"spnK遺伝子において3’-O-メチルトランスフェラーゼ活性を消失させる改変を生成することを含む、スピノサド生成菌株を、スピネトラム前駆体生成菌株へと転換するプロセス。前記改変が、インフレーム欠失、点突然変異、欠失、および挿入からなる群から選択される、請求項1に記載のプロセス。前記インフレーム欠失が、5’末端のインフレーム欠失、3’末端のインフレーム欠失、およびspnKコード領域のインフレーム欠失からなる群から選択される、請求項2に記載のプロセス。前記欠失が、spnK遺伝子の正常なリーディングフレームを破壊する、単一または複数のヌクレオチド塩基の欠失である、請求項2に記載のプロセス。前記挿入が、spnK遺伝子の正常なリーディングフレームを破壊する、単一または複数のヌクレオチド塩基の挿入である、請求項2に記載のプロセス。前記点突然変異が、spnK遺伝子の活性部位または基質結合部位におけるアミノ酸置換を結果としてもたらす、請求項2に記載のプロセス。前記点突然変異が、528、589、602、668、721、794、862、895、908、937、および1131位からなる群から選択される塩基対位置において生じる、請求項2に記載のプロセス。前記点突然変異が、化学的突然変異誘発の結果として生じる、請求項2に記載のプロセス。前記spnK遺伝子が、アンチセンス技術の使用を介して失効化される、請求項1に記載のプロセス。前記改変が、spnKコード領域内で生じる、請求項1に記載のプロセス。spnK遺伝子において3’-O-メチルトランスフェラーゼ活性を消失させる改変を生成することを含む、スピネトラム前駆体を生成させる遺伝子改変宿主細胞であって、正常では著しい量のスピネトラム前駆体を生成させない原核宿主細胞である、遺伝子改変宿主細胞。スピノシンJおよびLの生成を維持しながら、spnK遺伝子を失効化させることを含む、スピノサド生成菌株を、スピネトラム前駆体生成菌株へと転換する方法。spnK遺伝子の前記失効化が、インフレーム欠失、点突然変異、欠失、および挿入からなる群から選択される、請求項12に記載の方法。spnK遺伝子の前記失効化が、リボソーム結合部位を操作することにより引き起こされる、請求項12に記載の方法。前記リボソーム結合部位が、spnKシャイン-ダルガルノ配列である、請求項14に記載の方法。spnK遺伝子の前記失効化が、spnK遺伝子のプロモーターを操作することにより引き起こされる、請求項12に記載の方法。前記プロモーターが、spnJ遺伝子のプロモーターと共に共転写される、請求項16に記載の方法。前記インフレーム欠失が、5’末端のインフレーム欠失、3’末端のインフレーム欠失、およびspnKコード領域のインフレーム欠失からなる群から選択される、請求項13に記載の方法。前記欠失が、spnK遺伝子の正常なリーディングフレームを破壊する、単一または複数のヌクレオチド塩基の欠失である、請求項13に記載の方法。前記点突然変異が、spnK遺伝子の活性部位または基質結合部位におけるアミノ酸置換を結果としてもたらす、請求項13に記載の方法。スピノシン化合物の生成における難題は、極めて少量のスピノシンをもたらすのに、極めて大量の発酵容量が必要とされるという事実から生じる。スピノシン生成の効率を上昇させ、これにより、それらの費用を削減しながら、スピノシンの回収可能性を増大させることが極めて望ましい。また、異なるスペクトルの殺虫活性を示しうる、新規のスピノシン誘導体を生成させる方法をもたらす、クローニングされた生合成遺伝子を提供すれば有利であろう。既知のスピノシンは、広範なスペクトルにわたる昆虫を阻害するが、全ての有害生物をコントロールするわけではないため、新規の誘導体が所望される。異なるパターンのコントロールは、スピノシンの生合成中間体を介してもたらすこともでき、invivoにおいて生成させるそれらの誘導体を介してもたらすこともでき、invitroにおけるそれらの化学修飾から結果として得られる誘導体を介してもたらすこともできる。また、スピノシン生合成のための酵素をコードする特定の遺伝子の部分が、invitroにおいて特異的に突然変異させた同じ遺伝子の部分で置換されているか、または他の生物に由来する遺伝子の対応する部分で置換されている、サッカロポリスポラスピノーサSspinosaの突然変異体菌株により合成される新規の中間体を提供することも有利であろう。本発明は、スピノシンAおよびスピノシンDなどのスピノサド生成菌株を、スピノシンJおよびスピノシンLなどのスピネトラム前駆体生成菌株へと転換するプロセスを提供する。このようなプロセスは、spnK遺伝子において3’-O-メチルトランスフェラーゼ活性を消失させる改変の生成を包含しうる。改変は、インフレーム欠失、突然変異、置換、欠失、挿入などを介して引き起こすことができる。インフレーム欠失は、遺伝子全体にわたることが可能であり、5’末端の欠失、3’末端の欠失、およびspnKコード領域の欠失を包含しうる。このようなインフレーム欠失の1つには、配列番号9が含まれうる。点突然変異には、528、589、602、668、721、794、862、895、908、937、および1131位の塩基対における突然変異が含まれうるがこれらに限定されない。これらの突然変異は、spnK遺伝子の翻訳に変化をもたらしうる。このような変化は、アミノ酸の変化の場合もあり、アミノ酸の置換の場合もあり、停止コドンの創出の場合もある。このような改変は、スピノシンAおよびスピノシンDと比較して、スピノシンJおよびスピノシンLによるスピノシン化合物の生成を結果としてもたらす。本発明の特定の方法は、スピノシンJおよびスピノシンLの生成を維持しながら、spnK遺伝子を失効化させることを介して、スピノサド生成菌株を、スピネトラム前駆体生成菌株へと転換することを包含する。正常なspnKタンパク質活性の失効化または破壊は、インフレーム欠失、突然変異、置換、欠失、挿入などを介して生じうる。正常なspnKタンパク質活性の失効化または破壊はまた、プロモーター配列またはリボソーム結合部位配列に対する操作によっても引き起こされうる。本発明は、スピネトラム前駆体を生成させる遺伝子改変宿主細胞をさらに提供する。この遺伝子改変宿主は、spnK遺伝子を改変して3’-O-メチルトランスフェラーゼ活性を消失させることにより生成させることができる。改変は、インフレーム欠失、突然変異、置換、欠失、挿入などを介して引き起こすことができる。インフレーム欠失には、5’末端の欠失、3’末端の欠失、およびspnKコード領域の欠失が含まれうる。本発明はまた、spnK遺伝子を改変して3’-O-メチルトランスフェラーゼ活性を消失させることを介して、スピノサド生成菌株を、スピネトラム前駆体生成菌株へと転換するプロセスも提供する。このプロセスは、インフレーム欠失、点突然変異、欠失、および挿入を包含しうる。このようなインフレーム欠失には、5’末端のインフレーム欠失、3’末端のインフレーム欠失、およびspnKコード領域のインフレーム欠失が含まれうる。欠失には、spnK遺伝子の正常なリーディングフレームを破壊する、単一または複数のヌクレオチド塩基の欠失が含まれうる。挿入には、spnK遺伝子の正常なリーディングフレームを破壊する、単一または複数のヌクレオチド塩基の挿入が含まれうる。点突然変異は、528、589、602、668、721、794、862、895、908、937、および1131位の塩基対において生じうる。これらの点突然変異は、spnK遺伝子の活性部位または基質結合部位におけるアミノ酸置換を結果としてもたらしうる。本発明はまた、spnK遺伝子において3’-O-メチルトランスフェラーゼ活性を消失させる改変を生成することにより、スピネトラム前駆体を生成させる遺伝子改変宿主細胞であって、正常では著しい量のスピネトラム前駆体を生成させない原核宿主細胞である遺伝子改変宿主細胞も包含する。他の実施形態は、スピノシンJおよびスピノシンLの生成を維持しながら、spnK遺伝子を失効化させることにより、スピノサド生成菌株を、スピネトラム前駆体生成菌株へと転換する方法を包含する。このような方法は、インフレーム欠失、点突然変異、欠失、および挿入を包含しうる。このようなインフレーム欠失には、5’末端のインフレーム欠失、3’末端のインフレーム欠失、およびspnKコード領域のインフレーム欠失が含まれうる。欠失には、spnK遺伝子の正常なリーディングフレームを破壊する、単一または複数のヌクレオチド塩基の欠失が含まれうる。挿入には、spnK遺伝子の正常なリーディングフレームを破壊する、単一または複数のヌクレオチド塩基の挿入が含まれうる。点突然変異は、528、589、602、668、721、794、862、895、908、937、および1131位の塩基対において生じうる。これらの点突然変異は、spnK遺伝子の活性部位または基質結合部位におけるアミノ酸置換を結果としてもたらしうる。spnK遺伝子を失効化させる他の方法は、リボソーム結合部位を操作することにより行う場合もあり、spnK遺伝子のプロモーターを操作することにより行う場合もある。クローニングされたサッカロポリスポラスピノーサSaccharopolysporaspinosaのDNAには、多くの使用がなされている。これらのクローニングされた遺伝子を用いて、スピノシンの収率を改善し、新規のスピノシンを生成させることができる。特定の菌株のゲノム内に、どのような酵素であれ、その菌株において律速的である酵素の遺伝子の複製コピーを組み込むことにより、収率の改善を得ることができる。必要とされる酵素が欠如するために、特定の突然変異体菌株において生合成経路が遮断される場合には、必要とされる遺伝子のコピーを組み込むことにより、所望のスピノシン生成を回復させることができる。生合成経路が破壊されている場合には、異なる前駆体菌株を創出することができる。より具体的には、spnK遺伝子を破壊すると、スピノシンAおよびスピノシンDの生成と比較して、スピノシンJおよびスピノシンLの生成が結果としてもたらされうる。クローニングされたDNAの断片を用い、スピノシンの生合成ステップを破壊して、新規のスピノシンを生成させることができる。このような破壊は、前駆体またはシャント生成物前駆体の天然生成誘導体の蓄積をもたらしうる。破壊を実行するのに有用な断片は、遺伝子の5’末端および3’末端の両方、ならびに遺伝子の全体から塩基を削除した、遺伝子内部の断片である。このような断片を用いる相同組換えイベントは、遺伝子の2つの部分コピー:削除された塩基が5’末端から逸失している部分コピー、および削除された塩基が3’末端から逸失している部分コピーを結果としてもたらす。断片の各末端において削除される塩基数は、遺伝子の部分コピーのいずれもが活性を保持しないよう、十分に多数でなければならない。本明細書では、以下の定義を用いるが、特許請求の範囲および明細書を解釈する場合に参照されるべきである。別段に言及しない限り、本明細書で参照される米国特許および米国特許出願は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。本発明の要素または構成要素に前置される不定冠詞のあるaおよびあるanは、この要素または構成要素の場合の数すなわち、出現数に関して非制限的であることを意図する。したがって、あるaまたはあるanは、1または少なくとも1を包含すると読まれるべきであり、また、要素または構成要素の単数語形も、その数が明らかに単数を意味するのでない限り、複数を包含する。本明細書で用いられる含むおよび包含するという用語は、特許請求の範囲において言及される特徴、整数、ステップ、または構成要素の存在を意味するが、1または複数の他の特徴、整数、ステップ、構成要素、またはこれらの群の存在または付加を除外するものではない。これは、組成物、混合物、プロセス、方法、製品、または装置が含むかまたは包含する要素のリストが、これらの要素だけに限定されるものではなく、顕示的に列挙されているわけでもなく、それに固有であるわけでもない他の要素も包含しうることを意味する。本明細書で用いられるまたはとは、包含的なまたはおよび除外的なまたはを指す。例えば、AまたはBという条件は、以下:Aが真でありまたは存在し、かつ、Bが偽であるまたは存在しない、Aが偽でありまたは存在せず、かつ、Bが真であるまたは存在する、ならびにAおよびBのいずれもが真であるまたは存在するのうちのいずれか1つにより満たされる。本明細書で用いられる約という用語は、本発明の、または用いられる成分または試薬の量を修飾することを指し、例えば、濃縮物を作製するかまたは実世界で溶液を用いるのに用いられる典型的な測定手順および液体操作手順を介して、これらの手順における偶発的な誤差を介して、組成物を作製するかまたは方法を実施するのに用いられる成分の製造、供給源、または純度の差違などを介して生じうる、数値量の変化を指す。約という用語はまた、特定の初期混合物から結果として生じる組成物についての、異なる平衡条件に起因して異なる量も包含する。約という用語により修飾されていようと修飾されていなかろうと、特許請求の範囲は、その量の同等量を包含する。本明細書で用いられる発明または本発明という用語は、非限定的な用語であり、本明細書で説明され、特許請求の範囲で列挙される全ての可能な変化形を包含することを意図する。本明細書で用いられるポリペプチドおよびペプチドという用語は、互換的に用いられ、ペプチド結合により併せて接合される2つ以上のアミノ酸のポリマーを指す。一態様では、この用語にまた、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化なども含まれる。この定義には、例えば、1または複数のアミノ酸類似体または標識されたアミノ酸およびペプチド模倣体を含有するペプチドも包含される。ペプチドは、L-アミノ酸を含みうる。本明細書で用いられる対象のペプチド、POI、遺伝子産物、標的遺伝子産物、および標的コード領域の遺伝子産物という用語は、組換えにより発現する外来遺伝子を介してコードされる所望の異種ペプチド/タンパク質産物を指す。対象のペプチドは、タンパク質、融合タンパク質、酵素、ペプチド、ポリペプチド、およびオリゴペプチドが含まれるがこれらに限定されない任意のペプチド/タンパク質産物を包含しうる。対象のペプチドのサイズは、2~398アミノ酸の長さの範囲にある。本明細書で用いられる遺伝子構築物という用語は、生物の遺伝子型または表現型を変調させるのに有用な、一連の連続核酸を指す。遺伝子構築物の非限定的な例には、核酸分子、およびオープンリーディングフレーム、遺伝子、発現カセット、ベクター、プラスミドなどが含まれるがこれらに限定されない。本明細書で用いられる内因性遺伝子という用語は、生物のゲノムにおけるその天然の位置にある天然遺伝子を指す。本明細書で用いられる外来遺伝子とは、宿主生物において通常は見出されず、遺伝子導入により宿主生物に導入される遺伝子を指す。外来遺伝子は、非天然生物へと挿入された天然遺伝子、またはキメラ遺伝子を含みうる。本明細書で特定の生物/ゲノム内の配列に関して用いられる異種という用語は、その配列が外来種に由来すること、または、同じ種に由来する場合は、組成および/またはゲノムの遺伝子座において、人為的な介入によりその天然形態から実質的に改変されていることを指す。したがって、例えば、異種遺伝子の発現とは、1つの生物/ゲノムに由来する遺伝子を、異なる生物/ゲノムのゲノム内に配置することにより発現させるプロセスを指す。本明細書で用いられる組換えという用語は、例えば、化学合成により、または遺伝子操作法により単離された核酸のセグメントを操作することにより、そうしなければ分離している2つの配列セグメントを人工的に組み合わせることを指す。組換えはまた、異種核酸を導入することにより改変された細胞もしくはベクター、またはこのようにして改変された細胞に由来する細胞への言及も包含するが、人為的な介入なしに生じる変化など、自然発生のイベントによる細胞またはベクターの変化例えば、自発的突然変異、天然の形質転換、天然の形質導入、天然の転位は包含しない。遺伝子操作されたまたは遺伝子改変されたという用語は、生物における遺伝物質の構造に対する科学的な改変を意味する。それは、組換えDNAの生成および使用を伴う。より具体的には、それは、遺伝子操作生物または遺伝子改変生物を、自然発生生物と区別するのに用いられる。遺伝子操作は、例えば、プラスミド、ウイルス、または他のベクターを用いる、遺伝子置換、遺伝子増幅、遺伝子破壊、トランスフェクション、形質転換など、当技術分野において知られる多くの技法を介して行うことができる。遺伝子改変生物、例えば、遺伝子改変微生物はまた、組換え生物、例えば、組換え微生物と称することも多い。本明細書で用いられる破壊されたまたは破壊という用語は、遺伝子操作を介して、または遺伝子の活性を変化させる天然の原因を介して操作または改変された遺伝子を指す。このような遺伝子活性は、増大する場合もあり、低減される場合もある。加えて、このような破壊は、タンパク質の機能を消失させる場合もある。このような低減を促進するには、例えば、遺伝子の過小発現または破壊を介するなどして、遺伝子のコピー数を低減することができる。その転写レベルが、野生型遺伝子と比較して低減される場合は、遺伝子が過小発現するという。過小発現は、例えば、mRNA量を遺伝子発現の指標として定量化するノーザンブロット解析を介して測定することができる。本明細書で用いられる通り、生成するmRNAの量が、野生型遺伝子から生成するmRNAの量と比較して、少なくとも1、2、5、10、25、50、75、100、200、なおまたは500を超えて低減される場合は、遺伝子が過小発現する。代替的に、微弱なプロモーターを用いて、ポリヌクレオチドの発現を方向付けることもできる。別の実施形態では、遺伝子の上流にあるプロモーター、制御領域、および/またはリボソーム結合部位を変化させて、発現の低減を達成することができる。発現はまた、メッセンジャーRNAの相対半減期を短縮することによっても低減することができる。別の実施形態では、ポリペプチドのアミノ酸配列に活性を低減する1または複数の突然変異を用いることにより、ポリペプチド自体の活性を低減することができる。例えば、その対応する基質に対するポリペプチドのアフィニティーを変化させると、活性の低減を結果としてもたらすことができる。同様に、ポリペプチドの相対半減期を短縮することもできる。いずれの場合にも、遺伝子発現の低減または活性の低減である低減は、細胞培養培地の組成、および/または培養に用いられる方法を変化させることにより達成することができる。本明細書で用いられる発現の低減または活性の低減とは、野生型のタンパク質、ポリヌクレオチド、遺伝子と比較するか、またはポリヌクレオチドもしくはポリペプチドが低減される前に存在するタンパク質の活性および/もしくは濃度と比較した、少なくとも5、10、25、50、75、100、200、なおまたは500を超える低減を意味する。SpnKタンパク質の活性はまた、このタンパク質に、その活性の特異的阻害剤または一般的阻害剤を接触させることによっても低減することができる。本明細書では、活性の低減、活性の低減または消失を互換的に用いる。発現制御配列とは、宿主細胞におけるコード配列の転写および翻訳を集合的にもたらす、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写終結配列、上流の制御ドメイン、エンハンサーなどを集合的に指す。所望の遺伝子を転写および翻訳することが可能である限りにおいて、これらの制御配列の全てが組換えベクター内に常に存在しなくともよい。組換えとは、2つのDNA分子間または2つのRNA分子間における、DNA配列の部分またはRNA配列の部分の並べ替えを指す。各DNA分子に存在する相同的または相補的なヌクレオチド配列を介してハイブリダイズする2つのDNA分子間では、相同組換えが生じる。厳密な条件または厳密な条件下におけるハイブリダイゼーションという用語は、プローブが、その標的配列と優先的にハイブリダイズし、他の配列とのハイブリダイゼーションはより低度であるか、または他の配列とは全くハイブリダイズしない条件を指す。サザンハイブリダイゼーションおよびノーザンハイブリダイゼーションなど、核酸ハイブリダイゼーション実験の文脈における厳密なハイブリダイゼーションおよび厳密なハイブリダイゼーションの洗浄条件は、配列依存的であり、異なる環境パラメータ下で異なる。核酸ハイブリダイゼーションについての広範なガイドは、Tijssen1993、LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiologyHybridizationwithNucleicAcidProbes、I部、2章、Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassays、Elsevier、NewYorkにおいて見出される。一般に、高度に厳密なハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件は、規定のイオン強度およびpHにおける、特定の配列の熱融点Tmより約5°C低く選択する。Tmとは、標的配列のうちの50が、完全にマッチするプローブとハイブリダイズする温度規定のイオン強度およびpH下におけるである。極めて厳密な条件は、特定のプローブのTmと等しく選択する。サザンブロットまたはノーザンブロットのフィルターにおける、相補的残基が100を超える相補的核酸のハイブリダイゼーションのための厳密なハイブリダイゼーション条件の例は、42°Cでハイブリダイゼーションを一晩にわたって実施する場合、1mgのヘパリンを伴う50のホルムアミドである。高度に厳密な洗浄条件の例は、72°Cで約15分間にわたる、0.15MのNaClである。厳密な洗浄条件の例は、65°Cで約15分間にわたる、0.2×SSCによる洗浄であるSSC緩衝液の説明については、Sambrookら1989、MolecularCloningALaboratoryManual2版、1~3巻、ColdSpringHarborLaboratory、ColdSpringHarborPress、NYを参照されたい。高度な厳密性の洗浄に先立って、低度な厳密性の洗浄を行い、バックグラウンドのプローブシグナルを除去することが多い。例えば、100ヌクレオチドを超える二重鎖のための中程度な厳密性の洗浄の例は、45°Cで約15分間にわたる、1×SSCである。例えば、100ヌクレオチドを超える二重鎖のための低度な厳密性の洗浄の例は、40°Cで約15分間にわたる、4~6×SSCである。一般に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおいて、非類縁プローブについて観察される2倍のまたはこれを超えるシグナル対ノイズ比は、特異的なハイブリダイゼーションの検出を示す。厳密な条件下では互いとハイブリダイズしない核酸も、これらがコードするポリペプチドが実質的に同一である場合は、やはり実質的に同一である。これは、例えば、核酸のコピーを、遺伝子コードにより許容される最大のコドン縮重を用いて創出する場合に生じる。本発明はまた、厳密な条件下で、好ましくは高度に厳密な条件下で、本発明のポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能な単離ポリヌクレオチドにも関する。本明細書で用いられるハイブリダイズすることという用語は、互いに対して少なくとも約50、少なくとも約60、少なくとも約70、より好ましくは、少なくとも約80、なおより好ましくは、少なくとも約85~90、最も好ましくは少なくとも95相同であるヌクレオチド配列が、互いとのハイブリダイズを維持することが典型的である、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のための条件を説明することを意図する。一実施形態では、本発明の核酸が、本出願において示される核酸配列またはその相補体と、少なくとも40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99以上相同である。厳密なハイブリダイゼーション条件についての別の非限定的な例は、約45°Cで6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウムSSCの後、50°C、好ましくは55°C、より好ましくは60°C、およびなおより好ましくは65°Cで1×SSC、0.1のSDSにより1回または複数回にわたり洗浄することである。高度に厳密な条件には、ジゴキシゲニンDIGで標識したDNAプローブなどの標識DNAプローブを用いて、2~4日間など、数日間にわたり、42°Cでインキュベートした後で、室温で2×SSC、0.1のSDSにより1回または複数回にわたり洗浄し、65~68°Cで0.5×SSC、0.1のSDS、または0.1×SSC、0.1のSDSにより1回または複数回にわたり洗浄することが含まれうる。特に、高度に厳密な条件には、例えば、100μg/mlのサケ精子DNAを伴うかもしくは伴わない、DigEasyHyb溶液RocheDiagnosticsGmbHなどの溶液、または50のホルムアミド、5×SSC150mMのNaCl、15mMのクエン酸三ナトリウム、0.02のドデシル硫酸ナトリウム、0.1のN-ラウロイルサルコシン、および2のブロッキング試薬RocheDiagnosticsGmbHを含む溶液中で、DIG標識DNAプローブ例えば、DIG標識システムRocheDiagnosticsGmbH、68298Mannheim、Germanyを用いることにより調製するを用いる、42°Cで2時間~4日間にわたるインキュベーションの後、2×SSCおよび0.1のSDS中、室温で5~15分間にわたりフィルターを2回洗浄し、次いで、0.5×SSCおよび0.1のSDS中、または0.1×SSCおよび0.1のSDS中、65~68°Cで15~30分間にわたり2回洗浄することが含まれる。一部の実施形態では、高度に厳密な条件下で本発明のヌクレオチド配列とハイブリダイズする、本発明の単離核酸分子が、天然核酸分子に対応しうる。本明細書で用いられる天然核酸分子とは、自然発生するヌクレオチド配列を有するRNA分子またはDNA分子例えば、天然タンパク質をコードするRNA分子またはDNA分子を指す。当業者には、厳密なハイブリダイゼーション条件および高度に厳密なハイブリダイゼーション条件にどのような条件を適用すべきかがわかるであろう。このような条件についてのさらなる指針は、当技術分野において、例えば、Sambrookら、1989、MolecularCloningALaboratoryManual、ColdSpringHarborPress、NY;およびAusubelら編、1995、CurrentProtocolsinMolecularBiologyJohnWileySonsNYにおいて容易に得ることができる。スピノシン生合成酵素の遺伝子を含有するDNAのクローニングされた断片であれば、スピノシン生成における律速酵素をコードする遺伝子の複製を可能とするであろう。この断片であれば、コードされる活性のうちの1つが所望のスピノシンの合成を制限したとする任意の状況において、収率を増大させるのに用いうるであろう。この種類の収率の増大は、マクロシンをタイロシンへと転換する律速的メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を複製することにより、ストレプトミセスフラヂアエStreptomycesfradiaeの発酵において達成されたBaltzら、1997。スピノシン生合成酵素をコードする特定の遺伝子が破壊されているサッカロポリスポラスピノーサSspinosaの突然変異体菌株によれば、特異的な中間体またはこれらの天然の誘導体が合成されうるであろう。相同組換えを介して、標的遺伝子の内部断片を含有する突然変異誘発性プラスミドを組み込むことにより、このような菌株を発生させることができる。プラスミドを組み込むと、生合成遺伝子の2つの不完全なコピーが形成され、これにより、それがコードする酵素機能が消失する。突然変異体の菌株を発酵させると、この酵素またはその一部の天然の誘導体の基質が蓄積されるはずである。新規の6-デオキシエリトロマイシン誘導体を生成させるサッカロポリスポラエリトラエアSaccharopolysporaerythraeaの菌株を発生させるのには、このような戦略が効果的に用いられたWeberおよびMcAlpine、1992。二重交差相同組換えを介して、標的領域を、この標的領域を挟む非突然変異配列の間に新規の断片を含有する突然変異誘発性プラスミドとスワッピングすることによれば、このような菌株を発生させることができるであろう。このハイブリッド遺伝子であれば、活性を欠くか、または新規の酵素的形質転換を果たす、機能を変化させたタンパク質を生成させるであろう。突然変異体の菌株を発酵させれば、新規の誘導体が蓄積されるであろう。新規の無水エリトロマイシン誘導体を生成させるサッカロポリスポラエリトラエアSaccharopolysporaerythraeaの菌株を発生させるのには、このような戦略が用いられたDonadioら、1993。スピノシン生合成遺伝子および類縁のORFがクローニングされ、各々のDNA配列が決定された。本明細書の以下では、クローニングされたこれらの遺伝子およびORFを、spnA、spnB、spnC、spnD、spnE、spnF、spnG、spnH、spnI、spnJ、spnK、spnL、spnM、spnN、spnO、spnP、spnQ、spnR、spnS、ORFL15、ORFL16、ORFR1、ORFR2、サッカロポリスポラスピノーサSspinosagtt、サッカロポリスポラスピノーサSspinosagdh、サッカロポリスポラスピノーサSspinosaepi、およびサッカロポリスポラスピノーサSspinosakreと名付ける。サッカロポリスポラスピノーサSaccharopolysporaspinosaは、集合的にスピノシンと呼ばれる、9つの緊密な類縁化合物の混合物を生成させる。この混合物中では、スピノサドspinsoadとして知られるスピノシンAおよびスピノシンDが主要な成分であり、重要な昆虫標的に対して高度な活性を示す。スピノシン混合物中の微量成分のうちの2つであるスピノシンJおよびスピノシンLは、第二世代のスピノシン殺虫剤であるスピネトラムの前駆体である。本発明の実施形態は、3’-O-メチルトランスフェラーゼをコードするspnK遺伝子を操作することを介して、スピノサド生成菌株を、スピネトラム前駆体生成菌株へと直接的に転換することに関する。スピノサドとは、DowAgroSciencesIndianapolis、Ind.が生成させた殺虫剤であり、主に、約85のスピノシンAおよび約15のスピノシンDを含む。スピノシンAおよびスピノシンDは、米国特許第5,362,634号において開示される通り、サッカロポリスポラスピノーサSaccharopolysporaspinosaを発酵させることにより生成させる天然生成物である。スピノサドは、昆虫コントロール用生成物であるTRACER商標、SUCCESS商標、SPINTOR商標、およびCONSERVE商標を含めた、DowAgroSciencesから市販されている複数の殺虫用製剤の有効成分である。例えば、TRACER生成物は、約44~約48w/vのスピノサド、または1ガロン当たり約4ポンドのスピノサドを含む。顆粒製剤および液体製剤におけるスピノシン化合物は、クモ形類動物、線虫、および昆虫、特に、鱗翅目Lepidoptera種、総翅類Thysanoptera種、および双翅目Diptera種をコントロールするための使用が確立されている。本明細書ではまた、スピノシンAおよびスピノシンDを、スピノシンA/Dとも称する。スピネトラムとは、DowAgroSciencesが生成させた、5,6-ジヒドロ-3’-エトキシスピノシンJ主要成分および3’-エトキシスピノシンLの混合物である。この混合物は、スピノシンJおよびスピノシンLの混合物をエトキシル化した後で、水素化することにより調製することができる。スピノシンJの5,6二重結合およびその3’-エトキシは、スピノシンLおよびその3’-エトキシ誘導体のC-5におけるメチル基による立体障害のために、スピノシンLおよびその3’-エトキシ誘導体の5,6二重結合およびその3’-エトキシよりはるかに容易に水素化される。米国特許第6,001,981号を参照されたい。本明細書ではまた、スピノシンJおよびスピノシンLを、スピノシンJ/Lとも称する。近年、spnK遺伝子は、3’-O-メチルトランスフェラーゼをコードすることが示された。Kimら、JACS、13292901~32010を参照されたい。本出願人らは、インフレーム二重交差相同組換えを介して、下流の遺伝子であるspnLおよびspnMの転写に対して極性効果を及ぼすことなく、spnK遺伝子を、スピノシン生合成遺伝子クラスターから除去しうることを見出した。これにより、スピノサド生成菌株を操作して、スピネトラム前駆体生成菌株を生成させることが可能となる。これはまた、spnKノックアウト菌株が、3’-O-メチルトランスフェラーゼ活性を喪失していることも示す。本発明の実施形態は、スピノサド生成菌株において1または複数のコドンを除去することにより、spnK遺伝子のインフレーム欠失を結果としてもたらす、spnK遺伝子における操作を包含しうる。spnK遺伝子のインフレーム欠失は、spnK遺伝子の任意の部分に対する任意の切断を包含しうる。本発明によるインフレーム欠失は、欠失後にタンパク質コード配列のセグメントは除去するが、適正なリーディングフレームは保持する欠失を包含する。本発明の一部の実施形態は、完全な欠失である欠失、すなわち、遺伝子内に外因性DNA配列を含有しない欠失を包含しうる。spnK遺伝子のインフレーム欠失は、1~397アミノ酸におけるいずれかの除去を包含しうる。この欠失は、開始コドンの除去を包含しうる。この欠失は、任意の保存的ドメインまたは任意の転写開始領域の除去をさらに包含しうる。本明細書では、従来の記法を用いて、ポリヌクレオチド配列を記載する。一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側の末端を5’末端とし、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向を5’方向と称する。新生RNA転写物への5’~3’方向におけるヌクレオチドの付加を、転写方向と称する。mRNAと同じ配列を有するDNA鎖をコード鎖と称し、このDNAから転写されるmRNAと同じ配列を有するDNA鎖における配列であって、このRNA転写物の5’末端に5’側が位置する配列を上流配列と称し、RNAと同じ配列を有するDNA鎖における配列であって、このコードRNA転写物の3’末端に3’側が位置する配列を下流配列と称する。本発明の実施形態は、スピノサド生成菌株において1または複数のコドンを除去することにより、spnK遺伝子の5’末端のインフレーム欠失を結果としてもたらす、spnK遺伝子における操作を包含しうる。これらのコドンは、ATGコドンの第1、第2、または第3のインスタンスを包含しうるであろう。本発明のさらなる実施形態は、スピノサド生成菌株において1または複数のコドンを除去することにより、spnK遺伝子の3’末端のインフレーム欠失を結果としてもたらす、spnK遺伝子における操作を包含しうる。本発明の他の実施形態は、遺伝子の5’末端および3’末端の両方を完全なままに残しながらの、spnKコード領域の単一のコドンまたは複数のコドンのインフレーム欠失を結果としてもたらす、spnK遺伝子における操作を包含しうる。本発明のさらなる実施形態は、活性部位および/または基質結合部位が含まれるがこれらに限定されない複数の部位における未熟な転写の終結またはアミノ酸置換複数可を結果としてもたらす、単一または複数の点突然変異を包含する、spnK遺伝子における操作を包含しうる。このような単一または複数の点突然変異は、SAM結合モチーフ内で生じる可能性があり、結果として、活性部位または基質結合部位における初期の終結をもたらす。このような単一または複数の点突然変異はまた、全体のSpnK構造に影響を及ぼすか、または適正なフォールディングに影響を及ぼしてSpnK機能を消失させうる位置でもありうる。このような単一または複数の点突然変異は、機能的多型を検出することにより創出することもでき、突然変異誘発により創出することもできる。本明細書で用いられる機能的多型とは、遺伝子の塩基対配列の変化であって、この遺伝子によりコードされるタンパク質の活性における質的または量的な変化例えば、活性の特異性の変化、活性レベルの変化をもたらす変化を指す。機能的多型という用語は、突然変異、欠失、および挿入を包含する。一般に、対象の多型を検出するステップは、DNAを含有する生物学的試料を供給源から回収し、次いで、対象の多型を含有するDNAが、生物学的試料中に存在するかまたは存在しないかを決定することにより実施することができる。特定の突然変異をコードするDNAの存在または非存在の決定は、適切な検出可能基で標識されたオリゴヌクレオチドプローブにより実施することもでき、かつ/またはポリメラーゼ連鎖反応もしくはリガーゼ連鎖反応などの増幅反応次いで、この増幅反応の産物を、標識したオリゴヌクレオチドプローブまたは他の多数の技法により検出することができるにより実施することもできる。さらに、検出するステップは、対象が、特定の突然変異についてヘテロ接合であるか、またはホモ接合であるかを検出するステップも包含しうる。本発明を実施するのに用いうる多数の異なるオリゴヌクレオチドプローブアッセイフォーマットが知られている。例えば、Wahlらによる米国特許第4,302,204号Falkowらによる米国特許第4,358,535号Rankiらによる米国特許第4,563,419号;およびStavrianopoulosらによる米国特許第4,994,373号を参照されたい。選択された核酸配列または標的核酸配列の増幅は、任意の適切な手段により実施することができる。一般に、Kwohら、AmBiotechnolLab8、14~251990を参照されたい。適切な増幅法の例には、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅一般に、GWalkerら、ProcNatlAcadSciUSA89、392~3961992GWalkerら、NucleicAcidsRes20、1691~16961992を参照されたい、転写ベースの増幅DKwohら、ProcNatlAcadSciUSA86、1173~11771989を参照されたい、自家持続配列複製または3SRJGuatelliら、ProcNatlAcadSciUSA87、1874~18781990を参照されたい、Qβレプリカーゼ系PLizardiら、BioTechnology6、1197~12021988を参照されたい、核酸配列ベースの増幅またはNASBARLewis、GeneticEngineeringNews129、11992を参照されたい、修復鎖反応またはRCRRLewis、前出を参照されたい、およびブーメランDNA増幅またはBDARLewis、前出を参照されたいが含まれるがこれらに限定されない。一般には、ポリメラーゼ連鎖反応が好ましい。ポリメラーゼ連鎖反応PCRは、既知の技法にしたがい実施することができる。例えば、米国特許第4,683,195号;同第4,683,202号;同第4,800,159号;および同第4,965,188号を参照されたい。一般に、PCRは、まず、各核酸鎖と相補的な各プライマーの伸長産物が合成されるように、核酸試料を、ハイブリダイズ条件下において、各特定の配列鎖を検出するための1つのオリゴヌクレオチドプライマーで処理する例えば、熱安定的なDNAポリメラーゼの存在下において処理するステップであって、これらのプライマーが、各プライマーから合成される伸長産物がその相補体から分離されたときに他のプライマーの伸長産物を合成するための鋳型として用いられうるように、ハイブリダイズするのに十分な程度に各特定の配列鎖と相補的であるステップと、次いで、この試料を、熱変性条件下において処理し、検出される1または複数の配列が存在する場合は、それらの鋳型からプライマー伸長産物を分離するステップとを伴う。所望の程度の増幅が得られるまで、これらのステップをサイクルで反復する。増幅された配列の検出は、反応産物に、この反応産物とハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドプローブ例えば、本発明のオリゴヌクレオチドプローブであって、検出可能な標識を保有するプローブを添加し、次いで、この標識を既知の技法に従い検出することにより実施することもでき、ゲル上で直接的に可視化することにより実施することもできる。このようなプローブは、5~500ヌクレオチドの長さの場合もあり、好ましくは5~250核酸の場合もあり、より好ましくは5~100核酸の場合もあり、5~50核酸の場合もある。PCR条件が、全ての対立遺伝子型の増幅を可能とする場合は、対立遺伝子特異的プローブとのハイブリダイゼーションにより、制限エンドヌクレアーゼ消化により、変性勾配ゲル上における電気泳動により、または他の技法によりこれらの型を識別することができる。リガーゼ連鎖反応LCRもまた、既知の技法に従い実施することができる。例えば、RWeiss、Science254、12921991を参照されたい。一般に、その反応は、1つの対が検出される配列の一方の鎖に結合し、他の対が検出される配列の他方の鎖に結合する、2つのオリゴヌクレオチドプローブ対により実施される。各対を併せると、対応する鎖が完全に覆われる。反応は、まず、検出される配列の鎖を変性させ例えば、分離し、次いで、オリゴヌクレオチドプローブの各対が併せてライゲーションされるように、これらの鎖を、熱安定性リガーゼの存在下において、オリゴヌクレオチドプローブの2つの対と反応させ、次いで、反応産物を分離し、次いで、配列が所望の程度に増幅されるまで、このプロセスをサイクルで反復することにより実施される。次いで、PCRについて上記で説明したのと同じ方法で、検出を実施することができる。前出のようなDNA増幅法は、機能的多型を含有するDNAには特異的に結合するが、機能的多型を含有しないDNAには結合しないプローブ、プローブ対、または2つのプローブ対の使用を伴いうる。代替的に、このプローブまたはプローブ対は、機能的多型を含有するDNAおよび機能的多型を含有しないDNAの両方に結合しうるが、その中で検出可能な差違が確認されうる産物例えば、機能的多型が欠失突然変異である短い産物を生成させるかまたは増幅する例えば、伸長産物ことも可能であろう。このようなプローブは、標準的な技法に従い、spnK遺伝子に連結された遺伝子における既知のDNA配列またはspnK遺伝子に連結された遺伝子と関連する既知のDNA配列から生成させることもでき、標準的な技法に従い、このような遺伝子から生成させうる配列から生成させることもできる。本明細書で説明される検出するステップは、直接的に実施することもでき、間接的に実施することもできる。対立遺伝子型を間接的に決定する他の手段には、VNTR可変数のタンデム反復配列について示されている通り、特定の機能的多型に連結された多型マーカーを測定することが含まれる。分子生物学は、核酸配列およびタンパク質配列を解析するための多種多様な技法を含む。これらの技法および手順の多くは、臨床診断アッセイおよび臨床診断検査の基盤を形成している。これらの技法には、核酸ハイブリダイゼーション解析、制限酵素解析、遺伝子配列解析、ならびに核酸およびタンパク質の分離および精製が含まれる例えば、JSambrook、EFFritsch、およびTManiatis、MolecularCloningALaboratoryManual、2版、ColdspringHarborLaboratoryPress、ColdSpringHarbor、NY、1989を参照されたい。これらの技法の多くは、多数の試料に対して多数の操作例えば、ピペティング、遠心分離、および電気泳動を実施することを伴う。これらは、複雑かつ長時間を要することが多く、一般に、高度の精度を必要とする。多くの技法は、感度、特異度、または再現性の欠如により、それらの適用が制限されている。核酸ハイブリダイゼーション解析は一般に、比較的大量の複雑な非標的核酸中の過剰なプローブDNAにより、極めて少数の特異的標的核酸DNAまたはRNAを検出することを伴う。試料中の核酸の複雑性を低減することが、低コピー数すなわち、10,000~100,000の核酸標的を検出するのに有用である。DNAの複雑性の低減は、標的核酸配列を増幅することによって、ある程度達成されるMAInnisら、PCRProtocolsAGuidetoMethodsandApplications、AcademicPress、1990SDA増幅については、Spargoら、1996、MolecularCellularProbesを参照されたい。これは、標的核酸を増幅する結果として、非標的配列と比べて膨大な数の標的核酸配列がもたらされ、これにより、後続の標的ハイブリダイゼーションステップが改善されるからである。ハイブリダイゼーションステップは、調製されたDNA試料に、標的DNA配列とプローブとの間でハイブリダイゼーションが生じるように設定した最適の条件で、特異的なレポータープローブを接触させることを伴う。ハイブリダイゼーションは、多くのフォーマットのうちのいずれか1つにより実施することができる。例えば、多重試料による核酸ハイブリダイゼーション解析が、各種のフィルターフォーマットおよび固体支持体フォーマットにより実施されているBeltzら、MethodsinEnzymology、100巻、Partら編、AcademicPressNewYork、19章、266~308頁、1985を参照されたい。1つのフォーマットである、いわゆるドットブロットハイブリダイゼーションは、非共有結合により標的DNAをフィルターに結合させた後で、放射性同位元素で標識したプローブ複数可に対する後続のハイブリダイゼーションを行うことを伴う。ドットブロットハイブリダイゼーションは、過去20年間にわたり広範に用いられ、この間、多くの変化形が開発されたAndersonおよびYoung、NucleicAcidHybridizationAPracticalApproach、HamesおよびHiggins編、IRLPress、WashingtonDC、4章、73~111頁、1985を参照されたい。例えば、ゲノム突然変異を多重解析するためNanibhushanらによるEPA0228075のドットブロット法、および重複するクローンを検出し、ゲノムマップを構築するためEvansによる米国特許第5,219,726号のドットブロット法が開発されている。多重試料による核酸ハイブリダイゼーション解析を実施するためのさらなる技法には、マイクロフォーマットマルチプレックスデバイスまたはマイクロフォーマットマトリクスデバイス例えば、DNAチップが含まれるMBarinaga、253Science、1489頁、1991WBains、10BioTechnology、757~758頁、1992を参照されたい。これらの方法では通常、特定のDNA配列を、DNAチップのマイクロウェルなど、固定支持体の極めて小型の特定の領域に結合させる。これらのハイブリダイゼーションフォーマットは、従来のドットブロットハイブリダイゼーション系およびサンドウィッチハイブリダイゼーション系のマイクロスケールによる変化形である。マイクロフォーマットハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーションによる配列決定SBHを実施するのに用いることができるMBarinaga、253Science、1489頁、1991WBains、10BioTechnology、757~758頁、1992を参照されたい。SBHは、全ての可能なnヌクレオチドオリゴマーnマーを用いて未知のDNA試料におけるnマーを同定し、その後、これらをアルゴリズム解析により整列させて、DNA配列をもたらすDrmanacによる米国特許第5,202,231号を参照されたい。SBHを実施するには2つのフォーマットがある。第1のフォーマットは、支持体上で全ての可能なnマーのアレイを創出し、次いで、これらを標的配列とハイブリダイズさせるステップを伴う。第2のフォーマットは、標的配列を支持体に結合させ、これを、全ての可能なnマーにより逐次プロービングする。Southern英国特許出願第GB8810400号、1988EMSouthernら、13、Genomics、1008、1992は、第1のフォーマットを用いて、DNAを解析または配列決定することを提起した。Southernは、PCRにより増幅したゲノムDNAを用いて、既知の単一の点突然変異を同定した。Southernはまた、SBHのための固定支持体上で、オリゴヌクレオチドのアレイを合成する方法についても説明している。Drmanacら260、Science、1649~1652、1993は、第2のフォーマットを用いて、複数の短い116bpのDNA配列を配列決定した。標的DNAを、膜支持体に結合させたドットブロットフォーマット。各フィルターを、272の標識した10マーのオリゴヌクレオチドおよび1マーのオリゴヌクレオチドと逐次ハイブリダイズさせた。広範な厳密性条件を用いて、各nマーのプローブに特異的なハイブリダイゼーションを達成した。洗浄時間は、0°C~16°Cの温度を用いて、5分間~一晩で変化させた。大半のプローブは、16°Cで3時間にわたる洗浄を必要とした。ハイブリダイゼーションシグナルを検出するために、フィルターを、2~18時間にわたり曝露した。一般に、ハイブリダイゼーションイベントを検出および解析するには、多様な方法が利用可能である。DNAプローブを標識するのに用いられるレポーター基フルオロフォア、酵素、放射性同位元素などに応じて、検出および解析を、蛍光測定により、比熱測定により、またはオートラジオグラフィーにより実施する。蛍光放射または粒子放出など、放出される放射線を観察および測定することにより、ハイブリダイゼーションイベントについての情報を得ることができる。検出法が、極めて高度な内在性感度を示す場合であっても、非特異的な結合物質がバックグラウンドに存在するために、ハイブリダイゼーションイベントの検出は困難である。したがって、ハイブリダイゼーションイベントの検出は、ハイブリダイゼーションがどれほど特異的かつ高感度になされうるかに依存する。遺伝子解析に関しては、特異度および感度を増大させようと試みた複数の方法が開発されている。遺伝子解析の一形態は、一塩基多型またはSNPの解明を中心とする解析である。SNPの使用に好適な因子は、ヒトゲノムにおいてそれらが大量に存在することとりわけ、短いタンデム反復配列STRと比較して、遺伝子のコード領域または制御領域内にそれらが高頻度で位置決定されることタンパク質の構造または発現レベルに影響を及ぼしうる高頻度で位置決定されること、および世代を経るに従いそれらが安定化することであるLandegrenら、GenomeResearch、8巻、769~776頁、1998。SNPとは、2つの変異体において存在し、最も一般的な変異体が99未満の頻度で発生する、ゲノム内の任意の位置と定義される。SNPを広範な遺伝子マーカーとして用いるには、それらを、容易、迅速、正確、および費用効果的に遺伝子型決定しうることが重要である。SNPを類別するのに、現在多くの技法が利用可能であり総説としては、Landegrenら、GenomeResearch、8巻、769~776頁1998を参照されたい、これらの全ては、標的の増幅を必要とする。これらには、直接的配列決定Carothersら、BioTechniques、7巻、494~499頁、1989、一本鎖立体構成多型法Oritaら、ProcNatlAcadSciUSA、86巻、2766~2770頁、1989、対立遺伝子特異的増幅Newtonら、NucleicAcidsResearch、17巻、2503~2516頁1989、制限消化DayおよびHumphries、AnalyticalBiochemistry、222巻、389~395頁、1994、およびハイブリダイゼーションアッセイが含まれる。それらの最も基本的な形態において、ハイブリダイゼーションアッセイは、短いオリゴヌクレオチドレポーターを、マッチおよびミスマッチした標的と対比して識別することにより機能する。基本的なプロトコールに対して多くの適合形が開発されている。これらには、ライゲーション連鎖反応WuおよびWallace、Gene、76巻、245~254、1989およびミニ配列決定Syvanenら、Genomics、8巻、684~692頁、1990が含まれる。他の増強には、TaqDNAポリメラーゼの5’-ヌクレアーゼ活性Hollandら、ProcNatlAcadSciUSA、88巻、7276~7280頁、1991、分子ビーコンTyagiおよびKramer、NatureBiotechnology、14巻、303~308頁、1996、熱変性曲線Howellら、NatureBiotechnology、17巻、87~88頁、1999、およびDNAチップWangら、Science、280巻、1077~1082頁、1998の使用が含まれる。SNPを識別するのに用いうるさらなる現象は、単一の標的に対する複数の標的特異的プローブのハイブリダイゼーションに由来する、核酸相互反応エネルギーまたは塩基スタッキングエネルギーであるROrnsteinら、AnOptimizedPotentialFunctionfortheCalculationofNucleicAcidInteractionEnergies、Biopolymers、17巻、2341~2360巻1978JNorbergおよびLNilsson、BiophysicalJournal、74巻、394~402頁、1998;ならびにJPietersら、NucleicAcidsResearch、17巻、12号、4551~4565頁1989を参照されたい。この塩基スタッキング現象を、本発明における固有のフォーマットで用いて、高感度のTm差をもたらし、これにより、核酸試料におけるSNPの直接的な検出を可能とする。類縁生物における核酸配列を識別するか、またはDNAを配列決定するには、さらなる方法も用いられている。例えば、Hoganらによる米国特許第5,030,557号は、プローブオリゴヌクレオチドに加えて、ヘルパーオリゴヌクレオチドを結合させ、プローブと標的核酸との間でより高いTmを呈示させることにより、一本鎖標的核酸の二次構造および三次構造に影響を及ぼしうることを開示した。しかし、この出願は、その手法において、ハイブリダイゼーションエネルギーを、改変されずに放置されたなら、プローブが標的とハイブリダイズすることを妨げる傾向にある、自己アニーリングするRNA鎖の二次構造および三次構造を改変するためだけに用いることに限定されていた。DNAの配列決定について、例えば、KKhrapkoら、FederationofEuropeanBiochemicalSocietiesLetters、256巻、1、2号、118~122頁1989は、連続的なスタッキングによるハイブリダイゼーションが、結果として二重鎖の安定化をもたらすことを開示した。加えて、JKieleczawaら、Science、258巻、1787~1791頁1992は、DNA合成をプライミングするための連続的なヘキサマーの連なりの使用であって、この連続的な連なりが、プライミングを安定化させると考えられる使用について開示した。同様に、LKotlerら、ProcNatlAcadSciUSA、90巻、4241~4245頁1993は、ヘキサマーによるオリゴヌクレオチドモジュールおよびペンタマーによるオリゴヌクレオチドモジュールの使用を介する、DNA配列決定反応のプライミングにおける配列特異性について開示した。さらに、SParinovら、NucleicAcidsResearch、24巻、15号、2998~3004頁1996は、受動的DNA配列決定マイクロチップと関連するDNA配列決定のための塩基スタッキングオリゴマーの使用について開示した。さらに、GYershovら、ProcNatlAcadSciUSA、93巻、4913~4918頁1996は、受動的マイクロチップ上のSBHにおける塩基スタッキングエネルギーの適用について開示した。Yershovの例では、10マーのDNAプローブを、マイクロチップの表面に固定し、さらなる短いプローブと共に標的配列とハイブリダイズさせたところ、これらの組合せは、プローブの結合を安定化させると考えられた。このフォーマットならば、核酸配列の短いセグメントを明らかにし、DNA配列決定を行いうるであろう。Yershovは、彼らの系では、短いプローブ例えば、5マーのプローブを用いると、ミスマッチの不安定化効果が増大することについてさらに言及した。DNA配列決定におけるこのように短いプローブの使用は、プローブ/標的ハイブリダイゼーション複合体の1つの特定の位置におけるわずかに単一のミスマッチではなく、プロービングされる配列に沿ったミスマッチの存在を識別する能力をもたらした。長いプローブ例えば、8マー、10マー、および13マーのオリゴの使用は、このような目的にはそれほど機能的でなかった。核酸解析において塩基スタッキングを用いた方法のさらなる例には、Laneらによる米国特許第5,770,365号が含まれるが、ここでは、結合標的と共に作用して、スタッキングエネルギーを介して二重鎖の形成を安定化させる、一本鎖ループおよび二本鎖領域を有する、単分子による捕捉プローブを用いて核酸標的を捕捉する方法が開示される。ヌクレオチド配列は、従来の方法に従う部位指向突然変異誘発を介して、簡便に改変することができる。代替的に、所望のポリペプチドのアミノ酸配列に基づいてオリゴヌクレオチドをデザインするオリゴヌクレオチド合成器を用いること、および好ましくは、組換えポリペプチドを生成させる宿主細胞において好適なコドンを選択することが含まれるがこれらに限定されない化学合成により、ヌクレオチド配列を調製することもできる。新規のスピノシンはまた、クローニングされた遺伝子を突然変異誘発し、これらの突然変異させた遺伝子で、スピノシン生成生物における突然変異していないそれらの対応物を置換することによっても生成させることができる。突然変異誘発は、例えば、1KRドメイン、DHドメイン、またはERドメインの機能のうちの1または複数が遮断され、菌株が、スピノシンAの核には存在しない、二重結合、ヒドロキシル基、またはケト基を伴うラクトン核を有するスピノシンを生成させるように、KRドメイン、DHドメイン、またはERドメインを欠失または不活化させることDonadioら、1993を参照されたい、2異なるカルボン酸がラクトン核に組み込まれるように、ATドメインを置換することRuanら、1997を参照されたい、3菌株が、スピノシンAの核には存在しない、飽和結合、ヒドロキシル基、または二重結合を伴うラクトン核を有するスピノシンを生成させるように、KRドメイン、DHドメイン、またはERドメインを、既存のPKSモジュールに付加すること、4環状ラクトン核の炭素原子数が増大または減少するように、完全なPKSモジュールに付加または置換を施すことを伴いうる。スピノシンPKSローディングドメインを、異種PKSローディングドメインで置換することにより、ハイブリッドPKSを創出することができる。例えば、米国特許第7,626,010号を参照されたい。スピノシンのラクトン骨格に結合している糖の修飾を介するスピノシンは、ラムノース部分および/もしくはフォロサミン部分の修飾、または異なるデオキシ糖の結合を包含しうることがさらに言及されている。スペインのSalasの研究グループは、既存の糖分子を、異なる糖分子で置換することにより、新規のポリケチド化合物を生成させうることを示しているRodriguezら、JMolMicrobiolBiotechnol2000年7月2巻3号271~6。本出願全体で後出する例は、機能性を改変したスピノシンを生成させる突然変異誘発の使用を例示するのに一助となる。スピノシン遺伝子のクラスター領域に由来するDNAは、同種配列を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる。したがって、本明細書でクローニングされるDNAであれば、本明細書で説明される領域と重複し、また、サッカロポリスポラスピノーサSaccharopolysporaspinosaのゲノムにおける隣接領域に由来するいまだクローニングされていないDNAも含有する、サッカロポリスポラスピノーサSaccharopolysporaspinosa遺伝子ライブラリーに由来するさらなるプラスミドを位置決定するのにも用いうるであろう。加えて、本発明でクローニングされる領域に由来するDNAを用いて、他の生物における、同一ではないが類似の配列を同定することもできる。ハイブリダイゼーションプローブは通常、少なくとも約20塩基の長さであり、検出を可能とするようにこれらを標識する。本発明では、多様な目的に応じて、各種の突然変異誘発を用いることができる。これらには、部位指向性無作為的点突然変異誘発、相同組換え、DNAシャフリングまたは他の再帰的突然変異誘発法、キメラ構築物、ウラシル含有鋳型を用いる突然変異誘発、オリゴヌクレオチド指向性突然変異誘発、ホスホロチオエート修飾DNA突然変異誘発、ギャップトデュプレックスDNAを用いる突然変異誘発など、またはこれらの任意の組合せが含まれるがこれらに限定されない。さらなる適切な方法には、点ミスマッチ修復、修復欠損宿主細胞株を用いる突然変異誘発、制限選択および制限精製、欠失突然変異誘発、全遺伝子合成を介する突然変異誘発、二本鎖切断修復などが含まれる。本発明には、キメラ構築物を伴うことが含まれるがこれに限定されない突然変異誘発も包含される。一実施形態では、配列、配列の比較、物理的特性、結晶構造などが含まれるがこれらに限定されない、天然分子または改変された天然分子もしくは突然変異した天然分子についての既知の情報によって、突然変異誘発を方向付けることができる。本明細書で見出される教科書および例は、これらの手順について説明している。さらなる情報は、本明細書で引用されている以下の刊行物および参考文献:Lingら、ApproachestoDNAmutagenesisanoverview、AnalBiochem254巻2号157~1781997Daleら、Oligonucleotidedirectedrandommutagenesisusingthephosphorothioatemethod、MethodsMolBiol57369~3741996Smith、Invitromutagenesis、AnnRevGenet19423~4621985BotsteinおよびShortle、Strategiesandapplicationsofinvitromutagenesis、Science2291193~12011985Carter、Sitedirectedmutagenesis、BiochemJ2371~71986Kunkel、Theefficiencyofoligonucleotidedirectedmutagenesis、NucleicAcidsMolecularBiology、EcksteinFおよびLilleyDMJ編、SpringerVerlag、Berlin1987Kunkel、Rapidandefficientsitespecificmutagenesiswithoutphenotypicselection、ProcNatlAcadSciUSA、82488~4921985Kunkelら、Rapidandefficientsitespecificmutagenesiswithoutphenotypicselection、MethodsinEnzymol154、367~3821987Bassら、MutantTrprepressorswithnewDNAbindingspecificities、Science、242240~2451988MethodsinEnzymol100468~5001983MethodsinEnzymol154329~3501987ZollerおよびSmith、OligonucleotidedirectedmutagenesisusingM13derivedvectorsanefficientandgeneralprocedurefortheproductionofpointmutationsinanyDNAfragment、NucleicAcidsRes106487~65001982ZollerおよびSmith、OligonucleotidedirectedmutagenesisofDNAfragmentsclonedintoM13vectors、MethodsinEnzymol100468~5001983ZollerおよびSmith、OligonucleotidedirectedmutagenesisasimplemethodusingtwooligonucleotideprimersandasinglestrandedDNAtemplate、MethodsinEnzymol154329~3501987Taylorら、TheuseofphosphorothioatemodifiedDNAinrestrictionenzymereactionstopreparenickedDNA、NuclAcidsRes138749~87641985Taylorら、TherapidgenerationofoligonucleotidedirectedmutationsathighfrequencyusingphosphorothioatemodifiedDNA、NuclAcidsRes138765~87871985NakamayeおよびEckstein、InhibitionofrestrictionendonucleaseNciIcleavagebyphosphorothioategroupsanditsapplicationtooligonucleotidedirectedmutagenesis、NuclAcidsRes149679~96981986Sayersら、YTExonucleasesinphosphorothioatebasedoligonucleotidedirectedmutagenesis、NuclAcidsRes16791~8021988Sayersら、StrandspecificcleavageofphosphorothioatecontainingDNAbyreactionwithrestrictionendonucleasesinthepresenceofethidiumbromide1988、NuclAcidsRes16803~814Kramerら、ThegappedduplexDNAapproachtooligonucleotidedirectedmutationconstruction、NuclAcidsRes129441~94561984KramerおよびFritz、OligonucleotidedirectedconstructionofmutationsviagappedduplexDNA、MethodsinEnzymol154350~3671987Kramerら、ImprovedenzymaticinvitroreactionsinthegappedduplexDNAapproachtooligonucleotidedirectedconstructionofmutations、NuclAcidsRes1672071988Fritzら、OligonucleotidedirectedconstructionofmutationsagappedduplexDNAprocedurewithoutenzymaticreactionsinvitro、NuclAcidsRes166987~69991988Kramerら、PointMismatchRepair、Cell38879~8871984Carterら、ImprovedoligonucleotidesitedirectedmutagenesisusingM13vectors、NuclAcidsRes134431~44431985Carter、ImprovedoligonucleotidedirectedmutagenesisusingM13vectors、MethodsinEnzymol154382~4031987EghtedarzadehおよびHenikoff、Useofoligonucleotidestogeneratelargedeletions、NuclAcidsRes1451151986Wellsら、Importanceofhydrogenbondformationinstabilizingthetransitionstateofsubtilisin、PhilTransRSocLondA317415~4231986Nambiarら、TotalsynthesisandcloningofagenecodingfortheribonucleaseSprotein、Science、2231299~13011984SakamarおよびKhorana、Totalsynthesisandexpressionofagenefortheasubunitofbovinerodoutersegmentguaninenucleotidebindingproteintransducin、NuclAcidsRes146361~63721988Wellsら、Cassettemutagenesisanefficientmethodforgenerationofmultiplemutationsatdefinedsites、Gene34315~3231985Grundstromら、Oligonucleotidedirectedmutagenesisbymicroscale‘shotgun’genesynthesis、NuclAcidsRes133305~33161985Mandecki、OligonucleotidedirecteddoublestrandbreakrepairinplasmidsofEscherichiacoliamethodforsitespecificmutagenesis、ProcNatlAcadSciUSA、83717771811986Arnold、Proteinengineeringforunusualenvironments、CurrentOpinioninBiotechnology4450~4551993Sieberら、NatureBiotechnology、19456~4602001WPCStemmer、Nature、370、389~911994;ならびにIALorimer、IPastan、NucleicAcidsRes23、3067~81995において見出される。上記の方法のうちの多くについてのさらなる詳細は、各種の突然変異誘発法に伴うトラブルシューティングの問題に有用なコントロールについてもまた説明している、MethodsinEnzymology、154巻において見出すことができる。本明細書では、相同性またはパーセント同一性という用語が互換的に用いられる。本発明の目的では、2つのアミノ酸配列または2つの核酸配列のパーセント同一性を決定するために、配列を、最適比較を目的として整列することが、本明細書で定義される例えば、第2のアミノ酸配列または核酸配列によるアライメントを最適とするため、第1のアミノ酸配列または核酸配列にギャップを導入することができる。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第1の配列における位置が、第2の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドにより占められている場合、これらの分子はこの位置において同一である。2つの配列間におけるパーセント同一性とは、配列により共有される同一の位置の数の関数であるすなわち、同一性=同一である位置の数/位置の総数すなわち、重複する位置×100。2つの配列は長さが同じであることが好ましい。当業者は、2つの配列間における相同性を決定するのに、いくつかの異なるコンピュータプログラムが利用可能であることを承知しているであろう。例えば、2つの配列間における配列の比較およびパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。好ましい実施形態では、Blossom62行列またはPAM250行列、ならびに16、14、12、10、8、6、または4のギャップの重みおよび1、2、3、4、5、または6の長さの重みを用いる、GCGソフトウェアパッケージインターネットのaccelrysウェブサイトにおいて、より具体的には、httpwwwaccelryscomにおいて入手可能である中のGAPプログラムに組み込まれている、NeedlemanおよびWunschJMolBiol48444~4531970によるアルゴリズムを用いて、2つのアミノ酸配列間におけるパーセント同一性を決定する。当業者は、これらの異なるパラメータはいずれも、若干異なる結果をもたらすが、異なるアルゴリズムを用いても、2つの配列の全体的なパーセンテージ同一性はそれほど変化しないことを理解するであろう。さらに別の実施形態では、NWSgapdna.CMP行列、ならびに40、50、60、70、または80のギャップの重みおよび1、2、3、4、5、または6の長さの重みを用いる、GCGソフトウェアパッケージインターネットのaccelrysウェブサイトにおいて、より具体的には、httpwwwaccelryscomにおいて入手可能である中のGAPプログラムを用いて、2つのヌクレオチド配列間におけるパーセント同一性を決定する。別の実施形態では、ギャップ長ペナルティーを12とし、ギャップペナルティーを4として、PAM120による重みづけ残基表を用いる、ALIGNプログラムversion2.0インターネットのvegaウェブサイトにおいて、より具体的には、ALIGN-IGHMontpellier、より具体的には、httpvegaighcnrsfrbinalignguesscgiにおいて入手可能であるに組み込まれている、E.MeyersおよびW.MillerCABIOS、411~171989によるアルゴリズムを用いて、2つのアミノ酸配列間または2つのヌクレオチド配列間におけるパーセント同一性を決定する。本発明の核酸配列およびタンパク質配列は、公開データベースに対する検索を実施して、例えば、他のファミリーメンバーまたは類縁配列を同定するためのクエリー配列としてさらに用いることができる。このような検索は、Altschulら1990、JMolBiol215403~10によるBLASTNプログラムおよびBLASTXプログラムversion2.0を用いて実施することができる。スコア=100、ワード長=12とするBLASTNプログラムによりBLASTヌクレオチド検索を実施して、本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得ることができる。スコア=50、ワード長=3とするBLASTXプログラムによりBLASTタンパク質検索を実施して、本発明のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較を目的としてギャップアライメントを得るには、Altschulら、1997NucleicAcidsRes25173389~3402において説明されている通り、GappedBLASTを用いることができる。BLASTプログラムおよびGappedBLASTプログラムを用いる場合は、それぞれのプログラム例えば、BLASTXプログラムおよびBLASTNプログラムのデフォルトのパラメータを用いることができるインターネットのncbiウェブサイトにおいて、より具体的には、httpwwwncbinlmnihgovにおいて入手可能である。本発明の他の実施形態は、spnK遺伝子における操作であって、単一または複数のヌクレオチド塩基の欠失を包含することが可能であり、これによりspnK遺伝子の正常なリーディングフレームを破壊しうる操作を包含しうる。このような欠失には、1~1194ヌクレオチドのうちのいずれかの位置が含まれうる。このような欠失は、spnK遺伝子の正常なリーディングフレームに影響を及ぼし、その結果として、スピネトラム前駆体生成菌株の生成をもたらす。本発明の他の実施形態は、spnK遺伝子における操作であって、spnKコード領域において単一または複数のヌクレオチドの挿入複数可を包含することが可能であり、これによりspnK遺伝子の正常なリーディングフレームを破壊する操作を包含しうる。このような挿入は、spnK遺伝子の正常なリーディングフレームに影響を及ぼし、その結果として、スピネトラム前駆体生成菌株の生成をもたらす。本発明のさらなる実施形態は、spnK遺伝子における操作であって、SpnKタンパク質の生成を消失させるか、またはこれに著しく干渉する、アンチセンスまたはセンス技術の使用を包含する操作を包含しうる。当業者は、アンチセンス効果および共抑制効果をどのようにして達成するかについて承知している。例えば、共抑制による阻害は、JorgensenTrendsBiotechnol81990、340~344、NiebelらCurrTopMicrobiolImmunol1971995、91~103、FlavellらCurrTopMicrobiolImmunol1971995、43~46、PalaquiおよびVaucheretPlantMolBiol291995、149~159、VaucheretらMolGenGenet2481995、311~317、deBorneらMolGenGenet2431994、613~621において説明されている。したがって、本発明は、遺伝子サイレンシングの方法であって、サッカロポリスポラスピノーサSspinosaなどの生物において、センス標的化配列またはアンチセンス標的化配列に対する、5’側または3’側の逆方向反復配列を有する核酸であって、センス標的化配列またはアンチセンス標的化配列は、抑制される標的遺伝子と実質的な配列同一性を示すが、逆方向反復配列は、配列により標的遺伝子と類縁であるわけではない核酸を発現させることを介する方法をさらに提供する。別の実施形態では、異種逆方向反復配列を、5’側および3’側の標的化配列で挟む。遺伝子サイレンシング構築物は、最適の生物、例えば、細菌細胞、真菌細胞、真核細胞、例えば、植物細胞または哺乳動物細胞において発現させることができる。本発明で用いるのに適する発現ベクターには、原核生物ベクターおよび真核生物ベクター例えば、プラスミド、ファージミド、またはバクテリオファージが含まれ、哺乳動物ベクターおよび植物ベクターが含まれる。適切な原核生物ベクターには、アクチノミセスActinomyces属におけるDNA操作に一般的に用いられるプラスミド例えば、pSET152、pOJ260、pIJ101、pJV1、pSG5、pHJL302、pSAM2、pKC1250などであるがこれらに限定されないプラスミドが含まれる。このようなプラスミドは、KieserらPracticalStreptomycesGenetics、2000により開示されている。他の適切なベクターには、大腸菌Ecoliにおける複製が可能なプラスミド例えば、pBR322、ColE1、pSC101、PACYC184、itVX、pRSET、pBADInvitrogen、Carlsbad、Calif.などなどのプラスミドが含まれうる。このようなプラスミドは、SambrookMolecularCloningALaboratoryManual、2版、Sambrook、Fritsch、およびManiatis編、ColdSpringHarborLaboratory1989を参照により開示されており、このようなベクターの多くが市販されている。バチルスBacillus属のプラスミドには、pC194、pC221、pT127などが含まれ、GryczanTheMolecularBiologyoftheBacilli、AcademicPress、NY1982、307~329頁により開示されている。適切なストレプトミセスStreptomyces属のプラスミドには、pli101Kendallら、JBacteriol1694177~4183、1987が含まれ、適切なストレプトミセスStreptomyces属のバクテリオファージには、ΨC31Chaterら、SixthInternationalSymposiumonActinomycetalesBiology、AkademiaiKaido、Budapest、Hungary1986、45~54頁などが含まれるがこれに限定されない。シュードモナスPseudomonas属のプラスミドは、JohnらRevInfectDis8693~704、1986およびIzakiJpnJBacteriol33729~742、1978により総説されている。特定の遺伝子の発現抑制は、特定の目的により適合した遺伝子操作生物の探索および開発のいずれにも重要なツールである。遺伝子サイレンシングは、それらのいずれもが、トランス遺伝子ならびに内因性遺伝子の発現を低減する、そのプロモーターに対してアンチセンス方向にあるSheehyら、ProcNat’lAcadSciUSA、85880588081988Smithら、Nature、3347247261988か、またはそのプロモーターに対してセンス方向にあるNapoliら、PlantCell、22792891990vanderKrolら、PlantCell、22912991990;米国特許第5,034,323号;米国特許第5,231,020号;および米国特許第5,283,184号、対象の遺伝子に対応するトランス遺伝子を導入することにより達成することができる。転写後の遺伝子サイレンシングは、アンチセンスRNAの小型20~25ヌクレオチド断片であって、RNA鋳型から合成することができ、プロセスの特異性の決定因子および可動性の決定因子を表すアンチセンスRNAの小型断片の蓄積を伴うことが報告されているHamiltonおよびBaulcombe、Science、2869509521999。ある範囲の生物では、dsRNA二本鎖RNAの導入が、遺伝子サイレンシングをもたらす重要な構成要素であることが明らかとなっているFireら、Nature、3918068111998TimmonsおよびFire、Nature、3958541998;WO99/32619KennerdellおよびCarthew、Cell、95101710261998Ngoら、ProcNat’lAcadSciUSA、9514687146921998Waterhouseら、ProcNat’lAcadSciUSA、9513959139641998;WO99/53050CogoniおよびMacino、Nature、3991661691999Lohmannら、DevBiol2142112141999SanchezAlvaradoおよびNewmark、ProcNat’lAcadSciUSA、96504950541999。細菌では、レポーターのトランス遺伝子およびウイルス遺伝子のいずれもが、導入されたトランス遺伝子による転写後の遺伝子サイレンシングを受けるので、抑制される遺伝子が、内因性の細菌遺伝子でなくともよいEnglishら、PlantCell81791881996Waterhouseら、前出。しかし、上記の場合の全てにおいて、導入されるトランス遺伝子と、抑制される遺伝子との間では、ある程度の配列類似性が好ましい場合がある。前出の例では、CaMV35Sプロモーターの制御下において、ACCオキシダーゼ遺伝子の5’-UTR非翻訳領域、コード領域、および3’-UTRからなるセンストランス遺伝子を導入すると、トマト植物体集団のうちの15において、ACCオキシダーゼの酵素活性が低減されるHamiltonら、PlantJ157377461998;WO98/53083。しかし、このACCオキシダーゼの5’-UTRの一部である逆方向反復配列およびセンス反復配列を構築物に組み入れたところ、植物体のうちの96において抑制が観察されたHamiltonら、前出。加えて、配列がトランス遺伝子のコード領域とは類縁であるが、トランス遺伝子の5’-UTRとは類縁でない別のACCオキシダーゼ遺伝子が抑制されたことから、転写物の任意の部分による二本鎖RNAは、RNA転写物の全体を標的としてこれを分解することが示される。加えて、ウイルス遺伝子もしくはレポーター遺伝子のコード領域の逆方向反復配列を含有する構築物を導入することにより、または標的遺伝子のコード領域のセンス転写物およびアンチセンス転写物を発現する植物を併せて交配することによっても、高頻度かつ高レベルの転写後遺伝子サイレンシングが見出されているWaterhouseら、ProcNat’lAcadSciUSA、9513959139641998。同じ植物の異なるプロモーターの制御下において、センストランス遺伝子およびアンチセンストランス遺伝子を発現させることによっても同様の結果が得られたChuangおよびMeyerowitz、ProcNat’lAcadSciUSA、97498549902000。本発明の他の実施形態は、spnK遺伝子における操作であって、遺伝子サイレンシングを包含する操作を包含しうる。遺伝子サイレンシングという語句は、特定の遺伝子産物の発現が、低減されるかまたは弱められるプロセスを指す。遺伝子サイレンシングは、多様な経路を介して生じうる。別段に指定されない限り、本明細書で用いられる遺伝子サイレンシングとは、低分子の阻害性RNAsiRNAが、宿主タンパク質例えば、RNA誘導性サイレンシング複合体RISCと共に作用して、配列依存的な形でメッセンジャーRNAmRNAを分解すると定義されているが特徴づけは部分的にとどまるRNA干渉RNAiの結果として生じる、遺伝子産物発現の低減を指す。遺伝子サイレンシングのレベルは、ノーザンブロット解析、B-DNA法、転写感受性のレポーター構築物、発現プロファイリング例えば、DNAチップ、および関連する技法を介する転写物レベルの測定が含まれるがこれらに限定されない各種の手段により測定することができる。代替的に、サイレンシングのレベルは、特定の遺伝子によりコードされるタンパク質レベルを評価することによっても測定することができる。これは、ウェスタン解析を含めた多数の研究を実施することにより達成することもでき、例えば、蛍光特性を有するレポータータンパク質例えば、GFPまたは酵素活性を有するレポータータンパク質例えば、アルカリホスファターゼの発現レベルを測定することにより達成することもでき、いくつかの他の手順を介して達成することもできる。さらなる実施形態は、spnK遺伝子の活性部位または基質結合部位における単一または複数のアミノ酸置換複数可であって、spnK遺伝子を失効化し、結果として、スピノシンJ/Lを生成させるアミノ酸置換複数可を包含する。一般に、当業者は、それらの活性に不適切な形で有害な影響を及ぼすことなく、本発明のペプチドのアミノ酸配列に、わずかな欠失または置換を引き起こしうることを理解するであろう。したがって、このような欠失または置換を含有するタンパク質およびペプチドが、本発明のさらなる態様である。アミノ酸の置換substitutionsまたは置換replacementsを含有するペプチドでは、ペプチド配列のうちの1または複数のアミノ酸を、1または複数の他のアミノ酸で置換することができ、この場合、このような置換は、この配列の機能に影響を及ぼさない。このような変化は、アミノ酸が、本質的に同じ機能特性を有する他のアミノ酸で置換されるように、電荷密度、疎水性/親水性、サイズ、および立体構成などの物理的特徴におけるアミノ酸間の既知の類似性により方向付けることができる。例えば、Alaは、ValまたはSerで置換することができ;Valは、Ala、Leu、Met、またはIle、好ましくは、AlaまたはLeuで置換することができ;Leuは、Ala、Val、またはIie、好ましくは、ValまたはlIeで置換することができ;Glyは、ProまたはCys、好ましくは、Proで置換することができ;Proは、Gly、Cys、Ser、またはMet、好ましくは、Gly、Cys、またはSerで置換することができ;Cysは、Gly、Pro、Ser、またはMet、好ましくは、ProまたはMetで置換することができ;Metは、ProまたはCys、好ましくは、Cysで置換することができ;Hisは、PheまたはGin、好ましくは、Pheで置換することができ;Pheは、His、TyrまたはTrp、好ましくは、HisまたはTyrで置換することができ;Tyrは、His、PheまたはTrp、好ましくは、PheまたはTrpで置換することができ;Trpは、PheまたはTyr、好ましくは、Tyrで置換することができ;Asnは、GinまたはSer、好ましくは、Glnで置換することができ;Glnは、His、Lys、Glu、Asn、またはSer、好ましくは、AsnまたはSerで置換することができ;Serは、GIn、Thr、Pro、Cys、またはAlaで置換することができ;Thrは、GlnまたはSer、好ましくは、Serで置換することができ;Lysは、GinまたはArgで置換することができ;Argは、Lys、AspまたはGlu、好ましくは、LysまたはAspで置換することができ;Aspは、Lys、Arg、またはGlu、好ましくは、ArgまたはGluで置換することができ;Gluは、ArgまたはAsp、好ましくは、Aspで置換することができる。引き起こされた変化は、日常的な方法でスクリーニングして、機能に対するそれらの影響を決定することができる。本発明の他の実施形態は、spnK遺伝子における操作であって、リボソーム結合部位RBSの操作を包含する操作を包含しうる。spnK遺伝子コード配列の上流に位置するリボソーム結合部位シャイン-ダルガルノ配列と名付けられるは、spnK遺伝子が破壊され、その結果として、スピネトラム前駆体生成菌株が生成するように操作することができる。本発明のさらなる実施形態は、spnK遺伝子の複数のシグナル伝達経路に影響を及ぼす酵素的阻害であって、その結果として、スピネトラム生成菌株を生成させうる阻害を包含しうる。標的と関連する酵素活性を検出する方法は、酵素結合アッセイの使用を包含しうる。本発明の別の実施形態は、spnK遺伝子をコードするプロモーター配列の中断を包含する。このような中断は、切断、欠失、点突然変異、および挿入が含まれるがこれらに限定されない任意の種類の操作を介することが可能である。このような操作は、フレーム内の場合もあり、フレーム外の場合もある。このような操作は、結果として、スピネトラム生成菌株を生成させる。以下の非限定的な例では、本発明をより詳細に説明する。[実施例]spnK遺伝子における点突然変異の生成サッカロポリスポラスピノーサSaccharopolysporaspinosaのAおよびDの生成菌株をランダム突然変異誘発することにより、spnK遺伝子内に点突然変異を生成したKieserら、2000。スピノシンAおよびスピノシンDではなく、スピノシンJおよびスピノシンLを生成させる突然変異体菌株を、spnK遺伝子のPCR増幅の後で、DNA配列決定を介してさらに特徴づけた。spnK遺伝子は、FailSafePCRSystemEpicentreBiotechnologies、Madison、WIを用いて、spnKF配列番号1:GGGAATTCCATATGTCCACAACGCACGAGATCGAおよびspnKR配列番号2:GCCGCTCGAGCTCGTCCTCCGCGCTGTTCACGTCSによりPCR増幅した。結果として得られるPCR産物を、MoBioUltracleanPCRClean-upDNAPurificationKitMoBioLaboratories、SolanaBeach、CAを用いて精製し、T4DNAリガーゼInvitrogenLifeTechnologies、Carlsbad、CAを用いて、TAクローニングベクターへとクローニングした。PCR産物を含有すると推定される細菌コロニーを、制限酵素消化を介して単離および確認した。陽性のプラスミドクローンに対するDNA配列決定は、CEQ商標DTCS-QuickStartKitBeckman-Coulter、PaloAlto、CAを用いて、製造元のプロトコールにより説明される通りに実施した。製造元のプロトコールにより説明される通りに、PerformaDTRGelFiltrationCartridgesEdgeBioSystems、Gaithersburg、MDを用いて、反応物を精製した。Beckman-CoulterCEQ商標2000XLDNAAnalysisSystemにおいて配列反応物を解析し、SEQUENCHER商標GeneCodesCorporation、AnnArbor、MIを用いてヌクレオチドの特徴づけを実施した。配列決定の結果により、spnK遺伝子配列内の点突然変異の位置が確認された。結果として得られる点突然変異を、表1に列挙し、図1では影を付す。サッカロポリスポラスピノーサSaccharopolysporaspinosaのspnK突然変異体菌株の発酵は、BurnsらWO2003070908により説明される条件下で実施することができる。スピノシン因子の存在についての発酵培養液の解析は、Baltzら米国特許第6,143,526号により説明される条件下で実施することができる。上清におけるスピノシン因子の存在を確認するには、発酵培養液の抽出物を、SpeedVacにおいて一晩にわたり乾燥させた後、残留物を、水とエーテルとの間で分画した。エーテル層は、N2流下における蒸発により乾燥させた。次いで、試料をアセトンd6中に溶解させ、NMR用試験管へと移し、1DプロトンNMRを収集した。これらのNMRプロファイルを、スピノシン基準物質のNMRと比較した。NMRの結果は、A/Dに対して過剰なJ/Lの存在を示した。点突然変異を含有する菌株の発酵は、スピノシンAおよびスピノシンDを含有するスピノシン混合物を生成させる対照のサッカロポリスポラスピノーサSaccharopolysporaspinosaと比較して、スピノシンJおよびスピノシンLを含有するスピノシン混合物を生成させた。spnK欠失突然変異の生成spnKインフレーム欠失ベクターの構築スピノシンAおよびスピノシンDの生成菌株のゲノムDNAを用いて、1,595bpのDNA断片をPCR増幅したHopwoodら、1985。この断片は、spnK遺伝子の開始コドンの範囲にあり、spnJコード領域は含有したが、spnJ遺伝子の5’末端は伴わなかった図2。FailSafePCRキットEpicentreBiotechnologies、Madison、WI、ならびにフォワードプライマー1配列番号3:CGGTGCCCGAATTCCATGACCCGおよびリバースプライマー1配列番号4:GTGCGTTCTAGACATATGAGCTCCTCATGGCTGを用いて、PCR反応を完了した。第2のPCR反応を完了し、これにより、1,951bpのDNA断片を生成させたこの断片は、spnK遺伝子の3’末端、完全なspnL遺伝子、およびspnM遺伝子の5’末端を含有した図2。FailSafePCRキットならびにフォワードプライマー2配列番号5:GTGCCATCTAGACTGGACGACATATTGCACCTGおよびリバースプライマー2配列番号6:GAATGCGAAGCTTACGATCTCGTCGTCCGTGを用いて、PCR反応を完了した。製造元の指示書に従い、QIAquickPCRPurificationKitQiagen、Valencia、CAを用いて、PCR産物を精製した。1,595bpのPCR断片を、EcoRIおよびXbaIにより消化した。1,951bpのPCR断片を、XbaIおよびHindIIIにより消化した。制限酵素消化が完了したら、QIAquickPCRPurificationKitを用いて、断片を精製した。FastLinkDNALigationKitEpicentre、Madison、WIを用いて、消化された断片を、プラスミドpOJ260の対応するEcoRI制限部位およびHindIII制限部位へとライゲーションし、大腸菌EcoliTOP10コンピテント細胞Invitrogen、Carlsbad、CAへと形質転換した。制限酵素消化およびDNA配列解析を介して、所望のライゲーション産物について、コロニーを選択およびスクリーニングした。陽性のクローンを同定し、選択されたクローンを、サッカロポリスポラスピノーサSaccharopolysporaspinosaにおいて、後に続くspnKのインフレーム欠失に用いた。プラスミドpOJ260内で結果として得られる、欠失させたspnK遺伝子断片の配列を、表2に示す。したがって、spnK遺伝子における1つの欠失には、配列:ATGTCTAGACTGGACGACATATTGCACCTGGCCGACGTGAACAGCGCGGAGGACGAGTGA配列番号9が含まれるであろう。サッカロポリスポラスピノーサSaccharopolysporaspinosaへのspnK欠失ベクターのコンジュゲーションspnKインフレーム欠失構築物を、大腸菌Ecoliのコンジュゲーションドナー菌株であるET12567/pUZ8002へと形質転換した。陽性の形質転換菌株を同定し、これらを用いて、LuriaBroth培地適切な抗生剤を含有するのフラスコに接種して、225rpmで振とうしながら、37°Cで一晩にわたり増殖させた。プラスミドの識別確認は、プラスミドDNAを単離し、大腸菌Ecoliのドナー菌株からの制限酵素消化を完了することにより実施した。このクローンの忠実性が適正であることを確認したら、残りの培養物を、将来の使用のために、20のグリセロール中、-80°Cで保存した。spnKインフレーム欠失構築物を保有する大腸菌Ecoli細胞の、サッカロポリスポラスピノーサSaccharopolysporaspinosaとのコンジュゲーションは、Matsushimaら1994において説明される方法に従って実施した。spnKインフレーム欠失構築物のベクター骨格におけるアプラマイシン耐性遺伝子マーカーの存在により、アプラマイシンに耐性である推定トランスコンジュゲート体を選択した。トランスコンジュゲート体の確認、および組込み部位を決定するためのspnK領域の増幅R6培地において増殖させた単一の初代トランスコンジュゲート体を、50μg/mLのアプラマイシンおよび25μg/mLのナリジクス酸を補充したBrainHeartInfusionBHI寒天プレートへと移し、耐性表現型を確認した。トランスコンジュゲート体の菌糸体を、BHIプレートから、50μg/mLのアプラマイシンで補充したTrypticSoyBrothTSB培地へと接種した。培養物を、250rpmで振とうしながら、29°Cで72時間にわたりインキュベートした。72時間にわたるインキュベーションの後、菌糸体を回収し、製造元の指示書に従い、EdgeBioSystem’sGenomicDNAIsolationKitEdgeBiosystems、Gaithersburgh、MDを用いて、ゲノムDNAを単離した。鋳型としてのトランスコンジュゲート体から単離したゲノムDNAを、SpnKDelValidation1Forward配列番号7:GTTCACGGTGATTCCGGTGACTCGプライマーおよびSpnKDelValidation1Reverse配列番号8:ACCTGCACTGCTTCCTGGAGCTTCプライマーと共に用いて、PCRを実施した。加えて、サッカロポリスポラスピノーサSaccharopolysporaspinosa親対照菌株から単離したゲノムDNA、およびspnKインフレーム欠失構築物のプラスミドDNAを、対照のPCR反応の鋳型として用いた。PCR増幅の結果を配列決定した。配列決定データは、spnKインフレーム欠失構築物が、単一交差同種組換えを介して、spnLM領域へと組み込まれることを示した図3。染色体内のspnLM領域において、ベクター骨格であるpOJ260の上流に、spnJ遺伝子、spnK遺伝子、spnL遺伝子の完全コピー、切断型spnM遺伝子が組み込まれ、このベクター骨格の下流に、切断型spnJ遺伝子、ならびに完全spnL遺伝子およびspnM遺伝子が組み込まれた。二重交差spnKインフレーム欠失突然変異体の単離アプラマイシンに対して耐性である単一交差突然変異体を、アプラマイシンの非存在下にあるBHI寒天プレートに接種し、29°Cで14日間にわたりインキュベートした。Hopwoodら1985に従い、プレートから胞子を回収し、20のグリセロール中、-80°Cで保存した。胞子を、アプラマイシンを伴わない新規のBHI寒天プレート10枚へと接種し、プレートを、29°Cで14日間にわたりインキュベートした。このステップを3回にわたり反復した。20グリセロールを用いて、胞子調製物を、10-6倍まで希釈し、希釈された胞子を、10枚のBHI寒天プレートへと播種した。プレートを29°Cで10日間にわたりインキュベートし、単一のコロニーを発生させた。個々のコロニーを、アプラマイシンを伴う新規のBHI寒天プレート、およびアプラマイシンを伴わない新規のBHI寒天プレートへと継ぎ合わせた。全てのプレートを29°Cで10日間にわたりインキュベートし、菌糸体を発生させた。50μg/mLのアプラマイシンを含有するBHI寒天プレートでは増殖しなかったコロニーを、二重交差突然変異体の候補物質として同定し、PCRを用いる検証のために選択した。二重交差突然変異体の同定および検証PCRを介して、二重交差突然変異体を確認した。プライマーであるSpnKDelValidation1Forward配列番号7およびSpnKDelValidation1Reverse配列番号8を、spnL遺伝子およびspnJ遺伝子内で結合するようにデザインして、FailSafePCRSystemを用いるPCR増幅に用いる。PCR産物のサイズは、アガロースゲル電気泳動を介して決定した。spnK遺伝子の欠失を結果としてもたらす二重交差突然変異体を同定し図4、PCR産物のサイズに基づいてこれらを選択した。PCR断片のサイズおよびDNA配列は、spnK遺伝子のインフレーム欠失を示す。振とうフラスコ発酵を介する二重交差突然変異体によるスピノシン生成二重交差突然変異体の発酵は、BurnsらWO2003070908により説明される条件下で実施することができる。スピノシン因子の存在についての発酵培養液の解析は、Baltzら米国特許第6,143,526号により説明される条件下で実施することができる。上清におけるスピノシン因子の存在を確認するには、発酵培養液の抽出物を、SpeedVacにおいて一晩にわたり乾燥させた後、残留物を、水とエーテルとの間で分画した。エーテル層は、N2流下における蒸発により乾燥させた。次いで、試料をアセトンd6中に溶解させ、NMR用試験管へと移し、1DプロトンNMRを収集した。これらのNMRプロファイルを、スピノシン基準物質のNMRプロファイルと比較した。二重交差突然変異体の発酵は、スピノシンJおよびスピノシンLを生成させる。NMRの結果は、A/Dに対して過剰なJ/Lの存在を示した。spnK挿入突然変異の生成spnK遺伝子における挿入突然変異を介して、サッカロポリスポラスピノーサSaccharopolysporaspinosaの突然変異体を生成させる。spnK遺伝子内のインフレームのアプラマイシン耐性遺伝子カセットaac3IV、ならびにspnJ遺伝子およびspnL遺伝子の上流および下流にこれらを中断なしに挟み込む配列を含有するDNA断片を構築する図5。aac3IV遺伝子断片をプラスミドへとクローニングし、大腸菌Ecoliのコンジュゲーションドナー菌株であるET12567/pUZ8002へと形質転換する。陽性の形質転換菌株を同定し、これらを用いて、LuriaBroth培地適切な抗生剤を含有するのフラスコに接種して、225rpmで振とうしながら、37°Cで一晩にわたり増殖させる。プラスミドの識別確認は、プラスミドDNAを単離し、制限酵素消化を完了することにより実施する。アプラマイシン挿入カセットを含有するプラスミドが適正であることを確認したら、残りの培養物を、20のグリセロール中、-80°Cで保存する。大腸菌Ecoliドナー細胞の、サッカロポリスポラスピノーサSaccharopolysporaspinosaとのコンジュゲーションは、Matsushimaら1994において説明される方法に従って実施する。大腸菌Ecoliからのアプラマイシン遺伝子カセットの移送、および、その後におけるこのプラスミドの、サッカロポリスポラスピノーサSaccharopolysporaspinosaゲノムへの組込みは、アプラマイシンに対する耐性を用いて選択する。単一の初代トランスコンジュゲート体をR6培地において増殖させ、50μg/mLのアプラマイシンおよび25μg/mLのナリジクス酸を補充したBrainHeartInfusionBHI寒天プレートへと移し、耐性表現型を確認する。トランスコンジュゲート体の菌糸体を、BHIプレートから、50μg/mLのアプラマイシンで補充したTrypticSoyBrothTSB培地へと接種する。培養物を、250rpmで振とうしながら、29°Cで72時間にわたりインキュベートする。72時間にわたるインキュベーションの後、菌糸体を回収し、製造元の指示書に従い、EdgeBioSystem’sGenomicDNAIsolationKitEdgeBiosystems、Gaithersburgh、MDを用いて、ゲノムDNAを単離する。鋳型としてのトランスコンジュゲート体から単離したゲノムDNAを用いて、PCRを実施する。TOPO登録商標CloningTechnlologyInvitrogen、Carlsbad、CAを用いて、所望のPCR産物を、プラスミドへとクローニングする。制限酵素消化を介して、TOPO登録商標ベクター内にクローニングされたPCR産物を含有すると推定される細菌コロニーを単離および確認する。陽性のプラスミドクローンに対するDNA配列決定を実施する。配列決定の結果は、アプラマイシン挿入カセットが、二重交差相同組換えを介して、サッカロポリスポラスピノーサSaccharopolysporaspinosaのspnK遺伝子内に組み込まれることを示す。相同組換えを介して生じる挿入は、spnK遺伝子の転写を破壊し、これにより、spnK遺伝子の機能を消失させる。サッカロポリスポラスピノーサSaccharopolysporaspinosaのspnK突然変異体菌株の発酵は、BurnsらWO2003070908により説明される条件下で実施することができる。スピノシン因子の存在についての発酵培養液の解析は、Baltzら米国特許第6,143,526号により説明される条件下で実施することができる。上清におけるスピノシン因子の存在を確認するには、発酵培養液の抽出物を、SpeedVacにおいて一晩にわたり乾燥させた後、残留物を、水とエーテルとの間で分画する。エーテル層は、N2流下における蒸発により乾燥させる。次いで、試料をアセトンd6中に溶解させ、NMR用試験管へと移し、1DプロトンNMRを収集する。これらのNMRプロファイルを、スピノシン基準物質のNMRプロファイルと比較する。NMRの結果は、A/Dに対して過剰なJ/Lの存在を示す。挿入突然変異を含有する菌株の発酵は、スピノシンAおよびスピノシンDを含有するスピノシン混合物を生成させる対照のサッカロポリスポラスピノーサSaccharopolysporaspinosaと比較して、スピノシンJおよびスピノシンLを含有するスピノシン混合物を生成させる。spnKシャイン-ダルガルノ配列の破壊spnK遺伝子の上流に位置するシャイン-ダルガルノ配列図6を破壊すると、これにより、結果として、spnKmRNAの翻訳が低減される。実施例2において説明したのと同様のプロトコールを用いて、欠失させたspnKシャイン-ダルガルノ配列を含有するサッカロポリスポラスピノーサSaccharopolysporaspinosaの突然変異体菌株を生成させる。spnKシャイン-ダルガルノ配列の上流および下流に位置する、少なくとも1,500bpの2つの断片を、PCR増幅する。これらの断片は、以下の配列:5’-AGGAGCTC-3’を含有しない。2つの断片は、サッカロポリスポラスピノーサSaccharopolysporaspinosaとのコンジュゲーションに用いられうる、pOJ260などのプラスミド内に併せてライゲーションする。所望のプラスミドを、大腸菌Ecoliのコンジュゲーションドナー菌株であるET12567/pUZ8002へと形質転換する。陽性の形質転換菌株は、制限酵素消化を介して確認する。プラスミドを含有する大腸菌Ecoli株が適正であることを確認したら、Matsushimaら1994において説明される方法に従い、大腸菌Ecoli細胞の、サッカロポリスポラスピノーサSaccharopolysporaspinosaとのコンジュゲーションを実施する。大腸菌Ecoliドナー細胞からのプラスミドの移送、および、その後におけるこのプラスミドの、サッカロポリスポラスピノーサSaccharopolysporaspinosaゲノムへの組込みは、抗生剤に対する耐性を用いて選択する。サッカロポリスポラスピノーサSaccharopolysporaspinosaの染色体へのプラスミドの組込みは、特定のゲノムDNA領域をPCR増幅することにより分子的に特徴づけられる。略述すると、ゲノムDNAを単離し、spnKシャイン-ダルガルノ配列を含有する挿入をPCR増幅、クローニング、および配列決定する。配列決定データは、spnKシャイン-ダルガルノ欠失構築物が、単一交差同種組換えを介して、spnJK領域へと組み込まれることを示す。実施例2で説明したプロトコールを用いて、破壊されたspnKシャイン-ダルガルノ配列を含有する二重交差突然変異体を得る。抗生剤を含有するBHI寒天プレートでは増殖することが不可能なコロニーであって、ベクター骨格において存在するマーカーにより選択されるコロニーを、二重交差突然変異体の候補物質として同定し、PCRを用いる検証のために選択する。spnK遺伝子およびspnJ遺伝子内に結合するようにデザインされたプライマーを用いる。TOPO登録商標CloningTechnologyInvitrogen、Carlsbad、CAを用いて、結果として得られるPCR産物を、プラスミドへとサブクローニングする。制限酵素消化を介して、TOPO登録商標ベクター内にクローニングされたPCR産物を含有する細菌コロニーを単離および確認する。陽性のプラスミドクローンに対するDNA配列決定を実施する。配列決定の結果は、spnKシャイン-ダルガルノヌクレオチド配列が、サッカロポリスポラスピノーサSaccharopolysporaspinosaのゲノムから破壊されていることを示す。サッカロポリスポラスピノーサSaccharopolysporaspinosaのspnKシャイン-ダルガルノ配列突然変異体菌株の発酵は、BurnsらWO2003070908により説明される条件下で実施することができる。スピノシン因子の存在についての発酵培養液の解析は、Baltzら米国特許第6,143,526号により説明される条件下で実施することができる。上清におけるスピノシン因子の存在を確認するには、発酵培養液の抽出物を、SpeedVacにおいて一晩にわたり乾燥させた後、残留物を、水とエーテルとの間で分画する。エーテル層は、N2流下における蒸発により乾燥させた。次いで、試料をアセトンd6中に溶解させ、NMR用試験管へと移し、1DプロトンNMRを収集する。NMRの結果は、A/Dに対して過剰なJ/Lの存在を示す。これらのNMRプロファイルを、スピノシン基準物質のNMRプロファイルと比較する。欠失させたspnKシャイン-ダルガルノ配列突然変異体を含有する菌株の発酵は、スピノシンAおよびスピノシンDを含有するスピノシン混合物を生成させる対照のサッカロポリスポラスピノーサSaccharopolysporaspinosaと比較して、スピノシンJおよびスピノシンLを含有するスピノシン混合物を生成させる。アンチセンスRNAによるspnK遺伝子の下方制御を介する3’-O-メチルトランスフェラーゼ発現の低減spnK遺伝子のコード配列と相補的なasRNAアンチセンスRNAを生成させるように、プラスミドをデザインする。結果として得られるspnK遺伝子発現の下方制御は、結果として、spnK遺伝子の活性を低減する。spnK遺伝子のコード配列をPCR増幅し、サッカロポリスポラスピノーサSaccharopolysporaspinosaの染色体に組み込むため、pOJ260などのプラスミドへとクローニングする。代替的に、spnKコード配列を、サッカロポリスポラスピノーサSaccharopolysporaspinosaの細胞質ゾル内で安定的に維持および複製されるプラスミドへとクローニングすることもできる。結果として得られるプラスミドを、強力な構成的細菌プロモーターを用いてspnK遺伝子のアンチセンス鎖を発現させることにより、spnKasRNAを生成させるように構築する。このspnKasRNAプラスミドを、大腸菌Ecoliのコンジュゲーションドナー菌株であるET12567/pUZ8002へと形質転換する。陽性の形質転換菌株は、制限酵素消化を介して確認する。プラスミドを含有する大腸菌Ecoli株が適正であることを確認したら、Matsushimaら1994において説明される方法に従い、大腸菌Ecoliドナー細胞からの、サッカロポリスポラスピノーサSaccharopolysporaspinosaとのプラスミドのコンジュゲーションを実施する。大腸菌EcoliからサッカロポリスポラスピノーサSaccharopolysporaspinosaへのspnKasRNAプラスミドの移送は、抗生剤に対する耐性を用いて選択するこの耐性は、spnKasRNAプラスミドにおいてコードされる。トランスコンジュゲート体からゲノムDNAを単離し、これをPCR増幅の鋳型として用いて、プラスミドの存在を確認する。spnKasRNAプラスミドを含有する、サッカロポリスポラスピノーサSaccharopolysporaspinosa菌株の発酵は、BurnsらWO2003070908により説明される条件下で実施することができる。スピノシン因子の存在についての発酵培養液の解析は、Baltzら米国特許第6,143,526号により説明される条件下で実施することができる。上清におけるスピノシン因子の存在を確認するには、発酵培養液の抽出物を、SpeedVacにおいて一晩にわたり乾燥させた後、残留物を、水とエーテルとの間で分画する。エーテル層は、N2流下における蒸発により乾燥させた。次いで、試料をアセトンd6中に溶解させ、NMR用試験管へと移し、1DプロトンNMRを収集する。NMRの結果は、A/Dに対して過剰なJ/Lの存在を示す。これらのNMRプロファイルを、スピノシン基準物質のNMRプロファイルと比較する。spnKasRNAプラスミドを含有する菌株の発酵は、スピノシンAおよびスピノシンDを含有するスピノシン混合物を生成させる対照のサッカロポリスポラスピノーサSaccharopolysporaspinosaと比較して、スピノシンJおよびスピノシンLを含有するスピノシン混合物を生成させる。さらなるspnK欠失突然変異の生成実施例6.1:spnK遺伝子5’末端欠失ベクターの構築スピノシンAおよびスピノシンDの生成菌株のゲノムDNAHopwoodら、1985をPCR増幅して、2つのDNA断片を生成させた。第1の増幅断片は、約1,500bpの長さであり、ATG開始コドンのすぐ上流に位置する。第2の増幅断片は、約1,500bpの長さであり、spnK遺伝子の塩基対61のすぐ下流に位置する。当業者に知られる方法を用いて、PCR増幅を完了する。オリゴヌクレオチドプライマーを合成し、制限酵素結合配列を組み込む。結果として得られるPCR産物を、プライマーにより組み込まれた結合配列を切断する制限酵素により消化する。断片を併せてライゲーションし、次いで、プラスミドpOJ260の対応する制限部位へとライゲーションする。結果として得られるライゲーション産物を、大腸菌Ecoliコンピテント細胞へとクローニングする。制限酵素消化およびDNA配列解析を介して、所望のライゲーション産物について、コロニーを選択およびスクリーニングする。陽性のクローンを同定し、選択されたクローンを、その後、サッカロポリスポラスピノーサSaccharopolysporaspinosaにおいて、spnK遺伝子の5’末端を欠失させるのに用いる。プラスミドpOJ260内で結果として得られる、欠失させたspnK遺伝子断片の配列を、表3に示す。したがって、spnK遺伝子の開始コドンの欠失には、配列:配列番号10が含まれるであろう。サッカロポリスポラスピノーサSaccharopolysporaspinosaへのspnK欠失ベクターのコンジュゲーションspnK遺伝子の5’末端欠失構築物を保有する大腸菌Ecoli細胞の、サッカロポリスポラスピノーサSaccharopolysporaspinosaとのコンジュゲーションは、Matsushimaら1994において説明され、実施例2で例示される方法に従って実施する。spnK遺伝子の5’末端欠失構築物のベクター骨格におけるアプラマイシン耐性遺伝子マーカーの存在により、アプラマイシンに耐性である推定トランスコンジュゲート体を選択する。トランスコンジュゲート体の確認、および組込み部位を決定するためのspnK領域の増幅R6培地において増殖させた単一の初代トランスコンジュゲート体を、50μg/mLのアプラマイシンおよび25μg/mLのナリジクス酸を補充したBrainHeartInfusionBHI寒天プレートへと移し、耐性表現型を確認する。トランスコンジュゲート体の菌糸体を、BHIプレートから、50μg/mLのアプラマイシンで補充したTrypticSoyBrothTSB培地へと接種する。培養物を、250rpmで振とうしながら、29°Cで72時間にわたりインキュベートする。72時間にわたるインキュベーションの後、菌糸体を回収し、ゲノムDNAを単離する。鋳型としてのトランスコンジュゲート体から単離したゲノムDNAを、単一交差突然変異体を検出するようにデザインされたプライマーと共に用いて、PCRを実施する。PCR増幅産物の結果を配列決定する。配列決定データは、spnK遺伝子の5’末端欠失構築物が、単一交差同種組換えを介して、spnJK領域へと組み込まれることを示す。spnK遺伝子の5’末端二重交差欠失突然変異体の単離アプラマイシンに対して耐性である単一交差突然変異体を、アプラマイシンの非存在下にあるBHI寒天プレートに接種し、29°Cで14日間にわたりインキュベートする。Hopwoodら1985に従い、プレートから胞子を回収し、20のグリセロール中、-80°Cで保存する。胞子を、アプラマイシンを伴わない新規のBHI寒天プレートへと接種し、プレートを、29°Cで14日間にわたりインキュベートする。このステップを複数回にわたり反復する。20グリセロールを用いて、胞子調製物を希釈し、希釈された胞子を、BHI寒天プレートへと播種する。プレートを29°Cで10日間にわたりインキュベートし、単一のコロニーを発生させた。個々のコロニーを、アプラマイシンを伴う新規のBHI寒天プレート、およびアプラマイシンを伴わない新規のBHI寒天プレートへと継ぎ合わせる。全てのプレートを29°Cで10日間にわたりインキュベートし、菌糸体を発生させた。50μg/mLのアプラマイシンを含有するBHI寒天プレートでは増殖しなかったコロニーを、二重交差突然変異体の候補物質として同定し、PCRを用いる検証のために選択する。二重交差突然変異体の同定および検証PCRを介して、二重交差突然変異体を確認する。プライマーを、spnJ遺伝子およびspnK遺伝子内で結合するようにデザインして、PCR増幅に用いる。PCR産物のサイズは、アガロースゲル電気泳動を介して決定する。spnK遺伝子の5’末端の欠失を結果としてもたらす二重交差突然変異体を同定し、PCR産物のサイズに基づいてこれらを選択する。PCR断片のサイズおよびDNA配列は、spnK遺伝子のATG開始コドンおよび5’末端の欠失を示す。振とうフラスコ発酵を介するスピノシン生成二重交差突然変異体の発酵は、BurnsらWO2003070908により説明される条件下で実施することができる。スピノシン因子の存在についての発酵培養液の解析は、Baltzら米国特許第6,143,526号により説明される条件下で実施することができる。二重交差突然変異体の発酵は、スピノシンJおよびスピノシンLを生成させる。実施例6.2:spnKインフレーム欠失ベクターの構築スピノシンAおよびスピノシンDの生成菌株のゲノムDNAを用いて、2つのDNA断片をPCR増幅するHopwoodら、1985。第1の増幅断片は、約1,500bpの長さであり、第1の推定S-アデノシルメチオニン依存性メチルトランスフェラーゼドメインのすぐ上流に位置する。第2の増幅断片は、約1,500bpの長さであり、第1の推定S-アデノシルメチオニン依存性メチルトランスフェラーゼドメインのすぐ下流に位置する。当業者に知られる方法を用いて、PCR増幅を完了する。オリゴヌクレオチドプライマーを合成し、制限酵素結合配列を組み込む。結果として得られるPCR産物を、プライマーにより組み込まれた結合配列を切断する制限酵素により消化する。断片を併せてライゲーションし、次いで、プラスミドpOJ260の対応する制限部位へとライゲーションする。結果として得られるライゲーション産物を、大腸菌Ecoliコンピテント細胞へとクローニングする。制限酵素消化およびDNA配列解析を介して、所望のライゲーション産物について、コロニーを選択およびスクリーニングする。陽性のクローンを同定し、選択されたクローンを、その後、サッカロポリスポラスピノーサSaccharopolysporaspinosaにおいて、spnK遺伝子の第1の推定S-アデノシルメチオニン依存性メチルトランスフェラーゼドメインをインフレーム欠失させるのに用いた。プラスミドpOJ260内で結果として得られる、欠失させたspnK遺伝子断片の配列を、表4に示す。したがって、spnK遺伝子の欠失には、配列:配列番号11が含まれるであろう。サッカロポリスポラスピノーサSaccharopolysporaspinosaへのspnK欠失ベクターのコンジュゲーションspnKインフレーム欠失構築物を保有する大腸菌Ecoli細胞の、サッカロポリスポラスピノーサSaccharopolysporaspinosaとのコンジュゲーションは、Matsushimaら1994において説明され、実施例2で例示される方法に従って実施する。spnKインフレーム欠失構築物のベクター骨格におけるアプラマイシン耐性遺伝子マーカーの存在により、アプラマイシンに耐性である推定トランスコンジュゲート体を選択する。トランスコンジュゲート体の確認、および組込み部位を決定するためのspnK領域の増幅R6培地において増殖させた単一の初代トランスコンジュゲート体を、50μg/mLのアプラマイシンおよび25μg/mLのナリジクス酸を補充したBrainHeartInfusionBHI寒天プレートへと移し、耐性表現型を確認する。トランスコンジュゲート体の菌糸体を、BHIプレートから、50μg/mLのアプラマイシンで補充したTrypticSoyBrothTSB培地へと接種する。培養物を、250rpmで振とうしながら、29°Cで72時間にわたりインキュベートする。72時間にわたるインキュベーションの後、菌糸体を回収し、ゲノムDNAを単離する。鋳型としてのトランスコンジュゲート体から単離したゲノムDNAを、単一交差突然変異体を検出するようにデザインされたプライマーと共に用いて、PCRを実施する。PCR増幅の結果を配列決定する。配列決定データは、spnKインフレーム欠失構築物が、単一交差同種組換えを介して、spnK領域へと組み込まれることを示す。二重交差spnKインフレーム欠失突然変異体の単離アプラマイシンに対して耐性である単一交差突然変異体を、アプラマイシンの非存在下にあるBHI寒天プレートに接種し、29°Cで14日間にわたりインキュベートする。Hopwoodら1985に従い、プレートから胞子を回収し、20のグリセロール中、-80°Cで保存する。胞子を、アプラマイシンを伴わない新規のBHI寒天プレートへと接種し、プレートを、29°Cで14日間にわたりインキュベートする。このステップを複数回にわたり反復する。20グリセロールを用いて、胞子調製物を希釈し、希釈された胞子を、BHI寒天プレートへと播種する。プレートを29°Cで10日間にわたりインキュベートし、単一のコロニーを発生させた。個々のコロニーを、アプラマイシンを伴う新規のBHI寒天プレート、およびアプラマイシンを伴わない新規のBHI寒天プレートへと継ぎ合わせる。全てのプレートを29°Cで10日間にわたりインキュベートし、菌糸体を発生させた。50μg/mLのアプラマイシンを含有するBHI寒天プレートでは増殖しなかったコロニーを、二重交差突然変異体の候補物質として同定し、PCRを用いる検証のために選択する。二重交差突然変異体の同定および検証PCRを介して、二重交差突然変異体を確認する。プライマーを、spnK遺伝子内で結合するようにデザインして、PCR増幅に用いる。PCR産物のサイズは、アガロースゲル電気泳動を介して決定する。spnK遺伝子における第1の推定S-アデノシルメチオニン依存性メチルトランスフェラーゼドメインの欠失を結果としてもたらす二重交差突然変異体を同定し、PCR産物のサイズに基づいてこれらを選択する。PCR断片のサイズおよびDNA配列は、spnK遺伝子における第1の推定S-アデノシルメチオニン依存性メチルトランスフェラーゼドメインの欠失を示す。振とうフラスコ発酵を介するスピノシン生成二重交差突然変異体の発酵は、BurnsらWO2003070908により説明される条件下で実施することができる。スピノシン因子の存在についての発酵培養液の解析は、Baltzら米国特許第6,143,526号により説明される条件下で実施することができる。二重交差突然変異体の発酵は、スピノシンJおよびスピノシンLを生成させる。実施例6.3:spnKインフレーム欠失ベクターの構築スピノシンAおよびスピノシンDの生成菌株のゲノムDNAを用いて、2つのDNA断片をPCR増幅するHopwoodら、1985。第1の増幅断片は、約1,500bpの長さであり、第2の推定S-アデノシルメチオニン依存性メチルトランスフェラーゼドメインのすぐ上流に位置する。第2の増幅断片は、約1,500bpの長さであり、第2の推定S-アデノシルメチオニン依存性メチルトランスフェラーゼドメインのすぐ下流に位置する。当業者に知られる方法を用いて、PCR増幅を完了する。オリゴヌクレオチドプライマーを合成し、制限酵素結合配列を組み込む。結果として得られるPCR産物を、プライマーにより組み込まれた結合配列を切断する制限酵素により消化する。断片を併せてライゲーションし、次いで、プラスミドpOJ260の対応する制限部位へとライゲーションする。結果として得られるライゲーション産物を、大腸菌Ecoliコンピテント細胞へとクローニングする。制限酵素消化およびDNA配列解析を介して、所望のライゲーション産物について、コロニーを選択およびスクリーニングする。陽性のクローンを同定し、選択されたクローンを、その後、サッカロポリスポラスピノーサSaccharopolysporaspinosaにおいて、spnK遺伝子の第2の推定S-アデノシルメチオニン依存性メチルトランスフェラーゼドメインをインフレーム欠失させるのに用いた。プラスミドpOJ260内で結果として得られる、欠失させたspnK遺伝子断片の配列を、表5に示す。したがって、spnK遺伝子の欠失には、配列:配列番号12が含まれるであろう。サッカロポリスポラスピノーサSaccharopolysporaspinosaへのspnK欠失ベクターのコンジュゲーションspnKインフレーム欠失構築物を保有する大腸菌Ecoli細胞の、サッカロポリスポラスピノーサSaccharopolysporaspinosaとのコンジュゲーションは、Matsushimaら1994において説明され、実施例2で例示される方法に従って実施する。spnKインフレーム欠失構築物のベクター骨格におけるアプラマイシン耐性遺伝子マーカーの存在により、アプラマイシンに耐性である推定トランスコンジュゲート体を選択する。トランスコンジュゲート体の確認、および組込み部位を決定するためのspnK領域の増幅R6培地において増殖させた単一の初代トランスコンジュゲート体を、50μg/mLのアプラマイシンおよび25μg/mLのナリジクス酸を補充したBrainHeartInfusionBHI寒天プレートへと移し、耐性表現型を確認する。トランスコンジュゲート体の菌糸体を、BHIプレートから、50μg/mLのアプラマイシンで補充したTrypticSoyBrothTSB培地へと接種する。培養物を、250rpmで振とうしながら、29°Cで72時間にわたりインキュベートする。72時間にわたるインキュベーションの後、菌糸体を回収し、ゲノムDNAを単離する。鋳型としてのトランスコンジュゲート体から単離したゲノムDNAを、単一交差突然変異体を検出するようにデザインされたプライマーと共に用いて、PCRを実施する。PCR増幅の結果を配列決定する。配列決定データは、spnKインフレーム欠失構築物が、単一交差同種組換えを介して、spnK領域へと組み込まれることを示す。二重交差spnKインフレーム欠失突然変異体の単離アプラマイシンに対して耐性である単一交差突然変異体を、アプラマイシンの非存在下にあるBHI寒天プレートに接種し、29°Cで14日間にわたりインキュベートする。Hopwoodら1985に従い、プレートから胞子を回収し、20のグリセロール中、-80°Cで保存する。胞子を、アプラマイシンを伴わない新規のBHI寒天プレートへと接種し、プレートを、29°Cで14日間にわたりインキュベートする。このステップを複数回にわたり反復する。20グリセロールを用いて、胞子調製物を希釈し、希釈された胞子を、BHI寒天プレートへと播種する。プレートを29°Cで10日間にわたりインキュベートし、単一のコロニーを発生させた。個々のコロニーを、アプラマイシンを伴う新規のBHI寒天プレート、およびアプラマイシンを伴わない新規のBHI寒天プレートへと継ぎ合わせる。全てのプレートを29°Cで10日間にわたりインキュベートし、菌糸体を発生させた。50μg/mLのアプラマイシンを含有するBHI寒天プレートでは増殖しなかったコロニーを、二重交差突然変異体の候補物質として同定し、PCRを用いる検証のために選択する。二重交差突然変異体の同定および検証PCRを介して、二重交差突然変異体を確認する。プライマーを、spnK遺伝子内で結合するようにデザインして、PCR増幅に用いる。PCR産物のサイズは、アガロースゲル電気泳動を介して決定する。spnK遺伝子における第2の推定S-アデノシルメチオニン依存性メチルトランスフェラーゼドメインの欠失を結果としてもたらす二重交差突然変異体を同定し、PCR産物のサイズに基づいてこれらを選択する。PCR断片のサイズおよびDNA配列は、spnK遺伝子における第2の推定S-アデノシルメチオニン依存性メチルトランスフェラーゼドメインの欠失を示す。振とうフラスコ発酵を介するスピノシン生成二重交差突然変異体の発酵は、BurnsらWO2003070908により説明される条件下で実施することができる。スピノシン因子の存在についての発酵培養液の解析は、Baltzら米国特許第6,143,526号により説明される条件下で実施することができる。二重交差突然変異体の発酵は、スピノシンJおよびスピノシンLを生成させる。実施例6.4:spnK遺伝子の3’末端欠失ベクターの構築スピノシンAおよびスピノシンDの生成菌株のゲノムDNAを用いて、2つのDNA断片をPCR増幅するHopwoodら、1985。第1の増幅断片は、約1,500bpの長さであり、spnK遺伝子の塩基対1141のすぐ上流に位置する。第2の増幅断片は、約1,500bpの長さであり、spnK遺伝子の終始コドンのすぐ下流に位置し、spnL遺伝子の一部を包含する。当業者に知られる方法を用いて、PCR増幅を完了する。オリゴヌクレオチドプライマーを合成し、制限酵素結合配列を組み込む。結果として得られるPCR産物を、プライマーにより組み込まれた結合配列を切断する制限酵素により消化する。断片を併せてライゲーションし、次いで、プラスミドpOJ260の対応する制限部位へとライゲーションする。結果として得られるライゲーション産物を、大腸菌Ecoliコンピテント細胞へとクローニングする。制限酵素消化およびDNA配列解析を介して、所望のライゲーション産物について、コロニーを選択およびスクリーニングする。陽性のクローンを同定し、選択されたクローンを、その後、サッカロポリスポラスピノーサSaccharopolysporaspinosaにおいて、spnK遺伝子の3’末端を欠失させるのに用いた。プラスミドpOJ260内で結果として得られる、欠失させたspnK遺伝子断片の配列を、表6に示す。したがって、spnK遺伝子の欠失には、配列:配列番号13が含まれるであろう。サッカロポリスポラスピノーサSaccharopolysporaspinosaへのspnK欠失ベクターのコンジュゲーションspnK遺伝子の3’末端欠失構築物を保有する大腸菌Ecoli細胞の、サッカロポリスポラスピノーサSaccharopolysporaspinosaとのコンジュゲーションは、Matsushimaら1994において説明され、実施例2で例示される方法に従って実施する。spnK遺伝子の3’末端欠失構築物のベクター骨格におけるアプラマイシン耐性遺伝子マーカーの存在により、アプラマイシンに耐性である推定トランスコンジュゲート体を選択する。トランスコンジュゲート体の確認、および組込み部位を決定するためのspnK領域の増幅R6培地において増殖させた単一の初代トランスコンジュゲート体を、50μg/mLのアプラマイシンおよび25μg/mLのナリジクス酸を補充したBrainHeartInfusionBHI寒天プレートへと移し、耐性表現型を確認する。トランスコンジュゲート体の菌糸体を、BHIプレートから、50μg/mLのアプラマイシンで補充したTrypticSoyBrothTSB培地へと接種する。培養物を、250rpmで振とうしながら、29°Cで72時間にわたりインキュベートする。72時間にわたるインキュベーションの後、菌糸体を回収し、ゲノムDNAを単離する。鋳型としてのトランスコンジュゲート体から単離したゲノムDNAを、単一交差突然変異体を検出するようにデザインされたプライマーと共に用いて、PCRを実施する。PCR増幅の結果を配列決定する。配列決定データは、spnK遺伝子の3’末端欠失構築物が、単一交差同種組換えを介して、spnKL領域へと組み込まれることを示す。二重交差spnK3’末端欠失突然変異体の単離アプラマイシンに対して耐性である単一交差突然変異体を、アプラマイシンの非存在下にあるBHI寒天プレートに接種し、29°Cで14日間にわたりインキュベートする。Hopwoodら1985に従い、プレートから胞子を回収し、20のグリセロール中、-80°Cで保存する。胞子を、アプラマイシンを伴わない新規のBHI寒天プレートへと接種し、プレートを、29°Cで14日間にわたりインキュベートする。このステップを複数回にわたり反復する。20グリセロールを用いて、胞子調製物を希釈し、希釈された胞子を、BHI寒天プレートへと播種する。プレートを29°Cで10日間にわたりインキュベートし、単一のコロニーを発生させた。個々のコロニーを、アプラマイシンを伴う新規のBHI寒天プレート、およびアプラマイシンを伴わない新規のBHI寒天プレートへと継ぎ合わせる。全てのプレートを29°Cで10日間にわたりインキュベートし、菌糸体を発生させた。50μg/mLのアプラマイシンを含有するBHI寒天プレートでは増殖しなかったコロニーを、二重交差突然変異体の候補物質として同定し、PCRを用いる検証のために選択する。二重交差突然変異体の同定および検証PCRを介して、二重交差突然変異体を確認する。プライマーを、spnK遺伝子およびspnL遺伝子内で結合するようにデザインして、PCR増幅に用いる。PCR産物のサイズは、アガロースゲル電気泳動を介して決定する。spnK遺伝子の3’末端の欠失を結果としてもたらす二重交差突然変異体を同定し、PCR産物のサイズに基づいてこれらを選択する。PCR断片のサイズおよびDNA配列は、spnK遺伝子の3’末端の欠失を示す。振とうフラスコ発酵を介するスピノシン生成二重交差突然変異体の発酵は、BurnsらWO2003070908により説明される条件下で実施することができる。スピノシン因子の存在についての発酵培養液の解析は、Baltzら米国特許第6,143,526号により説明される条件下で実施することができる。二重交差突然変異体の発酵は、スピノシンJおよびスピノシンLを生成させる。言及された全ての特許および刊行物は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。前出は、本発明を例示するものであり、これを限定するものとしてはみなさないものとする。本発明は、以下の特許請求の範囲により規定されるが、これらの特許請求の範囲の同等物もその中に包含されるものとする。"