以下の構成要素:1シグナルペプチドをコードするセグメント、2異種性の酸化還元因子再生ポリペプチドを含むセグメント、3随意に、プロテアーゼ認識部位をコードするセグメント、4膜貫通リンカーをコードするセグメント、および5オートトランスポーターまたはそのバリアントのトランスポータードメインをコードするセグメントを含む、核酸分子。酸化還元因子再生ポリペプチドにより再生される酸化還元因子が、NADH、NADPH、FADH2、ヘム、金属イオン、グルタチオン、ピロロキノリン-キノン、リン酸ピリドキサール、チアミンピロリン酸およびアスコルベートを含む群より選択される、請求項1に記載の核酸分子。酸化還元因子再生ポリペプチドが、1または2以上のフラビン補助因子を含む、請求項1または2に記載の核酸分子。酸化還元因子再生ポリペプチドが、NADHオキシダーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼを含む群より選択される、請求項1~3のいずれか一項に記載の核酸分子。酸化還元因子を再生するポリペプチドが、Lactobacillusbrevis、Thermusthermophilus、Thermusaquaticus、BrevibacteriumspKU139およびStreptococcusfaecalisのNADHオキシダーゼ、好ましくはLactobacillusbrevisのNADHオキシダーゼ、およびそのバリアントを含む群より選択される、請求項4に記載の核酸分子。オートトランスポーターのトランスポータードメインが、Ssp、Ssph1、Ssph2、PspA、PspB、Ssa1、SphB1、AspANalP、VacA、AIDAI、IcsA、MisL、TibA、Ag43、ShdA、AutA、Tsh、SepA、EspC、EspP、Pet、Pic、SigA、Sat、Vat、EpeA、EatA、EspI、EaaA、EaaC、パータクチン、BrkA、Tef、Vag8、PmpD、Pmp20、Pmp21、AgA1プロテアーゼ、App、Hap、rOmpA、rOmpB、ApeE、EstA、Lip1、McaP、BabA、SabA、AlpA、Aae、NanBおよびそのバリアントを含む群より選択される、請求項1~5のいずれか一項に記載の核酸分子。酸化還元因子再生ポリペプチドが酸素感受性である、請求項1~6のいずれか一項に記載の核酸分子。請求項1~7のいずれか一項に記載の核酸分子によりコードされるポリペプチド。請求項8に記載のポリペプチドを、その表面上に発現するか、または、請求項1~7のいずれか一項に記載の核酸分子を用いて形質転換された、細胞。請求項9に記載の細胞から得られる膜画分。酸化還元因子を再生する方法であって、以下の工程:a請求項8に記載のポリペプチド、請求項10に記載の膜調製品または請求項9に記載の細胞を提供すること、b請求項8に記載のポリペプチド、請求項10に記載の膜調製品または請求項9に記載の細胞を、酸化還元因子を再生するポリペプチドの1または2以上の基質と接触させること、ここで、1つの基質または幾つかの基質は、酸化還元因子を含む、を含む、前記方法。酸化還元因子の再生のための、請求項9に記載の細胞の、または請求項10に記載の膜調製品の、または請求項8に記載のポリペプチドの、使用。好ましくは水溶液を脱酸素することによる、該水溶液の酸化還元環境の調整のための、請求項9に記載の細胞の、または請求項10に記載の膜調製品の、または請求項8に記載のポリペプチドの使用。その表面上に酸化還元因子再生ポリペプチドをディスプレイする細胞を生産するための方法であって、以下の工程:a請求項1~7のいずれか一項に記載の核酸を細胞に導入すること、b随意に、前記細胞を、1または2以上の酸化還元反応性補欠分子族と接触させることを含む、前記方法。酸化還元因子依存的酵素の産物を生産する方法であって、以下の工程:a酸化還元因子依存的酵素を提供すること、b請求項9に記載の細胞、請求項10に記載の膜調製品または請求項8に記載のポリペプチドを提供すること、およびc請求項9に記載の細胞、請求項10に記載の膜調製品または請求項8に記載のポリペプチドの存在下において、酸化還元因子依存的酵素をその基質の1または2以上と接触させること、ここで、請求項9に記載の細胞、請求項10に記載の膜調製品または請求項8に記載のポリペプチドは、酸化還元因子依存的ポリペプチドが依存する酸化還元因子を再生するポリペプチドを含む、を含む、前記方法。本発明は、限定するものとして理解されるべきではない以下の図面および例によってさらに説明され、これらから、本発明のさらなる特徴、態様、側面および利点を見出すことができる。例セリンプロテアーゼ、トリプシンまたはタンパク質キナーゼKの存在下において細菌をインキュベートすることにより、パッセンジャー、ここではNADHオキシダーゼの表面局在を検出することが可能である。トリプシンおよびプロテイナーゼKは、それらのサイズに起因してEcoliの外膜を通過することができないので、これらのプロテアーゼの存在下におけるホールセルのインキュベーションは、外膜の表面上に位置するタンパク質のみが消化される効果を有する。したがって、表面上に位置するパッセンジャーは消化されるが、膜に組み込まれたタンパク質構成要素は、酵素の攻撃に対して保護されており、したがって無傷のままである。このことは、SDS-PAGEにより確認することができる。酵素の方向は、ホールセル消化に基づいて評価した。図2は、IPTGによる発現の誘導後のEcoli株UT5600DE3pATNOxの単離された外膜、ならびにホールセル消化の後の単離された外膜を示す。IPTGによる誘導の後で、約100kDaの予想された融合タンパク質を外膜において検出することができたトラック3。トリプシンによるホールセルの消化は、初めはほぼ等しい強度であったOmpFCおよびOmpAを表わすバンドと比較して、対応するバンドの強度の減少をもたらし、これにより、タンパク質が膜の外側に対して向けられていることを確認したトラック4および5。NADHオキシダーゼがオートディスプレイ系を用いてEcoliの表面上にディスプレイされることを示すことができた。例2:NADHオキシダーゼ活性をモニタリングするための増殖および試験条件の確立NADHオキシダーゼの活性を、測光アッセイにより決定した。NADHは、2つの、すなわち260nmおよび340nmの波長において消光の最大値を示すが、一方、NADは、260nmにおいて1つのみの最大値を示す。この違いを、NADHのNADへの酸化の測光法によるモニタリングのために利用する。酵素の正しい折りたたみならびにFADの取り込みを可能にするために、用いた栄養培地または緩衝液にFADを添加した。NOX生体触媒の培養20mlのLB培地15μg/mlのカナマイシンに、対応する株のグリセリン培養物10μlを植菌し、37°Cおよび毎分200回転で終夜インキュベートした。メインの培養をセッティングするため、100mlのLB培地15μg/mlのカナマイシン、10μMのEDTA、10mMのメルカプトエタノールに、2.5mlの終夜培養物を播種した。OD578=0.6において、50mlの培養物を、1mMのIPTGにより誘導した。NADHオキシダーゼの場合、さらに10μMのFADを添加した。培養物を、1h、4hまたは20h、30°Cおよび毎分200回転で誘導した。培養物のもう半分は誘導せず、しかし他においては誘導した培養物と正確に同じ方法において処理した。NADHオキシダーゼアッセイのための細胞の調製誘導の後で、細胞を、初めに氷上で15分間保存し、次いで、毎分5000回転で10minの遠心分離による沈降物として分離した。沈降物を、20mlの0.1Mリン酸カリウム緩衝液pH7.5、10μMのFAD中で2回洗浄した。次いで、細胞のODを、同じ緩衝液により50に調整した。NADHオキシダーゼアッセイNADHオキシダーゼ活性を検出するためのアッセイを、0.1M硫酸カリウム緩衝液pH7.5、1mMのDTTおよび基質として100μMのNADHを含んだ1mlの試料を用いて行った。細胞を、最終OD578=1においてアッセイに用いた。室温における1時間のインキュベーションの後、細胞を遠心分離により試料から取り除いた。上清のスペクトルを、200~400nmの間の波長において記録した。第1に、両方の株について、NADHオキシダーゼ遺伝子の発現を1hにわたり誘導した。図3におけるUVスペクトルは、これらの条件下において酵素活性を検出することが不可能であったことを示す。なぜならば、NADHは、プラスミドを含まない宿主細胞により既に酸化されており、これが340nmにおける消光の最大値の消失をもたらしたからである。添加された酵素は、細胞により取り込まれるか、または細胞により分泌された酵素により転換される。いずれの効果も、ここでの細胞について見出されるような、指数増殖期において細胞が示す高い代謝率により説明することができる。細胞を静止増殖期stationarygrowthphaseへ移行させ、それによりそれらの一次代謝を最少化するために、発現の誘導を、第1に、4hまで延長した。添加されたNADHが、再び宿主細胞により酸化されたことが見出された図4。しかし、pATNOxを含む細胞のNADH酸化活性は、プラスミドを含まない宿主細胞の活性を上回った。さらに、誘導していない細胞と誘導した細胞との間の定量的差異を検出することができた。20hまで誘導時間を延長した後、プラスミドを含まない宿主細胞のNADHの酸化は、もはや検出することができなくなり、これは、図5において示すとおり、細胞なしの陰性対照の場合はNADHの消光の最大値が以前と同様に存在するという事実から観察することができる。今や、いわゆる静止状態の細胞静止期における細胞について、表面上に位置するNADHオキシダーゼによる、添加されたNADHの酸化を検出することが可能であった。EcoliBL21DE3とEcoliUT5600DE3との間の多くの差異は、明らかである。EcoliBL21DEpATNOxの場合、誘導されていない細胞は、供給されたNADHの約半分をNADに変換するが、一方、誘導された細胞は、全ての利用可能なNADHを変換する。誘導されていない細胞の活性は、NADHオキシダーゼの発現のために用いられるT7系が密denseでないこと、すなわち、T7プロモーターの抑制が完全でなく、これは、誘導されていない状態においてすら、T7ポリメラーゼによる遺伝子の低い発現をもたらすこと、に基づいて説明することができる。対照的に、EcoliUT5600DE3は、誘導されていない状態において活性を示さないが、誘導された細胞は、NADHの約半分のみを変換する。これらの結果は、オートトランスポーター系を用いて、Lactobacillusbrevisのフラボタンパク質-NADHオキシダーゼをEcoliの表面上にその活性形態において発現させることができることを証明する。その後のアポ酵素におけるFADの組み込みは、正しく進行するものと観察され、FADの添加のみを必要とする。ここまでの全ての測定は、アッセイをセッティングするため、および酵素の活性をモニタリングすることを可能にする条件を見出すための、質的性質のものであった。NADHの酸化を経時的に測定することによる酵素活性の量的モニタリングのために、可能な限り多くの試料の平衡観察を可能にするために、光学アッセイをマイクロタイタープレートに移した。最少培地M9における細胞の培養10mlのM9培地15μg/mlのカナマイシンに、対応する株のグリセリン培養物20μlを植菌し、37°Cおよび毎分200回転で終夜インキュベートした。メインの培養物、160mlのM915μg/mlのカナマイシンに植菌するために、終夜全培養物を用いた。7hにわたる培養物の初期増殖の後、1mMのIPTGおよび炭素源として0.2のラクトースを培養物の半分に添加した。さらに、10μMのFADをNADHオキシダーゼのために添加した。誘導は、16hにわたり30°Cおよび毎分200回転で行った。IPTGは、培養物のもう半分には添加しなかったが、他においてはこれらの培養物を正確に同じ方法において処理した。活性アッセイのための細胞の調製誘導の後、細胞を、第1に氷上で15分間保存し、次いで毎分5000回転での10minの遠心分離による沈降物として分離した。沈降物を、20mlの0.1Mリン酸カリウム緩衝液pH7.5、10μMのFAD中で2回洗浄した。次いで、細胞を、同じ緩衝液によりOD578=10に調整した。マイクロタイタープレート上でのNADHオキシダーゼアッセイ96ウェルのマイクロタイタープレートについてのNADHオキシダーゼアッセイを、1ウェルあたり240μlの試料において、0.1Mのリン酸カリウム緩衝液中で行った。細胞を、OD578=1がアッセイにおいて達成されるような量において用いた。反応を開始させるために、200μMのNADHを添加した。0、3、7、15、30、45または60分間の室温におけるインキュベートの後で、アッセイを、マイクロタイタープレート中で340nmにおいて観察したMithras、BertholdTechnologies。細胞の沈降を避けるために、消光を測定する前にプレートを振盪した。緩衝液中で対応するODを有する細胞懸濁物を参照物として用いた。一連の試験に基づいて、NADHオキシダーゼホールセル触媒の生産を、i活性がより高くなるように、ii誘導された細胞と誘導されていない細胞との間の差異が増大するように、およびiiiナンセンス対照については低い活性しか存在しないように、最適化することができた。特に、NADHオキシダーゼを測定するために用いられる培養物は、最適状態でなければならないことが見出された。図6は、方法セクションにおいて記載されるような、標準的な条件下において行われたNADHオキシダーゼアッセイの結果を示す。増殖および試験条件に関連する多様な因子が、この酵素活性の改善に寄与する。既に、より大規模における使用を目的として、細胞の増殖を、複雑なLB培地の代わりに既定のM9培地を用いるように改変した。誘導の間に、ラクトースを炭素源として添加し、細胞をより早くに約0.35のOD578において誘導した。通常では0.6におけるより後での誘導は、M9培地における過剰に長い増殖を必要とする結果を有し、これは、自発的な細胞溶解と、ナンセンス対照および誘導されていない対照の両方が基質として供給されたNADHを酸化する効果とをもたらす。このことは、細胞溶解の結果として放出される酵素に起因する可能性が非常に高い。NADHオキシダーゼアッセイを、今や、上記のように、マイクロタイタープレートにおいて、細胞懸濁液中で直接行い、観察した。このことは、取り扱いを遥かに容易にし、データは、より再現可能である。しかし、酵素活性の絶対値の決定は、可能でない。測光法により決定される酵素の活性は、ランベルトベールの法則から計算される。この式を適用することが可能であるためには、キュベットまたは96ウェルプレートの層の厚みが既知でなければならない。このパラメーターは、現在の試験のセットアップにおいては決定することができない。したがって、NADHオキシダーゼの活性を、光度計により、1cmの既定の層の厚みを有するキュベットを用いて測定した。その結果として、ベールランベルトの法則を適用することができる。30°Cの温度において、LB培地中の活性について12.23mU/mlを見出した。M9培地中での30°Cでの活性は、幾らかより高く、すなわち16.38mU/mlであった。Hummelら2003年の研究において、単純な様式において精製された酵素の活性は、10~15U/mgとして示された。例3:NADHオキシダーゼホールセル触媒の安定性および保存能力の試験NADHオキシダーゼホールセル触媒の保存能力および安定性を調査するために、誘導された細胞を、冷蔵庫中で8°Cにおいて、または冷凍庫中で-18°Cまたは-70°Cにおいて保存した。これらの細胞を、毎週、NADHオキシダーゼアッセイにより、3つの複製における試料を用いてチェックした。保存のために意図される細胞を、遺伝子発現の誘導の後で、リン酸カリウム緩衝液0.1M、pH7.5で2回洗浄し、この緩衝液中でOD578=10に調整し、部分試料に分割して、8週間にわたる8°Cでの保存に供した。細胞を-18°Cまたは-70°Cで保存する場合は、20のグリセリンをフリージングバッファーに添加した。活性アッセイのために、200μlの試料中の細胞を、前述の緩衝液でOD578=1まで希釈し、次いで、0.2mMのNADHを添加して反応を開始させた。NADHのNADへの酸化を、3つの複製における試料において、λmax=340nmにおける消光の減少を測定することによりモニタリングした。保存の間に起こる細胞溶解の効果を考慮するために、宿主株EcoliBL21DE3を、同じ方法において保存し、ホールセル生体触媒BL21DE3pATNOXと同じ型の活性アッセイに供した。図7におけるグラフは、8°Cで保存された多様な世代の細胞懸濁液中のNADHの濃度の減少を示す。予測されたとおり、対照として用いられた宿主株EcoliBL21DE3は、保存の前に何らのNADH活性も示さない。しかし、これらの宿主細胞について、たった1週間の保存の後で、アッセイにおいてNADHの濃度の明らかな減少が見出され、この減少は、保存時間が長くなるほどにより明白となる。この推定されたNADHオキシダーゼ活性は、細菌細胞の溶解これは、経験に基づいて、細胞が8°Cで保存された場合に比較的早く始まるにより説明することができる。冷蔵庫中でこの温度において保存された細胞は、数日後に既に溶液の粘性の増大を示し、完全に再懸濁することができない。この増大した粘性は、細胞溶解の間の染色体DNAの放出に起因し得る。さらに、細胞の溶解の結果として、酵素が放出され、これは明らかに、アッセイにおいて基質として用いられるNADHを酸化する。この効果はまた、NADHオキシダーゼホールセル触媒EcoliBL21DE3pATNOXの保存、およびその後の活性アッセイの場合においても観察される。保存時間が長くなると、冷蔵庫中で細胞の溶解により引き起こされるNADHの酸化が、保存の前に測定された触媒の活性を上回るであろう。したがって、NADHオキシダーゼホールセル触媒を冷蔵庫中で保存することは推奨され得ない。細胞を-18°Cで保存する場合、状況は異なる図8。陰性対照として用いられた宿主細胞について、大型冷凍庫中での-18°Cでの保存の後で、結果的なNADHの酸化は存在しないが、一方、NADHオキシダーゼホールセル触媒は、8週間後ですらなおNADHオキシダーゼ活性を示し、これは、正規分布に関して、初期の活性に匹敵する。ホールセル生体触媒の-70°Cでの7週間にわたる保存により、活性の有意な減少は観察されない図9。この場合における宿主細胞の溶解もまた、除外することができる。したがって、ホールセル生体触媒を-70°Cで保存することが推奨される。一方で、生体触媒の活性と並行して、生細胞カウントを決定した。結果を図10において示す。8°Cにおける保存により、生細胞カウントは、初めの4週間以内に3桁において減少する。保存がさらに3週間続くと、その後の生細胞カウントは、相対的に一定であり続ける。この形の曲線はまた、-18°Cまたは-70°Cにおける生体触媒の保存によっても観察される。しかし、この場合において、初めの4週間の間の生細胞カウントの減少は、2桁のみであった。生細胞カウントの減少は、7週間の期間にわたり、生体触媒の活性と相関しない。生細胞カウントは、-18°Cまたは-70°Cにおける保存により減少するが、活性はほぼ一定であり続ける。しかし、この試験は、大型冷凍庫-18°Cまたは-70°Cにおける保存が、冷蔵庫中での8°Cにおける保存よりも好ましいことを示す。例4:ホールセル生体触媒のリサイクル性の調査30分間の期間にわたる5サイクルにおけるNADHの変換に関するホールセル触媒EcoliBL21DE3pATNOxのリサイクル性を決定した。このアッセイについて、遺伝子発現の誘導の後で、細胞をリン酸カリウム緩衝液0.1M、pH7.5で2回洗浄し、この緩衝液中で最終OD578=10に調整した。活性を決定するために、200μlの試料中の細胞を、マイクロタイタープレート中で前述の緩衝液でOD578=1まで希釈し、次いで、0.2mMのNADHを添加して反応を開始させた。NADHのNADへの酸化を、3つの複製における試料において、λmax=340nmにおける消光の減少を測定することによりモニタリングした。リサイクルのために、反応の完了後に細胞を遠心分離により落とし沈殿させ、160μ1のリン酸カリウム緩衝液中で再懸濁した。再度、0.2mMのNADHを添加して反応を開始させ、酸化を測光法によりモニタリングした。この手順を全5サイクルにわたり繰り返した。処理の間に起こり得る細胞溶解の影響を考慮するために、陰性対照として宿主株EcoliBL21DE3を、ホールセル生体触媒BL21DE3と同じアッセイに供した。生体触媒を含まない宿主細胞を、対照として用いた。図11において観察することができるように、宿主細胞は、何らNADHを変換しない。第1のサイクルAにおいて、ホールセル生体触媒は、存在するNADHのほぼ100を30分以内に変換する。さらなるサイクルにおいて、変換および変換速度は減少する。最後のサイクル第5サイクル、Dにおいて、30少ないNADHがインキュベート時間内に変換される。細胞懸濁液の遠心分離が、後のサイクルにおける活性の減少の原因であるかもしれない。遠心力は、細胞に対する、特にその表面上に発現される分子に対する機械的ストレスを表わす。例5:ホールセル生体触媒EcoliBL21DE3pATNOxを用いるNADHのNADへの再生この試験は、ホールセル生体触媒EcoliBL21DE3pATNOxをNAD還元酵素のための再生系として用いることができるか否かを調査するために行った。これは、ホールセル生体触媒およびNAD還元酵素であるアルデヒドデヒドロゲナーゼALDHを含む系を用いて試験した。ALDHは、アルデヒドを対応するカルボン酸へと酸化し、したがってNADをNADHへと還元する酵素の群に属する。NADHの濃度を測光法によりモニタリングした。図12から観察することができるように、予測されたとおり、ホールセル生体触媒EcoliBL21DE3pATNOxを含む試料中のNADHの濃度は、持続的に減少する。対照的に、組換え酵素ALDHが生体触媒に添加される場合、ALDHにより持続的にNADHへと還元されるNADが、生体触媒EcoliBL22DE3pATNOxにより再生されるにつれ、NADとNADHとの間に平衡が確立される。したがって、この系は平衡にある。EcoliBL21DE3NitAfは、いわゆるナンセンス対照として役立った。図12からも観察することができるように、これらの細胞は、その表面上に、NADHを酸化することができないAfaecalisからのニトリラーゼをディスプレイする。図13は、グラフの上半分において、ALDHにより媒介されるNADHの増加を示す。NADを再生するための生体触媒EcoliBL21DE3pATNOxの添加に関して、NADHの濃度340nmにおける消光として決定されるを細胞カウントに関して標準化することができるように、宿主株EcoliBL21DE3が既にこの反応に添加されている。ALDH反応への生体触媒EcoliBL21DE3pATNOxの添加の後、ALDHにより形成されたNADHが持続的にNADへと再酸化されたため、NADHの経時的なさらなる増加は見出されなかった。したがって、この系は平衡にある。供給源の詳細先行技術の多様な文書に対する引用がなされる場合、これらの文書は、それらの全体において、参照により本明細書の部分を形成する。引用された先行技術の文書についての完全な書誌の詳細を、以下に示す:SanjustらBiochemMolBiolInt55562HummelおよびRiebelBiotechnolLett514AhmedおよびClaiborneJBiolChem267258229ElZahabらApplBiochemBiotechnol11716574LeeおよびPingBiotechnologyAdv25369384JoseおよびMeyerMicrobiolMolBiolRev7160019JoseApplMicrobiolBiotechnol200669607614JoseらJBiotechnol200295257268JoseらMolMicrobiol37880AusubelらCurrentProtocolsinMolecularBiologyWileyIntersciencePublishersHendersonらMicrobiolandMolecularBiologyReviews68692744JoseおよびvonSchwichowChemBioChem5491499BanerjeeらApplMicrobiolBiotechnol2002603344SarborskyおよびOgletreeBiochemBiophysResCommun612106ExportSystemsforrecombinantproteinsInternationalPatentApplicationWO9735022NiewertらDiarrheaClinDiagnLabImmunol1431499明細書において、配列表において、クレームにおいて、および/または図面において開示される本発明の特徴は、単独で、および任意の組み合わせにおいて、本発明をその多様な形態において実施するために、法律的に適切である。