"ピコルナウイルス科、カリチウイルス科またはトガウイルス科由来のRNAウイルスに対する抗ウイルス化合物であって、該ウイルスは、一本鎖の12kb未満のポジティブセンスゲノム、および多機能タンパク質を含むポリタンパク質をコードする第1のオープンリーディングフレームを有し、該化合物は、以下:a12~40のモルホリノサブユニットの配列であって、該配列は、該第1オープンリーディングフレームの翻訳開始領域をまたぐウイルス標的配列に実質的に相補的な標的化塩基配列を支持する、配列;およびb実質的に無電荷の骨格、を有するモルホリノオリゴマーを含む、化合物。請求項1に記載の化合物であって、前記サブユニットが、無電荷のリンを含有するサブユニット間結合によって接続され、1つのサブユニットのモルホリノ窒素を隣接するサブユニットの5’環外炭素に結合する、化合物。前記サブユニット間結合が、ホスホロジアミデート結合である、請求項2に記載の化合物。請求項3に記載の化合物であって、前記モルホリノサブユニットが、以下の構造:に従って、ホスホロジアミデート結合によって結合され、ここでY1はOであり、ZはOであり、Pjは、塩基特異的水素結合によって、ポリヌクレオチドの塩基に結合するのに有効な、プリン塩基対形成部分またはピリミジン塩基対形成部分であり、そしてXはアルキル、アルコキシ、チオアルコキシ、またはアルキルアミノである、化合物。請求項4に記載の化合物であって、XはNR2であり、各Rは独立して水素またはメチルである、化合物。請求項1に記載の化合物であって、前記オリゴマーは、前記ウイルス標的配列への結合に対して約50°Cよりも高いTmを有し、そして該化合物が哺乳動物細胞によって能動的に取り込まれる、化合物。請求項1に記載の化合物であって、該化合物は、ピコルナウイルスに対し、かつ以下:iMahoney株およびSabin株のポリオウイルスについては、配列番号16、iiA型肝炎ウイルスについては、配列番号17、iiiライノウイルス14については、配列番号18、ivライノウイルス16については、配列番号19、vライノウイルス1Bについては、配列番号20、viアフトウイルスについては、配列番号21および22、ならびにviiコクサッキーウイルスについては、配列番号23、24および25、からなる群より選択される配列に対して少なくとも90相同性を有する標的化配列を有する、化合物。ヒトライノウイルス16に対し、かつ配列番号18または19によって示される標的化配列を有する、請求項7に記載の化合物。請求項1に記載の化合物であって、該化合物は、カリチウイルスに対し、かつ以下:i血清群Pan-1ベシウイルスvesivirusについては、配列番号27、28、および29、iiブタベシウイルスについては、配列番号30、iiiノーウォークウイルスについては、配列番号31、ならびにivネコベシウイルスについては、配列番号32、からなる群より選択される配列に対して少なくとも90相同性を有する標的化配列を有する、化合物。血清型Pan-1ベシウイルスに対する請求項9に記載の化合物であって、前記オリゴマーが、ホスホロジアミデート結合モルホリノオリゴマーであり、配列番号27、28、および29からなる群より選択される標的化配列を有する、化合物。ネコベシウイルスに対する請求項9に記載の化合物であって、前記オリゴマーが、ホスホロジアミデート結合モルホリノオリゴマーであり、配列番号32の標的化配列を有する、化合物。請求項1に記載の化合物であって、該化合物は、E型肝炎ウイルスに対し、かつ配列番号33および34からなる群より選択される配列に対して少なくとも90相同性を有する標的化配列を有する、化合物。前記オリゴマーが、配列番号33および34からなる群より選択される配列を有するホスホロジアミデート結合モルホリノオリゴマーである、請求項12に記載の化合物。請求項1に記載の化合物であって、前記オリゴマーが、哺乳動物被験体に投与された数時間後に、該オリゴマーおよび前記RNAウイルスのウイルスゲノムの相補的部分からなるヘテロ二重鎖形態で、該被験体の血清または尿から回収され得る、化合物。ピコルナウイルス科、カリチウイルス科、またはトガウイルス科由来のRNAウイルスの複製を阻害するためのアンチセンス抗ウイルス剤であって、該ウイルスは、一本鎖の12kb未満のポジティブセンスゲノム、および多機能タンパク質を含むポリタンパク質をコードする第1のオープンリーディングフレームを有し、該化合物は、以下:a12~40のモルホリノサブユニットの配列であって、該配列は、該第1オープンリーディングフレームの翻訳開始領域をまたぐウイルス標的配列に実質的に相補的な標的化塩基配列を支持する、配列;およびb実質的に無電荷の骨格、を有するモルホリノオリゴマーを含む、アンチセンス抗ウイルス剤。前記ウイルスに感染した哺乳動物被験体を治療するための、請求項15に記載のアンチセンス抗ウイルス剤。前記オリゴマーが、哺乳動物被験体に投与された数時間後に、該オリゴマーおよび前記ウイルスゲノムの相補的部分からなるヘテロ二重鎖形態で、前記被験体の血清または尿から回収され得る、請求項16に記載のアンチセンス抗ウイルス剤。前記オリゴマーが、無電荷のリンを含有するサブユニット間結合を有し、1つのサブユニットのモルホリノ窒素を隣接するサブユニットの5’環外炭素に結合する、請求項15に記載のアンチセンス抗ウイルス剤。前記サブユニット間結合が、ホスホロジアミデート結合である、請求項18に記載のアンチセンス抗ウイルス剤。前記モルホリノサブユニットが、以下の構造:Y1はOであり、ZはOであり、Pjは、塩基特異的水素結合によって、ポリヌクレオチドの塩基に結合するのに有効な、プリン塩基対形成部分またはピリミジン塩基対形成部分であり、そしてXはアルキル、アルコキシ、チオアルコキシ、またはアルキルアミノである。に従って、ホスホロジアミデート結合によって結合される、請求項19に記載のアンチセンス抗ウイルス剤。XはNR2であり、各Rは独立して水素またはメチルである、請求項20に記載のアンチセンス抗ウイルス剤。ピコルナウイルスの複製を阻害するための請求項15に記載のアンチセンス抗ウイルス剤であって、前記標的化配列が、以下:iMahoney株およびSabin株のポリオウイルスについては、配列番号16、iiA型肝炎ウイルスについては、配列番号17、iiiライノウイルス14については、配列番号18、ivライノウイルス16については、配列番号19、vライノウイルス1Bについては、配列番号20、viアフトウイルスについては、配列番号21および22、ならびにviiコクサッキーウイルスについては、配列番号23、24および25、からなる群より選択される配列に対して少なくとも90相同性を有する、請求項15に記載のアンチセンス抗ウイルス剤。ヒトライノウイルス16の複製を阻害するための請求項22に記載のアンチセンス抗ウイルス剤であって、前記標的化配列が配列番号18または19であり、そして前記オリゴマーがホスホロジアミデート結合モルホリノオリゴマーである、アンチセンス抗ウイルス剤。カリチウイルスの複製を阻害するための請求項15に記載のアンチセンス抗ウイルス剤であって、前記標的化配列が、以下:i血清群Pan-1ベシウイルスについては、配列番号27、28、および29、iiブタベシウイルスについては、配列番号30、iiiノーウォークウイルスについては、配列番号31、ならびにivネコベシウイルスについては、配列番号32、からなる群より選択される配列に対して少なくとも90相同性を有する、アンチセンス抗ウイルス剤。血清型Pan-1ベシウイルスの複製を阻害するための請求項24に記載のアンチセンス抗ウイルス剤であって、前記標的化配列が配列番号27、28、および29からなる群より選択され、そして前記オリゴマーが、ホスホロジアミデート結合モルホリノオリゴマーである、アンチセンス抗ウイルス剤。ネコベシウイルスの複製を阻害するための請求項24に記載のアンチセンス抗ウイルス剤であって、前記標的化配列が配列番号32であり、そして前記オリゴマーがホスホロジアミデート結合モルホリノオリゴマーである、アンチセンス抗ウイルス剤。E型肝炎ウイルスの複製を阻害するための請求項15に記載のアンチセンス抗ウイルス剤であって、前記標的化配列は配列番号33および34からなる群より選択される配列に対して少なくとも90相同性を有し、そして前記オリゴマーがホスホロジアミデート結合モルホリノオリゴマーである、アンチセンス抗ウイルス剤。ピコルナウイルス、カリチウイルスまたはトガウイルスに感染した哺乳動物被験体と、感染ウイルスに対して標的化されたアンチセンスオリゴマーとの間の効果的な相互作用の存在を確認する方法であって、以下:該オリゴマーが投与された被験体から得られた体液のサンプルを、投与の後に選択された時間で、該アンチセンスオリゴマーおよび該感染ウイルスの第1オープンリーディングフレームの翻訳開始領域をまたぐウイルス標的配列の相補的部分を含むヌクレアーゼ耐性ヘテロ二重鎖の存在について、アッセイする工程、ここで、該オリゴマーは、12~40のモルホリノサブユニットの配列を有し、該ウイルス標的配列に実質的に相補的な標的化塩基配列を支持する、を包む、方法。前記オリゴマーが、無電荷のリンを含有するサブユニット間結合を有し、1つのサブユニットのモルホリノ窒素を、隣接するサブユニットの5’環外炭素に結合する、請求項28に記載の方法。前記結合が、ホスホロジアミデート結合である、請求項29に記載の方法。ピコルナウイルス感染、カリチウイルス感染またはトガウイルス感染の処置の有効性を決定するために使用される請求項28に記載の方法であって、処置期間を通して、前記アッセイ工程が定期的な間隔で実施される、方法。感染したピコルナウイルス、カリチウイルスまたはトガウイルスの科または属を決定する方法であって、以下:a複数のアンチセンスオリゴマーを提供する工程であって、該オリゴマーの各々は、ピコルナウイルス、カリチウイルスまたはトガウイルスから選択される複数の既知のウイルスのうちウイルス標的配列に実質的に相補的である塩基配列を有する、工程であって、ここで該ウイルス標的配列の各々が、iウイルスの科または属に共通であり、そしてiiヒトには見出されない、工程;b複数のオリゴマーのうちの少なくとも1つのオリゴマーが投与された被験体から得られた体液のサンプルを、投与の後に選択された時間で、該オリゴマーおよび該ウイルス標的配列の相補的部分を含むヌクレアーゼ耐性ヘテロ二重鎖の存在について、アッセイする工程;ならびにc投与されたアンチセンスオリゴマーおよび該ウイルス標的配列に相補的な部分を含むヘテロ二重鎖の存在または非存在に基づいて、感染ウイルスの科または属を同定する工程、を包む、方法。特異的に感染したピコルナウイルス、カリチウイルスまたはトガウイルスを同定するのに使用するための請求項32に記載の方法であって、さらに、以下:a第二の複数のアンチセンスオリゴマーを提供する工程であって、該オリゴマーの各々は、工程cにおいて同定される科または属由来の複数の既知のウイルスのうちの1つのウイルス標的配列に実質的に相補的である塩基配列を有する工程であって、ここで、該ウイルス標的配列の各々は、i該既知のウイルスの1つに特異的であり、そしてiiヒトにおいて見出されない、工程;b複数のオリゴマーのうちの少なくとも1つのオリゴマーが投与された被験体から得られた体液のサンプルを、投与の後に選択された時間で、該オリゴマーおよび該ウイルス標的配列の相補的部分を含むヌクレアーゼ耐性ヘテロ二重鎖の存在について、アッセイする工程;ならびにc投与されたアンチセンスオリゴマーおよび該ウイルス標的配列の相補的部分を含むヘテロ二重鎖の存在または非存在に基づいて、感染ウイルスの科または属を同定する工程、を包む、方法。本発明のこれらの目的および特徴ならびに他の目的および特徴は、以下の発明の詳細な説明が、添付の図面と組み合わせて読まれる場合、より十分に理解される。発明の詳細な説明I.定義以下の用語は、本明細書で使用される場合、他に示されない限り、次の意味を有する:用語オープンリーディングフレームまたはORFとは、単一の5’開始コドンを含み、1以上の個々のタンパク質をコードし、そして終止コドンで終結するヌクレオチド配列を言う。用語ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、およびオリゴマーは、交換可能に使用され、代表的なポリヌクレオチドに対して水素結合可能な塩基を支持する骨格を有する重合体分子を言い、このポリマー骨格は、この重合体分子と代表的なポリヌクレオチド例えば、一本鎖RNA、二本鎖RNA、一本鎖DNAまたは二本鎖DNAとの間の配列特異的な様式において、このような水素結合を可能にする様式で塩基を提示する。ポリヌクレオチドは、プリン塩基またはピリミジン塩基のNグリコシドまたはCグリコシドであるヌクレオチドを有するポリマー、ならびに非標準的なヌクレオチド骨格例えば、ホスホロジアミデートモノホリノ化学反応、ポリアミド連結例えば、ペプチド核酸またはPNAおよび他の合成の配列特異的な核酸分子を用いて形成された骨格を含む。生理学的条件下で、第一の配列を有するポリヌクレオチドが、第二の配列を有するポリヌクレオチドと特異的に結合するか、または特異的にハイブリダイズする場合、第一の配列は、第二の配列に対してアンチセンス配列である。用語アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびアンチセンスオリゴマーとは、ウイルスの標的配列である、ポジティブセンスssRNAにハイブリダイズするのに有効な、サブユニット間骨格によって連結した、ヌクレオチド塩基対部分を有するサブユニットの配列を言う。このようなオリゴマーは、代表的には、8~約40ヌクレオチドサブユニット長であり、より代表的には、約12~40ヌクレオチドサブユニット長であり、好ましくは、約12~30、または12~25ヌクレオチドサブユニット長である。このオリゴマーは、以下に定義されるように、この標的配列に対して正確な配列相補性または近い相補性を有し得る。このようなアンチセンスオリゴマーは、標的オープンリーディングフレームORFによってコードされたポリプロテインの翻訳をブロックまたは阻害し得る。オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドアナログのサブユニットとは、オリゴマーの1ヌクレオチドまたは、ヌクレオチドアナログ単位を言う。この用語は、荷電したサブユニットを言う場合、たとえ、この荷電が典型的にサブユニット間連結例えば、リン連結またはホスホロチオエート連結内に存在しても、付属したサブユニット間連結を伴うまたは伴わないヌクレオチド単位を言い得る。モルホリノオリゴマーは、図1A~Eに示した形態のモルホリノサブユニット構造からなるオリゴヌクレオチドアナログであり、ここで、iこの構造は、1~3原子長のリン含有連鎖によって連結され、この1つのサブユニットのモルホリノ窒素を隣接したサブユニットの5’環外炭素に連結し、iiPiおよびPjは、塩基特異的水素結合によって、ポリヌクレオチド中の塩基に結合するのに有効なプリン塩基対部分またはピリミジン塩基対部分である。プリン塩基対部分またはピリミジン塩基対部分は、代表的には、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシルまたはチミンである。モルホリノオリゴマーの合成、構造、および結合特性は、米国特許第5,698,685号、米国特許第5,217,866号、米国特許第5,142,047号、米国特許第5,034,506号、米国特許第5,166,315号、米国特許第5,521,063号、および5,506,337号に詳述され、これらの全ては、参考文献として本明細書中で援用される。図1Bに示したサブユニットおよび連結は、図2Bに示したように6個の原子が以下を含む場合:モルホリノ窒素、連結したリン原子、リン原子を5’環外炭素に連結する原子たいてい酸素、5’環外炭素、および次のモルホリノ環の2個の炭素原子、6個の原子の繰り返し単位の骨格に使用される。これらの構造において、5’環外モルホリノ炭素をリン群に連結する原子Y1は、硫黄、窒素、炭素、または好ましくは、酸素であり得る。このリン由来のX部分ペンダントは、塩基特異的な水素結合を妨害しない、任意の安定な群である。好ましいX群は、フルオロ、アルキル、アルコキシ、チオアルコキシ、およびアルキルアミノ環状アミンを含むを含み、これらの全ては、塩基特異的結合が破壊されない限りは、多様に置換され得る。アルキル、アルコキシおよびチオアルコキシは、好ましくは1~6個の炭素原子を含む。アルキルアミノは、好ましくは、より低いアルキルC1~C6置換を言い、環状アミンは、好ましくは、酸素、窒素、および硫黄から選択される1~2個のさらなるヘテロ原子を必要に応じて含む5~7員窒素ヘテロ環である。Zは、硫黄または酸素であり、好ましくは酸素である。好ましいモノホリノオリゴマーは、本明細書中でPMOと言われる、ホスホロジアミデート連結モルホリノオリゴマーである。このようなオリゴマーは、図2Bに示されるようなモノホリノサブユニット構造から構成され、ここで、X=NH2、NHR、またはNR2ここで、Rは低級アルキルであり、好ましくはメチルである、Y=O、およびZ=Oであり、そして、PiおよびPjは、塩基特異的な水素結合によって、ポリヌクレオチド中の塩基に結合するのに有効なプリン塩基対部分もしくはピリミジン塩基対部分である。このような構造も好ましく、図4Hにも示される。また、代替のホスホロジアミデート連結を有する構造であり、ここで、図2Bにおいて、Xは低級アルコキシ例えば、メトキシもしくはエトキシであり、YはNHもしくはNRここで、Rは低級アルキルであり、Z=Oである。用語置換したsubstitutedとは、特に、アルキル基、アルコキシ基、チオアルコキシ基、またはアルキルアミノ基に関して、炭素上の水素原子の、例えばハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、チオール、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ、イミノ、オキソケト、ニトロ、シアノ、あるいは種々の酸またはエステル例えば、カルボン酸、スルホン酸、またはホスホン酸のようなヘテロ原子含有置換基との置き換えを言う。また、ヘテロ原子上の水素原子例えば、アミン水素と、アルキル、カルボキシルまたは他の炭素含有基との置き換えも言い得る。2つの一本鎖ポリヌクレオチド間のアンチパラレルな配置においてハイブリダイゼーションが起こる場合、ポリヌクレオチドは、相互に相補的と表現される。もし第一ポリヌクレオチドの鎖の一本と第二ポリヌクレオチドの鎖の一本との間にハイブリダイゼーションが起こり得るならば、二本鎖ポリヌクレオチドは、もう1つのポリヌクレオチドと相補的であり得る。相補性1つのポリヌクレオチドがもう1つのポリヌクレオチドと相補的である度合いは、一般に受容された塩基対法則に従って、相互に水素結合を形成することが予期される対立する鎖中の塩基の割合すなわち、パーセンテージの点から定量化できる。アンチセンスオリゴマーは、標的配列に対して近いまたは実質的な相補性を有し得、なお依然として、本発明の目的において機能的である。好ましくは、この使用されたアンチセンスオリゴマーは、本明細書中に指定されたような配列番号16~配列番号35を有する例示的なオリゴマーと比較した場合、10ヌクレオチドのうち標的配列に対して多くとも1つのミスマッチを有し、好ましくは、20ヌクレオチドのうち標的配列に対して多くとも1つのミスマッチを有する。あるいは、この使用されたアンチセンスオリゴマーは、本明細書中に指定されたような配列番号16~配列番号35を有する例示的なオリゴマーと、少なくとも90の配列相同性を有し、好ましくは、少なくとも95の配列相同性を有する。もし、生理学的条件下Tmは実質的に37°Cより大きく、好ましくは少なくとも50°Cであり、典型的には60°C~80°Cまたはそれより上で、オリゴマーが標的にハイブリダイズするならば、このオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴマーは、この標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする。このようなハイブリダイゼーションは、好ましくは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に対応する。所定のイオン強度およびpHで、このTmは、50の標的配列が相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズする温度である。さらに、このようなハイブリダイゼーションは、アンチセンスオリゴマーの標的配列に対する、近いまたは実質的な相補性、および正確な相補性で起こり得る。ヌクレアーゼ耐性オリゴマー分子オリゴマーとは、非ハイブリダイズ型またはハイブリダイズ型において、その骨格が、ヌクレアーゼ切断体内の通常の細胞外ヌクレアーゼおよび細胞内ヌクレアーゼによるに対して、実質的に耐性であることを言う。つまり、オリゴマーが暴露される体内の正常なヌクレアーゼ条件下において、このオリゴマーは、ヌクレアーゼ切断をほとんどまたは全く示さない。ヘテロ二重鎖とは、アンチセンスオリゴマーと標的RNAの相補的部分との間の二重鎖を言う。ヌクレアーゼ耐性ヘテロ二重鎖とは、その相補的標的に対するアンチセンスオリゴマーの結合によって形成された二重鎖を言い、その結果、このヘテロ二重鎖は、細胞内ヌクレアーゼおよび細胞外ヌクレアーゼ例えば、二本鎖RNA/RNA複合体または二本鎖RNA/DNA複合体を切断可能である、RNAseHによるインビボの分解に対して、実質的に耐性である。本明細書中で使用される場合、用語標的とは、ウイルスゲノムRNAまたはmRNAに関連し、1以上の型の哺乳動物細胞において、一本鎖で発現されるまたは存在するmRNAまたはウイルスゲノムRNAを言う。標的RNAに関する塩基特異的な細胞内結合事象とは、細胞内部の標的RNA配列に対するオリゴマーの特異的な結合を言う。このような結合の塩基特異性は、配列特異的である。例えば、一本鎖ポリヌクレオチドは、配列中で相補的な一本鎖ポリヌクレオチドに特異的に結合し得る。アンチセンスオリゴマー組成物とは、本発明のRNA検出法に用いるための1以上のアンチセンスオリゴマーを含む組成物を言う。いくつかの場合には、このようなアンチセンスオリゴマー組成物は、複数のアンチセンスオリゴマーを含む。感染しているssRNAウイルスに対して標的化された、アンチセンスオリゴマーの有効量は、感染しているウイルスの複製の速度、および/またはウイルスの負荷、および/またはウイルス感染に関連する症状を低減するのに有効な量である。本明細書で使用される場合、用語体液とは、尿、唾液、血漿、血液、髄液、または生物学的起源の他のサンプル例えば、皮膚細胞もしくは真皮性細片を含む、被験体から得られた種々のサンプル型を含み、細胞もしくはその中に懸濁された細胞フラグメント、または液体培地およびその溶質を言い得る。用語相対量とは、試験測定とコントロール測定の間に比較がなされる場合に用いられる。反応中に複合体を形成する試薬の相対量は、コントロール試料と反応する量と比較して、試験試料と反応する量である。コントロール試料は、同じアッセイにおいて別々に実施され得るか、または、同じサンプルの一部例えば、組織切片中の悪性の領域を取り囲む正常組織であり得る。個体または細胞の処置は、個体または細胞の自然の経過を変えるための手段として提供された任意の型の処置interventionである。処置は、例えば、薬学的組成物の投与を含むが、これらに限定されず、予防的に、または病理学的な事象の開始後もしくは病因学的な薬剤との接触の開始後のいずれかに実施され得る。関連する用語改善された治療の結果とは、特定のウイルスに感染したと診断された患者に関し、ウイルスの増殖、またはウイルスの負荷、または特定のウイルスによる感染に関連する検出可能な症状の、緩徐化もしくは減少を言う。薬剤が、受動拡散以外の機構によって細胞膜を通過して細胞に入り得る場合、その薬剤は哺乳動物細胞に能動的に取り込まれたと言う。薬剤は、例えば、能動輸送によって輸送され得、これは、例えばATP依存性の輸送機構によって哺乳動物細胞膜を横断する薬剤の輸送を言い、または促進輸送によって輸送され得、この輸送は、輸送タンパク質への薬剤の結合を必要とし、その後、膜を横断する結合薬剤の通過を促進する輸送機構によって細胞膜を横断する、アンチセンス薬剤の輸送を言う。能動輸送と促進輸送の両方のために、アンチセンス薬剤は、以下に定義されるように、好ましくは実質的に無電荷の骨格を有する。あるいは、このアンチセンス化合物は、複合体形態例えば、カチオン性脂質またはカチオン性リポソームと複合体化されたアニオン性骨格を有する薬剤のようなで処方され得、エンドサイトーシスの機構によって細胞内に取り込まれ得る。II.標的化されたウイルス本発明は、特定の分類の小さな一本鎖のポジティブセンスRNAウイルスの有効な阻害は、このウイルスに感染した細胞を、以下のアンチセンス化合物に暴露することによって達成され得るという発見に基づくiウイルスの第一オープンリーディングフレームORF1の開始領域に対して標的化されたアンチセンス化合物、ならびにii物理的特徴および薬物動態学的特徴を有し、アンチセンス化合物と宿主細胞内のウイルスとの間の有効な相互作用を可能にするアンチセンス化合物。1つの局面において、これらのオリゴマーは、ウイルスに感染した哺乳動物被験体の処置に用いられ得る。本発明は、以下:i一本鎖の、ii正の極性の、iii12kb未満の、およびiv第一オープンリーディングフレームORF1でポリタンパク質をコードしている、ゲノムを有するRNAウイルスを標的とする。特に、標的化されたウイルス科としては、ピコルナウイルス科、カリチウイルス科、トガウイルス科またはフラビウイルス科が挙げられる。これらの4つの科およびそれらのメンバーの各々の、種々の物理学的特性、形態学的特徴、および生物学的特徴は、例えば、TextbookofHumanVirology、R.Belshe編、第二版、Mosby、1991に見出され得る。各科の主要な生物学的特徴のいくつかは、以下に要約される。A.ピコルナウイルスピコルナウイルスは、ヒトおよび動物の両方に感染し、重篤な麻痺麻痺性ポリオ、様相aspectic髄膜炎、肝炎、胸膜痛、皮膚発疹、心筋炎、および感冒不顕性の感染が一般的であるを引き起こし得る。医学的に重要ないくつかのメンバーには、ポリオウイルス、A型肝炎ウイルス、ライノウイルス、アフトウイルス口蹄疫ウイルス、およびコクサッキーウイルスが挙げられる。ライノウイルスは、ヒトにおける一般的な感冒の原因として認識される。血清型は、1Aから100まで指定されている。伝染は、最初にエアロゾル経路により、そしてそのウイルスは鼻の中で複製する。全てのポジティブセンスRNAウイルスと同じように、ピコルナウイルスのゲノムRNAは感染性である;すなわち、このゲノムRNAは、宿主の転写事象なしに、直接的にウイルスタンパク質の合成を指向し得る。B.カリチウイルスカリチウイルスは、ヒトおよび動物の両方に感染する。この属のベシウイルスは、哺乳動物において上皮の水疱形成を含む疾患症状発現を生じ、動物流産急性発症およびヒト肝炎非A型~E型肝炎の原因であることが疑われるSmithら、1998aおよび1998b。カリチウイルスの他の属には、ノーウォーク様ウイルスおよびサッポロ様ウイルスこれらは共にヒトカリチウイルスを構成するならびにラゴウイルスlagovirusこれらはウサギの出血性疾患を引き起こす、特に急激で致死的なウイルスであるが挙げられる。ヒトカリチウイルスは、成人において世界的に発生するウイルス性下痢の最も一般的な原因であり、そして乳幼児の有意な病原体であるO’Ryanら、1992。少なくとも5つのヒトカリチウイルスの型が存在し、胃腸管中に存在する。ノーウォークウイルスは、広範に行き渡ったヒト因子であり、急性の流行性胃腸炎を引き起こし、ヒトにおける胃腸炎の全発生数の約10を引き起こすMurrayら、1998。ベシウイルスは、現在、やや不明瞭かつ宿主特異的であるとみなされるものから、公知のウイルス病原体のより汎用性のある群の1つとして認識されるものまでが、出現している。例えば、単一の血清型は、塩水魚オパールアイopaleye、シーライオン、ブタ、およびヒトを含む16の異なる動物種の多様な群に感染することが示されている。C.トガウイルスこの科のメンバーは、蚊起源のウイルスを含み、これらはヒトおよび動物の両方に感染する。この科としては、アルファウイルス属、ルビウイルス属風疹、ペスチウイルス属粘膜疾患、アリテリウイルス属Arterivirusウマ動脈炎およびE型肝炎ウイルスHEVが挙げられる。HEVは、1987年に最初に記載され、1991年にU.S.で初めて報告された。このウイルスは、最初に、小さな、一本鎖RNA特性に基づいて、カリチウイルスとして記載された。いくつかのHEVは、依然としてカリチウイルスとして分類されているが、トガウイルス科のメンバーとしても分類されている。感染は、A型肝炎ウイルス感染に酷似しているように見える。この疾患は、急性のウイルス性肝炎であり、初期感染から約20日後に現れ、そしてこのウイルスは、約20日間血清中に観察され得る。伝染は、汚染した水を介して起こり、そしてこのウイルスは、地理的に発展途上国に限定される。D.フラビウイルスこの科のメンバーは、数種の系列のヒト病原体を含み、それらの中には、黄熱病、西ナイル熱、C型肝炎、日本脳炎、セントルイス脳炎、マリーバレー脳炎、およびデング熱などの蚊起源のウイルスがある。フラビウイルスビリオンは、直径約40~50nmである。フラビウイルスのヌクレオキャプシドの対称性は、完全には規定されていない。フラビウイルスエンベロープには、1種の糖タンパク質しか含まれないことが知られている。今のところはまだ、フラビウイルスについて、サブゲノムメッセンジャーRNAもポリタンパク質前駆体も検出されていない。III.ウイルス標的領域好ましい標的配列は、ウイルスゲノムの第一オープンリーディングフレームORF1のAUG開始部位に及ぶ領域である。この第一ORFは、一般に、ポリメラーゼ、ヘリカーゼおよびプロテアーゼのような非構造タンパク質を含むポリタンパク質をコードする。AUG開始部位に及ぶとは、この標的配列が、AUG開始部位の一方に少なくとも3塩基と、他方に少なくとも2塩基合計、少なくとも8塩基を含むことを意味する。好ましくは、この標的配列は、この開始部位の各々の側に少なくとも4塩基合計、少なくとも11塩基を含む。より一般的には、好ましい標的部位は、種々のウイルス単離体の間で保存されている標的を含む。他の嗜好される部位には、IRES内部リボソーム侵入部位、トランス活性化タンパク質結合部位、および複製開始部位、が挙げられる。複数の冗長な遺伝子を提供し得る複雑かつ大きなウイルスゲノムは、ウイルスの侵入をコードしている宿主細胞の遺伝子およびウイルスの存在に対する宿主の応答を標的化することによって、効率的に標的化され得る。多様なウイルスゲノム配列は、例えば、NCBIGenbankデータベースのような、周知の情報源から入手可能である。あるいは、当業者は、公開された文献中に、多数の目的のウイルスに関する配列を例えば、指定されたウイルスに関する配列情報を公開している参考文献の検索によって見出し得る。一旦完全なウイルス配列または部分的なウイルス配列が得られると、ウイルスのORF1は同定される。代表的に、ORF1は、遺伝子データベースまたは信頼される参考文献中で同定される。あるいは、これらの4つの科に関して下記のように、ウイルスの一般的なゲノム編成によって導かれ得る。ORF1のAUG開始部位はまた、遺伝子データベースまたは信頼される参考文献中で同定され得、または、ORF1開始部位であると予想される領域中のAUGコドンについて配列をスキャンすることによって見出され得る。これらの4つのウイルス科の各々の一般的なゲノム編成は以下に示され、続いて、選択された各々の科内のメンバー属、種または株に関して例示的な標的配列が得られる。A.ピコルナウイルス図3Aは、ピコルナウイルスこの場合は、ピコルナウイルス科のライノウイルスのゲノム構造10を示す。ピコルナウイルスを代表するライノウイルスゲノム10は、約7.5kbの一本鎖の、ポジティブセンスの、ポリアデニル化されたRNAの単一分子である。図のように、このゲノムは、第一ポリタンパク質の上流に位置する長いUTR12を含み、そしてその末端に共有結合的に付着したVPgウイルスゲノム連結タンパク質を有する単一のオープンリーディングフレームORFを含む。このORFは、2つのセグメント14、16に細分され、これらの各々はポリタンパク質をコードする。第一のセグメント14は、ウイルスタンパク質VP1~VP4を形成するために引き続いて分割されるポリタンパク質をコードし、そして第二のセグメント16は、Cis-pro、プロテアーゼ、およびポリメラーゼを含む、ウイルスタンパク質前駆体であるポリタンパク質をコードする。このORFは、ポリA終結配列18で終結する。この最初の標的AUG開始部位は、塩基位置615~640の間に位置する。この領域を標的化することは、ポリタンパク質セグメント14、16の両方の翻訳を阻害するのに有効である。B.カリチウイルス図3Bは、カリチウイルスこの場合は、カリチウイルス科のベシウイルスのゲノム20を示す。このゲノムは、約7.5kbの感染性の、一本鎖の、ポジティブセンスRNAの単一分子である。図のように、ゲノム20は、修飾されていない第一オープンリーディングフレームORF124の上流のUTR22を含む。ゲノム20の3’末端26は、ポリアデニル化されている。ゲノム20は、3つのオープンリーディングフレームを含む。第一のオープンリーディングフレーム24は、ヘリカーゼ、プロテアーゼ、RNA依存性RNAポリメラーゼ、および、ウイルスゲノムRNAの5’末端に結合するタンパク質であるVPgを含むウイルス性の非構造タンパク質を形成するために引き続いて分割される、ポリタンパク質をコードするClarkeおよびLambden、2000。第二のオープンリーディングフレーム28は、単一のキャプシドタンパク質をコードし、第三のオープンリーディングフレーム29は、本質的に塩基性であり、おそらくRNAと結合し得る構造タンパク質であることが報告されているものをコードするGreenら、2000。最初の標的AUG開始部位は、塩基位置7~35の間に位置する。この領域を標的化することは、第一リーディングフレーム24の翻訳を阻害するのに有効である。C.トガウイルス図3Cは、トガウイルスこの場合は、トガウイルス科のルベラウイルスのゲノム30の構造を示す。ゲノム30は、約11.7kbの一本鎖の、ポジティブセンスRNAの単一線状分子であり、感染性である。その5’末端32は、7-メチルG分子でキャップされ、3’末端34は、ポリアデニル化されている。全長のメッセンジャーRNAおよびサブゲノムのメッセンジャーRNAが明らかにされており、ポリタンパク質の翻訳後分割は、RNA複製の間に起こる。ゲノム30は、2つのオープンリーディングフレーム36、38を含む。第一のオープンリーディングフレーム36は、引き続いて4つの機能的なタンパク質であるnsP1~nsP4に分割されるポリタンパク質をコードしている。第二のオープンリーディングフレーム38は、ウイルスキャプシドタンパク質ならびに3つの他のウイルスタンパク質であるPE2、6KおよびE1をコードしている。第一オープンリーディングフレーム36のAUG開始部位は、塩基位置10~40の間に位置する。この領域を標的化することは、第一オープンリーディングフレーム36の翻訳を阻害するのに有効である。D.フラビウイルス図3Dは、フラビウイルス科のC型肝炎ウイルスのゲノム40の構造を示す。C型肝炎ウイルスゲノムは、約11kbの一本鎖の、ポジティブセンスRNAの単一線状分子である。その5’末端42は、m7GppAmp分子でキャップされ、3’末端44は、ポリアデニル化されていない。ゲノム40は、1つのオープンリーディングフレーム46のみを含み、これは、6つの構造的タンパク質および機能的タンパク質に分離し得る前駆体ポリタンパク質をコードする。最初のAUG開始部位は、塩基位置310に位置する。対応するウイルスゲノムのORF1開始部位を含む、例示的なウイルス核酸配列についてのGenBank照会は、以下の表3に列挙される。これらの配列は、文献リソースまたは特許リソースの利用可能な遺伝子配列データベースから入手可能であり得るので、4つのウイルス科のメンバーのORF1開始部位領域中の他の配列の例示にすぎないことが認識される。以下の配列は、配列番号1~15として同定され、本発明明細書の終末の表10に列挙される。表3.ORF1のAUG部位に及ぶ例示的なウイルス核酸配列前述のように、この標的化配列、つまり、アンチセンスオリゴマーの塩基配列は、好ましくはウイルス標的配列のAUGに及ぶ部分に対して指向される。特に、標的化配列は、前述のように、ウイルスゲノムの第一オープンリーディングフレームのAUG開始部位に及ぶ標的領域の部分に対して、相補的であるか、または実質的に相補的であり、そして、標的と標的化配列との間の相補性の程度は、安定な二本鎖を形成するのに十分である。最小の長さの8塩基では、この標的化配列は、AUGコドンに対して配向されるCAT配列を含み、そしてこの配列の片側に少なくとも3塩基を、他方側に2塩基を含む。標的RNA配列と相補性のあるアンチセンスオリゴマーの領域は、8~11塩基程度に短くてもよいが、好ましくは12~15塩基もしくはそれ以上例えば12~20塩基、または12~25塩基である。約15塩基のアンチセンスオリゴマーは、一般に、ウイルスゲノムにおいて特有の相補的配列を有するのに十分長い。さらに、相補的塩基の最小限の長さは、以下に考察されるように、必須の結合Tmに達するのに必要とされ得る。40塩基程度の長いオリゴマーが適切であり得、ここで、少なくとも最小数の塩基例えば、8~11塩基、好ましくは12~15塩基は、この標的配列に相補的である。一般には、しかし、細胞における促進性の取り込みまたは能動的取り込みは、約30塩基未満、好ましくは25塩基未満、より好ましくは20塩基またはより少数の塩基のオリゴマー長に最適化される。PMOオリゴマーに関して、さらに下記のように、結合安定性および取り込みの最適な平衡は、一般に、13~18塩基長で生じる。このオリゴマーは、このオリゴマーとウイルスの核酸標的配列との間に形成されたヘテロ二本鎖が、細胞性ヌクレアーゼもしくはインビボで起こり得る他の分解機序の作用に耐える程度に実質的に安定である限りは、ウイルス核酸標的配列に100相補的であり得るか、またはミスマッチ例えば、変異体に適応するを含み得る。ヌクレアーゼによる切断に感受性の低いオリゴマー骨格は、以下に考察される。ミスマッチは、もし存在するならば、ハイブリッド二本鎖の中央よりも末端領域に向かって、より不安定性が低い。許可されたミスマッチの数は、よく理解された二本鎖安定性の原理に従って、オリゴマーの数、二本鎖中のG:C塩基対のパーセンテージ、および二本鎖中のミスマッチの位置に依存する。このようなアンチセンスオリゴマーは、ウイルス核酸標的配列に100相補的である必要は無いが、核酸標的の生物学的活性例えば、ウイルスタンパク質の発現が調節されるように、標的配列に安定におよび特異的に結合するのに有効である。オリゴマーと標的配列との間に形成された二本鎖の安定性は、結合Tmおよび細胞性の酵素切断に対する二本鎖の感受性の関数である。相補的配列のRNAに対するアンチセンス化合物のTmは、Hamesら、NucleicAcidHybridization、IRLPress、1985、pp.107-108に記載されるような、従来の方法によって測定され得る。各々のアンチセンスオリゴマーは、相補的配列のRNAに対して、体温より高い結合Tm、好ましくは50°Cより高い結合Tmを有するべきである。60°C~80°Cの範囲またはそれより大きいTmは好ましい。周知の原理に従って、オリゴマー化合物のTmは、相補性に基づくRNAハイブリッドに対して、二本鎖中のC:G塩基対の比率の増大、および/またはヘテロ二本鎖の塩基対の長さの増大によって、増大され得る。同時に、結合Tmは、細胞性の取り込みを最適化する目的のために、オリゴマーのサイズを制限するのに有利であり得る。この理由のために、15塩基またはそれより小さい塩基の長さで、高いTm50°Cまたはそれより高いを示す化合物は、一般に、高いTm値のために必要な塩基をさらに20塩基超えることが好ましい。表4は、ピコルナウイルス科、カリチウイルス科、トガウイルス科、およびフラビウイルス科の選択されたウイルスの第一オープンリーディングフレームORF1の翻訳開始部位に及ぶ標的領域に対して指向される例示的な標的化配列を列挙する。これらの配列は、前述のとおり、前述の標的配列中のAUG部位に及ぶ1つまたはそれ以上の配列に対して相補的な配列の構築によって選択した。この一般的ルールの例外は以下である:配列番号26はウイルスゲノムの点に指向される;配列番号23~25は、下線によって示されるように、ミスマッチおよび/または挿入を含む;ならびに、配列番号33はATG開始コドンを1つだけ含む。表4.ORF1翻訳開始領域を標的化する例示的なアンチセンス配列IV.アンチセンスオリゴマーA.特性先に詳述したように、オリゴマーは、好ましくはORF1開始部位に及ぶ、ウイルスゲノムの標的化された部分に対して指向される塩基配列を有する。さらに、感染した宿主細胞例えば、感染した哺乳動物被験体に投与する場合、このオリゴマーは、効率的に感染ウイルスを標的にすることが可能である。後者の必要条件は、オリゴマー化合物が、a哺乳動物細胞によって能動的に取り込まれる能力を有し、そしてb一旦取り込まれると、標的ssRNA配列と約50°Cよりも大きいTmで二本鎖を形成する場合に、満たされる。下記のように、細胞によって取り込まれる能力は、オリゴマーの骨格が実質的に無電荷であることが必要であり、そして好ましくは、オリゴマー構造物が細胞膜を横断する能動輸送または促進輸送の基質として認識されることが必要である。標的RNAと安定な二本鎖を形成するためのオリゴマーの能力はまた、オリゴマーの骨格、ならびに前記の要因標的配列に対するアンチセンスの長さおよび相補性の度合い、A:T塩基対に対するG:C塩基対の比率、ならびに任意のミスマッチな塩基の位置に依存する。細胞性ヌクレアーゼに耐え得るアンチセンス薬剤の能力は、細胞質までのこの薬剤の残存および最終的な送達を促進する。以下は、これらの必要条件を満たす能力について、任意の所定の実質的に無電荷の骨格を試験するために開示された方法である。A1.細胞による能動的取り込みまたは促進的取り込みアンチセンス化合物は、もし遊離形態非複合型の形態で投与されるならば、宿主細胞膜を横断する促進的輸送もしくは能動的輸送によって宿主細胞に取り込まれ得、またはもし複合型の形態で投与されるならば、エンドサイトーシスの機構によって宿主細胞に取り込まれ得る。薬剤が遊離形態で投与される場合、このアンチセンス化合物は、実質的に無電荷サブユニット間連結の大多数が、生理学的pHにおいて無電荷であることを意味するであるべきである。本発明を支持して実施された実験は、正味電荷の少数例えば、15~20マーのオリゴマーに対して1~2荷電が、実質的に無電荷の骨格を持つ特定のオリゴマーの細胞性取り込みを実際に亢進し得ることを示す。この電荷は、オリゴマー自身に保有され得例えば、骨格連結中に、または末端荷電基付属物であり得る。好ましくは、荷電した連結の数は、4個の無電荷連結に対してわずか1個の荷電連結である。さらに好ましくは、この数は、10個または20個の無電荷連結に対してわずか1個の荷電連結である。1つの実施形態において、このオリゴマーは、完全に無電荷である。オリゴマーはまた、反対の電荷がほぼ同数で存在する限り、負に荷電された骨格連結および正に荷電された骨格連結の両方を含み得る。好ましくは、このオリゴマーは、いずれの電荷でも3~5より多い連続したサブユニットの連なりを含まない。例えば、オリゴマーは、所定数のアニオン性連結例えば、ホスホロチオエート結合またはN3’→P5’ホスホルアミデート結合、および匹敵する数のカチオン性連結例えば、N,N-ジエチレンジアミンホスホルアミデートを有し得るDagle,2000。正味電荷は、好ましくは、中性または1オリゴマー当たり多くとも1~2の正味電荷である。実質的に荷電されていないか、または全く荷電されていないことに加えて、このアンチセンス剤は、好ましくは、細胞膜を横断するオリゴマーの輸送を促進し得るか、細胞膜を横断するオリゴマーを能動的に輸送し得る膜輸送系すなわち、膜タンパク質単数または複数の基質である。この特徴は、以下のように、オリゴマー相互作用または細胞取り込みについての多数の試験のいずれかによって決定され得る。第1の試験は、細胞表面上でオリゴマー化合物が置換するか、または選択された荷電オリゴマー例えば、ホスホロチオエートオリゴマーによって置換される能力を調べることによって、細胞表面レセプターでの結合を評価する。これらの細胞は、約10~300nMの間の最終濃度で、所定の量の試験オリゴマーこれは、代表的には、蛍光標識されるとインキュベートされる。その直後例えば、10~30分後試験オリゴマーの有意な内部移行が生じ得る前、置換する化合物が、徐々に増大する濃度で添加される。試験化合物が細胞表面レセプターに結合し得る場合、置換する化合物は、試験化合物を置換することが観察される。置換する化合物が、10×試験化合物濃度以下の濃度で50置換を生じることが示された場合、試験化合物は、細胞輸送系について、置換する化合物と同じ認識部位で結合すると考えられる。第二の試験は、試験化合物が標識レポーター例えば、蛍光レポーターを細胞に輸送する能力を調べることによって、細胞輸送を測定する。細胞は、約10~300nMの最終濃度で添加された、標識された試験化合物の存在下でインキュベートされる。30~120分間のインキュベーション後、細胞は、細胞内標識について、例えば、顕微鏡検査によって、調べられる。有意な細胞内標識の存在は、促進された輸送または能動的な輸送によって試験化合物が輸送されることの証拠である。アンチセンス化合物はまた、複合体化された形態で投与され得、ここで複合体化剤は、代表的には、アンチセンス化合物における正味電荷とは反対の電荷を有するポリマー例えば、カチオン性脂質、ポリペプチド、または非生物学的カチオン性ポリマーである。アニオン性オリゴヌクレオチドとカチオン性脂質または他のポリマー成分との間の複合体二層複合体を含むを形成する方法は、周知である。例えば、リポソーム組成物Lipofectin登録商標Felgnerら、1987カチオン性脂質DOTMAN-[1-2,3-ジオレイルオキシプロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロライドおよび中性リン脂質DOPEジオレイルホスファチジルエタノールアミンを含むが広範に使用される。投与後、複合体は、エンドサイトーシス機構代表的には、エンドソーム体における粒子カプセル化を包含するを通じて細胞によって取り込まれる。あるいは、そして本発明の別の局面に従って、所定の骨格を有するオリゴマーの必要特性が、簡便なインビボ試験によって確認され得る。この簡便なインビボ試験では、標識された化合物を動物に投与し、そしてオリゴマーの投与数時間後に動物から採取した体液サンプルを、標的RNAとのヘテロ二重鎖の存在についてアッセイする。この方法は、以下のD節に詳述する。A2.RNaseHに対する実質的な抵抗性アンチセンスオリゴヌクレオチドによる発現の阻害を説明するために、2つの一般的な機構が提唱されている。例えば、Agrawalら、1990;Bonhamら、1995;およびBoudvillainら、1997を参照のこと。第一には、オリゴヌクレオチドとウイルスRNAとの間で形成されたヘテロ二重鎖が、RNaseHの基質として作用し、ウイルスRNAの開裂に至る。このクラスに属する、または属すると提唱されているオリゴヌクレオチドとしては、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、およびホスホジエステル未改変の天然のオリゴヌクレオチドが挙げられる。しかし、このような化合物は、オリゴマー:RNA二重鎖構造中のウイルスRNAをRNaseHによるタンパク質分解、および従って二重鎖の損失に曝露するので、それらは、本発明における使用のために最適に及ばない。オリゴヌクレオチドアナログの第二のクラス立体遮断剤stericblockerと呼ばれ、または別にRNaseH不活性またはRNaseH抵抗性と呼ばれるは、RNaseHの基質として作用することが観察されておらず、標的RNA核原形質輸送、スプライシング、または翻訳を立体的に遮断することにより作用すると考えられている。このクラスとしては、メチルホスホネートToulmeら、1996、モルホリノオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸PNA、特定の2’-O-アリルまたは2’-O-アルキル改変オリゴヌクレオチドBonham,1995、およびN3’→P5’ホスホルアミデートGee,1998;Ding,1996が挙げられる。試験オリゴマーは、Steinらに記載のように、試験化合物とRNA:オリゴマー二重鎖を形成し、次いで、標準的なアッセイ条件下で二重鎖をRNaseHとインキュベートすることによって、そのRNaseH抵抗性についてアッセイされ得る。RNaseHへの曝露後、インタクトな二重鎖の存在または不在は、ゲル電気泳動または質量分析によってモニターされ得る。A3.インビボ取り込み本発明の別の局面に従って、所定のアンチセンスオリゴマー型が上記の必要とされる特徴すなわち、高Tm、宿主細胞によって能動的に取り込まれる能力、およびRNaseHに対する実質的な抵抗性を提供することを確認するための、簡便で迅速な試験が提供される。この方法は、適切に設計されたアンチセンス化合物が、哺乳動物被験体に投与された場合にウイルスRNA標的の相補部分と安定なヘテロ二重鎖を形成し、このヘテロ二重鎖は続いて尿または他の体液中に出現するという発見に基づく。この方法の詳細はまた、同出願人の所有の米国特許出願第09/736,920号発明の名称標的RNAを検出するための非侵襲的方法非侵襲的方法、この開示内容は、参照することによって本明細書中に援用されているにおいて示される。簡潔には、既知のRNAに対して標的化された塩基配列を有する、評価される骨格を含む試験オリゴマーが、哺乳動物被験体に注入される。このアンチセンスオリゴマーは、宿主RNAまたは感染ウイルスのRNAを含む、任意の細胞内RNAに対して指向される。投与後数時間代表的には、8~72で、尿は、アンチセンス-RNAヘテロ二重鎖の存在についてアッセイされる。ヘテロ二重鎖が検出された場合、その骨格は、本発明のアンチセンスオリゴマーにおいて使用するために適切である。試験オリゴマーは、例えば、蛍光タグまたは放射性タグによって、それが哺乳動物に適切である場合、続く分析を促進するために、標識され得る。このアッセイは、任意の適切な固相または液体フォーマットであり得る。一般に、固相アッセイは、まずヘテロ二重鎖被分析物を固相支持体例えば、粒子またはポリマーまたは試験片基材に結合し、そして結合した二重鎖の存在/量を検出することを包含する。液相アッセイでは、代表的には、被分析サンプルは、干渉するサンプル成分を除去するために前処理される。オリゴマーが標識される場合、ヘテロ二重鎖の存在は、標識タグを検出することによって確認される。非標識化合物については、ヘテロ二重鎖は、固相フォーマットの場合、免疫アッセイにより、または溶液もしくは懸濁液フォーマットの場合、質量分析もしくは他の公知の方法によって、検出され得る。アンチセンスオリゴマーが、ウイルスゲノムのウイルス特異的領域例えば、上述のようなORF1の翻訳開始領域に相補的である場合、本方法は、所定のssRNAウイルスの存在、または処理方法の間のウイルスの量の減少を検出するために使用され得る。B.例示のオリゴマー骨格オリゴヌクレオチドアナログにおいて使用され得る非イオン性連結の例を、図4A~4Hに示す。これらの図において、Bは、塩基特異的水素結合によって、ポリヌクレオチド中の塩基好ましくは、アデニン、シトシン、グアニン、およびウラシルから選択されるに結合するのに有効なプリンまたはピリミジン塩基対合部分を表す。適切な骨格構造としては、炭酸結合4A,R=Oおよびカルバミン酸結合4A,R=NH2Mertes,1969;Gait,1974;ホスホン酸アルキル結合およびホスホトリエステルアルキル結合4B,R=アルキルまたは-O-アルキルMiller,1993;Lesnikowski,1990;アミド結合4CBloomers,1994;スルホン結合およびスルホンアミド結合4D,R1,R2=CH2Roughten,1995;McElroy,1994;ならびにチオホルムアセチル結合4EMatteucci,1990;Cross,1997が挙げられる。後者は、ホスホロチオエートアンチセンス化合物に関して二重鎖および三重鎖の増大した安定性を有することが報告されているCross,1997。構造4Fの3’-メチレン-N-メチルヒドロキシアミノ化合物もまた報告されているMohan,1995。ペプチド核酸PNA図4Gは、その骨格がデオキシリボース骨格と構造的に同形homomorphousであるDNAのアナログであり、ピリミジンまたはプリン塩基が結合したN-2-アミノエチルグリシン単位からなる。天然ピリミジンおよびプリン塩基を含むPNAは、ワトソン-クリック塩基対合規則に従う相補オリゴヌクレオチド、および塩基対合認識によって模倣DNAにハイブリダイズするEgholmら、1993。PNAの骨格は、ホスホジエステル結合よりむしろペプチド結合によって形成され、このことは、それらを、アンチセンス適用に十分に適するものとする。骨格は、荷電されておらず、通常より高い熱安定性を示すPNA/DNAまたはPNA/RNA二重鎖を生じる。PNAは、ヌクレアーゼにもプロテアーゼにも認識されない。好ましいオリゴマー構造は、上述のように、荷電していない連結によって接続された塩基対合部分を有するモルホリノベースのサブユニットを用いる。図4Hおよび図2B-Bにおいて説明されているような、実質的に荷電していないホスホロジアミデート結合モルホリノオリゴマーが、特に好ましい。モルホリノオリゴヌクレオチドアンチセンスオリゴマーを含むは、例えば、同出願人の所有の米国特許第5,698,685号、第5,217,866号、第5,142,047号、第5,034,506号、第5,166,315号、第5,185,444号、第5,521,063号、および第5,506,337号これらは全て、本明細書中に参照することによって明確に援用されているに詳述されている。図1A~Eに示すモルホリノベースのサブユニットの重要な特性としては、以下が挙げられる:安定な荷電されていない骨格連結によってオリゴマー形態に連結される能力;形成されるポリマーが、10~14塩基程度の短さのオリゴマーとでさえも、高Tmで、相補塩基標的核酸標的RNAを含むとハイブリダイズし得るように、ヌクレオチド塩基例えば、アデニン、シトシン、グアニン、またはウラシルを支持する能力;オリゴマーが哺乳動物細胞に能動的に輸送される能力;およびオリゴマー:RNAヘテロ二重鎖がRNAse分解に抵抗し得る能力。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの例示の骨格構造としては、図1A~Eに示されるβ-モルホリノサブユニット型が挙げられ、各々は、荷電されていないリン含有サブユニット結合によって連結される。図1Aは、図2Aここでは、モルホリノ環が1原子ホスホアミド結合によって連結されているに示される5原子反復単位骨格を形成するリン含有結合を示す。図1Bは、図2Bに示されるような6原子反復単位骨格を生成する連結を示す。この構造において、5’モルホリノ炭素をリン基に連結する原子Yは、イオウ、窒素、炭素、または好ましくは、酸素であり得る。リンから張り出したX部分は、フッ素、アルキルもしくは置換アルキル、アルコキシもしくは置換アルコキシ、チオアルコキシもしくは置換チオアルコキシ、または環状構造を含む未置換、単置換、もしくは二置換窒素例えば、モルホリノまたはピペリジンであり得る。アルキル、アルコキシ、およびチオアルコキシは、好ましくは、1~6の炭素原子を含む。Z部分は、イオウまたは酸素であり、そして好ましくは、酸素である。図1C~Eに示される連結は、図2C~Eにおいて構造が示されるように、7原子単位長の骨格について設計される。構造2Cでは、X部分は、構造2Bと同様であり、部分Yは、メチレン、イオウ、または好ましくは、酸素であり得る。構造2Dでは、X部分およびY部分は、構造2Bと同様である。構造2Eでは、Xは構造2Bと同様であり、そしてYはO、S、またはNRであって、ここでRは水素または低級アルキルであり、好ましくは水素またはメチルである。図2A~Eに示される全てのサブユニットにおいて、ZはOまたはSであり、そしてPiおよびPjの各々は塩基対合部分であり、好ましくは、アデニン、シトシン、グアニン、およびウラシルから選択される。特に好ましいモルホリノオリゴヌクレオチドとしては、図2Bに示される形態のモルホリノサブユニット構造ここで、X=NH2またはNCH32、Y=O、そしてZ=Oであるで構成されたモルホリノオリゴヌクレオチドが挙げられる。上述のように、実質的に荷電されていないオリゴマーは、有利に、限定された数の荷電連結例えば、5つの非荷電連結につき約1まで、より好ましくは、10の非荷電連結につき約1までを含み得る。従って、小数の荷電連結例えば、荷電されたホスホルアミデートまたはホスホロチオエートもまた、オリゴマーに組み込まれ得る。モルホリノオリゴマーの場合、このような荷電連結は、図2A~Eのいずれかによって表されるような連結ここで、Xはオキシド-O-またはスルフィド-S-であるであり得る。アンチセンス化合物は、上記の参考文献において詳述された方法を用いて、逐次固相合成によって調製され得る。いくつかの場合では、例えば、薬物動態を増強するため、または化合物の捕獲もしくは検出を容易にするために、さらなる化学部分をアンチセンス化合物に付加することが望ましいとされ得る。このような部分は、標準的な合成方法に従って、代表的にはオリゴマーの末端に、共有結合され得る。例えば、ポリエチレングリコール部分または他の親水性ポリマー例えば、10~100モノマーサブユニットを有するポリマーの付加は、可溶性を増強する際に有用であり得る。1つ以上の荷電基例えば、アニオン性荷電基例えば、有機酸は、細胞取り込みを増強し得る。レポーター部分例えば、フルオレセインまたは放射性標識基は、検出の目的のために結合され得る。あるいは、オリゴマーに結合されたレポーター標識は、標識された抗体もしくはストレプトアビジンを結合し得るリガンド例えば、抗原もしくはビオチンであり得る。オリゴマーアンチセンスの結合または改変について部分を選択する際に、一般には、無論、生体適合性であり、かつ望ましくない副作用がなく被験体によって寛容化され得ると思われる基の化学的化合物を選択することが望ましい。V.ウイルス複製の阻害上記で詳述したアンチセンス化合物は、ピコルナウイルス科、カリチウイルス科、トガウイルス科、およびフラビウイルス科のssRNAウイルスの複製を阻害する際に有用である。1つの実施形態では、このような阻害は、これらのウイルスによる宿主動物の感染を処置する際に有効である。従って、この方法は、1つの実施形態では、ウイルスに感染した細胞を、特定のウイルスのゲノムの第一のオープンリーディングフレームにコードされたポリタンパク質の翻訳を阻害するのに有効なアンチセンス剤と接触させる工程を包含する。さらなる実施形態では、アンチセンス剤は、適切な薬学的キャリア中で、所定のウイルスに感染した哺乳動物被験体例えば、ヒトまたは家庭内動物に投与される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、宿主においてRNAウイルスの増殖を阻止すると考慮される。RNAウイルスは、宿主の正常な成長または発達に有害な影響をほとんどまたは全く与えることなく、数が減少し得るか、または除去され得る。A.感染因子の同定感染を引き起こす特定のウイルスは、当該分野で公知の方法例えば、血清学的方法もしくは培養方法または本発明のアンチセンスオリゴマーを用いる方法によって決定され得る。血清学的同定は、被験体の生物学的標本例えば、糞便、尿、脳脊髄液、血液などから単離されたウイルスサンプルまたは培養物を使用する。一般に、ウイルスの検出の免疫アッセイは、当業者によって慣用的に使用される方法例えば、ELISAまたはウエスタンブロットによって実施される。さらに、特定のウイルス株または種に特異的なモノクローナル抗体はしばしば市販されている。培養方法は、種々の培養条件下で特徴例えば、増殖速度および形態を比較することを含むがこれらに限定されない技術を用いることによって、特定のタイプのウイルスを単離および同定するために使用され得る。感染した被験体においてウイルス感染因子を同定するための別の方法は、ウイルスの広範な科および/または属例えば、ピコルナウイルス科、カルシウイルス科、トガウイルス科およびフラビウイルス科を標的化する1つ以上のアンチセンスオリゴマーを用いる。任意の特徴的なウイルスRNAを標的化する配列が使用され得る。所望の標的配列は、好ましくは、i広範な科/属に共通であり、そしてiiヒトに見出されない。多数の感染ウイルスに特徴的な核酸配列は、公のデータベースで利用可能であり、そして特定のオリゴマーの設計の基礎として供し得る。複数のオリゴマーの各々について、以下の工程が実施される:aオリゴマー単数または複数を被験体に投与する;bその投与後の選択された時点で、体液サンプルを被験体から得る;およびcアンチセンスオリゴマーおよびウイルスゲノムの相補部分を含むヌクレアーゼ抵抗性ヘテロ二重鎖の存在についてサンプルをアッセイする。工程a~cは、少なくとも1つのこのようなオリゴマー、またはウイルスもしくはウイルスの科を同定するために必要とされる数のオリゴマーについて実施される。オリゴマーは、投与され、そして続いて、またはより便宜的には同時に、アッセイされ得る。ウイルスは、アンチセンスオリゴマーおよび所定の公知のウイルスまたはウイルス科のウイルスゲノムの相補部分を含むヘテロ二重鎖の存在または不在に基づいて同定される。好ましくは、広範な科を標的化するオリゴマーの第一の群をまず用いて、次いで、それにより同定される広範な科/属内で特定の属および/または種および/または株に相補的なオリゴマーを選択する。この第二の群のオリゴマーは、広範な科/属内の特定の属および/または種および/または株に対して指向される標的化配列を含む。一般に、いくつかの異なる第二のオリゴマー集団すなわち、第一段階で試験される広範なウイルス科/属の各々につき1つが提供される。i試験される個々の属/種/株に特異的であり、かつiiヒトにおいて見出されない配列が選択される。B.アンチセンスオリゴマーの投与標的核酸へのアンチセンスオリゴマーの有効な送達は、処置の重要な局面である。本発明によれば、アンチセンスオリゴマー送達の経路としては、種々の全身経路経口経路および非経口経路を含む例えば、静脈内、皮下、腹腔内、および筋内、ならびに吸入、経皮送達および局部送達が挙げられるが、これらに限定されない。適切な経路は、処置されている被験体の状態に適切であるように、当業者によって決定され得る。例えば、皮膚のウイルス感染の処置におけるアンチセンスオリゴマーの適切な送達のための経路は、局部送達であるが、ウイルス呼吸器感染の処置のためのアンチセンスオリゴマーの送達は吸入による。オリゴマーはまた、直接にウイルス感染部位に、または血流に送達され得る。アンチセンスオリゴマーは、生理学的に受容可能な任意の好都合なビヒクル中で投与され得る。このような組成物は、当業者によって使用される種々の標準的な薬学的に受容可能なキャリアのいずれかを含み得る。例としては、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水PBS、水、水性エタノール、乳濁液例えば、油/水乳濁液またはトリグリセリド乳濁液、錠剤、およびカプセルが挙げられるが、これらに限定されない。生理学的に受容可能なキャリアの適切な選択は、選択した投与様式に依存して変動する。いくつかの場合、リポソームが、細胞へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの取り込みを容易にするために使用され得る。例えば、Williams,S.A.,Leukemia1012:1980-1989,1996;Lappalainenら.,AntiviralRes.23:119,1994;Uhlmannら,ANTISENSEOLIGONUCLEOTIDES:ANEWTHERAPEUTICPRINCIPLE,ChemicalReviews,Volume90,No.4,pages544-584,1990;Gregoriadis,G.,Chapter14,Liposomes,DrugCarriersinBiologyandMedicine,pp.287-341,AcademicPress,1979を参照のこと。ヒドロゲルもまた、例えば、WO93/01286に記載されるように、アンチセンスオリゴマー投与のためのビヒクルとして使用され得る。あるいは、オリゴヌクレオチドは、ミクロスフェアまたは微粒子中で投与され得る。例えば、Wu,G.Y.およびWu,C.H.,J.Biol.Chem.262:4429-4432,1987を参照のこと。徐放性組成物もまた使用され得る。これらは、成形品の形態例えば、フィルムまたはマイクロカプセルで半透性ポリマーマトリクスを含み得る。本方法の1つの局面では、被験体は、ヒト被験体例えば、局部的なウイルス感染または全身ウイルス感染を有するとして診断された患者である。例えば、1免疫無防備状態である患者;2やけど患者;3留置カテーテルを有する患者;または4手術を受ける予定のある患者、もしくは最近手術を受けた患者の場合、患者の状態もまた、本発明のアンチセンスオリゴマーの予防的な投与を指示し得る。1つの好ましい実施形態では、オリゴマーは、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーであり、これは、薬学的に受容可能なキャリア中に含有され、経口送達される。別の好ましい実施形態では、オリゴマーは、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーであり、薬学的に受容可能なキャリア中に含有され、静脈内IV送達される。本方法の別の適用では、被験体は、家畜動物例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、ブタ、ウシまたはヤギなどであり、処置は、予防的または治療的のいずれかである。本発明はまた、上記のタイプの抗ウイルス性アンチセンス化合物の治療量以下の量を補充した穀物を含む、家畜および家禽の食餌組成物を包含する。また、抗ウイルス性の治療量以下レベルを補充した穀物を家畜および家禽に給餌する方法において、穀物に、上記の抗ウイルス性オリゴヌクレオチド組成物の治療量以下の量が補充されるという改善点が考慮される。アンチセンス化合物は、一般に、少なくとも200~400nMアンチセンスオリゴマーのピーク血中濃度を生じるのに有効な量および様式で投与される。代表的には、アンチセンスオリゴマーの1つ以上の用量が、一般には、約1~2週間の間、定期的な間隔で投与される。経口投与のための好ましい用量は、70kg当たり約1~25mgのオリゴマーからである。いくつかの場合では、患者当たり25mgより多いオリゴマーの用量が必要であり得る。静脈内投与について、好ましい用量は、70kg当たり約0.5mg~10mgのオリゴマーである。アンチセンスオリゴマーは、短時間の間に定期的な間隔例えば、2週間以下の間に毎日で投与され得る。しかし、いくつかの場合、オリゴマーは、より長い期間にわたって断続的に投与される。投与は、抗生物質または他の治療剤処置の投与が後に続き得るか、または同時であり得る。処置レジメは、処置を受けている被験体の免疫アッセイ、他の生化学的試験および生理学的試験の結果に基づいて、示されるように調整され得る用量、頻度、経路など。C.処置のモニタリング本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いる有効なインビボでの処置レジメは、投与の持続期間、用量、頻度、および経路、ならびに処置を受けている被験体の状態すなわち、予防的投与対局所感染または全身感染に応じた投与に従って変動し得る。従って、このようなインビボ治療は、最適な治療結果を達成するために、特定のタイプのウイルス感染に適切な試験によるモニタリング、および用量または処置レジメにおける対応する調整をしばしば必要とする。処置は、例えば、感染の一般的な指標例えば、全血球算定CBC、核酸検出方法、免疫診断試験、ウイルス培養、またはヘテロ二重鎖の検出によってモニタリングされ得る。インビボ投与された本発明のアンチセンスオリゴマーが1つ以上の型のRNAウイルスの増殖を阻害または除去する際の効力は、アンチセンスオリゴマーの投与前、投与の間に、および投与後に被験体から採取した生物学的サンプル組織、血液、尿などから決定され得る。このようなサンプルのアッセイは、1当業者に公知の手順例えば、電気泳動ゲル移動度アッセイを用いて標的配列と非標的配列とのヘテロ二重鎖の形成の存在または不在のモニタリング;2標準的な技術例えば、ELISAまたはウェスタンブロッティングにより決定されるようなウイルスタンパク質産生の量のモニタリング;または3例えば、Spearman-Karberの方法によりウイルス価に対する効果の測定を含む。例えば、Pari,G.S.ら、Antimicrob.AgentsandChemotherapy395:1157-1161,1995;Anderson,K.P.etal.,Antimicrob.AgentsandChemotherapy409:2004-2011,1996,Cottral,G.E.edin:ManualofStandardMethodsforVeterinaryMicrobiology,pp.60-93,1978を参照のこと。アンチセンス処理の有効性をモニターする好ましい方法は、アンチセンスRNAヘテロ二重鎖の検出による。アンチセンス投与後の選択された時間で、体液は、サンプル中のヘテロ二重鎖種の存在を検出および/またはヘテロ二重鎖種のレベルを測定するために収集される。代表的に、体液サンプルは、投与後3~24時間好ましくは、投与後約6~24時間で収集される。上記のように、体液サンプルは、尿、唾液、血漿、血液、脊髄液、または生物学的供給源の他の液体サンプルであり得、そして細胞またはそれらに懸濁された細胞フラグメント、あるいは液体培地およびその溶液を含み得る。収集されたサンプルの量は、代表的に0.1~10mlの範囲、好ましくは約1ml未満である。サンプルを処理して所望でない成分を除去し得、そして/またはサンプル中のヘテロ二重鎖種を処理して所望でないssRNAオーバーハング領域を例えば、RNaseでの処理によって除去し得る。もちろん、オーバーハングを除去することが特に重要であり、ヘテロ二重鎖検出はサイズ分離例えば、質量分光法の電気泳動に依存する。種々の方法は、サンプルから所望でない成分を除去するのに利用可能である。例えば、ヘテロ二重鎖は、正味の負電荷を有するので、電気泳動技術またはイオン交換技術を使用して、天然の物質または正電荷物質からヘテロ二重鎖を分離し得る。サンプルはまた、表面結合抗体またはヘテロ二重鎖を特異的に結合し得る他の試薬を有する固体支持体と接触され得る。結合していない物質を除去するために支持体を洗浄した後、ヘテロ二重鎖は、さらなる分析例えば、電気泳動、質量分光法または免疫アッセイのための実質的に精製された形態で放出され得る。実施例以下の実施例が示されるが、本発明を限定する任意の方法を意図していない。材料および方法標準の組換えDNA技術を、Ausubel,FMら、CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY,JohnWileyおよびSons,Inc.,Media,PA,1992およびSambrook,J.ら、MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,Vol.2,1989に記載されるように全ての構成に利用した。実施例1:インビトロでのピコルナウイルス科ヒトライノウイルスのアンチセンス阻害ライノウイルス14の翻訳開始ゾーンに標的化された配列を有するホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーPMOのライノウイルス16に対する阻害効果を、評価した。ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーPMOを、SummertonおよびWeller,1997に記載されるように、AVIBioPharmaCorvallis,ORで合成した。全長のオリゴマーの純度は、逆相高圧液体クロマトグラフィーおよびMALDITOF質量分光法によって決定されるように90以上であった。凍結乾燥したPMOを、細胞培養物において使用する前に滅菌した0.9NaClに溶解し、0.2μmのAcrodiscフィルターGelmanSciences,AnnArbor,MIに通して濾過した。PMOは、ライノウイルス14を標的化する核酸配列を含み、そしてライノウイルス16の標的配列に関して3つのミスペアを含む。この標的配列GenBankNC001752618-637;配列番号5および標的化配列配列番号18を以下に示す:ここで、太字のコドンは開始コドンであり、ミスペアには下線を引く。HeLa細胞の24時間経時した培養物を、6つのウェルプレート中で24時間増殖した。コンフルエントの単層を、5のウシ胎仔血清、L-グルタミン、抗生物質および重炭酸ナトリウムを補充したEarles最小必須培地MEM中で増殖させた。細胞を、37°C、5CO2中で、加湿した雰囲気下でインキュベートした。処理の前に、単層を、血清を含まないMEMで2回リンスした。PMOを、スクレイプ-ローディングscrape-loading法によって、培養した細胞に導入した。この方法は、培養物中の80~90の接着細胞にPMOを送達することが公知であるPartridgeら、1996。このオリゴマーを、血清を含まないMEM中で20μMの最終濃度まで希釈した。0.5ml体積のオリゴマー-MEM培地を培養物に添加し、室温で1分後、細胞をラバーポリスマンで穏やかにはがしたscrapoff。細胞をCO2インキュベーターに10分間戻し、次いで、仔ウシ血清を含むMEM8ml中に希釈し、そして96ウェルプレートの1ウェルライノウイルス16の対数希釈物を含むあたり0.1mlに分散した1希釈あたり8ウェル。これらのプレートを、72時間37°Cにて、CO2インキュベーター中でインキュベートし、その時間の後、これらを細胞変性効果の存在について、OlympusCK光学顕微鏡を用いて試験した。ウイルス力価TCID50を、Spearman-Karberの方法によって決定した。異なる処理グループに対するウイルス力価を以下の表6に示し、図5にグラフ化する。表6結果は、HRV-14に対するPMOアンチセンスで処理した場合、HRV-16のウイルス力価の75より多い阻害を示す。以前の研究において証明された、ライノウイルス16感染に対して指向されたライノウイルス16標的化配列の効果よりも効果は、低いが、3つのミスマッチ塩基対から予測されるように、この研究は、HRV-16遺伝子の翻訳開始ゾーンに対して実質的に相補的なPMOの抗ウイルス効果を確証する。実施例2:ブタの腎臓PK-15およびアフリカミドリザルの腎臓Vero組織培養物中のCaliciviridaeVesivirus単離物PCVPan-1よびSMSV-13のアンチセンス阻害Caliciviridaeのベシウイルス属のPan-1株およびSMSV-13株のORF1翻訳開始ゾーンに対して標的化した3つのホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーPMOの抗ウイルス効果を評価した。PMOを、上記のように、2つの宿主細胞株ブタの肝臓細胞PK-15ATCC番号CCL33およびアフリカミドリザルの腎臓細胞ATCC番号CCL18Vero、これらは、Pan-1株およびSMSV-13株のベシウイルスに実質的に曝露されたに対してスクレイプロードした。インキュベーションおよびウイルス負荷については、実施例に従った。3つのPMOの各々は、ORF1の開始コドンにわたってPan-1配列GenBank受入番号AF091736に対して相補的である標的化配列を含む。PMOを血清を含まない倍地中で20μmの濃度で使用した。生理食塩水ブランクおよびスクランブルした配列コントロールPMOを、研究に含めた。PMO配列ORF1.1配列番号27、ORF1.2配列番号28、およびORF1.3配列番号29として同定されるならびに標的部位の位置を、以下の表7に列挙する。表7:オリゴマー配列および標的位置PK-15およびVero細胞の両方におけるSMSV-13およびPan-1のウイルス力価に対するPMOの阻害効果を、表8に提供する。両方の細胞型を所定のウイルス株で試験した場合の簡単な阻害平均パーセントを示す。表8:PK-15およびVero宿主細胞中のベシウイルス、PCVPan-1株およびSMSV-13株のウイルス力価に対するアンチセンスPMOの効果ウイルス力価の有意な阻害を、ORF1標的化PMOを用いて、両方の細胞株中で、そして両方のウイルス血清型について観察し、ORF1.1が最も効果的であった。スクランブルしたコントロールPMOは、阻害効果を有さなかった。用量応答研究において、Vero細胞を、ORF1.1を有するPMOで、実施例1に記載のプロトコルに従って負荷した。ORF1.1PMOでの処理は、0.2μMおよび1.0μMで阻害を与えず、そして2.0μMで中程度の阻害を与え、20μMで高い阻害を与えた。ORF1.3PMOは、0.2μMでSMSV-13のウイルス力価の阻害を与えなかったが、阻害は、1.0μMで高く;さらなる阻害は、2μM、10μMおよび20μMで観察されなかった。実施例3:ネコのカリチウイルスのPMOアンチセンスの効果ネコに対して出血性のウイルスとなるネコカリチウイルスを単離し、そして細胞培地中で増殖させた。この細胞培地を実施例1に記載のプロトコルに従って、以下の標的化配列を有するアンチセンスPMOに曝露した:CAGAGTTTGAGACATTGTCTC配列番号32。ウイルス力価の1対数減少を細胞培地中で観察した。実施例4:HCV-TrimeraマウスのHCVウイルス血症に標的化されるアンチセンスPMOの効果この研究を、HarlanInc.WeizmannInstituteAnimalBreedingCenterで育てられそして維持されたから入手した病原体を含まない雌性CB6F1およびSCID/ベージュマウスで行った。マウスを、研究の開始前に、特定の病原体を含まない環境に収容し;滅菌した食物および酸性の水を自由に与えた。CB6F1マウスを、7~9週齢で胸腺摘出した。実験を、12~18週齢19~25g/マウスのCB6F1マウスを使用して行った。異種移植の前に、CB6F1マウスに、γビーム150-A60Co源CanadaのAtomicEnergyから0.7Gy/分の照射速度で、スプリット用量の全身照射4Gy、次いで1日後に11Gyを与えた。第1の照射後、シプロフロキサシン20μg/ml;Bayerを、7~10日間、飲み水に添加した。第2の照射線量の直後、マウスに、6~10週齢のSCID/ベージュマウスから得た4~6×106の骨髄細胞0.2mlPBS中を静脈内注射した。CB6F1マウスを、10mg/マウスの2,2,2トリブロモエタノールAldrichで麻酔し、そして開腹切開をした。C型肝炎ウイルスHCVを用いてエキソビボで感染したヒト肝臓フラグメントを、耳介の裏側に移植した。切開を9mmのオートクリップautoclipの創傷クリップで閉じた。マウスを、標的化配列GTGCTCATGGTGCAGGGTC配列番号35を有する第1のオープンリーディングフレームのAUG部位にわたるHCV核配列に対する、PMOアンチセンスで処理した。アンチセンス化合物または生理食塩水での処理を、4つのマウス群各群、約17動物を含むに対して、移植の10日~17日後に行った合計7日。0.01mg/マウス/日、0.03mg/マウス/日および0.1mg/マウス/日の用量のPMOを使用した。採血を16日目および21日目処置完了後が1日目で行い、血清サンプルを評価した。結果は、表9に要約され、そして図6にグラフ化さして示す。ウイルス負荷は、平均ウイルス負荷±SDHCV-RNAコピー/ml血清として与える。コントロールと処理した群のマウスとの間のHCVポジティブ動物のパーセンテージにおける差異を、χ2分析を使用して比較する。コントロールと処理された群のマウス群対との間のウイルス負荷における差異を、非パラメトリックのマンホイットニーのU検定によって比較する。表9:インビボでのアンチセンス用量応答効果の研究前記から、本発明の特定の実施形態が例示の目的で本明細書中に記載されるが、種々の改変が本発明の精神および範囲から逸脱することなくされ得ることが明らかである。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲以外に限定されない。表10:配列表"