"少なくとも2種のヌクレオチド配列識別子の組合せの、高処理配列決定用のサンプルDNAの調製での使用。前記高処理配列決定において複数の調製サンプルDNAが使用され、サンプルDNAの各調製物が、少なくとも2種のヌクレオチド配列識別子の固有の組合せを含み、ここで、第一ヌクレオチド配列識別子がヌクレオチド配列識別子の一群から選択され、第二ヌクレオチド配列識別子が前記ヌクレオチド配列識別子の群から選択される請求項1に記載の使用。第一および第二ヌクレオチド配列識別子に加えて、さらに、前記ヌクレオチド配列識別子の群から選択されるヌクレオチド配列識別子が使用される請求項2に記載の使用。調製サンプルDNAが、増幅産物を含む請求項1~3に記載の使用。調製サンプルDNAが、アダプタ連結DNA断片を含む請求項1~4に記載の使用。調製サンプルDNAが、増幅アダプタ連結断片および/またはアダプタ連結増幅産物を含む請求項1~5に記載の使用。高処理配列決定方法において、調製サンプルDNAの単一DNAテンプレートを使用する請求項1~6に記載の使用。前記単一DNAテンプレートが、2個の配列決定プライマ結合部位を含み、各配列決定プライマ結合部位が、異なるヌクレオチド配列識別子の3’位に位置している請求項7に記載の使用。連結および/または増幅サンプルDNAのサンプル起源を同定する方法であって、aアダプタおよび/または増幅プライマを提供するステップであって、少なくとも、ヌクレオチド配列識別子の群から選択される第一ヌクレオチド配列識別子と第二アダプタまたは増幅プライマとを含む第一アダプタまたは増幅プライマが、ヌクレオチド配列識別子の群から選択される第二ヌクレオチド配列識別子を含んで提供され、および場合によっては、さらなるアダプタまたは増幅プライマが、ヌクレオチド配列識別子の群から選択されるさらなるヌクレオチド配列識別子を含んで提供されるステップと、b複数のサンプルDNAを提供するステップと、cアダプタおよび/または増幅プライマを使用してサンプルDNA上で連結および/または増幅反応を行い、前記第一、第二および場合によってはさらなるヌクレオチド配列識別子を含む連結および/または増幅サンプルDNAを提供するステップと、d高処理配列決定を使用して、少なくとも、第一、第二および場合によってはさらなるヌクレオチド配列識別子の配列を決定するステップと、e連結および/または増幅サンプルDNAのサンプル起源を決定するステップと、を含む方法。複数のサンプルDNAから、増幅産物のサンプル起源を同定する方法であって、a複数のサンプルDNAを提供するステップと、bヌクレオチド配列識別子の一群を提供するステップと、c第一増幅プライマを提供するステップであって、各第一プライマが、前記ヌクレオチド配列識別子の群から選択される第一ヌクレオチド配列識別子を含むステップと、d第二増幅プライマを提供するステップであって、各第二プライマが、前記ヌクレオチド配列識別子の群から選択される第二ヌクレオチド配列識別子を含むステップと、e各サンプルDNAを、第一および第二増幅プライマの固有のペアで増幅し、増幅産物を得るステップと、f場合によっては、増幅産物の少なくとも一部をプールするステップと、g該増幅産物の第一識別子配列および第二識別子配列の配列を、高処理配列決定を使用して決定するステップと、h該増幅産物のサンプル起源を決定するステップと、を含む方法。複数のサンプルDNAから、アダプタ連結DNA断片のサンプル起源を同定する方法であって、a複数のサンプルDNAを提供するステップと、bヌクレオチド配列識別子の一群を提供するステップと、c第一アダプタを提供するステップであって、各第一アダプタが、前記ヌクレオチド配列識別子の群から選択される第一ヌクレオチド配列識別子を含むステップと、d第二アダプタを提供するステップであって、各第二アダプタが、前記ヌクレオチド配列識別子の群から選択される第二ヌクレオチド配列識別子を含むステップと、e各サンプルDNAを断片化するステップと、f第一および第二アダプタの固有のペアを各断片化サンプルDNAに連結し、アダプタ連結DNA断片を得るステップと、g場合によっては、アダプタ連結DNA断片の少なくとも一部をプールするステップと、hアダプタ連結DNA断片の第一識別子配列および第二識別子配列の配列を、高処理配列決定を使用して決定するステップと、iアダプタ連結DNA断片のサンプル起源を決定するステップと、を含む方法。アダプタ連結増幅産物のサンプル起源を同定する方法であって、a複数のサンプルDNAを提供するステップと、bヌクレオチド配列識別子の一群を提供するステップと、c第一増幅プライマを提供するステップと、d第二増幅プライマを提供するステップと、eサンプルDNAを、第一および第二増幅プライマのペアで増幅し、増幅産物を得るステップと、f場合によっては、それぞれ異なるプライマペアで増幅されたサンプルDNAの増幅産物の少なくとも一部をプールするステップと、g場合によっては、前記増幅産物を断片化するステップと、h第一アダプタを提供するステップであって、各第一アダプタが、前記ヌクレオチド配列識別子の群から選択される第一ヌクレオチド配列識別子を含むステップと、i第二アダプタを提供するステップであって、各第二アダプタが、前記ヌクレオチド配列識別子の群から選択される第二ヌクレオチド配列識別子を含むステップと、j場合によっては、さらなるアダプタを提供するステップであって、各アダプタが、前記ヌクレオチド配列識別子の群から選択されるさらなるヌクレオチド配列識別子を含むステップと、k第一アダプタを断片化された増幅産物に連結するステップと、l場合によっては、ステップkのアダプタ連結増幅産物の少なくとも一部をプールするステップと、m連結ステップを第二のおよびさらなるアダプタで繰り返し、各連結ステップの後、場合によっては、得られたアダプタ連結増幅産物の少なくとも一部をプールするステップと、nステップmで得たアダプタ連結増幅産物の第一、第二および場合によってはさらなる識別子配列の配列を、高処理配列決定を使用して決定するステップと、oアダプタ連結増幅産物のサンプル起源を決定するステップと、を含む方法。複数のサンプルDNAから、増幅アダプタ連結DNA断片のサンプル起源を同定する方法であって、a複数のサンプルDNAを提供するステップと、bヌクレオチド配列識別子の一群を提供するステップと、c第一アダプタを提供するステップであって、各第一アダプタが、前記ヌクレオチド配列識別子の群から選択される第一ヌクレオチド配列識別子を含むステップと、d場合によっては、第二アダプタを提供するステップであって、各第二アダプタが、場合によっては、前記ヌクレオチド配列識別子の群から選択される第二ヌクレオチド配列識別子を含むステップと、e各サンプルDNAを断片化するステップと、f少なくとも第一アダプタおよび場合によっては第二アダプタを、断片化サンプルDNAに連結し、アダプタ連結DNA断片を得るステップと、g場合によっては、アダプタ連結DNA断片の少なくとも一部をプールするステップと、h第一増幅プライマを提供するステップであって、各第一プライマが、前記ヌクレオチド配列識別子の群から選択される第三ヌクレオチド配列識別子を含むステップと、i場合によっては、第二増幅プライマを提供するステップであって、各第二プライマが、場合によっては、前記ヌクレオチド配列識別子の群から選択される第四ヌクレオチド配列識別子を含むステップと、jアダプタ連結DNA断片を、第一増幅プライマおよび場合によっては第二増幅プライマで増幅し、増幅アダプタ連結DNA断片を得るステップであって、第一、任意の第二、第三および任意の第四ヌクレオチド配列識別子の組合せが、各サンプルに関して固有であるステップと、k場合によっては、増幅アダプタ連結DNA断片の少なくとも一部をプールするステップと、l増幅アダプタ連結DNA断片の第一、任意の第二、第三および任意の第四識別子配列の配列を、高処理配列決定を使用して決定するステップと、m増幅アダプタ連結DNA断片のサンプル起源を決定するステップと、を含む方法。アダプタ連結増幅産物のサンプル起源を同定する方法であって、a複数のサンプルDNAを提供するステップと、bヌクレオチド配列識別子の一群を提供する方法と、c第一増幅プライマを提供するステップであって、各第一プライマが、前記ヌクレオチド配列識別子の群から選択される第一ヌクレオチド配列識別子を含むステップと、d第二増幅プライマを提供ステップであって、各第二プライマが、場合によっては、前記ヌクレオチド配列識別子の群から選択される第二ヌクレオチド配列識別子を含むステップと、e各サンプルDNAを、第一および第二増幅プライマのペアで増幅し、増幅産物を得るステップと、f場合によっては、それぞれ異なるプライマペアで増幅されたサンプルDNAの増幅産物の少なくとも一部をプールするステップと、g場合によっては、増幅産物を断片化するステップと、h第一アダプタを提供するステップであって、各第一アダプタが、前記ヌクレオチド配列識別子から選択される第三ヌクレオチド配列識別子を含むステップと、i場合によっては、第二アダプタを提供するステップであって、各第二アダプタが、場合によっては、前記ヌクレオチド配列識別子の群から選択される第四ヌクレオチド配列識別子を含むステップと、j少なくとも第一アダプタおよび場合によっては第二アダプタを、断片化された増幅産物に連結し、アダプタ連結増幅産物を得るステップであって、第一、任意の第二、第三および任意の第四ヌクレオチド配列識別子の組合せが、各サンプルに固有であるステップと、k場合によっては、アダプタ連結増幅産物の少なくとも一部をプールするステップと、lアダプタ連結増幅産物の第一、任意の第二、第三および任意の第四識別子配列の配列を、高処理配列決定を使用して決定するステップと、mアダプタ連結増幅産物のサンプル起源を決定するステップと、を含む方法。高処理配列決定を使用して識別子配列の配列を決定するステップにおいて識別子配列の配列を、調製サンプルDNAの単一DNAテンプレートから決定する請求項9~14のいずれかに記載の方法。前記単一DNAテンプレートにおいて、第一、第二および任意のさらなる識別子配列が、内部配列の少なくとも3’または5’位にある、請求項15に記載の方法。前記単一DNAテンプレートが、2個の配列決定プライマ結合部位を含み、各配列決定プライマ結合部位が、異なるヌクレオチド配列識別子の3’位に位置し、および高処理配列決定方法において、2つの異なる配列決定反応が、単一DNAテンプレートの2個の配列決定プライマ結合部位からの2個の配列決定プライマを用いて行なわれる請求項16に記載の方法。前記単一DNAテンプレートが、2個の配列決定プライマ結合部位を含み、少なくとも1個の配列決定プライマ結合部位が、少なくとも2個のヌクレオチド配列識別子の3’位に位置し、および高処理配列決定方法において、2つの異なる配列決定反応が、2つの単一DNAテンプレートの配列決定プライマ結合部位からの2つの配列決定プライマを用いて行われる請求項16に記載の方法。高処理配列決定技術容量の容量は、その導入から2年の期間毎に、大幅に増加してきている。ますます増大する数のサンプルの多重化を可能にする高処理配列決定では、サンプルの起源を同定するのに必要な固有のアダプタまたはプライマの数も増えていく。100個の異なるプライマまたはアダプタの使用が、すでに試されていると思われるが、その数が1000個にまで増えた場合、障害になる場合がある。したがって、使用しなければならないプライマおよび/またはアダプタの数を減らせることが望ましく、これにより、サンプル調製を単純化し、作業量を減らし、技術的性能を最適化し、そしてコストを減らすことができるからである。本発明は、異なる、必要なプライマおよび/またはアダプタの数の減少を可能にする。その数は、いわゆるスプリットバーコードを使用することによって、減らすことができる。本発明によるスプリットバーコードは、少なくとも2種のアダプタおよび/またはプライマ上に存在するヌクレオチド配列識別子である。サンプルDNAまたはサンプルDNAの組合せは、たとえば、プライマペアおよび/またはアダプタのペアを使用して調製され、ここで、ペアの各プライマまたは各アダプタは、ヌクレオチド配列識別子を含む。生成された増幅産物またはアダプタ連結DNA断片は、少なくとも2種のヌクレオチド配列識別子を含む。各異なるサンプルで、ヌクレオチド識別子の固有の組合せを使用することができる。ともにスプリットバーコードとしても示されるヌクレオチド配列識別子の組合せは、識別子としての機能を果たす。定義以下の説明および実施例において、数多くの用語が使用される。そのような用語が記載されている範囲を含有する明細書および請求項の明瞭で一貫性のある理解を提供するために、以下の定義が提供される。本明細書で他に定義がない限り、使用されている全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解されている意味と同じである。全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献の開示は、その全てが、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の方法で使用される従来技術を実施する方法は、当業者に明らかであろう。分子生物学、生化学、計算化学、細胞培養、組換えDNA、生物情報学、遺伝子学、配列決定および関連分野における従来の技術の行為は、当業者に周知であり、たとえば、以下の文献:Sambrookら、MolecularCloningに論じられている。LaboratoryManual,2ndEditionColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,1989;Ausubeletal.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileySons,NewYork,1987およびperiodicupdates;ならびにtheseriesMethodsinEnzymology,AcademicPress,SanDiego。本明細書で使用される、単数形1つのa、1つのanおよび前記theは、明細書で明らかに他のことが記載されていない限り、複数形も含有する。たとえば、単離DNAは、複数の単離DNA分子たとえば、10代、100代、1,000代、10,000代、100,000代、1,000,000代、またはそれ以上の分子を含有する。本発明によるヌクレオチド配列は、ピリミジンおよびプリン塩基、好ましくは、シトシン、チミンおよびウラシル、ならびにアデニンおよびグアニンのそれぞれ、ならびにこれらの組合せのような、ヌクレオチドの任意のポリマーまたはオリゴマーを含有してもよいAlbertL.Lehninger,PrinciplesofBiochemistry,793-800WorthPub.1982参照、この文献は、全ての目的のために、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる。本発明は、任意のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはペプチド核酸成分、および任意のその化学変種、たとえば、これらの塩基のメチル化、ヒドロキシメチル化、またはグルコシル化体などを想定する。ポリマーまたはオリゴマーは、その組成が、不均質でも均質でもよく、天然資源から単離されても、または人工的または合成的に生成されてもよい。また、ヌクレオチド配列は、DNAもしくはRNA、またはこれらの混合物でもよく、単鎖または二重鎖形態中に、永久にまたは過渡的に存在してもよく、ホモ二重鎖、ヘテロ二重鎖およびハイブリット形態が挙げられる。本発明によるサンプルDNAは、生物由来であり、DNAを含むサンプルである。サンプルDNAは、DNAを含む生物からの細胞を含んでもよいが、また生物の細胞から単離されたDNAを含んでもよい。サンプルDNAが本発明の方法で使用することができるDNAを含む限り、そのようなサンプルDNAは本発明で使用されてよい。サンプルDNAを取得し得る生物として、たとえば、植物、哺乳類、真菌類および微生物がある。また、サンプルDNAは、発現配列タグまたはcDNAを含んでもよく、ここで、生物の細胞内で発現したRNAそのものが、逆転写によって、二重鎖DNAに変換される。また、サンプルDNAは、生物の異なる部位および/または数種の異なる生物から得たプールサンプルDNAを含んでもよい。プールサンプルDNAは、たとえば、サンプルDNAに含まれている各サンプルの起源が決定されるように、3-Dプールスキームでプールされてもよいたとえば、国際公開第2007/037678号パンフレットに記載されるように。DNAの断片化は、サンプルDNAに適用される場合、DNA断片となる任意の技術を含有する。当該分野で周知の技術として、超音波処理、せん断および/または酵素的制限があるが、他の技術も想定することができる。制限エンドヌクレアーゼまたは制限酵素は、たとえば、二重鎖DNA分子中の特定のヌクレオチド配列認識部位を認識する酵素であり、各認識部位でまたはその近くで、DNA分子の両鎖を切断し、平滑末端または3’-もしくは5’-突出末端を離す。認識された特定のヌクレオチド配列は、切断の回数を決定してもよく、たとえば、6個のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、平均で、4096個のヌクレオチド毎に起こり、一方、4個のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、かなり頻繁に、平均で、256個のヌクレオチド毎に起こる。I型制限酵素は、それらの認識部位と異なり、該部位からある程度の距離少なくとも1000bp離れている部位で切断する。認識部位は、非対称であり、約6~8個のヌクレオチドのスペーサーで分離された、2つの部分、-1つは3~4個のヌクレオチドを含み、もう1つは4~5個のヌクレオチドを含む-で構成される。II型制限酵素は、通常分割されず、回文構造の認識部位を有し、長さは4~8個のヌクレオチドである。これらは、同じ部位で、DNAを認識し、切断する。II型は、それらの認識配列の外側で切断し、IIB型は、それらの認識部位の両側でDNAを切断し、認識部位を切り離す。III型制限酵素たとえばEcoP15は、逆に配向された2個の別個の非回文構造の配列を認識する。これらは、認識部位の後で、DNAを約20~30個の塩基ペアで切断する。IV型制限酵素は、メチル化DNAを切断する。研磨として、平滑末端化された3’または5’突出部を有してもよい、二重鎖ヌクレオチド配列を作成するために使用される任意の技術が挙げられる。たとえば、サンプルDNAが、超音波処理を使用して、または酵素を使用して断片化された場合、ねじれ型の突出末端となる。DNAポリメラーゼI、LargeKlenow断片は、5’突出部3’陥没末端とも呼ばれるを満たすためおよび3’突出部をチューバックするために使用することができ、またはマングビーンヌクレアーゼは、3’または5’突出部をチューバックするために使用することができる。本発明による連結することは、別個の二重鎖ヌクレオチド配列の結合に関与する。二重鎖DNA分子は、平滑末端化されていてもよく、または突出部が互いにハイブリット形成できるように、適合する突出部粘着性突出部を有してもよい。DNA断片の結合は、リガーゼ酵素、DNAリガーゼで、酵素的であってもよい。しかし、DNA断片が結合する、すなわち、共有結合を形成する限り、非酵素的連結が使用されてもよい。代表的には、別個の鎖の水酸基とリン酸エステル基との間にホスホジエステル結合が、連結反応によって形成される。二重鎖ヌクレオチド配列は、連結の前に、リン酸エステル化されてもよい。増幅プライマは、DNAの合成を刺激することができる単鎖ヌクレオチド配列を表す。DNAポリメラーゼは、プライマなしでは、新規に、DNAを合成することができない。増幅プライマがDNAに対してハイブリッド形成し、すなわち、塩基ペアが形成される。互いに相補的な塩基ペアを形成することができるヌクレオチドは、たとえば、シトシンとグアニン、チミンとアデニン、アデニンとウラシル、グアニンとウラシルである。増幅プライマと現存のDNA鎖との間の相補性は、100である必要はなく、すなわち、プライマの全ての塩基が、現存のDNA鎖とペアを作る必要はない。増幅プライマが部分的にハイブリット形成している、現存のDNA鎖、たとえば、サンプルDNAまたはアダプタ連結DNA断片の配列は、しばしば、プライマ結合部位PBSと言われる。現存のDNA鎖でハイブリッド形成されたプライマの3’-末端から、現存の鎖をテンプレートとして使用して、ヌクレオチドが導入されるテンプレート指向DNA合成。また、われわれは、増幅反応でプライマとして使用される、合成オリゴヌクレオチド分子にも言及する。増幅反応で新しく合成されたヌクレオチド配列は、内部配列と言われる場合がある。PCR反応が行われる場合、内部配列は、一般的に、2つのプライマ結合部位の間の配列である。本発明によれば、プライマが増幅ステップで使用され、追加の配列をDNAに導入することができる。これは、プライマに、追加の配列、たとえば、識別子、配列決定アダプタ、またはビオチン成分のような捕捉リガンドを提供することによって、達成することができる。修飾は、供給するプライマの部分から上流のプライマの5’-末端でそれらを提供し、DNAの合成を刺激することによって、導入することができる。増幅または増幅することは、ポリヌクレオチド増幅反応、すなわち、1つ以上の出発配列から複製されたポリヌクレオチドの集団を表す。増幅することは、種々の増幅反応を言い、ポリメラーゼ連鎖反応PCR、線状ポリメラーゼ反応、核酸配列系増幅、ローリングサークル増幅、およびこのような反応が挙げられるが、これらに限定されない。一般的に、増幅プライマが増幅のために使用され、増幅反応の結果物は、増幅産物である。配列決定プライマは、DNAの合成を刺激することができ、DNAを配列するために使用される単鎖ヌクレオチド配列を表す。また、増幅プライマは、配列決定プライマとして使用してもよい。配列決定プライマは、増幅プライマとして使用することもできる。DNAポリメラーゼは、プライマなしでは、新規にDNAを合成することができない。配列決定プライマがDNAに対してハイブリッド形成し、すなわち、塩基ペアが形成される。互いに相補的な塩基ペアを形成することができるヌクレオチドは、たとえば、シトシンとグアニン、チミンとアデニン、アデニンとウラシル、グアニンとウラシルである。増幅プライマと現存のDNA鎖との間の相補性は、100である必要はなく、すなわち、プライマの全ての塩基が、現存のDNA鎖とペアを作る必要はない。配列決定プライマが部分的にハイブリット形成する、現存のDNA鎖、たとえば、サンプルDNAまたはアダプタ連結DNA断片の配列は、しばしば、配列決定プライマ結合部位SEQと言われる。現存のDNA鎖でハイブリッド形成された配列決定プライマの3’-末端から、現存の鎖をテンプレートとして使用して、ヌクレオチドが導入されるテンプレート指向DNA合成。特定のヌクレオチドA、T、CまたはGの導入は、合成の間、たとえば、パイロシーケンス中、または蛍光で標識化されたヌクレオチドを使用する時に、検出され得る。または、連鎖終止反応、たとえば、Sanger配列決定またはDye終止配列決定を使用することができる。いずれの場合も、配列決定プライマでDNAを合成し、導入ヌクレオチドおよび/または合成断片を検出することによって、DNAテンプレートのヌクレオチドの順番が決定される限り、これらおよび他の方法が想定される。配列決定は、核酸サンプル、たとえば、DNAまたはRNAにおいて、ヌクレオチド塩基配列の順番を決定することを表す。Sanger配列決定および高処理配列決定技術HTSのような多くの技術が利用可能である。Sanger配列決定は、1つの実行で、384個までの毛細管が配列解析されてもよい、毛細管電気泳動を使う検出による配列決定に関与してもよい。高処理配列決定は、一度に、数千、数百万、またはそれ以上の配列の並列型塩基配列決定に関与する。HTSは、次世代の配列決定、すなわち、固相パイロシーケンスに基づく技術、または単一ヌクレオチドリアルタイム配列決定SMRTに基づく次の次の世代の配列決定として定義され得る。HTS技術は、Roche、IlluminaおよびAppliedBiosystemsLifeTechnologiesによって提供されているように、利用可能である。さらなる高処理配列決定技術が、Helicos、PacificBiosciences、CompleteGenomics、IonTorrentSystems、OxfordNanoporeTechnologies、Nabsys、ZSGenetics、GnuBioによって記載されおよび/または利用可能である。これらの配列決定技術は、それぞれ、実際の配列決定ステップの前に、各自のサンプルの調製方法を有する。これらのステップは、高処理配列決定方法に含有されてもよい。ある場合では、配列決定ステップのための特別のステップが、効率または経済的な理由で、実際の配列決定ステップの前に、サンプル調製プロトコルに組み込まれてもよい。たとえば、断片に連結されたアダプタは、後続配列決定ステップで使用することができるセクションを含んでもよいいわゆる配列決定アダプタ。または、配列決定の前に断片の一部を増幅するために使用されるプライマは、たとえば、増幅ステップの間、配列決定アダプタまたは捕捉する成分を、後続の配列決定ステップで使用することができる増幅産物中に導入することによって、配列決定ステップで後に使用することができるセクションを導入するそれらの配列内にパートを含んでもよい。また、使用される配列決定技術によっては、増幅ステップを省いてもよい。アダプタは、限られた数の塩基ペア、たとえば、長さで約10~約100個の塩基ペアを持つ短い二重鎖DNA分子であり、これは、DNA断片または増幅産物の末端に連結され得るように、設計されている。アダプタは、一般的に、少なくとも部分的に互いに相補的なヌクレオチド配列を有する2個の合成オリゴヌクレオチドで構成されている。アダプタは、平滑末端を有してもよく、ねじれ型の末端を有してもよく、または平滑末端およびねじれ型の末端を有してもよい。ねじれ型末端は、3’または5’突出部である。2つの合成オリゴヌクレオチドを適切な条件下溶液中で混合すると、これらは互いをアニールし、二重鎖構造を形成する。アニール後、アダプタ分子の1つの末端は、制限断片の末端と互換性があり、それに連結され得るように設計されてもよく、アダプタのもう1つの末端は、連結できないように設計することができるが、それは必要のない場合であって、たとえば、アダプタが、DNA断片間で連結される場合である。ある場合では、アダプタは、断片に連結され、アダプタ連結断片の後続の操作、たとえば、増幅または配列決定のために、出発点を提供することができる。後者の場合、いわゆる配列決定アダプタは、断片に連結されてもよい。本発明の第一態様では、少なくとも2種のヌクレオチド配列識別子の組合せの、高処理配列決定用のサンプルDNAの調製での使用が提供される。したがって、少なくとも2種のヌクレオチド配列識別子の組み合わせを、高処理配列決定用のサンプルDNAの調製に使用するステップを含む方法が提供される。これによるサンプルDNAの調製では、サンプルDNAは、少なくとも2種のNSIがサンプルDNAに含有されるように、すなわち、少なくとも2種のNSIが、たとえば、増幅産物および/またはアダプタ連結DNA断片もしくはその増幅産物に包含されるように調製されることを意味する。したがって、少なくとも2種のNSIは、単一ポリヌクレオチド分子が少なくとも2種のNSIを包含するようにサンプルDNAのヌクレオチド配列に含有される。NSIの組合せは、サンプルDNA用の固有の識別子スプリットバーコードとしての役割を果たす。設計の面から、使用できるヌクレオチド配列識別子の数に実際的な限定はない。たとえば、1個のヌクレオチドが、既に、ヌクレオチド配列識別子としての役割を果たしてもよい。したがって、4個の異なるヌクレオチド配列識別子は、A、G、CまたはTと設計されてもよい。そのような単一ヌクレオチド識別子に隣接する配列は、NSIの識別を先導する役割を果たしてもよい。バーコードのサイズを大きくすることによって、可能性の数は増える。3個のDNA塩基は、64の可能な3-mer配列43、256の可能な4-mer=44、1024の可能な5-mer=45および4096の可能な7-mer=46などを可能にする。しかし、実際のところ、1つしか異ならないヌクレオチド配列識別子たとえば、4-merの場合のGATCおよびGATTを同じ実験で使用することは、1つの塩基増幅または配列決定エラーの場合、間違った配置になる可能性があるので、これを避けるため、これらの配列からサブセットを選択するのが好ましいかもしれない。同様に、NGSプラットホームは、いわゆるホモポリマー配列に関し、より高いエラーレートを有するので、2個の同じ塩基が連続しているヌクレオチド配列識別子たとえば、5-merの場合、AATGCは2個のAが連続しているの使用は避けるのが好ましいかもしれない。このような選択基準にもかかわらず、一般的に、塩基の長さの増大は選択する最初の数の4倍高くなるので、適切なヌクレオチド配列識別子の不足はない。したがって、たとえば、調製サンプルDNAの高処理配列決定方法において、2つのNSI配列を決定する場合、2つのNSIの組合せが調製サンプルDNAの起源を決定する。このように、NSIの数、つまり、たとえば、使用しなければならない異なるプライマおよび/またはアダプタの数は、大きく減らすことができる。現在、100個のサンプルでは100個のNSIが使用され、たとえばNSIを含む100個の異なるフォワードプライマが、1個のリバースプライマと組合わされる。本発明によれば、スプリットバーコードを使用することによって、10個のNSIで十分であり、したがって、100個の固有の組合せを作ることができる10個の異なるフォワードプライマおよび10個の異なるリバースプライマを使用することができる。したがって、使用しなければならないプライマの総数は大きく減らされ、その数は、101個のプライマから20個のプライマに減らされる。したがって、サンプル調製ワークフローの複雑さが減り、サンプルの同じ表示の可能性が増し、作業量および必要な貯蔵容量は減り、実験コストは減る。さらなる実施形態では、高処理配列決定のためのサンプルDNAの調製における少なくとも2種のNSIの組み合わせの使用であって、高処理配列決定において複数の調製サンプルDNAが使用され、ここで、サンプルDNAの各調製物は、第一NSIはNSIの一群から選択され、および第二NSIは該NSIの群から選択される、少なくとも2種のNSIの固有の組合せを含む使用が提供される。使用されるNSIの群は、全てのNSIを含む。各サンプルDNAで、ヌクレオチド配列識別子は前記群から選択される。これは、少なくとも2種のNSIのサンプルDNAにおいて、NSIの組合せ中で同じNSIが選択されてもよいことを意味する。さらに、少なくとも2種のNSIのサンプルDNAにおいて、異なるNSIは、NSIの組合せで選択されてもよい。NSIの組合せが各サンプルDNAに関し固有である限り、そのような組合せを使用してもよい。また、NSIの群は、NSIの少なくとも2種のサブグループを含んでもよく、ここで、第一および第二NSIは、それぞれ、異なるサブグループから選択されてもよい。第一および第二NSIに加えて、NSIの群から選択されたさらなるNSIが使用されてもよい。NSIの一群は、少なくとも4、10、100または1000個のNSIを含んでもよい。発明の全体を通し、NSIの一群が提供される中で、該群は、仮想的に提供されてもよく、すなわち、物理的でなくてもよいことは理解される。該群は、たとえば、インシリコおよび/またはインフィジコで提供される。たとえば、NSIの一群は、配列のリストとして提供されてもよい。NSIは、そのリストから選択され、およびインシリコでプライマおよび/またはアダプタを設計するために使用されてもよい。したがって、NSIの一群を提供し、アダプタを提供する後続のステップは、インシリコでNSIの一群を提供することと、その群からインシリコでNSIを選択することと、インシリコでアダプタを設計することと、および次にインフィジコでNSIを含むアダプタを提供することとを含んでもよいと理解される。または、NSIは、インフィジコで提供され、たとえば、ヌクレオチド配列識別子からなるアダプタが使用されるシナリオで、直接使用されてもよい。または、たとえば、NSIは、インフィジコで提供され、他のヌクレオチド鎖に、アダプタおよび/または増幅プライマが生成されるように結合されたとえば、連結される、その他、これによって、NSIを含むアダプタおよび/または増幅プライマが提供されてもよい。本発明の理論的根拠は、試薬の前払い費用を減らすために、各サンプルに組み込まれる少なくとも2種の異なるヌクレオチド配列識別子を使用し、増殖力を活用することによって、多数の固有の組合せを創造することである。このことを、表1に2つのNSiの数多くの数学的に最適な条件で示す。繰返しになるが、前記概念は、表2に示された例示に限定されず、同じように他の組合せも考慮することができる。たとえば、最適ではない組合せが選択されてもよい。2個を超えるNSIに関与してもよい組合せも同様に選択され得る。たとえば、10個のNSIを使用し、4個のNSIと組合せ、10×10×10×10=10,000個の固有の組合せが可能である。使用される設計および/または組合せ方法では、実施上の配慮点、たとえば、サンプルDNAの調製に関する実施上の配慮点も考慮に入れられる。調製サンプルDNAは加工を受けたサンプルDNAであり、それにより、少なくとも2種のヌクレオチド配列識別子は、DNAに含まれ、すなわち、少なくとも2種のNSIは、2個のNSIとサンプルDNAからのDNA配列とを含むDNA分子に含有される。DNA分子は、二重鎖DNA分子であっても、単鎖DNA分子であってもよい。調製サンプルDNAは、複数の異なるDNA分子を含んでもよく、ここで、各DNA分子は、各DNA分子が、それが起源とするサンプルDNAに割り当てられ得るように、NSIの固有の組合せを含むと理解される。高処理配列決定方法では、DNA分子のそれぞれのうち、配列は、複数のDNA分子から高処理配列決定により決定されてもよい。一実施形態では、調製サンプルDNAは増幅産物を含む。たとえば、少なくとも2種のNSIは、増幅産物を調製するために使用されるプライマに含有される。したがって、増幅産物は、使用される少なくとも2種の異なるプライマからの少なくとも2種のNSIを含む。増幅産物は、たとえば、PCR反応で調製されてもよい。また、増幅産物は、ネステッドPCR、すなわち、第一の一組のプライマを使用して第一PCR反応により第一増幅産物を調製し、次いで、第二の一組のプライマであって、第一の一組のプライマとは異なり、および第一PCR反応の増幅産物を増幅するプライマを使用して第二PCR反応によって調製されてもよい。ネステッドPCRは、たとえば、非常に低い濃度のDNA配列を増幅するために行ってもよく、または、たとえば、追加の識別子または追加の識別子を提供する役割を果たしてもよい。一実施形態では、調製サンプルDNAは、アダプタ連結DNA断片を含み、サンプルDNAは、断片化され、およびアダプタは、DNA断片に連結される。少なくとも2種のアダプタは、DNA断片に連結され、少なくとも2種アダプタのそれぞれが、NSIを含む。一実施形態では、調製サンプルDNAは、増幅産物と、アダプタ連結断片とを含む。一実施形態では、調製サンプルDNAは、増幅アダプタ連結断片および/またはアダプタ連結増幅産物を含む。たとえば、サンプルDNAは、その後、断片化、アダプタ連結および増幅に供されてもよい。反対に、サンプルDNAは、たとえば、その後、増幅、断片化およびアダプタ連結に供されてもよい。この実施形態では、サンプルDNAの調製で使用される全ての増幅プライマおよび/またはアダプタの少なくとも2種が、NSIを含む。一実施形態では、本発明による方法は、以下のステップを含む。aアダプタおよび/または増幅プライマを提供するステップであって、少なくとも、ヌクレオチド配列識別子の群から選択される第一ヌクレオチド配列識別子と第二アダプタまたは増幅プライマとを含む第一アダプタまたは増幅プライマが、ヌクレオチド配列識別子の群から選択される第二ヌクレオチド配列識別子を含んで提供され、および場合によっては、さらなるアダプタまたは増幅プライマが、ヌクレオチド配列識別子の群から選択されるさらなるヌクレオチド配列識別子を含んで提供されるステップと、b複数のサンプルDNAを提供するステップと、cアダプタおよび/または増幅プライマを使用してサンプルDNA上で連結および/または増幅反応を行い、前記第一、第二および場合によってはさらなるヌクレオチド配列識別子を含む連結および/または増幅サンプルDNAを提供するステップと、d高処理配列決定を使用して、少なくとも、第一、第二および場合によってはさらなるヌクレオチド配列識別子の配列を決定するステップと、e連結および/または増幅サンプルDNAのサンプル起源を決定するステップ。サンプルDNAの調製において、少なくとも2種のNSIを使用し、2個のNSIとサンプルDNAからのDNA配列とを含む単一DNA分子となる限り、そのようなサンプル調製方法は、本発明により想定されてもよい。したがって、調製サンプルDNAに少なくとも2種のNSIを導入するために、別個の異なるアダプタ連結ステップおよび/または別個の増幅ステップは組合わされてもよい。また、サンプルDNAの調製は、NSIの追加に関与しないステップを含んでもよい。サンプルDNAの調製では、後続の配列決定ステップで行ってもよいステップが含有されてもよく、逆も同様であると理解される。また、後続の配列決定ステップに必要なステップが、サンプルDNAの調製に含有されてもよい。たとえば、配列決定反応において、テンプレートに存在する配列決定プライマ結合部位に結合する配列決定プライマを使用することができる。したがって、サンプルDNAの調製で使用されるアダプタおよび/または増幅プライマは、さらに、配列決定プライマ結合部位を含んでもよい。または、配列決定プライマ結合部位は、後の段階で、これらの追加の配列を提供する高処理配列決定方法に加えてもよい。高処理配列決定方法における少なくとも2種のNSIの配列決定に加えて、サンプルDNAからの配列も配列決定されてもよい。そのような配列は、これらは、サンプルDNA調製方法で捕捉および/または増幅され、目的のサンプルDNAからの未知の配列を表すかもしれない配列であるので、内部配列と言ってもよい。また、これら内部配列は、NSIとともに配列決定されてもよく、したがって、これらの内部配列を含むサンプルの起源は、NSIの組合せにより決定され得る。このように、たとえば、遺伝子多型は、小さなヌクレオチド遺伝子多型、遺伝子欠損、挿入その他のような異なるサンプル間で、内部配列を比べるおよび/または内部配列を参照配列と比べることによって検出されてもよい。さらに、これらの内部配列は、たとえば、以下に記載する、異なる配列決定の読みがコンティグを構築するために使用されるシナリオで、調製サンプルDNAに対する異なる読みの割り当を補助してもよい。高処理配列決定は、一度に行う数千、数百万またはそれ以上の配列の平行配列決定に関与する。使用される高処理配列決定方法のいずれでも、調製サンプルDNAのNSIは、NSIの各組合せが調製サンプルDNAに割り当てられるように決定される。たとえば、コンティグは、異なる配列決定読みを整列化し、組み合わせることによって構築してもよく、これによって、少なくとも2種のNSIは連結され、したがって、少なくとも2種のNSIを含む単一DNA分子に割り当てられ得る。また、2つの配列決定反応は、調製サンプルDNAの相補的な鎖で行われてもよく、これは、たとえば、内部配列が比較的大きい時に、断片の内部配列が両末端から求められる場合、好ましい。2つの配列決定の読みを、少なくとも2種のNSIとサンプルDNAからのDNA配列とを含む調製サンプルDNAに割り当てることができる場合、そのような高処理配列決定方法は想定され得る。また、少なくとも2種のNSIは、高処理配列決定方法で単一の配列決定読みから決定してもよい。たとえば、いわゆるペアエンド配列決定方法では、第一配列決定反応において、テンプレートとして前記鎖の1つを使用して、NSIを含有する第一配列が決定されてもよい。第一配列決定反応の後、最初にテンプレートとして使用された鎖から、相補的な鎖が産生されてもよい。続いて、この新しく産生した鎖を第二テンプレートとして使用して、第二配列決定反応を行うことができる。したがって、2本のDNAテンプレート鎖は、この方法で使用される。たとえば、第一配列決定テンプレート鎖の構造は、3’-配列プライマ結合部位1-NSI1-内部配列-逆補体NSI2-逆補体配列プライマ結合部位2-5’が可能である。第一配列決定反応の後、第一配列決定テンプレート鎖の逆補体を産生することができ、これは、続いて、第二配列決定反応において使用され得る。したがって、第二配列決定反応は、以下のテンプレート:3’-配列プライマ結合部位2-NSI2-逆補体内部配列-逆補体NSI1-逆補体配列プライマ結合部位1-5’を有する。両配列解読は共存するたとえば、同じウェル中、同じビーズ中ので、NSI1およびNSI2を含む2つの配列解読は、同じ調製サンプルDNAに割り当てられ、調製サンプルDNAを同定するために使用され得る。サンプル調製および後続の配列決定のそのようなシナリオは、図5、7および10に示されている。一実施形態では、高処理配列決定方法において、調製サンプルDNAの単一DNAテンプレートが使用される。本発明による単一DNAテンプレートは、少なくとも2種のヌクレオチド配列識別子を含む単鎖DNA分子を意味する。調製サンプルDNAからの単一DNAテンプレートは、複数の単一DNAテンプレート分子を含んでもよく、たとえば、サンプルDNAに由来する異なる内部配列であって、該異なる内部配列はそれぞれ、NSIの固有の組合せと結合しているものを含むと理解される。たとえば、調製サンプルDNAが増幅産物または複数の増幅産物である場合、増幅産物は、DNAの2本鎖を含む。この実施形態では、増幅産物の鎖の1本だけが、NSI配列を決定するための配列決定反応で使用される。このように、調製サンプルDNAの起源は、コンティグの構築なしにおよび/または他のDNAテンプレートに由来する配列を必要とせずに決定され得る。NSIは、調製サンプルDNAの内部配列と隣接してもよい。また、NSIは、調製サンプルDNAの内部配列の一方の側にあってもよい。これらのシナリオにおいて、調製サンプルDNAの単一DNAテンプレート分子は、以下の構造:3’-配列プライマ結合部位-NSI1-内部配列-NSI2-5’または3’-配列プライマ結合部位-NSI1-NSI2-内部配列-5’を有することできる。調製サンプルDNAは、追加の配列を含んでもよい。配列プライマ結合部位、NSIおよび内部配列の順番は、この構造的表現において、何が対象であるかである。配列プライマ結合部位は、サンプルDNAの調製の間に導入されてよくおよび/または高処理配列決定方法において導入されてもよい。高処理配列決定で産生された配列の長さおよび/または配列の品質は、限定されてもよい。一方、配列決定長さは、内部配列と隣接する両NSIが決定できないように、制限してもよい。両配列が単一の読みで決定することができるように、内部配列の片側、すなわち、先ず配列決定される単一DNAテンプレートのパートに、NSIを有することが有利であることもある。また、NSIは、内部配列の両側にあってもよい。一実施形態では、使用される単一DNAテンプレートは、2つの配列決定プライマ結合部位を含んでもよく、ここで、各配列決定プライマ結合部位は、異なるヌクレオチド配列識別子の3’に位置する。一般的に、単一DNAテンプレートは、第一セクションおよび第二セクションを含んでもよく、その間にサンプルDNAに由来する内部配列がある。第一セクションは、配列決定プライマ結合部位を含み、その5’に位置するNSIおよび任意でさらにNSIを有し、第二セクションは、第二配列決定プライマ結合部位を含む、その5’に位置するNSIおよび任意でさらにNSIを有する。このシナリオでは、調製サンプルDNAの単一DNAテンプレートは、以下の構造:3’-配列プライマ結合部位1-NSI1-内部配列-配列プライマ結合部位1NSI2-5’を有することができる。調製サンプルDNAは、追加の配列を含んでもよい。配列プライマ結合部位、NSIおよび内部配列の順番は、この構造的表現において、対象となるものである。したがって、配列決定プライマ結合部位は、直接ヌクレオチド配列識別子の3’に位置することができるが、追加の配列が、配列決定プライマ結合部位とヌクレオチド配列識別子との間に存在してもよい。このシナリオでは、高処理配列決定方法で、単一のテンプレートから、2つの異なる配列決定反応が連続的に行われてもよい。1つの配列決定反応は、1つまたはそれ以上のNSIを決定し、第二配列決定反応は、1つの第二NSIまたはそれ以上を決定することとなる。同じテンプレートを使用して高処理配列決定方法で行われるこの実施形態の2つの配列決定反応は、以下、シングル-リードダブル-タギング配列決定と表す場合がある。シングル-リードダブル-タギングのこのようなシナリオを、図6、8および9に示す。使用されるサンプル調製の間および/または高処理配列決定方法の間、異なるサンプルまたは異なるサンプルの一部は、同時に行われてもよいステップが同時に行われるように、プールされてもよい。サンプルがプールされずまたは異なるサンプルの一部がプールされ、サンプル起源がもはや遡ることがない場合、サンプル起源はさらに決定されてもよい。たとえば、サンプルDNAの調製において、NSIが異なるステップで加えられるシナリオでは、そのようなステップ後、サンプルの少なくとも一部を調製下にプールすることが有利なこともある。たとえば、6個のNSIが36個のサンプルのために使用されるシナリオでは、各サンプルDNAは、先ず、6個の異なるNSIA-Fの1個を加えるステップに供される。固有の識別子を含むサンプルはプールされA1、B1、C1、D1、E1、F1、そして各プールに6個の識別子が加えられ、ここで、6個の各グループは固有の第二識別子A2、B2、C2、D2、E2またはF2を有し、これによって、A1、およびA2などは同一または同一でないこともある。最後に、少なくとも2種の固有の識別子が導入されるので、全てのサンプルDNAが調製されると、調製サンプルDNAは、任意の可能な方法で、プールされてもよい部分的または全体。異なる方法で、少なくとも2種のNSIの固有の組合せを含む調製サンプルDNAのサンプル起源を同定することが可能である。本発明の一実施形態では、複数のサンプルDNAから、増幅産物のサンプル起源を同定する方法であって、以下のステップを含む方法が提供される。a複数のサンプルDNAを提供するステップと、bヌクレオチド配列識別子の一群を提供するステップと、c第一増幅プライマを提供するステップであって、各第一プライマは、ヌクレオチド配列識別子の群から選択される第一ヌクレオチド配列識別子を含むステップと、d第二増幅プライマを提供するステップであって、各第二プライマは、ヌクレオチド配列識別子の群から選択される第二ヌクレオチド配列識別子を含むステップと、e各サンプルDNAを、第一および第二増幅プライマの固有の一組で増幅し、増幅産物を得るステップと、f場合によっては、増幅産物の少なくとも一部をプールするステップと、g該増幅産物の第一識別子配列および第二識別子配列の配列を、高処理配列決定を使用して決定するステップと、h該増幅産物のサンプル起源を決定するステップ。この実施形態のこの方法のサンプル調製のスキームを、図1に示す。この方法では、2個のNSIが第一および第二増幅プライマに含有される。増幅産物は、2個のNSIを含む。増幅プライマは、対象である特定の内部配列を増幅するように設計されてもよい。内部配列の少なくとも一部および増幅産物の2個のNSIを配列決定することにより、それぞれ配列決定された部分的内部配列を、起源であるサンプルDNAに割り当ててもよい。または、増幅プライマは、特定のプライマ結合部位に対して選択性があるように設計されてもよい。2個のNSIの配列を決定するだけで、特定のサンプルDNAのための増幅産物の存在または非存在が決定される。使用される増幅プライマは、後続の高処理配列決定方法で使用してもよいし、アダプタの連結に適するリン酸化5’-末端を有してもよい。または、必要な場合は、増幅産物がリン酸化されてもよい。一実施形態では、複数のサンプルDNAから、アダプタ連結DNA断片のサンプル起源を同定する方法であって、以下のステップを含む方法が提供される。a複数のサンプルDNAを提供するステップと、bヌクレオチド配列識別子の一群を提供するステップと、c第一アダプタを提供するステップであって、各第一アダプタは、ヌクレオチド配列識別子の群から選択される第一ヌクレオチド配列識別子を含むステップと、d第二アダプタを提供するステップであって、各第二アダプタは、ヌクレオチド配列識別子の群から選択される第二ヌクレオチド配列識別子を含むステップと、e各サンプルDNAを断片化するステップと、f固有の一組の第一および第二アダプタを各断片化サンプルDNAに連結し、アダプタ連結DNA断片を得るステップと、g場合によっては、アダプタ連結DNA断片の少なくとも一部をプールするステップと、hアダプタ連結DNA断片の第一識別子配列および第二識別子配列の配列を、高処理配列決定を使用して決定するステップと、iアダプタ連結DNA断片のサンプル起源を決定するステップ。この実施形態の方法のサンプル調製を示すスキームを、図2に示す。この方法では、2個のアダプタがDNA断片に連結されている。図2に示すように、アダプタは、断片のどちらの部位に連結されてもよい。特にこれは、そのようなアダプタ連結方法が使用される高処理配列決定方法に適している。2個の異なるアダプタを断片に連結する多くの方法が可能である。たとえば、先ず、DNAは、2つの異なる認識部位を持つ2個の制限酵素で断片化されてもよい。これにより、1個の制限酵素の結果物である、末端を有するDNA断片となるが、また、2個の制限酵素の結果物でもある、末端を有する断片ともなる。各末端の特異的な制限末端に連結され得る2個の異なるアダプタが設計される場合、2個の異なるアダプタを含むアダプタ連結断片が形成され得る。さらに、同じアダプタ2個を含むアダプタ連結断片が形成される。または、DNAは、たとえば、単一の制限酵素で断片化され、次いでそれに相補的なアダプタで連結されてもよい。次に、アダプタ連結断片は、再び、今度はたとえば音波処理によって断片化されてもよい。次に、断片末端は研磨されてもよく、前記研磨末端に平滑末端アダプタが連結される。結果物は、制限酵素に相補的なアダプタを含むアダプタ連結断片を含有するアダプタ連結断片と、平滑末端に相補的なアダプタとの混合物である。両シナリオとも、2個のNSIを含んでもよいアダプタ連結断片が形成される。サンプル起源を決定するのに必要な2個のNSIの組合せであるから、2個の異なるアダプタを含むアダプタ連結断片だけで、サンプル起源を決定することができる。一実施形態では、アダプタ連結増幅産物のサンプル起源を同定する方法であって、以下のステップを含む方法が提供される。a複数のサンプルDNAを提供するステップと、bヌクレオチド配列識別子の一群を提供するステップと、c第一増幅プライマを提供するステップと、d第二増幅プライマを提供するステップと、eサンプルDNAを、第一および第二増幅プライマの一組で増幅し、増幅産物を得るステップと、f場合によっては、それぞれ異なるプライマペアで増幅されたサンプルDNAの増幅産物の少なくとも一部をプールするステップと、g場合によっては、前記増幅産物を断片化するステップと、h第一アダプタを提供するステップであって、各第一アダプタが、ヌクレオチド配列識別子の群から選択される第一ヌクレオチド配列識別子を含むステップと、i第二アダプタを提供するステップであって、各第二アダプタは、ヌクレオチド配列識別子の群から選択される第二ヌクレオチド配列識別子を含むステップと、j場合によっては、さらなるアダプタを提供するステップであって、各アダプタは、ヌクレオチド配列識別子の群から選択されるさらなるヌクレオチド配列識別子を含むステップと、k第一アダプタを断片化された増幅産物に連結するステップと、l場合によっては、ステップkのアダプタ連結増幅産物の少なくとも一部をプールするステップと、m連結ステップを第二のおよびさらなるアダプタで繰り返し、各連結ステップの後、場合によっては、得られたアダプタ連結増幅産物の少なくとも一部をプールするステップと、nステップmで得たアダプタ連結増幅産物の第一、第二および場合によってはさらなる識別子配列の配列を、高処理配列決定を使用して決定するステップと、oアダプタ連結増幅産物のサンプル起源を決定するステップ。この実施形態では、各サンプルDNAは、少なくとも1つのPCR増幅反応に供される。各サンプルで、たとえば、異なる標的配列に関して、複数のPCR反応が行われてもよい。各サンプルのこれらの異なる増幅産物は、場合によっては、プールされてもよい。この実施形態のNSIは、別個のステップで加えられてもよく、および各ステップ後、アダプタ連結増幅産物の少なくとも一部がプールされてもよい。他の実施形態では、アダプタの連結および増幅を組合せ、ここで、調製サンプルDNAのサンプル起源は、調製サンプルDNAの2~4個のNSIを決定することによって決定され得る。一実施形態では、複数のサンプルDNAから、増幅アダプタ連結DNA断片のサンプル起源を同定する方法であって、以下のステップを含む方法が提供される。a複数のサンプルDNAを提供するステップと、bヌクレオチド配列識別子の一群を提供するステップと、c第一アダプタを提供するステップであって、各第一アダプタは、ヌクレオチド配列識別子の一群から選択される第一ヌクレオチド配列識別子を含むステップと、d場合によっては、第二アダプタを提供するステップであって、各第二アダプタは、場合によっては、ヌクレオチド配列識別子の一群から選択される第二ヌクレオチド配列識別子を含むステップと、e各サンプルDNAを断片化するステップと、f少なくとも第一アダプタおよび場合によっては第二アダプタを、断片化サンプルDNAに連結し、アダプタ連結DNA断片を得るステップと、g場合によっては、アダプタ連結DNA断片の少なくとも一部をプールするステップと、h第一増幅プライマを提供するステップであって、各第一プライマは、ヌクレオチド配列識別子の一群から選択される第三ヌクレオチド配列識別子を含むステップと、i場合によっては、第二増幅プライマを提供するステップであって、各第二プライマは、場合によっては、ヌクレオチド配列識別子の一群から選択される第四ヌクレオチド配列識別子を含むステップと、jアダプタ連結DNA断片を、第一増幅プライマおよび場合によっては第二増幅プライマで増幅し、増幅アダプタ連結DNA断片を得るステップであって、第一、任意の第二、第三および任意の第四NSIの組合せは、各サンプルに関して固有であるステップと、k場合によっては、増幅アダプタ連結DNA断片の少なくとも一部をプールするステップと、l増幅アダプタ連結DNA断片の第一、任意の第二、第三および任意の第四識別子配列の配列を、高処理配列決定を使用して決定するステップと、m増幅アダプタ連結DNA断片のサンプル起源を決定するステップ。この実施形態の方法のサンプル調製のスキームを、図3に示す。このシナリオで、アダプタ連結断片は、先に記載したように調製されてもよい。または、1個のアダプタだけが断片に連結されていてもよい。アダプタ複数を含むは、NSIに加えて、後続の増幅で使用されるプライマ結合部位および好ましくは配列決定プライマ結合部位を含んでもよい。断片の片側で同じアダプタが使用されるシナリオでは、同じ増幅プライマが、アダプタ連結断片を増幅するために使用されてもよい。また、プライマ結合部位は、NSIの一部を含有してもよい。または、内部配列の制限認識部位配列を超えるDNA断片の内部配列に、追加の異なる相補的なヌクレオチドが必要な、より選択的なプライマが使用されてもよい。選択的プライマの概念は、たとえば、国際公開第2006/137733号パンフレットに詳細に記載され、この実施形態の方法は、そのような選択的プライマを使用するサンプルDNAの調製に関与する。たとえば、アダプタ配列の一部およびアダプタが連結されているサンプルDNAの内部配列に相補的なプライマが、制限認識部位と追加のヌクレオチドとを含むように設計される。追加のヌクレオチドは、プライマに選択性を与える選択的ヌクレオチドである。選択的プライマは、平均して、4個のアダプタ連結制限断片中1個に結合してもよく、伸長された3’-末端を有してもよい。選択的プライマの概念は、AFLP欧州特許第534858号明細書から、複雑な削減方法として周知である。いずれの場合も、最終結果物は、増幅アダプタ連結断片であって、これは、少なくとも2種のNSIまたは3種または4種のNSIを含んでもよい。より多くのNSIを含有させることは、これにより、さらにNSIの数を減らし得るので、有利である。たとえば、10,000個のサンプルに関して、2個のNSIの組合せで100個のNSIが必要であり100×100、4個のNSIの組合せでは10個のNSIが必要である10×10×10×10。一実施形態では、アダプタ連結増幅産物のサンプル起源を同定する方法であって、以下のステップを含む方法が提供される。a複数のサンプルDNAを提供するステップと、bヌクレオチド配列識別子の一群を提供する方法と、c第一増幅プライマを提供するステップであって、各第一プライマは、前記ヌクレオチド配列識別子の群から選択される第一ヌクレオチド配列識別子を含むステップと、d第二増幅プライマを提供ステップであって、各第二プライマは、場合によっては、前記ヌクレオチド配列識別子の群から選択される第二ヌクレオチド配列識別子を含むステップと、e各サンプルDNAを、第一および第二増幅プライマのペアで増幅し、増幅産物を得るステップと、f場合によっては、それぞれ異なるプライマペアで増幅されたサンプルDNAの増幅産物の少なくとも一部をプールするステップと、g場合によっては、増幅産物を断片化するステップと、h第一アダプタを提供するステップであって、各第一アダプタが、前記ヌクレオチド配列識別子から選択される第三ヌクレオチド配列識別子を含むステップと、i場合によっては、第二アダプタを提供するステップであって、各第二アダプタは、場合によっては、前記ヌクレオチド配列識別子の群から選択される第四ヌクレオチド配列識別子を含むステップと、j少なくとも第一アダプタおよび場合によっては第二アダプタを、断片化された増幅産物に連結し、アダプタ連結増幅産物を得るステップであって、第一、任意の第二、第三および任意の第四ヌクレオチド配列識別子の組合せは、各サンプルに固有であるステップと、k場合によっては、アダプタ連結増幅産物の少なくとも一部をプールするステップと、lアダプタ連結増幅産物の第一、任意の第二、第三および任意の第四識別子配列の配列を、高処理配列決定を使用して決定するステップと、mアダプタ連結増幅産物のサンプル起源を決定するステップ。この実施形態の方法のサンプル調製のスキームを、図4に示す。このシナリオでは、サンプルDNAは、先に記載したように、増幅に供されてもよく、ここでは、少なくとも1つのプライマがNSIを含んでいる。増幅産物は直接使用されてもよく研磨して、またはせずに、およびアダプタは増幅産物に連結されてもよい。このシナリオでは、アダプタ連結増幅産物は、どちらの末端も同じアダプタを含むだろう。このアダプタ連結増幅産物は、さらに、断片化および第二アダプタへのアダプタ連結に供してもよく、2個の異なるアダプタを有するアダプタ連結増幅産物を得る。または、増幅産物は、2個の異なるアダプタに相補的な2個の異なる末端を持つ断片を得る断片化ステップに供してもよい。いずれにしても、2~4個のNSIを含むアダプタ連結増幅産物が形成される。一実施形態では、先に記載した方法のいずれかに従った方法で、高処理配列決定を使用して識別子配列の配列を決定するステップにおいて、識別子配列の配列が、調製サンプルDNAの単一DNAテンプレートから決定される。前記方法において、調製サンプルDNAは、増幅産物、アダプタ連結断片、アダプタ連結増幅産物および/または増幅アダプタ連結断片を含むことは理解される。一実施形態では、単一DNAテンプレートにおいて、第一、第二および任意のさらなる識別子配列は、内部配列の少なくとも3’または5’である。調製サンプルDNA、これから配列識別子配列が調製サンプルDNA単一DNAテンプレートから決定される、のうち、サンプル起源を固有に同定するために必要な識別子配列の組合せは、内部配列の少なくとも3’または5’である。したがって、配列プライマ結合部位および内部配列が隣接する識別子配列を有するDNA配列決定テンプレートが調製され得る。そのようなDNA配列決定テンプレートの3’末端は、たとえば、以下のスキーム:’3-SEQ1-NSI4-NSI3-NSI2-NS1l-IS-などで表される。このように、テンプレートの配列が決定されると、全ての配列識別子が先ず決定される。そのようなDNAテンプレートは、内部配列の一末端に配列識別子を加えることによってのみ産生されてもよい。たとえば、アダプタをDNA断片の一端だけに加えることによって、および/または非対称アダプタを使用または1個のプライマだけが配列識別子を含む増幅プライマを使用することによって。または、アダプタおよび/または増幅プライマは、全ての配列識別子が両末端に位置するように、DNA断片の5’および3’末端の両方に加えてもよい。そのようなDNAテンプレートは、以下のスキーム:’’’3-SEQ1-NSI4-NSI3-NSI2-NS1l-IS-NSI1-NSI2-NSI3-NSI4-5’で表される。1つ以上の別個のステップにおいて、ISの両末端に加えられたNSIおよび一端だけに加えられたNSIを有するこれらの異なる方法の組合せも可能である。そのようなDNAテンプレートは、以下のスキーム:’’’3-SEQ1-NSI2-NSI1-IS-NSI1-5’で表される。配列識別子の固有の組合せは配列プライマ結合部位および内部配列が隣接するDNAテンプレートが産生される方法が使用される限り、そのようなDNAテンプレートは充分であろう。したがって、ヌクレオチド配列識別子を持つおよび持たない増幅プライマおよび/またはアダプタの異なる組合せが使用され得る。たとえば、実施例3および4に示すように、任意のNSI2およびNSI4が、NSI1およびNS3に対応する場合、適切なDNAテンプレートが産生されるすなわち、配列プライマ結合部位はまだ必要とし、それは高処理配列決定用のサンプル調製において加えられてもよい。同様に、NSI2およびNSI4配列は含有されなくてもよい。また、NSI2は含有されずおよびNSI4はNS3に対応してもよく、またはNS12はNSI1に対応しおよびNSI4は含有されなくてもよい。このシナリオでは、DNAテンプレートの一末端だけが、NSIの全てを含んでもよい。さらなる実施形態では、識別子配列の配列が、調製サンプルDNAの単一DNAテンプレートから決定される場合、単一DNAテンプレートは、各配列決定プライマ結合部位が、異なるヌクレオチド配列識別子の3’に位置し、および高処理配列決定方法において、2つの異なる配列決定反応が、単一DNAテンプレートの2つの配列決定プライマ結合部位からの2つの配列決定プライマで行われる、2つの配列決定プライマ結合部位を含んでもよい。2つの異なる配列決定プライマ結合部位および対応5’NSIまたはNSIは、調製サンプルDNAの内部配列と隣接することができる。調製サンプルDNAは、先に記載したように、増幅産物、アダプタ連結断片、アダプタ連結増幅産物および/または増幅アダプタ連結断片であってもよい。一実施形態では、単一DNAテンプレートは、2つの配列決定プライマ結合部位を含み、ここで、少なくとも1つの配列決定プライマ結合部位は、少なくとも2種のヌクレオチド配列識別子の3’に位置し、および高処理配列決定方法において、2つの異なる配列決定反応が、単一DNAテンプレートの2つの配列決定プライマ結合部位からの2つの配列決定プライマで行われる。一実施形態では、識別子配列の配列が、調製サンプルDNAの単一DNAテンプレートから決定される場合、単一DNAテンプレートは、2つの配列決定プライマ結合部位を含んでもよく、ここで、各配列決定プライマ結合部位は、1個以上のヌクレオチド配列識別子の3’に位置し、および高処理配列決定方法において、2つの異なる配列決定反応は、単一DNAテンプレートの2つの配列決定プライマ結合部位からの2つの配列決定プライマで行われる。2つの異なる配列決定プライマ結合部位および対応する5’NSIまたはNSIは、調製サンプルDNAの内部配列と隣接することができる。1個以上のヌクレオチド配列識別子のそれぞれは、同じであってもよい。そのような配置は、以下の’-3’-SEQ1-NS1-NS2-IS-SEQ2-NS1-NS2-5’と表される。このように、単一のテンプレートからの配列決定によって、固有の識別子の両固有の組合せが2度配列決定される。そのような調製サンプルDNAは、先に記載したように、増幅産物、アダプタ連結断片、アダプタ連結増幅産物および/または増幅アダプタ連結断片であってもよい。一実施形態では、識別子配列の配列が、調製サンプルDNAの単一DNAテンプレートから決定される場合、単一DNAテンプレートは、2つの配列決定プライマ結合部位を含んでもよく、ここで、1つの配列決定プライマ結合部位は、2個以上のヌクレオチド配列識別子の3’に位置し、およびもう1つの配列決定プライマ結合部位は、内部配列に隣に位置してもよい。高処理配列決定方法では、2つの異なる配列決定反応が、単一DNAテンプレートの2つの配列決定プライマ結合部位からの配列決定プライマで行われる。2つの異なる配列決定プライマ結合部位および対応は、調製サンプルDNAの内部配列と隣接してもよい。そのような配置は、模式的に、以下の’-3’-SEQ1-IS-SEQ2-NS1-NS2-5’と表される。このように、単一のテンプレートから一回の配列決定操作での配列決定により、内部配列が決定されてもよく、他の配列決定操作で、配列識別子の固有の組合せが決定されてもよい。実施例1以下に、スプリットバーコードによるサンプル調製用の2つの異なる適用例を例示するが、2つの異なる分子のサンプルへの導入に関与する他のサンプル調整方法も本発明の範囲に適合する。1バーコード化プライマを用いるPCR増幅、22つの制限酵素で設計されたサンプルへの、または単一酵素、その後アダプダ連結1、断片化末端の断片化および構築、アダプダ連結2で設計されたサンプルへのアダプダ連結。PCR増幅スプリットバーコードバーコード1およびバーコード2を内部に持つ、プライマペアの機能的要素を記載し、これは、ペアエンド配列決定Aまたは2つのプライミング現象で同じ鎖からの配列決定Bにより決定する。概略図を図11に示す。図11Aにおいて、ユニバーサルテール1太字の矢印は配列プライマ部位1すなわち、配列決定で使用されるプライマ部位であり、ユニバーサルテール2点状の矢印は配列プライマ部位1すなわち、配列決定で使用されるプライマ部位であることが観察され、例として、それぞれ、IlluminaGAペアエンド配列決定で使用されるような、P5およびP7プライマがある。図11Bで、ユニバーサルテール1太字の矢印は、配列プライマ部位1すなわち、配列決定で使用されるプライマ部位であり、およびユニバーサルテール2ストライプの矢印は配列プライマ部位2すなわち、配列決定で使用されるプライマ部位であり、例として、それぞれ、同じ鎖からの2つのプライマ現象によるIlluminaGAで使用されるように、P5およびP7プライマがある。概念は、プライマのペアによる増幅に関与する任意の方法を使用することができる。その例として、増幅産物配列決定たとえば、突然変異、天然の遺伝子多型の検出、KASPプライマ、Scorpionsプライマその他のようなPCRプライマに関与する多重化SNP遺伝子型判定がある。アダプダ連結全ゲノムフィジカルマッピング試験で、480個の異なるBACプールサンプルを組み合わせた。これには、480個の異なるEcoRIバーコード化アダプダが必要であった。アダプダのこの量は、5ntバーコードを有する80個のEcoRIアダプダを、3ntバーコードを持つ6個のMselのアダプダと組み合わせて使用することにより、回避し、これは、組合せで、480個の固有の8-merバーコードを産生する。この場合、前記PCR増幅および図11Bで記載するように、配列決定を、2つの配列プライマ現象を起こすことにより行った。図12で、2個のバーコード化アダプダの使用に関する概要を、IlluminaGA配列決定P5およびP7増幅および配列プライマ領域を使用するに照らして記載する。パートAは、DNAを消化するため2個の制限酵素を使用するサンプル調製を記載し、一方、パートBは、制限酵素の組合せおよび平滑末端アダプダ連結を使用するサンプル調製を記載する。2つのバーコード化アダプダの使用に関与するサンプル調整のための別の方法も、本発明の範囲に包含される。概念は、制限断片配列決定、AFLP、RAD、WGP、全ゲノム配列決定、ペアエンド配列決定、還元型表現配列決定、その他のような2つのアダプダの連結に関与する任意の方法を使用することができる。"