"半許容性ヒト腫瘍細胞内で出発株としての齧歯類パルボウイルスを連続的継代することによって入手可能なヒト腫瘍細胞を通して増殖及び伝播可能な齧歯類パルボウイルス変異体。ヒト腫瘍細胞を通して増殖及び伝播可能なパルボウイルス変異体であって、NS1のC末端における619~646位/NS2の中央エクソンにおける126~153位の28個のアミノ酸の欠失を含むことを特徴とするパルボウイルス変異体。ヒト腫瘍細胞を通して増殖及び伝播可能なパルボウイルス変異体であって、VP1/2における以下のアミノ酸置換、aH374Y、bD391N、及び/又はcD439S、を含むことを特徴とするパルボウイルス変異体。ヒト腫瘍細胞を通して増殖及び伝播可能なパルボウイルス変異体であって、請求項2に記載の欠失及び請求項3に記載の少なくとも1つの置換を含むことを特徴とするパルボウイルス変異体。前記出発株が、ラットパルボウイルスである請求項1~4のいずれか一項に記載のパルボウイルス変異体。前記ラットパルボウイルスが、ラットH1-PVである請求項4に記載のパルボウイルス変異体。前記腫瘍細胞が、神経膠腫細胞である請求項1~6のいずれか一項に記載のパルボウイルス変異体。前記神経膠腫は、膠芽細胞腫である請求項7に記載のパルボウイルス変異体。前記半許容性ヒト腫瘍細胞が、NCH149細胞である請求項1に記載のパルボウイルス変異体。前記連続的継代が、少なくとも10継代を含む請求項1~9のいずれか一項に記載のパルボウイルス変異体。前記継代後に、個々のウイルスクローンがプラーク精製される請求項1~10のいずれか一項に記載のパルボウイルス変異体。前記ウイルスクローンが、NB324K細胞上でプラーク精製される請求項11に記載のパルボウイルス変異体。ヒト腫瘍細胞を通して増殖及び伝播可能なパルボウイルス変異体を産生する方法であって、半許容性ヒト腫瘍細胞内で出発株としての齧歯類パルボウイルスを連続的に継代する工程を含む方法。請求項1~12のいずれか一項に記載の前記パルボウイルス変異体をコードするDNA。請求項14に記載のDNAを含む発現ベクター。請求項1~12のいずれか一項に記載のパルボウイルス変異体又は請求項15に記載の発現ベクターを含有する宿主細胞。請求項1~12のいずれか一項に記載のパルボウイルス変異体のNS1タンパク質に対する抗体であって、欠失を有する前記変異体のタンパク質にのみ結合して野生型のタンパク質には結合しないことをさらに特徴とする抗体。a請求項1~12のいずれか一項に記載のパルボウイルス変異体、b請求項14に記載のDNA、c請求項17に記載の抗体、及び/又は、場合により、d従来型補助物質、例えば溶媒、緩衝剤、担体、マーカー及びコントロールを含むキットであって、前記a~dの1つ以上の代表的成分が各々存在するキット。a請求項1~12のいずれか一項に記載のパルボウイルス変異体、請求項14に記載のDNA、請求項15に記載の発現ベクター、請求項16に記載の宿主細胞又は請求項17に記載の抗体、及びb薬学的に許容される担体を含有する医薬組成物。癌を治療するための医薬組成物を製造するための請求項1~12のいずれか一項に記載のパルボウイルス変異体、請求項14に記載のDNA、請求項15に記載の発現ベクター、請求項16に記載の宿主細胞又は請求項17に記載の抗体の使用。癌を治療する方法において使用するための請求項1~12のいずれか一項に記載のパルボウイルス変異体、請求項14に記載のDNA、請求項15に記載の発現ベクター、請求項16に記載の宿主細胞又は請求項17に記載の抗体。前記癌が、脳腫瘍である請求項20又は21に記載の使用。前記脳腫瘍が、神経膠腫、髄芽細胞腫、髄膜腫又は膠芽細胞腫である請求項22に記載の使用。このため、本発明の目的は、先行技術株の欠点を克服する、つまりヒト腫瘍組織を通して増殖及び伝播可能なパルボウイルスを提供することである。本発明によると、この課題は、特許請求の範囲に規定した主題によって解決される。本発明者らの初期の実験は、子孫PVビリオンは、当該子孫PVビリオンが培養液上清内に遊離する細胞溶解の前に核から細胞周縁へ小胞を通って往復することを証明している。さらに、この小胞放出は、細胞表面へ共積荷cocargoとして運ばれ、宿主抗腫瘍免疫刺激に寄与することができる複数の細胞内タンパク質潜在的腫瘍抗原を含むと関連している。ヒト膠芽細胞腫におけるウイルスの増殖及び伝播における最初のH1-PV単離体pSR19の欠損を修復するために、本発明者らは、半許容性の患者由来ヒト膠芽細胞腫細胞系における連続継代を通した増殖能力を有するH1-PV変異体を得ることを、すなわち感染プロセス脱穀、ウイルスゲノムの核への送達、二本鎖変換中の潜在的ボトルネックを回避することを目指し、H1-PVpSR-19の感染クローンDNAを様々なヒト膠芽細胞腫細胞系例、NCH149、NCH82、NCH89内にトランスフェクトし、この複製能力を有するDNAを細胞変性効果が視認できるようになるまで継代した。追加のウイルス継代>15は、vTEpH8.7中での反復冷凍及び解凍により得られた細胞関連子孫ビリオンと感染による培養液遊離ウイルスとを組合させた。次に増殖能力を有するウイルスのプールを効率的ウイルスDNA増幅、子孫ビリオンの生成及び様々なヒト膠芽細胞腫培養を通しての伝播を提示するNCH149細胞上での25継代後に分析した。この初代のプールから、個々のウイルスクローンをNB324K細胞上でのプラーク精製により単離し、再びNCH149細胞上で増幅させ、クローン化して配列決定した。全H1-PV変異体の遺伝分析は、NS1C-末端及びNS2のコーディング領域の28個のアミノ酸に影響を及ぼす84ntヌクレオチドの欠失ならびにVP2においてHis374をTyrへ変化させる3913位での単一のシトシンからチミジンへの移行を明らかにした。Asp391からAsn及びAsp439からSerへの変化をもたらすVP2領域における2つの追加のグアニジンからアデノシンへの置換3964及び4108は、2つの単離体にのみに起因する。3’非コーディング領域内でのわずかな変化は、保有率が様々なままであった。明らかに、およそ2,000~2,200ntの領域は、NS1/NS2機能の調節によりH1-PVの宿主環境への順応を可能にする変異のホットスポットを含んでいる。このため、この領域内の挿入/欠失により、H1-PVの宿主範囲のみならず、他の密接に関連するラットPV株、H3及びTVXも能動的に改変することができる。新規に産生されたH1-PV変異体は、ヒト膠芽細胞腫細胞系を通して増殖及び伝播することができる。これは、増加した感染/既に樹立されたヒト腫瘍の破壊を可能にし、その結果、より優れた抗腫瘍免疫刺激を発生させると予測される。本発明者らのパルボウイルス小胞放出に関する以前の発見と一致して、該表面への細胞内タンパク質の共輸送が宿主免疫応答のために腫瘍細胞を曝露させるために役立ち得ると想定することは道理にかなっている。この共積荷作用は、初代のH1-PV単離体pSR-19を使用した子孫ビリオン形成の不在下では存在しない。本発明の概略実施例において概説する半許容性細胞内で順応プロセス継代を行うと、多数の他のヒト膠芽細胞腫細胞系における増殖能力のあるH1-PV変異体を産生することができた。概説した方法は、腫瘍幹細胞を含む他のヒト腫瘍細胞系に拡張することができる。ラットH1-PVのヒト膠芽細胞腫細胞への順応は、H1のNS1のC末端/NS2の中央エクソンにおける欠失をもたらした。この領域はH1-PV宿主範囲を決定する変異のホットスポット領域を表しており、他のこれまでに特徴付けられていない齧歯類PV単離体の追加の順応/分析を行うと、この領域内で追加の変異を見いだすことができる。ヒト膠芽細胞腫の腫瘍組織内で細胞から細胞へ潜在的に伝播可能であり、このため適応度検定によって指摘されるように腫瘍細胞殺滅のより高い潜在能力を有するH1-PV変異体を産生する他、この単離体の子孫粒子は、小胞を通して細胞周縁へ能動的に輸送される。新規に合成されたビリオンの他、そのような小胞と結び付いている複数の細胞タンパク質が感染後に見いだされたが、これらは非感染ヒト膠芽細胞腫細胞内には存在しなかった。この共積荷作用は、宿主免疫系が腫瘍細胞を利用できるように当該腫瘍細胞を露出させることにより、ウイルス誘発性抗腫瘍免疫応答に寄与することができた。本発明は、第一態様において、半許容性ヒト腫瘍細胞内で出発株としての齧歯類パルボウイルスを連続的に継代することによって入手可能なヒト腫瘍細胞を通して増殖及び伝播可能なパルボウイルス変異体を提供する。さらに、本発明は、第二態様において、ヒト腫瘍細胞を通して増殖及び伝播可能なパルボウイルス変異体であって、NS1のC末端における619~646位RhodeandParadiso1983/NS2の中央エクソン内の126~153位RhodeandParadiso1983;Qiuetal2006からの28個のアミノ酸の欠失を含むことを特徴とするパルボウイルス変異体を提供する。本発明はさらに、ヒト腫瘍細胞を通して増殖及び伝播可能なパルボウイルス変異体であって、VP1/2における以下のアミノ酸置換、aH374Y、bD391N、及び/又はcD439S、を含むことを特徴とするパルボウイルス変異体を提供する。本明細書で使用する用語増殖するpropagatingは、本パルボウイルス変異体の子孫ビリオンが投与レベルに比して有意な増幅率即ち、>5倍を示すことを意味する。本明細書で使用する用語~を通して伝播するspreadingthroughは、本発明のパルボウイルス変異体の子孫ビリオンが一次的に感染細胞集団を殺滅することができるだけではなく、さらに第1ラウンドの感染中に産生された粒子により無処置の細胞の二次感染を引き起こすことができることを意味する。宿主細胞を特徴付けるために本明細書で使用する用語半許容性semipermissiveは、ウイルスによる感染が特定タイプの宿主細胞内での不完全ウイルス複製を結果として生じさせるが、ウイルスDNA増幅及び子孫ビリオンの最終的な低収率によって特徴付けられることを意味する。後者は、当該方法の開始時には必ずしも感染性であることを必要としない。語句パルボウイルスは、任意のパルボウイルス、特に齧歯類パルボウイルス、例えばマウスの微小ウイルスMVM及びH-1ウイルスならびにそのようなウイルスもしくは誘導体をベースとする関連ウイルスもしくはベクターを含んでいる。当業者であれば、出発株を以下の実施例において説明した連続継代を受けることによって、又は所望の生物学的特性の改変、即ち当該パルボウイルス変異体を、増殖させ、そして、パルボウイルスの非構造的タンパク質の既知の核酸配列及びアミノ酸配列、例えばパルボウイルスH-1RhodeandParadiso1983;Qiuetal2006から出発してヒト腫瘍細胞全体に伝播し、これにより殺滅する能力、を結果として生じさせる欠失を導入することによって、本発明によるパルボウイルス変異体に到達することができる。当業者であればさらに、以下の実施例において説明した検定法を使用することにより特定の変異体が所望の生物学的特性を示すかどうかを容易に評価することができる。好ましくは、本発明のパルボウイルス変異体は、パルボウイルスH1H-1PVもしくは関連齧歯類パルボウイルスに由来する。好ましい関連齧歯類パルボウイルスの例として、LuIII、マウス微小ウイルスMMV、マウスパルボウイルスMPV、ラット微小ウイルスRMV、ラットパルボウイルスRPV又はラットウイルスRVがあげられる。原理上は、本発明のパルボウイルス変異体を使用してあらゆる腫瘍を治癒することができるが、神経膠腫が好ましい。特に好ましい神経膠腫は、膠芽細胞腫である。好ましいヒト半許容性腫瘍細胞系は、NCH149である。連続継代の方法に関しては、当業者であれば、本発明のパルボウイルスに到達するために何回の継代で十分であるかを容易に決定することができる。しかし一般には、本発明の方法は、少なくとも10継代、好ましくは少なくとも20~25継代、又はそれ以上を含んでいる。好ましくは、継代は、NCH149細胞上で行われる。ウイルス変異体の純度及び安定性を保証するために、個々のクローンは、好ましくはNB324K細胞上で継代後にプラーク精製することができる。本発明はさらに、ヒト腫瘍細胞を通して増殖及び伝播可能なパルボウイルス変異体を産生する方法であって、上記及び以下の実施例に記載したように半許容性ヒト腫瘍細胞内で出発株としての齧歯類パルボウイルスを連続的に継代する工程を含む方法を提供する。本発明のまた別の主題は、核酸、特に上記のパルボウイルス変異体をコードするDNAに関する。本発明によるDNAは、ベクター及び発現ベクターの各々の中に存在してよい。当業者であれば、その例を熟知している。E.coli大腸菌に対する発現ベクターの場合、これらは例えば、pGEMEX、pUC誘導体、pGEX-2T、pET3b、T7をベースとする発現ベクター及びpQE-8である。酵母内での発現には、例えばpY100及びYcpad1を言及しなければならないが、例えば動物細胞内での発現には、例えばpKCR、pEFBOS、cDM8、pMSCND及びpCEV4を指定しなければならない。昆虫細胞内での発現には、バキュロウイルス発現ベクターpAcSGHisNT-Aが特に適している。好ましい実施形態では、本発明によるDNAを含有するベクターは、ウイルス、例えばアデノウイルス、ワクシニアウイルス、AAVウイルスもしくはパルボウイルス、例えばMVM又はH-1であるが、パルボウイルスが好ましい。ベクターは、さらにまたレトロウイルス、例えばMoMULV、MoMuLV、HaMuSV、MuMTV、RSVもしくはGaLVでありうる。本発明によるDNAを含有する発現ベクターを構築するためには、当該技術分野において公知の一般的方法を使用することができる。これらの方法には、例えば、インヴィトロinvitro組換え技術、合成方法及びインヴィヴォinvivo組換え法が含まれる。さらに、本発明は、上述した変異体もしくはベクターを含有する宿主細胞に関する。これらの宿主細胞には、ヒト293T、NBK、ラットRG2細胞、NCH149、NCH82、又はU87細胞が含まれる。これらの宿主細胞を形質転換させる方法、形質転換体を表現型的に選択する方法、及び上述したベクターを使用することによって本発明によるDNAを発現させる方法は、当該技術分野において公知である。そこで、本発明はさらに、本発明のパルボウイルス変異体を産生する方法であって、本発明の宿主細胞を適切な条件下で培養する工程及び当該細胞もしくは培地から当該パルボウイルス変異体を収集する工程を含む方法を提供する。さらに、本発明は、上述したパルボウイルス変異体、すなわち当該パルボウイルス変異体のポリペプチド領域を特異的に認識する抗体に関し、このとき、欠損は、当該齧歯類パルボウイルス変異体がヒト神経膠腫を通して増殖及び伝播可能な特性を明らかにして位置付けされる。抗体は、モノクローナル、ポリクローナルもしくは合成抗体又はそれらのフラグメント、例えばFab、Fv又はscFVフラグメントであってよい。好ましくは、モノクローナル抗体に関係する。製造のためには、動物、特にポリクローナル抗体にはウサギもしくはニワトリ、モノクローナル抗体にはマウス、を上記のパルボウイルス変異体もしくはそれらのフラグメントを用いて免疫することが好ましい。さらに動物の追加免疫は、同一パルボウイルス変異体又はそれらのフラグメントを用いて実行することができる。それから、ポリクローナル抗体は、動物の血清及び卵黄から各々得られる。モノクローナル抗体は、標準方法によって得られ、特にKohlerandMilsteinNature2561975495及びGalfreMethEnzymol7319813による方法を参照されたい。この場合、マウス骨髄腫細胞は、免疫動物に由来する脾臓細胞と融合される。本発明による抗体は、多数の方法で、例えば上述したパルボウイルス変異体の免疫沈降のため、又はそれらの単離のために使用することができる。これらの抗体は、イムノアッセイにおいて液相中で、もしくは固体担体に結合させることができる。この関連で、抗体は、様々な方法により標識することができる。当業者であれば、適切なマーカー及び標識方法に習熟している。イムノアッセイの例として、ELISA及びRIAが挙げられる。本発明の適用のために、キットも提供される。本キットは、a本発明によるパルボウイルス変異体、b本発明によるDNA、例えば発現ベクター、特にパルボウイルス、c本発明による抗体、及び/又は、場合により、d従来型補助剤、例えば溶媒、緩衝剤、担体、マーカー及びコントロールを含んでいる。成分a~dの内、1つ以上の代表的なものが各々存在してよい。本発明は、さらに本発明のパルボウイルス変異体、ベクター又は当該パルボウイルス変異体を産生する細胞パルボ治療剤もしくはパルボ治療用組成物、例えばヒト293T、NBKもしくはラットRG2細胞を含有する医薬組成物を提供する。投与のために、当該パルボ治療薬は適切な薬用担体と結合することができる。当該技術分野において周知であり容易に市販で入手可能なタイプの適切な薬用担体には、リン酸緩衝食塩水PBS溶液、水、例えば油/水型エマルジョンなどのエマルジョン、様々なタイプの湿潤剤、無菌溶液などが含まれる。そのような担体は、適切な用量で被験者に投与するため、パルボ治療薬を用いて、従来型の調製方法により調製することができる。追加の薬学的に適合する担体には、ゲル、生体吸収性マトリックス材料、該治療薬を含有する移植用成分又は他の適切な媒体vehicle、送達もしくは分注手段又は材料が含まれ得る。当該パルボ治療用医薬組成物の被験者、例えば脳腫瘍患者への投与は、任意の数多くの適切な方法のいずれか、例えば静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所、皮内、頭蓋内及び腫瘍内投与によって行うことができる。投与経路は、当然ながら、疾患の性質及び医薬組成物中に含有される特定治療薬に依存する。そのようなパルボ治療薬が血液脳関門を通って侵入する能力を備える感染性ウイルス粒子を含む場合、治療はウイルス治療薬、例えばH1-PV変異体の静脈内注射によって実施することができる、又は少なくとも開始することができる。長期静脈内治療はウイルス治療薬に対する中和抗体が形成されるため、非効率的になりやすく、様々な投与様式は静脈内ウイルス投与の初期投与計画後に順応させることができ、又はそのような様々な投与技術、例えばパルボウイルス治療の全経過を通して頭蓋内もしくは腫瘍内ウイルス投与を代わりに使用することができる。また別の特異的な投与技術として、パルボ治療薬ウイルス、ベクター及び/又は細胞剤を、患者に移植された起源から当該患者に投与できる。例えば、その後の外科的治療介入を行わずに該パルボ治療用組成物の様々な時点での局所的注射を可能にするため、例えばシリコンもしくは他の生体適合材料のカテーテルを腫瘍切除中に、又は別個の手法によって当該患者に据え付けられた小さな皮下リザーバRickhamリザーバへ接続することができる。本パルボウイルス変異体もしくはそれに由来するベクターもまた、例えば腫瘍内へ定位外科手術技術によって、又はニューロナビゲーションターゲティング技術によって注射することもできる。また、パルボウイルス剤もしくは組成物の投与は、ウイルス粒子又はウイルス粒子を含有する流体の移植カテーテルを通して、適切なポンプシステム、例えば蠕動式注入ポンプもしくは対流増加送達CEDポンプ、を使用して低流量での連続注入により実施することもできる。当該パルボ治療用組成物のさらにまた別の投与方法は、当該パルボ治療薬を所望の部位、例えば腫瘍へ分注するために構築及び配置された、移植装置からの投与である。例えば、当該パルボ治療用組成物、例えばパルボウイルスH-1変異体を含浸したウエハーを使用することができ、このとき当該ウエハーは外科的腫瘍切除の終了時に切除腔の辺縁に付着させられる。そのような治療介入では、複数のウエハーを使用することができる。当該パルボ治療薬、例えばパルボウイルスH-1変異体、又はH-1変異体ベクターを能動的に産生する細胞を、腫瘍除去後に所望の腫瘍内へ、又は腫瘍腔内へ注射することができる。2つ以上の上述した投与様式の組み合わせを、任意の適切な方法で、例えば同時に、同時期に、又は連続的に使用することができる。当該パルボ治療薬の投与計画は、当該技術分野の技術内で、患者のデータ、観察所見及び、例えば、投与される患者の体格、体表面積、年齢、性別、特定ウイルス、ベクター、細胞など、投与の時間及び経路、腫瘍のタイプ及び特性、患者の全身健康状態、ならびに該患者が服用している他の薬物もしくは受けている治療法を含むその他の臨床因子に基づき容易に決定することができる。したがって、本発明はさらに、癌を治療する目的の医薬組成物を調製するための、本発明によるパルボウイルス変異体、前記パルボウイルス変異体を産生する細胞、DNA、本発明の発現ベクターもしくは抗体の使用に関する。脳腫瘍好ましくは神経膠腫、髄芽細胞腫、髄膜腫又は膠芽細胞腫は、本発明の薬剤を用いた治療に特に適していると予測される。以下の実施例では、本発明をより詳細に説明する。ラットH1-PVpSR19のヒト神経膠腫への順応多数のヒト膠芽細胞腫細胞系のpSR19単離体目録番号NC_001358由来のH1-PVによる感染は、ウイルスタンパク質の発現及び結果として薬物誘導性アポトーシスに対するそれらの耐性とは無関係に細胞殺滅をもたらした。しかし、ウイルスDNA増幅及び子孫粒子産生をモニタリングしたところ、NCH89を除き、試験したヒト膠芽細胞腫細胞系の大多数がほとんどDNA増幅することができず、子孫産生を実質的に増加しなかったHerreroyCalleetal2004、DiPiazzaetal2007。この欠損を改良するため、DNA増幅に対する能力はあるが子孫ビリオン産生が妨害されたヒト膠芽細胞腫細胞におけるpSR19の連続継代を通してa増殖能力を有するH1-PV変異体を得ることを目指した。H1-PVの感染性クローンDNAであるpSR19をサザンブロッティングによって低レベルのDNA増幅を許容することが証明された細胞系であるNCH149細胞内にトランスフェクトした図1B。パルボウイルスは、一本鎖ゲノムから二本鎖転写鋳型への変換にはS期を必要とするため、急速に増殖する細胞に依存している。このため、初期接種トランスフェクト細胞を、表面上で集密度confluencyに達した後、最初は1:4の希釈度で増幅させた。細胞数が4×108個に達した後、細胞の3/4を収集し、冷凍及び解凍の繰り返しによって子孫ビリオンを上清中へ遊離させ、無処置細胞及びトランスフェクト細胞の組み合わせを集密度もしくはCPEが得られるまでこれらのビリオンを用いて再感染させた。この手法を20~25継代まで継続して実施した。ヒト神経膠腫順応H1-PVの分析20回超の連続継代後、本発明者らは、NCH149培養中で、ウイルスDNA増幅能力、子孫ビリオン産生能力及び伝播能力を有するウイルスストックを得た。このウイルスプールの特性を分析した。サザンブロッティングによる図1Cに示したように、このウイルスプールは、NCH149細胞の感染後の強力なDNA増幅、単量体及び二量体複製中間体ならびに一本鎖ビリオンDNAの産生を特徴とした。ゲノムウイルスDNAの産生を反映することに加えて、この後者の形態は、一本鎖DNAの産生にはパッケージングプロセスが結び付いているため、子孫ビリオンの形成を示している。さらに、感染した細胞の上清を採取してInf1、無処置NCH149細胞を感染させるとInf2、類似のDNA増幅及び一本鎖ビリオンDNAの産生が観察され、これはNCH149細胞内で多量の感染性子孫ビリオンが産生及び遊離されたことを証明している。実際に、培地上清中への子孫ビリオンの遊離は、ゲルゾリン中和抗体の適用がこのプロセスを阻害したので、細胞ゲルゾリンの活性に左右される。子孫ビリオンの遊離に対するゲルゾリンへのこの依存性は、子孫ビリオンの細胞周縁への能動的小胞輸送が関与することを示しているBaretal2008。図2Aに生化学的分画後の一本鎖子孫ビリオンDNAのサザンブロッティングによって示したように、子孫H1-PV変異体粒子は、感染した細胞の小胞分画と強度に関連することが見いだされている。さらに、銀染色によりタンパク質含量を分析して非感染対感染NCH149細胞由来の小胞を比較することにより、多数のタンパク質がビリオン含有小胞分画と関連しているが、非感染細胞中では欠如することが確認された。これらのタンパク質の性質は、現在ではMS/MS分析によって決定される。そこで、NCH149細胞において許容性表現型を誘発するウイルス改変体の性質が確認された。初代のH1-PVpSR19はラットRG-2神経膠腫から産生したが、順応させたH1-PV変異体hgH1-PVはNCH149内で産生した。どちらのウイルスストックも、許容性NB324K細胞中でのプラークアッセイによって滴定した。感染は、NCH149細胞中で、感染多重度10で実施し、ウイルスタンパク質の産生はウエスタンブロッティングによる経時的実験において決定した。図3Aに示したように、小さな非構造タンパク質NS2及びNS3の発現レベルにおける顕著な相違が観察されたが、hgH1-PV由来のNS1はpSR19由来のNS1よりはるかに不均質であることが証明された。NS1は、ウイルス増幅中に多数のプロセスに必要とされ、差次的リン酸化によってその機能が調節される多機能リンタンパク質である。実際、図3Bに示したように、ラットRG-2細胞及びヒトNCH149細胞の感染後にpSR19から得られたNS1のリン酸化パターンが分析され、NCH149の感染後の2つの特徴的なペプチドの欠如丸で囲まれているが観察された。これとは対照的に、hgH1-PVはこれらのリンペプチド及び矢印でマーキングされた追加のペプチドを産生することができ、これはウエスタンブロッティングにより観察された移動パターンにおける相違を説明している。さらに、MVMNS1リン酸化パターンの詳細な機能分析は、NCH149内でのRG-2/hgH1-PVにおいてpSR19について観察されたものに酷似しており、2つの丸で囲まれたペプチドがNS1タンパク質の複製機能に関係する重要なリン酸化であることを示唆している。最後に、順応させたhgH1-PVストックを、pSR19単離体と比較して様々なヒト膠芽細胞腫培養を通した増殖及び伝播への順応度について試験した。図4に示したように、NCH149細胞に加えて、これまでに試験した全ての他のヒト膠芽細胞腫細胞系はhgH1-PVpSR19ではない子孫ウイルス粒子を増幅させることについて投与レベルより少なくとも10倍有能であることが証明され、そして培養を通した伝播についてpSR19より優れていることが証明された。ヒト神経膠腫順応H1-PVの遺伝的特性解析初代の接種pSR19と比較してNCH149内での継代中に獲得された遺伝的変異hgH1-PVを決定するために、エンドポイント滴定を実施して個々のウイルス変異体をプラーク精製し、ビリオンDNAを単離した。図5及び5bに示したように、6つの個々のプラークのDNAを入手し、全コーディング領域を3段階のPCRによって増幅させ、重複フラグメントをpCR2.1内にクローニングした。遺伝的変異は、配列決定によって決定し、pSR19の公表された配列目録番号NC_001358と比較した。個々のプラーク単離体上に存在することが見いだされたpSR19配列と比較した突然変異をH1-マップ上に示し、番号付けし、位置決めした。詳細な配列変異は、図6及び6Bに示した。個々のクローンの性質をさらに特徴付けるため、個々のプラーク単離体のウイルスストックを産生し、それらがラットRG-2細胞中で産生したpSR19と比較し、伝播及びヒト膠芽細胞腫細胞培養物を殺滅するための適応度を試験した。図7に示したように、NS1のC末端部分/NS2の中央エクソンにおける欠失変異体を内部に持つ全ての単離体はそれらが伝播してヒト膠芽細胞腫細胞を殺滅することについての順応度においてpSR19より優れており、プールされた変異体を用いた初期所見を確証し、欠失変異体が観察された宿主範囲スウィッチの原因であることを証明している。H1-PV感染野生型及びプラーク3が腫瘍増殖に及ぼす影響U87膠芽細胞腫細胞を1.5pfu/細胞のMOI感染多重度でエキソヴォヴォexvivo感染させた、又は感染させなかったWTH-1PV野生型、プラーク3プラーク3由来の順応H-1PV、偽未感染U87細胞。細胞を洗浄し、感染4時間後にPBS中に溶解させ、100μLのPBS中の2×106個の偽、又はH-1PV感染細胞を1群当たり8匹のマウスに皮下移植した。腫瘍サイズ長さ、幅、高さは、腫瘍細胞移植12日後から開始して週2回、ノギスcalliperを用いて機械的に測定した。容積は次のように、1/2×長さ×幅2で計算した。動物は、腹膜癌又は悪性腹水が見られる場合、最大2,500mm3の腫瘍サイズの時点で屠殺した。全生存動物は、細胞移植61日後に屠殺した。生存として示された1×WT、2×プラーク3。図9、9a及び9bでは、プラーク3の腫瘍阻害がH-1PV野生型を用いた場合より強度であることが図示された。さらに、プラーク3は、H-1PV野生型より多数の生存動物を生じさせた。参照文献リストRhodeSLIIIandParadisoPRParvovirusprocessingstrategiespp253274InParvovirusesEdsKerrJRCotmoreSFBloomMELindenRMandParrishCRHodderArnoldLondon"