"配列番号2で示されるHPV45L1タンパク質をコードするヌクレオチドの配列を含み、核酸配列が酵母細胞における高レベル発現のためコドン最適化されている、核酸分子。請求項1に記載の核酸分子を含むベクター。請求項3に記載のベクターを含む宿主細胞。宿主細胞が、サッカロミセスセレビシエ、ハンゼヌラポリモルファ、ピキアパストリス、クルイベロミセスフラギリス、クルイベロミセスラクチス及びシゾサッカロミセスポンベからなる群から選択される、請求項3に記載の宿主細胞。宿主細胞がサッカロミセスセレビシエである、請求項4に記載の宿主細胞。ヌクレオチドの配列が、配列番号1で示されるヌクレオチドの配列を含む、請求項1に記載の核酸分子。請求項6に記載の核酸分子を含むベクター。請求項7に記載のベクターを含む宿主細胞。HPV45の組換えL1タンパク質又は組換えL1L2タンパク質を含み、前記組換えL1タンパク質又は組換えL1L2タンパク質が酵母中で産生される、ウイルス様粒子VLP。組換えL1タンパク質又は組換えL1L2タンパク質が、コドン最適化されたHPV45L1核酸分子によってコードされる、請求項9に記載のVLP。コドン最適化された核酸分子が、本質的に配列番号1で示されるヌクレオチドの配列からなる、請求項10に記載のVLP。aHPV45L1タンパク質又はHPV45L1L2タンパク質をコードするコドン最適化DNA分子で酵母を形質転換すること、b組換えパピローマウイルスタンパク質を産生するために、前記コドン最適化DNA分子の発現が可能な条件下で前記形質転換された酵母を培養すること、およびc請求項10に記載のVLPを産生するために、前記組換えパピローマウイルスタンパク質を単離すること、を含む、請求項10に記載のVLPを産生する方法。請求項10に記載のVLPを含むワクチン。請求項10に記載のVLPを含む薬剤組成物。請求項13に記載のワクチンを哺乳動物に投与することを含む、HPV感染を予防する方法。請求項10に記載のVLPを動物に投与することを含む、動物において免疫応答を誘導する方法。酵母が、サッカロミセスセレビシエ、ハンゼヌラポリモルファ、ピキアパストリス、クルイベロミセスフラギリス、クルイベロミセスラクチス及びシゾサッカロミセスポンベからなる群から選択される、請求項10に記載のウイルス様粒子。酵母がサッカロミセスセレビシエである、請求項17に記載のウイルス様粒子。少なくとも1個の別のHPVタイプのVLPをさらに含む、請求項13に記載のワクチン。少なくとも1個の別のHPVタイプが、HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV51、HPV52、HPV55、HPV56、HPV58、HPV59及びHPV68からなる群から選択される、請求項19に記載のワクチン。少なくとも1個のHPVタイプがHPV16を含む、請求項20に記載のワクチン。HPV18VLPをさらに含む、請求項21に記載のワクチン。HPV6VLP及びHPV11VLPをさらに含む、請求項22に記載のワクチン。HPV31VLPをさらに含む、請求項23に記載のワクチン。HPV31VLPをさらに含む、請求項22に記載のワクチン。HPVワクチンの開発及び上市は、首尾よく形質転換された宿主生物において外来性遺伝子の高発現レベルを得ることに付随する困難によって妨げられ、精製タンパク質の製造を制限されてきた。したがって、HPV45L1タンパク質などのHPVL1タンパク質をコードする野生型ヌクレオチド配列が特定されたにもかかわらず、目的宿主細胞における発現に対して最適化されたHPV45L1をコードするヌクレオチド配列を利用する容易に更新可能な粗製HPVL1タンパク質源を開発することがきわめて望ましい。また、ワクチン開発において使用される未変性タンパク質の免疫感作特性を有する多量のHPV45L1VLPを製造することが有用である。本発明は、子宮頚癌に関連するHPV45L1遺伝子によって発現されるタンパク質産物に対して免疫を誘発又は増強する組成物及び方法に関する。具体的には、本発明は、HPV45L1タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。このポリヌクレオチドは、酵母細胞において高レベルで発現されるように、コドン最適化されている。本発明は、さらに、酵母細胞中で組換えHPV45L1又はL1L2を発現させることによって産生されるHPV45ウイルス様粒子VLPを提供し、HPVに関連する癌の予防及び/又は治療用薬剤組成物及びワクチンにおけるHPV45VLPの使用を開示する。本発明は、HPV45L1タンパク質をコードする合成DNA分子に関する。合成分子のコドンは、酵母細胞に好ましいコドンを使用するように設計されている。合成分子は、自己集合してVLPになることができるHPV45L1タンパク質源として使用することができる。前記VLPは、VLP系ワクチンに使用することができる。本発明の例示的な実施態様は、配列番号2で示されるHPV45L1タンパク質をコードする合成核酸分子を含む。前記核酸分子は、配列番号1で示されるヌクレオチド配列を含む。本明細書を通して開示される核酸分子を含む、組換えベクター及び原核生物と真核生物の両方の組換え宿主細胞も提供される。本発明は、aHPV45L1タンパク質をコードする核酸を含むベクターを酵母宿主細胞に導入する段階と、b前記HPV45L1タンパク質の発現を可能にする諸条件下で前記酵母宿主細胞を培養する段階とを含む、組換え宿主細胞中でHPV45L1タンパク質を発現させる方法にも関する。本発明は、さらに、aHPV45L1タンパク質をコードする核酸を含むベクターを酵母宿主細胞に導入する段階であって、前記核酸分子が、前記酵母宿主細胞における最適な発現用にコドン最適化された段階と、b前記HPV45L1タンパク質の発現を可能にする諸条件下で前記酵母宿主細胞を培養する段階とを含む、組換え宿主細胞中でHPV45L1タンパク質を発現させる方法にも関する。好ましい実施態様においては、核酸は、配列番号1で示されるヌクレオチド配列45L1R配列を含む。本発明は、酵母細胞において産生されるHPV45ウイルス様粒子VLP、HPV45VLPを産生する方法及びHPV45VLPを使用する方法にも関する。本発明の好ましい実施態様においては、酵母は、サッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiae、ハンゼヌラポリモルファHansenulapolymorpha、ピキアパストリスPichiapastoris、クルイベロミセスフラギリスKluyveromycesfragilis、クルイベロミセスラクチスKluyveromyceslactis及びシゾサッカロミセスポンベSchizosaccharomycespombeからなる群から選択される。本発明の別の側面は、酵母細胞中でHPV45L1又はHPV45L1L2の組換え発現によって産生されるHPV45VLPである。本発明のさらに別の側面は、コドン最適化されたHPV45L1遺伝子によってコードされるHPV45L1タンパク質を含むHPV45VLPである。本発明のこの側面の例示的な実施態様においては、コドン最適化HPV45L1遺伝子は、配列番号1で示されるヌクレオチド配列を含む。本発明は、HPV45ウイルス様粒子を動物に投与する段階を含む、動物において免疫応答を誘導する方法も提供する。好ましい実施態様においては、HPV45VLPは、コドン最適化された遺伝子によって産生される。本発明のさらに別の側面は、HPV45VLPを含むワクチンを哺乳動物に投与する段階を含む、HPV関連子宮頚癌を予防又は治療する方法である。本発明のこの側面の好ましい実施態様においては、HPV45VLPは酵母中で産生される。本発明は、HPV45ウイルス様粒子VLPを含むワクチンにも関する。本発明のこの側面の別の実施態様においては、ワクチンは、少なくとも1個の別のHPVタイプのVLPをさらに含む。少なくとも1個の別のHPVタイプは、当分野で記述される任意のHPVタイプ又は引き続き特定される任意のHPVタイプを含めて、任意の目的とするHPVタイプとすることができる。好ましい実施態様においては、HPVタイプは、いぼ、子宮頚癌などの臨床表現型に関連するタイプである。さらに好ましい実施態様においては、少なくとも1個のさらに別のHPVタイプは、HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV51、HPV52、HPV55、HPV56、HPV58、HPV59及びHPV68からなる群から選択される。本発明は、HPV45ウイルス様粒子を含む薬剤組成物にも関する。また、本発明は、HPV45VLP及び少なくとも1個の別のHPVタイプのVLPを含む薬剤組成物に関する。好ましい実施態様においては、少なくとも1個のさらに別のHPVタイプは、HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV51、HPV52、HPV55、HPV56、HPV58、HPV59及びHPV68からなる群から選択される。本明細書を通して、また、添付された特許請求の範囲において、単数形a、an及びtheは、特段の明示がない限り、複数形も含む。本明細書及び添付された特許請求の範囲を通して、以下の定義及び略語が使用される。プロモーターという用語は、RNAポリメラーゼが結合するDNA鎖上の認識部位を指す。プロモーターは、RNAポリメラーゼと開始複合体を形成して転写活動を惹起し、推進する。この複合体は、エンハンサー又は上流活性化配列と称される配列を活性化することによって、或いはサイレンサーと称される配列を阻害することによって改変することができる。ベクターという用語は、宿主生物又は宿主組織にDNA断片を導入することができるいくつかの媒介手段を指す。プラスミド、アデノウイルスを含めたウイルス、バクテリオファージ及びコスミドを含めて、さまざまなタイプのベクターがある。45L1野生型配列という名称は、本明細書では配列番号345L1wtで示されるHPV45L1DNA配列を指す。HPV45L1野生型DNA配列はすでに記述されているが、臨床分離株から得られるDNA間の小さな配列変化を発見することは珍しいことではない。したがって、代表的な45L1野生型DNA配列は、HPV45DNAを含むことがすでに判明している臨床試料から単離された実施例1参照。45L1野生型配列は、本明細書に開示されるコドン最適化45L1配列を比較するための参照配列として使用された図1参照。HPV45L1R又は45L1Rという名称は、本明細書に開示される例示的な合成HPV45L1ヌクレオチド配列配列番号1を指す。この配列は、酵母細胞による高レベル発現に好ましいコドンを含むように再構築されている。有効量という用語は、十分なワクチン組成物が導入されて適切なレベルのポリペプチドが産生され、その結果、免疫応答が生じることを意味する。当業者は、このレベルが変わり得ることを認識している。保存的アミノ酸置換とは、1個のアミノ酸残基が化学的に類似した別のアミノ酸残基で置換されることを指す。かかる保存的置換の例は、1個の疎水性残基イソロイシン、ロイシン、バリン又はメチオニンと別の疎水性残基との置換、1個の極性残基と別の同じ電荷の極性残基との置換例えば、アルギニンとリジン;グルタミン酸とアスパラギン酸である。哺乳動物のという用語は、ヒトを含めて、任意の哺乳動物を指す。VLP又はVLPsとは、ウイルス様粒子又は複数のウイルス様粒子を意味する。合成とは、指定された天然の野生型HPV45L1遺伝子45L1wt、配列番号3中に存在するヌクレオチド配列と同じでないヌクレオチド配列を含むように、HPV45L1遺伝子が生成されたことを意味する。上述したとおり、酵母細胞による発現に好ましいコドンを含むヌクレオチド配列を含む合成分子が本発明では提供される。本発明によって提供される合成分子は、野生型HPV45L1遺伝子配列番号2と同じアミノ酸配列をコードする。子宮頚癌の大多数は、ヒトパピローマウイルスHPVの特定の腫瘍形成タイプの感染と関連がある。本発明は、発癌性HPVタイプの遺伝子によって発現されるタンパク質産物に対して免疫を誘発又は増強する組成物及び方法に関する。具体的には、本発明は、自己集合してHPV45ウイルス様粒子VLPになるHPV45L1タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供し、HPVに関連する癌の予防及び/又は治療用薬剤組成物及びワクチンにおける前記ポリヌクレオチド及びVLPの使用を開示する。野生型HPV45L1ヌクレオチド配列は報告されているGenbank受託NC_001590;Delius及びHofmann、Curr.Top.Microbiol.Immunol.186:13-311994も参照されたい。本発明は、HPV45L1タンパク質をコードする合成DNA分子を提供する。本発明の合成分子は、高レベル発現のために酵母細胞に好ましいコドンを使用するようにその少なくとも一部が改変されたコドン配列を含む。合成分子は、自己集合してVLPになることができるHPV45L1タンパク質の発現用コード配列として使用することができる。前記VLPは、パピローマウイルス感染に対して、中和抗体及び細胞性免疫による有効な免疫学的予防を提供するVLP系ワクチンに使用することができる。酵母細胞におけるHPVVLPの発現は、費用効果が高く、発酵槽中での大規模増殖に容易に適合する利点がある。しかし、HPV45L1を含めて多数のHPVL1タンパク質は、酵母細胞において、市販のスケールアップに望ましいレベルよりも低いレベルで発現される。したがって、本発明は、酵母細胞環境における高レベル発現用に最適化されたHPV45L1遺伝子配列に関する。考えられる4個のヌクレオチド塩基のトリプレットコドンには60個を上回る変形が存在し得る。これらのコドンは、わずか20個の異なるアミノ酸並びに転写開始及び終結のメッセージしか与えないので、一部のアミノ酸は2個以上のコドンによってコードされるコドンの重複性として知られる現象。代替コドンは、完全には解明されていない理由のために、さまざまな細胞タイプの内因性DNA中に均一には存在しない。実際、ある種の細胞タイプにおいてはある種のコドンに対して可変の自然階層又は優先度が存在すると考えられる。一例として、アミノ酸ロイシンは、CTA、CTC、CTG、CTT、TTA及びTTGを含めた6個のDNAコドンのいずれかによって指定される。微生物についてのゲノムコドン使用頻度の徹底的な分析によれば、E.コリE.coliの内因性DNAは最も一般的にはCTGロイシン指定コドンを含むが、酵母及び粘菌のDNAは最も一般的にはTTAロイシン指定コドンを含む。この階層を考慮すると、ロイシンの豊富なポリペプチドがE.コリ宿主によって高発現レベルで得られる可能性は、コドン使用頻度にある程度依存すると一般に考えられる。例えば、TTAコドンが豊富な遺伝子はE.コリ中で発現が不十分であるのに対し、CTGが豊富な遺伝子はこの宿主においておそらく高度に発現される可能性がある。同様に、酵母宿主細胞において、ロイシンが豊富なポリペプチドの発現に好ましいコドンはTTAである。組換えDNA技術に対するコドン優先現象の含意は明白であり、この現象は、首尾よく形質転換された宿主生物において外来性遺伝子の高発現レベルを達成する先の多数の失敗を説明するのに役立ち得る。すなわち、さほど好ましくないコドンが挿入遺伝子中に繰り返して存在し、宿主細胞の発現機構が効率的に働かない可能性がある。この現象によれば、計画された宿主細胞の好ましいコドンを含むように設計された合成遺伝子は、組換えタンパク質発現を実施するのに最適な形の外来遺伝物質を提供する。したがって、本発明の一側面は、酵母細胞における高レベル発現用にコドン最適化されたHPV45L1遺伝子である。本発明の好ましい実施態様においては、同じタンパク質配列をコードする代替コドンの使用は、酵母細胞によるHPV45L1タンパク質の発現に対する制約を排除できることが見出された。本発明によれば、HPV45L1遺伝子セグメントは、同一の翻訳配列を有するが、Sharp及びCoweによって記述されたように代替コドンの使用された配列に変換されたSynonymousCodonUsageinSaccharomycescerevisiae.Yeast7:657-6781991。これを参照により本明細書に組込む。この方法は、一般に、高度に発現される酵母遺伝子に共通して関連しない野生型配列中のコドンを特定する段階と、酵母細胞における高発現に最適なコドンでそれを置換する段階とからなる。次いで、新しい遺伝子配列は、これらのコドン置換によって望ましくない配列が生成されたかどうか検査される例えば、ATTTA配列、イントロンスプライス認識部位の不意の生成、望ましくない制限酵素部位、高GC含量、酵母によって認識される転写終結シグナルの有無など。望ましくない配列は、同じアミノ酸をコードする異なるコドンで既存のコドンを置換することによって除去される。次いで、合成遺伝子セグメントは、発現が改善されたかどうか試験される。上記方法を使用してHPV45L1の合成遺伝子セグメントが作製され、酵母細胞環境における高レベル発現用に最適化されたコドンを含む遺伝子が得られた。上記手順は、HPVワクチンに使用されるコドン最適化遺伝子を設計する本発明者らの方法の概要であるが、類似のワクチン効力又は遺伝子発現の増大は、手順をわずかに変えることによって、又は配列をわずかに変えることによって達成できることを当業者は理解されたい。したがって、本発明は、HPV45L1タンパク質或いはHPV45L1タンパク質の生物学的に活性な断片又は変異型をコードするヌクレオチド配列を含み、ポリヌクレオチド配列が酵母宿主細胞における発現用に最適化されたコドンを含む合成ポリヌクレオチドに関する。HPV45L1タンパク質の前記変異型としては、保存的アミノ酸置換、アミノ末端切断、カルボキシ末端切断、欠失、付加などが挙げられるが、これらだけに限定されない。任意のかかる生物学的に活性な断片及び/又は変異体は、配列番号2で示されるHPV45L1タンパク質の免疫学的諸特性を少なくとも実質的に模倣したタンパク質又はタンパク質断片をコードする。本発明の合成ポリヌクレオチドは、治療又は予防HPVワクチンの開発に有用であるように機能的HPV45L1タンパク質を発現するmRNA分子をコードする。本発明の一側面は、配列番号2で示されるHPV45L1タンパク質をコードするコドン最適化核酸分子を含む。前記核酸分子は、配列番号1で示されるヌクレオチド配列を含む。本発明は、本明細書を通して開示される核酸分子を含む、組換えベクター及び原核生物と真核生物の両方の組換え宿主細胞にも関する。本明細書に記載の方法によって構築される合成HPV45DNA又はその断片は、適切なプロモーターと他の適切な転写制御要素とを含む発現ベクター中への分子クローニングによって組換え発現され、原核生物又は真核生物宿主細胞に移されて組換えHPV45L1を産生することができる。かかる操作技術は、Sambrook等MolecularCloning:ALaboratoryManual;ColdSpringHarborLaboratory、ColdSpringHarbor、NewYork、1989;CurrentProtocolsinMolecularBiology、Ausubel等、GreenPub.AssociatesandWiley-Interscience、NewYork1988;YeastGenetics:ALaboratoryCourseManual、Rose等、ColdSpringHarborLaboratory、ColdSpringHarbor、NewYork、1990に詳細に記載されている。これらは参照により全体が組込まれる。したがって、本発明は、aHPV45L1タンパク質をコードする核酸を含むベクターを酵母宿主細胞に導入する段階と、b前記HPV45L1タンパク質の発現を可能にする諸条件下で前記酵母宿主細胞を培養する段階とを含む、組換え宿主細胞中でHPV45L1タンパク質を発現させる方法に関する。本発明は、さらに、aHPV45L1タンパク質をコードする核酸を含むベクターを酵母宿主細胞に導入する段階であって、前記核酸分子のコドンが、前記酵母宿主細胞における最適な発現用に最適化された段階と、b前記HPV45L1タンパク質の発現を可能にする諸条件下で前記酵母宿主細胞を培養する段階とを含む、組換え宿主細胞中でHPV45L1タンパク質を発現させる方法にも関する。本発明は、さらに、a配列番号1で示される核酸を含むベクターを酵母宿主細胞に導入する段階と、b前記HPV45L1タンパク質の発現を可能にする諸条件下で前記酵母宿主細胞を培養する段階とを含む、組換え宿主細胞中でHPV45L1タンパク質を発現させる方法にも関する。本発明の合成遺伝子は、宿主細胞においてHPV45L1タンパク質を効率的に発現するように設計された配列を含む発現カセットに組み立てることができる。このカセットは、好ましくは、合成遺伝子と、プロモーター、終結配列などの作用可能にそれに連結された関係する転写及び翻訳制御配列とを含む。好ましい実施態様においては、プロモーターはS.セレビシエGAL1プロモーターである。ただし、当業者は、GAL10、GAL7、ADH1、TDH3、PGKプロモーターなどのいくつかの他の公知の酵母プロモーター又は他の真核生物遺伝子プロモーターのいずれかを使用できることを承知しているはずである。好ましい転写ターミネーターはS.セレビシエADH1ターミネーターであるが、他の公知の転写ターミネーターも使用することができる。GAL1プロモーター-ADH1ターミネーターの組み合わせが特に好ましい。本発明の別の側面は、遺伝子酵母細胞においてHPV45L1又はL1L2を組換え発現することによって産生されるHPV45ウイルス様粒子VLP、HPV45VLPを産生する方法及びHPV45VLPを使用する方法である。VLPは、ヒト及び動物パピローマウイルスの主要なカプシッドタンパク質であるL1が、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞又は細菌において発現されるときに自己集合することができる総説として、Schiller及びRoden、PapillomavirusReviews:CurrentResearchonPapillomaviruses;Lacey,ed.Leeds、UK:LeedsMedicalInformationpp101-121996を参照されたい。形態学的に不明瞭なHPVVLPも、L1とL2カプシッドタンパク質の組み合わせを発現させることによって産生することができる。VLPは、T=7正二十面体構造中の72個のL15量体で構成されるBaker等、Biophys.J.606:1445-561991。VLPは、真正のビリオンに形態学的に類似しており、動物に投与すると高力価の中和抗体を誘導することができる。ウサギBreitburd等、J.Virol.696:3959-631995及びイヌSuzich等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA9225:11553-571995をVLPで免疫すると、中和抗体を誘発し、実験的なパピローマウイルス感染を防御することが示された。しかし、VLPは、潜在的発癌性ウイルスゲノムを含んでおらず、単一遺伝子から発現されたときに自己集合することができるので、HPVワクチン開発において、生きているウイルスの使用を安全に代替するものである総説として、Schiller及びHidesheim、J.Clin.Virol.19:67-742000を参照されたい。Marais及び同僚J.Med.Virol.60:331-3362000は、バキュロウイルスから発現されるHPV45L1遺伝子から昆虫細胞中で産生されたHPV45VLPを開示している。昆虫細胞におけるVLPの発現は、付随するコストが高いのでワクチン開発に有利ではない。また、昆虫細胞培養においてHPVL1遺伝子の発現を市販製品開発に必要な大容量にスケールアップすることは困難なことが多い。酵母細胞において産生されるHPV45VLPはまだ記述されていない。酵母細胞におけるHPVVLPの発現は、費用効果が高く、発酵槽中での大規模増殖に容易に適合する利点がある。また、酵母ゲノムは、潜在的な増殖及び発現能力が増強された組換え形質転換酵母が確実に選択されるように容易に変更することができる。したがって、本発明は、酵母細胞中で発現されるHPV45の組換えL1タンパク質又は組換えL1L2タンパク質を含むウイルス様粒子に関する。本発明の好ましい実施態様においては、HPV45VLPは、サッカロミセスセレビシエ、ハンゼヌラポリモルファ、ピキアパストリス、クルイベロミセスフラギリス、クルイベロミセスラクチス及びシゾサッカロミセスポンベからなる群から選択される酵母中でHPV45L1又はHPV45L1L2を発現させることによって産生される。本発明の別の側面は、コドン最適化されたHPV45L1遺伝子を発現させることによって産生されるHPV45L1タンパク質を含むHPV45VLPである。本発明のこの側面の好ましい実施態様においては、コドン最適化HPV45L1遺伝子は、配列番号1で示されるヌクレオチド配列を含む。本発明のさらに別の側面は、aHPV45L1タンパク質又はHPV45L1L2タンパク質をコードする組換えDNA分子で酵母を形質転換する段階と、b前記組換えDNA分子の発現が可能な諸条件下で、前記形質転換された酵母を培養して、組換えHPV45タンパク質を産生する段階と、c前記組換えHPV45タンパク質を単離して、HPV45VLPを産生する段階とを含む、HPV45VLPを産生する方法である。本発明のこの側面の好ましい実施態様においては、酵母は、コドン最適化HPV45L1遺伝子で形質転換されてHPV45VLPを産生する。特に好ましい実施態様においては、コドン最適化HPV45L1遺伝子は、配列番号1で示されるヌクレオチド配列を含む。本発明は、HPV45ウイルス様粒子を動物に投与する段階を含む、動物において免疫応答を誘導する方法も提供する。好ましい実施態様においては、HPV45VLPは、コドン最適化された遺伝子によって産生される。本発明のさらに別の側面は、HPV45VLPを含むワクチンを哺乳動物に投与する段階を含む、HPV関連子宮頚癌を予防又は治療する方法である。本発明のこの側面の好ましい実施態様においては、HPV45VLPは酵母中で産生される。本発明は、HPV45ウイルス様粒子VLPを含むワクチンにも関する。本発明のこの側面の別の実施態様においては、ワクチンは、少なくとも1個のさらに別のHPVタイプのVLPをさらに含む。好ましい実施態様においては、少なくとも1個のさらに別のHPVタイプは、HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV51、HPV52、HPV55、HPV56、HPV58、HPV59及びHPV68からなる群から選択される。本発明のこの側面の好ましい実施態様においては、ワクチンはさらにHPV16VLPを含む。別の本発明の好ましい実施態様においては、ワクチンはさらにHPV16VLP及びHPV18VLPを含む。さらに別の本発明の好ましい実施態様においては、ワクチンはさらにHPV6VLP、HPV11VLP、HPV16VLP及びHPV18VLPを含む。本発明は、HPV45ウイルス様粒子を含む薬剤組成物にも関する。また、本発明は、HPV45VLP及び少なくとも1個のさらに別のHPVタイプのVLPを含む薬剤組成物に関する。好ましい実施態様においては、少なくとも1個のさらに別のHPVタイプは、HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV51、HPV52、HPV55、HPV56、HPV58、HPV59及びHPV68からなる群から選択される。本発明のワクチン組成物は、あらゆる潜在的毒性を最小限に抑えながらHPV45感染を最適に阻害するために、定常試験によって規定される適切な投与量で単体で使用することができる。また、他の薬剤の同時投与又は逐次投与が望ましい場合もある。ワクチンレシピエントに導入されるウイルス様粒子の量は、発現される遺伝子産物の免疫原性によって決まる。一般に、VLPの約10μgから100μg、好ましくは約20μgから60μgの免疫学的又は予防的有効量が筋組織に直接投与される。皮下注射、皮内導入、皮膚を介した圧入及び腹腔内、静脈内、吸入送達などの他の投与方法も企図される。追加免疫ワクチン接種を施し得ることも企図される。本発明のワクチンの非経口導入と同時の、又はそれに続く、静脈内、筋肉内、皮下などの非経口投与又はミョウバン、Merckアルミニウムアジュバントなどのアジュバントを用いた他の投与手段も有利である。本発明に関連して使用することができる方法及び材料を説明し、開示するために、本明細書に記載するすべての刊行物は参照により本明細書に組込まれる。本発明が、先行発明の効力によってかかる開示に先行する権利がないことを認めるものと解釈すべきではない。添付図面を参照して本発明の好ましい実施態様を説明したが、本発明はこれらの厳密な実施態様に限定されず、さまざまな変更及び改変が、添付された特許請求の範囲に規定される本発明の範囲又は精神から逸脱することなく、当業者によって実施され得ることを理解されたい。以下の実施例は、本発明を説明するものであって、限定するものではない。代表的HPV45L1配列の決定HPV45L1配列はすでに記述されているGenbank受託NC_001590;Delius及びHofmannCurr.Top.Microbiol.Immunol.186:13-311994参照。しかし、臨床分離株から得られるDNA間の小さな配列変化を発見することは珍しいことではない。代表的HPV45L1野生型配列を決定するために、HPV45DNAを含むことがすでに判明している4個の臨床試料からDNAが単離された。HPV45L1配列は、TaqDNAポリメラーゼ及び以下のプライマー、すなわち、HPV45L1FとHPV45L1Bを用いたポリメラーゼ連鎖反応法PCRによって増幅された。増幅された生成物をアガロースゲル上で電気泳動させ、臭化エチジウム染色によって可視化した。約1500bpのL1バンドを切り取り、QIAquickPCR精製キットQiagen、Hilden、Germanyを用いてDNAを精製した。次いで、DNAをTAクローニングベクターInvitrogenCorp.、Carlsbad、CAに連結し、E.コリを連結混合物で形質転換し、アンピシリンIPTG及びX-galを含む青/白コロニー選択用LB寒天上に蒔いた。プレートを反転させ、37°Cで16時間インキュベートした。PCR増幅された4個の臨床分離株の各々に由来する8個の白コロニーについてコロニーPCRを実施した。HPV45L1DNAは、プライマーHPV45L1F及びHPV45L1Bを用いてPCR増幅された。特定のPCRプロトコルは、98°C15秒変性、50°C30秒アニーリング及び68°C2分伸長の25サイクルからなった。PCR産物は、アガロースゲル電気泳動後に臭化エチジウム染色によって可視化された。各分離株由来のいくつかのコロニーはL1バンドを含んだ。各分離株由来の第2のコロニーは、アンピシリンを含むLB培地中で37°Cで16時間振とうしながら培養された。ミニプレップを実施してコロニーからプラスミドDNAを抽出した。4個の臨床分離株由来の増幅されクローン化されたHPV45L1DNAを含むプラスミドについてDNA配列を決定した。DNAと翻訳されたアミノ酸配列を互いに比較し、GenbankHPV45L1配列と比較した。4個の臨床分離株の配列分析によれば、Genbank配列と同一な配列のないことが判明した。分離株33由来のHPV45L1プラスミドが代表的な45L1野生型wt配列として選択され、本明細書では45L1野生型配列配列番号3、図1参照と称される。この配列は、9個のヌクレオチド、3個のアミノ酸、後続の配列読み枠を維持する欠失、5つのアミノ酸変化を生じる5個の点突然変異及び8つのさらなるサイレントな点突然変異を含んだ。Genbank配列のアミノ酸495から497は45L1wtにおいて欠失している。Genbankアミノ酸番号23S->N、55N->S、303I->T、357S->N及び356Q->Hは、5つのアミノ酸変化を表すGenbankaa->45L1wtaa。8つのサイレントな突然変異は配列全体に分布した。図1を参照されたい。45L1野生型配列をLS-112とHPV45L1EASプライマーを用いて増幅してBglII伸長部を付加した。PCRは、Ventポリメラーゼを用いて実施された。PCR産物はアガロースゲルの臭化エチジウム染色によって可視化された。約1500bpのバンドを切り取り、QIAEXIIゲル抽出キットQiagenを用いてDNAを精製した。次いで、PCR産物は、BglIIを用いて37°Cで2時間消化され、QIAquickPCR精製キットを用いて精製された。BglIIによって消化されたHPV45L1PCR産物を、Hofmann等、Virology209:506-181995に記載されたBamHIによって消化されたpGAL110に連結し、E.コリDH5をこの連結混合物で形質転換した。コロニーを正確な配向のHPV45L1挿入断片についてPCRによってスクリーニングした。配列及び配向はDNA配列決定によって確認された。選択されたクローンは、pGAL110-HPV45L16と命名された。このクローンは、PstI、EcoRI及びHindIIIを用いて消化されて、pGAL110ベクター内のHPV45L1遺伝子の制限酵素断片プロファイルが求められた。DNA断片はアガロースゲル上を電気泳動された。得られた制限酵素断片プロファイルは臭化エチジウム染色によって可視化され、UV光を用いて観察された。MaxiprepDNAを調製した。サッカロミセスセレビシエ細胞は、Glusulaseを用いたスフェロプラスト化によって形質転換受容性とされ、pGAL110-HPV45L16で形質転換された。酵母形質転換混合物は、Leu-ソルビトールプレート上のLeu-ソルビトール上層寒天中に蒔かれ、30°Cで5から7日間反転インキュベートされた。コロニーが選択され、Leu-ソルビトールプレート上でのクローン単離のために画線された。続いて、単離されたコロニーは、回転試験管培養物中の1.6グルコース及び4ガラクトースを含む5×Leu-Ade-ソルビトール5mL中で30°Cで増殖されてL1転写及びタンパク質発現が誘発された。酵母コドン最適化酵母に好ましいコドンは記述されているSharp,PaulM及びCowe,Elizabeth1991SynonymousCodonUsageinSaccharomycescerevisiaeYEAST7:657-678。HPV45L1wtタンパク質の発現は検出可能であった。しかし、市販の製品開発に必要な高い発現を得るために、酵母に好ましいコドンを用いてHPV45L1遺伝子を再構築した。前記再構築配列は、ワクチン開発に使用される野生型をかなり上回る高いHPV45L1発現をもたらす。45L1wtのヌクレオチド配列は、酵母に最適化なコドン配列を利用して配列が再構築されると、392位が変化して45L1RR=再構築が生成された。しかし、アミノ酸配列は変わらなかった。HPV45L1Rのヌクレオチド配列番号1及びアミノ酸配列番号2配列を図2に示す。遺伝子再構築のために採用された戦略は、遺伝子にまたがり、長くオーバーラップするセンスオリゴマーとアンチセンスオリゴマーを設計し、もとのアミノ酸配列を維持しながら酵母に好ましいコドン配列でヌクレオチドを置換することであった。これらのオリゴマーは、PCR反応においてテンプレートDNAの代わりに使用された。テンプレートオリゴマー由来の再構築配列を増幅するために、追加の増幅プライマーが設計され、使用された。25サイクルのPCRにおいてPfuDNAポリメラーゼが使用された。最適増幅条件はセクション特異的section-specificであったが、94°C5分変性と、それに続く95°C30秒変性、55から50°C30秒アニール及び72°C1.5分伸長の25サイクルと、それに続く72°C7分の最終伸長並びに4°C保持に類似したプログラムが最も使用された。PCR産物はアガロースゲル電気泳動によって検査された。適切なサイズのバンドが切り取られ、DNAゲルが精製された。次いで、増幅断片は、1533nt再構築HPV45L1遺伝子を組み立てるためのテンプレートとして使用された。再構築後、1533ntバンドはゲル精製され、pCR4BluntInvitrogenに連結され、E.コリTOP10細胞はこの連結混合物で形質転換された。コロニーは、アンピシリンを含むLB4mL中で増殖され、プラスミドDNAが標準ミニプレップ技術によって抽出された。プラスミドDNAは、45L1再構築のための所望の変化の存在を確認するために配列決定された。45L1R再構築は、BamHI伸長部を両末端に付加し、さらにATG開始コドンの上流の酵母5’非翻訳リーダー配列を付加するためにpCR4Blunt-45L1Rから再増幅された。増幅断片は上記のようにクローン化され、プラスミドDNAは配列決定された。プラスミドpCR4Blunt-45L1RBamはBamHIで消化され、DNA断片はアガロースゲル上を電気泳動された。約1550bpの45L1RBam断片はゲル精製され、BamHIで消化されたpGAL110に連結され、TOP10F’E.コリInvitrogenに形質転換された。コロニーは、pGAL110における正確な配向のHPV45L1挿入断片についてPCRによってスクリーニングされた。配列及び配向はDNA配列決定によって確認された。MaxiprepプラスミドDNAが調製され、スフェロプラスト化によって形質転換受容性とされたS.セレビシエ細胞の形質転換に使用された。形質転換された酵母は、Leu-ソルビトールプレート上のLeu-ソルビトール上層寒天中に蒔かれ、7日間反転インキュベートされた。コロニーは、Leu-ソルビトールプレート上でのクローン単離のために画線された。続いて、単離されたコロニーは、回転試験管培養物中の1.6グルコース及び4ガラクトースを含む5×Leu-Ade-ソルビトール5mL中で30°Cで増殖されてL1転写及びタンパク質発現が誘発された。48時間後、OD600=10相当の培養体積をペレット化し、上清を除去し、ペレットを凍結し、-70°Cで保存した。RNA調製ガラクトース誘導によってHPV45L1を発現するように誘導された形質転換酵母の細胞ペレットを氷上で解凍し、Trizol試薬LifeTechnologies、GibcoBRL0.8mLに懸濁させ、室温で5分間インキュベートした。クロロホルム1/5体積をバイアルに添加した。次いで、それを15秒間激しく振とうして混合し、室温で3分間インキュベートした。13krpmで5分間遠心分離した後、上相を収集し新しいバイアルに移した。イソプロパノール0.4mLを添加し、室温で10分間インキュベートした。13krpmで10分間遠心分離してRNAをペレット化した。上清をデカントし、RNAペレットを75EtOHで洗浄し、遠心分離を繰り返した。上清をデカントし、RNAペレットを15分間風乾し、続いてRNaseを含まない水に懸濁させた。分光測光法を実施し、A260/280が1.7から2.0であるときの1のA260の読み=40μg/mlRNAと仮定して試料中のRNA濃度を求めた。ノーザンブロット分析1.1アガロースホルムアルデヒドゲルを成型した。RNA5及び10マイクログラムを変性緩衝剤最終濃度:6ホルムアルデヒド、50ホルムアミド及び0.1×MOPSと混合し、65°Cに10分間加熱した。ゲルローディングバッファー1/10体積を添加し、試料をゲルに載せた。電気泳動を1×MOPS緩衝剤中75ボルトで約3時間実施した。ゲルを10×SSCで60分間洗浄した。RNAを10×SSC中で毛管作用によって16時間かけてHybond-Nナイロン膜AmershamBiosciences、Piscataway、NJに移した。次いで、StratageneUVStratalinkerStratagene、LaJolla、CA自動架橋機能を用いた架橋によってRNAをナイロン膜に固定した。固定後、ナイロン膜を風乾させた。RocheDIGHighPrimeDNALabelingandDetectionKitIF.Hoffmann-LaRocheLtd.、Basel、Switzerlandを使用して、ノーザンブロットで45L1RRNAを検出するプローブとして使用されるDIGで45L1RDNA配列を標識した。プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション及び抗DIGアルカリホスファターゼ複合抗体を用いた免疫発生immunologicaldevelopmentを製造者の推奨に従って実施した。手短に述べると、ブロットを静かに振とうしながら37°Cで30分間プレハイブリッド形成させた。プローブを95°Cで5分間加熱して変性させ、氷上でクエンチした。プローブをプレハイブリダイゼーション溶液に添加し、静かに振とうしながら膜に44.6°Cで4時間塗布した。次いで、ハイブリダイゼーション溶液を除去し、0.1SDSを含む2×SSCを用いてブロットを室温で5分間2回洗浄し、続いて0.5×SSC及び0.1SDSを用いて65°Cでさらに洗浄した。次いで、ブロットを30分間ブロックし、抗DIGアルカリホスファターゼ複合抗体を1:5000希釈で30分間塗布した。ブロットを洗浄し、プローブに結合したRNAの有無をアルカリホスファターゼ複合抗DIG結合抗体のNBT/BCIP基質検出によって求めた。45L1wtを発現する酵母の初期の分析によれば、機能的HPV45L1転写及び翻訳が存在することが示唆された。しかし、配列は、酵母に好ましいコドン配列で再構築され、ワクチン開発に有用な高い発現レベルが得られた。再構築45L1配列は、考えられるあらゆる中途の転写終結点を取り除いて頑強な転写が確実になされるように操作された。45L1R転写物のノーザンブロット分析によって、完全長転写物が生成されたことが判明した図3。HPV45L1タンパク質発現ガラクトースによって誘導されたOD600=10相当の培養物の凍結酵母細胞ペレットを氷上で解凍し、PC緩衝剤100mMNa2HPO4及び0.5MNaCl、pH7.0300μlに2mMPMSFと一緒に懸濁させた。酸洗された0.5mmガラスビーズを約0.5g/試験管で添加した。1分間の中断をはさみ4°C5分間の3サイクルで試験管をボルテックス撹拌した。20Triton1007.5μlを添加し、ボルテックス撹拌を4°Cで5分間繰り返した。試験管を氷上に15分間置き、次いで4°Cで10分間遠心分離した。上清を無菌微量遠心管に移し、全酵母タンパク質抽出物のラベルを貼り、日付けを記入し、-70°Cで保存した。ウエスタンブロット分析各45L1構築体に対する20個の単離酵母コロニーから得られた全酵母タンパク質抽出物は、ウエスタンブロットによって分析されてガラクトース誘導後の45L1タンパク質の発現が確認された。全酵母タンパク質抽出物10マイクログラムをSDS-PAGEローディングバッファーと混合し、95°Cに10分間加熱した。タンパク質を10SDS-PAGEゲルに載せ、Tris-グリシン緩衝剤中で電気泳動させた。タンパク質分離後、タンパク質をウェスタン法によってゲルからニトロセルロースに移し、ブロットを揺動させながら1×希釈緩衝剤KirkegaardandPerryLaboratoriesで室温で1時間ブロックした。ブロットを3回洗浄し、次いでヤギ抗trpE-HPV45L1血清の1:2500希釈物と一緒に室温で16時間インキュベートした。次いで、ブロットを3回洗浄し、抗ヤギ-HRP複合抗体の1:2500希釈物と一緒に1時間インキュベートした。ブロットを再度3回洗浄し、NBT/BCIP検出基質を塗布したKirkegaardandPerryLaboratories。免疫反応性タンパク質は、ブロット上で紫色のバンドとして検出された。その結果、すべての場合において、45L1タンパク質は、ニトロセルロース上で約57kDaに相当する明瞭な免疫反応性バンドとして検出された図4。約55kDaである16L1タンパク質は、HPVL1を含まない負の対照の全酵母タンパク質抽出物と一緒に、正の対照として含まれたデータ示さず。ELISAアッセイHPV45L1を発現する酵母細胞は、回転試験管培養、振とうフラスコ及び発酵槽を含めてさまざまな方法によって増殖された。酵母を溶解し、総タンパク質量の1マイクログラム当たり産生されるHPV45L1ウイルス様粒子VLPの量を測定するためにタンパク質抽出物を調製した。HPV45L1VLP発現を実証するためにサンドイッチELISAが設計された。酵母タンパク質抽出物中に存在する45L1VLPに結合させるために、HPVタイプ18と45L1VLPの両方を認識するH18R.5モノクローナル抗体mAbを使用した。非結合タンパク質を洗浄除去し、HPV45L1VLPタイプの高次構造特異的mAbであるH45.10B11.A5を検出抗体として塗布した。真の高次構造的に正しい45L1VLPは結合し、抗マウスIgG1HRP複合抗体及びTMB基質を使用することによって検出が容易になった。具体的には、H18R.5を使用してImmulon4HBX96ウェルプレートの底部を終夜4°Cで被覆した。プレートをPBS及び0.05Tween20で3回洗浄し、続いてブロッキング溶液PBS0.05Tween201BSAでブロックした。プレートを3回洗浄し、抗原ブロッキング溶液で100μg/mlに希釈された全酵母細胞溶解物を列Aに2つ組で塗布した。精製HPV45L1VLPの比較基準を列Aカラム1及び2に100μg/ml全酵母タンパク質中3300ng/mlで塗布した。次いで、基準試料と試験試料を各カラム連続して2倍希釈した。室温で3時間後、過剰の抗原を吸引除去し、プレートを3回洗浄した。HPV45L1VLP高次構造特異的mAbH45.10B11.A5を含む細胞上清をブロッキング溶液で1:80希釈し、各ウェルに室温で1時間適用した。プレートを3回洗浄し、ブロッキング溶液で1:8000希釈された抗マウスIgG1HRP複合抗体を室温で1時間塗布した。プレートを洗浄し、TMBPierceを5分間適用して、HRP複合抗体複合体を検出した。2MH2SO4を添加して検出反応を停止した。プレートを波長450nmで読取り、比較基準と比較してHPV45L1VLPの濃度をngVLP/μg総タンパク質量単位で測定した。すべて2回分析された45L1wtと2個の別個の45L1Rクローンの比較を図5に示す。再構築HPV45L1VLP発現は45L1wtの観測結果の約2倍であった図6。透過型電子顕微鏡法45L1タンパク質が実際に自己集合して自己集合してウイルス様粒子になる5量体L1カプソメアを形成することを実証するために、ある程度精製された45L1Rタンパク質抽出物を透過型EMによって分析した。酵母細胞を小規模発酵条件下で増殖させ、ペレット化し、ペレットを精製処理した。L1タンパク質が発現され精製手順を通して保持されることを実証するために、ペレット及び浄化された酵母エキスを免疫ブロットによって分析した。次いで、浄化酵母エキスを45スクロースクッション上で遠心分離にかけ、生成したペレットを緩衝剤に懸濁させて透過型電子顕微鏡法EMによって分析した。産生された45L1RVLPの代表的試料を図6に示す。この粗製試料中の球状粒子の直径は40から60nmであり、一部の粒子は、規則的な配列のカプソメアを示した。"