"NIaプロテアーゼ変異体をコードする単離ポリペプチドであって、前記変異体が酸化に対して耐性を示し、且つ活性を保持する、単離ポリペプチド。前記NIaプロテアーゼ変異体における少なくとも1つのシステイン残基が置換される、請求項1に記載の単離ポリペプチド。前記少なくとも1つのシステイン残基が、セリン、バリン、又はアラニンに置換される、請求項2に記載の単離ポリペプチド。単離ポリペプチドであって、a.位置19のシステインがセリン又はバリンに置換されている、b.位置110のシステインがセリンに置換されている、c.位置151のシステインがセリン又はアラニンに置換されている、d.位置181のシステインがセリンに置換されている、及びe.位置211のシステインがセリンに置換されている、からなる群より選択される置換を有する配列番号1に示す配列を有するポリペプチドを含む、単離ポリペプチド。前記ポリペプチドが異種アミノ酸配列に融合する、請求項1又は4に記載の単離ポリペプチド。前記異種アミノ酸配列が、免疫グロブリン定常ドメイン若しくはその断片、リンカー、又はタグである、請求項5に記載の単離ポリペプチド。配列番号28に示される配列を有するポリペプチドを含む単離ポリペプチド。請求項4に記載のポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、単離ポリヌクレオチド。配列番号28に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、単離ポリヌクレオチド。配列番号42に示す配列を有するポリヌクレオチドを含む、単離ポリヌクレオチド。請求項4に記載のポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを含む、ベクター。配列番号42又は47に示す配列を有する単離ポリヌクレオチドを含む、ベクター。請求項11又は12に記載のベクターを含む、単離宿主細胞。ポリペプチドを発現させる方法であって、a.請求項11に記載の宿主細胞を提供する工程と;b.請求項4に記載の少なくとも1つのポリペプチドの発現に十分な条件下で前記宿主細胞を培養する工程と、を含む、方法。3C様プロテアーゼの使用に関する問題点は、活性部位及び/又は表面に露出しているシステインの酸化により非還元条件下において活性が低下することであり、そのために用途が制限されることであるHigakietal.,ColdSpringHarborSymposiaonQuantitativeBiology,615~621,1987。したがって、プロテアーゼは、その機能活性を維持するために還元剤を必要とするNunnetal.,J.Mol.Biol.350:145~55,2005;Birchetal.,ProteinExpressionandPurification6:609~18,1995。したがって、外因性の還元剤が存在しなくても活性を保持する改変された植物ウイルスプロテアーゼが必要とされている。本発明の1つの態様は、NIaプロテアーゼ変異体をコードする単離ポリペプチドであって、前記変異体が酸化に対して耐性を示し、かつ活性を保持する、単離ポリペプチドである。本発明の別の態様は、単離ポリペプチドであって、a.位置19のシステインがセリン又はバリンに置換されている、b.位置110のシステインがセリンに置換されている、c.位置151のシステインがセリン又はアラニンに置換されている、d.位置181のシステインがセリンに置換されている、及びe.位置211のシステインがセリンに置換されている、からなる群より選択されるアミノ酸置換を有する配列番号1に示す配列を有するポリペプチドを含む、単離ポリペプチドである。本発明の別の態様は、配列番号28に示される配列を有するポリペプチドを含む単離ポリペプチドである。本発明の別の態様は、本発明のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドである。本発明の別の態様は、本発明のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを含むベクターである。本発明の別の態様は、本発明のベクターを含む単離宿主細胞である。本発明の別の態様は、本発明のポリペプチドを発現させる方法である。特許及び特許出願を含み、それらには限定されない全ての刊行文献は、本明細書への参照により、完全に説明されているごとくに、本願に包含される。本明細書及び特許請求の範囲で使用されるとき、文脈で明確に指示されない限り、単数形a、and、及びtheは、複数形の言及を含む。したがって、例えば、ポリペプチドへの言及は1つ以上のポリペプチドへの言及であり、当業者に対して公知であるそれらの等価物を包含する。別段の規定がない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されている意味と同一の意味を有する。本明細書に記載されているのと類似の又は等価なあらゆる組成物及び方法を、本発明を実施又は試験するために使用することが可能であるが、代表的な組成物及び方法を本明細書に記載する。用語NIaプロテアーゼは、本明細書で使用するとき、GenBankアクセッション番号CAB58238に示されているウイルスプロタンパク質のアミノ酸2032~2264によりコードされているジャガイモウイルスAPVANIaプロテアーゼを指す。NIaプロテアーゼのポリペプチド配列を配列番号1に示す。本明細書で用いられる用語ポリペプチドは、ペプチド結合によって連結されてポリペプチドを形成する少なくとも2つのアミノ酸残基を含む分子を指す。アミノ酸が50個未満の低分子ポリペプチドは、ペプチドと呼ばれることもある。ポリペプチドはタンパク質と呼ばれることもある。用語ポリヌクレオチドは、本明細書で使用するとき、糖-リン酸骨格鎖又は他の等価な共有結合化学によって共有結合されたヌクレオチド鎖を含む分子を指す。二本鎖及び一本鎖のDNA及びRNAが、ポリヌクレオチドの典型的な例である。用語相補配列は、第1の単離ポリヌクレオチド配列と逆平行であり、第1のポリヌクレオチド配列におけるヌクレオチドに対して相補的なヌクレオチドを含む第2の単離ポリヌクレオチド配列を意味する。典型的には、このような相補配列は、適切な条件下で第1の単離ポリヌクレオチド配列と組み合わされたときに、二本鎖DNA又は二本鎖RNAのような二本鎖のポリヌクレオチド分子を形成することができる。用語変異体は、本明細書で使用するとき、レファレンス野性型ポリペプチド又はポリヌクレオチドとは異なり、本質的な特性を保持していても保持していなくてもよいポリペプチド又はポリヌクレオチドを指す。一般的に、野性型と変異体との配列の違いは、全体的には極めて類似しており、領域のほとんどは同一である。変異体は、例えば、ヌクレオチド又はアミノ酸の置換、挿入、又は欠失等の1以上の変更により、野性型配列と異なる場合がある。置換又は挿入により、保存的又は非保存的なアミノ酸置換、あるいは終止コドンの発生が生じる場合もある。ポリヌクレオチドの変異体は、天然に存在してもよく、野性型ポリヌクレオチドと70、75、80、85、90、95、96、97、98、又は99の同一性を有してもよい。活性、特異性、安定性、可溶性等を高める目的のために変異体ポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドの構造又は機能を変化させることが可能である。ロイシンをコードするコドンをイソロイシン又はバリンをコードするコドンに、アスパラギン酸をコードするコドンをグルタミン酸をコードするコドンに、トレオニンをコードするコドンをセリンをコードするコドンに置換すること、又は構造的に関連するアミノ酸をコードするコドンの同様の置換すなわち、保存的突然変異は、全てではないが、場合によっては、得られる分子の生物活性に大きな影響を与えない。保存的置換とは、化学的に関連する側鎖を共有するアミノ酸ファミリー内で起こる置換である。天然のアミノ酸は、その側鎖に基づいて、1酸性アスパラギン酸、グルタミン酸、2塩基性リジン、アルギニン、ヒスチジン、3非極性アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、及び4無電荷で極性グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシンの4つのファミリーに分けることができる。フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンは、芳香族アミノ酸として連帯的に分類される場合もある。あるいは、天然のアミノ酸は、1酸性アスパラギン酸、グルタミン酸、2塩基性リジン、アルギニン、ヒスチジン、3脂肪族グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニンセリン及びスレオニンは、所望により脂肪族ヒドロキシル基として別にグループ化される、4芳香族フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、5アミドアスパラギン、グルタミン、並びに6硫黄含有システイン及びメチオニンにグループ化することができるStryered.,Biochemistry,2nded,WHFreemanandCo.,1981。変異体ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド又はその断片のアミノ酸配列の変化により機能的ホモログを生じるかどうかは、本明細書に記載のアッセイを使用して、改変されたポリペプチド又は断片が非改変ポリペプチド又は断片と同様の反応を生じさせることができるかどうかを評価することにより容易に判定することができる。1つを超える置換が起こったペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を、同様のやり方で容易に試験することができる。用語野性型又はWTは、天然源から単離されたとき、そのポリペプチド又はポリヌクレオチドの特徴を有するポリペプチド又はポリヌクレオチドを指す。代表的な野性型ポリヌクレオチドは、集団内で最も高頻度でみられる遺伝子をコードするポリヌクレオチドであり、したがって、適宜正常又はレファレンス又は野性型形態と呼ばれる。用語活性又は活性であるは、本明細書で使用するとき、活性NIaプロテアーゼ、例えば、その基質を切断することができるNIaプロテアーゼを指す。代表的な基質は、例えば、表5及びMertisらMertisetal.,J.Gen.Virol.83:1211~1221,2002に記載されているSEVVLFQASS、SEAVYTQGS、又はSENVTFQGSSの同定されている認識配列に相当する合成ペプチドである。基質の部分的切断は、プロテアーゼの有効な生物活性にとって十分であり、例えば、基質の50、60、70、80、90、95、又は99である。したがって、生物活性は、基質の完全な切断を必要とするものではない。部分的に活性とは、その基質を部分的に切断するNIaプロテアーゼを指す。用語酸化に対して耐性又は酸化耐性は、本明細書で使用するとき、NIaプロテアーゼ変異体が活性であり、野性型NIaプロテアーゼの機能的安定性に必要な還元剤の非存在下で機能的に安定であることを意味する。野性型NIaプロテアーゼの活性に必要な還元剤は、典型的には0.1~10mMの範囲のジチオトレイトールDTT、2-メルカプトエタノール、又はトリスカルボキシエチルホスフェートTCEPであり得る。異種アミノ酸配列は、本明細書で使用するとき、自然界ではNIaプロテアーゼポリペプチドに融合しないアミノ酸配列を指す。異種アミノ酸配列は、標準的な方法を用いてNIaプロテアーゼポリペプチドのN末端又はC末端のいずれかに結合し得る。異種配列を用いて、ポリヒスチジン又はグルタミンS-トランスフェラーゼタグの結合等の融合タンパク質を精製するためのタグを提供することもでき、あるいは免疫グロブリン若しくはアルブミンの定常ドメイン又はこれらの断片の結合等のNIaプロテアーゼの半減期を延ばすこともできる。異種アミノ酸配列は、周知の方法を用いて、例えば、化学カップリング又はアミド結合を介してポリペプチドに融合させることができる。また、免疫グロブリンのヒンジ又はその断片、免疫グロブリンの可変領域の断片、あるいはリンカーをNIaプロテアーゼポリペプチドに融合させてもよい。用語ベクターは、生体系内で複製され得る、又はこうした系の間で移動可能である、ポリヌクレオチドを意味する。ベクターポリヌクレオチドは、典型的に、生体系においてこれらのポリヌクレオチドの複製又は維持を促進する機能を有する、複製起点、ポリアデニル化シグナル又は選択マーカーのような因子を含有する。このような生体系の例としては、細胞、ウイルス、細菌、動物、植物、及びベクターを複製することのできる生物学的成分を利用して再構成された生体系を挙げることができる。ベクターを含むポリヌクレオチドは、DNA又はRNA分子であってもよく、これらのハイブリッドであってよい。用語発現ベクターは、生体系又は再構成された生体系において、発現ベクター中に存在するポリヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドの翻訳を導くために利用することができるベクターを意味する。本発明は、酸化に対して耐性であるNIaプロテアーゼ変異体、該変異体をコードするポリヌクレオチド、これらポリヌクレオチドを含むベクター、単離宿主細胞、本発明のポリペプチドを発現させる方法、並びに本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドを用いる方法を提供する。本発明の変異体は、研究手段として有用であり、例えば、融合タンパク質を切断してタグを除去するために用いることができる。本発明の1つの実施形態は、NIaプロテアーゼ変異体をコードする単離ポリペプチドであって、該変異体が酸化に対して耐性を示し、その活性を保持する、単離ポリペプチドである。酸化条件では、すなわち、還元剤の非存在下では、野性型NIaは凝集し、不活性になる実施例1。別の実施形態では、酸化に対して耐性であり、その活性を保持しているNIaプロテアーゼ変異体は、少なくとも1つの置換されたシステイン残基を有する。他の変異体は、2、3、4、又は5つの置換されたシステイン残基を有し得る。配列番号1に示す野性型NIaプロテアーゼは、合計5つのシステイン:1つの活性部位は位置151のシステインであり、4つのシステインは位置19、110、181、及び211であり、これらは、結晶構造予測に基づいて、プロテアーゼの表面上に存在するので、酸化を受けやすい。代表的な置換は、セリン、バリン、又はアラニンへの置換である。代表的なNIaプロテアーゼの配列を表2に示す。本発明の変異体は、周知の方法、例えば、部位特異的又はランダム突然変異誘発Kunkel,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:488~492,1985;Weineretal.,Gene,151:119~123,1994;Ishiietal.,MethodsEnzymol.,293:53~71,1988、又は化学合成米国特許第6,670,127号、米国特許第6,521,427号により作製することができる。合理的設計を使用して、野性型プロテアーゼの構造又は活性に対して特定の効果を有することが期待される変異体を設計することができる。ポリペプチド又はその断片のアミノ酸配列の変化により機能的ホモログが生じるかどうかは、本明細書に記載のアッセイを使用して、変異体ポリペプチド又は断片が野性型ポリペプチド又は断片と同様の反応を生じさせることができるかを評価することにより容易に判定することができる。1つを超える置換が起こったペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を、同様のやり方で容易に試験することができる。プロテアーゼ活性を評価する代表的なアッセイは、タンパク質分解の際の4-4-ジメチルアミノフェニルアゾベンゾイルDABCYL-YGENVTFQGSK-5-[2-アミノエチルアミノ]ナフタレン-1-スルホン酸EDANS等のフルオロフォア/クエンチャー基質ペプチドにより放出される蛍光を測定するか、又はプロテアーゼ切断後のSDS-PAGEにおけるペプチド基質の切断を評価する。本発明のポリペプチドは、自動ペプチド合成機で固相ペプチド合成などの化学合成により生成してもよい。あるいは、本発明のポリペプチドは、網状赤血球溶解物に基づく発現系等の無細胞発現系の使用により、又は容易に単離される親和性標識ポリペプチドの組換え発現等の周知の技術による本発明の核酸配列を有する細胞からの発現及び単離により、これらポリペプチドをコードするポリヌクレオチドから得ることができる。本発明の別の実施形態は、単離ポリペプチドであって、a.位置19のシステインがセリン又はバリンに置換されている、b.位置110のシステインがセリンに置換されている、c.位置151のシステインがセリン又はアラニンに置換されている、d.位置181のシステインがセリンに置換されている、及びe.位置211のシステインがセリンに置換されている、からなる群から選択される置換を有する、配列番号1に示される配列を有する、ポリペプチドを含む、単離ポリペプチドである。本発明のポリペプチドは、異種ポリペプチドと融合した本発明のポリペプチドを含む融合ポリペプチドを含むことができる。このような異種ポリペプチドは、リーダー又は分泌シグナル配列、プレ-又はプロ-又はプレプロ-タンパク質配列、ヒスチジンタグHis-tagGentzetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:821-284,1989、HAペプチドタグWilsonetal.,Cell37:767~778,1984、グルタチオンS-トランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質GRF等の蛍光タグであってよい。代表的なNIaプロテアーゼ変異体-His-tag融合タンパク質は、配列番号37、38、又は39に示すアミノ酸配列を有する。1つの態様では、NIaプロテアーゼ変異体ポリペプチドは、免疫グロブリンの定常ドメイン又はその断片に融合する。このようなコンストラクトは周知であり、例えば、米国特許第5116964号、同第5709859号、同第6018026号;国際公開第04/002417号;同第04/002424号;同第05/081687号;及び同第05/032460号に記載されている。免疫グロブリンの定常ドメインは、CH1、CH2、若しくはCH3ドメイン、又はヒンジ領域であってよく、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、又はIgAに由来してよい。NIaプロテアーゼ変異体ポリペプチドは、リンカー、例えばグリシンリッチリンカーを介して、又は免疫グロブリン可変領域の断片を介して免疫グロブリンの定常ドメイン又はその断片に融合することができる。このようなリンカー及び可変領域の断片は、例えば、国際公開第08/011446号及び米国特許第5908626号に記載されている。代表的な融合タンパク質は、配列番号28に示されるアミノ酸配列を有するNIaプロテアーゼ変異体と、CH1、CH2、及びCH3ドメイン等の免疫グロブリンドメインに由来するか又は類似する1以上のドメインとを共にコンジュゲートさせることにより形成することができる。本発明の別の実施形態は、配列番号28に示す配列を有するポリペプチドを含む単離ポリペプチドである。別の実施形態では、本発明は、配列番号28に示す配列を有するポリペプチドを含む単離ポリペプチドを提供する。本発明のポリペプチドは、保存のために凍結乾燥することができ、使用前に好適なキャリアで再構成できる。代表的なキャリアは、リン酸緩衝生理食塩水である。この技術は、従来のタンパク質調製で有効であることが示されている。凍結乾燥及び再構成技術は、当該技術分野において周知であり、例えば、ReyandMay,DrugsandthePharmaceuticalSciencesVol.137,1999;Wang,Int.J.Pharm.203:1~60,2000を参照されたい。これら技術は、室温保存を含む長期間安定性の高いタンパク質製剤の開発、並びにより容易な地理的分布を可能にする。また、このプロセスは、再構成手順を調整することにより、タンパク質をより高濃度で用いることを可能にする。本発明の別の態様は、本発明のポリペプチド又はその相補体のいずれかをコードする単離ポリヌクレオチドである。特定の代表的なポリヌクレオチドを本明細書に開示するが、遺伝暗号の縮重及び所与の発現系におけるコドンの選択性を考慮して、本発明のNIaプロテアーゼ変異体をコードする他のポリヌクレオチドも本発明の範囲内に含まれる。代表的なポリヌクレオチドは、配列番号41~43及び46~48に示す核酸配列を含むポリヌクレオチドである。本発明のポリヌクレオチドは、自動ポリヌクレオチド合成機での固相ポリヌクレオチド合成のような化学合成により生成することができる。あるいは、本発明のポリヌクレオチドは、PCRに基づく複製、ベクターに基づく複製、又は制限酵素に基づくDNA操作技術などの他の技術によって生成することもできる。所与の公知の配列のポリヌクレオチドを生成する又は得るための技術は、当該技術分野において周知である。本発明のポリヌクレオチドはまた、転写されているが翻訳されていない配列、終結シグナル、リボソーム結合部位、mRNA安定化配列、イントロン、及びポリアデニル化シグナルなどの、少なくとも1つの非コード配列を含んでもよい。本発明の別の実施形態は、本発明のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを含むベクターである。本発明の別の実施形態は、配列番号42又は47に示す配列を有する単離ポリヌクレオチドを含むベクターである。本発明のベクターは、ポリヌクレオチドを維持し、ポリヌクレオチドを複製し、又は再構成された生体系を包含する生体系において本発明のベクターによりコードされたポリペプチドの発現を促進するために有用である。ベクターは、細菌プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入エレメント、酵母染色体エレメント、バキュロウイルス、SV40などのパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、家禽ジフテリアウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ピコロナウイルス及びレトロウイルスに由来するベクター、並びにコスミド及びファージミドなどのこれらの組み合わせに由来するベクターのような、染色体由来、エピソーム由来及びウイルス由来のものであってよい。本発明のベクターは、アジュバント、脂質、緩衝液又は特定用途に適当なその他の賦形剤とともに、微小粒子中に配合されることができる。本発明の1つの実施形態では、ベクターは発現ベクターである。発現ベクターは典型的に、このようなベクターによってコードされたポリペプチドの発現を制御、調節、惹起又は許容することができる核酸配列エレメントを含む。このようなエレメントは、転写エンハンサー結合部位、RNAポリメラーゼ開始部位、リボソーム結合部位、及び所与の発現系におけるコードされたポリペプチドの発現を促進する他の部位を含んでよい。このような発現系は、当該技術分野において周知の、細胞に基づく系、又は無細胞系であってよい。コードされたポリペプチドの発現に使用するのに好適な核酸配列エレメント及び親ベクター配列もまた、当該技術分野において周知である。本発明の他の実施形態は、本発明のベクターを含む単離宿主細胞である。代表的な宿主細胞の例としては、古細菌細胞;細菌細胞、例えば連鎖球菌、ブドウ球菌、腸球菌、大腸菌、ストレプトミセス、シアノバクテリア、枯草菌、及び黄色ブドウ球菌;真菌細胞、例えばクリベロマイセスKluveromyces、サッカロミセス、担子菌Basidomycete、カンジダアルビカンス、又はアスペルギルス;昆虫細胞、例えばドロソフィラS2及びスポドプテラSf9;動物細胞、例えばCHO、COS,HeLa、C127、3T3、BHK、293、CV-1、ボーズメラノーマBowesmelanoma、及び骨髄腫;並びに植物細胞、例えば裸子植物又は被子植物細胞が挙げられる。本発明の方法における宿主細胞は、個々の細胞として提供されても細胞群として提供されてもよい。ベクターなどのポリヌクレオチドの宿主細胞への導入は、当業者には周知の方法によって行うことができるDavisetal.,BasicMethodsinMolecularBiology,2nded.,AppletonLange,Norwalk,CT,1994;Sambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rded.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,2001。これらの方法としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディングscrapeloading、弾丸導入ballisticintroduction、及び感染が挙げられる。本発明の別の実施形態は、本発明の宿主細胞を提供する工程と、本発明の少なくとも1つのポリペプチドの発現に十分な条件下でこの宿主細胞を培養する工程とを含むポリペプチドの発現方法である。本発明のポリペプチドは、配列番号2~34及び37~39に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。宿主細胞は、所与の種類の宿主細胞を維持し又は増殖させるのに好適であり、ポリペプチドを発現させるために十分な、あらゆる条件下で培養され得る。ポリペプチドの発現に十分な培養条件、培地、及び関連する方法は、当該技術分野において周知である。例えば、多くの哺乳動物細胞種は、適切に緩衝されたDMEM培地を用いて37°Cにおいて好気的に培養することができ、一方、細菌、酵母及び他の細胞種は、LB培地中適切な雰囲気条件下で37°Cにて培養することができる。本発明の方法では、ポリペプチドの発現は、当該技術分野において周知の種々の異なる技術を用いて確認することができる。例えば、ポリペプチドの発現は、SDS-page、発現しているポリペプチドに特異的な抗体又は受容体リガンド等の検出試薬、あるいは例えばFACS又は免疫蛍光技術を用いて確認することができる。本発明の他の特徴は、本発明を説明するために与えられ、本発明を限定することを意図するものではない例示的実施形態に関する以下の記載において明らかになるであろう。実施例1NIa変異体の作製及び特性評価クローニング及び突然変異誘発親和性精製のためのN-末端ポリヒスチジンタグを含む、配列番号1に示されるジャガイモウイルスANIaプロテアーゼのアミノ酸配列Genbankアクセッション番号CAB58238、アミノ酸残基2032~2263を、コドン使用頻度を最適化したcDNA配列に逆翻訳した。配列をより小さな断片にしparsing、GENEWRITER商標技術を用いてオリゴヌクレオチドとしてこれらを合成し、RPHPLCDionex,Germanyにより精製することにより完全長cDNAを作製した。次いで、米国特許第6,670,127号及び同第6,521,427号に記載の通り、精製オリゴヌクレオチドを完全長の二本鎖cDNA断片に組み立てた。遺伝子組立プロセスにより得られたcDNAを、標準的なプロトコールを用いてpET9dベクターNovagen,Madison,WIのNcoI/XhoI部位にクローニングした。活性部位のシステイン及び表面のスルフィドリル変化を標的とする突然変異誘発を、表1に示すオリゴヌクレオチドを用いるQuikChange部位特異的突然変異誘発キットStratagene,LaJolla,CAを用いて行った。TEVNIaプロテアーゼのタンパク質配列のアラインメント及び解かれた結晶構造Allisonetal.,Virology154:9~20,1986;Phanetal.,J.Biol.Chem.277:50564~72,2002を用いて、NIaプロテアーゼにおける不対システイン残基が表面に露出しているかどうかを推定した。これらは全て表面に露出していると考えられたので、全てを点突然変異の標的とした。第1段階として、活性部位のシステインを除く全てをセリン残基に変化させた。位置19のシステイン残基は、タンパク質発現の欠損により示される通り、セリン置換を許容しなかった以下を参照されたい。結果として、位置19は、標準的なプロトコールを用いるQuikChange部位特異的突然変異誘発反応におけるNNKオリゴを用いてランダム化された。残基19の許容された置換を有する変異体を、タンパク質発現により同定した以下を参照されたい。C151S活性部位置換を上記の通りこれら変異体に導入して、触媒活性の差を評価した。作製された変異体及びそのアミノ酸配列を表2に示す。野性型NIa配列番号40及び以下のNIa変異体:C151S配列番号41、C19V/C110S/C181S/C211S配列番号42、C19V/C110S/C151S/C181S/C211S配列番号43、His6-WT配列番号44、WT-His6配列番号45、C151S-His6配列番号46、C19V/C110S/C181S/C211S-His6配列番号47、及びC19V/C110S/C151S/C181S/C211S-His6配列番号48について代表的なcDNA配列を示す。タンパク質発現表1のNIaプロテアーゼ変異体のcDNAをコードするプラスミドをBL21細胞に形質転換し、形質転換体からの単一コロニーを、37°Cで一晩100μg/mLのカナマイシンを含むLB培地中で培養した。培養物のOD600が0.6~0.8に達したとき、1mMのIPTGを用いて、又はTB自動誘導培地OvernightExpressAutoinductionMedia,EMDBiosciences,Gibbstown,NJ中で細胞を培養することにより誘導を行った。25°C又は18°Cで細胞を更に培養し、遠心分離し、-80°Cで保存した。野性型C19残基を有する全てのNIaプロテアーゼ変異体が、調べた全ての表面スルフヒドリル変化の組み合わせにおいて非常に良好に発現した表3。NNKライブラリについて、コンストラクトを上記の通りTB自動誘導培地中で可溶性タンパク質発現についてスクリーニングした。ウエスタンブロットを行って、NNK変異体の発現を分析した。位置19のNNK変異体のうちの幾つかは低レベルで検出可能であったが変異体I、K、L、M、R、S、T、W、Y、F、G及びH置換野性型NIaのうちの1~2、変異体C19Vは、任意の他の変異体よりも著しく高いレベル、及び野性型NIaと同等のレベルで発現した。この情報に基づいて、以下の変異体を更なる研究のために選択した:WT、C151S、C110S/C181S/C211S、C110S/C151S/C181S/C211S、C19V/C110S/C181S/C211S、及びC19V/C110S/C151S/C181S/C211S。タンパク質の精製還元剤である2mMのTCEPの存在下で、標準的な方法を用いてタンパク質の精製を行った。簡潔に述べると、0.1U/mLのベンゾアーゼ及び0.3mg/mLのリゾチームを添加したバッファA20mMtris-HCl,pH7.5,500mMNaCl,2mMTCEPに細胞ペレットを再懸濁させ、氷上で超音波処理し、濾過し、AKTAExplorer精製システムGELifesciences,Piscataway,NJを用いてバッファAで予め平衡化された5mLのHisTrapHPGEBiosciences,Piscataway,NJカラムに清澄化されたcleared溶解物をロードした。バッファA中50~500mMのイミダゾールのイミダゾール段階勾配を用いてタンパク質を溶出した。SDS-PAGEにより画分を分析し、対象タンパク質を含有する画分をプールし、濃縮し、濾過し、次いで、サイズ排除クロマトグラフィーSECにより更に精製した。濃縮及び精製されたサンプルを、バッファAで予め平衡化されたSuperdex75SECマトリクスGELifesciences,Piscataway,NJに直接ロードし、1mL/分の流速で均一濃度で分離した。SDS-PAGEにより画分を分析し、タンパク質を含有する画分をプールし、酵素活性について試験した。精製された変異体は全て良好に発現し、95を超える純度まで精製されていた。また、タンパク質の発現、安定性、及び活性に対する酸化環境の影響を評価するために、変異体の一部C151A、C19V/C110S/C181S/C211S、及びC19V/C110S/C151S/C181S/C211Sを還元剤である2mMのTCEPの非存在下で精製した。還元条件下でのみ、4つの遊離表面スルフヒドリルを有するC151A変異体は、主に単一の単量体種に崩壊する。しかし、全ての表面スルフヒドリルが変化したプロテアーゼは、還元剤の完全な非存在下で単量体タンパク質として挙動する。これは、これら変化が、触媒活性を保持しながら明らかな物理的効果を提供することを示唆する以下を参照されたい。基質及び活性の決定野性型認識配列EXVXXQXを用いて、PVAのポリタンパク質配列を探して、NIaプロテアーゼのコンセンサス認識配列を決定した。これは、PVAポリタンパク質内のプロセシング分岐点を同定する、公開されている研究Mertisetal.,J.GeneralVirol.,83:1211~1221,2002とは独立して行った。公開されている及び潜在的な認識配列、並びにこの研究で求められたコンセンサス配列を表4に列挙する。選択認識配列に相当する合成ペプチドを、固相ペプチド化学Anaspec,SanJose,CAを用いて合成し、野性型NIaプロテアーゼによる切断について試験した。5μMPVANIaプロテアーゼ及び500μMペプチドを含有する20mMtris-HCl、pH8.0、150mMNaCl、及び1mMジチオスレイトールDTT中で反応を実施し、逆相HPLC及びLC-MSにより分析した。また、NIaプロテアーゼのコンセンサス認識配列ENVTFQG配列番号65を含有する融合基質タンパク質を用いて、各変異体の酵素活性を求めた。コンセンサス配列を融合タンパク質に導入し、基質として用いて、全てのPVANIaプロテアーゼ変異体全ての酵素活性を評価した。配列はN-結合グリコシル化NVTのコンセンサス部位を含有していたので、同程度に成功する別の配列EAVTFQG配列番号66を探した。これら融合タンパク質は、精製を促進するためのN末端ポリヒスチジンタグ、PNIaプロテアーゼコンセンサス認識配列、タンパク質分解切断を高感度で検出するためのS-タグ、及び融合基質タンパク質の可溶性発現を促進するための可溶性の高いフィラータンパク質を含有していた。pET41Novagenのトロンビン切断部位の3’末端とXhoI部位との間の領域を増幅させ、5’プライマーに認識配列及びNdeIクローニング部位を付加し、pET28NovagenのNdeI及びXhoI制限部位に挿入することによりこのカセットを作製した。次いで、フィラータンパク質を、pET41から得られた複数のクローニング部位に挿入することができた。ENVTFQG及びEAVTFQGコンセンサス認識配列を含む融合タンパク質のポリペプチド配列を、それぞれ配列番号67及び68に示す。融合基質の対照として、TEVDoughertyetal.,Virology,171:356~364,1989及びTVMVNIaプロテアーゼ認識配列Nallamsettyetal.,ProteinExpr.andPurific.38:108~115,2004表4の両方を含む類似のコンストラクトを作製した。ヒトライノウイルス3CHRV3C認識配列と同様に、P2’プロリンを含む融合タンパク質もコンセンサス配列のために作製し、基質として試験した表4。上記、列挙されたTEV及びTVMVプロテアーゼについて公開されている認識配列を含む、全ての認識配列を融合基質タンパク質に挿入した。20mMTris-HCl、pH8.0、150mMNaCl及び1mMDTT中で反応を実施し、37°Cで一晩反応させた。3C様プロテアーゼの基質特異性は非常に高いことが示されているがTozeretal.,TheFEBSJ.272:514~523,2004、NIa野性型プロテアーゼは、TVMVNIaプロテアーゼ認識配列を含む融合基質を切断することができたが、PVANIaプロテアーゼコンセンサス配列よりもはるかに低い割合であった。しかし、NIa野性型プロテアーゼは、このフォーマットでP2’プロリン残基を含むTEVNIaプロテアーゼ認識配列、又はPVANIaプロテアーゼコンセンサス配列を切断することはできず、後者は、ある程度のレベルのP2’特異性を示唆する表4。野性型NIaプロテアーゼ及び変異体C151S、C110S/C181S/C211S、C110S/C151S/C181S/C211S、C19V/C110S/C181S/C211S及びC19V/C110S/C151S/C181S/C211Sを、ENVTFQGコンセンサス認識部位を含む融合基質タンパク質に対する活性についてスクリーニングした。反応条件は、上記と同一であった。基質のタンパク質分解切断をSDS-PAGEによりモニタした。活性部位にシステイン残基を含む各NIaプロテアーゼWT、C110S/C181S/C211S、C19V/C110S/C181S/C211Sは、これら条件下で完全に基質を切断した。また、野性型NIaと比較してデータは示されていない低効率ではあるが1~5の基質が切断された、NIaプロテアーゼ活性部位変異体C151S、C110S/C151S/C181S/C211S、C19V/C110S/C151S/C181S/C211Sも基質を切断した。酵素の反応速度野性型NIaプロテアーゼ及び活性部位及び表面システイン変異体を、フルオロフォア/クエンチャー基質ペプチド4-4-ジメチルアミノフェニルアゾベンゾイルDABCYL-YGENVTFQGSK-5-[2-アミノエチルアミノ]ナフタレン-1-スルホン酸EDANSAnaspec,SanJose,CAに対する活性について試験した。励起波長340nm及び発光波長490nmを用いてSpectramaxM2マイクロプレートリーダーMolecularDevicesにおいて反応速度測定を行った。2mMの酵素及び0.1~300μMの基質を含む50mMTris-HCl、pH8.0、150mMNaCl、1mMEDTA、1mMDTT中で反応を実施し、37°Cで30分間反応させた。計算された理論的吸光係数から酵素濃度を求めた。それぞれについて初期速度を求め、表5に示す。表面に露出しているシステイン残基の置換は、NIaプロテアーゼの触媒活性に対して大きな影響を与えなかったが、活性部位のシステイン残基C151における置換は、活性を著しく低下させた。これは、置換されたセリンが、活性部位内の微小環境において触媒に必要なヒドロキシルプロトンを供与できないことにより説明することができるが、システインの脱プロトン化は生理学的pHにおいて容易に生じる。しかし、精製プロセス中及び活性測定中に還元剤が存在するかどうかが活性部位のシステインを有する分子にのみ影響を与えるかどうかを判定するために、2つのPVANIaプロテアーゼ変異体C19V/C110S/C181S/C211S、及びC19V/C110S/C151S/C181S/C211Sを精製し、還元剤の非存在下でアッセイした。還元剤が存在しないことは、いずれの変異体の活性に対してもわずかな影響しか与えなかった表5。これは、これらタンパク質における活性部位のシステインが、酸化環境に対して過度に感受性ではない場合もあり、傾向は、主に非活性部位のシステイ残基によるものであることを示唆する。"