"細胞表面上でCD44の抗原性部分を発現するヒト腫瘍細胞の細胞毒性を媒介するためのプロセスであって、単離モノクローン抗体またはその抗原結合フラグメントに前記腫瘍細胞を接触させることを含み、前記抗体またはその抗原結合フラグメントが前記発現されたCD44の抗原性部分と結合する単離モノクローン抗体またはその抗原結合フラグメントであり、前記抗原性部分がPTA-4621としてATCCに寄託されたクローンによってコードされるモノクローン抗体の同定特性を持つ抗体に結合するという性質を持つことで、細胞毒性が前記結合の結果として生ずる、ヒト腫瘍細胞の細胞毒性を媒介するためのプロセス。前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメントがヒト化されている、請求項1にもとづくプロセス。前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメントが、限定されるものではないが、細胞毒性部分、酵素、放射活性化合物、および造血細胞からなる群から選択される構成要素と複合体を形成する、請求項1にもとづくプロセス。前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメントがキメラ化されている、請求項1にもとづくプロセス。前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメントがマウスのものである、請求項1にもとづくプロセス。前記ヒト腫瘍組織試料が、大腸、卵巣、肺、および乳房組織から選択される組織で生じる腫瘍から得られる、請求項1にもとづくプロセス。ウエスタンブロットによる結合タンパク質の同定抗体H460-16-2によって認識される抗原を同定するために、この抗原を発現する細胞膜をゲル電気泳動にかけ、さらに膜へ移した。ウエスタンブロットは、この抗体によって検出されるタンパク質を決定するために用いた。1.膜調製先行研究は、乳癌培養細胞株MDA-MB-231MB-231およびMDA-MB-468MB-468に対するH460-16-2のFACSによる結合を示した。したがって、これら2種類の培養細胞株から得た膜試料を用いて抗原の同定をおこなった。全細胞膜は、MB-231またはMB-468乳癌細胞の密集培養から調製した。培地をフラスコから取り除き、細胞をPBSで3回洗浄した。最終洗浄後、解離緩衝液ギブコGibco-BRL、グランドアイランド、NY、37°C、5分間によって細胞を解離させた。細胞を回収し、1,200rpmで4°C、10分間遠心した。遠心後、細胞ペレットを、1mLの低張緩衝液10μg/mLロイペプチン、10μg/mLアプロトニン、および25μg/mL4-2-アミノエチルベンゼンスルホニルフルオリドを含有に再懸濁した。次に、急速凍結および解凍を5回繰り返して細胞の溶解をおこなった。細胞溶解物を9,500rpmで4°C、10分間遠心し、核粒子を取り除いた。上清を回収し、続いて75,000xgで4°C、57分間遠心した。管から上清を注意深く取り除き、ペレットを0.5ないし1mLの高張溶解緩衝液1パーセントのトリトンX100を含有に再懸濁した。次に、タンパク質含有量について膜をアッセイし、-80°Cで保存した。2.1次元SDS-PAGE膜タンパク質の分離を、1次元SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動でおこなった。20μgの膜タンパク質を12パーセントSDS-PAGEゲルのレーン上に載せた。前染色分子量マーカーバイオラドBiorad、ミシサーガ、ONを参照レーンに加えた。ジチオスレイトルDTTの非存在下、非還元条件下で電気泳動することで、試料の分離をおこなった。電気泳動は、100Vで10分間、続いて150Vで65分間おこなった。40Vで16時間にわたりエレクトロブロッティングをおこなうことで、タンパク質をゲルからPVDFミリポアMillipore、ビルリカ、MA膜に移した。ゲルからその膜への前染色マーカーの完全移動を示すことで、定量的な移動を評価した。移動後、5パーセントスキムミルク粉末含有トリスTris緩衝食塩水0.5パーセントのツウィーンTween含むTBSTで2時間にわたり、膜のブロッキングをおこなった。次に膜を、3パーセントスキムミルク粉末含有TBSTに希釈した2~2.5μg/mLのH460-16-2で2時間インキュベートした。TBSTで3回洗浄した後、ジャクソンイムノロジカルズJacksonImmunologicalsウエストグローブ、PAから入手した西洋わさびペルオキシダーゼHRPと複合化したヤギ抗マウスIgGFcで1時間インキュベートした。このインキュベーションの後にTBSTで3回洗浄し、続いてHRP基質TMBベクターラボラトリーズVectorLaboratories、バーリントン、ONから入手した基質キットによるインキュベーションをおこなった。図1は、記載どおりのウエスタンブロットの結果を示す。H460-16-2は明らかに、MB-468膜タンパク質の2分子量MW領域に結合するレーン2。分子量標準と比較することで、抗体がMW80~90kDおよびMW120~150kDのタンパク質に結合する。抗体H460-16-2によって認識されたエピトープは、立体配座エピトープであると考えられる。なぜなら、この抗体は、DTT存在下、還元条件下でゲルから移されたスポットに結合することができなかったからであるレーン1。図2は、H460-16-2とMB-468レーン1およびMB-231レーン2細胞由来の膜との結合を比較する。MB-468膜では、H468-16-2が80~90kDおよび120~150kD両方のタンパク質と等しい強度で結合する。MB-231膜では、主結合タンパク質は80~90kDタンパク質であり、120~150kDの範囲内で同定された結合タンパク質の強度が劣る。3.2次元SDS-PAGE結合実体の分解能をより良くし、かつさらに詳しくタンパク質を特徴づけるために、2次元電気泳動を実施した。上記のとおりに調製した全膜タンパク質70~200μgを、プラスワン2-DクリーンアップキットアマシャムAmersham:ベードウルフェ、QCを用いて沈降させた後、pH範囲が3~10の両性電解質含有再水和緩衝液で再懸濁させた。試料を遠心して粒状物質を取り除き、続いて再水和溶液IPGストライプアマシャムAmersham:ベードウルフェ、QC上に載せた。以下のプロトコル、すなわちすなわち再水和16時間;500V、250V時間、1,000V、50V時間;5,000V、7,500V時間を用いて、タンパク質のフォーカシングをおこなった。次に、ストライプをストライプホルダーから取り出し、SDS-PAGE平衡緩衝液でインキュベートした。15分後、ストライプを8パーセントゲル上に置き、アガロース溶液で密封した。前染色MWマーカーをストライプの脇に載せた。電気泳動を100Vで10分間、続いて150Vで65分間おこなった。複数のゲルのうちの1枚を10パーセントメタノール/7パーセント酢酸で30分間にわたり固定した後、蛍光染料シプロルビーSYPRORuby登録商標モレキュラープローブスMolecularProbes、ユージン、ORで染色した。タンパク質スポットは、UV光下で可視化した。第2および第3のゲルについては、40Vで16時間にわたりエレクトロブロッティングをおこなうことで、それらのゲルからタンパク質をPVDFミリポア膜に移した。定量的移動の評価は、ゲルから膜への前染色マーカーの完全移動を測定することでおこなった。移動後、5パーセントスキムミルク粉末含有トリスTris緩衝食塩水0.5パーセントのツウィーンTween含むTBSTで2時間にわたり、膜のブロッキングをおこなった。次に、膜の1つを3パーセントスキムミルク粉末含有TBSTに希釈した2~2.5μg/mLのH460-16-2で2時間にわたりインキュベートした。同様の膜を同様の濃度のアイソタイプ対照マウス抗トリニトロフェノール、IgG1、κ;クローン107.3BDバイオサイエンスBDBiosciences、オークビル、ONでインキュベートした。TBSTで3回洗浄した後、ジャクソンイムノロジカルズJacksonImmunologicalsウエストグローブ、PAから入手した西洋わさびペルオキシダーゼHRPと複合化したヤギ抗マウスIgGFcで1時間インキュベートした。このインキュベーションの後にTBSTで3回洗浄し、続いてHRP基質TMBベクターラボラトリーズVectorLaboratories、バーリントン、ONから入手した基質キットによるインキュベーションをおこなった。図3aは、H460-16-2でインキュベートしたMB-468膜から得たウエスタンブロットを示す。2つの異なる結合スポットが観察され、1次元電気泳動で得られたものと分子量が一致する。1つは、MW標準に基づいた分子量が約80~90kDであり、pI3~4と推定されるゲルの酸性部分に観察された。第2のスポットは、MW標準に基づいた分子量約120~150kDにあり、80~90kDタンパク質よりも塩基性側のpIを有している。図3bは、アイソタイプ対照抗体とインキュベートした膜から得たウエスタンブロットを示す。このブロットでは何らスポットが見えなかったことから、H460-16-2の結合が人食い的結合ではなかったことを示している。図3cは、MB-468膜タンパク質のシプロルビーSYPRORuby登録商標染色2Dゲルを示す。注目すべきことは、同様のウエスタンブロットをMB-231膜で流した場合、80~90kDスポットのみが観察されることである図4。H460-16-2によって結合した抗体のグリコシル化の決定抗体H460-16-2によって認識された抗原が糖タンパク質であるかどうかを決定するために、製造元のプロトコルデグリコプロDeglycoPro脱グリコシル化キット;プロザイムProzyme、サンリアンドロ、CAに従って、室温または37°Cで24時間にわたり、MB-231膜をPNGアーゼF、エンド-O-グリコシダーゼ、およびシアリダーゼAとインキュベートした。記載どおりに1-Dポリアクリルアミドゲル電気泳動によって膜を分離した後、記載どおりにウエスタンブロットをH460-16-2で実施した。ウエスタンブロットの結果を図5に示す。グリコシダーゼ処理していないMB-468膜では、H460-16-2は予測85~95kDバンドを認識した図5、パネルA、レーン2。25°Cでグリコシダーゼ処理された膜では、このバンドが明確に低分子側に移動しているレーン4。37°Cでグリコシダーゼ処理された膜では、H460-16-2の結合が取り除かれているレーン3。脱グリコシル化の完全性を決定するために、同様のブロットを、高マンノース結合ガランサスニバリスgalanthusnivalis凝集素GNAを用いて精査した。図5で観察された結果では、パネルBは、25°Cレーン4では脱グリコシル化が不完全であり、また37°Cレーン3では本質的に完了していることを示す。したがって、完全脱グリコシル化の条件下で、H460-16-2はそれの抗原に結合することは不可能である。これらを合わせると、これらの結果は80~90kDバンドが糖タンパク質であることを示唆している。また、これらの結果は、H460-16-2によって認識されたエピトープが炭水化物依存型である証拠を示している。H460-16-2によって結合した抗原の同定1.免疫沈降1mLのプロテインGダイナビーズDynabeadsダイナルDYNALを0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液pH6.0で3回洗浄し、洗浄済みのビーズに対して2,500μgのH460-16-2を加えて、全量を500μlにした。この混合物を1時間にわたってやさしく混ぜ合わせながらインキュベートした。未結合抗体を除去し、H460-16-2被覆ビーズを、0.1パーセントのツウィーンTween20を含む2.5mL容量の0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液pH7.4で3回洗浄した。H460-16-2被覆ビーズを5mLの0.2MトリエタノールアミンpH8.2で2回洗浄した後、5mLを加えた。20mMジメチルピメリミデートを含む5mLの0.2MトリエタノールアミンpH8.2の存在下、30分間にわたりやさしく混ぜ合わせることで、H460-16-2をビーズに化学的に架橋させた。反応停止は、5mLの50mMトリスpH7.5を添加することによっておこなった。15分間インキュベートした後、H460-16-2架橋ビーズを0.1パーセントのツウィーンTween20を含有するPBSで3回洗浄した。H460-16-2架橋ビーズを0.1Mクエン酸pH3で3分間インキュベートして前溶離させた後、0.1パーセントツウィーンTween20含有の0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液pH7.4で3回洗浄した。MB-231細胞から得た3mgの全膜タンパク質を、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液pH7.40.1パーセントツウィーンTween20、5パーセントグルコース、5パーセントマンノース、5パーセントガラクトース、およびプロテアーゼ阻害剤中で、H460-16-2化学的架橋ビーズとともに、4°Cで4時間にわたりインキュベートした。インキュベーション後、免疫沈降物を、150mMNaClおよび0.1パーセントツウィーンTween20を含むPBSで3回洗浄した。H460-16-2架橋ビーズを0.1Mクエン酸pH3で4分間インキュベートすることで、ビーズからタンパク質を溶離させた。溶離タンパク質を-80°Cで保存した。3mgのタンパク質からの免疫沈降タンパク質を8パーセント非還元SDS-PAGEゲルの1つのレーンに載せた。前染色分子量マーカーバイオラドBiorad、ミシサーガ、ONの試料を参照レーンに加えた。試料を、100Vで10分間、続いて150Vで60分間にわたり電気泳動をおこなうことで分離した。タンパク質を、シプロルビーSYPRORuby登録商標で染色した。平行のウエスタンブロットでは、記載どおりにMB-231膜タンパク質100μgから免疫沈降させたタンパク質を電気泳動で分離した。40Vで16時間にわたり電気泳動をおこなうことで、タンパク質をゲルからPVDFミリポア、ビルリカ、MA膜に移した。定量的移動の評価は、ゲルから膜への前染色マーカーの完全移動を測定することでおこなった。移動後、5パーセントスキムミルク粉末含有トリスTris緩衝食塩水0.5パーセントのツウィーンTween含むTBSTで2時間にわたり、膜のブロッキングをおこなった。次に、3パーセントスキムミルク粉末含有TBSTに希釈した5μg/mLのH460-16-2を用いて、膜を調べた。TBSTで3回洗浄した後、膜を、適当な二次抗体、すなわちジャクソンイムノロジカルズJacksonImmunologicalsウエストグローブ、PAから入手した西洋わさびペルオキシダーゼHRPと複合化したヤギ抗マウスIgGFcで、1時間インキュベートした。このインキュベーションの後にTBSTで3回洗浄し、続いてHRP基質TMBベクターラボラトリーズVectorLaboratories、バーリントン、ONから入手した基質キットによるインキュベーションをおこなった。図6は、H460-16-2によって免疫沈降したタンパク質から得たゲルおよびブロットを示す。ゲルパネルA上では、免疫沈降タンパク質を含むレーンに80~90kD領域のバンドがあるレーン2、矢印参照。高分子量のバンドは、無傷の抗体から構成される。この試料にはほかのタンパク質は存在しない。対応するウエスタンブロットパネルBでは、H460-16-2は免疫沈降タンパク質レーン2と強く反応し、全膜レーン1でみられたものと類似の結合プロフィールを伴う。2.質量分析H460-16-2によって免疫沈降した80~90kDタンパク質に対応するゲルの領域図6、パネルA、レーン2を、滅菌したピペットのチップを用いて切り出した。次に、質量分析によるタンパク質の同定に、このゲルプラグを用いた。この試料を、トリプシンプロゲストProGestを用いたロボット式のインゲル消化にかけて、結果として生じた消化上清の一部をMALDI/MS分析に用いた。スポッティングは、ジップチップZipTipsを用いて無人操作ProMSでおこなった。すなわち、60パーセントアセトニトリル、0.2パーセントTFAに調製したマトリックスα-シアノ4-ヒドロキシ桂皮酸でC18物質からペプチドを溶離させた。この試料の分析を、200nL/分の流速で75μmC18カラムを用いてマイクロマスMicromassQ-Tof2上でナノLC/MS/MSによっておこなった。マスコットMASCOTのローカルコピーを用いて、MS/MSデータを調べた。H460-16-2免疫沈降物質のLC/MS/MS分析によって同定されたタンパク質を表1に示す。割り当てられたスコアは、一致したペプチドの数と同一性のレベルとに基づいた複合スコアである。試料中に存在する唯一のタンパク質がヒトCD44、すなわちリンパ球および複数の種類の癌細胞の細胞表面上にある80kD糖タンパク質と一致した。3.確認推定上の抗原の確認は、既知の抗CD44モノクローン抗体がH460-16-2によって免疫沈降したタンパク質と反応するかどうかを決定することで、おこなった。全MB-231膜タンパク質およびH460-16-2免疫沈降タンパク質を1次元SDS-PAGEで分離した。電気泳動およびウエスタンブロットは、上記のとおりに実施した。膜を、3パーセントスキムミルク粉末含有のTBSTで希釈した5~10μg/mLのH460-16-2、抗CD44クローンL178、BDバイオサイエンスBDBiosciences、オークビル、ONまたは抗HSP90負の対照、クローン16F1ストレスゲンStressgen、ビクトリア、BCと2時間にわたってインキュベートした。図7は、記載したとおりのウエスタンブロットの結果を示す。パネルAは、H460-16-2と全膜タンパク質レーン1および免疫沈降タンパク質レーン2との結合を示す。主結合タンパク質は、80~90kD領域にあるが、120~150kD領域にあるバンドもまた全膜タンパク質に見られる。L178を用いて平行ブロットの精査をおこなった場合パネルB、類似のパターンが見られた。L178は、H460-16-2によって免疫沈降したタンパク質に強く結合した。全膜タンパク質に対するH460-16-2およびL178の結合パターンはかなり類似しているパネルAおよびB、レーン1、負の対照抗HSP90によって精査した平行ブロットパネルCは、この抗体が免疫沈降物質には結合しなかったが、全膜試料内の異なる90kDタンパク質には結合したことを示した。この結果は、HSP90が偏在かつ粘着性細胞シャペロンタンパク質であることから、免疫沈降タンパク質に対する抗CD44の結合が特異的であり、汚染タンパク質の存在によるものではないこと確証する。図8は、H460-16-2の特異性を既知抗CD44抗体のものと比較した実験の結果を示す。MDA-MB-231膜を電気泳動で分離し、記載どおりにPVDF膜に移した。膜をH460-16-2パネルA、抗CD44クローンL178、BDバイオサイエンスBDBiosciences、パネルB、抗CD44var6クローンVFF-7、ベンデルメドシステムズBenderMedsystemsサンブルノ、CA、パネルC、および抗CD44var10クローンVFF-14、ベンデルメドシステムズBenderMedsystems、パネルDを用いて精査した。H460-16-2およびL178は、80~90kDおよび120~150kDタンパク質と反応し、ウエスタンブロットで同一の結合パターンを有する。対照的に、CD44変異体6および10に特異的な抗体は、H460-16-2および互いと、異なる結合を示す。両方の変異抗体は、より幅広い範囲のタンパク質と結合し、ゲルの80kD領域との強い結合は示さない。したがって、H460-16-2が変異体6または変異体10に向けられることはありそうもない。質量分析による同定は、既知の抗体を用いた確認と同様に、H460-16-2に対する抗原がCD44の一形態であることを示している。このことはまた、CD44が重量あたり約50パーセントのN結合糖を有すると思われることから、実施例2の脱グリコシル化実験と整合している。これらの実験もまた、H460-16-2がCD44の炭水化物依存型エピトープに結合することを示す。ブダペスト条約にもとづいて、米国20110-2209バージニア州VAマナサス、大学通り10801の米国菌培養収集所AmericanTypeCultureCollectionに2002年9月4日、寄託番号PTA-4621としてハイブリドーマ培養細胞株H460-16-2を寄託した。37CFR1.808によれば、寄託者は、寄託材料の公共性に対する有効性に課せられたすべての制限が特許の付与によって即座に取り除かれることを確証する。抗体生産:H460-16-2モノクローン抗体は、回収および再播種を2回/週おこなうとともにプロテインGセファロース4ファストフローアマシャムバイオサイエンスAmershamBiosciences、ベードウルフェ、QCによる標準的抗体精製手順を用いて、CL-1000フラスコBDバイオサイエンスBDBiosciences、オークビル、ONでハイブリドーマを培養することで産生された産生された。ヒト、ヒト化、キメラ化、またはマウス抗体であるモノクローン抗体を用いることは、この発明の範囲内である。H460-16-2を、細胞毒性アッセイで、いくつかの正の対照抗FasEOS9.1、IgM、カッパ、10μg/mL、イーバイオサイエンスeBioscience、サンディエゴ、CA、抗Her2/neuIgG1、カッパ、10μg/mL、インテルメディコInterMedico、マークハム、ON、抗EGFRC225、IgG1、カッパ、5μg/mL、セダルレーンCerdarlane、ホーンビー、ON、シクロヘキシミド100μM、シグマSigma、オークビル、ON、NaN30.1パーセント、シグマSigma、オークビル、ON、および負の対照107.3抗TNP、IgG1、カッパ、20μg/mL、BDバイオサイエンスBDBiosciences、オークビル、ON、G155-178抗TNP、IgG2a、カッパ、20μg/mL、BDバイオサイエンスBDBiosciences、オークビル、ON、MPC-11抗原特異性未知、IgG2b、カッパ、20μg/mL、BDバイオサイエンスBDBiosciences、オークビル、ON、J606抗フルクトサン、IgG3、カッパ、20μg/mL、BDバイオサイエンスBDBiosciences、オークビル、ON、IgG緩衝液2パーセントと比較した表3。乳癌MB-231、MB-468、黒色種A2058、A375、大腸癌HIT-29、肺癌NCI-H460、A549、卵巣腫瘍OVCAR-3、前立腺癌PC-3、および非癌CCD-27sk、Hs578.Bst、Hs888.Lu培養細胞株を試験したすべてをATCC、マナサス、VAから入手。生/死細胞毒性アッセイは、モレキュラープローブスMolecularProbesユージーン、ORから得た。このアッセイは、以下に概説する変更を加えて製造元の指示にしたがっておこなった。アッセイをおこなう前に、所定の適当な密度で細胞をプレーティングした。2日後、100μLの精製抗体を培地に希釈した後、細胞プレートに移して5パーセントCO2インキュベータ内で5日間にわたりインキュベートした。次に、プレートを逆さまにして空にし、拭き取って乾かした。MgCl2およびCaCl2を含む室温DPBSをマルチチャンネル小型容器から各ウエルに分注し、3回軽くたたき、逆さまにして空にした後、拭き取って乾かした。MgCl2およびCaCl2を含むDPBSで希釈した50μLの生/死用蛍光色素を各ウエルに添加し、5パーセントCO2インキュベータで37°C、30分間にわたりインキュベートした。パーキンエルマーPerkin-ElmerHTS7000蛍光プレートリーダーを用いてプレートの読み取りをおこない、データをマイクロソフトエクセルMicrosftExcelで分析し、さらに結果を一覧にして表2に示した。データは、三重反復試験した4回の実験の平均値を表し、以下のようにして定量的に示した。すなわち、閾値細胞毒性よりも高い値が得られた実験が4/4の場合、閾値細胞毒性よりも高い値が得られた実験が3/4の場合、および閾値細胞毒性よりも高い値が得られた実験が2/4の場合とした。表2中の印の無い細胞は、一貫性の無い閾値細胞毒性よりも低い効果のものを表した。H460-16-2抗体はA2058黒色腫細胞およびMBー231乳癌細胞で選択的細胞毒性を示したが残りの癌細胞に対しては細胞毒性を生じなかったことから、癌細胞に対する特異的な細胞毒性があることが示される。重要なことは、単離抗体がいくつかの非癌細胞、例えばCCD-27sk、Hs578.Bst、またはHs888.Luに対して細胞毒性を生じなかったことである。細胞毒性化学剤は、期待される細胞毒性を誘導する一方で、比較のために挙げられるいくつかの他の抗体もまた予想通りに機能して、生物学的細胞アッセイの限界を与えた。細胞の単層をDPBSCaおよびMgを含まないで最初に洗浄することで、FACS用に細胞を調製した。次に、細胞解離緩衝液インビトロゲンINVITROEN、バーリントン、ONを用いて、37°Cで細胞培養プレートから細胞を遊離させた。遠心後、細胞を収集し、MgCl2、CaCl2、および25パーセントのウシ胎仔血清を含むDPBS洗浄用メジウムに4°Cで再懸濁して係数し、適当な細胞密度になるように等分割し、遠心して細胞をペレットにし、30分間、氷上で試験抗体H460-16-2または対照抗体アイソタイプ対照、抗Her2/neuまたは抗EGFR20μg/mLの存在下、染色用メジウムMgCl2、CaCl2、および2パーセントのウシ胎仔血清を含むDPBSに4°Cで再懸濁した。アレクサフルオールAlexaFluor488複合二次抗体を添加する前に、細胞を洗浄用メジウムで1回洗浄した。次に、アレクサフルオール488複合抗体含有染色用メジウムを20分間にわたり添加した。次に、細胞を最後の時間に洗浄し、1μg/mLヨウ化プロピジウム含有染色用メジウムに再懸濁した。細胞のフローサイトメトリーによる獲得を、セルクエストCellQuestソフトウェアBDバイオサイエンスBDBiosciences、オークビル、ONを用いたDACスキャン上に試料を流すことで評価した。細胞の前方散乱FSCおよび側方散乱SSCを、FSCおよびSSC検出器で電圧および振幅利得を調製することで設定した。3つの蛍光チャンネルFL1、FL2、およびFL3に対する検出器を、細胞が約1~5単位の蛍光強度中央値を持つ均一なピークを持つようにして、精製アイソタイプ対照抗体で染色した後にアレクサフルオール488複合二次抗体で染色した細胞を流すことで調整した。生細胞は、FSCゲーティングおよびヨウ化プロピジウム排除によって獲得した。各試料について、約10,000個の生細胞を分析のために獲得し、その結果を表3に示した。表3は、アイソタイプ対照群を上回る平均蛍光強度の倍増を一覧にしてまとめたものであり、また定量的に5未満-、5ないし50、50ないし100、100超として示し、括弧内は染色された細胞の割合である。H460-16-2抗体の典型的なヒストグラムを図9用に編集し、いくつかの例での図示された双ピークを包含する結合特性を明示する。黒色種および乳癌細胞を含むいくつかの細胞型に対しては、アイソタイプ対照の100倍を上回ってH460-16-2が結合し、肺、大腸、前立腺、および卵巣腫瘍細胞に対しては5ないし100倍上回って結合した。これらは、H460-16-2抗体の非癌細胞への結合であったが、そのような結合による細胞毒性は生じなかった。このことは、結合がその同種抗原への抗体結合の結果を必ずしも予測するものではなく、非自明的な知見であったことを明示している。このことは、異なる細胞での抗体結合の状況が抗体結合よりはむしろ細胞毒性の決定因子であったことを示唆した。正常ヒト組織染色IHC研究は、ヒトでのH460-16-2抗原分布を特徴づけるために、既におこなわれたS.N.10/603,000。本研究は、H460-16-2をCD44に対する抗体L178と比較する。なぜなら、H460-16-2抗原は、生化学的方法で既に決定されたように、CD44の標準型の癌変異体であるかもしれないからである。59の正常ヒト組織に対する抗体の結合を、ヒト、正常器官組織アレイイムジェネックスImgenex、サンジエゴ、CAを用いて実施した。すべての一次抗体H460-16-2、L178抗CD44抗HCAM、BDファーミンゲンPharMingen、オークビル、ONとしても知られている、およびマウスIgG1負対照ダコDako、トロント、ONを抗体希釈緩衝液ダコDako、トロント、ONで希釈し、濃度を5μg/mlとした以前の最適化ステップで最適濃度であると見いだされた。負対照抗体は、製造元によってすべての哺乳類組織に対して負ネガティブであることが示されている。IHCに関する手順は以下の通りである。組織切片を1時間にわたって58°Cのオーブンで乾燥させることで、脱パラフィン化処理を行い、ガラスドーゼコプリンジャー内でキシレンに各回4分ずつ5回浸した。一連のエタノール勾配100~75で洗浄した後、切片を水中で再度水和させた。スライドをpH6の10mMクエン酸緩衝液ダコDako、トロント、オンタリオに浸し、次に各回5分に設定して高、中、および低電力で電子レンジにかけ、最終的に冷PBSに浸した。次に、スライドを3過酸化水素溶液に6分間浸し、PBSで各回5分ずつ3回洗浄し、乾燥し、汎用ブロッキング溶液ダコDako、トロント、オンタリオで室温、5分間にわたりインキュベートした。H460-16-2、L178、またはアイソタイプ対照抗体アスペルギルスニガーAspergillusnigerグルコースオキシダーゼに対する抗体であり、グルコースオキシダーゼは哺乳類組織に存在せず、また誘導もされないを抗体希釈緩衝液ダコDako、トロント、オンタリオで希釈してその作用濃度各抗体について5μg/mLにし、室温で1時間インキュベートした。スライドをPBSで各回5分ずつ3回洗浄した。一次抗体の免疫活性は、室温で30分間にわたり、供給ダコエンビジョンシステムDacoEnvisionSystem、トロント、オンタリオされたとおりにHRP複合二次抗体で検出/可視化した。このステップの後で、スライドをPBSで各回5分ずつ3回洗浄し、DAB3,3‘-ジアミノベンジジンテトラヒドラクロリド、ダコDako、トロント、オンタリオ色原体基質溶液を添加することによって呈色反応を引き起こして室温での10分間の免疫ペロキシダーゼ染色をおこなった。スライドを水道水で洗うことで、呈色反応を停止させた。マイヤーのヘマトキシリンシグマダイアグノスティックスSigmaDiagnostics、オークビル、ONで対比染色をおこなった後に、スライドをエタノール勾配75~100で脱水させ、キシレンできれいにした。マウンティング用のメジウムダコファラマウントDakoFaramount、トロント、オンタリオを用いることで、スライドカバースリップを載せた。スライドをアキソバートAxiovert200ツワイスカナダZeissCanada、トロント、ONを用いて顕微鏡観察し、デジタル画像を獲得し、ノーザンエクリプスイメージングソフトウェアNorthernEclipseImagingSoftwareミシサーガ、ONを用いて保存した。結果の読み取り、スコアリング、および解釈を病理学者がおこなった。表4は、正常ヒト組織のアレイをH460-16-2およびL178抗CD44で染色した結果をまとめたものを示す。H460-16-2による組織染色は、既に記載されたものS.N.10/603,000と同様である。再び注目すべきことは、抗原が一般に重要臓器例えば、肝臓、腎臓、心臓、および肺の細胞には存在しないことである。H460-16-2抗体は、マクロファージおよびリンパ球に結合し、それらの存在はそれらの切片状態にある器官のいくつかで観察される。しかし、L178抗CD44抗体によるリンパ球のより高強度の染色および広範囲な分布が見られた図10。H460-16-2に対して正ポジティブである組織もまた、L178抗CD44場合によっては強度が高いに対しても一般に正ポジティブである。例えば肝臓図11および食道の一試料でわずかな例外があるにもかかわらず、H460-16-2に対して負ネガティブである組織もまた、L178抗CD44に対して一般に負ネガティブである。これらの結果は、H460-16-2が、L178抗CD44抗体によって認識される組織のわずかに小さいサブセットに結合し、組織内では染色の強度もしばしば弱いことを示している。これらの結果は、H460-16-2に対する抗原が正常組織で幅広く発現され、抗体が特異的に限られた数のヒト組織に結合することを示している。また、これらのIHC研究で使用したL178抗CD44によって認識されたものよりもわずかに異なる変異体に対するものであるにもかかわらず、CD44のエピトープに対して、H460-16-2が向けられている点で、生化学的データを支持している。ヒト乳房腫瘍組織染色以前のIHCの比較研究は、ヒト乳癌とのH460-16-2抗原の癌関連性、およびH460-16-2抗体がヒト癌を認識しようとするかについてを決定するためにおこなわれたS.N.10/603,000。ここで、L178抗CD44染色と、アスペルギルスニガーAspergillusnigerグルコースオキシダーゼに対する抗体と、哺乳類組織には存在せず、また誘導もされない酵素負の対照とを比較した。50人の乳癌患者から得られた乳癌組織アレイと乳癌患者の非腫瘍性乳房組織に由来する9つの試料とを用いたイムジェネックスコーポレーションImgenexCorporation、サンジエゴ、CA。以下の情報は、各患者について提供された。すなわち、年齢、性別、対癌米国合同委員会AJCC腫瘍病期、リンパ節、エストロゲン受容体ER、およびプロゲステロン受容体PR状態。実施例5のIHCの手順に従った。すべての抗体は作用濃度5μg/mlで使用した。表5および6は、それぞれ乳癌組織アレイのH460-16-2およびL178抗CD44抗体染色をまとめたものである。全体的に、試験した50人の患者の62パーセントがH460-16-2抗原に対して正ポジティブであり、CD44に対しては76パーセントであった。H460-16-2およびL178抗CD44がともに同一の組織を染色した場合では、43の試料で、H460-16-2に比べて高強度の染色がL178抗CD44によって得られた。H460-16-2およびCD44抗原の両方について、乳癌患者由来の10個の正常乳房組織試料のうち4および6個のみがそれぞれ正ポジティブであった。エステロゲン受容体状態とプロゲステロン受容体状態との間に明らかな相関があることは証明されなかった。また、より高い腫瘍病期でH460-16-2およびCD44抗原の正の発現が高くなる傾向があるようには見えなかった。H460-16-2染色は、間質細胞が明らかに負ネガティブであり、悪性細胞シートがかなり正ポジティブである図12に示されるように、正常細胞と比較して、癌細胞に対して特異的であった。H460-16-2抗原で見られる細胞局在化パターンは、大部分の例で細胞膜に限定された。L178抗CD44抗体は、より多くの乳癌試料を染色し、H460-16-2と比べて細胞質局在よりも膜局在の度合いが高いことを示した表7。L178抗CD44はまた、H460-16-2の場合ではみられなかったが、ぺージェット病の悪性細胞を染色した図13。L178抗CD44は、H460-16-2と同様に乳癌患者由来の正常細胞の同じ試料を染色したH460-16-2試料について部分的に脱落スラフした1つをプラス。これらの結果は、H460-16-2に対する抗原がほぼ乳癌患者の3分の2で発現される可能性があることを示唆している。染色パターンは、患者試料で、その抗体が悪性細胞に対する高い特異性を持ち、またH460-16-2抗原が細胞膜に局在化していることから、それが魅力的かつ製薬化可能なdrugable標的となることを示している。H460-16-2対L178抗CD44抗体の、類似しているにもかかわらずより制限された染色は、H460-16-2エピトープがよりいっそう制限されたCD44の変異体である可能性を、ここでも示している。ヒト腫瘍組織染色H460-16-2が乳癌のみならず他のヒト癌組織で発現するかどうかを決定するために、既にH460-16-2が多重ヒト腫瘍組織アレイで使用されたS.N.10/603,000、イムジェネックスImgenex、サンジエゴ、CA。それらの研究を進める際に、H460-16-2の染色パターンをL178抗CD44の染色パターンと比較した。各患者について、年齢、性別、器官、および診断に関する情報を得た。使用した染色手順は、実施例5で概説したものと同様にした。同じ負の対照抗体をヒト乳房腫瘍組織アレイで説明したように用いた。すべての抗体は、作用濃度5μg/mLで使用した。表8に概説されるように、既に記載されたものS.N.10/603,000と整合する結果が得られたことに加え、乳房のほかに多数の様々なヒト癌がH460-16-2によって染色された。乳癌で見られるように、H460-16-2染色は膜上に局在化図14し、いくつかの癌では、癌細胞の細胞質内にも局在化した。L178抗CD44抗体は、細胞質に比べて膜でより高かく、さらにまたH460-16-2で観察されたものよりもより高い強度で正ポジティブに腫瘍組織を染色する割合が高かった図15。したがって、H460-16-2抗原は乳癌の膜のみに単に見いだされるだけではなく、かなり多様な腫瘍型の膜上にも見いだされると考えられる。これらの結果は、H460-16-2が乳癌の他に広範囲の腫瘍型で治療薬としての可能性があることを示している。また、L178抗CD44と比較してH460-16-2が類似はしていても異なった染色パターンを持つことは、H460-16-2がCD44変異体上に存在するエピトープを認識することを意味している。証拠の優位性は、CD44の変異体に存在する炭水化物依存型立体配座エピトープの結合を介して、H460-16-2が抗癌効果を媒介することを示している。実施例3では、H460-16-2抗体を用いて、MB-231細胞等の発現細胞から同種L178抗CD44を免疫沈降させることができることが明らかにされた。さらに、限定されるものではないが、FACS、細胞ELISA、またはIHCによって示される技術を用いて、特異的に結合するCD44抗原分を発現する細胞および/または組織の検出にH460-16-2抗体が使用可能であることを示すことができた。したがって、免疫沈降H460-16-2抗原は、そのようなFACS,細胞ELISA、またはIHCアッセイを用いて、そのような細胞または組織に対するH460-16-2の結合を阻害し得ることを示すことができた。さらに、H460-16-2抗体と同様に、他の抗CD44抗体を用いて、他の形態のCD44抗原の免疫沈降および単離をおこなうことができ、さらにその抗原を使用して、同一種類のアッセイを用いて抗原を発現する細胞または組織に対する抗体の結合を阻害することもできる。また、もしすべての形態のCD44すなわち汎CD44抗体を認識する抗CD44抗体がその同種抗原を単離するために使用されるならば、その抗原はまた、該抗原を発現する細胞または組織に対するH460-16-2の結合を阻止することができるので、その抗原を発現する細胞および組織上のCD44のエピトープに対するH460-16-2の結合も示される。あるいは、両方の抗体が含まれる競合結合アッセイ、ELISA、細胞ELISA、FACS、またはその他のアッセイでH460-16-2と汎CD44抗体とを比較することもまた、その抗体を発現する細胞および組織上でのCD44のエピトープに対するH460-16-2の結合を示すことができる。この明細書で言及されるすべての特許および刊行物は、本発明が関係する当該技術分野の当業者のレベルを示している。すべての特許および刊行物は、あたかも個々の刊行物が具体的および個別的に参照によって組み込まれることを示されるのと同等の範囲で、本明細書中に援用される。本発明の一定の形態が例証される一方で、それが本明細書に記載および示された部分の特定の形態または配置に限定されるものではないことが理解される。当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく種々の変更をおこなうことが可能であり、また本発明は明細書に示されたものや、記載されたものに限定されることを考慮しているものではないことが、容易に理解されよう。当業者は、ここに内在されるものと同様に、本発明が目的を実行することや、指摘した結果および利点を得たりするのに十分適していることを、容易に理解し得る。本明細書中に記載されているいっさいのオリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、生物学的に関連した化合物、方法、手順、および技術が、現在のところ好ましい実施形態の典型的なものであり、例示を意図したものであって、本発明の範囲を限定することを意図したものではない。当業者は、本発明の精神の中に包含され、かつ添付した特許請求の範囲に定義されるその中での変更および他の用途を思いつくであろう。本発明は特定の好ましい実施形態に関連して説明したが、特許請求の範囲に記載したように本発明はそのような特定の実施形態に、過度に限定されるものではないことを理解すべきである。実際、当業者に容易である本発明を実行するための記載されたモードの種々の修飾は、以下の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図されている。"