"髄膜炎菌ナイセリアメニンギティディスのPorAタンパク質のアミノ酸配列を含む単離タンパク質であって、前記PorAタンパク質の1つ以上の可変領域が、1つ以上のPorA保存領域、または1個以上の保存領域アミノ酸を含むことにより中断されている単離タンパク質。前記1つ以上の可変領域が、VR1領域;VR2領域;SVR1領域;およびSVR2領域からなる群から選択される、請求項1に記載の単離タンパク質。前記1つ以上の可変領域が、VR1領域;およびVR2領域からなる群から選択される、請求項2に記載の単離タンパク質。前記porA保存領域が、ループ2、ループ3、ループ7またはループ8のアミノ酸配列であるか、またはループ2、ループ3、ループ7またはループ8のアミノ酸配列のうちの1つ以上を含む、請求項1に記載の単離タンパク質。前記1つ以上の可変領域、または前記1つ以上の可変領域の1個以上のアミノ酸が不存在である、請求項1~4のいずれか一項に記載の単離タンパク質。前記1つ以上の可変領域が、その領域に挿入された1つ以上のPorA保存領域、または1個以上の保存領域アミノ酸を含む、請求項1~4のいずれか一項に記載の単離タンパク質。配列番号5~22のいずれか1つに記載のアミノ酸配列を含む、請求項1~6のいずれか一項に記載の単離タンパク質。配列番号11~22のいずれか1つに記載のアミノ酸配列を含む、請求項1~7のいずれか一項に記載の単離タンパク質。請求項1~8のいずれか一項に記載の単離タンパク質と少なくとも80の配列同一性を有する、その変異体である単離タンパク質であって、野生型PorAタンパク質でない単離タンパク質。請求項1~9のいずれか一項に記載の単離タンパク質の誘導体である単離タンパク質。請求項1~10のいずれか一項に記載の単離タンパク質の少なくとも20個の連続アミノ酸を含む断片であるか、またはその断片を含む単離タンパク質。対応する野生型PorAタンパク質により誘発されるよりも株特異的でない免疫応答を誘発し得る、請求項1~11のいずれか一項に記載の単離タンパク質。前記免疫応答が、髄膜炎菌N.メニンギティディスの複数の株に対する保護を提供する、請求項12に記載の単離タンパク質。請求項1~13のいずれか一項に記載の単離タンパク質を含む外膜タンパク質小胞OMV。請求項1~13のいずれか一項に記載の単離タンパク質をコードする単離核酸。配列番号26~43のいずれか1つに記載のヌクレオチド配列を含む、請求項15に記載の単離核酸。配列番号32~43のいずれか1つに記載のヌクレオチド配列を含む、請求項15に記載の単離核酸。請求項15~17のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列と少なくとも80の同一性のヌクレオチド配列を含む単離核酸。請求項15~18のいずれか一項に記載の単離核酸;および1つ以上の付加ヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物。請求項19に記載の遺伝子構築物を含む宿主細胞。細菌である、請求項20に記載の宿主細胞。髄膜炎菌N.メニンギティディスである、請求項21に記載の宿主細胞。組換えタンパク質を産生する方法であって、i請求項20~22のいずれか一項に記載の宿主細胞を、前記組換えタンパク質が前記宿主細胞中で発現されるように培養する工程;およびii前記組換えタンパク質を単離する工程を含む方法。請求項1~13のいずれか一項に記載の単離タンパク質に結合し、またはその単離タンパク質に対して生成された抗体または抗体断片。哺乳動物において髄膜炎菌N.メニンギティディスを検出する方法であって、i請求項24に記載の抗体または抗体断片を、哺乳動物から得られた生体試料と合わせる工程;およびii前記試料中における、前記抗体または抗体断片と髄膜炎菌N.メニンギティディスまたはPorAタンパク質とを含む複合体の存在または不存在を決定する工程を含み、前記複合体の存在が前記髄膜炎菌N.メニンギティディスを示す方法。髄膜炎菌N.メニンギティディスPorAタンパク質に対する抗体を検出する方法であって、i哺乳動物から得られた生体試料を、請求項1~13のいずれか一項に記載の単離タンパク質と接触させる工程;およびii前記試料中の前記単離タンパク質および髄膜炎菌N.メニンギティディスPorA抗体を含む複合体の存在または不存在を決定する工程を含む方法。髄膜炎菌N.メニンギティディスに対する殺菌性抗体を検出する方法であって、i請求項1~13のいずれか一項に記載の単離タンパク質により免疫化された哺乳動物から得られた生体試料を、髄膜炎菌N.メニンギティディスと接触させる工程;およびii前記試料中の前記殺菌性抗体の存在または不存在を決定する工程を含む方法。髄膜炎菌N.メニンギティディスを検出する方法であって、請求項15~18のいずれか一項に記載の単離核酸を使用して、哺乳動物から得られた生体試料中の前記髄膜炎菌N.メニンギティディスの存在を示す核酸配列を検出する工程を含む方法。前記生体試料がヒトから得られる、請求項26~28のいずれか一項に記載の方法。髄膜炎菌N.メニンギティディス感染を検出するためのキットであって、請求項1~13のいずれか一項に記載の単離タンパク質;請求項15~18のいずれか一項に記載の単離核酸;および/または請求項24に記載の抗体もしくは抗体断片;ならびに場合により1つ以上の他の試薬を含むキット。請求項1~13のいずれか一項に記載の単離タンパク質;請求項14に記載の外膜小胞OMV;請求項15~18のいずれか一項に記載の単離核酸;請求項19に記載の遺伝子構築物;請求項20~22のいずれか一項に記載の宿主細胞;請求項24に記載の抗体または抗体断片;および薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物。ワクチンである、請求項31に記載の医薬組成物。外膜タンパク質小胞OMV中の単離タンパク質を含む、請求項31または32に記載の医薬組成物。染色体に組み込まれた遺伝子構築物を含む細菌を含む、請求項32または33に記載の医薬組成物。前記細菌が、髄膜炎菌ナイセリアメニンギティディスである、請求項34に記載の医薬組成物。哺乳動物において髄膜炎菌N.メニンギティディス感染を予防または治療する方法であって、請求項1~13のいずれか一項に記載の単離タンパク質;請求項14に記載の外膜小胞;請求項15~18のいずれか一項に記載の単離核酸;請求項19に記載の遺伝子構築物;請求項20~22のいずれか一項に記載の宿主細胞;請求項24に記載の抗体もしくは抗体断片;および/または請求項31~35のいずれか一項に記載の医薬組成物を哺乳動物に投与し、それにより前記哺乳動物において前記髄膜炎菌N.メニンギティディス感染を予防または治療する工程を含む方法。前記宿主細胞が、染色体に組み込まれた遺伝子構築物を含む細菌である、請求項36に記載の方法。前記細菌が、髄膜炎菌ナイセリアメニンギティディスである、請求項37に記載の方法。前記単離タンパク質が、外膜タンパク質小胞OMV中に存在する、請求項36に記載の方法。前記哺乳動物が、ヒトである、請求項36~39のいずれか一項に記載の方法。哺乳動物における髄膜炎菌N.メニンギティディス感染の予防または治療において使用される、請求項1~13のいずれか一項に記載の単離;請求項14に記載の外膜小胞;請求項15~18のいずれか一項に記載の単離核酸;請求項19に記載の遺伝子構築物;請求項20~22のいずれか一項に記載の宿主細胞;請求項24に記載の抗体または抗体断片。染色体に組み込まれた遺伝子構築物を含む細菌である、請求項41に記載の使用される宿主細胞。前記細菌が、髄膜炎菌ナイセリアメニンギティディスである、請求項42に記載の使用される宿主細胞。外膜タンパク質小胞OMV中に存在する、請求項31に記載の使用される単離タンパク質。本発明者らは、PorAの高免疫原性の表面ループが、髄膜炎菌N.メニンギティディスの特定株由来のPorAタンパク質を包含するワクチンがその特定株に対して優先的に免疫化する傾向があるといったように、広範囲の保護ではない株特異的免疫応答の誘発を担うことを発見した。結果として、本発明者らは、野生型PorAにより誘発されるほど株特異的でない免疫応答を誘発するPorAタンパク質を産生することを追求した。免疫応答を主として保存エピトープに対して指向することにより、単離タンパク質を含むワクチンは、野生型PorAによる免疫化後に予期されるよりも広いスペクトルの髄膜炎菌N.メニンギティディス株に対して有効に免疫化するはずである。第1の態様において、本発明は、髄膜炎菌NeisseriameningitidisのPorAタンパク質のアミノ酸配列を含む単離タンパク質であって、前記PorAタンパク質の可変領域の1個以上のアミノ酸が中断されている単離タンパク質を提供する。好適には、前記PorAタンパク質の可変領域の1個以上のアミノ酸が、1つ以上のPorA保存領域、または1個以上の保存領域アミノ酸を含むことにより中断されている例えば、野生型PorAタンパク質と比較して。好ましくは、保存領域は、保存ループ2、保存ループ3、保存ループ7および/または保存ループ8のアミノ酸配列であり、またはそのアミノ酸配列を含む。好適には、可変領域は、VR1;VR2;SVR1;およびSVR2領域からなる群から選択される。好ましくは、可変領域は、VR1;およびVR2領域からなる群から選択される。可変領域および保存領域は、同一または異なるPorAタンパク質のもの、そのタンパク質由来であり、またはそのタンパク質起源であり得る。好適には、本発明の単離タンパク質は、免疫応答を誘発し得る。好ましくは、免疫応答は、対応する野生型PorAタンパク質により誘発されるよりも株特異的でない。より好ましくは、前記免疫応答は、髄膜炎菌N.meningitidisの1つ以上の株、またはよりいっそう好ましくは、髄膜炎菌N.meningitidisの複数の株に対する保護を提供する。この態様の単離タンパク質の特定の実施形態は、この態様の単離タンパク質の具体例に提供され、図1および2に提供される配列番号11~22。好ましくは、単離タンパク質は、配列番号11~22のいずれか1つに記載のアミノ酸配列を含む。好ましくは、単離タンパク質の中断された可変領域は、VR1および/またはVR2領域の欠失例えば配列番号2~4に記載のものからなることはない。第1の態様による本発明は、本発明の単離タンパク質のホモログ、断片、変異体および誘導体を含む。この態様の1つの特定の実施形態において、単離タンパク質は、外膜タンパク質小胞OMV中に存在する。第2の態様において、本発明は、第1の態様によるポリペプチドをコードする単離核酸を提供する。この態様の単離核酸の具体例は、図2に提供される配列番号23~43。好ましくは、単離核酸は、配列番号32~43のいずれか1つに記載のヌクレオチド配列を含む。第2の態様による本発明は、本発明の単離核酸のホモログ、断片、変異体および誘導体を含む。第3の態様において、本発明は、第2の態様による単離核酸および1つ以上の付加ヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物を提供する。好ましい形態において、遺伝子構築物は、発現ベクターおよび第2の態様による単離核酸を含む発現構築物であって、前記単離核酸が前記発現ベクター中の1つ以上の調節核酸に作動的に連結された発現構築物である。第4の態様において、本発明は、第3の態様による遺伝子構築物を含む宿主細胞を提供する。1つの好ましい実施形態において、宿主細胞は、染色体に組み込まれた発現構築物を含む細菌である。好ましくは、細菌は髄膜炎菌Neisseriameningitidisである。本発明の第5の態様において、第1の態様による組換え単離タンパク質を産生する方法であって、i第3の態様による発現ベクターを含有する宿主細胞を、前記ポリペプチドが前記宿主細胞中で発現されるように培養する工程;およびii前記組換えポリペプチドを単離する工程を含む方法が提供される。第6の態様において、本発明は、本発明の単離タンパク質、その断片、変異体または誘導体に結合し、またはそれらに対して生成された抗体または抗体断片を提供する。第7の態様において、本発明は、髄膜炎菌N.meningitidisを検出する方法であって、i第6の態様の抗体または抗体断片を、哺乳動物から得られた生体試料と合わせる工程;およびii前記試料中の前記抗体または抗体断片と髄膜炎菌N.meningitidisおよび/または髄膜炎菌N.meningitidisPorAタンパク質とを含む複合体の存在または不存在を決定する工程を含み、前記複合体の存在が前記髄膜炎菌N.meningitidisを示す方法を提供する。第8の態様において、本発明は、髄膜炎菌N.meningitidisPorAタンパク質に対する抗体を検出する方法であって、i哺乳動物から得られた生体試料を、第1の態様の単離タンパク質と接触させる工程;およびii前記試料中の前記単離タンパク質および髄膜炎菌N.meningitidisPorA抗体を含む複合体の存在または不存在を決定する工程を含む方法を提供する。第9の態様において、本発明は、髄膜炎菌N.meningitidisに対する殺菌性抗体を検出する方法であって、i第1の態様の単離タンパク質により免疫化された哺乳動物から得られた生体試料を、髄膜炎菌N.meningitidisと接触させる工程;およびii前記試料中の前記殺菌性抗体の存在または不存在を決定する工程を含む方法を提供する。第10の態様において、髄膜炎菌N.meningitidisを検出する方法であって、前記細菌の存在を示す、哺乳動物から得られた生体試料中の第2の態様による核酸配列を検出する工程を含む方法が提供される。好ましくは、哺乳動物はヒトである。第11の態様において、本発明は、髄膜炎菌N.meningitidis感染を検出するためのキットであって、第1の態様による単離タンパク質;第2の態様による単離核酸;および/または第6の態様の抗体もしくは抗体断片;ならびに場合により1つ以上の他の試薬を含むキットを提供する。第12の態様において、本発明は、第1の態様による単離タンパク質;第2の態様による単離核酸;第3の態様による遺伝子構築物;第4の態様による宿主細胞;および/または第6の態様の抗体もしくは抗体断片;ならびに薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。一実施形態において、医薬組成物は、染色体に組み込まれた発現構築物を含む細菌を含む。好ましくは、細菌は髄膜炎菌Neisseriameningitidisである。別の実施形態において、医薬組成物は、外膜タンパク質小胞OMV中の単離タンパク質を含む。好適には、医薬組成物は免疫原性組成物である。好ましくは、医薬組成物はワクチンである。第13の態様において、本発明は、哺乳動物において髄膜炎菌N.meningitidis感染を予防または治療する方法であって、第1の態様による単離タンパク質;第2の態様による単離核酸;第3の態様による遺伝子構築物;第4の態様による宿主細胞;第6の態様の抗体もしくは抗体断片;および/または第12の態様による医薬組成物を哺乳動物に投与し、それにより前記哺乳動物において前記髄膜炎菌N.meningitidis感染を予防または治療する工程を含む方法を提供する。一実施形態において、本方法は、染色体に組み込まれた発現構築物を含む細菌を投与する。好ましくは、細菌は髄膜炎菌Neisseriameningitidisである。別の実施形態において、本方法は、外膜タンパク質小胞OMV中の単離タンパク質を投与する。好ましくは、上記態様の哺乳動物はヒトである。本明細書を通して、文脈が特に要求しない限り、含むcomprise、含むcomprisesおよび含むcomprisingという語は、指定の整数または整数群を包含することを意味するが、任意の他の整数も整数群も除外しないと理解される。本発明の中心は、野生型PorAタンパク質における非保存アミノ酸を含む表面ループを中断することにより、免疫応答が保存エピトープ配列に対して指向され、それにより髄膜炎菌N.meningitidisの複数のヘテロロガスな株に対する保護を提供する免疫応答を免疫化時に誘発することができることの発見であることが認識される。一態様において、本発明は、髄膜炎菌NeisseriameningitidisのPorAタンパク質のアミノ酸配列を含む単離タンパク質であって、単離PorAタンパク質が髄膜炎菌Neisseriameningitidisの複数の株に対して免疫応答を誘発するように前記PorAタンパク質の1つ以上の可変領域が中断されている単離タンパク質を提供する。好適には、前記PorAタンパク質の可変領域の1個以上のアミノ酸が、1つ以上のPorA保存領域、または1個以上の保存領域アミノ酸を含むことにより中断されている例えば、野生型PorAタンパク質と比較して。本発明の目的のため、単離されたは、その天然状態から取り出され、またはそうでなければ人間による操作に供された材料を意味する。単離材料は、その天然状態で通常それに伴う構成成分を実質的にも本質的にも有さないことがあり、または、その天然状態で通常それに伴う構成成分と一緒に人工状態になるように操作されることができる。単離材料は、天然ネイティブまたは組換え形態であり得る。タンパク質は、アミノ酸ポリマーを意味する。アミノ酸は、当該技術分野において十分理解されている天然または非天然アミノ酸であり得る。ペプチドは、60個以下のアミノ酸を有するタンパク質である。ポリペプチドは、60個超のアミノ酸を有するタンパク質である。これに関連して中断されたは、本発明の単離タンパク質がPorAタンパク質膜貫通および/または細胞内アミノ酸配列を含むのアミノ酸配列を含む一方、1つ以上の可変領域もしくは1個以上の可変領域アミノ酸が少なくとも部分的に、もしくは完全に不存在であり、1個以上の保存領域アミノ酸により置き換えられていることおよび/または1つ以上の可変領域が、可変領域アミノ酸配列に存在し、もしくは挿入された1個以上の保存領域アミノ酸を有することを意味する。好適には、可変領域は、VR1;VR2;SVR1;およびSVR2領域からなる群から選択される。好ましくは、単離タンパク質の中断された可変領域は、VR1および/またはVR2領域の欠失例えば配列番号2~4に記載のものからなることはない。表1は、PorA例えば、髄膜炎菌N.meningitidis株MC58の野生型PorAタンパク質のアミノ酸配列により例示される;配列番号1の表面または細胞外ループ1~8を有する、本明細書に記載の可変領域すなわち、VR1、VR2、SVR1、SVR2および本明細書に記載の保存領域のアミノ酸配列の比較を提供する。髄膜炎菌N.meningitidisの多数の株と血清型との間の可変領域アミノ酸配列の多様性を実証する図3Aおよび3Bも参照される。VR1およびVR2の多様性は、http://pubmlst.org/neisseria/PorA/vr1.shtmlおよびhttp://pubmlst.org/neisseria/PorA/vr2.shtmlを参照して、ならびにラッセルRussellら,2004,EmergInfectDis.10674-8に記載のとおり、より詳細に例示される。したがって、本発明は、髄膜炎菌N.meningitidisのいずれの株または血清型のPorAにも適用可能であることが認識される。本発明の単離タンパク質の具体例は、図1および2に提供される配列番号5~22、または好ましくは、配列番号11~22。上記可変領域の最も多様性が高いものは、VR1およびVR2である。SVR1およびSVR2は半可変領域であり、SVR1はSVR2よりも多くの非保存アミノ酸を含む。したがって、好ましくは、中断された可変領域はVR1および/またはVR2領域である。しかしながら、特定の実施形態において、SVR1は、単独で、または1つ以上の他の可変領域、例えばVR1および/またはVR2に加えて中断されている。図3および表1から明らかであるとおり、特に、ループ1、4、5および6は、一般に、本明細書において参照される可変領域と相関する。しかしながら、VR1は、ループ1の非保存または可変部分配列例えば、AQAANGGASGQVKVTKVTKA;配列番号45であること、およびVR2は、ループ4の非保存または可変部分配列例えばYYTKNTNNNLTLVP;配列番号46であることが認識される。したがって、本発明の単離タンパク質は、VR1および/またはVR2の中断に加え、VR1およびVR2の一部でないループ1および/または4の1個以上のアミノ酸の中断を有し得る。同様に、本発明の単離タンパク質は、SVR1および/またはSVR2の中断に加え、SVR1およびSVR2の一部でないループ1および/または6の1個以上のアミノ酸の中断を有し得る。SVR1およびSVR2は、クラウディオClaudioら,1998,ClinDiagn.LabImmunol.5845-855において、アミノ酸247から261SVR1および299から302SVR2における株MC50アクセッション番号X12899のPorA遺伝子に関連して元々定義された。本明細書に参照されるvanderLeyモデルは、LSENGDKAKTKNSTTE配列番号52;表1参照を含むループ6を有する。典型的には、排他的ではないが、SVR2領域は、図3Bに示す一覧のそれらの他の残基の一部に見られる多様性に照らして大多数であるが全てではないループ6アミノ酸、例えばENGDKTKN配列番号91を含み得る。上記から理解されるとおり、1つの広範な実施形態において、1つ以上のPorA可変領域全体は、本発明の単離タンパク質中に不存在であり得、または1つ以上のPorA可変領域の1個または複数のアミノ酸が不存在であり得る。ここで、不存在の可変領域または可変領域アミノ酸は、保存PorAアミノ酸、例えばループ2、3、7および/または8のアミノ酸の1個もしくは複数、または保存ループ全体例えばループ2、3、7および/または8により有効に置き換えられる。特定の実施形態は、配列番号5~16および20~22に記載のアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態は、配列番号11~16および20~22に記載のアミノ酸配列を含む。それぞれのVR1、VR2、SVR1および/またはSVR2領域は、欠失され例えば配列番号5~10、保存ループ7または8のアミノ酸により置き換えられる配列番号11~16および20~22操作が独立して行われ得ることが認識される。このような操作は、可変領域を欠失させることができる一方、別の可変領域を保存ループ7または8のアミノ酸により置き換えるように組み合わされることができ例えば配列番号13および14、または異なる可変領域がループ7または8のアミノ酸配列により両方置き換えられることができる例えば配列番号15、16および20~22。例として、複数の可変領域アミノ酸は、VR1、VR2、SVR1およびSVR2を含む任意の可変領域の2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20または25個以上のアミノ酸であり得る。好適には、アミノ酸は連続している。具体例は表2および3ならびに図1に提供される。さらに例として、ループ2、3、7または8の複数の保存アミノ酸は、それらのループのいずれか1つの2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20個以上のアミノ酸であり得る。好適には、アミノ酸は連続している。具体例は表2および3ならびに図1に提供される。好ましくは、VR1およびVR2は完全に不存在であり、またはVR1もしくはVR2アミノ酸の1個もしくは複数が不存在である。具体的な実施形態において、ループ7アミノ酸はVR1領域全体を置き換え、および/またはループ8アミノ酸はVR2領域全体を置き換える配列番号11~16。他の実施形態において、VR1領域は不存在であり、保存ループ8またはループ7アミノ酸配列により置き換えられており、および/またはVR1領域は不存在であり、保存ループ7またはループ8アミノ酸配列により置き換えられている配列番号20~22。別の広範な実施形態において、保存アミノ酸例えばループ2、3、7および/または8アミノ酸の1個または複数、または保存ループ全体例えばループ2、3、7および/または8は、VR1、VR2、SVR1およびSVR2を含むPorA可変領域中またはそうでなければ存在するに挿入される。好適には、1つまたは複数の可変領域のアミノ酸が存在し、保存ループアミノ酸が可変領域アミノ酸配列中に存在し、または挿入される。好ましくは、保存ループアミノ酸は、PorAのVR1および/またはVR2領域中に存在し、または挿入される。特定の実施形態は、配列番号17~19に記載のアミノ酸配列を含む。代替的実施形態において、前記PorAタンパク質の1つ以上の可変領域は、1つ以上のPorA保存領域も1個以上の保存領域アミノ酸も含むことなく中断される例えば、野生型PorAタンパク質と比較して。1つ以上のPorA保存領域も1個以上の保存領域アミノ酸も挿入されずまたは存在せずに1つ以上の可変領域が不存在であるこの代替的実施形態の好ましい例は、配列番号5~10に提供される。図1配列番号1および表1が髄膜炎菌N.meningitidis株MC58を指す一方、本発明は髄膜炎菌N.meningitidisの任意の株に関して実施することができることも理解される。より具体的には、本発明の単離タンパク質は、髄膜炎菌N.meningitidisの複数の異なる株のアミノ酸配列を含み得る。例にすぎないが、髄膜炎菌N.meningitidisの2996Genbankアクセッション番号X60105.1株のPorAの保存アミノ酸を、髄膜炎菌N.meningitidisのM1336株GenBankアクセッション番号AAF70297.1のPorAに本質的に由来し、または対応するアミノ酸配列を含むPorAタンパク質中に含めることができる。PorAタンパク質構築物のまとめは、表7に提供される。1つ以上の可変領域の中断が、単離タンパク質の保存アミノ酸配列の免疫原性の変化、改変またはそうでなければ改善をもたらす野生型または中断されていないPorAタンパク質と比べてことが認識される。好適には、本発明の単離タンパク質は、髄膜炎菌Neisseriameningitidisの複数の株に対する免疫応答を誘発する。本明細書において使用される免疫応答を誘発するは、本発明の単離タンパク質の、それが投与される哺乳動物における免疫応答を産生する能力を指し、応答は髄膜炎菌N.meningitidisおよび/または前記タンパク質に指向される。好ましくは、免疫応答は殺菌性抗体の産生を含む。より好ましくは、免疫応答は髄膜炎菌N.meningitidis感染に対して保護的である。好適には、誘発された免疫応答は、野生型PorAタンパク質および/または1つ以上の中断された可変領域を有さないPorAタンパク質により誘発されるよりも株特異的でなく、または交差反応的である。株特異的は、オートロガスな髄膜炎菌N.meningitidis株に指向され、または少なくとも優勢的に指向される免疫応答に関連して本明細書において使用される。本明細書において使用される交差反応的は、本発明の単離タンパク質の、1つ以上のヘテロロガスな髄膜炎菌N.meningitidis株に指向される免疫応答を誘発する能力を意味する。本明細書において使用される交差保護的は、本発明の単離タンパク質の、免疫応答を誘発し、それにより1つ以上のヘテロロガスな髄膜炎菌N.meningitidis株による感染に対する保護を提供する能力を意味する。本発明はまた、例えば、配列番号2~22、または好ましくは配列番号11~22のいずれか1つに記載のアミノ酸配列を含む本発明の単離タンパク質の断片、ホモログおよび誘導体を提供する。一実施形態において、タンパク質断片は、前記単離タンパク質の100未満であるが少なくとも20、30、40、50、60、70、80または90~99を構成するアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、断片は、例えば、少なくとも6個、好ましくは、少なくとも10、12、15個、より好ましくは、少なくとも20または30個のアミノ酸長のペプチドである。好ましい実施形態において、断片は、本明細書に開示の中断された可変領域のアミノ酸配列を含む。好ましくは、断片は、例えば配列番号2~4に記載のVR1および/またはVR2領域の欠失からなるものではない。ペプチド断片は、標準的な組換え核酸技術の適用を介して得ることができ、または慣用の液相もしくは固相合成技術を使用して合成することができる。例えば、ニコルソンNicholsonにより編集され、ブラックウェルサイエンティフィックパブリケーションズBlackwellScientificPublicationsにより刊行された標題合成ワクチンSyntheticVaccinesの刊行物に含まれるアサートンAthertonおよびシェファードShephardによる標題ペプチド合成PeptideSynthesisの9章に記載の溶液合成または固相合成を例えば参照することができる。あるいは、ペプチドは、プロテアーゼ、例えばendoLys-C、endoArg-C、endoGlu-Cおよびブドウ球菌V8-プロテアーゼによる本発明のポリペプチドの消化により産生することができる。消化断片は、例えば、高速液体クロマトグラフィーHPLC技術により精製することができる。複数の同一または異なる断片を含むより大きいペプチドおよびポリペプチドが企図されることも認識される。好適には、本発明の単離タンパク質の断片は、1つ以上の抗原決定基またはエピトープを含む。好ましくは、抗原決定基またはエピトープは、複数の髄膜炎菌N.meningitidis株に対する免疫応答を誘発し得る。免疫原性断片は、断片を哺乳動物に投与し;哺乳動物において免疫応答を検出することにより同定することができる。このような応答には、髄膜炎菌N.meningitidisおよび/または前記単離タンパク質、変異体または誘導体に特異的に結合する要素の産生、および/または髄膜炎菌N.meningitidis感染に対する保護効果が含まれる。場合により、上記方法において免疫原性について特定の断片を試験する前に、種々の予測的方法を使用して特定の断片を使用してネイティブ抗原と交差反応する抗体を得ることができるかどうかを推定することができる。これらの予測的方法は、例えばオースベルAusubelら前掲の11.14章に記載のアミノ末端またはカルボキシ末端配列を基本とし得る。あるいは、これらの予測的方法は、例えば参照により本明細書に組み込まれるキートドーリトルKyteDoolittle1982,J.Mol.Biol.157105およびホップウッズHoppWoods,1983,Mol.Immunol.20483により記載された親水性の予測、または例えば参照により本明細書に組み込まれるチョーファスマンChooFasman,1978,Ann.Rev.Biochem.47251により記載された二次構造の予測をベースとし得る。さらに、エピトープマッピングは、本発明の抗体を使用して交差反応性エピトープを、最初にそれらの交差反応を提供する能力を試験し、次いで前記抗体により認識されるエピトープを同定することにより同定する。例示的方法は、コリガンColiganら,CURRENTPROTOCOLSINIMMUNOLOGY前掲に提供されている。本明細書において使用されるタンパク質ホモログは、規定可能なヌクレオチドまたはアミノ酸配列関係を本発明の単離タンパク質と共有する。好適には、ホモログは、野生型PorAタンパク質と比較して中断された可変領域例えばVR1、VR2、SVR1および/またはSVR2の1個以上のアミノ酸を含む。好適には、ホモログは、野生型PorAタンパク質ではない。好ましくは、変異体は、例えば配列番号2~4に記載のVR1および/またはVR2領域の欠失からなるものではない。好ましくは、タンパク質ホモログは、本発明のアミノ酸配列、例として、限定されないが配列番号5~22、または好ましくは配列番号11~22のいずれか1つに記載のアミノ酸配列と、70または75、好ましくは少なくとも80または85またはより好ましくは少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98または99の配列同一性を共有する。例えば、本明細書において例示されるものとは異なるが、免疫原性であり、好ましくは交差反応性免疫を提供するアミノ酸配列を有するようなホモログが企図される。本明細書において使用される用語ホモログは、変異体タンパク質を含む。本明細書において使用される本発明の変異体タンパク質は、1個以上のアミノ酸が欠失され、または1個以上のアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている。一部のアミノ酸は、ポリペプチドの免疫原性活性を変化することなく置換または欠失され得ることが当該技術分野において十分理解されている保存的置換。免疫原性に対するより実質的な変更は、より保存的でない置換または欠失を導入することにより行うことができる非保存的置換。用語変異体は、アレル変異体から産生され、またはその変異体のアミノ酸配列を含む本発明の単離タンパク質も含む。反応性タンパク質と核酸との配列関係を記載するために本明細書において一般に使用される用語は、比較ウインドウ、配列同一性、配列同一性の百分率および実質的な同一性を含む。それぞれの核酸/タンパク質はそれぞれ、1核酸/タンパク質により共有される完全な核酸/タンパク質配列の1つ以上の部分のみ、および2核酸/タンパク質間で相違する1つ以上の部分を含み得るので、配列比較は、典型的には、比較ウインドウにわたり配列を比較して配列類似性の局所領域を同定および比較することにより実施される。比較ウインドウは、典型的には、参照配列と比較される6、9または12個の連続残基の概念的セグメントを指す。比較ウインドウは、それぞれの配列の最適アラインメントのために参照配列と比較して約20以下の付加または欠失すなわち、ギャップを含み得る。比較ウインドウをアラインメントするための配列の最適アラインメントは、アルゴリズムのコンピュータへの実装インテリジェネティクスIntelligeneticsによるGeneworksプログラム;参照により本明細書に組み込まれるウィスコンシンジェネティクスソフトウェアパッケージリリース7.0WisconsinGeneticsSoftwarePackageRelease7.0におけるGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA,ジェネティクスコンピュータグループGeneticsComputerGroup,アメリカ合衆国ウィスコンシン州マディソンサイエンスドライブ575、または調査および選択される種々の方法のいずれかにより作成された最良のアラインメントすなわち、比較ウインドウにわたり最大百分率のホモロジーをもたらすにより実施することができる。例えば参照により本明細書に組み込まれるアルトシュルAltschulら,1997,Nucl.AcidsRes.253389により開示されたプログラムのBLASTファミリーを参照することもできる。配列分析の詳細な考察は、CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGYEds.オースベルAusubelら.ジョンウィリーサンズ社JohnWileySonsIncニューヨーク州,1995-1999のユニット1.3に見出すことができる。用語配列同一性は、本明細書において、配列が比較のウインドウにわたり同一である程度を考慮して標準的なアルゴリズムを使用する適切なアラインメントを考慮する正確なヌクレオチドまたはアミノ酸一致の数を含むようにその最も広い意味で使用される。したがって、配列同一性の百分率は、比較のウインドウにわたり2つの最適にアラインメントされた配列を比較し、同一核酸塩基例えば、A、T、C、G、Iが両配列中に生じる位置の数を決定して一致位置の数を得、その一致位置の数を比較のウインドウ中の位置の総数すなわち、ウインドウサイズにより割り、その結果に100を乗じて配列同一性の百分率を得ることにより算出される。例えば、配列同一性は、DNASIS登録商標コンピュータプログラムwindows登録商標用バージョン2.5;日立ソフトウェアエンジニアリング社,南サンフランシスコ,カリフォルニア州,アメリカ合衆国から入手可能により算出された一致百分率を意味すると理解することができる。したがって、本発明のタンパク質および核酸ホモログ、例えば上記定義の変異体を組換えDNA技術により調製することは十分に当業者の能力の範囲内である。例えば、本発明の核酸は、例えばトランスポゾン変異導入を使用するランダム変異導入、または部位特異的変異導入を使用して変異させることができる。次いで、得られたDNA断片を好適な発現宿主、例えば大腸菌E.coli中にクローニングする。本明細書において使用される誘導体タンパク質は、例えば、翻訳後修飾例えばリン酸化、アセチル化など、グリコシル化の改変例えばグリコシル化の付加、除去または変化および/または当該技術分野において理解される付加アミノ酸配列の包含により他の化学部分とのコンジュゲーションまたは複合体化により変化されている。付加アミノ酸配列は、融合タンパク質を作出する融合パートナアミノ酸配列を含み得る。例として、融合パートナアミノ酸配列は、単離融合タンパク質の検出および/または精製を支援し得る。非限定的な例には、金属結合例えばポリヒスチジン融合パートナ、マルトース結合タンパク質MBP、プロテインA、グルタチオンS-トランスフェラーゼGST、蛍光タンパク質配列例えばGFP、エピトープタグ、例えばmyc、FLAGおよびヘマグルチニンタグが含まれる。他の誘導体には、ポリペプチドを有する単離タンパク質が含まれ、そのポリペプチドを担体タンパク質として作用するオリゴ糖ベースワクチン構成成分に融合することができる。本発明により企図される他の誘導体には、限定されないが、側鎖への修飾、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質合成の間の非天然アミノ酸および/またはそれらの誘導体の取り込み、ならびに本発明のポリペプチド、断片および変異体に立体配座制約を付与する架橋剤および他の方法の使用が含まれる。本発明の別の態様は、本発明の単離タンパク質その単離タンパク質の断片変異体および誘導体を含むをコードする単離核酸を提供する。本明細書において使用される用語核酸は、一本鎖または二本鎖DNUおよびRNAを指定する。DNAには、ゲノムDNAおよびcDNAが含まれる。RNAには、mRNA、RNA、RNAi、siRNA、cRNAおよび自己触媒RNAが含まれる。核酸は、DNA-RNAハイブリッドであってもよい。核酸は、典型的にはA、G、C、TまたはU塩基を含むヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む。しかしながら、ヌクレオチド配列は、他の塩基、例えばイノシン、メチリシトシン、メチルイノシン、メチルアデノシンおよび/またはチオウリジンを含み得るが、それらに限定されない。ポリヌクレオチドは、80個以上の連続ヌクレオチドを有する核酸である一方、オリゴヌクレオチドは、80個未満の連続ヌクレオチドを有する。プローブは、好適には、例えばサザンまたはノザンブロッティングにおいて相補的配列を検出する目的のために標識された一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであり得る。プライマーは、通常、好ましくは15~50個の連続ヌクレオチドを有し、相補的核酸テンプレートにアニーリングし得、DNAポリメラーゼ、例えばTaqポリメラーゼ、RNA依存性DNAポリメラーゼまたはSequenase商標の作用によりテンプレート依存的に伸長され得る一本鎖オリゴヌクレオチドである。本発明の単離核酸の特定の実施形態は、図2に記載のヌクレオチド配列配列番号26~43を含む。好ましくは、単離核酸は、配列番号32~43のいずれか1つに記載のヌクレオチド配列を含む。本発明の別の特定の態様は、本発明の単離タンパク質をコードする単離核酸のホモログを提供する。一実施形態において、核酸ホモログは、本発明の単離タンパク質のホモログまたは変異体をコードする。好適には、核酸ホモログは、髄膜炎菌N.meningitidisの野生型PorAタンパク質をコードしない。好ましくは、核酸ホモログは、本明細書に記載のPorAの1つ以上の中断された可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、核酸ホモログは、例えば図2および/または配列番号26~43、または好ましくは、配列番号32~43に例示される本発明の単離核酸と、少なくとも60または65、好ましくは、少なくとも70または75、より好ましくは、少なくとも80または85、よりいっそう好ましくは、少なくとも90または95のヌクレオチド配列同一性を共有する。さらに別の実施形態において、核酸ホモログは、本発明の単離核酸例えば図2および/または配列番号26~43、または好ましくは、配列番号32~43に例示されるものに、少なくとも低いストリンジェンシー条件下で、好ましくは、少なくとも中程度のストリンジェンシー条件下で、より好ましくは、高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする。ハイブリダイズするおよびハイブリダイゼーションは、DNA-DNA、RNA-RNAまたはDNA-RNAハイブリッドを産生するための少なくとも部分的に相補的なヌクレオチド配列の対形成を示すために本明細書において使用される。相補的ヌクレオチド配列を含むハイブリッド配列は、当該技術分野において周知の相補的プリンとピリミジンとの間の塩基対形成を介して生じる。これに関して、修飾プリン例えば、イノシン、メチルイノシンおよびメチルアデノシンおよび修飾ピリミジンチオウリジンおよびメチルシトシンも塩基対形成に関与し得ることが認識される。本明細書において使用されるストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーションの間の温度およびイオン強度条件、ならびにある種の有機溶媒および/または洗浄剤の存在または不存在を指す。ストリンジェンシーが高ければ、ハイブリダイズするヌクレオチド配列間の相補性の要求されるレベルが高くなる。高いストリンジェンシー条件は、高頻度の相補的塩基を有する核酸のみがハイブリダイズする条件を指定する。本明細書における高いストリンジェンシー条件への参照には、i42°Cにおける、ハイブリダイゼーションのための少なくとも約31v/vから少なくとも約50v/vのホルムアミドおよび少なくとも約0.01Mから少なくとも約0.15Mの塩、ならびに42°Cにおける洗浄のための少なくとも約0.01Mから少なくとも約0.15Mの塩;ii65°Cにおける、ハイブリダイゼーションのための1BSA、1mMのEDTA、0.5MのNaHPO4pH7.2、7SDS、および65°C超の温度における、約1時間の洗浄のためのa0.1xSSC、0.1SDS;またはb0.5BSA、1mMのEDTA、40mMのNaHPO4pH7.2、1SDS;ならびにiii68°C以上における、約20分間の洗浄のための0.2xSSC、0.1SDSが含まれ、包含される。一般に、洗浄は、Tm=69.30.41GC-12°Cにおいて実施される。一般に、二本鎖DNAのTmは、ミスマッチ塩基の数が1増加するごとに約1°Cだけ減少する。上記にかかわらず、ストリンジェントな条件は当該技術分野において周知であり、例えばAusubelら前掲の2.9および2.10章に記載されている。当業者は、種々の要因は、ハイブリダイゼーションの特異性を最適化するように操作することができることも認識する。最終洗浄のストリンジェンシーの最適化は、高程度のハイブリダイゼーションを確保するために機能し得る。典型的には、相補的ヌクレオチド配列は、ヌクレオチドをマトリックス好ましくは、合成膜、例えばニトロセルロース上で固定化する工程、ハイブリダイゼーション工程、および典型的には、標識プローブまたは他の相補的核酸を使用する検出工程を含むブロッティング技術により同定される。サザンブロッティングは相補的DNA配列を同定するために使用され;ノザンブロッティングは相補的RNA配列を同定するために使用される。ドットブロッティングおよびスロットブロッティングは、相補的DNA/DNA、DNA/RNAまたはRNA/RNAポリヌクレオチド配列を同定するために使用することができる。このような技術は当業者により周知であり、Ausubelら前掲の2.9.1から2.9.20ページに記載されている。このような方法によれば、サザンブロッティングは、DNA分子をゲル電気泳動によりサイズに従って分離し、サイズにより分離されたDNAを合成膜に転写し、膜に結合したDNAを相補的ヌクレオチド配列にハイブリダイズすることを含む。代替的なブロッティング工程は、cDNAまたはゲノムDNAライブラリー中の相補的核酸を同定する場合に、例えばプラークまたはコロニーハイブリダイゼーションのプロセスを介して使用される。この手順の他の典型例は、サムブルックSambrookら前掲の8~12章に記載されている。0にハイブリダイズした標識核酸を検出する方法は、当該技術分野における実務者に周知である。このような方法には、オートラジオグラフィ、化学発光、蛍光および比色検出が含まれる。核酸は、核酸配列増幅技術を使用して単離、検出および/または組換えDNA技術に供することもできる。好適な核酸増幅技術は当業者に周知であり、その技術には、ポリメラーゼ連鎖反応PCR;相補鎖置換増幅SDA;ローリングサークル複製RCR;核酸配列ベース増幅NASBA、Q-βレプリカーゼ増幅およびヘリカーゼ依存性増幅が含まれるが、それらに限定されない。本明細書において使用される増幅産物は、核酸増幅により発生した核酸産物を指す。核酸増幅技術には、特定の定量および半定量技術、例えば当該技術分野において周知のqPCR、リアルタイムPCRおよび競合的PCRが含まれ得る。本発明のさらに別の態様は、本発明の単離核酸および1つ以上の付加ヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物を提供する。好適には、遺伝子構築物は、当該技術分野において十分理解されているプラスミド、バクテリオファージ、コスミド、酵母または細菌性人工染色体の形態であり、またはその遺伝子構成成分を含む。遺伝子構築物は、細菌または他の宿主細胞中での単離核酸の維持および伝播、組換えDNA技術による操作ならびに/または本発明の核酸もしくはコードされるタンパク質の発現に好適であり得る。宿主細胞発現の目的のため、遺伝子構築物は発現構築物である。好適には、発現構築物は、発現ベクター中の1つ以上の付加配列に作動的に連結された本発明の核酸を含む。発現構築物の非限定的な例を表2および表3に提供する。発現ベクターは、自己複製染色体外ベクター、例えばプラスミド、または宿主ゲノム中に組み込まれるベクターであり得る。作動的に連結されたは、前記付加ヌクレオチド配列が、好ましくは、転写を初期化、調節またはそうでなければ制御するように本発明の核酸に対して位置していることを意味する。一実施形態において、付加ヌクレオチド配列は調節配列である。調節ヌクレオチド配列は、一般に、発現に使用される宿主細胞に適切である。多数のタイプの適切な発現ベクターおよび好適な調節配列が、種々の宿主細胞について当該技術分野において公知である。典型的には、前記1つ以上の調節ヌクレオチド配列には、限定されないが、プロモータ配列、リーダまたはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始および終結配列、翻訳開始および終結配列、ならびにエンハンサーまたはアクチベータ配列が含まれ得る。当該技術分野において公知の構成的または誘導的プロモータが本発明により企図される。プロモータは、天然プロモータ、または2つ以上のプロモータの要素を組み合わせるハイブリッドプロモータであり得る。別の実施形態において、付加ヌクレオチド配列は、形質転換された宿主細胞の選択を可能とする選択可能マーカ遺伝子である。選択可能マーカ遺伝子は当該技術分野において周知であり、使用される宿主細胞によって変動する。付加ヌクレオチド配列の1つの特定の実施形態は、改変ポリG配列を含む。野生型porA遺伝子は、そのプロモータ中に株内および株間で多様性の高いポリGトラクトを有し、それにより多様な発現レベルがもたらされる。本発明の単離タンパク質の一貫した発現を確保するため、多様性を低減させるようにポリGトラクトを改変することができる。それというのも、G11がPorAの最適な発現に関連しているからである。ポリGトラクトの変化を低減させるため、それがG5AG5により置き換えられるようにそれを改変することができる。発現構築物は、本発明の組換えポリペプチドが上記の融合タンパク質として発現されるように融合パートナ典型的には発現ベクターにより提供されるをコードする付加ヌクレオチド配列も含み得る。発現構築物は、発現構築物中に存在する単離核酸の細菌ゲノム中への相同組換えを促進する1つ以上の付加ヌクレオチド配列も含み得る。例にすぎないが、髄膜炎菌N.meningitidisの内因性porA遺伝子を、本発明の単離核酸および付加ヌクレオチド配列を含む発現構築物による形質転換体および相同組換えの選択を可能とする外因性ヌクレオチド配列例えばpLK6からのLacZ-Kanrカセット;ザボSzaboら1992,J.Bacteriol1747245-7252またはpJJ260からのsacB-Kanr-TetrカセットニールNeilら,2009,InfectImmun.772285-2293.例えばpLK6からのLacZ-KanrカセットまたはpJJ260からのsacB-Kanr-Tetrカセットにより置き換えることができる。他の相同組換えアプローチは当業者に周知である。親和性クロマトグラフィーによる融合ポリペプチド精製の特定の目的のため、親和性クロマトグラフィーのための関連マトリックスは、それぞれグルタチオン-、アミロース-、およびニッケル-またはコバルト-コンジュゲート樹脂である。多くのこのようなマトリックスは、キット形態、例えばHIS6融合パートナについて有用なQIAexpress登録商標システムキアゲンQiagen登録商標およびファルマシアPharmacia登録商標GST精製システムで入手可能である。好ましくは、融合パートナは、例えば関連プロテアーゼが本発明の融合ポリペプチドを部分的に消化し、それによりそれから本発明の組換えポリペプチドを遊離させることを可能とする第Xa因子またはトロンビンについてのプロテアーゼ開裂部位も有する。次いで、遊離されたポリペプチドを、後続のクロマトグラフィー分離により融合パートナから単離することができる。本発明の単離タンパク質断片、誘導体およびホモログを含むは、当業者に公知の任意の好適な手順により調製することができる。好ましくは、単離タンパク質は組換えタンパク質である。例にすぎないが、本発明の組換え単離タンパク質は、i1つ以上の調節ヌクレオチド配列に作動的に連結された本発明の単離核酸を含む発現構築物を調製する工程;ii好適な宿主細胞を、発現構築物により形質移入または形質転換する工程;iii前記宿主細胞中で組換えタンパク質を発現させる工程;およびiv組換えタンパク質を前記宿主細胞から単離する工程を含む方法により産生することができる。発現に好適な宿主細胞は、原核または真核細胞であり得る。例えば、好適な宿主細胞は、哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞、昆虫細胞または細菌細胞である。本発明による単離タンパク質の発現に好ましい1つの宿主細胞は、細菌である。使用される細菌は、大腸菌Escherichiacoliまたは髄膜炎菌N.meningitidisであり得る。好ましい実施形態において、宿主細胞は髄膜炎菌N.meningitidisである。好ましくは、髄膜炎菌N.meningitidis宿主細胞は、内因性PorAもOpaもOpcも莢膜多糖も発現せず、所望のリポ多糖表現型を発現するように改変されている。宿主細胞原核と真核を問わず中への遺伝子構築物の導入は、例えばCURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGYEds.Ausubelら,JohnWileySons,Inc.1995-2009、特に9および16章に記載のとおり当該技術分野において周知である。髄膜炎菌N.meningitidisの形質転換に関連して、このような方法は当該技術分野において周知である。髄膜炎菌N.meningitidisは天然に形質転換可能であることも認識される。組換えタンパク質は、当業者が例えばサムブルックSambrookら,MOLECULARCLONING.ALaboratoryManualコールドスプリングハーバープレスColdSpringHarborPress,1989、特に16および17部;CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGYEds.Ausubelら,JohnWileySons,Inc.1995-2009、特に10および16章;ならびにCURRENTPROTOCOLSINPROTEINSCIENCEEds.Coliganら,JohnWileySons,Inc.1995-2009、特に1、5および6章に記載の標準的なプロトコルを使用して都合良く調製することができる。本明細書に開示の単離タンパク質、断片、ホモログおよび誘導体に対して生成され、それらに結合する抗体および/または抗体断片も提供される。好適には、抗体および/または抗体断片は、野生型PorAタンパク質に結合しない。好ましくは、抗体および/または抗体断片は、中断されたPorA可変領域例えばVR1、VR2、SVR1またはSVR2領域に特異的に結合し、野生型PorA可変領域例えばVR1、VR2、SVR1またはSVR2領域に結合しない。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得、ネイティブまたは組換えであり得る。抗体産生、精製および使用に適用可能な周知のプロトコルは、例えば、Coliganら,CURRENTPROTOCOLSINIMMUNOLOGYJohnWileySonsNY,1991-1994の2章およびハーロー,E.レーン,DHarlow,E.Lane,D.Antibodies:ALaboratoryManual,コールドスプリングハーバーColdSpringHarbor,コールドスプリングハーバーラボラトリーColdSpringHarborLaboratory,1988に見出すことができ、それらは両方とも参照により本明細書に組み込まれる。一般に、本発明の抗体は、本発明の単離タンパク質、断片、ホモログまたは誘導体に結合し、またはそれらとコンジュゲートする。例えば、抗体はポリクローナル抗体であり得る。このような抗体は、例えば本発明の単離タンパク質、断片、変異体または誘導体を、産生種マウスまたはウサギが含まれ得る中に注射してポリクローナル抗血清を得ることにより調製することができる。ポリクローナル抗体を産生する方法は、当業者に周知である。使用することができる例示的なプロトコルは、例えばColiganら,CURRENTPROTOCOLSINIMMUNOLOGY前掲、およびHarlowLane,1988前掲に記載されている。モノクローナル抗体は、例えば参照により本明細書に組み込まれるケーラーミルステインKoehlerMilstein,1975,Nature256,495による論文に記載の標準的方法を使用して、または例えばColiganら,CURRENTPROTOCOLSINIMMUNOLOGY前掲に記載のより近年のその改変により、本発明の単離タンパク質、断片、変異体または誘導体の1つ以上により接種された産生種由来の脾臓または他の抗体産生細胞を不死化させることにより産生することができる。本発明はまた、その範囲内に抗体断片、例えば上記参照のポリクローナルまたはモノクローナル抗体のFc、FabまたはFab2断片を含む。あるいは、抗体または抗体断片は、本発明のペプチドに対する単鎖Fv抗体scFvを含み得る。このようなscFvは、例えば米国特許第5,091,513号明細書、欧州特許第239,400号明細書またはウインターミルステインWinterMilstein,1991,Nature349293による論文にそれぞれ記載の方法に従って調製することができる。抗体および抗体断片は、髄膜炎菌N.meningitidis感染に対する受動免疫化に使用することができる。好ましくは、このような抗体は殺菌性である。抗体および抗体断片は、上記のエピトープマッピングに使用することができる。本発明の抗体および抗体断片は、親和性クロマトグラフィーに使用することができる。例えば、Coliganら,CURRENTPROTOCOLSINIMMUNOLOGY前掲の9.5章に記載の免疫親和性クロマトグラフィー手順を参照することができる。抗体および抗体断片は、髄膜炎菌N.meningitidisおよび/または髄膜炎菌N.meningitidisPorAタンパク質の検出に使用することができる。一態様において、哺乳動物において髄膜炎菌N.meningitidisを検出する方法は、i本発明の抗体または抗体断片を、哺乳動物から得られた生体試料と合わせる工程;およびii前記試料中で前記抗体または抗体断片と髄膜炎菌N.meningitidisおよび/または髄膜炎菌N.meningitidisPorAタンパク質とを含む複合体の存在または不存在を決定する工程を含み、前記複合体の存在は前記髄膜炎菌N.meningitidisを示す。生体試料中の髄膜炎菌N.meningitidisの存在または不存在は、哺乳動物から生体試料を得、上記抗体または抗体断片を生体試料と混合し、試料中の髄膜炎菌N.meningitidisの存在を示す特異的に結合した抗体または抗体断片を検出することにより決定することができる。典型的には、特異的に結合した抗体または抗体断片は、生体試料中の髄膜炎菌N.meningitidisPorAタンパク質との複合体を形成する。好適には、髄膜炎菌N.meningitidisPorAタンパク質は、前記哺乳動物に感染する髄膜炎菌N.meningitidis由来であり、またはその細菌起源である。本明細書において使用される用語生体試料は、個体、例えば患者から抽出、未処理、処理、希釈または濃縮することができる試料を指す。好適には、生体試料は、全血、血清、血漿、唾液、尿、汗、腹水、腹腔液、滑液、羊水、脳脊髄液、皮膚生検物などからなる群から選択される。別の態様において、生体試料中の髄膜炎菌N.meningitidisPorAタンパク質に対する抗体を検出する方法は、i哺乳動物から得られた生体試料を、本発明の単離タンパク質例えば配列番号2~22または好ましくは配列番号l1~22によるものと接触させる工程;およびii前記試料中の前記単離タンパク質および抗髄膜炎菌N.meningitidisPorA抗体を含む複合体の存在または不存在を決定する工程含む。好適には、抗髄膜炎菌N.meningitidisPorA抗体は、髄膜炎菌N.meningitidisによる哺乳動物の感染に応答して誘発される内因性抗体である。免疫アッセイ、タンパク質アッセイタンパク質インサイチューアレイ、DNA-タンパク質アレイおよび核酸プログラマブルアレイおよび二次元2D発現プロファイリングを含むを含むタンパク質検出に好適な任意の技術を使用することができるが、それらに限定されない。免疫アッセイには、限定されないが、当業者に周知の免疫ブロッティング、ウエスタンブロッティングおよびドットブロッティング、ラジオ免疫アッセイRIA、酵素結合免疫吸着アッセイELISAおよび免疫クロマトグラフィー技術ICTが含まれ得る。例えば、本発明に従って使用することができる種々の免疫アッセイを開示するColiganら,CURRENTPROTOCOLSINIMMUNOLOGY前掲の7章を参照することができる。免疫アッセイには、当該技術分野において理解されている競合的アッセイが含まれ得る。好ましい実施形態において、検出は、前記単離タンパク質、断片、ホモログもしくは誘導体、または前記抗体もしくは抗体断片を標識により修飾することにより実施される。一実施形態は、標識タンパク質、断片、ホモログまたは誘導体を免疫アッセイにおいて使用して髄膜炎菌N.meningitidis特異的抗体を検出する。別の実施形態は、標識抗体または抗体断片を免疫アッセイにおいて使用してPorAタンパク質を検出する。抗体および抗体断片に関して、標識は以下のものを含み得る:A抗体または抗体断片への標識の直接付着;B抗体または抗体断片への標識の間接付着;すなわち、続いて抗体または抗体断片に結合する別の試薬例えば二次抗体への標識の付着;およびC抗体または抗体断片の後続の反応産物への付着。標識は、発色体、触媒、酵素、蛍光体、化学発光分子、ランタノイドイオン、例えばユーロピウムEu34、放射性同位体および直接可視標識を含む群から選択することができる。直接可視標識の場合、コロイド状金属もしくは非金属粒子、色素粒子、酵素もしくは基質、有機ポリマー、ラテックス粒子、リポソーム、またはシグナル産生物質を含有する他の小胞などを使用することができる。本発明において有用な酵素標識の非限定的な例には、アルカリホスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、リゾチーム、マレートデヒドロゲナーゼなどが含まれる。酵素標識は、単独で、または第2の酵素と組み合わせて溶液中で使用することができる。蛍光体の非限定的な例には、フルオレセインイソチオシアネートFITC、アロフィコシアニンAPC、フルオレセイン誘導体、例えばFAMおよびROX、TexasRed、テトラメチルローダミンイソチオシアネートTRITL、R-フィコエリスリンRPE、AlexaおよびBodipy蛍光体が含まれるが、それらに限定されない。生体試料中の抗髄膜炎菌N.meningitidis抗体例えば殺菌性抗体を検出する方法も提供される。一態様において、i本発明の単離タンパク質例えば配列番号2~22または好ましくは配列番号11~22によるものにより免疫化された哺乳動物から得られた生体試料を、髄膜炎菌N.meningitidisと接触させる工程;およびii前記試料中の前記殺菌性抗体の存在または不存在を決定する工程含む、髄膜炎菌N.meningitidisに対する殺菌性抗体を検出する方法が提供される。典型的には、殺菌性抗体は、単離タンパク質による免疫化に応答して誘発される。殺菌性抗体を検出する殺菌アッセイの例は実施例に以下提供される。別の広範な態様において、本発明は、核酸に基づく検出方法を提供する。一実施形態において、生体試料中の髄膜炎菌N.meningitidisを検出する方法は、生体試料を患者から単離する工程および本発明の単離核酸を使用して試料中のPorAタンパク質をコードする核酸配列を検出する工程を含む。核酸の検出は、任意の好適な技術を使用して実施することができる。例えば、当該技術分野において周知のとおり、本発明による標識核酸を患者から得られた核酸抽出物のサザンブロットにおけるプローブとして使用することができる。あるいは、本発明による標識核酸は、患者からのRNAまたはcDNA抽出物のノザンブロットにおけるプローブとして利用することができる。好ましくは、患者からの核酸抽出物は、本発明の核酸配列のセンスおよびアンチセンス配列に対応するオリゴヌクレオチドプライマーと合わせて、核酸増幅技術、例えばPCRとともに利用されてそれにより増幅産物が産生される。増幅産物は、複数の技術のいずれかにより、例えば上記プローブハイブリダイゼーションにより検出することができる。種々の自動化固相検出技術も核酸の検出に適切である。これらの技術には、当該技術分野において十分理解されている巨大スケール固定化プライマーアレイVLSIPS商標、PCR増幅産物の磁気ビーズベース捕捉および核酸アレイが含まれる。本発明はまた、髄膜炎菌N.meningitidis感染を検出するためのキットを提供する。キットは、生体試料中の髄膜炎菌N.meningitidis、内因性髄膜炎菌N.meningitidisPorAタンパク質もしくはコーディング核酸、または抗体を検出するための1つ以上の検出試薬を含み得る。キットは、用いられる試験法の性質に応じて上記の1つ以上の特定の検出試薬を含有する。これに関連して、キットは、本発明による単離タンパク質、断片、ホモログ、誘導体、抗体、抗体断片または核酸例えばプライマーまたはプローブの1つ以上を含み得る。これらの任意の1つ以上を上記のとおり標識することができる。キットは、場合により1つ以上の他の試薬、例えば検出試薬、例えば標識二次抗体、比色または生物発光検出のための酵素および/または基質、陽性および/または陰性対照、洗浄溶液、希釈緩衝液、タンパク質または核酸サイズマーカ、DNAポリメラーゼ、DNAリガーゼ、Taqポリメラーゼなども、用いられる検出法に応じて含み得る。本発明のさらなる態様は、哺乳動物において髄膜炎菌N.meningitidis感染を治療するための予防および治療方法ならびに/または医薬組成物を提供する。1つの特定の態様において、哺乳動物において髄膜炎菌N.meningitidis感染を予防または治療する方法は、哺乳動物に、i本発明の単離タンパク質例えば配列番号2~22または好ましくは配列番号11~22によるものそのホモログ、誘導体および断片を含む;ii本発明の単離核酸例えば配列番号23~43または好ましくは配列番号32~43によるものそのホモログ、誘導体および断片を含む;iiiiiの単離核酸をコードする発現構築物;iviiiの発現構築物を含む宿主細胞;v本発明の単離タンパク質に結合する抗体または抗体断片;および/またはvii~vの1つ以上を含む医薬組成物からなる群から選択される免疫原性因子immunogenicagentを投与して、それにより前記哺乳動物において前記髄膜炎菌N.meningitidis感染を予防または治療する工程を含む。好適には、免疫原性因子は、野生型PorAタンパク質および/または1つ以上の中断された可変領域を有さないPorAタンパク質により誘発されるよりも株特異的でなく、または交差反応的である免疫応答を前記哺乳動物中で誘発する。好ましくは、誘発される免疫応答は保護的免疫応答である。好ましくは、哺乳動物はヒトである。1つの特定の好ましい実施形態において、本発明の単離タンパク質そのホモログ、誘導体および断片を含むは、OMV中に存在する。例えば、フラッシュ,C.Frasch,C.,L.ヴァンアルフェンL.vanAlphen,ら2001.髄膜炎性疾患のための外膜タンパク質小胞ワクチンOuterMembraneProteinVesicleVaccinesforMeningococcalDisease.MeningococcalVaccines:MethodsandProtocols.A.ポラードA.PollardおよびM.メイデンM.Maiden編,ヒューマナプレスHumanaPress.66:81-107に記載のとおりOMVワクチンを調製する多くの周知の方法が存在する。別の特定の好ましい実施形態において、本発明の単離タンパク質そのホモログ、誘導体および断片を含むは、染色体に組み込まれた発現構築物を含む細菌により発現される。好ましくは、細菌は髄膜炎菌N.meningitidisである。好適には、医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤を含む。薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤は、全身投与において安全に使用することができる固体または液体充填剤、希釈剤またはカプセル化物質を意味する。特定の投与経路に応じて、当該技術分野において周知の種々の担体を使用することができる。これらの担体は、糖、デンプン、セルロースまたはその誘導体、麦芽、ゼラチン、タルク、硫酸カルシウム、植物油、合成油、ポリオール、アルギン酸、リン酸緩衝溶液、乳化剤、等張生理食塩水および塩、例えば鉱酸塩、例として塩酸塩、臭化物および硫酸塩、有機酸、例えば酢酸塩、プロピオン酸塩およびマロン酸塩ならびにパイロジェンフリー水を含む群から選択することができる。薬学的に許容可能な担体、希釈剤および賦形剤を記載する有用な参照文献は、参照により本明細書に組み込まれるRemington’sPharmaceuticalSciencesマック出版社MackPublishingCo.ニュージャージー州,アメリカ合衆国,1991である。任意の安全な投与経路を本発明の免疫原性因子の投与に用いることができる。例えば、経口、経直腸、非経口、舌下、バッカル、静脈内、関節内、筋肉内、皮内、皮下、吸入、眼内、腹腔内、脳室内、経皮などを用いることができる。筋肉内および皮下注射は、例えば免疫原性組成物、ワクチンおよびDNAワクチンの投与に適切である。剤形には、錠剤、分散剤、懸濁剤、注射剤、液剤、シロップ剤、トローチ剤、カプセル剤、坐剤、エアロゾル剤、経皮貼付剤などが含まれる。これらの剤形には、この目的のために特別に設計された注射または移植用制御放出デバイスまたはこの様式で付加的に作用するように改変された他の形態のインプラントも含まれ得る。治療剤の制御放出は、例えば、それを疎水性ポリマー、例としてアクリル樹脂、ワックス、高級脂肪族アルコール、ポリ乳酸およびポリグリコール酸およびある種のセルロース誘導体、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロースによりコーティングすることにより実施することができる。さらに、制御放出は、他のポリマーマトリックス、リポソームおよび/またはマイクロスフェアを使用することにより実施することができる。経口または非経口投与に好適な本発明の医薬組成物は、別個単位、例えば、所定量の本発明の1つ以上の治療剤をそれぞれ含有するカプセル剤、サシェ剤または錠剤として、散剤または顆粒剤として、または水性液体、非水性液体、水中油型エマルションもしくは油中水型液体エマルション中の液剤もしくは懸濁剤として提供することができる。このような組成物は、製薬方法のいずれかにより調製することができるが、全ての方法は、上記の1つ以上の免疫原性因子を1つ以上の必須成分を構成する担体と会合させる工程を含む。一般に、組成物は、本発明の免疫原性因子を液体担体もしくは微細固体担体またはその両方と均一に緊密に混合し、次いで必要であれば、産生物を所望の提供物に成形することにより調製される。上記組成物は、投薬配合物と適合するように、患者を髄膜炎菌N.meningitidis感染から保護、または既存の感染を治療するために免疫原性的に有効であるような量で投与することができる。患者に投与される用量は、本発明に関連して、患者において経時的に利益応答、例えば髄膜炎菌N.meningitidisのレベルの低減をもたらすために、または髄膜炎菌N.meningitidisによる感染を阻害するために十分でなければならない。投与すべき免疫原性因子の量は、治療すべき対象その年齢、性別、体重および全身健康状態を含むに依存し得る。これに関連して、投与に要求される免疫原性因子の正確な量は、担当医の判断に依存する。髄膜炎菌N.meningitidisに対する治療または予防において投与すべき免疫原性因子の有効量の決定において、医師は、循環血漿レベル、疾患の進行、および抗髄膜炎菌N.meningitidis抗体の産生を評価することができる。いずれのイベントにおいても、本発明の免疫原性因子の好適な投薬量は当業者が容易に決定することができる。このような投薬量は、ナノグラムからミリグラムのオーダーの本発明の免疫原性因子であり得る。特定の実施形態において、本発明の免疫原性因子は、治療または予防ワクチンとして投与することができる。したがって、本発明は、活性物質として本発明の免疫原性因子の1つ以上を含有するワクチンの産生に及ぶ。種々の適用可能な手順がこのようなワクチンの産生に企図される。例示的な手順には、例えば、参照により本明細書に組み込まれるNEWGENERATIONVACCINES1997,レヴァインLevineら,マーセルデッカー社MarcelDekker,Inc.ニューヨーク,バーゼル香港BaselHongKongに記載のものが含まれる。本発明による免疫原性因子は、他の抗原、例として他の抗原のBまたはT細胞エピトープと混合、コンジュゲートまたは融合させることができる。さらに、本発明による免疫原性因子は、下記担体にコンジュゲートさせることができる。本発明のハプテン性ペプチドが使用される場合すなわち、コグネート同種の抗体と反応するが、それ自体で免疫応答を誘発し得ないペプチド、そのペプチドを免疫原性担体とコンジュゲートさせることができる。有用な担体は当該技術分野において周知であり、その担体には、例えば:サイログロブリン;アルブミン、例えばヒト血清アルブミン;毒素、類毒素または破傷風、ジフテリア、百日咳、シュードモナス菌Pseudomonas、大腸菌E.coli、ブドウ球菌Staphylococcus、および連鎖球菌Streptococcusからの毒素の任意の変異体交差反応性材料CRM;ポリアミノ酸、例えばポリリジン:グルタミン酸;インフルエンザ;ロタウイルスVP6、パルボウイルスVP1およびVP2;B型肝炎ウイルスコアタンパク質;B型肝炎ウイルス組換えワクチンなどが含まれる。あるいは、担体タンパク質または他の免疫原性タンパク質の断片またはエピトープを使用することができる。例えば、本発明のハプテン性ペプチドを細菌性毒素、類毒素またはCRMのT細胞エピトープにカップリングさせることができる。これに関連して、米国特許第5,785,973号明細書を参照することができる。本発明の免疫原性因子は、髄膜炎菌N.meningitidisの抗原、または他の生物病原性細菌インフルエンザ菌H.influenzae、カタル球菌M.catarrhalis、淋菌N.gonorrhoeae、大腸菌E.coli、肺炎連鎖球菌S.pneumoniaeなどを含むの抗原と組み合わせて多価サブユニットワクチンとして投与することができる。あるいは、または付加的に、これらは髄膜炎菌N.meningitidisのオリゴ糖または多糖構成成分に合わせて投与することができる。ワクチンおよび他の免疫原性組成物は、当該技術分野において周知のアジュバントを含み得る。本発明により企図されるアジュバントには、限定されないが、表面活性物質、例えばヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、オクタデシルアミノ酸エステル、リゾレシチン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、N,N-ジコクタデシル-N’,N’ビス2-ヒドロキシエチル-プロパンジアミン、メトキシヘキサデシルグリセロール、およびプルロニック登録商標ポリオール;ポリアミン、例えばピラン、硫酸デキストラン、ポリICカーボポール登録商標;ペプチド、例えばムラミルジペプチドおよび誘導体、ジメチルグリシン、タフトシン;油エマルション;ならびにミネラルゲル、例えばリン酸アルミニウム、水酸化アルミニウムまたはミョウバン;リンホカイン、QuilAおよび免疫刺激複合体ISCOMが含まれる。OMV送達に関する実施形態において、これらの小胞はアジュバント、例えばアルミニウム塩を用いてまたは用いずに産生することができる。アジュバントの例に関連して、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第99/36544号も参照される。特定の実施形態において、髄膜炎菌N.meningitidis感染を治療するための組成物および方法ワクチンおよび免疫化の方法を含むは、本発明の単離タンパク質をコードするDNA発現構築物を含み得る。例えば、本発明の免疫原性因子は、弱毒化ウイルス宿主により発現させることができる。弱毒化ウイルス宿主は、天然に実質的に無毒性であり、または実質的に無毒性とされたウイルスベクターを意味する。ウイルスは、任意の好適な物理的例えば、熱処理または化学的手段例えば、ホルムアルデヒド処理により実質的に無毒性とすることができる。実質的に無毒性は、感染性が破壊されたウイルスを意味する。理想的には、ウイルスの感染性は、ウイルスの免疫原性を担持するタンパク質に影響することなく破壊される。前記のことから、弱毒化ウイルス宿主は生ウイルスまたは不活化ウイルスを含み得ることが認識される。本発明によるワクチンにおいて有用であり得る弱毒化ウイルス宿主は、ウイルスベクターアデノウイルス、サイトメガロウイルスおよび好ましくは、ポックスウイルス、例えばワクシニア例えば米国特許第4,603,112号明細書および弱毒化サルモネラ菌Salmonella株例えば、米国特許第4,550,081号明細書に記載のものを含むを含み得る。生ワクチンは、それらが実質的に長時間持続する免疫を付与し得る長期刺激をもたらすので特に有利である。ナイセリア属Neisseriaタンパク質を使用する免疫化に潜在的に好適な種々のウイルスベクター、および送達方法を記載する別の参照文献は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第99/36544号である。多価ワクチンは、髄膜炎菌N.meningitidisの異なるエピトープ例えば、髄膜炎菌N.meningitidisの他の表面タンパク質またはエピトープを発現する1つ以上の微生物から調製することができる。さらに、他の病原性微生物のエピトープをワクチン中に取り込むことができる。例えば、このことは、本発明による核酸配列を発現させるための組換えワクシニアウイルスの構築を含み得る。組換えワクシニアウイルスは、宿主中に導入すると免疫原性因子を発現し、それにより宿主CTL応答を誘発する。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、免疫化プロトコルにおいて有用なワクシニアベクターおよび方法を記載する米国特許第4,722,848号明細書を参照することができる。本発明の免疫原性因子による治療的投与または免疫化に有用な広範な他のベクターは、本開示から当業者に明らかである。本発明を容易に理解し、実施することができるように、特定の好ましい実施形態を以下の非限定的な実施例としてここで記載する。実施例導入PorAは、髄膜炎菌Neisseriameningitidisの主要なタンパク質である。PorAは、株間で非常に多様性が高く、免疫応答を患者および無症状保有者の両方で、それが株同定のためのマーカとして使用される程度に発生させ、そのことは血清亜型系を表す非特許文献6。PorAモノマートポロジーの現行モデルは、8つの細胞外ループを示す。非特許文献8;非特許文献9。表1にまとめるとおり、最長ループ1および4は最も多様性が高く、ループ5および6においては多様性が低くそれぞれ半変異SVR1および2、残りのループにおいては本質的には多様性が見られない。ループ3は、PorAトリマーのそれぞれのサブユニットにより形成される細孔中でプラグを形成することが予測される。ループ1および4内でさえ、株間の多様性の大多数は、ループのチップを形成することが予測される残基に制限される。これらは可変領域VR1および2として公知である。多くの株のVR1およびVR2配列が同定されている例えば図3ならびに表3および4;Russellら,2004,Emerg.Infect.Dis.10674;http://neisseria.org/nm/typing/pora/vr1.shtmlおよびhttp://neisseria.org/nm/typing/pora/vr2.shtml参照。驚くべきことに、VR1/VR2の外側の領域も髄膜炎菌N.meningitidisに対する免疫応答にいかに寄与するかを記載する多くの科学文献が存在するジョーダンJordansら,2004,Infect.Immun.726503-10;非特許文献7;マーティンMartinら,2000,Vaccine182476-81;ウェッジWedegeら,2003,Infect.Immun.713775-81;コテルニコヴァKotelnikovaら,2005,Bull.Exp.Biol.139593-5;米国特許第7,238,345号明細書。本発明は、本明細書に例示の2つの広い実施形態を提供する:1髄膜炎菌Neisseriameningitidis株間で保存されているPorAの領域に対して免疫応答を向けるための可変領域の欠失;および2保存領域の新規提供が、髄膜炎菌Neisseriameningitidisの保存領域に対する免疫応答を向上させる。実施例1変異ループまたは領域が欠失されたPorAアレル、および選択可能マーカを有するporAアレルの作製porA遺伝子およびフランキング配列を髄膜炎菌Neisseriameningitidis株MC58のゲノムDNAからPCRにより増幅し、pGEMTeasy中にクローニングしてpPorAを作製した。このプラスミドを、種々のインバースPCR反応のための、または制限消化を介する組換え構築のためのテンプレートとして使用した。プラスミドをシーケンシングした。このように作製されたプラスミドは、表2および表3に列記される1個以上の欠失および/または中断を有した。付加的なプラスミドを、標準的な分子生物学方法制限消化、ライゲーション、クローニングにより構築して選択可能マーカにより置き換えられたporA遺伝子を有するプラスミドを作製した表2参照。欠失されたアミノ酸の数は、記載数よりも大きく、または小さいものであり得ることは明らかである。実施例2可変領域を置き換える保存領域を有するプラスミドプラスミドpDELVR1-2、およびpPorAをテンプレートとして使用してPCRおよび他の標準的分子生物学技術により、porAのVR1およびVR2コーディング領域が、表3および図1に記載のループ7および8の配列により置き換えられ、または改変されたいくつかのPorAアレルを作製した。PorAの他の保存アミノ酸配列、例えばループ2と定義される配列、VSVGGGATQWGNR配列番号48または任意の他の保存PorAペプチド配列をコードするDNA配列を、ヒトまたは動物免疫系に対する提供の向上のためにループ1および/または4中に取り込むことができることは明らかであるはずである。記載されたMC58および組換えPorA配列の一覧を図1に提供する。実施例3組換えPorAを発現する遺伝子による野生型PorAの置き換え表2、表3ならびに図1および図2に記載のPorAヌクレオチド配列を有するプラスミドを、髄膜炎菌N.meningitidis中に、天然形質転換により形質転換することができ、相同組換えは、組換え配列による野生型porAの置き換えをもたらす。あるいは、組換えporAアレルを上記組換えporAアレルを包含するプラスミドから増幅することができ、これらの増幅プライマーを使用して髄膜炎菌Neisseriameningitidisを形質転換することができる。形質転換体の同定を促進するため、porA遺伝子が欠失され、pLK6遺伝子からのLacZ-Kanrカセット、またはpJJ260からのsacB-Kanr-Tetrカセットにより置き換えられたレシピエント髄膜炎菌Neisseriameningitidis株を調製した表2参照。株¢3はレシピエント株非特許文献5であった。株¢09非特許文献5も、pPorDel:LacZkanにより形質転換し、X-galを含有する培地上での増殖後にブルーコロニーを選択した。続いて、¢02:delPorASacbの染色体DNAを¢09:delPorALacZ中に形質転換し、X-Galに基づき選択し、ホワイトコロニーを選択して¢09delPorASacbを作製した。この後者の株を、変異体porAアレルを含有するプラスミドによる形質転換のためのレシピエントとして使用した。10スクロースを含有する培地上での増殖により、porA:sacBアレルを変異体PorA遺伝子により置き換えたクローンについての選択を可能とした。こうして、ループ1、4、および5が欠失され、またはループ7および8によりそれぞれ置き換えられ、もしくは改変されたVR1およびVR2を有するPorAを発現する髄膜炎菌N.meningitidisの株を作製した。組換えporA遺伝子を他のプロモータに転写的に連結させ、相同組換えにより髄膜炎菌N.meningitidisの染色体中に挿入することができることは明らかである。実施例4細菌発現を改善するためのポリGトラクトの改変野生型porA遺伝子は、そのプロモータ中に株内および株間で多様性の高いポリGトラクトを有し、それにより多様な発現がもたらされる。PorAおよび変異体の一貫した発現を確保するため、多様性を低減させるようにポリGトラクトを改変した。それというのも、11個のGがPorAの最適な発現に関連しているからである。ポリGトラクトの変化を低減させるため、それがG5AG5により置き換えられるようにそれを改変することができる。この配列はG11と同一の長さであるが、G11ホモポリマートラクトよりも長さの変化が低頻度である。この目的のため、約330個のヌクレオチドをporAの上流に包含し、改変領域がネイティブポリGトラクトに代えてG5AG5を含む配列を合成した。この配列は、PorAの最初の38個のアミノ酸をコードするヌクレオチドを含み、pJJ260のカナマイシン耐性遺伝子の部分も取り込む。この配列をDNA2.0により合成し、プラスミドベクター中にクローニングした。これをSphI1およびRsrIIにより切断し、pPorDel:SacBのSphI-RsrII断片を置き換えるために使用した。得られたプラスミドpPorDelSacFixGを髄膜炎菌N.meningitidisの株¢9非特許文献5中に形質転換し、株¢3-Fixをもたらした。このようなレシピエントは、porAプロモータの全部または一部を置き換え得る。¢3-Fix後続の形質転換に使用されるは、プロモータ中の11個のGを含有する。組換えporAを包含するDNAによる後続の形質転換は、変異体porAアレルによるTetRSacBKan領域の置き換えをもたらす。こうして、プラスミドDNA、またはPCR増幅プライマープライマーPorAF1:5’GTTCGGTCGTTTCCGATAA-3’配列番号54およびOMWF5’-GGGGTATAATTGAAGACGTATCGG-3’配列番号92により増幅される、またはゲノムDNAは、10スクロースを含有する培地上で選択して、組換えporAの発現を有する株の同定を可能とした。配列分析は、プロモータ中のG残基の数をさらに同定した表5。組換えporA遺伝子を他のプロモータに転写的に連結させ、相同組換えにより髄膜炎菌N.meningitidisの染色体中に挿入することができることは明らかである。例えば、髄膜炎菌N.meningitidisからのporB遺伝子のプロモータおよびナイセリア属Neisseriaのopa遺伝子のプロモータを、髄膜炎菌N.meningitidisまたは淋菌N.gonorrhoeaeのゲノムDNAから増幅し、髄膜炎菌N.meningitidis中への組換えアレルの形質転換前に増幅プライマーを使用して表3に記載のプラスミドのいずれかのporAプロモータを置き換える。例えば、アクセッションAE002098.2のヌクレオチド2157459~2157528は、髄膜炎菌N.meningitidis株MC58のporB遺伝子のプロモータ5’-TAAATGCAAAGCTAAGCGGCTTGGAAAGCCCGGCCGGCTTAAATTTCTTAACCAAAAAAGGAATACAGCA-3’;配列番号93を包含する。同様に、淋菌N.gonorrhoeae株MS11のopaAのプロモータを、ベランドBellandら1997,MolMicrobiol.23:123-35により記載されたプライマーを使用するPCRにより増幅することができる。実施例5組換えPorAはヘテロロガスなPorAのエピトープに対する交差反応性を誘発する本発明のPorAタンパク質を含有する外膜小胞OMVは、髄膜炎菌N.meningitidisから調製し、ワクチンとして投与することができる。Fraschら2001,髄膜炎性疾患のための外膜タンパク質小胞ワクチン,MeningococcalVaccines:MethodsandProtocols.A.PollardおよびM.Maiden編,HumanaPress.66:81-107に記載のとおり、OMVワクチンを調製する多くの周知の方法、およびアジュバント、例えばアルミニウム塩を用い、または用いないそれらの調製が存在する。手短に述べると、OMVタンパク質をデオキシコレート法により単離し、タンパク質濃度をBCAアッセイにより評価してから水酸化アルミニウムゲルシグマSigmaに吸着させた。10匹のBALB/cマウスの群に0.1~10μgの全タンパク質を0、21および28日目に注射し、次いでワクチンの最終投与14日後に最終的な全採血により血液を回収した。血清を周知の方法により血液から調製することができる。手短に述べると、血液を室温において1~2時間凝固させ、4°Cにおいて一晩インキュベートした。血清を4°Cにおける5分間の10,000×gにおける遠心分離10分後に上澄みとして回収した。血清をPBS中で希釈し、4つの株およびそれらのアイソジェニックΔporA::tet変異体のサルコシル登録商標不溶性タンパク質に対するウエスタン免疫ブロットにおいて使用した。二次抗体はヤギ抗マウスIgGアルカリホスファターゼコンジュゲートSigmaであり、結合をNBT/BCIPSigmaを使用して比色的に検出した。このことは、株1728-2ループ7により置き換えられたVR1およびループ8により置き換えられたVR2を有するPorA;配列番号15を発現するからの単離タンパク質を含むOMVによりワクチン接種されたマウスからの血清が、全ての株からのPorAを認識することを示した表5および図5参照。使用した株およびそれらの関連PorA血清亜型は、MC58P1.7,16-2、BZ133P1.18-1,3、BZ232P1.5-2,2-2および400P1.19,15であった。実施例6組換えPorAタンパク質は、ELISAによるヘテロロガスなPorAの表面エピトープに対する交差反応性を誘発する固体培地BHI寒天上での一晩培養からの細菌を4時間継代培養してからA600nm=0.1まで再懸濁し、加熱死56°C、30分間させてから平底96ウェルプレートNuncimmunosorpをコーティングした。血清を、実施例5に記載のOMVとして調製された0.1~0.5μgのタンパク質によりワクチン接種されたマウスから回収した。ワクチン接種マウスからの血清を、それらの細菌細胞認識能についてこのアッセイにおいて試験した。二次抗体はヤギ抗マウス免疫グロブリンHRPコンジュゲートDAKOP0447、マウス免疫グロブリン、主としてIgGに対して生成されたものであった。逆数幾何平均力価を図6Aおよび6Bに報告し、表6は、読みが陰性対照を超えた陰性対照ODの平均に3SDを加えたものとして定義最終希釈である。それぞれの場合、血清を親株400、BZ133、およびBZ232およびそれぞれのアイソジェニックPorA変異株に対して試験した。驚くべきことに、株1728-2ループ7により置き換えられたVR1およびループ8により置き換えられたVR2を有するPorA;配列番号15を発現するおよび株D145ループ1、4、および5が欠失されたPorA;配列番号5を発現するからのOMVは、3つの試験PorA変異株よりも高い力価で3つの試験株を認識する抗体を誘発した。逆に、株¢9PorAP1.7,16-2を発現する、株027-3配列番号13のPorAを発現するおよび株028-10配列番号14のPorAを発現するからのOMVは、この実験においてPorA変異株よりも良好に野生株を認識するマウス抗体を一貫して誘発しなかった。実施例7変異体PorAを有するOMVの、オートロガスまたはヘテロロガスな株を標的化する能力を評価するための殺菌アッセイこのアッセイは、フーゲルホウトHoogerhoutら1995InfectionandImmunity63:3473-3478により記載された方法の改変により実施する。手短に述べると、細菌をBHIプレート上で37°Cにおいて5CO2中で一晩増殖させる。この一晩培養からの細菌を、同一条件下で4~6時間継代培養してから1mLのPBS中で懸濁する。細菌懸濁液をPBS中で約105cfu/mLに調整する。試験すべき血清を56°Cにおいて45分間熱不活化する。幼齢ウサギ補体を商業的供給業者例えばペルフリーズPelFreezから得る。アッセイは、無菌ポリスチレン平底96ウェルマイクロタイタープレート中で実施する。それぞれのウェルの全容量は24μLであり、12μLのPBS中2倍段階希釈血清および6μLの細菌懸濁液300~900の細菌を含有するを含む。血清および細菌を室温において10分間インキュベートしてから6μLのPBS中80補体最終濃度20vol/volを添加した。対照は、aPBS、細菌および補体、bPBS、細菌および血清である。全ての補体の添加および混合後、それぞれの対照ウェルからの7μLアリコートをBHI寒天プレートに移す。マイクロタイタープレート中を37°Cにおいて5CO2中で60分間インキュベートする。このインキュベーション後、それぞれのウェルからの7μLアリコートをBHI寒天プレートに移す。全てのBHIプレートを37°Cにおいて5CO2中で14~18時間インキュベートし、細菌コロニーを計数する。血清殺菌死滅を、細菌の少なくとも90が死滅する最大逆数希釈として報告する。それぞれの場合、個々のまたはプールしたマウス血清をMC58、MC58por::tetに対して、およびヘテロロガスなPorAおよびそれらのPorA変異体を発現する株に対して試験するMC58PorAはP1.7,16.2である一方、株2996およびM990は、例えばそれぞれP1.5.1,2-2およびP1.18,25である;図3A参照。本明細書を通して、本発明をいずれか1つの実施形態または特徴の具体的な集合に限定することなく、本発明の好ましい実施形態を記載することを目的とした。したがって、当業者により、本開示に照らして、本発明の範囲を逸脱することなく種々の改変および変更を例示された特定の実施形態において行うことができることが認識される。本明細書に参照された全てのコンピュータプログラム、アルゴリズム、特許および科学文献は、参照により本明細書に組み込まれる。"