"式Iで示す2-ニトロピロール構造を有する消光剤[式Iにおいて、R1及びR2はリボース、デオキシリボース、水素、水酸基、SH基、ハロゲン、置換又は未置換の、炭素数2ないし10のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基、窒素原子または硫黄原子を含む、1又は複数の5員ヘテロ環、1又は複数の6員ヘテロ環、1又は複数の複素環ヘテロ環、1又は複数の芳香族環、糖、糖鎖、アミノ酸、ペプチド、リンカーを介して結合した蛍光性分子からなる群から独立に選択される基である]。式Iにおいて、R1がリボースまたはデオキシリボースである、請求項1に記載の消光剤。人工塩基対の形成を検出する方法であって、1式II[式IIにおいて、R2は、水素、水酸基、SH基、ハロゲン、置換又は未置換の、炭素数2ないし10のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基、窒素原子または硫黄原子を含む、1又は複数の5員ヘテロ環、1又は複数の6員ヘテロ環、1又は複数の複素環ヘテロ環、1又は複数の芳香族環、糖、糖鎖、アミノ酸、ペプチド、リンカーを介して結合した蛍光性分子、からなる群から選択される基である]で表される消光性人工塩基を有するヌクレオシドまたはヌクレオチド、あるいは、2蛍光共鳴エネルギー転移FRET又は静的消光作用の供与体となりうる自己消光性を有する天然塩基修飾体、人工塩基、或いは塩基類似体を有するヌクレオシドまたはヌクレオチドのいずれか、あるいは双方を用いることを特徴とする、前記方法。人工塩基の塩基対の形成を検出する方法であって、蛍光性人工塩基と式II[式IIにおいて、R2は、水素、水酸基、SH基、ハロゲン、置換又は未置換の、炭素数2ないし10のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基、窒素原子または硫黄原子を含む、1又は複数の5員ヘテロ環、1又は複数の6員ヘテロ環、1又は複数の複素環ヘテロ環、1又は複数の芳香族環、糖、糖鎖、アミノ酸、ペプチド、リンカーを介して結合した蛍光性分子、からなる群から選択される基である]で表される消光性人工塩基との塩基対形成により、蛍光性人工塩基の蛍光の低下を観察することにより、人工塩基対が形成されたことが検出される、前記方法。蛍光性人工塩基の蛍光の低下により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法であって、以下のi7-2,2’-ビチエン-5-イルイミダゾ[4,5-b]ピリジン-3-イル基Dss;ii7-2,2’,5’,2’’-ターチエン-5-イルイミダゾ[4,5-b]ピリジン-3-イル基Dsss;iii2-アミノ-6-2,2’-ビチエン-5-イルプリン-9-イル基ss;iv2-アミノ-6-2,2’,5’,2’’-ターチエン-5-イルプリン-9-イル基sss;v4-2,2’-ビチエン-5-イル-ピロロ[2,3-b]ピリジン-1-イル基Dsas;vi4-[2-2-チアゾリルチエン-5-イル]ピロロ[2,3-b]ピリジン-1-イル基Dsav;及びvii4-[5-2-チエニルチアゾール-2-イル]ピロロ[2,3-b]ピリジン-1-イル基Dvas;からなる群より選択される蛍光性人工塩基と、以下の式III,又は式IVの消光性塩基[式IIIにおいて、R3は、-H、ヨード、-CH3、から選択される][式IVにおいて、R4は、-CH3、-CH2-NH2、及びここにおいて、nは0ないし12のいずれかの整数であるから選択される]との間で塩基対が形成されると、蛍光性人工塩基の蛍光が低下し、人工塩基対が形成されたことが検出される、前記方法。7-2,2’-ビチエン-5-イルイミダゾ[4,5-b]ピリジン-3-イル基Dssを塩基として有するポリヌクレオチドを含む、核酸プライマー;並びに、以下の式III,又は式IVの消光性塩基[式IIIにおいて、R3は、-H、ヨード、-CH3、から選択される][式IVにおいて、R4は、-CH3、-CH2-NH2、及びここにおいて、nは0ないし12のいずれかの整数であるから選択される]を塩基として有するポリヌクレオチドを含む、蛍光性人工塩基の蛍光の低下により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法に使用するためのキット。人工塩基対を検出する方法であって、式V[式Vにおいて、R5は、リンカーを介して結合した蛍光性分子である]で表される消光性人工塩基中の蛍光性分子の蛍光強度が、式Vの人工塩基が塩基対を形成することによって変化し、人工塩基対が形成されたことが検出される、前記方法。蛍光強度の変化により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法であって、7-2-チエニルイミダゾ[4,5-b]ピリジン3-イル基Dsと、以下の式VIの塩基:[式VIにおいて、R6は、リンカーを介して又は介さずに結合した蛍光性分子である]との間で塩基対が形成されると、式VIの塩基中の蛍光性分子の蛍光強度が増加し、人工塩基対が形成されたことが検出される、前記方法。蛍光性分子が、インドカルボシアニンCy3、インドジカルボシアニンCy5、5-カルボキシフルオレセイン5-FAM、6-カルボキシフルオレセイン6-FAM、5-カルボキシテトラメチルローダミン5-TAMRA、6-カルボキシテトラメチルローダミン6-TAMRA、5-ジメチルアミノナフタレン-1-スルホン酸DANSYL、5-カルボキシ-2’,4,4’,5’,7,7’-ヘキサクロロフルオレセイン5-HEX、6-カルボキシ-2’,4,4’,5’,7,7’-ヘキサクロロフルオレセイン6-HEX、5-カルボキシ-2’,4,7,7’-テトラクロロフルオレセイン5-TET、6-カルボキシ-2’,4,7,7’-テトラクロロフルオレセイン6-TET、5-カルボキシ-X-ローダミン5-ROX、及び6-カルボキシ-X-ローダミン6-ROXからなる群から選択される、請求項7又は8に記載の方法。7-2-チエニルイミダゾ[4,5-b]ピリジン3-イル基Dsを塩基として有するポリヌクレオシドを含む、核酸プライマー、並びに、式VIの塩基:[式VIにおいて、R6は、リンカーを介して又は介さずに結合した蛍光性分子である]を塩基として有するポリヌクレオチドを含む、蛍光強度の変化により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法に使用するためのキット。人工塩基対の形成を検出する方法であって、蛍光共鳴エネルギー転移FRET又は静的消光作用の供与体となりうる自己消光性を有する天然塩基修飾体、人工塩基、或いは塩基類似体を有するポリヌクレオシドを含む核酸を利用し、当該核酸中の人工塩基第一人工塩基と蛍光性分子を有する人工塩基第二人工塩基との間で人工塩基対が形成されると、前記天然塩基修飾体、人工塩基、或いは塩基類似体を有するポリヌクレオシドから、第二人工塩基の有する蛍光性分子への蛍光共鳴エネルギー転移又は静的消光作用が生じて、蛍光スペクトルが変化し、人工塩基対が形成されたことが検出される、前記方法。蛍光共鳴エネルギー転移又は静的消光作用による蛍光スペクトルの変化により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法であって、7-2,2’-ビチエン-5-イルイミダゾ[4,5-b]ピリジン-3-イル基Dssと、以下の式VIの塩基:[式VIにおいて、R6は、リンカーを介して又は介さずに結合した蛍光性分子である]との間で塩基対が形成されると、240-410nmの紫外線による励起により、Dssから式VIの塩基中の蛍光性分子への蛍光共鳴エネルギー転移又は静的消光作用が生じて、蛍光スペクトルが変化し、人工塩基対が形成されたことが検出される、前記方法。蛍光共鳴エネルギー転移又は静的消光作用による蛍光スペクトルの変化により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法であって、7-2-チエニルイミダゾ[4,5-b]ピリジン3-イル基Dsと、以下の式VIの塩基:[式VIにおいて、R6は、リンカーを介して又は介さずに結合した蛍光性分子である]との間で塩基対が形成されると、240-390nmの紫外線による励起により、少なくとも1つの2-アミノ-6-2-チエニルプリン-9-イル基sから、式VIの塩基中の蛍光性分子への蛍光共鳴エネルギー転移又は静的消光作用が生じ、蛍光スペクトルが変化し、人工塩基対が形成されたことが検出される、ここにおいて、Dsを塩基として有するポリヌクレオシドを含む核酸と同一鎖上に、2-アミノ-6-2-チエニルプリン-9-イル基sを塩基として有するポリヌクレオチドが少なくとも1つ存在する、前記方法。蛍光共鳴エネルギー転移又は静的消光作用による蛍光スペクトルの変化により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法であって、7-2-チエニルイミダゾ[4,5-b]ピリジン-3-イル基Dsと、以下の式VIの塩基:[式VIにおいて、R6は、リンカーを介して又は介さずに結合した蛍光性分子である]との間で塩基対が形成されると、350-390nmの紫外線による励起により、少なくとも1つの2-アミノ-6-2-チエニルプリン-9-イル基sから、式VIの塩基中の蛍光性分子への蛍光共鳴エネルギー転移又は静的消光作用が生じて蛍光スペクトルが変化し、人工塩基対が形成されたことが検出される、ここにおいて、Dsを塩基として有するポリヌクレオシドを含む核酸と同一鎖上に、少なくとも1つの2-アミノ-6-2-チエニルプリン-9-イル基sが天然型塩基に結合した塩基を有するポリヌクレオチドが少なくとも1つ存在する、前記方法蛍光共鳴エネルギー転移又は静的消光作用による蛍光スペクトルの変化により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法であって、7-2-チエニルイミダゾ[4,5-b]ピリジン3-イル基Dsと、以下の式VIの塩基:[式VIにおいて、R6は、リンカーを介して又は介さずに結合した蛍光性分子である]との間で塩基対が形成されると、240-410nmの紫外線による励起により、7-2,2’-ビチエン-5-イルイミダゾ[4,5-b]ピリジン-3-イル基Dssから、式VIの塩基中の蛍光性分子への蛍光共鳴エネルギー転移又は静的消光作用が生じて蛍光スペクトルが変化し、人工塩基対が形成されたことが検出される、ここにおいて、Dsを塩基として有するポリヌクレオシドを含む核酸と同一鎖上に、少なくとも1つの7-2,2’-ビチエン-5-イルイミダゾ[4,5-b]ピリジン-3-イル基Dssが天然型塩基に結合した塩基を有するポリヌクレオチドが存在する、前記方法。蛍光性物質が、インドカルボシアニンCy3、インドジカルボシアニンCy5、5-カルボキシフルオレセイン5-FAM、6-カルボキシフルオレセイン6-FAM、5-カルボキシテトラメチルローダミン5-TAMRA、6-カルボキシテトラメチルローダミン6-TAMRA、5-ジメチルアミノナフタレン-1-スルホン酸DANSYL、5-カルボキシ-2’,4,4’,5’,7,7’-ヘキサクロロフルオレセイン5-HEX、6-カルボキシ-2’,4,4’,5’,7,7’-ヘキサクロロフルオレセイン6-HEX、5-カルボキシ-2’,4,7,7’-テトラクロロフルオレセイン5-TET、6-カルボキシ-2’,4,7,7’-テトラクロロフルオレセイン6-TET、5-カルボキシ-X-ローダミン5-ROX、及び6-カルボキシ-X-ローダミン6-ROXからなる群から選択される、請求項11ないし15のいずれか1項に記載の方法。式VIの塩基中の置換基R6が以下の:の構造を有する、請求項12-15に記載の方法。検出スペクトルの変化が、肉眼で判定できる、請求項11ないし17のいずれか1項に記載の方法。核酸の塩基対が、転写、逆転写、複製又は翻訳の工程で形成される、請求項11ないし18のいずれか1項に記載の方法。以下のi-iiiからなる群から選択される、1つの核酸プライマー;i7-2,2’-ビチエン-5-イルイミダゾ[4,5-b]ピリジン-3-イル基Dssを塩基として有するポリヌクレオチドを含む、核酸プライマー;ii7-2-チエニルイミダゾ[4,5-b]ピリジン3-イル基Dsを塩基として有するポリヌクレオシド、及び、少なくとも1つの、2-アミノ-6-2-チエニル-9H-プリン-9-イル基sを塩基として有するポリヌクレオチドを含む、核酸プライマー;iii7-2-チエニルイミダゾ[4,5-b]ピリジン-3-イル基Dsを塩基として有するポリヌクレオシド、及び、少なくとも1つの、2-アミノ-6-2-チエニル-9H-プリン-9-イル基sが天然型塩基に結合した塩基を有するポリヌクレオチドを含む、核酸プライマー;及びiv7-2-チエニルイミダゾ[4,5-b]ピリジン3-イル基Dsを塩基として有するポリヌクレオシド、及び、7-2,2’-ビチエン-5-イルイミダゾ[4,5-b]ピリジン-3-イル基Dssが天然型塩基に結合した塩基を有するポリヌクレオチドを含む、核酸プライマー、並びに、式VIの塩基:[式VIにおいてここで、R6は、リンカーを介して又は介さずに結合した蛍光性分子である]を塩基として有するポリヌクレオチドを含む、蛍光共鳴エネルギー転移又は静的消光作用による蛍光スペクトルの変化により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法に使用するためのキット。本発明者らは、消光性を示す塩基を見いだし、そして、蛍光性を示す塩基と消光性を示す塩基とが選択的に塩基対を形成すれば、DNAが二本鎖を形成すると蛍光性人工塩基を強く消光させることができる可能性があり、PCRにおけるDNA増幅やモレキュラービーコンなどで目視判定が可能な検出技術を作り出すことができると考え、本発明に想到した。2-ニトロピロール誘導体は、本発明者らがこれまで開発してきた人工塩基対のPnやPxで表される塩基である。PnやPxは、第三の核酸塩基対人工塩基対として、その相補人工塩基Ds:7-2-チエニルイミダゾ[4,5-b]ピリジン3-イル基と塩基対Ds-Pn、Ds-Px塩基対を形成し、複製や転写で核酸中の特定部位に導入できることが示されている。また、蛍光性の人工塩基としてDsの改良塩基であるDss7-2,2’-ビチエン-5-イルイミダゾ[4,5-b]ピリジンとも2-ニトロピロールが塩基対を形成する。本発明者らは本発明において、2-ニトロピロールに消光性があることを初めて明らかにした。例えば、PnやPxが二本鎖DNA中でDssと塩基対を形成すると2-ニトロピロールの消光性によりDssの蛍光が消光されることを見いだした。なお、2-ニトロピロールに類似の3-ニトロピロールは、ユニバーサル塩基として知られているが、本発明の2-ニトロピロールと異なり消光作用は低い。DssとPnあるいはPxの塩基対を含む二本鎖核酸は、蛍光性のDssに消光性のPnあるいはPxが塩基対として接しているので、Dssの蛍光は効率よく消光される。しかし、二本鎖構造が一本鎖のDNAに変性した場合は、Dssを含むDNA鎖が発光する。このような人工塩基対はこれまでに例が無く、この性質を利用して、新たなモレキュラービーコンなどの検出診断技術が可能になった。2-ニトロピロールの4位にリンカーを介して蛍光色素を結合させると、そのヌクレオシドやヌクレオチド誘導体Pxの誘導体は2-ニトロピロールと色素が相互作用することによりその蛍光がある程度消光されることが分かった。しかしこのヌクレオチド誘導体がDNAやRNA中に導入されると、2-ニトロピロールと相互作用していた色素部分がDNAやRNA断片中の外側に飛び出すので、本来の蛍光強度が復活することも見出した。また、このPxの誘導体の基質ヌクレオシド三リン酸は、鋳型中の人工塩基Dsに相補して、複製によりDNA中に導入できる。これらのPx誘導体の蛍光変化の特性と複製におけるDNA中への部位特異的な取り込みを利用することにより、リアルタイムPCRなどの検出診断技術に本技術を利用することができる。また、発明者らが別途開発した蛍光性人工塩基sと本Ds-Px塩基対を組み合わせることにより、DNAのPCR増幅の可視化法を新たに開発した。この可視化PCRは、DNA増幅を裸眼で識別できるため、従来のリアルタイムPCRでは不可能であった臨床現場での迅速簡便なPCR診断法として用いることができ、テーラーメイド医療を目指したコンパニオン診断薬としての道を開く。また、本技術による特定のDNA配列の検出は、医療に限らず、ビールなどの発酵食品の品質管理酵母の遺伝子変異を検出や輸入食材の流通管理食品の遺伝子による真贋判定などにも応用できる。以上より、限定されるわけではないが、本発明は以下の態様を含む。[態様1]式Iで示す2-ニトロピロール構造を有する消光剤[式Iにおいて、R1及びR2はリボース、デオキシリボース、水素、水酸基、SH基、ハロゲン、置換又は未置換の、炭素数2ないし10のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基、窒素原子または硫黄原子を含む、1又は複数の5員ヘテロ環、1又は複数の6員ヘテロ環、1又は複数の複素環ヘテロ環、1又は複数の芳香族環、糖、糖鎖、アミノ酸、ペプチド、リンカーを介して結合した蛍光性分子からなる群から独立に選択される基である]。[態様2]式Iにおいて、R1がリボースまたはデオキシリボースである、態様1に記載の消光剤。[態様3]人工塩基対の形成を検出する方法であって、1式II[式IIにおいて、R2は、水素、水酸基、SH基、ハロゲン、置換又は未置換の、炭素数2ないし10のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基、窒素原子または硫黄原子を含む、1又は複数の5員ヘテロ環、1又は複数の6員ヘテロ環、1又は複数の複素環ヘテロ環、1又は複数の芳香族環、糖、糖鎖、アミノ酸、ペプチド、リンカーを介して結合した蛍光性分子、からなる群から選択される基である]で表される消光性人工塩基を有するヌクレオシドまたはヌクレオチド、あるいは、2蛍光共鳴エネルギー転移FRETや静的消光作用staticquenchingなどの供与体となりうる自己消光性を有する天然塩基修飾体、人工塩基、或いは塩基類似体を有するヌクレオシドまたはヌクレオチドのいずれか、あるいは双方を用いることを特徴とする、前記方法。[態様4]人工塩基の塩基対の形成を検出する方法であって、蛍光性人工塩基と式II[式IIにおいて、R2は、水素、水酸基、SH基、ハロゲン、置換又は未置換の、炭素数2ないし10のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基、窒素原子または硫黄原子を含む、1又は複数の5員ヘテロ環、1又は複数の6員ヘテロ環、1又は複数の複素環ヘテロ環、1又は複数の芳香族環、糖、糖鎖、アミノ酸、ペプチド、リンカーを介して結合した蛍光性分子、からなる群から選択される基である]で表される消光性人工塩基との塩基対形成により、蛍光性人工塩基の蛍光の低下を観察することにより、人工塩基対が形成されたことが検出される、前記方法。[態様5]蛍光性人工塩基の蛍光の低下により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法であって、以下の、i7-2,2’-ビチエン-5-イルイミダゾ[4,5-b]ピリジン-3-イル基Dss;ii7-2,2’,5’,2’’-ターチエン-5-イルイミダゾ[4,5-b]ピリジン-3-イル基Dsss;iii2-アミノ-6-2,2’-ビチエン-5-イルプリン-9-イル基ss;iv2-アミノ-6-2,2’,5’,2’’-ターチエン-5-イルプリン-9-イル基sss;v4-2,2’-ビチエン-5-イル-ピロロ[2,3-b]ピリジン-1-イル基Dsas;vi4-[2-2-チアゾリルチエン-5-イル]ピロロ[2,3-b]ピリジン-1-イル基Dsav;及びvii4-[5-2-チエニルチアゾール-2-イル]ピロロ[2,3-b]ピリジン-1-イル基Dvas;からなる群より選択される蛍光性人工塩基と、以下の式III,又は式IVの消光性塩基[式IIIにおいて、R3は、-H、ヨード、-CH3、から選択される][式IVにおいて、R4は、-CH3、-CH2-NH2、及びここにおいて、nは0ないし12のいずれかの整数であるから選択される]との間で塩基対が形成されると、蛍光性人工塩基の蛍光が低下し、人工塩基対が形成されたことが検出される、前記方法。[態様6]7-2,2’-ビチエン-5-イルイミダゾ[4,5-b]ピリジン-3-イル基Dssを塩基として有するポリヌクレオチドを含む、核酸プライマー;並びに、以下の式III、又は式IVの消光性塩基[式IIIにおいて、R3は、-H、ヨード、-CH3、から選択される][式IVにおいて、R4は、-CH3、-CH2-NH2、及びここにおいて、nは0ないし12のいずれかの整数であるから選択される]を塩基として有するポリヌクレオチドを含む、蛍光性人工塩基の蛍光の低下により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法に使用するためのキット。[態様7]人工塩基対を検出する方法であって、式V[式Vにおいて、R5は、リンカーを介して結合した蛍光性分子である]で表される消光性人工塩基中の蛍光性分子の蛍光強度が、式Vの人工塩基が塩基対を形成することによって変化し、人工塩基対が形成されたことが検出される、前記方法。[態様8]蛍光強度の変化により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法であって、7-2-チエニルイミダゾ[4,5-b]ピリジン3-イル基Dsと、以下の式VIの塩基:[式VIにおいて、R6は、リンカーを介して又は介さずに結合した蛍光性分子である]との間で塩基対が形成されると、式VIの塩基中の蛍光性分子の蛍光強度が増加し、人工塩基対が形成されたことが検出される、前記方法。[態様9]蛍光性分子が、インドカルボシアニンCy3、インドジカルボシアニンCy5、5-カルボキシフルオレセイン5-FAM、6-カルボキシフルオレセイン6-FAM、5-カルボキシテトラメチルローダミン5-TAMRA、6-カルボキシテトラメチルローダミン6-TAMRA、5-ジメチルアミノナフタレン-1-スルホン酸DANSYL、5-カルボキシ-2’,4,4’,5’,7,7’-ヘキサクロロフルオレセイン5-HEX、6-カルボキシ-2’,4,4’,5’,7,7’-ヘキサクロロフルオレセイン6-HEX、5-カルボキシ-2’,4,7,7’-テトラクロロフルオレセイン5-TET、6-カルボキシ-2’,4,7,7’-テトラクロロフルオレセイン6-TET、5-カルボキシ-X-ローダミン5-ROX、及び6-カルボキシ-X-ローダミン6-ROXからなる群から選択される、態様7又は8に記載の方法。[態様10]7-2-チエニルイミダゾ[4,5-b]ピリジン3-イル基Dsを塩基として有するポリヌクレオシドを含む、核酸プライマー、並びに、式VIの塩基:[式VIにおいて、R6は、リンカーを介して又は介さずに結合した蛍光性分子である]を塩基として有するポリヌクレオチドを含む、蛍光強度の変化により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法に使用するためのキット。[態様11]人工塩基対の形成を検出する方法であって、蛍光共鳴エネルギー転移FRETや静的消光作用staticquenchingなどの供与体となりうる自己消光性を有する天然塩基修飾体、人工塩基、或いは塩基類似体を有するポリヌクレオシドを含む核酸を利用し、当該核酸中の人工塩基第一人工塩基と蛍光性分子を有する人工塩基第二人工塩基との間で人工塩基対が形成されると、前記天然塩基修飾体、人工塩基、或いは塩基類似体を有するポリヌクレオシドから、第二人工塩基の有する蛍光性分子への蛍光共鳴エネルギー転移や静的消光作用staticquenchingにより、蛍光スペクトルが変化し、人工塩基対が形成されたことが検出される、前記方法。[態様12]蛍光共鳴エネルギー転移や静的消光作用staticquenchingなどによる蛍光スペクトルの変化により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法であって、7-2,2’-ビチエン-5-イルイミダゾ[4,5-b]ピリジン-3-イル基Dssと、以下の式VIの塩基:[式VIにおいて、R6は、リンカーを介して又は介さずに結合した蛍光性分子である]との間で塩基対が形成されると、240-410nmの紫外線による励起により、Dssから式VIの塩基中の蛍光性分子への蛍光共鳴エネルギー転移や静的消光作用staticquenchingなどが生じて、蛍光スペクトルが変化し、人工塩基対が形成されたことが検出される、前記方法。[態様13]蛍光共鳴エネルギー転移や静的消光作用staticquenchingなどによる蛍光スペクトルの変化により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法であって、7-2-チエニルイミダゾ[4,5-b]ピリジン3-イル基Dsと、以下の式VIの塩基:[式VIにおいて、R6は、リンカーを介して又は介さずに結合した蛍光性分子である]との間で塩基対が形成されると、240-390nmの紫外線による励起により、少なくとも1つの2-アミノ-6-2-チエニルプリン-9-イル基sから、式VIの塩基中の蛍光性分子への蛍光共鳴エネルギー転移や静的消光作用staticquenchingなどにより、蛍光スペクトルが変化し、人工塩基対が形成されたことが検出される、ここにおいて、Dsを塩基として有するポリヌクレオシドを含む核酸と同一鎖上に、2-アミノ-6-2-チエニルプリン-9-イル基sを塩基として有するポリヌクレオチドが少なくとも1つ存在する、前記方法。[態様14]蛍光共鳴エネルギー転移や静的消光作用staticquenchingなどによる蛍光スペクトルの変化により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法であって、7-2-チエニルイミダゾ[4,5-b]ピリジン-3-イル基Dsと、以下の式VIの塩基:[式VIにおいて、R6は、リンカーを介して又は介さずに結合した蛍光性分子である]との間で塩基対が形成されると、350-390nmの紫外線による励起により、少なくとも1つの2-アミノ-6-2-チエニルプリン-9-イル基sから、式VIの塩基中の蛍光性分子への蛍光共鳴エネルギー転移や静的消光作用staticquenchingなどにより蛍光スペクトルが変化し、人工塩基対が形成されたことが検出される、ここにおいて、Dsを塩基として有するポリヌクレオシドを含む核酸と同一鎖上に、少なくとも1つの2-アミノ-6-2-チエニルプリン-9-イル基sが天然型塩基に結合した塩基を有するポリヌクレオチドが少なくとも1つ存在する、前記方法。[態様15]蛍光共鳴エネルギー転移や静的消光作用staticquenchingなどによる蛍光スペクトルの変化により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法であって、7-2-チエニルイミダゾ[4,5-b]ピリジン3-イル基Dsと、以下の式VIの塩基:[式VIにおいて、R6は、リンカーを介して又は介さずに結合した蛍光性分子である]との間で塩基対が形成されると、240-410nmの紫外線による励起により、7-2,2’-ビチエン-5-イルイミダゾ[4,5-b]ピリジン-3-イル基Dssから、式VIの塩基中の蛍光性分子への蛍光共鳴エネルギー転移や静的消光作用staticquenchingなどにより蛍光スペクトルが変化し、人工塩基対が形成されたことが検出される、ここにおいて、Dsを塩基として有するポリヌクレオシドを含む核酸と同一鎖上に、少なくとも1つの7-2,2’-ビチエン-5-イルイミダゾ[4,5-b]ピリジン-3-イル基Dssが天然型塩基に結合した塩基を有するポリヌクレオチドが存在する、前記方法。[態様16]蛍光性物質が、インドカルボシアニンCy3、インドジカルボシアニンCy5、5-カルボキシフルオレセイン5-FAM、6-カルボキシフルオレセイン6-FAM、5-カルボキシテトラメチルローダミン5-TAMRA、6-カルボキシテトラメチルローダミン6-TAMRA、5-ジメチルアミノナフタレン-1-スルホン酸DANSYL、5-カルボキシ-2’,4,4’,5’,7,7’-ヘキサクロロフルオレセイン5-HEX、6-カルボキシ-2’,4,4’,5’,7,7’-ヘキサクロロフルオレセイン6-HEX、5-カルボキシ-2’,4,7,7’-テトラクロロフルオレセイン5-TET、6-カルボキシ-2’,4,7,7’-テトラクロロフルオレセイン6-TET、5-カルボキシ-X-ローダミン5-ROX、及び6-カルボキシ-X-ローダミン6-ROXからなる群から選択される、態様11ないし15のいずれか1項に記載の方法。[態様17]式VIの塩基中の置換基R6が以下の:の構造を有する、態様12-15に記載の方法。[態様18]検出スペクトルの変化が、肉眼で判定できる、態様11ないし17のいずれか1項に記載の方法。[態様19]核酸の塩基対が、転写、逆転写、複製又は翻訳の工程で形成される、態様11ないし18のいずれか1項に記載の方法。[態様20]以下のi-iiiからなる群から選択される、1つの核酸プライマー;i7-2,2’-ビチエン-5-イルイミダゾ[4,5-b]ピリジン-3-イル基Dssを塩基として有するポリヌクレオチドを含む、核酸プライマー;ii7-2-チエニルイミダゾ[4,5-b]ピリジン3-イル基Dsを塩基として有するポリヌクレオシド、及び、少なくとも1つの、2-アミノ-6-2-チエニル-9H-プリン-9-イル基sを塩基として有するポリヌクレオチドを含む、核酸プライマー;iii7-2-チエニルイミダゾ[4,5-b]ピリジン-3-イル基Dsを塩基として有するポリヌクレオシド、及び、少なくとも1つの、2-アミノ-6-2-チエニル-9H-プリン-9-イル基sが天然型塩基に結合した塩基を有するポリヌクレオチドを含む、核酸プライマー;及びiv7-2-チエニルイミダゾ[4,5-b]ピリジン3-イル基Dsを塩基として有するポリヌクレオシド、及び、7-2,2’-ビチエン-5-イルイミダゾ[4,5-b]ピリジン-3-イル基Dssが天然型塩基に結合した塩基を有するポリヌクレオチドを含む、核酸プライマー、並びに、式VIの塩基:[式VIにおいてここで、R6は、リンカーを介して又は介さずに結合した蛍光性分子である]を塩基として有するポリヌクレオチドを含む、蛍光共鳴エネルギー転移や静的消光作用staticquenchingなどによる蛍光スペクトルの変化により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法に使用するためのキット。I.消光剤1.消光剤の構造本発明は、新規な消光剤を提供する。本発明の消光剤は、式Iで示す2-ニトロピロール構造を有する[式Iにおいて、R1及びR2はリボース、デオキシリボース、水素、水酸基、SH基、ハロゲン、置換又は未置換の、炭素数2ないし10のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基、窒素原子または硫黄原子を含む、1又は複数の5員ヘテロ環、1又は複数の6員ヘテロ環、1又は複数の複素環ヘテロ環、1又は複数の芳香族環、糖、糖鎖、アミノ酸、ペプチド、リンカーを介して結合した蛍光性分子からなる群から独立に選択される基である]ことを特徴とする。本発明は、2-ニトロピロール構造が消光効果を有する、という発見に基づく。よって、R1及びR2は特に限定されず、任意の基を選択することが可能である。R1及びR2は任意に独立に選択される。iリボース、デオキシリボースR1及び/又はR2は、好ましくは、リボース、デオキシリボースである。好ましくは、R1はリボース、デオキシリボースである。リボースとは、五炭糖の単糖の1種で、IUPAC名は3R,4S,5R-5-ヒドロキシメチルテトラヒドロフラン-2,3,4-トリオールである。デオキシリボースとは、アルデヒド基を含む五炭糖の単糖の1種で、IUPAC名は2R,4S,5R-5-ヒドロキシメチルテトラヒドロフラン-2,4-ジオールである。本発明の消光剤は、好ましくは、ポリヌクレオシド又はポリヌクレオチド中の塩基として、人工塩基対を形成した場合に、塩基対を形成する相手方、あるいは、近傍に存在する塩基が蛍光性の塩基である場合に、その蛍光を消す消光効果を奏する。あるいは、塩基対を形成する相補性の人工塩基、あるいは、近傍に存在する塩基に結合した蛍光物質の蛍光を消光する。ii水素、水酸基、SH基、ハロゲンハロゲンの種類は特に限定されない。好ましくは、フッ素、臭素、ヨウ素等からなる群から選択される。iii置換又は未置換の、炭素数2ないし10のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基炭素数2ないし10のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基は、直鎖状でも枝分かれしていてもよく、特に限定されない。好ましくは、メチル基、エチル基、プロピニル基、エチレン基、エチニル基などが含まれる。これらの基は、置換されていてもよい。置換基は、特に限定されないが、好ましくは、アミノ基、水酸基、SH基、ハロゲン、カルボキシル基、ニトロ基等からなる群から選択される。iv窒素原子または硫黄原子を含む、1又は複数の5員ヘテロ環、1又は複数の6員ヘテロ環、1又は複数の複素環ヘテロ環、1又は複数の芳香族環R1及び/又はR2は、1又は複数のヘテロ環であってもよい。ヘテロ環は、チエニル基、チアゾリル基、イミダゾリル基、フラニル基、あるいはこれらの誘導体等から選択される、5員のヘテロ環である。好ましくは、2-チエニル基、2-チアゾリル基、2-イミダゾリル基、2,2’-ビチエン-5-イル基、2-2-チアゾリルチエン-5-イル基、5-2-チエニルチアゾール-2-イル基、及び2,2’,5’,2’’-ターチエン-5-イル基からなる群より選択される基である。6員ヘテロ環の例としては、ピラニル基、ピリジル基、ピリミジル基、等が挙げられる。複素環ヘテロ環の例としては、プリン、1-デアザプリン、キノリン等が挙げられる。芳香族環の例としては、フェニル基、ナフチル基等が挙げられる。ヘテロ環、複素環ヘテロ環や芳香族環の数は、特に限定されないが、好ましくは1ないし3である。より好ましくは1又は2である。v糖、糖鎖、アミノ酸、ペプチド糖は、特に限定されない。例えば、グルコース、アラビノース、フラノース等が含まれる。リボースまたはデオキシリボースも糖の一種である。糖鎖は、特に限定されない、例えば、スクロース、ラクトース等が含まれる。アミノ酸も、特に限定されない。例えば、グリシン、アラニン、フェニルアラニン等が含まれる。ペプチドの種類は、特に限定されない。好ましくは、ポリペプチドは、約2ないし10個のアミノ酸残基からなる。好ましいペプチドは例えば、フェニルアラニル-グリシンなどである。また、ペプチド核酸等の非天然型ペプチドも含まれる。viリンカーを介して結合した蛍光性分子リンカーの種類は特に限定されず、当業者は適宜採用可能である。リンカーは限定されるわけではないが、好ましくは、下記の化学式VIIおよびVIII:[式VII中、nは1ないし12の整数から選択される]及び[式VIII中、m及びlは、1ないし12の整数から各々独立に選択される]からなる群より選択される。式VII及びVIIIにおいて、n、m、lは各々好ましくは1-7、より好ましくは5である。蛍光性分子の種類は特に限定されない。好ましくは、インドカルボシアニンCy3、インドジカルボシアニンCy5、5-カルボキシフルオレセイン5-FAM、6-カルボキシフルオレセイン6-FAM、5-カルボキシテトラメチルローダミン5-TAMRA、6-カルボキシテトラメチルローダミン6-TAMRA、5-ジメチルアミノナフタレン-1-スルホン酸DANSYL、5-カルボキシ-2’,4,4’,5’,7,7’-ヘキサクロロフルオレセイン5-HEX、6-カルボキシ-2’,4,4’,5’,7,7’-ヘキサクロロフルオレセイン6-HEX、5-カルボキシ-2’,4,7,7’-テトラクロロフルオレセイン5-TET、6-カルボキシ-2’,4,7,7’-テトラクロロフルオレセイン6-TET、5-カルボキシ-X-ローダミン5-ROX、及び6-カルボキシ-X-ローダミン6-ROXからなる群から選択される。より好ましくは、インドカルボシアニンCy3である。2.消光される蛍光を有する物質本発明の式Iで示す2-ニトロピロール構造を有する消光剤の消光作用によって消光される蛍光を有する物質の種類は特に限定されない。蛍光を有する物質は、例えば、蛍光性人工塩基、蛍光色素などの蛍光性分子等任意の物質が含まれる。式Iで示す2-ニトロピロール構造は、好ましくは以下の塩基と対合を形成する特願2009-232851。7-2-チエニルイミダゾ[4,5-b]ピリジン-3-イル基Ds;7-2,2’-ビチエン-5-イルイミダゾ[4,5-b]ピリジン-3-イル基Dss;7-2,2’,5’,2’’-ターチエン-5-イルイミダゾ[4,5-b]ピリジン-3-イル基Dsss;2-アミノ-6-2-チエニルプリン-9-イル基s;2-アミノ-6-2,2’-ビチエン-5-イルプリン-9-イル基ss;2-アミノ-6-2,2’,5’,2’’-ターチエン-5-イルプリン-9-イル基sss;4-2-チエニル-ピロロ[2,3-b]ピリジン-1-イル基dDsa;4-2,2’-ビチエン-5-イル-ピロロ[2,3-b]ピリジン-1-イル基Dsas;4-[2-2-チアゾリルチエン-5-イル]ピロロ[2,3-b]ピリジン-1-イル基Dsav;4-2-チアゾリル-ピロロ[2,3-b]ピリジン-1-イル基dDva;4-[5-2-チエニルチアゾール-2-イル]ピロロ[2,3-b]ピリジン-1-イル基Dvas;及び4-2-イミダゾリル-ピロロ[2,3-b]ピリジン-1-イル基dDia。上記のうち、Dss、Dsss、ss、sss、Dsas、Dsav及びDvasは蛍光性塩基である。これらは本発明の式Iの消光剤と塩基対を形成すると、蛍光強度が低下するか、あるいは消光する。式Iの消光剤と直接塩基対を形成しない蛍光を有する物質であっても、式Iの消光剤と塩基対を形成する上記人工塩基の近くに存在する場合には、本願発明の消光剤の影響を受けうる。例えば、蛍光を有する人工塩基が上記人工塩基例えば、sと同一の一本鎖あるいは二本鎖、あるいは三本鎖核酸上で近接して存在する例えばとなり同士で隣接する場合、あるいは、上記人工塩基に結合している蛍光性分子の場合などは、式Iの消光剤と塩基対を形成する上記人工塩基の塩基対の形成により、蛍光を有する物質が本発明の消光剤の近傍に存在することとなり、消光の影響を受けうる。上述した式Iと塩基対を形成する人工塩基以外にも、蛍光性の核酸塩基類自体として、2-アミノプリン、エテノアデノシンなどが知られている。II.人工塩基対の形成を検出する方法本発明はまた、人工塩基対を検出する方法を提供する。本発明の方法は、1.式II[式IIにおいて、R2は、水素、水酸基、SH基、ハロゲン、置換又は未置換の、炭素数2ないし10のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基、窒素原子または硫黄原子を含む、1又は複数の5員ヘテロ環、1又は複数の6員ヘテロ環、1又は複数の複素環ヘテロ環、1又は複数の芳香族環、糖、糖鎖、アミノ酸、ペプチド、リンカーを介して結合した蛍光性分子、からなる群から選択される基である]で表される消光性人工塩基を有するヌクレオシドまたはヌクレオチド、あるいは、2蛍光共鳴エネルギー転移FRETや静的消光作用staticquenchingなどの供与体となりうる自己消光性を有する天然塩基修飾体、人工塩基、或いは塩基類似体を有するヌクレオシドまたはヌクレオチドのいずれか、あるいは双方を用いることを特徴とする。式IIの人工塩基の利用本発明の式IIの消光性人工塩基のピロール環の窒素原子は、リボースまたはデオキシリボースに結合して、ヌクレオシドまたはヌクレオチドを構成する。本発明の式IIの人工塩基は、Ds、Dss、Dsss、s、ss、sss、dDsa、Dsas、Dsav、dDva、Dvas、及び、dDia等の人工塩基と人工塩基対を形成する特願2009-232851。式IIの消光性人工塩基とこれらの人工塩基との塩基対の形成により、塩基対を形成した蛍光性人工塩基、あるいは、付近に存在する蛍光性塩基若しくは蛍光性分子の蛍光強度が変化、あるいは消光する。本発明の方法はその変化を利用して人工塩基対の形成を検出する。特に、上記のうち、Dss、Dsss、ss、sss、Dsas、Dsav及びDvasは蛍光性塩基であり、式IIの化合物と塩基対を形成することにより、人工塩基の蛍光が低下する、あるいは消光する。あるいは、本発明の消光性人工塩基に蛍光性分子を結合すると、本発明の消光性人工塩基の消光性により蛍光性分子の蛍光強度が低下する。これは蛍光性分子が消光性人工塩基と溶液中でスタッキングすることにより効率よく消光されるためと考えられる。そして、この蛍光性分子を結合した消光性人工塩基が、上記人工塩基との間で人工塩基対が形成し、核酸中に取り込まれると、蛍光性分子と消光性人工塩基との間のスタッキングが解消されるので、蛍光色素の蛍光強度が増す。この性質を利用して、人工塩基対の形成を検出することが可能である。蛍光共鳴エネルギー転移FRETや静的消光作用staticquenchingなどの利用本発明は、蛍光共鳴エネルギー転移FRETや静的消光作用staticquenchingなどの供与体となりうる自己消光性を有する天然塩基修飾体、人工塩基、或いは塩基類似体を有するヌクレオシドまたはヌクレオチドを利用して、人工塩基対を検出する方法も含む。蛍光共鳴エネルギー転移FRETは、ある蛍光分子から他の分子へ、共鳴により励起エネルギーが移動する現象を意味する。エネルギーを与える分子はドナー供与体、受け取る分子はアクセプター受容体と呼ばれる。FRETが生じると、エネルギーを失ったドナーは基底状態に戻り、同時にエネルギーを受け取ったアクセプターは励起状態となる。従って、ドナーの蛍光は弱まり、アクセプターが蛍光分子であればその蛍光が観察される。アクセプターが消光分子であれば、ドナーが単独の場合には観察されていた蛍光がFRETにより観察されなくなる。FRETによるタンパク質の検出、核酸の検出の一般的な方法は公知である。FRETが生じるためには、以下の3条件を満たす必要がある。iドナーの蛍光スペクトルとアクセプターの吸収スペクトルに重なりがあること。スペクトルの重なり範囲は大きい方が望ましいが、必ずしも完全に重なっている必要はない。iiドナーとアクセプターが物理的に近距離に存在すること。FRETが50の確率で生じる距離は3nmないし6nmと考えられており、FRETの効率はこの距離の変化に対して敏感に変化する。iiiドナーとアクセプターの相対的な向きが適切であること。本発明の方法は、蛍光共鳴エネルギー転移FRETの供与体となりうる自己消光性を有する天然塩基修飾体、人工塩基、或いは塩基類似体を利用するものである。また、消光の過程には、FRET以外にエキシマーなどの励起二量体の形成による静的消光作用staticquenchingも含まれる。人工塩基対の形成により、これらの自己消光性を有する天然塩基修飾体、人工塩基、或いは塩基類似体がアクセプターの近傍に存在した場合、これらの供与体に特有の波長のエネルギーを与えて励起することにより、これらの供与体からアクセプターにエネルギーが供与され、アクセプターが本来は蛍光を発しないはずの波長のエネルギーで蛍光を発する。限定するわけではないが、自己消光性を有する人工塩基としては、1以上の隣接するs、例えば、同一核酸上で隣接する2以上のs、ss、Dss、Dsssなどが含まれる。好ましくは、同一核酸上で隣接する2以上のsである。自己消光性を有する天然塩基修飾体とは、非限定的に、上記自己消光性を有する人工塩基例えばsを1以上結合した天然塩基例えば、sを結合したウラシル、sを2個結合したシトシン、Dssを結合したウラシル、などが含まれる。自己消光性を有する塩基類似体とは、例えば、サイズエキスパンデッド塩基類似体size-expandedbaseanalogs二量体、2-アミノプリン二量体などが含まれる。ここで検出される人工塩基対は、好ましくは上記式IIで表される消光性人工塩基とその相補的な人工塩基との間の塩基対である。しかしながら必ずしもそれに限定されない。蛍光共鳴エネルギー転移FRETや静的消光作用staticquenchingの供与体となりうる自己消光性を有する天然塩基修飾体、人工塩基、或いは塩基類似体を有するヌクレオシドまたはヌクレオチドを利用する方法であれば、その他の公知の人工塩基対であっても本発明の範囲に含まれる。例えば、s-y塩基対s:2-アミノ-6-チエニルプリン、y:ピリジン-2-オン、v-y塩基対v:2-アミノ-6-チアゾリルプリン、s-Pa塩基対Pa:ピロール-2-カルバルデヒド、Ds-Pa塩基対Ds:7-2-チエニル-イミダゾ[4,5-b]ピリジン、Pa-Q塩基対Q:9-メチルイミダゾ[4,5-b]ピリジン、isoG-isoC、5SICS-MMO2、5NaMなどの人工塩基対も、本発明のFRETを利用した方法により検出することが可能である。本発明は、好ましくは以下の態様を含む。A.蛍光性人工塩基と本発明の消光性人工性塩基の塩基対形成による蛍光の低下を利用する方法本発明の方法は、一態様において、蛍光性人工塩基と式II[式IIにおいて、R2は、水素、水酸基、SH基、ハロゲン、置換又は未置換の、炭素数2ないし10のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基、窒素原子または硫黄原子を含む、1又は複数の5員ヘテロ環、1又は複数の6員ヘテロ環、1又は複数の複素環ヘテロ環、1又は複数の芳香族環、糖、糖鎖、アミノ酸、ペプチド、リンカーを介して結合した蛍光性分子、からなる群から選択される基である]で表される消光性人工塩基との塩基対形成により、蛍光性人工塩基の蛍光の低下を観察することにより、人工塩基対が形成されたことを検出する。好ましくは、蛍光性人工塩基は式IIと塩基対を形成することが知られている以下の、i7-2,2’-ビチエン-5-イルイミダゾ[4,5-b]ピリジン-3-イル基Dss;ii7-2,2’,5’,2’’-ターチエン-5-イルイミダゾ[4,5-b]ピリジン-3-イル基Dsss;iii2-アミノ-6-2,2’-ビチエン-5-イルプリン-9-イル基ss;iv2-アミノ-6-2,2’,5’,2’’-ターチエン-5-イルプリン-9-イル基sss;v4-2,2’-ビチエン-5-イル-ピロロ[2,3-b]ピリジン-1-イル基Dsas;vi4-[2-2-チアゾリルチエン-5-イル]ピロロ[2,3-b]ピリジン-1-イル基Dsav;及びvii4-[5-2-チエニルチアゾール-2-イル]ピロロ[2,3-b]ピリジン-1-イル基Dvas;からなる群より選択される。その他にも蛍光性人工塩基として、2-アミノプリン、エテノアデノシンなどが利用されうる。好ましくは、本発明の消光性塩基は以下の式II1又は式IVである。[式IIIにおいて、R3は、-H、ヨード、-CH3、から選択される][式IVにおいて、R4は、-CH3、-CH2-NH2、及びここにおいて、nは0ないし12のいずれかの整数であるから選択される]式IVにおいて、nは好ましくは3-7、より好ましくは5である。本発明はまた、7-2,2’-ビチエン-5-イルイミダゾ[4,5-b]ピリジン-3-イル基Dssを塩基として有するポリヌクレオチドを含む、核酸プライマー;並びに、式III又は式IVの消光性塩基を塩基として有するポリヌクレオチドを含む、蛍光性人工塩基の蛍光の低下により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法に使用するためのキットを提供する。B.本発明の消光性人工性塩基に結合した蛍光性分子の蛍光強度が人工塩基対の形成により変化することを利用する方法本発明は、一態様において、人工塩基対の形成を検出する方法であって、式V[式Vにおいて、R5は、リンカーを介して結合した蛍光性分子である]で表される消光性人工塩基中の蛍光性分子の蛍光強度が、式Vの人工塩基が塩基対を形成することによって変化し、人工塩基対が形成されたことを検出する、前記方法を提供する。式Vの人工塩基が塩基対を形成する相補性の塩基対は、上述したDs、Dss、Dsss、s、ss、sss、dDsa、Dsas、Dsav、dDva、Dvas、及び、dDiaなど任意のものが可能である。好ましくは、Ds、s、ss、sss、dDsa、dDva、及び、dDia、より好ましくは7-2-チエニルイミダゾ[4,5-b]ピリジン3-イル基Dsである。消光性人工塩基は、好ましくは、以下の式VIの塩基:[式VIにおいて、R6は、リンカーを介して又は介さずに結合した蛍光性分子である]である。リンカーは、式Iの消光剤について上述したものと同様のものを使用可能である。蛍光性分子は、式Iの消光剤について上述したものと同様のものを使用可能である。本発明はまた、Ds7-2-チエニルイミダゾ[4,5-b]ピリジン3-イル基Dsを塩基として有するポリヌクレオシドを含む、核酸プライマー、並びに、式VIの塩基を有するポリヌクレオチドを含む、蛍光強度の変化により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法に使用するためのキットを提供する。C蛍光共鳴エネルギー転移FRETならびに静的消光作用staticquenchingなどの供与体となりうる自己消光性を有する天然塩基修飾体、人工塩基、或いは塩基類似体を有するポリヌクレオシドを含む核酸を利用して核酸を検出する方法本発明は、一態様において、人工塩基対の形成を検出する方法であって、蛍光共鳴エネルギー転移FRETならびに静的消光作用staticquenchingなどの供与体となりうる自己消光性を有する天然塩基修飾体、人工塩基、或いは塩基類似体を有するポリヌクレオシドを含む核酸を利用し、当該核酸中の人工塩基第一人工塩基と蛍光性分子を有する人工塩基第二人工塩基との間で人工塩基対が形成されると、前記天然塩基修飾体、人工塩基、或いは塩基類似体を有するポリヌクレオシドから、第二人工塩基の有する蛍光性分子への蛍光共鳴エネルギー転移や静的消光作用staticquenchingなどが生じて、蛍光スペクトルが変化し、人工塩基対が形成されたことが検出される、前記方法、を提供する。核酸中の人工塩基第一人工塩基と蛍光性分子を有する人工塩基第二人工塩基との間で人工塩基対は、好ましくは、本発明の式IIで表される消光性人工塩基を第二人工塩基として含む。しかしながら、必ずしもこれに限定されず、公知の人工塩基対について、蛍光共鳴エネルギー転移FRET及び/又は静的消光作用staticquenchingなどの供与体となりうる自己消光性を有する天然塩基修飾体、人工塩基、或いは塩基類似体を有するポリヌクレオシドを含む核酸を利用することが可能である。C-1本発明は、Cの方法の一態様として以下の態様を提供する。本発明の蛍光共鳴エネルギー転移や静的消光作用staticquenchingなどによる蛍光スペクトルの変化により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法は、7-2,2’-ビチエン-5-イルイミダゾ[4,5-b]ピリジン-3-イル基Dssと、以下の式VIの塩基:[式VIにおいて、R6は、リンカーを介して又は介さずに結合した蛍光性分子である]との間で塩基対が形成されると、240-410nmの紫外線による励起により、Dssから式VIの塩基中の蛍光性分子への蛍光共鳴エネルギー転移や静的消光作用staticquenchingなどが生じて、蛍光スペクトルが変化し、人工塩基対が形成されたことが検出される、前記方法である。本態様の模式図を図19に示す。240-410nmの紫外線はDssが励起される波長である。式VIの塩基中の蛍光性分子は通常、この波長では蛍光を生じずFRETは生じて始めて蛍光が観察されることが望ましい。以下のC-2ないしC-4の態様はいずれも7-2-チエニルイミダゾ[4,5-b]ピリジン3-イル基Dsと、式VIの塩基との間で人工塩基対の形成を検出するものである。C-2本発明は、Cの方法の一態様として以下の態様を提供する。本発明の蛍光共鳴エネルギー転移ならびに静的消光作用staticquenchingなどによる蛍光スペクトルの変化により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法は、7-2-チエニルイミダゾ[4,5-b]ピリジン3-イル基Dsと、式VIの塩基との間で塩基対が形成されると、240-390nmの紫外線による励起により、少なくとも1つの2-アミノ-6-2-チエニルプリン-9-イル基sから、式VIの塩基中の蛍光性分子への蛍光共鳴エネルギー転移や静的消光作用staticquenchingなどが生じ、蛍光スペクトルが変化し、人工塩基対が形成されたことが検出される、ここにおいて、Dsを塩基として有するポリヌクレオシドを含む核酸と同一鎖上に、2-アミノ-6-2-チエニルプリン-9-イル基sを塩基として有するポリヌクレオチドが少なくとも1つ存在する、前記方法である。本態様の模式図を図25に示す。ここにおいて、Dsを塩基として有するポリヌクレオシドを含む核酸と同一鎖上存在するsの数は限定されないが、好ましくは1-3、より好ましくは1又は2である。最も好ましくは2である。図24、レーン3で示したようにsが2個の場合には、sの自己消光性によりsの蛍光強度が低下あるいは消光されており自家消光、FRETによる蛍光スペクトルの変化がよりはっきりと観察される図24、レーン7。sが1個の場合はsの蛍光が観察される図24、レーン2。この場合も、FRETによりsの蛍光から蛍光性分子の蛍光が観察されるようになる図24、レーン5、6。sが2つ並んだ場合のように2以上の人工塩基が同一核酸上に2つ以上存在している態様だけでなく、天然塩基に自己消光性塩基が結合している場合、Dssのように1つの人工塩基中に2以上の消光性塩基部分sが存在するような場合も本発明のFRET及び又は静的消光作用を利用した方法が適用可能である。C-3本発明は、Cの方法の一態様として以下の態様を提供する。本発明の蛍光共鳴エネルギー転移や静的消光作用staticquenchingなどによる蛍光スペクトルの変化により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法は、Dsと、式VI塩基との間で塩基対が形成されると、350-390nmの紫外線による励起により、少なくとも1つの2-アミノ-6-2-チエニルプリン-9-イル基sから、式VIの塩基中の蛍光性分子への蛍光共鳴エネルギー転移や静的消光作用staticquenchingなどが生じて蛍光スペクトルが変化し、人工塩基対が形成されたことが検出される、ここにおいて、Dsを塩基として有するポリヌクレオシドを含む核酸と同一鎖上に、少なくとも1つの2-アミノ-6-2-チエニルプリン-9-イル基sが天然型塩基に結合した少なくとも1の塩基を有するポリヌクレオチドが少なくとも1つ存在する、前記方法である。本態様の模式図を図29a及び図31に示す。sが結合する天然塩基の種類は限定されず、A、T、G、C、Uのいずれでも可能である。また、sが結合する天然塩基が2以上隣接して存在する場合、隣接天然塩基は同じであっても、異なっていてもよい。好ましくは同じものが2以上隣接する。sが結合する天然塩基が同一核酸中に隣接する数も、sが核酸中に存在するC-2の態様と同様に、特に限定されないが、好ましくは1-3、より好ましくは1又は2である。最も好ましくは2である。また、C-3の態様には、1つの天然塩基に2以上のsが結合する態様も含む図31。結合するsの数は、特に限定されないが好ましくは2又は3,より好ましくは2である。C-4本発明は、Cの方法の一態様として以下の態様を提供する。本発明の蛍光共鳴エネルギー転移や静的消光作用staticquenchingなどによる蛍光スペクトルの変化により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法は、Dsと、式VIの塩基との間で塩基対が形成されると、240-410nmの紫外線による励起により、7-2,2’-ビチエン-5-イルイミダゾ[4,5-b]ピリジン-3-イル基Dssから、式VIの塩基中の蛍光性分子への蛍光共鳴エネルギー転移や静的消光作用staticquenchingなどが生じて蛍光スペクトルが変化し、人工塩基対が形成されたことが検出される、ここにおいて、Dsを塩基として有するポリヌクレオシドを含む核酸と同一鎖上に、少なくとも1つの7-2,2’-ビチエン-5-イルイミダゾ[4,5-b]ピリジン-3-イル基Dssが天然型塩基に結合した塩基を有するポリヌクレオチドが存在する、前記方法、である。本態様の模式図を図32に示す。本発明のC-1ないしC-4を含むCの態様において、蛍光性分子は特に限定されない。好ましくは、式Iの消光剤について上述したのと同様である。より好ましくはインドカルボシアニンCy3である。式VIの塩基中の置換基R6は好ましくは以下の:の構造を有する。本発明はまた、以下のi-iiiからなる群から選択される、1つの核酸プライマー;iDssを塩基として有するポリヌクレオチドを含む、核酸プライマー;iiDsを塩基として有するポリヌクレオシド、及び、少なくとも1つのsを塩基として有するポリヌクレオチドを含む、核酸プライマー;iiiDsを塩基として有するポリヌクレオシド、及び、少なくとも1つのsが天然型塩基に結合した少なくとも1の塩基を有するポリヌクレオチドを含む、核酸プライマー;及びivDsを塩基として有するポリヌクレオシド、及び、Dssが天然型塩基に結合した塩基を有するポリヌクレオチドを含む、核酸プライマー、並びに、式VIの塩基を塩基として有するポリヌクレオチドを含む、蛍光共鳴エネルギー転移ならびに静的消光作用staticquenchingなどによる蛍光スペクトルの変化により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法に使用するためのキットを提供する。Dss-PnならびにDss-Px塩基対は、PCRにおいても効率よく機能する。本発明においては、核酸の塩基対は、転写、逆転写、複製又は翻訳のいずれの工程で形成されるものであってもよい。本発明のFRET及び/又は静的消光作用を利用した検出方法において態様C、検出スペクトルの変化は、肉眼で判定できる、ことを特徴とする。本発明前は、可視で簡便に人工塩基対の形成、標的核酸の検出を行うことのできる方法は存在しなかった。本発明の検出方法を利用すると、リアルタイムPCRも可視化できる。よって、複雑かつ高価なPCR装置が不要となったまた、本発明の人工塩基対の検出方法を利用して核酸の増幅を行った場合、増幅された核酸をそのまま電気泳動し、簡便に検出することが可能である図23等。さらに、電気泳動のバンドの濃さにより定量化も可能である。以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。実施例1Cy3-hx-dPxTPの化学合成図51試薬、溶媒等試薬及び溶媒は、標準的な供給業者から購入し、さらに精製することなく使用した。1H-NMR300MHzおよび31P-NMR121MHzスペクトルは、BRUKERAV300核磁気共鳴スペクトロメーター上に記録した。合成したヌクレオシド5’-三リン酸は、GilsonHPLCシステムで最終精製を行った。エレクトロスプレイ-イオン化マススペクトルESI-MSは、Waters2690LCシステムを伴ったWatersZMD4000マスシステム上に記録した。21-2-デオキシ-β-D-リボフラノシル-4-[3-Cy3-カルボキサミドヘキサナミド-1-プロピニル]-2-ニトロピロール5’-三リン酸Cy3-hx-dPxTPの合成1-2-デオキシ-β-D-リボフラノシル-4-[3-6-アミノヘキサナミド-1-プロピニル]-2-ニトロピロール5’-三リン酸NH2-hx-dPxTP8.4μmolの100mMMNaHCO3-Na2CO3バッファー溶液pH8.6,500μlにCy3N-ヒドロキシスクシンイミジルエステルCy3-SE,6.0mg,7.63μmolのDMF300μl溶液を加えて室温で12時間静置した。50mMTEAA3.0mlを反応溶液に加えてDEAESephadexA-25ならびにHPLCで精製してCy3-hx-dPxTP2.7μmol,35を得た。3Cy3-hx-dPxTPの物性値1HNMR300MHz,D2Oδ8.55t,1H,J=13.6Hz,7.90t,2H,J=1.7Hz,7.85dd,2H,J=1.2,8.4Hz,7.78d,1H,J=2.1Hz,7.39dd,2H,J=1.9,8.5Hz,7.19d,1H,J=2.1Hz,6.64t,1H,J=5.9Hz,6.39dd,2H,J=2.8,13.5Hz,4.59m,1H,4.22-4.08m,9H,3.20q,32H,J=7.3Hz,3.07t,2H,J=6.5Hz,2.59dt,1H,J=6.1,13.3Hz,2.38dt,1H,J=6.2,13.8Hz,2.27-2.17m,2H,1.86m,2H,1.77s,12H,1.67-1.54m,4H,1.42-1.25m,56H.31PNMR121MHz,D2Oδ-8.65bs,1P,-10.72d,1P,J=19.7Hz,-22.32t,1P,J=20.4Hz.MSESIforC49H65N6O22P3S2計算値:1247.28MH,実測値:1247.43MH,計算値:1245.28M-H-,実測値:1244.91M-H-.実施例2人工塩基Pnによる相補鎖中の蛍光性人工塩基Dssの消光図7蛍光性人工塩基Dssを含むDNA断片12-mer、5’-GGTAACN1ATGCG-3’、N1=Dss配列番号1のみ、もしくは相補鎖のDNA断片12-mer、5’-CGCATN2GTTACC-3’、N2=Pn、Dss、Ds、もしくはT配列番号2と二本鎖を形成させた場合の蛍光変化を調べるために、10mMリン酸ナトリウムpH7.0,100mMNaCl,0.1mMEDTA溶液中で一本鎖DNAssDNAおよび二本鎖DNAdsDNAが5μMとなるように溶液を調製し、アニーリング後、365nmでのUVトランスイルミネーター照射により蛍光を撮影した結果を図7に示した。実施例3各DNA断片の蛍光スペクトル図8図8に、ETC-273T温度コントローラーを装備したJASCOFP-6500スペクトロメーターを用いて測定した各DNA断片の蛍光スペクトルを示した。Dssを含む一本鎖DNA断片12-mer、5’-GGTAACN1ATGCG-3’、N1=Dss配列番号1及びその相補鎖12-mer、5’-CGCATN2GTTACC-3’、N2=Pn、Dss、Ds、もしくはT配列番号2を含む二本鎖DNAを、10mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7.0、100mMNaCl、0.1mMEDTA溶液中で5μMとなるように調製し、アニーリング後、385nmでの励起による発光スペクトルを25°Cで測定した。比較として、Dsを含む一本鎖DNA断片12-mer、5’-GGTAACN1ATGCG-3’、N1=Ds、5μM配列番号3を用いて、310nmでの励起による発光スペクトルを25°Cで測定した。実施例4Pnの消光作用図9A.Pnのデオキシリボヌクレオシド三リン酸dPnTPの濃度依存による蛍光性人工塩基Dssのデオキシリボヌクレオシド三リン酸dDssTP,5μMの蛍光強度の変化ETC-273T温度コントローラーを装備したJASCOFP-6500スペクトロメーターを用いて、2mM、1mM、0.5mM、0.2mM、0.1mM、0.05mMのデオキシリボヌクレオシド三リン酸dPnTPを含む10mMリン酸ナトリウムpH7.0,100mMNaCl,0.1mMEDTA溶液100μlに、デオキシリボヌクレオシド三リン酸dDssTP、105μMを5μl加えて、370nmでの励起によるdDssTPの発光スペクトルを20°Cで測定した。同様に天然型塩基のデオキシリボヌクレオシド三リン酸存在下のdDssTPの蛍光消光効果を調べるために、15mM、12mM、9mM、6mM、3mM、1mMのデオキシリボアデノシン三リン酸dATP、デオキシリボグアノシン三リン酸dGTP、デオキシリボチミジン三リン酸dTTP、デオキシリボシチジン三リン酸dCTPを含む10mMリン酸ナトリウムpH7.0,100mMNaCl,0.1mMEDTA溶液100μlに、デオキシリボヌクレオシド三リン酸dDssTP、105μMを5μl加えて、370nmでの励起によるdDssTPの発光スペクトルを20°Cで測定した。B.dPnTPと天然型塩基の三リン酸とのDssに対する消光性の比較Pnならびに天然型塩基のデオキシリボヌクレオシド三リン酸による、蛍光性人工塩基のヌクレオシド三リン酸、dDssTP5μMの消光性をSteady-stateStern-Volmerplotにより解析した。具体的には、10mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7.0,100mMNaCl,0.1mMEDTA溶液中、20°Cで測定した発光スペクトル370nm励起を用いて、系中に存在するクエンチャーdPnTP,dATP,dGTP,dCTP,dTTPの濃度に対する蛍光強度の減少を以下のStern-Volmer式に代入することにより、Stern-Volmer定数KSVを算出した。Stern-Volmer式:F0/F1=1KSV[Q]ここで、F0は、クエンチャーの存在しない場合の蛍光強度、F1はクエンチャーの存在する場合の蛍光強度を示し、[Q]はクエンチャーの濃度である。具体的には、クエンチャーの濃度[Q]を横軸に、そのクエンチャー濃度に対するF0/F1を縦軸にプロットし、最小二乗法により得られた直線からKSVを求めた。ここで、KSVの値が大きいほど消光能が強いクエンチャーであることを示す。グアニン塩基は消光性を有することが知られているが、Pnはさらに強い消光性を示すことがわかった。実施例5dPnとその各種誘導体によるdDssの蛍光の消光図105mMまたは5mMdPnまたはその各種誘導体存在下での終濃度5μMdDssの蛍光を、励起波長385nm、測定温度25°Cで測定した結果を図10に示した。具体的には、各ヌクレオシド溶液20μMdDss、20mMdPnおよびその各種誘導体を以下の手順で調製した。dDss、dPnまたはその各種誘導体をそれぞれ約5mgとり、55-60°Cで6時間乾燥後、秤量し、dDssは2mM、dPnまたはその各種誘導体はそれぞれ20mMになるように20アセトニトリル水溶液を加えた。dDssはさらに希釈し、20μMとした。蛍光スペクトル測定用のサンプルに関しては、dPnまたはその各種誘導体の終濃度2.5mMの場合図10A、50μlの20μMdDss溶液、25μlの20mMdPnまたはその各種誘導体溶液、25μlの20アセトニトリル溶液、100μlのエタノールを混合して、全量を200μlとした。dPnまたはその各種誘導体の終濃度5mMの場合図10Bには、50μlの20μMdDss溶液、50μlの20mMdPnまたはその各種誘導体溶液、100μlのエタノールを混合して、全量を200μlとした。実施例6クレノウ断片によるDss-Pn塩基対のDNA中への一塩基取り込み実験表1クレノウ断片による一塩基取り込み実験を、文献に従っておこなったKimoto,M.;Yokoyama,S.;Hirao,I.Biotechnol.Lett.2004,26,999-1005、Petruska,J.;Goodman,M.F.;Boosalis,M.S.;Sowers,L.C.;Cheong,C.;Tinoco,I.Proc.Natl.Acad.Sci.USA1988,85,6252-6256、Goodman,M.F.;Creighton,S.;Bloom,L.B.;Petruska,J.Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.1993,28,83-126、Morales,J.C.;Kool,E.T.Nat.Struct.Biol.1998,5,950-954。具体的には、5’末端が6-カルボキシフルオレセインで標識されたプライマー20-mer、5’-ACTCACTATAGGGAGGAAGA-3’配列番号4または、5’-ACTCACTATAGGGAGCTTCT-3’配列番号5と鋳型DNA35-mer、5’-AGCTCTDssTCTTCCTCCCTATAGTGAGTCGTATTAT-3’配列番号6または、5’-TCGAGANAGAAGCTCCCTATAGTGAGTCGTATTAT-3’N=Pn、A、G、C、T配列番号7を、20mMMgCl2、2mMDTT、および100μg/mlウシ血清アルブミンBSAを含有する100mMTris-HClpH7.5緩衝液中で、95°Cで加温した後に、4°Cへ緩やかに冷却することによりアニーリングし、鋳型鎖とプライマーの二本鎖を形成させた。このプライマー―鋳型二本鎖DNA溶液10μMを5μlずつ分注した後,エキソヌクレアーゼ活性を持たないクレノウ断片KFexo-、AmershamUSBの酵素溶液2μlを加えて、37°Cで2分間インキュベートし、DNA酵素複合体を形成させた。その溶液に3μlの各基質、即ちヌクレオシド三リン酸溶液Dss、PnまたはA、G、C、Tのうち1種、1μM-5mMを加えて、37°Cで酵素反応1-35分間を行った。反応の終了は、10μlの20mMEDTAを含む95ホルムアミド溶液停止溶液を加えて75°Cで3分加温することで行った。反応条件をまとめると以下の通りである。溶液10μl中、5μMプライマー-鋳型二本鎖、5-50nM酵素及び0.3-1500μM基質を使用。溶液10μlは、50mMTris-HClpH7.5、10mMMgCl2、1mMDTT及び0.05mg/mlBSAを含む。反応は、37°Cで1-35分間。反応溶液の一部を停止溶液で希釈した後、その希釈反応液0.5μlをローディング溶液脱イオンホルムアミド:25mMEDTAを含む50mg/mlブルーデキストラン溶液=5:13μlと混合し、90°Cで2分加熱し、氷上に置いて急冷した。そのうちの約0.5μlを1レーンおきにシークエンスゲルにロードし電気泳動を行った。シークエンスゲル36cmWTRの組成は、6M尿素、10ポリアクリルアミドアクリルアミド:ビスアクリルアミド=19:1、0.5×TBEである。泳動用緩衝液は,0.5×TBEを用いた。RunModuleは、GSRun36C-2400である。泳動時間は約1時間とし、反応産物のピークパターンの解析及び定量は、GeneScanソフトウエアバージョン3.0装備した自動ABI377DNAシークエンサーで解析した。未反応のプライマー断片,および一塩基とりこまれて伸長したDNA断片のピークの面積を用いて、一ヌクレオチド伸長されたプライマーの割合を定量し、Hanes-WoolfplotGoodman,M.F.;Creighton,S.;Bloom,L.B.;Petruska,J.Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.1993,28,83-126により酵素学的パラメーターVmax、KMを算出した。なお、Vmaxの値は、使用された種々の酵素および二本鎖濃度に対して酵素濃度20nM、二本鎖濃度5μMに標準化された。結果を表1に示す実施例7大腸菌由来のDNAポリメラーゼIのクレノウ断片を用いたPnを含む鋳型DNAとdDssTPによるプライマー伸長反応図115’末端を32Pで標識したプライマー23-mer配列番号8とPnもしくはPaを含む鋳型DNA35-mer配列番号9を、14mMMgCl2、0.2mMDTTを含有する20mMTris-HClpH7.5緩衝液中で、95°Cで加温後、4°Cへ緩やかに冷却することによりアニーリングし、鋳型鎖とプライマーの二本鎖を形成させた。このプライマー―鋳型二本鎖DNA溶液400nMを5μlずつ分注した後、2.5μlの各基質、即ちヌクレオシド三リン酸溶液40μMdCTP、40μMdTTP、0-40μMdDssTPを氷上で加えた。この溶液に、エキソヌクレアーゼ活性をもつクレノウ断片KFexo、TaKaRaを滅菌水で希釈した酵素溶液2.5μl、1ユニットを加えることで反応を開始し、37°Cで3分間保温後、10μlの10M尿素を含む1×TBE溶液停止溶液を加えて75°Cで3分加温することで反応を止めた。反応産物を15ポリアクリルアミド―7M尿素ゲルで電気泳動し、バンドパターンをバイオイメージングアナライザーFLA7000、富士フィルムによるオートラジグラフィーにより解析した。実施例8Dss-Px塩基対を用いたDsを含むDNAのPCR増幅図12所定濃度の人工塩基基質、NH2-hx-dPxTPおよびdDssTP、の存在下で、Dsを含む鋳型DNAS2、55-merもしくは天然型塩基だけからなるDNA対照、55-merを用いてPCRを行い、その産物を電気泳動により解析した結果を図12に示した。使用した鋳型DNAおよびプライマーの配列は以下のとおりである。DNAS255-mer、下線部はプライマーのアニーリング部位5’-TTTCACACAGGAAACAGCTATGACGGCCCDsTTGCCCTATAGTGAGTCGTATTATC-3’配列番号10DNA対照55-mer、下線部はプライマーのアニーリング部位5’-TTTCACACAGGAAACAGCTATGACGGATCCATTCCCTATAGTGAGTCGTATTATC-3’配列番号115’側プライマー:5’-CGTTGTAAAACGACGGCCAGGATAATACGACTCACTATAG-3’配列番号123’側プライマー:5’-TTTCACACAGGAAACAGCTATGAC-3’配列番号13PCR反応スケール:40μlは鋳型として最終濃度0.4nMのDNA断片を用いて実施し、94°C-30秒、45°C-30秒、65°C-4分を1サイクルとして20サイクル行った。反応液の最終組成は20mMTris-HClpH8.8、10mMKCl、10mMNH42SO4、2mMMgSO4、0.1TritonX-100、DeepVentDNAポリメラーゼ0.02ユニット/μl、NEB、1μM5’側プライマー、1μM3’側プライマー、0.3mM各天然型塩基基質dNTP、10-25μMdDssTP、および25μMNH2-hx-dPxTPである。20サイクル後のPCR産物を15ポリアクリルアミド―7M尿素ゲルで電気泳動した。増幅されたDNAのバンドは、ゲルをSYBRGreenIILonzaで染色した後、バイオイメージャーLAS4000富士フィルムのSYBRモードで検出した。実施例9Dss-Px塩基対を用いたPCR増幅後のDNAのシーケンシング図13所定濃度の人工塩基基質、NH2-hx-dPxTPおよびdDssTP、の存在下で、Dsを含む鋳型DNAS2、55-merを用いてPCRを行い、その産物中に人工塩基Dssが保持されているかを、人工塩基基質dPa’TPもしくはddPa’TPを利用したDNAシーケンシングにより解析した結果を図13に示した。使用した鋳型DNAおよびプライマーの配列は以下のとおりである。DNAS255-mer、下線部はプライマーのアニーリング部位5’-TTTCACACAGGAAACAGCTATGACGGCCCDsTTGCCCTATAGTGAGTCGTATTATC-3’配列番号10PCR用プライマー5’側プライマー:5’-CGTTGTAAAACGACGGCCAGGATAATACGACTCACTATAG-3’配列番号123’側プライマー:5’-TTTCACACAGGAAACAGCTATGAC-3’配列番号13シーケンシング用プライマー:5’-CGTTGTAAAACGACGGCCAG-3’配列番号14PCR反応スケール:25μlは鋳型として最終濃度0.6nMのDNA断片を用いて実施し、94°C-30秒、45°C-30秒、65°C-4分を1サイクルとして15サイクル行った。反応液の最終組成は20mMTris-HClpH8.8、10mMKCl、10mMNH42SO4、2mMMgSO4、0.1TritonX-100、DeepVentDNAポリメラーゼ0.02ユニット/μl、NEB、1μM5’側プライマー、1μM3’側プライマー、0.3mM各天然型塩基基質dNTP、2-10μMdDssTP、および2-50μMNH2-hx-dPxTPである。15サイクル後のPCR産物全長を変性ゲルで精製した後、DNAシーケンスの鋳型とし、シーケンシング解析をおこなった。DNAのシーケンシング反応は、全量20μlスケールにて、市販のBigDyeTerminatorv1.1CycleSequencingKitAppliedBioSystemsのCycleSequencingMix8μlとプライマー4pmolとPCR増幅されたDNA断片およそ0.3pmol程度を混合し、40pmolのdPa’TPもしくは1nmolのddPa’TPの存在下、25サイクルのPCR96°C-10秒、50°C-5秒、60°C-4分を行った。未反応のダイダーミネーターをCentri-SepスピンカラムAppliedBioSystemsで反応溶液からとり除き、残りの溶液を減圧吸引により乾燥した。残存物にBlue-Dextranを希釈したホルムアミド溶液を4μl加えて懸濁し、その一部をABI377DNAシーケンサーにより解析した。解析に用いたゲル組成は、7ポリアクリルアミド―6M尿素ゲルであり、配列のピークパターンは、AppliedBioSystemsPRISMシークエンシング解析v3.2ソフトウエアを用いて解析した。実施例10Dss-Px塩基対を用いたリアルタイムPCR図15人工塩基Dssを含むプライマーを用いて、dPxTPの基質存在下でPCRを行った場合のリアルタイムPCRの原理を図14に示した。Dssに対してPxが相補鎖に取り込まれると、PxがDssのクエンチャー消光剤として作用するため、PCR増幅された二本鎖DNAをDssの蛍光強度の減少から検出することができる。図15は、実際に下記のDNA断片を用いて、リアルタイムPCRを実施した結果であり、定量的な増幅プロットが得られ、反応液中25μlに3コピーのDNAでも検出可能であることがわかった。実験に使用した配列下線部はプライマーアニーリング部位に相当5’-プライマー配列:5’-CATGTAGATGCCATCAAAGAAGCTC-3’配列番号153’-プライマー配列:5’-AATAATGCDssTCCTCAAAGGTGGTGACTTC-3’配列番号16二本鎖鋳型DNA98bp;片方の鎖のみ記載:5’-CATGTAGATGCCATCAAAGAAGCTCTGAGCCTCCTAAATGACATGCGTGCTCTGGAGAACGAAAAGAACGAAGACGTAGAAGTCACCACCTTTGAGGA-3’配列番号17具体的には、リアルタイムPCR装置ストラタジーン、Mx3005Pを用いて、プライマー各1μM、天然型塩基基質dNTP各0.2mM、人工塩基基質dPxTP2μMの存在下、94°C-2分の後に、94°C-5秒、68°C-40秒を1サイクルとする2ステップPCRの条件で55サイクルのPCRを行った。PCRの反応スケールは25μlで、反応液の組成は40mMTricine-KOHpH8.0、16mMKCl、3.5mMMgSO4、3.75μg/mlBSA、1×TitaniumTaqDNAポリメラーゼである。鋳型に用いたDNA断片は、反応液中にそれぞれ、0、3、15、30、150、300、1500、3000、15000、30000コピーになるように希釈し、それぞれの濃度につき、PCRを実施した。検出に用いたフィルターセットは、励起350nm-蛍光440nmALEXA用である。データ解析には、Plexor登録商標AnalySiSSoftwarev1.5.4.18,PromegaEragenBioSciencesを用いた。結果を図15に示した。実施例11Dss-Pn塩基対を含むDNAヘアピンの蛍光特性図16Dssを含む2種類のDNA、hairpinssDNA34-mer配列番号18とssDNA12-mer配列番号19を1×ExTaqBufferTaKaRa、2mMMgCl2含有中で1μMとなるように調製し、ReferenceDyeあるROXInvitrogen存在下最終濃度1000倍希釈、温度変化による蛍光強度の変化をMx3005Pのdissociationモードで検出した。ROXのシグナル強度で補正したのち、35°Cでの値を基準として規格化したときのグラフを図16に示した。構造をもたない直鎖上のssDNA12-merは、DNAを含まないBufferのみバックグラウンドと同様、少しずつ蛍光が現象するプロファイルであったのに対し、Dss-Pn塩基対を含むヘアピン構造を形成するhairpinssDNA34-merは、温度上昇とともに蛍光が上昇するプロファイルが得られた。これは、低温状態ではヘアピン構造をとっているために消光作用のあるPnがDssと塩基対を形成し、Dssの蛍光がPnで消光して蛍光強度が低くなっている一方で、温度を上げた場合にはヘアピン構造が壊れて消光作用がなくなり、Dssの蛍光が検出されるようになったため、と考えられる。実施例12Dss-Pn塩基対を用いたモレキュラービーコンの可視化図17各種DNA断片、モレキュラービーコンMB-C、26-mer配列番号20とTargetDNA71G、71-mer配列番号21をそれぞれ2μMとなるように調製し、等量50μlずつ混合した。ネガティブコントロールとして、TargetDNAを含まない溶液を、MB-C溶液と混合した。最終的な溶液組成はDNA濃度各1μM、10mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7.0、100mMNaCl、0.1mMEDTAである。この溶液をPCRマシンにて90°Cで10秒間加熱後、25°Cまで徐冷した。励起波長375nmのUV-LEDランプによる照射下もしくは自然光下にて、デジタルカメラにより撮影した写真を図17の右に示した。ターゲットDNA非存在下では、モレキュラービーコンはループ―ステム構造を形成して、Dss-Pn塩基対形成により、Dssの蛍光が消光されるが、ターゲットDNA存在下では、モレキュラービーコンのループ部分がハイブリダイゼーションによりターゲットDNAと二本鎖を形成し、ステム構造が壊れてDss-Pn塩基対が形成なくなり、Dssの蛍光が検出されることが目視にて確認できた。実施例13Dss-Pn塩基対を用いたモレキュラービーコンによる一塩基変異の検出図18500nMに希釈したモレキュラービーコン26-mer、MB-C配列番号20またはMB-T配列番号23の溶液を50μlずつ分注し、最終溶液の5倍濃度のTargetDNA断片71-mer、71G配列番号21または71A配列番号22、12.5μlと混合したサンプルをインキュベーターにて45°Cで5分以上保温して平衡状態とした。蛍光測定はJASCOFP-6500スペクトロメーターを用いて行い、セルに溶液を移したのち装置中45°C設定で2分放置後に、自動シャッター制御を使用して390nmで励起し430-470nmの蛍光スペクトルを測定した。最終溶液中の組成は、モレキュラービーコン400nM、TargetDNA0-3200nM、10mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7.0、100mMNaCl、0.1mMEDTAである。図18に示したグラフは、454nmの蛍光強度について、TargetDNA断片非存在下での蛍光強度でそれぞれ規格化してからプロットしたものである。一塩基のミスマッチがある場合には完全にマッチした場合よりも蛍光強度が有意に低くなることを利用して、一塩基変異をDss-Pn塩基対を利用したモレキュラービーコンにより検出できることがわかった。実施例14Cy3-Px/Dss塩基対を用いた可視化PCR図20人工塩基Dssを含むプライマーを用いて、Cy3-hx-dPxTPの基質存在下でPCRを行った場合のリアルタイムPCRの原理を図19に示した。Dssに対してCy3-hx-dPxが相補鎖に取り込まれると、350nm付近の照射でDssとCy3間にFRETが起こるため、PCR増幅された二本鎖DNAを特異的に光らせることができる。また、このFRETによる蛍光は目視検出が可能なこともわかった図20。実験に用いた配列は図15と同一である。実験に使用した配列下線部はプライマーアニーリング部位に相当5’-プライマー配列:5’-CATGTAGATGCCATCAAAGAAGCTC-3’配列番号153’-プライマー配列:5’-AATAATGCDssTCCTCAAAGGTGGTGACTTC-3’配列番号16二本鎖鋳型DNA98bp;片方の鎖のみ記載:5’-CATGTAGATGCCATCAAAGAAGCTCTGAGCCTCCTAAATGACATGCGTGCTCTGGAGAACGAAAAGAACGAAGACGTAGAAGTCACCACCTTTGAGGA-3’配列番号17具体的には、リアルタイムPCR装置ストラタジーン、Mx3005Pを用いて、プライマー各1μM、天然型塩基基質dNTP各0.2mM、人工塩基基質Cy3-hx-dPxTP2μMの存在下、94°C-2分の後、94°C-5秒、68°C-40秒を1サイクルとする2ステップPCRの条件で55サイクルのPCRを行った。PCRの反応スケールは25μlで、反応液の組成は40mMTricine-KOHpH8.0、16mMKCl、3.5mMMgSO4、3.75μg/mlBSA、1×TitaniumTaqDNAポリメラーゼである。鋳型に用いたDNA断片は、反応液中にそれぞれ、0、3、30、300、3000、30000、300000、3000000コピーになるように希釈し、それぞれの濃度につき、PCRを実施した。その反応チューブを直接、365nmのUVで照射し、オレンジフィルターを通して目視で蛍光を検出した。実施例15蛍光性分子Cy3を結合した消光性Px塩基によるリアルタイムPCR図22人工塩基Dsを含むプライマーを用いて、蛍光性分子Cy3などを結合したdPxTP誘導体の基質存在下でPCRを行った場合のリアルタイムPCRの原理を図21に示した。蛍光性分子を、消光性のPx塩基に結合させると、蛍光性分子の蛍光が30程度消光する。これを基質Cy3-hx-dPxTPにして、Ds塩基を導入したプライマーを用いたPCRを行うと、Cy3-hx-PxがDNA中に取り込まれることで、Cy3の蛍光強度が増大する。図22は、実際に下記のDNA断片を用いて、リアルタイムPCRを実施した結果であり、定量的な増幅プロットが得られ、反応液中25μlに3コピーのDNAでも検出可能であることがわかった。実験に使用した配列下線部はプライマーアニーリング部位に相当5’-プライマー配列:5’-CATGTAGATGCCATCAAAGAAGCTC-3’配列番号153’-プライマー配列:5’-AATAATGCDsTCCTCAAAGGTGGTGACTTC-3’配列番号24二本鎖鋳型DNA98bp;片方の鎖のみ記載:5’-CATGTAGATGCCATCAAAGAAGCTCTGAGCCTCCTAAATGACATGCGTGCTCTGGAGAACGAAAAGAACGAAGACGTAGAAGTCACCACCTTTGAGGA-3’配列番号17具体的には、リアルタイムPCR装置ストラタジーン、Mx3005Pを用いて、プライマー各1μM、天然型塩基基質dNTP各0.2mM、人工塩基基質Cy3-hx-dPxTP2μMの存在下、94°C-2分の後、94°C-5秒、68°C-40秒を1サイクルとする2ステップPCRの条件で55サイクルのPCRを行った。PCRの反応スケールは25μlで、反応液の組成は40mMTricine-KOHpH8.0、16mMKCl、3.5mMMgSO4、3.75μg/mlBSA、1×TitaniumTaqDNAポリメラーゼである。鋳型に用いたDNA断片は、反応液中にそれぞれ、0、3、30、300、3000、30000、300000、3000000コピーになるように希釈し、それぞれの濃度につき、PCRを実施した。検出に用いたフィルターセットは、励起545nm-蛍光568nmCY3用である。データ解析には、付属の解析ソフトMxProversion4.10を用いた。実施例16蛍光性分子Cy3を結合した消光性Px塩基によるリアルタイムPCR産物のゲル電気泳動上での検出図23図22に示したPCR産物は、Cy3が取り込まれているため、この産物をアガロースゲルで電気泳動した場合、従来のEtBrやSYBRGreenなどのDNA染色色素を用いることなく、ゲル上でPCR産物をCy3の蛍光で検出可能である。図23では、図22に示したPCR産物12μlを、4アガロースゲルで電気泳動し、バイオイメージングアナライザー、FLA7000富士フィルムのCy3検出モード励起レーザー:532nm、検出フィルター:O580でバンドパターンを検出した結果を示した。実施例17蛍光性分子Cy3ならびに蛍光性人工塩基Sを含むDNAの蛍光特性図24化学合成後HPLC精製したDNA断片を最終濃度が5μMとなるように、100mMNaCl、0.1mMEDTAを含む10mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7で調製し、これらの溶液の蛍光特性を目視ならびに蛍光スペクトルで調べた結果を図24に示した。UV照射は、UVトランスイルミネーターを用いて、下方より行った。蛍光性人工塩基sを一つ含むDNA断片は、254nm、302nm、365nmの照射で発光し写真レーン2、sを2つ隣接してDNA中に導入すると、その蛍光が消光した写真レーン3。Cy3を導入したDNAは、254nm、302nmの照射で少し発光するが、365nmの照射ではほとんど発光しなかった写真レーン4。これに対し、DNA中のCy3の近傍に、sを1つあるいは2つ導入するとCy3の蛍光が観測され、FRETが起こることが確認できた写真レーン5-7。溶液を365nmで励起した場合の蛍光スペクトルをグラフに示した。実施例18蛍光性分子Cy3を結合した消光性のPx塩基と蛍光性人工塩基Sを組み合わせた可視化PCR法図26-28人工塩基Dsおよび蛍光性人工塩基sを隣接して2つ含むプライマーを用いて、Cy3-hx-dPxTP基質存在下でPCRを行った場合のリアルタイムPCRの原理を図25に示した。sを隣接して2つ導入するとsの蛍光は完全に消光する。しかし、Sの近傍にDsを配置し、そのDsにCy3-hxが相補して特異的に組み込まれると、365nm付近の照射でSとCy3間にFRETが起こり、PCR増幅された二本鎖DNAのみを特異的に光らせることができる。図26は、実際に下記のDNA断片を用いて、PCR25サイクルを行った産物を目視で確認した結果である。図26のss-Cy3を利用した系では、PCR装置MJリサーチ、PTC-100を用いて、プライマー各1μM、天然型塩基基質dNTP各0.2mM、人工塩基基質Cy3-hx-dPxTP2μMの存在下、94°C-2分の後、94°C-5秒、68°C-40秒を1サイクルとする2ステップPCRの条件で25サイクルのPCRを行った。PCRの反応スケールは25μlで、反応液の組成は40mMTricine-KOHpH8.0、16mMKCl、3.5mMMgSO4、3.75μg/mlBSA、1×TitaniumTaqDNAポリメラーゼである。鋳型に用いたDNA断片濃度は0.5nMである。従来法であるSYBRGreenI存在下でのPCRでは、人工塩基基質Cy3-hx-dPxTP2μMの代わりに、SYBRGreenI最終濃度1/30000、レファレンス色素としてROX最終濃度1/500を加えている。SYBRGreenI存在下でのリアルタイムPCR検出は最もよく用いられる方法の一つであるが、図26中、右側2レーンの写真に示したとおり、DNA有無での蛍光変化が大きくないために、目視での検出は難しい。図26の左側2レーンに示した通り、本法ではPCR検出を目視での検出が可能である。図27aに示したリアルタイムPCRでは、リアルタイムPCR装置ストラタジーン、Mx3005Pを用いて、プライマー各1μM、天然型塩基基質dNTP各0.2mM、人工塩基基質Cy3-hx-dPxTP2μMの存在下、94°C-2分の後、94°C-5秒、68°C-40秒を1サイクルとする2ステップPCRの条件で55サイクルのPCRを行った。PCRの反応スケールは25μlで、反応液の組成は40mMTricine-KOHpH8.0、16mMKCl、3.5mMMgSO4、3.75μg/mlBSA、1×TitaniumTaqDNAポリメラーゼである。鋳型に用いたDNA断片は、反応液中にそれぞれ、0、3、30、300、3000、30000、300000、3000000コピーになるように希釈し、それぞれの濃度につき、PCRを実施した。さらに、図27aに示したように、反応液中25μlに3コピーのDNAでも365nm照射により、PCR産物を目視で検出可能であることがわかった。また、図28は図27aの可視化PCR産物をアガロースゲルで電気泳動した場合で、312nm照射でsからCy3へのFRETにより産物検出ができること、また532nm照射でDNA中に直接取り込まれたCy3の蛍光により産物検出ができることが確認できた。実験に使用した配列下線部はプライマーアニーリング部位に相当5’-プライマー配列:5’-CATGTAGATGCCATCAAAGAAGCTC-3’配列番号153’-プライマー配列:5’-AATAASSGCDsTCCTCAAAGGTGGTGACTTC-3’配列番号25二本鎖鋳型DNA98bp;片方の鎖のみ記載:5’-CATGTAGATGCCATCAAAGAAGCTCTGAGCCTCCTAAATGACATGCGTGCTCTGGAGAACGAAAAGAACGAAGACGTAGAAGTCACCACCTTTGAGGA-3’配列番号17図28では、図27aに示したPCR産物12μlを、4アガロースゲルで電気泳動し、バイオイメージングアナライザー、LAS4000富士フィルムのEtBr検出モード励起:312nm透過UV、検出フィルター605DF40を用いてsとCy3間のFRETにより産物を検出した結果、およびFLA7000富士フィルムのCy3検出モード励起レーザー:532nm、検出フィルター:O580でCy3の蛍光から直接産物を検出した結果を示した。実施例19蛍光性分子Cy3を結合した消光性のPx塩基と蛍光性人工塩基sを組み合わせた可視化PCR法:各PCRサイクルの蛍光強度の定量図27b-図27d本実施例は、図27aの実験の追実施例である。人工塩基Dsおよび蛍光性人工塩基sを隣接して2つ含むプライマーを用いて、Cy3-hx-dPxTP基質存在下でPCRを行った場合、増幅されたDNA中のCy3の蛍光強度の増加を測定することにより、リアルタイムPCR図27bにも利用できた。また、異なる初濃度のDNAのPCR増幅を目視での検出図27cも可能になった。さらには、PCRサイクル毎で、その増幅の過程をチューブの撮影画像を処理して、DNAの増幅を定量化することもできた図27d。実験に使用した配列下線部はプライマーアニーリング部位に相当5’-プライマー配列:5’-CATGTAGATGCCATCAAAGAAGCTC-3’配列番号153’-プライマー配列:5’-AATAAssGCDsTCCTCAAAGGTGGTGACTTC-3’配列番号26二本鎖鋳型DNA98bp;片方の鎖のみ記載:5’-CATGTAGATGCCATCAAAGAAGCTCTGAGCCTCCTAAATGACATGCGTGCTCTGGAGAACGAAAAGAACGAAGACGTAGAAGTCACCACCTTTGAGGA-3’配列番号17PCR反応は、リアルタイムPCR装置ストラタジーン、Mx3005Pを用いて、プライマー各1μM、天然型塩基基質dNTP各0.2mM、人工塩基基質Cy3-hx-dPxTP2μMの存在下、94°C-2分の後、94°C-5秒、68°C-40秒を1サイクルとする2ステップPCRの条件で30、35、40、45、55サイクルのPCRを行った。PCRの反応スケールは25μlで、反応液の組成は40mMTricine-KOHpH8.0、16mMKCl、3.5mMMgSO4、3.75μg/mlBSA、1×TitaniumTaqDNAポリメラーゼである。鋳型に用いたDNA断片は、反応液中にそれぞれ、0、3、30、300、3000、30000、300000、3000000コピーになるように希釈し、それぞれの濃度につき、PCRを実施した。反応終了後のチューブでの画像処理による定量解析は、以下の手順で行った。UVトランスイルミネーターを用いて、下方より365nmのUV照射下で、UVカットフィルターおよびオレンジフィルター越しにデジタルカメラにより撮影し、得られたファイルJPEG形式をAdobePhotoshopver.6.0で、画像モードをグレースケール、解像度を72pixel/inchとしてTiff形式ファイルに変換した。このファイルを、ScienceLab2005MultiGaugeソフトウエアで読み込み、定量解析を行った。具体的には、チューブの反応溶液部分[1015pixel2]のQuantumLevelQL値から、バックグラウンドの値チューブ間のエリア、7カ所の平均値を差し引き、その単位面積あたりの値を、それぞれPCRサイクルに対して、あるいは鋳型に用いたコピー数に対して、プロットした結果をグラフに示した。結果を図27b-dに示す。実施例20蛍光性分子s塩基を天然型塩基にリンカーを介して結合したヌクレオシド誘導体s-hx-dUとDs-Px塩基対を用いたPCR産物の検出法図29b-図29d本実施例は図29aの対実施例である。蛍光性人工塩基であるsをリンカーを介して天然型塩基Uに結合した修飾塩基s-hx-dUを隣接して2つ含むプライマーを用いて、Cy3-hx-dPxTP基質存在下でPCRを行った場合のリアルタイムPCRの原理を図29aに示した。s-hx-dUを隣接して2つ導入すると、sを隣接して2つ導入した場合と同様に図25、sの蛍光は消光される。しかし、s-hx-dUの近傍にDsを配置し、そのDsにCy3-hx-dPxが相補して特異的に組み込まれると、365nm付近の照射でsとCy3間にFRETが起こり、PCR増幅された二本鎖DNAのみを特異的に光らせることができる。図25の場合にはs塩基がプライマー中に2つ入るので、PCRによる相補鎖合成がこの部分で停止する可能性があるが、本法ではsを天然型塩基にリンカーを介して結合しているので、PCRでの相補鎖合成が進む。これにより、人工塩基を含む発色のための部位をプライマー中のどの部分にも導入できLAMP法やSMAP法などのPCR法に利用できる。またパドロックPCR法などのプライマー領域以外にも本手法を用いることができる。図29bは、用いたDNAの配列、ならびにPCRの条件を示した。図29cには55サイクルのリアルタイムPCRの結果を、図29dには55サイクルのPCR後の増幅産物を目視で確認した結果をそれぞれ示す。標的とするDNAターゲットDNAの量を0-3000000コピーの間でPCR増幅を行ったところ、3コピー以上で目視判定ができた。実験に使用した配列下線部はプライマーアニーリング部位に相当;Us=s-hx-dU5’-プライマー配列:5’-CATGTAGATGCCATCAAAGAAGCTC-3’配列番号153’-プライマー配列:5’-AATAAUsUsGCDsTCCTCAAAGGTGGTGACTTC-3’配列番号27二本鎖鋳型DNA98bp;片方の鎖のみ記載:5’-CATGTAGATGCCATCAAAGAAGCTCTGAGCCTCCTAAATGACATGCGTGCTCTGGAGAACGAAAAGAACGAAGACGTAGAAGTCACCACCTTTGAGGA-3’配列番号17具体的には、リアルタイムPCR装置ストラタジーン、Mx3005Pを用いて、プライマー各1μM、天然型塩基基質dNTP各0.2mM、人工塩基基質Cy3-hx-dPxTP2μMの存在下、94°C-2分の後、94°C-5秒、68°C-40秒を1サイクルとする2ステップPCRの条件で55サイクルのPCRを行った。PCRの反応スケールは25μlで、反応液の組成は40mMTricine-KOHpH8.0、16mMKCl、3.5mMMgSO4、3.75μg/mlBSA、1×TitaniumTaqDNAポリメラーゼである。鋳型に用いたDNA断片は、反応液中にそれぞれ、0、3、30、300、3000、30000、300000、3000000コピーになるように希釈し、それぞれの濃度につき、PCRを実施した。その反応チューブを直接、365nmのUVで照射し、オレンジフィルターを通して目視で蛍光を検出した。実施例21s-hx-dUアミダイト試薬図6の化合物の化学合成図308-ブロモ-1-オクチンの合成図30の工程a8-ヒドロキシ-1-オクチン1.95g,15mmolに脱水ジクロロメタン20ml、トリフェニルホスフィン5.91g,22.5mmolを加え、0°Cに冷却後、脱水ジクロロメタン10mlに溶解させた四臭化炭素7.46g,22.5mmolを滴下し、室温で2時間攪拌した。ジクロロメタン100ml、5炭酸水素ナトリウム150mlで分液、有機層を飽和食塩水150mlで洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィージクロロメタン:メタノール=100:0→99:1で精製し、8-ブロモ-1-オクチンcrudeを得た。8-ブロモ-1-オクチンの物性値1HNMR300MHz,DMSO-d6δ3.51t,2H,J=6.7Hz,2.71t,1H,J=2.7Hz,2.12-2.17m,2H,1.75-1.84m,2H,1.24-1.54m,6H.26-チエン-2-イル-9-7-オクチニル-2-アミノプリンの合成図30の工程b6-チエン-2-イル-2-アミノプリン1.2g,5.5mmolと炭酸カリウム2.3g,16.5mmolの脱水ジメチルホルムアミド25ml溶液に、1で得られた8-ブロモ-1-オクチン2.0g,10.6mmolを加えて、室温で15時間撹拌した。反応溶液を濃縮し、酢酸エチルと水で分液し、有機層を飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し中圧分取カラムクロマトグラムにより精製して6-チエン-2-イル-9-7-オクチニル-2-アミノプリン1.6g,4.9mmol,87を得た。6-チエン-2-イル-9-7-オクチニル-2-アミノプリンの物性値1HNMR300MHz,DMSO-d6δ8.53dd,1H,J=1.2,3.7Hz,8.14s,1H,7.79dd,1H,J=1.2,5.0Hz,7.26dd,1H,J=3.7,5.0Hz,6.48brs,2H,4.05t,2H,J=7.2Hz,2.72t,1H,J=2.6Hz,2.12m,2H,1.78m,2H,1.23-1.46m,6H.36-チエン-2-イル-9-7-オクチニル-2-フェノキシアセタミドプリンの合成図30の工程c1-ヒドロキシベンゾトリアゾール1.19g,8.84mmolを脱水ピリジンで3回共沸乾燥し、脱水ピリジン2.5ml、脱水アセトニトリル2.5ml、フェノキシアセチルクロリド1.08ml,7.85mmolを加え、室温で5分間攪拌後、0°Cに冷却し、これに脱水ピリジン25mLに溶解した。2で得られた6-チエン-2-イル-9-7-オクチニル-2-アミノプリン1.60g,4.91mmolを加え、室温で一晩攪拌した。酢酸エチル150ml、飽和食塩水150ml×2回で分液し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィージクロロメタン:メタノール=100:0→99:1で精製し、6-チエン-2-イル-9-7-オクチニル-2-フェノキシアセタミドプリン1.44g,3.13mmol,64を得た。6-チエン-2-イル-9-7-オクチニル-2-フェノキシアセタミドプリンの物性値1HNMR300MHz,DMSO-d6δ10.71s,1H,8.62d,1H,J=2.6Hz,8.54s,1H,7.92dd,1H,J=1.1,5.0Hz,7.31m,3H,6.92-6.93m,3H,5.15brs,2H,4.20t,2H,J=7.1Hz,2.71t,1H,J=2.6Hz,2.09-2.13m,2H,1.82-1.92m,2H,1.27-1.41m,6H.45-[6-チエン-2-イル-9-7-オクチニル-2-フェノキシアセタミドプリン]-5’-O-4,4’-ジメトキシトリチル-2’-デオキシウリジンの合成図30の工程d5’-O-4,4’-ジメトキシトリチル-5-ヨード-2’-デオキシウリジン1.64g,2.5mmol、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム0145mg,0.125mmol、ヨウ化銅76mg,0.4mmol、脱水ジメチルホルムアミド7.5mlを加え、アルゴンガスで置換し、脱水トリエチルアミン523μl,3.75mmolを加えた後、脱水ジメチルホルムアミド5ml、脱水ピリジン10mlに溶解した、3で得られた6-チエン-2-イル-9-7-オクチニル-2-フェノキシアセタミドプリン1.38g,3.00mmolを加え、マイクロウェーブ装置スタンダードモードで60°C,3時間攪拌した。酢酸エチル100ml、水100mlで分液、有機層を飽和食塩水100mlで洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィージクロロメタン:メタノール=100:0→97:3で精製し、5-[6-チエン-2-イル-9-7-オクチニル-2-フェノキシアセタミドプリン]-5’-O-4,4’-ジメトキシトリチル-2’-デオキシウリジン931mg,0.94mmol,38を得た。5-[6-チエン-2-イル-9-7-オクチニル-2-フェノキシアセタミドプリン]-5’-O-4,4’-ジメトキシトリチル-2’-デオキシウリジンの物性値1HNMR300MHz,DMSO-d6δ11.59brs,1H,10.70brs,1H,8.61dd,1H,J=0.9,3.8Hz,8.51s,1H,7.92dd,1H,J=0.9,5.0Hz,7.87s,1H,7.17-7.37m,12H,6.82-6.96m,7H,6.11t,1H,J=6.6Hz,5.31d,1H,J=4.4Hz,5.14brs,2H,4.02-4.28m,3H,3.70-3.91m,1H,3.12-3.16m,2H,2.04-2.24m,4H,1.76-1.99m,2H,1.15-1.20m,6H.55-[6-チエン-2-イル-9-7-オクチニル-2-フェノキシアセタミドプリン]-5’-O-4,4’-ジメトキシトリチル-2’-デオキシウリジン-3’-O-2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイトの合成図30の工程e4で得られた5-[6-チエン-2-イル-9-7-オクチニル-2-フェノキシアセタミドプリン]-5’-O-4,4’-ジメトキシトリチル-2’-デオキシウリジン890mg,0.9mmolを脱水ピリジンで3回、脱水テトラヒドロフランで3回共沸乾燥した。次いで、脱水テトラヒドロフラン4.5ml、脱水ジイソプロピルエチルアミン235μl,1.35mmol、2-シアノエチルN,N’-ジイソプロピルクロロホスホルアミジド241μl,1.08mmolを加え、室温で1時間攪拌した。脱水メタノール50μlを加え、酢酸エチル:トリエチルアミン20:1,50ml、5炭酸水素ナトリウム50mlで分液、有機層を飽和食塩水100mlで洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィーヘキサン:酢酸エチル:トリエチルアミン=98:0:2→78:20:2で精製し、5-[6-チエン-2-イル-9-7-オクチニル-2-フェノキシアセタミドプリン]-5’-O-4,4’-ジメトキシトリチル-2’-デオキシウリジン-3’-O-2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト867mg,0.73mmol,81を得た。5-[6-チエン-2-イル-9-7-オクチニル-2-フェノキシアセタミドプリン]-5’-O-4,4’-ジメトキシトリチル-2’-デオキシウリジン-3’-O-2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイトの物性値1HNMR300MHz,DMSO-d6δ11.57brs,1H,10.70brs,1H,8.60dd,1H,J=1.1,3.7Hz,8.50s,1H,7.89-7.92m,2H,7.14-7.36m,12H,6.79-6.95m,7H,6.10dt,1H,J=6.2,6.3Hz,5.13brs,2H,4.50-4.60m,1H,4.16t,2H,J=6.7Hz,3.99-4.06m,1H,3.17-3.71m,12H,2.26-2.76m,4H,2.05-2.10m,2H,1.74-1.77m,2H,0.82-1.39m,18H.31PNMR121MHz,DMSO-d6δ148.67,148.32.実施例22Dss-hx-dUアミダイト試薬図6の化合物の化学合成図3317-2,2’-ビチエン-5-イル-3-7-オクチニル-イミダゾ[4,5-b]ピリジンの合成図33の工程a7-2,2’-ビチエン-5-イル-イミダゾ[4,5-b]ピリジン850mg,3.0mmolと炭酸カリウム1.3g,9.0mmolのDMF15ml溶液を60°Cで1時間撹拌した。次いで、8-ブロモ-1-オクチン850mg,4.5mmolを加えて、60°Cで6時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチルと水で分液し、有機層を飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し中圧分取カラムクロマトグラムにより精製して7-2,2’-ビチエン-5-イル-3-7-オクチニル-イミダゾ[4,5-b]ピリジン520mg,1.3mmol,44を得た。7-2,2’-ビチエン-5-イル-3-7-オクチニル-イミダゾ[4,5-b]ピリジンの物性値1HNMR300MHz,DMSO-d6δ8.56s,1H,8.34d,1H,J=5.2Hz,8.21d,1H,J=3.9Hz,7.63d,1H,J=5.2Hz,7.58dd,1H,J=1.1,5.1Hz,7.46dd,1H,J=1.1,3.6Hz,7.44d,1H,J=4.0Hz,7.14dd,1H,J=3.6,5.1Hz,4.29t,2H,J=7.4Hz,2.72t,1H,J=2.7Hz,2.12m,2H,1.87m,2H,1.43-1.31m,6H.25-[7-2,2’-ビチエン-5-イル-3-7-オクチニル-イミダゾ[4,5-b]ピリジン]-2’-デオキシウリジンの合成図33の工程b5-ヨード-2’-デオキシウリジン294mg,0.83mmol、7-2,2’-ビチエニル-3-7-オクチニル-イミダゾ[4,5-b]ピリジン270mg,0.69mmol、CuI25mg、テトラキストリフェニルホスフィン48mg、トリエチルアミン173μlのDMF4.2ml溶液を室温で17時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチルと水で分液し、有機層を飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥しカラムクロマトグラム3メタノールの塩化メチレン溶液で溶出により精製して5-[7-2,2’-ビチエン-5-イル-3-7-オクチニル-イミダゾ[4,5-b]ピリジン]-2’-デオキシウリジン155mg,0.25mmol,36を得た。5-[7-2,2’-ビチエン-5-イル-3-7-オクチニル-イミダゾ[4,5-b]ピリジン]-2’-デオキシウリジンの物性値1HNMR300MHz,DMSO-d6δ11.54s,1H,8.56s,1H,8.34d,1H,J=5.2Hz,8.21d,1H,J=3.9Hz,8.09s,1H,7.63d,1H,J=5.2Hz,7.58dd,1H,J=1.1,5.1Hz,7.46dd,1H,J=1.1,3.6Hz,7.44d,1H,J=4.1Hz,7.14dd,1H,J=3.6,5.1Hz,6.10t,1H,J=6.9Hz,5.21d,1H,J=4.3Hz,5.06t,1H,J=5.0Hz,4.30t,2H,J=7.2Hz,4.21m,1H,3.77m,1H,3.56m,2H,2.33m,2H,2.09m,2H,1.88m,2H,1.45m,4H,1.29m,2H.35-[7-2,2’-ビチエン-5-イル-3-7-オクチニル-イミダゾ[4,5-b]ピリジン]-5’-O-4,4-ジメトキシトリチル-2’-デオキシウリジンの合成図33の工程c5-[7-2,2’-ビチエン-5-イル-3-7-オクチニル-イミダゾ[4,5-b]ピリジン]-2’-デオキシウリジン150mg,0.24mmol、4,4’-ジメトキシトリチルクロリド91mg,0.27mmolのピリジン2.4ml溶液を室温で1時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチルと5炭酸水素ナトリウム水溶液で分液し、有機層を飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥しカラムクロマトグラム2メタノールの塩化メチレン溶液で溶出により精製して5-[7-2,2’-ビチエニル-3-7-オクチニル-イミダゾ[4,5-b]ピリジン]-5’-O-4,4-ジメトキシトリチル-2’-デオキシウリジン183mg,0.2mmol,82を得た。5-[7-2,2’-ビチエン-5-イル-3-7-オクチニル-イミダゾ[4,5-b]ピリジン]-5’-O-4,4-ジメトキシトリチル-2’-デオキシウリジンの物性値1HNMR300MHz,DMSO-d6δ11.58s,1H,8.53s,1H,8.32d,1H,J=5.2Hz,8.20d,1H,J=3.9Hz,7.87s,1H,7.60-7.57m,2H,7.46-7.43m,2H,7.35-7.32m,2H,7.26-7.13m,8H,6.81d,4H,J=9.0Hz,6.10t,1H,J=7.0Hz,5.30d,1H,J=4.4Hz,4.26m,3H,3.89m,1H,3.69s,6H,3.15m,2H,2.18m,2H,2.05m,2H,1.78m,2H,1.22-1.13m,6H.45-[7-2,2’-ビチエン-5-イル-3-7-オクチニル-イミダゾ[4,5-b]ピリジン]-5’-O-4,4’-ジメトキシトリチル-2’-デオキシウリジン-3’-O-2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイトの合成図33の工程d5-[7-2,2’-ビチエン-5-イル-3-7-オクチニル-イミダゾ[4,5-b]ピリジン]-5’-O-4,4-ジメトキシトリチル-2’-デオキシウリジン180mg,0.2mmolをピリジンで3回、THFで3回共沸乾燥した後、THF1.0mlとジイソプロピルエチルアミン52μlを加えて撹拌した。この溶液に、2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト54μl,0.24mmolを加えて室温で1時間撹拌した。反応溶液に脱水メタノール50μlを加えた後、酢酸エチル/トリエチルアミン20:1,v/vと5炭酸水素ナトリウム水溶液で分液した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥して濃縮した。残さをシリカゲルカラムクロマトグラム酢酸エチル:塩化メチレン:トリエチルアミン、45:45:10、v/v/vで溶出で精製して5-[7-2,2’-ビチエン-5-イル-3-7-オクチニル-イミダゾ[4,5-b]ピリジン]-5’-O-4,4’-ジメトキシトリチル-2’-デオキシウリジン-3’-O-2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト220mg,99を得た。5-[7-2,2’-ビチエン-5-イル-3-7-オクチニル-イミダゾ[4,5-b]ピリジン]-5’-O-4,4’-ジメトキシトリチル-2’-デオキシウリジン-3’-O-2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイトの物性値1HNMR300MHz,DMSO-d6δ11.59s,1H,8.53s,s,1H,1H,8.32d,1H,J=5.2Hz,8.20d,1H,J=3.9Hz,7.89d,1H,J=2.1Hz,7.60-7.57m,2H,7.46-7.43m,2H,7.34m,2H,7.26-7.13m,8H,6.81m,4H,6.98dt,1H,J=6.3,6.5Hz,4.47m,1H,4.25t,2H,J=6.9Hz,4.05-3.98m,1H,3.71m,1H,3.69s,6H,3.60-3.42m,2H,3.20m,2H,2.73t,1H,J=5.9Hz,2.61t,1H,J=5.9Hz,2.44-2.25m,2H,2.07m,2H,1.77m,2H,1.09m,18H.31PNMR121MHz,DMSO-d6δ148.68,148.32.実施例23図2及び図3の化合物の合成11-2-デオキシ-β-D-リボフラノシル-4-ヨード-2-ニトロピロールの合成1-2-デオキシ-β-D-リボフラノシル-2-ニトロピロール456mg,2mmolのアセトニトリル8ml溶液にN-ヨードスクシンイミド900mg,4mmolを加えた。室温で一晩反応後、酢酸エチル200ml、水200mlで分液し、有機層を濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィーおよびHPLC精製し、1-2-デオキシ-β-D-リボフラノシル-4-ヨード-2-ニトロピロール587mg,1.66mmol,83を得た。1-2-デオキシ-β-D-リボフラノシル-4-ヨード-2-ニトロピロールの物性値1HNMR270MHz,DMSO-d6δ7.90d,1H,J=2.0Hz,7.40d,1H,J=2.0Hz,6.54t,1H,J=5.6Hz,5.27d,1H,J=4.3Hz,5.10t,1H,J=4.9Hz,4.23m,1H,3.83m,1H,3.53-3.85m,2H,2.18-2.45m,2H.21-2-デオキシ-β-D-リボフラノシル-4-チエン-2-イル-2-ニトロピロールの合成1-2-デオキシ-β-D-リボフラノシル-4-ヨード-2-ニトロピロール177mg,0.5mmol、二塩化ビストリフェニルホスフィンパラジウムII18mg,0.025mmolのDMF2.5ml溶液に2-トリブチルスタニルチオフェン476μl,1.5mmolを加えた。マイクロウェーブ装置スタンダードモードで100°C,30分間反応後、酢酸エチル50ml、水50mlで分液し、有機層を濃縮した。これをHPLC精製し、1-2-デオキシ-β-D-リボフラノシル-4-チエン-2-イル-2-ニトロピロール97mg,0.32mmol,63を得た。1-2-デオキシ-β-D-リボフラノシル-4-チエン-2-イル-2-ニトロピロールの物性値1HNMR300MHz,DMSO-d6δ8.13d,1H,J=2.3Hz,7.52d,1H,J=2.3Hz,7.42dd,1H,J=1.1,5.1Hz,7.33dd,1H,J=1.1,3.5Hz,7.06dd,1H,J=3.6,5.1Hz,6.59t,1H,J=5.7Hz,5.30d,1H,J=4.6Hz,5.17t,1H,J=5.1Hz,4.28m,H,3.86m,1H,3.70-3.74m,1H,3.58-3.69m,1H,2.41-2.45m,1H,2.25-2.33m,1H.31-2-デオキシ-β-D-リボフラノシル-4-フラン-2-イル-2-ニトロピロールの合成1-2-デオキシ-β-D-リボフラノシル-4-ヨード-2-ニトロピロール177mg,0.5mmol、二塩化ビストリフェニルホスフィンパラジウムII18mg,0.025mmolのDMF2.5ml溶液に2-トリブチルスタニルフラン472μl,1.5mmolを加えた。マイクロウェーブ装置スタンダードモードで100°C,30分間反応後、酢酸エチル50ml、水50mlで分液し、有機層を濃縮した。これをHPLC精製し、1-2-デオキシ-β-D-リボフラノシル-4-フラン-2-イル-2-ニトロピロール111mg,0.38mmol,76を得た。1-2-デオキシ-β-D-リボフラノシル-4-フラン-2-イル-2-ニトロピロールの物性値1HNMR300MHz,DMSO-d6δ8.08d,1H,J=2.3Hz,7.63dd,1H,J=0.7,1.8Hz,7.50d,1H,J=2.3Hz,6.69dd,1H,J=0.7,3.3Hz,6.61t,1H,J=5.7Hz,6.53dd,1H,J=1.8,3.3Hz,5.29d,1H,J=4.4Hz,5.12t,1H,J=5.1Hz,4.27m,1H,3.87m,1H,3.65-3.72m,1H,3.56-3.63m,1H,2.41-2.46m,1H,2.23-2.31m,1H.41-2-デオキシ-β-D-リボフラノシル-4-2,2’-ビチエン-5-イル-2-ニトロピロールの合成1-2-デオキシ-β-D-リボフラノシル-4-ヨード-2-ニトロピロール177mg,0.5mmol、二塩化ビストリフェニルホスフィンパラジウムII18mg,0.025mmolのDMF2.5ml溶液に2-トリブチルスタニルジチオフェン341mg,0.75mmolを加えた。マイクロウェーブ装置スタンダードモードで100°C,30分間反応後、酢酸エチル50ml、水50mlで分液し、有機層を濃縮した。これをHPLC精製し、1-2-デオキシ-β-D-リボフラノシル-4-2,2’-ビチエン-5-イル-2-ニトロピロール90mg,0.23mmol,46を得た。1-2-デオキシ-β-D-リボフラノシル-4-2,2’-ビチエン-5-イル-2-ニトロピロールの物性値1HNMR300MHz,DMSO-d6δ8.15d,1H,J=2.3Hz,7.57d,1H,J=2.3Hz,7.50dd,1H,J=1.1,5.1Hz,7.24-7.31m,3H,7.08dd,1H,J=3.6,5.1Hz,6.60t,1H,J=5.7Hz,5.28d,1H,J=3.6Hz,5.17t,1H,J=5.2Hz,4.29m,1H,3.87m,1H,3.68-3.75m,1H,3.57-3.65m,1H,2.41-2.46m,1H,2.26-2.34m,1H.51-2-デオキシ-β-D-リボフラノシル-4-メチル-2-ニトロピロールの合成1-2-デオキシ-β-D-リボフラノシル-4-ヨード-2-ニトロピロール142mg,0.4mmol、二塩化ビストリフェニルホスフィンパラジウムII14mg,0.02mmol、トリフェニルアルシン12mg,0.04mmolのDMF2ml溶液にテトラメチルスズ287μl,2mmolを加えた。60°C,2日間反応後、酢酸エチル50ml、水50mlで分液し、有機層を濃縮した。これをHPLC精製し、1-2-デオキシ-β-D-リボフラノシル-4-メチル-2-ニトロピロール15mg,0.06mmol,15を得た。1-2-デオキシ-β-D-リボフラノシル-4-メチル-2-ニトロピロールの物性値1HNMR300MHz,DMSO-d6δ7.55d,1H,J=2.8Hz,7.09d,1H,J=2.2Hz,6.55t,1H,J=5.9Hz,5.27d,1H,J=4.3Hz,5.00t,1H,J=5.3Hz,4.22m,1H,3.82m,1H,3.52-3.64m,2H,2.34-2.42m,1H,2.11-2.19m,1H,2.02s,3H.61-2-デオキシ-β-D-リボフラノシル-4-プロピニル-2-ニトロピロールの合成図3、R=-CH31-2-デオキシ-β-D-リボフラノシル-4-ヨード-2-ニトロピロール180mg,0.5mmol、二塩化ビストリフェニルホスフィンパラジウムII38mg,0.05mmolのDMF5ml溶液にトリブチル1-プロピニルスズ327μl,1mmolを加えた。100°C,90分間反応後、濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィーおよびHPLC精製し、1-2-デオキシ-β-D-リボフラノシル-4-プロピニル-2-ニトロピロール76mg,0.28mmol,57を得た。1-2-デオキシ-β-D-リボフラノシル-4-プロピニル-2-ニトロピロールの物性値1HNMR300MHz,DMSO-d6δ7.92d,1H,J=2.2Hz,7.27d,1H,J=2.2Hz,6.55t,1H,J=5.7Hz,5.28d,1H,J=4.5Hz,5.11t,1H,J=5.2Hz,4.24m,1H,3.85m,1H,3.53-3.70m,2H,2.45m,1H,2.22m,1H,1.99s,3H.[配列表]"