"Gaussiaルシフェラーゼの発光機能の阻害活性を有し、かつGaussiaルシフェラーゼを特異的に認識する、抗Gaussiaルシフェラーゼモノクローナル抗体もしくはその機能性断片。Gaussiaルシフェラーゼを抗原とし、マウス脾細胞を免疫感作して得られた細胞を、CpGモチーフを含むオリゴヌクレオチドからなる免疫賦活物質により活性化させ、次いでミエローマ細胞と融合して得られたハイブリドーマが産生する、請求項1に記載のモノクローナル抗体もしくはその機能性断片。前記ハイブリドーマがハイブリドーマGL-11-6株FERMP-22113、又はGL-61-2株FERMP-22114である、請求項2に記載のモノクローナル抗体もしくはその機能性断片。前記機能性断片が、少なくとも抗Gaussiaルシフェラーゼモノクローナル抗体軽鎖可変領域を含むものであり、CDR1領域として配列番号2もしくは5,CDR2領域として配列番号3もしくは6,CDR3領域として配列番号4もしくは7に示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項1~3のいずれかに記載のモノクローナル抗体もしくはその機能性断片。前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号48もしくは50に示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項4に記載のモノクローナル抗体もしくはその機能性断片。前記機能性断片が、少なくとも抗Gaussiaルシフェラーゼモノクローナル抗体重鎖可変領域を含むものであり、CDR1領域として配列番号8もしくは11,CDR2領域として配列番号9もしくは12,CDR3領域として配列番号10もしくは13に示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項1~5のいずれかに記載のモノクローナル抗体もしくはその機能性断片。前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号49もしくは51に示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項6に記載のモノクローナル抗体もしくはその機能性断片。Gaussiaルシフェラーゼの発光機能の阻害活性を有し、かつGaussiaルシフェラーゼを特異的に認識する抗Gaussiaルシフェラーゼモノクローナル抗体もしくはその機能性断片をコードする核酸であって、CDR1領域として配列番号2もしくは5,CDR2領域として配列番号3もしくは6,CDR3領域として配列番号4もしくは7に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を少なくとも含むアミノ酸配列をコードする核酸。前記軽鎖可変領域が配列番号48又は50に示されるアミノ酸配列を含む、請求項8に記載の核酸。Gaussiaルシフェラーゼの発光機能の阻害活性を有し、かつGaussiaルシフェラーゼを特異的に認識する抗Gaussiaルシフェラーゼモノクローナル抗体もしくはその機能性断片をコードする核酸であって、CDR1領域として配列番号8もしくは11,CDR2領域として配列番号9もしくは12,CDR3領域として配列番号10もしくは13に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を少なくとも含むアミノ酸配列をコードする核酸。前記重鎖可変領域が配列番号49又は51に示されるアミノ酸配列を含む、請求項10に記載の核酸。Gaussiaルシフェラーゼを抗原とし、マウス脾細胞を免疫感作して得られた細胞を、CpGモチーフを含むオリゴヌクレオチドからなる免疫賦活物質により活性化させ、次いでミエローマ細胞と融合して得られたハイブリドーマであって、Gaussiaルシフェラーゼの発光機能の阻害活性を有し、かつGaussiaルシフェラーゼを特異的に認識する、抗Gaussiaルシフェラーゼモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。ハイブリドーマGL-11-6株FERMP-22113、又はGL-61-2株FERMP-22114である、請求項11に記載のハイブリドーマ。請求項8~11のいずれかに記載のGaussiaルシフェラーゼの発光機能の阻害活性を有し、かつGaussiaルシフェラーゼを特異的に認識する抗Gaussiaルシフェラーゼモノクローナル抗体もしくはその機能性断片をコードする核酸を用いて形質転換された細胞であって、Gaussiaルシフェラーゼの発光機能の阻害活性を有し、かつGaussiaルシフェラーゼを特異的に認識する抗Gaussiaルシフェラーゼモノクローナル抗体もしくはその機能性断片を産生する形質転換細胞。本発明の課題は、Gaussiaルシフェラーゼを認識し、その機能を阻害する分子を、モノクローナル抗体あるいはCDR配列を活性化断片として提供することにある。さらに該抗体を容易にかつ多量に生産しうる細胞を提供しようとするものである。本発明者等は、以前に、体外に取り出した免疫細胞を免疫賦活物質、特にCpGモチーフを含むオリゴヌクレオチドを含有する培地で培養することにより、目的抗原を認識するB細胞が特異的に活性化され、かつミエローマ細胞との融合効率が飛躍的に高まることを見いだし、当該抗原特異的抗体産生細胞を片親としたハイブリドーマを用いた抗原特異モノクローナル抗体の産生方法に係る発明を完成させ、特許出願をしている特許出願2011-020472号。本発明者らは、このGaussiaルシフェラーゼの発光機能を変化させる抗体の提供が従来なされなかった理由が、Gaussiaルシフェラーゼを特異的に認識する陽性クローン数が少ないことに起因するのではないか、という推論をたて、上記本発明者らの開発した効率的な電気的細胞融合法を適用することに思い至った。その結果、Gaussiaルシフェラーゼを特異的に強く認識するだけでなく、かつGaussiaルシフェラーゼ活性を阻害して、その発光活性を変化させることのできるモノクローナル抗体産生能を有するハイブリドーマの樹立に成功し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下のとおりである。1Gaussiaルシフェラーゼの発光機能の阻害活性を有し、かつGaussiaルシフェラーゼを特異的に認識する、抗Gaussiaルシフェラーゼモノクローナル抗体もしくはその機能性断片。2Gaussiaルシフェラーゼを抗原とし、マウス脾細胞を免疫感作して得られた細胞を、CpGモチーフを含むオリゴヌクレオチドからなる免疫賦活物質により活性化させ、次いでミエローマ細胞と融合して得られたハイブリドーマが産生する、前記1に記載のモノクローナル抗体もしくはその機能性断片。3前記ハイブリドーマがハイブリドーマGL-11-6株FERMP-22113、又はGL-61-2株FERMP-22114である、前記2に記載のモノクローナル抗体もしくはその機能性断片。4前記機能性断片が、少なくとも抗Gaussiaルシフェラーゼモノクローナル抗体軽鎖可変領域を含むものであり、CDR1領域として配列番号2もしくは5,CDR2領域として配列番号3もしくは6,CDR3領域として配列番号4もしくは7に示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、前記1~3のいずれかに記載のモノクローナル抗体もしくはその機能性断片。5前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号48もしくは50に示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、前記4に記載のモノクローナル抗体もしくはその機能性断片。6前記機能性断片が、少なくとも抗Gaussiaルシフェラーゼモノクローナル抗体重鎖可変領域を含むものであり、CDR1領域として配列番号8もしくは11,CDR2領域として配列番号9もしくは12,CDR3領域として配列番号10もしくは13に示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、前記1~5のいずれかに記載のモノクローナル抗体もしくはその機能性断片。7前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号49もしくは51に示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、前記6に記載のモノクローナル抗体もしくはその機能性断片。8Gaussiaルシフェラーゼの発光機能の阻害活性を有し、かつGaussiaルシフェラーゼを特異的に認識する抗Gaussiaルシフェラーゼモノクローナル抗体もしくはその機能性断片をコードする核酸であって、CDR1領域として配列番号2もしくは5,CDR2領域として配列番号3もしくは6,CDR3領域として配列番号4もしくは7に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を少なくとも含むアミノ酸配列をコードする核酸。9前記軽鎖可変領域が配列番号48又は50に示されるアミノ酸配列を含む、前記8に記載の核酸。10Gaussiaルシフェラーゼの発光機能の阻害活性を有し、かつGaussiaルシフェラーゼを特異的に認識する抗Gaussiaルシフェラーゼモノクローナル抗体もしくはその機能性断片をコードする核酸であって、CDR1領域として配列番号8もしくは11,CDR2領域として配列番号9もしくは12,CDR3領域として配列番号10もしくは13に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を少なくとも含むアミノ酸配列をコードする核酸。11前記重鎖可変領域が配列番号49又は51に示されるアミノ酸配列を含む、前記10に記載の核酸。12Gaussiaルシフェラーゼを抗原とし、マウス脾細胞を免疫感作して得られた細胞を、CpGモチーフを含むオリゴヌクレオチドからなる免疫賦活物質により活性化させ、次いでミエローマ細胞と融合して得られたハイブリドーマであって、Gaussiaルシフェラーゼの発光機能の阻害活性を有し、かつGaussiaルシフェラーゼを特異的に認識する、抗Gaussiaルシフェラーゼモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。13ハイブリドーマGL-11-6株FERMP-22113、又はGL-61-2株FERMP-22114である、前記11に記載のハイブリドーマ。14前記8~11のいずれかに記載のGaussiaルシフェラーゼの発光機能の阻害活性を有し、かつGaussiaルシフェラーゼを特異的に認識する抗Gaussiaルシフェラーゼモノクローナル抗体もしくはその機能性断片をコードする核酸を用いて形質転換された細胞であって、Gaussiaルシフェラーゼの発光機能の阻害活性を有し、かつGaussiaルシフェラーゼを特異的に認識する抗Gaussiaルシフェラーゼモノクローナル抗体もしくはその機能性断片を産生する形質転換細胞。本発明の機能性抗体を用いれば、Gaussiaルシフェラーゼの発光を任意の場所で任意の時間に消滅させることが可能である。これにより、レポーターアッセイの高度化や、組織や細胞内でのGaussiaルシフェラーゼのより高精度な局在の可視化が可能となる。したがって、本発明により発光機能を制御可能なモノクローナル抗体が提供できたことで、創薬アッセイ、医薬あるいは化粧品その他の分野において大いに貢献できる。1.抗Gaussiaルシフェラーゼモノクローナル抗体本発明の抗Gaussiaルシフェラーゼモノクローナル抗体は、Gaussiaルシフェラーゼの発光機能の阻害活性を有し、かつGaussiaルシフェラーゼを特異的に認識するものであり、典型的にはハイブリドーマGL116株受託番号FERMP-22113、及びGL612株FERMP-22114が産生するモノクローナル抗体である。それぞれのハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体であるGL116抗体及びGL612抗体の可変領域、及びCDRの配列が決定されている。具体的には、GL116抗体の軽鎖可変領域VL,及び重鎖可変領域VHのアミノ酸配列が、それぞれ配列番号48及び配列番号49であり、GL612抗体のVL及びVHのアミノ酸配列が、それぞれ配列番号50及び51であることが決定され、各々のCDR領域に対応するCDR配列も決定されている表1,2。したがって、本発明のモノクローナル抗体及びその機能性断片は、上記特定のモノクローナル抗体由来のものに限られず、Gaussiaルシフェラーゼの発光機能の阻害活性を有する抗Gaussiaルシフェラーゼモノクローナル抗体もしくはその機能性断片であれば全て包含される。ここで、本発明の抗Gaussiaルシフェラーゼモノクローナル抗体における機能性断片というとき、抗Gaussiaルシフェラーゼモノクローナル抗体の特徴的な機能であるGaussiaルシフェラーゼの発光機能の阻害活性をし、かつGaussiaルシフェラーゼを特異的に認識する機能を保持する断片であることを意味する。いわゆるFab断片、VL断片、VH断片、scFv断片がこれに相当する。そのような機能性断片は、具体的には、少なくともCDR1領域として配列番号2もしくは5,CDR2領域として配列番号3もしくは6,CDR3領域として配列番号4もしくは7に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むか、又は、少なくともCDR1領域として配列番号8もしくは11,CDR2領域として配列番号9もしくは12,CDR3領域として配列番号10もしくは13に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含むことを特徴とする。そして、好ましくは、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、少なくともCDR1領域として配列番号2,CDR2領域として配列番号3,CDR3領域として配列番号4に示されるアミノ酸配列を含むか、又はCDR1領域として配列番号5,CDR2領域として配列番号6,CDR3領域として配列番号7に示されるアミノ酸配列を含む機能性断片であるか、あるいは重鎖可変領域のアミノ酸配列が、少なくともCDR1領域として配列番号8,CDR2領域として配列番号9,CDR3領域として配列番号10に示されるアミノ酸配列を含むか、又はCDR1領域として配列番号11,CDR2領域として配列番号12,CDR3領域として配列番号13に示されるアミノ酸配列を含む、機能性断片である。さらに好ましくは、軽鎖可変領域のアミノ酸配列として、配列番号48又は50に示されるアミノ酸配列を含む機能性断片であるか、又は重鎖可変領域のアミノ酸配列として、配列番号49又は51に示されるアミノ酸配列を含む機能性断片である。本発明の抗Gaussiaルシフェラーゼモノクローナル抗体というときも同様に、上記機能性断片を包含していればよいから、キメラ抗体又はヒト化抗体なども包含される。2.抗Gaussiaルシフェラーゼモノクローナル抗体の製造方法1ハイブリドーマ法本発明のGaussiaルシフェラーゼモノクローナル抗体は、Gaussiaルシフェラーゼを抗原とし、ハイブリドーマ法により得られたものであるが、この製法についてさらに具体的に説明する。使用する抗原は、Gaussiaルシフェラーゼ遺伝子を用いて形質転換した大腸菌からの組換えGaussiaルシフェラーゼを分離精製したものである。抗体を作製するにあたり、マウスに抗原を腹腔内注入し、免疫する方法を用いた。次いで、上述の本発明者らが以前に開発した免疫細胞の賦活化法特許出願2011-020472号の方法に従い、免疫感作されたマウス体外に取り出した脾細胞を、CpGモチーフを含むオリゴヌクレオチドからなる免疫賦活物質を含有する培地で培養し、Gaussiaルシフェラーゼを特異的に認識するB細胞を活性化させる。次いで、ミエローマ細胞と電気的細胞融合法により細胞融合させ、常法により、HAT培地でハイブリドーマを選別し、さらに限界希釈法により得たハイブリドーマの各クローンの培養上清を、上記抗原を使用した発光アッセイにより測定し、発光を変化させる陽性のハイブリドーマクローンを得る。この後、Gaussiaルシフェラーゼ抗体産生ハイブリドーマを得、産生能力及び増殖性が良好なクローンをさらにスクリーニングして、本発明のGaussiaルシフェラーゼモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得た。すなわち、Gaussiaルシフェラーゼを特異的に強く認識し、かつGaussiaルシフェラーゼ活性を阻害して、その発光活性を変化させることのできるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマGL116株、及びGL612株を樹立した。同時に、Gaussiaルシフェラーゼを特異的に強く認識するが発光活性は変化させないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマGL203株も樹立しており、比較のために用いた。以上の通りに得られたハイブリドーマGL116株、及びGL612株は、2011年4月28日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、それぞれ受託番号FERMP-22113、及びFERMP-22114として寄託されている。上記ハイブリドーマから得られた本発明の抗Gaussiaルシフェラーゼモノクローナル抗体は、いずれもGaussiaルシフェラーゼの発光を阻害する。2遺伝子組換え法本発明の抗Gaussiaルシフェラーゼモノクローナル抗体又はその機能的断片については、すでに軽鎖及び重鎖の可変領域、さらにはそれぞれのCDR領域の配列が決定されている上記1.ので、これら配列情報を利用して、一般的な遺伝子組換え技術によりCOS細胞、CHO細胞、HEK293細胞、HeLa細胞、NIH3T3細胞、Huvec細胞、Jurkat細胞など汎用の宿主細胞から、大量に製造することが可能である。また、上記CDR領域をヒト由来FR及び定常領域と機能的に繋ぎヒト化抗体を作製すること、又は上記軽鎖及び重鎖の可変領域をヒト由来定常領域と繋ぎキメラ抗体を作製することも可能である。3.本発明の抗Gaussiaルシフェラーゼモノクローナル抗体の特性1抗体の発光阻害機能の評価免疫に用いた組換えGaussiaルシフェラーゼを発光バッファーで段階的に希釈してウェル内に分注し、室温で反応させる。反応後に発光基質Coelenterazineを加え、ルミノメーターで発光を測定する。抗体濃度を変化させて,発光強度を測定することで、発光阻害機能を有することが実証できる。本発明のGL116抗体及びGL612抗体は、いずれも抗体濃度依存的にGaussiaルシフェラーゼの発光を阻害する。一方、発光阻害機能の無いGL203抗体は抗体濃度に関わらず一定の発光を示す。本発明のGL116抗体及びGL612抗体は、10μgで、1μgのGaussiaルシフェラーゼの発光量を10以下にまで低下させることができる。2抗体の抗原親和性の測定、評価Gaussiaルシフェラーゼへの抗原親和性の測定には、表面プラズモン共鳴法、ウェスタンブロッティング法、ラジオイムノアッセイ法、競合法などの種々の方法で決定できるが、典型的にはELISA法が用いられる。具体的には、免疫に用いた精製Gaussiaルシフェラーゼを、ウェル内でコーティング処理、ブロッキング処理を行い、精製抗体の段階的な希釈系列を作製して、1次抗体反応を行う。1次抗体反応溶液を廃棄、洗浄し、アルカリフォスファターゼ標識2次抗体を作用させる。アルカリフォスファターゼ発色基質で発色させ、マイクロプレートリーダーにより波長405nmにおける吸光度を測定する。本発明のGL116抗体及びGL612抗体は、いずれもGaussiaルシフェラーゼ全体に対しては、比較の高親和性GL203抗体と同様の強い反応を示したが、GaussiaルシフェラーゼN末端断片に対しても、C末端断片に対しても反応しなかった。一方、GL203抗体はC末端断片に対して反応性を示した。このことは、本発明の抗体は両者とも、Gaussiaルシフェラーゼ全体の構造を認識していることが示されている。そして、酵素の発光機能を阻害していることからみて、酵素活性部位の近傍に結合して、基質との結合阻害を起こしているか、又は酵素活性部位の構造を変化させる機能を有していると考えられる。3抗原認識部位配列の検討GaussiaルシフェラーゼのN末端側から隣り合う15アミノ酸のペプチドが8アミノ酸ずつオーバーラップするよう合成した24種類のペプチドを用い、ELISA法により本発明のGL116抗体及びGL612抗体の各ペプチドへの反応性を観察したところ、両抗体はいずれのペプチドに対しても反応性は見いだせず、比較のGL203抗体がNo14ペプチドとのみ強い反応性を示したことと対照的な結果を得た。このことも、前記2の結果と同様、本発明のGL116抗体及びGL612抗体が、Gaussiaルシフェラーゼの配列ではなく構造を認識していることを強く示唆するものであり、発光機能が阻害されたことは、酵素活性部位と基質との結合が阻害されたことを意味する。その際、酵素活性部位の近傍に結合することで基質との結合を阻害することが考えられるが、酵素への結合がその立体構造自体を変化させることで、活性部位近傍の構造が変化して基質との結合を阻害する結果を引き起こしている可能性もある。4.本発明の抗Gaussiaルシフェラーゼモノクローナル抗体の用途1細胞内のGaussiaルシフェラーゼ発光の変化の利用本発明の抗体は、10μgで、1μgのGaussiaルシフェラーゼの発光量を10以下にまで低下させることができるため、被検物質を、当該抗体又はその断片に繋いだ融合タンパク質として遺伝子工学的に発現させることで、生体内細胞内でGaussiaルシフェラーゼと結合しているターゲットタンパク質との相互作用を,発光量の変化で経時的に観察することができる。これは、反対に本発明の抗体又はその断片をターゲット物質の側に結合させておき、Gaussiaルシフェラーゼと結合した被検物質の挙動を観察することもできる。そして、本発明では、本発明の2つの抗体のVL及びVH領域と共に、CDR領域の配列も決定しているので、これらの配列を利用してヒトに対する抗原性の少ないヒトキメラ抗体及びヒト化抗体を得ることも可能である。したがって、ヒト生体内での診断用キットとして利用することも可能である。2抗Gaussiaルシフェラーゼモノクローナル抗体のその他の用途抗Gaussiaルシフェラーゼモノクローナル抗体は上記用途のほかにも様々な用途に使用できる。これらについて以下に例示する。aGaussiaルシフェラーゼ結合蛋白質の同定精製本発明の抗Gaussiaルシフェラーゼモノクローナル抗体を用いて、カラムを作成することにより、Gaussiaルシフェラーゼ及びその類似タンパク質、またGaussiaルシフェラーゼに特異的に結合する蛋白質の同定精製を行うことができる。b本発明の抗Gaussiaルシフェラーゼモノクローナル抗体の改変によるルシフェラーゼに対する抗体の作製本発明の抗Gaussiaルシフェラーゼモノクローナル抗体であるGL116及びGL612抗体遺伝子が単離され、軽鎖及び重鎖の可変領域の塩基配列も決定されているので、少なくとも2種類の抗原認識部位CDRの遺伝配列を対比し比較検討することで、CDR領域の必須配列を残し、他の部分に変異を導入することにより、抗体の抗原特異性、発光機能阻害活性をさらに高めることが可能となった。さらに、認識機能の異なるモノクローナル抗体やGaussiaルシフェラーゼの発光機能を制御する抗体の作製の可能性もある。以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。本発明におけるその他の用語や概念は、当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものであり、本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。また、各種の分析などは、使用した分析機器又は試薬、キットの取り扱い説明書、カタログなどに記載の方法を準用して行った。なお、本明細書中に引用した技術文献、特許公報及び特許出願明細書中の記載内容は、本発明の記載内容として参照されるものとする。実施例1抗原Gaussiaルシフェラーゼの調整1-1Gaussiaルシフェラーゼ発現ベクターの構築5 ́末端にHisタグ遺伝子を付加したGaussiaルシフェラーゼ遺伝子配列番号1を人工的に合成し、KpnIとSacIで切断し、切断断片を同様の制限酵素で切断したpET30aタカラバイオ社に組み込み発現ベクターを構築した。1-2Gaussiaルシフェラーゼの発現Gaussiaルシフェラーゼ発現ベクターをBL21へ導入し、形質転換クローンをクローニングした。形質転換クローンは01mMIPTGでGaussiaルシフェラーゼの発現を誘導し、その後回収した大腸菌を破砕し、抗Hisタグ抗体カラムを用いGaussiaルシフェラーゼを精製し抗原を調整した。実施例2Gaussiaルシフェラーゼの免疫抗原GaussiaルシフェラーゼとFREUNDCompleteADJUVANTを混合し、BALBcマウスの腹腔に抗原100μg匹となるよう投与し、1次免疫を2週間行った。続いて、抗原とFREUNDIncompleteADJUVANTを混合し、1次免疫と同様に2次免疫を行った。最後の免疫から2週間後にマウスの腹腔に抗原100μgを投与しブーストした。実施例3免疫細胞とミエローマ細胞のハイブリドーマ作製3-1免疫細胞の調整免疫を行ったマウスより脾臓を摘出し、RPMI培養液中に分散させ、セルストレーナーBD社を通し夾雑物を取り除いた。次いで、LympholyteM上に細胞懸濁液を重層し、23°C、1000gで20分間遠心し、赤血球を取り除き、培養液で2回洗浄した。3-2免疫細胞の幼若化上記3-1で調整した免疫細胞は025μMCpGODN配列番号52のホスホロチオエート化、北海道システムサイエンス株式会社に委託して作成を添加したRPMI培養液に懸濁し、培養プレートに10mLずつ分注し、37°C、5CO2インキュベータ内で2日間培養した。3-3ミエローマ細胞の調整エレクトロフュージョン3日前にミエローマ細胞を起眠し、1×106mLの濃度を超えないようRPMI培養液に懸濁し37°C、5CO2インキュベータ内で培養した。3-4エレクトロフュージョン幼若化した免疫細胞とミエローマ細胞を各々180gで5分間遠心し、290mOsmInositol、05mM塩化マグネシウム、01mM塩化カルシウム、1mMリン酸カリウム、pH72バッファーに懸濁し、2回洗浄した。洗浄した細胞を5×106mLの濃度になるよう185mOsmInositolバッファーに懸濁し、免疫細胞とミエローマ細胞を1:1で混合した。細胞混合液80μLを2mmギャップ電極のエレクトロフュージョンチャンバーへ添加し、185mOsmInositolバッファーに懸濁から2分後に電気的細胞融合装置LF100ベックス社を用いて、アラインメントパルス35V30sec、パルス300V20μsec2cycle、ポストアラインメントパルス35V30secを与え、10分間静置し、エレクトロフュージョンを行った。その後、細胞を20FCSHyClone社、5BricloneQEDBIOSCIENCE社含有のフェノールレッド不含RPMI培養液10mlに懸濁し96ウェルマイクロプレートに100μLウェルで分注し、37°C、5CO2インキュベータ内で培養した。実施例4抗Gaussiaルシフェラーゼ抗体産生ハイブリドーマの取得4-1抗体産生ハイブリドーマの発光阻害スクリーニングGaussialuciferaseを125μgmLとなるよう発光バッファー200mMNaCl50mMTris008TritonX100pH76で希釈し、遮光96ウェルマイクロプレートに40μLウェルで分注した。上記で7日間培養したハイブリドーマの培養上清50μLを各ウェルに分注し、室温で30分間反応させた。発光基質のCoelenterazineを05μMとなるよう発光バッファーで希釈し、40μLウェルで分注し10分後にルミノメーター、CentroLB960ベルトールド社で発光を測定した。その結果、96ウェル中のNo11とNo61の2ウェルのハイブリドーマ培養上清に発光阻害が認められ、1次スクリーニングのみによって機能性抗体を確認した。なお、同時に、比較のために発光阻害はないが抗原親和性の高いクローンGL203も採取した。4-2ハイブリドーマのクローニング上記4-1で取得した発光阻害陽性ウェルのハイブリドーマを25×102mLとなるよう20FCS、5Briclone、1×HAT含有のRPMI培養液に懸濁し、96ウェルマイクロプレートに200μLウェルで分注した。その後、37°C、5CO2インキュベータ内で培養した。培養7日後に顕微鏡下でシングルクローンのみが存在するウェルを確認し、培養上清を回収し、前記4-1と同様に発光阻害活性を確認した。発光阻害抗体陽性の2ウェルから各々クローニングを行い、ハイブリドーマクローンGL116とGL612を得た。実施例5抗Gaussiaルシフェラーゼ抗体の取得5-1腹水の作製GL116とGL612のクローンをそれぞれ2×106500μLとなるようPBSに懸濁し、マウスの腹腔内に投与した。10日後に腹腔から腹水を回収し、室温で1時間静置後、4°C、3000rpmで15分間遠心し、中間層を回収した。5-2腹水からのIgGの精製腹水3mLを15mLの結合バッファーPBSpH74で希釈し、1mLPriteinGカラムGE社へ1分間に02mLの流速で送液しIgG抗体をカラムに結合する。次いで5mLの結合バッファーを送液しカラムを洗浄後、5mLの溶出バッファー01MGlycineHClpH27を送液し抗体を溶出した。溶出した抗体溶液は500μL毎に中和バッファー1MTrisHClpH90を50μLを分注したチューブに回収し、直ちに中和後、各フラクションをOD280で測定し、抗体の濃度を算出した。GL116は22mgmLの濃度で22mL、GL612は32mgmLの濃度で16mLを回収した。比較のためのGL203も同様に、22mgmLの濃度で16mLを回収した。実施例6取得抗体の発光阻害機能評価Gaussiaルシフェラーゼを125μgmLとなるよう発光バッファーで希釈し、遮光96ウェルマイクロプレートに40μLウェルで分注した。精製した抗Gaussiaルシフェラーゼ抗体の各クローンGL203GL116GL612を02mgmLから0032mgmLまで発光バッファーで段階的に希釈し、50μLを各ウェルに分注し、室温で30分間反応した。反応後にCoelenterazineを05μMとなるよう発光バッファーで希釈し、40μLウェルで分注し、10分後にルミノメーター、CentroLB960ベルトールド社で発光を測定した。結果を図1に示す。発光阻害機能の無いGL203は抗体濃度に関わらず、一定の発光であったのに対して、GL116とGL612は抗体濃度依存的にGaussiaルシフェラーゼの発光を阻害した。実施例7取得抗体のアイソタイプ決定GL116とGL612のマウス腹水から精製した抗体を05μgmLとなるよう、1BSAPBSで希釈し、溶液150μLをMouseMonoclonalAntibodyisotypingKitを用いてアイソタイプを決定した。結果、GL116のアイソタイプはIgG1、軽鎖はκ鎖、GL612のアイソタイプはIgG1、軽鎖はκ鎖であった。実施例8抗Gaussiaルシフェラーゼ抗体可変領域の遺伝子配列決定8-1可変領域VL、VHの増幅GL116とGL612のハイブリドーマクローンからRneasyMicroKitを用いてトータルRNAを抽出し、cDNA合成キットPerfectRealTime、タカラバイオ社で一本鎖cDNAを合成した。得られた一本鎖cDNAを鋳型とし、MouseIgPrimerSetを用いてPCRにより軽鎖と重鎖の可変領域VL、VHを増幅した。8-2可変領域VL、VH塩基配列の決定上記増幅産物をPCRPurificationKitキアゲン社で精製し、pGEMTVectorプロメガ社に挿入、TAクローニングの後、シークエンスを行い、VHとVLの塩基配列を決定したGL116クローン由来のVL塩基配列は配列番号44,VH塩基配列は配列番号45,GL612クローン由来のVL塩基配列は配列番号46、VH塩基配列は配列番号47であった。なお、対応するアミノ酸配列は、それぞれ配列番号48~51である。実施例9抗Gaussiaルシフェラーゼ抗体可変領域のアミノ酸配列の解析各ハイブリドーマクローンVL、VHの決定した塩基配列をもとに、それらにコードされるアミノ酸配列を解析し、CDRとFRの領域を決定した。結果を図2,3に示すとともに、軽鎖のCDR部分の配列を表1、重鎖のCDR部分の配列を表2、に示した。また、GL116、GL612の相同性を図4A,Bに示した。実施例10抗Gaussiaルシフェラーゼ抗体の抗原親和性10-1ELISAによるGaussiaルシフェラーゼへの親和性測定実施例1で精製したGaussiaルシフェラーゼをコーティングバッファーNa2CO3、NaHCO3、pH96で5μgmLとなるよう調整し、96ウェルマイクロプレートに50μLウェルで分注後、4°Cで1晩コーティングした。コーティング溶液を廃棄し、005TweenPBSで1回洗浄し、Blockingreagentロシュダイアグノスティック社を250μLウェルで分注し、室温で2時間ブロッキングした。ブロッキング溶液を廃棄、005TweenPBSで1回洗浄し、精製抗体GL203、GL116、GL612を1BSAPBSで40μgmLとなるよう希釈、さらに5倍希釈で希釈系列を作製し、50μLウェルで分注後、室温で2時間、1次抗体反応を行った。1次抗体反応溶液を廃棄、005TweenPBSで5回洗浄し、アルカリフォスファターゼ標識2次抗体AntiMouseIgGAP、ケミコン社を1BSAPBSで5000倍希釈し、50μLウェルで分注後、室温で1時間1次抗体反応を行った。2次抗体反応溶液を廃棄、005TweenPBSで5回洗浄し、アルカリフォスファターゼ発色基質SIGMAFASTpNitrophenylphosphatetablets、シグマ社を100μLウェルで分注し、室温で発色させ、マイクロプレートリーダーバイオラッド社を使用し波長405nmにおける吸光度を測定した。結果を図5に示した。発光阻害機能を有するGL116とGGL612はコントロールのGL203と比較して、抗原のGaussiaルシフェラーゼに対する親和性は同等あるいはそれ以上であることを示した。10-2GaussiaルシフェラーゼN末端側断片、C末端側断片発現ベクターの構築実施例1で調製したGaussiaルシフェラーゼ発現ベクターをテンプレートとし、N末端側のドメイン1配列番号18をプライマー1、プライマー2使用し、N末端側のドメイン2配列番号19をプライマー3、プライマー4を使用し、各々、PCRによる遺伝子断片の増幅を行った。用いたプライマー配列を下記に示す。プライマー15’ATCCGGGTCATATGCGTGGCAAACTGCCGGGC3’配列番号14プライマー25’GATCTCGAGATCCACAATCGCTTCGCCAA3’配列番号15プライマー35’ATCCGGGTCATATGATTCCGGAAATTCCGGGC3’配列番号16プライマー45’GATCTCGAGATCGCCGCCCGCGCCTTTAA3’配列番号172アガロースゲル電気泳動により増幅産物を確認した後、ゲルから増幅産物を切り出し、WizardSVGelandPCRcleanUpSystemプロメガ社のキットを用いて使用書に従い、精製した。精製したGaussiaルシフェラーゼN末端側断片、C末端側断片それぞれを2種類の制限酵素NdeI、XhoIにより切断し、同じ制限酵素で切断し精製したpET30aベクターに組込みGaussiaルシフェラーゼドメイン1とドメイン2の発現ベクターを構築した。Gaussiaルシフェラーゼドメイン1、Gaussiaルシフェラーゼドメイン2の遺伝子配列は下記の通りである。10-3Gaussiaルシフェラーゼドメイン1、ドメイン2の発現構築したGaussiaルシフェラーゼN末端側発現ベクター、GaussiaルシフェラーゼC末端側発現ベクターをBL21へ導入し、形質転換クローンをクローニングした。形質転換されたGaussiaルシフェラーゼドメイン1クローンは、01mMIPTG、25°C、3時間で発現を誘導し、その後回収した大腸菌を破砕し全画分を回収した。Gaussiaルシフェラーゼドメイン2クローンは、04mMIPTG、37°C、3時間で発現を誘導し、その後回収した大腸菌を破砕し全画分を回収した。10-4ウエスタンブロットによるGaussiaルシフェラーゼの全長、ドメイン1、ドメイン2への親和性実施例1で調製したGaussiaルシフェラーゼ2μg、Gaussiaルシフェラーゼドメイン1発現大腸菌破砕液100μL分のタンパク溶液、Gaussiaルシフェラーゼドメイン2発現大腸菌破砕液100μL分のタンパク溶液の3サンプルをサンプルバッファー0125Mトリス塩酸バッファー、10メルカプトエタノール、4SDS、20グリセロール、001ブロモフェノルブルーと等量ずつ混合し、95°C、5分加熱処理した後、5~20SDSポリアクリルアミドグラジエントゲルにアプライし、20mAの定電流で80分間泳動した。泳動が終了したゲルを転写バッファー中で、10分間振とうさせながら平衡化した。PVDF膜を転写バッファーで10分間振とうさせながら平衡化した。平衡化したPVDF膜にゲルを重ね、セミドライ式転写装置にて80mA、45分間タンパク質を転写した。転写後のPVDF膜を、ブロッキングバッファー5スキムミルク、005Tween20、PBSpH74で1時間ブロッキングを行った。GL116、GL203、GL612の腹水をそれぞれブロッキングバッファーで10000倍GL116、30000倍GL203、GL612希釈し、PVDF膜を浸け一次抗体反応を室温で1時間行った。コントロール用に抗Hisタグ抗体をブロッキングバッファーで1000倍希釈し反応させた。反応後のPVDF膜は洗浄バッファー005Tween20、PBSpH74で10分、3回洗浄した。二次抗体として抗マウスIgGIgMHRPconjugatedケミコン社をブロッキングバッファーで10000倍希釈し、室温で1時間反応させた。反応後のPVDF膜は洗浄バッファー005Tween20、PBSpH74で10分、4回洗浄した。洗浄後のPVDF膜は、化学発光試薬を使用書に従って調製後反応させた後、化学発光専用撮影装置{ChemistageCC16mini、クラボウ社}を用いて検出した。結果を図6に示した。発光阻害機能を有するGL116とGL612及び発光阻害機能を有しないGL203は、いずれも全長のGaussiaルシフェラーゼにバンドが検出され、親和性を有することが示された。しかし、Gaussiaルシフェラーゼドメイン1及び、ドメイン2には親和性を示すバンドが認められなかった。これらの抗体がGaussiaルシフェラーゼへの結合するためには全長が必要であり、ドメイン1、ドメイン2の両ドメインが同時に存在する事によって構成される部位の構造を認識すると考えられる。実施例11抗Gaussiaルシフェラーゼ抗体のエピトプ決定11-1エピトープマッピングのペプチド合成GaussiaルシフェラーゼのN末端側から隣り合う15アミノ酸のペプチドが8アミノ酸ずつオーバーラップするよう24種類を合成した。合成したペプチドのアミノ酸配列は表3のとおりである。11-2抗Gaussiaルシフェラーゼ抗体のELISAによるエピトープ決定Gaussiaルシフェラーゼ5μgmL、合成ペプチド10μMとなるようコーティングバッファーNa2CO3、NaHCO3、pH96で調整し、96ウェルマイクロプレートに50μLウェルで分注後、4°Cで1晩コーティングした。コーティング溶液を廃棄し、005TweenPBSで1回洗浄し、Blockingreagentロシュダイアグノスティック社を250μLウェルで分注し、室温で2時間ブロッキングした。ブロッキング溶液を廃棄、005TweenPBSで1回洗浄し、精製抗体GL203、GL116、GL612を1BSAPBSで10μgmLとなるよう希釈し、50μLウェルで分注後、室温で2時間、1次抗体反応を行った。1次抗体反応溶液を廃棄、005TweenPBSで5回洗浄し、アルカリフォスファターゼ標識2次抗体AntiMouseIgGAP、ケミコン社を1BSAPBSで5000倍希釈し、50μLウェルで分注後、室温で1時間1次抗体反応を行った。2次抗体反応溶液を廃棄、005TweenPBSで5回洗浄し、アルカリフォスファターゼ発色基質SIGMAFASTpNitrophenylphosphatetablets、シグマ社を100μLウェルで分注し、室温で発色させ、マイクロプレートリーダーバイオラッド社を使用し波長450nmにおける吸光度を測定した。結果を図7に示した。コントロールのGL203はGaussiaルシフェラーゼ全長PCとペプチドNo14配列番号33に対して反応を示しており、ペプチドNo14の配列配列番号33を特異的に認識して結合することが明らかとなった。他方、GL116とGGL612はGaussiaルシフェラーゼ全長には反応しているが、ペプチドには反応を示さなかった。これは、ウェスタンブロッティングの結果と同様にGaussiaルシフェラーゼの配列ではなく構造を認識していることと共に、酵素活性部位の近傍に抗体が結合することで、発光機能を阻害していることを強く示唆するものである。[配列表フリーテキスト]1.Gaussialuciferasegene2.LightchainCDRCDR13.LightchainCDRCDR24.LightchainCDRCDR35.LightchainCDRCDR16.LightchainCDRCDR27.LightchainCDRCDR38.HeavychainCDRCDR19.HeavychainCDRCDR210.HeavychainCDRCDR311.HeavychainCDRCDR112.HeavychainCDRCDR213.HeavychainCDRCDR314.Gaussialuciferaseprimer115.Gaussialuciferaseprimer216.Gaussialuciferaseprimer317.Gaussialuciferaseprimer418.Gaussialuciferasedomain1ドメイン1遺伝子配列19.Gaussialuciferasedomain2ドメイン2遺伝子配列20.Gaussialuciferasepeptide121.Gaussialuciferasepeptide222.Gaussialuciferasepeptide323.Gaussialuciferasepeptide424.Gaussialuciferasepeptide525.Gaussialuciferasepeptide626.Gaussialuciferasepeptide727.Gaussialuciferasepeptide828.Gaussialuciferasepeptide929.Gaussialuciferasepeptide1030.Gaussialuciferasepeptide1131.Gaussialuciferasepeptide1232.Gaussialuciferasepeptide1333.Gaussialuciferasepeptide1434.Gaussialuciferasepeptide1535.Gaussialuciferasepeptide1636.Gaussialuciferasepeptide1737.Gaussialuciferasepeptide1838.Gaussialuciferasepeptide1939.Gaussialuciferasepeptide2040.Gaussialuciferasepeptide2141.Gaussialuciferasepeptide2242.Gaussialuciferasepeptide2343.Gaussialuciferasepeptide2444.Lightchainvariableregion45.Heavychainvariableregion46.Lightchainvariableregion47.Heavychainvariableregion48.Lightchainvariableregion49.Heavychainvariableregion50.Lightchainvariableregion51.Heavychainvariableregion52.CpGoligodeoxynucleotide"