"KLHに結合したTNFαを含み、前記TNFαが強力に不活性化されているこれは、100ng/mlの濃度の前記製品が試験Aの条件で、30未満の細胞溶解活性および/または15000を超える不活性化係数を示すことを意味する免疫原性製品。前記製品は長期間不活性化されたままであるこれは、100ng/mlの濃度の前記製品が試験Bの条件で、80未満の細胞溶解活性および/または500を超える不活性化係数を示すことを意味する、請求項1に記載の免疫原性製品。前記製品は、300kDaを超える遊離TNFαホモポリマーを含んでいてもよく、かつ前記製品が300kDaを超える遊離TNFαホモポリマーを含む場合、300kDaを超える遊離TNFαホモポリマーの割合は、試験Cで測定した場合に総TNFαの30w/w未満である、請求項1または請求項2に記載の免疫原性製品。前記製品は凍結乾燥されている、請求項1~3のいずれか1項に記載の免疫原性製品。請求項1~4のいずれか1項に記載の製品、油および界面活性剤またはそれらの混合物を含む免疫原性乳濁液であって、前記乳濁液は油中水型エマルションまたは水中油型エマルションであり、前記油、前記界面活性剤および/または油および界面活性剤の混合物は医薬的に許容される賦形剤である免疫原性乳濁液。油とアジュバント好ましくはISA51である界面活性剤との混合物を含む、請求項5に記載の免疫原性乳濁液。請求項1~4に記載の免疫原性製品または請求項5または6のいずれか1項に記載の乳濁液を含むワクチン組成物。KLHに結合したTNFαを含み、前記TNFαは強力に不活性化されているこれは、100ng/mlの濃度の前記製品が試験Aの条件で、30未満の細胞溶解活性を示すことを意味する製品の調製方法であって、ai精製されたTNFα、ii精製されたキーホールリンペットヘモシアニンおよびiiiグルタルアルデヒドを一緒に混合する工程と、b10kDa未満の分子量を有する化合物を除去する工程と、を含み、工程bの後に、c少なくとも60mMで少なくとも240時間~少なくとも120mMで少なくとも144時間の範囲の濃度/時間反応条件でホルムアルデヒドを添加する工程、di還元剤ならびにiiリジン、グリシンおよびそれらの混合物からなる群から選択されるアミノ酸から選択される失活化合物を添加して、ホルムアルデヒドとの反応を遮断する工程、e前記免疫原性製品を回収する工程、を行うことを特徴とする方法。工程aにおいて、グルタルアルデヒドを、1~50mMの濃度で110分超~400分未満、好ましくは25mMで240分間添加する、請求項8に記載の方法。工程cにおいて、ホルムアルデヒドを、少なくとも200mMの濃度で少なくとも240時間、好ましくは220~270mMで少なくとも300時間添加する、請求項8または請求項9に記載の方法。失活化合物、好ましくはi還元剤ならびにiiリジン、グリシンおよびそれらの混合物からなる群から選択されるアミノ酸から選択される失活化合物を添加して、グルタルアルデヒドとの反応を停止させる、請求項8~10のいずれか1項に記載の方法。工程fでの回収前に、300kDa未満の分子量を有する物質を除去する、請求項8~11のいずれか1項に記載の方法。KLHに結合したTNFαを含み、前記TNFαは強力に不活性化されているこれは、100ng/mlの濃度の前記製品が試験Aの条件で、30未満の細胞溶解活性を示すことを意味する製品の調製方法であって、ai精製されたTNFα、ii精製されたキーホールリンペットヘモシアニンおよびiiiグルタルアルデヒドを一緒に混合する工程と、b10kDa未満の分子量を有する化合物を除去する工程と、c少なくとも60mMで少なくとも144時間~少なくとも250mMで少なくとも96時間の範囲の濃度/時間反応条件でホルムアルデヒドを添加する工程と、を含み、工程aにおいて、少なくとも20mMの濃度で18時間を超える期間にわたってグルタルアルデヒドを添加し、失活化合物、好ましくはi還元剤ならびにiiリジン、グリシンおよびそれらの混合物からなる群から選択されるアミノ酸から選択される失活化合物を添加して、グルタルアルデヒドとの反応を停止させた後、前記製品を回収することを特徴とする方法。工程b後であって前記製品の回収前に、少なくとも250mMで少なくとも4日間の濃度/時間反応条件でホルムアルデヒドを添加し、次いで、i還元剤ならびにiiリジン、グリシンおよびそれらの混合物からなる群から選択されるアミノ酸から選択される失活化合物を添加して、ホルムアルデヒドとの反応を遮断する、請求項13に記載の方法。前記製品の回収前に、少なくとも100kDa好ましくは300kDaのカットオフ値を有する濾過膜を用いるタンジェンシャルフロー濾過工程を行う、請求項13または請求項14に記載の方法。TNFαの過剰産生に関連する疾患の予防または治療に使用される、それを必要としているヒトを含む動物に投与する工程を含む、請求項7に記載のワクチン組成物。TNFαの過剰産生に関連する前記疾患は、強直性脊椎炎、乾癬、関節リウマチ、若年性特発性関節炎、炎症性腸疾患、クローン病、悪液質および癌からなる群から選択される、請求項16に記載のワクチン組成物。請求項1~4に記載の免疫原性製品を含む少なくとも1つのバイアル、注射用水を含む少なくとも1つのバイアルおよびアジュバントを含む少なくとも1つのバイアル、ならびに水溶液を得るために前記免疫原性製品と前記水とを混合する手段、前記溶液を前記アジュバントと接触させる手段および前記水溶液と前記アジュバントとの混合物を乳化させる手段とを含み、少なくとも1本の針をさらに含むキット。請求項1~4に記載の免疫原性製品、請求項5または6のいずれか1項に記載の乳濁液または請求項7に記載のワクチン組成物を含む医療機器。従って、第1の態様では、本発明は、TNFαが強力に不活性化されているこれは、本製品が後述する試験Aの条件で、30未満、好ましくは25未満、より好ましくは20未満、より好ましくは15未満、さらにより好ましくは10未満の細胞溶解活性を示すことを意味する、KLHに結合したTNFαを含む免疫原性製品、油および界面活性剤と組み合わせた前記製品を含む乳濁液、ならびに前記乳濁液または前記製品を含むワクチン組成物を含む。一実施形態では、後述する試験Aの条件で、濃度が100ng/mlである本発明の免疫原性製品の細胞溶解活性を測定する。本明細書に使用されているTNFαは、哺乳類の生物体に由来する任意のTNFαを包含する。哺乳類のTNFαは、ヒトTNFα、ウマTNFα、ネコTNFα、イヌTNFα、ウシTNFα、ヒツジTNFαおよびヤギTNFαを包含し、それらは全て当業者によく知られており、それらをコードする対応するアミノ酸配列および核酸配列は、様々な核酸およびアミノ酸配列のデータベースなどに長年一般公開されている。例示として、ヒトTNFαジェンバンク登録番号:CAA26669、マウスTNFαジェンバンク登録番号:CAA68530、イヌTNFαジェンバンク登録番号:ABJ51909、ウマTNFαNCBI登録番号:NP-001075288、ネコTNFαNCBI登録番号:NP-001009835、雄ウシTNFαNCBI登録番号:NP-776391、ブタTNFαNCBI登録番号:NP-001166496、ヤギTNFαNCBI登録番号:AAF87741、ラットTNFαNCBI登録番号:NP036807、ヒツジTNFαNCBI登録番号:NP-001020031を含む様々な哺乳類のTNFαのアミノ酸配列が、ジェンバンクのデータベースおよびNCBI国立バイオテクノロジー情報センターのデータベースで照会される。一実施形態によれば、TNFαはヒトTNFα分子である。ヒトTNFαは、約17kDa17.35kDaの3つのTNFα分子の会合により形成されたホモ三量体のTNFα分子からなる。本発明によれば、試験Aを使用して、本発明の製品におけるヒトTNFαの生理活性の不活性化率を測定する。この試験は、アクチノマイシンDの存在下でヒトTNFαによって誘導されるマウスL929細胞の細胞溶解に基づく。この試験は、T0すなわち本製品が液状であって製造後10日未満の間4°Cで保存された状態で行う。以下の方法に従って試験Aを行う:L929マウス線維芽細胞Sigma社製No.85011425を、1.5×104/cm2で、培地10FBSSigma社製F7524、2mMのグルタミンSigma社製G7513、100U/mlのペニシリン/ストレプトマイシンSigma社製P0781および1mMのピルビン酸ナトリウムSigma社製S8636を添加したDMEMCambrex社製BE12604Fに播種し、37°Cおよび5CO2で2日間培養して、サブコンフルエントな単層を得る。次いで、L929細胞を回収し、2×104細胞/ウェルで、96ウェル平底培養プレート内の100μlの平板培地2FBS、2mMのグルタミン、100U/mlのペニシリン/ストレプトマイシンおよび1mMのピルビン酸ナトリウムを添加したDMEMF12Cambrex社製BE12719Fに播種し、37°Cおよび5CO2で21±1時間培養する。60μlのアッセイ培地2mMのグルタミン、100U/mlのペニシリン/ストレプトマイシンおよび1mMのピルビン酸ナトリウムを添加したHL1Cambrex社製US77201に希釈した6400ng/mlのTNFα当量の本発明の製品120μlから本発明の製品の10段階の2倍希釈系列を調製する。使用する濃度単位は、TNFα当量濃度実施例3またはBCA試験を用いて測定した総タンパク質実施例13であってもよい。一実施形態では、1μgのTNFα当量濃度は、BCA試験を用いて測定した1~5μgの総タンパク質に相当し、好ましくはBCA試験を用いて測定した1.5~2.4μgの総タンパク質に相当する。一実施形態では、1μgのTNFα当量濃度は、BCA試験を用いて測定した1.5μgの総タンパク質に相当する。別の実施形態では、1μgのTNFα当量濃度は、BCA試験を用いて測定した2.4μgの総タンパク質に相当する。一実施形態では、本製品の調製方法において、濾過膜を用いるタンジェンシャルフロー濾過の第1の工程が10kDaのカットオフ値を有し、かつ濾過膜を用いるタンジェンシャルフロー濾過の第2の工程が10kDaのカットオフ値を有する場合、1μgのTNFα当量濃度は、BCA試験を用いて測定した1.5μgの総タンパク質に相当する。別の実施形態では、本製品の調製方法において、濾過膜を用いるタンジェンシャルフロー濾過の第1の工程が10kDaのカットオフ値を有し、かつ濾過膜を用いるタンジェンシャルフロー濾過の第2の工程が300kDaのカットオフ値を有する場合、1μgのTNFα当量濃度は、BCA試験を用いて測定した2.4μgの総タンパク質に相当する。BCAタンパク質アッセイは、総タンパク質の比色検出および定量のためのビシンコニン酸BCAに基づく界面活性剤適合処方である。この方法は、アルカリ性媒体中のタンパク質によるCu2からCu1への周知の還元ビウレット反応を、ビシンコニン酸を含有する珍しい試薬を用いる銅IのカチオンCu1の高感度かつ高選択的な比色検出と組み合わせたものである。このアッセイの紫色の反応生成物は、BCAの2つの分子を1つの銅Iイオンでキレート化することにより生成される。この水溶性複合体は、562nmで、20~2000μg/mlの広い測定範囲にわたるタンパク質濃度の増加に比例する強い吸光度を示す。TNFα当量濃度単位により、細胞バイオアッセイおよびTNFαショックモデルで生体内において、同じTNFα含有量を有する異なるバッチを比較することができる。TNFα当量濃度は、以下のように求められる:[TNFα当量濃度]=プロセスの開始時におけるTNFαの量-10。300kDaのカットオフによる最終濾過工程を本発明の製品の調製方法で行った場合、75のTNFαが除去されTNFαを放射標識した放射性試験で証明される、TNFα当量濃度は、以下のように求められる:[TNFα当量濃度]=[開始時のTNFαの量-10-75]。なお、収率は製造プロセス中一貫している。標準物質ヒトTNFα、6.24mg/ml、BoehringerIngelheim社製03030R1の10段階の3倍希釈系列を、60μlのアッセイ培地中に8ng/mlの濃度のヒトTNFα120μlから調製する。Boehringer社製TNFαのEC50は、10~500pg/mlの範囲である。L929細胞の培養時間の終了時に、細胞をサブコンフルエントにしなければならない。次いで、平底培養プレートのウェルから培地を除去し、50μlの各希釈物を平底培養プレートのウェルに移す。2μg/mlのアクチノマイシンDSigma社製A9415を添加した50μlのアッセイ培地を各ウェルに添加する。次いで、L929細胞を37°Cおよび5CO2で20±1時間培養する。培養の終了時に、当該技術分野でよく知られている方法を用いてL929細胞の生存率を評価する。前記方法の一例は、以下のとおりである:20μl/ウェルのMTS/PMS溶液100μlのMTS/5μlのPMS、Promega社製G5430をウェルに添加し、そのプレートを37°Cおよび5CO2でさらに4時間インキュベートする。次いで、分光光度計を用いて490nmでそのプレートを読み取る。以下のように生存率を計算する:=1-[OD製品-ODTNFα標準物質/OD細胞-ODTNFα標準物質]OD製品は、本発明の製品を含むウェルの光学濃度を表す。ODTNFα標準物質は、200ng/mlの標準物質TNFαを含むウェルの光学濃度を表す。OD細胞は、標準物質も本発明の製品も含まない対照ウェルの光学濃度を表す。従って、当業者は、試験Aから、100ng/ml、200ng/ml、400ng/mlおよび800ng/mlのTNFα当量の被験製品の細胞溶解活性率を求めることができる。以下に示すように、実施例3および実施例13で試験Aを行う。本発明の一実施形態では、100ng/mlのTNFα当量濃度、好ましくは200ng/mlのTNFα当量濃度、より好ましくは400ng/mlのTNFα当量濃度、さらにより好ましくは800ng/mlのTNFα当量濃度の本製品は、30未満のL929細胞を死滅させこれは70を超えるL929細胞が生存可能であることを意味する、好ましくは25未満のL929細胞を死滅させこれは75を超えるL929細胞が生存可能であることを意味する、より好ましくは20未満のL929細胞を死滅させこれは80を超えるL929細胞が生存可能であることを意味する、より好ましくは15未満のL929細胞を死滅させこれは85を超えるL929細胞が生存可能であることを意味する、さらにより好ましくは10未満のL929細胞を死滅させるこれは90を超えるL929細胞が生存可能であることを意味する図1Bを参照。本発明の一実施形態では、100ng/mlのTNFα濃度の本製品は、30未満のL929細胞を死滅させこれは70を超えるL929細胞が生存可能であることを意味する、好ましくは25未満のL929細胞を死滅させこれは75を超えるL929細胞が生存可能であることを意味する、より好ましくは20未満のL929細胞を死滅させこれは80を超えるL929細胞が生存可能であることを意味する、より好ましくは15未満のL929細胞を死滅させこれは85を超えるL929細胞が生存可能であることを意味する、さらにより好ましくは10未満のL929細胞を死滅させるこれは90を超えるL929細胞が生存可能であることを意味する。本明細書において上に記載されている試験Aを使用して本製品のEC50および本製品の不活性化係数も求めることができる。EC50は、50のL929細胞を死滅させるのに必要な本製品の濃度に相当する。不活性化係数は、以下のように計算することができる:EC50製品/EC50TNFα。本発明の一実施形態では、本製品は、500ng/mlを超える、好ましくは1000ng/mlを超える、好ましくは2000ng/mlを超える、より好ましくは3000ng/mlを超える、さらにより好ましくは5000ng/mlを超えるEC50を示す。本発明の別の実施形態では、本製品は、15000を超える、好ましくは30000を超える、さらにより好ましくは50000を超える不活性化係数を示す。本発明の一実施形態では、本製品の不活性化係数は100000を超える。本発明は、不活性化をさらにより進めたものであり、本発明のワクチンを、ヒトの体温条件、すなわち生体内温度、典型的には37°Cで、必要な時間すなわち免疫を有効にしなければならない時間の間ずっと不活性なままにするものである。この点に関しては、欧州および米国薬局方に準拠して試験Bを設計した。本発明の意味では、不活性なままであるまたは長期間不活性であるという用語は、本製品が試験Bの条件で80未満の細胞溶解活性を示すことを意味する。一実施形態では、後述する試験Bの条件で、100ng/mlの濃度の本発明の免疫原性製品の細胞溶解活性を測定する。本発明によれば、試験Bを使用して、ヒトの体温条件下に置いた場合の本発明の製品におけるヒトTNFα生理活性の不活性化率を求める。上記試験は、アクチノマイシンDの存在下でヒトTNFαにより誘導されるマウスL929細胞の細胞溶解に基づいており、T6すなわち本製品が液状であって37°Cで6週間貯蔵された状態で行う。以下の方法に従って試験Bを行う:L929マウス線維芽細胞Sigma社製No.85011425を、1.5×104/cm2で、培地10FBSSigma社製F7524、2mMのグルタミンSigma社製G7513、100U/mlのペニシリン/ストレプトマイシンSigma社製P0781および1mMのピルビン酸ナトリウムSigma社製S8636を添加したDMEMCambrex社製BE12604Fに播種し、37°Cおよび5CO2で2日間培養して、サブコンフルエントな単層を得た。次いで、L929細胞を回収し、2×104細胞/ウェルで、96ウェル平底培養プレート内の100μlの平板培地2FBS、2mMのグルタミン、100U/mlのペニシリン/ストレプトマイシンおよび1mMのピルビン酸ナトリウムを添加したDMEMF12Cambrex社製BE12719Fに播種し、37°Cおよび5CO2で21±1時間培養した。本発明の製品の5段階の3倍希釈系列を、60μlのアッセイ培地2mMのグルタミン、100U/mlのペニシリン/ストレプトマイシンおよび1mMのピルビン酸ナトリウムを添加したHL1Cambrex社製US77201に希釈した6400ng/mlの本発明の製品120μlから調製した。使用する濃度単位は、TNFα当量濃度実施例4またはBCA試験を用いて測定した総タンパク質実施例13であってもよい。一実施形態では、1μgのTNFα当量濃度は、BCA試験を用いて測定した1~5μgの総タンパク質に相当し、好ましくはBCA試験を用いて測定した1.5~2.4μgの総タンパク質に相当する。一実施形態では、1μgのTNFα当量濃度は、BCA試験を用いて測定した1.5μgの総タンパク質に相当する。別の実施形態では、1μgのTNFα当量濃度は、BCA試験を用いて測定した2.4μgの総タンパク質に相当する。一実施形態では、1μgのTNFα当量濃度は、本製品の調製方法において、濾過膜を用いるタンジェンシャルフロー濾過の第1の工程が10kDaのカットオフ値を有し、かつ濾過膜を用いるタンジェンシャルフロー濾過の第2の工程が10kDaのカットオフ値を有する場合に、BCA試験を用いて測定した1.5μgの総タンパク質に相当する。別の実施形態では、1μgのTNFα当量濃度は、本製品の調製方法において、濾過膜を用いるタンジェンシャルフロー濾過の第1の工程が10kDaのカットオフ値を有し、かつ濾過膜を用いるタンジェンシャルフロー濾過の第2の工程が300kDaのカットオフ値を有する場合に、BCA試験を用いて測定した2.4μgの総タンパク質に相当する。BCAタンパク質アッセイは、総タンパク質の比色検出および定量のためのビシンコニン酸BCAに基づく界面活性剤適合処方である。この方法は、アルカリ性媒体中のタンパク質によるCu2のCu1への周知の還元ビウレット反応を、ビシンコニン酸を含有する珍しい試薬を用いた銅IのカチオンCu1の高感度かつ高選択的な比色検出と組み合わせたものである。このアッセイの紫色の反応生成物は、1つの銅IイオンによるBCAの2つの分子のキレート化によって生成される。この水溶性複合体は、562nmで、20~2000μg/mlの広い測定範囲にわたるタンパク質濃度の増加に比例する強い吸光度を示す。TNFα当量濃度により、細胞バイオアッセイおよびTNFαショックモデルで生体内において、同じTNFα含有量を有する異なるバッチを比較することができる。TNFα当量濃度は、以下のように求められる:[TNFα当量濃度]=プロセスの開始時のTNFαの量-10。本発明の製品の調製方法で300kDaのカットオフによる濾過の最終工程を行った場合、75のTNFαが除去されTNFαを放射標識した放射性試験で証明される、TNFα当量濃度は、以下のように求められる:[TNFα当量濃度]=[開始時のTNFαの量-10-75]。なお、収率は製造プロセス中一貫している。標準物質ヒトTNFα、6.24mg/ml、BoehringerIngelheim社製03030R1の10段階の3倍希釈系列を、60μlのアッセイ培地中に8ng/mlのヒトTNFα120μlから調製した。Boehringer社製TNFαのEC50は、10~500pg/mlの範囲である。L929細胞の培養時間の終了時に、細胞はサブコンフルエントであった。次いで、平底培養プレートのウェルから培地を除去し、50μlの各希釈物を平底培養プレートのウェルに移した。2μg/mlのアクチノマイシンDSigma社製A9415を添加した50μlのアッセイ培地を各ウェルに添加した。次いで、L929細胞を37°Cおよび5CO2で20±1時間培養した。培養の終了時に、当該技術分野でよく知られている方法を用いてL929細胞の生存率を評価する。前記方法の一例は、以下のとおりである:20μl/ウェルのMTS/PMS溶液100μlのMTS/5μlのPMS、Promega社製G5430をウェルに添加し、プレートを37°Cおよび5CO2でさらに4時間インキュベートする。次いで、分光光度計を用いて490nmでプレートを読み取る。以下のように生存率を計算する:=1-[OD製品-ODTNFα標準物質/OD細胞-ODTNFα標準物質]OD製品は、本発明の製品を含むウェルの光学濃度を表す。ODTNFα標準物質は、200ng/mlの標準物質TNFαを含むウェルの光学濃度を表す。OD細胞は、標準物質も本発明の製品も含まない対照ウェルの光学濃度を表す。従って、当業者は、37°Cで6週間後に残った被験製品の細胞溶解活性率を試験Bから求めることができる。以下に示す実施例4および実施例13で試験Bを行う。本発明の一実施形態では、100ng/mlの濃度の本製品は、80未満のL929細胞を死滅させこれは20を超えるL929細胞が生存可能であることを意味する、好ましくは70未満のL929細胞を死滅させこれは30を超えるL929細胞が生存可能であることを意味する、より好ましくは60未満のL929細胞を死滅させこれは40を超えるL929細胞が生存可能であることを意味する、さらにより好ましくは50未満のL929細胞を死滅させるこれは50を超えるL929細胞が生存可能であることを意味する。本発明の一実施形態では、100ng/mlのTNFα当量濃度の本製品は、80未満のL929細胞を死滅させこれは20を超えるL929細胞が生存可能であることを意味する、好ましくは70未満のL929細胞を死滅させこれは30を超えるL929細胞が生存可能であることを意味する、より好ましくは60未満のL929細胞を死滅させこれは40を超えるL929細胞が生存可能であることを意味する、さらにより好ましくは50未満のL929細胞を死滅させるこれは50を超えるL929細胞が生存可能であることを意味する。本発明の一実施形態では、350ng/mlのTNFα当量濃度の本製品は、90未満のL929細胞を死滅させこれは10を超えるL929細胞が生存可能であることを意味する、好ましくは80未満のL929細胞を死滅させこれは20を超えるL929細胞が生存可能であることを意味する、より好ましくは70未満のL929細胞を死滅させこれは30を超えるL929細胞が生存可能であることを意味する、より好ましくは60未満のL929細胞を死滅させこれは40を超えるL929細胞が生存可能であることを意味する、さらにより好ましくは50未満のL929細胞を死滅させるこれは50を超えるL929細胞が生存可能であることを意味する。本発明の一実施形態では、1000ng/mlのTNFα当量濃度の本製品は、90未満のL929細胞を死滅させこれは10を超えるL929細胞が生存可能であることを意味する、好ましくは80未満のL929細胞を死滅させこれは20を超えるL929細胞が生存可能であることを意味する、より好ましくは70未満のL929細胞を死滅させるこれは30を超えるL929細胞が生存可能であることを意味する。本明細書において上に記載されている試験Bを使用して、本製品のEC50および本製品の不活性化係数を求めることもできる。EC50は、37°Cで6週間貯蔵した後に50のL929細胞を死滅させるのに必要な本製品の濃度に相当する。不活性化係数は、以下のように計算することができる:EC50製品/EC50TNFα。本発明の一実施形態では、本製品は、37°C下に6週間置いた場合に、100ng/mlを超える、好ましくは250ng/mlを超える、より好ましくは500ng/mlを超えるEC50を示す。本発明の別の実施形態では、本製品は、37°C下に6週間置いた場合に、500を超える、好ましくは2000を超える、より好ましくは5000を超える、さらにより好ましくは10000を超える不活性化係数を示す。一実施形態によれば、本発明の製品は、遊離TNFαホモポリマーを含んでいてもよい。好ましい実施形態では、前記TNFαホモポリマーは、100kDaを超える、好ましくは300kDaを超える分子量を有する。一実施形態では、100kDaを超える、好ましくは300kDaを超える遊離TNFαホモポリマーの割合は、総TNFαの30w/w未満である。試験Cに従って、遊離TNFαホモポリマーの割合を測定してもよい。試験Cは、1抗TNFαモノクローナル抗体または抗KLHポリクローナル抗体のそれぞれでコーティングされた磁気ビーズを用いる免疫捕捉工程による遊離TNFαもしくはKLHホモポリマーの精製および2特異的ELISAによる遊離TNFαもしくはKLHホモポリマーの定量に基づいている。試験Cによれば、抗KLHもしくは抗TNFα抗体でコーティングされたビーズを調製するそのような調製の例は、実施例5に説明されている。コーティングされたビーズおよびコーティングされていないビーズを本製品と混合し、4°Cで12~16時間インキュベートする。次いで、上澄みを磁石で回収し、ELISAで分析する。次いで、3種類のELISAを行う:-捕捉抗体および一次抗体が抗KLH抗体であるKLH-KLHによるELISA、-捕捉抗体および一次抗体が抗TNFα抗体であるTNFα-TNFαによるELISA、-捕捉抗体が抗KLH抗体であり一次抗体が抗TNFα抗体であるかその逆であるKLH-TNFαによるELISA。例えば、ビオチンで標識された検出抗体、ポリストレプトアビジンHRP増幅システムおよびo-フェニレンジアミン二塩酸塩基質溶液を用いるような、当該技術分野で知られている任意の比色手段によって、ELISAを発色させる。ELISAの結果の分析により、実施例5に示すように、本発明の製品中に存在する総TNFαとの比較によって遊離TNFαホモポリマーの割合を求めることができる。より好ましい実施形態では、本製品は、100kDa未満の分子量これはホモ三量体のTNFα分子の二量体の見かけの分子量であるを有するTNFαホモポリマーを含有していない。より好ましい実施形態では、本製品は、300kDa未満の分子量これはホモ三量体のTNFα分子の六量体の見かけの分子量であるを有するTNFαオリゴマーを含有していない。どんな理論にも関連づけたくはないが、本出願人は、100kDa未満、一実施形態では300kDa未満のTNFαオリゴマーの除去により、ヒトおよび非ヒト哺乳類への使用に対する本製品の安全性を高め、最終免疫原性製品の免疫原性を高め得ることを示唆している。[乳濁液およびそのような乳濁液を含有するワクチン組成物]本発明は、本発明の製品の製剤にも関する。一実施形態では、本製剤は、本発明の製品を含有する液体製剤である。好適な液体製剤の例としては、例えば無菌溶液などの溶液、例えば無菌分散液などの分散液または乳濁液が挙げられる。別の実施形態では、本製剤は本発明の製品を含む固体製剤である。好適な固体製剤の例としては、例えば、本発明の製品を含む無菌注射溶液もしくは分散液の即時調製のための無菌粉末などの粉末が挙げられるが、これに限定されない。本発明のワクチン組成物は、前記製剤を含むか前記製剤で構成されていると有利である。一実施形態では、本発明の製剤中の本発明に係る免疫原性製品の量は、前記製剤の総重量の0.01w/w超~1未満w/wである。本発明は、本製品が乳濁液中に存在する本発明の製品の製剤にも関する。本発明のワクチン組成物が前記乳濁液を含むか前記乳濁液で構成されていると有利である。そのような乳濁液は、本発明の免疫原性製品、油および界面活性剤または少なくとも1種の油と少なくとも1種の界面活性剤との混合物を含む。好ましくは、上記油または油/界面活性剤の混合物は、医薬的に許容される賦形剤である。より好ましくは、油と界面活性剤との混合物はアジュバントであり、さらにより好ましくは免疫アジュバントである。好ましいアジュバントはISA51である。使用し得る免疫アジュバントの別の例はSWEスクアレン系水中油型エマルションである。使用し得る免疫アジュバントの別の例はSWE-aスクアラン系水中油型エマルションである。本発明の乳濁液は、油中水型エマルションまたは水中油型エマルションであってもよい。別の実施形態では、乳濁液中の本発明に係る免疫原性製品の量は、前記乳濁液の総重量の0.01w/w超~1未満w/wである。[アジュバント]本発明の乳濁液またはワクチン組成物は、アジュバント、特に免疫アジュバントを含んでいてもよい。一実施形態では、アジュバントの量は、ワクチン組成物の総重量の0.00001w/w~1、好ましくは0.0001~0.1、より好ましくは0.001~0.01w/wである。上記ワクチン組成物に、例えば、フロインド不完全アジュバント、ミコール酸系アジュバント例えば、トレハロースジミコール酸、細菌性リポ多糖LPS、ペプチドグリカンすなわち、ムレイン、ムコペプチド、またはN-Opaca、ムラミルジペプチド[MDP]もしくはMDP類似体などの糖タンパク質、MPLモノホスホリルリピドA、プロテオグリカン例えば、肺炎桿菌から抽出されたもの、連鎖球菌製剤例えばOK432、Biostim商標例えば、01K2、欧州特許第109942号、欧州特許第180564号および欧州特許第231039号のイスコムISCOM、水酸化アルミニウム、サポニン、DEAE-デキストラン、中性油例えば、ミグリオールMiglyol、植物油例えばアラキド油、リポソーム、プルロニック登録商標ポリオール、Ribiアジュバント系例えば、英国特許出願公開第A2189141号を参照、またはインターロイキン、特に細胞媒介性免疫を刺激するものなどの油系アジュバントを含む当業者によって知られている任意の好適なアジュバントを使用してもよい。放線菌目細菌属であるアミコラータAmycolataの抽出物からなる他のアジュバントについては、米国特許第4,877,612号に記載されている。さらに、登録商標を有するアジュバント混合物が市販されている。使用されるアジュバントは、投与される生物に部分的に依存している。投与するアジュバントの量は、動物の種類および大きさに依存している。最適用量は、常法によって容易に決定することができる。油中水型エマルションへの使用に適した油アジュバントは、鉱油および/または代謝可能な油を含んでいてもよい。鉱油は、バイオールBayol登録商標、Marcol登録商標、およびドラケオールDrakeol登録商標6VRPIC社、フランス登録商標などのドラケオールから選択してもよい。代謝可能な油は、SP油以下に記載、EmulsigenMPVLaboratories社、ネブラスカ州ラルストン、モンタニドMontanide264,266,26Seppic社、フランスのパリ、ならびに落花生油および大豆油などの植物油、魚油であるスクアランおよびスクアレンなどの動物油、トコフェロールおよびその誘導体から選択してもよい。さらに、当該アジュバントは、アジュバントの約0.1~25体積、より好ましくは約1~10体積、さらにより好ましくは約1~3体積の量で1種以上の湿潤剤または分散剤を含んでいてもよい。湿潤剤または分散剤として、非イオン性界面活性剤が特に好ましい。有用な非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレン/ポリオキシプロピレンブロック共重合体、特にプルロニック登録商標という商標で市販されているBASF社ニュージャージー州マウントオイーブから入手可能なものが挙げられる。他の有用な非イオン性界面活性剤としては、Tween80登録商標という商標で市販されているモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンなどのポリオキシエチレンエステルが挙げられる。本発明のワクチン組成物の一部として2種以上、例えば少なくとも2種の湿潤剤または分散剤をアジュバントに含めることが望ましい場合もある。数字の前の約という用語は、本明細書で使用されている場合、前記数字の値の±10を意味する。好適なアジュバントとしては、例えば、ヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、リゾレシチン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、N,N-ジオクタデシル-N’-N-ビス2-ヒドロキシエチル-プロパンジアミン、メトキシヘキサデシルグリセロールおよびプルロニックポリオール;ポラニオンpolanion、例えば、ピラン、硫酸デキストラン、ポリIC、ポリアクリル酸、カーボポールcarbopol;ペプチド類、例えば、ムラミルジペプチド、アイメチルグリシンaimethylglycine、タフトシン、油乳濁液、ミョウバンおよびそれらの混合物などの当業者によって知られている界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。他の可能なアジュバントとしては、大腸菌易熱性毒素またはコレラ毒素のBペプチドサブユニットが挙げられる。一実施形態では、本発明の乳濁液またはワクチン組成物は、免疫アジュバントを含む。好適な免疫アジュバントの例としては、ISA51PIC社、SWEまたはSWE-aローザンヌ大学のワクチン製剤研究室によって提供されているが挙げられる。[さらなる界面活性剤]乳濁液を含む本発明に係るワクチン組成物の実施形態では、本ワクチン組成物は、免疫原性製品と1種以上の油性免疫アジュバント物質との組み合わせに加えて、1種以上の界面活性剤も含有することが好ましい。界面活性剤の例示的な実施形態としては、アラセルArlacelPIC社、フランスという商標で販売されているモンタニド登録商標80などのモノオレイン酸マンニドが挙げられる。一実施形態では、界面活性剤の量は、ワクチン組成物の総重量の0.00001~1w/w、好ましくは0.0001~0.1w/w、より好ましくは0.001~0.01w/wの範囲である。[凍結乾燥した製品]一実施形態によれば、貯蔵のために、本発明の製品またはワクチン組成物を凍結乾燥してもよい。従って、ワクチン組成物をフリーズドライ凍結乾燥形態で提供してもよい。前記実施形態では、本発明に係る免疫原性製品を1種以上の凍結乾燥補助物質と組み合わせる。様々な凍結乾燥補助物質が当業者によってよく知られている。凍結乾燥補助物質は、ラクトースおよびマンニトールなどの糖類を包含する。ワクチン組成物が界面活性剤を含む液体乳濁液として使用される凍結乾燥された組成物からなるそのような実施形態では、ワクチン組成物は、前記ワクチン組成物の総重量の0.1w/w超~10未満w/wの量の本発明に係る免疫原性製品を含むことが好ましい。[安定化剤]いくつかの実施形態では、ワクチンを安定化剤と混合して、例えば、分解しやすいタンパク質を分解させないように保護して、ワクチンの貯蔵寿命を延ばしたり、凍結乾燥効率を高めたりしてもよい。有用な安定化剤は、SPGA、炭水化物例えば、ソルビトール、マンニトール、トレハロース、澱粉、スクロース、デキストランまたはグルコース、タンパク質アルブミン、カゼインまたはそれらの分解生成物など、および緩衝液例えばリン酸カリウムまたはリン酸二ナトリウムなどのアルカリ金属リン酸塩などである。[投与経路]本発明に係るワクチン組成物を、注射可能な方法、例えば、皮内、筋肉内、腹膜内もしくは皮下注射、あるいは例えば経皮送達などの局所的な方法を含む任意の従来の方法によって対象に投与して免疫してもよい。当該治療は、一定期間にわたる単回投与または複数回投与で構成されていてもよい。[剤形]注射可能な使用に適した形態としては、無菌溶液もしくは分散液および無菌注射溶液もしくは分散液の即時調製のための無菌粉末が挙げられる。例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸およびチメロサールなどの各種抗菌薬および抗真菌薬をワクチン組成物に添加して、微生物による汚染に対する予防を講じることができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖類または塩化ナトリウムもしくは塩化カリウムを含めることが好ましい。本組成物に吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを使用することにより、注射可能な組成物の持続的吸収を生じさせることができる。一実施形態によれば、本発明の凍結乾燥したワクチン組成物を注射用水に可溶化し、穏やかに混合した後、免疫アジュバント、好ましくはISA51を添加し、乳化のために混合物を穏やかに混合し、好適な注射器に充填する。使用し得る免疫アジュバントの別の例は、SWEまたはSWE-aである。従って、本発明は、本発明のワクチン組成物が後から充填されるか予め充填された注射器などの医療機器にも関する。理想的には、乳濁液を即座に調製する。但し、乳濁液を含む注射器を2~8°Cで10時間未満貯蔵することができる。この場合、注射前に手の間で摩擦により乳濁液を温めるべきである。[単位用量範囲]好ましくは、ヒトへの使用または非ヒト哺乳類への使用が求められる場合、本発明に係るワクチン組成物の用量単位は、動物のために設計される場合は0.1~1000μgの範囲であり、ヒトのために設計される場合は20~1000μgの範囲の量の免疫原性製品を含むことが好ましい。ヒトへの使用が求められる場合、本発明に係るワクチン組成物の典型的な用量単位は、好ましくは20μg~1000μg、最も好ましくは25μg~600μgの範囲の量の免疫原性製品を含むことが好ましい。[作用機序]本発明は、前記免疫原性製品が投与される哺乳類において、内因性サイトカインの免疫抑制特性、アポトーシス特性または血管新生特性を中和する抗体が誘導される体液性免疫応答などの免疫応答を誘導するのに有用な免疫原性製品の調製方法にも関する。一実施形態では、それが投与される哺乳類において免疫応答を誘導する免疫原性製品の能力は、内因性TNFαを中和する抗体を誘導するその能力によって測定することができる。一実施形態では、中和試験試験Dに従って、内因性TNFαを中和する抗体を誘導する能力を測定してもよい。以下の手順に従って、中和試験試験Dを行う:Haywardらによって記載されているhTNFαトランスジェニックマウスに、本発明のワクチン、本発明の乳濁液または本発明の免疫原性製品を含む組成物を筋肉内注射する。例えば、0日目D0、7日目D7および28日目D28などに、少なくとも1回、好ましくは2回、より好ましくは3回、マウスに筋肉内投与する。例えば、61日目D61、119日目D119および191日目D191などの免疫後数日目に血清を採取する。L929バイオアッセイを用いて、本発明の免疫原性製品で免疫されたhTNFαマウスからの血清の中和能を評価する。L929マウス線維芽細胞Sigma社製No.85011425を、1.5×104/cm2で、培地10FBSSigma社製F7524、2mMのグルタミンSigma社製G7513、100U/mlのペニシリン/ストレプトマイシンSigma社製P0781および1mMのピルビン酸ナトリウムSigma社製S8636を添加したDMEMCambrex社製BE12604Fに播種し、37°Cおよび5CO2で2日間培養して、サブコンフルエントな単層を得る。次いで、L929細胞を回収し、2×104細胞/ウェルで、96ウェル平底培養プレート内の100μlの平板培地2FBS、2mMのグルタミン、100U/mlのペニシリン/ストレプトマイシンおよび1mMのピルビン酸ナトリウムを添加したDMEMF12Cambrex社製BE12719Fに播種し、加湿インキュベータ中37°Cおよび5CO2で21±1時間培養する。血清を二つ組で試験する:1つのウェル当たり、使用希釈倍率1/100以上である4倍に希釈した60μlの血清または30μlのアッセイ培地2mMのグルタミン、100U/mlのペニシリン/ストレプトマイシン、1mMのピルビン酸ナトリウムを添加したHL1Cambrex社製US77201を添加した。被験血清および対照を6段階の2倍希釈系列で希釈する。アッセイ培地に希釈したヒトTNFαサイトカインを、30μl/ウェルで、使用濃度2.5ng/mL以上で、4倍に希釈した血清希釈プレートに添加し、このプレートを37°Cで90分、4°Cで30分および室温で15分インキュベートする。50μlの試料を96ウェル平底培養プレートに移し、そこで細胞をサブコンフルエントにしなければならない。次いで、2μg/mLのアクチノマイシンDを添加した50μlのアッセイ培地を添加し、プレートを加湿インキュベータ中37°Cおよび5CO2で20±1時間インキュベートする。次いで、1つのウェル当たり20μlのMTS/PMS100mLのMTSおよび5mLのPMS、Promega社製G5430を添加し、このプレートを加湿インキュベータ中37°Cおよび5CO2でさらに4時間インキュベートした。培養の終了時に、当該技術分野でよく知られている方法を用いてL929細胞の生存率を評価する。一例は、以下のとおりである:20μl/ウェルのMTS/PMS溶液100μlのMTS/5μlのPMS、Promega社製G5430をウェルに添加し、このプレートを加湿インキュベータ中37°Cおよび5CO2でさらに4時間インキュベートする。次いで、分光光度計を用いて490nmでこのプレートを読み取る。以下のように相対的細胞生存率を計算する:中和率=OD試験-ODTNFα標準物質/OD血清-ODTNFα標準物質OD試験は、血清およびhTNFαを含むウェルの光学濃度を表す。ODTNFα標準物質は、2.5ng/mlのTNFαのみを含むウェルの光学濃度を表す。OD血清は、血清のみを含む対照ウェルの光学濃度を表す。中和力価は、hTNFα活性の50を中和する血清希釈の逆数として表すすなわちNC50。実施例15で本発明の製品に対して中和試験を行い、本発明の製品がhTNFαに対して高い中和活性を有する抗体を誘導することが分かった。本発明は、本明細書において上に記載されているような免疫原性製品を前記哺乳類に投与することを含む、それを必要としている哺乳類において免疫応答を誘導する方法にも関する。一実施形態では、前記免疫応答は、内因性サイトカインの免疫抑制特性、アポトーシス特性または血管新生特性を中和する抗体が誘導される体液性免疫応答を含む。製造された免疫原性製品は、TNFαの過剰産生に関連する疾患を予防または治療するためのワクチン組成物に主に使用される。より具体的には、本発明は、TNFαの過剰産生に関連する疾患の予防または治療方法であって、ヒトを含む動物に、治療的有効量の本発明の製品、乳濁液またはワクチンを投与する工程を含む方法に関する。TNFαの過剰産生に関連する疾患は、強直性脊椎炎、乾癬、関節リウマチ、若年性特発性関節炎、炎症性腸疾患、クローン病、悪液質および癌からなる群から選択されてもよい。本発明の1つの目的は、TNFαの過剰産生に関連する疾患の予防または治療に使用される本明細書において上に記載されている本発明の製品、乳濁液またはワクチンである。従って、本発明のさらなる態様は、上に定義した免疫原性製品またはワクチン組成物の使用に関する。本発明のさらなる目的は、哺乳類において内因性TNFαの活性を中和する抗体の産生を誘導する方法であって、前記哺乳類にi上に開示したワクチン組成物またはii上に記載した免疫原性製品を1種以上の免疫アジュバントと共に投与する工程を含む方法を提供することである。[キットおよび医療機器]本発明は、以下を含むキットにも関する:-典型的には3mLの本発明の凍結乾燥された製品を含む1つのバイアルバイアルNo.1、-典型的には2mLの注射用水を含む1つのバイアルバイアルNo.2、-アジュバント、好ましくはISA51、SWEまたはSWE-aを含む1つのバイアルバイアルNo.3このバイアルは3mLのアジュバントを含むことができ、8mLの容器であってもよい、-1つの注射器、典型的には1mLのBraunInjektF登録商標、-乳濁液の調製のための1本の針針No.1この針は好ましくは20G針である、-注射、好ましくは筋肉内注射のための1本の針針No.2この針は好ましくは23G針である。本発明は、以下を含むキットからのワクチンの調製方法にも関する:1針No.1に接続した注射器を用いてバイアルNo.2からバイアルNo.1の中に注射用水を注入する、2調製物が完全に可溶化するまで、バイアルNo.1を1~5分間穏やかに回す、3同じ注射器および針を用いて、バイアルNo.3からアジュバントを抜き出す。この注射器内容物をバイアルNo.1の中に放出する、4内容物を乳化させるのに十分な回数、典型的には30回、全バイアル内容物をポンプで出し入れし、最終的に全乳濁液を抜き出す。注射前に、針No.1を好ましくは針No.2と交換し、注射器から空気を除去する。本発明は、本発明のワクチン組成物が事前に充填されたかこれから充填される注射器である医療機器にも関する。本発明は、本発明の製品または本発明のワクチン組成物が事前に充填されたバイアルまたはカープルを含む医療機器にも関する。[本発明の製品の調製方法]本発明は、TNFαが強力に不活性化されたこれは、本製品が試験Aの条件で、30、好ましくは25、より好ましくは20、より好ましくは15、さらにより好ましくは10未満の細胞溶解活性を示すか15000を超える不活性化係数を示すことを意味する、KLHに結合したTNFαを含む製品を調製するための2つの方法以下、主要方法および変形方法というにも関する。100ng/mlの濃度について本発明の製品の細胞溶解活性を測定することが好ましい。両方法において、TNFα出発製品は、当該技術分野に記載されている様々な方法によって得られる組換え型ヒトTNFαからなることが好ましい。例示として、TNFαは、ヒトTNFαをコードする発現カセットがその中に挿入されたプラスミドによって形質転換されている大腸菌細胞により産生された組換え型ヒトTNFαからなる。TNFα出発製品は、検出可能な量のエンドトキシンを含有していないことが最も好ましい。本発明の方法で使用するために、TNFαは、液体溶液、好ましくは6.5~7.5の範囲のpHを有する緩衝液であることが好ましい。いくつかの実施形態では、TNFαを含有する液体溶液は、好ましくは0.1w/w~5w/w、最も好ましくは0.5w/w~3w/wの範囲の最終濃度のDMSOジメチルスルホキシドも含有する。一実施形態では、TNFαを含有する液体溶液は、液体溶液の総重量に対して0.1w/w~2w/wの範囲の最終濃度、好ましくは1w/wの最終濃度のDMSOも含有する。一実施形態では、TNFαを含有する液体溶液はDMSOを含有していない、すなわち0w/wのDMSOを含有する。DMSOは、TNFα分子中に存在するグルタルアルデヒ反応基の利用能を増加させることができる周知の抗酸化化合物である。いくつかの実施形態では、TNFαを含有する液体溶液は、1mM~20mM、好ましくは3mM~10mMの範囲の最終濃度のEDTAも含有する。好ましくは、KLH出発製品は、海洋性腹足類軟体動物の鍵穴カサガイのリンパから抽出された高度に精製されたKLHからなり、前記KLH出発製品は、検出可能な量のエンドトキシンを含有していないことが好ましい。天然に産生されたKLHは一般に、2つの十量体からなる構造20個のサブユニットからなる非共有結合性管状組立体からなり、各十量体単位は、サブユニットKLH1またはKLH2のホモポリマーからなる。KLH1サブユニットの分子量が約350kDaであり、KLH2サブユニットの分子量が約390kDaであることを考慮すると、KLHの2つの十量体は、約8×106Daの分子量MWを有することが好ましい。TNFαKLHグルタルアルデヒドの反応第1の実施形態では、本発明の方法は、i精製されたTNFα、ii精製されたキーホールリンペットヘモシアニンKLHおよびiiiグルタルアルデヒドを一緒に混合する第1の工程工程aを含む。グルタルアルデヒドとKLHおよびTNFαの両方が有する遊離アミノ基との反応により、工程aの終了時に得られる製品は、それに関連するTNFα分子を有するKLHのモノマーおよびオリゴマーを含み、ここで、TNFα分子は、iTNFαモノマーおよびiiTNFαオリゴマーを含む。工程aの好ましい実施形態では、グルタルアルデヒドを添加する前に、最初にTNFαおよびKLHを適当な量で混合する。いくつかの実施形態では、工程aにおいて、TNFαおよびKLHを10:1~40:1の範囲のTNFα:KLHモル比で混合する。いくつかの好ましい実施形態では、工程aにおいて、TNFαおよびKLHを30:1~40:1の範囲のTNFα:KLHモル比で混合する。いくつかの好ましい実施形態では、工程aにおいて、TNFαおよびKLHを35:1~40:1の範囲のTNFα:KLHモル比で混合する。工程aのいくつかの実施形態以下、工程a1というでは、反応混合物中に1mM~50mM、好ましくは20mM~30mM、より好ましくは25mMの最終濃度でグルタルアルデヒドを使用する。工程aのいくつかの実施形態では、グルタルアルデヒドを、TNFαおよびKLHと共に、110分超~400分未満、好ましくは約120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230および240分間インキュベートする。一実施形態では、グルタルアルデヒドを25mMで約120分間添加する。別の実施形態では、グルタルアルデヒドを25mMで約240分間添加する。グルタルアルデヒドとのインキュベーション工程aを18°C~37°C、好ましくは18°C~27°Cの範囲の温度で行うと有利である。グルタルアルデヒド反応後の失活一実施形態によれば、失活化合物、好ましくはi還元剤ならびにiiリジン、グリシンおよびそれらの混合物からなる群から選択されるアミノ酸から選択される失活化合物を添加して、グルタルアルデヒドとの反応を停止させてもよい。上記還元剤は、それらの還元的性質によりTNFαまたはKLH遊離アミノ基のいずれとも反応していないグルタルアルデヒドの残った遊離アルデヒド基を還元する能力を有する当該技術分野で知られている還元剤のうちのいずれか1種で構成されていてもよい。上記還元剤は、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウムからなる群から選択してもよい。一実施形態によれば、前記失活化合物がアミノ酸である実施形態では、前記アミノ酸はグリシンからなる。グルタルアルデヒドとの反応を遮断するためにグリシンおよび/またはリジンが使用される工程bのいくつかの実施形態では、本明細書中の実施例に示すように、選択されたアミノ酸を、反応混合物中に0.01M~1M、好ましくは0.05M~0.5M、最も好ましくは0.08M~0.2M、例えば0.1Mの最終濃度で使用する。一実施形態では、本明細書中の実施例に示すように、失活化合物とのインキュベーションを1分~120分、好ましくは5分~60分、例えば15分間行う。別の実施形態では、この工程を20°C~30°C、好ましくは23°C~27°Cの温度で行う。本方法の工程bこの第1の実施形態では、本発明の方法は、工程aを行い、次いで任意に上記失活反応を行った後に、b10kDa未満の分子量を有する化合物を除去する工程である工程bを含む。工程bでは、反応混合物中に存在する10kDa未満の低分子化合物を除去する。これらの低分子化合物は主に、TNFαおよびKLHのどちらとも反応していない過剰なグルタルアルデヒドおよび過剰な失活化合物分子ならびに内因性TNFαまたは天然のKLHよりもサイズが小さい最終的なタンパク質分解生成物を包含する。工程bは、10kDa未満の化合物を除去することができる任意の公知の技術に従って行ってもよく、そのような技術としては、10kDaのカットオフを有する透析膜を用いる透析または10kDaのカットオフを有する濾過膜を用いる濾過が挙げられる。例示として、工程bは、本明細書中の実施例に示すように、10kDaのカットオフを有する濾過膜を用いるタンジェンシャルフロー濾過工程で構成されていてもよい。望ましくない低分子化合物を含まない濾過保持液retentateを、工程bの終了時に回収する。所望であれば、工程bは、工程bの終了時に得られる、反応混合物中に存在する最終的な化合物凝集体を除去する予備工程を含んでもよい。前記予備工程は、最終的に液体溶液で懸濁液中に存在する固体凝集体を除去するための従来の濾過工程、例えば、適当な濾過膜例えば0.2μmの孔径を有する濾過膜を用いる濾過工程で構成されていてもよい。本方法の工程cこの第1の実施形態では、本発明の方法は、工程bを行った後に、c少なくとも60mMで少なくとも240時間~少なくとも120mMで少なくとも144時間の範囲の濃度/時間反応条件でホルムアルデヒドを添加する工程cを含む。工程cは、指定された濃度および指定された期間でホルムアルデヒドを添加する工程からなる。工程cの終了時に得られる中間体生成物を、反応混合物中に少なくとも60mM、好ましくは60~500mM、より好ましくは100~300mMの濃度で少なくとも10日間、好ましくは240~500時間、より好ましくは288~336時間のホルムアルデヒド処理に供する。一実施形態では、工程cの終了時に得られる中間体生成物を、反応混合物中に少なくとも120mM、好ましくは120~270mMの濃度で少なくとも6日間144時間、好ましくは144~500時間、より好ましくは144~360時間のホルムアルデヒド処理に供する。一実施形態では、工程cにおいて、混合物中に220mM~270mMの濃度で300時間を超える期間にわたってホルムアルデヒド処理を行う。一実施形態では、本明細書中の実施例に示すように、その期間は、310、320および330時間を超え、例えば336時間14日間である。好ましくは、ホルムアルデヒドでの処理期間は、500時間を超えないことが好ましく、490、480、470、460、450、440、430、420、410、400、390、380、370および360時間未満の期間を包含する。工程cでは、反応混合物中のホルムアルデヒドの濃度は、200mMを超えていることが好ましい。200mMを超えるホルムアルデヒドの濃度は、特に220、230、240および250mMを超える濃度を包含する。一実施形態では、ホルムアルデヒドの濃度は270mM未満である。好ましい実施形態では、ホルムアルデヒドは、少なくとも200mMの最終濃度で少なくとも240時間、好ましくは220mM~270mM、好ましくは250mMで少なくとも300時間添加する。工程cでは、本明細書中の実施例に示すように、30°C~42°C、例えば37°Cの温度で、ホルムアルデヒドとのインキュベーションを行うことが好ましい。先行技術の知識から予期していたとおり、前記ホルムアルデヒド処理により、本製品に顕著な構造変化が生じる。従って、この処理にも関わらず、本発明に係る方法によって得られる免疫原性製品に期待した抗TNFα免疫原性が得られることはいっそう驚きであった。本方法の工程d本方法の工程dでは、失活化合物、好ましくはi還元剤ならびにiiリジンおよびグリシンからなる群から選択されるアミノ酸から選択される失活化合物を添加して、ホルムアルデヒドとの反応を停止させる。上記還元剤は、それらの還元的性質によりTNFαまたはKLHの遊離アミノ基のいずれとも反応していないホルムアルデヒドの残った遊離アルデヒド基を還元する当該技術分野で知られている還元剤のうちのいずれか1種で構成されていてもよい。上記還元剤は、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウムからなる群から選択してもよい。一実施形態によれば、前記失活化合物がアミノ酸である実施形態では、前記アミノ酸はグリシンからなる。ホルムアルデヒドとの反応を遮断するためにグリシンおよび/またはリジンが使用される工程bのいくつかの実施形態では、本明細書中の実施例に示すように、選択されたアミノ酸を、反応混合物中に0.01M~1.5M、好ましくは0.05M~1M、最も好ましくは0.2M~0.8M、例えば0.38Mの最終濃度で使用する。一実施形態では、本明細書中の実施例に示すように、失活化合物とのインキュベーションを5分間~120分間、好ましくは10分間~80分間、例えば60分間行う。別の実施形態では、18°C~30°C、好ましくは19°C~27°Cの温度でこの工程を行う。100kDa未満、好ましくは300kDa未満の化学種の除去工程dの後に、本発明の製品の回収を行ってもよい。但し、非常に好ましい実施形態によれば、工程dの後であって本製品の回収前に、さらなる工程を行う。この工程は、100kDa、好ましくは300kDa未満の分子量を有する物質の除去からなる。300kDa未満の分子量を有する物質の除去は、300kDa未満の分子量を有する物質を液体溶液から除去するための当該技術分野で知られている任意の技術によって当業者が行ってもよい。第1の実施形態では、使用される技術は、少なくとも100kDa、または一実施形態では少なくとも300kDaのカットオフ値を有する濾過膜を用いて行われる濾過工程であり、これは限外濾過工程またはタンジェンシャルフロー濾過工程を包含する。第2の実施形態では、使用される技術は、少なくとも300kDaのカットオフ値を含む少なくとも100kDaのカットオフ値を有する濾過膜を用いるタンジェンシャルフロー濾過工程からなる。どんな理論にも関連づけたくはないが、本出願人は、驚くべきことに、この工程を行うことは本製品にとって有利であることに気付いた。特に、この工程により、KLHと反応していないTNFαのホモポリマーが除去された。本方法のこの工程で50を超える最初のTNFαを除去し得ること、ならびに予想外に、残った生成物が免疫原性に関する限りさらにより良好なものであることを観察した。凍結乾燥任意に、使用前の長期貯蔵のために、本発明に係る最終免疫原性製品をさらに処理してもよい。本発明者らは、本発明の製品の凍結乾燥により、長期貯蔵に対するその安定性を高めることができ、かつTNFαの生物学的不活性化の不可逆性を高めることができることが分かった。本発明に係る凍結乾燥された免疫原性製品を、その使用まで約2°C~約25°Cの温度で、無菌および非発熱性密閉容器内で数ヶ月、例えば少なくとも6ヶ月間、変化させることなく貯蔵することができる。他の方法本発明の変形形態では、TNFαが強力に不活性化されたこれは、本製品が試験Aの条件で、好ましくは100ng/mlの濃度で試験した場合に、30、好ましくは25、より好ましくは20、さらにより好ましくは15未満の細胞溶解活性を示すことを意味する、KLHに結合したTNFαを含む製品の調製方法は、ai精製されたTNFα、ii精製されたキーホールリンペットヘモシアニンKLHおよびiiiグルタルアルデヒドを一緒に混合する工程と、b10kDa未満の分子量を有する化合物を除去する工程と、を含み、グルタルアルデヒドを、18時間を超える、20時間を超えるまたは24時間を超える期間にわたって少なくとも20mMの濃度で添加し、失活化合物、好ましくはi還元剤ならびにiiリジン、グリシンおよびそれらの混合物からなる群から選択されるアミノ酸から選択される失活化合物を添加してグルタルアルデヒドとの反応を停止させる工程aの具体的な実施形態以下、工程a2というを特徴とする。第1の実施形態では、次いで、本製品を回収する。工程a2の好ましい実施形態では、グルタルアルデヒドの添加前に、最初にTNFαおよびKLHを適当な量で一緒に混合する。工程a2において、TNFαおよびKLHを10:1~40:1のTNFα:KLHモル比で混合すると有利である。いくつかの好ましい実施形態では、工程aにおいて、TNFαおよびKLHを30:1~40:1のTNFα:KLHモル比で混合する。工程a2において、TNFαおよびKLHを35:1~40:1のTNFα:KLHモル比で混合することが好ましい。この変形方法では、上記主要方法に記載されているグルタルアルデヒド後の失活反応に関する特徴を準用する。この変形方法では、工程bを行い、上記主要方法に記載した工程bに関する特徴、すなわち10kDa未満の分子量を有する化合物の除去を準用する。第2の実施形態では、工程b後であって本製品の回収前に、ホルムアルデヒドを、少なくとも60mMで少なくとも4日間の濃度/時間反応条件で添加し、次いで、i還元剤ならびにiiリジン、グリシンおよびそれらの混合物からなる群から選択されるアミノ酸から選択される失活化合物を添加して、ホルムアルデヒドとの反応を遮断する。この変形方法では、上記主要方法に記載されている工程dに関する特徴、すなわちホルムアルデヒド後の失活反応を準用する。本発明の好ましい実施形態によれば、本製品の回収の直前に、少なくとも100kDa好ましくは300kDaのカットオフ値を有する濾過膜を用いてタンジェンシャルフロー濾過工程を行い、それにより100kDa好ましくは300kDa未満の分子量を有する物質を本製品から除去する。この変形方法では、上記主要方法に記載されている100kDa未満、好ましくは300kDa未満の化学種の除去に関する特徴を準用する。任意に、使用前の長期貯蔵のために、本発明に係る最終免疫原性製品をさらに処理してもよい。この変形方法では、上記主要方法に記載されている凍結乾燥に関する特徴を準用する。本発明の別の変形形態では、TNFαが強力に不活性化されたこれは、本製品が試験Aの条件で、好ましくは100ng/mlの濃度で試験した場合に、30、好ましくは25、より好ましくは20、さらにより好ましくは15未満の細胞溶解活性を示すことを意味する、KLHに結合したTNFαを含む製品の調製方法は、ai精製されたTNFα、ii精製されたキーホールリンペットヘモシアニンKLHおよびiiiグルタルアルデヒドを一緒に混合する工程と、b10kDa未満の分子量を有する化合物を除去する工程と、c少なくとも66mMで少なくとも144時間~少なくとも250mMで少なくとも96時間の範囲の濃度/時間反応条件でホルムアルデヒドを添加する工程と、を含み、グルタルアルデヒドを、18時間を超える、20時間を超える、24時間を超える、36時間を超える、48時間を超える、72時間を超える、96時間を超える期間にわたって少なくとも20mMの濃度で添加し、失活化合物、好ましくはi還元剤ならびにiiリジン、グリシンおよびそれらの混合物からなる群から選択されるアミノ酸から選択される失活化合物を添加して、グルタルアルデヒドとの反応を停止させる工程aの特定の実施形態以下、工程a2というを特徴とする。第1の実施形態では、次いで、本製品を回収する。工程a2の好ましい実施形態では、グルタルアルデヒドの添加前に、最初にTNFαおよびKLHを適当な量で一緒に混合する。工程a2において、TNFαおよびKLHを10:1~40:1のTNFα:KLHモル比で混合すると有利である。いくつかの好ましい実施形態では、工程aにおいて、TNFαおよびKLHを30:1~40:1のTNFα:KLHモル比で混合する。工程a2において、TNFαおよびKLHを35:1~40:1のTNFα:KLHモル比で混合することが好ましい。この変形方法では、上記主要方法に記載されているグルタルアルデヒド後の失活反応に関する特徴を準用する。この変形方法では、工程bを行い、上記主要方法に記載されている工程bに関する特徴、すなわち10kDa未満の分子量を有する化合物の除去を準用する。工程b後であって本製品の回収前に、少なくとも60mM、100mM、120mM、140mM、160mMで少なくとも6日間~少なくとも250mM、300mM、350mM、400mM、450mM、500mMで少なくとも4日間の範囲の濃度/時間反応条件で、ホルムアルデヒドを添加する。次いで、i還元剤ならびにiiリジン、グリシンおよびそれらの混合物からなる群から選択されるアミノ酸から選択される失活化合物を添加して、ホルムアルデヒドとの反応を遮断する。この変形方法では、上記主要方法に記載されている工程dに関する特徴、すなわちホルムアルデヒド後の失活反応を準用する。本発明の好ましい実施形態によれば、本製品の回収の直前に、少なくとも100kDa好ましくは300kDaのカットオフ値を有する濾過膜を用いるタンジェンシャルフロー濾過工程を行い、それにより100kDa好ましくは300kDa未満の分子量を有する物質を本製品から除去する。この変形方法では、上記主要方法に記載されている100kDa未満、好ましくは300kDa未満の化学種の除去に関する特徴を準用する。任意に、使用前の長期貯蔵のために、本発明に係る最終免疫原性製品をさらに処理してもよい。この変形方法では、上記主要方法に記載されている凍結乾燥に関する特徴を準用する。実施例1:本発明の製品の調製天然の形態のKLHは、サブユニットKLH1またはKLH2のホモポリマーに対応する2つの十量体からなる構造20個のサブユニットからなる非共有結合性管状組立体KLH1:KLH2=約0.9:1である、分子量MW=約8×106Da。天然のKLHは、一貫した比率のより大きなMWの多量体およびより小さなMWの十量体も含む。キーホールリンペットヘモシアニンKLHを海洋性腹足類軟体動物の鍵穴カサガイのリンパから抽出した後、GMP条件で精製した。2~8°Cの温度の貯蔵条件で行った安定性アッセイの結果から、精製されたKLHの貯蔵寿命は2~8°Cで36ヶ月であることが分かった。組換え型ヒトTNFαを、GMP条件で大腸菌により産生した。370mgのTNFα尺度の本発明の製品のバッチを、以下の開発した製造プロセスを用いて製造した。aグルタルアルデヒドとの結合TNFαを、緩衝液130mMの二ナトリウム、リン酸水素、133mMの塩化ナトリウムおよび6.6mMのEDTA、pH7.8に希釈して、1.05mg/mLの溶液を得、1DMSOを添加する。22±3°Cで30分間インキュベートした後、使用緩衝液100mMの二ナトリウム、リン酸水素、150mMの塩化ナトリウムおよび5mMのEDTA、pH7.8を添加して、TNFα混合物を0.51mg/mLまで希釈する。濾過したKLHを、UV濃度で1:0.58のTNFα:KLH比1個のモノマーのKLHに対して37個のモノマーのTNFαであるモル比に相当するにより、TNFα溶液に添加する。蠕動ポンプを用いて2.5w/vの原液から添加したグルタルアルデヒド反応媒体中で25mMになるまで添加との結合を行い、この溶液を23±2°Cで規定の時間にわたって混合する。bグリシンによる失活反応系を0.1Mのグリシンで15分間失活させた。c1回目のタンジェンシャルフロー濾過TFF1PallMinimIITFFシステムと、0.5MのNaOHで殺菌し、かつ使用緩衝液で平衡させた10kDaの分子量カットオフを有する0.02m2のポリエーテルスルホン膜とを用いて、1回目のTFFを行う。次いで、失活させた溶液を0.22μm濾過によって浄化する。中間体を使用緩衝液で2回希釈した後、タンジェンシャルフロー濾過TFFおよび12体積の使用緩衝液で透析濾過するdiafilter。保持液を回収し、20時間未満貯蔵する。dホルムアルデヒドによる不活性化規定の最終濃度に到達するまで、蠕動ポンプを用いてホルムアルデヒドを保持液に添加する。マグネチックスターラで溶液を毎日混合しながら、37±2°Cに設定したインキュベータ内で規定の時間にわたって不活性化反応を行う。eグリシンによる失活次いで、反応系を0.38Mのグリシンで1時間失活させる。f2回目のタンジェンシャルフロー濾過TFF2PallMinimIITFFシステムと、0.5MのNaOHで殺菌し、かつ製剤緩衝液で平衡させた300kDaの分子量カットオフを有する0.02m2のポリエーテルスルホン膜とを用いて、2回目のTFFを行う。失活させた溶液を0.2μm濾過で浄化する。中間体を約900mLの開始タンジェンシャルフロー体積を有するように濃縮し、次いで、12体積の製剤緩衝液1.47mMのKH2PO4、8.1mMのNa2HPO4、2.68mMのKCl、136.9mMのNaCl、pH7.3を用いてTFFで濾過して、TNFαの低分子量のホモポリマーおよび非反応性試薬を除去する。保持液を回収した後、BCAによって測定された濃度に基づく300μg/mLの理論濃度まで希釈し、次いで、0.2μm濾過して、本発明の製品を得る。実施例2:本発明のいくつかの製品の調製条件に関する記載および国際公開第2007/022813号に記載されている製品との比較B1は、国際公開第2007/022813号に記載されている製品に相当する。表1に記載されている条件で実施例1に記載されている方法によってGTP0902を得、ここでは、工程fにおいて300kDaのカットオフによる2回目のタンジェンシャルフロー濾過を行った。GTP0902は、GMP臨床バッチである。実施例3:試験Aによって示されるように本発明の製品は強力に不活性化されているこの試験を使用して、本発明の製品におけるヒトTNFα生理活性の不活性化率を求める。上記試験は、アクチノマイシンDの存在下でヒトTNFαによって誘導されるマウスL929細胞の細胞溶解に基づいている。この試験をT0すなわち本製品が液状であって4°Cで貯蔵された状態で行う。材料および方法L929マウス線維芽細胞Sigma社製No.85011425を、1.5×104/cm2で、培地10FBSSigma社製F7524、2mMのグルタミンSigma社製G7513、100U/mlのペニシリン/ストレプトマイシンSigma社製P0781および1mMのピルビン酸ナトリウムSigma社製S8636を添加したDMEMCambrex社製BE12604Fに播種し、37°Cおよび5CO2で2日間培養して、サブコンフルエントな単層を得た。次いで、L929細胞を回収し、2×104細胞/ウェルで、96ウェル平底培養プレート内の100μlの平板培地2FBS、2mMのグルタミン、100U/mlのペニシリン/ストレプトマイシンおよび1mMのピルビン酸ナトリウムを添加したDMEMF12Cambrex社製BE12719Fに播種し、37°Cおよび5CO2で21±1時間培養した。本発明の製品の10段階の2倍希釈系列を、60μlのアッセイ培地2mMのグルタミン、100U/mlのペニシリン/ストレプトマイシンおよび1mMのピルビン酸ナトリウムを添加したHL1Cambrex社製US77201に希釈した6400ng/mlTNFα当量の本発明の製品120μlから調製した。使用する濃度単位はTNFα当量濃度である。TNFα当量濃度により、細胞バイオアッセイおよびTNFαショックモデルで生体内において、同じTNFα含有量を有する異なるバッチを比較することができる。TNFα当量濃度は、以下のように求められる:[TNFα当量濃度]=プロセス開始時のTNFαの量-10。300kDaのカットオフによる濾過の最終工程を本発明の製品の調製方法で行った場合、75のTNFαが除去され、TNFαを放射標識した放射性試験で証明される、TNFα当量濃度は、以下のように求められる:[TNFα当量濃度]=[開始時のTNFαの量-10-75]。なお、収率は製造プロセス中一貫している。標準物質ヒトTNFα、6.24mg/ml、BoehringerIngelheim社製03030R1の10段階の3倍希釈系列を、60μlのアッセイ培地中に8ng/mlのヒトTNFα120μlから調製した。Boehringer社製TNFαのEC50は、10~500pg/mlの範囲である。L929細胞の培養時間の終了時に、細胞はサブコンフルエントであった。次いで、平底培養プレートのウェルから培地を除去し、50μlの各希釈物を平底培養プレートのウェルに移した。2μg/mlのアクチノマイシンDSigma社製A9415を添加した50μlのアッセイ培地を各ウェルに添加した。次いで、L929細胞を、37°Cおよび5CO2で20±1時間培養した。培養の終了時に、20μl/ウェルのMTS/PMS溶液100μlのMTS/5μlのPMS、Promega社製G5430を添加し、このプレートを37°Cおよび5CO2でさらに4時間インキュベートした。次いで、DYNEX社製分光光度計MRXIIを用いて、490nmでこのプレートを読み取った。以下のように生存率を計算した:=1-[OD製品-ODTNFα標準物質/OD細胞-ODTNFα標準物質]OD製品は、本発明の製品を含むウェルの光学濃度を表す。ODTNFα標準物質は、200ng/mlの標準物質TNFαを含むウェルの光学濃度を表す。OD細胞は、標準物質および本発明の製品のどちらも含まない対照ウェルの光学濃度を表す。結果製品B1、B2、B3、B5、B80、B11、B14、B140およびGTP0902を表1に記載されている条件に従って製造し、試験Aを行う前に10日未満4°Cおよび液状で貯蔵した。材料および方法の箇所に記載されているように、それらをL929バイオアッセイ試験Aで試験した。L929細胞の生存率を測定し、結果を図1Aおよび表2に示す。図1Aは、本製品の漸増濃度の関数である細胞生存率を示す。100ng/ml濃度では、B1国際公開第2007/022813号の製品は31の細胞を死滅させたが、本発明の製品は10未満の細胞を死滅させた。特に、B14およびGTP0902は、100ng/mlで5未満の細胞を死滅させた。図1Bは、100ng/mlの濃度の製品では、40未満の細胞がB1国際公開第2007/022813号の製品の存在下で生存したが、本発明の製品の存在下で60を超える細胞が生存したことを示す。特に、100ng/mlのB14およびGTP0902の存在下では、ほぼ90の細胞が生存した。結論として、本発明の製品は、試験Aによって示されるように強力に不活性化されている。結果を、細胞増殖を50減少させるのに必要な本製品の濃度であるEC50としても分析した。図2Aおよび表3は、B1国際公開第2007/022813号の製品のEC50が、本発明の製品のEC50と比較して極めて低い200ng/ml未満ことを示している。各製品の不活性化係数を以下のように計算した:EC50製品/EC50TNFα。図2Bおよび表4は、B1国際公開第2007/022813号の製品が本発明の製品の不活性化係数10000超と比較して極めて低い不活性化係数4000未満を有することを示している。これらの結果は、本発明の製品がB1国際公開第2007/022813号の製品よりも少なくとも2.5倍不活性であることを示している。特に、B14およびGTP0902は、B1よりも10000倍を超えて不活性である。実施例4:本発明の製品は、試験Bによって示されるように不活性化されたままであるこの試験を使用して、不活性化されたワクチンに対して古典的になされるように製造した後に本製品を液状および37°Cで6週間貯蔵した場合の復帰TNFα活性の再生の程度を測定する。この試験を行って、本発明の製品の不活性化が投与時または投与後に安定なままであるかを確認する。材料および方法L929マウス線維芽細胞Sigma社製No.85011425を、1.5×104/cm2で、培地10FBSSigma社製F7524、2mMのグルタミンSigma社製G7513、100U/mlのペニシリン/ストレプトマイシンSigma社製P0781および1mMのピルビン酸ナトリウムSigma社製S8636を添加したDMEMCambrex社製BE12604Fに播種し、37°Cおよび5CO2で2日間培養して、サブコンフルエントな単層を得た。次いで、L929細胞を回収し、2×104細胞/ウェルで、96ウェル平底培養プレート内の100μlの平板培地2FBS、2mMのグルタミン、100U/mlのペニシリン/ストレプトマイシンおよび1mMのピルビン酸ナトリウムを添加したDMEMF12Cambrex社製BE12719Fに播種し、37°Cおよび5CO2で21±1時間培養した。本発明の製品の5段階の3倍希釈系列を、60μlのアッセイ培地2mMのグルタミン、100U/mlのペニシリン/ストレプトマイシンおよび1mMのピルビン酸ナトリウムを添加したHL1Cambrex社製US77201に希釈した6400ng/mlTNFα当量の本発明の製品120μlから調製した。使用する濃度単位は、TNFα当量濃度実施例4またはBCA試験を用いて測定した総タンパク質実施例13である。TNFα当量濃度により、細胞バイオアッセイおよびTNFαショックモデルで生体内において、同じTNFα含有量を有する異なるバッチを比較することができる。TNFα当量濃度は、以下のように求められる:[TNFα当量濃度]=プロセス開始時のTNFαの量-10。本発明の製品の調製方法で300kDaのカットオフによる濾過の最終工程を行った場合、75のTNFαが除去されTNFαを放射標識した放射性試験で証明される、TNFα当量濃度は、以下のように求められる:[TNFα当量濃度]=[開始時のTNFαの量-10-75]。なお、収率は製造プロセス中一貫している。標準物質ヒトTNFα、6.24mg/ml、BoehringerIngelheim社製03030R1の10段階の3倍希釈系列を、60μlのアッセイ培地中に8ng/mlのヒトTNFα120μlから調製した。Boehringer社製のTNFαのEC50は、10~500pg/mlの範囲である。L929細胞の培養時間の終了時に、細胞はサブコンフルエントであった。次いで、平底培養プレートのウェルから培地を除去し、50μlの各希釈物を平底培養プレートのウェルに移した。2μg/mlのアクチノマイシンDSigma社製A9415を添加した50μlのアッセイ培地を各ウェルに添加した。次いで、L929細胞を、37°Cおよび5CO2で20±1時間培養した。培養の終了時に、20μl/ウェルのMTS/PMS溶液100μlのMTS/5μlのPMS、Promega社製G5430を添加し、このプレートを37°Cおよび5CO2でさらに4時間インキュベートした。次いで、DYNEX社製分光光度計MRXIIを用いて、490nmでこのプレートを読み取った。実施例3に記載されているように、生存率を計算した。結果表1に記載されている条件に従って、製品B1、B2、B3、B5、B80、B11、B14、B140およびGTP0902を製造し、試験Bを行う前に37°Cおよび液状で6週間貯蔵した。材料および方法の箇所に記載されているように、それらをL929バイオアッセイ試験Bで試験した。L929細胞の生存率を測定し、結果を図3Aに示す。図3Aおよび表5は、本製品の漸増濃度の関数である細胞生存率を示す。100ng/ml濃度では、B1国際公開第2007/022813号の製品は90を超える細胞を死滅させたが、本発明の製品は65未満の細胞を死滅させた。特に、B14およびGTP0902は、100ng/mlで約20の細胞を死滅させた。図3Bは、100ng/ml濃度の製品では、B1国際公開第2007/022813号の製品の存在下で10未満の細胞が生存したが、本発明の製品の存在下で35を超える細胞が生存したことを示している。特に、100ng/mlのB14およびGTP0902の存在下では80を超える細胞が生存した。結論として、試験Bによって示されるように、本発明の製品は強力に不活性化されたままである。結果を、細胞増殖の50の減少に必要な製品の濃度であるEC50としても分析した。図4Aおよび表6は、本発明の製品のEC50と比較してB1国際公開第2007/022813号の製品のEC50が極めて低い50ng/ml未満ことを示している。各製品の不活性化係数を以下のように計算した:EC50製品/EC50TNFα。図4Bおよび表7は、本発明の製品の不活性化係数と比較して、B1国際公開第2007/022813号の製品が極めて低い不活性化係数500未満を有することを示している。これらの結果は、本発明の製品がB1国際公開第2007/022813号の製品よりも少なくとも3倍不活性なままであることを示している。特に、B14およびGTP0902は、B1よりも30倍を超えて不活性なままである。実施例5:本発明の製品中の遊離TNFαホモポリマーの存在の測定試験C抗TNFαモノクローナル抗体工程1または抗KLHポリクローナル抗体工程1でコーティングした磁気ビーズを用いる免疫捕捉工程による選択的除去後に、TNFαおよびKLHのホモポリマーを精製した。ビーズでコーティングした抗TNFα抗体を用いることにより、遊離TNFαホモポリマーおよび本発明の製品を上澄みから除去し、それにより特異的ELISA工程2により遊離KLHホモポリマーを定量することができた。同様に、ビーズでコーティングした抗KLH抗体を用いることにより、遊離KLHホモポリマーおよび本発明の製品を上澄みから除去し、それにより特異的ELISA工程2により遊離TNFαホモポリマーを定量することができた。2種類の特異的ELISA法に基づく試験それぞれ、TNFα-TNFαおよびKLH-KLHによるELISAを用いて、本発明の製品中の遊離TNFαホモポリマーおよび遊離KLHホモポリマーの定量を行った。さらに、本発明の製品の試験試料からの完全な除去を制御するために、上澄みに対してKLH-TNFαによるELISAを行った。抗KLHAbsでコーティングした磁気ビーズを用いる免疫捕捉の原理抗KLH抗体でコーティングしたビーズを用いる免疫捕捉を用いて、TNFαのホモポリマーを、TNFα-TNFαELISAを用いて上澄み中で定量することができる。上澄み中の修飾TNFαのヘテロポリマーおよびホモポリマーの完全な除去は、KLH-KLHおよびKLH-TNFαELISAにより信号が存在しないことによって示される。材料および方法抗KLHまたは抗TNFα抗体に結合したビーズの調製1.3×109ビーズDynabeads登録商標M270Epoxy、Invitrogen社製14302Dを、20mg/mlの最終濃度になるまでPBSで希釈し、10分間インキュベートした。これらのビーズを磁石で洗浄した後、486μlのホウ酸塩緩衝液100mM、pH9に再懸濁した。最終濃度が1Mになるまで、333μlの硫酸アンモニウム3Mを添加した。次いで、182μlの抗TNFαモノクローナル抗体3B2/1H4/2E5-SO8038b、2.2mg/mlまたは235μlの抗KLHポリクローナル抗体S030.07122.1、1.7mg/mlを添加し、混合物を37°Cで12~16時間インキュベートした。次いで、ビーズを磁石で回収した。反応および非特異的部位を遮断するために、2BSAのリン酸緩衝食塩水1mlを使用してビーズを懸濁した後、混合物を4°Cで12~16時間インキュベートした。次いで、ビーズを磁石で回収した。試験試料とのインキュベーションコーティングしたビーズおよびコーティングしていないビーズ20mg/mlを被験試料と混合し1BSAのリン酸緩衝食塩水に1μg/mlで希釈した製品、次いで、4°Cで12~16時間インキュベートした。次いで、上澄みを磁石で回収し、ELISAで分析した。KLH-KLHによるELISA当該技術分野でよく知られているように、KLH-KLHによるサンドイッチELISAを行った。捕捉抗体アフィニティー精製した抗KLHウサギポリクローナル抗体600-401-466、Rockland社、1mg/mlを100ng/ウェルでコーティングした。一次抗体アフィニティー精製した抗KLHビオチン化ウサギポリクローナル抗体600-406-466、Rockland社、1mg/mlを25ng/mlで使用した。試料中のKLHのホモポリマーの定量を、標準物質として修飾KLHを用いて測定した。希釈緩衝液での2倍希釈系列によって、標準濃度400~15.625ng/mLを調製した。ポリストレプトアビジン-HRP1/5000を使用して反応を検出し、o-フェニレンジアミン二塩酸塩OPD基質溶液により複合体を発色させる。酵素反応の停止後、得られた色の強さを、分光光度法により490nmで測定する650nmの参照フィルタ。TNFα-TNFαによるELISA当該技術分野でよく知られているように、TNFα-TNFαのサンドイッチELISAを行った。捕捉抗体アフィニティー精製した抗huTNFαヤギポリクローナル抗体RDsystem社、AF210NA、1mg/mlを100ng/ウェルでコーティングした。一次抗体アフィニティー精製した抗huTNFαビオチン化ヤギポリクローナル抗体RDsystem社、BAF210、0.5mg/mlを75ng/mlで使用した。試料中のTNFαのホモポリマーの定量を、標準物質として修飾TNFαを用いて測定した。標準濃度100~0.391ng/mLを2倍希釈系列により調製した。ポリストレプトアビジン-HRP1/5000を使用して反応を検出し、o-フェニレンジアミン二塩酸塩OPD基質溶液により複合体を発色させる。酵素反応の停止後、得られた色の強さを、分光光度法により490nmで測定する650nmの参照フィルタ。KLH-TNFαによるELISA当該技術分野でよく知られているように、KLH-TNFαによるサンドイッチELISAを行った。捕捉抗体アフィニティー精製した抗KLHウサギポリクローナル抗体600-401-466、Rockland社、1mg/mlを100ng/ウェルでコーティングした。一次抗体アフィニティー精製した抗huTNFαビオチン化ヤギポリクローナルRDsystem社、BAF210、0.5mg/mlを75ng/mlで使用した。ポリストレプトアビジン-HRP1/5000を使用して反応を検出し、o-フェニレンジアミン二塩酸塩OPD基質溶液により複合体を発色させる。酵素反応の停止後、得られた色の強さを、分光光度法により490nmで測定する650nmの参照フィルタ。光学濃度を、同じプレート上で行ったTNFαの希釈系列の光学濃度と比較することにより、TNFα濃度A、C、Eを測定する。光学濃度を、同じプレートで行ったKLHの希釈系列の光学濃度と比較することにより、KLH濃度B、D、Fを測定する。免疫捕捉なしI、抗TNFα抗体による免疫捕捉後G、および抗KLH抗体による免疫捕捉後の光学濃度を比較することにより、対照G,H,Iを測定する。Eは、遊離TNFαホモポリマーに相当する。Fは、遊離KLHホモポリマーに相当する。Aは、TNFα-KLHホモポリマー遊離TNFαホモポリマーに相当する。Bは、TNFα-KLHホモポリマー遊離KLHホモポリマーに相当する。CおよびGを除去対照として使用して、抗TNFα抗体を用いる免疫捕捉を用いてTNFα-KLHホモポリマー遊離TNFαホモポリマーの完全な除去を確認する。DおよびHを除去対照として使用して、抗KLH抗体を用いる免疫捕捉を用いてTNFα-KLHホモポリマー遊離KLHホモポリマーの完全な除去を確認する。結果遊離TNFαホモポリマーの存在について、製品GTP0902および他の臨床バッチを試験した。抗TNFαでコーティングしたビーズと混合した被験試料から得られた上澄みに対して行ったKLH-KLHによるELISAにより、本製品GTP0902中に遊離KLHホモポリマーが全く存在していないことが分かった。従って、遊離TNFαホモポリマーの割合を、E/A×100として計算した。結果を表8に示す。従って、その結果から、300kDaのカットオフによる濾過の最終工程を行う方法に従って得られた本発明の製品が、遊離KLHホモポリマーを全く含有しておらず、30未満の遊離TNFαホモポリマーを含有していることが分かった。実施例6:本発明の製品の免疫原性材料および方法Balb/cの2つの群を、ISA51で乳化した1μgTNFα当量のB2、B3、B5、B80、B14、B140またはB1国際公開第2007/022813号の製品で免疫した。2つの群の間に1週間の遅れを設けて、0日目および21日目に免疫を行った。28日目に血清を採取し、ELISAにより抗huTNFα抗体の存在について試験した。結果図5に示すように、全ての製品により、高レベルの抗TNFα力価が得られた。結論として、本発明の製品は、製品B1と同じ免疫原性を有する。実施例7:本発明の製品の毒性TNFα媒介性ショックアッセイで、本製品の毒性を評価した。材料および方法このアッセイについては、LehmannetalJEM1987165657663に記載されている。簡潔に言うと、マウスに、20mgのD-ガラクトサミンおよび11μgのTNFα対照、4°Cで貯蔵または液状および37°Cで6週間貯蔵した11μgTNFα当量の製品B1、B80、B14、B140を含有する100μlの溶液を腹膜内注射した。24時間後に死亡率を評価した。結果図6に示すように、製品B1国際公開第2007/022813号の製品は、TNFαと同程度に致死的である。これに反して、本発明の製品は有毒ではなかった。Beromun登録商標の公開医薬品審査報告書EPARによって提供されている情報によれば、最大耐用量MTDは150~200μg/m2である。1.9m2の平均体表に基づく場合、TNFαのMTDは285μgに相当する。本発明の製品の投与量は180μgのタンパク質を表している。製造された異なるバッチに対する品質管理および安定性の結果では、復帰後の不活性化のレベルは常に、内因性TNFαと比較して10,000倍4対数を超えていた。従って、臨床用量180μgで投与されたTNFαの活性は、重量な安全限界15833を提供するTNFαのMTDよりも15,000倍低い18ng未満である。臨床用量360μgで投与されたTNFα活性は、重量な安全限界を提供するTNFαのMTDよりも7,500倍低い36ng未満に相当する。実施例8:本プロセスの終了時に濾過工程を行った場合の本発明の製品の免疫原性使用するTNFαをI125で標識したこと以外はGTP0902条件で、実施例1に記載されている方法に従って本発明の製品を製造した。本発明の製品の製造プロセスの終了時に、異なるカットオフによるタンジェンシャルフロー濾過を行った工程f。図7は、10kDa、100kDa、300kDaまたは500kDaの最終濾過後のI125で標識した製品のSE-HPLCプロファイルを示している。実施例5に記載されている方法に従って、濾過後に得られた異なる画分に対してTNFα-KLHによるELISAを行った。図8Aは、本発明の製品は、濾液100kDa中に存在しないが、濾液300kDa中で検出可能になり始めることを示している。実施例6に記載されている方法に従って濾過したか濾過していない0.2μgまたは0.5μgの製品でマウスを免疫することにより、300kDaのカットオフにより濾過したか濾過していない本製品の免疫原性を評価した。図8Aは、濾過した製品2種類のバッチD1およびD2により、より高レベルの抗TNFα力価が得られたことを示している。図8Bは、濾液に対する保持液の免疫原性の評価に相当し、300kDaの濾液が非免疫原性であることを示している。実施例9:本発明の製品を含む組成物の例2種類の例示的な組成物を表9および表10に記載する。実施例10:本発明の製品を含むワクチンの例本発明に係るワクチンの例を表11に記載する。実施例11:hTNFαトランスジェニックマウスにおける関節炎の治療実施例11は、非ヒト哺乳類におけるTNFαの過剰産生に関連する疾患の治療のための本発明の製品の有効性を開示する。簡潔に言うと、Haywardらによって記載されている10匹のhTNFαトランスジェニックマウスからなる第1の群に、実施例10に記載されているように調製したヒトTNFαkinoidのISA51乳濁液からなるワクチン組成物を筋肉内注射した。4μgのヒトTNFαkinoidを含有する量のワクチン組成物をそれぞれ、0日目D0、7日目D7および28日目D28に筋肉内に投与した。10匹のトランスジェニックマウスからなる第2の群に、第1の群のトランスジェニックマウスに注射したワクチン組成物の体積と同様の体積のリン酸緩衝食塩水PBSを筋肉内注射した。2つの群のマウスにおける平均関節炎スコアを求め、その結果を図9に示す。Leeらによって記載されているように、平均関節炎スコアを測定した。その結果は、PBSを投与したマウスでは関節炎が急激に発症したが、本発明のワクチン組成物を投与した動物では関節炎が完全に遮断されたことを示している。実施例12:クローン病の治療実施例12は、本発明の製品のクローン病患者における第I/II相非盲検漸増用量最適二段階免疫試験手順を開示する。A.臨床試験プロトコル1.適応症/試験対象母集団年齢が18~65歳のクローン病患者を、3種類の用量の実施例10に係る本発明のワクチンで免疫した。2.理論的根拠本試験は、クローン病患者においてISA51アジュバントと組み合わせた本発明の候補製品の安全性、反応源性および免疫原性を評価するように設計されている。0日目、7日目および28日目に投与する3種類の用量60μg、180μgおよび360μgで、3種類の用量のこれらの候補kinoidに対する安全性プロファイルおよび免疫応答を評価した。3.試験設計複数の試験機関にまたがる3群に関する国際的第I/II相最適二段階非無作為化試験:A群:アジュバントISA51と組み合わせた本発明のワクチン60μgの本発明の製品を投与した3人の対象、B群:アジュバントISA51と組み合わせた本発明のワクチン180μgの本発明の製品を投与した9人の対象、C群:アジュバントISA51と組み合わせた本発明のワクチン360μgの本発明の製品を投与した9人の対象。4.試験期間正の抗TNFα抗体応答ベースラインに対して3倍の増加として定義を示す全ての対象を、抗体力価が正常化されるまで、あるいは少なくとも140日目まで、安全性について追跡する。抗体応答を全く示さない対象は140日目まで追跡する。B.臨床試験の結果第1に、臨床試験の結果は、本発明のワクチンで治療した患者の中に深刻な有害作用を経験したものは誰もいないことを示し、この結果から、TNFα生物活性が安定かつ不可逆的に不活性化されていることが十分に確認される。第2に、最初に選択された患者のうち臨床試験の途中で棄権したものは誰もいなかったことを強調しておく。特に、最初に選択された患者の中で予期しない感染症に罹患したものは誰もいなかった副鼻腔炎の症例が1つ報告された。さらに、図10に示すように、ほぼ全ての患者において抗TNFα抗体応答を測定した:60μgでは33の患者、180μgおよび360μgではどちらも89の患者。図10に示すように、60μgの低用量では、65を超える患者が免疫後4週目に70を超えるCDAIスコアの減少を呈したようにNaberらによってTheJournalofMedicineVol61105110に記載されているように測定したCDAIクローン病活性指数スコア値、本発明のワクチンの治療的効果はクローン病患者において急速に現れる。さらに、図11に示されている結果は、本発明のワクチンのクローン病患者への投与により、患者の大部分において臨床的寛解状態が誘導されることを示している。より詳細には、図11は、60μgの最も低い用量について、30を超える患者が、注射後4週目および8週目に150未満のCDAIスコアを呈していることを示している。さらに、図11は、180μgの用量では、注射後8週目に、67の患者が150未満のCDAIスコア値を呈していることを示している。図12は、85を超える抗TNFα血清陽性患者が70点を超えるCDAIスコア値の減少を伴う治療効果を経験したことも示している。抗TNFα血清陽性患者の55超において寛解150以下のCDAIスコア値が観察されたが、抗TNFα血清陰性患者において寛解が認められたのは約10のみであったことも強調しておく。以下の表12に示されているように、よく知られている治療用抗TNFαモノクローナル抗体であるインフリキシマブ、アダリムマブおよびセルトリズマブと比較した場合、高い割合の患者がクローン病の寛解を経験していることにより、本発明のワクチンの高い治療効果が例証されている。Targan1997NEJM340102935Rutgeerts2004Gastroenterology126402Hanauer2006Gastroenterology130192930Colombe2007AmJournGastroenterol10254967Schreiber2007NEJM3571357実施例13:本発明の製品は、試験Aによって示されるように強力に不活性化されており、試験Bによって示されるように不活性化されたままである。実施例1に記載されている方法によって3種類のバッチ808、901、903を得、ここでは、工程aを、25mMのグルタルアルデヒド最終濃度で240分間行い、工程cを250mMのホルムアルデヒド最終濃度で14日間行い、300kDaのカットオフによる濾過を工程fで行う。本製品は、液状および4°Cで貯蔵するか37°Cで6週間貯蔵する。実施例3に従って試験Aを行う。以下の結果は、BCAタンパク質アッセイによって測定される総タンパク質濃度で表されている。BCAタンパク質アッセイは、総タンパク質の比色検出および定量のためのビシンコニン酸BCAに基づく界面活性剤適合処方である。この方法は、アルカリ性媒体中のタンパク質によるCu2からCu1への周知の還元ビウレット反応と、ビシンコニン酸を含有する珍しい試薬を用いた銅IのカチオンCu1の高感度かつ選択的な比色検出とを組み合わせたものである。このアッセイの紫色の反応生成物は、1つの銅IイオンによるBCAの2つの分子のキレート化によって生成される。この水溶性複合体は、562nmで、20~2000μg/mlの広い測定範囲にわたるタンパク質濃度の増加に比例する強い吸光度を示す。次いで、60μgの総タンパク質が25μgのTNFα当量に相当することを確認した。結果を図13Aおよび表13に示す。hTNFαについて示されている割合は、3回のアッセイで得られた値の平均に相当する。本製品を試験Aの条件で4°Cで貯蔵する場合、80を超えるL929細胞が生存可能であり、これは、本製品が20未満の細胞溶解活性を示していることを意味する。各製品のEC50を計算すると、100000を超えていた。各製品の不活性化係数を計算すると、100000を超えていた。実施例4に従って試験Bを行う。以下の結果は、BCAタンパク質アッセイによって測定される総タンパク質濃度で表されている。結果を図13Bおよび表14に示す。結果は、37°Cで6週間後に、50を超えるL929細胞が1000ng/ml未満の濃度で生存可能であったため、本製品が不活性化されたままであることこれは、本製品が50未満の細胞溶解活性を示していることを意味するを示している。hTNFαについて示されている割合は、3回のアッセイで得られた値の平均に相当する。図14、表15および表16は、各製品について計算したEC50および不活性化係数を示す。37°Cで6週間貯蔵した場合、本製品は、500を超えるEC50および10000を超える不活性化係数を示す。EC50TNFαは、イントラアッセイでのTNFα値を用いて計算した。実施例14:関節リウマチの治療実施例14は、本発明の製品の関節リウマチ患者におけるプラセボを対照とする第2相二重盲検漸増用量免疫試験のプロトコルを開示する。A.臨床試験の手順1.適応症/試験対象母集団少なくとも1種の抗TNFαモノクローナル抗体に対する二次耐性を発現した年齢が18~70歳の関節リウマチ患者を、3種類の用量の実施例10に係る本発明のワクチンで免疫した。2.理論的根拠本試験は、少なくとも1種の抗TNFαモノクローナル抗体に対する二次耐性を発現した関節リウマチ患者においてISA51アジュバントと組み合わせた本発明の候補製品の安全性および臨床的有効性を評価するように設計されている。安全性プロファイルおよび3種類の用量のこれらの候補kinoidに対する免疫応答を、0日目、7日目、および28日目または0日目および28日目に筋肉内に投与した3種類の用量90μg、180μgおよび360μgで評価した。3.試験設計4群に関する複数の試験機関にまたがる対照を用いた国際的第2相無作為化二重盲検試験:-A群:アジュバントISA51と組み合わせた本発明のワクチン90μgの本発明の製品を投与した6人の対象、-B群:アジュバントISA51と組み合わせた本発明のワクチン180μgの本発明の製品を投与した12人の対象、-C群:アジュバントISA51と組み合わせた本発明のワクチン360μgの本発明の製品を投与した12人の対象、-D群:アジュバントISA51と組み合わせたプラセボ30mgのマンニトールを投与した10人の対象。4.試験期間正の抗TNFα抗体応答ベースラインに対して2倍の増加として定義を示す全ての対象を、抗体力価が正常化されるまで、または少なくとも140日目まで、安全性について追跡する。抗体応答を全く示さない対象は140日目まで追跡する。B.臨床試験の結果関連する深刻な有害事象は全く報告されなかった。少数の軽微な一過性の局所および全身反応について免疫後に記録した。臨床試験の予備データを以下に示すが、360μgの用量についてのデータない。1.抗TNFα抗体A群90μgの用量の患者の50およびB群180μgの用量の患者の80において抗TNFα抗体が誘導された。この結果は、本発明の製品の関節リウマチ患者への投与により、前記患者において抗TNFα抗体応答が誘導されることを示している。C群については、抗TNFα抗体は分析されていない。予期したとおり、D群では抗TNFα抗体は検出されなかった。2.CRPレベルCRPC反応性タンパク質は関節リウマチにおける炎症のマーカーである。84日目にCRPレベルを滴定した。結果はベースラインからの絶対変化の平均として表す表17を参照。表17に示すように、CRPレベルは本発明の製品を投与した患者群で減少したが、プラセボを投与した患者では増加した。この結果は、本発明の製品が関節リウマチ患者における炎症に対して効果を有することを示している。3.ACR20ACR診断基準ACRは米国リウマチ学会を表すは、関節リウマチの治療の有効性を評価するための標準的な診断基準である。ACR20診断基準により、圧痛関節数または関節腫脹数ならびに以下の5つのパラメータ:急性期反応物質例えば、赤血球沈降速度またはCRPレベルなど、患者による疾患活動性評価、医師による疾患活動性評価、患者による疼痛評価、および障害/機能度評価のうちの3つにおいて20の改善を示す患者の割合を数値化することができる。84日目にACR20を評価した。結果は、ACR20応答を示す患者の数および割合として表す表18を参照。表18に示すように、ACR20の応答を有する患者の割合は、プラセボを投与した患者よりも本発明の製品を投与した患者において高い。この結果は、本発明の製品が関節リウマチに対して治療的に有効であることを示している。実施例15:本発明の製品で免疫したマウスからの血清の中和能実施例15は、本発明の免疫原性製品による、内因性TNFαの活性を中和する抗体の産生の誘導を測定する生体外細胞試験を開示する。Haywardらによって記載されている4匹のhTNFαトランスジェニックマウスに、実施例10に記載されているように調製したヒトTNFαkinoidのISA51乳濁液からなるワクチン組成物を筋肉内注射した。4μgのヒトTNFαkinoidを含有する量のワクチン組成物をそれぞれ、0日目D0、7日目D7および28日目D28に筋肉内に投与した。免疫後61日目、119日目および191日目に血清を採取した。本発明の免疫原性製品で免疫したhTNFαマウスからの血清の中和能を、L929バイオアッセイを用いて評価した。L929マウス線維芽細胞Sigma社製No.85011425を、1.5×104/cm2で、培地10FBSSigma社製F7524、2mMのグルタミンSigma社製G7513、100U/mlのペニシリン/ストレプトマイシンSigma社製P0781および1mMのピルビン酸ナトリウムSigma社製S8636を添加したDMEMCambrex社製BE12604Fに播種し、37°Cおよび5CO2で2日間培養して、サブコンフルエントな単層を得た。次いで、L929細胞を回収し、2×104細胞/ウェルで、96ウェル平底培養プレート内の100μlの平板培地2FBS、2mMのグルタミン、100U/mlのペニシリン/ストレプトマイシンおよび1mMのピルビン酸ナトリウムを添加したDMEMF12Cambrex社製BE12719Fに播種し、加湿インキュベータ中37°Cおよび5CO2で21±1時間培養した。血清を二つ組で試験した:1つのウェル当たり、使用希釈倍率1/100以上である4倍に希釈した60μlの血清または30μlのアッセイ培地2mMのグルタミン、100U/mlのペニシリン/ストレプトマイシン、1mMのピルビン酸ナトリウムを添加したHL1Cambrex社製US77201を添加した。被験血清および対照を6段階の2倍希釈系列で希釈した。アッセイ培地に希釈したヒトTNFαサイトカインを、30μl/ウェルで、使用濃度2.5ng/mL以上で、4倍に希釈した血清希釈プレートに添加し、このプレートを37°Cで90分間、4°Cで30分および室温で15分インキュベートした。50μlの試料を96ウェル平底培養プレートに移し、そこで、細胞をサブコンフルエントにしなければならない。次いで、2μg/mLのアクチノマイシンDを添加した50μlのアッセイ培地を添加し、プレートを、加湿インキュベータ中37°Cおよび5CO2で20時間±1時間インキュベートした。次いで、1つのウェル当たり20μlのMTS/PMS100mLのMTSおよび5mLのPMS、Promega社製G5430を添加し、このプレートを加湿インキュベータ中37°Cおよび5CO2でさらに4時間インキュベートした。次いで、DYNEX社製分光光度計MRXIIを用いて490nmでこのプレートを読み取った。以下のように相対的細胞生存率を計算した:中和率=OD試験-ODTNFα標準物質/OD血清-ODTNFα標準物質OD試験は、血清およびhTNFαを含むウェルの光学濃度を表す。ODTNFα標準物質は、2.5ng/mlのTNFαのみを含むウェルの光学濃度を表す。OD血清は、血清のみを含む対照ウェルの光学濃度を表す。中和力価は、hTNFα活性の50を中和する血清希釈の逆数として表したすなわちNC50。結果を図15に示す。図15は、本発明の製品がhTNFαを中和する抗体を誘導することができることを示している。中和力価は119日目で最大であり、NC50は3000を超えている。本発明の免疫原性製品の中和能は、製品B1194427の中和能よりも高い。実施例16:本発明の免疫原性製品をISA51またはSWEを含む乳濁液として注射した際に産生された抗hTNFα抗体の力価および中和能実施例16は、ISA51またはSWEを免疫アジュバントとして使用した際の本発明の免疫原性製品の免疫原性図16および中和能図17の比較を開示する。ISA51vgは、油系アジュバントのモンタニド登録商標ISA51である。ISA51vgは、植物由来の非イオン性界面活性剤であるモンタニド登録商標80vgと高度に精製された鉱油ドラケオール登録商標6VRとからなる無菌の透明な液体である。ISA51vgはSeppic社AirLiquide社の子会社によって製造されている。SWEは、スクアレン系水中油型エマルション組成:クエン酸塩緩衝液中にスクアレンが3.9、Spanが0.47、Tween80が0.47である。SWEは、ローザンヌ大学UNILのワクチン製剤研究室VFLによって提供された。Balb/Cマウスを、0日目D0および21日目D21に、ISA51またはSWEで乳化した2μgの本発明の免疫原性製品総タンパク質のμgを含有する本発明のワクチン組成物で注射によって2回免疫した。実施例6に記載されているように、35日目D35に、ISA51またはSWEで乳化した本発明の製品によって産生された抗hTNFα抗体の力価を測定した。結果を図16に示す。図16は、ISA51またはSWEを免疫アジュバントとして使用した際に、本発明の免疫原性製品の抗ヒトTNFα抗体の力価が著しく異ならないことを示しているウィルコクソン検定で求めたp値:0.018。実施例15に記載されているように、35日目D35に、ISA51またはSWEで乳化した本発明の製品の中和活性を測定した。結果を図17に示す。図17は、ISA51またはSWEを免疫アジュバントとして使用した際に、本発明の免疫原性製品がTNFαを中和する抗体を誘導する能力が著しく異ならないことを示しているウィルコクソン検定で求めたp値:0.089。実施例17:変形方法を用いた本発明の製品の調製以下のようにKinoidを調製した。1mgのhTNFαを、最初に1DMSOと共に使用緩衝液中で30分間インキュベートし、24時間KT94または72時間KT100の25mM0.25のグルタルアルデヒド処理によって、0.58mgのKLHと結合させた。グリシンによる失活0.1M、15分間によって反応を停止させた。中間体生成物を使用緩衝液中で10KDの膜で透析濾過した後、4日間の250mMのホルムアルデヒド処理により不活性化させる。グリシン0.37M、1時間による失活後、KinoidをPBS中で300KDで濾過する。最終製品を0.2μm濾過により滅菌し、4°Cで貯蔵する。KT94およびKT100製品に対して、本明細書において上に記載されている試験Aおよび試験Bを行った図18、表19および表20。結果は、試験Aでは100ng/ml濃度の製品KT94およびKT100が4の細胞を死滅させたことにより、KT94およびKT100は強力に不活性化されていることを示している。結果は、試験Bでは、100ng/ml濃度のKT94およびKT100において80を超える細胞が生存したことにより20未満の細胞溶解活性、KT94およびKT100は強力に不活性化されたままであることを示している。"