"実質的に明細書本文に記載した通りのスクリーニング方法。実施例実施例1.AcrABポンプによる流出を阻止することは、薬物標的遺伝子に染色体突然変異を有する微生物を薬物感受性にする。AcrAB複数薬物流出ポンプがない場合のEscherichiacoliのジャイラーゼ突然変異の無効性フルオロキノロン[FQ]は野生型Escherichiacoliの生育をきわめて低い濃度で阻害する。FQ流出が野生型E.coliに存在するが、臨床耐性の発達中に増進する場合以外はその重要性は最低である。marおよびsoxレギュロンの制御下にあるAcrAB流出ポンプの、E.coliにおけるFQに対する感受性と臨床耐性のレベルについての役割を理解するため、FQ耐性を有する二系列のE.coliK-12細胞野生型AG100および同質遺伝子型Mar突然変異体AG102由来をオフロキサシン[ofx]含有プレート上での生体外増幅で生成し、耐性突然変異株の性格付けを行った。AcrABをノックアウトするため、P1形質導入を用いた。放射線標識シオウロフラキシン[cfx]細胞全体へのエネルギー依存性取り込みを、AcrABの存在および不在で測定し、ofxMICをブロスミクロ希釈で測定した。AG100では、ofx耐性が4段階で0.03mg/lから4mg/lに増進した128倍が、各段階には発生の順序でgyrA突然変異、mar突然変異、未同定突然変異、および第2gyrA突然変異が含まれていた。Mar突然変異体から出発し、AG102を0.125mg/lから8mg/lへ64倍の3段階で増幅したが、それには1個のgyrA突然変異と2個の未同定突然変異が含まれていた。AxrABのノックアウトによりMICが4から128倍減少し、トポイソメラーゼ突然変異で媒介される耐性が劇的に減少した。ofxMIC±AcrABは以下の通りであったmg/l:AG100シリーズ:0.03/<0.015、0.25/0.06、1.0/0.06、2.0/0.06、4.0/0.126;AG102シリーズ:0.126/<0.015、1.0/0.06、4.0/0.06、8.0/0.06。cfxの能動流出がAcrAB流出ポンプの存在で見られた。しかしながら、活性化されたAcrAB欠失突然変異体における薬物蓄積は脱活性細胞中のものと同等、すなわち流出はAcrABの欠失で完全に消失した。従って、AcrAB複数薬物流出ポンプは、単にそれだけでないとしても、E.coliにおけるcfxの細胞内濃度を制御する主要な流出ポンプである。それが存在しない場合、高細胞内薬物濃度により、トポイソメラーゼ突然変異は臨床FQ耐性を達成する上で相対的に無効になる。AcrAB流出ポンプの欠失は、Escherichiacoliのジャイラーゼ突然変異体におけるフルオロキノロン耐性を減少させるフルオロキノロン耐性突然変異体を野生型EscherichiacoliK12株から選び、そのMar突然変異体を固体培地上でオフロキサシンのレベルを上げて段階的に暴露した。放射線標識シプロフロキサシンによるノーザンRNAブロット分析による突然変異段階の解析、配列決定および蓄積の研究から、標的遺伝子gyrAにおける突然変異、調節遺伝子marRおよび別な、AcrAB媒介シプロフロキサシン流出に影響すると思われる未同定の遺伝子のすべてがフルオロキノロン耐性に寄与していることが示された。AcrAB遺伝子座の不活化により、全ての種がフルオロキノロンおよびいくつかの他の関係しない薬物に過剰感受性になった。これらの研究は、AcrAB流出ポンプの野生型機能がトポイソメラーゼで媒介される臨床フルオロキノロン耐性の発現に必要であることを示した。Escherichiacoliにおけるフルオロキノロン[DQ]耐性は薬物、すなわちDNAジャイラーゼフーパーHooperD.C.ら、1987、TheamericanJournalofMedicine82:12-20;ピドックPiddockL.J.V、1995、Drugs49:19-35、およびトポイソメラーゼIVヘーシングHeising、P.、1996、Antimicrob.AgentsChemother.40:879-885の標的タンパク質の突然変異で起こり得る。marAコーエンCohen、S.P.ら、1993、J.Bacteriol.175:1484-1492;コーエン、1989、Antimicrob.AgentsChemothr.33:1318-1325またはsoxアマビルAmabile-Cuevas、C.FおよびデンプルDemple、B.、1991、NucleicAcisReserch19:4479-4484等の調節遺伝子に影響する突然変異も耐性をもたらす。後者の遺伝子は取り込みを減少させるか、および/または薬物の流出を増加させて細胞内薬物濃度を調節するアレクシャンAlekshun、M.N.およびレービーLevy、S.B.、1997、AgentsChemother.41:2067-2075。E.coliでは、MarAの過剰発現によりOmpFポリンの発現が減少しコーエンら、1988、J.Bacteriol.170:5416-5422、AcrAB発現を増加しオークスOkusu、H.ら、1996、J.Bacteriol.178:306-308、そのために多数の抗菌剤に対する耐性を得るアレクシャンおよびレービー、1977、Antimicrob.AgentsChgemother.41:2067-2075。高レベルの臨床的に重要なFQ耐性を導く一連の出来事はまだほとんど理解されていない。母体となる株を通常単離できないので、臨床的FQ耐性株に関する研究の支援は限られている。生体外で選択された突然変異株での研究は、フェノタイプの差MICの外膜のプロフィル、フルオロキノロンの蓄積の記述に限られるか、またはキノロン耐性QRDRを決めるgyeAおよび/またはparCの領域の突然変異に絞られていたヘーシングHeising、P.、1996、Antimicrob.AgentsChemother.40:879-885;ピドックPiddock、L.J.V.ら、1991、J.Antimicrob.Chemother.28:185-198;テネーTenney、J.H.ら、1983、Antimicrob.AgentsChemother.23:188-189;ワタナベWatanabe、M.ら、1990、Antimicrob.AgentsChemother.34:173-175。この生体外研究では、オフロキサシン上での段階的選別中に獲得したトポイソメラーゼ突然変異で媒介されるFQ耐性における、AcrAB流出ポンプの役割が調べられた。AcrAB流出ポンプがFQ耐性レベルに重要であることが見出された。この実施例では以下の材料と方法が用いられた。抗生物質、薬品および培地:オフロキサシンOFLはヘキストHoechst、フランクフルト、ドイツから提供された。放射線ラベル[14C]-シプロフロキキサシンはバイエルBayerAG、Leverkusen,ドイツから提供された。カルボニルシアナイドm-クロロフェニルヒドラゾンCCCPをシグマSigmaChemicalCo.,St.Louis、MOから購入し、有機溶剤をアルドリッチAldrich,ミルウォーキー、WIから購入した。特に注釈しない限り、株はLBブロス中10gのトリプトン、5gの酵母抽出物および10gのNaClで生育させた。細菌種およびプラスミド:全ての株はプラスミドのないE.coliK-12株AG100ジョージGeorgeA.M.およびレビーS.B.Levy、1983、J.Bacteriol.155:531-540およびテトラサイクリン上で2段階で選別したそのMar突然変異体AG112本研究由来である。野生型E.coliGC4468、それに由来するSox突然変異体JTG1078sozR105;グリーンベルグGreenberg、J.T.ら、1991、J.Bact.173:4433―4439およびsox遺伝子を432bp-フラグメント上に有するpSXSアマビルAmabile-Cuevas、C.F.およびデンプルB.Demple、1991、NucleicAcidReserch19:4479-4484。JZM120はマーMa,D、1995、Mol.Microbiol.16:45-55に記載されている。フルオロキノロン耐性突然変異体の選別:1-AG100、2°-AG100、3-AG100、4-AG100および1-AG112,2-AG112、3-AG112はそれぞれ、固体培地上のAG100およびAG112由来の段階的突然変異であった。各段階で、終夜培養の約1011個の細胞を、濃度を増加させたOFLで補充した数個のLB寒天プレート上でプレートした。単一コロニーをOFL補充寒天プレート上でさらに精製した。突然変異株2°-AG100が一つのシリーズで出現し、突然変異3-および4-AG100は第2シリーズで出現した。感受性試験:選択した抗菌剤のMICを、カチオン調節ミューラー-ヒントンMueller-HintonブロスベクトンディキンソンBecton-Dickinson、MDおよび5×105CFU/mlの接種体を用い、NCCLS法および説明ガイドラインに従って標準ブロスミクロ希釈法で決定したNCCLS.1997、希釈抗菌性感受性試験法。好気性生育細菌試験-第4版;承認標準法、NCCLS文書M7-A4ISBN1-56238-309-4、NCCLS,940WestValleyRoad、Suite1400、Wayne、Pennsilvania19087。市販マイクロタイタープレート上の抗菌剤MerlinDiagnosticsGmbH、Bornheim、GermanyはFQシプロフロシサシンCIP、エノキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシンOFL、ペフロキサシン、スパフロキサシンSPXおよびトロバフロキサシンTVAを含んでいた。それらはまた、テトラサイクリンTET、クロラムフェニコールCML、トリメトプリムTMP、セフォキシチンCFOX、セファクロール、セフィキシンおよびロラカルベフを含んでいた。胆汁酸塩のMICをブロスミクロ希釈法で測定した。コール酸ナトリウムおよびデオキシコール酸ナトリウムをLBブロス中で順番に希釈し、試験管を5×105CFU/mlで接種した。ブロス抗生物質と胆汁酸のMICを独立の実験で2回測定し、再現性のある結果を得た。P1形質導入:AcrAB欠失株をJZM120株マーMa、Dら、1995、Mol.Microbiol.16:45-55由来のacrAB::Tn903kanrのAG100、AG112、および全ての誘導FQ耐性突然変異体中へのP1形質導入プロベンスProvence、D.L.およびカーチスCurtisIII、1994、ゲルハルトP.Gerhardt、ミューレーMurray、W.A.WoodおよびクリークKrieg、N.R.編、一般および分子バクテリオロジー、AmericanSocietyforMicrobiology、Washington、317-347頁で構築した。AcrAB欠失株をAG100AK,1~4-AG100AK,AG112AKおよび1~3-AG112AKとした。各宿主毎に2個の独立した形質転換体を確保した。AcrABの欠失は、PCR分析で無傷の標的DNAがないこと、および先の報告タナシーThanassi,D.G.ら、1997、J.Bacteriol.179:1512-1518の通り、胆汁酸塩に対する感受性が大きく増加したことで確認した。DNA配列決定:フルオロキノロン耐性突然変異株におけるgyrAヌクレオチド123~366またはparCヌクレオチド145~492のQRDRをPCRで増幅し、先の記載通りQia-クイックカラムQuia-gen、Hilden,Germanyで精製したコンラッドConrad、S.M.ら、1996、J.Antimicrob.Chemother.38:442-455;コンラッドら、1996、第36回抗菌剤および化学療法国際会議プログラムおよびアブストラクト。marORをbp1311から1858まで、先の記載通りプライマーペアーORAB2およびRK3で増幅したエーシンガーOethinger、M.ら、1998、AgentsChemother,42:2089-2094。直接サイクル配列決定を自動373ADNAシーケンサーAppliedBiosystemsで行った。RNA抽出およびノーザンブロット分析:ノーザンブロット解析を先に詳細に述べられている様に行ったエーシンガーら、1998、Antimicrob.AgentsChemother.42:2089-2094。簡単に言えば、RNAを30°Cで生育した対数中期相から塩化セシウム法で収穫した。marRABオペロンおよびsoxRSオペロンそれぞれの状態の評価のため、培養体を分け、培養体の半分を5mMサリシル酸ナトリウムmarRABオペロンおよび1.3mMのパラクアットsoxRSオペロンでそれぞれ誘導した。最近の文献エーシンガーら、1998、Antimicrob.AgentsChemother.42:2089-2094とおり、双方のオペロンからの転写レベルを、放射線ラベルDNAプローブmarAまたはsoxSを膜結合RNA20μg/レーンへのハイブリダイゼーション、PhosphoImagerスクリーン経の暴露、およびImage-QuantソフトウエアMolecularDynamics、Sunnyvale、CAによる可視化で評価した。細胞全体の[14C]-シプロフロキサシンの蓄積:培養体を30°C、LBブロス中で対数相に生育し50mM燐酸カリウム/0.2グルコースpH7.4中で洗浄、同じ緩衝液中にOD600=5~7で懸濁した。[14C]-シプロフロキサシン比放射能:59mCi/mmolを10μMで加えた。50μlの細胞標識懸濁液を5mlの100mMLiCl/50mMKPO4pH7.4中に希釈し、5および15分後に平衡状態で蓄積を測定し、直ちにGelmanメトリセル混合セルロースエステルメンブレンフィルターポアサイズ0.45μm、GelmanScienceInc.、AnnArbor,MI上に集め、5mlの同じ緩衝液で洗浄した。フィルターを乾燥し、BetaflourNationalDiagnostics、Somerville、NJを用いて放射能を液体シンチレーションカウンターで分析した。計数効率は90であった。細胞がない場合のフィルターへの放射線標識の結合を差し引いた。使用時、プロトン駆動力を破壊するカルボニルサイアナイドm-クロロフェニルヒドラゾンCCCPを最終濃度200μMで加え、シプロフロキサシンの蓄積をその後5および15分に分析した。1つの実験で5種の株までを検討し、さらにAG112を対照株として含む様に、分析を設計した。結果をCIPの蓄積として、OD600ユニットあたりピコモル単位で計算したが、OD600が1に等しい場合、1OD600ユニットは1ml中の細胞数を現す約109E,coli細胞、約0.3mgのタンパク質。活性化細胞のCIP蓄積と脱活性化CCP-処理細胞のCIP蓄積の比を上記流出の間接目安として用いたレービー、1992、AgentsChemother.36:695-703。これらの計算で、5および15分前およびCCCP添加後25分および35分で得られた結果を平均し、比率を脱活性化すなわち最高蓄積ので表した。異なった段階の突然変異体の突然変異頻度は8×10-8~10-10の範囲であり、これは先のデータヘーシング、1996、AgentsChemother.40:879-885;ピドックPiddock,L.J.V.ら、1991、J.Antimicrob.Chgemother.28:185-198;ワタナベら、1990、Antimicrob.Chgemother.34:173-175と良く一致している。生育が損なわれた突然変異体はなかった。第1突然変異段階ではAG100とそのMar突然変異体でOFL耐性が8倍増加した表1。その後の増加は全ての段階で2~4倍であり表1および2、3-AG112で8μg/mlの最高MICOFLが得られた。MICとFQは平行に増加し、MICの順番はOFL>CIP>TVA=SPXであった表2。構造および調節遺伝子中の染色体突然変異の同定、および関連しない抗生物質への感受性:gyrAのQRDRの配列決定により、コドン87における同じ点突然変異グリシンのアスパルテートへの置換が、AG100およびAG112由来の突然変異体の双方で最初の突然変異段階で生じることが示された表1。これらの突然変異は、それ以外の複数の耐性フェノタイプMarを生じず、MICのFQへの増加をもたらした。より高いFQ耐性への段階的生体外突然変異誘発中の一連の出来事における最初の眼にみえる突然変異である、gyrA突然変異に関する報告はいくつかあるヘーシング、1996、Antimicrob.AgentsChemother.40:879-885;カーンKern、W.V.ら、1997、第37回抗菌剤および化学療法学際会議プログラムおよび抄録、トロント抄録;ピドックら、1991、J.Antimicrob.Chemother.28:185-198。第1gyrA突然変異の位置のAG100とAG112間の一致は、偶然の一致と思われる。AG100バックグラウンドにおける第2段階突然変異は、2°-AG100のノーザンブロット分析によるmarRABの過剰発現で示される様に、Mar突然変異であった。この様な過剰発現は、AG100の3個の独立に選んだ第2段階突然変異体で見出された。marAの構造過剰発現はTET、CMLおよびCFOXに対する耐性の増加と関連していた表2。marRの回想的配列決定により、第3段階の突然変異体3-AG100が2°-AG100由来であることが示された表1。多くの努力にもかかわらず、marR中の1634G→T転移による推定される第2段階Mar突然変異体は回収されず、さらに検討された。予想されたジョージおよびレービー、1983、J.Bacteriol.155:531-540様に、marRABはMar突然変異体およびその後に誘導された突然変異体内で抑制された。親株AG112のmarORの配列決定により、アミノ酸12のコドン後の5塩基対の欠失が同定され、1個のアミノ酸の欠失とその後の完全なタンパク質配列の変化となった表1。これらのデータは、gyrA遺伝子における1個の突然変異により、marA自体の発現より若干高い耐性が与えられることMICOFL=0.25μg/ml対0.125μg/ml;1AG100対AG112、表1、および2個の突然変異が増殖し得ることを示す。より高いFQ耐性へのその後の段階中に、ただ1個の突然変異体、4-AG100はコドン83でロイシンをセリンに置換する第2の突然変異を獲得した表1。gyrA、oarCまたはmarORにおけるそれ以上の突然変異はより耐性の突然変異体のいずれでも同定されず、どの段階でもsoxSを構造的に過剰発現しなかった。gyrA/Mar二重突然変異体1-AG112由来の突然変異体2-AG112は、marORにそれ以上の突然変異を起こさず、複数の薬物に対する耐性が増加していることを示した表2。可能なその他の突然変異により、acrABが調節される可能性がある。対照的に、次段階の突然変異体3-AG112がFQおよびCOFXのみに耐性を増加した表2。この耐性に対する分子的基盤は未知である。活性化細胞全体中のCIPの蓄積は、5分間でプラトーに達し、AG100で平均103pmolCIP/ODU600であった。プロトン駆動力が200μMCCPを添加することにより消失した場合、[14C-]シプロフロキサシンの蓄積は倍増した201pmolCIP/ODU600。これらの発見により、FQ感受性E.coli細胞がFQの蓄積を減少する、すなわち能動流出を示すためにエネルギーを使用するというノルフロキサシンによる先の研究コーエンら、1988、Antimicrob.AgentsChemother.32:1187-1191が確認された。この減少はまた、オフロシサシンを用いてProteusvulgarisでも観察されたイシイIshii、H.ら、1991、J.Antimicrob.Chemother.28:827-836。比較として、AG112における蓄積は野生型の54、平均56pmolCIP/ODU600であり、CCCP後に226CIP/ODU600に増加した。細胞を脱活性化した場合のCIPまたはノルフロキサシンのAG100親株のレベルへの迅速な蓄積コーエンら、1988、Antimicrob.AgentsChemother.32:1187-1191は、Mar突然変異体における薬物蓄積の減少の主な機構としての外膜ポリンのダウンレギュレーションを除外する。活性化第1段階突然変異体1-AG100および1-AG112で蓄積したCIPの量、および脱活性化後の薬物取り込みの減少は、親株AG100およびAG112それぞれのものと実質的に同じである。第2段階Mar突然変異体2°-AG100では、蓄積は65pmolCIP/ODU600野生型の65、図1に減少した。独立に単離された突然変異体3-および4-AG100では蓄積の減少は大きかったそれぞれ16pmolCIP/ODU600=野生型の16;および20pmolCIP/ODU600=野生型の19。同様に、突然変異体2-AG112および3-AG112はMar突然変異体AG112および1-AG112よりかなり少ないCIPを蓄積した双方の株で26pmolCIP/ODU600対56pmolpmolCIP/ODU600および57pmolCIP/ODU600、それぞれ野生型の25対54および55、図1。薬物のより効率的な流出のため、3-/4-AG100および2-/3-AG112における抗外部薬物レベルでのCIPの細胞内濃度は、低レベルでの親株のものと同じ程度とおもわれ、突然変異はより高い細胞内FQ濃度で生存する。元になる機構がどのようであれ、それが細胞のTET、CMLおよびCFOXに対する耐性も増加させる。ArcAB欠失の効果:AcrAB複数薬物流出ポンプが欠失すると、すべての株でCIPの能動流出が完全に失われた。ΔacrAB欠失を有する活性化AG100細胞は活性化acrAB細胞の2倍以上のCIPを蓄積した図1。marRABまたはgyrAの突然変異にも拘わらず、ΔacrABを有するいずれの株間でもCIP取り込みの差は認められなかった図1。全てのΔacrAB株はすべてのFQに対しきわめて過剰感受性になったが、gyrAに新しく獲得した突然変異を有する突然変異体表1は予期される倍数のFQ耐性を維持していた表2。しかしながら、この耐性は臨床的に優位であるよりははるかに下であった。例えばGyrA2重突然変異体4-AG100ΔacrABはわずか0.125μg/mlのMICOFLを示したのみであった。興味深いことに、異なったFQのMICの差がΔacrAB株ではもはや観測されなかった。例えば2°-AG100ΔacrABではMICOFL=MICCIP=MICTVA=0.06μg/ml、一方、acrB株では2°-AG100MICOFL=1μg/ml、MICCIP=0.5μg/ml、MICTVA=0.25μg/ml表2。SPX似たいして、全てのΔacrAB突然変異体は検出限界以下であったMICSPXΔ0.015μg/ml。このことは、活性化細胞でAcrABポンプで流出される薬物の割合がはるかに高いことを反映していると思われる。acrAB欠失はまた、marAの過剰発現で与えられる複数薬物耐性を除去し、従ってAcrAB複数薬物流出ポンプがMar突然変異体の抗生物質耐性フェノタイプで主要な役割を果たすという以前の結果オクツ、マーおよびニカイドウ、1996、J.Bacteriol.178:306-308を強調している。また別な、いまだ未知の突然変異もacrABの欠失で完全に消失した表2。従って、薬物耐性に対する1つ以上の別な突然変異の効果はacrABを経由して作用すると思われる。結論:ノルフロキサシン耐性E.coliの選別に関する以前の報告は、FQ体制突然変異体を生体外で増幅する間に7種の関係のない抗生物質のMICの変化を示さなかったテネーTenney、J.H.ら、11983、Antimicrob.AgentsChemother.23:188-189。別な研究では、gyrA突然変異体由来の10個の第2段階突然変異体のうち2個のみが複数耐性フェノタイプを示すことを示したピドックら、1991、J.Antimicrob.Chemother.28:185-198。本発明研究の結果は、先に報告された結果とは対照的である。3つの独立なシリーズにおけるFQ耐性の生体外増幅中の段階的突然変異の発生では、最初にgyrA突然変異を生じ、その後mar遺伝子座の過剰発現を生じる突然変異を起こした。marA突然変異も、FQ耐性E.coliの生体以外で選別中の第2段階の突然変異中に他の研究者により観察されたバーゲルBagel、S.ら、1999、Antimicrob.AgentsChemother.43:868-875。最近の実験で、同じ生体外実験条件が2個の臨床E,coli単離株の突然変異体を選別するために適用されたケルンKern、W.V.ら、1997、第37回抗菌剤および化学療法学際会議プログラムおよび抄録、トロント。第2段階突然変異体は一つの株ではMar突然変異体であり、他の株ではSox突然変異であったのでケルンら、1997、第37回抗菌剤および化学療法学際会議プログラムおよび抄録、トロント、調節遺伝子における突然変異がしばしば生じる。しかしながら、臨床起源のFQ耐性E.coliは、構造MarまたはSox突然変異体の割合はわずか10~15でありエーシンガーら、1998、Antimicrob.AgentsChemother.42:2089-2094、本発明の生体外実験より低い頻度であることが示されている。E.coli中のポンプの数が多いニカイドウ、1996、J.Bacteriol.、178:5853-5859;ポールセンPaulsen、I.T.ら、1996、Microbiol.Rev.,60:575-608ことを考えると、AcrABポンプがない場合は他のポンプのいずれもCIPを能動は流出しないことは驚くべきことである。従って、AcrAB複数薬物流出ポンプはCIPを基質として使用する唯一の、または少なくとも最も重要なポンプである様に思われる。これらの知見は、AcrABポンプの欠失に大きく影響されるE.coliのトリクロサン感受性に関する最近のデータに対応するマックミューリーら、1998、FEBSMicrobiol.Lett.、166:305-309。acrAB、marAまたはsoxSの過剰発現が細胞のトリクロサンに対する耐性を約2倍増加させるが、トリクロサンの標的であるエノイルリダクターゼfabIでコードされるの突然変異は細胞の耐性を約100倍にしたマックミューレーら、1998、Nature394:531-532。しかしながら、acrABの欠失は全ての株で耐性を10倍減少させ、fabI突然変異の効果をより小さくしているが、これはFQの場合のトポイソメラーゼ突然変異の有効性の減少と類似している。本研究の知見の優れた点は、AcrAB流出ポンプがE.coliの内在性および獲得耐性レベルの双方で強力な役割を有することである。これらのデータは、流出機構がFQの作用をPseudomonasニカイドウ、1996、J.Bacteriol.178:5833-5859のみならず、E.coliにおいても減少させることを示しているが、後者の微生物では薬物はより透過性のポリンチャネルを通って迅速に拡散するニカイドウ、1996、J.Bacteriol.178:5853―5859。marORまたはsozRSの突然変異に加えて、染色体遺伝子座における未同定の突然変異が、AcrABを経由する流出を増加させることにより、耐性レベルを明らかに変化させる。AcrAB流出ポンプを妨害すると、FQ等の薬物の効果をトポイソメラーゼ突然変異の場合でも増加させると考えられる。本出願で引用した全ての参考文献、係属出願および公開特許の内容は、参照資料として本明細書で明白に用いられている。同等物当業者は、通常の実験以上でない方法で、本明細書に記載された本発明の実施態様に対する多くの等価な内容を理解または確認し得ると考えられる。この様な同等物は本発明のクレームに含まれる。"