カルノシン酸若しくはその誘導体又はそれらの薬理学的に許容し得る塩を有効成分として含むことを特徴とする、医薬組成物。腎不全の進行抑制用のものである、請求項1記載の組成物。腎不全の合併症の予防及び/又は治療用のものである、請求項1記載の組成物。腎不全が、慢性腎不全又は末期腎不全である、請求項2又は3記載の組成物。腎不全の合併症が、動脈硬化、高血圧症、高脂血症、糖尿病、腎性骨ジストロフィ、心膜炎及び貧血からなる群より選ばれる少なくとも1種である、請求項3記載の組成物。カルノシン酸若しくはその誘導体又はそれらの薬理学的に許容し得る塩を有効成分として含むことを特徴とする、機能性食品。腎不全の進行抑制用のものである、請求項6記載の食品。腎不全の合併症の予防及び/又は治療用のものである、請求項6記載の食品。腎不全が、慢性腎不全又は末期腎不全である、請求項7又は8記載の食品。腎不全の合併症が、動脈硬化、高血圧症、高脂血症、糖尿病、腎性骨ジストロフィ、心膜炎及び貧血からなる群より選ばれる少なくとも1種である、請求項8記載の食品。カルノシン酸若しくはその誘導体又はそれらの薬理学的に許容し得る塩を有効成分として含むことを特徴とする、腎不全の進行抑制用キット。カルノシン酸若しくはその誘導体又はそれらの薬理学的に許容し得る塩を有効成分として含むことを特徴とする、腎不全の合併症の予防及び/又は治療用キット。腎不全が、慢性腎不全又は末期腎不全である、請求項11又は12記載のキット。腎不全の合併症が、動脈硬化、高血圧症、高脂血症、糖尿病、腎性骨ジストロフィ、心膜炎及び貧血からなる群より選ばれる少なくとも1種である、請求項12記載のキット。このような状況下において、腎不全患者、具体的には慢性腎不全及び末期腎不全の患者特に透析患者のいずれにも直接的に適用できる、新規薬物療法及び食事療法に用い得る医薬及び機能性食品の開発が望まれていた。本発明は、上記状況を考慮してなされたもので、以下に示す、腎不全の進行抑制用並びに腎不全の合併症の予防及び/又は治療用の医薬組成物、機能性食品及びキット等を提供するものである。1カルノシン酸若しくはその誘導体又はそれらの薬理学的に許容し得る塩を有効成分として含むことを特徴とする、医薬組成物。上記医薬組成物は、例えば、腎不全の進行抑制用の医薬組成物、あるいは、腎不全の合併症の予防及び/又は治療用の医薬組成物である。ここで、上記腎不全は、例えば、慢性腎不全又は末期腎不全であり、上記腎不全の合併症は、例えば、動脈硬化、高血圧症、高脂血症、糖尿病、腎性骨ジストロフィ、心膜炎及び貧血からなる群より選ばれる少なくとも1種である。2カルノシン酸若しくはその誘導体又はそれらの薬理学的に許容し得る塩を有効成分として含むことを特徴とする、機能性食品。上記機能性食品は、例えば、腎不全の進行抑制用の機能性食品、あるいは、腎不全の合併症の予防及び/又は治療用の機能性食品である。ここで、上記腎不全は、例えば、慢性腎不全又は末期腎不全であり、上記腎不全の合併症は、例えば、動脈硬化、高血圧症、高脂血症、糖尿病、腎性骨ジストロフィ、心膜炎及び貧血からなる群より選ばれる少なくとも1種である。3カルノシン酸若しくはその誘導体又はそれらの薬理学的に許容し得る塩を有効成分として含むことを特徴とする、腎不全の進行抑制用キット、あるいは、腎不全の合併症の予防及び/又は治療用キット。上記キットにおいて、上記腎不全は、例えば、慢性腎不全又は末期腎不全であり、上記腎不全の合併症は、例えば、動脈硬化、高血圧症、高脂血症、糖尿病、腎性骨ジストロフィ、心膜炎及び貧血からなる群より選ばれる少なくとも1種である。本発明によれば、慢性腎不全患者及び末期腎不全患者に対して直接的な薬物療法及び食事療法を可能とする、医薬組成物、機能性食品及びキット等を提供することができる。本発明の医薬組成物、機能性食品及びキットは、慢性腎不全及び末期腎不全の進行抑制、それらの合併症の予防及び治療改善を効果的に行うことができる点で、極めて有用性に優れたものである。また、本発明の機能性食品においては、有効成分であるカルノシン酸等をサプリメントとして摂取可能な状態で提供することもでき、実用性に優れたものである。以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。なお、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。1.本発明の概要前述したように、近年、本発明者らの研究等により、インドキシル硫酸の作用発現には活性酸素種ROS;reactiveoxygenspeciesの発生が深く関与していることが明らかとなったHidehisaShimizuetal2009前掲:非特許文献1。尿毒症物質であるインドキシル硫酸は、腎不全慢性腎不全及び末期腎不全により蓄積し、腎機能の低下腎不全の進行のみならず、動脈硬化をはじめとする種々の合併症の要因となる。本発明者は、ローズマリーシソ科植物の主成分の一つであるカルノシン酸が、生体内において極めて高い抗酸化活性を誘導するものであり、その結果、インドキシル硫酸の作用を低濃度で抑制又は阻害し得るものであることを見出した。より詳細に説明すると、次の通りである。すなわち、生体内においては、多くの抗酸化タンパク質HO1等の遺伝子発現が、転写因子Nrf2によって制御されている。通常の環境下非ストレス下では、Nrf2は、ユビキチンリガーゼKeap1と結合しており、プロテアソームにより恒常的に分解されているため、抗酸化タンパク質の発現は抑制状態にある。他方、非通常の環境下ストレス下にさらされると、細胞内のKeap1が修飾を受けて構造変化を起こし、Nrf2との相互作用結合が抑制される。そうすると、蓄積したNrf2が細胞核に移行し、一連の抗酸化タンパク質等の発現を亢進させ、その結果、抗酸化活性が誘導される。カルノシン酸はNrf2とKeap1との相互作用結合を弱め、Nrf2による抗酸化タンパク質の発現亢進を誘導し、結果として抗酸化活性を誘導することが知られている。そして、このカルノシン酸及びその誘導体等を主成分とする医薬組成物及び機能性食品が、腎不全慢性腎不全及び末期腎不全の進行阻害、並びにその合併症の予防や改善に有効に用い得ることを見出し、本発明を完成した。2.医薬組成物本発明の医薬組成物は、前述した通り、カルノシン酸若しくはその誘導体又はそれらの薬理学的に許容し得る塩以下カルノシン酸等ということがあるを有効成分として含むことを特徴とするものである。詳しくは、本発明の医薬組成物は、腎不全の進行抑制用、並びに腎不全の合併症の予防及び/又は治療用のものであることが好ましい。なお、本発明は、カルノシン酸等を用いること具体的には、カルノシン酸等の有効量を患者に投与することを特徴とする腎不全の進行抑制方法、並びに腎不全の合併症の予防及び/又は治療方法;腎不全の進行抑制用、並びに腎不全の合併症の予防及び/又は治療用の薬剤を製造するためのカルノシン酸等の使用;腎不全の進行抑制用、並びに腎不全の合併症の予防及び/又は治療用のカルノシン酸等の使用;腎不全の進行抑制用、並びに腎不全の合併症の予防及び/又は治療用のカルノシン酸等をも含むものである。本発明において、腎不全としては、腎不全の進行過程第1期~第4期に伴う腎機能が低下した状態をすべて含むものとするが、特に慢性腎不全及び末期腎不全の状態のことをいう。慢性腎不全とは、腎機能が正常時の30以下程度に低下した状態をいい例えば、血清クレアチニン値が3mgdL以上、一般には第3期に相当する。末期腎不全とは、腎機能が正常時の10以下に低下し例えば、血清クレアチニン値が8mgdL以上、そのままでは生命維持ができないため透析人工透析等が必要な状態をいい、一般には第4期に相当する。本発明において、腎不全の合併症としては、限定はされないが、動脈硬化、高血圧症、高脂血症、糖尿病、腎性骨ジストロフィ、心膜炎及び貧血等が挙げられるが、中でも特に、動脈硬化、高血圧症及び糖尿病が、本発明の医薬組成物による予防及び治療の対象疾患として好適である。本発明の医薬組成物の有効成分である、ローズマリー葉成分のカルノシン酸は、公知の市販のもの例えばシグマ社製等を使用することができるが、限定はされず、独自に抽出及び精製等したものを使用してもよい。なお、カルノシン酸は下記式で表されるものである。また、本発明の医薬組成物の有効成分としては、カルノシン酸と共に又はカルノシン酸に代えて、カルノシン酸誘導体を用いることもできる。当該誘導体としては、カルノシン酸由来の化学構造を有する等、当業者の技術常識に基づいてカルノシン酸の誘導体と考えられるものであればよく、限定はされないが、抗酸化活性の誘導能がカルノシン酸と同程度ものが好ましい。具体的には、カルノシン酸誘導体としては、例えば下記式で表されるものが挙げられる。上記式中、R1、R3及びR4は、それぞれ独立して、水素原子、酸素原子、任意に置換されてもよいC110アルキル、任意に置換されてもよいC210アルケニル、任意に置換されてもよいC210アルキニル、任意に置換されてもよいC614アリール、又は任意に置換されてもよい5~14員ヘテロアリールを表し、R2は、カルボキシル基、アシル基、ヒドロキシル基、又はカルボニル基これらの基は任意の基で置換されていてもよいを表す。ここで、R1、R2、R3及びR4における上記置換基は、酸素原子、C16アルキル、OR20及びCOOR20R20は、水素原子、C16アルキル、若しくはC26アルケニルを表す。のうちの1種又は複数種から選択される。なお、上記において、例えばC110との表記は、炭素数1~10のとの意味を表す。カルノシン酸及びその誘導体の薬理学的に許容し得る塩としては、限定はされないが、例えば、ハロゲン化水素酸塩例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、及びヨウ化水素酸塩など、無機酸塩例えば、硫酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩、炭酸塩、及び重炭酸塩など、有機カルボン酸塩例えば、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、及びクエン酸塩など、有機スルホン酸塩例えば、メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、及びカンファースルホン酸塩など、アミノ酸塩例えば、アスパラギン酸塩、及びグルタミン酸塩など、四級アミン塩、アルカリ金属塩例えば、ナトリウム塩、及びカリウム塩など、アルカリ土類金属塩例えば、マグネシウム塩、及びカルシウム塩などなどが好ましく挙げられる。カルノシン酸等としては、例えば、生体内で酸化、還元、加水分解、又は抱合などの代謝を受けるものも包含するほか、生体内で酸化、還元、又は加水分解などの代謝を受けてカルノシン酸等を生成する化合物をも包含する。カルノシン酸等は、化合物の構造上生じ得るすべての異性体例えば、幾何異性体、不斉炭素に基づく光学異性体、回転異性体、立体異性体、及び互変異性体等及びこれら異性体の2種以上の混合物をも包含し、便宜上の構造式の記載等に限定されるものではない。また、カルノシン酸等は、S体、R体あるいはRS体のいずれであってもよく、限定はされない。さらに、カルノシン酸等は、その種類により水和物の形で存在する場合もあり、本発明においては当該水和物もカルノシン酸等に含むものとする。本発明の医薬組成物において、有効成分としてのカルノシン酸等の含有割合は、限定はされず、適宜設定することができるが、例えば、医薬組成物全体に対して、001~99重量の範囲内とすることができ、さらに001~95重量、001~90重量、005~80重量、01~70重量、02~50重量、05~30重量又は1~20重量の範囲内としてもよい。有効成分の含有割合が上記範囲内であることにより、本発明の医薬組成物は、腎不全の進行抑制、並びに腎不全の合併症の予防及び/又は治療の効果を十分に発揮することができる。本発明の医薬組成物は、カルノシン酸等以外にも、本発明の効果が著しく損なわれない範囲で他の成分を含んでいてもよく、例えば、後述する薬剤製造上一般に用いられるもの等を含むことができる。本発明の医薬組成物は、ヒト又は非ヒト哺乳動物に対して、種々の投与経路、具体的には、経口、又は非経口例えば静脈内注射静注、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、直腸投与、経皮投与で投与することができる。従って、本発明に使用するカルノシン酸等は、単独で用いることも可能であるが、投与経路に応じて慣用される方法により薬学的に許容し得る担体を用いて適当な剤形に製剤化して用いることができる。剤形としては、経口剤では、例えば、錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、被覆錠剤、カプセル剤、内用水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、及びトローチ剤等が挙げられ、非経口剤では、例えば、注射剤点滴剤を含む、吸入剤、軟膏剤、点鼻剤、及びリポソーム剤等が挙げられる。なお、上述した各種経口剤とする場合、本発明の医薬組成物は、場合によりサプリメント剤後述する本発明の機能性食品にも該当するとして利用することもできる。これら製剤の製剤化に用い得る担体としては、例えば、通常用いられる賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、及び矯味矯臭剤のほか、必要に応じ、安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、pH調整剤、防腐剤、抗酸化剤、増量剤、湿潤化剤、表面活性化剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、及び無痛化剤等が挙げられ、医薬品製剤の原料として用いることができる公知の成分を配合して常法により製剤化することが可能である。当該成分として使用可能な無毒性のものとしては、例えば、大豆油、牛脂、及び合成グリセライド等の動植物油;流動パラフィン、スクワラン、及び固形パラフィン等の炭化水素;ミリスチン酸オクチルドデシル、及びミリスチン酸イソプロピル等のエステル油;セトステアリルアルコール、及びベヘニルアルコール等の高級アルコール;シリコン樹脂;シリコン油;ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ひまし油、及びポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレンブロックコポリマー等の界面活性剤;ヒドロキシエチルセルロース、ポリアクリル酸、カルボキシビニルポリマー、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、及びメチルセルロース等の水溶性高分子;エタノール、及びイソプロパノール等の低級アルコール;グリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ソルビトール、及びポリエチレングリコール等の多価アルコールポリオール;グルコース、及びショ糖等の糖;無水ケイ酸、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、及びケイ酸アルミニウム等の無機粉体;塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム等の無機塩;精製水等が挙げられ、いずれもその塩またはその水和物であってもよい。賦形剤としては、例えば、乳糖、果糖、コーンスターチ、白糖、ブドウ糖、マンニトール、ソルビット、結晶セルロース、及び二酸化ケイ素等が、結合剤としては、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、メチルセルロース、エチルセルロース、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、シェラック、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリプロピレングリコールポリオキシエチレンブロックポリマー、及びメグルミン等が、崩壊剤としては、例えば、澱粉、寒天、ゼラチン末、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、クエン酸カルシウム、デキストリン、ペクチン、及びカルボキシメチルセルロースカルシウム等が、滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ、及び硬化植物油等が、着色剤としては医薬品に添加することが許可されているものが、矯味矯臭剤としては、例えば、ココア末、ハッカ脳、芳香散、ハッカ油、竜脳、及び桂皮末等が、それぞれ好ましく挙げられ、いずれもその塩又はそれらの水和物であってもよい。本発明の医薬組成物の投与量は、一般には、製剤中の有効成分カルノシン酸等の配合割合を考慮した上で、投与対象患者の年齢、体重、病気の種類進行状況や、投与経路、投与回数/1日、投与期間等を勘案し、適宜、広範囲に設定することができる。本発明の医薬組成物を、非経口剤又は経口剤として用いる場合について、以下に具体的に説明する。非経口剤として用いる場合、一般にその形態は限定されないが、各種注射剤の場合は、例えば、単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態や、使用時に溶解液に再溶解させる凍結乾燥粉末の状態で提供され得る。当該非経口剤には、有効成分となるカルノシン酸等のほかに、各種形態に応じ、公知の各種賦形材や添加剤を上記有効成分の効果が損なわれない範囲で含有することができる。例えば、各種注射剤の場合は、水、グリセロール、プロピレングリコールや、ポリエチレングリコール等の脂肪族ポリアルコール等が挙げられる。非経口剤の投与量1日あたりは、限定はされないが、例えば各種注射剤であれば、一般には、有効成分となるカルノシン酸等を、適用対象患者の体重1kgあたり、1~100mg服用できる量とすることができ、あるいは2~50mg服用できる量や5~10mg服用できる量とすることもできる。経口剤として用いる場合、一般にその形態は限定されず、前述した剤形のいずれであってもよいし、使用する際に再溶解させる乾燥生成物にしてもよい。当該経口剤には、有効成分となるカルノシン酸等のほかに、各種形態に応じ、公知の各種賦形材や添加剤を上記有効成分の効果が損なわれない範囲で含有することができる。例えば、結合剤シロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビトール、トラガカント、ポリビニルピロリドン等、充填材乳糖、糖、コーンスターチ、馬鈴薯でんぷん、リン酸カルシウム、ソルビトール、グリシン等、潤滑剤ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ等、崩壊剤各種でんぷん等、および湿潤剤ラウリル硫酸ナトリウム等等が挙げられる。経口剤の投与量1日あたりは、一般には、有効成分となるカルノシン酸等を、適用対象被験者;患者の体重1kgあたり、1~100mg服用できる量とすることができ、あるいは2~50mg服用できる量や5~10mg服用できる量とすることもできる。また、経口剤中の有効成分の配合割合は、限定はされず、1日あたりの投与回数等を考慮して、適宜設定することができる。3.機能性食品本発明の機能性食品は、前述した通り、カルノシン酸等を有効成分として含むことを特徴とするものである。詳しくは、本発明の機能性食品は、腎不全の進行抑制用、並びに腎不全の合併症の予防及び/又は治療用のものであることが好ましい。食品の種類としては、経口摂取できるものであればよく、限定はされず、公知の各種食料及び飲料が含まれる。サプリメント剤錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、被覆錠剤、カプセル剤、内用水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤及びトローチ剤等としての形態も、本発明の機能性食品に含まれる。例えば、食料の具体例としては、例えば、調味料、マヨネーズ、ヨーグルト及び各種菓子等が挙げられ、飲料の具体例としては、例えば、ローズマリー茶、緑茶、コカコーラ、野菜ジュース、果物ジュース及び栄養ドリンク等が挙げられる。なお、腎不全、腎不全の合併症、カルノシン酸等、カルノシン酸誘導体等に関しては、前記2項での説明記載が適宜適用できる。本発明の機能性食品において、有効成分としてのカルノシン酸等の含有割合は、限定はされず、食品の種類及び形態等に応じて適宜設定することができるが、例えば、機能性食品全体に対して、001~99重量の範囲内とすることができ、さらに001~95重量、001~90重量、005~80重量、01~70重量、02~50重量、05~30重量又は1~20重量の範囲内としてもよい。有効成分の含有割合が上記範囲内であることにより、本発明の機能性食品は、腎不全の進行抑制、並びに腎不全の合併症の予防及び/又は治療の効果を十分に発揮することができる。本発明の機能性食品は、カルノシン酸等以外にも、本発明の効果が著しく損なわれない範囲で他の成分を含んでいてもよい。本発明の機能性食品の摂取量は、一般には、食品中の有効成分カルノシン酸等の配合割合を考慮した上で、摂取対象患者の年齢、体重、病気の種類進行状況、摂取回数/1日、摂取期間等を勘案し、適宜、広範囲に設定することができる。本発明の機能性食品の摂取量1日あたりは、一般には、有効成分となるカルノシン酸等を、適用対象被験者;患者の体重1kgあたり、1~100mg服用できる量とすることができ、あるいは2~50mg服用できる量や5~10mg服用できる量とすることもできる。4.キット腎不全の進行抑制、並びに腎不全の合併症の予防及び治療を行うに当たっては、カルノシン酸等を含むキット具体例として、前述した本発明の医薬組成物を含むキットを用いることができる。当該キットにおけるカルノシン酸等の形態は、限定はされないが、安定性保存性及び使用容易性等を考慮し、例えば溶解した状態で備えられていてもよい。当該キットは、カルノシン酸等以外にも、適宜、他の構成要素を含むことができる。当該キットは、構成要素として少なくとも前述したカルノシン酸等を備えているものであればよい。従って、腎不全の進行抑制、並びに腎不全の合併症の予防及び治療に必須となる構成要素の全てを、当該カルノシン酸等と共に備えているものであってもよいし、別々に備えているものであってもよく、限定はされない。以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。<材料>下記の材料をそれぞれ入手して用いた材料名:入手元。インドキシル硫酸IS:株式会社クレハウシ血清アルブミン、トリプシン阻害剤、エラスターゼIII:SigmaコラゲナーゼICLS1:WorthingtonBiochemicalCoダルベッコ変法イーグル培地highgulcose、ペニシリン/ストレプトマイシンPS:Sigmaウシ胎児血清FBS:Gibcoリン酸緩衝食塩水PBS:NissuiPharmaceuticalPDGFBB:AustralBiologicalsBCATMProteinAssayReagent:PiercePVDFメンブレン:MilliporePhosphoERKAntibody、phosphop38Antibody、PhosphoPDGFReceptorβantibody:CellSignalingTechnologyGoatantiratIgGHRPconjugated、AntimouseIgGconjugated、AntiPDGFReceptorβ:SantaCruzBiotechnologyAntiαTubulinMousemAbDM1A:CalbiochemAntiPhosphotyrosineclone4G10:UpstateCellSignalingSolutionsChemiLumiOneL:ナカライテスクNアセチルLシステインNAC、diphenyleneiodium、PD98059、SB203580:Calbiochem2’7’ジクロロフルオレセインDCF:WakoCellTiter96AqueousOneSolutionCellProliferationAssaykit:Promegaポリカーボネートメンブレン:Corning<方法>血管平滑筋細胞VSMCの単離培養日本チャールズリバー社より購入した5週齢雄のSpragueDawleyラットより、エーテル麻酔下で、胸部大動脈を採取した。その後、3PSを含むPBS中で血管の周りの結合組織を除去した後、HEPES、ウシ血清アルブミン、トリプシン阻害剤、エラスターゼIIIを含むDMEMに血管を浸し、37°Cで30分間酵素処理を行った。次に外膜を剥離し、血管を細かくなるまで切断して細胞を回収し、コラゲナーゼIを含むDMEM中で37°C、2時間反応させた。その後、遠心分離1000rpm、5分、室温を行い、細胞を回収して細胞培養用ディッシュで37°C、5CO2存在下で培養した。継代数3代まではコラーゲンコート処理されたディッシュを用い、4代目以降は通常のディッシュを使用した。10FBS、1PSを含むDMEMhighglucoseを用いて細胞を継代した。実験には継代数5代から10代までの細胞を用いた。細胞増殖の測定CellTiter96AqueousOneSolutionCellProliferationAssaykitを用いて細胞増殖を評価した。96穴プレートにVSMCを3x104cellswell播種し接着させた後、01FBSを含むDMEMで48時間同調培養した。その後、PDGF又はISを添加し48時間後、上記キットで評価した。ISの前処理実験では、VSMCを48時間同調培養後にISを添加し24時間培養し、PBSを用いた洗浄によりISを除去した後、PDGFを添加し、さらに48時間培養した。その結果を、図1に示した。ボイデンチャンバー変法による遊走の測定VSMCを10cmディッシュに9x105cells播種し接着させた後、01FBSを含むDMEMによって48時間同調培養を行った。細胞を回収し、フィブロネクチンコート処理をしたボイデンチャンバーに2x105個の細胞を播種した。チャンバーの下位区画にIS又はPDGFを添加し、5時間後にメタノールで細胞を固定し、ヘマトキシリンで核を染色した。2~7日後、メンブレン下側に遊走した細胞を顕微鏡で観察し、6視野当たりの細胞数を数え、細胞遊走を評価した。ISの前処理実験では、VSMCを48時間同調培養後にISを添加し、24時間培養した。その後、PBSを用いた洗浄によりISを除去した後、細胞を回収し、ボイデンチャンバーに播種した。その結果を、図1に示した。細胞内活性酸素種ROSの測定VSMCを35cmディッシュに2x105cells播種して接着させた後、01FBSを含む培地で48時間同調培養を行った。その後、以下の2つの条件で細胞内ROS量を測定した。第一の条件では、蛍光試薬2’7’ジクロロフルオレセインジアセテートを添加して15分間反応させた後、IS又はPDGFで10分間刺激し、HBSSで2回洗浄後、共焦点蛍光顕微鏡を用いて488nmの励起波長で生じた蛍光強度を測定し、細胞内ROS産生の指標とした。第二の条件では、ISで24時間刺激したが、刺激終了15分前にDCFDAを添加した。その後は、第一の条件と同様の処理を行った。その結果を、図2に示した。また、ISの前処理実験では、VSMCを48時間同調培養後にISを添加し、24時間培養した。培養終了15分前にDCFDAを添加し、HBSSを用いた洗浄によりISを除去した後、PDGFで10分間刺激し、第一の条件で測定した。その結果を、図2に示した。ウェスタンブロッティング反応後のVSMCは、ただちに80°Cで凍結した。その後、Lysisbufferを加え、スクレイパーで細胞を剥ぎ取り、回収した。氷上に20分間静置し、4°C、14000rpmで15分間遠心分離を行い、上清を回収した。その後、BCATMProteinAssayReagentを用いて回収した細胞抽出液のタンパク質濃度を測定し、一定量のタンパク質を含む細胞抽出液をSDSPAGEに供した。泳動終了後、分離したタンパク質をPVDFメンブレンに転写した。その後、5スキムミルクTBSTまたは5BSATBSTでブロッキングを行い、各種一次抗体で反応させた。1xTBSTで15分間メンブレンを洗浄後、二次抗体を反応させた。再び、1xTBSTで15分間メンブレンを洗浄後、ChemiLumiOneLを用いて、二次抗体に標識された西洋わさびペルオキシダーゼによる化学発光を、LAS1000又はLAS4000miniにより検出した。その結果を、図3に示した。<材料>下記の材料をそれぞれ入手して用いた材料名:入手元。インドキシル硫酸IS:株式会社クレハカルノシン酸:Sigmaロスマリン酸、コーヒー酸:Caymanナリンギン:Extrasyntheseウルソル酸:BiomolAntibioticantimycotic、ウシ胎児血清FBS:Invitrogen1000mglグルコースを含むダルベッコ変法イーグル培地DMEMlowglucose、4500mglグルコースを含むダルベッコ変法イーグル培地DMEMhighglucose、ウシ血清アルブミンBSA、トリプシン阻害剤、エラスターゼIII、ペニシリン/ストレプトマイシンPS:SigmaコラゲナーゼICLS1:WorthingtonbiochemicalCo血小板由来増殖因子PDGF:AustralBiologicals線維芽細胞増殖因子bFGF:Peprotechハンクス平衡塩類溶液HBSS、Lアルギニン:SigmaH2O2、フィブロネクチン、メタノール、エタノール:WakoCellTiter96登録商標AQueousOneSolutionReagent:Promegaトリパンブルー:Gibco1オレオイルリゾホスファチジン酸LPA:Caymanボイデンチャンバー:Corning11ジフェニル2ピクリルヒドラジルDPPH:ナカライテスクジアミノフルオレセイン2ジアセテートDAF2DA:第一化学薬品株式会社ISOGEN:ニッポンジーンイソプロパノール:ナカライテスクランダムプライマー:TakaraReversetranscriptionbuffer、Faststartuniversalgreenmaster:RocheRNase阻害剤:ToyoboジチオスレイトールDTT、MMLVReversetranscriptase:Invitrogenクロロホルム:WakodNTPs:Appliedbiosystems各種プライマー:RIKAKENなお、上記カルノシン酸、ロスマリン酸、コーヒー酸、ナリンギン及びウルソル酸の具体的な構造式は下記の通りである。<方法>11diphenyl2picrylhydrazyDPPHラジカル消去による抗酸化活性の評価DPPH400μM、MESバッファー200mM、pH60及び20エタノールを等量ずつ加えて混合液を調製した。予め、DPPHは100エタノールに溶解させ400μMに調整し、MESバッファーはMillQに溶解させた後NaOH溶液を用いてpH60、200mMに調整した。200μMの各種化合物トロロクス6hydroxy2578tetramethylchroman2carboxylicacid東京化成工業株式会社、カルノシン酸、ロスマリン酸、コーヒー酸、ナリンギン、ウルソル酸及びエピガロカテキンガレートEGCG三井農林株式会社を最終濃度0~50μM、総容量30μlになるように80エタノールに溶解し、96wellプレートに添加した。その後、各wellに混合液を90μlずつ添加し、10秒程度攪拌した。室温に20分間静置した後、マイクロプレートリーダーを用いて550nmの波長を測定した。その結果を、図4に示した。血管内皮細胞VECの単離培養と畜場よりブタの胸部大動脈を入手し、PBSで洗浄した後、3PSを含むPBSに30分以上浸して滅菌した。滅菌後の血管をハサミで切り開き、血管内側の表面の細胞を、メスを用いて採取した。その後、遠心1500rpm、5分、室温によって細胞を回収し、上清を除去後、細胞培養用ディッシュで培養した。10FBS、1PSを含むDMEMlowglucoseを用い、5CO2、37°Cにて培養した。実験には4代から10代までの細胞を用いた。血管平滑筋細胞VSMCの単離培養日本チャールズリバー社より購入した5週齢雄のSpragueDawleyラットより、エーテル麻酔下で、胸部大動脈を採取した。その後、3PSを含むPBS中で血管の周りの結合組織を除去した後、HEPES、ウシ血清アルブミン、トリプシン阻害剤、エラスターゼIIIを含むDMEMに血管を浸し、37°Cで30分間酵素処理を行った。次に、外膜を剥離し、血管を細かくなるまで切断して細胞を回収し、コラゲナーゼIを含むDMEM中で37°C、2時間反応させた。その後、遠心分離1000rpm、5分、室温を行い、細胞を回収して細胞培養用ディッシュで37°C、5CO2存在下で培養した。継代数3代まではコラーゲンコート処理されたディッシュを用い、4代目以降は通常のディッシュを使用した。10FBSを含むDMEMhighglucoseを用いて細胞を継代した。実験には継代数5代から10代までの細胞を用いた。細胞増殖の測定CellTiter96AqueousOneSolutionCellProliferationAssaykitを用いて細胞増殖を評価した。VECの場合、96穴プレートに細胞を2x104cellswell播種し接着させた後、1FBSを含むDMEMで16時間同調培養した。その後、最終濃度の100倍濃度の各種化合物カルノシン酸、ロスマリン酸、コーヒー酸、ナリンギン及びウルソル酸を調製し、カルノシン酸は最終濃度01、03、1、3、10、30μMとなるように添加し、その他の化合物については10、20、30μMとなるように添加して、さらに24時間培養した。その後、上記キットで評価した。VSMCの場合、96穴プレートに細胞を3x104cellswell播種し接着させた後、01FBSを含むDMEMで48時間同調培養した。続いてPDGF刺激群においては、最終濃度の100倍濃度の各種化合物カルノシン酸、ロスマリン酸、コーヒー酸、ナリンギン及びウルソル酸を調製し、カルノシン酸は最終濃度1、3、10、30、100μMとなるように添加し、その他の化合物については最終濃度10、30、100μMとなるように添加して、30分後に、さらにPDGFを最終濃度20ngmlになるように添加し、48時間培養した。非刺激群においては化合物のみで48時間培養した。その後、上記キットで評価した。また、インドキシル硫酸に対するカルノシン酸の効果を調べる場合は、48時間同調培養後、最終濃度の100倍濃度のカルノシン酸を調製し、最終濃度1μM、3μM及び5μMとなるように添加し12時間培養した。その後、250μMのインドキシル硫酸存在下で48時間培養し、上記キットで評価した。以上の結果を、図5、図6及び図12に示した。Woundhealingassayによる創傷治癒の評価VECを35cmディッシュに2x105cells播き、8時間接着させた後、1FBSを含むDMEMによって16時間同調培養を行った。続いて、最終濃度の100倍濃度の各種化合物カルノシン酸、ロスマリン酸、コーヒー酸及びナリンギンを調製し、カルノシン酸は最終濃度3μMとなるように添加し、その他の化合物については最終濃度30μMとなるように添加して、30分後に200μlチップを用いて細胞層に模擬的な傷を作った。ポジティブコントロールとして5μMのLPAを用いた。傷を作った時間を0時間として、0時間と24時間後の傷周辺の写真を、明視野顕微鏡LEICADMIRBEを用いて撮影した。1種類の化合物につき3視野の写真を撮影し、24時間経過後に傷の範囲内に移動した細胞数を計測し、創傷治癒能力の指標とした。その結果を、図7に示した。ボイデンチャンバー変法によるVSMCの遊走の測定VSMCを10cmディシュに9x105cells播種し接着させた後、01FBSを含むDMEMによって48時間同調培養を行った。続いて、最終濃度の100倍濃度の各種化合物カルノシン酸、ロスマリン酸及びコーヒー酸を調製し、カルノシン酸は最終濃度1μMとなるように添加し、ローズマリー酸とコーヒー酸は最終濃度10μMとなるように添加して、30分間反応させた後細胞を回収し、フィブロネクチンコート処理をしたボイデンチャンバーに2x105cellsを播種した。PDGF刺激群においては下位区画にPDGFを最終濃度20ngmlとなるように添加した。各種化合物も上下両区画に添加した。5時間後にメタノールで細胞を固定し、ヘマトキシリンで核を染色した。2~7日後、メンブレン下側に遊走した細胞を顕微鏡で観察し、6視野当たりの細胞数を数え、細胞遊走を評価した。また、インドキシル硫酸に対するカルノシン酸の効果を調べる場合は、48時間同調培養後、最終濃度の100倍濃度のカルノシン酸を調製し、最終濃度1μM、3μM及び5μMとなるように添加し12時間培養した。その後は、PDGFの代わりに、インドキシル硫酸を最終濃度250μMとなるように添加した以外は、上記と同様の条件で測定した。その結果を、図8および図12に示した。VECのH2O2に対する保護効果の実験96穴プレートに細胞を2x104cellswell播種し接着させた後、1FBSを含むDMEMで16時間同調培養した。その後、各化合物を添加し24時間培養後、化合物をPBSにより洗浄除去後、H2O2を最終濃度600μMとなるように添加し、さらに化合物非共存下で24時間培養した。細胞数はCellTiter96AqueousOneSolutionCellProliferationAssaykitで評価した。その結果を、図9に示した。RealtimePCRによるmRNA定量VECを6cmディッシュに5x105cellsで播き接着させた後、1FBSを含むDMEMで16時間同調培養を行った。その後、カルノシン酸を添加し、図10に示す時間12時間及び24時間反応した。全RNA抽出はISOGENニッポンジーンを用い、添付のプロトコールに従って抽出した。全RNA2~5μgを、ランダムプライマーを用いた逆転写反応に供した。逆転写によって得たcDNAにFaststartuniversalgreenmaster072x、Fowardプライマー02μM及びReverseプライマー02μMをそれぞれ加え、7300FastRealTimePCRSystemAppliedBiosystemeによってリアルタイムPCRを行った。各タンパク質のmRNA量を18SまたはGAPDHの発現量によって補正し比較した。その結果を、図10に示した。細胞内活性酸素種ROSの測定VSMCを35cmdishに2x105cells播種して接着させた後、01FBSを含む培地で48時間同調培養を行った。その後、カルノシン酸の存在下と非存在下とでそれぞれ24時間培養し、蛍光試薬2’7’dichlorofluoreseindiacetateを添加し15分間反応させた後、ISで10分間刺激した。HBSSで2回洗浄後、共焦点蛍光顕微鏡を用いて488nmの励起波長で生じた蛍光強度を測定し、細胞内ROS産生の指標とした。その結果を、図11に示した。<材料>下記の材料をそれぞれ入手して用いた材料名:入手元。インドキシル硫酸IS:株式会社クレハカルノシン酸:SigmaAntibioticantimycotic、ウシ胎児血清FBS:Invitrogenダルベッコ変法イーグル培地/栄養混合物F12ハムDMEMF12:SigmaISOGEN:ニッポンジーンイソプロパノール:ナカライテスクエタノール、クロロホルム:WakoNアセチルLシステインNACCellTiter96登録商標AQueousOneSolutionReagent:PromegaReversetranscriptionbuffer、Faststartuniversalgreenmaster:RocheRNase阻害剤:ToyoboMCP1Antibody、TGFβAntibody:CellSignalingTechnologyAntiαTubulinMousemAbDM1A:CalbiochemGoatantiratIgGHRPconjugated、AntimouseIgGconjugatedαSMactinAntibody:SigmaジチオスレイトールDTT、MMLVReversetranscriptase:InvitrogendNTPs:Appliedbiosystems各種プライマー:RIKAKEN<方法>ヒト近位尿細管細胞株HK2の培養ヒト近位尿細管細胞株HK2をAmericanTypeCultureCollectionから購入し、10FBSおよびITSインスリン1gl、トランスフェリン055gl、亜セレン酸ナトリウム000067glを含むDMEMF12培地で培養した。RealtimePCRによるmRNA定量HK2細胞を35cmディッシュに3x105cellsで播き接着させた後、01FBSを含むDMEMF12で12時間同調培養を行った。その後、最終濃度の100倍濃度のカルノシン酸を調製し、最終濃度1μM、3μM、5μMとなるように添加し、24時間培養後、さらに、インドキシル硫酸を最終濃度250μMとなるように添加して48時間反応させた。また、カルノシン酸の代わりにNACを加えた同様の実験を行った。その場合、12時間の同調培養後、NACを添加30分反応させた後、さらに72時間反応させた。全RNA抽出はISOGENニッポンジーンを用い、添付のプロトコールに従って抽出した。全RNA2~5μgを、ランダムプライマーを用いた逆転写反応に供した。逆転写によって得たcDNAにFaststartuniversalgreenmaster072x、Fowardプライマー02μM及びReverseプライマー02μMをそれぞれ加え、7300FastRealTimePCRSystemAppliedBiosystemsによってリアルタイムPCRを行った。各タンパク質のmRNA量を18SまたはGAPDHの発現量によって補正し比較した。その結果を、図13に示した。ウェスタンブロッティングMCP1、TGFβ、αSMactinの検出に関しては、HK2細胞を35cmディッシュに3x105cellsで播き接着させた後、01FBSを含むDMEMF12で12時間同調培養を行った。その後、最終濃度の100倍濃度のカルノシン酸を調製し、最終濃度1μM、3μM、5μMとなるように添加し、24時間培養後、さらに、インドキシル硫酸を最終濃度250μMとなるように添加して、72時間反応させた。HO1の検出に関しては、上記同様12時間の同調培養を行った後、濃度依存性を調べる場合は、最終濃度の100倍濃度のカルノシン酸を調製し、最終濃度1μM、3μM、5μMとなるように添加し12時間培養した。また、時間依存性を調べる場合は、カルノシン酸を最終濃度5μMとなるように添加し、6時間、12時間、24時間培養を行った。反応後のHK2は、ただちに80°Cで凍結した。その後、Lysisbufferを加え、スクレイパーで細胞を剥ぎ取り、回収した。氷上に20分間静置し、4°C、14000rpmで15分間遠心分離を行い、上清を回収した。その後、BCATMProteinAssayReagentを用いて回収した細胞抽出液のタンパク質濃度を測定し、一定量のタンパク質を含む細胞抽出液をSDSPAGEに供した。泳動終了後、分離したタンパク質をPVDFメンブレンに転写した。その後、5スキムミルクTBSTまたは5BSATBSTでブロッキングを行い、各種一次抗体で反応させた。1xTBSTで15分間メンブレンを洗浄後、二次抗体を反応させた。再び、1xTBSTで15分間メンブレンを洗浄後、ChemiLumiOneLを用いて、二次抗体に標識された西洋わさびペルオキシダーゼによる化学発光を、LAS1000又はLAS4000miniにより検出した。その結果を、図14及び図15に示した。図14及び図15に示すように、本実施例により、カルノシン酸が抗酸化活性を介してインドキシル硫酸のVSMC、VEC及びHK2に対する作用を効果的に抑制することが確認された。