の位置18516、SEQIDNO107の位置27530、SEQIDNO108の位置23446、SEQIDNO109の位置17446、SEQIDNO110の位置21447、SEQIDNO111の位置19523、SEQIDNO112の位置18513、SEQIDNO113の位置22536、SEQIDNO114の位置18445、SEQIDNO115の位置18526、SEQIDNO116の位置18538、SEQIDNO117の位置23435、SEQIDNO118の位置21442、SEQIDNO119の位置23435、SEQIDNO120の位置20445、SEQIDNO121の位置21443、SEQIDNO122の位置20445、SEQIDNO123の位置23443、SEQIDNO124の位置20445、SEQIDNO125の位置21435、SEQIDNO126の位置20437、SEQIDNO127の位置21442、SEQIDNO128の位置23434、SEQIDNO129の位置20444、SEQIDNO130の位置21435、SEQIDNO131の位置20445、SEQIDNO132の位置21446、SEQIDNO133の位置21435、SEQIDNO134の位置22448、SEQIDNO135の位置23433、SEQIDNO136の位置23434、SEQIDNO137の位置23435、SEQIDNO138の位置23435、SEQIDNO139の位置20445の位置、SEQIDNO140の位置20437、SEQIDNO141の位置21435、SEQIDNO142の位置20437、SEQIDNO143の位置21435、SEQIDNO144の位置26435、SEQIDNO145の位置23435、SEQIDNO146の位置24443、SEQIDNO147の位置20445、SEQIDNO148の位置21441、およびSEQIDNO149の位置20437、好ましくはSEQIDNO1の位置26529またはSEQIDNO2の位置18514に対応する成熟ポリペプチド。0042配列類似性を判定するのに適したアルゴリズムの例はBLASTアルゴリズムであり、それらはAltschuletal1990JMolBiol215403410に記載されている。BLAST分析を実行するためのソフトウェアはNationalCenterforBiotechnologyInformationにより公開されている。このアルゴリズムは、最初に、クエリー配列において、データベース配列中の同じ長さのワードと整列された際に、ある正の値をもつ閾値スコアTと一致するかまたはそれを満たす長さWのショートワードを同定することによる、高スコア配列対HSPの同定を伴う。これらの最初の近傍ワードヒットが、それらを含むより長いHSPを見出すための出発点として用いられる。累積アラインメントスコアを増大させることができる限り、これらのワードヒットを、比較する2配列それぞれに沿って両方向へ拡張する。下記の場合には、ワードヒットの拡張を停止する:累積アラインメントスコアが最大達成値から量X低下した場合;累積スコアがゼロ以下になった場合;またはいずれかの配列の末端に到達した場合。BLASTアルゴリズムパラメーターW、TおよびXは、アラインメントの感度および速度を決定する。BLASTプログラムは、テデフォルトとしてワード長さW11、BLOSUM62スコアリング行列アラインメントB50、期待値E10、M’5、N’-4、および両鎖の比較を用いる。0043大部分のCBHIポリペプチドは分泌されることから、ポリペプチドが細胞から分泌される際に切断されるシグナル配列を含む状態で発現する。したがって、特定の観点において、本発明のバリアントCBHIポリペプチドは、シグナル配列をさらに含む。代表的なシグナル配列は、下記に対応するアミノ酸配列を含む:SEQIDNO1の位置125、SEQIDNO2の位置117、SEQIDNO3の位置125、SEQIDNO5の位置123、SEQIDNO6の位置117、SEQIDNO7の位置126、SEQIDNO8の位置127、SEQIDNO9の位置119、SEQIDNO11の位置117、SEQIDNO12の位置117、SEQIDNO13の位置117、SEQIDNO14の位置118、SEQIDNO15の位置118、SEQIDNO17の位置122、SEQIDNO18の位置118、SEQIDNO19の位置122、SEQIDNO20の位置118、SEQIDNO22の位置118、SEQIDNO23の位置118、SEQIDNO24の位置118、SEQIDNO25の位置119、SEQIDNO26の位置117、SEQIDNO27の位置118、SEQIDNO28の位置117、SEQIDNO29の位置122、SEQIDNO30の位置118、SEQIDNO31の位置117、SEQIDNO32の位置117、SEQIDNO33の位置118、SEQIDNO34の位置117、SEQIDNO35の位置125、SEQIDNO36の位置118、SEQIDNO37の位置118、SEQIDNO38の位置117、SEQIDNO39の位置118、SEQIDNO40の位置118、SEQIDNO41の位置117、SEQIDNO42の位置123、SEQIDNO43の位置117、SEQIDNO44の位置118、SEQIDNO45の位置125、SEQIDNO46の位置118、SEQIDNO47の位置117、SEQIDNO48の位置117、SEQIDNO49の位置118、SEQIDNO50の位置117、SEQIDNO52の位置126、SEQIDNO53の位置120、SEQIDNO54の位置118、SEQIDNO55の位置118、SEQIDNO56の位置117、SEQIDNO57の位置119、SEQIDNO58の位置117、SEQIDNO59の位置117、SEQIDNO60の位置125、SEQIDNO61の位置118、SEQIDNO62の位置118、SEQIDNO63の位置125、SEQIDNO64の位置117、SEQIDNO65の位置118、SEQIDNO66の位置118、SEQIDNO68の位置118、SEQIDNO69の位置118、SEQIDNO70の位置123、SEQIDNO71の位置117、SEQIDNO72の位置118、SEQIDNO73の位置117、SEQIDNO74の位置122、SEQIDNO75の位置119、SEQIDNO76の位置117、SEQIDNO77の位置117、SEQIDNO78の位置121、SEQIDNO79の位置118、SEQIDNO81の位置118、SEQIDNO82の位置120、SEQIDNO83の位置118、SEQIDNO84の位置117、SEQIDNO85の位置116、SEQIDNO86の位置117、SEQIDNO87の位置117、SEQIDNO88の位置122、SEQIDNO89の位置117、SEQIDNO90の位置120、SEQIDNO91の位置117、SEQIDNO92の位置118、SEQIDNO93の位置119、SEQIDNO94の位置117、SEQIDNO95の位置121、SEQIDNO96の位置115、SEQIDNO97の位置120、SEQIDNO98の位置118、SEQIDNO99の位置118、SEQIDNO100の位置118、SEQIDNO101の位置117、SEQIDNO102の位置118、SEQIDNO103の位置119、SEQIDNO104の位置118、SEQIDNO105の位置117、SEQIDNO106の位置117、SEQIDNO107の位置126、SEQIDNO108の位置122、SEQIDNO109の位置116、SEQIDNO110の位置120、SEQIDNO111の位置118、SEQIDNO112の位置117、SEQIDNO113の位置121、SEQIDNO114の位置117、SEQIDNO115の位置117、SEQIDNO116の位置118、SEQIDNO117の位置122、SEQIDNO118の位置120、SEQIDNO119の位置122、SEQIDNO120の位置119、SEQIDNO121の位置120、SEQIDNO122の位置119、SEQIDNO123の位置122、SEQIDNO124の位置119、SEQIDNO125の位置120、SEQIDNO126の位置119、SEQIDNO127の位置121、SEQIDNO128の位置122、SEQIDNO129の位置119、SEQIDNO130の位置120、SEQIDNO131の位置119、SEQIDNO132の位置120、SEQIDNO133の位置120、SEQIDNO134の位置121、SEQIDNO135の位置122、SEQIDNO136の位置122、SEQIDNO137の位置122、SEQIDNO138の位置122、SEQIDNO139の位置119、SEQIDNO140の位置119、SEQIDNO141の位置120、SEQIDNO142の位置119、SEQIDNO143の位置120、SEQIDNO144の位置125、SEQIDNO145の位置122、SEQIDNO146の位置123、SEQIDNO147の位置119、SEQIDNO148の位置120、およびSEQIDNO149の位置119。52バリアントCBHIポリペプチドの組換え発現521細胞培養系0044本発明はまた、バリアントCBHIポリペプチドを発現するように操作された組換え細胞を提供する。適切には、バリアントCBHIポリペプチドは、プロモーターに作動可能に連結された核酸によりコードされる。0045糸状菌宿主における組換え発現が望ましい場合、プロモーターは糸状菌プロモーターであってもよい。核酸は、たとえばヘテロロガスプロモーターの制御下にあってもよい。バリアントCBHIポリペプチドは、構成的または誘導性プロモーターの制御下で発現させることもできる。使用できるプロモーターの例には、セルラーゼプロモーター、キシラナーゼプロモーター、1818プロモータートリコデルマのESTマッピングにより高発現タンパク質として以前に同定されたが含まれるが、これらに限定されない。たとえば、プロモーターは、適切にはセロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、またはβ-グルコシダーゼのプロモーターであってもよい。特に適切なプロモーターは、たとえばトリコデルマリーゼイのセロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、またはβ-グルコシダーゼのプロモーターであってもよい。プロモーターの非限定的な例には、cbhl、cbh2、egl1、egl2、egl3、egl4、egl5、pki1、gpdl、xynl、またはxyn2プロモーターが含まれる。0046適切な宿主細胞にはいずれかの微生物たとえば、細菌、原生生物、藻類、真菌たとえば、酵母または糸状菌、または他の微生物の細胞が含まれ、好ましくは細菌、酵母または糸状菌の細胞である。0047細菌属の適切な宿主細胞には、エシェリキア属、バチルス属、ラクトコッカス属、シュードモナス属、およびストレプトミセス属の細胞が含まれるが、これらに限定されない。適切な細菌種の細胞には、大腸菌、バチルスサブティリス、バチルスリケニフォルミス、ラクトバチルスブレビス、シュードモナスエルギノーサ、およびストレプトミセスリビダンスの細胞が含まれるが、これらに限定されない。0048酵母属の適切な宿主細胞には、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、カンジダ属、ハンゼヌラ属、ピチア属、クルイベロミセス属、およびファフィア属の細胞が含まれるが、これらに限定されない。適切な酵母種の細胞には、サッカロミセスセレビシエ、シゾサッカロミセスポンベ、カンジダアルビカンス、ハンゼヌラポリモルファ、ピチアパストリス、ピチアカナデンシス、クルイベロミセスマルキシアヌス、およびファフィアロドザイマの細胞が含まれるが、これらに限定されない。0049糸状菌の適切な宿主細胞には、Eumycotina亜門のすべての糸状形態のものが含まれる。糸状菌属の適切な細胞には、下記の細胞が含まれるが、これらに限定されない:アクレモニウム属、アスペルギルス属、オーレオバシジウム属、ブジェルカンデラ属、セリポリオプシス属、クリソポリウム属、コプリヌス属、コリオラス属、コリナスカス属、ケトミウム属、クリプトコッカス属、フィロバシジウム属、フザリウム属、ジベレラ属、ヒューミコラ属、ヒポクレア属、マグナポルテ属、ムコール属、ミセリオフトラ属、ムコール属、ネオカリマスティクス属、ニューロスポラ属、ペシロミセス属、ペニシリウム属、ファネロケテ属、フレビア属、ピロミセス属、プロイロタス属、シタルジウム属、シゾフィラム属、スポロトリクム属、タラロミセス属、テルモアスカス属、チエラビア属、トリポクラジウム属、トラメテス属、およびトリコデルマ属。より好ましくは、組換え細胞はトリコデルマ属の種たとえば、トリコデルマリーゼイ、ペニシリウム属の種、ヒューミコラ属の種たとえば、ヒューミコラインソレンスアスペルギルス属の種たとえば、アスペルギルスニガー、クリソポリウム属の種、フザリウム属の種、またはヒポクレア属の種である。適切な細胞には、これらの糸状菌属の種々のアナモルフおよびテレオモルフ形態のものも含めることができる。0050糸状菌種の適切な細胞には、下記の細胞が含まれるが、これらに限定されない:アスペルギルスアワモリ、アスペルギルスフミガータス、アスペルギルスフェチダス、アスペルギルスヤポニカス、アスペルギルスニデュランス、アスペルギルスニガー、アスペルギルスオリゼ、クリソポリウムルックノウェンス、フザリウムバクトリディオイデス、フザリウムセレアリス、フザリウムクルックウェレンス、フザリウムクルモラム、フザリウムグラミネアルム、フザリウムグラミウム、フザリウムヘテロスポラム、フザリウムネグンディ、フザリウムオキシスポラム、フザリウムレティキュラタム、フザリウムロゼウム、フザリウムサムブシナム、フザリウムサルコクロウム、フザリウムスポロトリチオイデス、フザリウムスルフレウム、フザリウムトルロサム、フザリウムトリコテシオイデス、フザリウムベネナツム、ブジェルカンデラアダスタ、セリポリオプシスアネイリナ、セリポリオプシスアネイリナ、セリポリオプシスカレギエア、セリポリオプシスギルベッセンス、セリポリオプシスパンノシンタ、セリポリオプシスリブロサ、セリポリオプシスサブルファ、セリポリオプシスサブベルミスポラ、コプリヌスシネレウス、コリオラスヒルスタス、ヒューミコラインソレンス、ヒューミコララヌギノサ、ムコールミーヘイ、ミセリオフトラテルモフィラ、ニューロスポラクラッサ、ニューロスポラインテルメディア、ペニシリウムプルプロゲナム、ペニシリウムカネッセンス、ペニシリウムソリタム、ペニシリウムフニキュロサム、ファネロケテクリソスポリウム、フレビアラディアテ、プロイロタスエリンギイ、タラロミセスフラブス、チエラビアテレストリス、トラメテスビローサ、トラメテスベルシカラー、トリコデルマハルジアヌム、トリコデルマコニンギイ、トリコデルマロンギブラキアタム、トリコデルマリーゼイ、およびトリコデルマビリデ。0051操作された宿主細胞を、プロモーターを活性化するのに適切であるように改変した一般的な栄養培地で培養して、形質転換体を選択するか、またはバリアントCBHIポリペプチドをコードする核酸配列を増幅することができる。培養条件、たとえば温度、pHなどは、発現のために選択した宿主細胞について従来用いられているものであり、当業者に自明であろう。前記のように、細菌および真菌に由来する細胞を含めた多くの細胞の培養および製造については多数の参考文献がある。細胞培養培地は、一般にAtlasandParks1993TheHandbookofMicrobiologicalMediaCRCPressBocaRatonFLに述べられており、これを本明細書に援用する。糸状菌細胞における組換え発現については、たとえば、Pourquieetal1988BiochemistryandGeneticsofCelluloseDegradationedsAubertetalAcademicPresspp7186およびIlmenetal1997ApplEnvironMicrobiol6312981306に記載されているような、生理的塩類および栄養素を含有する標準培地で細胞を培養する。培養条件も標準的であり、たとえば培養物を28°Cにおいて振とう培養または発酵槽で、所望のレベルのバリアントCBHI発現に達するまでインキュベートする。所定の糸状菌に好ましい培養条件は、科学文献中にあり、ならびに/あるいは真菌の供給源、たとえばAmericanTypeCultureCollectionから入手できる。真菌の増殖が確立した後、バリアントCBHIの発現を起こすかまたは許容するのに有効な条件下に細胞をおく。0052バリアントCBHIコード配列が誘導性プロモーターの制御下にある場合、誘導剤、たとえば糖、金属塩または抗生物質を、バリアントCBHI発現を誘導するのに有効な濃度で培地に添加する。00531態様において、組換え細胞はアスペルギルスニガーであり、これは過剰発現ポリペプチドを得るために有用な株である。たとえば、アスペルギルスニガー変異株アワモリdgr246は、多量の分泌セルラーゼを産生することが知られている。アスペルギルスニガー変異株アワモリの他の株、たとえばGCDAP3、GCDAP4およびGAP3-4が知られている。0054別の態様において、組換え細胞はトリコデルマリーゼイであり、これは過剰発現ポリペプチドを得るために有用な株である。たとえば、SheirNeissetal1984ApplMicrobiolBiotechnol204653により記載されるRL-P37は、多量のセルラーゼ酵素を分泌することが知られている。RL-P37の機能均等物には、トリコデルマリーゼイ株RUT-C30ATCCNo.56765および株QM9414ATCCNo.26921が含まれる。これらの株はバリアントCBHIポリペプチドの過剰発現にも有用であると考えられる。0055本発明のバリアントCBHIポリペプチドを発現する細胞を、バッチ発酵、フェドバッチ発酵または連続発酵の条件下で増殖させることができる。古典的なバッチ発酵は閉鎖系であり、その際、培地の組成は発酵の開始時に設定され、発酵中は人為的な変更を受けない。バッチシステムの変法はフェドバッチ発酵であり、その場合は発酵が進行するのに伴って基質を漸増添加する。フェドバッチシステムは、異化代謝産物抑制が細胞の代謝を阻害する可能性がある場合、および培地中に限定量の基質があることが望ましい場合に有用である。バッチ発酵およびフェドバッチ発酵は一般的であり、当技術分野で周知である。連続発酵は解放系であり、その際、規定の発酵培地をバイオリアクターに連続添加し、同時に等量の馴化培地を処理のために取り出す。連続発酵は、一般に培養物を一定の高密度に維持し、ここで細胞は主に対数増殖期にある。連続発酵システムは、定常状態の増殖条件を維持するように努める。連続発酵プロセスのための栄養素および増殖因子を調節する方法、ならびに生産物形成の速度を最大にするための手法は、工業微生物学の技術分野で周知である。522植物における組換え発現0056本発明は、バリアントCBHIポリペプチドを組換え発現するトランスジェニック植物および種子を提供する。本発明は、バリアントCBHIポリペプチドを含む植物生産物、たとえば油類、種子、葉、抽出物なども提供する。0057トランスジェニック植物は双子葉植物または単子葉植物であってもよい。本発明は、これらのトランスジェニック植物および種子を作成および使用する方法も提供する。バリアントCBHIを発現するトランスジェニック植物または植物細胞は、当技術分野で既知のいずれかの方法に従って構築できる。たとえば、USPatentNo6309872を参照。トリコデルマリーゼイCBHIをトランスジェニックタバコおよびバレイショにおいて発現させるのに成功している。Hookeretal2000GlycosylHydrolasesforBiomassConversionACSSymposiumSeriesVol769Chapter4pp5590を参照。0058特定の観点において、本発明は、トランスジェニック植物または植物器官におけるCBHIバリアントの発現、およびその産生方法を提供する。好ましくは、バリアントCBHIポリペプチドの発現を指令することができる調節配列の制御下にある、バリアントCBHIポリペプチドをコードする核酸で植物を形質転換するための、DNA発現構築体を提供する。これらの調節配列には、植物において構成的にあるいは時期特異的および/または組織特異的な様式で転写を指令することができる配列が含まれる。0059植物におけるバリアントCBHIポリペプチドの発現は、多様な手段で達成できる。具体的には、たとえば双子葉植物の種たとえば、タバコ、バレイショ、トマト、ペチュニア属、アブラナ属および単子葉植物の種を含めた多数の植物種を形質転換するための技術を利用できる。さらに、たとえば外来遺伝子を植物で発現させるための方策を利用できる。さらにまた、植物および植物細胞において機能性発現できるキメラ遺伝子の構築に使用できる植物遺伝子由来の調節配列が同定されている6407Smithetal1990MolGenGenet22447781。0060植物への核酸の導入は、アグロバクテリウムツメファシエンス、またはアグロバクテリウムリゾゲネスによる形質転換を含めた幾つかの技術を用いて達成できる。形質転換できる植物組織の非限定的な例には、プロトプラスト、小芽胞または花粉、ならびに外植体、たとえば葉、幹、根、下子葉および子葉が含まれる。さらに、バリアントCBHIをコードするDNAを、プロトプラストおよび植物の細胞または組織に、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、粒子衝撃法、および直接DNA取込みによって直接導入することができる。0061バリアントCBHIポリペプチドを、植物において多様な発現系により産生させることができる。たとえば、構成的プロモーター、たとえばカリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーターの使用は、トランスジェニック植物の実質的にすべての器官における発現タンパク質の蓄積のために役立つ。あるいは、組織特異的および/または時期特異的であるプロモーターを使用できp297、バリアントCBHIポリペプチドを標的組織および/または所望の発生時期に発現させることができる。53バリアントCBHIポリペプチドの組成物0062一般に、細胞培養に際して産生されたバリアントCBHIポリペプチドは培地中へ分泌され、たとえば目的外成分を細胞培養培地から除去することによって精製または単離することができる。しかし、場合によってはバリアントCBHIポリペプチドは細胞性形態で産生され、細胞溶解物からの回収が必要となる可能性がある。そのような場合、バリアントCBHIポリペプチドを、それが産生された細胞から、当業者がルーティンに用いる手法で精製する。例には下記のものが含まれるが、これらに限定されない:アフィニティークロマトグラフィー215218、イオン交換クロマトグラフィー法:高い分解能をもつ物質を用いるイオン交換、疎水性相互作用クロマトグラフィー、および2相分配を含む。0063本発明のバリアントCBHIポリペプチドは、セルラーゼ組成物中に用いるのに適切である。セルラーゼはセルロースベータ-1,4-グルカンまたはベータD-グルコシド結合を加水分解してグルコース、セロビオース、セロオリゴ糖などを生成する酵素として当技術分野で知られている。セルラーゼ酵素は、伝統的に3つの主要クラスに分類されている:エンドグルカナーゼEG、エキソグルカナーゼまたはセロビオヒドロラーゼEC3.2.1.91CBH、およびベータ-グルコシダーゼEC3.2.1.21BG234243。0064特定の真菌は、エキソ-セロビオヒドロラーゼまたはCBH型セルラーゼ、エンドグルカナーゼまたはEG型セルラーゼ、およびβ-グルコシダーゼまたはBG型セルラーゼを含む、完全なセルラーゼ系を産生する234243。そのようなセルラーゼ組成物を本明細書中で全セルラーゼと呼ぶ。しかし、時にはこれらの系はCBH型セルラーゼを欠如し、細菌セルラーゼも一般にCBH型セルラーゼをほとんどまたはまったく含まない。さらに、EG成分とCBH成分は相乗的に相互作用してセルロースをより効率的に分解することが示された。たとえば、Wood1985BiochemicalSocietyTransactions13407410を参照。0065本発明のセルラーゼ組成物は、一般にバリアントCBHIポリペプチドのほかに1つ以上のセロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼおよび/またはβ-グルコシダーゼを含む。セルラーゼ組成物は、それらの最も粗製の形態では、それらの酵素成分を産生した微生物培養物を含有する。セルラーゼ組成物は、微生物の粗製発酵産物をも表わす。粗製発酵産物は、好ましくは微生物の細胞および/または細胞屑から分離したたとえば、遠心および/または濾過により発酵ブロスである。場合によっては、ブロス中の酵素を所望により希釈、濃縮、部分精製もしくは精製および/または乾燥することができる。バリアントCBHIポリペプチドは、セルラーゼ組成物の他の成分のうちの1つ以上と同時発現させることができ、あるいはそれを別個に発現させ、場合により精製し、他のセルラーゼ成分のうちの1つ以上を含む組成物と混和することができる。0066バリアントCBHIは、セルラーゼ組成物中に用いる場合、一般にバイオマスから可溶性糖を放出させるのに十分な量で存在する。バリアントCBHI酵素の添加量は糖化すべきバイオマスのタイプに依存し、当業者が容易に決定できる。特定の態様において、バリアントCBHIポリペプチドの重量は、適切には、セルラーゼ組成物中の総ポリペプチドの少なくとも1、少なくとも5、少なくとも10、または少なくとも20重量である。代表的なセルラーゼ組成物は、本発明のバリアントCBHIを下記の範囲の量で含有する:組成物中の総ポリペプチドの約1から約20重量まで、約1から約25重量まで、約5から約20重量まで、約5から約25重量まで、約5から約30重量まで、約5から約35重量まで、約5から約40重量まで、約5から約45重量まで、約5から約50重量まで、約10から約20重量まで、約10から約25重量まで、約10から約30重量まで、約10から約35重量まで、約10から約40重量まで、約10から約45重量まで、約10から約50重量まで、約15から約20重量まで、約15から約25重量まで、約15から約30重量まで、約15から約35重量まで、約15から約30重量まで、約15から約45重量まで、または約15から約50重量まで。54バリアントCBHIポリペプチドの有用性0067本発明のバリアントCBHIポリペプチド、およびバリアントCBHIポリペプチドを含む組成物を、多様な用途において有用であることは認識できる;たとえば、高い洗浄能、軟化剤としての機能を示し、および/または木綿布帛の感触を改善するたとえば、ストーンウォッシングまたはバイオポリッシング洗浄剤組成物、あるいは木材パルプを糖に分解するためのたとえば、バイオ-エタノール製造のためのセルラーゼ組成物。他の用途には、機械的パルプの処理、飼料添加剤としての用途、および穀粒湿式製粉が含まれる。541糖化反応0068エタノールは、セルロース系バイオマス、たとえば樹木、草本植物、都市固形廃棄物、ならびに農業および林業の残渣から、糖化および発酵プロセスにより製造できる。しかし、微生物が産生する天然のセルラーゼ混合物内の個々のセルラーゼ酵素の比率は、バイオマス中のセルロースを迅速にグルコース転化するために最も効果的ではない可能性がある。エンドグルカナーゼは、それ自体がセロビオヒドロラーゼの作用に対する基質である新たなセルロース鎖末端を生成する作用をもち、これによりセルラーゼ系全体の加水分解効率を改善することが知られている。最適化されたセロビオヒドロラーゼ活性を用いると、エタノールの製造を大幅に向上させることができる。0069本発明のバリアントCBHIポリペプチドのうちの1つ以上を含むセルラーゼ組成物を糖化反応に用いて、発酵のための単純糖simplesugarsを製造することができる。したがって本発明は、本発明のバリアントCBHIポリペプチドを含むセルラーゼ組成物とバイオマスを接触させることを含む糖化方法を提供し、場合により、得られた糖を微生物により発酵させる。0070本明細書中で用いる用語バイオマスは、セルロース場合により、ヘミセルロースおよび/またはリグニンもを含むいずれかの組成物を表わす。本明細書中で用いる場合、バイオマスには、限定ではなく、種子、穀粒、塊茎、植物廃棄物または食品加工もしくは工業加工の副産物たとえば、茎、トウモロコシたとえば、穂軸、葉茎などを含む、牧草たとえば、インディアングラス、たとえばソルガムヌータンスまたはスイッチグラス、たとえばキビ属種、たとえばパニカムウィルガツムを含む、木材、紙、パルプ、および再生紙が含まれる。他のバイオマス材料には、限定ではなく、バレイショ、ダイズたとえば、ナタネ、オオムギ、ライムギ、オートムギ、コムギ、ビート、およびサトウキビのバガスが含まれる。0071糖化したバイオマスたとえば、本発明の酵素により処理したリグノセルロース材料を、たとえば微生物発酵および/または化学合成などのプロセスで多数の生物性製品にすることができる。本明細書中で用いる場合、微生物発酵は、発酵微生物を適切な条件下で増殖させて収穫するプロセスを表わす。発酵微生物は、生物性製品を製造するために目的とする発酵プロセスに用いるのに適したいずれの微生物であってもよい。適切な発酵微生物には、限定でなく、糸状菌、酵母および細菌が含まれる。糖化したバイオマスを、たとえば発酵および/または化学合成により燃料たとえばバイオ燃料、たとえばバイオエタノール、バイオブタノール、バイオメタノール、バイオプロパノール、バイオディーゼル、ジェット燃料などにすることができる。糖化したバイオマスを、たとえば発酵および/または化学合成により有用化学物質たとえば、アスコルビン酸、イソプレン、1,3-プロパンジオール、脂質、アミノ酸、ポリペプチド、および酵素にすることもできる。0072したがって、特定の観点において、本発明のバリアントCBHIポリペプチドは、個別または同時に行なう糖化および発酵プロセスでバイオマスからエタノールを製造するために有用である。個別の糖化および発酵は、それによりバイオマス中に存在するセルロースを糖化して単純糖たとえば、グルコースにし、その後これらの単純糖を微生物たとえば、酵母により発酵させてエタノールにするプロセスである。同時に行なう糖化および発酵は、それによりバイオマス中に存在するセルロースを糖化して単純糖たとえば、グルコースにし、同時に同じ反応器内で微生物たとえば、酵母がこれらの単純糖を発酵してエタノールにするプロセスである。0073糖化の前に、セルロース材料をより酵素に接近しやすくまたは感受性にし、したがって本発明のバリアントCBHIポリペプチドによる加水分解をより受けやすくするために、好ましくはバイオマスに1以上の前処理段階を施す。0074代表的な態様において、前処理は、バイオマス材料に反応器内で強酸および金属塩の希溶液を含む触媒を付与することを伴う。バイオマス材料は、たとえば生材料または乾燥材料であってもよい。この前処理によって、セルロース加水分解の活性化エネルギーまたは温度を低下させることができ、最終的には発酵性糖の収量を高めることができる。たとえば、USPatentNo66605066423145を参照。0075別の代表的な前処理方法は、水性媒体中で、セルロースからグルコースへの顕著な脱重合を達成することなく、主にヘミセルロースを効率的に脱重合するように選択した温度および圧力で、バイオマス材料に第1の加水分解段階を施すことにより、バイオマスを加水分解することを伴う。この段階によりスラリーが得られ、その水性液相はヘミセルロースの脱重合から得られた溶解した単糖類を含有し、固相はセルロースおよびリグニンを含有する。次いで、セルロースの主要部分が脱重合する条件下でこのスラリーに第2の加水分解段階を施して、溶解した/可溶性のセルロース脱重合生成物を含有する水性液相が得られる。たとえば、USPatentNo5536325を参照。0076さらなる代表的な方法は、約0.4~約2の強酸を用いる1以上の希酸加水分解段階;続いて酸加水分解された材料の反応しなかった固体リグノセルロース成分をアルカリ脱リグニン処理することにより、バイオマス材料を加工することを伴う。たとえば、USPatentNo6409841を参照。別の代表的な前処理方法は、下記を含む:バイオマスたとえば、リグノセルロース材料を前加水分解反応器内で前加水分解すること;酸性液体を固体リグノセルロース材料に添加して混合物を調製すること;この混合物を反応温度に加熱すること;リグノセルロース材料を、リグノセルロース材料からのリグニンのうち少なくとも約20を含有する可溶化された部分とセルロースを含有する固体画分とに分画するのに十分な期間、反応温度を維持すること;可溶化された部分を固体画分から分離し、可溶化された部分を反応温度またはその付近にある間に取り出すこと;および、可溶化された部分を回収すること。固体画分中のセルロースを、より酵素消化を受けやすいようにする。たとえば、USPatentNo5705369を参照。さらなる前処理方法は、過酸化水素H2O2の使用を伴うことができる。Gould1984BiotechandBioengr264652を参照。0077前処理は、バイオマス材料を化学量論的量の水酸化ナトリウムおよび水酸化アンモニウムときわめて低い濃度で接触させることを含むこともできる。Teixeiraetal1999ApplBiochemandBiotech77791934を参照。前処理は、リグノセルロースをpH約9~約14の化学物質たとえば塩基、たとえば炭酸ナトリウムまたは水酸化カリウムと適度の温度、圧力、およびpHで接触させることを含むこともできる。PCTPublicationWO2004081185を参照。0078アンモニア前処理も採用できる。そのような前処理方法は、バイオマス材料を高い固形分の条件下で低いアンモニア濃度におくことを含む。たとえば、USPatentPublicationNo20070031918およびPCTpublicationWO06110901を参照。542バリアントCBHIタンパク質を含む洗浄剤組成物0079本発明はまた、本発明のバリアントCBHIポリペプチドを含む洗浄剤組成物を提供する。洗浄剤組成物には、バリアントCBHIポリペプチドのほかに、界面活性剤陰イオン、非イオンおよび両性界面活性剤を含む;ヒドロラーゼ;漂白剤;青み剤;粘結防止剤;可溶化剤;および陽イオン界面活性剤のうち1つ以上を使用できる。これらの成分はすべて洗浄剤技術分野で既知である。0080バリアントCBHIポリペプチドは、好ましくはセルラーゼ組成物の一部として提供される。セルラーゼ組成物は、洗浄剤組成物全体の約0.00005重量から約5重量まで、または約0.0002重量から約2重量まで使用できる。セルラーゼ組成物は、希釈液、顆粒、エマルジョン、ゲル、ペーストなどの形態であってもよい。そのような形態は当業者に既知である。固体洗浄剤組成物を用いる場合、セルラーゼ組成物は好ましくは顆粒として配合される。6実施例61材料および方法611生化学的特性分析のためのCBHIポリペプチドの調製0081PEG仲介形質転換法を用いてCBHIの発現構築体で形質転換したアスペルギルスニガー宿主株において、タンパク質発現を行なった;発現構築体は選択マーカーとしてハイグロマイシン耐性遺伝子を含み、全長CBHI配列シグナル配列、触媒ドメイン、リンカー、およびセルロース結合ドメインは、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼgpdプロモーターの制御下にあった。形質転換体を再生培地上でハイグロマイシンに対する耐性に基づいて選択した。選択した形質転換体をアスペルギルス用の塩類培地pH6.2;抗生物質ペニシリン、ストレプトマイシンおよびハイグロマイシン、ならびに80g/Lのグリセロール、20g/Lのソイトン、10mMのウリジン、20g/LのMESを補充したもの中で、バフル付き振とうフラスコ内において30°C、170rpmで培養した。5日間のインキュベーション後、分泌タンパク質上清全体を回収し、次いで中空繊維濾過を行なって濃縮し、試料を酢酸緩衝液50mMNaAc,pH5に交換した。CBHIタンパク質は、これらの試料中の総タンパク質の90を超えていた。タンパク質純度をSDS-PAGEにより分析した。タンパク質濃度をゲル密度計測および/またはHPLC分析により決定した。すべてのタンパク質濃度をアッセイ前に正規化し、1~2.5mg/mlに濃縮した。612CBHI活性アッセイ00824-メチルウンベリフェリルラクトシド4-MULアッセイ:このアッセイは、蛍光源基質4-MULMULとしても知られるに対するCBHIの活性を測定する。アッセイをcostar96ウェル黒底プレート内で実施し、緩衝液中の酵素に4-MULを添加することによりアッセイを開始した2mMの4-MUL;200mMMES中,pH6。SPECTRAMAXTMプレートリーダーで5分間にわたる蛍光読出しにより、酵素速度をモニターしたex/em365/450nm。直線範囲のデータを用いて初速度Voを計算した。0083リン酸膨潤セルロースPASCアッセイ:このアッセイは、PASCを基質として用いてCBHIの活性を測定する。アッセイ期間中、PASCに結合しているカルコフロール由来の蛍光シグナルによりPASCの濃度をモニターするex/em365/440nm。酵素15μlと反応用緩衝液85μlの0.2PASC,200mMMES,pH6を混合することによりアッセイを開始し、次いで35°C、225RPMで振とうしながらインキュベートした。2時間後、1反応体積のカルコフロール停止溶液100μg/ml,500mMグリシン中,pH10を添加し、蛍光読出しを得たex/em365/440nm。0084バガスアッセイ:このアッセイは、バガス、すなわちリグノセルロース基質に対するCBHIの活性を測定する。5希酸で前処理したバガスを入れた10mlバイアル内で反応を行なった反応液5ml当たり250mgの固体。各反応物は、4mgのCBHI酵素/g固体、200mMのMESpH6、カナマイシン、およびクロラムフェニコールを含有していた。反応物を35°Cにおいて、20RPMで回転しているハイブリダイゼーションインキュベーターRobbinsScientific内においてインキュベートした。均質スラリー状の試料150μlを96ウェルのディープウェルプレート内へ移し、停止用緩衝液450μlの500mM炭酸ナトリウム,pH10で反応停止することにより、タイムポイントを求めた。タイムポイント測定を24時間毎に72時間行なった。0085セロビオース耐容性アッセイまたはセロビオース阻害アッセイ:セロビオースに対する耐容性または、セロビオースにより引き起こされる阻害を、2方式のCBHIアッセイで試験した。直接投与型の耐容性試験方法は、すべてのCBHIアッセイすなわち、4-MUL、PASC、および/またはバガスアッセイに適用でき、既知量のセロビオースを外からアッセイ混合物に添加することを伴う。別の間接的方法は、過剰量のβ-グルコシダーゼBGをPASCアッセイおよびバガスアッセイに添加することを伴う一般に、1mgのβ-グルコシダーゼ/g装填固体。BGは、これらのアッセイに際して生成するセロビオースを酵素加水分解するであろう;したがって、BGの存在下でのCBHI活性をセロビオースの非存在下での活性の尺度とみなすことができる。さらに、BGの存在下と非存在下での活性が同様である場合、これはセロビオースに対する耐容性を示す。明らかであるが、BG活性が望ましくないけれども粗製CBHI酵素調製物中に存在する可能性がある場合は、BG阻害剤であるグルコノラクトンをCBHIアッセイに添加して、セロビオース分解を阻止することができる。62ライブラリースクリーニングアッセイ0086改善された生産物耐容性を備えたバリアントを同定するために、野生型CBHIポリペプチドBD29555を変異誘発した。BD29555バリアントの小規模60のメンバーライブラリーを設計して、生産物阻害が低減したバリアントCBHIポリペプチドを同定した。この生産物離脱部位ライブラリーは、セロビオースとの相互作用が減弱したバリアントを同定するために、セロビオース産物と直接相互作用する残基であってそこから生産物が野生型酵素より容易に離脱する残基に基づいて設計された。60メンバーの進化ライブラリーは、BD29555SEQIDNO:1の位置R273、W405およびR422における野生型残基および変異を含み、下記の置換を含んでいた:R273WT、R273Q、R273K、R273A、W405WT、W405Q、W405H、R422WT、R422Q、R422K、R422L、およびR422E位置273における4バリアント×位置405における3バリアント×位置422における5バリアント=合計60のバリアント。ライブラリーの全メンバーを、4-MULアッセイを用いて、250g/Lのセロビオースの存在下および非存在下で、BG活性をいずれも阻害するためのグルコノラクトンを用いてスクリーニングした。R273A、R273Q、およびR273K/R422Kバリアントは、増強された生産物耐容性を示した。R273K/R422Kバリアントは、バリアント間で最大の活性、および250mg/Lのセロビオース耐容性を示した。R273Kバリアントは発現が低いため、生産物阻害試験を行なわなかった。63BD29555の生産物耐容性バリアントの特性分析0087R273K/R422K置換を、野生型BD29555バックグラウンドと、拡張した生産物離脱部位進化ライブラリーのスクリーニングで同定された置換Y274Q、D281K、Y410H、P411Gとの組合わせの両方で特性分析した。0088野生型、R273K/R422KバリアントおよびR273K/Y274Q/D281K/Y410H/P411G/R422Kバリアントを、4-MULに対する活性について、250g/Lのセロビオースの存在下および非存在下で試験し、R273K/R422KバリアントはBGの存在下および非存在下でのバガスアッセイにおいても試験した。結果を表5にまとめる。0089これらの活性アッセイからの結果を、セロビオースの存在下および非存在下で残留する活性のパーセントに換算し、その際、100に近い値はセロビオース耐容性を示した。MULアッセイにおいて、セロビオースの非存在下と対比してセロビオース存在下で残留する活性のパーセントは、R273K/R422Kバリアントが最も耐容性であり、続いてR273K/Y274Q/D281K/Y410H/P411G/R422Kバリアント、次いで野生型が、それぞれ95、78、および25の活性であったことを示す。0090BD29555の野生型およびR273K/R422Kバリアントのセロビオース用量応答曲線を4-MULアッセイに際して求めた。酵素速度Voを、種々の濃度のセロビオースの存在下で測定した200mMMESpH6,25°C。速度を四連で測定した。結果を図1A~1Bに示す。図1Aは、野生型BD2955がセロビオースによって半最大阻害濃度IC50値60mg/Lで阻害されることを示す。図1Bは、R273K/R422Kバリアントが250mg/Lまでのセロビオースに対して耐容性であることを示す。0091表5BGの存在下と対比して非存在下で残留する活性のパーセントを列挙するに示すバガスアッセイ結果も、野生型BD29555の活性パーセントがR273K/R422Kバリアントの活性パーセントより低いことを証明し、これは、セロビオースの存在に対してR273K/R422Kバリアントが野生型より感受性が低いことを示す。図2A~2Bは、BD29555対R273K/R422Kバリアントのバガスアッセイについての棒グラフデータを示す。図2Aにおいて、棒は相対活性を示し、それらはセロビオースの非存在下での野生型活性に対して正規化されているWTBG=非阻害活性=1。図2Bにおいて、棒はセロビオースの存在下での活性-BGとセロビオースの非存在下での活性BGの比により表わした、セロビオースに対する耐容性を示す;1に近い比は、セロビオースに対する耐容性がより大きいことを示す。これらのデータも、BD29555のR273K/R422Kバリアントが野生型BD29555よりセロビオースに対してより耐容性であることを証明する。0092野生型およびR273K/R422KバリアントをPASCアッセイにおいても特性分析した。結果を図3に示す。野生型BD29555SEQIDNO:1および野生型トリコデルマリーゼイCBHISEQIDNO:2の両方の活性が約1g/Lのセロビオース濃度から阻害され始めIC50値はそれぞれ2.2および3g/L、これに対しR273K/R422Kバリアントは10g/Lのセロビオースの存在下でほとんど阻害を示さなかった。64トリコデルマリーゼイCBHIの生産物耐容性バリアントの特性分析0093セロビオース生産物耐容性置換をトリコデルマリーゼイCBHISEQIDNO:2に導入した。R268およびR411にアラニンおよびリジンの単一または二重置換をもつバリアントのパネルを発現させ、分析した。これらのバリアントを4-MULに対する活性について、250mg/Lのセロビオースの存在下および非存在下で、またバガスアッセイにおいてBGの存在下および非存在下で試験した。これらのアッセイからの結果を、それぞれセロビオースおよびBGの存在下および非存在下で残留する活性のパーセントに換算した。数値を表6にまとめる。0094表6に示す4-MULアッセイ結果は、野生型トリコデルマリーゼイCBHIの活性がセロビオースの存在下で23に低下し、これに対しR268およびR411における二重変異体は同じ条件下で90を超える活性を保持していたことを証明する。0095表6に示すバガスアッセイの結果は、野生型トリコデルマリーゼイCBHIの活性が、BGの存在によって、単一または二重置換バリアントの活性より著しい影響を受けることを示し、これはこれらのバリアントがセロビオースの蓄積に対して野生型より感受性が低いことを示す。図4および5は、バリアントと対比した野生型トリコデルマリーゼイCBHIのバガスアッセイについての棒グラフデータを示す。図4において、棒は相対活性を示し、それらはセロビオースの非存在下での野生型活性に対して正規化されているWTBG=1。図5において、棒は蓄積セロビオースの存在下での活性-BGとセロビオースの非存在下での活性BGの比により表わした、セロビオースに対する耐容性を示す;1に近い比は、セロビオースに対する耐容性がより大きいことを示す。7具体的態様および援用0096本明細書に引用するすべての刊行物、特許、特許出願、および他の文書は、それぞれの刊行物、特許、特許出願、および他の文書が個々にあらゆる目的で本明細書に援用されると示されたのと同程度に、あらゆる目的でその全体が本明細書に援用される。0097多様な具体的態様を説明および記載したが、本発明単数または複数の精神および範囲から逸脱することなく多様な変更をなしうることは認識されるであろう。"