セルピンフィンガーポリペプチドおよび生物学的活性ポリペプチドを含む、融合ポリペプチド。セルピンフィンガーポリペプチドのアミノ酸2位のアミノ酸残基がグルタミン酸であることを特徴とする、請求項1記載の融合ポリペプチド。セルピンフィンガーポリペプチドが、8~14個のアミノ酸残基の長さのアミノ酸配列を有することを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。生物学的活性ポリペプチドが、HIV融合インヒビターポリペプチドであることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。セルピンフィンガーポリペプチドのアミノ酸配列が、より選択されることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。セルピンフィンガーポリペプチドのアミノ酸配列が、であることを特徴とする、請求項5記載の融合ポリペプチド。セルピンフィンガーポリペプチドと生物学的活性ポリペプチドとの間に、GGSGGSEQIDNO12のアミノ酸配列を有するペプチド性リンカーポリペプチドを含むことを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。HIV融合インヒビターポリペプチドのアミノ酸配列が、であることを特徴とする、請求項4~7のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。請求項1~8のいずれか一項記載の融合ポリペプチドとセルピンとのタンパク質複合体。セルピンがα1アンチトリプシンおよびアンチトロンビンより選択されることを特徴とする、請求項9記載のタンパク質複合体。薬剤としての使用のための、請求項1~8のいずれか一項記載の融合ポリペプチド、または、請求項9もしくは10のいずれか一項記載のタンパク質複合体。ウイルス感染症の処置における使用のための、請求項1~8のいずれか一項記載の融合ポリペプチド、または、請求項9もしくは10のいずれか一項記載のタンパク質複合体。HIV感染症の処置における使用のための、請求項4~8のいずれか一項記載の融合ポリペプチド、または、請求項9もしくは10のいずれか一項記載のタンパク質複合体。請求項1~8のいずれか一項記載の融合ポリペプチドとのタンパク質複合体の製造のための、α1アンチトリプシンまたはアンチトロンビンの使用。‐請求項1~8のいずれか一項記載の融合ポリペプチド、または、請求項9もしくは10のいずれか一項記載のタンパク質複合体、および‐α1アンチトリプシンまたはアンチトロンビンを含む、キット。発明の詳細な説明本明細書において、‐セルピンフィンガーポリペプチド、および‐さらなるポリペプチドを含み、該さらなるポリペプチドが、阻害、活性化、結合、または標識などの生物学的活性を発揮する任意のポリペプチドであり得る、セルピンフィンガー融合ポリペプチドが報告される。本明細書における一つの局面において、セルピンフィンガー融合ポリペプチドおよびセルピンを含み、該融合ポリペプチドが、セルピンの鎖4aとしてβシートAの中央の中に組み込まれる、タンパク質複合体が報告される。セルピンフィンガー融合ポリペプチドは、セルピンに対して高親和性および機能的空間配向で、融合されたさらなるポリペプチドを標的とし、かつ固定する。一つの態様において、ペプチド性リンカーポリペプチドを介してHIV融合インヒビターポリペプチドに融合されたセルピンフィンガーポリペプチドを含む、セルピンフィンガー融合ポリペプチドが報告される。本発明内で使用されるセルピンフィンガーポリペプチドという用語は、セルピンの天然の反応性中央ループか、またはその合成類似体のいずれかに由来する、8~16個のアミノ酸残基からなるポリペプチドを表す。一つの態様において、ポリペプチドのアミノ酸配列は、11~13個のアミノ酸残基からなる。一つの態様において、セルピンフィンガーポリペプチドのアミノ酸配列は、より選択される。一つの態様において、セルピンフィンガーポリペプチドのアミノ酸配列は、である。一つの態様において、セルピンフィンガーポリペプチドは、α1アンチトリプシンまたはアンチトロンビン由来である。セルピンという用語は、多様な機能を有するタンパク質のスーパーファミリーを表す。セルピンスーパーファミリーの例示的なメンバーを、以下に列挙する。一つの態様において、セルピンは、α1アンチトリプシンセルピンA1、アンチトリプシン関連タンパク質セルピンA2、α1アンチキモトリプシンセルピンA3、カリスタチンセルピンA4、プロテインCインヒビターセルピンA5、コルチゾール結合グロブリンセルピンA6、チロキシン結合グロブリンセルピンA7、アンジオテンシノーゲンセルピンA8、センテリンcenterinセルピンA9、プロテインZ関連プロテアーゼインヒビターセルピンA10、セルピンA11、バスピンvaspinセルピンA12、セルピンA13、単球好中球エラスターゼインヒビターセルピンB1、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター2セルピンB2、扁平上皮癌抗原1および2セルピンB3およびB4、マスピンセルピンB5、PI6セルピンB6、メグシンmegsinセルピンB7、PI8セルピンB8、PI9セルピンB9、ボマピンbomapinセルピンB10、セルピンB11、ユコピンyukopinセルピンB12、ハーピンhurpin/ヘッドピンheadpinセルピンB13、アンチトロンビンセルピンC1、ヘパリン補因子IIセルピンD1、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター1セルピンE1、グリア由来ネキシン/プロテアーゼネキシンIセルピンE2、色素上皮由来因子セルピンF1、α2アンチプラスミンセルピンF2、補体1インヒビターセルピンG1、HSP47セルピンH1、ニューロセルピンセルピンI1、およびパンクピンpancpinセルピンI2より選択される。セルピンの断片とは、本明細書において報告されるセルピンフィンガー融合ポリペプチドを、セルピン断片の鎖4aとしてβシートAの中央の中に組み込む機能を依然として発揮する分子である。本明細書において使用される生物学的活性ポリペプチドという用語は、例えば細胞株およびウイルスを用いるバイオアッセイなどの、人工的な生物系においてもしくはそれに対して、または、鳥、もしくはヒトを含む哺乳動物を含むがそれに限定されない動物に対してインビボで、投与された時に生物学的効果を引き起こす、有機分子、例えば、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、核タンパク質、ムコタンパク質、リポタンパク質、合成ポリペプチドまたはタンパク質などの生体高分子を指す。この生物学的効果は、酵素阻害または活性化、受容体またはリガンドへの結合、結合部位または周囲のいずれかでのシグナル誘発またはシグナル調節であり得るが、それらに限定されない。生物学的活性分子は、非限定的に、例えば、免疫グロブリン、またはホルモン、またはサイトカイン、または増殖因子、または受容体リガンド、またはアゴニストもしくはアンタゴニスト、または細胞傷害剤、または抗ウイルス剤、または造影剤、または酵素インヒビター、酵素アクチベーター、もしくはアロステリック基質などの酵素活性調節物質である。一つの態様において、生物学的活性ポリペプチドは、免疫グロブリン、免疫グロブリン結合体、またはHIV融合インヒビターポリペプチドである。HIV融合インヒビターポリペプチドとは、とりわけ、膜融合が原因のHIウイルスによる感染していない細胞の感染の阻害を含む、膜融合に関連する事象または膜融合事象自体を阻害するポリペプチドである。HIV融合インヒビターポリペプチドは、一つの態様において、直鎖状ポリペプチドである。例えば、それは、一つの態様におけるように、HIVgp41外部ドメイン由来である。例えば、DP107またはDP178などである。HIV融合インヒビターポリペプチドのアミノ酸配列は、5~100個のアミノ酸残基からなり、一つの態様において、10~75個のアミノ酸残基からなり、さらなる態様において、15~50個のアミノ酸残基からなる。一つの態様において、HIV融合インヒビターポリペプチドのアミノ酸配列は、SEQIDNO13およびSEQIDNO32~42からなる群より選択される。HIV融合インヒビターポリペプチドのさらなる例は、米国特許第5464933号、米国特許第5656480号、米国特許第6013263号、米国特許第6017536号、米国特許第6020459号、米国特許第6093794号、米国特許第6060065号、米国特許第6258782号、米国特許第6348568号、米国特許第6479055号、米国特許第6656906号、国際公開公報第199619495号、国際公開公報第199640191号、国際公開公報第199959615号、国際公開公報第200069902号、および国際公開公報第2005067960号において見出され得る。例えば、HIV融合インヒビターポリペプチドのアミノ酸配列は、米国特許第5464933号のSEQIDNO1~10;米国特許第5656480号のSEQIDNO1~15;米国特許第6013263号のSEQIDNO1~10および16~83;米国特許第6017536号のSEQIDNO1~10、20~83、および139~149;米国特許第6093794号のSEQIDNO1~10、17~83、および210~214;米国特許第6060065号のSEQIDNO1~10、16~83、および210~211;米国特許第6258782号のSEQIDNO1286および1310;米国特許第6348568号のSEQIDNO1129、1278~1309、1311、および1433;米国特許第6479055号のSEQIDNO1~10、および210~238;米国特許第6656906号のSEQIDNO1~171、173~216、218~219、222~228、231、233~366、372~398、400~456、458~498、500~570、572~620、622~651、653~736、739~785、787~811、813~823、825、827~863、865~875、877~883、885、887~890、892~981、986~999、1001~1003、1006~1018、1022~1024、1026~1028、1030~1032、1037~1076、1078~1079、1082~1117、1120~1176、1179~1213、1218~1223、1227~1237、1244~1245、1256~1268、1271~1275、1277、1345~1348、1350~1362、1364、1366、1368、1370、1372、1374~1376、1378~1379、1381~1385、1412~1417、1421~1426、1428~1430、1432、1439~1542、1670~1682、1684~1709、1712~1719、1721~1753、1755~1757;または国際公開公報第2005067960号のSEQIDNO5~95を含む群より選択され得る。表1HIV融合インヒビターポリペプチドのアミノ酸配列本出願内で使用されるペプチド性リンカーポリペプチドという用語は、天然および/または合成起源のペプチド性リンカーポリペプチドを表す。それは、20個の天然に存在するアミノ酸が単量体構成要素である、直鎖状アミノ酸残基鎖からなる。鎖は、1~50個のアミノ酸残基の長さ、一つの態様において、1~28個のアミノ酸残基の長さ、別の態様において、3~25個のアミノ酸残基の長さを有する。ペプチド性リンカーポリペプチドは、反復アミノ酸配列、またはヒンジ機能を有するポリペプチドなどの、天然に存在するポリペプチドの配列を含有してもよい。ペプチド性リンカーポリペプチドは、ポリペプチドの各々が正確にフォールディングし、かつ適切に提示されるのを可能にすることにより、結合された/融合されたポリペプチドの結合体または融合体各々におけるポリペプチドが、その生物学的活性を果たせることを確実にする機能を有する。一つの態様において、ペプチド性リンカーポリペプチドは、グリシン、グルタミン、および/またはセリン残基に富むように設計されている合成ペプチド性リンカーポリペプチドである。残基は、例えば、などの、5個までのアミノ酸残基の小さな反復単位において配置される。反復単位は、多量体単位を形成するように2~5回反復されてもよい。多量体単位のアミノ末端および/またはカルボキシ末端に、6個までの追加的な任意の天然に存在するアミノ酸残基が付加されてもよい。他の合成ペプチド性リンカーポリペプチドは、例えば、リンカーにおけるセリンのように、10~20回反復される単一のアミノ酸残基から構成され、アミノ末端および/またはカルボキシ末端に、6個までの追加的な任意の天然に存在するアミノ酸残基を含んでもよい。一つの態様において、ペプチド性リンカーポリペプチドは、抗体ヒンジ領域、より選択される。すべてのペプチド性リンカーポリペプチドは、核酸分子によりコードされ得、かつ従って、組み換えで発現させることができる。ペプチド性リンカーポリペプチドは、それ自体ポリペプチドであるため、セルピンフィンガーポリペプチドは、2個のアミノ酸の間に形成されるペプチド結合を介してペプチド性リンカーポリペプチドに連結される。表2ペプチド性リンカーポリペプチドのアミノ酸配列鎖4aとしてβシートAの中央の中にという用語は、セルピンのβシートA、例えばα1アンチトリプシン、またはアンチトロンビンのβシートAの鎖4および5の間の、セルピンフィンガー融合ポリペプチドの挿入を表す。任意でペプチド性リンカーを介して生物学的活性を有するポリペプチドに融合されたセルピンフィンガーポリペプチドを含む融合ポリペプチドにおいて、融合された生物学的活性を有するポリペプチドは、単離されたポリペプチドと比較して改善された特性を有する。融合ポリペプチドは、例えば、α1アンチトリプシンなどのセルピンのβシートA中に挿入され、融合された生物学的活性を有するポリペプチドのインビボ半減期を改善することができる。アンチトロンビン由来のセルピンフィンガーポリペプチドは、α1アンチトリプシンのβシート中に良好に挿入することが見出されている。この組み合わせは、本発明の局面の一つの態様である。これは、例えば、表3に提示されるインビトロの会合データから見ることができる。さらに、6個のアミノ酸残基の最短のアミノ酸配列を有するセルピンフィンガーポリペプチドは、最速で挿入しないが、11~13個のアミノ酸残基の長さのより長いものは、最速で挿入することが、見出されている。さらに、セルピンフィンガーポリペプチドの2番目のアミノ酸セルピンフィンガーポリペプチドのN末端から数えてとしてのアミノ酸であるグルタミン酸は、セルピンフィンガー融合ポリペプチドのセルピンβシート中への挿入効率を増大させる。表3セルピンフィンガーポリペプチドのアミノ酸配列およびセルピンα1アンチトリプシンとのインビトロの会合T12以下に、本明細書において報告される局面を、ペプチド性リンカーポリペプチド、および生物学的活性ポリペプチドとしてHIV融合インヒビターポリペプチドを含む、セルピンフィンガー融合ポリペプチドで例証する。以下は、単に本明細書において報告される主題を例証するために提示され、かつ、限定または制限として扱われるべきではない。様々な融合ポリペプチドが調製されている。コードする遺伝子は、化学的遺伝子合成により取得され、かつポリペプチドは、大腸菌Ecoliにおいて組み換えで生産されている。様々な融合ポリペプチドが、精製タグとしてのストレプトアビジン担体タンパク質、トリプシン切断部位、セルピンフィンガーポリペプチド、ペプチド性リンカーポリペプチド、およびHIV融合インヒビターポリペプチドを含む構築物として、発現されている。一つの態様において、トリプシン切断部位のアミノ酸配列は、GRである。セルピンフィンガーポリペプチドのアミノ酸配列は、一つの態様において、であり、N末端および/またはC末端のリンカーを有するかまたは有さないかのいずれかであり、該リンカーは、独立してかつ個々に、S、またはG、またはSGより選択される。ペプチド性リンカーポリペプチドのアミノ酸配列は、一つの態様において、である。融合ポリペプチドFP1のアミノ酸配列はSEQIDNO76であり、融合ポリペプチドFP2のアミノ酸配列はSEQIDNO77であり、かつ融合ポリペプチドFP3のアミノ酸配列はSEQIDNO78である。融合ポリペプチドFP1~FP3において、同一のセルピンフィンガーポリペプチドが、異なるHIV融合インヒビターポリペプチドに結合されている。融合ポリペプチドFP3は、大腸菌においてFP2よりも良好に発現され、次に、FP2は、融合ポリペプチドFP1よりも良好に発現される。BIAcoreアッセイにおける、標的HIVHR1ポリペプチドに対する結合について、融合ポリペプチドの同一の配列が得られるFP3>FP2>FP1。同一の配列はまた、細胞間融合アッセイCCFアッセイにおける抗ウイルス活性についても見出されている。ゲル電気泳動尿素PAGEにより、本発明による融合ポリペプチドおよびα1アンチトリプシンのタンパク質複合体が形成されることが示されている。個々のFPX融合ポリペプチドとα1アンチトリプシンとの間の安定な複合体形成を、図1に示す。タンパク質複合体および遊離のα1アンチトリプシンは、SDSPAGEゲル電気泳動により分離することができないため、HR1ポリペプチドビオチン結合体とのインキュベーションを伴うウェスタンブロットによる、タンパク質複合体の形成の測定を行わなければならない。例示的なブロットを、図2に示す。遊離の融合ポリペプチドおよびタンパク質複合体の調製用分離のために、サイズ排除クロマトグラフィーを使用することができる。個々の分画のSDSPAGE分析と共に、例示的なクロマトグラムを、図3に示す。様々なセルピンフィンガー融合ポリペプチドを、セルピンα1アンチトリプシンとの会合速度についてアッセイしている。最速の結合物質は、1~4時間のインビトロの会合T12を有する。表4に、単離されたHIV融合インヒビターポリペプチドと比較した、FP1~FP3融合ポリペプチドの結合特性を示す。表4FP1~FP3のHIVHR1ポリペプチドに対する結合特性表面プラズモン共鳴により測定した結合親和性は、遊離の融合インヒビターおよび3種の融合ペプチドについて同様の結合定数を呈する。図4に示すBIAcore結合ダイアグラムより、一方で、タンパク質複合体がHIVHR1ポリペプチドに結合していること図4b、かつ他方で、FP2を含有するタンパク質複合体が、固定化されたHR1ポリペプチドについて3種の複合体のうちで最高の親和性を有することが、見られ得る。表5より、融合ポリペプチドFP1~FP3は、単離されたHIV融合インヒビターポリペプチドのように匹敵する抗ウイルス活性を有することが、見られ得る。表5CCFアッセイにおける融合ポリペプチドの抗ウイルス活性以下の実施例、配列表、および図面は、本発明の理解を手助けするために提供され、本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に示される。本発明の精神から逸脱することなく、示される手順において改変が作製され得ることが、理解される。配列表の説明材料および方法組み換えDNA技術SambrookJetalMolecularCloningALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratoryPressColdSpringHarborNewYorkに記載されているような標準的な方法を用いて、DNAを操作した。分子生物学用試薬を、製造業者の指示に従って使用した。遺伝子合成所望の遺伝子セグメントを、化学合成により調製した。所望の遺伝子セグメントを、遺伝子合成により調製した。合成した遺伝子断片を、特定の発現ベクター中にクローニングした。サブクローニングした遺伝子断片のDNA配列を、DNA塩基配列決定法により確認した。タンパク質測定結合体のタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算したモル吸光係数を用いて、280nmでの光学密度ODを測定することにより決定した。実施例1発現プラスミドの作製融合ポリペプチドFP1、FP2、およびFP3を、組み換え手段により調製した。それらを、大腸菌における高レベル発現のための担体タンパク質としてコアストレプトアビジンを用い、大腸菌においてより大きな融合タンパク質として発現させた。トリプシンFP1およびFP2またはエンドプロテイナーゼLysCFP3のいずれかを用いたインビトロの酵素的切断により、所望のポリペプチドを放出させた。コアストレプトアビジン担体融合タンパク質の設計ポリペプチドFP1SEQIDNO76=GRSEQIDNO05SEQIDNO52SEQIDNO37、FP2SEQIDNO77=GRSEQIDNO82SEQIDNO75SEQIDNO13、およびFP3SEQIDNO78=GRSEQIDNO83SEQIDNO50SEQIDNO40を、それぞれ独自のトリプシンまたはLysCエンドプロテイナーゼ切断部位を含有するGRまたはGKプロテアーゼリンカーを介して、コアストレプトアビジン配列SEQIDNO81に融合させた。コアストレプトアビジンをコードする核酸、短いエンドプロテイナーゼリンカーGRをコードする核酸、セルピンフィンガーポリペプチドをコードする核酸、リンカーをコードする核酸、およびHIV融合インヒビターペプチドをコードする核酸を含むコアストレプトアビジン融合遺伝子を、応じた核酸セグメントの連結により、公知の組み換え方法および技術で構築した。ポリペプチドF1、F2、およびF3をコードする核酸配列は、化学合成により作製し、その後、増幅のために大腸菌プラスミド中にライゲーションした。サブクローニングした核酸配列を、DNA塩基配列決定法により検証した。基礎の/出発となる大腸菌発現プラスミド4980の作製および説明プラスミド49804980pBRoriURA3LACISACは、大腸菌におけるコアストレプトアビジンの発現のための発現プラスミドである。それは、プラスミド19661966pBRoriURA3LACITリピート;EPB1422237において報告されている由来の3142塩基対の長さのEcoRICelII断片の、435塩基対の長さのコアストレプトアビジンをコードするEcoRICelII断片とのライゲーションにより生成した。コアストレプトアビジン大腸菌発現プラスミドは、以下の要素を含む:‐大腸菌における複製のための、ベクターpBR322由来の複製開始点SutcliffeGetalQuantBiol437790による25173160位の塩基対に対応する、‐大腸菌pyrF変異体株の相補によるプラスミド選択を可能にするウラシル栄養要求性、オロチジン5ホスファートデカルボキシラーゼをコードするサッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiaeのURA3遺伝子RoseMetalGene29113124、‐以下で作られているコアストレプトアビジン発現カセット‐StueberDら下記参照による合成リボゾーム結合部位を含む、T5ハイブリッドプロモーターBujardHetalMethodsEnzymol155416433およびStueberDetalImmunolMethodsIV121152によるT5PN250304ハイブリッドプロモーター、‐コアストレプトアビジン遺伝子、および‐2種のバクテリオファージ由来転写ターミネーターである、λT0ターミネーターSchwarzEetalNature272410414およびfdターミネーターBeckEandZinkBGene133558、ならびに‐大腸菌由来のlacI抑制遺伝子FarabaughPJNature274765769。FP1、FP2、およびFP3融合ポリペプチド発現プラスミドの作製aプラスミド4981プラスミド49814981SACセルピン1T1249は、大腸菌におけるコアストレプトアビジンFP1タンパク質の発現のためのプラスミドである。それは、以下の232塩基対の長さのNheICelIIF1遺伝子セグメントF1ポリペプチドをコードするSEQIDNO84の、3547塩基対の長さのNheICelII4980プラスミド断片中への挿入により調製した。bプラスミド4982プラスミド49824982SACセルピン2T651は、大腸菌におけるコアストレプトアビジンFP2タンパク質の発現のためのプラスミドである。それは、以下の181塩基対の長さのNheICelIIF2遺伝子セグメントF2ポリペプチドをコードするSEQIDNO85の、3547塩基対の長さのNheICelII4980プラスミド断片中への挿入により調製した。cプラスミド4983プラスミド49834983SACセルピン3T2635は、大腸菌におけるコアストレプトアビジンFP3タンパク質の発現のためのプラスミドである。それは、以下の232塩基対の長さのNheICelIIF3遺伝子セグメントF3ポリペプチドをコードするSEQIDNO86の、3547塩基対の長さのNheICelII4980プラスミド断片中への挿入により調製した。実施例2大腸菌におけるコアストレプトアビジン融合タンパク質の発現コアストレプトアビジン融合タンパク質4981、4982、および4983の発現のために、大腸菌栄養要求性PyrFの相補により抗生物質フリーのプラスミド選択を可能にする大腸菌宿主/ベクター系を使用した例えば、EPB0972838および米国特許第6291245号参照。融合タンパク質を、大腸菌株CSPZ2leuBproCtrpEthi1ΔpyrFにおいて発現させた。選択培地におけるpyrF栄養要求性の相補による形質転換および細胞培養大腸菌K12株CSPZ2leuBproCtrpEthi1ΔpyrFを、前の段階において得られた発現プラスミドそれぞれ4981、4982、および4983で形質転換させた。形質転換したCSPZ2細胞を、最初に37°Cで寒天プレート上で増殖させ、その後、05カザミノ酸Difcoを含有するM9最小培地中で振盪培養において06~09の550nmでの光学密度OD550まで増殖させ、続いて、IPTG1~5mmollの最終濃度で誘導した。37°Cでの4~16時間の誘導期の後、細胞を遠心分離により収集し、50mmollリン酸カリウム緩衝液、pH65で洗浄し、さらなる加工処理まで20°Cで保存した。発現解析発現解析のために、3OD550nm単位1OD550nm=1の550nmでのODを有する1mlの細胞懸濁液の遠心分離した培養培地由来の細胞沈殿物を、025mlの10mmollリン酸カリウム緩衝液、pH65に再懸濁し、超音波処理50強度での30秒の2パルスにより細胞を溶解した。不溶性の細胞成分を沈降させ遠心分離、14000rpm、5分、上清を15の容積の5×SDS試料緩衝液と混合した1×SDS試料緩衝液:50mmollトリスHCl、pH68、1SDS、50mmollDTT、10グリセロール、0001ブロモフェノールブルー。不溶性の細胞破片分画沈殿物を、03mlの1×SDS試料緩衝液に再懸濁し、試料を5分間、95°Cでインキュベーションして、再び遠心分離した。続いて、タンパク質をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動PAGELaemmliUKNature227680685により分離し、クマシーブリリアントブルーR色素で染色した。合成したコアストレプトアビジン融合タンパク質は均質であり、不溶性のタンパク質凝集物、いわゆる封入体IBの形態で、不溶性の細胞破片分画のみにおいて見出された。発現率は、すべてのクローンにおいて測定精度の範囲内で匹敵し、大腸菌タンパク質全体に対して30~60の間であった。実施例3コアストレプトアビジン融合タンパク質の組み換え生産のための大腸菌の10lの高細胞密度発酵前培養:前培養物を調製するために、1000mlエルレンマイヤーフラスコにおいて、300mlのM9プラス培地05カザミノ酸、ならびに各々09glのTrp、Pro、およびLeuを追加したM9培地に、それぞれプラスミド4981、4982、および4983で形質転換した大腸菌CSPZ2の1mlのグリセロールストックを接種した。30のOD578nmに達するまで、約6時間、37°Cで、150rpmの傍心振盪機上で培養物をインキュベーションした。10lの流加主発酵:発酵の初めに、前培養物を10リットルの発酵槽中に移した。主培養を、グルコースの代わりに14グリセロール、2カザミノ酸、ならびに各々01のアミノ酸Trp、Leu、およびProを含有する、規定されたM9塩培地において、20のOD578nmまで増殖させた。続いて、培養へのグリセロール酵母用量ストック溶液:30酵母エキスおよび33グリセロールの供給を開始し、その流速を、培養物のpH値の動向に応じて08~35ml分の間で変動させ、それにより補正液H3PO4、KOHのいかなるさらなる添加も回避した。pHは、pH70に維持し、撹拌機速度を制御することにより、pO2値を50に保持した。70のOD578nmで、15mmollIPTGを添加した。160~180のOD578nmで、発酵を終了した。生物体量の収集:発酵槽の内容物を、フロースルー遠心分離13000rpm、13lhで遠心分離し、収集した生物体量を、さらなる加工処理まで20°Cで保存した。実施例4細胞溶解およびIBの調製200g大腸菌細胞湿重量を1リットルの01mollトリスHCl、pH70に0°Cで懸濁し、300mgリゾチームを添加して、20分間、0°Cでインキュベーションした。続いて、高圧分散により機械的に、細胞を完全に溶解し、2mlの1mollMgCl2および10mgDNAseを添加することにより、30分間、25°Cで、DNAを消化した。その後、500mlの60mmollEDTA、6TritonX100、および15mollNaCl、pH70を溶解溶液と混合し、さらに30分間、0°Cでインキュベーションした。続いて、不溶性成分細胞破片およびIBを、遠心分離により沈降させた。沈殿物を、1リットルの01mollトリスHCl、20mmollEDTA、pH65に懸濁し、30分間、25°Cでインキュベーションして、遠心分離により、IB調製物を単離した。実施例5F1、F2、およびF3を含有するコアストレプトアビジン融合タンパク質の可溶化、酵素による放出、ならびにF1、F2、およびF3ポリペプチドの精製前実施例において得られた封入体を、2回、各々100mMリン酸カリウム緩衝液、pH65、500mM塩化ナトリウム、20mMEDTA、および再蒸留水で、洗浄した。10mlの30mM水酸化カリウム溶液の添加により、1グラム湿重量の沈殿した封入体を溶解させた。30分の撹拌後、1Mホウ酸の添加により、pH値をpH89に変化させた。可溶化およびpH調整の後、F1およびF2を含有するコアストレプトアビジン融合タンパク質を、トリプシン125000wwで酵素的に消化し、他方、F3を含有するコアストレプトアビジン融合タンパク質を、LysC120000ww;10μlの10μMLysC溶液で酵素的に消化した。溶液を、15°Cで一晩インキュベーションした。10倍モル過剰のアプロチニンの添加により、トリプシン消化を停止させた。recSerETIアフィニティークロマトグラフィーにより、残留プロテアーゼを精製して除去した。F3のLysC消化は、recSerETIアフィニティークロマトグラフィーのみにより停止させた。放出されたF1、F2、およびF3融合ポリペプチドを、EurospherC8クロマトグラフィーカラムを用いた逆相クロマトグラフィーにより精製した。実施例6融合ポリペプチドおよびα1アンチトリプシンのタンパク質複合体の形成PBSリン酸緩衝生理食塩水、1mMKH2PO4、10mMNa2HPO4、105mMNaCl、27mMKCl中の25μMα1アンチトリプシンを、37°Cで、4~5倍過剰の融合ポリペプチド例えば、125μMと共に24時間インキュベーションした。より長いインキュベーション時間を用いても、タンパク質複合体のさらなる形成はもたらされなかった。インキュベーション後、サイズ排除濾過により、タンパク質複合体を、複合体形成していないセルピンフィンガーポリペプチドから分離した。ほぼ同一の分子量の分子を含む分画を、混ぜ合わせた。混ぜ合わせた分画を濃縮し、試料をSDSPAGEゲルにアプライした。SDSPAGEゲル上の個々のバンドを、1DImageMasterAmershamBioscienceを用いて分析し、タンパク質複合体の分画を定量化して、分子量の差を測定した。混ぜ合わせて濃縮した分画の活性を、BIAcoreにより測定した図3参照。反応混合物において、二量体α1アンチトリプシン125kDa、約14、タンパク質複合体60kDa、約15、および単量体α1アンチトリプシン55kDaが検出された。実施例7BIAcore解析すべての表面プラズモン共鳴測定を、BIAcore3000機器GEHealthcareBiosciencesABSweden上で、25°Cで行った。化学的に調製したHIVHR1ペプチドを、製造業者の指示GEHealthcareBiosciencesABSwedenに従って、CM5バイオセンサーチップ上に固定化した。融合ポリペプチドを25nMの濃度に希釈し、50μl分の流速で5分にわたって注入した。その後、様々な混ぜ合わせた分画から得られたタンパク質複合体を、250nMおよび80nMの濃度になるよう同一緩衝液中に希釈し、50μl分の流速で5分にわたって注入した。後に、センサーチップを、1分間、PBS、pH80、0005vvTween20で再生させた。データ解析を、BIAevaluationソフトウェアBIAcoreSwedenで行った図4参照。