"ヒト心筋由来トロポニンIの第一の結合部に特異的に結合することができる第一の結合分子と、前記第一の結合分子とは異なる部位でトロポニンIに特異的に結合することができる第二の結合分子と、前記第一の結合分子及び前記第二の結合分子のトロポニンI結合部位とは異なる部位に結合することができる第三の結合分子と、を用いることを特徴とするトロポニンIの測定方法。請求項1に記載の第一の結合分子が抗体分子由来のアミノ酸配列を持つことを特徴とする請求項1に記載のトロポニンIの測定方法。請求項1に記載の第二の結合分子が抗体分子由来のアミノ酸配列を持つことを特徴とする請求項1~2に記載のトロポニンIの測定方法。請求項1に記載の第一の結合分子及び第二の結合分子は、C末端側に第3の結合分子が結合することができるアミノ酸配列を持つことを特徴とする請求項1~3に記載のトロポニンIの測定方法。請求項1に記載の第三の結合分子が、抗体分子由来のアミノ酸配列を持つことを特徴とする請求項1~4に記載のトロポニンIの測定方法。請求項1に記載の第一の結合分子及び第二の結合分子は、scFv抗体で構成されることを特徴とする請求項1~5に記載のトロポニンIの測定方法。請求項1に記載の第一の結合分子及び第二の結合分子において、第3の結合分子に結合することができるアミノ酸配列が同じアミノ酸配列から構成されることを特徴とする請求項1~6に記載のトロポニンIの測定方法。請求項7に記載の第一の結合分子及び第二の結合分子が第三の結合分子と結合するアミノ酸配列は、20以下のアミノ酸から構成されることを特徴とする請求項1~7に記載のトロポニンIの測定方法。しかしながら、特許文献1に記載のような結合力の抗体分子では、高感度にトロポニンIを検出することが困難であるという課題があった。上記の課題を解決するために、本発明の測定方法では、ヒト心筋由来トロポニンIの第一の結合部に特異的に結合することができる第一の結合分子と、第一の結合分子とは異なる部位でトロポニンIに特異的に結合することができる第二の結合分子と、第一の結合分子及び前記第二の結合分子のトロポニンI結合部位とは異なる部位に結合することができる第三の結合分子とを用いる。第一の結合分子が抗体分子由来のアミノ酸配列を持つ。第二の結合分子が抗体分子由来のアミノ酸配列を持つ。第一の結合分子及び第二の結合分子は、C末端側に第3の結合分子が結合することができるアミノ酸配列を持つ。第三の結合分子が、抗体分子由来のアミノ酸配列を持つ。第一の結合分子及び第二の結合分子は、scFv抗体で構成される。第一の結合分子及び第二の結合分子において、第3の結合分子に結合することができるアミノ酸配列が同じアミノ酸配列から構成される。第一の結合分子及び第二の結合分子が第三の結合分子と結合するアミノ酸配列は、20以下のアミノ酸から構成される。本発明のトロポニンIの測定方法は、これまでのトロポニンI検査に対して高感度にトロポニンIを検出することができる測定方法を提供することができる。本発明の測定方法は、ヒト心筋由来トロポニンIの第一の結合部に特異的に結合することができる第一の結合分子と、第一の結合分子とは異なる部位でトロポニンIに特異的に結合することができる第二の結合分子と、第一の結合分子及び前記第二の結合分子のトロポニンI結合部位とは異なる部位に結合することができる第三の結合分子とを用いる。このような構成にすると、アビディティ効果により、強固にトロポニンIと結合することができるため、好ましい。また、第三の分子を用いることで、第一の分子及び第二の分子を近傍に配置することができるため、好ましい。また、本発明の測定方法は、前記記載の第一の結合分子が抗体分子由来のアミノ酸配列を持つ。このような構成にすると、トロポニンIに対して特異性が高く、かつ比較的強い結合力でトロポニンIに結合することができるため、好ましい。また、ハイブリドーマ法であったり、進化分子工学的手法で分子を作製することができるため、好ましい。また、本発明の測定方法は、前記第二の結合分子が抗体分子由来のアミノ酸配列を持つ。このような構成にすると、トロポニンIに対して特異性が高く、かつ比較的強い結合力でトロポニンIに結合することができるため、好ましい。また、ハイブリドーマ法であったり、進化分子工学的手法で分子を作製することができるため、好ましい。また、本発明の測定方法は、前記記載の第一の結合分子及び第二の結合分子は、C末端側に第3の結合分子が結合することができるアミノ酸配列を持つ。このような構成にすると、第一の結合分子及び第二の結合分子のトロポニンI認識部位とは異なる領域に結合することができるため、好ましい。また、本発明の測定方法は、前記記載の第三の結合分子が、抗体分子由来のアミノ酸配列を持つ。このような構成にすると、第一の結合分子及び第二の結合分子に対し、特異性が高く、かつ比較的強い結合力で結合することができるため、好ましい。また、ハイブリドーマ法や、進化分子工学的手法といった既存の方法で分子を作製することができるため、好ましい。また、本発明の測定方法は、前記記載の第一の結合分子及び第二の結合分子は、scFv抗体で構成される。このような構成にすると、抗体分子に対し分子量が小さいため、第一の結合分子と第二の結合分子が立体障害を受けずに、同時にトロポニンIに結合できる可能性が高くなるため好ましい。また、本発明の測定方法は、前記記載の第一の結合分子及び第二の結合分子において、第3の結合分子に結合することができるアミノ酸配列が同じアミノ酸配列から構成される。このような構成にすると、例えば抗体分子などを第三の結合分子に用いた場合、第一の結合分子、第二の結合分子、及び第三の結合分子で三者複合体を形成することができるため、好ましい。三者複合体を形成することで、上記に記載のアビディティ効果をより効果的に利用することができる。また、本発明の測定方法は、前記記載の第一の結合分子及び第二の結合分子が第三の結合分子と結合するアミノ酸配列は、20以下のアミノ酸から構成される。このような構成にすると、第一の結合分子及び第二の結合分子が、第三の結合分子と結合する際、立体障害の影響を受けにくいため、好ましい。また、FLAG、His、HA、c-Mycなどのタグ配列を用いることができるため、好ましい。本発明の結合分子作製には、ファージディスプレイ法を用いることができる。また、ファージディスプレイを用いた結合タンパク質の分子フォーマットには、scFv抗体を用いることができる。ファージディスプレイ法は、Smithにより考案されたもので、M13ファージのような一本鎖環状DNAを持つ線状のバクテリオファージが用いられる。ファージ粒子はDNAの周囲を取り囲んでファージ粒子の大部分を構成するgp8というタンパク質と、ファージが大腸菌に感染する時に機能する5個のgp3と呼ばれるタンパク質などからなっている。このgp3もしくはgp8と融合した形でポリペプチドをコードするように遺伝子を構築し、ファージ粒子表面にそのタンパクを発現させるシステムがファージディスプレイシステムである。他の物質との結合活性を持つタンパク質を表面に保持したファージ粒子は、そのリガンドとの結合活性を利用して濃縮することができる。こうして目的とする結合活性を有するファージ粒子を濃縮する方法は、パニング法と呼ばれている。濃縮されたファージ粒子には、必要な結合活性を持つタンパク質をコードするDNAがパッケージングされている。このように繊維状ファージの利用によって、結合活性に基づくスクリーニングと、DNAのクローニングとをきわめて効率的に行うことができるシステムが実現した。ファージディスプレイシステムでは、特定の抗原に結合可能な抗体分子と、その抗体分子をコードする遺伝子も同時に得られる点に大きな利点がある。本発明において、scFv抗体とは、Fv領域、即ち、重鎖可変領域VH領域及び軽鎖可変領域VL領域を含み、これらがリンカーにより架橋されて構成される抗体である。また、scFv抗体遺伝子とは、VH領域をコードする遺伝子VH遺伝子、VL領域をコードする遺伝子VL遺伝子、及びリンカー配列から構成される。VH領域とVL領域とを架橋するリンカーには、汎用的なものを用いることができ、例えば、グリシン-セリンからなるペプチドリンカーが用いられる。本発明において、ライブラリーとは、多様な同種の構成要素からなる集合体を意味する。scFv抗体ライブラリーとは、多様なscFv抗体を含有する集合体である。本発明においては、各scFv抗体はファージ表面に発現されている。換言すれば、表面にscFv抗体を発現しているファージクローンの集合によりscFv抗体ライブラリーが形成される。また、scFv抗体ライブラリーは、生体内の多様性を包含するのに十分なクローン数を有することが好ましい。これにより、多種多様な抗原に対して、当該抗原と結合可能なscFv抗体を表面に発現するクローンを選択することが可能となる。本発明におけるscFv抗体ライブラリーは、scFv抗体をその表面に発現しているファージクローンの集合により構成されるが、かかるscFv抗体ライブラリーはscFv抗体遺伝子を保有するファージミドクローンの集合以下、scFv抗体ファージミドライブラリーというより調製することができる。なお、本発明において、scFv抗体遺伝子を保有するクローンの集合から構成されるライブラリーをscFv抗体遺伝子ライブラリーと呼ぶ。したがって、scFv抗体ファージミドライブラリーはscFv抗体遺伝子ライブラリーでもある。また、scFv抗体遺伝子を保有するファージミドにより形質転換された大腸菌の集合もscFv抗体遺伝子ライブラリーを構成する。ファージミドには、gp3やgp8等のファージの構成タンパク質をコードする遺伝子に、発現させたい外来タンパク質をコードする遺伝子、即ち、scFv抗体遺伝子を連結する。scFv抗体遺伝子は、上述のようにVH遺伝子、VL遺伝子、及びリンカー配列から構成されるが、VH遺伝子、VL遺伝子は、任意の抗体産生細胞より得ることができる。抗体産生細胞としては、例えば、末梢血リンパ球や脾臓細胞等を挙げることができる。それぞれの遺伝子の単離には、公知のプライマーを用いたRT-PCR法を利用することができる。得られた各領域の遺伝子とリンカー配列とを連結することによりscFv抗体遺伝子が構成される。scFv抗体ファージミドライブラリーからのscFv抗体ライブラリーの調製方法は次のように行うことができる。まず、scFv抗体ファージミドライブラリーを構成する各クローンを宿主にトランスフェクションさせる。次に、この宿主にヘルパーファージを重感染させる。ヘルパーファージM13K07の重感染によってファージ粒子として回収することができる。このとき利用されるファージミドのgp3タンパク質が外来タンパク質すなわちscFv抗体と融合されていれば、完成するファージの表面にはscFv抗体が提示されることとなる。scFv抗体ライブラリーを特定の抗原でスクリーニングし、当該抗原に結合可能なscFv抗体を発現しているファージクローンが選択される。抗原は、目的に応じて種々のものが用いられる。また、抗原を用いたスクリーニングは以下に示すパニング法により行うことができる。まず、目的とする抗原にscFv抗体ライブラリーを接触させ、この抗原に結合するクローンを回収する。回収したクローンを増幅し、再び目的の抗原と接触させて、結合するクローンを回収する工程を繰り返す。ファージの増幅は、ファージを大腸菌に感染させ、回収することによって行われる。この工程を繰り返すことによって、目的とする反応性を持つscFv抗体をその表面に発現しているファージクローンが濃縮される。抗原との結合性に基づくスクリーニングは、一般にクローンの回収率が上昇するまで行われる。ここで回収率とは、抗原に対して添加したファージクローンの数に対する、抗原への結合性を有するものとして回収されたファージクローンの数の割合である。回収率がその前のスクリーニングに比較して明らかに上昇するとき、目的とする反応性を持つscFv抗体をその表面に発現しているファージクローンが濃縮されつつあることを意味する。上記工程により選択したファージクローンより、scFv抗体をコードする遺伝子scFv抗体遺伝子が取得される。即ち、ファージクローンより、VH領域、VL領域、及びリンカーをコードする遺伝子が切り出される。このとき、His,MycなどのTagを含有するものを用いてもよい。具体的なscFv抗体遺伝子の切り出し方法としては、ファージDNAのscFv抗体遺伝子導入部位、即ち、scFv抗体遺伝子の両端の制限酵素サイトを特異的に切断する制限酵素を用いる。scFv抗体遺伝子を切り出す際に、scFv抗体遺伝子の一端又は両端の配列を変換する2つのプライマーを用いてPCRを行い、制限酵素サイトの変換されたscFv抗体遺伝子を切り出し、かつ増幅する。また、scFv抗体遺伝子の末端に適当なリンカーを付加することにより、所望の制限酵素サイトを形成してもよい。上記工程で取得したscFv抗体遺伝子を発現ベクターに組み込むことが行われる。発現ベクターはscFv抗体遺伝子を組み込むことによりscFv抗体遺伝子発現産物を発現可能なものを用いる。このような発現ベクターとしては、5’側より順に、開始コドン、scFv抗体遺伝子を導入する部位をコードする塩基配列を有するものが用いられる。また、scFV抗体遺伝子を導入する部位の後にHis-tag、myc-tag、又はHA-tagなどをコードする塩基配列以下、タグ配列というを有する発現ベクターを用いることができる。タグ分子の特定物質との親和性を利用してscFv抗体を精製することが可能となる。また、タグ配列を入れる位置はこれに限られるものではなく、scFv抗体遺伝子導入部位の5’上流域に入れておくこともできる。但し、タグ配列にコードされる分子とscFv抗体とが融合したものとして発現される位置に入れる必要がある。上記特性を備える発現ベクターは、市販の発現ベクターを周知の遺伝子操作技術を用いて改良することにより作製することができる。また、上記特性を備えるファージミドベクターは、市販のベクターを周知の遺伝子操作技術を用いて改良することにより作製することができる。[実施例]本実施例では、ヒト心筋由来のトロポニンIに結合し得るscFv抗体分子を作製するために以下の工程を行った。1トロポニンIの配列に含まれる2種類ペプチドをマウスに免疫し、その脾臓及び骨髄より抗体可変領域の遺伝子を増幅する工程、2工程1より得られた抗体可変領域の遺伝子を用い、scFv抗体ライブラリーを調製する工程、3トロポニンIに結合可能なscFv抗体を発現しているファージクローンを選択する工程、及び選択したファージクローンより、scFv抗体をコードする遺伝子を取得する工程、4工程3で取得した遺伝子を発現可能な発現ベクターに組込み、大腸菌から封入体を抽出し、封入体を巻き戻すことによりscFvタンパク質を得る工程。1トロポニンIをマウスに免疫し、その脾臓及び骨髄より抗体可変領域の遺伝子を増幅する工程ヒト心筋由来のトロポニンIのペプチド配列RPAPAPIRRRSSNYRAYATEPHAKKKSKISASRKLQLKTLLLQIAK配列番号:1及びQPLELAGLGFAELQDL配列番号:2を、sulfoSMCCクロスリンカーを介しヒト血清アルブミンと結合させた。完全フロイドアジュバンドにて、BALB/cマウスに免疫し、2週間毎にPBS溶液にて計3回免疫を行った。その免疫したマウスより、骨髄脾臓を摘出し、それぞれ1mLのTRIzolインビトロジェン株式会社を加え、十分に攪拌した。次に、0.2mLの99.9クロロホルムを加え、再度攪拌を行い、12000g、4°Cにて15分間遠心機にかけた。遠心チューブより上清を500μL採取し、エタノール沈殿を行うことで、乾燥状態の全RNAを取得した。さらに、得られた全RNAよりOligotexTM-dT30<Super>mRNAPurificationkitタカラバイオ株式会社を使用し、mRNAを抽出した。また、OligotexTM-dT30<Super>mRNAPurificationkitのスピンカラムよりmRNAを溶出する際には、40μLのDistilledWaterDNAseRNasefreeGIBCOを用いて行った。次に、PrimescriptTMReverseTranscriptaseタカラバイオ株式会社を用い、上記にて得られたmRNAよりcDNA合成を行った。次に、得られたcDNAより、抗体H鎖、L鎖可変領域のPCR増幅を行った。ここで、PCR増幅に用いるプライマーとしては、Biol.Pharm.Bull.2971325-13302006記載の塩基配列を含むプライマーを用いた。ここで、VLを伸張させるプライマーにSf1I、BamHIの制限酵素サイトを付加し、VHを伸張させるプライマーには、NotI、BamHIの制限酵素サイトを付加した。ポリメラーゼには、TaKaRaExTaqHotstartVersionタカラバイオ株式会社を用いた。PCR反応の温度サイクルは、95°Cにて2分間反応させた後、96°Cで30秒間反応、52°Cで1分間反応、68°Cにて1分間反応を35回繰り返し、さらに、68°Cにて4分間反応させた。上記PCR反応を終えた反応溶液を2重量濃度のアガロースを含むゲルにて電気泳動により分離し、WizardSVGelandPCRCrean-UPSystemPromegaを用い、VHH鎖可変領域及びVLL鎖可変領域のDNA断片の精製を行った。2トロポニンIに結合し得るscFvを含むscFv抗体ライブラリーを調製する工程次に、上記工程1にて調製したVL及びVH遺伝子をファージミドベクターへと組み込んだ。ファージミドベクターとしては、市販のpCANTAB5Eベクターファルマシアと同様の機能となるよう所望の遺伝子工学技術により作製した。VL遺伝子及びファージミドベクターを制限酵素SfiITOYOBO、BglIITOYOBOで処理した後に、アガロース電気泳動し、目的分子量付近のバンドを切り出して、WizardSVGelandPCRCrean-UPSystemPromegaで精製した。次に、制限酵素処理を加えたVL遺伝子及びファージミドベクターをLigationhighver2TOYOBOで連結させた後、エレクトロポレーションを用いて、大腸菌TG1株Lucigenに導入させた。形質転換を行った大腸菌を1グルコース、100μg/mLアンピシリン含有2×TYプレート培地にて、30°C、16時間培養を行った。次に、上記プレート培地上に形成された全コロニーを15グリセロール含有PBS溶液にて懸濁させ、QIAprepSpinMiniprepKit株式会社キアゲンを用いてファージミドベクターの抽出を行った。次に、VL遺伝子が組み込まれたファージミドベクターにVH遺伝子を組み込んだ。VL遺伝子が組み込まれたファージミドベクター及びVH遺伝子をそれぞれ、BamHI及びNotI制限酵素で処理した後に、アガロース電気泳動し、目的分子量付近のバンドを切り出して、WizardSVGelandPCRCrean-UPSystemPromegaで精製した。次に、制限酵素処理を加えたVH遺伝子及びファージミドベクターをLigationhighver2TOYOBOで連結させた後、エレクトロポレーションを用いて、大腸菌TG1株Lucigenに導入させた。形質転換を行った大腸菌を1グルコース、100μg/mLアンピシリン含有2×TYプレート培地にて、30°C、16時間培養を行った。上記プレート培地上に形成された全コロニーを15グリセロール含有PBS溶液にて懸濁させ、1グルコース、100μg/mLアンピシリン含有2×TY培地で波長600nmの吸光度が0.5になるよう培養した後、ヘルパーファージM13K07インビトロジェンを加え、30°Cで30分静置することで、ヘルパーファージM13K07を感染させた。次に、ヘルパーファージM13K07を加えた大腸菌溶液を5000g、4°Cにて5分間遠心した後、形成された沈殿物に、培地2×YT培地に100μg/mLアンピシリンと50μg/mLのカナマイシンを加えた液100mLを加えて懸濁し、30°Cで一晩培養した。上記培養液を4°Cで8000g、10分間遠心し、その上澄80mlに2.5Mの塩化ナトリウムを加えた平均分子量約8000の20ポリエチレングリコール水溶液を20ml加えて氷上で1時間静置した後、4°Cで10800g、30分間遠心して沈殿を回収し、15のグリセロールを加えたPBSを2ml加えて沈殿を溶解させることで、scFv抗体を提示したファージ群を回収した。3トロポニンIに結合可能なscFv抗体を発現しているファージクローンを選択する工程トロポニンI抗原をPBSで10μg/mLに調製し、試験管3本Nunc社製Maxisorpに1mLずつ添加して4°Cで24時間インキュベートして、試験管内表面へトロポニンI抗原を吸着させた。吸着後、抗原溶液を捨て、PBSで3回洗浄した後、3スキムミルク含有PBS溶液を4mLずつを加えて25°Cで1時間反応させ、scFv抗体を提示したファージが非特異的に試験管に結合することを防ぐためにブロッキングを行った。作製した抗原吸着済試験管に前記工程で得たscFv抗体を提示したファージ群を1×10^12CFU/mLに調製し、その溶液1mlを2mlの3スキムミルク、0.05Tween20含有PBSと混合させ、この液を試験管に添加して25°Cで2時間反応させた後、0.05Tween20を加えたPBSで10回、PBSで10回洗浄した。続いて抗原結合試験管に結合したファージを以下のように回収した。0.5Mグリシン塩酸塩pH2.6を試験管に1mL添加し、ローテーターを用いて室温で6分間反応させ乖離させた後、1MTris-HCl緩衝液pH7.41mLを加えて中和し、この液を回収した。回収した液はファージの大腸菌への感染、ヘルパーファージの感染、ファージの回収のそれぞれの工程処理を行い、含まれているファージを精製増幅した。大腸菌TG1を2×YT培地5mLで培養し、波長600nmの吸光度が0.5になるよう増殖させ、上記で乖離させたファージ液1mlを加えて37°Cで30分静置させた。静置後の培地を5000g、4°Cにて5分間遠心し、沈殿した菌体を2×YT培地1mLで再懸濁し、1グルコース、100μg/mLアンピシリン含有2×TYプレート培地にて30°Cで16時間培養した。上記プレート培地上に形成された全コロニーを15グリセロール含有PBS溶液にて溶解させ、1グルコース、100μg/mLアンピシリン含有2×TY培地で波長600nmの吸光度が0.5になるよう培養した後、ヘルパーファージM13K07インビトロジェンを加え、30°Cで30分静置することで、ヘルパーファージM13K07を感染させた。次に、ヘルパーファージM13K07を加えた大腸菌溶液を5000g、4°Cにて5分間遠心した後、沈殿物を培地2×YT培地に100μg/mLアンピシリンと50μg/mLのカナマイシンを加えた液100mLで懸濁し、30°Cで一晩培養した。上記培養液を4°Cで8000g、10分間遠心し、その上澄80mlに2.5Mの塩化ナトリウムを加えた平均分子量約8000の20ポリエチレングリコール水溶液を20ml加えて氷上で1時間静置した後、4°Cで10800g、30分間遠心して沈殿を回収し、15のグリセロールを加えたPBSを2ml加えて沈殿を溶解し、ファージ群を回収した。上記のようにして、トロポニンI結合試験管に結合したファージの回収、増幅という作業を3回繰り返し行った。次に、上記の作業3回後に乖離させたファージ液1mlを2×YT培地5mLで波長600nmの吸光度が0.5になるよう増殖させた大腸菌TG1に加えて、37°Cで30分静置させた。静置後の培地を5000g、4°Cにて5分間遠心し、沈殿した菌体を2×YT培地1mLで再懸濁し、懸濁液1μlを2×YT培地10mLに加え、1グルコース、100μg/mLアンピシリン含有2×TYプレート培地にて30°Cで16時間培養した。培養後形成されたコロニーをランダムに96個ピックアップし、上記と同様にして96クローンのscFv提示ファージを回収増幅した。次に96クローンのうち、トロポニンIに結合可能なscFv抗体を発現しているファージクローンの選択をELISA法で行った。まず、ELISA用のプレートを以下のように調製した。トロポニンI抗原2μg/mLを96ウェルマイクロタイタープレートNunc社製Maxisorpの各ウェルに50μL添加して4°Cで18時間結合させたのち、3スキムミルク含有PBSブロッキング液を各ウェルに200μL添加して37°Cで1時間ブロッキングした。ブロッキング液を捨てた後、PBSで3回洗浄した。このようにして得られたプレートの各ウェルに、6スキムミルク含有PBSを25μLずつ加え、さらに上記96クローンのファージ溶液を25μLずつ加え混合し、25°Cで1時間反応させた。反応後、005のTWEEEN20含有PBSで4回洗浄し、5000倍希釈のHRPで標識された抗M13抗体GEヘルスケア製を50μL加えて25°Cで1時間反応させた。次に、各ウェルを005のTWEEEN20含有PBSで4回洗浄した後、TMBperoxidaseEIAsubstratekitの溶液50μLを加えて暫時反応させた後、1N硫酸を加えて反応を停止し、波長450nmにおける吸光度を測定した。その結果、RPAPAPIRRRSSNYRAYATEPHAKKKSKISASRKLQLKTLLLQIAK及びQPLELAGLGFAELQDLに対し、特異的に結合することができるA2及びA1scFv抗体を得ることができた。4上記工程にて取得したscFv遺伝子を発現可能な発現ベクターに組込み、大腸菌から封入体を抽出し、封入体を巻き戻すことによりscFvタンパク質を得る工程前記で得られたトロポニンIに結合するクローンのファージミドベクターより、scFv遺伝子をNcoINotI制限酵素処理し、アガロースゲル電気泳動して目的の断片を回収し、市販のpET15bベクタータカラバイオに連結させた。また、pET15bベクターのマルチクローニングサイトのC末端側にヒスチジンタグを導入し、scFv抗体のC末端側にヒスチジンタグが導入されるように設計した。次に上記発現ベクターをBL21pLysS大腸菌株タカラバイオに導入させ、100μg/mLアンピシリン含有LBプレート培地にて37°Cで16時間培養した。プレート培地上に形成されたシングルコロニーを1Lの100μg/mLアンピシリン含有LBプレート培地にうつし、波長600nmの吸光度が0.5になるよう37°Cにて増殖させ、1mMIPTGを1ml加え、37°Cにて5時間振とう培養した。次に、培養液を5000g、4°Cにて5分間遠心し、菌体を沈殿させ、50mLのPBSで菌体を再懸濁した。再懸濁液を超音波処理により菌体を破砕した後、10000g、4°C、30分間遠心することで、封入体を含む不溶性物を沈殿させた。封入体を含む不溶性物を4のTritonX-100含有PBSで2回、PBSで2回洗浄した。次に、得られた沈殿物に10mLの可溶化溶液6Mグアニジン塩酸塩、0.1MNaCl、50mMMES、10mMEDTA、pH6.0を加え、4°Cにて18時間反応させ、封入体の可溶化を行った。可溶化後の溶液を0.45μmのフィルターを通し、不溶化物を除去した。次に、可溶化溶液1mLに対し、巻き戻し溶液0.1MTrisHCl2mMEDTA10アルギニン塩酸塩373mMシスタミン、673mMシステアミン塩酸塩pH8.02mLを50μlずつ混合しながら滴下した。次に、得られた3mLの溶液を1Lの上記巻き戻し溶液に50μlずつ混合しながら滴下した後、4°Cにて撹拌しながら96時間インキュベートした。インキュベート後の溶液を10mLまで濃縮し、HiLoad2660Superdex75pgにて精製した。このようにして、ヒト心筋由来のトロポニンIに結合することができるA1及びA2scFv抗体を得ることができた。A1及びA2scFv抗体のアフィニティ測定次に、BiacoreT100GEヘルスケアを用い、A1及びA2scFv抗体のアフィニティ測定を行った。測定用センサチップには、CM5GEヘルスケアを用いた。ヒト心筋由来のトロポニンIフナコシをアミドカップリング法にて、約1000RUをCM5チップ上のフローセル2に固定化させた。また、フローセル1をEDC/NHSで活性後、エタノールアミンで処理し、リファレンスとした。次に、上記工程で得られたA1及びA2scFv抗体をPD10GEヘルスケアカラムを用い、HBバッファーに置換した。それぞれの溶液を、HBにて50nM25nM125nM625nM313nM107nMに希釈し、アナライト溶液とした。ランニングバッファーにHBを用い、流速60μl/min、結合時間120秒、解離時間1200秒にて結合実験を行った。また、再生溶液には、pH2.0のグリシン溶液を用いた。得られたセンサグラムをBIAevaluationSoftwareGEヘルスケアにて解析した結果、A2scFv抗体のアフィニティKD2631E9及びA1scFv抗体のアフィニティKD196E10が決定された。抗ヒスチジンタグ抗体、A1scFv抗体、A2scFv抗体を用いたトロポニンIの測定以下では、作製したA1scFv抗体、A2scFv抗体及び抗ヒスチジンタグ抗体を用い、BiacoreT100でトロポニンIを測定した場合の例を示す。上記と同様にして抗ヒスチジンタグ抗体キアゲンを約3600RUCM5チップ上のフローセル2に固定化させた。また、フローセル1をエタノールアミンで処理し、リファレンス用とした。次に、A1scFv抗体及びA2scFv抗体を等モル濃度で混合させ、フローセルに流した。A1scFv抗体及びA2scFv抗体は上記に記載したようにC末端側にヒスチジンタグを持つため、チップ上に固定化された抗ヒスチジンタグ抗体に結合することができる。次にアナライト溶液として、HBS-EPにバッファー置換したヒト心筋由来のトロポニンIフナコシを100nM50nM25nM125nM625nM312nMに調製した。抗ヒスチジンタグ抗体、A1scFv抗体、A2scFv抗体を用いたトロポニンIの測定にはBiacoreT100GEヘルスケアのキャプチャー法を用いた。キャプチャー分子の溶液は、上記のA1scFv抗体及びA2scFv抗体を等モル濃度で混合させたものを用いた。ランニングバッファーにHBを用い、流速60μl/min、キャプチャー時間40秒、結合時間180秒、解離時間1800秒にて結合実験を行った。また、再生溶液には、pH2.0のグリシン溶液を用いた。得られたセンサグラムをBIAevaluationSoftwareGEヘルスケアにて解析した結果、KD111E12のアフィニティが決定された。上記のようにして、異なるエピトープに結合する2種の抗トロポニンIscFv及び2種の抗体を同時に結合することができる抗ヒスチジンタグ抗体を用いることで、強い結合力でトロポニンIと結合することができた。なお、本実施例においてはトロポニンIの高感度な検出にBiacoreT100GEヘルスケアを用いた例を示したが、本発明の測定方法に関しては、これに限定されない。なお、本実施例においては、scFvの作製にマウス免疫ライブラリーを用いたが、これに限定されない。その他の動物種、あるいはナイーブライブラリーや合成ライブラリーを用いて作製することもできる。また、ハイブリドーマより抗体分子のmRNAを抽出し、そこからcDNA化を行うことで、抗体遺伝子を得ることもできる。なお、本実施例においては、scFvにヒスチジンタグを用いたが、これに限定されない。例えばFLAGタグやHAタグ、Eタグといった既存のタグ配列を用いることもできる。また、任意のペプチド配列をタグとして利用し、任意のペプチド配列に対する抗体は、既存の免疫法により得ることもできる。なお、本実施例においては、抗体を第三の分子として用いたが、これに限定されない。例えばscFvのC末端をビオチン化し、ストレプトアビジンを第三の結合分子として用いることもできる。"