"蛍光共鳴エネルギー移動の原理に基づく一分子型FRETバイオセンサーのリンカーであって、52アミノ酸残基以上400アミノ酸残基以下を含むポリペプチドであって、全アミノ酸残基数の少なくとも45がグリシン及びアラニンの少なくともいずれかであり、アラニンを全アミノ酸残基数の少なくとも10含むことを特徴とするリンカー。84アミノ酸残基以上を含むポリペプチドである請求項1に記載のリンカー。セリン及びスレオニンの少なくともいずれかを全アミノ酸残基数の少なくとも10含む請求項1又は2に記載のリンカー。全アミノ酸残基数の少なくとも95がグリシン、セリン、スレオニン及びアラニンからなり、グリシンを35から65、セリン及びスレオニンの少なくともいずれかを10から40、アラニンを10から40含む請求項3に記載のリンカー。全アミノ酸配列の少なくとも95がSAGG及びGGASのいずれかのアミノ酸配列の繰り返しからなり、SAGG及びGGASのいずれかのアミノ酸配列の繰り返し単位を13個以上100個以下含むことを特徴とする請求項4に記載のリンカー。アルギニン及びグルタミン酸の少なくともいずれかを全アミノ酸残基数の少なくとも10含む請求項1又は2に記載のリンカー。全アミノ酸残基数の少なくとも95がグリシン、アルギニン、グルタミン酸及びアラニンからなり、グリシンを4から30、アルギニンを5から30、グルタミン酸を5から30、及びアラニンを30から60含む請求項6に記載のリンカー。請求項1から7のいずれかに記載のリンカーをコードすることを特徴とする遺伝子。請求項1から7のいずれかに記載のリンカーをコードする遺伝子を含むことを特徴とする発現ベクター。請求項9に記載の発現ベクターを保持してなることを特徴とする形質転換された細胞。請求項9に記載の発現ベクターを保持してなることを特徴とするトランスジェニック非ヒト動物。蛍光共鳴エネルギー移動の原理に基づく一分子型FRETバイオセンサーであって、センサー領域、リガンド領域、アクセプター蛍光タンパク質領域、ドナー蛍光タンパク質領域、及び、該センサー領域と該リガンド領域とを連結するリンカー領域を有する融合タンパク質であり、該リンカー領域が、請求項1から7のいずれかに記載のリンカーからなることを特徴とする一分子型FRETバイオセンサー。該ドナー蛍光タンパク質がYPetである請求項12に記載の一分子型FRETバイオセンサー。請求項12及び13のいずれかに記載の一分子型FRETバイオセンサーをコードすることを特徴とする遺伝子。請求項14に記載の一分子型FRETバイオセンサーをコードする遺伝子を含むことを特徴とする発現ベクター。請求項15に記載の発現ベクターを保持してなることを特徴とする形質転換された細胞。請求項15に記載の発現ベクターを保持してなることを特徴とするトランスジェニック非ヒト動物。請求項12に記載の一分子型FRETバイオセンサーを用いてFRETを検出する工程を含み、セリンスレオニンリン酸化酵素活性、チロシンリン酸化酵素活性、及び、低分子量GTP結合タンパク質活性のいずれかを測定することを特徴とする測定方法。請求項16に記載の形質転換された細胞または請求項17に記載のトランスジェニック非ヒト動物を用いてFRETを検出する工程を含み、セリンスレオニンリン酸化酵素活性、チロシンリン酸化酵素活性、及び、低分子量GTP結合タンパク質活性のいずれかを測定することを特徴とする測定方法。a請求項16に記載の形質転換された細胞と被検物質とを接触させる工程、およびbFRETを検出することによりセリンスレオニンリン酸化酵素活性、チロシンリン酸化酵素活性、及び、低分子量GTP結合タンパク質活性のいずれかの変化を検出する工程、を含む、セリンスレオニンリン酸化酵素活性、チロシンリン酸化酵素活性、及び、低分子量GTP結合タンパク質活性のいずれかの調節物質のスクリーニング方法。本発明は、前記従来における問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。すなわち、本発明は、蛍光共鳴エネルギー移動の原理に基づく一分子型FRETバイオセンサーを最適化し高感度の一分子型FRETバイオセンサーを得るために広く使用することができるリンカー以下、本明細書においては、本発明のリンカーをEVEnhancedvisualizationリンカーと称することがある、該リンカーを含むバイオセンサー、該リンカー又はバイオセンサーをコードする遺伝子、該リンカー又はバイオセンサーを含む発現ベクター、該発現ベクターを有する形質転換された細胞およびトランスジェニック非ヒト動物、および、前記リンカーを含むバイオセンサーを用いるセリンスレオニンリン酸化酵素活性、チロシンリン酸化酵素活性、低分子量GTP結合タンパク質の活性を測定するのに好適な前記一分子型FRETバイオセンサーを用いる測定方法を提供することを目的とする。前記課題を解決するために鋭意検討したところ、一定以上の長さを有するリンカーが前記問題を解決し、蛍光共鳴エネルギー移動の原理に基づく一分子型FRETバイオセンサーを最適化し高感度の一分子型FRETバイオセンサーを得るために広く使用することができるリンカーとなることを見出した。さらに、特定のアミノ酸を一定の割合又は一定の配列の繰り返しとして含むことにより、最適化の効果が高まることを見出した。すなわち、本発明は、一定以上の長さを有するリンカーを用いることで、一分子型FRETバイオセンサーのゲインを低くする要因である基底状態のFRETを、著しく低減させることができるという知見に基づくものであり、一分子型FRETバイオセンサー作成に汎用的に用いることが出来るものである。本発明のリンカーは、前記一分子型FRETバイオセンサーのゲインを増大させるために開発されたものであり、その技術的価値は非常に大きい。即ち、前記課題を解決するための手段は以下のとおりである。<1>蛍光共鳴エネルギー移動の原理に基づく一分子型FRETバイオセンサーのリンカーであって、52アミノ酸残基以上400アミノ酸残基以下を含むポリペプチドであって、全アミノ酸残基数の少なくとも45がグリシン及びアラニンの少なくともいずれかであり、アラニンを全アミノ酸残基数の少なくとも10含むことを特徴とするリンカーである。<2>84アミノ酸残基以上を含むポリペプチドである前記<1>に記載のリンカーである。<3>セリン及びスレオニンの少なくともいずれかを全アミノ酸残基数の少なくとも10含む前記<1>又は<2>に記載のリンカーである。<4>全アミノ酸残基数の少なくとも95がグリシン、セリン、スレオニン及びアラニンからなり、グリシンを35から65、セリン及びスレオニンの少なくともいずれかを10から40、アラニンを10から40含む前記<3>に記載のリンカーである。<5>全アミノ酸配列の少なくとも95がSAGG及びGGASのいずれかのアミノ酸配列の繰り返しからなり、SAGG及びGGASのいずれかのアミノ酸配列の繰り返し単位を13個以上100個以下含むことを特徴とする前記<4>に記載のリンカーである。<6>アルギニン及びグルタミン酸の少なくともいずれかを全アミノ酸残基数の少なくとも10含む前記<1>又は<2>に記載のリンカーである。<7>全アミノ酸残基数の少なくとも95がグリシン、アルギニン、グルタミン酸及びアラニンからなり、グリシンを4から30、アルギニンを5から30、グルタミン酸を5から30、及びアラニンを30から60含む前記<6>に記載のリンカーである。<8>前記<1>から<7>のいずれかに記載のリンカーをコードすることを特徴とする遺伝子である。<9>前記<1>から<7>のいずれかに記載のリンカーをコードする遺伝子を含むことを特徴とする発現ベクターである。<10>前記<9>に記載の発現ベクターを保持してなることを特徴とする形質転換された細胞である。<11>前記<9>に記載の発現ベクターを保持してなることを特徴とするトランスジェニック非ヒト動物である。<12>蛍光共鳴エネルギー移動の原理に基づく一分子型FRETバイオセンサーであって、センサー領域、リガンド領域、アクセプター蛍光タンパク質領域、ドナー蛍光タンパク質領域、及び、該センサー領域と該リガンド領域とを連結するリンカー領域を有する融合タンパク質であり、該リンカー領域が、前記<1>から<7>のいずれかに記載のリンカーからなることを特徴とする一分子型FRETバイオセンサーである。<13>該ドナー蛍光タンパク質がYPetである前記<12>に記載の一分子型FRETバイオセンサーである。<14>前記<12>及び<13>のいずれかに記載の一分子型FRETバイオセンサーをコードすることを特徴とする遺伝子である。<15>前記<14>に記載の一分子型FRETバイオセンサーをコードする遺伝子を含むことを特徴とする発現ベクターである。<16>前記<15>に記載の発現ベクターを保持してなることを特徴とする形質転換された細胞である。<17>前記<15>に記載の発現ベクターを保持してなることを特徴とするトランスジェニック非ヒト動物である。<18>前記<12>に記載の一分子型FRETバイオセンサーを用いてFRETを検出する工程を含み、セリンスレオニンリン酸化酵素活性、チロシンリン酸化酵素活性、及び、低分子量GTP結合タンパク質活性のいずれかを測定することを特徴とする測定方法である。<19>前記<16>に記載の形質転換された細胞または前記<13に記載のトランスジェニック非ヒト動物を用いてFRETを検出する工程を含み、セリンスレオニンリン酸化酵素活性、チロシンリン酸化酵素活性、及び、低分子量GTP結合タンパク質活性のいずれかを測定することを特徴とする測定方法である。<20>a前記<16>に記載の形質転換された細胞と被検物質とを接触させる工程、およびbFRETを検出することによりセリンスレオニンリン酸化酵素活性、チロシンリン酸化酵素活性、及び、低分子量GTP結合タンパク質活性のいずれかの変化を検出する工程、を含む、セリンスレオニンリン酸化酵素活性、チロシンリン酸化酵素活性、及び、低分子量GTP結合タンパク質活性のいずれかの調節物質のスクリーニング方法である。本発明のリンカーによれば、蛍光共鳴エネルギー移動の原理に基づく一分子型FRETバイオセンサーを最適化し高感度の一分子型FRETバイオセンサーを得ることができる。また、本発明の一分子型FRETバイオセンサーによれば、非侵襲的なセリンスレオニンリン酸化酵素活性、チロシンリン酸化酵素活性、低分子量GTP結合タンパク質の活性の測定が可能となる。以下に、本発明の実施の形態を説明する。本発明のリンカーEVリンカーと称するは、蛍光共鳴エネルギー移動FRETの原理に基づく一分子型FRETバイオセンサーのリンカーであって、52アミノ酸残基以上400アミノ酸残基以下を含むポリペプチドであって、全アミノ酸残基数の少なくとも45がグリシン及びアラニンの少なくともいずれかであり、アラニンを全アミノ酸残基数の少なくとも10含むことを特徴とするリンカーである。本発明のリンカーは、蛍光共鳴エネルギー移動FRETの原理に基づく一分子型FRETバイオセンサー、すなわち、一分子型FRETバイオセンサー中に構成要素のひとつとして連結されて用いられるものである。本発明において、FRETとは、励起状態にある蛍光分子ドナー:エネルギー供与体からごく近傍の蛍光分子アクセプター:エネルギー受容体へ励起エネルギーが移動する現象のことをいう。一分子型FRETバイオセンサーは、一般にドナー蛍光タンパク質、アクセプター蛍光タンパク質、センサードメイン、リガンドドメインの4つの領域を有するが、リンカーはそれらの2つの領域の間をつないで連結されるものである。図3は一分子型FRETバイオセンサー中に用いられる本発明のリンカーの例示である。CFPをドナー蛍光タンパク質の一例として、YFPをアクセプター蛍光タンパク質の一例として、本発明の具体的説明を行なうが、後述するようにドナー蛍光タンパク質及びアクセプター蛍光タンパク質はこれに限られない。センサードメインとリガンドドメインは、基底状態では空間的に離れた位置にあり、この状態では、ドナー蛍光タンパク質とアクセプター蛍光タンパク質もまた空間的に離れた位置にあり、基底状態のFRET効率は低い。活性化状態においては、リン酸化、GTP結合など様々なシグナルにより誘導されるセンサー領域Aの構造変化を構造認識ドメインからなるリガンド領域Bが認識して結合することにより、ドナーとアクセプターが近接し、これにより、FRET効率が上昇する。ここで、FRET効率とは、ドナー蛍光タンパク質を励起して得られる蛍光強度の、アクセプター蛍光タンパク質存在下における減少割合を指すが、本明細書においては、一分子型FRETバイオセンサーをドナー蛍光タンパク質の励起波長で照射した場合の、ドナー蛍光タンパク質の蛍光強度とアクセプター蛍光タンパク質の蛍光強度との比蛍光強度比を便宜的に用いる非特許文献1及び3参照。以下、本明細書において記載する参照文献は参照により、その全教示が本明細書中に取り込まれる。本明細書に係るEVリンカーは、少なくとも52アミノ酸以上400アミノ酸以下の長さを有し、安定した3次構造をとらないポリペプチドである。52アミノ酸未満であると、基底状態でのFRET効率が高くなりゲインを大きく取れず、400アミノ酸を超えると、FRETバイオセンサーの分子量が大きくなり発現量が低下する等の問題が生じる。前記ゲインを大きく取る観点からは、84アミノ酸以上であることがより好ましく、116アミノ酸以上であることが特に好ましい。前記分子量を抑える観点からは244アミノ酸以下であることがより好ましい。前記観点から、リンカーの長さとしては、84アミノ酸以上244アミノ酸以下であることが特に好ましい。本発明のEVリンカーは、安定した3次構造をとらないポリペプチドであり、全アミノ酸残基数の少なくとも45がグリシン及びアラニンの少なくともいずれかであり即ち、グリシン残基とアラニン残基の合計が全アミノ酸残基数の少なくとも45を占める意である、アラニンを全アミノ酸残基数の少なくとも10含むことを特徴とするリンカーである。全アミノ酸残基数の少なくとも45がグリシン及びアラニンの少なくともいずれかからなることは、可動性が大きいポリペプチドを作成する観点から重要であり、アラニンを全アミノ酸残基数の少なくとも10含むことにより、グリシンのみのリンカーよりゲインを大きくとることができる。グリシン及びアラニン以外のアミノ酸残基としては安定した3次構造をとらないことに配慮すれば、他のアミノ酸を含むことができる。安定した三次構造をとらないポリペプチドを作成する観点から、セリン、スレオニン、アルギニン、グルタミン酸などを特に好適に含むことができる。例えば、アラニン及びグリシンに加えて、セリン及びスレオニンの少なくともいずれかを全アミノ酸残基数の少なくとも10含むポリペプチドが好ましい。このようなポリペプチドとしては、全アミノ酸残基の数の少なくとも95がGly、Ser、Thr、及び、Alaからなり、Glyを35から65、Ser及びThrの少なくともいずれかを10から40、Alaを10から40含むポリペプチドが挙げられる。これらのアミノ酸残基は、全長にわたって均一に分布させることが好ましく、中でも、Ser-Ala-Gly-Gly、その逆配列であるGly-Gly-Ala-Ser、または、Gly-Ala-Gly-Serを繰り返し含む配列が好ましい。このような配列としては、例えば、Ser-Ala―Gly-Gly、Gly-Gly-Ala-Ser、または、Gly-Ala-Gly-Serの繰り返し単位を全アミノ酸残基の数の95以上含み、前記基本配列の他にGly、Ser、Ala、Thr等が全体の5未満の範囲で配列中に挿入されているような配列も好ましい。さらに、上記配列において、Serと性質の非常に近いアミノ酸であるThrをSerと置換した配列もまた好ましい。前記、アミノ酸配列の繰り返し単位を13個以上100個以下含むことが好ましい。このようなリンカーの具体例としては次のものが挙げられる。EV52リンカー配列番号:12SAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGEV84リンカー配列番号:15SAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGEV116リンカー配列番号:18SAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGEV180リンカー配列番号:23SAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGEV244リンカー配列番号:26SAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGまた、アラニン及びグリシンに加えて、アルギニン及びグルタミン酸の少なくともいずれかを全アミノ酸残基数の少なくとも10含むポリペプチドも好ましい。このようなポリペプチドとしては、全アミノ酸残基数の少なくとも95がグリシン、アルギニン、グルタミン酸及びアラニンからなり、グリシンを4から30、アルギニンを5から30、グルタミン酸を5から30、及びアラニンを30から60含むポリペプチドが挙げられる。これらのアミノ酸残基は、全長にわたって均一に分布させることが好ましく、例えば下記のような配列が挙げられる。EV3x8リンカー配列番号:45EAAAREAAAREAAARGGEAAAREAAAREAAARGGEAAAREAAAREAAARGGEAAAREAAAREAAARGGEAAAREAAAREAAARGGEAAAREAAAREAAARGGEAAAREAAAREAAARGGEAAAREAAAREAAAREV6x4リンカー配列番号:46EAAAREAAAREAAAREAAAREAAAREAAARGGEAAAREAAAREAAAREAAAREAAAREAAARGGEAAAREAAAREAAAREAAAREAAAREAAARGGEAAAREAAAREAAARAAREAAAREAAAREV3x8リンカーは、EAAARの配列を3回繰り返した15アミノ酸残基の配列単位を8個、GG配列で繋げた134アミノ酸残基のポリペプチドである。全アミノ酸残基数134個のうちのアラニンが72個53.7、グリシンが14個10.4、グルタミン酸が24個17,9、アルギニンが24個17.9である。アラニン及びグリシンを合わせると64.1である。また、EV6x4リンカーは、124アミノ酸残基のポリペプチドであり、全アミノ酸残基数124個のうちのアラニンが71個57,3、グリシンが6個4,8、グルタミン酸が23個18,5、アルギニンが24個19,4であり、アラニン及びグリシンを合わせると62,1である。本発明のEVリンカーは、一分子型FRETバイオセンサーのゲインを大きくさせるものであり、その一分子型FRETバイオセンサー中の挿入部位は基底状態と活性化状態におけるFRET効率の差、すなわち、ゲインの増大を考慮して、適宜選択され得る。すなわち、一分子型FRETバイオセンサーのドナー蛍光タンパク質、アクセプター蛍光タンパク質、センサードメイン、および、リガンドドメインの領域から選択されるいずれか2つの領域の間を連結して用いることができ、どの領域間に用いるかは特に制限されない。例えば、図3のように、センサードメインとリガンドドメインの間の連結に用いることができる。本発明に係る一分子型FRETバイオセンサーは、蛍光共鳴エネルギー移動の原理に基づく一分子型FRETバイオセンサーであって、センサー領域、リガンド領域、アクセプター蛍光タンパク質領域、ドナー蛍光タンパク質領域、及び、該センサー領域と該リガンド領域とを連結するリンカー領域を有する融合タンパク質であり、該リンカー領域が、前記本発明のリンカーからなる。本発明に係る一分子型FRETバイオセンサーの好ましい態様としては、ドナー蛍光タンパク質、アクセプター蛍光タンパク質、センサードメイン、リガンドドメイン、リンカーの5つの領域を少なくともひとつずつ含み、かつ、アミノ末端側より、ドナーまたはアクセプター蛍光タンパク質、センサーまたはリガンドドメイン、EVリンカー、リガンドまたはセンサードメイン、アクセプターまたはドナー蛍光タンパク質を含む態様1、ドナー蛍光タンパク質、アクセプター蛍光タンパク質、センサードメイン、リガンドドメイン、リンカーの5つの領域を少なくともひとつずつ含み、かつ、アミノ末端側より、センサーまたはリガンドドメイン、ドナーまたはアクセプター蛍光タンパク質、EVリンカー、アクセプターまたはドナー蛍光タンパク質、リガンドまたはセンサードメインを含む態様2、ドナー蛍光タンパク質、アクセプター蛍光タンパク質、センサードメイン、リガンドドメイン、リンカーの5つの領域を少なくともひとつずつ含み、かつ、アミノ末端側より、ドナーまたはアクセプター蛍光タンパク質、センサーまたはリガンドドメイン、EVリンカー、アクセプターまたはドナー蛍光タンパク質、リガンドまたはセンサードメインを含む態様3、ドナー蛍光タンパク質、アクセプター蛍光タンパク質、センサードメイン、リガンドドメイン、リンカーの5つの領域を少なくともひとつずつ含み、かつ、アミノ末端側より、センサーまたはリガンドドメイン、ドナーまたはアクセプター蛍光タンパク質、EVリンカー、アクセプターまたはドナー蛍光タンパク質、リガンドまたはセンサードメインを含む態様4が挙げられる。センサー領域に、リン酸化されるペプチドあるいは低分子量GTP結合タンパク質を含む場合は態様1が好ましい。従って、該EVリンカーは、一分子型FRETバイオセンサーにおいて、リガンド領域とセンサー領域との間に介在することが好ましい。なお、一分子型FRETバイオセンサーにおいて、ドナー蛍光タンパク質、アクセプター蛍光タンパク質、リガンド領域、アクセプター領域、EVリンカーは必ずしもひとつずつである必要はなく、複数存在してもよい。ドナー蛍光タンパク質領域を構成するドナー蛍光タンパク質としてはFRETのペアとなる機能が保たれていれば特に限定されるものはないが、機能的観点から、好ましくはCFPまたはTFPTealFluorescenceProteinである。一方のアクセプター蛍光タンパク質領域を構成するアクセプター蛍光タンパク質も同様にFRETのペアとなる機能が保たれていれば特に限定されるものはないが、機能的観点から、好ましくはYFPである。ここで、FRETのペアとなる機能とは、励起状態にあるドナー蛍光タンパク質から近傍のアクセプター蛍光タンパク質へ励起エネルギーが移動し、該励起エネルギーの移動が検出できることをいう。ドナー蛍光タンパク質および/またはアクセプター蛍光タンパク質は、FRETのペアとなる機能が保たれていればそれらタンパク質の一部でもよく、必ずしも全部全長である必要はない。しばしば、それらのアミノ酸配列のカルボキシル末端を短くすることにより、FRET効率の差の増大が生ずる。たとえば、アクセプター蛍光タンパク質および/またはドナー蛍光タンパク質の一部としては、それらのアミノ酸配列のカルボキシル末端領域に好ましくは少なくとも1個、より好ましくは1~11個の欠損を有してなるものを挙げることができる。なお、かかる領域におけるアミノ酸の欠損部位には特に限定はない。たとえば、YFPの場合、そのアミノ酸配列のカルボキシル末端領域において好ましくは少なくとも1個、より好ましくは1~11個、さらに好ましくは11個のアミノ酸の欠損を有してなるものが好ましい。また、CFPの場合、そのアミノ酸配列のカルボキシル末端領域において好ましくは少なくとも1個、より好ましくは1~11個、さらに好ましくは11個のアミノ酸の欠損を有してなるものが好ましい。ここで、カルボキシル末端領域とは、本発明に使用するGFP関連タンパク質のアミノ酸配列において、そのカルボキシル末端から、アミノ酸の個数で好ましくは1~20個までの、より好ましくは11個までの領域をいう。なお、FRETのペアとなる機能が保たれているか否かは、たとえば、公知の方法に従いFRETのペアを形成すると想定される1対のタンパク質分子を共に大腸菌で生産し、当該1対のタンパク質を含む細胞抽出液において、当該タンパク質それぞれの想定される励起波長での蛍光強度を観察するという方法により評価することができる。さらに、アクセプター蛍光タンパク質および/またはドナー蛍光タンパク質は変異を有していてもかまわない。かかる変異の導入は、FRETのペアとなる機能が保たれている限り、アクセプター蛍光タンパク質および/またはドナー蛍光タンパク質のアミノ酸配列における任意の部位に対し行うことができる。たとえば、変異の態様としては複数のアミノ酸の置換が挙げられ、かかるアミノ酸置換の具体的態様としては、たとえば、GFPの変異体であるLeu65Phe、Phe47Leu、Thr66Serなどが挙げられる。このような変異を導入することで発色団形成効率の上昇や、FRET効率の上昇などの効果が得られるので好ましい。変異の導入は、公知のPCRポリメラーゼ連鎖反応を用いる方法などにより行うことができる。YFPの変異体としては、例えば、YpetNguyenAWandPSDaughertyEvolutionaryoptimizationoffluorescentproteinsforintracellularFRET2005NatBiotechnol23355360、EYFP,VenusNagaiTKIbataESParkMKubotaKMikoshibaandAMiyawakiAvariantofyellowfluorescentproteinwithfastandefficientmaturationforcellbiologicalapplications2002NatBiotechnol208790などが挙げられ、CFPの変異体としては、例えば、CyPetNguyenAWandPSDaughertyEvolutionaryoptimizationoffluorescentproteinsforintracellularFRET2005NatBiotechnol23355360、ECFP、SECFP非特許文献5、Turquoiseなどが挙げられる。アクセプター蛍光タンパク質およびドナー蛍光タンパク質の組み合わせとしては、VenusとECFP、YPetとECFP、VenusとTurquoise、YPetとTurquoiseが好適に使用できる。センサー領域を構成するセンサータンパク質及びリガンド領域を構成するリガンドの組み合わせとしては、特に制限はないが、セリンスレオニンリン酸化酵素活性、チロシンリン酸化酵素活性、及び、低分子量GTP結合タンパク質活性のいずれかを測定可能な組み合わせが好適に挙げられる。セリンスレオニンリン酸化酵素活性を測定する組み合わせとしては、ホークヘッド会合Forkhead-associated,以下FHA1と記載するドメイン、WWTrp-Trpドメイン、あるいはBRCTBRCA1-C末端ドメインとセリンまたはスレオニンを含むペプチド配列が、チロシンリン酸化酵素活性を測定する組み合わせとしては、SH2Srcホモロジー2ドメインまたはPTBPhsophotyrosine-bindingドメインとチロシンを含むペプチド配列が、低分子量GTP結合タンパク質活性を測定する組み合わせとしては、Rasファミリー低分子量GTP結合タンパク質、Rhoファミリー低分子量GTP結合タンパク質、Rabファミリー低分子量GTP結合タンパク質、Arfファミリー低分子量GTP結合タンパク質、あるいはRan低分子量GTP結合タンパク質と、とそれぞれの標的タンパク質が好適に挙げられる。本発明の一分子型FRETバイオセンサーの構成要素およびそれぞれの特に好ましい組み合わせとしては、有効性、特異性および感度の観点から、センサー領域が低分子量GTP結合タンパク質Rasであり、リガンド領域がRasの標的タンパク質Rafであり、ドナー蛍光タンパク質がCFPであり、アクセプター蛍光タンパク質がYFPであるか、センサー領域が低分子量GTP結合タンパク質Rac1であり、リガンド領域がRac1の標的タンパク質Pakであり、ドナー蛍光タンパク質がCFPであり、アクセプター蛍光タンパク質がYFPであるか、またはセンサー領域が低分子量GTP結合タンパク質Cdc42であり、リガンド領域がCdc42の標的タンパク質Pakであり、ドナー蛍光タンパク質がCFPであり、アクセプター蛍光タンパク質がYFPであるか、または、センサー領域がプロテインキナーゼAAキナーゼ、以下PKAと記載するによりリン酸化されるペプチドであり、リガンド領域がFHA1ドメインであり、ドナー蛍光タンパク質がCFPであり、アクセプター蛍光タンパク質がYFPであるか、または、センサー領域が細胞外シグナル調節キナーゼExtracellularSignal-regulatedKinase、以下ERKと記載するによりリン酸化されるペプチドであり、リガンド領域がWWドメインであり、ドナー蛍光タンパク質がCFPであり、アクセプター蛍光タンパク質がYFPであるか、または、センサー領域がチロシンリン酸化酵素によりリン酸化されるペプチドであり、リガンド領域がCrkタンパク質のSH2ドメインであり、ドナー蛍光タンパク質がCFPであり、アクセプター蛍光タンパク質がYFPである。アクセプターまたはドナー蛍光タンパク質、リガンドまたはセンサードメインまた、低分子量GTP結合タンパク質、標的タンパク質、の結合の順序は、ゲインの増大の観点から、本発明のEVリンカーを含む一分子型FRETバイオセンサーにおいて、好ましくはアミノ末端側よりYFP-FHA1-EVリンカーPKA基質ペプチド-CFP、YFP-FHA1-EVリンカーERK基質ペプチド-CFP、YFP-Raf-EVリンカーRas-CFP、YFP-Rac1-EVリンカーPak-CFP、YFP-Cdc42-EVリンカーPak-CFP、またはYFP-CRKSH2ドメイン-EVリンカーチロシンキナーゼ基質ペプチド-CFPが挙げられる。また、これらにおいてYFPとCFPとの位置が互いに交換されてなるもの、あるいは、YFPおよびCFPの様々な変異体、たとえば、Ypet、CyPet、EYFP,ECFP,SECFP、Venusなども好適に使用できる。本発明の一分子型FRETバイオセンサーは、前記5つの領域を有するものであればよく、細胞内分布を目的に応じて変化させるため、あるいは一分子型FRETバイオセンサーの精製を容易にする目的などのために、ペプチドタグあるいは、他の蛍光タンパク質、あるいは細胞内局在シグナル、タンパク-タンパク質間相互作用を司るドメインなどをそのN末端、C末端、あるいはまた、一分子型FRETバイオセンサー内部に含むものも好適に用いることが出来る。なお、上述する本発明のEVリンカーが本発明の所望の効果を発現し得るか否かについての評価は、たとえば、後述の実施例1に記載の方法に準じて評価することができる。本発明はまた、本発明に係る前記EVリンカーをコードする遺伝子DNAならびに本発明に係る前記一分子型FRETバイオセンサーをコードする遺伝子を提供する。EVリンカーの遺伝子は、化学合成することが可能であり、また、前記一分子型FRETバイオセンサーの遺伝子は、EVリンカー以外の前記各構成タンパク質については遺伝子情報をGenBank等から入手し、公知のPCRを用いた方法と制限酵素とリガーゼとを用いた方法により常法に従って作製することができる。本発明はさらに、前記遺伝子を含む発現ベクターを提供する。かかるベクターは、公知の方法に従い、本発明のEVリンカーまたは一分子型FRETバイオセンサーをコードする遺伝子を公知の原核細胞発現ベクター、例えばpGEX-2TGEヘルスケア社製、真核細胞発現ベクター、例えばpCAGGSNiwaHKYamamuraandJMiyazaki1991EfficientselectionforhighexpressiontransfectantswithanoveleukaryoticvectorGene108193200に、あるいはウイルスベクター、例えばpCX4IwaharaTTAkagiYFujitsukaandHHanafusa2004CrkIIregulatesfocaladhesionkinaseactivationbymakingacomplexwithCrkassociatedsubstratep130CasProcNatlAcadSciUSA1011769317698に挿入することにより得ることができる。本発明はさらに、前記発現ベクターを保持する形質転換された細胞およびトランスジェニック非ヒト動物を提供する。かかる形質転換された細胞は、前記発現ベクターを対象とする細胞に導入することにより得られる。細胞への導入法としては公知のトランスフェクション法やウイルス感染法が使用でき特に制限はないが、たとえばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、あるいはトランスポゾンを用いる方法等が使用できる。該細胞としては真核細胞あるいは原核細胞を用いることができ、特に制限はない。たとえば、真核細胞としては、ヒト癌由来のHeLa細胞、ヒト胎児腎臓由来HEK293細胞、イヌ腎臓由来MDCK細胞、サル腎臓由来COS7細胞、ラットC6グリオーマ細胞、酵母など、原核細胞としては、大腸菌など、その他、各種細胞を使用できる。一方、前記発現ベクターを公知の方法、たとえば、マウス受精卵の核内にプラスミドDNAをマイクロインジェクションする方法、あるいはTol2トランスポゼースを介する方法SumiyamaKKKawakamiandKYagita2010AsimpleandhighlyefficienttransgenesismethodinmicewiththeTol2transposonsystemandcytoplasmicmicroinjectionGenomics95306311などにより、マウス等の個体に直接導入することでトランスジェニック非ヒト動物を得ることができる。トランスジェニック非ヒト動物としては、ヒト以外であれば特に制限はないが、マウス、ラット、ブタ、ゼブラフィッシュ、線虫などが挙げられる。医薬産業への応用の観点からマウスが好ましい。本発明においてはさらに、本発明の一分子型FRETバイオセンサーを用いてFRETを検出する工程を含み、セリンスレオニンリン酸化酵素活性、チロシンリン酸化酵素活性、及び、低分子量GTP結合タンパク質活性のいずれかを測定する測定方法を提供する。本発明の一分子型FRETバイオセンサーを用いてFRETを検出する工程としては、一分子型FRETバイオセンサーを発現する細胞株を蛍光顕微鏡において観察し、タイムラプスイメージングを行なう方法や、一分子型FRETバイオセンサーを発現する細胞株をフローサイトメーターを用いて解析する手法などが挙げられる。かかる方法によれば、本発明に係る一分子型FRETバイオセンサーにおけるFRETを検出することでセリンスレオニンリン酸化酵素活性、チロシンリン酸化酵素活性、低分子量GTP結合タンパク質の活性を測定することができる。また、本発明においては、本発明に係る形質転換された細胞またはトランスジェニック非ヒト動物を用いてFRETを検出する工程を含む、セリンスレオニンリン酸化酵素活性、チロシンリン酸化酵素活性、及び、低分子量GTP結合タンパク質活性のいずれかを測定する測定方法を提供する。セリンスレオニンリン酸化酵素活性、チロシンリン酸化酵素活性、及び、低分子量GTP結合タンパク質活性は、前述のセリンスレオニンリン酸化酵素活性、チロシンリン酸化酵素活性、及び、低分子量GTP結合タンパク質活性のいずれかを測定可能なセンサー領域およびリガンド領域を有する一分子型FRETバイオセンサーを用いることにより測定することができる。FRETを検出する工程としては、FRETによる励起エネルギーの移動が検出できれば特に制限はないが、例えば、顕微鏡を用いた測定方法、フローサイトメーターを用いた測定方法、分光光度計を用いた方法、蛍光ELISAリーダーを用いた方法などが挙げられる。この測定方法においては、FRETを検出し、当該細胞または動物におけるセリンスレオニンリン酸化酵素活性、チロシンリン酸化酵素活性、低分子量GTP結合タンパク質の活性を直接測定することもできる。かかる場合、別途、リン酸化特異的抗体を用いて、リン酸化の割合を算出し、さらに対応するFRET効率を測定して検量線を作成することや、GTPの結合した低分子量GTP結合タンパク質とGTPからの無機リン酸の遊離によって生じるGDPの結合した低分子量GTP結合タンパク質とを測定してGTP/GDP比またはGTP/GDPGTP比いずれもモル比を算出し、さらに対応するFRET効率を測定して検量線を作成することができる。かかる検量線を用いれば、当該細胞または動物におけるFRET効率に基づいて、リン酸化やGTP/GDP比を算出することができる。たとえば、具体的には以下のような方法が例示される。本発明に係る一分子型FRETバイオセンサーを発現した本発明の形質転換細胞またはトランスジェニック非ヒト動物を蛍光顕微鏡で観察し、センサー領域の構造変化前後に生ずるFRET効率の変化を直接的に検出する。この測定法については、非特許文献1に準じて行うことができる。トランスジェニック非ヒト動物の場合には、例えば外耳など固定しやすい部位を観察対象とすることが好ましい。用いる蛍光顕微鏡には特に制限はないが、公知のキセノン光源を有する倒立型蛍光顕微鏡IX81、オリンパス社製に回転式蛍光励起フィルターおよび回転式蛍光発光フィルターを備え、高感度冷却CCDカメラを備えたものが好ましい。さらにフィルターおよびカメラ画像は、モレキュラーデバイス社製MetaMorph画像解析ソフトにて制御ならびに解析できるシステムが望ましい。前記細胞または動物にドナー蛍光タンパク質の励起光を照射し、ドナー蛍光タンパク質の蛍光波長での画像をCCDカメラにより撮影し、その後、アクセプター蛍光タンパク質の蛍光波長での画像を撮影する。両画像の蛍光強度の比を測定することにより各測定点でのFRET効率を算出できる。本発明によれば、本発明に係るEVリンカーを含み、非侵襲的にセリンスレオニンリン酸化酵素活性、チロシンリン酸化酵素活性、低分子量GTP結合タンパク質の活性を測定することを可能にする一分子型FRETバイオセンサー、その遺伝子等が提供される。非侵襲的な活性測定が可能となるのは、用いる励起光が可視光領域であるためである。また、かかる一分子型FRETバイオセンサーを発現し、非侵襲的なセリンスレオニンリン酸化酵素活性、チロシンリン酸化酵素活性、低分子量GTP結合タンパク質の活性の測定に有用な前記発現ベクターを保持する形質転換された細胞およびトランスジェニック非ヒト動物、ならびに前記EVリンカーを含む一分子型FRETバイオセンサーを用いるセリンスレオニンリン酸化酵素活性、チロシンリン酸化酵素活性、低分子量GTP結合タンパク質の活性を測定する方法が提供される。従って、セリンスレオニンリン酸化酵素活性、チロシンリン酸化酵素活性、低分子量GTP結合タンパク質の活性を細胞内または個体内で非侵襲的に知ることが可能となり、生命現象の理解のみならず、薬剤開発たとえば、癌、自己免疫疾患、アレルギー性疾患等の治療剤または予防剤において多大な利益をもたらし得る。さらに本発明の別の態様として、セリンスレオニンリン酸化酵素活性、チロシンリン酸化酵素活性、低分子量GTP結合タンパク質の活性調節物質のスクリーニング方法を提供する。すなわち、a本発明の形質転換された細胞と被検物質とを接触させる工程、および、bFRETを検出することによりセリンスレオニンリン酸化酵素活性、チロシンリン酸化酵素活性、及び、低分子量GTP結合タンパク質活性のいずれかの変化を検出する工程、を含む、セリンスレオニンリン酸化酵素活性、チロシンリン酸化酵素活性、及び、低分子量GTP結合タンパク質活性のいずれかの調節物質のスクリーニング方法である。本発明の形質転換された細胞は、本発明の一分子型FRETバイオセンサーを発現する、EVリンカーを含む一分子型FRETバイオセンサー遺伝子を含む発現ベクターを保持する形質転換された細胞である。本発明のスクリーニング方法によれば、本発明のEVリンカーを含む一分子型FRETバイオセンサーを発現する細胞を構築し、バイオアッセイ系を用いることによって、セリンスレオニンリン酸化酵素活性、チロシンリン酸化酵素活性、低分子量GTP結合タンパク質の活性を変化させる物質またはその塩すなわち、セリンスレオニンリン酸化酵素活性、チロシンリン酸化酵素活性、低分子量GTP結合タンパク質の活性調節物質を効率よくスクリーニングすることができる。当該方法における被検物質としては特に限定されるものではないが、たとえば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性物質、合成物質、発酵生産物等を挙げることができる。以下、本発明を実施例により説明するが、本発明の範囲はかかる実施例のみに限定されるものではない。実施例1Eevee-PKAによるセリンスレオニンリン酸化酵素AキナーゼPKAの酵素活性の測定1PKAの酵素活性を測定するための、EVリンカーを含む一分子型FRETバイオセンサーをコードする遺伝子の作成iEVリンカー遺伝子を挿入するためのプラットフォームEevee-PKA-G723520NES遺伝子の作成一分子型FRETバイオセンサーEevee-PKA-G723520NES遺伝子は、PCR等の公知の方法を用いて作成した図3。すなわち、一分子型FRETバイオセンサーは、アミノ末端よりYFP、リンカー、リガンドドメインここではリン酸化スレオニンに特異的に結合するFHA1ドメイン、リンカー、PKAによりリン酸化される基質配列、リンカー、CFPドナー蛍光タンパク質を有する。この塩基配列配列番号:1および予測されるアミノ酸配列配列番号:2を説明する:nt1-714:オワンクラゲAequoreaのYFPYPetnt715-720:リンカーLeu-Glunt721-1143:酵母のRad53遺伝子のFHA1ドメインnt1144-1149:リンカーGly-Thrnt1150-1392:グリシンリンカーnt1393-1437:PKAの基質配列nt1438-1446:リンカーGly-Gly-Argnt1447-2163:オワンクラゲのCFPECFPnt2164-2169:リンカーSer-Argnt2170-2205:核外移行シグナルNESnt2206-2208:終止コドンiiEV20リンカーの合成とEevee-PKA-20遺伝子3532NESの作成センスプライマーF_20a.a_linker配列番号:3およびアンチセンスプライマーR_20a.a_linker配列番号:4をアニーリングし、3520NESのAsp718IとAor13HIの制限酵素切断部位に挿入した。この挿入されたヌクレオチドがコードする20アミノ酸のリンカーをEV20リンカーと呼ぶ配列番号:5。さらに、YPetはVenusに置換した。作成された一分子型FRETバイオセンサーをEevee-PKA-203532NESと命名した。かかる塩基配列配列番号:6および予測されるアミノ酸配列配列番号:7を説明する:nt1-714:オワンクラゲAequoreaのYFPVenusnt715-720:リンカーLeu-Glunt721-1143:酵母のRad53遺伝子のFHA1ドメインnt1143-1149:リンカーGly-Thrnt1150-1209:EV20リンカー配列番号:5nt1210-1215:リンカーSer-Glynt1216-1239:PKAの基質配列nt1239-1248:リンカーGly-Gly-Argnt1249-1965:オワンクラゲのCFPECFPnt1966-1971:リンカーSer-Argnt1972-2007:核外移行シグナルNESnt2008-2010:終止コドンiiiEevee-PKA-523535NESの作成Eevee-PKA-20の哺乳細胞発現ベクターpEevee-PKA-20を制限酵素EcoRIとAsp718Iで切断し、サイズの大きいほうの断片をベクターとして調整した。このpEevee-PKA-20断片をEcoRIとAor13HIで切断したリンカーを含む部分および、センスプライマーF_10a.a_linker配列番号:8およびアンチセンスプライマーR_10a.a_linker配列番号:9をアニーリングしたDNAの3者をライゲーションし、pEevee-PKA-52を作成した。かかる塩基配列配列番号:10および予測されるアミノ酸配列配列番号:11を説明する:nt1-714:オワンクラゲAequoreaのYFPVenusnt715720:リンカーLeu-Glunt721-1143:酵母のRad53遺伝子のFHA1ドメインnt1144-1149:リンカーGly-Thrnt1150-1305:EV52リンカー配列番号:12nt1306-1311:リンカーSer-Glynt1312-1335:PKAの基質配列nt1336-1344:リンカーGly-Gly-Argnt1345-2061:オワンクラゲのCFPECFPnt2062-2067:リンカーSer-Argnt2068-2103:核外移行シグナルNESnt2104-2106:終止コドンivpEevee-PKA-843537NESの作成Eevee-PKA-20の哺乳細胞発現ベクターpEevee-PKA-20を制限酵素EcoRIとAsp718Iで切断し、サイズの大きいほうの断片をベクターとして調整した。このpEevee-PKA-20断片をEcoRIとAor13HIで切断したリンカーを含む部分および、センスプライマーF_10aa_linker配列番号:8およびアンチセンスプライマーR_10a.a_linker配列番号:9をアニーリングしたDNAの3者をライゲーションし、Eevee-PKA-84を作成した。かかる塩基配列配列番号:13および予測されるアミノ酸配列配列番号:14を説明する。:nt1-714:オワンクラゲAequoreaのYFPYPetnt715-720:リンカーLeu-Glunt721-1143:酵母のRad53遺伝子のFHA1ドメインnt1144-1149:リンカーGly-Thrnt1150-1401:EV84リンカー配列番号:15nt1402-1407:リンカーSer-Glynt1408-1431:PKAの基質配列nt1432-1440:リンカーGly-Gly-Argnt1441-2157:オワンクラゲのCFPECFPnt2158-2163:リンカーSer-Argnt2164-2199:核外移行シグナルNESnt2200-2202:終止コドンvpEevee-PKA-1163536NESの作成Eevee-PKA-52の哺乳細胞発現ベクターpEevee-PKA-20を制限酵素EcoRIとAsp718Iで切断し、サイズの大きいほうの断片をベクターとして調整した。このpEevee-PKA-52断片をEcoRIとAor13HIで切断したリンカーを含む部分および、センスプライマーF_10aa_linker配列番号:8およびアンチセンスプライマーR_10aa_linker配列番号:9をアニーリングしたDNAの3者をライゲーションし、Eevee-PKA-116を作成した。かかる塩基配列配列番号:16および予測されるアミノ酸配列配列番号:17を説明する。nt1-714:オワンクラゲAequoreaのYFPYPetnt715-720:リンカーLeu-Glunt721-1143:酵母のRad53遺伝子のFHA1ドメインnt1144-1149:リンカーGly-Thrnt1150-1497:EV116リンカー配列番号:18nt1498-1503:リンカーSer-Glynt1504-1527:PKAの基質配列nt1528-1536:リンカーGly-Gly-Argnt1537-2247:オワンクラゲのCFPECFPnt2248-2253:リンカーSer-Argnt2254-2289:核外移行シグナルNESnt2290-2292:終止コドンvipEevee-PKA-53522NESの作成一分子型FRETバイオセンサーpEevee-PKA-5は、PCR等の公知の方法を用いて作成した。かかる塩基配列配列番号:19および予測されるアミノ酸配列配列番号:20を説明する。nt1-714:オワンクラゲAequoreaのYFPVenusnt715-720:リンカーLeu-Glunt721-1143:酵母のRad53遺伝子のFHA1ドメインnt1144-1170:リンカーGly-Thr-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Glynt1171-1194:PKAの基質配列nt1195-1203:リンカーGly-Gly-Argnt1204-1920:オワンクラゲのCFPECFPnt1921-1926:リンカーSer-Argnt1927-1962:核外移行シグナルNESnt1963-1965:終止コドンviipEevee-PKA-1803597NESの作成pEevee-PKA-116を制限酵素EcoRIとAsp718Iで切断し、サイズの大きいほうの断片をベクターとして調整した。このpEevee-PKA-116断片をEcoRIとAor13HIで切断したリンカーを含む部分および、センスプライマーF_10aa_linker配列番号:8およびアンチセンスプライマーR_10aa_linker配列番号:9をアニーリングしたDNAの3者をライゲーションし、Eevee-PKA-180を作成した。さらにVenusはYPetに置換した。かかる塩基配列配列番号:21および予測されるアミノ酸配列配列番号:22を説明する。nt1-714:オワンクラゲAequoreaのYFPYPetnt715-720:リンカーLeu-Glunt721-1143:酵母のRad53遺伝子のFHA1ドメインnt1144-1149:リンカーGly-Thrnt1150-1689:EV180リンカー配列番号:23nt1690-1695:リンカーSer-Glynt1696-1719:PKAの基質配列nt1720-1728:リンカーGly-Gly-Argnt1729-2439:オワンクラゲのCFPECFPnt2440-2445:リンカーSer-Argnt2446-2481:核外移行シグナルNESnt2482-2484:終止コドンviipEevee-PKA-2443598NESの作成pEevee-PKA-116を制限酵素EcoRIとAsp718Iで切断し、サイズの大きいほうの断片をベクターとして調整した。このpEevee-PKA-116断片をEcoRIとAor13HIで切断したリンカーを含む部分および、センスプライマーF_10aa_linker配列番号:8およびアンチセンスプライマーR_10aa_linker配列番号:9をアニーリングしたDNAの3者をライゲーションし、Eevee-PKA-244を作成した。かかる塩基配列配列番号:24および予測されるアミノ酸配列配列番号:25を説明する。nt1-714:オワンクラゲAequoreaのYFPYPetnt715-720:リンカーLeu-Glunt721-1143:酵母のRad53遺伝子のFHA1ドメインnt1144-1149:リンカーGly-Thrnt1150-1881:EV244リンカー配列番号:26nt1882-1887:リンカーSer-Glynt1888-1911:PKAの基質配列nt1912-1920:リンカーGly-Gly-Argnt1921-2631:オワンクラゲのCFPECFPnt2632-2637:リンカーSer-Argnt2638-2673:核外移行シグナルNESnt2674-2676:終止コドン2哺乳類細胞でのEVリンカーを含む一分子型FRETバイオセンサーEevee-PKAの発現とタイムラプス蛍光顕微鏡による解析ここでは、様々な長さのEVリンカーを有するPKAのバイオセンサーをEevee-PKA、その哺乳細胞発現ベクターをpEevee-PKAと総称する。哺乳細胞発現ベクターとしては、pCAGGSNiwaHKYamamuraandJMiyazaki1991EfficientselectionforhighexpressiontransfectantswithanoveleukaryoticvectorGene108193200を至適に用いることが出来る。子宮頸癌由来HeLa細胞は10ウシ胎仔血清を含むDMEM培地INVITROGEN社製で培養した。該HeLa細胞に前記1で得られたpEevee-PKAを293fectinINVITROGEN社製を用いて、該試薬に添付のプロトコールに従いトランスフェクトした。トランスフェクト後のHeLa細胞を10ウシ胎仔血清を含むDMEM培地INVITROGEN社製で培養し、Eevee-PKAタンパク質を発現させた。トランスフェクションの24時間後に、培養細胞をタイムラプス蛍光顕微鏡による観察に供した。かかる顕微鏡は、回転式蛍光励起フィルター装置および回転式蛍光発光フィルター装置LUDLelectronic社製を備え、さらに高感度冷却CCDカメラ日本ローパー社製、CoolSNAP-HQを備えた、キセノン光源を有する倒立型蛍光顕微鏡オリンパス社製、IX81であり、観察の際は、該顕微鏡の制御ならびに観察結果の解析を日本モレキュラーデバイス社製メタモルフ画像解析ソフトにより行うシステムを用いた。蛍光励起フィルター、蛍光発光フィルター、ダイクロイックミラーはオメガ社より購入した。前記培養細胞に440nmの励起光を照射し、480nmのCFPドナーの蛍光波長での画像をCCDカメラにより撮影し、次いで、530nmのYFPアクセプターの蛍光波長での画像を撮影した。両画像データをもとに両者の蛍光強度の比を求めることにより各測定点でのFRET効率の指標とした。PKAの活性化剤である1mMのヂブチリルcAMPを添加し、刺激前のFRET効率と比較することでEevee-PKAのゲインを知ることができる。図4に示すように、PKAの活性化によって変化するゲインは、52アミノ酸以上の長さのEVリンカーを用いることにより顕著に増加することがわかる。さらに、YFPドナータンパク質を、FRETに最適化したもの、例えばYPetにすることで、その効果はさらに顕著となる図6。しかし、その効果は116アミノ酸でほぼ飽和しており、それ以上長くしても顕著な効果はない。このゲインの増大の原因を調べるために、基底状態における蛍光プロフィールを測定した図7A、B及びC。EVリンカーが長くなるにつれ、基底状態におけるYFPドナータンパク質の蛍光が減少することがわかった。すなわち、EVリンカーは、基底状態におけるFRETを低減させることで高いゲインをもたらしていることがわかった。この効果は244アミノ酸まで続いた。3Eevee-PKAのリン酸化レベルのイムノブロッティングによる解析前記と同様に、Eevee-PKAをHeLa細胞に発現させ、24時間後に、1mMのヂブチリルcAMPおよび50nMカリクリンで処理したのちに、公知の方法で細胞を可溶化し、SDS-PAGEにより分離した。なお、PhosTagPhosTagコンソーシアム50μMを含むポリアクリルアミド6ゲルをタンパク質の分離に用いた。PVDFメンブレンミリポア社製に転写後、anti-GFP抗体自家製と反応させ、引き続き、IRDye800CW標識抗ウサギ抗体LI-COR社製でEevee-PKAタンパク質を検出した。結合した蛍光標識抗体はオデッセイ蛍光アナライザーLI-COR社製にて定量した。図8Aおよび図8Bに示すように、EVリンカーは、基底状態におけるリン酸化レベルを著しく低減させていることがわかる。すなわち、リガンドドメインは一般に、センサードメインに結合することにより、活性化状態のセンサードメインが基底状態に戻るのを阻害する効果があるが、EVリンカーはこの効果を低下させ、それによって基底状態のFRETを低下させ、このことがゲインの増大をもたらしていることが明らかとなった。実施例2Eevee-Aktによるセリンスレオニンリン酸化酵素Aktの酵素活性の測定1セリンスレオニンリン酸化酵素Aktの酵素活性を測定するための、EVリンカーを含む一分子型FRETバイオセンサーをコードする遺伝子の作成Eevee-Akt-843547NESおよびEevee-Akt-1163548NESのPKA基質配列部位を、Aktのリン酸化に適したアミノ酸配列に置換した遺伝子を、合成プライマー等を利用して作成した。前記Eevee-PKAにこの配列を挿入し、かつ、アミノ末端にAktのPHドメインを挿入することにより作成した遺伝子Eevee-Akt-84およびEevee-Akt-116の塩基配列配列番号:27,29および予測されるアミノ酸配列配列番号:28,30を提示する。また、その構造を図9A及びBに示す。Eevee-Akt-843547NESnt1-453:Aktタンパク質のAHドメインnt454-462:リンカーGlu-Phe-Glynt463-1176:オワンクラゲAequoreaのYFPYPetnt1177-1182:リンカーLeu-Glunt1183-1605:酵母のRad53遺伝子のFHA1ドメインnt1606-1611:リンカーGly-Thrnt1612-1863:EV84リンカーnt1864-1869:リンカーSer-Glynt1870-1902:PKAの基質配列nt1903-1911:リンカーGly-Gly-Argnt1912-2622:オワンクラゲのCFPECFPnt2623-2628:リンカーSer-Argnt2629-2664:核外移行シグナルNESnt2665-2667:終止コドンEevee-Akt-1163548NESnt1-453:Aktタンパク質のAHドメインnt454-462:リンカーGlu-Phe-Glynt463-1176:オワンクラゲAequoreaのYFPYPetnt1177-1182:リンカーLeu-Glunt1183-1605:酵母のRad53遺伝子のFHA1ドメインnt1606-1611:リンカーGly-Thrnt1612-1959:EV116リンカーnt1864-1965:リンカーSer-Glynt1870-1998:PKAの基質配列nt1903-2007:リンカーGly-Gly-Argnt1912-2718:オワンクラゲのCFPECFPnt2623-2724:リンカーSer-Argnt2629-2760:核外移行シグナルNESnt2665-2763:終止コドン2哺乳類細胞でのEVリンカーを含む一分子型FRETバイオセンサーEevee-Aktの発現とタイムラプス蛍光顕微鏡による解析実施例1―2に記載の方法により、解析した。ただし、細胞はCOS7細胞を用いた。図10に示すように、116アミノ酸のEVリンカーは顕著に基底状態の顕著な低下をもたらす。実施例3Eevee-ERKによるERKの酵素活性の測定1ERKの酵素活性を測定するための、EVリンカーを含む一分子型FRETバイオセンサーEevee-ERK3550NESをコードする遺伝子の作成Eevee-PKA-116の基質配列部位およびリン酸化ペプチド認識配列をERKの基質配列に置換したプラスミドを、PCRおよび合成プライマーを利用して作成した。作成したプラスミドをEevee-ERKと命名した。かかる塩基配列配列番号:31および予測されるアミノ酸配列配列番号:32を説明する:nt1-714:オワンクラゲAequoreaのYFPYPetnt715-720:リンカーLeu-Glunt721-882:Pin1遺伝子のWWドメインnt1144-888:リンカーGly-Thrnt1150-1236:EV116リンカーnt1498-1242:リンカーSer-Glynt1504-1272:ERKの基質配列nt1528-1281:リンカーGly-Gly-Argnt1537-1992:オワンクラゲのCFPECFPnt2248-2004:リンカーGlyArgSer-Argnt2254-2040:核外移行シグナルNESnt2290-2043:終止コドンさらに、ERKの基質に特有のドッキング配列を付加したベクターも同様に作成し、Eevee-ERK-DS3560NESと命名した。かかる塩基配列配列番号:33および予測されるアミノ酸配列配列番号:34を説明する:nt1-714:オワンクラゲAequoreaのYFPYPetnt715-720:リンカーLeu-Glunt721-882:Pin1遺伝子のWWドメインnt883-888:リンカーGly-Thrnt889-1236:EV116リンカーnt1237-1242:リンカーSer-Glynt1243-1272:ERKの基質配列nt1273-1284:リンカーAla-Lys-Leu-Sernt1285-1296:ドッキング配列Phe-Gln-Phe-Pront1297-1305:リンカーGly-Gly-Argnt1306-2016:オワンクラゲのCFPECFPnt2017-2028:リンカーGly-Arg-Ser-Argnt2029-2064:核外移行シグナルNESnt2065-2067:終止コドン2哺乳類細胞でのEVリンカーを含む一分子型FRETバイオセンサーEevee―ERKの発現とタイムラプス蛍光顕微鏡による解析実施例12に記載の方法により、解析した。すなわち、HeLa細胞にEvee-ERKを発現させ、EGFで刺激した。図11A、B、C及びDに示すように、EVリンカーを有するバイオセンサー3560NESは、Glyリンカーを含むバイオセンサーEKAR-1667nesより広いゲインを有する。この効果の一つは、基底状態におけるFRETの低さに起因している。実施例4EVリンカーを含む一分子型FRETバイオセンサーPicchu-734によるチロシンキナーゼ活性の測定1チロシンキナーゼ活性を測定するための、EVリンカーを含む一分子型FRETバイオセンサーPicchu-734の作成Eevee-PKA-1163536NESのXhoIおよびAsp718Iで切断したものにCrkIIタンパク質のSH2ドメインを含む領域をPCRにて増幅して挿入した。さらに、基質配列部位を置換し、Picchu-734の遺伝子を作成した。かかる塩基配列配列番号:35および予測されるアミノ酸配列配列番号:36を説明する:nt1-714:オワンクラゲAequoreaのYFPYPetnt715-720:リンカーLeu-Glunt721-1332:CRKII遺伝子のSH2ドメインnt883-1338:リンカーGly-Thrnt889-1686:EV116リンカーnt1237-1692:リンカーSer-Glynt1243-1719:CRKIIのチロシンリン酸化基質配列nt1273-1728:リンカーAla-Lys-Leu-Sernt1306-2439:オワンクラゲのCFPECFPnt2017-2451:リンカーGly-Arg-Ser-Argnt2029-2487:核外移行シグナルNESnt2065-2490:終止コドン2哺乳類細胞でのチロシンキナーゼ活性を測定するための、EVリンカーを含む一分子型FRETバイオセンサーPicchu-734の発現とタイムラプス蛍光顕微鏡による解析。実施例3-2に記載の方法により、解析した。図12に示すように、EVリンカーを含むPicchuバイオセンサーPicchu-734はこれを含まないPicchuバイオセンサーPicchu-730KurokawaKNMochizukiYOhbaHMizunoAMiyawakiandMMatsuda2001ApairofFRETbasedprobesfortyrosinephosphorylationoftheCrkIIadaptorproteininvivoJBiolChem2763130531310より広いゲインを有することがわかった。実施例5Raichu-Rac1によるRac1活性の測定1Rac1活性を測定するための、EVリンカーを含む一分子型FRETバイオセンサーRaichu-Rac12246Xの作成Rac1活性を測定する一分子型FRETバイオセンサーRaichu-Rac12241Xは、PCR等を用いて、既知のRaichu-Rac11011X非特許文献5をもとに作成した。かかる塩基配列配列番号:37および予測されるアミノ酸配列配列番号:38を説明する:nt1-714:オワンクラゲAequoreaのYFPYPetnt715-720:リンカーLeu-Glunt721-969:Pakタンパク質のCRIBドメインnt883-996:グリシンリンカーnt1237-1527:Rac1nt1273-1536:リンカーArg-Gly-Argnt1306-2247:オワンクラゲのCFPTurquoisent1273-2253:リンカーSer-Argnt2017-2313:KRasタンパク質のC末端ドメインnt2065-2316:終止コドンRac1活性を測定するEVリンカーを含む一分子型FRETバイオセンサーRaichu-Rac12246Xは、Raichu-Rac12241Xをもとに、リンカーを入れ替えることで作成した。かかる塩基配列配列番号:39および予測されるアミノ酸配列配列番号:40を説明する:nt1-714:オワンクラゲAequoreaのYFPYPetnt715-720:リンカーLeu-Glunt721-969:Pakタンパク質のCRIBドメインnt970-1332:EV116リンカーnt1333-1860:Rac1nt1861-1869:リンカーArg-Gly-Argnt1870-2580:オワンクラゲのCFPTurquoisent2581-2586:リンカーSer-Argnt2587-2646:KRasタンパク質のC末端ドメインnt2647-2649:終止コドン2哺乳類細胞でのRac1活性を測定するための、EVリンカーを含む一分子型FRETバイオセンサーをRaichu-Rac1の発現とタイムラプス蛍光顕微鏡による解析。実施例3-2に記載の方法により、解析した。図13Aおよび図13Bに示すように、EVリンカーを有するRaichuバイオセンサーRaichu-2246Xは通常のリンカーを有するRaichuバイオセンサーRaichu-2241Xよりも基底状態におけるFRETが低く、EGF刺激下に観察される上昇、すなわち感度が大きく上昇している。3Raichu-Rac12246Xを安定発現する細胞株の樹立。Raichu-Rac12246Xの遺伝子をpPBプラスミドに挿入した。このプラスミドと、トランスポゼース発現ベクターpCMV-mPBaseYusaKRRadJTakedaandABradley2009GenerationoftransgenefreeinducedpluripotentmousestemcellsbythepiggyBactransposonNatMethods6363369と同時にC6細胞にトランスフェクトし、2日後にBlasticidineを10μg/mlの濃度に添加し、2週間培養を続けた。その後、96ウェル培養皿でクローニングを行った。その結果、バイオセンサーを安定に発現する培養細胞株の樹立に成功した。この細胞株を用いることにより、長期間にわたってRac1の活性をモニターすることができた。図14A、B、C及びD。実施例6Raichu-Cdc422253XによるCdc42活性の測定1Cdc42活性を測定するための、EVリンカーを含む一分子型FRETバイオセンサーRaichu-Cdc422253Xの作成Cdc42活性を測定する一分子型FRETバイオセンサーRaichu-Cdc422253Xは、PCR等を用いて、既知のRaichu-Cdc421054Xをもとに作成した。作成した遺伝子Raichu-Cdc422253Xの塩基配列配列番号:41および予測されるアミノ酸配列配列番号:42を提示する。nt1-714:オワンクラゲAequoreaのYFPYPetnt715-720:リンカーLeu-Glunt721-969:Pakタンパク質のCRIBドメインnt970-1332:EV116リンカーnt1333-1857:Cdc42nt1858-1866:リンカーArg-Gly-Argnt1867-2577:オワンクラゲのCFPTurquoisent2578-2583:リンカーSer-Argnt2584-2643:KRasタンパク質のC末端ドメインnt2644-2646:終止コドン2哺乳類細胞でのCdc42活性を測定するためのEVリンカーを含む一分子型FRETバイオセンサーRaichu-Cdc42の発現とタイムラプス蛍光顕微鏡による解析。実施例3-2に記載の方法により、解析した。図15Aから図15Cに示すように、このバイオセンサーも基底状態における低いFRETが観察され、これまで困難であったEGF刺激依存性のCdc42の活性化を高感度に検出することが出来るようになった。実施例8Raichu-HRas3705XによるHRas活性の測定1HRas活性を測定するための、EVリンカーを含む一分子型FRETバイオセンサーRaichu-HRas3705Xの作成HRas活性を測定する一分子型FRETバイオセンサーRaichu-HRas3705Xは、PCR等を用いて、既知のRaichu-HRasMochizukiNSYamashitaKKurokawaYOhbaTNagaiAMiyawakiandMMatsuda2001SpaciotemporalimagesofgrowthfactorinducedactivationofRasandRap1Nature41110651068をもとに作成した。作成した遺伝子Raichu-HRas3705Xの塩基配列配列番号:43および予測されるアミノ酸配列配列番号:44を提示する。nt1-714:オワンクラゲAequoreaのYFPYPetnt715-720:リンカーLeu-Glunt721-1236:HRasタンパク質nt1237-1602:EV116リンカーnt1603-1845:Rafタンパク質のRBDドメインnt1846-1854:リンカーGly-Gly-Argnt1855-2565:オワンクラゲのCFPTurquoisent2566-2571:リンカーSer-Argnt2584-2631:KRasタンパク質のC末端ドメインnt2632-2634:終止コドン2哺乳類細胞でのHRas活性を測定するためのEVリンカーを含む一分子型FRETバイオセンサーRaichu-HRasの発現とタイムラプス蛍光顕微鏡による解析。実施例3-2に記載の方法により、解析した。図16A及びBにはタイムラプスFRETイメージングのデータを示している。プロトタイプのHRasMochizukiNSYamashitaKKurokawaYOhbaTNagaiAMiyawakiandMMatsuda2001SpaciotemporalimagesofgrowthfactorinducedactivationofRasandRap1Nature41110651068より早期にかつ、強く活性化を検出できていることがわかる。実施例10Eevee-ERK3560NESおよびEevee-PKA3536NESを発現するトランスジェニックマウスの作成1ERKおよびPKAの酵素活性を測定するための、EVリンカーを含む一分子型FRETバイオセンサーEevee-ERK3560NESおよびEevee-PKA3536NESをコードする遺伝子の受精卵へのマイクロインジェクション実施例1に記載のEevee-PKA3536NESあるいは実施例3に記載のEevee-ERK3560NES遺伝子を含む哺乳細胞発現プラスミドを、トランスポゾン認識配列を有するプラスミドpT2Aに挿入した。このプラスミドと、Tol2トランスポゾンを既報のとおりマイクロインジェクションしたSumiyamaKKKawakamiandKYagita2010AsimpleandhighlyefficienttransgenesismethodinmicewiththeTol2transposonsystemandcytoplasmicmicroinjectionGenomics95306311。2バイオセンサーを発現するトランスジェニックマウスのスクリーニング生まれたマウスは、420nmのLEDで照射し、470nmの短波長カットフィルターを使い、カラーデジタルカメラで撮影して緑色蛍光を確認することで容易に組み込みの起きたマウスを同定することができる。また、胎児の矢状断のFRET画像を実施例1に記載の蛍光顕微鏡で撮影することで、ERKあるいはPKA活性の空間分布を調べることもできる図17。実施例11Eevee-ERK3560NESを発現する細胞株を用いた薬剤感受性試験1ERKの酵素活性を測定するための、EVリンカーを含む一分子型FRETバイオセンサーEevee-ERK3560NESをコードする遺伝子を安定発現する細胞株の樹立実施例3に記載のEevee-ERK3560NES遺伝子を含む哺乳細胞発現プラスミドを、トランスポゾン認識配列を有するプラスミドに挿入した。このプラスミドと、トランスポゾン発現ベクターを既報のとおりトランスフェクションし、ブラストサイジンでバイオセンサー発現細胞株を選別したYusaKRRadJTakedaandABradley2009GenerationoftransgenefreeinducedpluripotentmousestemcellsbythepiggyBactransposonNatMethods6363369。2バイオセンサーを安定発現する細胞株でのFRET測定を行った。培養細胞株を96ウェル培養皿に植え、段階希釈した阻害剤を入れたのちに、25ngmlのEGFで刺激した。30分後に、実施例3に記載のとおりERKの活性を測定した図18A~図18H。30個以上の細胞について、ERKの活性を測定し、平均したものをグラフ化した。用いた阻害剤はEGF受容体阻害剤AG1478、MEK阻害剤PD15035、PD184351、BRAFの阻害剤PLX4720、ホスファチジルイノシトール3リン酸キナーゼの阻害剤LY294002、RSKの阻害剤BI-D1870、JNKの阻害剤JNKinhibitorVIIIである。結果はEGF依存性のERK活性化が、HeLa細胞においてはEGF受容体AG1478およびMEKの阻害剤PD153035、PD184352によって効果的に抑制されることを示している。EGF依存性のERK活性化が、これらの阻害剤によって濃度依存性に阻害されることが、生細胞を用いてきわめて容易に測定できた。実施例12Eevee-PKA3536NESを発現するトランスジェニックマウスを用いた薬剤感受性試験1Eevee-PKA3536NESを発現するトランスジェニックマウスの小腸イメージング実施例10で作成したEevee-PKA3536NESを発現するトランスジェニックマウスをイソフルレンで麻酔し、小腸をオリンパス社製倒立型二光子顕微鏡IX81FV1000にてタイムラプス撮影した。SpectraPhysics社のチタンサファイヤレーザMaiTaiDeepSeeHPを用いて、細胞を840nmで励起し、CFPの蛍光をBA460500蛍光フィルター、YFPの蛍光をBA520560にて取得し、実施例3に記載のようにFRET画像を作成した。2生きたマウスでの薬剤効果の可視化マウスにホスホジエステラーゼの阻害剤であるテオフィリンおよび環状アデノシン三リン酸のアナログであるアクトシンをそれぞれ静注し、PKAの活性を測定した。図19および図20に示すように、筋間神経細胞、腸管平滑筋、血管平滑筋のそれぞれにおけるPKAの活性変化がリアルタイムに可視化できる。実施例13リンカーの長さを長くすると、プロテアーゼによる分解が起こりやすくなることが懸念される。そこで、リンカーからグリシンを減らして、アルファヘリクスを獲りやすいアラニンを増加させたリンカーである、EV3x8およびEV6x4を作成し、ゲインを調べた。1iEevee-PKA-3x83676NESの作成実施例11iiiと同様に、Eevee-PKA-20の哺乳細胞発現ベクターpEevee-PKA-20を制限酵素Asp718IとAor13HIで切断し、サイズの大きいほうの断片をベクターとして調整した。EV3x8リンカー配列番号:45に対応するDNAに制限酵素Asp718IとAor13HIを両端に付加したDNAは、合成した。このDNAをAsp718IとAor13HIで切断したものをインサートとして用いた。インサートとベクターをライゲーションし、pEevee-PKA-3x8を作成した。かかる塩基配列配列番号:47および予測されるアミノ酸配列配列番号:48を説明する:nt1-714:オワンクラゲAequoreaのYFPYPetnt715-720:リンカーLeu-Glunt721-1143:酵母のRad53遺伝子のFHA1ドメインnt1144-1149:リンカーGly-Thrnt1150-1551:EV3x8リンカー配列番号:45nt1552-1557:リンカーSer-Glynt1558-1581:PKAの基質配列nt1582-1590:リンカーGly-Gly-Argnt1591-2307:オワンクラゲのECFPnt2308-2313:リンカーSer-Argnt2314-2349:核外移行シグナルNESnt2350-2352:終止コドン1iiEevee-PKA-6x43677NESの作成Eevee-PKA-20の哺乳細胞発現ベクターpEevee-PKA-20を制限酵素Asp718IとAor13HIで切断し、サイズの大きいほうの断片をベクターとして調整した。EV6x4リンカー配列番号:46に対応するDNAに制限酵素Asp718IとAor13HIを両端に付加したDNAは、合成した。このDNAをAsp718IとAor13HIで切断したものをインサートとして用いた。インサートとベクターをライゲーションし、pEevee-PKA-6x4を作成した。かかる塩基配列配列番号:49および予測されるアミノ酸配列配列番号:50を説明する:nt1-714:オワンクラゲAequoreaのYFPYPetnt715-720:リンカーLeu-Glunt721-1143:酵母のRad53遺伝子のFHA1ドメインnt1144-1149:リンカーGly-Thrnt1150-1521:EV6x4リンカー配列番号:46nt1522-1527:リンカーSer-Glynt1528-1551:PKAの基質配列nt1552-1560:リンカーGly-Gly-Argnt1561-2277:オワンクラゲのECFPnt2278-2283:リンカーSer-Argnt2284-2319:核外移行シグナルNESnt2320-2322:終止コドン2実施例1と同様にゲインを調べたところ、EV3x8およびEV6x4とも、116アミノ酸と匹敵するゲインを有することが分かった図21。"