"タンパク質の分離及び精製のためのシステムにおいて、a.混合ループと、b.酸又はアルカリの供給源と連通している入口と、前記混合ループと連通している出口と、を有する一次ポンプと、c.酸又はアルカリの供給源と連通している入口と、前記混合ループと連通している出口と、を有する濃縮ポンプと、d.前記混合ループと連通し、イオン交換樹脂が詰められており、第1の等電点を有する第1のタンパク質と第2の等電点を有する第2のタンパク質とを含有するタンパク質溶液が装填される液体クロマトグラフィー塔と、e.前記混合ループと連通していて、前記混合ループの中の滴定溶液のpHが検出され、検出されたpHに基づいて前記滴定溶液のpHが調節されるように、インラインプロセスpH分析部を含んでいる、プロセス制御フィードバックループと、を備えており、それにより、前記混合ループの中に前記一次ポンプと前記濃縮ポンプによって前記滴定溶液が提供され、前記混合ループの中の前記滴定溶液のpHが、前記フィードバックループによって、前記インラインプロセスpH分析部によって検出されたpHに基づき、前記第1のタンパク質と前記第2のタンパク質を前記液体クロマトグラフィー塔から別々に溶離させるように当該クロマトグラフィー塔へ概ね直線状のpH勾配を提供するべく調節される、システム。前記混合ループ内に再循環ポンプを更に備えている、請求項1に記載のシステム。前記プロセス制御フィードバックループは、酸又はアルカリの供給源と連通している入口と前記混合ループと連通している出口とを有する滴定ポンプを含み、前記混合ループの中の前記滴定溶液のpHが前記滴定ポンプからの酸又はアルカリを用いて調節されるようにしている、請求項3に記載のシステム。前記プロセス制御フィードバックループは、前記滴定ポンプの入口と連通している複数の自動式滴定弁を含んでいる、請求項3に記載のシステム。前記インラインプロセスpH分析部は、前記混合ループと連通しているpHセンサーと、前記pHセンサー、前記滴定ポンプ、及び前記自動式滴定弁と連通している制御器と、を含んでいる、請求項4に記載のシステム。前記インラインプロセスpH分析部は、前記混合ループと連通しているpHセンサーと、前記pHセンサー及び前記滴定ポンプと連通している制御器と、を含んでいる、請求項3に記載のシステム。前記制御器はプログラム可能な論理制御器である、請求項6に記載のシステム。前記制御器はPID制御器として構成されている、請求項6に記載のシステム。前記インラインプロセスpH分析部は、前記混合ループと連通しているpHセンサーと、前記pHセンサーと連通している制御器と、を含んでいる、請求項1に記載のシステム。前記制御器はプログラム可能な論理制御器である、請求項9に記載のシステム。前記制御器はPID制御器として構成されている、請求項9に記載のシステム。前記一次ポンプは、WFIポンプである、請求項1に記載のシステム。前記プロセス制御フィードバックループは、前記混合ループの中の前記滴定溶液のpHが、前記一次ポンプからの酸又はアルカリ及び/又は前記濃縮ポンプからの酸又はアルカリによって調節されるように、前記一次ポンプと前記濃縮ポンプの少なくとも一方と連通している、請求項1に記載のシステム。前記インラインプロセスpH分析部は、前記混合ループと連通しているpHセンサーと、前記pHセンサー及び前記一次ポンプと前記濃縮ポンプの少なくとも一方と連通している制御器と、を含んでいる、請求項13に記載のシステム。前記制御器はプログラム可能な論理制御器である、請求項14に記載のシステム。前記制御器はPID制御器として構成されている、請求項14に記載のシステム。タンパク質を分離し精製するための方法において、a.混合ループと、前記混合ループと連通している一次ポンプと、前記混合ループと連通している濃縮ポンプと、前記混合ループと連通している液体クロマトグラフィー塔と、前記混合ループと連通していて、前記混合ループの中の滴定溶液のpHが検出され、検出されたpHに基づいて前記滴定溶液のpHが調節されるように、インラインプロセスpH分析部を含んでいる、プロセス制御フィードバックループと、を提供する段階と、b.前記液体クロマトグラフィー塔にイオン交換樹脂を詰める段階と、c.前記クロマトグラフィー塔に、第1の等電点を有する第1のタンパク質と第2の等電点を有する第2のタンパク質を含有するタンパク質溶液を装填する段階と、d.前記一次ポンプを使用して前記混合ループに酸又はアルカリを供給する段階と、e.前記濃縮ポンプを使用して前記混合ループに酸又はアルカリを供給し、前記混合ループの中に前記滴定溶液を作製する段階と、f.前記混合ループの中の前記滴定溶液を、前記フィードバックループを使用して、前記インラインプロセスpH分析部によって検出されたpHに基づき、前記第1のタンパク質と前記第2のタンパク質を前記液体クロマトグラフィー塔から別々に溶離させるように当該クロマトグラフィー塔へ概ね直線状のpH勾配を提供するべく調節する段階と、を備えている方法。前記プロセス制御フィードバックループは、滴定ポンプを含んでおり、前記f段階の前記滴定溶液は、前記滴定ポンプによって提供される酸又はアルカリによって調節される、請求項17に記載の方法。前記プロセス制御フィードバックループは、前記一次ポンプと前記濃縮ポンプの少なくとも一方と連通しており、前記f段階の前記滴定溶液は、一次ポンプ及び/又は濃縮ポンプによって提供される酸又はアルカリによって調節される、請求項17に記載の方法。前記一次ポンプと前記濃縮ポンプの一方の周波数は、前記d段階と前記e段階の間は定常に保持され、一方、前記一次ポンプと前記濃縮ポンプの他方の周波数は、前記d段階と前記e段階の間は変化する、請求項17に記載の方法。0013本発明によれば、図3に全体が20で表示されているもの、及びBellafioreら本出願の譲受人に譲渡されている米国特許第7515994号にある様な、精密配合モジュール又はインライン緩衝剤希釈装置を、液体クロマトグラフィー塔に装填されたタンパク質溶液からのタンパク質の分離及び精製に向けて配合液体の直線状のpH勾配を作り出すために使用することができる。米国特許第7515994号並びに関連の米国特許第7,072,742号及び米国特許出願公開第2008/0279038号の内容を、これにより参考文献として援用する。[0014]図3は、本発明のシステムの或る実施形態におけるIBD装置20の配管及び器具類の配線図を示している。酸又は塩基/アルカリの何れかが一次ポンプ21に接続され、他方が濃縮ポンプ22に接続されている。一次入口弁23が一次ポンプ21の入口と連通しており、同ポンプ21は注入水WFIポンプであってもよい。多数の濃縮入口弁25a-25dが濃縮ポンプ22の入口と連通している。酸性溶液とアルカリ性溶液は、好適には再循環ポンプ27を特徴とする混合ループ24の中へ送り込まれるが、そこでは得られた滴定溶液をpHセンサー26を介し制御器30によって即座に分析することができ、こうしてインラインプロセスpH分析部が形成されている。センサー26は制御器30とインターフェースし、当該制御器30は自動式滴定弁31a-31c及び滴定ポンプ32とインターフェースしており、こうして図3に全体が28で表示されているプロセス制御フィードバックループが形成されている。[0015]制御器30は、単に一例として、プログラム可能な論理制御器PLCであってもよい。使用者によって定義されたpHパラメータに従って、制御器30は、pHセンサー26を介し、継続的に、混合ループ24の中の溶液の酸性度を監視し、自動式滴定弁31a-31cを操作し、滴定ポンプ32を制御することによって、酸又は塩基をそれぞれ混合ループへ送り込ませ、前記酸性度を調節する。その結果、滴定ポンプ32の運転と弁31a-30cの設定によって、使用者の要件を満たすべく概ね直線状のpH勾配が作成される。本発明の方法の或る実施形態によれば、使用者の要件とは、クロマトグラフィー塔34に装填されたタンパク質溶液からのタンパク質の分離及び精製に向けて、当該液体クロマトグラフィー塔34への配合液体の送達中に直線状のpH勾配を提供させることである。[0016]制御器30は、制御器ソフトウェアを介して、滴定弁31a-31c及び滴定ポンプ32を制御し、使用者によって定義された設定点をIBD装置20へ組み込むように、比例-積分-微分PID制御器として構成されているのが望ましい。当技術で知られている様に、PID制御器アルゴリズムの3つのパラメータを調整することにより、制御器は特定のプロセス要件用に設計された制御動作を提供することができる。制御器の応答は、制御器の誤差に対する感応度、即ち制御器が設定点を行き過ぎる度合い及びシステムの振れの度合い、の観点で記述することができる。[0017]本発明のシステム及び方法の或る実施形態によれば、図3のIBD装置20は、陽イオン交換樹脂例えば、TosohBiosciences社から入手可能が詰められたクロマトグラフィー塔34に接続されている。単に一例として、クロマトグラフィー塔は、10cmの内径を有していてもよい。陽イオン樹脂の代わりとして陰イオン交換樹脂が使用されていてもよい即ち、本発明では何れのイオン交換樹脂が使用されていてもよいものと理解されたい。以下でより詳細に説明されている様に、本発明の或る実施形態では、2つのタンパク質、例えばリボヌクレアーゼAとトリプシノゲン例えばWorthingtonEnzymes社及びSigmaAldrich社からそれぞれ入手可能を分離及び精製するのに、酢酸例えばAmresco社から入手可能と水酸化アンモニウム例えばJTBaker社から入手可能が、図3の40と42の酸と塩基/アルカリとしてそれぞれ使用されている。[0018]図3のIBD装置20を使用し、酢酸20mM溶液の供給源40が、開いている入口弁25bを介して濃縮ポンプ22に接続され、濃縮ポンプ22は12.3の同じ起点ポンプ周波数と終点ポンプ周波数で稼働される。水酸化アンモニウム10mMの供給源42が、開いている入口弁23を介して一次ポンプ21に接続され、一次ポンプ21は14の起点ポンプ周波数と10の終点周波数で運転される。溶液の酸性度が、継続的に、pHセンサー26と制御器30を介し、10の起点ポンプ周波数と100の終点ポンプ周波数の滴定ポンプ32から送達される水酸化アンモニウム100mMを用いて調節され、当該水酸化アンモニウムの供給源は図3に36で表示されている。滴定弁31bは開いているが、弁31aと31cは閉じている。最初の5分間は、配合物のpHは6に維持され、その後に30分間に亘ってpH10.3に達するまで直線状勾配実行方式が続く。[0019]起点ポンプ周波数と終点ポンプ周波数はポンプの強さに依存することに留意されたく、ポンプの強さは、図示の実施形態では、一次ポンプ21が300リットル/時、そして濃縮ポンプ22が150リットル/時である。例えば、仮に一次1ポンプ21の強さが300リットル/時から400リットル/時に変更されたなら、直線状のpH勾配を得るためには新しいポンプ周波数が必要となるであろう。加えて、仮に溶液のモル濃度が、例えば20mMから40mMに変更されたなら、ポンプ周波数も調節されなければならないであろう。[0020]上の段落の方法との比較を提供するため、図3のIBD装置を使用して、但しフィードバックループ28と滴定ポンプ32は使用せずに、pH勾配を生成した。より具体的には、pH調節のためのフィードバック制御を空転状態としたこと以外、ポンプ21と22の向きと移動相の濃度は上の段落の直線状pH勾配の場合と同じであった。濃縮ポンプ22の起点周波数は29.3、終点は7.39であり、一方、一次ポンプ21は初期10から40分間を経て最終29.45に上昇した。初期pHは5未満しかなかったが、最終pHは約11であった。[0021]2つのタンパク質のうち、トリプシノゲンは8.3に等しい等電点pIを有し、リボヌクレアーゼAは9.4に等しいpIを有している。前述の実行方式の両方について、それぞれのタンパク質50mgを、20mM酢酸、pH4、と10mM塩化ナトリウムに溶かした。混合物を陽イオン交換樹脂が詰められた塔34へ装填した。装填前、塔をpH6の開始緩衝剤で事前に平衡化した。[0022]先に述べられている様に、それぞれの実行方式では、弱酸である20mM酢酸を10mM水酸化アンモニウムを用いて滴定して、pH曲線を作成した。図4は2つの実行方式の結果を示している。フィードバックループ28と滴定ポンプ32を介したpH調節及び制御なしに、単純に酸とアルカリを配合した方式即ち、受動的IBD装置では、図4のX線42によって示されている様に典型的なS字状の滴定曲線が生成された。pH値の6.5から9.5への急激な上昇は、pIがこの範囲に入るであろうとされるタンパク質を分解するのを困難にする。対照的に、IBD装置20の能動的使用、即ち、フィードバックループ28と滴定ポンプ32を使用すると、図4のO線44で表わされている直線状のpH勾配を発現させ、塔34へ送達することができた。能動的IBD装置20の方法でのインターフェースされたプロセス制御フィードバックループ28は、絶えずループ24の中の溶液のpHを分析、調節し、何れの所与の時点においても、現在のプロセス値を、制御器30の中の使用者によって定義されたpH目標設定点図4の線46に参照付けた。より具体的には、制御器30は、pHセンサー26からの読み取り値に基づき、信号を送って滴定ポンプ32の速度を調節させ、混合ループ24の中の動的pH値が事前に決められた設定点に向けて継続的に調節されるようにした。[0023]以上に述べられている様に、能動的IBD装置システム及び方法におけるpH制御の有効性を例証するために、似たpIを有する2つのタンパク質であるトリプシノゲンとリボヌクレアーゼAが選定されており、有効性は当該2つのタンパク質の溶離挙動が表されている図5に最も明瞭に示されている。受動的IBD装置20運転の場合には、pHが数分内に6.5から9.5へ急上昇したことで、両方のタンパク質が脱離し、ほとんど一体に、塔から出口50図3を通って溶離してしまった。結果として、図5の線52で明証されているように、分解はうまくいかなかった。他方、能動的IBD装置pH制御による緩やかなpH増加は、2つのタンパク質のイオン特性を選択的に制御し、ゆっくりと変化させた。結果として、タンパク質は両方とも、図4の線54で示されているように出口50を通って基線分離された。[0024]図に示され、以上に説明されている本発明のシステム及び方法の実施形態、即ち、能動的IBD装置が使用されている実施形態は、概ね直線状のpH勾配を作り出すことができた。プロセス制御フィードバックループ28内に含められたインラインプロセスpH分析部pHセンサー26と制御器30を有することによって、2つのタンパク質、トリプシノゲンとリボヌクレアーゼAは、首尾よく分解された。本発明の技術は、互いに似たpIを有する他のタンパク質同士を分離したり、高分子重量凝集体を親単量体から取り除いたりするように拡張することもできるであろう。[0025]図3-図5に示され、以上に説明されている本発明のシステム及び方法の実施形態は、3つの液体又は溶媒を配合/混合しているが、本発明は、代わりの実施形態として、例えば図3の一次ポンプ21と濃縮ポンプ32を介して提供される2つの液体又は溶媒を混合することによって直線状のpH勾配が得られる実施形態に構成され、実践されてもよい。図3のシステムは、その様な実施形態では、滴定ポンプ32を非活動/空転状態にして使用されてもよい。[0026]その様な2液手法の結果の一例が図6に提供されている。図6を生成するのに使用されている2溶媒システムでは、酢酸40mM、pH4、が一次ポンプ21を介して提供され、リン酸三ナトリウム20mM、pH12、が濃縮ポンプ22を介して提供されている。図6に62で表示されている直線状の勾配を実現するため、ポンプ21及び22からの溶媒は、得られた滴定溶液をpHセンサー26に接続されている制御器30によって即座に分析し、ひいてはインラインプロセスpH分析部を形成している、混合ループ24の中へ送り込まれる。図3に示されている様に、同様にPID制御器として構成されているのが望ましいとされる制御器70は、ポンプ21及び22とインターフェースし、それらのポンプを制御しており、こうして図3に全体が72で表示されているプロセス制御フィードバックループが形成されている。使用者によって定義されたpHパラメータに従って、制御器70は、pHセンサー26を介し、継続的に、溶液の酸性度を監視し、ポンプ21と22を制御して酸又は塩基を提供させることにより、酸性度を調節する。その結果、ポンプ21と22の運転により、使用者の要件を満たすべく概ね直線状のpH勾配が作成される。[0027]流量制御運転モードでの上の段落の方法との比較を提供するために、図3のIBD装置20を使用し、但しpHセンサー26も制御器70も使用せずに、pH勾配を生成した。より具体的には、pH調節のためのフィードバック制御を空転状態としたこと以外、ポンプ21と22の向きと移動相の濃度は上の段落の直線状pH勾配実行方式の場合と同じであった。結果として、図6に60で表わされている流量制御曲線が生成された。図6では曲線60のpH8から開始して2分間を経てpH11まで上昇する急勾配の傾きに注目されたい。[0028]図6の直線状勾配方式結果62を生成する際に、一次ポンプ21は、24の起点周波数と10の終点周波数で運転され、一方、濃縮ポンプ22は10の起点周波数と67の終点周波数で運転された2つのポンプの合同流量は0.4L/分に等しい。図6の流量制御方式結果60を生成するために、一次ポンプ21は、64の起点周波数と10の終点周波数で運転され、一方、濃縮ポンプ22は、5の起点周波数と67の終点周波数で運転された2つのポンプの合同流量は0.4L/分に等しい。[0029]本発明の好適な実施形態を示し説明してきたが、実施形態には、付随の特許請求の範囲によって範囲が定義されている本発明の精神から逸脱することなく変更、修正を加えてもよいことが当業者には自明であろう。"