"肝臓単核球からのTNF-αおよびIFN-γ産生を亢進することを特徴とするナチュラルキラーT細胞。養子移植することによりレシピエント動物に、非アルコール性脂肪性肝炎を発症させる請求項1記載のナチュラルキラーT細胞。ナチュラルキラーT細胞が、非アルコール性脂肪性肝炎の病態モデル動物の肝臓から単離されるものである請求項1および2記載のナチュラルキラーT細胞。非アルコール性脂肪性肝炎の病態モデル動物が、肝臓におけるケモカインCXCL16の発現が低下または発現してしない病態モデル動物である請求項3記載のナチュラルキラーT細胞。病態モデル動物がげっ歯類である請求項3または4記載のナチュラルキラーT細胞。肝臓におけるケモカインCXCL16の発現が低下または発現してしない病態モデル動物にコリン欠乏食を摂食させ、該病態モデル動物の肝臓から単離することを特徴とする肝臓単核球からのTNF-αおよびIFN-γ産生を亢進することを特徴とするナチュラルキラーT細胞の取得方法。病態モデル動物がげっ歯類である請求項6記載の肝臓単核球からのTNF-αおよびIFN-γ産生を亢進するナチュラルキラーT細胞の取得方法。本発明者らは、これまでケモカインによる種々疾病制御機構の解明を行ってきた。ケモカインは免疫細胞の動態を制御する一連のサイトカイン群であるため、特に炎症性疾患との関連性が強い。中でもCXCL16は、肝臓のiNKT細胞の動態機能制御を行うことで、肝免疫系の恒常性維持や肝炎症性疾患に関わっているが、CXCL16と肝慢性炎症疾患であるNASHとの直接的な関連性は全く報告がない。本発明の課題は、NASHにおけるCXCL16の関与の検討を行い、新たにNASHの治療薬や治療法の構築に有用なツールを提供することにある。本発明者らは、CXCL16欠損マウスを用いたNASHモデルの作製を行い、病理所見など臨床的な評価方法によってNASHにおけるCXCL16の関与の検討した。さらに、CXCL16と肝iNKT細胞の関係に着目し、NASHモデルマウスの肝iNKT細胞の動態機能解析を行い、病態に寄与する可能性を検証した。加えて、解析したiNKT細胞を介した病態形成機序を検証するために養子移植実験およびエキソビボでの解析を行った結果、非アルコール性脂肪性肝炎の発症に関与するインバリアントナチュラルキラーT細胞を見出し、本発明を完成した。以下、本発明を詳細に説明する。本発明は、非アルコール性脂肪性肝炎の病態モデル動物の肝臓から単離される肝臓単核球からのTNF-α、およびIFN-γ産生を亢進することを特徴とするナチュラルキラーT細胞である。より具体的には、本発明のナチュラルキラーT細胞は、肝臓におけるケモカインCXCL16の発現が低下または発現してしない非アルコール性脂肪性肝炎の病態モデル動物から単離される肝臓単核球からのTNF-αおよびIFN-γ産生を亢進することを特徴とするナチュラルキラーT細胞である。本発明のナチュラルキラーT細胞とは、T細胞受容体Tcellreceptor:TCRにより、MHCクラスIb分子に属するCD1dにより提示される糖脂質や疎水性ペプチドを認識し、さらに、肝臓単核球からのTNF-αおよびIFN-γ産生を亢進することを特徴とするナチュラルキラーT細胞である。本発明のナチュラルキラーT細胞は、例えば、以下の方法によって取得することができる。1肝臓におけるケモカインCXCL16の発現が低下または発現してしない病態モデル動物にコリン欠乏食などの脂肪肝を誘導する餌を摂食させる。2病態モデル動物から肝臓を摘出する。3摘出した肝臓から肝単核球を単離する。4単離した肝単核球からにナチュラルキラーT細胞を分離する。本発明の肝臓単核球からのTNF-αおよびIFN-γ産生を亢進することを特徴とするナチュラルキラーT細胞により、NASHの初期病態例えば、肝細胞への中性脂肪蓄積などを誘導することができる。具体的には、例えば、肝臓単核球からのTNF-αおよびIFN-γ産生を亢進することを特徴とするナチュラルキラーT細胞を養子移植することが挙げられる。この場合、例えば、レシピエントとしてJα18ノックアウトマウスなどのNKT細胞を欠損させたマウスを用いればよい。本発明の肝臓単核球からのTNF-αおよびIFN-γ産生を亢進することを特徴とするナチュラルキラーT細胞により、NASHにおける肝細胞への中性脂肪蓄積などの初期病態を誘導することができる。また、CDAA食餌CXCL16ノックアウトマウスは、NASHの初期病態を誘導するモデル動物として、肝臓における異常免疫応答を基盤とする慢性炎症の研究に用いることができる。本発明の肝臓単核球からのTNF-αおよびIFN-γ産生を亢進することを特徴とするナチュラルキラーT細胞の取得に用いられる病態モデル動物として、肝臓におけるケモカインCXCL16の発現が低下または発現してしないマウス、ラットなどのげっ歯類が挙げられる。好ましいものとして、ケモカインCXCL16の発現が健常マウスの1100以下に低下しているマウス、CXCL16欠損マウス、グルタミン酸ナトリウム誘発マウスMSGマウスなどが挙げられる。コリン欠乏食としては、例えば、コリン欠乏L-アミノ酸規定食CholinedeficientLaminoaciddefineddiet:CDAA、メチオニンコリン欠乏食MethionineandCholinedeficiendiet:MCDなどが挙げられるが、好ましいものとして、CDAAが挙げられる。コリン欠乏食を摂取させる期間としては、例えば、CXCL16欠損マウスでは、1週間以上、好ましくは2週間以上である。肝単核球からにナチュラルキラーT細胞を分離するには、例えば、CD1dとβ2-ミクログロブリンβ2mの複合体を蛍光色素のアロフイコシアニンAPCやフィコエリスチンPEで標識されたストレプトアビジンにより4量体化した試薬例えば、Cd1dTetramerなどで肝単核球を標識した後、磁気細胞分離法MACSなどを用いて行えばよい。以下、実施例で説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。実施例1<コリン欠乏食食餌誘導性NAFLD/NASHモデルの作製>1CXCL16欠損マウスBALB/cマウスバックグラウンドのCXCL16SR-PSOX欠損マウスCXCL16KOマウスは、JImmunol17981728179に記載の方法に準じて作製した。すなわち、定法に従い、ネオマイシン耐性遺伝子をコードしたターゲットベクターをエレクトロポレーション法によりES細胞に遺伝子導入し、ネオマイシン耐性株のうちCXCL16遺伝子欠損株をサザンブロット法にてスクリーニングすることで樹立した。2動物飼育環境野生型BALB/cマウスwildtypeWTマウスおよびCXCL16KOマウスは、富山大学和漢医薬学総合研究所病態生化学分野の動物飼育室にて飼育した。水および固形飼料は自由摂食とした。本実験は、国立大学法人富山大学動物実験取扱規則に基づき、動物実験委員会の承認後、動物倫理に十分配慮し行った。3コリン欠乏食食餌CXCL16欠損マウスコリン欠乏食は、CholinedeficientLaminoaciddefineddietを用い、4~5週齢、雄性のWTマウスおよびCXCL16KOマウスに2週間自由摂食させた。また、対照群として通常飼育食LaboMRStock日本農産工業製を同様にWTマウスおよびCXCL16KOマウスの両マウスに摂食させた。摂食開始から2週間後、マウスを犠牲死させ、血液、肝臓、脾臓、精巣上体部脂肪組織を採取した。血液は腹部下大静脈から採血をおこない、常温で1時間、4°Cで一晩静置し、卓上遠心機にて4°C、3000回転、20分間遠心分離後、上清を血清サンプルとした。血清サンプルは解析に用いるまでディープフリーザー-80°C内で保存した。肝臓は、一部RT-PCR後述用サンプルとしてRNAStabilizationReagentRNAlater:キアゲン社に浸けて解析に用いるまで-20°Cで保存した。また病理組織及び免疫染色用に10中性緩衝ホルマリン中にて4°Cで保存した。精巣上体部脂肪組織は液体窒素にて瞬間凍結後、ディープフリーザーにて保管した。CXCL16KOマウスではわずか2週間のCDAA食摂食により、脂肪肝に特徴的な強い白色性の肝臓肉眼所見図1Aおよび肝肥大を認めた図1B。4肝臓の病理組織学的所見とその評価ホルマリン固定した肝臓はパラフィン包埋し、4μmの連続切片を作製した。薄切した組織サンプルはヘマトキシリンエオジンHE染色を行い、病理組織像をもとに組織学的診断に供した。NAFLD/NASHの病理組織学的評価は、NASHClinicalNetworkScoringSystemに基づいてNAFLDActivityScoreNASを算出したHepatology4113131321。NAS≧5をNASH、NAS>3をNASH進行性脂肪肝と判断した。このスコアリングシステムは、脂肪沈着を0~3、肝小葉の細胞浸潤を0~3、そして肝細胞のballooning変性の程度を0~2として段階評価し、その合計値をNAS値として、NAS値<3を除外診断、NAS値≧5をNASHと診断するものである。CDAA食餌CXCL16KOマウスでは肝臓への著しい大滴性脂肪沈着を認め図2A、さらに脂質構成成分として中性脂肪が有意に増加している図2B。CDAA食餌WTではNAS値が3を越える個体が1匹も該当しなかったのに対し平均NAS値:24、CDAA食餌CXCL16KOマウスではNAS値が5以上の個体が全体の半数存在した図2C。5肝臓組織中中性脂肪の定量肝臓組織中中性脂肪の抽出はFolchらの方法JBiolChem497509を一部改変して行った。すなわち、100mg~200mg肝臓に4mLのクロロホルム/メタノール2:1,v/vを加え、ガラスホモジナイザーでホモジナイズした後、ポリプロピレン製ファルコンチューブに移して、50mM塩化ナトリウム水溶液を1mL添加し、1分間ボルテックスした。室温、1500×g、10分間遠心分離し、パスツールピペットを用いて下層のクロロホルム層を別のファルコンチューブに移した。さらに収量を増やすため、上層に1容のクロロホルムを加えて同様にボルッテクス、遠心分離した後、下層を先の下層と合わせた。合わせたクロロホルム層のうち、100μLに20μLのイソプロピルアルコール/トリトンX9:1,v/vを加え、ドラフト内で自然乾燥させた。乾燥したものをイソプロピルアルコール/トリトンX9:1,v/vに溶かし、トリグリセライドE-テストワコー和光純薬工業製を用い、単位肝重量当たりの中性脂肪量を算出した図2B。実施例2<コリン欠乏食餌CXCL16欠損マウスにおける肝iNKT細胞>1マウス肝単核球の単離通常食またはCDAA食を2週間摂食したWTおよびCXCL16欠損マウスの肝臓を温ハンクス平衡塩類液HanksBalancedSaltSolutions:HBSSにて還流後、摘出細断し、10FCS含有RPMI1640培地で洗いこみながらナイロンメッシュ上でホモジナイズして細胞懸濁液を得た。4°C、2000回転、10分間の条件下で細胞懸濁液を遠心分離した後、細胞を10FCS含有RPMI1640培地に再懸濁して、33PercollGEヘルスケア製上に重層し、室温、2000回転、30分間の条件下、比重分離して単核球分画を得た。さらに、低張処理により赤血球を除去した。その後、細胞を10FCS含有PRMI1640培地で2回洗浄し、リン酸緩衝生理食塩水PBSに106~107cells/mLの細胞密度で懸濁した。2iNKT細胞の単離磁気細胞分離法MACS用いて肝単核球からiNKT細胞を単離した。MACSにはMiltenyiBiotech社のminiMACSkitAnti-PEマイクロビーズ、MSカラム、MACSセパレーターを用いた。すなわち、CD1dTetramer-PEMBL社製によりiNKT細胞をラベルした後、iNKT細胞を80μLのMACS緩衝液2FCS、2mMEDTA含有PBSを脱気したものに懸濁し、Anti-PEマイクロビーズを20μL添加した。氷上にて15分間インキュベートした後、MACS緩衝液で洗浄して500μLのMACS緩衝液に再懸濁し、細胞懸濁液を調製した。MACSMSカラムをMACS緩衝液にてリンスした後、MiniMACSセパレーターを用いて調製した細胞懸濁液からiNKT細胞をポジティブセレクションした。また純度を高めるために、2回MSカラムに細胞を通し、純度が80以上のものを実験及び解析に用いた。さらに細胞洗浄による細胞の損失を抑えるため、一部セルローション日本全薬工業製を用いて細胞の洗浄を行った。3iNKT細胞ポピュレーションの解析肝単核球5×105cells/100μLを15mLエッペンドルフチューブに分注し、卓上遠心機にて4°C、2000回転、5分間遠心し、洗浄した。沈殿した細胞を50μLの2FCS含有PBSFCM緩衝液に再懸濁した後、CD16/CD32モノクローナル抗体クローン24G205mg/mLを1μL添加し、氷上にて10分間インキュベートした。CD16/CD32モノクローナル抗体によるFc受容体のブロッキングの後、CD1dTetramer-PEを10mL添加し、室温にて30分間インキュベートしてiNKT細胞を蛍光標識した。続いて、PerCP-Cy55標識抗マウスCD3εモノクローナル抗体を加え、氷上にて30分間インキュベートした。FCM緩衝液を1mL加え、4°C、2000回転、5分間遠心して洗浄し、300μLのFCM緩衝液に懸濁した後、フローサイトメーターを用いて細胞表面上の蛍光強度を解析した。WTではCDAA食摂食による肝iNKT細胞比率の変化は認められなかったのに対し、CXCL16KOマウスでは通常食摂食時に比べて、CDAA食餌により肝iNKT細胞が2倍近く増加している図3A。4iNKT細胞のサブポピュレーションの解析iNKT細胞ポピュレーション解析と同様に、CD1dTetramer-PEにてiNKT細胞を蛍光標識し、その後PerCP-Cy55標識抗マウスCD4モノクローナルとFITC標識抗マウスCD8モノクローナル抗体を加え、氷上で30分間インキュベートした。続いて、磁気細胞分離法によりiNKT細胞を単離し、フローサイトメーターを用いてiNKT細胞のサブポピュレーションの解析を行った。WTマウス、CXCL16KOマウスともCDAA食摂食によりiNKT細胞数がベースラインよりも増加していたが、CDAA食餌CXCL16KOマウスの肝iNKT細胞の増加率の方が顕著であった図3B。また、CDAA食餌WTマウスとCXCL16KOマウスの肝iNKT細胞集団は構成しているiNKT細胞のサブポピュレーションが異なっていた図3C。実施例3<コリン欠乏食食餌CXCL16KOマウス肝iNKT細胞の機能解析>1invitroにおける肝単核球培養とβガラクトシルセラミドβGalCer刺激実施例21の方法に従い、肝単核球を単離した後、細胞を10FCS、50μM2-メルカプトエタノール添加RPMI1640培地に懸濁し、2×105cells/100μLの細胞密度で96ウェルプレートに播種した。iNKT細胞の特異的なリガンドであるβ-ガラクトシルセラミドβ-Galactosylceramide:β-GalCerは、ジメチルスルスルホキシドにて1mg/mLに調製し、肝単核球刺激の際には終濃度100ng/mLとして用いた。2酵素免疫測定法EnzymedlinkedImmunosorbentAssay:ELISAによるサイトカイン産生量肝単核球の培養上清、およびマウスの血清サンプル中のIFN-γ、IL-2、IL-4、TNF-αはそれぞれ市販のELISAキットベイバイオサイエンス社製を用いて定量した。3invivoにおけるβ-ガラクトシルセラミドβ-GalCer刺激05ポリソルベイト20添加生理食塩水によりDMSO溶解β-GalCerを希釈し、2μg/200μLとして、各WTマウス、CXCL16KOマウスに経尾静脈投与した。投与から1.5時間後に各マウスを犠牲死させて肝単核球を採取し、iNKT細胞の細胞内サイトカイン染色を行った。β-GalCer刺激によるサイトカイン産生プロファイルの結果、WTマウスではCDAA食の摂食によっていずれのサイトカインにも有意な産生能の変化は見られなかった。一方、CXCL16KOマウスではCDAA食餌により、いずれのサイトカインにおいてもベースラインよりもサイトカイン産生能が上昇していた。4iNKT細胞内サイトカイン染色によるサイトカイン産生プロファイル変化細胞固定/細胞膜浸透化キットBDバイオサイエンス社製を用いて、細胞内部のサイトカインの保持、細胞固定、細胞膜透過処理を行った。すなわち、単離した肝単核球を1×106cells/mLの細胞密度で24ウェルプレートコースターに播種し、ゴルジ体からの小胞輸送阻害剤であるモネンシン存在下で、3時間培養して細胞内にサイトカインを蓄積させ、その後、細胞を回収し、前述のようにFCM緩衝液で洗浄した後、PerCP-Cy55標識ラット抗マウスCD4モノクローナル抗体RM4-5およびCD1dTetramerによりiNKT細胞の細胞表面抗原を蛍光標識した。続いて、キットのプロトコールに従って細胞固定、細胞膜透過処理を行い、細胞内の各種サイトカインを蛍光標識抗サイトカイン抗体にて染色した後、CD1dtetramer陽性細胞をゲートし、フローサイトメーターにより解析を行った。なお、染色用抗サイトカイン抗体として、FITC標識抗マウスIFN-γクローン:XMG12、FITC標識抗マウスIL-17ATC11-18H101、FITC標識抗マウスIL-4BVD6-24G2、FITC標識抗マウス/ラットTNF-αTN3-19、また同位体対照としてFITC標識ラットIgG1κ抗体を用いた。その結果、CDAA食摂食によりWTマウスのCD4iNKT細胞は、IFN-γ182→252、IL-437→84の発現が亢進していた。CXCL16KOマウスではCDAA摂食によるCD4iNKT細胞のサイトカイン産生亢進の程度がIFN-γ96→179、IL-443→138共にWTよりも顕著であった図5。実施例4<コリン欠乏食餌CXCL16欠損マウスのNASH病態形成における機能変異iNKT細胞の寄与>1養子移植通常食またはCDAA食を摂食したWTマウスおよびCXCL16KOマウスドナーの肝iNKT細胞をMACSにより単離した。単離したiNKT細胞をPBSで洗浄した後、トリパンブルー染色により生細胞数をカウントし、55×105cell/200μLPBSをiNKT細胞欠損マウスJα18ノックアウトマウス:レシピエントに経尾静脈移入した。細胞移入から2週間後にマウスを犠牲死させ、血清、肝臓、精巣上体部脂肪組織を採取し、保存した。なお、肝臓へのiNKT細胞生着の有無については、フローサイトメーターによりレシピエント肝単核球中のiNKT細胞を検出することで確認した図6。2肝臓の病理組織学的所見ホルマリン固定した肝臓はパラフィン包埋し、4μmの連続切片を作製した。薄切した組織サンプルはヘマトキシリン染色を行い、病理組織像をもとに組織学的診断に供した。また、ヘマトキシリンとスダンIVの対比染色により肝臓への脂肪沈着を評価した。CDAA食餌CXCL16KOマウスの肝iNKT細胞を養子移植したレシピエント肝では、他ドナーマウスから単離した肝iNKT細胞を移植した場合と比較しても、脂肪肝に特徴的な白色肝が明らかに認められた図7A上。この時、各群のレシピエント肝重量比を算出すると、CDAA食餌CXCL16KOマウスの肝iNKT細胞の移植した場合、通常食餌CXCL16KOマウスのiNKT細胞を移植した場合より有意に高値を示し、CDAA食餌WT群の肝iNKT細胞を移植した場合より、高い傾向を示した図7B。また、CDAA食餌CXCL16KOマウスの肝iNKT細胞を移植したレシピエント肝では脂質蓄積が誘導された図7A下。3肝臓組織中脂質肝臓組織中の中性脂肪、コレステロール、遊離コレステロール、リン脂質量はリポタンパク質の受託解析サービススカイライトバイオテック社により解析を行った。なお、解析にはホルマリン固定肝臓サンプルを用いた。その結果、遊離コレステロール、総コレステロール、リン脂質はどのドナー由来の肝iNKT細胞を移植しても変化が認められないのに対し、CDAA食餌CXCL16KOマウスの肝iNKT細胞を移入した場合には、レシピエントマウスの肝臓に有意な中性脂肪の蓄積の誘導があった図8。4リアルタイムRT-PCRによる肝臓組織の各種遺伝子発現変動の評価[RNA抽出]肝組織中RNAは、RNeasyminikitキアゲン社を用いて抽出した。すなわち、RNAlater中で保存した肝組織50mgを1.5mLチューブRNase-freeにとり、600μLのRLT緩衝液2-メルカプトエタノール添加1,v/vを加えて氷上にてホモジナイズした。肝ホモジネートをキット付属のプロトコールにしたがってシリカゲルカラムに通し、RNAを溶出させた。得られたRNA濃度を吸光光度計にて測定し、各サンプル1ng/10μLに調製した。調製したRNAサンプルは解析に用いるまで-30°Cで保存した。[逆転写反応]OLIGODTプライマーインビトロジェンを用いてMRNAを増幅した後、逆転写反応はSuperScriptIIreversetranscriptionインビトロジェンを使用して行った。[リアルタイムPCR]逆転写反応によりcDNAを得た後、SYBRPremixExTaqタカラバイオ社とMx3000pストラタジーン社および測定解析ソフトMxProストラタジーン社を用いてリアルタイムPCRを行った。測定結果はすべてハウスキーピング遺伝子であるglyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenaseGAPDHの発現量により比較Ct法にて補正した。NASH病態形成と関連の深い、TNF-α、IL-1βといった炎症性サイトカインの発現を指標に炎症状態を評価した。その結果、異常iNKT細胞を移入することで、レシピエントの肝臓でもTNF-α、IL-1βの発現誘導が確認された図9。5肝単核球の活性化状態解析各レシピエントの肝単核球を単離し、RPE標識抗マウスF4/80モノクローナル抗体、FITC標識抗マウスCD69モノクローナル抗体クローンH12F3で染色した後、CD69の発現レベルをフローサイトメーターで解析し、単核球活性化の指標とした。ドナー由来iNKT細胞をレシピエントに移入後、肝単核球の共通活性化マーカーであるCD69の発現レベルをフローサイトメーターにより解析した。その結果、CDAA食餌CXCL16KOマウス由来の機能異常iNKT細胞を移入した場合には、CD69発現細胞の増加が認められた図10A。kupffer細胞のマーカーとしてF4/80を用い、CD69との二重染色によってiNKT細胞の移入によるkupffer細胞の活性化の程度をフローサイトメーターにより解析した。その結果、CDAA食餌CXCL16KOマウス由来の肝iNKT細胞移入によって、CD69陽性kupper細胞の割合が増加していた図10B。実施例5<機能変異iNKT細胞を起点とした肝細胞への脂肪蓄積機構>1肝iNKT細胞とその他肝単核球による共培養系肝iNKT細胞は、それぞれ通常食またはCDAA食を2週間摂食させたWTマウスおよびCXCL16KOマウスの肝臓からMACSを用いて単離した。また、iNKT細胞との共培養に用いた肝単核球はiNKT細胞欠損マウスJα18ノックアウトマウスの肝臓より単離し、これにより他のiNKT細胞による影響を排除した実験系を組み立てた。共培養系は、iNKT細胞:肝単核球=2×104cells:8×104cellsを10FCS、50μM2-メルカプトエタノール添加RPMI1640培地に懸濁して96ウェルプレートに播種し、37°C、炭酸ガスインキュベーター内で72時間培養した。2マウス初代肝細胞培養肝細胞を捲き込む前日に、96ウェルプレートをマトリゲルMatrigel、BDBiosciences社でコーティングしておく。実際には、1mg/mLマトリゲルをPBSにより50μg/mLに希釈し、40μL/ウェルをプレートに添加した。続いて、クリーンベンチ内で一晩風乾し、無血清RPMI1640培地で1度洗浄した後に培養に用いた。無処置WTマウスまたはiNKT細胞欠損マウスの肝臓をEGTA添加HBSSで還流後、肝臓を摘出し、125μg/mLコラゲナーゼIVシグマ社/HBSS溶液に浸けて細断して、37°C温浴シェーカー中で15分間インキュベートした。その後、肝組織をナイロンメッシュ100μmに通して細胞浮遊液を得た。細胞浮遊液を、4°C、500回転、1分間遠心し、上清をアスピレーターにより除去した後、10FCS添加RPMI1640培地にて細胞を3回程洗浄し、上清が澄んできたら無血清RPMI1640培地で細胞を1~2回洗浄して肝細胞を得た。3×104cells/100μLの細胞密度に調整し、マトリゲルでコーティングした96ウェルプレートに播種した。3共培養系上清馴化培地によるマウス初代肝細胞への脂肪蓄積誘導肝細胞を無血清RPMI1640培地で16時間培養し飢餓状態にしておく。肝細胞を無血清RPMI1640培地で1回洗浄し、共培養系馴化培地にて肝細胞を24時間培養した。4肝細胞脂質染色共培養系馴化培地下で24時間培養した後、培養上清を除去して4パラホルムアルデヒドで肝細胞を固定し、AdipogenesisAssayKitCaymanChemical社を用いて肝細胞中の脂質を染色したOilred-O染色。CDAA食餌CXCL16KOマウス肝臓由来の機能変異iNKT細胞と肝単核球の共培養によって得られたCMでマウス初代肝細胞を培養することで非常に強力な脂質蓄積が誘導された図11A。5共培養系におけるサイトカイン産生量共培養系上清中に産生された液性因子として、IFN-γ、IL-2、IL-4、TNF-αはそれぞれ市販のELISAキットReadySetGo,eBioscience社を用いて定量した。CDAA食餌CXCL16KOマウスの肝iNKT細胞は肝単核球との共培養を行わずとも、それ単独でもCDAA食餌WTマウス、通常食餌CXCL16KOマウスの肝iNKT細胞よりも高いTNF-α産生能を有していた図11B。6中和抗体によるサイトカイン機能阻害実験Putifiedanti-mouse/ratTNF-αTN3-19、anti-mouseIFN-γXMG1.2eBioscienceまたはコントロールIgGラットIgG、Inter-CellTechnoligyを終濃度1μg/mLとして、馴化培地を用いた初代肝細胞培養系に添加した。その結果、機能変異iNKT細胞と肝単核球の共培養CMに抗IFN-γ中和抗体、抗TNF-α中和抗体をそれぞれ単独で添加させるだけで、共培養CMによる脂質蓄積作用はほぼ完全に阻害された図12。"