"チロシンフェノールリアーゼtyrosinephenollyase活性を有する酵素をコードする遺伝子が、宿主のコリネ型細菌に導入された、フェノール生産能を有する形質転換体。チロシンフェノールリアーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が、パントエアアグロメランスPantoeaagglomerans由来の遺伝子、シトロバクターブラッキーCitrobacterbraakii由来の遺伝子、デスルフィトバクテリュームハフニエンスDesulfitobacteriumhafniense由来の遺伝子、クロロフレクサスオウランティアカスChloroflexusaurantiacus由来の遺伝子、ノストックパンクチフォルメ由来の遺伝子、又はトレポネマデンティコラTreponemadenticola由来の遺伝子である請求項1に記載の形質転換体。チロシンフェノールリアーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が下記の又はのDNAである請求項1に記載の形質転換体。配列番号36の塩基配列からなるDNA、配列番号39の塩基配列からなるDNA、配列番号42の塩基配列からなるDNA、配列番号45の塩基配列からなるDNA、配列番号48の塩基配列からなるDNA、又は配列番号51の塩基配列からなるDNAの何れかの塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつチロシンフェノールリアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA宿主のコリネ型細菌が、その染色体上に存在する下記及び/又はの遺伝子が破壊され、又は欠損したものである、請求項1~3の何れかに記載の形質転換体。プレフェン酸デヒドラターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子フェノール2モノオキシゲナーゼphenol2monooxygenase活性を有する酵素をコードする遺伝子宿主のコリネ型細菌の以下の及び/又はの代謝遺伝子が、宿主で高発現している請求項1~4の何れかに記載の形質転換体。DAHPシンテターゼ3deoxyDarabinoheptulosonate7phosphatesynthase活性を有する酵素をコードする遺伝子コリスミン酸ムターゼchorismatemutase活性を有する酵素をコードする遺伝子宿主のコリネ型細菌がコリネバクテリウムグルタミカムである請求項1~5の何れかに記載の形質転換体。宿主のコリネバクテリウムグルタミカムが、コリネバクテリウムグルミカムRFERMP-18976、ATCC13032、又はATCC13869である請求項6に記載の形質転換体。宿主のコリネバクテリウムグルタミカムが、コリネバクテリウムグルミカムRFERMP-18976、ATCC13032、又はATCC13869の染色体上に存在する下記及び/又はの遺伝子が破壊され、又は欠損したものである、請求項6に記載の形質転換体。プレフェン酸デヒドラターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子フェノール2モノオキシゲナーゼphenol2monooxygenase活性を有する酵素をコードする遺伝子宿主のコリネバクテリウムグルタミカムが、コリネバクテリウムグルミカムRFERMP-18976、ATCC13032、又はATCC13869において、以下の及び/又はの代謝遺伝子が高発現しているものである、請求項6又は8に記載の形質転換体。DAHPシンテターゼ3deoxyDarabinoheptulosonate7phosphatesynthase活性を有する酵素をコードする遺伝子コリスミン酸ムターゼchorismatemutase活性を有する酵素をコードする遺伝子コリネバクテリウムグルタミカムPHE7受託番号:NITEBP-976形質転換体。請求項1~10の何れかに記載の形質転換体を、還元条件下、糖類を含有する反応液中で反応させる工程と、反応液中のフェノールを回収する工程とを含むフェノールの製造方法。反応工程において、形質転換体が実質的に増殖しない請求項11記載のフェノールの製造方法。還元条件下の反応液の酸化還元電位が-200~-500ミリボルトである請求項11又は12に記載のフェノールの製造方法。糖類がグルコース、フルクトース、マンノース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、スクロース、マルトース、ラクトース、セロビオース、トレハロース、及びマンニトールからなる群より選ばれるものである請求項11~13の何れかに記載のフェノールの製造方法。本発明は、糖類を原料として効率よくフェノールを製造できる微生物、及びこの微生物を用いて糖類を原料として効率よくフェノールを製造できる方法を提供することを課題とする。上記課題を解決するために本発明者らは研究を重ね、以下の知見を得た。コリネ型細菌はフェノールに対して高い耐性を有する。コリネ型細菌にチロシンフェノールリアーゼ遺伝子を導入した形質転換体は、効率よくフェノールを生産する。この形質転換体において、宿主のコリネ型細菌の染色体上に存在するプレフェン酸デヒドラターゼ遺伝子及び/又はフェノール2モノオキシゲナーゼ遺伝子が破壊又は欠損しているときは、一層効率よくフェノールを生産できる。この形質転換体において、DAHPシンテターゼ遺伝子、及び/又はコリスミン酸ムターゼ遺伝子が、形質転換前の宿主の遺伝子発現レベルに比べて高発現しているときは、一層効率よくフェノールを生産できる。この形質転換体は、還元条件下の反応液中で実質的に増殖しない状態で反応させる場合、好気性の反応液中で増殖させつつ反応させる場合に比べて、フェノール生産効率が高い。本発明は上記知見に基づき完成されたものであり、以下の形質転換体及びフェノールの製造方法を提供する。項1.チロシンフェノールリアーゼtyrosinephenollyase活性を有する酵素をコードする遺伝子が、宿主のコリネ型細菌に導入された、フェノール生産能を有する形質転換体。項2.チロシンフェノールリアーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が、パントエアアグロメランスPantoeaagglomerans由来の遺伝子、シトロバクターブラッキーCitrobacterbraakii由来の遺伝子、デスルフィトバクテリュームハフニエンスDesulfitobacteriumhafniense由来の遺伝子、クロロフレクサスオウランティアカスChloroflexusaurantiacus由来の遺伝子、ノストックパンクチフォルメ由来の遺伝子、又はトレポネマデンティコラTreponemadenticola由来の遺伝子である項1に記載の形質転換体。項3.チロシンフェノールリアーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が下記の又はのDNAである項1に記載の形質転換体。配列番号36の塩基配列からなるDNA、配列番号39の塩基配列からなるDNA、配列番号42の塩基配列からなるDNA、配列番号45の塩基配列からなるDNA、配列番号48の塩基配列からなるDNA、又は配列番号51の塩基配列からなるDNAの何れかの塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつチロシンフェノールリアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA項4.宿主のコリネ型細菌が、その染色体上に存在する下記及び/又はの遺伝子が破壊され、又は欠損したものである、項1~3の何れかに記載の形質転換体。プレフェン酸デヒドラターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子フェノール2モノオキシゲナーゼphenol2monooxygenase活性を有する酵素をコードする遺伝子項5.宿主のコリネ型細菌の以下の及び/又はの代謝遺伝子が、宿主で高発現している項1~4の何れかに記載の形質転換体。DAHPシンテターゼ3deoxyDarabinoheptulosonate7phosphatesynthase活性を有する酵素をコードする遺伝子コリスミン酸ムターゼchorismatemutase活性を有する酵素をコードする遺伝子項6.宿主のコリネ型細菌がコリネバクテリウムグルタミカムである項1~5の何れかに記載の形質転換体。項7.宿主のコリネバクテリウムグルタミカムが、コリネバクテリウムグルミカムRFERMP-18976、ATCC13032、又はATCC13869である項6に記載の形質転換体。項8.宿主のコリネバクテリウムグルタミカムが、コリネバクテリウムグルミカムRFERMP-18976、ATCC13032、又はATCC13869の染色体上に存在する下記及び/又はの遺伝子が破壊され、又は欠損したものである、項6に記載の形質転換体。プレフェン酸デヒドラターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子フェノール2モノオキシゲナーゼphenol2monooxygenase活性を有する酵素をコードする遺伝子項9.宿主のコリネバクテリウムグルタミカムが、コリネバクテリウムグルミカムRFERMP-18976、ATCC13032、又はATCC13869において、以下の及び/又はの代謝遺伝子が高発現しているものである、項6又は8に記載の形質転換体。DAHPシンテターゼ3deoxyDarabinoheptulosonate7phosphatesynthase活性を有する酵素をコードする遺伝子コリスミン酸ムターゼchorismatemutase活性を有する酵素をコードする遺伝子項10.コリネバクテリウムグルタミカムPHE7受託番号:NITEBP-976形質転換体。項11.項1~10の何れかに記載の形質転換体を、還元条件下、糖類を含有する反応液中で反応させる工程と、反応液中のフェノールを回収する工程とを含むフェノールの製造方法。項12.反応工程において、形質転換体が実質的に増殖しない項11記載のフェノールの製造方法。項13.還元条件下の反応液の酸化還元電位が-200~-500ミリボルトである項11又は12に記載のフェノールの製造方法。項14.糖類がグルコース、フルクトース、マンノース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、スクロース、マルトース、ラクトース、セロビオース、トレハロース、及びマンニトールからなる群より選ばれるものである項11~13の何れかに記載のフェノールの製造方法。本発明の形質転換体を用いることにより、従来公知の形質転換体に比べて、糖類からフェノールを高効率で製造することができる。一般に微生物はフェノールのような溶剤の細胞毒性により生育が阻害されるため、微生物を用いてフェノールを製造することは困難であったが、本発明方法によれば、微生物を用いて、実用上十分に効率良くフェノールを製造することができる。以下、本発明を詳細に説明する。Iフェノール生産能を有する形質転換体本発明のフェノール生産能を有する形質転換体は、チロシンフェノールリアーゼtyrosinephenollyase活性を有する酵素をコードする遺伝子が、宿主のコリネ型細菌に導入された形質転換体である。宿主コリネ型細菌とは、バージーズマニュアルデターミネイティブバクテリオロジーBargeysManualofDeterminativeBacteriology、Vol8、5991974に定義されている一群の微生物であり、通常の好気的条件で増殖するものならば特に限定されるものではない。具体例を挙げれば、コリネバクテリウム属菌、ブレビバクテリウム属菌、アースロバクター属菌、マイコバクテリウム属菌、マイクロコッカス属菌等が挙げられる。コリネ型細菌の中ではコリネバクテリウム属菌が好ましい。コリネバクテリウム属菌としては、コリネバクテリウムグルタミカム、コリネバクテリウムエフィシェンスCorynebacteriumefficiens、コリネバクテリウムアンモニアゲネスCorynebacteriumammoniagenes、コリネバクテリウムハロトレランスCorynebacteriumhalotolerance、コリネバクテリウムアルカノリティカムCorynebacteriumalkanolyticum等が挙げられる。中でも、安全でかつフェノール生産性が高い点で、コリネバクテリウムグルタミカムが好ましい。好適な菌株として、コリネバクテリウムグルタミカムCorynebacteriumglutamicumR株FERMP18976、ATCC13032株、ATCC13869株、ATCC13058株、ATCC13059株、ATCC13060株、ATCC13232株、ATCC13286株、ATCC13287株、ATCC13655株、ATCC13745株、ATCC13746株、ATCC13761株、ATCC14020株、ATCC31831株、MJ233FERMBP1497、MJ233AB41FERMBP1498等が挙げられる。中でも、R株FERMP18976、ATCC13032株、ATCC13869株が好ましい。なお、分子生物学的分類により、ブレビバクテリウムフラバムBrevibacteriumflavum、ブレビバクテリウムラクトファーメンタムBrevibacteriumlactofermentum、ブレビバクテリウムディバリカタムBrevibacteriumdivaricatum、コリネバクテリウムリリウムCorynebacteriumlilium等のコリネ型細菌もコリネバクテリウムグルタミカムCorynebacteriumglutamicumに菌名が統一されているLieblWetalTransferofBrevibacteriumdivaricatumDSM20297TBrevibacteriumflavumDSM20411BrevibacteriumlactofermentumDSM20412andDSM1412andCorynebacteriumglutamicumandtheirdistinctionbyrRNAgenerestrictionpatternsIntJSystBacteriol41255260、駒形和男らコリネフォルム細菌の分類発酵と工業45944963。旧分類のブレビバクテリウムラクトファーメンタムATCC13869株、ブレビバクテリウムフラバムのMJ233株FERMBP1497、MJ233AB41株FERMBP1498なども好適なコリネバクテリウムグルタミカムである。ブレビバクテリウム属菌としては、ブレビバクテリウムアンモニアゲネスBrevibacteriumammoniagenes例えばATCC6872株等が挙げられる。アースロバクター属菌としては、アースロバクターグロビフォルミスArthrobacterglobiformis例えばATCC8010株、ATCC4336株、ATCC21056株、ATCC31250株、ATCC31738株、ATCC35698株等が挙げられる。マイコバクテリウム属菌としては、マイコバクテリウムボビスMycobacteriumbovis例えばATCC19210株、ATCC27289株等が挙げられる。マイクロコッカス属菌としては、マイクロコッカスフロイデンライヒMicrococcusfreudenreichii例えばNo239株FERMP13221、マイクロコッカスルテウスMicrococcusleuteus、マイクロコッカスウレアエMicrococcusureae例えばIAM1010株、マイクロコッカスロゼウスMicrococcusroseus例えばIFO3764株等が挙げられる。また、コリネ型細菌は、野生株の他に、その変異株や人為的な遺伝子組換え体であってもよい。例えば、ラクテート乳酸デヒドロゲナーゼlactatedehydrogenase:LDH、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼphosphoenolpyrvatecarboxylase、マレートデヒドロゲナーゼmalatedehydrogenaseなどの遺伝子の破壊株が挙げられる。このような遺伝子破壊株を宿主として用いることにより、フェノールの生産性を向上させたり、副生成物の生成を抑制したりすることができる。中でも、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊株が好ましい。この遺伝子破壊株は、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が破壊されていることにより、ピルビン酸から乳酸への代謝経路が遮断されている。中でも、コリネバクテリウムグルタミカムの、特にRFERMP18976株のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊株が好ましい。このような遺伝子破壊株は、遺伝子工学的手法により常法に従い作製できる。例えば、WO2005/010182A1に、乳酸デヒドロゲナーゼ破壊株、及びその作製方法が記載されている。チロシンフェノールリアーゼ酵素遺伝子チロシンフェノールリアーゼ酵素は、下記の2反応を触媒する酵素である。チロシンフェノールリアーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子の由来は特に限定されないが、パントエアアグロメランスPantoeaagglomerans由来の遺伝子、シトロバクターブラッキーCitrobacterbraakii由来の遺伝子、デスルフィトバクテリュームハフニエンスDesulfitobacteriumhafniense由来の遺伝子、クロロフレクサスオウランティアカスChloroflexusaurantiacus由来の遺伝子、ノストックパンクチフォルメ由来の遺伝子、トレポネマデンティコラTreponemadenticola由来の遺伝子が好ましい。中でも、パントエアアグロメランス、シトロバクターブラッキー、又はデスルフィトバクテリュームハフニエンス由来の遺伝子が好ましく、シトロバクターブラッキー由来の遺伝子がより好ましい。パントエアアグロメランス由来のチロシンフェノールリアーゼ酵素遺伝子としては、配列番号36の塩基配列からなるDNAが挙げられ、シトロバクターブラッキー由来のチロシンフェノールリアーゼ酵素遺伝子としては、配列番号39の塩基配列からなるDNAが挙げられ、デスルフィトバクテリュームハフニエンス由来のチロシンフェノールリアーゼ酵素遺伝子としては、配列番号42の塩基配列からなるDNAが挙げられ、クロロフレクサスオウランティアカス由来のチロシンフェノールリアーゼ酵素遺伝子としては、配列番号45の塩基配列からなるDNAが挙げられ、ノストックパンクチフォルメ由来のチロシンフェノールリアーゼ酵素遺伝子としては、配列番号48の塩基配列からなるDNAが挙げられ、トレポネマデンティコラ由来のチロシンフェノールリアーゼ酵素遺伝子としては、配列番号51の塩基配列からなるDNAが挙げられる。また、本発明では、配列番号36、39、42、45、48、又は51の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつチロシンフェノールリアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAも使用できる。本発明においてストリンジェントな条件は、一般的な条件、例えば、MolecularCloningALaboratoryManualSecondEdition1989Vol2p1145に記載された条件を指す。具体的には、完全ハイブリッドの融解温度より5~10°C低い温度でハイブリダイゼーションが起こる場合を指す。チロシンフェノールリアーゼ活性は、後述する実施例3に記載の方法で測定できる。また、本発明では、配列番号36、39、42、45、48、又は51の塩基配列と同一性が90以上、好ましくは95以上、より好ましくは98以上の塩基配列からなり、かつチロシンフェノールリアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAも使用できる。塩基配列の同一性は、GENETYXver8GENETYX株式会社ゼネティックス製により算出した値である。配列番号36、39、42、45、48、又は51の塩基配列からなるDNAのホモログは、例えば、これらの塩基配列に基づき常法に従い設計したプライマー又はプローブを用いたPCR又はハイブリダイゼーションにより、他生物種のDNAライブラリーから選択することができ、これにより高確率でチロシンフェノールリアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAが得られる。形質転換のためのベクターの構築PCRで増幅したチロシンフェノールリアーゼ酵素をコードするDNAは、宿主で増幅できる適切なベクターにクローニングすればよい。プラスミドベクターとしては、コリネ型細菌内で自律複製機能を司る遺伝子を含むものであれば良い。その具体例としては、ブレビバクテリウムラクトファーメンタムBrevibacteriumlactofermentum2256由来のpAM330特開昭5867699、MiwaKetalCrypticplasmidsinglutamicacidproducingbacteriaAgricBiolChem48290129031984及びYamaguchiRetalDeterminationofthecompletenucleotidesequenceoftheBrevibacteriumlactofermentumplasmidpAM330andtheanalysisofitsgeneticinformationNucleicAcidsSympSer162652671985、コリネバクテリウムグルタミカムATCC13058由来のpHM1519MiwaKetalCrypticplasmidsinglutamicacidproducingbacteriaAgricBiolChem48290129031984及びpCRY30KurusuYetalIdentificationofplasmidpartitionfunctionincoryneformbacteriaApplEnvironMicrobiol577597641991、コリネバクテリウムグルタミカムT250由来のpCG4特開昭57183799、KatsumataRetalProtoplasttransformationofglutamateproducingbacteriawithplasmidDNAJBacteriol、1593063111984、pAG1、pAG3、pAG14、pAG50特開昭62166890、pEK0、pEC5、pEKEx1EikmannsBJetalAfamilyofCorynebacteriumglutamicumEscherichiacolishuttlevectorsforcloningcontrolledgeneexpressionandpromoterprobingGene10293981991などが挙げられる。好ましいプロモーターとしては、コリネバクテリウムグルタミカムR由来のグリセルアルデヒド3フォスフェートデヒドロゲナーゼA遺伝子のプロモーターPgapA、マレートデヒドロゲナーゼ遺伝子mdhのプロモーターPmdh、ラクテートデヒドロゲナーゼA遺伝子ldhAのプロモーターPldhAなどが挙げられ、中でも、PgapAが好ましい。好ましいターミネーターとしては、大腸菌rRNAオペロンのrrnBT1T2ターミネーター、大腸菌のtrpAターミネーター、ブレビバクテリウムラクトファーメンタムBrevibacteriumlactofermentumのtrpターミネーターなどが挙げられ、中でも、rrnBT1T2ターミネーターが好ましい。形質転換形質転換方法は、公知の方法を制限無く使用できる。このような公知の方法として、例えば塩化カルシウム/塩化ルビジウム法、リン酸カルシウム法、DEAE-デキストラン介在トランスフェクション、電気穿孔法などが挙げられる。中でも、コリネ型細菌には、電気パルス法が好適であり、電気パルス法は、公知の方法KurusuYetalElectroporationtransformationsystemforCoryneformbacteriabyauxotrophiccomplementationAgricBiolChem544434471990及びVertesAAetalPresenceofmrrandmcrlikerestrictionsystemsinCoryneformbacteriaResMicrobiol1441811851993により行うことができる。形質転換体は、微生物の培養に通常使用される培地を用いて培養すればよい。この培地としては、通常、炭素源、窒素源、無機塩類及びその他の栄養物質等を含有する天然培地又は合成培地等を用いることができる。炭素源としては、グルコース、フルクトース、スクロース、マンノース、マルトース、マンニトール、キシロース、アラビノース、ガラクトース、澱粉、糖蜜、ソルビトール、グリセリン等の糖質又は糖アルコール;酢酸、クエン酵、乳酸、フマル酸、マレイン酸又はグルコン酸等の有機酸;エタノール、プロパノール等のアルコール等が挙げられる。また、所望によりノルマルパラフィン等の炭化水素等も用いることができる。炭素源は、1種を単独で使用でき、又は2種以上を混合して使用してもよい。培地中のこれら炭素源の濃度は、通常、約01~10w/vとすればよい。窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機又は有機アンモニウム化合物、尿素、アンモニア水、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等が挙げられる。また、コーンスティープリカー、肉エキス、ベプトン、NZ-アミン、蛋白質加水分解物、アミノ酸等の含窒素有機化合物等も使用できる。窒素源は、1種を単独で使用してもよく、また2種以上を混合して使用してもよい。培地中の窒素源濃度は、使用する窒素化合物によっても異なるが、通常、約01~10w/vとすればよい。無機塩類としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト又は炭酸カルシウム等が挙げられる。これら無機塩は、1種を単独で使用してもよく、また2種以上を混合して使用してもよい。培地中の無機塩類濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常、約001~1w/vとすればよい。栄養物質としては、例えば肉エキス、ペプトン、ポリペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、コーンスティープリカー、脱脂粉乳、脱脂大豆塩酸加水分解物、又は動植物若しくは微生物菌体のエキスやそれらの分解物等が挙げられる。栄養物質の培地濃度は、使用する栄養物質によっても異なるが、通常、約01~10w/vとすればよい。さらに、必要に応じて、ビタミン類を添加することもできる。ビタミン類としては、例えば、ビオチン、チアミンビタミンB1、ピリドキシンビタミンB6、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が挙げられる。培地のpHは約5~8が好ましい。好ましい微生物培養培地としては、A培地InuiMetalMetabolicanalysisofCorynebacteriumglutamicumduringlactateandsuccinateproductionsunderoxygendeprivationconditionsJMolMicrobiolBiotechnol7182196、BT培地OmumasabaCAetalCorynebacteriumglutamicumglyceraldehyde3phosphatedehydrogenaseisoformswithoppositeATPdependentregulationJMolMicrobiolBiotechnol891103等が挙げられる。培養温度は約15~45°Cとすればよく、培養時間は約1~7日間とすればよい。宿主染色体遺伝子の破壊又は欠失宿主のコリネ型細菌は、その染色体上に存在するプレフェン酸デヒドラターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子、及び/又はフェノール2モノオキシゲナーゼphenol2monooxygenase活性を有する酵素をコードする遺伝子が、破壊され、または欠失していることが好ましく、これにより一層効率良くフェノールを製造することができる。pheA及びpoxFが共に破壊され、または欠失していることがより好ましい。遺伝子の部分配列を欠失し、正常に機能する酵素タンパク質を産生しないように改変した欠失型遺伝子を作製し、該遺伝子を含むDNAで細菌を形質転換して、欠失型遺伝子と染色体上の遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の遺伝子を欠失型又は破壊型の遺伝子に置換することができる。欠失型又は破壊型の遺伝子によってコードされる酵素タンパク質は、生成したとしても、野生型酵素タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失している。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子欠失又は破壊は既に確立しており、温度感受性複製起点を含むプラスミド、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で複製起点を持たないスイサイドベクターを利用する方法などがある米国特許第6303383号、特開平05007491号。具体的には、実施例2の項目に記載の方法により、プレフェン酸デヒドラターゼ酵素遺伝子や、フェノール2モノオキシゲナーゼ酵素遺伝子が破壊又は欠失したコリネ型細菌を得ることができる。代謝遺伝子の高発現宿主のコリネ型細菌は、DAHPシンテターゼ3deoxyDarabinoheptulosonate7phosphatesynthase遺伝子aroG、及び/又はコリスミン酸ムターゼchorismatemutase遺伝子csmが、宿主の本来のレベル、即ち野生型宿主のレベルより高発現していることが好ましい。この高発現は、形質転換による遺伝子導入、又は宿主染色体上の遺伝子のコピー数を高めることにより達成される。aroG及びcsmが共に高発現していることがより好ましい。形質転換について述べれば、導入するDAHPシンテターゼ遺伝子及びコリスミン酸ムターゼ遺伝子は、宿主の遺伝子と同じ又は実質的に同じDAHPシンテターゼ遺伝子及びコリスミン酸ムターゼ遺伝子でもよく、その他のDAHPシンテターゼ遺伝子及びコリスミン酸ムターゼ遺伝子であってもよい。宿主の遺伝子と同じ又は実質的に同じ、DAHPシンテターゼ遺伝子及び/又はコリスミン酸ムターゼ遺伝子を導入する方が好ましい。例えば、コリネバクテリウムグルタミカム由来のDAHPシンテターゼ遺伝子としては、配列番号30の塩基配列からなるDNAが挙げられ、コリネバクテリウムグルタミカム由来のコリスミン酸ムターゼ遺伝子としては、配列番号31の塩基配列からなるDNAが挙げられる。その他のコリネ型細菌のDHAPシンターゼ遺伝子としては、コリネバクテリウムエフィシェンスCorynebacteriumefficiens由来の遺伝子配列番号62、日本DNAデータバンク:CE2073、マイコバクテリウムスメグマティスMycobacteriumsmegmatis由来の遺伝子配列番号63、日本DNAデータバンク:MSMEG4244、ロドコッカスオパカスRhodococcusopacus由来の遺伝子配列番号64、日本DNAデータバンク:ROP08400などがあり、コリスミン酸ムターゼ遺伝子としては、コリネバクテリウムエフィシェンス由来の遺伝子配列番号65、日本DNAデータバンク:CE0929、マイコバクテリウムスメグマティス由来の遺伝子配列番号66、日本DNAデータバンク:MSMEG5536、ロドコッカスオパカス由来の遺伝子配列番号67、日本DNAデータバンク:ROP56380などがある。また、DAHPシンテターゼ遺伝子又はコリスミン酸ムターゼ遺伝子について実質的に同じ遺伝子としては、当該遺伝子がコードするポリペプチドのアミノ酸配列と90以上、好ましくは95以上、より好ましくは98以上の同一性を有するポリペプチドであって、DAHPシンテターゼ活性又はコリスミン酸ムターゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAが挙げられる。また、DAHPシンテターゼ遺伝子又はコリスミン酸ムターゼ遺伝子について実質的に同じ遺伝子としては、当該遺伝子と90以上、好ましくは95以上、より好ましくは98以上の同一性を有するDNAであって、DAHPシンテターゼ活性又はコリスミン酸ムターゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAが挙げられる。DAHPシンテターゼ活性の有無は、ホスホエノールピルビン酸とエリトロース4リン酸を基質として反応させ、生じた3deoxyDarabinoheptulosonate7phosphateを、チオバルビツール酸を用いた発色法により定量ApplEnvironMicrobiol7454975503することにより検出することができる。また、コリスミン酸ムターゼ活性の有無は、コリスミ酸を基質として反応後、生じたプレフェン酸prephenateを終濃度067N塩酸によりフェニルピルビン酸phenylpyruvateに変換。宿主染色体上のDAHPシンテターゼ遺伝子又はコリスミン酸ムターゼ遺伝子のコピー数を高める方法について述べれば、これらの遺伝子をコリネ型細菌の染色体DNA上に多コピー導入すればよい。微生物の染色体DNA上に遺伝子を多コピーで導入するには、染色体DNA上に多コピー存在する配列を標的に利用して、相同組換え法ExperimentsinMolecularGeneticsColdSpringHarborLabにより行うことができる。染色体DNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーテッドリピートが利用できる。また、特開平2109985号公報に開示されているように、目的遺伝子をトランスポゾンと共に転移させて染色体DNA上に多コピー導入することも可能である。さらに、Muファージを用いる方法特開平2109985号で宿主染色体に目的遺伝子を組み込むこともできる。また、コリネ型細菌の染色体上のDAHPシンテターゼ遺伝子及び/又はコリスミン酸ムターゼ遺伝子のプロモーター等の発現調節配列をより強力なものに置換することによっても、これらの遺伝子の発現を高めることができる。例えば、tacプロモーター、lacプロモーター、trcプロモーター、trpプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。また、国際公開WO0018935に開示されているように、遺伝子のプロモーター領域に数塩基の塩基置換を導入し、より強力なものに改変することも可能である。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文ProkaryoticpromotersinbiotechnologyBiotechnolAnnuRev19951105128等に記載されている。発現調節配列の置換は、例えば、温度感受性プラスミドを用いた遺伝子置換と同様にして行うことができる。さらに、リボソーム結合部位RBSと開始コドンとの間のスペーサ、特に開始コドンのすぐ上流の配列における数個のヌクレオチドの置換がmRNAの翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することによって、翻訳量を向上させることもできる。上記のような遺伝子置換を行う方法としては、例えば、温度感受性複製起点を含むプラスミド、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で複製起点を持たないスイサイドベクターを利用する方法などがある米国特許第6303383号明細書、または特開平05007491号公報。IIフェノールの製造方法上記説明した本発明の形質転換体を、還元条件下、糖類を含有する反応液中で反応させる工程と、反応液中のフェノールを回収する工程とを含む方法によりフェノールを製造することができる。微生物の増殖反応に先立ち、形質転換体を好気条件下で、温度約25~38°Cで、約12~48時間培養して増殖させることが好ましい。培養用培地反応に先立つ形質転換体の好気的培養に用いる培地は、炭素源、窒素源、無機塩類およびその他の栄養物質等を含有する天然培地または合成培地を用いることができる。炭素源として、糖類グルコース、フルクトース、マンノース、キシロース、アラビノース、ガラクトースのような単糖;スクロース、マルトース、ラクトース、セロビオース、キシロビオース、トレハロースのような二糖;澱粉のような多糖;糖蜜等、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、グリセリンのような糖アルコール;酢酸、クエン酵、乳酸、フマル酸、マレイン酸、グルコン酸のような有機酸;エタノール、プロパノールのようなアルコール;ノルマルパラフィンのような炭化水素等も用いることができる。炭素源は、1種を単独で、又は2種以上を混合して使用できる。窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウムのような無機又は有機アンモニウム化合物、尿素、アンモニア水、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等を使用できる。また、コーンスティープリカー、肉エキス、ペプトン、NZ-アミン、蛋白質加水分解物、アミノ酸等の含窒素有機化合物等も使用できる。窒素源は、1種を単独で、又は2種以上を混合して使用できる。窒素源の培地中の濃度は、使用する窒素化合物によっても異なるが、通常、約01~10w/vとすればよい。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、炭酸カルシウム等が挙げられる。無機塩は、1種を単独で、又は2種以上を混合して使用できる。無機塩類の培地中の濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常、約001~1w/vとすればよい。栄養物質としては、肉エキス、ペプトン、ポリペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、コーンスティープリカー、脱脂粉乳、脱脂大豆塩酸加水分解物、動植物又は微生物菌体のエキスやそれらの分解物等が挙げられる。栄養物質の培地中の濃度は、使用する栄養物質によっても異なるが、通常約01~10w/vとすればよい。さらに、必要に応じて、ビタミン類を添加することもできる。ビタミン類としては、ビオチン、チアミンビタミンB1、ピリドキシンビタミンB6、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が挙げられる。培地のpHは約6~8が好ましい。具体的な好ましいコリネ型細菌用培地としては、A培地InuiMetalMetabolicanalysisofCorynebacteriumglutamicumduringlactateandsuccinateproductionsunderoxygendeprivationconditionsJMolMicrobiolBiotechnol7182196、BT培地OmumasabaCAetalCorynebacteriumglutamicumglyceraldehyde3phosphatedehydrogenaseisoformswithoppositeATPdependentregulationJMolMicrobiolBiotechnol891103等が挙げられる。これらの培地において、糖類濃度を上記範囲にして用いればよい。反応液反応液としては、炭素源、窒素源、無機塩類およびその他の栄養物質等を含有する天然培地または合成培地を用いることができる。炭素源としては糖類を用いる。糖類としては、グルコース、フルクトース、マンノース、キシロース、アラビノース、ガラクトースのような単糖;スクロース、マルトース、ラクトース、セロビオース、キシロビオース、トレハロースのような二糖;澱粉のような多糖;糖蜜等が挙げられる。中でも、単糖が好ましく、グルコースがより好ましい。炭素源として、糖類の他に、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、グリセリンのような糖アルコール;酢酸、クエン酵、乳酸、フマル酸、マレイン酸、グルコン酸のような有機酸;エタノール、プロパノールのようなアルコール;ノルマルパラフィンのような炭化水素等も用いることができる。炭素源は、1種を単独で、又は2種以上を混合して使用できる。反応液中の糖類の濃度は、約1~20w/vが好ましく、約2~10w/vがより好ましく、約2~5w/vがさらにより好ましい。また、糖類を含む全炭素源の反応液中の濃度は、通常、約2~5w/vとすればよい。窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウムのような無機又は有機アンモニウム化合物、尿素、アンモニア水、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等を使用できる。また、コーンスティープリカー、肉エキス、ペプトン、NZ-アミン、蛋白質加水分解物、アミノ酸等の含窒素有機化合物等も使用できる。窒素源は、1種を単独で、又は2種以上を混合して使用できる。窒素源の反応液中の濃度は、使用する窒素化合物によっても異なるが、通常、約01~10w/vとすればよい。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、炭酸カルシウム等が挙げられる。無機塩は、1種を単独で、又は2種以上を混合して使用できる。無機塩類の反応液中の濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常、約001~1w/vとすればよい。栄養物質としては、肉エキス、ペプトン、ポリペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、コーンスティープリカー、脱脂粉乳、脱脂大豆塩酸加水分解物、動植物又は微生物菌体のエキスやそれらの分解物等が挙げられる。栄養物質の反応液中の濃度は、使用する栄養物質によっても異なるが、通常約01~10w/vとすればよい。さらに、必要に応じて、ビタミン類を添加することもできる。ビタミン類としては、ビオチン、チアミンビタミンB1、ピリドキシンビタミンB6、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が挙げられる。反応液のpHは約6~8が好ましい。具体的な好ましいコリネ型細菌用培地としては、前述したA培地、BT培地等が挙げられる。これらの培地において、糖類濃度を上記範囲にして用いればよい。反応条件反応温度、即ち形質転換体の生存温度は、約20~50°Cが好ましく、約25~47°Cがより好ましい。上記温度範囲であれば、効率良くフェノールを製造できる。また、反応時間は、約1~7日間が好ましく、約1~3日間がより好ましい。培養は、バッチ式、流加式、連続式の何れでもよい。中でも、バッチ式が好ましい。反応は、好気的条件で行ってもよく、還元条件で行ってもよい。<還元条件>還元条件では、コリネ型細菌は実質的に増殖せず、一層効率的にフェノールを生産させることができる。還元条件は、反応液の酸化還元電位で規定される。反応液の酸化還元電位は、約-200mV~-500mVが好ましく、約-250mV~-500mVがより好ましい。反応液の還元状態は簡便にはレサズリン指示薬還元状態であれば、青色から無色への脱色で推定できるが、正確には酸化還元電位差計例えば、BROADLEYJAMES社製、ORPElectrodesを用いて測定できる。還元条件にある反応液の調整方法は、公知の方法を制限なく使用できる。例えば、反応液の液体媒体として、蒸留水などの代わりに反応液用水溶液を使用してもよく、反応液用水溶液の調整方法は、例えば硫酸還元微生物などの絶対嫌気性微生物用の培養液調整方法Pfennig,Net.al.1981:Thedissimilatorysulfate-reducingbacteria,InTheProkaryotes,AHandbookonHabitats,IsolationandIdentificationofBacteria,Ed.byStarr,M.P.et.al.p.926-940,Berlin,SpringerVerlag.や農芸化学実験書第三巻、京都大学農学部農芸化学教室編、1990年第26刷、産業図書株式会社出版などが参考となり、所望する還元条件下の水溶液を得ることができる。具体的には、蒸留水などを加熱処理や減圧処理して溶解ガスを除去することにより、還元条件の反応液用水溶液を得ることができる。この場合、約10mmHg以下、好ましくは約5mmHg以下、より好ましくは約3mmHg以下の減圧下で、約1~60分程度、好ましくは約5~40分程度、蒸留水などを処理することにより、溶解ガス、特に溶解酸素を除去して還元条件下の反応液用水溶液を作成することができる。また、適当な還元剤例えば、チオグリコール酸、アスコルビン酸、システィン塩酸塩、メルカプト酢酸、チオール酢酸、グルタチオン、硫化ソーダ等を添加して還元条件の反応液用水溶液を調整することもできる。これらの方法を適宜組み合わせることも有効な還元条件の反応液用水溶液の調整方法である。反応中も反応液を還元条件に維持することが好ましい。反応途中での還元条件を維持するために、反応系外からの酸素の混入を可能な限り防止することが望ましく、具体的には、反応系を窒素ガス等の不活性ガスや炭酸ガス等で封入する方法が挙げられる。酸素混入をより効果的に防止する方法としては、反応途中において本発明の好気性細菌の菌体内の代謝機能を効率よく機能させるために、反応系のpH維持調整液の添加や各種栄養素溶解液を適宜添加する必要が生じる場合もあるが、このような場合には添加溶液から酸素を予め除去しておくことが有効である。フェノールの回収上記のようにして培養することにより、反応液中にフェノールが生産される。反応液を回収することによりフェノールを回収できるが、さらに、公知の方法でフェノールを反応液から分離することもできる。そのような公知の方法として、蒸留法、膜透過法、有機溶媒抽出法等が挙げられる。以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。実施例1フェノール生産用宿主としての適性試験;フェノールによるコリネバクテリウムグルタミカム及び他種菌体への影響1フェノールによる好気増殖への影響コリネバクテリウムグルタミカム、エシェリヒアコリおよびシュードモナスプチダについて、好気培養におけるフェノールの生育阻害試験を行った。尚、本試験に用いたシュードモナスプチダS12は、溶媒耐性菌として報告されており、これまでに唯一フェノール生産の宿主として用いられた技術が開示されている。コリネバクテリウムグルタミカムRをA寒天培地2CO2g、2SO47g、KH2PO405g、K2HPO405g、MgSO47H2O05g、006Fe2SO47H2O0042MnSO42H2O1ml、002biotinsolution1ml、001thiaminsolution2ml、yeastextract2g、vitaminassaycasaminoacid7g、glucose40g、寒天15gを蒸留水1Lに懸濁に塗布し、33°C、15時間暗所に静置した。上記のプレートで生育したコリネバクテリウムグルタミカムRを、A液体培地2CO2g、2SO47g、KH2PO405g、K2HPO405g、MgSO47H2O05g、006Fe2SO47H2O0042MnSO42H2O1ml、002biotinsolution1ml、001thiaminsolution2ml、yeastextract2g、vitaminassaycasaminoacid7g、glucose40gを蒸留水1Lに溶解10mlの入った試験管に一白金耳植菌し、33°Cにて13時間、好気的に振盪培養を行った。上記条件で生育したコリネバクテリウムグルタミカムRを、A液体培地100mlに初期菌体濃度OD610005となるように植菌し、同時にフェノールが終濃度0、016、02、024、032mMとなるように添加し、33°Cにて好気的に振盪培養を行った。菌体の生育はOD610の吸光度を測定することにより行った。エシェリヒアコリJM109をLB寒天培地1ポリペプトン、05酵母エキス、05塩化ナトリウム、および15寒天に塗布し、37°C、15時間暗所に静置した。上記プレートで生育したエシェリヒアコリJM109を、LB液体培地1ポリペプトン、05酵母エキスおよび05塩化ナトリウム10mlの入った試験管に一白金耳植菌し、37°Cにて13時間、好気的に振盪培養を行った。上記条件で生育したエシェリヒアコリJM109をLB液体培地100mlに初期菌体濃度OD610005となるように植菌し、同時にフェノール濃度が終濃度0、016、020mMとなるように添加し、37°Cにて好気的に振盪培養を行った。菌体の生育はOD610の吸光度を測定することにより行った。シュードモナスプチダF1およびS12をLB寒天培地1ポリペプトン、05酵母エキス、05塩化ナトリウム、および15寒天に塗布し、30°C、15時間暗所に静置した。上記プレートで生育したシュードモナスプチダF1およびS12を、LBグルコース液体培地1ポリペプトン、05酵母エキス、05塩化ナトリウムおよび04グルコース10mlの入った試験管に一白金耳植菌し、30°Cにて13時間、好気的に振盪培養を行った。上記条件で生育したシュードモナスプチダF1およびS12株をLBグルコース液体培地100mlに初期菌体濃度OD610005となるように植菌し、同時にフェノール濃度が終濃度0、010、020mMとなるように添加し、30°Cにて好気的に振盪培養を行った。菌体の生育はOD610の吸光度を測定することにより行った。培地中へのフェノール添加による好気増殖への影響の解析結果を図1に示す。図1の縦軸はOD610である。エシェリヒアコリは、016フェノール存在下で著しく増殖阻害を受け、020フェノールでは完全に増殖が阻害された。シュードモナスプチダF1及び溶剤耐性菌として報告されていたシュードモナスプチダS12は、ほぼ同じ傾向を示し、010フェノール存在下で著しく増殖阻害を受け020フェノールでは完全に増殖が阻害された。これに対して、コリネバクテリウムグルタミカムは、エシェリヒアコリが顕著な増殖阻害を受けた016のフェノール存在下においても増殖への影響はほとんどなく、エシェリヒアコリやシュードモナスプチダでは完全に増殖を阻害された020のフェノール存在下においても良好な生育を示した。さらに024のフェノール存在下において増殖が可能であった。このように、コリネバクテリウムグルタミカムはエシェリヒアコリおよびシュードモナスプチダと比較して、フェノールに対し高い耐性を有し、フェノール生産の宿主として高い適性を有することが示された。により回収した。得られた菌体を、10wvとなるようにBT液体培地07硫酸アンモニウム、005リン酸二水素カリウム、005リン酸水素二カリウム、005硫酸マグネシウム7水和物、00006硫酸鉄7水和物、000042硫酸マンガン水和物、000002ビオチン、000002チアミン塩酸塩に懸濁した。このそれぞれの菌体懸濁液60mlを容量100mlメディウム瓶に入れ、還元条件下酸化還元電位;450mV、グルコースを8、フェノール濃度を0、024、038、046mMとなるように添加し、33°Cに保った水浴中で攪拌しながら反応させた。この時、反応液のpHが70を下回らないように25Nのアンモニア水を用いてpHコントローラー微生物からの染色体DNAの抽出コリネバクテリウムグルタミカムCorynebacteriumglutamicumRからの染色体DNA抽出は、A培地2CO2g、2SO47g、KH2PO405g、K2HPO405g、MgSO47H2O05g、006Fe2SO47H2O0042MnSO42H2O1ml、002biotinsolution1ml、001thiaminsolution2ml、yeastextract2g、vitaminassaycasaminoacid7gを蒸留水1Lに溶解に、炭素源として、最終濃度4になるように50グルコース溶液を添加し、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで33°Cで振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット商品名:GenomicPrepCellsandTissueDNAIsolationKit、アマシャム社製を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。パントエアアグロメランスPantoeaagglomeransNBRC12686からの染色体DNA抽出は、NBRCMediumNo802培地polypeptone10gyeastextract2gMgSO47H2O1gを蒸留水1Lに溶解に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで30°Cで振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キットを用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。シトロバクターブラッキーCitrobacterbraakiiATCC6750からの染色体DNA抽出は、NutrientBrothベクトンディッキンソン社製BD234000に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで37°Cで振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キットを用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。デスルフィトバクテリュームハフニエンスDesulfitobacteriumhafnienseY51からの染色体DNA抽出は、MMYP培地K2HPO478g、KH2PO412g、sodiumcitrate05g、MgSO47H2O01g、yeastextract20g、sodiumpyruvate55g、resazurinsodiumsalt10mgを蒸留水1Lに溶解及びpH72に調整に、白金耳を用いて植菌後、嫌気培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キットを用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。クロロフレクサスオウランティアカスChloroflexusaurantiacusJ10flATCC29366からの染色体DNA抽出は、Chloroflexus培地Nitrilotriaceticacid01g、MicronutrientSolution10ml、FeCl3Solution10ml、CaSO42H2O006g、MgSO47H2O01g、NaCL0008g、KNO30103g、NaNO30689g、Na2HPO40111g、NH4Cl02g、yeastextract05g、glycylglycine05gを蒸留水1Lに溶解;MicronutrientSolution:H2SO405ml、MnSO47H2O228g、ZnSO47H2O05g、H3BO305g、CuSO42H2O0025g、Na2MoO42H2O0025g、CoCl26H2O0045gを蒸留水1Lに溶解、FeCl3Solution:FeCl302905gを蒸留水1Lに溶解に、白金耳を用いて植菌後、タングステンランプ照射及び50°Cで振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キットを用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。デスルフィトバクテリュームハフニエンスDesulfitobacteriumhafnienseY51からの染色体DNA抽出は、MMYP培地K2HPO478g、KH2PO412g、sodiumcitrate05g、MgSO47H2O01g、yeastextract20g、sodiumpyruvate55g、resazurinsodiumsalt10mgを蒸留水1Lに溶解及びpH72に調整に、白金耳を用いて植菌後、嫌気培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キットを用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。ノストックパンクチフォルメNostocpunctiformeATCC29133からの染色体DNA抽出は、Bluegreennitrogenfixing培地K2HPO4004g、MgSO47H2O0075g、CaCl22H2O0036g、Citricacid60mg、Ferricammoniumcitrate60mg、EDTA10mg、Na2CO3002g、TraceMetalMixA510mlを蒸留水1Lに溶解及びpH71に調整;TraceMetalMixA5:H3BO3286g、MnCl24H2O181g、ZnSO47H2O0222g、Na2MoO42H2O039g、CuSO45H2O0079g、Co26H2O494mgを蒸留水1Lに溶解に、白金耳を用いて植菌後、光照射2000~3000lux及び26°Cで培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キットを用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。トレポネマデンティコラTreponemadenticolaJCM8153の染色体DNACatalogNoRDB6217は独立行政法人理化学研究所より入手した。クローニングベクターの構築クローニングベクターpCRB22の構築コリネバクテリウムカゼイJCM12072由来のプラスミドpCASE1のDNA複製起点以降、pCASE1oriと記す配列、及びクローニングベクターpHSG298タカラバイオ株式会社製をそれぞれ含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。PCRに際して、pCASE1ori配列、クローニングベクターpHSG298をそれぞれクローン化するべく、配列番号1pCASE1ori配列、配列番号2クローニングベクター-pHSG298を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。pCASE1ori配列増幅用プライマーa1;5’ATAGATCTAGAACGTCCGTAGGAGC3’配列番号3b1;5’ATAGATCTGACTTGGTTACGATGGAC3’配列番号4尚、プライマーa1及びb1には、BglII制限酵素部位が付加されている。クローニングベクターpHSG298増幅用プライマーa2;5’ATAGATCTAGGTTTCCCGACTGGAAAG3’配列番号5b2;5’ATAGATCTCGTGCCAGCTGCATTAATGA3’配列番号6尚、プライマーa2及びb2には、BglII制限酵素部位が付加されている。鋳型DNAは、JapanCollectionofMicroorganismsより入手したコリネバクテリウムカゼイJCM12072から抽出したトータルDNA及びクローニングベクターpHSG298タカラバイオ株式会社製を用いた。実際のPCRは、サーマルサイクラーGeneAmpPCRSystem9700を用い、反応試薬としてTaKaRaLATaqタカラバイオ株式会社製を用いて下記の条件で行った。以上を混合し、この50μlの反応液をPCRにかけた。pCASE1ori配列を増幅する場合はプライマーa1とb1の組み合わせ、クローニングベクターpHSG298を増幅する場合はプライマーa2とb2の組み合わせで行った。以上を1サイクルとし、30サイクル行った。上記で生成した反応液10μlを08アガロースゲルにより電気泳動を行い、pCASE1ori配列の場合約14kb、クローニングベクターpHSG298の場合、約27kbのDNA断片が検出できた。上記のPCRにより増幅したコリネバクテリウムカゼイ株由来のプラスミドpCASE1ori配列含む約14kbDNA断片10μl及びクローニングベクターpHSG298を含む約27kbDNA断片10μlを各々制限酵素BglIIで切断し、70°Cで10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4DNAリガーゼ10×緩衝液1μl、T4DNAリガーゼタカラバイオ株式会社製1unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μlにして、15°Cで3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションA液とした。得られたライゲーションA液を、塩化カルシウム法JournalofMolecularBiology53159によりエシェリヒアコリJM109を形質転換し、カナマイシン50μgmlを含むLB寒天培地1ポリペプトン、05酵母エキス、05塩化ナトリウム、および15寒天に塗布した。培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素BglIIでそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、クローニングベクターpHSG298約27kbのDNA断片に加え、pCASEori配列の約14kbDNA断片が認められた。pCASE1ori配列を含むクローニングベクターをpCRB22と命名した。クローニングベクターpCRB11の構築コリネバクテリウムグルタミカム内で複製可能なプラスミドpCG1由来のDNA複製起点以降、pCG1oriと記す配列、及びクローニングベクターpHSG398タカラバイオ株式会社製をそれぞれ含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。PCRに際して、pCG1ori配列、クローニングベクターpHSG398をそれぞれクローン化するべく、配列番号7pCG1ori配列、配列番号8クローニングベクターpHSG398を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。pCG1ori配列増幅用プライマーa3;5’ATAGATCTAGCATGGTCGTCACAGAG3’配列番号9b3;5’ATAGATCTGGAACCGTTATCTGCCTATG3’配列番号10尚、プライマーa3及びb3には、BglII制限酵素部位が付加されている。クローニングベクターpHSG398増幅用プライマーa4;5’ATAGATCTGTCGAACGGAAGATCACTTC3’配列番号11b4;5’ATAGATCTAGTTCCACTGAGCGTCAG3’配列番号12尚、プライマーa4及びb4には、BglII制限酵素部位が付加されている。鋳型DNAは、pCG1及びクローニングベクターpHSG398タカラバイオ株式会社製を用いた。実際のPCRは、サーマルサイクラーGeneAmpPCRSystem9700を用い、反応試薬としてTaKaRaLATaqタカラバイオ株式会社製を用いて下記の条件で行った。以上を混合し、この50μlの反応液をPCRにかけた。pCG1ori配列を増幅する場合はプライマーとの組み合わせ、クローニングベクターpHSG398を増幅する場合はプライマーとの組み合わせで行った。以上を1サイクルとし、30サイクル行った。上記で生成した反応液10μlを08アガロースゲルにより電気泳動を行い、pCG1ori配列の場合約19kb、クローニングベクターpHSG398の場合、約22kbのDNA断片が検出できた。上記のPCRにより増幅したプラスミドpCG1由来pCG1ori遺伝子含む約19kbDNA断片10μl及びクローニングベクターpHSG398を含む約22kbDNA断片10μlを各々制限酵素BglIIで切断し、70°Cで10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4DNAリガーゼ10×緩衝液1μl、T4DNAリガーゼタカラバイオ株式会社製1unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μlにして、15°Cで3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションB液とした。得られたライゲーションB液を、塩化カルシウム法JournalofMolecularBiology53159によりエシェリヒアコリJM109を形質転換し、クロラムフェニコール50μgmlを含むLB寒天培地1ポリペプトン、05酵母エキス、05塩化ナトリウム、および15寒天に塗布した。培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素BglIIでそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、クローニングベクターpHSG398約22kbのDNA断片に加え、pCG1ori配列の約19kbDNA断片が認められた。pCG1ori配列を含むクローニングベクターをpCRB11と命名した。クローニングベクターpCRB15の構築クローニングベクターpCRB11を含むDNA断片及びpSELECTzeomcsインビトロジェン株式会社製由来のゼオシン耐性遺伝子をそれぞれ含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。PCRに際して、クローニングベクターpCRB11及びゼオシン耐性遺伝子をそれぞれクローン化するべく、配列番号13pCRB11及び配列番号14ゼオシン耐性遺伝子を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。クローニングベクターpCRB11配列増幅用プライマーa5;5’ATGATATCCGAAGTGATCTTCCGTTCGA3’配列番号15b5;5’ATGATATCAAGGCAGTTATTGGTGCCCT3’配列番号16尚、プライマーa5及びb5には、EcoRV制限酵素部位が付加されている。ゼオシン耐性遺伝子増幅用プライマーa6;5’ATGATATCTAGCTTATCCTCAGTCCTGC3’配列番号17b6;5’ATGATATCCCATCCACGCTGTTTTGACA3’配列番号18尚、プライマーa6及びb6には、EcoRV制限酵素部位が付加されている。鋳型DNAは、クローニングベクターpCRB11及びpSELECTzeomcsインビトロジェン株式会社製を用いた。実際のPCRは、サーマルサイクラーGeneAmpPCRSystem9700を用い、反応試薬としてTaKaRaLATaqタカラバイオ株式会社製を用いて下記の条件で行った。以上を混合し、この50μlの反応液をPCRにかけた。クローニングベクターpCRB11配列を増幅する場合はプライマーとの組み合わせ、ゼオシン耐性遺伝子を増幅する場合はプライマーとの組み合わせで行った。以上を1サイクルとし、30サイクル行った。上記で生成した反応液10μlを08アガロースゲルにより電気泳動を行い、クローニングベクターpCRB11配列の場合約33kb、ゼオシン耐性遺伝子の場合約05kbのDNA断片が検出できた。上記のPCRにより増幅したクローニングベクターpCRB11を含む約33kbDNA断片10μl及びpSELECTzeomcsプラスミド由来ゼオシン耐性遺伝子を含む約05kbDNA断片10μlを各々制限酵素EcoRVで切断し、70°Cで10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4DNAリガーゼ10×緩衝液1μl、T4DNAリガーゼタカラバイオ株式会社製1unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μlにして、15°Cで3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションC液とした。得られたライゲーションC液を、塩化カルシウム法JournalofMolecularBiology53159によりエシェリヒアコリJM109を形質転換し、ゼオシン25μgmlを含むLB寒天培地1ポリペプトン、05酵母エキス、05塩化ナトリウム、および15寒天に塗布した。培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素EcoRVでそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、クローニングベクターpCRB11由来約33kbのDNA断片に加え、ゼオシン耐性遺伝子の場合、約05kbDNA断片が認められた。ゼオシン耐性遺伝子を含むクローニングベクターをpCRB15と命名した。クローニングベクターpCRB207の構築コリネバクテリウムグルタミカムR由来のグリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼglyceraldehyde3phosphatedehydrogenaseをコードするgapA遺伝子のプロモーター配列以降、PgapAと記すを含むDNA断片、及びクローニングベクターpKK2233ファルマシア社製由来rrnBT1T2双方向ターミネーター配列以降、ターミネーター配列と記すを含むDNA断片を以下の方法により増幅した。PCRに際して、PgapA配列及びターミネーター配列をそれぞれクローン化するべく、配列番号19PgapA配列、配列番号20ターミネーター配列を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。PgapA配列増幅用プライマーa7;5’CTCTGTCGACCCGAAGATCTGAAGATTCCTG3’配列番号21b7;5’CTCTGTCGACGGATCCCCATGGTGTGTCTCCTCTAAAGATTGTAGG3’配列番号22尚、プライマーa7には、SalI制限酵素部位が、プライマーb7には、SalI、BamHI及びNcoI制限酵素部位が付加されている。ターミネーター配列増幅用プライマーa8;5’CTCTGCATGCCCATGGCTGTTTTGGCGGATGAGAGA3’配列番号23b8;5’CTCTGCATGCTCATGAAAGAGTTTGTAGAAACGCAAAAAGG3配列番号24尚、プライマーa8には、SphI及びNcoI制限酵素部位が、プライマーb8には、SphI及びBspHI制限酵素部位が付加されている。鋳型DNAは、コリネバクテリウムグルタミカムRから抽出した染色体DNA及びpKK2233プラスミドファルマシア社製を用いた。実際のPCRは、サーマルサイクラーGeneAmpPCRSystem9700を用い、反応試薬としてTaKaRaLATaqタカラバイオ株式会社製を用いて下記の条件で行った。以上を混合し、この50μlの反応液をPCRにかけた。PgapA配列を増幅する場合はプライマーとの組み合わせ、ターミネーター配列を増幅する場合はプライマーとの組み合わせで行った。以上を1サイクルとし、30サイクル行った。上記で生成した反応液10μlを08アガロースゲルにより電気泳動を行い、PgapA配列の場合約06kb、ターミネーター配列の場合、約04kbのDNA断片が検出できた。上記のPCRにより増幅したコリネバクテリウムグルタミカムR由来PgapA配列を含む約06kbDNA断片10μlとクローニングベクターpCRB22約41kbを各々制限酵素SalIで切断し、70°Cで10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4DNAリガーゼ10×緩衝液1μl、T4DNAリガーゼタカラバイオ株式会社製1unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μlにして、15°Cで3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションD液とした。得られたライゲーションD液を、塩化カルシウム法JournalofMolecularBiology53159によりエシェリヒアコリJM109を形質転換し、カナマイシン50μgmlを含むLB寒天培地1ポリペプトン、05酵母エキス、05塩化ナトリウム、および15寒天に塗布した。培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素SalIでそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、クローニングベクターpCRB22約41kbのDNA断片に加え、PgapA配列の約06kbDNA断片が認められた。PgapA配列を含むクローニングベクターをpCRB206と命名した。上記PCRにより増幅したpKK2233プラスミド由来ターミネーター配列を含む約04kbDNA断片10μlを制限酵素NcoI及びBspHIで、上述のクローニングベクターpCRB2062μlを制限酵素NcoIで切断し、70°Cで10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4DNAリガーゼ10×緩衝液1μl、T4DNAリガーゼタカラバイオ株式会社製1unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μlにして、15°Cで3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションE液とした。得られたライゲーションE液を、塩化カルシウム法JournalofMolecularBiology53159によりエシェリヒアコリJM109を形質転換し、カナマイシン50μgmlを含むLB寒天培地1ポリペプトン、05酵母エキス、05塩化ナトリウム、および15寒天に塗布した。培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素で切断し、挿入断片を確認した。この結果、クローニングベクターpCRB206約47kbのDNA断片に加え、ターミネーター配列の約04kbDNA断片が認められた。rrnBT1T2ターミネーター配列を含むクローニングベクターをpCRB207と命名した。クローニングベクターpCRB209の構築コリネバクテリウムグルタミカムR由来のgapAglyceraldehyde3phosphatedehydrogenaseA遺伝子のプロモーター以降、PgapAと記す配列を含むDNA断片を以下の方法により増幅した。PCRに際して、pCRB207配列をクローン化するべく、配列番号25pCRB207を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。pCRB207配列増幅用プライマーa9;5’CTCTCATATGCTGTTTTGGCGGATGAGAG3’配列番号26b9;5’CTCTCATATGGTGTCTCCTCTAAAGATTGTAGG3’配列番号27尚、プライマーa9及びb9にはNdeI制限酵素部位が付加されている。鋳型DNAは、gapAプロモーター及びrrnBT1T2ターミネーター配列を含有するクローニングベクターpCRB207を用いた。実際のPCRは、サーマルサイクラーGeneAmpPCRSystem9700を用い、反応試薬としてTaKaRaLATaq宝酒造株式会社製を用いて下記の条件で行った。以上を混合し、この50μlの反応液をPCRにかけた。pCRB207配列を増幅する場合はプライマーとの組み合わせで行った。以上を1サイクルとし、30サイクル行った。上記で生成した反応液10μlを08アガロースゲルにより電気泳動を行い、クローニングベクターpCRB207配列を含む約51kbのDNA断片が検出できた。上記のPCRにより増幅したpCRB207由来遺伝子を含む約51kbDNA断片10μlを制限酵素NdeIで切断し、70°Cで10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、これにT4DNAリガーゼ10×緩衝液1μl、T4DNAリガーゼ宝酒造株式会社製1unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μlにして、15°Cで3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションF液とした。得られたライゲーションF液を、塩化カルシウム法JournalofMolecularBiology53159によりエシェリヒアコリJM109を形質転換し、カナマイシン50μgmlを含むLB寒天培地1ポリペプトン、05酵母エキス、05塩化ナトリウム、および15寒天に塗布した。この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素NdeIで切断し、制限酵素サイトの挿入を確認した。PgapA配列及びrrnBT1T2ターミネーター配列を含むクローニングベクタ-をpCRB209と命名した。クローニングベクターpCRB210の構築コリネバクテリウムグルタミカムR由来のgapAglyceraldehyde3phosphatedehydrogenaseA遺伝子のプロモーター以降、PgapAと記す配列を含むDNA断片を以下の方法により増幅した。PCRに際して、pCRB207配列をクローン化するべく、配列番号25pCRB207を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。pCRB207配列増幅用プライマーa10;5’CTCTGATATCCTGTTTTGGCGGATGAGAGA3’配列番号28b10;5’CTCTGATATCTCTCCTCTAAAGATTGTAGGAAATG3’配列番号29尚、プライマーa10及びb10にはEcoRV制限酵素部位が付加されている。鋳型DNAは、gapAプロモーター及びrrnBT1T2ターミネーター配列を含有するクローニングベクターpCRB207を用いた。実際のPCRは、サーマルサイクラーGeneAmpPCRSystem9700を用い、反応試薬としてTaKaRaLATaq宝酒造株式会社製を用いて下記の条件で行った。以上を混合し、この50μlの反応液をPCRにかけた。pCRB207配列を増幅する場合はプライマーとの組み合わせで行った。以上を1サイクルとし、30サイクル行った。上記で生成した反応液10μlを08アガロースゲルにより電気泳動を行い、クローニングベクターpCRB207配列を含む約51kbのDNA断片が検出できた。上記のPCRにより増幅したpCRB207由来遺伝子を含む約51kbDNA断片10μlを制限酵素EcoRVで切断し、70°Cで10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、これにT4DNAリガーゼ10×緩衝液1μl、T4DNAリガーゼ宝酒造株式会社製1unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μlにして、15°Cで3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションG液とした。得られたライゲーションG液を、塩化カルシウム法JournalofMolecularBiology53159によりエシェリヒアコリJM109を形質転換し、カナマイシン50μgmlを含むLB寒天培地1ポリペプトン、05酵母エキス、05塩化ナトリウム、および15寒天に塗布した。この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素EcoRVで切断し、制限酵素サイトの挿入を確認した。PgapA配列及びrrnBT1T2ターミネーター配列を含むクローニングベクターをpCRB210と命名した。フェノール生産遺伝子のクローニングコリネバクテリウムグルタミカム由来のフェノール生産遺伝子のクローニングコリネバクテリウムグルタミカム由来のDAHPシンテターゼをコードするaroG遺伝子、コリスミ酸ムターゼをコードするcsm遺伝子をそれぞれ含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。PCRに際して、aroG遺伝子及びcsm遺伝子をそれぞれクローン化するべく、配列番号30コリネバクテリウムグルタミカムaroG遺伝子及び配列番号31コリネバクテリウムグルタミカムcsm遺伝子を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライドバイオシステムズAppliedBiosystems社製394DNARNAシンセサイザーsynthesizerを用いて合成し、使用した。aroG遺伝子増幅用プライマーa11;5’CTCTCATATGAATAGGGGTGTGAGTTGG3’配列番号32b11;5’CTCTCATATGTTAATTACGCAGCATTTCTGCAACG3’配列番号33尚、プライマーa11及びb11には、NdeI制限酵素部位が付加されている。csm遺伝子増幅用プライマーa12;5’CTCTCATATGACTAATGCAGGTGACAACTTC3’配列番号34b12;5’CTCTCATATGTTATCCGAGCTTTCCGCG3’配列番号35尚、プライマーa12及びb12には、NdeI制限酵素部位が付加されている。パントエアアグロメランス由来のフェノール生産遺伝子のクローニングパントエアアグロメランス由来のチロシンフェノールリアーゼ活性を有する遺伝子をコードするtpl遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。PCRに際して、tpl遺伝子をクローン化するべく、配列番号36パントエアアグロメランスtpl遺伝子を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライドバイオシステムズAppliedBiosystems社製394DNARNAシンセサイザーsynthesizerを用いて合成し、使用した。tpl遺伝子増幅用プライマーa13;5’CTCTCATATGAACTATCCTGCCGAGC3’配列番号37b13;5’CTCTCATATGTTAAATAAAGTCAAAACGCGCAGTAAAG3’配列番号38尚、プライマーa13及びb13には、NdeI制限酵素部位が付加されている。シトロバクターブラッキー由来のフェノール生産遺伝子のクローニングシトロバクターブラッキー由来のチロシンフェノールリアーゼ活性を有する遺伝子をコードするtpl遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。PCRに際して、tpl遺伝子をクローン化するべく、配列番号39シトロバクターブラッキーtpl遺伝子を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライドバイオシステムズAppliedBiosystems社製394DNARNAシンセサイザーsynthesizerを用いて合成し、使用した。tpl遺伝子増幅用プライマーa14;5’CTCTTCATGAATTATCCGGCAGAACCC3’配列番号40b14;5’CTCTTCATGATTAGATATAGTCAAAGCGTGCAG3’配列番号41尚、プライマーa14及びb14には、BspHI制限酵素部位が付加されている。デスルフィトバクテリュームハフニエンス由来のフェノール生産遺伝子のクローニングデスルフィトバクテリュームハフニエンス由来のチロシンフェノールリアーゼ活性を有する遺伝子をコードするtpl遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。PCRに際して、tpl遺伝子をクローン化するべく、配列番号42デスルフィトバクテリュームハフニエンスtpl遺伝子を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライドバイオシステムズAppliedBiosystems社製394DNARNAシンセサイザーsynthesizerを用いて合成し、使用した。tpl遺伝子増幅用プライマーa15;5’CTCTGATATCATGAAAACCTATCCTGCAGAACC3’配列番号43b15;5’CTCTGATATCTCAAATGTGTTCAAATCTGGCGG3’配列番号44尚、プライマーa15及びb15には、EcoRV制限酵素部位が付加されている。クロロフレクサスオウランティアカス由来のフェノール生産遺伝子のクローニングクロロフレクサスオウランティアカス由来のチロシンフェノールリアーゼ活性を有する遺伝子をコードするtpl遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。PCRに際して、tpl遺伝子をクローン化するべく、配列番号45クロロフレクサスオウランティアカスtpl遺伝子を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライドバイオシステムズAppliedBiosystems社製394DNARNAシンセサイザーsynthesizerを用いて合成し、使用した。tpl遺伝子増幅用プライマーa16;5’CTCTCATATGCAGGAACAAGACTACCC3’配列番号46b16;5’CTCTCATATGTCATTCCACCGGTTCAAACC3’配列番号47尚、プライマーa16及びb16には、NdeI制限酵素部位が付加されている。ノストックパンクチフォルメ由来のフェノール生産遺伝子のクローニングノストックパンクチフォルメ由来のチロシンフェノールリアーゼ活性を有する遺伝子をコードするtpl遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。PCRに際して、tpl遺伝子をクローン化するべく、配列番号48ノストックパンクチフォルメtpl遺伝子を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライドバイオシステムズAppliedBiosystems社製394DNARNAシンセサイザーsynthesizerを用いて合成し、使用した。tpl遺伝子増幅用プライマーa17;5’CTCTCATATGACCGATGCCAAGCAAAC3’配列番号49b17;5’CTCTCATATGTTACTGCAATTCAAATCTTGCTTGAAAG3’配列番号50尚、プライマーa17及びb17には、NdeI制限酵素部位が付加されている。トレポネマデンティコラ由来のフェノール生産遺伝子のクローニングトレポネマデンティコラ由来のチロシンフェノールリアーゼ活性を有する遺伝子をコードするtpl遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。PCRに際して、tpl遺伝子をクローン化するべく、配列番号51トレポネマデンティコラtpl遺伝子を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライドバイオシステムズAppliedBiosystems社製394DNARNAシンセサイザーsynthesizerを用いて合成し、使用した。tpl遺伝子増幅用プライマーa18;5’CTCTCATATGGATATTAAAAATTATCCTGCGGAAC3’配列番号52b18;5’CTCTCATATGTTAGATATGCTCAAAGCGTGCC3’配列番号53尚、プライマーa18及びb18には、NdeI制限酵素部位が付加されている。鋳型DNAは、コリネバクテリウムグルタミカムは、コリネバクテリウムグルタミカムRから抽出した染色体DNAを用いた。パントエアアグロメランスは、NITEBiologicalResourceCenterNBRCより入手したパントエアアグロメランスNBRC12686から抽出した染色体DNAを用いた。シトロバクターブラッキーは、AmericanTypeCultureCollectionより入手したシトロバクターブラッキーATCC6750から抽出した染色体DNAを用いた。デスルフィトバクテリュームハフニエンスは、デスルフィトバクテリュームハフニエンスY51から抽出した染色体DNAを用いた。クロロフレクサスオウランティアカスは、AmericanTypeCultureCollectionより入手したクロロフレクサスオウランティアカスJ10f1ATCC29366から抽出した染色体DNAを用いた。ノストックパンクチフォルメは、AmericanTypeCultureCollectionより入手したノストックパンクチフォルメATCC29133から抽出した染色体DNAを用いた。トレポネマデンティコラは、JapanCollectionofMicroorganismsより入手したトレポネマデンティコラ染色体DNAcatalogNoRDB6217を用いた。実際のPCRは、サーマルサイクラーGeneAmpPCRSystem9700を用い、反応試薬としてTaKaRaLATaqタカラバイオ株式会社製を用いて下記の条件で行った。以上を混合し、この50μlの反応液をPCRにかけた。コリネバクテリウムグルタミカムaroG遺伝子を増幅する場合はプライマーとの組み合わせ、コリネバクテリウムグルタミカムcsm遺伝子を増幅する場合はプライマーと、パントエアアグロメランスtpl遺伝子を増幅する場合はプライマーとの組み合わせ、シトロバクターブラッキーtpl遺伝子を増幅する場合はプライマーとの組み合わせ、デスルフィトバクテリュームハフニエンスtpl遺伝子を増幅する場合はプライマーとの組み合わせ、クロロフレクサスオウランティアカスtpl遺伝子を増幅する場合はプライマーとの組み合わせ、ノストックパンクチフォルメtpl遺伝子を増幅する場合はプライマーとの組み合わせ、トレポネマデンティコラtpl遺伝子を増幅する場合はプライマーとの組み合わせで行った。以上を1サイクルとし、30サイクル行った。上記で生成した反応液10μlを08アガロースゲルにより電気泳動を行い、コリネバクテリウムグルタミカムaroG遺伝子の場合約14kb、コリネバクテリウムグルタミカムcsm遺伝子の場合約03kb、パントエアアグロメランスtpl遺伝子の場合約14kb、シトロバクターブラッキーtpl遺伝子の場合約14kb、デスルフィトバクテリュームハフニエンスtpl遺伝子の場合約14kb、クロロフレクサスオウランティアカスtpl遺伝子の場合約14kb、ノストックパンクチフォルメtpl遺伝子の場合約14kb、トレポネマデンティコラtpl遺伝子の場合約14kbのDNA断片が検出できた。フェノール生産遺伝子発現プラスミドの構築フェノール生産遺伝子のpCRB207へのクローニング上記項に示したPCRにより増幅したシトロバクターブラッキー株由来tpl遺伝子を含む約14kbDNA断片10μlを制限酵素BspHIで、PgapAプロモーターを含有するクローニングベクターpCRB2072μlを制限酵素NcoIで切断し、70°Cで10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4DNAリガーゼ10×緩衝液1μl、T4DNAリガーゼタカラバイオ株式会社製1unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μlにして、15°Cで3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションH液とした。得られたライゲーションH液を、塩化カルシウム法JournalofMolecularBiology53159によりエシェリヒアコリJM109を形質転換し、カナマイシン50μgmlを含むLB寒天培地1ポリペプトン、05酵母エキス、05塩化ナトリウム、および15寒天に塗布した。各々培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素でそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCRB207約51kbのDNA断片に加え、シトロバクターブラッキー株由来tpl遺伝子ライゲーションH液の場合、長さ約14kbの挿入断片が認められた。シトロバクターブラッキー株由来tpl遺伝子を含むプラスミドをpCRB207tplCBと命名した図3。フェノール生産遺伝子のpCRB209へのクローニング上記項に示したPCRにより増幅したコリネバクテリウムグルタミカム株由来aroG遺伝子を含む約14kbDNA断片、コリネバクテリウムグルタミカム株由来csm遺伝子を含む約03kbDNA断片、パントエアアグロメランス株由来tpl遺伝子を含む約14kbDNA断片、クロロフレクサスオウランティアカス株由来tpl遺伝子を含む約14kbDNA断片、ノストックパンクチフォルメ株由来tpl遺伝子を含む約14kbDNA断片及びトレポネマデンティコラ株由来tpl遺伝子を含む約14kbDNA断片10μl及びPgapAプロモーターを含有するクローニングベクターpCRB2092μlを各々制限酵素NdeIで切断し、70°Cで10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4DNAリガーゼ10×緩衝液1μl、T4DNAリガーゼタカラバイオ株式会社製1unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μlにして、15°Cで3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションI液、J液、K液、L液、M液及びN液とした。得られた6種のライゲーションI液、J液、K液、L液、M液及びN液それぞれを、塩化カルシウム法JournalofMolecularBiology53159によりエシェリヒアコリJM109を形質転換し、カナマイシン50μgmlを含むLB寒天培地1ポリペプトン、05酵母エキス、05塩化ナトリウム、および15寒天に塗布した。各々培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素でそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCRB209約51kbのDNA断片に加え、コリネバクテリウムグルタミカム株由来aroG遺伝子ライゲーションI液の場合、長さ約14kbの挿入断片が、コリネバクテリウムグルタミカム株由来csm遺伝子ライゲーションJ液の場合、長さ約03kbの挿入断片が、パントエアアグロメランス株由来tpl遺伝子ライゲーションK液の場合、長さ約14kbの挿入断片が、クロロフレクサスオウランティアカス株由来tpl遺伝子ライゲーションL液の場合、長さ約14kbの挿入断片が、ノストックパンクチフォルメ株由来tpl遺伝子ライゲーションM液の場合、長さ約14kbの挿入断片が、トレポネマデンティコラ株由来tpl遺伝子ライゲーションN液の場合、長さ約14kbの挿入断片が認められた。コリネバクテリウムグルタミカム株由来aroG遺伝子を含むプラスミドをpCRB209aroGCG、コリネバクテリウムグルタミカム株由来csm遺伝子を含むプラスミドをpCRB209csmCG、パントエアアグロメランス株由来tpl遺伝子を含むプラスミドをpCRB209tplPA、クロロフレクサスオウランティアカス株由来tpl遺伝子を含むプラスミドをpCRB209tplCA、ノストックパンクチフォルメ株由来tpl遺伝子を含むプラスミドをpCRB209tplNP、トレポネマデンティコラ株由来tpl遺伝子を含むプラスミドをpCRB209tplTDとそれぞれ命名した図3。フェノール生産遺伝子のpCRB210へのクローニング上記項に示したPCRにより増幅したデスルフィトバクテリュームハフニエンス株由来tpl遺伝子を含む約14kbDNA断片10μl及びPgapAプロモーターを含有するクローニングベクターpCRB2102μlを各々制限酵素EcoRVで切断し、70°Cで10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4DNAリガーゼ10×緩衝液1μl、T4DNAリガーゼタカラバイオ株式会社製1unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μlにして、15°Cで3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションO液とした。得られたライゲーションO液を、塩化カルシウム法JournalofMolecularBiology53159によりエシェリヒアコリJM109を形質転換し、カナマイシン50μgmlを含むLB寒天培地1ポリペプトン、05酵母エキス、05塩化ナトリウム、および15寒天に塗布した。各々培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素でそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCRB210約51kbのDNA断片に加え、デスルフィトバクテリュームハフニエンス株由来tpl遺伝子ライゲーションO液の場合、長さ約14kbの挿入断片が認められた。デスルフィトバクテリュームハフニエンス株由来tpl遺伝子を含むプラスミドをpCRB210tplDHと命名した図3。フェノール生産遺伝子のpCRB1へのクローニング上述のプラスミドpCRB209aroGCGを制限酵素BamHIで切断し、アガロース電気泳動後、アガロースゲルからQIAquickGelExtractionKit株式会社キアゲン社製によって回収したgapAプロモーターとコリネバクテリウムグルタミカム株由来aroG遺伝子及びターミネーター配列を連結した約24kbのDNA断片とBamHIで切断したクローニングベクターpCRB1NakataKetalVectorsforthegeneticsengineeringofcorynebacteriainSahaBCFermentationBiotechnologyACSSymposiumSeries862WashingtonAmericanChemicalSociety175191約41kbを70°Cで10分処理させることにより制限酵素を失活させたDNA断片を混合し、これにT4DNAリガーゼ10×緩衝液1μl、T4DNAリガーゼタカラバイオ株式会社製1unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μlにして、15°Cで3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションP液とした。得られたライゲーションP液を用い、塩化カルシウム法JournalofMolecularBiology53159によりエシェリヒアコリJM109を形質転換し、クロラムフェニコール50μgmlを含むLB寒天培地1ポリペプトン、05酵母エキス、05塩化ナトリウム、および15寒天に塗布した。この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素BamHIで切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCRB1約41kbのDNA断片に加え、コリネバクテリウムグルタミカム株由来aroG遺伝子ライゲーションP液の場合、長さ約24kbの挿入断片が認められた。コリネバクテリウムグルタミカム株由来aroG遺伝子を含むプラスミドをpCRB1aroGCGと命名した図4。フェノール生産遺伝子のpCRB15へのクローニング上述のプラスミドpCRB209csmCGを制限酵素BamHIで切断し、アガロース電気泳動後、アガロースゲルからQIAquickGelExtractionKit株式会社キアゲン社製によって回収したgapAプロモーターとコリネバクテリウムグルタミカム株由来csm遺伝子及びターミネーター配列を連結した約13kbのDNA断片とBamHIで切断した上述のプラスミドpCRB15約38kbを70°Cで10分処理させることにより制限酵素を失活させたDNA断片を混合し、これにT4DNAリガーゼ10×緩衝液1μl、T4DNAリガーゼタカラバイオ株式会社製1unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μlにして、15°Cで3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションQ液とした。得られたライゲーションQ液を用い、塩化カルシウム法JournalofMolecularBiology53159によりエシェリヒアコリJM109を形質転換し、ゼオシン25μgmlを含むLB寒天培地1ポリペプトン、05酵母エキス、05塩化ナトリウム、および15寒天に塗布した。この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素BamHIで切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCRB15約38kbのDNA断片に加え、コリネバクテリウムグルタミカム株由来csm遺伝子ライゲーションQ液の場合、長さ約13kbの挿入断片が認められた。コリネバクテリウムグルタミカム株由来csm遺伝子を含むプラスミドをpCRB15csmCGと命名した図4。コリネバクテリウムグルタミカムの染色体遺伝子破壊用プラスミドの構築コリネバクテリウムグルタミカム株pheA遺伝子破壊用プラスミドの構築コリネバクテリウムグルタミカム株の染色体上pheA遺伝子のマーカーレス破壊用プラスミドを構築するために必要なDNA断片を以下のPCR法により増幅した。PCRに際してコリネバクテリウムグルタミカムRの配列を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライドバイオシステムズAppliedBiosystems社製394DNARNAシンセサイザーsynthesizerを用いて合成し、使用した。pheA1領域増幅用プライマーa19;5’CTCTCTGCAGTGAAGTGCGTGTAAACGCAC3’配列番号54b19;5’GCTTAGCTAGTTGGTCGGTTGCAATGATTTGCACGTTGGAG3’配列番号55尚、プライマーa19には、PstI制限酵素部位が付加されている。pheA2領域増幅用プライマーa20;5’AACCGACCAACTAGCTAAGC3’配列番号56b20;5’CTCTTCTAGAAATTACTCCTGCCATGGCAG3’配列番号57尚、プライマーb20には、XbaI制限酵素部位が付加されている。鋳型DNAは、コリネバクテリウムグルタミカムRから抽出した染色体DNAを用いた。実際のPCRは、サーマルサイクラーGeneAmpPCRSystem9700を用い、反応試薬としてTaKaRaLATaqタカラバイオ株式会社製を用いて下記の条件で行った。以上を混合し、この50μlの反応液をPCRにかけた。pheA1領域を増幅する場合はプライマーとの組み合わせ、pheA2領域を増幅する場合はプライマーとで行った。以上を1サイクルとし、30サイクル行った。上記で生成した反応液10μlを08アガロースゲルにより電気泳動を行い、コリネバクテリウムグルタミカムコリpheA1領域の場合約09kb、pheA2領域の場合約08kbのDNA断片が検出できた。次に、上記のPCRにより増幅したpheA1領域断片とpheA2領域断片を1μlずつ混合し、PCRにより2種の断片の結合反応を行った。実際のPCRは、サーマルサイクラーGeneAmpPCRSystem9700を用い、反応試薬としてTaKaRaLATaqタカラバイオ株式会社製を用いて下記の条件で行った。以上を混合し、この50μlの反応液をPCRにかけた。pheA1領域断片とpheA2領域断片で行った。以上を1サイクルとし、30サイクル行った。さらに、得られたpheA1及びpheA2の結合断片を鋳型とし、PCRによりpheA欠失断片の増幅を行った。実際のPCRは、サーマルサイクラーGeneAmpPCRSystem9700を用い、反応試薬としてTaKaRaLATaqタカラバイオ株式会社製を用いて下記の条件で行った。以上を混合し、この50μlの反応液をPCRにかけた。pheA欠失断片を増幅する場合はプライマーとの組み合わせで行った。以上を1サイクルとし、30サイクル行った。上記で生成した反応液10μlを08アガロースゲルにより電気泳動を行い、pheA欠失断片約16kbが検出できた。上記のPCRにより増幅したコリネバクテリウムグルタミカムR由来pheA欠失配列約16kbDNA断片10μlと約44kbのマーカーレス染色体遺伝子導入用プラスミドpCRA725JMolMicrobiolBiotechnol、Vol8、243254、特開20061244402μlを各々制限酵素PstI及びXbaIで切断し、70°Cで10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4DNAリガーゼ10×緩衝液1μl、T4DNAリガーゼタカラバイオ株式会社製1unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μlにして、15°Cで3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションR液とした。得られたライゲーションR液を、塩化カルシウム法JournalofMolecularBiology53159によりエシェリヒアコリJM109を形質転換し、カナマイシン50μgmlを含むLB寒天培地1ポリペプトン、05酵母エキス、05塩化ナトリウム、および15寒天に塗布した。培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素PstI及びXbaIでそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCRA725約44kbのDNA断片に加え、コリネバクテリウムグルタミカム株由来pheA欠失遺伝子ライゲーションR液の場合、長さ約16kbの挿入断片が認められた。コリネバクテリウムグルタミカム株由来pheA欠失遺伝子を含むプラスミドをpCRA725pheACGと命名した。コリネバクテリウムグルタミカム株poxF遺伝子破壊用プラスミドの構築コリネバクテリウムグルタミカム株の染色体上poxF遺伝子のマーカーレス破壊用プラスミドを構築するために必要なDNA断片を以下のPCR法により増幅した。PCRに際してコリネバクテリウムグルタミカムRの配列を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライドバイオシステムズAppliedBiosystems社製394DNARNAシンセサイザーsynthesizerを用いて合成し、使用した。poxF1領域増幅用プライマーa21;5’CTCTTCTAGATACGTCCTAAACACCCGAC3’配列番号58b21;5’GACCAACCATTGCTGACTTGCGTATCCATAGTCAGGCTTC3’配列番号59尚、プライマーa21には、XbaI制限酵素部位が付加されている。poxF2領域増幅用プライマーa22;5’CAAGTCAGCAATGGTTGGTC3配列番号60b22;5’CTCTTCTAGATGATCAGTACCAAGGGTGAG3’を用い、反応試薬としてTaKaRaLATaqタカラバイオ株式会社製を用いて下記の条件で行った。以上を混合し、この50μlの反応液をPCRにかけた。poxF1領域を増幅する場合はプライマーとの組み合わせ、poxF2領域を増幅する場合はプライマーとで行った。以上を1サイクルとし、30サイクル行った。上記で生成した反応液10μlを08アガロースゲルにより電気泳動を行い、コリネバクテリウムグルタミカムpoxF1領域の場合約08kb、poxF2領域の場合約08kbのDNA断片が検出できた。次に、上記のPCRにより増幅したpoxF1領域断片とpoxF2領域断片を1μlずつ混合し、PCRにより2種の断片の結合反応を行った。実際のPCRは、サーマルサイクラーGeneAmpPCRSystem9700を用い、反応試薬としてTaKaRaLATaqタカラバイオ株式会社製を用いて下記の条件で行った。以上を混合し、この50μlの反応液をPCRにかけた。poxF1領域断片とpoxF2領域断片で行った。以上を1サイクルとし、30サイクル行った。さらに、得られたpoxF1及びpoxF2の結合断片を鋳型とし、PCRによりpoxF欠失断片の増幅を行った。実際のPCRは、サーマルサイクラーGeneAmpPCRSystem9700を用い、反応試薬としてTaKaRaLATaqタカラバイオ株式会社製を用いて下記の条件で行った。以上を混合し、この50μlの反応液をPCRにかけた。poxF欠失断片を増幅する場合はプライマーとの組み合わせで行った。以上を1サイクルとし、30サイクル行った。上記で生成した反応液10μlを08アガロースゲルにより電気泳動を行い、poxF欠失断片約16kbが検出できた。上記のPCRにより増幅したコリネバクテリウムグルタミカムR由来poxF欠失配列約17kbDNA断片10μlと約44kbのマーカーレス染色体遺伝子導入用プラスミドpCRA725JMolMicrobiolBiotechnol、Vol8、243254、特開20061244402μlを各々制限酵素XbaIで切断し、70°Cで10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4DNAリガーゼ10×緩衝液1μl、T4DNAリガーゼタカラバイオ株式会社製1unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μlにして、15°Cで3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションS液とした。得られたライゲーションS液を、塩化カルシウム法JournalofMolecularBiology53159によりエシェリヒアコリJM109を形質転換し、カナマイシン50μgmlを含むLB寒天培地1ポリペプトン、05酵母エキス、05塩化ナトリウム、および15寒天に塗布した。培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素XbaIでそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCRA725約44kbのDNA断片に加え、コリネバクテリウムグルタミカム株由来pheA欠失遺伝子ライゲーションS液の場合、長さ約17kbの挿入断片が認められた。コリネバクテリウムグルタミカム株由来poxF欠失遺伝子を含むプラスミドをpCRA725poxFCGと命名した。副生経路及びフェノール分解に関わる遺伝子破壊株の構築マーカーレス染色体遺伝子導入用ベクターpCRA725は、コリネバクテリウムグルタミカムR内で複製不能なプラスミドである。pCRA725pheACGを用いて、電気パルス法AgricBiolChem、Vol54、443447及びResMicrobiol、Vol144、181185により、コリネバクテリウムグルタミカムRを形質転換し、カナマイシン50μgmlを含むA寒天培地A液体培地、および15寒天に塗布した。上記の培地で得られた一重交叉株を、10スクロース含有BT寒天培地2CO2g、2SO47g、KH2PO405g、K2HPO405g、MgSO47H2O05g、006Fe2SO47H2O0042MnSO42H2O1ml、002biotinsolution1ml、001thiaminsolution2mlを蒸留水1Lに溶解、および15寒天に塗付した。プラスミドpCRA725pheACGが染色体上の相同領域との一重交叉株の場合、pCRA725pheACG上のカナマイシン耐性遺伝子の発現によるカナマイシン耐性と、バチラスサブチリスBacillussubtilisのsacRsacB遺伝子の発現によるスクロース含有培地での致死性を示すのに対し、二重交叉株の場合、pCRA725pheACG上のカナマイシン耐性遺伝子の脱落によるカナマイシン感受性と、sacRsacB遺伝子の脱落によるスクロース含有培地での生育性を示す。従って、マーカーレス染色体遺伝子破壊株は、カナマイシン感受性及びスクロース含有培地生育性を示す。そこで、カナマイシン感受性及びスクロース含有培地生育性を示した株を選択した。このコリネバクテリウムグルタミカムR株pheA遺伝子マーカーレス破壊株をコリネバクテリウムグルタミカムCorynebacteriumglutamicumPHE1と命名した表1。同様に、上記5で構築した、コリネバクテリウムグルタミカムR株においてフェノール2モノオキシゲナーゼ活性を有する酵素をコードするpoxF遺伝子マーカーレス破壊用プラスミドpCRA725poxFCGを用いて電気パルス法AgricBiolChem、Vol54、443447及びResMicrobiol、Vol144、181185により、コリネバクテリウムグルタミカムΔpheA株を形質転換し、カナマイシン50μgmlを含むA寒天培地に塗布した。上記の培地で得られた一重交叉株を、10スクロース含有BT寒天培地に塗付しカナマイシン感受性及びスクロース含有培地生育性を選択した。この得られたpheA遺伝子及びpoxF遺伝子マーカーレス破壊株をコリネバクテリウムグルタミカムCorynebacteriumglutamicumPHE2と命名した表1。チロシンフェノールリアーゼ活性を有するtpl酵素遺伝子導入株の構築上述のプラスミド6種類pCRB209tplPA、pCRB207tplCB、pCRB210tplDH、pCRB209tplCA、pCRB209tplNP及びpCRB209tplTDを用いて、電気パルス法AgricBiolChem、Vol54、443447及びResMicrobiol、Vol144、181185により、コリネバクテリウムグルタミカムR株を形質転換し、カナマイシン50μgmlを含むA寒天培地に塗布した。この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素で切断し、挿入断片を確認した。この結果、上記で作製のプラスミドpCRB209tplPA、pCRB207tplCB、pCRB210tplDH、pCRB209tplCA、pCRB209tplNP及びpCRB209tplTDの導入が認められた。得られた株をコリネバクテリウムグルタミカムCorynebacteriumglutamicumRpCRB209tplPA、RpCRB207tplCB、RpCRB210tplDH、RpCRB209tplCA、RpCRB209tplNP及びRpCRB209tplTDと命名した。フェノール生産遺伝子導入株の構築上述のプラスミドpCRB209tplPAを用いて、電気パルス法AgricBiolChem、Vol54、443447及びResMicrobiol、Vol144、181185により、コリネバクテリウムグルタミカムR株を形質転換し、カナマイシン50μgmlを含むA寒天培地に塗布した。この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素で切断し、挿入プラスミドを確認した。この結果、上記で作製のプラスミドpCRB209tplPAの導入が認められた。得られた株をコリネバクテリウムグルタミカムCorynebacteriumglutamicumPHE3と命名した。また、上述のプラスミドpCRB209tplPA及びpCRB1aroGCGを用いて、電気パルス法AgricBiolChem、Vol54、443447及びResMicrobiol、Vol144、181185により、コリネバクテリウムグルタミカムR株を形質転換し、カナマイシン50μgml及びクロラムフェニコール5μgmlを含むA寒天培地に塗布した。尚、これら2種類のプラスミドは、コリネバクテリウムグルタミカム内で共存可能なプラスミドである。この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素で切断し、挿入断片を確認した。この結果、上記で作製のプラスミドpCRB209tplPA及びpCRB1aroGCGの導入が認められた。得られた株をコリネバクテリウムグルタミカムCorynebacteriumglutamicumPHE4と命名した。上述のプラスミドpCRB209tplPA、pCRB1aroGCG及びpCRB15csmCGを用いて、電気パルス法AgricBiolChem、Vol54、443447及びResMicrobiol、Vol144、181185により、コリネバクテリウムグルタミカムR株を形質転換し、カナマイシン50μgml、クロラムフェニコール5μgml及びゼオシン25μgmlを含むA寒天培地に塗布した。尚、これら3種類のプラスミドは、コリネバクテリウムグルタミカム内で共存可能なプラスミドである。この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素で切断し、挿入断片を確認した。この結果、上記で作製のプラスミドpCRB209tplPA、pCRB1aroGCG及びpCRB15csmCGの導入が認められた。得られた株をコリネバクテリウムグルタミカムCorynebacteriumglutamicumPHE5と命名した。尚、本株の遺伝子組換えの概要は、表2にまとめて示した。表2内の表示の略語は以下の通り<遺伝子起源略語>PA;パントエアアグロメランスCG;コリネバクテリウムグルタミカムR副生経路及びフェノール分解遺伝子破壊株へのフェノール生産遺伝子の導入上述のプラスミドpCRB209tplPA、pCRB1aroGCG及びpCRB15csmCGを用いて、電気パルス法AgricBiolChem、Vol54、443447及びResMicrobiol、Vol144、181185により、コリネバクテリウムグルタミカムPHE1ΔpheA株、及びPHE2ΔpheAΔpoxF株を形質転換し、カナマイシン50μgml、クロラムフェニコール5μgml及びゼオシン25μgmlを含むA寒天培地に塗布した。尚、これら3種類のプラスミドは、コリネバクテリウムグルタミカム内で共存可能なプラスミドである。この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素で切断し、挿入断片を確認した。この結果、上記で作製のプラスミドpCRB209tplPA、pCRB1aroGCG及びpCRB15csmCGの導入が認められた。PHE1ΔpheA株に導入した株をコリネバクテリウムグルタミカムCorynebacteriumglutamicumPHE6、PHE2ΔpheAΔldhA株に導入した株をコリネバクテリウムグルタミカムCorynebacteriumglutamicumPHE7と命名した。尚、本株の遺伝子組換えの概要は、表6にまとめて示した。コリネバクテリウムグルタミカムCorynebacteriumglutamicumPHE7は、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足258郵便番号2920818の独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託した受託日:2011年8月12日、受託番号:NITEBP976原寄託の受託日:2010年8月31日、受託番号:NITEP976。表内の表示の略語は以下の通り<遺伝子起源略語>PA;パントエアアグロメランスCG;コリネバクテリウムグルタミカムR実施例3tpl遺伝子導入株におけるチロシンフェノールリアーゼ活性測定チロシンフェノールリアーゼの活性測定実施例2において構築したチロシンフェノールリアーゼ遺伝子を導入したコリネバクテリウムグルタミカムRpCRB209tplPA、RpCRB207tplCB、RpCRB210tplDH、RpCRB209tplCA、RpCRB209tplNP及びRpCRB209tplTDを、カナマイシン50μgml含むA寒天培地2CO2g、2SO47g、KH2PO405g、K2HPO405g、MgSO47H2O05g、006Fe2SO47H2O0042MnSO42H2O1ml、002biotinsolution1ml、001thiaminsolution2ml、yeastextract2g、vitaminassaycasaminoacid7g、glucose40g、寒天15gを蒸留水1Lに懸濁に塗布し、28°C、20時間暗所に静置した。上記のプレートで生育した各コリネバクテリウムグルタミカムチロシンフェノールリアーゼ遺伝子導入株を、カナマイシン50μgmlを含むA液体培地2CO2g、2SO47g、KH2PO405g、K2HPO405g、MgSO47H2O05g、006Fe2SO47H2O0042MnSO42H2O1ml、002biotinsolution1ml、001thiaminsolution2ml、yeastextract2g、vitaminassaycasaminoacid7g、glucose40gを蒸留水1Lに溶解10mlの入った試験管に一白金耳植菌し、33°Cにて16時間、好気的に振盪培養を行った。上記条件で生育したチロシンフェノールリアーゼ遺伝子導入株を、カナマイシン50μgmlを含有したA液体培地100mlに植菌し、33°Cにて16時間、好気的に振盪培養を行った。コリネバクテリウムグルタミカムRは、A培地にカナマイシンを添加しないこと以外は同様の条件にて培養した。このようにして培養増殖されたそれぞれの菌体を、遠心分離により回収した。ガラスビーズで菌体細胞を破砕した後、遠心分離によって得た細胞破砕上清を粗酵素液として用い、以下の方法によりTpl活性を測定した。50mMリン酸カリウムバッファーpH8025mMLTyr01mMピリドキサールリン酸20グリセロール、粗酵素液を混合し、30°C、30分間反応を行った。反応停止は06N塩酸終濃度添加により行った。これをフィルターろ過後、生じたフェノールはHPLCで分析、定量したCosmosilC18ARII移動相20MeOH007過塩素酸。酵素反応により生じたフェノールと、酵素比活性を表4に示した。この結果、コリネバクテリウムグルタミカムで発現させたパントエアアグロメランス株由来tpl遺伝子、シトロバクターブラッキー株由来tpl遺伝子及びデスルフィトバクテリュームハフニエンス株由来tpl遺伝子は特に高い活性を示し、クロロフレクサスオウランティアカス株由来tpl遺伝子、ノストックパンクチフォルメ株由来tpl遺伝子、トレポネマデンティコラ株由来tpl遺伝子についても活性が認められた。実施例4コリネバクテリウムグルタミカムフェノール生産遺伝子導入株のフェノール生成実験フェノール生産遺伝子であるチロシンフェノールリアーゼ酵素活性を有する酵素をコードするパントエアアグロメランスのtpl遺伝子、DAHPシンテターゼをコードするコリネバクテリウムグルタミカムのaroG遺伝子、コリスミン酸ムターゼをコードするコリネバクテリウムグルタミカムのcsm遺伝子の効果を調べる為に、コリネバクテリウムグルタミカムR株に各遺伝子を順番に積み重ねて導入し、フェノールの生産比較を行った。実施例2で構築した表2参照PHE3、PHE4tpl遺伝子及びaroG遺伝子導入及びPHE5tpl遺伝子、aroG遺伝子及びcsm遺伝子導入株を、PHE3株はカナマイシン50μgml、PHE4株はカナマイシン50μgml及びクロラムフェニコール5μgml、PHE5株はカナマイシン50μgml、クロラムフェニコール5μgml及びゼオシン25μgmlを含むA寒天培地2CO2g、2SO47g、KH2PO405g、K2HPO405g、MgSO47H2O05g、006Fe2SO47H2O0042MnSO42H2O1ml、002biotinsolution1ml、001thiaminsolution2ml、yeastextract2g、vitaminassaycasaminoacid7g、glucose40g、寒天15gを蒸留水1Lに懸濁に塗布し、28°C、20時間暗所に静置した。上記のプレートで生育したコリネバクテリウムグルタミカム単一遺伝子導入株を、各抗生物質を含むA液体培地2CO2g、2SO47g、KH2PO405g、K2HPO405g、MgSO47H2O05g、006Fe2SO47H2O0042MnSO42H2O1ml、002biotinsolution1ml、001thiaminsolution2ml、yeastextract2g、vitaminassaycasaminoacid7g、glucose40gを蒸留水1Lに溶解10mlの入った試験管に一白金耳植菌し、28°Cにて15時間、好気的に振盪培養を行った。上記条件で生育したフェノール生産遺伝子導入株を、各抗生物質を含むA液体培地100mlに植菌し、33°Cにて24時間、好気的に振盪培養を行った。フェノールの定量は、サンプリングした反応液を遠心分離4°C、15000×g、10分し、得られた上清液を液体クロマトグラフィーで分析することにより行った。結果を以下の表5に示す。コリネバクテリウムグルタミカムPHE3は、24時間後に01mMのフェノールを、コリネバクテリウムグルタミカムPHE4は、24時間後に04mMのフェノールを、コリネバクテリウムグルタミカムPHE5は、24時間後に09mMのフェノールを培養液中に生産していた。すなわち、tpl遺伝子の導入によりグルコースからフェノール生成を可能とし、aroG遺伝子及びcsm遺伝子の導入による代謝改変により、フェノール生成量の増大を達成した。表内の表示の略語は以下の通り<遺伝子起源略語>PA;パントエアアグロメランスCG;コリネバクテリウムグルタミカムR実施例5フェノール生産遺伝子を導入した、副生経路及びフェノール分解遺伝子破壊株のフェノール生成実験実施例2において構築したフェノール生産遺伝子発現プラスミドpCRB209tplPA、pCRB1aroGCG及びpCRB15csmCGを導入したコリネバクテリウムグルタミカム染色体遺伝子マーカーレス破壊株PHE6、及びPHE7株を、カナマイシン50μgml、クロラムフェニコール5μgml及びゼオシン25μgml含むA寒天培地2CO2g、2SO47g、KH2PO405g、K2HPO405g、MgSO47H2O05g、006Fe2SO47H2O0042MnSO42H2O1ml、002biotinsolution1ml、001thiaminsolution2ml、yeastextract2g、vitaminassaycasaminoacid7g、glucose40g、寒天15gを蒸留水1Lに懸濁に塗布し、28°C、20時間暗所に静置した。上記のプレートで生育したフェノール生産遺伝子導入株を、カナマイシン50μgml、クロラムフェニコール5μgml及びゼオシン25μgmlを含むA液体培地2CO2g、2SO47g、KH2PO405g、K2HPO405g、MgSO47H2O05g、006Fe2SO47H2O0042MnSO42H2O1ml、002biotinsolution1ml、001thiaminsolution2ml、yeastextract2g、vitaminassaycasaminoacid7g、glucose40gを蒸留水1Lに溶解10mlの入った試験管に一白金耳植菌し、33°Cにて16時間、好気的に振盪培養を行った。上記条件で生育したフェノール生産遺伝子導入株を、カナマイシン50μgml、クロラムフェニコール5μgml及びゼオシン25μgmlを含有したA液体培地100mlに植菌し、33°Cにて24時間、好気的に振盪培養を行った。フェノールの定量は、サンプリングした反応液を遠心分離4°C、15000Xg、10分し、得られた上清液を液体クロマトグラフィーで分析することにより行った。この結果、24時間後に、コリネバクテリウムグルタミカム野生株を宿主としたPHE5は、24時間後に09mMのフェノールを生成したのに対して、pheA遺伝子を破壊したコリネバクテリウムグルタミカムを宿主としたPHE6は、58mMのフェノールを、pheA及びpoxF遺伝子を破壊したコリネバクテリウムグルタミカムを宿主としたPHE7は、69mMのフェノールを生成していた。すなわち、フェニールアラニンへの副生経路を遮断したpheA遺伝子破壊、及びフェノールの分解経路を遮断したpoxF遺伝子破壊による代謝工学的改変により、順次フェノール生産性の向上が達成された。表内の表示の略語は以下の通り<遺伝子起源略語>PA;パントエアアグロメランスCG;コリネバクテリウムグルタミカム実施例6コリネバクテリウムグルタミカムPHE7を用いた還元条件下におけるフェノール生成実験実施例2で創製したコリネバクテリウムグルタミカムPHE7フェノール生成株を、カナマイシン50μgml、クロラムフェニコール5μgml及びゼオシン25μgmlを含有したA寒天培地に塗布し、28°C、20時間暗所に静置した。上記のプレートで生育したコリネバクテリウムグルタミカムPHE7フェノール生成株を、カナマイシン50μgml、クロラムフェニコール5μgml及びゼオシン25μgmlを含有したA液体培地10mlの入った試験管に一白金耳植菌し、28°Cにて15時間、好気的に振盪培養を行った。上記条件で生育したコリネバクテリウムグルタミカムPHE7フェノール生成株を、カナマイシン50μgml、クロラムフェニコール5μgml及びゼオシン25μgmlを含有したA液体培地500mlの入った容量2Lの三角フラスコに植菌し、28°Cにて15時間、好気的に振盪培養を行った。このようにして培養増殖されたそれぞれの菌体は、遠心分離により菌体を回収した。得られた菌体を、終濃度OD61035となるようにBT液体培地07硫酸アンモニウム、005リン酸二水素カリウム、005リン酸水素二カリウム、005硫酸マグネシウム7水和物、00006硫酸鉄7水和物、000042硫酸マンガン水和物、000002ビオチン、000002チアミン塩酸塩に懸濁した。このそれぞれの菌体懸濁液60mlを容量100mlメディウム瓶に入れ、還元条件下酸化還元電位;450mV、グルコースを8となるように添加し、33°Cに保った水浴中で攪拌しながら反応させた。この時、反応液のpHが70を下回らないように25Nのアンモニア水を用いてpHコントローラーし、得られた上清液を用いてフェノールの定量を行った。この結果、コリネバクテリウムグルタミカムPHE7フェノール生成株は、還元条件下における反応において、好気培養と比較して高い生産性を示し、24時間後に113mMのフェノールを生成していた。"