"幹細胞のフォワードプログラミングによって肝細胞を産生する方法であって、該方法は、FOXA2、HNF4A、ならびにHHEX、HNF1A、FOXA1、TBX3-1、GATA4、NR0B2、SCML1、CEBPB、HLF、HLX、NR1H3、NR1H4、NR1I2、NR1I3、NR5A2、SEBOX、ZNF391およびZNF517からなる群より選択される1つ以上の追加の肝細胞プログラミング因子遺伝子の発現レベルを人工的に増加させる条件下において該幹細胞を培養することによって、該幹細胞のフォワードプログラミングから肝細胞を産生する工程を包含する、方法。前記幹細胞が、前記肝細胞プログラミング因子遺伝子のうちの1つ以上を含む少なくとも1つの外因性発現カセットを含む、請求項1に記載の方法。前記幹細胞を、該幹細胞から肝細胞へのフォワードプログラミングを引き起こすのに十分な量において前記肝細胞プログラミング因子遺伝子の遺伝子産物を含む肝細胞プログラミング因子と接触させる工程を包含する、前述の請求項のいずれかに記載の方法。前記遺伝子産物が、前記肝細胞プログラミング因子遺伝子のポリペプチドまたはRNA転写物である、前述の請求項のいずれかに記載の方法。前記幹細胞が、間葉系幹細胞、造血幹細胞または人工多能性幹細胞である、前述の請求項のいずれかに記載の方法。前記肝細胞プログラミング因子遺伝子の数が、2、3、4、5または6である、前述の請求項のいずれかに記載の方法。前記肝細胞プログラミング因子遺伝子が、フォークヘッドボックスタンパク質A1FOXA1、フォークヘッドボックスA2FOXA2、造血細胞発現ホメオボックスタンパク質HHEX、肝細胞核因子1ホメオボックスAHNF1A、肝細胞核因子4アルファHNF4A、GATA結合タンパク質4GATA4、NR0B2核内レセプターサブファミリー0、グループB、メンバー2、中脚上の性節様1SCML1またはT-ボックス転写因子TBX3を含む、前述の請求項のいずれかに記載の方法。前記肝細胞プログラミング因子遺伝子が、FOXA1、FOXA2、HHEX、HNF1A、HNF4AおよびTBX3を含む、前述の請求項のいずれかに記載の方法。前記肝細胞プログラミング因子遺伝子が、FOXA2、HHEX、HNF4A、GATA4、NR0B2およびSCML1を含む、前述の請求項のいずれかに記載の方法。前記幹細胞またはその子孫細胞が、レポーター遺伝子に作動可能に連結された肝細胞特異的転写制御エレメントを含むレポーター発現カセットをさらに含む、前述の請求項のいずれかに記載の方法。前記肝細胞特異的転写制御エレメントが、アルブミン、α-1-抗トリプシンAAT、シトクロムp4503A4CYP3A4、アポリポタンパク質A-IまたはAPOEのプロモーターである、前述の請求項のいずれかに記載の方法。前記肝細胞が、iグルコース-6-ホスファターゼ、アルブミン、α-1-抗トリプシンAAT、サイトケラチン8CK8、サイトケラチン18CK18、アシアロ糖タンパク質レセプターASGR、アルコールデヒドロゲナーゼ1、I型アルギナーゼ、シトクロムp4503A4CYP3A4、肝臓特異的有機アニオントランスポーターLST-1またはそれらの組み合わせを含む1つ以上の肝細胞マーカーの発現;iiグルコース-6-ホスファターゼ、CYP3A4、胆汁の産生もしくは分泌、尿素の産生、または生体異物の解毒の活性;iii肝細胞の形態学的特徴;またはiv免疫不全被験体におけるインビボでの肝臓の生着を含む肝細胞の特性の1つ以上を備える、前述の請求項のいずれかに記載の方法。肝細胞について選択または濃縮する工程をさらに包含する、前述の請求項のいずれかに記載の方法。前記幹細胞またはその子孫細胞が、オンコスタチンMOSMを含む1つ以上の成長因子を含む培地中で培養される、前述の請求項のいずれかに記載の方法。前記培地が、肝細胞成長因子HGFをさらに含む、前述の請求項のいずれかに記載の方法。前記幹細胞およびその子孫細胞が、線維芽細胞成長因子FGFを本質的に含まない培地中で培養される、前述の請求項のいずれかに記載の方法。前記幹細胞およびその子孫細胞が、上皮成長因子EGFを本質的に含まない培地中で培養される、前述の請求項のいずれかに記載の方法。前記幹細胞およびその子孫細胞が、ニコチンアミドを本質的に含まない培地中で培養される、前述の請求項のいずれかに記載の方法。前記条件で培養した後、10日未満または約10日間で前記肝細胞を得る工程を包含する、前述の請求項のいずれかに記載の方法。前記条件で培養した後、5日未満または約5日間で前記肝細胞を得る工程を包含する、前述の請求項のいずれかに記載の方法。肝細胞に対する薬理学的作用または毒物学的作用について化合物を評価する方法であって、該方法は:a請求項1から20のいずれかに記載の方法によって提供された肝細胞を該化合物と接触させる工程;およびb該肝細胞に対する該化合物の薬理学的作用または毒物学的作用をアッセイする工程を包含する、方法。aFOXA2、HNF4A、ならびにHHEX、HNF1A、FOXA1、TBX3-1、GATA4、NR0B2、SCML1、CEBPB、HLF、HLX、NR1H3、NR1H4、NR1I2、NR1I3、NR5A2、SEBOX、ZNF391からなる群より選択される1つ以上の追加の肝細胞プログラミング因子遺伝子を含む1つ以上の外因性発現カセット;ならびにbレポーター遺伝子に作動可能に連結された肝細胞特異的プロモーターを含むレポーター発現カセットを含む、肝細胞または幹細胞。1つ以上の外因性発現カセットを含む肝細胞または幹細胞であって、ここで、該1つ以上の外因性発現カセットは、FOXA2、HNF4A、ならびにHHEX、HNF1A、FOXA1、TBX3-1、GATA4、NR0B2、SCML1、CEBPB、HLF、HLX、NR1H3、NR1H4、NR1I2、NR1I3、NR5A2、SEBOX、ZNF391からなる群より選択される1つ以上の追加の肝細胞プログラミング因子遺伝子を含み、該外因性発現カセットの少なくとも1つは、外部から誘導可能な転写制御エレメントに作動可能に連結されている、肝細胞または幹細胞。造血性前駆細胞の少なくとも80が、FOXA2、HNF4A、ならびにHHEX、HNF1A、FOXA1、TBX3-1、GATA4、NR0B2、SCML1、CEBPB、HLF、HLX、NR1H3、NR1H4、NR1I2、NR1I3、NR5A2、SEBOX、ZNF391からなる群より選択される1つ以上の追加の肝細胞プログラミング因子遺伝子を含む1つ以上の外因性発現カセットを含む、肝細胞を含む細胞集団。肝機能不全を有するかまたは有するリスクのある被験体を処置するための、請求項1から20のいずれかに記載の方法によって得られる肝細胞、請求項22もしくは23に記載の肝細胞、または請求項24に記載の細胞集団。ゆえに、治療用途および研究用途の肝細胞系譜、特に、ヒト肝細胞の産生が求められている。発明の要旨本発明は、肝細胞を提供する際の当該分野における主な欠点を、患者特異的な肝細胞を無制限に供給するフォワードプログラミングforwardprogrammingによって克服するものである。第1の実施形態において、体細胞または幹細胞を含む種々の細胞型のフォワードプログラミングによって肝細胞を提供する方法が提供される。肝細胞へのフォワードプログラミングは、非肝細胞から肝細胞へのフォワードプログラミングを引き起こすことができる十分な数の肝細胞プログラミング因子遺伝子の発現レベルを増加させることを含み得る。別の実施形態では、非肝細胞を直接プログラムする方法例えば、多能性幹細胞から肝細胞への分化も提供され得、その方法は、肝臓系譜細胞または肝細胞へのフォワードプログラミングを引き起こし、ゆえにそれらの細胞を肝細胞に直接プログラムすることができる十分な数の肝細胞プログラミング因子遺伝子例えば、表1中の遺伝子ならびにそれらのバリアントおよびアイソフォームの発現を増加させる工程を包含する。フォワードプログラミングは、本明細書中で使用されるとき、図1の上の部分に例証されるような、中間の各細胞段階に適合させた培養条件を用いてそのような段階を経て細胞を培養する必要が本質的にないプロセス、および/または必要に応じて、出発細胞源と所望の最終的な細胞産物例えば、肝細胞との間の種々の時点において種々の成長因子を加える必要がないプロセスのことを指す。優先出願仮出願61/323,689において使用されている用語ダイレクトプログラミングまたは直接分化は、本願において使用される用語フォワードプログラミングと同等であると意図されている。フォワードプログラミングは、多分化能または多能性を失った分化した体細胞とは異なり、多分化能細胞または多能性細胞における1つ以上の特定の系譜決定遺伝子の発現を人工的に増加させることによる多分化能細胞または多能性細胞のプログラミングを含み得る。例えば、フォワードプログラミングは、胚性幹細胞ESCまたは人工多能性幹細胞inducedpluripotentstemcelliPSCを肝細胞様細胞または他の分化した前駆細胞もしくは体細胞にプログラムするプロセスのことを記載し得る。他のある特定の態様において、フォワードプログラミングとは、分化細胞が、中間の多能性段階を通過せずに別の分化細胞型に直接プログラムされる分化転換のことを指し得る。その一方で、図1の下の部分は、段階的な分化プロセスに存在する様々な発生段階およびそのプロセス中の種々の時点において種々の成長因子を加える必要性を示しており、これは、本発明のある特定の態様に記載される方法よりも多くの労力、時間および費用を要する。ゆえに、本発明のある特定の態様におけるフォワードプログラミングの方法は、プログラミングまたは分化の種々の段階において種々の成長因子を加える必要が回避されて効率が改善されることにより、有利である。例えば、プログラムされる細胞またはその子孫細胞を培養するための培地は、種々の発生段階に沿った漸進的プログラミングすなわち、下で定義されるような定方向分化に通常必要とされる、線維芽細胞成長因子FGF、上皮成長因子EGFおよびニコチンアミドのうちの1つ以上を本質的に含まなくてもよい。本発明のある特定の態様において使用されるフォワードプログラミングは、定方向分化とは異なり得る。定方向分化では、成長因子または小分子が培養液に加えられることによって、内在性遺伝子の高発現が間接的に引き起こされる。定方向分化では、加えられる成長因子または小分子が、細胞表面タンパク質および表面タンパク質媒介性シグナル伝達を介してシグナル伝達してsignalthough、所望の系譜への内因性経路が活性化される。それとは反対に、フォワードプログラミングでは、通常は細胞内だけに存在するプログラミング因子例えば、転写因子が、遺伝子発現カセットを導入することによってもしくは誘導することによって、または直接加えられることによって例えば、ポリペプチドまたはRNAの形態で、発現を増加させざるを得ず、それによって、直接分化するためのプログラミング因子遺伝子が直接活性化され、細胞表面タンパク質および表面タンパク質媒介性シグナル伝達経路が迂回される。プログラミング因子の発現を増加させるためのこれらの手段は、人工的と定義され得、成長因子または小分子を培地に加えることによって内在性プログラミング因子遺伝子の高発現を間接的に引き起こすことを含む定方向分化とは異なり得る。肝臓のフォワードプログラミングに適した細胞の起源としては、任意の幹細胞または非肝細胞の体細胞が挙げられ得る。例えば、その幹細胞は、多能性幹細胞であってもよいし、任意の非多能性幹細胞であってもよい。その多能性幹細胞は、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、または核移植もしくは細胞融合によって得られる多能性幹細胞であり得る。その幹細胞には、多分化能幹細胞、少能性幹細胞または単能性幹細胞も含まれ得る。その幹細胞には、胎児幹細胞または成体幹細胞例えば、造血幹細胞、間葉系幹細胞、神経幹細胞、上皮幹細胞、皮膚幹細胞も含まれ得る。ある特定の態様において、幹細胞は、臍、胎盤、羊水、絨毛膜絨毛chorionvilli、胚盤胞、骨髄、脂肪組織、脳、末梢血、臍帯血、月経血、血管、骨格筋、皮膚および肝臓から単離され得る。他の態様において、肝細胞は、非肝細胞の体細胞の分化転換によって産生され得る。肝臓系譜プログラミング用の体細胞は、肝細胞以外の、生物の身体を形成する任意の細胞であり得る。いくつかの実施形態において、その体細胞は、ヒト体細胞例えば、皮膚線維芽細胞、脂肪組織由来細胞およびヒト臍帯静脈内皮細胞HUVECである。特定の態様において、その体細胞は、例えば、テロメラーゼ逆転写酵素TERTのレベルを増加させることによって、細胞を無制限に供給するために不死化され得る。これは、その内在性遺伝子からTERTの転写を増加させることによって、または任意の遺伝子送達方法もしくは遺伝子送達システムを介して導入遺伝子を導入することによって、実施され得る。肝細胞プログラミング因子遺伝子には、単独でまたは組み合わせて非肝細胞に肝臓の運命を直接課す任意の遺伝子、特に、細胞において発現されると肝臓の分化または肝臓の機能において重要である遺伝子または転写因子遺伝子が含まれる。例えば、表1に列挙されるような1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれ以上の例示的な遺伝子およびそれらのアイソフォームまたはバリアントが、本発明のある特定の態様において使用され得る。これらの遺伝子の多くが、種々のアイソフォームを有し、それらは、類似の機能を有し得るので、本発明のある特定の態様における使用について企図される。特定の実施形態において、本明細書中で使用される肝細胞プログラミング因子遺伝子は、フォークヘッドボックスタンパク質A1FOXA1、フォークヘッドボックスA2FOXA2例えば、FOXA2-2;NM_153675.2、造血細胞発現hematopoietically-expressedホメオボックスタンパク質HHEX、肝細胞核因子1ホメオボックスAHNF1A、肝細胞核因子4アルファHNF4A例えば、HNF4A-2;NM_000457.3、GATA結合タンパク質4GATA4、NR0B2核内レセプターサブファミリー0、グループB、メンバー2、中脚上の性節sexcombonmidleg様1SCML1およびT-ボックス転写因子TBX3例えば、TBX3-1;NM_005996.3のうちの1、2、3、4、5または6つを含み得る。より特定の態様において、肝細胞プログラミング因子遺伝子には、FOXA2、HHEX、HNF1AおよびHNF4Aが含まれる。例えば、肝細胞プログラミング因子遺伝子は、FOXA1、FOXA2、HHEX、HNF1A、HNF4AおよびTBX3の組み合わせであり得る。別の例において、肝細胞プログラミング因子遺伝子は、FOXA2、HHEX、HNF4A、GATA4、NR0B2およびSCML1の組み合わせであり得る。ある特定の態様において、多能性幹細胞のフォワードプログラミングによって肝細胞を提供する方法が提供され、その方法は:幹細胞例えば、多能性幹細胞から肝細胞へのフォワードプログラミングを引き起こすことができる十分な数の肝細胞プログラミング因子遺伝子の発現レベルを増加させる条件下において多能性幹細胞を培養することによって、その多能性幹細胞が肝細胞に直接分化するのを引き起こすことによって、肝細胞を提供する工程を包含する。当業者は、肝細胞にプログラムされる細胞において肝細胞プログラミング因子遺伝子の発現を増加させるための方法が、当該分野で公知の任意の方法、例えば、その細胞に予め導入された1つ以上の発現カセットの発現を誘導することによる方法、またはその細胞に核酸例えば、DNAまたはRNA、ポリペプチドまたは小分子を導入することによる方法を含み得ることを理解するだろう。内在性であるが転写が抑制されたある特定のプログラミング因子遺伝子の発現を増加させることも、上流の転写因子の発現またはエピジェネティックな調節を制御することによって、これらのプログラミング因子遺伝子の発現に対するサイレンシング作用または阻害作用を逆転させ得る。1つの態様において、肝臓系譜プログラミング用の細胞は、少なくとも1つの外因性発現カセットを含み得、ここで、その発現カセットは、非肝細胞から肝細胞へのフォワードプログラミングまたは分化転換を引き起こすのに十分な数の肝細胞プログラミング因子遺伝子を含む。その外因性発現カセットは、肝細胞プログラミング因子遺伝子を誘導可能に発現するための外部から誘導可能な転写制御エレメント例えば、テトラサイクリン応答エレメントを含む誘導性プロモーターを含み得る。さらなる態様において、肝細胞プログラミング用の外因性発現カセットの1つ以上は、遺伝子送達系に含められ得る。遺伝子送達系の非限定的な例としては、トランスポゾン系、ウイルス遺伝子送達系またはエピソーム遺伝子送達系が挙げられ得る。ウイルス遺伝子送達系は、RNAベースまたはDNAベースのウイルスベクターであり得る。エピソーム遺伝子送達系は、プラスミド、エプスタインバーウイルスEBVベースのエピソームベクター、酵母ベースのベクター、アデノウイルスベースのベクター、サルウイルス40SV40ベースのエピソームベクター、ウシパピローマウイルスBPVベースのベクターなどであり得る。別の態様において、肝臓系譜プログラミング用の細胞は、幹細胞から肝細胞へのフォワードプログラミングを引き起こすのに十分な量で肝細胞プログラミング因子と接触され得る。その肝細胞プログラミング因子は、肝細胞プログラミング因子遺伝子の遺伝子産物を含み得る。その遺伝子産物は、肝細胞プログラミング因子遺伝子のポリペプチドまたはRNA転写物であり得る。さらなる態様において、肝細胞プログラミング因子は、細胞内移行および/または核移行を促進する1つ以上のタンパク質伝達ドメインを含み得る。そのようなタンパク質伝達ドメインは、当該分野で周知であり、例えば、HIVTATタンパク質伝達ドメイン、HSVVP22タンパク質伝達ドメイン、DrosophilaAntennapediaホメオドメインまたはそれらのバリアントである。上記方法は、フォワードプログラミングまたは分化転換から提供された肝細胞に対する選択工程または濃縮工程をさらに包含し得る。選択または濃縮を助けるために、プログラミング用の細胞例えば、多能性幹細胞またはその子孫細胞は、レポーター遺伝子を含む選択可能またはスクリーニング可能なレポーター発現カセットを含み得る。そのレポーター発現カセットは、レポーター遺伝子に作動可能に連結された肝細胞特異的転写制御エレメントを含み得る。肝細胞特異的転写制御エレメントの非限定的な例としては、アルブミン、α-1-抗トリプシンAAT、シトクロムp4503A4CYP3A4、アポリポタンパク質A-IまたはapoEのプロモーターが挙げられる。成熟肝細胞特異的転写制御エレメントは、アルブミン、α1-抗トリプシン、アシアロ糖タンパク質レセプター、サイトケラチン8CK8、サイトケラチン18CK18、CYP3A4、フマリルアセト酢酸ヒドラーゼFAH、グルコース-6-リン酸、チロシンアミノトランスフェラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼおよびトリプトファン2,3-ジオキシゲナーゼのプロモーターを含み得る。本発明のある特定の態様において提供される肝細胞の特性としては、以下:iグルコース-6-ホスファターゼ、アルブミン、α-1-抗トリプシンAAT、サイトケラチン8CK8、サイトケラチン18CK18、アシアロ糖タンパク質レセプターASGR、アルコールデヒドロゲナーゼ1、I型アルギナーゼ、シトクロムp4503A4CYP3A4、肝臓特異的有機アニオントランスポーターliver-specificorganicaniontransporterLST-1またはそれらの組み合わせを含む1つ以上の肝細胞マーカーの発現;ii肝臓特異的酵素例えば、グルコース-6-ホスファターゼまたはCYP3A4の活性、副産物例えば、胆汁および尿素の産生もしくは胆汁の分泌、または生体異物の解毒;iii肝細胞の形態学的特徴;またはiv免疫不全被験体におけるインビボでの肝臓の生着のうちの1つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。肝細胞の選択または濃縮のために、肝臓のレポーター遺伝子の発現または本明細書中に記載されるような1つ以上の肝細胞の特性を含む肝細胞を識別することによる工程がさらに提供され得る。特定の態様において、本明細書中に提供される肝細胞は、成熟肝細胞であり得る。その成熟肝細胞は、レポーター遺伝子に作動可能に連結された成熟肝細胞特異的転写制御エレメントを含むスクリーニング可能もしくは選択可能なレポーター発現カセットを使用すること、またはASGRなどの肝細胞特異的細胞表面抗原に対する抗体を使用した磁気細胞選別を使用することによって、あるいは当該分野で公知であるような成熟肝細胞に特異的な特性を評価することによって、選択され得るかまたは濃縮され得る。例えば、成熟肝細胞は、以下:肝細胞成長因子レセプター、アルブミン、α1-抗トリプシン、アシアロ糖タンパク質レセプター、サイトケラチン8CK8、サイトケラチン18CK18、CYP3A4、フマリルアセト酢酸ヒドラーゼFAH、グルコース-6-リン酸、チロシンアミノトランスフェラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼおよびトリプトファン2,3-ジオキシゲナーゼが存在すること、ならびに細胞内で膵臓関連のインスリンまたはプロインスリンが産生されていないことのうちの1つ以上によって識別され得る。さらなる態様において、本明細書中に提供される肝細胞様細胞は、表1に詳述される遺伝子の人工的な高発現によって成熟肝細胞にさらにフォワードプログラミングされ得る。より多くの成熟肝細胞を産生するために、オンコスタチンMOSMなどの1つ以上の成長因子を含むかまたは肝細胞成長因子HGFをさらに含む培地中で出発細胞集団が培養され得る。その培養工程は、肝細胞プログラミング因子の発現が行われる前、行われている最中、または行われた後であり得る。肝細胞は、高発現または成長因子の存在下もしくは非存在下での培養の少なくとも約3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20日後またはその中の導き出せる任意の範囲に、またはそれらの日数までに、提供され得る。さらなる実施形態において、肝細胞は、本明細書中に示される方法のいずれかによって産生され得る。ある特定の態様において、本明細書中に記載される方法によって提供される肝細胞を含む、組織が操作された肝臓も提供され得る。別の態様において、肝細胞を含む肝細胞ベースのバイオ人工肝臓BALが提供され得る。ある特定の態様において、本発明は、1つ以上の肝細胞プログラミング因子遺伝子例えば、表1中の遺伝子およびそれらのアイソフォームまたはバリアントを含む1つ以上の外因性発現カセットを含む細胞を提供する。その外因性発現カセットは、その肝細胞プログラミング因子遺伝子の2、3、4、5または6個を含み得る。例えば、その外因性発現カセットは、FOXA2、HNF4A、およびHHEX、HNF1A、FOXA1、TBX3-1、GATA4、NR0B2、SCML1、CEBPB、HLF、HLX、NR1H3、NR1H4、NR1I2、NR1I3、NR5A2、SEBOX、ZNF391からなる群より選択される1つ以上の追加の肝細胞プログラミング因子遺伝子を含み得る。特定の例において、その外因性発現カセットは、FOXA1、FOXA2、HHEX、HNF1A、HNF4AおよびTBX3を含む。別の例において、その肝細胞プログラミング因子遺伝子は、FOXA2、HHEX、HNF4A、GATA4、NR0B2およびSCML1の組み合わせであり得る。肝細胞プログラミング因子遺伝子の誘導可能な発現のために、上記外因性発現カセットのうちの少なくとも1つが、外部から誘導可能な転写制御エレメントを含み得る。特定の態様において、1つ以上の外因性発現カセットを含む細胞が提供され得、ここで、その1つ以上の外因性発現カセットは、FOXA2、HNF4A、およびHHEX、HNF1A、FOXA1、TBX3-1、GATA4、NR0B2、SCML1、CEBPB、HLF、HLX、NR1H3、NR1H4、NR1I2、NR1I3、NR5A2、SEBOX、ZNF391からなる群より選択される1つ以上の追加の肝細胞プログラミング因子遺伝子を含み、その外因性発現カセットのうちの少なくとも1つは、外部から誘導可能な転写制御エレメントに作動可能に連結されている。上記外因性発現カセットは、1つ以上の遺伝子送達系に含められていることがある。その遺伝子送達系は、トランスポゾン系;ウイルス遺伝子送達系;エピソーム遺伝子送達系;または相同組換え系例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写アクチベーター様エフェクターTALEヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼなどを利用するものであり得る。上記細胞は、レポーター遺伝子に作動可能に連結された肝細胞特異的プロモーターを含むスクリーニング可能または選択可能なレポーター発現カセットをさらに含み得る。その肝細胞特異的転写制御エレメントは、アルブミン、α-1-抗トリプシンAAT、シトクロムp4503A4CYP3A4、アポリポタンパク質A-I、apoEのプロモーター、または当該分野における他の任意の肝細胞特異的プロモーターもしくはエンハンサーであり得る。1つの態様において、上記細胞は、幹細胞またはその子孫細胞であり得る。その幹細胞は、多能性幹細胞であってもよいし、任意の非多能性幹細胞であってもよい。その多能性幹細胞は、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、または核移植もしくは細胞融合によって得られる多能性幹細胞であり得る。その幹細胞は、多分化能幹細胞、少能性幹細胞または単能性幹細胞であってもよい。その幹細胞は、胎児幹細胞または成体幹細胞、例えば、造血幹細胞、間葉系幹細胞、神経幹細胞、上皮幹細胞または皮膚幹細胞でもあり得る。別の態様において、上記細胞は、不死化されたまたは不死化されていない体細胞であり得る。上記細胞はまた、肝細胞、より詳細には、成熟肝細胞または未成熟肝細胞例えば、肝細胞様細胞でもあり得る。2つの細胞型、すなわち、肝細胞および肝細胞にプログラムされた細胞を含み、かつ他の中間の細胞型を本質的に含まない細胞集団を含む組成物も提供され得る。例えば、そのような細胞集団は、幹細胞および肝細胞を含むが肝臓の分化プロセスの中間の発生段階における他の細胞型を本質的に含まない2つの細胞型を有し得る。特に、幹細胞および肝細胞からなる細胞集団を含む組成物が提供され得る。その幹細胞は、特に、多能性幹細胞、例えば、人工多能性幹細胞であり得る。肝細胞は、その細胞集団の少なくとも約1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.9または任意の中間の範囲もしくはそれらまで、またはその中の導き出せる任意の範囲であり得る。肝細胞を含む細胞集団も提供され得、ここで、造血性前駆細胞の少なくとも20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.9または任意の中間の範囲が、FOXA2、HNF4A、およびHHEX、HNF1A、FOXA1、TBX3-1、GATA4、NR0B2、SCML1、CEBPB、HLF、HLX、NR1H3、NR1H4、NR1I2、NR1I3、NR5A2、SEBOX、ZNF391からなる群より選択される1つ以上の追加の肝細胞プログラミング因子遺伝子を含む1つ以上の発現カセットを含む。本明細書中に提供される肝細胞は、肝細胞に対する当該分野で現在公知の任意の方法および応用法において使用され得る。例えば、化合物を評価する方法が提供され得、その方法は、本明細書中に提供される肝細胞または組織操作された肝臓に対するその化合物の薬理学的性質または毒物学的性質をアッセイする工程を包含する。肝細胞に対する作用について化合物を評価する方法もまた提供され得、その方法は:a本明細書中に提供される肝細胞をその化合物と接触させる工程;およびbその肝細胞に対するその化合物の作用をアッセイする工程を包含する。さらなる態様において、肝機能不全を有するかまたはそのリスクを有する被験体を処置するための方法も提供され得、その方法は、治療有効量の本明細書中に提供される肝細胞または肝細胞含有細胞集団をその被験体に投与する工程を包含する。本発明の方法および/または組成物の文脈において論じられる実施形態は、本明細書中に記載される他の任意の方法または組成物に対して用いられ得る。したがって、1つの方法または組成物に関係する実施形態は、本発明の他の方法および組成物にも同様に適用され得る。本明細書中で使用されるとき、核酸に関する用語コードするencodeまたはコードするencodingは、当業者が本発明を容易に理解できるようにするために使用されるが、しかしながら、これらの用語は、それぞれ含むcompriseまたは含むcomprisingと交換可能に使用され得る。本明細書中で使用されるとき、aまたはanは、1つ以上を意味し得る。請求項で使用されるように、単語含むcomprisingとともに使用されるとき、単語aまたはanは、1つ、または2つ以上を意味し得る。請求項における用語またはの使用は、明示的に選択肢のことだけを指すと示されないか、または選択肢が相互排他的でない限り、および/またはを意味するために使用されるが、本開示は、選択肢だけのことを指す定義とおよび/またはのことを指す定義とを支持する。本明細書中で使用されるとき、別のは、少なくとも第2またはそれ以上のことを意味し得る。本願全体を通して、用語約は、ある値が、デバイス、その値を測定するために用いられる方法または研究被験体の間に存在するばらつきに固有の誤差のばらつきを含むことを示すために使用される。本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるだろう。しかしながら、この詳細な説明から、本発明の精神内および範囲内の様々な変更および改変が当業者に明らかになるだろうという理由で、詳細な説明および特定の例が、本発明の好ましい実施形態を示すが説明という目的でのみ与えられることが理解されるべきである。例証的な実施形態の説明本発明は、プログラミングによる肝細胞産生のための方法および組成物を提供することによって、現在の技術が抱えるいくつかの主な欠点を克服するものである。段階的な分化プロトコルを用いた以前の方法とは対照的に、これらの方法のある特定の態様は、非肝細胞における肝細胞プログラミング転写因子のレベルを増加させて、フォワードプログラミングによって肝細胞を提供する。様々な中間の発生段階において種々の成長因子を加えることを含む余分な工程は、本方法のある特定の態様において、不要であり得る。ゆえに、本方法のある特定の態様は、より時間効率が良くかつ費用効率が高く、更新可能な起源、例えば、幹細胞から治療用の肝細胞の製造を可能にし得る。本発明のさらなる実施形態および利点は、下記に記載される。I.定義プログラミングは、プログラミングなしの同じ条件下でもたらされ得る子孫と比べて、培養またはインビボにおいて少なくとも1つの新しい細胞型の子孫を形成するように細胞を変化させるプロセスである。これは、十分に増殖した後の、新しい細胞型の表現型の特性を有する測定できるほどの割合の子孫本質的に、プログラミング前にはそのような子孫が形成できなかった場合;あるいは、新しい細胞型の特性を有する割合が、プログラミング前よりも測定可能な程度に多いことを意味する。このプロセスには、分化、脱分化および分化転換が含まれる。分化は、それほど特殊化していない細胞が、より特殊化した細胞型になるプロセスである。脱分化は、部分的に分化した細胞または最終分化した細胞が、より前の発生段階例えば、多能性または多分化能に戻る細胞プロセスである。分化転換は、1つの分化細胞型から別の分化細胞型に変換するプロセスである。ある特定の条件下において、新しい細胞型の特性を有する子孫の割合は、優先度の低い方から順に少なくとも約1、5、25またはそれ以上であり得る。用語外因性は、細胞または生物におけるタンパク質、遺伝子、核酸もしくはポリヌクレオチドに関して使用されるときは、人工的な手段によってその細胞もしくは生物に導入された、タンパク質、遺伝子、核酸またはポリヌクレオチドのことを指すか、または細胞に関しては、単離され、続いて、人工的な手段によって他の細胞もしくは生物に導入された細胞のことを指す。外因性核酸は、異なる生物もしくは細胞由来であり得るか、または生物内もしくは細胞内に天然に存在する核酸のさらなる1コピー以上であり得る。外因性細胞は、異なる生物由来であってもよいし、同じ生物由来であってもよい。非限定的な例として、外因性核酸は、天然の細胞の染色体の位置とは異なる染色体の位置に存在するか、または、天然に見られる核酸配列とは異なる核酸配列と別途隣接する。発現構築物または発現カセットは、転写を指示することができる核酸分子のことを意味する。発現構築物は、1つ以上の所望の細胞型、組織または器官において遺伝子発現を指示する少なくとも1つ以上の転写調節エレメント例えば、プロモーター、エンハンサーまたはそれらの構造機能的な等価物を含む。転写終結シグナルなどの追加のエレメントも含められることがある。ベクターまたは構築物時折、遺伝子送達系または遺伝子導入ビヒクルと称されるは、インビトロまたはインビボにおいて宿主細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む高分子または分子の複合体のことを指す。ベクターの通常のタイプであるプラスミドは、染色体DNAから独立して複製することができる、染色体DNAとは離れた染色体外のDNA分子である。ある特定の場合において、プラスミドは、環状かつ二本鎖である。複製開始点oriまたは複製起点は、細胞内のプラスミドに存在するとき、そのプラスミド内の連結された配列を維持することができるDNA配列例えば、リンパ球向性lymphotrophicヘルペスウイルスにおけるDNA配列、および/またはDNA合成が開始する部位もしくはその付近の部位である。EBVに対するoriは、FR配列不完全な20コピーの30bpリピートおよび好ましくはDS配列を含むが、しかしながら、EBVにおける他の部位が、EBNA-1に結合し、例えば、Rep配列は、複製開始点としてDSと置き換わることができるKirshmaierandSugden,1998。したがって、EBVの複製起点は、FR、DSもしくはRep配列、あるいは核酸改変による任意の機能的に等価な配列またはそれらから得られる合成の組み合わせを含む。例えば、本発明は、Lindnerら、2008に詳しく記載されているような個別のエレメントの挿入または変異などによって遺伝的に操作されたEBVの複製起点も使用し得る。用語~に対応するは、あるポリヌクレオチド配列が、参照ポリヌクレオチド配列の全部もしくは一部と相同的であるすなわち、同一であって、厳密には進化的に関係しないこと、またはあるポリペプチド配列が、参照ポリペプチド配列と同一であることを意味するために本明細書中で使用される。対照的に、用語~と相補的は、相補的な配列が、参照ポリヌクレオチド配列の全部または一部と相同的であることを意味するために本明細書中で使用される。例として、ヌクレオチド配列TATACは、参照配列TATACに対応し、参照配列GTATAと相補的である。特定のタンパク質をコードする遺伝子、ポリヌクレオチド、コード領域、配列、セグメント、フラグメントまたは導入遺伝子は、適切な制御配列の支配下に配置されるとき、転写され、そして必要に応じてインビトロまたはインビボにおいて遺伝子産物例えば、ポリペプチドに翻訳もされる、核酸分子である。そのコード領域は、cDNA、ゲノムDNAまたはRNAの形態で存在し得る。その核酸分子は、DNAの形態で存在するとき、一本鎖すなわち、センス鎖または二本鎖であり得る。コード領域の境界は、5’アミノ末端における開始コドンおよび3’カルボキシ末端における翻訳終止コドンによって決定される。遺伝子には、原核生物または真核生物のmRNA由来のcDNA、原核生物または真核生物のDNA由来のゲノムDNA配列、および合成DNA配列が含まれ得るが、これらに限定されない。転写終結配列は、通常、遺伝子配列に対して3’に配置され得る。用語調節エレメントとは、プロモーター領域、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流制御ドメイン、複製開始点、内部リボソーム進入部位IRES、エンハンサー、スプライスジャンクションなどのことを集合的に指し、それらは、レシピエント細胞内のコード配列の複製、転写、転写後プロセシングおよび翻訳を集合的に提供する。選択されたコード配列が、適切な宿主細胞において複製されること、転写されることおよび翻訳されることができる限り、これらの調節エレメントのすべてが、常に存在する必要はない。用語プロモーターは、DNA制御配列を含むヌクレオチド領域のことを指すためにその通常の意味において本明細書中で使用され、ここで、その制御配列は、RNAポリメラーゼに結合することができ、かつ下流の3’方向のコード配列の転写を開始することができる遺伝子に由来する。エンハンサーとは、プロモーターの近位に位置するとき、エンハンサードメインの非存在下のプロモーターから生じる転写活性と比べて転写活性の増加をもたらす核酸配列のことを意味する。核酸分子に関する作動可能に連結されるは、2つ以上の核酸分子例えば、転写される核酸分子、プロモーターおよびエンハンサーエレメントが、その核酸分子の転写を可能にするように接続されていることを意味する。ペプチド分子および/またはポリペプチド分子に関する作動可能に連結されるは、2つ以上のペプチド分子および/またはポリペプチド分子が、単一のポリペプチド鎖、すなわち、融合ポリペプチドその融合物のペプチド成分および/またはポリペプチド成分の各々の少なくとも1つの性質を有するをもたらすように接続されていることを意味する。その融合ポリペプチドは、好ましくは、キメラ、すなわち、異種分子から構成される。相同性とは、2つのポリヌクレオチド間または2つのポリペプチド間の同一性のパーセントのことを指す。1つの配列と別の配列との対応は、当該分野で公知の手法によって決定され得る。例えば、相同性は、配列情報をアラインメントし、容易に利用可能なコンピュータプログラムを使用することによって、2つのポリペプチド分子間の配列情報の直接的な比較によって測定され得る。あるいは、相同性は、相同的な領域の間で安定した二重鎖を形成する条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションに続く、一本鎖特異的ヌクレアーゼでの消化、および消化されたフラグメントのサイズの測定によって測定され得る。2つのDNA配列または2つのポリペプチド配列は、上記の方法を用いて測定されるとき、それぞれそれらのヌクレオチドまたはアミノ酸の少なくとも約80、好ましくは、少なくとも約90、最も好ましくは、少なくとも約95が、その分子の規定の長さにわたってマッチするとき、互いに実質的に相同的である。用語細胞は、当該分野におけるその最も広い意味において本明細書中で使用され、多細胞生物の組織の構造単位であり、それを外側から隔離する膜構造によって囲まれていて、自己複製する能力を有し、かつ遺伝情報およびそれを発現するための機構を有する、生体のことを指す。本明細書中で使用される細胞は、天然に存在する細胞または人工的に改変された細胞例えば、融合細胞、遺伝的に改変された細胞などであり得る。本明細書中で使用されるとき、用語幹細胞とは、少なくとも1つのタイプのより特殊化した細胞を生じることができる細胞のことを指す。幹細胞は、自己更新する能力、すなわち、未分化な状態を維持しつつ数多くの細胞分裂サイクルを経験する能力を有し、かつ発生能、すなわち、特殊化した細胞型に分化する能力を有する。代表的には、幹細胞は、損傷した組織を再生することができる。本明細書中の幹細胞は、胚性幹ES細胞、人工多能性幹細胞または組織幹細胞組織特異的幹細胞または体性幹細胞とも呼ばれるであり得るが、これらに限定されない。上に記載された能力を有し得る人工的に産生された任意の細胞例えば、本明細書中で使用される、融合細胞、再プログラムされた細胞などは、幹細胞であり得る。胚性幹ES細胞は、初期胚に由来する多能性幹細胞である。ES細胞は、1981年に初めて樹立され、1989年以降、ノックアウトマウスの作出にも応用されている。1998年には、ヒトES細胞が樹立され、現在、再生医学に利用可能になってきている。ES細胞とは異なり、組織幹細胞は、限定的な分化能を有する。組織幹細胞は、組織内の特定の位置に存在し、未分化な細胞内構造を有する。ゆえに、組織幹細胞の多能性は、通常低い。組織幹細胞は、より高い核/細胞質比を有し、細胞内の細胞小器官をほとんど有しない。ほとんどの組織幹細胞が、低い多能性、長い細胞周期および個体の寿命を超える増殖能を有する。組織幹細胞は、それらの細胞が由来する部位例えば、皮膚系、消化系、骨髄系、神経系などに基づいてカテゴリーに分けられる。皮膚系における組織幹細胞としては、表皮幹細胞、毛包幹細胞などが挙げられる。消化系における組織幹細胞としては、膵臓一般的な幹細胞、肝幹細胞などが挙げられる。骨髄系における組織幹細胞としては、造血幹細胞、間葉系幹細胞などが挙げられる。神経系における組織幹細胞としては、神経幹細胞、網膜幹細胞などが挙げられる。通常、iPS細胞またはiPSCと省略される人工多能性幹細胞とは、リプログラミング因子と称されるある特定の遺伝子を挿入することによって、非多能性細胞、代表的には成体の体細胞、または最終分化した細胞例えば、線維芽細胞、造血細胞、筋細胞、ニューロン、表皮細胞などから人工的に調製されるあるタイプの多能性幹細胞のことを指す。多能性とは、1つ以上の組織もしくは器官を構成するすべての細胞、または好ましくは、3つの胚葉:内胚葉胃の内壁、消化管、肺、中胚葉筋肉、骨、血液、泌尿生殖器または外胚葉表皮組織および神経系のうちのいずれかに分化する潜在能力を有する幹細胞のことを指す。本明細書中で使用される多能性幹細胞とは、その3つの胚葉のうちのいずれかに由来する細胞に分化することができる細胞、例えば、全能性幹細胞または人工多能性幹細胞の直接的な子孫のことを指す。本明細書中で使用されるとき、全能性幹細胞とは、生物を構成するすべての細胞に分化する能力を有する細胞例えば、卵細胞および精子細胞の融合から産生される細胞のことを指す。受精卵の最初の数回の分裂によって生成される細胞もまた、全能性である。これらの細胞は、胚細胞型および胚外細胞型に分化し得る。多能性幹細胞は、任意の胎児細胞型または成熟細胞型を生じ得る。しかしながら、それらは、胎盤などの胚外組織に寄与する潜在能力を欠いているので、単独では、胎仔または成体の動物に発生することはできない。対照的に、多くの前駆細胞は、多分化能幹細胞であり、すなわち、それらは、限られた数の細胞運命に分化することができる。多分化能前駆細胞は、いくつかの他の細胞型を生じ得るが、それらのタイプは、限られた数である。多分化能幹細胞の例は、造血細胞いくつかのタイプの血液細胞になり得るが、脳細胞または他のタイプの細胞になることができない血液幹細胞である。形づくる長い一連の細胞分裂の終わりに、胚は、最終分化した細胞または特定の機能を永久的に課されたと考えられる細胞となる。本明細書中で使用されるとき、用語体細胞とは、生殖細胞例えば、卵、精子など以外の、次の世代にそのDNAを直接伝達しない任意の細胞のことを指す。代表的には、体細胞は、限られた多能性を有するか、または多能性を有しない。本明細書中で使用される体細胞は、天然に存在し得るか、または遺伝的に改変され得る。本明細書中で使用されるとき、細胞が、10未満のある特定の望まれない細胞型を有するとき、それらの細胞は、その望まれない細胞型を実質的に含まず、1未満の望まれない細胞型を有するとき、ある特定の細胞型を本質的に含まない。しかしながら、全細胞集団の0.5未満または0.1未満が望まれない細胞型を構成する細胞集団が、なおもより望ましい。したがって、集団の0.1~1未満すべての中間のパーセンテージを含むが望ましくない細胞型を構成する細胞集団は、これらの細胞型を本質的に含まない。培地は、本明細書中で使用されるある特定の試薬が外部から加えられないとき、そのような薬剤を本質的に含まない可能性がある。より好ましくは、これらの薬剤は、存在しないか、または検出不可能な量で存在する。本明細書中で使用される用語肝細胞は、成熟肝細胞ならびに成熟した十分に機能的な肝細胞のすべてではないがいくつかの特徴を示す肝細胞様細胞を含むと意味される。本方法によって産生される細胞は、今までの定方向分化によって産生される肝細胞と少なくとも同程度に機能的であり得る。この手法は、それがさらに改善されるとき、形態、マーカーの発現、インビトロおよびインビボにおける機能的アッセイによって測定される、肝細胞のすべての特性を有する完全に十分に機能的な肝細胞を産生することを可能にし得る。II.肝細胞のプログラミングに関わる細胞本発明のある特定の実施形態において、肝細胞でない細胞のフォワードプログラミングによって肝細胞を産生するための方法および組成物が開示される。1つ以上の肝細胞プログラミング因子遺伝子および/または肝細胞の識別のために特異的なレポーター発現カセットを含む外因性発現カセットを含む細胞もまた提供され得る。いくつかの実施形態において、それらの細胞は、幹細胞であり得、それらとしては、胚性幹細胞、胎児幹細胞または成体幹細胞が挙げられるが、これらに限定されない。さらなる実施形態において、それらの細胞は、任意の体細胞であり得る。A.幹細胞幹細胞は、すべてではないがほとんどの多細胞生物に見られる細胞である。それらは、有糸分裂の細胞分裂によってそれ自体を更新することができる能力および多種多様な範囲の特殊化した細胞型に分化する能力を特徴とする。哺乳動物の幹細胞の2つの大きなタイプは:胚盤胞に見られる胚性幹細胞、および成体組織に見られる成体幹細胞である。発生中の胚では、幹細胞は、特殊化した胚組織のすべてに分化し得る。成体の生物では、幹細胞および前駆細胞は、特殊化した細胞を補充する身体の修復システムとして作用するが、再生器官の通常のターンオーバーも維持する例えば、血液、皮膚または腸管組織。ヒト胚性幹細胞ESCおよび人工多能性幹細胞iPSCは、肝細胞を含む身体のすべての細胞型に分化する潜在能力を保持しつつ、インビトロにおいて長期間増殖することができる。したがって、これらの細胞は、潜在的に、創薬と移植治療の両方のための患者特異的な機能的肝細胞を無制限に供給し得る。インビトロにおけるヒトESC/iPSCから肝細胞への分化は、通常のインビボでの発生を反復し、すなわち、それらは、以下の経時的な発生段階を経験する:胚体内胚葉definitiveendoderm、肝臓特異化、未成熟肝細胞および成熟肝細胞図1。これには、種々の分化段階における種々の成長因子の添加が必要であり、通常、20日を超える分化が必要である図4。より重要なことには、ヒトESC/iPSCに由来する肝細胞は、一般に、ヒト初代成人型肝細胞の完全な機能的範囲をまだ示さない。本発明のある特定の態様は、iPSCの産生と同様に肝細胞の分化/機能にとって重要なある組み合わせの転写因子の発現によって肝細胞例えば、肝細胞様細胞または完全に機能的な肝細胞がヒトESC/iPSCから直接誘導され得、すべてではないがほとんどの通常の発生段階を迂回することを提供した図1。このアプローチは、より時間効率が良くかつ費用効率が高く、ヒト初代成人型肝細胞と全く同じではないにしても極めてよく似た機能を有する肝細胞を産生し得る。さらに、無限の増殖能を有するヒトESC/iPSCは、肝細胞分化用の出発細胞集団としての体細胞と比べて独特の利点を有する。1.胚性幹細胞胚性幹細胞株ES細胞株は、胚盤胞またはそれより早い桑実胚段階の胚の内部細胞塊ICMの胚盤葉上層組織に由来する細胞の培養物である。胚盤胞は、ヒトにおいておよそ4~5日齢の、50~150個の細胞からなる、初期胚である。ES細胞は、多能性であり、発生中に、3つの一次胚葉:外胚葉、内胚葉および中胚葉の誘導体のすべてを生じる。換言すれば、ES細胞は、特定の細胞型にとって十分かつ必要な刺激を与えられたとき、成体の身体の200を超える細胞型の各々になり得る。ES細胞は、胚体外膜または胎盤に寄与しない。今までのほぼすべての研究は、マウス胚性幹細胞mESまたはヒト胚性幹細胞hESを用いて実施していた。その両方ともが、本質的な幹細胞の特性を有するが、未分化な状態を維持するために、非常に種々の環境を必要とする。マウスES細胞は、ゼラチン層上で成長し得、白血病抑制因子LIFの存在を必要とし得る。ヒトES細胞は、マウス胎仔線維芽細胞MEFのフィーダー層上で成長し得、しばしば、塩基性線維芽細胞成長因子bFGFまたはFGF-2の存在を必要とし得る。胚性幹細胞は、最適な培養条件または遺伝的操作なしにChambersら、2003、迅速に分化する。ヒト胚性幹細胞もまた、いくつかの転写因子および細胞表面タンパク質の存在によって定義され得る。転写因子のOct-4、NanogおよびSox-2が、分化をもたらす遺伝子の抑制および多能性の維持を確実にするコアの制御ネットワークを形成するBoyerら、2005。hES細胞を識別するために最も一般的に使用される細胞表面抗原としては、糖脂質であるSSEA3およびSSEA4、ならびにケラタン硫酸抗原であるTra-1-60およびTra-1-81が挙げられる。マウスES細胞を得るための方法は、周知である。1つの方法では、129系統のマウス由来の着床前胚盤胞をマウス抗血清で処理して栄養外胚葉を除去し、ウシ胎仔血清を含む培地中の、化学的に不活性化されたマウス胎仔線維芽細胞のフィーダー細胞層上で内部細胞塊を培養する。発生する未分化なES細胞のコロニーは、ウシ胎仔血清の存在下のマウス胎仔線維芽細胞のフィーダー層上で継代培養されることにより、ES細胞の集団が生成される。いくつかの方法では、マウスES細胞は、サイトカインである白血病抑制因子LIFを血清含有培養液に加えることによって、フィーダー層の非存在下において成長し得るSmith,2000。他の方法では、マウスES細胞は、骨形成タンパク質およびLIFの存在下の無血清培地中で成長し得るYingら、2003。ヒトES細胞は、以前に報告された方法Thomsonら、1995;Thomsonら、1998;ThomsonandMarshall,1998;Reubinoffら、2000を用いて胚盤胞から得ることができる。1つの方法では、5日目のヒト胚盤胞を、ウサギ抗ヒト脾臓細胞抗血清に曝露し、次いで、1:5希釈のモルモット補体に曝露することにより、栄養外胚葉細胞を溶解する。溶解された栄養外胚葉細胞をインタクトな内部細胞塊から除去した後、その内部細胞塊を、ウシ胎児血清の存在下において、ガンマ不活性化されたマウス胎仔線維芽細胞のフィーダー層上で培養する。9~15日後に、その内部細胞塊から得られた細胞の凝集塊は、化学的に解離され得るかすなわち、トリプシンに曝露されてまたは機械的に解離され得、ウシ胎児血清およびマウス胎仔線維芽細胞のフィーダー層を含む新鮮培地に再プレーティングされ得る。さらに増殖したら、未分化な形態を有するコロニーが、マイクロピペットによって選択され、凝集塊中に機械的に解離され、再プレーティングされる米国特許第6,833,269号を参照のこと。ES様の形態は、核と細胞質との比が明らかに高く、顕著な核小体を有する緻密なコロニーとして特徴づけられる。得られたES細胞は、短いトリプシン処理またはマイクロピペットによる個別のコロニーの選択によって、通例のとおり継代され得る。いくつかの方法では、ヒトES細胞は、塩基性線維芽細胞成長因子の存在下において、線維芽細胞のフィーダー層上でES細胞を培養することによって、血清なしで成長し得るAmitら、2000。他の方法では、ヒトES細胞は、それらの細胞を、塩基性線維芽細胞成長因子を含む条件培地の存在下においてタンパク質マトリックス例えば、MatrigelTMまたはラミニン上で培養することによって、フィーダー細胞層なしで成長し得るXuら、2001。その培地は、線維芽細胞と共培養することによって予め条件設定されている。アカゲザルおよびコモンマーモセットのES細胞を単離するための方法も公知であるThomson,andMarshall,1998;Thomsonら、1995;ThomsonandOdorico,2000。ES細胞の別の起源は、樹立されたES細胞株である。様々なマウス細胞株およびヒトES細胞株が公知であり、それらの成長条件および増殖条件が定義されている。例えば、マウスCGR8細胞株は、マウス系統129の胚の内部細胞塊から樹立され、CGR8細胞の培養物は、フィーダー層なしのLIFの存在下において成長し得る。さらなる例として、ヒトES細胞株H1、H7、H9、H13およびH14は、Thompsonらによって樹立された。さらに、H9株のサブクローンH9.1およびH9.2が開発された。当該分野で公知の実質的に任意のES細胞株または幹細胞株、例えば、YuandThompson,2008本明細書中で参考として援用されるに記載されている細胞株が、本発明とともに使用され得ると予想される。本発明に関連して使用するためのES細胞の起源は、胚盤胞、胚盤胞の内部細胞塊を培養することに由来する細胞、または樹立細胞株の培養物から得られた細胞であり得る。したがって、本明細書中で使用されるとき、用語ES細胞とは、胚盤胞の内部細胞塊の細胞、内部細胞塊の細胞innermasscellsの培養物から得られたES細胞、およびES細胞株の培養物から得られたES細胞のことを指し得る。2.人工多能性幹細胞人工多能性幹iPS細胞は、ES細胞の特性を有するが、分化した体細胞のリプログラミングによって得られる、細胞である。人工多能性幹細胞は、様々な方法によって得られる。1つの方法では、ヒト成人皮膚線維芽細胞を、レトロウイルス導入を用いて転写因子Oct4、Sox2、c-MycおよびKlf4でトランスフェクトするTakahashiら、2007。トランスフェクトされた細胞を、塩基性線維芽細胞成長因子bFGFが補充された培地中においてSNLフィーダー細胞LIFを産生するマウス細胞の線維芽細胞株上にプレーティングする。およそ25日後、ヒトES細胞コロニーに似たコロニーが培養物中に出現する。そのES細胞様コロニーを拾い、bFGFの存在下においてフィーダー細胞上に広げる。細胞の特性に基づくと、ES細胞様コロニーの細胞は、人工多能性幹細胞である。その人工多能性幹細胞は、ヒトES細胞と形態学的に類似であり、様々なヒトES細胞マーカーを発現する。また、その人工多能性幹細胞は、ヒトES細胞の分化をもたらすと知られている条件下で成長すると、しかるべく分化する。例えば、その人工多能性幹細胞は、ニューロンの構造およびニューロンのマーカーを有する細胞に分化し得る。実質的に任意のiPS細胞またはiPS細胞株例えば、YuandThompson,2008に記載されているものを含むが、本発明とともに使用され得ると予想される。別の方法では、ヒト胎児線維芽細胞またはヒト新生児線維芽細胞を、レンチウイルス導入を用いて4つの遺伝子Oct4、Sox2、NanogおよびLin28でトランスフェクトするYuら、2007。感染の12~20日後に、ヒトES細胞の形態を有するコロニーが、目に見えるようになる。そのコロニーを拾い、広げる。そのコロニーを構成する人工多能性幹細胞は、ヒトES細胞と形態学的に類似であり、様々なヒトES細胞マーカーを発現し、マウスへの注射後に神経組織、軟骨および腸上皮を有する奇形腫を形成する。マウスから人工多能性幹細胞を調製する方法も公知であるTakahashiandYamanaka,2006。iPS細胞の誘導には、代表的には、Soxファミリーの少なくとも1つのメンバーおよびOctファミリーの少なくとも1つのメンバーの発現またはそれらへの曝露が必要である。SoxおよびOctは、ES細胞の独自性を特定する転写制御階層の中心であると考えられる。例えば、Soxは、Sox-1、Sox-2、Sox-3、Sox-15またはSox-18であり得;Octは、Oct-4であり得る。Nanog、Lin28、Klf4またはc-Mycのような追加の因子は、リプログラミング効率を増加させ得る;リプログラミング因子の特定のセットは、Sox-2、Oct-4、Nanog、および必要に応じてLin-28を含むセットであり得るか;またはSox-2、Oct4、Klf、および必要に応じてc-Mycを含むセットであり得る。ES細胞のようにiPS細胞は、SSEA-1、SSEA-3およびSSEA-4に対する抗体DevelopmentalStudiesHybridomaBank,NationalInstituteofChildHealthandHumanDevelopment,BethesdaMd.ならびにTRA-1-60およびTRA-1-81に対する抗体Andrewsら、1987を用いる免疫組織化学またはフローサイトメトリーによって識別され得るかまたは確認され得る特徴的な抗原を有する。胚性幹細胞の多能性は、8~12週齢の雄SCIDマウスの後肢の筋肉におよそ0.5~10×106個の細胞を注射することによって確認され得る。3つの胚葉の各々の少なくとも1つの細胞型を示す奇形腫が発生する。本発明のある特定の態様において、iPS細胞は、上に記載されたようなKlfまたはNanogとともにOctファミリーメンバーおよびSoxファミリーメンバー例えば、Oct4およびSox2を含むリプログラミング因子を用いて体細胞をリプログラミングすることによって産生される。リプログラミング用の体細胞は、多能性に誘導され得る任意の体細胞例えば、線維芽細胞、ケラチノサイト、造血細胞、間葉系細胞、肝臓細胞、胃細胞またはβ細胞であり得る。ある特定の態様において、T細胞もまた、リプログラミング用の体細胞の起源として使用され得る米国出願番号61/184,546本明細書中で参考として援用されるを参照のこと。リプログラミング因子は、1つ以上のベクター例えば、組み込みベクターまたはエピソームベクター、例えば、EBVエレメントベースの系米国出願番号61/058,858本明細書中で参考として援用される;Yuら、2009を参照のことに含められた発現カセットから発現され得る。さらなる態様において、リプログラミングタンパク質またはRNA例えば、mRNAまたはmiRNAは、タンパク質導入またはRNAトランスフェクションによって体細胞に直接導入され得る米国出願番号61/172,079本明細書中で参考として援用される;Yakubovら、2010を参照のこと。3.体細胞核移植によって得られる胚性幹細胞多能性幹細胞は、体細胞核移植を用いて調製され得、その体細胞核移植では、ドナー核が、紡錘体を含まない卵母細胞に移される。核移植によって産生された幹細胞は、ドナー核と遺伝的に同一である。1つの方法では、アカゲザルの皮膚線維芽細胞由来のドナー線維芽細胞核を、電気融合によって、紡錘体を含まない第II成熟分裂中期のアカゲザル卵母細胞ooctyeの細胞質に導入するByrneら、2007。融合された卵母細胞を、イオノマイシンに曝露し、次いで、胚盤胞期までインキュベートすることによって、活性化する。次いで、選択された胚盤胞の内部細胞塊を培養することにより、胚性幹細胞株が得られる。その胚性幹細胞株は、正常なES細胞の形態を示し、様々なES細胞マーカーを発現し、インビトロとインビボの両方において複数の細胞型に分化する。本明細書中で使用されるとき、用語ES細胞とは、受精核を含む胚に由来する胚性幹細胞のことを指す。ES細胞は、体細胞核移植によって得られた胚性幹細胞と称される、核移植によって産生された胚性幹細胞と区別される。4.他の幹細胞胎児幹細胞は、自己更新能および多能性分化能を有する細胞である。それらは、胎仔栄養膜細胞欧州特許EP0412700ならびに絨毛膜絨毛、羊水および胎盤WO/2003/042405から単離され得、増大され得る。これらは、その全体が本明細書によって参考として援用される。胎児幹細胞の細胞表面マーカーとしては、CD117/c-kit、SSEA3、SSEA4およびSSEA1-が挙げられる。体性幹細胞は、ほとんどの器官組織において同定されている。最もよく特徴付けられているのは、造血幹細胞である。これは、細胞表面マーカーおよび機能的特性に基づいて精製された、中胚葉に由来する細胞である。骨髄、血液、臍帯血、胎児肝および卵黄嚢から単離された造血幹細胞は、レシピエントの生命のために造血を再開し、複数の造血系をもたらす、前駆細胞である米国特許第5,635,387号;同第5,460,964号;同第5,677,136号;同第5,750,397号;同第5,759,793号;同第5,681,599号;同第5,716,827号;Hillら、1996を参照のこと。これらは、その全体が本明細書によって参考として援用される。造血幹細胞は、致死的な放射線を照射された動物またはヒトに移植されると、赤血球、好中球-マクロファージ、巨核球およびリンパ系の造血細胞プールを再配置させ得る。インビトロにおいて、造血幹細胞は、少なくともいくらかの自己更新細胞分裂を起こすように誘導され得、そしてインビボで見られるのと同じ系譜に分化するように誘導され得る。ゆえに、この細胞は、幹細胞の基準を満たす。次に最もよく特徴付けられているのは、もともと胚性中胚葉に由来し、成体の骨髄から単離され、分化して筋肉、骨、軟骨、脂肪、髄間質marrowstromaおよび腱を形成し得る、間葉系幹細胞MSCである。中胚葉は、胚形成中に、骨、軟骨、脂肪、骨格筋およびおそらくは内皮を発生させる組織である肢芽中胚葉になる。中胚葉は、心筋、平滑筋、または内皮前駆細胞および造血性前駆細胞からなる血島を生じ得る内臓中胚葉にも分化する。ゆえに、原始中胚葉幹細胞または間葉系幹細胞は、いくつかの細胞型および組織型に対する起源を提供し得る。いくつかの間葉系幹細胞が、単離されている例えば、米国特許第5,486,359号;同第5,827,735号;同第5,811,094号;同第5,736,396号;米国特許第5,837,539号;同第5,837,670号;同第5,827,740号;Jaiswalら、1997;Cassiedeら、1996;Johnstoneら、1998;Yooら、1998;Gronthos,1994;Makinoら、1999を参照のこと。これらは、その全体が本明細書によって参考として援用される。報告されている多くの間葉系幹細胞のうち、すべてが、間葉系起源であると一般に考えられている分化細胞だけを形成する限定的な分化を示した。今までに、ほとんどの多分化能間葉系幹細胞が、SH2SH4CD29CD44CD71CD90CD106CD120aCD124CD14-CD34-CD45-表現型を発現する。胃腸幹細胞、表皮幹細胞、神経幹細胞および肝幹細胞卵形細胞とも呼ばれるを含む他の幹細胞も同定されているPotten,1998;Watt,1997;Alisonら、1998。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載される方法にとって有用な幹細胞としては、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、間葉系幹細胞、骨髄由来の幹細胞、造血幹細胞、軟骨細胞前駆細胞、表皮幹細胞、胃腸幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞、脂肪由来の間葉系幹細胞、膵前駆細胞、毛包幹細胞、内皮前駆細胞および平滑筋前駆細胞が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載される方法のために使用される幹細胞は、臍帯、胎盤、羊水、絨毛膜絨毛、胚盤胞、骨髄、脂肪組織、脳、末梢血、消化管、臍帯血、血管、骨格筋、皮膚、肝臓および月経血から単離される。月経血において調製される幹細胞は、子宮内膜再生細胞と呼ばれるMedistemInc.。当業者は、そのような幹細胞を配置すること、単離すること、および増大することができる。様々な起源からヒト幹細胞を単離するための詳細な手順は、CurrentProtocolsinStemCellBiology2007に記載されており、これは、その全体が本明細書によって参考として援用される。あるいは、市販のキットおよび単離システムが使用され得る。例えば、BDBiosciences製のBDFACSAria細胞選別システム、BDIMag磁気細胞分離システムおよびBDIMagマウス造血性前駆細胞濃縮セット。様々な起源から幹細胞を単離する方法および培養する方法は、5,486,359、6,991,897、7,015,037、7,422,736、7,410,798、7,410,773、7,399,632にも記載されており、これらは、その全体が本明細書によって参考として援用される。B.体細胞本発明のある特定の態様において、分化転換の方法、すなわち、1つの体細胞タイプから別の体細胞タイプへの直接変換、例えば、肝細胞を他の体細胞から導き出す直接変換も提供され得る。分化転換は、肝細胞を産生するために体細胞において肝細胞プログラミング因子の遺伝子の発現レベルを増加させるそのような遺伝子または遺伝子産物の使用を含み得る。しかしながら、ヒト体細胞は、供給、特に、生存ドナーからの供給には限りがあり得る。プログラミング用の出発細胞staringcellを無制限に供給するある特定の態様では、不死化遺伝子または不死化タンパク質例えば、hTERTまたは癌遺伝子oncoogenesの導入によって、体細胞が不死化され得る。細胞の不死化は、可逆的であってもよいし例えば、除去可能な発現カセットを用いてまたは誘導性であってもよい例えば、誘導性プロモーターを用いて。本発明のある特定の態様における体細胞は、初代細胞非不死化細胞例えば、動物から単離したばかりの細胞であってもよいし、細胞株不死化細胞に由来してもよい。それらの細胞は、被験体から単離した後に細胞培養において維持され得る。ある特定の実施形態において、それらの細胞は、本発明の方法において使用する前に1回または2回以上例えば、2~5、5~10、10~20、20~50、50~100回またはそれ以上継代されている。いくつかの実施形態において、それらの細胞は、本発明の方法において使用する前に1、2、5、10、20または50回以下だけ継代されている可能性がある。それらは、凍結、解凍などされ得る。本明細書中で使用されるかまたは記載される体細胞は、天然の体細胞であってもよいし、操作された体細胞、すなわち、遺伝的に変更された体細胞であってもよい。本発明の体細胞は、代表的には、哺乳動物細胞例えば、ヒト細胞、霊長類細胞またはマウス細胞である。それらは、周知の方法によって得られることがあり、生存している体細胞を含む任意の器官または組織、例えば、血液、骨髄、皮膚、肺、膵臓、肝臓、胃、腸、心臓、生殖器、膀胱、腎臓、尿道および他の泌尿器などから得ることができる。本発明において有用な哺乳動物の体細胞としては、セルトリ細胞、内皮細胞、顆粒膜上皮細胞、ニューロン、膵島細胞、表皮細胞、上皮細胞、肝細胞、毛包細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラノサイト、軟骨細胞、リンパ球BおよびTリンパ球、赤血球、マクロファージ、単球、単核細胞、心筋細胞および他の筋細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、細胞は、所望の細胞型だけにおいてまたは所望の細胞型において主に発現されると知られている内因性マーカーの発現に基づいて選択される。例えば、ビメンチンは、線維芽細胞マーカーである。他の有用なマーカーとしては、様々なケラチン、細胞接着分子例えば、カドヘリン、フィブロネクチン、CD分子などが挙げられる。体細胞の集団は、18~96時間、例えば、24~48時間、48~72時間などの平均の細胞周期時間を有し得る。いくつかの実施形態において、それらの細胞の少なくとも90、95、98、99またはそれ以上が、所定の時間例えば、24、48、72または96時間内に分裂すると予想され得る。本明細書中に記載される方法は、1つ以上の体細胞、例えば、体細胞のコロニーまたは集団を肝細胞にプログラムするために使用され得る。いくつかの実施形態において、本発明の細胞の集団は、それらの細胞の少なくとも90が目的の表現型または特性を示すという点において、実質的に均一である。いくつかの実施形態において、それらの細胞の少なくとも95、96、97、98、99、99.5、99.8、99.9、99.95またはそれ以上が、目的の表現型または特性を示す。本発明のある特定の実施形態において、上記体細胞は、分裂する能力を有し、すなわち、上記体細胞は、分裂終了細胞ではない。体細胞は、部分的にまたは完全に分化していることがある。分化は、それほど特殊化していない細胞がより特殊化した細胞型になるプロセスである。細胞の分化は、その細胞のサイズ、形状、極性、代謝活性、遺伝子発現および/またはシグナルに対する応答性の変化を含み得る。例えば、造血幹細胞は、分化することにより、骨髄細胞系列単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球/血小板、樹状細胞およびリンパ系列T細胞、B細胞、NK細胞を含むすべての血液細胞型を生じる。分化の進行中に、細胞の最終的な運命が、より固定されるようになる。本明細書中に記載されるように、部分的に分化した体細胞と、完全に分化した体細胞の両方が、本明細書中に記載されるようにプログラムされることにより、肝細胞などの所望の細胞型が産生され得る。III.肝細胞プログラミング因子本発明のある特定の態様は、肝細胞フォワードプログラミングのための肝細胞プログラミング因子を提供する。上記肝細胞は、細胞内の肝細胞プログラミング因子のレベルを増加させることによって、他の細胞起源から直接産生され得る。肝細胞の数多くの機能は、肝細胞に豊富な限られた数の転写因子の協調作用によって、転写レベルで調節され得る。肝細胞に豊富な転写因子、特に、表1に列挙されるその遺伝子のような、肝細胞の分化または機能にとって重要な任意の転写因子が、本明細書中で使用され得る。表1に列挙される遺伝子のアイソフォームおよびバリアントのすべてが、本発明に含められ得、ある特定のアイソフォームまたはバリアントに対するアクセッション番号の非限定的な例が提供される。例えば、表1中の転写因子の組み合わせの発現をもたらすことによって、多能性幹細胞から肝細胞へのフォワードプログラミングは、すべてではないがほとんどの通常の発生段階を迂回し得る。示される例は、以下の転写因子:FOXA1、FOXA2、HHEX、HNF1A、HNF4AおよびTBX3の組み合わせ、またはFOXA2、HHEX、HNF4A、GATA4、NR0B2およびSCML1の組み合わせである。肝細胞に豊富な転写因子としては、肝細胞核因子1-αHNF-1α、-1β、-3α、-3β、-3γ、-4αおよび-6、ならびにc/ebpファミリーのメンバーが挙げられるが、これらに限定されない。肝細胞核因子HNFは、多種多様な群の遺伝子からタンパク質への転写を制御する系統的に無関係な転写因子の一群である。これらのタンパク質としては、血液凝固因子、ならびにさらに、グルコース、コレステロールおよび脂肪酸の輸送および代謝に関わる酵素およびトランスポーターが挙げられる。これらのうち、HNF4AHNF4αまたは核内レセプター2A1またはNR2A1としても知られるおよびHNF1Aすなわち、HNF1αは、培養ヘパトーマ細胞の分化した表現型と相関するとみられる。HNF1Aヌルマウスが生存可能であることから、この因子が、活性な肝実質の形成に対する絶対条件でないことが示唆される。対照的に、HNF4Aヌルマウスは、胚形成中に死亡する。HNF4Aは、発生の初期に発現され、肝臓が発生するかなり前である胎生期4.5日目のマウス臓側内胚葉におけるインサイチュハイブリダイゼーションによって可視である。HNF4Aが、臓側内胚葉において不可欠であるとみられるのに対し、胎児肝の発生の最も最初の工程にとっては必要ではない可能性があるLiら、2000。HNF-4Aは、哺乳動物の肝発生における肝細胞の分化にとって不可欠であり、かつ代謝制御および適切な肝機能にとって重大であるHayhurstら、2001。HNF-4Aは、TCF;HNF4;MODY;MODY1;NR2A1;TCF14;HNF4a7;HNF4a8;HNF4a9;NR2A21;およびFLJ39654としても知られる。6つの転写バリアントまたはアイソフォームが、ゲノム遺伝子、アイソフォームa、bc、d、d、eおよびfGenbankアクセッション番号:NM_000457.3、NM_001030003.1、NM_001030004.1、NMJ75914.3、NM_178849.1およびNM_178850.1から生成される。すべてのアイソフォームが、ジンクフィンガーC4型DNA結合ドメインおよびリガンド結合ドメインを含む。そのコードされるタンパク質は、ホモ二量体としてDNAに結合し、いくつかの遺伝子の発現を調節する核転写因子いくつかの肝臓遺伝子の発現を制御する転写因子であるHNF1Aを含むである。55個を超える異なる標的遺伝子が、HNF4Aに対して同定されている。それらの遺伝子の多くが、2つ以上のHNF4A結合部位を含むので、種で重複しない異なるHNF4A結合部位の総数は、現在、74である。これらの遺伝子は、機能例えば、栄養分の輸送および代謝、血液の維持、免疫機能、肝臓の分化および成長因子に従って、いくつかの異なるカテゴリーにグループ化することができる。最もよく特徴付けられたHNF-4A標的遺伝子は、脂質輸送に関わる遺伝子例えば、アポリポタンパク質遺伝子およびグルコース代謝に関わる遺伝子例えば、L-PKおよびPEPCKである。これまでに同定された標的遺伝子のほぼすべてが、主に肝臓において発現され;いくつかは、膵臓などの他の器官においても同様に発現される。HNF1Aは、HNF1、LFB1、TCF1およびM0DY3としても知られる。HNF1Aは、肝臓において高度に発現され、かついくつかの肝臓特異的遺伝子例えば、ヒトクラスIアルコールデヒドロゲナーゼの発現の制御に関わる、転写因子である。HNF-1AGenbankアクセッション番号:NM000545.4は、ホメオボックス遺伝子ファミリーに属し、ホメオボックスDNA結合ドメインを含む。ホメオボックスは、DNAに結合するDNA配列である。翻訳されたホメオボックスは、高度に保存された一続きの60アミノ酸残基である。フォークヘッドボックスA2FOXA2は、HNF-3β、HNF3B、TCF3BおよびMGC19807としても知られる。FOXA2は、DNA結合タンパク質のフォークヘッドクラスのメンバーである。そのフォークヘッドボックスは、DNAに結合するモチーフを形成する80~100アミノ酸の配列である。このフォークヘッドモチーフは、そのドメインのタンパク質構造におけるループのチョウ形の外観に起因して、ウィングドヘリックスとしても知られる。これらの肝細胞核因子は、アルブミンおよびトランスサイレチンなどの肝臓特異的遺伝子に対する転写活性化因子であり、クロマチンとも相互作用する。マウスにおける類似のファミリーメンバーは、代謝の制御ならびに膵臓および肝臓の分化における役割を有する。この遺伝子は、若年発症成人型糖尿病の孤発例に関係づけられている。異なるアイソフォームであるアイソフォーム1および2をコードする転写物バリアントが、この遺伝子Genbankアクセッション番号:NM021784.4;FOXA2-1およびNM_153675.2;FOXA2-2に対して同定されている。CCAAT/エンハンサー結合タンパク質C/EBPアルファは、CCAAT/エンハンサー結合タンパク質である。C/EBPは、細胞の分化、末端の機能および炎症反応にとって不可欠な転写因子のファミリーである。このファミリーの6つのメンバーが、特徴づけられておりC/EBPアルファ、C/EBPベータ、C/EBPデルタ、C/EBPイプシロン、C/EBPガンマおよびC/EBPゼータ、種々の組織に分布している。造血系によって発現されるホメオボックスタンパク質HHEXは、ヒトではHHEX遺伝子によってコードされるタンパク質である。この遺伝子は、転写因子のホメオボックスファミリーのメンバーをコードするそのメンバーの多くは、発生プロセスに関わっている。HHEXは、肝臓の初期発生にとって必要である。HHEXのヌル変異によって、肝芽形成の失敗および胚致死がもたらされる。T-ボックス転写因子TBX3は、ヒトではTBX3遺伝子によってコードされるタンパク質である。この遺伝子は、共通のDNA結合ドメインであるT-ボックスを共有する遺伝子の系統学的に保存されたファミリーのメンバーである。T-ボックス遺伝子は、発生プロセスの制御に関わる転写因子をコードする。このタンパク質は、転写抑制因子であり、四肢類の前肢の前/後軸に関与すると考えられている。この遺伝子の変異は、肢、アポクリン腺、歯、毛および生殖器の発生に影響する尺骨乳房症候群を引き起こす。この遺伝子の選択的スプライシングによって、異なるアイソフォームをコードする3つの転写物バリアントが生じる。GATA4遺伝子は、ジンクフィンガー転写因子のGATAファミリーのメンバーをコードする。このファミリーのメンバーは、多くの遺伝子のプロモーターに存在するGATAモチーフを認識する。GATA4タンパク質は、胚形成ならびに心筋の分化および機能に関わる遺伝子を制御すると考えられている。この遺伝子の変異は、心中隔欠損ならびに生殖欠陥を伴う。NR0B2遺伝子核内レセプターサブファミリー0,グループB,メンバー1;以前の名称は、量感受性性転換dosage-sensitivesexreversalDAX1であるは、DNA結合ドメインを含むタンパク質をコードする。コードされるタンパク質は、レチノイン酸レセプターによって媒介される転写のドミナントネガティブ制御因子として作用する。このタンパク質は、Sryに対して拮抗的に作用することによって、抗精巣遺伝子としても機能する。この遺伝子の変異は、X連鎖性先天性副腎低形成と低ゴナドトロピン性性腺機能低下症の両方をもたらす。コードされるタンパク質は、いくつかのホルモン産生組織の正常な発生において重要な役割を果たす。これらの組織としては、副腎、脳に位置する脳下垂体および視床下部、ならびに男性生殖構造および女性生殖構造精巣および卵巣が挙げられる。コードされるタンパク質は、胚発生中の、これらの組織を形成する細胞におけるある特定の遺伝子の活性を調節する。他の遺伝子の活性を調節するタンパク質は、転写因子として知られている。コードされるタンパク質は、それらが形成された後のこれらの組織におけるホルモン産生の制御においても、役割を果たす。SCML1中脚上の性節様タンパク質1は、推定上のポリコーム群PcGタンパク質をコードする。PcGタンパク質は、発生全体を通じてホメオティック遺伝子の転写的に抑制された状態を維持するために必要な多タンパク質複合体を形成することによって、作用する。コードされるタンパク質は、性成熟中の精子形成に関わり得る。IV.遺伝子または遺伝子産物の送達ある特定の実施形態において、肝臓系譜プログラミング因子または分化因子をコードする核酸を送達するためのベクターが、細胞においてこれらの因子を発現するように構築され得る。これらのベクターの構成要素および送達方法の詳細は、下記に開示される。さらに、タンパク質導入組成物またはタンパク質導入方法もまた、肝細胞プログラミング因子の発現をもたらすために使用され得る。さらなる態様において、肝細胞などの所望の細胞型の識別用のレポーター発現カセットの送達においても、以下の系および方法が使用され得る。特に、肝細胞特異的制御エレメントを使用することにより、レポーター遺伝子の発現が駆動され得、ゆえに、フォワードプログラミングに由来する肝細胞が、特徴づけられ得るか、選択され得るか、または濃縮され得る。A.核酸送達系当業者は、標準的な組換え手法例えば、Sambrookら、2001およびAusubelら、1996両方が本明細書中で参考として援用されるを参照のことによってベクターを構築する能力を十分備えているだろう。ベクターとしては、プラスミド、コスミド、ウイルスバクテリオファージ、動物ウイルスおよび植物ウイルスおよび人工染色体例えば、YAC、例えば、レトロウイルスベクター例えば、モロニーマウス白血病ウイルスベクターMoMLV、MSCV、SFFV、MPSV、SNVなどに由来するもの、レンチウイルスベクター例えば、HIV-1、HIV-2、SIV、BIV、FIVなどに由来するもの、アデノウイルスAdベクターその複製可能型、複製欠損型およびガットレス型gutlessformを含む、アデノ随伴ウイルスAAVベクター、サルウイルス40SV-40ベクター、ウシパピローマウイルスベクター、エプスタインバーウイルス、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ハーベイマウス肉腫ウイルスベクター、マウス乳腺腫瘍ウイルスベクター、ラウス肉腫ウイルスベクターが挙げられるがこれらに限定されない。1.ウイルスベクター組換えウイルスベクターを産生する際、非必須遺伝子が、代表的には、異種または非天然タンパク質に対する遺伝子またはコード配列で置き換えられる。ウイルスベクターは、ウイルス配列を利用して核酸およびあるいはタンパク質を細胞に導入する、一種の発現構築物である。ある特定のウイルスが細胞に感染する能力またはレセプター媒介性のエンドサイトーシスによって細胞に侵入する能力、およびウイルス遺伝子を宿主細胞のゲノムに組み込んで安定的かつ効率的に発現する能力のおかげで、それらのウイルスベクターは、外来核酸を細胞例えば、哺乳動物細胞に伝達するための魅力的な候補となる。本発明のある特定の態様の核酸を送達するために使用され得るウイルスベクターの非限定的な例は、下記に記載される。レトロウイルスは、それらの遺伝子を宿主ゲノムに組み込む能力、大量の外来遺伝物質を伝達する能力、広範囲の種および細胞型に感染する能力、ならびに特別な細胞株においてパッケージングされる能力に起因して、遺伝子送達ベクターとして有望であるMiller,1992。レトロウイルスベクターを構築するために、ある核酸を、ある特定のウイルス配列の代わりにウイルスゲノムに挿入して、複製欠損のウイルスを生成する。ビリオンを生成するために、gag、polおよびenv遺伝子を含むがLTRおよびパッケージング構成要素を有しないパッケージング細胞株が構築されるMannら、1983。レトロウイルスLTRおよびパッケージング配列とともにcDNAを含む組換えプラスミドが、特別な細胞株に導入されると例えば、リン酸カルシウム沈殿によって、そのパッケージング配列のおかげで、組換えプラスミドのRNA転写物が、ウイルス粒子にパッケージングされ、次いで、そのウイルス粒子は、培養液中に分泌されるNicolasandRubenstein,1988;Temin,1986;Mannら、1983。次いで、その組換えレトロウイルスを含む培地を回収し、必要に応じて濃縮し、遺伝子導入のために使用する。レトロウイルスベクターは、幅広い種類の細胞型に感染することができる。しかしながら、組み込みおよび安定した発現には、宿主細胞の分裂が必要であるPaskindら、1975。レンチウイルスは、共通のレトロウイルス遺伝子であるgag、polおよびenvに加えて、制御機能または構造機能を有する他の遺伝子を含む、複雑なレトロウイルスである。レンチウイルスベクターは、当該分野で周知である例えば、Naldiniら、1996;Zuffereyら、1997;Blomerら、1997;米国特許第6,013,516号および同第5,994,136号を参照のこと。組換えレンチウイルスベクターは、非分裂細胞に感染することができ、インビボとエキソビボの両方における遺伝子導入および核酸配列の発現のために使用され得る。例えば、好適な宿主細胞に、パッケージング機能を保持する2つ以上のベクターすなわち、gag、polおよびenv、ならびにrevおよびtatをトランスフェクトする、非分裂細胞に感染することができる組換えレンチウイルスが、米国特許第5,994,136号本明細書中で参考として援用されるに記載されている。2.エピソームベクタープラスミドベースまたはリポソームベースの染色体外すなわち、エピソームのベクターの使用もまた、本発明のある特定の態様において提供され得る。そのようなエピソームベクターとしては、例えば、oriPベースのベクター、および/またはEBNA-1の誘導体をコードするベクターが挙げられ得る。これらのベクターは、DNAの大きなフラグメントを、細胞に導入すること、染色体外に維持すること、1回の細胞周期あたり1回複製されること、効率的に娘細胞に分配されること、および実質的に免疫応答を誘発しないことを可能にし得る。特に、oriPベースの発現ベクターの複製に必要な唯一のウイルスタンパク質であるEBNA-1は、MHCクラスI分子上での抗原提示に必要なプロセシングを迂回する有効な機構を発達させているので、細胞性免疫応答を誘発しないLevitskayaら、1997。さらに、EBNA-1は、クローニングされた遺伝子の発現を増強するようにトランスで作用し得、それにより、クローニングされた遺伝子の発現がいくつかの細胞株において最大100倍誘導されるLangle-Rouaultら、1998;Evansら、1997。最後に、そのようなoriPベースの発現ベクターの製造は、安価である。他の染色体外ベクターとしては、他のリンパ球向性ヘルペスウイルスベースのベクターが挙げられる。リンパ球向性ヘルペスウイルスは、リンパ芽球例えば、ヒトBリンパ芽球において複製し、その天然の生活環の一部の間、プラスミドになる、ヘルペスウイルスである。単純ヘルペスウイルスHSVは、リンパ球向性ヘルペスウイルスではない。例示的なリンパ球向性ヘルペスウイルスとしては、EBV、カポジ肉腫ヘルペスウイルスKSHV;リスザルヘルペスウイルスHSおよびマレック病ウイルスMDVが挙げられるが、これらに限定されない。エピソームベースのベクターの他の起源も企図される例えば、酵母ARS、アデノウイルス、SV40またはBPV。当業者は、標準的な組換え手法によってベクターを構築する能力を備えているだろう例えば、Maniatisら、1988およびAusubelら、1994両方が本明細書中で参考として援用されるを参照のこと。ベクターは、遺伝子送達および/もしくは遺伝子発現をさらに調節するかまたは標的にされた細胞に有益な性質を別途提供する、他の構成要素または機能も含み得る。そのような他の構成要素としては、例えば、細胞への結合または標的化に影響を及ぼす構成要素細胞型または組織に特異的な結合を媒介する構成要素を含む;その細胞によるベクター核酸の取り込みに影響を及ぼす構成要素;取り込み後の細胞内のポリヌクレオチドの局在化に影響を及ぼす構成要素例えば、核局在化を媒介するもの;およびそのポリヌクレオチドの発現に影響を及ぼす構成要素が挙げられる。そのような構成要素は、ベクターによって送達された核酸を取り込み、それを発現している細胞を検出するためまたは選択するために使用され得る検出可能および/または選択可能なマーカーなどのマーカーも含み得る。そのような構成要素は、そのベクターの本来の特徴として提供され得る例えば、結合および取り込みを媒介する構成要素または機能を有するある特定のウイルスベクターの使用か、またはベクターは、そのような機能を提供するように改変され得る。多種多様のそのようなベクターが、当該分野で公知であり、一般に利用可能である。ベクターが宿主細胞内で維持されるとき、そのベクターは、自律的な構造として有糸分裂中にその細胞によって安定して複製され得るか、宿主細胞のゲノム内に組み込まれ得るか、または宿主細胞の核もしくは細胞質において維持され得る。3.トランスポゾンベースの系特定の実施形態によると、核酸の導入は、トランスポゾン-トランスポザーゼ系を使用し得る。使用されるトランスポゾン-トランスポザーゼ系は、周知のSleepingBeauty、FrogPrinceトランスポゾン-トランスポザーゼ系後者の説明については、例えば、EP1507865を参照のことまたはTTAA特異的トランスポゾンpiggyBac系であり得る。トランスポゾンは、転位と呼ばれるプロセスである、単一の細胞のゲノム内の種々の位置にあちこち移動し得るDNAの配列である。そのプロセスでは、トランスポゾンは、変異を引き起こし得、ゲノム内のDNAの量を変化させ得る。トランスポゾンは、かつてはジャンピング遺伝子とも呼ばれ、可動性遺伝因子の例である。種々の可動性遺伝因子が存在し、それらは、転位の機構に基づいてグループ分けされ得る。クラスI可動性遺伝因子、すなわちレトロトランスポゾンは、まず、RNAに転写され、次いで、逆転写酵素によってDNAに逆転写し戻されて、そしてそのゲノムの別の位置に挿入されることによって、自身を複製する。クラスII可動性遺伝因子は、トランスポザーゼを用いて、それらをゲノム内に切り貼りして、1つの位置から別の位置に直接移動する。4.相同組換えヌクレアーゼベースの系相同組換えHRは、1980年代中頃以降、哺乳動物細胞におけるゲノム操作の標準的な方法である標的化ゲノム改変手法である。哺乳動物細胞における標準的なHRの効率は、処理された細胞のうちたった10-6~10-9であるCapecchi,1990。メガヌクレアーゼまたはホーミングエンドヌクレアーゼ例えば、I-SceIの使用を用いることにより、HRの効率が上昇した。天然のメガヌクレアーゼと、改変された標的化特異性を有する操作されたメガヌクレアーゼの両方が、HR効率を上昇させるために利用されたPingoudandSilva,2007;Chevalierら、2002。HRの効率を上昇させる別の道は、プログラム可能なDNA特異性ドメインを有するキメラエンドヌクレアーゼを操作することだったSilvaら、2011。ジンクフィンガーヌクレアーゼZFNは、そのようなキメラ分子の1つの例であり、ここで、ジンクフィンガーDNA結合ドメインは、FokIなどのTypeIIS制限エンドヌクレアーゼの触媒ドメインに融合されるDuraiら、2005;PCT/US2004/030606に概説されているように。そのような特異性分子の別のクラスとしては、FokIなどのTypeIIS制限エンドヌクレアーゼの触媒ドメインMillerら、2011:PCT/IB2010/000154に融合された転写アクチベーター様エフェクターTALEDNA結合ドメインが挙げられる。B.調節エレメント:ベクターに含められる真核生物の発現カセットは、好ましくは、タンパク質コード配列に作動可能に連結された真核生物転写プロモーター、介在配列を含むスプライスシグナル、および転写終結/ポリアデニル化配列を5’から3’の方向で含む。1.プロモーター/エンハンサープロモーターは、転写の開始および比率を調節する核酸配列の一領域である調節配列である。プロモーターは、制御タンパク質および制御分子例えば、RNAポリメラーゼおよび他の転写因子が結合して、核酸配列の特定の転写を開始し得る、遺伝的エレメントを含み得る。句作動可能に位置する、作動可能に連結される、制御下および転写制御下は、プロモーターが、ある核酸配列の転写開始および/または発現を調節するようにその配列に対して妥当な機能的位置におよび/または妥当な方向で存在することを意味する。プロモーターは、通常、RNA合成の開始部位の位置を定めるように機能する配列を含む。このうち最もよく知られている例は、TATAボックスであるが、TATAボックスを欠くいくつかのプロモーター例えば、哺乳動物のターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子に対するプロモーターおよびSV40後期遺伝子に対するプロモーターでは、開始部位自体に存在する不連続のエレメントが、開始の位置を固定するのを助ける。追加のプロモーターエレメントは、転写開始の頻度を制御する。代表的には、これらは、開始部位の30~110bp上流の領域に位置するが、いくつかのプロモーターは、開始部位の下流にも同様に機能的エレメントを含むと示されている。コード配列をプロモーターの制御下にするために、転写読み枠の転写開始部位の5’末端が、選択されたプロモーターの下流すなわち、3’に置かれる。上流のプロモーターは、DNAの転写を刺激し、コードされるRNAの発現を促す。プロモーターエレメント間の間隔は、それらのエレメントが、互いに対して反転されるかまたは移動されてもプロモーターの機能が保存されるように、可撓性であることが多い。tkプロモーターでは、プロモーターエレメント間の間隔は、活性が低下し始める前に50bpまで離され得る。プロモーターに応じて、個別のエレメントが、転写を活性化するように協同的にまたは独立して機能し得るとみられる。プロモーターは、核酸配列の転写活性化に関わるシス作用性の制御配列のことを指すエンハンサーとともに使用されてもよいし、使用されなくてもよい。プロモーターは、コーディングセグメントおよび/またはエキソンの上流に位置する5’非コード配列を単離することによって得られることがあるように、天然に核酸配列に付随するものであり得る。そのようなプロモーターは、内在性と呼ばれ得る。同様に、エンハンサーは、天然には、その配列の下流または上流に位置する核酸配列に付随するものであり得る。あるいは、コーディング核酸セグメントを組換えプロモーターまたは異種プロモーター天然の環境では通常その核酸配列に付随しないプロモーターのことを指すの制御下に置くことによって、ある特定の利点が得られる。また、組換えエンハンサーまたは異種エンハンサーは、天然の環境では通常その核酸配列に付随しないエンハンサーのことを指す。そのようなプロモーターまたはエンハンサーには、他の遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー、および他の任意のウイルスまたは原核細胞もしくは真核細胞から単離されたプロモーターまたはエンハンサー、ならびに天然に存在しない、すなわち、異なる転写制御領域の異なるエレメントおよび/または発現を変化させる変異を含むプロモーターまたはエンハンサーが含まれ得る。例えば、組換えDNA構築物において最も一般的に使用されるプロモーターとしては、β-ラクタマーゼペニシリナーゼ、ラクトースおよびトリプトファンtrpプロモーター系が挙げられる。プロモーターおよびエンハンサーの核酸配列を合成的に生成することに加えて、配列は、本明細書中に開示される組成物に関連して組換えクローニングおよび/または核酸増幅技術PCRTMを含むを使用して生成され得る米国特許第4,683,202号および同第5,928,906号これらの各々が本明細書中で参考として援用されるを参照のこと。さらに、核以外の細胞小器官例えば、ミトコンドリア、葉緑体など内の配列の転写および/または発現を指示する調節配列も同様に使用され得ることが企図される。当然のこととして、発現のために選択された細胞小器官、細胞型、組織、器官または生物におけるDNAセグメントの発現を効果的に指示するプロモーターおよび/またはエンハンサーを使用することが重要であり得る。分子生物学の当業者は、通常、タンパク質発現のためのプロモーター、エンハンサーおよび細胞型の組み合わせの使用について承知している例えば、Sambrookら、1989本明細書中で参考として援用されるを参照のこと。使用されるプロモーターは、構成的であり得、組織特異的であり得、誘導性であり得、そして/または導入されたDNAセグメントの高レベルの発現を指示するのに適切な条件下において有用例えば、組換えタンパク質および/または組換えペプチドの大規模生成において有益であり得る。そのプロモーターは、異種性であってもよいし、内在性であってもよい。さらに、任意のプロモーター/エンハンサーの組み合わせ例えば、epd.isb-sib.ch/におけるワールドワイドウェブを介して、EukaryoticPromoterDataBaseEPDBに従ってもまた、発現を駆動するために使用され得る。T3、T7またはSP6細胞質発現系の使用が、別の可能性のある実施形態である。適切な細菌ポリメラーゼが、送達複合体の一部としてまたは追加の遺伝的発現構築物として提供される場合、真核細胞は、ある特定の細菌プロモーターからの細胞質の転写を支持し得る。プロモーターの非限定的な例としては、初期または後期ウイルスプロモーター例えば、SV40初期または後期プロモーター、サイトメガロウイルスCMV最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスRSV初期プロモーター;真核細胞プロモーター例えば、ベータアクチンプロモーターNg,1989;Quitscheら、1989、GADPHプロモーターAlexanderら、1988,Ercolaniら、1988、メタロチオネインプロモーターKarinら、1989;Richardsら、1984;および連鎖状のconcatenated応答エレメントプロモーター例えば、サイクリックAMP応答エレメントプロモーターcre、血清応答エレメントプロモーターsre、ホルボールエステルプロモーターTPAおよび最小TATAボックス近傍の応答エレメントプロモーターtreが挙げられる。ヒト成長ホルモンプロモーター配列例えば、Genbankアクセッション番号X05244,ヌクレオチド283-341に記載されているヒト成長ホルモン最小プロモーターまたはマウス乳腺腫瘍プロモーターATCC,Cat.No.ATCC45007から入手可能を使用することも可能である。特定の例は、ホスホグリセリン酸キナーゼPGKプロモーターであり得る。組織特異的な導入遺伝子発現特に、フォワードプログラミングから生成された肝細胞におけるレポーター遺伝子発現例えば、抗生物質耐性遺伝子の発現のためのものは、生成された肝細胞を識別する方法として望ましい。特異性と活性の両方を増加させるために、シス作用性の制御エレメントの使用が企図されている。例えば、肝細胞特異的プロモーター例えば、アルブミン、α-1-抗トリプシンAAT、シトクロムp4503A4CYP3A4、アポリポタンパク質A-IまたはAPOEのプロモーターが使用され得る。ある特定の態様において、これは、エンハンサー配列、すなわち、プロモーターの活性を高め、その配向に関係なく、比較的長い距離にわたっても標的プロモーターから数キロベースまで離れていてもシスで作用する能力を有する核酸配列にも関係する。しかしながら、エンハンサーは、所与のプロモーターと近位であっても機能し得るので、エンハンサーの機能は、必ずしもそのような長い距離に限定されるものではない。肝臓の場合、そのような器官特異的制御配列をレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスのベクターまたは非ウイルスベクターしばしば、ハウスキーピング肝細胞特異的細胞性プロモーターに加えてに組み込む数多くのアプローチが、これまでに報告されているFerryら、1998;Ghoshら、2000;Miaoら、2000;Follenziら、2002。肝臓特異的遺伝子のいくつかのエンハンサー配列が、証明されている。WO2009130208には、いくつかの肝臓特異的制御エンハンサー配列が記載されている。WO95/011308には、プロモーターおよび導入遺伝子に連結された肝細胞特異的調節領域HCRエンハンサーを含む遺伝子治療ベクターが記載されている。ヒトアポリポタンパク質E-肝細胞調節領域ApoE-HCRは、アポリポタンパク質EApoE遺伝子の肝臓特異的発現のための遺伝子座調節領域LCRである。ApoE-HCRは、ApoE/CI/CII遺伝子座に位置し、全長771bpを有し、肝臓における遺伝子ApoEおよびApoC-Iの発現において重要であるSimonetら、1993。WO01/098482では、この特異的なApoEエンハンサー配列またはその短縮バージョンと肝臓プロモーターとの組み合わせが提唱されている。非短縮型ApoE-HCRエンハンサーとヒトアルファ-抗トリプシンAATプロモーターとを組み合わせているベクター構築物が、インビボにおいて最高レベルの治療用タンパク質を生成することができることMiaoら、2000、および異種導入遺伝子とともに使用されるとき、持続性の発現をもたらし得ることMiaoら、2001が示された。例えばpAAV-ApoHCR-AAT-FIXIA構築物VandenDriesscheら、2007において使用されるような、このApoE-HCR-AAT発現カセットは、公知の最も強力な肝臓特異的FIX発現構築物の1つであり、重症血友病Bを有するヒトにおける第1/2相用量漸増臨床研究において適用に成功しているMannoら、2006。このhFIXミニ遺伝子の発現は、ヒトAATプロモーターに接続されたApoE-HCRから駆動される。ヒトAAT遺伝子の5’フランキング配列は、およそ1.2kbの全長を有する遠位エンハンサーおよび近位配列を含む複数のシス制御エレメントを含む。主に肝臓において、また、それほどではないにせよ、AATを発現すると知られている他の組織において、遺伝子発現を駆動することによってインビボにおいて組織特異性を付与するのに十分であると示されたShenら、1989。ApoEエンハンサーとともにこの1.2kbの領域のうちの347bpのフラグメントは、長期間にわたる肝臓特異的遺伝子発現をインビボにおいて達成することができるLeら、1997。興味深いことに、このより短いプロモーターは、より大きなAATプロモーターフラグメントについて報告されているものよりも特異的に発現を肝臓に対して標的にするYullら、1995。他のキメラ肝臓特異的構築物、例えば、AATプロモーターおよびアルブミンもしくはB型肝炎エンハンサーKramerら、2003、またはアポリポタンパク質Eエンハンサーエレメントの2つのタンデムコピーに連結されたアルコールデヒドロゲナーゼ6ADH6基本プロモーターGehrkeら、2003を有する構築物もまた、文献において提案されている。後者の刊行物の著者らは、比較的小さいサイズ1068bpのこのエンハンサー-プロモーター組み合わせの重要性を強調している。2.開始シグナルおよび内部リボソーム結合部位特異的な開始シグナルもまた、コード配列の効率的な翻訳のために使用され得る。これらのシグナルは、ATG開始コドンまたは隣接配列を含む。ATG開始コドンを含む外因性の翻訳調節シグナルは、提供される必要があり得る。当業者は、このことを判断することおよび必要なシグナルを提供することが容易に可能であろう。挿入物全体の翻訳を確実にするためには、開始コドンが所望のコード配列の読み枠とインフレームで存在しなければならないことは、周知である。外因性の翻訳調節シグナルおよび開始コドンは、天然のものまたは合成のものであり得る。発現効率は、適切な転写エンハンサーエレメントを含めることによって増大され得る。本発明のある特定の実施形態において、内部リボソーム進入部位IRESエレメントの使用を用いることにより、多重遺伝子、すなわちポリシストロニックなメッセージが作り出される。IRESエレメントは、5’メチル化Cap依存的翻訳のリボソームスキャニングモデルを迂回することおよび内部部位において翻訳を開始することができるPelletierandSonenberg,1988。ピコルナウイルス科の2つのメンバーポリオおよび脳心筋炎由来のIRESエレメントPelletierandSonenberg,1988ならびに哺乳動物のメッセージ由来のIRESMacejakandSarnow,1991が報告されている。IRESエレメントは、異種オープンリーディングフレームに連結され得る。複数のオープンリーディングフレーム各々、IRESによって分断されているが、同時に転写されて、ポリシストロニックなメッセージが生成され得る。IRESエレメントのおかげで、各オープンリーディングフレームが、効率的な翻訳のためにリボソームに接近可能になる。複数の遺伝子が、単一のメッセージを転写する単一のプロモーター/エンハンサーを用いて効率的に発現され得る米国特許第5,925,565号および同第5,935,819号各々が、本明細書中で参考として援用されるを参照のこと。3.複製開始点宿主細胞においてベクターを増やすために、そのベクターは、複製が開始される特定の核酸配列である1つ以上の複製開始点部位しばしばoriと呼ばれる、例えば、上に記載されたようなEBVのoriP、またはプログラミングにおいて類似の機能もしくは高められた機能を有する遺伝的に操作されたoriPに対応する核酸配列を含み得る。あるいは、上に記載されたような他の染色体外で複製するウイルスの複製起点または自律複製配列ARSが使用され得る。4.選択およびスクリーニング可能なマーカー本発明のある特定の実施形態において、本発明の核酸構築物を含む細胞は、マーカーを発現ベクターに含めることによって、インビトロまたはインビボにおいて識別され得る。そのようなマーカーは、その発現ベクターを含む細胞の容易な識別を可能にする識別可能な変化を細胞に付与し得る。一般に、選択マーカーは、選択を可能にする性質を付与するものである。ポジティブ選択マーカーは、マーカーの存在によって、その選択が可能になるものであるのに対し、ネガティブ選択マーカーは、その存在が選択を妨げるものである。ポジティブ選択マーカーの例は、薬物耐性マーカーである。通常、薬物選択マーカーを含めることによって、形質転換体のクローニングおよび識別が助けられ、例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、DHFR、GPT、ゼオシンおよびヒスチジノールに対する耐性を付与する遺伝子が、有用な選択マーカーである。条件の実行に基づいて形質転換体の判別を可能にする表現型を付与するマーカーに加えて、GFPなどのスクリーニング可能なマーカーその根拠は比色解析であるを含む他のタイプのマーカーも企図される。あるいは、ネガティブ選択マーカーとしてスクリーニング可能な酵素例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼtkまたはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼCATが利用され得る。当業者は、おそらくFACS解析とともに、免疫学的マーカーを使用する方法も承知しているだろう。使用されるマーカーは、遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現されることができる限り、重要であると考えられていない。選択およびスクリーニング可能なマーカーのさらなる例は、当業者に周知である。本発明の1つの特徴は、プログラミング因子がそれらの細胞における所望のプログラミング変化をもたらした後に、選択およびスクリーニング可能なマーカーを使用することにより、肝細胞が選択されることを含む。C.核酸送達DNAまたはRNAなどの核酸を、本発明によってプログラムされる細胞に導入することは、本明細書中に記載されるようなまたは当業者に公知であり得るような、細胞を形質転換するための核酸送達に適した任意の方法を使用し得る。そのような方法としては、DNAの直接的な送達例えば、エキソビボトランスフェクションWilsonら、1989,Nabelら、1989、注入米国特許第5,994,624号、同第5,981,274号、同第5,945,100号、同第5,780,448号、同第5,736,524号、同第5,702,932号、同第5,656,610号、同第5,589,466号および同第5,580,859号各々が本明細書中で参考として援用されるマイクロインジェクションHarlandandWeintraub,1985;米国特許第5,789,215号本明細書中で参考として援用されるを含む;エレクトロポレーション米国特許第5,384,253号本明細書中で参考として援用される;Tur-Kaspaら、1986;Potterら、1984;リン酸カルシウム沈殿GrahamandVanDerEb,1973;ChenandOkayama,1987;Rippeら、1990;DEAEデキストランに続いてポリエチレングリコールを使用することGopal,1985;ダイレクトソニックローディングdirectsonicloadingFechheimerら、1987;リポソーム媒介性トランスフェクションNicolauandSene,1982;Fraleyら、1979;Nicolauら、1987;Wongら、1980;Kanedaら、1989;Katoら、1991およびレセプター媒介性トランスフェクションWuandWu,1987;WuandWu,1988;微粒子銃microprojectilebombardmentPCT出願番号WO94/09699および95/06128;米国特許第5,610,042号;同第5,322,783号、同第5,563,055号、同第5,550,318号、同第5,538,877号および同第5,538,880号各々が本明細書中で参考として援用される;炭化ケイ素繊維との撹拌Kaepplerら、1990;米国特許第5,302,523号および同第5,464,765号各々が本明細書中で参考として援用される;Agrobacterium媒介性形質転換米国特許第5,591,616号および同第5,563,055号各々が本明細書中で参考として援用される;乾燥/阻害媒介性DNA取り込みPotrykusら、1985ならびにそのような方法の任意の組み合わせによるものが挙げられるが、これらに限定されない。これらのような手法を適用することにより、細胞小器官、細胞、組織または生物が、安定にまたは一過性に形質転換され得る。1.リポソーム媒介性トランスフェクション本発明のある特定の実施形態において、核酸が、例えばリポソームなどの脂質複合体に捕捉され得る。リポソームは、リン脂質二重層膜および内側の水性媒体によって特徴づけられる小胞構造である。多層リポソームは、水性媒体によって分断された複数の脂質層を有する。それらは、リン脂質が過剰量の水溶液中で懸濁されたとき、自発的に形成する。脂質成分は、自己再配列を起こした後、閉鎖構造を形成し、水および溶解された溶質を脂質二重層の間に捕捉するGhoshandBachhawat,1991。LipofectamineGibcoBRLまたはSuperfectQiagenと複合体化された核酸も企図される。使用されるリポソームの量は、使用されるリポソームならびに細胞の性状に応じて変動し得、例えば、100万~1000万個の細胞あたり約5~約20μgのベクターDNAが企図され得る。インビトロにおける外来DNAのリポソーム媒介性の核酸の送達および発現は、非常に成功しているNicolauandSene,1982;Fraleyら、1979;Nicolauら、1987。培養ニワトリ胚、HeLaおよびヘパトーマ細胞における外来DNAのリポソーム媒介性の送達および発現の実行可能性も証明されているWongら、1980。本発明のある特定の実施形態において、リポソームは、センダイウイルスHVJと複合体化され得る。これは、細胞膜との融合を促進し、リポソームに被包されたDNAが細胞に進入するのを促すと示されたKanedaら、1989。他の実施形態において、リポソームは、核の非ヒストン染色体タンパク質HMG-1と複合体化され得るか、またはそれとともに使用され得るKatoら、1991。なおもさらなる実施形態において、リポソームは、HVJとHMG-1の両方と複合体化され得るか、またはそれらとともに使用され得る。他の実施形態において、送達ビヒクルは、リガンドおよびリポソームを含み得る。2.エレクトロポレーション本発明のある特定の実施形態において、核酸は、エレクトロポレーションを介して細胞小器官、細胞、組織または生物に導入される。エレクトロポレーションは、細胞およびDNAの懸濁液を高電圧放電に曝露することを含む。レシピエント細胞は、機械的損傷による形質転換に対してより感受性にされ得る。また、使用されるベクターの量は、使用される細胞の性状に応じて変動し得、例えば、100万~1000万個の細胞あたり約5~約20μgのベクターDNAが企図され得る。エレクトロポレーションを用いた真核細胞のトランスフェクションは、かなり成功している。この様式において、マウスpreBリンパ球が、ヒトカッパー免疫グロブリン遺伝子でトランスフェクトされPotterら、1984、ラット肝細胞が、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子でトランスフェクトされたTurKaspaら、1986。3.リン酸カルシウム本発明の他の実施形態において、核酸は、リン酸カルシウム沈殿を用いて細胞に導入される。この手法を用いて、ヒトKB細胞が、アデノウイルス5DNAでトランスフェクトされたGrahamandVanDerEb,1973。また、この様式において、マウスLA9、マウスC127、CHO、CV-1、BHK、NIH3T3およびHeLa細胞が、ネオマイシンマーカー遺伝子でトランスフェクトされChenandOkayama,1987、ラット肝細胞が、種々のマーカー遺伝子でトランスフェクトされたRippeら、1990。4.DEAE-デキストラン別の実施形態において、核酸は、DEAEデキストランに続いてポリエチレングリコールを用いて細胞に送達される。この様式において、レポータープラスミドは、マウスミエローマおよび赤白血病細胞に導入されたGopal,1985。5.ソニケーションローディング本発明の追加の実施形態は、ダイレクトソニックローディングによる核酸の導入を含む。LTK-線維芽細胞は、ソニケーションローディングによってチミジンキナーゼ遺伝子でトランスフェクトされたFechheimerら、1987。6.微粒子銃微粒子銃法は、少なくとも1つの細胞小器官、細胞、組織または生物に核酸を導入するために使用され得る米国特許第5,550,318号;米国特許第5,538,880号;米国特許第5,610,042号;およびPCT出願WO94/09699;これらの各々が本明細書中で参考として援用される。この方法は、DNAでコーティングされたマイクロ発射体microprojectileを高速に加速する能力それにより、細胞膜を貫通して、細胞を殺滅することなく細胞に進入することが可能になるに依存するKleinら、1987。当該分野で公知の多種多様の微粒子銃法が存在し、それらの多くは、本発明に適用可能である。この微粒子銃法では、1つ以上の粒子が、少なくとも1つの核酸でコーティングされ、そして推進力によって細胞に送達され得る。小粒子を加速させるためのいくつかのデバイスが開発されている。そのようなデバイスの1つは、電流を生成して輸送力を提供する高圧放電に依存しているYangら、1990。使用されるマイクロ発射体は、生物学的に不活性な物質例えば、タングステンまたは金の粒子またはビーズからなる。例示的な粒子としては、タングステン、白金、および好ましくは金を含む粒子が挙げられる。場合によっては、金属粒子上へのDNA沈殿は、微粒子銃を用いたレシピエント細胞へのDNA送達に必要でないことがあると企図される。しかしながら、粒子が、DNAでコーティングされるのではなくDNAを含み得ることが企図される。DNAでコーティングされた粒子は、粒子銃を介したDNA送達のレベルを増加させ得るが、それら自体が必要であるわけではない。照射の場合、懸濁液中の細胞は、フィルター上または固体培地上に濃縮される。あるいは、未成熟胚または他の標的細胞は、固体培地上に並べられ得る。照射される細胞は、大微粒子銃停止プレートmacroprojectilestoppingplateの下に適切な距離で配置される。B.タンパク質伝達本発明のある特定の態様において、肝細胞にプログラムされる細胞は、フォワードプログラミングに十分な量で、肝細胞転写因子遺伝子のポリペプチドを含む肝細胞プログラミング因子と接触され得る。タンパク質伝達は、細胞への高分子の送達を高めるための方法として使用されている。タンパク質伝達ドメインは、肝細胞プログラミングポリペプチドまたはその機能的フラグメントを細胞に直接導入するために使用され得る。多くのグループによる研究から、HIVTatタンパク質に由来するTATタンパク質のある領域が、標的タンパク質と融合されることによって、標的タンパク質がその細胞に進入することが可能になり得ることが示された。このドメインの特定の例示的なタンパク質配列は、RKKRRQRRR配列番号1であり、ここで、Rはアルギニンをコードし、Kはリジンをコードし、Qはグルタミンをコードする。この配列は、N末端融合またはC末端融合の両方として、タンパク質融合物の進入を可能にすると示されている。このTAT媒介性の進入の機構は、マクロピノサイトーシスによるものであると考えられているGumpandDowdy。タンパク質伝達ドメインまたはPTDは、生体膜、特に、細胞膜を通過し得るアミノ酸配列である。PTDは、異種ポリペプチドに付着されるとき、生体膜を越えた異種ポリペプチドのトランスロケーションを増強し得る。PTDは、代表的には、異種DNA結合ドメインに共有結合的に付着される例えば、ペプチド結合によって。例えば、PTDおよび異種DNA結合ドメインは、単一の核酸、例えば、共通のオープンリーディングフレーム内または共通の遺伝子の1つ以上のエキソン内の核酸によって、コードされ得る。例示的なPTDは、10~30アミノ酸を含み得、両親媒性ヘリックスを形成し得る。多くのPTDが、塩基性の性質である。例えば、塩基性のPTDは、少なくとも4、5、6または8つの塩基性残基例えば、アルギニンまたはリジンを含み得る。PTDは、細胞壁を欠く細胞または特定の種由来の細胞、例えば、哺乳動物細胞例えば、ヒト、サル、マウス、ウシ、ウマ、ネコまたはヒツジの細胞へのポリペプチドのトランスロケーションを増強することが可能であり得る。PTDは、例えば可撓性リンカーを用いて、人工的な転写因子に連結され得る。可撓性リンカーは、自由な回転を可能にする1つ以上のグリシン残基を含み得る。例えば、PTDは、少なくとも10、20または50アミノ酸によって、転写因子のDNA結合ドメインと間隔が空けられ得る。PTDは、DNA結合ドメインに対してNまたはC末端に配置され得る。特定のドメインに対してNまたはC末端に配置されることは、その特定のドメインに隣接することを必要としない。例えば、DNA結合ドメインに対してN末端のPTDは、スペーサーおよび/または他のタイプのドメインによってDNA結合ドメインと間隔が空けられ得る。PTDは、化学的に合成され、次いで、別個に調製されたDNA結合ドメインにリンカーペプチドありまたはなしで化学的に結合体化され得る。人工的な転写因子はまた、複数のPTD、例えば、複数の異なるPTDまたは少なくとも2コピーの1種のPTDを含み得る。いくつかのタンパク質および小ペプチドは、レセプターまたはエンドサイトーシスに媒介される従来の経路とは無関係に、生体膜を通って伝達するかまたは移行する能力を有する。これらのタンパク質の例としては、HIV-1TATタンパク質、単純ヘルペスウイルス1HSV-1DNA結合タンパク質VP22、およびDrosophilaAntennapediaAntpホメオティック転写因子が挙げられる。これらのタンパク質由来の低分子タンパク質伝達ドメインPTDは、他の高分子、ペプチドまたはタンパク質を細胞に首尾良く輸送するために、それらと融合され得る。これらのタンパク質由来の伝達ドメインの配列アラインメントは、これらの領域と膜内の負に帯電した脂質との相互作用を促進し得る塩基性アミノ酸LysおよびArgの含有量が多いことを示す。二次構造解析は、3つすべてのドメイン間で一貫した構造を示さない。これらの伝達ドメインの融合を使用する利点は、タンパク質の進入が、迅速であり、濃度依存的であり、困難な細胞型とともに働くとみられる点である。ヒト免疫不全ウイルスI型HIV-1由来のTatタンパク質は、外因的に加えられたとき、細胞に進入する注目すべき能力を有するFrankelandPabo,1988;MannandFrankel,1991;Fawellら、1994。TatPTDの特定の例は、ヒト免疫不全ウイルスTatタンパク質の残基47~57を含み得る:YGRKKRRQRRR配列番号2。このペプチド配列は、本明細書中でTATと称される。このペプチドは、インビトロおよびインビボにおいて100kDaを超える異種ペプチドおよび異種タンパク質の哺乳動物細胞への導入を首尾良く媒介すると示されているHoら、2001。Schwarzeらは、TATと融合された120kDaのβ-ガラクトシダーゼタンパク質が、マウスの腹腔内に注射されたとき、その融合タンパク質は、血液脳関門が原因で困難であると考えられている脳さえも含むすべてのタイプの細胞および組織において見られたことを示したSchwarzeら、1999。アンテナペディアホメオドメインもまた、PTDであるペプチドを含むDerossiら、1994。Penetratinとも称されるこのペプチドは、アミノ酸配列:AKIWFQNRRMKWKKENN配列番号3を含む。HSVVP22タンパク質もまた、PTDを含む。このPTDは、VP22のC末端の34アミノ酸残基:DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE配列番号4に位置する。例えば、ElliottandO’Hare1997および米国特許第6,184,038号を参照のこと。1つの実施形態において、PTDは、ヒトまたは他の哺乳動物のタンパク質から得られる。例示的な哺乳動物のPTDは、WO03/059940ヒトSIM-2およびWO03/059941Mphに記載されている。ある特定の実施形態において、PTDは、合成PTDであり得る。最小TatPTDaa47~57は、タンパク質伝達能力を最適化するように改変されたHoら、2001。一連の合成PTDと結合されたFITCが、培養Tリンパ球を用いて試験された。いくつかの合成PTDは、TatPTDと比べてタンパク質伝達の増大を示した。これらのPTDとしては:YARKARRQARR配列番号5;YARAARRAARR配列番号6;YARAARRAARA配列番号7;YARAAARQARA配列番号8が挙げられる。特に、合成PTDYARAAARQARA配列番号8と結合体化されたFITCは、マウスにi.p.注射されたとき、全血細胞による取り込みの増大を示した。約6~12アルギニン残基から構成されるポリ-アルギニンペプチドもまた、場合によっては、タンパク質伝達を媒介し得る。ポリ-アルギニンについての追加情報については、例えば、Rothbardら2000;Wenderら2000を参照のこと。PTDについての追加情報については、U.S.2003/0082561;U.S.2002/0102265;U.S.2003/0040038;Schwarzeら1999;Derossiら1996;Hancockら1991;Bussら1988;Derossiら1998;Lindgrenら2000;Kilicら2003;Asohら2002;およびTanakaら2003も参照のこと。PTDに加えて、細胞取り込みシグナルが使用され得る。そのようなシグナルは、細胞レセプターまたは他の表面タンパク質によって特異的に認識されるアミノ酸配列を含む。細胞取り込みシグナルと細胞との相互作用は、その細胞取り込みシグナルを含む人工的な転写因子の内部移行を引き起こす。いくつかのPTDは、細胞レセプターまたは他の表面タンパク質との相互作用によっても機能し得る。アミノ酸配列がPTDとして機能し得るかを判定するために、いくつかのアッセイが利用可能である。例えば、上記アミノ酸配列をβ-ガラクトシダーゼなどのレポータータンパク質と融合することにより、融合タンパク質が形成され得る。この融合タンパク質を、培養細胞と接触させる。その細胞を洗浄し、次いで、レポーター活性についてアッセイする。別のアッセイは、対象のアミノ酸配列および別の検出可能な配列、例えば、エピトープタグを含む融合タンパク質の存在を検出する。この融合タンパク質を、培養細胞と接触させる。その細胞を洗浄し、次いで、Westernまたは免疫蛍光法によって解析することにより、細胞内の検出可能な配列の存在を検出する。なおも他のアッセイを用いることにより、推定上のPTD、DNA結合ドメイン、および必要に応じてエフェクタードメインを含む融合タンパク質の転写制御活性が検出され得る。例えば、そのような融合タンパク質と接触させた細胞を、例えば、マイクロアレイ、質量分析およびハイスループット法を用いて、mRNAまたはタンパク質の存在またはレベルについてアッセイし得る。V.細胞培養一般に、本発明の細胞は、細胞の成長を持続させることができる、栄養分に富んだ緩衝液である培養液中で培養される。本明細書中に記載される方法に従った、単離、増大および幹細胞から肝細胞への分化に適した培養液としては、高グルコースダルベッコ改変イーグル培地DMEM、DMEM/F-15、LiebovitzL-15、RPMI1640、イスコフ改変ダルベッコ培地IMDMおよびOpti-MEMSFMInvitrogenInc.が挙げられるがこれらに限定されない。既知組成培地は、ヒト血清アルブミン、ヒトExCyteリポタンパク質、トランスフェリンtransfernin、インスリン、ビタミン類、必須アミノ酸および可欠アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、グルタミンならびにマイトジェンが補充された最小必須培地例えば、イスコフ改変ダルベッコ培地IMDMGibcoを含み、これもまた好適である。本明細書中で使用されるとき、マイトジェンとは、細胞の細胞分裂を刺激する物質のことを指す。ある物質は、通常、細胞が細胞分裂を始めるように奨励して、有糸分裂を誘発するいくつかの形態のタンパク質である、化学物質であり得る。1つの実施形態において、U.S.Ser.No.08/464,599およびWO96/39487に記載されているような無血清培地ならびに米国特許第5,486,359号に記載されているような完全培地が、本明細書中に記載される方法とともに使用するために企図される。いくつかの実施形態において、その培養液には、ヘパリン2U/mlが補充された、10ウシ胎児血清FBS、ヒト自己血清、ヒトAB血清または多血小板血漿が補充される。細胞培養物は、培養液のpHを維持するために、例えば5~12のCO2雰囲気中で維持され得、湿気のある雰囲気において37°Cでインキュベートされ得、85未満のコンフルエンスを維持するように継代され得る。肝細胞に分化される多能性幹細胞は、多能性を維持するのに十分な培地中で培養され得る。本発明のある特定の態様において産生される人工多能性幹iPS細胞の培養は、霊長類の多能性幹細胞、より具体的には、U.S.Pat.App.20070238170およびU.S.Pat.App.20030211603に記載されているような胚性幹細胞を培養するために開発された、様々な培地および手法を使用し得る。例えば、ヒト胚性幹hES細胞のように、iPS細胞は、80DMEMGibco♯10829-018または♯11965-092、熱失活されていない20の既定のウシ胎児血清FBS、1可欠アミノ酸、1mML-グルタミンおよび0.1mMベータ-メルカプトエタノール中で維持され得る。あるいは、ES細胞は、80Knock-OutDMEMGibco♯10829-018、20血清代替品Gibco♯10828-028、1可欠アミノ酸、1mML-グルタミンおよび0.1mMベータ-メルカプトエタノールを用いて調製された無血清培地中で維持され得る。使用の直前に、ヒトbFGFが、約4ng/mLという最終濃度まで加えられ得るWO99/20741。本発明の肝細胞は、多能性幹細胞または他の非肝細胞から肝細胞へのプログラミングを促すのに十分なまで肝細胞プログラミング因子の細胞内レベルを上昇させる条件下の培地中で、それらの細胞を培養することによって産生され得る。その培地は、様々な種類の成長因子のような1つ以上の肝細胞分化物質および肝細胞成熟物質も含み得る。しかしながら、肝細胞プログラミング転写因子の細胞内レベルを上昇させることによって、本発明の態様は、成熟肝細胞に向かう段階の各々のために培地を変更する必要なく、それらのほとんどの段階を迂回する。ゆえに、本発明によって提供される利点を考慮して、特定の態様において、肝細胞プログラミング下で細胞を培養するための培地は、肝細胞分化物質および肝細胞成熟物質のうちの1つ以上を本質的に含まなくてもよいし、そのような物質の異なる組み合わせを含む培地による連続した変更を受けなくてもよい。これらの物質は、細胞がより成熟表現型になるように、もしくは成熟細胞の生存を優先的に促すように、またはこれらの作用の両方の組み合わせを有するように誘導するのを助け得る。本開示において例証される肝細胞分化物質および肝細胞成熟物質には、肝細胞系譜の細胞の成長を促すことができる可溶性成長因子ペプチドホルモン、サイトカイン、リガンド-レセプター複合体および他の化合物が含まれ得る。そのような物質の非限定的な例としては、上皮成長因子EGF、インスリン、TGF-α、TGF-β、線維芽細胞成長因子FGF、ヘパリン、肝細胞成長因子HGF、オンコスタチンMOSM、IL-1、IL-6、インスリン様成長因子IおよびIIIGF-I、IGF-2、ヘパリン結合性成長因子1HBGF-1ならびにグルカゴンが挙げられるがこれらに限定されない。熟練の読者は、オンコスタチンMが、白血病抑制因子LIF、インターロイキン-6IL-6および毛様体神経栄養因子CNTFと構造的に関係していることをすでに認識しているだろう。追加の例は、以前の特許開示米国特許第6,458,589号、米国特許第6,506,574号;WO01/81549に記載されているようなn-ブチレートである。同様の作用を有し、本発明の実施において代替物として使用され得るn-ブチレートのホモログは、容易に同定され得る。いくつかのホモログが、n-ブチレートの構造的および物理化学的な性質と類似の性質:3~10個の炭素原子を含む酸性炭化水素、ならびにカルボキシレート、スルホネート、ホスホネートおよび他のプロトンドナーからなる群より選択される結合体ベースconjugatebaseを有する。例としては、イソ酪酸、ブテン酸、プロパン酸、他の短鎖脂肪酸およびジメチルブチレートが挙げられる。同配体のisoteric炭化水素スルホネートまたは炭化水素ホスホネート例えば、プロパンスルホン酸およびプロパンホスホン酸および結合体例えば、アミド、糖類、ピペラジンおよび環状誘導体もまた含められる。ブチレートホモログのさらなるクラスは、ヒストン脱アセチル化酵素のインヒビターである。非限定的な例としては、トリコスタチンA、5-アザシチジン、トラポキシンA、オキサンフラチンoxamflatin、FR901228、シスプラチンおよびMS-27-275が挙げられる。別のクラスの物質は、DMSOのような有機溶媒である。類似の性質を有する代替物としては、ジメチルアセトアミドDMA、ヘキサメチレンhexmethyleneビスアセトアミドおよび他のポリメチレンビスアセトアミドが挙げられるがこれらに限定されない。このクラスにおける溶媒は、細胞の膜透過性を高める性質によって部分的に関係づけられる。ニコチンアミドなどの溶質もまた、興味深い。VI.肝細胞の特性細胞は、いくつかの表現型の基準に従って特徴付けられ得る。その基準としては、発現される細胞マーカーの検出または定量、酵素活性、ならびに形態学的特徴および細胞間シグナル伝達の特徴づけが挙げられるがこれらに限定されない。他の態様において、プログラムされる細胞は、肝細胞識別のために肝細胞特異的プロモーターのような組織特異的または細胞特異的な転写制御エレメントを含むレポーター遺伝子発現カセットを含み得る。本発明のある特定の態様において例示される肝細胞は、天然において肝細胞例えば、器官起源由来の初代肝細胞に特徴的な形態学的特徴を有する。それらの特徴は、そのようなものを査定する際に当業者によって容易に認識され、それらの特徴には、以下のいずれかまたはすべてが含まれる:多角形の細胞形状、二核性の表現型、分泌タンパク質を合成するための粗面小胞体の存在、細胞内タンパク質を選別するためのゴルジ-小胞体リソソーム複合体の存在、ペルオキシソームおよびグリコーゲン顆粒の存在、比較的大量のミトコンドリア、ならびに細胞間のタイトジャンクションを形成する能力それにより毛細胆管の空間bilecanalicularspacesが生じる。単一の細胞に存在するいくつかのこれらの特徴は、その細胞が肝細胞系譜のメンバーであることと一致する。細胞が肝細胞に特徴的な形態学的特徴を有するか否かの公平な判定は、プログラミング中の子孫細胞、成熟または胎仔肝細胞、および1つ以上のネガティブコントロール細胞例えば、線維芽細胞またはRPE網膜色素上皮細胞の顕微鏡像をコード化し、次いで、その顕微鏡像を盲検形式で査定し、そのコードを解読することにより、そのフォワードプログラミングから産生された細胞が正確に識別されるかを判定することによって行われ得る。本発明の細胞はまた、それらが肝細胞系譜の細胞に特徴的な表現型マーカーを発現しているか否かに従って特徴付けられ得る。肝細胞の区別において有用な細胞マーカーの非限定的な例としては、アルブミン、アシアロ糖タンパク質レセプター、α1-抗トリプシン、α-フェトプロテイン、apoE、アルギナーゼI、apoAI、apoAII、apoB、apoCIII、apoCII、アルドラーゼB、アルコールデヒドロゲナーゼ1、カタラーゼ、CYP3A4、グルコキナーゼ、グルコース-6-ホスファターゼ、インスリン成長因子1および2、IGF-1レセプター、インスリンレセプター、レプチン、肝臓特異的有機アニオントランスポーターLST-1、L型脂肪酸結合タンパク質、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、トランスフェリン、レチノール結合タンパク質ならびにエリトロポイエチンEPOが挙げられる。成熟肝細胞マーカーとしては、アルブミン、α1-抗トリプシン、アシアロ糖タンパク質レセプター、サイトケラチン8CK8、サイトケラチン18CK18、CYP3A4、フマリルアセト酢酸ヒドラーゼFAH、グルコース-6-リン酸、チロシンアミノトランスフェラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼおよびトリプトファン2,3-ジオキシゲナーゼが挙げられるが、これらに限定されない。そのようなマーカーの発現レベルの評価は、他の細胞との比較において判定され得る。成熟肝細胞のマーカーについてのポジティブコントロールとしては、目的の種の成人型肝細胞および樹立された肝細胞株が挙げられる。読者は、永久細胞株または長期間の肝臓細胞培養物が、代謝的に変更され得、初代肝細胞のある特定の特性を発現しないことに注意されたい。ネガティブコントロールとしては、別個の系譜の細胞例えば、成熟線維芽細胞株または網膜色素上皮RPE細胞が挙げられる。未分化な幹細胞は、上に列挙されたマーカーのうちのいくつかについて陽性であるが、下記の例において例証されるような成熟肝細胞のマーカーについては陰性である。本開示に列挙される組織特異的例えば、肝細胞特異的なタンパク質決定基およびオリゴ糖決定基は、任意の好適な免疫学的手法例えば、細胞表面マーカーに対するフロー免疫細胞化学、細胞内マーカーまたは細胞表面マーカーに対する免疫組織化学例えば、固定された細胞または組織切片のもの、細胞抽出物のウエスタンブロット解析、および細胞抽出物または培地中に分泌された生成物に対する酵素結合イムノアッセイを用いて検出され得る。有意に検出可能な量の抗体が、標準的な免疫細胞化学またはフローサイトメトリーアッセイ必要に応じて細胞の固定後、および必要に応じて、標識された二次抗体または標識を増幅する他の結合体例えば、ビオチン-アビジン結合体を用いるにおいて抗原に結合し得る場合、その細胞による抗原の発現は抗体検出可能であると言われる。組織特異的例えば、肝細胞特異的マーカーの発現は、ノーザンブロット解析、ドットブロットハイブリダイゼーション解析、または標準的な増幅法において配列特異的プライマーを用いるリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応RT-PCR米国特許第5,843,780号によって、mRNAレベルでも検出され得る。本開示に列挙される特定のマーカーに対する配列データは、GenBankなどの公的データベースから得ることができる。代表的な管理実験において標準的な手順に従って細胞サンプルに対してアッセイを行うことにより、標準的な時間枠内において明らかに識別可能なハイブリダイゼーションまたは増幅産物が生じる場合、そのmRNAレベルでの発現は、本開示に記載されるアッセイのうちの1つに従って検出可能であると言われる。別段要求されない限り、特定のマーカーの対応するmRNAがRT-PCRによって検出可能である場合、そのマーカーの発現が示唆される。タンパク質レベルまたはmRNAレベルにおいて検出されるような組織特異的マーカーの発現は、そのレベルが、コントロール細胞例えば、未分化な多能性幹細胞、線維芽細胞または他の無関係な細胞型のレベルよりも少なくとも2倍、好ましくは、10または50倍超高い場合、陽性であると考えられる。細胞は、それらが肝細胞系譜の細胞に特徴的な酵素活性を示すかによっても特徴付けられ得る。例えば、グルコース-6-ホスファターゼ活性についてのアッセイは、Bublitz1991;Yasminehら1992;およびOckerman1968によって報告されている。肝臓細胞におけるアルカリホスファターゼALPおよび5-ヌクレオチダーゼ5’-Naseについてのアッセイは、Shiojiri1981によって報告されている。研究およびヘルスケアの部門を務めるいくつかの研究室は、商業サービスとして、肝臓の酵素についてのアッセイを提供している。他の実施形態において、本発明の細胞は、生体異物の解毒を示唆する活性についてアッセイされる。シトクロムp450は、モノオキシゲナーゼ系の重要な触媒成分である。シトクロムp450は、生体異物投与された薬物および多くの内因性化合物の酸化的代謝に関与する血液タンパク質のファミリーを構成する。種々のシトクロムが、特徴的かつ重複する基質特異性を示す。体内変換能力の大部分は、1A2、2A6、2B6、3A4、2C9-11、2D6および2E1と命名されたシトクロムに起因するGomes-Lechonら、1997。シトクロムp450酵素活性によって生体異物の解毒を測定するためのいくつかのアッセイが当該分野で公知である。CYP3A4による解毒は、P450-GloTMCYP3A4DMSO-寛容アッセイルシフェリン-PPXEおよびP450-GloTMCYP3A4細胞ベースの/生化学的アッセイルシフェリン-PFBEPromegaInc,♯V8911および♯V8901を用いて証明される。CYP1A1およびまたはCYP1B1による解毒は、P450-GloTMアッセイルシフェリン-CEEPromegaInc.,♯V8762を用いて証明される。CYP1A2およびまたはCYP4Aによる解毒は、P450-GloTMアッセイルシフェリン-MEPromegaInc.,♯V8772を用いて証明される。CYP2C9による解毒は、P450-GloTMCYP2C9アッセイルシフェリン-HPromegaInc.,♯V8791を用いて証明される。別の態様において、プログラミングによって提供された肝細胞の生物学的機能は、例えば、グリコーゲン貯蔵を解析することによって、査定される。グリコーゲン貯蔵は、グリコーゲン顆粒に対するPeriodicAcidSchiffPASによる機能的染色をアッセイすることによって特徴付けられる。まず、肝細胞様細胞を過ヨウ素酸によって酸化する。その酸化的プロセスにより、炭素間結合の切断によってアルデヒド群が形成される。酸化が起こるためには、遊離ヒドロキシル基が存在するはずである。それがアルデヒドの段階に達すると、酸化は完了する。そのアルデヒド基が、Schiff試薬によって検出される。無色の不安定なジアルデヒド化合物が形成され、次いでそれは、キノイド発色団の回復によって有色の最終生成物に変換されるThompson,1966;SheehanandHrapchak,1987。PAS染色は、http://www.jhu.edu/~iic/PDFjrotocols/LM/GlycogenStaining.pdfおよびhttp://library.med.utah.edu/WebPath/HISTHTML/MANUALS/PAS.PDFに記載されているプロトコルに従って、肝細胞様細胞のインビトロ培養についていくらかの改変を加えて行われ得る。当業者は、適切な改変を行うことができるはずである。別の態様において、本発明のある特定の態様においてフォワードプログラミングによって産生された肝細胞は、尿素産生について特徴付けられる。尿素産生は、尿素およびアンモニアについてのウレアーゼによる還元の生化学反応、ならびにその後の2-オキソグルタレートとの反応によるグルタメートおよびNADの形成に基づくSigmaDiagnostic製のキットを用いてMiyoshiら、1998比色測定によってアッセイされ得る。別の態様では、胆汁分泌が解析される。胆汁の分泌は、フルオレセインジアセテート経時的アッセイによって測定され得る。簡潔には、肝細胞様細胞の単層培養物をリン酸緩衝食塩水PBSで3回すすぎ、ドキシサイクリンおよびフルオレセインジアセテート20μg/mlSigma-Aldrichが補充された無血清肝細胞成長培地とともに37°Cで35分間インキュベートする。その細胞をPBSで3回洗浄し、蛍光イメージングを行う。フルオレセインジアセテートは、フルオレセインの非蛍光性の前駆体である。その像を査定することにより、その化合物が取り込まれていて、肝細胞様細胞においてフルオレセインに代謝されていることが判定される。いくつかの実施形態において、その化合物は、細胞の単層の細胞間の間隙中に分泌される。あるいは、胆汁分泌は、GebhartandWang1982によって報告された、フルオレセインナトリウムを用いた方法によって測定される。なおも別の局面では、脂質合成が解析される。肝細胞様細胞における脂質合成は、オイルレッドO染色によって判定され得る。オイルレッドOSolventRed27、SudanRed5B、C.I.26125、C26H24N4Oは、凍結切片上の中性トリグリセリドおよび脂質ならびにパラフィン切片上のいくつかのリポタンパク質の染色のために使用されるリゾクロムlysochrome脂溶性色素ジアゾ色素である。それは、518359nmで最大吸収を有する赤色粉末の外観を有する。オイルレッドOは、Sudan染色のために使用される色素の1つである。類似の色素としては、SudanIII、SudanIVおよびSudanBlackBが挙げられる。その染色は、新鮮なサンプルおよび/またはホルマリン固定されたサンプルにおいて行われなければならない。肝細胞様細胞を、顕微鏡用スライド上で培養し、PBSで3回すすぎ、そのスライドを室温で30~60分間風乾し、氷冷10ホルマリン中で5~10分間固定し、次いで、直ちに蒸留水に3回交換してすすいだ。次いで、そのスライドを、オイルレッドO中に水が保有されるのを回避するために無水プロピレングリコール中に2~5分間置き、予め温められたオイルレッドO溶液中、600°Cのオーブンにおいて8分間、染色する。次いで、そのスライドを、85プロピレングリコール溶液中に2~5分間置き、蒸留水に2回交換してすすぐ。オイルレッドO染色はまた、library.med.utah.edu/WebPath/HISTHTML/MANUALS/OILRED.PDFに記載されているプロトコルに従って、当業者による肝細胞様細胞のインビトロ培養についていくらかの改変を加えて行うこともできる。なおも別の態様において、上記細胞は、グリコーゲン合成についてアッセイされる。グリコーゲンアッセイは、当業者に周知である例えば、PassonneauandLauderdale1974におけるもの。あるいは、市販のグリコーゲンアッセイ例えば、BioVision,Inc.製、カタログ♯K646-100が使用され得る。肝細胞系譜の細胞は、グリコーゲンを貯蔵する能力によっても査定され得る。好適なアッセイは、単糖類および二糖類と反応しないがグリコーゲンおよびデキストランなどの長鎖ポリマーを染色するPeriodicAcidSchiffPAS染色を使用する。PAS反応によって、複合糖質ならびに可溶性および膜結合型の炭水化物化合物の定量的な推定が提供される。Kirkebyら1992には、炭水化物化合物および界面活性剤の定量的PASアッセイが記載されている。vanderLaarseら1992には、PAS反応を用いたグリコーゲンについてのマイクロデンシトメトリーによるmicrodensitometric組織化学的アッセイが記載されている。細胞が、線維芽細胞などのコントロール細胞のレベルよりも少なくとも2倍、好ましくは、10倍超高いレベルでPAS陽性である場合、グリコーゲン貯蔵の証拠が確定される。それらの細胞は、標準的な方法に従う核型分析によっても特徴付けられ得る。小分子薬物の抱合、代謝または解毒に関わる酵素に対するアッセイも利用可能である。例えば、細胞は、尿路または胆管を通る排出のための、ビリルビン、胆汁酸および小分子薬物を抱合する能力によって特徴付けられ得る。細胞を、好適な基質と接触させ、好適な時間にわたってインキュベートし、次いで、培地を解析するGCMSまたは他の好適な手法によってことにより、抱合産物が形成されたかが判定される。薬物代謝酵素の活性としては、脱エチル化、脱アルキル化、ヒドロキシル化、脱メチル化、酸化、グルクロ抱合glucuroconjugation、スルホ抱合、グルタチオン抱合およびN-アセチルトランスフェラーゼの活性が挙げられるInvitroMethodsinPharmaceuticalResearch,AcademicPress,1997におけるA.Guillouzo,pp411-431。アッセイとしては、フェナセチン脱エチル化peenacetinde-ethylation、プロカインアミドN-アセチル化、パラセタモールスルホ抱合およびパラセタモールグルクロン酸抱合が挙げられるChesneら、1988。本発明のある特定の細胞集団のさらなる特徴は、それらが、適切な状況下において、霊長類の肝臓細胞に向性を有する病原体に感受性である点である。そのような病原体としては、A、B、Cおよびデルタ型肝炎、エプスタインバーウイルスEBV、サイトメガロウイルスCMV、結核ならびにマラリアが挙げられる。例えば、B型肝炎による感染性は、フォワードプログラミングによって得られた培養肝細胞を、感染性のB型肝炎粒子の供給源例えば、ヒトHBVキャリア由来の血清と混和することによって、測定され得る。次いで、その肝臓細胞は、免疫組織化学またはRT-PCRによって、ウイルスコア抗原HBcAgの合成について試験され得る。熟練の読者は、フォワードプログラミングによって得られた肝細胞の利点が、その肝細胞が、成体または胎児の肝組織から単離された初代肝細胞培養物に通常混入する他の細胞型を本質的に含まないという点であることを容易に認識するだろう。類洞内皮細胞に特徴的なマーカーとしては、フォンビルブラント因子、CD4、CD14およびCD32が挙げられる。胆管上皮細胞に特徴的なマーカーとしては、サイトケラチン-7、サイトケラチン-19およびγ-グルタミルトランスペプチダーゼが挙げられる。星細胞に特徴的なマーカーとしては、α-平滑筋アクチンα-SMA、ビメンチン、シナプトフィジン、グリア線維性酸性タンパク質GFAP、神経細胞接着分子N-CAM、および脂質滴の存在自己蛍光またはオイルレッドOによる染色によって検出可能が挙げられる。クッパー細胞に特徴的なマーカーとしては、CD68、ある特定のレクチン、およびマクロファージ系列の細胞に対するマーカー例えば、HLAクラスIIおよびファゴサイトーシスのメディエーターが挙げられる。免疫染色および蛍光活性化定量または他の適切な手法によって測定されるとき、フォワードプログラミングによって得られた肝細胞は、0.1未満好ましくは、100または10ppm未満が望まれない細胞型のマーカーまたは他の特徴を有する場合、これらの細胞型の一部または全部を本質的に含まないと特徴付けられ得る。本発明のある特定の態様に係るフォワードプログラミングによって提供される肝細胞は、それらが相当すると意図されている細胞の段階のいくつかの特徴を有し得る。特定の細胞に存在するこれらの特徴が多いほど、その細胞は、肝細胞系譜の細胞として特徴づけられ得る。これらの特徴のうち少なくとも2、3、5、7または9つを有する細胞が、ますますより好ましい。培養容器内または投与用の調製物中に存在し得る特定の細胞集団に関しては、これらの特徴の発現の細胞間の均一性は、有益であることが多い。この状況において、それらの細胞のうちの少なくとも約40、60、80、90、95または98が所望の特徴を有する集団が、ますますより好ましい。本発明のある特定の態様において提供される肝細胞の他の望ましい特徴は、薬物スクリーニングアッセイにおいて標的細胞として作用する能力、およびインビボと体外デバイスの一部としての両方において肝機能を再構成する能力である。これらの特徴は、以下の項においてさらに記載される。VII.肝細胞の使用本発明のある特定の態様の方法および組成物によって提供される肝細胞は、種々の応用法において使用され得る。これらとしては、いくつか挙げると、インビボにおける肝細胞の移植または植え込み;インビトロにおける細胞傷害性化合物、発癌性物質、突然変異原、成長/制御因子、薬学的化合物などのスクリーニング;肝臓の疾患および感染症の機構の解明;薬物および/または成長因子が作動する機構の研究;患者における癌の診断およびモニタリング;遺伝子治療;ならびに生物学的に活性な生成物の産生が挙げられるが、これらに限定されない。A.被験化合物のスクリーニングフォワードプログラミングによって得られる本発明の肝細胞は、本明細書中に提供される肝細胞の特徴に影響する、因子例えば、溶媒、小分子薬物、ペプチドおよびポリヌクレオチドまたは環境条件例えば、培養条件または操作についてスクリーニングするために使用され得る。いくつかの応用法において、幹細胞分化したものまたは未分化なものは、肝細胞系譜にのっとった細胞の成熟を促す因子または長期間培養においてそのような細胞の増殖および維持を促す因子をスクリーニングするために使用される。例えば、異なるウェルにおいて肝細胞成熟因子の候補または成長因子を幹細胞に加え、次いで、生じる任意の表現型の変化を、さらなる培養および細胞の用途にとって望ましい基準に従って判定することによって、その肝細胞成熟因子の候補または成長因子が試験される。本発明の特定のスクリーニング応用法は、薬物研究における薬学的化合物の試験に関する。読者は、一般に標準的な教科書であるInvitroMethodsinPharmaceuticalResearch,AcademicPress,1997および米国特許第5,030,015号を参照されたい。本発明のある特定の態様において、肝細胞系譜にプログラムされた細胞は、以前は短期間培養物中の肝細胞株または初代肝細胞に対して行われたような、標準的な薬物スクリーニングアッセイおよび毒性アッセイに対する被験細胞の役割を果たす。薬学的化合物候補の活性の評価は、一般に、本発明のある特定の態様において提供される肝細胞と候補化合物とを混和すること、その化合物に起因する、細胞の形態、マーカーの表現型または代謝活性の任意の変化を判定すること未処理の細胞または不活性な化合物で処理された細胞と比較して、次いで、その化合物の作用を観察された変化と相関させることを含む。その化合物は、肝臓細胞に対して薬理学的作用を有するようにデザインされているので、または他に作用を有するようにデザインされた化合物が、意図されない肝臓の副作用を有し得るので、上記スクリーニングが行われ得る。薬物間の可能性のある相互作用を検出するために、2つ以上の薬物が組み合わせて上記細胞と同時にまたは連続的に組み合わせることによって試験され得る。いくつかの応用法では、最初に、潜在的な肝毒性について化合物がスクリーニングされるCastellら、1997。細胞傷害性は、第1の場合において、細胞の生存率、生存時間、形態および培養液への酵素の漏出に対する作用によって、測定され得る。化合物が、毒性を引き起こさずに細胞の機能例えば、糖新生、尿素形成および血漿タンパク質合成に影響するかを判定するために、より詳細な解析が行われる。乳酸デヒドロゲナーゼLDHは、その肝臓のアイソザイムV型が、培養条件において安定していて、12~24時間インキュベートした後の培養上清における再現可能な測定を可能にするので、優れたマーカーである。酵素例えば、ミトコンドリアのグルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼおよびグルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼの漏出もまた使用され得る。Gomez-Lechonら1996には、肝細胞の糖新生に対する薬学的化合物の作用を測定するために使用され得る、グリコーゲンを測定するためのマイクロアッセイが記載されている。肝毒性を査定する他の現行の方法としては、アルブミン、コレステロールおよびリポタンパク質の合成および分泌;抱合された胆汁酸およびビリルビンの輸送;尿素形成;シトクロムp450のレベルおよび活性;グルタチオンのレベル;α-グルタチオンs-トランスフェラーゼの放出;ATP、ADPおよびAMPの代謝;細胞内のKおよびCa2の濃度;核マトリックスタンパク質またはオリゴヌクレオソームの放出;ならびにアポトーシスの誘導細胞が丸くなること、クロマチンの凝縮および核断片化によって示唆されるの測定が挙げられる。DNA合成は、[3H]-チミジンまたはBrdUの取り込みとして測定され得る。DNAの合成または構造に対する薬物の作用は、DNAの合成または修復を測定することによって判定され得る。[3H]-チミジンまたはBrdUの取り込み、特に、細胞周期中の不定期の時点におけるそれらの取り込み、または細胞の複製に必要なレベルより高いそれらの取り込みは、薬物の作用と一致する。望まれない作用には、分裂中期スプレッドによって判定される異常な割合の姉妹染色分体交換も含まれ得る。読者は、さらなる詳述についてVickers1997を参照されたい。B.肝臓治療および移植本発明はまた、急性、慢性または遺伝性の肝機能障害におそらく起因して肝機能の程度を回復する治療を必要とする被験体の肝機能の程度を回復するための、本明細書中に提供される肝細胞の使用も提供する。治療的な応用法に対する本明細書中に提供される肝細胞の適格性を判定するために、まず、それらの細胞は、好適な動物モデルにおいて試験され得る。1つのレベルにおいて、細胞は、インビボにおいて生存する能力およびその表現型を維持する能力について評価される。本明細書中に提供される肝細胞を、免疫不全動物例えば、SCIDマウス、または化学的にもしくは照射によって免疫不全にされた動物のさらなる観察に耐えられる部位例えば、腎被膜下、脾臓内、または肝小葉内に投与する。数日から数週間またはそれ以上後に組織を回収し、多能性幹細胞などの出発細胞型がまだ存在するかについて評価する。これは、投与された細胞に検出可能な標識例えば、緑色蛍光タンパク質またはβ-ガラクトシダーゼを提供すること;または投与された細胞に特異的な構成的マーカーを測定することによって行われ得る。本明細書中に提供される肝細胞が、げっ歯類モデルにおいて試験されている場合、投与された細胞の存在および表現型は、ヒト特異的抗体を用いた免疫組織化学もしくはELISA、またはヒトポリヌクレオチド配列に特異的な増幅を引き起こすプライマーおよびハイブリダイゼーション条件を用いたRT-PCR解析によって評価され得る。mRNAレベルまたはタンパク質レベルでの遺伝子発現の評価に適したマーカーは、本開示の別の箇所に提供されている。動物モデルにおいて肝細胞様細胞の運命を測定するための概要は、Grompeら1999;Peetersら1997;およびOhashiら2000に提供されている。別のレベルでは、本明細書中に提供される肝細胞は、完全な肝機能を欠く動物において肝機能を回復する能力について評価される。Braunら2000は、HSV-tk遺伝子についてトランスジェニックであるマウスにおけるトキシン誘導性の肝疾患に対するモデルの概要を述べている。Rhimら1995およびLieberら1995は、ウロキナーゼの発現による肝疾患に対するモデルの概要を述べている。Mignonら1998は、細胞表面マーカーであるFasに対する抗体によって誘導される肝疾患の概要を述べている。Overturfら1998は、Fah遺伝子の標的破壊による、マウスにおける遺伝性チロシン血症I型に対するモデルを開発した。その動物は、2-2-ニトロ-4-フルオロ-メチル-ベンゾイルbenzyol-1,3-シクロヘキサンジオンNTBCを供給することによって、その欠損からレスキューされ得るが、NTBCが取り除かれると、肝疾患を発症する。急性肝疾患は、90の肝切除によってモデル化され得るKobayashiら、2000。急性肝疾患は、動物を肝臓毒例えば、ガラクトサミン、CCl4またはチオアセトアミドで処置することによってもモデル化され得る。肝硬変などの慢性肝疾患は、線維症を誘導するのに十分長く動物を致死未満量の肝臓毒で処置することによってモデル化され得るRudolphら、2000。本明細書中に提供される肝細胞が肝機能を再構成する能力の評価は、それらの細胞を上記のような動物に投与すること、次いで、状態の進行について動物をモニターしつつ、1~8週間またはそれ以上にわたって生存を測定することを含む。肝機能に対する作用は、肝臓組織において発現されるマーカー、シトクロムp450の活性、および血液中の指標例えば、アルカリホスファターゼ活性、ビリルビン抱合およびプロトロンビン時間、ならびに宿主の生存を査定することによって測定され得る。これらの基準のいずれかに従った生存、疾患の進行または肝機能の維持の任意の改善は、その治療の有効性に関し、さらなる最適化をもたらし得る。代謝酵素のプロファイルによるところの望ましい機能的特性または動物モデルにおける有効性を示す本発明のある特定の態様において提供される肝細胞は、肝機能が損なわれているヒト被験体への直接的な投与にも好適であり得る。止血の目的で、それらの細胞は、循環への適切なアクセスを有する任意の部位代表的には腹腔内の部位に投与され得る。いくつかの代謝機能および解毒機能については、その細胞が胆管へのアクセスを有することが有益である。したがって、それらの細胞は、肝臓付近に例えば、慢性肝疾患の処置においてまたは脾臓付近に例えば、劇症肝不全の処置において投与される。1つの方法では、それらの細胞は、留置カテーテルによる注入によって、肝動脈または門脈を通って肝循環に投与される。門脈におけるカテーテルは、それらの細胞が、主に脾臓もしくは肝臓またはその両方の組み合わせに流れるように操作され得る。別の方法では、それらの細胞は、代表的には、ボーラスを所定位置に保持し得る賦形剤またはマトリックス中のボーラスを標的器官付近の腔に入れることによって投与される。別の方法では、それらの細胞は、肝葉または脾葉に直接注射される。本発明のある特定の態様において提供される肝細胞は、肝機能を回復するかまたは補う必要のある任意の被験体の治療のために使用され得る。そのような治療にとって適切であり得るヒトの状態としては、任意の原因に起因する劇症肝不全、ウイルス肝炎、薬物誘導性の肝臓の損傷、肝硬変、遺伝性の肝不全例えば、ウィルソン病、ジルベール症候群またはα1-抗トリプシン欠損、肝胆道癌腫、自己免疫性肝疾患例えば、自己免疫性慢性肝炎または原発性胆汁性肝硬変、および肝機能を損なう他の任意の状態が挙げられる。ヒトを治療する場合、用量は、被験体の体重、苦痛の性状および重症度、ならびに投与される細胞の複製能に対して調整を行って、一般に約109~1012細胞、代表的には約5×109~5×1010細胞である。処置様式および適切な用量の決定についての最終責任は、管理している臨床医にある。C.肝臓補助デバイスにおける使用本発明のある特定の態様は、被包されているかまたはバイオ人工肝臓デバイスの一部である、本明細書中に提供される肝細胞を含む。様々な形態の被包が、CellEncapsulationTechnologyandTherapeutics,1999に記載されている。本発明のある特定の態様において提供される肝細胞は、インビトロまたはインビボにおいて使用するために、そのような方法に従って被包され得る。臨床上使用するためのバイオ人工器官は、長期間治療の一部として、または劇症肝不全と肝臓の再構成または肝臓移植との間の時間を乗り越えるために、肝機能を損なっている個体を支援するようにデザインされる。バイオ人工肝臓デバイスは、前掲書中のMacdonaldら、CellEncapsulationTechnologyandTherapeuticsのpp.252~286に概説されており、米国特許第5,290,684号、同第5,624,840号、同第5,837,234号、同第5,853,717号および同第5,935,849号に例証されている。懸濁液タイプのバイオ人工肝臓は、プレート型透析器内に懸濁されている細胞、好適な基材中にマイクロカプセル化されている細胞、または細胞外マトリックスでコーティングされたマイクロキャリアビーズに付着されている細胞を含む。あるいは、肝細胞は、固体支持体上、充填層中、マルチプレートフラットベッドmultiplateflatbed中、マイクロチャネルスクリーン上、または中空糸毛細管の周囲に配置され得る。そのデバイスは、被験体の血液が通過する入口および出口、ならびに時折、それらの細胞に栄養分を供給する別個の出入口のセットを有する。肝細胞は、先に記載された方法に従って調製され、次いで、デバイス内の好適な基材例えば、Matrigel登録商標またはコラーゲンのマトリックス上にプレーティングされる。そのデバイスの有効性は、輸入afferentチャネル中の血液組成を輸出efferentチャネル中のそれと比較することによって輸入流から取り出された代謝産物および輸出流中の新しく合成されたタンパク質に関して、評価され得る。この種類のデバイスは、血液などの体液を解毒するために使用され得、ここで、その体液は、本発明のある特定の態様において提供される肝細胞がその体液中のトキシンを除去するかまたは改変することを可能にする条件下においてその肝細胞と接触する。その解毒は、通常は肝臓によって処理される少なくとも1つのリガンド、代謝産物または他の化合物天然および合成の化合物を除去することまたは変更することを含み得る。そのような化合物としては、ビリルビン、胆汁酸、尿素、ヘム、リポタンパク質、炭水化物、トランスフェリン、ヘモペキシン、アシアロ糖タンパク質、インスリンおよびグルカゴンのようなホルモン、ならびに種々の小分子薬物が挙げられるがこれらに限定されない。そのデバイスは、合成されたタンパク質例えば、アルブミン、急性期反応物質および負荷されていないキャリアタンパク質について輸出液を濃縮するためにも使用され得る。そのデバイスは、種々のこれらの機能が果たされることにより、必要とされる肝機能と同じ数の肝機能を回復するように最適化され得る。治療的なケアという状況では、そのデバイスは、肝細胞不全の患者からの血流を処理し、次いで、その血液がその患者に戻される。D.商業目的、治療目的および研究目的のための配布製造、配布および使用の目的で、本発明の肝細胞系譜細胞は、代表的には、等張性の賦形剤または培養液中の細胞培養物または細胞懸濁液の形態、必要に応じて、輸送または保管を容易にするために凍結されて、供給される。本発明は、製造中、配布中または使用中の任意の時点において存在する細胞のセットまたは組み合わせを含む、種々の試薬系も含む。それらの細胞セットは、本開示に記載される2つ以上の細胞集団の任意の組み合わせを含み、その細胞集団としては、未分化な幹細胞、体細胞由来の肝細胞または他の分化細胞型と組み合わされる、プログラミングによって得られた細胞肝細胞系譜細胞、それらの前駆体およびサブタイプが例証されるがこれらに限定されない。そのセットにおける細胞集団は、時折、同じゲノムまたはその遺伝的に改変された形態を共有する。そのセットの各細胞型は、一緒に包装されてもよいし、同じ施設または異なる場所において、同じまたは異なる時点において、取引関係を共有する同じ団体または異なる団体の管理下において、別個の容器内に包装されてもよい。VIII.プログラミングにおける候補遺伝子を試験するための細胞および方法特定の候補遺伝子または候補遺伝子の組み合わせが肝細胞などの特定の細胞型に対してフォワードプログラミング因子として作用する能力は、本開示に提供される方法および細胞を用いて試験され得る。フォワードプログラミングにおける特定の候補遺伝子または候補遺伝子の組み合わせの有効性は、細胞の形態、マーカーの発現、酵素活性、増殖能、または目的の他の特徴に対する作用によって評価され得、次いで、それらは、候補遺伝子または組み合わせを含まない平行して培養されたものとの比較において判定される。候補遺伝子は、所望の細胞型への分化または所望の細胞型の機能にとって重要な転写因子であり得る。ある特定の実施形態において、候補遺伝子または候補遺伝子の組み合わせを発現させるための少なくとも1つの発現カセットを含む出発細胞例えば、多能性幹細胞が提供され得る。その発現カセットは、誘導性プロモーターなどの外部から調節可能な転写制御エレメントを含み得る。これらのプロモーターの活性は、生物的または非生物的な因子の存在または非存在によって誘導され得る。誘導性プロモーターに作動可能に連結された遺伝子の発現は、生物の発生のある特定の段階または特定の組織においてオンまたはオフにされ得るので、それらの誘導性プロモーターは、遺伝子操作において非常に強力なツールである。大腸菌のテトラサイクリン耐性オペロンの必須の制御成分に基づいたTet-OnおよびTet-Offの誘導可能な遺伝子発現系が使用され得る。いったん、出発細胞において確立されると、インデューサーのドキシサイクリンDox、テトラサイクリン誘導体は、用量依存的様式で発現系を調節することにより、候補遺伝子の発現レベルを正確に調節し得る。所望の細胞型の識別を助けるために、出発細胞は、細胞特異的または組織特異的なレポーター発現カセットをさらに含んでもよい。そのレポーター発現カセットは、所望の細胞型に特異的な転写制御エレメントに作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含み得る。例えば、そのレポーター発現カセットは、肝細胞の産生、単離、選択または濃縮のための肝細胞特異的プロモーターを含み得る。そのレポーター遺伝子は、当該分野で公知かつ前述の開示に例証された、任意の選択可能またはスクリーニング可能なマーカー遺伝子であり得る。VIII.実施例以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すために含められる。以下の実施例に開示される手法は、本発明の実施において十分に機能すると本発明者らによって発見された手法であり、ゆえに、それを実施するための好ましい形式を構成すると考えられ得ることは、当業者に認識されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示に鑑みて、開示される特定の実施形態において多くの変更が行われ得、その変更によって、本発明の精神および範囲から逸脱することなくなおも同様または類似の結果を得ることができることを認識するべきである。実施例1-肝細胞へのフォワードプログラミングヒトESC/iPSCからの肝細胞分化のための代替アプローチを図1に示す。成熟肝細胞などの肝細胞系譜細胞はおそらく、通常の分化において必要な発生段階下のボックスのすべてではないがほとんどを迂回して、適切な導入遺伝子の組み合わせの発現によってヒトESC/iPSCから効率的に誘導され得る上のボックス。ヒトESC/iPSCを肝細胞系譜細胞成熟肝細胞を含むに直接変換し得る導入遺伝子を同定するために使用されるストラテジーを図2に示す。ヒトESC/iPSCを、肝細胞特異的プロモーターの制御下にレポーターを保有するように、および誘導可能な遺伝子発現用のrtTETタンパク質を構成的に発現するように、操作した。誘導性プロモーターPtightの制御下の導入遺伝子は、操作されたhESC/iPSCに脂質媒介性トランスフェクションまたはエレクトロポレーションによって導入され得る。ドキシサイクリンDoxを加えると、導入遺伝子発現が誘導され得、肝細胞の分化が、レポーターおよび肝細胞特異的マーカー遺伝子の発現、ならびに追加の肝細胞特異的機能解析によってモニターされ得る。いったん正しい導入遺伝子の組み合わせが同定されると、その肝細胞は、インビトロとインビボの両方の機能的アッセイのために精製され得る。肝細胞分化用のヒトESC/iPSCレポーター/誘導可能R/I株を樹立した図3。染色体の位置に依存したサイレンシング作用を最小限にしつつ、肝細胞特異的レポーターとrtTETの両方を発現させるために、3番染色体上のヒトRosa26遺伝子座を選択した。まず、LoxP組換え部位LOX71およびLOX2272を、相同組換えによってヒトROSA26遺伝子のエキソン1とエキソン2の間の部位に導入した。標的化構築物KI構築物は、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーターPGKによって駆動される、ネガティブ選択用のジフテリア毒素Aフラグメント遺伝子DTAの発現を使用し、約2.0kbの5’アームおよび4.5kbの3’アームを含む。ヒトBCL2遺伝子由来のスプライシングアクセプターシグナルSAをLOX71部位の前に配置することにより、内在性ヒトROSA26プロモーターによる選択マーカーの発現を可能にした。ガンシクロビルを用いた工程2における不適当なCre/LoxP組換え事象に対するネガティブ選択を可能にするために、チミジンキナーゼTKに対するコード領域を含めた。相同組換えにおけるポジティブ選択のために、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼNeoを使用した工程1。内在性ヒトROSA26プロモーターからTKおよびNeo遺伝子を同時発現するために、口蹄疫ウイルスペプチドF2Aを使用した。BGHpAは、ウシ成長ホルモン遺伝子に由来するポリアデニル化シグナルである。その相同組換えによって、Cre/LoxP組換えによる効率的なカセット交換用のヒトESC/iPSCの親系統が得られた。肝細胞分化用のレポーター/誘導可能細胞株を樹立するために、F2Aペプチドに連結されたマーカー遺伝子mOrangeおよびブラストサイジンSデアミナーゼBSD肝細胞特異的プロモーターApoE4pAATによって駆動されるおよびrtTET恒常的に活性な真核生物の伸長因子1αプロモーター-pEFによって駆動されるを、組換え媒介性カセット交換RMCEベクターおよびCre発現プラスミドの脂質媒介性の同時トランスフェクションによってRosa26遺伝子座に導入した。組換え事象について選択するために、ピューロマイシンN-アセチル-トランスフェラーゼPuroを使用した。正しく組み換えられたR/I細胞は、ピューロマイシンPuroおよびガンシクロビルTK-に耐性であり、かつジェネテシン選択Neo-に感受性である。通常のヒトESC分化中の肝細胞における制限されたマーカー遺伝子mOrange発現を確認した図4A~4B。ヒトH1ESCR/I株を、マトリゲル低成長因子;BDBioscience上の100ng/mlbFGFCM100が補充されたMEF条件ヒトES細胞培地中で通例のとおり維持した。分化にむけて、AccutaseInvitrogenを用いてヒトESCを回収し、CM100中、0.5×105細胞/cm2の密度で3日間、マトリゲルでコーティングされた10cmディッシュ上にプレーティングした。RPMI/B27培地Invitrogen中の100ng/mlアクチビンARDSystemsとともに5日間培養し胚体内胚葉分化、その後、RPMI/B27中の20ng/mlBMP4Peprotechおよび10ng/mlFGF-2Invitrogenとともに5日間培養し肝臓特異化、次いで、RPMI/B27中の20ng/mlHGFPeprotechとともに5日間培養し未成熟肝細胞分化、最後に、SingleQuotsが補充された肝細胞培養液Lonza中の20ng/mlオンコスタチン-MRDSystemsとともに5日間培養すること肝細胞成熟によって、肝細胞の分化を惹起した。ヒトH1ESCR/I株において、Tet-On誘導可能な遺伝子発現を確認した図5A~5C。PtightプロモーターrtTET応答性誘導性プロモーターによって駆動されるEGFPを、図5Aの両方のベクターのFugeneHD媒介性トランスフェクションを用いてヒトESCR/I株に導入した。安定なPiggyBacトランスポゾンの組み込みを有するヒトESCを、ジェネテシン100μg/mlを用いて選択した。ドキシサイクリン1μg/mlありまたはなしでの誘導の2日後のヒトESCR/I株を含む像を図5Bに示す。ドキシサイクリン1μg/mlありまたはなしで4日間誘導した後、ヒトESCR/I株におけるEGFPの発現をフローサイトメトリーによって解析した図5C。ドキシサイクリン誘導の4日後、83.3のヒトESCR/I株が、EGFP発現によって、安定したPiggyBacトランスポゾンの組み込みを示した。導入遺伝子の発現によってヒトESCR/I株から肝細胞を直接誘導した図6。通常の哺乳動物の発生中に肝臓の分化に関わる遺伝子または成人型肝細胞に豊富な遺伝子を、Ptightプロモーターの制御下のPiggyBacベクター図5Aにクローニングした表1。通常の肝臓の分化または肝臓の機能におけるこれらの遺伝子の公知の機能的重要性に基づいて、さらにこれらの遺伝子の優先順位をつけた。ヒトESCに肝臓の運命を直接課することができる転写因子についてスクリーニングするために、導入遺伝子を発現するPiggyBacベクターとhPBaseを発現するベクターとの様々な組み合わせを、FugeneHD媒介性トランスフェクションまたはエレクトロポレーションによって、マトリゲル上のCM100中で培養されたヒトESCR/I株に導入した。安定したゲノム導入遺伝子の組み込みについてジェネテシン100μg/mlで選択した後、ドキシサイクリン1μg/mlを加えることにより、導入遺伝子の発現を誘導し、CM100を、SingleQuots、20ng/mlHGFおよび50ng/mlオンコスタチン-MHCMが補充された肝細胞培養液Lonzaで置き換えた。誘導後3~5日間におけるmOrangeマーカーの遺伝子発現によって、肝臓系譜の誘導をモニターした。ドキシサイクリン誘導ありの場合と対照的に、ドキシサイクリン誘導の非存在下ではHCM培地中で3日間培養した後に有意な細胞死が観察された。本明細書中で使用される転写因子の組み合わせは、以下からの組み合わせである:FOXA1、FOXA2-2、HHEX、HNF1A、HNF4A-2およびTBX3-1表1。肝細胞特異的プロモーターによって駆動されるmOrangeを発現するかなりの数の細胞が、HCM中のドキシサイクリン誘導の5日後に観察された。ヒトESCを直接、肝細胞様細胞に変換するのに十分な別の組み合わせの遺伝子FOXA2、HHEX、HNF4A、GATA4、NROB2およびSCML1を同定した図7A~7C。簡潔には、hPBase発現ベクター4μgとともに導入遺伝子発現PiggyBacベクター各2μgを、ヌクレオフェクションによって、マトリゲル上のmTeSR1中で培養されたヒトESCR/I株に導入した。約2~3×106ESCを、各ヌクレオフェクションのために使用したヌクレオフェクション溶液:Mirus,Madison,WI製の100μlのIngenio登録商標エレクトロポレーション溶液;プログラム:AmaxaB-016。安定したゲノム導入遺伝子の組み込みについてジェネテシン100μg/mlで選択した後、フォワードプログラミングにむけて細胞を12ウェルマトリゲルプレートにプレーティングした。プレーティングの翌日、ドキシサイクリン1μg/mlを加えることにより、最初に、1日間にわたるmTeSR1中、その後、5日間にわたるSingleQuotHMM,Lonza、20ng/mlHGFおよび20ng/mlオンコスタチン-MOSMが補充された肝細胞維持培地中で、導入遺伝子の発現を誘導した。6日間導入遺伝子を誘導した後に、解析前にさらに10~11日間にわたって、OSMが補充されたHMM中でさらに細胞を培養した。肝細胞特異的マーカーであるアルファ-フェトプロテインAFP図7A、アルブミンALB図7Bおよびアシアロ糖タンパク質asiologlycoproteinレセプター1ASGPR1図7Cに対する抗体を用いた免疫学的染色によって、肝臓の誘導を調べた。追加の遺伝子表1の発現は、ヒトESCからの肝臓系譜のプログラミングの効率または肝臓の機能を改善し得る。フォワードプログラミングによってヒトESCR/I株から肝細胞様細胞を誘導し得る追加の組み合わせを表2に示す。フォワードプログラミング用の追加の組み合わせの例を図8に示す。hPBase発現ベクター4μgとともに、導入遺伝子発現PiggyBacベクター各2μgを、ヌクレオフェクションnuleofectionによって、マトリゲル上のmTeSR1中で培養されたヒトESCR/I株に導入した。約2~3×106ESCを、各ヌクレオフェクションのために使用したヌクレオフェクション溶液:Mirus,Madison,WI製の100μlのIngenio登録商標エレクトロポレーション溶液;プログラム:AmaxaB-016。安定したゲノム導入遺伝子の組み込みについてジェネテシン100μg/mlで選択した後、フォワードプログラミングにむけて細胞を12ウェルマトリゲルプレートにプレーティングした。プレーティングの翌日、ドキシサイクリンDoxcycline1μg/mlを加えることにより、SingleQuotHMM,Lonza、20ng/mlHGFおよび20ng/mlオンコスタチン-MOSMが補充された肝細胞維持培地中で、4日間にわたって導入遺伝子の発現を誘導した。4日間導入遺伝子を誘導した後に、解析前にさらに12日間にわたって、OSMが補充されたHMM中でさらに細胞を培養した。肝細胞特異的マーカーであるアルファ-フェトプロテインAFP、アルブミンALBおよびアシアロ糖タンパク質レセプター1ASGPR1に対する抗体を用いた免疫染色によって、肝臓の誘導を調べた。本明細書中に開示される方法および特許請求される方法のすべてが、本開示に鑑みて過度の実験を行うことなく、実行され、達成され得る。本発明の組成物および方法は、好ましい実施形態に関して記載されてきたが、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書中に記載される方法およびそれらの方法の工程または一連の工程にバリエーションが適用され得ることが当業者には明らかであろう。より詳細には、化学的かつ生理的に関係するある特定の物質が、本明細書中に記載される物質の代わりに用いられ得るが、同じまたは類似の結果が達成され得ることが明らかであろう。当業者に明らかなそのような類似の代替物および改変のすべてが、添付の請求項によって定義される本発明の精神、範囲および概念の範囲内であるとみなされる。参考文献以下の参考文献は、それらが、本明細書中に示されるものに加えて例示的な手順の詳細または他の詳細を提供する範囲内において、明確に本明細書中で参考として援用される。"