"CH1ドメイン及びヒンジ領域を含む少なくとも1つの重鎖を含むクラスIgG4の抗体であって、それぞれの重鎖中、a.CH1ドメイン中でKabatのナンバリングシステムに従いナンバリングした位置127における鎖間システインが別のアミノ酸で置換されており、且つb.上部ヒンジ領域中に位置する1つ又は複数のアミノ酸がシステインで置換されている、上記抗体。システインで置換された、上部ヒンジ領域中に位置する1つ又は複数のアミノ酸が、Kabatのナンバリングシステムに従いナンバリングした227、228、229及び230から選択される、請求項1に記載の抗体。Kabatのナンバリングシステムに従いナンバリングした位置230におけるグリシンがシステインで置換されている、請求項2に記載の抗体。Kabatのナンバリングシステムに従いナンバリングした位置229におけるチロシンがシステインで置換されている、請求項2に記載の抗体。Kabatのナンバリングシステムに従いナンバリングした位置228におけるリシンがシステインで置換されている、請求項2に記載の抗体。Kabatのナンバリングシステムに従いナンバリングした位置227におけるセリンがシステインで置換されている、請求項2に記載の抗体。重鎖中でKabatのナンバリングシステムに従いナンバリングした位置239におけるシステイン及び位置242におけるシステインが別のアミノ酸で置換されている、請求項1から6までのいずれか一項に記載の抗体。重鎖中でKabatのナンバリングシステムに従いナンバリングした位置239におけるシステインが別のアミノ酸で置換されている、請求項1から6までのいずれか一項に記載の抗体。重鎖中でKabatのナンバリングシステムに従いナンバリングした位置242におけるシステインが別のアミノ酸で置換されている、請求項1から6までのいずれか一項に記載の抗体。CH1ドメイン及びヒンジ領域を含む少なくとも1つの重鎖を含むクラスIgG4の抗体であって、それぞれの重鎖中、a.Kabatのナンバリングシステムに従いナンバリングした位置127における鎖間システインが別のアミノ酸で置換されており、且つb.Kabatのナンバリングシステムに従いナンバリングした位置239におけるシステイン又は位置242におけるシステインが別のアミノ酸で置換されている、上記抗体。位置239におけるシステイン及び/又は位置242におけるシステインが非チオール含有アミノ酸によって置換されている、請求項7から10までのいずれか一項に記載の抗体。非チオール含有アミノ酸がセリンである、請求項11に記載の抗体。位置127におけるシステインが非チオール含有アミノ酸によって置換されている、請求項1から12までのいずれか一項に記載の抗体。非チオール含有アミノ酸がセリンである、請求項13に記載の抗体。重鎖が突然変異して、Kabatのナンバリングシステムに従いナンバリングしたアミノ酸226と243の間に3個のアミノ酸が挿入されている、請求項1から14までのいずれか一項に記載の抗体。重鎖が突然変異してKabatのナンバリングシステムに従いナンバリングした位置238と239の間に3個のアミノ酸が挿入されている、請求項15に記載の抗体。Kabatのナンバリングシステムに従いナンバリングした位置238と239の間に3個のアラニンが挿入されている、請求項16に記載の抗体。Kabatのナンバリングシステムに従いナンバリングした位置238と239の間にスレオニン、ヒスチジン及びさらなるスレオニンが挿入されている、請求項16に記載の抗体。Kabatのナンバリングシステムに従いナンバリングした位置241におけるセリンがプロリンで置換されている、請求項1から18までのいずれか一項に記載の抗体。位置230におけるグリシンがシステインで置換されており、位置227におけるセリンがプロリンで置換されており、位置229におけるチロシンがセリンで置換されており、位置237におけるプロリンがアスパラギン酸で置換されており、位置238におけるプロリンがリシンで置換されており、アミノ酸配列スレオニン-ヒスチジン-スレオニンが位置238と239の間に挿入されており、且つ位置241におけるセリンがプロリンで置換されている、請求項1から19までのいずれか一項に記載の抗体。重鎖がCH2ドメイン及びCH3ドメインを含む、請求項1から20までのいずれか一項に記載の抗体。請求項1から21までのいずれか一項で定義した2つの重鎖を含む、請求項1から21までのいずれか一項に記載の抗体。重鎖が同一である、請求項22に記載の抗体。重鎖又はそれぞれの重鎖が12~17アミノ酸長の上部ヒンジ領域及びコア領域を含む、請求項1から23までのいずれか一項に記載の抗体。上部ヒンジ領域及びコア領域が15アミノ酸長である、請求項24に記載の抗体。請求項1から25までのいずれか一項で定義した抗体をコードする配列を含む発現ベクター。請求項26で定義したベクターを含む宿主細胞。疾患又は障害の治療において使用するための、請求項1から25までのいずれか一項で定義した抗体。治療有効量の、請求項1から25までのいずれか一項で定義した抗体を投与することを含む、疾患又は障害を治療するための方法。上部ヒンジ、コア及び下部ヒンジを有する重鎖を含むIgG4の抗体であって、重鎖又はそれぞれの重鎖中の前記上部ヒンジ及びコアが、15アミノ酸長などの12~17アミノ酸長である、上記抗体。一態様において、本発明は、CH1ドメイン及びヒンジ領域を含む少なくとも1つの重鎖を含むクラスIgG4の抗体であって、それぞれの重鎖中、a.CH1ドメイン中でKabatのナンバリングシステムに従いナンバリングした位置127における鎖間システインが別のアミノ酸で置換されており、且つb.上部ヒンジ領域中に位置する1つ又は複数のアミノ酸がシステインで置換されている抗体を提供する。軽鎖中のシステインと鎖間ジスルフィド結合を形成するCH1ドメイン中のシステインは、図1b中に示すようにKabatのナンバリングシステムに従いナンバリングした位置127におけるシステインである。IgG4定常領域中のジスルフィド結合の位置の変更は、Fabドメインに関して観察されるより高いTmをもたらす。50のタンパク質がアンフォールディング状態である温度をTmで表す。実験によってTmは、例えば蛍光-温度曲線の変曲点即ち、蛍光-温度曲線が最も急勾配である温度として決定される。したがって、高いTmは高い耐熱性を暗示する。したがって、本開示の分子はより高い耐熱性を有する。理論によって束縛されることは望まないが、これは得られたジスルフィド結合又はポリペプチド分子内の歪み又は内部張力の低減の結果であり得る。耐熱性のさらなる改善は、IgG4定常領域へのさらなる修飾の導入によって得ることもできる。システインで置換される上部ヒンジ領域中に位置する1つ又は複数のアミノ酸は、図1b中に示すようにKabatのナンバリングシステムに従いナンバリングした226、227、228、229、230、237及び238から選択することができる上部ヒンジ領域中のアミノ酸に下線を引く。好ましい実施形態では、システインで置換される上部ヒンジ領域中に位置する1つ又は複数のアミノ酸は、図1b及び2a中に示すようにKabatのナンバリングシステムに従いナンバリングした227、228、229及び230から選択される位置における1つ又は複数のアミノ酸である。したがって、この後者の配置では、鎖間軽鎖-重鎖ジスルフィド結合の形成は、IgG1定常領域中に見られるジスルフィド架橋と類似した位置内である。本発明者らは、IgG1はFab及びFcドメインにおいてIgG4分子より高い耐熱性を有することを立証している。しかしながら本開示は、ADCCエフェクター機能はないが、IgG1分子と同様の耐熱性及び/又は他の有利な性質を有するIgG4分子の提供を可能にする。形成されるIgG4分子中のFabドメインの安定性に影響を与える、3つの一般的な態様が存在する。第一の態様はジスルフィド架橋の位置である。第二の態様はジスルフィド架橋に隣接する環境、即ちジスルフィド結合周囲の残基の性質であり、第三の態様は上部ヒンジ領域の長さである。したがって本発明は、上部ヒンジ、コア及び下部ヒンジを有する重鎖を含むIgG4抗体も提供し、前記重鎖又はそれぞれの重鎖中の上部ヒンジ及びコアは13~17アミノ酸長、例えば15アミノ酸長などである。一実施形態では、IgG4抗体は15アミノ酸長の上部ヒンジ及びコアを有する。一実施形態では、上部ヒンジ及びコアは、IgG4ヒンジ中に見られる天然12アミノ酸、及びさらなる3つのアミノ酸、例えば3アラニン残基、又は3グリシン残基又はそれらの組合せを含む。一実施形態では、ヒンジは以下の配列の1つを有する:ESKYGPPAAACPSCPSEQIDNo72ESKYGPPGGGCPSCPSEQIDNo73ESKYGPPTHTCPSCPSEQIDNo74ESKYGDKTHTCPSCPSEQIDNo75EPSKYGPPAAACPSCPSEQIDNo76EPSKYGPPGGGCPSCPSEQIDNo77EPSKYGPPTHTCPSCPSEQIDNo78EPSKYGDKTHTCPSCPSEQIDNo79ESKSYGPPAAACPSCPSEQIDNo80ESKSYGPPGGGCPSCPSEQIDNo81ESKSYGPPTHTCPSCPSEQIDNo82ESKSYGDKTHTCPSCPSEQIDNo83ESKYGPPAAACPPCPSEQIDNo84ESKYGPPGGGCPPCPSEQIDNo85ESKYGPPTHTCPPCPSEQIDNo86ESKYGDKTHTCPPCPSEQIDNo87EPSKYGPPAAACPPCPSEQIDNo88EPSKYGPPGGGCPPCPSEQIDNo89EPSKYGPPTHTCPPCPSEQIDNo90EPSKYGDKTHTCPPCPSEQIDNo91ESKSYGPPAAACPPCPSEQIDNo92ESKSYGPPGGGCPPCPSEQIDNo93ESKSYGPPTHTCPPCPSEQIDNo94ESKSYGDKTHTCPPCPSEQIDNo95一実施形態では、本開示のIgG4分子中の上部ヒンジ及びコアは、天然IgG1ヒンジ、即ちEPKSCDKTHTCPPC配列番号96又はEPKSCDKAAACPPCPSEQIDNo97EPKSCDKGGGCPPCPSEQIDNo98EPKSCDKTHTSPPCPSEQIDNo99EPKSCDKTHTCPPSPSEQIDNo100EPKSCDKTHTSPPSPSEQIDNo101EPKSCDKAAASPPCPSEQIDNo102EPKSCDKAAACPPSPSEQIDNo103EPKSCDKAAASPPSPSEQIDNo104EPKSCDKGGGSPPCPSEQIDNo105EPKSCDKGGGCPPSPSEQIDNo106EPKSCDKGGGSPPSPSEQIDNo107などのその誘導体からなる。さらなる態様では、本発明は、CH1ドメイン及びヒンジ領域を含む少なくとも1つの重鎖を含むクラスIgG4の抗体であって、それぞれの重鎖中、CH1ドメイン中でKabatのナンバリングシステムに従いナンバリングした位置127における鎖間システインが別のアミノ酸で置換されており、且つ重鎖又はそれぞれの重鎖中のヒンジが15アミノ酸長である抗体を提供する。適切なヒンジは前に記載する。さらなる態様では、本発明は、CH1ドメイン及びヒンジ領域を含む少なくとも1つの重鎖を含むクラスIgG4の抗体であって、それぞれの重鎖中、a.Kabatのナンバリングシステムに従いナンバリングした位置127におけるシステインが別のアミノ酸で置換されており、且つb.Kabatのナンバリングシステムに従いナンバリングした位置239におけるシステイン又は位置242におけるシステインが別のアミノ酸で置換されている抗体も提供する。本発明の後の態様による一実施形態では、IgG4分子は、例えば前に記載したようにヒンジ中に22アミノ酸をさらに含有する。本発明により提供される抗体は、野生型IgG4抗体と比較して有利な性質を示す。本発明の抗体は、野生型IgG4抗体と比較して特にFabドメインの改善された耐熱性を示すことが、驚くことに分かっている。さらなる態様では、本発明は、CH1ドメイン及びヒンジ領域を含む少なくとも1つの重鎖を含むクラスIgG3の抗体であって、それぞれの重鎖中、a.軽鎖中のシステインと鎖間ジスルフィド結合を形成するCH1ドメイン中のシステインが別のアミノ酸で置換されており、且つb.上部ヒンジ領域中に位置する1つ又は複数のアミノ酸がシステインで置換されている抗体も提供する。さらなる態様では、本発明は、CH1ドメイン及びCH2ドメインを含む少なくとも1つの重鎖を含むクラスIgMの抗体であって、それぞれの重鎖中、a.軽鎖中のシステインと鎖間ジスルフィド結合を形成するCH1ドメイン中のシステインが別のアミノ酸で置換されており、且つb.CH1ドメイン又はCH2ドメイン中に位置する1つ又は複数のアミノ酸がシステインで置換されている抗体を提供する。さらなる態様では、本発明は、CH1ドメイン及びヒンジ領域を含む少なくとも1つの重鎖を含むクラスIgDの抗体であって、それぞれの重鎖中、a.軽鎖中のシステインと鎖間ジスルフィド結合を形成するCH1ドメイン中のシステインが別のアミノ酸で置換されており、且つb.ヒンジ領域中に位置する1つ又は複数のアミノ酸がシステインで置換されている抗体を提供する。本発明は、本発明の抗体をコードする配列を含む発現ベクター、及びその発現ベクターを含む宿主細胞も提供する。本発明は、疾患又は障害の治療において使用するための前に定義した抗体も提供する。治療有効量の前に定義した抗体を投与することを含む、疾患又は障害を治療するための方法をさらに提供する。一実施形態では、抗体は、癌以外の疾患の治療において使用するためのものである。配列の簡単な説明配列番号1は、IgG1野生型抗体のCH1及びヒンジ領域配列を示す。配列番号2は、IgG4野生型抗体のCH1及びヒンジ領域配列を示す。配列番号3は、ヒト野生型kappa軽鎖の定常領域の一部分を示す。配列番号4は、ヒトIgG1抗体のCH1ドメインのN末端配列の一部分を示す。配列番号5は、ヒトIgG1抗体のヒンジ領域を示す。配列番号6は、ヒトIgG2抗体のCH1ドメインのN末端配列の一部分を示す。配列番号7は、ヒトIgG2抗体のヒンジ領域を示す。配列番号8は、ヒトIgG3抗体のCH1ドメインのN末端配列の一部分を示す。配列番号9は、ヒトIgG3抗体のヒンジ領域を示す。配列番号10は、ヒトIgG4抗体のCH1ドメインのN末端配列の一部分を示す。配列番号11は、ヒトIgG4抗体のヒンジ領域を示す。配列番号12~37は、それぞれ抗体6、7、8、15、16、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、44、45、46、47、2、3、48、28P及び44PのCH1ドメイン及びヒンジ領域配列を示す。配列番号38~63は、それぞれ抗体6、7、8、15、16、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、44、45、46、47、2、3、48、28P及び44PのCH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメイン及びCH3ドメイン配列を示す。配列番号64は、野生型IgG4CH2及びCH3ドメイン配列を示す。配列番号65は、野生型IgG4CH2及び野生型IgG1CH3ドメイン配列を示す。配列番号66は、ヒト野生型kappa軽鎖の定常領域配列を示す。配列番号67は、ヒトIgGD抗体のCH1ドメインのN末端配列の一部分を示す。配列番号68は、ヒトIgGD抗体のヒンジ領域の一部分を示す。配列番号69は、ヒトIgGM抗体のCH1ドメインのN末端配列の一部分を示す。配列番号70は、ヒトIgGM抗体のCH1ドメインのC末端配列の一部分を示す。配列番号71は、ヒトIgGM抗体のCH2ドメインの一部分を示す。配列番号72~295は、様々なヒンジ領域を示す。ここで本発明をより詳細に記載する。文脈が他の事を示さない限り、用語タンパク質とポリペプチドは本明細書中で交互に使用する。ペプチドは10個以下のアミノ酸を指すものとする。文脈が他の事を示さない限り、用語ポリヌクレオチドは遺伝子、DNA、cDNA、RNA、mRNAなどを含む。本明細書の文脈において、本明細書中で使用する用語comprisingは、含むincludingとして解釈すべきである。本発明の文脈における用語野生型は、天然に存在し得る、又は如何なる遺伝子操作型突然変異も含まない環境から単離することができる抗体を意味する。本明細書中の置換突然変異体に関する表示は、文字、次に数字、次に文字からなる。最初の文字は、野生型タンパク質中のアミノ酸を表す。数字はアミノ酸置換が施されているアミノ酸位置を指し、二番目の文字は野生型アミノ酸との置換に使用されるアミノ酸を表す。抗体の可変及び定常ドメイン中の残基は、Kabatらにより考案されたシステムに従い従来ナンバリングされている。このシステムは、Kabatetal.,1987,inSequencesofProteinsofImmunologicalInterest,USDepartmentofHealthandHumanServices,NIH,USA中に述べられるここでは以後Kabatら上記。Kabatの残基表示は、アミノ酸残基の直線的ナンバリングに常に直接対応するわけではない。実際の直線アミノ酸配列は、構造要素、基本可変ドメイン構造のフレームワーク又は相補性決定領域CDRの縮小、若しくはそこへの挿入に応じて厳密なKabatのナンバリング中より少ないか又は多くのアミノ酸を含有し得る。残基の正確なKabatのナンバリングは、標準Kabatナンバリング配列と抗体配列中の相同残基のアラインメントにより、所与の抗体に関して決定することができる。或いは、アミノ酸残基のナンバリングは、Kabatetal.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD.1991中にも記載されたEU-インデックス又はEUナンバリングシステムにより実施することができる。抗体中のアミノ酸残基のさらなるナンバリングシステムはIMGTナンバリングシステムであるLefranc,M.-P.etal.,Dev.Comp.Immunol.,29,185-2032005。EUナンバリングシステム又はIMGTナンバリングシステムを使用することを他に示す場合以外、Kabatのナンバリングシステムを本明細書中で使用する。4つのIgG4アイソタイプ間で、重鎖及び軽鎖中で鎖間ジスルフィド結合配置は類似しており、一方鎖間ジスルフィド結合配置はそれぞれのアイソタイプに関して特有である[Wypych,J.,Li,M.,Guo,A.,Zhang,Z.,Martinez,T.,Allen,M.J.,Fodor,S.,Kelner,D.N.,Flynn,G.C.,Liu,Y.D.,Bondarenko,P.V.,Ricci,M.S.,Dillon,T.M.,Balland,A.,2008.ヒトIgG2抗体はジスルフィド仲介型構造アイソフォームを示す。HumanIgG2antibodiesdisplaydisulphide-mediatedstructuralisoforms.JBiolChem.283,16194-16205により総説される]。図1b中に示すように、4つのIgG4アイソタイプのヒンジ領域配列は異なる。典型的に、完全又は遺伝子ヒンジ領域はKabatのナンバリングシステムに基づきナンバリングした残基226~251からなる。図1bは、4つのIgG4アイソタイプのヒンジ領域の、上部、コア及び下部を示す。IgG1アイソタイプに関しては、上部ヒンジ領域は残基226~238であり、コアヒンジ領域は残基239~243であり、下部ヒンジ領域は残基244~251である。IgG4アイソタイプに関しては、上部ヒンジ領域は残基226~238であり、コアヒンジ領域は残基239~243であり、下部ヒンジ領域は残基244~251である。したがって、IgG1中の上部ヒンジ、コア及び下部ヒンジを含むヒンジは、図1a中に示すように23アミノ酸長である。上部ヒンジは10アミノ酸である。コアは5アミノ酸であり、下部ヒンジは8アミノ酸である。例えば図1b参照。IgG4中の上部ヒンジ、コア及び下部ヒンジを含むヒンジは、図1a中に示すように20アミノ酸長である。上部ヒンジは7アミノ酸である。コアは5アミノ酸であり、下部ヒンジは8アミノ酸である。例えば図1b参照。IgG4内の鎖間ジスルフィド結合配置の修飾、具体的には軽鎖LCと重鎖HCの間のCL-CH1鎖間ジスルフィド結合配置を修飾することによって、本発明による新たな突然変異IgG4抗体を開発している。図1bは、鎖間CL-CH1ジスルフィド結合を形成するシステイン位置下線を示す、IgG1~4アイソタイプに関するヒトIgG重鎖及び軽鎖配列の一部分を示す。IgG1の鎖間CL-CH1ジスルフィド結合は、LCC214Kabatのナンバリングシステムとヒンジ領域直前のHCのC233Kabatのナンバリングシステムの間で形成される。対照的に、IgG2、3及び4に関するCH1-CLジスルフィド結合は、LCC214とHCの鎖間ジスルフィド結合のC127N末端の間で形成される。CL-CH1ジスルフィド結合形成に関与するシステイン残基周囲のLC及びHC配列は、図1b中に示し一直線に並べる。本発明は、どのようにCL-CH1ジスルフィド結合が、耐熱性、構造安定性、ジスルフィドアイソフォーム不均一性、及び抗体の親和性を含めたIgG4抗体の性質に影響を与えるかを調べている。IgG4の突然変異体は、別のアミノ酸と位置127におけるCH1中のシステイン残基の置換、及び上部ヒンジ領域中の1つ又は複数のアミノ酸、好ましくはIgG4のKabatのナンバリングシステムに従いナンバリングした227、228、229及び230から選択される位置におけるアミノ酸と、システインの置換によって作製した。位置227、228、229又は230は、IgG1システイン233が位置するのと同等の構造位置又はその付近に存在する。それぞれの重鎖は、IgG4ヒンジ領域中のシステイン残基239と242の一方又は両方と別のアミノ酸の置換を含めた、さらなる突然変異を含む可能性がある。IgG1ヒンジと同じ長さに位置238と239の間で3アミノ酸IgG4上部ヒンジ領域を延長する突然変異も、いくつかの抗体中に含めた。S241P突然変異もいくつかの抗体中に導入した。本発明による突然変異IgG4抗体は、有利な性質を示すことが分かっている。一実施形態では、本発明による突然変異IgG4抗体は、野生型IgG4抗体と比較して増大した耐熱性を示す。突然変異してCH1ドメイン中の位置127におけるシステインが別のアミノ酸で置換されており、且つ位置227~230の間の重鎖ヒンジ領域中にシステインが導入されている突然変異IgG4抗体は、野生型IgG4抗体と比較して改善された耐熱性を示すことが、驚くことに分かっている。位置127におけるシステインを除去する突然変異は、重鎖と軽鎖の間CL-CH1の鎖間ジスルフィド結合を形成する位置を変え、重鎖ヒンジ領域中の位置227と230の間に導入されるシステインとのジスルフィド結合を軽鎖に形成させる。したがって一実施形態では、システイン127が別のアミノ酸で置換されており、且つ軽鎖のシステインが位置227、228、229又は230における操作型システインとジスルフィド結合を介して連結したIgG4抗体を提供する。IgG4ヒンジ領域に3アミノ酸を加えてIgG4ヒンジ領域を延長することにより、耐熱性に対するさらなる改善も驚くことに分かった。突然変異してCH1ドメイン中の位置127におけるシステインが別のアミノ酸で置換されており、且つ重鎖ヒンジ領域中の位置239又は位置242におけるシステインが別のアミノ酸で置換されている突然変異IgG4抗体は、野生型IgG4抗体と比較して改善された耐熱性を示すことも、驚くことに分かっている。一実施形態では、本発明の抗体は、いわゆる半分子の低減した形成を示す。C239に突然変異を含むがC242には突然変異がない本発明の抗体は、低減した半分子の形成を一般に示す。理論によって束縛されることは望まないが、これは、位置239におけるシステインの除去は重鎖中の鎖内ジスルフィド結合の形成を低減し、したがって、C239又はC242に突然変異がない抗体と比較して半分子の数を減らすことが原因であると考えられる。C242に突然変異があるがC239に突然変異がない抗体は、C239に突然変異があるがC242に突然変異がない抗体と比較して、より多くの半分子を形成するようである。理論によって束縛されることは望まないが、位置239におけるシステインは位置242におけるシステインと比較してより反応性が高く、重鎖ヒンジシステイン又は軽鎖システインのいずれかとジスルフィド結合を形成することができると考えられる。C239とC242の両方に突然変異がある抗体は、2重鎖間に鎖間ジスルフィド結合形成がないため、多数の半分子を形成する。しかしながら、C239とC242の両方に突然変異を含む抗体は、非共有結合を介した重鎖の結合のため、完全抗体分子を依然として形成することができる。低減した半分子の形成は、S241P突然変異がある抗体においても観察される。一実施形態では、上部ヒンジ及びコア領域は以下の配列の1つから選択される:ESKYGPPCPSCPSEQIDNo108ESKYGDKCPSCPSEQIDNo109EPSKYGPPCPSCPSEQIDNo110EPSKYGDKCPSCPSEQIDNo111ESKSYGPPCPSCPSEQIDNo112ESKSYGDKCPSCPSEQIDNo113ESKYGPPAACPSCPSEQIDNo114ESKYGPPGGCPSCPSEQIDNo115ESKYGPPHTCPSCPSEQIDNo116ESKYGDKHTCPSCPSEQIDNo117EPSKYGPPAACPSCPSEQIDNo118EPSKYGPPGGCPSCPSEQIDNo119EPSKYGPPHTCPSCPSEQIDNo120EPSKYGDKHTCPSCPSEQIDNo121ESKSYGPPAACPSCPSEQIDNo122ESKSYGPPGGCPSCPSEQIDNo123ESKSYGPPHTCPSCPSEQIDNo124ESKSYGDKHTCPSCPSEQIDNo125ESKYGPPACPSCPSEQIDNo126ESKYGPPGCPSCPSEQIDNo127ESKYGPPTTCPSCPSEQIDNo128ESKYGDKTTCPSCPSEQIDNo129EPSKYGPPACPSCPSEQIDNo130EPSKYGPPGCPSCPSEQIDNo131EPSKYGPPTTCPSCPSEQIDNo132EPSKYGDKTTCPSCPSEQIDNo133ESKSYGPPACPSCPSEQIDNo134ESKSYGPPGCPSCPSEQIDNo135ESKSYGPPTTCPSCPSEQIDNo136ESKSYGDKTTCPSCPSEQIDNo137ESKYGPPTHCPSCPSEQIDNo138ESKYGDKTHCPSCPSEQIDNo139EPSKYGPPTHCPSCPSEQIDNo140EPSKYGDKTHCPSCPSEQIDNo141ESKSYGPPTHCPSCPSEQIDNo142ESKSYGDKTHCPSCPSEQIDNo143ESKYGPPHTCPSCPSEQIDNo144ESKYGDKHTCPSCPSEQIDNo145EPSKYGPPHTCPSCPSEQIDNo146EPSKYGDKHTCPSCPSEQIDNo147ESKSYGPPHTCPSCPSEQIDNo148ESKSYGDKHTCPSCPSEQIDNo149ESKYGPPTCPSCPSEQIDNo150ESKYGDKTCPSCPSEQIDNo151EPSKYGPPTCPSCPSEQIDNo152EPSKYGDKTCPSCPSEQIDNo153ESKSYGPPTCPSCPSEQIDNo154ESKSYGDKTCPSCPSEQIDNo155ESKYGPPHCPSCPSEQIDNo156ESKYGDKHCPSCPSEQIDNo157EPSKYGPPHCPSCPSEQIDNo158EPSKYGDKHCPSCPSEQIDNo159ESKSYGPPHCPSCPSEQIDNo160ESKSYGDKHCPSCPSEQIDNo161EPKSCDKAACPPCPSEQIDNo162EPKSCDKGGCPPCPSEQIDNo163EPKSCDKHTSPPCPSEQIDNo164EPKSCDKHTCPPSPSEQIDNo165EPKSCDKHTSPPSPSEQIDNo166EPKSCDKAASPPCPSEQIDNo167EPKSCDKAACPPSPSEQIDNo168EPKSCDKAASPPSPSEQIDNo169EPKSCDKGGSPPCPSEQIDNo170EPKSCDKGGCPPSPSEQIDNo171EPKSCDKGGSPPSPSEQIDNo172EPKSCDKACPPCPSEQIDNo173EPKSCDKGCPPCPSEQIDNo174EPKSCDKTSPPCPSEQIDNo175EPKSCDKTCPPSPSEQIDNo176EPKSCDKTSPPSPSEQIDNo177EPKSCDKASPPCPSEQIDNo178EPKSCDKACPPSPSEQIDNo179EPKSCDKASPPSPSEQIDNo180EPKSCDKGSPPCPSEQIDNo181EPKSCDKGCPPSPSEQIDNo182EPKSCDKGSPPSPSEQIDNo183EPKSCDKCPPCPSEQIDNo184EPKSCDKCPPCPSEQIDNo185EPKSCDKSPPCPSEQIDNo186EPKSCDKCPPSPSEQIDNo187EPKSCDKSPPSPSEQIDNo188EPKSCDKSPPCPSEQIDNo189EPKSCDKCPPSPSEQIDNo190EPKSCDKSPPSPSEQIDNo191EPKSCDKSPPCPSEQIDNo192EPKSCDKCPPSPSEQIDNo193EPKSCDKSPPSPSEQIDNo194EPKSCDKTTSPPCPSEQIDNo195EPKSCDKTTCPPSPSEQIDNo196EPKSCDKTTSPPSPSEQIDNo197EPKSCDKTHSPPCPSEQIDNo198EPKSCDKTHCPPSPSEQIDNo199EPKSCDKTHSPPSPSEQIDNo200ESKYGPPCPPCPSEQIDNo201ESKYGPPCPPCPSEQIDNo202ESKYGPPCPPCPSEQIDNo203ESKYGDKCPPCPSEQIDNo204EPSKYGPPCPPCPSEQIDNo205EPSKYGPPCPPCPSEQIDNo206EPSKYGPPCPPCPSEQIDNo207EPSKYGDKCPPCPSEQIDNo208ESKSYGPPCPPCPSEQIDNo209ESKSYGPPCPPCPSEQIDNo210ESKSYGPPCPPCPSEQIDNo211ESKSYGDKCPPCPSEQIDNo212ESKYGPPAACPPCPSEQIDNo213ESKYGPPGGCPPCPSEQIDNo214ESKYGPPHTCPPCPSEQIDNo215ESKYGDKHTCPPCPSEQIDNo216EPSKYGPPAACPPCPSEQIDNo217EPSKYGPPGGCPPCPSEQIDNo218EPSKYGPPHTCPPCPSEQIDNo219EPSKYGDKHTCPPCPSEQIDNo220ESKSYGPPAACPPCPSEQIDNo221ESKSYGPPGGCPPCPSEQIDNo222ESKSYGPPHTCPPCPSEQIDNo223ESKSYGDKHTCPPCPSEQIDNo224ESKYGPPACPPCPSEQIDNo225ESKYGPPGCPPCPSEQIDNo226ESKYGPPTTCPPCPSEQIDNo227ESKYGDKTTCPPCPSEQIDNo228EPSKYGPPACPPCPSEQIDNo229EPSKYGPPGCPPCPSEQIDNo230EPSKYGPPTTCPPCPSEQIDNo231EPSKYGDKTTCPPCPSEQIDNo232ESKSYGPPACPPCPSEQIDNo233ESKSYGPPGCPPCPSEQIDNo234ESKSYGPPTTCPPCPSEQIDNo235ESKSYGDKTTCPPCPSEQIDNo236ESKYGPPTHCPPCPSEQIDNo237ESKYGDKTHCPPCPSEQIDNo238EPSKYGPPTHCPPCPSEQIDNo239EPSKYGDKTHCPPCPSEQIDNo240ESKSYGPPTHCPPCPSEQIDNo241ESKSYGDKTHCPPCPSEQIDNo242ESKYGPPHTCPPCPSEQIDNo243ESKYGDKHTCPPCPSEQIDNo244EPSKYGPPHTCPPCPSEQIDNo245EPSKYGDKHTCPPCPSEQIDNo246ESKSYGPPHTCPPCPSEQIDNo247ESKSYGDKHTCPPCPSEQIDNo248ESKYGPPTCPPCPSEQIDNo249ESKYGDKTCPPCPSEQIDNo250EPSKYGPPTCPPCPSEQIDNo251EPSKYGDKTCPPCPSEQIDNo252ESKSYGPPTCPPCPSEQIDNo253ESKSYGDKTCPPCPSEQIDNo254ESKYGPPHCPPCPSEQIDNo255ESKYGDKHCPPCPSEQIDNo256EPSKYGPPHCPPCPSEQIDNo257EPSKYGDKHCPPCPSEQIDNo258ESKSYGPPHCPPCPSEQIDNo259ESKSYGDKHCPPCPSEQIDNo260EPKSCDKTHTCPPCPSEQIDNo261EPKSCDKTHTCPSCPSEQIDNo262ESKYCPPACPSCPSEQIDNo263ESKYCPPAACPSCPSEQIDNo264ESKYCPPAAACPSCPSEQIDNo265ESKYCPPAAASPSCPSEQIDNo266ESKYCPPAAACPSSPSEQIDNo267ESKCGPPAAACPSCPSEQIDNo268ESKYCPPAAAACPSCPSEQIDNo269ESKYCPPAAAAACPSCPSEQIDNo270ESKYCPPGGGCPSCPSEQIDNo271ESKYCPPSSSCPSCPSEQIDNo272ESKYCPPTCPSCPSEQIDNo273ESKYCPPTHCPSCPSEQIDNo274ESKYCPPTHTCPSCPSEQIDNo275ESKYCPKTHTCPSCPSEQIDNo276ESKYCDKTHTCPSCPSEQIDNo277ESKYCDKTHCPSCPSEQIDNo278ESKYCDKTCPSCPSEQIDNo279ESKYCDKAAACPSCPSEQIDNo280ESKYCDKCPSCPSEQIDNo281ESKSCDKTHTCPSCPSEQIDNo282EPKYCDKTHTCPSCPSEQIDNo283EPKSCPPCPSCPSEQIDNo284ESKSCPPCPSCPSEQIDNo285EPKYCPPCPSCPSEQIDNo286ECKYGPPCPSCPSEQIDNo287ECKYGPPSPSCPSEQIDNo288ECKYGPPCPSSPSEQIDNo289ESCYGPPCPSCPSEQIDNo290ESCYGPPSPSCPSEQIDNo291ESCYGPPCPSSPSEQIDNo292ESKCGPPCPSCPSEQIDNo293ESKCGPPSPSCPSEQIDNo294ESKCGPPCPSSPSEQIDNo295本発明による抗体は、野生型IgG4抗体と比較して、標的抗原に対して匹敵する親和性も示す。本発明の抗体に対する突然変異を、ここでさらに詳細に記載する。アミノ酸を置換するための方法は、分子生物学の分野でよく知られている。このような方法は、例えば、アミノ酸の欠失及び/又は置換又は合成配列のdenovo設計のためにPCRなどの方法を使用する、部位特異的突然変異誘発を含む。図2aは、IgG1野生型、IgG4野生型のヒンジ残基、及び本発明の抗体中の突然変異を導入した位置を示す。Kabatのナンバリングシステムに基づくナンバリング。本発明による抗体は、システイン残基が別のアミノ酸、好ましくはチオール基を含有しないアミノ酸によって置き換えられた、位置127における突然変異C127を含む。置き換え又は置換によって、本発明者らは、鎖間システイン127が抗体重鎖中に通常見られる場合、別のアミノ酸がその場所に存在することを意味する。C127における突然変異は、アミノ酸残基をシステインから別の適切なアミノ酸に変える、位置127における1、2又は3個のアミノ酸をコードするヌクレオチドに対する任意の適切な突然変異であってよい。適切なアミノ酸の例には、セリン、スレオニン、アラニン、グリシン又は任意の極性アミノ酸がある。特に好ましいアミノ酸はセリンである。別のアミノ酸と位置127におけるシステインの置換は、野生型IgG4において軽鎖中のシステインとジスルフィド結合を通常形成する、CH1ドメイン中のシステインを除去する。したがって、鎖間ジスルフィド結合を介して軽鎖と重鎖対を形成するため、軽鎖は、重鎖のヒンジ領域中に位置するシステインとジスルフィド結合を形成しなければならない。本発明の第一の態様では、本発明による抗体は、Kabatのナンバリングシステムに従いナンバリングした227、228、229及び230から選択される位置における1つ又は複数のアミノ酸がシステインで置換された重鎖を含む。したがって、本発明による抗体は、1つ又は複数の以下の突然変異を有し得る:S227CK228CY229CG230C227、228、229及び230から選択されるただ1つの残基が、システイン残基で置換されることが好ましい。本発明の特に好ましい抗体は突然変異Y229C又はG230Cを有する。重鎖のヒンジ領域内の227、228、229及び230から選択される位置におけるシステイン残基の封入は、重鎖と軽鎖の間の形成のための鎖間ジスルフィド結合に関する新たな位置をもたらす。本発明者らにより、この新たな鎖間ジスルフィド結合配置は、野生型IgG4抗体と比較して改善された耐熱性を有するIgG4抗体をもたらすことが分かっている。さらなる突然変異を、本発明のこの態様の抗体に導入することができる。一実施形態では、Kabatのナンバリングシステムに従いナンバリングした重鎖中の位置239におけるシステインC239及び/又は位置242におけるシステインC242は別のアミノ酸、好ましくはチオール基を含有しないアミノ酸で置換されている。置き換え又は置換によって、本発明者らは、システイン239及び/又はシステイン242が抗体重鎖中に通常見られる場合、別のアミノ酸がその場所に存在することを意味する。C239及び/又はC242における突然変異は、アミノ酸残基をシステインから別の適切なアミノ酸に変える、1、2又は3個のアミノ酸をコードするヌクレオチドに対する任意の適切な突然変異であってよい。適切なアミノ酸の例には、セリン、スレオニン、アラニン、グリシン又は任意の極性アミノ酸がある。特に好ましいアミノ酸はセリンである。一実施形態では、重鎖中の位置239におけるシステインは別のアミノ酸で置換されており、重鎖中の位置242におけるシステインは別のアミノ酸で置換されている。この実施形態では、C239とC242の両方の置換は、別の重鎖中の対応するシステインと重鎖間ジスルフィド結合を通常形成する、重鎖のヒンジ領域内の両方のシステイン残基を除去する。生成する半分子は、2重鎖間の非共有結合を介して完全抗体分子を形成することができる。別の実施形態では、重鎖中の位置239におけるシステインは別のアミノ酸で置換されている。この実施形態では、位置242におけるシステインは別のアミノ酸で置換されていない。さらなる別の実施形態では、重鎖中の位置242におけるシステインは別のアミノ酸で置換されている。この実施形態では、位置239におけるシステインは別のアミノ酸で置換されていない。C239又はC242の一方の置換により、別の重鎖中のシステインと重鎖間ジスルフィド結合を形成することができる、重鎖中の1つのシステインが残る。理論によって束縛されることは望まないが、ヒンジ領域内の1システインの置換、特にC239の置換はヒンジ領域内の鎖内ジスルフィド結合の形成を減らし、したがって半抗体分子の形成を減らす可能性があると考えられる。位置227におけるセリンがシステインで置換されている本発明の一実施形態では、抗体は位置C239及びC242に突然変異を含まないことが好ましい。位置227におけるセリンがシステインで置換されている別の実施形態では、重鎖中の位置239におけるシステインは別のアミノ酸で置換されているが、位置242におけるシステインは別のアミノ酸で置換されていないことが好ましい。一実施形態では、本発明の抗体は、突然変異させてアミノ酸226~243の間に1つ又は複数のアミノ酸を挿入したIgG4重鎖を含む。挿入するアミノ酸の数は1~10、1~5、1~3であってよく、1、2、3又は4個のアミノ酸を挿入することが好ましい。アミノ酸はアミノ酸238と239の間に挿入することが好ましい。アラニン、グリシン、セリン又はスレオニン、及びこれらの組合せなどの、任意の適切なアミノ酸をヒンジ領域中に挿入することができる。3個のアラニンAAA、3個のグリシンGGG、3個のセリンSSS又は3個のスレオニンTTT、又は1個のスレオニン、ヒスチジンと別のスレオニンTHTを挿入することが好ましい。突然変異させて3個のアミノ酸をヒンジ領域中に挿入したIgG4重鎖を含む本発明の抗体は、改善された耐熱性を示すことが分かっている。本発明による抗体中に導入することができるさらなる突然変異は、突然変異S241Pである。この突然変異は、半分子の形成を減らすことが以前に示されているAngal,S.etal.,1993.1個のアミノ酸置換がキメラマウス/ヒトIgG4抗体の不均一性をなくす。Asingleaminoacidsubstitutionabolishestheheterogeneityofchimericmouse/humanIgG4antibody.MolImmunol30,105-108。本発明による抗体は、ヒンジ領域中に1つ又は複数のさらなる突然変異を含む可能性がある。例えば抗体は、1つ又は複数の以下の突然変異S227P、Y229S、P237D及びP238Kをさらに含む可能性がある。一実施形態では、本発明による抗体は、残基226~243上部ヒンジ及びコアヒンジのIgG1ヒンジ領域を効率よく含む。したがって本発明の抗体は、位置230におけるグリシンがシステインで置換されており、位置227におけるセリンがプロリンで置換されており、位置229におけるチロシンがセリンで置換されており、位置237におけるプロリンがアスパラギン酸で置換されており、位置238におけるプロリンがリシンで置換されており、アミノ酸配列スレオニン-ヒスチジン-スレオニンが位置238と239の間に挿入されており、且つ位置241におけるセリンがプロリンで置換されているヒンジ領域を含む。図2a中に示すように、これらの突然変異は、S227P、Y229S、G230C、P237D、P238KTHT及びS241Pとして表記することもできる。IgG4ヒンジ領域への、これらのさらなる突然変異の導入は、改善された耐熱性を有する抗体をもたらすことが分かっている。本発明による抗体は、残基244~251のIgG4下部ヒンジAPEFLGGPを有することが好ましい。理論によって束縛されることは望まないが、IgG4下部ヒンジ領域は、IgG4抗体のエフェクター機能の欠如に貢献すると考えられる。本発明の第二の態様では、抗体は、前に記載したように位置127におけるシステインが別のアミノ酸で置換されており、Kabatのナンバリングシステムに従いナンバリングした重鎖中の位置239におけるシステイン又は位置242におけるシステインが別のアミノ酸で置換されている、重鎖を含む。この第二の態様では、位置227、228、229及び230におけるいずれの残基もシステイン残基で置換されていない。本発明の第二の態様による抗体は、野生型IgG4抗体と比較して、改善された耐熱性を有することが驚くことに分かっている。本発明の第二の態様では、抗体は、1つ又は複数のさらなる突然変異を含む可能性がある。一実施形態では、抗体は、前に記載したように、突然変異させてアミノ酸226~243の間、好ましくはアミノ酸238と239の間に3個のアミノ酸を挿入したIgG4重鎖を含む。さらなる実施形態では、抗体は突然変異S241Pを含む。さらなる実施形態では、抗体は1つ又は複数の以下の突然変異S227P、Y229S、P237D及びP238Kをさらに含む可能性がある。以下の表1は、本発明の例示的な抗体、及びIgG4野生型配列と比較して導入した突然変異を列挙する。表1は、野生型IgG1及びIgG4抗体及び対照抗体も含む。図3a及び4aも、本発明によるIgG4抗体に導入された突然変異を示す。図3b及び4bは、本発明のIgG4抗体中のシステイン残基の位置を示し、軽鎖LC又は別の重鎖HC中のシステインとシステインの予想される結合も示す。LC又はHCを示すシステイン残基に関しては、システインは軽鎖又は重鎖中のシステインと結合することが可能であるが、LC又はHCの一方に下線を引く場合、これは主として存在すると考えられるジスルフィド結合である。好ましい実施形態では、本発明は、少なくとも1つの重鎖を含む抗体であって、それぞれの重鎖がCH1ドメイン及びヒンジ領域を含み、且つそれぞれの重鎖が表1中に示すような2、3、6、7、8、15、16、28、28P、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、44、44P、45、46、47及び48から選択される抗体の突然変異を含む抗体を提供する。したがって本発明は、少なくとも1つの重鎖を含む抗体であって、それぞれの重鎖がCH1ドメイン及びヒンジ領域を含み、且つそれぞれの重鎖が以下の配列:配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36及び配列番号37の1つを含む抗体を提供する。好ましい実施形態では、本発明の抗体は、それぞれの重鎖がCH1ドメイン及びヒンジ領域を含み、且つ以下の配列:配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32配列番号35、配列番号36及び配列番号37の1つを含む、少なくとも1つの重鎖を含む。より好ましくは、本発明の抗体は、それぞれの重鎖がCH1ドメイン及びヒンジ領域を含み、且つそれぞれの重鎖が以下の配列:配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32配列番号35、配列番号36及び配列番号37の1つを含む、少なくとも1つの重鎖を含む。さらなる好ましい実施形態では、本発明は、少なくとも1つの重鎖を含む抗体であって、それぞれの重鎖がCH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメイン及びCH3ドメインを含み、且つそれぞれの重鎖が表1中に示すような2、3、6、7、8、15、16、28、28P、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、44、44P、45、46、47及び48から選択される抗体の突然変異を含む抗体を提供する。したがって本発明は、少なくとも1つの重鎖を含む抗体であって、それぞれの重鎖がCH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメイン及びCH3ドメインを含み、且つそれぞれの重鎖が以下の配列:配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62及び配列番号63の1つを含む抗体を提供する。本発明の特に好ましい抗体は、それぞれの重鎖がCH1ドメイン及びヒンジ領域を含み、且つ配列番号36抗体28P、配列番号37抗体44P又は配列番号35抗体48を含む少なくとも1つの重鎖を含む。本発明のさらなる特に好ましい抗体は、それぞれの重鎖がCH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメイン及びCH3ドメインを含み、且つ配列番号62抗体28P、配列番号63抗体44P又は配列番号61抗体48を含む少なくとも1つの重鎖を含む。抗体28P、44P及び48が特に好ましい。それらは有意に改善された耐熱性を示し、低減した半分子形成をさらに示すからである。抗体2、3及び8は、相当量のいわゆる半分子HLを形成することが示されている。これらの突然変異体はinvitroで非変性状態下において完全抗体分子H2L2を形成することはできるが、重鎖間及び/又は重鎖と軽鎖の間の如何なる非共有結合も非還元SDS-PAGE状態下において除去される。半分子の形成を減らすことが望ましいと教示されることは多いが、半分子を形成する高い傾向を有する抗体は特定用途に有利である可能性がある。別の重鎖と共有又は非共有結合を形成することができない抗体重鎖のため、安定した半分子HLを形成するが完全抗体H2L2はほとんど又は全く形成しない抗体が特に対象である。安定した半分子を形成する抗体は、一価抗体の生成に有利である可能性がある。半分子を形成する抗体も、それぞれの抗原に関して二重特異性及び一価であり異なる特異性を有する半分子からの完全抗体の形成のため、二重特異性抗体を生成するのに有用な方法をもたらす可能性がある。抗体3はヒンジ領域中にC239を保持するが、おそらくC末端軽鎖システインとヒンジC239の間のジスルフィドの効率よい形成のため、ヒンジ間重鎖ジスルフィド結合を形成することはできないようである。抗体2と3の比較は、軽鎖ジスルフィドがヒンジ領域中でC242よりC239に効率よく結合する点で、軽鎖のC末端システインの到達の程度を示す。さらに抗体3は、抗体2と比較して増大した安定性を示す。本発明による突然変異抗体をIgG4アイソタイプに関して前に記載したが、当業者は、IgG4抗体に施す突然変異を、IgG4抗体と同じジスルフィド結合配置を有する他の抗体アイソタイプ又はクラスに適用して、改良型抗体をもたらすことも可能であることを理解している。IgG4抗体と同じジスルフィド結合配置を有する抗体の具体例は、IgG3抗体、IgM抗体及びIgD抗体である。図1b中に示すように、IgG3及びIgMはCH1ドメイン中の位置127にシステインを有し、IgDはCH1ドメイン中の位置128に、軽鎖中のシステインと鎖間ジスルフィド結合を形成するIgG4のCH1ドメイン中のC127と等しいシステインを有する。さらに、IgG3及びIgDの上部ヒンジ領域、並びにCH1ドメインのC末端領域、並びにIgM中のCH2ドメインのN末端領域は、IgG1の上部ヒンジ領域の残基と等しいシステイン残基を含有しないことも、図1bから見ることができる。したがって本発明は、軽鎖中のシステインと鎖間ジスルフィド結合を形成するCH1ドメイン中のシステインが別のアミノ酸で置換されており、且つIgG1又はIgG4の上部ヒンジ領域と構造上類似した位置に存在する1つ又は複数のアミノ酸がシステインで置換されている、IgG3抗体、IgD抗体及びIgM抗体をさらに提供する。したがって本発明は、CH1ドメイン及びヒンジ領域を含む少なくとも1つの重鎖を含むクラスIgG3の抗体であって、それぞれの重鎖中、a.軽鎖中のシステインと鎖間ジスルフィド結合を形成するCH1ドメイン中のシステインが別のアミノ酸で置換されており、且つb.上部ヒンジ領域中に位置する1つ又は複数のアミノ酸がシステインで置換されている抗体も提供する。本発明のIgG3抗体態様の好ましい実施形態では、軽鎖中のシステインと鎖間ジスルフィド結合を形成するCH1ドメイン中のシステインは、図1b及び2b中に示すように、Kabatのナンバリングシステムに従いナンバリングした位置127におけるシステインである。本発明のIgG3抗体態様の好ましい実施形態では、システインと置換することができる上部ヒンジ領域中に位置する1つ又は複数のアミノ酸は、図1b及び2b中に示すように、Kabatのナンバリングシステムに従いナンバリングした、226、227、228、229、230、232及び233から選択される位置における1つ又は複数のアミノ酸である。本発明は、CH1ドメイン及びCH2ドメインを含む少なくとも1つの重鎖を含むクラスIgMの抗体であって、それぞれの重鎖中、a.軽鎖中のシステインと鎖間ジスルフィド結合を形成するCH1ドメイン中のシステインが別のアミノ酸で置換されており、且つb.CH1ドメイン又はCH2ドメイン中に位置する1つ又は複数のアミノ酸がシステインで置換されている抗体をさらに提供する。本発明のIgM抗体態様の好ましい実施形態では、軽鎖中のシステインと鎖間ジスルフィド結合を形成するCH1ドメイン中のシステインは、図1b及び2c中に示すように、Kabatのナンバリングシステムに従いナンバリングした位置127におけるシステインである。本発明のIgM抗体態様の好ましい実施形態では、CH1ドメインのC末端又はCH2ドメインのN末端に位置する1つ又は複数のアミノ酸が、システインで置換されている。システインと置換することができるCH1ドメインのC末端に位置する好ましいアミノ酸は、図1b及び2c中に示すように、Kabatのナンバリングシステムに従いナンバリングした、223、223A、223B及び223Cから選択される位置における1つ又は複数のアミノ酸である。システインと置換することができるCH2ドメインのN末端に位置する好ましいアミノ酸は、図1b及び2c中に示すように、Kabatのナンバリングシステムに従いナンバリングした、243G、243H及び243Iから選択される位置における1つ又は複数のアミノ酸である。したがって、任意の1つ又は複数のアミノ酸223~243はシステインと置換することができる。本発明は、CH1ドメイン及びヒンジ領域を含む少なくとも1つの重鎖を含むクラスIgDの抗体であって、それぞれの重鎖中、a.軽鎖中のシステインと鎖間ジスルフィド結合を形成するCH1ドメイン中のシステインが別のアミノ酸で置換されており、且つb.ヒンジ領域中に位置する1つ又は複数のアミノ酸がシステインで置換されている抗体をさらに提供する。本発明のIgD抗体態様の好ましい実施形態では、軽鎖中のシステインと鎖間ジスルフィド結合を形成するCH1ドメイン中のシステインは、図1b及び2d中に示すように、Kabatのナンバリングシステムに従いナンバリングした位置128におけるシステインである。IgD抗体のヒンジ領域は、Kabatのナンバリングシステムに従いR224~P243として定義することができる。本発明のIgD抗体態様の好ましい実施形態では、システインと置換することができるヒンジ領域中に位置する1つ又は複数のアミノ酸は、図1b及び2d中に示すように、Kabatのナンバリングシステムに従いナンバリングした、227、228、229、230、231、232及び233から選択される位置における1つ又は複数のアミノ酸である。本発明によって提供されるIgG3、IgD又はIgM抗体は、IgG4抗体に関して前に論じたように、ヒンジ領域に対する1つ又は複数のさらなる突然変異を含むことができる。本明細書で使用する用語抗体は、VHドメイン、CH1ドメイン及びヒンジ領域を含む少なくとも1つの重鎖を含む、完全全抗体及び機能活性断片を含む。本発明による抗体は、少なくとも1つの軽鎖を含むことが好ましい。したがって、本発明中の用語抗体は、二価、三価又は四価抗体、Fab’及びFab’2断片、1つの軽鎖と重鎖対を含む半抗体分子又は半分子、並びに2つの軽鎖と重鎖対を含む完全抗体分子を包含する。当技術分野でよく知られるように、典型的なFab’分子は、重鎖が可変領域VH、定常ドメインCH1及びヒンジ領域を含み、軽鎖が可変領域VL及び定常ドメインCLを含む、1つの重鎖と軽鎖対を含む。一実施形態では、本開示によるFab’の二量体を提供し、例えば二量体化はヒンジを介したものであってよい。一実施形態では、重鎖はCH2ドメイン及びCH3ドメイン、及び場合によってはCH4ドメインを含む。一実施形態では、抗体は2つの重鎖を含み、その各々は本発明の第一又は第二の態様で前に定義したものである。本発明による抗体は、2つの軽鎖をさらに含むことが好ましい。抗体が2つの重鎖を含むこの実施形態では、両方の重鎖配列が、本発明の第一又は第二の態様で前に定義したように同一であることが好ましい。好ましい実施形態では、本発明の抗体は、2つの軽鎖及び2つの重鎖を含む完全抗体であり、それぞれの重鎖は、Kabatのナンバリングシステムに従いナンバリングした位置127におけるシステインが別のアミノ酸で置換されているIgG4CH1、IgG1上部及び中央ヒンジ領域、IgG4下部ヒンジ領域、CH2ドメイン及びCH3ドメインを含む。IgG4抗体の完全ヒンジ領域は、典型的にはKabatのナンバリングシステムに基づきナンバリングした残基226~251からなる。しかしながら、ヒンジ領域は必要に応じて縮小又は延長することができる。例えば、本発明の第一の態様による抗体では、野生型アミノ酸は位置227、228、229又は230でシステイン残基で置換されており、ヒンジ領域は位置227、228、229又は230における新たなシステイン残基の後で終わる可能性がある。本発明による抗体は、ヒンジ領域のN末端及び/又はC末端に位置する1つ又は複数のさらなるアミノ酸も含むことができる。さらに、柔軟性などのヒンジの性質に影響を与える可能性がある、軽鎖の鎖間システインからのヒンジシステイン単数又は複数の距離、ヒンジのシステイン間の距離、及びヒンジ中の他のアミノ酸の組成などの、ヒンジの他の特性を調節することができる。例えば、グリシンをヒンジ中に取り込ませ旋回柔軟性を増大することができ、又はプロリンをヒンジ中に取り込ませ柔軟性を低減することができる。或いは、荷電残基又は疎水性残基の組合せをヒンジ中に取り込ませ、多量体化又は精製特性をもたらすことができる。他の修飾ヒンジ領域は完全に合成であってよく、長さ、組成及び柔軟性などの望ましい性質を有するように設計することができる。存在する場合、本発明中で利用する、特にFcドメイン中の定常領域ドメインは、抗体エフェクター機能が必要とされないIgG4アイソタイプであることが好ましい。したがって、それぞれの重鎖は、配列番号64中に示すように、IgG4CH2ドメイン及びCH3ドメインを含むことが好ましい。Fc定常領域ドメインの配列変形も使用可能であることは理解されよう。一実施形態では、それぞれの重鎖は、位置409EUナンバリングにおけるアルギニンがリシン、スレオニン、メチオニン又はロイシンで置換されて低pHでの凝集体形成が阻害されるUS2008/0063635Takahashietal.、IgG4CH2及びCH3ドメインを含む。CDC活性を弱めるためのUS2008/0063635Takahashietal.、EUナンバリングシステムに従いナンバリングしたL235、D265、D270、K322、P331及びP329における突然変異も教示される。EUナンバリングシステムに従いナンバリングした位置409におけるアルギニン残基、位置405におけるPhe残基又は位置370におけるLysの置換によりFabアーム交換する低い能力を有する安定IgG4抗体を開示するWO2008/145142VandeWinkeletal.中に教示されたような突然変異を、それぞれの重鎖は含み得る。一実施形態では、それぞれの重鎖は、配列番号65中に示すように、IgG4CH2ドメイン及びIgG1CH3ドメインを含む。抗体が突然変異IgG3、IgD又はIgM抗体である本発明の実施形態では、それぞれの重鎖は、CH2ドメイン及びCH3ドメイン、及び場合によってはCH4ドメインを含むことが好ましい。IgG3抗体では、それぞれの重鎖はIgG3CH2ドメイン及びIgG3CH3ドメインを含むことが好ましい。IgD抗体では、それぞれの重鎖はIgDCH2ドメイン及びIgDCH3ドメインを含むことが好ましい。IgM抗体では、それぞれの重鎖はIgMCH2ドメイン、IgMCH3ドメイン及びIgMCH4ドメインを含むことが好ましい。一実施形態では、抗体はモノクローナル、完全ヒト、ヒト化又はキメラ抗体断片である。一実施形態では、抗体は完全ヒト又はヒト化である。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技法KohlerMilstein,Nature,1975,256,495-497、トリオーマ技法、ヒトB細胞ハイブリドーマ技法Kozboretal.,ImmunologyToday,1983,4,72及びEBVハイブリドーマ技法Coleetal.,モノクローナル抗体と癌治療MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,pp.77-96,AlanR.Liss,Inc.,1985などの、当技術分野で知られている任意の方法により調製することができる。本発明中で使用するための抗体は、例えばBabcook,J.etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1996,9315,7843-7848,WO92/02551,WO2004/051268及びWO2004/106377により記載された方法によって、特異的抗体の生成用に選択した単一リンパ球から作製した免疫グロブリン可変領域cDNAのクローニング及び発現により、単一リンパ球抗体法を使用して作製することもできる。ヒト化抗体は、非ヒト種由来の1つ又は複数の相補性決定領域CDR、及び非ヒト種由来の1つ又は複数のドナー残基を場合によっては含むヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する、非ヒト種由来の抗体分子である例えば、US5,585,089参照。本発明中で使用するための抗体は、当技術分野で知られている様々なファージディスプレイ法を使用して作製することもでき、Brinkmanetal.,J.Immunol.Methods,1995,182,41-50;Amesetal.,J.Immunol.Methods,1995,184,177-186;Kettleboroughetal.Eur.J.Immunol.,1994,24,952-958;Persicetal.,Gene,1997187,9-18;及びBurtonetal.,免疫学の進歩AdvancesinImmunology,1994,57,191-280;WO90/02809;WO91/10737;WO92/01047;WO92/18619;WO93/11236;WO95/15982;及びWO95/20401;及びUS5,698,426、5,223,409、5,403,484、5,580,717、5,427,908、5,750,753、5,821,047、5,571,698、5,427,908、5,516,637、5,780,225、5,658,727、5,733,743、及び5,969,108により開示されたものを含む。さらに、トランスジェニックマウス、又は他の哺乳動物を含めた他の生物を使用して、ヒト化抗体を作製することができる。完全ヒト抗体は、重鎖と軽鎖の両方の可変領域と定常領域存在する場合がいずれもヒト起源である、又は必ずしも同じ抗体に由来するわけではないが、ヒト起源の配列と実質的に同一である抗体である。完全ヒト抗体の例は、例えば前に記載したファージディスプレイ法によって生成される抗体、及び例えば、EP0546073B1、US5,545,806、US5,569,825、US5,625,126、US5,633,425、US5,661,016、US5,770,429号、EP0438474B1及びEP0463151B1中に一般的に記載された、マウス免疫グロブリン可変及び/又は定常領域遺伝子がそれらのヒト相当物によって置換されているマウスによって生成される抗体を含むことができる。本発明中で使用するための抗体出発物質は、抗体の可変及び定常領域単数又は複数をコードするDNAの操作及び再発現を含む、組換えDNA技法の使用によって調製することができる。標準的な分子生物学の技法を使用して、望む場合アミノ酸又はドメインを修飾、付加又は欠失することができる。可変又は定常領域に対する任意の改変が、本明細書で使用する用語可変及び定常領域により依然として包含される。抗体出発物質は、例えばマウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ラクダ、ラマ、ヤギ又はヒトを含めた任意の種から得ることができる。抗体の一部分は2つ以上の種から得ることができる。例えば抗体はキメラであってよい。一例では、定常領域は一種に由来し、可変領域は他種に由来する。抗体出発物質は修飾することもできる。別の例では、組換えDNA操作技法を使用して抗体の可変領域を作製している。このような操作型は、例えば天然抗体のアミノ酸配列の挿入、欠失又は変更によって天然抗体可変領域から作製されたものを含む。このタイプの具体例には、一抗体由来の少なくとも1つのCDR、及び場合によっては1つ又は複数のフレームワークアミノ酸を含有する操作型可変領域ドメイン、及び第二の抗体由来の残りの可変領域ドメインがある。これらの抗体を作製及び製造するための方法は、当技術分野でよく知られている例えば、Bossetal.,US4,816,397;Cabillyetal.,US6,331,415;Shraderetal.,WO92/02551;Wardetal.,1989,Nature,341,544;Orlandietal.,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,3833;Riechmannetal.,1988,Nature,322,323;Birdetal,1988,Science,242,423;Queenetal.,US5,585,089;Adair,WO91/09967;MountainandAdair,1992,Biotechnol.Genet.Eng.Rev,10,1-142;Vermaetal.,1998,JournalofImmunologicalMethods,216,165-181を参照。一実施形態では、抗体は、同族対である結合ドメインを形成する可変ドメイン対を含む。本明細書で利用する同族対は、即ち単一抗体又は抗体発現細胞から単離した、可変ドメインの本来の対を指すものとする。可変ドメインは最適化及び/又はヒト化されている可能性がある。同族対に由来する最適化/ヒト化可変ドメインは、最適化/ヒト化後、同族対と依然考えられる。したがって本発明は、ヒト、ヒト化又はキメラ分子に及ぶ。一実施形態では、分子は標的抗原と特異的に結合する。本明細書で利用する特異的結合は、それが特異的である標的抗原に対する高い親和性を有し、低い若しくは一層低い親和性で、それが特異的でない抗原と結合する又は全く結合しない分子を指すものとする。親和性を測定するための方法は当業者に知られており、BIAcore商標などのアッセイを含む。本発明の抗体分子は、特にナノモル又はピコモルで、高い結合親和性を適切に有する。BIAcore商標を含めた当技術分野で知られている任意の適切な方法を使用して、親和性を測定することができる。一実施形態では、本発明の分子は約100pM以上の結合親和性を有する。一実施形態では、本発明の分子は約50pM以上の結合親和性を有する。一実施形態では、本発明の分子は約40pM以上の結合親和性を有する。一実施形態では、本発明の分子は約30pM以上の結合親和性を有する。一実施形態では、本発明の分子は完全ヒト又はヒト化であり、約100pM以上の結合親和性を有する。本明細書で利用する本来存在するドメインの誘導体は、本来存在する配列中の1、2、3、4又は5アミノ酸が例えば置換又は欠失して、望ましくない性質の排除などによりドメインの性質が最適化したが、ドメインの特徴的な性質単数又は複数は保持される誘導体を指すものとする。一実施形態では、本発明の抗体分子は1つ又は複数のアルブミン結合ペプチドを含む。invivoではペプチドはアルブミンと結合し、それによって分子の半減期は増大する。アルブミン結合ペプチドは、1つ又は複数の可変領域、分子のヒンジ又はC末端、又は分子の抗原結合性に干渉しない任意の位置から付加し得る。アルブミン結合ペプチドの例はWO2007/106120中に提供される。抗体が様々な翻訳後修飾を経る可能性があることも、当業者によって理解されよう。これらの修飾のタイプ及び程度は、分子を発現させるために使用する宿主細胞系、及び培養条件に依存することが多い。このような修飾は、グリコシル化、メチオニン酸化、ジケトピペラジン形成、アスパラギン酸異性化及びアスパラギン脱アミド化の変形を含むことができる。Harris,RJ.クロマトグラフィージャーナルJournalofChromatography705:129-134,1995中に記載されたように、頻繁な修飾は、カルボキシペプチダーゼの作用によりリシン又はアルギニンなどのカルボキシ末端塩基性残基の消失となる。望む場合、本発明中で使用するための分子は1つ又は複数のエフェクター分子単数又は複数と結合させることが可能である。エフェクター分子が、本発明の抗体分子と結合することができる一成分を形成するように連結した、1個のエフェクター分子又は2個以上のこのような分子を含むことができることは理解されよう。エフェクター分子と連結した本発明による抗体を得ることを望む場合、抗体を直接的に、又はカップリング剤を介してエフェクター分子に連結させる、標準的化学手順又は組換えDNA手順によりこれを調製することができる。このようなエフェクター分子を抗体と結合させるための技法は、当技術分野でよく知られているHellstrometal.,徐放型薬剤送達ControlledDrugDelivery2ndEd.,Robinsonetal.,eds.,1987,pp.623-53;Thorpeetal.,1982,Immunol.Rev.,62:119-58及びDubowchiketal.,1999,薬理学及び治療学PharmacologyandTherapeutics83,67-123を参照。個々の化学手順には、例えば、WO93/06231、WO92/22583、WO89/00195、WO89/01476及びWO03031581中に記載された手順がある。或いは、エフェクター分子がタンパク質又はポリペプチドである場合、例えばWO86/01533及びEP0392745中に記載されたような組換えDNA手順を使用して、連結を得ることができる。本明細書で使用する用語エフェクター分子は、例えば抗新生物薬、薬剤、毒素、生物活性タンパク質、例えば酵素、他の抗体若しくは抗体断片、合成若しくは天然に存在するポリマー、核酸及びその断片、例えばDNA、RNA及びその断片、放射性核種、特に放射性ヨウ素、放射性同位体、キレート金属、ナノ粒子、及び蛍光化合物などのレポーター群、又はNMR若しくはESR分光法により検出可能な化合物を含む。エフェクター分子の例は、細胞に有害である例えば殺傷する任意の作用物質を含めた、サイトトキシン又は細胞毒性物質を含むことができる。例には、コンブレスタチンcombrestatins、ドラスタチン、エポチロン、スタウロスポリン、メイタンシノイド、スポンジスタチン、リゾキシン、ハリコンドリン、ロリジン、ヘミアステルリン、タキソール、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルチシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1-デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びピューロマイシン、並びにこれらのアナログ又はホモログがある。エフェクター分子には、代謝拮抗薬例えば、メトトレキサート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-フルオロウラシルデカルバジン、アルキル化剤例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチンBSNU及びロムスチンCCNU、シクロトスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンC、及びシス-ジクロロジアミン白金IIDDPシスプラチン、アントラサイクリン例えば、ダウノルビシン以前はダウノマイシン及びドキソルビシン、抗生物質例えば、ダクチノマイシン以前はアクチノマイシン、ベロマイシン、ミトラマイシン、アントラマイシンAMC、カリケアマイシン又はデュオカルマイシン、及び抗分裂剤例えば、ビンクリスチン及びビンブラスチンもあるが、これらだけには限られない。他のエフェクター分子は、111In及び90Y、Lu177、ビスマス213、カリフォルニウム252、イリジウム192及びタングステン188/レニウム188などのキレート化放射性核種、又はアルキルホスホコリン、トポイソメラーゼI阻害剤、タキソイド及びスラミンなどだけには限られないが、これらの薬剤を含むことができる。他のエフェクター分子には、タンパク質、ペプチド及び酵素がある。対象の酵素には、タンパク質分解酵素、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼがあるが、これらだけには限られない。対象のタンパク質、ポリペプチド及びペプチドには、免疫グロブリン、アブリン、リシンA、シュードモナスエキソトキシン、又はジフテリア毒素などの毒素、インスリン、腫瘍壊死因子、α-インターフェロン、β-インターフェロン、神経増殖因子、血小板由来増殖因子又は組織プラスミノゲンアクチベータなどのタンパク質、抗血栓薬、又は抗血管新生薬、例えばアンギオスタチン若しくはエンドスタチン、又はリンホカイン、インターロイキン-1IL-1、インターロイキン-2IL-2、顆粒球マクロファージ-コロニー刺激因子GM-CSF、顆粒球コロニー刺激因子G-CSF、神経増殖因子NGF又は他の増殖因子及び免疫グロブリンなどの生物反応修飾物質があるが、これらだけには限られない。他のエフェクター分子は、例えば診断において有用な検出可能な物質を含むことができる。検出可能な物質の例には、様々な酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性核種、ポジトロンエミッショントモグラフィーにおいて使用するためのポジトロン放出金属、及び非放射性常磁性金属イオンがある。診断剤として使用するための抗体と結合可能な金属イオンに関する、米国特許第4,741,900号を一般に参照。適切な酵素にはホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼがあり、適切な補欠分子団にはストレプトアビジン、アビジン及びビオチンがあり、適切な蛍光物質にはウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド及びフィコエリスリンがあり、適切な発光物質にはルミノールがあり、適切な生物発光物質にはルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンがあり、且つ適切な放射性核種には125I、131I、111In及び99Tcがある。別の例では、エフェクター分子はinvivoで抗体の半減期を増大することができ、及び/又は抗体の免疫原性を低減することができ、及び/又は免疫系への上皮壁を介した抗体の送達を高めることができる。このタイプの適切なエフェクター分子の例には、ポリマー、アルブミン、アルブミン結合タンパク質又はアルブミン結合化合物、WO05/117984中に記載されたものなどがある。エフェクター分子がポリマーである場合、それは一般に、合成又は天然に存在するポリマー、例えば場合によっては置換された直鎖状若しくは分岐鎖状ポリアルキレン、ポリアルケニレン若しくはポリオキシアルキレンポリマー、又は分岐鎖状若しくは非分岐鎖状多糖、例えばホモ-若しくはヘテロ-多糖であり得る。前述の合成ポリマー上に存在し得る具体的な任意選択の置換基には、1つ又は複数のヒドロキシ、メチル若しくはメトキシ基がある。合成ポリマーの具体例には、場合によっては置換された直鎖状若しくは分岐鎖状ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールポリビニルアルコール又はそれらの誘導体、特に場合によっては置換されたメトキシポリエチレングリコールなどのポリエチレングリコール又はそれらの誘導体がある。具体的な天然に存在するポリマーには、ラクトース、アミロース、デキストラン、グリコーゲン又はそれらの誘導体がある。本明細書で使用する誘導体は、反応性誘導体、例えばチオール選択的反応基、例えばマレイミドなどを含むものとする。反応基はポリマーと直接、又はリンカーセグメントを介してポリマーと連結することができる。幾つかの場合このような基は、本開示の抗体とポリマーの間の連結基として生成物の一部を形成することは理解されよう。ポリマーの大きさは必要に応じて変えることはできるが、一般に500Da~50000Da、例えば5000~40000Da、20000~40000Daなどの平均分子量範囲である。特にポリマーの大きさは、生成物の目的用途、例えば腫瘍などの特定組織に局在する能力、又は長い循環半減期に基づいて選択することができる総説に関しては、Chapman,2002,AdvancedDrugDeliveryReviews,54,531-545を参照。したがって、例えば生成物を、例えば腫瘍の治療において使用するために、循環中に放置し組織に浸透させることを目的とする場合、低分子量ポリマー、例えば約5000Daの分子量を有するポリマーを使用することが有利である可能性がある。生成物を循環中に放置する場合の適用例に関しては、高分子量ポリマー、例えば20000Da~40000Daの範囲の分子量を有するポリマーを使用することが有利である可能性がある。適切なポリマーには、ポリアルキレンポリマー、ポリエチレングリコール又は、特に、メトキシポリエチレングリコール又はそれらの誘導体など、及び特に約15000Da~約40000Daの範囲の分子量を有するポリマーがある。一例では、本発明中で使用するための抗体をポリエチレングリコールPEG部分と結合させる。1つの具体例では、抗体中に位置する任意の利用可能なアミノ酸側鎖又は末端アミノ酸官能基、例えば任意の遊離アミノ、イミノ、チオール、ヒドロキシル若しくはカルボキシル基を介して、PEG分子を結合させることが可能である。このようなアミノ酸は抗体中に本来存在する可能性があり、又は組換えDNA法を使用して抗体中に操作することができる例えば、US5,219,996、US5,667,425、WO98/25971を参照。一例では本発明の分子は、その修飾がエフェクター分子の結合を可能にするためのその重鎖の1つ又は複数のアミノ酸のC末端への付加である、修飾抗体である。多数の部位を使用して2つ以上のPEG分子を結合させることが可能である。一実施形態では、PEG分子を軽鎖中のシステイン171と連結させる。例えば、参照として本明細書に組み込まれるWO2008/038024を参照。PEG分子は、抗体中に位置する少なくとも1つのシステイン残基のチオール基を介して共有結合させることが適切である。修飾抗体と結合するそれぞれのポリマー分子は、抗体中に位置するシステイン残基のイオウ原子に共有結合させることが可能である。一般に共有結合は、ジスルフィド結合又は、特に、イオウ-炭素結合である。適切に活性化したエフェクター分子の結合地点としてチオール基を使用する場合、例えば、マレイミド及びシステイン誘導体などのチオール選択的誘導体を使用することができる。前に記載したポリマー修飾抗体の調製中の出発物質として、活性化ポリマーを使用することができる。活性化ポリマーは、チオール反応基、例えばα-ハロカルボン酸又はエステル、例えばヨードアセトアミド、イミド、例えばマレイミド、ビニルスルホン又はジスルフィドなどを含有する任意のポリマーであってよい。このような出発物質は例えばNektar、以前はShearwaterPolymersInc.、Huntsville、AL、USAから市販されているものを得ることができ、又は従来の化学的手順を使用して市販の出発物質から調製することができる。特定のPEG分子は、20Kメトキシ-PEG-アミンNektar、以前はShearwater;RappPolymere;andSunBioから入手可能及びM-PEG-SPANektar、以前はShearwaterから入手可能を含む。本発明は、本明細書に記載する抗体分子をコードする単離DNAも提供する。さらなる態様では、前記DNAを含むベクターを提供する。それによってベクターを構築することができる一般的な方法、トランスフェクション法及び培養法は当業者によく知られている。この点に関しては、分子生物学における現代のプロトコールCurrentProtocolsinMolecularBiology、1999、F.M.Ausubeled、WileyInterscience、NewYork、及びColdSpringHarborPublishingによって作成されたManiatisManualを参照。さらなる態様では、前記ベクター及び/又はDNAを含む宿主細胞を提供する。任意の適切な宿主細胞/ベクター系を、本発明の分子をコードするDNA配列の発現に使用することができる。細菌、例えば大腸菌E.coli、及び他の微生物系を使用することができ、又は真核生物、例えば哺乳動物、宿主細胞発現系も使用することができる。適切な哺乳動物宿主細胞には、CHO、ミエローマ又はハイブリドーマ細胞がある。本発明は、本明細書に記載する抗体分子を生成するための方法であって、本発明の抗体分子をコードするDNAからタンパク質の発現をもたらすのに適した条件下で本発明のベクター及び/又はDNAを含有する宿主細胞を培養すること、及び抗体分子を単離することを含む方法も提供する。重鎖と軽鎖の両方を含む産物を生成するために、2つのベクター、軽鎖ポリペプチドをコードする第一のベクター及び重鎖ポリペプチドをコードする第二のベクターで細胞系をトランスフェクトすることができる。或いは、1つのベクター、軽鎖及び重鎖ポリペプチドをコードする配列を含むベクターを使用することができる。本開示による抗体分子は、それらを商業的処理に施すのに適切なレベルで宿主細胞から発現される。抗体は任意の標的抗原に対して特異的であってよい。抗原は、細胞結合タンパク質、例えば細菌細胞、酵母細胞、T細胞、内皮細胞又は腫瘍細胞などの細胞上の細胞表面タンパク質であってよく、又はそれは可溶性タンパク質であってよい。対象の抗原は、疾患又は感染中に上方制御されるタンパク質などの何らかの医学的関連があるタンパク質、例えば受容体及び/又はそれらの対応するリガンドであってもよい。細胞表面タンパク質の具体例には、接着性分子、例えばβ1インテグリンなどのインテグリン、例えばVLA-4、E-セレクチン、Pセレクチン又はL-セレクチン、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD11a、CD11b、CD18、CD19、CD20、CD23、CD25、CD33、CD38、CD40、CD40L、CD45、CDW52、CD69、CD134OX40、ICOS、BCMP7、CD137、CD27L、CDCP1、CSF1又はCSF1-受容体、DPCR1、DPCR1、ジュジュリン2、FLJ20584、FLJ40787、HEK2、KIAA0634、KIAA0659、KIAA1246、KIAA1455、LTBP2、LTK、MAL2、MRP2、ネクチン様2、NKCC1、PTK7、RAIG1、TCAM1、SC6、BCMP101、BCMP84、BCMP11、DTD、癌胎児性抗原CEA、ヒト乳脂肪グロブリンHMFG1及び2、MHCクラスI及びMHCクラスII抗原、KDR及びVEGF、PD-1、DC-SIGN、TL1A、DR3、IL-7受容体A、及び適切な場合、これらの受容体がある。可溶性抗原には、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12、IL-13、IL-14、IL-16、又はIL-17、例えばIL17A及び/又はIL17Fなどのインターロイキン、ウイルス抗原、例えば呼吸器合胞体ウイルス又はサイトメガロウイルス抗原、IgEなどの免疫グロブリン、インターフェロンα、インターフェロンβ若しくはインターフェロンγなどのインターフェロン、腫瘍壊死因子TNF以前は腫瘍壊死因子-αとして知られ、本明細書ではTNF又はTNFαと呼ぶ、腫瘍壊死因子-β、G-CSF又はGM-CSFなどのコロニー刺激因子、及びPDGF-α、及びPDGF-β、WISP-1などの血小板由来増殖因子、及び適切な場合、これらの受容体がある。他の抗原には、細菌細胞表面抗原、細菌毒素、インフルエンザ、EBV、HepA、B及びCなどのウイルス、バイオテロ物質、放射性核種及び重金属、並びにヘビ及びクモ毒及び毒素がある。一実施形態では、抗体を使用して対象の抗原の活性を機能的に改変することができる。例えば抗体は、直接的又は間接的に、前記抗原の活性を中和、アンタゴナイズ又はアゴナイズすることができる。本発明の抗体分子は、病状の治療及び/又は予防において有用である。したがって、例えば医薬製剤中にその治療有効量を投与することにより、治療において使用するための本発明による抗体を提供する。一実施形態では、本発明による抗体を、例えば吸引により肺に局所投与する。本発明により提供される抗体は、炎症疾患及び障害、免疫疾患及び障害、線維形成障害及び癌を含めた疾患又は障害の治療において有用である。用語炎症疾患又は障害及び免疫疾患又は障害には、慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎、スティル病、MuckleWells病、乾癬、クローン病、潰瘍性大腸炎、SLE全身性エリテマトーデス、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、血管炎、I型糖尿病、移植及び移植片対宿主病がある。用語線維形成障害は、突発性肺線維症IPF、全身性硬化症又は硬皮症、腎線維症、糖尿病性ネフロパシー、IgAネフロパシー、高血圧、末期腎疾患、腹膜線維症持続的外来腹膜透析、肝硬変、加齢黄斑変性ARMD、網膜症、反応性心筋線維化、瘢痕、ケロイド、火傷、皮膚潰瘍、血管形成術、冠動脈バイパス手術、関節形成術及び白内障手術を含む。用語癌は、皮膚又は、より一般的には、身体器官、例えば乳房、卵巣、前立腺、肺、腎臓、膵臓、胃、膀胱又は腸の内膜中で見られる、上皮から生じる悪性の新たな増殖を含む。癌は隣接組織に浸潤し、遠位器官、例えば骨、肝臓、肺又は脳に拡散転移する傾向がある。本発明は、1つ又は複数の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体と組合せて、本発明の抗体を含む医薬又は診断組成物も提供する。したがって、医薬品を製造するための、本発明の抗体の使用を提供する。通常組成物は、薬学的に許容される担体を通常含む滅菌医薬組成物の一部として供給される。本発明の医薬組成物は、薬学的に許容されるアジュバントを追加的に含むことができる。本発明は、1つ又は複数の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体と一緒に本発明の抗体を添加し混合することを含む、医薬又は診断組成物を調製するための方法も提供する。本開示の抗体は医薬若しくは診断組成物中の唯一の活性成分であってよく、又は他の抗体成分、例えば抗TNF、抗IL-1β、抗T細胞、抗IFNγ若しくは抗LPS抗体、又はキサンチンなどの非抗体成分を含めた他の活性成分を伴ってよい。他の適切な活性成分には、耐性を誘導することができる抗体、例えば抗CD3又は抗CD4抗体がある。さらなる実施形態では、本開示による抗体又は組成物は、さらなる薬学的活性物質、例えばコルチコステロイドフルチカゾンプロピオネートなど及び/又はβ-2-アゴニストサルブタモール、サルメテロール又はフォルモテロールなど、又は細胞の成長及び増殖の阻害剤ラパマイシン、シクロホスファミド、メトトレキサートなど、又は別のCD28及び/又はCD40阻害剤と組合せて利用する。一実施形態では、阻害剤は小分子である。別の実施形態では、阻害剤は標的に特異的な抗体である。医薬組成物は、治療有効量の本発明の抗体を適切に含む。本明細書で使用する用語治療有効量は、標的疾患若しくは状態を治療、改善若しくは予防するのに必要な、又は検出可能な治療若しくは予防効果を示す治療剤の量を指す。細胞培養アッセイ又は動物モデルのいずれかにおいて、通常げっ歯類、ウサギ、イヌ、ブタ又は霊長類において、治療有効量を最初に推定することができる。動物モデルを使用して、適切な濃度範囲及び投与の経路を決定することもできる。したがって、このような情報を使用して、ヒトにおいて有用な用量及び投与経路を決定することができる。ヒト対象に関する正確な治療有効量は、疾患状態の重度、対象の一般的な健康状態、対象の年齢、体重及び性別、食生活、投与の時間及び頻度、薬剤の組合せ単数又は複数、療法に対する反応感度及び耐性/応答に依存する。この量は通常の実験によって決定することができ、臨床医の判断の範囲内にある。一般に、治療有効量は0.01mg/kg~50mg/kg、例えば0.1mg/kg~20mg/kgである。医薬組成物は、用量当たり所定量の本発明の活性剤を含有する単位剤形で、好都合に存在することができる。組成物は患者に個別に投与することができ、又は他の作用物質、薬剤若しくはホルモンと併用して例えば同時、逐次若しくは別々に投与することができる。本発明の抗体を投与する用量は、治療する状態の性質、例えば存在する疾患/炎症の程度、及び分子を予防的に使用するか又は既存の疾患を治療するために使用するかに依存する。投与の頻度は、抗体の半減期及びその影響期間に依存する。抗体が短い半減期例えば、2~10時間を有する場合、一日当たり一回又は複数回の投与を与えることが必要であり得る。或いは、抗体が長い半減期例えば、2~15日間を有する場合、一日当たり一回、一週間当たり一回、又はさらに1ヶ月若しくは2ヶ月毎に一回のみ投与を与えることが必要であり得る。薬学的に許容される担体自体は、組成物を与える個体に有害な抗体の生成を誘導することはないはずであり、毒性であってはならない。適切な担体は、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー及び不活性ウイルス粒子などの、高分子の、ゆっくり代謝されるマクロ分子であってよい。薬学的に許容される塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩及び硫酸塩などの無機酸塩、又は酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩及び安息香酸塩などの有機酸塩を使用することができる。治療用組成物中の薬学的に許容される担体は、水、生理食塩水、グリセロール及びエタノールなどの液体を追加的に含有することができる。追加的に、湿潤剤若しくは乳化剤若しくはpH緩衝物質などの補助物質が、このような組成物中に存在してよい。このような担体は、患者により摂取される、錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー及び縣濁液として医薬組成物を製剤化するのを可能にする。投与に適した形には、非経口投与に適した形、例えば注射又は注入による投与、例えばボーラス注射又は連続注入による投与がある。製品が注射又は注入用である場合、それは油性又は水性媒体中の縣濁液、溶液又はエマルジョンの形をとってよく、それは縣濁剤、防腐剤、安定剤及び/又は分散剤などの調節物質を含有することができる。或いは、本開示の分子は、適切な滅菌液で使用前に元に戻すための乾燥形であってよい。製剤化後、本発明の組成物は対象に直接投与することができる。治療する対象は動物であってよい。しかしながら、1つ又は複数の実施形態では、ヒト対象への投与に組成物を適合させる。本開示による製剤において、最終製剤のpHが抗体の等電点の値と類似していないことが適切である。例えば製剤のpHが7である場合、したがって8~9以上のpIが適切であり得る。理論によって束縛されることは望まないが、これは改善された安定性を有する最終製剤を最終的にもたらす可能性があり、例えば抗体が溶液中に残存すると考えられる。本発明の医薬組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、くも膜下内、心室内、経真皮、経皮例えば、WO98/20734参照、皮下、腹膜内、鼻腔内、腸溶性、局所、舌下、膣内又は直腸経路だけには限られないが、これらを含めた任意の数の経路によって投与することができる。皮下スプレーを使用して、本発明の医薬組成物を投与することもできる。典型的には、治療用組成物は注射可能な物質として、液体溶液又は縣濁液のいずれかとして調製することができる。注射前に液体媒体中の溶液又は縣濁液に適した固体形も調製することができる。組成物の直接送達は一般に皮下、腹膜内、静脈内又は筋肉内注射によって実施することができ、又は組織の間質空間に送達することができる。組成物は病変に投与することもできる。投与治療は、一回投与スケジュール又は複数回投与スケジュールであってよい。組成物中の活性成分は抗体であろうことは理解されよう。このように、それは胃腸管中で分解を受けやすい。したがって、胃腸管を使用した経路によって組成物を投与する場合、組成物は分解から抗体を保護するが、胃腸管から吸収された後に抗体を放出する作用物質を含有する必要がある。薬学的に許容される担体の徹底的な考察は、Remington’sPharmaceuticalSciencesMackPublishingCompany、N.J.1991において入手可能である。一実施形態では、吸引を含めた局所投与用の製剤として製剤を提供する。適切で吸引可能な調製物には、吸引可能な粉末、プロペラントガスを含有する調節エアロゾル、又はプロペラントガスを含まない吸引可能な溶液がある。活性物質を含有する本開示による吸引可能な粉末は前述の活性物質のみから、又は前述の活性物質と生理的に許容される賦形剤の混合物からなる可能性がある。これらの吸引可能な粉末は、単糖例えば、グルコース又はアラビノース、二糖例えば、ラクトース、サッカロース、マルトース、オリゴ-及び多糖例えば、デキストラン、ポリアルコール例えば、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、塩例えば、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム又はこれらの互いの混合物を含むことができる。単糖又は二糖の使用、特にラクトース又はグルコースの使用が適切であるが、ただしそれらの水和物の形のみではない。肺中に沈着する粒子は、10ミクロン未満、1~9ミクロンなど、例えば0.1~5μm、特に1~5μmの粒径を必要とする。活性成分抗体などの粒径が最も重要である。吸引可能なエアロゾルを調製するために使用することができるプロペラントガスは、当技術分野で知られている。適切なプロペラントガスは、n-プロパン、n-ブタン又はイソブタンなどの炭化水素、及びメタン、エタン、プロパン、ブタン、シクロプロパン若しくはシクロブタンの塩素化誘導体及び/又はフッ素化誘導体などのハロ炭化水素中から選択される。前述のプロペラントガスは単独で、又はそれらの混合物で使用することができる。特に適切なプロペラントガスは、TG11、TG12、TG134a及びTG227中から選択されるハロゲン化アルカン誘導体である。前述のハロゲン化炭化水素の中では、TG134a1,1,1,2-テトラフルオロエタン及びTG2271,1,1,2,3,3,3-ヘプタフルオロプロパン及びこれらの混合物が特に適している。プロペラントガスを含有する吸引可能なエアロゾルは、共溶媒、安定剤、表面活性物質界面活性剤、抗酸化剤、潤滑剤、及びpHを調節するための手段などの、他の成分も含有し得る。全てのこれらの成分は当技術分野で知られている。本発明によるプロペラントガスを含有する吸引可能なエアロゾルは、最大5重量の活性物質を含有し得る。本発明によるエアロゾルは、例えば0.002~5重量、0.01~3重量、0.015~2重量、0.1~2重量、0.5~2重量、又は0.5~1重量の活性成分を含有する。或いは、肺への局所投与は、例えばネブライザー、例えばコンプレッサーと接続したネブライザー例えば、PariRespiratoryEquipment、Inc.、Richmond、Vaによって製造されたPariMasterRコンプレッサーと接続したPariLC-JetPlusRネブライザーなどのデバイスを利用した、液体溶液又は縣濁液製剤の投与による投与であってもよい。本発明の抗体は、溶媒中に分散させて、例えば溶液又は縣濁液の形で送達することができる。本発明の抗体は、適切な生理溶液、例えば、生理食塩水又は他の薬理的に許容される溶媒又は緩衝溶液中に縣濁することができる。当技術分野で知られる緩衝溶液は、約4.0~5.0のpHを得るために、水1mL当たり0.05mg~0.15mgのエデト酸二ナトリウム、8.0mg~9.0mgのNaCl、0.15mg~0.25mgのポリソルベート、0.25mg~0.30mgの無水クエン酸、及び0.45mg~0.55mgのクエン酸ナトリウムを含有することができる。縣濁物質、例えば凍結乾燥分子を利用することができる。治療用縣濁液又は溶液製剤は、1つ又は複数の賦形剤も含有し得る。賦形剤は当技術分野でよく知られており、バッファー例えば、クエン酸バッファー、リン酸バッファー、酢酸バッファー及び重炭酸塩バッファー、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質例えば、血清アルブミン、EDTA、塩化ナトリウム、リポソーム、マンニトール、ソルビトール、及びグリセロールを含む。溶液又は縣濁液は、リポソーム又は生分解性ミクロスフェア中に封入することができる。一般に製剤は、滅菌製造プロセスを利用して実質的に滅菌状態の形で提供される。これは、当業者が精通している方法による、製剤に使用する緩衝溶媒/溶液、滅菌緩衝溶媒溶液中の分子の無菌縣濁液の濾過、及び滅菌容器中への製剤の分散による、生成及び滅菌を含むことができる。本開示による噴霧可能な製剤は、例えば、ホイルエンベロープに包まれた一回用量単位例えば、密閉プラスチック容器又はバイアルとして提供することができる。それぞれのバイアルは、体積、例えば2mLの溶媒/溶液バッファー中に単位用量を含有する。本開示の抗体は、噴霧による送達に特に適していると考えられる。本明細書の文脈における含むcomprisingは、含むことincludingを意味するものとする。技術的に適切である場合、本発明の実施形態は組合せることができる。本発明はここで以下の実施例を参照しながら記載し、これらの実施例は単なる例示的なものであり、決して本発明の範囲を制限するとして解釈すべきではない。1.IgG4重鎖の突然変異誘発及び突然変異型IgG4重鎖一遺伝子ベクターの作製アミノ酸の突然変異を、Quickchange登録商標LighteningMultiSiteDirectedMutagenesisSDMキット又はQuickchange登録商標IIDSMキットStratagene登録商標から入手それぞれカタログ番号210516及び200521を使用して実施し、製造者の説明書に従い実施した。突然変異はDNA配列決定によって確認した。以下の表中の少なくとも抗体1~47のIgG4重鎖を生成した:抗体48の重鎖配列番号35をPCR及び制限酵素クローニングによって作製した。PCR産物は、IgG1上部及びコアヒンジ領域配列及び制限部位BglIIをコードするフォワードオリゴ、並びに制限酵素DraIIIをコードするリバースオリゴによって作製した。次いでPCR断片を前述の酵素で消化し、適切な可変領域を含有するhG4一遺伝子ベクターに連結させた。2.突然変異型IgG4抗体の発現全ての突然変異DNAをCHOK1細胞又はCHO-SXE細胞にトランスフェクトした。細胞2×108個の細胞/mlは1mlのアール平衡塩類溶液Sigma中に再縣濁し、400μgのDNA200μgの重鎖DNA及び200μgのkappa軽鎖DNAと混合した。800μlのアリコートを0.4cmのキュベットBioradに移した。500mlの培養用に、6つのキュベットを以下のパラメーターの下でエレクトロポレーション処理した。1ms、9.6Amps、10ms、0Amps、40ms、3.2Amps。トランスフェクトした細胞は、37oCで5CO2湿度環境において140rpmで攪拌しながら24時間インキュベートし、10~13日間32oCでトランスフェクション後第2日から続けた。トランスフェクション後第4日に、1.6mlの1M酪酸ナトリウムを培養物に加えた。細胞が40の生存率に達した後、又は第13日までに、上清を採取した。培養物は4000rpmで45分間遠心分離した。上清は0.22μMのStericupフィルターMilliporeに通して精製した。図28中のデータは、操作型突然変異体によってコードされるIgG4の耐熱性の変化は、CHO-K1又はCHO-SXE細胞の一方からタンパク質が生成されたときと同じであったことを示す。3.突然変異型IgG4抗体の精製上清200~500mlを、プロテインA5mlHiTrapMabSelectSuReカラムGEHealthcare、AmershamUKを使用して精製した。2Mトリス-HClpH8.5の上清体積の50分の1を加えることによりサンプルを調製した。サンプルは1ml/分でカラムに充填した。カラムはPBSpH7.4で洗浄した。サンプルを溶出するため、0.1Mクエン酸ナトリウム、pH3.4を1ml/分でカラムに通し、0.5ml分画を回収した。0.125mlの2Mトリス-HClpH8.5をそれぞれに加えることにより、ピーク分画を中和した。UV検出は280nmで設定した。例4.精製した突然変異型IgG4抗体の特徴付けSDSPAGE解析:粗製上清を1200rpmで5分間遠心分離し、OCTETで定量化した。適量の抗体、4×ローディングバッファーInvitrogen及び2μlの100mMNEMを加えることにより、抗体サンプル25~30ngを調製した。dH2Oを使用して20μlの合計体積を作製した。次いでサンプルを100°Cで3分間煮沸し、15ウエル1.5mmの4~20トリス-グリシンゲル上に載せた。1×タンクバッファー中で1.5時間150Vをゲルに施した。8分間の移動に設定したiBlot乾燥移動システムを使用して、抗体をニトロセルロース膜に移した。膜は攪拌プラットフォームでPBS-TMにおいて室温RTで1時間インキュベートし、次に室温で攪拌しながら1時間、ウサギ抗ヒトIgGFcHRP結合抗体JacksonImmunoresearch又はヤギ抗ヒトKappa軽鎖HRP結合抗体Bethylとインキュベートした。これに、それぞれPBS-Tで5分間3回の洗浄を続けた。製造者の説明書に従いPierce金属増感型DAB基質キットを使用して、ブロットを解明した。ウエスタンブロット解析の結果を図7、8、9及び10中に示す。図7~10中、Hは重鎖を表し、Lは軽鎖を表し、H2L2は2重鎖及び2軽鎖を含む完全抗体分子であり、HLは1重鎖及び1軽鎖を含む半分子である。図7は、抗体15、16、6、7、8、17、18、19、1、2、3、12及び13に関するウエスタンブロット解析を示す。ヒンジ突然変異体C239SとC242Sの両方の存在のためH2L2を全く又はほとんど示さない抗体8以外、抗体が優れたレベルのH2L2を示すことを図7から見ることができる。しかしながら、抗体8は重鎖間の非共有結合によりH2L2を形成することができる。突然変異体3もH2L2をほとんど示さず、この突然変異体はC239を保持するが、おそらくC末端軽鎖LCシステインとヒンジC239の間の効率よいジスルフィド形成のため、ヒンジ中で鎖間ジスルフィド結合を形成することはできない。突然変異体C239Sを含むがC242Sは含まない抗体抗体2、6及び12は、C239SもC242Sも含まない抗体又はC242Sを含むがC239Sは含まない抗体と比較して、HLの形成の低減を示すことを見ることもできる。S241P突然変異体を含む抗体16もHLの形成の低減を示す。突然変異体2と3の比較は重鎖とジスルフィド結合を形成する軽鎖のC末端システインの到達の程度を示し、軽鎖システインは、重鎖中のC242よりC239と効率よく結合するようである。図8は、抗体15、6、7、8、28、29、30、31、17、19、32、33、33、34、35、36、37、38及び39に関するウエスタンブロット解析を示す。ヒンジ領域中の突然変異体C239SとC242Sの存在のためH2L2を全く又はほとんど示さない抗体8、31、35及び39以外、抗体が優れたレベルのH2L2を示し、したがって2重鎖間でジスルフィド結合が形成されないことを図8から見ることができる。しかしながら、抗体8、31、35及び39は重鎖間の非共有結合によりH2L2を形成することができる。突然変異体C239Sを含むがC242Sは含まない抗体抗体6、29、33及び37は、C239SもC242Sも含まない抗体又はC242Sを含むがC239Sは含まない抗体と比較して、HLの形成の低減を示すことを見ることもできる。突然変異体15は、CH1及び重鎖間ジスルフィドにおいて軽鎖とG230Cの間でジスルフィド結合を形成することができ、したがって完全構築及びジスルフィド結合タンパク質をもたらす。さらに、突然変異体15C127SG230C、28C127SY229C、32C127SK228C及び36C127SS227Cの比較は、上部ヒンジ中に導入するシステインの位置によって、LC-HC間のジスルフィド結合形成が改善することを示す。G230及びY229は、システインを導入するのに特に好ましい位置である。突然変異体28C127SY229Cは低レベルのHL及びH2を示し、したがって低いジスルフィド結合不均一性を有する。図9は、抗体15、6、7、8、44、45、46、47、17及び19に関するウエスタンブロット解析を示す。ヒンジ領域中の突然変異体C239SとC242Sの存在のためH2L2を全く又はほとんど示さない抗体8及び47以外、抗体が優れたレベルのH2L2を示し、したがって2重鎖間でジスルフィド結合が形成されないことを図9から見ることができる。しかしながら、抗体8及び47は重鎖間の非共有結合によりH2L2を形成することができる。突然変異体C239Sを含むがC242Sは含まない抗体抗体6及び45は、C239SもC242Sも含まない抗体又はC242Sを含むがC239Sは含まない抗体と比較して、HLの形成の低減を示すことを見ることもできる。特に突然変異体44は、上部ヒンジ中の3アミノ酸の挿入もHL及びH2の形成を減らすことができ、したがって比較可能な突然変異体15より低レベルのジスルフィド不均一性を有することを示す。図10は、抗体48、17、18及び19に関するウエスタンブロット解析を示す。抗体48が優れたレベルのH2L2を示しHLはほとんど示さないことを、図10から見ることができる。突然変異体48は、IgG4上部ヒンジ配列の代わりに、コアヒンジS241P突然変異と共にIgG1上部ヒンジ配列EPKSCDKTHTを含有する。したがって突然変異体48は、上部及びコアヒンジ配列EPKSCDKTHTCPPCPを有する。突然変異体48は、野生型IgG4抗体17と比較して低レベルのジスルフィド結合不均一性、並びにIgG4S241P突然変異体18及び野生型IgG1抗体19と比較してほぼ等しい低レベルのジスルフィド結合不均一性を示す。Thermofluorアッセイ:SYPRO登録商標Orangeを使用しthermofluorアッセイにおいて、精製モノクローナル抗体の耐熱性を解析し、タンパク質の熱アンフォールディング過程をモニタリングした。5μlのモノクローナル抗体、1mg/ml、5μlの30xdye、及び40μlのPBSを一緒に加えた。10μlの混合物を384PCR光学ウエルプレートに四連で分配し、7900HTFastリアルタイムPCRシステムAgilentTechnologiesUKLtd、WokinghamUKに施した。このPCRシステムは、20°C~99°Cに設定した正確な温度調節のための加熱用デバイスを含有し、電荷結合素子はウエル中の蛍光変化を同時にモニタリングする。図11、12、13、14及び15は、野生型IgG1及びIgG4抗体と比較した、IgG4抗体突然変異体の耐熱性分析の結果を示す。野生型IgG4突然変異体17と突然変異体15の比較は、改変されたジスルフィド配置のためFabTmの増大を示す。突然変異体15と28の比較は、G230C突然変異を含む突然変異体15と比較して、Y229C突然変異を含む突然変異体28に関するFabTmのさらなる改善を示す。突然変異体15と44の比較は、G230C突然変異体のFabTmは、上部ヒンジ中に3アミノ酸をさらに挿入することによって、さらに増大することができることを示す。突然変異体17と18の比較は、S241P中央ヒンジ突然変異によって、それはHL形成を有意に減らすが、FabTmが増大することはないことを示す。突然変異体48も、野生型IgG4突然変異体17と突然変異体15の両方と比較して、有意に改善されたFabTmを示す。図15は、本発明による選択IgG4突然変異体の耐熱性の全体順位を示す。突然変異体48、44、44P、46、45、6、29、30、28、28P、31、8、47及び15は全て、野生型IgG4突然変異体17及び野生型IgG4S241P突然変異体18と比較して、有意に高いFabTm値を示す。抗体の親和性:標的可溶性サイトカインに対して選択した本発明の突然変異IgG4抗体の親和性を、Biacore商標によって測定した。アッセイ形式は、抗Fc表面上のIgGの捕捉、次に可溶性サイトカインの滴定であった。これらの結果は図16中に示し、この場合、突然変異抗体が、対照のIgG1及びIgG4野生型抗体と比較して、可溶性サイトカインに匹敵する親和性を示したことを見ることができる。用語kds-1は、抗体-抗原相互作用の解離速度定数を指す。前記値はkoff値とも呼ばれる。本明細書で使用する用語kaM-1s-1は、抗体-抗原相互作用の結合速度定数を指す。本明細書で使用する用語KDM又はKDpMは、抗体-抗原相互作用の解離平衡定数を指す。サイズ排除SECHPLC分析:約50ugの精製抗体を、S200カラムを使用してHPLCに施した。抗体1~19を分析に使用した。この結果は、ヒトIgG4分子のDSB配置に対する改変にもかかわらず、非共有結合H2L2が形成されることを示す。HPLC分析の結果は図17中に示す。他の上部ヒンジスペーサーの長さ1~5アミノ酸長のポリ-アラニンスペーサーを、PPとCPSPの間、即ち^によって示す位置、ESKYCPP^CPSPAに挿入した。図18は、任意の長さのスペーサーの挿入は、突然変異体15におけるH2又はL2形成の量を減らすのに十分であることを示す。しかしながら、3アミノ酸以上の挿入長は耐熱性の最大の増大をもたらすようであった。3アミノ酸挿入が、IgG1とIgG4の間の上部ヒンジ長の違いに最も酷似していることに留意されたい。他の上部ヒンジスペーサーのアミノ酸組成ESKYCPP^CPSPAにおける3アラニン挿入に特別な性質があったかどうか調べるため、上部ヒンジスペーサーとして、2つの他の3アミノ酸挿入、GGG及びTHTを試験した。図19は、GGGとTHTの両方がスペーサー領域として機能的であったことを示すが、結果はそれらが同一ではなかったことを示唆した。GGGは、AAA又はTHTよりH2及びL2形成を減らす能力が低いようであった。GGG及びTHTに関する耐熱性の増大は、AAAに関して観察した増大ほど大きくなかった。他の上部ヒンジスペーサーのアミノ酸長及び組成IgG4はCH1鎖間システインと第一のコアヒンジシステインの間に2アミノ酸PPスペーサーを有し、一方IgG1は5アミノ酸DKTHTスペーサーを有する。4個の突然変異体68、67、66及び56を構築して突然変異体15ESKYCPPCPSCPとの比較を可能にした。最初に、IgG4のPPスペーサーをIgG1において見られる等しい長さのDKスペーサーで置換し、突然変異体68ESKYCDKCPSCP、次いでアミノ酸を1個増やしてIgG1上部ヒンジスペーサーを模倣した:突然変異体67ESKYCDKTCPSCP突然変異体66ESKYCDKTHCPSCP突然変異体56ESKYCDKTHTCPSCP。図21中のデータは、1つの最も重要な変化は、突然変異体15と比較してH2、H及びL形成の低減をもたらしたPPからDKへの変化であることを示唆する。スペーサー挿入T、TH及びTHTのような追加的IgG1の長さの増大はH2の最小の漸増的低減に影響を与えたようであるが、HL形成の追加的漸増をもたらした可能性がある。突然変異体68、67、66及び56はCPSCコアヒンジ配列を含有するので、HL形成の増大は、分子内ジスルフィド結合を形成する傾向をそれ故有するコアヒンジシステインからのLC-HC鎖間ジスルフィド結合システインの単離において、スペーサーがより有効である証拠となり得る。図22中のデータは、突然変異体15ESKYCPPCPSCP及び68ESKYCDKCPSCP及び突然変異体55ESKYCPPTHTCPSCP及び56ESKYCDKTHTCPSCPと比較して、ジスルフィドアイソフォーム不均一性を低減する点で2アミノ酸スペーサーの選択肢として、DKはPPより好ましいことを示唆する。PPなどの短いポリ-プロリンモチーフは一定レベルのヘリックスターンポテンシャルをコード可能であることが知られており、これはLC-HCとコアヒンジシステインの局所隣接をもたらす可能性がある。この局所的影響は、突然変異体44ESKYCPPAAACPSCPにおいて見られたように追加的AAAによって十分克服されるようである。突然変異体68、55、56、44又は69はいずれも、有意に異なる耐熱性を有していないようであった。非スペーサー上部ヒンジ配列組成の影響LC-HC間CH1システインの上部ヒンジ配列N末端の配列組成の影響を理解するためにIgG4中のESKY及びIgG1中のEPKS、突然変異体の全ての置換は突然変異体15ESKYCPPCPSCPの状況で行った。図23中のデータは、PPスペーサーの状況では、上部ヒンジ組成の置換はいずれも、ジスルフィドアイソフォーム不均一性に有意に影響を与えないようであったことを示す。前に示したデータは、この影響の欠如は主に、分子内ジスルフィド結合形成を可能にする短いPPスペーサー及びコアヒンジモチーフを、タンパク質が含有することが原因であることを示唆する。しかしながら、耐熱性の有意な違いを観察した。自然に進化した配列;ESKP83.8°CとEPKS80.6°Cの両方は、ハイブリッド配列;EPKY76.3°CとEPKS79.0°Cのいずれか一方より安定していた。このデータは、IgG1EPKS配列が最も好ましいことを示す。より好ましいDKTHTスペーサー領域の状況でESKY又はEPKS上部ヒンジモチーフの重要性を理解するために、全ての置換を実施した。図24中のデータは、天然IgG4ESKYモチーフ突然変異体56ESKYCDKTHTCPSCPが、ジスルフィドアイソフォーム不均一性の影響を最も受けやすいことを示す。図24中のデータによって、天然IgG1上部ヒンジ配列突然変異体65EPKSCDKTHTCPSCPはジスルフィドアイソフォーム不均一性に関して最小の可能性を有し、高い耐熱性を有することを確認する。コアヒンジSerからProへの交換の影響最も好ましい突然変異体48EPKSCDKTHTCPPCPを突然変異させて、天然IgG4コアヒンジSerKabatのナンバリングによりSer241を再導入し、突然変異体65EPKSCDKTHTCPSCPを生成した。図20中のデータによって、突然変異体48が、突然変異体15ESKYCPPCPSCPと比較して非常に有意に低減したレベルのH2、HL、H及びL、及び非常に有意に増大した耐熱性を有することを確認する。コアヒンジSer241の再導入突然変異体65は突然変異体48と比較して耐熱性に影響を与えることはなかったが、有意なレベルのHLの再出現をもたらした。突然変異体65は突然変異体15より少量のH2、H及びLを依然有しており、ジスルフィドアイソフォーム均一性に関する上部ヒンジ配列の長さ及び組成の重要性を示すことに留意されたい。細胞溶解による抗体エフェクター機能アッセイ細胞表面抗原を発現する標的細胞は、蛍光増大リガンドBADTAとのインキュベーションにより標識した、その細胞内含有物を有していた。BADTAは細胞内で親水性リガンド、TDAに変換される。標識細胞は、抗体及びPBMC末梢血単核細胞及び溶解剤とインキュベートする。細胞溶解時に、ユーロピウムを細胞培養物に加えると、この実施例ではADCCにより、TDAが放出され蛍光で安定したキレートEuTDAを形成する。本質的に、細胞含有物のBADTA標識は細胞溶解の定量化を可能にする。したがって細胞溶解は、IgGにおけるエフェクター機能の存在の指標となる。図25及び26では、ADCCによる細胞及びIgG4の溶解を試みる。IgG1野生型とIgG4野生型の両方に関して、ヘルセプチン抗体のアナログトラスツズマブを作製した。ヘルセプチンのHer-2抗原はMCF7及びSKBR3細胞上で発現される。IgGヘルセプチンアナログの突然変異体も作製し、ADCCアッセイ中で使用するためIgGを精製した。対照IgG1野生型wtとIgG4野生型wtの間の違いにより確認されるように、IgG4はADCCを実施する非常に低い能力を有することが知られている。先天的ADCC能力のこの欠如は、試験した4つのIgG4突然変異体の如何なる1つによっても影響を受けることはなかった。特にこれらは、改変された鎖間LC-HCジスルフィド結合配置を有する突然変異体28、44及び48、及び最も顕著にはIgG1上部及びコアヒンジモチーフを含有する突然変異体48EPKSCDKTHTCPPCPを含む。したがってこれらのデータは、IgG1上部及びコアヒンジ配列の使用により、記載する突然変異体はエフェクター機能を得られないことを示す。IgG4抗体に対する突然変異体の広範囲の適用例。これまで記載したすべてのデータは、具体的なUCB所有のIgG4抗体、抗体410に関するものである。ジスルフィドアイソフォーム均一性及び耐熱性の改善が、このIgGの可変領域コード構造/安定性に特有でなかったことを実証するために、幾つかの型の他のIgG4を作製した。公に入手可能な配列情報を使用して、3個の工業的関連があるIgGのIgG4アナログ、トラスツズマブヘルセプチン、ナタリズマブタイサブリ及びトシリズマブアクテムラを作製した。集合的に、図28~33中に示すデータは、IgG4の主要突然変異体の相対的性能は、ジスルフィドアイソフォーム均一性と相対的耐熱性の両方の点で、全てのIgG4型において非常に類似していることを示す。それぞれの型の絶対的安定性は、IgGの異なる独自の安定性に関して以前に公開された観察結果から予想されるように互いに異なる。これらのデータは、記載する突然変異体は、すべてのIgG4分子において、ジスルフィドアイソフォーム均一性を改善し、耐熱性を増大することができることを示唆する。実用的考察に関するIgG4突然変異体の影響:発現及び宿主細胞記載する突然変異体は、IgG4分子の範囲内で、ジスルフィドアイソフォーム均一性を改善し耐熱性を増大している。図27中のデータは、これらの突然変異体はIgG4発現にマイナスの影響を与えないことを示す。示した発現データは、記載する4抗原特異性の各々、Ab410、並びにトラスツズマブ、ナタリズマブ及びトシリズマブのアナログに関するCHO細胞から一時的に発現された各突然変異体に関する平均的な発現である。これらのデータは、Fabアーム鎖間ジスルフィド構造並びに上部及びコアヒンジ配列は、CHO細胞からの収率の主要決定要因ではないことを示唆する。図31中のデータは、突然変異体がCHO-K1細胞中又はCHO-SXE細胞中で発現されようと、Ab410の耐熱性は同じであることを示す。これらのデータは、IgGFabアーム鎖間ジスルフィド構造並びに上部及びコアヒンジ配列に対する突然変異が、改善された耐熱性の主要決定要因であることを支持する。"