"被験体内のがんを治療する方法であって、a治療を必要とする被験体に、該被験体内のがん細胞に結合するタグ付きタンパク質の配合物を投与することと、b前記被験体に、前記タグ付きタンパク質に結合し、がん細胞死を誘導する治療的に有効な抗タグキメラ抗原受容体AT-CAR発現T細胞集団を投与し、それにより被験体内のがんを治療することと、を含む、方法。被験体内のがんを治療する方法であって、a治療を必要とする被験体に、該被験体内のがん細胞に結合する1つ又は複数のタグ付きタンパク質の配合物を投与することと、b前記被験体に、前記タグ付きタンパク質に結合し、がん細胞死を誘導する1つ又は複数の治療的に有効なAT-CAR発現T細胞集団を投与し、それにより被験体内のがんを治療することと、を含む、方法。被験体内のがんを治療する方法であって、a治療を必要とする被験体に、該被験体内のがん細胞に結合する少なくとも2つのタグ付きタンパク質の配合物を投与することと、b前記被験体に、前記タグ付きタンパク質に結合し、がん細胞死を誘導する少なくとも2つの治療的に有効なAT-CAR発現T細胞集団を投与し、それにより被験体内のがんを治療することと、を含む、方法。各々のタグ付きタンパク質の配合物のタグが同じであるか又は異なり、該タグがフルオレセインイソチオシアネートFITC、ストレプトアビジン、ビオチン、ヒスチジン、ジニトロフェノール、ペリジニンクロロフィルタンパク質複合体、緑色蛍光タンパク質、フィコエリトリンPE、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、パルミトイル化、ニトロシル化、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ及びマルトース結合タンパク質からなる群から選択される、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。各々のタグ付きタンパク質の配合物のタンパク質が同じであるか又は異なり、該タンパク質が抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、セツキシマブ、ニモツズマブ、パニツムマブ、リツキシマブ、オマリズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、ゲムツズマブ、アレムツズマブ、ベバシズマブ、又はそのいずれかの抗原結合フラグメントである、請求項5に記載の方法。各々のAT-CAR発現T細胞集団のAT-CARが同じであるか又は異なり、該AT-CARがタグ結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び活性化ドメインを含む、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。前記タグ結合ドメインが抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項7に記載の方法。前記タグ結合ドメインがFITC、ビオチン、PE、ヒスチジン又はストレプトアビジンに特異的に結合する、請求項7に記載の方法。前記抗原結合フラグメントが一本鎖可変フラグメントscFvである、請求項8に記載の方法。前記抗原結合フラグメントが、FITC、ビオチン、PE、ヒスチジン又はストレプトアビジンに特異的に結合する一本鎖可変フラグメントscFvである、請求項8に記載の方法。前記膜貫通ドメインがヒトCD8α鎖のヒンジ領域及び膜貫通領域である、請求項7に記載の方法。前記活性化ドメインがCD28の細胞質領域、CD13741BBの細胞質領域、OX40、HVEM、CD3ζ及びFcRεのうち1つ又は複数を含む、請求項7に記載の方法。各々のAT-CAR発現T細胞集団のT細胞が同じであるか又は異なり、該T細胞が、末梢血単核細胞PBMCに由来する任意のHLAバックグラウンドのT細胞、前記被験体の腫瘍移植片から単離されたT細胞、及び前記被験体の腫瘍内T細胞からなる群から選択される、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。各々のAT-CAR発現T細胞集団のT細胞が、HLA-A2末梢血単核細胞PBMCからなる、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。前記タグ付きタンパク質の配合物単数又は複数を、前記治療的に有効なAT-CAR発現T細胞集団単数又は複数の投与の前に前記被験体に投与する、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。前記タグ付きタンパク質の配合物単数又は複数を、前記治療的に有効なAT-CAR発現T細胞集団単数又は複数の投与と同時に前記被験体に投与する、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。前記タグ付きタンパク質の配合物単数又は複数を、前記治療的に有効なAT-CAR発現T細胞集団単数又は複数の投与の後に前記被験体に投与する、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。前記タグ付きタンパク質の配合物単数又は複数及び前記治療的に有効なAT-CAR発現T細胞集団単数又は複数を、任意の順序で前記被験体に投与する、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。前記タグ付きタンパク質に結合するAT-CAR発現T細胞が、細胞傷害性T細胞活性化を誘導する、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。前記被験体がヒトである、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。したがって、有効なinvivo治療手段への既存のCART細胞系の発展を妨げている障害に対処し克服する、この系の変更が必要とされている。本発明は、現行の系の欠陥に完全に対処する、汎用であり適応性のある抗タグキメラ抗原受容体AT-CAR発現T細胞系を提供する。この系は、様々ながんタイプを認識することが可能であり、T細胞ベースの療法の使用にとって広範かつ有益な臨床的意義を有する免疫細胞を生成するために遺伝子療法プラットフォームを用いる。本明細書中で開示されるように、抗体等のタグ付きタンパク質を認識し、それと結合する特異性をT細胞に与える多用途のAT-CAR系を開発した。例えば、本明細書中に更に記載するように、様々なヒトがん細胞を、これらの細胞にがん反応性FITC標識抗体が結合している場合に特異的に認識するαFITC-CAR発現ヒトT細胞を開発した。αFITC-CAR発現T細胞の活性化は、効率的な標的溶解、T細胞増殖及びサイトカイン/ケモカイン産生をinvitro及びexvivoで誘導することが示されている。invivoでは、αFITC-CAR発現T細胞FITC-セツキシマブCtxは、結腸がん腫瘍の確立を遅らせるが、腫瘍関連抗原TAA陰性がん細胞の選択を引き起こす。一様なTAA発現を有する膵臓腫瘍モデルを用いて、αFITC-CAR発現T細胞が確立された腫瘍を根絶し、腫瘍の成長を抑えることが観察されている。この汎用のofftheshelf系は、がん患者の治療において様々なタグ付きタンパク質を標的とするその可能性から既存のCAR技術を進展させたものである。或る特定の実施の形態では、本発明は、被験体内のがんを治療する方法であって、a治療を必要とする被験体に、被験体内のがん細胞に結合するタグ付きタンパク質の配合物を投与することと、b被験体に、タグ付きタンパク質に結合し、がん細胞死を誘導する治療的に有効な抗タグキメラ抗原受容体AT-CAR発現T細胞集団を投与し、それにより被験体内のがんを治療することと、を含む、方法に関する。関係する実施の形態では、本発明は、被験体内のがんを治療する方法であって、a治療を必要とする被験体に、被験体内のがん細胞に結合する1つ又は複数のタグ付きタンパク質の配合物を投与することと、b被験体に、タグ付きタンパク質に結合し、がん細胞死を誘導する1つ又は複数の治療的に有効なAT-CAR発現T細胞集団を投与し、それにより被験体内のがんを治療することと、を含む、方法に関する。更に関係する実施の形態では、本発明は、被験体内のがんを治療する方法であって、a治療を必要とする被験体に、被験体内のがん細胞に結合する少なくとも2つのタグ付きタンパク質の配合物を投与することと、b被験体に、タグ付きタンパク質に結合し、がん細胞死を誘導する少なくとも2つの治療的に有効なAT-CAR発現T細胞集団を投与し、それにより被験体内のがんを治療することとを含む、方法に関する。本発明の実施の形態の特定の態様では、各々のタグ付きタンパク質の配合物のタグは同じであるか又は異なり、タグはフルオレセインイソチオシアネートFITC、ストレプトアビジン、ビオチン、ヒスチジン、ジニトロフェノール、ペリジニンクロロフィルタンパク質複合体、緑色蛍光タンパク質、フィコエリトリンPE、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、パルミトイル化、ニトロシル化、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ及びマルトース結合タンパク質からなる群から選択される。本発明の実施の形態の特定の態様では、各々のタグ付きタンパク質の配合物のタンパク質は同じであるか又は異なり、タンパク質は抗体又はその抗原結合フラグメントである。好ましい態様では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、セツキシマブ、ニモツズマブ、パニツムマブ、リツキシマブ、オマリズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、ゲムツズマブ、アレムツズマブ、ベバシズマブ、又はそのいずれかの抗原結合フラグメントである。本発明の実施の形態の特定の態様では、各々のAT-CAR発現T細胞集団のAT-CARは同じであるか又は異なり、AT-CARはタグ結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び活性化ドメインを含む。好ましい態様では、タグ結合ドメインは抗体又はその抗原結合フラグメントである。好ましい態様では、タグ結合ドメインはFITC、ビオチン、PE、ヒスチジン又はストレプトアビジンに特異的に結合する。タグ結合ドメインが抗原結合フラグメントである好ましい態様では、抗原結合フラグメントは一本鎖可変フラグメントscFv、例えばFITC、ビオチン、PE、ヒスチジン又はストレプトアビジンに特異的に結合するscFvである。好ましい態様では、膜貫通ドメインはヒトCD8α鎖のヒンジ領域及び膜貫通領域である。好ましい態様では、活性化ドメインはCD28の細胞質領域、CD13741BBの細胞質領域、OX40、HVEM、CD3ζ及びFcRεのうち1つ又は複数を含む。本発明の実施の形態の特定の態様では、各々のAT-CAR発現T細胞集団のT細胞は同じであるか又は異なり、T細胞は、末梢血単核細胞PBMCに由来する任意のHLAバックグラウンドのT細胞、被験体の腫瘍移植片から単離されたT細胞、及び被験体の腫瘍内T細胞からなる群から選択される。本発明の実施の形態の特定の態様では、各々のAT-CAR発現T細胞集団のT細胞は、HLA-A2末梢血単核細胞PBMCからなる。本発明の実施の形態の特定の態様では、タグ付きタンパク質の配合物単数又は複数を、治療的に有効なAT-CAR発現T細胞集団単数又は複数の投与の前に被験体に投与する。本発明の実施の形態の特定の態様では、タグ付きタンパク質の配合物単数又は複数を、治療的に有効なAT-CAR発現T細胞集団単数又は複数の投与と同時に被験体に投与する。本発明の実施の形態の特定の態様では、タグ付きタンパク質の配合物単数又は複数を、治療的に有効なAT-CAR発現T細胞集団単数又は複数の投与の後に被験体に投与する。本発明の実施の形態の特定の態様では、タグ付きタンパク質の配合物単数又は複数及び治療的に有効なAT-CAR発現T細胞集団単数又は複数を、任意の順序で被験体に投与する。本発明の実施の形態の特定の態様では、タグ付きタンパク質に結合するAT-CAR発現T細胞は細胞傷害性T細胞活性化を誘導する。本発明の実施の形態の特定の態様では、被験体はヒトである。以下の発明を実施するための形態をよりよく理解することができるように、上記に幾らか広範に本発明の特徴及び技術的利点を概説した。本発明の特許請求の範囲の対象となる本発明の付加的な特徴及び利点を本明細書中で記載する。当業者であれば、本明細書中で開示される任意の概念及び具体的な実施形態を、本発明の同じ目的を遂行するために、他の配合物の変更又は設計の基礎として容易に利用することができることを理解するであろう。かかる均等な配合物が、添付の特許請求の範囲に記載される本発明の趣旨及び範囲を逸脱するものではないことも当業者には認識されるであろう。その構成及び操作方法の両方について本発明の特徴であると考えられる新規の特徴は、更なる目的及び利点とともに、添付の図面と関連して検討することによって以下の記載からよりよく理解される。しかしながら、任意の記載、図面、実施例等は例示及び説明のみを目的として提示され、本発明を限定することを決して意図するものではないことが明白に理解されよう。I.定義特に指定のない限り、技術用語は従来の用法に従って使用される。分子生物学における一般用語の定義は例えば、BenjaminLewinGenesVIIOxfordUniversityPress刊行2000ISBN019879276X、KendrewetalTheEncyclopediaofMolecularBiologyBlackwellPublishers刊行1994ISBN0632021829、及びRobertAMeyersMolecularBiologyandBiotechnologyaComprehensiveDeskReferenceWileyJohnSonsInc刊行1995ISBN0471186341、並びに他の同様の技術的参照文献に見ることができる。本明細書中で使用される場合、a又はanは1つ又は複数を意味する場合がある。本明細書中で使用される場合、a又はanという単語は、を含むcomprisingという単語とともに使用される場合に1つ又は2つ以上を意味する場合がある。本明細書中で使用される場合、別のは少なくとも2つ目又はそれ以上を意味する場合がある。さらに、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、単数形の用語は複数のものを含み、複数形の用語は単数のものを含む。本明細書中で使用される場合、約は、明示されているか否かを問わず、例えば整数、分数及びパーセンテージを含む数値を指す。約という用語は一般に、当業者が列挙した値と同等である例えば、同じ機能又は結果を有すると考え得る数値の範囲例えば、列挙した値の±5~10を指す。場合によっては、約という用語は、最も近い有効数字まで四捨五入した数値を含み得る。II.本発明個別のT細胞ベースの免疫療法の広範な使用を可能にする、適応性のあるCARの生成方法を開発した。ヒトT細胞を、抗FITCCAR-CD28-41BB-CD3ζαFITC-CARと称されるを発現するように操作した。このプラットフォームは、抗FITCscFv細胞表面上とFITCとの高親和性相互作用、並びにFITC分子又は他のタグを、様々なタイプのがんを有する患者の治療に使用されるセツキシマブ抗EGFR、リツキシマブ抗CD20及びハーセプチン抗Her2等の任意の抗がん型anticancerbasedモノクローナル抗体に安価かつ容易に結合させる能力を利用するものである。この系は抗原に対する極めて高い特異性を可能にし、自己抗原に対する交差反応性なしに、強力なエフェクター機能及び増殖能を伴う。エフェクター細胞本発明の方法に使用されるエフェクター細胞は自家、同系又は同種異系であってもよく、その選択は治療対象の疾患及び治療に利用可能な手段によって決まる。本方法に使用することができる好適なエフェクター細胞の集団は、T細胞等の細胞溶解活性を有する任意の免疫細胞を含む。例示的なT細胞の亜集団としては、CD3CD8T細胞、CD3CD4T細胞及びNKT細胞を含むCD3を発現するT細胞が挙げられるが、これらに限定されない。一態様では、T細胞はHLA-A2末梢血単核細胞PBMCであるが、T細胞はPBMCに由来する任意のHLAバックグラウンドのものであってもよく、自家、同系又は同種異系の系で利用することができる。また、T細胞は治療を受ける被験体の腫瘍移植片、又は治療を受ける被験体の腫瘍内T細胞に由来するものを含む任意の供給源から単離することができる。便宜上、エフェクター細胞は本明細書中でT細胞と一般に称されるが、任意のT細胞への言及は、他に指示のない限り、本明細書中で規定される全てのエフェクター細胞タイプへの言及であることを理解されたい。抗タグキメラ抗原受容体AT-CAR当業者であれば、本発明の方法に使用されるT細胞によって発現される抗タグキメラ抗原受容体AT-CARが高い柔軟性を可能にすることを理解するであろう。本方法に使用されるAT-CARの唯一の要件は、iAT-CARが、腫瘍関連抗原TAAに結合するタンパク質抗体等に結合させることができる特定のタグに対して結合特異性を有すること、及びiiT細胞をAT-CARを発現するように操作することができることである。要求されるわけではないが好ましい付加的な特徴としては、iAT-CARが、T細胞の結合及び活性化の際に効率的な標的溶解を誘導する活性化ドメインを含むこと、並びにiiAT-CARのscFv部分を、invivoで使用される抗体等の標的すなわち腫瘍反応性タンパク質に結合させることができる他のタグ、例えばビオチン又はフィコエリトリンに対して特異性を有するものに置き換えることが可能であることが挙げられる。特定の態様では、AT-CARは3つのドメインを含む。第1のドメインはタグ結合ドメインである。このドメインは通常、AT-CARを含むポリペプチドのアミノ末端に存在する。タグ結合ドメインがアミノ末端に位置することにより、タグ結合ドメインが標的細胞に結合するタグ付きタンパク質に自由にアクセスすることが可能となる。本明細書中で使用される場合、タグ結合ドメインは通常、抗体又はその抗原結合フラグメントである。抗体又はフラグメントの同一性は、タグ付きタンパク質のタグの同一性によってのみ制限される。例えば、抗体は好ましくはヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ又はネコ等の哺乳動物から得るのが好ましいが、任意の種の動物から得ることができる。好ましくは、抗体はヒト抗体又はヒト化抗体である。使用することができる抗体も特定のクラスに限定されず、IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体、IgG4抗体、IgM抗体、IgA1抗体、IgA2抗体、IgD抗体及びIgE抗体が挙げられる。抗体フラグメントとしては、一本鎖可変フラグメントscFv、一本鎖抗体、Fab’2フラグメント、Fabフラグメント、及びFab発現ライブラリーによって産生されるフラグメントが挙げられ、唯一の限定は抗体フラグメントが選択されたタグに結合する能力を保持していることである。抗体は、例えば非ヒト抗体の抗原結合領域例えば、Fab’2又は超可変領域を、組換えDNA法によってヒト抗体のフレームワークに移入して、実質的にヒトの分子が産生される場合のポリクローナル抗体、モノクローナル抗体又はキメラ抗体であってもよい。scFv等の抗原結合フラグメントをそれから調製することができる。本発明のAT-CARの利点の1つは、市販の抗体を用いて産生することができることである。代替的に、選択されたタグに対する抗体を産生することができる。抗体の産生のために、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト等を含むが、これらに限定されない様々な宿主を特定のタンパク質、又は該タンパク質の免疫特性を保持する任意の部分、フラグメント若しくはオリゴペプチドの注射によって免疫化することができる。宿主の種に応じて、免疫応答を増大させるために様々なアジュバントを使用することができる。かかるアジュバントとしては、大腸菌Ecoliに由来する解毒易熱性毒素、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウム等のゲル状鉱物mineralgels、並びにリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシニアン及びジニトロフェノール等の界面活性物質が挙げられるが、これらに限定されない。BCGカルメットゲラン桿菌及びコリネバクテリウムパルヴムCorynebacteriumparvumも潜在的に有用なアジュバントである。抗体及びそのフラグメントは、抗体分子の産生をもたらす任意の技法を用いて、例えばモノクローナル抗体の産生のための培養における連続細胞株によって調製することができる。かかる技法としては、KoehlerandMilsteinによって初めて記載されたハイブリドーマ法Nature256495497、ヒトB細胞ハイブリドーマ法KosboretalImmunolToday472、CoteetalProcNatlAcadSci8020262030、及びEBVハイブリドーマ法ColeetalMonoclonalAntibodiesandCancerTherapyAlanRLissIncNewYorkNYpp7796が挙げられるが、これらに限定されない。キメラ抗体の産生のために開発された技法、すなわち適切な抗原特異性及び生物活性を有する分子を得るためのマウス抗体遺伝子のヒト抗体遺伝子へのスプライシングも用いることができるMorrisonetalProcNatlAcadSci8168516855、NeubergeretalNature312604608、TakedaetalNature314452454。代替的に、例えば米国特許第4,946,778号その全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとするに開示される一本鎖抗体の産生について記載される技法を、タグ特異的一本鎖抗体を産生するように適応させて用いることができる。一態様では、タグ結合ドメインは一本鎖可変フラグメントscFvである。scFvは、通常10アミノ酸~約25アミノ酸の短ペプチドによって連結した、抗体の重鎖VH及び軽鎖VLの可変領域を含む。リンカーはVHのN末端とVLのC末端とを接続するか、又はその逆であり得る。上記で示したように、タグ結合ドメインの結合特異性は、標的細胞に結合するために使用されるタンパク質に結合させるタグの同一性によって決まる。例えば、タグがFITCフルオレセインイソチオシアネートである場合、タグ結合ドメインは抗FITCscFvを構成し得る。代替的に、タグがビオチン又はPEフィコエリトリンである場合、タグ結合ドメインは抗ビオチンscFv又は抗PEscFvを構成し得る。第2のドメインは膜貫通TMドメインである。TMドメインはCARをT細胞の細胞膜に固定する。例示的なTMドメインとしては、ヒトCD8α鎖のヒンジ領域及び膜貫通領域が挙げられるが、これらに限定されない。第3のドメインは、存在する場合、T細胞活性化ドメインである。このドメインは、標的細胞に結合するタグ付きタンパク質にCARが結合する際のT細胞活性化を助ける。T細胞活性化には、サイトカイン及びケモカインの産生の誘導、並びに細胞の細胞溶解活性の活性化が含まれる。例示的なT細胞活性化ドメインとしては、T細胞の生存及び増殖を向上させる働きがあるCD28、CD13741BB、OX40及びHVEMの細胞質領域、並びにT細胞活性化を誘導するCD3ζ及びFcRεが挙げられるが、これらに限定されない。1つ又は2つ以上のT細胞活性化ドメイン、例えば2つ、3つ、4つ又はそれ以上のT細胞活性化ドメインがCARに含まれ得る。AT-CART細胞産生T細胞は、当業者に容易に知られる手段によってAT-CARを発現するように操作することができる。一般に、AT-CARをコードするポリヌクレオチドベクターを構築し、このベクターをT細胞集団にトランスフェクトする。次いで、細胞をT細胞によるAT-CARの発現を促進する条件下で成長させる。良好なトランスフェクションすなわちウイルス媒介性の遺伝子組込みを指す形質導入及びT細胞によるAT-CARの提示は、従来の手段によって行われ、その幾つかを本明細書の実施例で開示する。一態様では、T細胞は、選択されたAT-CARをコードするレトロウイルスベクターを初めに構築することによってAT-CARを産生するように操作することができる。例示的なレトロウイルスベクターとしては、pMSGVマウス幹細胞ウイルスベースのsplice-gagベクターに由来するベクター骨格pMSGV1-CD8-28BBZが挙げられるが、これに限定されない。DNAシークエンシングを、T細胞のトランスフェクション前に適当なベクターの構築を確認するために用いることができる。レトロウイルス形質導入は既知の技法、例えばJohnsonetalBlood114535546の技法を用いて行うことができる。形質導入したT細胞でのAT-CARの表面発現は、例えば細胞をタグ結合タンパク質又はタグ結合デキストランビーズで染色した後のフローサイトメトリーによって決定することができる。タンパク質又はビーズのタグ部分には、細胞によって発現されるCARのタグ結合ドメインが結合する。AT-CART細胞投与AT-CAR発現T細胞集団は、被験体に投与するために当業者に既知の技法を用いて配合することができる。AT-CAR発現T細胞集団を含む配合物には、薬学的に許容される添加剤単数又は複数が含まれ得る。配合物に含まれる添加剤は、例えばAT-CARを含むタグ結合ドメインの性質、使用されるT細胞の亜集団、及び投与様式に応じて異なる目的を有する。一般に使用される添加剤の例としては、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、注射用水、グリセロール、エタノール及びこれらの組合せ、安定剤、可溶化剤及び界面活性剤、緩衝剤及び防腐剤、等張化剤、充填剤、並びに潤滑剤が挙げられるが、これらに限定されない。AT-CAR発現T細胞集団を含む配合物は、通常は動物血清例えばウシ血清アルブミン等の任意の非ヒト構成要素の非存在下で調製及び培養される。配合物は、1つのAT-CAR発現T細胞集団、又は2つ以上、例えば2つ、3つ、4つ、5つ、6つ又はそれ以上のAT-CAR発現T細胞集団を含み得る。種々のAT-CART細胞集団はタグ結合ドメインの同一性、活性化ドメインの同一性、T細胞の亜集団の同一性、又はそれらの組合せに基づいて異なり得る。例えば、配合物は1つ、又は2つ以上、例えば2つ、3つ、4つ、5つ、6つ又はそれ以上の異なるタグ付きタンパク質を認識し、それと結合するAT-CAR発現T細胞集団を含み得る。一例として、配合物はFITC、ビオチン及びPEを認識し、それと結合するAT-CAR発現T細胞集団を含み得る。このため、この例では、配合物はFITC結合抗体、ビオチン結合抗体及びPE結合抗体によってタグ付けられた細胞を認識し、それと結合する3つの異なるAT-CAR発現T細胞集団を含む。この配合物は、したがってαFITC-CAR発現T細胞、αビオチン-CAR発現T細胞及びαPE-CAR発現T細胞を含む。AT-CART細胞集団単数又は複数を含む配合物は、当業者に既知の様式及び技法を用いて被験体に投与することができる。例示的な様式としては、静脈内注射が挙げられるが、これに限定されない。他の様式としては、腫瘍内、皮内、皮下s.c.、s.q.、sub-Q、ハイポ、筋肉内i.m.、腹腔内i.p.、動脈内、髄内、心臓内、関節内関節、滑液嚢内関節液領域、頭蓋内、髄腔内及びくも膜下髄液の様式が挙げられるが、これらに限定されない。配合物の非経口注射又は注入に有用な既知の任意のデバイスを、かかる投与を行うために使用することができる。被験体に投与されるAT-CAR発現T細胞集団単数又は複数を含む配合物は、特定の適応症又は疾患の治療及び/又は予防に有効な多数のAT-CAR発現T細胞を含む。このため、本発明の方法を実施する場合、治療的に有効なAT-CAR発現T細胞集団が被験体に投与される。概して、約1×104個~約1×1010個のAT-CAR発現T細胞を含む配合物を投与する。大抵の場合、配合物は約1×105個~約1×109個のAT-CAR発現T細胞、約5×105個~約5×108個のAT-CAR発現T細胞、又は約1×106個~約1×107個のAT-CAR発現T細胞を含む。しかしながら、被験体に投与されるAT-CAR発現T細胞の数は、がんの位置、原因、同一性、程度及び重症度、治療を受ける個体の年齢及び状態等に応じて広い範囲で変化する。医師によって使用すべき適切な投与量が最終的に決定される。タグ付きタンパク質タグ付きタンパク質は、AT-CAR発現T細胞の投与の前、又はそれと同時、又はその後に被験体に投与される。タグ付きタンパク質は被験体内の標的細胞に結合する。概して、タグ付きタンパク質のタンパク質部分は標的細胞に結合する分子の部分である。例えば、タンパク質は、標的細胞によって発現される腫瘍関連抗原TAA又は腫瘍特異的抗原TSAに結合する抗体であり得る。しかしながら、タンパク質は標的細胞に結合する任意の分子であってもよい。例示的なタンパク質としては、セツキシマブ抗EGFR、ニモツズマブ抗EGFR、パニツムマブ抗EGFR、リツキシマブ抗CD20、オマリズマブ抗CD20、トシツモマブ抗CD20、トラスツズマブ抗Her2、ゲムツズマブ抗CD33、アレムツズマブ抗CD52及びベバシズマブ抗VEGF等の抗がん型のモノクローナル抗体が挙げられるが、これらに限定されない。タグ付きタンパク質のタグ部分は、AT-CAR、具体的にはAT-CARのタグ結合ドメインが認識し、特異的に結合することができる分子であることによってのみ制約される。例示的なタグとしては、フルオレセインイソチオシアネートFITC、ジニトロフェノール、ペリジニンクロロフィルタンパク質複合体、緑色蛍光タンパク質、ビオチン、フィコエリトリンPE、ヒスチジン、ストレプトアビジン、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、パルミトイル化、ニトロシル化、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、グルタチオンS-トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質、及び量子ドットナノ結晶を含む任意のタイプの蛍光物質が挙げられるが、これらに限定されない。このため、一部の態様では、タグ付きタンパク質はFITC結合抗体、ビオチン結合抗体、PE結合抗体、ヒスチジン結合抗体及びストレプトアビジン結合抗体を含み、抗体は標的細胞によって発現されるTAA又はTSAに結合する。例えば、本発明のタグ付きタンパク質としては、FITC結合セツキシマブ、FITC結合リツキシマブ、FITC結合ハーセプチン、ビオチン結合セツキシマブ、ビオチン結合リツキシマブ、ビオチン結合ハーセプチン、PE結合セツキシマブ、PE結合リツキシマブ、PE結合ハーセプチン、ヒスチジン結合セツキシマブ、ヒスチジン結合リツキシマブ、ヒスチジン結合ハーセプチン、ストレプトアビジン結合セツキシマブ、ストレプトアビジン結合リツキシマブ、及びストレプトアビジン結合ハーセプチンが挙げられるが、これらに限定されない。代替的に、AT-CAR細胞を、腫瘍に栄養を与える血管細胞を標的とし、及び/又はそれを破壊するように再指向化することができる。例えば、AT-CARとしてαFITC-VEGFを発現するT細胞は、FITCタグ付きVEGFが結合する血管内皮細胞を標的とすることができ、この場合、FITCタグ付きVEGFにVEGF受容体が結合する。一部の態様では、タグを欠いたタンパク質をタグ付きタンパク質として使用することができる。例えば、標的細胞上のTAA又はTSAに結合する裸のタグの付いていないタンパク質抗体等をタグ付きタンパク質として使用することができる。かかる状況下では、AT-CARはタンパク質を認識し、それと特異的に結合する。一例として、タグ結合ドメインは第2の抗体を認識し、それと結合する抗体又はその抗原結合フラグメントであってもよく、この場合、第2の抗体はタグ付きタンパク質として機能し、第2の抗体はタグを欠いている。タグは、化学カップリング及び化学架橋剤等の技法を用いてタンパク質に結合させることができる。代替的に、融合タンパク質としてタグ付きタンパク質をコードするポリヌクレオチドベクターを調製することができる。次いで、細胞株をタグ付きタンパク質を発現するように操作することができ、タグ付きタンパク質を培養培地から単離し、精製し、本明細書中で開示される方法に使用することができる。タグ付きタンパク質は、被験体に投与するために当業者に既知の技法を用いて配合することができる。タグ付きタンパク質の配合物には、薬学的に許容される添加剤単数又は複数が含まれ得る。配合物に含まれる添加剤は、例えばタグの性質、タンパク質、及び投与様式に応じて異なる目的を有する。一般に使用される添加剤の例としては、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、注射用水、グリセロール、エタノール及びこれらの組合せ、安定剤、可溶化剤及び界面活性剤、緩衝剤及び防腐剤、等張化剤、充填剤、並びに潤滑剤が挙げられるが、これらに限定されない。タグ付きタンパク質の配合物は、1つのタイプのタグ付きタンパク質、又は2つ以上、例えば2つ、3つ、4つ、5つ、6つ又はそれ以上のタイプのタグ付きタンパク質を含み得る。種々のタイプのタグ付きタンパク質はタグの同一性、タンパク質の同一性、又はその両方に基づいて異なり得る。例えば、3つのタイプのタグ付きタンパク質を含む配合物は、FITC結合セツキシマブ、FITC結合リツキシマブ及びFITC結合ハーセプチン、又はFITC結合セツキシマブ、ビオチン結合セツキシマブ及びPE結合セツキシマブを含み得る。タグ付きタンパク質は、当業者に既知の様式及び技法を用いて被験体に投与することができる。例示的な様式としては、静脈内注射、腹腔内注射及び腫瘍内注射が挙げられるが、これらに限定されない。他の様式としては、皮内、皮下s.c.、s.q.、sub-Q、ハイポ、筋肉内i.m.、動脈内、髄内、心臓内、関節内関節、滑液嚢内関節液領域、頭蓋内、髄腔内及びくも膜下髄液の様式が挙げられるが、これらに限定されない。配合物の非経口注射又は注入に有用な既知の任意のデバイスを、かかる投与を行うために使用することができる。タグ付きタンパク質を含む配合物は、特定の適応症又は疾患の治療及び/又は予防に有効な量で被験体に投与される。概して、少なくとも約0.1mg/kg体重~約100mg/kg体重のタグ付きタンパク質を含む配合物を治療を必要とする被験体に投与する。大抵の場合、投与量は投与経路、症状等を考慮して1日当たりタグ付きタンパク質約1mg/kg体重~約10mg/kg体重である。一例としては、タグ付きベバシズマブを約2.5mg/kg~約5mg/kgの投与量で投与する。更なる例としては、タグ付きセツキシマブを約100mg/m2~約400mg/m2の投与量で投与する。しかしながら、被験体に投与される配合物中のタグ付きタンパク質の量は、がんの位置、原因、同一性、程度及び重症度、治療を受ける個体の年齢及び状態等に応じて広い範囲で変化する。医師によって使用すべき適切な投与量が最終的に決定される。がん本発明は、がんを有する被験体を治療する方法であって、治療を必要とする被験体に、がん細胞に結合する1つ又は複数のタグ付きタンパク質の配合物を投与することと、タグ付きタンパク質に結合し、がん細胞死を誘導する1つ又は複数の治療的に有効なAT-CAR発現T細胞集団を投与することと、を含む、方法に関する。がんという用語は広範に解釈されることを意図し、異常な細胞成長及び/又は細胞分裂の全ての側面を包含する。例としては、腺癌、扁平上皮癌、腺扁平上皮癌、未分化癌、大細胞癌、小細胞癌を含むが、これらに限定されない癌、及び皮膚、乳房、前立腺、膀胱、膣、頸部、子宮、肝臓、腎臓、膵臓、脾臓、肺、気管、気管支、結腸、小腸、胃、食道、胆嚢のがん;軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性血管内皮腫、悪性シュワン腫、骨肉腫、軟部組織肉腫を含むが、これらに限定されない肉腫、並びに骨組織、軟骨組織、脂肪組織、筋組織、血管組織及び造血組織のがん;成熟B細胞新生物、例えば慢性リンパ球性白血病/小リンパ球性リンパ腫、B細胞前リンパ球性白血病、リンパ腫及び形質細胞新生物、成熟T細胞新生物及びナチュラルキラーNK細胞新生物、例えばT細胞前リンパ球性白血病、T細胞大型顆粒リンパ球性白血病、侵攻性NK細胞白血病、及び成人T細胞白血病/リンパ腫、ホジキンリンパ腫、及び免疫不全関連リンパ増殖異常症を含むが、これらに限定されないリンパ腫及び白血病;精巣がん及び卵巣がんを含むが、これらに限定されない胚細胞腫瘍;肝芽腫、髄芽腫、腎芽腫、神経芽腫、膵芽腫、胸膜肺芽腫及び網膜芽腫を含むが、これらに限定されない芽腫が挙げられる。この用語は良性腫瘍も包含する。本明細書中で使用される場合、治療するtreat、治療するtreating及び治療treatmentという用語は、それらの通常及び慣例の意味を有し、被験体におけるがんの症状の重症度及び/又は頻度の抑止、改善若しくは軽減、及び/又は被験体におけるがん細胞の成長、分裂、拡散若しくは増殖、若しくはがんの進行例えば新たな腫瘍の発生の抑制の1つ又は複数を含む。治療とは、本発明の方法を実施していない被験体に対する約1~約100の抑止、改善、軽減又は抑制を意味する。好ましくは、抑止、改善、軽減又は抑制は、本発明の方法を実施していない被験体に対する約100、99、98、97、96、95、90、80、70、60、50、40、30、20、10、5又は1の抑止、改善、軽減又は抑制である。AT-CAR発現T細胞集団を含む配合物及びタグ付きタンパク質の配合物のどちらの投与頻度も、治療対象の疾患、AT-CAR発現T細胞及びタグ付きタンパク質を含む要素、並びに投与様式を含む因子によって異なる。各々の配合物を1日4回、3回、2回又は1回、1日おき、2日おき、3日おき、4日おき、5日おき、週1回、7日おき、8日おき、9日おき、週2回、月1回及び月2回独立して投与することができる。治療期間は治療対象の疾患に基づき、担当医によって最良のものが決定される。しかしながら、治療の継続は数日、数週間又は数ヶ月の間続けられることが企図される。本発明は治療方法に柔軟性をもたらし、その結果として、タグ付きタンパク質の配合物単数又は複数及びAT-CAR発現T細胞集団単数又は複数を被験体に任意の順序で投与することができる。このため、タグ付きタンパク質の配合物単数又は複数を、AT-CAR発現T細胞集団単数又は複数の前、後又はそれと同時に被験体に投与することができる。代替的に、2つ以上のタグ付きタンパク質の配合物及び/又は2つ以上のAT-CAR発現T細胞集団を被験体に投与する場合、投与を調整することができる。例えば、第1のタグ付きタンパク質の配合物の投与に続いて第1のAT-CAR発現T細胞集団を投与することができ、これに続いて第2のタグ付きタンパク質の配合物、次いで第2のAT-CAR発現T細胞集団を投与することができる。本発明は、被験体へのAT-CAR発現T細胞の投与の前にAT-CAR発現T細胞集団をタグ付きタンパク質でコーティングする方法も含む。本発明の実施形態の各々において、治療を受ける被験体はヒト又は非ヒト動物、例えば非ヒト霊長類、鳥類、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、コンパニオンアニマル、例えばイヌ、ネコ若しくは齧歯類等、又は他の哺乳動物である。本発明は、1つ又は複数のAT-CAR発現T細胞集団及び1つ又は複数のタグ付きタンパク質の配合物を充填した1つ又は複数の容器を含むキットも提供する。キットは使用説明書も含み得る。医薬品又はバイオ製品の製造、使用又は販売を規制する行政機関によって指定される形式の、機関によるヒト投与のための製造、使用又は販売の認可を反映する通知もキットに更に付属し得る。IV.実施例マウス及び細胞株NOD-scidIL2RγnullNSGマウスは、JacksonLaboratoryBarHarbor,ME,USAから購入し、メリーランド大学ボルチモア校の特定病原体除去動物施設に収容し、養子免疫療法のレシピエントとして使用した。実験はメリーランド大学ボルチモア校の動物管理使用委員会によって審査され、承認された。ヒトEGFR結腸腺癌細胞株SW480ATCC,Manassas,VAは、10加熱不活性化ウシ胎仔血清GeminiBioProducts,WestSacramento,CA,USA、2mML-グルタミンGIBCOブランド;Invitrogen及び1ペニシリン-ストレプトマイシンGIBCOブランド;Invitrogenを添加したダルベッコ変法イーグル培地DMEMGIBCOブランド;Invitrogen,Carlsbad,CA,USAで維持した。EGFRHER2膵臓腺癌細胞株Panc6.03は、ElizabethJaffee博士ジョンズホプキンス大学シドニーキンメルがんセンターの厚意で提供され、20FBS、1MEM非必須アミノ酸GIBCOブランド;Invitrogen、1ピルビン酸ナトリウムGIBCOブランド;Invitrogen、2mML-グルタミン、1ペニシリン-ストレプトマイシン及び100IU/mlのインスリンを添加したRPMI1640培地GIBCOブランド;Invitrogenで培養した。HER-2乳腺癌細胞株AU565ATCCは、10FBS、2mML-グルタミン及び1ペニシリン-ストレプトマイシンを添加したRPMI1640培地で培養した。PhoenixAmphoパッケージング細胞株は、OrbigenSanDiego,CA,USAから購入し、DMEM、10FBS、1ピルビン酸ナトリウム、2mML-グルタミン及び1ペニシリン-ストレプトマイシンを含有するD10培地で維持した。SW480細胞株、Panc6.03細胞株及びAU565細胞株でのEGFR又はHER2の表面発現は、FITC結合セツキシマブCtx又はFITC結合ハーセプチンHer2を用いたフローサイトメトリーによって決定した。レトロウイルスベクターの構築レトロウイルスベクター骨格pMSGV1-CD8-28BBZHughesMSetalTransferofaTCRgenederivedfromapatientwithamarkedantitumorresponseconveyshighlyactiveTcelleffectorfunctionsHumGeneTher2005Apr1645772は、RichardMorgan博士米国国立がん研究所の厚意で提供され、pMSGVマウス幹細胞ウイルスベースのsplice-gagベクターに由来するものである。図1Aは、ベクター構築物及び5’末端から3’末端へのフレーム単位の構成要素の配置順序の概略図である。FITCに対するマウスscFvはαFITC-CARと称され、ヒトCD8α鎖ヌクレオチド配列1271~1519、GenbankNM001768.6のヒンジ領域及び膜貫通領域、並びにヒトCD28分子ヌクレオチド配列760~882、GenbankNM006139.2、4-1BB分子ヌクレオチド配列886~1026、GenbankNM001561.5及びCD3ζ分子ヌクレオチド配列299~637、GenbankNM000734.3の細胞質領域に連結する。αFITC-CAR配列は、BlueHeronBothell,WAによって合成されている。この配列はDNAシークエンシングにより確認され、以下の配列を有するものであった:agttgcctgttaggttgttggtgctgatgttctggattcctgcttccagcagtgatgtcgtgatgacccaaactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatctcttgcagatctagtcagagccttgtacacagtaatggaaacacctatttacgttggtacctgcagaagccaggccagtctccaaaggtcctgatctacaaagtttccaaccgattttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttatttctgctctcaaagtacacatgttccgtggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaaagtagtgctgatgatgctaagaaggatgctgctaagaaggatgatgctaagaaggatgatgctaagaaggatggtgaggtgaagctggatgagactggaggaggcttggtgcaacctgggaggcccatgaaactctcctgtgttgcctctggattcacttttagtgactactggatgaactgggtccgccagtctccagagaaaggactggagtgggtagcacaaattagaaacaaaccttataattatgaaacatattattcagattctgtgaaaggcagattcaccatctcaagagatgattccaaaagtagtgtctacctgcaaatgaacaacttaagagttgaagacatgggtatctattactgtacgggttcttactatggtatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcc配列番号1。この配列をpMSGV1へとライゲートし、αFITC-CARレトロウイルスベクターを生成した。ヒトT細胞のレトロウイルス形質導入健常ドナーに由来するHLA-A2末梢血単核細胞PBMCを、BiologicalSpecialtyCorpColmar,PA,USAから購入し、Ficoll-PaqueGEHealthcare,Piscataway,NJ,USA密度勾配遠心分離によって単離した。単離したPBMCを、24ウェル組織培養プレートで5ヒトAB血清SigmaAldrich、1MEM非必須アミノ酸、1ペニシリン-ストレプトマイシン及び100U/mlの組換えヒトIL-2BioLegend,SanDiego,CA,USAを添加したAIMV培地GIBCOブランド;Invitrogen中、3×106個/ウェルで培養し、50ng/mlのOKT3eBioscience,SanDiego,CA,USAで活性化した。2日後、レトロウイルス形質導入のために細胞を回収した。形質導入のために、24ウェル非組織培養処理プレートBDBiosciences,FranklinLakes,NJ,USAに、10μg/mlの組換えヒトフィブロネクチンフラグメントRetroNectin;タカラバイオ株式会社、日本、滋賀県大津市0.5ml/ウェルを4°Cで一晩コーティングした。インキュベーション後、ウェルを2.5ヒトAB血清を加えた1mlのハンクス液GIBCOブランド;Invitrogenを用いて室温で30分間ブロッキングし、2.5N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N’-2-エタンスルホン酸HEPESGIBCOブランド;Invitrogenを加えたハンクス液で洗浄した。形質導入は以前に記載されているように行ったJohnsonetalBlood114535546。簡潔に述べると、およそ2.5mlのレトロウイルス上清を各々のコーティングウェルに添加し、続いて32°Cで2時間、2000gで遠心分離した。1.5mlのウイルス上清を取り出し、1×106個0.5mlの活性化PBMCを、100U/mlのIL-2の存在下で各々のウェルに添加した。プレートを1000gで10分間遠心分離した後、37°Cで一晩インキュベートした。形質導入後、細胞を洗浄し、IL-2100U/mlの存在下で維持し、形質導入の5日後に実験に使用した。形質導入ヒトT細胞でのαFITC-CARの表面発現を、細胞をCD3又はCD8及びFITC結合セツキシマブで染色した後にフローサイトメトリーによって決定した。一部の実験では、αFITC-CAR形質導入T細胞をFITC結合デキストランビーズで染色した。FITC結合精製ヒトIgGInvitrogenで染色した細胞をアイソタイプ対照として使用した。T細胞増殖アッセイ、サイトカイン産生及びケモカイン産生のアッセイ形質導入の3日~5日後に、1×105個のT細胞をセツキシマブ、FITC結合セツキシマブ又はFITC-デキストランでコーティングした96ウェル丸底プレートで72時間培養した。腫瘍細胞に対するT細胞特異的反応性のために、SW480細胞に指定の濃度の抗体を37°Cで1時間パルスし、3回洗浄した。1×105個のエフェクターT細胞及び1×105個の腫瘍細胞を、96ウェル丸底プレートで72時間、200μlの培養液量で共培養した。採取の16時間前に、0.5μCiの3H-チミジンを各々のウェルに添加した後、1450LSCルミネッセンスカウンターPerkinElmer,Waltham,MA,USAを用いてチミジン取り込みを測定した。サイトカイン及びケモカインの産生レベルを、刺激の48時間後に回収した培養上清からサイトカイン/ケモカインキットMillipore,Billerica,MA,USAを用いてメーカーの使用説明書に従って測定した。一部の実験では、腫瘍移植片を細かく刻み、37°Cで2時間トリプシン中で培養し、続いて陰性選択キットInvitrogenLifeTechnologies,GrandIsland,NYを用いてT細胞濃縮を行った。200000個のT細胞をSW480結腸がん細胞50000個と共培養し、これにFITC-Ctx又はCtx0.5μg/1×106細胞をパルスした。3日後に[3H]チミジン取り込み±SDによって増殖を決定するか、又はMilliplexアレイを用いてサイトカイン及びケモカインの産生を測定した。細胞毒性アッセイ腫瘍標的細胞に対する細胞毒性活性を、標準的な51Cr放出アッセイを用いて測定した。1×106個の標的細胞を37°Cで2時間、200μCiの51Crで標識し、3回洗浄し、抗ヒト抗体を37°Cで1時間パルスした。次いで、1×104個の標識標的細胞を96ウェル丸底プレート、200μlの培養液量で漸減数のエフェクターT細胞と指定のエフェクター対標的E:T比で共培養した。培地単独でインキュベートした標的細胞を使用して自然51Cr放出を決定し、標識標的細胞を10TritonX-100中でインキュベートすることによって最大放出を決定した。37°Cで5時間後、50μlの上清を回収し、51Cr放射活性を1450LSCルミネッセンスカウンターで測定した。特異的溶解の平均パーセンテージを以下の方程式に従って算出した:特異的溶解=試験放出-自然放出/最大放出-自然放出×100。全ての試験を三連ウェルで行った。結果は平均値±SDとして示す。腫瘍モデル及び養子免疫療法予防的腫瘍モデルでは、6週齢~8週齢の雄NSGマウス各群についてn=5の後肢側面に、1~2×106個のSW480腫瘍細胞又はPanc6.03腫瘍細胞を皮下s.c.注射した。翌日、マウスにFITC-Ctx又はCtx25μg/マウスを腹腔内i.p.注射した。Ctx注射の翌日、マウスに5×106個のαFITC-CAR形質導入ヒトT細胞を静脈内i.v.注射した。養子T細胞移入の後、マウスに抗体25μg/マウスを3週間にわたって毎週i.p.注射した。腫瘍部をデジタルキャリパーを用いて盲検下で週2回~3回測定し、腫瘍サイズmm2を縦径による垂直測定によって算出した。腫瘍サイズが200mm2に達した場合、又はマウスが瀕死状態若しくは歩行困難となった場合にマウスを安楽死させた。全ての実験を独立して少なくとも2回行い、同様の結果を得た。生存データを直接ログランク検定で分析した。実験1末梢血単核細胞をIL-2の存在下で抗CD3mAbによって活性化し、続いて図1Aに示され、上に記載したようにα-FITC-CD28-41BB-CD3ζ-CARベクターαFITC-CARと称されるを形質導入した。T細胞でのαFITCscFvの発現を、細胞を抗CD8又は抗CD3及びFITC標識セツキシマブビーズFITC-Ctx又はFITC標識デキストランビーズFITC-Dexで染色することによって分析した。平均すると、全T細胞の60がαFITC-CARを発現した図1B。それらの機能性及び特異性を確認するために、αFITC-CART細胞又は対照モック形質導入T細胞を、漸増濃度のプレート結合FITC-Ctxビーズ、非結合セツキシマブビーズ、又はFITC-Dexビーズを用いて活性化した。αFITC-CART細胞は、FITC-Ctx及びFITC-Dexによる刺激を受けて活発かつ用量依存的に増殖したが、Ctx単独による刺激に応じて分裂しなかった図1C、左パネル。対照的に、対照T細胞はFITC-Ctx又はFITC-Dexに対して増殖しなかった図1C、右パネル。また、T細胞を漸増濃度のFITC-Ctxで染色したEGFR結腸がん細胞SW480と共培養した。αFITC-CART細胞によるFITC反応性が、FITC-Ctx染色がん細胞による活性化を受けて分裂するそれらの能力によって実証された図1D。しかしながら、増殖は最低濃度のFITC-Ctxでの対照の増殖と同様であった。対照T細胞は、いずれの濃度のFITC-Ctx染色がん細胞によっても増殖性を示さなかった図1D。それらの細胞溶解能を決定するために、αFITC-CART細胞をFITC-Ctx染色SW480結腸がん細胞とともに様々なエフェクター対標的比で培養した。αFITC-CART細胞は、T細胞対標的細胞が1:20という低いエフェクター対標的比でSW480結腸がん細胞を溶解したが図1E、左パネル、FITC-マウスIgGで標識したがん細胞を溶解しなかった図1E、右パネル。同様に、対照T細胞は、FITC-Ctx標識SW480がん細胞又はFITC-IgG標識SW480がん細胞に対して感知され得るレベルの細胞溶解活性を示さなかった図1E。種々の抗原を発現する様々な標的細胞を認識するそれらの能力を確認するために、αFITC-CART細胞を、FITC-Ctxで染色した又はFITC-ハーセプチン抗Her-2mAb;FITC-Her2で染色した膵臓がん細胞Panc6.03及びFITC-Her2で染色した乳がん細胞AU565と共培養した。αFITC-CART細胞は、FITC-Ctx又はFITC-Her2で染色したがん細胞を効果的かつ特異的に溶解した図1F。FITC-Ctxで染色した細胞を上回る、FITC-Her2染色膵臓がん細胞に対する細胞溶解活性の増大が、EGFRと比較してより高いHer-2の発現レベルと関連する可能性があるということは注目に値するデータは示さない。さらに、αFITC-CART細胞はT細胞の生存、拡大及び走化性に有益である多様なサイトカインを産生した表1。FITC-Ctx又はCtxで染色したがん細胞を用いて活性化した対照T細胞によって生じるバックグラウンドサイトカインレベルは、それぞれ同一であった。まとめると、これらのデータは、1αFITC-CART細胞の機能性、2可溶性FITCではなく、FITC-Ab染色細胞に対するそれらの特異性、3多様な腫瘍細胞タイプを溶解するそれらの能力、及び4様々なFITCタグ付き抗体の使用を実証するものである。実験2αFITC-CART細胞を再指向化して、腫瘍細胞をinvivoで排除する能力を検証した。マウスにSW840結腸がん細胞をs.c.注射し、続いてFITC-Ctx又はCtxをi.p.注射によって投与した。翌日、αFITC-CART細胞を尾静脈へのi.v.注射によって投与した。腫瘍成長動態はαFITC-CART細胞Ctxを与えたマウスと、Ctx単独を与えたマウスとで同様であった図2A、左パネル。全く対照的に、αFITC-CART細胞FITC-Ctxを与えたマウスにおいて腫瘍成長は著しく抑制された図2A、左パネル。同様に、腫瘍消失率tumorfreeoccurrence図2A、中央パネル及び全生存図2A、右パネルは、αFITC-CART細胞FITC-Ctxを与えたマウスにおいて対照群と比較して顕著に改善された。しかしながら、この生存利点にもかかわらず、α-ITC-CART細胞FITC-Ctxを与えたマウスは、腫瘍生着の55日以内に腫瘍チャレンジのため死亡した。長期治療におけるαFITC-CART細胞の減少に寄与する機構を更に調査した。T細胞はCD3mAb及びIL-2で活性化されたため、CART細胞はCD28又は41BBから生存促進性シグナルを受けたにもかかわらず短い寿命を示し得る非特許文献1、BrentjensetalNatMed9279286。脾臓、肝臓、骨髄、循環系を含む様々な組織及び腫瘍移植片におけるαFITC-CART細胞の存在をアッセイした。αFITC-CART細胞は分析した全ての組織において見られた。腫瘍移植片において検出された全てのヒトT細胞のおよそ10がαFITC-CART細胞であった図2B。同様のパーセンテージが他の組織でも見られたデータは示さない。しかしながら、臓器摘出時38日目~45日目のαFITC-CART細胞の全パーセンテージは、注入時の60という開始パーセンテージよりも顕著に低かった。40~50という開始パーセンテージと比較して、マウスから回収したT細胞の60~90がCD8であったことも注目に値する。これらのデータから、invivoでのCD4T細胞に対するCD8サブセットの潜在的な生存利点が示される。CD4TRegの頻度又は役割は検証しなかったが、これは依然として更に調査する価値がある実行可能な選択肢である。代替的に、αFITC-CART細胞は、おそらくはアナジー又は他の抑制機構のために抗原FITCによって十分に活性化されなかったと考えられる。全T細胞を腫瘍移植片から濃縮し、FITC-Ctx又はCtx単独で染色した組織培養物に由来するSW480細胞を用いて即座に再活性化した。αFITC-CART細胞は、FITC-Ctx染色SW480細胞による刺激後に増殖し図2C、様々なエフェクター分子及びケモカインを産生したが図2D、Ctxで染色したSW480細胞に応答しなかった。残念ながら、腫瘍移植片から単離されたαFITC-CART細胞の数は、それらの殺傷適性を試験するのに十分ではなかった。しかしながら、exvivoで分裂し、エフェクター分子を産生するそれらの能力に基づくと、α-FITC-CART細胞は明らかにFITC刺激に応答することが可能である。α-FITC-CARがマウスに存在し、FITC-CAR刺激に応答性であるという観察結果に基づいて、腫瘍移植片でのEGFR発現を検証した。フローサイトメトリーによって検証されるように、アイソタイプ対照及び組織培養物から採取したSW480細胞と比較して、全ての腫瘍移植片が完全にEGFR発現を欠いている図2E。加えて、組織培養物から採取したSW480細胞の大半がEGFRを発現するが、その発現はEGFRを欠く一部の細胞とは異質であった。総合すると、これらのデータは、αFITC-CARがEGFR細胞を死滅させるが、やがてαFITC-CART細胞の標的ではないEGFR-細胞の成長を許すという主張を裏付けている。また、EGFR発現の欠如、したがってFITC媒介刺激の欠如が、注射前のαFITC-CART細胞のパーセンテージと比較して、後の時点で担腫瘍マウスにおいて観察されたαFITC-CART細胞の頻度の低下に寄与していたと考えられる。さらに、これらのデータは、TAAが不均一に発現される患者において腫瘍回避が起こる可能性を浮き彫りにする。これらの研究から、幾つかのTAAに対して特異性を有するCART細胞を使用することの潜在的必要性も強調される。抗タグCART細胞の使用の利点の1つは、幾つかのFITCタグ付き腫瘍反応性抗体を同時に使用することが可能であることである。また、ビオチンに特異的なscFv又はPE結合抗体を発現するCARの使用は、抗タグCARの多様性を増大させ得る。実験3SW480がん細胞でのEGFR発現の不均一性を考慮して、全ての細胞が抗原を発現するがん細胞集団を破壊するαFITC-CART細胞の能力を検証した。膵臓がん細胞株Panc6.03を、EGFRを一様に発現する細胞として選択した図3A。αFITC-CART細胞の細胞溶解活性を、予防的腫瘍モデルにおいて実験2に記載したものと同じ手順を用いて検証した。腫瘍成長は、αFITC-CART細胞FITC-Ctxを与えたマウスにおいて明らかに抑制され、α-FITC-CART細胞Ctxを与えたマウスは急速な腫瘍成長を示した図3B、左パネル。αFITC-CART細胞Ctxを与えた全てのマウスが、腫瘍生着の35日以内に腫瘍チャレンジのため死亡した図3B、右パネル。i.v.注射、i.p.注射又は腫瘍内注射によるFITC-Ctxの投与は、全て腫瘍への抗体局在をもたらしたデータは示さないことは注目に値する。T細胞を腫瘍に再指向化することの代替的方法は、養子移入前にαFITC-CART細胞をFITC-Ctxでコーティングすることである。実験4確立された膵臓腫瘍を破壊するαFITC-CART細胞の能力を検証した。膵臓腫瘍を腫瘍が十分に血管新生される3mm2~10mm2のサイズまで成長させた後、FITC-Ctx又はCtxを注射i.p.した。翌日、マウスにαFITC-CART細胞を尾静脈注射によって投与した。EGFRに対して再指向化された特異性を有するT細胞は、全てのマウスにおいて確立された膵臓腫瘍を根絶し図3C、左パネル、Ctx及びαFITC-CART細胞で処理したマウスと比較して生存を改善した図3C、右パネル。観察期間中に腫瘍の再発は起こらなかった。要約すると、これらの研究は、T細胞特異性を、様々ながんタイプに結合して腫瘍破壊を媒介するFITCタグ付き抗体に与える汎用であり適応性のあるCAR系の生成を初めて説明するものである。この報告は、TAA陰性腫瘍変異株が生じ、最終的に宿主を死に至らせる可能性があるために、2つ以上のTAAを標的とするためにCART細胞を使用することの重要性を初めて強調するものでもある。このプラットフォームは、様々ながんタイプを標的とするために、様々なタグ付きタンパク質すなわち抗体を標的とするその可能性から既存のCAR技術を大幅に進展させる汎用の系とみなされる。本発明の範囲又は趣旨を逸脱することなく、本発明において様々な変更形態及び変形形態を行うことができることが当業者には明らかである。本発明の他の実施形態は、本明細書を検討し、本明細書に開示される本発明を実施することによって当業者に明らかである。本明細書及び実施例は単なる例示とみなされ、本発明の真の範囲及び趣旨は添付の特許請求の範囲によって示されることが意図される。本願全体を通して、様々な刊行物、特許及び/又は特許出願は、本発明が関連する現行の技術水準をより完全に説明するために参照される。これらの刊行物、特許及び/又は特許出願の開示は、各々独立した刊行物、特許及び/又は特許出願が具体的かつ個別に引用することにより本明細書の一部をなすかのように、それらの全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする。"