"植物又は単離された植物細胞中で生産された組み換えコラーゲンであって、植物又は単離された植物細胞の液胞に少なくとも一種のコラーゲン鎖及び外因性プロリル-4-ヒドロキシラーゼP4Hを標的化して、前記外因性P4Hによるが植物又は単離された植物細胞の内因性P4Hによらない前記少なくとも一種のコラーゲン鎖のヒドロキシル化を可能にすることによって生産された組み換えコラーゲン。ウェスタンブロットによってアッセイされた場合に33°Cで15分間安定である請求項1に記載の組み換えコラーゲン。前記植物又は植物細胞は、リシルヒドロキシラーゼ3LH3、プロテアーゼN及びプロテアーゼCからなる群から選択される外因性ポリペプチドを発現する請求項1に記載の組み換えコラーゲン。I型コラーゲンである請求項1に記載の組み換えコラーゲン。前記P4Hは、ヒトのP4Hである請求項1に記載の組み換えコラーゲン。前記コラーゲンは、哺乳類のコラーゲンである請求項1に記載の組み換えコラーゲン。前記哺乳類のコラーゲンは、ヒトのコラーゲンである請求項1に記載の組み換えコラーゲン。アルファ1鎖及びアルファ2鎖を含む請求項1に記載の組み換えコラーゲン。前記少なくとも一種のコラーゲン鎖は、アルファ鎖を含む請求項1に記載の組み換えコラーゲン。前記少なくとも一種のコラーゲン鎖は、C末端及び/又はN末端プロペプチドを含む請求項1に記載の組み換えコラーゲン。組み換えコラーゲンのコラーゲン鎖がGly-X-YトリプレットのY位置でヒドロキシル化されている請求項1に記載の組み換えコラーゲン。前記哺乳類のP4Hは、ヒトのP4Hである請求項5に記載の組み換えコラーゲン。植物又は単離された植物細胞中でコラーゲンを生産する方法であって、少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖及び外因性P4Hを植物又は単離された植物細胞中で発現させ、それにより植物中でコラーゲンを生産させることを含み、前記少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖は、液胞に標的化させるためのシグナルペプチドを含み、前記外因性P4Hは、液胞に標的化させるためのシグナルペプチドを含み、前記外因性P4Hは、ER残留配列を欠いており、前記外因性P4Hは、前記少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖のGly-X-YトリプレットのY位置を特異的にヒドロキシル化することができ、前記外因性P4Hは、ヒトのP4H又はその相同体である、方法。少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖をコードする外因性ポリヌクレオチド及びP4Hをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、遺伝的に改変された植物又は単離された植物細胞であって、前記少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖は、液胞に標的化させるためのシグナルペプチドを含み、前記外因性P4Hは、液胞に標的化させるためのシグナルペプチドを含み、前記外因性P4Hは、ER残留配列を欠いており、前記外因性P4Hは、前記少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖のGly-X-YトリプレットのY位置を特異的にヒドロキシル化することができ、前記外因性P4Hは、ヒトのP4H又はその相同体である、植物又は単離された植物細胞。以下のものを含む植物システム:iコラーゲンアルファ1鎖をコードする外因性ポリヌクレオチド及びiiP4Hをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、第一の遺伝的に改変された植物;及びiコラーゲンアルファ2鎖をコードする外因性ポリヌクレオチド及びiiP4Hをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、第二の遺伝的に改変された植物ただし、前記コラーゲンアルファ1鎖及びコラーゲンアルファ2鎖のそれぞれは、液胞に標的化させるためのシグナルペプチドを含み、前記外因性P4Hは、液胞に標的化させるためのシグナルペプチドを含み、前記外因性P4Hは、ER残留配列を欠いており、前記外因性P4Hは、前記少なくとも一種のコラーゲン鎖のGly-X-YトリプレットのY位置を特異的にヒドロキシル化することができ、前記外因性P4Hは、ヒトのP4H又はその相同体である。a請求項15の植物システムを得ること;b前記第一植物と前記第二植物を交配させること;及びc前記コラーゲンアルファ1鎖及び前記コラーゲンアルファ2鎖を発現する子孫を選択し、それによりコラーゲンを生産することを含む、請求項13に記載の方法。以下のものを含む植物システム:iコラーゲンアルファ1鎖をコードする外因性ポリヌクレオチド及びiiコラーゲンアルファ2鎖をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、第一の遺伝的に改変された植物;及びP4Hをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、第二の遺伝的に改変された植物ただし、前記コラーゲンアルファ1鎖及びコラーゲンアルファ2鎖のそれぞれは、液胞に標的化させるためのシグナルペプチドを含み、前記外因性P4Hは、液胞に標的化させるためのシグナルペプチドを含み、前記外因性P4Hは、ER残留配列を欠いており、前記外因性P4Hは、前記少なくとも一種のコラーゲン鎖のGly-X-YトリプレットのY位置を特異的にヒドロキシル化することができ、前記外因性P4Hは、ヒトのP4H又はその相同体である。ヒトのP4H及び液胞に標的化するためのシグナルペプチドをコードし、かつER残留配列を欠いているポリヌクレオチドを含む核酸構築物であって、前記ポリヌクレオチドが、植物細胞中で機能的なプロモーターの転写制御下に配置されている、核酸構築物。前記コラーゲンは、I型コラーゲンである請求項14に記載の植物又は単離された植物細胞。外因性LH3を発現させることをさらに含む請求項13に記載の方法。前記少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖は、アルファ1鎖を含む請求項13に記載の方法。前記少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖は、アルファ2鎖を含む請求項13に記載の方法。前記少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖は、C末端及び/又はN末端プロペプチドを含む請求項13に記載の方法。前記植物は、ストレス条件に供される請求項13に記載の方法。前記ストレス条件は、渇水、塩分、傷害、寒さ、及びストレス誘導化合物の噴霧からなる群から選択される請求項24に記載の方法。前記コラーゲンアルファ1鎖及び前記コラーゲンアルファ2鎖のそれぞれは、C末端及び/又はN末端プロペプチドを含む請求項15に記載の方法。外因性LH3を発現させることをさらに含む請求項14に記載の植物又は植物細胞。前記少なくとも一種のコラーゲン鎖の配列は、配列番号1又は4に規定される配列である請求項1に記載の組み換えコラーゲン。前記コラーゲンアルファ鎖は、コラーゲンERシグナルを欠く請求項13に記載の方法。前記コラーゲンアルファ1鎖及び前記コラーゲンアルファ2鎖は、コラーゲンERシグナルを欠く請求項15又は17に記載の植物システム。本発明は、哺乳類のコラーゲンの特徴を示すコラーゲン及びコラーゲン線維を生産するために使用されることができるコラーゲンを発現して蓄積する植物の発明である。本発明の原理および作用は、図面および付随する説明を参照してより十分に理解することができる。本発明の少なくとも1つの実施形態を詳しく説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明において示される細部、または、実施例によって例示される細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、または、様々な方法で実施することができ、または、様々な方法で実施される。また、本明細書中で用いられる表現法および用語法は記述のためであって、限定であると見なしてはならないことを理解しなければならない。コラーゲン生産植物は、当該技術分野で知られている。かかる植物は、コラーゲン鎖ならびにコラーゲンを生産するために使用されることができるが、かかる鎖は不正確にヒドロキシル化されており、従って、その自己会合は、植物中で生じるか否かにかかわらず、本来不安定なコラーゲンに導く。本発明を実施に移す際に、本発明者らは、コラーゲン鎖の正確なヒドロキシル化を確実にし、従ってヒトI型コラーゲンの特徴例えば温度安定性を良く模倣するコラーゲンの植物中での生産を可能にする植物発現アプローチを案出した。従って、本発明の一つの側面によれば、少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖を発現することができかつそれを内因性P4H活性を欠く細胞内区画中に蓄積することができる遺伝的に改変された植物が提供される。本明細書で使用される通り、遺伝的に改変された植物geneticallymodifiedplantは、外因性ポリヌクレオチド配列で安定に又は一過的に形質転換されるいかなる下等植物例えば苔又は高等植物維管束植物、又はその組織もしくは単離された細胞例えば細胞懸濁液に言及する。植物の例は、タバコ、トウモロコシ、アルファルファ、イネ、ジャガイモ、ダイズ、トマト、小麦、大麦、カノーラ、綿並びに苔の如き下等植物を含む。本明細書で使用される通り、句コラーゲン鎖は、コラーゲン線維のアルファ1又は2鎖の如きコラーゲンサブユニット、好ましくはI型線維に言及する。本明細書で使用される通り、句コラーゲンは、会合したコラーゲントリマーに言及し、これはI型コラーゲンの場合、二つのアルファ1鎖及び一つのアルファ2鎖を含む。コラーゲン線維は、末端プロペプチドC及びNを欠くコラーゲンである。本明細書で使用される通り、句内因性P4H活性を欠く細胞内区画は、植物のP4H又は植物様P4H活性を有する酵素を含まない細胞のいかなる区画化された領域に言及する。かかる細胞内区画の例は、液胞、アポプラスト及び細胞質並びにクロロプラスト、ミトコンドリアなどのオルガネラを含む。いかなる種類のコラーゲン鎖も本発明の遺伝的に改変された植物によって発現されることができる。その例は、原線維形成コラーゲンI,II,III,V及びXI型、網状組織形成コラーゲンIV,VIII及びX型、原線維表面に結合するコラーゲンIX,XII及びXIV型、膜貫通タンパク質として生じるコラーゲンXIII及びXVII型、又は11nmの周期でビーズを有するフィラメントVI型を含む。さらなる記述については、Hulmes、2002年を参照されたい。好ましくは、発現されるコラーゲン鎖は、I型コラーゲンのアルファ1及び/又は2鎖である。発現されるコラーゲンアルファ鎖は、いかなる哺乳類から由来するいかなるポリヌクレオチド配列によってコードされることができる。好ましくは、コラーゲンアルファ鎖をコードする配列は、ヒトのものであり、配列番号1及び4によって規定されるものである。典型的には、植物中で発現されるアルファコラーゲン鎖は、それらの末端ポリペプチド即ち、プロペプチドC及びプロペプチドNを含んでいてもよく、又は含まなくてもよい。Ruggieroら2000年は、植物のタンパク質分解活性によるプロコラーゲンの処理は、ヒトにおける正常な処理とは異なること、及び開裂部位は不明であるが、プロペプチドCは、植物のタンパク質分解活性によって除去されることに気付いた。Cプロペプチドの開裂は、トリマーの会合の前にプロコラーゲンペプチドに対して生じるであろう三つのCプロペプチドの会合がトリマーの会合を開始するために必須である。植物のタンパク質分解活性によるNプロペプチドの開裂は、成熟した植物では生じるが苗木では生じない。かかる開裂は、Nテロペプチドから2個のアミノ酸を除去する17個のうちの2個。Cプロペプチド及びより少ない程度のNプロペプチドは、プロコラーゲンが動物細胞を通過する間、プロコラーゲンを可溶性に維持しBulleidら、2000年、植物細胞でも同様の効果を有すると予測される。細胞外マトリックス中へのプロコラーゲン分子の分泌後又は分泌中、プロペプチドはプロコラーゲンN及びCプロテイナーゼによって除去され、それにより原線維へのコラーゲン分子の自発的な自己会合を引き起すHulmes、2002年。プロコラーゲンN及びCプロテイナーゼによるプロペプチドの除去は、プロコラーゲンの可溶性を10000倍以上低下させ、コラーゲンの線維への自己会合を開始するのに必要かつ十分である。この会合過程にとって重要なのは、三重らせんドメインの終わりに位置する短い非三重らせんペプチドテロペプチドと称されるであり、これは、原線維構造内のコラーゲン分子の正確な位置決めを確実にし、自己会合のための臨界濃度を低下させるBulleidら、2000年。従来技術は、コラーゲンの生産中にプロペプチドを開裂させるためのペプシンの使用を記述するBulleidら、2000年。しかし、ペプシンはテロペプチドを損傷させ、結果としてペプシン抽出されたコラーゲンは、整列された線維状構造を形成することができないBulleidら、2000年。ヒトP4Hのベータサブユニットを形成するタンパク質ジスルフィドイソメラーゼPDIは、トリマー会合に先立ってCプロペプチドに結合し、それにより鎖会合の間の分子シャペロンとしても作用することが示されているRuggieroら、2000年。様々な植物中で発現されるヒトI型プロコラーゲンNプロテイナーゼ及びプロコラーゲンCプロテイナーゼの使用は、生来的なヒトのコラーゲンに一層類似しかつ整列された原線維構造を形成することができるコラーゲンを生産することができるであろう。NもしくはCプロペプチド又はこれらの両方が、発現されるコラーゲン鎖に含まれる場合、本発明の遺伝的に改変された植物はそれぞれのプロテアーゼ即ちCもしくはN又はこれらの両方を発現することもできる。かかるプロテアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号18プロテアーゼC及び20プロテアーゼNによって例示される。かかるプロテアーゼは、それらがコラーゲン鎖と同じ細胞内区画中に蓄積されるように発現されることができる。内因性P4H活性を欠く細胞内区画中での発現されるコラーゲン鎖の蓄積は、いくつかのアプローチのいずれか一つによって実行されることができる。例えば、発現されるコラーゲン鎖は、発現されるタンパク質をアポプラスト又はオルガネラ例えば葉緑体の如き細胞内区画へと標的化するためのシグナル配列を含むことができる。好適なシグナル配列の例は、葉緑体輸送ペプチドSwiss-ProtエントリーP07689、アミノ酸1~57に含まれる及びミトコンドリア輸送ペプチドSwiss-ProtエントリーP46643、アミノ酸1~28に含まれるを含む。以下の実施例セクションは、好適なシグナル配列の追加の例示並びにかかるシグナル配列を植物細胞中でのコラーゲン鎖の発現において使用するためのガイドラインを与える。代わりに、コラーゲン鎖の配列は、植物中で発現されたときにコラーゲンの細胞内局在化を変化させるような方法で改変されることができる。上述の通り、植物のERは、コラーゲン鎖を正確にヒドロキシル化することができないP4Hを含む。コラーゲンアルファ鎖は、発現されるコラーゲンをER中に指向させるER標的化配列を生来的に含み、発現されるコラーゲンはER中で翻訳後修飾される不正確なヒドロキシル化を含む。従って、ER標的化配列の除去は、いかなるヒドロキシル化も含む翻訳後修飾を欠くコラーゲン鎖の細胞質内蓄積に導くであろう。以下の実施例セクションの実施例1は、ER配列を欠くコラーゲン配列の生成を記述する。また代わりに、コラーゲン鎖は、葉緑体又はミトコンドリアの如きDNA含有オルガネラ中に発現されて蓄積されることができる。葉緑体発現のさらなる記述は以下に与えられる。上述の通り、アルファ鎖のヒドロキシル化は、安定なI型コラーゲンの会合のために要求される。本発明の遺伝的に改変された植物によって発現されるアルファ鎖は、内因性P4H活性を欠く、細胞内区画中に蓄積するので、かかる鎖は、植物、植物組織又は細胞から単離されなければならず、インビトロでヒドロキシル化されなければならない。かかるヒドロキシル化は、Turpeenniemi-Hujanen及びMyllylaによって記述される方法Concomitanthydroxylationofprolineandlysineresiduesincollagenusingpurifiedenzymesinvitro.BiochimBiophysActa.1984Jul16:800159-65によって達成されることができる。かかるインビトロヒドロキシル化は、正確にヒドロキシル化されたコラーゲン鎖に導くことができるが、達成するのが困難である場合があり費用がかかる場合がある。インビトロヒドロキシル化の制限を克服するため、本発明の遺伝的に改変された植物は、コラーゲンアルファ鎖を正確にヒドロキシル化する即ち、Gly-X-YトリプレットのプロリンY位置のみをヒドロキシル化することができるP4Hを共発現することが好ましい。P4Hは、二つのサブユニットアルファ及びベータからなる酵素である。これら両方が活性酵素を形成するのに必要であるが、ベータサブユニットはシャペロン機能をも担持する。本発明の遺伝的に改変された植物によって発現されるP4Hは、例えば配列番号12及び14によってコードされるヒトP4Hであることが好ましい。加えて、増大された基質特異性を示すP4H突然変異体又はP4H相同体も使用されることができる。好適なP4H相同体は、NCBIアクセッションNP179363によって同定されるアラビドプシスのオキシドレダクターゼによって例示される。本発明者らによって行われたこのタンパク質の配列とヒトP4Hアルファサブユニットの対様式アラインメントは、植物のいかなる公知のP4H相同体の機能性ドメイン間の最高の相同性を明らかにした。P4Hは、発現されたコラーゲン鎖と共蓄積される必要があるので、そのコード配列は、それに応じて改変されることが好ましいシグナル配列の付加、ER標的化を防止することができる欠失など。哺乳類細胞では、コラーゲンはリシルヒドロキシラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ及びグルコシルトランスフェラーゼによっても修飾される。これらの酵素は、特定位置のリシル残基をヒドロキシリシル、ガラクトシルヒドロキシリシル及びグルコシルガラクトシルヒドロキシリシル残基へと連続的に修飾する。単一のヒト酵素であるリシルヒドロキシラーゼ3LH3は、ヒドロキシリシンに関連する炭水化物形成における三つの連続的ステップすべてを触媒することができる。従って、本発明の遺伝的に改変された植物は、哺乳類のLH3も発現することが好ましい。配列番号22によって規定されるようなLH3コード配列が、かかる目的のために使用されることができる。上述のコラーゲン鎖及び修飾酵素は、植物の機能的プロモーターの転写制御下に配置されたアルファ鎖及び/又は修飾酵素例えばP4H及びLH3をコードするポリヌクレオチド配列を含む、安定に組込まれた又は一過的に発現される核酸構築物から発現されることができる。かかる核酸構築物本明細書では発現構築物とも称されるは、植物全体での発現のために、又は限定された植物組織もしくは限定された植物細胞での発現のために、又は植物の限定された発生段階での発現のために構成されることができる。かかる構築物は、選択マーカー例えば抗生物質耐性、エンハンサーエレメント及び細菌での複製のための複製起点も含むことができる。二つの発現性挿入物例えば二つのアルファ鎖型又はアルファ鎖及びP4Hを含む構築物は、それぞれの挿入物について個別のプロモーターを含むことが好ましいことは理解されるであろう。又は代わりにかかる構築物は、単一のプロモーターから両方の挿入物配列を含む単一の転写キメラを発現することができる。かかる場合、キメラ転写物は、下流の挿入物が翻訳されることができるように二つの挿入物の間にIRES配列を含む。組織特異的、発生段階特異的、構成的、又は誘導性であることができる多数の植物機能的発現プロモーター及びエンハンサーが本発明の構築物によって利用されることができ、いくつかの例が以下に与えられる。本明細書及び特許請求の範囲で使用される通り、句植物プロモーター又はプロモーターは、植物細胞DNA含有オルガネラを含む中での遺伝子発現を指図することができるプロモーターを含む。かかるプロモーターは、植物、細菌、ウイルス、真菌又は動物起源のものであることができる。かかるプロモーターは、構成的、即ち複数の植物組織中での高レベルの遺伝子発現を指図することができるか、又は組織特異的、即ち特定の植物組織での遺伝子発現を指図することができるか、又は誘導性、即ち刺激の下で遺伝子発現を指図することができるか、又はキメラ、即ち少なくとも二つの異なるプロモーターの部分から形成されるものであることができる。従って、使用される植物プロモーターは、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、誘導性プロモーター、又はキメラプロモーターであることができる。構成的植物プロモーターの例は、CaMV35S及びCaMV19Sプロモーター、FMV34Sプロモーター、サトウキビ桿状バドナウイルスプロモーター、CsVMVプロモーター、アラビドプシスACT2/ACT8アクチンプロモーター、アラビドプシスユビキチンUBQ1プロモーター、大麦葉チオニンBTH6プロモーター、及びイネアクチンプロモーターを含むがこれらに限定されない。組織特異的プロモーターの例は、マメファゼオリン貯蔵タンパク質プロモーター、DLECプロモーター、PHSプロモーター、ゼイン貯蔵タンパク質プロモーター、ダイズからのコングルチンガンマプロモーター、AT2S1遺伝子プロモーター、アラビドプシスからのACT11アクチンプロモーター、ブラシカナプスからのnapAプロモーター、及びジャガイモパタチン遺伝子プロモーターを含むがこれらに限定されない。誘導性プロモーターは、例えば光、温度、化学物質、渇水、高塩分、浸透圧ショック、酸化的条件又は病原体を含むストレス条件の如き特定の刺激によって誘導されるプロモーターであり、エンドウマメrbcS遺伝子由来の光誘導性プロモーター、アルファルファrbcS遺伝子由来のプロモーター、渇水時に活性となるプロモーターDRE,MYC及びMYB、高塩分及び浸透圧ストレス時に活性となるプロモーターINT,INPS,prxEa,Hahsp17.7G4及びRD21、及び病原体ストレス時に活性となるプロモーターhsr203J及びstr246Cを含むがこれらに限定されない。好ましくは、本発明によって利用されるプロモーターは、挿入された構築物の過剰発現が植物の形質転換後に行われるような強い構成的プロモーターである。本発明で使用されるいかなる構築物型も、各構築物型において同一又は異なる選択マーカーを使用して同一植物中へと共形質転換されることができることは理解されるであろう。代わりに、第一の構築物型が第一植物中に導入され、第二の構築物型が第二同系植物中に導入され、その後、生じたトランスジェニック植物が交配され、子孫が二重形質転換体について選択されることができる。かかる子孫のさらなる自家交配は、両方の構築物について同型接合体である遺伝系統を作成するために使用されることができる。単子葉植物及び双子葉植物の両方に核酸構築物を導入する様々な方法があるPotrykus,L.,Annu.Rev.Plant.Physiol.,Plant,Mol.Biol.199142:205-225;Shimamotoetal.,Nature1989338:274-276。かかる方法は、核酸構築物又はその一部の植物ゲノム中への安定な組込み又は核酸構築物の一過性発現に依存しており、後者の場合、これらの配列は植物の子孫には遺伝しない。加えて、核酸構築物が、葉緑体の如きDNA含有オルガネラのDNA中に直接導入されることができるいくつかの方法がある。本発明の核酸構築物の中に含まれるような外因性配列を植物ゲノム中に安定に組込むためには二つの原理的な方法がある:iアグロバクテリウムによって媒介される遺伝子移入:Kleeetal.1987Annu.Rev.PlantPhysiol.38:467-486;KleeandRogersinCellCultureandSomaticCellGeneticsofPlants,Vol.6,MolecularBiologyofPlantNuclearGenes,eds.Schell,J.,andVasil,L.K.,AcademicPublishers,SanDiego,Calif.1989p.2-25;Gatenby,inPlantBiotechnology,eds.Kung,S.andArntzen,C.J.,ButterworthPublishers,Boston,Mass.1989p.93-112。ii直接DNA取込み:Paszkowskietal.,inCellCultureandSomaticCellGeneticsofPlants,Vol.6,MolecularBiologyofPlantNuclearGeneseds.Schell,J.,andVasil,L.K.,AcademicPublishers,SanDiego,Calif.1989p.52-68;この方法は、プロトプラストへDNAを直接取込むための方法を含む:Toriyama,K.etal.1988Bio/Technology6:1072-1074。植物細胞の短い電気ショックによって誘導されるDNA取込み:Zhangetal.PlantCellRep.19887:379-384.Frommetal.Nature1986319:791-793。粒子衝撃による植物細胞又は組織中へのDNA注入:Kleinetal.Bio/Technology19886:559-563;McCabeetal.Bio/Technology19886:923-926;Sanford,Physiol.Plant.199079:206-209。マイクロピペット系の使用による植物細胞又は組織中へのDNA注入:Neuhausetal.,Theor.Appl.Genet.198775:30-36;NeuhausandSpangenberg,Physiol.Plant.199079:213-217。又は発芽花粉とのDNAの直接培養による植物細胞又は組織中へのDNA注入:DeWetetal.inExperimentalManipulationofOvuleTissue,eds.Chapman,G.P.andMantell,S.H.andDaniels,W.Longman,London,1985p.197-209;andOhta,Proc.Natl.Acad.Sci.USA198683:715-719。アグロバクテリウム系は、植物ゲノムDNA中に組込まれる限定されたDNAセグメントを含むプラスミドベクターの使用を含む。植物組織の接種方法は、植物種及びアグロバクテリウム送達系によって異なる。幅広く使用されているアプローチは、リーフディスク手順であり、これは植物全体への分化を開始するのに良好な源を提供するいかなる組織外植体を用いて行われることができる。Horschetal.inPlantMolecularBiologyManualA5,KluwerAcademicPublishers,Dordrecht1988p.1-9参照。補助的なアプローチは、アグロバクテリウム送達系を減圧浸潤との組合せで使用する。アグロバクテリウム系は、トランスジェニック双子葉植物の作成において特に実行可能である。植物細胞中への直接DNA移入には様々な方法がある。エレクトロポレーションでは、プロトプラストは強い電場に短時間さらされる。マイクロ注入では、DNAは極めて小さいマイクロピペットを使用して細胞中へ直接機械的に注入される。微小粒子衝撃では、DNAは硫酸マグネシウムの結晶、タングステン粒子又は金粒子の如き微小投射物に吸着され、この微小投射物が細胞又は植物組織中へと物理的に加速される。形質転換後、植物の繁殖が行われる。植物繁殖の最も一般的な方法は種子による方法である。しかし、種子繁殖による再生は、異型接合性のため作物には均一性の欠失があるという欠点を有する。何故なら種子は、メンデルの法則によって支配される遺伝的変異に従って植物によって生産されるからである。基本的に、各種子は遺伝的に異なり、各種子はそれ自身の特異的な形質を有して成長するであろう。従って、形質転換植物は、再生された植物が親のトランスジェニック植物と同一の形質及び特徴を有するように生産されることが好ましい。それ故、形質転換植物は、形質転換植物の迅速で一貫した再生を与える微小繁殖によって再生されることが好ましい。本発明の核酸構築物内に含まれる単離された核酸を一過的に発現させるために利用されることができる一過的発現方法は、上述のマイクロ注入及び衝撃しかし一過的発現が好ましい条件下で、及びウイルスによって媒介される発現を含むがこれらに限定されない。ウイルスによって媒介される発現では、核酸構築物を含むパッケージ化された又はパッケージ化されていない組換えウイルスベクターが植物組織又は細胞を感染させるために利用され、そこに確立された繁殖する組換えウイルスが非ウイルス性核酸配列を発現する。植物宿主の形質転換のために有用であることが示されているウイルスはCaMV,TMV及びBVを含む。植物ウイルスを使用した植物の形質転換は、米国特許第4885237号BGV,EP-A67553TMV、日本国公開特許公報第63-14693号TMV,EPA第194809号BV,EPA第278667号BV及びGluzman,Y.etal.,CommunicationsinMolecularBiology:ViralVectors,ColdSpringHarborLaboratory,NewYork,pp.172-1891988に記述されている。植物を含む多くの宿主中で外来DNAを発現させるのに使用するためのシュードウイルス粒子は、WO87/06261に記述されている。植物中に非ウイスル性外因性核酸配列を導入して発現させるための植物RNAウイルスの構築は、上述の文献並びにDawson,W.O.eral.,Virology1989172:285-292;Takamatsuetal.EMBOJ.19876:307-311;Frenchetal.Science1986231:1294-1297;andTakamatsuetal.FEBSLetters1990269:73-76によって示されている。ウイルスがDNAウイルスである場合、構築はウイルス自体に対してなされることができる。代わりに、ウイルスは、外来DNAを有する望ましいウイルスベクターを構築するのが容易なように細菌プラスミド中へとまずクローニングされることができる。次にウイルスはプラスミドから切り出されることができる。もしウイルスがDNAウイルスであるなら、細菌の複製起点がウイルスDNAに取付けられることができ、ウイルスDNAは細菌によって複製されることができる。このDNAの転写及び翻訳は、ウイルスDNAを包囲するコートタンパク質を生産するであろう。もしウイルスがRNAウイルスであるなら、ウイルスは一般的にcDNAとしてクローニングされ、プラスミド中に挿入される。次にプラスミドは構築物のすべてを作るために使用される。次にRNAウイルスは、プラスミドのウイルス配列を転写することよって及びウイルス遺伝子を翻訳してウイルスRNAを包囲するコートタンパク質を生産することによって生産される。本発明の構築物中に含まれるような非ウイルス性外因性核酸配列の植物中への導入及び発現のための植物RNAウイルスの構築は、上述の文献並びに米国特許第5316931号によって示されている。一つの実施態様では、生来的コートタンパク質コード配列がウイルス核酸から欠失されており、かつ植物宿主中での発現、組換え植物ウイルス核酸のパッケージング及び組換え植物ウイルス核酸による宿主の全身的感染を確実にすることができる非生来的プロモーター、好ましくは非生来的コートタンパク質コード配列のサブゲノムプロモーターが挿入されている植物ウイルス核酸が提供される。代わりに、コートタンパク質遺伝子は、タンパク質が生産されるようにその中に非生来的核酸を挿入することによって不活性化されることができる。組換え植物ウイルス核酸は一以上の追加の非生来的サブゲノムプロモーターを含むことができる。それぞれの非生来的サブゲノムプロモーターは、植物宿主中の隣接遺伝子又は核酸配列を転写又は発現させることができるが、相互に及び生来的サブゲノムプロモーターと組換えられることができない。非生来的外来性核酸配列は、一以上の核酸配列が含められる場合、生来的な植物ウイルスサブゲノムプロモーター又は生来的な及び非生来的な植物ウイルスサブゲノムプロモーターに隣接して挿入されることができる。非生来的核酸配列はサブゲノムプロモーターの制御下で宿主植物中で転写又は発現され、望ましい生成物を生産する。第二の実施態様では、生来的なコートタンパク質コード配列が非生来的なコートタンパク質コード配列の代わりに非生来的なコートタンパク質サブゲノムプロモーターの一つに隣接して配置されていることを除いては第一の実施態様と同様の組換え植物ウイルス核酸が提供される。第三の実施態様では、生来的なコートタンパク質遺伝子がそのサブゲノムプロモーターに隣接されておりかつ一以上の非生来的サブゲノムプロモーターがウイルス核酸中に挿入されている組換え植物ウイルス核酸が提供される。挿入された非生来サブゲノムプロモーターは、隣接遺伝子を転写又は発現させることができるが、相互に及び生来的サブゲノムプロモーターと組換えられることができない。非生来的な核酸配列は、前記配列がサブゲノムプロモーターの制御下で宿主植物中で転写又は発現され、望ましい生成物を生産するように非生来的なサブゲノム植物ウイルスプロモーターに隣接して挿入されることができる。第四の実施態様では、生来的なコートタンパク質コード配列が非生来的なコートタンパク質コード配列によって置換されていることを除いては第三の実施態様と同様の組換え植物ウイルス核酸が提供される。ウイルスベクターは、組換え植物ウイルス核酸によってコードされるコートタンパク質によって包囲されて組換え植物ウイルスを生産する。組換え植物ウイルス核酸又は組換え植物ウイルスは、適切な宿主植物を感染させるために使用される。組換え植物ウイルス核酸は、宿主中で複製し、宿主中に全身的に広がり、宿主中で外来遺伝子単離された核酸を転写又は発現させて望ましいタンパク質を生産することができる。外因性核酸配列を葉緑体のゲノムに導入するための技術が知られている。この技術は下記の手順を伴う。第1に、植物細胞が、細胞あたりの葉緑体の数を約1個に減らすように化学的に処理される。その後、外因性核酸が、少なくとも1つの外因性核酸分子を葉緑体に導入することを目指して、粒子衝撃によって細胞に導入される。外因性核酸は、相同的組換えこれは葉緑体に固有の酵素によって容易に行われるによる葉緑体ゲノムへの組込みを可能にするように選択される。この目的のために、外因性核酸は、目的とする遺伝子に加えて、葉緑体ゲノムに由来する少なくとも1つの核酸配列を含む。加えて、外因性核酸は選択マーカーを含み、そのような選択マーカーは、逐次的な選抜手法によって、そのような選抜の後の葉緑体ゲノムのすべてまたは実質的にすべてのコピー体が外因性核酸を含むことを確認するために役立つ。この技術に関するさらなる詳細が、米国特許第4945050号および同第5693507号に見出されるこれらは参考として本明細書中に組み込まれる。従って、ポリペプチドを葉緑体のタンパク質発現系によって産生させることができ、かつ、葉緑体の内膜に一体化させることができる。上述の形質転換アプローチは、いかなる種の植物又はそこから由来する植物組織もしくは単離された植物細胞においてコラーゲン鎖及び/又は修飾酵素並びに会合されたコラーゲンプロペプチドあり又はなしを生産するために使用されることができる。好ましい植物は、本明細書に記述されたコラーゲン鎖、コラーゲン及び/又は処理酵素を多量に蓄積することができるものである。かかる植物は、ストレス条件に対するそれらの抵抗性及び発現された成分又は会合されたコラーゲンが抽出される容易さに従って選択されることもできる。好ましい植物の例は、タバコ、トウモロコシ、アルファルファ、イネ、ジャガイモ、ダイズ、トマト、小麦、大麦、カノーラ、ニンジン及び綿を含む。コラーゲン線維は、食品及び化粧品産業で広範囲に使用される。従って、植物によって発現されるコラーゲン線維成分アルファ鎖及び修飾酵素はコラーゲンの産業的合成において有用性を見出し、植物中での完全なコラーゲンの生産は、その簡単さ及び費用効率のために好ましい。植物中でI型コラーゲンを生成するためにいくつかのアプローチが使用されることができる。例えば、コラーゲンアルファ1鎖は、コラーゲンアルファ1及びP4H及び所望によりLH3を発現する植物から単離されることができ、コラーゲンアルファ2及びP4H及び所望によりLH3及びプロテアーゼC及び/又はNを発現する植物から単離されるコラーゲンアルファ2鎖と混合されることができる。コラーゲンアルファ1鎖はそれ自身によって三重らせんへと自己会合するため、混合前にかかるホモトリマーを変性させてコラーゲンアルファ2鎖と共に再生することが必要であるかもしれない。好ましくは、コラーゲンアルファ1及びP4H及び所望によりLH3及びプロテアーゼC及び/又はNを発現する第一植物は、コラーゲンアルファ2を発現する第二及び好ましくは同系の植物と交配されることができるか、又は代わりに両アルファ鎖を発現する第一植物は、P4H及び所望によりLH3及びプロテアーゼC及び/又はNを発現する第二植物と交配されることができる。上述の植物育種アプローチは二つの個別に形質転換された植物を利用するが、それぞれが一つ又は二つの成分を発現する三つ以上の個別に形質転換された植物を利用するアプローチも利用できるということは注意されるべきである。当業者は様々な植物育種技術に精通しているであろう。従って、かかる技術のさらなる記述は本明細書中では与えられない。植物育種アプローチが好ましいが、コラーゲンアルファ1及び2、P4H及びLH3及び所望によりプロテアーゼC及び/又はNを発現する単一の植物が、それぞれが一以上の発現可能な成分を細胞中に導入するために設計されているいくつかの形質転換事象を介して作成されることができることに注意すべきである。かかる場合には、各形質転換事象の安定性は特異的な選択マーカーを使用して確認されることができる。いかなる場合でも、形質転換及び植物育種アプローチはいかなる数の成分を発現するいかなる植物を作成するために使用されることができる。現在好まれているものはコラーゲンアルファ1及び2鎖、P4H,LH3及び少なくとも一つのプロテアーゼ例えばプロテアーゼC及び/又はNを発現する植物である。以下の実施例の節でさらに記述されるように、かかる植物は42°Cまでの温度で安定性を示すコラーゲンを蓄積する。育種から生じた子孫又は代わりに多数回形質転換植物は、核酸又はタンパク質プローブ例えば抗体を使用して外因性mRNA及び/又はポリペプチドの存在を確認することによって選択されることができる。後者のアプローチが好ましい。何故なら、それは発現されたポリペプチド成分の局在化を可能にし例えば分別された植物抽出物をプロービングすることによって、従って、正確な処理及び会合についての可能性も確認するからである。好適なプローブの例は以下の実施例の節に与えられる。一旦コラーゲンを発現する子孫が同定されたら、かかる植物はコラーゲン鎖ならびに修飾酵素の発現を最大にする条件下でさらに栽培される。遊離プロリンの蓄積は、本発明の遺伝的に改変された植物によって発現されるコラーゲン鎖を含む様々なプロリンリッチタンパク質の過剰生産を容易にすることができ、好ましい栽培条件は栽培された植物中での遊離プロリンの蓄積を増大させるようなものである。遊離プロリンの蓄積は、渇水、塩分、低温、高温、病原体感染、重金属毒性、嫌気生活、栄養欠乏、大気汚染及びUV照射を含む広範囲の環境ストレスに対する応答において様々な植物中に蓄積するHareandCress,1997年。遊離プロリンは、ABAの如き化合物での植物又は土壌の処理に対する応答において又は銅、塩、パラコート、サリチル酸などの如き化合物を含むストレスに対する応答においても蓄積することがあり得る。従って、コラーゲンを発現する子孫は様々なストレス条件例えば50mMから250mMまでの範囲のNaClの異なる濃度下で生長させられることができる。コラーゲン生産をさらに増大させるために、コラーゲン発現に対する様々なストレス条件の影響が調査され、植物の生存性、バイオマス及びコラーゲン蓄積に関して最適化されるであろう。植物組織/細胞は成熟時に収穫されることが好ましく、コラーゲン線維は周知の従来技術の抽出アプローチを使用して単離され、一つのかかるアプローチが以下に詳述される。形質転換植物の葉は液体窒素下で粉末へと磨砕され、ホモジネートは0.2MのNaClを含む0.5M酢酸中で60時間4°Cで抽出される。不溶性材料は遠心分離によって除去される。組換えコラーゲンを含む上澄みは0.4M及び0.7MのNaClで塩分画される。組換えヘテロトリマーコラーゲンを含む0.7MNaCl沈殿は0.1Mの酢酸中に溶解されてこれに対して透析され、-20°Cで貯蔵されるRuggieroら、2000年に従う。本発明のさらなる目的、利点および新規な特徴が、限定であることが意図されない下記の実施例を検討したとき、当業者には明らかになる。加えて、本明細書中上記に描かれるような、また、下記の請求項の節において特許請求されるような本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれは、実験的裏付けが下記の実施例において見出される。次に下記の実施例が参照されるが、下記の実施例は、上記の説明と一緒に、本発明を非限定様式で例示する。本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学及び組み換えDNAの技法が広く含まれている。これらの技法は文献に詳細に説明されている[例えば以下の諸文献を参照されたい。MolecularCloning:AlaboratoryManualSambrookら1989年;Ausubel,R.M.編1994年CurrentProtocolsinMolecularBiologyI~III巻;Ausubelら著1989年CurrentProtocolsinMolecularBiologyJohnWileyandSons,米国メリーランド州バルチモア;Perbal著APracticalGuidetoMolecularCloningJohnWileySons,米国ニューヨーク1988年;Watsonら、RecombinantDNAScientificAmericanBooks、米国ニューヨーク;Birrenら編GenomeAnalysis:ALaboratoryManualSeries1~4巻、ColdSpringHarborLaboratoryPress、米国ニューヨーク1998年;米国特許の4666828号、4683202号、4801531号、5192659号及び5272057号に記載される方法;Cellis,J.E.編CellBiology:ALaboratoryHandbookI~III巻1994年;Freshney,Wiley-Liss著、CultureofAnimalCells-AManualofBasicTechnique第3版N.Y.1994年;Coligan,J.E.編CurrentProtocolsinImmunologyI~III巻1994年;Stitesら編BasicandClinicalImmunology第8版、AppletonLange、米国コネティカット州ノーウォーク1994年;MishellとShiigi編SelectedMethodsinCellularImmunology、W.H.FreemanandCo.、米国ニューヨーク1980年;また利用可能な免疫検定法は、例えば以下の特許と科学文献に広範囲にわたって記載されている。米国特許の3791932号、3839153号、3850752号、3850578号、3853987号、3867517号、3879262号、3901654号、3935074号、3984533号、3996345号、4034074号、4098876号、4879219号、5011771号及び5281521号;Gait,M.J.編OligonucleotideSynthesis1984年;Hames,B.D.及びHigginsS.J.編NucleicAcidHybridization1985年;Hames,B.D.及びHigginsS.J.編TranscriptionandTranslation1984年;Freshney,R.I.編AnimalCellCulture1986年;ImmobilizedCellsandEnzymesIRLPress1986年;Perbal,B.著APracticalGuidetoMolecularCloning1984年及びMethodsinEnzymology1~317巻、AcademicPress;PCRProtocols:AGuideToMethodsAndApplications、AcademicPress、米国カリフォルニア州サンディエゴ1990年;Marshakら、StrategiesforProteinPurificationandCharacterization-ALaboratoryCourseManual、CSHLPress、1996年;なおこれらの文献類は、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである]。その外の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。本明細書に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。本明細書に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。実施例1構築及び形質転換スキーム本研究で使用された発現カセットの構築は図1a-dに示されている。本研究におけるコード配列のすべては、タバコ中での発現のために最適化され、望ましいフランキング領域配列番号1,4,7,12,14,16,18,20,22を有するように化学的に合成された。図1a:液胞シグナルもしくはアポプラストシグナル配列番号7によってコードされるに融合された又はシグナルなしのCol1及びCol2配列番号1,4をコードする合成遺伝子は、キクrbcS1プロモーター及び5′UTR配列番号10並びにキクrbcS13′UTR及びターミネーター配列番号11からなる発現カセット中にクローニングされた。完全な発現カセットはpBINPLUS植物形質転換ベクターのマルチクローニングサイト中にクローニングされたvanEngelenら、1995年、TransgenicRes4:288-290。図1b:液胞シグナルもしくはアポプラストシグナル配列番号7によってコードされるに融合された又はシグナルなしのP4Hベータヒト、P4Hアルファヒト及びP4H植物配列番号12,14及び16をコードする合成遺伝子は、ベクターpJD330によって担持されるCaMV35Sプロモーター及びTMVオメガ配列及びアグロバクテリウムノパリン合成酵素NOSターミネーターからなる発現カセット中にクローニングされた。完全な発現カセットは、Col1又はCol2の発現ベクターを担持するpBINPLUSベクターのマルチクローニングサイト中にクローニングされた。図1c:液胞シグナルもしくはアポプラストシグナル配列番号7によってコードされるに融合されたプロテイナーゼC及びプロテイナーゼN配列番号18,20をコードする合成遺伝子は、キクrbcS1プロモーター及び5′UTR配列番号10並びにキクrbcS13′UTR及びターミネーター配列番号11からなる発現カセット中にクローニングされた。完全な発現カセットはpBINPLUS植物形質転換ベクターのマルチクローニングサイト中にクローニングされた。図1d:液胞シグナルもしくはアポプラストシグナル配列番号7によってコードされるに融合された又はシグナルなしのLH3配列番号22をコードする合成遺伝子フランキングイチゴツル結合ウイルスSVBVプロモーターNCBIアクセッションAF331666REGION:623..950バージョンAF331666.1GI:13345788を有しかつアグロバクテリウムオクトピン合成酵素OCSターミネーターNCBIアクセッションZ37515REGION:1344..1538バージョンZ37515.1GI:886843で末端停止されているは、Col1及びP4Hベータの発現カセットを担持するpBINPLUSベクターのマルチクローニングサイト中にクローニングされた。図1に記述される発現カセットを利用した宿主植物中への共形質転換スキームは図2に図示される。各発現カセット挿入物はコード配列の短い名前によって表される。コード配列及び関連する配列番号は表1に記載されている。それぞれの共形質転換は二つのpBINPLUSバイナリーベクターによって行われる。それぞれの長方形は一つ、二つ又は三つの発現カセットを担持する単一のpBINPLUSベクターを表す。プロモーター及びターミネーターは図1で特定される。実施例2植物コラーゲン発現以下の表1に提示されるタンパク質をコードする合成ポリヌクレオチド配列が設計され、タバコ植物中での発現のために最適化された。シグナルペプチドiチオールプロテアーゼアレウレインaleurain前駆体についての大麦遺伝子の液胞シグナル配列NCBIアクセッションP05167GI:113603iiアラビドプシスタリアーナのエンド1,4-ベータ-グルカナーゼのアポプラストシグナルCel1、NCBIアクセッションCAA67156.1GI:2440033;配列番号9、配列番号7によってコードされるプラスミドの構築植物発現ベクターは実施例1に教示されるようにして構築された。それぞれの構築された発現ベクターの組成は制限酵素分析及び配列決定を介して確認された。以下の発現カセットを含む発現ベクターが構築された:1.コラーゲンアルファ12.コラーゲンアルファ1ヒトP4Hベータサブユニット3.コラーゲンアルファ1ヒトP4HベータサブユニットヒトLH34.コラーゲンアルファ25.コラーゲンアルファ2ヒトP4Hアルファサブユニット6.コラーゲンアルファ2アラビドプシスP4H7.ヒトP4HベータサブユニットヒトLH38.ヒトP4Hアルファサブユニット上述のコード配列のそれぞれは、液胞輸送ペプチドもしくはアポプラスト輸送ペプチドに翻訳的に融合されたか、又はいかなる輸送ペプチド配列も欠いており、その場合、細胞質蓄積が期待される。植物形質転換及びPCRスクリーニングタバコ植物ニコチアーナタバクム、SamsunNNは、図2に教示される形質転換スキームに従って上述の発現ベクターで形質転換された。生じた形質転換植物は、コラーゲンアルファ1の324bpフラグメント及びコラーゲンアルファ2の537bpフラグメントを増幅することができるように設計された四つのプライマー表2を使用したマルチプレックスPCRを介してスクリーニングされた。図3は一つのマルチプレックスPCRスクリーニングの結果を示す。実施例3トランスジェニックタバコ植物中でのヒトコラーゲンの検出全可溶性タンパク質は、完全なプロテアーゼ阻害剤カクテルRocheDiagnosticsGmbHからの製造1836145、50mlの緩衝液あたり一錠を使用して0.5mlの50mMTris-HClpH7.5中で500mgの葉を粉砕することによってタバコ形質転換体2,3及び4から抽出された。粗抽出物は、10ベータ-メルカプト-エタノール及び8SDSを含む250μlの4Xサンプル適用緩衝液と混合され、サンプルは7分間沸騰され、13000rpmで8分間遠心分離された。20μlの上澄みは10ポリアクリルアミドゲル中に添加され、抗コラーゲンI変性抗体ChemiconInc.からのAB745を使用して標準的なウェスタンブロット手順でテストされた図4。W.T.は野生型タバコである。陽性コラーゲンバンドは、コラーゲンI型アルファ1又はアルファ2又は両方についてPCR陽性である植物において見ることができる。ヒト胎盤ChemiconInc.からのCC050からの500ngのコラーゲンI型の陽性コントロールバンドは、トランスジェニック植物からのサンプル中の約0.3の全可溶性タンパク質約150μgを表す。全可溶性タンパク質の1までの予測される分子量でコラーゲンを発現する植物は、コラーゲンが液胞に対して標準化された場合に検出された図4。アポプラストに対する全長コラーゲンの細胞内標的化は成功裏に達成された図5。細胞質中でコラーゲンを発現する植物即ち標的化ペプチドなしは、コラーゲンを検出可能なレベルに蓄積せず、植物中でのコラーゲンの細胞内標的化は成功のために重要であることを示した。N-プロペプチドを欠くコラーゲンが有意なタンパク質分解に供されることを示すRuggieroら2000年及びMerleら2002年の研究に加えて及びこれらの研究とは対照的に、現在のアプローチを使用すると、C-プロペプチド及びN-プロペプチドを有する全長コラーゲンタンパク質は高レベルで細胞内区画中に蓄積した。本データはまた、それぞれが異なるコラーゲン鎖型を発現する二つの植物を交配することは、それぞれの鎖型を最適レベルで発現する植物の選択及び望ましいコラーゲン生産植物を達成するための続く植物交配を可能にする点で有利であるということを明らかに示す。本発明の植物によって生産されるコラーゲンは、生来的なプロペプチドを含み、従って、タンパク質分解によって精製されたヒトのコントロールタンパク質より大きなタンパク質を形成すると予測される。ヒドロキシル化又はグリコシル化を有さないコラーゲンアルファ1及びアルファ2鎖の計算される分子量は以下の通りである:プロペプチドを有するCol1-136kDa、プロペプチドを有さないCol1-95kDa、プロペプチドを有するCol2-127kDa、プロペプチドを有さないCol2-92kDa。図4からわかるように、形質転換体3-5及び3-49中のCol1バンドは他の植物中のCol1バンドより大きく見える。これは、これらの植物中で共発現されてヒトコラーゲン鎖と同じ細胞内区画例えば液胞に対して標的化されたアルファ及びベータサブユニットからなるヒトプロリン-4-ヒドロキシラーゼホロ酵素によってコラーゲン鎖中でプロリンがヒドロキシル化されることを示す。実施例4コラーゲン三重らせん会合及びトランスジェニック植物中での熱安定性コラーゲン三重らせん会合及びトランスジェニック植物中でのらせん熱安定性は、トランスジェニック植物の全粗タンパク質抽出物の熱変性及び続くトリプシン又はペプシン消化によってテストされた図6a~b。第一の実験では、タバコ2-9Colアルファ1のみを発現し、P4Hを発現しない及びタバコ3-5Colアルファ2及びP4Hの両方を発現するからの全可溶性タンパク質は、0.5mlの50mMTris-HClpH=7.5中で500mgの葉を粉砕して13000rpmで10分間遠心分離し、上澄みを収集することによって抽出された。50μlの上澄みは熱処理33°C又は43°Cで15分間に供され、次に直ちに氷上に置かれた。トリプシン消化は、各サンプルに50mMTris-HClpH=7.5中の1mg/mlトリプシン6μlを添加することによって開始された。サンプルは室温約22°Cで20分間インキュベートされた。消化は、10ベータメルカプトエタノール及び8SDSを含む20μlの4Xサンプル適用緩衝液の添加によって停止され、サンプルは7分間沸騰され、13000rpmで7分間遠心分離された。50μlの上澄みは10ポリアクリルアミドゲル中に添加され、抗コラーゲンI抗体ChemiconInc.からのAB745を使用して標準的なウェスタンブロット手順でテストされた。陽性コントロールは、w.t.タバコから抽出された50μlの全可溶性タンパク質に添加された約500ngのヒトコラーゲンIChemiconInc.からのCC050であり、ペプシン消化によってヒト胎盤から抽出されたもののサンプルであった。図6aに示されるように、植物3-5中で形成されたコラーゲン三重らせん並びにコントロールのヒトコラーゲンは33°Cでの変性に対して抵抗性であった。対照的に、植物2-9によって形成されたコラーゲンは33°Cで変性した。熱安定性におけるこの相違は、コラーゲンアルファ1及びコラーゲンアルファ2並びにP4Hベータ及びアルファサブユニットの両方を発現する形質転換体3-5中での成功した三重らせん会合及び翻訳後のプロリンヒドロキシル化を示唆する。形質転換体2-9における二つのバンドはダイマー又はトリマーを表すかもしれず、これらはSDS及びメルカプトエタノールを使用した7分間の沸騰後も安定である。同様のバンドがヒトのコラーゲン上部パネルにおいて及び形質転換体3-5において見ることができる。可能な説明は、異なる三重らせん中の二つのペプチドの間の等価なバンドクロスリンクがリシンオキシダーゼによる二つのリシンの酸化的脱アミノ化後に形成されたということである。第二の実験では、トランスジェニックタバコ13-6コラーゲンIアルファ1及びアルファ2鎖矢印によって示される、ヒトP4Hアルファ及びベータサブユニット及びヒトLH3を発現するからの全可溶性タンパク質は、0.5mlの100mMTris-HClpH=7.5及び300mMNaCl中で500mgの葉を粉砕して10000rpmで7分間遠心分離し、上澄みを収集することによって抽出された。50μlの上澄みは熱処理33°C、38°C又は42°Cで20分間に供され、次に直ちに氷上に置かれた。ペプシン消化は、各サンプルに0.1MHCl4.5μl及び10mM酢酸中の2.5mg/mlペプシン4μlを添加することによって開始された。サンプルは室温約22°Cで30分間インキュベートされた。消化は、5μlの非緩衝化1MTrisを添加することによって停止された。各サンプルは、10ベータメルカプトエタノール及び8SDSを含む22μlの4Xサンプル適用緩衝液と混合され、7分間沸騰され、13000rpmで7分間遠心分離された。40μlの上澄みは10ポリアクリルアミドゲル中に添加され、抗コラーゲンI抗体ChemiconInc.からのAB745を使用して標準的なウェスタンブロット手順でテストされた。陽性コントロールは、w.t.タバコから抽出された全可溶性タンパク質に添加された約50ngのヒトコラーゲンChemiconInc.からのCC050であり、ペプシン消化によってヒト胎盤から抽出されたもののサンプルであった。図6bに示されるように、植物13-6中で形成されたコラーゲン三重らせんは42°Cでの変性に対して抵抗性であった。プロペプチドの開裂は、33°Cでまず見ることができ、温度が38°Cに上昇したとき及び42°Cに上昇したとき再び効果的に徐々に増大する。開裂されたコラーゲン三重らせんドメインは、ペプシン処理されたヒトコラーゲンのゲル上での移動と同様の移動を示す。この実験で使用されたヒトコラーゲンは、ペプシンタンパク質分解によってヒト胎盤から抽出されたものであり、従ってプロペプチド及びいくつかのテロペプチドを欠いている。実施例5植物のP4H発現生来的な植物P4Hの誘導タバコP4HcDNAは、クローニングされ、内因性P4H発現を誘導する条件及び処理を決定するためのプローブとして使用された。ノーザンブロット分析図7は、P4Hは茎頂では比較的高レベルでそして葉では低レベルで発現されることを明らかに示す。P4Hレベルは擦傷処理下方パネルの傷つけられたの4時間後に葉で有意に誘導された。同様の結果が他のストレス条件を使用して達成された図示せず。トランスジェニックタバコ植物中でのヒトP4Hアルファ及びベータサブユニット及びコラーゲンアルファ1及びアルファ2の検出トランスジェニックタバコ植物中でのヒトP4Hアルファ及びベータサブユニット及びコラーゲンアルファ1及びアルファ2鎖の検出は、抗ヒトP4Hアルファサブユニット抗体ICNBiomedicalsInc.からの63-163、抗ヒトP4Hベータサブユニット抗体ChemiconInc.からのMAB2701及び抗コラーゲンI抗体ChemiconInc.からのAB745を使用して行われた。これらの抗体でプローブされたウェスタンブロットの結果は図8に示される。P4Hアルファ、P4Hベータ及びコラーゲンIアルファ1及びアルファ2バンドの発現は植物13-6ヒトLH3でも形質転換されている中で確認された。液胞シグナルペプチドを含むP4Hアルファ及びベータの計算された分子量はそれぞれ、65.5kDa及び53.4kDaである。プロペプチドを有する、ヒドロキシル化又はグリコシル化を有さないコラーゲンアルファ1及びアルファ2鎖の計算された分子量はそれぞれ、136kDa及び127kDaである。明確にするため別個の実施態様で説明されている本発明の特定の特徴は単一の実施態様に組み合わせて提供することもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施態様で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで提供することもできる。本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更及び変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更及び変形すべてを包含するものである。本願で挙げた刊行物、特許、特許願及びGenBankアクセッション番号はすべて、個々の刊行物、特許、特許願及びGenBankアクセッション番号が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用又は確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。"