ADARsアデノシンデアミナーゼ、RNA特異的活性を決定するためのinvitro法であって、a編集酵素ADAR1a、ADAR1b、およびADAR2、ならびにホスホジエステラーゼサブタイプ8APDE8Aを発現する哺乳類細胞を含有する生体サンプルを得る工程;b細胞抽出物において、前記細胞抽出物から得られた細胞RNA抽出物において測定されたPDE8AmRNA前駆体の編集プロフィール、好ましくは、前記PDE8AmRNA前駆体の同定された各アイソフォームの平均比率を表す前記編集プロフィールを決定する工程;c工程bで得られた特性を前記哺乳類細胞と、ADARs活性が既知である対照細胞で得られたPDE8AmRNA前駆体編集プロフィールとで比較する工程を含んでなる、方法。患者がADARsにより触媒されるmRNA前駆体編集機構の変更に関連する病状を呈するかどうか、または前記病状を発症するリスクがあるかどうかを診断または同定するためのinvitro法であって、a被験患者から編集酵素ADAR1a、ADAR1b、およびADAR2、ならびにPDE8Aを発現する細胞を含有する生体サンプル、好ましくは、PBMC末梢血単核細胞を含有する生体サンプルを得る工程;b前記細胞を含有する生体サンプルから得られた細胞RNA抽出物において測定されたPDE8AmRNA前駆体の編集プロフィール、好ましくは、前記PDE8AmRNA前駆体の同定された各アイソフォームの平均比率を表す前記編集プロフィールを決定する工程;c前記患者がこのような病状を呈するかどうか、またはこのような病状を発症するリスクがあるかどうかを、工程bにおいて得られたPDE8AmRNA前駆体の編集プロフィールと、正常な患者および/またはこのmRNA編集機構の変更に関連する病状を示す患者に関して得られたPDE8AmRNA前駆体の対照編集プロフィールとを比較することによって同定する工程を含んでなる、方法。ADARsにより触媒されるmRNA前駆体またはmRNA編集機構の変更に関連する病状を有するか、または前記病状を呈するリスクがある患者において治療的処置の有効性をモニタリングするためのinvitro法であって、a前記処置の前と前記処置中の少なくとも1期間の後に前記患者から、編集酵素ADAR1a、ADAR1b、およびADAR2、ならびにPDE8Aを発現する細胞を含有する生体サンプルを得る工程;b前記生体サンプルからの細胞抽出物において、前記細胞抽出物から得られた細胞RNA抽出物において測定されたPDE8AmRNA前駆体の編集プロフィール、好ましくは、前記PDE8AmRNA前駆体の同定された各アイソフォームの平均比率を表す前記編集プロフィールを決定する工程;c工程bで得られた結果を、処置前と処置中の前記期間の後に前記患者から得られた前記生体サンプル細胞抽出物間で比較する工程を含んでなる、方法。前記処置中の前記期間の後に測定された前記PDE8AmRNA前駆体編集プロフィールの改変が有意でなければ、前記治療的処置の有効性がないことを示す、請求項3に記載の方法。前記期間後に測定されたPDE8AmRNA前駆体編集プロフィールが、ADARsにより触媒されるmRNA前駆体編集機構の変更に関連する病状を呈しないか、または前記病状を呈するリスクのない被験体からの生体サンプル対照に関して得られたものと有意に同じ特性を有することが、前記処置の有効性を示す、請求項3および4に記載の方法。患者における投与後の試験化合物の潜在毒性または副作用を決定するためのinvitro法であって、前記化合物がADARsにより触媒されるmRNA前駆体またはmRNA編集機構の変更に関連する病状を予防または治療するその能力に関して試験され、a編集酵素ADAR1a、ADAR1b、およびADAR2、ならびにホスホジエステラーゼサブタイプ8APDE8Aを発現する哺乳類細胞を含有する生体サンプルを得る工程;b前記哺乳類細胞を被験化合物と接触させる工程;c細胞抽出物において、前記細胞抽出物から得られた細胞RNA抽出物において測定されたPDE8AmRNA前駆体の編集プロフィール、好ましくは、前記PDE8AmRNA前駆体の同定された各アイソフォームの平均比率を表す前記編集プロフィールを決定する工程;d工程cで得られた結果を、工程bで得られた前記被験化合物で処置された細胞と非処置対照細胞とで比較する工程を含んでなる、方法。ADARsにより触媒されるmRNA前駆体またはmRNA編集機構ADAR依存性のAからIへのmRNA前駆体編集機構の変更に関連する病状の処置に有用な治療化合物を選択するためのinvitro法であって、a編集酵素ADAR1a、ADAR1b、およびADAR2、ならびにPDE8Aを発現する哺乳類細胞を含有する生体サンプルを得る工程;b前記哺乳類細胞と被験化合物を接触させる工程;c細胞抽出物において、前記細胞抽出物から得られた細胞RNA抽出物において測定されたPDE8AmRNA前駆体の編集プロフィール、好ましくは、前記PDE8AmRNA前駆体の同定された各アイソフォームの平均比率を表す前記編集プロフィールを決定する工程;d工程cで得られた結果を、前記被験化合物で処置された細胞と非処置対照細胞とで比較する工程を含んでなる、方法。請求項1~5の工程bおよび請求項6~7の工程cが、前記細胞の細胞抽出物における前記編集酵素ADAR1a、ADAR1bおよびADAR2の量的発現を決定することをさらに含んでなり;かつ請求項1~5の工程cおよび請求項6~7の工程dが、工程cで得られた結果を、ADAR発現に関して処置細胞と非処置対照細胞とで比較することをさらに含んでなる、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。請求項1~5の工程bおよび請求項6~7の工程cにおいて、細胞RNA抽出物において測定されたPDE8AmRNA前駆体の編集プロフィールと前記編集酵素ADAR1a、ADAR1bおよびADAR2の量的発現が同じ細胞抽出物において決定される、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。前記編集酵素ADAR1a、ADAR1bおよびADAR2の量的発現が、前記編集酵素のmRNA発現の測定によるか、または細胞抽出物において発現された前記編集酵素タンパク質の測定によって決定される、請求項8または9に記載の方法。前記編集酵素ADAR1a、ADAR1bおよびADAR2の量的発現が前記編集酵素のmRNA発現の測定によって決定され、好ましくは、PDE8AmRNA前駆体の編集プロフィールの決定に用いられたものと同じ全RNA細胞抽出物において決定される、請求項9に記載の方法。工程aにおいて、ADARSアイソタイプADAR1a、ADAR1bおよびADAR2ならびにPDE8Aを発現し得る前記哺乳類細胞が進化した霊長類に由来する、請求項1~11のいずれか一項に記載の方法。前記哺乳類細胞がヒト細胞またはヒト由来細胞である、請求項12に記載の方法。工程aにおいて、ADARSアイソタイプADAR1a、ADAR1bおよびADAR2ならびにPDE8Aを発現し得る前記哺乳類細胞が、白血球を含有する血液サンプル、大脳皮質からなる生体サンプルの群から選択される、被験体または患者の生体サンプルに由来する、請求項1~13のいずれか一項に記載の方法。工程aにおいて、ADARSアイソタイプADAR1a、ADAR1bおよびADAR2ならびにPDE8Aを発現し得る前記哺乳類細胞が、細胞系統に由来する細胞を含有する生体サンプルに由来する、請求項1~13のいずれか一項に記載の方法。工程aにおいて、ADARSアイソタイプADAR1a、ADAR1bおよびADAR2ならびにPDE8Aを発現し得る前記哺乳類細胞が、進化した霊長類の腫瘍細胞系統、好ましくは、神経芽腫細胞系統、膠芽腫細胞系統、星状細胞腫細胞系統、より好ましくは、ヒト由来のものからなる群から選択される細胞系統ヒト神経芽腫SH-SY5Y細胞系統が最も好ましいに由来する細胞を含有する生体サンプルに由来する、請求項15に記載の方法。工程aにおいて、ADARSアイソタイプADAR1a、ADAR1bおよびADAR2ならびにPDE8Aを発現し得る前記哺乳類細胞が、ADAR1a、ADAR1bおよびADAR2アイソタイプから選択される進化した霊長類のADARSアイソタイプ、または進化した霊長類のPDE8Aのうち少なくとも1つをコードする核酸を担持するベクターによって形質転換されてもよい、組換え細胞系統に由来する細胞を含有する生体サンプルに由来する、請求項1~13のいずれか一項に記載の方法。前記ADARsにより触媒されるmRNA前駆体編集機構の変更に関連する病状が、ADARsにより触媒される5-HT2c受容体5-HT2CRmRNA編集機構;ADARsにより触媒されるGluR-B受容体mRNA編集機構;ADARsにより触媒されるKV1-1カリウムチャネルmRNA編集機構;ADARsにより触媒されるFlnAまたはBlcapmRNA編集機構;ADARsにより触媒される感染後ウイルスRNAmRNA編集機構の変更に関連する病状から選択される病状である、請求項2~16のいずれか一項に記載の方法。前記ADARsにより触媒されるmRNA前駆体またはmRNA編集機構の変更に関連する病状が、PDE8AイントロンのAからIへのmRNA前駆体編集の変更に関連する精神症候群、神経症候群、免疫症候群および変性症候群からなる群から選択される、請求項18に記載の方法。前記病状がADARsにより触媒される5-HT2C受容体mRNA編集機構に関連する場合、精神障害、統合失調症、鬱病、双極性疾患、自殺または異常摂食行動食欲不振症、肥満、軽度認知障害MCI、癲癇、アルツハイマーまたは慢性疼痛症候群からなる群から選択される、請求項18または19に記載の方法。前記病状がADARsにより触媒されるGluR-B受容体mRNA編集機構に関連する場合、MCI、癲癇、アルツハイマーおよび筋萎縮性側索硬化症ALSからなる群から選択される、請求項18または19に記載の方法。前記哺乳類細胞が5-HT2C受容体をさらに発現し、請求項1~5の工程bおよび請求項6~7の工程cが、5-HT2C受容体mRNAの編集プロフィールを決定することをさらに含んでなり;かつ請求項1~5の工程cおよび請求項6~7の工程dが、5-HT2C受容体mRNAの編集プロフィールに関して得られた結果を比較することをさらに含んでなる、請求項1~21のいずれか一項に記載の方法。前記細胞抽出物から得られた細胞RNA抽出物において測定されたPDE8AmRNA前駆体の編集プロフィール、好ましくは、前記PDE8AmRNA前駆体の同定された各アイソフォームの平均比率を表す前記編集プロフィールが、アイソフォームI、J、K、L、MもしくはN、または編集された編集部位I、J、K、L、MもしくはNを少なくとも含んでなるPDE8AmRNA前駆体アイソフォームのうち少なくとも1つの決定および/または定量を少なくとも含んでなる、請求項1~22のいずれか一項に記載の方法。前記細胞抽出物から得られた細胞RNA抽出物において測定されたPDE8AmRNA前駆体の編集プロフィール、好ましくは、前記PDE8AmRNA前駆体の同定された各アイソフォームの平均比率を表す前記編集プロフィールが、PDE8AmRNA前駆体アイソフォームAB、ABC、ABE、ABEF、ABEFG、ABG、B、BC、BD、BE、BEG、BF、BFG、BG、Mまたは非編集アイソフォームnedの決定および/または定量を少なくとも含んでなる、請求項1~22のいずれか一項に記載の方法。前記の測定されたPDE8AmRNA前駆体の編集プロフィールが、アイソフォームN、または編集された編集部位Nを少なくとも含んでなるPDE8AmRNA前駆体アイソフォームのうち少なくとも1つの決定および/または定量を少なくとも含んでなる、請求項23に記載の方法。前記の測定されたPDE8AmRNA前駆体の編集プロフィールが、非編集アイソフォームnedの決定および/または定量を少なくとも含んでなる、請求項22~24のいずれか一項に記載の方法。前記の測定されたPDE8AmRNA前駆体の編集プロフィールが、アイソフォームnedおよびB、好ましくは、少なくとも非編集BおよびABアイソフォーム、より好ましくは、少なくとも非編集B、ABおよびBCアイソフォームの決定および/または定量を少なくとも含んでなる、請求項23または24に記載の方法。進化した霊長類細胞、好ましくはヒトの細胞RNA抽出物において評価される5PDE8AmRNA前駆体の編集プロフィール、好ましくは、同定された各アイソフォームの平均比率を表す前記編集プロフィールが、RTとその後の、2回のPCRを含んでなるネステッドPCRにより測定され、a1回目のPCRが下記のプライマーセット:フォワード:PDE8A-1FWD配列番号13リバース:PDE8A-1REV配列番号12により行われ、b2回目のPCRが下記のプライマーセット:フォワード:PDE8A-2FowFAM配列番号10リバース:PDE8A-2RevVIC配列番号11により行われる、請求項1~27のいずれか一項に記載の方法。ADARs特異的アイソフォームが前記方法で決定される場合に、進化した霊長類、好ましくはヒト、ADARmRNAPCR増幅に特異的なプライマー対が、ADAR1-150アイソフォームmRNA増幅用のフォワード:配列番号14リバース:配列番号15ADAR1-110アイソフォームmRNA増幅用のフォワード:配列番号16リバース:配列番号17ADAR2mRNA増幅用のフォワード:配列番号18リバース:配列番号19からなる群から選択される、請求項1~28のいずれか一項に記載の方法。各アイソフォームの分離および同定を含むPDE8AmRNA前駆体前駆体の編集プロフィールの定量が、キャピラリー電気泳動一本鎖構造多形CE-SSCPにより行われる、請求項28および29に記載の方法。a下記のプライマーセット:配列番号13配列番号12およびb下記のプライマーセット好ましくは標識される:配列番号10配列番号11を含んでなる、PDE8AmRNA前駆体の編集プロフィールを決定するためのキット。a編集酵素ADAR1a、ADAR1bおよびADAR2ならびにPDEA8、場合により、セロトニン2C受容体5HTR2Cを発現する、進化した霊長類細胞系統、好ましくはヒト細胞系統由来の哺乳類細胞;およびb前記哺乳類細胞のRNA抽出物に存在し得るPDE8AmRNA前駆体の編集プロフィールを、2回のPCRを含んでなるネステッドPCRにより決定するための2つのプライマーセット;および/またはc場合により、編集酵素ADAR1a、ADAR1bおよびADAR2の量的発現を定量的Q-PCRにより測定するためのプライマーセットを含んでなるPDE8AmRNA前駆体の編集プロフィールを決定するためのキット。前記哺乳類細胞が進化した霊長類の腫瘍細胞系統、好ましくは、膠芽腫、星状細胞腫または神経芽腫細胞系統、好ましくは、ヒト神経芽腫細胞系統、より好ましくは、ヒト神経芽腫SH-SY5Y細胞系統に由来する、請求項32に記載のキット。bの2つのプライマーセットが、a下記のプライマーセット:配列番号13配列番号12およびb下記のプライマーセット好ましくは標識される:配列番号10配列番号11である、請求項32および33に記載のキット。実施例I:材料および方法1-細胞培養、IFNα処置、細胞溶解およびRNA抽出SH-SY5Yヒト神経芽腫細胞系統をECACC参照94030304、ロット番号06H021から購入した。細胞を、10透析済みFCSPAA、参照A15-507、ロット番号A50708-0050、2mMグルタミンSigma、G7513およびAntibiotic-AntimycoticStabilized1倍混合物Sigma、参照A5955を添加した高グルコースD-MEM培地Sigma、参照D6546中、37°C、5CO2の加湿雰囲気下で培養した。hIFNα処置の前日、SH-SY5Y細胞を8枚の異なる6ウェルプレートに7.105細胞/ウェルの密度で播種した。翌日、培養培地を除去し、細胞を適正な濃度のhIFNαPBLbiomedicallaboratories、参照111001-1、ロット番号3734とともに48時間インキュベートした。試験当日に、hIFNα保存溶液-80°Cで保存した無菌1倍D-PBS中105I.U/mlを氷上で解凍した後、FCSおよびAntibiotic-Antimycoticを添加したD-MEMで終濃度が1、10、100、1000および1000IU/mlとなるように即希釈した。各ウェルにおいて、細胞を2mlの検量線用溶液で処理した。保存溶液のアリコートを一度だけ用いた。対照ビヒクルとしては、細胞を、添加を行った2mlのD-MEMで処理した。インキュベーション48時間後、培地を排出し、1試験条件8ウェルに相当する細胞を、供給者が記載しているように、600μlのPLT溶解バッファーQiagen、RNeasyPlusミニキット、参照74134中でそのまま溶解させた。RNAの単離および精製は、本質的に製造者Qiagen、RNeasyPlusミニキット、参照74134が記載しているように行った。ホモジナイゼーションのため、細胞溶解液をまず、2ml回収試験管内に置いたQIAシュレッダースピンカラムQiagen、参照79656に通した。次に、残留するゲノムDNAを除去するために、流出液をRNeasyPlusミニキットのgDNAEliminatorスピンカラムに移した。その後、RNeasyスピンカラム上でRNAを精製し、40μlのRNアーゼ不含水で溶出させた。溶出したRNAはさらなる試験のために氷上で維持するか、-30°Cで保存した。各精製から得られた全RNAの量を、Qubit蛍光計Invitrogen、参照Q32857およびQuant-ITRNABRアッセイInvitrogen、参照Q10211を用いて測定した。RNAの品質は、1μgの材料を非変性1.5アガロースゲルにのせることによって確認した。28Sおよび18SrRNAに相当するバンドの強度を各サンプルに対して確認した。2-ヒト全血からのPBMCの単離およびRNA抽出血液サンプル2×5mlをヘパリン処理試験管に採取し、プールし、等容量のCa2およびMg2不含1倍PBSリン酸緩衝生理食塩水無菌溶液で希釈した。予温した3mlの分離媒体Ficoll-PaquePlus、GEHealthcareBio-SciencesAB、参照17-1440-02を満たした2本のLeucoSepチューブGreinerBio-One、参照163289または163290を室温にて1000gで30秒遠心分離した。希釈した血液量の半量を2本の分離媒体含有LeucoSepチューブのそれぞれに注意深く注いだ。1000g、室温で10分の遠心分離の後、高密度細胞画分を回収し、プールしたリンパ球/PBMC=白いリング。次に、細胞を10mlのCa2およびMg2不含1倍PBS無菌溶液で洗浄した。250gで10分の遠心分離後、乾燥ペレットを1mlのTRIzol試薬Invitrogen中で破砕した。下記の相分離およびRNA沈降工程を製造者TRizol試薬、Invitrogenの説明書に従って行った。RNAペレットを1mlの75エタノールで2回洗浄し、乾燥させ、50μlのRNアーゼ不含水に再懸濁させた。RNA濃度は、Qubit蛍光計Invitrogen、Q32857およびQuant-ITRNABRアッセイInvitrogen、参照Q10211を用いて測定した。3-CE-SSCP用の標準編集アイソフォームの構築cDNAの合成前に、1μgの全RNAヒト末梢血白血球全RNA、Clontech、参照636580[53名の男/女白色人種、年齢:20~50のプール]およびヒト大脳皮質全RNA、Clontech、参照636561[10名の男/女白色人種、年齢:20~68のプール]を37°Cで30分、1単位のRQ1RNアーゼ不含DNアーゼPromega、参照M610Aで処理した。1μlの停止溶液20mMEGTA、Promega、参照パート番号M199Aを加えることにより反応を停止させた後、酵素の変性とRNAの線状化の双方のために65°Cで10分加熱した。その後すぐにRNAを含有する試験管を氷上に置き、維持した。次に、DNアーゼで処理したRNAを、RT-PCRsystemPlusTaqInvitrogen、参照11146-032とヒトPDE8A遺伝子のイントロン9内に置かれた遺伝子特異的プライマーPDE8A-RT:配列番号5を用いて逆転写させた。202bpの断片を生じるPCR反応最終容量50μlを、2μlの逆転写産物に対して、1単位のPlatinumPfxDNAポリメラーゼInvitrogen、参照11708-013とイントロン9特異的プライマーフォワードプライマー:配列番号6およびリバースプライマー:配列番号7;終濃度各0.3μΜを用いて行った。95°Cで5分の変性工程後、PCRは、35サイクル95°Cで30秒、62°Cで30秒、10サイクル目以降、1サイクルごとに0.5°C減温、および68°Cで30秒、および68°Cで2分の最終伸長工程の後にその最終点に達した。増幅産物のアリコート5μlを用いて2アガロース分析ゲル上でアンプリコンの量と品質を確認した。各PCR反応の残りの45μlを分取2アガロースゲルで泳動させた。長波長UV光下で、PCR産物を含有するアガローススライスを切り取った後、QIAquickゲル抽出キットQiagen、参照28704を用いてDNAを精製した。精製したPCR産物をpUC57ベクター中へのクローニングおよび配列決定のためにGeneCustに送った。両組織源大脳皮質および白血球から得られた150のクローンの配列決定を行った。配列分析はBiocortechで行い、各編集アイソフォームの存在度を定量した。次に、種々の編集アイソフォームに相当するプラスミドを増幅し、CE-SSCP試験で標準として用いた。4-逆転写およびネステッドPCRヒト全血RNAを、PAXgeneBloodRNAキット50PreAnalytiX、参照762174を製造者の説明書に従って用いて抽出した。全RNAをRQ1RNアーゼ不含DNアーゼPromega、参照M610Aで37°Cにて30分処理した。1μlの停止溶液20mMEGTA、Promega、参照パート番号M199Aを加えることにより反応を停止させた後、酵素の変性とRNAの線状化の双方のために65°Cで10分加熱した。その後すぐにRNAを含有する試験管を氷上に置き、維持した。1μg、500ng、250ng、125ngまたは62.5ngのDNアーゼ処理済みRNAを、ThermoscriptRT-PCRsystemPlusTaqInvitrogen、参照11146-032とヒトPDE8A遺伝子のイントロン9内に置かれた遺伝子特異的プライマーPDE8A-RT:配列番号5を用いて逆転写させた。495bpの断片を生じる1回目のPCR反応最終容量25μlを、1μlの逆転写産物に対して、1単位のPlatinumTaqDNAポリメラーゼInvitrogen、参照11146-032とイントロン9特異的非標識プライマーフォワードプライマー:配列番号8およびリバースプライマー:配列番号9;終濃度各0.3μΜを用いて行った。95°Cで3分の変性工程の後、PCRは、35サイクル95°Cで30秒、50°Cで30秒、および72°Cで30秒、および72°Cで2分の最終伸長工程の後にその最終点に達した。この1回目のPCRの産物を2アガロース分析ゲル上で確認した後、2回目のPCRのために1:100希釈した。175bpの断片をもたらす、この2回目の反応最終容量25μlを、1:100希釈液1μlに対して、1単位のPlatinumPfxDNAポリメラーゼInvitrogen、参照11708-013とイントロン9特異的標識プライマーフォワードプライマー:配列番号10およびリバースプライマー:配列番号11;終濃度各0.3μΜを用いて行った。94°Cで4分の変性工程の後、PCRは、35サイクル95°Cで30秒、50°Cで30秒、および68°Cで30秒、および68°Cで2分の最終伸長工程の後にその最終点に達した。増幅産物のアリコート5μlを用いて2アガロース分析ゲル上でアンプリコンの量と品質を確認した。他のRNA源Tヘルパー/インデューサーリンパ球CD4陽性からの全RNA、YorkshireBioscience、参照N1121;ヒト末梢血白血球全RNA、Clontech、参照636580;ヒト大脳皮質全RNA、Clontech、参照636561およびPBMCまたはSH-SY5Y神経芽腫細胞系統からの全RNAについては、500ngの全RNAを逆転写させ、得られたcDNAを上記のようにネステッドPCRにより増幅させた。5-リアルタイムPCR分析によるADAR1a-p150mRNA発現の定量SH-SY5Y細胞におけるADAR1amRNAの発現レベルを定量するために、第一鎖cDNAを逆転写のより合成し上記の通り、TaqMan定量的リアルタイムPCR分析AppliedBiosystemsを行った。定量的PCRに用いたプローブおよびプライマーはAppliedBiosystemsから入手したものであったGeneExpressionAssays、Assay-On-Demand:ADAR1a:参照Hs01020780_mlヒトGAPDH製品番号4326317E;AppliedBiosystemsを各マルチプレックスPCRにおいて内部対照として含めた。Q-PCRとその後の分析を、96ウェルブロックStepOnePlusリアルタイムPCRシステムAppliedBiosystemsを用いて行った。総てのサンプルにおける標的遺伝子発現の定量を、式Ct標的-CtGAPDH=ΔCt式中、Ctは閾値サイクル数であるによってGAPDH発現に対して正規化した。非処理細胞からのサンプルの平均ΔCt値を求め、IFNα処理細胞に相当するサンプルの参照点として用いた。個々の変動を含む、非処理細胞と処理細胞との差を、式ΔCt個々の処理サンプル-ΔCt非処理サンプルの平均=ΔΔCtにより計算した。各サンプルにおける標的遺伝子発現の変化n倍を、2ーΔΔCtにより計算し、それから平均および標準偏差SDを導いた。6-キャピラリー電気泳動による一本鎖cDNA断片の分離CE-SSCPFAM標識およびVIC標識cDNA断片をそれらの独特な一本鎖構造多形SSCPの手段によって分析するために、蛍光PCR産物1:20~1:200希釈液1μlおよび脱イオン化ホルムアミド11μlを、移動標準と編集アイソフォーム標準の混合物0.5μlに加えた。移動標準は、ROX蛍光色素EurofmsMWGoperonsで標識された種々のサイズのPCRアンプリコンである。それらはキャピラリー内の電気泳動移動の較正のために用いられる。編集アイソフォーム標準FAM標識されたものとVIC標識されたものの双方構造は上記は、種々のサンプル中に存在する種々の編集アイソフォームを明確に同定するために用いられる。添加前に、サンプルと標準の混合物を90°Cで2分間変性させ、その後すぐに氷上で冷やした。非変性電気泳動は、ABIPRISM登録商標3100-AvantGeneticAnalyzerAppliedBiosystemsにて、グリセロールを含まない7POP商標ConformationalAnalysisPolymerAppliedBiosystems、1倍Tris-ホウ酸-EDTAを満たした80cm長のキャピラリーにより行った。15kVで3分間予備泳動を行った後、サンプルを2kVで15秒間注入し、温度を厳密に24°Cに制御して15kVで105分間電気泳動を行った。これらの条件で、各編集アイソフォームに対して個々の保持時間を得た。RNA編集のCE-SSCP分析に用いた手順は、Poyauおよび共同研究者ら16により文献に詳細に記載されている。7-複雑な混合物中の各cDNA形態の同定および相対的定量ABIPRISM登録商標3130xltGeneticAnalyzerから得られた生データをPeakFit登録商標v4.11ソフトウエアによるシグナルプロセシングのために抽出した。ベースラインの処理および各電気泳動特性FAM標識断片またはVIC標識断片の正規化の後、種々の編集されたアイソフォームの相対存在量を、独自の時間単位でアイソフォームおよびサンプルシグナルのデコンボルーションを可能とする自家製ソフトウエアによって定量した。8-タンパク質抽出およびウエスタンブロット分析培養培地の排出後、SH-SY5Y細胞をリン酸緩衝溶液PBS、GibcoInvitrogenCorporationで2回洗浄し、破砕し、150mMNaCl、5mMEDTA、1TritonX-100、0.1デオキシコール酸ナトリウム、10mMTris-HCl[pH8.0]を含有し、プロテアーゼ阻害剤1mMフッ化フェニルメチルスルホニルおよびComplete商標ミニプロテアーゼ阻害剤カクテル[Roche]1錠を添加した可溶化バッファー中、4°Cで2時間可溶化させた。次に、この溶解液を4°Cにて13.000xgで10分間遠心分離して細胞残渣をペレットとした。上清透明溶解液に存在するタンパク質をQubit蛍光計Invitrogen、Q32857およびQuant-ITタンパク質アッセイInvitrogen、参照Q33211を用いて定量した。各試験条件に対応する透明溶解液75μgを4~20Tris-HClゲルBio-Rad、CriterionPrecastGels参照345-0033上、100Vにて3時間分離した。次に、タンパク質全細胞抽出物からの透明溶解液をニトロセルロース膜ニトロセルローストランスファーメンブランProtranBA85、SchleicherandSchuellに、Towbinバッファーと半乾燥エレクトロトランスファーデバイスBio-Radを用いて転写した。転写後、膜をアジ化ナトリウム0.1を添加したTBST10mMTris-HCl[pH8.0]、150mMNaCl、0.05Tween20中5の脱脂乾燥ミルク中で2時間ブロッキングした。その後、この膜を同じバッファーで1:200希釈した一次抗体Santa-Cruz、抗PDE8AC-15参照sc-17232とともに室温で16時間インキュベートした。TBSTで数回洗浄した後、ブロットを1:10000希釈したAlexaFluor680抗ヤギ二次抗体Invitrogen、A21088とともにインキュベートした。その後、シグナルをOdyssey装置LiCorBiosciencesで読み取った。9-特に5-HT2C受容体の編集プロフィールの決定のためのCE-SSCP法CE-SSCPの決定に用いた方法は、すでにヒトサンプル2008年6月13日に出願された特許PCT/EP2008/057519、および2009年12月17日に出願された特許PCT/EP2009/067464に記載されている。実施例II:PDE8AのAからIへの編集はヒトを含むより進化した霊長類に特異的なものである興味深いことに、図4に示されるように、PDE8Aヒト遺伝子A、B、C、D、E、FおよびGのイントロン9において編集されたことが表されている総てのアデノシンは、チンパンジーの対応するイントロン配列において保存されている。全体の同一性極めて高く=428/43299、これらの2配列のアライメントにはギャップは存在しない=0/4320。これら2つのイントロン間のこの極めて高い配列の、およびおそらくは二次構造の類似性は、これらのアデノシン残基がヒト配列の場合と同様にチンパンジーでも編集される可能性があることを強く示唆する。アカゲザル配列において、これらのアデノシンは一部が保存されている図5参照。実際に、編集部位Aはアカゲザル配列には存在せず、全体の配列相同性はチンパンジーで見られるものよりも低い=399/43392。さらに、10ギャップ/4332が検出され、これは二次元RNA構造の保存性はより低いことを暗示する。マウスおよびラットゲノムに対する類似のBLAST分析は、遺伝子PDE8Aのイントロン9の配列は、これらの他の2つの種では保存されていないことを示す。これらの結果は、遺伝子PDE8Aのイントロン配列イントロン9の潜在的編集が哺乳類では霊長類に限定されていることを示唆する。このように編集が保存されている機能的な理由は知られていないが、霊長類のより高度な脳の活動、および特に気分障害を含意しているかもしれない。最後に、PDE8A遺伝子のイントロン9における可能性のある編集部位は、ヒトおよびチンパンジーですでに同定されている保存されている8つの部位とともに、いくつかの霊長類種に特異的であると思われる。実施例III:このゲノム領域における編集部位の同定は、ヒト大脳皮質および白血球双方のRNA抽出物から得られた150のクローンに対して実現されたクローニングおよび配列決定技術によって完遂された実施例1:材料および方法参照これらの新たな編集部位はI、J、K、L、M、Nと呼ばれ、対応する、発現された編集アイソフォームを下表に示す。表I:新たな編集部位および種々のヒト組織における対応する編集アイソフォームこの発見のさらなる興味深い点は、脳および末梢ヒト組織ならびにヒト由来細胞系統において発現される各編集アイソフォームの標準の調製が可能となるということであった。これは方法の節に示されているように、RT-PCR産物をpUC57ベクターにサブクローニングすることによって実現された。実施例IV:次に、PDE8AmRNA前駆体の編集および非編集アイソフォームの分布の厳密な測定の条件をバリデートし、ここに一例として種々の組織または細胞において示したこのように、ヒト組織において、RNA前駆体アイソフォームの214の理論的組合せに対してこれらの14編集部位の同定を行うことができ、種々のヒト組織およびヒト細胞系統において編集プロフィールの複雑性の程度を確認することが重要であった。典型的な例として、ヒト大脳皮質RNA、ヒト末梢血単核細胞PBMC全RNA、全血RNAおよびSH-SY5Yヒト細胞系統神経芽腫由来においてPDE8Aの編集プロフィールを同定し、その定量をバリデートした図参照。これらの細胞において、インターフェロンα20~50の処置患者において重篤な気分悪化作用を誘導することが知られている分子14、15の作用を評価し、編集酵素の活性の変更を追跡するための、編集プロフィールを決定するという着眼点を実証することを可能とした。全RNA抽出物から出発し、初期全RNA量を70ng未満に制限することを可能とするため、かつ、キャピラリー電気泳動による発現されたアイソフォームの特異的分離を可能とする特異的に標識されたフォワードおよびリバース一本鎖の最良の組合せを得るために、7つの編集部位を含む遺伝子配列の増幅条件を試験した。最後に、最良の感受性RTのための最初のRNA材料62ngに対して十分な結果および発現されたアイソフォームの十分な同定を得るために、以下の二段階ネステッドPCRを下記プライマーを用いてバリデートした。よって、定義されるプライマーは1stPCR/非標識プライマー:PDE8A-1REV配列番号12PDE8A-1FWD配列番号132dPCR/FAMFWD標識およびVICREV標識プライマー:PDE8A-2RevVIC配列番号11PDE8A-2FowFAM配列番号10である。この選択は、最良の感受性所定のサンプルにおける全RNAの初期濃度の使用限界およびPCR産物の最良の信頼性および所定の組織において発現されたアイソフォームの大部分の良好な分離を可能とするのに最良な一本鎖の長さを決定するための、特異的スクリーニングからの結果であった図7、8A~8Cおよび9A~9B参照。実施例V:編集酵素の活性の変更の信頼性のある指標としての編集アイソフォーム特性の同定一例として、ADAR1a-150アイソエンザイムの発現の薬理学的変更によってもたらされる変更をSH-SY5Y細胞系統で試験した。結果を図10にまとめる。このように、この細胞系統において、アイソフォームB発現の正の変動は明らかに濃度依存的であることが示される。nedアイソフォームは、その変動がこの編集酵素の発現の変動と密接な相関があることから図11参照、アイソフォームBがもっぱらではなくとも主としてADAR1a-p150によりもたらされることを示す対称的反比例で減少する。この試験から計算されたEC50は、同じ細胞系統において同じ条件で5-HT2cRの編集に関してすでに示されたEC50と同程度の値であった。実施例VI:PDE8Aは脳において発現され、編集プロフィールが確認可能であるよって、それらの編集部位によって特徴付けられるPDE8ARNA編集アイソフォームは、下記のように要約することができるプロセスに従って全脳RNAから同定することができる。材料および方法脳は剖検時に採取し、輪切りにし、急速冷凍し、解剖まで-80°Cで保存した。脳外傷、中枢神経系病状、アルコール依存症または薬物使用障害は排除基準とした。脳サンプルは死因を知らない人によってアッセイおよび分析された。pHは小脳で測定した。心理学的剖検を用いて、DSM-IV第I軸および第II軸診断を得た。対照被験体n=10は自殺以外の原因で死亡し、生涯において第I軸の判定基準を満たさなかった。自殺n=10は、自殺行動のコロンビア分類の判定基準を満たした。脳領域およびRNA抽出背外前頭前皮質ブロードマン野9、DPFCx、前帯状皮質ブロードマン野24、ACCxおよび内側嗅領皮質ブロードマン野28/34、ERCxは鬱病および/または自殺において変更されていると一貫して関連づけられていたことから、これらを対象領域として選択した。組織の湿重平均±SEMはDPFCxで80±4mg、ACCxで84±4mg、およびERCxで80±5mgであった。全RNAをアフィニティーカラムからRNeasy脂質組織ミニキットQiagenを用いて単離した。ゲノムDNAの混入はオンカラムDNアーゼ消化によって除去した。全RNAの収量260nmでの吸光度は12~57μgの範囲であった。各サンプルの逆転写に用いたRNAの総量は、一様に1μgであった。逆転写、ネステッドPCRならびに各脳サンプルの同定および相対的定量前記材料および方法の節に記載の通り。統計分析個々の値は、正規分布を有するデータとなるように対数正規LN変換を行った。次に、発現された各アイソフォーム、検討される脳領域の各皮質、各被験体群を正確に指数化し、独立変数として用いた。対照個体の3領域DPFCx、ACCxおよびERCxにおいて、または自殺と対照個体の1つの特定の領域本実施例ではACCxにおいて測定されたアイソフォームをそれぞれLN形質転換した比率間の、あり得る総ての差を判別ANOVAおよび適切な事後分析Scheffe検定により分析した。領域または被験体群の間に差がない場合にp値を示し、これらの差はp≦0.05で有意とみなされる。結果PDE8AmRNA前駆体の編集プロフィールは3つの皮質領域で有意に異なり図13AおよびB、鬱性自殺と対照とで変更されている一例として図14まず、本発明者らは、対照被験体の3つの脳領域[背外前頭前皮質DPFCx、前帯状皮質ACCxおよび内側嗅領皮質ERCx]におけるPDE8AmRNA前駆体の編集プロフィールを確定した。3つの脳領域のうち少なくとも1つにおいて3より高い比率を有する6つの編集アイソフォームB、ABC、Ne、BE、ABE、ABを分析した図13A参照。これらの各アイソフォームについて、DPFCx、ACCxおよびERCxにおけるそれらの割合の比率を図13Bに示す。異なる領域間で、特に、3つの皮質領域において差次的に発現されるABアイソフォームの場合に有意な変動が見られたDPFCxとERCx、およびACCxとERCxを比較。これらの結果は、対照被験体に脳における、代謝調節型レギュレーターとしてPDE8Aを用いている細胞ネットワークの属性と機能的定常状態に応じたPDE8AmRNA前駆体編集の緻密な調節を明らかに示した。第二段階では、同じアイソフォームの割合を、3つの皮質領域において対照被験体と鬱性自殺とで比較した。一例として、鬱性自殺と対照のACCxにおける6つのアイソフォームの割合を図14Aに示す。6つのアイソフォームのそれぞれについて、鬱性自殺と対照のそれらの割合の比率を図14Bに示す。PDE8AmRNA前駆体の編集プロフィールは鬱性自殺のACCxにおいて有意に変更され、編集アイソフォームはおそらく種々の細胞コンパートメントでアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションを受けている。実施例VI:ADARsおよびPDE8AのmRNA発現は自殺企図者の血液サンプルにおいて変更されているPDE8Aは、編集酵素と同様に全血中に存在する。従って、RNA編集のこの標的が特定の自殺リスクの結果として変更されたのかどうかを調べるため、編集酵素およびPDE8AmRNAの発現のあり得る変更を検討することに着目した。編集酵素ADAR1a、ADAR1bおよびADAR2と、それらの標的PDE8Aの発現のうち1つの双方の変更の例は、2つの患者集団においてこれらのマーカーを測定することによって実証された。1つは自殺企図直後に試験した鬱病被験体特定の自殺リスク集団SuicideAttと考えられるであり、対照として用いたもう1つのものは自殺企図のない鬱病MDとして含められた。最初の結果を図15にまとめる全血中のこれらのバイオマーカーRNAの濃度の定常状態を測定した後に得られた。自殺企図者の血液における自殺傾向に関連するPDE8AmRNA発現の変更の例自殺企図のない鬱病患者に比べて自殺企図者では編集酵素およびPDE8Aの発現レベルの変更が見られたn=25。ADAR1a、ADAR1b、ADAR2およびPDE8AmRNAを全血PAXgeneRNAチューブから測定した。ADAR1a、ADAR1b、ADAR2およびPDE8AmRNA定常状態濃度は、特異的プライマーそれぞれHS01020780_ml;HS01017596_ml;HS00210762_mlおよびHS00400174_ml、AppliedBiosystems参照を使用して、500ngの全RNAサンプルからQPCRにより測定し、ヒト白血球全RNAの参照プールにおいて見られた個々の値と比較することにより正規化した。[参照遺伝子:グリセルアルデヒド-3リン酸-デヒドロゲナーゼGAPDHおよびβ2ミクログロブリンβ2Μ]。本発明者らは、自殺企図者に見られる編集の極めて有意な変更に着目する。最後に、脳のPDE8AmRNA前駆体編集プロフィールは自殺者において変更されている。他方、編集酵素およびPDE8Aの発現は、自殺企図者の血液において変更されている。ヒトおよびヒト以前の霊長類において独特なこの特定の調節能は、特に興味深い、血液検査により自殺リスクを評価する方法を提供する。本実施例は、自殺リスクに関連する編集プロセスの著しい変更を示す。編集酵素と同様にPDE8Aが考えられ、この標的の非コード配列の編集がこの標的の調節に直接的または間接的に関与する可能性があることが示唆され得る。参照文献