"標的モチーフに付着したα1-α2プラットフォームドメインを含む、非天然、単量体、可溶性の哺乳類MHCクラスI鎖関連MIC分子であって、前記標的モチーフは、MICのα3ドメインおよび1つ以上の異種ペプチドを含み、前記異種ペプチドは、非カルボキシ末端部位のループ1、ループ2、およびループ3からなる群から選択される1つ以上の部位内でMICのα3ドメインに挿入され、また、前記異種ペプチドは、前記標的モチーフの、1つ以上の標的細胞上の1つ以上の標的分子への結合を誘導し、それによって前記付着したα1-α2プラットフォームドメインを前記標的細胞に送達する、前記分子。前記α1-α2プラットフォームドメインおよび前記α3ドメインは、ヒトMICタンパク質に由来する、請求項1に記載の分子。前記α1-α2プラットフォームドメインは、ヒトMICAまたはMICBタンパク質の野生型α1-α2プラットフォームドメインと少なくとも80同一であり、前記α1-α2プラットフォームドメインは、NKG2D受容体に結合する、請求項1または請求項2に記載の分子。前記MICAタンパク質は、配列番号1~6、および13からなる群から選択される、請求項3に記載の分子。前記MICBタンパク質は、配列番号7~12からなる群から選択される、請求項3に記載の分子。前記MICAまたはMICBタンパク質は、その膜貫通ドメインを欠損している、請求項3または請求項5に記載の分子。前記α3ドメインは、欠失のない完全な野生型α3ドメインである、請求項1に記載の分子。前記α3ドメインは、野生型α3ドメインであり、前記ドメインの一部が欠失されている、請求項1に記載の分子。前記欠失している部分は、前記異種ペプチドの前記挿入部位の10アミノ酸残基内にある、請求項8に記載の分子。前記α3ドメインは、前記挿入部位とは異なる部位に、欠失、挿入、アミノ酸置換、突然変異、またはそれらの組み合わせを含む、請求項1に記載の分子。ループ1は、配列番号1~13からなる群から選択されるMICタンパク質の前記α3ドメインのアミノ酸数190~199に対応し、ループ2は、アミノ酸残基221~228に対応し、ループ3は、アミノ酸残基250~258に対応する、請求項1に記載の分子。ループ1、ループ2、またはループ3のうちの1つ以上の全体または一部が欠失し、前記異種ペプチドで置換される、請求項1~6、および8~11のいずれかに記載の分子。ループ1、ループ2、またはループ3のうちの1つ以上の全体が欠失し、前記欠失したループの片側または両側に隣接する前記α3ドメインのさらに1つ、2つ、3つ、4つ、または5つの追加のアミノ酸が欠失している、請求項12に記載の分子。ループと、前記欠失したループの両側の2つの追加のアミノ酸とが欠失し、その結果、配列番号1~13からなる群から選択されるMICタンパク質のα3ドメインのアミノ酸残基188~201、219~230、または248~260に対応する全体的な欠失をもたらす、請求項13に記載の分子。同じ標的分子に結合する異種ペプチドが、ループ1、ループ2、またはループ3のうちの2つまたは3つに挿入される、請求項1~14のいずれか1項に記載の分子。前記異種ペプチドは、同じアミノ酸配列を含む、請求項15に記載の分子。前記ループのうちの2つまたは3つが欠失し、異なる標的分子に結合する異種ペプチドで置換される、請求項1~6および8~14のいずれか1項に記載の分子。前記標的分子は、同じ細胞または細胞型上にある、請求項15または請求項16に記載の分子。前記標的分子は、異なる細胞または細胞型上にある、請求項15または請求項16に記載の分子。前記標的分子は、同じ細胞または細胞型上にある、請求項17に記載の分子。前記標的分子は、異なる細胞または細胞型上にある、請求項17に記載の分子。前記標的分子は、細胞表面分子である、請求項1に記載の分子。前記標的細胞は悪性であり、前記標的分子は、インテグリン、ErbB2、FGF1受容体、FGF2受容体、FGF3受容体、IGF1受容体、IGF2受容体、VEGF1受容体、VEGF2受容体、CD19、CD20、CD113、CD271、もしくは癌遺伝子によってコードされるタンパク質生成物、またはそれらの断片である、請求項1に記載の分子。前記標的細胞は、ウイルスに感染し、前記標的細胞上の前記標的分子は、ホスファチジルセリン、もしくはアクセサリータンパク質を含むホスファチジルセリン;またはウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、フラビウイルス、フィロウイルス、肝炎ウイルス、パピローマウイルス、サイトメガロウイルス、ワクシニア、ロタウイルス、インフルエンザ、パルボウイルス、西ナイルウイルス、狂犬病、ポリオーマ、風疹、ジステンパー、もしくは日本脳炎ウイルスによってコードされる表面糖タンパク質である、請求項1に記載の分子。前記異種ペプチドは、抗体の1つ以上の相補性決定領域である、請求項1に記載の分子。前記MIC分子がグリコシル化される、前記請求項のいずれか1項に記載の分子。前記分子が多様な個々の標的結合特性を有する、請求項1~26のいずれか1項に記載のMIC分子をコードする遺伝子を含むライブラリー。前記分子が多様な個々の標的結合特性を有する、請求項1~26のいずれか1項に記載のMIC分子を含むライブラリー。有効量の請求項1に記載の分子を哺乳動物に投与することを含む、悪性腫瘍またはウイルス感染を有することが疑われる前記哺乳動物を治療する方法であって、異種ペプチド一つまたは複数は、標的モチーフの、標的細胞上の標的分子への結合を誘導し、前記標的細胞は、悪性細胞またはウイルス感染細胞である、前記方法。前記投与される分子は、NKG2D保有細胞と前記悪性細胞または前記ウイルス感染細胞を結合し、その結果、前記NKG2D保有細胞の、前記悪性細胞または前記ウイルス感染細胞への接着をもたらす、請求項29に記載の方法。前記NKG2D保有細胞を接着することは、前記悪性細胞または前記ウイルス感染細胞の生存能を破壊する、請求項30に記載の方法。請求項1~26のいずれか1項に記載の非天然の単量体MIC分子をコードする核酸分子。請求項1~26のいずれか1項に記載の非天然の単量体MIC分子と、担体または賦形剤とを含む、組成物。本発明は、哺乳動物に投与した後、MICAまたはMICBタンパク質のNKG2D結合部分、すなわち、それらのα1-α2プラットフォームドメインα1ドメインおよびα2ドメインそれぞれにつき、アミノ酸1~85および86~178を、α1-α2プラットフォームに付着した標的モチーフを介して意図する標的分子または細胞標的上の分子に特異的に結合させることによって、特異的な細胞の標的細胞を攻撃するためにNK細胞および特定のT細胞を動員および活性化することができる可溶性、単量体、非天然のタンパク質分子について記載する。標的モチーフは、MICAまたはMICBタンパク質のα3ドメインを含み、挿入された異種ペプチド一つまたは複数が標的分子に結合する。異種ペプチドは、天然にはまたは通常はα3ドメイン内に存在しないペプチドである。いくつかの実施形態において、異種ペプチドは、可溶性MICAまたはMICBのα3ドメインの溶媒に暴露されたループのうちの1つに統合される。統合された異種ペプチドは、MICのα3ドメインの非末端構成要素であってもよく、MICα3ドメインの標的分子への結合を誘導する。異種ペプチドは、既存のループのいずれも欠失させることなく、ループの2つの隣接する残基の間でα3ドメインのループに挿入されてもよい。代替として、ループの全体または一部が欠失し、異種ペプチドで置換されてもよい。好ましい実施形態において、ループの全体が欠失し、インサートで置換される。さらなる実施形態において、ループの全体が欠失し、欠失部位の片側または両側に隣接するα3ドメインの1つ、2つ、3つ、4つ、または5つの追加のアミノ酸もまた欠失している。好ましい実施形態において、欠失部位の片側または両側の1つ、2つ、または3つの残基が欠失している。特定の態様において、配列番号1~13の188~201に対応する残基および/または残基250~258が欠失している。いくつかの実施形態において、1つ以上の残基を含むループの一部が欠失し、異種ペプチドで置換される。特定の実施形態において、欠失した部分は、ループの1つ~3つの残基であるか、またはループの1つ~5つのアミノ酸残基であるか、またはさらにはループの1つ~7つの残基である。具体的な実施形態において、欠失した部分は、挿入部位の10アミノ酸残基内にある。他の実施形態において、欠失した部分は、挿入部位の9、8、7、6、5、4、3、2、または1アミノ酸残基内にある。いくつかの実施形態において、異種ペプチドは、スペーサーおよび結合モチーフを含んでもよい。そのようなスペーサーは、その標的分子に結合できるように、または標的分子に結合する能力を向上させることができるように、異種ペプチドの結合モチーフを位置付けるために使用される、短い可撓性のリンカーペプチドであってもよい。具体的な実施形態において、異種ペプチドは、天然もしくは組換え抗体、別のタンパク質もしくはペプチド分子、または結合モチーフの補体決定領域の一部を含んでもよい。特定の実施形態において、異種ペプチドは、抗体の補体決定領域である。他の実施形態において、異種ペプチドは、付着した多糖または他の炭水化物、核酸分子のアプタマーまたは合成類似体等の核酸分子をさらに含む。異種ペプチド一つまたは複数を組み入れることによって、MICAまたはMICBタンパク質の非自然または非天然の、修飾または変換されたα3ドメインが生じ、それは、異種ペプチド一つまたは複数の結合特性例えば、同族の結合パートナーに基づいて、α1-α2プラットフォームの標的化を誘導する有用な機能を獲得する。本発明の非天然の一価分子は、一般的な提示表面に結合されないまたは限定されないという明確な利点を有し、それによって、修飾すること、製剤化すること、および従来の生物製剤として哺乳動物に投与することができる。好ましい実施形態において、本発明の非天然、可溶性の単量体MICタンパク質のループ1、ループ2、またはループ3のうちの1つより多くが異種ペプチドを含む。いくつかの実施形態において、異種ペプチドは、同じ標的分子に結合する。一態様において、異種ペプチドは、結合モチーフ内に同じアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、標的分子は、同じ細胞または同じ細胞型上にあってもよい。他の態様において、標的分子は、異なる細胞または細胞型上にあってもよい。他の実施形態において、異種ペプチドは、異なる標的分子に結合する。いくつかの態様において、標的分子は、同じ細胞または同じ細胞型上にあってもよい。他の態様において、標的分子は、異なる細胞または細胞型上にあってもよい。所望されるα3ドメインに対する修飾は、標的細胞例えば、悪性細胞またはウイルス感染細胞の表面上の分子等の標的分子に対するα3ドメインの結合の特異性または感受性を加えるかまたは増加させるものを含む。α1-α2プラットフォームドメインは、修飾された標的α3ドメインに繋ぎ止められ、哺乳動物の細胞間または血管内の空間において拡散性である。好ましくは、本発明の非天然MICタンパク質のα1-α2プラットフォームドメインは、ヒトMICAまたはMICBタンパク質の野生型または天然のα1-α2ドメインと少なくとも80同一または相同であり、NKG2D受容体に結合する。いくつかの実施形態において、α1-α2プラットフォームドメインは、ヒトMICAまたはMICBタンパク質の野生型または天然のα1-α2プラットフォームドメインと80同一であり、NKG2D受容体に結合する。他の実施形態において、α1-α2プラットフォームドメインは、ヒトMICAまたはMICBタンパク質の野生型または天然のα1-α2プラットフォームドメインと90、95、96、97、98、または99同一であり、NKG2D受容体に結合する。いくつかの実施形態において、α3ドメインは、ヒトMICAまたはMICBタンパク質の野生型または天然のα3ドメインと85同一いずれの修飾されたループも含まずにである。他の実施形態において、α3ドメインは、ヒトMICAまたはMICBタンパク質の野生型または天然のα3ドメインと90、95、96、97、98、または99同一いずれの修飾されたループも含まずにである。例示的なヒトMICAタンパク質可溶性形態は、配列番号1~6、および13を含む。例示的なヒトMICBタンパク質全タンパク質は、配列番号7~12を含む。他の実施形態において、異種ペプチドタグは、可溶性MICタンパク質の精製を補助するために、可溶性MICタンパク質のN末端またはC末端に融合されてもよい。タグ配列は、ポリヒスチジン、myc-ペプチド、またはFLAGタグ等のペプチドを含む。そのようなタグは、当業者に既知の方法によってMIC分子の単離後に除去されてもよい。本明細書で使用される場合、可溶性MICタンパク質、可溶性MICA、および可溶性MICBは、MICタンパク質のα1、α2、およびα3ドメインを含むが、貫通膜または細胞内ドメインを含まないMICタンパク質を指す。例示的な可溶性MICタンパク質は、配列番号1~13のアミノ酸残基1~274または1~276を含む。本明細書で使用される場合、完全なMICタンパク質は、α1、α2、およびα3ドメイン、膜貫通ドメイン、ならびに細胞内ドメインを含むMICタンパク質を指す。完全なMICタンパク質の例は、配列番号7~12に記載される。本発明は、MIC遺伝子のライブラリーまたはその結果生じる可溶性MICタンパク質をさらに提供し、ライブラリーの各メンバーは、標的細胞に対するその結合特性等の異なる特性を有するかまたは示すため、多様な分子のライブラリーが生じる。例えば、ライブラリーは、10以上の異なる結合特異性を表す多様な個々の標的結合特性を含むことができる。本明細書で使用される場合、多様な個々の標的結合特性とは、ライブラリーの個々のメンバーが、異なる標的分子に結合するか、または同じ標的分子に対して異なる親和性もしくは結合力を有する、MICタンパク質のライブラリーを指す。いくつかのMICタンパク質のライブラリーにおいて、2つ以上のメンバーが同じ標的に結合してもよいが、異なる結合親和性または結合力を有してもよい。本発明のさらなる実施形態において、悪性腫瘍またはウイルス感染を有する哺乳動物は、悪性またはウイルス性の状態に影響を与えるように有効量の可溶性MICタンパク質を投与することによって治療することができる。哺乳動物への分子の投与は、NKG2D保有NK細胞またはT細胞の標的悪性細胞またはウイルス感染細胞への接着をもたらし得、NK細胞またはT細胞が、標的悪性細胞またはウイルス感染細胞を破壊的に攻撃するかまたは破壊する。本発明の方法に照らして本明細書で使用される場合の破壊するという用語は、標的細胞の生存能を破壊することを意味する。本明細書で使用される場合、悪性または悪性の状態は、癌、一群の細胞が制御されない増殖を示す疾患のクラス、隣接する組織に侵入して破壊する浸潤、および場合によっては転移すなわち、リンパまたは血液を介して体内の他の場所に広がることを指す。いくつかの実施形態において、悪性腫瘍は、白血病、リンパ腫、または骨髄腫である。具体的な実施形態において、白血病は、急性リンパ性白血病ALL、急性骨髄性白血病AML、慢性リンパ性白血病CLL、慢性骨髄性白血病CML、有毛細胞白血病、または急性単球性白血病AMOLであり、リンパ腫は、ホジキンリンパ腫または非ホジキンリンパ腫であり、骨髄腫は多発性骨髄腫である。他の実施形態において、悪性腫瘍は、乳癌、卵巣癌、肺癌、前立腺癌、膵臓癌、脳癌、神経膠芽腫、頭頸部癌、結腸癌、食道癌、肝臓癌、胃癌、子宮癌、内分泌癌、腎癌、膀胱癌、または子宮頸癌を含む悪性固形腫瘍である。好ましい実施形態において、悪性腫瘍は、乳癌、卵巣癌、肺癌、前立腺癌、膵臓癌、脳癌、神経膠芽腫、頭頸部癌、または結腸癌である。より好ましい実施形態において、悪性腫瘍は乳癌である。また、本発明は、MICタンパク質のα3ドメインたとえば、配列番号1~13のアミノ酸182~274を、NKG2D保有NK細胞またはT細胞を誘引するか、動員するか、またはそれらに結合するために、その繋ぎ止められたα1-α2ドメインを細胞間空間から標的細胞表面に直接送達することができる特異的な標的ドメインに変換する手段も含む。これらの受動ワクチンの用途は、病的であるにもかかわらず、NK細胞または特定のT細胞を攻撃するために必要な適切なレベルのMICAまたはMICB等のリガンドを発現しない病的細胞を破壊することである。例えば、ヒト肺癌のわずか30がMICAを発現するBusche,Aetal.2006。神経膠芽腫細胞は、先天性の免疫攻撃を防止するNK細胞阻害シグナルを過剰発現するが、実験動物の肺癌または神経膠芽腫細胞における天然MICA遺伝子産物の過剰発現は、NK細胞の癌に対する効果的な攻撃を回復するFriese,M.etal.2003。NKG2D受容体に結合したヒトMICAの高分解能構造が解明されており、MICAのα3ドメインは、NKG2D受容体と直接的には相互作用しないことが示されているLietal.2001.ComplexstructureoftheactivatingimmunoreceptorNKG2DanditsMHCclassI-likeligandMICA.NatureImmunol.2:443-451;ProteinDataBankaccessioncode1HYR。MICAのα3ドメインは、MICBのα3ドメインと同様に、短い可撓性のリンカーペプチド、アミノ酸175~182[配列番号1~13]によってα1-α2プラットフォームドメインに接続され、それ自体がプラットフォームと、MICを発現する細胞の表面との間のスペーサーとして天然に位置する。ヒトMICAおよびMICBのα3ドメインの三次元構造は、ほぼ同一であり94C-αα’s上で平均二乗距離の平方根<1Å、機能的に交換可能であるHolmesetal.2001.StructuralStudiesofAllelicDiversityoftheMHCClassIHomologMICB,aStress-InducibleLigandfortheActivatingImmunoreceptorNKG2D.JImmunol.169:1395-1400。さらに、MICタンパク質のIg様α3ドメインの三次元構造は、テンダミスタットの構造に類似し、また配列反転形態においては、10番目のヒトフィブロネクチンドメインIII型の構造に類似している:どちらの構造も、タンパク質結合モチーフを操作するための足場としての役割を果たしてきたPflugrath,JW,GWiegand,RHuber,LVertesy1986Crystalstructuredetermination,refinementandthemolecularmodeloftheα-amylaseinhibitorHoe-467A.J.Molec.Biol.189:383-386;KoideA,BaileyCW,HuangX,KoideS.1998.ThefibronectintypeIIIdomainasascaffoldfornovelbindingproteins.J.Mol.Biol.284:1141-1151;Li,R,RHHoess,JSBennettandWFDeGrado2003Useofphagedisplaytoprobetheevolutionofbindingspecificityandaffinityinintegrins.ProteinEngineering16:65-72;Lipovsek,D.etal.2007Evolutionofaninter-loopdisulfidebondinhigh-affinityantibodymimicsbasedonfibronectintypeIIIdomainandselectedbyyeastsurfacedisplay:molecularconvergencewithsingle-domaincamelidandsharkantibodies.J.MolBiol368:1024-1041;米国特許第7153661号;ProteinDataBankaccessioncode1TTG。本発明の一態様は、MICAまたはMICBのα3ドメインの溶媒に暴露された6つのループのうちの1つ以上に、遺伝子操作によって特異的結合特性を持たせることを企図し、哺乳動物への投与後、血管内または細胞間空間内に拡散し、続いて、意図する標的細胞上の標的分子に高い感受性および特異性で付着することができ、それによって、結合ならびにそれに続くNKG2D保有NKおよび/またはT細胞による特定の標的細胞の破壊的攻撃を促進することができる、可溶性の非天然MIC分子が形成される。標的悪性細胞上の表面接近性分子の例は、インテグリン、癌遺伝子産物またはそれらの断片、例えば、NK-1R、ヒト上皮増殖因子2Her2またはErbB2、増殖因子受容体、例えば、上皮増殖因子受容体EGFR、FGF受容体3、CD30、CD19、CD20、血管新生因子受容体血管内皮増殖因子VEGF受容体およびVEGF関連分子のため等、メラノーマ抗原、ならびにLNcaPおよびPC-3前立腺癌細胞の抗原を含む。標的ウイルス感染細胞上の表面接近性分子は、アポリポタンパク質H、Gas6、MFG-E8等のアクセサリータンパク質を有するかまたは有しない裏表が反転したホスファチジルセリン;ウイルスによってコードされる抗原、ウイルスによってコードされる肝炎ウイルスの抗原;アデノウイルス;サイトメガロウイルス;他のヘルペスウイルス;HIV特にpI7;ワクシニア;ポックスウイルス;ロタウイルス;インフルエンザ;パルボウイルス;西ナイルウイルス;狂犬病;ポリオーマ;パピローマウイルス;風疹;ジステンパー;および日本脳炎ウイルスを含むBalasubramanian,KandSchroit,AJ.2003.Ann.Rev.Physiol.65:701-734;Soares,MM,SWKingPEThorpe.2008Targetinginside-outphosphatidylserineasatherapeuticstrategyforviraldiseases.NatureMedicine14:1358-62;Slavuljicaetal,2010。本発明の組成物は、合成DNA、バクテリオファージディスプレイ、または酵母表面ディスプレイもしくは細菌表面ディスプレイ技術これらのうちのいくつかは、テンダミスタットおよび10番目のヒトフィブロネクチンドメインIIIに特異的結合特性を形成するために展開されているを展開して、MICAまたはMICBのα3ドメインに特異的な結合モチーフを導入することによって生成することができるMcConnell,SJandRHHoess,1995TendamistatasaScaffoldforConformationallyConstrainedPhagePeptideLibraries.J.Molec.Biol250:460-470;Lietal.2003;Sidhu,S.S.S.Koide2007Phagedisplayforengineeringandanalyzingproteininteractioninterfaces.CurrentOpinioninStruct.Biol.17:481-487;Lipovsek,D.etal.2007。これらの方法は、溶媒に暴露されたループ内で高度に多様化され、選択、スクリーニング、またはパニング全て当業者に既知であるによって、所望の表現型の結合特性を示すこれらのα3ドメインをコードする遺伝子型をそこから単離するための、α3ドメイン構造のライブラリーを作製することを伴う。Millerらの多様性を生成するレトロエレメントDGRは、ループ内の多様なアミノ酸位置に多様性を生成する方法の一例であるMedhekar,B.J.F.Miller.2007.Diversity-GeneratingRetroelements.CurrentOpinioninMicrobiol.10:388-395、および米国特許第7,585,957号。ヒトMICAおよびMICBのα3ドメインは、276個のアミノ酸の水溶性形態うちの95個のアミノ酸182~276からなっているため、全ての溶媒に暴露されたループ、たとえば、配列番号1~13のアミノ酸190~199、208~211、221~228、231~240、250~258、または264~266が多様化されてもよく、またさらには、操作可能であることが分かっている長さである200ヌクレオチドを超えない長さの合成鋳型反復配列TemplateRepeat:TRを展開して突然変異誘発をホーミングすることにより、挿入したアミノ酸によって伸長されてもよいGuo,Hetal.2008.Diversity-GeneratingRetroelementHomingRegeneratesTargetSequencesforRepeatedRoundsofCodonRewritingandProteinDiversification.MolecularCell31,813-823。いくつかの要因によって、α3ドメインの、多様化された、溶媒に暴露されたループのDGRベースのライブラリの作成が誘導される。第1に、DGRは、可変反復配列variablerepeat:VRと称される、タンパク質をコードするDNA配列の所定のセグメントに多様性を生成する。いくつかの異種配列は、VRとして機能するために、それらの末端で変異原性ホーミングの開始initiationofmutagenichoming:IMH配列と隣接する。IMH配列は、変異原性ホーミングを誘導し、配列の多様化の3’境界を決定する、シス作用部位としての役割を果たす。第2に、VRの多様化の5’境界は、VRとその同族TRとの間の相同性の程度によって決定され得る。部分的な相同性のみが必要とされ、ミスマッチも許容される。第3に、多様化に供されるVRの特異的部位は、TRにおけるアデニン残基の位置によって決定され得る。合成TRの適切な位置にアデニン残基を挿入することによって、特異的なVRによってコードされるアミノ酸残基を多様化することができる。第4に、atdタンパク質、TRによってコードされるRNA中間体、およびRT逆転写酵素は、異種プロモーター、例えば、PtetAまたはPbad-の制御下でプラスミドベクターpDGR上に発現されたときに効率的にトランスで機能する。このことは、細菌細胞内の多様化を切り換えるための便利な手段、および多様化される正確な部位をプログラムするための合成TR配列への便利なアクセスを提供する。さらに、トランス作用構成要素の高レベルの発現は、高効率の多様化をもたらす。α3ドメインを多様化するためのDGRベースのアプローチの一般的な概要を図5に示す。多様化される配列は、α3ドメインのループに対応する。IMH配列は、α3ドメインをコードする遺伝子の停止コドン約AV277のすぐ下流に位置し、多様化に供される合成VRを作製するα3ドメインをコードする合成VRは、プラスミドpDGR上の合成TRによって多様化される図5。このTR要素は、IMHと、VRに相同な上流配列とを含む。突然変異誘発に供される特異的なVR残基は、TRにおけるアデニンの置換によって正確にプログラムされ、高密度のアデニン残基がシステムによって許容され得る。また、pDGRは、AtdおよびRT逆転写酵素をコードする座位も含む。Atd、TR、およびrtは、厳重に抑制されたtetAプロモーター/オペレーターPtetAから発現され、アンヒドロテトラサイクリンの添加または除去により、多様化プロセスの正確な制御を可能にする。標準的なファージディスプレイ形式において、DGR機構を介してα3ドメインを多様化することを検討することは有益である。この場合、α3ドメインは、大腸菌においてファージミドベクター上でコードされる繊維状ファージコートタンパク質に融合される。VRは、α3ドメインの溶媒に暴露されたループを含み、pDGRは、それらのループ内の指定された場所で効率的にVRを多様化するように設計されるGuoetal.2008。atd、TR、およびrtの発現を活性化することにより、ファージミドゲノム上に存在するVR配列の突然変異が誘発される。この結果、ファージのライブラリーが作製され、それらの各々が、その表面上で多様化された結合タンパク質を表し、コード化DNAパッケージングする。所望の特異性は、固定化された標的分子、例えば、癌遺伝子Her2の表面露出タンパク質生成物にファージを結合させ、非結合ファージを除去するために洗浄し、再増幅および濃縮することによって選択される。選択された表現型のさらなる最適化のラウンドは、単純に、pDGRを含む大腸菌を選択またはパニングされたファージに感染させ、上述のステップを繰り返すことによって効率的に達成することができる。このシステムは、従来のアプローチによって達成されるものよりも数桁大きいライブラリーサイズを生成することができる。α3ドメイン骨格の完全性を犠牲にすることなく、累積的な改善を伴って連続ラウンドの最適化が達成され得る容易さも、等しく有利である。大腸菌等の細菌の表面上に多様化したタンパク質を表示することは、ファージディスプレイに優る潜在的な利点を提供する代替のアプローチである。例えば、いずれのファージも作製する必要なく、または選択されたファージの複数ラウンドの感染を繰り返す必要もなく、連続ラウンドの最適化を達成することができる。また、α3ドメインは、直接的な生化学的または物理的分析のために細菌の表面から切断されるように設計することができる。DGRは、40を超える細菌種のゲノム内に天然に見られるが、いずれも大腸菌において同定されていない。しかしながら、最近、レジオネラニューモフィラ由来のDGRのシスおよびトランス作用構成要素が大腸菌において効率的に機能することがMillerらによって示された。MICAまたはMICBの多様化されたα3ドメインは、非限定的な例として、腸管病原性大腸菌によってコードされたEaeAインチミンタンパク質の外膜局在化およびアンカードメインから構成される融合タンパク質として、大腸菌の表面上で発現されるLuoY,FreyEA,PfuetznerRA,CreaghAL,KnoechelDG,HaynesCA,FinlayBB,StrynadkaNC.2000CrystalstructureofenteropathogenicEscherichiacoliintimin-receptorcomplex.Nature.405:1073-7。EaeAは、タンパク質を外膜にアンカリングする約500アミノ酸のN末端セグメントからなり、転位を促進するポリン様構造を有する逆平行βバレルを形成すると考えられるTouzeT,HaywardRD,EswaranJ,LeongJM,KoronakisV.2004Self-associationofEPECintiminmediatedbythebeta-barrel-containinganchordomain:aroleinclusteringoftheTirreceptor.MolMicrobiol.51:73-87。この転位ドメインの後には、一連のIg様モチーフと、腸上皮表面への結合に寄与するC末端C型レクチンドメインとが続く図6。インチミンの細長い構造と、異種タンパク質ドメインを大腸菌外膜の外面に輸出してアンカリングするその能力は、それが、多様化されたα3タンパク質の表面ディスプレイのための理想的かつ用途の広い融合パートナーであることを示唆しているWentzelA,ChristmannA,AdamsT,KolmarH.2001.DisplayofpassengerproteinsonthesurfaceofEscherichiacoliK-12bytheenterohemorrhagicE.coliintiminEaeA.JBacteriol.183:7273-84;AdamsTM,AWentzel,andHKolmar2005Intimin-MediatedExportofPassengerProteinsRequiresMaintenanceofaTranslocation-CompetentConformation.J.ofBacteriology,187:522-533。MICAおよびMICBの天然の配向では、C末端が細胞膜にアンカリングされるI型膜タンパク質。α3ドメインは、N末端のα1-α2プラットフォームと細胞膜との間に存在する。しかしながら、これらのα3ドメインのループをα1-α2プラットフォームから離れて突出するように多様化するために、反対の配向例えば、II型膜タンパク質が所望される、すなわち、配列番号1~13のアミノ酸位置190~199、221~228、250~258に位置するループ等のループが標的分子の結合に容易に利用可能となるように、N末端で図1のα3ドメインのリンカー部分をEaeAに付着させる。そのようなII型膜タンパク質の配向は、正に図6のEaeAの配向である。さらに、α3ドメインは、EaeAと同様にIg様モチーフを有するため、EaeAはα3ドメインを大腸菌表面に転位させるLietal.1999.CrystalstructureoftheMHCclassIhomologMICA,aγδΤcellligand.Immunity10:577-584。実際、EaeAが異種パッセンジャーポリペプチドを転位させる能力は文献に記述されているWentzeletal.2001;Adamsetal,2005。EaeA-α3融合タンパク質は、araBADプロモーターPbadから発現され、増殖培地に加えられたアラビノースの濃度に用量依存性の様式で応答する。これにより、細菌細胞の表面上でα3ドメインの密度を正確に制御することができる。多様化システム、例えば、レジオネラニューモフィラatdTRrt配列pDGR、図2は、マルチコピープラスミド上で厳重に制御されたtetAプロモーター/オペレーターの制御下に置くことができる。atdTRrt配列の発現は、増殖培地にアンヒドロテトラサイクリンを添加することによって誘発され、α3VR配列の高頻度な多様化をもたらす。一旦、多様化が達成されると、増殖培地から誘発物質を除去することによりシステムα3-VRが安定状態にロックされる。多様化は、α3-VRの多様化を誘発するために、EaeA-α3融合タンパク質およびアンヒドロテトラサイクリンの発現を誘導するようにアラビノースの存在下で表面ディスプレイ大腸菌を増殖することによって最初に達成される。該当する結合特性を示す細菌細胞は、蛍光活性化セルソーティングFACSまたは磁気ビーズ分離法等の標準的な方法を使用して濃縮することができる。選択された細菌細胞は、アラビノースの存在下およびアンヒドロテトラサイクリンの非存在下で成長させることによって増幅される。さらなる濃縮ステップが含まれてもよく、単純にプロトコルを繰り返すことによって追加ラウンドの最適化を達成することができる。重要なのは、NK細胞またはT細胞の攻撃のために望ましくない標的に結合するα3ドメインは、所望の結合特性の選択前に、例えば正常な組織に対してパニングすることによって、多様化ライブラリーから枯渇させることができるということである。選択されたα3タンパク質は、FactorXaプロテアーゼの添加によって細菌細胞の表面から切断することができ、次いで、さらなる特徴付けおよび使用のために6xHisタグ化C末端ドメインの親和性精製によって精製される。これにより、選択されたα3ドメインの構造および機能に関する簡便な生化学的または物理的分析が可能となる。所望の非天然α3ドメインをコードする単離されたDNAを、α1-α2プラットフォームドメインをコードするMIC遺伝子の一部に融合することにより、いずれの場合においても、リンカーまたはテザーアミノ酸177-182を介して所望の非天然α3ドメインを残りの可溶性MICタンパク質に再導入し、単離されたα3ドメインの特異性および感受性を有する所望の受動的NK細胞ワクチンを作製することができる。選択された遺伝子型は、細菌、酵母、昆虫、または哺乳類細胞において非天然または非自然の、可溶性の同族MICタンパク質を生成および単離するために使用することができる。生成されたMICAは、要求される程度まで精製され、インビトロおよびインビボで安定化するための利用可能な方法によって製剤化され、ヒトまたは他の哺乳動物に非経口的にまたは他の経路によって投与されることができ、そこで、先天性免疫系の細胞構成要素による標的攻撃を促進することにより、悪性腫瘍またはウイルス性疾患を治療するために拡散することができる。いくつかの実施形態において、非天然MIC分子は、薬学的に許容される賦形剤または担体とともに製剤化される。そのような構成要素は、過度の有害な副作用なくヒトまたは動物に使用するために好適な構成要素である。有害な副作用の非限定的な例は、毒性、刺激、および/またはアレルギー反応を含む。賦形剤または担体は、通常、妥当な利益/リスク比に見合ったものである。多くの実施形態において、担体または賦形剤は、局所または全身投与に好適である。非限定的な薬学的な担体は、滅菌水溶液または非水溶液、懸濁液、およびエマルションを含む。その例は、限定されないが、リン酸緩衝生理食塩水、水、油/水エマルション等のエマルション、および種々の種類の湿潤剤等の標準的な薬学的賦形剤を含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、およびオレイン酸エチル等の注射可能な有機エステルである。水性担体は、食塩水および緩衝媒体を含む、水、アルコール/水溶液、エマルション、または懸濁液を含む。非経口ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸化リンゲル、またはおよび固定油を含む。静脈内ビヒクルは、流体および栄養補充剤、電解質補充剤リンゲルデキストロースなどに基づくもの等を含む。任意選択的に、本開示の非天然MIC分子を含む組成物は、当該技術分野で周知の手段を使用して凍結乾燥または噴霧されてもよい。その後の再構成および使用は、当該技術分野で既知であるように実践することができる。経口的および局所的使用に好適な薬学的グレードの有機または無機担体および/または希釈剤が、治療的に活性な化合物を含む組成物を作製するために使用されてもよい。安定化剤、湿潤剤および乳化剤、浸透圧を変化させるための塩、または適切なpH値を確保するための緩衝液が含まれてもよい。非天然MIC分子は、通常、安全かつ有効な量または濃度で使用され、それは、上述のような過度の有害な副作用なく所望の治療応答をもたらすのに十分な量を意味する。非天然MIC分子は、そのインビボでの薬物動態特性を変化させるために生化学的に修飾されてもよい。循環タンパク質分子の半減期を増加させるための周知の方法は、MICタンパク質の結合機能に影響を及ぼすことなく、基本構造にポリエチレングリコールPEGを化学的に付着すること、または、遺伝子操作により、グリシンおよびセリン等の天然アミノ酸のポリマーをN末端、C末端、または内部配列番号1~13のアミノ酸179~182のα1-α2とα3ドメインとの間のテザー内等に付加することである。非天然MIC分子は、治療的に有効な量または濃度で使用されてもよく、それは、所望の治療応答を生じさせるための量を指し、例えば、限定されないが、標的細胞を死滅させるのに十分なNK細胞またはT細胞を動員するために標的細胞に結合するために効果的な量である。安全かつ有効な量または治療的に有効な量は、種々の要因に伴って変化するが、過度の実験を行うことなく、熟練した医師によって容易に決定され得る。要因の非限定的な例は、治療される具体的な状態、対象の物理的状態、治療される対象の種類、治療の期間、ある場合は併用療法の性質、および用いられる特定の製剤を含む。~を含むincluding、~を含むcontaining、または~によって特徴付けられると交換可能に使用される含むcomprisingという用語は、包括的または開放型言語であり、追加の列挙されていない要素または方法ステップを除外しない。~からなるという句は、特許請求の範囲に規定されていないあらゆる要素、ステップ、または成分を除外する。~から本質的になるという句は、特許請求の範囲の範囲を、規定される材料またはステップ、および請求される発明の基盤および新規特徴に大きな影響を及ぼすことのないものに限定する。本発明の開示は、これらの句の各々の範囲に対応する本発明の実施形態、組成物、および方法を企図する。よって、列挙される要素またはステップを含む組成物または方法は、組成物または方法が、これらの要素またはステップから本質的になるかまたはなる具体的な実施形態を企図する。本明細書に列挙される全ての参考文献は、以前に明示的に組み込まれているかまはいないかにかかわらず、参照によって、それらの全体が本明細書に組み込まれる。本明細書で使用される場合、a、an、およびanyという用語は、各々、単数形および複数形の両方を含むことを意図する。本発明について十分に説明してきたが、当業者は、本発明の主旨および範囲から逸脱することなく、また過度な実験を行うことなく、様々な同等のパラメータ、濃度、および条件においてそれを実施することができることを理解するであろう。本発明は、その特定の実施形態に関連して説明されてきたが、さらなる変更が可能であることを理解されたい。本出願は、一般に本発明の原理に従い、また本発明が関連する技術における既知のまたは一般的な慣行に属するような、本発明の開示からのそのような逸脱を含む、本発明のいかなる変形、使用、または改作も包含することを意図し、上文に記載される本質的な特徴に適用されてもよい。本明細書において提供される場合、所望の表現型をコードするDNAを単離するために選択、スクリーニング、またはパニングを可能にするために、どちらも当業者に周知である2つの技術を使用して、MICAのα3ドメインの遺伝子型をその結合表現型に物理的に付着した。第1の技術は、α3ドメインをコードするDNAを内部に持つ細菌の表面にα3ドメインが表示される、細菌表面ディスプレイである。第2の技術は、コードするDNA、遺伝子型がファージゲノム内にある、キメラファージのカプシドタンパク質としてのα3ドメインのバクテリオファージディスプレイである。表示されたα3ドメインの表現型を反映する結合表現型を有する可溶性の修飾されたヒトMICA分子を作製するためにα3ドメインの遺伝子型を使用する能力も、本明細書において証明される。1.大腸菌の表面上におけるMIC-α3ドメインタンパク質の表示端的に述べると、α3ドメインをコードするDNAを大腸菌eaeAインチミン遺伝子の一部に融合し、その結果得られた融合タンパク質を、α3ドメインが細菌表面に遠位であるそのC末端部分と方向を合わせるような様式で、大腸菌の表面上で発現させた。オリゴヌクレオチドのAV1401配列番号15およびAV1402配列番号16をキナーゼ化し、アニーリングし、NdeIおよびNcoIで消化したプラスミドpET30aNovagenのアリコートに連結して、pelB分泌シグナル配列を含むpSW249を作製した。プラスミドpSW249をNcoIおよびBlpIで消化し、キナーゼ化およびアニーリングしたオリゴヌクレオチドAV1445配列番号17およびAV1446配列番号18に連結してpSW263を作製した。この構築物は、pelB配列の次の6つのヒスチジン残基配列番号127をコードする配列を含んでいた。5’非翻訳配列の一部、シグナル配列、および成熟コード配列のコドン1~276、続いて停止コドンを含むヒトMICAのcDNAを、プライマーAV1466配列番号19およびAV1448配列番号20を使用して、ヒト脾臓一本鎖cDNAInvitrogenより調達からPCRにより増幅した。PCR断片をNheIおよびHindIIIで消化し、同じくNheIおよびHindIIIで消化したpCDNA5-FRTInvitrogenに連結してpSW265を作製した。定方向突然変異誘発により3つの突然変異G14W、A24T、およびE125KのMICAコード化領域を修正してpSW271を作製した。プライマーAV1447配列番号21およびAV1448配列番号20を用いてpSW271の一部をPCR増幅した。PCR断片は、tevプロテアーゼ切断部位ENLYFQG配列番号128、続いてヒトMICAのコドン1~276からなっていた。このPCR断片をXhoIIIおよびHindIIIで消化し、同じくXhoIおよびHindIIIで消化したプラスミドpSW263のアリコートに連結してプラスミドpSW286を作製した。AV1408配列番号22およびAV1409配列番号23プライマーを使用して大腸菌EDL933ゲノムDNAからeaeA遺伝子を増幅した。このPCR産物をBamHIおよびHindIIIで消化し、同じくBamHIおよびHindIIIで消化したBluescript-SKDNAStratageneに連結してpSW284を作製した。プライマーAV1602配列番号24およびAV1603配列番号25を使用してプラスミドpSW284の一部をPCR増幅した。PCR断片をNdeIおよびXhoIで消化し、同じくNdeIおよびXhoIで消化したpSW286のアリコートに連結してSW289を作製した。プライマーkk43配列番号26およびkk44配列番号27を用いてpSW289の一部をPCR増幅した。その結果得られた、tevプロテアーゼ切断部位ENLYFQG配列番号128、続いてMICAの残基181~276をコードする配列注:連続する6C’sを分割するために、PI83のコドンをCCCからCCAに変更したを含むPCR断片をXhoIおよびHindIIIで消化し、XhoIおよびHindIIIで消化したpSW289の別のアリコートの消化物からアガロースゲル上で精製された約7185bpの断片に連結してpKK5を作製した。7185bpの断片で、EaeA1~659、その後にGG、次いでFactorXaによる切断部位IEGR配列番号129、6つのHis残基配列番号127、次いで、XhoI部位を提供することの他は機能のないLEをコードするXhoI部位をコードした。プライマーkk52配列番号28およびkk45配列番号29を用いてpKK5をPCR増幅した。NcoIおよびHindIIIでPCR断片を消化し、NcoIおよびHindIIIで消化したpBAD24ATCCからのアリコートに連結してpKK29を作製した。製造業者の推奨に従って、クローン株である大腸菌NEB10-βNewEnglandBioLabsカタログ番号AVC3019HにプラスミドpKK29を形質転換し、100μg/mlカルベニシリンに対する耐性のために選択した。pKK29で形質転換した大腸菌細胞のアラビノース誘導型および非誘導型の細胞質タンパク質、内膜タンパク質、および外膜タンパク質を各々単離し、SDS-PAGEにより分析した。SDS-PAGEゲルをクマシーブルーで染色するか、またはヒトMICAタンパク質に対すル抗体を用いてウエスタンブロットした。OD600が0.915に等しくなるまでLB/Carb100中で細胞を増殖させた。10mlの細胞のアリコートを2本の50ml円錐管の各々に加えた。一方の管は0.002アラビノースで誘導し、他方は誘導しないままにした。37°Cで1時間振盪しながらサンプルをインキュベートした。Eppendorf5810R卓上型遠心機にて10分間4000rpmで細胞を遠心分離した。上清を廃棄し、6mlのFP緩衝液0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液pH7.0、0.1MKCl、5mMEDTA、1mMジチオスレイトール、1mMフッ化フェニルメチルスルホニル中に細胞ペレットを緩やかに再懸濁し、15ml円錐管に移した。BiologiesIncの300V/Tモデル超音波ホモジナイザーを使用して、6×15秒のバーストで細胞を超音波処理した。バースト間に氷上でサンプルをインキュベートした。超音波処理後、Eppendorf5810R卓上型遠心機にて管を5分間4000rpmで遠心分離にかけ、破損した細胞を全て除去した。上清をBeckmanポリカーボネート遠心管カタログ番号AV355631に移し、Type60Tiローターを使用して、BeckmanL8-80M床置き型超遠心機にて100,000Xgで1時間4°Cで回転させた。細胞質タンパク質を含む上清を新しい管に移し、4°Cで保存した。2mlのME緩衝液10mMTris-HClpH8.0、35mMMgCl2、1TritonX-100中に細胞膜のペレットを再懸濁した。サンプルを2時間25°Cで緩やかに振盪し、次いで、Type60Tiローターを使用して、BeckmanL8-80M床置き型超遠心機にて100,000Xgで30分間4°Cで再度遠心分離した。細胞膜のTriton可溶性タンパク質を含む上清を新しい管に移し、4°Cで保存した。外膜タンパク質を含む最終的なペレットSchnaitman,CA.1971.SolubilizationoftheCytoplasmicMembraneofEscherichiacolibyTritonX-100.J.Bacteriology108:545-552を0.1mlの水に再懸濁し、SDS-PAGEによる分析に供する前に同じく4°Cで保存し、クマシーブルーで染色するか、またはヒトMICAに対するヤギポリクローナル抗体を使用してウエスタンブロットした図2。SDS-PAGE分析では、サンプルを等量のNovexTris-GlycineSDS2Xサンプル緩衝液InvitrogenAVLC2676と混合し、4~20Tris-GlycineGradientGelInvitrogenAVEC60285BOX上で電気泳動した。ウエスタンブロット法では、スラブゲル中で電気泳動したサンプルのレーンをInvitrogenXCellIIBlotModuleAVEI9051を使用してニトロセルロース膜InvitrogenNitrocelluloseMembraneFilterPaperSandwichAVLC2001に移した。5牛乳-リン酸緩衝生理食塩水、Tween-20PBST中、4°Cで膜フィルターを一晩ブロックした。一次抗体抗ヒトMICA抗体-RDSystemsAVAF1300を、5牛乳-PBST中、1:500の希釈率で使用した。その結果得られたフィルターのブロットを緩やかに振動させながら2時間25°Cでインキュベートした。続いて、フィルターのブロットをPBSTで20分間25°Cで洗浄し、その後、5牛乳-PBST中、1:1000の希釈率で二次抗体抗ヤギIgG-HRP抗体-RDSystemsAVHAF017を加えた。フィルターのブロットを2時間25°Cで振動させ、次いで、再びPBSTで20分間洗浄した。NovexHRPChromogenicSubstrate-TMBInvitrogenAVWP20004を用いてフィルターのブロットを展開した。独立した方法によりα3ドメインの細菌表面ディスプレイを確認するために、インタクトな、アラビノース誘導型および非誘導型大腸菌の蛍光顕微鏡法により、誘導型培養由来のインタクトな細菌の表面にのみ、MICAのα3の染色を確認した。2.内部標的ドメインを有する可溶性の非天然ヒトMICタンパク質の生成ヒトMICAは天然にグリコシル化されているが、その非グリコシル化形態は、その受容体であるNKG2Dにインビトロで結合するLietal,2001。しかしながら、インビトロで、そして最終的にはインビボでヒト様グリコシル化形態を評価できるように、我々は、培養したヒト細胞においてMICAを発現させた。発現のために、ヒトCMVプロモーターおよびウシ成長ホルモンbghポリアデニル化シグナルを有する一過性発現ベクターpcDNA5/FRTに、2つの一般的なヒト対立遺伝子を挿入した図3。機能的なプラスミド構築物プライマーAV1466配列番号30およびAV1448配列番号31を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応PCRによりヒト脾臓一本鎖cDNALifeTechnologies/Invitrogenより入手可能から適切なDNA配列を増幅することによって、成熟HUMMHCREPヒトMHCクラスI関連タンパク質mRNAの分泌シグナル配列およびコドン1~276を得た。増幅DNA産物をNheIおよびHindIII制限酵素で消化し、得られた産物をNheI/HindIIIで消化したpCDNA5/FRTInvitrogenに連結してpSW265を作製した。pSW265の挿入されたPCR産物のDNAを配列決定し、NheI部位の後にb5’非翻訳UT配列の26塩基、その後に成熟HUMMHCREPの分泌シグナル配列およびコドン1~276、その後に終止コドン、その後にHindIII部位を含むことを確認した。コード化配列が、翻訳された場合にアミノ酸の違いを生じるように意図する配列から逸脱した場合、アミノ酸配列が、配列番号13のように記載される配列の関連部分アミノ酸1~276と一致するように、部位特異的突然変異誘発によりコドンを変更したNewEnglandBioLabsPhusion登録商標部位特異的突然変異誘発キットおよび適切なプライマーを使用。修正されたプラスミドはpSW271と称され、5’UT配列の26塩基をコードする修正されたDNA配列、その後に成熟HUMMHCREPの分泌シグナル配列およびコドン1-276、その後に終止コドン、配列番号14を含んでいた。プライマーAV1490配列番号32およびAV1489配列番号33ならびにpSW271を使用してPCR産物を生成し、続いてBamHIおよびBsmBIで消化し、pSW271の約5259bpのBamHI/BsmBI断片に連結した。その結果得られた構築物pSW275は、BsmBI部位を欠損している。NewEnglandBioLabsPhusion登録商標の部位特異的突然変異誘発キットならびにプライマーAV1493配列番号34およびAV1494配列番号35を使用して、2つのBsmBI部位をpSW275のMICAコード化領域に挿入してpSW276を作製した。MICAコドン125がAAGLysの代わりにGAGGluであることを除いて、プラスミドpSW267はpSW271と同じである。これは、部位特異的突然変異誘発によりpSW265から得たNewEnglandBioLabsPhusionキットをプライマーAV1478配列番号39およびAV1479配列番号40とともに使用。この突然変異誘発により、GGGGly~TGGTrpのMICAコドン14およびGCTAla~ACTThrのコドン24を変更した。プライマーAV1486配列番号41およびAV1487配列番号42を使用して、部位特異的突然変異誘発によりpSW267からプラスミドpSW273を作製した。pSW273は、シグナルペプチドと成熟ペプチドの残基1との間に6つのヒスチジンコドンを含む。部分的hphハイグロマイシン耐性遺伝子からBsmBI部位が欠失されていることを除いて、プラスミドpKK33はプラスミドpSW273と同一である。プライマーAV1490配列番号32および1489配列番号33を用いて増幅することによりプラスミドpSW273からPCR断片を得た。この約727bpの断片をBamHIおよびBsmBIで消化し、pSW273の約5277bpのBamHI/BsmBI消化断片に連結した。これにより、BsmBI部位が除去され、pKK34が作製された。次に、MICAのα3ドメインのループ1に結合配列を挿入するためのpKK34に由来する構築物について説明する。以下のループ1の構築物は、MICAのT189とV200との間に指定された異種ペプチドインサートを挿入し、位置190~199の残基を指定されたインサートで置換することによって生成した。MICAのT189とV200との間に挿入されたSRGDHPRTQ配列番号43、ループ3.1と称されるをコードする配列を有するpKK36を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドAV1830上の鎖配列番号44およびAV1831下の鎖配列番号45をBsmBIで消化したpKK34に連結した。MICAのT189とV200との間に挿入されたRTSRGDHPRTQ配列番号46、ループ3.2と称されるをコードする配列を有するpKK37を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドAV1832上の鎖配列番号47およびAV1833下の鎖配列番号48をBsmBIで消化したpKK34に連結した。MICAのT189とV200との間に挿入されたRVPRGDSDLT配列番号49、ループ3.3と称されるをコードする配列を有するpKK38を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドAV1834上の鎖配列番号50およびAV1835下の鎖配列番号51をBsmBIで消化したpKK34に連結した。MICAのT189とV200との間に挿入されたRSARGDSDHR配列番号52、ループ3.4と称されるをコードする配列を有するpKK39を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドAV1836上の鎖配列番号53およびAV1837下の鎖配列番号54をBsmBIで消化したpKK34に連結した。MICAのT189とV200との間に挿入されたVTRGDTFTQS配列番号55、ループ5.1と称されるをコードする配列を有するpKK40を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドAV1838上の鎖配列番号56およびAV1839下の鎖配列番号57をBsmBIで消化したpKK34に連結した。MICAのT189とV200との間に挿入されたRGDTFTQS配列番号58、ループ5.2と称されるをコードする配列を有するpKK41を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドAV1840上の鎖配列番号59およびAV1841下の鎖配列番号60をBsmBIで消化したpKK34に連結した。MICAのT189とV200との間に挿入されたHLARGDDLTY配列番号61、ループ5.3と称されるをコードする配列を有するpKK42を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドAV1842上の鎖配列番号62およびAV1843下の鎖配列番号63をBsmBIで消化したpKK34に連結した。MICAのT189とV200との間に挿入されたSGGSGGGSTSRGDHPRTQSGGSGGG配列番号64、伸長ループ3.2spと称されるをコードする配列を有するpKK44を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドAV1854上の鎖配列番号65およびAV1855下の鎖配列番号66をBsmBIで消化したpKK34に連結した。MICAのT189とV200との間に挿入されたSGGSGGGSRVPRGDSDLTSGGSGGG配列番号67、伸長ループ3.3spと称されるをコードする配列を有するpKK45を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドAV1856上の鎖配列番号68およびAV1857下の鎖配列番号69をBsmBIで消化したpKK34に連結した。MICAのT189とV200との間に挿入されたSGGSGGGSVTRGDTFTQSSGGSGGG配列番号70、伸長ループ5.1spと称されるをコードする配列を有するpKK46を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドAV1858上の鎖配列番号71およびAV1859下の鎖配列番号72をBsmBIで消化したpKK34に連結した。MICAのT189とV200との間に挿入されたSGGSGGGSHLARGDDLTYSGGSGGG配列番号73、伸長ループ5.3spと称されるをコードする配列を有するpKK47を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドAV1860上の鎖配列番号74およびAV1861下の鎖配列番号75をBsmBIで消化したpKK34に連結した。次に、ループ3に結合配列を挿入するための構築物について説明する。以下のループ3の構築物は、MICA残基イソロイシン249とシステイン259との間に指定された異種ペプチドインサートを挿入し、位置250~258の残基を指定されたインサートで置換することによって生成した。プラスミドpSW276をBsmBIで消化し、キナーゼ化およびアニーリングしたオリゴヌクレオチドAV1826配列番号36およびAV1827配列番号37に連結してpKK35を作製した。このプラスミドは、MICA残基イソロイシン249とシステイン259との間のSGGSGGGSHHHHHHHHHHSGGSGGG配列番号38をコードし、位置250~258の残基を置換する配列を含んでいた。SGGSGGGSTSRGDHPRTQSGGSGGG配列番号76、伸長ループ3.2spと称されるをコードする配列を有するpKK48を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドAV1864上の鎖配列番号77およびAV1865下の鎖配列番号78をBsmBIで消化したpSW276に連結した。MICAのI249とC259との間に挿入されたSGGSGGGSRVPRGDSDLTSGGSGGG配列番号79、伸長ループ3.3spと称されるをコードする配列を有するpKK49を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドAV1866上の鎖配列番号80およびAV1867下の鎖配列番号81をBsmBIで消化したpSW276に連結した。MICAのI249とC259との間に挿入されたSGGSGGGSVTRGDTFTQSSGGSGGG配列番号82、伸長ループ5.1spと称されるをコードする配列を有するpKK50を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドAV1868上の鎖配列番号83およびAV1869下の鎖配列番号84をBsmBIで消化したpSW276に連結した。MICAのI249とC259との間に挿入されたSGGSGGGSHLARGDDLTYSGGSGGG配列番号85、伸長ループ5.3spと称されるをコードする配列を有するpKK51を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドAV1870上の鎖配列番号86およびAV1871下の鎖配列番号87をBsmBIで消化したpSW276に挿入した。次に、緊密なループ1に結合配列を挿入するための構築物について説明する。以下の緊密なTループ1の構築物は、MICAのN187とC202の間に指定された異種ペプチドのインサートを挿入することによって生成した、すなわち、MICAの残基188~201を指定されたインサートで置換した。プラスミドpKK34をプライマーAV1873配列番号88およびAV1872配列番号89で変異誘発し、MICAのN187とC202との間のインサートをクローン化するために好適である都合のよいBsmBI部位を含むpSW324を作製した。MICAのN187とC202との間に挿入されたTSRGDHPRTQ配列番号90、緊密T-3.1と称されるをコードする配列を有するpKK52を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドAV1874上の鎖配列番号91およびAV1875下の鎖配列番号92をBsmBIで消化したpSW324に連結した。MICAのN187とC202との間に挿入されたGSRGDSLIMH配列番号93、緊密T-3.5と称されるをコードする配列を有するpKK53を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドAV1876上の鎖配列番号94およびAV1877下の鎖配列番号95をBsmBIで消化したpSW324に連結した。MICAのN187とC202との間に挿入されたRVPRGDSDLT配列番号96、緊密T-3.3と称されるをコードする配列を有するpKK54を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドAV1878上の鎖配列番号97およびAV1879下の鎖配列番号98をBsmBIで消化したpSW324に連結した。MICAのN187とC202との間に挿入されたVTRGDTFTQS配列番号99、緊密T-5.1と称されるをコードする配列を有するpKK55を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドAV1880上の鎖配列番号100およびAV1881下の鎖配列番号101をBsmBIで消化したpSW324に連結した。MICAのN187とC202との間に挿入されたHLARGDDLTY配列番号102、緊密T-5.3と称されるをコードする配列を有するpKK56を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドAV1882上の鎖配列番号103およびAV1883下の鎖X、配列番号104をBsmBIで消化したpSW324に連結した。MICAのN187とC202との間に挿入されたYQSWRYSQ配列番号105、テンダミスタット由来のループ1、緊密T-AMYと称されるをコードする配列を有するpKK84を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドAV1906上の鎖配列番号106およびAV1907下の鎖配列番号107をBsmBIで消化したpSW324に連結した。次に、同じ可溶性MICA分子のループ1およびループ3の両方に結合配列を挿入するための構築物について説明する。ループ1およびループ2の両方に挿入された結合配列を有する可溶性MICA分子をコードする構築物を作製するために、我々はpKK115を作製した。ベクターpKK115は、ループ1の伸長5.1sp配列番号82と、他の配列をループ3にクローン化するのに好適である都合のよいBsmBI部位とを含む。ベクターpKK115は、プライマーAV1493配列番号108およびAV1494配列番号109を用いたpKK46の部位特異的突然変異誘発によって作製した。ループ1の伸長5.1spと、MICAのI249とC259との間に挿入されたSGGSGGGSTSRGDHPRTQSGGSGGG配列番号76、伸長ループ3.2spと称されるをコードする配列とを有するpKK128を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドAV1864上の鎖配列番号77およびAV1865下の鎖配列番号78をBsmBIで消化したpKK115に連結した。ループ1の伸長5.1spと、MICAのI249とC259との間に挿入されたSGGSGGGSVTRGDTFTQSSGGSGGG配列番号82、伸長ループ5.1spと称されるをコードする配列とを有するpKK129を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドAV1868上の鎖X、配列番号83およびAV1869下の鎖配列番号84をBsmBIで消化したpKK115に連結した。ループ1の伸長5.1spと、MICAのI249とC259との間に挿入されたSGGSGGGSHLARGDDLTYSGGSGGG配列番号85、伸長ループ5.3spと称されるをコードする配列とを有するpKK130を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドAV1870上の鎖配列番号86およびAV1871下の鎖配列番号87をBsmBIで消化したpKK115に連結した。ループ1の伸長5.1spと、MICAのI249とC259との間に挿入されたSGGSGGGSVTRGDTFTQSSGGSGGG配列番号82、非相同伸長ループ5.1spNHと称されるをコードする配列とを有するpKK131を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドAV1908上の鎖配列番号110およびAV1909下の鎖配列番号111をBsmBIで消化したpKK115に連結した。次に、内部結合インサートを有する可溶性MICA分子をコードする上述の作製した構築物の培養ヒト細胞発現と、それらの標的結合のELISAに基づく分析について説明する。プラスミド構築物pKK35-42、pKK44-56、およびpKK128-131の場合、10cm組織培養皿中の培養密度90の293T細胞ATCCの培養物に、FugeneHD遺伝子導入試薬RocheAppliedScienceを使用して、10μgの各プラスミドDNAを遺伝子導入した。3日後、各培養物の培養培地を回収し、Eppendorf5810R卓上型遠心機にて4000rpmで遠心分離することにより、浮遊している細胞を除去した。Pierce濃縮機の7ml/9Kカタログ番号AV89884A回転管を使用して、回収された約9.5mlの各サンプルを濃縮した。回転機は、リン酸緩衝生理食塩水PBSで予め洗浄した。各サンプルを濃縮機に加え、次いで、Eppendorf5810R卓上型遠心機にて30分間4000rpmで遠心分離した。6mlのPBSで各サンプルを3回洗浄し、濃縮した:各回ともEppendorf5810R卓上型遠心機にて30分間4000rpm回転させた。可溶性MICAのためのELISAによって、得られた各サンプル溶液中の可溶性MICAの濃度を推定した。捕捉剤は、マウス抗ヒトMICARDSystems部品番号841612、検出抗体は、ストレプトアビジン-HRPおよびUltraTMBを用いて展開したビオチン化ヤギ抗ヒトMICARDSystems部品番号841613であった。意図する標的タンパク質であるインテグリンαVβ3またはαVβ5をELISAプレート上の捕捉剤として使用して、ELISAより、濃縮した上清の各々において可溶性MICA分子が標的分子に結合する能力を測定した。それぞれのインテグリンがELISAプレートのウェルの底に接着した後、ウェルを洗浄し、本分野で周知のようにブロックした。293T細胞によって生成および分泌された可溶性MICAの各サンプル100μlを、αVβ3またはαVβ5を含むウェルに加え、インキュベートし、洗浄した。UltraTMB-ELISA基質を用いて展開したヒトMICAに対するHRPコンジュゲート抗体により、インテグリンによって捕捉された可溶性MICA分子を検出し、光学密度を読み取った。MICA特異的ELISAにより、各サンプル中の可溶性MICAの量を決定した。結合した可溶性MICA分子から特異的なインテグリンへのシグナル全MICAのng当たりが示される。非結合陰性対照MICApSW273によって生成したからのELISAシグナルを各インテグリン結合シグナルから差し引いた。対照とともに、pKK35~42およびpKK44~56から生成された単一ペプチドインサートを有するMICA産物の結果を表1に示す。それらの特異的インサートのアミノ酸配列および配列番号を表2に表す。遺伝子操作によってそれらのループのうちの1つのみに挿入された結合ペプチドを有する可溶性MICA分子は、インテグリン標的に結合する。表1.可溶性MICA中の単一インサートからのインテグリン結合ELISAデータ表2.293細胞において発現されたプラスミドとファージプラスミドの相関関係、それらの慣用名、ループ1、ループ3、またはループ1および3の両方に挿入されたアミノ酸配列、ならびに対応するインサートの配列番号対照とともに、pKK128~131から生成された1つより多くのループに挿入された結合ペプチドを有するMICAの結果を表3に示す。pKK128~131から生成された可溶性MICA分子のインテグリン標的結合についてのELISAアッセイを以下のように行った。それぞれのインテグリンがELISAプレートのウェルの底に接着した後、ウェルを洗浄し、ブロックした。培養上清の各サンプル100μlをαVβ3またはαVβ5を含むウェルに加え、インキュベートし、洗浄した。UltraTMB-ELISA基質を用いて展開したヒトMICAに対するHRPコンジュゲート抗体により、インテグリンによって捕捉された可溶性MICA分子を検出し、光学密度を読み取った。MICA特異的ELISAにより、各サンプル中の可溶性MICAの量を決定した。特異的インテグリンに結合した1つより多くのインサートを有する可溶性MICA分子のシグナル全MICAのng当たりを表3に示す。それらの特異的インサートのアミノ酸配列および配列番号を表2に表す。1つより多くの内部ループに挿入された結合ペプチドを有するこれらの可溶性MICA分子は、単一の内部結合ペプチドのみを有する分子よりも高い結合を示し、分子当たり1つより多くの結合モチーフの結合力効果が示唆された。さらに、可溶性MICA分子がMICA分子当たり1つより多くのαVβ5特異的な内部結合ぺプチドを有する場合に、可溶性MICA分子の意図する標的、例えば、αVβ5への特異性が、密接に関連する標的であるαVβ3よりも高かった。その標的に対する結合力を示すMICA分子には、そのような結合および結合特異性の増加が期待された。よって、複製結合剤および異なる結合剤の両方である二価のMICA結合剤を作製し、二重特異性MICA分子およびその標的に対する親和性を超える結合力を有するMICA分子を生成することができた。表3.可溶性MICAにおける2つのインサートからのインテグリン結合ELISAデータ3.M13ファージ上のMICA-α3ドメインタンパク質の表示所望の標的結合表現型を有する遺伝子操作したMICA分子をコードする新しい遺伝子の単離のためのシステムを開発するために、α3ドメインのアミノ酸181~276をコードするDNAをコドン位置198でM13ファージM13mp18、Smithベクター型33のカプシド遺伝子IIIに融合し図4、混合された野生型wtおよびα3-pIIIキメラカプシドを用い、ヘルパーファージM13ファージを用いずに生成したBassetal.,1990。大腸菌からPEG精製したファージ調製物のタンパク質染色SDS-PAGE分析により、集団における融合タンパク質およびwtpIIIタンパク質の両方の存在を確認したデータは示さず。テンダミスタットは、MICAのα3ドメインの構造に類似した三次元構造を有する細菌タンパク質であるPflugrathetal.,1986。ランダムペプチドをテンダミスタットに挿入し、ヒトインテグリンへの結合のためにM13ファージディスプレイによって選択したMcConnellandHoess,1995;Lietal,2003。ELISAアッセイのための陽性対照として、テンダミスタットをM13のpIIIに融合した。平行して、ここで、MICAのα3ドメインのループ1または3に挿入された同じデカペプチドのうちのいくつかが、カプシドpIIIに融合されたα3ドメインを表示するM13ファージを、ELISAフォーマットにおいてインテグリンに結合するように同様に誘導することができるかどうかを判定した。次に、ループ1、ループ3、またはループ1およびループ3の両方に異なる結合ペプチドを有するMICAのα3ドメインを表示するM13ファージの構築、発現、およびアッセイについて説明する。M13ファージM13KENewEnglandBioLabsから得たを、プライマーAV1887配列番号112およびAV1888配列番号113を用いたPCR増幅反応における鋳型として使用した。M13KE遺伝子IIIのC末端部分からなるPCR産物をEcoRIおよびHindIIIで消化し、EcoRI/HindIIIで消化したM13ファージベクターM13mp18GenBankX02513に連結してファージベクターpSW326を作製した。EcoRIおよびAvrIIで消化した合成配列TEND配列番号114をEcoRI/AvrIIで消化したpSW326に挿入することにより、ファージベクターpKK59を作製した。EcoRIおよびAvrIIで消化した合成配列TEND-3A配列番号115をEcoRI/AvrIIで消化したpSW326に挿入することにより、ファージベクターpKK60を作製した。EcoRIおよびAvrIIで消化した合成配列TEND-3B配列番号116をEcoRI/AvrIIで消化したpSW326に挿入することにより、ファージベクターpKK61を作製した。EcoRIおよびAvrIIで消化した合成配列TEND-5A配列番号117をEcoRI/AvrIIで消化したpSW326に挿入することにより、ファージベクターpKK63を作製した。EcoRIおよびAvrIIで消化した合成配列TEND-5B配列番号118をEcoRI/AvrIIで消化したpSW326に挿入することにより、ファージベクターpKK64を作製した。EcoRIおよびAvrIIで消化した合成配列TEND-His8配列番号119、His8は配列番号130をEcoRI/AvrIIで消化したpSW326に挿入することにより、ファージベクターpKK65を作製した。ファージベクターpKK106を作製するために、プライマーAV1897配列番号120およびAV1898配列番号121を使用して、PCRによりpKK29から約320bpの断片を増幅した。次いで、野生型MICAのα3配列配列番号1~6、13を表すこの断片を、EcoRIおよびBsmBIで消化し、MfeI/AvrIIで消化した約7911bpのpKK59の断片に連結した。ファージベクターpKK91を作製するために、プライマーAV1897配列番号120およびAV1898配列番号121を使用して、PCRによりpKK35から約356bpの断片を増幅した。次いで、この断片をEcoRIおよびBsmBIで消化し、MfeI/AvrIIで消化した約7911bpのpKK59の断片に連結した。ファージベクターpKK92を作製するために、プライマーAV1897配列番号120およびAV1898配列番号121を使用して、PCRによりpKK36から約305bpの断片を増幅した。次いで、この断片をEcoRIおよびBsmBIで消化し、MfeI/AvrIIで消化した約7911bpのpKK59の断片に連結した。ファージベクターpKK93を作製するために、プライマーAV1897配列番号120およびAV1898配列番号121を使用して、PCRによりpKK37から約311の断片を増幅した。次いで、この断片をEcoRIおよびBsmBIで消化し、MfeI/AvrIIで消化した約7911bpのpKK59の断片に連結した。ファージベクターpKK94を作製するために、プライマーAV1897配列番号120およびAV1898配列番号121を使用して、PCRによりpKK38から約308bpの断片を増幅した。次いで、この断片をEcoRIおよびBsmBIで消化し、MfeI/AvrIIで消化した約7911bpのpKK59の断片に連結した。ファージベクターpKK95を作製するために、プライマーAV1897配列番号120およびAV1898配列番号121を使用して、PCRによりpKK39から約308bpの断片を増幅した。次いで、この断片をEcoRIおよびBsmBIで消化し、MfeI/AvrIIで消化した約7911bpのpKK59の断片に連結した。ファージベクターpKK96を作製するために、プライマーAV1897配列番号120およびAV1898配列番号121を使用して、PCRによりpKK40から約308bpの断片を増幅した。次いで、この断片をEcoRIおよびBsmBIで消化し、MfeI/AvrIIで消化した約7911bpのpKK59の断片に連結した。ファージベクターpKK97を作製するために、プライマーAV1897配列番号120およびAV1898配列番号121を使用して、PCRによりpKK41から約302bpの断片を増幅した。次いで、この断片をEcoRIおよびBsmBIで消化し、MfeI/AvrIIで消化した約7911bpのpKK59の断片に連結した。ファージベクターpKK98を作製するために、プライマーAV1897配列番号120およびAV1898配列番号121を使用して、PCRによりpKK42から約308bpの断片を増幅した。次いで、この断片をEcoRIおよびBsmBIで消化し、MfeI/AvrIIで消化した約7911bpのpKK59の断片に連結した。ファージベクターpKK100を作製するために、プライマーAV1897配列番号120およびAV1898配列番号121を使用して、PCRによりpKK44から約353bpの断片を増幅した。次いで、この断片をEcoRIおよびBsmBIで消化し、MfeI/AvrIIで消化した約7911bpのpKK59の断片に連結した。ファージベクターpKK101を作製するために、プライマーAV1897配列番号120およびAV1898配列番号121を使用して、PCRによりpKK45から約353bpの断片を増幅した。次いで、この断片をEcoRIおよびBsmBIで消化し、MfeI/AvrIIで消化した約7911bpのpKK59の断片に連結した。ファージベクターpKK102を作製するために、プライマーAV1897配列番号120およびAV1898配列番号121を使用して、PCRによりpKK46から約353bpの断片を増幅した。次いで、この断片をEcoRIおよびBsmBIで消化し、MfeI/AvrIIで消化した約7911bpのpKK59の断片に連結した。ファージベクターpKK103を作製するために、プライマーAV1897配列番号120およびAV1898配列番号121を使用して、PCRによりpKK47から約353bpの断片を増幅した。次いで、この断片をEcoRIおよびBsmBIで消化し、MfeI/AvrIIで消化した約7911bpのpKK59の断片に連結した。ファージベクターpKK104を作製するために、プライマーAV1897配列番号120およびAV1898配列番号121を使用して、PCRによりpKK48から約356bpの断片を増幅した。次いで、この断片をEcoRIおよびBsmBIで消化し、MfeI/AvrIIで消化した約7911bpのpKK59の断片に連結した。ファージベクターpKK105を作製するために、プライマーAV1897配列番号120およびAV1898配列番号121を使用して、PCRによりpKK49から約356bpの断片を増幅した。次いで、この断片をEcoRIおよびBsmBIで消化し、MfeI/AvrIIで消化した約7911bpのpKK59の断片に連結した。ファージベクターpKK107を作製するために、プライマーKK69配列番号122およびAV1898配列番号121を使用して、PCRによりpKK52から約344bpの断片を増幅した。次いで、この断片をEcoRIおよびBsmBIで消化し、MfeI/AvrIIで消化した約7911bpのpKK59の断片に連結した。ファージベクターpKK108を作製するために、プライマーKK70配列番号123およびAV1898配列番号121を使用して、PCRによりpKK53から約284bpの断片を増幅した。次いで、この断片をEcoRIおよびBsmBIで消化し、MfeI/AvrIIで消化した約7911bpのpKK59の断片に連結した。ファージベクターpKK109を作製するために、プライマーKK71配列番号124およびAV1898配列番号121を使用して、PCRによりpKK54から約284bpの断片を増幅した。次いで、この断片をEcoRIおよびBsmBIで消化し、MfeI/AvrIIで消化した約7911bpのpKK59の断片に連結した。ファージベクターpKK110を作製するために、プライマーKK72配列番号125およびAV1898配列番号121を使用して、PCRによりpKK55から約284bpの断片を増幅した。次いで、この断片をEcoRIおよびBsmBIで消化し、MfeI/AvrIIで消化した約7911bpのpKK59の断片に連結した。ファージベクターpKK111を作製するために、プライマーKK73配列番号126およびAV1898配列番号121を使用して、PCRによりpKK56から約284bpの断片を増幅した。次いで、この断片をEcoRIおよびBsmBIで消化し、MfeI/AvrIIで消化した約7911bpのpKK59の断片に連結した。ファージベクターpKK112を作製するために、プライマーAV1897配列番号120およびAV1898配列番号121を使用して、PCRによりpKK84から約278bpの断片を増幅した。次いで、この断片をEcoRIおよびBsmBIで消化し、MfeI/AvrIIで消化した約7911bpのpKK59の断片に連結した。ファージベクターpKK136を作製するために、プライマーAV1897配列番号120およびAV1898配列番号121を使用して、PCRによりpKK128から約413bpの断片を増幅した。次いで、この断片をEcoRIおよびBsmBIで消化し、MfeI/AvrIIで消化した約7911bpのpKK59の断片に連結した。ファージベクターpKK137を作製するために、プライマーAV1897配列番号120およびAV1898配列番号121を使用して、PCRによりpKK129から約413bpの断片を増幅した。次いで、この断片をEcoRIおよびBsmBIで消化し、MfeI/AvrIIで消化した約7911bpのpKK59の断片に連結した。ファージベクターpKK138を作製するために、プライマーAV1897配列番号120およびAV1898配列番号121を使用して、PCRによりpKK130から約413bpの断片を増幅した。次いで、この断片をEcoRIおよびBsmBIで消化し、MfeI/AvrIIで消化した約7911bpのpKK59の断片に連結した。ファージベクターpKK139を作製するために、プライマーAV1897配列番号120およびAV1898配列番号121を使用して、PCRによりpKK131から約413bpの断片を増幅した。次いで、この断片をEcoRIおよびBsmBIで消化し、MfeI/AvrIIで消化した約7911bpのpKK59の断片に連結した。NEBαF’tet形質転換受容性大腸菌細胞にファージベクターを独立して形質転換した。形質転換細胞によって生成されたファージを滴定し、それらの濃度を1ml当たり1013に希釈して調製した。意図する標的タンパク質であるインテグリンαVβ3またはαVβ5をELISAプレート上の捕捉剤として使用して、ELISAによりファージ調製物の各々における可溶性MICA分子の能力を測定した。それぞれのインテグリンがELISAプレートのウェルの底に接着した後、ウェルを洗浄し、本分野で周知のようにブロックした。ファージ調製物の各サンプル100μlを、αVβ3またはαVβ5を含むウェルに加え、インキュベートし、洗浄した。UltraTMB-ELISA基質を用いて展開したM13ファージコートに対するHRPコンジュゲート抗体により、インテグリンによって捕捉されたファージを検出し、光学密度を読み取った。M13ファージの力価は、8X1012~1.1X1013/mlの範囲だった。pKK91~98および100~112から生成された単一ペプチドインサートを有するα3ドメインを表示するファージの結果を表4に示す。それらの特異的インサートのアミノ酸配列および配列番号を表2に表す。遺伝子操作によってそれらのループのうちの1つのみに挿入された結合ペプチドを有するα3ドメインを表示する、pIIIカプシドタンパク質に融合されたファージは、インテグリン標的に結合する。表4.MICAのα3-PIIIバクテリオファージディスプレイにおける単一インサートからのインテグリン結合ELISAデータ対照とともに、pKK136、138、および139から生成された1つより多くのループに挿入された結合ペプチドを有するα3ドメインを表示するファージの結果を表5に示す。結合ペプチドインサートが1つより多くのループに移植されたα3ドメインを表示するM13ファージのインテグリン標的結合に関するELISAアッセイを以下のように行った。それぞれのインテグリンがELISAプレートのウェルの底に接着した後、ウェルを洗浄し、ブロックした。ファージ調製物の各サンプル100μlをαVβ3またはαVβ5を含むウェルに加え、UltraTMB-ELISA基質を用いて展開したM13ファージコートに対するHRPコンジュゲート抗体により、インテグリンによって捕捉されたファージを検出し、光学密度を読み取った。M13ファージの力価は、8X1012~1.1X1013/mlの範囲だった。pKK136、138、および139から生成された1つより多くのペプチドインサートを有するα3ドメインを表示するファージ、ならびにpKK93、102、もしくは103から生成された1つのインサートを有するか、またはインサートを含まないpKK106α3ドメインを表示する対照の結果を示す。それらの特異的インサート複数可のアミノ酸配列および配列番号を表2に表す。1つより多くの内部ループに挿入された結合ペプチドを有するこれらのα3ドメインは、単一の内部結合ペプチドのみを有するドメインよりも高いファージの標的結合を伝達し、分子当たり1つより多くの結合モチーフの結合力効果が裏付けられた。さらに、α3ドメインが1つより多くのαVβ5特異的な内部結合ペプチドを有する場合に、α3ドメインのその意図する標的、例えば、αVβ5への特異性が、この場合も、密接に関連する標的であるαVβ3よりも高かった結合力効果。表5.MICAのα3-PIIIバクテリオファージディスプレイにおける移植された2つのインサートからのインテグリン結合ELISAデータ4.可溶性の標的MICAは、標的細胞を死滅させるためにNK細胞を動員するための特異的なアダプター分子として作用した。LIVE/DEAD登録商標細胞生存率アッセイを、Chromyetal,2000によって本質的に記載されるように、また、製造業者のプロトコルInvitrogen、Carlsbad,CA従って行った。端的に述べると、96ウェル平底培養プレートに、1x104細胞/ウェルの密度でヒト標的細胞MCF7およびHeLaを播種したところ、2日で80の培養密度に達した。pKK131を一過性に遺伝子導入した293T細胞の培養上清を、Pierce9KMWCO回転機により約100倍に濃縮し、MICA特異的ELISAによってMICAの濃度を決定した。可溶性の標的MICA分子が標的細胞を死滅させるためにヒトNK細胞を動員する能力を証明するために、標的細胞を含む異なるウェルにおいて、異なる濃度の濃縮した可溶性MICAタンパク質を16時間インキュベートした。次いで、リン酸緩衝生理食塩水PBSを用いてウェルを2回洗浄することにより、非結合タンパク質を除去した。次いで、可溶性MICAに暴露した標的細胞をカルセイン-AM2μΜを用いて30分間37°Cで処理し、全ての生存細胞において緑色蛍光を得た。インキュベーション後、再びPBSを用いて細胞を2回洗浄し、次いで、標的細胞に対して10:1および5:1の比率で生存NK-92MI細胞に暴露した。NK-92MI細胞を標的細胞とともに4時間インキュベートし、次いで、非結合NK-92MI細胞を除去し、PBSを用いて標的細胞を2回洗浄した。次に、30分間37°Cでエチジウムホモ二量体2μΜを加え、NK細胞死滅の程度を判定した。細胞を洗浄し、蛍光プレートリーダーSoftMaxPro上で分析した。NK細胞の非存在下において、また5:1および10:1の比率ならびに0,64pgおよび128pgで可溶性の標的MICAを加えたウェルからの赤色エチジウムおよび緑色カルセイン-AMの蛍光シグナルの平均を使用して、生存細胞および死滅細胞を定量した。標的MICAの非存在下において0、5:1、10:1の比率でNK細胞を加えたところ、死滅したMCF細胞からの赤色蛍光シグナルは、12.6±1.1から12.9±2.9、そして12.0±1.0へと変化した。64pgの標的MICAの存在下において、0、5:1、10:1の比率でNK細胞を加えたところ、死滅したMCF細胞からの赤色蛍光シグナルは、19.9±2.4から27.0±1.0、そして31.0±1.6へと変化した。標的MICAを128pgで加えた場合、5:1、10:1の比率でNK細胞を加えたところ、死滅したMCF細胞からの赤色蛍光シグナルは、25.6±2.2から41.0±6.7へと変化した。標的MICAの非存在下で、0、5:1、10:1の比率でNK細胞を加えたところ、同じウェル内の生存細胞からの対応する蛍光緑色シグナルは、5621±372、5535±205および5721±335であった。64pgの標的MICAの存在下において、0、5:1、10:1の比率でNK細胞を加えたところ、生存MCF細胞からの緑色蛍光シグナルは、5028±177から5181±102、そして3697±591へと変化した。標的MICAを128pgで加えた場合、5:1、10:1の比率でNK細胞を加えたところ、生存MCF細胞からの緑色蛍光シグナルは、3459±394から2191±331へと変化した。徐々に増加する量の標的MICAをウェルに加えたところ、標的インテグリンを発現しないHeLa細胞からの蛍光シグナルは、NK-92MI細胞による死滅の増加を示唆しなかった。"