"エリスロポエチンEPO、非ペプチドポリマー及び免疫グロブリンFcフラグメントが共有結合した治療学的有効量の持続型エリスロポエチン結合体と、緩衝溶液及びマンニトールを含むアルブミンフリー安定化剤とを含む持続型エリスロポエチンEPO結合体の液剤。前記マンニトールが、液剤の総体積比で1~20w/vの濃度を有するものである請求項1に記載の液剤。前記緩衝溶液が、クエン酸、リン酸、酒石酸、炭酸、コハク酸、乳酸及び酢酸緩衝溶液からなる群から選択されるものである請求項1に記載の液剤。前記緩衝溶液が、5~100mMの濃度を有するものである請求項1に記載の液剤。前記緩衝溶液が、4~8のpHを有するものである請求項1に記載の液剤。前記アルブミンフリー安定化剤が、等張化剤、多価アルコール、糖類、非イオン性界面活性剤、中性アミノ酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択された成分をさらに含むものである請求項1に記載の液剤。前記等張化剤が、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム及びそれらの組み合わせからなる群から選択された塩である請求項6に記載の液剤。前記等張化剤が、5~200mMの濃度を有するものである請求項6に記載の液剤。前記非イオン性界面活性剤が、ポリソルベート系又はポロキサマー系非イオン性界面活性剤である請求項6に記載の液剤。前記ポリソルベート系非イオン性界面活性剤が、ポリソルベート20、ポリソルベート40、ポリソルベート60及びポリソルベート80からなる群から選択されるものである請求項9に記載の液剤。前記非イオン性界面活性剤が、液剤の総体積比で0.001~0.05w/vの濃度を有するものである請求項6に記載の液剤。前記糖類が、マンノース、グルコース、フコースfucose、キシロースxylose、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、デキストラン及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるものである請求項6に記載の液剤。前記糖類が、液剤の総体積比で1~20w/vの濃度を有するものである請求項6に記載の液剤。前記多価アルコールが、プロピレングリコール、低分子量ポリエチレングリコール、グリセロール、低分子量ポリプロピレン及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるものである請求項6に記載の液剤。前記多価アルコールが、液剤において1~15w/vの濃度を有するものである請求項6に記載の液剤。前記中性アミノ酸が、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるものである請求項6に記載の液剤。前記中性アミノ酸が、液剤において0.1~10w/vの濃度を有するものである請求項6に記載の液剤。前記アルブミンフリー安定化剤が、3~12w/vの量のマンニトールを含み、中性アミノ酸を含まないものである請求項6に記載の液剤。前記アルブミンフリー安定化剤が、5~100mMの濃度のリン酸緩衝溶液、1~20w/vの濃度のマンニトール、5~200mMの濃度の塩化ナトリウム、及び0.001~0.05w/vの濃度のポリソルベート80を含むものである請求項1に記載の液剤。前記EPOが、野生型EPOから1つもしくは複数のアミノ酸が置換、除去もしくは挿入されることにより変異した変異体EPOタンパク質、又は野生型EPOと同程度の活性を示すペプチド類似体である請求項1に記載の液剤。前記持続型EPO結合体が、1~500μg/mlの濃度を有するものである請求項1に記載の液剤。前記免疫グロブリンFcフラグメントが、IgG、IgA、IgD、IgE、IgM及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるものである請求項1に記載の液剤。前記免疫グロブリンFcフラグメントが、IgG、IgA、IgD、IgE及びIgMからなる群からの異種由来のドメインからなるハイブリッドhybridフラグメントである請求項22に記載の液剤。前記免疫グロブリンFcフラグメントが、同種由来のドメインからなる一本鎖免疫グロブリンで構成される二量体又は多量体形態である請求項22に記載の液剤。前記免疫グロブリンFcフラグメントがIgG4Fcフラグメントである請求項22に記載の液剤。前記免疫グロブリンFcフラグメントがヒト非グリコシル化IgG4Fcフラグメントである請求項25に記載の液剤。前記非ペプチドポリマーが、生分解性ポリマー、脂質ポリマー、キチン類、ヒアルロン酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるものである請求項1に記載の液剤。前記生分解性ポリマーが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、PLAポリ乳酸及びPLGAポリ乳酸グリコール酸からなる群から選択されるものである請求項27に記載の液剤。よって、本発明は、EPO、非ペプチドポリマー及び免疫グロブリンFcフラグメントが共有結合した持続型エリスロポエチン結合体と、緩衝溶液及びマンニトールを含むアルブミンフリー安定化剤とを含む液剤を提供することを目的とする。一実施形態によれば、本発明は、EPO、非ペプチドポリマー及び免疫グロブリンFcフラグメントが共有結合した持続型エリスロポエチン結合体と、緩衝溶液及びマンニトールを含むアルブミンフリー安定化剤とを含む液剤を提供する。本発明で使用された持続型エリスロポエチン結合体又は持続型EPO結合体という用語は、生理活性のEPO、少なくとも1つの非ペプチドポリマー、及び少なくとも1つの免疫グロブリンFcフラグメントが共有結合した形態のタンパク質であって、野生型EPOに比べて作用持続期間が増加したものを意味する。本発明で使用された持続型という用語は、作用持続期間が野生型に比べて増加したものを意味する。結合体という用語は、エリスロポエチン、非ペプチドポリマー及び免疫グロブリンFcフラグメントが共有結合した構成を意味する。本発明に使用されるEPOは、ヒトエリスロポエチン又はこれに密接に関連する類似体のアミノ酸配列を有する。本発明に有用なEPOは、天然に存在するタンパク質でもよく、組換えタンパク質でもよい。また、EPOは、本来の生物学的活性に大きく影響を及ぼさない範囲で変異したアミノ酸の置換、除去又は挿入による変異体でもよい。本発明に有用なヒトEPO又はその類似体は、脊椎動物から抽出されてもよく、化学的に合成されてもよい。あるいは、EPO又はその類似体は、遺伝子組換え手法を用いてEPO又はその類似体をコードする遺伝子に形質転換された原核又は真核生物から得てもよい。これに関連して、大腸菌例えば、Ecoli、酵母例えば、Scerevisiae、又は哺乳動物細胞例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞、サル細胞を宿主として使用してもよい。使用した宿主に応じて、組換えEPO又はその類似体は、哺乳動物又は他の真核動物の炭水化物とグリコシル化されてもよく、グリコシル化されなくてもよい。発現される場合、組換えEPO又はその類似体は初期のメチオニン残基を含んでもよい位置-1。組換えヒトEPOHuEPOは、CHO細胞を宿主として利用して製造されることが好ましい。本発明に使用される免疫グロブリンFcフラグメントは、ヒト免疫グロブリンFcフラグメント又はこれに密接に関連する類似体のアミノ酸配列を有する。Fcフラグメントは、ウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット及びモルモットが含まれる動物から分離した天然形態でもよい。また、免疫グロブリンFcフラグメントは、IgG、IgA、IgD、IgE及びIgM由来のもの又はそれらの組み合わせcombinationもしくはハイブリッドhybridによるFcフラグメントでもよい。ヒト血液に最も豊富なタンパク質であるIgG又はIgM由来のものが好ましく、リガンド結合タンパク質の半減期を向上させることが知られているIgG由来のものが最も好ましい。ここで、免疫グロブリンFcは、ヒト又は動物の有機体から全免疫グロブリンを分離することにより天然の免疫グロブリンから得てタンパク質分解酵素で処理して製造したものでもよく、形質転換された動物細胞又は微生物から得られた組換え体又はその誘導体でもよい。大腸菌Ecoli形質転換体から製造した組換えヒト免疫グロブリンFcであることが好ましい。一方、IgGもIgG1、IgG2、IgG3及びIgG4サブクラスに分けられ、本発明にはこれらの組み合わせ又はハイブリッドも含まれる。IgG2及びIgG4サブクラスが好ましく、補体依存性細胞傷害CDC,Complementdependentcytotoxicityなどのエフェクター機能effectorfunctionのほとんどないIgG4のFcフラグメントが最も好ましい。すなわち、最も好ましい本発明の薬物キャリア用免疫グロブリンFcフラグメントは、ヒトIgG4由来のグリコシル化されていないFcフラグメントである。ヒト生体で抗原として作用し、抗原に対して新たな抗体を生成するなどの好ましくない免疫反応を起こし得る非ヒト由来のFcフラグメントに比べて、ヒト由来のFcフラグメントが好ましい。本発明に有用な持続型EPO結合体は、EPOと免疫グロブリンFcフラグメントを共に結合して製造する。これに関連して、EPOと免疫グロブリンFcフラグメントは、非ペプチドポリマーにより架橋してもよく、組換え技術を用いて融合タンパク質を形成してもよい。架橋の際に使用される非ペプチドポリマーは、生分解性ポリマー、脂質ポリマー、キチン類、ヒアルロン酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択されてもよい。生分解性ポリマーは、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、PLAポリ乳酸、PLGAポリ乳酸グリコール酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択されてもよい。ポリエチレングリコールが好ましく、ポリエチレングリコールPEGが最も好ましい。また、当該分野で既に知られているこれらの誘導体や、当該分野の技術水準で容易に製造できる誘導体なども本発明の範囲に含まれる。本発明に有用な持続型EPO結合体は、韓国特許登録第10-0725315号に記載されているように、遺伝工学的方法を用いて製造することができる。本発明による液剤は、治療学的有効量の持続型EPO結合体を含む。一般に、EPOの治療学的有効量は、単回使用バイアルsingleusevial1本当たり2,000~10,000国際単位internationalunit,IUの範囲である。本発明で使用される持続型EPO結合体の濃度は1~5,000μg/ml、好ましくは50~3,000μg/mlである。本発明で使用された安定化剤という用語は、持続型EPO結合体が安定して保存されるようにする物質を意味する。安定化という用語は、所定時間の間、保存条件下で、活性成分の損失が特定量未満、一般に10未満であることを意味する。10°Cで2年間、25°Cで6カ月間又は40°Cで1~2週間の保存後にEPOが90以上、好ましくは95以上の初期活性を維持する場合、このような製剤は安定しているものと解される。EPOなどのタンパク質において、保存安定性は正確な投与量を保証するためだけでなく、EPO型の抗原性物質の潜在的な生成を抑制するためにも重要である。保存期間の間、EPO活性が約10の損失を示すが、これはEPOが組成物内で凝集体やフラグメントになって抗原性物質を形成しない限り、投与の際に許容されるものと解される。本発明における好ましい前記安定化剤は、持続型EPO結合体に安定性を付与するために考案された緩衝溶液及びマンニトールを含む。また、本発明による安定化剤は、アルブミンを含有しないことが好ましい。タンパク質の安定化剤として利用されるヒト血清アルブミンは、人体の血液から製造されるので、ヒト由来の病原性ウイルスによる汚染可能性がある。ゼラチンやウシ血清アルブミンは、疾患を引き起こしたり、一部の患者にアレルギー反応を引き起こす可能性がある。本発明のアルブミンフリー安定化剤は、ヒト又は動物由来の血清アルブミンや精製されたゼラチンなどの異種タンパク質を含有しないので、ウイルス感染の恐れがない。糖アルコールの一種であるマンニトールは、持続型EPO結合体の安定性を増大させる役割を果たすので、本発明の安定化剤として使用された。マンニトールは、好ましくは液剤の総体積比で1~20w/v、より好ましくは3~12w/v、最も好ましくは5~10w/vの濃度で使用される。本発明の一実施形態によれば、リン酸緩衝溶液の存在下でマンニトールを安定化剤として使用すると、持続型EPO結合体の保存安定性がソルビトール、マルトース、PEG400及びアミノ酸が含まれる市販の安定化剤を使用する場合より増加するという結果が確認された表1参照。また、特開2009-249292号においてEPOの安定化剤として使用されているマルトースを本発明に適用すると、保存期間が長くなるほど持続型EPO結合体の安定性を減少させることを見出した表8参照。これらの結果は、他の安定化物質と比較して持続型EPO結合体の安定化剤としてのマンニトールの特異性を明らかにし、安定化の対象に応じて異なる安定化剤を適用しなければならないことを示す。前記安定化剤に含まれる緩衝溶液は、液剤のpHが急激に変化しないように溶液のpHを維持し、持続型EPO結合体を安定化する役割を果たす。本発明の緩衝溶液は、アルカリ塩リン酸ナトリウムもしくはリン酸カリウム又はそれらの水素塩もしくは二水素塩、クエン酸ナトリウム/クエン酸、酢酸ナトリウム/酢酸及びそれらの組み合わせが含まれる薬学的に許容可能なpH緩衝剤を含んでもよい。本発明に好適な緩衝溶液としては、クエン酸緩衝溶液、リン酸緩衝溶液、酒石酸緩衝溶液、炭酸緩衝溶液、コハク酸緩衝溶液、酢酸緩衝溶液があり、そのうちリン酸緩衝溶液phosphatebuffer及びクエン酸緩衝溶液citratebufferが好ましく、リン酸緩衝溶液がより好ましい。リン酸緩衝溶液において、リン酸塩は、好ましくは5~100mM、より好ましくは10~50mMの濃度である。緩衝溶液は、好ましくは4.0~8.0、より好ましくは5.0~7.0のpHを有する。本発明の他の実施形態において、本発明に有用な安定化剤は、緩衝溶液及びマンニトールに加えて、等張化剤、多価アルコール、糖類、非イオン性界面活性剤及び中性アミノ酸からなる群から選択された少なくとも1つの成分をさらに含んでもよい。等張化剤は、持続型EPO結合体を溶液状で体内に投与すると浸透圧を適切に維持するだけでなく、持続型EPO結合体を溶液状でより安定化する役割を果たす。前記等張化剤としては水溶性無機塩が挙げられる。それらは、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化カルシウム及びそれらの組み合わせである。塩化ナトリウムが最も好ましい。等張化剤の濃度は5~200mMであることが好ましい。この範囲内であれば、等張化剤の濃度は液剤が等張液になるように剤形に含まれる成分の種類及び量に応じて調節することができる。本発明の一実施形態によれば、緩衝溶液の存在下で持続型EPO結合体の安定性に及ぼす影響を様々な種類の塩について分析した。その結果、リン酸緩衝溶液と共に、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、又は硫酸ナトリウムと塩化ナトリウムの組み合わせを含む液剤は、塩を添加しない対照群に比べて持続型EPO結合体の安定性が増大することが確認された表2参照。これらの結果から、本発明による持続型EPO結合体は、使用される塩の種類により安定化する程度が異なり、特定の塩においてより大きな安定性を示すことが分かる。持続型EPO結合体の保存安定性を増大させるためにさらに含まれる糖類の好ましい例としては、マンノース、グルコース、フルクトース、キシロースなどの単糖類と、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、デキストランなどの多糖類がある。液剤において、前記糖類は、好ましくは1~20w/v、より好ましくは5~20w/vの量で使用される。本発明に有用な多価アルコールの例としては、プロピレングリコール、低分子量のポリエチレングリコール、グリセロール、及び低分子量のポリプロピレングリコールが挙げられる。これらは単独で用いてもよく、組み合わせて用いてもよい。また、前記液剤において、これらの濃度は、好ましくは1~15w/v、より好ましくは5~15w/vである。非イオン性界面活性剤は、タンパク質溶液の表面張力を低減し、疎水性表面へのタンパク質の吸着や凝集を防止する。本発明に好適な非イオン性界面活性剤としては、ポリソルベート系非イオン性界面活性剤及びポロキサマー系非イオン性界面活性剤が挙げられる。これらは単独で用いてもよく、組み合わせて用いてもよい。ポリソルベート系非イオン性界面活性剤がより好ましい。そのうち、ポリソルベート20、ポリソルベート40、ポリソルベート60及びポリソルベート80が好ましく、ポリソルベート80がより好ましい。前記非イオン性界面活性剤を液剤に高濃度で使用することは好ましくない。非イオン性界面活性剤が高濃度で存在すると、UV分光法や等焦点法などに干渉を誘発し、タンパク質の濃度や安定性の正確な評価が困難になるからである。従って、本発明の液剤には、前記非イオン性界面活性剤が好ましくは0.1w/v又はそれ未満、より好ましくは0.01~0.05w/vの濃度で含まれる。本発明の一実施形態によれば、リン酸緩衝溶液の存在下で非イオン性界面活性剤がタンパク質の安定性に及ぼす影響を試験した。1週間の短い保存期間では、非イオン性界面活性剤は持続型EPO結合体の安定性に特に影響を及ぼさないことを確認した表3参照。また、非イオン性界面活性剤としてポリソルベート80を使用すると、持続型EPO結合体は、0.1のポリソルベート80よりも0.01のポリソルベート80を含む安定化剤組成のほうが、保存中により安定化されることが確認された表4参照。前記液剤の安定化剤として使用できるアミノ酸は、溶液状態でEPOの周辺により多くの水分子を引き寄せ、EPOの最外部の親水性アミノ酸分子をより安定化するWangIntJPharm1851291881999。これに関連して、電荷を有するアミノ酸は、EPOとの静電気的結合を誘導することができ、EPOの凝集を促進することができる。従って、一般にグリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシンなどの中性アミノ酸を安定化剤として添加して使用する。液剤において、中性アミノ酸は、好ましくは0.1~10w/vの濃度である。本発明の一実施形態においては、マルトースは単独で使用した場合よりもグリシンと組み合わせて使用した場合に、持続型EPO結合体の高い保存安定性を保証した。しかし、マンニトールを3~12w/vの高濃度で処理した場合、マルトースとグリシンの組み合わせで処理した場合より、中性アミノ酸を添加しなくても高い安定性を提供することを確認した表10参照。従って、持続型EPO結合体に高い安定性を付与する液剤は、中性アミノ酸を添加しなくても、高濃度のマンニトールを利用することにより製作することができる。しかし、20w/v以上のマンニトール濃度は等張範囲を超える。従って、液剤において、マンニトールは1~20w/v、好ましくは3~12w/v、より好ましくは5~10w/vの濃度で使用される。緩衝溶液、等張化剤、糖アルコール、中性アミノ酸及び非イオン性界面活性剤が含まれる前述した成分以外にも、本発明の液剤には、本発明の効果を失わない範囲内で当業界で公知の他の成分が選択的にさらに含まれてもよい。本発明の好ましい一実施形態において、液剤は、アルブミンを含有せず、緩衝溶液、マンニトール、等張化剤及び非イオン性界面活性剤を含む。より具体的には、本発明は、持続型EPO結合体及び安定化剤を含む液剤を提供するが、前記安定化剤はリン酸又はクエン酸緩衝溶液、マンニトール、等張化剤及びポリソルベート80を含み、前記等張化剤は塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。前記液剤は、5~100mMの濃度のリン酸又はクエン酸緩衝溶液、1~20w/vの濃度のマンニトール、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム及びそれらの組み合わせからなる群から選択される5~200mMの濃度の等張化剤、並びに0.001~0.05w/vの濃度のポリソルベート80を含むことが好ましい。前記液剤は、5~100mMの濃度のリン酸緩衝溶液、3~12w/vの濃度のマンニトール、100~200mMの濃度の塩化ナトリウム、及び0.001~0.05w/vの濃度のポリソルベート80を含むことがより好ましい。前記液剤は、10mMの濃度のリン酸ナトリウム緩衝溶液pH6.5、5~10w/vの濃度のマンニトール、100~200mMの濃度のナトリウム、及び0.001~0.05w/vの濃度のポリソルベート80を含み、中性アミノ酸を含まないことが最も好ましい。本発明の一実施形態によれば、10mMの濃度のリン酸ナトリウム緩衝溶液pH6.5、5~10w/vの濃度のマンニトール、100~200mMの濃度の塩化ナトリウム、及び0.001~0.05w/vの濃度のポリソルベート80を含む持続型EPO結合体の液剤におけるEPOの保存安定性を、公知のEPO製剤であるロシュ社のレコルモンRecormonと比較した。EPOは、商業的に利用可能な製剤より、本発明の液剤のほうが安定していることを確認した表6及び表14参照。また、本発明によるEPOの液剤におけるEPOの保存安定性を、現在貧血治療剤として使用されているアムジェン社のアラネスプAranesp、リウマチ関節炎治療剤として使用されているアムジェン社のエンブレルEnbrel,TNFR-Fc、PBSのみ含まれるものなどの他の剤形と比較した。その結果、本発明の持続型EPO結合体の液剤が他の液剤より高い安定性を示すことを確認した表17参照。他の実施形態において、本発明による持続型EPO結合体の液剤の長期保存安定性を分析し、持続型EPO結合体が12カ月間安定性を維持し、加速条件下で6カ月間保存しても少なくとも92.5の活性を有することを確認した表19~表21参照。これらの結果から、緩衝溶液及び1~20w/vの濃度のマンニトールを含む液剤は、中性アミノ酸を添加しなくても、持続型EPO結合体を12カ月以上安定して保存できることが分かる。本発明による持続型エリスロポエチン結合体の液剤は、緩衝溶液及びマンニトールを含有する安定化剤を含み、ヒト血清アルブミン及び他の人体に潜在的に有害な因子を含まないので、ウイルス感染の恐れがなく、EPOと免疫グロブリンFcフラグメントの結合により構成されるので、野生型EPOに比べて分子量が大きく、作用持続期間が増加した持続型EPO結合体の優れた保存安定性を提供する。また、中性アミノ酸を含まなくても、本発明の液剤はEPOの高い安定性を提供することができるので、他の安定化剤や凍結乾燥製剤に比べて経済的により有利である。以下、下記実施例により本発明をより詳細に説明するが、下記実施例は本発明を例示するものにすぎず、本発明の範囲がこれらに限定されるものではない。実施例1持続型EPO結合体の製造<1-1>免疫グロブリンを利用した免疫グロブリンFcフラグメントの製造本実施例に有用な免疫グロブリンFcフラグメントは、ヒト非グリコシル化IgG4Fcフラグメントであり、韓国特許登録第725314号に記載された方法により大腸菌形質転換体から発現されたものである。<1-2>組換えヒトエリスロポエチンの製造本実施例に使用されたヒトEP0は、韓国登録特許第880509号に記載された方法により得られた。このために、遺伝子の転写調節配列であるジヒドロ葉酸レダクターゼdihydrofolatereductase遺伝子プロモータを人為的に弱体化させ、遺伝子の増幅効率を大きく改善できるベクターで形質転換された動物細胞株を利用してヒトEPOタンパク質を発現するように培養した。高グリコシル化されたタンパク質のみ精製して使用した。<1-3>免疫グロブリンFcフラグメントを利用した持続型EPO結合体の製造本実施例における持続型EPO結合体は、ヒトエリスロポエチンと免疫グロブリンFcフラグメントを非ペプチドポリマーで共有結合して製造した。また、前記結合体は、韓国登録特許第725315号及び第775343号に記載された方法により得られた。実施例2各種安定化剤による持続型EPO結合体の安定性評価リン酸緩衝溶液存在下で、糖類、糖アルコール、多価アルコール及びアミノ酸が含まれる各種安定化剤における持続型EPO結合体の安定化能力を分析した。分析のために、リン酸緩衝溶液としてリン酸ナトリウムNaphosphate緩衝溶液を、糖アルコールとしてマンニトールmannitol又はソルビトールsorbitolを、アミノ酸としてヒスチジンhistidine又はメチオニンmethionineを、糖類としてマルトースmaltoseを、多価アルコールとしてPEG400を使用した。下記表1の組成のものを40°Cで1週間保存し、その後逆相クロマトグラフィーreversephasechromatography,RPCで分析した。結果を下記表1に示す。RPC面積/初期面積は初期値に対する持続型EPO結合体の残存率を示す。表1に示すように、安定化剤としてマンニトールを使用すると、持続型EPO結合体が最も安定して維持された。実施例3塩による持続型EPO結合体の安定性評価リン酸緩衝溶液の存在下で、各種塩の持続型EPO結合体を安定化する能力を分析するために下記実験を行った。アルカリ塩、無機塩などの塩は、pH緩衝剤として持続型結合体にさらなるpH安定性を付与するだけでなく、等張化剤として浸透圧を適切に維持する役割を果たす。下記表2の組成のものを40°Cで1週間保存し、その後逆相クロマトグラフィーで分析した。分析のために、緩衝溶液としてリン酸ナトリウム緩衝溶液pH6.5を、塩として塩化銅II、硫酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム及び炭酸ナトリウムを使用した。結果を下記表2に示す。RP-HPLCは初期値に対する持続型EPO結合体の残存率を示す。表2に示すように、持続型EPO結合体の安定性は、リン酸緩衝溶液の条件下で、塩を添加しない対照群に比べて、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、又は硫酸ナトリウムと塩化ナトリウムの組み合わせを使用すると増加した。それに対して、持続型EPO結合体の安定性は、塩化銅IIを使用すると、対照群に比べて低下した。これらの結果から、本発明の持続型EPO結合体は、使用される塩の種類により安定化する程度が異なり、特定の塩においてより高い安定性を示すことが分かる。実施例4非イオン性界面活性剤による持続型EPO結合体の安定性評価リン酸緩衝溶液の存在下で、各種非イオン性界面活性剤の持続型EPO結合体を安定化する能力を分析するために下記実験を行った。分析のために、非イオン性リン酸緩衝溶液としてポリソルベート80を使用し、塩、糖アルコール及び糖類を含み、持続型EPO結合体に安定性を付与することが示された他の製剤を適切に組み合わせた。単純化のために、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム及びクエン酸ナトリウムが含まれる検証された塩から塩化ナトリウムを選択した。また、実施例1において最も高い安定性を示すことが確認されたマンニトールを使用した。EPOの濃度を200μg/mlとし、緩衝溶液として10mMリン酸ナトリウムpH6.5を使用する同一条件下で、下記表3の組成を有する本発明の持続型EPO結合体を40°Cで1週間保存し、その後逆相クロマトグラフィーで分析した。結果を下記表3に示す。RP-HPLCは初期値に対する持続型EPO結合体の残存率を示す。表3に示すように、リン酸緩衝溶液条件下で、EPOは非イオン性界面活性剤の存在に関係なく、EPOの安定性に大きく影響を与えないことが確認され、これは、非イオン性界面活性剤が1週間の短い保存期間ではEPO安定性に特に影響を及ぼさないことを示す。また、持続型EPO結合体の安定性に対して非イオン性界面活性剤の濃度が及ぼす影響を実験した。EPOの濃度を200μg/mlとし、緩衝溶液として10mMリン酸ナトリウムpH6.5を使用する同一条件下で、下記表4の組成のものを本発明の持続型EPO結合体の安定化剤として使用し、40°Cで2週間保存し、その後逆相クロマトグラフィーで分析した。結果を下記表4に示す。RP-HPLCは初期値に対する持続型EPO結合体の残存率を示す。表4に示すように、2週の保存期間の間、持続型EPO結合体は、10mMリン酸ナトリウムpH6.5緩衝溶液に5マンニトール及び150mMの塩化ナトリウムを含む液剤において、0.1ポリソルベート80を補充した場合より、0.01ポリソルベート80を補充した場合のほうが安定性が高かった。実施例5持続型EPO結合体の液剤の比較I保存安定性について、市販のEPO液剤であるロシュ社のレコルモンRocheを、本発明の持続型EPO結合体の液剤と比較した。レコルモンの組成は明らかでないが、緩衝溶液としてのリン酸ナトリウム、界面活性剤としてのポリソルベート20、塩としての塩化ナトリウム、並びに安定化物質としてのウレア、塩化カルシウムCaCl、グリシンglycine、ロイシンleucine、イソロイシンisoleucine、トレオニンthreonine、グルタミン酸glutamicacid及びフェニルアラニンphenylalanineを含む。本発明の持続型EPO結合体の液剤は、界面活性剤として0.1~0.005の様々な濃度のポリソルベート80を、塩として150及び200mMの濃度の塩化ナトリウムを、安定化剤として1~10w/vの濃度のマンニトール又はウレアを使用した。本発明の持続型EPO結合体は、下記表5の組成のものを40°Cで2週間保存し、その後逆相クロマトグラフィーとサイズ排除クロマトグラフィーSizeexclusionchromatography,SE-HPLCで分析した。結果を下記表6に示す。RP-HPLC及びSE-HPLCは初期値に対する持続型EPO結合体の残存率を示す。表6に示すように、2週間の保存期間の間、本発明の持続型EPO結合体の液剤のうち、界面活性剤として0.1ポリソルベート80を有する5番液剤と、安定化剤としてウレアを有する7番液剤を除いて、本発明の全ての持続型EPO結合体の液剤がレコルモンより高い保存安定性を示した。実施例6持続型EPO結合体に保存安定性を付与する安定化剤の探索持続型EPO結合体に長期間の保存安定性を付与する安定化剤を探索するために、持続型EPO結合体の液剤を下記表7の組成で製造した。これに関連して、グリシンとメチオニンをそれぞれ界面活性剤-塩化ナトリウム-マルトースの組成に添加して長期間の保存安定性に対するアミノ酸の影響を試験した。また、前記液剤において、EPOの濃度を10mMリン酸ナトリウム緩衝溶液pH6.5中で200μg/mlにした。40°Cで4週間保存し、持続型EPO結合体の液剤を一週間毎に逆相クロマトグラフィーで分析した。結果を下記表8に示す。RP-HPLCは初期値に対する持続型EPO結合体の残存率を示す。表8に示すように、4週間の保存期間の間、持続型EPO結合体は、塩化ナトリウムと共にマルトースとグリシンを安定化剤として組み合わせた液剤において、安定性が最も高く維持されることが確認された。2週間保存し、その後安定化剤として10マルトースを単独で使用した液剤は、10マルトース及び1グリシンを組み合わせて使用した液剤と同程度の保存安定性を示した。しかし、10マルトースを単独で使用した液剤は、4週間の保存後の保存安定性が著しく低下した。それに対して、10マルトース及び1グリシンを使用した液剤は、4週間の保存後も高い安定性を維持することが確認された。2番液剤と3番液剤を比較すると、メチオニンが持続型EPO結合体の安定性を大きく低下させたが、これは中性アミノ酸、特にグリシンが持続型EPO結合体の長期間の保存安定性を大きく増大させることを示すものである。実施例7持続型EPO結合体の長期間の保存安定性に対するマンニトール及びマルトースの評価実施例6で持続型EPO結合体の最も大きな安定性を示したマルトース-グリシンを含む液剤、同一条件でマルトースの代わりにマンニトールを含む液剤、及びマンニトールのみを含む液剤の3種類の液剤を下記表9のように製造した。これらの長期間の保存安定性を評価した。液剤において、EPOの濃度を10mMリン酸ナトリウム緩衝溶液pH6.5中で200μg/mlにした。40°Cで4週間保存し、一週間毎に逆相クロマトグラフィーで分析した。結果を下記表10に示す。RP-HPLCは初期値に対する持続型EPO結合体の残存率を示す。また、表10の結果を図1にグラフで示し、市販のEPO液剤であるレコルモンの値を外挿した。表10に示すように、5週間の保存期間の間、持続型EPO結合体は、安定化剤としてマルトース-グリシンを含む液剤より、マンニトール-グリシンを含む液剤の保存安定性のほうが高いことが確認された。また、マンニトールのみを含む液剤も同程度の保存安定性を示した。これらの結果は、マルトースのみを含む液剤がマルトース-グリシン製剤に比べて保存安定性が大きく低下したのとは際立って対照的に、マンニトールが中性アミノ酸の助けなしに持続型EPO結合体に長期間の保存安定性を付与することを示すものである。また、マンニトールを5~15w/vの高濃度で使用すると、中性アミノ酸が存在しなくてもEPO結合体を高い安定性で長期間保存できることを示す。実施例8持続型EPO結合体の長期間の保存安定性に対する緩衝溶液の評価緩衝溶液の持続型EP0結合体を安定化する能力について評価した。持続型EPO結合体の安定性と塩及び糖アルコールの容量の関係について試験するために下記実験を行った。まず、緩衝溶液の持続型EPO結合体の安定性に対する影響を確認するために、0.01ポリソルベート、150mM塩化ナトリウム、及びリン酸緩衝溶液又はクエン酸緩衝溶液を調合して下記表11のように液剤を製造した1番及び2番。液剤組成には、安定化剤として高濃度5のマンニトールを含み、いかなるアミノ酸も含まず、持続型EPO結合体を200μg/mlの濃度で添加した。持続型EPO結合体の液剤を40°Cで4週間保存し、保存中の1週間後及び4週間後に逆相クロマトグラフィーで分析した。結果を下記表12に示す1番及び2番。RP-HPLCは初期値に対する持続型EPO結合体の残存率を示す。実施例7のマンニトールを含む液剤、リン酸緩衝溶液の代わりにクエン酸緩衝溶液を含む液剤、及び塩と糖アルコールの容量を半分にした液剤について、持続型EPO結合体の安定性に対する影響を実験した。液剤において、持続型EPO結合体の濃度を200μg/mlにして下記表11の安定化剤を使用した。持続型EPO結合体の液剤を40°Cで4週間保存し、保存中の1週間後及び4週間後に逆相クロマトグラフィーで分析した。結果を下記表12に示す。RP-HPLCは初期値に対する持続型EPO結合体の残存率を示す。表12のデータから分かるように、液剤がマンニトールを含む場合、持続型EPO結合体の保存安定性の水準は液剤に含まれる緩衝溶液の種類に大きく影響を受けない。これらの結果は、リン酸緩衝溶液以外の通常の緩衝溶液を利用しても、持続型EPO結合体に長期間の保存安定性を付与する液剤を製造できることを意味する。実施例9持続型EPO結合体の液剤の保存安定性の比較II保存安定性について、実施例2~8で安定化能力が証明された、リン酸緩衝溶液pH6.5、塩化ナトリウム、マンニトール及びポリソルベート80で製造された液剤を、市販のEPO液剤であるロシュ社のレコルモンと比較した。本発明の液剤とレコルモンの組成を下記表13に示す。これらを40°Cで4週間保存し、持続型EPO結合体の液剤を保存中の2週間後及び4週間後に逆相クロマトグラフィーとサイズ排除クロマトグラフィーで分析した。結果を下記表14に示す。RP-HPLCとSE-HPLCは初期値に対する持続型EPO結合体の残存率を示す。表14から分かるように、安定化剤として高濃度のマンニトールを含む液剤は、様々な種類の中性アミノ酸を含むレコルモンよりも優れたEPOの保存安定性を示す。これらの結果から、本発明の液剤は持続型EPO結合体に特異的に優れた保存安定性を提供できることが分かる。実施例10各種液剤組成間の保存安定性の比較保存安定性について、実施例2~8で保存安定性が証明された、リン酸緩衝溶液pH6.5、塩化ナトリウム、マンニトール及びポリソルベート80で製造された液剤を、市販されている様々な種類の剤形の組成を持続型EPO結合体に適用して製造された液剤と比較した。下記表15に開示される液剤を本実施例に使用した。表15において、1番は現在貧血治療剤として使用されているアムジェン社製のアラネスプAranespであり、2番はリン酸緩衝溶液pH6.5、塩化ナトリウム、マンニトール及びポリソルベート80を含む安定化剤組成で製造された液剤であり、3番はアラネスプにおいて薬物を持続型EPO結合体に代えた液剤であり、4番は関節リウマチ治療剤であるアムジェン社製のエンブレルEnbrel,TNFR-Fcにおいて薬物を本発明の持続型EPO結合体に代えた液剤であり、5番はPBSのみ含む液剤である。40°Cで3週間保存し、持続型EPO結合体の液剤を1週間毎に逆相クロマトグラフィーとサイズ排除クロマトグラフィーで分析した。結果を下記表17に示す。RP-HPLCとSE-HPLCは初期値に対する持続型EPO結合体の残存率を示す。表17から分かるように、10mMリン酸ナトリウム緩衝溶液pH6.5、0.005ポリソルベート80、10マンニトール及び200nM塩化ナトリウムを含む本発明の液剤を除く全ての液剤において、3週間の保存中に凝集aggregationが観察された。従って、10mMリン酸ナトリウム緩衝溶液pH6.5、0.005ポリソルベート80、10マンニトール及び200nM塩化ナトリウムを含む本発明の液剤は、持続型EPO結合体の長期保存において最も有望な製剤である。実施例11持続型EPO結合体の液剤の長期保存及び加速安定性の試験長期保存安定性及びその加速安定性を確認するために、最も優れた保存安定性を示すことが確認された安定化剤組成であるリン酸緩衝溶液pH6.5、塩化ナトリウム、マンニトール及びポリソルベート80を含む持続型EPO結合体の液剤を4°Cで12カ月間保存して試料の保存安定性を分析した。保存の具体的な条件を下記表18に示す。分析結果を下記表19及び図2に示す。表19において、RP-HPLC及びSE-HPLCは初期値に対する持続型EPO結合体の残存率を示す。また、前述した持続型EPO結合体の液剤を4°Cで12カ月間保存した試料の保存安定性を試験管内invitroで確認した図3。本実施例に使用された持続型EPO結合体の試験管内の力価確認にはTF-1細胞株erythroleukemiacell,ATCCCRL2003を用いた。TF-1細胞を窒素タンクに保存し、細胞を所定量に培養して細胞数を測定した。BRP-EPOと持続型EPO結合体を所定比率で混合して50μL/ウェルずつ96ウェルプレートに入れた。既に細胞数が確認された細胞を利用して40000細胞/mLとなるようにアッセイ培地で希釈し、これを50μL/ウェルずつ96ウェルプレートに入れた。37°CのCO2インキュベーターで72時間培養し、その後96ウェルプレートにCellTiter96AqueousOneSolutionReagentPROMEGA,G358Bをそれぞれ15μLずつ添加した。さらに、37°CのCO2インキュベーターで4時間培養した。軽いピペッティングpipetingで染色試薬を除去し、その後490nmで吸光度を測定してEC50を計算した。計算されたEC50値から比活性度を得た。表19に示すように、持続型EPO結合体は、本発明による安定化剤組成を含む液剤において12カ月間高い安定性を維持することが確認された。また、前述した安定化剤組成からなる持続型EPO結合体の液剤を4°Cで12カ月間保存し、その後25°Cで6カ月間保存して試料の保存安定性を分析した。結果を下記表20及び表21に示す。表20及び表21において、RP-HPLC、SE-HPLC、タンパク質含有量及び生物学的不活性試験は初期値に対する持続型EPO結合体の残存率を示す。表20及び表21に示すように、持続型EPO結合体は、本発明による安定化剤組成の液剤において12カ月間高い安定性を維持し、加速条件で6カ月間保存しても初期活性の92.5を有することが確認された。従って、本発明による持続型EPO結合体の液剤の効果的な保存安定性が確認された。本発明の好ましい実現例が例示的な目的で記載されたとしても、当業者であれば添付の請求の範囲に記載された本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、様々な変更、追加又は置換が可能であることを理解するであろう。"