"目的の細胞へのリポソームのエンドサイトーシスにより調節されるシグナルを有する検出可能マーカーを含む、エンドサイトーシスの遠隔検出のためのリポソーム。前記検出可能マーカーが、常磁性金属キレートであるかまたはリポポリマーと結合した常磁性金属キレートである、請求項1に記載のリポソーム。前記検出可能マーカーが、ガドリニウムDTPA-BMA、ガドリニウムDTPAおよびガドリニウムHP-DO3Aからなる群から選択される、請求項2に記載のリポソーム。前記リポソームが低い水透過性の膜を含んでなる、請求項2に記載のリポソーム。前記検出可能マーカーが蛍光マーカーであり、前記リポソームが蛍光消光剤をさらに含む、請求項1に記載のリポソーム。前記検出可能マーカーが蛍光マーカーであり、そして自己消光濃度で存在する、請求項1に記載のリポソーム。細胞内在化可能リガンドをさらに含んでなる、請求項1に記載のリポソーム。該細胞内在化可能リガンドが抗体断片である、請求項7に記載のリポソーム。該リポソームが、末端に誘導体化されたPEG-ホスファチジルエタノールアミンリンカーと共有結合した抗体を含んでなる、請求項8に記載のリポソーム。前記検出可能マーカーがリポポリマーと結合している、請求項1に記載のリポソーム。前記リポソームがpH感受性リポポリマーを含んでなる、請求項1に記載のリポソーム。aエンドサイトーシスが起こり得る条件下で、細胞をそのシグナルが目的の細胞へのリポソームのエンドサイトーシスにより調節される検出可能マーカーを含むリポソームと接触させること、そしてbエンドサイトーシス後に検出可能マーカーのシグナルを検出することを含む、リポソームのエンドサイトーシスの遠隔検出のための方法。前記検出可能マーカーが、ガドリニウムDTPA-BMA、ガドリニウムDTPAおよびガドリニウムHP-DO3Aからなる群から選択される、請求項12に記載の方法。前記リポソームが低い水透過性の膜を含んでなる、請求項12に記載の方法。該検出工程が、MRI法によるプロトン緩和能の増強を含む、請求項12に記載の方法。前記検出可能マーカーが蛍光マーカーであり、前記リポソームが蛍光消光剤をさらに含む、請求項12に記載の方法。該検出工程が、レーザーイメージング法による増強された蛍光活性の検出を含む、請求項16に記載の方法。前記検出可能マーカーが蛍光マーカーであり、かつ自己消光濃度で存在する、請求項12に記載の方法。該検出工程が、レーザーイメージング法による増強された蛍光活性の検出を含む、請求項18に記載の方法。前記リポソームが細胞内在化可能リガンドを含んでなる、請求項12に記載の方法。前記検出可能マーカーがリポポリマーと結合している、請求項12に記載の方法。a遠隔検出可能マーカー;およびb治療薬を含む、リポソーム。該遠隔検出可能マーカーが、目的の細胞へのリポソームのエンドサイトーシスにより調節されるシグナルを有する検出可能マーカーである、請求項22に記載のリポソーム。前記遠隔検出可能マーカーがリポポリマーと結合している、請求項22に記載のリポソーム。該結合された検出可能マーカーが、ジステアロイルアミノ-PEG-Lys-Gd-DOTA4である、請求項24に記載のリポソーム。該治療薬が抗ガン剤である、請求項22に記載のリポソーム。該抗ガン剤がドキソルビシンである、請求項26に記載のリポソーム。該治療薬および該遠隔検出可能マーカーが一緒になって一対のイオン結合対である、請求項22に記載のリポソーム。該治療薬が陽イオンであり、該遠隔検出可能マーカーが陰イオンである、請求項28に記載のリポソーム。該治療薬が陰イオンであり、該遠隔検出可能マーカーが陽イオンである、請求項28に記載のリポソーム。細胞内在化可能リガンドをさらに含む、請求項22に記載のリポソーム。該細胞内在化可能リガンドが抗体断片である、請求項31に記載のリポソーム。該リポソームが、末端に誘導体化されたPEG-ホスファチジルエタノールアミンリンカーと共有結合した抗体断片を含んでなる、請求項32に記載のリポソーム。該抗体断片が抗HER2抗体断片であり、前記治療薬がドキソルビシンである、請求項32に記載のリポソーム。ai目的の細胞へのリポソームのエンドサイトーシスにより調節されるシグナルを有する遠隔検出可能マーカー、およびii治療薬を含むリポソームを投与すること、そしてb遠隔検出可能マーカーのシグナルを検出することを含む、患者の身体におけるリポソーム薬剤の非侵襲的なモニタリングのための方法。前記検出可能マーカーが、ガドリニウムDTPA-BMAおよびガドリニウムHP-DO3Aを含む常磁性ガドリニウムキレートである、請求項35に記載の方法。前記リポソームが低い水透過性の膜を含む、請求項36に記載の方法。該検出工程が、MRI法によるプロトン緩和能の増強を含む、請求項35に記載の方法。前記検出可能マーカーが蛍光マーカーであり、前記リポソームが蛍光消光剤をさらに含む、請求項35に記載の方法。該検出工程が、レーザーイメージング法による増強された蛍光活性の検出を含む、請求項39に記載の方法。前記検出可能マーカーが蛍光マーカーであり、かつ自己消光濃度で存在する、請求項35に記載の方法。該検出工程が、レーザーイメージング法による増強された蛍光活性の検出を含む、請求項41に記載の方法。前記リポソームが細胞内在化可能リガンドを含んでなる、請求項35に記載の方法。該治療薬および該遠隔検出可能マーカーが一緒になって一対のイオン結合対である、請求項35に記載の方法。該治療薬が陽イオンであり、該遠隔検出可能マーカーが陰イオンである、請求項44に記載の方法。該治療薬が陰イオンであり、該遠隔検出可能マーカーが陽イオンである、請求項44に記載の方法。該治療薬が抗ガン剤である、請求項35に記載の方法。該抗ガン剤がドキソルビシンである、請求項47に記載の方法。該遠隔検出可能マーカーがリポポリマーと結合している、請求項35に記載の方法。詳細な説明例えば、常磁性または超磁性MRIプローブなどの遠隔検出可能なプローブは、腫瘍細胞結合および内在化によりシグナル生成オンを可能とするように、非シグナリングオフ構造でリポソーム内部に封入され得る。内在化は、非特異的または特異的な受容体仲介エンドサイトーシスの結果であり得る。リガンド受容体認識および腫瘍細胞内在化に基づく標的プローブ送達は、ガン細胞の主要かつ機能的分子特性を検出するための強力な方法を提供する。これらの修飾は、表面結合放射性核種および内部封入MRI剤の両方を有する多機能の免疫リポソームリポーター内に容易に結合され得る。この免疫リポソームリポーターは免疫リポソーム薬剤と同じモジュール構造およびターゲティング技術に基づくため、その2つを、イメージング、処置、および処置モニタリングのための密接に統合された方法における使用のために共に開発することができる。本発明は、標的細胞における内在化および放出により遠隔シグナリングを可能とする診断リポソームを提供する。この方法は、例えば、患者の身体内の細胞における病理学的マーカーの存在に依存するエンドサイトーシスの遠隔検出を可能とし、その目的のために、エンドサイトーシスによって誘発される検出可能シグナルを有するリポソームを、リガンド依存性の細胞内送達のための標的と結合する。本方法は、非侵襲的な方法で身体の疾患状態を検出するのに有用である。本発明はまた、治療的および診断的有用性を合わせて有するリポソームを提供する。1つの好ましい態様にて、リポソームを治療薬と一緒に充填する。次に、前記リポソームを、リポソームと安定な結合となるようにリポポリマーが結合するのを可能とする条件下で、遠隔検出可能な官能基と結合したリポポリマーと接触させる。治療薬の一例は、細胞毒性の抗ガン剤または遺伝子であり、診断化合物は、ガドリニウムIIIなどの常磁性イオン、またはガリウム67もしくはインジウム111などの放射活性イオンと結合した脂質-ポリエチレングリコール-キレーター結合複合体などの遠隔検出可能なリポポリマー複合体である。故に、かかるリポソームの例は、非侵襲的な放射活性走査または磁気共鳴イメージングMRIにより患者の腫瘍への処置剤の送達を医者がモニタリングするのを可能とし、その結果、それぞれの患者のための治療法を最適化することができるであろう。好ましくは、遠隔検出特性を有する前記診断化合物、および治療化合物が、イオン的に結合する一対のメンバーであり、すなわち、一方が陰イオンであるとき、他方が陽イオンであり、またはその逆である。かかるイオン的に結合する対の1つのメンバーを、その後の活性ローディング法による第二のメンバーのローディングを補助し得る膜貫通イオンまたは電気化学勾配を生じるような方法で、まず初めにリポソームに充填する。例えば、MRI造影特性を有する遠隔検出化合物は、ジアンモニウムガドリニウムジエチレントリアミンペンタ酢酸NH42Gd-DTPAであり得る。リポソームに封入され、さらにリポソーム外媒体から除去されるとき、この化合物はまた、Gd-DTPAとイオン対を形成する陽イオン性抗ガン剤であるドキソルビシンの高効率事実上定量的共ローディングをもたらすアンモニウムイオン勾配を提供する。驚いたことに、この方法にて、高充填治療薬および高充填遠隔マーカーを有するリポソームを効率よく作製することができることが発見された。これらの二重に充填したリポソームを、自己報告self-reportingとして、遠隔検出可能な薬剤自体、またはリガンド特異的に病理細胞を標的とした組合せに用いることができる。細胞内在化に感受性を有する遠隔検出可能なプローブを封入するリポソーム上記のように、本発明の1つの局面は、目的の細胞へのリポソームのエンドサイトーシスにより調節されるシグナルを有する検出可能マーカーを含む、エンドサイトーシスの遠隔検出のためのリポソームである。好ましくは、前記検出可能マーカーは、常磁性金属キレートであるかまたはガドリニウムDTPA-BMA、ガドリニウムDTPA、またはガドリニウムHP-DO3Aなどのリポポリマーと結合した常磁性金属キレートである。前記リポソームは低い水透過性の膜を含み得、前記検出可能マーカーは蛍光マーカーであり得る。前記検出可能マーカーが蛍光マーカーであるとき、それは自己消光濃度で存在し得るかまたはリポソームが蛍光消光剤をさらに含む。好ましくは、前記リポソームは、pH感受性リポポリマーを含む。多数の研究により、蛍光プローブおよび治療薬の細胞内放出を増大するためのpH感受性または還元依存性リポソームの開発に至ったChuetalPharmRes7824-8341990DrummondetalBiophysJ64A721993DrummondetalBiophysJ72A131997DrummondetalProgressinLipidResearch39409-602000DauzgaunesetalBiochemistry243091-30981985DauzgaunesetalinMembraneFusionpp713-730MarcelDekkerIncNewYorkKirpotinetalFEBSLett388115-118、1996LerouxetalJControlledRel7271-842000MeyeretalFEBSLett42161-641998StraubingeretalFEBSLett。179、148-1541985ZignanietalBiophysActa1463383-3942000。これらの研究は、インビボにおける好ましい薬物動態学的特性を維持しながらの、細胞内放出についての重要な方法に関する手引きを提供する。これまでにpH感受性リポソームおよびエンドサイトーシス感受性リポソームの設計には、リポソーム表面の多数の修飾が必要とされ、結果として静脈内投与による急速な除去が起こり、故に利用可能性が制限されていた。しかしながら、本発明は、膜表面の大幅な修飾を必要とすることなく全体の薬剤をpHまたは酵素感受性にし、よってリポソーム担体がその好ましい薬物動態学的特性を維持することを可能とするためのいくつかの方法を提供する。本発明は、結果として造影剤、すなわち検出可能マーカーの漏出をもたらすか、もしくは水の透過性を単に増大するリポソーム膜自体の酵素感受性か、またはリポソームの内部で保護された消光剤の酵素またはpH感受性に依存する。これらの方法は、プローブが治療薬としてのいくつかの薬物動態学的特性を有することを可能とし、故にこの薬剤による処置の適切性が事実上予測される。コレステロールおよび高い相転移の脂質からなるGd3含有リポソームは、これらの膜を通過する水のゆっくりした拡散のために、Gd3の比較的低い緩和能を示す。しかしながら、コレステロールおよび低い相転移のリン脂質それらは理論的には37°Cで液晶相であるからなるリポソームは、高い緩和能およびMRIにより容易に検出可能なシグナルを示す。2つの調製物間のT1の差違は、約12倍であった。実際には、単一の生体内分布および腫瘍局在の目的に関して、これらのリポソームは、それらの増大したシグナル強度のために好適である。しかしながら、効率的に消光されるシグナルは、高い相転移のリポソームの場合、プローブがリポソーム担体から放出されるまで検出可能シグナルを囲うための特異な機会を提供する。図1を参照、これは、37°Cで一般的にゲル相であるリン脂質からなるリポソームはリポソーム膜を通過する水の比較的ゆっくりとした拡散を有し、結果として非常に低下した緩和能を生じ、故に効率よくGd3プローブを消光することを記載する。しかしながら、一般に、液晶相より液体状態であるリン脂質からなるリポソームは、リポソーム膜を通過する水の流速の著しい増加、およびそれ故の増強された緩和能を有する。本発明の1つの態様にて、このことは、受容体過剰発現ガン細胞およびエンドサイトーシスによるリガンド標的リポソームの認識に一致する。エンドサイトーシスにより、脂質膜はリソソーム中で分解され、効率的にマーカー、すなわち、MRIプローブを囲いから出し、結果として検出可能なシグナルのかなりの増加となり得る。実際には、リポソーム担体は、Gd3キレートが担体内から漏出し得る程度まで分解される必要はないが、膜を通過する水のより迅速な交換を可能とする程度まで分解される必要がある図2。故に、リポソームを結合し、かつ内在化する細胞のみが、この技術を用いて効果的にイメージングされ得る。多くの研究が、マクロファージ、繊維芽細胞、内皮細胞、および腫瘍細胞による内在化後の、脂質、および封入または結合タンパク質どちらかの両方の分解を証明しているStraubingeretal1983DijkstraetalExpCellRes150161-1761984JettetalCancerRes454810-48151985StormetalBiochimBiophysActa965136-1451988DerksenetalBiochimBiophysActa971127-1361988TrubetskayaetalFEBSLett228131-1341988ChuetalPharmRes7824-8341990。リポソームからのドキソルビシンの増大された放出は、腹腔マクロファージの取り込み後に見られ、集められた上清は、かなりの増殖阻害活性を有することが示されたStormetalBiochimBiophysActa965136-1451988。分解率はリポソームの脂質組成に依存して変化し、高い相転移リン脂質遅い放出を含むリポソームは、低い相転移リン脂質を含むリポソームよりもゆっくりと分解されたrapid-releaseStormetalBiochimBiophysActa965136-1451988。本発明のもう1つの態様は、pH感受性コポリマーで修飾された低下した透過性のリポソームを提供する。pH応答性コポリマーは、それらが、ほとんどすべての組成物のリポソームの製造に用いられ得るために、薬物動態学における修飾および内容物漏出の影響を低下させる点で、pH感受性リポソームを作製するための多くの他の方法よりも有利である。酸滴定の結果、ポリマー構造の修飾およびリポソーム膜とのその結合が起こり、結果としてその不安定化および内容物漏出をもたらす図5。N-イソプロピルアクリルアミドNIPAMおよびメチルアクリル酸MAAのコポリマーは、pH感受性コポリマーの一例として用いられている。これらのコポリマーは、オクタデシルアクリレートODAなどの疎水性アンカーを用いてリポソーム膜に固定され得る。これらのコポリマーであるポリNIPAMco-MAA-co-ODAの1つの例を、図4に示す。pH感受性コポリマーの他の例には、スクシニル化ポリグリシドール、ポリアクリル酸誘導体、およびポリヒスチジンが含まれる。酵素的に囲われた常磁性キレート本発明の他の態様にて、pHまたは酵素感受性遮蔽基を、キレート化イオンの常磁性特性を囲うために用いることができる。低いpH、またはリソソームもしくは後期エンドソームなどの細胞内オルガネラにある酵素への曝露による遮蔽基の細胞内への放出は、水分子の緩和能に変化をもたらすであろう。ミードMeadeと同僚は、最近、MRIを用いて非侵襲的にβ-ガラクトシダーゼ遺伝子の発現を検出するために用いられたβ-ガラクトシダーゼ感受性Gd3キレーターについて記載しているMoatsetalAngewChemIntlEdnEngl726-7281997LouieetalNatureBiotechnology18321-52000。この化合物において、ガラクトピラノース分子は、前記キレーターにGd3の最後の配位部位を水から遮蔽するように結合され、かつ配置され、故に3つまでの因子による緩和能を効果的に低下させる。ガラクトピラノース分子の加水分解は、この最後の配位部位の利用可能性および緩和能の増加をもたらす。グルクロニダーゼにより切断され得る同じシリーズの化合物が合成され、それらは緩和能に同じく効果があることが証明された。グルクロニダーゼは、リソソームおよびおそらく細胞の後期エンドソームに存在しDuttonGlucuronicacidfreeandcombinedAcademicPressNewYorkFishmanMetabolicconjugationandmetabolichydrolysisAcademicPress、NewYork、故に、エンドサイトーシスが起こったことを示す有効なトリガーとなり得る。それはまた、腫瘍から放出され;その後、腫瘍間質にあることが示された。しかしながら、細胞外に誘導されたグルクロニダーゼを利用するのではなく、リソソーム酵素を利用するリポソーム内部への結合キレーターの封入は、酵素がその基質に近づくために脂質バリアーの破壊を必要とするため、エンドサイトーシスによりシグナルを増幅するだろう。pHにより囲われた常磁性キレート最後に、陽電子放射断層撮影PET、電子常磁性共鳴EPRイメージング、およびMRIによる非侵襲的なイメージングのためのpH感受性プローブが、記載されているHelpernetalMagneticResonanceinMedicine5302-51987MorikawaetalInvestigativeRadiology29217-231994MehtaetalBioconjugateChemistry7536-401996KhramtsovetalCellularMolecularBiology461361-742000MikawaetalJournalofBiomedicalMaterialsResearch49390-52000WittetalBiomaterials21931-82000。水素イオンに対して半透性膜のリポソームへのこれらの薬剤の封入BiegeletalBiochemistry203474-34791981ClementetalBiochemistry201534-15381981は、インビボでのエンドサイトーシスの非侵襲的な検出を可能とするだろう。カルセインおよびピラニンを含むpH感受性蛍光プローブは、蛍光顕微鏡により定性的にかまたは蛍光比イメージングにより定量的にエンドサイトーシスを観察するために細胞培養にて従来から用いられているDalekeetaBiochimBiophysActa1024352-3661990StraubingeretalBiochemistry294929-49391990LeeetalBiochemistry32889-8991993KirpotinetalBiochemistry3666-751997。しかしながら、リポソームのエンドサイトーシスの非侵襲的なインビボモニタリングは、困難な問題を有している。本発明は、既述の酵素感受性リンカーと同様の方法でGd3-DTPAキレートを可逆的に囲うための、pH感受性シトラコニルcitraconyl-スキーム2、図7記載またはヒドラジドまたはリンカーを記載する。シトラコニルと結合した結合体の合成に関して、N-ブロモスクシンイミドを等モル量の無水シトラコン酸と合わせ、その後、四塩化炭素中の触媒量のベンゾイルペルオキシド反応開始剤を加えた。混合物を加熱台の上に移し、反応物を一晩還流し、2-無水ブロモシトラコン酸IIを形成させた。精製した産物を減圧蒸留後に回収し、最終収量が60であった。1,4,7,10-テトラシクロドデカン-1,4,7-トリス酢酸t-ブチルエステルIMacrocyclicsDallasTXを、精製した2-無水ブロモシトラコン酸IIで誘導体化し、中間体IIIを形成させることができた。その後、シトラコン酸の官能基を、取り込まれたグルコサミンおよびガドリニウムと反応させ、pH感受性Gd-DOTA造影剤IVを形成させ得る。リソソームまたは後期エンドソームに見られるような酸性条件下、シトラコン酸リンカーを分子内反応に付し、その結果消光剤グルコサミンおよび遊離Gd-DOTAキレートの放出を生じる。ガドリニウムのポリアミノポリカルボキシルキレートの非キレート基は、結合した水分子の交換可能性に実質的な影響を有しており、この現象をpH応答性のガドリニウムプローブの構築に用いることができることが示されているZhangetalInvestRadiol3682-862001。Gd-DOPA複合体のカルボキシル基と結合したポリオールガラクトースが、常磁性コアへの水の到達を阻害することにより緩和能を低下し、そしてこれらのポリオール基の除去によりGd-DOTA複合体の高い緩和能が回復することが示されているミードの基Louie、etal、NatureBiotechnology18、321-5、2000WillneretalBioconjChem4521-5271993は、中性pHで比較的安定であって、エンドソームおよびリソソームに一般的なpH5.0-5.5で分離するヒドラゾン結合を用いる生体結合体で示されている。生体分子のpH囲い込み法は、一般に証明されているDrummond2001。本発明は、エンドサイトーシス検出プローブその緩和能は、エンドソームおよび/またはリソソームの酸性環境にて不可逆的にかつ極めて増大するを作製するpHで囲われた常磁性キレートを提供する。そのため、DTPAモノ-およびビス-ヒドラジドを、無水エタノール中でDTPA環状無水物DTPA-caと1または2当量のヒドラジンを反応させることにより合成する。モノおよびポリ置換DOTAヒドラジドを、ジオキサン/ジメトキシエタン中DCCの存在下で調製したDOTAのNHS-エステルへのヒドラジンの作用により合成することができる。これらのヒドラジドキレーターを、常套的な方法でガドリニウムに結合させることができる。異なるカルボニル反応基を有するポリオール基を担持するカルボニルを、DMF中トリエチルアミンの存在下にてケト酸レブリン酸、アセト酢酸、またはピルビン酸のNHSエステルとアミノ糖グルコサミン、ガラクトサミンを反応させることにより調製することができる。囲われた結合体を、アルコール中、糖ケトアシルアミドのケト酸基とヒドラジドキレートのヒドラジド基間にヒドラゾン結合を形成することにより製造することができる。遮蔽方法は、非内在化リポソームからの基準シグナルを抑制するのに十分であり得る。しかしながら、シグナルの増加がpHまたは酵素感受性MRIプローブを含む非遮蔽リポソームを用いて2~4倍しか達成されないならば、この相違のみでは標的細胞における十分なシグナル調節をもたらすことはできない。とりわけ見込みがあると思われる方法は、上記の比較的不透過性のリポソームIL膜の内在化により誘発されるエンドソーム分解を伴う。本研究者らの初期の研究は、内在化対非内在化ILを区別するための実質的な能力を提供する本方法のシグナルの少なくとも20倍の増加を示唆する。この増加は、標的部位特異的に活性化されたイメージング剤を用いる他の方法で報告されるよりも数倍大きい。組合せた方法が、とりわけ強力であり得る:記載したリポソーム遮蔽方法を、同様に本質的に活性化可能な封入プローブと併用することができ、結果として可能性のある添加剤またはシグナル強度における相乗効果をもたらす。蛍光マーカーとは、本発明のリポソームに用いるために好適な遠隔検出可能マーカーのもう1つの群である。遠赤色光または光スペクトルの赤外領域に最大励起を有するマーカーが、当技術分野で公知の生体の赤外線レーザーイメージング系を用いることができる組織を通る励起および発光放射線のより深部への侵入のためにとりわけ好適である。インドカルボシアニン緑などのカルボシアニン色素血管イメージングおよび心血管診断に用いられる蛍光色素が、とりわけ好適である。2mM以上の濃度でリポソームに内包されるとき、これらの色素は、リポソームからの放出による蛍光の増大が驚くほど大きい。特定の作用機序に制約されることなく、この現象はリポソームに封入される色素の自己消光により理論的に説明され得る。目的の細胞によるエンドサイトーシスにより、かかるポソームは分解され、色素が放出され、そして細胞のかかる取り込みの存在を示す蛍光が経時的に増加する。細胞特異的イメージングおよび薬剤送達のための放射性核種またはMRI剤結合リポソームあるリガンドを取り込むための細胞の能力は、これらの細胞の病理学的性質を決定するのに役立ち、故に、疾患の診断および/または処置を改善するのに役立つ。本発明により、エンドサイトーシス感受性リポソームプローブを、ガン細胞に特異的なリガンドへの付着によりガン細胞などの特定の型の細胞に特異的で、かつ好ましくは、エンドサイトーシスも高効率で誘導するように作製する。細胞特異的リガンドおよびそれらの認識分子の種類は、当技術分野でよく知られている。1つの好ましい場合にて、かかるリガンドは、抗体および抗体断片である。抗体または抗体断片と結合したリポソームを、免疫リポソームと称す。効率的な結合方法は、比較的非反応性のリポソームを標的細胞内在化可能免疫リポソームに形質転換するために必須である。抗体および抗体断片などの標的基とリポソームの結合は、いかなる公知の方法または当技術分野で公知となる方法によっても達成され得る。例えば、前もって成形した薬剤を充填したリポソームに、抗体断片などのタンパク質の結合を2工程で行うミセル取り込み法が、既述[米国特許番号第6,210,707号それは、参照により本明細書に含まれる、およびKirpotinetal1999の図2cを参照のこと]である。本方法によれば、Fab’またはscFvなどの断片をまず、溶液中、末端に誘導体化されたPEG-ホスファチジルエタノールアミンリンカーと共有結合させ、ミセル形成免疫結合体を生じさせる。次に、前記結合体を、薬剤を充填したリポソーム中に共インキュベーションにより組み込み、PEG鎖の末端に共有結合したMAb断片を生じさせ、リポソーム表面にそれらの脂質基を介して固定した。本方法により産される抗HER2IL-ドキソルビシンは、結合、内在化、および前記の方法により産される抗HER2IL-ドキソルビシンに対するインビボ効果にて同等であって、ここでMAb断片は、官能基部位を含む特別に構築されたリポソームと結合されたParketalJControlRelease7495-1132001。同様のミセル挿入法を、ペプチドおよびオリゴ糖oligisaccharideなどのより小さな標的リガンドのリポソーム付着に適用することができるδ088126156226932323322119。36.5mg177μmol、10過剰量ジシクロヘキシルカルボジイミド99AldrichMilwaukeeWIを、無水CHCl3/エチレングリコールジメチルエーテル3:1に溶解した100mgのコハク酸ジオクタデシル161μmolおよび20.3mg177μmol、10過剰量N-ヒドロキシスクシンイミド97AldrichMilwaukeeWIに加えた。室温で12時間撹拌後、混合物は、白色沈殿ジシクロヘキシル尿素DCUを含む無色の溶液を形成した。反応混合物を、368mg242μmol、50過剰量のビス3-アミノプロピル末端ポリエチレングリコールAldrichMilwaukeeWIを含む無水CHCl3/エチレングリコールジメチルエーテル3:1溶液に直接フィルター処理して加えた。12時間撹拌後、溶媒をロータリーエバポレーションにより除去した。得られた物質を3mlの水に溶解し、100mlセファデックスG75カラムでクロマトグラフィーし、そして4mlの画分で集めた。TLCにより決定した画分を含む試料を合わせ、そして溶媒を真空下で除去し、82.5mgの白色薄片産物アミノポリエチレングリコールジオクタデシルアミンを得た。23.9mgの1,4,7,10-テトラアザシクロドデカノン-1,4,7-トリス酢酸-t-ブチルエステル-10-酢酸モノN-ヒドロキシスクシンイミジルエステル47.6μmol、20過剰量および443μmolのトリエチルアミンを、無水DMF中82.5mgのアミノポリエチレングリコールジオクタデシルアミンに加えた。12時間室温で撹拌後、溶媒を真空下で除去し、淡褐色のケイクを得た。4mlの水を固形のケイクに加え、NaOHでpH7に滴定し、45°Cで10分間加熱した。溶液を遠心10,000RPMで5分間により分け、淡黄色の上清を100mlセファデックスG75カラムでクロマトグラフィーし、4mlの画分を集めた。TLCを、産物を含む画分を決定するために用い、それらを合わせ、溶媒を真空下で除去し、29.9mgの白色の薄片状の物質として得た。産物の純度を、TLCを用いて確認した。クロマトグラフィー条件:CHCl3/MeOH4:1移動相、Rf=0.91を用いたC-18逆相シリカ。産物は、完全な1級アミン官能基を示すフルオレサミン色素に負の応答を示した。実施例5コレステロールヘミスクシナチルhemisuccinatyl-ポリエチレングリコールの合成図12100mg205μmolのコレステロールヘミコハク酸塩CHEMSSigmaStLouisMOを、CHCl3/エチレングリコールジメチルエーテル3:1に溶解し、そこへ26mgの226μmol、10過剰量N-ヒドロキシスクシンイミド97AldrichNHSおよび46.5mgの226μmol、10過剰量ジシクロヘキシルカルボジイミド99AldrichDCCを加え、室温で6時間撹拌し、白色沈殿を含む無色の溶液を得た。反応混合物を、468mg307μmol、50過剰量のビス3-アミノプロピル末端ポリエチレングリコールAldrichを含むCHCl3/エチレングリコールジメチルエーテル3:1溶液に直接フィルター処理し、室温で12時間撹拌した。溶媒をロータリーエバポレーター処理で除去し、淡黄色のケイクを得た。産物をさらなる精製なしにTLCで確認した。クロマトグラフィー条件:順相のシリカおよびCHCl3/MeOH4:1からなる移動相を用いた、産物Rf=0.59。アミノ-ポリエチレングリコール-コレステロールを、1,4,7,10-テトラアザシクロドデカノン-1,4,7-トリス酢酸-t-ブチルエステル-10-酢酸モノN-ヒドロキシスクシニミジルエステルで修飾し、DOTA-PEG-Chol誘導体を得る。その後、ガドリニウムを、pH7-8にて一晩95°Cで酸化ガドリニウムと一緒に合わせてインキュベートすることによりキレートに挿入する。その後、遊離ガドリニウムをセファデックスG-75カラムで除去した。実施例61,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノール-N-アミノグルタル酸の合成図131,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミンDSPEを、Sygenaから購入した。グルタル酸無水物97およびトリエチルアミン99.5をAldrichから購入した。すべての試薬をさらなる精製なしに用いた。3倍モル過剰量のグルタル酸無水物465mg、4.08mmolおよび4倍モル過剰量のトリエチルアミン5.44mmolを無水クロロホルム中DSPE1.02g、1.36mmolに加え、得られた混合物をアルゴン下で室温にて12時間撹拌した。反応混合物を0.1酢酸2および水2で洗浄し、pH9NaHCO3CHCl3画分を、ヘキサン/酢酸エチル2:1を用いてシリカカラムでクロマトグラフした。溶媒を真空下で除去し、白色ケイクを得た460mg、理論値の39.3。産物の純度を、TLCおよび1H-NMRにより確認した。産物は、完全な1級アミン官能基を示すフルオレサミン色素に負の応答を示した。分析データ:TLC移動相ヘキサン/酢酸エチル2:1Rf=0.45、1H-NMRδ0883126161195230337416438523。Glu-DSPE誘導体は、NHS/DCCで活性化され得、ビス3-アミノプロピル末端ポリエチレングリコールAldrichMilwaukeeWIで修飾され得る。アミノ-ポリエチレングリコール-DSPEは、1,4,7,10-テトラアザシクロドデカノン-1,4,7-トリス酢酸-t-ブチルエステル-10-酢酸モノN-ヒドロキシスクシンイミジルエステルで修飾され得、DOTA-PEG-DSPE誘導体を得る。その後、ガドリニウムを、ガドリニウムオキシドと一緒に合わせて95°Cで一晩pH7-8にてインキュベートすることによりキレートに挿入した。その後、遊離ガドリニウムをセファデックスG-75カラムで除去した。実施例7O-グルタリール-ジオクタデシルグリセロールグルタリール-DOGの合成図141,2-O-ジオクタデシル-sn-グリセロール99をBACHEMKingofPrussia,PAから購入した。グルタル酸無水物97および4-ジメチルアミノピリジン99を、AldrichMilwaukeeWIから購入した。すべての試薬をさらなる精製なしに用いた。2倍モル過剰量のグルタル酸無水物76.4mg、0.76mmolおよび4-ジメチルアミノピリジン81.8mg、0.76mmolを、無水クロロホルム中1,2-O-ジオクタデシル-sn-グリセロール0.2g、0.335mmolに加え、得られた混合物を室温で12時間アルゴン下にて撹拌した。溶媒をロータリーエバポレーター処理で除去し、産物を、シリカカラムにてヘキサン/酢酸エチル2:1で溶出することにより精製した。産物を含む画分を合わせ、溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、115mg0.162mmol、理論値の48.4のO-グルタリール-ジオクタデシルグリセロールを得た。産物の純度を、TLCおよび1H-NMRにより確認した。分析データ:TLC移動相ヘキサン/酢酸エチル2:1Rf=0.45、1H-NMRδ0866126155195240347357364-O410423739。Glu-DOG誘導体を、NHS/DCCで活性化し、ビス3-アミノプロピル末端ポリエチレングリコールAldrichMilwaukeeWIで修飾することができる。アミノ-ポリエチレングリコール-DOGを、1,4,7,10-テトラアザシクロドデカノン-1,4,7-トリス酢酸-t-ブチルエステル-10-酢酸モノN-ヒドロキシスクシンイミジルエステルで修飾し、DOTA-PEG-DOG誘導体を与えることができる。その後、ガドリニウムを、pH7-8にて95°Cで一晩ガドリニウムオキシドと一緒にインキュベートすることによりキレートに挿入することができる。その後、遊離ガドリニウムをセファデックスG-75カラムで除去する。実施例8イメージング能を有する治療リポソーム:免疫リポソームへのイメージング剤および治療薬の共封入リポソームをエタノール注入により形成させ、その後0.1μmポリカーボネートフィルターを通して繰り返し成形した。簡単には、乾燥させた脂質DSPC/Chol/PEG-DSPE、3:2:0.015、mol:mol:molを、60°Cで加熱しながら0.5mlのエタノールに溶解した。ジエチレントリアミンペント酢酸、ガドリニウムIIIGd-DTPAおよびクエン酸アンモニウム鉄IIIをAldrichMilwaukeeWIから購入した。Gd-DTPAのジアンモニウム塩を、Gd-DTPA水溶液を水酸化アンモニウムで滴定することにより形成させた。リポソームを、500mMジアンモニウム-ジ-Gd-DTPAまたは250mMクエン酸アンモニウム鉄IIIの存在下で水和し、当技術分野で公知のイオン勾配遠隔ローディング法を用いてローディングしたLasicetal1992Haranetal1993。しかしながら、我々の知識では、これはGdIIIまたはFeIIIキレーターおよび薬剤トラップ剤の二役でキレート化剤を用いる最初の例であり、本方法の使用は、薬剤およびイメージング剤の両方をインビボ治療およびその同時モニタリングのために必要な濃度で効率よく封入することを可能にする。500mMアンモニウム-Gd-DTPAまたは250mMクエン酸アンモニウム鉄III溶液4.5mlを60°Cまで加熱し、その後、エタノール性の脂質溶液0.5ml、300μmolPLに速やかに注入し、水和した脂質溶液を形成させた。その後、エタノールをロータリーエバポレーターで除去し、脂質懸濁液を、2枚重ねのポリカーボネートフィルター0.1μmを15回通して押し出し成形した。成形後に、非封入アンモニウム-Gd-DTPAまたはクエン酸アンモニウム鉄IIIを、Hepes緩衝食塩水pH6.5で溶出したセファデックスG-75カラムで除去した。その後、リン脂質PL含有量をリン酸塩分析Bartlett1959により決定し、ドキソルビンを1μmolPLに対して150μgの薬剤の割合で加えた。薬剤を、薬剤とリポソームを60°Cで30分間インキュベートすることにより充填し、その後15分間氷上で反応をクエンチした。非封入薬剤を、第二のセファデックスG-75ゲルろ過カラムで除去し、またHepes緩衝食塩水、pH6.5で溶出した。精製したリポソーム試料中の薬剤の量を、酸イソプロパノール90イソプロパノール、101NHCl中に薬剤を充填したリポソームを溶解後、吸光測定λex=490nm、λem=550nmにて鉄IIIの干渉による蛍光により定量し、そしてリン脂質含有量を標準的なリン酸塩分析Bartlett1959により決定した。薬剤充填効率を、1μmolのリン脂質に対して1μgの薬剤を発現する絶対量、および加えた初期量の薬剤と比較して充填された1の薬剤を発現する相対量を両方とも測定した。ドキソルビシンのローディング効率は、1μmolのリン脂質に対して150μgの薬剤を最初に加えたとき、92-100の範囲であった。リポソームサイズを光子相関分光法により決定し、それは105-120nmの範囲であった。以下のドキソルビシン封入効率を得た:その後、これらのリポソームを、可溶化による緩和能の変化、または薬剤およびイメージング剤の両方の完全な放出を決定するためにNMRにより特徴付けた。磁性GdまたはFeIIIが薬剤沈殿を起こした場合、これはDSPC/Cholリポソームの低下した水透過性の影響によると見られるよりもさらに大きな程度で緩和能に作用し得るという仮説をたてた。しかしながら、以下の表に見られるように、無傷intリポソームと可溶化solリポソームのτ1緩和能ΔR1の割合、ΔR1sol/ΔR1intは、薬剤を充填していないリポソームLs-Gd-HP-DO3Aについて上記で観察されるのと同様であった。故に、前記リポソームは、1個の抗ガン剤の高封入と遠隔エンドサイトーシス検出特性を兼ね備えている。実施例9GdDTPA-BMA封入抗-HER2免疫リポソームの改善されたMR検出能および腫瘍MRシグナル強度の変化を標的とした抗体の貢献度の検出本研究の目的alsは、MR腫瘍シグナル強度SIのより大きな増加を達成するために抗HER2免疫リポソーム組成物を修飾すること、腫瘍シグナル強度を増すために抗HER2標的の貢献度を測定すること、およびシグナル強度と測定されたT1の変化の関係を決定することである。腫瘍SIのかなりの増加が、従前の剤形と比較して新規のリポソームリン脂質組成物にて観察されたが、しかしながらリポソーム直径の減少は、腫瘍SIに大きな影響は与えなかった。標的の付加は、非標的リポソームと比較して腫瘍SIで増加するという結果となった。シグナル強度は、測定されたT1と相関することが発見された。ハーセプチンおよび抗HER2免疫リポソームなどの腫瘍標的治療剤は、ガンの選択的処置に重要な役割を果たす可能性を有する。標的剤の分布を非侵襲的に測定する能力は、新規の標的治療剤の開発および評価を助長し得る。現在の研究にて、腫瘍の透過性ILのMR検出能/可視度を改善する方法が検討されており、リポソーム注入後に見られた腫瘍SIの増大への抗体標的化の貢献を評価するために不透過性リポソームを利用する。本研究にて、直径80nmおよび50nmの新規の組成物の透過性PGdDTPA-BMA封入抗HER2免疫リポソームILを、ヒト乳ガンのマウスモデルにおける標的ILおよび非標的NTL水-不透過性IMPリポソームの両方で測定し比較した。GdDTPA-BMA封入リポソームの4つの型を合成した:透過性DOPC/Chol/PEG-DPSE3:1:1抗HER2標的免疫リポソームILの2つのサイズ平均直径80および50nm、および不透過性DSPC/DPPC/Chol/PEG-DPSE2.2:0.3:2:0.3リポソームILおよび非標的、平均直径~75nm。ILは、viaおよびF5scFv抗体を標的とした。ヌードマウスに、HER2/neuを過剰に発現するヒト乳ガン系BT474を移植した。腫瘍の容量を合わせ、マウスを2匹1組で、Gd-リポソーム組成物0.05mmolGdDTPA-BMA/kgの1種を静脈内注射前および注射後156時間までイメージングした。イメージングの間、マウスを1.5イソフルランで麻酔した。イメージングを常套的な腕輪および特注の動物ホルダーを用いて1.5TGESignaスキャナGeneralElectricMedicalSystems、Milwaukee、WIで行った。高い解像度の冠状3DFGREイメージがそれぞれの時間点で得られTR/TE17/4.2ms、FOV8cm、マトリックス512×256、4NEX、T1もまた、3D可変フリップ角高速勾配エコー技術を用いて測定した。シグナル強度を、全腫瘍容量および血中に及ぶ目的の領域ROISについて測定した。T1もまた、腫瘍ROIについて測定した。MR腫瘍容量は、3Dイメージの連続した薄片で腫瘍を描くことにより測定される。結果:POPCのDOPCへの置換は、POPC剤形で24時間にて見られる8の増加と比較して、24時間で31n=5の平均腫瘍SI変化という著しい増加を生じた。80から50nmへのリポソーム直径の減少は、24時間で腫瘍SIの大きな相違を生じなかった31対28。IMP-lLおよびIMP-NTLn=4は共に、透過性lLの血中SI245と比較して注射後5分で同じくらい増加した平均115。IMP-NTL12と比較したIMP-IL17の24時間での腫瘍SIの平均の変化の相違は、有意であるp=0.05。考察:改善された増加が、POPCよりも水透過性であるDOPC層を有するリポソーム組成物に見られる腫瘍シグナル強度で発見された。50nmP-ILおよび80nmP-ILが腫瘍イメージングに関して等しく有効であった事実は、70-80nmがリポソームのGd封入、緩解および生体内分布特性に関与する、イメージングの最適サイズであることを示し得る。P-ILからのシグナル強度の変化は、DOPCと比較して、水に対するDSPCリン脂質二重層の低下した透過性によると予期され得るように、IMP-ILよりも血液および腫瘍の両方で比例的に高かった。驚くべきことに、血中SIの変化はIMP-ILおよびIMP-ヌルで両方とも同じであったが、IMP-ILは腫瘍にてより大きなSI増加を生じ、それは、細胞へのILのエンドサイトーシスにより誘発されるマーカーの放出を示し得る。実施例10ドキソルビシンおよび常磁性マーカーであるGd-DTPA-ビストリエチルアンモニウムまたはクエン酸アンモニウム鉄のリポソームへの共ローディング、および得られる薬剤とマーカーを共ローディングしたリポソームの特性リポソームをエタノール注入により形成させ、次に0.1μmポリカーボネートフィルターを通して繰り返し押し出し成形した。簡単には、乾燥させた脂質DSPC/Chol/PEG-DSPE、モル比3:2:0.015を、60°Cに加熱することにより0.5mlのエタノールに溶解した。Gd-DTPATEA-Gd-DTPAのトリエチルアンモニウム塩を、Gd-DTPA二塩基酸の水溶液AlrdichCorpMilwakeeUSAとトリエチルアミン原液でpH5.0-5.4に滴定することにより形成させた。リポソームを、500mMTEA-Gd-DTPAの存在下にて水和した。500mMTEA-Gd-DTPA4.5mlを60°Cに加熱し、その後、すばやくエタノール性脂質溶液0.5ml、300μmolPLに注入し、水和した脂質溶液を形成させた。その後エタノールをロータリーエバポレーターで除去し、脂質懸濁液を、2枚重ねのポリカーボネートフィルター0.1μmを15回通して押し出し成形した。成形後、非封入TEA-Gd-DTPAまたはクエン酸アンモニウム鉄IIIをHEPES緩衝食塩水pH6.5で溶出したセファデックスG-75カラムで除去した。その後、リン脂質PL含有量を、リン酸塩の分光学的分析により決定し、次に酸消化しBartlettGR1959JBiolChem234466-468、ドキソルビシン塩化水素を、1μmolPLに対して150μg薬剤の割合でリポソームに加えた。薬剤を、薬剤とリポソームを60°Cで30分間インキュベートすることによりローディングし、その後、氷上で15分間で反応をクエンチした。非封入薬剤を、第二のセファデックスG-75ゲルろ過カラムで除去し、Hepes緩衝食塩水、pH6.5で溶出した。精製したリポソーム試料中の薬剤の量を、酸イソプロパノール90イソプロパノール、101NHCl中への薬剤ローディングリポソームの溶解後に蛍光λex=490nm、λem=550nmにより定量し、リン脂質含有量をBartlett1959による方法により決定した。薬剤ローディング効率を、1μmolのリン脂質に対して1μgの薬剤が発現されたときの絶対量、および加えた最初の量の薬剤と比較してローディングした1の薬剤が発現されたときの相対量の両方を測定した。1μmolのリン脂質に対して150μgの薬剤を最初に加えたとき、ドキソルビシンのローディング効率は、92-100の範囲であった。リポソームサイズを、光子相関分光法により決定し、それは105-120nmであった。Gd-DTPA/ドキソルビシンをどちらも含む前記の間に構築されたリポソームを、保存中の安定性についてモニタリングした。3ヶ月後、Gd-DTPA/ドキソルビシンリポソームは、それらが製造されたときと同じサイズであった123.9±23.8対121.0±20.7nm。Gd-DPTA/ドキソルビシンをまた、HER2過剰発現SKBR3細胞を用いたインビトロ細胞毒性分析にて特徴付けた。結果を図16に示す。HER2標的免疫リポソームを封入するGd-DTPA/ドキソルビシンは、遊離薬剤と同じくらい活性であって、非標的リポソーム剤形よりも100倍ほど活性であった。この活性は、常套的なHER2標的硫酸アンモニウムを充填したドキソルビシンリポソームで見られるのと同程度であり、その活性および安定性の両方を維持したGd3を含むリポソームを示す。血漿安定性の研究は、微量透析分析を用いて37°Cで50ヒト血漿の存在下で行った。50血漿中のリポソーム試料を、30nmポリカーボネート膜を有する32mL主チャンバーから分け、Spectra/PorMicrodialyzerSpectrumLabsGardenaCAの試料ウェル各0.4mlに入れた。そのチャンバーを、50v/vのヒト血漿HEPES緩衝生理食塩水で希釈で無菌的に満たした。血漿タンパク質、遊離非封入薬剤、および遊離イメージング剤は膜を自由に通過し、かつ一番低いチャンバーに蓄積する。前記透析器を、37°Cで振とうしながらインキュベートした。所定の時間点で、各ウェル由来の試料のアリコートを取り出し、サイズ除去クロマトグラフィーにより精製し、漏出または遊離薬剤からのリポソーム薬剤またはイメージング剤をさらに分離する。単離されたリポソームを、リン脂質PL、ドキソルビシンDOX、およびGd3について分析し、初期試料からのDox-対-PLまたはGd3-対-PLの変化を、リポソームから漏出する薬剤および/または検出可能マーカーの測定として計測した。ドキソルビシンを、70酸イソプロパノール中498nmで分光学的分析により決定し、リン脂質を、Bartlettの方法1959の変法を用いてリン酸分析により決定した。Gd濃度を、界面活性剤1トライトンX-100の存在下60°Cで5分間リポソームの溶解後、プロトン緩和能におけるGdの効果に基づくNMRにより決定した。以前観察された結果と同様に、ドキソルビシン封入の安定性は非常に良く、48時間後にリポソームと結合して残っているドキソルビシンは80以上であった図17を参照のこと。図は、薬剤をトラップする物質としてGd-DTPAまたはクエン酸FeIIIをどちらも用いてローディングされたリポソーム中におけるドキソルビシン封入の血漿安定性を示す。ドキソルビシン対リン脂質比の変化は、リポソームからのドキソルビシンの喪失に直接関係する。リポソーム試料を、上記のように37°Cで微量透析分析において50ヒト血漿とインキュベートした。Gd-対-リン脂質の変化は、時間が経つにつれて同様の傾向がみられた。72時間インキュベーション後に封入されて残ったGdの量は、ドキソルビシンのそれと近かった75保有。故に、本発明の二重薬剤-常磁性マーカーを共ローディングしたリポソームは、両成分に関して活性であるのみでなく、ヒト血漿の存在下でリポソームからの成分の漏出に対して安定でもあった。図18は、ドキソルビシンをトラップするための物質としてGd-DTPAを用いてローディングされたリポソームにおけるガドリニウム封入の血漿安定性を示す。Gd-対-リン脂質の割合の変化は、リポソームからのGdの喪失と直接関係し得る。リポソーム試料を、37°Cにおける微量透析分析にて50ヒト血漿と一緒にインキュベートした。本明細書中、上記のすべての刊行物および特許は、参照により本明細書に含まれる。記載した方法の様々な改良法および変法、ならびに本発明の系は、本発明の範囲および精神を逸脱することなく当業者に理解されるだろう。本発明は、特定の好ましい態様について記載されているが、本発明の請求の範囲はかかる特定の態様に限定されると不当に介されるべきでないことが理解されるべきである。実際、当業者に明らかな本発明を実行するための記載した方法の様々な改良法が、上記の特許請求の範囲内に意図されている。"