"同位体フッ素交換化学作用によって18Fと結合した配列番号1、配列番号2又はそれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを含むイメージング剤組成物であって、単離ポリペプチドがHER2又はその変異体に特異的に結合する、組成物。i配列番号1、配列番号2又はそれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを用意すること、iiポリペプチドをフッ化ケイ素含有部分と反応させて、フッ化ケイ素結合ポリペプチドを形成させること、及びiiiフッ化ケイ素結合ポリペプチドを18F部分又は18F供給源と反応させて、18F-フッ化ケイ素結合ポリペプチドを形成させることを含む、請求項1記載のイメージング剤組成物を作成する方法。i配列番号1、配列番号2又はそれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを用意すること、iiポリペプチドをSiFA基を含むリンカーと反応させて、SiFA結合ポリペプチドを形成させること、及びiiiSiFA結合ポリペプチドを18F部分又は18F供給源と反応させることを含む、請求項1記載のイメージング剤組成物を作成する方法。請求項1記載のイメージング剤組成物、及び医薬的に許容される担体を含む、医薬組成物。本発明の組成物は、HER2又はその変異体に特異的に結合する能力がある新たな種類のイメージング剤である。1以上の実施形態では、イメージング剤組成物は、ジアミンジオキシムキレーターによって99mTcと結合した配列番号1、配列番号2又はそれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを含む。ジアミンジオキシムキレーターは、Pn216、cPn216、Pn44又はそれらの誘導体を含むことができる。単離ポリペプチドはHER2又はその変異体に特異的に結合する。1以上の実施形態では、イメージング剤組成物は、NOTAキレーターによって67Ga又は68Gaと結合した配列番号1、配列番号2又はそれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを含む。単離ポリペプチドはHER2又はその変異体に特異的に結合する。1以上の実施形態では、イメージング剤組成物は、Al18F-NOTAキレートと結合した配列番号1、配列番号2又はそれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを含む。単離ポリペプチドはHER2又はその変異体に特異的に結合する。1以上の実施形態では、イメージング剤組成物は、リンカーによって18Fと結合した配列番号1、配列番号2又はそれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを含む。リンカーは、アミノキシ基、アジド基又はアルキン基に由来する基を含む。単離ポリペプチドはHER2又はその変異体に特異的に結合する。1以上の実施形態では、イメージング剤組成物は、同位体フッ素交換化学作用によって18Fと結合した配列番号1、配列番号2又はそれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを含む。単離ポリペプチドはHER2又はその変異体に特異的に結合する。1以上の実施形態では、本明細書で記載されるイメージング剤組成物を作成する方法が提供される。本発明のイメージング剤組成物を調製する方法の例は、i配列番号1、配列番号2又はそれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを用意すること、及びiiジアミンジオキシムキレーターをポリペプチドと反応させて、キレーター結合ポリペプチドを形成させることを含む。別の例において、方法は、i配列番号1、配列番号2又はそれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを用意すること、iiポリペプチドをリンカーと反応させること、及びiiiリンカーを18F部分と反応させて、18F結合ポリペプチドを形成させることを含む。リンカーはアミノキシ基、アジド基又はアルキン基を含むことができる。別の例において、方法は、i配列番号1、配列番号2又はそれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを用意すること、iiポリペプチドをNOTA-キレーターと反応させて、NOTA-キレーター結合ポリペプチドを形成させること、及びiiiNOTA-キレーター結合ポリペプチドをAl18F部分と反応させて、Al18F-NOTAキレーター結合ポリペプチドを形成させることを含む。別の例において、方法は、i配列番号1、配列番号2又はそれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを用意すること、iiポリペプチドをフッ化ケイ素例として[19F]-フッ化ケイ素含有部分と反応させて、フッ化ケイ素結合ポリペプチドを形成させること、及びiiiフッ化ケイ素結合ポリペプチドを18F部分と反応させて、18F-フッ化ケイ素結合ポリペプチドを形成させることを含む。本発明のこれら及び他の特徴、態様及び利点は、以下の詳細な説明を添付の図を参照しながら読むと、より良く理解されるようになろう。本発明のイメージング剤組成物は、一般に、放射性同位体、例えば18F、99mTc、67Ga若しくは68Ga、111In、123I、124I、89Zr又は64Cuなどと結合した配列番号1、配列番号2又はそれらの保存的変異体の単離ポリペプチド及び該組成物を作成及び使用する方法を含む。単離ポリペプチドはHER2又はその変異体に特異的に結合する。1以上の実施形態では、単離ポリペプチドの配列は、配列番号1、配列番号2又はそれらの保存的変異体のいずれかに対して90以上の配列類似性を有する。単離ポリペプチドは、天然アミノ酸、合成アミノ酸又は自然に存在するアミノ酸と類似の様式で機能するアミノ酸模倣物を含むことができる。自然に存在するアミノ酸は、遺伝暗号によりコードされたものや、同様に後から修飾されたアミノ酸であり、例えば、ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタミン酸、O-ホスホセリン、ホスホスレオニン及びホスホチロシンである。単離ポリペプチドは標準的な固相合成技術を用いて調製することができる。あるいは、ポリペプチドは組換え技術を用いて調製してもよい。ポリペプチドが組換え技術を用いて調製される場合、ポリペプチド又はその保存的変異体をコードするDNAを単離することができる。ポリペプチド又はその保存的変異体をコードするDNAは、クローニングベクター内に挿入し、宿主細胞例として、真核生物細胞、植物細胞又は原核生物細胞中に導入して、当該技術分野で認められている任意の発現系を用いて発現させることができる。ポリペプチドは、単一のキラル型のアミノ酸残基から実質的に構成することができる。従って、本発明のポリペプチドは、L-アミノ酸又はD-アミノ酸のいずれかから実質的に構成することができる。しかし、L-アミノ酸とD-アミノ酸との組み合わせもまた利用することができる。本明細書で提供されるポリペプチドはタンパク質AのZ-ドメインに由来することから、結合面上の残基は、結合活性を保つかぎり、非保存的に置換されてもよく、保存的に置換されてもよい。いくつかの実施形態では、置換される残基は20個の自然に存在するアミノ酸又はそれらの任意のアナログのいずれかに由来し得る。ポリペプチドは約49残基から約130残基の長さであることができる。具体的なポリペプチド配列は表1に記載される。選択的機能性を付与するため、付加配列を末端に加えることができる。従って、付加配列は、ポリペプチドの精製又は単離を促進するため、片方又は両方の末端に、単独又は結合標的と連結して付け加えることができる例として、Hisタグをポリペプチドに付け加えることによって。表1に記載されたポリペプチドは、リンカーによって18Fと、ジアミンジオキシムキレーターによって99mTcと、NOTAキレーターによって67Ga若しくは68Gaと、Al18F-NOTAによって18Fと、SiFAすなわち、フッ化ケイ素アクセプター若しくはフッ化ケイ素交換化学作用によって18Fと、DOTAキレーター化学作用によって111Inと、ヨードベンズアルデヒドを用いたフルオロベンズアルデヒド様化学作用によって123I若しくは124Iと、又はNOTA-キレーター化学作用によって64Cuと結合させることができる。表2はこれらポリペプチドの等電点pIを提供する。1以上の実施形態では、配列番号1、配列番号2又はそれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドは、18Fと結合させることができる。18Fは、単離ポリペプチドのC末端、N末端又は内部位置に組み込むことができる。1以上の実施形態では、18Fはリンカーによって単離ポリペプチドに結合させることができる。リンカーはアミノキシ基、アジド基又はアルキン基を含むことができる。リンカーのアミノキシ基はアルデヒド、例えばフッ素置換アルデヒドなどと結合することができる。リンカーのアジド基はフッ素置換アルキンと結合することができる。同様に、リンカーのアルキン基はフッ素置換アジドと結合することができる。リンカーはまた、チオール反応性基を含んでもよい。リンカーはマレイミド-アミノキシ、マレイミド-アルキン又はマレイミド-アジド基から構成されてもよい。18F結合ポリペプチドは、i配列番号1、配列番号2又はそれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを用意すること、iiポリペプチドをアミノキシ基、アジド基又はアルキン基を含むリンカーと反応させて、リンカー結合ポリペプチドを形成させること、及びリンカーを18F部分と反応させて、18F結合ポリペプチドを形成させることにより、調製することができる。18F結合ポリペプチドは、i配列番号1、配列番号2又はそれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを用意すること、iiポリペプチドをマレイミド-アミノキシ、マレイミド-アルキン又はマレイミド-アジド基を含むリンカーと反応させて、リンカー結合ポリペプチドを形成させること、及びリンカーを18F部分と反応させて、18F結合ポリペプチドを形成させることにより、調製することができる。別の実施形態では、方法は、i配列番号1、配列番号2又はそれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを用意すること、iiリンカーを用意すること、iiiリンカーを18F部分と反応させて、18F標識リンカーを形成させること、及びiv18F標識リンカーを配列番号1、配列番号2又はそれらの保存的変異体の単離ポリペプチドと反応させて、18F結合ポリペプチドを形成させることを含むことができる。上記の例を用いて、フッ素又は放射性フッ素原子複数可、例えば18Fなどを、ポリペプチド上に導入することができる。フッ素置換アルデヒドをリンカー結合ポリペプチドのアミノキシ基と反応させる場合、フッ素置換ポリペプチドが結果として得られる。同様に、フッ素置換アジド又はアルキン基をリンカー結合ポリペプチドの各アルキン又はアジド基と反応させる場合、フッ素置換ポリペプチドが結果として得られる。放射性フッ素置換アルデヒド、アジド又はアルキンをリンカー結合ポリペプチドの各アミノキシ、アルキン又はアジド基と反応させる場合、放射性フッ素標識ポリペプチド又はイメージング剤組成物が結果として得られる。さらに、リンカーは、放射性フッ素18F標識のイメージング剤組成物を調製するため、放射性フッ素置換基を有してもよい。ポリペプチド上にフッ素を導入する方法はまた、任意の長さのフッ化イメージング剤組成物を調製するのに用いてもよい。従って、いくつかの実施形態では、イメージング剤組成物のポリペプチドは、例えば、40から130個のアミノ酸残基を含むことができる。本発明のイメージング剤又はイメージング剤組成物の調製において用いるためのリンカー結合ポリペプチド又は18F結合リンカーは、本発明の方法により調製することができるが、この方法は今まで知られていた方法より効率的で高い収率につながるものである。この方法はより容易に行うことができ、より早く、及びより緩やかでよりユーザーフレンドリーな条件下で実施される。例えば、ポリペプチドを18F結合リンカー例として、18F-フルオロベンズアルデヒド18F-FBAで標識する方法は、当該技術分野で知られている手順より簡単である。18F結合リンカーは、トリメチルアニリニウム前駆体上に18Fを直接的に求核導入することにより1段階で調製される。18F-リンカーすなわち18F-FBAは次いでポリペプチド、例えばAffibody登録商標及び本明細書で記載されるポリペプチドなどに結合される。リンカーの調製もまた、当該技術分野で知られている方法より容易である。その上、放射性標識アミノキシ系リンカーと結合したポリペプチド及びcPnファミリーのキレーターと結合したポリペプチド例として、Affibody登録商標は、顕著により良好な生体分布及びより良好な腫瘍取込み、同様により少ない肝臓取込みを伴うより良好なクリアランスを示す。フッ素標識のイメージング剤組成物は、診断用途で大変望ましい物質である。18F標識イメージング剤組成物は、確立したイメージング技術、例えばPETを用いて可視化することができる。別の実施形態では、ポリペプチドは式1のジアミンジオキシムキレーターによって99mTcと結合させることができる。式中、R、R、R、Rは独立してH若しくはC110アルキル、C310アルキルアリール、C210アルコキシアルキル、C110ヒドロキシアルキル、C110アルキルアミン、C110フルオロアルキルであり、又は2以上のR基は、それらが結合している原子と共に炭素環、複素環、飽和若しくは不飽和環を形成し、ここでRはH、C110アルキル、C310アルキルアリール、C210アルコキシアルキル、C110ヒドロキシアルキル、C110アルキルアミン若しくはC110フルオロアルキルであることができる。1つの実施形態では、nは0~5まで変わり得る。ジアミンジオキシムキレーターを調製する方法の例は、Methodsofradiofluorinationofbiologicallyactivevectorと題するPCT出願、国際公開番号WO2004080492A1及びRadiolabelledconjugatesofRGD-containingpeptidesandmethodsfortheirpreparationviaclick-chemistryと題するPCT出願、国際公開番号WO2006067376A2に記載されており、これらの文献は参照により本明細書に組み込まれる。99mTcは、ジアミンジオキシムによって単離ポリペプチドのN末端で、単離ポリペプチドに結合させることができる。キレーターは二官能性化合物であることができる。1つの実施形態では、二官能性化合物はMal-cPN216であることができる。Mal-cPN216は、配列番号1又は配列番号2のポリペプチドの末端システインへのコンジュゲーションのためのチオール反応性マレイミド基、及び99mTcをキレートするためのビス-アミノオキシム基ジアミンジオキシムキレーターを含む。Mal-cPN216は式IIを有することができる。ジアミンジオキシムキレーター結合ペプチドは、i配列番号1、配列番号2又はそれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを用意すること、iiジアミンジオキシムキレーターをポリペプチドと反応させて、ジアミンジオキシム結合ポリペプチドを形成させることにより、調製することができる。ジアミンジオキシムキレーターはさらに99mTcと結合してもよい。1以上の実施形態では、ポリペプチドはNOTA1,4,7-トリアザシクロノナン-N,N,N-トリ酢酸キレーターによって67Ga又は68Gaと結合させることができる。NOTA-キレーター結合ポリペプチドは、i配列番号1、配列番号2又はそれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを用意すること、iiNOTAキレーターをポリペプチドと反応させて、NOTA-キレーター結合ポリペプチドを形成させることにより、調製することができる。NOTAキレーターはさらに67Ga又は68Gaと結合してもよい。1つの実施形態では、Ga、特に67Gaは、NOTAキレーターによって単離ポリペプチドに結合させることができる。NOTAキレーターは、式IIIに記載されるように、マレイミド基で官能化することができる。1以上の実施形態では、ポリペプチドはNOTA1,4,7-トリアザシクロノナン-N,N,N-トリ酢酸キレーターによってAl18Fと結合させることができる。NOTAキレーター結合ポリペプチドは、i配列番号1、配列番号2又はそれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを用意すること、iiNOTA-キレーターをポリペプチドと反応させて、NOTA-キレーター結合ポリペプチドを形成させることにより、調製することができる。NOTA-キレーター結合ポリペプチドは次いで、さらにAl18Fと結合して、Al18F-NOTA-キレーター結合ポリペプチドを形成させてもよい。1以上の実施形態では、ポリペプチドはNOTA-キレーターによって18Fと結合させることができる。NOTA-キレーター結合ポリペプチドは、i配列番号1、配列番号2又はそれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを用意すること、iiNOTA-キレーターを18F供給源例として、Al18Fと反応させて、18F-NOTA-キレーターを形成させること、及びiii18F-NOTA-キレーターを単離ポリペプチドと反応させて、18F-NOTA-キレーター結合ポリペプチドを形成させることにより、調製することができる。1以上の実施形態では、キレーターは、キレート部分例としてNOTA、DOTA単独で、又はキレート部分及びリンカーを含むことができ、これらは各々本明細書で記載されている。例として、NOTA-キレーターは、本明細書で記載されているNOTAキレート部分単独又はリンカーに結合したNOTAキレート部分を表すことが可能である。1以上の実施形態では、ポリペプチドはSiFA化学作用によって18Fと結合させることができる。18F-SiFA結合ポリペプチドは、i配列番号1、配列番号2又はそれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを用意すること、iiポリペプチドをフッ化ケイ素アクセプターSiFA基を含むリンカーと反応させて、SiFA結合ポリペプチドを形成させること、及びiiiSiFA結合ポリペプチドを18F部分又は18F供給源と反応させることにより、調製することができる。18F部分又は18F供給源は、SiFA基と反応する能力のある任意のかかる部分又は供給源であり、同位体フッ素交換化学作用を受けることが可能である。下のスキームIは、[18F]SiFカップリングを用いたZ02891配列番号2の放射性標識を説明する。1以上の実施形態では、本明細書で記載される本発明の放射性標識イメージング剤又はイメージング剤組成物を作成する方法は、自動化されている。例えば、本発明の放射性標識イメージング剤又はイメージング剤組成物は、自動放射性合成装置によって自動で好都合に調製することができる。かかるプラットフォーム装置の市販例はいくつかあり、TRACERlab商標例として、TRACERlab商標MX及びFASTlab商標いずれもGEHealthcareLtd.が挙げられる。かかる装置は一般にカセットを含むが、これはしばしば使い捨てで、その中で放射性化学作用を実施するものであり、放射性合成を実施するため装置に取り付けられる。カセットは通常、液体経路、反応器及び試薬バイアルを受け入れるためのポート、同様に放射性合成後の精製段階において用いられる任意の固相抽出カートリッジを包含する。任意選択で、本発明のさらなる実施形態では、自動放射性合成装置は高速液体クロマトグラフHPLCに連結可能である。本発明はそれ故に、各々本明細書で規定される本発明の放射性標識イメージング剤又はイメージング剤組成物の自動合成のためのカセットを提供する。本発明はまた、対象の少なくとも一部をイメージングする方法を含む。1つの実施形態では、方法は、本発明の放射性標識イメージング剤又はイメージング剤組成物を対象に投与すること及び対象をイメージングすることを含む。対象は、例えば、診断デバイスを使用してイメージングすることができる。1以上の実施形態では、イメージング方法は、該剤又は組成物が対象に送達されるのをモニターする段階、及び対象をHER2関連の病態例として、乳がんと診断する段階をさらに含んでもよい。1つの実施形態では、対象は哺乳類、例えばヒトであることができる。別の実施形態では、対象は細胞又は組織を含むことができる。組織は生検において用いることができる。診断デバイスは、磁気共鳴イメージング、光学イメージング、光干渉断層撮影、X線、単一光子放射型コンピュータ断層撮影法SPECT、陽電子放射断層撮影PET又はそれらの組み合わせから選ばれるイメージング方法を利用することができる。本発明の放射性標識イメージング剤又はイメージング剤組成物は医薬組成物としてヒト及び他の動物に非経口的に投与することができる。本発明の医薬組成物は、本明細書で記載される放射性標識イメージング剤又はイメージング剤組成物、及び医薬的に許容される担体、賦形剤、溶媒又は希釈剤を含む。例えば、非経口注入のための本発明の医薬組成物は、医薬的に許容される滅菌された水性若しくは非水性溶液、分散液、懸濁液又はエマルジョン、同様に使用直前に滅菌された注入可能な溶液若しくは分散液へと再構成するための滅菌粉末を含む。適した水性及び非水性担体、希釈剤、溶媒又は媒体の例としては、水、エタノール、ポリオール例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど及びそれらの適した混合物、植物油例えばオリーブ油など、並びに注入可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルなどが挙げられる。例えばコーティング材料、例えばレシチンなどを用いることにより、分散液中の粒子サイズを調整することにより、及び界面活性剤を用いることにより、適切な流動性を維持可能である。本発明の医薬組成物はまた、アジュバント、例えば保存料、湿潤剤、乳化剤及び分散剤などを含有してもよい。微生物作用の予防は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを包含させることにより、確実にできる。等張性の剤、例えば糖、塩化ナトリウムなどを包含させることもまた望ましい。注入可能な医薬形態の持続性吸収は、吸収を遅らせる剤、例えばアルミニウムモノステアレート及びゼラチンなどを包含させることにより、もたらされ得る。本発明の放射性標識イメージング剤又はイメージング剤組成物は、潜在的な毒性を最小化するため、生理的に許容される担体中に分散することができる。従って、イメージング剤はpHが約6から約8の生体適合性溶液中に分散することができる。いくつかの実施形態では、該剤はpHが約7から約7.4の生体適合性溶液中に分散することができる。他の実施形態では、該剤はpHが約7.4の生体適合性溶液中に分散される。本発明のイメージング剤組成物又は医薬組成物は、医薬産業において化合物を水性媒体中に懸濁又は溶解するのに一般に用いられる他の添加物と組み合わせ、次いで懸濁液又は溶液は当該技術分野で知られている技術により滅菌することができる。イメージング剤組成物は、種々の形態で投与し、選ばれた投与経路に適合させることができる。例えば、該剤は、局所的にすなわち組織又は粘膜経由で、静脈内に、筋肉内に、皮内に又は皮下に投与することができる。注入に適した形態としては、滅菌水溶液又は分散液、及び滅菌された注入可能な溶液、分散液、リポソーム製剤若しくはエマルジョン製剤を調製するための滅菌粉末が挙げられる。吸入使用に適した形態としては、エアロゾル中に分散されたような剤が挙げられる。局所投与に適した形態としては、クリーム、ローション、軟膏などが挙げられる。本発明のイメージング剤組成物又は医薬組成物は、好ましい量の剤を対象へと好都合に送達するように濃縮し、所望の形態で容器中に包装することができる。剤は容器中に分注することができ、この中で剤は、対象のkg体重あたり0.1mgから50mgの間の剤濃度での剤の投与を好都合に促進する、生理的に許容される溶液中に分散される。1以上の実施形態では、標的組織は、該剤の投与後約4時間でイメージングすることができる。代替的実施形態では、標的組織は、対象への該剤の投与後約24時間でイメージングすることができる。以下の例は説明の目的のみのために提供されるものであり、本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。材料合理的なHER2発現の可能性を有する腫瘍原性細胞株のパネルを、利用可能な文献Bruskin,et.al.Nucl.Med.Biol.2004:31:205;Tran,et.al.ImagingagentcompositionChem.2007:18:1956に基づいて、表3に記載されるように選択した。全ての細胞株はAmericanTypeCultureCollectionATCCから入手し、推奨されるように培養した。細胞は、使用前に>90コンフルエンスまで培養した。フローサイトメトリーBeckmanCoulterCytomicsFC500MPLは、間接的な免疫蛍光染色の定量分析のため、表4に記載された細胞株に対して、抗Her2一次抗体RDSystems、PNMAB1129及びDakoQIFIKITPNK0078を用いて行った。異なる数のMab分子を有する5つの異なる集団を持つ較正ビーズを、細胞株と一緒に、細胞あたりの表面受容体数を決定するのに用いた。全ての場合、適切なアイソタイプの対照を該当する販売業者から入手した。付着細胞は、細胞表面受容体のタンパク質分解を避けるため、トリプシンよりむしろ細胞分離緩衝液PBS10mMEDTAを用いてフラスコから遊離させた。細胞をPBSで2回洗浄し、氷冷FC緩衝液PBS0.5BSAw/v中に濃度5~10×106細胞/mlになるように再懸濁した。100μLの一定分量の細胞を5μgの一次抗体と混合し、氷上で45分間インキュベートした。細胞を次いで1mlの氷冷フローサイトメトリーFC緩衝液2ウシ血清アルブミンを添加したPBSで洗浄し、300×gで5分間遠心分離して、0.5μLのFC緩衝液中に再懸濁した。PBSで1:50に希釈した二次抗体断片Fab2FITC-結合ヤギ抗マウス免疫グロブリンを100μL加え、氷上、暗所で45分間インキュベートした。細胞を次いで1mLの氷冷FC緩衝液で2回洗浄し、300×gで5分間遠心分離して、500μLのFC緩衝液中に再懸濁した。全ての染色細胞は、フローセルが詰まるのを防ぐため、フローサイトメトリーの前に100ミクロンのフィルターを通過させた。フローサイトメトリーはBeckmanCoulterCytomicsFC500MPL上で行った。各チューブについて最少で5×104のイベントを収集した。全ての分析は単一色で、FL1におけるFITCの検出を使用したものであった。前方散乱FS及び側方散乱SSのデータは、全ての細胞集団がしっかりグループ分けされることを実証した。フローサイトメトリーはインビトロでのHER2発現について細胞を評価するのに用いられ図2A、2B及び2C、SKOV3細胞は最も高いHER2発現レベルを示した図3。図3の結果は再現性があったn=3。最も高発現の細胞株はSKOV3であった。これらの細胞を6~12週齢の免疫不全マウスに注射し、腫瘍を増殖させた。腫瘍増殖曲線及び成功率は、接種した細胞数に依存した。最適な腫瘍増殖は300万から400万個の細胞/マウスを使用して得られた。インビボ研究は、週齢が6週から15週の間の範囲である雌性CD-1ヌードマウスCharlesRiverLabs、Hopkinton、MAを使用して行った。マウスは換気ラック中で、食餌及び水を自由摂取させて、標準的な12時間の昼夜照明サイクルで飼育した。異種移植のため、動物に100μlのPBS中の細胞を注入した。細胞を右後部に皮下移植した。移植はイソフルラン麻酔下で実施した。SKOV3の場合、3×106~4×106の細胞を各マウスに移植した。これらの条件下で、使用可能な腫瘍100~300μgが注入された動物の80超で3から4週の間に得られた。剥離によりマウスから腫瘍を回収し、全腫瘍を処理まで-20°Cで保存した。腫瘍はプロテアーゼ阻害剤カクテルSantaCruzBiotech、SantaCruz、CA24948添加RIPA緩衝液1mlの中で、Dounceホモジナイザー中で氷上で粉砕した。ホモジネートは次いで氷上で30分間インキュベートし、次いで冷却遠心分離機中で10,000×Gで10分間、遠心分離した。上清を回収して、さらなる処理まで氷上又は4°Cで保存した。溶解液中のタンパク質濃度は、BCAタンパク質アッセイキットPierceBiotechnology23225を用いて決定した。溶解液は、マイクロタイタープレート中で20μgのタンパク質/ウェルが得られるよう、標準的な濃度に希釈した。ELISAは市販のヒトHER2キットRDSystems、DYC1129を使用して、製造業者の説明書に従って行った。各試料について3回測定を行い、データをpgHER2/μg総タンパク質として報告し、誤差を標準偏差として報告した。インビボでの標的の発現は、ELISAにより測定した。切除した腫瘍をホモジナイズし、市販のマッチドペアキットRDsystems、DYC1129、Minneapolis、MNを用いてHER2について分析した。図3の結果は、SKOV3細胞株が高発現腫瘍を増殖させることを示す。ELISAの対照は、フローサイトメトリーに用いた陰性対照株の細胞培養物溶解液であった。これらの結果は、SKOV3の腫瘍異種移植片がヒトHER2を標的とする分子のインビボ研究に適切であることを指し示す。全てのポリペプチドは、SwedenにあるAffibody登録商標ABから受け入れた。ポリペプチドは、Zを前に付けた、数字で表される内部開発コードで呼ばれる。表1は本明細書で記載されるポリペプチドを詳述する。ポリペプチドとしては、ポリペプチドZ00342配列番号1、ポリペプチドZ02891配列番号2、ポリペプチドZ00477配列番号3及び4及びZ00477のダイマー、すなわちZ004772配列番号5が挙げられる。ポリペプチドとHER2/neu抗原との間の結合相互作用は、インビトロで表面プラスモン共鳴SPRの検出を用いて、Biacore商標3000機器GEHealthcare、Piscataway、NJ上で測定した。Her2/neu抗原の細胞外ドメインは、RDSystemsMinneapolis、MNからヒトIgGのFc領域とのコンジュゲートFc-Her2として入手し、CM-5デキストラン官能化センサーチップGEHealthcare、Piscataway、NJに共有結合で結合させたが、このセンサーチップはHBS-EP緩衝液0.01MHEPESpH7.4、0.15MNaCl、3mMEDTA、0.005v/v界面活性剤P20を10μL/分で使用して予め平衡化し、続いてEDC及びNHSで活性化したものである。10mM酢酸ナトリウムpH5.5中のFc-HER25μg/mlは、所望の固定化レベル約3000ResonanceUnitに達するまで2分、活性化センサーチップ上に注入した。センサーチップ上の残りの活性化基は、エタノールアミン1M、pH8.5を注入してブロックした。非共有結合的に結合したあらゆるコンジュゲートは、2.5MNaCl、50mMNaOHを使用して繰り返し5回洗浄することで除去した。同じセンサーチップ上の2つ目のフローセルは、屈折率変化及びセンサーチップとの非特異的な結合相互作用の対照表面として働かせるため、Fc-HER2固定化を行わない点を除いて同様に処理した。動態研究の前に標的分析物の結合を両表面上で試験して表面安定性実験を実施し、結合した分析物の十分な除去と、2.5MNaCl、50mMNaOHでの処理後のセンサーチップ再生とを確実にした。SPRセンサーグラムはBIAevaluationソフトウェアGEHealthcare、Piscataway、NJを用いて分析した。動態学的モデルのロバスト性は、計算された動態学的パラメーターの各々についての残差及び標準誤差、適合度χ2<10を評価することにより、並びにモデル化したセンサーグラムを実験データと直接的に比較することにより決定した。SPR測定値を8つの分析物濃度0~100nMタンパク質で収集し、結果として得られたセンサーグラムを1:1のLangmuir結合モデルに適合させた。図1は、ヒトHER2官能化表面上で測定したときのZ00477配列番号3及びZ004772配列番号5について得られた、例の表面プラスモン共鳴SPRデータを示す。この関係はアフィニティーが知られている全てのポリペプチド表2について当てはまり、この中でダイマーZ4772配列番号5の値は親和性の性向affectに基づく推定である。His6配列番号7タグ付加ポリペプチドのfac-[99mTcCO3]コアでの標識は、以前に公表された手順Waibel,R.;etal.,A.Nat.Biotechnol.1999,17,897を改変したものを用いて達成した。簡潔には、生理食塩水中のNa[99mTcO4]4mCi、2mLをIsolink登録商標ボラノカーボネートキットAlberto,R.etal,J.Am.Chem.Soc.2001,123,3135に加えた。結果として得られた溶液を95°Cまで15~20分間加熱することで、fac-[99mTcCO3H2O3]が生じた。溶液の一定分量2mCi、1mLを取り出し、1NHClを使用してpH約7に中和した。325μLの一定分量を取り出し、His6-ポリペプチド配列番号740μgの溶液に加えた。結果として得られた溶液を35~37°Cの水浴中で40分間加熱した。典型的な放射化学的収率は80~95の範囲であったITLC-SG、Biodex、0.9NaClにより決定。粗反応生成物についてNAP-5カラムGEHealthcare、10mMPBS上でクロマトグラフィーにかけて、>99放射化学的純度の生成物が生じた。得られた典型的活性は3~4μCi/μgであった。結果として得られた溶液を次いで10mMPBSで希釈することで、その後の生体分布研究に適当な濃度を与えた。HPLCは、Grace-VydacPeptide/ProteinC44.6×250mmカラム及びRaytestGABI放射能検出器を備えたAgilent1100シリーズHPLC上で行った。溶媒Aは0.1TFAを添加した95:5水:MeCNで、溶媒Bは0.1TFAを添加した5:95水:MeCNであった。グラジエントは以下であった全ては直線的に変化する。時間/B:0/0、4/20、16/60、20/100、25/100、26/0、31/0。各ポリペプチドは、精製前にトリカルボニルテクネチウムのコアで高収率>90に標識した。NAP-5クロマトグラフィーによる精製で、99mTc標識ポリペプチド試料が>99の放射化学的純度で生じた表4。NAP-5で精製された放射性標識ポリペプチドの代表的なHPLCクロマトグラムを図4に示す。放射性標識種の保持時間は、220nmのUVクロマトグラムにおける対応する非標識ポリペプチドの保持時間と実質的に変わらなかったUV検出器及びγ検出器の物理的分離が原因である時間差を除く。データは図示せず。99mTcCO3His6-ポリペプチドの研究に用いた動物モデルHis6は配列番号7として開示インビボ研究は、週齢が6週から15週の間の範囲である雌性CD-1ヌードマウスCharlesRiverLabs、Hopkinton、MAを使用して行った。マウスは換気ラック中で、食餌及び水を自由摂取させて、標準的な12時間の昼夜照明サイクルで飼育した。異種移植のため、動物に100μlのPBS中の細胞を注入した。細胞を右後部に皮下移植した。移植はイソフルラン麻酔下で実施した。SKOV3の場合、3×106~4×106の細胞を各マウスに移植した。これらの条件下で、使用可能な腫瘍100~300μgが注入された動物の80超で3から4週の間に得られた。生体分布マウスに約1μgの99mTc標識ポリペプチド約3μCi/1μgを尾静脈注射した。マウスは安楽死までろ紙を並べたケージの中に置かれた。各時点で3匹のマウスを安楽死させ、目的の組織を切除してPerkinElmerWallacWizard1480γCounter上でカウントした。血液、腎臓、肝臓、脾臓及び注入部位尾部についてデータを収集した。ケージからの尿を膀胱と共にプールして、これもまたカウントした。残りの組織をカウントし、各動物について全組織尿の和を合計して、全注入用量が与えられた。各器官についての注入用量はこの全量に基づいて決定し、器官はグラムあたりの注入用量ID/gを決定するために秤量した。データは、その時点での全3匹のマウスについての平均値として、群の標準偏差を表すエラーバーと共に報告される。99mTc標識Z00477配列番号4ポリペプチドをSKOV3マウスに注入した。図6はこれらの実験についての腫瘍及び血液曲線を示す。Z00477配列番号4ポリペプチドは標的発現SKOV3腫瘍において良好な腫瘍への取込みを示し、最大値は注入後PI30分で組織のグラムあたりの注入用量のおよそ3であり、ピークの腫瘍:血液比はPI240分で8より大きい。ポリペプチドは単指数関数的な血液からのクリアランスを呈し、半減期は2分未満である。このクリアランスは主として肝臓及び腎臓が媒介する。表5に記載されるように、脾臓におけるポリペプチドの取込みは中程度で、肝臓において中程度から高度の取込みが観察されている。二価のポリペプチドは対応するモノマーより高いアフィニティーを呈するが、これはおそらく親和性効果のためである。それらのより大きなサイズは、しかしながら、腫瘍の浸透を妨げ得る。HER2ポリペプチドの場合、各々4つの高アフィニティーポリペプチドの二価形態が利用可能であった。Z00477配列番号3のダイマーであるZ004772配列番号5を放射性標識し、SKOV3腫瘍マウスにおける4時間の生体分布実験に用いた。一価及び二価のポリペプチドはその他の点では似たような生体分布特性を呈し、血中半減期はいずれについても1から2分の範囲内に観察されている。結果は、モノマー及び二価ポリペプチドのいずれもインビボでHER2を標的にすることが可能であることを明確に指し示す。99mTcキレーターのcPN216図7を導入するため、二官能性化合物のMal-cPN216を、ポリペプチドの末端システインへのコンジュゲーションのためのチオール反応性マレイミド基、及び99mTcをキレートするためのアミンオキシム基を含んで合成した。cPN216-アミンはGEHealthcareから入手した。N-β-マレイミドプロピオン酸はPierceTechnologiesRockford、ILから購入した。N-メチルモルフォリン、ベンゾトリアゾール-1-イルオキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェートPyBoP、ジチオスレイトールDTT、炭酸水素アンモニウム及び無水DMFはAldrichMilwaukee、WIから購入した。PBS緩衝液1×、pH7.4はInvitrogenCarlsbad、CAから入手した。HPLCグレードのアセトニトリルCH3CN、HPLCグレードのトリフルオロ酢酸TFA及びMillipore18mΩ水をHPLC精製に用いた。実施例1N-β-マレイミドプロピオン酸108mg、0.64mmol、cPN216-アミン200mg、0.58mmol及びPyBoP333mg、0.64mmolを0°Cの無水DMF中に溶解した氷冷溶液に、0.4MのDMF中N-メチルモルフォリン128μL、1.16mmolを加えた。氷浴を2時間後に除去し、混合物を室温で一晩撹拌し、HPLC精製に供した。生成物のMal-cPN216は白色粉末として得られた230mg、80収率。1H-NMR400MHz、DMSO-d6:δ1.35m、2H、1.43s、12H、1.56m、5H、1.85s、6H、2.33dd、J1=8Hz、J2=4Hz、2H、2.78m、4H、3.04m、2H、3.61dd、J1=8Hz、J2=4Hz、2H、7.02s、2H、8.02s、1H、8.68s、4H、11.26s、2H;[MH]についてのm/z=495.2C24H43N6O5、計算されたMW=495.3。ポリペプチドZ00477配列番号3を、脱気したばかりのPBS緩衝液1×、pH7.4を使用して濃度およそ1mg/mLで溶解した。ポリペプチド内のジスルフィド結合は、脱気したばかりのPBS緩衝液1×、pH7.4中にDTT溶液を加えることにより還元した。DTTの最終濃度は20mMであった。反応混合物を2時間ボルテックスし、脱気PBS緩衝液1×、pH7.4で予め平衡化したZeba脱塩スピンカラムPierceTechnologiesを通過させて、過剰なDTT試薬を除去した。溶出した還元ポリペプチド分子を回収し、二官能性化合物のMal-cPN216をDMSO溶液として加え等価のポリペプチドあたり20当量、混合物を室温で3時間ボルテックスして、液体窒素で凍らせた。反応混合物を一晩保存して、逆相HPLC精製に供した図8A及び8B。HPLC精製は、MiCHROMMagicC18AQ5μ200AカラムMiChromBioresources、Auburn、CA上で実施した。溶媒A:H2O0.1ギ酸を添加、溶媒B:CH3CN0.1ギ酸を添加。グラジエント:30分間かけて5~100のB。所望の生成物を含有する画分を合わせ、100mM炭酸水素アンモニウム溶液を使用して中和し、凍結乾燥により溶媒を除去することで、所望のイメージング剤組成物を白色固体として生じた収率41。精製生成物のLC-MS分析により所望の生成物の存在を確認し、MWによりcPN216標識は1つだけがポリペプチドコンストラクトに加えられたことが示唆されたZ00477配列番号3-cPN216:計算されたMW:7429Da、見出されたもの:7429Da;Z02891配列番号2-cPN216計算されたMW:7524Da、見出されたもの:7524Da。実施例220mLバイアルに10.00mLの蒸留脱イオン水を加えた。窒素ガスをこの溶液に通しておよそ30分間バブリングした後、NaHCO3450mg、5.36×103mol、Na2CO360mg、5.66×104mol及びパラ-アミノ安息香酸ナトリウム20mg、1.26×104molを加えた。全ての試薬は独立して秤量し、水を含有するバイアルに加えた。塩化スズ1.6mg、7.09×106mol及びMDP2.5mg、1.42×105molを1ドラムバイアル中に合わせて秤量し、その後におよそ1mLの炭酸塩緩衝液混合物中に迅速に懸濁することにより移動させたその後に1回洗浄した。10μLの一定分量を取り出して、窒素流下でシラン処理されたバイアルに移し、直ちに凍らせて凍結乾燥まで液体窒素浴の中で維持した。各バイアルはゴムのセプタムを使用して部分的に蓋をかぶせ、トレー式凍結乾燥機の中に一晩置いた。バイアルは真空下で密封し、凍結乾燥機から取り出し、アルミニウムキャップでクリンプシールし、無水窒素で再加圧して、将来使用するまで冷凍庫の中で保存した。実施例3放射性標識ポリペプチドの合成は、テクネチウム還元剤としての塩化第一スズ、フリーラジカルスカベンジャーとしてのメチレンジホスホン酸、p-アミノ安息香酸及び緩衝液としての炭酸水素ナトリウム/炭酸ナトリウムpH9.2からなる凍結乾燥混合物を含有する内製の1段階キット処方ChelakitAを用いて実施した。間断なく、20μLの2μg/μLポリペプチド生理食塩水溶液をChelakitに加え、その後直ちにCardinalHealthAlbany、NYから入手した0.080mLの生理食塩水0.15MNaCl中のNa99mTcO40.8mCi、29.6MBqを加えた。混合物を1回かき混ぜ、周囲温度で20分間置いた。終了次第、粗放射化学的収率をITLCにより決定した下の表6はITLC-SG、Biodex、0.9NaClによる。0.35mLの150mM滅菌NaClを使用して反応容量を0.45mLに増量し、最終生成物をサイズ排除クロマトグラフィーNAP5、GEHealthcare、10mMPBSを使用して飽和させたものにより精製した。粗反応混合物をNAP5カラム上にロードし、ゲル層に入り込ませ、0.8mLの10mLPBSを使用して溶出した後に最終精製生成物を単離した。最終活性は標準的な用量キャリブレーターCRC-15R、Capintec、Ramsey、NJ中でアッセイした。放射化学的収率表6及び純度は、ITLC>98.5、C4RP-HPLC図9及びSEC-HPLC分析により決定した。最終生成物10~15μCi/μg、0.2~0.5μCi/μL0.37MBq/μg、7.4MBq/mLは直ちに生体分布研究に用いた。この実験に用いたHPLC条件は以下であった。C4RP-HPLC方法1:溶媒A:95/5H2O/CH3CN0.05TFAを添加、溶媒B:0.05TFAを添加した95/5CH3CN/ddH2O蒸留脱イオン水。グラジエント溶出:0分0B、4分20B、16分60B、20分100B、25分100B、26分0B、31分0B。C4RP-HPLC方法2:溶媒A:0.06NH3水、溶媒B:CH3CN。グラジエント溶出:0分0B、4分20B、16分60B、20分100B、25分100B、26分0B、31分0B。RP-HPLC分析は、G1311AQuatPump、100μLシリンジ及び2.0mLシートキャピラリーの付いたG1313Aオートインジェクター、GraceVydac-タンパク質C4カラムS/NE050929-2-1、4.6mm×150mm、G1316Aカラムヒーター、G1315ADAD並びにRamonStar-GABIγ検出器を備えたHPAgilent1100上で実施した。SECHPLC:溶媒:1×10mMPBSGibco、Invitrogen、pH7.4、CaCl2及びMgCl2を含有する。30分間均一濃度で溶出。分析は、PerkinElmerSEC-4SolventEnviromentalコントロール、Series410LCポンプ、ISS200AdvancedLCサンプルプロセッサー及びSeries200DiodeArrayDetector上で実施した。Socket81030111ピンホール0.7のmm内径、250μLの容量を有するを備えたRaytestGABIフローセルγ検出器はPerkinElmerNCI900NetworkChromatographyInterfaceによってインターフェーズ接続した。用いたカラムはSuperdex7510/300GLHighPerformanceSECカラムGEHealthcare.コード:17-5174-01、ID番号0639059であった。99mTcをcPN216キレートに組み込むのに用いたChelakitの動作pHpH=9.2は、計算されたZ00477配列番号3ポリペプチドのpIとほとんど一致した。これらの条件下での標識は、最終生成物中の凝集の原因になると決定された図5A及び5B。凝集は、サイズ排除HPLCにより、及び生体分布研究において観察された血液滞留時間及び肝臓取込みの増加を通じて確認された。ポリペプチドの等電点を変えることにより、99mTcはZ02891配列番号2コンストラクト上に成功裡に組み込まれた。サイズ排除HPLCにより適切な分子量を有する種の存在を確認し、生体分布研究により腫瘍異種移植片へのトレーサーの取込みが示された。インビボ研究は、週齢が6週から15週の間の範囲である雌性CD-1ヌードマウスCharlesRiverLabs、Hopkinton、MAを使用して行った。マウスは換気ラック中で、食餌及び水を自由摂取させて、標準的な12時間の昼夜照明サイクルで飼育した。異種移植のため、動物に100μlのPBS中の細胞を注入した。細胞を右後部に皮下移植した。移植はイソフルラン麻酔下で実施した。SKOV3の場合、3×106~4×106の細胞を各マウスに移植した。これらの条件下で、使用可能な腫瘍100~300μgが注入された動物の80超で3から4週の間に得られた。マウスに約1μgの99mTc標識ポリペプチド約10μCi/1μgを尾静脈注射した。マウスは安楽死までろ紙を並べたケージの中に置かれた。各時点で3匹のマウスを安楽死させ、目的の組織を切除してPerkinElmerWallacWizard1480γCounter上でカウントした。血液、腎臓、肝臓、脾臓及び注入部位尾部についてデータを収集した。ケージからの尿を膀胱と共にプールして、これもまたカウントした。残りの組織をカウントし、各動物について全組織尿の和を合計して、全注入用量が与えられた。各器官についての注入用量はこの全量に基づいて決定し、器官はグラムあたりの注入用量ID/gを決定するために秤量した。データは、その時点での全4から5匹のマウスについての平均値として、群の標準偏差を表すエラーバーと共に報告される。4時間の間に4つの時点が取られた注入後5、30、120及び240分。Z02891配列番号2-cPN216-99mTcポリペプチドは標的発現SKOV3腫瘍において強い腫瘍への取込みを示し、注入後PI30分での組織のグラムあたりの注入用量の7.11±1.69n=5という値であって、この値はPI240分までの研究のタイムコースにわたってほとんど一定のままである。腫瘍:血液比は注入後30、120及び240分でそれぞれ2、5及び5であった。図10、11及び12はこれらの実験についての腫瘍、血液及び腫瘍:血液曲線を示す。ポリペプチドは単指数関数的な血液からのクリアランスを呈し、半減期は2分未満である。このクリアランスは主として腎臓が媒介し、注入後PI240分で10.58±2.96n=5ID/器官である。活性は主として尿中に分泌されている。脾臓におけるポリペプチドの取込みは潜在的な凝集が原因で中程度から高いものであって、肝臓において中程度の、例として、研究経過全体にわたって12ID/器官マウスにおける値でID/gと等価の取込みが観察されている。Z02891配列番号2-cPN216-99mTcの生体分布結果実施例4Z00477配列番号4、Z00342配列番号1及びZ02891配列番号2-システインポリペプチドを、人工的に作り出されたC末端システインによって、アミノキシ基で官能化した。与えられたポリペプチド分子の純度を高速液体クロマトグラフィーHPLCにより>95と決定した。実施例518Fをポリペプチド分子に組み込むため、2つの直交性の基:人工的に作り出されたシステインへのコンジュゲーションのためのチオール反応性マレイミド基及びアルデヒド反応性アミノキシ基を含む二官能性リンカーのMal-アミノオキシを合成した図13A及び13B。このリンカーは、Boc保護形態のリンカーを生じる1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミドEDCを介したカップリング条件を用いて、N-2-アミノエチルマレイミドを2-tert-ブトキシカルボニルアミノオキシ酢酸と反応させることにより調製した。Boc保護基を次いで酸切断により脱保護することで、最終のMal-AO生成物が定量的収率で生じた。最終生成物はさらに精製せずに直接的に用いた。一般事項ジクロロメタン、2-tert-ブトキシカルボニルアミノオキシ酢酸、トリエチルアミン、N-2-アミノエチルマレイミドトリフルオロ酢酸TFA塩、N-ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物HOBT、1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミドEDC、ジチオスレイトールDTT及び全ての他の標準的合成試薬はSigma-AldrichChemicalCo.St.Louis、MOから購入した。全ての化学物質はさらに精製せずに用いた。PBS緩衝液1×、pH7.4はInvitrogenCarlsbad、CAから入手した。HPLCグレードの酢酸エチル、ヘキサン、アセトニトリルCH3CN、トリフルオロ酢酸TFA及びMillipore18mΩ水を精製に用いた。実施例62-tert-ブトキシカルボニルアミノオキシ酢酸382mg、2mmolの無水ジクロロメタン溶液20mLにトリエチルアミン307μL、2.2mmol、N-2-アミノエチルマレイミドTFA塩508mg、2mmol、HOBT306mg、2mmol及びEDC420mg、2.2mmolを順次加えた。室温で24時間撹拌後、反応混合物を酢酸エチル50mLで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液3×30mL、水30mL及びブライン30mLで洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで脱水し、ろ過した。ろ液を淡黄色固体へと濃縮し、カラムクロマトグラフィーヘキサン中に70の酢酸エチルで精製することで、生成物が白色粉末として生じた500mg、80収率。1H-NMR400MHz、CDCl3:δ1.50s、9H、3.55tt、J1=6.0Hz、J2=6.5Hz、2H、3.77dd、J=7.6Hz、2H、4.30s、2H、6.3s、2H。実施例79.3mgのMal-AO-Bocを1mLのメタノール中3MHClに溶解した溶液を室温で18時間撹拌した。溶媒を真空下で除去することで、Mal-AOが薄黄色の固体として生じた80収率。1H-NMR400MHz、DMSO-d6:δ3.27CH2t、J=4.0Hz、2H、3.49CH2t、J=4.0Hz、2H、4.39CH2Os、2H、7.00CH=CHs、2H;[MH]についてのm/z=214.07C8H12N3O4、計算されたMW=214.11実施例8ポリペプチドZ00477配列番号4、Z00342配列番号1又はZ02891配列番号2を、脱気したばかりのPBS緩衝液1×、pH7.4を使用して濃度およそ1mg/mLで溶解した。ポリペプチド内のジスルフィド結合は、脱気したばかりのPBS緩衝液1×、pH7.4中にジチオスレイトールDTT溶液を加えることにより還元した。DTTの最終濃度は20mMである。反応混合物を2時間ボルテックスし、脱気PBS緩衝液で予め平衡化したZeba脱塩スピンカラムPierceTechnologiesを通過させて、過剰なDTT試薬を除去した。還元したポリペプチドを回収し、二官能性Mal-AO化合物をDMSO溶液として加えた等価のポリペプチドあたり15当量。室温で一晩ボルテックスした後、反応混合物を高速液体クロマトグラフィーHPLCを使用して精製した図14A及び14B。HPLC精製は、MiCHROMMagicC18AQ5μ200AカラムMiChromBioresources、Auburn、CA上で実施した。溶媒A:H2O0.1ギ酸を添加、溶媒B:CH3CN0.1ギ酸を添加。グラジエント:30分間かけて5~100のB。所望の生成物を含有する画分を合わせ、100mM炭酸水素アンモニウム溶液を使用して中和し、凍結乾燥により溶媒を除去することで、アミノキシ修飾ポリペプチドが白色固体として生じた。ESI-TOF-MS分析により予想された分子量を有する標的生成物の存在を確認したZ00477配列番号4-ONH2、Z00342配列番号1-ONH2及びZ02891配列番号2-ONH2それぞれについて計算されたMW:6964Da、8531Da及び7243Da、見出されたもの:6963Da、8532Da及び7244Da。実施例918FBAの調製方法:全ての反応は、窒素雰囲気下又は使用前に窒素パージしたクリンプトップの密封バイアル中のいずれかで実施した。Kryptofix222Aldrich及びK2CO3EMDScienceは購入して受け取ったらすぐに用いた。Optima商標グレードのアセトニトリルをHPLC及び反応溶媒の両方として用いた。K18F精製水中に40mCimL11480MBqmL1はIBAMolecularAlbany、NY及びPETNETSolutionsAlbany、NYから入手し、受け取ったらすぐに用いた。[18F]フッ化物は最初にChromafix30-PS-HCO3アニオン交換カートリッジABX、Radeberg、ドイツ上に固定化し、次いで、KryptofixK222376g.mol1、8mg、2.13×105mol及び炭酸カリウム138.2g.mol1、2.1mg、1.52×105molを含有するアセトニトリル:蒸留脱イオン化H2OddH2Oの4:1混合物を1mL使用してドライダウンdrydown容器中に溶出した。部分的な真空下、窒素流下で穏やかに加温しながら溶媒を除去した約45°C約15分間。供給源のバイアル及びアニオン交換カートリッジを次いでK2228mgを含有するアセトニトリル0.5mLで洗浄し、反応混合物を再び部分的な真空下で穏やかに加温しながら乾燥させた約10分間。反応器は窒素を使用して再加圧し、共沸性ドライダウンを0.5mLのアセトニトリルを添加して1回繰り返した。4-ホルミル-N,N,N-トリメチルアニリニウムトリフレート313.30gmol1、3.1mg、9.89×106molを0.35mLの無水DMSOAcros中に溶解し、K18FK222、K2CO3を含有する反応器に直接的に加えた。反応混合物を90°Cまで15分間加温し、直ちに3mLのddH2Oを使用してクエンチした。この混合物を続いてカチオン交換カートリッジWatersSepPakLightAccellPlusCMを通過させ、ddH2Oで10mLに希釈し、逆相C18SepPakWatersSepPakPlusC18上にロードした。SepPakは10mLのddH2Oでフラッシュし、次いで30mLの空気でパージした。[18F]4-フルオロベンズアルデヒド18FBAを1.0mLのメタノール中に溶出した。実施例10別々に、高回収バイアル2mL、NationalScientificにZ00477-配列番号3-ONH20.35~0.5mg、Z00342-配列番号1-ONH20.35~0.5mg又はZ02891-配列番号2-ONH20.35~0.5mgのいずれかを充填した。固体を25μLのddH2O及び8μLのトリフルオロ酢酸中に懸濁した。25μLのメタノール中の18FBA実施例9を参照を反応バイアルに移した。容器は蓋をかぶせ、クリンプし、ヒートブロック中に置いて、60°Cで15分間維持した。この時点で小分量<5μLを分析HPLC分析用に取り出した。450μLの0.1TFA添加ddH2Oは、セミ分取HPLC精製のための調製において、溶液をおよそ500μLに希釈するのに用いた。18FB-ポリペプチドはセミ分取HPLCにより単離精製された。生成物0.113mCi/4.18MBqを含有するHPLC画分をddH2Oで5:1希釈し、続いてtC18PlusSepPakWaters上に固定化した。SepPakは最初に5mLのddH2O、次いで30mLの空気でフラッシュした。18FB-ポリペプチドは、最初に空隙容量およそ0.5mLを溶出し、その後に250から300μLの溶出液を別々のフラスコ中に回収することにより、最小限の量のエタノール中に単離した。放射化学的及び化学的純度を確立するため、単離生成物に対してRP-HPLC分析を実施した。典型的には、処方後分析のため、10μLの0.1μCi/μL溶液を注入した。単離放射化学的収率は表9中に指し示され、18FBAへのポリペプチド添加量及び放射化学的純度>99から減衰補正されている。あるいは、反応混合物を10mMPBSでおよそ0.5mLに希釈してゲル上にロードすることにより、18F標識ポリペプチドをNAP5サイズ排除クロマトグラフィーにより単離した。18F標識ポリペプチドは0.8mLの10mMPBSでカラムを溶出することにより単離し、さらなる修飾はせずに用いた。これらの結果を表8及び図15中で説明する。用いた分析HPLC条件は以下である。分析は、G1311AQuatPump、100μLシリンジ及び2.0mLシートキャピラリーの付いたG1313Aオートインジェクター、PhenomenexGeminiC18カラム4.6mm×150mm、5μ、100ÅS/N420477-10、G1316Aカラムヒーター、G1315ADAD並びにRamonStar-GABIγ検出器を備えたHPAgilent1100上で実施した。0.05TFAを添加した95:5ddH2O:CH3CN、溶媒B:0.05TFAを添加したCH3CN。グラジエント溶出1.0mLmin1:0分0B、1分15B、21分50B、22分100B、26分100B、27分0B、32分0B又はグラジエント溶出1.2mLmin1:0分0B、1分15B、10分31B、10.5分100B、13.5分100B、14分0B、17分0B。用いたセミ分取HPLC条件は以下である。精製は、DG-2080-544ラインDegasser、MX-2080-32DynamicMixer及び2個のPU-2086PlusPrepポンプ、大容量注入キットがインストールされたAS-2055PlusIntelligentオートインジェクター、ガード付きPhenomenex5μLunaC182100Å、250×10mm、5μカラムS/N295860-1、P/N00G-4252-N0、MD-2055PDA及びCarrollRamseyAssociatesModel105SAnalogueRatemeterを取り付けた固体SiPINフォトダイオードγ検出器を備えたJascoLC上で実施した。グラジエント溶出:0分5B、32分20B、43分95B、46分95B、49分5B、溶媒A:0.05TFAを添加したddH2O:CH3CN、溶媒B:0.05TFAを添加したCH3CN。実施例11インビボ研究は、週齢が6週から15週の間の範囲である雌性CD-1ヌードマウスCharlesRiverLabs、Hopkinton、MAを使用して行った。マウスは換気ラック中で、食餌及び水を自由摂取させて、標準的な12時間の昼夜照明サイクルで飼育した。異種移植のため、動物に100μlのPBS中の細胞を注入した。細胞を右後部に皮下移植した。移植はイソフルラン麻酔下で実施した。SKOV3の場合、3×106~4×106の細胞を各マウスに移植した。これらの条件下で、使用可能な腫瘍100~300μgが注入された動物の80超で3から4週の間に得られた。マウスに約1μgの18F標識ポリペプチド約4μCi/1μgを尾静脈注射した。マウスは安楽死までろ紙を並べたケージの中に置かれた。各時点で3匹のマウスを安楽死させ、目的の組織を切除してPerkinElmerWallacWizard1480γCounter上でカウントした。血液、腎臓、肝臓、脾臓、骨及び注入部位尾部についてデータを収集した。ケージからの尿を膀胱と共にプールして、これもまたカウントした。残りの組織をカウントし、各動物について全組織尿の和を合計して、全注入用量が与えられた。各器官についてのパーセント注入用量はこの全量に基づいて決定し、器官はグラムあたりのパーセント注入用量ID/gを決定するために秤量した。データは、その時点での全3匹のマウスについての平均値として、群の標準偏差を表すエラーバーと共に報告される。ポリペプチドに対し、SKOV3細胞異種移植モデルにおける生体分布研究を行った。4時間の間に4つの時点が取られた注入後5、30、120及び240分。完全な生体分布データを表12SKOV3担がんマウスにおけるID/gZ02891配列番号2-18F-フルオロベンジルオキシム及び表13SKOV3担がんマウスにおけるID/gZ00342配列番号118F-フルオロベンジルオキシム中に記載する。図16、17及び18はこれらの試験についての腫瘍、血液、腫瘍:血液及びクリアランス曲線を示す。Z02891配列番号218F-フルオロベンジルオキシムポリペプチドは標的発現SKOV3腫瘍において強い腫瘍への取込みを示し、注入後PI240分での組織のグラムあたりの注入用量の17.47±2.89n=3という値である。腫瘍:血液比は注入後30、120及び240分でそれぞれおよそ3、34及び128であった。Z00342配列番号118F-フルオロベンジルオキシムポリペプチドは標的発現SKOV3腫瘍において強い腫瘍への取込みを示し、PI240分での組織のグラムあたりの注入用量の12.45±2.52n=3という値である。腫瘍:血液比は注入後30、120及び240分でそれぞれおよそ3、32及び53であった。ポリペプチドは単指数関数的な血液からのクリアランスを呈し、半減期は2分未満である。このZ02891配列番号2のクリアランスは主として腎臓が媒介し、PI240分で0.95±0.07n=3ID/器官である。活性は主として尿中に分泌されている。脾臓におけるポリペプチドの取込みはごくわずかであって、肝臓において低い取込み、例として、研究経過全体注入後4時間にわたって約1.8ID/器官マウスにおける値でID/gと等価の取込みが観察されている。一般事項全ての反応は、窒素雰囲気下又は窒素パージしたクリンプトップの密封バイアル中のいずれかで実施する。Optima商標グレードのアセトニトリルをHPLC及び反応溶媒の両方として用いる。実施例12[123I]4-ヨードベンズアルデヒド123IBAを、ポリペプチド-ONH2Z02891、配列番号2、0.35~0.5mgを含有する高回収バイアル2mL、NationalScientificに加える。反応は、ポリペプチドを25μLのddH2O中に溶解し、8μLのトリフルオロ酢酸、その後にメタノール中の123IIBAを添加することにより、始まる。容器は蓋をかぶせ、クリンプし、ヒートブロック中に置いて、60°Cで15分間維持する。反応状況を査定するため、小分量<5μLを分析HPLC分析用に取り出す。反応混合物は、セミ分取HPLC精製のための調製において、0.1TFAを含有するddH2O:アセトニトリル混合物の1:1混合物の最少量に希釈される。123IB-ポリペプチドはセミ分取HPLC又はNAP5サイズ排除クロマトグラフィーにより単離精製される。生成物を含有するHPLC画分をddH2Oでさらに希釈5:1し、続いてtC18PlusSepPakWaters上に固定化する。SepPakを最初に5mLのddH2O、次いで30mLの空気でフラッシュすることで、最小限の量のエタノール中に123IB-ポリペプチドが生じるが、これは最初に空隙容量およそ0.5mLを溶出し、その後に250から300μLの溶出液を別々のフラスコ中に回収することにより、得られるものである。放射化学的及び化学的純度を確立するため、単離生成物に対してRP-HPLC分析を実施する。実施例1367Ga-NOTA-Z00477配列番号3の調製NOTA1,4,7-トリアザシクロノナン-N,N,N-トリ酢酸キレーターをポリペプチドに結合した後、ポリペプチドZ00477配列番号3をGa、特に67Gaで標識した図19。Mal-NOTAのポリペプチド分子へのバイオコンジュゲーションは、次のように達成した。脱気したばかりのPBS緩衝液1×、pH7.4を使用して濃度およそ1mg/mLで溶解した。ポリペプチド内のジスルフィド結合は、脱気したばかりのPBS緩衝液1×、pH7.4中にDTT溶液を加えることにより還元させた。DTTの最終濃度は20mMであった。反応混合物を2時間ボルテックスし、脱気PBS緩衝液1×、pH7.4で予め平衡化したZeba脱塩スピンカラムPierceTechnologiesを通過させて、過剰なDTT試薬を除去した。溶出した還元ポリペプチドを回収し、二官能性化合物mal-NOTAをDMSO溶液として加え等価のポリペプチドあたり15当量、混合物を室温でボルテックスした。反応は、ポリペプチド分子の完全な変換を確実にするため、一晩続けられた。HPLC精製は、MiCHROMMagicC18AQ5μ200AカラムMiChromBioresources、Auburn、CA上で実施された。溶媒A:H2O0.1ギ酸を添加、溶媒B:CH3CN0.1ギ酸を添加。グラジエント:30分間かけて5~100のB図20A。所望の生成物を含有する画分を合わせ、100mM炭酸水素アンモニウム溶液を使用して中和し、凍結乾燥により溶媒を除去することで、結合ポリペプチドが白色固体として生じた。精製生成物のLC-MS分析により所望の生成物の存在を確認し、MWによりNOTAキレーターは1つだけがポリペプチドコンストラクトに加えられたことが示唆されたZ00477配列番号3-NOTAについて計算されたMW:7504Da、見出されたもの:7506Da図20B。放射性標識は続いて次のように達成した。25μlのHEPES溶液63mMを始めにスクリュートップバイアルに加え、その後に0.04MHCl中の40.5MBq67GaCl3GEHealthcareを10μl加えた。30μlH2O中の30μgMW=7506、4.0×109molのNOTAZ00477配列番号3を次いで反応混合物に加えることで、濃度が61μMでpHが3.5~4.0である最終NOTAZ00477配列番号3が生じた。反応バイアルを密封して、反応を周囲温度で維持した。粗反応混合物の逆相HPLC分析により、67Ga-NOTAZ00477配列番号3の放射化学的純度は、室温で2時間の後にHPLCによると95であると決定された図21。1日の反応時間の後、67Ga-NOTAZ00477配列番号3をHPLCにより精製した。22MBqの67Ga-NOTAZ00477配列番号3を精製のためにHPLC上に注入した。15MBqの67Ga標識生成物が精製から得られた放射化学的収率=68。HPLC溶媒を真空下で除去することで、容量がおよそ0.5mLの溶液を生じた。およそ1.45mLのダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水を次いで添加することで、pH6~6.5で放射能濃度が7.7MBq/mLである最終溶液を生じた。精製された処方物67Ga-NOTAZ00477配列番号3は室温で2時間以上安定であることが見出されたRCP=96、HPLCによる図22。用いた分析HPLC条件は以下である。GraceVydacC4タンパク質5ミクロン、300Å、4.6×250mmHPLCカラム。溶媒A=0.05トリフルオロ酢酸TFA中の95/5H2O/MeCN、溶媒B=0.05TFA中の95/5CH3CN/H2O。HPLCグラジエント分/B:0/0、4/20、16/60、20/100、25/100、26/0。用いたセミ分取HPLC条件は以下である。カラム:GraceVydacC4タンパク質5ミクロン、300Å、4.6×250mm。溶媒A=0.05トリフルオロ酢酸TFA中の95/5H2O/MeCN、溶媒B=0.05TFA中の95/5CH3CN/H2O。HPLCグラジエント分/B:0/0、4/20、16/60、20/100、25/100、26/0。一般事項組換えHER2Z28921-CysはAffibodyAB、Swedenから購入し、Eei-アミノオキシ酢酸コハク酸エステルはIRISBiotechから、及びジ-tert-ブチルジフルオロシランはFluorochemから購入した。試薬及び溶媒はIRISBiotech、Merck、Romil及びFlukaから購入した。分析LC-MSスペクトルは、エレクトロスプレーイオン化ESIによりポジティブモードで運転されるThermoFinniganMSQ機器上で記録したが、これに連結したThermoFinniganSurveyorPDAクロマトグラフィーシステムでは以下の条件を用いた。特に指示がなければ溶媒A=H2O/0.1TFA及び溶媒B=ACN/0.1TFA、流速:0.6mL/分、カラム:PhenomenexLuna3μmC18220×2mm、検出:UV214/254nm。セミ分取逆相HPLCのランは、BeckmanSystemGoldクロマトグラフィーシステム上で、以下の条件を用いて実施した。特に指示がなければ溶媒A=H2O/0.1TFA及び溶媒B=ACN/0.1TFA、流速:10mL/分、カラム:PhenomenexLuna5μmC182250×21.2mm、検出:UV214nm。分取逆相HPLCのランは、WatersPrep4000システム上で、以下の条件を用いて実施した。特に指示がなければ溶媒A=H2O/0.1TFA及び溶媒B=ACN/0.1TFA、流速:50mL/分、カラム:PhenomenexLuna10μC182250×50mm、検出:UV214/254nm。略語:AlaA:アラニンArgR:アルギニンAsnN:アスパラギンAspD:アスパラギン酸ACN:アセトニトリルBoc:tert-ブチルオキシカルボニルCysC:システインDIPEA:ジイソプロピルエチルアミンDMF:N,N-ジメチルホルムアミドDMAB:4-ジメチルアミノ-ベンズアルデヒドDOTA:1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-テトラ酢酸EDT:1,2-エタンジチオールEMS:エチルメチルスルフィドESI:エレクトロスプレーイオン化eq:当量FBA:4-フルオロベンズアルデヒドGlnQ:グルタミンGluE:グルタミン酸hr複数可:時複数可HER2:ヒト上皮成長因子受容体HOAt:1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾールHPLC:高速液体クロマトグラフィーIleI:イソロイシンLC-MS:液体クロマトグラフィー-質量分析LeuL:ロイシンLysK:リジンMetM:メチオニンmin:分μm:マイクロメーターnm:ナノメーターNMP:1-メチル-2-ピロリジノンNOTA:1,4,7-トリアザシクロノナン-1,4,7-トリ酢酸PDA:フォトダイオードアレイPET:陽電子放射断層撮影PheF:フェニルアラニンProP:プロリンPyAOP:7-アザベンゾトリアゾール-1-イルオキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェートSer複数可:セリンSiFA:4-ジ-tert-ブチルフルオロシリルベンズアルデヒドTFA:トリフルオロ酢酸ThrT:スレオニンTIS:トリイソプロピルシランTrpW:トリプトファンTyrY:チロシンValV:バリン実施例14化合物2の半自動放射性合成FASTlabTMプラットフォームGEHealthcareを[18F]フルオロベンズアルデヒド[18F]FBAの調製に用いたが、これは典型的にはエタノール中で7GBqの[18F]FBA1.5mL、減衰未補正の収率で12~54を産出するものである。この[18F]FBA溶液の小画分92μLを次いで、シラン処理されたP6バイアル中、水138μL中のアニリン塩酸塩3.2mg、25μmolの存在下で、アミノキシ前駆体30.4mg、55nmolと手作業で結合させた。混合物を70°Cまで20分間、Peltierヒーターを用いて加熱した。サイズ排除クロマトグラフィーNAP5カートリッジ、GEHealthcareによって2を単離した。0.25mL生理食塩水/0.1アスコルビン酸ナトリウムを使用した初めの溶出は廃棄した。その後の2を含有する0.75mL生理食塩水/0.1アスコルビン酸ナトリウム溶出物を回収し、同じ溶出混合物と共にpH5~5.5で処方することで、所望の放射性濃度を生じた。コンジュゲーション段階から単離された2の減衰未補正収率は17~38、手作業で調製した2の放射化学的純度RCP値は≧95であったTLCシステム:PerkinElmerInstantImager、水/30アセトニトリルv/vを移動相として使用したC18逆相シートを用いた。標識ペプチドは起点に留まった。Gilson322ポンプを用い、GilsonUV/ViS156検出器、BioscanFlow-Count放射能検出器及びLunaC18Phenomenexカラム50×4.6mm、3μm又はLunaC18Phenomenexカラム150×4.6mm、5μmを備えたHPLCにより、生成物をさらに分析した。移動相は溶媒A0.1M酢酸アンモニウム及びBアセトニトリルからなり、1mL/分で直線的なグラジエント15分間で5~95のBで流した。UV吸収を280及び350nmで測定した。図23は処方2の分析HPLCトレースの代表例を示す。実施例14a化合物3の調製iEei-アミノオキシアセチル-マレイミドの調製N-2-アミノエチルマレイミドTFA塩51mg、0.20mmol及びEei-AOAc-OSu77mg、0.30mmolをNMP2mL中に溶解した。Sym.-コリジン80μL、0.6mmolを加え、反応混合物を70分間撹拌した。反応混合物を水7mLで希釈し、生成物のeei-アミノオキシアセチル-マレイミドをセミ分取HPLCにより精製した。セミ分取HPLCグラジエント:40分間かけて15~30のB、A=水/0.1酢酸及びB=ACNを用いた精製は、43mg75の純粋なEei-アミノオキシアセチル-マレイミドを産出。精製された物質のeei-アミノオキシアセチル-マレイミドをLC-MSにより性質決定したグラジエント:5分間かけて10~40のB。tR:1.93分、見出されたm/z:284.1、予想されたMH:284.1。ii化合物3の調製組換えZ02891-Cys144mg、0.205mmolAffibodyAB、Swedenから購入及びeei-アミノオキシアセチル-マレイミド17mg、0.60mmolを水3mL中に溶解した。酢酸アンモニウムの添加により溶液をpH6に調整し、反応混合物を90分間振とうした。反応混合物を水7mLで希釈し、生成物をセミ分取HPLCにより精製することで、126mgの凍結乾燥Eei保護生成物を産出した。eei保護生成物をアルゴン被覆下で20分間、2.5TFA/水16mLを使用して処理した。溶液を水144mLで希釈し、アルゴン被覆下でイソプロパノール/ドライアイス浴を用いて凍結させ、凍結乾燥することで、149mg100のZ02891-Cys-マレイミド-アミノオキシアセチル3を産出した。凍結乾燥Z02891-Cys-マレイミド-アミノオキシアセチル3を分析LC-MSにより分析したグラジエント:5分間かけて10~40のB、tR:3.28分、見出されたm/z:1811.8、予想されたMH44:1811.4。実施例15tC2SepPak精製を用いた化合物2の自動放射性合成FASTlab商標カセットは、第一のバイアル8.25mg/21.9μmolのKryptofix、1.16mg/8.4μmolのK2CO3、165μLの水、660μLのアセトニトリル、第二のバイアル1.5mg/4.8μmolのトリフレート1、1.5mLの無水DMSO、第三のバイアル5.5mg/0.76μmolの3、8.2mg/63μmolのアニリン塩酸塩、0.7mLの酢酸アンモニウム緩衝液pH4.5/0.25M、第四のバイアル4mL、4w/vのアンモニア水、エタノール25mL及びリン酸1w/w、25mLの外部バイアル、調整済みのQMAlightSepPakカートリッジ、OASISMCXSepPakカートリッジ並びに2個のtC2SepPakカートリッジを含有して組み立てた。生成物バイアルはp-アミノ安息香酸水溶液0.08w/w、19mLを含有した。カセットのレイアウトを図24に示す。必要とされるプログラムシーケンスをPCコントロールから合成機モジュールへとアップロードし、組み立てたカセットを機械上に設置した。ウォーターバッグ及び生成物バイアルを取り付けた。[18F]水300MBq、1mLを含有するバイアルをFASTlab商標モジュールに取り付け、放射性合成を始めた。プロセスは、QMAカートリッジから溶出した[18F]-Kryptofix/炭酸カリウム複合体の共沸乾燥段階、[18F]FBAの放射性合成、MCXカートリッジ、アンモニア溶液及びエタノールでの溶出を用いた[18F]FBAの精製、2を生産するコンジュゲーション段階並びにtC2カートリッジ上でリン酸/エタノールを用いた精製及び処方段階を包含した。全プロセスは1時間かかり、2を33の減衰未補正の放射化学的収率で、94の放射化学的純度で生成させた。実施例16Sephadex精製を用いた化合物2の自動放射性合成FASTlab商標カセットは、第一のバイアル8.25mg/21.9μmolのKryptofix、1.16mg/8.4μmolのK2CO3、165μLの水、660μLのアセトニトリル、第二のバイアル1.5mg/4.8μmolのトリフレート1、1.5mLの無水DMSO、第三のバイアル5.0mg/0.69μmolの3、8.2mg/63μmolのアニリン塩酸塩、0.7mLの酢酸アンモニウム緩衝液pH4.5/0.25M、第四のバイアル4mL、4w/vのアンモニア水、エタノール25mL及び生理食塩水Polyfusor、0.9w/v、25mLの外部バイアル、調整済みのQMAlightSepPakカートリッジ、OASISMCXSepPakカートリッジ並びに乾燥SephadexG10500mg、Sigma-Aldrich、Cat.G10120を含有するカスタム充填サイズ排除カートリッジ2mL、Supelco、Cat.57608-Uを含有して組み立てた。カセットのレイアウトを図26に示す。2の放射性合成を実施例15に記載されたように実施した。生理食塩水5mLを使用してSephadexカートリッジをプライミングした後、粗反応混合物をSephadexカートリッジを通して送り込み、純粋な2を生成物バイアル中に回収した。合成時間は40分間で、減衰未補正の放射化学的収率は10であった。生成物の放射化学的純度は95で、DMABレベルは0.8μg/mLであった。図27は最終生成物のHPLC分析を示す。実施例17[18F]AlF-NOTACOOH2-Z02891配列番号25の放射性合成NOTACOOH2-Z028914746μg、100nmolの酢酸ナトリウム緩衝液50μL、pH4.0、0.5M溶液を、コニカルポリプロピレン遠心分離バイアル1.5mL中でAlCl3溶液酢酸ナトリウム緩衝液、pH4.0、0.5M中に3μL、3.33μg、25nmolと混合した。この混合物をキャップ付きのP6バイアル中で少量の[18F]フッ化物50μLに加えた。このバイアルを100°Cで15分間加熱した。生理食塩水100μLで希釈した後、反応溶液をNAP5サイズ排除カートリッジGEHealthcareに移した。最終生成物は生理食塩水750μLを用いてP6バイアル中に溶出した。標識ペプチド5は11の減衰未補正の放射化学的収率を有するものとして得られた。図28は処方生成物の分析HPLCを示す。表11に個々のランのデータをまとめる。実施例17a化合物4の調製iNOTAビス-tBuの調製aテトラトシル-N,N-ビス2-ヒドロキシエチルエチレンジアミンの合成N,N-ビス2-ヒドロキシエチル-エチレンジアミンAldrich、14.8g、100mmol及びピリジンFluka、200mLを0°C、窒素下で、トルエン-4-スルホニルクロリドFluka、77g、400mmolのピリジンFluka、100mL溶液を75分間かけてこの溶液中に入れながら撹拌した。温度をゆっくりと室温に上昇させ、4時間撹拌し続けた。溶液を氷250mLと塩酸濃縮物、250mLとの混合物中に撹拌しながら注ぎ込んで、黒ずんだ粘着性の油を産出した。溶媒をデカンテーションにより除去し、粗生成物を水で洗浄し、デカンテーションしてメタノール250mL中に再溶解した。結果として得られたスラリーをろ過により単離し、粗生成物を熱メタノール60°C、600mL中に再溶解して冷却した。固体生成物をろ別し、真空中で乾燥させた。収率36.36g47.5。生成物をNMRにより検証した。b1-ベンジル-4-7-ジトシル-1,4,7-トリアゾナンの合成テトラトシル-N,N-ビス2-ヒドロキシエチルエチレンジアミン実施例17aiaを参照、2.0g、2.6mmol、ベンジルアミン500μl、4.6mmol、炭酸カリウムFluka、792mg、5.7mmol及びアセトニトリルMerck、25mLを100°Cまで加熱し、一晩撹拌した。ろ過により溶媒を固体生成物から除去した。固体をアセトニトリルで洗浄し2×10mL、溶媒を蒸発させて除いた。固体を熱エタノール15mL中に溶解し、室温で3日間置いた。ろ過により結晶を回収して、真空中で一晩乾燥させた。生成物をLC-MSにより確認したPhenomenexLunaC1822.0×50mm、3μm、溶媒:A=水/0.1トリフルオロ酢酸及びB=アセトニトリル/0.1トリフルオロ酢酸、グラジエントは5分間かけて10~80のB、流速0.6mL/分、214及び254nmでUV検出、ESI-MS。tR=3.66分。収率1g72。c4-ベンジル-7-tert-ブトキシカルボニルメチル-[1,4,7]トリアゾナン-1-イル-酢酸tert-ブチルエステルの合成硫酸Sigma、濃縮物、25mLを撹拌しながら1-ベンジル-4-7-ジトシル-1,4,7-トリアゾナン実施例17aibを参照、2.5g、4.7mmolに加え、100°Cに加熱して20時間置いた。反応混合物を室温に冷却し、ジエチルエーテルVWR、500mL中に滴下した。生成物白色沈殿をろ別し、アセトニトリル、クロロホルム及びジクロロメタンで洗浄した。溶媒を真空中で除去した。粗生成物986.3mg、4.5mmolをアセトニトリル50mL中でトリエチルアミンFluka、1.4mL、10mmolと混合した。tert-ブチルブロモ酢酸Fluka、1.47mL、10mmolをアセトニトリル25mL中に溶解し、滴下した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。pHを制御し、必要な場合はトリエチルアミンを加えた。溶媒を真空中で除去し、粗物質をジクロロメタン150mL中に溶解して、水2×25mL、0.1M塩酸1×25mL及び水1×25mLで洗浄した。有機相をろ過し、溶媒を蒸発させて除いた。粗物質をアセトニトリル/水1:1中に溶解し、分取HPLCPhenomenexLunaC1825μm250×21.2mm、溶媒:A=水/0.1トリフルオロ酢酸及びB=アセトニトリル/0.1トリフルオロ酢酸、グラジエントは60分間かけて10~80のBにより精製して凍結乾燥した。LC-MSPhenomenexLunaC1822.0×50mm、3μm、溶媒:A=水/0.1トリフルオロ酢酸及びB=アセトニトリル/0.1トリフルオロ酢酸、グラジエントは5分間かけて10~80のB、流速0.6mL/分、214及び254nmでUV検出、ESI-MS。tR=3.99分、M1447.4。生成物をNMRにより検証した。生成物をPd/C10、235mg及びメタノール25mLと混合し、アルゴン下で撹拌した。次いで吸引によりアルゴンを除去し、水素ガスの供給を開始した。撹拌して連続的に水素ガスを供給しながら、反応混合物を3時間置いた。触媒を遠心分離により除去し、溶媒を蒸発させて除いた。粗生成物を分取HPLCPhenomenexLunaC1825μm250×21.2mm、溶媒:A=水/0.1トリフルオロ酢酸及びB=アセトニトリル/0.1トリフルオロ酢酸、グラジエントは60分間かけて2~80のBを使用して精製した。LC-MSPhenomenexLunaC1822.0×50mm、3μm、溶媒:A=水/0.1トリフルオロ酢酸及びB=アセトニトリル/0.1トリフルオロ酢酸、グラジエントは5分間かけて10~80のB、流速0.6mL/分、214及び254nmでUV検出、ESI-MS。tR=2.55分、M1357.9。収率150mg。生成物をNMRにより確認した。d4,7-ビス-tert-ブトキシカルボニルメチル-[1,4,7]トリアゾナン-1-イル-酢酸[NOTAビス-tBu]の合成4-tert-ブトキシカルボニルメチル-[1,4,7]トリアゾナン-1-イル-酢酸tert-ブチルエステル実施例17aidを参照、280μmol、100mg及びブロモ酢酸Fluka、1mmol、138.21mgをメタノール1mL中に溶解した。水1mL中に溶解した炭酸カリウムを撹拌しながら加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌し、真空中で濃縮した。残渣を水2.5mL中に溶解し、塩酸1Mを使用してpHを4に調整した。粗生成物を分取HPLCPhenomenexLunaC1825μm250×21.2mm、溶媒:A=水/0.1トリフルオロ酢酸及びB=アセトニトリル/0.1トリフルオロ酢酸、グラジエントは60分間かけて10~80のBにより精製した。LC-MSPhenomenexLunaC1822.0×50mm、3μm、溶媒:A=水/0.1トリフルオロ酢酸及びB=アセトニトリル/0.1トリフルオロ酢酸、グラジエントは5分間かけて10~80のB、流速0.6mL/分、214及び254nmでUV検出、ESI-MS。tR=2.40分。収率117.7mg。生成物をNMRにより確認した。NOTAビス-tBuを分取HPLCグラジエント:40分間かけて20~40のBにより精製して、72mgの純粋なNOTAビス-tBuを産出した。精製された物質をLC-MSグラジエント:5分間かけて10~40のBにより性質決定した。tR:3.75分、見出されたm/z:416.2、予想されたMH:416.3。iiNOTAビス-tBu-マレイミドの調製N-2-アミノエチルマレイミドトリフルオロ酢酸塩23mg、0.090mmol、NOTAビス-tBu30mg、0.072mmol及びPyAOP51mg、0.10mmolをN,N-ジメチルホルムアミドDMF2mL中に溶解した。Sym.-コリジン29μL、0.40mmolを加え、反応混合物を1時間振とうした。混合物を水/0.1トリフルオロ酢酸TFA6mLで希釈し、生成物をセミ分取HPLCにより精製した。セミ分取HPLCグラジエント:60分間かけて20~50のBを用いた精製は、33mg87の純粋なNOTAビス-tBu-マレイミドを産出した。精製された物質をLC-MSグラジエント:5分間かけて10~40のBにより性質決定した。tR:4.09分、見出されたm/z:538.2、予想されたMH:538.3iiiNOTAビス-酸-マレイミドの調製NOTAビス-tBu-マレイミド33mg、61μmolは、2.5トリイソプロピルシランTIS及び2.5水のTFA10mL溶液を使用して4時間30分、処理した。TFAを真空中で蒸発させ、残渣を水/0.1TFA8mL中に溶解し、生成物をセミ分取HPLCにより精製した。セミ分取HPLCグラジエント:40分間かけて0~20のBを用いた精製は、15mg58の純粋なNOTAビス-酸-マレイミドを産出した。精製された物質をLC-MSグラジエント:5分間かけて0~30のBにより性質決定した。tR:1.34分、見出されたm/z:426.0、予想されたMH:426.2。iv4の調製組換えZ02891-Cys40mg、5.7μmolAffibodyAB、Swedenから購入及びNOTAビス-酸-マレイミド6.1mg、14μmolを水1.5mL中に溶解した。酢酸アンモニウムを加えることにより溶液をpH6に調整し、混合物を1時間振とうした。反応混合物を水/0.1TFA6mLで希釈し、生成物をセミ分取HPLCを用いて精製した。セミ分取HPLCグラジエント:40分間かけて20~30のBを用いた精製は、38mg90の純粋な化合物4を産出した。精製された4を分析LC-MSグラジエント:5分間かけて10~40のBにより分析した。tR:3.31分、見出されたm/z:1864.5、予想されたMH44:1864.5。実施例18[18F]AlF-NOTACOOH3-Z02891配列番号25aの放射性合成についてのタイムコース研究W.J.McBrideetal.Bioconj.Chem.2010,21,1331に記載されているように、フッ素-18をQMAカートリッジを用いて精製して生理食塩水で溶出した。18F水溶液25μL、12MBqを酢酸ナトリウム緩衝液1.5μL、pH4.0、0.5M中のAlCl31.667μg、12.5nmol及び化合物6380μg、50nmolの酢酸ナトリウム緩衝液25μL、pH4.0、0.5M溶液と混合した。混合物を100°Cに加熱し、一定分量をHPLCにより分析した。分析データを図29に示す。実施例18a化合物6の調製iNOTAトリス-tBuの調製aα-ブロモグルタル酸5-ベンジルエステルの合成0°Cに冷却したL-グルタミン酸-5-ベンジルエステルFluka、3.0g、0.013mol及び臭化ナトリウムFisher、4.6g、0.044molの臭化水素酸水溶液Fluka、1M、22.5mLに亜硫酸ナトリウムFluka、1.6g、0.023molを少しずつ加えた。0°Cで2時間の撹拌後、濃硫酸Merck、1.2mL、その後にジエチルエーテルEternellを加えた。水相をジエチルエーテルで3回抽出した。合わせた有機相をブラインで4回洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水して、減圧下で蒸発させた。粗生成物を順相クロマトグラフィーシリカカラム40g、溶媒:A=ヘキサン、B=酢酸エチル、グラジエント:20分間かけて10~35のB、流速40mL/分、214及び254nmでUV検出を用いて精製し、1.81gの純粋な生成物を産出した。収率46。構造をNMRにより検証した。bα-ブロモグルタル酸5-ベンジルエステル1-tert-ブチルエステルの合成BioorgMedChemLett20001021332135α-ブロモグルタル酸-5-ベンジルエステル実施例18aiaを参照、1.2g、4.0mmolのクロロホルムMerck、5mL溶液に、tert-ブチル2,2,2-トリクロロアセトイミデートFluka、1.57mL、8.52mmolのシクロヘキサンMerck、5mL溶液を5分間かけて滴下した。N,N-ジメチルアセトアミドFluka、0.88mLを、その後にホウ素トリフルオリドエチルエーテラートAldrich、80μLを触媒として加えた。反応混合物を室温で5日間撹拌した。ヘキサンを加え、有機相をブラインで3回洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水して、減圧下で蒸発させた。粗生成物を順相クロマトグラフィーシリカカラム40g、溶媒:A=ヘキサン、B=酢酸エチル、グラジエント:15分間かけて10から35のB、流速40mL/分、214及び254nmでUV検出を用いて精製し、1.13g79の純粋な生成物を産出した。構造をNMRにより検証した。c2-[1,4,7]トリアゾナン-1-イル-ペンタン二酸5-ベンジルエステル1-tert-ブチルエステルの合成α-ブロモグルタル酸-5-ベンジルエステル1-tert-ブチルエステル実施例18aiaを参照、513mg、1.44mmolのクロロホルムMerck、20mL溶液を3時間かけて1,4,7トリアザシクロノナンFluka、557mg、4.31mmolのクロロホルムMerck、20mL溶液に加えた。混合物を室温で3日間撹拌し、真空中で薄黄色の油になるまで濃縮した。粗生成物を順相クロマトグラフィーシリカカラム40g、溶媒:A=エタノール:アンモニア水95:5、B=クロロホルム:エタノール:アンモニア水385:175:20、グラジエント:6分間かけて0のB、12分間かけて100のB、流速40mL/分、214及び254nmでUV検出を用いて精製し、半純粋なsemi-pure生成物289mgを産出した。収率49。生成物をLC-MSカラムPhenomenexLunaC1822.0×50mm、3μm、溶媒:A=水/0.1トリフルオロ酢酸及びB=アセトニトリル/0.1トリフルオロ酢酸、グラジエントは5分間かけて10~50のB、流速0.6mL/分、214及び254nmでUV検出、ESI-MSにより確認した。tR=2.5分、m/zMH、406.3。d2-4,7-ビス-tert-ブトキシカルボニルメチル-[1,4,7]トリアゾナン-1-イル-ペンタン二酸5-ベンジルエステル1-tert-ブチルエステルの合成乾燥アセトニトリル40mL中の2-[1,4,7]トリアゾナン-1-イル-ペンタン二酸5-ベンジルエステル1-tert-ブチルエステル実施例18aibを参照、600mg、1.48mmolをゼロ度に冷却した後、乾燥アセトニトリル10mL中のtert-ブチルブロモ酢酸Fluka、548mg、414μL、2.81mmolを15分間かけて滴下した。反応混合物をさらに15分間撹拌した後に乾燥炭酸カリウムFluka、1.13g、814mmolを加え、反応混合物を4時間かけてゆっくりと室温に温めた。混合物をCeliteでろ過し、乾燥するまで蒸発させて、粗生成物を産出した。生成物をLC-MSカラムPhenomenexLunaC1822.0×50mm、3μm、溶媒:A=水/0.1トリフルオロ酢酸及びB=アセトニトリル/0.1トリフルオロ酢酸、グラジエントは5分間かけて10~80のB、流速0.6mL/分、214及び254nmでUV検出、ESI-MSにより確認した。tR=3.9分、m/zMH、634.4。e2-4,7-ビス-tert-ブトキシカルボニルメチル-[1,4,7]トリアゾナン-1-イル-ペンタン二酸1-tert-ブチルエステル[NOTAトリス-tBu]の合成2-4,7-ビス-tert-ブトキシカルボニルメチル-[1,4,7]トリアゾナン-1-イル-ペンタン二酸5-ベンジルエステル1-tert-ブチルエステル実施例18aicを参照、938mg、1.48mmolを2-プロパノールArcus、115mL中に溶解し、水3mL中に懸濁した10Pd/CKoch-Light、315mgを加えた。混合物は水素4気圧を使用して3時間処理し、Celiteでろ過して、乾燥するまで蒸発させた。残渣はシリカゲル上でクロマトグラフィーを行いシリカカラム4g、溶媒:2-プロパノール:アンモニア95:5、流速40mL/分、214及び254nmでUV検出、半純粋な生成物225mgを産出した。生成物をLCMSPhenomenexLunaC182、2.0x50mm、3μm、溶媒:A=水/0.1トリフルオロ酢酸及びB=アセトニトリル/0.1トリフルオロ酢酸、グラジエントは5分間かけて10~80のB、流速0.6mL/分、214及び254nmでUV検出、ESI-MSにより確認した。tR2.4分、MH544.5。精製されたNOTAトリス-tBuをLC-MSグラジエント:5分間かけて10~80のBにより性質決定した。tR:2.4分、見出されたm/z:544.5、予想されたMH:544.4。iiNOTAトリス-tBu-NH-CH2CH2-NH2の調製NMP1mL中に溶解したPyAOP96mg、0.18mmolを、NOTAトリス-tBu100mg、0.18mmol及びエチレンジアミン1.2mL、18mmolのNMP1mL溶液に加えた。反応混合物を1時間振とうし、次いで2回目の一定分量のPyAOP38mg、0.073mmolを加えた。振とうを30分間続けた。20ACN/水5mLを加え、生成物をセミ分取HPLCにより精製した。セミ分取HPLCグラジエント:40分間かけて20~50のBを用いた精製は、123mg98の純粋なNOTAトリス-tBu-NH-CH2CH2-NH2を産出した。精製された物質をLC-MSグラジエント:5分間かけて20~50のBにより性質決定した。tR:1.95分、見出されたm/z:586.4、予想されたMH:586.4。iiiNOTAトリス-tBu-NH-CH2CH2-NH-マレイミドNOTAトリス-tBu-NH-CH2CH2-NH2123mg、0.176mmol、3-マレイミド-プロピオン酸NHSエステル70mg、0.26mmol及びsym.-コリジン346μL、2.60mmolをNMP2mL中に溶解した。反応混合物を6時間撹拌した。水6mLを加え、生成物をセミ分取HPLCにより精製した。セミ分取HPLCグラジエント:40分間かけて20~50のBを用いた精製は、115mg87の純粋なNOTAトリス-tBu-NH-CH2CH2-NH-マレイミドを産出した。精製された物質をLC-MSグラジエント:5分間かけて10~60のBにより性質決定した。tR:3.36分、見出されたm/z:737.4、予想されたMH:737.4。ivNOTAトリス-酸-NH-CH2CH2-NH-マレイミドの調製NOTAトリス-tBu-NH-CH2CH2-NH-マレイミド115mg、0.150mmolは、2.5TIS及び2.5水のTFA10mL溶液を使用して4時間処理した。溶媒を真空中で蒸発させ、残渣を水8mL中に再溶解して、生成物をセミ分取HPLCにより精製した。セミ分取HPLCグラジエント:40分間かけて0~20のBを用いた精製は、80mg90の純粋なNOTAトリス-酸-NH-CH2CH2-NH-マレイミドを産出した。精製された物質をLC-MSグラジエント:5分間かけて0~30のBにより性質決定した。tR:2.74分、見出されたm/z:569.5、予想されたMH:569.2。v化合物6の調製a合成Z02891-Cysの調製配列:EAKYAKEMRNAYWEIALLPNLTNQQKRAFIRKLYDDPSQSSELLSEAKKLNDSQAPKVDCを、0.05mmolNovaPEGRinkAmide樹脂を使用して開始するFmoc化学作用を用いたCEMLibertyマイクロ波ペプチド合成機上で組み立てた。0.45mmolHBTU/0.45mmolHOAt/1.0mmolDIPEAをインサイチュ活性化のために用いる各カップリング段階75°Cで5分間において、0.5mmolのアミノ酸をアプライした。DMF中の5ピペラジンによりFmocを除去した。両Argについてダブルカップリングを適用した。Asp-Ser及びLeu-Serのシュードプロリンジペプチド0.5mmolを配列内に組み込んだ。同時に起こる側鎖保護基の除去及び樹脂からのペプチドの切断は、2.5TIS、2.5EDT、2.5EMS及び2.5水を含有するTFA40mL中で1時間行った。ろ過により樹脂を除去し、TFAで洗浄し、合わせたろ液を真空中で蒸発させた。ジエチルエーテルを残渣に加え、形成された沈殿をジエチルエーテルで洗浄して乾燥させた。切断手順をもう1度繰り返した。乾燥沈殿を20ACN/水中に溶解し、残存するTrp保護基を除去するため、一晩置いた。溶液を凍結乾燥して、148mg42の粗Z02891-Cysを産出した。148mgの粗Z02891-Cysをセミ分取HPLC4ラン、グラジエント:40分間かけて25~30のBにより精製して、33mg9の純粋なZ02891-Cysを産出した。精製された物質をLC-MSグラジエント:5分間かけて10~40のBにより性質決定した。tR:3.40分、見出されたm/z:1758.3、予想されたMH44:1758.4。合成Z02891-Cys13.7mg、1.95μmol及びNOTAトリス-酸-NH-CH2CH2-NH-マレイミド11mg、19.3μmolを水1mL中に溶解した。酢酸アンモニウムを加えることにより溶液をpH6に調整し、混合物を3時間振とうした。反応混合物を水/0.1TFA6.5mLで希釈し、生成物をセミ分取HPLCを用いて精製した。セミ分取HPLCグラジエント:40分間かけて15~35のBを用いた精製は、8.4mg57の純粋な6を産出した。化合物6を分析LC-MSグラジエント:5分間かけて10~40のBにより分析した。tR:3.31分、見出されたm/z:1900.7、予想されたMH44:1900.2。実施例19[18F]AlF-NOTACOOH2-Z02891配列番号25の放射化学的収率に対するAlCl3/ペプチド比の影響4149μg、20nmolの酢酸ナトリウム緩衝液10μL、pH4.0、0.5M溶液3つをコニカルポリプロピレン遠心分離バイアル1.5mL中でAlCl3それぞれ0.33μg、2.49nmol;0.66μg、4.98nmol;及び1.33μg、9.96nmolの酢酸ナトリウム緩衝液1μL、pH4.0、0.5M溶液と混合した。これらのバイアルに少量の[18F]フッ化物10μLを添加した。バイアルを100°Cで15分間加熱し、続いてHPLCにより分析した。導入収率を表12に示す。実施例20[18F]AlF-NOTACOOH2-Z02891配列番号25の放射化学的収率に対する試薬希釈の影響4373μg、50nmolの酢酸ナトリウム緩衝液25μL、pH4.0、0.5M溶液をコニカルポリプロピレン遠心分離バイアル1.5mL中でAlCl31.66μg、12.5nmolの酢酸ナトリウム緩衝液1.5μL、pH4.0、0.5M溶液と混合した。少量の[18F]フッ化物10μL、80MBqを加えた。この混合物を酢酸ナトリウム緩衝液1.5μL、pH4.0、0.5Mで2段階希釈したもの50及び25v/vを調製した。3つのバイアルを次いで100°Cで15分間加熱し、続いてHPLCにより分析した。データを表13に示す。実施例21[18F]AlF-NOTACOOH2-Z02891配列番号25の放射化学的収率に対するペプチド/AlCl3濃度の影響[18F]フッ化物25μL、23~25MBq、AlCl31.5μLの酢酸ナトリウム緩衝液、pH4.0、0.5M中にペプチド4の1/4当量及び酢酸ナトリウム緩衝液25μL、pH4.0、0.5M中の450、100、150nmolを含有する3つのバイアルを100°Cで30分間加熱した。図30は15及び30分後の導入データを示す。実施例22[18F]AlF-NOTACOOH2-Z02891配列番号25の放射化学的収率に対するマイクロ波加熱の影響[18F]フッ化物25μL、29MBq、1.5μLの酢酸ナトリウム緩衝液、pH4.0、0.5M中のAlCl31.66μg、12.5nmol、及び酢酸ナトリウム緩衝液25μL、pH4.0、0.5M中の4373μg、50nmolを含有するWheatonバイアル3mLを、マイクロ波デバイスResonanceInstrumentsModel521、設定温度80°C、50Wを用いて5、10及び15秒間加熱した。表14はこれらの時点の後のHPLC分析の概要を示す。実施例23[18F]AlF-NOTACOOH3-Z02891配列番号25aの調製[18F]フッ化物25μL、29MBq、1.5μLの酢酸ナトリウム緩衝液、pH4.0、0.5M中のAlCl31.66μg、12.5nmol、及び酢酸ナトリウム緩衝液25μL、pH4.0、0.5M中の6380μg、50nmolを含有するPP遠心分離バイアル1.5mLを100°Cで15分間加熱した。5aの分析的RCYは15~20であった。図31は反応混合物のHPLCプロファイルを示す。実施例24[18F]SiFA-Z02891配列番号27の調製ペプチド前駆体8750μg、100nmolの酢酸ナトリウム緩衝液50μL、pH4.0、0.5M溶液を、ポリプロピレン遠心分離バイアル1.5mL中の[18F]フッ化物の水50μL溶液に加え、95°Cで15分間加熱した。生理食塩水100μL、0.9w/vを加えた後、混合物を生理食塩水で調整したNAP5カラムGEHealthcareを用いて精製した。生成物7は、26分後に18の減衰未補正の放射化学的収率及び87の放射化学的純度を有するものとして得られた。図32は最終生成物のHPLC分析を示す。実施例24a化合物8の調製iSiFaの合成ヘキサン中のn-ブチルリチウム2.5M、3.2mL、7.9mmolを、冷却-78°Cした2-4-ブロモフェニル-1,3-ジオキソラン1.8g、7.9mmolの乾燥テトラヒドロフランTHF6mL溶液にアルゴン下で滴下した。-78°Cで2時間撹拌後、結果として得られた黄色の懸濁液をシリンジ中に吸い上げ、冷却-70°Cしたジ-tert-ブチルジフルオロシラン1.5mL、8.33mmolのTHF15mL溶液に20分間かけて滴下した。反応混合物を-70°Cで1時間撹拌し、次いで周囲温度まで温めた。2時間30分後に試料3mLを反応混合物から取り出し、水/0.1TFAを使用してクエンチして、ジオキソラン保護基の除去に至った。脱保護された生成物を分取HPLCにより精製した。分取HPLCグラジエント:60分間かけて40~95のBを用いた精製は、純粋なSiFAを産出した。精製された物質をLC-MSグラジエント:5分間かけて50~95のBにより性質決定した。tR:2.05分、見出されたm/z:検出されず、予想されたMH:267.2。iiSiFA-アミノオキシアセチル-マレイミドの調製Eei-アミノオキシアセチル-マレイミド20mg、71μmolを水/ACN/0.1TFA中のSiFAに加えたHPLC分取画分から。1MHCl1mLを加えて反応混合物を一晩撹拌した。生成物をセミ分取HPLCにより精製した。セミ分取HPLCグラジエント:40分間かけて40~80のBを用いた精製は、15mg45の純粋なSiFA-アミノオキシアセチル-マレイミドを産出した。精製された物質をLC-MSグラジエント:5分間かけて40~70のBにより性質決定した。tR:3.00分、見出されたm/z:462.1、予想されたMH:462.2。iii化合物8の調製組換えZ02891-CysAffibody24mg、3.4μmol及びSiFA-アミノオキシアセチル-マレイミド4.7mg、10μmolを50ACN/水1mL中に溶解した。酢酸アンモニウムを加えることにより溶液をpH6に調整し、混合物を1時間振とうした。反応混合物を10ACN/水/0.1TFA8mLで希釈し、生成物をセミ分取HPLCを用いて精製した。セミ分取HPLCグラジエント:40分間かけて20~40のBを用いた精製は、26mg100の純粋なZ02891-Cys-マレイミド-アミノオキシアセチル-SiFA8を産出した。精製されたZ02891-Cys-マレイミド-アミノオキシアセチル-SiFA8を分析LC-MSグラジエント:5分間かけて10~40のBにより分析した。tR:3.87分、見出されたm/z:1873.6、予想されたMH44:1873.5。実施例25腫瘍モデルの検証腫瘍増殖及びHER2発現についてA431及びNCI-N87異種移植モデルを検証した。動物モデルの立ち上げには動物あたりで100μlの50PBS/50Matrigel中の2×106個のNCI-N87細胞又は107個のA431細胞を右脇腹に皮下接種することが必要で、その後に30日の接種期間があった。これらの腫瘍におけるHER2発現を、免疫組織化学により、FDAがバリデートしたHercepTestDako、K5204を用いて査定した。図33は、推奨される強度スケール0→3を使用するとNCI-N87腫瘍は強く染色されるが3、A431細胞はかなり弱い染色強度1を示すことを描写する。これらのデータは、腫瘍モデルのHER2発現は顕著に異なり、それ故にHER2を標的とするAffibody分子の取込みを比較するのに適していることを示唆する。IHCスコアが十分に離れていたことに基づいて、さらなる定量的評価は必要ないと考えられた。実施例26正常マウスにおける化合物2、5及び7の生体分布生理食塩水で処方されたトレーサー化合物2、5及び7はナイーブCD1マウスを用いて評価されている。活性3MBqの静脈内注射2分の時点で2.5MBqの後、動物を注入後2、90、120及び180分で屠殺し、放射活性の保持を主要な器官において評価した。生体分布測定において、5は顕著な腎臓での保持注入後90分で70.3IDを示したが、2及び7では観察されなかった注入後90分でそれぞれ4.8ID及び10ID。7の脱フッ素が観察された注入後90分の骨への取込みが5.3ID/g。図34では対応する[111In]DOTA-Z02891配列番号29化合物と生体分布データを比較する。実施例27化合物2、5及び7の腫瘍への取込み高レベル及び低レベルのHER2発現腫瘍細胞それぞれNC87及びA431を有する腫瘍マウスモデルにおいて、化合物2、5及び7の取込みの差が予想通り観察された。図35、表15及び16では、対応する[111In]DOTA-Z02891配列番号29化合物と生体分布データを比較する。実施例28二重腫瘍異種移植モデルにおける2のイメージングA431及びNCI-N87を2つの脇腹の各々に移植することにより、二重腫瘍異種移植マウスが生み出された。これらのマウスは2の生体分布を評価するのに用いられ、低及び高HER2発現腫瘍の両方における取込みを同一の動物で評価することを可能にした。時点は注入後30及び60分を包含した。図36は2の性能が単一腫瘍動物研究において観察されたものに匹敵するものであったことを示し、A431腫瘍とNCI-N87腫瘍との間でバインダー取込みが、注入後30分の早い時期から始まって良好に分離している。バックグラウンドの組織クリアランスに関しては主要な組織比について表7を参照、注入後60分の血液レベルが顕著に低下しておりNCI-N87の腫瘍:血液比4.52をもたらしたが、30分においては、部分的な血液クリアランスにより2.39の比を生じ、これは肯定的な腫瘍:肝臓比である1.39を伴っている。これらの性質は、2の薬物動態が適したイメージングウィンドウ内でヒト対象をイメージングするのに十分なことを示唆する。実施例29NCI-N87腫瘍マウスにおける化合物2のアドバックadd-back研究バインダーの効力における過剰量のコールドリガンドの効果を査定するためにNCI-N87腫瘍モデルにおいて実施されるアドバック研究のため、以下の4つの異なる調製物を注入後90分で査定した。1.標準的な化合物2調製物2.標準的な調製物マウスあたり100μg/kgのコールド前駆体3.標準的な調製物マウスあたり500μg/kgのコールド前駆体4.標準的な調製物マウスあたり1000μg/kgのコールド前駆体標準的な調製物におけるコールド前駆体の濃度はマウスあたり120μg/kgであって、それ故にこの研究では、マウスにおいて元々用いられた濃度の10倍の濃度でコールド前駆体の効果が試験された。図37は、腫瘍取込みに対する効果は顕著ではなく、他の組織からのクリアランスも顕著には影響されなかったことを示す。実施例30二重脇腹A431/NCI-N87腫瘍マウスにおける化合物2のインビボイメージング研究実施例28に記載した二重腫瘍マウスモデルを予備的なイメージング研究を実施するのに用いた。動物あたり10MBqの2を静脈内注射して、マウスを注入後120分で開始して30分間イメージングした。図38のイメージは、生体分布研究を通じて先に実証されたようにクリアランスが腎臓及び膀胱を経由したことを示す。横断イメージングは、2の腫瘍における取込みがNCI-N87腫瘍ではA431腫瘍よりかなり高いシグナル強度を示しており、実施例28の二重腫瘍生体分布研究と一致することを示す。現行の2のイメージング研究とAffibody登録商標9のイメージング研究との比較図38は、高及び低HER2発現腫瘍の間の取込みの差が同様であることを示す。しかしながら、2は腎臓からのバックグラウンドがかなり改善されており、これは生体分布においてまた見られる最小限の腎臓保持のためである。上で論じられた、及び/又は引用された全ての特許、雑誌論文、刊行物及び他の資料は参照により本明細書に組み込まれる。"