"下記一般式I:[式中、Xは、フェニレン基;Yは、水素原子、または-CH2mR1;mは0~4のいずれかの整数;R1は、R2は、置換されていてもよいC1~C6アルキル基、置換されていてもよいアリール基、またはC1~C6アルコキシ基;R3およびR4は、それぞれ独立して水素原子、C1~C6アルキル基、あるいはR3とR4が隣接する窒素原子と一緒になって含窒素複素環を形成していてもよい;R5は、水素原子、C1~C6アルキル基、またはC1~C6アルキルスルホニル基;Zは、水素原子またはC1~C6アルキル基を示す。]で表される化合物、もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物を有効成分とする、血小板の機能を維持するための組成物。前記一般式Iで表わされる化合物が、N-[2-4-ブト-2-イニルオキシベンゼンスルホニル-1-4-ジエチルアミノメチルフェニルエチル]-N-ヒドロキシホルムアミド、またはN-{4-[2-4-ブト-2-イニルオキシベンゼンスルホニル-1-ホルミルヒドロキシアミノエチル]ベンジル}メタンスルホンアミド、である、請求項1に記載の組成物。血小板の機能を維持するための試薬または血小板を含む血液製剤への添加剤である、請求項1または2に記載の組成物。巨核球に分化し得る細胞から巨核球に分化誘導させ、該巨核球から血小板を産生させる培養系に、下記一般式I:[式中、Xは、フェニレン基;Yは、水素原子、または-CH2mR1;mは0~4のいずれかの整数;R1は、R2は、置換されていてもよいC1~C6アルキル基、置換されていてもよいアリール基、またはC1~C6アルコキシ基;R3およびR4は、それぞれ独立して水素原子、C1~C6アルキル基、あるいはR3とR4が隣接する窒素原子と一緒になって含窒素複素環を形成していてもよい;R5は、水素原子、C1~C6アルキル基、またはC1~C6アルキルスルホニル基;Zは、水素原子またはC1~C6アルキル基を示す。]で表される化合物、もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物を添加することを特徴とする、血小板を調製するための方法。前記一般式Iで表わされる化合物が、N-[2-4-ブト-2-イニルオキシベンゼンスルホニル-1-4-ジエチルアミノメチルフェニルエチル]-N-ヒドロキシホルムアミド、またはN-{4-[2-4-ブト-2-イニルオキシベンゼンスルホニル-1-ホルミルヒドロキシアミノエチル]ベンジル}メタンスルホンアミド、である、請求項4に記載の方法。前記培養系における培養温度が35~38°Cであることを特徴とする、請求項4または5に記載の方法。巨核球に分化し得る細胞から巨核球に分化誘導させ、該巨核球から血小板を産生させる培養系に、下記一般式I:[式中、Xは、フェニレン基;Yは、水素原子、または-CH2mR1;mは0~4のいずれかの整数;R1は、R2は、置換されていてもよいC1~C6アルキル基、置換されていてもよいアリール基、またはC1~C6アルコキシ基;R3およびR4は、それぞれ独立して水素原子、C1~C6アルキル基、あるいはR3とR4が隣接する窒素原子と一緒になって含窒素複素環を形成していてもよい;R5は、水素原子、C1~C6アルキル基、またはC1~C6アルキルスルホニル基;Zは、水素原子またはC1~C6アルキル基を示す。]で表される化合物、もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物を添加した培養物。前記一般式Iで表わされる化合物が、N-[2-4-ブト-2-イニルオキシベンゼンスルホニル-1-4-ジエチルアミノメチルフェニルエチル]-N-ヒドロキシホルムアミド、またはN-{4-[2-4-ブト-2-イニルオキシベンゼンスルホニル-1-ホルミルヒドロキシアミノエチル]ベンジル}メタンスルホンアミド、である、請求項7に記載の培養物。下記一般式I:[式中、Xは、フェニレン基;Yは、水素原子、または-CH2mR1;mは0~4のいずれかの整数;R1は、R2は、置換されていてもよいC1~C6アルキル基、置換されていてもよいアリール基、またはC1~C6アルコキシ基;R3およびR4は、それぞれ独立して水素原子、C1~C6アルキル基、あるいはR3とR4が隣接する窒素原子と一緒になって含窒素複素環を形成していてもよい;R5は、水素原子、C1~C6アルキル基、またはC1~C6アルキルスルホニル基;Zは、水素原子またはC1~C6アルキル基を示す。]で表される化合物、もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物が添加された、血小板を含む血液製剤。前記一般式Iで表わされる化合物が、N-[2-4-ブト-2-イニルオキシベンゼンスルホニル-1-4-ジエチルアミノメチルフェニルエチル]-N-ヒドロキシホルムアミド、またはN-{4-[2-4-ブト-2-イニルオキシベンゼンスルホニル-1-ホルミルヒドロキシアミノエチル]ベンジル}メタンスルホンアミド、である、請求項9に記載の血液製剤。下記一般式I:[式中、Xは、フェニレン基;Yは、水素原子、または-CH2mR1;mは0~4のいずれかの整数;R1は、R2は、置換されていてもよいC1~C6アルキル基、置換されていてもよいアリール基、またはC1~C6アルコキシ基;R3およびR4は、それぞれ独立して水素原子、C1~C6アルキル基、あるいはR3とR4が隣接する窒素原子と一緒になって含窒素複素環を形成していてもよい;R5は、水素原子、C1~C6アルキル基、またはC1~C6アルキルスルホニル基;Zは、水素原子またはC1~C6アルキル基を示す。]で表される化合物、もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物を、血小板を含む血液製剤に添加することを特徴とする、血液製剤における血小板の機能を維持するための方法。前記一般式Iで表わされる化合物が、N-[2-4-ブト-2-イニルオキシベンゼンスルホニル-1-4-ジエチルアミノメチルフェニルエチル]-N-ヒドロキシホルムアミド、またはN-{4-[2-4-ブト-2-イニルオキシベンゼンスルホニル-1-ホルミルヒドロキシアミノエチル]ベンジル}メタンスルホンアミド、である、請求項11に記載の方法。本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、ADAM17のメタロプロテアーゼ活性を特異的に抑制し、GPIbαのシェディングを抑制することによって、血小板の機能を維持することを可能とする化合物を同定することにある。さらなる本発明の目的は、同定した化合物を利用して血小板の機能を維持する組成物を提供すること、効率的に血小板を産生すること、および血液製剤の品質維持の向上を図ることにある。本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ES細胞やiPS細胞等に由来する造血前駆細胞から巨核球への分化誘導や、該巨核球からの血小板産生は、25°Cの室温条件での培養では行うことができず、37°C付近の培養条件が好ましいことを見出した。そこで、本発明者らは、次に、37°C付近の培養において生じるADAM17によるGPIbαのシェディングを特異的に抑制しうる化合物の探索を行った。その結果、特定の構造を有するN-ヒドロキシホルムアミド誘導体が、ADAM17に対して特異的な阻害作用を有し、血小板を産生させる培養系やヒト末梢血由来の血小板に添加した場合、GPIbαのシェディングが抑制され、37°C付近の温度条件下においても血小板の機能が維持されることを見出した。本発明者らは、同定したN-ヒドロキシホルムアミド誘導体のこのような作用から、当該誘導体が効率的な血小板の産生や血小板を含む血液製剤の品質維持の向上などにおいて極めて有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。本発明は、より詳しくは、以下の発明を提供するものである。1下記一般式I:[式中、Xは、フェニレン基;Yは、水素原子、または-CH2mR1;mは0~4のいずれかの整数;R1は、R2は、置換されていてもよいC1~C6アルキル基、置換されていてもよいアリール基、またはC1~C6アルコキシ基;R3およびR4は、それぞれ独立して水素原子、C1~C6アルキル基、あるいはR3とR4が隣接する窒素原子と一緒になって含窒素複素環を形成していてもよい;R5は、水素原子、C1~C6アルキル基、またはC1~C6アルキルスルホニル基;Zは、水素原子またはC1~C6アルキル基を示す。]で表される化合物、もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物を有効成分とする、血小板の機能を維持するための組成物。2前記一般式Iで表わされる化合物が、N-[2-4-ブト-2-イニルオキシベンゼンスルホニル-1-4-ジエチルアミノメチルフェニルエチル]-N-ヒドロキシホルムアミド、またはN-{4-[2-4-ブト-2-イニルオキシベンゼンスルホニル-1-ホルミルヒドロキシアミノエチル]ベンジル}メタンスルホンアミド、である、1に記載の組成物。3血小板の機能を維持するための試薬または血小板を含む血液製剤への添加剤である、1または2に記載の組成物。4巨核球に分化し得る細胞から巨核球に分化誘導させ、該巨核球から血小板を産生させる培養系に、下記一般式I:[式中、Xは、フェニレン基;Yは、水素原子、または-CH2mR1;mは0~4のいずれかの整数;R1は、R2は、置換されていてもよいC1~C6アルキル基、置換されていてもよいアリール基、またはC1~C6アルコキシ基;R3およびR4は、それぞれ独立して水素原子、C1~C6アルキル基、あるいはR3とR4が隣接する窒素原子と一緒になって含窒素複素環を形成していてもよい;R5は、水素原子、C1~C6アルキル基、またはC1~C6アルキルスルホニル基;Zは、水素原子またはC1~C6アルキル基を示す。]で表される化合物、もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物を添加することを特徴とする、血小板を調製するための方法。5前記一般式Iで表わされる化合物が、N-[2-4-ブト-2-イニルオキシベンゼンスルホニル-1-4-ジエチルアミノメチルフェニルエチル]-N-ヒドロキシホルムアミド、またはN-{4-[2-4-ブト-2-イニルオキシベンゼンスルホニル-1-ホルミルヒドロキシアミノエチル]ベンジル}メタンスルホンアミド、である、4に記載の方法。6前記培養系における培養温度が35~38°Cであることを特徴とする、4または5に記載の方法。7巨核球に分化し得る細胞から巨核球に分化誘導させ、該巨核球から血小板を産生させる培養系に、下記一般式I:[式中、Xは、フェニレン基;Yは、水素原子、または-CH2mR1;mは0~4のいずれかの整数;R1は、R2は、置換されていてもよいC1~C6アルキル基、置換されていてもよいアリール基、またはC1~C6アルコキシ基;R3およびR4は、それぞれ独立して水素原子、C1~C6アルキル基、あるいはR3とR4が隣接する窒素原子と一緒になって含窒素複素環を形成していてもよい;R5は、水素原子、C1~C6アルキル基、またはC1~C6アルキルスルホニル基;Zは、水素原子またはC1~C6アルキル基を示す。]で表される化合物、もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物を添加した培養物。8前記一般式Iで表わされる化合物が、N-[2-4-ブト-2-イニルオキシベンゼンスルホニル-1-4-ジエチルアミノメチルフェニルエチル]-N-ヒドロキシホルムアミド、またはN-{4-[2-4-ブト-2-イニルオキシベンゼンスルホニル-1-ホルミルヒドロキシアミノエチル]ベンジル}メタンスルホンアミド、である、7に記載の培養物。9下記一般式I:[式中、Xは、フェニレン基;Yは、水素原子、または-CH2mR1;mは0~4のいずれかの整数;R1は、R2は、置換されていてもよいC1~C6アルキル基、置換されていてもよいアリール基、またはC1~C6アルコキシ基;R3およびR4は、それぞれ独立して水素原子、C1~C6アルキル基、あるいはR3とR4が隣接する窒素原子と一緒になって含窒素複素環を形成していてもよい;R5は、水素原子、C1~C6アルキル基、またはC1~C6アルキルスルホニル基;Zは、水素原子またはC1~C6アルキル基を示す。]で表される化合物、もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物が添加された、血小板を含む血液製剤。10前記一般式Iで表わされる化合物が、N-[2-4-ブト-2-イニルオキシベンゼンスルホニル-1-4-ジエチルアミノメチルフェニルエチル]-N-ヒドロキシホルムアミド、またはN-{4-[2-4-ブト-2-イニルオキシベンゼンスルホニル-1-ホルミルヒドロキシアミノエチル]ベンジル}メタンスルホンアミド、である、9に記載の血液製剤。11下記一般式I:[式中、Xは、フェニレン基;Yは、水素原子、または-CH2mR1;mは0~4のいずれかの整数;R1は、R2は、置換されていてもよいC1~C6アルキル基、置換されていてもよいアリール基、またはC1~C6アルコキシ基;R3およびR4は、それぞれ独立して水素原子、C1~C6アルキル基、あるいはR3とR4が隣接する窒素原子と一緒になって含窒素複素環を形成していてもよい;R5は、水素原子、C1~C6アルキル基、またはC1~C6アルキルスルホニル基;Zは、水素原子またはC1~C6アルキル基を示す。]で表される化合物、もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物を、血小板を含む血液製剤に添加することを特徴とする、血液製剤における血小板の機能を維持するための方法。12前記一般式Iで表わされる化合物が、N-[2-4-ブト-2-イニルオキシベンゼンスルホニル-1-4-ジエチルアミノメチルフェニルエチル]-N-ヒドロキシホルムアミド、またはN-{4-[2-4-ブト-2-イニルオキシベンゼンスルホニル-1-ホルミルヒドロキシアミノエチル]ベンジル}メタンスルホンアミド、である、11に記載の方法。本発明において見出されたN-ヒドロキシホルムアミド誘導体によれば、ADAM17のメタロプロテアーゼ活性を特異的に抑制し、GPIbαのシェディングを抑制することによって、37°C付近の温度条件下においても血小板の機能を維持することが可能である。従って、当該誘導体によれば、インビトロにおいて、機能的に安定した血小板を大量に生産することが可能であり、また、血小板を含む血液製剤の品質の安定化を図ることができる。本発明の組成物は、下記一般式I:[式中、Xは、フェニレン基;Yは、水素原子、または-CH2mR1;mは0~4のいずれかの整数;R1は、R2は、置換されていてもよいC1~C6アルキル基、置換されていてもよいアリール基、またはC1~C6アルコキシ基;R3およびR4は、それぞれ独立して水素原子、C1~C6アルキル基、あるいはR3とR4が隣接する窒素原子と一緒になって含窒素複素環を形成していてもよい;R5は、水素原子、C1~C6アルキル基、またはC1~C6アルキルスルホニル基;Zは、水素原子またはC1~C6アルキル基を示す。]で表される化合物、もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物を有効成分とする、血小板の機能を維持するための組成物である。前記一般式Iで表される化合物におけるC1~C6、C6~C14は、それぞれ、炭素数が1~6、6~14の範囲内にあることを意味する。R2,R3,R4,R5およびZにおける置換されていてもよいC1~C6アルキル基のC1~C6アルキル基とは、直鎖または分岐状のC1~C6アルキル基を意味し、具体例としては、メチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、イソブチル基、tert-ブチル基、sec-ブチル基、n-ペンチル基、tert-アミル基、3-メチルブチル基、ネオペンチル基、n-ヘキシル基等が挙げられる。前記、置換されていてもよいC1~C6アルキル基における置換基とは、水酸基、ハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基、C1~C6アルコキシ基、カルボキシル基、C1~C6アルコキシカルボニル基等が挙げられる。これらは、全ての可能な位置で一個以上置換しうる。複数個置換する場合は、それらの置換基は同一であっても異なっていてもよいし、同一の炭素原子に置換していてもよいし異なる炭素原子に置換していてもよい。ハロゲン原子とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子を意味する。C1~C6アルコキシ基とは、アルキル部分が、前記C1~C6アルキル基と同義であるアルコキシ基を意味し、たとえば、メトキシ基、エトキシ基、n-プロポキシ基、イソプロポキシ基、n-ブトキシ基、イソブトキシ基、tert-ブトキシ基、sec-ブトキシ基、n-ペンチルオキシ基、tert-アミルオキシ基、3-メチルブトキシ基、ネオペンチルオキシ基、n-ヘキシルオキシ基などの直鎖または分岐状のアルコキシ基が挙げられる。C1~C6アルコキシカルボニル基とは、オキシカルボニル部分を除いたアルキル部分が直鎖または分岐状のC1~C6アルキル基であるものを意味し、たとえば、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、n-プロポキシカルボニル基、イソプロポキシカルボニル基、n-ブトキシカルボニル基、イソブトキシカルボニル基、tert-ブトキシカルボニル基、sec-ブトキシカルボニル基、n-ペンチルオキシカルボニル基、tert-アミルオキシカルボニル基、3-メチルブトキシカルボニル基、ネオペンチルオキシカルボニル基、n-ヘキシルオキシカルボニル基等が挙げられる。R3およびR4が隣接する窒素原子と一緒になって形成する含窒素複素環としては、例えば、環構成原子として炭素原子以外に少なくとも1個の窒素原子を含み、さらに酸素原子、硫黄原子および窒素原子から選ばれるヘテロ原子を1または2個含んでいてもよい5~7員の含窒素複素環が挙げられる。該含窒素複素環の好適な例としては、ピペリジン環、ピペラジン環、モルホリン環、チオモルホリン環、ピロリジン環、イミダゾリジン環等が挙げられる。R2における置換されていてもよいアリール基のアリール基とは、芳香族炭素環を表わし、C6~C14の芳香族炭素環が好ましく、たとえば、フェニル基、ナフチル基等が挙げられる。前記、置換されていてもよいアリール基における芳香環上の置換基とは、水酸基、ハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基、トリフルオロメチル基、置換されていてもよいC1~C6アルキル基、C1~C6アルコキシ基、カルボキシル基、C1~C6アルコキシカルボニル基等が挙げられる。これらは、全ての可能な位置で一個以上置換しうる。複数個置換する場合は、それらの置換基は同一であっても異なっていてもよいし、同一の炭素原子に置換していてもよいし異なる炭素原子に置換していてもよい。ここで、ハロゲン原子、置換されていてもよいC1~C6アルキル基、C1~C6アルコキシ基およびC1~C6アルコキシカルボニル基は前記と同じ意味を示す。R5におけるC1~C6アルキルスルホニル基とは、アルキル部分が、前記C1~C6アルキル基と同義であるアルキルスルホニル基を意味し、たとえば、メタンスルホニル基、エタンスルホニル基などがあげられる。一般式Iで表される化合物において、不斉炭素が存在する場合には、そのラセミ体、ジアステレオ異性体および個々の光学活性体のいずれも本発明に包含されるものであり、また幾何異性体が存在する場合にはE体、Z体およびその混合物のいずれも本発明に包含されるものである。一般式Iで表される化合物の塩としては、薬理学的に許容される塩であればとくに制限されず、たとえば、無機塩基との塩、有機塩基との塩、有機酸との塩、無機酸との塩およびアミノ酸との塩等が挙げられる。無機塩基との塩の例としては、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ金属塩およびアルカリ土類金属塩等が挙げられる。有機塩基との塩の例としては、トリエチルアミン塩、ピリジン塩、エタノールアミン塩、シクロヘキシルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、ジベンジルエタノールアミン塩等が挙げられる。有機酸との塩の例としては、ギ酸塩、酢酸塩、酒石酸塩、マレイン酸塩、コハク酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、アスコルビン酸塩、シュウ酸塩、グリコール酸塩、フェニル酢酸塩、メタンスルホン酸塩等が挙げられる。無機酸との塩の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、スルファミン酸塩、硝酸塩等が挙げられる。また、アミノ酸との塩の例としては、グリシン塩、アラニン塩、アルギニン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩等が挙げられる。一般式Iで表される化合物はプロドラッグの形態をとり得る。プロドラッグの例としては、一般式Iの化合物のカルボキシル基のメチルエステル、エチルエステル、アミノアルキルエステル誘導体、一般式Iの化合物の水酸基およびアミン官能基のアセテート、ホルメート、およびベンゾエート誘導体等が挙げられるが、これらに限定されない。前記一般式Iで表わされる化合物は、種々の方法で製造できるが、以下に示す製造方法により、効率よく製造することができる。なお、以下の製造方法において使用される保護基の具体例としては、tert-ブチル基、ベンジル基、o-メチルベンジル基、p-ニトロベンジル基、p-メトキシベンジル基、o-クロロベンジル基、2,4-ジクロロベンジル基、p-ブロモベンジル基、アリル基、tert-ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、o-メチルベンジルオキシカルボニル基、p-ニトロベンジルオキシカルボニル基、p-メトキシベンジルオキシカルボニル基、o-クロロベンジルオキシカルボニル基、2,4-ジクロロベンジルオキシカルボニル基、p-ブロモベンジルオキシカルボニル基、アリルオキシカルボニル基、tert-ブチルジメチルシリル基、tert-ブチルジフェニルシリル基、トリエチルシリル基、トリメチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、メトキシメチル基、テトラヒドロピラニル基、カルボニルの保護基たとえば、エタンジオール、プロパンジオール、メルカプトエタノール、メルカプトプロパノール、エタンジチオール、プロパンジチオールなどによる保護基等が挙げられる。前記一般式Iで表される化合物は、例えば下記の工程1~工程2における反応により製造することができる。式中、X、YおよびZは前記と同じ意味を示す。。<工程1>工程1においては、ヒドロキシルアミンまたはその塩を化合物IIに付加し、一般式IIIで表される化合物を製造する。この付加反応では、ヒドロキシルアミンが塩塩酸塩や酢酸塩などの場合、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウムなどの無機塩基の存在下に行なわれる。反応溶媒としては、反応を著しく阻害しない溶媒であればとくに限定されないが、水、テトラヒドロフラン、シクロペンチルメチルエーテル、アセトニトリル、1,4-ジオキサン、ジエチルエーテルまたはそれらの混合溶媒などが好ましい。反応温度はとくに限定されず、通常、0~100°Cで行なわれ、反応時間は、2時間から1週間が好ましい。<工程2>工程2においては、工程1で得られた化合物IIIを、一般式IVで表される中間体と縮合し、一般式Iで表される化合物を製造する。中間体IVは、ギ酸の混合酸無水物ギ酸と酢酸の混合酸無水物など、ギ酸ペンタフルオロフェニルまたはギ酸とカルボジイミドジシクロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミドまたは水溶性カルボジイミドから得られる活性中間体である。反応を円滑に行なうためにトリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン、ルチジン、コリジン、ジメチルアミノピリジンなどの有機塩基を共存させてもよい。これらの場合の幾つかとくにカルボジイミドから活性中間体を得る場合は1-ヒドロキシベンゾトリアゾールおよび/または4-ジメチルアミノピリジンを加えることにより反応が促進される。反応溶媒としては、反応を著しく阻害しない溶媒であればとくに限定されないが、クロロホルム、塩化メチレン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、シクロペンチルメチルエーテル、1,4-ジオキサン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ピリジンなどが好ましい。反応温度はとくに限定されず、通常、0~100°Cで行なわれ、反応時間は、1~24時間が好ましい。なお、本工程において、原料の化学的性質により、ヒドロキシルアミノ基の水酸基にもCHO基が付加する場合があるが、これは、酸性、塩基性または中性条件下において低級アルコールで処理することにより目的物である化合物Iに変換できる。低級アルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノールなどが好ましい。補助溶媒を使用してもよく、その場合使用する補助溶媒はとくに限定されない。X、Y、およびZの性質によっては、前記工程1~工程2の反応において事前に保護基を使用することおよび事後に保護基の除去を行なうことが必要であることは言うまでもない。保護されていない場合、次工程あるいは次次工程の収率が低下したり、中間体の取り扱いが困難な場合がある。前記化合物IIは、以下に示すように、工程3~工程5により製造することができる。式中、X、Y、およびZは前記と同じ;Eは、C1~C6アルコキシ基、ハロゲン原子、N,O-ジメチルヒドロキシアミノ基などの脱離性官能基;M1は、Li、CeCl2、NaBH3、LiBH3、LiBEt3、KBEt3、LiB[CHCH3C2H53、KBCHCH3C2H53、AlCHCH3C2H52などを表す。Etはエチル基を表す。。<工程3>工程3においては、一般式Vで表される化合物を塩基によりアニオンにしたのち、一般式VIで表される化合物と反応させて化合物VIIを製造する。使用する塩基としては、リチウムジイソプロピルアミド、リチウムビストリメチルシリルアミド、リチウムテトラメチルピペラジド、ナトリウムビストリメチルシリルアミド、カリウムビストリメチルシリルアミド、n-ブチルリチウム、sec-ブチルリチウム、tert-ブチルリチウム等が挙げられる。これらの塩基は、単独で用いるか、または場合によって2つ以上を組み合わせて使用する。反応溶媒としては、反応を著しく阻害しない溶媒であればとくに限定されないが、テトラヒドロフラン、シクロペンチルメチルエーテル、テトラヒドロピラン、ジエチルエーテル、tert-ブチルメチルエーテルまたはそれらの混合溶媒などが好ましい。反応温度は、通常-100~40°Cで行なわれ、反応時間は、1~12時間が好ましい。なお、この工程においては、化合物VIの化学的性質により化合物IIが得られる場合があるが、本製造目的を斟酌すると問題にならない。<工程4>工程4においては、工程3で得られた化合物VIIを一般式VIIIで表される化合物と反応させ、一般式IXで表される化合物を製造する。反応溶媒としては、化合物VIIIが水素化ホウ素ナトリウムまたは水素化ホウ素リチウムの場合には、メタノール、エタノール、イソプロパノール、テトラヒドロフラン、シクロペンチルメチルエーテル、ジクロロメタン、クロロホルムまたはそれらの混合溶媒などが好ましく、化合物VIIIが前記2種以外の場合は、テトラヒドロフラン、シクロペンチルメチルエーテル、テトラヒドロピラン、ジエチルエーテル、tert-ブチルメチルエーテルまたはそれらの混合溶媒などが好ましい。反応温度は、通常-100~30°Cで行なわれ、反応時間は、1~12時間が好ましい。なお、工程4の反応中あるいは反応後に、生成した化合物IXの水酸基が自然脱離し、一部あるいは全部が化合物IIになる場合がある。一部の場合、それらを分離することなく工程5を行なうことができ、全部の場合、工程5を省略することができる。<工程5>工程5においては、工程4で得られた化合物IXを脱水反応により化合物IIを製造する。脱水反応は、水酸基を活性化する試薬と有機塩基の組み合わせにより行なわれ、水酸基を活性化する試薬としては、塩化メタンスルホニル、塩化p-トルエンスルホニル、塩化ベンゼンスルホニル、塩化メタンスルホニル、塩化チオニル、塩化スルフリル、五塩化リン等が挙げられる。有機塩基としては、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ジアザビシクロウンデセン、ジアザビシクロノネン、ピリジン、ジメチルアミノピリジン、ルチジン、コリジン等が挙げられる。好適な組み合わせとして、塩化メタンスルホニルとトリエチルアミンがあげられる。また、別の脱水試薬として、トリフェニルホスフィン-ジエチルアゾジカルボキシラート、トリフェニルホスフィン-ジイソプロピルアゾカルボキシラート、トリn-ブチルホスフィン-ジエチルアゾジカルボキシラート、トリn-ブチルホスフィン-ジイソプロピルアゾカルボキシラート等が挙げられる。反応溶媒としては、反応を著しく阻害しない溶媒であればとくに限定されないが、クロロホルム、塩化メチレン、テトラヒドロフラン、シクロペンチルメチルエーテル、アセトニトリル、1,4-ジオキサン、ジメチルホルムアミドなどが好ましい。反応温度はとくに限定されず、通常、0~100°Cで行なわれ、反応時間は、1~24時間が好ましい。X,Y、およびZの性質によっては、前記工程3~工程5の反応において事前に保護基などを使用することおよび事後に保護基などの除去を行なうことが必要であることは言うまでもない。前記化合物Vは、以下に示すように、工程6により製造することができる。式中、Zは前記と同じ;J1はハロゲン原子、メタンスルホニルオキシ基、p-トルエンスルホニルオキシ基、ベンゼンスルホニルオキシ基、トリフルオロメタンスルホニルオキシ基または水酸基を表す。。<工程6>工程6においては、一般式Xで表される化合物またはその塩と一般式XIで表される化合物を無機塩基の存在下縮合させ、化合物Vを製造する。好適な無機塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸セシウム、水酸化カルシウム等が挙げられる。ただし、J1が水酸基の場合は、一般式Xで表される化合物またはその塩の水酸基を試薬により活性化し、一般式XIで表される化合物を縮合させ、化合物Vを製造する。水酸基の活性化に適した試薬としては、アゾジカルボン酸ジエチルDEAD-トリフェニルホスフィン、アゾジカルボン酸ジイソプロピル-トリフェニルホスフィン、シアノメチレントリブチルホスホラン、シアノメチレントリメチルホスホラン、ブチルリチウム-クロロジフェニルホスフィン等が挙げられる。また、ブチルリチウム-クロロジフェニルホスフィンで活性化する場合は、2,6-ジメチル-1,4-ベンゾキノン、テトラフルオロ-1,4-ベンゾキノンなどのキノン類を添加する。反応溶媒としては、反応を著しく阻害しない溶媒であればとくに限定されないが、水、メタノール、エタノール、tert-ブタノール、テトラヒドロフラン、シクロペンチルメチルエーテル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、ジメチルエーテル、ジクロロメタン、1,4-ジオキサン、2-メトキシエタノール、N,N-ジメチルホルムアミドまたはそれらの混合溶媒などが好ましい。反応温度はとくに限定されず、通常、-80~120°Cで行なわれ、反応時間は、1~24時間が好ましい。また、前記化合物IIは、以下に示すように、工程7~工程11によっても製造することができる。式中、X、Y、Z、E、M1およびJ1は前記と同じ、P1は水酸基の保護基を表す。。<工程7>工程7においては、工程3と同様にして、一般式XIIで表される化合物を塩基によりアニオンとした後、化合物VIと反応させて化合物XIIIを製造する。<工程8>工程8においては、工程4と同様にして、一般式XIIIで表される化合物を一般式VIIIで表される化合物と反応させ、化合物XIVを製造する。XおよびYの性質によっては、前記工程7~工程8の反応において事前に保護基などを使用することおよび事後に保護基などの除去を行うことが必要であることは言うまでもない。<工程9>工程9においては、工程5と同様にして、化合物XIVを脱水反応により化合物XVを製造する。なお、工程9において保護基P1が自然脱離し、一部あるいは全部が化合物XVIになる場合がある。一部の場合、それらを分離することなく工程10を行なうことができ、全部の場合、工程10を省略する事ができる。<工程10>工程10においては、一般式XVで表される化合物に使用されている保護基P1の種類にあわせて、公知の方法によりその脱保護を行い、一般式XVIで表される化合物を製造する。<工程11>工程11においては、工程6と同様にして、化合物XVIと一般式Xで表される化合物またはその塩を縮合させ、化合物IIを製造する。前述した方法で製造される本発明のN-ヒドロキシホルムアミド誘導体は遊離化合物、その塩、その水和物もしくはエタノール和物などの各種溶媒和物または結晶多形の物質として単離精製される。一般式Iの化合物の薬理学的に許容される塩は常法の造塩反応により製造することができる。単離精製は抽出分別、結晶化、各種分画クロマトグラフィーなどの化学操作を適用して行なわれる。また、光学異性体は適当な原料化合物を選択することにより、またはラセミ化合物の光学分割により立体化学的に純粋な異性体として得ることができる。本発明の組成物は、前記化合物、もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物mz2251HNMRδ788710473304187。1-2:{4-[2-4-ブト-2-イニルオキシベンゼンスルホニルアセチル]ベンジル}カルバミン酸tert-ブチルエステルVII-1前記1-1で得た化合物V-11.36g6.08mmolのテトラヒドロフラン70mL溶液に、アルゴン雰囲気下-78°Cでリチウムジイソプロピルアミドの2.0Mヘキサン-ヘプタン-エチルベンゼン溶液3.65mL7.29mmolを加え、30分間撹拌した後、リチウムヘキサメチルジシラジドの1.0M-テトラヒドロフラン溶液12.16mL12.16mmolと、4-tert-ブトキシカルボニルアミノメチル安息香酸メチルVI-11.61g6.08mmolのテトラヒドロフラン溶液5mLを加えた。-78°Cにて5分間撹拌した後、徐々に室温まで昇温し、1時間撹拌した。飽和食塩水を加えた後、酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を減圧下留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーヘキサン:酢酸エチル=2:1→1:1にて精製し、{4-[2-4-ブト-2-イニルオキシベンゼンスルホニルアセチル]ベンジル}カルバミン酸tert-ブチルエステルVII-12.02g4.41mmolを無色飴状物質として得た収率72。物性値を以下に示す。MSmz4801HNMRδ793781740707472470439187157。1-3:{4-[2-4-ブト-2-イニルオキシベンゼンスルホニル-1-ヒドロキシエチル]ベンジル}カルバミン酸tert-ブチルエステルIX-1前記1-2で得た化合物VII-12.02g4.41mmolのメタノール50mL溶液に、0°Cで水素化ホウ素ナトリウム167mg4.41mmolを加えた。2時間30分間撹拌した後、飽和食塩水と飽和塩化アンモニウム水溶液を加えた。メタノールを減圧下留去した後、酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下留去し、{4-[2-4-ブト-2-イニルオキシベンゼンスルホニル-1-ヒドロキシエチル]ベンジル}カルバミン酸tert-ブチルエステルIX-12.04g4.41mmolを無定形状固体の粗精製物として得た収率99。物性値を以下に示す。MSmz482。1-4:{4-[2-4-ブト-2-イニルオキシベンゼンスルホニルビニル]ベンジル}カルバミン酸tert-ブチルエステルII-1a前記1-3で得た化合物IX-12.04g4.41mmolとトリエチルアミン3.1mL22.1mmolのジクロロメタン45mL溶液に0°Cで塩化メタンスルホニル0.7mL8.8mmolを加えた。3時間30分間撹拌した後、飽和食塩水を加え、クロロホルムで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下留去した後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィークロロホルム:酢酸エチル=3:1で精製し、{4-[2-4-ブト-2-イニルオキシベンゼンスルホニルビニル]ベンジル}カルバミン酸tert-ブチルエステルII-1a1.77g4.00mmolを無色無定形状固体として得た収率91。物性値を以下に示す。1HNMRδ787761743730710682488471433186145。1-5:4-[E-2-4-ブト-2-イニルオキシベンゼンスルホニルビニル]ベンジルアミン塩酸塩II-1b前記1-4で得た化合物II-1a295mg0.67mmolのメタノール5mL溶液に、0°Cで4M-塩酸/ジオキサン2mLを加えて10分間撹拌した後、室温まで昇温し、2時間撹拌した。溶媒を減圧下留去した後、メタノール20mLを加えて再び、溶媒を減圧下留去し、4-[E-2-4-ブト-2-イニルオキシベンゼンスルホニルビニル]ベンジルアミン塩酸塩II-1bを無色固体として得た。物性値を以下に示す。1HNMRδ785778752720487405183。1-6:{4-[E-2-4-ブト-2-イニルオキシベンゼンスルホニルビニル]ベンジル}ジエチルアミンII-1c前記1-5で得た化合物II-1bのメタノール6mL溶液に、0°Cでアセトアルデヒド1mL、トリアセトキシヒドロほう酸ナトリウム212mg1.00mmolおよび酢酸3滴をそれぞれ加えた後、室温にて1時間30分間撹拌した。飽和食塩水と飽和重曹水を加えた後、溶媒を減圧下留去した。クロロホルムで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下留去した後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィークロロホルム:メタノール=20:1→10:1にて精製し、{4-[E-2-4-ブト-2-イニルオキシベンゼンスルホニルビニル]ベンジル}ジエチルアミンII-1c111.7mg0.28mmolを淡黄色無定形状固体として得た2段階収率42。物性値を以下に示す。MSmz398。1-7:N-[2-4-ブト-2-イニルオキシベンゼンスルホニル-1-4-ジエチルアミノメチルフェニルエチル]ヒドロキシルアミンIII-1前記1-6で得た化合物II-1c108mg0.27mmolのテトラヒドロフラン8mL溶液に、50ヒドロキシルアミン溶液3mLを加え、室温にて25時間攪拌した。反応溶液を減圧下留去した後、水を加え、クロロホルムで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧濃縮した。N-[2-4-ブト-2-イニルオキシ-ベンゼンスルホニル-1-4-ジエチルアミノメチルフェニルエチル]ヒドロキシルアミンIII-192.9mg0.22mmolを淡黄色無定形状固体として得た収率81。物性値を以下に示す。1HNMRδ784727720707472375351333249187103。1-8:N-[2-4-ブト-2-イニルオキシベンゼンスルホニル-1-4-ジエチルアミノメチルフェニルエチル]-N-ヒドロキシホルムアミドI-1ギ酸1mLを0°Cに冷却し、無水酢酸0.3mLを滴下した後、30分間撹拌することでギ酸―酢酸の混合酸無水物溶液を調製した。前記1-7で得た化合物III-192mg0.21mmolのテトラヒドロフラン3mL溶液に、0°Cで、先に調製したギ酸―酢酸の混合酸無水物溶液0.6mLを加え、室温で4時間撹拌した。反応混合物を減圧濃縮した後、トルエンで共沸した。得られた油状物をクロロホルム2mLおよびメタノール10mLに溶解し、12時間撹拌した。この溶液を減圧濃縮し、得られた油状物をクロロホルムに溶解し、飽和重曹水を加えて中和した。クロロホルムで抽出した後、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィークロロホルム:メタノール=95:5→75:25により精製し、N-[2-4-ブト-2-イニルオキシベンゼンスルホニル-1-4-ジエチルアミノメチルフェニルエチル]-N-ヒドロキシホルムアミドI-153.9mg0.11mmolを淡黄色無定形状固体として得た収率52。物性値を以下に示す。MSmz4591HNMRδ832810780786721730706714565536474420405348357246187099。実施例2N-[2-4-ブト-2-イニルオキシベンゼンスルホニル-1-4-ジメチルアミノメチルフェニルエチル]-N-ヒドロキシホルムアミドI-2実施例1と同様の操作により、上記の化合物I-2を得た。MSmz4311HNMRδ828814779791704732569535474418407347333211187。実施例3N-{4-[2-4-ブト-2-イニルオキシベンゼンスルホニル-1-ホルミルヒドロキシアミノエチル]ベンジル}-2-メトキシアセトアミドI-33-1:N-{4-[2-4-ブト-2-イニルオキシベンゼンスルホニルビニル]ベンジル}-2-メトキシアセトアミドII-3前記実施例11-5で得た化合物II-1b283mg0.75mmolのピリジン溶液5mLに、室温でメトキシアセチルクロリド0.2mL1.85mmolを滴下した。2日後、飽和食塩水を加え、酢酸エチルで抽出し、飽和食塩水で洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧下留去した後、シリカゲルクロマトグラフィークロロホルム:メタノール=20:1→10:1にて精製し、化合物II-3296mg0.71mmolを淡黄色固体として得た収率94。物性値を以下に示す。MSmz414。3-2:N-{4-[2-4-ブト-2-イニルオキシベンゼンスルホニル-1-ホルミルヒドロキシアミノエチル]ベンジル}-2-メトキシ-アセトアミドI-3前記3-1で得た化合物II-3を用い、前記実施例1と同様な方法1-7および1-8により、N-{4-[2-4-ブト-2-イニルオキシベンゼンスルホニル-1-ホルミルヒドロキシアミノエチル]ベンジル}-2-メトキシアセトアミドI-3を得た。物性値を以下に示す。1HNMRδ832809777788720731706716565537475439447416403393390346340187。実施例4N-{4-[2-4-ブト-2-イニルオキシベンゼンスルホニル-1-ホルミルヒドロキシアミノエチル]ベンジル}メタンスルホンアミドI-4実施例3と同様の操作により、上記の化合物I-4を得た。MSmz4811HNMRδ842787778788730735706717565539475428415400345291289187。実施例5N-{4-[2-4-ブト-2-イニルオキシベンゼンスルホニル-1-ホルミルヒドロキシアミノエチル]ベンジル}ベンズアミドI-5実施例3と同様の操作により、上記の化合物I-5を得た。MSmz5071HNMRδ831808773787751742727733707714565537473454462415400345186。実施例6N-[2-4-ブト-2-イニルオキシベンゼンスルホニル-1-4-モルホリン-4-イルメチルフェニルエチル]-N-ヒドロキシホルムアミドI-66-1:tert-ブチル-4-メタンスルホニルフェノキシジメチルシランXII-64-メチルスルホニルフェノール10g58.07mmolのN,N-ジメチルホルムアミド溶液150mLにイミダゾール9.9g145.18mmolを加えて溶解させた後、tert-ブチルジメチルクロロシラン10.5g69.7mmolを加えて撹拌した。反応終了後、飽和食塩水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で3回洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーヘキサン:酢酸エチル=5:1→3:1にて精製し、tert-ブチル-4-メタンスルホニルフェノキシジメチルシランXII-615.97g55.75mmolを得た収率96。物性値を以下に示す。1HNMRδ783781697695304156025。6-2:2-[4-tert-ブチルジメチルシラニロキシベンゼンスルホニル]-1-4-モルホリン-4-イルメチルフェニルエタノンXIII-6前記6-1で得たtert-ブチル-4-メタンスルホニルフェノキシジメチルシランXII-62.0g6.98mmolのテトラヒドロフラン溶液に、アルゴン雰囲気下-78°Cでリチウムジイソプロピルアミドの2.0Mヘキサン-ヘプタン-エチルベンゼン溶液4.19mL8.37mmolを加え、リチウムヘキサメチルジシラジドの1.0M-テトラヒドロフラン溶液6.98mL6.98mmolと、4-モルホリン-4-イルメチル安息香酸メチルIX-61.6g6.98mmolのテトラヒドロフラン溶液5mLを加えた。その後、撹拌しながら徐々に室温まで昇温した。反応終了後、飽和食塩水を加え、酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を減圧下留去した。2-[4-tert-ブチルジメチルシラニロキシベンゼンスルホニル]-1-4-モルホリン-4-イルメチルフェニルエタノンXIII-63.74gを粗精製物として得た。6-3:2-[4-tert-ブチルジメチルシラニロキシベンゼンスルホニル]-1-4-モルホリン-4-イルメチルフェニルエタノールXIV-6前記6-2で得た化合物XIII-63.74g6.98mmolのメタノール50mL溶液に、0°Cで水素化ホウ素ナトリウム264mg6.98mmolを加えた。1時間撹拌した後、飽和食塩水を加えた。メタノールを減圧下留去した後、酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー酢酸エチル→酢酸エチル:メタノール=10:1で精製し、2-[4-tert-ブチルジメチルシラニロキシベンゼンスルホニル]-1-4-モルホリン-4-イルメチルフェニルエタノールXIV-6を2.19g4.48mmol得た。物性値を以下に示す。1HNMRδ783725730698522368346330240099025.。6-4:4-[E-2-4-モルホリン-4-イルメチルフェニルエテンスルホニル]フェノールXVI-6前記6-3で得た2-[4-tert-ブチルジメチルシラニロキシベンゼンスルホニル]-1-4-モルホリン-4-イルメチルフェニルエタノールXIV-62.19g4.48mmolのジクロロメタン溶液45mLにトリエチルアミン3.10mLを加え、0°Cにて撹拌した。塩化メタンスルホニル0.61mL8.91mmolを加えた後、室温にて8時間撹拌した。さらにトリエチルアミン3.10mL、塩化メタンスルホニル0.61mLをそれぞれ加え、4時間撹拌した。飽和食塩水を加えてクロロホルムで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーヘキサン:酢酸エチル=1:2→酢酸エチル→酢酸エチル:メタノール=10:1で精製し、4-[E-2-4-モルホリン-4-イルメチルフェニルエテンスルホニル]フェノールXVI-6を0.757g2.11mmol得た収率47。物性値を以下に示す。1HNMRδ801781761735747692681371351244。6-5:4-{4-[E-2-4-ブト-2-イニルオキシベンゼンスルホニルビニル]ベンジル]モルホリンII-6前記6-4で得た4-[E-2-4-モルホリン-4-イルメチルフェニルエテンスルホニル]フェノールXVI-6187mg0.520mmolのN,N-ジメチルホルムアミド溶液に炭酸カリウム108mg0.780mmolおよび1-ブロモ-2-ブチン0.094mL1.04mmolを加え、4時間撹拌した。飽和食塩水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー酢酸エチル:クロロホルム=1:1→1:2→酢酸エチルで精製し、4-{4-[E-2-4-ブト-2-イニルオキシベンゼンスルホニルビニル]ベンジル]モルホリンII-6を0.0238g0.0578mmol得た収率11。物性値を以下に示す。1HNMRδ787763735744707683471369350243186。6-6:N-[2-4-ブト-2-イニルオキシベンゼンスルホニル-1-4-モルホリン-4-イルメチルフェニルエチル]-N-ヒドロキシホルムアミドI-6前記6-5で得た化合物II-6を用い、前記と同様な方法1-7および1-8により、N-[2-4-ブト-2-イニルオキシベンゼンスルホニル-1-4-モルホリン-4-イルメチル-フェニルエチル]-N-ヒドロキシホルムアミドI-6を得た。物性値を以下に示す。MSmz4731HNMRδ845811780788723732707716563538475419403364371340351239187。実施例7N-ヒドロキシ-N-[1-4-モルホリン-4-イルメチルフェニル-2-4-ペント-2-イニルオキシベンゼンスルホニルエチル]ホルムアミドI-7実施例6と同様の操作により、上記の化合物I-7を得た。MSmz4871HNMRδ844811778788726732706716563538475418403372364370341348236243124。スキーム1~4に従い、実施例1~7と同様の方法にて、以下の化合物I-8~I-28を得た。実施例8N-[2-4-ブト-2-イニルオキシベンゼンスルホニル-1-4-ジメチルアミノフェニルエチル]-N-ヒドロキシホルムアミドI-8MSmz4171HNMRδ840804773789702722662549558522531473398423337355293291187。実施例9N-[2-4-ブト-2-イニルオキシベンゼンスルホニル-1-3-ジメチルアミノフェニルエチル]-N-ヒドロキシホルムアミドI-9MSmz4171HNMRδ845807777789704721657668554562527534469477400425341354290295187。実施例10N-[2-4-ブト-2-イニルオキシベンゼンスルホニル-1-2-ジメチルアミノフェニルエチル]-N-ヒドロキシホルムアミドI-10MSmz4171HNMRδ831808788783707742657668604588471478399408339351261254186。実施例11N-[2-4-ブト-2-イニルオキシベンゼンスルホニル-1-4-ピペリジン-1-イルメチルフェニルエチル]-N-ヒドロキシホルムアミドI-11MSmz4711HNMRδ828810777789704730561569531539469478399426335353237187135159。実施例12N-[2-4-ブト-2-イニルオキシベンゼンスルホニル-1-3-ピペリジン-1-イルメチルフェニルエチル]ヒドロキシホルムアミドI-12MSmz4711HNMRδ838810777789704730570530538469477401427323360230187131155。実施例13N-[2-4-ブト-2-イニルオキシベンゼンスルホニル-1-3-モルホリン-4-イルメチルフェニルエチル]-N-ヒドロキシホルムアミドI-13MSmz4731HNMRδ846810778790706731565535542470478398426368339354236244187。実施例14N-[2-4-ブト-2-イニルオキシベンゼンスルホニル-1-{4-[エチルメチルアミノメチル]フェニル]エチル}-N-ヒドロキシホルムアミドI-14MSmz4451HNMRδ835811778789706728565532540471477399424338353238187105。実施例15N-2-4-ブト-2-イニルオキシベンゼンスルホニル-1-{3-[エチルメチルアミノメチル]フェニル}エチル-N-ヒドロキシホルムアミドI-15MSmz4451HNMRδ837811778790706734570532540470478400422329359238187103。実施例16N-{4-[2-4-ブト-2-イニルオキシベンゼンスルホニル-1-ホルミルヒドロキシアミノエチル]ベンジル}-N-メチルメタンスルホンアミドI-16MSmz4951HNMRδ822811775786709742713570540483489418386416294263184。実施例17N-{4-[2-4-ブト-2-イニルオキシベンゼンスルホニル-1-ホルミルヒドロキシアミノエチル]ベンジル}-4-メチルベンゼンスルホンアミドI-17MSmz5571HNMRδ837803769788704733561531539470483392417336351243187。実施例18N-{4-[2-4-ブト-2-イニルオキシベンゼンスルホニル-1-ホルミルヒドロキシアミノエチル]ベンジル}-4、N-ジメチルベンゼンスルホンアミドI-18MSmz5711HNMRδ847811778789770735723732706717564536543471478396422338352258254245187。実施例19N-{4-[2-4-ブト-2-イニルオキシベンゼンスルホニル-1-ホルミルヒドロキシアミノエチル]ベンジル}-N-メチルスルホニルメタンスルホンアミドI-19MSmz5591HNMRδ812821780735744732731714541571487483400416384398325184。実施例20N-{2-4-ブト-2-イニルオキシベンゼンスルホニル-1-[4-2-ジメチルアミノエチルフェニル]エチル}-N-ヒドロキシホルムアミドI-20MSmz4451HNMRδ830814776789700724571529536469476402421342359243254210228219187。実施例21N-{2-4-ブト-2-イニルオキシベンゼンスルホニル-1-[4-2-モルホリン-4-イルエチルフェニル]エチル}-N-ヒドロキシホルムアミドI-21MSmz4871HNMRδ844810777789705727562532539469478396423371339353269277243256187。実施例22N-2-{4-[2-4-ブト-2-イニルオキシベンゼンスルホニル-1-ホルミルヒドロキシアミノエチル]フェニル}エチルメタンスルホンアミドI-22MSmz4951HNMRδ839807778789705730565533541470478395421331352280291187。実施例23N-{2-4-ブト-2-イニルオキシベンゼンスルホニル-1-[4-3-ジメチルアミノプロピルフェニル]エチル}-N-ヒドロキシホルムアミドI-23MSmz4591HNMRδ806813774788702724564575522532468476402422340358251217208206187152166。実施例24N-{2-4-ブト-2-イニルオキシベンゼンスルホニル-1-[4-3-ジエチルアミノプロピルフェニル]エチル}-N-ヒドロキシホルムアミドI-24MSmz4871HNMRδ829807775789704724564528537469477400423341355233260187161172091101。実施例25N-{2-4-ブト-2-イニルオキシ-ベンゼンスルホニル-1-[4-3-モルホリン-4-イルプロピルフェニル]エチル}-N-ヒドロキシホルムアミドI-25MSmz5011HNMRδ837808776789704724564529538468477398423367340353252263224246187165176。実施例26N-{2-4-ブト-2-イニルオキシベンゼンスルホニル-1-[4-4-モルホリン-4-イルブチル-フェニル]-エチル}-N-ヒドロキシホルムアミドI-26MSmz5151HNMRδ841810777789705724557566531538469477397423367340353252263224246187139163。実施例27N-{4-[1-ホルミルヒドロキシアミノ-2-4-ペント-2-イニルオキシベンゼンスルホニルエチル]ベンジル}メタンスルホンアミドI-27MSmz4951HNMRδ829800775788723735705716566531541471480426395418339350289224114。実施例28N-{4-[1-ホルミルヒドロキシアミノ-2-4-オクト-2-イニルオキシベンゼンスルホニルエチル]ベンジル}メタンスルホンアミドI-28MSmz5371HNMRδ835803776788727736706717566534542472482423433394418338351290289222145155123138087。試験例3ADAM17阻害実験実施例1~7において得られたN-ヒドロキシホルムアミド誘導体のADAM17に対する阻害作用の有無を調べた。すなわち、先ず、ADAM17の塩基配列はモスMossらにより報告されているMossら、Nature、1997年、385巻、733-736ページ参照ので、ヒト単球細胞株THP-1細胞から定法にしたがってADAM-17のcDNAを取得し、これを発現ベクターに組み込み、次いでこのベクターを哺乳動物細胞あるいは昆虫細胞に形質転換し、ADAM17を発現させ取得した。次に、得られたADAM17を酵素として用い、また基質としては、膜結合型TNFのADAM17切断配列を含んだ蛍光合成基質NmaN-メチルアントラニル酸-Leu-Ala-Gln-Ala-Val-Arg-Ser-Ser-Lys-Dnpジニトロフェニル-D-Arg-NH2を用いて、被験物質存在下または非存在下におけるADAM17の活性を以下のようにして測定した。すなわち、アッセイバッファーA200mmol/L塩化ナトリウム、5mmol/L塩化カルシウム、10μmol/L硫酸亜鉛、2mg/mL牛血清アルブミンを含む、50mmol/Lトリス-塩酸緩衝液pH7.5にて調製した14unitsの酵素液25°Cの条件下で1pmolの基質を1分間で分解する酵素量を1unitと定義した90μL、およびアッセイバッファーB200mmol/L塩化ナトリウム、5mmol/L塩化カルシウム、10μmol/L硫酸亜鉛、0.05PLURONICF-68を含む、50mmol/Lトリス-塩酸緩衝液pH7.5にて20μmol/Lに調製した蛍光合成基質90μLを混合し、37°Cで1.5時間反応させた。この後、蛍光強度計FluoroskanAscentにて、励起波長355nm、測定波長460nmの条件で測定し、酵素活性を求めた。そして、被験化合物の存在下および非存在下の酵素活性より阻害率を求め、50抑制濃度IC50を算出した。得られた結果を表1に示す。表1に示した結果から明らかなように、本発明にかかる化合物N-ヒドロキシホルムアミド誘導体であるI-1~I-7はいずれも低濃度にてADAM17の酵素活性を阻害することが確認された。試験例4各種評価試験次に実施例1~7において得られたN-ヒドロキシホルムアミド誘導体の中から、ADAM17に対する阻害効果の高かった化合物I-1以下、S-45282とも称する及びI-4以下、S-45457とも称するについて、下記の方法にて、その阻害剤としての特異性と細胞におけるTACE阻害活性を調べた。比較のために非選択的なメタロプロテアーゼ阻害剤であるGM6001EMD/Calbiochem社、製品番号364205も評価した。<酵素阻害試験>この試験において用いた酵素は下記の通りであるMatrixmetalloproteinase1MMP-1Calbiochem社製、製品番号:444208Matrixmetalloproteinase2MMP-2Calbiochem社製、製品番号:444213Matrixmetalloproteinase3MMP-3Calbiochem社製、製品番号:444217Matrixmetalloproteinase8MMP-8Calbiochem社製、製品番号:444229Matrixmetalloproteinase9MMP-9Calbiochem社製、製品番号:444231Matrixmetalloproteinase13MMP-13Chemicon社製、製品番号:CC068Matrixmetalloproteinase14MMP-14Calbiochem社製、製品番号:475935Matrixmetalloproteinase17MMP-17Calbiochem社製、製品番号:475940Adisintegrinandmetalloproteinase10ADAM10フナコシ社製、商品コード:936-AD-020Adisintegrinandmetalloproteinase17ADAM17、TACE試験例3の通り、科研製薬にて遺伝子組み換え法を用いて作製したものを使用した。なお、試験例3の通り、25°Cの条件下で1pmolの基質を1分間で分解する酵素量を1unitと定義した。。また、この試験で用いた基質は下記の通りである444221基質DNP-Pro-Cha-Gly-CysMe-His-Ala-LysNma-NH2、カスタム合成:励起波長355nm、蛍光波長460nmTACE基質試験例3で用いたものと同じ:励起波長355nm、蛍光波長460nm3168基質MOCAc-Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu-Nva-Trp-Arg-LysDnp-NH2、ペプチド研究所社製:励起波長320nm、蛍光波長405nm3163基質MOCAc-Pro-Leu-Gly-Leu-A2prDnp-Ala-Arg-NH2、ペプチド研究所社製:励起波長320nm、蛍光波長405nm。そして、前記酵素及び基質を用いて酵素反応を行った。すなわち、酵素によっては製造元の情報に従い予めAPMA終濃度1mmol/L、p-aminophenylmercuricacetate、Sigma-Aldrich社製、A9563で活性化させた後、蛍光専用96wellプレートにアッセイバッファーA200mmol/L塩化ナトリウム、5mmol/L塩化カルシウム、10μmol/L硫酸亜鉛、2mg/mL牛血清アルブミンを含む、50mmol/Lトリス-塩酸緩衝液pH7.5にて調製した酵素液90μLに、アッセイバッファーB200mmol/L塩化ナトリウム、5mmol/L塩化カルシウム、10μmol/L硫酸亜鉛、0.05PLURONICF-68を含む、50mmol/Lトリス-塩酸緩衝液pH7.5にて20μmol/Lに調製した基質90μLを混合し、25°Cもしくは37°Cで数時間反応させた。そして、反応前後の蛍光強度を蛍光強度計にて測定し、酵素活性を求め、試験物質の存在下および非存在下の酵素活性より阻害率を求め、50抑制濃度IC50を算出した。各酵素の反応条件は表2に示す。<細胞におけるTACE阻害試験>THP-1細胞ヒト急性単球型白血病由来の細胞、ATCCカタログ番号:TIB202を10v/vFBS含有RPMI1640に懸濁し、96ウェル培養プレートに、200μL/well1×105個ずつ分注し、PMA終濃度50nmol/L添加し、37°C、5CO2存在下にて40~48時間培養し、THP-1細胞をマクロファージ様細胞へと分化させた。分化後に、培地を捨て、細胞をTHP-1洗浄バッファーRPMI1640、20mMHEPES-NaOHpH7.4で洗浄した。細胞の洗浄後、THP-1アッセイバッファーRPMI1640、20mmol/LHEPES-NaOHpH7.4、0.01w/vPF-68、10v/vFBSを100μL/wellずつ添加した。そして、試験物質I-1又はI-4含有THP-1アッセイバッファーをさらに50μL/wellずつ添加し、タッピングによって混合し、CO2インキュベーター内にて30~45分間プレインキュベートした後、LPS入りTHP-11アッセイバッファーを50μL/well加えたLPSの最終濃度は1μg/mLとなる。更に、プレートをタッピングすることで混合し、CO2インキュベーター内にて6時間インキュベートした。インキュベート終了後、培養上清中のヒトTNF-α濃度を市販キットHumanTNF-αCytoSetBIOSOURCE社製、または、HumanTNF-αReady-Set-GoeBioscience社製で測定した。これらの試験方法で得られた結果を表3に示す。表3に示した結果から明らかなように、本発明にかかる化合物であるI-1及びI-4は共にADAM17以外のメタロプロテアーゼと比較して、ADAM17に対して高い特異性を有していることが確認された。マクロファージ様細胞に発現したTACEに対する阻害活性も確認された。また、両化合物は、ADAM10もADAM17に比べると若干弱いものの抑制した。ADAM10は、ADAM17と同一の基質をも切断する酵素でありCaescuら、BiochemicalJ.、2009年、424巻、79~88ページ参照、その阻害は血小板機能の保存に有用であることが示唆されているBenderら、DifferentiallyregulatedGPVIectodomainsheddingbymultipleplatelet-expressedproteinases.、Blood、2010年7月19日電子版参照。然るに、本発明にかかる化合物であるI-1及びI-4はADAM17特異的阻害剤であり、同様の基本骨格を有する他の本発明にかかる化合物例えば、I-2、I-3、I-5、I-6もADAM17特異的阻害剤であることが示唆された。一方、ヒドロキサム酸構造を有するGM6001は、従来知られているように非特異的にメタロプロテアーゼを強く阻害したが、ADAM17に対する阻害活性は弱いものであった。試験例5GM6001及びS-45282のES細胞由来血小板に対する機能維持効果についての検証前述の通りにして得られたES細胞由来の造血前駆細胞を、図6に示した条件下プロトコール1で血小板の誘導を行った。すなわち、造血前駆細胞を巨核球/血小板に誘導する前述の8日間の培養過程において、2days:フローサイトメトリー解析にかける2日前図6において示すd22にGM6001、S-45282、又はDMSOを添加して培養、又は8days:ES細胞由来の造血前駆細胞を播き直してから8日間図6において示すd15以降、GM600150μM、S-452825μM又は50μM、又はDMSOを添加して培養という条件下で各々培養を行い、前述の通り回収して、フローサイトメトリーにて、CD41CD42bにおいても、本発明にかかる化合物であるS-45457を添加することによって、その添加した濃度依存的にADAM17によるGPIbαのシェディングを阻害していることが確認された。さらに、図13及び15に示した結果から明らかなように、本発明にかかる化合物であるS-45457はES細胞及びiPS細胞、並びにこれらから分化誘導される細胞に対する毒性は低いことも確認された。試験例8S-45457のヒト末梢血由来の血小板に対する機能維持効果における濃度依存性についての検証前述のような培養系を用いて得られた血小板だけでなく、採血によって得られた末梢血由来の血小板においても、本発明にかかる化合物は機能維持効果を発揮するのかを検証した。すなわち、図6に示した<プロトコール2>の通り、先ず、採血して得られたヒト末梢血にその1/10量のACDを加え、ブレーキ無し、900rpmで10分間遠心した。遠心して得られた上清を更にブレーキ無し、1500rpmで10分間遠心した後、上清を除去した。得られた沈殿物をTyrode-HEPESバッファーカルシウム含まずに懸濁し、懸濁液中の血小板数を数え、5×107~1×108個Tyrode-HEPESバッファーカルシウム含まず200μLになるように血小板を含む懸濁液洗浄血小板、WashedPlateletを調製した。次に、このように調製して得られた洗浄血小板に100μMCCCPCarbonylcyanidem-chlorophenylhydrazoneと共に、50μMGM6001、1.5~50μMS-45457、又はDMSOを添加し、37°Cで24時間インキュベーションし、フローサイトメトリーにて、CD41CD42bの数、CD41CD42b-の数を測定した。なお、CCCPの添加により、血小板表面上のGPIbαのシェディングは亢進されることが知られているBergmeierら、Blood、2003年、102巻、4229~4235ページ参照。得られた結果を図17に示す。統計処理は、試験例7と同様である。図17に示した結果から明らかなように、本発明にかかる化合物は、GM6001と同様に、ヒト末梢血由来の血小板に対する機能維持効果、特に37°Cにおける機能維持効果を有していることが確認された。試験例9S-45457及びp38阻害剤のヒト末梢血由来の血小板に対する機能維持効果の検証p38を阻害することにより、GPIbαのシェディングは阻害されることが知られているMatthiasC.ら、TRANSFUSIONMEDICINE、BLOOD、2010年3月4日、115巻、9号、1835~1842ページ参照。そこで、ヒト末梢血由来の血小板に対する機能維持効果において、p38阻害剤と本発明にかかる化合物とを比較した。すなわち、試験例8と同様にして調製して得られた洗浄血小板に100μMCCCPと共に、40μMp38阻害剤2種p38MAPキナーゼ阻害剤、Calbiochem社製、製品番号SB202190及びSB203580、50μMS-45457、又はDMSOを添加し、37°Cで24時間インキュベーションし、フローサイトメトリーにて、CD41及びCD42bのドットプロット解析を行った。得られた結果を図18に示す。なお。図18中、X軸はCD41を示し、Y軸はCD42bを示す。また、図中202190203580は40μM各p38阻害剤溶媒:DMSOを添加した結果を示す。さらに、試験例8と同様にして調製して得られた洗浄血小板に100μMCCCPと共に、40μM前記p38阻害剤2種、50μMGM6001、0.5~50μMS-45457、又はDMSOを添加し、37°Cで24時間インキュベーションし、フローサイトメトリーにて解析し、血小板におけるCD41CD42bの割合を算出した。得られた結果を図19に示す。図18及び図19に示した結果から明らかなように、p38阻害剤の添加におけるGPIbαCD42b細胞の数は、DMSO添加のそれと比較して多いことから、p38阻害剤もヒト末梢血由来の血小板に対する機能維持効果を有していることが確認された。しかしながら、本発明にかかる化合物の添加による効果は、p38阻害剤の添加による効果よりも優れたものであった。試験例10S-45457及びp38阻害剤のES細胞由来の血小板に対する機能維持効果についての検証前述の通りにして得られたES細胞由来の造血前駆細胞を、図6に示した条件下プロトコール1で血小板の誘導を行った。すなわち、ES細胞由来の造血前駆細胞を播き直してから8日間図6において示すd15以降、50μMGM6001、0.15~50μMS-45457、40μM前記p38阻害剤2種、50μMGM6001、又はDMSOを添加して培養を行い、前述の通り回収して、フローサイトメトリーにて、血小板の総数、血小板におけるCD41CD42bの割合を測定、算出した。得られた結果を図20及び図21に示す。図20に示した結果から明らかなように、p38阻害剤の添加によって得られた血小板の数は著しく少ないものであり、顕著な細胞毒性が確認された。また、図21に示した結果から明らかなように、本発明にかかる化合物の添加によるES細胞由来の血小板に対する機能維持効果は認められるが、p38阻害剤の添加による効果は、全く認められなかった。試験例11S-45457及びS-45282のヒト末梢血由来の血小板に対する機能維持効果についての検証S-45457及びS-45282のヒト末梢血由来の血小板に対する機能維持効果を調べるため、試験例8と同様にして、洗浄血小板に100μMCCCPと共に、50μMGM6001、5μM若しくは50μMS-45457、50μMS-45282、又はDMSOを添加し、37°Cで24時間インキュベーションし、フローサイトメトリーにて、血小板の総数及びCD42bの数を測定し、血小板におけるCD42bの割合を算出した。得られた結果を図22に示す。図22に示した結果から明らかなように、本発明にかかる化合物は、GM6001と同様に、ヒト末梢血由来の血小板に対する機能維持効果、特に37°Cにおける機能維持効果を有していることが確認された。試験例12ヒト末梢血PRPに対する機能維持効果についての検証ヒト末梢血PRPplatelet-richplasma、多血小板血漿を用いて、各化合物が有する血小板に対する機能維持効果の持続性について調べた。すなわち、先ず、採血して得られたヒト末梢血にその1/10量のACDを加え、室温下、ブレーキ無し、900rpmで10分間遠心した。次に、このようにして得られた上清PRPに、50μMGM6001、50μMS-45457、5μMS-45282、40μM前記p38阻害剤2種、又はDMSOを添加し、37°Cで24時間又は72時間インキュベーションし、フローサイトメトリーにて、CD41CD42bの数、CD41CD42b-の数を測定し、血小板におけるCD41CD42b-又はCD41CD42bの割合を算出した。得られた結果を図23に示す。また図23中、freshはヒト末梢血PRPをインキュベーションせずにフローサイトメトリーにて解析した結果を示す。図23に示した結果から、本発明にかかる化合物であるS-45457は72時間インキュベーションしてもADAM17によるGPIbαCD42bのシェディングを抑制し続けられることが明らかになった。また、本発明にかかる化合物であるS-45282も5μMという添加濃度を考慮すると高いヒト末梢血PRPに対する機能維持効果を有していることが明らかになった。一方、p38阻害剤の効果は弱いか、あるいはほぼ観察できないレベルしか認められなかった。試験例13ヒト末梢血由来の血小板に対する機能維持効果の検証試験例8と同様にして得た洗浄血小板に100μMCCCPと共に、50μMGM6001、50μMS-45457、5μMS-45282、40μM前記p38阻害剤2種、又はDMSOを添加し、37°Cで24時間インキュベーションし、フローサイトメトリーにて、CD41及びCD42bのドットプロット解析を行った。得られた結果を図24に示す。なお図24中、X軸はCD41を示し、Y軸はCD42bを示す。また図24中、freshは洗浄血小板をインキュベーションせずにフローサイトメトリーにて解析した結果を示す。図24に示した結果から明らかなように、本発明にかかる化合物であるS-45457はADAM17によるGPIbαCD42bのシェディングを抑制していることが確認された。また、S-45457には劣るものの、本発明にかかる化合物であるS-45282も高いヒト末梢血由来の血小板に対する機能維持効果を有していることが確認された。さらに、p38阻害剤の効果は弱いことが確認された。試験例14S-45457のヒト末梢血由来の血小板に対する機能維持効果における濃度依存性についての検証試験例8と同様にして、洗浄血小板に100μMCCCPと共に、50μMGM6001、0.5~50μMS-45457、又はDMSOを添加し、37°Cで24時間インキュベーションし、フローサイトメトリーにて、CD41及びCD42bのドットプロット解析を行い、S-45457のヒト末梢血由来の血小板に対する機能維持効果を調べた。得られた結果を図25に示す。なお図25中、X軸はCD41を示し、Y軸はCD42bを示す。図25に示した結果から明らかなように、本発明にかかる化合物は、その濃度依存的にADAM17によるGPIbαCD42bのシェディングを抑制していることが確認された。試験例15フローチャンバーを用いた、S-45457による血小板接着能の維持効果の検証通常、血管壁が損傷すると、血管内皮細胞下のコラーゲン組織の露出が生じ、血漿中のフォンウィルブランド因子VWFがコラーゲン組織に結合するようになる。そして、VWFとGPIbαCD42bとの相互作用、及び、VWFとα2bβ3インテグリンとの相互作用を介して、血小板は血管に接着するようになると解されている。また、血管に接着した血小板を起点として、VWFとGPIbαとの相互作用、並びに、VWFとα2bβ3インテグリンとの相互作用を介して、血小板どうしも接着していき、血栓は発達していくと解されているRuggeriZM.、NatureMedicine、2002年11月、8巻、11号、1227~1234ページ参照。そこで、試験例1~14において示された、本発明にかかる化合物S-45457等によるGPIbαシェディングに対する抑制効果は、VWFとGPIbαCD42bとの相互作用を維持し、血小板の接着能の維持に寄与しているのかを、血栓形成の経過を定量的に評価することのできるフローチャンバーを用いて、評価した。すなわち、先ず、採血して得られたヒト末梢血にACDを加え、ブレーキ無し、900rpmで10分間遠心して上清を回収した。得られた上清に1μMプロスタグランジンE1PGE1を加え、ブレーキ無し、1500rpmで10分間遠心した後、上清を除去した。得られた沈殿物をTyrodeHEPESCa-緩衝液中に懸濁し、100μMCCCPを添加し、同時にDMSO若しくは15μMS-45457とを添加した後、37°Cで24時間インキュベーションした。なお、この際CCCPとDMSOとを添加してインキュベーションしたものを陰性対照として、何も添加せずインキュベーション処理を行わなかったものを陽性対照として用意した。そして、インキュベーション後陽性対照はインキュベーションせずに、懸濁液に1/2000に希釈したTMREテトラメチルローダミンエチルエステル、過塩素酸を添加し、室温下で15分間インキュベートして血小板を蛍光標識した。その後、TyrodeHEPESCa-緩衝液を加え、ブレーキ無し、1500rpmで8分間遠心し、洗浄を行った。次に、蛍光標識した各血小板サンプルを、アルガトロバン抗トロンビン薬にて抗凝固処理を行って採取したヒト末梢血の全血サンプルに、全血血小板の10の数になるように加え、混合した。そして、このように調製した血液サンプルを一定の壁剪断速度1500S-1で、シリンジポンプHarvardApparatus社製により、VWFで表面をコ―ティングしたチャンバー内に注入し、この表面上にVWFを介して接着し、血栓を形成する蛍光標識した血小板を倒立ステージエピ蛍光ビデオ顕微鏡システムDMIRB、Leica社製を用いて可視化し、その顕微鏡像を感光性カラーCCDカメラL-600、Leica社製を用いてデジタル化し、更にイメージ-JソフトウェアNIHイメージを用いて、血小板による表面積カバー率を算出した。なお、かかる試験は2回ずつ行い、陽性対照freshな血小板における表面積カバー率の最大値を各々100にして、各サンプルの生データを換算して、2回の試験から得られた値の平均値を算出した。得られた結果は図26及び図27に示す。なお、図26及び27中、縦軸は前記平均値を示し、S-45457は15μMS-45457を添加して調製した血小板における結果を示し、DMSOは陰性対照における結果を示し、freshは陽性対照freshな血小板における結果を示す。また、図26中の横軸はチャンバー内に注入してからの計測時間単位:分を示す。図26及び図27に示した結果から明らかなように、本発明にかかる化合物S-45457は、陰性対照であるDMSOを添加してCCCPと共にインキュベーションした結果と比較して、血小板による表面積カバー率は大きいものであった。然るに、本発明にかかる化合物はADAM17によるGPIbαのシェディングを抑制し、ひいてはGPIbαとVWFとの会合をも可能とし、血小板の接着能を維持することができることが明らかになった。試験例16生体分子イメージング手法を用いた、S-45457による血小板接着能の維持効果の検証本発明者等によって開発された血栓形成モデル並びに生体分子イメージング手法を用いて、本発明にかかる化合物S-45457等による血小板接着能の維持効果、特に血小板の血管への接着能をインビボにおいて評価した。なお、本試験例において用いた血栓形成モデルは、レーザー照射とヘマトポルフィリン等とを用いて、活性酸素ROSを血管内に局所的に発生させ、血管内皮細胞に障害を引き起こすことにより、血小板を血管に接着させ、血栓形成を誘発させるものである。また、本試験例において用いた生体分子イメージング手法は、高速レーザー共焦点顕微鏡及びマルチビーム式の共焦点ユニットを用いて、血流の方向と平行にごく狭い断面に焦点を合わせて高速画像を取得することが可能であるため、血管内を変形しながら流れる血小板等に各々フォーカスを合わせて観察することにより、単一血小板レベルでの生体イメージングを可能とするものであるTakizawaら、TheJournalofClinicalInvestigation、2010年1月、120巻、1号、179~190ページ参照。以下、本試験例で用いた血栓形成モデル並びに生体分子イメージング手法について説明する。先ず、血栓形成モデルマウスに注入するための血小板を調製した。すなわち、採血して得られたヒト末梢血に10vvになるようACDを加え、ブレーキ無し、900rpmで10分間遠心して上清を回収した。得られた上清に1μMPGE1を加え、ブレーキ無し、1500rpmで10分間遠心した後、上清を除去した。得られた沈殿物をTyrodeHEPESCa-緩衝液に懸濁し、100μMCCCPと、DMSO又は15μMS-45457とを添加した後、37°Cで24時間インキュベーションした。なお、この際CCCPとDMSOを添加してインキュベーションしたものを陰性対照として、何も添加せずインキュベーション処理を行わなかったものを陽性対照として用意した。インキュベーション後陽性対照はインキュベーションせずに、かかる沈殿物における血小板の数を計測し、2mlTyrodeHEPESCa-緩衝液1μMPGE1含有中に懸濁した。そして、かかる懸濁液に5μMTMREを添加し、室温下で15分間インキュベートして血小板を蛍光標識した。その後、TyrodeHEPESCa-緩衝液を加え、ブレーキ無し、1500rpmで8分間遠心し、洗浄を行った。次に、血栓形成モデルマウスを調製した。すなわち、予め2Gyの放射線処置によって血小板減少処置を施しておいたNOGマウス重度複合免疫不全マウスを麻酔して腹壁に小切開を施し、腸間膜における微小循環及び血栓形成を視覚的に解析できるようにした。さらに、NOGマウス由来の血球の動態を可視化するために、FITC-デキストラン20mg/kg体重をこのNOGマウスの尾静脈に注入した。そして、前記の通りにして蛍光標識した血小板をこのNOGマウスに、このマウスの循環血小板数の15の数になるように注入した。さらに、血栓形成を誘発させるために、ヘマトポルフィリン1.8mg/kg体重をこのNOGマウスに投与した。なお、このようにマウスを処理することにより、血球動態及び血栓形成は、レーザー照射及びROS産生の間可視化されることになる。そして、レーザー照射の際のかかる可視化画像シークエンシャル画像は、回転ディスク共焦点顕微鏡横河電機株式会社製、CSU-X1及びEMElectronMultiplying-CCDカメラiXon、Andor社製を用いて、20秒間、30フレーム/秒で、先に施した小切開部位~3mmを通して観察及び撮影することにより得た。なお、かかる観察は、S-45457を添加して調製した血小板を注入したマウス、陰性対照、陽性対照について、閉塞性血栓を形成した20本の独立した血管を対象として行った。得られた結果は図28及び図29に示す。なお、図28及び図29中、S-45457は15μMS-45457を添加して調製した血小板を注入したマウスにおける血栓形成を示し、DMSOは陰性対照における血栓形成の結果を示し、freshは陽性対照における血栓形成の結果を示す。また、代表例である図28中の白い矢印は血流の方向を示し、白い三角が指している箇所はヒト由来の血小板が血管に付着している箇所を示し、スケールバーは10μmを示す。さらに、図29中の縦軸は、血栓形成に関与した血小板総数に占めるヒト血小板数の割合であり、値は、20本の平均標準誤差である。図28及び図29に示した結果から明らかなように、本発明にかかる化合物S-45457を添加して調製した血小板を注入したマウスにおいては、陰性対照と比較して、ヒト由来の血小板が血栓形成に寄与する割合が大きかった。然るに、本発明にかかる化合物は、ADAM17によるGPIbαのシェディングを抑制することにより、血小板の血管への接着能を維持することができることが明らかになった。"