"イヌ乳癌乳房腫瘍を罹患するイヌでイヌ乳癌乳房腫瘍を治療する方法であって、前記イヌの乳房細胞によって発現される分化抗原と同じタイプの異種分化抗原の免疫学的に有効な量をイヌに投与する工程を含む、前記方法。異種の乳腺腫瘍関連分化抗原がHer2neuである、請求項1に記載の方法。異種の乳腺腫瘍関連分化抗原がラットHer2neuである、請求項1に記載の方法。異種の乳腺腫瘍関連分化抗原が、乳腺腫瘍関連分化抗原のイヌでの発現を促進するプロモーターの制御下に異種の治療用乳腺腫瘍関連分化抗原をコードするDNA配列を含むベクターとして投与される、請求項1から3のいずれかに記載の方法。イヌ乳腺癌腫瘍を罹患するイヌでイヌ乳腺腫瘍を治療する方法であって、前記イヌの乳腺細胞によって発現される分化抗原と同じタイプの異種分化抗原の免疫学的に有効な量を前記イヌに投与する工程を含み、前記異種乳腺癌腫瘍関連分化抗原が、異種乳腺腫瘍関連分化抗原のイヌでの発現を促進するプロモーターの制御下に異種の治療用乳腺癌腫瘍関連分化抗原をコードするDNA配列を含むベクターとして投与され、さらに前記ベクターが配列番号:1に示す配列の106-3885を含む配列を有する、前記方法。さらに、1Her2neu関連癌を外科的に減量手術する工程;2異種Her2neuをコードする第一のプラスミドを含む基礎免疫を施す工程;及び3エレクトロトランスファーエレクトロポレーションにより追加免疫を施す工程を含み、前記追加免疫が第一のプラスミド、又は、配列番号:3若しくは4によってコードされる異種Her2neuをコードするプラスミドを含む、別個の異種Her2neuをイヌにおいてinvivoで発現することができる第二のプラスミドであるか、又はHer2neu関連癌によって発現される非相同Her2neuに対して治療的に有効な免疫応答を誘引できる、任意のHer2neuタンパク質をinvivoで発現できる組換えベクターである、請求項1から4のいずれか1項に記載の方法。1初期免疫が、針を使用せずに実施される投与工程を含み、2第一のプラスミドが配列番号:2に示す配列をイヌでinvivoにて発現することができ、3追加免疫が工程2のプラスミドを投与する工程を含む、請求項6に記載の方法。追加免疫が、3-6カ月毎に1回生存イヌに提供される、請求項6又は7に記載の方法。異種分化抗原が、前記異種分化抗原の発現を促進するプロモーターの制御下に前記異種分化抗原をコードするDNAを含む非ウイルス性プラスミドベクター中で前記異種分化抗原をコードするDNAを用いて、対象動物のDNA免疫によって投与される、請求項1から4のいずれか1項に記載の方法。乳腺腫瘍MGTの切除と同時に実施される、請求項1から4又は9のいずれか1項に記載の方法。配列番号:2に示すタンパク質をイヌでinvivoにて発現することができるベクター。発明の詳細な説明本発明は、乳腺関連分化抗原に対する免疫応答を刺激することによって、対象動物で乳腺腫瘍を治療する方法を提供する。前記対象動物は好ましくはイヌ又はネコであるが、ただし本発明は、他の動物種好ましくは哺乳動物又はトリの種にも同様に応用できる。本出願の明細書及び特許請求の範囲で用いられるように、免疫応答という用語は細胞性及び液性免疫応答の両方を包含する。好ましくは、前記免疫応答は、標的分化抗原を発現する腫瘍の増殖に対抗する免疫防御を提供するために十分である。刺激するという用語は新規な免疫応答の最初の刺激又は既に存在する免疫応答の強化を意味する。本発明にしたがえば、対象動物は、当該対象動物の乳腺腫瘍細胞によって発現される標的分化抗原と同じタイプの異種分化抗原を、免疫応答の刺激に有効な量で投与することによって治療される。したがって、例えば、標的分化抗原が乳腺細胞で見出されるHer2neu抗原である場合、治療用抗原は異種Her2neu抗原である。ある実施態様では、本発明の方法は以下の工程を含むことができる:1異種抗原例えば配列番号:2に示すラットHer2neuであって、前記は配列番号:1に示す配列のヌクレオチド106-3885によってコードされるの必要がある動物への免疫、2針を使用しない免疫応答のプライミング、3エレクトロトランスファーによる追加免疫、及び4外科的一次療法による腫瘍の減量手術後のワクチン免疫。別の実施態様では、本発明の方法は、転移が存在しないすなわち乳癌進行の比較的初期対象動物愛玩動物を含むで実施される。いくつかの実施態様では、追加免疫は、異種抗原例えばラットHer2タンパク質配列番号:2をコードするものをコードするプラスミドを投与する工程を含む。いくつかの実施態様では、異種抗原は配列番号:1に示す配列に関して好ましいヌクレオチド置換を有するヌクレオチドによってコードされる。好ましい置換には、乳房腫瘍乳癌の細胞によって発現されるHer2neuに対して免疫応答の改善をもたらす任意の変更が含まれる。置換は、Her2関連乳癌に対して標的動物で治療的に有効な免疫応答を誘引することができる既存の配列、例えばネズミHer2配列番号:3、ヒトHer2配列番号:4若しくは任意の他の異種Her2配列又は前記のフラグメントを含むことができる。いくつかの実施態様では、追加免疫は異種分化抗原を投与する工程を含む。異種分化抗原は供給源生物から誘導した精製分化抗原として投与できる。タンパク質はこの目的のためにカラムクロマトグラフィーによる方法を用いて細胞溶解物から精製できる。この目的のためのタンパク質はまた、組換え供給源から、例えば所望の生成物を発現する細菌若しくは酵母菌クローン又は哺乳動物若しくは昆虫細胞株から精製してもよい。異種分化抗原の投与はいくつかのルートによって達成できる。第一に、異種分化抗原はワクチン組成物の部分として投与でき、前記ワクチン組成物は、免疫応答の強度を高めるために1つ以上のアジュバント例えばミョウバン、QS21、TITERMAX若しくはその誘導体、不完全若しくは完全フロイントのアジュバント及び関連アジュバント、及びサイトカイン例えば顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、flt3リガンド、インターロイキン2、インターロイキン4及びインターロイキン12を含むことができる。ワクチン組成物は溶液又は懸濁液中の異種分化抗原の形態であってもよく、又は治療用分化抗原は脂質担体例えばリポソームに導入してもよい。そのような組成物は一般的には、皮下、皮内又は筋肉内ルートによって投与されるであろう。発現された異種分化抗原を含むワクチン組成物は、対象動物で標的分化抗原に対して免疫応答を刺激するために有効な量で投与される。投与されるべき好ましい量は対象動物の種及び具体的な抗原に左右され、日常的な予備試験により決定できる。前記予備試験では、用量増加が提供され、抗体形成又はT細胞応答の程度がELISA又は類似の試験によって測定される。T細胞応答はまた、細胞性免疫アッセイ、例えば細胞傷害性、サイトカイン遊離アッセイ及び増殖アッセイによって測定できる。異種分化抗原はまた、本発明にしたがってDNA免疫技術を用いて導入できる。前記DNA免疫技術では、抗原をコードするDNAは、異種分化抗原が対象動物によって発現されるように対象動物に導入される。分化抗原をコードするcDNAは、哺乳動物細胞での核酸ポリマーの発現に有効なプロモーターと結合される。これは、核酸ポリマーを制限エンドヌクレアーゼで消化し、プロモーター例えばSV40プロモーター、サイトメガロウイルスCMVプロモーター又はラウス肉腫ウイルスRSVプロモーターを含むプラスミドでクローニングすることによって達成できる。続いて得られた構築物を遺伝子免疫用ワクチンとして用いる。前記核酸ポリマーはまた、哺乳動物細胞に形質導入できることが知られているプラスミド及びウイルスベクターでクローン化することもできよう。これらのベクターには、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ポックスウイルスベクター及びアデノウイルス関連ベクターが含まれる。プロモーター及び抗原コード領域を含む核酸構築物は直接投与するか、又は投与前にリポソーム中に包み込むか、若しくは金コロイド粒子上に被覆してもよい。DNAワクチンをリポソームに包み込む技術は当業界では公知であり、例えば以下からMurrayedGeneTransferandExpressionProtocolsHumanaPresCliftonNJ1991知ることができる。同様に、裸のDNAを金粒子上に被覆する技術は以下の文献で教示されYangGenetransferintomammaliansomaticcellsinvivoCritRevBiotech123353561992、さらにウイルスベクターを用いてタンパク質を発現させる技術は以下で見出されるAdolphKedViralGenomeMethodsCRCPressFlorida1996。遺伝子免疫のためには、ワクチン組成物は、好ましくは皮内、皮下又は筋肉内に注射によって又は気体誘導粒子ボンバードメントによって投与され、さらに有効な量でデリバーされて、宿主生物で免疫応答を刺激する。組成物はまた、リポソームトランスフェクション、粒子ボンバードメント又はウイルス感染共培養技術を含むを用いて、血液又は骨髄由来細胞APCを含むにexvivoで投与できる。続いて、前記処理細胞は免疫されるべき対象動物に再導入される。必要とされる物質量はそれぞれ個々の構築物の免疫原性に左右され、演繹的に予想することができないことは理解されるところであるが、与えられた任意の構築物についての適切な投薬量を決定するプロセスは回りくどくはない。具体的には、サイズを増加させた一連の投薬量01μgから始めるを投与し、生じる免疫応答を、例えばELISAを用いる抗体力価の測定、クロム放出アッセイを用いるCTL応答検出又はサイトカイン放出アッセイを用いるTHヘルパーT細胞応答検出によって観察する。異種分化抗原の投与によりいったん寛容が壊れたら、同系分化による後続治療を利用して免疫応答を維持し、いくつかの事例では免疫応答を強化することができる例えば以下を参照されたい:WeberetalTumorimmunityandautoimmunityinducedbyimmunizationwithhomologousDNAJClinInvest10212581998。したがって、本発明のある実施態様では、対象動物は、第一に異種分化抗原の投与によって例えば3治療サイクルの場合、続いて同系分化抗原の投与によって例えばさらに追加の3治療サイクルの場合処置される。異なる治療薬剤を用いる治療サイクルの代替として、異種及び同系分化抗原の両方を含むただ1つの治療薬剤を用いてもよい。したがって、例えばrHer2pING及びhHer2pINGベクターの混合物、又はラット及びヒトHer2neuの両方をそれらがイヌ対象動物で発現されるようにプロモーターの制御下でコードするただ1つのベクターを、イヌでの乳腺腫瘍の治療に用いることができる。ベクターは市場で例えばStratagene及び他の会社から入手でき、それらベクターは2つの独立した遺伝子を発現できる。通常は、これらベクターは、この2つの遺伝子の間に内部リボソームエントリー部位又はIRESを利用する。このアプローチは、単一治療薬剤としての承認を必要とするだけであるという利点を有する。本明細書に引用した全文献は参照によりその全体が本明細書に含まれる。本発明は、これから以下の非限定的実施例を参考にしながらさらに詳しく記述されるであろう。Her2neu発現プラスミドの構築ラットHER2neuの細胞外ドメイン配列番号:1のヌクレオチド17-3799を、フォワードプライマー5’CGAAGCTTACCATGGAGCTGGCGGCCTGG3’;配列番号:6及びリバースプライマー5’CGGAATTCTTATGTCACCGGGCTGGC3’;配列番号:7を用いpCMVneuNTAmicietal1998からPCRによって増幅させた。HindIIIEcoRIフラグメントをpcDNA31InvitrogenCarlsbadCA及び図2でクローニングした。ラットのneucDNAの本来の配列は以前に報告されBargmannetal1986、本明細書では配列番号:1ヌクレオチド17から3799のコード配列を含むに示す。続いてラットのHER2neuコード配列をpINGベクターBergmanetalClinCancerRes9128412902003;骨格は図3に示し、マップは図3に示し、配列は配列番号:5に示すでサブクローニングしてラットHER2neupINGを得る。乳腺腫瘍MGT陽性のイヌのpINGrHer2による免疫この試みでは、MGTを有する10匹のイヌを登録し、1回分用量当たり100μgのpINGrHer2DNAで免疫した。これらのイヌの個体判別は表1に腫瘍の病期は表2に示す。表1:試験動物の特徴表2:腫瘍病期表示のように、このグループは、5匹の病期I及び5匹の病期IIIのイヌを含み、それらのイヌはいずれも2週間間隔で3回の1回分用量ワクチンの投与を受けた。1回目及び2回目の用量はVITAJETTM経皮装置で投与され、3回目の用量はエレクトロポレーションと同時に筋肉内注射によって投与された。ワクチン接種は、卵巣子宮摘出OHEを同時に実施するMGTの外科的切除に続いて開始した。全てのイヌが領域リンパ節転移及び肺転移について陰性であった。外科手術の日を0日目として用いて無病生存期間及び全生存期間を計算し、結果を表3に提示した。表3:無病生存期間及び全生存期間19匹のイヌのグループを経過コントロール群として認定した。全コントロール犬に同時OHEと併せてMGTの外科的切除を施し、いずれも領域リンパ節転移及び肺転移について陰性であった。このグループは、7匹の病期I、3匹の病期II及び9匹の病期IIIのイヌを含んでいた。外科手術の日を0日目として用い、これらのイヌについて無病生存期間及び全生存期間を計算した。これらのイヌの個体判別は表4に示し、各イヌの腫瘍病期は表5に示す。無病生存期間及び全生存期間をコントロールグループについて計算し、図1A-1Cで提示する。表4:コントロールのイヌの個体判別表5:コントロールのイヌの腫瘍病期Philibertら2003は、MGTを有する97匹のイヌの生存統計を精査し、直径が3cm未満のMGTを有する41匹のイヌの生存期間の中央値が22カ月約666日であるのに対して、直径が3cmを超えるMGTを有する56匹のイヌでは14カ月約424日であることを報告した。リンパ節への関わり合い又は転移がなければ、3cm未満の腫瘍サイズは病期Iと相関性を有し、3cmを超える腫瘍サイズは病期II又はそれより進行した病期と相関性を有する。彼らは、病期II、III及びIVのイヌについては生存期間に相違を見出さなかった。pINGrHer2ワクチンで処置した全てのイヌの全生存期間中央値は678日である。この値は、NTUによって提供された19匹のイヌの経過データ全生存期間中央値は300日であることを示している、及びPhilibertら2003の発表したデータ病期II又はそれより進んだMGTを有するイヌの生存期間は424日であることを示していると比較して有意に長かった。pINGrHer2DNAワクチンは、既存のHer2組織発現アッセイを用いる腫瘍組織分析によりHer2抗原を過剰発現することを示す腫瘍を有するイヌ及びネコを標的とするであろう。本ワクチンは、VetjetTM経皮装置を用いて投与され、100μgのDNAをイヌの内側大腿又はネコの外側大腿に、2週間間隔で4回デリバーするであろう。生存しているイヌ又はネコには6ヶ月毎に追加免疫用量が投与されるであろう。これから本発明は以下の非限定的な特許請求の範囲によって記述されるであろう。参考文献OrlandietalAntibodyandCD8TcellResponsesagainstHER2neuRequiredforTumorEradicationafterDNAImmunizationwithaFlt3LigandFusionVaccineClinCancerRes200713October152007AmiciAetalVenanziFMConcettiAGeneticimmunizationagainstneuerbB2transgenicbreastcancerCancerImmunolImmunother19984718390BergmanPJetalLongTermSurvivalofDogswithAdvancedMalignantMelanomaafterDNAVaccinationwithXenogeneicHumanTyrosinaseAPhaseITrialCCRVol912841290April2003BargmannetalTheneuoncogeneencodesanepidermalgrowthfactorreceptorrelatedproteinNature1986Jan162231922630NorellHetalVaccinationwithaplasmidDNAencodingHER2neutogetherwithlowdosesofGMCSFandIL2inpatientswithmetastaticbreastcarcinomaapilotclinicaltrialJTM7June2010853JacobJBetalCombiningHumanandRatSequencesinHer2DNAVaccinesBluntsImmuneToleranceandDrivesAntitumorImmunityCancerResJanuary1201070119DeMariaRetalSpontaneousFelineMammaryCarcinomaisaModelofHer2OverexpressingPoorPrognosisHumanBreastCancerCancerRes200565907912PhilibertJCetalInfluenceofHostFactorsonSurvivalinDogswithMalignantMammaryGlandTumorsJVetInternMed200317102106PressMFetalExpressionoftheHer2neuprotooncogeneinnormalhumanadultandfetaltissuesOncogene595362RungsipipatAetalCerbB2oncogeneandP21WAFCIPItumorsuppressorgeneexpressionasprognosticfactorsincaninemammaryadenocarcinomasCompClinPathol2008173541WinstonJetalImmunohistochemicaldetectionofHer2neuexpressioninspontaneousfelinemammarytumoursVeterinaryandComparativeOncology318152005ChangSYetalEnhancedefficacyofDNAvaccinationagainstHer2neutumorantigenbygeneticadjuvantsIJCvol111pages869510Aug2004PupaetalHER2AbiomarkeratthecrossroadsofbreastcancerimmunotherapyandmolecularmedicineJCPVol205pages101810May2005QuaglinoEetalConcordantmorphologicandgeneexpressiondatashowthatavaccinehaltsHER2neupreneoplasticlesionsJCIVol113No5March2004BernhardHetalVaccinationagainsttheHER2neuoncogenicproteinEndocrineRelatedCancer93344,2002BertaGNetalAntiHER2DNAvaccineprotectsSyrianhamstersagainstsquamouscellcarcinomasBrJCancervol9328November2005DisisetalPeptidebasedbutnotwholeproteinvaccineselicitimmunitytoHER2neuanoncogenicselfproteinTheJournalofImmunology15631513158May11996EcketalZhaietalAntigenSpecificTumorVaccinesTheJournalofImmunology156700710Jan1996VermaandSomiaGeneandtherapypromisesproblemsandprospectsNature389239242Sep1997MillerandVileTargetedvectorsforgenetherapyFASEBJ91901991995DeonarainMahendraLigandtargetedreceptormediatedvectorsforgenedeliveryExpOpinTherPatents853691998CrystalTransferofGenestoHumansEarlyLessonsandObstaclestoSuccessScience270404410Oct201995BBouchardetalInductionofPigmentationinMouseFibroblastsbyExpressionofHumanTyrosinasecDNAJExpMed1989vol169pp20292042BBouchardetalProductionandCharacterizationofAntibodiesagainstHumanTyrosinaseTheJournalofInvestigativeDermatology1994vol102No3pp291295JRowelletalLysosomeAssociatedMembraneProtein1MediatedTargetingoftheHIV1EnvelopeProteintoanEndosomalLysosomalCompartmentEnhancesItsPresentationtoMHCClassIIRestrictedTCellsTheAmericanAssociationofImmunologists1995pp18181828SKrishnanetalPavingthewaytowardsDNAvaccinesNatureMedicine1995vol1No6pp521522SBarclayetalRapidisolationofmonoclonalantibodiesspecificforcellsurfacedifferentiationantigensProcNatlAcadSciUSA1986vol83pp43364340SVijayasaradhietalIntracellularSortingandTargetingofMelanosomalMembraneProteinsIdentificationofSignalsforSortingoftheHumanBrownLocusProteinGP75TheJournalofCellBiology1995vol130No4pp807820DPardolletalExposingtheImmunologyofNakedDNAVaccinesImmunityCellPress1995vol3pp165169SVijayasaradhietalTheMelanomaAntigengp75istheHumanHomologueoftheMousebLocusGeneProductJExpMed1990vol171pp13751380GAdemaetalMolecularCharacterizationoftheMelanocyteLineagespecificAntigengp100TheJournalofBiologyChemistryTheAmericanSocietyforBiochemistryandMolecularBiology1994vol269No31pp2012620133AHoughtonetalRecognitionofAutoantigensbyPatientswithMelanomaAnnalsNewYorkAcademyofSciences1993pp5969CNaftzgeretalImmuneresponsetoadifferentiationantigeninducedbyalteredantigenAstudyoftumorrejectionandautoimmunityProcNatlAcadSciUSA1996vol93pp1480914814FAusubeletalExpressionofProteinsisInsectCellsusingBaculoviralVectorsCurrentProtocolsinMolecularBiologyGreenePublishingandWileyInterscience1990vol8168116117JUlmeretalHeterologousProtectionAgainstInfluenzabyInjectionofDNAEncodingaViralProteinScience1993vol259pp17451749CTiffsetalTheFoldingandCellSurfaceExpressionofCD4RequiresGlycosylationTheJournalofBiologicalChemistry1992vol267No5pp32683273SParkJL1ANovelDifferentiationAntigenofHumanCorticalThymocyteJExpMedTheRockefellerUniversityPress1993vol178pp14471451CCabanasetalCharacterizationofaCD11cReactiveMonoclonalAntibodyObtainedbyImmunizingwithPhorbolEsterDifferentiatedU937CellsHybridoma1988vol7No2pp167177NNandaetalInductionofAntiSelfImmunitytoCureCancerCell1995vol82pp1317上述の全ての文献は引用により本明細書に取り込まれるものとする。"