"逆転写酵素および/またはプロテアーゼと関連する出現頻度の低い1以上のHIV配列バリアントを検出するための、下記の段階を含む方法:aHIV試料集団中の複数のRNA分子からcDNA種を生成させ;bこれらのcDNA種から複数の第1アンプリコンを増幅させて、第1アンプリコンの増幅コピーを作成し、その際、それぞれの第1アンプリコンはクレイドA、クレイドB、クレイドC、クレイドD、クレイドF、およびクレイドGを含むHIVクレイドからアンプリコンを生成しうる核酸プライマー対を用いて増幅され;c第1アンプリコンの増幅コピーをクローン増幅させて、複数の第2アンプリコンを生成させ;d第2アンプリコンの核酸配列組成を決定し;そしてe第2アンプリコンの核酸配列組成における1以上の配列バリアントを検出する。さらに、f検出した配列バリアントとHIV逆転写酵素またはプロテアーゼと関連する変異との相関性を求める段階を含む、請求項1に記載の方法。HIV逆転写酵素またはプロテアーゼと関連する変異が、ある阻害剤に対する耐性と関連することが分かっている、請求項1に記載の方法。核酸プライマー対は、クレイドA、クレイドB、クレイドC、クレイドD、クレイドF、およびクレイドGからなる群から選択される2つのクレイドの組換え体を含む組換えHIVクレイドからアンプリコンを生成することができる、請求項1に記載の方法。複数のアンプリコンが6つのアンプリコンを含む、請求項1に記載の方法。前記6つのアンプリコンを増幅させるためのプライマー対が、Ti13FMultiプライマーとTi1RMultiプライマー;Ti2FMultiD-2プライマーとTi2RMultiE-2プライマー;Ti13FMultiプライマーとTi3RMultiBプライマー;Ti4FMultiD2プライマーとTi4RMultiBプライマー;Ti5FMultiプライマーとTi5RMultiBプライマー;およびTi6FMultiプライマーとTi6RMultiプライマーを含む、請求項5に記載の方法。前記6つのアンプリコンが、HIVの逆転写酵素およびプロテアーゼと関連する領域の完全適用範囲を備えている、請求項5に記載の方法。前記6つのアンプリコンが、HIVの逆転写酵素およびプロテアーゼと関連する領域の少なくとも二重の適用範囲を備えている、請求項7に記載の方法。複数のアンプリコンが4つのアンプリコンを含む、請求項1に記載の方法。前記4つのアンプリコンを増幅させるためのプライマー対が、Ti13FMultiプライマーとTi3RMultiBプライマー;Ti4FMultiAプライマーとTi5Rプライマー;Ti5FnプライマーとTi2Rプライマー;およびTi6FMultiプライマーとTi6RMultiプライマーを含む、請求項9に記載の方法。前記4つのアンプリコンが、HIVの逆転写酵素およびプロテアーゼと関連する領域の完全適用範囲を備えている、請求項9に記載の方法。検出した配列バリアントがHIVウイルス集団において1以下の頻度で生じる、請求項1に記載の方法。請求項1に記載の第1アンプリコンを増幅させるために用いる複数の核酸プライマー対を含む、逆転写酵素および/またはプロテアーゼの領域と関連する1以上のHIV配列バリアントを検出するためのキット。1以上のプライマー対が、Ti13FMultiプライマーとTi1RMultiプライマー;Ti2FMultiD-2プライマーとTi2RMultiE-2プライマー;Ti13FMultiプライマーとTi3RMultiBプライマー;Ti4FMultiD2プライマーとTi4RMultiBプライマー;Ti5FMultiプライマーとTi5RMultiBプライマー;Ti6FMultiプライマーとTi6RMultiプライマーからなる群から選択される、請求項13に記載のキット。1以上のプライマー対が、Ti13FMultiプライマーとTi3RMultiBプライマー;Ti4FMultiAプライマーとTi5Rプライマー;Ti5FnプライマーとTi2Rプライマー;およびTi6FMultiプライマーとTi6RMultiプライマーからなる群から選択される、請求項13に記載のキット。454Sequencingplatformにより得られる長い読み長さは、1回の配列決定行程で多数の対象からの数千のクローン読みを作成するのに理想的に適している。したがって、配列に基づくHIV逆転写酵素およびプロテアーゼ阻害剤耐性決定アッセイこの場合、クローン配列は、労働集約的なクローニング段階なしに、ウイルスRNA偽種から直接に得られるによるこれらの変異の効率的な検出はきわめて望ましく、早期検出によって疾患および処置の可能性を知ることにおいて実質的な前進を可能にする。さらに、多量並列処理と呼ぶことができるものを可能にしたハイスループット配列決定法の態様は、以前の配列決定法より実質的にいっそう強力な分析、感度、および処理量の特性をもつ。たとえば、本明細書に記載する発明のHIV特異的プライマーを用いるハイスループット配列決定法は、集団中の対立遺伝子バリアントの1以下の頻度を含めた存在量の低い対立遺伝子を検出する感度を達成できる。前記のように、これはHIVバリアントの検出に関して重要であり、高感度は重要な早期検出機構を提供し、これが療法上の実質的な有益性をもたらす。本発明の態様は、核酸の配列決定に関する。より具体的には、本発明の態様は、ハイスループット配列決定法を用いて配列バリアントを検出するための方法およびシステムに関する。逆転写酵素および/またはプロテアーゼと関連する出現頻度の低い1以上のHIV配列バリアントを検出するための、下記の段階を含む方法を記載する:aHIV試料集団中の複数のRNA分子からcDNA種を生成させ;bこれらのcDNA種から複数の第1アンプリコンを増幅させ、その際、それぞれの第1アンプリコンはクレイドA、クレイドB、クレイドC、クレイドD、クレイドF、およびクレイドGを含むHIVクレイドからアンプリコンを生成しうる核酸プライマー対を用いて増幅され;c第1アンプリコンの増幅コピーをクローン増幅させて、複数の第2アンプリコンを生成させ;d第2アンプリコンの核酸配列組成を決定し;そしてe第2アンプリコンの核酸配列組成における1以上の配列バリアントを検出する。上記の態様および実施形態は必ずしも包括的または相互排他的ではなく、それらが同一または異なる態様または実施形態と関連して提示されたとしても、矛盾せずかつ他の点において可能ないずれかの様式で組み合わせることができる。1つの態様または実施形態の記載は、他の態様および/または実施形態に関して限定することを意図したものではない。同様に、本明細書の他の箇所に記載したいずれか1以上の機能、段階、操作または手法を、別の実施形態において、概要に記載したいずれか1以上の機能、段階、操作または手法と組み合わせることができる。したがって、上記の態様および実施形態は限定ではなく例示である。より詳細に以下に記載するように、本明細書に記載する発明は、クレイドA、B、C、D、F、およびGにおけるHIVバリアントを1回の配列決定アッセイで同時に検出するように設計された標的特異的配列またはプライマー種を使用するための、ならびにそれらのプライマーを逆転写酵素およびプロテアーゼ領域におけるHIV配列バリアントの高感度検出に使用するための、システムおよび方法を含む。a.全般用語フローグラムは、一般的に、SBS法、特にピロホスフェートに基づく配列決定法ピロ配列決定法とも呼ばれるにより作成した配列データの図形表現を表わし、より具体的にはピログラムと呼ぶことができる。本明細書中で用いる用語読みまたは配列の読みは、一般的に、1つの核酸鋳型分子から、またはその鋳型核酸分子の実質的に同一である複数のコピーの集団から得られる、全配列データを表わす。本明細書中で用いる用語行程または配列決定行程は、一般的に、1以上の核酸鋳型分子の配列決定操作で実施される一連の配列決定反応を表わす。本明細書中で用いる用語フローは、一般的に、一般的に鋳型核酸分子を含む流体溶液を反応環境へ導入する反復プロセスの一部である単一サイクルを表わし、その際、その溶液は、新生分子に付加するためのヌクレオチド種、あるいは他の試薬、たとえば配列決定プロセスに使用できるかまたは前のヌクレオチド種のフローからのキャリーオーバーまたはノイズ効果を低減するために使用できる緩衝液、洗浄溶液または酵素を含有することができる。本明細書中で用いる用語フローサイクルは、一般的に、連続した一連のフローを表わし、その際、ヌクレオチド種を含む流体はそのサイクル中で1回流されるすなわち、フローサイクルはT、A、C、Gヌクレオチド種を順に連続添加することを含むことができるが、他の配列組合わせもこの定義の一部とみなされる。一般に、フローサイクルはサイクル間で同じシーケンスのフローを伴う反復サイクルである。本明細書中で用いる用語読み長さは、一般的に、信頼性をもって配列決定できる鋳型分子の長さの上限を表わす。あるシステムおよび/またはプロセスの読み長さに関与する多数の要因があり、それには鋳型核酸分子中のGC含有度が含まれるが、これに限定されない。本明細書中で用いる用語検査フラグメントまたはTFは、一般的に、品質管理、検量、または関連する他の目的で使用できる既知の配列組成をもつ核酸エレメントを表わす。本明細書中で用いる用語プライマーは、一般的に、ある核酸鎖に対して相補的なプライマー伸長生成物の合成が適宜な緩衝液中で適切な温度において誘導される条件下で、DNA合成の開始点として作用するオリゴヌクレオチドを表わす。プライマーは、好ましくは一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドである。本明細書中で用いる用語新生分子は、一般的に、鋳型依存性DNAポリメラーゼにより鋳型分子中の対応するヌクレオチド種に対して相補的なヌクレオチド種の取込みによって伸長されるDNA鎖を表わす。本明細書中で用いる用語鋳型核酸、鋳型分子、標的核酸、または標的分子は、一般的に、配列決定反応の対象である核酸分子を表わし、それから配列のデータまたは情報が作成される。本明細書中で用いる用語ヌクレオチド種は、一般的に、新生核酸分子に一般に取り込まれるプリン類アデニン、グアニンおよびピリミジン類シトシン、ウラシル、チミンを含めた核酸モノマーの種類を表わす。天然ヌクレオチド種には、たとえばアデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、およびチミンが含まれる。上記の天然ヌクレオチド種の修飾形には、限定ではなく、ヒポキサンチン、キサンチン、7-メチルグアニン、5,6-ジヒドロウラシル、および5-メチルシトシンが含まれる。本明細書中で用いる用語モノマー反復配列またはホモポリマーは、一般的に、同じヌクレオチド種を含む2以上の配列位置すなわち、反復ヌクレオチド種を表わす。本明細書中で用いる用語均一伸長は、一般的に、実質的に同一である鋳型分子の集団の各メンバーがその反応において同じ伸長段階を均一に行なう、伸長反応の関係または期を表わす。本明細書中で用いる用語完成効率は、一般的に、そのフローに際して適正に伸長した新生分子のパーセントを表わす。本明細書中で用いる用語不完全伸長率は、一般的に、すべての新生分子の数に対する適正に伸長できなかった新生分子の数の比率を表わす。本明細書中で用いる用語ゲノムライブラリーまたはショットガンライブラリーは、一般的に、生物または個体の全ゲノムすなわち、ゲノムの全領域に由来する、および/または全ゲノムを提示する、分子集合体を表わす。本明細書中で用いる用語アンプリコンは、一般的に、選択された増幅生成物、たとえばポリメラーゼ連鎖反応法またはリガーゼ連鎖反応法から生成したものを表わす。本明細書中で用いる用語バリアントまたは対立遺伝子は、一般的に、類似するけれども互いにある程度の相異をもつ配列組成をそれぞれコードする複数の種のうちの1つを表わす。この相異には、当業者に既知のいずれかのタイプの変異を含めることができ、これには多型、たとえば一塩基多型SNP、挿入または欠失挿入/欠失事象の組合わせはindelとも呼ばれる、反復配列縦列反復配列とも呼ばれる数の差、および構造変異が含まれるが、これらに限定されない。本明細書中で用いる用語対立遺伝子頻度は、一般的に、ある集団の全バリアントのうち特定のバリアントからなる割合を表わす。本明細書中で用いる用語鍵配列または鍵エレメントは、一般的に、鋳型核酸分子に既知のロケーションで会合したすなわち、一般にライゲートしたアダプターエレメント中に含まれる既知の配列組成を含む核酸配列エレメント一般に、約4つの配列位置のもの、すなわちTGAC、または他の組合わせのヌクレオチド種を表わし、それは鋳型分子から作成される配列データに対する品質管理基準として用いられる。配列データが適正なロケーションにおける鍵エレメントと関連する既知の配列組成を含むならば、その配列データは品質管理に合格する。本明細書中で用いる用語キーパスまたはキーパスウェルは、一般的に、既知の配列組成をもつ全長核酸検査配列すなわち、前記で述べた検査フラグメントまたはTFの反応ウェルにおける配列決定を表わす;その際、TF配列および/または鍵配列TFに会合した、または標的核酸に会合したアダプター中のに由来する配列の精度を、TFおよび/または鍵の既知の配列組成と比較し、その配列決定の精度の尺度として、また品質管理のために用いる。典型的な態様において、配列決定行程におけるウェルの総数のうちのある割合がキーパスウェルであり、それらはある態様において、分散した領域にあってもよい。本明細書中で用いる用語平滑末端は、当業者の理解と一致して解釈され、一般的に、一対の相補的ヌクレオチド塩基種で終わる末端をもつ線状二本鎖核酸分子を表わし、その際、一対の平滑末端は一般に相互ライゲーションに適合する。本明細書中で用いる用語粘着末端またはオーバーハングは、一般的に、当業者の理解と一致して解釈され、一般的に、その分子の一方の鎖の末端に1以上の非対合ヌクレオチド種をもつ線状二本鎖核酸分子を表わし、その際、非対合ヌクレオチド種はいずれか一方の鎖上に存在し、単一の塩基位置または複数の塩基位置を含む時には付着末端とも呼ばれる。本明細書中で用いる用語SPRIは、当業者の理解と一致して解釈され、一般的に、特許技術固相可逆固定化を表わし、その場合、標的核酸は特定の緩衝条件下にビーズの存在下で選択的に沈降し、その際、それらのビーズはしばしばカルボキシル化されており、かつ常磁性である。沈降した標的核酸はビーズに固定化され、オペレーターの要望に従って溶離により分離されるまで結合を維持する47424743。本明細書中で用いる用語カルボキシル化されたは、当業者の理解と一致して解釈され、一般的に、微粒子などの材料を少なくとも1つのカルボキシル基の付加により修飾することを表わす。カルボキシル基はCOOHまたはCOO-である。本明細書中で用いる用語常磁性は、当業者の理解と一致して解釈され、一般的に材料の特性を表わし、その材料の磁性は外部印加磁界の存在下でのみ発生し、その外部印加磁界が除かれると磁化は全く維持されない。本明細書中で用いる用語ビーズまたはビーズ支持体は、一般的に、いずれか好都合なサイズの不規則または規則的な形状のいずれかのタイプの固相粒子を表わし、それらはたとえば下記の多数の既知材料から作成される:セルロース、セルロース誘導体、アクリル樹脂、ガラス、シリカゲル、ポリスチレン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ビニルとアクリルアミドのコポリマー、ジビニルベンゼンなどで架橋したポリスチレン13851390に記載されるもの、ポリアクリルアミド、ラテックスゲル、ポリスチレン、デキストラン、ゴム、シリコン、プラスチック、ニトロセルロース、天然スポンジ、シリカゲル、制御ポアガラス、金属、架橋デキストラン、アガロースゲル、および当業者に既知の他の固相ビーズ支持体。本明細書中で用いる用語反応環境は、一般的に、反応を行なうことができるある体積の空間を表わし、一般にそこに反応体を少なくとも一時的に収容または拘束して、少なくとも1種類の反応生成物を検出することができる。反応環境の例にはキュベット、チューブ、ボトル、および平面または非平面支持体上の1以上の窪み、ウェル、またはチャンバーが含まれるが、これらに限定されない。本明細書中で用いる用語仮想ターミネーターは、一般的に、反応速度を実質的に低下させるターミネーターを表わし、その際、反応を停止させるための追加段階、たとえば反応体の除去を採用してもよい。試料の調製および処理、配列データの作成、および配列データの分析と関連するシステムおよび方法の若干の代表的態様を一般的に以下に記載する;それらの一部または全部を本明細書に記載する発明の態様について使用できる。特に、鋳型核酸分子の調製、鋳型分子の増幅、標的特異的アンプリコンおよび/またはゲノムライブラリーの作成のためのシステムおよび方法、配列決定の方法および機器装備、ならびにコンピューターシステムの代表的態様を記載する。一般的態様において、実験試料または診断試料に由来する核酸分子を、それの原形態から調製および処理して、ハイスループット配列決定に適した鋳型分子にすべきである。その処理法は適用毎に異なる可能性があり、その結果、多様な特性を含む鋳型分子が得られる。たとえば、ハイスループット配列決定のある態様において、少なくとも特定の配列決定によりそれについて精確に配列データを得ることができる長さに匹敵する配列または読み長さをもつ鋳型分子を作成することが好ましい。この例において、長さには約25~30塩基、約50~100塩基、約200~300塩基、約350~500塩基、約500~1000塩基の範囲、1000塩基より大、または特定の配列決定適用に適した他のいずれかの長さを含めることができる。ある態様において、試料、たとえばゲノム試料に由来する核酸を、当業者に既知である多数の方法を用いてフラグメント化する。好ましい態様において、核酸をランダムにフラグメント化するすなわち、特定の配列または領域を選択しない方法には、噴霧法または音波処理法と呼ばれるものを含めることができる。しかし、他のフラグメント化法、たとえば制限エンドヌクレアーゼを用いる消化をフラグメント化の目的に使用できることは認識されるであろう。同様にこの例において、ある処理法は、希望する長さの核酸フラグメントを選択的に単離するために当技術分野で既知のサイズ選択法を使用できる。同様に、ある態様において、追加の機能エレメントをそれぞれの鋳型核酸分子と関連づけることが好ましい。それらのエレメントは多様な機能のために使用でき、下記を含むが、それらに限定されない:増幅および/または配列決定法のためのプライマー、品質管理エレメントすなわち、たとえば鍵エレメントまたは他のタイプの品質管理エレメント、原試料または患者などとの種々の関連性をエンコードするユニーク識別子多重識別子またはMIDとも呼ばれる、あるいは他の機能エレメント。たとえば、本発明のある態様は、既知の識別可能な配列組成をもつ1以上の態様のMIDエレメントを試料と関連づけ、それらの態様のMIDエレメントを関連づけた試料に由来する鋳型核酸分子とカップリングさせることを含む。MIDカップリングした、多数の異なる試料に由来する鋳型核酸分子をプールして、単一の多重試料または組成物にし、次いでそれを効率的に処理して、MIDカップリングした鋳型核酸分子それぞれについての配列データを作成することができる。鋳型核酸分子それぞれについての配列データをデコンボルーションして、カップリングしたMIDエレメントの配列組成を同定し、原試料との関連性を同定する。この例において、多重組成物は約384の試料からの代表、約96の試料、約50の試料、約20の試料、約16の試料、約12の試料、約10の試料、または他の数の試料を含むことができる。各試料を、研究に関して、種々の実験条件、処理、種、または個体と関連づけることができる。同様に各試料を、診断に関して、種々の組織、細胞、個体、条件、薬物、または他の処理と関連づけることができる。前記に挙げた試料の数は代表例を示す目的で提示され、したがって限定とみなすべきではないことは、当業者に認識されるであろう。好ましい態様において、各MIDエレメントの配列組成は容易に同定でき、配列決定プロセスで導入される過誤を生じにくい。MIDエレメントのある態様は、自然界に存在する配列との配列類似性が最小であるユニーク配列組成の核酸種を含む。あるいは、MIDエレメントの態様は、自然界に存在する配列とのある程度の配列類似性を含むことができる。同様に、好ましい態様において、鋳型核酸分子のある特徴および/または鋳型核酸分子にカップリングしたアダプターエレメントと対比して、各MIDエレメントの位置が分かっている。各MIDエレメントの位置が分かっていることは、配列データ中にMIDエレメントを見出して、MID配列組成を過誤の可能性について解釈し、その後、原試料と関連づけるために有用である。たとえば、MIDエレメントに対する位置関係の手掛かりとして有用なある特徴には、鋳型分子の長さすなわち、MIDエレメントは5’または3’末端からどのくらいの配列位置にあるかが分かっている、MIDエレメントに隣接した位置にある認識可能な配列マーカー、たとえば鍵エレメントおよび/または1以上のプライマーエレメントが含まれるが、これらに限定されない。この例において、鍵エレメントおよびプライマーエレメントは一般に既知の配列組成を含み、これは一般に多重組成物において試料毎に変動せず、MIDエレメントを探索するための位置基準として使用できる。アプリケーション135により実装される分析アルゴリズムをコンピューター130で実行し、それぞれのMIDカップリングした鋳型について作成された配列データを分析して、より容易に認識できる鍵エレメントおよび/またはプライマーエレメントを同定し、それらの位置から外挿して、MIDエレメントの配列を含むと推定される配列領域を同定することができる。アプリケーション135は、次いでこの推定領域およびおそらくそのフランキング領域内のある距離離れた領域の配列組成を処理して、MIDエレメントおよびそれの配列組成を確実に同定することができる。前記の機能エレメントの一部または全部を組み合わせてアダプターエレメントにし、これらをある処理段階でヌクレオチド配列にカップリングさせることができる。たとえば、ある態様は、プライミング配列エレメント、あるいは増幅および/または配列決定に用いたプライマー配列に対して相補的な配列組成を含む領域を、会合させることができる。さらに、これらの同じエレメントを、鎖選択と呼ぶことができるものおよび固相支持体への核酸分子の固定化のために使用できる。ある態様において、2セットのプライミング配列領域以後、プライミング配列Aおよびプライミング配列Bと呼ぶを鎖選択に使用でき、その際、1コピーのプライミング配列Aおよび1コピーのプライミング配列Bをもつ一本鎖のみを選択し、調製試料として含める。別態様において、アダプターエレメントのデザイン特徴により鎖選択の必要性が除かれる。これらの同じプライミング配列領域を増幅および固定化のための方法に使用でき、その際、たとえばプライミング配列Bを固体支持体上に固定化し、それから増幅生成物を延長させることができる。フラグメント化、鎖選択、ならびに機能エレメントおよびアダプターの付加のための試料処理の他の例は、USPatentApplicationSerialNo10767894タイトルMethodforpreparingsinglestrandedDNAlibraries2004年1月28日出願USPatentApplicationSerialNo12156242タイトルSystemandMethodforIdentificationofIndividualSamplesfromaMultiplexMixture2008年5月29日出願およびUSPatentApplicationSerialNo12380139タイトルSystemandMethodforImprovedProcessingofNucleicAcidsforProductionofSequencableLibraries2009年2月23日出願に記載されており、これらのそれぞれを全体としてあらゆる目的で本明細書に援用する。鋳型核酸分子の増幅を実施して実質的に同一であるコピーの集団を作成するためのシステムおよび方法の種々の例を記載する。SBSのある態様において、1以上のヌクレオチド種を鋳型分子のコピーと関連するそれぞれの新生分子に取り込ませる際に、それぞれの核酸エレメントの多数コピーを生成させてより強い信号を発生させるのが望ましいことは当業者に認識されるであろう。核酸分子のコピーを作成するための当技術分野で既知の手法が多数ある;たとえば、細菌ベクターと呼ばれるものを用いる増幅、ローリングサークル増幅前記で援用したUSPatentNo6274320および7211390に記載およびポリメラーゼ連鎖反応PCR法;これらの各手法を本明細書に記載する発明に使用するものとして適用できる。ハイスループット適用に特に適したPCR法のひとつには、エマルジョンPCR法emPCR商標法とも呼ばれるが含まれる。エマルジョンPCR法の代表的態様には、2つの非混和性物質の安定なエマルジョンを形成して、その内部で反応を行なうことができる水性液滴を形成することが含まれる。特に、PCR法に使用するのに適したエマルジョンの水性液滴は、液滴として懸濁または分散した第1流体、たとえば水を基礎とする流体不連続相とも呼ばれるを、一般的にあるタイプの油を含む他の流体、たとえば疎水性流体連続相とも呼ばれる内に含むことができる。使用できる油の例には鉱油、シリコーンを基礎とする油、またはフッ素化油が含まれるが、これらに限定されない。さらに、あるエマルジョンの態様は、エマルジョンを安定化する作用をもつ界面活性剤を使用でき、これはPCRなど特定の処理法に特に有用な可能性がある。界面活性剤のある態様には、1種類以上のシリコーンまたはフッ素化界面活性剤を含めることができる。たとえば、1種類以上の非イオン界面活性剤を使用でき、これには下記のものが含まれるが、これらに限定されない:ソルビタンモノオレエートSpan商標80とも呼ばれる、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートTween商標80とも呼ばれる、またはある好ましい態様において、ジメチコーンコポリオールAbil登録商標EM90とも呼ばれる、ポリシロキサン、ポリアルキルポリエーテルコポリマー、ポレグリセロールエステル、ポロキサマー類、およびPVP/ヘキサデカンコポリマーUnimerU-151とも呼ばれる、あるいはより好ましい態様において、シクロペンタシロキサン中の高分子量シリコーンポリエーテルDC5225Cとも呼ばれ、DowCorningから入手できる。エマルジョンの液滴は、コンパートメント、マイクロカプセル、マイクロリアクター、微小環境、または関連技術分野で一般に用いられている他の名称で呼ぶこともできる。水性液滴のサイズは、エマルジョンの成分または組成物の組成、それに含有される含量、および用いる調製法に応じて、広範に及ぶ可能性がある。前記エマルジョンは、内部でPCRなどの化学反応を行なうことができる微小環境を形成する。たとえば、希望するPCR反応を実施するのに必要な鋳型核酸およびすべての試薬をエマルジョンの液滴内に封入し、化学的に隔離することができる。ある態様において、追加の界面活性剤または他の安定剤を用いて前記の液滴の安定性をさらに増進することができる。液滴を用いてPCR法に典型的なサーモサイクリング操作を実施して、封入された核酸鋳型を増幅し、鋳型核酸の実質的に同一である多数のコピーを含む集団を作成することができる。ある態様において、液滴内の集団をクローン単離した、コンパートメント化した、封鎖した、封入した、または局在化した集団と呼ぶことができる。同様に、この例において、前記の液滴の一部または全部はさらに、鋳型および鋳型の増幅コピー、鋳型に対して相補的な増幅コピー、またはその組合わせを付着させるための、固体支持体、たとえばビーズを封入することができる。さらに、固体支持体を他のタイプの核酸、試薬、標識、または他の関係分子が付着できるようにすることができる。エマルジョンを破壊してビーズを回収した後、一般的態様において、それに固定化した鋳型核酸分子の増幅に成功した実質的に同一であるコピーの集団を含むビーズを富化することが望ましい。たとえば、DNA陽性ビーズを富化するための方法は、固定化された増幅コピーの遊離末端領域一般にアダプター配列中にあるにプライマー種をハイブリダイズさせ、そのプライマーをポリメラーゼ仲介延長反応により延長させ、そのプライマーを富化用支持体、たとえば磁性ビーズまたはセファロースビーズに結合させることを含むことができる。それらのビーズを含む溶液に、選択的条件、たとえば磁界または遠心を適用することができ、その際、富化用ビーズはその選択的条件に応答し、DNA陰性ビーズすなわち、固定化されたコピーを全くまたはわずかしか含まないから分離される。本明細書に記載する発明に有用なエマルジョンの態様は、前記の化学反応を多量に並行して実施できるきわめて高い密度の液滴またはマイクロカプセルを含むことができる。増幅に用いるエマルジョンおよび配列決定用としてのそれらの使用の他の例は、USPatentNo7638276762228078424577927797および8012690、ならびにUSPatentApplicationSerialNo13033240に記載されており、これらのそれぞれを全体としてあらゆる目的で本明細書に援用する。時にはウルトラディープ配列決定と呼ばれる配列決定用の標的特異的アンプリコンを生成する態様も、標的核酸を含む試料から選択した標的領域単数または複数を増幅するための特異的核酸プライマーのセットの使用を含む本明細書に記載する発明に使用できる。さらに、試料は、研究または診断用途と関連する配列組成を含む配列バリアントを含有することが分かっているかまたはその疑いがある核酸分子の集団を含むことができ、その際、それらのプライマーを用いて試料中の配列バリアントを増幅させ、その分布を洞察することができる。たとえば、核酸試料中の多数の対立遺伝子の特異的増幅および配列決定により配列バリアントを同定するための方法を実施することができる。目的領域または核酸集団に共通のセグメントを囲む領域を増幅するように設計したPCRプライマー対により、核酸をまず増幅させる。PCR反応の各生成物第1アンプリコンを、次いで別個の反応器、たとえば前記のエマルジョンに基づく反応器内でさらに個別に増幅させる。それぞれ第1アンプリコン集団の1メンバーに由来する生成アンプリコン本明細書中で第2アンプリコンと呼ぶを配列決定し、この配列集合体を用いて、存在する1以上のバリアントの対立遺伝子頻度を決定する。重要なことは、この方法は存在するバリアントを予め知る必要がなく、一般に核酸分子の集団中に<1の頻度で存在するバリアントを同定できることである。前記の標的特異的な増幅および配列決定法の幾つかの利点には、これまで達成されたものより高いレベルの感度が含まれ、これは鋳型核酸分子の混合集団を含む方式に特に有用である。さらに、ハイスループット配列決定機器装備を用いる態様、たとえば454LifeSciencesCorporationにより提供されるPicoTiterPlate登録商標アレイ時にはPTP商標プレートまたはアレイとも呼ばれるのウェルと呼ばれるものを用いる態様において、前記方法を用いて行程または実験当たり100,000以上、300,000,以上、500,000、または1,000,000以上の核酸領域について配列組成を作成することができ、これは少なくとも一部は利用者の好み、たとえばガスケットなどの使用により可能になる列構成に依存する。同様に、前記方法は、試料中に存在する対立遺伝子バリアントの1以下である可能性がある低い存在度の対立遺伝子を検出する感度を提供する。前記方法の他の利点には、分析した領域の配列を含むデータが作成されることが含まれる。重要なことは、分析される遺伝子座の配列の予備知識をもつ必要がないことである。配列決定のための標的特異的アンプリコンの他の例は、USPatentApplicationSerialNo11104781タイトルMethodsfordeterminingsequencevariantsusingultradeepsequencing2005年4月12日出願PCTPatentApplicationSerialNoUS2008003424タイトルSystemandMethodforDetectionofHIVDrugResistantVariants2008年3月14日出願およびUSPatentNo7888034タイトルSystemandMethodforDetectionofHIVTropismVariants2009年6月17日出願に記載されており、これらのそれぞれを全体としてあらゆる目的で本明細書に援用する。さらに、配列決定の態様には、サンガー型手法、すなわち一般にハイブリダイゼーションによる配列決定SequencingbyHybridizationSBH、ライゲーションによる配列決定SBL、または取込みによる配列決定SBIと呼ばれる手法を含めることができる。配列決定には、ポロニー配列決定法と呼ばれるもの;ナノポア、導波、および他の単分子検出法;または可逆ターミネーター法も含めることができる。前記のように、好ましい手法には、合成による配列決定法を含めることができる。たとえば、あるSBS態様は、核酸鋳型の実質的に同一であるコピーの集団を配列決定するものであり、一般的に、試料鋳型分子の予め定めた相補的位置にアニールするように設計された1以上のオリゴヌクレオチドプライマー、または鋳型分子に結合した1以上のアダプターを用いる。このプライマー/鋳型複合体に、核酸ポリメラーゼ酵素の存在下でヌクレオチド種が提示される。そのヌクレオチド種が、試料鋳型分子上でオリゴヌクレオチドプライマーの3’末端のすぐ隣の配列位置に対応する核酸種に対して相補的であれば、ポリメラーゼがそのヌクレオチド種でプライマーを延長するであろう。あるいは、ある態様において、プライマー/鋳型複合体に複数の関係ヌクレオチド種一般に、A、G、C、およびTが一度に提示され、試料鋳型分子上でオリゴヌクレオチドプライマーの3’末端のすぐ隣の配列位置の対応する配列に対して相補的なヌクレオチド種が取り込まれる。上記のいずれの態様においても、それ以上の延長を阻止するためにヌクレオチド種を化学的にブロックするたとえば、3’-O位置においてことができ、それは次のラウンドの合成の前に脱ブロックする必要がある。ヌクレオチド種を新生分子の末端に付加するプロセスは、プライマーの末端への付加について前記に述べたものと実質的に同じであることも認識されるであろう。前記のように、ヌクレオチド種の取込みは当技術分野で既知の多様な方法により、たとえば光を発生する酵素反応プロセスを用いてピロホスフェートPPiの放出を検出することにより、またはH放出の検出およびpH変化の測定により例は、USPatentNo62108916258568および6828100に記載されており、これらのそれぞれを全体としてあらゆる目的で本明細書に援用する、あるいはヌクレオチドに結合した検出可能な標識により検出できる。検出可能な標識の若干例には質量タグおよび蛍光標識または化学発光標識が含まれるが、これらに限定されない。代表的態様において、取り込まれなかったヌクレオチドを、たとえば洗浄により除去する。さらに、ある態様において、取り込まれなかったヌクレオチドに、酵素分解、たとえばアピラーゼまたはピロホスファターゼ酵素を用いる分解を施すことができる;USPatentApplicationSerialNo12215455タイトルSystemandMethodforAdaptiveReagentControlinNucleicAcidSequencing2008年6月27日出願および12322284タイトルSystemandMethodforImprovedSignalDetectioninNucleicAcidSequencing2009年1月29日出願に記載;これらのそれぞれを全体としてあらゆる目的で本明細書に援用する。検出可能な標識を用いる態様において、それらは一般に、次の合成サイクルの前に不活性化されなければならないであろうたとえば、化学的開裂または光漂白により。鋳型/ポリメラーゼ複合体における次の配列位置を、次いで前記のように他のヌクレオチド種または複数の関係ヌクレオチド種で照会することができる。ヌクレオチド付加、延長、信号取得、および洗浄の反復サイクルにより、鋳型鎖のヌクレオチド配列を決定できる。信頼できる検出に十分なほど強い信号を達成するために、この例を継続して、実質的に同一である多数の鋳型分子または集団たとえば、103、104、105、106または107の分子をいずれか1つの配列決定反応において一般に同時に分析する。さらに、ある態様において、対合末端配列決定方式と呼ぶことができるものを用いることにより、配列決定プロセスの読み長さ性能および質を改善することが有利であろう。たとえば、ある態様の配列決定法は、高品質で信頼性のある読みを得ることができる分子の全長に制限がある。言い換えると、採用する配列決定法の態様によっては、信頼性のある読み長さについての配列位置の総数が25、50、100、または500塩基を超えない可能性がある。対合末端配列決定方式は、各末端が中央でリンカー配列により連結した元の鋳型核酸分子のフラグメントを含む分子の各末端時にはタグ末端と呼ばれるを個別に配列決定することによって、信頼性のある読み長さを延長する。それらの鋳型フラグメントの元の位置関係は分かっているので、配列読みから得られるデータを再結合して、より長い高品質の読み長さをもつ単一の読みにすることができる。対合末端配列決定態様の他の例は、USPatentNo7601499タイトルPairedendsequencingおよびUSPatentApplicationSerialNo12322119タイトルPairedendsequencing2009年1月28日出願に記載されており、これらのそれぞれを全体としてあらゆる目的で本明細書に援用する。SBS装置の幾つかの例は前記方法の一部または全部を実装することができ、1以上の検出デバイス、たとえば電荷結合デバイスすなわち、CCDカメラもしくは光学的検出のための共焦点型構築物、イオンもしくは化学物質の検出のための構築物についてのイオン感受性電界効果トランジスターISFETとも呼ばれるもしくは化学物質感受性電界効果トランジスターChemFETとも呼ばれる、ミクロ流体素子チャンバーもしくはフローセル、反応支持体、および/またはポンプおよび流動弁を含むことができる。ピロホスフェートに基づく配列決定法の例をとれば、ある態様の装置は、発生するバックグラウンドノイズのレベルが本来低い化学発光検出方式を採用できる。ある態様において、配列決定のための反応支持体には、平面支持体、たとえばスライド型支持体、ISFET検出素子を収容したウェル型構造物を含む半導体チップ、またはある態様においてウェル型構造物を含むことができる導波管型反応支持体を含めることができる。さらに、反応支持体には、前記のように454LifeSciencesCorporationから入手できるPTP商標アレイと呼ばれるものを含めることができ、これは実質的に同一である鋳型分子の集団をそれぞれが保持できるようにした無数のきわめて小さなウェルを生成するように酸エッチングされた光ファイバーフェースプレートから形成されるすなわち、ある好ましい態様は、約330万個のウェルを70×75mmのPTP商標アレイ上に35μmのウェル間ピッチで含む。ある態様において、実質的に同一である鋳型分子の各集団をそれぞれ、固体支持体、たとえばビーズ上に配置することができ、それらをそれぞれ上記のウェルのひとつに配置することができる。たとえば、ある装置は、流体試薬をPTPプレートホルダーへ供給するための試薬送達素子、およびPTPプレート上の各ウェルから放射される光の光子を収集できるようにしたCCD型検出デバイスを含むことができる。改善された信号認識のための特徴を含む反応支持体の例は、USPatentNo7682816タイトルTHINFILMCOATEDMICROWELLARRAYSANDMETHODSOFMAKINGSAME2005年8月30日出願に記載されており、これを全体としてあらゆる目的で本明細書に援用する。SBSタイプの配列決定およびピロホスフェート配列決定を実施するための装置および方法の他の例は、USPatentNo7323305および7575865に記載されており、これらは両方とも前記で援用したものである。さらに、1以上の試料調製プロセス、たとえば前記のemPCR商標プロセスを自動化するシステムおよび方法を採用できる。たとえば、自動化システムを用いて、emPCR処理のためのエマルジョンを調製し、PCRサーモサイクリング操作を実施し、作成に成功した配列決定用の核酸分子集団を富化するための、有効な解決策を得ることができる。自動化された試料調製システムの例は、USPatentNo7927797およびUSPatentApplicationSerialNo13045210に記載されており、これらを全体としてあらゆる目的で本明細書に援用する。また、本明細書に記載する発明のシステムおよび方法は、コンピューターシステムで実行するために記憶させたコンピューター可読媒体を用いるある設計、分析、または他の操作の実装を含むことができる。たとえば、SBSシステムおよび方法を用いて検出した信号の処理および/または作成したデータの分析のための幾つかの態様であって、処理および分析の態様をコンピューターシステムに実装できるものを以下に詳細に記載する。本明細書に記載する発明に使用するための代表的態様は、いずれかのタイプのコンピュータープラットホーム、たとえばワークステーション、パーソナルコンピューター、サーバー、または他のいずれかの現在もしくは将来のコンピューターを含むことができる。ただし、本明細書に記載する上記コンピュータープラットホームは本発明の特殊な操作を実施するために特別に構築されたものであり、汎用コンピューターとはみなされないことは、当業者に認識されるであろう。コンピューターは一般に、既知の構成素子、たとえばプロセッサー、オペレーティングシステム、システムメモリー、メモリー記憶デバイス、入出力コントラー、入出力デバイス、およびディスプレーデバイスを含む。可能なコンピューターの構築物および構成素子が多数あり、キャッシュメモリー、データバックアップユニット、および他の多数のデバイスも含まれることも当業者に認識されるであろう。ディスプレーデバイスには、視覚情報を提供するディスプレーデバイスを含めることができ、この情報は一般にピクセルのアレイとして論理的および/または物理的に組織化できる。インターフェースコントローラーも含めることができ、これは入出力インターフェースを提供するための多様な既知または将来のソフトウェアプログラムのいずれかを含むことができる。たとえば、インターフェースには、1以上の図形表現をユーザーに提供する、一般に図形ユーザーインターフェースと呼ばれるものしばしばGUIと呼ばれるを含めることができる。インターフェースは一般に、当業者に既知の選択または入力の手段を用いたユーザー入力を受理できるようになっている。同じまたは別の態様において、コンピューターのアプリケーションは、コマンドラインインターフェースと呼ばれるものしばしばCLIと呼ばれるを含むインターフェースを使用できる。CLIは一般に、アプリケーションとユーザーの間にテキストに基づく対話を提供する。一般に、コマンドラインインターフェースはディスプレーデバイスによりテキストのラインとして出力を提示し、かつ入力を受理する。たとえば、ある実装は、シェルと呼ばれるもの、たとえば当業者に既知のUnixShell、またはMicrosoft.NETフレームワークなどのオブジェクト指向型プログラミングアーキテクチャーを用いるMicrosoftWindowsPowershellを含むことができる。インターフェースが1以上のGUI、CLIまたはその組合わせを含むことができるのは当業者に認識されるであろう。プロセッサーには、市販のプロセッサー、たとえばIntelCorporation製のCeleron登録商標、Core商標またはPentium登録商標プロセッサー、SunMicrosystems製のSPARC登録商標プロセッサー、AMDcorporation製のAthlon商標、Sempron商標、Phenom商標またはOpteron商標プロセッサーを含めることができ、あるいはそれは入手できるかまたは入手できるようになるであろう他のプロセッサーのひとつであってもよい。プロセッサーのある態様には、マルチコアプロセッサーと呼ばれるもの、および/または単一もしくは多重コア構成の並列処理技術を採用できるようにしたものを含めることができる。たとえば、マルチコアアーキテクチャーは一般に2以上のプロセッサー実行コアを含む。この例において、それぞれの実行コアは、多重スレッドの並列実行を可能にする独立したプロセッサーとして動作することができる。さらに、プロセッサーを、一般に32または64ビットアーキテクチャーと呼ばれるもの、あるいは現在既知であるかまたは将来開発される可能性のある他のアーキテクチャー構成物に構成できることは当業者に認識されるであろう。プロセッサーは一般にオペレーションシステムを実行し、それはたとえば下記のものであってもよい:MicrosoftCorporationからのWindows登録商標型オペレーティングシステムたとえば、Windows登録商標XP、WindowsVista登録商標、またはWindows登録商標_7;AppleComputerCorp.からのMacOSXオペレーティングシステムたとえば、MacOSXvl0.6SnowLeopardオペレーティングシステム;多数の業者またはオープンソースと呼ばれるものから入手できるUnix登録商標またはLinux型のオペレーティングシステム;他のまたは将来のオペレーティングシステム;あるいはそのいずれかの組合わせ。オペレーティングシステムは周知の様式でファームウェアおよびハードウェアとインターフェース構築し、多様なプログラミング言語で書かれる可能性のある各種コンピュータープログラムの機能をプロセッサーが組み合わせて実行するのを容易にする。オペレーティングシステムは、一般にプロセッサーと協調して、コンピューターの他の構成素子の機能を組み合わせて実行する。オペレーティングシステムは、スケジューリング、入出力制御、ファイルおよびデータの管理、メモリー管理、ならびに通信制御および関連のサービスも提供し、これらはすべて既知の技術に従う。システムメモリーには、多様な既知または将来のメモリー記憶デバイスをいずれも含めることができる。例には、一般的に入手できるいずれかのランダムアクセスメモリーRAM、磁気媒体、たとえば常駐ハードディスクまたはテープ、光学媒体、たとえば読出しおよび書込み用コンパクトディスク、あるいは他のメモリー記憶デバイスを含めることができる。メモリー記憶デバイスには、多様な既知または将来のデバイスをいずれも含めることができ、これにはコンパクトディスクドライブ、テープドライブ、着脱式ハードディスクドライブ、USBもしくはフラッシュドライブ、またはディスケッテドライブが含まれる。そのようなタイプのメモリー記憶デバイスは一般に、プログラム記憶媒体示していない、たとえばそれぞれコンパクトディスク、磁気テープ、着脱式ハードディスク、USBもしくはフラッシュドライブ、またはフロッピーディスケッテから読み出し、および/またはそれらに書き込む。これらのプログラム記憶媒体、あるいは現在用いられているかまたは将来開発される可能性のある他のものはいずれも、コンピュータープログラムプロダクトとみなすことができる。認識されるように、これらのプログラム記憶媒体は一般にコンピューターソフトウェアプログラムおよび/またはデータを記憶する。コンピューター制御論理とも呼ばれるコンピューターソフトウェアプログラムは、一般にメモリー記憶デバイスと併せて用いられるシステムメモリーおよび/またはプログラム記憶デバイスに記憶される。ある態様において、制御論理プログラムコードを含むコンピューターソフトウェアプログラムがそれに記憶されたコンピューター使用可能媒体を含む、コンピュータープログラムプロダクトを記載する。制御論理は、プロセッサーにより実行されると、プロセッサーに本明細書に記載する機能を行なわせる。他の態様において、ある機能は、たとえばハードウェア状態機械を用いて、主にハードウェアに実装される。本明細書に記載する機能を行なうようなハードウェア状態機械の実装は、当業者に自明であろう。入出力コントローラーには、ヒトまたは機械のいずれであっても、ローカルまたはリモートのいずれであっても、ユーザーからの情報を受理して処理するための多様な既知のデバイスを含めることができる。そのようなデバイスには、たとえばモデムカード、ワイヤレスカード、ネットワークインターフェースカード、サウンドカード、または多様な既知の入力デバイスのいずれかのための他のタイプのコントローラーが含まれる。出力コントローラーには、ヒトまたは機械のいずれであっても、ローカルまたはリモートのいずれであっても、ユーザーに情報を提示する多様な既知のディスプレーデバイスのためのコントローラーを含めることができる。本明細書に記載する態様において、コンピューターの機能素子はシステムバスを介して相互に通信する。ある態様のコンピューターは、ネットワークまたは他のタイプの遠隔通信を用いて、ある機能素子と通信することができる。当業者に自明のとおり、機器制御および/またはデータ処理アプリケーションをソフトウェアに実装すれば、システムメモリーおよび/またはメモリー記憶デバイスにロードし、それから実行することができる。機器制御および/またはデータ処理アプリケーションの全部または一部が、メモリー記憶デバイスの読出し専用メモリーまたはそれに類するデバイス中にあってもよく、それらのデバイスは機器制御および/またはデータ処理アプリケーションを入出力コントローラーによって最初にロードする必要がない。機器制御および/またはデータ処理アプリケーションあるいはその一部を、プロセッサーによって既知の方法で、実行に有利なようにシステムメモリーもしくはキャッシュメモリーまたは両方にロードしてもよいことは、当業者に理解されるであろう。また、コンピューターは、システムメモリーに記憶された1以上のライブラリーファイル、実験データファイル、およびインターネットクライアントを含むことができる。たとえば実験データは、1以上の実験またはアッセイに関係するデータ、たとえば1以上のSBS実験または方法と関連する検出信号値または他の数値を含むことができる。さらに、インターネットクライアントは他のコンピューター上のリモートサービスにネットワークを用いてアクセスできるようにされたアプリケーションを含むことができ、たとえば一般にウェブブラウザーと呼ばれるものを含むことができる。この例において、ある一般的に用いられるウェブブラウザーには、MicrosoftCorporationから入手できるMicrosoft登録商標InternetExplorer8、MozillaCorporationからのMozillaFirefox登録商標3.6、AppleComputerCorp.からのSafari4、Google商標CorporationからのGoogleChrome、あるいは当技術分野で現在知られているかまたは将来開発される可能性のある他のタイプのウェブブラウザーが含まれる。同様に、同じまたは他の態様において、インターネットクライアントは、ネットワークを介してリモート情報にアクセスできるように特殊化されたソフトウェアアプリケーション、たとえば生物学的アプリケーション用のデータ処理アプリケーションを含むことができ、あるいはその構成素子であってもよい。ネットワークには、当業者に周知の多種多様なタイプのネットワークのうちの1以上を含めることができる。たとえば、ネットワークには、一般にTCP/IPプロトコルスイートと呼ばれるものを通信に用いるローカルエリアネットワークまたは広域ネットワークを含めることができる。ネットワークには、一般にインターネットと呼ばれる世界的な相互結合コンピューターネットワークのシステムを含むネットワークを含めることができ、あるいはイントラネットアーキテクチャーも含めることができる。ネットワーク接続環境にある若干のユーザーが、ハードウェアおよび/またはソフトウェアシステムへの、あるいはそれらからの情報トラフィックを制御するために、一般にファイアウォールfirewall時にはパケットフィルターまたはボーダープロテクションデバイスとも呼ばれると呼ばれるものを利用するのを好むことも当業者に認識されるであろう。たとえば、ファイアウォールはハードウェアもしくはソフトウェア素子またはその何らかの組合わせを含むことができ、一般にユーザー、たとえばネットワーク管理者などが導入したセキュリティーポリシーを実施するように設計されている。b.本明細書に記載する発明の態様前記のように、本発明の態様は、試料に由来するクレイドA、B、C、D、F、およびG、または多数クレイドの組換え体からHIV逆転写酵素およびプロテアーゼ配列バリアントを検出し、そのバリアント配列組成を薬物耐性および/または感受性タイプと関連づけることによりHIV逆転写酵素およびプロテアーゼ機能を標的とする薬物に対する耐性および/または感受性の相関性を検出する方法に関する。さらに本発明の態様は、個々の試料の同時検出のために、複数の試料を組み合わせて組合わせプールにして配列決定し、クレイドA、B、C、D、F、およびG、またはその組換え体からのバリアントを並行して検出する、多重配列決定アッセイに関する;その際、各試料に多重識別子配列MIDを割り当てて、同定したバリアントを試料と関連づける。試料が一般に単一クレイドまたは2以上のクレイド間の組換え体に由来してもよいことは当業者に認識されるであろう。さらに、相関性には、検出したバリアントと薬物耐性および/または感受性と関連することが分かっている変異との相関性の診断、ならびに検出したバリアントと試料の薬物耐性および/または感受性表現型との相関性の新知見を含めることができるのは理解されるであろう。本発明の態様は、薬物耐性および/または感受性タイプと関連することが分かっているHIV逆転写酵素およびプロテアーゼの領域を標的とする2段階PCR法すなわち、前記の第1および第2アンプリコンの生成を含み、これを数千のウイルス粒子からの配列情報が並行して得られる配列決定法と連携させ、これにより、出現するHIV逆転写酵素およびプロテアーゼのタイプをそれらのタイプと検出した試料中のバリアントの配列組成の関連性に基づいて、それらのタイプが試料中に低頻度で出現する場合ですら同定できる。事実、本発明の態様は、HIVウイルス粒子を非-化学量論的な対立遺伝子量で含有する試料中に存在する配列バリアント、たとえば50以上、50未満、25未満、10未満、5未満、または1未満で存在するHIV逆転写酵素およびプロテアーゼバリアントを検出できる。上記の態様は、迅速で信頼性のある、かつ経費効率の良い方法で、そのような同定を行なうことができる。代表的な配列決定の態様において、1以上のプロセス段階を自動化する1以上の機器素子を使用できる。たとえば、ある配列決定法の態様は、一部または全部の段階を自動化して実施する機器装備を用いて実行できる。図1は、配列決定機器100の図例を示し、これは、光信号を捕獲する必要がある配列決定プロセスのために、一般に、反応支持体105で行なわれる配列決定反応の実行およびデータ捕捉のための光学サブシステムおよび流体素子サブシステムを含む。しかし、他のモードのデータ捕獲すなわち、pH、温度、電気化学などを必要とする配列決定法についてはそのモードのデータ捕獲のための当業者に既知のサブシステムを採用できることは認識されるであろう。たとえば、鋳型分子の試料をユーザー101または何らかの自動化態様により反応支持体105に装填し、次いで配列決定機器100を用いて多量に並行して配列決定して、それぞれの鋳型分子の配列組成を示す配列データを得ることができる。重要なことは、ユーザー101には独立した研究者、技術者、臨床医、大学、または企業体を含むいかなるユーザーも含めることができ、これらに限定されないことである。ある態様において、機器100を用いる配列決定に必要な調製の一部または全部を実施するように構成された試料調製機器180を用いて、試料を任意に全自動化または部分自動化様式での配列決定用に調製できる。試料調製機器180は説明のために提示され、個々の配列決定アッセイに必要な試料調製と関連する段階の一部または全部を実施するようにそれぞれ設計された1以上の機器を表わすことができるのは、当業者に認識されるであろう。試料調製機器の例には、ロボット式プラットホーム、たとえばHamiltonRobotics、BeckmanCoulter、またはCaliperLifeSciencesから入手できるものを含めることができる。さらに、図1に示すように、配列決定機器100は1以上の外部コンピューター構成素子、たとえばコンピューター130に作動可能な状態で連携していてもよく、これはたとえばシステムソフトウェアまたはファームウェア、たとえばアプリケーション135を実行でき、これは1以上の機器、たとえば配列決定機器100または試料調製機器180の指示制御、および/またはデータ分析機能を提供できる。コンピューター130はさらに他のコンピューターまたはサーバーにネットワーク150を介して作動可能な状態で接続していてもよく、これは機器システムを遠隔操作でき、大量のデータを記憶および処理が可能なシステムに輸出することができる。この例において、配列決定機器100および/またはコンピューター130は、前記に一般的に記載した態様の構成素子および特徴の一部または全部を含むことができる。本発明の1観点において、標的特異的プライマーは、クレイドA>500配列、B>1000配列、C>4000配列、D>800配列、およびF/G約300配列に由来するHIV配列のアラインメントから設計され、前記の配列決定アプリケーションに直接使用するためにきわめて低いバイアスでアンプリコンを生成するように設計されたた。既知HIV配列のアラインメントは、当業者に既知の方法を用いて実施できる。たとえば、多数の配列アラインメント方法、アルゴリズムおよびアプリケーションが当技術分野で得られ、これには下記のものが含まれるが、これらに限定されない:SmithWatermanアルゴリズムJMolBiol195197、BLASTアルゴリズム403410、およびClustal48764882。配列をアラインさせて単一配列にすることにより、HIV配列集団の最も頻度の高い配列組成のコンセンサス配列が得られる。またこの例では、ソフトウェアアプリケーションにより、HIV型別のための目的領域およびプライマー配列に対する標的領域を、このアラインさせたコンセンサス配列に対してプロットすることができる。目的領域には、変異を生じやすく、HIV阻害剤耐性に関与する可能性があることが分かっている領域が含まれる。次いで、このコンセンサス配列のうち既知の変異感受性領域より保存度が大きいすなわち、変異する可能性がより少ない領域に対するプライマーセットを設計することができる。また、プライマー設計には、追加の考慮事項、たとえば増幅生成物の配列組成を決定するために採用する配列決定技術の読み長さ性能に関して得られる増幅生成物の長さが含まれる。低い変異率をもつ標的配列領域をプライマー設計のための標的とする利点には、プライマーを結合できないようにする標的領域変異のため失敗する実質的リスクなしに、設計されたプライマーは信頼性をもって使用できることが含まれる。重要なことは、本発明のプライマーは各プライマーセットが多重のHIVクレイドからアンプリコンを生成するように設計されることであり、具体的には各プライマーセットはHIVクレイドA、B、C、D、F、およびG、ならびに2以上のクレイドの関連組換え体からアンプリコンを生成するであろう。事実、本発明はクレイド間で起きる組換え事象の検出に特に有用である。たとえば、本発明のプライマーはクレイドA、B、C、D、F、およびGの群内の特定のクレイドに対して選択的ではないので、少なくとも2つの異なるクレイドに由来する組換えバリアントが増幅され、前記方法に従って配列決定されるであろう;これは、少なくとも一部は、本発明の配列決定法はクレイドに由来する配列エレメントが組み換えられる破断点に対して感受性ではないという事実による。したがって、クレイド特異的な配列シグネチャーとの関連以外の先験情報は必要ないので、得られる配列データを分析して組換え事象を同定することができる。さらに、コンセンサス配列の保存された領域とみなすことができる範囲内の特定位置はそれらの組成がなお変動性であって縮重位置とみなされることは、当業者に認識される。ある好ましい態様において、プライマー設計に用いるパラメーターには、コンセンサス配列を決定するために用いる多重配列アラインメントに際して、ある位置のヌクレオチド種が98未満の頻度である場合、プライマー組成中のその位置の縮重塩基を置換することが含まれる。さらに、結合標的領域およびプライマー組成の選択に影響を与える他のパラメーターには、2つのオルタナティブヌクレオチド種のみをもつものに縮重位置を制限し、かつ2つを超えない縮重位置にプライマー組成を制限して、プライマー反復数を最小限に維持することにより、増幅反応におけるプライマー二量体形成のリスクを減らし、また十分な量の増幅生成物が生成する可能性を高めることが含まれるそれぞれの縮重位置は、それぞれがオルタナティブヌクレオチド種のひとつを含む少なくとも2つの反復を必要とする。ある態様において、縮重位置をプライマー組成の最後の5つの配列位置に制限することも望ましいすなわち、フォワードプライマーの3’末端、およびリバースプライマーの5’末端;この最後の5つの位置は高度に保存されていることが結合効率にとって有利だからである。たとえば、縮重配列位置は一般に少なくとも2つの異なるヌクレオチド種をもち、それらはその位置にオルタナティブ配列組成として現われる。本明細書に記載する発明において、2つを超えるヌクレオチドを提示する縮重ヌクレオチドはプライマー設計に取り込まれなかったすなわち、3または4つのヌクレオチドを提示する可能性のあるH、B、VまたはNsを用いなかった;これもまた、十分な量の増幅生成物が生成する可能性を高める。縮重塩基は当業者に周知であり、多様なタイプの縮重が、そのタイプと関連するオルタナティブヌクレオチド組成を表わすIUPAC記号により示される。たとえば、IUPAC記号Rはプリン塩基すなわち、AおよびGがオルタナティブの可能性をもつことを表わす。本発明の1態様は、ハイスループット配列決定に適した6つのアンプリコンを生成するように設計された下記のプライマー種を含む:図2は、上記に説明したプライマーから生成したHIV逆転写酵素およびプロテアーゼ領域に対する6つのアンプリコンの相対位置の図例を示す。図2において、アンプリコン205、215、225、235、245および255はプロテアーゼ/逆転写酵素領域200上に広がる交差した関係で配置されているが、図2に説明したアンプリコンの厳密な関係は代表例を示す目的で提示したものであって限定とみなすべきではないことは認識されるであろう。さらに、上記に開示したプライマーのサブセットを用いて、ウイルスRNAから1以上のcDNA生成物を作成できる。下記の表1は、本発明の上記6アンプリコン発明のプライマーから作成した生成アンプリコンとおおよそのアンプリコン長さすなわち、アンプリコンの長さは個々のアンプリコン種の変異の程度およびタイプに基づいて変動する可能性があるの関係の例を示す。アンプリコンの長さには本明細書に記載するアダプターエレメントの一部または全部が含まれる可能性があることも認識されるであろう。前記の6アンプリコン法のより詳細な適用範囲を図4Aにも示す;これは配列のフィンガープリントの図形表現を提示し、それらのアンプリコンがHIV逆転写酵素/プロテアーゼ領域の完全な適用範囲を提供することを示す。本発明の第2態様は、ハイスループット配列決定に適した4つのアンプリコンを生成するように設計された下記のプライマー種を含むで示したプライマーは前記の第1態様にも存在するが、第1態様とは異なるエレメント、たとえばMIDエレメント、増幅/配列決定用プライマー配列などが含まれてもよい。第2態様には、ウイルスRNAから1以上のcDNA生成物を作成するための下記のプライマーも使用できる。あるいは上記に開示したアンプリコンプライマーのサブセットを使用できる。HXB2およびおよび位置情報がHXB2基準ゲノムHXB2HIV株に由来するを表わすことも分かるであろう。図3は、上記に説明したプライマーから生成した4つのアンプリコンの相対位置の図例を示す。図3において、アンプリコン225、315、325および255はプロテアーゼ/逆転写酵素領域300上に広がる交差した関係で配置されているHXB2基準目盛を使用が、アンプリコン225および255は前記の6アンプリコン法と共通であること、ならびに図3に説明したアンプリコンの厳密な関係は代表例を示す目的で提示したものであって限定とみなすべきではないことは認識されるであろう。さらに、上記に開示したプライマーのサブセットを用いて、ウイルスRNAから1以上のcDNA生成物を作成できる。上記に示したRTP4RcDNAプライマーはcDNAプライマー部位350にアニールし、RTP5RcDNAプライマーはcDNAプライマー部位360に結合する。下記の表2は、本発明の上記4アンプリコン発明のプライマーから作成した生成アンプリコンとおおよそのアンプリコン長さすなわち、アンプリコンの長さは個々のアンプリコン種の変異の程度およびタイプに基づいて変動する可能性があるの関係の例を示す。この場合も、アンプリコンの長さには本明細書に記載するアダプターエレメントの一部または全部が含まれる可能性があることも認識されるであろう;この場合、たとえば表2のアンプリコン225および255は、表1に記載したアンプリコン225および255より20塩基対長く、これは異なるエレメント、たとえば本明細書の他の箇所に記載した種々の目的で付加したMID配列または他のエレメントに起因する可能性がある。前記の4アンプリコン法のより詳細な適用範囲を図4Bにも示す;これは配列のフィンガープリントの図形表現を提示し、それらのアンプリコンがHIV逆転写酵素/プロテアーゼ領域の完全な適用範囲を備えていることを示す。プライマーセットについてある程度の配列組成変動性があること、および開示したプライマー配列に対して90以上の相同性は本明細書に記載する発明の範囲内とみなされることは、当業者に認識されるであろう。たとえば、前記プライマーセットについての標的領域はわずかにシフトする可能性があり、したがってプライマー配列組成の若干の相異が予想される。また、コンセンサス配列に対する改良がなされる可能性があり、あるいは特定の位置における新たな配列縮重が見出された結果として標的領域の配列組成がわずかに変化する可能性があり、同様にプライマー配列組成に若干の変異が予想される。本発明のある態様において、たとえば6アンプリコン法に示されるように、逆転写酵素およびプロテアーゼ領域の適用範囲がオーバーラップしたアンプリコン生成物を生成することが有利であり、これにより少なくとも二重適用範囲が得られ、これは品質管理における実質的有益性、およびアンプリコン生成物のうちのいずれかが適正に増幅できない場合または他の何らかのタイプの実験アーチファクトを生じた場合の余剰性を提供できる。代表的態様において、希望するアンプリコンと関連するプライマー組合わせを用いて各アンプリコンを個別の反応で作成する。さらに、ある態様において、アンプリコンはPCRなどの増幅技術で信頼性をもって調製できる長さすなわち、誤増幅率が低いなどより長く、したがって各アンプリコンは同じプライマー組合わせを用いる2回の増幅から得られる生成物であってもよい。この例において、生成物は一般にある程度のオーバーラップをもち、これもアンプリコン生成物の組立ておよび品質管理に役立つ。ある態様において、個々のアンプリコンからの第2ラウンドの増幅のために用いられるもうひとつの一般的プライマーを含むアダプターエレメントを、処理中にアンプリコンの各末端にライゲートさせて、クローンコピーの集団を生成させるすなわち、第2アンプリコンを作成する。アダプターが本明細書の他の箇所に記載する他のエレメント、たとえば品質管理エレメント、他のプライマー、たとえば配列決定用プライマーおよび/または増幅用プライマーまたは増幅用および配列決定用の両方のプライマーとして機能できるようにした単一プライマー、ユニーク識別子エレメントすなわち、前記のMIDエレメントなども含むことができるのは認識されるであろう。同様に、ある態様において、前記の標的特異的プライマーを、後続プロセス段階に使用できる1以上の他のエレメントと組み合わせることができる。たとえば、一本鎖核酸分子が一方の末端に追加の配列エレメントに隣接して標的特異的プライマー配列を含むことができる。この標的特異的プライマーは標的領域にハイブリダイズし、他のエレメントはそれらの配列組成が標的領域の隣のフランキング配列に対して非相補性であるため懸垂した状態になり、この場合、増幅生成物は目的領域のコピーおよび追加の配列エレメントを含む。本発明のある態様において、第1鎖cDNAはHIVRNAから標的特異的プライマーまたは特異的cDNAプライマーを用いて作成される。1態様において、第1鎖cDNAは、前記の配列決定用アダプター時にはSADと呼ばれるを含まない単一プライマーを用いて作成することができる。次いで、標的特異的プライマー/プロセシングエレメント方式を用いて第1アンプリコンを生成させる。こうして得られるアンプリコンは必要なプロセシングエレメントがプライマーに会合しているため、それらを含む。同様に、ある態様において、前記のエマルジョンに基づくPCR増幅方式を用いて第2ラウンドの増幅を行ない、これにより、一般にビーズ支持体上に固定化された第2アンプリコンのクローン集団が得られ、この支持体は第2アンプリコンを効果的に捕捉して、エマルジョンが破壊された際に拡散するのを阻止する。一般に、本明細書の他の箇所に記載するように、次いで数千の第2アンプリコンを並行して配列決定する。たとえば、固定化された第2アンプリコン集団を含むビーズを反応支持体105に装填し、配列決定機器100を用いて処理する;これは>1000クローンの読みを各試料から作成し、その配列データを処理のためにコンピューター130へ出力する。コンピューター130は特殊化されたソフトウェアたとえば、アプリケーション135を実行して、試料に由来する1以下の存在度で生じるバリアントを含めたバリアントを同定する。同一または異なる態様のソフトウェアアプリケーションにより配列データをさらに分析して、それぞれの読みからの情報をHIVタイプと関連する既知のハプロタイプと関連づけることもできる;その際、個々の読みからの配列データはコンセンサス配列に由来する変異を含んでもよく、含まなくてもよい。本明細書中で用いる用語ハプロタイプは一般的に、一緒に伝播されるかまたは統計的に関連性をもつ、ある核酸配列と関連する対立遺伝子の組合わせを表わし、これはHIVの場合はHIVRNA配列を含む。1以上の特殊化されたデータ構造物、たとえばハプロタイプおよび/または逆転写酵素/プロテアーゼ関連情報を記憶した1以上のデータベースの使用をこの関連づけに含めることができるのは、当業者に認識されるであろう。このソフトウェアアプリケーションはデータ構造物を含むかあるいは既知の方法でそれと通信して、データ構造物から情報を引き出し、および/またはそれに新たな情報を供給することができる。図5は、6アンプリコン方式により得られる配列データから作成したアプリケーション135の出力の図例を示し、これはインターフェース500を含み、既知バリアント503と試料505の比較を含む。図5の図において、試料505は各試料と関連するクレイドまたは組換えクレイドの指標を提示し、セル507は各バリアントについてバリアント503の検出頻度の尺度を提示する。たとえばインターフェース500は、クレイドA、B、C、および組換えクレイドAEが試料505と関連しており、その際、最も右の欄において、試料WWRB350がクレイドHと関連し、バリアントNNRTI_Stanford_L100V_1がこのウイルス集団中に0.39の頻度で検出されたことを指摘する。同様に、図6は、4アンプリコン方式により得られる配列データから作成したアプリケーション135の出力の図例を示し、これはインターフェース600を含み、既知バリアント603と試料605の比較を含む。図6の図において、試料605は各試料と関連するクレイドまたは組換えクレイドの指標を提示し、セル607は各バリアントについてのバリアント603の検出頻度の尺度を提示する。たとえば、インターフェース600は、クレイドB、C、およびG、ならびに組換えクレイドAE、AGおよびBGが試料605と関連しており、その際、最も左の欄において、試料ALP1がクレイドGと関連し、バリアントNNRTI_V1O6A3がこのウイルス集団中に1.66の頻度で検出されたことを指摘する。さらに、図7は、6アンプリコン方式により得られる配列データから作成したアプリケーション135の出力の図例を示し、これは未知バリアントまたは未知の可能性があるバリアントの検出を表わすインターフェース700を含む。インターフェース700は、それぞれが個々のHIVRNA分子に由来する単一の読みを表わす複数の配列705とアラインメントしたコンセンサス配列703の視覚表現をユーザー101に提供する多重ペインを含む。インターフェース700はコンセンサス配列703と配列組成が異なる塩基コール710も同定し、その際、そのような同定は、関連技術分野で既知である、異なる色、太字、イタリックまたは他の視覚表現手段による塩基コール710の強調を含むことができる。インターフェース700は、試料中に検出した変異のレベル720を基準配列703中の塩基位置により視覚表現すること、およびそれらの塩基位置における配列読み数730の表現も、ユーザー101に提供する。図7の例において、試料中に1以下の頻度で出現するるバリアントが、クローン読みの検査によって容易に測定される。上記のように、多数の核酸を並行して配列決定する方法は、本明細書に記載する発明に必要な感度を備えている。たとえば、二項統計学に基づいて、完全装填した60mm×60mmPicoTiterPlateについて95信頼度での検出下限すなわち1事象2×106の高品質塩基、200,000×100塩基の読みからなるは少なくとも0.002の対立遺伝子頻度をもつ集団についてであり、99信頼度では少なくとも0.0039の対立遺伝子頻度をもつ集団についてである70×75mmPicoTiterPlateを前記に従って使用でき、これによればさらに多数の読みが可能であり、したがって感度が増大することも認識されるであろう。比較として、ピロホスフェートに基づく配列決定によるSNP検出は、最少頻出対立遺伝子が集団中に10以上存在する場合に限って、四倍体ゲノム上の分離した対立遺伝子状態の検出を報告している592603。一般的な蛍光DNA配列決定はよりさらに感度が低く、50/50すなわち50ヘテロ接合体対立遺伝子の解像に支障がある103110。表3は、一定数N=100の配列決定されたアンプリコンについて、全集団中のSNPの出現率に基づいてゼロまたは1以上の事象の検出確率を示す。は出現率が5.0である場合に少なくとも1事象を検出できない確率3.7を示す;同様に、は出現率が7である場合に1以上の事象を検出できない確率0.6を表わす。したがってこの表は、5のレベルで存在するSNPを検出する信頼レベルが95以上であり、同様に、7のレベルで存在するSNPを検出する信頼度は99以上であることを示す。当然、多重分析は検出の深さより大きな適用能をもち、表3は単一のPicoTiterPlateアレイ上で同時にスクリーニングできるSNPの数を95および99の信頼度で検出できる最小の対立遺伝子頻度について示す。RNA試料を定量するのが実用的でない場合、血漿の元のウイルス負荷が100,000コピー/mlであれば、少なくとも140μlの血漿についてRNA抽出を実施して最大60μlの総溶出液にすることができる。これより低いウイルス負荷については、それに応じて血漿の量を調節し、ウイルスを20,600rpm、4°Cで1時間30分、ペレット化する。抽出操作に十分な上清を除去して140μlの濃縮液を残す。PCRを設定し、数試料について二重反応物を配列決定して、低頻度バリアントの着実な検出を立証する。次いで、図8の例に示すのは、HIVRNA試料を調製し、6アンプリコン方式で配列決定する方法である。最初に、段階805に示すように、HIV試料集団からRNA試料を処理してcDNA鋳型を作成する。試料からのcDNAの作成は、下記の操作を用いて実施できる:96ウェルプレートをクーラーに入れ、12.5μlのRNAおよび0.5μlのcDNAプライマー4μΜを各ウェルに添加した。プレートを65°Cで10分間インキュベートし、次いで直ちに氷に乗せた。下記の成分を含有する逆転写酵素RTミックスを調製し、多数のチューブ用にスケールアップした:TranscriptorRTreactionbuffer反応緩衝液Rocheから入手できる-4μlProtectorRNaseInhibitor阻害剤Rocheから入手できる-0.5μl10mMdNTPミックス-2μlTranscriptorReverseTranscriptase逆転写酵素Rocheから入手できる-0.5μlRTミックスを短時間、ボルテックス処理し、それをRNA試料に添加するまで氷上に保持した。各ウェルに7μlのRTミックスを添加した。プレートを密閉し、短時間遠心し、次いでサーモサイクラーに装入し、下記のcDNAプログラムに従って作動させた:50°Cで60分間、85°Cで5分間、および4°Cで不定期間。その後、ウェル当たり1μlのRNAseHRocheから入手できるを添加し、プレートを37°Cのサーモサイクラーブロック加熱した蓋を50°C以上に設定に戻して20分間おく。このcDNAを-80°Cで保存するか、あるいは直ちにアンプリコン作成に使用する。続いて、段階810に示すように、段階805で作成したcDNA鋳型に由来する標的領域を、領域特異的プライマー対を用いて下記の操作により増幅する。下記の13×ミックスで1つの96ウェルプレートに十分である6アンプリコン、10試料2対照。この方法を必要に応じてスケールアップまたはスケールダウンすることができる。6本の1.5ml遠心チューブに下記のラベルを付けた:MultiRTPR1、MultiRTPR2、MultiRTPR3、MultiRTPR4、MultiRTPR5、MultiRTPR6、。これらのラベルは下記のアンプリコン/プライマーのセットを表わす:注釈:上記の標的特異的プライマー配列のほかに、下記のプライマーは下記のエレメントを含む:フォワードおよびリバースプライマーに特異的なSAD配列;ならびに鍵エレメント=TCAG多重識別子MIDが実験に必要な場合、各セットのアンプリコンについて対応するMIDプライマーを付加した。MID1を用いる場合、プライマーセットAのすべてのプライマーがフォワードおよびリバース両方向のプライマーに合成により取り込まれたMID1をもっていた。MID配列は10塩基対の長さであり、理想的には配列アダプター配列の後、標的プライマー配列の直前でプライマーに挿入される。各チューブ内で、プライマーセットを用いて下記のラベルにより示されるPCRマスターミックスを調製した:第1横列の各ウェルに、22μlのMultiRTPR1PCRマスターミックスを添加した。同様に、22μlのMultiRTPR2PCRマスターミックスを第2横列の各ウェルに、22μlのMultiRTPR3PCRマスターミックスを第3横列の各ウェルに、22μlのMultiRTPR4PCRマスターミックスを第4横列の各ウェルに、22μlのMultiRTPR5PCRマスターミックスを第5横列の各ウェルに、22μlのMultiRTPR6PCRマスターミックスを第6横列の各ウェルに添加した。これらのウェルのそれぞれに、3μlのcDNAを添加し縦列当たり1試料、その際、縦列11の陽性対照は既知のcDNA試料であり、縦列12の陰性対照はcDNA合成からの水対照である。プレートをプレートシールで覆い、次いで900×gで30秒間、遠心処理した。プレートをサーモサイクラーブロックに装入し、下記のcDNAプログラムに従って作動させた:95°Cで3分間;続いて95°Cで30秒間、55°Cで20秒間、そして72°Cで45秒間、合計40サイクル;次いで72°Cで8分間、次いで4°Cに不定期間保持。プレートを直ちに使用しない場合、同日処理についてはそれを氷上に、または-20°Cで保存した。段階810で作成したアンプリコンを、ある態様において、次いで段階813に示すように、当技術分野で既知の固相可逆固定化SPRIとも呼ばれるまたはサイズ選択のためのゲル切断法を用いて清浄化または精製することができる。たとえば、アンプリコンの精製は、下記の方法を用いて実施できる:プレートを900×gで30秒間遠心した。8チャネルマルチピペッターを用いて、96ウェル丸底PPプレートFisherScientificから入手できるの縦列1~11の各ウェルに、22.5μlの分子グレード水を添加した。PCR生成物22.5μlをPCRプレートから丸底PPプレートの各ウェルへ、2プレートそれぞれについて同じ配置を維持しながら移した。各ウェルに72μlのSPRIビーズを添加し、SPRIビーズ/PCR混合物が均一になるまで少なくとも12回の上下ピペッティングによって十分に混合した。プレートを上清が透明になるまで室温で10分間インキュベートし、次いでプレートを96ウェル磁気リングスタンドAmbion,Inc.から入手できるに乗せ、室温で5分間インキュベートした。プレートがなお磁気リングスタンド上にある状態で、ビーズを乱さずに上清を分離し、次いで廃棄した。PPプレートを次いで磁気リングスタンドから取り出し、調製したばかりの70エタノール200μlを添加した後、プレートを磁気リングスタンドへ戻した。この溶液を撹拌し、PPプレートを磁気リングスタンド上方で約10回、タッピング/揺動することによりペレットを分散させ、次いでプレートを磁気リングスタンドへ戻して1分間インキュベートした。プレートがなお磁気リングスタンド上にある状態で、ビーズを乱さずに上清を分離して廃棄した。調製したばかりの70エタノールの添加、混合および上清除去の段階を繰り返し、次いでPPプレート/磁気リングスタンドを一緒に、すべてのペレットが完全に乾燥するまで10~20分間、40°Cに設定した加熱ブロックに乗せておいた。各ウェルに10μlの1×TEpH7.6±0.1を添加した。すべてのペレットが分散するまでPPプレートを磁気リングスタンド上で前記と同じ前後/旋回運動でタッピングした。PPプレートを再び磁気リングスタンドに乗せて2分間インキュベートした。各ウェルからの上清を新たな96ウェル黄色プレートへ移した後、プレートをプレートシールで覆って-20°Cで保存した。1以上の態様において、アンプリコンを定量することも有利であろう。この例において、下記の方法を用いてアンプリコンの定量を実施できる:当技術分野で既知の方法を用いて、1μlのアンプリコンをPicoGreen登録商標試薬で定量した。5ng/μl以下と定量されたアンプリコンをいずれも、さらに2100BioanalyzerAgilientTechnologiesから入手できるで評価した。それぞれの精製アンプリコン1μlをBioanalyzerDNAチップに装填し、DNA-1000シリーズIIアッセイを行なった。予想サイズのバンドが存在し、プライマー二量体が3:1以下のモル比であることが明らかな場合、PicoGreen定量を用い、続いてアンプリコンをプールした。他方、予想サイズのバンドが存在し、プライマー二量体が3:1を超えるモル比であることが明らかな場合、SPRIおよびPicoGreen定量を繰り返し、続いてBioanalyzer分析を行なって、プライマー二量体の除去を確認した。陰性PCR対照反応物1μlをBioanalyzerで分析した。プライマー二量体以外のバンドはみられなかった。次に、段階815に示すように、アンプリコンからの核酸鎖を選択し、本明細書の他の箇所に記載したようにエマルジョン液滴に導入し、増幅させた。ある態様において、試料当たり2つのエマルジョンを用意してもよい:1つはAmpliconAキットを用い、1つはAmpliconBキットを用い、両方とも454LifeSciencesCorporationから入手できる。異なる態様において異なる数のエマルジョンおよび/または異なるキットを使用できることは認識されるであろう。最終ミックスのためのアンプリコンを下記の方法により選択できる:各試料につき6つのアンプリコンを作成し、それらをそれぞれ等モル量でemPCR反応用に混合した。必ずしもすべてのアンプリコンが等しい効率で作成されるわけではないので、場合によりきわめて少量のアンプリコンが作成され、代わりに多量のプライマー二量体が存在する可能性がある。最適な配列決定結果を達成するためには、あるアンプリコンの質が標準以下であった場合でも、各試料につき良好と定量された比較的純粋な後記を参照アンプリコンのみを最終ミックスに用いることが重要である。種々のアンプリコン間にかなりのオーバーラップがあるため、その試料の完全適用範囲を得るために必ずしも6つすべてのアンプリコンが必要なわけではないので、これが可能である。6つの高品質アンプリコンのセットが得られなかった場合、各試料につき最終ミックス用のアンプリコンを選択するための下記の規則に従った:そのアンプリコンがBioanalyzerで定量可能なバンドと認められなかった場合、それを6.2の最終アンプリコンミックスに用いなかった。プライマー二量体とアンプリコンのモル比が3:1以上であった場合、それを最終アンプリコンミックスに用いなかった。この測定は、6.1においてAgilentBioanalyzerアッセイでさらに定量した低濃度アンプリコンについて実施できるにすぎなかった。同様に段階815の一部として、emPCRに用いるためにアンプリコンの混合および希釈のための下記の方法を採用できる:特定の試料に由来する6つのアンプリコンそれぞれについて濃度分子/μlを下記の方程式により計算した:109分子/μlの濃度で6つのアンプリコンそれぞれの希釈を行なった:1μlのアンプリコン溶液に下記の体積の1×TEを添加した:等体積の6つの各アンプリコン希釈液、たとえば10μlを混合した。いずれかのアンプリコンが無い場合、オーバーラップするアンプリコンの体積を段階405に指針に従って増加させた。さらに、109分子/μlの溶液1μlを499μlのl×TEに添加することにより混合アンプリコンを2×l06分子/μlに希釈し、この最終希釈液2×l06分子/μlを-20°Cで0.5mlのO-リングキャップ付きチューブ内に保存した。増幅後、段階820に示すようにエマルジョンを破壊し、固定化核酸の増幅集団を含むビーズを富化した。たとえば、本明細書の他の箇所に記載したようにDNA含有ビーズを富化することができる。この富化したビーズを次いで段階830に示すように配列決定した。ある態様において、各試料を本明細書の他の箇所に記載したように配列決定する。たとえば、プールしたMID含有アンプリコンについて、配列決定のために富化および処理した後、合わせたエマルジョンから、4列ガスケットを備えた70×75金属沈着PTP上の列当たり790,000のビーズ陽性対照試料を含むを装填し、GS-FLX機器454LifeSciencesCorporationから入手できるで配列決定する。GS-FLXTitaniumシリーズ配列決定機器は3つの主アセンブリーを含む:流体素子サブシステム、光ファイバースライドカートリッジ/フローチャンバー、およびイメージングサブシステム。試薬導入ライン、多重弁マニホールド、および蠕動ポンプが流体素子サブシステムの一部を形成する。個々の試薬を適宜な試薬導入ラインに接続し、これにより試薬を一度に1試薬ずつ、前プログラミングした流速および期間でフローチャンバー内へ送達できる。光ファイバースライドカートリッジ/フローチャンバーは、スライドのエッチングした側とフローチャンバー天井の間に250μmの空間をもつ。フローチャンバーは、試薬および光ファイバースライドの温度制御手段ならびに遮光ハウジングも含んでいた。スライドの研磨したエッチングしていない側をイメージングシステムと直接接触させる。光ファイバースライドウェルへの配列決定用試薬の循環送達、およびウェルからの配列決定反応副生物の洗浄除去は、前プログラミングした流体素子システムの操作により達成される。このプログラムは一般にインターフェース制御言語ICLスクリプトの形で書き込まれ、試薬名洗浄剤、dATPαS、dCTP、dGTP、dTTP、およびPPi標準品、流速、および各スクリプト段階の期間を特定する。たとえば、可能な1態様において、すべての試薬について、約1cm/秒のフローチャンバー内-線速度で、流速を4mL/分に設定できる。配列決定試薬のフロー順序を組織化してカーネルにすることができ、その際、第1カーネルはPPiフロー21秒間、続いて14秒間の基質フロー、28秒間のアピラーゼ洗浄、および21秒間の基質フローを含む。最初のPPiフローに続いて、21サイクルのdNTPフローdC-基質-アピラーゼ洗浄-基質dA-基質-アピラーゼ洗浄-基質-dG-基質-アピラーゼ洗浄-基質-dT-基質-アピラーゼ洗浄-基質を行ない、その際、各dNTPフローは4つの個々のカーネルからなる。各カーネルは84秒間の長さであるdNTP-21秒間、基質フロー-14秒間、アピラーゼ洗浄-28秒間、基質フロー-21秒間;21秒後および63秒後にイメージを取得する。21サイクルのdNTPフローの後、PPiカーネルを導入し、次いでもう一度21サイクルのdNTPフローを行なう。配列決定行程の終了に続いて、第3のPPiカーネルを導入する。全行程時間は一般に244分間である。この行程を完了するのに必要な試薬体積は下記のとおりである:500mLの各洗浄溶液、100mLの各ヌクレオチド溶液。この行程期間中、すべての試薬を室温に保持する。フローチャンバーおよびフローチャンバー入口配管の温度を30°Cに制御し、フローチャンバーに入るすべての試薬を30°Cに予熱する。続いて、出力配列データを段階840に示すように分析する。ある態様において、高品質を得るためにフィルタリングしたフローグラムデータを含むSFFファイルを、特殊なアンプリコンソフトウェアにより処理し、そのデータを分析する。前記に述べた段階は説明のためのものにすぎず、限定ではないこと、さらにこれらの段階の一部または全部を異なる態様において種々の組合わせで使用できることは理解されるであろう。たとえば、他のHIV特徴/領域について調べるために、前記に述べた方法に用いるプライマーを追加のプライマーセットと組み合わせて、より総合的な診断または療法有益性を得ることができる。この例において、そのような組合わせはプレート上にドライダウン状態で供給でき、前記の逆転写酵素/プロテアーゼプライマー、ならびにHIV薬物耐性または指向性領域の検出のためのプライマーの一部または全部、ならびに他のいずれかの目的領域を含むことができる。他の例は、PCTApplicationSerialNoUS2008003424タイトルSystemandMethodforDetectionofHIVDrugResistantVariants2008年3月14日出願および/またはUSPatentApplicationSerialNo12456528タイトルSystemandMethodforDetectionofHIVTropismVariants2009年6月17日出願に記載されており、これらを全体としてあらゆる目的で本明細書に援用する。"