"組換え1型インターフェロンタンパク質を産生する方法であって、該方法は、宿主細胞における発現のために最適化されたコード配列を含む発現構築物を含むPseudomonasまたはE.coliの宿主細胞の培養によって組換えインターフェロンタンパク質を発現する工程と、宿主細胞を溶解する工程と、溶解工程からの不溶画分および可溶画分を得る工程と、それを非変性の抽出条件にさらすことによって不溶画分を抽出する工程と、不溶画分から抽出ペレットおよび抽出上清を得る工程と、を含み、抽出上清中の組換えタンパク質は、さらに再生または再折り畳みの工程にさらされずに、可溶形態、活性形態またはその組み合わせで存在することを特徴とする方法。組換え1型インターフェロンタンパク質を抽出する方法であって、前記組換えインターフェロンタンパク質は不溶画分中に存在し、前記不溶画分は、前記組換えインターフェロンタンパク質を発現するPseudomonasまたはE.coliの宿主細胞の溶解後に産生され、該方法は、不溶画分を非変性の抽出条件にさらす工程と、不溶画分から抽出ペレットを得る工程と、を含み、前記抽出ペレットは、前記組換えインターフェロンタンパク質を含み、ここで、前記抽出ペレット中の前記組換えインターフェロンタンパク質は、再生又は再折り畳みの工程にさらされずに、可溶形態、活性形態、またはそれらの組み合わせであることを特徴とする方法。組換え1型インターフェロンタンパク質を含む不溶画分を作成する方法であって、前記組換えインターフェロンタンパク質は、lac誘導体プロモーターに操作可能に連結される核酸配列を含む核酸構築物から、PseudomonasまたはE.coliの宿主細胞において発現され、該方法は、約80~約160までのOD600まで、約25°C~約33°Cの温度で、かつ約5.7~約6.5のpHで、宿主細胞を成長させる工程と、約0.08mM~約0.4mMのIPTG濃度で宿主細胞を誘導する工程と、宿主細胞を溶解し、ペレット画分を作成するためにそれを遠心分離機にかける工程と、を含み、可溶性の、活性な、または可溶性で活性な組換えインターフェロンタンパク質は、その後の再生又は再折り畳みの工程なしに、非変性の抽出条件の下でペレット画分の抽出により得ることができることを特徴とする方法。前記非変性の抽出条件が、穏やかな界面活性剤の存在を含むことを特徴とする請求項1乃至3のいずれかに記載の方法。前記穏やかな界面活性剤が、両性イオン界面活性剤であることを特徴とする請求項1乃至4のいずれかに記載の方法。前記両性イオン界面活性剤が、Zwittergent3-08、Zwittergent3-10、Zwittergent3-12、又はZwittergent3-14であることを特徴とする請求項1乃至5のいずれかに記載の方法。前記非変性の抽出条件が、約0.5から約2のZwittergent3-14を含むことを特徴とする請求項1乃至6のいずれかに記載の方法。前記非変性の抽出条件が、カオトロピック剤およびコスモトロピック塩をさらに含むことを特徴とする請求項1乃至7のいずれかに記載の方法。前記カオトロピック剤が、尿素または塩酸グアニジウムであり、および前記コスモトロピック塩が、NaCl、KClまたはNH42SO4であることを特徴とする請求項1乃至8のいずれかに記載の方法。前記非変性の抽出条件が、約0.5~約2のZwittergent3-14、約0~約2Mの尿素、約0~約2MのNaClを含み、およびpHは約6.5~約8.5であることを特徴とする請求項1、2又は4乃至9のいずれかに記載の方法。前記非変性の抽出条件が、1のZwittergent3-14、約2Mの尿素、約2MのNaClを含み、およびpHは約8.2であることを特徴とする請求項1、2又は4乃至10のいずれかに記載の方法。前記非変性の抽出条件が、さらに約5w/vの固体を含むことを特徴とする請求項1乃至11のいずれかに記載の方法。前記非変性の抽出条件が、さらに約1~約40w/vの固体を含むことを特徴とする請求項1乃至12のいずれかに記載の方法。前記組換え1型インターフェロンタンパク質が、インターフェロン-β、インターフェロンタ-α、インターフェロンタ-κ、またはインターフェロンタ-ωであることを特徴とする請求項1乃至13のいずれかに記載の方法。前記組換え1型インターフェロンタンパク質が、インターフェロン-βまたはインターフェロン-αであることを特徴とする請求項1乃至14のいずれかに記載の方法。前記組換え1型インターフェロンタンパク質が、インターフェロン-βであり、前記インターフェロン-βは、ヒトインターフェロン-β1bおよびヒトインターフェロン-β1bC17Sからなる群から選択されることを特徴とする請求項1乃至15のいずれかに記載の方法。前記組換え1型インターフェロンタンパク質が、インターフェロン-αであり、前記インターフェロン-αは、ヒトインターフェロン-α2aおよびヒトインターフェロン-α2bからなる群から選択されることを特徴とする請求項1乃至15のいずれかに記載の方法。不溶画分および抽出上清画分中の組換え1型インターフェロンタンパク質の量を測定する工程をさらに含み、抽出上清画分中で検出される組換えインターフェロンタンパク質の量が、不溶画分中で検出される組換えインターフェロンタンパク質の量の約10~約95であることを特徴とする請求項1、又は4乃至17のいずれかに記載の方法。組換えタンパク質の活性を測定する工程をさらに含み、アッセイされた組換えタンパク質の総量と比較すると、抽出上清中に存在する組換えタンパク質の約40~約100が活性であると測定されることを特徴とする請求項1、又は4乃至18のいずれかに記載の方法。前記組換えタンパク質が、インターフェロン-βであり、活性な組換えタンパク質の量は、ブルーセファロースアフィニティカムクロマトグラフィー、受容体結合アッセイ、抗ウイルス活性アッセイまたは細胞変性効果アッセイによって測定されることを特徴とする請求項1乃至16、18又は19のいずれかに記載の方法。前記組換えタンパク質がインターフェロン-βであり、さらに、非変性の抽出条件は、図4のBの情報を用いて最適化されることを特徴とする請求項1乃至16又は18乃至20のいずれかに記載の方法。抽出上清中の前記組換えタンパク質が、約0.3g/L~約10g/Lの濃度で存在することを特徴とする請求項1又は3乃至21のいずれかに記載の方法。前記宿主細胞が、約1~約20リットルまたはそれ以上の量で培養されることを特徴とする請求項1乃至22のいずれかに記載の方法。前記宿主細胞が、約1リットル、約2リットル、約3リットル、約4リットル、約5リットル、約10リットル、約15リットル、又は約20リットルの容積で培養されることを特徴とする請求項1乃至23のいずれかに記載の方法。前記発現構築物又は核酸構築物が誘導プロモーターを含むことを特徴とする請求項1、又は3乃至22のいずれかに記載の方法。前記発現構築物又は核酸構築物が、lacプロモーター誘導体を含み、前記インターフェロンの発現はIPTGによって誘導されることを特徴とする請求項1、又は3乃至23のいずれかに記載の方法。前記宿主細胞が、約25°C~約33°Cの温度で、約5.7~約6.5のpHで成長し、およびIPTGは、OD575が約80~約160に達したとき、約0.08mM~約0.4mMの最終濃度まで加えられることを特徴とする請求項1乃至9、又は12乃至26のいずれかに記載の方法。前記宿主細胞が、約32°Cの温度で約5.7~6.25のpHで成長し、IPTGは、OD575が約120~約160に達したとき、約0.2mMの最終濃度まで加えられることを特徴とする請求項1乃至27のいずれかに記載の方法。前記発現構築物又は核酸構築物が、高活性リボソーム結合部位を含むことを特徴とする請求項1、又は3乃至28のいずれかに記載の方法。前記宿主細胞が、lonhslUVプロテアーゼ欠失株であることを特徴とする請求項1乃至29のいずれかに記載の方法。前記1型インターフェロンが、前記宿主細胞の細胞質において発現されることを特徴とする請求項1乃至28のいずれかに記載の方法。前記1型インターフェロンが、ヒトインターフェロン-β1bまたはヒトインターフェロン-β1bC17Sであり、前記ヒトインターフェロン-β1bまたはヒトインターフェロン-β1bC17Sが、前記宿主細胞の細胞質において発現されることを特徴とする請求項14乃至16、又は18乃至31のいずれかに記載の方法。前記温度が約32°Cであり、前記IPTG濃度が約0.2mMであることを特徴とする請求項3に記載の方法。前記穏やかな界面活性剤がN-ラウロイル-サルコシンNLSではないことを特徴とする請求項4乃至32のいずれかに記載の方法。組換えタンパク質の活性を測定する工程をさらに含み、標準サンプル中の活性タンパク質の量と比較すると、抽出上清中に存在する組換えタンパク質の約75~約100が活性であることが測定され、ここで、各サンプルからの同じ量のタンパク質がアッセイにおいて使用されることを特徴とする請求項1、又は4乃至34のいずれかに記載の方法。本発明は、P.fluorescens内でのインターフェロンの発現および穏やかな界面活性剤を用いて、かつ再折り畳みのプロセスの必要性なしに、発酵生成物から活性タンパク質を抽出する新しい方法の開発に関する。特に、本発明は、組換え1型インターフェロンタンパク質を産生する方法を提供し、該方法は、宿主細胞における発現のために最適化されたコード配列を含む発現構築物を含むPseudomonasまたはE.coliの宿主細胞の培養によって組換えインターフェロンタンパク質を発現する工程、宿主細胞を溶解する工程、溶解工程からの不溶画分および可溶性画分を得る工程、それを非変性の抽出条件にさらすことによって不溶画分を抽出する工程、および、不溶画分から抽出ペレットおよび抽出上清を得る工程を含み、抽出上清中の組換えタンパク質は、さらに再生または再折り畳みの工程にさらされずに、可溶形態、活性形態またはその組み合わせで存在する。実施形態において、非変性の抽出条件は、穏やかな界面活性剤の存在を含む。特定の実施形態において、穏やかな界面活性剤は両性イオン界面活性剤である。具体的な実施形態において、両性イオン界面活性剤は、Zwittergent3-08、Zwittergent3-10、Zwittergent3-12、又はZwittergent3-14である。実施形態において、非変性の抽出条件は、約0.5から約2のZwittergent3-14を含む。特定の実施形態において、穏やかな界面活性剤はN-ラウロイル-サルコシンNLSではない。実施形態において、非変性の抽出条件は、穏やかな界面活性剤の存在を含み、カオトロピック剤およびコスモトロピックcosmotropic塩をさらに含む。特定の実施形態において、カオトロピック剤は尿素または塩酸グアニジウムであり、コスモトロピック塩は、NaCl、KClまたはNH42SO4である。具体的な実施形態において、非変性の抽出条件は、約0.5~約2のZwittergent3-14;約0~約2Mの尿素;約0~約2MのNaClを含み;およびpHは約6.5~約8.5である。実施形態において、非変性の抽出条件は:1のZwittergent3-14;2Mの尿素;2MのNaClを含み;およびpHは約8.2である。他の実施形態において、非変性の抽出条件は、さらに約1~約40w/vの固体を含む。特定の実施形態において、非変性の抽出条件はさらに約5w/vの固体を含む。実施形態において、組換え1型インターフェロンタンパク質は、インターフェロンタ-β、インターフェロンタ-α、インターフェロンタ-κ、インターフェロンタ-τ、またはインターフェロンタ-ωである。具体的な実施形態において、組換え1型インターフェロンタンパク質はインターフェロン-βまたはインターフェロン-αである。実施形態において、組換え1型インターフェロンタンパク質は、インターフェロン-βであり、該インターフェロン-βは、ヒトインターフェロン-β1bおよびヒトインターフェロン-β1bC17Sからなる群から選択される。実施形態において、組換え1型インターフェロンはインターフェロン-αであり、インターフェロン-αは、ヒトインターフェロン-α2aおよびヒトインターフェロン-α2bからなる群から選択される。更なる実施形態において、権利を主張された方法はさらに、不溶画分および抽出上清画分中の組換え1型インターフェロンタンパク質の量を測定する工程を含み、抽出上清画分中で検出される組換えインターフェロンタンパク質の量は、不溶画分中で検出される組換えインターフェロンタンパク質の量の約10~約95である。他の実施形態において、該方法は、さらに、組換えタンパク質の活性を測定する工程を含み、抽出上清の中に存在する組換えタンパク質の約40~約100は活性であると測定される。関連する実施形態において、組換えタンパク質は、インターフェロン-βであり、活性組換えタンパク質の量は、ブルーセファロースアフィニティカムクロマトグラフィー、受容体結合アッセイ、抗ウイルス活性アッセイまたは細胞変性効果アッセイによって測定される。他の実施形態において、組換えタンパク質は、インターフェロン-αであり、インターフェロン-κ、またはインターフェロン-ωであり、活性組換えタンパク質の量は、ブルーセファロースアフィニティカムクロマトグラフィー、受容体結合アッセイ、抗ウイルス活性アッセイまたは細胞変性効果アッセイによって測定される。本発明は、さらに、組換え1型インターフェロンタンパク質を産生するための方法を含み、該方法は、宿主細胞における発現のために最適化されたコード配列を含む発現構築物を含むPseudomonasまたはE.coliの宿主細胞の培養によって組換えインターフェロンタンパク質を発現する工程、宿主細胞を溶解する工程、溶解工程から不溶画分及び可溶画分を得る工程、それを非変性抽出条件にさらすことによって不溶画分を抽出する工程、および不溶画分から抽出ペレットおよび抽出上清を得る工程を含み、抽出上清中の組換えタンパク質は、再生または再折り畳みの工程にさらされることなく、可溶性の形態、活性の形態、またはそれらの組み合わせで存在し、組換えタンパク質はインターフェロン-βであり、さらに、非変性の抽出条件は、図4のBの情報を用いて最適化される。実施形態において、抽出上清中の組換えタンパク質は、約0.3g/L~約10g/Lの濃度で存在する。他の実施形態において、宿主細胞は、約1から約20リットルまたはそれ以上の量で培養される。具体的な実施形態において、宿主細胞は、約1リットル、約2リットル、約3リットル、約4リットル、約5リットル、約10リットル、約15リットル、又は約20リットルの容積で培養される。本発明の実施形態において、発現構築物は誘導プロモーターを含む。具体的な実施形態において、発現構築物は、lacプロモーター誘導体を含み、インターフェロンの発現はIPTGによって誘導される。実施形態において、宿主細胞は、約25°C~約33°Cの温度で、約5.7~約6.5のpHで成長し、IPTGは、OD575が約80~約160までに達したとき、約0.08mM~約0.4mMの最終濃度まで加えられる。具体的な実施形態において、宿主細胞は、約32°Cの温度で5.7~6.25のpHで成長し、IPTGは、OD575が約160に達したとき、約0.2mMの最終濃度まで加えられる。本発明の実施形態において、発現構築物は、高活性リボソーム結合部位を含む。特定の実施形態において、宿主細胞は、lonhslUVプロテアーゼ欠失株である。他の実施形態において、1型インターフェロンは宿主細胞の細胞質において発現される。関連する実施形態において、1型インターフェロンは、ヒトインターフェロン-β1bまたはヒトインターフェロン-β1bC17Sであり、宿主細胞の細胞質において発現される。本発明はまた、組換え1型インターフェロンタンパク質を抽出する方法を提供し、組換えインターフェロンタンパク質は不溶画分中に存在し、その不溶画分は、組換えインターフェロンタンパク質を発現するPseudomonasまたはE.coliの宿主細胞の溶解後に産生され、該方法は、不溶画分を非変性の抽出条件にさらす工程、および不溶画分から抽出ペレットを得る工程を含み、抽出ペレットは、組換えインターフェロンタンパク質を含み、抽出ペレット中の組換えインターフェロンタンパク質は、再生又は再折り畳みの工程にさらされずに、可溶形態、活性形態、またはそれらの組み合わせである。実施形態において、抽出される組換え1型インターフェロンタンパク質は、インターフェロン-β、インターフェロン-α、インターフェロン-κ、インターフェロン-τ、またはインターフェロン-ωである。特定の実施形態において、組換え1型インターフェロンタンパク質はインターフェロン-βまたはインターフェロン-αである。実施形態において、組換え1型インターフェロンタンパク質は、インターフェロン-βであり、該インターフェロン-βは、ヒトインターフェロン-β1bおよびヒトインターフェロン-β1bC17Sからなる群から選択される。他の実施形態において、インターフェロン-αは、ヒトインターフェロン-α2aおよびヒトインターフェロン-α2bからなる群から選択される。本発明は、さらに、組換え1型インターフェロンタンパク質を含む不溶画分を作成する方法を提供し、組換えインターフェロンタンパク質は、lac誘導体プロモーターに操作可能に連結される核酸配列を含む核酸構築物から、PseudomonasまたはE.coliの宿主細胞において発現され、その方法は、約80~約160までのOD600まで、約25°C~約33°Cの温度で、かつ約5.7~約6.5のpHで、宿主細胞を成長させる工程、および約0.08mM~約0.4mMのIPTG濃度で宿主細胞を誘導する工程、宿主細胞を溶解し、ペレット画分を作成するためにそれを遠心分離機にかける工程を含み、可溶性の、活性な、または可溶性で活性な組換えインターフェロンタンパク質は、その後の再生又は再折り畳みの工程なしに、非変性の条件の下でペレット画分の抽出により得ることができる。実施形態において、不溶画分に包含される組換え1型インターフェロンタンパク質は、インターフェロン-β、インターフェロン-α、インターフェロン-κまたはインターフェロン-ωである。具体的な実施形態において、組換え1型インターフェロンタンパク質はインターフェロン-βまたはインターフェロン-αである。実施形態において、組換え1型インターフェロンタンパク質がインターフェロン-βであり、インターフェロン-βは、ヒトインターフェロン-β1bおよびヒトインターフェロン-β1bC17Sからなる群から選択される。実施形態において、1型インターフェロンタンパク質がインターフェロン-αであり、インターフェロン-αは、ヒトインターフェロン-α2aおよびヒトインターフェロン-α2bからなる群から選択される。実施形態において、組換え1型インターフェロンタンパク質を含む不溶画分を作成するための方法において、宿主細胞が成長する温度は、約32°Cであり、IPTG濃度は約0.2mMである。参照による組み込みこの特許明細書の中で言及されている全ての出版物、特許、特許出願は、個々の出版物、特許、特許出願が具体的にかつ個別的に参照することにより組み込まれる件を示すのと同程度に参照することにより本明細書に組み込まれる。本発明の新しい特徴は、添付の特許請求の範囲の中に詳細に明らかにされている。本発明の原理が利用されている実施形態を示す下記の詳細な説明を参照することで、及び添付している図面において本発明の特徴と長所のさらなる理解が得られるであろう。本発明は、Pseudomonas発現系において大量の可溶性組換えインターフェロンタンパク質を産生するための方法に関する。特に、この方法は、一般に必要とされる変性工程とその後の再生/再折り畳み工程の必要性を除去する。バクテリアの発現系における組換えインターフェロンβの産生は、不溶性の封入体の中のタンパク質の隔離により妨げられてきた。封入体の可溶化は、変性を必要とし、これは今度は費用がかかり、時間がかかり、かつタンパク質の収量を減少させる再折り畳み工程を用いることを必要とする。本発明は、変性によらずにインターフェロンを産生し、可溶化するための方法を提供することにより、再折り畳み工程の必要性を回避する。タンパク質に変性工程を受けさせることなく、バクテリア発現系の中で、可溶性である、活性である、あるいはその両方である組換えインターフェロンタンパク質を産生するための方法が提供される。特に、可溶性のインターフェロンタンパク質を結果としてもたらす非変性の抽出工程が記載される。バクテリア発現系において発現されたインターフェロンは、概して不溶画分に局在化する。本発明の抽出工程において、この不溶画分は非変性の濃度の緩やかな界面活性剤を含み、可溶性タンパク質を産生する抽出条件の影響を受けやすい。特に発明の抽出方法が使用されるとき、Pseudomonas宿主細胞にとっての成長条件が可溶性組換えインターフェロンタンパク質の収量を最大化するために最適化される組換えインターフェロンタンパク質を産生するための方法もまた、本発明によって提供される。可溶性タンパク質の産生に対するE.coliの成長条件の影響の研究が報告されてきた。Pseudomonasにおいて発現される時の所与のタンパク質の可溶性は、E.coliにおける可溶性と異なり得る。これは、例えば、宿主としてE.coli又はP.fluorescensを使用して産生された幾つかのタンパク質の可溶性の量の対照比較を示す米国特許出願公開第2006/0040352号、ExpressionofMammalianProteinsinPseudomonasFluorecensの中で説明されており、これは、さらに、可溶性は、例えばアミノ酸配列のようなタンパク質構造に強く影響を受けるため、たとえ同じ宿主の中にあっても異なるタンパク質の可溶性の間で相当な差異が存在する。E.coliにおいてIFN-βを産生するという以前に報告された試みは、再折り畳みを必要とするタンパク質を結果としてもたらした。例えば、Russell-Harde,1995,TheUseofZwittergent3-14inthePurificationofRecombinantHumanInterferon-βSer17BetaseronetalJInterferonandCytokineRes.15:31-37,andGhane,etal2008OverExpressionofBiologicallyActiveInterferonBetaUsingSyntheticGeneinE.coli,JofSciences,IslamicRepublicofIran193:203-209を参照両者は参照により本明細書に組み込まれる。その方法は、さらに、成長温度、プロモーターの誘導時のOD、誘導物質の濃度及びpHを含む最適成長条件を提供する。提供された抽出条件は、界面活性剤の型、濃度、カオトロピック剤、コスモトロピック塩cosmotropicsalt、及びpHを含む。最適パラメータ範囲と同様に特性値が与えられる。提供された範囲を用いる抽出条件を最適化するための方法もまた提供される。バクテリアの成長条件本発明の実施形態において、バクテリアの成長条件は本明細書に提供されるような抽出方法を用いて得られる可溶性インターフェロンタンパク質の量を増加させるために最適化される。他の抽出条件、例えば当該技術分野で記載され、使用される他の方法と共に、本発明の成長条件を使用することもまた熟考される。発明の抽出方法と関連して特に有用な最適成長条件は以下を含む:約25°C~約33°Cの温度;約5.7~約6.5のpH、及び培養物が約80~約160のOD575に達したときの約0.08mM~約0.4mMIPTGでの誘導。培養物のpHはpHバッファーと当事者に既知の方法を用いることにより維持することができる。培養中のpHの制御もまた、アンモニア水を用いることにより達成することができる。実施形態において、培養物のpHは約5.7~約6.5である。特定の実施形態において、pHは5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4又は6.5である。他の実施形態において、pHは5.7~5.9、5.8~6.0、5.9~6.1、6.0~6.2、6.1~6.3又は6.2~6.5である。さらに他の実施形態において、pHが5.7~6.0、5.8~6.1、5.9~6.2、6.0~6.3、6.1~6.4、又は6.2~6.5である。特定の実施形態において、pHは約5.7~約6.25である。実施形態において、成長温度は約25°C~約33°Cに維持される。特定の実施形態において、成長温度は約25°C、約26°C、約27°C、約28°C、約29°C、約30°C、約31°C、約32°C又は33°Cである。他の実施形態において、成長温度は約25°C~約27°C、約25°C~約28°C、約25°C~約29°C、約25°C~約30°C、約25°C~約31°C、約25°C~約32°C、約25°C~約33°C、約26°C~約28°C、約26°C~約29°C、約26°C~約30°C、約26°C~約31°C、約26°C~約32°C、約27°C~約29°C、約27°C~約30°C、約27°C~約31°C、約27°C~約32°C、約26°C~約33°C、約28°C~約30°C、約28°C~約31°C、約28°C~約32°C、約29°C~約31°C、約29°C~約32°C、約29°C~約33°C、約30°C~約32°C、約30°C~約33°C、約31°C~約33°C、約31°C~約32°C、約30°C~約33°C、又は約32°C~約33°Cに維持されている。誘導本明細書の中の他の記載箇所で記載されているように、組換えインターフェロン遺伝子の発現を制御するために誘導性プロモーターが発現構築物expressionconstructにおいて使用され得る。例えばtacプロモーターのようなlacプロモーターの誘導体又はファミリーメンバーの場合、エフェクター化合物が、IPTGイソプロピル-β―D-1-チオガラクトピラノシド、イソプロピルチオガラクシドとも呼ばれるのような非代謝性誘導物質のような誘導物質である。実施形態において、lacプロモーター誘導体は使用され、細胞密度が約80~約160のOD575により識別される水準に達したとき、さらにインターフェロン発現は、約0.08mM~約0.4mMの最終濃度までIPTGを加えることにより誘導される。実施形態において、培養誘導時のOD575は、約80、約90、約100、約110、約120、約130、約140、約150、約160、約170又は約180である。他の実施形態において、OD575は、約80~約100、約100~約120、約120~約140、約140~約160である。他の実施形態において、OD575は、約80~約120、約100~約140、又は約120~約160である。他の実施形態において、OD575は、約80~約140又は約100~160である。細胞密度は他の方法により測定することができ、他の単位で、例えば単位体積当たりの細胞で表現することができる。例えば、Pseudomonasfluorescensの培養物の約80~約160のOD575は、およそ1mL当たり8×1010から約1.6×1011のコロニー形成単位又は35~70g/L乾燥菌重量と等しい。実施形態において、培養誘導時における細胞密度は、細胞密度又は測定単位を測定するために使用される方法に関わらずOD575での吸光度により本明細書で明示された細胞密度と等しい。当事者は、任意の細胞培養のための適切な形質転換の仕方を知っているだろう。実施形態において、培養物の最終IPTG濃度は、約0.08mM、約0.1mM、約0.2mM、約0.3mM,又は0.4mMである。他の実施形態において、培養物の最終IPTG濃度は、約0.08mM~約0.1mM、約0.1mM~約0.2mM、約0.2mM~約0.3mM、約0.3mM~約0.4mM、約0.2mM~約0.4mM又は約0.08~約0.2mMである。実施形態において、インターフェロンは、当該技術分野で既知の方法および、文献、例えば米国特許第7759109号のHighdensitygrowthofT7expressionstrainswithauto-inductionoptionにおいて記載されている方法により、IPTG、ラクトース、又はアロラクトースを用いて、lacプロモーター又は誘導体を誘導することによって発現されるこれは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。ラクトースを含まない型のanon-lactypeのプロモーターが使用される実施形態において、本明細書及び文献の中で記載されるように、他の誘導物質又はエフェクターが使用され得る。誘導が開始された後で、培養物は組換えインターフェロンタンパク質が発現する間の概して約24時間の期間に増殖する。細胞培養物は、遠心分離によって濃縮され、その培養ペレットは、その後の溶解手順に適切なバッファー又は溶液中に再懸濁され得る。実施形態において、細胞は、高圧の機械細胞破壊のための装置例えばMicrofluidicsMicrofluidizer,ConstantCellDisruptor,Niro-Soaviホモジナイザー、APV-Gaulinホモジナイザーのように商業的に入手できるを用いて破壊される。細胞を溶解するために当該技術分野で既知の任意の適切な方法が、不溶性画分を遊離するために使用され得る。例えば、実施形態において、細胞壁溶菌酵素及びEDTAのような化学的および/または酵素的細胞溶解試薬を使用することができる。凍結した、又は以前に保管された培養物の使用もまた、本発明の方法において熟考される。培養物は、溶解前にOD標準化OD-normalizedされ得る。遠心分離は、任意の適切な装置又は方法を用いて行なわれる。可溶画分を不溶画分から分離するための細胞培養物あるいは溶解液の遠心分離は、当該技術分野で周知である。例えば、溶解された細胞は、20800×gで20分間4°Cで遠心分離され、上清は、手作業のあるいは自動化された液体の処理方法を用いて除去され得る。ペレット不溶画分は、例えばリン酸緩衝塩類溶液PBS、pH7.4のような緩衝液中に再懸濁される。再懸濁は、例えばオーバーヘッドミキサー、磁力攪拌子、ロッキングシェーカーなどに接続されたインペラーのような装置を使用して行われる。可溶画分、即ち溶解液の遠心分離の後に得られる可溶性の上清、及び不溶画分、即ち溶解液の遠心分離の後に得られるペレットは、培養物の溶解及び遠心分離の結果としてもたらされる。これらの二つの画分は、それぞれ第1の可溶画分と第1の不溶画分と呼ぶこともできる。pHや誘導ODがあまりしっかりと制御されていない状況下で例えば実施例2参照、培養物を増殖することにより準備される発現培養物から本発明による抽出法を用いて可溶性のIFN-βを得ることが可能である。本明細書に記載されているように、成長条件を最適化することは、実質的には可溶性のIFN-βの収量を増加させることに結果としてつながる。非変性の抽出工程高水準の可溶性インターフェロンタンパク質は、本発明の非変性の抽出方法を用いて不溶画分から得ることができるということがわかった。高水準の可溶性組換えインターフェロンタンパク質の産生にとって特に有用だと認められた非変性の抽出条件は、以下を含む:非変性の濃度の緩やかな界面活性剤、例えばZwittergent3-140.5~2w/v;カオトロピック剤、例えば尿素0-2Mおよび6.5~8.5のバッファーのpHで固体濃度が5-20w/vでのコスモトロピック塩、例えばNaCl0-2M。可溶画分と不溶画分を得た後、上に記載されているように,可溶性組換えインターフェロンタンパク質は、本明細書に記載されている非変性の抽出条件下において再懸濁された不溶画分を培養することにより、不溶画分から抽出される。培養後、抽出された混合物は抽出上清可溶化組換えタンパク質を含む抽出後に得られる可溶性の上清画分と抽出ペレット抽出後に得られる不溶性の沈殿物画分を作製するために遠心分離される。これらの破片は、第2の可溶画分及び第2の不溶画分とも呼ばれ得る。抽出条件抽出条件のための多くの異なったパラメータは、本明細書中の実施例3に記載されているように、抽出上清の中で観察される可溶性タンパク質の量に対する影響について評価された。他のパラメータが変化したときと同じく、変化する濃度において、抽出条件が多くの異なる界面活性剤のいずれかを含むとき、可溶性インターフェロンタンパク質が観察されたということが分かった。しかしながら、特定のパラメータは、産生された可溶性タンパク質の量に特に顕著な影響を有した。特に両性イオン界面活性剤Zwittergentを含む抽出条件は、最も高い可溶性タンパク質収量をもたらした。特に両性イオン界面活性剤、Zwittergent3-08、Zwittergent3-10、Zwittergent3-12、及び特にZwittergent3-14を用いると、最も高い収量を結果としてもたらした。N-ラウロイルザルコシンNLSは、特に高い収量を生みだしたが、得られた可溶性タンパク質は、アフィニティアッセイに基づき、不活性であることが分かったセファロースブルーアフィニティカラム結合。それゆえ、本明細書で使用される用語緩やかな界面活性剤は、N-ラウロイルザルコシンを含まないことを意図する。界面活性剤は、非変性の濃度で試験された。少なくとも0.5w/vの、好ましくは1のZwittergent3-143-N,N-デシルジメチルアンモニオプロパンスルホナートの濃度は臨界ミセル濃度0.01を軽く超えているが、可溶性インターフェロンタンパク質の最も効率的な抽出をもたらす。それゆえ、緩やかな界面活性剤、特に両性イオン界面活性剤、より具体的にはZwittergent3-08、Zwittergent3-10、Zwittergent3-12、及びZwittergent3-14、さらに特にZwittergent3-14及びNLSでないものの非変性の濃度の使用は、本発明の抽出条件において用いるために熟考される。本発明の他の実施形態において、非変性の抽出条件は、約0.5~約2w/vの濃度のZwittergent3-14を含む。実施形態において、Zwittergent3-14のw/v濃度は、約0.5~約1、約1~約1.5、約1.5~約2、あるいは約1~約2である。特定の実施形態において、Zwittergent3-14のw/v濃度は、約0.5、約0.6、約0.7、約0.8、約0.9、約1.0、約1.1、約1.2、約1.3、約1.4、約1.5、約1.6、約1.7、約1.8、約1.9、あるいは約2.0である。本発明の他の実施形態において、非変性の抽出条件は、約0.5~約2w/vの濃度のZwittergent3-08、Zwittergent3-10、あるいはZwittergent3-12を含む。実施形態において、Zwittergent3-08、Zwittergent3-10、あるいはZwittergent3-12のw/v濃度は、約0.5~約1、約1~約1.5、約1.5から約2、あるいは約1~約2である。特定の実施形態において、Zwittergent3-08、Zwittergent3-10、あるいはZwittergent3-12のw/v濃度は、約0.5、約0.6、約0.7、約0.8、約0.9、約1.0、約1.1、約1.2、約1.3、約1.4、約1.5、約1.6、約1.7、約1.8、約1.9あるいは約2.0である。緩やかな界面活性剤は、低水準、例えば2又はそれ以下でタンパク質のアンフォールディングを引き起こさない。例えば、SDSとNLSは、これらの水準においてタンパク質を変性させることができるので、一般的により強い界面活性剤と考えられる。非変性の濃度は、タンパク質が変性されない試薬の濃度を示す。処理中に変性されないタンパク質は、再折り畳みを必要としない。実施形態において、本発明の非変性の抽出条件は、約0.5~約2のZwittergent3-14;約0~約2Mの尿素;約0~約2MのNaClを含み;そこではpHが約6.5~約8.5である。下記の表に、イオン性の、非イオン性の、両性イオン性の界面活性剤を含む一般の界面活性剤の例とそれらの特性を記載する。界面活性剤の重要な特性は、臨界ミセル濃度CMCであり、それは、タンパク質溶液からの界面活性剤のその後の除去の容易さのみでなく、そのタンパク質可溶化能力にも関係がある。非変性の抽出条件が、カオトロピック試薬、尿素、コスモトロピック塩、NaCl、Zwittergent3-14、および適切なバッファー範囲の組み合わせを含むとき、抽出収量は、Zwittergent3-14単独での使用と比較して数倍に増加するということが、さらにまた観察された。カオトロピック試薬は、タンパク質又は核酸の3次元構造を破壊し、変性を引き起こす。実施形態において、非変性の抽出条件は、カオトロピック試薬、例えば尿素又は塩酸グアニジニウムの低い、非変性の濃度を含む。実施形態において、非変性の抽出条件は、約0.5M~約2M又はもっと高い濃度で尿素を含む。6Mの尿素は、IFN-βを変性することが分かった。一般的に、尿素又は塩酸グアニジニウムの非変性の濃度は、3Mよりも低い。実施形態において、非変性の抽出条件は、約0.5~約1M、約1~1.5M、約1.5~約2M、約1~約2M、約0.5M、約0.6M、約0.7M、約0.8M、約0.9M、約1.0M、約1.1M、約1.2M、約1.3M、約1,4M、約1.5M、約1.6M、約1.7M、約1.8M、約1.9M、又は約2.0Mの濃度で尿素を含む。他の実施形態において、抽出条件は0.5~2Mの濃度での塩酸グアニジニウムを含む。実施形態において、抽出条件は、0.5~1M、1~1.5M、1.5~2M、1~2M、0.5M、約0.6M、約0.7M、約0.8M、約0.9M、約1.0M、約1.1M、約1.2M、約1.3M、約1.4M、約1.5M、約1.6M、約1.7M、約1.8M、約1.9Mあるいは約2.0Mの濃度で塩酸グアニジニウムを含む。コスモトロピック塩は、安定性と水―水相互作用の構造に寄与する。コスモトロープcosmotropesは、水分子に良好に相互作用させ、それはまたタンパク質のような高分子において分子間相互作用を安定化させる。任意のこのような適切な薬剤は、当該技術分野で公知であるように、本発明の抽出条件において用いられ得る。実施形態において、非変性の抽出条件は、NaCl、KCl、NH42SO4から選択されたコスモトロピック塩を含む。特定の実施形態において、NaClは約0.15~約2Mの濃度で存在する。実施形態において、NaClは、約0.15M~約0.5M、約0.5~約0.75M、約0.75M~約1M、約1M~約1.25M、約1.25M~約1.5M、約1.5M~約1.75M、約1.75M~約2M、約0.15M~約1M、約1M~約1.5M、約1.5M~約2M、約1M~約2M、約0.15M、約0.25M、約0.5M、約0.6M、約0.7M、約0.8M、約0.9M、約1.0M、約1.1M、約1.2M、約1.3M、約1.4M、約1.5M、約1.6M、約1.7M、約1.8M、約1.85M、約1.9Mあるいは約2.0Mの濃度での抽出条件において存在する。他の実施形態において、KClは、約0.15~約0.5M、約0.5~約0.75M、約0.75M~約1M、約1M~約1.25M、約1.25M~約1.5M、約1.5M~約1.75M、約1.75M~約2M、約0.15M~約1M、約1M~約1.5M、約1.5M~約2M、約1M~約2M、約0.15M、約0.25M、約0.5M、約0.6M、約0.7M、約0.8M、約0.9M、約1.0M、約1.1M、約1.2M、約1.3M、約1.4M、約1.5M、約1.6M、約1.7M、約1.8M、約1.85M、約1.9M、又は約2.0Mの濃度での非変性の抽出条件において存在する。他の実施形態において、NH42SO4は、約0.15~約0.5M、約0.5M~約0.75M、約0.75M~約1M、約1M~約1.25M、約1.25M~約1.5M、約1.5M~約1.75M、約1.75M~約2M、約0.15M~約1M、約1M~約1,5M、約1.5M~約2M、約1M~約2M、約0.15M、約0.25M、約0.5M、約0.6M、約0.7M、約0.8M、約0.9M、約1.0M、約1.1M、約1.2M、約1.3M、約1.4M、約1.5M、約1.6M、約1.7M、約1.8M、約1.85M、約1.9M又は約2.0Mの濃度での非変性の抽出条件において存在する。抽出条件は、pHが6.5~8.5の範囲内に維持されるとき、最も効率的であるということが分かった。効果的なpHバッファーは、標準タンパク質精製テキスト例えば、ProteinPurification:PrinciplesandPractice,著RobertScopesSpringer,1993において推奨されているものであり、ここで用いられることができ、Tris、Bis-Tris、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、グリシン、ジエタノールアミン、2-アミノ-2―メチル―1,3-プロパンジオール、トリエタノールアミン、イミダゾール、ヒスチジン、ピリジンなどを含む。多くのバッファーは、文献の中で記載されてきており、商業的に入手可能である。実施形態において、非変性の、抽出条件のpHは、約6.5、約6.6、約6.7、約6.8、約6.9、約7.0、約7.1、約7.2、約7.3、約7.4、約7.5、約7.6、約7.8、約7.9、約8.0、約8.1、約8.2、約8.3、約8.4、又は約8.5である。他の実施形態において、pHは、約6.5~約6.8、約6.6~約6.9、約6.7~約7.0、約6.8~約7.1、約6.9~約7.2、約7.0~約7.3、約7.1~約7.4、約7.2~約7.5、約7.3~約7.6、約7.4~約7.7、約7.5~約7.8、約7.6~約7.9、約7.8~約8.1、約7.9~約8.2、約8.0~約8.3、約8.1~約8.4又は約8.2~約8.5である。他の実施形態において、pHは、約6.5~約7.0、約7.0~約7.5、又は約7.5~約8.0である。非変性の抽出条件における固体濃度もまた、変えられた。このパラメータは、抽出培養混合物中の固体成分を示す。固体濃度は、湿ったペレット不溶画分の重さを量ることにより、及びこの重量を抽出混合物の総重量と比較することにより、決定され得る。具体的な固体濃度は、不溶画分を濃縮する又は希釈することにより達成される。高い抽出収量は、5~40w/vの固体濃度の範囲を超えて観察された。本発明の実施形態において、非変性の抽出条件における固体は、約5、約7.5、約10、約12.5、約15、約17.5、約20、約22.5、約25、約27.5、約30、約32.5、約35、約37.5、又は約40のw/v濃度で存在する。本発明の他の実施形態において、非変性の抽出条件における固体は、約5~約7.5、約7.5~約10、約10~約12.5、約12.5~約15、約15~約17.5、約17.5~約20、約20~約22.5、約22.5~約25、約25~約27.5、約27.5~約30、約30~約32.5、約32.5~約35、約35~約37.5、約37.5~約40、約5~約10、約10~約15、約15~約20、約20~約25、約25~約30、約35~約40、約5~約15、約5~約25、約5~約30、約5~約35、約10~約20、約20~約30、約30~約40、約5~約20、又は約20~約40のw/v濃度で存在する。実施形態において、本発明の抽出方法は、タンパク質収量をさらに高めるため、吸着のような同時濃縮技術と組み合わされる。可溶化タンパク質は、遠心分離および/または、例えばサイズ排除、陰イオン又は陽イオン交換、疎水性相互作用あるいはアフィニティクロマトグラフィーのようなクロマトグラフィーによって、他のタンパク質と細胞片から分離または精製され得る。インターフェロンヒトインターフェロンは、3つの主要な型に分類されてきた。I型インターフェロン:I型IFNは、IFNAR1とIFNAR2鎖から成るIFN-α受容体IFNARとして知られている特定の細胞表面の受容体複合体に結び付く。ヒトI型インターフェロンが含むのは、IFN-α、IFN-β、IFN-κ、IFN-ω、IFN-εである。II型インターフェロン:II型IFNヒトIFN-γは、IFNGRに結び付く。III型インターフェロン:III型インターフェロンは、IL10R2CRF2-4とも呼ばれるとIFNLR1CRF2-12とも呼ばれるから成る受容体複合体を介して信号を送る。ヒトI型インターフェロンは、2つの受容体サブユニットであるIFNAR-1とIFNAR-2に結合すると考えられ、これらは、様々な細胞型の細胞の表面に広く分布される。リガンドの関与は、それぞれIFNAR-1と2に結合されるチロシンキナーゼであるTYK2とJAK-1のリン酸化を誘導する。いったんリン酸化されると、STATタンパク質は、受容体から放出され、ヘテロ二重体だけでなく、ホモ二重体からも形成する。いったん放出されると、インターフェロンResponsiveFactor9IRF-9と関連し、STATの二重体であるDNA結合プロテインは、IFN-刺激遺伝子因子―3ISGF-3と呼ばれる複合体を形成し、それは核に移動する。次に、ISGF-3複合体は、全てのIFN誘導遺伝子の上流に存在するDNA要素に結び付く。I型インターフェロンは、例えば米国特許第7,625,555号の、Recombinanthumaninterferon-likeproteins,incorporatedhereinbyreferenceのような文献の中で広く記載されている。1型IFNは、それらの配列とそれらの共有の受容体結合能により明示されるように、実質的な構造上の類似点を有する。Kontsek,P.,1994HumantypeIinterferons:structureandfunction,ActaVirol.386:345-60これは、参照により本明細書の中に組み込まれるヒトI型インターフェロンその時点で13個が報告されていたは、20の全体の配列相同性を有し、それは、ポリペプチドの同一の二次の、又は三次の折り畳みを決定する。さらに、Kontsekは、3次元のモデルは、I型のIFNの球状構造が、2つのポリペプチドドメインを形成するかもしれない5α―らせん体の束から成ることを示唆すると報告する。ジスルフィド結合Cys29-Cys139は、生理活性の配置において両方のドメインを安定させる。アミノ酸aa30-41と120-145と関連する2つの保存された親水性の領域は、I型IFN中の受容体認識部位の基本的なフレームワークを構成すると考えられ、ヒトI型IFN中における生物学的効果の異なる範囲は、aa30-41と120-145のセグメント内におけるわずかな配列の異種性や、可変の親水性aa領域である23-26、68-85、および112-121に起因するものだと推測される。Oritani,etal.,2001,TypeIinterferonsandlimitin:acomparisonofstructures,receptors,andfunctions,CytokineGrowthFactorRev124:337-48これは参照により本明細書に組み込まれるによるその後の報告は、ファミリーメンバーIFN-α、IFN-β、IFN-pi、又はIFN-tauを記載する。その研究論文は、またIFN-αとIFN-βは、5つのらせん体から成る球状構造を有することも報告し、比較配列解析、原型の3次元構造、モノクローナル抗体による解析、混成分子の構造、又は特定部位の定方向突然変異誘発について論ずる。本発明の方法を用いる任意のI型インターフェロンタンパク質の産生が熟考される。本発明の方法を用いて産生され得るI型インターフェロンタンパク質は、ヒトIFN-α2aおよび2b、ヒトIFN-β1b、ヒトIFN-κ例えば、NM_020124、AAK63835、これらはLaFleur,etal.,2001,Interferon-kappa,anoveltypeIinterferonexpressedinhumankeratinocytes,J.Biol.Chem.27643,39765-39771,これは、参照により本明細書の中に組み込まれるによって記載されるおよびヒトIFN-ω例えばNM_002177、NP_002168、これらはまた米国特許第7,470,675号、Methodsfortreatingcancerusinginterferon-ω―expressingpolynucleotides,これは参照することにより全体として本明細書の中に組み込まれる中に記載されているを含むが、これらに限定されない。本発明の方法を用いるIFN-τの産生もまた熟考される。アミノ酸と核酸配列は、公的に、例えばGenBankから利用できる。IFN-αタンパク質の14サブタイプが記載されている:IFNA1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNA8、IFNA10、IFNA13、IFNA14、IFNA16、IFNA17、IFNA21。IFN-αは、ペグインターフェロンalfa-2aやペグインターフェロンalfa-2bのような治療薬として合成的に作られる。IFN―βIFNB1、又はIFN-β1bは主なβサブタイプである例えばGenBankNP002167.1参照、それは成熟したペプチド配列を提供する。Betaseronは、ヒトIFN-βアナログであり、その中でセリンは、ポジション17のシステインと置換するように遺伝子上操作され、それはIFN-β1bC17Sとして知られている米国特許第4,588,585Humanrecombinantcysteinedepletedinterferon-βmuteins,これは、参照により本明細書の中に組み込まれるにおいて記載される。分子は、1つのジスルフィド結合を伴った165アミノ酸の小さなポリペプチドであり、非グリコシル化タンパク質として産生される。IFN-τは記載され、IFN-τの配列が、例えば米国特許第7,214,367号,Orally-administeredinterferon-taucompositionsandmethods,これは、全体として参照により本明細書の中に組み込まれるに開示される。多くのI型IFNは、ヒトにおいて疾患を処置する時にFDAにより使用が認可されてきた。下記の表は、I型インターフェロン薬物の例を挙げる。本発明の実施形態において、これらの薬物の任意のものは、本明細書の中で出願され、または記載される方法を用いて作り出される。実施形態において、1型インターフェロンタンパク質の変異及び改変は、本発明の方法を用いて作り出される。例えば、IFN-β変異体は、米国特許第6,531,122号Interferon-βvariantsandconjugatesおよび米国特許第7,625,555号に記載され、両方とも参照として本明細書に組み込まれる。共役はペグ1型インターフェロン、例えば、表4に示されるPEGylated、および非ペプチド部分に連結されたインターフェロンを含む。本発明の方法は、それらの構造類似性によりすべての1型インターフェロンに役立つと予想される。特定の構造上無関係なタンパク質、例えばヒトGCSFは、本発明の方法を用いて産生するためにあまり候補とならないbepoorcandidateとわかった。本明細書に記載される方法を用いてGCSFが産生され、抽出される時、不溶画分中のGCSFタンパク質の5未満の量は、可溶性タンパク質として抽出された示されないデータ。一般に、アミノ酸配列に関して、用語改変modificationは、置換、挿入、伸長、欠失および誘導単独、またはそれらの組み合わせを含む。幾つかの実施形態において、ペプチドは、非本質的なアミノ酸残基の1つ以上の改変を含むかもしれない。この文脈において、非本質的なアミノ酸残基は、新規なアミノ酸配列において、ペプチド例えばアナログペプチドの活性例えばアゴニスト活性を実質的に減少させることなく変更、例えば、欠失または置換、することができる残基である。幾つかの実施形態において、ペプチドは、不可欠なアミノ酸残基の1以上の改変を含み得る。この文脈において、不可欠なアミノ酸残基は、新規なアミノ酸配列において、変更、例えば、欠失または置換されると、参照ペプチドの活性が実質的に減少されるまたは無効にされる残基である。必須アミノ酸残基が変更されるような実施形態において、改変されたペプチドは、提供される方法において、対象の1型インターフェロンの活性を有し得る。置換、挿入および欠失は、N末端またはC末端である場合もあり、またはタンパク質の内部の部分にある場合もある。一例として、タンパク質は、連続的な形式で、又はペプチド分子の全体にわたって間隔を置いての両方で、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれ以上の置換を含み得る。単独又は置換と組み合わせて、ペプチドは、連続的な形式で又はペプチド分子の全体にわたって間隔を置いてかのいずれかで、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれ以上の挿入を含み得る。ペプチドは、単独または置換及び/又は挿入と組み合わせて、重ねて連続的な形式で、又はペプチド分子の全体にわたって間隔を置いてのいずれかで、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれ以上の欠失を含み得る。ペプチドはまた、単独でまたは置換、挿入及び/又は欠失と組み合わせて、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれ以上のアミノ酸付加を含み得る。置換は、保存的なアミノ酸置換を含む。保存的なアミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似した側鎖または物理化学的特性例えば、静電気的な、水素結合の、等配電子のisosteric、疎水性の特徴を有するアミノ酸残基と交換されるアミノ酸残基である。アミノ酸は、天然である場合もあり又はまたは非天然normatural人工的である場合もある。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該技術分野で公知である。これらのファミリーは、塩基性の側鎖例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン、酸性の側鎖例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、荷電していない極性側鎖例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、メチオニン、システイン、無極性の側鎖例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、β-分枝側鎖例えば、トレオニン、バリン、イソロイシンおよび芳香族側鎖例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンを含む。置換はまた、非保存的な変化を含み得る。最適な抽出条件を選択するための方法本発明の実施形態において、提供されるパラメータ値の範囲内の抽出条件をさらに最適化するために、図4Bにおいて明らかにされた統計分析の結果を使用する。明らかにされた範囲内の任意の値を用いて本発明を実行すると、すべての1型インターフェロンの高水準の可溶性タンパク質産生が観察されると予期される。それにもかかわらず、近い将来にその必要を満たすために抽出条件を最適化するために、図4のBに示されるツールを利用することは当業者の能力内にある。産生物の評価タンパク質収量本明細書に記載される不溶性および可溶性の画分中のタンパク質収量は、例えば、キャピラリーゲル電気泳動法CGEおよびウエスタンブロット分析によって、当業者に既知の方法によって測定されることができる。タンパク質収量の有用な測定は、例えば、培養量当たりの組換えタンパク質の量例えば、タンパク質のgまたはmg/培養物のL、溶解後に得られる不溶性のペレット中で測定された組換えタンパク質のパーセントまたは画分抽出上清中の組換えタンパク質の量/不溶画分中のタンパク質の量、活性タンパク質のパーセントまたは画分例えば、活性タンパク質の量/アッセイにおいて使用されるタンパク質の量、全細胞タンパク質tcpのパーセント又は画分、タンパク質/細胞の量およびパーセント乾燥バイオマスを含む。実施形態において、本明細書に記載されるタンパク質の測定は、得られた可溶性のタンパク質の量または活性タンパク質の量、またはその両方に基づく。実施形態において、本発明の方法は、約0.3グラム/L~約10グラム/Lの抽出される組換えタンパク質収量を得るために使用することができる。特定の実施形態において、抽出される組換えタンパク質は、約0.3グラム/L~約1グラム/L、約1グラム/L~約2グラム/L、約2グラム/L~約3グラム/L、約3グラム/L~約4グラム/L、約4グラム/L~約5グラム/L、約5グラム/L~約6グラム/L、約6グラム/L~約7グラム/L、約7グラム/L~約8グラム/L、約8グラム/L~約9グラム/L、又は約9グラム/L~約10グラム/Lである。実施形態において、抽出されるタンパク質収率は、約1グラム/L~約3グラム/L、約2グラム/L~約4グラム/L、約3グラム/L~約5グラム/L、約4グラム/L~約6グラム/L、約5グラム/L~約7グラム/L、約6グラム/L~約8グラム/L、約7グラム/L~約9グラム/L、又は約8グラム/L~約10グラム/Lである。実施形態において、抽出されるタンパク質収率は、約0.5グラム/L~約4グラム/L、約1グラム/L~約5グラム/L、約2グラム/L~約6グラム/L、約3グラム/L~約7グラム/L、約4グラム/L~約8グラム/L、約5グラム/L~約9グラム/L、又は約6グラム/L~約10グラム/Lである。実施形態において、抽出されるタンパク質収率は、約0.5グラム/L~約5グラム/L、約1グラム/L~約6グラム/L、約2グラム/L~約7グラム/L、約3グラム/L~約8グラム/L、約4グラム/L~約9グラム/L、又は約5グラム/L~約10グラム/Lである。実施形態において、抽出上清画分中で検出される組換えインターフェロンタンパク質の量は、不溶画分中で検出される組換えインターフェロンタンパク質の量の約10から約95である。実施形態において、この量は、約10、約15、約20、約25、約30、約35、約40、約45、約50、約55、約60、約65、約70、約75、約80、約85、約90、又は約95である。実施形態において、この量は、約10~約20、20~約50、約25~約50、約25~約50、約25~約95、約30~約50、約30~約40、約30~約60、約30~約70、約35~約50、約35~約70、約35~約75、約35~約95、約40~約50、約40~約95、約50~約75、約50~約95、又は約70~約95である。材料が抽出プロセスの間に失われるので、抽出されていない不溶画分中で測定されるタンパク質収量は、典型的には、抽出上清中の収量より高い。発酵培養物からの収量は、より小さなHTP培養からの収量より典型的にはより高い。パーセント全細胞タンパク質は、総計の細胞のタンパク質の割合としての宿主細胞中のタンパク質またはポリペプチドの量である。パーセント全細胞タンパク質の測定は、当該技術分野において周知である。実施形態において、産生される抽出上清画分中で検出されるインターフェロンタンパク質の量は、全細胞タンパク質の約1から約75である。特定の実施形態において、産生される組換えタンパク質は、全細胞タンパク質の約1、約2、約3、約4、約5、約10、約15、約20、約25、約30、約35、約40、約45、約50、約55、約60、約65、約70、約75、約1~約5、約1~約10、約1~約20、約1~約30、約1~約40、約1~約50、約1~約60、約1~約75、約2~約5、約2~約10、約2~約20、約2~約30、約2~約40、約2~約50、約2~約60、約2~約75、約3~約5、約3~約10、約3~約20、約3~約30、約3~約40、約3~約50、約3~約60、約3~約75、約4~約10、約4~約20、約4~約30、約4~約40、約4~約50、約4~約60、約4~約75、約5~約10、約5~約20、約5~約30、約5~約40、約5~約50、約5~約60、約5~約75、約10~約20、約10~約30、約10~約40、約10~約50、約10~約60、約10~約75、約20~約30、約20~約40、約20~約50、約20~約60、約20~約75、約30~約40、約30~約50、約30~約60、約30~約75、約40~約50、約40~約60、約40~約75、約50~約60、約50~約75、約60~約75、または約70~約75である。溶解度および活性タンパク質の溶解度および活性は、性質に関連するが、一般的に、異なる方法によって測定される。タンパク質、特に疎水性タンパク質の溶解度は、疎水性アミノ酸残基が折り畳まれたタンパク質の外部に誤って位置付けられることを示す。タンパク質活性それは別の方法を用いて評価することができるは、例えば、下記に記載されるように、適切なタンパク質構造の別の指標である。本明細書に使用されるように、可溶性の、活性な、またはその両方は、当業者に知られている方法によって、可溶性、活性、または可溶性かつ活性の両方であると測定されるタンパク質を指す。インターフェロン活性アッセイインターフェロンタンパク質活性を評価するためのアッセイは、当該技術分野で知られており、インターフェロンの標準リガンドへの結合を測定する結合活性アッセイ、例えばブルーセファロースカラム、又は特異抗体カラムを含む。インターフェロンの生物学的活性は、既知のアッセイを用いて定量化することができ、その多くは、キットで市販されている。大部分またはすべてのインターフェロンの種類は、I型およびII型IFNのための異なる受容体の存在にもかかわらず、応答細胞におけるインビトロの生物学的活性の類似したスペクトルを働かせることが示された。IFNによって誘導された生物学的活性は、抗ウイルス活性を含み、それは細胞受容体によって媒介され、シグナル伝達経路の活性化、特定の遺伝子産物の発現および抗ウイルス機構の発展に依存する。IFNを媒介とした抗ウイルス活性に対する細胞の感受性は、可変的で、細胞型、IFN受容体および下流のエフェクター反応要素の発現、抗ウイルス機構の有効性、および細胞を感染させるために使用されるウイルスの型を含む多くの因子に依存する。生物学的活性アッセイは、例えば、細胞変性効果アッセイCPE、抗ウイルス活性アッセイ、細胞増殖の阻害、機能的な細胞活性の調整、細胞の分化の調整および免疫調節を測定するアッセイを含む。レポーター遺伝子アッセイは、実施例において本明細書に記載されるルシフェラーゼレポーター細胞ベースのアッセイを含む。レポーター遺伝子アッセイでは、IFN応答遺伝子のプロモーター領域は、異種のレポーター遺伝子、例えばホタルルシフェラーゼ又はアルカリフォスファターゼ、と連結され、IFN感受性細胞株へトランスフェクトされる。IFNにさらされた、安定してトランスフェクトされた細胞株は、IFNの用量と直接関係してレポーター遺伝子産物の発現を増加させ、そのリードアウトは、この産物の酵素の作用の測定値である。多くの活性アッセイツールおよびキットが市販されている。インターフェロンのための生物学的アッセイは、例えば、MeagerABiologicalassaysforinterferons,1Mar2002、J.Immunol.Methods2611-2:21-36によって記載され、これは、参照として本明細書に組み込まれる。実施形態において、活性は、アッセイされた総量に対する、抽出上清中の活性タンパク質で表わされる。これは、アッセイにおいて用いられるタンパク質の総量に関連するアッセイによって活性であることを測定されたタンパク質の量に基づく。他の実施形態において、活性は、標準、例えば天然タンパク質に対するタンパク質の活動レベルによって表わされる。これは、標準サンプルそこでは、各々のサンプルからの同じ量のタンパク質がアッセイにおいて使用される中の活性タンパク質の量に関連する上清抽出液サンプル中の活性タンパク質の量に基づく。実施形態において、組換えインターフェロンタンパク質の約40~約100までが活性であることが測定される。実施形態において、約40、約50、約60、約70、約80、約90、または約100の組換えインターフェロンタンパク質が活性であると測定される。実施形態において、約40~約50、約50~約60、約60~約70、約70~約80、約80~約90、約90~約100、約50~約100、約60~約100、約70~約100、約80~約100、約40~約90、約40~約95、約50~約90、約50~約95、約50~約100、約60~約90、約60~約95、約60~約100、約70~約90、約70~約95、約70~約100、または約70~100の組換えインターフェロンタンパク質が活性であることが測定される。他の実施形態において、約75~約100の組換えインターフェロンタンパク質が活性であることが測定される。実施形態において、約75~約80、約75~約85、約75~約90、約75~約95、約80~約85、約80~約90、約80~約95、約80~約100、約85~約90、約85~約95、約85~約100、約90~約95、約90~約100、または約95~約100の組換えインターフェロンタンパク質が活性であることが測定される。発現系本発明の方法において有用な宿主細胞のみでなくシュードモナス宿主細胞においても有用な調節配列例えば、プロモーター、分泌リーダーおよびリボソーム結合部位を含む異種のタンパク質を発現するための方法は、米国特許出願公開第2008/0269070号および米国特許出願第12/610,207号,共に、発明の名称MethodforRapidlyScreeningMicrobialHoststoIdentifyCertainStrainswithImprovedYieldand/orQualityintheExpressionofHeterologousProteins、米国特許出願公開第2006/0040352号、ExpressionofMammalianProteinsinPseudomonasFluorescens、および米国特許出願公開第2006/0110747号、ProcessforImprovedProteinExpressionbyStrainEngineering、これらは全て、その全体が参照として本明細書に組み込まれるに記載される。これらの出版物はまた、本発明の方法を実行する際に有用な細菌宿主株を記載し、それらは、折り畳みモジュレーターを過剰発現するように設計されており、または異種のタンパク質発現を増加させるためにプロテアーゼ変異体が導入されている。配列リーダーは、米国特許出願第12/610,207号のみでなく、米国特許出願公開第2008/0193974号,Bacterialleadersequencesforincreasedexpression、および、米国特許出願公開第2006/0008877号、ExpressionsystemswithSec-secretion両方ともその全体が参照として本明細書に組み込まれるにも記載される。プロモーター本発明に従って使用されるプロモーターは、構成的プロモーター、または調節プロモーターであり得る。有用な調節プロモーターの一般的な例は、lacプロモーターすなわちlacZプロモーター、特に、Ptac16、Ptac17、PtacII、PlacUV5、およびT7lacプロモーターだけでなく、DeBoerの米国特許第4,551,433号に記載されるtacおよびtrcプロモーターも含む。1つの実施形態において、プロモーターは、宿主の細胞生物体に由来しない。特定の実施形態において、プロモーターは、E.coli生物体に由来する。誘導性プロモーター配列は、本発明の方法に従ってインターフェロンの発現を調節するために使用することができる。実施形態において、本発明の方法において有用な誘導プロモーターは、lacプロモーターすなわちlacZプロモーター、特に、Ptac16、Ptac17、PtacII、PlacUV5、およびT7lacプロモーターだけでなく、DeBoerの米国特許第4,551,433号に記載されるtacおよびtrcプロモーターも含む。1つの実施形態において、プロモーターは、宿主細胞生物体に由来しない。特定の実施形態において、プロモーターは、E.coli生物体に由来する。本発明による発現系において有用なlacを含まない型のnon-lac-typeプロモーターの一般的な例は、例えば表5にリストされたものを含む。例えば、以下を参照:J.Sanchez-RomeroV.DeLorenzo1999ManualofIndustrialMicrobiologyandBiotechnologyA.DemainJ.Davies,eds.pp.460-74ASMPress,Washington,D.C.;H.Schweizer2001CurrentOpinioninBiotechnology,12:439-445;およびR.SlaterR.Williams2000MolecularBiologyandBiotechnologyJ.WalkerR.Rapley,eds.pp.125-54TheRoyalSocietyofChemistry,Cambridge,UK。選択された細菌の宿主細胞に固有のプロモーターのヌクレオチド配列を有するプロモーターはまた、標的ポリペプチド、例えば、シュードモナスアントラニラートまたは安息香酸塩オペロンプロモーターPant、Pbenをコード化する導入遺伝子の発現を制御するために使用され得る。1を超えるプロモーターが別のものそれが、配列において同じであろうと又は異なろうとまたは同じ若しくは異なる生物体に由来しようと、に共有結合するタンデムプロモーター、例えば、Pant-Pbenタンデムプロモーター内部プロモーターハイブリッドinterpromoterhybridまたはPlac-Placタンデムプロモーター、も使用され得る。調節プロモーターはプロモーターが一部分である遺伝子の転写を制御するためにプロモーター調節タンパク質を利用する。調節プロモーターが本明細書に使用される場合、相当するプロモーター調節タンパク質はまた、本発明による発現系の一部分である。プロモーター調節タンパク質の例は、以下を含む:活性化タンパク質、例えば、E.coliカタボライト活性化タンパク質、MalTタンパク質;AraCファミリー転写活性化因子;抑制タンパク質、例えばE.coliLacIタンパク質;および二重機能調節タンパク質dual-functionregulatoryprotein、例えばE.coliNagCタンパク質。多くの調節プロモーター/プロモーター調節―タンパク質の組が当該技術分野において知られている。1つの実施形態において、標的タンパク質のための発現構築物および対象の異種のタンパク質は、同じ調節要素の制御下にある。プロモーター調節タンパク質は、エフェクター化合物、すなわち、タンパク質が、放出されるか、又はプロモーターの制御下にある遺伝子の少なくとも1つのDNA転写制御領域に結合することが可能にするように調節タンパク質と可逆的にまたは不可逆的に関連する化合物と相互作用し、それによって、遺伝子の転写を開始する際に転写酵素の作用をさせる又は遮断する。エフェクター化合物は、誘導物質または抑制補体のいずれかとして分類され、これらの化合物は、天然のエフェクター化合物および非代謝性誘導物質化合物を含む。多くの調節プロモーター/プロモーター調節タンパク質/エフェクター-化合物の三つ組trioが、当該技術分野において知られている。エフェクター化合物は細胞培養または発酵の全体にわたって使用することができるが、調節プロモーターが使用される好ましい実施形態において、所望の量または密度の宿主細胞バイオマスの増殖後に、対象のタンパク質またはポリペプチドをコード化する所望の遺伝子の発現を直接的又は間接的に結果としてもたらすために、適切なエフェクター化合物が培養物に加えられる。lacファミリープロモーターが利用される実施形態において、lacI遺伝子はまた、系に存在し得る。lacI遺伝子、それは、通常本質的に発現される遺伝子である、は、Lac抑制タンパク質LacIタンパク質をコード化し、それはlacファミリープロモーターのlacオペレーターに結合する。従って、lacファミリープロモーターが利用される場合、lacI遺伝子も含まれ得、発現系において発現し得る。シュードモナスにおいて有益なプロモーター系は、文献、例えば、米国特許出願公開第2008/0269070号に記載され、これらも上に参照される。他の調節要素実施形態において、可溶性タンパク質は、産生の間、細胞の細胞質または周辺質のいずれかの中に存在する。タンパク質を標的化するのに役立つ分泌リーダーは、本明細書の至る所、および米国特許出願公開第2008/0193974号、米国特許出願公開第2006/0008877号において、および米国特許出願第12/610,207号に記載され、これらは、上に参照される。本発明の方法を実施する際に有用な発現構築物は、タンパク質コード配列に加えて、それらに操作可能に結合する以下の調節要素を含み得る:プロモーター、リボソーム結合部位RBS、転写ターミネーター、および翻訳の開始および停止信号。有用なRBSは、例えば、米国特許出願公開第2008/0269070号および米国特許出願第12/610,207号に従って、発現系において宿主細胞として有益な任意の種から得ることができる。多くの特異的なおよび様々なコンセンサスRBS、例えば、D.Frishmanetal.,Gene2342:257-658Jul.1999;およびB.E.Suzeketal.,Bioinformatics1712:1123-30December2001において記載され、およびそれらに参照されるもの、が知られている。さらに、天然又は合成のRBSのいずれかは、EP0207459syntheticRBSs;O.Ikehataetal.,Eur.J.Biochem.1813:563-701989nativeRBSsequenceofAAGGAAGに記載されたものが使用され得る。方法、ベクター、および翻訳および転写の要素および本発明において有用な他の要素のさらなる例は、例えば、Gilroyの米国特許第5,055,294号およびGilroyetal.の米国特許第5,128,130号;Rammleretal.の米国特許第5,281,532号;Barnesetal.の米国特許第4,695,455号及び第4,861,595号;Grayetal.の米国特許第4,755,465号;およびWilcoxの米国特許第5,169,760号に記載される。宿主株シュードモナスを含む細菌の宿主、および密接に関連する細菌の生物体が本発明の方法を実施する際に使用するために熟考される。特定の実施形態において、シュードモナス宿主細胞は、Pseudomonasfluorescensである。宿主細胞はまた、E.coli細胞であり得る。シュードモナスおよび密接に関連する細菌は、一般に、グラム-プロテオバクテリアサブグループ1又はグラム陰性好気性の桿菌および球菌BuchananandGibbonseds.1974Bergey’sManualofDeterminativeBacteriology,pp.217-289として規定されるグループの一部である。シュードモナス宿主株は、文献、例えば、米国特許出願公開第2006/0040352号に記載され、これは、上に引用される。例えば、シュードモナス宿主は、属シュードモナス、シュードモナス-エナリアenaliaATCC14393、シュードモナスニグリファシエンスnigrifaciensiATCC19375およびシュードモナスプトレファシエンスputrefaciensATCC8071に由来する細胞を含み得、それらは、それぞれ、アルテロモナスハロプランクティスhaloplanktis、アルテロモナスニグリファシエンスnigrifaciensおよびアルテロモナスプトレファシエンスputrefaciensとして再分類された。同様に、例えば、シュードモナス-アシドボランスATCC15668およびシュードモナス-テストステロニATCC11996は、その後、それぞれ、コマモナスアシドボランスおよびコマモナステストステローニとしてそれぞれ再分類され;およびシュードモナスニグリファシエンスATCC19375およびシュードモナスピシシダpiscicidaATCC15057は、それぞれ、シュードモナスニグリファシエンスおよびシュードモナスピシシダとして再分類された。宿主細胞はグラム陰性プロテオバクテリアサブグループ16から選択され得る。グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ16は、以下のシュードモナス種ATCCまたは典型的な株の他の寄託番号を括弧内に示すのプロテオバクテリアのグループとして定義される:シュードモナスアビエタニフィラabietaniphilaATCC700689;シュードモナスエルジノーサaeruginosaATCC10145;シュードモナスアルカリゲネスalcaligenesATCC14909;シュードモナスアンギリセプチカanguillisepticaATCC33660;シュードモナスシトロネロリスcitronellolisATCC13674;シュードモナスフラベセンスflavescensATCC51555;シュードモナスメンドシナmendocinaATCC25411;シュードモナスニトロレデュセンスnitroreducensATCC33634;シュードモナスオレオボランスATCC8062;シュードモナスシュードアルカリゲネスpseudoalcaligenesATCC17440;シュードモナスレジノボランスresinovoransATCC14235;シュードモナスストラミネアstramineaATCC33636;シュードモナスアガリシagariciATCC25941;シュードモナスアルカリフィラalcaliphila;シュードモナスアルギノボラalginovora;シュードモナスアンデルソニイandersonii;シュードモナスアスプレニイaspleniiATCC23835;シュードモナスアゼライカazelaicaATCC27162;シュードモナスベイジェリンキイbeyerinckiiATCC19372;シュードモナスボレアリスborealis;シュードモナスボレオポリスboreopolisATCC33662;シュードモナスブラシカセラムbrassicacearum;シュードモナスブタノボラbutanovoraATCC43655;シュードモナスセルロサcellulosaATCC55703;シュードモナスアウランチアカaurantiacaATCC33663;シュードモナスクロロラフィスchlororaphisATCC9446、ATCC13985、ATCC17418、ATCC17461;シュードモナスフラジfragiATCC4973;シュードモナスルンデンシスlundensisATCC49968;シュードモナスタエトロレンスtaetrolensATCC4683;シュードモナスシシコーラcissicolaATCC33616;シュードモナスコロナファシエンスcoronafaciens;シュードモナスジテルペニフィラditerpeniphila;シュードモナスエロンガータelongataATCC10144;シュードモナスフレクテンスflectensATCC12775;シュードモナスアゾトフォルマンスazotoformans;シュードモナスブレンネリbrenneri;シュードモナスセドレラcedrella;シュードモナスコルガータcorrugataATCC29736;シュードモナスエクストレモリエンタリスextremorientali;シュードモナスフルオレッセンスATCC35858;シュードモナスゲサルディイgessardii;シュードモナスリバネンシスlibanensis;シュードモナスマンデリイmandeliiATCC700871;シュードモナスマージナリスmarginalisATCC10844;シュードモナスミグラエmigulae;シュードモナスムシドレンスmucidolensATCC4685;シュードモナスオリエンタリスorientalis;シュードモナスローデシアエrhodesiae;シュードモナスシンクサンタsynxanthaATCC9890;シュードモナストラアシイtolaasiiATCC33618;シュードモナスベロニイveroniiATCC700474;シュードモナスフレデリクスベルゲンシスfrederiksbergensis;シュードモナスゲニクラタgeniculataATCC19374;シュードモナスギンゲリgingeri;シュードモナスシュードモナスグラミニスgraminis;シュードモナスグリモンティgrimontii;シュードモナスハロデニトリフィカンスhalodenitrificans;シュードモナスハロフィラhalophila;シュードモナスヒビシコラhibiscicolaATCC19867;シュードモナスヒュッチエンシスhuttiensisATCC14670;シュードモナスヒドロゲノボラhydrogenovora;シュードモナスジェッセニイjesseniiATCC700870;シュードモナスキロネンシスkilonensis;シュードモナスランセオラタlanceolataATCC14669;シュードモナスリニlini;シュードモナスマルギナタmarginataATCC25417;シュードモナスメフィチカmephiticaATCC33665;シュードモナスデニトリフィカンスdenitrificansATCC19244;シュードモナスペルツシノゲナpertucinogenaATCC190;シュードモナスピクトラムpictorumATCC23328;シュードモナスサイクロフィラpsychrophila;シュードモナスフィルバfilvaATCC31418;シュードモナスモンテイリイmonteiliiATCC700476;シュードモナスモッセリイmosselii;シュードモナスオリジハビタンスoryzihabitansATCC43272;シュードモナスプレコグロシシダplecoglossicidaATCC700383;シュードモナスプチダputidaATCC12633;シュードモナスレアクタンスreactans;シュードモナススピノサspinosaATCC14606;シュードモナスバレアリカbalearica;シュードモナスルテオラluteolaATCC43273;シュードモナススタッツェリstutzeriATCC17588;シュードモナスアミグダリamygdaliATCC33614;シュードモナスアベラナエavellanaeATCC700331;シュードモナスカリカパパヤエcaricapapayaeATCC33615;シュードモナスシコリーcichoriiATCC10857;シュードモナスフィクセレクタエficuserectaeATCC35104;シュードモナスフソコバギナエfuscovaginae;シュードモナスメリアエmeliaeATCC33050;シュードモナスシリンゲsyringaeATCC19310;シュードモナスビリジフラバviridiflavaATCC13223;シュードモナスサーモカルボキシドボランスthermocarboxydovoransATCC35961;シュードモナスサーモトレランスthermotolerans;シュードモナスチベルバレンシスthivervalensis;シュードモナスバンコウベレンシスvancouverensisATCC700688;シュードモナスウィスコンシネンシスwisconsinensis;およびシュードモナスキアメンシスxiamenensis。宿主細胞はまた、グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ17から選択され得る。グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ17は、例えば、以下のシュードモナス種に属するものを含む蛍光性シュードモナスとして当該技術分野で既知のプロテオバクテリアのグループとして定義される:シュードモナスアゾトフォルマンスazotoformans;シュードモナスブレンネリbrenneri;シュードモナスセドレラcedrella;シュードモナスコルガータcorrugata;シュードモナスエクストレモリエンタリスextremorientalis;シュードモナスフルオレッセンスfluorescens;シュードモナスゲサルディイgessardii;シュードモナスリバネンシスlibanensis;シュードモナスマンデリイmandelii;シュードモナスマージナリスmarginalis;シュードモナスミグラエmigulae;シュードモナスムシドレンスmucidolens;シュードモナスオリエンタリスorientalis;シュードモナスローデシアエrhodesiae;シュードモナスシンクサンタsynxantha;シュードモナストラアシイtolaasii;およびシュードモナスベロニイveronii。コドン最適化細菌の宿主における発現を向上させるためにコドンを最適化する方法は、当該技術分野で知られており、文献に記載されている。例えば、シュードモナス宿主株における発現のためのコドンの最適化は、米国特許出願公開第2007/0292918号、CodonOptimizationMethodに記載され、これは、その全体が参照として本明細書に記載される。E.coliにおける発現のためのコドン最適化は、例えば、Welch,etal.,2009,PLoSOne,DesignParameterstoControlSyntheticGeneExpressioninEscherichiacoli,49:e7002,Ghane,etal.,2008,OverexpressionofBiologicallyActiveInterferonΒUsingSyntheticGeneinE.coli,JournalofSciences,IslamicRepublicofIran193:203-209、およびValente,etal.,2004,TranslationalFeaturesofHumanAlpha2bInterferonProductioninEscherichiacoli,AppliedandEnvironmentalMicrobiology708:5033-5036によって記載され、これらはすべて本明細書に参照として組み込まれる。発酵様式本発明による発現系は、任意の発酵様式fermentationformatにおいて培養され得る。例えば、バッチ、フェドバッチ、半連続式、又は連続式の発酵モードが本明細書において利用され得る。実施形態において、発酵培地は、富栄養培地、最少培地および無機塩培地の中から選択され得る。他の実施形態において、最少培地または無機塩培地のいずれかが選択される。特定の実施形態において、無機塩培地が選択される。無機塩培地は、無機塩と、例えば、グルコース、スクロース、グリセロールなどの炭素源からなる。無機塩培地の例は、例えば、M9培地、シュードモナス培地ATCC179、及びDavis-Mingioli培地BDDavisESMingioli1950J.Bact.60:17-28を参照を含む。無機塩培地を作るために使用される無機塩は、例えば、リン酸カリウム、硫酸アンモニウム又は塩化アンモニウム、硫酸マグネシウム又は塩化マグネシウム、および鉄、銅、マンガンおよび亜鉛の塩化カルシウム、ホウ酸塩および硫酸塩などの微量金属の間から選択されるものを含む。典型的には、ペプトン、トリプトン、アミノ酸または酵母抽出物など有機窒素源は、無機塩培地に含まれていない。代わりに、無機窒素源が使用され、これは、例えばアンモニウム塩、アンモニア水、気体のアンモニアの間から選択され得る。無機塩培地は、典型的には炭素源としてグルコースまたはグリセロールを含む。無機塩培地と比較して、最少培地も無機塩と炭素源を含み得るが、補うことができ、例えば、低レベルのアミノ酸、ビタミン、ペプトンまたは他の成分で補われ得、もっとも、これらは、ごく最低限のレベルで加えられる。培地は、当該技術分野において、例えば、米国特許出願公開第2006/0040352号において記載され、それは、上に引用され、参照として組み込まれる。培養手順および本発明の方法において有用な無機塩培地の詳細は、Riesenberg,Detal.,1991,HighcelldensitycultivationofEscherichiacoliatcontrolledspecificgrowthrate,J.Biotechnol.201:17-27によって記載される。発酵は任意の規模で行なわれ得る。本発明による発現系は、任意の規模での組換えタンパク質発現のために有用である。したがって、例えば、マイクロリットルの規模、センチリットルの規模、およびデシリットルの規模の発酵容量が使用されてもよく、1リットルの規模およびより大きな発酵容量を使用することができる。実施形態において、発酵容量は約1Lであり、または1Lを超える。幾つかの実施形態において、醗酵容量は約1L~約100Lである。実施形態において、醗酵容量は、約1L、約2L、約3L、約4L、約5L、約6L、約7L、約8L、約9L、又は約10Lである。実施形態において、発酵容量は、約1L~約5L、約1L~約10L、約1L~約25L、約1L~約50L、約1L~約75L、約10L~約25L、約25L~約50L、あるいは約50L~約100Lである。他の実施形態において、発酵容量は、5Lであり、あるいは5Lを超え、10L、15L、20L、25L、50L、75L、100L、200L、500L、1,000L、2,000L、5,000L、10,000Lまたは50,000Lである。本発明の好ましい実施形態が、本明細書に示され記載されているが、このような実施形態が、ほんの一例として提供されることは当業者に明白であるであろう。ここで、本発明から逸脱することなく、多数の変更、変化、及び置換がなされることは、当業者によって理解される。本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代替案が、本発明を実行する際に利用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を規定するものであり、この特許請求の範囲及びそれらの同等物の範囲内の方法及び構成がそれによって包含されることが意図される。実施例1:高スループット発現サンプルからのrIFN-βの産生下記の実験において、IFN-βC17S発現株を作製し、各々の得られた不溶画分中のIFN-βの量を定量化した。結果として得られたデータに基づくと、特定の株を本発明の非変性の抽出プロセスを最適化する際に、使用するために選択した。IFN-β発現株の作製と増殖IFN-β1bコード配列を、治療上のBetaseronに相当するヒトIFN-βアミノ酸配列をコード化するためにP.fluorescensの好ましいコドンを用いて作製した。図7は、アミノ酸と合成のIFN-βBetaseron遺伝子のDNA配列を示す。19のP.fluorescens分泌リーダーへ融合されたコドン最適化されたIFN-βを産出するcarryプラスミドを作製した。タンパク質がきちんと折り畳まれた活性型において回復され得る周辺質にタンパク質を標的化するために、分泌リーダーを入れた。細胞質の発現のために設計されたコドンを最適化されたIFN-βを産出する1つのプラスミドを作製した。Ptacプロモーターと、高活性Hiおよび中活性Medリボソーム結合部位RBSのいずれかから開始される翻訳がIFN-βの発現を引き起こした。結果として生じた20のプラスミドを、600の発現株を産生するために、30のP.florescens宿主株16のプロテアーゼ欠損株、13の折り畳みモジュレーター過剰発現株および1の野生株に形質転換した表6及び7参照。折り畳みモジュレーターは、存在しているとき、第2のプラスミドにコード化され、マンニトール誘導性プロモーターが発現を引き起こした。20のIFN-β発現プラスミド全部で600の発現宿主の各々を産出する第30宿主株を、96ウェルプレートで3通りintriplicate増殖させた。誘導の24時間後に回収したサンプルを分析に用いた。96-ウェルフォーマットにおけるPfenex発現技術を用いるIFN-βの発現各々のプラスミド表6を、下記のように30のP.fluorescens宿主株表7に形質転換した。:コンピテント細胞の25マイクロリットルを解凍し、96ウェルの電気穿孔プレートBTXECM630Electroporatorに移し、各々のウェルに1μlのミニプレッププラスミドDNAを加えた。細胞を、2.5KV、200オーム、および25μFで電気穿孔した。細胞を微量元素を用いて75μlのHTP-YE培地中に再懸濁し、500μlのM9塩1グルコース培地を用いて96ウェルのディープウェルプレートに移し種培養、30°Cで培養し、48時間の間、300rpmおよび50mm直径のスローthrowで振盪した。種培養10μlを96ウェルのディープウェルプレートの3通りのウェルに移し、各々のウェルはHTPYE培地500μlを含み、24時間の間、以前と同じように培養した。イソプロピル-β-D-1-チオガラクトピラノシドIPTGをIFN-βの発現を誘導するために、0.3mMの最終濃度のために各々のウェルに加えた。HTPマイクロウェル中での小さな培養物の成長のために、具体的な培養pHはあまり厳しく制御せず、細胞密度をウェルごとにわずかに異ならせることがある。モジュレーター過剰発現株を折り畳む際に、折り畳みモジュレーターの発現を誘導するために、MannitolSigma,M1902を1の最終濃度で各々のウェルに加え、温度を25°Cに下げた。誘導の24時間後、培養物を分析のために集めた。OD正規化のために、BiomekリキッドハンドリングステーションBeckmanCoulterを用いて、400μlの最終容量で最終OD600=20を得るために、細胞を無菌の1XPBSと混ぜた。サンプルをクラスター試験管立ての中に集めた。サンプルの調製とSDS-CGE分析可溶画分溶解液の遠心分離後に得られた上清及び、不溶画分溶解液の遠心分離後に得られたペレットを、OD正規化培養菌を超音波処理することにより調製し、その後遠心分離にかけた。凍結した、正規化された培養物ブロス400μlを解凍し、3.5分間超音波処理した。溶解液を20分間4°C20,800×gで遠心分離し、可溶画分は、手動の又は自動化されたリキッドハンドリングを用いて除去する。不溶画分を凍結し、その後残りの上清を取り除くために、20,080×gで20分間4°Cでもう一度遠心分離するために解凍した。不溶画分を1×リン酸緩衝食塩水PBS,pH7.4400μL中に再懸濁した。SDS-CGE分析のための可溶画分及び不溶画分のさらなる希釈を、1×リン酸緩衝食塩水PBS,pH7.4の中で行った。可溶画分及び不溶画分を、ジチオスレイトールDTTの存在下で、SDS毛管ゲル電気泳動CGECaliperLifeSciences,proteinExpressLabChipKit,Part760301による、分析のために調製した。IFN-βを発現する600の株の各々のウェルから正規化された可溶画分と不溶画分を、可溶画分と不溶画分のための1つの複製において、SDS―CGE分析を減少させることにより分析した。可溶画分においてIFN-β信号を検出しなかった。不溶画分において、IFN-β信号は、無信号から400mg/L以上まで変化した。試験された20のプラスミドのうち5つだけが全ての30の宿主株の不溶画分においてIFN-βの測定可能な信号を示した:p530-001、p530-007、p530-011、p530-018、およびp530-020。CaliperLabChipGXsoftwareを用いるIFN-β信号の谷から谷への積分valleytovalleyintegrationを30の宿主株中の上記の5つのプラスミドから成る全ての150の株において行い、容積測定収量を算出するためにデータを用いた。分析された150の株の容積測定収量は、2~482mg/Lに及んだ。p-530-020を産出する株は、一貫して、他の発現株よりも、不溶画分において、IFN-βのより高い収量を得た。;しかしながら、SDS-CGEで予期されるよりもより高く移動するmigratehigherタンパク質は、分泌リーダーが開裂cleaveされなかったということを示した。高い収量もまた、p530-001産出をする2つの宿主株によって、観察された。不溶画分中の30の株の間で、潜在的に1つの株、DC441、alonhslUVプロテーゼ欠損株を除いてIFN-βの大きな違いは観察されなかったが、その1つの株は、他の29の株よりもいくらかより高い収量を示した。17のトップの発現株のサブセット表8は、プラスミドp530-020を含む株を除外するが、これをさらなる分析のために選択した。プラスミドp530-020を含む発現株は、潜在的に加工されないリーダーのためにこの実験においてさらなる考慮をしなかった。SDS-CGE分析は、これらの株に関して可溶画分と不溶画分において行った。SDSCGEアウトプットの定量化を表8に示す。IFN-βタンパク質濃度は、102から482mg/L以上まで及ぶ。不溶性の収量と周辺質リーダー配列またはIFN-βからのN末端Metのいずれかのプロセシングに基づいて、株を、発酵評価を行うために選択した。実施例2.高スループット発現材料からのIFN-β1bの抽出IFN-β1bを、Zwittergent3-14界面活性剤を含む抽出条件を用いて、HTP発現培養物からの不溶画分からうまく抽出した。細胞質のIFN―β1bと530-220を過剰発現させ、分泌IFN-β1bを過剰発現している実施例1記載Pseudomonasfluorescens株PS530-001のHTP発現プレート培養物は、不溶画分と可溶画分を得るためにこれを超音波処理し、遠心分離した。ペレットを、抽出バッファー1XPBS、pH7.4あるいはpH4.5の酢酸ナトリウムにおいて再懸濁した。各々のバッファーを、1w/vのZwittergent3-14を含む場合と含まない場合において、試験した。バッファーと界面活性剤の4つの組み合わせのそれぞれを、室内温度で1-2時間の間、又は4°Cで一晩振蘯しながら培養した。抽出後、各々のサンプルを第2の不溶性ペレット画分抽出ペレット及び第2の可溶性上清画分抽出上清を作成するために、20分間20,080xgで4°Cで遠心分離した。第1の不溶画分、第1の可溶画分、抽出ペレット画分及び抽出上清画分をSDS-CGEによって分析した。表1A及び1Bに結果を示す。レーン7を見て分かるように、PBSバッファーとZwittergent3-14を含む抽出条件が、可溶性IFN-βを産出した。実施例3.抽出条件の最適化発酵培養物からの不溶画分を、異なった界面活性剤を含む条件下で抽出した。株PS530-001の1Lの発酵物32°C、pH6.5で成長し、100のOD575で0.2mMIPTGを用いて誘導したからの凍結した細胞ペーストは、組換えIFN-β1bを過剰発現しているが、それを、20mMリン酸ナトリウムJTBaker、pH7.4を含む溶解バッファー中において20w/vの最終固体濃度まで再懸濁した。よく混ぜ合わせた懸濁液を、一定の細胞スラリーConstantSystems,Inc.を介して38kpsiで2回のパスを用いて溶解した。溶解液を半分に分け、15,000xgで30分間4°Cで遠心分離により回転させたBeckmanCoulter,PN♯J-20,XPF。ペレットIFN-β細胞破片を含むを再懸濁し、各々をバッファーA20mMリン酸ナトリウム、pH7.4及びバッファーB20mM酢酸ナトリウム、pH4.0のいずれかの中で洗浄した。サンプルを、初めの回転のために記載された同じ条件下で遠心分離により回転し、上清を取り除き、ペレットを20の固体濃度でバッファーAあるいはBのいずれか中にもう一度再懸濁した。各々のバッファーについて、1mLごとの20のアリコートを1.5mL円錐チューブの中に置いた。界面活性剤のストック溶液を異なる濃度において円錐体のチューブに加えた。全てのチューブは、室温で1時間、あるいは4°Cで一晩18時間絶え間なく混ぜながら培養した。抽出後、液体を遠心分離し、抽出上清画分を、SDSCGEによってタンパク質濃度について分析した。表2は、どのようにサンプルの準備と抽出を実施するかを示すフローチャートを提供する。試験された界面活性剤のうち、Zwittergent3-14及びN-lauroylsarcosineNLSは、バッファーと培養時間に関わらず、最高収量をもたらすことが分かった表9。しかしながら、NLSを用いて抽出された産生物は、セファロースアフィニティカラムまたは陽イオン交換カラムSPHPデータは示されていないのいずれかに結合することができないことにより測定されるように、活性ではない。Zwittergent3-14を用いて抽出された産生物は、活性であることが測定された。Zwittergentアナログの評価同様の方法を用いて、Zwittergentアナログの抽出効率を評価した。その結果を表10に示す。最も高い収量は、Zwittergent3-14に関して観察した。Zwittergent3-12、Zwittergent3-10、Zwittergent3-08もまた、効果的だった。Zwittergent3-14の濃度の評価タンパク質を効率的に可溶性にするために、界面活性剤の濃度は、典型的に、そのCMC値を超える必要がある。Zwittergent3-14のCMCは、約0.01w/vである。Zwittergent3-14の増加する濃度を有するpH7.4でのリン酸ナトリウムバッファーを含む抽出条件を評価した。使用される細胞ペーストを、32°C、pH6.5で株PS530-001を成長させることによって得、100のOD575で0.2mMのIPTGを使用して誘導した。表11の結果は、1w/vの濃度でのZwittergent3-14の使用が、最も高い抽出収量をもたらしたことを示す。追加の化学試薬の評価表11に示されるように、pH7.4でのリン酸ナトリウムバッファー中の1w/vの濃度でZwittergent3-14を含む抽出条件によって、元来の不溶画分中で検出された21のIFN-β1bをもたらした。さらなる最適化を行った。高濃度例えば6~8Mの尿素および塩酸グアニジンのようないくつかのカオトロピック試薬は、封入体の可溶化のための強力な変性剤として一般に使用されてきた。尿素などのカオトロープは、界面活性剤の臨界ミセル濃度CMCを増加させることができ、抽出効率を向上させる可能性がある。低濃度の尿素2M以内を、抽出条件で評価した。塩、例えば、NaClはまた、界面活性剤のCMCに影響を与え得る。変更させたZwittergent3-14濃度を、界面活性剤のCMCとカオトロピック試薬および塩の存在との間で起こり得る相互作用によって評価した。抽出条件中の不溶性の封入固体の濃度も変更させた。以前に使用された20w/vより低い固体の濃度を評価した。要約すると、抽出効率への以下のパラメータを変えることの効果を試験した。塩化ナトリウム:150-1850mM尿素:0-2MZwittergent3-14:0.1-1.0w/v固体:5-20w/vpH:6.5-8.5図3のフローチャートは、この最適化研究のための第1の不溶性のペレット画分の調製および抽出を記載する。表12は研究の結果を示す。図4のAおよびBは、各パラメータの抽出収量への効果の結果および有意性を要約する。不溶画分からのインターフェロンβの抽出を最適化するために、2水準5因子半分実施要因実験を使用した。JMPソフトウェアSASInstitute,Cary,NCを、実験の計画および分析に使用した。ソフトウェアは、実験の結果抽出されたインターフェロンの量への個々の因子および相互作用の効果を推測する。上記のデータに基づいて、最適化された抽出条件を、以下に記載される実験のために選択した:1w/vのZwittergent3-14、2Mの尿素、2MのNaCl、固体5のw/v、バッファーpH7.5~8.5。これらの最適化された条件を使用して、抽出上清内の観察された抽出収量は、一貫して90以上すなわち、不溶画分中で測定された組換えタンパク質の量の90以上であることがわかった。実施例4.大規模発酵からのrIFN-β1bの産生PseudomonasfluorescensのPfenexExpressionTechnology商標の株PS530-001内の組換えヒト-βインターフェロンIFN-β1bタンパク質の産生は、2リットルの発酵槽においてうまく達成された。複数の発酵条件は、9.2g/LまでのIFN-β1bの発現を結果としてもたらすと評価された。本明細書および、例えば、Riesenberg,D.,etal.,1991によって記載されるように発酵培養物を、無機塩培地を含む2リットルの発酵槽中で成長させた。培養条件を、32°Cおよびアンモニア水を加えることによるpH6.5で維持した。溶解酸素を、発酵槽への拡散された空気および酸素の撹拌および流れの増加によって過剰に維持した。過剰レベルを維持するために、グリセロールを、発酵の間中に培養物に送達した。誘導のための標的培養物の光学濃度A575が達成されるまで、これらの条件を維持し、その時に、IFN-β産生を開始するためにIPTGを加えた。誘導での光学濃度、IPTGの濃度、pHおよび温度をすべて、発現のための最適条件を決定するために変化させた。24時間後、各発酵槽からの培養物を、遠心分離によって採取し、細胞ペレットを-80°Cで凍結させた。発酵培養を、0.2mMのIPTGを使用して100OD575で、pH6.5で、および32°Cの温度で誘導した。複製発酵Replicatefermentationsは、最初の不溶画分のSDS-CGEによって測定されるように、7.5、8.4、および7.9g/LでのIFN-β産生を結果的にもたらした図5。これらの不溶画分が抽出にさらされた時1w/vのZwittergent3-14、2Mの尿素、2MのNaCl、固体5w/v、およびバッファーpH8.2を含む条件下、可溶性になったIFN-βを、2.2、2.4、および2.6g/Lでの抽出上清中で観察した。これは、31の平均抽出収量を示す。誘導ODを120から160に増加させ、発酵pHを5.7から6.25に減少させることで、最初の不溶画分中のIFN-β力価を8.8から9.2g/Lまで増加させた図6。図5に示される実験に関する同じ抽出条件を使用するこれらの細胞ペレットの抽出は、抽出された上清画分において3.1~4.0g/LのIFN-βを結果的にもたらし、これは39の平均抽出収量であった表13。実施例5.IFN-βの抽出産物の活性分析Pseudomonasfluorescens株PS530-001の発酵からのブロース0.2mMのIPTGを使用して100のOD575で誘導した、32°C、pH6.0での1Lの発酵を遠心分離にかけ、上清を捨てた。細胞ペーストを、20mMのTris、pH8.2で再懸濁し1:4の比率で、15,000psiでMicrofluidicsMicrofluidizerM110Yに通すことによって溶解した。溶解物を遠心分離にかけ、可溶画分を捨てた。不溶画分は、室温で1時間、抽出バッファー20mMのTris、2MのNaCl、2Mの尿素、1のZwittergent3-14、pH8.2と混合し、遠心分離にかけ、抽出物の上清画分および抽出物のペレット画分を作り出した。IFN-βの抽出収量抽出物の上清画分中のIFN-β/最初の不溶画分中のIFN-βは、SDS-CGE分析に基づいて、100>99に近かったデータは示されず。抽出上清をろ過し、20mMのTris、2MのNaCl、pH8.2によって平衡化された5mLのGEHealthcareBlueSepharoseカラム上に充填した。カラムを、同じバッファーで洗浄し、IFN-βを、20mMのTris、2MのNaCl、50のプロピレングリコール、pH8.2によって溶出した。溶出プール中のタンパク質を、SDS-CGEによって分析し、98以上の純度のIFN-βであることがわかった。溶出プールのアリコートを、バッファーC5mMのグリシンpH3.0およびD5mMのアスパラギン酸、9のトレハロース、pH4.0へと交換した。交換されたサンプルを、SDS-CGEによって、および細胞ベースのアッセイPBLInterferonSource,51100-1によっても分析した。細胞ベースのアッセイは、1型IFN受容体によって感作されたヒト細胞株PIL5を使用する。IFN-βが受容体に結合することで、Jak1/STAT1信号伝達経路を介して信号を送り、InterferonSensitiveResponseElementISREを介してISG15-ルシフェラーゼ転写を活性化する。製造業者のプロトコル51100rev01通りに、細胞ベースのアッセイキットインストラクションに従った。信号を、発光検出によるプレートリーダーを使用して読み出した。表14は、SDS-CGEおよび細胞ベースのアッセイの結果を示し、これは、サンプル中のIFN-βが十分に活性であったことを示す。実施例6.高スループットの発現サンプルからのIFN-α2aおよび2bの産生IFN-α2aおよびIFN-α2bコード配列を、ヒトタンパク質に関してコード化するために、P.fluorescensの好ましいコドンを使用して構築した。図8は、合成のIFN-α2a遺伝子のアミノ酸およびDNAの配列を示し、図9は、合成のIFN-α2b遺伝子のアミノ酸およびDNAの配列を示す。どちらかのタンパク質を発現するプラスミドを、構築し、異なる宿主株に形質転換した。発現株を、本明細書のIFN-βに関して記載されるように、HTP分析を使用して、組換えタンパク質を発現するそれらの能力に関して試験した。発現株のサブセットを発酵研究のために選択する。選択された菌株を、本発明に従って成長させ、誘導した。細胞を、IFN-βに関して本明細書に記載されるように、遠心分離にかけ、溶解し、再び遠心分離にかけた。結果として生じる不溶画分および第1の可溶画分を、本明細書に記載される抽出条件を使用して抽出した。結果として生じるIFN-α2aおよびIFN-α2bの抽出上清の量を、SDS-CGEを使用して計ったデータは示されず。実施例7.高スループット発現材料からのIFN-α2aおよび2bの抽出実施例6に記載されるように得られた第1の不溶画分を、本発明の抽出条件を使用して抽出する。結果として生じる第2の可溶画分中のIFN-α2aおよび2bを、CGEおよび生物活性のアッセイによって評価する。実施例8.大規模発酵からのIFN-α2aおよび2bの産生HTP分析によって選択されるIFN-α2aおよび2bを発現する菌株を、本発明の最適化した発酵条件を使用して、例えば、実施例4に記載されるように、2リットルの発酵槽中で成長させる。第1の不溶画分を、本発明の方法を使用して、例えば、実施例4に記載されるように抽出する。第1の不溶性および第2の可溶性の画分中に存在するIFN-α2aおよび2bのタンパク質を、CGEによって評価し、比較する。実施例9.IFN-α2aおよび2bの抽出産物の分析実施例8で得られた抽出産物を、IFN-α2aおよび2bの生物活性に関して分析する。"