"式Iで表される抗癌活性を有するサイクリン依存性キナーゼ阻害剤としてのインディルビン-3’-オキシム誘導体化合物。式Iここで、R1はF、Cl、OH又はCH3から選択され、R2はF、Cl又はNO2から選択される。R1がOHであり、R2がNO2である、請求項1に記載のインディルビン-3’-オキシム誘導体化合物。R1がFであり、R2がNO2である、請求項1に記載のインディルビン-3’-オキシム誘導体化合物。iR1がOHであり、R2がClである化合物、iiR1がOHであり、R2がFである化合物、iiiR1がClであり、R2がNO2である化合物、及びivR1がCH3であり、R2がNO2である化合物である、請求項1に記載のインディルビン-3’-オキシム誘導体化合物。ヒト肺癌セルライン、ヒト繊維肉腫セルライン、ヒト大腸癌セルライン、ヒト白血病セルライン、ヒト胃癌セルライン、ヒト鼻咽頭癌セルライン及び/又はヒト乳癌セルラインに対する優れた抗癌活性を有する、請求項1に記載のインディルビン-3’-オキシム誘導体化合物。前記インディルビン-3’-オキシム誘導体化合物及び医薬として許容可能な担体を有する抗癌組成物。本発明の目的は、式Iで表される抗癌活性を有するサイクリン依存性キナーゼ阻害剤としてのインディルビン-3’-オキシム誘導体化合物を提供することである。式Iここで、R1はF、Cl、CH又はCH3から選択され、R2はF、Cl又はNO2から選択される。また、本発明は、R1がOHであり、R2がNO2である化合物;R1がFであり、R2がNO2である化合物を提供する。また、本発明は、iR1がOHであり、R2がClである化合物、iiR1がOHであり、R2がFである化合物、iiiR1がClであり、R2がNO2である化合物、及びivR1がCH3であり、R2がNO2である化合物を提供する。更に、本発明は、ヒト肺癌セルライン、ヒト繊維肉腫セルライン、ヒト大腸癌セルライン、ヒト白血病セルライン、ヒト胃癌セルライン、ヒト鼻咽頭癌セルライン及び/又はヒト乳癌セルラインに対する優れた抗癌活性を有する式Iで表されるインディルビン-3’-オキシム誘導体化合物を提供する。更に、本発明の目的は、前記インディルビン-3’-オキシム誘導体化合物及び医薬として許容可能な担体を有する抗癌組成物を提供する。インディルビン誘導体を含む抗癌剤のターゲットであるCDK2/サイクリンEに対する阻害活性を向上させるために、5’位及び5位の両方を置換した新規な一連のインディルビン-3’-オキシム誘導体を設計し、合成した。5’-置換類縁体の、OH又はハロゲンとの結合状態はCDK2のATP結合部位における分子ドッキングの研究により予測され、更に、CDK2阻害活性の向上を説明する可能性のある重要な相互作用も示された。構造活性相関解析は、5’位では、CH3やOCH3のような電子供与性基よりもOH基やハロゲン基の方が好ましいことを示している。合成した誘導体の中では、5’-ヒドロキシ-5-ニトロ-インディルビン-3’-オキシム11b及び5’-フルオロ-5-ニトロ-インディルビン-3’-オキシム13bが、CDK2に対してIC50値がそれぞれ1.9nM、1.7nMの強力な阻害活性を示し、また、種々のヒト癌セルラインに対してIC50値が0.2~3.3μMの範囲の抗増殖効果を示した。10種の異なる受容体型チロシンキナーゼ及びセリン/チロシンキナーゼのパネルでの11bのキナーゼ選択性プロファイルの研究の結果、CDKに対する阻害活性の選択性は500倍以上であった。11bの抗癌活性が更に確認され、5mg/kgの用量で静脈内投与されたインビボ異種移植動物モデルは体重の減少もなく対照動物に比べて84の腫瘍容積の減少を示した。組織学的解析を通した抗腫瘍活性の機序がアポトーシス及び増殖のマーカーによって示され、それぞれアポトーシスは増加し、増殖は減少した。更に、他の類縁体、例えば5’-ヒドロキシ-5-クロロ-インディルビン-3’-オキシム11a、5’-ヒドロキシ-5-フルオロ-インディルビン-3’-オキシム11c、5’-クロロ-5-ニトロ-インディルビン-3’-オキシム12b及び5’-メチル-5-ニトロ-インディルビン-3’-オキシム14bが効果的な抗癌剤と考えられた。本発明は、以下の通り、更に具体的に説明することができる。設計戦略のための分子ドッキング化合物2の増強された抗増殖効果に取り組むために、CHARMm-ベース分子動力学ドッキングプログラムDiscoveryStudio2.0のCDockerを用いて、CDK2図2のATP結合部位における分子ドッキングの研究を行った。図2aは、化合物2の1’位の窒素、2位のカルボニルの酸素及び1位の窒素がATP結合部位のヒンジ部分Gln81、Leu83と3個の水素結合の相互作用を維持していることを示している。更に、オキシム部分の3’-ヒドロキシル基はGln31の主鎖カルボニルと水素結合を形成し、5-ニトロ基はLys33、Asp145の側鎖との塩橋に寄与している。図2bは、リガンド、2及び5’-Br基の周囲4Å以内の静電ポテンシャルを有する結合面が、実質的な結合相手である正に帯電したアミノ酸残基のLsy89が存在するATP結合ポケットの外側の水性の空間に向かって投影されているようであることを示している。5’-Br基の孤立電子対の電子と正に帯電したLys89残基との別の静電的な相互作用がCDK2との高い結合親和性を与えているようであり、その結果、5’-非置換-インディルビン-3’-オキシム類縁体の1に比べて2がより強力な抗増殖活性を有することに貢献しているという仮説を立てることができる。ドッキングの研究によって得られたデータによれば、5-置換基Cl、NO2、F及びOCF3に加えて更に5’-位の誘導体化を行うことは、CDK2の結合親和性を最適化するためのインディルビンスキャフォールドの修飾の戦略に理想的であろう。CDK阻害活性及び抗増殖活性に関してインディルビン骨格の5’位での構造活性相関を調査するために、次のグループを誘導体化に選定した。15’-F,5’-Cl5’-ブロモ類縁体の2の場合と同様な静電相互作用をLys89と形成することができる、25’-OHCDK2に更なる水素結合を提供して親水性の性質を導入する、35’-OCH3、5’-CH3ハロゲン置換類縁体と比較した対比効果を期待する。事実、設計した分子の代表例、5’-ヒドロキシ-5-ニトロ-インディルビン-3’-オキシム誘導体11bのCDK2のATP結合部位におけるドッキングモデルは、新しい水素結合の相互作用が溶媒露出領域において11bの5’-OH基とAsp86の間で形成されているようであり、また、11bのオキシム部がGln131ではなくIle10と相互作用しているようであることを示した。図2dは、11bの周囲4Å以内の静電ポテンシャルを有する結合面を提示し、5’-OHがどのように外側の水性の表面、溶媒露出領域の中へ向って突き出ているかを示した。化学5’,5-置換-3’-インディルビンオキシム誘導体を合成するために、5-置換インドキシルN,O-ジアセテート5a~dを対応する5-置換アントラニル酸3a~dから調整したスキーム1。簡潔に言えば、化合物3a~dをグリオキシル酸エチルの存在下で還元的アルキル化条件に置き、続いて、加水分解してジカルボン酸4a~dを得、最終的にこれを無水酢酸中で環化して5a~dを得た。5’-ヒドロキシ誘導体の場合、フェノール性ヒドロキシル基も環化条件下でアセチル化されるので、環化化合物5aはトリアセテートの形で得た。Moon,M.J.etal.,Bioorg.Med.Chem.2006,14,237-246では、5-置換インドキシルN,O-ジアセテート5a~dを種々の5-置換イサチン類縁体6a~dと共役反応させて塩基性条件下で5’,5-置換インディルビン誘導体7~10を得、続いて、ケトンを3’-オキシム基に変換するためにそれぞれのインディルビン7~10をヒドロキシルアミンと反応させて、5’,5-置換-3’-インディルビンオキシム誘導体11~14が合成されたスキーム2。5’-メトキシ-5-置換-3’-オキシム化合物16a~cは、対応する5’-ヒドロキシ-5-置換―インディルビン誘導体15a~cから、フェノール性ヒドロキシル基をメチル化し、続いて、ヒドロキシルアミンと反応させることによって合成したスキーム3。CDK阻害活性及びキナーゼ選択制プロファイル5’,5-置換-インディルビン-3’-オキシム誘導体は、最初に、1μMでCDK1/サイクリンB、CDK2/サイクリンEに対する阻害活性を評価した図3。5’-位の置換体の効果の比較のために、5-ニトロインディルビン-3’-オキシム1も併せて試験した。CDK1と比べた場合のCDK2に対するこれらの化合物の阻害活性及び選択性は、R1-位の5’-置換基に依存することが分かった。一般に、5’,5-置換インディルビン-3’-オキシム誘導体は、12d及び16a~cを除いて、CDK2に対して1μMで90以上の阻害効力を有する強力な阻害活性を示した。特に、5’-OH類縁体の11a~dは、CDK1及びCDK2の両方に対して最も高い阻害効力示した。R1位の5’-OHは、CDK1と比べたCDK2の選択性を減少させる結果となったが、しかしながら、文献によれば、CDK1及びCDK2に対する同時阻害剤が抗癌活性の点で更なる利点を有する可能性があるという観点から、この結果は重要と言える。更に、5’-ヒドロキシル基の置換は、インディルビン類縁体の物理化学的性質の中で大きな欠点であった水溶性を改善させた。5’-OH-置換インディルビン-3’-オキシム誘導体とは対照的に、5’-クロロ及び5’-フルオロ置換インディルビン-3’-オキシム誘導体12a~d及び13a~dは、CDK1と比べて6~10倍の選択性で強力なCDK2阻害活性を保持した。例えば、5’-クロロ-5-ニトロ-インディルビン-3’-オキシム12bは、CDK2に対しては、CDK1よりも約8倍強力であった表1。表1.5’,5-置換インディルビン-3’-オキシム誘導体のCDK2/サイクリンE阻害活性実験の項に記載したように、一連のインディルビン誘導体を10種の濃度でCDK2/サイクリンEキナーゼアッセイの試験をした。用量反応曲線からIC50を計算した。CDK1/サイクリンBキナーゼアッセイにおける11b及び12bのIC50値は、それぞれ13nM及び195nMである。5’-ハロゲン化によってCDK1阻害効力が低下することは、5-ニトロ-インディルビン-3’-オキシム1に比べて低いCDK1阻害活性IC50=190nMを示した5’-ブロモ-5-ニトロ-インディルビン-3’-オキシム2についての報告によって更に裏付けることができる。5’位に電子供与性基を有する一連の化合物の中で、5’-CH3を有する14bは、CDK1と比べて7倍の選択性で強力なCDK2阻害活性を保持した。しかしながら、5’-OCH3置換誘導体16a~cは、1nMでCDK1及びCDK2に対して弱い阻害活性を示したか又は阻害活性は示さなかった。CDK2阻害活性に関して、5’,5-インディルビン-3’-オキシム誘導体の構造活性相関をIC50値により分析した表1。5’-OCH3誘導体16a~cを除いて、ほとんどの誘導体は1~70nMのIC50値で強力な阻害活性を示した。R1位の5’-置換基の効果に関しては、-OCH3<-Cl<-H、-CH3<-OH、Fの順に従ってCDK2阻害活性は増加した。例えば、5’-クロロ-置換-インディルビン-3’-オキシム誘導体12a~dは、5’-フルオロ-インディルビン-3’-オキシム誘導体13a~cIC50=1~8nMよりも10倍弱いCDK2阻害活性IC50=10~76nMを示した。他の電子供与性基である5’-CH3-が置換されたインディルビン-3’-オキシム14bは16bに比べて270倍の増強された阻害効果を示したが、電子供与性基の5’-OCH3置換基16a~cは2-8μMのIC50値で極めて低いCDK2阻害活性を示した。特に、最も強力なCDK2阻害剤である11b、13b及び13cは、CDK2に対するIC50値が約2nMで、5’-非置換-5-ニトロ-インディルビン-3’-オキシム1IC50=7nMよりも約4倍高い効力を示した。インディルビン-3’-オキシム誘導体のR2位の5-置換の効果の分析では、ニトロ基及びフルオロ基は、クロロ基又はトリフルオロメトキシ基のような他の5-置換基よりも、概してCDK2阻害により有利であった。総合すれば、5’-位のOH及びF並びに5-位のNO2及びFのような電子的効果を与える置換基の組み合わせを有するインディルビン-3’-オキシム誘導体は、CDK2に対して強力な阻害活性を示した。代表的な強力で選択的なCDK2阻害剤11b及び12bは、受容体型チロシンキナーゼ及びセリン/スレオニンキナーゼを含むキナーゼのより多様なパネルに対して、更に評価を行った図4。11bは、試験したキナーゼの中でAuroraA、IKKβ及びTrkAに対してのみ弱い阻害活性を示し、IC50値は1~10μMの範囲であった。12bは、試験した全てのキナーゼパネルに対して、無視できる程度の阻害活性しか示さなかった。11b及び12bのCDK1及び2に対するIC50値が低いナノモルの範囲にあることから、この研究で試験したセリン/スレオニンキナーゼ及び受容体型チロシンキナーゼにおけるキナーゼ選択性プロファイルはCDK1及びCDK2に非常に有利と言える。抗増殖活性種々の癌セルライン、A549、HT1080、HCT116、K562、SNU638、KB、MCF-7に対する5’,5-置換-インディルビン-3’-オキシム誘導体の抗増殖活性をSRBアッセイにより評価し、癌細胞増殖阻害のIC50値を表2にまとめた。5’-ブロモ-5-ニトロ-インディルビン-3’-オキシム2及びロスコビチンは、このアッセイにおいて、ポジティブコントロールとして一緒に試験した。表2.異なるヒト癌セルラインについての5’,5-置換インディルビン-3’-オキシム誘導体の抗増殖活性実験の項で説明したように、SRBアッセイを用いて、a一連のインディルビン誘導体の種々のヒト癌セルラインに対する効果を5つの濃度で試験した。IC50μM値は、用量反応曲線から計算した。bヒト肺癌細胞。cヒト繊維肉腫細胞。dヒト大腸癌細胞。eヒト白血病細胞。fヒト胃癌細胞、gヒト鼻咽頭癌細胞。hヒト乳癌細胞。i実験は、ポジティブコントロールとして、2及びロスコビチンについても実施した。5’-ヒドロキシ誘導体11a~dの抗増殖活性は、NO2>F>Cl、OCF3の順で、5位の置換基に応じてCDK2に対するこれらの阻害活性の効力と良く相関した。特に、5’-ヒドロキシ-5-ニトロ-インディルビン-3’-オキシム11bは、HT1080及びHCT116セルラインに対して~0.4μMのIC50値を有し、2と比較して、癌細胞に応じて同程度の又は改善された阻害活性を示した。2の5’-ブロモ基をF及びClのような他のハロゲン基に置き換えた化合物の中で、5-ニトロ誘導体12b及び13bは、5’-ブロモ-5-ニトロ-インディルビン-3’-オキシム化合物2よりも、特にサイクリンD1の調節を解除しているヒト大腸癌細胞HCT116に対して、約0.3μMのIC50値で、より効果的であった。特に、5’-フルオロ-5-ニトロ-インディルビン-3’-オキシム13bは、その強力なCDK2阻害活性と相関して、全ての癌細胞に対して最も広い阻害効力スぺクトルIC50=0.28~0.94μMを示した。化合物13bは、他の誘導体の多くが弱い活性であるのとは対照的に、ヒト肺癌細胞A549に対して、他にはないナノモルのIC50値の抗増殖活性を有する。しかしながら、5’-CH3、5’-OCH3のような電子供与性基と置換されたインディルビン-3’-オキシム誘導体14及び16は、抗増殖活性がIC50値0.8~1μMの範囲である5’-メチル-5-ニトロ-3’-オキシム14bを除いて、多くの癌細胞に対して非常に弱い阻害剤であった。5-位R2の置換の効果に関しては、5-NO3基は、5’-OH、Cl、F、CH3と組み合わせたときに、一連の5’,5-二置換誘導体の中で最も強力な抗増殖効果を示した。この結果は、我々の以前に発表した結果23とよく一致し、また、2及び11bの仮定した結合状態、すなわちCDK2のATP結合部位において5-ニトロ基とAsp145、Lys33との間で塩橋を有する更なる結合が形成されているようであるということによって指示されている。5’-OCH3誘導体の場合、5-F置換類縁体16bのみが中程度の抗増殖活性を示し、これにより異なる作用機序がこの類縁体に関連している可能性が示唆された。この研究の結果を組み合わせると、5’-ヒドロキシル基又はハロゲン基は、おそらくCDK2のATP結合部位で更なる水素結合の相互作用を形成することによって、CDKや癌細胞増殖の阻害に有利だろうという重要な考察が示唆される。11bのインビボ抗癌活性5’-OH-5-ニトロ類縁体11bのインビボの効果を探索するために、我々のグループが発表したように、k-ras遺伝子及びGFP/Luc遺伝子を有しているRK3Eラット腎臓細胞が皮下移植されたSpragueDawleySDラットの腫瘍異種移植動物モデルを利用した。移植の5日後に、11bを5mg/kgで1日おきに、合計5回、日々モニタリングしながら動物にi.v.投与した。腫瘍の容積は、コントロール群図5a及び図5bと比較して約84.3で、有意に減少した。11bの投与期間中は、コントロール群と比較して体重に有意な差はなかったデータは示さず。11bの処置の後10日目に得られたバイオルミネセンスイメージは、腫瘍成長の指標であるルミネセンス強度が有意に減少していることを示した図5c。組織学的分析により、未処置のコントロールの固形腫瘍は、多くの有糸分裂像、多病巣性壊死及び出血を示している未分化の癌腫に属していることが明らかになった。しかし、11bで処置した腫瘍は、広範な細胞死を引き起こした図6a左側。TUNEL-陽性のアポトーシス細胞は、11bで処置した動物の組織の場合はコントロールの組織と比べて約6倍増加した図6a中央及び図6b。一方、細胞増殖マーカーであるPCNAの発現レベルは、11bで処置した動物においてはコントロールと比べて低下した図6a右側及び図6c。これらの結果は、インビボにおける細胞増殖阻害及びアポトーシス活性化を通して、11bが腫瘍の成長を抑制することを示している。要約すると、種々の癌セルラインに抗増殖活性を有する、CDK1及び2に対する強力な阻害剤として、いくつかの新規な5’,5-置換-インディルビン-3’-オキシム化合物を開発した。5’,5-置換インディルビン-3’-オキシム誘導体の増強された阻害活性は、CDK2のATP結合部位における分子ドッキングの研究によって、5’-非置換インディルビン-3’-オキシム1と比較して解釈できた。その結果、溶媒露出領域に向かった分子の更なる投影図及び5’-ヒドロキシ類縁体11bで例示されるようなATP結合ポケットの提示されたアミノ酸残基との相互作用が決定された。特に、5’-ヒドロキシ-5-ニトロ-インディルビン-3’-オキシム11b及び5’-フルオロ-5-ニトロ-インディルビン-3’-オキシム13bは、それぞれ1.71nM及び1.91nMのIC50値を有する強力なCDK2阻害剤であり、更に、0.2~3.3μMの範囲のIC50値を有する種々のヒト癌セルラインへの強力な抗増殖剤でもあった。構造活性相関分析により、5’位は、5’-CH3、5’-OCH3のような電子供与性基よりOH基及びハロゲン基の方が好ましいことが示された。代表的な類縁体である5’-ヒドロキシ-5-ニトロ-インディルビン-3’-オキシム11bは、選択したキナーゼパネルについてCDKに対する阻害活性の選択性は500倍以上を示し、また、重要なインビボ抗癌活性も示した。この研究から得られた情報は、CDK阻害剤に基づくドラッグデザインの開発及び臨床応用に貢献することが期待された。更に、5’-ヒドロキシ-5-クロロ-インディルビン-3’-オキシム11a、5’-ヒドロキシ-5-フルオロ-インディルビン-3’-オキシム11c、5’-クロロ-5-ニトロ-インディルビン-3’-オキシム12b及び5’-メチル-5-ニトロ-インディルビン-3’-オキシム14bのような他の類縁体も有効な抗癌剤と考えられた。本発明は、次の実施例によって、より具体的に説明することができる。しかし、本発明の範囲は、次の実施例に限定して解釈してはならい。化学300MHzのJEOLJNM-LA300WB分光計又は400MHzのJEOLJNM-ECX400P分光計を用いて、1HNMRスペクトルを決定した。スペクトルは、CDCl3、DMSO-d6又はアセトン-d6において取得した。特に明記しない限り、化学シフトは、内部テトラメチルシランからの低磁場側のppm又はDMSO2.5ppm、アセトン2.04ppmからの相対的なppmとして表示する。質量分析法は、エレクトロスプレーで実施し、FAB、EIJEOL:マスレンジ2600amu、10kV加速及びESIで高分解能質量スペクトルm/zを記録した。高分解能質量分析はKoreaBasicScienceInstituteDaeguで実施した。全ての最終生成物の純度はHPLCで決定した特に明記しない限り、少なくとも95の純度。純度の決定は、島津Shim-packC18分析カラム250mm4.6mm,5m,100Åリニアグラジエント溶媒システムを用いて、島津SCL-10AVPHPLCシステムにより行った。溶媒システムは、流速=1mL/minでH2O:CH3CN=65:35から5:95へ30minとした。ピークはダイオードアレイ検出器を用いたUV吸収により検出した。5-置換インドキシN,O-ジアセテート5a~dの調製5-置換アントラニル酸1.0g、6.45mmolを50mlのメタノールに溶解した溶液に0.5mlの酢酸を加え、次いでグリオキシル酸エチル1ml,9.7mmol及びNaCNBH3609.5mg,9.7mmolを加えた。反応混合物は室温で3時間撹拌した。その後、エバポレーションによってメタノールを除去した。残渣を飽和NH4Cl水溶液に溶解し、酢酸エチルで抽出した。抽出物を合せ、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、エバポレーションを行った。生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィCH3Cl:メタノール=30:1で精製し、更に、この生成物1.4g,5.8mmolを25mlの1規定のNaOHaqと10mlのメタノールの中で加水分解した。反応混合物を室温で1時間撹拌し、得られた溶液を1規定のHClで酸性化した。形成された沈殿物をろ過によって集め、水で洗浄した。得られた二酸化合物4a~d1.2g,4.97mmolを無水酢酸15mlとNa2CO31.3g,12.4mmolの中へ加えた。反応混合物を4時間還流した。生成物を酢酸エチルで抽出し、水で洗浄した。抽出物を合せ、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、エバポレーションを行った。生成物は、シリカゲルカラムクロマトグラフィヘキサン:酢酸エチル=2:1で精製した。1-アセチル-1H-インドール-3,5-ジイルジアセテート5aのデータ1HNMR846776730711267236231ESIMH273831-アセチル-5-クロロ-1H-インドール-3-イルアセテート5bのデータ1HNMR840775753734261239ESIMH249831-アセチル-5-フルオロ-1H-インドール-3-イルアセテート5cのデータ1HNMR842775719710259237ESIMH233881-アセチル-5-メチル-1H-インドール-3-イルアセテート5dのデータ1HNMR831765731719257244236ESIMH229805’,5-置換インディルビン-3’-オキシム誘導体11~14の調製イサチン類縁体77mg,0.425mmolをメタノール5mlに溶解した溶液に5-置換インドキシN,O-ジアセテート100mg,0.425mmolを加え、混合物を5分間撹拌した。無水Na2CO3112.5mg,1.06mmolを加え、室温で3時間撹拌を継続した。黒色の沈殿物をろ過し、冷水で洗浄し、減圧下で乾燥して、5,5-置換インディルビンの誘導体7~10を得た。適当なインディルビン誘導体10mg,0.032mmolをピリジン0.3mlに溶解し、塩酸ヒドロキシルアミン6.6mg,0.095mmolを加えた。反応混合物を還流下で120°C、2時間加熱した。冷却後、生成物を1規定HClで酸性化した。沈殿物をろ過し、水で洗浄して、対応する3’-オキシムを定量的に、2’Z,3’Eの形態で選択的に得た。生成物は、シリカゲルカラムクロマトグラフィクロロホルム:メタノール=20:1で精製した。2’Z,3’E-5’-ヒドロキシ-5-クロロ-インディルビン-3’-オキシム11aのデータ1HNMR11711078927859774724711687685HRMSMcalcd3270411found3270408Purity922’Z,3’E-5’-ヒドロキシ-5-ニトロ-インディルビン-3’-オキシム11bのデータ1HNMR138711781135941932805776729704686HRMSMcalcd3380651found33806482’Z,3’E-5’-ヒドロキシ-5-フルオロ-インディルビン-3’-オキシム11cのデータ1HNMR11691066925842773724681699HRMSMcalcd3110706found3110707Purity932’Z,3’E-5’-ヒドロキシ-5-トリフルオロメトキシ-インディルビン-3’-オキシム11dのデータ1HNMR11701078922850770721703688680HRMSMHcalcd3760545found37605462’Z,3’E-5’-クロロ-5-クロロ-インディルビン-3’-オキシム12aのデータ1HNMR13051182981867835745716697HRMSMcalcd3450072found34500752’Z,3’E-5’-クロロ-5-ニトロ-インディルビン-3’-オキシム12bのデータ1HNMR11981139945825808750705HRMSMHcalcd3550234found35502422’Z,3’E-5’-クロロ-5-フルオロ-インディルビン-3’-オキシム12cのデータ1HNMR12961178971841832740750688691HRMSMHcalcd3280289found32802912’Z,3’E-5’-クロロ-5-トリフルオロメトキシ-インディルビン-3’-オキシム12dのデータ1HNMR13021182988863834747711703HRMSMHcalcd3940206found39402152’Z,3’E-5’-フルオロ-5-クロロ-インディルビン-3’-オキシム13aのデータ1HNMR11811085862797747731715688HRMSMHcalcd3280289found32802952’Z,3’E-5’-フルオロ-5-ニトロ-インディルビン-3’-オキシム13bのデータ1HNMR11891140943808800751733706HRMSMcalcd3400608found34006102’Z,3’E-5’-フルオロ-5-フルオロ-インディルビン-3’-オキシム13cのデータ1HNMR11761068841793739730693684HRMSMcalcd3130663found3130666Purity932’Z,3’E-5’-フルオロ-5-トリフルオロメトキシ-インディルビン-3’-オキシム13dのデータ1HNMR1202107285980274171870069HRMScalcd3790579found37905802’Z,3’E-5’-メチル-5-クロロ-インディルビン-3’-オキシム14aのデータ1HNMR11851076864810729720710686231HRMSMcalcd3250618found32506232’Z,3’E-5’-メチル-5-ニトロ-インディルビン-3’-オキシム14bのデータ1HNMR11871138946811807737726705232HRMSMHcalcd3350780found3350787Purity932’Z,3’E-5’-メチル-5-フルオロ-インディルビン-3’-オキシム14cのデータ1HNMR11781061843806726717686680228HRMSMcalcd3090914found30909122’Z,3’E-5’-メチル-5-トリフルオロメトキシ-インディルビン-3’-オキシム14dのデータ1HNMR11801087859809734725710694233HRMSMcalcd3750831found37508335’-メトキシ-5-置換インディルビン-3’-オキシム誘導体16a~cの調製5’-ヒドロキシ-インディルビン類縁体7d10mg,0.028mmolをアセトン1mlに溶解した溶液にヨウ化メチル17L,0.276mmolを滴下し、K2CO319mg,0.138mmolを加え、室温で4時間撹拌を続けた。黒色の沈殿物をろ過し、冷水で洗浄し、減圧下で乾燥して、5’-メトキシ-5-置換インディルビン15cを得た。適当なインディルビン誘導体6mg,0.016mmolをピリジン0.3mlに溶解し、塩酸ヒドロキシルアミン3.4mg,0.048mmolを加えた。反応混合物を還流下で120°C、1時間加熱した。冷却後、生成物を1規定HClで酸性化した。沈殿物をろ過し、水で洗浄して、対応する3’-オキシムを定量的に、2’Z,3’Eの形態で選択的に得た。生成物は、シリカゲルカラムクロマトグラフィヘキサン:酢酸エチル=2:1で精製した。2’Z,3’E-5’-メトキシ-5-ニトロ-インディルビン-3’-オキシム16aのデータ1HNMR1182946933812777730724685339HRMSMHcalcd3510729found3510724Purity942’Z,3’E-5’-メトキシ-5-フルオロ-インディルビン-3’-オキシム16bのデータ1HNMR1168922844770721696679326HRMSMcalcd3250863found32508592’Z,3’E-5’-メトキシ-5-トリフルオロメトキシ-インディルビン-3’-オキシム16cのデータ1HNMR1170862828790724712704699333HRMSMcalcd3910780found3910782分子ドッキングDiscoveryStudio2.0AccelrysのCHARMm-ベース分子動力学ドッキングアルゴリズムのCDockerを用いて、分子ドッキングを行った。5-ブロモ-インディルビンと共結晶化したCDK2の構造は、PDBデータバンクPDBコード:2BHEから得た。続いて、プロテインクリーンプロセス及びCHARMm-力場を適用した。半径8Åの5-ブロモ-インディルビンの周囲の領域を活性部位として選択した。複合体の構造からリガンドを除去した後、活性部位の周囲に3軸方向において結合球面を構成した。全てのデフォルトパラメータは、ドッキングプロセスに使用した。CHARMm-ベース分子動力学1,000ステップを使用してランダムなリガンド11bのコンフォメーションを作成し、剛体回転リジッドボディローテーション続いて700Kでのシミュレーティドアニーリングを行って、結合部位におけるリガンド11bの位置を最適化した。最終的なエネルギー最小化は、フルポテンシャルモードとして設定した。11bの最終的な結合コンフォメーションは、エネルギーに基づいて決定した。リガンド2、13bのドッキング研究を上記の通り実施した。生物学的方法酵素アッセイCDK1/サイクリンB、CDK2/サイクリンEは、MilliporeBillerica,MAから購入した。キナーゼ活性は、0.1mg/mLのヒストンH1を含むバッファー8mMMOPSpH7.0,0.2mMEDTA,10mM酢酸マグネシウム中で、CDK1については45M-33PATP500cpm/pmolの存在下で、又は、CDK2については120μMγ-33PATP500cpm/pmolの存在下で、最終反応量25μMで試験した。MgATP混合物を添加することによって反応を開始した。30°Cで40分間インキュベーションした後、3リン酸溶液を5μL添加することによって反応を停止した。上清の10μL分量をWhatmanP30ホスホセルロース紙の2.5cm×3cm小片上にスポットし、20秒後にそのフィルタを75mMリン酸中で5分間3回洗浄し、乾燥前にメタノール中で1回洗浄した。1mLのACSAmershamシンチレーション液の存在下で、湿ったフィルタを計数した。活性は、通常、最大活性、すなわち阻害剤の非存在下のパーセンテージとして表される。コントロールには適当に希釈したDMSOを用いた。種々の組換えキナーゼc-Met,MetM1250T,Ron,VEGF2,EGFR,TrkA,PI3Kγ,IKKβインスリン受容体,AuroraAに対するキナーゼ活性の阻害を、ホモジニアス時間分解蛍光HTRFアッセイを用いて測定した。簡潔に言えば、アッセイはATPの存在下でペプチド基質のリン酸化に基づいている。結果として生じたリン酸化された基質は、TR-FRET時間分解蛍光共鳴エネルギー転移シグナルによって検出する。キナーゼドメインを含む組換えタンパク質は、MilliporeBillerica,MAから購入した。酵素、ATP及び基質の最適濃度は、HTRFKinEASEキットCisbioを用いて、製造業者の指示に従って、それぞれの酵素について設定した。アッセイは、キナーゼ反応バッファー250mMHEPESpH7.0,0.5mMオルトナバジウム酸塩,0.05BSA,0.1NaN3中で、連続的に希釈した化合物及びペプチド基質に酵素を混合して構成する。検出用試薬の添加の後、EnVisionマルチ-ラベルリーダーPerkanElmer,Waltham,MAを用いてTR-FRETシグナルを測定した。細胞増殖アッセイ細胞A549,HT1080,HCT116,K562,SNU638,KB,MCF-7を計数し、新鮮な培地10FBSを含むMEME,DMEM又はRPMIで5×104cells/mLに希釈し、190μLの細胞懸濁液を種々の濃度の試験化合物10DMSO水溶液中に10μLを含む96穴プレートに加えた。試験プレートをCO2インキュベーターで37°C3日間インキュベートした。0日目のコントロールとして、細胞をCO2インキュベーターで37°C30分間インキュベートした。全ての処理は、3連で行った。インキュベーション期間経過後、細胞を、冷却した50TCA50μLで4°Cで30分間固定し、水道水で5回洗浄し、風乾した。固定した細胞を、0.4SRB溶液含有1酢酸水溶液で室温で1時間染色した。次いで、1酢酸で5回洗浄することによって遊離のSRB溶液除去し、風乾した。結合した色素を200Lの10mMTris-basepH10.0で溶解し、吸光度をELISA用マイクロプレートリーダーを用いて515nmで測定した。最終的に、各々の処理手順で得られた吸光度の値を平均して、0日目のコントロールで得られた平均値を引き算した。これらの結果は、溶媒で処理したコントロールのインキュベーションに対してのパーセンテージとして表し、IC50値は非線形回帰分析生存パーセント対濃度を用いて計算した。腫瘍異種移植動物モデルk-ras-形質転換ラットの腎臓上皮細胞セルラインRK3E-rasは、10FCS、100ユニット/mLペニシリン及び100Ag/mLストレプトマイシンを追加したDMEM中で保持した。RK3E-ras細胞は、EricFearon博士ミシガン大学医学部、AnnArbor,MIから快く提供を受け、以前の報告に記載されている。インビボでの腫瘍成長の抑制を調べるために、雄のSDラット生後6週を用いた。0日目のラットの側腹部にRK3E-ras-Luc細胞5×106を皮下移植し、以前に記載したように5日目にラットをランダムにグループ化した5匹/グループ。11bを含有するPEG400、EtOH及びDWの混合物の溶液30:33:37,3mg/mL,5mg/kgを1日おきに、合計5回、無麻酔状態で静脈内に投与した。最終投与の48時間後に動物を屠殺し、ラットの体重及び腫瘍の容積を測定した。腫瘍成長の容積は、次の通り計算した:V=ab2/2、ここで、aは腫瘍の最も長い直径、bは腫瘍の最も短い直径である。全て実験は、Chosun大学歯学部Gwangju,韓国の動物実験委員会により承認されたプロトコルの下で実施した。生物発光イメージングアッセイ生物発光イメージングのために、ラットにランパン/ケタミン1:1麻酔でルシフェリンMolecularProbes,PaloAlto,CAをi.p.投与した。LAS-1000plusイメージングシステム富士フィルム,東京,日本を用いて、ラットをイメージングし、腫瘍から放出されたバイオルミネセンスシグナルを記録した。放出された光を取り込むためにCCDカメラを備えているLAS-1000システムを用い、データ解析のためにLivingImageソフトウエアMultiGaugev3.0を用いた。組織学、免疫組織化学及びTUNELアッセイ切除した固形腫瘍を10緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンで包理した。光学顕微鏡検査のために、4-μmの切片とした組織をHEで染色した。免疫組織化学的染色は、抗-PCNA抗体を用いてアビジン-ビオチン複合体法で行った。免疫反応は、3,3’-ジアミノベンジジンで可視化し、マイヤーヘマトキシリンで対比染色した。ApopTagPlusPeroxidaseInSituApoptosisDetectionkitIntergen,Purchase,NYを用いて、製造業者の指示に従って、TUNELアッセイを行った。簡潔に言えば、スライドを脱パラフィンし、20μg/mLのプロテイナーゼKで37°Cで15分間処理し、染色を増強した。内因性のペルオキシダーゼをブロックするために3過酸化水素中に漬けた後、スライドをターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを含む反応バッファーで37°Cで1時間インキュベートした。次いで、スライドをペルオキシダーゼ結合抗ジゴキシゲニン抗体とともに30分間インキュベートし、反応生成物を2mMの過酸化水素を含む0.03の3,3’-ジアミノベンジジン溶液で可視化した。スライドは、0.5のメチルグリーンで対比染色した。"