"iカルジオトロフィン-1またはその機能的に同等の変種、およびii冷臓器保存液を、一緒にまたは別々に、含んでなる、冷臓器保存組成物。冷臓器保存液がa少なくとも1種類の緩衝剤、b少なくとも1種類の不浸透剤、およびc少なくとも1種類の電解質を含んでなる、請求項1に記載の組成物。緩衝剤が、リン酸塩、重炭酸塩、硫酸塩、ヒスチジン、ヒスチジン-HCl、HEPES、クエン酸塩およびそれらの組合せからなる群から選択され;不浸透剤が、ヒスチジン、グルコース、スクロース、マンニトール、トレハロース、グルコン酸塩、クエン酸塩、ラクトビオン酸塩、ラフィノースおよびそれらの組合せからなる群から選択され;および/または、電解質が、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、塩化物およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項2に記載の組成物。冷臓器保存液がユーロコリンズ液ECである、請求項3に記載の組成物。冷臓器保存液が、少なくとも1種類のコロイド物質、少なくとも1種類の代謝物質、少なくとも1種類のアミノ酸、少なくとも1種類の酸化防止剤、少なくとも1種類のビタミン、および/または、少なくとも1種類の抗生物質をさらに含んでなる、請求項1~4のいずれか一項に記載の組成物。不浸透剤が、ラクトビオン酸塩、ラフィノースおよび両方の組合せからなる群から選択される、請求項2、3または5に記載の組成物。コロイド物質が、ヒドロキシエチルデンプンHES、ポリエチレングリコールまたは両方の組合せからなる群から選択される、請求項5または6に記載の組成物。冷臓器保存液がウィスコンシン大学液UWである、請求項7に記載の組成物。カルジオトロフィン-1がヒト由来のものである、請求項1~8のいずれか一項に記載の組成物。ヒト由来のカルジオトロフィン-1が配列番号1のものである、請求項9に記載の組成物。カルジオトロフィン-1が、0.01mg/l~0.50mg/lの間の濃度である、請求項1~10のいずれか一項に記載の組成物。冷臓器保存組成物を調製する方法であって、カルジオトロフィン-1またはその機能的に同等の変種を冷臓器保存液に加えることを含んでなる、方法。冷臓器保存液がa少なくとも1種類の緩衝剤、b少なくとも1種類の不浸透剤または不浸透化剤、およびc少なくとも1種類の電解質を含んでなる、請求項12に記載の方法。緩衝剤が、リン酸塩、重炭酸塩、硫酸塩、ヒスチジン、ヒスチジン-HCl、HEPES、クエン酸塩およびそれらの組合せからなる群から選択され;不浸透剤が、ヒスチジン、グルコース、スクロース、マンニトール、トレハロース、グルコン酸塩、クエン酸塩、ラクトビオン酸塩、ラフィノースおよびそれらの組合せからなる群から選択され;および/または、電解質が、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、塩化物およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項12または13に記載の方法。冷臓器保存液がユーロコリンズ液ECである、請求項14に記載の方法。冷臓器保存液が、少なくとも1種類のコロイド物質、少なくとも1種類の代謝物質、少なくとも1種類のアミノ酸、少なくとも1種類の酸化防止剤、少なくとも1種類のビタミン、および/または、少なくとも1種類の抗生物質をさらに含んでなる、請求項12~14のいずれか一項に記載の方法。不浸透剤が、ラクトビオン酸塩、ラフィノースおよび両方の組合せからなる群から選択される、請求項13、14または16に記載の方法。コロイド物質が、ヒドロキシエチルデンプンHES、ポリエチレングリコールまたは両方の組合せからなる群から選択される、請求項16または17に記載の方法。冷臓器保存液がウィスコンシン大学液UWである、請求項18に記載の方法。カルジオトロフィン-1がヒト由来のものである、請求項12~19のいずれか一項に記載の方法。ヒト由来のカルジオトロフィン-1が配列番号1のものである、請求項20に記載の方法。カルジオトロフィン-1が、0.01mg/l~0.50mg/lの間の濃度である、請求項12~21のいずれか一項に記載の方法。移植のための冷臓器保護および/または保存用組成物の調製のための、カルジオトロフィン-1またはその機能的に同等の変種の使用。移植のための冷臓器保護および/または保存のための、請求項1~11のいずれか一項に記載の組成物の使用。移植用臓器が単離されている、請求項24に記載の組成物の使用。移植用臓器が腎臓である、請求項24または25に記載の組成物の使用。移植用臓器が肺である、請求項24または25に記載の組成物の使用。移植用臓器が心臓である、請求項24または25に記載の組成物の使用。移植のための冷臓器保護および/または保存における使用のための、請求項1~11のいずれか一項に記載の冷臓器保存組成物。前記冷保護および/または保存が、ドナーにおけるinvivo灌流によって行われる、請求項29に記載の使用のための組成物。請求項30に記載の使用のための組成物であって、ドナーからの摘出後に、さらに、移植用臓器が該組成物への浸漬に付される、組成物。前記冷保護および/または保存が、ドナーから単離臓器の灌流によって行われる、請求項29または30に記載の使用のための組成物。請求項32に記載の使用のための組成物であって、単離臓器の灌流後に、さらに、前記移植用臓器が該組成物への浸漬に付される、組成物。臓器の冷保存方法であって、請求項1~11のいずれか一項に記載の組成物と該臓器を接触させることを含んでなる、方法。臓器が単離されている、請求項34に記載の方法。前記組成物が、洗浄、浸漬、灌流またはそれらの組合せによって臓器と接触する、請求項34または35に記載の方法。前記組成物が、ドナーにおけるinvivo灌流によって臓器と接触する、請求項34に記載の方法。前記組成物でinvivo灌流された臓器が、摘出後に請求項1~11のいずれか一項に記載の組成物中で浸漬した状態で維持されない、請求項37に記載の方法。前記組成物が、ドナーにおける灌流によって、および、摘出後の浸漬によって臓器と接触する、請求項36に記載の方法。臓器がドナーから単離されている場合、前記組成物が、灌流によって該臓器と接触する、請求項37に記載の方法。単離臓器の灌流後に、さらに、該移植用臓器が、請求項1~11のいずれか一項に記載の組成物中で浸漬した状態で維持されない、請求項40に記載の方法。単離臓器の灌流後に、さらに、該移植用臓器が、請求項1~11のいずれか一項に記載の組成物中の浸漬した状態で維持される、請求項40に記載の方法。臓器が死亡ドナーから得られたものである、請求項34~36のいずれか一項に記載の方法。前記組成物が、死亡ドナーにおける灌流によって臓器と接触する、請求項43に記載の方法。前記組成物で灌流された臓器が、摘出後に、請求項1~11に記載の組成物中で浸漬した状態で維持されない、請求項44に記載の方法。前記組成物が、死亡ドナーにおける灌流によって、および、摘出後の浸漬によって臓器と接触する、請求項43に記載の方法。前記組成物が、灌流によって、および、該灌流後は浸漬によって、死亡ドナーから摘出された単離臓器と接触する、請求項43または44に記載の方法。前記組成物が、灌流によって、死亡ドナーから摘出された単離臓器と接触しており、該灌流後に、請求項1~11に記載の組成物中で浸漬した状態で維持されない、請求項43または44に記載の方法。冷臓器保存組成物が0°C~25°Cの間の温度である、請求項34~48のいずれか一項に記載の方法。冷臓器保存組成物がおよそ4°Cの温度である、請求項49に記載の方法。臓器が腎臓である、請求項34~50のいずれか一項に記載の方法。臓器が肺である、請求項34~50のいずれか一項に記載の方法。臓器が心臓である、請求項34~50のいずれか一項に記載の方法。請求項34~53のいずれか一項に記載の方法によって得られる、冷保存された単離臓器。腎臓である、請求項54に記載の臓器。肺である、請求項54に記載の臓器。心臓である、請求項54に記載の臓器。冷臓器保存組成物の調製のためのキットであって、iカルジオトロフィン-1またはその機能的に同等の変種、およびii冷臓器保存液、あるいは、該溶液の調製のための媒質および添加剤を含んでなる、キット。従って、技術の現状において、冷保存された臓器の冷虚血および移植後再灌流に関連した損傷を減らすことを可能にする適当な冷臓器保存組成物を提供する必要がある。本発明の第1の側面は、iカルジオトロフィン-1CT-1またはその機能的に同等の変種、およびii冷臓器保存液を、一緒にまたは別々に、含んでなる冷臓器保存組成物に関する。本発明の別の側面は、冷臓器保存組成物を調製する方法であって、カルジオトロフィン-1またはその機能的に同等の変種を冷臓器保存液に加えることを含んでなる方法に関する。本発明の別の側面は、移植のための冷臓器保護および/または保存用組成物の調製のためのカルジオトロフィン-1またはその機能的に同等の変種の使用に関する。本発明のさらに別の側面は、移植のための冷臓器保護および/または保存に用いる、本発明による組成物の使用に関する。本発明の別の側面は、移植のための冷臓器保護および/または保存における使用のための、本発明による冷臓器保存組成物に関する。本発明の別の側面はまた、臓器の冷保存方法であって、本発明による組成物と該臓器を接触させることを含んでなる方法にも関する。本発明の別の側面は、本発明の方法によって得られる冷保存された単離臓器に関する。本発明の最後の側面は、冷臓器保存組成物の調製のために設計されたキットであって、iカルジオトロフィン-1またはその機能的に同等の変種、およびii冷臓器保存液、あるいは、該保存液の調製のための媒質および添加剤を含んでなるキットに関する。材料および方法サンプルの調製および分析腎臓の一部を分離し、ホモジネートバッファー[0.05M第一リン酸カリウムおよび1mMEDTA、0.25コール酸ナトリウム含有;pH7.8]で、0°C~4°Cの間に及ぶ温度で洗浄して、酸化の進行を最小限に抑えた。続いて、それを重量測定し、1:10w/vの割合の量の同じホモジネートバッファーを用いてホモジナイズした。ホモジネートを、温度4°Cで、100,000gで60分間遠心分離した。得られた可溶性画分をアリコートに分け、分析まで-80°Cで凍結保存した。これらのサンプルを用いて、スーパーオキシドアニオンSOA、TNFαおよびIL-6の腎レベルを決定した。腎臓の別の部分を分離して、ウエスタンブロットによりタンパク質を測定した。まずに、サンプルを、組織100mg当たり1mlの割合の溶解バッファー25mMHEPES、pH7.5;150mMNaCl;1mMEDTA;1IGEPALCA-630;10グリセロール;10mMMgCl2;0.25デオキシコール酸ナトリウム;10μg/mlアプロチニン;10μg/mlロイペプチン;10mMフッ化フェニルメチルスルホニルPMSF;100mMオルトバナジン酸ナトリウムNa2VO4;および25mMフッ化ナトリウムNaFで、氷中で30~60分間ホモジナイズした。続いて、それを12,000gおよび4°Cで25分間遠心分離し、上清を集め、使用するまで、アリコートで、-80°Cで凍結した。スーパーオキシドアニオンO2-SOAの産生の決定腎臓におけるSOA産生レベルを決定するために、O2-ラジカルによるシトクロムCの還元に基づいた、ミトコンドリアに関するBoverisにより記載されている技術BoverisAMethodsEnzymol1984105429435の改良法を用いた。簡潔には:100μlのシトクロムC75μM、20μlのスーパーオキシドジスムターゼSOD;およそ264U、25μlのサンプルおよび緩衝液0.1Mリン酸カリウム0.1mMEDTA;pH7.8を入れ、容量1,000μlにして、分光測定用キュベット1-mlキュベットを準備し;サンプルは加えず、100μlのシトクロムC75μM、20μlのSODおよび緩衝液を入れ、容量1,000μlにして、参照キュベットを準備し;シトクロムCの非特異的還元を調査するために、SODを含めない別の同様のキュベットを準備し;2つの状態、1.-シトクロムCの非特異的還元SOD不含、および2.-シトクロムCのスーパーオキシド依存性還元SOD含有において、分光光度測定値[λ550nm;pH7.8および温度25°Cで、6秒間隔で1分間、1-mlキュベットにおいて、1-cm光路長による]によって、シトクロムCの還元を追跡し;参照キュベット中のシトクロムCは完全に酸化され、観測された吸光度の増加は還元生成物の吸光度を単に表すΔ吸光度:還元型-酸化型ことを前提として、反応混合物における吸光度単位の増加を、モル吸光係数:ΔE550/21.0x103M-lcm-1を用いてSOAのナノモルに換算し;このようにして、SOAスーパーオキシドアニオンの産生をnmol/mgタンパク質/分で表した。サイトカインTNFαおよびIL-6の決定腎組織、血清および保存液中のTNFαのレベルをELISAによって、DuoSetELISADevelopmentSystemratTNFα/TNFSF1Akitを用い、製造業者の使用説明書に従って決定した。同様に、IL-6のレベルをELISAによって、市販のDuoSetELISADevelopmentSystemratIL-6kitを用いて決定した。どちらの場合も、レベルをpg/mlで表した。ウエスタンブロットによるiNOS、sICAM-1、sVCAM-1、IκBおよびNFκBの決定ウエスタンブロットによりタンパク質を定量するために、組織サンプルを溶解バッファーで希釈し1:20、ローリー法に基づいたBioRad社製キットを使用した。反応は96ウェルプレートMicrotest商標96BectonDickinsonLabwareNJUSAにおいて、サンプルおよび標準曲線についていずれも5μlを用いて行った。各測定は三反復で行った。これに先立ち、既知濃度のBSAを含有する標準溶液に基づいて、較正曲線を準備した。続いて、25μlの試薬Aサンプルは界面活性剤:IGEPALCA-630を含有していたため、試薬A1ml当たり20μlの試薬Sを添加したを添加した。その後、200μlの試薬Bを添加した。混合物を少なくとも15分間インキュベートし、吸光度を750nmで測定した。電気泳動によるタンパク質の分離はレムリ法に基づく。17アクリルアミドミックスローディングゲル29.2アクリルアミド、0.8ビス-アクリルアミドと、タンパク質のサイズおよびローディングするサンプル容量に応じた様々な厚さのアクリルアミドミックス分離ゲルとを含む1.5-mm厚のトリス-グリシン-ポリアクリルアミドゲル中にタンパク質をローディングした。分子量マーカーもローディングしたLow/BroadrangeBioRadLaboratoriesCAUSAまたはBenchMark商標着色済みタンパク質ラダーInvitrogenCorporationCAUSA。用いた組織抽出物の量はタンパク質200μg/ウェルであった。各サンプルを、等容量のローディングバッファー12-メルカプトエタノール、2ドデシル硫酸ナトリウム[SDS]、10グリセロール、125mMTris、pH6.8、0.0005w/vブロモフェノールブルーと混合し、タンパク質を100°Cで5分間変性させ、続いて、少量のローディングバッファーを、サンプルを加えずに、ウェルの底に入れ、全ウェルの残りのスペースに電気泳動バッファー192mMグリシン、0.1SDS、25mMTris塩基、pH8.3を満たした。電気泳動は、電気泳動バッファー中、一定の電圧100Vを印加した状態で行った。アクリルアミドゲル中で分離され含まれているタンパク質を膜へ転写した。転写は、転写液190mMグリシン、20mMTris、pH8.3が入ったキュベット中、一定のアンペア数400mAを保った状態で行い、材料ブロッティングペーパーおよびスポンジは予め浸漬し、ゲルおよびニトロセルロース膜Hybond-ECLAmershamBioscienceは転写バッファー中で15分間平衡化しておいた。転写が完了したら、膜をTTBS洗浄バッファー0.1v/vTWEEN-20;150mMNaCl;20mMTris、pH7.5で洗浄し、その直後に、免疫検出の間の非特異的結合を防ぐため、10mlのブロッキングバッファーとともに、常に撹拌しながらインキュベートした。対応するバッファー中適当な希釈度および温度での一次抗体との、常に撹拌しながらのインキュベーションは、各タンパク質に応じて異なる時間で行った。一次抗体とのインキュベーション後、洗浄バッファーを用いて5分間の洗浄を4回行い、続いて、適当な希釈度の対応する二次抗体とともに、各タンパク質について指定の時間で膜をインキュベートした。最後に、洗浄バッファーを用いてさらに5分間の洗浄を4回行った。異なるタンパク質の特異的バンドは化学発光アッセイによって検出した;このために、市販の顕色液の1:1の割合での混合物を、常に撹拌しながら1分間、周囲温度で維持し、続いて、その顕色液を捨てた。その後、膜をチャンバーに入れて、画像を撮ったImageQuantRTECLImagerGEHealthcare。画像が撮れたら、得られたバンドの光学濃度を、プログラムを用いて定量したImageQuantTソフトウェア。各測定の後、続いて、ローディング対照として用いたα-チューブリンを定量するために、市販の溶液Re-BlotPlusStrongAntibodyStrippingSolutionChemiconInternationalCAUSAを用いてストリッピングを行った。使用した抗体は以下であった:α-チューブリン抗体2144CellSignalingTechnologyiNOS/NOSII型抗体BDTransductionLaboratories610332ICAM-1抗体SantaCruzBiotechnologyINCsc-1511VCAM-1抗体SantaCruzBiotechnologyINCsc-1504IκB-β抗体RDSystemsMAB3425NFκB抗体SantaCruzBiotechnologyNFκBp65F-6:sc-8008pNFκB抗体SantaCruzBiotechnologyp-NFκBp65A-8:sc-166748腎機能クレアチニンおよびクレアチニンクリアランスの分析腎機能を測定するために、クレアチニンの血漿濃度および、糸球体濾過速度の尺度であるクレアチニンクリアランスを決定した。クレアチニンクリアランスCCrは下式を用いて計算した:CCr=FU×CrO/CrP、式中、FUは尿流率ml/分であり、CrOは尿中のクレアチニンの濃度mg/mlであり、CrPはクレアチニンの血漿濃度mg/mlである。尿中および血漿中のクレアチニン濃度は半自動分析装置レフレトロンRocheによって測定した。統計学データの統計分析は、ダブルエントリー分散分析を用いて行い、続いて、データがパラメトリックであるかノンパラメトリックであるかによって、シェフェ法またはクラスカルワリス検定を用いて行った。有意差は、p値が0.005以下の場合に認められると判断した。分析にはNCSS2000統計プログラムを用いた。実施例1冷臓器保存組成物の調製基礎冷臓器保存液として、ユーロコリンズ液ECあるいはウィスコンシン大学液UWを用い、カルジオトロフィン-1CT-1を添加した様々な冷臓器保存組成物を調製した。前記冷保存液を実験ラットモデルでアッセイするため、その媒質を補うために、DROBiosystemsにより供給されているラットCT-1を用いた。そのCT-1は、大腸菌BL21において、アミノ末端のヒスチジンテールを有する融合タンパク質として製造されたものである。該組換えタンパク質の発現は、終濃度0.5mMのIPTGにより25°Cにて2時間で誘導された。細菌ペレットのホモジナイゼーション後、ニッケル親和性カラムクロマトグラフィーQiagenBarcelonaSpainによってHis-CT-1融合タンパク質は精製された。用いたCT-1の配列は配列番号2である。EC液はLaboratoriosEsteveから購入し、UW液はBristolMyersSquibbから購入したViaSpanBristolMyersSquibbSLMadridSpain。臓器保存および移植アッセイのために、基礎溶液に異なる量のCT-1を加えることによって異なる冷臓器保存組成物を調製した。表1および表2に、調製した異なる冷臓器保存組成物の組成を示す。実施例2カルジオトロフィン-1濃度0.1mg/lでの冷腎保存の研究ウィンスター系ラットを用いた第1回目の研究では225~300g/ラット雄、第2回目の研究では225~250g/ラット雄。塩化ケタミン75mg/kgジアゼパム50mg/kgおよびアトロピン20mg/kgの腹膜内注射によりラットに麻酔した。正中開腹を行い、後腹膜を切開して、腹部大動脈および腎動脈~大動脈分岐部腸骨動脈を露出した。続いて、腎血管を、下副腎動脈分枝部および性腺動脈分枝部の結紮によって解離し、尿道周囲脂肪に注意しながら尿管の近位半分を乾燥させた。続いて、臓器の灌流洗浄灌流のために、腎動脈口下で大動脈をクランプし、それによってその血管新生を維持した。分岐部での遠位結紮後に、前面での大動脈横切開によって大動脈カテーテル挿入を行った。クランプを外して、アッセイする1mg/kgヘパリンナトリウム含有冷臓器保存組成物での冷灌流4°Cを開始すると同時に、左腎動脈上での結紮によって大動脈を閉塞した。大静脈との接合部で切断した腎静脈を通じて排液を行った。腎臓を灌流したら、尿管乾燥させた経路内および腎動脈を切断した。腎臓を摘出し、アッセイする冷保存組成物が、臓器を保護するのに十分な量で入った容器に入れて浸し、温度4°Cで維持した。前設定時間での冷保存後に、サンプルを採取して、異なる対象パラメーターを分析した。各研究では、i様々な冷保存組成物;およびii様々な前設定保存時間それぞれ、3時間、6時間、12時間、24時間および48時間の保存効力を評価し比較するために、異なる動物群を用いて、平行アッセイを行った。各研究では、保存していない場合の研究パラメーターのベースライン値保存0時点を決定するために、ラット模擬群Simも含めた。模擬群は、保存していないサンプルを評価するために、腎臓を摘出し、腎臓を冷保存液での洗浄灌流に付し、直ちにサンプルを採取し処理することにより構成した。評価したパラメーターは、酸化的ストレスの指標としてのスーパーオキシドアニオンフリーラジカルSOAの産生;および腫瘍壊死因子TNFαの産生、一酸化窒素合成酵素iNOS誘導、ならびに炎症過程のマーカーとしてのNFκB転写因子の活性化であった。第1回目の研究では、CT-10.1mg/lの効力を、基礎溶液としてユーロコリンズ液を用いた冷保存組成物EC[CT1]において、この組成物における保存効力を、対照として用いたユーロコリンズ液ECにおける保存と比較して、評価した。分析したパラメーターの結果を図1に示す。スーパーオキシドアニオンフリーラジカルの腎レベルSOAを測定した結果、総ての時点においてEC群とEC[CT1]群との間に有意差p<0.001が認められ;Sim群とEC[CT1]群との間でも48時間の時点において認められたp<0.001図1A。腫瘍壊死因子αの腎レベルTNFαに関しては、6時間後にEC群とEC[CT1]群との間に有意差が認められp<0.001;12時間後にSim群とEC[CT1]群との間に認められた12時間:p<0.05;24時間後:p<0.001図1B。誘導型一酸化窒素合成酵素の腎レベルiNOSに関しては、総ての時点においてEC群とEC[CT1]群との間に有意差が認められたp<0.001図1C。腎IκBレベルによって測定したNFκB転写因子の活性化IκBでは、総ての時点においてEC群とEC[CT1]群との間に有意差が認められp<0.001;EC[CT1]群ではSim群と比べて有意な低下も認められたp<0.001図1D。第2回目の研究では、CT-10.1mg/lの効力を、基礎溶液としてウィスコンシン大学液を用いた冷保存組成物UW[CT1]において評価した。同様に、UW[CT1]における保存効力を、対照として用いたウィスコンシン大学液UWにおける保存と比較した。分析したパラメーターの結果を図2に示す。スーパーオキシドアニオンフリーラジカルの腎レベルSOAを測定した結果、48時間の時点においてUW群とUW[CT1]群との間に有意差が認められp<0.05、UW[CT1]群とSim群との間でも認められたp<0.01図2A。腫瘍壊死因子αの腎レベルTNFαに関しては、24時間後にUW群とUW[CT1]群との間に有意差が認められp<0.05;12時間後にUW群とSim群との間に認められp<0.05;UW[CT1]群とSim群との間でも48時間の時点において認められたp<0.001図2B。誘導型一酸化窒素合成酵素の腎レベルiNOSに関しては、総ての時点においてUW群とUW[CT1]群との間に有意差が認められたp<0.001図2C。IκBの腎レベルによって測定したNFκB転写因子の活性化IκBでは、総ての時点においてUW群とUW[CT1]群との間に有意差が認められp<0.001;UW[CT1]群とSim群との間でも認められたp<0.01図2D。実施例3.カルジオトロフィン-1濃度0.2mg/lでの冷腎保存の研究雄ウィンスター系ラット、225~250g/ラットを用いた。摘出の前に、腎臓および肝臓の冷灌流を、保存組成物を用いて4°Cで行った。続いて、同じ外科的行為の間に、2つの臓器を別々に摘出した。まずに、肝間膜を切断した。続いて、移植ドナー手術をシミュレートするために胆管を切断し、右腎静脈および右腎動脈を結紮した。続いて、幽門静脈の両端の二重結紮を行い、それを乾燥させた。その後、1mlのヘパリン添加生理食塩水を静脈内注射により投与した。大動脈に20Gカテーテルを用いてカニューレ挿入し、12mlの冷保存組成物を用いて速度4ml/分で灌流した。灌流直後に、下大静脈を切開して、灌流液の排出を可能にし、その後、肝上の大静脈および門脈を切開した。同時灌流の6分後に、左腎動脈および左腎静脈を結紮し、左腎を摘出し、保存組成物中に4°Cで前設定時間の間、浸した。肝臓をさらに6mlで灌流し続け、肝臓腔から摘出し、最後にまた、4°Cで前設定時間の間、冷保存組成物が入った容器に入れて浸した。予め決定した冷保存時間が経過したら、サンプルを採取して分析した。0.2mg/lのCT-1を含有する、本発明による組成物をウィスコンシン大学液においてアッセイしUW[CT1]、ウィスコンシン大学液を対照として用いたUW。本研究には9つのラット群を含めた:UWを用いて、それぞれ、30分、3時間、24時間および48時間の期間、保存を行った4群;UW[CT1]を用いて、それぞれ、30分、3時間、24時間および48時間の期間、保存を行った4群;さらに異なる対象パラメーターのベースライン値を評価するための、冷保存していない1模擬群Sim。前設定時間での冷保存後に、サンプルを採取して、異なる対象パラメーターを分析した。この場合には、以下を評価した:SOAの産生、TNFαの産生、iNOSの誘導、NFκB因子の活性化およびVCAM-1血管接着分子のレベルこれも炎症過程の指標である。得られた結果を図3に示す。スーパーオキシドアニオンの腎レベルSOAを測定した結果、6時間および24時間の時点においてUW群とUW[CT1]群との間に有意差が認められp<0.05;Sim群とUW群との間でも認められたp<0.05図3A。腫瘍壊死因子αの腎レベルTNFαに関しては、24時間および48時間の時点においてUW群とUW[CT1]群との間に有意差が認められp<0.05、Sim群とUW群との間でも認められたp<0.05図3B。誘導型一酸化窒素合成酵素iNOS腎レベルに関しては、6時間の時点においてUW群とUW[CT1]群との間に有意差が認められp<0.05;Sim群とUW群との間でも差が認められた図3C。Ser311リン酸化p65タンパク質の腎レベルpNFκBに関しては、6時間の時点においてUW群とUW[CT1]群との間に有意差が認められ;Sim群とUW群との間でも有意差が認められた図3E。VCAM-1血管接着分子の腎レベルでは、24時間の時点においてUW群とUW[CT1]群との間に有意差が認められp<0.05;Sim群とUW群との間でも有意差が認められたp<0.05図3F。実施例4カルジオトロフィン-1濃度が0.1mg/lの組成物を用いた冷腎保存および移植の研究外科手技は、GarciaCriadoetalによって既に記載されているプロトコールに従ってを行った。本研究は雄フィッシャーラット、225~250g/ラットにおいて行った。まず第一に、腎臓を採取するために、50mg/kg塩酸ケタミンケトラール、ParkeDavis、50mg/kgジアゼパムValium、Rocheおよび25mg/kgアトロピンAtropina、Braunの組合せによりドナー動物に麻酔した。動物を恒温表面に置き、腎臓の特定および指示後、腎周囲および尿管周囲脂肪のごく一部を保存して、扱いやすくした。尿管を切断し、プラスチックチューブ0.68mmOD、0.28mmID、問い合わせ番号427400、Intramedic、ClayAdamsを用いてカニューレ挿入した。この時点において、ラットにヘパリン1,000IUを投与し、心臓拍動中に、腎臓を4°Cおよび速度0.74ml/分で150秒間、アッセイする冷保存組成物で灌流した。その後、腎動脈および腎静脈を切り離し、ポリエチレンチューブ1.57mmOD、1.14mmID、問い合わせ番号427430、Intramedic商標-ClayAdamsを腎静脈に挿入した。腎臓を摘出したら、腎臓を冷保存組成物4°C中で24時間保存した。最後に、移植自体を行った。レシピエントラットは、既に記載したとおりに麻酔した。開腹後、左腎を摘出し、保存する腎臓を洗浄し、レシピエントラットに正所性に移し、ポリアミドモノフィラメント糸を用いて腎動脈の吻合を行った。ドナー腎臓に予め挿入しておいたプラスチックチューブを用いてドナーおよびレシピエントの静脈および尿管を吻合した。腹膜および腹筋は、バイクリル5/0での連続縫合により単一面で閉鎖した。皮膚はステープルで閉鎖した。吻合-再灌流の継続は10分以下とし、レシピエントラットでの合計時間は30分を超えなかった。動作および反応が正常に戻るまで、白熱電球を用いて動物を温め続けた。移植が完了したら、血液再灌流を前設定時間の間維持し、その後、血液、尿および腎臓サンプルを採取した。異なる群についての前設定再灌流時間は、それぞれ、単位:日td:1、3、7および14であった。さらに、ラット模擬群を含めたSim。0.1mg/lのCT-1を含有する、本発明による組成物をウィスコンシン大学液においてアッセイしUW[CT1]、ウィスコンシン大学液を対照として用いたUW。本研究には11のラット群を含めた総ての群で、n>15移植数:UWを用いて腎臓保存を行い、再灌流時間が各群で異なっているそれぞれ、1日、3日、7日、14日および30日5群;UW[CT1]を用いて該保存を行い、再灌流時間が同様に異なっている5群;および上記のとおりに腎臓を各ドナーラットから摘出したが、冷保存液UWでの洗浄後、直ちに移植した1模擬群Sim。この研究では以下を分析した:移植レシピエントラットの生存時間;SOAおよびTNFα、IL-6、および可溶型のsICAM-1およびsVCAM-1細胞間接着分子の産生;NFκBの活性化;ならびに、腎機能の指標として、血清クレアチニンレベルおよびクレアチニンクリアランス。得られた結果を図4に示す。生存に関しては、第5日目からUW群とUW[CT1]群との間p<0.01およびUW群とSim群との間p<0.001に有意差が認められた図4A。血清クレアチニンレベルCREATを測定した結果、総ての時点においてUW群とUW[CT1]群との間に有意差が認められp<0.05、UW群とSim群との間でも認められたp<0.01図4B。クレアチニンクリアランスのレベルCRCLに関しては、総ての時点においてUW群とUW[CT1]群との間に有意差が認められp<0.01、UW群とSim群との間でも認められたp<0.01図4C。スーパーオキシドアニオンフリーラジカルの腎レベルSOAに関しては、総ての時点においてUW群とUW[CT1]群との間に有意差が認められp<0.001、UW群とSim群との間でも認められたp<0.001図4D。腫瘍壊死因子αの腎レベルTNFαについては、総ての時点においてUW群とUW[CT1]群との間に有意差が認められp<0.01、UW群とSim群との間でも認められたp<0.01図4E。インターロイキン-6の腎レベルIL-6については、総ての時点においてUW群とUW[CT1]群との間に有意差が認められp<0.05、UW群とSim群との間では3日の時点において認められたp<0.01図4F。IκBの腎レベルによって測定したNFκB転写因子の活性化IκBに関しては、総ての時点においてUW群とUW[CT1]群との間に有意差が認められp<0.01、UW群とSim群との間でも認められたp<0.01図4G。可溶型ICAM-1接着分子のレベルsICAM-1に関しては、総ての時点においてUW群とUW[CT1]群との間に有意差が認められp<0.01、UW群とSim群との間でも認められたp<0.01図4H。可溶型VCAM-1接着分子のレベルsVCAM-1に関しては、総ての時点においてUW群とUW[CT1]群との間に有意差が認められp<0.01、UW群とSim群との間でも認められたp<0.01図4I。実施例5.カルジオトロフィン1濃度0.2mg/Lでの冷心肺保存の研究本研究は雄ウィンスター系ラット280~320gにおいて行った。腹膜内チオペンタール30mg/kgによりラットに麻酔し、気管切開を行い、気管挿管した。ラットを齧歯類用ベンチレーターとつなぎ、周囲空気を通した。ラットに50IUのヘパリンを、陰茎静脈を通じて投与し、5分後に腹腔鏡下で胸骨切開を行った。胸部大静脈を切断し、20mlの冷ウィスコンシン液を用いて水圧20cmで肺動脈を通して肺を灌流した。肺を膨らませ、気管を結紮した後、心肺ブロックを動物から分離し、40mlのウィスコンシン液が入った容器に入れ、4°Cで0時間、24時間および48時間それを維持した。その時間が経過したら、心臓および肺を分離し、重量を測定し、液体窒素中で凍結した。それぞれの時間の動物の半数において、カルジオトロフィン-1を濃度0.2μg/mlで保存液に加えたn=5。従って、実験群は以下となるであろう:1.0時点-対照:CT-1不含ウィスコンシン液で灌流したら、臓器を直ちに凍結するN=5。2.0時点-CT-1:CT-1含有ウィスコンシン液で灌流したら、臓器を直ちに凍結するN=5。3.24時間時点-対照:CT-1不含ウィスコンシン液で灌流したら、臓器をCT-1不含ウィスコンシン液中で24時間保存するN=5。4.24時間時点-CT-1:CT-1含有ウィスコンシン液で灌流したら、臓器をCT-1含有ウィスコンシン液中で24時間保存するN=5。5.48時間時点-対照:CT-1不含ウィスコンシン液で灌流したら、臓器をCT-1不含ウィスコンシン液中で48時間保存するN=5。6.48時間時点-CT-1:CT-1含有ウィスコンシン液で灌流したら、臓器をCT-1含有ウィスコンシン液中で48時間保存するN=5。用いたカルジオトロフィンはラットCT-1であった。予め決定した時間での冷保存後に、様々な対象パラメーターを分析するためのサンプルを準備し、分析した。凍結した肺および心臓を、0.50ml/lのTritonX-100も含めた5容量のtris-HClバッファー50mM、pH7.4中4°Cで、Ultra-TurraxT25ホモジナイザ-を用いて13,000rpmで2分間ホモジナイズした。遠心分離後、上清を得、ローリー法を用いてそのタンパク質濃度を測定した。この場合、肺については、iNOS誘導、p65NFκBレベル、pNFκBレベルおよびSOA産生を評価した。心臓については、iNOS誘導、p65NFκBレベル、ICAMレベル、SOA産生およびTNFα産生を評価した。この場合に用いる抗体は、前の実験に用いたものとは異なる企業のものであり、それらは以下である:α-チューブリン抗体CellSignaling2144ローディング対照iNOS/NOSII型抗体S-20SantaCruzBiotechnologysc-651NFκB抗体CellSignalingNFκBp65,9242pNFκB抗体CellSignalingp-NFκBp65,3031ICAM-1抗体LabgenCTS11333活性型カスパーゼ3抗体Asp-175CellSignaling9661図5Aは、CT-1不含ウィスコンシン液を用いた保存によって、ラット肺において誘導型一酸化窒素合成酵素iNOS発現チューブリンによって補正したの増加が誘導され、24時間の保存ではそのようであり、48時間の保存ではなおさらそのようであることを示している。CT-1含有ウィスコンシン液を用いて保存した場合にはこの増加は認められない。図5Bは、CT-1不含ウィスコンシン液を用いた24時間および48時間の保存によって、ラット肺においてp65NFκB発現の小幅な増加が誘導されることを示している。CT-1含有ウィスコンシン液を用いて保存した場合にはこの増加は認められない。図5Cは、CT-1不含ウィスコンシン液を用いた24時間および48時間の保存によって、phospho-p65NFκBpNFκB組織レベルの著しい上昇が誘導されることを示している。CT-1含有ウィスコンシン液を用いて肺を保存した場合にはこの上昇は認められない。図5Dは、CT-1不含ウィスコンシン液を用いたラット肺の24時間および48時間の保存によって、スーパーオキシドアニオン濃度の著しい上昇が誘導されることを示している。CT-1含有ウィスコンシン液を用いて保存した場合にはこの上昇はずっと小さい。図6Aは、CT-1不含ウィスコンシン液を用いた保存によって、ラット心臓において誘導型一酸化窒素合成酵素発現チューブリンによって補正したの増加が誘導され、24時間の保存ではそのようであり、48時間の保存ではなおさらそのようであることを示している。この増加は、CT-1含有ウィスコンシン大学液を用いて保存した場合と違いはなかった。図6Bは、CT-1不含ウィスコンシン液を用いた48時間の保存によって、ラット心臓においてp65NFκB発現の増加が誘導されることを示している。CT-1含有ウィスコンシン液を用いて保存した場合にはこの増加は認められなかった。図6Cは、CT-1不含ウィスコンシン液を用いた24時間および48時間の保存によって、ラット心臓においてICAM-1組織レベルの著しい上昇が誘導されることを示している。この上昇は、CT-1含有ウィスコンシン液を用いて保存した場合と同様である。図6Dは、CT-1不含ウィスコンシン液を用いた24時間および48時間の保存によって、ラット心臓においてスーパーオキシドアニオンSOA濃度の著しい上昇が誘導されることを示している。CT-1含有ウィスコンシン液を用いて保存した場合にはこの上昇は著しく小さい。図7は、保存液ウィスコンシン大学液にCT-1を加えた場合には、該保存液中に認められるTNF-αの量が、CT-1を加えなかった場合よりも少ないことを示している。これは保存24時間および48時間の両方の時点において認められる0時点の保存液ではTNF-αは検出されない。実施例6.カルジオトロフィン1濃度0.2mg/Lの場合の、冷保存誘発性腎損傷に対する、洗浄液、保存液またはそれらの両方に入っているカルジオトロフィン1の保護効果の比較ウィンスター系ラット雄225~250g/ラットを用いた。塩化ケタミン75mg/kgジアゼパム50mg/kgおよびアトロピン20mg/kgの腹膜内注射によってラットに麻酔した。正中開腹を行い、後腹膜を切開して、腹部大動脈および腎動脈~大動脈分岐部腸骨動脈を露出した。続いて、腎血管を、下副腎動脈分枝部および性腺動脈分枝部を結紮することによって解離し、尿管をその近位半分に切開し、尿管周囲脂肪を保存した。次いで、臓器の灌流のために、腎動脈口下で大動脈をクランプし、それによって血管新生を維持した洗浄灌流W。分岐部の高さでの遠位結紮後に、前面での大動脈横切開によって大動脈カテーテル挿入を行った。クランプを外して、冷臓器保存組成物CT-1含有または不含の、1mg/Kgヘパリンナトリウム含有ウィスコンシン大学UW液での冷灌流4°Cを開始したら、左腎動脈上での結紮によって大動脈を閉塞した。大静脈との接合部で切断した腎静脈を通じて排液を行った。腎臓を灌流したら、大動脈および尿管を切断することにより腎臓を分離し、20mlの保存液0.2mg/LCT-1含有または不含の0.25mg/Lのヘパリンナトリウム含有ウィスコンシン大学UW液に浸漬した。腎臓を保存液中で24時間または48時間維持した。研究群は6群であった:1-P-24時間群:CT-1を保存液に含めたが、洗浄液には含めなかった場合の24時間の保存。2-W-24時間群:CT-1を洗浄液に含めたが、保存液には含めなかった場合の24時間の保存。3-PW-24時間群:CT-1を保存液にも洗浄液にも含めた場合の24時間の保存。4-P-48時間群:CT-1を保存液に含めたが、洗浄液には含めなかった場合の48時間の保存。5-W-48時間群:CT-1を洗浄液に含めたが、保存液には含めなかった場合の48時間の保存。6-PW-48時間群:CT-1を保存液にも洗浄液にも含めた場合の48時間の保存。各群を5動物で構成した。保存時間が経過したら、腎臓を保存媒質から取り出し、冷生理食塩水で洗浄し、直ちに液体窒素中で凍結した。評価したパラメーターは、酸化的ストレスの指標としてのスーパーオキシドアニオンSOAフリーラジカルの産生;および腫瘍壊死因子TNFαの産生、誘導型一酸化窒素合成酵素iNOSおよびICAM-1接着分子の組織レベル、ならびに腎臓における保存誘発性炎症過程マーカーとしてのNFκB転写因子活性化ホスホ-p65およびIκBの組織レベルとして測定であった。サンプル調製および分析ならびにSOA、TNFα、iNOS、ICAM-1およびNFκB活性化を決定するための方法は、材料および方法の節に記載した。保存を24時間行った場合に得られた結果は以下の通りであった。SOA組織レベルは、洗浄液にも保存液にもCT-1を加えた場合により低かったが、保存液にのみP、洗浄液にのみWまたはそれらの両方にPWCT-1を加えた場合では有意差は認められなかった図8A。洗浄液にWまたは保存液にも洗浄液にもPWCT-1を入れた場合には、保存液中のTNFαレベルは、保存液にのみCT-1を入れた場合Pよりも著しく低く図8B、これらの2群の間に有意差はなかった。保存液にのみP、洗浄液にのみWまたはそれらの両方にPWCT-1を入れた場合では、腎組織におけるiNOSチューブリンによって補正したレベルに有意差はない図8C。保存液にのみP、洗浄液にのみWまたはそれらの両方にPWCT-1を入れた場合では、腎組織におけるICAM-1接着分子チューブリンによって補正したレベルに有意差は認められなかった図8D。保存液にのみP、洗浄液にのみWまたはそれらの両方にPWCT-1を入れた場合では、NFκB転写因子腎活性化IκB組織レベルとして測定したに有意差は認められなかった図8E。保存液にのみP、洗浄液にのみWまたはそれらの両方にPWCT-1を入れた場合では、NFκB転写因子腎活性化phospho-p65組織レベルとして測定したに有意差は認められなかった図8F。保存を48時間行った場合に得られた結果は以下であった:保存液にも洗浄液にもCT-1を入れた場合PWには、SOA組織レベルは、保存液にのみそれを入れた場合Pより低かったが、洗浄液にのみそれを加えた場合Wと差はないことが認められた図8G。保存液にも洗浄液にもCT-1を入れた場合PWには、灌流液中のTNF-αレベルは、保存液にのみそれを入れた場合Pより低かったが、洗浄液にのみそれを入れた場合Wと差はなかった図8H。保存液にも洗浄液にもCT-1を入れた場合PWには、iNOSチューブリンによって補正した組織レベルは、保存液にのみPまたは洗浄液にのみWそれを入れた場合より低かったが、それらに有意差はなかった図8I。保存液にのみP、洗浄液にのみW、または保存液にも洗浄液にもPWCT-1を入れた場合では、iCAMチューブリンによって補正した組織レベルに有意差はなかった図8J。保存液にのみP、洗浄液にのみWまたはそれらの両方にPWCT-1を入れた場合では、NFκB転写因子腎活性化IκB組織レベルとして測定したに有意差は認められなかった図8K。保存液にのみP、洗浄液にのみWまたはそれらの両方にPWCT-1を入れた場合では、NFκB転写因子腎活性化phospho-p65組織レベルとして測定したに有意差はなかった図8L。この研究では、CT-1不含の保存液および洗浄液を使用する対照群を含めていないが、該対照を含めた前の比較実験において得られたデータは、総ての分析群保存液中にのみP、洗浄液中にのみWまたはそれらの両方にPWCT-1において、SOA、iNOSチューブリンによって補正した、ICAMチューブリンによって補正した、IκBおよびphospho-p65の組織レベル、ならびに灌流液中のTNF-αレベルが、該対照群において観測されたものより、常にずっと低かったことを示し、記載した3条件のいずれの場合にも用いたCT-1の抗酸化作用および抗炎症作用を実証していることを指摘することが重要である。結論上記研究から、まずに、移植のために用いる冷臓器保存液にCT-1を加えることによって、それがユーロコリンズ液であろうとウィスコンシン大学液であろうと、特には、ウィスコンシン大学液を非常に長い保存時間24~48時間に付した場合に、保存される腎臓での酸素フリーラジカルの産生は減少すると結論づけられる。ユーロコリンズ保存液とUW保存液は組成がまったく異なっているため、CT-1は他の冷保存液に関しても同様に効果的であると考えるのが妥当であろう。第二に、CT-1の保護効果は、ユーロコリンズ液を基礎溶液として用いて腎臓を保存した場合により明らかであり、それは恐らく、ユーロコリンズ液が腎臓の冷保存において提供する性能がより低いためである。しかしながら、行ったアッセイでは、CT-1含有UW液を用いた場合に、冷保存および再灌流の両方で最良の結果が得られた。最後に、保存された腎臓を同系ラットに移植する場合に、冷保存液にCT-1を加えることによって、動物の生存、腎機能、組織学的損傷、酸化的ストレス、炎症誘発性サイトカインの産生、iNOSの誘導、好中球の浸潤およびNFκB転写因子の活性化は、CT-1不含の冷保存液中で保存された腎臓と比べて改善される。要するに、冷保存液にCT-1を添加することで、冷虚血によって引き起こされる損傷や、虚血/移植後再灌流腎臓における急性尿細管壊死の原因によって引き起こされる損傷を防ぎ減少させ、それによって、腎機能および生存が改善されるといえる。加えて、心肺ブロックに関しては、実験により、心肺ブロックの冷保存液にCT-1を添加することで、生じるNFκB活性化は低下し、心臓および肺の両方においてスーパーオキシドアニオンSOA産生は減少し、さらに保存液へのTNF-α放出も減少すると結論付けることができ、虚血および冷保存により刺激される酸化過程および炎症過程の誘導がより少なくなることが実証されている。肺の場合、さらに、冷保存液にCT-1を添加することで、生じるiNOS誘導が減少することも観察される。最後に、ラットにおいてウィスコンシン大学冷保存液を用いた実験腎保存モデルでは、腎臓洗浄液にのみCT-1を加えた場合でも、測定した抗酸化作用および抗炎症作用に関する因子に関しては、洗浄液および保存液の両方にCT-1を加えた場合より悪い結果は生じないことが見出された。このことから、臓器保存プロセスでのCT-1の処理を非常に単純化することおよびCT-1へのレシピエントの潜在的曝露を著しく減少させることも可能であろう。"