対応付け分子のmRNA部分を連結するためのDNAリンカーであって、その5末端に、前記mRNA部分の5末端の配列に相補的なmRNA相補性領域、及び、その3末端に、DNAリンカー相互間で相補的な自己相補性領域を含み、その5末端がリン酸化されているDNAリンカー。対応付け分子のmRNA部分の5末端の配列が、5末端側からプロモーター配列、Ω様配列、T7ペプチドタグ遺伝子をこの順序で含む、請求項1に記載のDNAリンカー。下記の工程を含む、相互作用する蛋白質をコードする遺伝子が連結したDNAの合成方法。対応付け分子をその蛋白質部分で相互作用させる工程相互作用した対応付け分子のmRNA部分を、請求項1又は2に記載のDNAリンカーを介してアニーリングにより連結させる工程であって、対合は、前記mRNA部分の5末端の配列と前記mRNA相補性領域との間、及び、前記自己相補性領域間に生じる前記工程逆転写により前記mRNA部分をDNARNAハイブリッドにする工程前記DNAリンカーの5末端と、逆転写で合成されたDNA鎖の3末端を連結する工程DNARNAハイブリッドを構成するRNAを分解する工程前記DNAリンカー3末端を伸長してcDNAを合成する工程請求項3に記載の合成方法で得られたDNAの塩基配列を決定し、相互作用した蛋白質をコードする遺伝子の組または相互作用した蛋白質の組を特定することを含む相互作用の解析方法。本発明は、固定したベイトを用いたアフィニティ選択が不要な生体分子相互作用の解析方法を提供することを目的とする。本発明者らは、mRNAprotein対応付け分子の蛋白質部分が相互作用した場合に、近接することとなるそれぞれのmRNA部分の間の架橋が、特定の構造を有するオリゴDNAリンカーにより可能になることを見出し、本発明を完成した。本発明は、対応付け分子のmRNA部分を連結するためのDNAリンカーであって、その5末端に、前記mRNA部分の5末端の配列に相補的なmRNA相補性領域、及び、その3末端に、DNAリンカー相互間で相補的な自己相補性領域を含み、その5末端がリン酸化されているDNAリンカーを提供する。対応付け分子のmRNA部分の5末端の配列は、5末端側からプロモーター配列、Ω様配列、T7ペプチドタグ遺伝子をこの順序で含むものであってもよい。本発明は、また、下記の工程を含む、相互作用する蛋白質をコードする遺伝子が連結したDNAの合成方法を提供する。対応付け分子をその蛋白質部分で相互作用させる工程相互作用した対応付け分子のmRNA部分を、本発明のDNAリンカーを介してアニーリングにより連結させる工程であって、対合は、前記mRNA部分の5末端の配列と前記mRNA相補性領域との間、及び、前記自己相補性領域間に生じる前記工程逆転写により前記mRNA部分をDNARNAハイブリッドにする工程前記DNAリンカーの5末端と、逆転写で合成されたDNA鎖の3末端を連結する工程DNARNAハイブリッドを構成するRNAを分解する工程前記DNAリンカー3末端を伸長してcDNAを合成する工程本発明はさらに、本発明の合成方法で得られたDNAの塩基配列を決定し、相互作用した蛋白質をコードする遺伝子の組または相互作用した蛋白質の組を特定することを含む相互作用の解析方法を提供する。本発明により、固定したベイトを用いたアフィニティ選択が不要な生体分子相互作用の解析方法が提供される。蛋白質のアミノ酸配列をDNAの塩基配列に変換し、且つ、その解析を次世代シーケンサーで行なうことにより、蛋白質間相互作用を網羅的に解析することができる。また、ベイト蛋白質の調製を必要とせず、ライブラリー中に存在する全てのmRNAprotein対応付け分子がベイトになり得る。ヒトの場合、蛋白質間相互作用は30万種程度と見積もられているが、次世代シーケンサーの解析能力は50万~1億リードrunであるため、期待値の上では、全ての蛋白質間相互作用が一度に検出されることになる。<1>本発明DNAリンカー本発明DNAリンカーは、対応付け分子のmRNA部分を連結するためのDNAリンカーであって、その5末端に、前記mRNA部分の5末端の配列に相補的なmRNA相補性領域、及び、その3末端に、DNAリンカー相互間で相補的な自己相補性領域を含み、その5末端がリン酸化されていること特徴とする。対応付け分子としては、後述するように通常の対応付け分子が使用できる。例えば、対応付け分子のmRNA部分の5末端の配列が、5末端側からプロモーター配列、Ω様配列、T7ペプチドタグ遺伝子をこの順序で含むものが挙げられる。プロモーターの箇所は試験管内転写反応が可能なプロモーター配列であれば特に制限は無くSP6プロモーターの箇所は試験管内転写反応が可能なプロモーター配列であれば特に制限は無い。例えばT7プロモーターも利用できる。Ω様配列の部分は、翻訳効率を高める配列であれば特に制限は無い。T7tagの箇所もペプチドタグであれば特に制限は無い。本発明DNAリンカーのmRNA相補性領域は、用いる対応付け分子のmRNA部分の5末端の配列に相補的な配列を選択すればよい。mRNA相補性領域の長さは、通常には、8~30bpであり、好ましくは、10~20bpである。また、この領域のTmは、通常には、20~70°Cであり、好ましくは25~50°Cである。本発明DNAリンカーの自己相補性領域は、リンカーの3末端が相補配列により対合する限り、特に限定されず、通常には、10~35bpであり、好ましくは、12~30bpである。また、この領域のTmは、通常には、22~72°Cであり、好ましくは25~55°Cである。自己相補領域とmRNA相補領域との間にスペーサーとなるDNAを挿入してもよい。スペーサーの長さは、通常には、3~15bpであり、好ましくは、4~10bpである。<2>本発明DNA合成方法本発明DNA合成方法は、相互作用する蛋白質をコードする遺伝子が連結したDNAの合成方法であり、下記の工程を含む。対応付け分子をその蛋白質部分で相互作用させる工程相互作用した対応付け分子のmRNA部分を、本発明DNAリンカーを介してアニーリングにより連結させる工程であって、対合は、前記mRNA部分の5末端の配列と前記mRNA相補性領域との間、前記自己相補性領域間に生じる前記工程逆転写により前記mRNA部分をDNARNAハイブリッドにする工程前記DNAリンカーの5末端と、逆転写で合成されたDNA鎖の3末端を連結する工程DNARNAハイブリッドを構成するRNAを分解する工程前記DNAリンカー3末端を伸長してcDNAを合成する工程以下、各工程について説明する。1相互作用対応付け分子の蛋白質部分の相互作用が次工程のアニーリングで維持される限り、特に条件は限定されない。例えば、特許文献2に記載の条件で相互作用させることができる。無細胞翻訳系で合成した対応付け分子を混合してもよいし、後述するようにコード分子を同一の系で翻訳共翻訳してもよい。2アニーリング相互作用した対応付け分子のmRNA部分を、請求項1又は2に記載のDNAリンカーを介してアニーリングにより連結させる。この際には、対合は、前記mRNA部分の5末端の配列と前記mRNA相補性領域との間、前記自己相補性領域間に生じればよく、両対合は、同時でもよいし、いずれか一方が先でもよい。同時に対合させる場合は、両領域のTmを近くする通常には5°C以内。また、Tmの高い方の領域を先に対合させて、ついでもう一方を対合させてもよい。例えば、別の系で、DNAリンカーの自己相補性領域を対合させてから、相互作用の系に対合DNAリンカーを加えて、対応付け分子のmRNA部分の5末端の配列とmRNA相補性領域とを対合させてもよい。DNAリンカーはその自己相補領域を利用して予めハイブリッドを作成しやすいため、自己相補性領域のTmをTms、mRNA領域とのTmをTmrとすれば、Tms≧Tmrとすることが好ましい。また、以後の工程における各種酵素反応の中で逆転写反応と伸長反応時の温度例えば37°Cで反応を行う必要がある。そのため、Tmr酵素反応温度とする必要がある。アニーリングの際に加えるDNAリンカーは、通常には、10fM~10pM、好ましくは、50fM~5pMの濃度である。3逆転写逆転写により前記mRNA部分をDNARNAハイブリッドにする。逆転写は、通常の条件で行うことができる。4ライゲーション反応前記DNAリンカーの5末端と、逆転写で合成されたDNA鎖の3末端を連結する。通常のライゲーション反応条件で連結することができる。5RNA分解DNARNAハイブリッドのRNAを分解する。RNaseHを用いて行うことができる。6伸長反応DNAリンカーをプライマーとして、DNAポリメラーゼを用いて通常の条件で伸長させることができる。伸長したDNAは、通常のクローニングや通常のPCRにより精製、増幅することができる。図2に本発明の合成方法のスキームを示す。従来のIVV法と同様に、蛋白質のC末端はピューロマイシンを介してmRNAと連結している。mRNAの5’末端と3’末端は、constantregionをもつ。例えば、5’constantregionにはプロモーター配列や翻訳効率を高めるOmega配列などを用いる。一方、3’末端はFLAGペプチドなどのアフィニティタグを用いる。このようなmRNAprotein対応付け分子のライブラリーを、mRNAライブラリーから構築する。蛋白質蛋白質相互作用を形成する対応付け分子は、そのmRNA部の5’末端が近接する確率が高まる。ここで、接近した2つのIVVを連結するためには、同じ方向の核酸を連結する必要がありスクエア反応、従来の単純な逆方向の連結方法では実現出来ない。そこで、自己相補配列をもち、かつmRNAの5’末端に相補性を有するオリゴDNAを加え、mRNAの5’末端を架橋するリンカーとして機能させる。ここで、におけるライゲーション反応を可能とするために、リンカーオリゴDNAの5’末端には、リン酸基を付加しておく。次に、mRNAの3’末端に相補性を有するプライマーを用いて逆転写反応を行う。続いてDNAリガーゼを用いて、伸長したcDNAとリンカーDNAを連結する。これで、mRNAcDNAのハイブリッドが完成する。次に、RNaseHを用いてRNA部を分解する。続いてDNAポリメラーゼを用い、cDNAの3’末端の伸長反応を行う。伸長反応が完結するとのように、相互作用する蛋白質Aと蛋白質Bをコードする遺伝子が、リンカーDNAを介して連結されたDNAの断片が得られる。このDNA断片をシーケンサーにより解析すれば、蛋白質間相互作用をDNAの塩基配列情報として読み取ることができる。<3>本発明解析方法本発明の合成方法で得られたDNAの塩基配列を決定することにより、相互作用した蛋白質をコードする遺伝子の組または相互作用した蛋白質の組を特定することができ、これによって相互作用を解析できる。塩基配列の決定は、DNAをクローニングしてから行ってもよい。サンガー法のシーケンシングの場合であれば、一度クローニングを行なうことで、同一長のDNA断片でも純化するので、個々の配列のシーケンシングが可能になる。また、スペーサーに制限酵素部位を挿入しておき、予め切断してからPCRを行ない、その後、クローニングしシーケンシングを行なうこともできる。次世代シーケンサーで、シーケンスしてもよい。本発明の解析方法では、ベイトを用いたアフィニティ選択を行なう必要がない。図1c2に示すように、蛋白質が相互作用すると、連結したRNAは近接し、オリゴDNAリンカーによる架橋が可能となる。この時、本発明では、通常の核酸連結とは異なる同じ方向の核酸を連結する必要が出て来る図1c2;スクエア反応が、特定の数工程の組み合わせによりこれが可能となる。これにより、相互作用する蛋白質をコードする遺伝子が、リンカーを介して連結されたDNA断片を得ることができる図1d2。その後、cDNAライブラリーからmRNAprotein対応付け分子ライブラリーを構築し、さらに解析を進めることができる。ベイト調製が不要で、樹脂ビーズへの固定も洗いの工程も必要なくなるため、相互作用解析が飛躍的に効率化される。また、ライブラリー中に存在する全ての相互作用を一挙に同定できる。そのため、大量の相互作用データを取得でき、次世代シーケンサーの能力を充分に活用して解析を行うことができる。<4>対応付け分子本明細書において、対応付け分子とは、表現型と遺伝子型と対応付ける分子を意味する。対応付け分子は、遺伝子型を反映する塩基配列を有する核酸を含む遺伝子型分子と、表現型の発現に関与する蛋白質を含む表現型分子とが結合してなる。遺伝子型分子は、遺伝子型を反映する塩基配列を、その塩基配列が翻訳され得るような形態で有するコード分子と、スペーサー部とが結合してなる。このような対応付け分子は、例えば、特許文献2に記載されているので特許文献2を参照して説明する。なお、本発明においては連結DNAの配列決定により相互作用を判定できるので、特許文献2における相互作用の検出のための修飾又はラベル化は本発明では不要である。対応付け分子における、表現型分子に由来する部分、スペーサー分子に由来する部分、及び、コード分子に由来する部分をそれぞれ、デコード部、スペーサー部及びコード部と呼ぶ。また、遺伝子型分子における、スペーサー分子に由来する部分、及び、コード分子に由来する部分をそれぞれ、スペーサー部及びコード部と呼ぶ。特許文献2図8に、対応付け分子、スペーサー分子及びコード分子の一例の大まかな構成が示されている。この対応付け分子は、ピューロマイシンを含むスペーサーと表現型のコードを反映する塩基配列からなる。この対応付け分子は、コード分子に何らかの方法によってピューロマイシンを含むスペーサー部を結合して遺伝子型分子とし、無細胞翻訳系において、リボソーム上で表現型分子と連結した構成をもつ。スペーサー分子は、ポリエチレングリコールを主成分としたPEG領域、少なくともピューロマイシンあるいはピューロマイシンと1残基以上のDNAあるいはまたはRNAからなるCCA領域、少なくとも1残基以上のDNAあるいはまたはRNAを含むドナー領域、さらに、少なくとも1残基のDNAあるいはまたはRNAの塩基に機能修飾を施した機能付与ユニットからなる。コード分子は、デコード部の一部の配列からなるDNAあるいはまたはRNAのポリA配列を含む3末端領域、および、DNAあるいはまたはRNAからなる転写プロモーターおよび翻訳エンハンサーを含んだ5UTR、さらに、主として表現型分子の配列からなるORF領域から構成される。以下、この例を参照して説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。<4-1>スペーサー分子スペーサー分子は、核酸の3末端に結合できるドナー領域と、ドナー領域に結合した、ポリエチレングリコールを主成分としたPEG領域と、PEG領域に結合した、ペプチド転移反応によってペプチドと結合し得る基を含むペプチドアクセプター領域とを含む。核酸の3末端に結合できるドナー領域は、通常、1以上のヌクレオチドからなる。ヌクレオチドの数は、通常には1~15、好ましくは1~2である。ヌクレオチドはリボヌクレオチドでもデオキシリボヌクレオチドでもよい。ドナー領域の5末端の配列は、ライゲーション効率を左右する。コード部とスペーサー部をライゲーションさせるためには、少なくとも1残基以上を含むことが必要であり、ポリA配列をもつアクセプターに対しては、少なくとも1残基のdCあるいは2残基のdCdCが好ましい。塩基の種類としては、CU又はTGAの順で好ましい。PEG領域はポリエチレングリコールを主成分とするものである。ここで、主成分とするとは、PEG領域に含まれるヌクレオチドの数の合計が20bp以下、又は、ポリエチレングリコールの平均分子量が400以上であることを意味する。好ましくは、ヌクレオチドの合計の数が10bp以下、又は、ポリエチレングリコールの平均分子量が1000以上であることを意味する。PEG領域のポリエチレングリコールの平均分子量は、通常には、400~30000、好ましくは1000~10000、より好ましくは2000~8000である。ここで、ポリエチレングリコールの分子量が約400より低いと、このスペーサー分子に由来するスペーサー部を含む遺伝子型分子を対応付け翻訳したときに、対応付け翻訳の後処理が必要となることがあるがLiuRBarrickESzostakJWRobertsRWMethodsinEnzymologyvol318268293、分子量1000以上、より好ましくは2000以上のPEGを用いると、対応付け翻訳のみで高効率の対応付けができるため、翻訳の後処理が必要なくなる。また、ポリエチレングリコールの分子量が増えると、遺伝子型分子の安定性が増す傾向があり、特に分子量1000以上で良好であり、分子量400以下ではDNAスペーサーと性質がそれほどかわらず不安定となることがある。ペプチドアクセプター領域は、ペプチドのC末端に結合できるものであれば特に限定されないが、例えば、ピューロマイシン、3Nアミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド3NAminoacylpuromycinaminonucleosidePANSアミノ酸、例えばアミノ酸部がグリシンのPANSGly、バリンのPANSVal、アラニンのPANSAla、その他、全アミノ酸に対応するPANS全アミノ酸が利用できる。また、化学結合として3アミノアデノシンのアミノ基とアミノ酸のカルボキシル基が脱水縮合した結果形成されたアミド結合でつながった3Nアミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド3AminoacyladenosineaminonucleosideAANSアミノ酸、例えばアミノ酸部がグリシンのAANSGly、バリンのAANSVal、アラニンのAANSAla、その他、全アミノ酸に対応するAANS全アミノ酸が利用できる。また、ヌクレオシドあるいはヌクレオシドとアミノ酸のエステル結合したものなども利用できる。その他、ヌクレオシドあるいはヌクレオシドに類似した化学構造骨格を有する物質と、アミノ酸あるいはアミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物質を化学的に結合可能な結合様式のものなら全て利用することができる。ペプチドアクセプター領域は、好ましくは、ピューロマイシンもしくはその誘導体、又は、ピューロマイシンもしくはその誘導体と1残基もしくは2残基のデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドからなることが好ましい。ここで、誘導体とは蛋白質翻訳系においてペプチドのC末端に結合できる誘導体を意味する。ピューロマイシン誘導体は、ピューロマイシン構造を完全に有しているものに限られず、ピューロマイシン構造の一部が欠落しているものも包含する。ピューロマイシン誘導体の具体例としては、PANSアミノ酸、AANSアミノ酸などが挙げられる。ペプチドアクセプター領域は、ピューロマイシンのみの構成でもかまわないが、5側に1残基以上のDNAあるいはまたはRNAからなる塩基配列を持つことが好ましい。配列としては、dCピューロマイシンrCピューロマイシンなど、より好ましくはdCdCピューロマイシンrCrCピューロマイシンrCdCピューロマイシンdCrCピューロマイシンなどの配列で、アミノアシルtRNAの3末端を模倣したCCA配列PhilippsGRNature223374377が適当である。塩基の種類としては、CU又はTGAの順で好ましい。<4-2>コード分子コード分子は、転写プロモーターおよび翻訳エンハンサーを含む5非翻訳領域と、5非翻訳領域の3側に結合した、蛋白質をコードするORF領域と、ORF領域の3側に結合した、ポリA配列及び、必要によりその5側に翻訳増強配列例えば制限酵素XhoIが認識する配列を含む3末端領域を含む核酸である。コード分子は、DNAでもRNAでもよく、RNAの場合、5末端にCap構造があってもなくても良い。また、コード分子は任意のベクターやプラスミドに組み込まれたものとしてもよい。3末端領域は、好ましくはSNNS配列例えばXhoI配列とその下流にポリA配列を含む。スペーサー分子とコード分子とのライゲーション効率に影響を与える要素としては3末端領域のポリA配列が重要であり、ポリA配列は、少なくとも2残基以上のdAあるいはまたはrAの混合あるいは単一のポリA連続鎖であり、好ましくは、3残基以上、より好ましくは6以上、さらに好ましくは8残基以上のポリA連続鎖である。コード分子の翻訳効率に影響する要素としては、転写プロモーターと翻訳エンハンサーからなる5UTR、および、ポリA配列を含む3末端領域の組み合わせがある。3末端領域のポリA配列の効果は通常には10残基以下で発揮される。5UTRの転写プロモーターはT7T3あるいはSP6などが利用でき、特に制限はない。好ましくはSP6であり、特に、翻訳のエンハンサー配列としてオメガ配列やオメガ配列の一部を含む配列Ω様配列を利用する場合はSP6を用いることが特に好ましい。翻訳エンハンサーは好ましくはオメガ配列の一部であり、オメガ配列の一部としては、TMVのオメガ配列GallieDRWalbotVNucleicAcidsResvol2046314638の一部を含んだものが好ましい。また、翻訳効率に関し、3末端領域においては、XhoI配列とポリA配列の組み合わせが重要となる。また、ORF領域の下流部分、すなわちXhoI配列の上流に親和性タグがついたものとポリA配列の組み合わせも重要となる。親和性タグ配列としては、抗原抗体反応など、蛋白質を検出できるいかなる手段を用いるための配列であればよく、制限はない。好ましくは、抗原抗体反応によるアフィニティー分離分析用タグであるFlagtag配列である。ポリA配列効果としては、Flagtag等の親和性タグにXhoI配列がついたものとそこへさらにポリA配列がついたものの翻訳効率が上昇する。上記の翻訳効率に関し効果のある構成は、対応付け効率にも有効である。ORF領域については、DNAあるいはまたはRNAからなるいかなる配列でもよい。遺伝子配列、エキソン配列、イントロン配列、ランダム配列、あるいは、いかなる自然界の配列、人為的配列が可能であり、配列の制限はない。また、コード分子の5UTRをSP6O29とし、3末端領域を、たとえば、FlagXhoIAnとすることで、各長さは、5UTRで約60bp、3末端領域で約40bpであり、PCRのプライマーにアダプター領域として組み込める長さである。このため、あらゆるベクターやプラスミドやcDNAライブラリーからPCRによって、5UTRと3末端領域をもったコード分子を簡単に作成できる。コード分子において、翻訳はORF領域を超えてされてもよい。すなわち、ORF領域の末端に終止コドンがなくてもよい。特許文献2図10に、コード分子の一例の詳細な構成が示されている。コード分子は、3末端領域と、DNAあるいはまたはRNAからなる転写プロモーターおよび翻訳エンハンサーを含む5UTRと、デコード部の配列情報からなる、すなわち表現型蛋白質をコードするORF領域とからなる。ここでは、3末端領域として、DNAあるいはまたはRNAからなる親和性タグ配列、XhoI配列、ポリA配列を含み、Flagtag配列を用いている。5UTRとして、転写プロモーターのSP6、翻訳エンハンサーのオメガ配列の一部であるO29を含む配列を用いている。<4-3>遺伝子型分子およびその製造方法遺伝子型分子は、転写プロモーターおよび翻訳エンハンサーを含む5非翻訳領域と、5非翻訳領域の3側に結合した、蛋白質をコードするORF領域と、ORF領域の3側に結合した、ポリA配列を含む3末端領域を含む核酸であるコード分子の3末端と、スペーサー分子のドナー領域とが結合してなる。遺伝子型分子を構成するコード分子は、上記のコード分子においてXhoI配列が必須ではない他は、コード分子について説明したとおりである。しかしながら、XhoI配列を有することが好ましい。遺伝子型分子は、上記コード分子の3末端と、スペーサー分子のドナー領域を、通常のリガーゼ反応により結合させることにより製造できる。反応条件としては、通常、4~25°Cで4~48時間の条件が挙げられ、PEG領域を含むスペーサー分子のPEG領域内のポリエチレングリコールと同じ分子量のポリエチレングリコールを反応系に添加する場合には、15°Cで05~4時間に短縮することも可能である。スペーサー分子とコード分子の組み合わせはライゲーション効率に重要な効果をもたらす。アクセプターにあたるコード部の3末端領域において、少なくとも2残基以上、好ましくは3残基以上、さらに好ましくは6~8残基以上のDNAあるいはまたはRNAのポリA配列があること、さらに、5UTRの翻訳エンハンサーとしては、オメガ配列の部分配列が好ましく、スペーサー部のドナー領域としては、少なくとも1残基のdCあるいは2残基のdCdCが好ましい。このことによって、RNAリガーゼを用いることでDNAリガーゼのもつ問題点を回避し、かつ効率を60~80に保つことができる。遺伝子型分子がRNAである場合には、転写プロモーターおよび翻訳エンハンサーを含む5非翻訳領域と、5非翻訳領域の3側に結合した、蛋白質をコードするORF領域と、ORF領域の3側に結合した、ポリA配列を含む3末端領域を含むコード分子の3末端と、1~4のいずれか1項に記載のスペーサー分子のドナー領域であってRNAからなるものとを、スペーサー分子内のPEG領域を構成するポリエチレングリコールと同じ分子量をもつ遊離のポリエチレングリコールの存在下で、RNAリガーゼにより結合させることが好ましい。ライゲーション反応時に、PEG領域を含むスペーサー部のPEG領域と同じ分子量のポリエチレングリコールを添加することによって、スペーサー部のポリエチレングリコールの分子量によらずライゲーション効率が80~90以上に向上し、反応後の分離工程も省略することができる。<4-4>対応付け分子及びその製造方法対応付け分子は、上記の遺伝子型分子を、ペプチド転移反応で、遺伝子型分子内のORF領域によりコードされた蛋白質である表現型分子と連結してなるものである。対応付け分子は、遺伝子型分子を無細胞翻訳系で翻訳することにより、ペプチド転移反応で、遺伝子型分子内のORF領域によりコードされた蛋白質である表現型分子と連結することを含む。無細胞翻訳系は、好ましくは、小麦胚芽又はウサギ網状赤血球のものである。翻訳の条件は通常に採用される条件でよい。例えば、25~37°Cで15~240分の条件が挙げられる。無細胞翻訳系については、これまで大腸菌、ウサギ網状赤血球、小麦胚芽の系で対応付け分子の形成が検討され、ウサギ網状赤血球の系でのみ対応付け分子が確認されていたがNemotoNMiyamotoSatoEYanagawaHFEBSLett414405RobertsRWSzostakJWProcNatlAcadSciUSA9412297、この態様によれば、PEG領域を含むスペーサー部をもつ対応付け分子として、小麦胚芽の系でも対応付け分子の形成を行うことができる。また、これまでウサギ網状赤血球の系では遺伝子型分子の安定性を欠くために実用性に乏しく、短い鎖長の遺伝子型分子にのみ適用されてきたがRobertsRWSzostakJWProcNatlAcadSciUSA9412297NemotoNMiyamotoSatoEYanagawaHFEBSLett414405、PEG領域を含むスペーサー部をもつ対応付け分子は、小麦胚芽の系ではより安定であり長い鎖長を取り扱える実用的な系である。リボソーム上で翻訳されることにより合成される蛋白質およびそのライブラリーのいろいろな組み合わせを用いて、invitroで蛋白質と物質の相互作用解析が可能であり、たとえば、IVVの一次スクリーニング後の詳細な遺伝子ネットワークを解析する二次スクリーニングに利用できる。無細胞共翻訳で相互作用が実現される場合、その無細胞翻訳系については、大腸菌、ウサギ網状赤血球、小麦胚芽の系などいずれでも構わない。invitrovirus法IVV法では、対応付け分子の形成は、大腸菌はかなり不安定であるが、ウサギ網状赤血球の系FEBSLett414405RobertsRWSzostakJWProcNatlAcadSciUSA9412297では安定に確認されており、さらに小麦胚芽の系ではより安定に確認されている。以下、具体的に本発明の実施例を記述するが、下記の実施例は本発明についての具体的認識を得る一助とみなすべきものであり、本発明の範囲は下記の実施例により何ら限定されるものでない。<実施例1>[F遺伝子mRNAの構築]PCRによって、ヒトFOS蛋白質のロイシンジッパー構造を含む領域をコードするDNA断片の5’側に、SP6プロモーター、Ω様配列、T7タグペプチドをコードする塩基配列を連結した。また、3’側にFLAGタグペプチドをコードする塩基配列とヘキサアデニル酸を連結し、F遺伝子DNA断片を構築した。このとき、フォワードプライマーとして、SP6プロモーター、Ω様配列、T7タグペプチド、およびFOS遺伝子の一部をコードするオリゴDNApriSP6O’T7FOS117fを用いた。リバースプライマーとしてヘキサアデニル酸、FLAGタグ、およびFOS遺伝子の1部をコードするオリゴDNApriFOS211FLAGA6rを用いた。これらのオリゴDNAは株ファスマックより購入した。PCRはKODPlusTOYOBOを用い、添付のマニュアルに従い行なった。サーマルサイクラーのプログラムは、94°C30秒、58°C30秒、68°C30秒を30サイクルである。鋳型DNAはヒトFOS遺伝子のcDNAである。このPCR産物を鋳型として、SP6RNAポリメラーゼPromegaを用い、invitroでF遺伝子mRNAを合成した図3。反応条件は37°Cで3時間である。[DNAリンカーの構築]自己相補性領域と、上記で構築したF遺伝子mRNAのプロモーター配列、Ω様配列、T7ペプチドタグ遺伝子に相補的な領域をもつDNAリンカーSqlinker09を設計し合成した図4。Sqlinker09の5’末端には、リン酸基を付加した。オリゴDNAは、株ファスマックより購入した。[スクエア反応]1アニーリング上記で構築したF遺伝子mRNAを20pmol、上記で構築したSqlinkerを40pmol、F遺伝子mRNAの3’側に結合する逆転写用プライマーpriFOS211FLAGA6rを40pmol、混合し10μlとした。90°Cで30秒加熱後、室温まで徐冷した。2逆転写逆転写酵素、逆転写用反応緩衝液、基質dNTPミックスの混合溶液10μlを、1で調製した溶液と混合し、37°Cで1時間、逆転写反応を行った。逆転写酵素は、Promega製のMMLV逆転写酵素RNaseHminuspointmutantである。3ライゲーション反応DNAライゲースを含む溶液20μlを、2で調製した溶液と混合し、25°Cで1時間、ライゲーション反応を行った。DNAライゲースは、TOYOBOのLigationhighver2を用いた。4RNA分解3で調製した溶液に、RNaseHを1μl混合し、RNA部分を分解した。RNaseHは、Invitrogen社のものを用いた。5伸長反応4で調製した溶液に、DNAポリメラーゼ、dNTPミックス、DNAポリメラーゼ反応用緩衝液の混合溶液を加え、56°Cで15分伸長反応を行なった。この際、4で調製した試料を表1に記した分量加えた。6PCR反応5の反応液に、priFOS211FLAGA6r20pmolμlを、表1に記した分量加えた。サーマルサイクラーのプログラムは、94°C30秒、56°C30秒、72°C3分、を40サイクルである。7PCR反応産物を電気泳動した。その結果を図5に示す。DNAマーカーの濃いバンドは500bpに相当する。18のサンプルに於いて、300400bpに濃いDNAバンドが観られた。これは、F遺伝子DNA397bpに相当する。本来、図2hに示すDNA断片の合成に成功していれば、その約2倍の長さのDNA断片が得られるはずである。モノマーのF遺伝子DNAに相当するDNA断片が得られた理由は、試料に含まれる未反応のSqlinker09がプライマーとして働き、Sqlinker09とpriFOS211FLAGA6rで挟まれた領域が増幅されたためと考えられる。そこで、Sqlinker09の持ち込み量を減らす目的で、試料の量を減らしlane789、さらにpriFOS211FLAGA6rの添加量を増やしlane147、PCRにより、priFOS211FLAGA6rで挟まれたDNA断片が、増幅される確率を高めるよう試みた。その結果、lane7には、うっすらではあるが700800bp長のDNA断片が得られた矢印。8このPCR産物をゲルから切り出した後に精製し、PCRの鋳型として用いた。反応液の組成は、KODPlusver2緩衝液、dNTP、MgSO4、priFOS211FLAGA6r、KODPlusTOYOBO、鋳型DNA、DEPC水を含む。サーマルサイクラーのプログラムは、94°C30秒、56°C30秒、68°C1分を30サイクルである。得られたPCR産物の電気泳動結果を図6aに示す。プライマーとしてpriFOS211FLAGA6rのみを用いることによって、700800bp長のDNA断片を増幅することができた。このことから図2hに示す構造のDNA断片が得られたと考えられる。9しかし、上記DNA断片は分子全体としてパリンドローム配列になっており、DNAシーケンシングによる塩基配列の決定は、上記のPCR産物を鋳型とし、Sqlinker09の1部からなるpriSq0702とpriFOS211FLAGA6rをプライマーとして用いてPCRを行なった図7。このPCRにより、上記DNAの約半分の長さに相当するDNA断片が得られると予想される。このPCR産物の電気泳動結果を図6bに示す。300400bpのサイズにDNAが得られ、予想通りのDNA断片が得られた。10上記で得られたDNA断片をクローニングしInvitrogenPCRTOPO、DNAシーケンシングにより、塩基配列を決定した。その結果を図8に示す。斜体字で示した部分はベクター由来の配列である。太字で示した文字はSqlinker09あるいはpriSqlinler0702由来の配列である。ACTGGT領域のTとGの境界で、Sqlinker09の5’末端とF遺伝子のcDNAの3‘末端が、正しく連結されたことが確認された。以上、8、9、10の結果を合わせて考察すると、図2hあるいは図7のDNA断片が得られたと推測できる。上記のスクエア反応において、F遺伝子mRNAの量を20pmolから2pmolに変更する他は同様に反応を行った。この場合、700800bpにバンドは得られなかった図9。本実施例に於いてスクエア反応に成功した場合のmRNA濃度は2μMであり、逆に成功しなかった場合のmRNA濃度は02μMであった。このことは、IVV分子濃度が2μM以上であれば、蛋白質間相互作用がなくてもIVV分子のmRNA部分とリンカーとの相補性により、cDNAダイマーが得られてしまうことを示している。逆に、IVV濃度を02μM以下に設定し、スクエア反応を行えば、核酸部分での相補性によるcDNAダイマーの合成は確認されず、蛋白質間相互作用が検出される可能性がある。つまり、Kdで表したときに、Kd2x107以下の結合の強さをもつ蛋白質間相互作用であれば、本実験条件により、その相互作用を検出できることになる。<実施例2>1リンカーとcDNAの連結の確認自己相補配列を有する一本鎖オリゴDNASqlinker08と命名;ファスマック社製をDNAリンカーとして用いた図10a、配列番号6。Sqlinker08の5’末端にはリン酸基が付加されていた。まずSqlinker08のセルフハイブリダイゼーションを行った。100μMのSqlinker08を5μl、10xT4RNALigase緩衝液宝バイオ社製を10μl、DEPC水を18μl、混合し95°Cで3分加熱し、その後68°Cまで徐冷した図11a。F遺伝子FOS遺伝子のロイシンジッパー領域、実施例1参照から転写により得られた16pmolμlのmRNAを6μl、J遺伝子JUN遺伝子のロイシンジッパー領域、実施例1参照から転写により得られた15pmolμlのmRNAを7μl添加し、その後、15°Cまで冷却した。mRNAの5’末端にはリン酸基が付加されていた。Sqlinker08は、F遺伝子のSP6プロモーターおよびΩ配列に相補的な配列を有している。次にT4RNAligase宝バイオ社製を125μl添加し、15°Cで終夜連結反応を行った図11b。この反応溶液は10nmolμlのPEG2000を6μl、01MのDTTを3μl、40mMのATPを1μl、DMSOを20μl、酵素に添付のBSA溶液を20μl、RNase阻害剤を2μl、DEPC水を424μl含むものであった。連結反応後、生成物はエタノール沈殿により回収した。また連結反応は電気泳動により確認した。続いて逆転写反応を行った図11c。反応溶液は5pmolのRNA、20μMのプライマーpriFOS1r、図1b、配列番号7、添付の5x緩衝液、2mMdNTPを125μlおよびDEPC水を155μl含む。95°Cで30秒加熱後、50°Cに徐冷し、3分放置した後、MMLVRTaseプロメガ社製を5μl添加した。50°Cで1時間放置した後、ゲルろ過スピンカラムBioRad社製、MicroBioSpin6ChromatograpyColumnsにより精製した。逆転写反応により合成されたcDNA部とリンカー部をLigationhighver2東洋紡社製を用いて連結した。その際、精製済みの逆転写反応生成物とLigationhighver2を50μlずつ混合し、16°Cで終夜連結反応を行った図11d。続いてRNaseHインビトロジェン社製を10μl添加し、RNAcDNAのRNA部を分解した図11e。上記の反応産物にリンカーを加え伸長反応を行った図11f。反応溶液は10xKODPlus2ver2緩衝液を5μl、2mMdNTPを5μl、25mMMgSO4を3μl、20μMのリンカーをプライマーとして1μl、連結反応生成物を1μl、KODPlus東洋紡社製を1μl、DEPC水を34μl含む。反応条件は94°Cで1分30秒、68°Cを3分である。続いてPCRを行った図11g。この反応溶液には反応溶液は10xKODPlus2ver2緩衝液を5μl、2mMdNTPを5μl、25mMMgSO4を3μl、20μMのフォワードプライマーpriSqlinker0801f、図10c、配列番号8と20μMのリバースプライマーpriFOS1rを1μlずつ、伸長反応生成物を1μl、KODPlus東洋紡社製を1μl、DEPC水を33μl含むものであった。反応条件は94°Cで1分のあと94°C、30秒、58°C、30秒、68°Cを1分を35サイクルであった。得られた資料をアガロース電気泳動により分析したところ、約200塩基対のサイズに相当するバンドが得られた。この領域をゲルから切り出しクローニングし、塩基配列を決定した。その配列を図10dに示す。この結果から、リンカー部とF遺伝子のSP6プロモーター部が正しく連結されていることが分かるただし、斜線で示した塩基は何らかの理由により欠失していた。以上の解析から、リンカーとcDNAが連結されていたことが確認された。2IVV分子の無細胞翻訳系からの精製法についての検討FOSおよびJUN相互作用領域に対応するIVV分子の構築IVV分子としてFOSとJUNの相互作用領域を用いた。これらの構造遺伝子の構造、構築方法、およびRNAへの転写反応は、実施例1に記載した通りである。得られたRNA分子とスペーサーピューロマイシンp2TpPEGp2Puro記号はWO0248347に定義された通りであるは、T4RNAリガーゼ宝酒造製を用い、WO0248347の実施例1に記載の方法に従い連結した。連結反応は25°Cで1時間行なった。ライゲーション産物をRNeasyMiniKitQIAGEN社製を用いて精製した。精製されたライゲーション産物を無細胞翻訳系プロメガ社Wheatgermplusに加えて翻訳を行ない、IVV分子を合成した図12。無細胞翻訳反応液の組成は、40μlの小麦胚芽抽出液、13μlのRNasinPlusRNaseInhibitorプロメガ社、および5pmolのライゲーション産物を含む。翻訳反応は25°Cで1時間行なった。IVV分子の精製翻訳反応産物50μlにTBSTE緩衝液50mMTrisHCl150mMNaCl02Tween2010mMEDTA450μlを混合後、15000rpmで10分遠心し、上澄み液を回収した。回収した上澄み液に40μlスラリーのantiM2agarosebeadsシグマ社製を添加し、IVV分子のアフィニティ精製を行った。アフィニティ精製は、上澄み液とアフィニティビーズの結合反応1時間4°Cの後に400μlのTBESTE緩衝液を用いて洗浄することで行った。図12に示したように、IVV分子のタンパク質部分には、FOSあるいはJUN由来のアミノ酸配列のC末端側に、FLAGペプチドタグが付加されていた実施例1参照。IVV分子の逆転写反応精製したIVV分子を逆転写した。逆転写反応溶液は、逆転写キット添付の緩衝液、dNTPミックス、MMLV逆転写酵素RNaseHminuspointmutant、およびpriFLAGA6r図10eを含むものであった。この反応溶液を精製済みのビーズに添加し、37°Cで1時間反応させた図13。逆転写反応溶液にはDTTが含まれるために、ビーズに結合しているantiM2抗体は逆転写反応中に変性し、IVV分子はビーズから解離する。したがって、この混合液をスピンカラムによるゲルろ過BIORAD社製、MicroBioSpin6ChromatograpyColumnsにより精製することで、mRNA部分がcDNAとハイブリッド化したIVV分子を回収できるMatsumuraetalFASEBJ24220122102010参照。本実施例でもこの方法によりハイブリッド化IVV分子を回収した。尚、回収した溶液の1μlを鋳型としてPCRを行い、逆転写反応が進行し、ハイブリッド化IVV分子が形成、回収されることを確認した図14。尚、逆転写反応を行わない場合は、このようなバンドは一切得られなかった。実施例2に於いては、リンカーとcDNAの連結を塩基配列の解析から確認された。また、IVVスクエア法の実施には、逆転写反応を阻害する夾雑物を含む無細胞翻訳系からIVV分子を精製する必要がある。上述のようにIVV分子のペプチド部分に付加したFLAGtagを用いた精製法により精製できることが確認された。