"i少なくとも50個のプロリンProおよびアラニンAlaアミノ酸残基からなる、もっぱら、プロリンおよびアラニンアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む生合成ランダムコイルポリペプチドまたはポリペプチドセグメントと、iia生物学的に活性なタンパク質、または生物活性を有する、もしくは媒介するアミノ酸配列を含むか、もしくは生物活性を有する、もしくは媒介するアミノ酸配列であるポリペプチドおよびb小分子薬からなる群から選択される薬物とを含む薬物コンジュゲート。前記ランダムコイルポリペプチドまたはポリペプチドセグメントが、約50個~約3000個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の薬物コンジュゲート。前記プロリン残基が、アミノ酸配列の約10超かつ約75未満を構成する、請求項1または2に記載の薬物コンジュゲート。前記ランダムコイルポリペプチドまたはポリペプチドセグメントが、複数のアミノ酸リピートを含み、前記リピートが、プロリンおよびアラニン残基からなり、6個以下の連続したアミノ酸残基が同一である、請求項1から3のいずれか一項に記載の薬物コンジュゲート。前記ランダムコイルポリペプチドまたはポリペプチドセグメントが、またはこれらの配列全体もしくはこれらの配列の部分の環状パーミューテッドバージョンもしくは多量体単数または複数からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の薬物コンジュゲート。前記生物活性を有するポリペプチド、前記生物学的に活性なタンパク質、または前記生物活性を有するか、もしくは媒介するアミノ酸配列を含むか、もしくは生物活性を有する、もしくは媒介するアミノ酸配列であるポリペプチドが、結合タンパク質、抗体断片、サイトカイン、増殖因子、ホルモンまたは酵素からなる群から選択される、請求項1から5のいずれか一項に記載の薬物コンジュゲート。前記生物活性を有するポリペプチドが、結合タンパク質であり、前記結合分子が、抗体、Fab断片、Fab’2断片、CDR由来ペプチドミメティック、一本鎖可変断片scFv、ドメイン抗体、レクチン、免疫グロブリンドメイン、フィブロネクチンドメイン、プロテインAドメイン、SH3ドメイン、アンキリンリピートドメインおよびリポカリンからなる群から選択される、請求項6に記載の薬物コンジュゲート。前記生物学的に活性なタンパク質が、顆粒球コロニー刺激因子、ヒト成長ホルモン、α-インターフェロン、β-インターフェロン、γ-インターフェロン、腫瘍壊死因子、エリスロポエチン、凝固因子VIII、gp120/gp160、可溶性腫瘍壊死因子IおよびII受容体、レテプラーゼ、エキセンディン-4、アナキンラ、インターロイキン-2、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン、卵胞刺激ホルモン、グルコセレブロシダーゼ、チモシンα1、グルカゴン、ソマトスタチン、アデノシンデアミナーゼ、インターロイキン11、凝固因子VIIa、凝固因子IX、ヘマタイド、λ-インターフェロン、レプチン、インターロイキン-22受容体サブユニットαIL-22ra、インターロイキン-22、ヒアルロニダーゼ、線維芽細胞増殖因子18、線維芽細胞増殖因子21、グルカゴン様ペプチド1、オステオプロテジュリン、IL-18結合タンパク質、成長ホルモン放出因子、可溶性TACI受容体、トロンボスポンジン-1、可溶性VEGF受容体Flt-1およびIL-4ムテインからなる群から選択される、請求項1から7のいずれか一項に記載の薬物コンジュゲート。前記生合成ランダムコイルポリペプチドまたはポリペプチドが、前記薬物コンジュゲートの増大したinvivoおよび/またはinvitro安定性を媒介する、請求項1から8のいずれか一項に記載の薬物コンジュゲート。前記増大したinvivo安定性が、少なくとも50個のプロリンProおよびアラニンAlaアミノ酸残基からなる、もっぱら、プロリンおよびアラニンアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む前記生合成ランダムコイルポリペプチドまたはポリペプチドセグメントを含む前記薬物コンジュゲートの、前記ランダムコイルランダムコイルポリペプチドまたはポリペプチドセグメントを欠く対照ポリペプチドまたは対照コンジュゲートの安定性と比較した場合における、延長された血漿半減期である、請求項9に記載の薬物コンジュゲート。前記小分子が、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、ドキソルビシン、カリケアマイシン、カンプトテシン、フマギリン、デキサメタゾン、ゲルダナマイシン、パクリタキセル、ドセタキセル、イリノテカン、シクロスポリン、ブプレノルフィン、ナルトレキソン、ナロキソン、ビンデシン、バンコマイシン、リスペリドン、アリピプラゾール、パロノセトロン、グラニセトロン、シタラビンNX1838、ロイプロリド、ゴセレリン、ブセレリン、オクトレオチド、テデュグルチドteduglutide、シレンジチドcilengitide、アバレリックス、エンフビルチド、グレリン、α4インテグリン阻害剤、アンチセンス核酸、短鎖干渉RNA、マイクロRNA、ステロイド、DNAまたはRNAアプタマーならびにペプチドおよび/またはペプチドミメティックからなる群から選択される、請求項1から10のいずれか一項に記載の薬物コンジュゲート。請求項1から11のいずれか一項に記載の薬物コンジュゲートを含む組成物。1または複数の薬学的に許容される担体を場合によりさらに含む医薬組成物である、または診断用組成物において許容される1または複数の担体を場合によりさらに含む診断用組成物である、請求項12に記載の組成物。請求項1から11のいずれか一項に記載の薬物コンジュゲート中に含まれるランダムコイルポリペプチドまたはポリペプチドセグメントをコードする核酸分子、または請求項6から8のいずれか一項に記載の生物学的に活性なタンパク質を含み、少なくとも50個のプロリンProおよびアラニンAlaアミノ酸残基からなる、もっぱら、プロリンおよびアラニンアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む生合成ランダムコイルポリペプチドまたはポリペプチドセグメントを含むタンパク質コンジュゲートをコードする核酸分子。i翻訳されるアミノ酸および/またはリーダー配列をコードする核酸配列と;ii少なくとも50個のプロリンProおよびアラニンAlaアミノ酸残基からなる、もっぱら、プロリンおよびアラニンアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む生合成ランダムコイルポリペプチドまたはポリペプチドセグメントをコードする核酸配列と;iii生物学的に活性なタンパク質、または生物学的活性および/もしくは治療活性を有する、もしくは媒介するアミノ酸配列を含むか、または生物学的活性および/もしくは治療活性を有する、もしくは媒介するアミノ酸配列である前記ポリペプチドをコードする核酸配列と;iv翻訳停止コドンを表すか、または翻訳停止コドンである核酸配列とを含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の薬物コンジュゲートをコードする核酸分子。iiに記載およびiiiに記載の核酸分子部分またはセグメントが、薬物コンジュゲートをコードする前記核酸分子上でそれらの位置が交換されている、請求項15に記載の核酸分子。iに記載およびiiに記載の部分もしくはセグメントの間、ならびに/またはiiおよびiiiに記載の部分もしくはセグメントの間に、プロテアーゼおよび/または化学的切断部位および/または認識部位を場合により含む、請求項15または16に記載の核酸分子。少なくとも50個のプロリンProおよびアラニンAlaアミノ酸残基からなる、もっぱら、プロリンおよびアラニンアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む生合成ランダムコイルポリペプチドまたはポリペプチドセグメントをコードする核酸であって、前記核酸分子が、i翻訳されるアミノ酸および/またはリーダー配列をコードする核酸配列と;iiもっぱら、プロリンおよびアラニンアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む前記生合成ランダムコイルポリペプチドまたはポリペプチドセグメントをコードする核酸配列と;iii翻訳停止コドンを表すか、または翻訳停止コドンである核酸配列とを含む核酸。iおよびiiの間に、プロテアーゼおよび/または化学的切断部位および/または認識を場合により含む、請求項18に記載の核酸分子。請求項14から19のいずれか一項に記載の核酸を含むベクター。請求項14から19のいずれか一項に記載の核酸または請求項20に記載のベクターを含む宿主細胞。真核宿主細胞である、請求項21に記載の宿主細胞。前記真核宿主細胞が、真菌または動物細胞である、請求項22に記載の宿主細胞。請求項1から11のいずれか一項に記載の薬物コンジュゲート中に含まれるランダムコイルポリペプチドもしくはランダムコイルポリペプチドセグメントを調製する方法、前記ランダムコイルポリペプチドもしくは前記ランダムコイルポリペプチドセグメントを含む生物学的に活性なタンパク質もしくは薬物もしくは食品コンジュゲートを調製する方法、および/または請求項1から8のいずれか一項に記載の生物活性を有する、もしくは媒介するアミノ酸配列を含むか、または生物活性を有する、もしくは媒介するアミノ酸配列であり、前記ランダムコイルポリペプチドもしくはランダムコイルポリペプチドセグメントをさらに含むポリペプチドを調製する方法であって、請求項21から23のいずれか一項に記載の細胞を培養することと、前記ランダムコイルポリペプチドもしくは生物学的に活性なタンパク質および/または前記生物学的に活性なタンパク質もしくは前記ポリペプチドを、培養物から、または前記細胞から単離することとを含む方法。ホルモン欠乏症関連障害、自己免疫疾患、増殖性障害、癌、貧血、血管新生疾患、感染/炎症性疾患、アレルギー性障害、血栓症、心筋梗塞、再狭窄restinosis、糖尿病、不妊症、ゴーシェ病、慢性B型肝炎、C型肝炎、低血糖、先端巨大症、アデノシンデアミナーゼ欠乏症、血小板減少症、血友病、貧血、肥満症、アルツハイマー病、リポジストロフィーlipodistrophy、乾癬、転移性黒色腫、変形性関節症、脂質代謝異常、関節リウマチ、全身性エリテマトーデスsystemiclupuserythromatosis、多発性硬化症、喘息、骨粗鬆症および再灌流傷害またはその他の腎臓疾患の治療のための、請求項1から11のいずれか一項に記載の薬物コンジュゲート、請求項12または13に記載の組成物、請求項14から19のいずれか一項に記載の核酸、請求項20に記載のベクター、請求項21から23のいずれか一項に記載の細胞、または請求項24に記載の方法によって調製された、前記ランダムコイルポリペプチドもしくはランダムコイルポリペプチドセグメントを含む生物学的に活性なタンパク質もしくはポリペプチド。前記ランダムコイルポリペプチドまたはポリペプチドセグメント、生物学的に活性なタンパク質または薬物コンジュゲートの、invivoおよび/またはinvitro安定性が増大した医薬として使用するための、請求項1から11のいずれか一項に記載の薬物コンジュゲート、請求項12または13に記載の組成物、請求項14から19のいずれか一項に記載の核酸、請求項20に記載のベクターまたは請求項21から24のいずれか一項に記載の細胞。化粧品における、美容的処置における、栄養における、または食品技術における、または製紙業における、請求項1から5のいずれか一項に記載、または請求項14から19のいずれか一項に記載の核酸分子もしくはその一部によってコードされるランダムコイルポリペプチドまたはランダムコイルポリペプチドセグメントの使用。請求項1から11のいずれか一項に記載のコンジュゲート、化粧品、美容的処置において使用される化合物、食品もしくは飲料または産業において注目されるコンジュゲートを製造する方法であって、請求項21から23のいずれか一項に記載の細胞を培養することと、前記ランダムコイルポリペプチド、前記生物学的に活性なタンパク質および/または生物活性もしくは注目される活性を有する、もしくは媒介するアミノ酸配列を有するか、もしくは生物学的に活性なタンパク質および/または生物活性もしくは注目される活性を有する、もしくは媒介するアミノ酸配列であり、前記ランダムコイルポリペプチドもしくはランダムコイルポリペプチドセグメントをさらに含む前記生物学的に活性なタンパク質もしくは前記ポリペプチドを培養物から、または前記細胞から単離することとを含む方法。前記前記ランダムコイルポリペプチド、前記生物学的に活性なタンパク質および/または生物活性もしくは注目される活性を有する、もしくは媒介するアミノ酸配列を含むか、もしくは生物活性もしくは注目される活性を有する、もしくは媒介するアミノ酸配列であり、前記ランダムコイルポリペプチドもしくはランダムコイルポリペプチドセグメントをさらに含む前記生物学的に活性なタンパク質もしくは前記ポリペプチドが、増殖培地または培養培地、細胞溶解物、細胞膜画分、前記宿主細胞の周辺質から単離される、請求項28に記載の方法。前記ランダムコイルポリペプチドが、注目される分子に連結および/またはカップリングされている、請求項28または29に記載の方法。前記連結または前記カップリングが、化学的連結またはカップリングである、請求項30に記載の方法。本発明を、本発明およびその多数の利点のより良好な理解を提供する以下の例示的な限定されない例によってさらに記載する。特に断りのない限り、例えば、Sambrook同著に記載される組換え遺伝子技術の確立された方法を使用した。Pro/Alaアミノ酸ポリマー/ポリペプチドの遺伝子合成。本明細書において上記で記載されるように、ProおよびAla残基からなるアミノ酸リピートは、本明細書においてPro/AlaまたはPAと表される。ProおよびAlaを含む反復ポリマー配列をコードする遺伝子断片配列番号1に対応するPA番号1は、図1に示される2種の相補的オリゴデオキシヌクレオチド配列番号17および配列番号18のハイブリダイゼーションと、それに続く、相互に適合するが、非回文構造の付着末端のDNAライゲーションによる方向性のある方法でのコンカテマー形成によって得た。オリゴデオキシヌクレオチドは、ThermoScientificUlm、Germanyから購入し、分取尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製した。オリゴデオキシdesoxyヌクレオチドの核酸配列が図1に表されている対応する付着末端のライゲーションの際に以下のPA番号1配列リピートの一部となる、アラニンに対するさらなるGCCコドンを含む配列番号17および18。酵素的リン酸化は、100μlの50mMTris/HClpH7.6、10mMMgCl2、5mMDTT、1mMATP中で200pmolの両オリゴデオキシヌクレオチドを混合し、10uのポリヌクレオチドキナーゼMBIFermentas、St.Leon-Rot、Germanyの存在下、37°Cで30分間インキュベートすることによって実施した。80°Cで10分間変性させた後、混合物を室温に一晩冷却して、ハイブリダイゼーションを達成した。次いで、50μlのこの溶液を、1uのT4DNAリガーゼMBIFermentasおよび10μlの100mMTris/HClpH7.4、50mMMgCl2、20mMDTT、10mMATP、場合によっては、5mMの各dATP、dCTP、dGTPおよびdTTPを100μlの総容量に添加することおよび氷上で55分間インキュベートすることによってライゲーションした。70°Cで10分間熱不活性化した後、ライゲーション生成物を、TAEバッファー40mMTris、20mM酢酸、1mMEDTAの存在下で1.5w/vアガロースゲル電気泳動によって分離した。臭化エチジウムを用いて染色した後、300bpの長さの組み立てられたassembled遺伝子セグメントに対応するバンドを切り出し、単離した。Fab-PA番号1融合タンパク質の発現ベクターとしてのpFab-PA番号1200の構築。実施例1から得られたPA番号1の20個のアミノ酸配列をコードする10マーのリピートの合成遺伝子断片のクローニングのために、プラスミドベクターpASK88-Fab-2xSapI配列番号22、軽鎖の3’末端に、逆の相補的方向に2つのSapI制限部位を有するヌクレオチド配列を有するFab断片の発現プラスミドSchlapschyProteinEngDesSel20273~284頁図2Aを使用した。pASK75の誘導体であるSkerra、AGene151131~135頁このベクターを、SapIを用いて切断し、エビアルカリホスファターゼUSB、Cleveland、OHを用いて脱リン酸化し、実施例1から得られた合成DNA断片の300bpのカセットとライゲーションした。得られた中間プラスミドpFab-PA番号1100を、SapIを用いて再度切断し、エビアルカリホスファターゼを用いて脱リン酸化し、実施例1から得られた合成DNA断片の300bpのカセットとライゲーションした図2Bに例示されるが、PA番号120ポリマー/ポリペプチドカセットのみを有する。得られたプラスミドは、pFab-PA番号1200配列番号28図2Cと表した。このプラスミド上、200個の残基のPA番号1配列リピートのコーディング領域は、2つのSapI制限が隣接しており、これによって、5’-GCCヌクレオチドオーバーハングを保持する全配列カセットの正確な切り出しおよびさらなるサブクローニングが可能となるということは留意されなければならない。大腸菌EcoliXL1-Blueを形質転換した後BullockBiotechniques5376~378頁、プラスミドを調製し、クローニングされた合成核酸インサートの配列を、BigDye商標ターミネーターキットならびに両側からの配列決定を可能にしたオリゴデオキシヌクレオチドプライマーを使用して、制限分析および二本鎖DNA配列決定ABI-Prism商標310Geneticanalyzer、Perkin-ElmerAppliedBiosystems、Weiterstadt、Germanyによって確認した。PA番号1200-IFNa2b融合タンパク質の発現ベクターとしてのpASK-PA番号1200-IFNa2bの構築。200個の残基のPA番号1配列リピート、PA番号1200を有する融合物としてIFNa2bをコードする発現プラスミドを構築するために、pASK-IFNa2b配列番号32図2DをSapI用いて切断し、エビアルカリホスファターゼを用いて脱リン酸化し、SapIを用いる制限消化によって、先に構築したプラスミドpFab-PA番号1200実施例2から切り出した、200個の残基のPA番号1ポリペプチドをコードする遺伝子断片とライゲーションした図2Eに例示されるが、PA番号120ポリマー/ポリペプチドカセットのみを有する。大腸菌EcoliJM83形質転換した後YanischPerronGene33103~119頁、プラスミドを調製し、制限分析によって正しいインサートの存在を確認した。得られたプラスミドは、pPA番号1200-IFNa2b配列番号37図2Fと表した。Fab断片および遺伝子によってコードされるPA番号1ポリマー/ポリペプチド間の融合タンパク質の細菌製造および精製。Fab断片算出された質量:48.0kDaおよびFab-PA番号1200融合物算出された質量:64.3kDaを、100mg/lのアンピシリンおよび30mg/lのクロラムフェニコールを含有する2LのLB培地を用い、振盪フラスコ培養を使用して、実施例3から得られた対応する発現プラスミドを、フォールディングヘルパープラスミドpTUM4SchlapschyProteinEngDesSel19385~390頁と一緒に有する大腸菌EcoliKS272において22°Cで製造した。組換え遺伝子発現の誘導は、OD550=0.5で一晩、0.4mgのアンヒドロテトラサイクリンを加えることによって実施した通常、回収時に約1.0のOD550をもたらす。50μg/mlリゾチームを含有する、500mMスクロース、1mMEDTA、100mMTris/HClpH8.0の存在下での周辺質抽出を、別の場所に記載されるように実施しBreustedtBiochimBiophysActa1764161~173頁、続いて、500mMベタイン、50mMNa-ホスフェートpH7.5中、0~200mMのイミダゾール勾配を用い、固定された金属親和性クロマトグラフィーSkerraGene14179~84頁を使用してHis6-タグによって精製した。両組換えFab断片の均一なタンパク質調製物が得られ図3A、融合していないFabについて0.2mgL-1OD-1およびFab-PA番号1200について0.1mgL-1OD-1の収率を有する。高モル濃度Trisバッファー系を使用してSDS-PAGEを実施したFlingAnalBiochem15583~88頁。Pro/Alaポリマーが、その芳香族アミノ酸がないためにUV吸収に関与しなかったので、融合していないFabおよびそのPA番号1ポリマー融合物のタンパク質濃度は、68290M-1cm-1の算出された吸光係数を使用して280nmでの吸収に従って決定したGillAnalBiochem182319~326頁。IFNa2および遺伝子によってコードされるPA番号1ポリマー/ポリペプチド間の融合タンパク質の細菌製造および精製IFNa2b算出された質量:20.9kDaおよびPA番号1200-IFNa2b算出された質量:37.0kDaを、100mg/lのアンピシリンおよび30mg/lのクロラムフェニコールを含有する2LのLB培地を用い、振盪フラスコ培養を使用して、実施例3から得られた対応する発現プラスミドを、フォールディングヘルパープラスミドpTUM4Schlapschy同著と一緒に有する大腸菌EcoliKS272において22°Cで製造した。組換え遺伝子発現の誘導は、OD550=0.5で一晩、0.4mgのアンヒドロテトラサイクリンを加えることによって実施した通常、回収時に約1.0のOD550をもたらす。50μg/mlリゾチームを含有する、500mMスクロース、1mMEDTA、100mMTris/HClpH8.0の存在下での周辺質抽出を、別の場所に記載されるように実施しBreustedt同著、続いて、150mMNaCl、1mMEDTA、100mMTris/HCl、pH8.0の存在下で、ストレプトアビジン親和性クロマトグラフィーを使用してStrep-タグIIによって精製したSchmidtNatProtoc21528~1535頁。両組換えIFNa2bタンパク質の均一なタンパク質調製物が得られ図3B、IFNa2bについて0.15mgL-1OD-1およびPA番号1200-IFNa2bについて0.1mgL-1OD-1の収率を有する。高モル濃度Trisバッファー系を使用してSDS-PAGEを実施したFling同著。融合していないIFNa2bおよびそのPA番号1ポリマー融合物のタンパク質濃度は、23590M-1cm-1の算出された吸光係数を使用して280nmでの吸収に従って決定したGill同著。Fab断片および200個の残基の遺伝子によってコードされるPA番号1ポリマー間の組換え融合タンパク質の流体力学的容積の、分析用ゲル濾過による測定。サイズ排除クロマトグラフィーSECを、Akta精製器10システムGEHealthcareを使用し、ランニングバッファーとしてPBS115mMNaCl、4mMKH2PO4、16mMNa2HPO4;pH7.4を用い、1ml/分の流速でSuperdexS200HR10/300GLカラムGEHealthcareEurope、Freiburg、Germanyで実施した。実施例4に記載されるように、金属親和性親和性クロマトグラフィーから得られた、精製されたFab断片およびその200個の残基PA番号1融合物の250μlのサンプルを、PBS中、0.25mg/mlの濃度で個々に適用した。両タンパク質とも、図4Aに示されるように単一の均一なピークで溶出した。カラム較正のために図4B、250μlの以下の球状タンパク質の適当な混合物Sigma、Deisenhofen、Germanyを、PBS中、0.2mg/mlから0.5mg/mlの間のタンパク質濃度で適用した:チトクロムc、12.4kDa;炭酸脱水酵素、29.0kDa;オボアルブミン、43.0kDa;ウシ血清アルブミン、66.3kDa;アルコール脱水素酵素、150kDa;β-アミラーゼ、200kDa;アポフェリチン、440kDa。結果として、200個の残基のPA番号1ポリマー/ポリペプチドを有する融合タンパク質は、同一分子量を有する対応する球状タンパク質よりも大幅に大きな大きさを示した。Fab-PA番号1200の見かけの大きさの増大は、融合していないFab断片と比較して7.4倍であったのに対し、真の質量は、1.3倍大きいだけであった。この知見は、本発明のPro/Alaポリペプチドセグメントによって生物学的に活性なFab断片に付与された、かなり増大した流体力学的容積を明確に示す。IFNa2bおよび200個の残基の遺伝子によってコードされるPA番号1ポリマー間の組換え融合タンパク質の流体力学的容積の分析用ゲル濾過による測定。サイズ排除クロマトグラフィーを、IFNa2bおよびPA番号1200-IFNa2bを用い、実施例6に記載されるのと同様に、Akta精製器10システムGEHealthcareを使用し、1ml/分の流速でSuperdexS200HR10/300GLカラムGEHealthcareで実施した。両タンパク質とも、図4Cに示されるように単一の均一なピークで溶出した。結果として、200個の残基のPA番号1ポリマー/ポリペプチドを有する融合タンパク質は、同一分子量を有する対応する球状タンパク質よりも大幅に大きな大きさを示した図4D。PA番号1200-IFNa2bの見かけの大きさの増大は、融合していないIFNa2bタンパク質と比較して、10.2倍であったのに対し、真の質量は、1.8倍大きいだけであった。この知見は、本発明のPro/-Alaポリマー/ポリペプチドによって生物学的に活性なインターフェロンに付与された、かなり増大した流体力学的容積を明確に示す。Fab断片に融合している生合成PA番号1ポリマーのランダムコイルコンホメーションの円二色性分光法による検出。石英キュベット106-QS0.1mm路長;Hellma、Mullheim、Germanyを備えたJ-810分光偏光計Jasco、Groβ-Umstadt、Germanyを使用して二次構造を分析した。実施例4から得られた、50mMK2SO4、20mMK-ホスフェートpH7.5中、3.12から15.4μMのタンパク質溶液を使用して16回の実施を蓄積することによって、室温で190から250nmのスペクトルを記録したバンド幅1nm、スキャン速度100nm/分、反応4秒。溶液ブランクを補正した後、スペクトルを、機器ソフトウェアを使用してスムージングし、以下の方程式に従ってモル楕円率ΘMを算出した:[式中、Θobsは、測定された楕円率を示し、cは、タンパク質濃度[mol/l]、dは、石英キュベットの路長を示す[cm]]。KaleidagraphSynergySoftware、Reading、PAを使用して、ΘM値を波長に対してプロットした。組換えFabの測定された円二色性CDスペクトルは、βシートに偏った免疫グロブリンimmunglobulineフォールドと一致していたのに対し、Fab-PA番号1200融合タンパク質のスペクトルは、ランダムコイルコンホメーションの相当な寄与を示した図5A。Pro/Alaポリペプチドセグメントによる分光学的寄与をより詳細に分析するために、融合していないFab断片に関するモル差CDスペクトルを、Fab-PA番号1200のものから後者のスペクトルをサブトラクションすることによって算出した図5B。結果として、ランダムコイルコンホメーションに特有の約200nmの強い最小が観察された。したがって、組換え融合タンパク質の一部としてのPro/Ala配列は、生理学的バッファー条件下でランダムコイルポリマーとして存在すると思われる。IFNa2bと融合している遺伝子によってコードされるPA番号1ポリマーのランダムコイルコンホメーションの円二色性分光法による検出。3.6~38.7μMのタンパク質溶液を使用し、実施例8に記載のように、IFNa2bおよびPA番号1200-IFNa2b実施例5から得られたのCD測定によって二次構造を分析した。PA番号1200-IFNa2bのスペクトルは、α-ヘリックス二次構造の相当な寄与を示し、これは、インターフェロンの公知のα-ヘリックス束フォールドならびにランダムコイルコンホメーションを示す図5C。Pro/Alaポリマー融合パートナーによる分光学的寄与をより詳細に分析するために、融合していないIFNa2bに関するモル差CDスペクトルを、2つの個々のスペクトルをサブトラクションすることによって算出した図5D。結果として、ランダムコイルコンホメーションに特有の約200nmの強い最小が観察された。したがって、組換え融合タンパク質の一部としてのPro/Alaポリペプチドセグメントは、水性バッファー条件下でランダムコイルポリマーとして存在すると思われる。Fab断片の、IFNa2bの、およびそれらの200個の残基のPA番号1ポリマー融合物の二次構造の定量的分析。Fab断片、Fab-PA番号1200、IFNa2bおよびPA番号1200-IFNa2bの二次構造含量を、複雑なCDスペクトルのデコンボリューションのために一連の33のベーススペクトルを用い、二次構造デコンボリューションプログラムCDNNバージョン2.1BohmProteinEng5191~195頁を使用して、実施例8および9において測定された対応するCDスペクトルから個々に定量した。この分析の結果が、以下の表に提供されている:その公知の免疫グロブリンフォールドEigenbrotJMolBiol229969~995頁参照のことに一致している組換えFab断片の大部分のβ-シート二次構造含量と比較して、構築されていないコンホメーションの割合ランダムコイルおよびβ-ターンを含むは、PA番号1ポリマーがFab断片に融合される場合には明確に増大する。Pro/Alaポリペプチドセグメントの差CDスペクトルは、明確なランダムコイルコンホメーションを示す。二次構造の分析は、全二次構造のほぼ100を含む、高い割合の構築されていないコンホメーションランダムコイルおよびβ-ターンを含むの存在を示す。同様に、α-ヘリックス束タンパク質としてのその公知の三次元構造RadhakrishnanStructure41453~1463頁に一致している組換えIFNa2bの大部分のα-ヘリックス二次構造含量と比較して、全タンパク質の構築されていないコンホメーションの割合は、PA番号1ポリマーがIFNa2bに融合される場合には明確に増大する。Pro/Alaポリペプチドセグメントの差CDスペクトルは、明確なランダムコイルコンホメーションを示す。二次構造の分析は、全二次構造のほぼ100を含む、高い割合の構築されていないコンホメーションランダムコイルおよびβ-ターンを含むの存在を示す。チョウ-ファスマンアルゴリズムChouandFasmanBiochemistry13222~245頁を使用してPA番号1ポリマー配列の理論的分析が実施された場合には、異なる結果が得られた。この分析の結果が図7に示されている。このアルゴリズムは、100のα-ヘリックス二次構造を予測し、これは、実験データとは明確に対照的である。したがって、このアルゴリズムは、本発明のアミノ酸ポリマーの構築されていないコンホメーションを確信を持って予測するのには有用でない。His6-PA番号1200-hGH融合タンパク質の発現ベクターとしてのpASK75-His6-PA番号1200-hGHの構築。200個の残基のPA番号1配列リピート、PA番号1200を有する融合物として、hGHをコードする発現プラスミドを構築するために、pASK75-His6-hGH配列番号41図6Aを、SapIを用いて切断し、エビアルカリホスファターゼを用いて脱リン酸化し、SapIを用いる制限消化によって、先に構築したプラスミドpFab-PA番号1200実施例2から切り出した、200個の残基のPA番号1ポリペプチドをコードする遺伝子断片とライゲーションした図6Bに例示されるが、PA番号120ポリマー/ポリペプチドカセットのみを有する。大腸菌EcoliJM83を形質転換した後YanischPerron同著、プラスミドを調製し、制限分析によって正しいインサートの存在を確認した。得られたプラスミドは、pASK75-His6-PA番号1200-hGH配列番号46図6Cと表した。チャイニーズハムスター卵巣細胞における、200個の残基のPA番号1ポリマー/ポリペプチドと融合しているヒト成長ホルモンの分泌性製造のための発現ベクターの構築。hGHPA番号1融合タンパク質の原核生物製造を可能にするベクターpASK75-His6-PA番号1200-hGH配列番号46、pASK75の誘導体Skerra同著を、NheIおよびHindIIIを用いて切断した。この断片をアガロースゲル電気泳動によって精製し、相応に切断されたベクターpCHO配列番号50とライゲーションした。大腸菌EcoliXL1-Blueを形質転換した後Bullock同著、プラスミドを調製し、制限分析によって断片の正しいインサートを確認した。得られたHis6タグ、PA番号1200ポリペプチドセグメントおよびヒト成長ホルモンhGHと融合しているhGHシグナルペプチドをコードするプラスミドは、pCHO-PA番号1200-hGH配列番号48と表し、図6Dに表されている。CHO細胞における、ヒト成長ホルモンhGHおよび遺伝子によってコードされるPA番号1ポリマー間の融合タンパク質の分泌性製造。CHO-K1細胞ATCC番号CCL-61を、50コンフルエンシーが達せられるまで、100mmプラスチックディッシュ中で、Quantum263培地PAALaboratories、Colbe、Germanyで培養した。細胞を、NanofectinキットPAALaboratories、Colbe、Germanyを使用して、8μgのpCHO-PA番号1200-hGH配列番号48で、または対照のために、pCHO-hGH配列番号49、hGHをコードするがPA番号1200配列を含まない同様のプラスミドでトランスフェクトした。6時間後、細胞培養培地を、7mlのOpti-MEM登録商標-I還元血清培地Invitrogen、Darmstadt、Germanyによって交換し、細胞を37°C、5CO2を含む加湿雰囲気中でインキュベートした。2日後、20μlの細胞培養上清を採取し、5μlのβ-メルカプトエタノールを含有するSDS-PAGEローディングバッファーを用いて希釈した。95°Cで5分加熱した後、15μlの各サンプルを、12SDS-PAGEに付した。セミドライブロッティング装置によって、ニトロセルロースメンブランSchleicherSchuell、Dassel、Germany上にエレクトロトランスファーした後、メンブランを、10mlPBST0.1v/vTween20を含有するPBSを用いて15分間3回洗浄した。メンブランを10mlのウマラディッシュペルオキシダーゼとコンジュゲートされた抗ヒト成長ホルモン抗体ab1956Abcam、Cambridge、UKの1:1000希釈物をとともにインキュベートした。1時間インキュベートし、メンブランを20mlのPBSTを用いて5分間で2回、PBSを用いて5分間で2回洗浄した後、15mlのSIGMAFAST商標3,3-ジアミノベンジジン溶液Sigma-AldrichChemie、Munich、Germanyの存在下で発色反応を実施した。水で洗浄することによって反応を停止させ、メンブランを風乾した。両組換えタンパク質サンプルについて、ブロットはシグナルを示し図6E、したがって、CHO細胞におけるPA番号1ポリペプチドを有するhGH融合タンパク質の分泌性製造を提供する。hGHおよび遺伝子によってコードされるPA番号1ポリマー/ポリペプチド間の融合タンパク質の細菌製造および精製。ヒト成長ホルモンhGH算出された質量:23.4kDa、PA番号1200-hGH算出された質量:39.6kDa、PA番号1400-hGH算出された質量:55.8kDaおよびPA番号1600-hGH算出された質量:72.0kDaを、実施例11から得られた対応する発現プラスミドまたはそれぞれ、2倍400個の残基をコードするもしくは3倍600個の残基のPA番号1配列カセットを有するその誘導体を有する大腸菌EcoliKS272において製造した。細菌製造は、2.5g/Lのグルコース、0.5g/Lのプロリンおよび100mg/lのアンピシリンを含有する2LのLB培地を用い、振盪フラスコ培養において22°Cで実施した。組換え遺伝子発現の誘導は、OD550=0.5で3時間、0.4mgのアンヒドロテトラサイクリンを加えることによって実施した。50μg/mlリゾチームを含有する、500mMスクロース、1mMEDTA、100mMTris/HClpH8.0の存在下での周辺質抽出を、別の場所に記載されるように実施しBreustedt同著、続いて、バッファーとして40mMNa-ホスフェートpH7.5、0.5MNaClを用い、HisTrapHighPerformance親和性カラムGEHealthcareを使用して、His6-タグによって精製した。タンパク質は、0~150mMのイミダゾール濃度勾配を使用して溶出しランニングバッファーに溶解され、HClを用いてpH7.5に調整された、PBS115mMNaCl、4mMKH2PO4、16mMNa2HPO4、pH7.4を用いて平衡化したSuperdex200-HR10/30カラムGEHealthcareを使用するサイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製した。サイズ排除クロマトグラフィー後に、すべての組換えhGH融合タンパク質について均一なタンパク質調製物が得られ、凝集の徴候はなく、hGHについて1mgL-1OD-1、PA番号1200-hGHについて0.3mgL-1OD-1、PA番号1400-hGHについて0.3mgL-1OD-1およびPA番号1600-hGHについて0.2mgL-1OD-1の収率を有していた。SDS-PAGEは、高モル濃度Trisバッファーシステムを使用して実施したFling同著。融合していないhGHおよびすべてのそのPA番号1ポリペプチド融合物のタンパク質濃度は、16050M-1cm-1の算出された吸光係数を使用して280nmでの吸収に従って決定したGill同著。表面プラズモン共鳴を使用する、ヒト成長ホルモン受容体の細胞外ドメインに向けた、ヒト成長ホルモンおよびそのPA番号1ポリマー融合物の結合親和性の測定。hGHおよびそのPA番号1ポリペプチド融合物のヒト成長ホルモン受容体Fc融合タンパク質hGHR-Fc;RDSystemsに対する親和性を、Biacore2000システムGEHealthcareで表面プラズモン共鳴SPRリアルタイム測定によって決定した。まず、15μlの10mM酢酸NapH5.0中、100μg/mlの濃度のマウス抗ヒトIgG-Fc捕獲抗体JacksonImmunoResearchを、アミンカップリングキットGEHealthcareを使用してCMDPチップXanTecbioanalyticsの2つのフローチャネルの表面に固定した。この結果、約2700反応単位RUが得られた。フローバッファーとしてPBS/T0.05v/vTween20を含有するPBSを用いて平衡化した後、チップの1つのチャネルに、2μg/mlのhGHR-Fcを、約300RUのさらなるシグナルが達せられるまで5μl/分の流速で入れた。次いで、75μlのPBS/T中の、hGHまたはそのPA番号1ポリペプチド融合物を変動する濃度で注入し、20μl/分の連続バッファーフロー下で会合および解離相を測定した。再生するために、10mMグリシン/HClpH2.7の3回の6μlパルスを適用した。固定された受容体を有さないチャネルについて測定された対応するシグナルを2度サブトラクションすることによってセンソグラムを補正し、いくつかのバッファーブランク注入から平均化したベースラインを決定したMyszkaMolRecognit12279~284頁。動的データ評価を、BIAevaluationソフトウェアバージョン3.1GEHealthcareを使用する、1:1Langmuir結合モデルに従う、少なくとも7回の異なるサンプル注射から得られたトレースの全体的適合によって実施した。hGHまたはそのPA番号1融合物およびヒト成長ホルモン受容体間の複合体の速度定数および導かれる平衡定数のSPR測定から得られた値が、以下の表に要約されている:これらのデータは、hGHの種々の長さのPA番号1ポリペプチドとの融合物は、受容体結合に大きくは干渉しないということを示す。すべてのhGHPA番号1ポリペプチド融合物は、PA番号1ポリペプチドを欠く組換えhGHと比較して5倍内の受容体結合活性を保持する。Fab断片および遺伝子によってコードされるPA番号1ポリマー間の組換え融合タンパク質のinvivoでの延長された血漿半減期の検出。成体BALB/cマウスSPFstockbreeding;TUMunchen、Freising、Germanyに、以下の表に従って静脈内に注射した:静脈内に投与された試験項目の総容積を、個体の体重b.w.に従って算出し、投与日に記録した例えば、100μlの1mg/ml試験項目を与えられた20gの体重を有する動物。血液サンプリングは、以下の表に従って実施した:各物質試験項目について、全部で9匹の動物-各3匹の動物を有する3つの亜群1~3に分けられた-に注射し、各々が、種々の時点で4種のサンプルを提供する。血液サンプルおよそ50μlを、尾静脈veneから採取し、4°Cで30分間保存した。10000g、4°Cで10分間遠心分離した後、上清血漿を直ちに凍結し、-20°Cで保存した。ELISAにおけるFab融合タンパク質の定量的検出のために、96ウェルマイクロタイタープレートMaxisorb、NUNC、Denmarkのウェルを50mMNaHCO3pH9.6中の組換えHer2/ErbB2外部ドメイン抗原の10μg/ml溶液50μlを用いて4°Cで一晩コーティングした。次いで、PBS中の3w/vBSA200μlを用いてウェルを1時間ブロッキングし、PBS/T0.1v/vTween20を含有するPBSを用いて3回洗浄した。血漿サンプルは、未処理動物から得た0.5v/vマウス血漿を含有するPBS/T中の希釈シリーズで適用し、1時間インキュベートした。次いで、ウェルをPBS/Tを用いて3回洗浄し、PBS/T中の抗ヒトCk抗体アルカリホスファターゼコンジュゲートの1:1000希釈溶液50μlとともに1時間インキュベートした。PBS/Tを用いて2回およびPBSを用いて2回洗浄した後、基質として100mMTris/HClpH8.8、100mMNaCl、5mMMgCl2中の0.5μg/mlのp-ニトロフェニルホスフェート50μlを添加することによって発色反応を開始させ、25°Cで15分後、405nmの吸光度を測定した。血漿サンプル中のFab、Fab-PA番号1200およびFab-PA番号1600の濃度を、測定されたシグナルを、0.5v/v未処理動物由来マウス血漿を含有するPBS/T中、定義された濃度の対応する精製されたタンパク質の希釈シリーズについて決定された標準曲線と比較することによって定量化した。Fab、Fab-PA番号1200およびFab-PA番号1600の血漿半減期を推定するために、ELISA測定値から各時点の濃度値、ctを決定し、静脈内注射後の時間、tに対してプロットした。これらのデータを、以下の方程式に従って双指数関数的biexponential減衰を推定しながらKaleidaGraphソフトウェアを使用して数値的にフィッティングした。[式中、tα1/2およびtβ1/2は、それぞれ、分布相αおよび排出相βの半減期の値である。c0は、時点ゼロでの総血液濃度であり、cαは、分布相の濃度振幅である]。図8は、BALB/cマウスにおける3種の試験項目の薬物動態を表す。組換えFabは、迅速な血液クリアランスを示し、実に約1.3時間という排出半減期を有し、Fab-PA番号1200およびFab-PA番号1600融合タンパク質は、3倍および29倍を超える拡張された半減期を有し、それぞれ、約4.1時間および38.8時間の対応する値を有する。これらのデータは、Fab断片のinvivo血漿半減期は、Pro/Alaポリマー/ポリペプチドとの融合によって大幅に延長され、それによって半減期は、アミノ酸ポリマーの長さが増大するにつれてより長くなるということを証明する。P1A1およびP1A3アミノ酸ポリマー/ポリペプチドの遺伝子合成およびFab-P1A1200およびFab-P1A3200融合タンパク質の発現ベクターとしてのpFab-P1A1200およびpFab-P1A3200の構築。Pro/Alaポリペプチド/ポリマーP1A1配列番号51およびPA番号3、配列番号3とも表されるP1A3を含む反復ポリマー配列をコードする遺伝子断片を、実施例1に記載されるように、相補的オリゴデオキシヌクレオチド、それぞれ、P1A1のための配列番号52および配列番号53ならびにP1A3のための配列番号54および配列番号55の対のハイブリダイゼーションによって得た。軽鎖LCのC末端に200個の残基の対応するPro/Alaポリマー/ポリペプチドセグメントを有するFab断片LCFab-P1A1200のアミノ酸配列:配列番号56;LCFab-P1A3200のアミノ酸配列:配列番号57をコードするpFab-P1A1200配列番号58およびpFab-P1A3200配列番号59を、類似の方法で、実施例2に記載されているpFab-PA番号1200に構築した。以下では、配列番号56、57、58および59も再現される。しかし、これらの配列はまた、本発明の開示内容および説明の特定の部分である添付の配列表中に含まれる。配列番号56配列番号57配列番号58配列番号59Fab断片および遺伝子によってコードされるP1A1またはP1A3ポリペプチド/ポリマー間の組換え融合タンパク質の流体力学的容積の分析用ゲル濾過による測定。SECを、ランニングバッファーとしてPBSを用い、Akta精製器10システムGEHealthcareを使用して、1ml/分の流速でSuperdexS200HR10/300GLカラムGEHealthcareEurope、Freiburg、Germanyで実施した。実施例4においてFab-PA番号1200について記載されたように、同様に製造され、精製された図9、Fab-P1A1200およびFab-P1A3200融合タンパク質のサンプル250μlを、PBS中、0.25mg/mlの濃度で個別に適用した。両タンパク質とも、図10に示されるように単一の均一なピークで溶出した。結果として、200個の残基を有する融合タンパク質P1A1またはP1A3ポリマー/ポリペプチドは、対応する融合していないFab断片よりも大幅に大きな大きさを示した。Fab-P1A1200およびFab-P1A3200の見かけの大きさの増大は、Fab断片図4B参照のことと比較して、それぞれ、5.8倍および5.2倍であったのに対し、真の質量は、1.4倍および1.3倍大きいだけであった。この知見は、本発明の生合成P1A1およびP1A3ポリペプチドセグメントによって生物学的に活性なFab断片に付与された、かなり増大した流体力学的容積を明確に示す。Fab断片と融合している生合成P1A1およびP1A3ポリマー/ポリペプチドのランダムコイルコンホメーションの円二色性CD分光法による検出。バッファーとして50mMK2SO4、20mMK-ホスフェートpH7.5を使用して実施例4に記載されるものと同様に調製した、それぞれ、4.2および6.5μMタンパク質溶液を使用して、実施例8に記載されるように、Fab-P1A1200およびFab-P1A3200のCDスペクトルを記録した。Fab-P1A1200およびFab-P1A3200融合タンパク質のスペクトルは、大幅な割合のランダムコイルコンホメーションを示した図11A。Pro/Alaポリペプチドセグメントによる分光学的寄与をより詳細に分析するために、融合していないFab断片に関するモル差CDスペクトル実施例8参照を、同一モル濃度に正規化した後に、それぞれ、Fab-P1A1200およびFab-P1A3200のものから後者のスペクトルをサブトラクションすることによって算出した図11B。結果として、ランダムコイルコンホメーションに特有である、およそ200nmの波長の強い最小が観察された。したがって、組換え融合タンパク質の一部としてのP1A1およびP1A3配列は、生理学的バッファー条件下でランダムコイルコンホメーションで存在すると思われる。His6-SUMO-PA番号1200融合タンパク質の発現ベクターとしてのpSUMO-PA番号1200の構築。200個の残基のPA番号1配列リピートと融合している、6個の残基のHis-タグおよび小さいユビキチン様モディファイヤーSUMOタンパク質PanavasMethodsMolBiol497303~17頁をコードする発現プラスミドを構築するために、サッカロマイセスセレビシエSaccharomycescerevisiae由来のSUMOタンパク質[Smt3p;Uniprot:Q12306としても知られる]を、クローニングされたcDNAからポリメラーゼ連鎖反応PCRによって増幅した。5’-プライマーは、PCR産物中に、Met開始コドンATGおよびさらなるLysコドンを含有するNdeI制限部位ならびにHis6-タグをコードする配列を導入し、3’-プライマーは、HindIIIおよびSapI制限部位を導入した。得られたDNA断片を、NdeIおよびHindIIIを用いて消化し、プラスミドpSA1SchmidtJChromatogr676337~345頁の相応に消化された誘導体とライゲーションし、SapI制限部位がサイレント突然変異によって排除されている。得られたプラスミドを、SapIを用いて切断し、エビアルカリホスファターゼを用いて脱リン酸化し、プラスミドpFab-PA番号1200実施例2において記載されるからSapIを用いる制限消化によって切り出した図2Eに例示されるものと類似の方法で200個の残基のPA番号1ポリペプチドセグメントをコードする遺伝子断片とライゲーションした。得られたプラスミドは、pSUMO-PA番号1200配列番号60と表し、図12Aに表されている。遺伝子によってコードされるPA番号1200ポリマー/ポリペプチドの細菌発現および単離。PA番号1200ポリペプチド算出された質量:16.1kDaを、発現プラスミドpSUMO-PA番号1200実施例21に記載されるを、T7プロモーターを抑制するプラスミドpLysEStudierJMolBiol21937~44頁と一緒に有する大腸菌EcoliBLRDE3NEB、Ipswich、MA、USAの細胞質において、小さいユビキチン様モディファイヤーSUMOタンパク質算出された質量:12.2kDaとの融合タンパク質として最初に製造した。細菌製造は、2.5g/LのD-グルコース、0.5g/LのL-プロリン、100mg/lのアンピシリンおよび30mg/lのクロラムフェニコールを含有する2LのLB培地を用い、振盪フラスコ培養において30°Cで実施した。組換え遺伝子発現は、0.5mMの最終濃度へのイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシドIPTGの添加によって誘導された。細菌は、誘導の3時間後に回収し、100mMNaCl、40mMNa-ホスフェートpH7.5に再懸濁し、FrenchpressurecellThermoScientific、Waltham、MA、USAを使用して溶解した。溶解物を遠心分離15分、15000gした後、封入体は観察されなかった。可溶性融合タンパク質を含有する上清を、70°Cで15分間インキュベートし、遠心分離15分、15000gして、熱に不安定な宿主細胞タンパク質を除去した。His6-SUMO-PA番号1200融合タンパク質を、Akta精製器システムGEHealthcareに連結させた、12mlのNi2をチャージさせたHisTrap高性能カラムGEHealthcareを使用してIMACSkerraGene14179~84頁によって上清から精製し、500mMNaCl、40mMNa-ホスフェートpH7.5中、0から150mMのイミダゾール勾配を用いて溶出した。その後の分取SECステップ後に、His6-SUMO-PA番号1200融合タンパク質の均一な調製物図12Bが得られ、1LのOD550=1を有する細菌培養物あたりおよそ5mgの収率を有していた。His6-SUMO-PA番号1200ポリペプチド融合物のタンパク質濃度は、1280M-1cm-1の算出された吸光係数を使用し、280nmでの吸収に従って決定したGill同著。PA番号1200ポリペプチドセグメントは、その芳香族または硫黄含有アミノ酸側鎖がないために280nmでの吸収に関与しないということは留意されたい。切断バッファー0.2w/vIgepal、1mMDTT、150mMNaCl、50mMTris-HClpH8.0中、30°Cで1時間の2U/mgのサッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiae由来のUbl特異的プロテアーゼ1Invitrogen、Carlsbad、CA、USAを用いる部位特異的タンパク質分解切断Pro/Alaポリペプチドセグメントの前のGly-Glyモチーフの下流によって、融合タンパク質から生合成PA番号1200ポリペプチドを遊離させた。切断プロセスは、高モル濃度Trisバッファーシステムを使用するSDS-PAGEによって図12B調べたFlingAnalBiochem15583~88頁。切断されたHis6-SUMOタンパク質、残存する切断されていない融合タンパク質およびまたSUMOプロテアーゼ、His6-タグを保持するすべてのものを除去するために、反応混合物を5mlのNi2をチャージしたHisTrap高性能カラムGEHealthcareおよびランニングバッファーとして500MNaCl、20mMホスフェート、pH7.5を使用する別のIMACに付した。今回は、フロースルーが純粋な生合成PA番号1200ポリペプチドを含有していた図13E。この方法で調製された生合成PA番号1200ポリペプチド/ポリマー配列番号61は、合計201個のアミノ酸残基を含み、これは、図1に示される、各々、20個のアミノ酸残基をコードする、10のライゲーションされた二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドビルディングブロックおよびクローニングに使用された下流SapI制限部位のトリプレットDNAオーバーハングによってコードされる追加のAla残基の、コードされる組み合わされた遺伝子産物に起因するということは留意されたい。PA番号1200を有する小分子/薬物コンジュゲートの調製および特性決定。実施例21から得られたHis6-SUMO-PA番号1200融合タンパク質の未精製タンパク質分解切断反応混合物を、50mMNaHCO3pH8.3に対して4°Cで2回透析し、10倍モル過剰の無水ジメチルホルムアミドDMF中、6-[フルオレセイン-56-カルボキサミド]ヘキサン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステルフルオレセイン-NHSエステル;Sigma-Aldrichの溶液と混合した後、室温で1時間インキュベートした。このために、DMFに溶解したフルオレセイン-NHSエステルの10mM溶液17.6μlに、His6-SUMO-PA番号1200切断混合物の2.5mg/ml溶液200μlを加えた。得られた混合物を室温で1時間インキュベートし、実施例21に記載されるようにIMACに適用して、切断されたHis6-SUMOタンパク質、残存する切断されていない融合タンパク質およびSUMOプロテアーゼを除去し、PBSで平衡化したSuperdexS20010/300GLカラムで分取SECによって、0.5ml/分の流速でさらに精製した。次いで、種々のステップから得られたサンプルを、PBSで平衡化したSuperdexS20010/300GLカラムで分析用SECによって、0.5ml/分の流速で分析した。SUMOタンパク質は、280nmでその芳香族側鎖によって検出され、Pro/Alaポリペプチドまたはポリペプチドセグメントのものを含めたペプチド結合は、225nmで検出されたが、フルオレセインは、494nmで検出された図13A~G。比較のために、遊離フルオレセインSigma-Aldrichの溶液のUV/VISスペクトルおよびSECにおいて検出された各個別のピークに由来する画分のUV/VISスペクトルを、λ9機器PerkinElmer、Waltham、MA、USAを使用して測定した図13H~K。クロマトグラフィーカラムの大きさ較正のために図13L、PBS中、0.2から0.5mg/mlの間の濃度の、以下の球状タンパク質の適当な混合物Sigma-Aldrich250μlを適用した:アプロチニン、6.5kDa;チトクロムc、12.4kDa;炭酸脱水酵素、29.0kDa;ウシ血清アルブミン、66.3kDa;アルコール脱水素酵素、150kDa;β-アミラーゼ、200kDa;アポフェリチン、440kDa。結果として、生合成PA番号1200ポリペプチド/ポリマーのフルオレセイン-NHSエステルとのカップリング後に、IMACおよびSECによって、PA番号1200ポリペプチド/ポリマーの大きさの特性および小分子、すなわち、フルオレセイン基の分光学的サインを本質的に示す高分子コンジュゲートが単離された。これは、小分子が生合成Pro/Alaポリペプチド/ポリマーに成功裏にカップリングされたことを実証し、これは、本発明に従って、コンジュゲートされた小分子薬または化合物の流体力学的容積を著しく増大する。生合成Pro/Alaポリペプチド/ポリマーおよび植物ステロイドジゴキシゲニン間の同様のコンジュゲートを調製するために、上記のように、実施例21から得られた0.1mgの精製されたPA番号1200ポリペプチドを、50mMNaHCO3pH8.3に対して透析した。精製されたPA番号1200ポリペプチドの濃度は、205nmでの吸収に従って決定したGill同著。PA番号1200ポリペプチドは、10倍モル過剰のジゴキシゲニン-3-O-メチルカルボニル-ε-アミノカプロン酸NHSエステルDIG-NHSエステル;RocheDiagnostics、Mannheim、Germanyを用いてカップリングした。この目的のために、50mMNaHCO3pH8.3中の、精製されたPA番号1200ポリペプチドの1mg/ml溶液100μlを、無水DMFに溶解したDIG-NHSエステルの30mM溶液2μlに加え、反応混合物を室温で1時間インキュベートした。得られたコンジュゲートの溶液を、7kDaのカットオフを有するZeba商標スピン脱塩カラムThermoScientificを使用して精製し、10mM酢酸アンモニウムバッファーpH6.8に対して2回透析し、正イオンモードを使用して、Q-TofUltima機器Waters、Eschbronn、GermanyでESI質量分析によって分析した。結果として、ジゴキシゲニン-PA番号1200コンジュゲートのスペクトルは、16671.4Daの質量を示し、これは、16670.6Daの算出された質量に本質的に一致する図13M。これは、生合成Pro/Alaポリペプチド/ポリマー、特に、PA番号1200は、小分子薬を用いて効率的にコンジュゲートされ得ることを明確に実証する。本発明は、以下の例示された配列に関し、以下の例示された配列を指し、それによって、添付の配列表が説明の一部として示され、したがって、本明細書の一部である。配列番号1は、PA番号1のアミノ酸配列を示す。配列番号2は、PA番号2のアミノ酸配列を示す。配列番号3は、PA番号3のアミノ酸配列を示す。配列番号4は、PA番号4のアミノ酸配列を示す。配列番号5は、PA番号5のアミノ酸配列を示す。配列番号6は、PA番号6のアミノ酸配列を示す。配列番号7は、配列番号1の環状に順序をかえられたもののアミノ酸配列を示す。配列番号8は、配列番号1の環状に順序をかえられたもののアミノ酸配列を示す。配列番号9は、配列番号1の環状に順序をかえられたもののアミノ酸配列を示す。配列番号10は、配列番号1の環状に順序をかえられたもののアミノ酸配列を示す。配列番号11は、配列番号1の環状に順序をかえられたもののアミノ酸配列を示す。配列番号12は、配列番号1の環状に順序をかえられたもののアミノ酸配列を示す。配列番号13は、配列番号1の環状に順序をかえられたもののアミノ酸配列を示す。配列番号14は、配列番号1の環状に順序をかえられたもののアミノ酸配列を示す。配列番号15は、配列番号1の環状に順序をかえられたもののアミノ酸配列を示す。配列番号16は、配列番号1の環状に順序をかえられたもののアミノ酸配列を示す。配列番号17は、ビルディングブロックPA番号1の作製に使用される上部/コーディング鎖オリゴデオキシヌクレオチドの核酸配列を示す。配列番号18は、ビルディングブロックPA番号1の作製に使用される下部/非コーディング鎖オリゴデオキシヌクレオチドの核酸配列を示す。配列番号19は、pASK88-Fab-2xSapI上にコードされる、抗体Fab断片の免疫グロブリン軽鎖のC末端の周囲の、核酸配列ストレッチ上部/コーディング鎖を示す。配列番号20は、pASK88-Fab-2xSapI上にコードされる、抗体Fab断片の免疫グロブリン軽鎖のC末端の周囲の、核酸配列ストレッチ下部/非コーディング鎖を示す。配列番号21は、pASK88-Fab-2xSapI上にコードされる、Fab断片の軽鎖のC末端のアミノ酸配列を示す。配列番号22は、pASK88-Fab-2xSapIの核酸配列を示す。配列番号23は、1つのPA番号120ポリマーの挿入後の、Fab軽鎖のC末端のアミノ酸配列をコードする核酸配列ストレッチ上部/コーディング鎖を示す。配列番号24は、1つのPA番号120ポリマーの挿入後の、Fab軽鎖のC末端のアミノ酸ストレッチのための核酸配列下部/非コーディング鎖を示す。配列番号25は、1つのPA番号120ポリマーの挿入後の、Fab軽鎖のC末端のアミノ酸配列ストレッチを示す。配列番号26は、pFab-PA番号1200上にコードされるFab重鎖のアミノ酸配列を示す。配列番号27は、pFab-PA番号1200上にコードされるPA番号1200ポリマーと融合しているFab軽鎖のアミノ酸配列を示す。配列番号28は、pFab-PA番号1200の核酸配列を示す。配列番号29は、INFa2bのN末端およびStrep-タグII最後の2個のアミノ酸のみのアミノ酸配列をコードする核酸配列上部/コーディング鎖を示す。配列番号30は、INFa2bのN末端およびStrep-タグII最後の2個のアミノ酸のみのアミノ酸配列をコードする核酸配列下部/非コーディング鎖を示す。配列番号31は、Strep-タグIIのC末端およびINFa2bのN末端のアミノ酸配列を示す。配列番号32は、pASK-IFNa2bの核酸配列を示す。配列番号33は、1つのPA番号1ポリマー配列カセットの挿入後の、Strep-タグIIのC末端およびIFNa2bのN末端をコードする核酸配列ストレッチ上部/コーディング鎖を示す。配列番号34は、1つのPA番号1ポリマー配列カセットの挿入後の、Strep-タグIIのC末端およびIFNa2bのN末端の核酸配列ストレッチ下部/非コーディング鎖を示す。配列番号35は、1つのPA番号1ポリマーカセットとの融合後の、Strep-タグIIのC末端およびIFNa2bのN末端のアミノ酸配列ストレッチを示す。配列番号36は、pPA番号1200-IFNa2b上にコードされるPA番号1200ポリマーと融合している、IFNa2bおよびStrep-タグIIのアミノ酸配列を示す。配列番号37は、pPA番号1200-IFNa2bの核酸配列を示す。配列番号38は、His6-hGHのN末端の周囲のアミノ酸配列をコードするpASK75-His6-hGH上の核酸配列ストレッチ上部/コーディング鎖を示す。配列番号39は、hGHのN末端の周囲のアミノ酸配列をコードするpASK75-His6-hGH上の核酸配列ストレッチ下部/非コーディング鎖を示す。配列番号40は、pASK75-His6-hGH上にコードされるHis6-hGHのN末端のアミノ酸配列ストレッチを示す。配列番号41は、pASK75-His6-hGHの核酸配列を示す。配列番号42は、PA番号120ポリマーの挿入後のHis6-hGHのN末端のアミノ酸配列をコードする核酸配列上部/コーディング鎖ストレッチを示す。配列番号43は、1つのPA番号1ポリマー配列カセットの挿入後のhGHのN末端をコードする核酸配列下部/非コーディング鎖を示す。配列番号44は、PA番号120ポリマーの挿入後のHis6-hGHのN末端のアミノ酸配列を示す。配列番号45は、pASK75-His6-PA番号1200-hGH上にコードされる成熟したHis6-PA番号1200-hGHのアミノ酸配列を示す。配列番号46は、pASK75-His6-PA番号1200-hGHの核酸配列を示す。配列番号47は、pCHO-PA番号1200-hGH上にコードされるHis6-PA番号1200-hGHのアミノ酸配列を示す。配列番号48は、pCHO-PA番号1200-hGHの核酸配列を示す。配列番号49は、pCHO-hGHの核酸配列を示す。配列番号50は、pCHOの核酸配列を示す。配列番号51は、P1A1のアミノ酸配列を示す。配列番号52は、P1A1のビルディングブロックの作製に使用される上部/コーディング鎖オリゴデオキシヌクレオチドoligodesoxynucleotideの核酸配列を示す。配列番号53は、P1A1のビルディングブロックの作製に使用される下部/非コーディング鎖オリゴデオキシヌクレオチドoligodesoxynucleotideの核酸配列を示す。配列番号54は、P1A3のビルディングブロックの作製に使用される上部/コーディング鎖オリゴデオキシヌクレオチドoligodesoxynucleotideの核酸配列を示す。配列番号55は、P1A3のビルディングブロックの作製に使用される下部/非コーディング鎖オリゴデオキシヌクレオチドoligodesoxynucleotideの核酸配列を示す。配列番号56は、pFab-P1A1200上にコードされるP1A1200ポリマーと融合しているFab軽鎖のアミノ酸配列を示す。配列番号57は、pFab-P1A3200上にコードされるP1A3200ポリマーと融合しているFab軽鎖のアミノ酸配列を示す。配列番号58は、pFab-P1A1200の核酸配列を示す。配列番号59は、pFab-P1A3200の酸配列を示す。配列番号60は、pSUMO-PA番号1200の核酸配列を示す。配列番号61は、薬物コンジュゲート10の遺伝子カセットをコードする20マーのライゲーションによって作製され、下流ライゲーション部位に起因する1個の追加のC末端Ala残基を含むの調製に使用されるPA番号1200ポリペプチド/ポリマーを示す。"