"腸炎ビブリオVibrioparahaemolyticusのF0F1-ATP合成酵素のデルタサブユニットと特異的に抗原抗体反応を起こし得るモノクローナル抗体。配列番号1に記載されたアミノ酸配列からなるペプチドによって構成されるエピトープを認識し、腸炎ビブリオVibrioparahaemolyticusのF0F1-ATP合成酵素のデルタサブユニットと特異的な抗原抗体反応を起こし得るモノクローナル抗体。請求項1又は2に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞。受託番号FERMP-22157として寄託されたハイブリドーマ細胞。受託番号FERMP-22157として寄託されたハイブリドーマ細胞が産生するモノクローナル抗体。試料と請求項1、2、5の何れか1項に記載のモノクローナル抗体を接触させる工程を含む腸炎ビブリオの検出方法。試料をスポットして担体に吸着させる工程を含む請求項6に記載の腸炎ビブリオの検出方法。前記モノクローナル抗体は標識された抗体である請求項6又は7に記載の腸炎ビブリオの検出方法。試料と接触させた後の前記標識された抗体と、前記標識と反応して可視化できる試薬を接触させる工程をさらに含む請求項8に記載の腸炎ビブリオの検出方法。試料とモノクローナル抗体を接触させる前の工程として、試料に対して前処理を施す工程をさらに含む請求項6~9の何れか1項に記載の腸炎ビブリオの検出方法。前記前処理は、界面活性剤と接触させる工程である請求項11に記載の腸炎ビブリオの検出方法。食品を培養液に浸漬して培養する培養工程と、当該培養工程から腸炎ビブリオの選択培地上で培養する培養工程とを含み、前記選択培地で培養されたコロニーを試料とする請求項6~11の何れか1項に記載の腸炎ビブリオの検出方法。請求項1、2、5の何れか1項に記載のモノクローナル抗体を含む腸炎ビブリオの検出用試薬。前記モノクローナル抗体は、標識された抗体である請求項13に記載の腸炎ビブリオの検出用試薬。前記モノクローナル抗体は、ペルオキシダーゼ標識されたモノクローナル抗体である請求項14に記載の腸炎ビブリオの検出用試薬。前記モノクローナル抗体が基材に固定された請求項13~15の何れか1項に記載の腸炎ビブリオの検出用試薬。本発明は上記の背景技術に鑑みてなされたものであって、本発明の目的は、より簡便かつ迅速な腸炎ビブリオの検出同定方法を提供することにある。本発明の腸炎ビブリオの検出方法は、腸炎ビブリオのF0F1-ATP合成酵素のデルタサブユニットに対するモノクローナル抗体によって、試料中の腸炎ビブリオを検出する方法である。本発明によると、より簡便かつ短時間に腸炎ビブリオを検出同定できる。本発明の検出方法は、試料と腸炎ビブリオのF0F1-ATP合成酵素のデルタサブユニットに対するモノクローナル抗体以下抗F0F1モノクローナル抗体と称する場合がある。を接触させる工程を有する。抗F0F1モノクローナル抗体は、腸炎ビブリオのF0F1-ATP合成酵素のデルタサブユニット以下デルタサブユニット抗原と称する場合がある。に対して、特異的な抗原抗体反応を起こすモノクローナル抗体である。F0F1-ATP合成酵素は細胞膜に埋め込まれたF0部分と細胞質側にあるF1部分からなる酵素である。この酵素は、膜を介したプロトンの移動によって生じたエネルギーを用いて、ADPからATPを合成する機能を有し、プロトンの移動にはF0部分が関与し、ATP合成にはF1部分が関与する。F0部分はそれぞれ分子量の異なるa、b、cの3つのサブユニットで構成され、F1部分はそれぞれ分子量の異なるα、β、γ、δ、εの5つのサブユニットで構成されている。本発明で用いられる抗F0F1モノクローナル抗体は、このF0F1-ATP合成酵素のデルタサブユニットと特異的な抗原抗体反応を示す抗体であればよい。例えば、下記に示す寄託されたハイブリドーマ細胞によって生産されたモノクローナル抗体が本発明の腸炎ビブリオの検出同定方法に使用され得る。また、このモノクローナル抗体は、配列番号1で示されたアミノ酸配列からなるペプチドによって構成されるエピトープを認識する。従って、配列番号1で示されたアミノ酸配列からなるペプチドによって構成されるエピトープを認識して、F0F1-ATP合成酵素のデルタサブユニットと特異的な抗原抗体反応を生じるモノクローナル抗体も、発明の腸炎ビブリオの検出同定方法に使用され得る。本発明において検出とは、試料中における腸炎ビブリオの存在を確認することを意味し、検出方法とは試料中における腸炎ビブリオの存在を確認する方法を意味する。また、本発明において同定とは、前記検出に含まれる概念であって、分離培地上で分離培養された細菌が腸炎ビブリオであるかどうかを確定することを意味し、同定方法とは、前記検出方法に含まれる概念であって、分離培地上で分離培養された細菌が腸炎ビブリオであるかどうかを確定する方法を意味する。抗F0F1モノクローナル抗体は、腸炎ビブリオの菌体抽出物を免疫源として作製されたハイブリドーマから産生され得る。また、デルタサブユニット抗原を免疫源として作製されたハイブリドーマや配列番号1で示されたアミノ酸配列を有するペプチドを免疫源として作製されたハイブリドーマによっても産生され得る。免疫源として使用可能なペプチドは、配列番号1で示されたアミノ配列を含み抗原性を提示する10~20程度のアミノ酸からなるペプチドであり、化学合成により作製され得る。本発明のハイブリドーマは公知の方法に従って得られる。ハイブリドーマは、上記の腸炎ビブリオの菌体抽出物やペプチド等を免疫源として動物を免疫した後、抗体産生細胞とミエローマ細胞を細胞融合する工程、選択培地を用いた融合細胞の選択とクローン化を実施する工程、及び複数のクローン化された融合細胞から目的の抗F0F1モノクローナル抗体を産生するクローンを選択する工程で作製され得る。抗体産生細胞は、好ましくは脾臓細胞である。当該ハイブリドーマとして、実施例に記載の方法に従って得られたハイブリドーマMouseMousehybridomaVP34が例示される。このハイブリドーマは、2011年7月26日付けで日本国茨城県つくば市東1-1-1つくばセンター中央第6、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、受託番号FERMP-22157で寄託された。抗F0F1モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、例えば次の工程により選択される。融合した細胞の選択培養とクローン化を行った後、各クローンを培養用プレートの各ウェルで培養する。細胞が増殖した後ウェル中の培養液の上清の一部を採取し、デルタサブユニット抗原やエピトープを含むペプチド又は腸炎ビブリオ、その他の菌種に対する抗体価を酵素免疫測定法ELISAで測定し、腸炎ビブリオ特異的な抗体を産生するハイブリドーマを選び出す。選択されたハイブリドーマはinvitro又はinvivoで培養され、モノクローナル抗体の産生に用いられる。モノクローナル抗体の産生も公知の方法が用いられ得る。Invitroの場合、ハイブリドーマは、例えばFCS含有MEM培地やRPMI-1640培地などのハイブリドーマの培養に適した培地で培養される。モノクローナル抗体は、培養後の培養液の上清から分離精製される。invivoの場合、ハイブリドーマは、任意の動物に移植される。この動物は、細胞融合に用いられた抗体産生細胞を採取した動物と同一種の動物が好ましい。ハイブリドーマが、例えば、動物の腹腔内に移植されると、モノクローナル抗体を高濃度に含む腹水が腹腔内に蓄積する。モノクローナル抗体は、採取された腹水から分離精製される。分離精製も公知である任意の方法が採用される。例えば、培養液の上清又は腹水を遠心分離した後その上清を分取し、塩析や透析、限外濾過、カラムクロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィなどの各種分離手段により精製する方法がある。本発明の腸炎ビブリオ検出方法は、上記抗F0F1モノクローナル抗体と試料を接触させる工程を包含する。本発明において試料とは、腸炎ビブリオの存否を確認したい対象物を示すあらゆる意味で用いられる。具体的には、この試料は、検査対象物そのものであり、検査対象物を浸漬した液体であり、検査対象物を浸漬した培地を培養した液であり、腸炎ビブリオ用の選択寒天培地で培養して得られたコロニーから採取した菌体などであり得る。検査対象物の浸漬に用いられる液体は、精製水であり、生理食塩水などの食塩添加液であり、検査対象物に含まれる細菌のタンパクを抽出可能な界面活性剤を含む溶液であり、腸炎ビブリオ用の非選択培地であり、選択培地であり得る。検査対象物は特に制約を受けないが、ほとんどの場合は食品である。食品中の腸炎ビブリオが食品衛生上問題となるからである。抗F0F1モノクローナル抗体と接触させる試料はそれぞれ公知の方法により作製される。その一例として、適当量の検査対象物の食品をそのまま試料とする方法が例示される。また、他の例として、サンプリングした適当量の検査対象物を前記各種の液体に浸漬し、試料を作製する方法が例示される。さらに、他の例として、サンプリングした適当量の検査対象物を浸漬した培地で培養して、試料を作製する方法が例示される。この方法は前記増菌工程に相当する方法である。この方法は腸炎ビブリオの検出方法の一部として公知であり、アルカリペプトン液などの培地に接種し、約36°Cで一晩程度培養する方法が例示される。さらに、こうした増菌培養液を、腸炎ビブリオの選択寒天培地で培養して試料とする方法が例示される。この方法は前記分離工程に相当する方法である。この方法も腸炎ビブリオの検出方法の一部として公知であり、TCBS寒天培地やビブリオ寒天培地、クロモアガービブリオ寒天培地などの選択性の強い培地で培養する方法が例示される。また、検査対象物を濾紙やメンブレンなどの吸着媒体と接触させて腸炎ビブリオと疑われる菌体を吸着させる方法や吸着媒体を前記各種の液体、例えば非選択培地で培養した培養液に浸漬する方法なども例示される。本発明においては、腸炎ビブリオの検出を確実にする上で、分離工程において分離されたコロニー、すなわち、腸炎ビブリオの選択培地上で培養されたコロニーが試料として好適である。なお、上記のコロニーとは、腸炎ビブリオであると疑わしいコロニーを意味し、例えば、腸炎ビブリオの選択培地であるTCBS寒天培地上で形成された緑色のコロニーや、同クロモアガービブリオ寒天培地上で形成された紫色のコロニーである。従って、本発明の抗F0F1モノクローナル抗体に陽性を示すVnatriegensなど、明らかに腸炎ビブリオではないと判断されるコロニーは除かれる。Vnatriegensは、TCBS寒天培地上では黄色のコロニーを、クロモアガービブリオ寒天培地上では白色のコロニーを形成するので、目視にて腸炎ビブリオでないと判断できるからである。得られた試料は本発明の抗F0F1モノクローナル抗体と接触させ、抗原抗体反応を起こさせる。抗原抗体反応は、腸炎ビブリオに由来するデルタサブユニット抗原と抗F0F1モノクローナル抗体が接触すれば十分である。そこで、抗原抗体反応を起こさせる方法として、腸炎ビブリオが疑われるコロニーの菌体と抗F0F1モノクローナル抗体を直接接触させる方法、培養した培養液や菌体破砕液、菌体抽出液とモノクローナル抗体と接触させる方法が例示される。デルタサブユニット抗原は細胞質側に存在する細胞膜表在性タンパク質である。このことより、試料を抗F0F1モノクローナル抗体と接触させる前に、デルタサブユニット抗原を露出ないし可溶化する処理前処理をすることが望ましい。この処理を行うことにより、確実に抗原抗体反応を起こさせることができる。また、前処理は、抗原としての性質を失わせない処理方法が好ましい。前処理は、例えば腸炎ビブリオとの接触により、デルタサブユニット抗原を菌体から抽出または露出させることができる薬剤前処理剤との接触であり得る。前処理剤は、例えば、界面活性剤であり、有機溶媒であり得る。界面活性剤は、例えば、陰イオン系界面活性剤脂肪酸塩、アルファスルホ脂肪酸エステルナトリウムなど、陽イオン系界面活性剤アルキルトリメチルアンモニウム塩、ジアルキルジメチルアンモニウム塩など、両性イオン界面活性剤アルキルアミノ脂肪酸塩、アルキルベタイン、アルキルアミンオキシドなど、非イオン系界面活性剤ショ糖脂肪酸エステルソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミドなどであり得る。また、界面活性剤を有効成分とするタンパク質抽出剤でもあり得る。多くの種類のタンパク質抽出剤が市販されており、BPERBacterialProteinExtractionReagentPIERCERockfordIL、BPERIIBacterialProteinExtractionReagentPIERCE、BugBusterProteinExtractionReagentEMDChemicalsSanDiegoCAなどが例示される。界面活性剤は抗原の可溶化にも寄与するので、好ましい処理剤である。また、有機溶媒は、例えば、ホルマリンホルムアルデヒドの水溶液であり、メタノールエタノール,イソプロピルアルコールなどの低級アルコールであり得る。前処理剤の濃度や処理時間は前処理剤の種類に応じて適宜決定される。また、前処理剤との接触は、いかなる方法でもよく、例えば、適当な濃度となるように前処理剤を上記の試料に添加する方法が例示される。もちろん、このような前処理剤を用いることなく、超音波照射や凍結融解処理などの物理的方法により試料菌体を破壊した破砕物と抗F0F1モノクローナル抗体とを接触させて、抗原抗体反応を起こさせてもよい。試料と抗体の接触は、試料中に含まれるデルタサブユニット抗原と抗F0F1モノクローナル抗体が反応し得る環境下におくことを意味し、例えば、液体である試料と抗体を含む液体を混合する方法液液反応、固体である試料を、抗体を含む液体に投入する方法固液反応、液体である試料にビーズ等に固相化した抗体を投入する方法液固反応が例示される。抗F0F1モノクローナル抗体と試料の接触により生じる抗原抗体反応の検出には、公知の方法が利用できる。当該方法として、酵素免疫測定法EIAELISA、放射免疫測定法RIA、電気化学免疫測定法、免疫凝集法、イムノクロマトグラフィ法などが例示される。EIAELISA法には、直接法、間接法、サンドイッチ法、競合法などの測定方法が例示される。標識は、任意の標識が適宜選択される。例えば、酵素であり、補酵素であり、アポ酵素であり、蛍光物質であり、色素物質であり、発色物質であり、放射性物質であり得る。標識として、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ビオチン、フルオロセインイソチオシアネート、金コロイド、放射性ヨウ素I125などが例示される。公知である任意の方法、例えば、チオール基とマレイミド基の反応、アミノ基とアルデヒド基の反応等により抗体が標識される。これらの標識には市販の標識用キットが用いられ得る。酵素で標識された抗体を用いた場合、標識に用いた酵素の酵素反応により抗原抗体反応を検出する。例えば、ペルオキシダーゼによる標識抗体を用いた場合には、テトラメチルベンジジン3355Tetramethylbenzidine、アミノアンチピリン4Aminoantipyrine、フェニレンジアミン12Phenylenediamineなどの基質を反応させる。このようにして酵素反応等により生じた反応を検出して判定が下される。例えばテトラメチルベンジジンを基質に用いた場合であれば、青色の発色が観察されると、試料中に腸炎ビブリオの存在が確認されたことになる。また、標識物の検出に先立ち、必要に応じて、反応系に存在する夾雑成分が検出に対して好ましくない反応副反応を引き起こすことを排除する処理を行うのが望ましい。当該処理は、標識物に応じて適宜選択され、処理のための薬剤や反応条件薬剤濃度や処理時間などは適宜設定され得る。例えば、標識物がペルオキシダーゼである場合、菌体自身に含まれる内在性ペルオキシダーゼの失活処理であり得る。失活処理も公知の方法であり、例えば、過酸化水素水との接触であり得る。これらの処理を行わない場合には、腸炎ビブリオのデルタサブユニット抗原が存在しないのにも拘わらず陽性を示す場合偽陽性があるからである。抗原抗体反応には、ドットブロッティング法も好ましく用いられる。ドットブロッティング法は、濾紙やニトロセルロースメンブレンなどの担体に試料をスポットして担体に担持させた後に、担持した試料と抗F0F1モノクローナル抗体を接触させる方法である。この方法は操作が非常に簡便でもあるため、より好ましい方法と言える。ELISA法やドットブロッティング法のように抗原ないし抗体の固定化を行う抗原抗体反応の検出系においては、非特異的な反応が起こるのを抑制するためにいわゆるブロッキングを行うのが好ましい。ブロッキングは公知の方法であり、スキムミルク、BSAウシ血清アルブミン、界面活性剤など公知のブロッキング剤の1種若しくは2種以上が用いられる。ブロッキング剤の種類や濃度、時間などの処理条件は、適宜定められる。ブロッキングを行う時期や時間は適宜設定され、通常、ブロッキングは抗原抗体反応に先だって行われる。また、抗原抗体反応や当該反応の検出に際して、反応系に含まれる余剰の抗体やブロッキング剤などの夾雑成分を除去するために、界面活性剤を含む液による洗浄が行われる場合がある。洗浄も公知の方法であり、必要に応じて適宜選択される。従って、界面活性剤を含む液による洗浄操作が菌体の前処理を兼ね備える場合もあり得る。本発明に係る腸炎ビブリオの検出用試薬はハイブリドーマから単離された抗F0F1モノクローナル抗体を含む。当該試薬は抗F0F1モノクローナル抗体であり、抗F0F1モノクローナル抗体を含む組成物でもあり得る。組成物は抗F0F1モノクローナル抗体の他に、水などの担体、pH調整剤、緩衝剤、界面活性剤、ブロッキング剤などを含み得る。検出用試薬は液状であり固体でもあり得る。また、検査用試薬は、抗F0F1モノクローナル抗体がウェルに固定された測定用のプレートであり、抗F0F1モノクローナル抗体が固定された濾紙やメンブレンの担体であり、抗F0F1モノクローナル抗体が結合されたラテックス粒子や磁気ビーズでもあり得る。上記のように本発明に係るモノクローナル抗体を用いれば、存在が疑われる試料中の腸炎ビブリオを迅速に検出できる。また、分離培養された細菌が、腸炎ビブリオであることの同定確定を速やかに行うことができる。次に、本発明について下記の実施例に基づいてさらに詳細に述べるが、下記実施例はあくまでも例示であり、本発明は下記実施例に限られるものではない。腸炎ビブリオ特異的モノクローナル抗体抗F0F1モノクローナル抗体:MAb-VP34の作製1マウスの免疫免疫源には、患者糞便から分離された腸炎ビブリオV2409O3K6をB-PERIIバクテリアタンパク抽出試薬BPERIIBacterialProteinExtractionReagentを用いて処理したのち、遠心分離21900×g,10minして得られた上清を用いた。この上清のタンパク濃度を測定した後、90μgのタンパク量分をフロイントの完全アジュバント和光純薬株製と2:3の用量比で乳化させ、腹腔内投与してマウスを免疫した。4、7、10、13週後にフロイントの不完全アジュバントと上記免疫源を乳化したものをそれぞれ腹腔内に投与し、追加免疫を行った。14週間後に採血し、前記免疫源を用いたELISA法により各マウスの血清中の上記免疫源に対する抗体力価を測定した。最も高い抗体価を有していたマウスの腹腔内に、免疫開始20週後に上記免疫源のみ300μgを投与して最終免疫をおこなった。2ハイブリドーマの作製最終免疫の3日後にマウスの脾臓細胞を、P3X63Ag8U1ミエローマ細胞と融合し、得られた融合細胞からハイブリドーマを調製した。ハイブリドーマの作製方法は川津らの方法KawatsuKetal2008DevelopmentandevaluationofimmunochromatographicassayforsimpleandrapiddetectionofCampylobacterjejuniandCampylobactercoliinhumanstoolspecimensJClinMicrobiol4612261231に準じた。すなわち、細胞融合に次いで選択培養とクローン化を行い、各クローンの培養上清について上記免疫源を用いたELISA法によるスクリーニングを行い、陽性クローンを選択した。3ELISA法によるスクリーニング前記ハイブリドーマの陽性クローンについて、その培養上清を用いてELISA法により、腸炎ビブリオに特異的なモノクローナル抗体を産生する細胞のスクリーニングを行った。スクリーニングには、6株の腸炎ビブリオ4株の臨床分離株:O3K6,O4K68,O4K8,O1KUT及び2株の食品魚介類分離株:O12KUT,01KUTと、5株のその他ビブリオ属細菌VmimicusVvulnificusValginolyticusVcampbelliiVharveyiの培養液を抗原としてコーティングされたプレートが用いられた。ELISA法は次の方法に従った。ELISA法上記11株の腸炎ビブリオ属細菌をそれぞれ2mlの1の塩化ナトリウムを含むTSB培地BectonDickinsonandCompany社製に懸濁し、36°C又は28°Cで16時間静置培養した。培養液を50mMの重炭酸バッファーで10倍に希釈し、その50μlを、96ウェルのELISA用プレートGreinerBioOne社製のウェルに分注し、4°Cで一夜放置した。抗原液をプレートから除去した後、20FBSを含むPBSを用いて、室温で1時間ブロッキング反応を行った。ブロッキング液を除去した後、005の界面活性剤Tween20:商品名を含むPBSPBS-Tで3回洗浄した。次いで、20のFBSを含むPBS-Tで1:10に希釈したハイブリドーマの培養上清の50μlを前記ウェルに加え、室温で1時間反応させた。さらにPBS-Tでウェルを4回洗浄した後、50μlのペルオキシダーゼで標識された抗マウスIgG溶液IgGSigmaChemical社製20のFBSを含むPBS-Tで希釈した05μg/ml濃度の溶液をウェルに加え、室温で1時間反応させた。PBS-Tで5回洗浄後、酵素基質であるテトラメチルベンジジンを加えて10分間室温で反応させた。2Mの硫酸を加えて反応を停止し、吸光度の自動計測装置を用いて450nmにおける吸光度を計測した。吸光度が02を超えた場合に陽性であるとした。細胞融合の結果、3520株のハイブリドーマが得られた。得られたハイブリドーマをスクリーニングしたところ、腸炎ビブリオに対して特異性を示す抗体を産生する3株のハイブリドーマVP-22株,VP-34株,VP-39株を得た。これら3株のハイブリドーマの培養液上清は、前記腸炎ビブリオ6株全てに対して反応を示す一方で、前記その他ビブリオ属細菌5株に対しては反応を示さなかった。4腸炎ビブリオに対する特異性次に、スクリーニングにより選択されたハイブリドーマを再クローン化した後、拡大培養によって得られた培養上清から、モノクローナル抗体を精製した。ハイブリドーマからの抗体の取得及び抗体の精製も、前記川津らの方法に従った。また、特異性の検討には、140株の腸炎ビブリオ臨床検体より分離した89株、魚介類より分離した51株と、28種62株のその他ビブリオ属細菌と29種35株の非ビブリオ属細菌を用いた。用いた腸炎ビブリオ株は、1984年から2010年に分離され、血清型O抗原とK抗原の組み合わせで72の型に分類された。これらは、KimらによるtoxR-PCR法KimYBetal1999IdentificationofVibrioparahaemolyticusstrainsatthespecieslevelbyPCRtargetedtothetoxRgeneJClinMicrobiol3711731177により、腸炎ビブリオであることを確認した。腸炎ビブリオを除くビブリオ属細菌として、62株が用いられた。このうち22株は次に示す株であり、これらの株は分譲機関から分譲を受けた。Vibrioaestuarianus,NBRC15629TVibrioalginolyticusNBRC15630T,VibrioazureusNBRC104587T,NBRC15631T,VibriocomitansNBRC102076T,VibriodiazotrophicusNBRC103148T,VibrioezuraeNBRC102218T,VibriofischeriNBRC101058,VibriogazogenesNBRC103151T,VibriohalioticoliNBRC102217T,VibrioichthyoenteriNBRC15847T,VibrioinusitatusNBRC102082T,VibriomediterraneiNBRC15635T,VibrionatriegensNBRC15636T,VibrionereisNBRC15637T,VibrioorientalisNBRC15638T,VibriopenaeicidaNBRC15640T,VibrioproteolyticusNBRC13287T,VibriorarusNBRC102084T,VibriosplendidusNBRC101061,VibriotubiashiiNBRC15644TNITEBiologicalResourceCenteChibaJapan,VibrioharveyiRIMD2224001TResearchInstituteforMicrobiolDiseasesOsakaJapan。Tが付された株は標準株である以下同じ。残る40株のうち38株は患者及び食品から分離された株であり、2株は由来が不明である。これらは次のとおりである。1株のVibrioalginolyticus,8株のVibriocholerae,9株のVibriofluvialis,3株のVibriofurnissii,4株のVibrioharveyi,1株のVibriometschinikovii,5株のVibriomimicus,9株のVibriovulnificus。非ビブリオ属細菌として、次に示す35株が用いられた。29種を含む35株のうち、21株はInternationalculturecollectionから提供された。これらの株は次のとおりである。RaoultellaornithinolyticaATCC31898T,RaoultellaplanticolaATCC43176,RaoultellaterrigenaATCC33628T,ShewanellaalgaeATCC51192TAmericanTypeCultureCollectionManassasVAUSA,AeromonashydrophilaIAM1646,AeromonassobriaIAM12333,AlcaligenesfaecalisIAM12369T,EnterobactercloacaeIAM12349T,EnterobacterintermediusIAM14238T,ProteusvulgarisIAM12542T,PseudomonasaeruginosaIAM1514TInstituteofAppliedMicrobiologyCultureCollectionTokyoJapan,EnterobacteraerogenesJCM1235T,KlebsiellaoxytocaJCM1665TKlebsiellapneumoniaesubspozaenaeJCM1663T,MorganellamorganiiJCM1672TJapanCollectionofMicroorganismsSaitamaJapan,CitrobacterfreundiiNBRC12681T,CronobactersakazakiiNBRC102416T,KlebsiellapneumoniaesubsppneumoniaeNBRC14940T,ListonellaanguillarumNBRC13266T,ListonellapelagiaNBRC13287T,PhotbacteriumdamselaesubspdamselaeNBRC15633T。残る14株は次のとおりである。それぞれ1株のAeromonascaviae,Bacilluscereus,Citrobacterfreundii,Citrobacterkoseri,3株のEscherichiacoli,3株のGrimontiahollisae,1株のListeriamonocytogenes,2株のPlesiomonasshigelloides,1株のProvidenciaalcalifaciensである。上記安定した増殖性を示した3株のハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体について、腸炎ビブリオに対する特異性を調べたところ、そのうちの一つであるVP-34株が産生するモノクローナル抗体MAb-VP34が、表1に示すように140株の腸炎ビブリオに対して陽性反応を示し、Vnatriegensを除く56菌種96株のその他ビブリオ属細菌及び非ビブリオ属細菌に対しては陽性反応を示さなかった。上記の安定した増殖性及び腸炎ビブリオに対する特異性を備えた上記VP-34株MouseMousehybridomaVP34は、2011年7月26日付けで日本国茨城県つくば市東1-1-1つくばセンター中央第6、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、受託番号FERMP-22157で寄託された。モノクローナル抗体のタイピング、認識抗原の解析MAb-VP34のサブクラスのタイピングを前記川津らの方法に従って行った。その結果、MAb-VP34は、G1kのサブクラスに属していた。3株の腸炎ビブリオ臨床分離株;O3K6,O4K8,O1KUTと6株のその他ビブリオ属細菌VmimicusVvulnificusVcampbelliiVharveyiValginolyticusVcholeraeを、600nmにおける吸光度が06-07となるようにPBSに懸濁した。この懸濁液を遠心分離して沈殿した菌体をSDS-PAGE用のサンプルバッファーに懸濁した。得られた懸濁液をSDS-PAGEに供し、分離されたタンパク質をPVDFメンブレンフッ化ポリビリニデン膜:BioRadLaboratories社製に電気的にブロッティングした。この膜を15の過酸化水素を含むTBSで処理し、T-TBSで3回洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識したMAb-VP34をCanGetSignalSolution2登録商標:東洋紡社製に溶かした溶液005μg/mlと反応させ、抗原抗体反応を生じさせた。その後、テトラメチルベンジジン3355Tetramethylbenzidine商品名:1StepTMTMBBlottingPierceを基質に用いて抗原抗体反応を検出した。その結果を図1に示す。この結果から、MAb-VP34が認識する腸炎ビブリオの菌体抗原の分子量は約20kDaであることが明らかになった。一方、その他ビブリオ属細菌ではバンドは検出されなかった。次に、腸炎ビブリオの抗原をMAb-VP34を捕捉用抗体として用いたイムノアフィニティクロマトグラフィにより精製し、質量分析法によって解析した。抗原の精製において、まず、腸炎ビブリオV2409;O3K6の菌体抽出物をTBSに懸濁し、予めMAb-VP34をカップリングしたHiTrapNHSactivatedHPColumnsに流した後、TBSでカラムを洗浄した。次に、1SDSを含むTBSで結合タンパク質を溶出した。溶出した液をSDS-PAGEに供し、ウェスタンブロッティングを行い、溶出したタンパクのサイズ、およびMAb-VP34との反応性を確認した。質量分析法による抗原解析では、まず、CoomassieBrilliantBlue染色を行ったSDS-PAGEゲルBioSafeCBBG250stain、BioRadLaboratories社製より切り出された目的タンパク質のバンドを脱色し、Shevchenkoらの方法ShevchenkoAetal2006IngeldigestionformassspectrometriccharacterizationofproteinsandproteomesNatProtoc128562860に従って、ゲル内でトリプシン消化を行った。消化された試料についてnanoelectrosprayerGLサイエンス社製を備えたイオントラップ型質量分析計LC-ESIITTOFMS、島津製作所製を用いて質量分析を行った。この分析結果を基に、サーチエンジンMascotMSMSIonSearchengine:MatrixScience社を用いてNCBIデータベースを検索した。この結果、検出された8つのペプチドは、F0F1-ATP合成酵素のデルタサブユニットのアミノ酸全配列の61を占める部分に帰属した。データベースに記載されているF0F1-ATP合成酵素のデルタサブユニットの分子量は196kDaであり、上記抗原の分子量とほぼ同じであった。リコンビナント抗原に対する反応性の確認次に、MAb-VP34がF0F1-ATP合成酵素のデルタサブユニットを認識するかどうか、リコンビナントタンパク質を作製し、ウェスタンブロッティングにより確認した。腸炎ビブリオのF0F1-ATP合成酵素のデルタサブユニットの全遺伝子配列は、GenBankデータベースより取得されたaccessionnumber:BA0000031。当該タンパク質をコードする遺伝子を、腸炎ビブリオV2409のゲノムDNAを鋳型としてPCRにより増幅しこの際、配列番号2で示される塩基配列を有するプライマーForward側及び配列番号3で示される塩基配列を有するプライマーReverse側が用いられた。、TAクローニングキットChampionpETSUMOproteinexpressionsystem:Invitrogen社製を用いてベクターpET-SUMOに導入した。このベクターによりEscherichiacoliBL21DE3を形質転換し、1mMのIPTGIsopropylβD1thiogalactopyranosideによりリコンビナントタンパク質の発現を誘導した。このタンパク質はSDS-PAGEおよび、MAb-VP34を用いたウェスタンブロッティングに供された。この際、ネガティブコントロールには、pET-SUMO/CATベクターにより形質転換されたEscherichiacoliBL21DE3を用いた。その結果を図2に示す。この結果、リコンビナントタンパクを流したレーンでは、SUMOタンパクとリコンビナントF0F1-ATP合成酵素のデルタサブユニットの合計分子量である約33kDa付近にバンドが検出された。一方、ネガティブコントロールではバンドは検出されず、MAb-VP34はF0F1-ATP合成酵素のデルタサブユニットを抗原として認識することが結論づけられた。VP-Dot法次に、MAb-VP34を用いて、分離平板上のコロニーが腸炎ビブリオであるかどうかを判別するドットブロッティング法VP-Dot法を開発した。VP-Dot法は以下の方法に従った。TCBS寒天培地上に形成されたショ糖非分解性の1コロニーを、1μlループを用いてかきとり、20μlの50mMの重炭酸バッファーpH96に懸濁した。その1μlをニトロセルロース膜BioRadLaboratories社製上にスポットし、36°Cで5分間乾燥させた。以下の反応はすべて室温で行った。03の過酸化水素水と5分間反応させた後、蒸留水で20秒間洗浄した。その後、05のTween-20を含むトリス緩衝液TBSTで5分間洗浄した。この膜を、05μg/mlのペルオキシダーゼ標識されたMAb-VP34抗体を含むTBS溶液01のTween-20と20のFBSを含む中で5分間反応させた。TBSTで2分間洗浄する作業を4回行い、基質であるテトラメチルベンジジンと3分間反応させ、大量の水で反応を停止させた。サンプルをスポットした部位に明瞭な青色の呈色が認められた場合を陽性とした。VP-Dot法の精度の評価表2に示す菌株を用いて、VP-Dot法の精度をtoxR-PCR法の同定結果と比較することにより評価した。用いた20株の腸炎ビブリオと10株のその他ビブリオ属細菌並びに9種の未同定株は、Vcampbelliiを除いて、TCBS寒天培地上で36°Cで1晩培養された。Vcampbelliiは一般にTCBS寒天培地で成育するが、今回の実験で用いたVcampbelliiNBRC15631株はTCBS寒天培地では成育しなかったので、1NaClを含むTSA培地で培養した。9株の未同定株は、TCBS寒天培地上でコロニーを形成し、かつショ糖非分解性の菌である。また、MAb-VP34は、ペルオキシダーゼラベリングキット-SH同仁化学研究所社製を用いて予めペルオキシダーゼを標識した。toxR-PCR法では、山崎らの方法YamazakiWetal2008DevelopmentofaloopmediatedisothermalamplificationassayforsensitiveandrapiddetectionofVibrioparahaemolyticusBMCMicrobiol8163169に従って平板上のコロニーからDNAテンプレートを作製し、PCRは前記Kimらの方法に従った。それらの結果を表2及び図3に示す。この結果によると、VP-Dot法はすべての腸炎ビブリオ株に対して陽性を示した。また、toxR-PCR法による同定結果とVP-Dot法による同定結果はすべての株において一致した。なお、MAb-VP34は、Vnatriegensに対して交差反応を示したが、この菌はショ糖分解性であってTCBS寒天培地上では黄色のコロニーを形成する。このため、分離培養においてTCBS寒天培地では緑色のコロニーに対してVP-Dot法を適用することにより、腸炎ビブリオのみを確実に検出することができる。上記のVP-Dot法によるとコロニーの採取から約40分程度で腸炎ビブリオであるとの同定を行うことができた。モノクローナル抗体MAb-VP34のエピトープマッピングモノクローナル抗体MAb-VP34のエピトープマッピングを行った。まず、GenBankデータベースより取得された腸炎ビブリオのF0F1-ATP合成酵素のデルタサブユニットの完全遺伝子配列177個のアミノ酸、停止コドンを含む534bpを元にして、デルタサブユニットの上流側1~87番目のアミノ酸から構成されると下流側80~177番目のアミノ酸で構成されるに対応するリコンビナントタンパク質を作製し、上記VP-Dot法に準じて、抗原抗体反応を確認した。前記リコンビナント抗原に対する認識性の確認における方法と同様の方法でリコンビナントタンパク質を作製した。この際、上流側のタンパク発現用として配列番号2で示される塩基配列を有するプライマーForward側及び配列番号4で示される塩基配列を有するプライマーReverse側を、下流側のタンパク発現用として配列番号5で示される塩基配列を有するプライマーForward側及び配列番号3で示される塩基配列を有するプライマーReverse側を用いた。VP-Dot法には、リコンビナントタンパク質を発現した大腸菌をBPERIIBacterialProteinExtractionReagentPIERCEを用いてタンパクを可溶化して得た上清液を用いた。この結果、上流側のタンパクとの反応が認められたが、下流側のタンパクとの反応は認められなかった。ネガティブコントロールには、IPTG誘導前の大腸菌BL21DE3を用いた。そこで、デルタサブユニットの上流側アミノ酸配列から、オーバーラップするように3つのリコンビナントタンパク質A,B,CタンパクA:1~46番目のアミノ酸から構成される、タンパクB:46~87番目のアミノ酸から構成される、タンパクC:16~73番目のアミノ酸から構成されるを上記方法に準じて作製し、上記VP-Dot法に従って抗原抗体反応を確認した。この際、タンパクAの発現用として配列番号2で示される塩基配列を有するプライマーForward側及び配列番号6で示される塩基配列を有するプライマーReverse側を、タンパクBの発現用として配列番号7で示される塩基配列を有するプライマーForward側及び配列番号8で示される塩基配列を有するプライマーReverse側を、タンパクCの発現用として配列番号9で示される塩基配列を有するプライマーForward側及び配列番号4で示される塩基配列を有するプライマーReverse側を用いた。この結果、リコンビナントタンパク質B及びリコンビナントタンパク質Cについて抗原抗体反応がそれぞれ認められ、エピトープは46~73番目のアミノ酸配列に存在すると考えられた。デルタサブユニットの46~73番目のアミノ酸配列から表3に示す24種類のペプチドNo46~59及びNo47-1~47-9を合成し、各ペプチドについてVP-Dot法を適用した。その結果を表3に示した。なお、ペプチドの合成は、JPTPeptideTechnologiesGmbH社に依頼した。これにより、配列番号1で示されたアミノ酸配列ペプチドNo47-6が、MAb-VP34が認識するエピトープであると結論づけられた。したがって、このエピトープを認識し、腸炎ビブリオVibrioparahaemolyticusのF0F1-ATP合成酵素のデルタサブユニットと特異的な抗原抗体反応を生じるモノクローナル抗体を、腸炎ビブリオの検出又は同定に用いることもできる。"