"IMGTナンバリングシステムによって定義される配列番号1~6および30~33のアミノ酸配列を含んでなるCDRから選択される少なくとも一つの相補性決定領域CDRを含んでなる、単離された抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体の一つ。配列番号1、2および3のアミノ酸配列をそれぞれ含んでなるCDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3を含んでなる軽鎖と、配列番号4、5および6のアミノ酸配列をそれぞれ含んでなるCDR-H1、CDR-H2およびCDR-H3を含んでなる重鎖とを含んでなる、請求項1に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体の一つ。配列番号7のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖と、配列番号8のアミノ酸配列を含んでなる重鎖とを含んでなる、請求項2に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体の一つ。キメラ抗体であり、かつ配列番号56、57または58からなる群から選択される配列の重鎖と、配列番号59の配列の軽鎖とを含んでなる、請求項2に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体の一つ。ヒト化抗体であり、かつ配列番号64からなる配列の重鎖可変領域と、配列番号65、66、82または83からなる群から選択される配列の軽鎖可変領域とを含んでなる、請求項2に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体の一つ。ヒト化抗体であり、かつ配列番号67、68または69からなる群から選択される配列の重鎖と、配列番号70、71、84または85からなる群から選択される配列の軽鎖とを含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントを含んでなる、請求項2に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体の一つ。機能的フラグメントが、フラグメントFv、scFv、Fab、Fab’2、Fab‘、scFv-Fc、ダイアボディ、または半減期が化学修飾によって延長された任意のフラグメントからなる、請求項2に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体の一つ。配列番号54のアミノ酸配列を含んでなるscFvである、請求項7に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメントまたは誘導体の一つ。配列番号1、2および30のアミノ酸配列をそれぞれ含んでなるCDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3を含んでなる軽鎖と、配列番号31、32および33のアミノ酸配列をそれぞれ含んでなるCDR-H1、CDR-H2およびCDR-H3を含んでなる重鎖とを含んでなる、請求項1に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体の一つ。配列番号34のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖と、配列番号35のアミノ酸配列を含んでなる重鎖とを含んでなる請求項9に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体の一つ。以下の核酸から選択された、単離核酸:a請求項1~10のいずれか一項に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体の一つをコードする核酸、DNA、またはRNA、b配列番号14~19および41~45からなるCDR配列群から選択されるDNA配列を含んでなる核酸、c配列番号20、21、46、47、72、73、74、86、および87からなる重および軽可変ドメイン配列群から選択されるDNA配列を含んでなる核酸、d配列番号60~63、75~79、88、および89からなる重鎖および軽鎖配列群から選択されるDNA配列を含んでなる核酸、e配列番号55からなるDNA配列を含んでなる核酸、fb、c、dまたはeに定義される核酸の対応するRNA核酸、ga、b、c、dおよびeに定義される核酸の相補的核酸、およびh高ストリンジェンシー条件下で配列番号14~19および41~45の配列のCDRの少なくとも一つとハイブリダイズすることができる少なくとも18個のヌクレオチドの核酸。請求項11に記載の核酸を含んでなる、ベクター。請求項12に記載のベクターを含んでなる、宿主細胞。請求項12に記載のベクターによって形質転換された少なくとも一つの細胞を含んでなる、ヒト以外のトランスジェニック動物。請求項1~10のいずれか一項に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体の一つを生産する方法であって、a請求項13に記載の細胞の培地および適当な培養条件での培養工程、およびbこのようにして該培養培地または該培養細胞から生産された、該抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体の一つの回収工程、を含んでなる、方法。請求項15に記載の方法によって得ることができる、または得られた抗体、またはその機能的フラグメントもしくは誘導体の一つ。薬剤としての、請求項1~10および16のいずれか一項に記載の抗体。PBMCにおけるHIV-1KON一次単離物の複製を、少なくとも5μg/ml、好ましくは少なくとも10μg/mlのIC90で阻害する、請求項1~10または16~17のいずれか一項に記載の抗体、またはその機能的フラグメントもしくは誘導体の一つ。請求項1~10および16~18のいずれか一項に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体の一つからなる化合物を活性成分として含んでなる、組成物。薬剤としての、請求項19に記載の組成物。HIV感染の予防または治療のための、請求項19または20に記載の組成物。前記HIV感染がX4指向性HIV感染である、請求項21に記載の組成物。前記HIV感染がX4/R5指向性HIV感染である、請求項21に記載の組成物。HIVの侵入および/または複製を特異的に阻害することができる化合物の中から選択される少なくとも一つの第二の抗HIV化合物を含んでなる、請求項19~23のいずれか一項に記載の組成物。少なくとも第二の抗HIV化合物が、HIVプロテアーゼ阻害剤PI、ヌクレオシド/ヌクレオチドHIV逆転写酵素阻害剤NRTI/NtRTI、非ヌクレオシドHIV逆転写酵素阻害剤NNRTI、HIV侵入阻害剤、HIVインテグラーゼ阻害剤のような抗レトロウイルス薬からなる群から選択される、請求項24に記載の組成物。少なくとも第二の抗HIV化合物が抗CCR5化合物である、請求項24または25に記載の組成物。抗CCR5化合物がマラビロクである、請求項26に記載の組成物。CXCR4アンタゴニスト抗ウイルス剤としての分子をスクリーニングおよび/または同定する方法であって、aCXCR4を発現する細胞を選択する工程、b前記細胞を、請求項1~10または16~18のいずれか一項に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体の一つとともにインキュベートする工程、c抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体の一つと、CXCR4との間の結合の潜在的な阻害のための供試分子を評価する工程、およびd前記阻害が可能な分子を選択する工程を含んでなる、方法。HIV複製を阻害するための薬剤を調製するための、請求項1~10および16のいずれか一項に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体の一つ、および/または請求項19~27のいずれか一項に記載の組成物の使用。HIV疾患の予防または治療のための薬剤を調製するための、請求項1~10および16のいずれか一項に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体の一つ、および/または請求項19~27のいずれか一項に記載の組成物の使用。HIVの予防または治療の方法であって、請求項1~10および16のいずれか一項に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメントまたは誘導体の一つ、および/または請求項19~27のいずれか一項に記載の組成物を、それを必要とする患者に投与することからなる工程を含んでなる、前記方法。抗CCR5化合物を前記患者に投与することからなる工程をさらに含んでなる、請求項31に記載の方法。実施例1:ヒトCXCR4に対するモノクローナル抗体Mabの作製CXCR4に対するモノクローナル抗体を作製するため、Balb/cマウスに組換えNIH3T3-CXCR4細胞および/またはCXCR4細胞外N末端およびループに相当するペプチドを感作させた。6~16週齢のマウスに、完全フロイントアジュバントにて抗原を1回、皮下s.c.感作させた後、フロイントの不完全アジュバントにて抗原を2~6回s.c.感作させた。免疫応答を眼窩後方採血によって測定した。血清をELISAによりスクリーニングし下記の通り、抗CXCR4抗体力価が高いマウスを融合に用いた。屠殺および脾臓摘出の2日前にマウスの静脈内に抗原を追加投与した。ELISA抗CXCR4抗体を産生するマウスを選択するため、免疫マウスからの血清をELISAによって調べた。要するに、マイクロタイタープレートを、BSAと結合された精製[1-41]N末端ペプチドで5μg相当量のペプチド/mL、100μL/ウェルにてコーティングし、4°Cでの一晩インキュベートした後、PBS中0.5ゼラチン250μL/ウェルでブロックした。CXCR4免疫マウスからの血漿希釈液を各ウェルに加え、37°Cで2時間インキュベートした。これらのプレートをPBSで洗浄した後、HRPと結合されたヤギ抗マウスIgG抗体とともに37°Cで1時間インキュベートした。洗浄後、プレートをTMB基質で現像し、5分後に100μL/ウェルの1MH2SO4を加えることによって反応を停止させた。最高力価の抗CXCR4抗体を生じたマウスを抗体作製に用いた。CXCR4に対するMabを産生するハイブリドーマの作製最高力価の抗CXCR4抗体を生じたBalb/cマウスから単離したマウス脾細胞を、PEGを用いてマウス骨髄腫細胞系統Sp2/Oと融合させた。細胞をマイクロタイタープレートにおよそ1×105/ウェルで播種した後、ウルトラカルチャー培地2mML-グルタミン1mMピルビン酸ナトリウム1×HATを含有する選択培地で2週間インキュべートした。次に、ウェルをELISAによって、抗CXCR4モノクローナルIgG抗体に関してスクリーニングした。その後、抗体を分泌するハイブリドーマを制限希釈により少なくとも2回サブクローニングし、invitroで培養し、さらなる分析のための抗体を作製した。実施例2:FACS分析による抗CXCR4Mab515H7および301aE5結合特異性NIH3T3-CXCR4形質転換体の特性決定この実験では、抗CXCR4Mab515H7および301aE5のヒトCXCR4hCXCR4への特異的結合をFACS分析によって調べた。NIH3T3およびNIH3T3-hCXCR4トランスフェクト細胞を、10μg/mlのモノクローナル抗体515H7および301aE5とともにインキュベートした。その後、これらの細胞を1BSA/PBS/0.01NaN3で洗浄した。次に、Alexa標識された二次抗体をこれらの細胞に加え、4°Cで20分間インキュベートした。その後、細胞を再び2回洗浄した。2回目の洗浄後、FACS分析を行った。これらの結合試験の結果を、[FACSによって得られた平均蛍光強度MFI]を示す下表8に示す。抗CXCR4Mab515H7および301aE5はヒトCXCR4-NIH3T3トランスフェクト細胞系統と特異的に結合するが、親NIH3T3細胞に対する認識は見られなかった。実施例3:FACS分析による末梢血単核細胞PBMCに対する抗CXCR4Mab515H7および301aE5の結合の特性決定健康なドナーから血液をバフィーコートとして採取した。100μlの全血を、示された濃度の抗ヒトCXCR4抗体クローン515H7および301aE5とともに4°Cで20分間インキュベートした。血液をPBS-BSA1-NaN30.01中で3回洗浄し、1:500希釈のヤギ抗ヒトAlexa488IgGとともに4°Cで20分間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、CD14-PEまたはCD3-PEとともに4°Cで10分間インキュベートし、3回洗浄した。赤血球をHighYield溶解液で室温にて10分間溶解させた。すぐにFacscaliburを用いて細胞を分析した。単球でのCXCR4発現はCD14陽性細胞で行い、T細胞でのCXCR4発現はCD3陽性細胞で行った図1。結果は抗原結合能ABCで表す。図2Aおよび2Bに示されるように、抗ヒトCXCR4クローン515H7および301aE5はTリンパ球図2Aおよび単球図2Bの両者を染色したが、このことは、515H7および301aE5Mabが単球およびTリンパ球の細胞表面で発現された天然型のCXCR4を認識可能であることを示している。実施例4:生物発光共鳴エネルギー移動BRETアプローチによるCXCR4ホモ二量体に対する515H7および301aE5Mabの効果この機能的アッセイは、SDF-1および/または515H7MabがCXCR4受容体に結合した際に誘発されるコンフォメーション変化をCXCR4ホモ二量体のレベルで評価することができる。検討する相互作用相手の発現ベクターを、従来の分子生物学的技術を適用することにより、対応する色素ウミシイタケルシフェラーゼRlucおよび黄色蛍光タンパク質YFPとの融合タンパク質として構築した。BRET試験を行う2日前に、HEK293細胞を、対応するBRET相手:[CXCR4/RlucCXCR4/YFP]をコードする発現ベクターで一時的にトランスフェクトし、CXCR4ホモ二量体形成を調べた。翌日、細胞を、ポリリシンをプレコーティングした白色96MWプレートの完全培養培地[10FBSを添加したDMEM]に分注した。まず、細胞をプレートに接着させるために、CO25、37°Cで培養した。その後、200μlDMEM/ウェルで一晩、細胞を飢餓状態にした。BRET試験の直前に、DMEMを除去し、細胞を手早くPBSで洗浄した。その後、細胞をPBS中、抗体の存在下または非存在下、37°Cにて10分間インキュベートした後、最終量50μl中、SDF-1300nMとともに、または伴わずにコエレンテラジンH5μMを添加した。37°Cでさらに10分間インキュベートした後、MithrasLB940マルチラベルリーダー1s/波長/ウェル、室温で15反復を用い、485nmおよび530nmでの発光獲得を誘導した。BRET比の計算は従前に記載されているように行った:[発光530nm-発光485nm×Cf]/発光485nm、式中、Cf=同じ試験条件下でRluc融合タンパク質単独を発現する細胞の発光530nm/発光485nm。この式を簡単にすると、BRET比が、二つのBRET相手が存在する場合に得られる530/485nm比を、同じ試験条件下で、Rlucと融合された相手だけがアッセイ中に存在する場合に得られる530/485nm比により補正したものに相当することが示される。読み取りやすいように、結果はミリBRET単位mBUで表すが、mBUはBRET比に1000を掛けたものである。SDF1300nMは、CXCR4受容体と融合されたアダプタータンパク質とアクセプタータンパク質が空間的に近接していることから生じるBRETシグナルを約20増強したが、それはおそらくCXCR4/CXCR4ホモ二量体形成または既存の二量体のコンフォメーション変化を示唆する図3AおよびB。515H7および301aE5Mabは、CXCR4ホモ二量体に関してSDF-1により誘発されるコンフォメーション変化を調節することができた515H7および301aE5に関して、SDF-1により誘発されるBRET増強の69阻害、図3AおよびB。515H7および301aE5Mabはまた、それ自体、CXCR4/CXCR4の空間的近接を調節することもできたが、このことはCXCR4/CXCR4ホモ二量体コンフォメーションに対する515H7および301aE5Mabの影響を示唆する図3Aおよび3B。実施例5:抗CXCR4Mab515H7および301aE5による、ヒトPBMCにおけるHIV-1一次単離物KONX4ウイルス複製の阻害HIV-1に対して血清反応陰性の健康なドナーからのPBMCをバフィーコートから、またはフィコール-ハイパーク勾配遠心分離による血球成分分離法から単離した。PBMCを、25mMHEPES、5mlペニシリン10000U/ml-ストレプトマイシン10000μg/ml2mML-グルタミンを含有し、10熱不活性化FCSを添加したRPMI1640細胞培養培地中、PHAの存在下で活性化し、1サイクルの中和アッセイで細胞標的として用いた。一次ヒトPBMCにおけるHIV-1複製は、ウイルスp24抗原の細胞内染色をFACS分析によって分析することにより行った。要するに、25μl/ウェルの、種々の希釈率のMab515H7、301aE5および12G5または対照として培養培地RPMI1640、10FCS、0.1IL-2を、25μl/ウェルのHIV-1KONX4一次単離物希釈液とともに37°Cで1時間、二反復でインキュベートした。PHA活性化ヒトPBMC25μl/ウェルを96ウェルプレートU底、Costar3599中のMab/ウイルス混合物に20×106細胞/mlで加え、RPMI1640、10FCSおよび0.1IL-2中、37°Cで24~36時間培養した。Mabを含まない培地中、非感染PBMCからなる対照を導入した。HIV感染PBMCを検出するために、ウイルスp24抗原の細胞内染色を行い、フローサイトメトリーによって分析した。細胞を固定し、Cytofix/Cytopermキットを製造者のプロトコールに従って用いて透過処理を施し、1/160希釈で用いる暗所にて4°Cで10分間インキュベートされる蛍光抗p24MabクローンKC57-CoulterBeckmanで染色した。PBS-3FCS培地で洗浄した後、フローサイトメトリー分析前にPBMCをPBSで希釈した。種々のサンプルにおけるp24陽性細胞の割合を、生細胞集団に対する20,000事象をゲートすることにより決定した。この生細胞のサブセットのp24発現を、非感染細胞のバックグラウンド染色と比べて分析した。p24抗原陽性値は、mock感染細胞におけるバックグラウンド事象を差し引いた後に得た。中和の割合は、Mabを含まない対照感染ウェルと比べてのp24陽性細胞の減少と定義した。中和力価は、感染細胞の割合を90低下させるMabの希釈率と定義した。抗CXCR4Mab515H7および301aE5を、HIV適用の参照の抗CXCR4Mabとして知られる12G5Mabと比較した。図4AおよびBおよび5に示されるように、抗CXCR4Mab515H7および301aE5は、それぞれIC9010μg/ml66nMおよび150μg/ml1μMで、PBMCにおけるHIV-1KON一次単離物の複製を阻害することができるが、12G5MabはPBMCにおけるHIV-1KON一次単離物の複製を阻害することができなかった図4A。実施例6:CXCR4受容体により媒介される細胞内カルシウム貯蔵の動員この機能的アッセイは、小胞体の細胞内貯蔵からのカルシウム遊離を誘導するホスホリパーゼC経路の刺激を介したCXCR4受容体シグナル伝達を測定するように設計された。ヒトCXCR4受容体を安定的かつ構成的に発現するCHO-K1細胞は、ナイーブCHO-K1細胞ATCCCCL-61を、ヒトCXCR4受容体の全コード配列RefSeqNM_003467を含む哺乳類発現ベクターでトランスフェクトした際に得られたものである。細胞を完全培養培地[5ウシ胎仔血清FCSおよび500μg/mlのゲネチシンを添加したDMEM-ハムF12培地]で増殖させた。細胞を黒色96MWプレートに適当な培養培地中100,000細胞/ウェルの密度で播種した。試験前に細胞を一晩飢餓状態にした。細胞にローディングバッファー[HBSS1×、HEPES20mM、プロベネシド酸25mM]中、蛍光カルシウム色素を、37°Cで30分間、その後、25°Cで30分間負荷した。SDF-1による刺激は、各ウェルに直接注入することにより行った。拮抗作用試験では、10μlのMab溶液をSDF-1の少なくとも10分前にローディングバッファーに直接添加する。動的蛍光測定は、マルチモード蛍光マイクロプレートリーダーMithrasLB940にて、以下の設定で行う:485nmでの励起、535nmでの発光、10000任意単位での励起エネルギー。各ウェルの蛍光をSDF-1注入前基底シグナルに毎秒0.1秒、20秒間記録する。その後、20μlのSDF-1を注入し、データ記録を2分間続ける。各試験条件を2反復で行う。各ウェルの値をまず、基底蛍光と細胞を含まない対照ウェルによって発せられた蛍光を差し引くことによって補正する。相対的データをSDF-1100nMによって得られた最大刺激の割合として表す。SDF1100nMは、組換えCHO/CXCR4において細胞内カルシウムの迅速かつ強い放出を誘導したが、ナイーブCHO-K1細胞では蛍光シグナルは検出されなかった。最大強度は基底蛍光の140超に達し、SDF-1による刺激時に約40秒で見られた図6A、6B、および6C。Mab515H7133nM図6Aおよびc515H7133nM図6Cは、SDF-1100nMにより誘発されたカルシウムシグナルの強い阻害をもたらした。Mab301aE5133nM図6Bは、SDF-1100nMにより誘発されたカルシウムシグナルの部分的阻害をもたらした。実施例7:抗CXCR4Mab515H7、c515H7および301aE5による、ヒトPBMCにおけるHIV-1一次単離物KON、MN、および92UG024X4ウイルスの複製の阻害1サイクル中和アッセイこのアッセイは、感染2日後に2の感染CD4Tリンパ球の検出を可能とするように相応に濃縮および希釈した一次単離物KON、MN、および92UG024を用いて36時間行う。種々の希釈率のMab515H7、c515H7および301aE525μlを、25μlのウイルスとともに37°Cで1時間インキュベートした。20×106細胞/mlのヒトPBMC25μlを96ウェルプレートU底、Costar3599中のMab/ウイルス混合物に加え、RPMI164010FCSおよび20U/mlIL-2中で36時間培養した。2日間の培養後、HIV感染リンパ球を、ウイルスp24Agの細胞内染色により検出した。細胞を固定し、製造者に従いCytofix/CytopermおよびPerm/Washキットの両者を用いて透過処理を施し、Perm/Wash溶液中1/160希釈で用いる4°Cで15分間加える蛍光抗p24MabFITC-またはPE-抗p24、クローンKC57、BeckmanCoulterImmunotechHialeahFLで染色した。3FBSを含むPBSで洗浄した後、PBMCを300μlのPBSに希釈した後、DIVAソフトウエアを用いてフローサイトメトリー分析を行った。種々のサンプル中のp24陽性細胞の割合を、前方および側方散乱パラメーターによって同定された生細胞集団に対する20,000事象をゲートすることにより決定した。これらの生細胞のサブセットは、livedeadsolutionkitを用いて分析した。p24Ag陽性値は、mock感染細胞におけるバックグラウンド事象を差し引いた後に得た。中和パーセントは、Mabを含まない対照感染ウェルと比べてのp24陽性細胞の減少と定義した。中和力価は、感染細胞の割合を90低下させる抗体の濃度3反復で行った連続希釈率の間に挿入と定義した。図7、8および9に示されるように、抗CXCR4Mab515H7、c515H7、および301aE5は、PBMCにおけるHIV-1X4MN、KON、および92UG024一次単離物の複製を阻害することができる。ICμg/mlにおいての結果を表9にまとめる。実施例8:抗CXCR4Mab515H7、c515H7および301aE5による、ヒトPBMCにおけるHIV-1一次単離物89.6X4/R5二重ウイルスの複製の阻害1サイクル中和アッセイこのアッセイは、感染2日後に2の感染CD4Tリンパ球の検出を可能とするように相応に濃縮および希釈した一次単離物89.6を用いて36時間行う。種々の希釈率のMab515H7、c515H7および301aE525μlを、25μlのウイルスとともに37°Cで1時間インキュベートした。20×106細胞/mlのヒトPBMC25μlを96ウェルプレートU底、Costar3599中のMab/ウイルス混合物に加え、RPMI164010FCSおよび20U/mlIL-2中で36時間培養した。2日間の培養後、HIV感染リンパ球を、ウイルスp24Agの細胞内染色により検出した。細胞を固定し、製造者に従いCytofix/CytopermおよびPerm/Washキットの両者を用いて透過処理を施し、Perm/Wash溶液中1/160希釈で用いる4°Cで15分間加える蛍光抗p24MabFITC-またはPE-抗p24、クローンKC57、BeckmanCoulterImmunotechHialeahFLで染色した。3FBSを含むPBSで洗浄した後、PBMCを300μlのPBSに希釈した後、DIVAソフトウエアを用いてフローサイトメトリー分析を行った。種々のサンプル中のp24陽性細胞の割合を、前方および側方散乱パラメーターによって同定された生細胞集団に対する20,000事象をゲートすることにより決定した。これらの生細胞のサブセットは、livedeadsolutionkitを用いて分析した。p24Ag陽性値は、mock感染細胞におけるバックグラウンド事象を差し引いた後に得た。中和パーセントは、Mabを含まない対照感染ウェルと比べてのp24陽性細胞の減少と定義した。中和力価は、感染細胞の割合を90低下させる抗体の濃度3反復で行った連続希釈率の間に挿入と定義した。図10および11に示されるように、抗CXCR4Mab515H7、c515H7、および301aE5は、PBMCにおけるHIV-189.6一次単離物の複製を阻害することができる。ICμg/mlの結果を表10にまとめる。実施例9:抗CXCR4Mabc515H7と抗CCR5分子マラビロクの組合せによる、ヒトPBMCにおけるHIV-1一次単離物89.6およびUG93067X4/R5二重ウイルスの複製の阻害中和アッセイ、一次PBMCにおける複数回のHIV一次単離物複製の分析:c515H7Mabまたはマラビロクまたは両者の組合せの連続希釈液と、ウイルスの連続希釈液とを組み合わせるこのアッセイは、PBMC末梢血単核細胞に対する複数回の感染を分析する。要するに、c515H7Mabまたはマラビロクまたは両者の組合せの連続希釈液2倍の25μlアリコート四つをそれぞれ、予め含水させた96ウェルフィルタープレート孔径1.25μm、DuraporDv、MilliporeMolsheimFranceにて、ウイルスの連続希釈液25μlとともに培養した。ウイルスの対照滴定希釈c515H7Mabまたはマラビロクの代わりに25μlのRPMIを、c515H7Mabまたはマラビロクまたは両者の組合せの希釈液の存在下での滴定と同じプレートで行った。37°Cで1時間後、4×106細胞/mlの濃度のPHA刺激PBMC25μl5人の健康なドナーからのPHA活性化PBMCのプールを、RPMIの最終培養容量75μl、10ウシ胎仔血清FCSおよび20IUのインターロイキン-2IL-2/mlとなるように加えた。37°Cで24時間後、100μlの同じ培養培地を加えた。4日目に濾過により2回の洗浄各200μlのRPMIを行ってc515H7Mabおよびマラビロクを除去し、200μlの新鮮培養培地を加えた。7日目に、培養上清におけるp24の存在をELISAにより測定し、陰性対照ウイルス希釈液で感染させ、10-6Mジドブジン[AZT]の存在下で維持した培養物の場合と比べ、陽性ウェルを判定した。4反復のウェルを用い、各希釈率のc515H7Mabまたはマラビロクまたは両者の組合せの非存在下V0および存在下Vnでウイルス力価50組織培養感染量[TCID50]を決定した。中和力価は、ウイルス力価の90低下をもたらすVn/V0=0.1c515H7Mabまたはマラビロクまたは両者の組合せの希釈率として定義した。図12に示されるように、二重指向性X4R5ウイルス89.6の複製は、c515H7Mabにより、IC902μg/mlで阻害された図12。マラビロク50μg/mlでは、IC90阻害活性に達しなかった図12。さらに、2μg/mlのマラビロクを抗体515H7に添加したところ、IC900.2μg/mlでc515H7Mabの阻害活性を増強した図12。c515H7Mabとマラビロクの組合せの有益な効果を、種々の希釈率のこれらの2分子および別の二重指向性ウイルスUG93067を用いて評価した。図13に示されるように、Mabc515H7およびマラビロクの阻害活性は同等であった。これらの結果は、ウイルスUG93067の、CCR5受容体またはCXCR4受容体のいずれかを用いる能力が匹敵していたことを示唆する。UG93067ウイルスを用いると、より良い活性を証明することができ、これらのX4c515H7MabとR5マラビロク阻害剤各10μg/mlの組合せだけが、ウイルス力価の90低下を可能とした図13。実施例10:抗CXCR4キメラMabc515H7の生産ネズミ515H7Mabのキメラ形式を設計した。これは、着目するネズミ抗体の軽鎖および重鎖可変ドメインを、ヒトCκおよびIgG1/IgG2/IgG4定常ドメインと遺伝的に融合したものに相当する。この組換えMabは、HEK293/EBNA系をpCEP4発現ベクターとともに使用することによって、一時的トランスフェクション時に作製されたものである。個々のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は本明細書に上記した。さらに、上記の表3にIgG2および4イソ型好ましいイソ型の配列が開示されているため、ここでも、IgG1イソ型の重鎖、すなわち、配列番号80のアミノ酸配列および配列番号81のヌクレオチド配列に相当するc515H7VHG1wtの配列を挙げることができる。515H7Mab軽鎖および重鎖の可変ドメインに相当する全ヌクレオチド配列は、グローバル遺伝子合成によって合成されたものである。それらを、ヒトIgG1/IgG2/IgG4免疫グロブリンの軽鎖[Cκ]または重鎖[CH1-Hinge-CH2-CH3]のいずれかの定常ドメインの全コード配列を有するpCEP4ベクターにサブクローニングした。全クローニング工程は、theLaboratorymanualに記載されている従来の分子生物学的技術に従って、または供給者の説明書に従って行った。各遺伝子構築物を、BigDyeターミネーターサイクルシーケンシングキットを用いたヌクレオチド配列決定によって完全にバリデートし、3100ジェネティックアナライザーを用いて分析した。懸濁適合HEK293EBNA細胞を常法により、オービタルシェーカー回転速度110rpm上、250mlフラスコにて、6mMグルタミンを添加した血清不含培地Excell29350ml中で増殖させた。一時的トランスフェクションは、水中終濃度1mg/mlで調製した直鎖25kDaポリエチレンイミンPEI、混合およびプラスミドDNA重鎖:軽鎖プラスミド比1:1で、終濃度1.25μg/mlを用い、2.106細胞/mlで行った。トランスフェクション4時間後に、培養物を1容量の新鮮培養培地で希釈して、最終細胞密度を106細胞/mlとした。培養工程を細胞の生存率およびMab生産に基づいて測定した。一般に、培養は4~5日間維持された。Mabは、プロテインA樹脂での従来のクロマトグラフィーアプローチを用いて精製した。Mabは機能的評価に好適なレベルで生産された。生産性レベルは一般に、精製Mab6~15mg/lの範囲である。実施例11:FACS分析による抗CXCR4キメラMabc515H7結合特異性の特性決定この試験では、抗CXCR4キメラMabc515H7のヒトCXCR4に対する特異的結合をFACS分析によって調べた。NIH3T3-hCXCR4トランスフェクト細胞を0μg/ml~10μg/mlの用量範囲のモノクローナル抗体c515H7とともにインキュベートした。その後、これらの細胞を1BSA/PBS/0.01NaN3で洗浄した。次に、Alexaで標識した二次抗体をこれらの細胞に加え、4°Cで20分間インキュベートした。その後、これらの細胞を再び2回洗浄した。2回目の洗浄後に、FACS分析を行った。この結合試験の結果を図15に示すが、これは、抗CXCR4キメラMabC515H7がヒトCXCR4-NIH3T3トランスフェクト細胞系統と特異的に結合することを示す。NIH3T3wt細胞との結合は検出されなかったデータは示されていない。実施例12:生物発光共鳴エネルギー移動BRETアプローチによるCXCR4ホモ二量体に対するc515H7Mabの効果この機能的アッセイは、SDF-1および/またはc515H7MabがCXCR4受容体に結合した際に誘発されるコンフォメーション変化をCXCR4ホモ二量体のレベルで評価することができる。検討する相互作用相手の発現ベクターを、従来の分子生物学的技術を適用することにより、対応する色素ウミシイタケルシフェラーゼRlucおよび黄色蛍光タンパク質YFPとの融合タンパク質として構築した。BRET試験を行う2日前に、HEK293細胞を、対応するBRET相手:[CXCR4/RlucCXCR4/YFP]をコードする発現ベクターで一時的にトランスフェクトし、CXCR4ホモ二量体形成を調べた。翌日、細胞を、ポリリシンをプレコーティングした白色96MWプレートの完全培養培地[10FBSを添加したDMEM]に分注した。まず、細胞をプレートに接着させるために、CO25、37°Cで培養した。その後、200μlDMEM/ウェルで一晩、細胞を飢餓状態にした。BRET試験の直前に、DMEMを除去し、細胞を手早くPBSで洗浄した。その後、細胞をPBS中、抗体の存在下または非存在下、37°Cにて10分間インキュベートした後、最終量50μl中、SDF-1100nMとともに、または伴わずにコエレンテラジンH5μMを添加した。37°Cでさらに10分間インキュベートした後、MithrasLB940マルチラベルリーダー1s/波長/ウェル、室温で15反復を用い、485nmおよび530nmでの発光獲得を誘導した。BRET比の計算は従前に記載されているように行った:[発光530nm-発光485nm×Cf]/発光485nm、式中、Cf=同じ試験条件下でRluc融合タンパク質単独を発現する細胞の発光530nm/発光485nm。この式を簡単にすると、BRET比が、二つのBRET相手が存在する場合に得られる530/485nm比を、同じ試験条件下で、Rlucと融合された相手だけがアッセイ中に存在する場合に得られる530/485nm比により補正したものに相当することが示される。読み取りやすいように、結果はミリBRET単位mBUで表すが、mBUはBRET比に1000を掛けたものである。SDF1100nMは、CXCR4受容体と融合されたドナータンパク質と、アクセプタータンパク質とが空間的に近接していることから生じるBRETシグナルを約10増強したが、それはおそらくCXCR4/CXCR4ホモ二量体形成または既存の二量体のコンフォメーション変化を示唆する図16。Mabc515H7は、CXCR4ホモ二量体に関して、SDF-1により誘発されるコンフォメーション変化を調節することができたSDF-1により誘発されるBRET増強の96阻害、図16。Mabc515H7はまた、それ自体、CXCR4/CXCR4の空間的近接を調節することもできたが、このことはCXCR4/CXCR4ホモ二量体コンフォメーションに対するこのMabの影響を示唆する図16。実施例13:CD4およびCXCR4またはCCR5を発現するGFP形質導入ヒト骨肉腫GHOST細胞を用いたMab515H7抗HIV-1活性のinvitro評価CXCR4515H7Mabの特異性を判定するために、本発明者らは、CD4およびCXCR4またはCCR5を発現するGHOST細胞を用い、このMabの抗HIV-1活性を評価した。このアッセイは、X4HIV-1LAIウイルスCXCR4を発現するGhost細胞を持つまたはR5HIV-1BaLウイルスCCR5を発現するGhost細胞を持つのいずれかを用いて48時間行う。500μlのGhost細胞を、10FCSを添加したダルベッコの培養培地で24時間平板培養した2.5105細胞/ml。種々の希釈率のMab515H7を37°Cで1時間インキュベートした後、これらの細胞に希釈したHIV-1LAIウイルス1/10およびHIV-1BaLウイルス1/7を48時間加えた。細胞をトリプシン処理し、PBSで1回洗浄した。細胞を固定し、また、ウイルスを不活性化するために、この細胞ペレットに300μLの1.5パラホルムアルデヒドを暗所、4°Cで2時間加えた。GFP陽性細胞をフローサイトメトリーにより分析し、HIV-1感染の阻害を算出した。感染細胞の阻害パーセントは、Mabを含まない対照感染ウェルと比較して定義した。ICsμg/mlの結果を表11にまとめる。抗CXCR4Mab515H7は、Ghost細胞を発現するCXCR4においてHIV-1X4Laiウイルスの感染を阻害することができたが、Ghost細胞を発現するCCR5においてHIV-1R5BaLウイルスの感染阻害には全く不活性であった。実施例14:515H7抗CXCR4ネズミ抗体のヒト化および該h515H7のフラグメントの作製一般手順515H7抗CXCR4抗体のヒト化は、CDRグラフト法のグローバルルールを適用することで行った。免疫原性分析ならびにCDRおよびフレームワークFR領域の定義は、IMGTユニークナンバリングスキームならびにIMGTライブラリーおよびツールを適用することで行った。515H7のヒト化変異体の結合は、ヒトCXCR4で安定的にトランスフェクトされたNIH3T3細胞系統にて判定した。結合活性は、ビオチン化マウス抗体を用いた競合アッセイによって評価した。第二の試みにおいて、ヒト化抗体を、ビオチン化SDF-1のRAMOS細胞との結合を阻害する能力に関して評価した。RAMOS細胞は、CXCR4の発現が高く、CXCR7およびSDF-1の発現が低いために選択された。これらのアッセイを用いて、抗CXCR4抗体の組換えヒト化型を特性決定した。可変ドメインをヒトIgG1/k定常ドメインでフォーマットし、哺乳類発現ベクターpCEPにクローニングした。組換えIgG1/κ由来抗体をHEK293細胞で一時的に発現させた。発現培養上清を濾過し、プロテインAセファロースを用いて抗体を精製した。精製抗体に再びPBSバッファーを加え、抗体濃度をELISAにより測定した。組換え抗体フラグメントを、ヒト化抗体の可変ドメインに特異的なオリゴヌクレオチドを用いたPCRによって作製し、これらを大腸菌系にサブクローニングした。抗体フラグメントの精製は、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーIMACによって行った。515H7可変ドメインのヒト化重鎖および軽鎖可変ドメインの種々の配列アライメントを図17および18に示す。最初の一連の試験では、三つの第一のヒト化変異体の抗CXCR4結合活性を分析した。VH変異体1VH1をネズミVLと組合せ、これらの構築物の、ビオチン化ネズミ515H7親抗体の結合を阻害する能力を評価した。VH1の可変ドメインのアミノ酸配列は配列番号90を含んでなり、ヌクレオチド配列は配列番号91を含んでなる。全長VH1のアミノ酸配列は配列番号92を含んでなり、ヌクレオチド配列は配列番号93を含んでなる。この構築物は、キメラ抗体と同等の、ネズミ抗体との競合能を示した図19A。このことは、ほとんどのヒトVH変異体がキメラと同等の結合能を有することを示唆する。よって、VH1をVLの変異体2と組み合わせた図19B。さらなる試験では、抗体515H7のヒト化変異体がSDF-1のCXCR4発現細胞への結合を阻害するか否かを判定した図20。このhz515H7のヒト化変異体の阻害能は、フローサイトメトリーにおいてビオチン化SDF-1を検出することによって評価した。ヒト化抗体hz515H7VH1D76NVL2は、キメラc515H7と同等のSDF-1結合阻害能を有する。また、ヒト化変異体hz515H7VH1VL2の抗体フラグメントも試験したところ、この抗体フラグメントがSDF-1の結合を完全に阻害することができることが分かった図20。実施例15:FACS分析による抗CXCR4ヒト化Mab515H7結合特異性の特性決定この試験では、抗CXCR4ヒト化Mab515H7の、ヒトCXCR4に対する特異的結合をFACS分析により調べた。NIH3T3、NIH3T3-hCXCR4トランスフェクト体を、100μlのFacsバッファー中、暗所、4°Cにて20分間、0~10μg/mLのヒト化Mab515H7hz515H7VH1D76NVL2、hz515H7VH1D76NVL2.1、hz515H7VH1D76NVL2.2、hz515H7VH1D76NVL2.3とともにインキュベートした。Facsバッファー中で3回洗浄した後、細胞を、暗所、4°Cにて20分間、二次抗体であるヤギ抗ヒトAlexa4881/500希釈とともにインキュベートした。Facsバッファー中で3回洗浄した後、各ウェルにヨウ化プロピジウムを加え、生存細胞のみをFacsにより分析した。少なくとも5000の生存細胞を評価し、各条件について蛍光強度の平均値を見積もった。これらの結合試験の結果を、[FACSによって得られた平均蛍光強度MFI]を示す図21に示す。抗CXCR4ヒト化Mabhz515H7は、ヒトCXCR4-NIH3T3トランスフェクト細胞系統と特異的に結合したNIH3T3親細胞ではMFI=2.2。実施例16:生物発光共鳴エネルギー移動BRETアプローチによるCXCR4ホモ二量体に対するhz515H7Mabの効果この機能的アッセイは、SDF-1および/またはhz515H7VH1D76NVL2、hz515H7VH1D76NVL2.1、hz515H7VH1D76NVL2.2、hz515H7VH1D76NVL2.3がCXCR4受容体に結合した際に誘発されるコンフォメーション変化をCXCR4ホモ二量体のレベルで評価することができる。検討する相互作用相手の発現ベクターを、従来の分子生物学的技術を適用することにより、対応する色素ウミシイタケルシフェラーゼRlucおよび黄色蛍光タンパク質YFPとの融合タンパク質として構築した。BRET試験を行う2日前に、HEK293細胞を、対応するBRET相手:[CXCR4/RlucCXCR4/YFP]をコードする発現ベクターで一時的にトランスフェクトし、CXCR4ホモ二量体形成を調べた。翌日、細胞を、ポリリシンをプレコーティングした白色96MWプレートの完全培養培地[10FBSを添加したDMEM]に分注した。まず、細胞をプレートに接着させるために、CO25、37°Cで培養した。その後、200μlDMEM/ウェルで一晩、細胞を飢餓状態にした。BRET試験の直前に、DMEMを除去し、細胞を手早くPBSで洗浄した。その後、細胞をPBS中、抗体の存在下または非存在下、37°Cにて10分間インキュベートした後、最終量50μl中、SDF-1100nMとともに、または伴わずにコエレンテラジンH5μMを添加した。37°Cでさらに10分間インキュベートした後、MithrasLB940マルチラベルリーダー1s/波長/ウェル、室温で15反復を用い、485nmおよび530nmでの発光獲得を誘導した。BRET比の計算は従前に記載されているように行った:[発光530nm-発光485nm×Cf]/発光485nm、式中、Cf=同じ試験条件下でRluc融合タンパク質単独を発現する細胞の発光530nm/発光485nm。この式を簡単にすると、BRET比が、二つのBRET相手が存在する場合に得られる530/485nm比を、同じ試験条件下で、Rlucと融合された相手だけがアッセイ中に存在する場合に得られる530/485nm比により補正したものに相当することが示される。読み取りやすいように、結果はミリBRET単位mBUで表すが、mBUはBRET比に1000を掛けたものである。SDF1100nMは、CXCR4受容体と融合されたドナータンパク質と、アクセプタータンパク質とが、空間的に近接していることから生じるBRETシグナルを約12増強したが、それはおそらくCXCR4/CXCR4ホモ二量体形成または既存の二量体のコンフォメーション変化を示唆する図22。515H7ヒト化Mabは、CXCR4ホモ二量体に関してSDF-1により誘発されるコンフォメーション変化を調節することができ、SDF-1により誘発されるBRET増強の阻害割合は、hz515H7VH1D76N-VL2Mabで約88、hz515H7VH1D76N-VL2.1Mabで65、hz515H7VH1D76N-VL2.2Mabで33およびhz515H7VH1D76N-VL2.3Mabで21であった図22。実施例17:抗CXCR4Mabhz515H7によるMT-4細胞中でのHIV-1IIIBX4ウイルスの複製の阻害このアッセイでは、HIV-1IIIBに対するhz515H7Mabの活性は、MT-4細胞におけるウイルスによって誘導される細胞病原性の阻害に基づいている。5日以内に生存細胞の数を90減少させるウイルス量の50組織培養感染量TCID50の5倍のHIV-1IIIB単離物を細胞に感染させた。37°Cにて30分間吸着させた後、感染細胞を、20熱不活性化したウシ胎仔血清FCS、100IU/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、2mMのグルタミンを添加したRPMI1640培地中2105細胞/mlに調整し、種々の濃度のhz515H7Mab100μlを有する96ウェルの平底組織培養プレートCOSTAR3596100μl/ウェルに播種した。5日目に、細胞の生存能を比色反応MTTによって測定した。hz515H7Mabで処置した感染細胞の保護の割合を、下記の式によって計算した:図23に示されるように、hz515H7Mabは、MT-4細胞においてHIV-1IIIB-によって誘導される細胞病原性を阻害することができるので、顕著な抗HIV-1活性を示す。実施例18:抗CXCR4Mabhz515H7による、ヒトPBMCにおけるHIV-1一次単離物KONX4ウイルス複製の阻害1サイクル中和アッセイこのアッセイは、感染2日後に2の感染CD4Tリンパ球の検出を可能とするように相応に濃縮および希釈した一次単離物KONを用いて36時間行った。種々の希釈率のMab515H725μlを、25μlのウイルスとともに37°Cで1時間培養した。20×106細胞/mlのヒトPBMC25μlを96ウェルプレートU底、Costar3599中のMab/ウイルス混合物に加え、RPMI1640、10FCSおよび20U/mlIL-2中で36時間培養した。2日間の培養後、HIV感染リンパ球を、ウイルスp24Agの細胞内染色により検出した。細胞を固定し、製造者に従いCytofix/CytopermおよびPerm/Washキットの両者を用いて透過処理を施し、Perm/Wash溶液中1/160希釈で用いる4°Cで15分間加える蛍光抗p24MabFITC-またはPE-抗p24、クローンKC57、BeckmanCoulterImmunotechHialeahFLで染色した。3FBSを含むPBSで洗浄した後、PBMCを300μlのPBSに希釈した後、DIVAソフトウエアを用いてフローサイトメトリー分析を行った。種々のサンプル中のp24陽性細胞の割合を、前方および側方散乱パラメーターによって同定された生細胞集団に対する20,000事象をゲートすることにより決定した。これらの生細胞のサブセットは、livedeadsolutionkitを用いて分析した。p24Ag陽性値は、mock感染細胞におけるバックグラウンド事象を差し引いた後に得た。中和パーセントは、Mabを含まない対照感染ウェルと比べてのp24陽性細胞の減少と定義した。中和力価は、感染細胞の割合を低下させる抗体の濃度3反復で行った連続希釈率の間に挿入と定義した。図24に示されるように、抗CXCR4Mab515H7は、PBMCにおけるHIV-1X4KON一次単離物の複製を阻害することができる。実施例19:抗CXCR4Mabhz515H7と抗CCR5分子マラビロクの組合せによる、ヒトPBMCにおけるHIV-1一次単離物89.6およびUG93067X4/R5二重ウイルスの複製の阻害中和アッセイ、一次PBMCにおける複数回のHIV一次単離物複製の分析:hz515H7Mabまたはマラビロクまたは両者の組合せの連続希釈液と、ウイルスの連続希釈液とを組み合わせるこのアッセイは、PBMC末梢血単核細胞に対する複数回の感染を分析する。要するに、hz515H7Mabまたはマラビロクまたは両者の組合せの連続希釈液2倍の25μlアリコート四つをそれぞれ、予め含水させた96ウェルフィルタープレート孔径1.25μm、DuraporDv、MilliporeMolsheimFranceにて、ウイルスの連続希釈液25μlとともに培養した。ウイルスの対照滴定希釈hz515H7Mabまたはマラビロクの代わりに25μlのRPMIを、hz515H7Mabまたはマラビロクまたは両者の組合せの希釈液の存在下での滴定と同じプレートで行った。37°Cで1時間後、4×106細胞/mlの濃度のPHA刺激PBMC25μl5人の健康なドナーからのPHA活性化PBMCのプールを、RPMIの最終培養容量75μl、10ウシ胎仔血清FCSおよび20IUのインターロイキン-2IL-2/mlとなるように加えた。37°Cで24時間後、100μlの同じ培養培地を加えた。4日目に濾過により2回の洗浄各200μlのRPMIを行ってhz515H7Mabおよびマラビロクを除去し、200μlの新鮮培養培地を加えた。7日目に、培養上清におけるp24の存在をELISAにより測定し、陰性対照ウイルス希釈液で感染させ、10-6Mジドブジン[AZT]の存在下で維持した培養物の場合と比べ、陽性ウェルを判定した。4反復のウェルを用い、各希釈率の515H7Mabまたはマラビロクまたは両者の組合せの非存在下V0および存在下Vnでウイルス力価50組織培養感染量[TCID50]を決定した。中和力価は、ウイルス力価の90低下をもたらすVn/V0=0.1515H7Mabまたはマラビロクまたは両者の組合せの希釈率として定義した。hz515H7Mabとマラビロクの間の相乗効果の可能性を、種々の希釈率のこれらの2分子の組合せを用い、二重指向性ウイルス89.6およびUG93067を用いて評価した。図25および26に示されるように、Mabhz515H7およびマラビロクの阻害活性は同等であった。これらのX4hz515H7MabおよびR5マラビロク阻害剤の組合せが、PBMCにおける89.6とUG93067の二重ウイルスX4/R5ウイルス力価の90低下を可能としたそれぞれ、図25および26。実施例20:抗CXCR4Mabhz515H7IgG4による、ヒトPBMCにおけるHIV-1一次単離物KONX4ウイルスの複製の阻害1サイクル中和アッセイこのアッセイは、感染2日後に2の感染CD4Tリンパ球の検出を可能とするように相応に濃縮および希釈した一次単離物KONを用いて36時間行う。種々の希釈率のMabhz515H7IgG425μlを、25μlのウイルスとともに37°Cで1時間培養した。20×106細胞/mlのヒトPBMC25μlを96ウェルプレートU底、Costar3599中のMab/ウイルス混合物に加え、RPMI164010FCSおよび20U/mlIL-2中で36時間培養した。2日間の培養後、HIV感染リンパ球を、ウイルスp24Agの細胞内染色により検出した。細胞を固定し、製造者に従いCytofix/CytopermおよびPerm/Washキットの両者を用いて透過処理を施し、Perm/Wash溶液中1/160希釈で用いる4°Cで15分間加える蛍光抗p24MabFITC-またはPE-抗p24、クローンKC57、BeckmanCoulterImmunotechHialeahFLで染色した。3FBSを含むPBSで洗浄した後、PBMCを300μlのPBSに希釈した後、DIVAソフトウエアを用いてフローサイトメトリー分析を行った。種々のサンプル中のp24陽性細胞の割合を、前方および側方散乱パラメーターによって同定された生細胞集団に対する20,000事象をゲートすることにより決定した。これらの生細胞のサブセットは、livedeadsolutionkitを用いて分析した。p24Ag陽性値は、mock感染細胞におけるバックグラウンド事象を差し引いた後に得た。中和パーセントは、Mabを含まない対照感染ウェルと比べてのp24陽性細胞の減少と定義した。中和力価は、感染細胞の割合を低下させる抗体の濃度3反復で行った連続希釈率の間に挿入と定義した。図27に示されるように、抗CXCR4Mabhz515H7IgG4は、PBMCにおけるHIV-1X4KON一次単離物の複製を阻害することができる。実施例21:抗CXCR4Mabhz515H7IgG4と抗CCR5分子マラビロクの組合せによる、ヒトPBMCにおけるHIV-1一次単離物89.6X4/R5二重ウイルスの複製の阻害中和アッセイ、一次PBMCにおける複数回のHIV一次単離物複製の分析:hz515H7IgG4Mabまたはマラビロクまたは両者の組合せの連続希釈液と、ウイルスの連続希釈液とを組み合わせるこのアッセイは、PBMC末梢血単核細胞に対する複数回の感染を分析する。要するに、hz515H7IgG4Mabまたはマラビロクまたは両者の組合せの連続希釈液2倍の25μlアリコート四つをそれぞれ、予め含水させた96ウェルフィルタープレート孔径1.25μm、DuraporDv、MilliporeMolsheimFranceにて、ウイルスの連続希釈液25μlとともにインキュベートした。ウイルスの対照滴定希釈hz515H7IgG4Mabまたはマラビロクの代わりに25μlのRPMIを、hz515H7IgG4Mabまたはマラビロクまたは両者の組合せの希釈液の存在下での滴定と同じプレートで行った。37°Cで1時間後、4×106細胞/mlの濃度のPHA刺激PBMC25μl5人の健康なドナーからのPHA活性化PBMCのプールを、RPMIの最終培養容量75μl、10ウシ胎仔血清FCSおよび20IUのインターロイキン-2IL-2/mlとなるように加えた。37°Cで24時間後、100μlの同じ培養培地を加えた。4日目に濾過により2回の洗浄各200μlのRPMIを行ってhz515H7IgG4Mabおよびマラビロクを除去し、200μlの新鮮培養培地を加えた。7日目に、培養上清におけるp24の存在をELISAにより測定し、陰性対照ウイルス希釈液で感染させ、10-6Mジドブジン[AZT]の存在下で維持した培養物の場合と比べ、陽性ウェルを判定した。4反復のウェルを用い、各希釈率のhz515H7IgG4Mabまたはマラビロクまたは両者の組合せの非存在下V0および存在下Vnでウイルス力価50組織培養感染量[TCID50]を決定した。中和力価は、ウイルス力価の90低下をもたらすVn/V0=0.1hz515H7IgG4Mabまたはマラビロクまたは両者の組合せの希釈率として定義した。hz515H7IgG4Mabとマラビロクの間の相乗効果の可能性を、これらの2分子の種々の希釈率の組合せを用い、二重指向性ウイルス89.6を用いて評価した。図28に示されるように、これらのX4hz515H7IgG4MabおよびR5マラビロク阻害剤の組合せが、PBMCにおける89.6の二重ウイルスX4/R5のウイルス力価の90低下を可能とした図28。"