TRA及びESAと結合する癌治療用二重特異性アプタマー。cMet及びCD16αと結合する、請求項1に記載の二重特異性アプタマー。配列番号82及び配列番号87から成る群から選択される核酸配列を含む、請求項2に記載の二重特異性アプタマー。医薬として使用される、請求項1から3の1項に記載の二重特異性アプタマー。癌の医薬として使用される、請求項4に記載の二重特異性アプタマー。本発明を例示するために以下の実施例が含まれる。しかしながら、これら実施例は本発明を制限するのではなく、本発明の実施方法を提案しようとするだけであることを理解されたい。さらにまた本実施例は本発明を制限するものと解されるべきではなく、これら実施例の技術的教示は、癌治療用二重特異性アプタマーに関して本発明を実施するために適用し得る本出願の明細書中の任意の技術的教示と組み合わせることができる。フィルターSELEXフィルターSELEXは、溶液中で標的タンパク質とアプタマーをインキュベートした後、標的タンパク質をニトロセルロース膜に固定して、標的結合アプタマーの分離及び洗浄を可能にすることを基本とした。選別は全体積100μLのダルベッコーDulbeccoPBSDPBS中で実施し、選別過程の間ずっと非特異的競合tRNAの濃度及び洗浄体積を増加させるとともに、標的タンパク質の量を減少させてストリンジェンシーを強化する。1ラウンド目については、出発プールの1x1014分子を用い最終濃度166μM、その後のラウンドではその前のラウンドから得られた出力プールを1μMに調節した。フィルターはKOHで前処理し、フィルターへのDNAプールの非特異的結合を減少させた。陰性前選別でのフィルター結合アプタマーの除去のために1ラウンド目では省略する、50μLのプールDPBSを前処理フィルターに添加し、2000rpmで1分間遠心分離した。前記のフロースルーをその後の陽性陰性選別工程で使用するために収集した。逆選別は、標的とされるべきではない成分からアプタマーを除去することが所望される場合に例えば用いた組換え標的タンパク質のHisタグ又はFc融合部分;1ラウンド目では省略した、陰性選別のフロースルーにタンパク質及びDPBSを90μLの全体積中に1μMの最終タンパク質濃度で添加することによって適用した。37°Cで1時間インキュベートした後、このプールDPBS溶液を前処理フィルターに添加し、2000rpmで1分間遠心分離し、フロースルーを陽性選別工程で使用するために収集した。陽性選別は、以前の逆選別の場合の標的タンパク質及び競合物質量を90μLのプールDPBSフロースルーに、100μLの全体積に1μMのタンパク質となるように添加することによって実施した。陽性選別混合物は37°Cで1時間インキュベートし、続いて前処理セントレックスCentrexカラムに添加し、2000rpmで1分間遠心分離し、フロースルーを廃棄した。それによってフィルターは所望のタンパク質:プール複合体を捕捉した。これらを前加温した1000μLのDPBS1ラウンド目では500μLで2回洗浄し、以前のように遠心分離しフロースルーを廃棄し、200μLの90°Cに前加熱した溶出液で2回の1分間インキュベーションによって溶出させ、上記のように遠心分離し両方のフロースルー溶出分画を一緒にした合計400μL。この工程の間、熱及び尿素変性標的タンパク質はそれらの正確な折り畳みを喪失し、フロースルーで収集された構造エピトープ結合アプタマーを遊離させた。これらのアプタマーをその後のPCRのためにイソプロパノール沈殿により精製し、10μLのdH2Oに再懸濁した。アプタマープールの増幅は二工程PCR設定で達成した。最初の小規模PCRssPCRは、DNA濃度を10ngμLの標準濃度に調節するために実施し、同時にPCRサイクルモニタリングによって選別アプタマーの量を間接的に調べた。アプタマーが濃縮されればされるほど、所望の濃度を得るために必要なPCRサイクルの数は減少した。次の工程では、大規模PCRlsPCRが続きその後の選別ラウンドのために十分なアプタマー材料が得られた。lsPCR溶液をエタノールで沈殿させ、ペレットを乾燥させ、30μLのTE緩衝液pH80に再懸濁して15mLのチューブに移した。一本鎖アプタマーは、二本鎖PCR生成物の鎖の選別により入手しなければならなかった。3’リボ改変リバースプライマーの使用は、アンチセンス鎖のアルカリ誘導による鎖の断裂を可能にし、1本の大きなセンス鎖アプタマー及び2本のより小さなアンチセンスフラグメントを生じ、これらをポリアクリルアミドゲル電気泳動、受動ゲル溶出、DNA沈殿によって分離し、仕上げに40μLのDPBS中の懸濁物の濃度を決定して、次のSELEXラウンドに使用できる濃縮アプタマープールを得た。我々は、NK細胞のCD16α及びCD16αの両方と結合するが、CD16βとは結合しない高い特異性他の細胞又はタンパク質と結合しない及び高い親和性2桁のナノモル範囲又はそれ未満のKdを有するCD16αアプタマーを選別した。CD16αアプタマーについていくつかの重要な明細事項は下記の表1に示される。表1:CD16DNASELEXの明細標的タンパク質はCD166Hisであり、一方CD16β10Hisを逆選別に適用し、tRNAを非特異的競合物として供した。一定量のアプタマーを再増幅するために必要なPCRサイクルをモニターし強調表現で示す。MTPはマイクロタイタープレートである。我々は、cMet陽性細胞上のcMetと高い特異性及び親和性で結合するcMetアプタマー上記を選別した。他の腫瘍特異抗原TSA例えばEGFRを適用する場合は、アプタマーもまた二重特異性アプタマーの構築のために選別及び適用できる。アプタマーは、DNA、dRmY、rGmH、rRfY、dCmD、mRfY、MNA又はrRnY組成から成り得る。Rはプリン、Yはピリミジン、HはA、C、Uであり、DはA、G、Uでありdは2’デオキシで、rは2’ヒドロキシで、mは2’メトキシでfは2’フルオロでnは2’アミンである。入手データ-CD16aアプタマーDNA及びrRfyアプタマーが、フィルターSELEX及び細胞SELEXによりCD16αに対して選別されたDNAフィルターSELEX:CLN001531、細胞SELEX:CLN0118128、rRfYフィルターSELEX:CLN004763。CD16と特異的に結合する全てのアプタマーの配列は以下であった:ADNAアプタマー配列番号1CLN0015;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCGGCAGAAGAAATATCGAAACCCAGAATGGTCGGCCAGGCGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号2CLN0016;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCCAAGCACAAGAACTTTCAAAACGCAGAATGCTGGGCTTGGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号3CLN0017;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCCAGACGAGAATTTGGAAAACGCGGAACGCCGTCTGGTGTGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号4CLN0018;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCATCACGTGGTGGGCAAATAACCGGTTGGGGTGGGTCGAGGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号5CLN0019;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCAACGGGAAGAAATGTCGAAACCCTTGAAAGGTCACGGACTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号6CLN0020;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGGCAGGTCGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号7CLN0021;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCGCAAGTATGAGCGCAGGAGTTAGGTCCCGTGGCGATGGGTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号8CLN0022;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCGTAGGTGGGGGACTGGGGACGGGTATGGGCACACGGTATGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号9CLN0023;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCGACGTTAAGCTAGCAGGTGTTAGGTCCCGTGGTGATGAATGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号10CLN0024;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCGGGAGGAGAATTAATAAAAACCCGGGACGGCCGACGGGATGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号11CLN0025;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCCAGAACAAAGCGGGAGAATTATGAAAACGCGGAACGCCACGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号12CLN0026;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCGCTAAGAGAAATATCGAAACCCTGGATAGGCTGAGTGACTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号13CLN0027;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCAGGTGTAGGCCCTGTGGTGATGAATCGCGTGTCGAGGGGTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号14CLN0028;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCCGCAGCGGAGAAATTTCGAAACCCAGGATGGCCGCGAGGTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号15CLN0029;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCGACGGGACGAAAAACGGTTGGATGAGGTTGGTTGGGTGTGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号16CLN0030;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCTAAACCCCAAAACAGTGCAACTAGGTGTAGGTCCCGTGGTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号17CLN0031;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCGGCCAGAGAAATGTCGAAACCCGGTAACGGATGGTAAGCTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号18CLN0032;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCCAGCCACTGGAGAAAGTAAGAAACGCAGAATGCCCAGTGGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号19CLN0118;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCACGGACTCGCAAAAGGTGGAACAGGAGTGGGCCCCGCGGCGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号20CLN0119;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCTGCGGCGAGAAATGTCGAAACGGTGAAACCCGCCATGCGTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号21CLN0120;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCCACCCGTCAGGGGTTCGTTGTGAGGAGAGAGGGTTGGGCCGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号22CLN0121;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCCGAGTGAAAGAGGCAGGTGTAGGTCCCGTGGAGGTCAGGTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号23CLN0122;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCAGGCGCGAGAAATATCGAAACACCGGACGGTCGCGACGCTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号24CLN0123;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCAGAGGGGAGGGTCGGGTATCGGCGTGTTCGGGGGATCTGCGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号25CLN0124;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCCCGGGAGAATTAGATTAAAACGCGGAACGCCCCGTGCCCGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号26CLN0125;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCAGTGTAGGGAGCGGAGTAGGCAGGCGTAGGTCCTGTGGTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号27CLN0126;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCGGCGTTGTCGGGCGCAGGTGTAGGCCTCGTGGTGGTGGGTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号28CLN0127;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCGGGGGACAAGGGTCGGGTATGGGCGCCTCGAGAACTGGGTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号29CLN0128;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCATAGGCAACGGGGATGATAACCAGTTGGGGTGGGACGAGGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCCBrRfYCD16特異的アプタマー配列番号30CLN0047;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCTGCGGAAGGTAGGTTATACGAGCGCGCAGGACTGGTAATAGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号31CLN0048;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCAGTGAGAGGTTAAAGGAAGGGTGCGTTGTCAAAGGCTGGTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号32CLN0049;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCGTAAGCGAAGGGTCAAAAAGGCCGAGCGGTTTAGGCATCAGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号33CLN0050;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCTAAACCCCAAAACAGTGCAACTAGGTGTAGGTCCCGTGGTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号34CLN0051;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCCCGGCTTCGAAGGGTGAATACTGAGCGGAAGTGAGAGGAAGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号35CLN0052;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCGCAAGGAGGTAAAAGGAAGGGTGGTTGCTTGGCGCTAACGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号36CLN0053;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCGTAATGGAAGGGCGTTATGAACGCTGAGCGCATTAGGGGTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号37CLN0054;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCCTAGTGTTATGACCCTAGAAATAGATGAGTTGAGAGGTCGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号38CLN0055;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCGCATGTGAAGGGACCAATCCGAGCGACATGGTGCGGGATAGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号39CLN0056;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCTATGGAAGGGATAGGGTATCCGAGCGCAGAGGCTGAGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号40CLN0057;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCATAGAGGTGAGAGGAAGGGTGTGTTGTATGTTGATAACGAGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号41CLN0058;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCTCACGAAGTCAGCAATAATTTGCTGTAGGCGGTGGGGACTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号42CLN0059;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCACGTAGTGGGAGGACGCGGAAAGTCGAGCGCATTAGGTGGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号43CLN0060;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCGCGGTGGAAGGCTGAACATTGGCGAGCGCATCGGAGATCTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号44CLN0061;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCCAGAGAAACATAAACCATAAACGCAGAAGCTGGCTGTGAGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号45CLN0062;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCGTTCTTGTAGTGCATCCAATTGCAGAGCGAAGGAGGTGTTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号46CLN0063;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCACGTAGTTGAAGGACTTTTGGGTTGAGCGGACTAGGTGTAGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCCCmRfYCD16特異的アプタマー配列番号47CLN0072;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCAATGACATATTTCTTATATCGGGTTTGGAGTGCCTTGCCTAGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号48CLN0076;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCAATGACATTTTCTTATATCGGGTTTGGAGTGCCCTGCCTAGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号49CLN0077;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCATGTATTGCGGATGATTTTGTATTTAATGTGTATGCCTCGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCCDNACD16αアプタマーのみ性状をさらに調べて、3候補のみを得た。CLN0020配列番号6:生化学的結合及び親和性:CD16α6Hisに対して45±29nMn=10、V158及びF158の両アロタイプと結合、CD16βとは全く結合せず、Hisタグとの結合は無し、データはドットブロットによって得られた。細胞結合は以下の細胞でFACSによって確認した:1組換えCD16α陽性Jurkat細胞株、2組換えCD16α陽性Jurkat細胞株、3新しく単離したCD16α陽性PBMCNK細胞を含む、4新しく単離したNK細胞。非特異的結合はCD16α陰性細胞株JurkatE61、CD16α陰性PBMC、GTL16では認められなかった。セツキシマブBouAssalyandMukherjiAJNRAmJNeuroradiol316267及びCD16α特異的mAb3G8との競合ドットブロットによるエピトープマッピングは、CLN0020はFc結合ドメインで又はその近傍で結合することを示した抗体アナローグ、わずかに約10x高い親和性。構造予測による最小化は、FLアプタマーと類似する特性を示す縮小型84merに代わり41merMS1と称する及び34merMS3と称する、下記参照を生じた。FBS中での血清安定性は半減期が約10時間であることを示した。CLN0123配列番号24:生化学的結合及び親和性:CD16α6Hisに対して231nM、V158アロタイプとのみ結合、CD16βとは全く結合せず、Hisタグとの結合は無し、データはドットブロットによって得られた。CLN0020との競合ドットブロットは、CLN0123は異なるエピトープと結合し、したがってFC結合部位には結合せず、したがって血清IgGと競合しないことを明らかにした。細胞結合は以下の細胞でFACSによって確認した:1組換えCD16α陽性Jurkat細胞株、2組換えCD16α陽性Jurkat細胞株、3新しく単離したPBMCNK細胞を含む、4新しく単離したNK細胞。非特異的結合はCD16α陰性細胞株JurkatE61、CD16陰性PBMCでは認められなかった。CLN0018配列番号4:生化学的結合及び親和性:CD16α6Hisに対して38±26nMn=4、V158アロタイプとのみ結合、CD16βとは全く結合せず、Hisタグとの結合は無し、データはドットブロットによって得られた。FACSによる細胞結合分析は広い非特異的結合を示した。DNAcMetアプタマーcMetDNAアプタマーを組換えFccMetを用いフィルターSELEXにより選別した。cmetと特異的に結合する全てのアプタマーの配列は以下である:配列番号50CLN0001;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCCGGGGTGGGGAGTAACAGGCTGTTGGTAGGGGTGGACCTGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号51CLN0002;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCAAAGGAGAAGGTCCAAAACGGCCTGGGTGGTGGGTATGTGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号52CLN0003;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCTGGATGGTAGCTCGGTCGGGGTGGGTGGGTTGGCAAGTCTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号53CLN0004;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCGAGTGCGTAATGGTACGATTTGGGAAGTGGCTTGGGGTGGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号54CLN0005;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCAAAGGAGAAGGCTCAAAACGGCCTGGGTGGTGGGTATGTGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号55CLN0006;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCGGATACAGCAGAATAAGGGAAGGGGCAGATCGGGGTGGGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号56CLN0007;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCAGCAAACAGCAGGTAGAGGGAAGTGGCAGATCGGGGTGGGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号57CLN0008;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCGAGCGGGGACGAACACATATGGGGAAGTGGCTTGGGGTGGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号58CLN0009;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCGAGTGCGTAATGGTACGATTTGGGAAGTGGTTTGGGGTGGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号59CLN0010;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCCGACAGTGGGTAGCGGTTAAGGGGAAGTGGCTTGGGGTGGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号60CLN0011;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCCGGGGTGGGATAAAAGCATGGTTGGTAGGGGTTGGGGCATGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号61CLN0012;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCAAGGCGTGTGTATCCCTGTGGTAGGGGTTGGTCGGGGTGGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号62CLN0013;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCCAGGGTCGGGATTGGGCGGGGTCTGGAAGATCATGTGCCAGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号63CLN0014;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCCGGGGGGGGAAGACGAGTGTAAGTTGGTAGGGTGGGGTAGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC2つのアプタマーのみが低ナノモル結合の基準を満たし、さらに性状を調べたCLN0008はCLN0004との高い配列類似性により除外した。CLN0003配列番号53:生化学的結合及び親和性:FcHiscMetに対して91±40pMn=3、Fc結合無し、Hisタグ結合無し、データはドットブロットによって得られた。細胞結合はcMet陽性細胞株GLT16、MNK45、EBC1を用いてFACSによって確認した。Jurkat細胞では非特異的結合は認められなかった。最小化を適用したが成功しなかった下記参照。CLN0004配列番号54:生化学的結合及び親和性:FcHiscMetに対して11±6nMn=6、Fc結合無し、Hisタグ結合無し、データはドットブロットによって得られた。細胞結合はcMet陽性細胞株GLT16、MNK45、EBC1を用いてFACSによって確認した。Jurkat細胞では非特異的結合は認められなかった。最小化は、FLアプタマーと類似する特性を示す縮小型84merに代わり41merMS2と称する下記参照をもたらした。FBS中での血清安定性は半減期が約10時間であることを示した。二重特異性アプタマーTRA本体とESA本体のリンカーによる結合:以下の種々のタイプのリンカーを用いた:-PEG、PEG、PEG-ヌクレオチド:15dA-ヌクレオチドフランキング配列のリンカー配列長さは7-24ヌクレオチド結合は、抗体中のCDRからFc結合ドメインまでの距離と相関する両アプタマー本体間の距離を構成する態様で達成された約75nm。以下の異なる方法による2つのアプタマーのカップリングの達成によって、最終構築物、アプタマー1C7NHCOPEGマレイミドSC3アプタマー2が得られた:1.いくつかの配列及び長さを有するヌクレオチド又は炭素PEGリンカーを取り込む直接的完全合成;2.NHS活性化PEGに対しC7炭素スペーサーを有する5’アミン官能基付加アプタマー及びPEGの他方の末端に結合させたマレイミドに対しC3炭素スペーサーを有する3’チオール官能基付加アプタマーのカップリング。以下の二重特異性アプタマーが構築された:CD16cMet二重特異性DNAアプタマー配列番号64bsA1;CCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGGCAGGTCGAGTGCGTAATGGTACGATTTGGGAAGTGGCTTGGGGTGGG配列番号65bsA2;GAGTGCGTAATGGTACGATTTGGGAAGTGGCTTGGGGTGGGCCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGGCAGGTC配列番号66bsA3;CCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGGCAGGTCAAAAAAAAAAAAAAAGAGTGCGTAATGGTACGATTTGGGAAGTGGCTTGGGGTGGG配列番号67bsA31;CCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGGCAGGTCAAAAAAAAAAAAAAAGAGTGCGTAATGGTACGATTTGGGAAGTGGCTTGGGGTGGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号68bsA32;CCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGAAAAAAAAAAAAAAAGAGTGCGTAATGGTACGATTTGGGAAGTGGCTTGGGGTGGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号69bsA4;GAGTGCGTAATGGTACGATTTGGGAAGTGGCTTGGGGTGGGAAAAAAAAAAAAAAACCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGGCAGGTC配列番号70bsA5;CCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGGCAGGTCiSp9GAGTGCGTAATGGTACGATTTGGGAAGTGGCTTGGGGTGGG配列番号71bsA6;GAGTGCGTAATGGTACGATTTGGGAAGTGGCTTGGGGTGGGiSp9CCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGGCAGGTC配列番号72bsA7;CCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGGCAGGTCiSp18GAGTGCGTAATGGTACGATTTGGGAAGTGGCTTGGGGTGGG配列番号73bsA8;GAGTGCGTAATGGTACGATTTGGGAAGTGGCTTGGGGTGGGiSp18CCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGGCAGGTC配列番号74bsA9;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGGCAGGTCGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCCGGAGGGAAAAGTTATCAGGCTGGATGGTAGCTCGGTCGGGGTGGGTGGGTTGGCAAGTCTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号75bsA10;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCTGGATGGTAGCTCGGTCGGGGTGGGTGGGTTGGCAAGTCTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCCGGAGGGAAAAGTTATCAGGCCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGGCAGGTCGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号76bsA11;CCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGGCAGGTCGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCCGGAGGGAAAAGTTATCAGGCTGGATGGTAGCTCGGTCGGGGTGGGTGGGTTGGCAAGTCTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号77bsA12;CCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGGCAGGTCGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCCGGAGGGAAAAGTTATCAGGCGAGTGCGTAATGGTACGATTTGGGAAGTGGCTTGGGGTGGGATTAGTTTTGGAGTACTC配列番号78bsA13;GAGTGCGTAATGGTACGATTTGGGAAGTGGCTTGGGGTGGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCCGGAGGGAAAAGTTATCAGGCCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGG配列番号79bsA14;GGAGGGAAAAGTTATCAGGCTGGATGGTAGCTCGGTCGGGGTGGGTGGGTTGGCAAGTCTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCCC7NH2及び官能性残基NH2及びSHを有するGTTATCAGGCCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGGCAGGTCC3SHがPEGによって結合されてアプタマー1C7NHCOPEGマレイミドSC3アプタマー2を生じる。配列番号80bsA15:GGAGGGAAAAGTTATCAGGCAGAGGGGAGGGTCGGGTATCGGCGTGTTCGGGGGATCTGCGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCCGGAGGGAAAAGTTATCAGGCTGGATGGTAGCTCGGTCGGGGTGGGTGGGTTGGCAAGTCTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号81bsA16;GAGTGCGTAATGGTACGATTTGGGAAGTGGCTTGGGGTGGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCCGGAGGGAAAAGTTATCAGGCAGAGGGGAGGGTCGGGTATCGGCGTGTTCGGGGGATCTGCGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号82bsA17;CCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGGCAGGTCGGAGGGAAAAGTTATCAGGCTGGATGGTAGCTCGGTCGGGGTGGGTGGGTTGGCAAGTCTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号83bsA18;CCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGGCAGGTCATCAGGCGAGTGCGTAATGGTACGATTTGGGAAGTGGCTTGGGGTGGGATTAGTTTTGGAGTACTC配列番号84bsA19;CCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGGCAGGTCAAAAAAAAAAAAAAAGGAGGGAAAAGTTATCAGGCTGGATGGTAGCTCGGTCGGGGTGGGTGGGTTGGCAAGTCT配列番号85bsA20;CCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGGCAGGTCGGAGGGAAAAGTTATCAGGCTGGATGGTAGCTCGGTCGGGGTGGGTGGGTTGGCAAGTCT配列番号86bsA21;CCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGGCAGGTCAAAAAAAAAAAAAAAGGAGGGAAAAGTTATCAGGCTGGATGGTAGCTCGGTCGGGGTGGGTGGGTTGGCAAGTCTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC配列番号87bsA22;CCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGAAAAAAAAAAAAAAAGGAGGGAAAAGTTATCAGGCTGGATGGTAGCTCGGTCGGGGTGGGTGGGTTGGCAAGTCTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC以下の表2は本発明の二重特異性アプタマーの詳細を示す。二重特異性アプタマーの詳細二重特異性アプタマーについて以下の実験を実施した:-対応するアプタマー本体の結合特性が変化していないことを確認するドットブロットKdは下記を参照されたい-対応するデータは図2に要約されている-両タンパク質の同時結合を証明する電気泳動移動度シフトアッセイEMSA両方の標的タンパク質と結合したときのTBEゲルにおけるアプタマーのバンドシフトは図3に示される。選択アプタマーの血清安定性重要なシングルアプタマーCLN0004、CLN0020及び二重特異性構築物bsA3及びbsA17についてウシ胎児血清安定性を決定し、血清半減期は64-203時間であった。得られた結果は図4に示す。腫瘍細胞溶解を評価するADCCアッセイ以下の細胞株を用いた:GTL16:ヒト胃腺癌PaloPorporatoNovaraMerckkGaAEBC1:ヒト扁平上皮肺癌HealthScResResourcesBankJCRB0920031496全てのADCCアッセイはGTL16細胞を用いて実施したが、bsA17についてはFBC1もまた用いて評価した図5のC部分を参照されたい。本発明の二重特異性アプタマーはセツキシマブと類似するADCC活性を媒介することは図5から容易に理解できる。図6はbsA22について得られた結果を示す。