イソバレリル基転移酵素遺伝子istとacyB2調節遺伝子連鎖遺伝子が、イソバレリルスピラマイシンI生成菌WSJ2中において共同表現のクローン菌株であることを特徴とする一株イソバレリルスピラマイシンI成分高含有量、高生産量遺伝子工程菌。A耐熱ストレプトマイセスStreptomycesthermotolarencesCGMCC41501総DNAを鋳型とし、NCBIに公開されたistacyB2配列に基づき、プライマーを設計し、PCRでistacyB2連鎖遺伝子断片を獲得し、其の中に適当な制限酵素部位を加入し、また適当的な制限酵素部位を通じて夫夫istとacyB2遺伝子断片を、イソバレリルスピラマイシンI生成菌が転入できる整合型ベクターと結合し、含istacyB2遺伝子の組換えプラスミドを獲得し;B含istacyB2組換えプラスミドをイソバレリルスピラマイシンI生成菌WSJ2に転入し、抗性選択により獲得した形質転換体が加薬のない情況下に連続に後世に伝えた後、更に加薬検出して安定表現の組換えプラスミド含有イソバレリルスピラマイシンI生成菌を獲得し、命名:WSJIA、菌種受託番号CGMCCNo3942、を特徴とする請求項1に記載の遺伝子工程菌構築方法。獲得したWSJIA菌種がPCR検証により遺伝子水準にistacyB2配列を含有することを特徴とする請求項2に記載の遺伝子工程菌構築方法。WSJIA菌種が培養、発酵をした後、発酵能力を計算し、獲得したWSJIA菌種発酵能力が1160μgml以上で、生成したイソバレリルスピラマイシンI総含有量が12061以上であることを特徴とする請求2に記載の遺伝子工程菌構築方法。《実施例1》含istacyB2双遺伝子組換えプラスミドpSET52iaの構築本実験室がまず構築した組換えプラスミドpSW4尚広東等、生物工程学報199915171中から、SmaIBamHIに制限酵素で、含ist完整遺伝子と含acyB2遺伝子上流部分の1820bp断片を獲得し、中国微生物菌種寄託管理委員会普通微生物センターから提供された耐熱ストレプトマイセスStreptomycesthermotolarencesCGMCC41501総DNAを鋳型とし、NCBI公布のacyB2配列によって、プライマーp1:CGCTCAGGGACGCAAGACCとP2:CCGGAATTCGCCCCGTGACCTCACCGTCを設計し、PCR反応により、反応条件は94°C、予変性2min;94°C30s、60°C30s、72°C1min、28循環;72°C延伸5minである。acyB2遺伝子下流部分1013bp断片を獲得し、PCRの生産物をBamHIEcoRI制限酵素で、934bp断片を獲得し、前記SmaIBamHI、BamHIEcoRI934bp断片をpBluesriptIIKSベクターMerck会社のSmaIEcoRI制限酵素部位に接合し、含istと完整acyB2遺伝子組換えプラスミドpBKSiaを獲得した。XbaIEcoRI制限酵素部位により大腸桿菌ストレプトマイセスストレプトマイセス接合転移プラスミド整合型pSET152プラスミドBiermanMetalGene19921164349来自遺伝子バンク共享資源wwwgenecoolcomに結合し、istacyB2遺伝子組換えプラスミドpSET52iaを獲得した実験方法は宝生物工程大連有限公司操作規程に寄った。構築フロシートは図1に示す。《実施例2》組換えプラスミドpSET52iaがイソバレリルスピラマイシンI生成菌WSJ2に転化イソバレリルスピラマイシンI生成菌WSJ2は本実験室にて構築されたのであるChunyanMaetalCurrentMicrobiology2011621620。前記菌種が斜面培地に大豆ケーキ粉20グルコース10澱粉30、CaCO305NaCl04寒天2028°Cで710日間培養し、文献DAHopwood等GeneticmanipulationofStreptomyces、ALaboratoryManual、NorwichJohnInnesFoundationUK、1985において説明の方法によって原生質体を製造し具体的に、菌種を塊堀りし、含ショ糖R2YE培地に接種し28°Cで24日間培養し、10接種量にて前記培地に転種し、かつ05グリシン、20時間培養し、遠心で菌糸を収集し、103ショ糖溶液で23回洗浄し、含溶菌酵素2mgmlのP溶液中において37°Cで1560分間溶菌し、綿を通しロ過して原生質体を獲得した。イソバレリルスピラマイシンI生成菌WSJ2が外来遺伝子に対する限制修飾作用を克服するために、本発明にはまず組換えプラスミドpSET52iaをメチル化欠陥型大腸桿菌Ecoli12567MacNeiletalGene19921116168に転入、遺伝子バンク共同に享受資源からのであるwwwgenecoolcom。形質転換体からプラスミドDNAを採取し、その後PEGを介し原生質体に転入しかつR2YE固体培地に塗布し、28°Cで24時間培養した後、含アラビア酵素溶液で培養物を被って、アラビア酵素を培地中における最終濃度50μgmlにせしめ、続いて710日間培養し抗性形質転換体を選択した。加薬しない条件下で連続に世代した後、更に加薬検定を通じて、安定表現抗性の組換えプラスミドpSET52iaを含有したイソバレリルスピラマイシンI生成菌WSJIAを獲得した。ist上流及びacyB2遺伝子下流区プライマーP3:GAGGTAGAAGGCGAAGGTとP4:CGTCAGATGCCAGTTCACを設計し、夫夫対照菌WSJ2と本発明WSJIA形質転換体4個総DNAを鋳型としPCRを行い、PCR反応過程:94°C予変性2min;94°C30s、60°C30s、72°C2min、28個循環;72°C延伸5minである図2。結果は、WSJIA遺伝子グループから1733bpPCR産物を獲得できたが、対照菌中ではPCR産物が得られない、これはistacyB2遺伝子が既に成功に目的菌種の遺伝子グループへ整合したことを説明した。前記菌株が2010年6月25日に北京市朝陽区北辰西路1号院3号の中国微生物菌保藏種管理委員会普通微生物中心へ寄託し、受託番号NoCGMCC3942、分類命名はStreptomycesspiramyceticusである。《実施例3》WSJIA菌株特徴の鑑定と確認本発明は《放線菌分類及び鑑定》閏孫初監修、1992年を参照し、WSJIA菌株に対し菌株特徴の鑑定と確認を行った。1、WSJIA培養形態及び生理生化特徴1培養特徴菌株の異なった培地における気生菌糸、基内菌糸と可溶性色素の色を観察し、結果を表1に示す。2顕著な特徴:胞子糸柔軟、フック状と螺旋形;胞子柱形と楕円形。表1WSJIA菌株の培養特徴注:CzapekDox培地ショ糖30g、NaNO330g、MgSO47H2O05g、KCl05g、FeSO44H2O、K2HPO410g、寒天150g、蒸留水10リットルpH6065。グルコースアスパラグス培地:グルコース10g、アスパラグス05g、K2HPO405g、寒天150g、蒸留水10リットルpH7274。グリセリンアスパラグス培地:グリセリン10g、アスパラグス05g、K2HPO405g、寒天150g、蒸留水10リットルpH7274。無機塩澱粉培地:可溶性澱粉100g、MgSO47H2O10g、NaCl10、NH42SO420g、CaCO320gK2HPO410g、MnCl24H2O10mg、FeSO410mg、ZnSO47H2O10mg、寒天150g、蒸留水10リットル、pH72。ISP2培地:酵母クリーム40g、マルトエキスクリーム100g、グルコース40g、寒天200g、蒸留水10リットル、pH7274。オートミール培地:オートミール200g、微量塩溶液1ml、寒天15g、蒸留水10リットル、pH72。注:微量塩液溶液FeSO47H2O01g、MnCl24H2O01g、ZnSO47H2O01g、100ml蒸留水。Gause’s一号培地:可溶性澱粉200g、KNO310g、K2HPO405g、MgSO47H2O05g、NaCl05g、FeSO47H2O001g寒天150g、蒸留水10リットル、pH7274。Santa’s培地:KH2PO405g、MgSO47H2O05g、クエン酸20g、クエン酸鉄アンモニウム005g、グリセリン60ml、アスパラミド40g、寒天150g、蒸留水10リットル、pH74。3生理生化特徴A、選択基礎培地上にWSJIA菌株の炭源に対する利用を検出基礎培地:2SO420g、MgSO47H2O02g、NaH2PO4H2O05g、CaCl22H2O01g、K2HPO405g、蒸留水10リットル、測定炭源が0105で夫夫基礎培地に入った。滅菌後、菌懸濁液を持って接種し、28°Cで培養、連続に3代移種、菌体成長情況にてWSJIA菌株の炭源に対する利用を確認。B、マロン酸利用の基礎培地測定:酵母クリーム10g、2SO420g、K2HPO406g、KH2PO404gNaCl20g、マロン酸ナトリウム30g、ブロムチモールブルー0025g、蒸留水10リットル、pH7074。滅菌後、菌懸濁液で接種し、28°C12日培養、培地がグリーン色からブルー色に変化したものはマロン酸利用とした。C、酒石酸塩利用の基礎培地測定蛋白ゼリー100g、NaCl50g、酒石酸ナトリウム100g、ブロモチモールブルー02125ml、蒸留水10リットル、滅菌。同時に酢酸鉛飽和溶液を製造した。菌懸濁液接種後14日間、28°Cで培養14日間、等体積酢酸鉛試薬を仕込み、溶液が緑黄色に変化し、少量酢酸鉛沈殿のものは酒石酸利用を表した。D、ゼラチン液化:基礎培地蛋白ゼリー50g、ゼラチン100150g、蒸留水10リットル、pH7274、滅菌。成長1824時間の菌培養物を取って、それにゼラチン培地に挿し接種、かつ未接種対照を設け、20°C保温箱中にて培養し、271014と30日間、20°C以下室温で菌体成長及びゼラチン液化を観察し、結果、菌が既に成長、ゼラチン表面に凹部なし且つ安定的な凝塊を示せば、ゼラチン液が陰性と認められる。E、ミルク反応:新鮮ミルク煮沸、冷蔵庫に一晩に放置し、底層脱脂ミルクを取った;リトマス25gを100ml蒸留水に一晩に浸漬し、ろ過、25リトマス水溶液4ml、脱脂ミルク100mlを取って、装入試験管の高さが約4cm、滅菌、菌株接種28°Cで培養135714和30日間、観察結果は、ミルク塊ゼリー化を表した。F、硝酸塩還元:培地肉エキスゼリー培地10リットル、KNO310g、pH7076、各管に45mlを装入、滅菌。グリース氏Griess試薬:ap-アミノベンゼンスルファニル酸05g、希酢酸10150ml;bナフチルアミン01g、蒸留水20ml、希酢酸10150ml。ジアニリン試薬:ジアニリン05gを100ml濃硫酸に溶解し、20ml蒸留水で希釈した。菌種を硝酸塩培地に接種し、28°Cで培養135日間、洗浄管に135日間の培養液を少量に加入、夫夫一滴a、b液を滴下し、溶液は赤色に変化すれば、硝酸塩が亜硝酸塩に還元されたと表示、一滴ジアニリン試薬を加入し、青色反応を呈していない。G、チロシン酵素:菌種がGause’s一号液体培地に接種され、28°Cで7912日間培養、別々に2ml培養液をサンプルし、遠心後に上清液を取り、2mlリン酸緩衝液pH59と1ml004チロシン溶液を仕込、37°Cで5分間保温し、赤色反応を呈しない。H、澱粉酵素:菌種が肉エキスゼリー中に接種して02可溶性澱粉寒天培地中に加入し、28°Cで25日間培養し、寒天平板上で明らかにコロニーに形成した後、平板上にヨード液ヨード10g、ヨード化カリウム20g、300ml蒸留水、コロニー周囲に不辺色の透明環を呈すると、澱粉水解を表明した。WSJIA菌株の生理生化特徴は表2に示す。2、WSJIAの分子系統学特徴分析116SrDNA遺伝子配列:16SrDNAが細菌リボソームの組成部分で、16SrDNA遺伝子は細菌染色体上にコードrRNA相応的なDNA配列で、それは遺伝学に高度保守性を備えるため、従って、其の配列が既に細菌分子分類学の特徴の一に公認された。以下の16SrDNAプライマー:5’AGAGTTTGATCMTGGCTCAG3’5’GGTTACCTTGTTACGACTT3’を採用WSJIA菌株総DNAを鋳型にして、PCR反応過程:96°C予変性1min;各循環中に、96°Cで変性30s、50°Cでアニール30s、72°Cで延伸15min、25個循環72°Cで延伸10min。1393bp配列表1を獲得。表2WSJIA菌株の生理生化特徴表3WSJIA16SrDNA遺伝子配列と既知菌との比較本発明はまたWSJIA菌株において、ストレプトマイセス分子分類学に通用の以下五つ肝心な遺伝子atpDgyrBrpoBrecAとtrpBに対し配列を測定した。これら遺伝子は単コピーとコード蛋白の遺伝子で、これら遺伝子配列構造が安定で、其の中に隙間又は重ね現象が存在していない。従って、其の配列測定結果は直接にヌクレオチド水準及びアミノ酸水準で菌株の種間における比較に用いられ、更にWSJIAが分類中における位置を確定できる。2肝心遺伝子A.atpD遺伝子配列atpD遺伝子はATP合成酵素サブユニットで、微生物種属中において高い安定性と普遍性を備え種系分類の分子標識とするのは適合である。本発明は以下プライマーを採用:5’GTCGGCGACTTCACCAAGGGCAAGGTGTTCAACACC3’5’GTGAACTGCTTGGCGACGTGGGTGTTCTGGGACAGGAA3’WSJIA菌株総DNAを鋳型にして、PCR反応過程:96°C予変性1min;各循環中96°Cで変性30s、63°Cでアニール30s、72°C延伸10min、28個循環72°C延伸10min。680bp配列表2を獲得。B.gyrB遺伝子配列GyrBはDNAジャイレース四量体のサブユニットで、原核生物II型DNAトポロジ異性酵素に属され、かれがDNA切断と重複接合作用によってDNAのトポロジ構造を調節し、ある抗生素生成菌の抗性と関わり、微生物種属中において高い安定性と普遍性を備え種系分類の分子標識とするのは適合である。従って、其の配列が既に細菌分子分類学の特徴の一に公認された。本発明は以下プライマーを採用:5’GAGGTCGTGCTGACCGTGCTGCACGCGGGCGGCAAGTTCGGC3’5’GTTGATGTGCTGGCCGTCGACGTGAGCGTCCGCCAT3’WSJIA菌株総DNAを鋳型にして、PCR反応過程:96°C予変性1min;各循環中96°Cで変性30s、65°Cでアニール30s、72°C延伸10min、28個循環72°C延伸10min1177bp配列表3を獲得。C.rpoB遺伝子配列rpoBはRNAポリメラーゼbサブユニットで、ストレプトマイセスにおいて広汎に存在している。本発明は以下プライマーを採用::5’GAGCGCATGACCACCCAGGACGTCGAGGC3’5’CCTCGTAGTTGTGACCCTCCCACGGCATGA3’WSJIA菌株総DNAを鋳型にして、PCR反応過程:96°C予変性1min;各循環中96°Cで変性30s、65°Cでアニール30s、72°C延伸10min、28個循環72°C延伸10min870bp配列表4を獲得。D.recA遺伝子配列RecAは組換え酵素で、DNA同源組換えと損害修復DNAの過程において重要な役割を果たす。RecAの存在は菌株遺伝子グループDNA構造安定性の重要ファクターで、従って、其の配列が既に細菌分子分類学の特徴の一に公認された。本発明は以下プライマーを採用::5’CCGCRCTCGCACAGATTGAACGSCAATTC3’5’GCSAGGTCGGGGTTGTCCTTSAGGAAGTTGCG3’WSJIA菌株総DNAを鋳型にして、PCR反応過程:96°C予変性1min;各循環中96°Cで変性30s、65°Cでアニール30s、72°C延伸10min、28個循環72°C延伸10min701bp配列表5を獲得。E.trpB遺伝子配列trpB遺伝子はコードトリプトファン合成酵素で、ストレプトマイセス初級代謝に参与し、菌株種属特異性を有すると認められ、其の配列が既に細菌分子分類学の特徴の一に公認された。。本発明は以下プライマーを採用::5’GCGCGAGGACCTGAACCACACCGGCTCACACAAGATCAACA3’5’TCGATGGCCGGGATGATGCCCTCGGTGCGCGACAGCAGGC3’WSJIA菌株総DNAを鋳型にして、PCR反応過程:96°C予変性1min;各循環中96°Cで変性30s、66°Cでアニール30s、72°C延伸10min、28個循環72°C延伸10min611bp配列表6を獲得。表3、表4から、WSJIA菌株16SrDNA及び五つ肝心遺伝子配列が既知菌株遺伝子配列と比べ完全な一致性がないので、WSJIAは一つストレプトマイセス新種であると判断できる。表4WSJIA肝心遺伝子配列と既知菌の比較《実施例3》WSJIA菌種の中等試験規模発酵能力検出WSJIA菌種が《実施例2》前記斜面培地28°Cで培養710日間、塊堀りで種子培地大豆ケーキ粉15、澱粉30、NaCl04、CaCO305、魚蛋白ゼリー03、KH2PO4005に接種し、一級28°Cで48時間培養して、二級種子培養に転入し28°Cで24時間培養し、50L種子缶培養に転入し36時間培養し、更に2トン発酵缶に転入し、発酵培地グルコース05、澱粉60、酵母粉05、魚粉20、NH4NO306、NaCl10、CaCO305、KH2PO4005、MgSO401、28°Cで96時間発酵培養した。発酵液から遠心上清液をサンプルし、含3NaClのpH7880リン酸塩緩衝液で希釈した。胞子桿菌CGMCC63501を検出菌とし、培地配合蛋白ゼリー06牛肉浸漬粉015酵母エキスクリーム06グルコース02寒天1520中国薬典2010版二部附録XIAによる基準曲線方法に基づき、アセチルスピラマイシンを基準品にして、発酵能力を計算した。本実験に三次重複した後、得られたWSJIA菌種発酵能力平均は1160mgml、含ist単遺伝子のWSJ2菌種対照発酵能力の平均が280μgml表5である。《実施例4》WSJIA菌種発酵生産生イソバレリルスピラマイシンI成分の検出《実施例3》で獲得発酵液からのサンプルをpH85までに調整し、等量酢酸エチルで抽出し、酢酸エチル抽出液を濃縮し、乾しまでにした後、メタノールに溶解した。以下の条件を採用し:KromasilC18カラム45mm×150mm、5μm;流動相:メタノール:リン酸ジヒドロナトリウム溶液体積比5347;検出波長:231nm;流速:10mLmin1;カラム温度25°C;仕込み量:1020μL。HPLCにて産物中におけるイソバレリルスピラマイシンI成分の含有量を検出図2、三回実験結果から、WSJIA菌種発酵で生成したイソバレリルスピラマイシンI総含有量は平均に12061で、含ist単遺伝子のWSJ2菌種対照生成イソバレリルスピラマイシンI総含有量は7088で、《実施例3》により発酵培養を行い、微生物法で二つ菌種発酵能力を測定し、酢酸エチル抽出産物に対しHPLC分析図3を行った。HPLC中ピーク面積により両者生成イソバレリルスピラマイシンI成分の情況を比較し、夫夫に両者生成イソバレリルスピラマイシンIがスピラマイシンとの比例を計算し、結果、istacyB2遺伝子の導入によってWSJIA菌種発酵能力414を向上し、生成イソバレリルスピラマイシンI含有量も1702を向上、相応的にスピラマイシンの生成を下げ、イソバレリルスピラマイシンI成分とスピラマイシン比例が218を向上した表5。本発明は含istacyB2遺伝子生成イソバレリルスピラマイシンIの菌種を提供し、当該菌種が一定発酵条件下で、元々にist遺伝子のみを含有した菌種生成イソバレリルスピラマイシンI成分含有量より17倍を向上し、発酵能力は414倍を向上した。表5WSJIAとWSJ2菌種発酵能力及び成分含有量の比較