大腸菌株KO11に対する以下の遺伝子改変を含む、遺伝子改変大腸菌株:aクレブシエラオキシトカcasAB遺伝子の、lacYの終止コドンの後への挿入;bエルウィニアクリサンテミcelY遺伝子のfrdA遺伝子への組み込み;cfocAZmobilispdcadhBpflBの不活性化または欠失;d天然の大腸菌アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の不活性化または欠失;およびeアセテートキナーゼ遺伝子の不活性化または欠失。不活性化または欠失した抗生物質耐性遺伝子をさらに含む、請求項1記載の遺伝子改変大腸菌株。クレブシエラオキシトカcasAB遺伝子およびエルウィニアクリサンテミcelY遺伝子が、遺伝子改変大腸菌株において挿入後に不活性化されているかまたは欠失している、請求項1記載の遺伝子改変大腸菌株。クレブシエラオキシトカcasAB遺伝子およびエルウィニアクリサンテミcelY遺伝子が、遺伝子改変大腸菌株において挿入後に不活性化されているかまたは欠失している、請求項2記載の遺伝子改変大腸菌株。代謝的に進化している、請求項2記載の遺伝子改変大腸菌株。代謝的に進化している、請求項3記載の遺伝子改変大腸菌株。代謝的に進化している、請求項4記載の遺伝子改変大腸菌株。抗生物質遺伝子がFLPリコンビナーゼにより欠失される、請求項1、2、3、4、5、6、または7記載の遺伝子改変大腸菌株。SZ186である、請求項7記載の遺伝子改変大腸菌株。SZ132である、請求項5記載の遺伝子改変大腸菌株。菌株のmgsA遺伝子が、遺伝子改変大腸菌株において不活性化されているかまたは欠失している、請求項1、2、3、4、または5記載の遺伝子改変大腸菌株。mgsA遺伝子が不活性化されているかまたは欠失している大腸菌株SZ194を含む、遺伝子改変大腸菌株。代謝的に進化している、請求項12記載の遺伝子改変大腸菌株。TG112、TG113、またはTG114である、請求項13記載の遺伝子改変大腸菌株。不活性化または欠失した天然のldhA遺伝子と、組換えによって挿入されたL特異的乳酸デヒドロゲナーゼをコードする異種遺伝子とをさらに含む、請求項11または12記載の遺伝子改変大腸菌株。L特異的乳酸デヒドロゲナーゼ異種遺伝子が、ldhL遺伝子から得たldhL遺伝子である、請求項15記載の遺伝子改変大腸菌株。代謝的に進化している、請求項15または請求項16記載の遺伝子改変大腸菌株。以下からなる群より選択される、遺伝子改変大腸菌株:SZ132;SZ186;SZ194;TG103;TG102;TG105;TG106;TG107;TG108;TG112;TG113;TG114;TG128;TG129;およびTG130。請求項1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、または18記載の一つまたは複数の遺伝子改変大腸菌株を培地に播種する段階、および遺伝子改変大腸菌株を培養または増殖する段階を含む、遺伝子改変大腸菌株の培養または増殖方法。D乳酸の生成を可能とし、任意でD乳酸を中和してDラクテートを形成することを可能にする条件下で、請求項1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、または14記載の一つまたは複数の遺伝子改変大腸菌株を培養する段階を含む、DラクテートまたはD乳酸の生成方法。一つまたは複数の遺伝子改変大腸菌株がTG112、TG113、TG114、またはSZ194から選択される、請求項20記載の方法。L乳酸の生成を可能とし、任意でL乳酸を中和してLラクテートを形成することを可能にする条件下で、請求項15、16、または17記載の一つまたは複数の遺伝子改変大腸菌株を培養する段階を含む、LラクテートまたはL乳酸の生成方法。一つまたは複数の遺伝子改変大腸菌株がTG103、TG105、TG106、TG107、またはTG108である、請求項22記載の方法。遺伝子改変大腸菌株が無機塩培地で培養される、請求項19、20、21、22、または23記載の方法。無機塩培地が2~20の間の糖を含む、請求項24記載の方法。無機塩培地が2、25、3、35、4、45、5、55、6、65、7、75、8、85、9、95、10、105、11、115、12、125、13、135、14、145、15、155、16、165、17、175、18、185、19、195、または20の糖を含む、請求項25記載の方法。糖が、グルコースまたはスクロースまたはグルコースとスクロースの組合せである、請求項25または26記載の方法。請求項11記載の遺伝子改変大腸菌株が、キラル的に純粋なDラクテートまたはD乳酸の生成を可能とする条件下で培養される、請求項20記載の方法。請求項15、16、または17記載の遺伝子改変大腸菌株が、キラル的に純粋なLラクテートまたはL乳酸の生成を可能とする条件下で培養される、請求項22記載の方法。キラル的に純粋なDラクテートまたはD乳酸を生成する、請求項21記載の方法。キラル的に純粋なLラクテートまたはL乳酸を生成する、請求項23記載の方法。キラル的に純粋なラクテートを精製する段階をさらに含む、請求項28、29、30、または31記載の方法。ラクテートが少なくとも05Mの濃度で生成される、請求項20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、または32記載の方法。培地が、化学的に定義された無機塩培地またはNBS無機塩培地である、請求項33記載の方法。乳酸の収量が少なくとも90である、請求項20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、または34記載の方法。収量が少なくとも90、905、91、915、92、925、93、935、94、945、95、955、96、965、97、975、98、985、または99である、請求項35記載の方法。他の立体異性形態を伴う乳酸もしくはラクテートの立体異性形態の検出可能な混入が1つもないか、または特定の立体異性体のキラル純度が少なくとも999である、請求項29、30、31、32、33、34、35、または36記載の方法。請求項1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、または18記載の一つまたは複数の遺伝子改変大腸菌株と、培地とを含む、組成物。本発明の目的は、乳酸生成に効果的な材料および方法を提供することである。本発明は、乳酸の生成に有用な新規な微生物を提供する。さらに、本発明は、任意の多数の宿主生物、好ましくは大腸菌を形質転換して、特定の遺伝子を発現およびまたは抑制し、宿主生物を発酵性の培地で培養すると乳酸が生成されるといった使用のための新規構築物を提供する。従って、本発明の材料および方法を用いて、宿主生物での乳酸生成を促進することができ、それによって食品および工業用途での使用のための乳酸の供給増加をもたらすことができる。特定の態様では、エタノール生成大腸菌K011の派生物がDラクテートの生成のために構築される。本発明の別の態様では、大腸菌はLラクテートの生成のために本発明に従って操作される。本発明に従って、競合経路をコードする遺伝子を欠失させることにより大腸菌K011に基づく新規生体触媒を調製し、続いてグルコースおよびまたはスクロースを発酵させる能力が改良された変異株を、増殖に基づいて選択する。本発明の操作された微生物は、好ましくはスクロースの利用のために天然の遺伝子を含む。本発明の特定の操作された大腸菌株は10グルコースまたはスクロースを発酵させて、発酵培養液によるが、約88~約95の範囲の代謝された糖に基づく収量で、発酵培養液1lあたり1モルを超えるDラクテートを生成することができる。本発明の他の操作された大腸菌株は、グルコースまたはスクロースを発酵させてLラクテートを生成することができる。本発明1は、大腸菌株KO11に対する以下の遺伝子改変を含む、遺伝子改変大腸菌株である:aクレブシエラオキシトカcasAB遺伝子の、lacYの終止コドンの後への挿入;bエルウィニアクリサンテミcelY遺伝子のfrdA遺伝子への組み込み;cfocAZmobilispdcadhBpflBの不活性化または欠失;d天然の大腸菌アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の不活性化または欠失;およびeアセテートキナーゼ遺伝子の不活性化または欠失。本発明2は、不活性化または欠失した抗生物質耐性遺伝子をさらに含む、本発明の遺伝子改変大腸菌株である。本発明3は、クレブシエラオキシトカcasAB遺伝子およびエルウィニアクリサンテミcelY遺伝子が、遺伝子改変大腸菌株において挿入後に不活性化されているかまたは欠失している、本発明の遺伝子改変大腸菌株である。本発明4は、クレブシエラオキシトカcasAB遺伝子およびエルウィニアクリサンテミcelY遺伝子が、遺伝子改変大腸菌株において挿入後に不活性化されているかまたは欠失している、本発明の遺伝子改変大腸菌株である。本発明5は、代謝的に進化している、本発明の遺伝子改変大腸菌株である。本発明6は、代謝的に進化している、本発明の遺伝子改変大腸菌株である。本発明7は、代謝的に進化している、本発明の遺伝子改変大腸菌株である。本発明8は、抗生物質遺伝子がFLPリコンビナーゼにより欠失される、本発明~のいずれか一発明の遺伝子改変大腸菌株である。本発明9は、SZ186である、本発明の遺伝子改変大腸菌株である。本発明10は、SZ132である、本発明の遺伝子改変大腸菌株である。本発明11は、菌株のmgsA遺伝子が、遺伝子改変大腸菌株において不活性化されているかまたは欠失している、本発明~のいずれか一発明の遺伝子改変大腸菌株である。本発明12は、mgsA遺伝子が不活性化されているかまたは欠失している大腸菌株SZ194を含む、遺伝子改変大腸菌株である。本発明13は、代謝的に進化している、本発明の遺伝子改変大腸菌株である。本発明14は、TG112、TG113、またはTG114である、本発明の遺伝子改変大腸菌株である。本発明15は、不活性化または欠失した天然のldhA遺伝子と、組換えによって挿入されたL特異的乳酸デヒドロゲナーゼをコードする異種遺伝子とをさらに含む、本発明またはの遺伝子改変大腸菌株である。本発明16は、L特異的乳酸デヒドロゲナーゼ異種遺伝子が、ldhL遺伝子から得たldhL遺伝子である、本発明の遺伝子改変大腸菌株である。本発明17は、代謝的に進化している、本発明またはの遺伝子改変大腸菌株である。本発明18は、以下からなる群より選択される、遺伝子改変大腸菌株である:SZ132;SZ186;SZ194;TG103;TG102;TG105;TG106;TG107;TG108;TG112;TG113;TG114;TG128;TG129;およびTG130。本発明19は、本発明~のいずれか一発明の一つまたは複数の遺伝子改変大腸菌株を培地に播種する段階、および遺伝子改変大腸菌株を培養または増殖する段階を含む、遺伝子改変大腸菌株の培養または増殖方法である。本発明20は、D乳酸の生成を可能とし、任意でD乳酸を中和してDラクテートを形成することを可能にする条件下で、本発明~のいずれか一発明の一つまたは複数の遺伝子改変大腸菌株を培養する段階を含む、DラクテートまたはD乳酸の生成方法である。本発明21は、一つまたは複数の遺伝子改変大腸菌株がTG112、TG113、TG114、またはSZ194から選択される、本発明の方法である。本発明22は、L乳酸の生成を可能とし、任意でL乳酸を中和してLラクテートを形成することを可能にする条件下で、本発明~のいずれか一発明の一つまたは複数の遺伝子改変大腸菌株を培養する段階を含む、LラクテートまたはL乳酸の生成方法である。本発明23は、一つまたは複数の遺伝子改変大腸菌株がTG103、TG105、TG106、TG107、またはTG108である、本発明の方法である。本発明24は、遺伝子改変大腸菌株が無機塩培地で培養される、本発明~のいずれか一発明の方法である。本発明25は、無機塩培地が2~20の間の糖を含む、本発明の方法である。本発明26は、無機塩培地が2、25、3、35、4、45、5、55、6、65、7、75、8、85、9、95、10、105、11、115、12、125、13、135、14、145、15、155、16、165、17、175、18、185、19、195、または20の糖を含む、本発明の方法である。本発明27は、糖が、グルコースまたはスクロースまたはグルコースとスクロースの組合せである、本発明またはの方法である。本発明28は、本発明の遺伝子改変大腸菌株が、キラル的に純粋なDラクテートまたはD乳酸の生成を可能とする条件下で培養される、本発明の方法である。本発明29は、本発明~のいずれか一発明の遺伝子改変大腸菌株が、キラル的に純粋なLラクテートまたはL乳酸の生成を可能とする条件下で培養される、本発明の方法である。本発明30は、キラル的に純粋なDラクテートまたはD乳酸を生成する、本発明の方法である。本発明31は、キラル的に純粋なLラクテートまたはL乳酸を生成する、本発明の方法である。本発明32は、キラル的に純粋なラクテートを精製する段階をさらに含む、本発明~のいずれか一発明の方法である。本発明33は、ラクテートが少なくとも05Mの濃度で生成される、本発明~のいずれか一発明の方法である。本発明34は、培地が、化学的に定義された無機塩培地またはNBS無機塩培地である、本発明の方法である。本発明35は、乳酸の収量が少なくとも90である、本発明~のいずれか一発明の方法である。本発明36は、収量が少なくとも90、905、91、915、92、925、93、935、94、945、95、955、96、965、97、975、98、985、または99である、本発明の方法である。本発明37は、他の立体異性形態を伴う乳酸もしくはラクテートの立体異性形態の検出可能な混入が1つもないか、または特定の立体異性体のキラル純度が少なくとも999である、本発明~のいずれか一発明の方法である。本発明38は、本発明~のいずれか一発明の、一つまたは複数の遺伝子改変大腸菌株と、培地とを含む、組成物である。本発明により、乳酸生成に効果的な材料および方法が提供された。本発明のさらなる利点は、以下の説明から容易に明らかとなる。本発明は、種々の発酵条件で増殖した場合に乳酸を生成する能力のある新規微生物を提供する。また、本発明は、このような微生物を操作するための方法、ならびに本発明の新規微生物を用いて効果的かつ安定して乳酸を生成するための方法を提供し、その結果グルコースまたはスクロースなどの比較的安価な原産物から乳酸が高い収量でもたらされる。乳酸という用語は、本出願では遊離酸または塩形態の2ヒドロキシプロピオン酸を指す。乳酸の塩形態は、中和剤、すなわち炭酸カルシウムまたは水酸化アンモニウムに関わらずラクテートと呼ばれる。本明細書において述べられるように、乳酸は、乳酸のいずれの立体異性形態乳酸またはD乳酸も指すことがある。ラクテートという用語は、ラクテートのいずれの立体異性形態ラクテートまたはDラクテートも指すことがある。本発明は、乳酸またはラクテートの単一の立体異性体を生成する微生物を提供する。本発明のいくつかの局面に従って生成される乳酸立体異性体またはラクテート立体異性体は、キラル的に純粋である。キラル的に純粋なという表現は、他の立体異性形態を伴う乳酸またはラクテートの立体異性形態の検出可能な混入が1つもないことを示す。メチルグリオキサル経路が欠失しているかまたは不活性化されている、本明細書において開示される遺伝子改変微生物は、キラル的に純粋なD乳酸またはL乳酸を生成することが可能である。本発明の特定の態様としては、本発明の操作された微生物を用いてL乳酸が生成される。本発明の別の態様では、本発明の操作された微生物を用いてD乳酸が生成される。一態様では、本発明は、グルコースおよびまたはスクロースの乳酸への変換を促進するために大腸菌を生体触媒として使用する。本発明に従って、種々の遺伝子を導入し、発現させることによって、微生物の代謝を改変することができる。本発明に従って、形質転換された微生物が種々の発酵条件で大量の乳酸を生成することができるように、種々の新規プラスミドを大腸菌に導入することができる。本発明の組換え型大腸菌は好ましくは、グルコースおよびまたはスクロースを含む培地で増殖させると、乳酸を安定して高い収量で生成するように、改変されている。本発明のプラスミドを含有する大腸菌宿主は、AgriculturalResearchServiceCultureCollectionに寄託した。アクセッション番号および寄託日は以下のとおりである。本培養物は、米国特許法施行規則114条および米国特許法122条の下で係属中の本特許出願が米国特許商標庁長官により認定されると決まるまで、培養物の利用を可能とすることを保証するという条件で寄託されている。本出願またはその後代物の対応する特許が申請される国において、この寄託物は、外国の特許法による要求に応じて利用可能である。しかし、寄託物が利用可能であるということが、行政措置により認可された特許権を侵害して本発明を実践する権利をなすものではないということは当然理解されるべきである。さらに、本寄託培養物は、微生物の寄託に関するブダペスト条約の規定に従って保存され、一般に公開される。すなわち培養物は、寄託物のサンプル提供の最も新しい要求から少なくとも5年間、またいずれにしても、寄託日から少なくとも30年間、または培養物の開示を公開しうる任意の特許が法的効力をもつ期間、生存可能かつ汚染のない状態を保つために必要なあらゆる配慮をもって保存される。寄託機関が要求を受けた時に寄託物の状態によりサンプルを提供することができない場合、寄託者は、寄託物を交換する責務を受け入れる。本寄託培養物の一般への利用可能性に関するあらゆる規制は、それらを開示する特許の認可に際して解除されることはない。本発明の一態様により、種々の培地で細胞増殖およびラクテート生成を促進するよう操作された大腸菌B菌株が提供される。一態様では、SZ132菌株を以下の段階により構築し、Dラクテートを生成することができる:セロビオース利用のためのクレブシエラオキシトカcasAB遺伝子をlacYの終止コドンの後ろへ組み込み、エンドグルカナーゼをコードするエルウィニアクリサンテミcelY遺伝子をfrdA遺伝子へ組み込むことによって、大腸菌K011から菌株LY52を構築する段階GeneticimprovementofEscherichiacoliforethanolproductionbychromosomalintegrationofZymomonasmobilisgenesencodingpyruvatedecarboxylaseandalcoholdehydrogenaseIIApplEnvironMicrobiol57893900Moniruzzamanetal1997ZhouandIngram1999;菌株SZ63を構築するために用いた大腸菌K12の特定の突然変異をLY52へ順次形質導入する段階ProductionofopticallypureDlacticacidinmineralsaltmediumbymetabolicallyengineeredEscherichiacoliW3110ApplEnvironMicrobiol69399407菌株SZ31由来のΔfocApflB欠失のP1形質導入により、エタノール生成のためのZモビリス遺伝子を排除する段階菌株TC20由来のadhE突然変異のP1形質導入によって、天然の大腸菌アルコールデヒドロゲナーゼ生成を不活性化する段階菌株SZ61由来の突然変異を用いてアセテートキナーゼを欠失させる段階選択に用いた抗生物質遺伝子をFLPリコンビナーゼによって取り除く段階ならびに段階の抗生物質遺伝子を取り除く間にcasABの内部セグメントを欠失させる段階。本発明の関連する態様は、菌株SZ132を形質転換して全ての外来遺伝子を取り除く段階をさらに含む。一態様では、クレブシエラオキシトカcasABおよびエルウィニアクリサンテミcelY遺伝子を、直鎖DNAを用いる相同組換えによって菌株SZ132から欠失させ、次に菌株SZ132の構築の際に用いた抗生物質遺伝子を、FLPリコンビナーゼを用いて排除した。生じた菌株SZ186は、天然の大腸菌遺伝子だけを含む。本発明の別の態様においては、種々の培地において細胞増殖および乳酸のL異性体の生成を促進するよう操作された大腸菌B菌株が提供される。一態様では、TG103菌株は、以下の段階によって構築することができる:本明細書において記載されるような方法を用いて菌株SZ186を操作する段階;増殖の増大およびまたは乳酸生成の増加を選択するために菌株SZ186を連続的な培養に供する段階;異種のL乳酸遺伝子およびカナマイシンマーカーをSZ194の天然のldhA遺伝子へ組み込み、コード領域の中央部分を欠失させてTG101を作製する段階;抗生物質遺伝子をFLPリコンビナーゼにより取り除いてTG102を作製する段階;ならびに予め播種しておいた培養物から毎日、1100に希釈した培養液を用いて菌株TG102を数日間の連続的な植継ぎに供し、増殖の改良およびまたはL乳酸生成の増加を示す菌株を選択する段階。本発明の特定の態様によれば、増殖の増加と乳酸生成の増加には関連がある。増殖および乳酸生成の改良された菌株の同時選択プロセスを代謝の進化と呼ぶ。また、本発明の特定の態様は、本出願により提供される遺伝子改変生物内の特定の遺伝子の不活性化または欠失を提供する。本発明の一局面では、遺伝子は、所望の活性を不活性化させるために欠失させる。機能を回復させるための逆突然変異の機会がないので、欠失によって最大の安定性が提供される。または、遺伝子の機能およびまたは発現を乱す核酸配列の挿入により遺伝子を不活性化することができる。本明細書において論じられるように一つまたは複数の特定のポリヌクレオチド配列の不活性化または欠失は、遺伝子の改変と呼ぶこともある。特定の遺伝子を宿主微生物へ導入するために用いられるベクターは、宿主微生物において複製可能であるかぎり、いかなるベクターであってもよい。本発明のベクターは、選択された宿主細胞においてクローニングベクターまたは発現ベクターとして作動可能であり得る。多数のベクターが当業者に公知であり、適切なベクターおよび宿主細胞の選択は、選定の問題である。ベクターは、例えば、バクテリオファージ、プラスミド、ウイルス、またはそのハイブリッド型、例えばManiatisTetalMolecularCloningALaboratoryManualColdSpringsHarborLaboratoryAusubelFMetalCurrentProtocolsinMolecularBiologyJohnWileySonsIncMillerJHAshortcourseinbacterialgeneticsAlaboratorymanualandhandbookforEscherichiacoliandrelatedbacteriaColdSpringHarborPressSambrookJandRussellDWMolecularcloningAlaboratorymanualColdSpringHarborPressに記載のものなどであってもよい。さらに、本発明のベクターは非融合ベクターまたは融合ベクターであってもよい。各特定のベクター内では、種々の部位が関心対象の核酸配列の挿入のために選択され得る。これらの部位は通常それを切断する制限酵素またはエンドヌクレアーゼによって指定される。ベクターは、遺伝子の末端配列に適合する制限酵素で消化することができ、配列を連結できる。連結は通常T4DNAリガーゼなどのリガーゼを用いることによって達成される。組換えベクターを形成する際、選択したヌクレオチド断片のベクターへの挿入用に選定される特定の部位は、種々の要因によって決まる。これらには、発現させるポリペプチドのサイズおよび構造、宿主細胞成分およびそのタンパク質の混入による酵素分解に対する所望のポリペプチドの感受性、開始コドンおよび終止コドンの位置などの発現特性、ならびに当業者の認識する他の要因が挙げられる。これらの要因はどれも単独では全く特定のポリペプチドの挿入部位の選択を制御しない。それどころか、これらの要因のバランスを選定部位は反映するので、全ての部位が所与のタンパク質に対して等しく効果的であるとは限らない。種々のベクター宿主細胞発現系を本発明の実践に用いることができる。細菌の菌株、例えば大腸菌は、本発明の実践に際して乳酸の生成に特に有用である。しかし、本明細書に記載される新規な発明は、種々の乳酸生成スキームに望ましい多数の宿主を用いて適用され得る。宿主菌株は、細菌、菌類または酵母起源であってよい。宿主菌株を選択する際に考慮され得る要素としては、基質範囲、耐久力、糖耐性、塩耐性、温度耐性、pH耐性、およびラクテート耐性が挙げられる。最も適切な宿主ベクター系を確認することは、当業者の技術の範囲内にある。染色体欠失、組み込み、および除去可能な抗生物質耐性遺伝子のための方法は既に記載されているEngineeringEscherichiacoliforefficientconversionofglucosetopyruvateProcNatlAcadSciUSA10122352240DatsenkoKAWannerBLOnestepinactivationofchromosomalgenesinEscherichiacoliK12usingPCRproductsProcNatlAcadSciUSA9766406645MartinezMoralesFetalChromosomalintegrationofheterologousDNAinEscherichiacoliwithpreciseremovalofmarkersandrepliconsduringconstructionJBacteriol18171437148Zhouetal2003。このような公知の方法の任意の1つまたはそれらの組合せを本発明の実践に用いてよい。プロモーターが宿主細胞において遺伝子機能に特異的な場合、宿主微生物に存在する、遺伝子の発現のためのプロモーターとして、このプロモーターを使用できる。または、プロモーターの制御下で発現を得るために、外来プロモーターを、遺伝子をコードするDNAと連結させることも可能である。エシェリキア属の細菌を宿主として用いる場合、このようなプロモーターとして、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、tacプロモーター、λファージのPRプロモーターおよびPLプロモーター、tetプロモーター、amyEプロモーター、spacプロモーターなどが使用できる。さらに、断片をプロモーターの制御下で発現させるために、pUC19のようにプロモーターを含有する発現ベクターを用いて、例えばKオキシトカcasABをコードするDNA断片をベクターへ挿入することも可能である。染色体DNAの調製、PCR、プラスミドDNAの調製、DNAの消化および連結、形質転換、プライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドの設計および合成などのための方法は、当業者に周知の通常の方法であってよい。このような方法は、例えば、SambrookJetalMolecularCloningALaboratoryManualSecondEditionColdSpringHarborLaboratoryPressなどに記載されている。乳酸は、上記のように形質転換された微生物によってグルコースおよびまたはスクロースを乳酸へ変え、生成された乳酸を回収することにより生成することができる。本発明の一局面では、形質転換された生物が無機塩培地、例えばNBS無機塩培地で培養される場合に、05Mを上回るレベルで乳酸が生成され得る。本発明のベクターは、自己複製させても、または宿主のゲノムに組み込んでもよい。組み込みは、一般に相同組換えによって、またはベクター上のいかなる遺伝子とも無関係の染色体の部位で起こる。組み込みは、単一かまたは二重のクロスオーバー事象によって起こり得る。また、構築された同じ微生物で起こるこれらの組み込みおよび複製については多数有することも可能である。特定の態様では、本発明の操作された微生物の培養は、約05~240時間、好気性条件下で行われる。培養の間、培養温度は好ましくは約25°C~45°Cに調整され、pHは好ましくは、5~8に調整される。pH調整には無機もしくは有機の、酸性基質またはアルカリ性基質、ならびにアンモニアガスなどを用いることができる。本発明の微生物は、乳酸の生成に有用な特定の酵素を発現するためエシェリキア属に属する細菌を形質転換することによって得ることができる。好ましい実施態様では、本発明で使用され得るエシェリキア属に属する細菌は、大腸菌である。本発明の他の態様では、本発明で使用され得る細菌としては、限定されるものではないが、グルコノバクターオキシダンス、グルコノバクターアサイイ、アクロモバクターデルマルバ、アクロモバクタービスコサス、アクロモバクターラクチカム、アグロバクテリウムツメファシエンス、アグロバクテリウムラジオバクター、アルカリゲネスフェカーリス、アルスロバクターシトレウス、アルスロバクターツメセンス、アルスロバクターパラフィネウス、アルスロバクターヒドロカーボグルタミクス、アルスロバクターオキシダンス、オーレオバクテリウムサペルダエ、アゾトバクターインディカス、ブレビバクレリウムアンモニアゲネス、ブレビバクテリウムディバリカツム、ブレビバクテリウムラクトフェルメンタム、ブレビバクテリウムフラバム、ブレビバクテリウムグロボサム、ブレビバクテリウムフスカム、ブレビバクテリウムケトグルタミカム、ブレビバクテリウムヘルコルム、ブレビバクテリウムプシルム、ブレビバクテリウムテスタアセウム、ブレビバクテリウムロゼウム、ブレビバクテリウムインマリオフィラム、ブレビバクテリウムリネンス、ブレビバクテリウムプロトファルミエ、コリネバクテリウムアセトフィラム、コリネバクテリウムグルタミカム、コリネバクテリウムカルナエ、コリネバクテリウムアセトアシドフィラム、コリネバクテリウムアセトグルタミカム、エンテロバクターアエロゲネス、エルウィニアアミロボーラ、エルウィニアカロトボーラ、エルウィニアヘルビコーラ、エルウィニアクリサンテミ、フラボバクテリウムペレグリナム、フラボバクテリウムフカタム、フラボバクテリウムアウランティナム、フラボバクテリウムレナヌム、フラボバクテリウムセワネンセ、フラボバクテリウムブレベ、フラボバクテリウムメニンゴセプティカム、ミクロコッカス属種CCM825、モルガネラモルガニイ、ノカルディアオパカ、ノカルディアルゴーサ、プラノコッカスユーシナタス、プロテウスレッゲリ、プロピオニバクテリウムシャーマニイ、シュードモナスシンキサンタ、シュードモナスアゾトフォルマンス、シュードモナスフルオレッセンス、シュードモナスオバリス、シュードモナススタッツェリ、シュードモナスアシドボランス、シュードモナスムシドレンス、シュードモナステストステロニ、シュードモナスエルジノーサ、ロドコッカスエリスロポリス、ロドコッカスロドクラウス、ロドコッカス属種ATCC15592、ロドコッカス属種ATCC19070、スポロサルシナウレエ、スタフィロコッカスアウレウス、ビブリオメチニコフィイ、ビブリオチロゲネス、アクチノマヅラマヅレ、アクチノマイセスビオラセオクロモゲネス、キタサトスポリアパルロサ、ストレプトマイセスコエリコロル、ストレプトマイセスフラベラス、ストレプトマイセスグリセオラス、ストレプトマイセスリビダンス、ストレプトマイセスオリバセウス、ストレプトマイセスタナシエンシス、ストレプトマイセスバージニエ、ストレプトマイセスアンチバイオチクス、ストレプトマイセスカカオイ、ストレプトマイセスラベンジュレ、ストレプトマイセスビリドクロモゲネス、アエロモナスサルモニシダ、バシラスプミルス、バシラスサーキュランス、バシラスチアミノリティカス、エシェリキアフロインディイ、ミクロバクテリウムアンモニアフィラム、セラチアマルセッセンス、サルモネラチフィムリウム、サルモネラショットムレリ、ザントモナスシトリなどが挙げられる。乳酸は、本発明に従って調製された形質転換微生物を含有する培養物を、スクロースおよびまたはグルコースと接触させることによって、反応混合物中に生成され得る。本発明の他の態様では、形質転換微生物の培養物から分離および回収された細胞;アセトン処理または凍結乾燥に供した、処理済みの形質転換微生物細胞;このような形質転換微生物細胞または処理済みの細胞から調製される細胞不含抽出物;このような細胞不含抽出物から分画された膜画分などの画分;あるいは形質転換微生物細胞、処理済みの細胞、細胞不含抽出物および画分を固定することにより作製できる固定された物質;以上のいずれかを独立にまたは組み合わせてスクロースおよびまたはグルコースと接触させて乳酸を生成する。微生物は、1種類の微生物からなっていてもよく、2種類以上の微生物の任意の混合物として用いられてもよい。発酵パラメータは、組換え酵素の生成に用いられる宿主生物の種類に依存する。増殖培地は、最少培地定義された培地または完全培地複合培地であってよい。発酵性の炭素源としては、六炭糖および五炭糖、デンプン、セルロース、キシラン、オリゴ糖、およびその組合せを挙げることができる。本発明に従って使用できる培地の一形態としては、MillerJHに記載されるように、改変されたLuriaBertani培地が挙げられる。本発明の他の態様では、本発明の構築した菌株の培養物は、NBS無機塩培地で増殖させてもよく、2~20の糖あるいは5かまたは10いずれかの糖を補給してもよい。微生物はNBS無機塩培地中またはNBS無機塩培地上で培養することができる。NBS無機塩培地は、以下の成分を含むか、本質的に以下の成分からなるか、または以下の成分からなる:KH2PO435g;K2HPO450g;2HPO435g;MgSO47H2O025g;CaCl22H2O15mg;チアミン05mg;および微量金属保存液1ml、グルコース、および15寒天。微量金属保存液は01MHCl中に調製され、以下を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる:FeCl316g;CoCl26H2O02g;CuCl201gZnCl24H2O02g;NaMoO402g;H3BO3005g。pH調整が必要な場合は、4モルホリノプロパンスルホン酸を液体培地と固体培地の双方に加えることができる。また、最少培地は、スクシネートを唯一の炭素源に用いて調製することができ、必要であればグルコース最少培地への補充として加えることができる。特定の態様では、菌株構築の必要に応じて抗生物質を含めることができる。増殖およびラクテートの生成は、通常のバッチ発酵、流加発酵または連続発酵で実施することができる。特定の態様では、特定の宿主のための低酸素または嫌気性条件下で発酵を行うのが望ましい。他の態様では、ラクテート生成は、酸素とともに;および任意で、エアリフト発酵槽または同等の発酵槽を用いて実施することができる。発酵のpHは、宿主が増殖およびラクテート生成ができるように十分高くあるべきである。発酵培養液のpHの調整は、炭酸カルシウムまたは水酸化カルシウムなどの中和剤を用いて行ってよい。または膜技術、電気透析、溶媒抽出、および吸収性樹脂などの方法を用いて発酵の間に乳酸を継続的に取り出すことができる。任意の前記発酵法の選択および組み込みは、宿主菌株および好ましい後続処理に高度に依存する。本発明の種々の限定されない態様としては、以下が含まれる:1大腸菌株KO11に対する以下の遺伝子改変を含む、遺伝子改変大腸菌株:aクレブシエラオキシトカcasAB遺伝子の、lacYの終止コドンの後への挿入;bエルウィニアクリサンテミcelY遺伝子の、frdA遺伝子への組み込み;cfocAZmobilispdcadhBpflBの不活性化または欠失;d天然の大腸菌アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の不活性化または欠失;およびeアセテートキナーゼ遺伝子の不活性化または欠失;2不活性化または欠失した抗生物質耐性遺伝子をさらに含む、態様の遺伝子改変大腸菌株;3クレブシエラオキシトカcasAB遺伝子およびエルウィニアクリサンテミcelY遺伝子が、遺伝子改変大腸菌株において挿入後に不活性化されているかまたは欠失している、態様の遺伝子改変大腸菌株;4クレブシエラオキシトカcasAB遺伝子およびエルウィニアクリサンテミcelY遺伝子が、遺伝子改変大腸菌株において挿入後に不活性化されているかまたは欠失している、態様の遺伝子改変大腸菌株;5代謝的に進化している、態様の遺伝子改変大腸菌株;6代謝的に進化している、態様またはの遺伝子改変大腸菌株;7代謝的に進化している、態様の遺伝子改変大腸菌株;8抗生物質遺伝子がFLPリコンビナーゼにより欠失される、態様、、、、、、またはの遺伝子改変大腸菌株;9SZ186である、態様の遺伝子改変大腸菌株;10SZ132である、態様の遺伝子改変大腸菌株;11菌株のmgsA遺伝子が、遺伝子改変大腸菌株において不活性化されているかまたは欠失している、態様、、、、またはの遺伝子改変大腸菌株;12mgsA遺伝子が不活性化されているかまたは欠失している大腸菌株SZ194を含む、遺伝子改変大腸菌株;13代謝的に進化している、態様の遺伝子改変大腸菌株;14TG112、TG113、またはTG114である、態様の遺伝子改変大腸菌株;15不活性化または欠損した天然のldhA遺伝子と、組換えによって挿入されたL特異的乳酸デヒドロゲナーゼをコードする異種遺伝子とをさらに含む、態様またはの遺伝子改変大腸菌株;16L特異的乳酸デヒドロゲナーゼ異種遺伝子が、ldhL遺伝子から得たldhL遺伝子である、態様の遺伝子改変大腸菌株;17代謝的に進化している、態様またはの遺伝子改変大腸菌株;18TG112、TG113またはTG114、SZ194、SZ132、SZ186、またはTG103から選択される、遺伝子改変大腸菌株;19態様、、、、、、、、、、、、、、、、、またはの一つまたは複数の遺伝子改変大腸菌株を培地に播種する段階、および遺伝子改変大腸菌株を培養または増殖する段階を含む、遺伝子改変大腸菌株の培養または増殖方法;20D乳酸の生成を可能とし、任意でD乳酸を中和してDラクテートを形成することを可能にする条件下で、態様、、、、、、、、、、、、、またはの一つまたは複数の遺伝子改変大腸菌株を培養する段階を含む、DラクテートまたはD乳酸の生成方法;21一つまたは複数の遺伝子改変大腸菌株がTG112、TG113、TG114、またはSZ194から選択される、態様の方法;22L乳酸の生成を可能とし、任意でL乳酸を中和してLラクテートを形成することを可能にする条件下で、態様、、またはの一つまたは複数の遺伝子改変大腸菌株を培養する段階を含む、LラクテートまたはL乳酸の生成方法;23一つまたは複数の遺伝子改変大腸菌株がTG103、TG105、TG106、TG107、またはTG108である、態様の方法;24遺伝子改変大腸菌株が無機塩培地で培養される、態様、、、、またはの方法;25無機塩培地が2~20の間の糖を含む、態様の方法;26無機塩培地が2、25、3、35、4、45、5、55、6、65、7、75、8、85、9、95、10、105、11、115、12、125、13、135、14、145、15、155、16、165、17、175、18、185、19、195、または20の糖を含む、態様の方法;27糖が、グルコースまたはスクロースまたはグルコースとスクロースの組合せである、態様またはの方法;28態様の遺伝子改変大腸菌株が、キラル的に純粋なDラクテートまたはD乳酸の生成を可能とする条件下で培養される、態様の方法;29態様、、またはの遺伝子改変大腸菌株が、キラル的に純粋なLラクテートまたはL乳酸の生成を可能とする条件下で培養される、態様の方法;30キラル的に純粋なDラクテートまたはD乳酸を生成する、態様の方法;31キラル的に純粋なLラクテートまたはL乳酸を生成する、態様の方法;32キラル的に純粋なラクテートラクテートまたはDラクテートを精製する段階をさらに含む、態様、、、またはの方法;33ラクテートラクテートまたはDラクテートが少なくとも05Mの濃度で生成される、態様、、、、、、、、、、、、またはの方法;34培地が、NBS無機塩培地などの化学的に定義された無機塩培地である、態様の方法;35乳酸乳酸またはD乳酸の収量が少なくとも90であるか、または90を上回る、態様、、、、、、、、、、、、、、またはの方法;36収量が少なくとも90、905、91、915、92、925、93、935、94、945、95、955、96、965、97、975、98、985、または99である、態様の方法;37他の立体異性形態を伴う乳酸もしくはラクテートの立体異性形態の検出可能な混入が1つもない、態様、、、、、、、またはの方法;38態様、、、、、、、、、、、、、、、、、またはの、一つまたは複数の遺伝子改変大腸菌株と、培地とを含む、組成物。以下の実施例は本発明の実践のための手順を説明する。これらの実施例は制限的なものであると解釈されるべきではない。特別の定めのない限り、全てのパーセンテージは重量パーセンテージであり、全ての溶媒混合物の比は容量比である。実施例1大腸菌株SZ132およびSZ186の調製および分析本実施例で用いられる大腸菌株を表1に列挙する。菌株SZ63は大腸菌K12の派生物である。KO11は、pflB遺伝子へ組み込まれたザイモモナスモビリスエタノール生成遺伝子を含む大腸菌Bの派生物である。表1大腸菌株培養物を、改変されたLuriaBertani培養液中で、あるいは、5かまたは10の糖を補給したNBS無機塩培地中で37°Cにて増殖した。菌株構築の必要性に応じて抗生物質を含めた。標準法をプラスミド構築に用いた。染色体欠失、組み込み、および除去可能な抗生物質耐性遺伝子のための方法は既に記載されている。菌株大腸菌DH5αおよびS171をプラスミド構築の宿主として用いた。菌株NC3を中間体宿主として用いて、K12菌株からB菌株へのP1形質導入間の制限酵素に関連する問題を最小限にした。ShuklaらおよびZhouらに既に記載されているように種培養を調製し、小さな発酵容器への播種に用いた。6NKOHを自動的に添加して培養液をpH70で維持した。グラフ表示されたデータは2回以上の複製の平均を表す。平均値の標準誤差を表すバーには3回以上の発酵の平均が含まれる。ラクテートの最大容量生産性を、各グラフの最も急な領域から評価した。種培養の増殖の間または発酵培養液中には抗生物質を含めなかった。550nmでの光学濃度を測定することによって細胞量を評価した。有機酸の総生成量を塩基消費により測定した。発酵の最後に酸性生成物を高速液体クロマトグラフィーによって分析した。ガスクロマトグラフィーによってエタノールを測定した。菌株SZ132の構築セロビオースの利用のためのクレブシエラオキシトカcasAB遺伝子をlacYの終止コドンの後ろへ組み込むこと、およびエンドグルカナーゼをコードするエルウィニアクリサンテミcelY遺伝子をfrdA遺伝子へ組み込むことによってKO11から菌株LY52を構築した。ラクテート生成のためのSZ63を構築するために用いた、既に特徴付けられた大腸菌K12の突然変異を順次LY52へ形質導入した。エタノール生成のためのZモビリス遺伝子を、SZ31由来のΔfocApflB欠失のP1形質導入により排除した。TC20由来のadhE突然変異のP1形質導入により天然の大腸菌アルコールデヒドロゲナーゼを不活性化した。SZ61における突然変異を用いてアセテートキナーゼを欠失させた。選択に用いた抗生物質遺伝子をFLPリコンビナーゼにより取り除いた。FLPリコンビナーゼでの抗生物質遺伝子の除去の際に、casABの内部セグメントも欠失させた。casABおよびプロモーターの配列解析によりFLPリコンビナーゼの認識部位に非常によく似たDNA領域の存在が明らかとなり、この欠失の原因であると推定される。1の接種物で順次継代培養することによって、生じた菌株を最少培地に順応させた。これらの植継ぎの間に、細胞増殖とラクテート生成の双方が改良された。最終植継ぎからの培養液を、クローンの単離のために固形培地に塗布した。1つを選択し、SZ132と命名した。菌株SZ186の構築全ての外来遺伝子を取り除いた、SZ132のさらなる派生物を構築した。KオキシトカcasABおよびEクリサンテミcelY遺伝子を、直鎖DNAを用いる相同組換えによって欠失させた。構築の間に、FLPリコンビナーゼを用いて、用いた抗生物質遺伝子を排除した。生じた菌株SZ186は天然の大腸菌遺伝子のみを含む。乳酸生成の分析類似の遺伝子突然変異体を大腸菌K12および大腸菌Bの派生物に構築して、それぞれSZ63およびSZ132を作製した。細胞増殖およびラクテート生成に関して、SZ132がSZ63より優れていた。富栄養培地において、SZ132は10グルコースの発酵を48時間で完了してラクテート1モルlを超える発酵培養液を生成し、これは大腸菌K12に基づく菌株について以前報告されたものの2倍であった。SZ63および10グルコースを用いる発酵は72時間後に失速し、120時間後にわずかラクテート840ミリモルlの培養液しか生成しなかった。富栄養培地において、ラクテートの収量は、SZ132のほうがK12菌株SZ63のものより高かった。SZ132の最大容量生産性は75ミリモルl時間であり、SZ63のものより76高かった。表2乳酸発酵の概要5グルコースを含有するNBS無機塩培地において、SZ132の細胞収量および容量生産性はSZ63の2倍であった。菌株SZ132は5グルコースの発酵を36時間以内に完了したが、これはSZ63の要した時間の14未満である。これらの条件下で、NBS無機塩培地での発酵の細胞収量および容量生産性は、富栄養培地および10グルコースでの発酵のわずか25~35であった。菌株SZ132もSZ63もNBS無機塩培地において10グルコースの発酵を144時間以内に完了しなかった。双方の菌株のラクテート収量は、代謝された糖を基準として90を超えた。10グルコースを含有するNBS無機塩培地で、SZ132の細胞収量、ラクテート生成、および容量生産性は、SZ63のものよりも約2倍高かった。NBS無機塩培地および10グルコースでは、SZ132の容量生産性は富栄養培地で観察されたものの20未満であった。スクロースは、富栄養培地において、またNBS無機塩培地においてグルコースよりもゆっくり発酵した。これまでの研究から、SZ63は富栄養培地において5スクロースの発酵を完了するのに36時間を要することが示されているが、この培地では10スクロースの発酵を完了することができなかった。SZ132は富栄養培地において10スクロースの発酵を120時間以内に完了し、ラクテート1モルlを超える発酵培養液を生成した、これはスクロースプラスミドを擁するSZ63に関して既に報告されているもののほぼ2倍である。10スクロースを含有するNBS無機塩培地におけるSZ132の容量生産性は、スクロースを含む富栄養培地において観察されたものの13であり、10グルコースを含有する富栄養培地において観察されたものの18未満であった。5スクロースはNBS無機塩培地において72時間以内に完全に発酵したが、10スクロースは培養時間を延ばしてもこの培地において完全には代謝されなかった。代謝された糖を基準にして、スクロースの収量は双方の培地で86~93の範囲であった。これらの結果は、改変された大腸菌Bの菌株によって、グルコースおよびまたはスクロースから高レベルの有機酸を生成することができることを実証する。富栄養培地における最大容量生産性はラクテート75ミリモルl時間と推定された、これはNBS無機塩培地での推定値より3倍以上高かった。改良のための余地は多く残っている。10スクロースの代謝を完了するために必要とされる培養時間は、複合培地における10グルコースに関するものより3倍長く、無機塩培地におけるよりものよりさらに長い。費用のかかる複合栄養の添加をせずに発酵時間を減少させることが不可欠であろう。増殖および生産性を増加させる構成成分を同定することが、発酵に関連する費用を実質的に削減し、また、ラクテート精製および廃棄物処理に関連する支出を削減する機会ももたらすであろう。図2~5は、種々の態様、すなわちNBS無機塩培地における、種々の発酵条件下での本発明のSZ132、SZ186、およびSZ194による、乳酸生成の進行を説明する。実施例2大腸菌株SZ194の調製菌株SZ194の調製に用いた菌株およびプラスミドを表3に列挙する。培養物を、改変Luria培養液において、またはベタイン1mMおよび2~14の糖を補給したNBS無機塩培地において、37°Cにて増殖させた。必要な場合、アンピシリンおよびカナマイシンを菌株構築に用いた。表3大腸菌株およびプラスミドDNA増幅、酵素消化、精製およびプラスミド構築に標準的な方法を用いた。染色体遺伝子欠失および組み込みのための方法は既に記載されているProductionsofopticallypureDlacticacidinmineralsaltmediumbymetabolicallyengineeredEscherichiacoliDlactatedehydrogenasegenewiththeLlactatedehydrogenasegenefromPediococcusacidilacticiApplEnvironMicrobiol6922372244。プラスミドpLOI3924を構築して、lacYおよびlacA遺伝子をORFmersを用いてクローニングすること、ならびにpLOI2511由来のFRTkanFRTカセットをlacYのカルボキシ末端のNdeI部位とlacAのN末端ATGとの間に挿入することによりcasAB遺伝子の欠失を促進した。このプラスミド由来の増幅された断片を染色体の組み込みに用い、casAB遺伝子を欠失させた。さらなる遺伝子欠失に用いた、標的遺伝子の先頭または終端の約45塩基対に対応する配列に加えてFRTに隣接するカナマイシンカセットに対応する20塩基対のDNA配列を含めたハイブリッドプライマーを表4に記載する。表4プライマー特に定めない限り、1mMベタインおよび10の糖を含有するNBS無機塩培地を全ての発酵に用いた。種培養を、既に記載されているように調製し、500ml発酵容器の播種に用いて初期密度を33mgcdwl1とした。指示されている場合は、ベタインも加えた。培養液のpHを6NKOHの自動的な添加によって維持した。合計12のグルコースを、次のとおり流加発酵に用いた:21グラムのグルコースを含む308mlのNBS培地。24時間後および48時間後、21mlの50グルコースを各容器へ徐々に加えた。pH調整された発酵による細胞を、様々な時間で連続的に植え継ぎし、増殖に基づく選択を通じて代謝の進化を促進した。順次移された培養物を初期密度33mgcdwl1にて播種した。選択の最後に単離されたクローンに新規な菌株名を与えた。BauschLombSpectronic70分光光度計を用いて550nmにて光学濃度を測定することにより細胞量を評価した。総有機酸生成量を、pHの維持のための塩基消費によって評価した。酸性生成物およびキラル純度を、発酵の最後に高速液体クロマトグラフィーによって分析した。グラフ表示されたデータは2回以上の複製の平均を表す。標準偏差を表すバーには3回以上の発酵の平均が含まれる。乳酸生成量の分析保護性のあるオスモライトであるベタインは、高い糖濃度を含有する無機塩培地におけるSZ132による細胞増殖およびラクテート生成に非常に有益であったが、これはおそらくグルタミン酸塩およびトレハロースなどの天然のオスモライトの生合成への不十分な炭素の分割に起因すると思われるEnhancedtrehaloseproductionimprovesgrowthofEscherichiacoliunderosmoticstressApplEnvironMicrobiol7137613769。10スクロースを含有する無機塩培地でSZ132を連続的に植え継ぎし、ベタインの不在下で同等の能力を有する菌株を選択した。菌株SZ132における増殖のためのエネルギー生成は、NADH酸化の主要経路としてラクテートを含む解糖流量に依存しているので、増殖を基準とした選択をもたらす。増殖および酸生成は連続的な植継ぎの間に着実に改良された。最終の植継ぎにおいて、ベタインを添加せずに10スクロースを完全に発酵させた。この培養液からクローンを単離し、菌株SZ136と命名した。この菌株は96時間後に、親株SZ132の細胞収量の2倍量の、かつ3倍高力価のラクテートを生成した。SZ136はまた、SZ132よりも高レベルのスクシネートおよびエタノールを生成し、ラクテートの収量を低下させた。表5グルコース発酵からの生成物a特に定めない限り10グルコースを含有するNBS無機塩培地。指示されている場合、1mMベタインも添加された。b収量は、最大理論収量を六炭糖1モルあたりラクテート2モルと仮定し、代謝された糖に基づく。10スクロースに関するSZ132における増殖の改良は、増殖を改良したが副生成物経路のための突然変異遺伝子の機能を部分的に回復させもした、突然変異に伴って起こったように思われる。菌株SZ132におけるフマル酸レダクターゼ突然変異はあまり特徴がなく、当初はTn5欠失として、その後frdAとfrdBとの間へのcelYの挿入Fermentationof10sugartoDlactatebyengineeredEscherichiacoliBBiotechnolLett2718911896により得られたものであった。FRT部位が隣接する抗生物質マーカーの挿入によってアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を阻害した。次に、フリッパーゼを用いて抗生物質遺伝子を除去してFRT領域のみを残した。SZ162を作製するためのfrdBCおよびadhEのためのコード領域のさらなる欠失は、双方の副生成物を排除したが、不完全な糖利用による増殖および最終のラクテート力価を低下させた。この菌株にさらなる欠失も作り出し、セルロース利用のために既に組み込まれていた外来遺伝子:クレブシエラオキシトカ由来のcasABおよびエルウィニアクリサンテミ由来のcelYを排除した。生じた菌株SZ186は、ごく少量のレベルの副生成物を生成したが、ベタインを含むまたは含まない無機塩培地において10の糖を完全に利用することができなかった。しかし、代謝された糖に基づく収量はSZ162とSZ186の双方で高かった。副生成物経路を排除したSZ136における欠失も、細胞収量をほぼ半分減少させ、生合成への炭素の分割に悪影響を及ぼした。代謝の進化を用いて、1mMベタインおよび10グルコースの存在下で、増殖および発酵性能の双方が改良されたSZ186の派生物を同時選択した。細胞収量および有機酸生成量は選択の初期段階の間に同時に増加した。単一のクローンを最後の増菌より単離し、SZ194と命名した。菌株SZ194はSZ186よりも急速に増殖し、高い細胞収量に達した。最大900mMのラクテート濃度がいくつかの発酵でSZ194により生成され、一貫してSZ186のものよりも高かった。双方の菌株は、最小の副生成物で理論収量に近い量でグルコースよりラクテートを生成した。しかし、双方の菌株で、長期の培養の後でさえもpH70で糖が未使用のまま残った。pH70で、10グルコースから生成された800~900mMラクテートは、pH70での増殖を阻害するために必要な最大ラクテート濃度をはるかに上回り、さらなるグルコース代謝も阻害し得る。SZ194による10糖の不完全な発酵の可能性のある原因として2つの要因:未知の栄養上の欠点とラクテート耐性を調べた。1mMベタインを含有する無機塩培地をpH70でLuria培養液と交換することは、ラクテート収量またはラクテート生成にほとんど効果がなかった。pHの発酵への効果を比較することによりラクテートの毒性を試験した。ラクテートなどの弱有機酸の毒性は、共役の中性型の脱共役作用に一部分関連していてOrganicacidtoxicitytoleranceandproductionofEscherichiacolibiorefiningapplicationsMicrobialCellFactories425、それが今度は反比例してpHに関連する。類似の傾向が発酵にも観察された。Luria培養液では、最終のラクテート力価がpH65で最も低く、pH75およびpH80で最も高かった。pHの変化は細胞収量にあまり効果がなかった。pH75で、10グルコースを、Luria培養液を用いて72時間で完全に発酵させた。表6ラクテート生産性の比較a特に定めない限り、10グルコースおよび1mMベタインを含有する無機塩。b最も生産的な24時間期の平均値。このpHの増加の恩典を、1mMベタインを含有する無機塩培地において確認した。pH75で、10および12グルコースは完全に発酵し、ごく微量の副生成物とともに1モルl1を超えるラクテートを生成した。グルコース1gあたりラクテート095gの生成物収量は、発酵に加えられた糖の合計に基づく最大理論収量の95を表す。より高レベルの糖の添加は、最終のラクテート力価をさらに増加させなかった。流加実験の間に類似の最終力価が観察され、追加の糖を加えた場合もさらに増加しなかった。最終のラクテート力価の約10~12Mは、SZ194によるpH75での糖代謝の上限を表しているように思われる。発酵に最適なpHであるpH75が、大腸菌の細胞質について報告されているものと非常に近いことは興味深いTransportoflactateandacetatethroughtheenergizedcytoplasmicmembraneofEscherichiacoliBiotechnolBioeng47819Warneckeetal2005。ラクテートトランスポーター遺伝子は大腸菌内で1つも確認されていないが、いくつかの研究から大腸菌および乳酸細菌でのそれらの存在の証拠が提供されているThecellmembraneandthestruggleforlifeoflacticacidbacteriaAntonievanLeeuwenhoek82327PoolmanBTransportersandtheirrolesinLABcellphysiologyAntonievanLeeuwenhoek82147164。これらの輸送体はラクテートH共輸送体であると推測され、その活性は外部のpHの増加とともに効率を増加させてもよい。エネルギー再利用モデルGenerationofanelectrochemicalprotongradientinbacteriabytheexcretionofmetabolicendproductsFEMSMicrobialLett5357364によれば、担体に媒介される、ラクテートなど代謝の最終生成物の流出は、膜を横切る電気化学的プロトン勾配の生成をもたらし、ATP生成に寄与し得る。乳酸菌におけるラクテートの流出は、全細胞エネルギーの30に寄与すると推定されているMicrobialexportoflacticand3hydroxypropanoicacidimplicationsforindustrialfermentationprocessesMetabolicEngineering6245255。大腸菌SZ194および乳酸菌は同様の経路によってグルコースを代謝するので、大腸菌でのラクテート流出によりさらなるATPが生成されることも可能である。SZ194により生成されたラクテートのキラル純度を調べ、95を超えるDラクテートであることが見出された。良好ではあるが、このキラル純度は親株SZ132のものよりも低い。このキラル不純物の出所は不明である。本発明によれば、1mMベタインを補給した無機塩培地においてpH75で大腸菌SZ194によって1Mを超えるラクテート力価を生成できる。この培地において、SZ194のラクテート生産性および細胞収量は、Luria培養液のものと同等であった。菌株SZ194の最終のラクテート力価の110gl1および収量は、LヘルベティクスMetabolicengineeringofLactobacillushelveticusCNR32forproductionofpureLlacticacidApplEnvironMicrobiol6638353841およびLデルブリュッキィEnhancedproductionofDlacticacidbymutantsofLactobacillusdelbrueckiiATCC9649JIndMicrobiolBiotechnol112328などの乳酸菌と有利に匹敵し、以前に操作された生体触媒の富栄養培地または無機塩培地における生産力を超えたReplacementofametabolicpathwayforlargescaleproductionoflacticacidfromengineeredyeastsApplEnvironMicrobiol6542114215SaitohSetalGeneticallyengineeredwineyeastproducesahighconcentrationofLlacticacidofextremelyhighopticalpurityApplEnvironMicrobiol7127892792vanMarisAJAetalHomofermentativelactateproductioncannotsustainanaerobicgrowthofengineeredSaccharomycescerevisiaepossibleconsequenceofenergydependentlactateexportApplEnvironMicrobiol7028982905。実施例3材料および方法菌株、プラスミド、培地および増殖条件本研究で利用した大腸菌株、プラスミドおよびプライマーを表7に列挙する。菌株SZ194は以前に大腸菌Bの派生物から構築され、構築の出発点としての役割を果たしたFermentationof12glucoseto12MlactatebyEscherichiacoliBstrainSZ194usingmineralsaltsmediumBiotechnolLettInPress参照。菌株構築の間、培養物を2グルコースまたはアラビノースを含有するLuria培養液において30°C、37°C、または39°Cで好気的に増殖させた。アンピシリン、テトラサイクリン、またはカナマイシンを必要に応じて加えた。発酵試験のため、菌株を、1mMベタインおよび2~12グルコースを補給したNBS無機塩培地において抗生物質を用いずに37°Cで増殖させた。MOPSバッファーを、pH調整を欠く条件下で固体培地または液体培地に加えた。遺伝子的方法DNA精製、制限エンドヌクレアーゼ消化、DNA増幅および形質転換については、製造元のプロトコールおよび標準法に従った。染色体欠失および組み込みのための方法は既に記載されている。mgsA遺伝子の先頭または終端の50ヌクレオチドと相同である配列に加えて、FRTに隣接するpKD4のカナマイシンカセットの配列に対応する20ヌクレオチドを含むハイブリッドプライマーを、天然のmgsA遺伝子の欠失に用いた。プラスミドpLOI2398を予め構築してペディオコッカスアシディラクチシldhLの大腸菌の染色体ldhA遺伝子への組み込みを促進した。発酵前接種物は、250mlフラスコグルコースを含むNBS培地100mlおよび100mMMOPS、pH74にコロニーを播種することで増殖させた。16時間後、この前接種物を350mlNBS培地を含有する500ml発酵容器へ希釈して33mgdcwl1とした。24時間後、この培養物を用いて出発接種物33mgdcwl1を提供した。容量生産性を、最も活性のある24時間について報告する。比生産性を、容量生産性を24時間での細胞量で割った商として計算した。代謝の進化pH調整された発酵からの細胞を24時間または48時間間隔で連続的に植え継ぎ、競合的な、増殖に基づく選択によって代謝の進化を促進した。植継ぎごとに、接種物を予め温めた新鮮培地へ希釈した。これらの選択から単離されたクローンに新規な菌株名を与えた。分析BauschLombSpectronic70分光光度計を用いて550nmにて光学濃度を測定することにより細胞量を評価した。総有機酸生成量を、pH70の維持のためのKOH消費によって評価した。酸性生成物およびキラル純度を、発酵の最後に高速液体クロマトグラフィーによって分析した。塩基消費量による有機酸の推定値は、一貫してHPLCによるラクテートの測定値よりも低かったが、これはおそらく無機代謝に起因するものと思われる。結果および考察Dラクテート生成のためのキラル純度の回復菌株SZ194は、無機塩培地においてキラル純度99にてグルコースからDラクテートを効果的に生成することが示されている。ベタインは、高濃度の糖を含むラクテートの生産性を増加させたが、キラル純度を95まで低下させた。大腸菌にはいくつかの考えられるLラクテートの源がある。Lラクテートは、双方とも本培地では存在しないラムノースまたはフコースの異化中間体LlyxosemetabolismemploystheLrhamnosepathwayinmutantcellsofEscherichiacoliadaptedtogrowonxyloseJBacteriol17351445150であるラクトアルデヒドから生成することも、解糖のメチルグリオキサルバイパスからの生成物として生成することもある。メチルグリオキサルバイパスは、急速な解糖の際のジヒドロキシアセトンリン酸の蓄積によって、またATP合成のためのリン酸制限によって誘導される、短縮溢流経路を意味する。ジヒドロキシアセトンリン酸の蓄積とリン酸制限の双方とも、高い速度の解糖流量によって激化する場合もあり得る。この仮説を試験するため、最初の関与段階である、メチルグリオキサルシンターゼをコードするmgsA遺伝子を欠失させた。生じた菌株TG112は、キラル的に純粋なDラクテートを生成した。増殖および初期生産性はこの欠失によってSZ194と比較して増加した。HPLC分析に基づく収量は類似した。TG112におけるさらなる改良点を、81日間の増殖の間の代謝の進化によって選択した。発酵中の培養物を、10グルコース、12グルコース、および1mMベタインを含む12グルコースを含有する無機塩培地に連続的に植え継いだ。1つのクローンを28日目に単離し、別のクローンを増菌の最後に単離した。Dラクテートの生産性および細胞収量は、このプロセスの間に改善された。SZ114を用いた発酵はほとんどの実験において実質的に48時間以内に完了し、最終収量は098Dラクテートgグルコースg1であった。高度な接種物は、比生産性および容量生産性において適度なさらなる改良をもたらした。副生成物およびキラル不純物はこれらのmgsA欠失菌株で検出以下であった。TG114によるDラクテートの生成は有利に他の生体触媒に匹敵し、単純な培地および発酵条件で高い生産性、力価、収量、およびキラル純度を提供する。キラル的に純粋なLラクテートの生成Dラクテート菌株、SZ194を再操作してD乳酸デヒドロゲナーゼをコードする天然のldhA遺伝子を、L乳酸デヒドロゲナーゼをコードするPアシディラクチシ由来のldhL遺伝子に置換することによって、主にLラクテートを生成した。生じた菌株TG102は、主にLラクテートを生成し、5グルコース、10グルコース、および1mMベタインを含む10グルコースを含有する最少培地に連続的に植え継いで、改良された増殖および生産性について選択した。24日後、1つのクローンを選択し、TG103と命名した。解糖流量の増加に起因してラクテート生産性は改善されたが、Lラクテートに5Dラクテートが混入した。メチルグリオキサルバイパスはラクテートの両キラル型を生成する可能性があるため、mgsAを最も可能性の高いキラル不純物の起源と特定した。絶対キラル純度はmgsAの欠失後に回復した。生じた菌株TG105は、Lラクテートのみを生成した。さらなる改良点は、10~12グルコースおよび1mMベタインを含有する無機塩培地における連続的な植継ぎの際の同時選択による増殖および生産性であった。TG106およびTG107を、それぞれ10回および22回の植継ぎの後に中間体菌株として単離した。菌株TG108を99日後に単離した。全てがLラクテートだけを高い収量で最小レベルの副生成物とともに生成した。12グルコースにおける容量生産性および細胞収量は、菌株選択の間に増加したが、比生産性は本質的に一定のままであった。より高度な接種物では、最大容量生産性に僅かな増加が観察された。菌株TG108をLラクテート生成について他の生体触媒と比較した。この菌株の力価および収量は他の生物について報告されているものよりも高かった。他の利点としては、単純な発酵条件および培地、ならびにキラル純度が挙げられる。結論高力価のキラル的に純粋なLおよびDラクテートは、1mMベタインを補給した無機塩培地において組換え型大腸菌Bによって容易に生成することができる。メチルグリオキサルバイパスの排除は、ラクテートのDおよびL型鏡像異性体双方の不純物を排除するために不可欠である。実施例4TG114由来の全ての外来DNAの除去によるTG128の構築ラクテート生成のための組換え型大腸菌株の市販用途を促進するため、先の遺伝子操作の間に染色体に残されていた全ての外来性DNAを除去した、TG114のさらなる派生物を構築した。除去されたDNAには、抗生物質マーカーを除去するために用いたフリッパーゼのFRT認識部位を含有するスカー領域、ザイモモナスモビリス由来の小さなDNA断片、クレブシエラオキシトカcasABの一部、およびエルウィニアクリサンテミcelYの一部が含まれる。これらの外来DNAセグメントは、ラクテートの生成を改良するために選択された遺伝子の中心領域が削除された、天然の染色体DNAのみを残して完全に排除された。菌株、プラスミド、培地、および増殖条件本研究で用いられた大腸菌株、プラスミド、およびプライマーを表11に列挙する。菌株TG114は以前に大腸菌Bの派生物から構築され、構築の出発点としての役割を果たした。菌株構築の間、培養物を、2グルコースもしくはアラビノースまたは10スクロースを含有するLuria培養液において30°C、37°C、または39°Cで好気的に増殖させた。アンピシリン、クロロテトラサイクリン、またはクロラムフェニコールを必要に応じて加えた。培養物を2グルコースを補給したNBS無機塩培地を含有するプレートで維持した。MOPSバッファーを、pH調整を欠く条件下で固体培地または液体培地に加えた。発酵試験のため、AM1無機塩培地2HPO4、087gNH4H2PO4、037gMgSO47H2O、24mgFeCl3、03mgCoCl26H2O、015mgCuCl2、03mgZnCl24H2O、03mgNaMoO4、0075mgH3BO3、0075mgMnCl24H2O2、1mMベタインおよび120gLグルコースにおいて抗生物質を用いずに37°Cで菌株を増殖させた。遺伝子的方法遺伝子のクローニング、DNA精製、制限エンドヌクレアーゼ消化、DNA増幅、および形質転換については、製造元のプロトコールおよび標準法に従った。染色体欠失および組み込みのための方法は既に記載されている。用いられるプラスミドおよびプライマーの説明を表11に列挙する。プラスミド構築大腸菌BgDNA、frdAfrdBfrdCおよびfrdDのfrdABCDオペロン内で増幅したプライマーを設計し、その後Invitrogenクローニングベクター、pCR21TOPOに連結することによりプラスミドpLOI4411を作成した。関心対象の天然の遺伝子、ackA、adhE、focAplfB、およびmgsAをそれぞれクローニングするために、プラスミドpLOI4412、pLOI4413、pLOI4415、およびpLOI4416を類似のアプローチで構築した。継ぎ目のない遺伝子ノックアウトをコードするプラスミドを、アンチセンスプライマーを用いて作成した。5にリン酸基を有するアンチセンスプライマーを設計して除外する遺伝子領域を引いた全プラスミドを増幅した。例えば、pLOI4417は、frdAの3末端から上流へ向かってアニーリングしたプライマー、およびfrdCの中から下流へ向かってアニーリングしたプライマーを用いて、pLOI4411のPCRを実施することにより作成した。生じた4263bpのPCR産物を制限酵素DpnIで処理して天然のpLOI4411プラスミドを消化した。新規なプラスミドpLOI4417を作成するため、消化されたPCR産物をその後自己連結した。同じような方法で表11に列挙されるプライマーセットを用いてプラスミドpLOI4418、pLOI4419、pLOI4421、およびpLOI4422を作成した。これらのプラスミドは、所望の欠失を含み、かつ全ての異種配列を欠く直鎖DNAを増幅するためのPCR鋳型としての役割を果たす。この直鎖DNAを用いてFRTスカー領域、異種DNA、およびsacBを、相同組換えにより置換した。このような方法で、選択された遺伝子の継ぎ目のない欠失を染色体上に作成した。FRTスカーおよび異種DNAのTG114からの除去DatsenkoandWannerの一段階欠失法によって残された~85bpFLP認識標的スカーを二段階アプローチによって除去した。最初に、FRT部位を環状のFRTcatsacBカセットによって個別に標的化し、その結果このカセットの染色体上のFRTスカーへの単一クロスオーバー組み込みをもたらした。catsacBFRTカセットを含有する環状DNAを以下のように構築した:1プラスミドpLOI4151を鋳型として用いるFRTcatsacBカセットのPCR増幅。増幅したカセットは隣接するPstI部位を含む;2PstIでの消化の後の自己連結で自己複製ができない閉じた環を作製。この環状DNAを組み込みに用いた。cat遺伝子の発現はクロラムフェニコール耐性を付与し、この組み込みを含有する細胞の直接的な選択を可能にした。第二段階で、sacB遺伝子は、sacBを含有するDNA領域が相同組換えによって取り除かれている細胞の直接選択を可能にした。10スクロースの存在下でsacBを発現している細胞CurrentprotocolsinmolecularbiologyJohnWileySonsIncNewYorkNYLeeECYuKMartinezdeVelascoJTessarolloLSwingDACourtDLJenkinsNAandCopelandNGAhighlyefficientEscherichiacolibasedchromosomeengineeringsystemadaptedforrecombinogenictargetingandsubcloningofBACDNAGenomics735665を死滅させ、多糖類の細胞内生成によって溶解させた。この方法を用いて、DNAが挿入されてsacBを置換している組換え体を大きな個体群から選択することができ得る。この実施例において、ダブルクロスオーバー事象を介した直鎖DNA断片の組み込みの結果、全ての異種DNAを欠く、天然のDNAまたは欠失を有する天然のDNAのみを含有する完全なノックアウト菌株を生じた。天然のDNA配列または所望の遺伝子欠失を含有する天然の配列をこの第二段階に用いてFRTスカー領域および菌株TG114由来の全ての異種DNAを完全に除去した。直鎖状DNA断片を用いるエレクトロポレーションの後、細胞を1mLSOC培地において37°Cで4時間振盪しながら培養した。4時間増殖した後、細胞を、10スクロースを補給した、塩を含まない50mLLB培地において16~20時間培養した。次に、細胞を5スクロースを補給した、塩を含まないLB寒天プレート上に塗布した。FRTcatsacBを保持している大多数の細胞はスクロースの存在下での長期間の後で生存能力がなかった。コロニーを形成している生存細胞は、sacB、およびスカー領域を欠いていた。この方法を用いてTG114に存在する全ての5つのFRTスカーを順次排除し、lacオペロンを回復させた。このプロセスに用いたプライマー、プラスミド、および菌株を表11に要約する。また、lacAに組み込まれたcasAB遺伝子も取り除き、この二段階法の変法を用いてこの領域中の野生型配列で置換した。frdAに組み込まれたエルウィニアクリサンテミcelYの断片を、継ぎ目のないfrdBC欠失の構築の間に取り除いた。生じた菌株TG128はFRTスカーを欠き、表11に示される遺伝子中の欠失された領域とともに天然のDNA配列のみを含む。遺伝子欠失の領域での元の配列との比較をTG114およびTG128について示す。天然のlacオペロンの回復TG114は、lacY、lacA領域における先の構築物から異種DNAのセグメントを含んでいた。これらはTG122を作製するためTG120から取り除かれ、TG122のその後の派生物には存在しない。この構築のためのプライマーを表11に列挙する。これを達成するため、天然のlacZからcynXの領域を大腸菌Bから増幅し、pCR21TOPOへクローニングしてpLOI3956を作製した。組換え体の選択を促進するため、pLOI3956の中央の領域を、cat遺伝子およびsacB遺伝子を含有するカセットで次のように置換した。pLOI3956を鋳型として用い、NheI部位を含有するアンチセンスプライマーを用いてlacZ、pCR21、およびcynXを増幅させた。NheI部位を含有する第2のプライマーのセットを用いてcatsacBカセットをプラスミドpEL04から増幅した。NheIでの消化後、これらのPCR産物を連結してlacZsacBcatcynXを含むPCR21の派生物であるpLOI3957を作製した。プラスミドpLOI3957を鋳型として用いて、lacZsacBcatcynX領域をPCRによって増幅し、TG120へ組み込み、クロラムフェニコール耐性について選択してTG121を作製した。pLOI3956を鋳型として用いて、野生型lacZlacYlacAcynX領域をPCRによって増幅し、TG121へ組み込んだ。lacZYAオペロンの天然の配列を含有する組み込み体を、スクロースの存在下での増殖の間にsacB機能の欠如によって選択した。これらのうちの1つをTG122と命名した。菌株TG122はTG128の構築の間の中間体菌株であった。発酵前接種物を、2グルコースおよび100mMMOPSを含む100mlのNBS培地を含有する250mlフラスコへコロニーを播種することによって増殖させた。16時間後、この前接種物を350mlAF1無機塩培地を含有する500ml発酵容器へ希釈して33mgdcwLとした。24時間後、生じた培養物を用いて33mgdcwLの出発接種物を準備し、同じ条件下で96時間培養した。サンプルを分析のために取り出した。分析BauschLombSpectronic70分光光度計を用いて550nmにて光学濃度を測定することにより細胞量を推定した。総有機酸生成量を、pH70を維持するために用いたKOH消費によって推定した。酸性生成物およびキラル純度を、発酵の最後に高速液体クロマトグラフィーによって分析した。塩基消費量による有機酸の推定値は、一貫してHPLCによるラクテートの測定値よりも低かったが、これはおそらく無機質代謝に起因するものと思われる。TG128によるグルコースの発酵菌株TG114を、集中的な遺伝子操作に供してFRTスカーおよび他の外来性DNAを除去した。生じた生物、菌株TG128は、不必要な発酵生成物を排除するため天然の野生型DNA配列および継ぎ目のない遺伝子の欠失のみを含む。この菌株の発酵性能はTG114のものと本質的に同等であり、最大理論収量の96~98のラクテート収量であった。ラクテート生成のための熱耐性変異株の代謝の進化による選択代謝の進化を用いて、高温下で効果的なラクテート生成の可能な菌株を選択した。pH調整された発酵からの細胞を24時間間隔で連続的に植え継いで、競合的な、増殖に基づく選択によって代謝の進化を促進した。植継ぎごとに、接種物を予め温められた新鮮な培地へ希釈した。増殖によって熱耐性菌株の単離が促進されるように、培養温度を僅かな程度上昇させた。菌株TG128は、37°Cで至適に発酵する。変異株を、連続的な植継ぎの間に培養温度を漸増させることによって得た。このアプローチを用いて、現在39°Cおよび43°Cで効果的な発酵の可能なTG128から、新規な菌株を選択した。高温下での双方の熱耐性菌株の収量は、37°CでのTG114と同等であった。TG128によるグルコースの発酵菌株TG114を、集中的な遺伝子操作に供してFRTスカーおよび他の外来性DNAを除去した。生じた生物、菌株TG128は、不必要な発酵生成物を排除するため天然の野生型DNA配列および継ぎ目のない遺伝子の欠失のみを含む。この菌株の発酵性能はTG114のものと本質的に同等であり、最大理論収量の96~98のラクテート収量であった。ラクテート生成のための熱耐性変異株の選択代謝の進化を用いて、高温下で効果的なラクテート生成の可能な菌株を選択した。温度を僅かな程度上昇させた発酵槽への連続的植継ぎは、39°Cで至適に発酵するTG129および43°Cで至適に発酵するTG130の単離を可能にした。高温下での双方の収量は、37°CでTG114と同等であった。表7本研究で用いられた大腸菌株、プラスミド、およびプライマー表8グルコース発酵からの生成物a特別の定めのない限り、12グルコースを含有するNBS無機塩培地。示されている場合、1mMベタインも添加された。太字の菌株はDラクテートを生成する。下線の菌株はLラクテートを生成する。b収量は、最大理論収量を六炭糖1モルあたりラクテート2モルと仮定し、代謝された糖に基づく。表9操作された大腸菌Bによるラクテート生産性a12グルコース、1mMベタインを含有する、pH70に調整した無機塩。太字の菌株はDラクテートを生成する。下線の菌株はLラクテートを生成する。bpH75に調製。c5接種物。d10接種物。e10グルコース。f最も生産的な24時間の平均値。表10細菌、酵母および菌類によるグルコースからのキラルラクテート生成表11本研究で用いられた大腸菌株、プラスミド、およびプライマー表12欠失領域の部分配列a太字で示されている部分は遺伝子の5および3領域の部分配列であり、斜体部分はFRTスカーであり、下線部はTG128株において欠失された領域である。bこの領域もZモビリスプロモーター由来の部分配列、ならびにEクリサンテミcelY遺伝子由来の部分配列を含んでいた。cダッシュ記号は欠失領域を示す。表13グルコース発酵からの生成物apH70に調整した12グルコース、1mMベタインを含有する無機塩。b収量は、最大理論収量を六炭糖1モルあたりラクテート2モルと仮定し、代謝された糖に基づく。本明細書において参照または引用された全ての特許、特許出願、および刊行物は、全ての図および表をはじめ、本明細書の明示的な開示と矛盾しない程度まで、参照として全文が本明細書に組み入れられる。当然のことながら、本明細書において記載される実施例および態様は例証目的のためだけのものであり、その点を踏まえての種々の改変または変更は、当業者に示唆され、かつ本願の精神および範囲内に含まれるものである。参考文献その他の文献は、以下に示す通りである。米国公開特許第20040005677号米国公開特許第20030003553号米国公開特許第20050112737号米国公開特許第20040029256号BianchiMMBrambillaLProtaniFLiuCLievensePorroDEfficienthomolacticfermentationbyKluveromyceslactisstrainsdefectiveinpyruvateutilizationandtransformedwithheterologousLDHgeneApplEnvironMicrobiol6756215625PosfaiGKoobMDKirkpatrickHABlattnerFCVersatileinsertionplasmidsfortargetedgenomemanipulationsinbacteriaIsolationdeletionandrescueofthepathogenicityislandLEEoftheEscherichiacoliO157H7genomeJBacteriol17944264428