"変性疾患、心疾患、代謝性疾患、及び障害からなる群から選択される病的状態の幹細胞に基づく治療による処置に使用するためのグリピカンファミリーのメンバーの発現及び/又は活性が、弱められ又は消失させられた、幹細胞又は前駆細胞。前記幹細胞又は前駆細胞が、ヒト胚に直接由来しない、請求項1に記載の使用のための幹細胞又は前駆細胞。奇形腫の形成を抑える、請求項1又は2に記載の使用のための幹細胞又は前駆細胞。前記グリピカンファミリーのメンバーがグリピカン4である、請求項1~3のいずれか一項に記載の使用のための幹細胞又は前駆細胞。細胞分化を引き起こす環境条件に供された場合、初期分化を示す幹細胞又は前駆細胞のインビトロ生成方法であって、以下:幹細胞又は前駆細胞において前記グリピカンファミリーのメンバーの発現及び/又は活性を弱め又は消失させ;それによって、細胞分化を引き起こす環境条件に供された場合、初期分化を示す幹細胞又は前駆細胞を回収することを含む、方法。前記幹細胞又は前駆細胞が、ヒト胚に直接由来しない、請求項5に記載の方法。体細胞における前記グリピカンファミリーのメンバーの発現及び/又は活性を一過性に増加し又は誘導し、次に一過性に減少し又は弱め、それによって人工多能性幹細胞iPS細胞を回収することを含む、体細胞由来の人工多能性幹細胞のインビトロ生成方法。請求項5~7のいずれか一項に記載のインビトロ方法により取得できる、幹細胞、前駆細胞、又はiPS細胞。変性疾患、心疾患、代謝性疾患、及び障害からなる群から選択される病的状態の幹細胞に基づく治療による処置に使用するための、請求項5又は6に記載のインビトロ方法により取得できる、幹細胞又は前駆細胞。幹細胞又は前駆細胞から分化した細胞のインビトロ生成方法であって、以下のステップ:a請求項5又は6に記載の方法により細胞分化を引き起こす環境条件に供された場合、初期分化を示す幹細胞又は前駆細胞を生成し;及びb細胞分化を引き起こす環境条件に、ステップaにおいて生成された前記幹細胞又は前駆細胞を供することを含み、それによって分化した細胞を生成する、方法。毒物学的スクリーニングのために請求項5~7のいずれか一項に記載のインビトロ方法により生成される幹細胞、前駆細胞、又はiPS細胞の使用。サンプルから幹細胞、前駆細胞、ガン幹細胞、又は組織特異的幹細胞を特異的に精製するための前記グリピカンファミリーのメンバーの使用。サンプルから幹細胞、前駆細胞、ガン幹細胞、又は組織特異的幹細胞を特異的に精製するためのインビトロ方法であって、ここで前記サンプルが前記グリピカンファミリーのメンバーのリガンドと接触し;それによって前記サンプル中に存在する幹細胞、前駆細胞、ガン幹細胞、又は組織特異的幹細胞を精製する、方法。前記ガンの処置に使用するための前記グリピカンファミリーのメンバーの活性調節因子。変性疾患後の組織再生を誘導するための、好ましくは再生させる前記組織中に存在する組織特異的幹細胞の分化を増強するための前記グリピカンファミリーのメンバーの活性のアンタゴニスト。本発明は、グリピカン4タンパク質が、さまざまな幹細胞型により発現され、並びに自己複製及び分化の幹細胞特性を確立し及び維持するために必要であることを本発明者等が発見したことに基づく。具体的には、本発明者等により行われたマウスESCにおけるグリピカン4の生物学的機能の遺伝子に関する研究は、グリピカン4が自己複製対分化の適切なバランスを確立するために必要であることを明らかにした。特に、本発明者等は、ESCにおけるグリピカン4活性の減少が、細胞が多能性シグナルを奪われた場合、又はそれらが分化シグナルに供される場合、早期分化prematuredifferentiationを引き起こすことを示した。さらに、gpc4mutESCを使用するインビボアッセイを行うことにより、本発明者等は、これらの細胞が、野生型と対照的に、ヌードマウスに移植した場合、奇形腫を発症しないが、それらが、依然としてすべての胚性組織について発生する能力があることを示した。要するに、本発明者等の知見は、gpc4mut細胞が、多能性であるが、非許容的な自己複製条件に置かれた場合に、時期尚早に分化する固有の能力を有することを示す。本発明は、従って、幹細胞又は前駆細胞に関し、ここで多くのグリピカンファミリーの発現及び/又は活性が、変性疾患、心疾患、代謝性疾患及び障害からなる群から選択される病的状態の幹細胞に基づく治療法による処置用に使用するために、弱められ又は消失abolishさせられている。第二態様において、本発明は、幹細胞又は前駆細胞中のグリピカンファミリーのメンバーの発現及び/又は活性を弱め又は消失することを含む、細胞分化を引き起こす環境条件に供される場合、初期分化earlydifferentiationを示す幹細胞又は前駆細胞を生産するためのインビトロ方法に関し;それによって、細胞分化を引き起こす環境条件に供される場合、初期分化を示す幹細胞又は前駆細胞を得る。本発明の第三態様において、体細胞におけるグリピカンファミリーのメンバーの発現及び/又は活性を一過性に増加し又は誘導し、次に、一過性に減少し又は弱めることを含む、体細胞から人工多能性幹細胞iPS細胞を生産するためのインビトロ方法に関連し、それによって、人工多能性幹細胞を得る。第四態様において、本発明は、上記インビトロ方法により取得できる幹細胞、前駆細胞、又はiPS細胞に関する。本発明の第五態様は、変性疾患、心疾患、代謝性疾患及び障害からなる群から選択される病的状態の幹細胞に基づく治療による処置用の使用のための上記インビトロ方法により取得できる幹細胞又は前駆細胞に関連する。本発明の第六態様は、以下のステップ:a上記方法によって細胞分化を引き起こす環境条件に供される場合、初期分化を示す幹細胞又は前駆細胞を生産し、及びb細胞分化を引き起こす環境条件に、ステップaで生産した幹細胞又は前駆細胞を供することを含む、幹細胞又は前駆細胞から分化した細胞を生産するためのインビトロ方法に関し、それによって分化した細胞を生産する。本発明の第七態様は、毒性学的スクリーニングのための、上記インビトロ方法により生産された幹細胞、前駆細胞、又はiPS細胞の使用を目的とする。第八態様において、本発明は、サンプル由来の幹細胞、前駆細胞、ガン幹細胞、又は組織特異的幹細胞を特異的に精製するためのグリピカンファミリーのメンバーの使用に関連する。本発明の第九態様は、サンプル由来の幹細胞、前駆細胞、ガン幹細胞、又は組織特異的幹細胞を特異的に精製するためのインビトロ方法に関し、ここでサンプルは、グリピカンファミリーのメンバーのリガンドと接触し;それによって、サンプル中に存在する幹細胞、前駆細胞、ガン幹細胞、又は組織特異的幹細胞を精製する。本発明の第十態様は、ガンの処置用に使用するためのグリピカンファミリーのメンバーの活性の調節因子に関連する。本発明の第十一態様は、変性疾患後の組織再生誘導用に使用するためのグリピカンファミリーのメンバーの活性のアンタゴニストに関する。細胞本明細書で使用されるように、用語体細胞又は分化した細胞differentiatedcellは、区別なく使用され、そして具体的な構造を示し、具体的な機能を提供する対象の非胚細胞non‐germcellを意味し、ここで遺伝子の発現における潜在的可能性が制限されている。本明細書で使用されるように、用語幹細胞は、自己複製すなわち、同じ分化能を有する子孫を行うことができ、及びまた分化能についてより制限された子孫細胞を生産する細胞を意味する。従って、本発明によれば幹細胞は、以下の2つの特性:i自己複製、すなわち未分化状態を維持しつつ、細胞分裂の多数のサイクルを通過する能力;及びii潜在能力potential、すなわち特異的な細胞型に分化する能力を持っている。本発明の文脈において、幹細胞は、全能性幹細胞、多能性幹細胞、多能性幹細胞multipotentstemcell、及び寡能性幹細胞oligopotentstemcellを包含する。用語全能性幹細胞は、胚細胞及び胚体外細胞extraembryoniccell型に分化できる細胞を意味する。そのような細胞は、完全な生存能力がある生命体を構成する。これらの細胞は、卵子と精細胞の融合から生産される。受精卵の最初の数回の分割により生産される細胞も、全能性である。用語多能性幹細胞は、いずれかの三胚葉:内胚葉、中胚葉、及び外胚葉に分化する能力を有する幹細胞を意味する。多能性幹細胞は、任意の胎児又は成体細胞型を生じさせることができる。しかしながら、単細胞又は多能性細胞の集合体conglomerateは、それらが、胚をまとめる能力を欠いているため、胎児又は成体動物に成長できないMitolipov及びWolfAdvBiochemEngBiotechnol114185199。用語多能性幹細胞multipotentstemcellは、多くの細胞に分化できるが、細胞の近縁のファミリーのものにのみ分化できる幹細胞を意味する。用語寡能性幹細胞oligopotentstemcellは、リンパ球系幹細胞又は骨髄系幹細胞などのいくつかの細胞にのみ分化できる幹細胞を意味する。本発明の文脈では、幹細胞は、胚性幹細胞ESC;胚本体の幹細胞及び羊水幹細胞、臍帯血幹細胞、ウォルトン膠質Wharton’sjelly幹細胞、羊膜幹細胞、胎盤幹細胞などの胚体外組織の幹細胞を含む胎児性幹細胞;成体幹細胞、ガン幹細胞、並びに人工多能性幹細胞を包含する。好ましくは、本発明によれば幹細胞は、胎児性幹細胞、成体幹細胞、ガン幹細胞、及び人工多能性幹細胞を包含する。より好ましくは、本発明によれば幹細胞は、胎児性幹細胞、成体幹細胞、及び人工多能性幹細胞を包含する。用語胚性幹細胞は、胚盤胞又は桑実胚期前の胚の内細胞塊の胚盤葉上層組織由来の多能性幹細胞を意味する。ヒト胚は、受精後4~5日で胞胚期に達し、その時点で、それらは50~150の細胞からなる。胚性幹細胞は、Oct4、Nanog、Sox2などのいくつかの転写因子、及びグリコリピド、SSEA3、SSEA4などの細胞表面タンパク質、及びケラチン硫酸抗原Tra‐1‐60とTra‐1‐81の発現によりまた定義されてもよい。好ましくは本発明によれば、用語幹細胞は、ヒト胚由来の幹細胞を含まない。より好ましくは本発明によれば、幹細胞は、ヒト胚に直接由来しない。さらに好ましくは、公的に入手可能な及び以前に確立された幹細胞系に由来する胚性幹細胞は、本発明において使用されるような幹細胞の意味の範囲内に含まれる。特に、表1に記載の細胞系の一つに由来するヒト胚性幹細胞は、本発明において使用されるような幹細胞の意味の範囲内に含まれる。用語胎児性幹細胞fetalstemcellは、胎児本体、又は好ましくは臍帯血、羊水、ウォルトン膠質、羊膜、及び胎盤を含む妊娠の間に現れる胚体外組織のいずれかに由来する幹細胞を意味する。羊水幹細胞amnioticfluidstemcellは、羊水中に存在する幹細胞に対応する。それらは、すべての三胚葉由来の異種集団を表す。羊膜幹細胞amnioticmembranestemcellは、羊膜又は羊膜amnionの内層羊膜上皮細胞、又は外層羊膜間葉系間質細胞mesenchymalstromalcell、若しくは羊膜由来の幹細胞に由来する幹細胞に対応する。臍帯血細胞は、臍帯血に由来する幹細胞に対応し、そして特に、造血幹細胞及び間葉系幹細胞を含む。臍帯マトリックス幹細胞、臍帯血管周囲細胞umbilicalcordperivascularcell、又は臍帯間質細胞とも呼ばれるウォルトン膠質幹細胞は、ウォルトン膠質として公知の、臍帯の外側領域に由来する幹細胞に対応する。ウォルトン膠質は、臍帯の2つの動脈と1つの静脈を囲む粘液状の結合組織である。胎盤幹細胞は、胎盤組織由来の幹細胞に対応し、そして絨毛間葉系間質細胞、及び絨毛栄養膜細胞を含む。本明細書で使用されるように、用語成体幹細胞adultstemcell、体性幹細胞、及び組織特異的幹細胞は区別なく使用され、そしてそれ自体のような他の細胞を分割して作り出すための能力、及びそれ自体よりもより分化した細胞を分割して作り出すための能力を有する発達した生物に見られる未分化細胞を意味する。好ましくは、成体幹細胞は、多能性幹細胞である。成体幹細胞は、血液、骨髄、脳、嗅上皮、皮膚、膵臓、骨格筋、及び心筋を含むさまざまな成体組織から単離されてきた。これらの幹細胞のそれぞれは、遺伝子発現、因子応答性、及び培地中の形態に基づいて特徴付けることができる。本発明の文脈において、成体幹細胞は、造血幹細胞、乳腺幹細胞、間葉系幹細胞、脂肪由来幹細胞、内皮幹細胞、神経幹細胞、心臓幹細胞、嗅成体幹細胞olfactoryadultstemcell、及び神経堤幹細胞を包含する。造血幹細胞は、骨髄で見られる幹細胞を意味し、そしてそれは血液型を生じさせる。乳腺幹細胞は、乳腺に由来する幹細胞を意味し、そしてそれは、乳腺の内腔及び筋上皮細胞の両方を生じさせる。間葉系幹細胞は、間質起源の幹細胞を意味し、そして特に、脂肪組織、肺、骨髄、及び歯に由来する。脂肪由来幹細胞は、脂肪組織で見られる幹細胞を意味する。内皮幹細胞は、骨髄で見られる幹細胞の第3の種類を意味する。神経幹細胞は、神経系で見られる幹細胞を意味する。心臓幹細胞は、心臓で見られる幹細胞を意味する。嗅成体幹細胞は、鼻の裏に存在する嗅粘膜で見られる幹細胞を意味する。神経堤幹細胞は、毛包、消化管、坐骨神経、心室流出路、並びに脊髄及び交換神経節で見られる幹細胞を意味し、そしてそれは、胚性神経堤の幹細胞のレムナントを表すように見える。神経堤幹細胞は、神経細胞、シュワン細胞、筋線維芽細胞、軟骨細胞、及びメラニン細胞を生じさせる可能性がある。本明細書で使用されるように、ガン幹細胞は、正常細胞に関連する特性、具体的には、特定のガンサンプルで見られるすべての細胞型を生じさせる能力を有するガン細胞を意味する。好ましくは、ガン幹細胞は、はっきりと区別できる集団として腫瘍において存在し、新たな腫瘍を生じさせることにより、再発、耐性及び/又は転移を引き起こす。ガン幹細胞の例は、当業者に周知であり、及び具体的には、白血病性幹細胞、脳ガン幹細胞、乳ガン幹細胞、大腸ガン幹細胞、卵巣ガン幹細胞、膵臓ガン幹細胞、及び前立腺ガン幹細胞を含む。本明細書で使用されるように、用語人工多能性幹細胞又はiPS細胞は、分化した細胞例えば、非多能性細胞、典型的に成体線維芽細胞などの成体体細胞に人工的に由来例えば、完全又は部分的逆転により誘導されるする多能性幹細胞の種類を意味する。本明細書で使用されるように、用語前駆細胞は、分化により生じることができる細胞と比較して、より原始的である例えば、完全に分化した細胞よりも発生経路又は進行に従ってより初期である細胞表現型を有する細胞を意味する。しばしば前駆細胞は、有意又は非常に高い増殖能も有する。前駆細胞は、発生経路及び細胞が成長し及び分化する環境に依拠して、複数のはっきりと区別できる分化した細胞型、又は単一に分化した細胞型を生じさせることができる。好ましくは、本発明の文脈において、前駆細胞は、ヒト胚に直接由来しない。グリピカン本発明の文脈において、用語グリピカンファミリーは、グリコシル‐ホスファチジルイノシトールGPIアンカーにより細胞膜の外表面に結合しているヘパラン硫酸プロテオグリカンのグループを意味する。ヒトゲノムにおいて6つのグリピカンファミリーメンバー:グリピカン1、グリピカン2、腸管タンパク質OCl‐5又はGTR2‐2又はMXR7とも呼ばれるグリピカン3、K‐グリピカンとも呼ばれるグリピカン4、グリピカン5、及びグリピカン6が存在する。グリピカンタンパク質は、555~580の間のアミノ酸長である。それらは特に、Filmusら、2008GenomeBiology9224において記載される。グリピカンファミリーのすべてのメンバーは、N末端分泌シグナルペプチド、GPIアンカーの付着のために必要である推定疎水性C末端シグナル配列、及び膜付着点近くにグリコサミノグリカン鎖の挿入のための2~4のコンセンサス部位を運ぶSong及びFilmusBiochimBiophysActa1573241246。それらはすべて、それらの主要なポリペプチド配列の保存を示す。特に、14個のシステイン残基が保存され、分子内ジスルフィド結合を形成し、すべてのグリピカンが3次元構造を維持すると考えられる。典型的に、ヒトグリピカン1のアミノ酸配列は、スイスプロットナンバーSwissProtNumberP35052の下、引用され;ヒトグリピカン2のアミノ酸配列は、スイスプロットナンバーQ8N158の下、引用され;ヒトグリピカン3のアミノ酸配列は、スイスプロットナンバーP51654の下、引用され;ヒトグリピカン4のアミノ酸配列は、スイスプロットナンバーO75487の下、引用され;ヒトグリピカン5のアミノ酸配列は、スイスプロットナンバーP78333の下、引用され;及びヒトグリピカン6のアミノ酸配列は、スイスプロットナンバーQ9Y625の下、引用される。本発明の文脈において、上記スイスプロットの引用は、2010年5月5日に利用可能であったものである。グリピカンは、異なる胚の構造の形態形成の間に、主に発現するSong及びFilmusBiochemBiophysActa1573241246。それらの細胞内局在のため、それらは、細胞外環境に存在するすべての手がかりcue、特に分泌されたシグナルペプチドに供され、そしてそれは、細胞生理学的プロセスの基礎をなす胚発生、組織の恒常性、及び病態生理学の重要な制御因子である。グリピカンは、これらの指令的なシグナルの必須の細胞膜調節因子として進化してきた。特にそれらは、標的細胞が定義された細胞内及び発生の事象に関して受けることができるように、これらのシグナル伝達の手がかりが、適切な強度で及び適切な時に細胞膜で気づかれることを確保するGalliら、Development13049194929Ficoら、CellMolLifeSciWilliamsら、ProcNatlAcadSci10758695874Capurroら、DevCell1470011Capurroら、CancerRes65624554。これと一致して、グリピカンの機能の変化は、ヒト先天的形成異常及びガンの根底にあるCanoGauciら、JCellBiol14625564Capurroら、CancerRes65624554。グリピカンの主な機能は、Wnts、ヘッジホッグHedgehogsHhs、線維芽細胞成長因子FGFs、骨形成タンパク質BMPs、及び肝細胞増殖因子HGFのシグナル伝達を調節するTopczewskiら、DevelopmentalCell1251264Songら、JBiolChem28021162125Yan及びLinDevelopmentalBiology312203216Ohkawaraら、Development13021292138WilliamsonCancerRes675765。生物学的な文脈に依拠して、グリピカンは、シグナル伝達活性を促すことができるか、又は阻害することができるかのいずれかである。好ましくは、本発明の文脈において、グリピカンファミリーのメンバーは、グリピカン4である。グリピカン4は、発生している前脳、すなわち前腸内胚葉細胞anteriorvisceralendodermcell及び前方神経隆起細胞anteriorneuralridgecellの誘導及びパターン形成のために重要である2つのシグナル伝達中心によりマウス胚において発現する最も重要なグリピカン遺伝子である。前方神経隆起に隣接する前方神経外胚葉細胞anteriorneuroectodermalcellにおけるグリピカン4の発現は、グリピカン4が、細胞を誘導し及び応答することの両方におけるシグナル伝達を調節するかもしれないことを示唆しているLuxardiら、BiochemBiophysResComm3525560。マウス胚における頭屈head‐fold期の間、グリピカン4は、推定前脳領域で主に発現する。続いて、その発現は、発生している前脳の神経前駆に存在するHagiharaら、DevelopmentalDynamics219353367。一般的に、グリピカン4のアミノ酸配列は、配列番号1に示される。好ましくは、本発明によれば、グリピカンファミリーのメンバーは、配列番号1と少なくとも80の同一性がある配列を含むか、又は配列番号1と少なくとも80の同一性がある配列からなるタンパク質であり、より好ましくは、配列番号1と少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、又は少なくとも99の同一性がある配列を含むか、又は配列番号1と少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、又は少なくとも99の同一性がある配列からなるタンパク質である。本明細書で意図したように、第二アミノ酸配列と少なくともxの同一性がある第一アミノ酸配列は、第二ペプチド配列の全長に関して、2つの配列が最適に整列された対である場合、xが、第二配列のそれらのペアのアミノ酸と同一である第一配列のアミノ酸の数を示すことを意味する。本明細書で意図したように、2つの配列は、xが最大である場合、最適に整列された対であるといわれる。アライメントは、手動又は自動で行うことができる。ペプチド配列の自動化された整列のためのアルゴリズムは、当業者に周知であり、そして例えば、Altschulら、NucleicAcidsRes253389に記載され、ブラストBlastソフトフェアなどのソフトウェアにより実装される。ニードルneedleプログラム、そしてそれは、2つの配列の全長を検討する場合、Needleman‐WunschグローバルアライメントアルゴリズムNeedleman及びWunschJMolBiol48443453を使用してそれらの最適なアライメントギャップを含むを見つけるが、例えば本発明に従って同一性のパーセンテージを計算するために使用されてもよい。ニードルプログラムは、例えば、ebiacukワールドワイドウェブサイト上で入手できる。本発明に従った同一性のパーセンテージは、好ましくは、10.0と同等のギャップオープンGapOpenパラメーター、0.5と同等のギャップエクステンドGapExtendパラメーター、及びBlosum62マトリックスを有するEMBOSS::ニードルグローバルプログラムを使用して計算する。上で定義された配列と少なくとも80同一である前記アミノ酸配列は、例えば少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠損、又は置換により、及び/又は化学処理により、変異により天然のペプチド配列から得てもよい。本発明によれば、グリピカンファミリーの数は、また配列番号1の配列の断片からなってもよい。本明細書で使用されるように、引用配列の用語断片fragmentは、引用配列の1つに劣る長さを有する配列を意味する。本発明の文脈において、断片は、例えば、10~550の間のアミノ酸、より好ましくは、50~450の間のアミノ酸、100~350の間のアミノ酸、又は150~250の間のアミノ酸を含む長さを有してもよい。本発明によれば、断片は特に、グリピカンファミリーのメンバーの断片でもよく、及び好ましくはグリコサミノグリカンGAG付着部位を欠いているグリピカンコアタンパク質か、又はグリコシルホスファチジルイノシトールGPIアンカーを欠いているグリピカンタンパク質のN末端ドメインのいずれかを含んでもよい。これらの機能性ドメインは、例えば、Williamsら、ProcNatlAcadSciUSA10758695874、及びZittermanら、IntJCancer12612911301に記載されている。グリピカンファミリーのメンバーの発現及び/又は活性が弱められ又は消失させられた幹細胞又は前駆細胞本発明の第一態様は、上で定義されたような幹細胞又は前駆細胞の使用に関し、ここでグリピカンファミリーのメンバーの発現及び/又は活性は、弱められ又は消失させられている。本明細書で使用されるように、用語発現は、RNA及びタンパク質の生産、必要に応じて、タンパク質の分泌、該当する場合は、これらに限定されないが、例えば、転写、翻訳、折りたたみ、修飾、及びプロセシングを含む細胞プロセスを意味する。本明細書で使用されるように、用語グリピカンファミリーのメンバーの活性は、グリピカンファミリーのメンバーにより介在される任意の生物活性を含む。例えば、グリピカンは、Wnts、ヘッジホッグ、線維芽細胞成長因子FGFs、骨形成タンパク質BMPs、及び肝細胞増殖因子HGFのシグナル伝達を調節する。グリピカンファミリーのメンバーの活性を評価するための手法は、当業者に周知であり、そして例えば、Williamsら、ProcNatlAcadSciUSA10758695874、及びYanら、DevelopmentalCell17471484に記載されている。それらは、特に、Wnt又はFGFsなどのグリピカンリガンドにより引き起こされるシグナル伝達経路の活性化のアッセイを含む。特に、グリピカン4の活性は、ESCにおけるWnt経路の活性化をアッセイすることにより、又は神経外胚葉細胞におけるFGF経路の活性化をアッセイすることにより評価してもよい。用語減少するdecrease、弱めるreduce、消失するabolish、又は阻害するinhibitは、本明細書で一般的に、統計的に有意な量の減少を意味する。しかしながら、誤解を避けるために、弱めるreduce又は減少するdecrease又は阻害するinhibitは、参照レベルと比較して少なくとも10の減少、少なくとも20の減少、又は少なくとも30の減少、又は少なくとも40の減少、又は少なくとも50の減少、又は少なくとも60の減少、又は少なくとも70の減少、又は少なくとも80の減少、又は少なくとも90の減少、又は100までの減少例えば、参照サンプルと比較して消失レベル、又は参照レベルと比較して10~100の間の任意の減少を意味する。好ましくは、消失abolishは、少なくとも約90の減少、又は100までの減少例えば、参照サンプルと比較して消失レベルを意味する。用語統計的に有意又は有意は、統計学的有意性を意味し、及び分子濃度の正常未満、又はより低い2標準偏差2SDを一般的に意味する。当該用語は、差がある統計的証拠を意味する。帰無仮説が実際正しい場合、帰無仮説を棄却する決定の確率として定義される。決定は、しばしばP値を使用してなされる。本発明は、細胞分化を引き起こす環境条件に供される場合、幹細胞又は前駆細胞におけるグリピカンファミリーのメンバーの発現及び/又は活性の減少又は消失が、これらの細胞の初期分化の誘導を可能にすることを示してきた。従って、幹細胞又は前駆細胞は、ここで本発明によれば、グリピカンファミリーのメンバーの発現及び/又は活性が弱められ又は消失させられており、細胞分化を引き起こす環境条件に供される場合、初期分化を示す幹細胞又は前駆細胞である。本発明の目的は、従ってまた、幹細胞又は前駆細胞におけるグリピカンファミリーのメンバーの発現及び/又は活性を弱めること又は消失することを含む、細胞分化を引き起こす環境条件に供される場合、初期分化を示す幹細胞又は前駆細胞を生産するためのインビトロ方法であり;それによって、細胞分化を引き起こす環境条件に供される場合、初期分化を示す幹細胞又は前駆細胞を取得する。本発明の文脈において、用語分化differentiation又は細胞分化celldifferentiationは、それによって細胞が、発生経路のさらに下流に移動し、そしてより特定化され、及び最終分化した細胞にさらに近づいた細胞に関連することが知られているマーカー及び表現型の特徴を発現し始めるプロセスを意味する。分化は、それによって細胞がより特定化された表現型を取る、例えば、他の細胞型とはっきりと区別できる1つ以上の特徴又は機能を獲得する発生上のプロセスである。本明細書で使用されるように、初期分化を示す細胞cellsdisplayinganearlydifferentiationという表現は、細胞分化を引き起こす同様の環境条件に供された場合、野生型又は非前処理幹細胞又は前駆細胞よりも、より特定化された細胞に、より素早く分化する幹細胞又は前駆細胞を意味する。典型的に、本発明によれば、初期分化を示す細胞は、細胞分化を引き起こす同様の環境条件に供される場合、野生型又は非前処理細胞よりも1~5日早く、特に2~4日早く、好ましくは3日早くそれらの分化の次のステップに到達する。本明細書で使用されるように、細胞分化を引き起こす環境条件environmentalconditionstriggeringcelldifferentiationという表現は、幹細胞又は前駆細胞が、より特定化された細胞への前記細胞の分化を引き起こすために培養される培養条件を意味する。細胞分化を引き起こす環境条件は特に、細胞が培養される培地の特性、適切な細胞フィーダー層の存在又は不存在、温度条件、湿度、大気のCO2含有量、又は転写因子を発現している細胞の形質移入を包含する。当業者に周知なように、細胞分化を引き起こす環境条件は、培養される細胞型、及び生産される特定化された細胞型に依拠する。特に、特定の系列に向かう分化は、内因性の転写因子を活性化することにより、形質移入因子を偏在的に発現している細胞を形質移入することにより、選択された成長因子に細胞を供することにより、又は系列誘導できる細胞型で細胞を共培養することにより実現されてもよい。幹細胞又は前駆細胞はまた、成長因子及び/又はそれらのアンタゴニストの組み合わせにより目的の系列に分化させてもよい。特定の組織型の分化した細胞を得るために、幹細胞又は前駆細胞の細胞培養物中に添加してもよい主要な誘導因子は、例えば、TrousonEndocrineRev27208219において要約される。好ましくは、本発明によれば、細胞分化を引き起こす環境条件は、神経又は心臓分化を引き起こす環境条件である。神経分化を引き起こす環境条件は、例えば、Ficoら、StemCellsandDevelopment17573584、Yingら、NatBiotechnol21183186、及びVierbuchenら、Nature46310351041に記載されている。典型的に、神経分化は、以下のプロトコールを使用して引き起こされてもよい。0日目で、ESCは、単一細胞懸濁液中で分離されてもよく、及び1000細胞/cm2が、ゼラチンコートプレート上に播種されてもよい。培地は、好ましくは、分化プロセスの間、毎日交換する。神経分化のための培地血清不含ノックアウト血清代替物KnockoutSerumReplacementKSR添加培地は、15のKSRInvitrogen、2mMのグルタミン、100U/mlのペニシリン/ストレプトマイシン、及び0.1mMのβ‐メルカプトエタノールを添加したノックアウトダルベッコDulbecco最小必須培地を典型的に含んでもよい。心臓分化を引き起こす環境条件は、例えば、Maltsevら、MechDev444150に記載されている。典型的に心臓分化は、以下のプロトコールを使用することにより引き起こされてもよい。胚体EBは、5mlのPBSを含む10cmの細菌用皿の蓋の上に懸滴300細胞/30μlドロップでESCから調製してもよい。EBを含む懸滴は、2日間、5のCO2を含む大気中、37°Cでインキュベートしてもよい。懸滴は、その後、20FCSを含むDMEM培地で洗浄し、新しい皿に再度播種し、そしてさらに3日間37°Cでインキュベートして5日齢のEBを産生する。5日目に、EBは、鼓動している心筋細胞の形態分析のためにゼラチンコート24ウェルプレート上に別々に播種してもよく、RT‐PCR及びウェスタンブロットのために100mmの組織培養プレート上に播種してもよい。幹細胞又は前駆細胞においてグリピカンファミリーのメンバーの発現及び/又は活性を弱め又は消失させるための手法は、当業者に周知であり、そして例えば、核酸分子阻害剤の使用、及びグリピカンファミリーのメンバーのアンタゴニストと幹細胞又は前駆細胞とを接触することを含む。ピリグリカンファミリーのメンバーのアンタゴニストは、特に可溶性グリピカン3例えば、Zittermanら、IntJCancer1261291301に記載されている、グリピカン4抗体例えば、Geraldesら、InvestOphthalmolVisSci4857505755に記載されている、グリピカン3抗体例えば、Ishiguroら、CancerRes6898329838に記載されている、及びグリピカン5抗体が挙げられる。適切な核酸分子阻害剤は、低分子干渉RNAsiRNA、短ヘアピンRNAshRNA、及びマイクロRNAなどのアンチセンスRNA又はRNAiを含む。遺伝子のインビボでの翻訳を阻害するためのアンチセンス方法の使用は、当該技術分野において周知である例えば、米国特許第7,425,544号;米国特許第7,307,069号;米国特許第7,288,530号;米国特許第7,1791796号。アンチセンス核酸は、RNA分子例えば、mRNA分子などの特定の核酸分子の少なくとも一部と相補的であり、又はハイブリダイズする核酸分子例えば、DNAヌクレオチド、RNAヌクレオチド、若しくは修飾例えば、2’‐O‐アルキル例えば、メチル置換分子などの分子の安定性を増加する修飾、又はそれらの組み合わせを含む分子であるWeintraubScientificAm2624046。アンチセンス核酸は、mRNAsなどの一致する核酸とハイブリダイズして2本鎖分子を形成し、そしてそれは、細胞が2本鎖mRNAを翻訳しないので、mRNAの翻訳を干渉する。本発明で使用されるアンチセンス核酸は、例えば、少なくとも15、20、25、50、75、又は100ヌクレオチド長、典型的に少なくとも10~12ヌクレオチド長である。アンチセンス核酸はまた、抑制性二本鎖を形成することを意図される標的核酸と同じ長さであってもよい。アンチセンス分子は、グリピカンファミリーのメンバー、特にグリピカン4を対象にするアンチセンス分子は、当該技術分野において公知であり、本発明における使用のために特に適切である。そのようなアンチセンス分子は、例えば、Hauptら、JCellPhysiol220780791TaylorPLoSPathog5e1000666、及びUmezuCancerSci101143148に記載されている。アンチセンス核酸は、例えば遺伝子治療法を使用して、アンチセンスオリゴヌクレオチドとして細胞内に導入でき、又はアンチセンス核酸をコードする核酸が導入される細胞において生産できる。siRNAは、両端に短い2~3のヌクレオチドの3’オーバーハングを有する約20~25のヌクレオチド長の2本鎖合成RNA分子である。2本鎖siRNA分子は、標的mRNA分子のセンス及びアンチセンス鎖の一部分、この場合、グリピカンファミリーのメンバー、特にグリピカン4のmRNAの一部分を示す。siRNA分子は、典型的に開始コドンから約50~100ヌクレオチド下流のmRNA標的の領域を標的にするように設計される。細胞への導入において、siRNA複合体は、内因性のRNA干渉RNAi経路を引き起こし、標的mRNAの切断及び分解を生じる。さらに、安定性、特異性、及び有効性を高めるために、siRNA分子の一方又は両方の鎖内に、修飾ヌクレオチド又はモチーフの取り込みなどのsiRNA組成物のさまざまな改良が記載され、そして本発明の本態様に従った使用にために適切である国際公開第2004/015107号;国際公開第2003/070918号;国際公開第1998/39352号;米国特許出願公開第2002/0068708号;米国特許出願公開第2002/0147332号;米国特許出願公開第2008/0119427号を参照。短又は小ヘアピンRNA分子は、機能的にsiRNAと類似しているが、タイトなヘアピンカーブを作るより長いRNA配列を含む。siRNAのように、それらは、細胞のRNA干渉経路を通じて遺伝子発現を静める。shRNAは、細胞機構によりsiRNAに切断される。本発明の方法に従って使用できるグリピカン4の発現を阻害する適切なshRNA分子は、限定されないが、以下の配列のSigmaにより商品化されたshRNA分子を含む。RNAi分子を設計する場合に考慮すべき検討事項は、例えば、標的とされる配列、RNA標的の二次構造、及びRNA結合タンパク質の結合を含む。siRANを最適化するための方法は、当業者に明らかであろう。典型的な方法が、例えば、Vickerら、JBiolChem27871087118、及びYangら、ProcNatlAcadSciUSA9999429947に記載されている。核酸阻害剤例えば、siRNAsを作製するための方法は、通常の方法であり、そして当業者に明らかであろう。インビトロ方法は、例えば、無細胞系におけるグリピカン4配列のプロセシング例えば、RNAseIII又はダイサーDicerで長い2本鎖RNAsを消化すること、インビトロにおける組み換え2本鎖グリピカン4DNAの転写、及びグリピカン4配列に対するヌクレオチド配列ホモログの化学合成を含む例えば、Tuschlら、GenesDev1331913197を参照。インビボ方法は、例えば1基質がインビボでsiRNAに変換されるように細胞内へのDNAベクターの形質移入例えば、Kawasakiら、NucleicAcidsRes31700707を参照、2RNAポリメラーゼIIIプロモーターを使用するプラスミド系からの短ヘアピンRNAsの発現例えば、Kawasakiら、NucleicAcidsRes31700707を参照、及び/又は3タンデムプロモーターからの短RNAの発現例えば、Miyagishiら、NatureBiotechnol20497500を参照が挙げられる。一般的に、培養物において細胞でのグリピカン4の発現を阻害するために、1つ以上のsiRNAが、培地中の細胞に添加でき、典型的に約50~200μg、好ましくは約50μgのsiRNA/mlの最終濃度である。形質移入、エレクトロポレーション、又は当該技術分野における公知の他の技術を含む、任意のさまざまな従来の方法が、細胞内にsiRNAを導入するために使用できる例えば、HannonNature418244251を参照。Schiffelersら、NucleicAcidRes32e149などにより記載されているようなナノ粒子方法、及びSongら、NatureBiotechnol23709717などにより記載されているような融合タンパク質方法が、また有用である。PROMEGA登録商標Madison,WI又はAMBION登録商標Austin,TXからのsiRNA分子合成キットなどの市販のキットが、siRNA分子を合成するために使用されてもよい。他の例において、QIAGEN登録商標社Germantown,MD、INVITROGEN登録商標Carlsbad,CA、AMBION登録商標Austin,TX、DHARMACON登録商標Lafayette,CO、SIGMA‐ALDRICH登録商標SaintLouis,MO、又はOPENBIOSYSTEMS登録商標Huntsville,ALからなどの商業用供給源から取得する。本明細書で使用されるように、グリピカンファミリーのメンバーのアンタゴニストという表現は、グリピカンファミリーのメンバーの活性化により仲介されるシグナルの誘導を阻害する、好ましくはグリピカンファミリーのメンバーに結合することにより阻害する天然又は合成化合物を意味する。グリピカンファミリーのメンバーのアンタゴニストは、化合物、特に、グリピカンファミリーのメンバーに結合する炭水化物、又はグリピカンファミリーのメンバーに特異的な抗体、好ましくはグリピカンファミリーのメンバーに特異的な中和若しくは遮断抗体でもよい。グリピカンファミリーのメンバーに特異的な、特にグリピカン4に特異的な中和又は遮断抗体は、例えば、FordPerrissら、DevelopmentalDynamics227170184に記載されている。本明細書で使用されるように、用語抗体は、免疫グロブリン分子、及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち抗原と免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子を意味する。そのように、抗体という用語は、抗体分子全体だけでなく、抗体断片と抗体及び抗体断片の変異体誘導体を含む、並びに非従来型抗体も包含する。用語抗体は、本明細書で使用されるように、モノクローナル及びポリクローナル抗体の両方を含み、そして例えば、抗原により免疫された動物により生産されたインビボで作られた抗体、及び例えば、ハイブリドーマにより産生されたインビトロで作られた抗体を包含する。本発明によれば、抗体は、哺乳類由来の抗体、特にマウス、ラット、ウサギ、ラクダ、又はヒト由来の抗体でもよい。本発明によれば、抗体はまた、サメ由来の抗体でもよい。好ましくは、本発明によれば、抗体は、モノクローナル抗体である。用語モノクローナル抗体は、単一のアミノ酸組成の抗体を意味し、特異的な抗原に対して向けられており、そしてB細胞又はハイブリドーマの単一クローンにより生産される。目的の免疫原で特異的に反応するポリクローナル及びモノクローナル抗体を生産するための方法は、当業者公知の方法である例えば、Harlow及びLaneAntibodiesALaboratoryManualColdSpringHarborPressNYStitesら、BasicandClinicalImmunologyLangeMedicalPublicationLosAltosCA、及びKohlerandMilsteinNature256495497を参照。望む特異性を有する本発明従った抗体を含む抗血清を生産するために、目的のグリピカンファミリーのメンバーが、マウス、ウサギ、又は霊長類などの適切な動物を免疫するために使用できる。フロイントアジュバントなどの標準的なアジュバントは、標準的な免疫付与プロトコールに従って使用することができる。免疫原調製物に対する動物の免疫反応は、試験採血し、そして目的の抗原に対する反応性の力価を決定することによりモニターしてもよい。さらに、抗原に対して特異的に反応する抗体を濃縮するための抗血清の分画、及び抗体の精製が、当業者に周知の方法を使用して、続いて達成することができる。モノクローナル抗体は、当業者によく知られているさまざまな手法を使用して得られてもよい。典型的に、望む抗体で免疫した動物由来の脾臓細胞が、通常、骨髄腫細胞と融合することにより不死化されるKohler及びMilsteinEurJImmunol6511519。不死化の代替的な方法は、例えば、エプスタインバーウィルス、ガン遺伝子、若しくはレトロウィルスでの形質転換、又は当該技術分野において周知の他の方法を含む。単一の不死化細胞から生じるコロニーは、抗原に対する望む特異性及び親和性の抗体の生産のためにスクリーニングされ、そしてそのような細胞から生産されたモノクローナル抗体の収率は、脊椎動物宿主の腹腔内への注射を含む、さまざまな手法により高められてもよい。さらに、モノクローナル抗体は、Huseら、Science24612751281により概説される一般的なプロトコールに従ってヒトB細胞cDNAライブラリーをスクリーニングすることにより、望む特異性を有する抗体又はそのような抗体の結合断片をコードする核酸配列の同定によって組み換え的に生産されてもよい。モノクローナル抗体はまた、組み換えDNA方法例えば、米国特許第4,816,567号を参照を使用して生産されてもよく、又はファージディスプレイにより生産されてもよい。用語ファージディスプレイは、本明細書では、バクテリオファージカプシド上に発現され、及びカプシドをコードする遺伝子中に挿入される核酸配列によりコードされるリガンドを選択するための方法を意味する。本方法は、当業者に周知であり、そして特に、Scott及びSmithScience249386390、及びMarksら、JMolBiol222581597により記載されている。用語抗体断片は、これらに限定されないが、Fv、Fab、Fab’2、Fab’、Fd、dAb、dsFv、scFv、scFV2、CDR、抗体断片から形成されるナノボディ、ダイアボディ、多重特異的抗体multi‐specificantibody、及び完全な抗体の可変領域の少なくとも一部を保持する他の抗体断片が挙げられる。抗体断片は、ペプシン、パパイン、又はトリプシンなどでの、完全な抗体の酵素的又は化学的切断により生産されてもよい。あるいは、それらは、米国特許第513,957号、693,249号、789,619号、776,391号、799,770号、799,772号、及び809,083号などにおいて記載されるような組み換えDNA手法を使用して調製でき、ここで、抗体断片は、公知の組み換え手法を使用して免疫された動物由来の抗体産生B細胞のRNAから生産される。用語Fabは、約50000Daの分子量及び抗原結合活性を有する抗体一価断片antibodymonovalentfragmentを意味し、そして軽鎖可変ドメインVL、重鎖可変ドメインVH、軽鎖定常ドメインCL、及び第一重鎖定常ドメインCH1からなる。Fv断片は、Fab断片のN末端部分であり、そして1つの軽鎖及び1つの重鎖の可変部分からなる。用語Fab’2は、約100000Daの分子量、及び抗原結合活性を有する抗体二価断片antibodybivalentfragmentを意味し、そしてそれは、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により結合される2つのFab断片を含む。用語Fabは、約50000Daの分子量、及び抗原結合活性を有する抗体断片を意味し、そしてそれは、Fab’2断片のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することにより得られる。用語Fdは、VH及びCH1ドメインからなる抗体断片を意味する。用語dAbWardら、Nature341544546は、単一の可変ドメイン抗体、すなわちVH又はVLドメインからなる抗体断片を意味する。一本鎖FvscFvポリペプチドは、ペプチドコード化リンカーにより結合されるVH及びVLをコードする遺伝子を含む遺伝子融合から通常発現されるVH::VLヘテロダイマーと共有結合する。dsFvは、ジスルフィド結合により安定化されたVH::VLヘテロダイマーである。二価及び多価抗体断片は、一価scFvsの結合により自然発生的に形成されるか、又は二価scFv2などのペプチドリンカーにより一価scFvを結合することにより産生できる。用語ダイアボディは、2つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を意味し、そしてその断片は、同じポリペプチド鎖VH‐VLにおいてVLドメインと連結するVHドメインを含む。同じ鎖上の2つのドメインの間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーを使用することにより、ドメインを、他の鎖の相補性ドメインと強制的に対形成して、そして2つの抗原結合部位を作る。非従来型抗体は、これらに限定されないが、ナノボディ、線状抗体linearantibodyZapataら、ProteinEng810571062、単一ドメイン抗体、一本鎖抗体、アフィボディaffibody、オリゴボディoligobody、アビマーavimer、ミニボディ、並びに多価例えば、ダイアボディ、トリボディ、テトラボディ、及びペンタボディを有する抗体が挙げられる。ナノボディは、軽鎖の不存在下で十分に機能的であるために発展してきた天然の重鎖抗体の最小断片である。ナノボディは、一本鎖Fv断片のたった半分のサイズであるが、従来の抗体の親和性及び特異性を有する。それらの極度の安定性とヒト抗体フレームワークとの高度のホモロジーの組み合わせの、この特有の構造の結果は、ナノボディが、従来の抗体がアクセスできなかった治療標的と結合できることである。多重scFv例えば、ダイアボディ、テトラボディなどの多価を有する組み換え抗体断片は、60~100kDaのサイズの小さな分子が、より早い血液クリアランス及び素早い組織取り込みを提供するので、親抗体について改良を提供するPowerら、MethodsMolBiol207335350、及びWuら、TumorTargeting44758を参照。非従来型抗体を作製するためのさまざまな手法が、記載されている。ロイシンジッパーを使用して生産される二重特異性抗体が、Kostelnyら、JImmunol14815471553で記載されている。ダイアボディ技術が、Hollingerら、ProcNatlAcadSciUSA9064446448で記載されている。一本鎖Fvダイマーの使用により二重特異性抗体断片を作製するための他の方法が、Gruberら、JImmunol1525368で記載されている。三重特異性抗体が、Tuttら、JImmunol14760で記載されている。アフィボディAffibodyは、スタフィロコッカスアウレウスStaphylococcusaureus菌由来の表面タンパク質、プロテインAのIgG結合ドメインの一つの足場に基づく3へリックスバンドルからなる、6kDaの分子量を有する小さな単純タンパク質である。この足場は、親和性リガンドとして素晴らしい特性を有し、そして任意の所定の標的タンパク質と高い親和性で結合するように設計できる。ドメインは58のアミノ酸からなり、13のアミノ酸がランダム化されて、多くのリガンド変異体を有するアフィボディ登録商標ライブラリーを産生する。従って、ライブラリーは、同一のフレームワーク及び可変表面結合特性を有する多数のタンパク質リガンドからなる。アビマーavimerは、インビトロエキソンシャッフリング及びファージディスプレイを使用して改変された多重結合タンパク質又はペプチドである。複数の結合ドメインが結合され、単一エピトープ免疫グロブリンドメインと比較してより大きな親和性及び特異性を生じる。ミニ抗体mini‐antibody又はミニボディは、ヒンジ領域によりscFvから分離された、それらのC末端でオリゴマー化ドメインを含むscFvポリペプチド鎖であるPackら、Biochem3115791584。オリゴマー化ドメインは、自己会合self‐associatingα‐へリックス、例えば、ロイシンジッパーを含み、そしてそれは、追加のジスルフィド結合によりさらに安定化できる。オリゴマー化ドメインは、ポリペプチドの機能的結合タンパク質へのインビボでのフォールディングを促進すると考えられるプロセスである、膜を横断する一方向性フォールディングvectorialfoldingと適合性であるように設計される。ミニボディは、当業者に周知の組み換え方法を使用して生産してもよい例えば、Packら、Biochem3115791584、及びCumberら、JImmunology149B120126を参照。オリゴボディは、合成抗体である。これらの試薬の特異性は、ウェスタンブロット分析及び免疫組織化学により明らかにされている。それらはいくつかの望む特性、すなわち、それらの生産が免疫系から独立しているので、それらは数日で調製でき、そして精製された標的タンパク質の必要性がないという特性を有するRadrizzaniら、Medicine597538。オリゴボディは、当該技術分野において周知の組み換え方法を使用して生産されるRadrizzaniら、Medicina60Suppl25560。Fab断片は、プロテアーゼ、パパインで本発明に従ってモノクローナル抗体を処理することにより得ることができる。またそのようなFab断片は、原核生物の発現系又は真核生物の発現系に関してベクター内に上記抗体のFabをコードするDNAを挿入し、そして原核生物又は真核生物内にベクターを導入して必要に応じてFab断片を発現することにより生産できる。Fab’2断片は、プロテアーゼ、ペプシンで本発明に従ってモノクローナル抗体を処理することにより得ることができる。また、そのようなFab’2断片は、チオエーテル結合又はジスルフィド結合を介して、下記のようにFab’断片を結合することにより生産できる。Fab’断片は、還元剤、ジチオトレイトール、及び任意によりスルフヒドリル基に対する保護基で、上で定義したようにFab’2断片を処理することにより、ジスルフィド結合の切断が生じ、得ることができる。また、そのようなFab’断片は、原核生物に関する発現ベクター、又は真核生物に関する発現ベクター内に本発明に従ったモノクローナル抗体のFab’断片をコードするDNAを挿入し、そして原核生物又は真核生物内にベクターを導入して必要に応じてその発現を行うことにより生産できる。これらの方法は、例えば、Goldenberg、米国特許第4,036,945号、及び4,331,647号、Nisonoffら、ArchBiochemBiophys89230PorterBiochemJ73119及びEdelmanら、InMethodinEnzymologyVol1p422AcademicPressで記載されている。一価の軽‐重lightheavy鎖断片を形成するための重鎖の分離、さらに断片の切断、又は他の酵素的、化学的、若しくは遺伝子的手法などの抗体を切断する他の方法が、上で定義されたようにグリピカンファミリーのメンバーに結合する断片であるかぎり、また使用されてもよい。scFvは、オリゴヌクレオチドによりつながれるVH及びVLドメインをコードするDNA配列を含む構造遺伝子を構築することにより調製できる。構造遺伝子を、次に、原核生物に対する発現ベクター又は真核生物に対する発現ベクター内に挿入し、そしてそれを、続いて原核又は真核宿主細胞内に導入して必要に応じてscFv断片を発現する。組み換え宿主細胞は、その後、2つのVドメインを結合するリンカーペプチドを有する単一のポリペプチド鎖を合成する。scFvを生産するためのそのような方法は、例えば、Whitlowら、MethodsACompaniontoMethodsinEnzymology297Birdら、Science242423426Ladnerら、米国特許第4,946,778Packら、Biotechnology1112711277、及びSandhuCritRevBiotech12437で記載されている。ヒト化scFv断片を生産するために、相補性決定領域CDRグラフティングと呼ばれる周知の手法が使用されてもよく、そしてそれは、ドナーscFv断片からCDRを選択すること、及び例えば、国際公開第98/45322号;国際公開87/02671号;米国特許第5,859,205号;米国特許第5,585,089号;米国特許第4,816,567号;及び欧州特許第0173494号に記載されているように公知の三次元構造のヒトscFv断片フレームワークにそれらを移植することを含む。抗体断片の他の形態は、単一のCDRをコードするペプチドである。CDRペプチドは、本発明に従ったモノクローナル抗体のCDRをコードする遺伝子を構築することにより得ることができる。そのような遺伝子は、例えば、Larrickら、MethodsACompaniontoMethodsinEnzymology2106で記載されているように、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を使用することにより、抗体産生細胞のRNAから可変領域を合成して、調製してもよい。具体的な実施態様において、本発明に従った抗体は、キメラ抗体である。キメラ抗体は、少なくとも2つの異なる起源由来の構成要素で構成される抗体を意味する。特定の実施態様において、キメラ抗体は、他の分子、例えば、第二の種由来の抗体の一部と融合した第一の種由来の抗体の一部を含む。そのような特定の実施態様において、キメラ抗体は、ヒト由来の抗体の一部と融合した非ヒト動物由来の抗体の一部を含む。そのような特定の実施態様において、キメラ抗体は、ヒト由来の抗体の定常領域と融合した非ヒト動物由来の抗体の可変領域の全部又は一部を含む。特に、本発明に従った抗体は、ヒト化抗体であってもよい。ヒト化抗体は、ヒト抗体とより厳密に一致アミノ酸配列でするように改変した非ヒト抗体を意味する。特定の実施態様において、非ヒト抗体の可変領域の抗原結合残基の外側のアミノ酸残基が改変される。ほとんどの部分について、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域由来の残基が、望む特異性、親和性、及び結合能力を有するマウス、ラット、ウサギ、又は非ヒト霊長類などの非ヒト種ドナー抗体の超可変領域由来の残基により置換されるヒト免疫グロブリンレシピエント抗体である。特定の実施態様では、ヒト化抗体は、ヒト抗体のCDRの全部又は一部と、望む抗原結合特異性を有する非ヒト抗体などの他の抗体由来のCDRの全部又は一部とを置換することにより構築される。特定の実施態様において、ヒト化抗体は、CDRの全部又は実質的に全部が、非ヒト抗体のCDRに対応し、及びフレームワーク領域FRの全部又は実質的に全部が、ヒト抗体のFRに対応する可変領域を含む。そのような特定の実施態様において、ヒト化抗体はさらに、ヒト抗体の定常領域Fcを含む。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体中、又はドナー抗体中において見られない残基を含んでもよい。用語ヒト抗体は、ヒト抗体配列を含み、及び非ヒト動物由来の抗体配列を含まないモノクローナル抗体を意味する。特定の実施態様において、ヒト抗体は、天然の抗体において見られない合成配列を含んでもよい。当該用語は、抗体が作られる方法によって限定されない。例えば、さまざまな実施態様において、ヒト抗体は、トランスジェニックマウスにおいて、ファージディスプレイにより、ヒトBリンパ球により、又は組み換え方法より作られてもよい。好ましくは、本発明に従ったグリピカンファミリーのメンバーの具体的な抗体は、グリピカンファミリーのメンバーの特異的な中和又は遮断抗体である。本明細書で使用されるように、用語中和抗体又は遮断抗体は、抗体が特異的に結合するエピトープを含む抗原の生物活性を遮断し、又は中和することができる抗体を意味する。使用される中和抗体の量に従って、抗原によって産生される残存生物活性が残るかもしれない。中和抗体は、インビトロ及び/又はインビボにおいて生物活性を遮断又は弱めることができる。本発明の文脈において、グリピカンファミリーのメンバーの特異的な中和抗体は、前記グリピカンファミリーのメンバーと結合し、それによって前記グリピカンファミリーのメンバーにより仲介されるシグナル伝達を阻止及び/又は阻害する抗体を意味する。グリピカンファミリーのメンバー、特に、グリピカン4の特異的な中和又は遮断抗体は、例えば、FordPerrissら、DevelopmentalDynamics227170184に記載されている。グリピカンアンタゴニストを同定するための手法は、当業者に周知であり、そして典型的に、グリピカンタンパク質を発現する細胞において早期に神経及び心臓分化を誘導する候補化合物の能力をアッセイすることを含む。典型的に、グリピカン4の発現は、以下のプロトコールを使用することにより弱め又は消失させてもよい。10cmの組織培養プレートおいて、細胞を、10mlの完全培地中に約105細胞で播種してもよい。細胞をCO2インキュベーターにおいて37°Cで、好ましくは24時間、それらが70~80コンフェルトに達するまで、インキュベートしてもよい。細胞を、その後、標準方法を使用して、リポフェクタミンを用いて、形質移入してもよい。それぞれの形質移入に関して、2μgのshRNAを、レポーター遺伝子例えば、GFPを含む500ngのDNAと組み合わせてもよい。レポーター遺伝子の発現は、典型的に、細胞形質移入の効率を検査することを可能にする。形質移入混合物を取り除いた後、通常生育培地を、交換してもよく、そして細胞をグリピカン4の発現分析例えば、半定量的RT‐PCR又は定量的RT‐PCRをする前に、さらに24~48時間培養してもよい。好ましくは、上記方法により生産された幹細胞又は前駆細胞の自己複製は、幹細胞又は前駆細胞が、上で定義されたような細胞分化を引き起こす環境条件に供されないかぎり、維持される。特に、本発明に従って生産された幹細胞又は前駆細胞は、それらが、上で定義されたような細胞分化を引き起こす環境条件に供されない場合、長期培養において自然に分化しない。本発明の他の目的はまた、上で定義されたようなインビトロ方法により取得できる又は取得される幹細胞又は前駆細胞に関する。上で定義されたようなインビトロ方法により取得できる又は取得される幹細胞又は前駆細胞はまた、分化した細胞を生産するために使用されてもよい。本発明は従ってまた、以下のステップ:a上で定義された方法により細胞分化を引き起こす環境条件に供された場合、初期分化を示す幹細胞又は前駆細胞を生産し;及びb上で定義されたような細胞分化を引き起こす環境条件に、ステップaで生産された幹細胞又は前駆細胞を供することを含み、それによって分化した細胞が生産される、幹細胞又は前駆細胞から分化した細胞を生産するためのインビトロ方法に関する。人工多能性幹細胞を生産するための方法本発明者等は、早期の及び/又は増進した分化を引き起こす幹細胞におけるグリピカン4の機能の喪失を証明したので、それらは、体細胞におけるグリピカン4活性の調節が、これらの細胞の脱分化を誘導でき、そして従って人工多能性幹細胞を生産することを可能にすることを予測した。本発明は、従ってまた、体細胞におけるグリピカンファミリーのメンバーの発現及び/又は活性を、一過性に増加又は誘導し、次に一過性に減少又は弱め、それによって人工多能性幹細胞を得ることを含む、体細胞から人工多能性幹細胞iPS細胞を生産するためのインビトロ方法に関する。本明細書で使用されるように、用語増加increase、増進enhance、又は活性化activateは、一般的に、統計的に有意な量による増加を意味する。なんらかの誤解を避けるために、用語増加、増進、又は活性化は、参照レベルと比較して少なくとも10の増加、例えば、少なくとも約20、又は少なくとも約30、又は少なくとも約40、少なくとも約50、又は少なくとも60、又は少なくとも約70、又は少なくとも約80、又は少なくとも約90、又は100までの増加、又は参照レベルと比較して10~100の間の任意の増加、又は少なくとも約2倍、又は少なくとも約3倍、又は少なくとも約4倍、又は少なくとも約5倍、又は少なくとも約10倍の増加、又は参照レベルと比較して2倍~10倍以上間の任意の増加を意味する。用語減少するdecrease、又は弱めるreduceは、本明細書において、上項グリピカンファミリーのメンバーの発現及び/又は活性が弱められ又は消失させられた幹細胞又は前駆細胞で定義されたものと同じ意味を有する。用語統計的に有意statisticallysignificant、又は有意significantlyは、統計学的有意性を意味し、及び分子濃度の正常超、又はより高い2標準偏差2SDを一般的に意味する。当該用語は、差がある統計的証拠を意味する。帰無仮説が実際正しい場合、帰無仮説を棄却する決定の確率として定義される。決定は、しばしばP値を使用してなされる。本明細書において使用されるように、グリピカンファミリーのメンバーの発現及び/又は活性の一過性の増加/減少transientincrease/decreaseoftheexpressionand/oractivityofthememberoftheglypicanfamily、又はグリピカンファミリーのメンバーの発現及び/又は活性を一過性に増加し/減少するtransientlyincrease/decreaseoftheexpressionand/oractivityofthememberoftheglypicanfamilyという表現は、グリピカンファミリーのメンバーの発現及び/又は活性が、定められた期間の間のみ、増加され/減少されることを意味する。体細胞においてグリピカンファミリーのメンバーの発現及び/又は活性を一過性に誘導又は増加するための手法は、当業者に周知であり、そして例えば、グリピカンファミリーのメンバーをコードする核酸で体細胞を一過性に形質移入すること、又はグリピカンファミリーのメンバー若しくはグリピカンファミリーのメンバーの活性化因子と体細胞とを一過性に接触することを含む。好ましい実施態様において、核酸は、配列番号1と少なくとも80、少なくとも85、90、95、又は100同一性の配列を含む、又は配列番号1と少なくとも80、少なくとも85、90、95、又は100同一性の配列からなるタンパク質をコードする。本明細書において使用されるように、用語形質移入transfection、又は形質移入することtransfectingは、細胞内に核酸を意図的に導入するプロセスを意味する。当業者に周知なように、形質移入の手法は、シクロデキストリン、ポリマー類、DEAE‐デキストラン若しくはポリエチレンイミンなどの特にカチオンポリマー、リン酸カルシウム緩衝液、リポソーム、デンドリマー、又はナノ粒子を使用する化学物質に基づく形質移入;エレクトロポレーション、ソノポレーション、光学形質移入opticaltransfection;遺伝子ガンgenegun、マグネットフェクション若しくはマグネットアシストトランスフェクションMagnetassistedtransfection、インペールフェクションimpalefection;形質導入などのウィルス方法、;ヌクレオフェクションnucleofection、又はヒートショックが挙げられる。本明細書において使用されるように、用語核酸は、デオキシリボ核酸DNA、そして適切ならば、リボ核酸RNAなどのポリヌクレオチドを意味する。当該用語はまた、均等物として、ヌクレオチドアナログから作られたRNA又はDNAいずれかのアナログを含むことを理解すべきである。本明細書において使用されるように、グリピカンファミリーのメンバーの活性化因子activatorという表現は、グリピカンファミリーのメンバーの活性化に仲介されるシグナルの誘導を活性化又は増強する天然又は合成化合物を意味する。グリピカンファミリーのメンバーの活性化因子は、特に、グリピカンファミリーのメンバーと結合する炭水化物、又はグリピカンファミリーのメンバーの特異的な活性化抗体であってもよい。細胞においてグリピカンファミリーのメンバーの発現及び/又は活性を一過性に弱める手法は、当業者に周知であり、そして例えば、核酸分子阻害剤の使用、特にsiRNA又はshRNAでの細胞の形質移入、及び上項グリピカンファミリーのメンバーの発現及び/又は活性が弱められ又は消失させられた幹細胞又は前駆細胞で記載されたように、幹細胞又は前駆細胞と、グリピカンファミリーのメンバーのアンタゴニストとを一過性に接触させることを含む。特定の理論に拘泥されることなく、特定の期間の間のグリピカンファミリーのメンバーの一過性の増加が、初期化効率を改善するために必要であり、そして次のグリピカンファミリーのメンバーの一過性の減少が、奇形腫リスクを克服するために重要であると考えられる。好ましくは、上で定義された方法により生産されたiPS細胞が、上で定義されたような細胞分化を引き起こす環境条件に供される場合、それらの自己複製は、維持される。本発明はまた、上で定義されたインビトロ方法により取得できる又は取得されるiPS細胞に関する。幹細胞又は前駆細胞の使用本発明は、幹細胞又は前駆細胞におけるグリピカン4の調節は、インビボで注入された場合、腫瘍形成を予防することを可能にし、従って、幹細胞又は前駆細胞の適用の具体的な有効性を付与し、ここでグリピカン4の発現及び/又は活性は、再生医療において弱められ又は消失させられる。本発明の他の目的は、従って、幹細胞又は前駆細胞に関し、ここでグリピカンファミリーのメンバーの発現及び/又は活性は、病的状態の幹細胞に基づく治療による処置用の使用のために弱められ又は消失させられている。具体的な実施態様において、病的状態は、変性疾患、心疾患、代謝性疾患、及び障害からなる群から選択される。本発明はまた、病的状態の幹細胞に基づく治療による処置用の使用のために上で定義されたインビトロ方法により取得できる又は取得される幹細胞又は前駆細胞に関する。好ましい実施態様において、病的状態は、変性疾患、心疾患、代謝性疾患、及び障害からなる群から選択される。本発明はまた、グリピカンファミリーのメンバーの発現及び/又は活性が弱められ又は消失させられた幹細胞又は前駆細胞の治療上の有効量を、それを必要とする個体に投与することを含む、個体における病的状態の幹細胞に基づく治療による処置方法を記載する。好ましい実施態様において、病的状態は、変性疾患、心疾患、代謝性疾患、及び障害からなる群から選択される。本発明はまた、上で定義されたインビトロ方法により取得できる又は取得される幹細胞又は前駆細胞の治療上の有効量を、それを必要とする個体に投与することを含む、個体における病的状態の幹細胞に基づく治療による処置方法を記載する。好ましい実施態様において、病的状態は、変性疾患、心疾患、代謝性疾患、及び障害からなる群から選択される。本発明の文脈において、個体individualは、齧歯動物ラット、マウス、ウサギ、霊長類チンパンジー、ネコ科の動物ネコ、イヌ科の動物イヌなどのヒト又は非ヒト哺乳動物を示す。好ましくは、個体は、ヒトである。本明細書において使用されるように、用語処置treatment又は処置することtreatingは、治療的処置、及び予防的prophylactic又は予防的preventative手段の両方を意味し、ここで本目的は、疾患の進行を阻止し又は遅らせることである。治療上の有効量は、任意の治療に適用できる妥当な利益/リスクで、疾患を処置するための細胞の十分な量を意味する。本明細書において開示されるような細胞の一日の総使用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医によって決定されることが理解されるであろう。必要とされる正確な量は、治療される疾患の種類及び疾患の重度などの因子に依拠して変化するであろう。本発明の文脈において、変性疾患degenerativediseaseは、運動又は食生活などの通常の身体上の摩損又はライフスタイルの選択にかかわらず、時間とともに病気に冒された組織又は器官の機能又は構造が、徐々に悪くなる疾患を意味する。変性性疾患の例は、筋委縮性側索硬化症ALS又はルーゲーリック病、アルツハイマー病、パーキンソン病、多系統委縮症、ニーマンピック病、アテローム性動脈硬化症、進行性核上麻痺、ガン、テイサックス病、糖尿病、心臓疾患、円錐角膜を含める炎症性大腸炎IBD、前立腺炎、変形性関節症、骨粗鬆症、関節リウマチ、及びハンチントン病が挙げられる。好ましくは、本発明に従った変性疾患は、筋委縮性側索硬化症、パーキンソン病、多系統委縮症、ガン、糖尿病、心臓疾患、及びハンチントン病からなる群から選択される。本発明の文脈において、用語心疾患cardiacdisorder、又は心臓疾患heartdiseaseは、心臓に影響を及ぼす疾患を意味する。特に、心疾患は、冠動脈性心疾患、心筋症、心臓血管疾患、虚血性心疾患、心不全、高血圧性心疾患、炎症性心疾患、及び心臓弁膜症を包含する。冠動脈性心疾患は、心筋及び周囲組織に十分な血液循環を供給するための冠動脈血液循環の障害を意味する。心筋症は、なんらかの理由による心筋の機能低下を意味する。心臓血管疾患は、心臓自体及び/又は血管系、特に心臓に出入りする静脈及び動脈に影響を及ぼす疾患を意味する。虚血性心疾患は、通常、冠動脈疾患に起因する、心筋の虚血により特徴付けられる疾患を意味する。心不全は、体全体にわたって血液の十分な量を満たす又は送り込むための心臓の能力を損なう任意の構造的又は機能的心疾患に起因し、そのために心臓及び体の不全をもたらす状態を意味する。高血圧性心疾患は、高血圧、特に局所的な高血圧により引き起こされる心疾患を意味する。炎症性心疾患は、心筋及び/又はその周囲組織の炎症に関連する疾患を意味する。心臓弁膜症は、心臓の1以上の弁に影響を及ぼす疾患プロセスを意味する。好ましくは、本発明に従った心疾患は、心筋症、虚血性心疾患、心不全、高血圧性心疾患、及び心臓弁膜症からなる群から選択される。本発明の文脈において、代謝性疾患は、正常な代謝を混乱させる疾患を意味する。好ましくは、本発明に従った代謝性疾患は、炭水化物代謝障害である。本明細書において使用されるように、炭水化物代謝障害は、炭水化物、例えば、グルコースの代謝が乱されている疾患を意味する。炭水化物代謝障害は、糖尿病、空腹時高血糖、太り過ぎoverweight、及び肥満が挙げられる。本明細書において使用されるように、糖尿病は、通常、異常に高い血糖値を引き起こす、遺伝性の及び環境の要因の組み合わせに起因する混乱した代謝症候群を意味する。本明細書において使用されるように、空腹時高血糖は、6.1mmol/l超の血糖を引き起こす、混乱した代謝症候群を意味する。本明細書において使用されるように、太り過ぎは、過剰な体脂肪が、健康に悪影響を及ぼすかもしれない程度にまで蓄積している状態を意味する。太り過ぎは、通常、25kg/m2以上のボディマスインデックスとして定義される。本明細書において使用されるように肥満は、過剰な体脂肪が、健康に悪影響を及ぼすかもしれない程度にまで蓄積している状態を意味する。肥満は、通常、30kg/m2以上のボディマスインデックスとして定義される。本明細書において使用されるように、用語障害injuryは、外部の化学物質又は力により引き起こされる身体の構造又は機能に生じた被害又は損傷を意味し、そしてそれは、物理的又は化学的、及び偶然によって又は意図的によってのいずれかでもよい。障害は、特に、あざ、外傷、切り傷、擦り傷、火傷、骨折、関節脱臼、脳震盪、捻挫、及びショックを包含する。あざは、打撲傷により引き起こされる皮下出血を意味する。外傷、切り傷、及び擦り傷は、出血を引き起こす皮膚に対する又は皮膚を貫く損傷を意味する。火傷は、過剰な熱、化学物質への暴露、又は低温により引き起こされる損傷である。骨折は、骨の損傷である。関節脱臼は、肩又は指の脱臼など、その正常な関節からの骨の移動である。脳震盪は、頭蓋骨又は脳へのなんらかの侵入なしに、衝撃により引き起こされる軽度の外傷性脳損傷である。捻挫は、突然の極端な伸縮により引き起こされる靭帯に生じる損傷である。ショックは、組織が十分な酸素及び栄養を取ることができない重度の病状である。上で説明したように、本発明者等は、奇形腫の発生のリスクが、グリピカン4の発現が弱められた幹細胞をヌードマウスの脇腹に移植した場合、野生型細胞と比較して、克服されたことを示した。従って、好ましい実施態様において、グリピカンファミリーのメンバーの発現及び/又は活性が弱められ又は消失させられた幹細胞又は前駆細胞を使用した場合、奇形腫の形成は抑えられる。本発明の文脈において、奇形腫は、すべての三胚葉の正常な誘導体に類似している組織又は器官構成要素を有する被包型腫瘍を意味する。本発明はまた、スクリーニングアッセイ、好ましくはインビトロスクリーニングアッセイ、特に医薬品、遺伝子的、又は毒物学的スクリーニングアッセイ、好ましくは毒物学的スクリーニングのための上で定義されたインビトロ方法により生産された幹細胞、前駆細胞、又はiPS細胞の使用を提供する。グリピカンファミリーのメンバーの活性の調節因子及びその使用上記のように、ガン幹細胞は、腫瘍形成をする特性を有する幹細胞である。実際、それらは、自己複製及び複数の細胞型について分化の幹細胞プロセスを通じで腫瘍を生み出すであろう。それらは、腫瘍中に生き残り、新たな腫瘍を生じることにより再発及び転移を引き起こすと考えられる。従って、ガンを処置するための方策は、具体的にガン幹細胞を標的にすることである。本発明等は、これらの細胞の運命について決定を下すことができる幹細胞におけるグリピカン4の発現及び/又は活性の調節を示した。特に、ガン幹細胞におけるグリピカン4の発現及び/又は活性を弱め又は消失することが、ガン幹細胞の自己複製を低下し、及び/又は分化マーカーの発現を促進することができるかもしれない。従って、本発明の他の態様は、ガンの処置用に使用するためのグリピカンファミリーのメンバーの活性の調節因子に関する。本発明はまた、グリピカンファミリーのメンバーの活性の調節因子の治療上の有効量を、それを必要とする個体に投与することを含む、個体におけるガンを処置するための方法を記載する。本発明の文脈において、用語調節modulateは、当該技術分野におけるその使用、例えば、目的のプロセス、経路、若しくは事象における定性的な若しくは定量的な変化、変更、若しくは修飾を引き起こし又は容易にすることの意味で、一貫して使用される。限定なしに、そのような変化は、プロセス、経路、若しくは事象の異なる構成要素若しくは分岐の相対的な強度若しくは活性における増加、減少、又は変更であってもよい。本明細書において使用されるように、調節因子modulatorは、目的のプロセス、経路、若しくは事象において定性的若しくは定量的に変化、変更、若しくは修飾を引き起こす又は容易にする作用物質である。特に、グリピカンファミリーのメンバーの活性の調節因子は、グリピカンファミリーのメンバーの活性化因子又はグリピカンファミリーのメンバーのアンタゴニストでもよい。好ましくは、グリピカンファミリーのメンバーの活性の調節因子は、グリピカンファミリーのメンバーのアンタゴニストである。本明細書において使用されるように、グリピカンファミリーのメンバーのアンタゴニストという表現は、上項グリピカンファミリーのメンバーの発現及び/又は活性が弱められ又は消失させられた幹細胞又は前駆細胞で定義されたものと同じ意味である。本明細書において使用されるように、グリピカンファミリーのメンバーの活性化因子という表現は、上項人工多能性幹細胞を生産するための方法で定義されたものと同じ意味である。本明細書において使用されるように、用語ガンは、任意の悪性病変、又は悪性細胞分裂若しくは悪性腫瘍、又は制御されていない若しくは不適切な細胞分裂を含む任意の状態を含み、及び制限されないが、制御されていない又は不適切な細胞増殖により特徴付けられる任意の疾患を含む。ガンは、ガン腫、肉腫、腺ガン、腺腫、白血病、リンパ腫、及び骨髄腫が挙げられる。特に、ガンは、膀胱ガン、乳ガン、大腸及び直腸ガン、子宮内膜ガン、腎臓腎細胞ガン、白血病、肺ガン、黒色腫、皮膚ガン非黒色腫、非ホジキンリンパ腫、膵臓ガン、前立腺ガン、甲状腺ガン、胃ガン、肝臓ガン、卵巣ガンでもよく、これらを含んでもよい。ガンはまた、副腎ガン、肛門ガン、再生不良性貧血、胆管ガン、膀胱ガン、骨ガン、脳ガン、乳ガン、気管支及び肺ガン、中枢神経系ガン、子宮頸ガン、大腸及び直腸ガン、結合組織ガン、脳神経ガン、消火器ガン、子宮内膜ガン、内分泌ガン、食道ガン、ユーイングファミリー腫瘍、胆嚢ガン、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、頭頸部ガン、ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、腎臓ガン、喉頭及び下咽頭ガン、喉頭ガン、白血病leukaemiacancer、白血病‐リンパ腫、白血病‐骨髄腫、不特定の細胞型ガンの白血病leukaemiaofunspecifiedcelltypecancer、口唇ガン、肝臓ガン、肺カルチノイド腫瘍、リンパ球、造血及び関連組織ガンLymphoidhaematopoieticandrelatedtissuescancer、リンパ腫ガン、悪性免疫増殖性ガン、悪性新生物ガン、生殖器の悪性新生物、尿路ガンの悪性新生物、髄膜ガン、中皮腫ガン、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔及び中耳ガン、上咽頭ガン、鼻咽頭ガン、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫ガン、非ホジキンリンパ腫、神経芽細胞腫、口腔及び口腔咽頭ガン、骨肉腫、中咽頭ガン、卵巣ガン、膵臓ガン、副甲状腺ガン、陰茎ガン、末梢及び皮膚T細胞リンパ腫ガン、末梢神経ガン、腹膜ガン、咽頭ガン、下垂体腫瘍、輪状後部領域ガン、前立腺ガン、網膜芽腫、横紋筋肉腫、唾液腺ガン、肉腫、軟組織ガン、黒色腫皮膚ガン、非黒色腫皮膚ガン、副鼻腔ガン、小腸ガン、胃ガン、精巣ガン、胸腺腫及び胸腺ガン、甲状腺ガン、舌ガン、へんとう腺ガン、気管ガン、ガンNOS、泌尿器ガン、尿道ガン、子宮ガン、子宮肉腫、膣ガン、外陰ガン、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、並びにウィルムス腫瘍であってもよい。好ましくは、上で定義されたようにガンの処置用の使用のためのグリピカンファミリーのメンバーの活性の調節因子は、ガン幹細胞の自己複製を低下し、及び/又は分化マーカーの発現を引き起こす例えば、Piccirilloら、Nature444761765。本発明の他の態様は、成体幹細胞におけるグリピカン4の活性の調節に関する。上記のように、成体幹細胞又は組織特異的幹細胞は、さまざまな組織で見られ、そして自己複製及び分化の特性を有する。従って、それらは、疾患後の組織再生のための重要な治療標的と考えられる。本発明は特に、グリピカン4の活性を調節することにより、あるべき場所における成体幹細胞に影響を与えて、それらの分化能を高め、そして組織修復を促進することを提示する。従って、本発明はまた、特に変性疾患後の組織再生を含む使用のためのグリピカンファミリーのメンバーの活性のアンタゴニストに関する。本発明はまた、グリピカンファミリーのメンバーの活性のアンタゴニストの治療上の有効量を、それを必要とする個体に投与することを含む、特に変性疾患後の個体における組織再生を含む方法を提供する。本明細書において使用されるように、グリピカンファミリーのメンバーのアンタゴニストという表現は、上項グリピカンファミリーのメンバーの発現及び/又は活性が弱められ又は消失させられた幹細胞又は前駆細胞において定義されたものと同じ意味である。本発明の文脈において、用語組織再生、又は組織修復は、互換的であり、そして修復される組織へと発生することができる細胞の増殖、分化、生存、及び移動を意味する。特に、この経路において、特定の組織の機能細胞が、おそらく組織特異的幹細胞又は組織特異的前駆細胞から再生され、正常な機能性組織の再生を生じる。従って、本発明の文脈において、組織再生の誘導用に使用するためのアンタゴニストは、再生される組織に存在する組織特異的細胞、成体幹細胞、又は組織特異的前駆細胞の分化を増強するためのものである。好ましくは、アンタゴニストは、再生される組織に存在する組織特異的幹細胞の分化を増強するために使用されるものである。本方法において処置できる疾患又は障害は、特に、上で定義された変性疾患、脊髄損傷、心疾患、脳卒中、自閉症、眼疾患、慢性閉塞性肺疾患、自己免疫疾患、虚血性心疾患、ガン、創傷治癒、及び火傷が挙げられる。好ましくは、本方法において処置される疾患は、上で定義された変性疾患である。特に脳、心臓、血管系、呼吸系、腎臓系、脾臓系、リンパ系、骨髄、骨、骨格筋系、免疫系、生殖器系、皮膚、軟骨、神経系、消火器系、肝臓、膵臓系、造血系、ホルモン系含む本質的に任意の組織又は器官が、誘導組織再生のための標的にできる。上で定義された調節因子、アンタゴニスト、及び活性化因子は、懸濁液、ミクロエマルション、マクロエマルション、ミセル、蓄積注射などのためのデポー製剤、局所及び皮下投与又はリポソーム中に適切な乾燥製剤などの任意の適切な形態の下、処方されてもよい。それらは、例えば、PGAポリグリコール酸などのポリマーと、又はシクロデキストリンと組み合わせることにより、放出制御製剤として処方されてもよい。好ましくは、上で定義したような調節因子、アンタゴニスト、及び活性化剤は、少なくとも1つの医薬的に許容される担体をさらに含む医薬組成物の形態で投与される。用語医薬的に許容できる担体は、本発明の化合物と一緒に患者に投与されてもよい担体を意味し、そして化合物の治療上の有効量を送達するために十分な用量について投与する場合、それらの医薬品活性を損なわず、非毒性である。本発明の組成物に使用してもよい医薬的に許容できる担体及び媒体vehicleは、制限されないが、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、d‐a‐トコフェロールポリエチレングリコール1000コハク酸などの自己乳化薬剤送達システムSEDDS、ツイーン又は他の同様のポリマー送達マトリックスなどの製剤中で使用される界面活性剤、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、リン酸、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分的なグリセリド混合物などの緩衝物質、水、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩などの塩又は電解質、コロイド性シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系の物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン‐ポリオキシプロピレン‐ブロックポリマー、ポリエチレングリコール、及び羊毛脂肪などが挙げられる。当業者によって理解されるように、組成物は、意図する投与経路と適合するように、適切に処方される。適切な投与経路の例としては、静脈内、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内などの非経口投与、頬側、吸入、点鼻、及び肺噴霧pulmonarysprayなどの経口投与、皮内投与、経皮局所投与、経粘膜的投与、眼内投与、腫瘍内投与、及び直腸投与が挙げられる。本発明に従った組成物は、約0.01μg/kg~約5000μg/kgの範囲の投与量、あるいは約0.1~約1000μg/kgの範囲の投与量、あるいは約1~約500μg/kgの範囲の投与量で送達されてもよい。効果的な投与量はまた、投与経路及び他の薬剤との併用の可能性に依拠して変化する。精製方法グリピカン4は、さまざまな幹細胞型に大部分が存在しているので、本発明者等は、幹細胞及び分化細胞の両方を含んでもよい細胞の混合物から細胞のこの型を精製するためにこれらの細胞上のグリピカン4の存在を使用することを提示する。本発明は従って、サンプルから幹細胞、前駆細胞、ガン幹細胞、又は組織特異的幹細胞を特異的に精製するためのグリピカンファミリーのメンバーのリガンドの使用にまた関する。本発明は、サンプルから幹細胞、前駆細胞、ガン幹細胞、又は組織特異的幹細胞を特異的に精製するためのインビトロ方法を提供し、ここでサンプルは、グリピカンファミリーのメンバーのリガンドと接触し、それによってサンプル中に存在する幹細胞、前駆細胞、ガン幹細胞、又は組織特異的幹細胞を精製する。本明細書において使用されるように、サンプルは、大きい集まりの一部を意味する。好ましくは、本発明に従ったサンプルは、生体由来の物質である。生体サンプルの例は、限定されないが、腎臓、肝臓、心臓、肺など、動脈、静脈などの臓器又は組織の一部、血漿、血小板、血液細胞の亜集団などの血液及びそれらの成分が挙げられる。本発明の文脈において、幹細胞を特異的に精製することspecificallypurifyingstemcellという表現は、構成要素の混合物の中にいる、特に細胞の混合物の中にいる幹細胞を特異的に単離することを意味する。特異的な精製の後、混入物質が幹細胞の間にまだ存在するかもしれないが、幹細胞は、精製細胞の大部分を示す。例えば、幹細胞は、85超の精製細胞、より好ましくは90超、さらに好ましくは95超、最も好ましくは99超の精製細胞を示す。本明細書において使用されるように、グリピカンファミリーのメンバーのリガンドは、グリピカンファミリーのメンバーに向かって結合親和性を有する分子を意味する。特に、リガンドは、特異的な態様でグリピカンファミリーのメンバーと結合することが好ましく、グリピカンファミリーのメンバーと選択的に結合するリガンドであり、細胞の他のタンパク質と比較して特異的であることが好ましい。特異的なリガンドは特に、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及び組み換え抗体、又はFab断片、Fab’2断片、及びscFv断片などのそれらの断片;ファージ抗体phAbs;ラマ及びラクダ抗体;及びアプタマーからなる群から選択される。好ましくは、特異的なリガンドは、モノクローナル抗体である。本発明に従った精製方法において、グリピカンファミリーのメンバーのリガンドは、サンプルから幹細胞の単離を容易にするために固定化できる。特に、グリピカンファミリーのメンバーのリガンドは、固体支持体への結合を介して固定化できる。適切な固体支持体の非限定的な例は、ガラス若しくはプラスチックスライド、樹脂、組織培養プレート、マイクロタイターウェル、チューブ、シリコンチップ、又はビーズ限定されないが、ラテックス、ポリスチレン、若しくはガラスビーズを含むなどの粒子が挙げられる。共有及び非供給結合、又は受動的吸収の使用を含む、当該技術分野における公知の任意の方法が、固体支持体にグリピカンファミリーのメンバーのリガンドを付着するために使用できる。本発明を、以下の図面及び例によりさらに説明する。実施例1:gpc4mut細胞の細胞分化特性本発明者等は、経時的に多能性及び系列特異的マーカーの発現を追うことによりGpc4変異体細胞の細胞分化特性を評価するために、半定量的RT‐PCR方法を使用した。免疫細胞化学を、的確な時点で細胞分化を定量するために適用した。最後に、培養プレートにおいて、次に起こる神経分化、及び胚体の収縮能に基づき発生している心筋細胞の機能活性に関して、顕微鏡検査を適用した。材料及び方法グリピカン4変異体細胞本発明者等により使用されたグリピカン4変異体細胞Gpc4変異体を、WSkarnesによって遺伝子トラップ技術を使用して作製したSkarnesら、ProcNatlAcadSciUSA9265926596。マウス胚性幹細胞129/Olaマウス株由来のE14Tg2a.4を、分泌型トラップベクターpGT1.8TM、pGT1Mpfsと共にエレクトロポレーションした。cDNA末端の迅速増幅RACEにより得られたcDNAのダイレクトシークエンシングにより、グリピカン4の内在性遺伝子に接合した遺伝子トラップベクター配列からなる融合転写物を発現する2つのESC系を同定した。本発明者等は、これらのESC系が、グリピカン4のエキソン1におけるプライマー及び分泌型トラップベクターのlacZ遺伝子におけるもう一つのプライマーを使用してRT‐PCR分析を行うことにより、この融合転写産物を産生したことを確認した。ゲノムウォーキングを行うことにより、本発明者等は、遺伝子トラップベクターの挿入が、マウスグリピカン4遺伝子座の第一イントロンにおいて発生したことを示した。本発明者等により使用された2つのGpc4変異体ESC系を、Gpc4gt‐1及びGpc4gt‐2と命名した。半定量的RT‐PCR研究全RNAを、酸‐フェノール抽出Trizol;Gibco/BRL、Gaithersburg、MDにより単離した。逆転写PCRRT‐PCRを、Perkin‐ElmerRT‐PCRキットで、メーカーが推奨するように行った。cDNAをPCRにより増幅した。サイクル数を、PCRの飽和効果を回避するために、反応曲線の直線部分のPCR条件を選択するように選んだ。特異的プライマーの配列、サイクル数、アニーリング温度、及び増幅産物の長さを、それぞれのプライマーの組み合わせについて確立した。免疫細胞化学細胞を、室温で30分間、4のパラホルムアルデヒド及び1×リン酸緩衝生理食塩水PBS中で固定した。固定に続いて、サンプルを、5分間、1×PBSで、3回洗浄し、そして次に室温で15分間、10の正常ヤギ血清及び0.1のTritonX‐100を有する1×PBS中でインキュベートした。細胞を、その後、5分間、1×PBS中で、3回洗浄し、そして対応する使用希釈倍率で、10の正常ヤギ血清及び1×PBS中で一次抗体と共にインキュベートした。一次抗体でのインキュベーション後、細胞を1×PBSで3回洗浄し、さらに室温で30分間、10の正常ヤギ血清及び1×PBS中で適切な二次抗体と共にインキュベートした。最後に、サンプルを1×PBSで4回洗浄し、そして4,6‐ジアミジノ‐2‐フェニルインドールDAPI、250ng/mlで対比染色した。標識を、倒立顕微鏡を使用して蛍光灯で検出した。結果マウス胚性幹細胞におけるGpc4本発明者等は、gpc4エキソン1及びエキソン3におけるPCRプライマーを使用して半定量性RT‐PCRにより野生型の及びgpc4短縮転写産物のレベルを分析した。図11に示すように、gpc4遺伝子をマウスESCにおいて発現させ、そしてmRNAレベルを、2つのGpc4変異体ESC系、Gpc4gt‐1及びGpc4gt‐2について著しく減少させた。定量分析では、Gpc4転写産物がそれぞれ、Gpc4gt‐1細胞について80±1減少し、Gpc4gt‐2細胞について50±0.5減少したことを示したP<0.001。さらに、短縮転写産物を、ノーザンブロット分析により検出しなかった。また、融合転写産物のレベルは、Gpc4gt‐1ESCよりもGpc4gt‐2において高かった図11。一貫して、ウェスタンブロット分析は、Gpc4タンパク質のレベルが、野生型対照と比較してGpc4変異体ESC系において減少していたことを示した図12。Gpc4ハイポモルフ型突然変異体hypomorphicmutationはマウスESCの分化を加速する自己複製及び分化系列決定の特性を調節する際のGpc4に関する機能的要求を評価するために、本発明者等は、自己複製のために最適な条件下、野生型及びGpc4変異体ESCを培養し、そしてそれはLIFの存在下、及び胚性線維芽細胞フィーダー層における生育に関与する。Gpc4gt‐1及びGpc4gt‐2ESC系の両方が、野生型対照と類似している形態的及び生育特性を示した。変異体細胞は、Oct4、Nanog、Sox2、及びRex‐1などの多能性マーカーを同程度のレベルで発現し、そして分化のマーカーを欠損していた図13。注目すべきは、他のGpcファミリーメンバーにおける代償性変化compensatorychangeを、Gpc4変異体ESCsにおいて検出しなかった。従って、Gpc4変異体細胞は、外因性の自己複製維持シグナルによって完全に支持される場合、ESCの分子及び細胞特性を保持する。本発明者等は、Gpc4変異体細胞が、野生型胚性幹細胞よりも3日早く、Oct4などの多能性マーカーの発現を有意に下方制御し、そして神経及び心臓系それぞれネスチン及びαMHCのマーカーを有意に上方制御したことを示した図1及び2。さらに、神経分化Gpc4変異体細胞において見られるOct4ポジティブ細胞の60の減少は、失われた多能性Oct4細胞が、神経細胞型について細胞運命の切り替えを受けたことを示しており、ネスチンポジティブ細胞の60の増加と著しく相関する図3及び4。Gpc4変異体細胞が、すべての細胞系について分化するための胚性幹細胞特性を保持するかどうかについて理解するために、本発明者等は、胚盤胞内にGpc4変異体細胞を注射し、そして胚組織においてそれらの存在を追った。本発明者等は、Gpc4変異体細胞が、すべての三胚葉外胚葉、中胚葉、内胚葉において存在していたことを示した。これらの研究は、Gpc4変異体細胞が、発生シグナルに対する応答及び全ての体細胞型についての分化の重要な特性を保持することを証明した。実施例2:腫瘍形成を抑えるグリピカン4の調節実施例1に記載した結果は、発明者等に、Gpc4の調節が、インビボで注射した場合、腫瘍形成を抑えるかどうかを評価するために駆り立てた。多能性細胞は、着床前のマウス胚に戻す場合、すべての三胚葉の誘導体へと発生するMurry及びKellerCell132661680。Gpc4変異体ESCは、迅速な分化を示し、さらに複数の細胞型を生じる。Gpc4がインビボで細胞多能性の側面を制御するかどうかを評価するために、本発明者等は、野生型マウスの胚盤胞にGpc4gt‐1ESCを注射することによりキメラマウス胚を作製した。Gpc4機能の喪失が、アフリカツメガエル胚における原腸形成及び脳のパターニングに影響を及ぼすことGalliら、Development13049194929を以前に示したので、本発明者等は、初期発生段階、すなわちE6.75/E7.5,E9.5及びE13.5で、胚を分析した。Gpc4変異体細胞、Gpc4gt‐1の分布に続いてβ‐Gal発現があった。E6.75/E7.5で採取された胚の85.7が、β‐Galであり12/14胚、E9.5で72がポジティブであり13/18胚、そしてE13.5で62.5であった10/16胚。β‐Gal染色の全組織標本の試験は、発生している胚の組織に対するGpc4変異体のESC誘導体の広範な寄与を明らかにし、そしてそれは、対応する発生段階でのgpc4mRNAの発現プロファイルと似ていた。組織切片は、Gpc4gt‐1ESCが、神経上皮、頭部間葉headmesenchyme、発生している心筋、肺、及び腸内に統合されたことを明らかにした。注目すべきは、β‐Gal発現の全組織標本により評価されるように、キメラ現象の程度は、胚が後の段階に達するにつれてE6.75/E7.5~E9.5、約50減少減少した。さらに高度のキメラ現象を有する胚の画分は、頭部、中胚葉節somite及び尾芽において、全体の形態異常を示した。まとめると、これらの知見は、Gpc4変異体ESCが、すべての胚細胞系の初期発生に寄与し、従って、重要な多能性特性を保持することを示した。それらはまた、Gpc4欠乏が、特異的な発生のプロセスと互換性がないかもしれないことを示唆した。本発明者等は次に、野生型及びGpc4変異体ESCGpc4gt‐1を回収し、PBSで洗浄し、そして5×107細胞/mlの濃度でPBSに懸濁したかどうかを求めた。全量で100μlの細胞懸濁液を、6週齢の胸腺欠損ヌードマウスC3H/HeNCr‐nuに皮下注射した。6匹のマウスをそれぞれの実験に使用し、そしてそれらを、2連で行った。マウスを、注射後1週間、奇形腫形成に関してモニターした。腫瘍の発生を、合計4週間、1日おきにモニターした。腫瘍を、腫瘍重量を確立するために解剖し、そしてさらにHEで染色したパラフィン包埋切片を作製することにより分析した。一般的には、SCIDマウスへの野生型ESCの注射は、奇形腫形成を引き起こすMurry及びKeller、2008。これと一致して、野生型ESCを注射したマウスは、4週間後、大きな奇形腫を発生した図5及び6。これらの奇形腫平均重量は、4.5±1.9gであり図7、そしてそれらは、神経上皮外胚葉、軟骨/骨中胚葉、及び粘液産生上皮内胚葉を含むすべての三胚葉由来の組織含んでいた。驚くべきことに、Gpc4gt‐1ESCの注射は、0.8±0.4gの平均重量図7を有する小さな組織塊図5及び6の発生をもたらした。組織学的分析は、胚葉由来の組織がないが、β‐Gal発現Gpc4gt‐1細胞の存在を明らかにした。要約すると、本発明者等は、Gpc4変異体細胞をヌードマウスの脇腹に移植した場合、野生型細胞と対照的に、奇形腫のリスクを克服したことを示す図5。定性的及び定量的分析は、Gpc4変異体細胞が、単離された細胞として残ったか、又は野生型細胞よりも10倍小さい細胞凝集塊の一部となったかのいずれかを示し、なんらかの奇形腫形態を示さなかった図6及び7。従って、Gpc4は、異種環境に移植した場合、明確な幹細胞性特性、すなわち奇形腫を発生する能力の維持に関与することにより、ESCの運命を制御する。従って、それらは、Gpc4調節が、初めて、それらの腫瘍形成特性からESC分化能の分離を可能にすることを明らかにする。実施例3:幹細胞における基本的なGpc4機能の分子機構本発明者等は次に、Gpc4が細胞多能性を調節する環境シグナルを制御する可能性を評価するために幹細胞における基本的なGpc4機能の分子機構を調査した。胚性幹細胞における多能性を維持するためのペプチドシグナルは、骨形成タンパク質、白血病阻害因子、及びWntファミリーメンバーが挙げられる。Wntシグナル伝達経路の活性化を、TOP‐FLASHアッセイを使用して試験した。野生型及びGpc4変異体胚性幹細胞を、TOP‐FLASHルシフェラーゼレポータープラスミド、又はその変異体対照、FOP‐FLASHルシフェラーゼレポータープラスミドのいずれかで、ウミシイタケRenillaルシフェラーゼ含有プラスミドと一緒に形質移入した。TOP‐FLASHプラスミドベクター中の酵素ルシフェラーゼの上流のTcf配列に結合する内因性β‐カテニンcatenin/Tcf転写複合体は、Wnt経路の活性化によってルシフェラーゼ発現を駆動する。FOP‐FLASHプラスミドを、変異したTcf配列を含むため、対照として使用した。形質移入24時間後、細胞を24時間、5ng、10ng、及び50ng/mlのWnt3aで形質移入し、そしてライセートを、ReporterlysisbufferPromega中に採取した。ルシフェラーゼ活性を、LumistarGalaxyLuminometerBMGLabtechで測定し、そしてウミシイタケルシフェラーゼ活性に対して標準化した。アッセイを、少なくとも2つの独立した実験において2連で行った。値を、Wnt3aを含まない培地で処理することにより標準化した。本発明者等は、Wnt活性が、野生型ESCと比較してGpc4変異体ESCで減少したことを示し、従って、Gpc4が、Wntシグナル伝達に対して幹細胞の適切な応答のために必要であることを証明した図8。実施例4:心臓の修復のためのグリピカン4調節の使用本発明者等は、インビトロ分化におけるESC中のGpc4の役割を評価した。本発明者等は、胚体EBを使用して、中胚葉及び内胚葉の細胞系にGpc4変異体及び野生型ESCを分化した。EBは、収縮性部分により明らかにされる、心筋細胞などのさまざまな分化した細胞型を産生するParisiら、JCellBiol163303314。特に、野生型及びGpc4変異体ESCを、本質的に、Maltsevら、MechDev444150に記載されるように、EBにおいて培養した。簡潔に説明すると、EBの調製を、5mlのPBSを含む10cmの細菌用皿の蓋の上に懸滴300細胞/30μlドロップ中で行った。EBを含む懸滴を、2日間、5のCO2を含む大気中、37°Cでインキュベートした。懸滴は、その後、20のFCSを含むDMEM培地で洗浄し、新しい皿に再度播種し、そしてさらに3日間37°Cでインキュベートして5日齢のEBを産生する。5日目に、EBを、鼓動している心筋細胞の形態分析のためにゼラチンコート24ウェルプレート上に別々に播種し、又はRT‐PCR及びウェスタンブロットのために100mmの組織培養プレート上に播種した。Gpc4変異体及び野生型EBのサイズは、培養5日後、類似していたGpc4gt‐1EB:14625±625細胞;野生型EB:12825±325細胞;P>0.05。対照的に、それらの系列分化の動態は、大幅に異なっていた。野生型培養物において、鼓動しているEBは、7日目で最初に現れ、そしてそれらのパーセンテージは、15日目で65±1まで増加した図16。それよりも、鼓動するEBの増加は、Gpc4変異体細胞で加速及び増強され、そして6日目で80±1.35、7日目で95±1に達した図16。サルコメアタンパク質α‐アクチンに関して免疫染色されたより大きな領域が、Gpc4gt‐1EBで見られた。興味深いことに、Gpc4gt‐2細胞における鼓動しているEBの数は、野生型とGpc4gt‐1の間中間であり図16、Gpc4が用量依存的にESCの運命を制御していることを示していた。これらの知見と一致して、Oct4及びクリプトCriptoなどの未分化細胞に関するマーカーの発現は、7日目になって初めて変化した野生型対照とは対照的に、Gpc4変異体EBにおいて、2日目及び5日目で減少した図17。一貫して、初期中胚葉ブラキュリBrachyury、心筋細胞Nkx2.5及びα‐Mhc、並びに内皮細胞CD31に関するマーカーは、途中で上方制御が見られた図17。内胚葉の分化例えばGata4もまた、変異体EBにおいて発生したが、大幅な変化は、肝細胞Tdoマーカー;図17などの完全に分化した細胞の発現プロファイルにおいて観察されなかった。Gpc4変異体EBのこの著しい分化表現型は、ESCにおけるGpc4レベルを弱めることが、細胞系移行celllineageentryを増強することを示唆している。さらに、本発明者等は、gpc4mut心筋細胞が、野生型細胞よりもしっかりとして永続的な収縮能を有することを示した図9。結論として、本発明者等は、鼓動するEBのパーセンテージが、野生型ESCよりもGpc4変異体ESCで高く、そしてこの高いパーセンテージをはるかに迅速に実現したことを示した。実施例5:パーキンソン病の細胞に基づく治療のためのグリピカン4調節の使用Gpc4は、神経系に向かってもESC分化の開始を制御するGpc4が特異的な細胞型の分化率を制御するかどうか、又は分化に対するESC関与の段階でより一般的に必要とされるかどうかを理解するために、本発明者等は、定義されたプロトコールFicoら、StemCellsandDevelopment17573584を使用することにより、神経細胞系を生じるGpc4変異体ESCの能力を試験した。特に、野生型及びGpc4変異体ESCを、0日目で、単一細胞懸濁液において分離し、そして1000細胞/cm2を、ゼラチンコートプレート上に播種した。分化プロセスの間、培地を毎日交換した。神経分化のための培地血清不含ノックアウト血清代替物KSR添加培地は、15のKSRInvitrogen、2mMのグルタミン、100U/mlのペニシリン/ストレプトマイシン、及び0.1mMのβ‐メルカプトエタノールを添加したノックアウトダルベッコDulbecco最小必須培地を含んでいた。神経分化後、Ficoら、StemCellsandDevelopment17573584に記載されたように、形態学的検査及びマーカー分析を続けた。異なる時点で分化している細胞の免疫染色では、非常に多くのネスチンポジティブ神経前駆細胞を、野生型と違って、2日目でGpc4変異体細胞において検出し図3、そしてそれらのパーセンテージは、4日目での野生型についてよりも約60高い図4ことが明らかになった。Tuj1、GABA、及びカルレチニンなどの神経マーカーを、野生型対照と比較した場合、分化しているGpc4gt1ESCにおいて初期段階でまた発現していた図14。EBにおける以前の結果と一致して、本発明者等は、野生型細胞よりも約60低い図4、4日目でのOct4の有意な下方制御図3を見出した。異なる時期での、Oct4、ネスチン、及びMap‐2などの細胞型マーカーの発現プロファイル分析は、免疫染色結果を支持した図15。ホスホヒストンH3又は活性化カスパーゼ3ポジティブ細胞を数えることで、神経誘導体の増加した数が、神経前駆細胞の増殖又は生存の増加から主に生じたというよりもむしろ、この系列に移行するためにGpc4gt1ESCの増強された能力から主に生じたことを明らかにした。総合すれば、これらの結果は、ESCにおけるGpc4の損失が、それらの複数の細胞系に向かう分化に影響を及ぼすことを示した。これらの著しい変化は、系列分化の開始時に起こり、Gpc4が、ESCの自己複製及び分化系列決定のバランスを制御できることを示す。さらに、本発明者等は、神経細胞に分化したGpc4変異体細胞が、通常はドーパミン作動性細胞の運命を引き起こすために必要とされる因子の不存在下ですら、中脳ドーパミン作動性細胞の特性を有するチロシンヒドロキシラーゼ神経の多数を発生するための本質的な能力を有する野生型細胞よりも15倍超ことを示した図10。実施例6:Gpc4は、インビボにおける神経幹細胞の維持を制御する本発明者等は、Gpc4のmRNAは、神経SCが存在する新生動物の神経形成領域及び成体マウス脳において発現することを見出したAlvarezBuylla及びGarciaVerdugo、JNeurosci22629634Kokoevaら、EMBOJ2123122322。従って、本発明者等は、Gpc4が高度に発現している嗅球OB神経発生系に集中している神経SCなどの他のSC型の運命を、Gpc4がまた、制御するかどうかを決定した。放射状グリア初代神経SCに由来する生後産生されたOB神経またB型細胞と呼ばれるは、脳室下帯に位置したSVZDoetschら、Cell97703716。これらの神経SCは、ゆっくりと分割して、Mash1を発現している、高速分割fast‐dividing一過性増幅transit‐amplifying前駆細胞またC型細胞と呼ばれるを産生し、そしてそれは、ダブルコルチンDoublecortinなどの神経マーカーを発現している神経芽細胞またA型細胞と呼ばれるを順に産生する。神経芽細胞は、OBに吻側移動経路RMSを通じて移動し、ここでそれらは、局所介在神経へと分化するAlvarezBuylla及びGarciaVerdugo、2002。生後脳エレクトロポレーションに合わせてRAN干渉に基づく以前に記載した方法が、OB神経発生の間の遺伝子機能を分析するために許容されるBoutinら、PLoSOne3e1883Boutinら、ProcNatlAcadSciUSA10712011206。本発明者等は、SVZ神経SCにおけるGpc4機能を研究するためにこの方法を採用した。本発明者等は、最初に、Gpc4特異的shRNAプラスミドの活性を、NHI3T3細胞内にマウスGpc4、Mycタグ含有発現プラスミドと共に、それらのそれぞれを同時形質移入co‐transfectingすることにより検証した。ウェスタンブロット分析は、sh‐2及びsh‐5が低活性であり、そしてsh‐3が全く活性を示さなかった一方で、それらの1つであるsh‐1がGpc4タンパク質の発現を効果的に阻害したことを示したGpc4タンパク質の下方制御:sh1、76;sh2、43;sh5、40;アクチンローディング対照を使用して標準化。すべての4つのshRNAプラスミドを、最初のインビトロ試験のために使用した。Gpc4shRNAベクター又は空の対照ベクターを、GFP発現プラスミドと共に同時エレクトロポレーションco‐electroporationし、そしてそれは、形質移入した細胞の可視化を可能にした。エレクトロポレーションされた生後脳細胞のエレクトロポレーション及び形態学/分子分析を、以前に記載されたように行ったBoutinら、2008Boutinら、2010。これらの研究のために、エレクトロポレーションを、1日齢の仔P1の側部心室壁について行い、そして分析を、エレクトロポレーション6日後P6に行った。最初に、発明者等は、GFP発現により、VZ,SVZ、及びRMSについて形質移入細胞の広範囲の分布を調べた。GFPポジティブ細胞を、それらの形態に応じて分類した。初代神経SCC型細胞を、それらの強いGFP発現、並びに心室及び内膜表面を含有する頂側膜apical/基底膜basalプロセスのそれぞれにより、同定した。C型細胞は、相対的に低いGFPレベル、丸い形状、及びしばしば形成されたクラスターを有する。A型細胞は、最も低いGFPレベル、小さな体細胞及び最大2つのプロセスを有する。P6で、対照及びGpc4shRNAでエレクトロポレーションした両方の脳において、多くのA型ポジティブ細胞は、RMSに既に入っており、そしてさらにOBに達していた。しかしながらSVZにおいて、2つの群の間の3つの異なる細胞型の割合について、著しい差があった。GFPポジティブ細胞の総数に対するGFPポジティブ初代神経SCB型細胞のパーセンテージは、Gpc4shRNA条件において大幅に減少した対照:26.5±3.9、Gpc4sh1:6±0.5;図18。興味深いことに、神経SCパーセンテージにおける減少は、GPC4の下方制御のレベルと正比例し、GPC4発現は、用量依存的にインビボにおける神経SCプールの維持のために重要であることを示した。Gpc4下方制御後のSVZにおけるC型細胞及びA型細胞の数を、GFPとMash1及びダブルコルチンとの共局在化により測定した。Mash11:100;BDPharmigen及びダブルコルチン1:250;SantaCruzを使用する免疫染色を、Boutinら、2008Boutinら、2010に記載されたように行った。データを、平均±標準誤差として示す。スチューデントアンペアードt検定、又はマン‐ホイットニー検定を使用して、InstatソフトウェアGraphPadSoftwareを使用するデータ群間の差を評価した。P<0.05の場合、差を統計的に有意とみなした。本発明者等は、対照及びsh1エレクトロポレーション群の両方について、GFPポジティブ細胞の同様の大部分が、DCXポジティブA型細胞であることを見出した対照:64.7±2.3、Gpc4shRNA:65.6±2.2。対照的に、本発明者等は、しばしばクラスターを形成する対照と比較して、sh1をエレクトロポレーションした動物で、Mash1ポジティブC型細胞であるGFPポジティブ細胞について強い増加を見出した対照:8.8±1.6、GpcshRNA:28.4±2.2図18。つまり、インビボでの神経SCおけるGpc4下方抑制が、初代神経SCの直接のより少ない未熟な娘前駆細胞を選んで、初代神経SCの割合を減少し、従って、分化に向かうNSCからバランスをシフトする。従って、これらのデータは、Gpc4が、インビボにおいて神経SCプールを維持することに関与し、そしてSVZにおいて分化の開始を抑えることを示す。実施例7:パーキンソン病治療のための神経の臨床的に関連性のある細胞源としてのGpc4変異体ESC弱められたGpc4活性を有するESCのインビトロでの神経分化を行うことにより、本発明者等は、これらの細胞が、腹側中脳ドーパミン作動性特性を有する多数のチロシンヒドロキシラーゼTHを発現している神経を自然的に発生することを発見した。本発明者等は、パーキンソン病のためのラット動物モデルにおいて、前臨床試験を行うことにより、これらの細胞型の潜在的な治療の影響について検討した。本目的のために、本発明者等は、黒質線条体路への6‐OHDAの融合を通じて、一側性病変unilaterallesioningシクロスポリン免疫抑制ラットによりパーキンソン病の動物モデルを作製した。本発明者等は、これらのパーキンソン病の脳の線条体おける弱められたGpc4活性を有する細胞の移植が、行動試験によって評価されたように、野生型細胞よりも、パーキンソン病の症状のより効果的な機能的回復につながることを見出した図19。さらに、Gpc4変異体細胞は、インビボにおいて奇形腫を発生しなかったので、これらの細胞の治療効果が後の段階で持続し、そしてそれは対照的に、野生型細胞において発生することにより、脳異常形成及び死につながった図19。要するに、上記研究は、減少させたGpc4活性を有する多能性細胞が、奇形腫の副作用を避けて、インビボにおいて検討した機能的回復を行うために適切な細胞系になることができるインビボでの証拠を提供する。"