a複数の異なる核酸分子を提供するステップ、b前記核酸分子の3’末端および5’末端にアダプター配列を付加するステップ、c水滴の大部分が前記複数の異なる核酸分子の1つを含むまたはまったく含まないことを特徴とする油中水型エマルションを調製するステップ、およびd前記複数の異なる核酸分子をクローン的に増幅するステップ、を含む、核酸のクローン前増幅のための方法。前記異なる核酸分子が一本鎖分子、好ましくはRNA分子、より好ましくはポリアデニル化RNA分子、最も好ましくはmRNA分子であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。b1前記複数の異なる核酸分子に第一の一本鎖アダプター分子をハイブリダイズさせるステップ、ここで該アダプター分子は、‐プライマー結合部位に相当する5’末端部、および‐少なくとも5ヌクレオチド長のオリゴdT配列、少なくとも5ヌクレオチド長の基本的にランダム化された配列、または遺伝子もしくは遺伝子ファミリー特異的配列のいずれかである3’末端部を含み、b2一本鎖cDNAのプールを作製するために、RNA依存性DNAポリメラーゼおよびdNTP混合物の存在下で第一鎖cDNA合成を行うステップ、およびb3該一本鎖cDNAのプールに第二の一本鎖アダプター分子を付加するステップ、を含む、請求項2に記載の方法。ステップb3が、b3iホモポリマー突出部を作るために、1つの特定のdNTPの存在下でターミナルトランスフェラーゼ反応を行うステップ、b3ii前記一本鎖cDNAのプールに第二の一本鎖アダプター分子をハイブリダイズさせるステップ、ここで該第二の一本鎖アダプター分子は更に、‐前記第一の一本鎖アダプター分子の5’末端部と同一のまたは異なる、プライマー結合部位に相当する5’末端部、および‐ステップb3iで作られた前記ホモポリマー突出部に相補的な、ホモポリマーヌクレオチド残基の3’末端部を含む、を含む、請求項3に記載の方法。‐前記複数の異なる核酸分子がmRNA分子であり、‐前記第一の一本鎖アダプター分子の3’末端部が、少なくとも5ヌクレオチド長のオリゴdT配列を含み、‐ステップb3iにおける前記特定のdNTPがdATPである、ことを特徴とする、請求項4に記載の方法。ステップb2とb3iとの間またはステップb3iの間のいずれかに、RNAseHとのインキュベーションによって前記mRNA分子を消化するステップを更に含む、請求項5に記載の方法。ステップb2とb3iとの間に、アルカリホスファターゼとのインキュベーションによって前記dNTP混合物を分解するステップを更に含む、請求項5または6に記載の方法。ステップb2とステップb3iとの間に、好ましくはDNAエキソヌクレアーゼIである3’5’エキソヌクレアーゼとのインキュベーションによって前記第一の一本鎖アダプター分子を分解するステップを更に含む、請求項5~7のいずれか1項に記載の方法。更に、e前記エマルションを破壊するステップ、およびf前記クローン的に増幅された複数の異なる核酸分子を配列決定するステップ、を含む、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。更に、e前記エマルションを破壊するステップ、およびfリアルタイムPCR反応を行うステップ、を含む、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。更に、e前記エマルションを破壊するステップ、およびfDNAマイクロアレイ解析を行うステップ、を含む、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。前記複数の異なる核酸分子が、100細胞未満、好ましくは10細胞未満、最も好ましくは1細胞に由来する、請求項1~11のいずれか1項に記載の方法。‐第一の一本鎖アダプター分子、ここで、該分子は‐プライマー結合部位に相当する5’末端部、および‐少なくとも5ヌクレオチド長のオリゴdT配列、少なくとも5ヌクレオチド長の基本的にランダム化された配列、または遺伝子もしくは遺伝子ファミリー特異的配列のいずれかである3’末端部を含む、‐一本鎖cDNAのプールに対する第二の一本鎖アダプター分子、ここで、該第二の一本鎖アダプター分子は、‐第一の一本鎖アダプター分子の5’末端部と同一のまたは異なる、プライマー結合部位に相当する5’末端部、および‐ホモポリマーヌクレオチド残基の3’末端部を含む、を含むキット。更に、少なくともターミナルトランスフェラーゼ、ならびに任意選択で逆転写酵素および/または耐熱性DNAポリメラーゼを含む、請求項13に記載のキット。更に、前記第一の一本鎖アダプター分子の3’末端部が少なくとも5ヌクレオチド長のオリゴdT配列を含むことを特徴とする、請求項13または14に記載のキット。本発明は、標的核酸配列を増幅するすなわち、多数のコピーを作り出すための方法、組成物およびキットを提供する。核酸解析は、病原体の検出および同定、規定の表現型につながる遺伝子変化の検出、遺伝性疾患または疾患に対する感受性の診断、発生、疾患および規定の刺激への応答における遺伝子発現の評価、ならびに様々なゲノム解析計画に有用であるため、この技術は幅広い適用性を有する。本発明の主要な概念は、NAライブラリー調製手順と、単一または多くとも2~3個の標的核酸分子が区画化されている状態でのそれらのライブラリーの増幅との組合せである。区画化は、油中水型エマルションの水滴中で行われる。それによって、鋳型核酸分子はエマルションの微小な水滴中に隔離され、単独でPCRにより増幅される。水滴が少量であるため、増幅の効率に重大な影響を及ぼす初期の鋳型濃度が上昇し、単一分子でも増幅を可能にするNakanoMら、JBiosciBioeng99293295。概略図を図1に示す。全トランスクリプトームRNAの増幅に適用される場合の主要な概念の概略図は図2に示す。最初に、RNAトランスクリプトームは、特定の3’末端および共通の5’末端からなるアンカープライマーの存在下で、逆転写酵素活性を有するRNA依存性DNAポリメラーゼを用いてcDNAライブラリーに変換される。第二鎖cDNA合成は、ターミナルトランスフェラーゼ活性を用いたポリNテーリングの後に実施でき、共通の末端配列を有する断片のcDNAライブラリーを生じる。これらの断片はその後、共通の末端に特異的なプライマーを用いてエマルション中で増幅される。より詳細な例を図3に示す。最初に、RNAトランスクリプトームは、特定の3’末端および共通の5’末端からなるオリゴdTアンカープライマーの存在下で、逆転写酵素を用いてcDNAライブラリーに変換される。第二鎖cDNA合成は、エキソヌクレアーゼIおよびアルカリホスファターゼ処理を用いた、未反応のオリゴdTアンカープライマーおよびdNTPの除去後に実施され得る。ターミナルトランスフェラーゼを用いたポリAテーリングは、5’末端と3’末端との両方に共通の末端配列を有する断片のcDNAライブラリーを生じる。これらの断片はその後、共通の末端に特異的なプライマーを用いてエマルション中で増幅される。本発明の第一の態様は、下記の4ステップ:すなわち、a複数の異なる核酸分子を提供するステップ、bその核酸分子の3’末端および5’末端にアダプター配列を付加するステップ、c水滴の大部分がその複数の異なる核酸分子の1つを含むまたはまったく含まないことを特徴とする油中水型エマルションを調製するステップ、およびdその複数の異なる核酸分子をクローン的に増幅するステップ、を含む、核酸のクローン前増幅のための方法として定義され得る。ステップa複数の異なる核酸分子を提供するステップ原理的には、新規方法は、二本鎖DNA、一本鎖DNAなどの任意の種類の核酸、特に、リボソームRNA、tRNA、snRNA、hnRNAなどの任意の種類の一本鎖RNAに適用できる。特に、新規方法は、mRNA分子のようなポリアデニル化RNA分子のクローン前増幅に非常に有利である。従って、言い換えると、本発明は、わずか数個の細胞に由来する全トランスクリプトームの偏りのない前増幅のための新規方法を提供し、それによって、偏りのない遺伝子発現解析を可能にする。複数の異なる核酸分子を提供するステップは、精製されたDNAもしくはRNAまたはmRNAサンプルもしくはcDNAサンプルなどを提供する当技術分野において公知の任意の方法を含みうる。このステップは更に、酵素的消化、機械的せん断、超音波処理、噴霧などの核酸断片化の任意の公知の方法を含みうる。ステップb核酸分子の3’末端および5’末端にアダプター配列を付加するステップ本発明の文脈において、プライマー結合部位という用語は頻繁に使用される。この文脈において、この用語は、ポリメラーゼ連鎖反応のような、ポリメラーゼに触媒されるプライマー伸長反応によって伸長される各プライマーを用いるその後のステップに使用されるであろう、プライマーの配列と同一の配列として理解されるべきである。クローン的に増幅されるべき複数の異なる核酸分子がDNAである場合、二本鎖アダプターがそれぞれのDNA断片の末端にライゲーションされる。アダプター配列はその後、ステップdでのクローン増幅の間に共通のプライマー結合部位として機能する。二本鎖DNA断片は平滑末端型で提供され、それは当技術分野においてよく知られた方法によって達成されうる。あるいは、二本鎖断片は同一の一本鎖3’突出部または5’突出部を含み、それはゲノムDNAの個々の制限酵素消化によって生成されうる。好ましい特定の実施形態では、ゲノムDNAは制限エンドヌクレアーゼ処理によって断片化される。このような制限エンドヌクレアーゼは、例えばMseIT|TAAであり得、それは100~1500bpの範囲の断片を生じるKleinCAら、ProcNatlAcadSciUSA9644944499。その後、それらの再ライゲーションを防ぐために、DNA断片のアルカリホスファターゼ処理が用いられる。アダプターオリゴヌクレオチドは、T4DNAリガーゼを用いてゲノムDNA断片にライゲーションされる。アダプターオリゴヌクレオチドには2つの種類がある。1つは、5’リン酸修飾を有する一般的な配列を有する。他の1つは、アダプターのセルフライゲーションを防ぐために3’修飾を有する。このような修飾は、3’OH基の削除または3’NH基または3’C7アミノ修飾基aminomodifierのいずれかでありうる。任意選択で、アダプターはキメラ5’DNA3’RNAオリゴヌクレオチドでありえ、この場合、RNAseH処理はこのようなアダプターを破壊し、その後のPCR増幅でのあらゆる干渉を排除する。クローン的に増幅されるべき核酸の種類に依存して、適切なアダプター配列を付加するステップは、複数の酵素処理ステップを必要とする。mRNA分子の場合、本発明の方法は、ステップbの中に下記のステップを含みうる。すなわち、b1複数の異なる核酸分子に第一の一本鎖アダプター核酸分子をハイブリダイズさせるステップ、ここで、そのアダプター分子は、‐プライマー結合部位に相当する5’末端部、および‐少なくとも5ヌクレオチド長のオリゴdT配列、少なくとも5ヌクレオチド長の基本的にランダム化された配列、または遺伝子もしくは遺伝子ファミリー特異的配列のいずれかである3’末端部を含み、b2一本鎖cDNAのプールを作製するために、RNA依存性DNAポリメラーゼおよびdNTP混合物の存在下で第一鎖cDNA合成を行うステップ、およびb3その一本鎖cDNAのプールに第二の一本鎖アダプター分子を付加するステップ。RNA依存性DNAポリメラーゼは、TranscriptorRocheAppliedScienceカタログ番号04379012001、AMV逆転写酵素、MMuLV逆転写酵素または逆転写酵素活性を有する耐熱性DNAポリメラーゼなどの、逆転写酵素活性を有する任意のポリメラーゼでありうる。好ましい実施形態では、ステップbは、下記のステップを含む。すなわち、b1複数の異なる核酸分子に第一の一本鎖アダプター核酸分子をハイブリダイズさせるステップ、ここで、そのアダプター分子は、‐プライマー結合部位に相当する5’末端部、および‐少なくとも5ヌクレオチド長のオリゴdT配列、または基本的にランダム化された配列、または遺伝子もしくは遺伝子ファミリー特異的配列のいずれかである3’末端部を含み、b2一本鎖cDNAのプールを作製するために、第一鎖cDNA合成を行うステップ、b3iホモポリマー突出部を作るために、同一のdNTPsの存在下でターミナルトランスフェラーゼ反応を行うステップ、b3ii一本鎖cDNAのプールに第二の一本鎖アダプター分子をハイブリダイズさせるステップ、ここで、その第二の一本鎖アダプター分子は、‐第一の一本鎖アダプター分子の5’末端部と同一のまたは異なる、プライマー結合部位に相当する5’末端部、および‐ステップb3iで作られたホモポリマー突出部に相補的な、ホモポリマーヌクレオチド残基の3’末端部を含む。b1の第一の一本鎖アダプター分子は、基本的に2つの機能を果たすように設計される。5’末端のプライマー結合部位は、本方法において後のステップdの間に、すべてのcDNA分子の増殖を可能にするために導入される。3’末端部は、アダプター分子が目的とするすべてのRNA分子に結合し、その逆転写をプライミングできるように設計される。例えば、ポリアデニル化mRNA分子の完全な集団を完全長で前増幅する場合には、3’末端部は、少なくとも5ヌクレオチド長、または好ましくは少なくとも15ヌクレオチド長であるが、50ヌクレオチド長を超えない相補的オリゴdT配列を有するであろう。好ましくは、このようなプライマーはアンカープライマーとして設計される。このようなオリゴdTアンカープライマーは、dT伸長部に続く3’末端に少なくとも1つのTではないヌクレオチドすなわちA、CまたはGを有するオリゴヌクレオチドの混合物である。この方法により、オリゴdTアンカープライマーは、ポリA尾部の5’開始部位に結合させられる。従って、ポリA尾部の実際の長さは、プライミングに影響を及ぼさない。あるいは、ある実施形態においてRNA分子の集団全体を前増幅する場合であって、完全長cDNAコピーは必要とされない場合には、3’末端部は、少なくとも5ヌクレオチド長の完全にランダムに選択された配列を含みうる。場合によっては、特定の遺伝子または規定の遺伝子ファミリーの転写産物のみを前増幅することが要求されることもありうる。その場合、3’末端部は、その特定の遺伝子の転写産物の配列またはその遺伝子ファミリーの転写産物のコンセンサス配列の一部に相補的な配列を含みうる。一本鎖RNAは、ステップb2の間にRNA依存性DNAポリメラーゼを用いて一本鎖DNAに逆転写される。この方法では、AMV、MMLV、HIV逆転写酵素またはCthermポリメラーゼなどのポリメラーゼが、使用されるプライマーの種類によって決定される部位で:すなわち、オリゴdTアンカーオリゴヌクレオチドがプライマーとして用いられた場合、ポリAmRNAの3’末端で、ランダムヘキサマーアンカープライマーを用いた場合、鋳型に沿った非特異的部位で、もしくは配列特異的アンカープライマーに対するプライマー結合部位で、新たなDNA鎖を合成する。更に、EColiのポリAポリメラーゼもしくはSchizosaccharomycespombeのポリUポリメラーゼを用いた処理によって3’末端がポリAもしくはポリU尾部により修飾されている一本鎖RNAを逆転写するために、オリゴdTまたはオリゴdAアンカーオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用することが可能である。ステップb3iのターミナルトランスフェラーゼ処理は、cDNAの3’末端にホモポリマーのA尾部を付加するために適用される。しかし、生成された第一鎖cDNAの3’末端に特異的に効率的なホモポリマーテーリングを可能にするために、下記の2つの酵素処理を行うことが非常に有利である。iステップb1の間に添加されたハイブリダイズせず、伸長されていない一本鎖DNAアダプター核酸分子が除去される場合、有利であることが証明された。結果として、その後のターミナルトランスフェラーゼ反応における反応副生成物の生成が減少する。従って、本発明の特定の実施形態は、ステップb1の間に添加されたハイブリダイズしていない一本鎖DNAアダプター核酸分子を除去するステップを含む。1つの実施形態では、これは、ステップb2とb3iとの間でのDNAエキソヌクレアーゼI処理によって達成され得る。この酵素は、一本鎖DNAを分解する3→5エキソヌクレアーゼであり、ターミナルトランスフェラーゼ反応の間の前記の分子の望ましくない伸長を防ぐ。あるいは、このような除去は、クロマトグラフィー精製によって、例えば、グラスファイバー吸着による精製によって達成され得る。更に、後のターミナルトランスフェラーゼ反応においてホモポリマーテーリングを確実にするために、ステップb3でのターミナルトランスフェラーゼ反応の前に本発明の1つの態様におけるdNTPが分解される場合、有利であることが証明された。本発明の範囲内で、これは、ステップb2とb3iとの間でのアルカリホスファターゼとのインキュベーションによって達成され、好ましくはこのインキュベーションは、上記に開示されたようなDNAエキソヌクレアーゼIによる処理の後に行われる。アルカリホスファターゼの通常の熱不活性化の後、ターミナルトランスフェラーゼ反応の間のホモポリマー伸長生成物の生成を可能にするために、dATPまたは他の特定のdNTPが添加されうる。あるいは、ハイブリダイズせず、伸長されていない一本鎖DNAアダプター核酸分子、ならびに余分なdNTPは、cDNA精製によって除去され得る。このような精製は、シリカビーズまたはフィルターカラムへのcDNA吸着によって達成され得るVogelsteinBら、ProcNatlAcadSciUSA76615619。あるいは、cDNA精製は、例えばWhiteheadInstituteで開発された固相可逆的固定化技術SolidPhaseReversibleImmobilizationtechnologyDeAngelisMMWangDGおよびHawkinsTLら、NucleicAcidsRes23474247439のような、特殊なバッファー条件を用いた常磁性粒子へのその固定化によって達成され得る。上述のように、ターミナルトランスフェラーゼ処理は、cDNAの3末端にホモポリマー尾部を付加するために用いられる。好ましくは、ステップb3iでの同一のdNTPは、ホモポリマーポリA尾部を生成するようなdATPである。脊椎動物のコード配列および5’非翻訳RNA領域はGC残基に偏っている傾向があるため、ポリA尾部の使用は、第二のオリゴdTアンカープライマーによる不適切な末端切断の可能性を減少させる。加えて、ポリA尾部は、GC結合よりも弱いAT結合ゆえに使用され、従って、オリゴdTアンカープライマーが内部部位に結合して増幅産物の末端切断を起こす前に、より長いA残基の伸長部が必要とされる。第一鎖cDNA合成は最初に、RNA第一鎖cDNAハイブリッドの生成をもたらす。経験的には、DNAエキソヌクレアーゼI、アルカリホスファターゼおよびターミナルトランスフェラーゼ反応の実施は、第一鎖cDNA分子がその本来の鋳型にまだ結合しているという事実に影響を受けないことが示されている。しかし、第二鎖cDNA生成および特にRTPCR反応は、本来の鋳型RNAが除去されていない場合には、より効率的ではないことが知られている。従って、特定の実施形態では、本発明の方法は、ステップb2とb3iとの間であるが、好ましくはDNAエキソヌクレアーゼIおよびアルカリホスファターゼとのインキュベーションの後に、RNADNAハイブリッド中のRNAを除去するために、RNAseH処理によってRNAを消化するステップを含む。あるいは、RNAseHは、RNA鋳型の消化のために、ステップb3iでのターミナルトランスフェラーゼ反応の最中に添加されうる。尾部を付加されたcDNA分子はその後、第二鎖cDNA合成のために使用される。前提条件として、第二の一本鎖アダプター分子が、一本鎖cDNAのプールにハイブリダイズされ、その第二の一本鎖アダプター分子は、‐第一の一本鎖アダプター分子の5’末端部と同一のまたは異なる、プライマー結合部位に相当する5’末端部、および‐ステップb3iで作られたホモポリマー突出部に相補的な、ホモポリマーヌクレオチド残基の3’末端部を含む。ホモポリマーAがステップb3iの間に付加された場合、その3’末端部は、オリゴdTプライマー、好ましくは少なくとも1つのランダムに選択された3’末端残基、最も好ましくは少なくとも1つのランダムに選択された3’末端残基およびランダムに選択された3’末端隣接残基を有するオリゴdTアンカープライマーである。1つの実施形態では、第二の一本鎖アダプター分子の5’末端部は、第一の一本鎖アダプター分子の5’末端部と同一である。結果として、ステップdの間のクローン増幅のために、1つのプライマーのみが必要である。別の実施形態では、第二の一本鎖アダプター分子の5’末端部は、第一の一本鎖アダプター分子の5’末端部とは異なる。結果として、ステップdにおけるクローン増幅によって、すべてのcDNA分子が本来の3’末端に第一の特異的アダプター配列を、5’末端に第二の特異的アダプター配列を有していることを特徴とする、方向性を持って増幅されたライブラリーを生じる。更に、第二のアダプター配列がターミナルトランスフェラーゼによるテーリングおよびそれに続くプライマーハイブリダイゼーションとは異なる方法によって導入される場合、それもまた本発明の範囲内である。例えば、ステップb3、すなわち、一本鎖cDNAのプールに第二の一本鎖アダプター分子を付加するステップはまた、一本鎖cDNAのプールに一本鎖アダプター分子をライゲーションすることによっても得られうる。その一本鎖アダプター分子は通常、その後の増幅に必要とされるような、プライマー結合部位に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドである。そのプライマーは、第一の一本鎖アダプター分子の5’末端部と同一であってもよく、または異なっていてもよい。あるいは、その一本鎖アダプター分子は、‐第一の一本鎖アダプター分子の5’末端部と同一のまたは異なる、プライマー結合部位に相当する5’末端部、および‐ランダムに選択されたヌクレオチド残基の3’末端部、を含む分子である。有利には、この実施形態は、ホモポリマーテーリングまたはライゲーションなどのいずれの中間酵素段階をも必要としないが、欠点は、第二のアダプター分子配列のランダム化によって、第一鎖cDNAが不完全な3’末端の形でしか増幅されないことである。ステップcおよびd油中水型エマルションを調製するステップおよび複数の異なる核酸分子をクローン的に増幅するステップステップcの間に、それぞれの側に付加されたアダプター配列を有する核酸分子の集団を含有する水性サンプルは、油中水型エマルションを調製するために適切な油組成物と混合される。エマルションは、当技術分野において公知の任意の適切な方法に従って形成されうる。ポリメラーゼの活性を失わせないエマルションを調製するための任意の方法が使用されうる。それぞれの方法は、当技術分野においてよく知られている。エマルションは、一方の相が顕微鏡サイズのまたはコロイドサイズの液滴として他方の相に分散した2つの非混和性液相の不均一系である。エマルションは、非混和性の液体の任意の適切な組合せから調製されうる。本発明に使用されるエマルションは、細かく分離された液滴の形で存在する相分散相、内相または不連続相としての生化学的成分を含有する水、およびこれらの液滴が懸濁するマトリックス非分散相、連続相または外相としての疎水性の非混和性の液体油を有する。このようなエマルションは油中水型WOと呼ばれる。これは、生化学的成分を含有する水相全体が、個別のdiscrete液滴内相に区画化されるという利点を有する。疎水性の油である外相は、通常いずれの生化学的成分も含有せず、従って不活性である。エマルションは、1種以上の界面活性剤の添加によって安定化されうる。これらの界面活性剤は乳化剤と呼ばれ、相の分離を防ぐまたは少なくとも遅らせるために水/油界面に作用する。多くの油および多くの乳化剤が、油中水型エマルションの調製のために使用でき;最近の編集物には16000種を超える界面活性剤が記載され、それらの多くは乳化剤として使用されるAshおよびAsh1993。適切な油は、ライトホワイトミネラルオイルならびにソルビタンモノオレエートSpanTM80ICIおよびポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートTweenTM80ICIなどの非イオン界面活性剤Schick1966を含む。陰イオン界面活性剤の使用もまた有益でありうる。適切な界面活性剤は、コール酸ナトリウムおよびタウロコール酸ナトリウムを含む。特に好ましいのはデオキシコール酸ナトリウムであり、好ましくは05wvまたはそれ以下の濃度である。このような界面活性剤の含有は、ある場合には、遺伝因子の発現および/または遺伝子産物の活性を増加させ得る。乳化されていない反応混合物へのいくつかの陰イオン界面活性剤の添加は、翻訳を完全に停止させる。しかし、乳化の間に、界面活性剤は水相から界面に移行し、活性は回復する。乳化されるべき混合物への陰イオン界面活性剤の添加は、反応が区画化後にのみ進行することを保証する。エマルションの調製は通常、強制的に相を一体にするために機械的エネルギーの適用を必要とする。その方法には様々なものがあり、撹拌器マグネティック撹拌子、プロペラ型およびタービン型撹拌機、パドル型装置および泡立て器など、ホモジナイザーローターステーターホモジナイザー、高圧バルブホモジナイザーおよびジェットホモジナイザーを含む、コロイドミル、超音波および膜乳化装置を含む、様々な機械装置を利用する。本発明の状況において好ましい方法は、アジュバント法adjuvantmethods、向流法counterflowmethods、逆流法crosscurrentmethods、回転ドラム法rotatingdrummethods、および膜法membranemethodsを包含する。更に、マイクロカプセルのサイズは、成分の流量および流速を変えることによって調整されうる。例えば、液滴の添加において、液滴のサイズおよび総供給時間が変更されうる。1つの実施形態では、増幅溶液混合物は、回転している生体適合性油例えば、ライトミネラルオイルSigmaの混合物に滴下され、乳化される。使用される油には、1種以上の生体適合性の乳化安定剤が添加されうる。これらの乳化安定剤は、Atlox4912、Span80、AgrimerAL22US7575865EP1735458および他の認められ市販されている適切な安定剤を包含しうる。好ましくは、形成される液滴は、サイズにして5ミクロン~500ミクロン、より好ましくは約50~300ミクロン、最も好ましくは100~150ミクロンの範囲に及ぶ。WilliamsらWilliamsRら、NatMethods3545550によれば、emPCRに適した油界面活性剤混合物は、下記の成分を50ml遠心管において25°Cで完全に混合することによって調製され得る。Span20最終濃度45Tween80最終濃度04TritonX100最終濃度005ミネラルオイルSigma50mlに調整その後、水相を油界面活性剤混合物に15分間にわたって滴下し、更に5分間連続撹拌する。この方法によって、1ミリリットルのエマルションあたり約108~109個のPCR可能な区画を含む油中水型エマルションが調製され得る。尾部を付加されたcDNA分子は、油中水型エマルションの過剰量の水滴中に統計的に分布している。それによって、尾部を付加されたcDNA分子はエマルションの微小な水滴中に隔離され、個々の、または多くとも2~3個の尾部を付加されたcDNA分子が、尾部を付加されたcDNAの3’末端および5’末端に導入されたプライマー結合部位に相補的なプライマーを用いたPCRによって増幅される。上記に開示されたように、cDNAの3’末端のプライマー結合部位は、cDNAテーリングの間に付加され、一方、cDNAの5’末端のプライマー結合部位は、cDNA合成の間に挿入されている。これにより、後のステップdの間に、最初に生成された一本鎖cDNA分子の大部分のクローン増幅が可能となる。より正確には、水滴の大部分が複数の異なる核酸分子の1つを含むまたはまったく含まないように、条件を選択する。尾部を付加された一本鎖cDNA分子数の分布は、典型的なポアソン分布に従うことが想定され得る。従って、当業者は、下記の2つの必要条件を満たす条件を特定できるであろう。すなわち、第一に、液滴の数は、50以上、好ましくは80以上の液滴が最大1個までの尾部を付加されたcDNA分子を含有するのに十分なほど大きい必要がある。これは、後のステップdの間のクローン増幅のための必要条件である。クローン増幅の原理、すなわちそれぞれの元の一本鎖cDNA分子の個別増幅によって、偏りのない増幅されたcDNAの集団を得ることができる。言い換えると、ステップdの結果として増幅されたcDNAの集団に見られる各種のcDNA配列の提示頻度は、もともと提供された複数の異なる核酸分子中に存在する各種のcDNA配列の提示頻度と一致すべきである。第二に、尾部を付加されたcDNA鋳型を含有しない水滴の数は、ステップcおよびdでのエマルションおよび増幅試薬の必要量をおさえ、ひいてはできるかぎり効率的な方法を提供するために、十分低く保たれる必要がある。ステップdは、尾部を付加されたDNAを水滴中でクローン的に増幅するために行われる。通常、このような増幅はPCRを用いて達成され、これは油中水型エマルションの水滴中でも機能することが知られているMarguliesMら、NaturePublGroup43737680NakanoMら、JBiotechnol102117124。当技術分野においてemPCRとも呼ばれる、このような増幅方法は、標準的な温度サイクル法を用いて行われ得る。ステップdのエマルションPCRに使用されるプライマーは、上記に開示される第一および第二の一本鎖アダプター分子によって導入されるプライマー結合部位に相補的なオリゴヌクレオチドである。第二のアダプター分子が第一のアダプター分子のそれと同一のプライマー結合部位を有する場合、1つのプライマーだけが増幅のために必要とされる。両アダプターのプライマー結合部位が異なる場合、1対の2つの異なるプライマーが必要である。後者の場合、方向性のある増幅cDNAが生成されている。本発明に従って適用される、二本鎖cDNAが増幅の対数期にあることを保証するPCRのサイクル数は、最適化され得、主として、例えば、サンプルDNAの初期濃度に依存する。その後、エマルションは破壊される。エマルションの破壊は、適切なろ過法によって行われうる。好ましくは、エマルションの破壊は、増幅されたcDNAライブラリーをエマルションから回収するために、イソプロパノールまたは界面活性剤によるエマルションの処理によって達成されうる。高速遠心分離と組み合わせたイソプロパノール処理は、定量的沈降によってエマルションからの核酸の回収を可能にする。カオトロピックバッファーを含有するドデシル硫酸ナトリウムおよびTritonX100を用いた界面活性剤処理は、エマルションを破壊し、シリカビーズまたはフィルターカラムへの吸着による核酸の回収を可能にする。WilliamsらWilliamsRら、NatMethods3545550によれば、エマルションは、25°Cで5分間の13000gでの遠心分離によって破壊され得る。上相油相を廃棄する。水飽和ジエチルエーテルのような有機溶媒を用いた数回の抽出は、エマルションから残存する油を更に除去し、それを破壊させ得る。読み取り法本発明の方法は、少数の細胞のみに由来する核酸を分析するために特に有用である。特に、複数の異なる核酸分子が、100細胞未満、10細胞未満、およびわずか1細胞のみに由来する場合に有用である。本発明の方法は偏りのない増幅のための解決法を提供するので、得られるサンプルは、サンプル中にもともと存在するすべての種類の核酸分子が、元のサンプルにおけるそれらの提示と比較して同等の相対量で提示されることを特徴とする増幅核酸を含有する。これによって、更なる定量的な分析実験を高精度で実施できる可能性が提供される。具体的には、本発明は、RNA、特にmRNAが出発材料として使用される場合、高精度の遺伝子発現解析のための解決法を提供する。第一の実施形態では、クローン的に増幅された複数の異なる核酸分子は、パラメーター特異的増幅プライマーを用いた、定性的または定量的リアルタイムPCR反応実験に供されうる。リアルタイムPCRでは、サンプル分析は、同一機器の同一チューブ内で増幅と同時に行われる。PCR産物の形成は、PCRの各サイクルにおいてモニタリングされる。それは通常、増幅反応の間に蛍光シグナルを測定するための更なる装置を有するサーモサイクラーにおいて測定される。DNA色素または蛍光プローブは、増幅の前にPCR混合物に添加され、増幅の間にPCR産物を分析するために使用され得る。この複合アプローチは、更なる分析のためにそれらの密閉容器からサンプルを取り出す必要がないため、サンプル操作を減らし、時間を節約し、その後の反応のために産物の汚染の危険性を大きく低下させる。1つの特定の実施形態では、二本鎖増幅産物の量は通常、サンプル中にもともと存在する分析されるべき核酸の量を上回るため、二本鎖DNA特異的色素が使用されてもよく、それは、適切な波長を用いて励起された際、二本鎖DNAに結合した場合に限り、蛍光の増加を示す。好ましくは、SybrGreenIIのように、例えば、PCR反応の効率に影響を及ぼさない色素のみが使用されうる。別の特定の実施形態では、その標的核酸に結合した時だけに蛍光を放射する蛍光標識ハイブリダイゼーションプローブが使用され得る。例えば、一本鎖のハイブリダイゼーションプローブは2つの成分によって標識される。第一成分が適切な波長の光によって励起されると、蛍光共鳴エネルギー転移の原理に従って、吸収されたエネルギーは、第二成分、いわゆるクエンチャーに転移される。PCR反応のアニーリングステップの間に、ハイブリダイゼーションプローブは標的DNAに結合し、その後の伸長段階の間にTaqポリメラーゼの5’3’エキソヌクレアーゼ活性によって分解される。その結果、励起された蛍光成分およびクエンチャーは互いに空間的に離され、従って第一成分の蛍光放射が測定され得る。TaqMan加水分解プローブアッセイは、US5210015、US5538848、およびUS5487972において詳細に開示される。TaqManハイブリダイゼーションプローブおよび試薬混合物は、US5804375に開示される。別法では、モレキュラービーコンMolecularBeaconハイブリダイゼーションプローブは、第一成分およびクエンチャーによって標識され、その標識は好ましくはプローブの両端に位置している。プローブの二次構造の結果として、両成分は溶液中で空間的に近接している。標的核酸へのハイブリダイゼーション後、適切な波長の光によって励起された後に第一成分の蛍光放射が測定され得るように、両成分は互いに離されるUS5118801。更に別法として、リアルタイムPCRは、FRETハイブリダイゼーションプローブを用いてリアルタイムでモニタリングされる。FRETハイブリダイゼーションプローブ試験形式は、リアルタイムPCRを含むすべての種類の均質なhomogenousハイブリダイゼーションアッセイに有用であるUS6174670。それは、同時に使用され、増幅される標的核酸の同一鎖の隣接した部位に相補的な、2つの一本鎖ハイブリダイゼーションプローブを特徴とする。両プローブは異なる蛍光成分によって標識される。適切な波長の光によって励起された場合、第一成分は、蛍光共鳴エネルギー転移の原理に従って吸収したエネルギーを第二成分に転移するので、第二成分の蛍光放射は、両ハイブリダイゼーションプローブが検出されるべき標的分子の隣接した位置に結合した時に測定され得る。FRETアクセプター成分の蛍光増加のモニタリングの代わりに、ハイブリダイゼーション事象の定量的測定としてFRETドナー成分の蛍光減少をモニタリングすることもまた可能である。第二の実施形態では、クローン的に増幅された複数の異なる核酸分子は、配列決定されうる。サンガーの配列決定のような任意の種類の配列決定、または任意のハイスループット配列決定法が実施されうる。例えば、配列決定は、454ゲノムシークエンサーFLXシステムRocheAppliedScienceで実施されうる。このシステムは、1回の稼動あたり100万を超える質の高い解読および400塩基の長さの解読を実施することができ、従って、任意のサイズの全ゲノムおよびトランスクリプトームのdenovo配列決定、複合サンプルのメタゲノム解析、再配列決定研究などのために理想的に適している。一連の標準的な分子生物学的技術を用いて、3’末端と5’末端との両方に特異的な短いアダプターAおよびBが、配列決定されるべき各断片に付加される。そのアダプターは、精製、増幅、および配列決定のステップに使用される。AおよびBアダプターを有する一本鎖断片は、その後の作業工程に使用されるサンプルライブラリーを構成する。一本鎖DNAライブラリーは、特別に設計されたDNA捕捉ビーズ上に固定化される。各ビーズは、固有の一本鎖DNAライブラリー断片を保持する。ビーズに結合したライブラリーは、増幅試薬とともに油中水型混合物に乳化され、その結果、1つの固有のサンプルライブラリー断片を有する1つのビーズのみを含有するマイクロリアクターを生じる。それぞれの固有のサンプルライブラリー断片は、それ自体のマイクロリアクター内で増幅される。断片コレクション全体の増幅が並行して行われ、各断片に対して、これはビーズあたり数百万コピー数を生じさせる。その後、エマルションPCR構造は破壊されるが、増幅断片はそれらの特異的ビーズに結合したままである。その時、断片は、配列決定のためにピコタイタープレート装置上に載せることができる状態である。ピコタイタープレートのウェルの直径は、ウェルあたり1つのビーズのみを許容する。配列決定用酵素の添加後、ゲノムシークエンサーFLX装置の流体サブシステムは、ビーズ1つずつを含む何十万ものウェルを通って、一定の順序で個々のヌクレオチドを流す。続いて、パイロシークエンス反応が行われ、鋳型鎖に相補的な1つまたはそれ以上のヌクレオチドの付加によって、ゲノムシークエンサーFLXのCCDカメラによって記録される化学発光シグナルが生じる。遺伝子発現解析のために、増幅されたcDNA分子の全集団は大規模並列方法で配列決定され、異なるmRNA種の相対存在量が比較され得る。この場合、本発明は、下記のステップを含む。すなわち、a複数の異なるmRNA分子を提供するステップ、bその核酸分子の3’末端および5’末端にアダプター配列を付加するステップであって、それが、b1その複数の異なる核酸分子に第一の一本鎖アダプター核酸分子をハイブリダイズさせること、そのアダプター分子は、‐プライマー結合部位に相当する5’末端部、および‐少なくとも5ヌクレオチド長のオリゴdT配列である3’末端部を含むb2一本鎖cDNAのプールを作製するために、第一鎖cDNA合成を行うこと、b3iホモポリマー突出部を作るために、同一のdNTP好ましくはdATPであるの存在下でターミナルトランスフェラーゼ反応を行うこと、b3iiその一本鎖cDNAのプールに第二の一本鎖アダプター分子をハイブリダイズさせること、その第二の一本鎖アダプター分子は、‐第一の一本鎖アダプター分子の5’末端部と同一のまたは異なる、プライマー結合部位に相当する5’末端部、および‐ステップb3iで作られたホモポリマー突出部に相補的な、ホモポリマーヌクレオチド残基の3’末端部を含むによるステップ、c水滴の大部分がその複数の異なる核酸分子の1つを含むまたはまったく含まないことを特徴とする油中水型エマルションを調製するステップ、dその複数の異なる核酸分子をクローン的に増幅するステップ、eクローン的に増幅された複数の異なる核酸を配列決定するステップ。プライマー結合部位に相当する5’末端部が、第一の一本鎖アダプター分子の5’末端部とは実質的に異なる場合、本方法は、454ゲノムシークエンサーシステムのライブラリーと一体化され得る。従って、本発明はまた、下記のステップを含む方法を対象とする。すなわち、a複数の異なるmRNA分子を提供するステップ、bその核酸分子の3’末端および5’末端にアダプター配列を付加するステップであって、それが、b1その複数の異なる核酸分子に第一の一本鎖アダプター核酸分子をハイブリダイズさせること、そのアダプター分子は、‐プライマー結合部位に相当する5’末端部、および‐少なくとも5ヌクレオチド長のオリゴdT配列である3’末端部を含むb2一本鎖cDNAのプールを作製するために、第一鎖cDNA合成を行うこと、b3iホモポリマー突出部を作るために、同一のdNTP好ましくはdATPであるの存在下でターミナルトランスフェラーゼ反応を行うこと、b3iiその一本鎖cDNAのプールに第二の一本鎖アダプター分子をハイブリダイズさせること、その第二の一本鎖アダプター分子は、‐第一の一本鎖アダプター分子の5’末端部と同一のまたは異なる、プライマー結合部位に相当する5’末端部、および‐ステップb3iで作られたホモポリマー突出部に相補的な、ホモポリマーヌクレオチド残基の3’末端部を含み、そのアダプター分子の5’末端は、ビーズに結合しているによるステップ、c水滴の大部分がその複数の異なる核酸分子の1つを含むまたはまったく含まないことを特徴とする油中水型エマルションを調製するステップ、dその複数の異なる核酸分子を油中水型エマルション中でクローン的に増幅するステップ、ならびにeそのエマルションを破壊するステップ、ならびにfクローン的に増幅された複数の異なる核酸分子を配列決定するステップ。最後に、遺伝子発現をモニタリングするために、個々のcDNA配列に相当する配列決定事象の存在量が互いに比較される。第三の実施形態では、クローン的に増幅された複数の異なる核酸分子は、DNAマイクロアレイ上にハイブリダイズされうる。DNAマイクロアレイ上へのハイブリダイゼーションを検出するために、クローン的に増幅された複数の異なる核酸分子を蛍光化合物で標識することが必要であり、それは後にスキャナーのようなそれぞれの機器によって検出可能である。当技術分野における核酸サンプルを標識するための好ましいコンセプトは、ランダムプライムラベリングである。このコンセプトのために、5~12ヌクレオチドモノマーの長さを有するランダムなプライマーの集団が、サンプルDNAに最初にハイブリダイズされる。その後、dNTPを取り込むことによってプライマーを伸長するために、3’5’エキソヌクレアーゼ活性を欠如しているKlenowフラグメントDNAポリメラーゼが添加される。標識は、標識化プライマー、あるいは、少なくとも1種類の標識化デオキシヌクレオシド三リン酸のいずれかを用いることによって導入されている。標識は、好ましくは蛍光標識であり、Cy3、Cy35、Cy5、またはCy55などのシアニン色素が最も好ましい。従って、本発明はまた、a複数の異なるmRNA分子を提供するステップ、bその核酸分子の3’末端および5’末端にアダプター配列を付加し、それは、b1その複数の異なる核酸分子に第一の一本鎖アダプター核酸分子をハイブリダイズさせることそのアダプター分子は、‐プライマー結合部位に相当する5’末端部、および‐少なくとも5ヌクレオチド長のオリゴdT配列である3’末端部を含むb2一本鎖cDNAのプールを作製するために、第一鎖cDNA合成を行うこと、b3iホモポリマー突出部を作るために、同一のdNTP好ましくはdATPであるの存在下でターミナルトランスフェラーゼ反応を行うこと、b3iiその一本鎖cDNAのプールに第二の一本鎖アダプター分子をハイブリダイズさせること、その第二の一本鎖アダプター分子は、‐第一の一本鎖アダプター分子の5’末端部と同一のまたは異なる、プライマー結合部位に相当する5’末端部、および‐ステップb3iで作られたホモポリマー突出部に相補的な、ホモポリマーヌクレオチド残基の3’末端部を含むによるステップ、c水滴の大部分がその複数の異なる核酸分子の1つを含むまたはまったく含まないことを特徴とする油中水型エマルションを調製するステップ、dその複数の異なる核酸分子をクローン的に増幅するステップ、e好ましくはランダムプライムラベリングによって、その増幅された複数の異なる核酸分子を標識化するステップ、fその標識化され、増幅された複数の異なる核酸分子をDNAマイクロアレイ上にハイブリダイズさせるステップ、を含む方法を包含する。当業者は、遺伝子発現をモニタリングするために使用されるアレイ上に必要なプローブを設計する方法を知っている。あるいは、このような遺伝子発現アレイは市販されている例えばRocheAppliedScienceカタログ番号05543789001。DNAマイクロアレイによって放射される蛍光パターンの解析は、個々のRNAの相対発現レベルを示す。本発明のキット別の態様では、本発明は、上記に開示されたような本発明の方法を実施するために有用なキットを対象とする。このようなキットは、‐第一の一本鎖アダプター核酸分子、これは、‐プライマー結合部位に相当する5’末端部、および‐少なくとも5ヌクレオチド長のオリゴdT配列、または基本的にランダム化された配列または遺伝子もしくは遺伝子ファミリー特異的配列のいずれかである3’末端部を含む‐一本鎖cDNAのプールに対する第二の一本鎖アダプター分子、第二の一本鎖アダプター分子は、‐第一の一本鎖アダプター分子の5’末端部と同一のまたは異なる、プライマー結合部位に相当する5’末端部、および‐ホモポリマーヌクレオチド残基の3’末端部を含む‐逆転写酵素活性を有するRNA依存性DNAポリメラーゼを含むであろう。RNA依存性DNAポリメラーゼは、TranscriptorRocheAppliedScienceカタログ番号03531317001、AMV逆転写酵素RocheAppliedScienceカタログ番号11495062001、MMULV逆転写酵素RocheAppliedScienceカタログ番号11062603001またはCarboxydothermushydrogenoformans由来のDNAポリメラーゼのKlenowフラグメントRocheAppliedScienceカタログ番号12016346001などの、逆転写酵素でありうる。好ましくは、このようなキットに含まれる第一の一本鎖アダプター分子の3’末端部は、少なくとも5ヌクレオチド長、またはより好ましくは少なくとも15ヌクレオチド長であるが、50ヌクレオチド長を超えないオリゴdT配列を有する。更に、キットは、加えて下記のリストの化合物、試薬および酵素の1つまたはいくつかの代表的なものを含みうる。すなわち、‐ターミナルトランスフェラーゼRocheAppliedScienceカタログ番号03333566001‐RNAseHRocheAppliedScienceカタログ番号10786349001‐アルカリホスファターゼRocheAppliedScienceカタログ番号11097075001‐DNAエキソヌクレアーゼNewEnglandBiolabsカタログ番号MO293L‐エマルションPCRのための油中水型エマルションを調製するために使用され得る油‐emPCRを行うことができる耐熱性DNAポリメラーゼ‐1つ以上の種類のデオキシヌクレオシド三リン酸‐増幅プライマーまたは増幅プライマー対上記に開示された第一および第二の一本鎖アダプター分子によって導入されるプライマー結合部位に相補的なオリゴヌクレオチドである。第二のアダプター分子が第一のアダプター分子のそれと同一のプライマー結合部位を有する場合、1つのプライマーだけが増幅のために必要とされる。両アダプターのプライマー結合部位が異なる場合、1対の2つの異なるプライマーが必要である。増幅されていないcDNAライブラリーと前増幅されたライブラリーとの間での遺伝子発現の一致の比較この比較は、全RNA源としてHeLa細胞を用いて実施された。具体的には、比較は、‐補正用サンプルとして、RocheTranscriptor第一鎖cDNA合成キットRocheAppliedScience04379012001を用いた増幅されていないcDNAライブラリー、‐使用説明書に従ってNuGen社RocheAppliedScience05190894001、RubiconSigma社WTA1およびClontechTakara社634925の既存の前増幅キットを用いて前増幅されたライブラリー、ならびに‐油中水型エマルション構造中でClontechTakara社634925の前増幅キットを用いてクローン的に前増幅されたライブラリーを用い、増幅されていないcDNAライブラリーと前増幅されたライブラリーとの間での発現について実施した。エマルション中での前増幅は、ClontechTakaraSMARTercDNA合成キット634925に基づき、下記の変更を加えて実施された。すなわち、全RNAを、SMARTerMMLV逆転写酵素および共通のアンカー配列を含む改変したオリゴdTプライマー3’SMARTCDSPrimerIIAを用いて逆転写した。SMARTScribeRTがmRNAの5’末端に到達すると、その酵素のターミナルトランスフェラーゼ活性が、cDNAの3’末端に数個の更なるヌクレオチドを付加する。非鋳型ヌクレオチド伸長部にSMARTerオリゴヌクレオチドIIAが塩基対合し、伸長された鋳型を作り出す。SMARTScribeRTはその後、鋳型を切り替えて、オリゴヌクレオチドの末端まで複製を続けるChoら、BioTechniques30p892897。結果として生じる一本鎖cDNAは今、1つは5’末端に、1つは3’末端に、2つの共通のアンカー配列を有する。その後、これらのcDNAを、PCR反応混合物ポリメラーゼ、塩類、バッファー、dNTP、プライマー、ならびにAtlox4912、Span80、AgrimerAL22および他の認められている市販の適切な安定剤を含む1つ以上の生体適合性乳化安定剤を加えたミネラルオイルを含有する、油中水型エマルションの過剰量の水滴内に分配した特許EP1735458号およびUS7575865号も参照せよ。PCRによる増幅は、共通のアンカー配列に特異的なプライマーを基にした。二本鎖cDNAが増幅の対数期にあることを保証する最適なPCRのサイクル数の後、エマルションを破壊し、定量PCRによる更なる比較遺伝子発現解析のために、増幅されたcDNAライブラリーをエマルションから回収した。クローン的に増幅されたcDNAライブラリーはその後、LightCycler480装置RocheAppliedScience05015278001でRealTimeReadyHumanReferenceGenePanelRocheAppliedScience05339545001を用いて、閾値サイクル比較法comparativethresholdcyclemethodLivakKJおよびSchmittgenTDMethods25402408SchmittgenTDおよびLivakKJNatProtoc311011108に従って、相対的遺伝子発現解析のために使用された。簡潔には、全RNA源としてHeLa細胞を用いて、相対的遺伝子発現を測定した。Transcriptor第一鎖cDNA合成キットRocheAppliedScience04379012001を用いて5ngの全RNAから合成されたcDNAを補正物として使用した。この補正物に基づき、各5ngRNAを用いてNuGen前増幅キット、RubiconSigmaWTA前増幅キット、ClontechTakaraSMARTer前増幅キット、および変更されエマルション化されたSMARTer前増幅キットの遺伝子発現を比較した。qPCR発現解析の結果を、下記の表に要約する:表から理解されるように、補正物に対する標的遺伝子の相対的遺伝子発現は、油中水型エマルションと組み合わせたClontechの前増幅キットの使用表1の最も右側のカラム参照が、補正用サンプルcDNA合成キットのみを分析した際に遺伝子発現について得られる値との最少の違いをもたらすことを示した。従って、本発明の方法、すなわち油中水型エマルション中でのクローン前増幅は、当技術分野において利用可能な方法を上回る優れた結果をもたらす。増幅されていないcDNAライブラリーと更なるターミナルトランスフェラーゼ処理によって調製された前増幅されたライブラリーとの間での遺伝子発現の一致の比較この比較は、全RNA源としてHeLa細胞を用いて実施された。具体的には、比較は、‐補正用サンプルとして、RocheTranscriptor第一鎖cDNA合成キットRocheAppliedScience04379012001を用いた増幅されていないcDNAライブラリー、および‐前増幅のために油中水型エマルション構造と組み合わせた、変更された53RACEKitRocheAppliedScience03353621001に基づく、クローン的に前増幅されたライブラリーを用い、増幅されていないcDNAライブラリーと前増幅されたライブラリーとの間での発現について実施した。変更は下記の通りであった。すなわち、全RNAを、AMVを基にしたTranscriptor逆転写酵素および共通のアンカー配列を含む改変したオリゴdTプライマーを用いて逆転写した。第一鎖cDNA合成の後、グラスファイバー吸着によるcDNAの精製によって、未反応のプライマーを除去したRocheAppliedScience11732668001。その後、ターミナルトランスフェラーゼ処理を用いて、cDNAの3’末端にホモポリマーA尾部を付加した。尾部を付加されたcDNA分子はその後、DNAポリメラーゼおよび第二のオリゴdTアンカープライマーを用いて、第二鎖cDNA合成のために使用された。更に、尾部を付加されたcDNA分子を、PCR反応混合物ポリメラーゼ、塩類、バッファー、dNTP、プライマー、ならびにAtlox4912、Span80、AgrimerAL22および他の認められている市販の適切な安定剤を含む1つ以上の生体適合性乳化安定剤を加えたミネラルオイルを含有する、油中水型エマルションの過剰量の水滴内に統計的に分配した特許US7575865EP1735458も参照せよ。それによって、尾部を付加されたcDNA分子はエマルションの微小な水滴中に隔離され、個々の、または多くとも2~3個の尾部を付加されたcDNA分子が、アンカープライマーに特異的なプライマーを用いたPCRによって増幅される。二本鎖cDNAが増幅の対数期にあることを保証する最適なPCRのサイクル数の後、エマルションを破壊し、増幅されたcDNAライブラリーをエマルションから回収した。クローン的に増幅されたcDNAライブラリーはその後、実施例1に開示されたように、相対的遺伝子発現解析のために使用した。qPCR発現解析の結果を、下記の表に要約する:表から理解されるように、補正物に対する標的遺伝子の相対的遺伝子発現は、19遺伝子のうち18遺伝子が上述の油中水型エマルションに基づく手順によってうまく前増幅されうることを示した。補正用サンプルとの一致は、中程度から低く発現される標的遺伝子絶対Cp≧25で高く、一方、サンプル中により豊富な遺伝子の発現レベルはしばしば過大評価された。このことから、本発明の方法、すなわち油中水型エマルション中でのクローン前増幅の実施が、サンプル中で最初は低いRNA濃度を有する標的転写産物の分析、または微量の全RNAしか存在しないサンプルからのRNAの前増幅例えば、細針生検に由来する少数の細胞の分析もしくは単一細胞レベルでの分析に、優れた結果をもたらすことが示される。