"HER2受容体の発現によって特徴付けられる癌を有すると診断された患者に対して、一回分の量と投薬頻度で示される第1用量を決定すること、該第1用量は、免疫リポソームを含まないリポソームアントラサイクリン系化学療法剤についての用量であり、該用量は、該リポソームアントラサイクリン系化学療法剤の安全で有効な量を患者に提供するために決定される、及び、アントラサイクリン含有抗HER2免疫リポソームの投与のための用量を決定すること、複数の該免疫リポソームは、それぞれがその表面に複数の抗HER2抗体分子を担持し、それぞれがアントラサイクリン系化学療法剤を含有する、ここで、該アントラサイクリン含有抗HER2免疫リポソームの投与のための安全で有効な用量は、前記第1用量である、を含んでなる、アントラサイクリン含有抗HER2免疫リポソームの投与によるHER2受容体の発現によって特徴付けられる癌を有していると診断されているヒト癌患者の治療に用いるための、安全で有効な用量を決定する方法。HER2受容体の発現によって特徴付けられる癌を有すると診断された患者に対して、一回分の量と投薬頻度で示される第1用量を決定すること、該第1用量は、免疫リポソームを含まないリポソームアントラサイクリン系化学療法剤についての用量であり、該用量は、該リポソーム剤の安全で有効な量を患者に提供するために決定される、及び、アントラサイクリン含有抗HER2免疫リポソームを投与すること、複数の該免疫リポソームは、それぞれがその表面に複数の抗HER2抗体分子を担持し、それぞれがアントラサイクリン系化学療法剤を含有する、ここで、アントラサイクリン含有抗HER2免疫リポソームは、前記第1用量で患者に投与される、を含んでなる、アントラサイクリン含有抗HER2免疫リポソームの投与によってヒト癌患者を治療する方法。アントラサイクリンがドキソルビシンである、請求項1又は2に記載の方法。免疫リポソームを含まないリポソームアントラサイクリン系化学療法剤がドキソルビシンHClリポソーム注射であり、及び、HER2標的免疫リポソームがMM-302である、請求項3に記載の方法。癌が乳癌、カポジ肉腫、卵巣癌、又は多発性骨髄腫である、請求項1~4の何れか一項に記載の方法。第1用量が、2週間毎、3週間毎又は4週間毎に、50mg/m2、40mg/m2、30mg/m2、20mg/m2又は10mg/m2である、請求項1~5の何れか一項に記載の方法。HER2受容体の発現によって特徴付けられる癌が更に、HER22、HER23又はHER2FISH陽性であると特徴付けられる、請求項1~6の何れか一項に記載の方法。ErbB2受容体の発現によって特徴付けられる癌が更に、平均して細胞当り少なくとも200,000個の細胞表面ErbB2受容体を発現するとして特徴付けられる、請求項1~7の何れか一項に記載の方法。第1用量で免疫リポソームを投与することが、癌を治療するのに有効である、請求項1~8の何れか一項に記載の方法。第1用量で免疫リポソームを投与することが、免疫リポソームを含まないリポソームアントラサイクリン系化学療法剤の第1用量での投与と比較して、心臓毒性の増大を引き起こさない、請求項1~9の何れか一項に記載の方法。第1用量で患者に免疫リポソームを投与することが、患者の血流中に免疫リポソームのピーク濃度をもたらし、及び、ここで、ほぼ該ピーク濃度で免疫リポソームを含有する培地中で培養することによりインビトロでヒト心筋細胞を処置することが、免疫リポソームを含有しない培地で培養したコントロールのヒト心筋細胞と比較して、培養された心筋細胞中のpERK又はpAKTのヘレグリン刺激による増大を減少させないか、又は5未満減少させる、請求項1~10の何れか一項に記載の方法。患者の血流中の免疫リポソーム濃度が、血清の免疫リポソーム濃度として測定される、請求項11に記載の方法。HER2免疫リポソームのそれぞれが、その表面に平均して45個の抗HER2抗体分子を担持している、請求項1~12の何れか一項に記載の方法。本発明は、例えば、ドキソルビシンHClリポソーム注射DOXIL登録商標と比べて心臓毒性の危険性が増大することなく、その他の長所をもたらして、HER2を発現している癌を治療するための、抗HER2免疫リポソームアントラサイクリンの安全な用量及び安全な使用を確認する方法を提供する。抗ErbB2を標的とする、アントラサイクリン含有免疫リポソーム、例えば、MM-302もまた、ドキソルビシンHClリポソーム注射と同じく心臓毒性がないこと、及び、心臓毒性の危険性を何ら増大させることなく又は有効性を低下させることなく、ドキソルビシンHClリポソーム注射で用いるのと全く同じ用量すなわち、用量及び投与量並びにスケジュールを用いて投与できることが今見出された。さらに、MM-302はインビトロ又はインビボで細胞当り200,000又はそれ以上のErbB2HER2受容体を発現している細胞を有効に標的にできることが今明らかにされて、HER23例えば、HERCEPTEST登録商標による、HER2FISHHER2遺伝子増幅用蛍光insituハイブリダイゼーション、又はHER22例えば、HERCEPTESTによるの何れかであるHER2過剰発現腫瘍を有する患者を治療するために用いることができることを示唆している。従って、本明細書には、アントラサイクリン含有抗HER2免疫リポソームの投与によってヒト癌患者の治療に用いるための安全で有効な用量を決定する方法が開示されており、該患者は、HER2受容体の発現によって特徴づけられる癌を有していると診断されており、方法は、HER2受容体の発現を特徴とする癌を有していると診断された患者に対する用量の規模と投薬頻度で示される第1用量を決定すること、該第1用量は、免疫リポソームを含んでいないリポソームアントラサイクリン系化学療法剤に関する用量であり、この用量はリポソームアントラサイクリン系化学療法剤の安全で有効な量を患者にもたらすよう決定される;及び、アントラサイクリン含有抗HER2免疫リポソームの投与についての用量を確定すること、複数の該免疫リポソームは、それぞれがその表面に複数の抗HER2抗体分子を担持しており、それぞれがアントラサイクリン系化学療法剤を含有しており、ここで、アントラサイクリン含有抗HER2免疫リポソームの投与の安全で有効な用量は第1用量であること、を含んでいる。アントラサイクリン含有抗HER2免疫リポソームの投与によってヒト癌患者を治療する方法も開示されていて、方法は、HER2受容体の発現を特徴とする癌を有していると診断された患者に対して、用量の規模と投薬頻度で示される第1用量を決定すること、該第1用量は免疫リポソームを含有していないリポソームアントラサイクリン系化学療法剤に関するものであって、この用量はリポソーム製剤の安全で有効な量を患者にもたらすように決定される、及び、アントラサイクリン含有抗HER2免疫リポソームを投与すること、複数の該免疫リポソームは、それぞれがその表面に複数の抗HER2抗体分子を担持しており、それぞれがアントラサイクリン系化学療法剤を含有しており、ここで、アントラサイクリン含有抗HER2免疫リポソームは第1用量を患者に投与される、を含んでいる。ある特定の態様では、アントラサイクリンはドキソルビシンである。別の態様では、免疫リポソームを含有していないリポソームアントラサイクリン系化学療法剤はドキソルビシンHClリポソーム注射であり、及びHER2を標的とする免疫リポソームはMM-302である。他には、癌は乳癌、カポジ肉腫、卵巣癌、又は多発性骨髄腫である。さらに別の態様では、第1用量が、2週間毎又は3週間毎又は4週間毎に、50mg/m2、40mg/m2、30mg/m2、20mg/m2、又は10mg/m2である。別の態様では、HER2受容体の発現を特徴とする癌はさらに、HER22、HER23、又はHER2FISH陽性であることを特徴としている。他には、ErbB2受容体の発現を特徴とする癌はさらに、細胞当り平均で少なくとも200,000の細胞表面ErbB2受容体を発現することを特徴としている。さらにまた、第1用量での免疫リポソームの投与は癌の治療に有効であり、及び他には、第1用量での免疫リポソームの投与は、免疫リポソームを含有していないリポソームアントラサイクリン系化学療法剤の第1用量での投与と比べて心臓毒性の増大を生じさせない。別の態様では、患者へ第1用量での免疫リポソームの投与は、患者の血流中において免疫リポソームのピーク濃度をもたらし、及びほぼピーク濃度の免疫リポソームを含有している培地中で培養することによるインビトロでのヒト心筋の治療が、免疫リポソームを含んでいない培地中で培養したコントロールのヒト心筋細胞と比べて、培養した心筋細胞中のpERK又はpAKTのヘレグリン刺激による増大を減少させないか又は5未満だけ減少させる。別の態様では、患者の血流中の免疫リポソーム濃度は血清免疫リポソーム濃度として測定される。さらに別の態様では、それぞれのHER2免疫リポソームはその表面に、平均45の抗HER2抗体分子を担持している。MM-302リポソームは、ドキソルビシンをゲル化又は沈降状態で含有している水性スペースを封入している直径が約75~110nmの単層脂質二重層ベシクルである。脂質膜は、ホスファチジルコリン、コレステロール、及びポリエチレングリコール誘導体化ホスファチジルエタノールアミンからなり、該ポリエチレングリコール誘導体化ホスファチジルエタノールアミンはリン脂質分子200に対してPEG分子約1つの量を有しており、ここで、それぞれ1780のリン脂質分子に対する約1個のPEG鎖はその末端にHER2と結合する単鎖Fv抗体断片を有している。MM-302リポソームは、HSPC水素化大豆ホスファチジルコリン:コレステロール植物由来:PEG-DSPEポリエチレングリコール-ジステロイルホスフォエタノールアミンのモル比3:2:0.3から製造される。MM-302の総HSPC脂質濃度は約40ミリモル/Lである。MM-302は約10ミリモル/Lの脂質、及び約2mg/mLのドキソルビシンを含有している。MM-302は、0.16~0.30mg/mLのDSPE-PEG-F5米国特許第6,210,707号に記載のようにして製造されるを含有しているリポソーム中に1.8~2.2mg/mLのドキソルビシンを含有している。F5は抗ErbB2HER2scFv抗体断片ATCCプラスミド受託番号PTA-7843によってコードされるである。MM-302リポソームは、130~170gのドキソルビシン/モルリン脂質及び12~25gF5-PEG-DSPE/モルリン脂質を含有している。MM-302は緩衝液pH6.5として滅菌した10mM/Lのヒスチジン-HCl、及び等張性を保持するために10のスクロース中に製剤化される。MM-302リポソームは予め組み込まれている硫酸アンモニウムを用いて組み込まれる。MM-302の投与用量1用量2用量3用量4用量51週間に1度10mgm220mgm230mgm240mgm250mgm22週間に1度10mgm220mgm230mgm240mgm250mgm23週間に1度10mgm220mgm230mgm240mgm250mgm24週間に1度10mgm220mgm230mgm240mgm250mgm25週間に1度10mgm220mgm230mgm240mgm250mgm2mg/m2は、患者の体表面積の平方メートル当りのドキソルビシンMM-302として製剤化されたのmgを示す。乳癌に対しては、用量3、4、又は5が望ましい。カポジ肉腫に対しては用量1、2、又は3が望ましく、卵巣癌に対しては用量3、4、又は5が望ましく、そして多発性骨肉腫に対しては用量2、3、4、又は5が望ましい。投与計画は進行性転移性腫瘍と比べて早期である転移前、例えば、アジュバント乳癌固形腫瘍を有する患者において変えることができる。好ましい腫瘍は腫瘍細胞がHER2を過剰発現するものである。HER2を過剰発現している腫瘍は、HercepTest登録商標によってHER23又はHER22であると、或いは蛍光insituハイブリダイゼーションによってHER2FISHであると同定されるものである。或いは、HER2を過剰発現する好ましい腫瘍は、実施例に記載されている方法で定量して、細胞当り平均200,000又はそれ以上の受容体を発現するものである。進行性乳癌のMM-302による治療FISHによって若しくはIHCによって又は細胞当りのHER2受容体の平均数を決定することによって確認されるように、HER2を過剰に発現している局所進行性/切除不能の又は転移性進行性乳癌を有する患者に、MM-302を4週間に1度、8、16、30、40、又は50mg/m2を、60分かけて静脈内IV注入により投与する。1絶対好中球数ANC≧1,500/μL;2血小板数≧100,000/μL;及び3ヘモグロビン≧9g/dL輸血許容から明らかなように、患者は適切な骨髄予備能を有していなければならない。1血清総ビリルビン≦ULNの1.5倍;並びに2アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼAST、アラニンアミノトランスフェラーゼALT及びアルカリホスファターゼALPが正常であるか又は正常上限の2.5倍までULN;肝転移及び/又は骨転移がある場合はALPに関して5倍のULNは許容されるから明らかなように、患者は適切な肝機能を有していなければならない。血清クレアチニン≦ULNの1.5倍から明らかなように、患者は適切な腎機能を有していなければならない。患者は、以前の手術、放射線治療又は乳癌の治療を意図するその他の治療の何れかの臨床関連毒性作用から回復していなければならない。生殖能力のある男性と同様に妊娠の可能性がある女性及び彼らのパートナーにも、治療中及びMM-302の最終投与から90日間、性行為を慎むか又は避妊の効果的な形態を用いるように警告しなければならない。治療の約30日以内にECHO又はMUGAで測定された≧50の左心室駆出分画率から明らかなように、患者は適切な心臓機能を有していなければならない。妊娠中又は授乳中の患者及びNYHAクラスIII又はIVの鬱血性心不全、或いは<50の左心室駆出分画率LVEF、或いは延長したQTC間隔≧460msを有する患者は、MM-302で治療しないことが好ましい。以下の実施例は単なる説明であって、本開示を目にした当業者には多くの改変及び均等物が明らかであるように、本開示の範囲は限定して解釈されるべきではない。これらの実施例で用いられる材料及び方法:材料:ドキソルビシンはSIGMAALDRICHInc製である。FITC結合レクチンlycopersiconesculentumトマトレクチン、CatFL-1171はVectorLaboratoriesIncから入手した。酢酸、メタノール、及びアセトニトリルはEMDChemicalsInc製である。水及びトリフルオロ酢酸TFAはJTBaker製である。HOECHST33342三塩酸塩三水和物、ProLongGold登録商標、及びDiIC185-DSDiI5は、Invitrogen製である。コレステロール及び1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン-N-[アミノポリエチレングリコール-2000]アンモニウム塩PEG-DSPEは、AvantiPolarLipidsInc.製である。水素化大豆ホスファチジルコリンHSPCはLipoid製である。RPMIはLonza製であり、ウシ胎仔血清FBSはTissueCultureBiologicals製であり、そしてペニシリンG/硫酸ストレプトマイシン混合物はGIBCOから入手した。これらの細胞は、LIMドメインホメオボックス遺伝子Isl-1、トロポニンT、及びミオシン軽鎖2cのような心筋細胞の適切な細胞マーカーを発現することが示されている。トロポニン陽性細胞のパーセントを分化後に確認する。トロポニンTについて70未満の陽性を含有しているバッチを廃棄する。誘導多能性幹細胞由来iPSd細胞をCellDynamicsInternationalから入手して製造会社のプロトコルに従って取り扱う。異種移植の検討:5~7週齢の雌性ヌードマウスをCharlesRiverLaboratories又はTaconicFarmsInc.から購入するNCrヌードマウス。別段に指示されない限り、マウスはマウスの背部右脇腹内に皮下注射で、s.c.BT474-M3乳癌細胞又はNCI-N87胃癌細胞NCI-DPT、RPMI100μL中10×106細胞を接種される。腫瘍が平均体積~200mm3に達したときに、以下に記載のような検討を行った。腫瘍HER2レベルの検査:ホモ接合型NCrヌードマウスの右上側から二番目の乳房脂肪体に15×106個のBT474-M3細胞を接種する。BT474-M3腫瘍を、ドキソルビシンを有さない蛍光標識された以下に記載されるようにDiI5で、HER2標的化又は非標的化リポソーム4mg/mlの単回用量で注射した。24時間後に、腫瘍を摘出して機械的又は酵素的手段で解離する。抗HER2による表面染色の後、細胞をFACSCalibur登録商標装置BDBiosciences上でのフローサイトメトリーによって分析する。HER2のシグナルが増大することによって定義された狭く囲われた細胞サブセットにおいて、上昇したリポソーム含有量を有する細胞の全てを含めたパーセントをプロットすることによって、フローサイトメトリーのデータセットを所定の閾値を上回るHER2の表面発現レベルとリポソームの取り込みとの間の関係について分析する。細胞表面HER2の単一細胞における分布:BT474-M3腫瘍異種移植組織を抗HER2抗体で染色してDAPIで対比染色する。スライドを、Aperio登録商標Scanscope登録商標を用いて倍率20倍で画像化して、画像を分析する。HER2膜染色の強度を、HER2層の内縁の平均値HER2層の外縁の平均値として単一細胞を基準として定量する。有効性の検討:3mg/kgq7d、n=3、総用量で、PBSコントロール、MM-302又はPLDを投与されたマウス由来の平均腫瘍体積に基づいて、マウスを3つの処置群n=7/群に無作為に分ける。1週間に2回腫瘍をノギスで測定する。式:幅2×長さ×0.52、を用いて腫瘍体積を計算する。1週間に2回マウスの体重を測定して体重減少を観察する。HER2を発現している細胞株のリポソームの取り込み:各種レベルのHER2を発現している複数の細胞株を15μg/mlのMM-302又はPLDで2時間処置して、細胞内ドキソルビシンをHPLCで定量する。マウス4T1乳癌細胞及びヒトHeLa子宮頸癌細胞をATCCから得て、ATCCのアドバイスに従って増殖させる。市販の抗HER2抗体BDBiosciences340552を用いるフローサイトメトリーで、細胞をヒトHER2発現について特徴付ける。この抗体はマウスHER2とは交差反応しないがヒトHER2を検出する。ヒトHER2をコードするネオマイシン選択可能な発現ベクターをGeneCopeiaから入手する。4T1及びHeLa細胞をこの構築物で、非脂質ポリマートランスフェクション試薬MegaTran登録商標1.0Origeneを用い製造会社の使用説明書に従って、トランスフェクトした。400~500μg/mlのジェネテシン/ネオマイシンInvitrogenを用いてトランスフェクトした細胞を選択する。生存細胞を減少したジェネテシン/ネオマイシン100μg/mlの下で増殖させ、BDBiosciencesFACSAria登録商標装置でふるい分けして、親のHeLa細胞で観察されるものを上回るヒトHER2の発現を有する濃縮された細胞集団を得る。次いで選別により濃縮された細胞を限定希釈によってサブクローン化し、コロニーをHER2表面レベルによってランク付けし、HER2を異なった範囲で発現する4T1及びHeLa細胞の代表的な集団を得る。フローサイトメトリーで測定されるHER2による表面染色の蛍光強度を、製造会社の使用説明書に従ってQuantum登録商標SimplyCellular登録商標抗マウスIgGミクロスフェアBangsLaboratories815に結合する同じ抗体を用いた染色と比較して、細胞のHER2表面受容体の数を計算する。心筋細胞におけるリポソームの取り込み:iPSd心筋細胞CellDynamicsInternationalCatCMC100110001を、製造会社の説明書に従って、24ウェルの組織培養プレートに250,000細胞/ウェルで蒔く。2日後に、ウェル中の培地を0.5ml除去して、MM-302、PLD又は遊離ドキソルビシンを15.0μg/mldoxequiv.で含む0.5mlと置き換える。プレートを8の字様に20回回転させて細胞のリポソームへの曝露を最大にする。細胞をMM-302、PLD、又は遊離ドキソルビシンと示された期間培養して、その後培地を除去し、細胞を0.5mlのPBSで一回洗浄する。PBSを除去して、0.5mlの0.05トリプシンを各ウェルに添加する。細胞を観察して、細胞の剥離が始まったら、FBSを含有している0.5mlの培地を各ウェルに添加してトリプシンを不活性化する。細胞を採取してマイクロ遠心分離管に入れる。細胞を1,500rpmで4°C、5分間回転させる。細胞ペレットを1.0酢酸のメタノール溶液0.5ml中にボルテックス及びピペッティングすることによって再懸濁し、-80°Cで1時間放置してドキソルビシンを抽出する。再懸濁した細胞ペレットを含有しているマイクロ遠心分離管を低温室で10分間10,000rpmで回転させて、450μlの上澄液をHPLC管に移す。サンプルをHPLC機械上で操作してサンプル当りの濃度をドキソルビシンの標準曲線に関連する値によって決定する。リポソームの生体内分布:PBS、ドキソルビシン、MM-302-DiI5、又はPLD-DiI5の何れかを単回静脈内i.v.用量全て3mg/kgで投与されたマウスを、それぞれ4群に無作為に分ける。マウスn=4/時点/群を、単回投与後0.5、4、24、及び96時間ドキソルビシン又は168時間MM-302-DiI5及びPLD-DiI5に屠殺する。屠殺の5分前に、血管系を標識化するために100μlのFITC-レクチンをマウスに注射する。ドキソルビシンのHPLCによる定量化:心臓組織の重さを量り、3分間TissueLyser登録商標Qiagenを用いて1mlの水で分離させる。次いで、100μlのホモジネートを新しい管に移して1酢酸/メタノールを900μl添加する。培養細胞に関しては、細胞を、上記のように薬剤で処置し、トリプシン処置して、1.0酢酸のメタノール溶液を用いて溶解する。溶解物を10秒間ボルテックスして、-80°Cで1時間放置する。サンプルを室温RTで10分間、10,000RPMで回転させる。上澄液及びドキソルビシン標準品をC18逆相カラムSynergi登録商標POLAR-RP登録商標80Å250x4.60mm4μmカラムを用いるHPLCDionexで分析する。ドキソルビシンは、30アセトニトリル;700.1トリフルオロ酢酸TFA/H2Oから55アセトニトリル;450.1TFA/H2Oの濃度勾配を流速1.0ml/分、7分間で走らせて溶出する。ドキソルビシンのピークは、485nmで励起され、590nmで発光し、インライン蛍光検出器を用いて6.5分に検出される。心臓組織からのドキソルビシンの抽出効率は、既知量のドキソルビシンでスパイクしたコントロールの心臓で測定されるように、83であった。心臓スナップ凍結切片の共焦点顕微鏡及び画像分析:厚さ10μmの心臓切片を室温で30分間風乾し、封入剤ProLongMadisonWisconsinCDICMC100010001Lot1258680を、iCell登録商標PlatingMediumを用いて培養して、MM-302の成分に曝露する。次いで、心筋細胞中のリン酸化AKTpAKT及びリン酸化ERKpERKのレベルを免疫染色及びハイコンテント顕微鏡法を用いて測定する。細胞を、トラスツズマブ、ラパチニブ、又はMM-302抗体F5-scFvのいずれかで、及びドキソルビシンを含有していないMM-302の5.0μg/mlと等価な濃度のMM-302分子リポソームF5-リポで前処置する。10nM及び5nMのヘレグリンでの10分間の刺激に続いて、ApAKT及びBpERKのそれぞれについて上に記載したように細胞を染色し、そしてハイコンテント顕微鏡法を用いて画像化する。以下の一次抗体をブロッキングバッファーで1:400に希釈して用いる:pERK抗体-CellSignalingTechnology-Catalog9106LMousemAb9106;pAKT抗体-CST-Catalog4060LXP登録商標RabbitmAb4060。二次抗体は、抗マウスIgGHL、Fab’2断片AlexaFluor登録商標647Conjugate-CST-Catalog4410;抗ウサギIgGHL、Fab’2断片AlexaFluor登録商標647Conjugate-CST-Catalog4414である。全細胞染色及びDNA染色Hoechst33342を上記のように用いる。画像を分析して個々の細胞をHoechst33342核染色に基づいて区分する。単一細胞のシグナル伝達強度をそれぞれの染色について定量して個々の細胞の平均相対強度として表わす。以下の実施例の結果は上記の方法又はそれに些細な変更を有する方法を用いて得られた。HER2を種々のレベルで発現する腫瘍細胞株での細胞取り込み試験は、MM-302がHER2を過剰に発現している腫瘍細胞にPLDと比べて著しく高いレベルでドキソルビシンを送達すること、高い透過性を有する遊離ドキソルビシンと比べて同等又はより高いレベルで送達することを明らかにしている。しかしながら、ヒト心筋細胞では、遊離のドキソルビシンが高いレベルで再び取り込まれたのに対して、MM-302及びPLDの両方でのドキソルビシンの取り込みは劇的に低かった。マウスにおける薬物動態試験は、MM-302が、PLDと比較して類似の半減期、クリアランス、及び臓器分布を有していることを明らかにしている。HER2を過剰発現しているBT474乳癌及びNCI-N87胃癌異種移植片において、MM-302は遊離アントラサイクリン及びPLDの両方よりも優れた抗腫瘍活性を示す。腫瘍微小分布研究はさらに、腫瘍におけるドキソルビシンの局在性の差が遊離ドキソルビシン及びPLDと比べたMM-302の活性の増大の要因であることを示唆している。実施例1:インビトロにおけるHER2発現とMM-302の取り込みの間の相関関係:多数の細胞株における細胞表面HER2発現のレベルを上記のように確認した。次いでこれらの同じ細胞株を15μg/mlのMM302図1A、表1又はPLD図1B、表2で180分処置し、その後細胞を採取して細胞に結合しているドキソルビシンの量をHPLCで定量した。処置後にそれぞれの細胞株について細胞当りのHER2受容体の数対同一細胞株における細胞当りのドキソルビシンの量をプロッティングすることによって、増大するHER2レベルと増大するドキソルビシンの間の関係が明らかになる。この提示により、細胞当り約200,000のHER2受容体に変曲点があると考えられ、ここでこの数より多くを発現している細胞は一貫してより高いレベルの細胞に結合したドキソルビシン有していると考えられる。纏めると、これらの結果は、変曲点以上のレベルのHER2を発現している細胞HER2過剰発現癌のようなによる高い取り込み、及び変曲点以下のレベルのHER2を発現している細胞正常組織の細胞、例えば、心筋細胞のようなには取り込まれないか最小限取り込まれるという、MM-302の特異性を裏付けている。異なった細胞集団内への取り込みを定量するために、赤色蛍光性カルボシアニンのトレーサーであるDiIC185-DSInvitrogenD12730-DiI5と省略されるを含有するようにMM-302を製造した。DiI5は押出し工程中にリポソームの脂質二重層内に挿入する脂溶性の蛍光染料である。異なった範囲のヒトHER2を発現している4T1-Her2細胞集団を10μg/mlの蛍光標識したMM302と3時間培養し、洗浄して、更に21時間培養した。細胞を採取し、細胞表面ヒトHER2を染色して、フローサイトメトリーによってHER2レベル及びリポソーム結合の両方を分析した。4T1細胞株はネズミHER2を発現するのに対して、MM-302はネズミ受容体と結合しない。図は、これらのリポソームの4T1への取り込みがヒトHER2発現に強く依存していたことを示す図1C。異なった範囲のHER2を発現しているHeLa細胞株の集団について同様な結果が得られた図1D。これらの結果は更に、MM-302は高レベルのHER2を有している細胞を非常に有効に結合するが比較的低いHER2タンパク質発現を有する細胞とは殆ど結合しないことを明らかにしている。実施例2:MM-302はHER2過剰発現腫瘍細胞内に効率的に内部移行し、そして異種移植モデルにおいて腫瘍の生育を有意に阻害する:MM-302のHER2過剰発現腫瘍細胞への結合及び内部移行のレベルを測定するために、BT474-M3細胞1.7×106HER2/細胞を15μg/mlのMM-302、PLD又は遊離ドキソルビシンと最大3時間培養した図2A。総細胞結合図2A及び核内ドキソルビシン蓄積図2Bから分かるように、MM-302は効果的に腫瘍細胞内に取り込まれた。対照的に、標的化されていない類似物であるPLDは、感知できるほどのいかなる蓄積も示さず、このことはインビトロでリポソームドキソルビシンを効果的に送達するために標的化の必要性を示している。コントロールとしての、遊離ドキソルビシンは自由に細胞に入って核内に蓄積することが示された。結果は、HER2過剰発現腫瘍細胞へのMM-302の効果的な結合及び内部移行を示した。乳癌の異種移植モデルにおいてMM-302の抗腫瘍活性を評価した。マウスにBT474-M3細胞を接種して、腫瘍体積が平均250mm3に達したときに、PBSコントロール、MM-302又はPLD両方とも6mg/kgdoxequiv.による処置を開始したq7d、n=3、用量。MM-302とPLDの両方はコントロールと比較して有意に腫瘍の生育を阻害した55日目のt検定;p<0.0001。MM-302はPLDと比較して腫瘍生育のより強い阻害をもたらした55日目のt検定;p=0.0310図2C。検討終了時に、3例の完全退行がMM-302で観察されたが、PLDではたった1例であった。MM-302及びPLDは同様な薬物動態プロファイルを有していて図2D、改善された効果は、長期に渡る曝露ではなく、HER2標的化の結果であることを示唆している。実施例3:インビボにおけるMM-302の取り込みに対するHER2レベルの影響:異種移植モデル由来の標的腫瘍細胞内へのMM-302のHER2介在取り込みを、非標的化リポソームドキソルビシンと比較して明らかにするための実験を行った。乳房脂肪体にBT474-M3異種移植腫瘍を担持しているマウスにDiI5で標識したMM-302DiI5-F5-PLD又はUT-PLDDiI5-UT-PLを注射した。腫瘍の単一細胞懸濁液を調製してFITC-HER2抗体で染色した。DiI5陽性-HER2陽性細胞をFACSで測定した。上昇したドキソルビシンレベルを有する特徴的な細胞集団が確認され、リポソームは腫瘍間質腔内に蓄積されているばかりではなく、細胞自体の中にも取り込まれていることが示された図3A。これはHER2標的化リポソームで処置した腫瘍に由来する細胞サンプルにおいて特に明らかだった。上昇したリポソーム含量を有する細胞のパーセントは細胞当り平均100,000及び200,000のHER2受容体を発現する細胞サブセットで上昇し始めた。非標的化リポソームはHER2陽性細胞への優先的な取り込みを示さなかった。これらの結果は、インビボにおける腫瘍細胞へのMM-302の取り込みがHER2依存性であることを明らかにし、さらに細胞当り少なくとも100,000~200,000のHER2受容体がMM-302の有意な結合及び内部移行を可能にするために必要であることを裏付けている。HER2の膜での強度分布が、全組織切片において単一細胞を基準として測定され、図3Bに示されており、これは組織における発現のばらつきを表わしている。実施例4:ヒト心筋細胞はMM-302を活発に取り込むのに十分なレベルのHER2を発現しない:ヒト心筋細胞は低レベルのHER2を発現することが報告されているので、MM-302を取り込む可能性を有していると考えられていた。インビトロにおいてヒト心臓細胞に対するMM-302の効果を検討するために、ESCd及びiPSdヒト心筋細胞を入手した。心筋細胞上のHER2受容体レベルは、qFACSによって、ESCd及びiPSdヒト心筋細胞において、それぞれ細胞当り約70,000及び200,000受容体であると確認した。これらの結果は、報告されているヒト心臓組織における低いHER2発現と一致しているFuchsetalBreastCancerResTreat200382238。正常及び病変ヒト心臓組織におけるHER2の発現レベルを定量的免疫組織化学によって測定した。ヒト心臓組織マイクロアレイTMAをHER2に対して及びDAPIで染色して、平均HER2強度/コアをDefiniens登録商標ソフトウェアを用いて定量した。異なったHER2発現レベルの細胞株を用いて細胞ペレットアレイを上記のように染色し、平均HER2強度/コアを定量し、対応するLOGHER2受容対数に対してプロットして標準を作成した。作成した標準に基づいて、異なったヒト心臓TMAコアについて平均HER2受容対数/コアを内挿した表3。心筋細胞におけるHER2発現のレベルがMM-302の取り込みを誘発するのに十分であるかを確認するために、ESCd図4A及びiPSd図4B心筋細胞の処置に続いて、総細胞内ドキソルビシンをHPLCで定量した。遊離のドキソルビシンで処置した心筋細胞及び癌細胞は全ての細胞にドキソルビシン蓄積をもたらした。PLDによる処置は、何れの心筋細胞の細胞型にもドキソルビシンの送達の増大をもたらさなかった。HER2過剰発現癌細胞と対照的に、心筋細胞におけるHER2発現レベルはMM-302の活発な取り込みを促進するのに十分ではなかった。纏めると、これらの結果は、MM-302によるドキソルビシンの送達が、PLDと比べて、心筋細胞のような低いレベルのHER2を発現する非標的細胞へのドキソルビシン曝露を増強しないことを明らかにしている。実施例5:MM-302はヒト心筋細胞の生存能を減少させないか又はアポトーシス応答を刺激しない:低レベルのドキソルビシンへの曝露は細胞毒性になることがある。MM-302又はPLDによる処置が心筋細胞の生存能に影響するかどうかを確認するために、ESCd心筋細胞を指示された濃度の遊離ドキソルビシン、PLD又はMM-302と3時間培養した後、洗浄して、新鮮な培地と24時間培養した。遊離のドキソルビシンによる処置は0.2μg/ml程度の低い濃度で生存能の損失をもたらした図4C。反対に、MM-302及びPLDによる処置は、最大45μg/mlの非常に優れた治療濃度を含む、試験した何れの濃度でも生存能の減少をもたらさなかった。MM-302又はPLDによる処置が心筋細胞の生存能に影響するかを更に試験するために、iPSd心筋細胞を指示された濃度の遊離ドキソルビシン、PLD又はMM-302で24時間処置した。ドキソルビシンによる処置はPLD及びMM-302による処置と比べて生存能の顕著な減少をもたらした図4D。上昇したレベルの心臓トロポニンの存在は心臓障害の臨床指標である。DにおけるiPSd心筋細胞由来の上澄液をトロポニンIのレベルについて分析した。図4Eに示されるように、ドキソルビシン処置はPLD又はMM-302による処置と比べてトロポニンIの顕著な増大をもたらした。これらの結果は、ESCd及びiPSd心筋細胞がドキソルビシンに対して感受性があること、及びMM-302及びPLDによる処置は心筋細胞の生存能に影響を与えるのに十分なドキソルビシン曝露をもたらさないことを明らかにしている。細胞の低レベルのドキソルビシンへの曝露は、DNA損傷、細胞ストレス及び初期アポトーシスを含む、細胞生存能測定では明らかにできない僅かな細胞変化を誘発する可能性がある。MM-302、PLD及び遊離ドキソルビシンによる処置に続いて、それらの応答経路のそれぞれにおいてタンパク質で染色して、ハイコンテント顕微鏡を用いて画像化した。ImageRailを用いて得られた画像を分析して単一細胞のデータを作成した。二本鎖DNA損傷に応答して、ヒストンH2AXはリン酸化されて、γ-H2AXを形成する。心筋細胞の遊離ドキソルビシンによる処置は、核γ-H2AXの用量依存性増大をもたらした図5A。しかしながら、MM-302及びPLDによる処置は試験した何れの濃度においても核γ-H2AXシグナルを増大させず、リポソームカプセル化がインビトロにおいて心筋細胞のDNA損傷を阻害したことを示唆している。細胞ストレスに応答して、HSP27及びp53はリン酸化されて、損傷の程度に応じて細胞周期停止、続いてDNA修復又はアポトーシスを引き起こす。遊離ドキソルビシンに曝露された心臓細胞は、処置に続く細胞ストレスの誘発を示唆しているリン酸化HSP27及びリン酸化p53の用量依存性増大を明らかにしている図5B及び5C。しかしながら、濃度に関わらずMM-302又はPLDの何れかで処置した細胞ではリン酸化HSP27の増大は観察されなかった。多くの場合、MM-302又はPLDで処置した細胞においては、5.0μg/mlのMM-302による処置に続くリン酸化p53の僅かな増大を除いて、リン酸化p53に対する影響はないと考えられた。しかしながら、この濃度及びより高い濃度での処置は細胞死を引き起こさなかった。重度のDNA損傷及び細胞ストレスの場合は、細胞はカスパーゼカスケードの活性化を含むアポトーシス経路を開始して、最終的にはDNA修復タンパク質PARPの切断を引き起こす。遊離ドキソルビシン5.0μg/mlによる処置は、観察された細胞死の増大と相関する、核の切断されたcleavedPARPcPARPの増大を引き起こした図5D。しかしながら、MM-302及びPLDによる処置は核cPARPの増大を引き起こさず、これらの条件下での処置がアポトーシスを誘発するのには十分ではないことを示唆した。実施例6:心筋細胞の細胞内シグナル伝達に対するHER2標的化薬剤の影響:ドキソルビシンとトラスツズマブの併用は、この組み合わせで治療された患者で観察された心臓事象の受入れ難い高発生率により禁忌である。この組み合わせに関連する心臓毒性の作用メカニズムは、ドキソルビシンによる細胞ストレスの誘発と、ドキソルビシンによって誘発された細胞ストレスへの応答に必要とされるHER2シグナル伝達経路のトラスツズマブ介在性の阻害による細胞ストレスの誘発とが、同時に起こることであると考えられる。MM-302による前処置がHER2の介在するシグナル伝達心筋細胞における必須経路を変化させるか否かを確認するために、iPDd心筋細胞をトラスツズマブ、ラパチニブ小分子のHER2チロシンキナーゼ阻害剤、又はMM-302抗体F5-scFv及びドキソルビシンを含有していないことを除いてMM-302と同一の空リポソームF5-lipoで24時間前処置した。10nM図6A及び5nM図6BのヘレグリンHRGで10分間刺激した後、リン酸化AKTpAKT、図6A及びリン酸化ERKpERK、図6Bのレベルを上記のようにハイコンテント顕微鏡法で測定した。トラスツズマブによる24時間の前処置は両タンパク質のHRG介在性のリン酸化の減少をもたらした。ラパチニブによる前処置はAKTとERKの基礎リン酸化の減少、さらにはこれらタンパク質のHRG誘発性のリン酸化の完全阻害をもたらした。F5-lipoでの前処置はAKT又はERKのHRG誘発性のリン酸化を阻害しなかった。これらの結果は、HER2を標的にしているのにも関わらず、MM-302は、心筋細胞におけるリガンドによって誘発されるリン酸化AKT及びリン酸化ERKのシグナル伝達を阻害せず、これらの重要な意味をもつシグナル伝達経路を機能的なままにしておくことを示唆している。これらの結果は、トラスツズマブ及びラパチニブが、F5scFv又はF5lipoよりも、心筋細胞におけるこのシグナル伝達経路に対して有意に大きな悪影響を有していることも示している。これは同様に、MM-302の抗HER2抗体成分が、抗HER2抗体トラスツズマブより心臓毒性が低いことを示している。この結果は、単独の又はMM-302リポソームの外側に結合しているF5が、必須の細胞内シグナル伝達様式であり、その阻害はトラスツズマブ誘発性の心臓毒性を仲介する主要なメカニズムであると考えられている、ヘレグリンリガンドによって刺激されるHER2/HER3ヘテロ二量体が介在するシグナル伝達を心筋細胞において妨害しないことを示している。実施例7:MM-302はマウス心臓組織内に、遊離ドキソルビシンと比べてより低い蓄積を有している:F5のような特異性の高い抗体断片を有するリポソームの標的化は、一般に、リポソームの総組織沈着を変化させず、むしろ血管外溢出に続くそれらの微小分布を変化させる。MM-302四角、PLDUT-PLD、三角及びドキソルビシン遊離dox、丸のマクロレベル生体内分布を、上記のように接種したNCI-N87腫瘍担持マウスのマウス心臓組織図7A、ヒト異種移植腫瘍組織図7B及び足組織図7Cにおいて比較した。マウスn=4/時点/群にMM-302、PLD、又は遊離ドキソルビシン全て、3mg/kg、doxequiv.を静脈内注射して、注射後0.5、4、24、及び96時間ドキソルビシンに関して又は168時間MM-302及びPLDに関してに心臓を採取して、ドキソルビシンをHPLCで定量した図7A。遊離ドキソルビシンの注射は2つのリポソーム製剤と比べて0.5時間目に心臓に高いピークの曝露をもたらした注射した用量i.d./組織gの10。遊離ドキソルビシン注射後の心臓組織からのドキソルビシンのクリアランスはMM-302及びPLDと比べてより速く、そして24時間におけるドキソルビシンの検出量i.d./組織gの0.77はバックグラウンドに接近していた。MM-302とPLDの両方は24時間がピークMM-302とPLDがそれぞれ2.8と2.6である持続した蓄積プロファイルを有したが、168時間目に値はバックグラウンドに戻った。これらの結果は別のPLD製剤の心臓生体内分布について先に報告されたデータのそれと類似の範囲内であった。MM-302とPLDの心臓生体内分布の間に有意な差異は観察されなかった。実施例8:MM-302はマウス組織において遊離ドキソルビシンと比べてより低い核内ドキソルビシン蓄積をもたらす:遊離ドキソルビシン、MM-302-DiI5又はPLD-DiI5の何れか全て3mg/kgdoxequiv.を注射したマウスの注射後0.5、4及び24時間の心臓組織から作成した凍結切片において、ドキソルビシン自然蛍光性及びリポソームDiI5標識化の微小分布を分析した。心臓血管を可視化するために、屠殺前5分にマウスにFITCレクチンを静脈内注射した。心臓切片を蛍光共焦点顕微鏡で画像化した。3時点で分析した0.5、4及び24時間異なる処置群の代表的な領域を図7Dに示す。非処置心臓も画像化して、代表的な画像を図7D左図に示す。ドキソルビシンと核シグナルとの共局在化を図7Dの下図に示す。0.5時間時点におけるドキソルビシンとMM-302の両方についての、核ドキソルビシンシグナルの高倍率画像を図7Eに示す。MM-302では核内にドキソルビシンシグナルが見えないのに対して、遊離ドキソルビシンでは大部分の核がドキソルビシン陽性である。画像を上記のように分析して、ドキソルビシン陽性核のパーセントを確認した。遊離ドキソルビシンの注射は0.5時間時点で、約50の核がドキソルビシンに陽性を示し、ドキソルビシンの顕著な核内蓄積をもたらした。しかしながら、4時間までにはわずか23の核がドキソルビシンに対して陽性であって、24時間時点でシグナルは基底レベル内に戻った。リポソーム製剤では、多くの視野でシグナルが殆ど又は全く検出されなかった。DiI5チャンネルリポソームでシグナルがたまに検出された。これらの場合は、リポソームのシグナルは大部分がFITCレクチンシグナルと共局在化していて、リポソームが心臓組織内に侵出していないが血管成分に保持されていることを示している。MM-302-DiI5又はPLD-DiI5で処置すると、時点に関係なく、分析した大部分の心臓領域の核内にドキソルビシンは検出されなかった。0.5時間時点に採取した4つのMM-302-DiI5心臓のうちの1つにおいて及び4時間時点に採取した4つのMM-302-DiI5心臓のうちの1つにおいて、血管外スペースにリポソームシグナルが検出され、そしてわずかな割合の核にドキソルビシンが見出された。同様に、0.5時間時点に採取した4つのPLD心臓のうちの1つにおいて及び24時間時点に採取した4つのPLD心臓のうちの2つにおいて、画像が血管外リポソームシグナル及び核ドキソルビシンの存在を明らかにした。これらの領域は代表的な画像として表わされていないが、これらの値は図7Fに示される定量化に関して考慮されている。MM-302とPLDの両方の曲線下領域は遊離ドキソルビシンAUCより統計的有意に低かったp<0.001。MM-302とPLDのAUCの間に有意な差異は観察されなかった。心臓組織におけるドキソルビシン及びリポソームの分布の広範な可視化を得るために、全心臓切片のスキャンを行った。全心臓切片スキャンは、共焦点顕微鏡の結果を可視的に確認して、遊離ドキソルビシン注射による核局在化を有する広範なドキソルビシン分布を示し、DiI5MM-302又はDiI5PLDの何れかを注射したマウスの心臓内に極めてまれにリポソーム及びドキソルビシンシグナルを示している。要約すると、MM-302又はPLDの何れかでの処置は、遊離ドキソルビシンによる処置後に見られるものより有意に低い核内ドキソルビシン蓄積を示す一方で、これはMM-302とPLDの間では有意に異なっていなかった。均等物当業者は、本明細書に記載されている特定の実施態様の多くの均等物を確認するか、通常の実験以上のものを用いずに評価及び実施できるだろう。このような均等物は以下の特許請求の範囲の範囲内であることが意図されている。従属クレームに開示されている実施態様の何れかの組み合わせは本開示の範囲内であることが意図されている。参照による取り込み本明細書中に言及されている米国及び外国の特許及び係属中の特許出願、並びに刊行物はその全てが参照により本明細書に明確に取り込まれている。"