粒子に共有結合されたコラーゲンを含む組成物であって、コラーゲンの遊離カルボン酸基と粒子のアミン反応基との間で共有アミド結合が形成され、かつ粒子が、50~1000ナノメートルに及ぶ平均粒径サイズを有する、該組成物。コラーゲンが架橋されている、請求項1記載の組成物。架橋されたコラーゲンが多孔性であり、かつ500ナノメートルから200マイクロメートルまたは1マイクロメートルから100マイクロメートルに及ぶ平均細孔サイズを有する、請求項2記載の組成物。コラーゲンが粒子を通じて架橋されており、コラーゲンの遊離カルボン酸基と少なくとも1つの粒子上の少なくとも2つのアミン反応基との間で少なくとも2つの共有アミド結合が形成されている、請求項3記載の組成物。コラーゲンがカルボジイミド架橋剤で架橋されている、請求項2記載の組成物。粒子が50~150ナノメートルの平均粒径を有する、請求項1~5のいずれか一項記載の組成物。粒子が金属材料を含む、請求項1~6のいずれか一項記載の組成物。金属材料が、金、銀、白金、チタン、ニッケル、および銅からなる群より選択される、請求項7記載の組成物。金属材料が金である、請求項8記載の組成物。粒子がセラミック材料または生分解性材料を含む、請求項1~9のいずれか一項記載の組成物。反応基がメルカプトエチルアミンもしくはシスタミンまたはその両方である、請求項1~10のいずれか一項記載の組成物。粒子とコラーゲンとの比率が、コラーゲン1mgあたり粒子1×109個からコラーゲン1mgあたり粒子2×1010個の範囲である、請求項1~11のいずれか一項記載の組成物。コラーゲン30mgあたりカルボジイミド架橋剤2~4mgを用いて共有結合を形成させる、請求項1~12のいずれか一項記載の組成物。粒子1×109~2×1010個あたりカルボジイミド架橋剤05~02mgを用いて共有結合を形成させる、請求項1~13のいずれか一項記載の組成物。胚性幹細胞、成体幹細胞、人工多能性幹細胞、上皮細胞、外分泌もしくは内分泌細胞、筋芽細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、軟骨芽細胞、間質細胞、肝細胞、島細胞、神経芽細胞、角化細胞、破骨細胞、骨細胞、心臓細胞、軟骨細胞、内皮細胞、または筋肉細胞、あるいはそれらの任意の組み合わせをさらに含む、請求項1~14のいずれか一項記載の組成物。ゲル、溶液、ペースト、または脱水された剛構造である、請求項1~15のいずれか一項記載の組成物。注射器の中に含まれる、請求項1~16のいずれか一項記載の組成物。真皮または表皮の皮膚等価体である、請求項1~17のいずれか一項記載の組成物。コラーゲンの遊離カルボン酸基の15~20がアミド結合を通じて粒子に共有結合されている、請求項1~18のいずれか一項記載の組成物。個人において組織容量を増加させることにより関節軟骨を膨化させるための方法であって、それを必要としている個人に請求項1~19のいずれか一項記載の組成物を投与する段階を含み、組成物が関節包への注射により投与される、該方法。コラーゲンが架橋されていて、多孔性であり、かつ500ナノメートルから200マイクロメートルに及ぶ平均細孔サイズを有する、請求項20記載の方法。粒子が50~150ナノメートルの平均粒径を有する、請求項21記載の方法。反応基がメルカプトエチルアミンもしくはシスタミンまたはその両方である、請求項20~22のいずれか一項記載の方法。粒子とコラーゲンとの比率が、コラーゲン1mgあたり粒子1×109個からコラーゲン1mgあたり粒子2×1010個の範囲である、請求項20~23のいずれか一項記載の方法。組成物が、ゲル、溶液、ペースト、または脱水された剛構造である、請求項20~24のいずれか一項記載の方法。コラーゲンの遊離カルボン酸基の15~20がアミド結合を通じて粒子に共有結合されている、請求項20~25のいずれか一項記載の方法。コラーゲン30mgあたりカルボジイミド架橋剤2~4mgを用いて共有結合を形成させる、請求項20~26のいずれか一項記載の方法。粒子1×109~2×1010個あたりカルボジイミド架橋剤05~02mgを用いて共有結合を形成させる、請求項20~27のいずれか一項記載の方法。個人において間隙、欠損を充填するための方法、または組織容量を増大するための方法であって、それを必要としている患者に請求項1~19のいずれか一項記載の組成物を投与する段階を含み、組成物が皮内注射または皮下注射によって投与される、該方法。間隙が顔の小じわ、しわ、ひだ、くぼみ、または小さなこぶであり、かつ顔の小じわ、しわ、ひだ、くぼみ、または小さなこぶの出現が組成物の投与後に低減される、請求項29記載の方法。組成物が個人の口唇に投与され、かつ組成物の投与後に口唇の容量が増加する、請求項29記載の方法。反応アミン基を有しかつ50~1000ナノメートルに及ぶ平均粒径を有する粒子とコラーゲンを複合化させる段階を含む、酵素的分解によるインビトロでのまたはインビボでのコラーゲン分解を低減する方法であって、ここで共有アミド結合がコラーゲンの遊離カルボン酸基と粒子上の反応アミン基との間で形成され、かつその結果、コラゲナーゼによるコラーゲンの分解が低減される、該方法。例示的な態様の説明本発明者らは、コラーゲンまたはコラーゲン原線維の遊離カルボン酸基の位置で粒子をコラーゲンに共有結合させることにより、コラーゲンの分解を低減できることを発見した。これによって、特定の疾患または皮膚状態を処置または予防するため哺乳類に投与される場合にさらに安定なコラーゲンに基づく材料が得られる。さらに、20~1000ナノメートル、50~1000ナノメートル、または場合によって50~150ナノメートルの平均粒径を有する粒子を用いることにより、得られるコラーゲン粒子材料は、20ナノメートルに満たないまたは50ナノメートルに満たない粒子と比較した場合に毒性の低減を示しながら、細胞成長および浸潤を促進する環境を作出する。すなわち、本発明者らは、既存のコラーゲンに基づく材料において現在みられる毒性副作用のリスクなしに細胞成長を促進しながらも、コラーゲン分解を低減することによってコラーゲンを安定化する有効な方法を発見した。理論によって束縛されることを望むわけではないが、コラーゲンの遊離カルボキシ部位にて形成された共有結合はコラゲナーゼ結合部位のいくつかを妨害およびまたは遮断し、しかし一方で粒子サイズにより、細胞接着、細胞充実性の増大、およびタンパク質吸着を可能にし、それによって細胞増殖および成長を促進する十分な表面積および表面エネルギーが提供されるものと考えられる。さらに、金属粒子は、活性酸素種および細胞に損傷を与えうる他の遊離基を低減する抗酸化作用をもたらすことができ、金属粒子は抗菌作用をもたらすことができる。さらに、粒子サイズは、細胞による粒子の取り込みを防ぐまたは減らすことによって周辺環境における毒性を低減するのに十分である。本発明のこれらのおよび他の局面を、以下のさらなる非限定的な詳細において記述する。Aコラーゲンコラーゲンは皮膚、骨、腱、筋肉および軟骨のような、生体組織を結び付けかつ支持する、哺乳類においてみられるタンパク質の一種である。コラーゲンはまた、内部器官の支持となり、歯に存在している。体内には天然に存在する25種超のコラーゲンがあり、これらの全てを本発明との関連で用いることができる。より多くみられるコラーゲンには、I型、器官、骨にみられる、II型、III型、IV型ならびにV型が含まれる。コラーゲンの、より多くみられる構造的特徴のいくつかには、グリシン、プロリン、ヒドロキシプロリン、遊離カルボン酸基、および遊離アミン基の豊富さが含まれる。CollagenStructureandMechanicsを参照されたい。皮膚に関して、コラーゲンは強度、柔軟性および弾性を皮膚にもたらす。コラーゲンはまた、皮膚における細胞および血管の成長のための枠組みをもたらす。コラーゲン分解は、皮膚での小じわ、しわ、くぼみ、小さなこぶ、ひだなどの存在を引き起こす。これらの皮膚欠損の出現を減らすための一つの方法は、コラーゲンを皮膚へ注射することであり、これが結果的に、皮膚欠損を充填することになり、ゆえに皮膚充填剤になる。コラーゲンにはまた、関節可動性の増大、熱傷および他の開放皮膚創の処置、骨形成不全症すなわち、骨が脆い病気の処置に及ぶいくつかの医学的用途、ならびに本明細書の全体で開示および主張される他の医学的用途が有る。本発明との関連で使用できるコラーゲンは、広範囲の供給源から抽出することができる。使用できる非限定的なコラーゲン材料には、組み換えヒトコラーゲン、組織工学によって作製されたヒトに基づくコラーゲン、ブタコラーゲン、ヒト胎盤コラーゲン、ウシコラーゲン、自家コラーゲン、コラーゲン原線維、およびヒト組織コラーゲンマトリックスが含まれる。同様に使用できるさらなるコラーゲンおよびコラーゲンに基づく製品は、市販されており、それらの非限定的な例が、参照により組み入れられるInternationalCosmeticIngredientDictionaryandHandbook第12版、第1巻、656頁に掲載されている。本発明との関連で使用できる市販のコラーゲン製品のさらなる非限定的な例としては、Cosmoderm1および2、CosmoPlast、Zyderm、ならびにZyplastが挙げられ、これらの全てがInamedCorpSantaBarbaraCAEvolenceによって製造されている。特定の態様において、ブタコラーゲンが用いられる。B粒子およびコラーゲンとの共有結合形成上記で説明されたように、20~1000ナノメートル、50~1000ナノメートル、または50~150ナノメートルの平均粒径サイズを有する粒子を、本発明との関連で用いることができる。平均粒径サイズは動的光散乱によって判定することができる。DLSは、懸濁状態の粒子のサイズ分布プロファイルを与える技法である。サイズ分布プロファイルから平均粒子サイズを判定することができる。さらに、特定の直径サイズを有する粒子を購入または入手できるいくつかの供給源が利用可能であるTedPellaIncのNanoXactBioPure金および銀コロイドNanoPartzIncの精密球状金ナノ粒子、金ナノロッド、マイクロゴールド、金ナノビーズ、金ナノワイア、白金、パラジウム、およびトライメタルナノ粒子ならびにNanoparticleBiochemIncの金ナノ粒子、銀ナノ粒子、白金ナノ粒子、パラジウムナノ粒子、およびグリーンナノ粒子。使用できる粒子は、金属材料、セラミック材料およびもしくは生分解性材料またはそれらの組み合わせを含むことができ、またはそれらで構成されることができる。金属粒子に関して、非限定的な例としては、金、銀、白金、チタン、ニッケル、およびまたは銅が挙げられる。特定の例では、粒子に用いられる材料は抗菌性を有することができ、これは感染の可能性を低減するのに有用でありうる。さらに、そのような粒子材料は電子受容体として機能することができ、それゆえ、活性酸素種によって引き起こされる遊離基による損傷を低減することができる。本発明との関連で用いられる粒子は反応基を含むことができ、この非限定的な例としてはアミン反応基、カルボキシレート反応基、チオール反応基、カルボン酸反応基、もしくはヒドロキシル反応基、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。そのような官能性を持たせた粒子は、市販されており、当業者によって作出されうる。さらに、架橋剤の使用は、コラーゲンと粒子との間の共有結合の形成を促進するために用いることができ、コラーゲンそれ自体の間での架橋結合を促進するために用いることもできる。非限定的な工程を以下に示す。特定の態様において、粒子は、コラーゲンに存在する遊離カルボン酸基とアミド結合を形成できるアミン反応基を含む。例として、図1にはそのような態様が記述されている。具体的には、図1では、コラーゲン原線維1上のカルボン酸官能基がEDCによって最初に活性化され、その後、求核付加を通じて、コラーゲン原線維と金属ナノ材料2との間でアミド結合を作出することが例証されている。EDCはコラーゲン原線維上のカルボキシレート基と活性エステル官能基を形成するしかし加水分解がすぐに起こり、したがってEDCは、通常、スルホNHSとカップリングされてスルホNHSエステル中間体を形成する。エステル中間体が次に、金属ナノ粒子上のアミン基と反応する。EDCスルホNHSはイソ尿素副産物を放出して、粒子に付着されたMEAとコラーゲンとの間のアミド結合を促進する。一般的にNHSをEDCに加えて、安定性および結合を増強する。コラーゲンと粒子との間の共有結合の形成を促進するために、ならびにコラーゲンを架橋するために利用される化学物質の毒性が考慮されるべきである。グルタルアルデヒド、ヘキサメチレンジイソシアネート、およびEDCは全て、一般的に用いられる架橋剤であるが、しかしカルボジイミドだけが無毒性であり、架橋結合中にコラーゲンの足場内に取り込まれるようにならない、Lee、Rault、Grtzer、Chan、Billiar、Pieper、Haidekkerを参照のこと。逆に、グルタルアルデヒドおよびヘキサメチレンジイソシアネートは、足場内に取り込まれるようになり、足場が分解されるときに体内へ毒性残留物を放出しうる。さらに、過剰な架橋結合は微細構造を劇的に変化させることがあり、足場を、線維層で覆われるようになって、健常組織に決して置き換えられないほど分解に対して耐性にさせることがある。C複合体を作出するための工程以下の手順は本発明の複合化された材料を作出するための非限定的な方法である非重合化コラーゲンを得るa凍結乾燥コラーゲン30mgを酢酸1mLと混合する。bバイアルをゆっくり回転させることによって室温で3時間溶解する。濃縮された官能性ナノ材料を調製するa100nmの金ナノ粒子懸濁液91uLをAuNP懸濁液02mLに加える。dピペットにより、3回反転させて、または室温における5秒間のボルテックスによって官能性ナノ材料を得るように混合する。10×リン酸緩衝生理食塩水溶液を調製する。EDC00032gおよびスルホNHS000424gを10×PBS緩衝液02mLに溶解する。ラットコラーゲンが使われるなら、10×PBS緩衝液中のEDCおよびNHS02mLに官能性ナノ材料全0209mLを加える。ヒトコラーゲンが使われるなら、同じ緩衝系が使われてもよく、または異なるものが使われてもよい。PBS緩衝液中のナノ材料に1MNaOH0045mLを加える。30gLのコラーゲン溶液1mLに対してNaOHを有する10×PBS緩衝液中の官能性ナノ材料EDC、NHS0454mLを混合する。5~10回ピペッテイングにより上下させて混合を確実にする。37°Cのインキュベーター中に90分間置いて重合させる。新たに形成された足場をインキュベーターから取り出し、30Gaの注射針から注射されるように調整し、または足場を他の形態に調製する。上記のように、この工程は、本発明との関連のなかで粒子コラーゲン複合体を作出するための一つの方法の非限定的な例である。修正および変形が企図され、特定の処置選択肢に望ましい最終産物を調製するためになされうる。D本発明の組成物上記のように、本発明の複合化された材料は、注射可能な組成物、局所組成物、移植可能な組成物などの組成物に含めることができ、種々の形態をとることができる。組成物はまた、投与の経路の性質およびまたは処置される特定の疾患に依り、美容的成分および薬学的成分のようなさらなる成分を含むことができる。CTFAInternationalCosmeticIngredientDictionaryandHandbook、第12版には、本発明との関連で使用できる多種多様の非限定的な美容的成分が記述されている。局所製品に有用でありうるこれらの成分の例としては、吸着剤、乳化剤、安定剤、滑沢剤、溶媒、保湿剤、撥水剤、ビタミン、植物抽出物、抗菌剤、抗酸化物質、キレート剤、ならびに保存料が挙げられる。同様に使用できる薬学的成分の非限定的な例としては、鎮痛剤、麻酔薬、非ステロイド系抗炎症薬を含む抗炎症剤、抗生物質、抗真菌薬、抗ウイルス薬、抗菌薬、抗がん活性剤、抗乾癬剤、抗脂漏剤、生物学的に活性なタンパク質およびペプチド、熱傷処置剤、焼灼剤、皮膚保護薬バリア剤、ホルモンおよびコルチコステロイドを含むステロイド、創傷処置剤、創傷治癒剤などが挙げられる。Eキット本発明のある種の局面において用いられるものとしてキットも企図される。例えば、本発明の材料または組成物はキットの中に含めることができる。キットは容器を含むことができる。容器はボトル、金属チューブ、ラミネートチューブ、プラスチックチューブ、注射器、分注器、加圧容器、バリア容器、包装、仕切り、または材料もしくは組成物が保持される射出もしくは中空成形プラスチック容器のような他の種類の容器を含むことができる。キットは、キットおよびまたは組成物を用いるための使用説明書を含むこともできる。使用説明書は、組成物をどのように適用するか、使用するか、および維持するかの説明を含むことができる。実施例以下の実施例は、本発明のある種の非限定的な局面を実証するために含まれる。以下に続く実施例において開示される技法は、本発明の実践において十分に機能することが本発明者によって発見された技法に当たることが当業者によって理解されるはずである。しかしながら、当業者は、本発明の開示に照らして、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、開示される特定の態様において多くの変更を加えることができ、それでもなお同様のまたは類似の結果を得ることができるものと理解するはずである。実施例120ナノメートルの平均粒径サイズを有する金ナノ粒子に15uMの2メルカプトエチルアミンで官能性を持たせた。FTIR分光分析により、AuNP上の官能基の存在を確認する。さらに、MEAの最適濃度を電解質の添加前後のUVVis分光法の使用によって判定する。最適濃度は、AuNPを安定化し、10NaClの添加後でさえも凝集を阻止し、分散を維持したMEAの濃度と定義された。図2に示されるように、UVVisスペクトルは、MEAで官能性を持たせた場合に吸光度ピークの変化を起こす。官能性を持たせたナノ材料を次いで、コラーゲン原線維上のカルボキシル基との共有結合を容易にするために2mMEDCカルボジイミドおよび5mMスルホNHSと混合する。実施例2AuNPコラーゲンゲルの足場を形成させるため、ラット尾部コラーゲン25mLを10×PBS05mL、1MNaOH0057mL、EDC40mg、スルホNHS53mgおよび官能性AuNP溶液05mLの混合物に加えた。次に、このマトリックスを、重合および架橋結合のために90分間37°Cのインキュベーター中に置いた。ナノ粒子の数とコラーゲン溶液との間の比率は、ラット尾部コラーゲン9mgあたりAuNP38×109個である。システインEDCNHS架橋剤を通じて20nmAuNPが付着されている例示的なコラーゲンゲルの足場のSEMが、図3。SEMは、コラーゲンゲルの足場における金ナノ粒子の分布および密度を特徴付ける。100×でAuNPコラーゲン材料のSEMを表示している図3に示されるように、AuNPは足場全体に存在しており、これは、AuNPがコラーゲン原線維に結合していることを示す。ゲルは、あらゆる未結合のAuNPをコラーゲンの足場から除去する徹底的な洗浄を受けている。図3に示されたSEM顕微鏡写真からナノ粒子の付着が確認される一方で、図4から、付着された粒子が金粒子であることが確認される。図4は、コラーゲンの足場に共有結合的に固定化された金ナノ粒子のEDS像である。実施例3上記のように、本発明者らは、コラーゲン原線維上のカルボン酸結合部位の一部分を粒子で遮断することにより、コラゲナーゼ活性の減少および結果として生じるコラーゲン分解速度の減少が起こりうるものと考える。これが実験的に確認された。図5に例示されるように、異なる濃度でコラーゲン分解に及ぼすナノ材料の効果を調べ、ナノ材料なしのサンプルと比較する。金ナノ粒子の直径サイズは100nmで各サンプルに対して一定とし、複合化された材料を作出した工程は、本明細書の例示的な態様の説明のC節に記述されているものであり、これは参照により本実施例に組み入れられる。濃度はサンプル間で異なった。長さゼロの架橋剤1エチル3カルボジイミドの濃度もサンプル間で異なった。対照サンプルには、ナノ粒子なしでECDにより架橋されたラット尾部コラーゲンを含有させた。コラゲナーゼアッセイ法を行って、架橋されたサンプルの生物学的安定性を試験した。サンプルの分解を通じた生物学的安定性は、ヒドロキシプロリン放出の量によって測定した。分解されたマトリックスの割合は、図5に対照と比べて報告してある。誤差棒は8サンプルから算出された標準偏差を表す。長さゼロの架橋剤ECDの濃度を単純に倍増することによって、足場の分解が30だけ顕著に減らされた。金ナノ粒子をマトリックスに加えることによっても、マトリックスの分解を減らす顕著な効果があった。100nmの金ナノ粒子の1×濃度は50の分解を低減し、その上、2×濃度ではたったの7の分解にまで顕著に低減された。AuNPおよびAuNPならびに2×濃度までのEDCの増加とともにAuNPの間には有意差がない。これらの結果は、100nmの金ナノ粒子の添加がコラーゲンのタンパク質分解耐性に役立ち、マトリックスの生物学的安定性を増大することを示す。これらの結果はまた、コラーゲン原線維に沿ってコラゲナーゼ結合部位にナノ材料が付着することで足場の分解速度が低下することを示す。これらの結果はさらに、約20~約1000nmの直径を有するナノロッドなどの、さまざまなサイズおよび形状のナノ材料を利用できることを示す。さらに、アミン基でナノ材料に官能性を持たせることによって、ナノ材料とコラーゲンとの間で形成される結合の数を最大化することができる。さらに、各ナノ粒子は複数の付着部位を与えられるが、大部分の架橋剤は、典型的には、コラーゲン原線維間の2点結合を与える。この手法は、組織内殖および天然コラーゲン沈着に最適な、特定の予め定められたコラーゲンマトリックス細孔サイズの製造を可能にしうる。金ナノ材料は遊離基捕捉剤として作用するので、足場はまた、抗菌作用も与えながら抗酸化作用に寄与するであろう。体内へ挿入されたら特異的な相互作用を容易にするように他のタンパク質をナノ材料に複合化させてもよい。例えば、線維素をMEAでナノ材料に付加させて、創傷治癒中の血液凝固を補助することができる。実施例4図6は、WST1生存性アッセイ法を介して細胞生存性に用いられた金ナノ粒子の効果を示すデータを提供する。特に、1×、2×、4×、および8×の濃度にて実施例3で調製された金ナノ粒子を有するコラーゲンの足場を3日間細胞とともにインキュベートした。細胞の生存性をUVVisで記録された吸光度値へのWST1の変換によって判定した。図3に示される結果は、対照の生存性がナノ粒子の存在下での細胞生存性よりも有意に高くないことを示す。それゆえ、ナゾ材料は非常に低い細胞毒性を有する。いっそう高濃度の金ナノ粒子からのいっそう高い吸光度読み値により、いっそう多くのWST1を変換する金ナノ粒子の存在下でのいっそう高い細胞代謝回転が認められ、またはAuNPの2×濃度での結合部位の数は飽和しており、金ナノ粒子を培地中に残し、UVVis吸光度値に干渉していることが示唆される。実施例5実施例3において調製されたコラーゲンの足場を分析して、足場上に残存している遊離カルボン酸基の量を判定した。具体的には、金粒子有りおよび無しの足場に対してフーリエ変換赤外分光を用いた。この技法は、コラーゲン上のCOOHへの金の結合を示すカルボン酸部位でのピークの低減を示すために用いられる。図7に例示されるように、1125~920nm域でのピークの減少が認められたが、これはCOH結合の低減を示す。曲線下の面積は03680から03になったが、これはコラーゲン粒子複合体の足場上の遊離カルボン酸基の18の減少である。実施例6本実施例では、細胞充実性、細胞生存性、細胞外マトリックス産生、および細胞分布に及ぼす複合化されたコラーゲン粒子材料の効果を未処理対照と比べて示すデータを提供する。材料および方法足場群の割付金ナノ粒子およびコラーゲンゲルの5つの異なる組み合わせを評価した。これらの群に1~5の番号を付けたが、その概要を表1に示す。計10個の構築体を皮膚線維芽細胞に播種し、7日間および14日間インキュベートした。計50サンプルを分析した。線維芽細胞の収集および培養皮膚真皮を本研究とは無関係の理由でバルビツール酸塩の過剰摂取によって人道的に安楽死されたイヌから収集した。組織を輸送のため、10ウシ胎仔血清、0008ヘペス緩衝液、0008非必須アミノ酸、0002ペニシリン100IUmLストレプトマイシン100ugmL、アンフォテリシンB25ugmL、0002Lアスコルビン酸塩、001Lグルタミンを有するダルベッコ改変イーグル培地中に入れた。無菌操作下で10の手術用メスの刃を用いて真皮組織を2mm×2mmの切片にした。組織断片をRPMI1640溶液中75mgmLの濃度で、無菌のIA型クロストリジウムコラゲナーゼ溶液と混ぜ合わせた。混合物を6時間37°C、5CO2、95湿度のインキュベーター中で撹拌した。消化溶液を10分間1000RPMで遠心分離した。上清をデカントし、細胞ペレットをDMEMFBS5mLに再懸濁した。フラスコを37°C、5CO2、95湿度でインキュベートし、無菌の培地交換を3日ごとに行った。組織培養フラスコあたり95の細胞集密が観察されるまで倒立顕微鏡を用い成長について線維芽細胞をモニタリングした。細胞を、3回目の継代が達成されるまで継代培養により75mLの組織培養フラスコに移し入れ、その後、将来使うために凍結した。細胞をその後、融解し、単層から放出させ、使用の前に溶液中に置いた。足場の播種近似体積でコラーゲンゲル250μlをそれぞれの群および処理から形作った。各群の構築体10個を24時間PBS中、組織培養プレートの個々のウェルに配し、予浸順化として37°C、5CO2、95湿度の無菌インキュベーター内に配した。事前の微生物培養および感受性検査により、3日間の構築体の培養3日後に成長のないことが確認された。予浸後に、培地を各ウェルから除去し、細胞1×106個mlの濃度の線維芽細胞溶液と置き換えた。構築体を細胞溶液とともに静的に24時間培養し、その時点で、細胞溶液をDMEMFBS培地と試験の間中、置き換えた。構築体の収集および評価5つの構築体を7日目および14日目に各群から収集した。細胞生存性および分布の評価のために各構築体から断面をとった。エチジウムホモ二量体1およびカルセインAM蛍光染色を用い、紫外線鏡検法を用いて細胞生存性を判定した。1マイクロメートルの切片を作出し、室温で20分間染色剤とともにインキュベートし、ガラス顕微鏡スライド上に置き、数滴のPBSで湿らせ、蛍光二重標識法を用いて染色した。切片を10×の倍率下で調べた。各切片の像をOlympusDP70デジタルカメラによってデジタル的に捕捉し、Tiffファイルとして保存した。各構築体の残りを凍結乾燥し、乾燥重量を得て、その後、パパイン溶液1mlと混合した。各消化物の一部分を用いて、ジメチルメチレンブルーアッセイ法によりGAG含量を、およびヒドロキシプロリン濃度の判定によりコラーゲン含量を判定した。残りの溶液を4時間水浴中にて60°Cでインキュベートした。QuantiTPicoGreenTM二本鎖DNA定量化アッセイ法を用いて、残りの足場の細胞充実性を判定した。ウシ胸腺から抽出された二本鎖DNAをTE緩衝液と混合して、1000、100、10および1ngmlの標準DNA濃度を作出した。標準物質および各パパイン消化サンプル100ulを96ウェルプレートに加えた。2ugmlのPicoGreen試薬100uLを各ウェルに加え、プレートを5分間インキュベートした。サンプル蛍光をSyngergyHTKC4分光光度プレートリーダーにより485nmの励起528nmの発光で読み取った。吸光度をngl濃度に変換し、総二本鎖DNAの収量をFT4ソフトウェアによりng単位で表した。各データセットを調べ、外れ値を、残りのデータセットから外れて2標準偏差を上回ったまたは下回った値により判定し、それらの値を捨てた。統計的有意性をp95であった。生存細胞充実性の集密が圧倒的であったためにコンピュータ画像解析による特異的な生存性の定量化を不可能にする、著しい細胞ラフティングが全群において明らかであった。細胞死の指標と解釈されるようなものを示す群はなかった。各群は細胞接着、保持および増殖を示した。7日目の群では大きなラフトにおいて細胞表面増殖のより多くの証拠が示されたが、14日目までに、ゲル構築体の内部へのさらに深い浸透が各群において目撃された。主観的に、群間の細胞浸透の度合いまたは程度において差異を検出できなかった。ゲルにおいてAuNPの結合した空洞が目撃された切片において、細胞増殖はチャネルに沿って豊富であることに気が付いた。結論実施例6におけるこれらのデータは、コラーゲンゲルの初期細胞化が非処理ゲルにおいて最適であるように思われたが、長期的な分析から、一般的に、AuNP処理群が非処理ゲル構築体よりも良好に細胞を保持するように思われまたはその増殖を助長するように思われることが明らかにされたことを示唆する。これらの所見が14日目時点だけでの傾向に主に基づいており、群間のDNA含量に関する唯一の統計的差異は、群5よりも高い細胞充実性を保有している群2であったことに留意すべきである。これらの2つの群間の処理の差異は、細胞保持または増殖に悪影響を与えうる群5でのEDC濃度の倍加であった。しかし、各処理内の2時点を調べると、群2および3は増加を示したのに対し、群1は、経時的な細胞充実性の著しい低下を示した唯一の群である。細胞有糸分裂誘発または増殖はここでは特に調べられなかったが、それらの群におけるこの細胞充実性の増加は、いずれの時点でもさらなる細胞が加えられなかったので、細胞充実性の増大の結果である可能性が高かった。全群で、検出可能な細胞死の証拠なく経時的に細胞を保持する能力およびゲル構築体の内部へのその集積を助長する能力が示された。対をなすdsDNA細胞生存性のデータに基づき、細胞は7日目と14日目の間で群1においてあまりうまく保持されなかったようであり、かくして処理群はまた、とりわけ群2および3において、さらに良好に細胞保持に有利に働いたことを意味していた。この細胞充実性の増大は、14日目の時点の群2におけるGAG産生の、対応する大幅な増加に関与していた可能性が高い。コラーゲン産生の決定因子としてのヒドロキシプロリンの試験に関して、群1、2および3の活性は両方の時点で非常に似通っていた。興味深いことに、群4は、とりわけ14日目に、より低いレベルのHP濃度を示した。図5は、経時的に顕著に低下したHP含量の初期の急激な上昇を示した。本明細書において開示および主張される材料、組成物、または方法の全てを本開示に照らして過度の実験なしに作出および実行することができる。本発明の材料、組成物、または方法を特定の態様に関して記述してきたが、本発明の概念、趣旨および範囲から逸脱することなく材料、組成物、または方法に変形を適用できることが当業者には明らかであろう。参考文献以下の参考文献は、本明細書において記述されるものを補足する例示的な手順のまたは他の詳細を提供する程度まで、参照により組み入れられる。