"単一抗原結合アーム及びFc領域を含有してなる抗体断片であり、該抗原結合アームを含んでなるFab分子と比較して該抗体断片の安定性が増大しており、該Fc領域が第一及び第二Fcポリペプチドの複合体を含んでなり、Fcポリペプチドの一方だけでなく両方がN末端切断型重鎖である、抗体断片。前記抗体断片がアグリコシル化されている、請求項1に記載の抗体断片。前記抗体断片が免疫抑制性質をほとんど持たない、請求項1又は2に記載の抗体断片。前記免疫抑制性質がT細胞枯渇に影響する能力を含む、請求項3に記載の抗体断片。FcRn結合以外の実質的なエフェクター機能を保持しない、請求項1ないし4の何れか一に記載の抗体断片。前記エフェクター機能が補体溶解である、請求項5に記載の抗体断片。前記抗体断片がFcRnに結合する、請求項1ないし6の何れか一に記載の抗体断片。T細胞表面抗原に特異的に結合しない、請求項1ないし7の何れか一に記載の抗体断片。前記T細胞表面抗原がCD3又はCD4である、請求項8に記載の抗体断片。前記T細胞表面抗原がCD3である、請求項9に記載の抗体断片。腫瘍抗原に特異的に結合する、請求項1ないし10の何れか一に記載の抗体断片。レセプター二量体化により活性化される細胞表面レセプターに特異的に結合する、請求項1ないし11の何れか一に記載の抗体断片。前記抗体断片が軽鎖可変ドメインを含有してなる第一ポリペプチド、重鎖可変ドメイン及び該第一Fcポリペプチドを含有してなる第二ポリペプチド、並びに、該第二Fcポリペプチドを含有してなる第三ポリペプチドを含んでなる、請求項1ないし12の何れか一に記載の抗体断片。前記第一ポリペプチドがヒト軽鎖定常ドメインに融合した非ヒト軽鎖可変ドメインを含んでなる、請求項13に記載の抗体断片。前記第一ポリペプチドがヒト化又はヒトフレームワーク配列に融合した非ヒト種由来のCDRを含んでなる、請求項13に記載の抗体断片。前記第二ポリペプチドがヒト重鎖定常ドメインに融合した非ヒト重鎖可変ドメインを含んでなる、請求項13に記載の抗体断片。前記第二ポリペプチドがヒト化又はヒトフレームワーク配列に融合した非ヒト種由来のCDRを含んでなる、請求項13に記載の抗体断片。前記第三ポリペプチドがN末端に少なくとも一のヒンジ配列を含有するN末端切断型重鎖を含んでなる、請求項13に記載の抗体断片。前記2つのFcポリペプチドが共有結合している、請求項1ないし18の何れか一に記載の抗体断片。前記2つのFcポリペプチドがヒンジ領域で分子内ジスルフィド結合を介して連結している、請求項1ないし19の何れか一に記載の抗体断片。標的分子に結合する場合に、前記抗体断片が標的分子の多量体化を阻害する、請求項1ないし20の何れか一に記載の抗体断片。標的分子に結合する場合に、前記抗体断片が同系結合パートナーの標的分子への結合を阻害する、請求項1ないし21の何れか一に記載の抗体断片。前記第一Fcポリペプチドと前記第二Fcポリペプチドが作用領域で会合し、該第二Fcポリペプチドの作用領域が第一Fcポリペプチドの作用領域内のキャビティ内に位置しうる隆起を含んでなる、請求項1ないし22の何れか一に記載の抗体断片。前記第二Fcポリペプチドが鋳型/起源ポリペプチドから変更されて前記隆起をコードしているかあるいは、前記第一Fcポリペプチドが鋳型/起源ポリペプチドから変更されて前記キャビティをコードしているか、その両方である、請求項1ないし23の何れか一に記載の抗体断片。前記第二Fcポリペプチドが鋳型/起源ポリペプチドから変更されて前記隆起をコードしており、第一Fcポリペプチドが鋳型/起源ポリペプチドから変更されて前記キャビティをコードしているか、その両方である、請求項1ないし24の何れか一に記載の抗体断片。前記第一Fcポリペプチドと前記第二Fcポリペプチドが作用領域で会合し、該第二Fcポリペプチドの作用領域が第一Fcポリペプチドの作用領域内のキャビティ内に位置しうる隆起を含んでなり、該キャビティ又は該隆起あるいはその両方が該第一Fcポリペプチド及び該第二Fcポリペプチドのそれぞれの作用領域内に取り込まれている、請求項1ないし25の何れか一に記載の抗体断片。前記隆起及び前記キャビティが前記それぞれのFcポリペプチドの作用領域内に取り込まれている、請求項24ないし26の何れか一に記載の抗体断片。前記隆起及び前記キャビティのそれぞれが天然に生じるアミノ酸残基を含んでなる、請求項24ないし27の何れか一に記載の抗体断片。前記隆起を含有してなる前記Fcポリペプチドが、鋳型/起源のポリペプチドの作用領域の元の残基を元の残基より大きい側鎖容量を有する移入残基で置換することによって生成される、請求項24ないし28の何れか一に記載の抗体断片。前記隆起を含有してなる前記Fcポリペプチドが、前記ポリペプチドの作用領域の元の残基をコードする核酸を元の残基より大きい側鎖容量を有する移入残基をコードする核酸で置換する工程を含んでなる方法により生成される、請求項24ないし29の何れか一に記載の抗体断片。前記元の残基がスレオニンである、請求項29又は30の抗体断片。前記移入残基がアルギニンである、請求項29ないし31の何れか一に記載の抗体断片。前記移入残基がフェニルアラニンである、請求項29ないし31の何れか一に記載の抗体断片。前記移入残基がチロシンである、請求項29ないし31の何れか一に記載の抗体断片。前記移入残基がトリプトファンである、請求項29ないし31の何れか一に記載の抗体断片。キャビティを具備する前記Fcポリペプチドは、鋳型/元のポリペプチドの作用領域内の元の残基を元の残基より小さな側鎖容量を有する移入残基に置換することによって生成される、請求項23ないし28の何れか一に記載の抗体断片。キャビティを具備する前記Fcポリペプチドは、該ポリペプチドの作用領域の元の残基をコードする核酸を元の残基より小さな側鎖容量を有する移入残基をコードする核酸に置換する工程を含む方法によって生成される、請求項23ないし28及び36の何れか一に記載の抗体断片。元の残基がスレオニンである、請求項36又は37に記載の抗体断片。元の残基がロイシンである、請求項36又は37に記載の抗体断片。元の残基がチロシンである、請求項36又は37に記載の抗体断片。移入残基がシステインでない、請求項36ないし40の何れか一に記載の抗体断片。移入残基がアラニンである、請求項36ないし40の何れか一に記載の抗体断片。移入残基がセリンである、請求項36ないし40の何れか一に記載の抗体断片。移入残基がスレオニンである、請求項36ないし40の何れか一に記載の抗体断片。移入残基がバリンである、請求項36ないし40の何れか一に記載の抗体断片。キャビティを具備する前記Fcポリペプチドが、スレオニン、ロイシン及びチロシンからなる群から選択される2以上の元のアミノ酸の置換を具備する、請求項36ないし45の何れか一に記載の抗体断片。キャビティを具備する前記Fcポリペプチドが、アラニン、セリン、スレオニン及びバリンからなる群から選択される2以上の移入残基を具備する、請求項36ないし46の何れか一に記載の抗体断片。キャビティを具備する前記Fcポリペプチドがスレオニン、ロイシン及びチロシンからなる群から選択される2以上の元のアミノ酸の置換を具備し、該元のアミノ酸がアラニン、セリン、スレオニン及びバリンからなる群から選択される移入残基で置換される、請求項36ないし47の何れか一に記載の抗体断片。キャビティを具備する前記Fcポリペプチドが、カバットのEU番号付けスキームに従ったアミノ酸番号366位のスレオニンからセリンへの置換を具備する、請求項23ないし48の何れか一に記載の抗体断片。キャビティを具備する前記Fcポリペプチドが、カバットのEU番号付けスキームに従ったアミノ酸番号368位のロイシンからアラニンへの置換を具備する、請求項23ないし48の何れか一に記載の抗体断片。キャビティを具備する前記Fcポリペプチドが、チロシンのバリンへの置換を具備する、請求項23ないし50の何れか一に記載の抗体断片。キャビティを具備する前記Fcポリペプチドが、T366SL368A及びY407Vからなる群から選択される2以上のアミノ酸置換を具備する、請求項23ないし51の何れか一に記載の抗体断片。隆起を具備する前記Fcポリペプチドが、カバットのEU番号付けスキームに従ったアミノ酸番号366位のスレオニンからトリプトファンへの置換を具備する、請求項23ないし52の何れか一に記載の抗体断片。第一Fcポリペプチド及び第二Fcポリペプチドのそれぞれが抗体定常ドメインを具備する、請求項1ないし53の何れか一に記載の抗体断片。前記抗体定常ドメインがCH2及び/又はCH3ドメインである、請求項54に記載の抗体断片。前記抗体定常ドメインがIgG由来である、請求項54又は55に記載の抗体断片。前記IgGがヒトIgG1である、請求項56に記載の抗体断片。単一特異性である、請求項1ないし57の何れか一に記載の抗体断片。単一特異性イムノアドへシンである、請求項1ないし58の何れか一に記載の抗体断片。抗体イムノアドへシンキメラである、請求項1ないし59の何れか一に記載の抗体断片。イムノグロブリンの少なくとも75が請求項1ないし60の何れか一に記載の抗体断片であるイムノグロブリンの集合を含んでなる組成物。抗体断片をコードする核酸を含有してなる宿主細胞を培養し;宿主細胞培養物から抗体断片を回収することを含んでなる、請求項1ないし60の何れか一に記載の抗体断片の調整方法。抗体断片を含有してなるポリペプチドが、イムノグロブリンの少なくとも50が請求項1ないし60の何れか一に記載の抗体断片であるイムノグロブリンの集合となる割合で発現される、請求項62に記載の方法。該ポリペプチドがほぼ等モル量で発現される、請求項63に記載の方法。前記ポリペプチドをコードする核酸がほぼ等しい強さの翻訳開始領域TIRsに作用可能に結合される、請求項64に記載の方法。前記宿主細胞が原核生物である、請求項62ないし65の何れか一に記載の方法。宿主細胞が大腸菌である、請求項66に記載の方法。大腸菌が内在性プロテアーゼ活性欠陥株のものである、請求項67に記載の方法。前記宿主細胞が真核生物のものである、請求項62ないし65の何れか一に記載の方法。前記宿主細胞がCHOである、請求項69に記載の方法。前記抗体断片が培養液から回収される、請求項62ないし70の何れか一に記載の方法。前記抗体断片が細胞溶解物から回収される、請求項62ないし70の何れか一に記載の方法。第二Fcポリペプチドの作用領域をコードする核酸が隆起をコードするように第二Fcポリペプチドの元の作用領域をコードする核酸から変更されているか、あるいは第一Fcポリペプチドの作用領域をコードする核酸がキャビティをコードするように第一Fcポリペプチドの元の作用領域をコードする核酸から変更されているか、あるいはその両方である抗体断片をコードする核酸を含有してなる宿主細胞宿主細胞を培養し、前記宿主細胞培養物から抗体断片を回収する工程を含んでなる、請求項23ないし60の何れか一に記載の抗体断片の調整方法。第二Fcポリペプチドをコードする核酸が隆起をコードするように元の核酸から変更されており、第一ポリペプチドをコードする核酸がキャビティをコードするように元の核酸から変更されている、請求項73に記載の方法。第二Fcポリペプチドの作用領域の元のアミノ酸残基をコードする核酸が、元のアミノ酸残基より大きな側鎖容量を有する移入アミノ酸残基をコードする核酸で置換される工程が工程に先行するものであり、大きな側鎖容量を有する移入残基が隆起を含有してなる、請求項73に記載の方法。第一Fcポリペプチドの作用領域の元のアミノ酸残基をコードする核酸が、キャビティを形成するように元のアミノ酸残基より小さい側鎖容量を有する移入アミノ酸残基をコードする核酸で置換される工程が工程に先行するものである、請求項73に記載の方法。第一Fcポリペプチド及び第二Fcポリペプチドをコードする核酸が宿主細胞に導入される工程が工程に先行するものである、請求項73に記載の方法。抗体断片を形成するポリペプチドを調製し;ヘテロ多量体化を起こす;工程を含んでなり、これによって抗体断片が形成される、請求項1ないし60の何れか一に記載の抗体断片の調整方法。形成されたイムノグロブリンポリペプチド複合体の少なくとも50が請求項1ないし60の何れか一に記載の抗体断片である、請求項62ないし78の何れか一に記載の方法。形成されたイムノグロブリンポリペプチド複合体の少なくとも50がヘテロ三量体である、請求項62ないし78の何れか一に記載の方法。工程が第一Fcポリペプチドと第二Fcポリペプチドのインビトロでの結合を含んでなる、請求項62ないし78の何れか一に記載の方法。元の作用領域のアミノ酸配列が遺伝子操作した作用領域内に隆起及びキャビティを生成するように変更されている、請求項62ないし78の何れか一に記載の方法。請求項1ないし60の何れか一に記載の抗体断片をコードする単離した核酸。請求項1ないし60の何れか一に記載の抗体断片を集合的にコードする二以上の組み換え核酸を含有してなる組成物。請求項83又は84に記載の核酸を含有してなる宿主細胞。抗原結合アームをコードする核酸が単一ベクター内に存在する、請求項85に記載の宿主細胞。抗原結合アームをコードする核酸が別々のベクター内に存在する、請求項85に記載の宿主細胞。抗原結合アーム及びN末端切断型重鎖をコードする核酸が単一ベクター内に存在する、請求項85に記載の宿主細胞。ポリペプチドが発現するように請求項83又は請求項84に記載の核酸を含有する宿主細胞を培養して、該細胞培養物から抗体断片を回収することを含んでなる、請求項1ないし60の何れか一に記載の抗体断片の作製方法。前記抗体断片が細胞溶解物から回収される、請求項89に記載の方法。前記抗体断片が細胞培養液から回収される、請求項89に記載の方法。前記宿主細胞が原核生物細胞である、請求項89に記載の方法。前記宿主細胞が大腸菌である、請求項90に記載の方法。前記宿主細胞が哺乳類のものである、請求項89に記載の方法。請求項1ないし60の何れか一に記載の抗体断片と担体を含有してなる組成物。単一抗原結合アームを含有してなるFab分子と比較して抗体断片の安定性を向上させる単一抗原結合アーム及びFc領域を含有してなる抗体断片の生成方法であり、抗原結合アームの形成と該Fc領域が形成されるための第一Fcポリペプチドと第二Fcポリペプチドの二量体化とが起こる条件下にて抗原結合アームと第一及び第二のFcポリペプチドをコードする好適な宿主細胞核内で発現させることを含んでなり、該Fcポリペプチドの両方ではなく他方がN末端切断型重鎖である方法。前記方法がイムノグロブリンの異種性集団を生成し、イムノグロブリンの少なくとも50が単一抗原結合アームを含有してなるFab分子と比較して抗体断片の安定性を向上させるFc領域及び単一抗原結合アームを含有してなる、請求項96に記載の方法。実施例1本発明の抗体断片の生成及び特徴づけ以下、一アーム形抗体又はFab/c抗体とも呼称する発現ベクターの構築完全長又はFab/c抗cmet抗体の発現のためのプラスミドはすべて、重鎖及び軽鎖及びFc断片の転写のための独立したphoAプロモータAPKikuchi等NucleicAcidsRes956715678を基として、それに転写開始のためのシャインダルガーノ配列Yanofsky等NucleicAcidsRes966476668及びChang等Gene55189196が続く、独立したシストロンシステムSimmons等JImmunolMethods263133147に基づくものであった。加えて、耐熱性毒素IIシグナル配列STIIPicken等InfectImmun42269275及びLee等InfectImmun42264268を、重鎖及び軽鎖及びFc断片の周辺質分泌に用いた。翻訳開始領域TIR内にサイレントコドン変異を含有する、相対的な翻訳強度を測定した前述のSTIIシグナル配列変異形を用いて、両鎖及びFc断片の翻訳を良好にコントロールしたSimmons及びYansuraNatureBiotechnol14629634andSimmonsetalJImmunolMethods263133147。最後に、λt0転写ターミネータSchlosstissek及びGrosseNucleicAcidsRes153185、を両鎖及びFc断片のコード配列の下流に配置した。すべてのプラスミドはpBR322ベースのベクター系のフレームワークを用いるSutcliffeColdSpringHarborSympQuantBiol437790。起源抗cmet抗体は、米国特許第5686292号;同第5,646,036号;同第6,207,152号;同第6,214,344号及び同第6,468,529号に記載される5D5抗体であった。5D5起源抗体のハイブリドーマ細胞株は、ATCC番号HB11895ハイブリドーマ5D5116として、アメリカ培養細胞系統保存機関12301ParklawnDriveRockvilleMdUSAに既に寄託された寄託日:1995年5月23日。プラスミドpxcM11Cキメラ5D5抗cmet抗体をコードする所望のpxcM11Cプラスミドを生成するするために2つの中間型プラスミドを用いた。。始めに、5D5重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、各々の鎖の発現のためにpBR322ベースのプラスミド上に別々に移入した。以下はこれら中間型プラスミドpxcMLC及びpxcMHCの調製の後のpxcM11Cの構築について記載する。pxcMLCこのプラスミドは、マウス5D5抗体の軽鎖可変ドメインを完全長抗体生成に関して互換性を持つヒト軽鎖フレームワークへ移入するために構築した。このプラスミドの構築には3つのDNA断片のライゲーションが伴う。第一ものは、小さなMluIBamHI断片が除去されているpPho51ベクターであったSimmons及びYansuraNatureBiotechnol14629634、変異形1。ライゲーションの第二部分は、軽鎖の最後の15アミノ酸、λt0転写終結区及びtet遺伝子を開始領域をコードするpST7LC由来のおよそ516の塩基対のAlwNIBamHI断片であった。プラスミドpST7LCは、STIIシグナル配列の下流にヒトκ軽鎖を有する変異形6の誘導体である上記参照。ライゲーションの第三部分は、5D5Fab配列を含有するプラスミドから以下のプライマー:5’TAAATTTAACGCGTACGCTGACATTATGATGTCCCAGTCTCCATCC5’GGGCGAGCTCAGGCCCTGATGGGTGACTTCGCAGGCを用いて生成されるおよそ623塩基対のMluIAlwNIPCR断片であった以下の実施例2では5D5Fabのクローニング及び組み換え発現と記載。pxcMHCこのプラスミドは、マウス5D5抗体の重鎖可変ドメインを完全長抗体生成に関して互換性を持つヒト重鎖フレームワークへ導入するために構築した。このpxcMHCの構築には2つのDNA断片のライゲーションが伴う。第一のものは、小さなMluIBstEII断片が除去されているpST2HCベクターであった。プラスミドpST2HCは、ヒトIgG1重鎖とSTIIシグナル配列の下流を融合した変異形3の誘導体である上記参照。ライゲーションの第二部分は、5D5Fab配列を含有するプラスミドから以下のプライマー:5’GCTACAAACGCGTACGCTCAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGG5’AAGAGACGGTGACCGAGGTTCCTTGACCを用いて生成されるおよそ346塩基対のMluIBstEIIPCR断片であった以下の実施例2では5D5Fabのクローニング及び組み換え発現と記載。pxcM11CpxcM11Cプラスミドは、完全長5D5キメラ抗体を発現するように構築した。プラスミドの構築には4つのDNA断片のライゲーションが伴う。第一のものは、小さなMluIBstEII断片が除去されているpaTF20ベクターであったSimmons等JImmunolMethods263133147、paTF20は1の軽鎖及び1の重鎖のTIRを有する多シストロン性ベクターである。ライゲーションの第二部分は、pxcMLC由来のおよそ623塩基対のMluIAlwNI断片であった。第三部分は、paTF50由来のおよそ547塩基対のAlwNIBsiWI断片であった上記を参照;paTF50は、1の軽鎖及び1の重鎖のTIRを有する独立したシストロンベクターである。ライゲーションの最終部分は、pxcMHC由来のおよそ349塩基対のBsiWIBstEII断片であった。プラスミドpxcM11CFcpxcM11CFcの構築のために、APプロモーター、STIIシグナル配列及びλt0転写終結区を含む上記の調節要素すべてを有するFc断片の発現をコードするカセットを、pxcM11Cプラスミドに加えた。pxcM11cFcの構築につながる2つのプラスミド、pBR322VNERKHC及びpBR322Fcが始めに記載のように必要である。pBR322VNERKHCpBR322VNERKHCプラスミドは、STIIシグナル配列の下流にヒト重鎖を有する変異形1の誘導体であるSimmons及びYansuraNatureBiotechnol14629634。このプラスミドは、2つのDNA断片を共にライゲーションすることによって構築した。第一ものは、小さなEcoRIClaI断片が除去されているベクターpBR322であった。ライゲーションの第二部分は、APプロモーター、STIIシグナル配列、重鎖、λt0転写終結区及びtet遺伝子の開始領域をコードするpVG11VNERKから以下のプライマー:5’TTTCCCTTTGAATTCTTGGTTGTTAACGTTGCCGACGCGCATC5’TTTCCCTTTATCGATGATAAGCTGTCAAACATGAGTAAACAATAAAAAACGCCCを用いて生成されるおよそ1885塩基対のEcoRIClaIPCR断片であった。プラスミドpVG11VNERKは、軽鎖及び重鎖可変ドメインが抗VEGF抗体VNERKに変化されている1の軽鎖及び1の重鎖のTIRsを有する独立したシストロンベクターの誘導体であるSimmons等JImmunolMethods263133147。pBR322FcpBR322Fcプラスミドは、上記の調節要素をすべて有するFc断片の発現をコードするpBR322VNERKHCプラスミドの誘導体である。pBR322Fcプラスミドは、2つのDNA断片を共に連結させることによって構築した。第一のものは、小さなMluINsiI断片が除去されたベクターpBR322VNERKHCであった。ライゲーションの第二部分は、アミノ酸SGTTの後にヒトIgG1のアミノ酸221~429をコードするpJAL226からのおよそ1319塩基対のMluINsiI断片であった。pJAL226は、STIIシグナル配列の下流にヒトFc断片を有する変異形3の誘導体であるSimmons及びYansuraNatureBiotechnol14629634。pxcM11CFcpxcM11CFcは、2つのDNA断片を共に連結させることによって構築した。第一のものは、小さなHpaIClaI断片が除去されたベクターpxcM11Cであった。ライゲーションの第二部分は、pBR322Fc由来のおよそ1198塩基対のHpaIClaI断片であった。このライゲーションにより、所望のプラスミド消化型pxcM11CFcが生じた。プラスミドpxcM11CHFcKプラスミドpxcM11CHFcKは、pxcM11C重鎖のCH3ドメインを孔本明細書においてキャビティとも称する突然変異T366S、L368A、Y407Vを有するCH3ドメインで置換したpxcM11CFcの誘導体であるMerchant等NatureBiotechnology16677681。加えて、Fc断片のCH3ドメインを、ノブ本明細書において隆起とも称する突然変異T366Wを有するCH3ドメインで置換した上記を参照。pxcM11CHプラスミドを2工程で構築した。第1工程では、2つのDNA断片を共にライゲーションすることによって孔突然変異導入した。第一のものは、小さなSacIINsiI断片が除去されたベクターpxcM11Cであった。ライゲーションの第二部分は、pBR322VNERKHCH由来のおよそ411塩基対のSacIINsiI断片であった。pBR322VNERKHCHは孔突然変異T366S、L368A、Y407Vが導入されたpBR322VNERKHCプラスミドの誘導体である上記参照Merchant等NatureBiotechnology16677681。この中間型プラスミドをpxcM11CHと呼称する。pxcM11CHFcK第2工程により、ノブ突然変異をFc断片に導入して、2つのDNA断片のライゲーションを行った。第一のものは、小さなClaIHpaI断片が除去されたベクターpxcM11CHであった。ライゲーションの第二部分は、ノブ突然変異を有するFc断片の発現カセットをコードするpBR322FcK由来のおよそ1198塩基対のClaIHpaI断片であった。pBR322FcKは、ノブ突然変異T366WMerchant等NatureBiotechnology16677681及び上記すべての調節要素を有するFc断片の発現をコードするpBR322Fcプラスミド上記参照の誘導体である。このライゲーションにより、pxcM11CHFcKと称する所望のプラスミドが生じた。抗cMet一アーム形Fab/c抗体の発現及び特徴づけ親のコンストラクト5D5抗cMetのpxcM11C及び一アーム形Fab/c抗体コンストラクトpxcM11CFcを用いて抗体の小規模誘導を行った。各々のコンストラクトの小規模発現のために、宿主細胞として、大腸菌株33D3W3110ΔfhuAΔtonAptr3lacIqlacL8ΔompTΔnmpcfepEdegP41kanRを用いた。形質転換後、選択された形質転換体選択候補を、カルベニシリン50μg/mLを添加した5mLのLuria―Bertani培地に播種して、終夜培養振とう器上で30°Cで生育した。次いで、それぞれの培養物を、メディアをCRAPリン酸制限培地にて希釈1100したSimmons等JImmunolMethods263133147。次いで、カルベニシリンを50μg/mLの濃度で誘導培養物に添加し、培養物を培養振とう器上で30°C、およそ24時間生育した。特に明記しない限り、振とうフラスコ誘導はすべて5mLの容量で行った。誘導された培養物からの非還元型全細胞溶解物を、以下の通りに調製した:11OD600mLの誘導試料を、微量遠心管チューブにて遠心分離した;2それぞれのペレットを、90μLのTE10mMトリスpH7.6、1mMEDTAに再懸濁した;310μLの100mMヨード酢酸SigmaI2512を各々の試料に添加して、任意の遊離システインのブロック及びジスルフィド混合の予防を行った;420μLの10SDSを、各々の試料に加えた。試料をボルテックス混合して、およそ90°Cで3分間加熱し、それから再びボルテックス混合した。試料が室温までに冷却した後、750μLのアセトンを加えてタンパク質を沈殿させた。試料をボルテックス混合し、およそ15分間、室温に置いた。マイクロ遠心機にて5分間、遠心した後、各々の試料の上清を吸引除去し、それぞれのタンパク質ペレットを、50μLdH2O50μL2XNOVEXSDSサンプルバッファに再懸濁した。次いで、試料をおよそ90°Cで4分間加熱し、よくボルテックス混合して、室温まで冷却した。そうして、最終的に5分間の遠心分離を行い、上清をきれいなチューブへ移した。誘導された培養物からの還元型全細胞溶解物を、以下の通りに調製した:11OD600mLの誘導試料を、微量遠心管チューブにて遠心分離した;2それぞれのペレットを、90μLのTE10mMトリスpH7.6、1mMEDTAに再懸濁した;310μLの1MジチオスレイトールSigmaD5545を各々の試料に添加して、ジスルフィド結合を還元した;420μLの10SDSを、各々の試料に加えた。試料をボルテックス混合して、およそ90°Cで3分間加熱し、それから再びボルテックス混合した。試料が室温までに冷却した後、750μLのアセトンを加えてタンパク質を沈殿させた。試料をボルテックス混合し、およそ15分間、室温に置いた。マイクロ遠心機にて5分間、遠心した後、各々の試料の上清を吸引除去し、それぞれのタンパク質ペレットを、10μLの1Mジチオスレイトール40μLdH2O50μL2XNOVEXSDSサンプルバッファに再懸濁した。次いで、試料をおよそ90°Cで4分間加熱し、よくボルテックス混合して、室温まで冷却した。そうして、最終的に5分間の遠心分離を行い、上清をきれいなチューブへ移した。調製後、各々の試料の5-8μLを1.0mmNOVEX製の12トリスグリシンSDSPAGEの10のウェルに流し、~120ボルトで1.5~2時間、電気泳動にかけた。次いで、結果として生じるゲルを、クーマシーブルーで染色するかあるいはウエスタンブロット分析に用いた。ウエスタンブロット分析のために、SDSPAGEゲルを10mMCAPS緩衝液pH113メタノール中のニトロセルロース膜NOVEX上で電気的にブロットした。次いで、膜を、1×NET150mMNaCl、5mMEDTA、50mMトリスpH7.4、0.05トリトンX1000.5ゼラチン溶液を用いて、およそ30分から1時間室温で振とうして反応を遮断した。遮断工程後、抗Fabウエスタンブロット分析のために膜を1×NET0.5ゼラチン抗Fab抗体ヒトIgGFabに対するペルオキシダーゼ抱合ヤギIgG分画;CAPPEL55223溶液中に置いた。抗Fab抗体希釈液は、抗体のロットに従って、1:50000から1:1000000までの範囲とした。あるいは、抗Fcウエスタンブロット分析のために、膜を1×NET0.5ゼラチン抗Fc抗体ヒトFc断片に対するペルオキシダーゼ抱合ヤギIgG分画;BETHYLA80104P41溶液に置いた。抗Fc抗体希釈液は、抗体のロットに従って、1:50000から1250000までの範囲とした。何れの場合の膜も室温で浸透しながら終夜抗体溶液に置いた。翌朝、膜を、1×NET0.5ゼラチンにて最低10分で3回、その後TBS20mMトリスpH7.5、500mMNaClにて15分で1回洗浄した。抗Fab抗体及び抗Fc抗体に結合したタンパク質バンドは、AmershamPharmaciaBiotechECL検出法及びX線フィルムに膜を曝すことによって可視化した。抗cMetFab/c抗体発現についての抗Fabウエスタンブロットの結果を図1に示す。レーン1では完全に折り畳まれて集積した完全長抗体、レーン2では一アーム形Fab/c抗体の発現が示された。抗Fab抗体がFc断片を結合することができないために検出されないことを注記する。非還元試料では、完全長抗cMet抗体とFc断片との共発現により、完全に折り畳まれて集積した完全長抗体から、完全に折り畳まれて集積した一アーム形Fab/c抗体まで、実質的に推移した。還元試料では、完全長抗cMet抗体及び一アーム形抗cMetFab/c抗体について検出された重鎖及び軽鎖の量は同じである。おそらく分泌経路にわずかな補助機能があるために、一アーム形抗cMetFab/cコンストラクトの軽鎖前駆体の量にわずかな増加がみられた。同様に、抗Fcウエスタンブロットの結果を図2に示す。それらもレーン2では完全に折り畳まれて集積した一アーム形Fab/c抗体の発現が示された。抗Fc抗体は軽鎖を結合できないので検出されない。非還元試料では、完全長抗cMet抗体とFc領域との共発現により、完全に折り畳まれて集積した完全長抗体から完全に折り畳まれて集積した一アーム形Fab/c抗体までの推移が示された。加えて、Fcポリペプチド単量体及び二量体も、抗Fcウエスタンブロットで検出される。還元試料では、完全長抗cMet抗体及び一アーム形抗cMetFab/c抗体発現について検出される重鎖の量が同じである。おそらく一アーム形Fab/c抗体コンストラクトにより分泌経路にいくらか補助機能があるために、前駆体Fc断片の量も少ない。上記のデータから明らかなように、一次抗体種が所望の一アーム形Fab/c抗体であるイムノグロブリン集団を生成することは可能である。しかしながら、抗体の完全な形態すなわち完全に折り畳まれて集積された抗cMet完全長抗体は、抗Fab及び抗Fc両方のウエスタンブロット分析によって依然として検出可能だった。抗cmet5D5抗体の完全な形態がcmetレセプターのアゴニストであり、アンタゴニスト効果を必要とする治療的スキームでは望ましくないため、通常、生成される抗体の完全な形態の量を最小限にすることが望ましい。隆起及びキャビティ以下、孔へのノブとも称するを含んでなる一アーム形Fab/c抗cMet抗体の発現及び特徴づけ抗cMetFab/c抗体の調製において完全長抗cMet抗体の形成を更に最小化するために、Merchant等NatureBiotechnology16677681に記載されるように、孔へのノブ突然変異を基本的にFcのCH3ドメインに作製した。コンストラクトは、孔突然変異T366S、L368A、Y407Vを完全長重鎖に、ノブ突然変異T366WをFc断片に導入することによって、一アーム形Fab/c抗cMet抗体pxcM11CHFcKについて調製した。完全長抗cMet抗体pxcM11C、一アーム形Fab/c抗cMet抗体pxcM11CFc及び一アーム形Fab/c孔へのノブ抗cMet抗体pxcM11CHFcKコンストラクトが上記と同様に発現された。全細胞溶解物を調製し、SDSPAGEによって分離し、ニトロセルロースへ転移し、前記のヤギ抗ヒトFab抱合抗体及びヤギ抗ヒトFc抱合抗体を用いて検出した。抗Fabウエスタンブロットの結果を図3に示す。一アーム形Fab/c孔へのノブ抗cMet抗体の折りたたみ及び集積に顕著な改善が示された。加えて、抗Fabウエスタンブロットの結果では、検知されないレベルにまで完全長抗cMet抗体が減少したことが示される。また、抗Fab抗体がFc断片を結合できない点に注意することが重要である。非還元試料では、一アーム形孔へのノブ抗cMet抗体の発現により、完全に折り畳まれて集積された完全長抗体から完全に折り畳まれて集積された一アーム形Fab/c抗体までの実質的な推移が生じる。野生型Fcから孔へのノブFcまで移動する一アーム形Fab/c抗体の折りたたみ及び集積にも顕著な改善がある。還元試料では、完全長であるもの、一アーム形Fab/c及び一アーム形Fab/c孔へのノブ抗cMet抗体について検出される重鎖の量は同じである。また、プロセシングされた軽鎖の量は増加し、一アーム形Fab/c孔へのノブ抗cMetコンストラクトにより軽鎖前駆体が減少したようである。同様に、図4の抗Fcウエスタンブロットの結果は、野生型一アーム形Fab/c抗cMet抗体に対して一アーム形Fab/c孔へのノブの折りたたみ及び集積に顕著な改善がみられる。また、抗Fcウエスタンブロットの結果により、検知されないレベルにまで完全長抗cMet抗体の減少がみられた。抗Fc抗体は軽鎖を結合することができないので検出されない。還元試料では、完全長のもの、野生型一アーム形Fab/c及び一アーム形Fab/c孔へのノブ抗cMet抗体について検出される重鎖の量は同じである。実施例2本発明の抗体の薬物動態学的特徴及び治療有効性材料及び方法材料-前記の8;14ように、HGF及びcMetIgGはGenentechで生産された。NUNCからMaxisorbミクロタイタープレートを購入した。JacksonImmunochemicalから抗hFcを購入した。ZymedからHRPストレプトアビジンを購入した。AmershamIncから3Hチミジンを購入した。MDAMB435細胞はATCCから得た。ピログルタミン酸アミノペプチダーゼはTakaraBiochemicalsから得た。ResearchOrganicsからNHSXビオチンを購入した。MilliporeからイモビロンPSQPVDFを購入した。スーパースクリプトIIRNアーゼH-逆転写酵素は、GibcoBRLからのものであった。TaqポリメラーゼはPerkinElmerCetusから、BakerbondABX、40m孔径はJTBakerから、SPセファロース高性能樹脂はPharmaciaBiotechIncから得た。ビオチン抗PTyrはUpstateBiotechから、TMBペルオキシダーゼ基質はKPLから購入した。抗体及びFab断片の生成抗cMetモノクローナル抗体の生成5D5抗体を含む抗cmetモノクローナル抗体の生成は記載した。例えば、米国特許第5,686,292号;同第5,646,036号;同第6,207,152号;同第6,214,344号及び同第6,468,529号を参照。BALB/cマウスを、第0、7、14、21、28、266、273及び279日目に、MPL/TDMアジュバントに懸濁した2.5μgの可溶性cMetIgG2672616626171をそれぞれ後部足蹠に注入して免疫化した。最後の免疫化の4日後に、リンパ節細胞を回収して、記載されている55251ように、35のポリエチレングリコールを用いてP3/X63Ag8U1骨髄腫細胞811と融合させた。cMet特異的な抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株を、始めに捕獲ELISAによって選択し、その後cMetを発現するBAF3形質転換細胞を用いてフローサイトメトリによってスクリーニングした。更に、選択されたハイブリドーマを、後述するように、cMetIgGへのビオチンHGF結合を阻害する能力について試験した。ハイブリドーマを限界希釈によって二回クローン化し、次いでそれらの拮抗性及び作用性能力について更に特徴づけした。腹水をbalb/cマウスにおいて生産させ、モノクローナル抗体をタンパク質Gアフィニティーカラムを用いて精製した。タンパク質濃度は、吸光係数1.4を用いて280nmの吸光度で測定した。天然のFabの生成及び精製抗体5D5は、20mMリン酸塩、10mMEDTA緩衝液にて終夜透析し、次いで、セントリコン30に7mg/mlまで濃縮した。半量mlの固定されたパパインを消化緩衝液にて洗浄し、次いで10mgの5D5を加えて、200rpmで振盪しながら37°Cで、終夜インキュベートした。1.5倍量mlの結合用緩衝液を混合液に加え、上清をビーズから分離して、結合用緩衝液にて予め平衡化したプロテインAカラムに通した。付加的な結合用緩衝液をカラムに流し、溶出液を1ml分画に回収した。各々の分画の吸光度は280nmで読み取り、Fab断片を含有する溶出液をプールした。タンパク質はPBSにて終夜透析し、吸光係数1.53を用いて280nmの吸光度によりタンパク質濃度を測定した。更にFab断片をゲル濾過によって精製し、残余Fab ́2を除去した。5D5FabのN末端配列決定5D5Fabの一定分量を、4-20の勾配SDSゲル上に分割して、BioRadトランスブロット転移細胞2621003510038中で250mAの定電流で1時間、PVDF膜上に電気的にブロットした。膜を0.1クーマシーブルーR250を含む50メタノールにて0.5分染色し、10酢酸を含む50メタノールにて2-3分間脱色した。膜を水にて完全に洗浄して乾燥させ、Blottカートリッジを用いて、モデル473A自動タンパク質配列決定器にて配列決定を行った。ピークは、Nelson分析機760インターフェイスを用いたJusticeInnovationソフトウェアにて積算した。DECα4044152にて配列解読を行った。5D5重鎖の配列を得るためには、以下のように行う非ブロック化を必要とした。Fab断片を、45°Cで1時間、7mMDTTにて還元し、25°Cで20分、180mMイソプロピルアセトアミドでアルキル化した209109116。次いで、アルキル化されたFab断片を、10mMDTT消化緩衝液を含有する0.1Mリン酸ナトリウムにて、Microcon10中で3回交換し、20μlの消化緩衝液中で45°Cで3時間、1mUピログルタミン酸アミノペプチダーゼによって消化した。次いで、非ブロック化されたFabをPVDFへ移し、上記の通りに配列決定した。5D5Fabのクローニング及び組換え発現N末端配列データを用いて、PCRプライマーを軽鎖及び重鎖の可変領域の5末端に特異的に設定し、3プライマーは各々の鎖のコンセンサスフレームワーク4にアニール化されるように設定したPublicHealthServiceNationalInstitutesofHealthBethesdaMD。また、プライマーは、クローニングのための制限酵素部位が付加されるように設計した。StratageneRNA単離キットを用いてハイブリドーマ5D5の108細胞から抽出した全RNAを、RTPCRの基質として用いた。フレームワーク4特異的なプライマーとSuperscriptIIRNアーゼH逆転写酵素を用いて、標準的条件下にて逆転写を行った。2DMSOが反応混合液に含まれること以外は記載されている通りに、Taqポリメラーゼを用いてPCR増幅を行った。増幅されたDNA断片は、制限酵素SfiI及びRsrII軽鎖又はMluI及びApaI重鎖を用いて消化し、ゲル精製して、発現プラスミドpAK1910163167の誘導体にクローン化した。このベクターpXCA730は部位特異的突然変異82488によって修飾して、STIIシグナル配列と可変ドメインの間、及び、各々の鎖の可変ドメイン及び定常ドメインの接合部に固有の制限酵素部位を含有するようにした。軽鎖及び重鎖の可変ドメインcDNAを、ヒトCk及びCH1ドメインのフレームの上流及びフレーム内に挿入した。ジスルフィド架橋を形成してF2分子を与えうるpAK19の重鎖のC末端システインを取り除いて、抗体のFab型だけが発現できるようにした。Carter等10163167の記載に従って、組換え5D5Fabを大腸菌K12株33B6argFlac169において発現した556370。10Lの発酵からの細胞ペレットを連続的供給遠心分離によって回収し、凍結して-70°Cに保存した。一部のペレットを、120mMMES、pH6及び5mMEDTA5ml/gのペーストからなる抽出緩衝液に懸濁した。ultraturraxを用いておよそ15分間、4°Cで、懸濁液を完全に混合した。次いで、完全細胞を、冷却コイルを取り付けた細胞破砕機に2回通して破壊した。次いで、懸濁液を、pH6に調製してある5貯蔵液を用いて0.1ポリエチレンイミンに調製した。完全細胞及びPEI凝集した細片を、25400×gで30分間、遠心することによって可溶性分画から分離した。上清を、純水を加えて4mS未満の伝導率に調整して、BakerbondABX、40μ孔径のカラム1×10cmに流した。カラムを、50mMMES、5mMEDTA、pH6で平衡化した。全ての処置は線流速100cm/hで行った。調整された上清を流した後に、カラム溶出物の吸光度が基準線と同じになるまで、カラムを平衡化緩衝液で洗浄した。溶出は、0から100mMの硫酸アンモニウムの直線濃度勾配平衡化緩衝液の16カラム容量を用いて行った。カラム分画をSDS‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析し、Fabを含有する分画をプールした。ABXカラムのプールの伝導率を4mS未満まで下げて、25mMMOPS緩衝液pH6.9において平衡化されたSPSepharose高性能樹脂のカラム1×10cmに流した。全ての処置は、線流速100cm/hで行った。流した後、カラムを、平衡化緩衝液の1カラム容量にて洗浄した。次いで、5D5Fabを、0から200mMの酢酸ナトリウムの直線濃度勾配平衡化緩衝液の16カラム容量を用いてカラムから溶出した。カラム分画をSDS‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析し、FAbを含有した分画をプールした。一アーム形5D5タンパク質小規模生成発現プラスミドpxcM11CHFcK上記を用いてEcoli株33D3W3110kanRΔfhuAΔtonAptr3lacIqlacL8ompTΔnmpcfepEdegPを形質転換して、次いで形質転換体をカルベニシリン50μg/mLを添加したLB培地中で30°Cで終夜生育した。LB培養物を、カルベニシリン50μg/mL含有のCRAP培地に100倍希釈し、30°Cで振盪しながらおよそ24時間生育した。少ない分割量を取り除き、抗Fab抗体ヒトIgGFabへのペルオキシダーゼ抱合ヤギIgG分画;CAPPEL55223又は抗Fc抗体ヒトFc断片へのペルオキシダーゼ抱合ヤギIgG分画;BethylA08104P41を用いたウェスタンブロット及びSDS-PAGEによって抗体発現を検査した。次いで、残りの培養物を遠心分離し、抗体精製工程を始めるまで細胞ペーストを-70°Cに凍らせた。一アーム形5D5の精製。冷凍された細胞ペーストを解凍して、10容量の溶解緩衝液25mMトリスHCl、5mMEDTA、pH7.5に懸濁して、遠心分離した。不溶性ペレットは、ポリトロンホモジナイザを用いて溶解緩衝液に再懸濁し、ミクロフルイダイザーを通して細胞を破壊した。ポリエチレンイミン0.1v/vを溶解物に加え、4°Cで1時間撹拌し、その後15000×gで遠心分離した。結果として生じた上清をプロテインA親和性樹脂と混合し、4°Cで終夜撹拌した。樹脂を沈め、上清を流し出し、樹脂を液体クロマトグラフィシステムに付着されたカラムに注入した。カラムを、10mMトリスHCl、1mMEDTA緩衝液、pH7.5の後、0.5MNaClを含む同じ緩衝液にて洗浄し、pH6からpH2への勾配を有する50mMクエン酸ナトリウム、0.1MNaCl緩衝液にて溶出させた。溶出された分画を、直ちに最終濃度2M尿素及びpH5.4に調整して、SDS‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。一アーム形抗cMetを含有する分画をプールして、25mMMES、2M尿素pH5.4にて平衡化したSPセファロースカラム上の陽イオン交換クロマトグラフィを行った。カラムは、0M~1MNaClの勾配を有する25mMMES、pH5.4にて溶出した。SDSPAGE分析後、プールされた溶出液を0.4M硫酸ナトリウム、pH6に調製し、0.4M硫酸ナトリウム、25mMMESpH6にて平衡化したHiPropylカラムに流した。カラムを0.4M~0M硫酸ナトリウムの勾配を有する25mMMES、pH6にて溶出した。結果として生じた溶出液を、SDSPAGE分析後、CentriPrep10を用いて濃縮し、10mM琥珀酸ナトリウム、0.15MNaCl、pH5.0にて平衡化したSuperdex200カラムにてサイズ排除クロマトグラフィを行った。タンパク質濃度は定量的アミノ酸分析で測定した。エンドトキシンレベルはLALアッセイで測定した。これらの抗体調製はその後の分析に用いた。アッセイ細胞培養A549肺カルシノーマ細胞を10FBS添加の最小必須培地中で培養した。既に記載133709718のようにヒトcMetを形質移入したBaF3cMet細胞、及びベクターを形質移入したBaF3ネオ細胞を、10FCS、5WEHI231細胞培養条件培地IL3を含有、2mMグルタミン、βメルカプトエタノール4μl/L、0.5mg/mlG418を添加したRPMI1640中で培養した。U87及びU118神経膠芽腫細胞、7860腎臓カルシノーマ細胞を10FCS含有のRPMI1640中で培養した。HGFcMet結合cMetIgGがミクロタイタープレート上のIgGドメインを介して捕獲される固相システムのビオチンHGFを用いてHGF結合研究を行った。HGFは、20倍モルの過剰なNHSXビオチンと共に0.1MNaHCO3、pH8.5中でインキュベートすることによってビオチン化した。NHSXビオチンを4分割して、室温で撹拌しながら、それぞれを15分間隔で加えた。非抱合型ビオチンを透析によって除去し、ラベルをつけて材料を4°Cで保存した。ミクロタイタープレートは、2μg/mlのAffiniPureウサギ抗ヒトIgGFcを用いてコーティング緩衝液0.05M炭酸塩/重炭酸塩pH9.6中で終夜、4°Cでコートした。プレートは0.5BSApH7.4を含有するPBSによって室温で1時間、ブロックした後、2μg/mlのcMetIgGと共に2時間インキュベートした。次いで、0.01-1000nMの競合物質である非標識HGF、抗cMet5D5mAb、Fab又は一アーム形抗体と共に又はこれらを含まないで53ng/mlのビオチン標識HGFを、RTで1時間、添加した。プレートに西洋わさびペルオキシダーゼHRPストレプトアビジン1:10000希釈、AmershamをRTで1時間、添加した後、ホスファターゼ基質CPニトロフェニルリン酸塩を添加して、405nmの吸光度を測定した。結果を図5に示す。競合的結合アッセイにおいて、一アーム形抗cmet5D5抗体は、抗cmetFabと同様であった。KIRAによるcMetのチロシンリン酸化cMetのチロシンリン酸化は、Sadick等の方法に基づいてサンドイッチELISAで測定した。その測定方法は可溶化されたレセプターが抗レセプター抗体でコートされたプレート上で捕獲され、抗PTyrで検出されるものである235207214。106/mlのU87細胞を96ウェルプレート中で終夜、37°Cでプレート培養した。次いで、培地をMEM、0.1FBSに交換して、HGF及び/又は抗体と共に10分間置いた。次いで、細胞を100μlの溶菌緩衝液20mMトリス、pH7.5、150mMNaCl、1mMNa2EDTA、1nMEGTA、1トリトン、1×プロテアーゼインヒビター反応混液Sigma、1×ホスファターゼインヒビター反応混液IISigmaにてプレート振とう器上でRTで30分間抽出し、氷上又は-70°Cに保存した。溶解物を抗cMetmAb1949Genentechでコートしたプレートに加えて終夜置いた。ホスホチロシンcMetは、1:4000希釈のビオチン化抗ホスホチロシンの後にHRPストレプトアビジン及びTMBを用いた発色により検出した。総cMetは、1:10000抗cMet抗体を用いて同様に測定した。結果を図6に示す。細胞増殖、移動アッセイBaF3は、通常cMetを発現せず、HGFに反応しないマウスIL3依存性リンパ系細胞である。しかしながら、ヒトcMetの正常な完全長cDNAの形質移入によって得たBaF3hMet133709718では、HGFは、IL3の非存在下で増殖及び生存を促進する。BaF3hMet及びBaF3neo細胞は通常、IL3の起源として、RPMI1640、5ウシ胎児血清、4μl/LβME、100U/mlペニシリン、100μg/ml硫酸ストレプトマイシン、2mMLグルタミン及び5WEHI条件培地にて継代した。HGF依存性増殖を測定するために、3日間の治療の後、25μlAlarmaBlueを加えて4時間後の蛍光強度を測定することによって細胞数を定量化した。特異性の対象のために、一アーム形5D5も、IL3にて刺激したBaF3hMet細胞において試験した。結果を図7に示す。MDAMB435PGL細胞及びU87細胞の移動は、変性ボイデンチャンバアッセイを用いて評価した。10μg/mlのフィブロネクチンでコートした5μm孔のポリカーボネートを有する上部試験糟に細胞を播いた2×104/ウェル。上記の量の5D5Fab又は一アーム形抗体と共に又は伴わない100ng/mlのHGFを、下部試験糟中の培地に加えた。細胞は終夜培養した。細胞は特別なスポンジ綿を用いたフィルター膜の上側から濾し出され、フィルタの下面に移動した細胞は固定されて、YOPRO3ヨウ化物で着色され、それから蛍光顕微鏡検査法によって計数した。結果を図8に示す。薬物動態学OA5D5又は5D5Fab5mg/kgをヌードマウスに静脈内注射した。一定の時間点で、4匹のマウスから血清試料を回収して、cMetIgGでコートしたプレート上で捕獲されるサンドイッチELISAによって検定して、次いで軽鎖特異的な二次抗体を用いて検出した。結果を図9Aに示す。一アーム形5D5抗体の半減期は、そのFab相対物と比較して有意に増加した。OA5D5が生体内で分解するかどうかを調べるために、7日目のPK試料からのOA5D5でELISAによる40ng相当の血清量を還元又は非還元条件下でSDSPAGEゲルに流した。ゲルをニトロセルロース上に転写して、HRP抱合抗ヒトFcによってブロットした1:5000、ヒト特異的、JacksonLabs。対照として、ナイーヴマウスからの血清の等量を平行に流した。結果を図9Bに示す。血清一アーム形5D5抗体は投与後7日目では完全であった。インビボ腫瘍有効性研究2500000個のA549ヒト肺癌細胞又はU87MG細胞自己分泌HGFを分泌してcMetを発現するヒト神経膠芽腫を皮下的に接種した4~6週齢の雌性胸腺欠損ヌードマウスを用いて有効性研究を行った。一アーム形5D5抗体、5D5Fab抗体又は対照抗体抗gp120を用いた処置を、腫瘍細胞接種すなわちアジュバント治療又は腫瘍が~150mm3に成長した後の何れかのときに開始した。全ての抗体は、週に1回で4週間、腹膜内投与した。一アーム形5D5抗体だけがアジュバント治療投薬計画において抗gp120対照を用いて試験した点を注記する。図10は、U87MG細胞の接種によって生成される腫瘍の結果を示す。図10Aアジュバント治療及び図10B腫瘍発達後の治療に示すように、一アーム形5D5抗体は、腫瘍の後退を阻害するかまたは引き起こすことが可能であった。図10Bに示すように、一アーム形5D5抗体は、そのFab相対物と比較して優れた治療有効性を有した。面白いことに、100nMの一アーム形5D5抗体は、インビトロでのU87細胞数に対する効果が最小であった。A549細胞の接種から生成される腫瘍の治療の結果は陰性であった。これは特異的対照であり、U87腫瘍に対する一アーム形5D5抗cmet抗体の効果が非特異的毒性によるものでないことが確認された。また、一アーム形5D5抗cmet抗体は、他の確立されたインビボ腫瘍モデル技術、例えば米国特許第6271342号に記載される腫瘍試験モデルを用いた腫瘍発達調整能力について試験できる。一アーム形5D5抗体が30mg/kg、2×/週で投与される場合に、MRC5線維芽細胞ATCCCCL171を共接種したBxPC3膵臓ATCC番号CRL1687細胞の腫瘍成長は50阻害された。他の例証となるデータを以下に一覧にする:一アーム形5D5抗体、q7dすなわち7日間毎日、10mg/kgを用いた腫瘍試験RXF1220腎臓における腫瘍成長の~30阻害;10mg/kg、q7dを用いた腫瘍試験PAXF736膵臓;10mg/kg、q7dを用いた腫瘍試験GXF97胃;30mg/kg、q7dを用いた腫瘍試験LXFA526肺;30mg/kg、q7dを用いた腫瘍試験LSFA297肺;における腫瘍成長の<20の阻害;10mg/kg、q7dの一アーム形5D5抗体を用いたA549異種移植片において活性は観察されなかった;30mg/kg、q7dを用いたLXFA650肺において活性は観察されなかった。"