"リベロマイシンAまたはその合成中間体の生産能を有するストレプトマイセス属細菌であって、配列番号36のアミノ酸配列または該アミノ酸配列と80以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするrevQ遺伝子の発現が親株と比較して増大するように改変され、それにより前記生産能が該親株よりも向上したストレプトマイセス属細菌。revQ遺伝子のコピー数を高めること、またはrevQ遺伝子のプロモーターの改変によってrevQ遺伝子の発現が増大した、請求項1に記載の細菌。ストレプトマイセスspSN593株をrevQ遺伝子の発現が増大するように改変することによって得られる、請求項1または2に記載の細菌。請求項1~3のいずれか一項に記載のストレプトマイセス属細菌を培地で培養し、培地中にリベロマイシンAまたはその合成中間体を蓄積させ、その培養物からリベロマイシンAまたはその合成中間体を回収することを含む、リベロマイシンAまたはその合成中間体の製造方法。配列番号36のアミノ酸配列または該アミノ酸配列と80以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードし、リベロマイシンAまたはその合成中間体の生産能を有するストレプトマイセス属細菌に導入したときに、該生産能を向上させるポリヌクレオチド。配列番号35の121-951の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、リベロマイシンAまたはその合成中間体の生産能を有するストレプトマイセス属細菌に導入したときに、該生産能を向上させるポリヌクレオチド。配列番号14のアミノ酸配列または該アミノ酸配列と80以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するRevGタンパク質を下記化合物Iに作用させることにより、該化合物Iを下記化合物IIに変換する工程を含む、化合物IIの製造方法。R1およびR3は、独立して、水素、または炭素数1~25の飽和もしくは不飽和の脂肪族炭化水素基水素原子は、水酸基、カルボキシル基、オキソ基、フェニル基またはピリジル基で置換されてもよく、2つの水素原子はOにより環を形成してもよいであり、R2およびR4は独立して、炭素数1~10のアルキル基である。前記RevGタンパク質とともに配列番号20のアミノ酸配列または該アミノ酸配列と80以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するRevJタンパク質を化合物Iに作用させる、請求項7に記載の化合物IIの製造方法。化合物Iが下記iで示される化合物であり、化合物IIが下記iiで示されるいずれかまたは両方の化合物である、請求項7または8に記載の方法。配列番号14のアミノ酸配列または該アミノ酸配列と80以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、化合物Iを化合物IIに変換する反応を触媒する活性を有するタンパク質。請求項10に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。配列番号13の121-939の塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする、請求項11に記載のポリヌクレオチド。配列番号2、4、6、8、10、12、16、18、20、22、24、26、28、30、34、38、40、42または44のアミノ酸配列と80以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードし、リベロマイシン生合成関連タンパク質をコードするポリヌクレオチド。下記一般式IIIまたはIVで表される化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする、抗癌剤。R5、R6、R7、R8およびR9は炭素数1~6のアルキルを示し、R10は水素原子または炭素数1~5のアルキルを示す。R11、R12、R13、R14およびR15は炭素数1~6のアルキルを示す。下記一般式IIIで表される化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする、抗真菌剤。R5、R6、R7、R8およびR9は炭素数1~6のアルキルを示し、R10は水素原子を示す。下記一般式IVで表される化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする、骨疾患治療剤。R11、R12、R13、R14およびR15は炭素数1~6のアルキルを示す。以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。<1>本発明の細菌およびそれを用いたリベロマイシンAまたはその合成中間体の製造法本発明の細菌は、リベロマイシンAまたはその合成中間体の生産能を有するストレプトマイセス属細菌であって、配列番号36のアミノ酸配列または該アミノ酸配列と80以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするrevQ遺伝子の発現が親株と比較して増大するように改変され、それにより前記生産能が該親株よりも向上したストレプトマイセス属細菌である。本発明において明らかとなったリベロマイシンAの生合成経路を図2に示すが、リベロマイシンA合成中間体としては、RMA1a、RMA2a、RMA3a、RMA3b、RMTなどが挙げられる。revQ遺伝子は、ストレプトマイセスspSN593株などのリベロマイシンAまたはその合成中間体の生産能を有するストレプトマイセス属細菌に導入したときに、該生産能を向上させるポリヌクレオチドである限り特に限定されないが、例えば、配列番号35の121-951の塩基配列を有するストレプトマイセスspSN593株由来の遺伝子を挙げることができる。また、revQ遺伝子は、リベロマイシンAまたはその合成中間体の生産能を向上させる遺伝子である限り、上記塩基配列の相補配列を有するDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAであってもよい。ここで、ストリンジェントな条件としては、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60°C、1×SSC,0.1SDS、好ましくは、0.1×SSC、0.1SDSに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。また、revQ遺伝子は、配列番号36のアミノ酸配列と80以上、好ましくは90以上、より好ましくは95以上、特に好ましくは99以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードし、リベロマイシンAまたはその合成中間体の生産能を向上させる遺伝子であってもよい。さらに、revQ遺伝子は、配列番号36のアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加された配列を有するアミノ酸配列をコードし、リベロマイシンAまたはその合成中間体の生産能を向上させる遺伝子であってもよい。ここで、1または数個とは、好ましくは、1~20個、より好ましくは1~10個、特に好ましくは1~5個を意味する。また、ストレプトマイセスspSN593株以外のストレプトマイセス属細菌、または他の微生物由来のrevQ遺伝子を使用することもできる。これらのrevQ遺伝子は、ホモロジーに基いてリベロマイシンAまたはその合成中間体の生産能を向上させる遺伝子を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列にしたがって合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やPCR法によりORF部分を含む領域を増幅することによって、取得することができる。revQ遺伝子の発現が親株と比較して増大するように改変されたとは、ストレプトマイセスspSN593株などの親株改変前の株と比較してrevQ遺伝子の発現量が、単位菌体重量当たり15倍以上増強されていることが好ましく、2倍以上増強されていることがより好ましい。遺伝子の発現量は、RTPCRやノザンブロット法により確認することができる。ストレプトマイセスspSN593株は平成2年6月5日付で工業技術院微生物工業技術研究所現名称、産業技術総合研究所特許生物寄託センター、住所郵便番号3058566茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6に寄託され、その寄託番号はFERMP-11503であり、その後国際寄託に移行しており、その寄託番号はFERMBP-3406である特開平05-051303。本発明に用いる細菌は、ストレプトマイセスspSN593株以外にも、以下に例示されるような細菌を親株として用い、該親株をrevQ遺伝子の発現が増大するように改変することによって得ることができる。ストレプトマイセスプルニカラーStreptomycesprunicolorストレプトマイセスシナモネウスStreptomycescinnamoneusストレプトマイセスクロモフスカスStreptomyceschromofuscusストレプトマイセスリビダンスStreptomyceslividansストレプトマイセスアキヨシエンシスStreptomycesakiyoshiensisストレプトマイセスアズレウスStreptomycesazureusストレプトマイセスハワイエンシスStreptomyceshawaiiensisストレプトマイセステンダエStreptomycestendaeストレプトマイセスバージニアStreptomycesvirginiaeストレプトマイセスアマクサエンシスStreptomycesamakusaensisストレプトマイセスアンチビオティカスStreptomycesantibioticusストレプトマイセスチバエンシスStreptomyceschibaensisストレプトマイセスアルバスStreptomycesalbusストレプトマイセスリンコエンシスStreptomyceslincolnensisストレプトマイセスカナマイセティカスStreptomyceskanamyceticusストレプトマイセスカスガエンシスStreptomyceskasugaensisストレプトマイセスセリカラーStreptomycescoelicolorストレプトマイセスグリセウスStreptomycesgriseusストレプトマイセスエバミチリスStreptomycesavermitilisストレプトマイセスアンボファシエンスStreptomycesambofaciensストレプトマイセスフラディアStreptomycesfradiae上記ストレプトマイセス属細菌は、IFOカタログ、ATCCカタログ、JCMカタログ等に掲載されており、当業者は容易に入手することができる。なお、本発明において親株として用いられる上記細菌は、野生株だけでなく、UV照射やNTG処理等の通常の変異処理により得られる変異株、細胞融合もしくは遺伝子組換え法などの遺伝学的手法により誘導される組換え株などのいずれの株であってもよい。revQ遺伝子の発現の増強は、遺伝子組換え法、例えば、revQ遺伝子のコピー数を高めること、またはこの遺伝子のプロモーターを置換することによって行うことができる。revQ遺伝子のコピー数を高めるためには、例えば、上記のようなrevQ遺伝子を宿主微生物で機能しうるプラスミドに発現可能に組込み、宿主微生物に導入すればよい。revQ遺伝子を組み込むことができるプラスミドベクターとしては、宿主細菌内での複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むものであれば特に制限されない。上記自立複製に関与するベクターとして、例えば、プラスミドDNA、ウイルス、バクテリオファージ、細菌の染色体等が挙げられる。プラスミドDNAとしては、例えば大腸菌由来のプラスミドpBR322、pUC18、pUC19、pUC118、pUC119、pBluescriptなどのColE系プラスミドが挙げられる。また、下記のような放線菌由来のプラスミドも使用することができる。pIJ486Mol.Gen.Genet.203,468478,1986、pKC1064Gene103,97991991、pUWLKSGene1651491501995、pIJ702J.Gen.Microbiol.129:270327141983、pIJ8600Microbiology145:222122271999ファージDNAとしてはλファージCharon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11等が挙げられる。宿主への組換えDNAの導入は、公知方法により行うことができる。例えば、ストレプトマイセス属細菌の形質転換法としては、リゾチームを利用してストレプトマイセス属細菌をスフェロプラスト化した後、組換えDNAベクターとポリエチレングリコールを含む緩衝液とを加えて該ベクターを細胞内に取り込ませる方法[ThompsonCJetalJBacteriol151668677またはHopwoodDAetalGeneticManipulationofStreptomycesALaboratoryManualTheJohnInnesFoundationNorwich参照]がよく用いられる。また、電気パルス法ResMicrobiolVol144p1811851993によって行うこともできる。また、DNAが導入されたことの確認は、選択マーカー遺伝子例えばアンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子等を用いて行うとよい。また、revQ遺伝子の発現増強は、公知の相同組換え法によって染色体上でrevQ遺伝子を多コピー化させることによって行うこともできる。また、revQ遺伝子の発現増強は、宿主染色体上でrevQ遺伝子のプロモーターを置換または改変することによっても行うことができる。プロモーター置換の方法としては、例えば、公知の相同組み換え法やsacB遺伝子を用いる方法SchaferAetalGene1456973が挙げられる。上記組み換えプラスミドによる導入または染色体上での相同組換えにおいて、revQ遺伝子を発現させるためのプロモーター、または染色体上のrevQ遺伝子のプロモーターを置換するために使用するプロモーターは、宿主細菌で機能しうるものであれば特に制限されないが、例えば、以下のものが挙げられる。抗生物質のチオストレプトン添加により転写が誘導されるtipAプロモーターGene94:5359、1990;Gene103:9799、1991;Gene166:133137、1995、グリセロールにより誘導されるglyCABプロモーターMol.Microbiol.12:737745、1994およびマイトマイシンCにより誘導されるmcrABプロモーターGene175:261267、1996が発現ベクターに利用されている。また、大腸菌で用いられるlacプロモーターやtacプロモーターやtrcプロモーターなどが挙げられる。なお、DNAの切断、連結、その他、染色体DNAの調製、PCR、プラスミドDNAの調製、形質転換、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設定等の方法は、当業者によく知られている通常の方法を採用することができる。これらの方法は、SambrookJFritschEFandManiatisTMolecularCloningALaboratoryManualSecondEditionColdSpringHarborLaboratoryPress等に記載されている。上記細菌を栄養源含有培地に接種し、好気的に培養することによりリベロマイシンAおよびその合成中間体が製造される。培養に用いられる培地としては、ストレプトマイセス属細菌が利用できる栄養源を含有する培地であればよく、各種の合成培地、半合成培地、天然培地などいずれも用いることができる。培地組成としては炭素源としてのグルコース、シュークロース、フルクトース、グリセリン、デキストリン、澱粉、糖蜜、コーンスティープリカー、有機酸、などを単独または組み合せて用い得る。窒素源としてはファーマメディア、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、大豆粉、カゼイン、アミノ酸、尿素などの有機窒素源、硝酸ナトリウム、硫酸アンモニウムなどの無機窒素源を単独または組み合せて用い得る。ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、リン酸塩、その他の重金属塩なども必要に応じて添加使用され得る。なお、培養中発泡の著しいときは、アデカノール登録商標、シリコーンオイル等の公知の各種消泡剤を適宜培地中に添加することもできるが、その添加は目的物質の生産に悪影響を与えないものとする必要がある。例えば0.5以下で使用することが好ましい。培地のpHは微生物の至適pH範囲、通常中性付近とするのが望ましい。培地温度は、微生物が良好に生育する温度、通常20~40°C、特に好ましくは27°C付近に保つのがよい。培養時間は液体培養の場合、一般に1~5日間程度、好ましくは約72時間である。上記培養によってリベロマイシンAおよびその合成中間体が生成蓄積される。もちろん上述した各種の培養条件は、使用微生物の種類や特性、外部条件などに応じて適宜変更でき、またそれぞれに応じて上記範囲から最適条件を選択、調節される。上記培養により生産されるリベロマイシンAやその合成中間体の単離は、リベロマイシンAやその合成中間体と不純物との溶解度差を利用する手段、吸着親和力の差を利用する手段、分子量の差を利用する手段のいずれによっても実施でき、それぞれの方法は単独、または適宜組合せて、あるいは反復して使用される。具体的には、リベロマイシンAは、培養濾液にその大部分が存在するので、その培養濾液を各種のゲル濾過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー等を組合せて精製すると、リベロマイシンA及びその他の活性成分を含む画分がえられる。この画分を凍結乾燥して得られた粉末を更に高速液体クロマトグラフィー例えばカプセルパックカラムを用い、例えば18メタノール:0.01アンモニアの系で展開により精製すれば、リベロマイシンAの精製白色粉末を得ることができる特開平05051303。他のリベロマイシンA合成中間体は実施例に記載の方法で得ることができる。<2>スピロケタール環含有化合物の製造法本発明はまた、配列番号14のアミノ酸配列または該アミノ酸配列と80以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するRevGタンパク質を下記化合物Iに作用させることにより、該化合物Iを下記化合物IIに変換する工程を含む、化合物IIの製造方法を提供する。ここで、R1およびR3は、独立して、水素、または炭素数1~25好ましくは1~10の飽和もしくは不飽和の脂肪族炭化水素基水素原子は、水酸基、カルボキシル基、オキソ基、フェニル基またはピリジル基で置換されてもよく、2つの水素原子はOにより環を形成してもよいであり、R2およびR4は独立して、炭素数1~10のアルキル基であり、好ましくは炭素数1~6のアルキル基である。化合物Iとしては下記iに記載の化合物が好ましく、化合物IIとしては下記iiに記載の化合物が好ましい。また、化合物Iとしては図11に記載の化合物も挙げられる。なお、RevGタンパク質とともにRevJタンパク質を化合物Iに作用させてもよい。RevGタンパク質としては、配列番号16のアミノ酸配列を有するストレプトマイセスspSN593株由来のタンパク質が挙げられるが、配列番号16のアミノ酸配列と80以上、好ましくは90以上、より好ましくは95以上、特に好ましくは99以上の同一性を有し、化合物Iを化合物IIに変換する反応を触媒する活性を有するタンパク質であってもよい。さらに、RevGタンパク質は、配列番号16のアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加された配列を有し、化合物Iを化合物IIに変換する反応を触媒する活性を有するタンパク質であってもよい。ここで、1または数個とは、好ましくは、1~20個、より好ましくは1~10個、特に好ましくは1~5個を意味する。RevJタンパク質としては、配列番号20のアミノ酸配列を有するストレプトマイセスspSN593株由来のタンパク質が挙げられるが、配列番号20のアミノ酸配列と80以上、好ましくは90以上、より好ましくは95以上、特に好ましくは99以上の同一性を有し、RevGとともに化合物Iを化合物IIに変換する反応を触媒する活性を有するタンパク質であってもよい。さらに、RevJタンパク質は、配列番号20のアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加された配列を有し、RevGとともに化合物Iを化合物IIに変換する反応を触媒する活性を有するタンパク質であってもよい。ここで、1または数個とは、上記と同様である。RevGタンパク質およびRevJタンパク質はストレプトマイセスspSN593株などのストレプトマイセス属細菌から精製することによって得ることもできるが、revG遺伝子およびRevJタンパク質を適当な宿主ストレプトマイセス属細菌、エシェリヒア属細菌、酵母などまたは無細胞系で発現させた後に、RevGタンパク質およびRevJタンパク質を精製することによって得ることもできる。その際に、精製の簡便のため、ポリヒスチジンやGSTなどのタグを融合させて発現させ、そのタグに対するアフィニティを利用して精製することが好ましい。この際に用いることのできるrevG遺伝子は、化合物Iを化合物IIに変換する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えば、配列番号13の121-939の塩基配列を有するストレプトマイセスspSN593株由来の遺伝子を挙げることができる。revJ遺伝子は、RevGとともに化合物Iを化合物IIに変換する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えば、配列番号19の121-1128の塩基配列を有するストレプトマイセスspSN593株由来の遺伝子を挙げることができる。また、revG遺伝子およびrevJ遺伝子は、化合物Iを化合物IIに変換する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするものである限り、上記塩基配列の相補配列を有するDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAであってもよい。ここで、ストリンジェントな条件としては、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60°C、1×SSC,0.1SDS、好ましくは、0.1×SSC、0.1SDSに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。なお、RevGタンパク質およびRevJタンパク質を含む画分や粗精製、細菌そのものを用いてもよい。RevGタンパク質、またはRevGタンパク質およびRevJタンパク質とIの化合物との反応は、溶液中で両者を混合すればよい。反応温度は酵素反応に適した温度であるが、好ましくは20~40°Cである。<3>新規ポリヌクレオチド本発明は、上記revG遺伝子およびrevQ遺伝子に加えて、さらに、下記の各新規ポリヌクレオチドを提供する。revC遺伝子:配列番号1コードされるアミノ酸配列は配列番号2revA遺伝子:配列番号3コードされるアミノ酸配列は配列番号4revB遺伝子:配列番号5コードされるアミノ酸配列は配列番号6revD遺伝子:配列番号7コードされるアミノ酸配列は配列番号8revE遺伝子:配列番号9の1211221コードされるアミノ酸配列は配列番号10revF遺伝子:配列番号11の1211569コードされるアミノ酸配列は配列番号12revH遺伝子:配列番号15の1211641コードされるアミノ酸配列は配列番号16revI遺伝子:配列番号17の1211311コードされるアミノ酸配列は配列番号18revJ遺伝子:配列番号19の1211128コードされるアミノ酸配列は配列番号20revK遺伝子:配列番号21の1211050コードされるアミノ酸配列は配列番号22revL遺伝子:配列番号23の1211191コードされるアミノ酸配列は配列番号24revM遺伝子:配列番号25の1211080コードされるアミノ酸配列は配列番号26revN遺伝子:配列番号27の1211035コードされるアミノ酸配列は配列番号28revO遺伝子:配列番号29の121777コードされるアミノ酸配列は配列番号30revP遺伝子:配列番号33の121792コードされるアミノ酸配列は配列番号34revR遺伝子:配列番号37の1211119コードされるアミノ酸配列は配列番号38revS遺伝子:配列番号39の1211857コードされるアミノ酸配列は配列番号40revT遺伝子:配列番号41の1211449コードされるアミノ酸配列は配列番号42revU遺伝子:配列番号43の1212889コードされるアミノ酸配列は配列番号44また、上記の各遺伝子は、実施例で示されるようなリベロマイシン生合成に関与する活性を有するタンパク質をコードする限り、各塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであってもよい。また、上記の各遺伝子は、実施例で示されるようなリベロマイシン生合成に関与する活性を有するタンパク質をコードする限り、各アミノ酸配列において、1若しくは複数の位置での1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含むアミノ酸配列をコードする、ホモログ、変異体又は人為的な改変体であってもよい。ここで、1若しくは数個とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には1~20個、好ましくは1~10個、より好ましくは1~5個を意味する。さらに、上記の各遺伝子は、リベロマイシン生合成に関与するタンパク質をコードする限り、各アミノ酸配列全体に対して、80以上、好ましくは90以上、より好ましくは95以上、特に好ましくは97以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子であってもよい。<4>抗癌剤本発明の抗癌剤は下記一般式IIIまたはIVで表される化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含む。R5、R6、R7、R8およびR9は炭素数1~6のアルキルを示し、R5、R7、R8およびR9は好ましくは炭素数1~3のアルキルであり、より好ましくはメチルである。R6は好ましくは炭素数3~6のアルキルであり、より好ましくはブチルである。R10は水素原子または炭素数1~5のアルキルを示し、好ましくは水素原子、メチルまたはエチルである。R11、R12、R13、R14およびR15は炭素数1~6のアルキルを示し、R11、R13、R14およびR15は好ましくは炭素数1~3のアルキルであり、より好ましくはメチルである。R12は好ましくは炭素数3~6のアルキルであり、より好ましくはブチルである。薬学的に許容される塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩等の鉱酸塩;又はpトルエンスルホン酸塩等の有機酸塩;ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩等の金属塩;アンモニウム塩;メチルアンモニウム塩等の有機アンモニウム塩;グリシン塩等のアミノ酸塩を挙げることができるが、これらに限定されることはない。下記の抗真菌剤、骨疾患治療剤として用いる場合も同様である。本明細書中、抗癌剤とは、癌細胞殺傷、癌細胞増殖抑制、癌転移防止、癌再発防止又は癌発生予防等の目的で使用されるものをいう。投与の対象となる癌の具体例としては、悪性黒色腫、悪性リンパ腫、消化器癌、肺癌、食道癌、胃癌、大腸癌、直腸癌、結腸癌、尿管腫瘍、胆嚢癌、胆管癌、胆道癌、乳癌、肝臓癌、膵臓癌、睾丸腫瘍、上顎癌、舌癌、口唇癌、口腔癌、咽頭癌、喉頭癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、前立腺癌、甲状腺癌、脳腫瘍、カポジ肉腫、血管腫、白血病、真性多血症、神経芽腫、網膜芽腫、骨髄腫、膀胱腫、肉腫、骨肉腫、筋肉腫、皮膚癌、基底細胞癌、皮膚付属器癌、皮膚転移癌、皮膚黒色腫などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。上記化合物を患者に投与する場合の投与量は、患者の年齢、体重、癌の種類と進行度、症状等に応じて適宜設定することができるが、一般的には、成人一人一日当たり有効成分として0.1~1000mg/kg体重、特に1~100mg/kg体重を1~数回に分けて投与することができる。投与経路は、特に限定されず、例えば、経口投与、又は注射などの非経口投与により投与することができる。注射による投与を行う場合は、静脈注射、動脈注射、皮下注射、皮内注射、腹腔内注射、筋肉内投与等を行うことができる。本発明の抗癌剤は、有効成分として含有する式IIIもしくはIVで示される化合物またはそれらの塩に加えて、医薬組成物で通常用いられている担体を含有することができる。その製剤形態は、使用目的や使用対象に応じて適宜選択することができ、例えば、注射剤液剤、懸濁剤等、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤等の形態で用いることができる。上記担体としては、賦形剤、結合剤、崩壊剤、乳化剤、可溶化剤、分散剤、滑沢剤、コーティング剤、着色剤、安定剤、等張剤等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。腑形剤としては、乳糖、白糖、ブドウ糖などの糖類、デンプン、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム等の無機物、結晶セルロース、蒸留水、精製水、ゴマ油、ダイズ油、トウモロコシ油、オリーブ油、綿実油等の一般に使用されているものを例示することができる。本発明の薬剤は、これらの添加物を用いて常法によって製剤化することができる。また、本発明の抗癌剤は、他の医薬品例えば、他の抗癌剤などと併用することもできる。さらに、式IIIもしくはIVで示される化合物又はその薬学的に許容される塩の治療有効量を、ヒトを含む哺乳類動物に投与する工程を含む、癌の治療方法が本発明により提供される。<5>抗真菌剤本発明の抗真菌剤は、下記一般式IIIで表される化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含む。R5、R6、R7、R8およびR9は炭素数1~6のアルキルを示し、R10は水素原子を示す。R5、R7、R8およびR9は好ましくは炭素数1~3のアルキルであり、より好ましくはメチルである。R6は好ましくは炭素数3~6のアルキルであり、より好ましくはブチルである。抗真菌剤とは、真菌類に対して殺菌作用または増殖阻害作用を有する薬剤を広く意味する。真菌類としては、酵母、キノコの他、いわゆる糸状菌カビが挙げられ、特に、内因感染の原因となるカンジダアルビカンスCandidaalbicansやカンジダシュードトロピカリスCandidapseudotropicalisなどの真菌に対しても用いられる。本発明の抗真菌剤は、例えば、カンジダ属、白癬菌属Trichophyton又はアスペルギルス属等に起因する局所性真菌感染、粘膜感染、全身性真菌感染等の治療に用いることができる。さらに、式IIIで示される化合物又はその薬学的に許容される塩の治療有効量を、ヒトを含む哺乳類動物に投与する工程を含む、局所性真菌感染、粘膜感染、全身性真菌感染等の治療方法が本発明により提供される。抗真菌活性の測定は方法は特に限定されない。例えば、検定菌として上記した何れか1種以上の菌を用いて、平板培地での増殖阻止円の形成を指標としたり、あるいは液体培地中で適当な期間のインキュベーション後に培地の濁度を測定することなどにより抗真菌活性を測定することができる。有効成分として用いる一般式IIIで表される化合物又はその薬学的に許容される塩は、そのままで又は上述したような医薬組成物で通常使用される各種の担体と組み合わせた形で抗真菌剤として使用することができる。その製剤形態は、使用目的や使用対象に応じて適宜選択することができ、例えば、クリーム又は軟膏などの皮膚外用剤、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、注射剤液剤、懸濁剤等等の形態で用いることができる。本発明の抗真菌剤はヒトを含む哺乳動物に投与することができる。投与経路は経口投与でも非経口投与でもよい。本発明の抗真菌剤の投与量は患者の年齢、性別、体重、症状、及び投与経路などの条件に応じて適宜増減されるべきであるが、一般的には、有効成分量として成人一日あたり1μg/kgから1000mg/kg程度の範囲であり、好ましくは10μg/kgから100mg/kg程度の範囲である。上記投与量は一日一回投与しても一日に数回に分けて投与してもよい。また投与期間及び投与間隔も特に限定されず、毎日投与してもよいしあるいは数日間隔で投与してもよい。さらに、本発明の抗真菌剤は、医薬品としてのみならず、食品、飼料、化粧品等のように人又は動物の体内に摂取され、または体表面に適用される製品、その他一般に真菌の増殖を防止又は抑制することが望まれるあらゆる製品に配合して使用することができる。また、本発明の抗真菌剤を製品又は原料素材の表面処理に用いることもできる。具体的には、食品、医薬品、医薬部外品、各種化粧品、各種歯磨用品、各種生理用品、各種ベビー用品、各種高齢者用品、各種洗剤、各種除菌用品、ペット飼料、各種家畜試料、各種養魚飼料、各種建築材料、各種塗料、各種農園芸用品、並びにそれらの原料となる素材、その他一般に真菌等の微生物の増殖の防止、抑制が望まれるあらゆる物品に添加、配合、噴霧、付着、被覆、含浸等を行ってもよく、またその他一般に真菌類の増殖防止、抑制が望まれるあらゆる物品の処理に用いることもできる。<6>骨疾患治療剤本発明の骨疾患治療剤は、下記一般式IVで表される化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含む。R11、R12、R13、R14およびR15は炭素数1~6のアルキルを示す。R11、R13、R14およびR15は好ましくは炭素数1~3のアルキルであり、より好ましくはメチルである。R12は好ましくは炭素数3~6のアルキルであり、より好ましくはブチルである。骨疾患としては、骨量減少等の内因性骨疾患、及び物理的骨折等の外因性骨疾患の両方を含み、本発明の薬剤は上記骨疾患の治療、あるいは上記骨疾患の治療期間の短縮のために使用することができる。内因性骨疾患としては、生体内での破骨細胞の過剰な形成及び/又は過剰な機能を伴う全ての疾患が包含される。骨疾患の具体例としては、骨粗鬆症、骨疾患関連性高カルシウム血症、骨ページェット病、破骨細胞腫、骨肉腫、関節症、慢性関節リウマチ、変形性骨炎、原発性甲状腺機能亢進症、骨減少症、骨多孔症、骨軟化症、外傷性骨折、疲労骨折、又は栄養障害、悪性腫瘍など他の疾病が原因による骨組織の脆弱化及び骨折などが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。本発明の骨疾患治療剤は、その使用目的にあわせて通常の薬学的手法に準じて投与方法、剤型、投与量を適宜決定することが可能である。例えば治療を目的としてヒトなどの哺乳動物に投与する場合は、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、溶剤等として経口的に、または注射剤、坐剤、経皮吸収剤、吸入剤等として非経口的に投与することができる。また、一般式IVで表される化合物又はその薬学的に許容される塩の治療有効量を、上述したような医薬組成物で通常使用される各種の担体と組み合わせて医薬組成物とすることができる。投与量は疾患の状態、投与ルート、患者の年齢、または体重によっても異なるが、有効成分量として成人に経口で投与する場合、通常20~500mg/kg/日、好ましくは50~300mg/kg/日、非経口で投与する場合、通常10~300mg/kg/日、好ましくは20~200mg/kg/日を投与する。これを1回あるいは数回に分割して投与すればよい。さらに、式IVで示される化合物又はその薬学的に許容される塩の治療有効量を、ヒトを含む哺乳類動物に投与する工程を含む、骨疾患の治療方法が本発明により提供される。以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例の態様に限定されない。1.リベロマイシン生産菌からのリベロマイシン生合成遺伝子クラスターの取得以下の手順に従い、リベロマイシン生産菌からのリベロマイシン生合成遺伝子クラスターの取得を行った。<実験条件>リベロマイシン生産菌培養MS寒天プレートマンニトール2寒天で2週間28°Cで培養を行い、胞子を着生させた。一白金耳の胞子をSY培養液70ml500mlK1フラスコに植菌し2日間28°Cで150rpmで培養した。この前培養液1mlを70mのRMA高生産培地RMPM1モルト抽出物1乾燥酵母5トマトジュース01K2HPO401NaCl003MgSO47H2O001NaNO30005ZnSO47H2Oand0005CuSO45H2Oオートクレーブ前pH65又はRMA低生産培地SK20014KH2PO40042MgSO4pH76に植菌して5日間28°Cで培養した。遺伝子配列解析リベロマイシン生産菌の全ゲノムショットガンシークエンスにより配列解析を行った。このためにインサートDNAサイズが25kbのプラスミドライブラリーを作成した。更に配列解析が難しい領域を網羅するために40kbのインサートDNAを有するフォスミドライブラリーを作成した。配列解析はBigDyeterminatorver31kitを用いて3730xlcapillarysequencersで解析した。誘導発現PKS遺伝子断片のRTPCRによる取得と全長配列の決定ポリケチド合成酵素配列を持つ遺伝子を特異的に増幅するためのプライマーを設計し、これらのプライマーによりリベロマイシン生産培地での培養時に特異的に増幅されるリベロマイシン低生産性培地培養時には増幅されない遺伝子の取得を試みた。リベロマイシン生産菌の胞子をSK2培地中で2日間、28°Cで培養後、この前培養液1mlをそれぞれ70mlの生産培地RMPM及び低生産性培地に植菌した。60時間後、培養液5mlから全RNAをTRIzolMaxBacterialRNAisolationkitを用いて抽出した。DNaseIにより混在する染色体DNAを除去した後、SuperScriptIIIを用いて逆転写反応を行った。PCR反応は、TaKaRaLAtaqタカラバイオを用いて94°C2分3035又は40サイクルの反応を94°C30秒62°C30秒72°C30秒で行った。使用したプライマーおよび略称を以下に示す。ketosynthaseAcyltransferaseenoylreductaseKSF1TSGCSATGGACCCSCAGCAG配列番号47KSR1CCSGTRCCGTGCGCCTCSAC配列番号48KSATF1GTCGACACSGCCTGYTCSTC配列番号49KSATR1GCGGCGATCTCGCCCTGSGAGTG配列番号50ERF1GTGGGCSTGAACTTCCGCGACGT配列番号51ERF2GACGTGSTGAMCGSCCTCGGGATG配列番号52ERF3GCSGGSGTCGTCACCGCCGTCGG配列番号53ERR1CGGCAGCAACCGCAGCGASGCGTC配列番号54ERR2GGTCTTGCCCATCTCSASGAASCG配列番号55ERR3GACGACCTTGCCCACATGACG配列番号56KSKSAT及びERプライマーは、それぞれ0615及び07kb増幅するようにデザインした。RMPM培地で特異的に増幅した遺伝子断片をpGEMTEasyvectorに連結し大腸菌EcoliDH5αを形質転換後にプラスミドを回収しM13forwardおよびM13reverseプライマーを用いて配列を解析した。リベロマイシン生産培地で特異的に増幅されたDNA断片の情報とゲノムドラフト配列により得られたコンティグ情報を統合した結果、配列決定した約70のポリケチド合成酵素配列は近接したコンティグ情報に集約された。さらに、候補プローブを用いたDNAハイブリダイゼーション解析からフォスミドクローンを選定し、その配列を解析することにより全長を網羅するDNA情報を取得した。得られた全遺伝子配列をFramePlot及びBLAST解析したところ、全長91kb、21遺伝子から構成されるRMA生合成遺伝子クラスターを得ることに成功した図1。PKS遺伝子は13モジュール64ドメインから構成されることが遺伝子配列から推定された。同定された各遺伝子のORFのサイズ、各ORFの推定される機能、相同性が高いタンパク質、それとの同一性、および相同性が高いタンパク質のアクセス番号を表1に示す。これらの遺伝子にコードされるORFはいずれも公知のアミノ酸配列とは相同性が低いものであった。実験手法遺伝子破壊プラスミド作製以上のようにして得られた候補遺伝子クラスターが確かにRMA生合成遺伝子クラスターであることを確認するために、ポリケチド生合成遺伝子revCrevDの二重遺伝子破壊を行った。revCの3末端領域及びrevDの5末端領域を欠失させ、内部にカナマイシン耐性化に関わるaphII遺伝子約16kbを組み込んだ。更にaphII遺伝子の上流及び下流に約25kbの相同組換えDNA領域を含む接合伝達ベクターを調製した。同様な手法でrevHrevIの二重遺伝子破壊株作製用のプラスミドを構築した図4A。また、クラスター境界のorf配列番号31、orf1配列番号45及びrevGの遺伝子破壊を行うために、各遺伝子の内部配列をaphII遺伝子に置き換え、同様に上流及び下流に約25kbの相同組換えDNA領域を含む遺伝子破壊ベクターを調製した。具体的な手順は以下のとおりである。revCとrevDの2重破壊用プラスミドを構築するために、25kbのrevCフラグメントと27kbのrevDフラグメントを、フォスミドクローンを鋳型に、revCはrevCEcoBamF5CCGGAATTCGGATCCGCCGGCTGCACGAGGAGTCGTCG3配列番号57とrevCHindAscR5CCCAAGCTTGGCGCGCCTCGGGTGCGTCCTGCGCGGTG3配列番号58を、revDはrevDHindAscF5CCCAAGCTTGGCGCGCCTGCCCGACGTGATCGACGACGC3配列番号59とrevDXhoBamR5CCGCTCGAGGGATCCAGCCCCTCGGCCACCGACA3配列番号60をプライマーに用いたPCRを行った。増幅したrevC断片をEcoRIとHindIIIで消化し、pETDuetベクターNovagenに組み込んで、pETCを得た。増幅したrevD断片をHindIIIとXhoIで消化し、pETCに組み込み、pETCDを得た。HindIIIサイト付きプライマーaphHindF5CTCGAGAAGCTTCAGTGAGTTCGAGCGACTCGAGA3とaphHindR5CTCGAGAAGCTTCTGGTACCGAGCGAACGCGTA3配列番号61,62で増幅したaphII遺伝子をHindIIIで消化し、pETCDのHindIIIサイトに組み込んでpETCaphDを構築した。得られたpETCaphDをBamHIで消化し、得られたrevCとrevDの2重破壊用カセットを接合プラスミドpIMのBamHIサイトに導入してpIMCaphDを得た。revGorfおよびorf1の破壊は、PCRによる遺伝子置換λRedsystemによって行ったProcNatlAcadSciUSA10015416。フォスミド11A0218G01および30B04をそれぞれ、revGorfおよびorf1の遺伝子置換の鋳型に用い、表2に記載のプライマーをそれぞれ用いた。ただし、SspSN593はサイズの大きい遺伝子を導入するのが難しかったため、破壊型遺伝子を含む約66kbのDNA断片を下記表3のプライマーにより増幅して、これをpIM接合ベクターのHindIIIサイトに組み込んだ。なお、revG破壊のスキームを図3aに示した。revErevKrevMについても同様の方法で遺伝子破壊を行った。revErevKrevM破壊のスキームを図12に示した。RevL遺伝子破壊は、以下の手法で行った。まず、revl遺伝子の両端に25kb相同組み換え領域を有するようにフォスミドクローンを鋳型に、RevLHindF5CCCAAGCTTGGACTTCGCCTGCGCGTTGAACTT3配列番号83とrevLHindR5CCCAAGCTTAGGCTTCCTGGAGGAAGTCCGTCA3配列番号84をプライマーに用いたPCRを行った。この遺伝子断片をpUC19のHindIIIサイトに導入した。これを鋳型として、revL領域を除くようにrevLXhoFとrevLXhoRプライマーを用いてPCRを行い、DpnI処理、XhoI切断の後にセルフライゲーションを行った。RevLが破壊された領域を持つ遺伝子断片をHindIIIで切断し、pIM破壊ベクターのHindIIIサイトに導入した。下線部は相同組み換えに利用した相同配列である。下線部は制限酵素認識配列である。遺伝子相補プラスミド作製破壊した遺伝子の機能相補を確認するために、aphIIプロモーターEcoRI、BamHI断片にrevG遺伝子BamHIHindIII断片を連結したDNAを作製し、染色体へのDNA組み込み機能を有するpTYM19ベクターJAntibiot569506に導入した。具体的には、aphIIプロモーターを含む断片をTn5から下記配列番号75と76のプライマーを用いて増幅し、pTYM19に組みこんだ。得られたpTYM19aphIIをBamHIとHindIIIで消化し、ここに下記配列番号77と78のプライマーで11A02から増幅したrevG断片を組み込んで、revG相補用ベクターを構築した。下線部は制限酵素認識配列である。破壊したrevE、revK、revLおよびrevM遺伝子の機能相補の確認を行った。aphIIプロモーターEcoRI、BamHI断片にrevL遺伝子BamHI、HindIII断片を連結したDNAを作製し、染色体へのDNA組み込み機能を有するpTYM19ベクターJAntibiot569506に導入した。pTYM19aphIIをBamHIとHindIIIで消化し、ここに下記配列番号93RevLBamFCGCGGATCCATGAACGAATCACTGGCTCTGGTCと94RevLHindRCCCAAGCTTTCAGTAGATGCCCTCCGGGGCGTTプライマーで11A02から増幅したrevL断片を組み込んで、revL相補用ベクターを構築した。また、pTYM19をEcoRIとHindIIIで消化し、ここに下記配列番号95RevKEcoFCCGGAATTCCACCGGGATGGTGACCTCCACと96RevNHindRCCCAAGCTTTCACGTGTGTTGCGTCCAGGCTTCプライマーで11A02を鋳型として増幅した内生のプロモーターを有するrevK、revM遺伝子を組み込み、revKおよびrevM相補用ベクターを構築した。また、破壊したrevE遺伝子の機能相補を確認するために、pTYM19aphIIをBamHIとHindIIIで消化し、ここに下記配列番号97RevEBamFCGCGGATCCATGGACATCACCGCAGCAGTGATCと98RevEHindRCCCAAGCTTTCACCGGTGCGTGAGCACCACCTTプライマーで11A02から増幅したrevE断片を組み込んで、revE相補用ベクターを構築した。接合伝達法による遺伝子導入破壊遺伝子導入は大腸菌からリベロマイシン生産菌への接合伝達法により行った。大腸菌はGM2929hsdSTn10ProcNatlAcadSciUSA1072646を使用し、接合伝達ベクターは、pKU250ProcNatlAcadSciUSA1072646からBamHIKpnI領域を除くことにより最適化を行ったpIMベクターを使用した。遺伝子破壊ベクターを有する大腸菌の選別には、カナマイシン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン及びスペクチノマイシンを含むLB培地を利用した。遺伝子相補ベクターを有する場合には、カナマイシンの代わりにアンピシリンを用いた。リベロマイシン生産菌の胞子を調製し、SY培地で28°C、4時間培養後、遺伝子破壊ベクターを含む大腸菌GM2929hsdSTn10と50:1の割合で混合し、MS2マンニットール25mMMgCl22寒天プレート上に植菌した。28°C、20時間培養後、終濃度で20μgml1チオストレプトン、5μgml1カルモナムを添加し、更に1週間培養を進めた。遺伝子相補の場合には、チオストレプトン耐性のクローンを選別で形質転換が完了するが、遺伝子破壊の場合には、更に04μgml1のリボスタマイシンを含むMSプレートで二次選別を行った後、得られた耐性クローンを薬剤を含まないSY培地で液体培養、MSプレート上で胞子形成を行い、単一の胞子から得られたコロニーを調製し、リボスタマイシン耐性、チオストレプトン感受性のクローンを選別した。遺伝子破壊検証遺伝子破壊株の確認にはサザンハイブリダイゼーション解析を行った図3b。PrimeSTARHSDNApolymeraseを用いて各プローブ調製を行った。反応は、98°C10秒25サイクル98°C10秒後67°C5秒68°C25分の25サイクルPCR反応、又は98°C10秒後98°C10秒67°C5秒68°C40秒の25サイクルPCR反応を行った。増幅したDNA断片はゲル切り出し精製し、AlkPhosDirectLabellingReagentsにより標識を行った。遺伝子破壊株からの代謝産物の抽出野生株及び遺伝子破壊株をSY培地で2日間培養を行った。その後、前培養液1mlをRMPM培地に植菌し更に5日間培養を行った。その後、等量のアセトンを加え撹拌後、アセトンを除去し、酢酸でpHを4に調整し、等量の酢酸エチルを添加して抽出を2回行った。その後、酢酸エチルを除去し、メタノール20mlに溶解し、LCMSにて解析を行った。ESIMS解析は、マススペクトロメーターを装備したWatersAllianceHPLCシステムを用いた。HPLCは、A溶媒:005ギ酸水溶液、B溶媒:アセトニトリル、XTerra商標MSC185μmカラムを用いて、流速02mlmin1で解析を行った。30B溶媒で平衡化されたカラムに試料をロード後、20分間で30から100B溶媒のリニアグラジエント溶出を行い、さらに20分間100B溶媒で溶出を行った。マススペクトルはESIネガティブモードで解析を行った。<結果>orf破壊株、およびorf1破壊株を解析した結果、これらの株はいずれもリベロマイシン類の生産において野生株と変わらなかった。したがって、これらの遺伝子はリベロマイシン生合成系に関与していないことが考えられた。ΔrevCΔrevD2重変異株ではリベロマイシンAの生成が見られなかったことから、revCおよびrevDはリベロマイシンAの生合成に関与していることが考えられた。しかし、ΔrevCΔrevD2重変異株にRMA1aを加えたところ、リベロマイシンAを生成したことから、revCおよびrevDはRMA1aより上流の反応に関与することが示唆された図2。RevA、RevB、RevC、RevD遺伝子産物は、それぞれポリケチドシンターゼPKSとして機能することが確認された。一方、ΔrevG株では、リベロマイシンAは生成せず、RMA1aが蓄積した図3d、g。そして、ΔrevG株においてrevGを相補すると、リベロマイシンAが生成した図3e、h。したがって、revGはRMA1aとリベロマイシンAの間の反応に関与することが考えられた。なお、RMA1aはC18HPLCを用い、アセトニトリル005蟻酸水溶液で精製した。RMA1eは、ΔrevG株を5日以上培養することによって得られた。RMA1eはC18HPLCを用い、アセトニトリル005蟻酸水溶液で精製した。また、ΔrevGをrevG遺伝子で相補した株を70mlのSY培地で28°C、2日間培養したロータリーシェーカー、150rpm。1mlの全培養液を70mlのRMPM培地に加え、5日間培養した。全5lの培養液を抽出し、25gの粗抽出物を得た。これをSiO2カラムクロマトグラフィーにかけ、クロロホルム/メタノールの段階的濃度勾配により溶出させた。9画分を得た。chloroformmethanolで溶出した画分をC18HPLCmethanol005蟻酸水溶液で精製して971mgのRMTを得た。このRMTはΔrevCΔrevD株では効率的にリベロマイシンAに変換され、RMTは生合成中間体であることが示唆された。図4より、ΔrevHΔrevI二重遺伝子破壊株は、主中間産物としてRMA1aRMA2a同時に微量のRMA3aRMA3bを蓄積するフェノタイプを示した。これに対し、revIを再導入した株では、ΔrevHΔrevI二重遺伝子破壊株と同様なフェノタイプを示したが、revHを再導入した株revI破壊株ではRMTが蓄積した。このことから、RevI遺伝子産物はRMTヒドロキシラーゼとして作用し、revI破壊株は、RM安定誘導体であるRMT生産株として有用であることが判明した。大腸菌を用いて、RevS蛋白質を異種発現し精製することにより、機能を推定したところ、不飽和脂肪酸に特異的なCoAリガーゼであることが判明した。放線菌StreptomyceslividansTK23を用いてRevT蛋白質を異種発現し精製し、生化学的機能を推定したところ、トランス2ヘキセノイルCoAやトランス‐2-オクテノイルCoAを基質として、ブチルマロニルCoAやヘキシルマロニルCoAを生成することが判明した。大腸菌を用いて、RevH、RevN蛋白質を異種発現し精製することにより、RevNは、RevHのバイアービリガー酸化酵素により生成したエステル結合を切断するエステラーゼであることが判明した。revKrevLrevMの遺伝子機能解析結果3級水酸基へのヘミサクシニネートの構築は困難であり、有機化学的には、15000気圧という超高圧下での反応が行われているが、リベロマイシン生産菌は常温常圧下で生合成反応を行う事が出来る。C18hydroxyRMTからRMAを生成するヘミサクシニネート化機構を明らかにするためにrevKrevLrevMの各遺伝子破壊解析を行った。遺伝子破壊とサザンハイブリダイゼーションによる確認結果を図12に示す、ΔrevL、ΔrevM。次に、revKrevL及びrevM遺伝子破壊株に蓄積する生合成中間産物の解析を行った。機能未知のrevK遺伝子の破壊株には、主にmz559MHのC18hydroxyRMT及びRMT1の56spiroacetal体が蓄積した。また、マイナー産物として、RMT1とRMT2の水酸化体と予想されるmz575MHの2つのピークが検出された。更に、遺伝子破壊株にrevK遺伝子を再導入すると、RMA生産が回復することが確認できた。機能未知のrevL遺伝子の破壊株には、revK破壊株と同様に、主にmz559MHのRMT1及びRMT2が蓄積し、マイナー産物として、mz575MHの2つのピークが確認された。更にrevL遺伝子を相補する事によってRMA生産が回復する事が確認出来た。RevK及びRevL破壊株に蓄積する代謝産物が同一であることから、RMT1以後の反応に二つの酵素が必要であることが示唆された。また、相補株中に、mz675MHを示す新規類縁体が見出された。機能未知のrevM遺伝子の破壊株は、RMT1T2T3T4に加え、mz657のRM誘導体を生産した。また、revM遺伝子を導入する事によってRMA生産が回復する事を確認出来た。RevMは、NADPHを補酵素としてRMHを還元することでRMAを生成する酵素であることが示唆された。以上の遺伝子破壊解析から、revK及びrevLはRMT1へのフマル酸転移に関わる新規酵素であることが判明した。revE遺伝子の遺伝子機能解析結果revE遺伝子破壊とサザンハイブリダイゼーションによる確認結果を図14abに示す。ΔrevE株では、リベロマイシンAは生成せず、主産物としてmz529MHのRMA6a時間経過的にmz645MHのRMA9aが蓄積した図14d。そして、ΔrevE株においてrevEを相補すると、リベロマイシンAが生成した図14e。したがって、revEはRMA6aとリベロマイシンAの間の反応に関与することが判明した。2.リベロマイシン類の大量生産系の構築RM類の生産増強のための遺伝子導入には、接合伝達法を行った。構成的発現のために、接合伝達ベクターpTYM19のプロモーターをaphII遺伝子に置き換え、その下流に発現にさせる遺伝子を組み込んだ。大腸菌は、GM2929hsdSTn10を使用し、選別には、アンピシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン及びスペクチノマイシンを含むLB培地を利用した。リベロマイシン生産菌の胞子を調製し、SY培地で28°C、4時間培養後、接合伝達ベクターを含む大腸菌と50:1の割合で混合し、MS2プレート上に植菌した。28°C、20時間培養後、終濃度でチオストレプトン20μgml1、カルモナム5μgml1を添加し、1週間培養を行い、チオストレプトン耐性形質転換株を選別した。野生株、revQ遺伝子破壊株、及び遺伝子導入株をSY培地で2日間培養を行った。その後、前培養液1mlをRMPM培地に植菌し更に5日間培養を行った。その後、等量のアセトンを加え撹拌後、アセトンを除去し、酢酸でpHを4に調整し、等量の酢酸エチルを添加して抽出を2回行った。その後、酢酸エチルを除去し、メタノールに溶解し、LCMS解析を行った。通常SspSN593株が生産するRM類RMAは、SY培地では12mgL1程度であるが、高生産培地では、RM類の生産量は150200mgLである図5C。revQ遺伝子破壊ではRM類の生産能を失ったが、破壊株にrevQ遺伝子を相補することで、RM類の生産が野生株レベルに回復した。このことから、RevQは転写制御に重要であることが判明した。更に、野生株にrevQ遺伝子を構成的に発現させることによりRM類の生産量は約1gL1の生産量に増大した。3.スピロケタール環化酵素の同定revG遺伝子の大腸菌異種発現ベクター作製revG遺伝子を含む鋳型フォスミド11A02、下記のプライマー、およびPrimeSTARHSDNApolymeraseを用い、98°C10秒後、98°C10秒62°C5秒68°C15分の25サイクルPCR反応を行った。5GGAATTCCATATGACGCGACGACTCGACGGTAAG3配列番号795CCGCTCGAGTTACGGGGTGGTGAAGCCGGCGTC3配列番号80得られた822bpのrevG遺伝子断片を制限酵素NdeI及びXhoIで切断後、大腸菌異種発現に用いるpET28bbポリヒスチジン融合タンパク質発現ベクター:Novagenに導入しpET28brevGを作製した。RevGの大量発現と酵素の精製EcoliBL21Star商標にpET28brevGを導入した。カナマイシンを含むTB培地中で、OD600が05になるまで28°C培養し、05mMIPTGを添加して遺伝子発現を誘導した。7時間28°Cで培養後、大腸菌を遠心分離により回収した。その後、05mgリゾチームml1及び125Uベンゾナーゼを含む20ml緩衝液A500mMNaCl5mMイミダゾール10グリセロールに懸濁し超音波破砕を行った。遠心分離後、上清をNiNTAカラムに添着した。その後、02Tween20を含む緩衝液A、40mMイミダゾールを含む緩衝液Aで洗浄後、250mMイミダゾールを含む緩衝液AでRevGを溶出した。その後、緩衝液B100mMNaCl1mMDTT10緩衝液で透析を行い、アミコンウルトラセル30Kで濃縮し精製酵素RevGを調製した。RevG反応産物の解析以下の最適化条件でスピロケタール環化酵素RevG反応を行った。50mMglycineNaOH1mMDTT1mMNAD10glycerol005mMRMA1aを含む溶液を30°Cで5分保温したのちに、28pmol精製酵素を添加し反応を開始した。インキュベーション後43μlアセトニトリルを添加して反応を停止した。20000×g遠心分離後に上清を回収し反応産物をLCESIMSにて解析した。反応産物をSepPakPLUSC18columnにかけ、30アセトニトリルで洗浄後、100アセトニトリルで溶出して反応産物を得た。その結果、図6a、c、dに示すように、反応1分ではRMA2aが生成し、反応10分ではRMA3a及びRMA3bが生成した。このことから、非環化状態のRMA1aから、反応中間体RMA2a、さらに不安定中間体C15dehydroRMA2aを経由して酸性HPLC条件下、スピロケタール環を有するRMA3a及びRMA3bに変換されることが判明した。なお、RMA1a、RMT、RMA2a、RMA3aおよびA3bのNMRチャートを図7~10に示した。4.RevJの大量発現と機能解析revJ遺伝子の大腸菌異種発現ベクター作製revJ遺伝子を含む鋳型フォスミド11A02、下記のプライマー、およびPrimeSTARHSDNApolymeraseを用い、98°C10秒後、98°C10秒62°C5秒68°C15分の25サイクルPCR反応を行った。5GGAATTCCATATGGTGACCGAGACCGAACAGCTC3配列番号815CCGCTCGAGTCAGACCCGGGTGAGGTCGAC3配列番号82得られたrevJ遺伝子断片を制限酵素NdeI及びXhoIで切断後、大腸菌異種発現に用いるpET28bbポリヒスチジン融合タンパク質発現ベクター:Novagenに導入しpET28brevJを作製した。RevJの大量発現と酵素の精製EcoliBL21Star商標にpET28brevJを導入した。カナマイシンを含むTB培地中で、OD600が05になるまで28°C培養し、05mMIPTGを添加して遺伝子発現を誘導した。7時間28°Cで培養後、大腸菌を遠心分離により回収した。その後、05mgリゾチームml1及び125Uベンゾナーゼを含む20ml緩衝液A500mMNaCl5mMイミダゾール10グリセロールに懸濁し超音波破砕を行った。遠心分離後、上清をNiNTAカラムに添着した。その後、02Tween20を含む緩衝液A、40mMイミダゾールを含む緩衝液Aで洗浄後、250mMイミダゾールを含む緩衝液AでRevJを溶出した。その後、緩衝液B100mMNaCl1mMDTT10緩衝液で透析を行い、アミコンウルトラセル30Kで濃縮し精製酵素RevJを調製した。RevGRevJ反応産物の解析RevGとRevJカップリング反応を以下の組成で行った。50mMTrisHCl1mMDTT2mMNAD1mMNADPH50μMFAD005mMRMA1a296nmol精製RevG及び293nmol精製RevJを含む溶液を30°Cで20分反応した。20000×g遠心分離後に上清を回収し反応産物をLCESIMSにて005ギ酸存在下図6fと非存在下図6eで解析した。その結果、RevJが存在する場合のみ、最終生合成産物のスピロアセタール構造と一致する15S体のみが生成することから、RevJは立体制御因子であることが判明した。5.動物細胞に対する増殖阻害活性の測定HL60細胞ヒト急性前骨髄性白血病細胞株、K562細胞ヒト慢性骨髄性白血病細胞株は,RPMI1640mediumInvitrogen製に10FetalBovineSerumNichirei製、05penicilinstreptomycin溶液を添加した培地中、37°C、5CO2の湿気中培養下で維持した。tsFT210細胞マウス乳がん細胞CDC2温度感受性株は,RPMI1640mediumInvitrogen製に5calfserumHyclone製、05penicilinstreptomycin溶液を添加した培地中、32°C、5CO2の湿気中培養下で維持した。HL60細胞、K562細胞は96穴プレートIWAKI製に15×104cellswell100μlとなるように播種した。tsFT210細胞は96穴プレートに16×104cellwell100μlとなるように播種した。表5の各薬剤を05vvで添加し、HL60細胞、K562細胞を37°C、5CO2の湿気中培養下、tsFT210細胞を32°C、5CO2の湿気中培養下で維持した。薬剤添加から48時間後に、生細胞数測定試薬SF溶液WST8試薬、Nakaraitesque製を各ウェルに10μl添加し、HL60細胞、K562細胞を37°C、5CO2の湿気中培養下で30分、tsFT210細胞を32°C、5CO2の湿気中培養下で1時間維持した。反応後、マイクロプレートリーダーPerkinElmer製を用いて、450nmの吸光度を測定し、測定値から細胞増殖率を求めた。6.大腸菌に対する増殖阻害活性の測定大腸菌HO141株は、05Polypeptone、05MeatExtract、03NaCl、0001SodiumDodecylSulfateSDSの培地中、37°Cで前培養した。600nmの吸光度を測定し、吸光度が0005となるように調製した大腸菌溶液を、96穴プレートに100μlずつ播種した。表5の各薬剤を05vvで添加し、37°Cで維持した。薬剤添加から6時間後に、マイクロプレートリーダーPerkinElmer製を用いて、600nmの吸光度を測定し、測定値から増殖率を求めた。7.酵母に対する増殖阻害活性の測定出芽酵母MLC30M株は、2Polypeptone、1YeastExtract、2Glucose、002Adenine、0001SodiumDodecylSulfateSDSの培地中、30°Cで前培養した。吸光度を測定し、吸光度が005となるように調製した酵母溶液を、96穴プレートに100μlずつ播種した。表5の各薬剤を05vvで添加し、30°Cで維持した。薬剤添加から18時間後に、マイクロプレートリーダーPerkinElmer製を用いて、600nmの吸光度を測定し、測定値から増殖率を求めた。8.破骨細胞に対する生存阻害活性の測定5週齢雄ddYマウス日本SLC製の大腿骨および脛骨から骨髄細胞を採取し、αMEMmediumSigmaAldrich製に10fetalbovineserum、05penicilinstreptomycin溶液、50ngmlhumanMCSFロイコプロール、協和発酵製、1ngmlhumanTGFβ1RDSystems製を添加した培地中、タイプIコラーゲンコートプレートIWAKI製に播種し、37°C、5CO2の湿気中培養下で3日間維持した。その後、細胞をPBSで2回洗浄後、プレートに接着している細胞を骨髄マクロファージ細胞として使用した。骨髄マクロファージ細胞を、さらにαMEMmediumに10fetalbovineserum、05penicilinstreptomycin溶液、50ngmlhumanMCSF、50ngmlhumansolubleRANKLPeprotech製を添加した培地中、37°C、5CO2の湿気中培養下で3日間維持し、破骨細胞へ分化させた。破骨細胞に表5の各薬剤を05vvで添加し、37°C、5CO2の湿気中培養下で24時間維持した。その後、細胞を37formalinを含むPBS溶液で室温下30分反応させ、溶液を除去後、さらにacetoneethanol溶液11volvolで室温下1分反応させ、溶液を除去して乾燥させた。固定化細胞にTRAP溶液50mMsodiumtartrate、90mMsodiumacetate、001naphtholASMXphosphateSigma製、005fastredvioletLBsaltSigma製、pH50で室温下30分反応させ、その後蒸留水で洗浄した。TRAP陽性多核破骨細胞数をカウントし、生存率を求めた。9.イソロイシルtRNA合成酵素に対する阻害活性の測定酵素反応溶液20mMimidazolepH75、75mMMgCl2、05mMDTT、1UmltRNAEcoli由来、Sigma製、3mMATP、1μMisoleucine、10μCiml3HisoleucineGEHealthcare製、10μgproteinHT1080celllysateに、表5の各薬剤を1vvで添加し、合計量100μlで25°C、20分間反応させた。その後、1mgmlBSA溶液400μlおよび10TCA溶液500μlを添加して反応を止め、4°Cで一晩静置させた。遠心操作で得た沈殿物をGFCフィルターWhatman製上に移し、5TCA溶液で3回洗浄後、フィルターを乾燥させた。バイアルに2mlaquasol2PerkinElmer製とフィルターを入れ、激しく攪拌後、3Hisoleucine量を液体シンチレーションカウンターBeckman製で測定し、酵素活性率を求めた。結果と考察上記5~9の結果を表5にまとめた。その結果、RMTはRMAに比べより高い癌細胞増殖阻害活性と標的分子IRSに対する酵素阻害活性を示した。このことから、RMTはRMAよりも強い抗癌作用を発揮することが期待される。また、RMTメチルエステル、RMTエチルエステル、およびRMEも高い癌細胞増殖阻害活性を示した。さらに、RMTは酵母に対する増殖阻害作用を示し、抗真菌剤として使用できることが分かった。さらに、RMEは破骨細胞に対する生存阻害作用を示し、骨疾患治療剤として使用できることが分かった。なお、表5の各化合物は以下のようにして調製した。RMEの調製野生株をSY培地で2日間培養後、前培養液1mlをRMPM培地に植菌し、更に5日間培養を行った。その後、計3Lの培養液に対して等量のアセトンを加え撹拌後、アセトンを除去し、酢酸でpHを4に調整し、等量の酢酸エチルを添加して抽出を2回行った。その後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、クロロホルムメタノール画分を回収し、C18HPLCアセトニトリル:005ギ酸=4753により849mgを精製した。RMA2bの調製野生株をSY培地で2日間培養後、前培養液200mlをRMPM培地に植菌しジャーファーメンターで4日間培養を行った。その後、等量のアセトンを加え撹拌後、アセトンを除去し、酢酸でpHを4に調整し、等量の酢酸エチルを添加して抽出を2回行った。C18MPLCクロマトグラフィー後、PegasilODSを用いて005ギ酸アセトニトリル55100グラジェント溶出を行い、033mgを精製した。SFASFBの調製OrgLett2005755735576清水らにより合成された。RMTethylester及びRMTmethylesterの調製野生株をSY培地で2日間培養を行った。その後、前培養液1mlをRMPM培地に植菌し培養を行った。3日後、終濃度で1になるようにエタノールを加え、さらに2日間培養を行った。その後、合計14Lの培養液に等量のアセトンを加え撹拌後、アセトンを除去し、酢酸でpHを4に調整し、等量の酢酸エチルを添加して抽出を2回行った後、酢酸エチルを除去し、12gの粗画分を得た。ヘキサン酢酸エチル酢酸溶媒を用いてシリカゲルカラムクロマト後にC18HPLC精製を行いRMTethylesterを得た。RMTmethylesterの調製は、上記と同様であるが、エタノールの代わりにメタノールを添加して培養した。RMA8aの調製RevHの大量発現と機能解析revH遺伝子の大腸菌異種発現ベクター作製大腸菌による異種発現を容易にするために、revH遺伝子はオペロンバイオテクノロジー株式会社の人工遺伝子合成サービスにより配列を最適化して合成した。合成した配列制限酵素配列を含むを配列番号99に示す。合成されたrevH遺伝子断片を制限酵素NdeI及びXhoIで切断後、大腸菌異種発現に用いるpET28bポリヒスチジン融合タンパク質発現ベクター:Novagenに導入しpET28brevHを作製した。RevHの大量発現と酵素の精製EcoliBL21StarにpET28brevHを導入した。カナマイシン50μgml-1を含むTB培地中でOD600が15になるまで37°Cで培養1lし、01mMIPTGを添加して遺伝子発現を誘導した。16時間18°Cで培養後、大腸菌を遠心分離により回収した。その後LysisBufferに懸濁し、超音波破砕を行った。遠心分離後、上清をNiNTA2×2cmカラムに吸着した。その後、50mMTrisHCl01MNaCl20mMイミダゾール20グリセロールで洗浄後、50mMTrisHCl01MNaCl250mMイミダゾール20グリセロールで溶出した。その後アミコンウルトラセル30Kを用い、50mMTrisHCl01MNaClでバッファー交換後、濃縮しRevHの精製酵素を調製した。RMA8aの調製以下の反応溶液組成でRMA8aを調製した。50mMTrisHCl05mMDTT1mMNAD07mMNADPH01mMFAD004mMRMA1a100nmol精製RevG及び31nmol精製RevHを含む溶液30mlを30°Cで150分間反応した。次に20nmolの精製RevJを添加しさらに30°Cで120分間反応を行った。反応終了後反応溶液を等量の酢酸エチルで2回抽出し、硫酸ナトリウムで脱水した後、酢酸エチルをエバポレーターで溜去した。残渣をメタノールに溶解し、HPLCに供し、分取した。溶出は85アセトニトリル、流速8mlmin1で行い、溶出時間は25分であった。さらにアセトニトリル水をエバポレーターで溜去し、約03mgのRMA8aを得た。RMA6a、RMA9aの調製RMA6aとRMA9aはrevE破壊株により生産される図14。revE遺伝子破壊株をSY培地で2日間培養を行った後、この前培養液1mlをRMPM培地に植菌し本培養を5日間行った。合計5Lの培養液に等量のアセトンを加え代謝産物の抽出、アセトン除去、酢酸でpHを4に調整を行った。次に、等量の酢酸エチルを添加して3回抽出を行い、酢酸エチルを除去し3gの粗画分を得た。その後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、クロロホルムメタノール画分を回収し、C18HPLC精製を行った。更にC18HPLCにより69mgのRMA6aを精製した。RMA6aと同一の粗画分から、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、クロロホルムメタノール画分を回収し、C18HPLC精製によりRMA9aを含む画分130mgを得た。更にこれをC18HPLC精製により18mgのRMA9aを精製した。"