Rv1196関連抗原を含む免疫原性組成物であって、組成物の導電率が13mScm以下である及び又は前記組成物中の塩濃度が130mM以下である及び又は前記組成物中の塩化ナトリウム濃度が130mM以下である、免疫原性組成物。組成物の導電率が10mScm以下である、請求項1に記載の免疫原性組成物。組成物の導電率が3mScm以下である、請求項2に記載の免疫原性組成物。前記組成物中の塩濃度が100mM以下である、請求項1~3のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。前記組成物中の塩濃度が40mM以下である、請求項4に記載の免疫原性組成物。前記組成物中の塩化ナトリウム濃度が100mM以下である、請求項1~5のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。前記組成物中の塩化ナトリウム濃度が40mM以下である、請求項6に記載の免疫原性組成物。免疫原性組成物中のCaCl2濃度が30mM以下である、請求項1~7のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。免疫原性組成物中のMgSO4濃度が60mM以下である、請求項1~8のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。NH4、Mg2及びCa2イオンの合計濃度が40mM以下である、請求項1~9のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。非イオン性等張化剤を更に含む、請求項1~10のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。非イオン性等張化剤が多価アルコールである、請求項11に記載の免疫原性組成物。多価アルコールがソルビトールである、請求項12に記載の免疫原性組成物。ソルビトール濃度が約4~約6である、請求項13に記載の免疫原性組成物。スクロース濃度が約4~約6である、請求項1~13のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。1以上の免疫賦活薬を更に含む、請求項1~15のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。免疫賦活薬がサポニン及び又はTLR4作動薬である、請求項16に記載の免疫原性組成物。免疫賦活薬がリポソームの形態である、請求項17に記載の免疫原性組成物。サポニンがQS21である、請求項17又は18に記載の免疫原性組成物。TLR4作動薬が3脱Oアシル化モノホスホリルリピドAである、請求項17~19のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。モル浸透圧濃度が250~750mOsmkgである、請求項1~20のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。組成物が50μL~1mLの単位用量として提供される、請求項1~21のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。単位用量が100μL~750μLである、請求項22に記載の免疫原性組成物。単位用量が1~100μgのRv1196関連タンパク質を含有する、請求項22又は23に記載の免疫原性組成物。単位用量が5~50μgのRv1196関連タンパク質を含有する、請求項24に記載の免疫原性組成物。前記組成物のpHが70~90の範囲にある、請求項1~25のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。Rv1196関連抗原が配列番号1と少なくとも70の同一性を有する配列を含む、請求項1~26のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。Rv1196関連抗原が配列番号1と少なくとも90の同一性を有する配列を含む、請求項27に記載の免疫原性組成物。Rv1196関連抗原が長さ少なくとも350アミノ酸である配列番号1の断片を含む、請求項1~26のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。Rv1196関連抗原が配列番号7と少なくとも90の同一性を有する配列を含む、請求項1~26のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。Rv1196関連抗原が配列番号7と少なくとも90の同一性を有する配列からなる、請求項1~26のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。Rv1196関連抗原が配列番号7のアミノ酸配列を含む、請求項31に記載の免疫原性組成物。Rv1196関連抗原が配列番号7のアミノ酸配列からなる、請求項32に記載の免疫原性組成物。免疫原性組成物の抗原性の少なくとも80が、25°Cで24時間貯蔵した後に残っている、請求項1~33のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。医薬で使用するための、請求項1~34のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。医薬品の製造における、請求項1~34のいずれか一項に記載の免疫原性組成物の使用。安全且つ有効な量の請求項1~34のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を投与することを含む、ヒト型結核菌による感染などマイコバクテリウムによる感染を予防、治療又は改善する方法。請求項1~34のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を作製する方法であって、aRv1196関連抗原を凍結乾燥するステップと、bステップaの凍結乾燥したRv1196関連抗原を水溶液を用いて再構成するステップであって、該溶液の導電率が13mScm以下である及び又は、該溶液中の塩濃度が130mM以下である及び又は、該溶液中の塩化ナトリウム濃度が130mM以下であるステップとを含む方法。請求項1~34のいずれか一項に記載の安定な免疫原性組成物を作製する方法であって、aRv1196関連抗原を凍結乾燥するステップと、bステップaの凍結乾燥したRv1196関連抗原を水溶液を用いて再構成するステップであって、該溶液の導電率が13mScm以下である及び又は、該溶液中の塩濃度が130mM以下である及び又は、該溶液中の塩化ナトリウム濃度が130mM以下であるステップとを含み、免疫原性組成物の抗原性の少なくとも80が、25°Cで24時間貯蔵した後に残っている、方法。以下、a凍結乾燥したRv1196関連抗原と、b水溶液であって、該溶液の導電率が13mScm以下である及び又は、該溶液中の塩濃度が130mM以下である及び又は、該溶液中の塩化ナトリウム濃度が130mM以下である水溶液とを含むキット。水溶液が免疫賦活薬を含む、請求項38若しくは39に記載の方法又は請求項40に記載のキット。水溶液がリポソーム製剤中のサポニン及びTLR4作動薬、並びに非イオン性等張化剤を含む、請求項41に記載の方法又はキット。非イオン性等張化剤がソルビトールである、請求項42に記載の方法又はキット。ソルビトール濃度が約25~約15である、請求項43に記載の方法又はキット。サポニンがQS21である、請求項42~44のいずれか一項に記載の方法又はキット。TLR4作動薬が3脱Oアシル化モノホスホリルリピドAである、請求項42~45のいずれか一項に記載の方法又はキット。確実に免疫原性を維持するには、タンパク質抗原の製剤化が極めて重要である。免疫賦活薬を使用して、いずれかの所与の抗原に対して引き起こされる免疫応答が改善される場合もある。しかし、免疫原性組成物中にアジュバントを含めることは、成分調製の複雑さ並びに組成物の配分及び製剤化の複雑さを増大させる。製剤者は、アジュバント成分及び抗原成分の各々の調製を考慮しなければならない。特に、アジュバント成分と抗原成分との適合性を考慮すべきである。これは、凍結乾燥した抗原又は抗原性調製物をアジュバント調製物と一緒に再構成するよう意図する場合に特に当てはまる。そのような状況では、アジュバント調製物の緩衝液が抗原に対して適切であり、抗原の免疫原性又は可溶性がアジュバントによる影響を受けないことが重要である。本発明者らは、Rv1196関連抗原が塩の存在に対して特に感受性であることを初めて同定した。理論に限定されるものではないが、Rv1196関連抗原は、塩析として公知の現象によって有害な影響を受けると考えられており、塩析は塩化ナトリウムなどの塩との相互作用により、溶液からタンパク質が沈殿することとして定義できる。本発明者らは、これらの抗原が、150mMほどの低い塩化ナトリウム濃度で凝集し沈殿することを見出した。結果的に、Rv1196関連抗原を含む免疫原性組成物の安定性は、塩化ナトリウム濃度を減少させることによって驚くほど改善できる。したがって、本発明はRv1196関連抗原を含む免疫原性組成物であって、組成物の導電率が13mScm以下である、免疫原性組成物を提供する。加えて、Rv1196関連抗原を含む免疫原性組成物であって、前記組成物中の塩濃度が130mM以下である、免疫原性組成物が提供される。本発明はまた、Rv1196関連抗原を含む免疫原性組成物であって、前記組成物中の塩化ナトリウム濃度が130mM以下である、免疫原性組成物を提供する。配列識別子の簡単な説明配列番号1ヒト型結核菌H37Rv由来のRv1196タンパク質のアミノ酸配列配列番号2ヒト型結核菌H37Rv由来のRv1196タンパク質をコードしているヌクレオチド配列配列番号3ヒト型結核菌F11由来のRv1196タンパク質のアミノ酸配列配列番号4ヒト型結核菌F11由来のRv1196タンパク質をコードしているヌクレオチド配列配列番号5M72タンパク質のアミノ酸配列配列番号6M72タンパク質をコードしているヌクレオチド配列配列番号7二つのN末端His残基を持つM72タンパク質のアミノ酸配列配列番号8二つのN末端His残基を持つM72タンパク質をコードしているヌクレオチド配列配列番号9Mtb72fタンパク質のアミノ酸配列配列番号10Mtb72fタンパク質をコードしているヌクレオチド配列配列番号11六つのN末端His残基を持つMtb72fタンパク質のアミノ酸配列配列番号12六つのN末端His残基を持つMtb72fタンパク質をコードしているヌクレオチド配列配列番号13CpGオリゴ1のヌクレオチド配列配列番号14CpGオリゴ2のヌクレオチド配列配列番号15CpGオリゴ3のヌクレオチド配列配列番号16CpGオリゴ4のヌクレオチド配列配列番号17CpGオリゴ5のヌクレオチド配列発明の詳細な説明第一の態様において、本発明はRv1196関連抗原を含む免疫原性組成物であって、組成物の導電率が13mScm以下である、免疫原性組成物を提供する。特に、本発明はRv1196関連抗原を含む免疫原性組成物であって、免疫原性組成物の導電率が12mScm以下、例えば10mScm以下、8mScm以下、6mScm以下、5mScm以下、4mScm以下又は3mScm以下である、免疫原性組成物を提供する。特定の実施形態において、免疫原性組成物の導電率は、25mScm以下、例えば225mScm以下又は20mScm以下である。更なる特定の実施形態において、免疫原性組成物の導電率は、15~25mScmである。第二の態様において、本発明はRv1196関連抗原を含む免疫原性組成物であって、前記組成物中の塩濃度が130mM以下である、免疫原性組成物を提供する。特に、本発明はRv1196関連抗原を含む免疫原性組成物であって、前記組成物中の塩濃度が100mM以下、例えば90mM以下、80mM以下、70mM以下、60mM以下、50mM以下又は40mM以下である、免疫原性組成物を提供する。特定の実施形態において、前記組成物中の塩濃度は35mM以下、例えば30mM以下又は25mM以下である。更なる特定の実施形態において、前記組成物中の塩濃度は20~40mM、例えば25~35mMである。第三の態様において、本発明はRv1196関連抗原を含む免疫原性組成物であって、塩化ナトリウム濃度が130mM以下である、免疫原性組成物を提供する。特に、本発明はRv1196関連抗原を含む免疫原性組成物であって、塩化ナトリウム濃度が100mM以下、例えば、90mM以下、80mM以下、70mM以下、60mM以下、50mM以下、40mM以下、30mM以下、20mM以下又は15mM以下である、免疫原性組成物を提供する。特定の実施形態において、免疫原性組成物中の塩化ナトリウム濃度は、10mM以下、例えば75mM以下である。適切には、免疫原性組成物中の塩化ナトリウム濃度は、5mM又はそれ未満である。更なる特定の実施形態において、免疫原性組成物は、本質的に塩化ナトリウムを含まない。本質的に含まないとは、塩化ナトリウム濃度が0mM又はほぼ0mMであることを意味している。適切には、免疫原性組成物中のCaCl2濃度は、40mM以下、30mM以下、20mM以下、15mM以下又は10mM以下である。適切には、免疫原性組成物中のMgSO4濃度は、80mM以下、60mM以下、40mM以下、30mM以下、20mM以下又は10mM以下である。適切には、免疫原性組成物中のNH4、Mg2及びCa2イオンの合計濃度は、80mM以下、60mM以下、40mM以下、30mM以下、20mM以下又は10mM以下である。本発明の免疫原性組成物は、水溶性調製物である。本発明の免疫原性組成物の導電率は、当該技術分野において公知の技術を使用して測定できる。一つの適切な機器は、MalvernInstruments製のZetasizerNanoZSである。当業者は、公知の技術及びキットを使用して、ナトリウム及び塩化物イオン両方の濃度を容易に試験できる。例えば、ナトリウムは、Biosupply製のSodiumEnzymaticAssayKitなどのキットを使用して測定できる。塩化物は、Biosupply製のChlorideEnzymaticAssayKitなどのキットを使用して測定できる。結核は、ヒト型結核菌及び他のマイコバクテリウム種の感染によって引き起こされる慢性感染症である。それは、発展途上国の主要な疾患であり、世界の先進地域においても増加している問題である。20億人超が結核菌に感染し、毎年約940万例がTBの新規症例であり、170万人が死亡すると考えられている。結核菌感染者の10は活動性TBを発症し、活動性TBの各人が1年につき平均して10~15人の他人を感染させる。世界的に年間発生率はピークに達したが、人口増加により死亡及び症例数はなお上昇している。ヒト型結核菌は、呼吸経路を経由して個体に感染する。肺胞マクロファージは細菌を貪食するが、細菌は酸性リソソームとのファゴソーム融合を阻害することによって生存し、増殖することができる。CD4及びCD8T細胞が関与する複雑な免疫応答が続いて起こり、結果として最終的に肉芽腫の形成を起こす。ヒト型結核菌の病原体としての成功に重要なことは、分離されたが根絶されなかった細菌が長期間残存することができ、後に活動性TBを発症するまで個体を脆弱なままにするという事実である。感染個体の5未満が感染後一年以内に活動性TBを発症する。肉芽腫は数十年間残存する場合があり、酸素及び栄養分を奪われた休止状態で生きているヒト型結核菌を含有すると考えられている。しかし、休止状態の細菌の大多数は、全身に拡散している非マクロファージ細胞型の中に位置していることが最近示唆されている1665~1677頁。例えば免疫抑制性の事象の結果として、宿主の自然免疫と病原体の間のバランスが変化する場合に、活動性TBの発症が起こる7~13頁EhlersS、Infection、20093787~95頁。潜伏TBと活動性TBとのバランスについて記載している動的な仮説も提案されてきた80~86頁。感染は相当な期間無症状である場合があるが、活動性疾患は通常急性肺炎を示し、疲労、体重減少、発熱及び持続性の咳をもたらす。治療しない場合、通常は重篤な合併症及び死亡をもたらす。結核は、長期にわたる抗生物質療法を使用して一般に管理できる。しかしそのような治療は疾患の蔓延を防止するには不十分である。活動性感染した個体は、しばらくの間ほとんど無症状だが、伝染性である可能性はある。加えて、治療計画の遵守は重要だが、患者の挙動をモニタリングすることは困難である。一部の患者は治療過程を完了しないため、効果が無い治療になったり薬物抵抗性の発生をもたらしたりする場合がある。多剤耐性TBは、第一選択薬に応答しない形態である。全TB症例の33がMDRTBであり、推定で440000例の新規MDRTB症例が毎年発生している。第一選択薬に対する抵抗性に加えて第二選択薬に対する抵抗性が発生する場合、広範な薬物抵抗性TBが現れる。実質的に処置不能のXDRTBが、58カ国で確認されている。抗生物質治療の全過程を完了した場合であっても、ヒト型結核菌感染を感染個体から根絶することはできず、再活性化される可能性がある潜伏感染として残る場合がある。結核の蔓延を管理するには、有効なワクチン接種プログラム及び疾患の正確な早期診断が何より重要である。現在では、生細菌を用いるワクチン接種が、防御免疫を誘導するために最も広く使用されている方法である。この目的に利用されている最も一般的なマイコバクテリウムは、カルメットゲラン菌であり、60年以上前に初めて開発されたウシ型結核菌の無毒株である。しかし、BCGの安全性及び有効性は論争の元であり小児における重症疾患の徴候に対して防御する一方で、BCGは潜伏TBの確立又は成人期における肺疾患の再活性化を防止しない。加えて、米国などいくつかの国はこの薬剤を用いて公衆に予防接種を行わない。マイコバクテリウム感染の初期段階に強く発現するタンパク質のいくつかが、動物のワクチン接種モデルにおいて予防効果をもたらすことが示された。しかし、感染の初期段階に高発現する抗原を用いるワクチン接種は、感染の後期段階に対する最適な免疫応答を生じることができない。潜伏感染中の適切な管理は、その時に発現している特定の抗原に対して特異的なT細胞を必要とし得る。休眠中の持続性細菌を直接標的にする感染後投与ワクチンは、TBの再活性化の防止に役立ち、それによってTBの管理が強化され、又は感染の除去さえ可能になる。したがって潜伏TBを標的にするワクチンは、世界的なTB感染率を著しく及び経済的に減少させる可能性がある。後期抗原に基づくサブユニットワクチンを初期抗原と組み合わせて利用して、多相ワクチンを提供することもできる。別法として、初期及び又は後期抗原を使用して、BCGワクチン接種を補充及び改善することができる。タンパク質抗原Rv1196は、結核の治療又は予防に対して潜在的な利点がある。Rv1196は、例えば、Dillonら、InfectionandImmunity、1999、672941~2950頁にMtb39aという名称で記載されている。Rv1196タンパク質は高度に保存されており、H37Rv、C、Haarlem、CDC1551、KZN605、KZN1435及びKZN4207株にわたって100配列同一性を有し、F11株は単一点突然変異を有する。タンパク質抗原Mtb72f及びM72は、Rv1196を含む融合タンパク質であり、結核の治療又は予防に対して潜在的な利点がある。Mtb72fは、いくつかの動物モデルにおいて予防を可能にすることが示されてきた6622~6632頁Skeikyら、JImmunol、20041727618~7628頁Tsenovaら、InfectImmun、2006742392~2401頁Reedら、PNAS、20091062301~2306頁を参照のこと。Mtb72fは、臨床試験の対象にもなった475~482頁。M72は改善された抗原であり、この抗原はMtb72fと比較して単一のセリンからアラニンへの変異を組み込んでおり、その結果安定特性が改善されている。M72関連抗原は、潜伏TBモデルにおいても有用性があるものであることが示されている。本明細書では用語Rv1196関連抗原は、配列番号1で示されるRv1196タンパク質又はその免疫原性誘導体を意味している。本明細書では用語誘導体は、参照配列に対して改変された抗原を意味している。免疫原性誘導体は、参照配列に十分類似しており、参照配列の免疫特性を保持しており、参照配列に対する免疫応答が引き起こされる能力を残している。誘導体は、例えば、参照配列の改変版を含むことができ、又は参照配列の改変版からなることができる。Rv1196関連抗原は、例えば1000アミノ酸残基未満、例えば900アミノ酸残基未満、特に800アミノ酸残基未満を含有し得る。T細胞エピトープは、T細胞によって認識される連続するアミノ酸の短い領域である。T細胞エピトープの同定は、当業者に公知であるエピトープマッピング実験によって達成され得るBeissbarthら、Bioinformatics、200521i29~i37頁を参照のこと。ヒトなど非近交系の多様な集団において、異なるHLA型は、特定のエピトープが集団の全てのメンバーに認識されるとは限らないことを意味している。結核においてT細胞の応答が大きく関与するため、認識レベル及び免疫応答の程度を最大化するには、Rv1196の免疫原性誘導体は、望ましくは大部分のT細胞エピトープを完全なまま含有するものである。単一のアミノ酸若しくは少しのパーセンテージのアミノ酸を変更、追加又は欠失する、Rv1196タンパク質に対する個別の置換、欠失又は付加は、免疫原性誘導体であることを当業者は認識することになり、その変更は、機能的に類似しているアミノ酸によるアミノ酸の置換、又は免疫原性機能に実質的に影響を与えない残基の置換欠失付加をもたらす。機能的に類似しているアミノ酸を提供する保存的置換表は、当技術分野で周知である。一般に、そのような保存的置換は、以下に指定したアミノ酸グループの一つに分類されることになるが、状況によっては、他の置換が、抗原の免疫原特性に実質的に影響を及ぼすことなく可能である場合もある。以下の八つの各群は、典型的に互いに保存的に置換されるアミノ酸を含有する1アラニン、グリシン2アスパラギン酸、グルタミン酸3アスパラギン、グルタミン4アルギニン、リシン5イソロイシン、ロイシン、メチオニン、バリン6フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン7セリン、トレオニン及び8システイン、メチオニン。適切には、そのような置換はエピトープ領域に起こらず、したがって抗原の免疫特性に著しい影響を与えない。免疫原性誘導体は、参照配列と比較して追加的なアミノ酸が挿入されているものも含み得る。適切には、そのような挿入はエピトープ領域に起こらず、したがって抗原の免疫特性に著しい影響を与えない。挿入の一つの例には、問題の抗原の発現及び又は精製に役立つヒスチジン残基の短い領域がある。免疫原性誘導体は、参照配列と比較してアミノ酸が欠失しているものを含む。適切には、そのような欠失はエピトープ領域に起こらず、したがって抗原の免疫特性に著しい影響を与えない。特定の免疫原性誘導体は、置換、欠失及び付加を含み得ることを、当業者は認識する。二つ以上のポリペプチド配列において、用語同一又はパーセンテージ同一性とは、以下の配列比較アルゴリズムの一つを使用して又は手作業によるアライメントと目視検査によって測定されるように、比較ウィンドウ若しくは指定された領域上で比較及び整列させ、最大限一致させたときに、同じ又は指定されたパーセンテージの同じアミノ酸残基を有する二つ以上の配列若しくは部分配列を意味している。この定義は試験配列の相補体も意味している。場合によっては、同一性は、長さ少なくとも250アミノ酸、例えば300アミノ酸又は350アミノ酸の領域にわたって存在する。適切には、この比較は、参照配列の全長に相当するウィンドウにわたって実施される。配列比較の場合、一つの配列が参照配列になり、これに対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験及び参照配列がコンピュータに入力され、必要に応じて部分配列座標が指定され、配列アルゴリズムのプログラムパラメータが指定される。初期設定プログラムパラメータを使用でき、又は代わりのパラメータを指定することができる。次いで配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセンテージを算出する。本明細書では比較ウィンドウは部分を意味し、その部分において、二つの配列を最適に整列させた後に、配列は連続する位置にある同数の参照配列と比較され得る。比較するために配列を整列させる方法は、当技術分野で周知である。比較するための配列の最適なアライメントは、例えば、SmithWaterman、AdvApplMath、2482頁の局所的相同性アルゴリズムによって、NeedlemanWunsch、JMolBiol、48443頁の相同性アライメントアルゴリズムによって、PearsonLipman、ProcNatlAcadSciUSA、852444頁の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムをコンピュータ化して実行することによって、又は手作業によるアライメントと目視検査によってを参照のこと実行できる。有用なアルゴリズムの一例は、PILEUPである。PILEUPは、漸進性ペアワイズアライメントを使用して、関連配列の群から多重配列のアライメントを作成し、関係性及び配列同一性パーセントを示す。アライメントを作成するために使用されたクラスタリング関係を示す樹形図又は系統図も表示する。PILEUPは、FengDoolittle、JMolEvol、35351~360頁の漸進性整列方法を簡略化したものを使用している。使用されている方法は、HigginsSharp、CABIOS、5151~153頁によって記載されている方法に類似している。このプログラムは、最大長5000ヌクレオチド又はアミノ酸の各々を300配列まで整列させることができる。多重アライメントの手順は、二つの最も類似している配列のペアワイズアライメントから始まり、二つの配列が整列したクラスターを作製する。次いでこのクラスターが、次に最も相関する配列又は整列した配列クラスターと整列される。二つの配列クラスターは、二つの個々の配列のペアワイズアライメントを単純に拡張することによって整列される。最終的なアライメントは、一連の漸進性ペアワイズアライメントによって達成される。プログラムは、配列を比較する領域に対する特定の配列及びそのアミノ酸座標を指定することによって、並びにプログラムパラメータを指定することによって実行される。PILEUPを使用して、以下のパラメータ初期設定ギャップ加重、初期設定ギャップ長さ加重及び加重末端ギャップを使用して、参照配列を他の試験配列と比較し、配列同一性パーセント関係を決定する。PILEUPは、GCG配列分析ソフトウェアパッケージ、例えば70版から入手できる。配列同一性パーセント及び配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの別の例は、BLAST及びBLAST20アルゴリズムであり、それぞれ、Altschulら、NucAcidsRes、253389~3402頁及びAltschulら、JMolBiol、215403~410頁に記載されている。BLAST分析を実施するためのソフトウェアは、米国立バイオテクノロジー情報センターによって一般公開されている。このアルゴリズムでは、データベース配列中にある同じ長さのワードと整列したときに一致する又はいくつかの正の値の閾値スコアTを満たす、問い合わせ配列内にある長さWの短いワードを同定することによって高スコア配列対を最初に同定する。Tは、近傍ワードスコア閾値と呼ばれている。これらの最初の近傍ワードヒットは、それを含有する更に長いHSPを見出す検索を開始するためのシードの働きをする。ワードヒットは、累積アライメントスコアが増加できる限り、各配列に沿って両方向に広げられる。ヌクレオチド配列の場合、累積スコアは、パラメータM常に0及びNを使用して算出される。アミノ酸配列の場合、スコアマトリックスを使用して累積スコアを算出する。各方向に拡張するワードヒットは、次の場合に停止する累積アライメントスコアが最大達成値から量Xだけ低下する場合1以上の負のスコアになる残基のアライメントが蓄積することにより、累積スコアが0以下になる場合又は、いずれかの配列の末端に達する場合。BLASTアルゴリズムパラメータW、T及びXは、アライメントの感度及び速度を決定する。BLASTNプログラムは、初期設定としてワード長11、期待値又は10、M5、N4及び両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列の場合、BLASTPプログラムは、初期設定としてワード長3及び期待値10、及びBLOSUM62スコアマトリックスを参照のことアライメント50、期待値10、M5、N4及び両鎖の比較を使用する。BLASTアルゴリズムも、二つの配列間の類似性の統計分析を実施するを参照のこと。BLASTアルゴリズムによって提示される類似性の一つの尺度は、最小合計確率であり、二つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間の一致が偶然に起こる確率の指標を与える。例えば、参照核酸と試験核酸との比較において、最小合計確率が約02未満、より好ましくは約001未満、最も好ましくは約0001未満である場合、核酸は参照配列に類似していると見なされる。いずれにしても、ポリペプチド配列の免疫原性誘導体は、参照配列と本質的に同じ活性を有する。本質的に同じ活性とは、リンパ増殖、培養上清中にあるサイトカインの産生、又は細胞内外を染色しその後フローサイトメータで分析することによるT及びB細胞応答の特徴付けにより細胞の活性化を測定する、特定の抗原を用いるPBMC又は全血の、invitro再刺激アッセイにおける、少なくとも50、適切には少なくとも75、特に少なくとも90の参照配列の活性を意味している。適切には、本質的に同じ活性とは、T細胞増殖及び又はIFNγ産生アッセイにおける、少なくとも50、適切には少なくとも75、特に少なくとも90の参照配列の活性を意味している。適切には、Rv1196関連抗原は、配列番号1に対して少なくとも70の同一性を有する配列、例えば少なくとも80、特に少なくとも90、特別に少なくとも95、例えば少なくとも98、例えば少なくとも99の同一性を有する配列を含む、例えばその配列からなる。Rv1196関連抗原の具体例は、配列番号1で示されるヒト型結核菌H37Rv株由来のRv1196である。したがって、本発明の一実施形態において、Rv1196関連抗原は配列番号1を含むタンパク質である。本発明の第二の実施形態において、Rv1196関連抗原は配列番号1からなるタンパク質である。Rv1196関連抗原のさらなる例は、配列番号3で示されるヒト型結核菌F11株由来のRv1196である。本発明の一実施形態において、Rv1196関連抗原は配列番号3を含むタンパク質である。本発明の第二の実施形態において、Rv1196関連抗原は配列番号3からなるタンパク質である。典型的なRv1196関連抗原は、少数の欠失、挿入及び又は置換を有する配列番号1の免疫原性誘導体を含む、例えばそれからなる。例えば、0~5個所に最大5残基までの欠失、0~5個所に最大5残基までの挿入及び最大20残基までの置換を有するものがある。Rv1196の他の免疫原性誘導体は、長さ少なくとも250アミノ酸、例えば長さ少なくとも300アミノ酸又は長さ少なくとも350アミノ酸である配列番号1の断片を含む、例えばそれからなる。Rv1196のさらなる免疫原性誘導体は、長さ少なくとも250アミノ酸、例えば長さ少なくとも300アミノ酸、長さ少なくとも350アミノ酸又は長さ少なくとも380アミノ酸である配列番号3の断片を含む、例えばそれからなる。Rv1196関連抗原は、以前に記載されている方法2941~2950頁国際公開第2006117240号、実施例に提供されている方法、又はそれに類似した方法によって調製できる。免疫原性組成物は、1以上の更なる抗原成分を含んでもよい。そのような追加的な抗原成分は、組成物中の塩の存在に対してそれ自身必ずしも感受性である必要はない。追加的な抗原成分は、結核の予防及び治療の分野においてRv1196関連抗原に応答する免疫応答の強化若しくは補充を目的とすることができ、又は追加的な抗原は他の病原体に関連するものであり得、便利さ故にRv1196関連抗原と一緒に投与することを目的としている。いくつかの抗原成分が製剤中に存在する場合、これらは、個別のポリペプチド又は融合タンパク質の形態で提供され得る。状況によっては、追加的な抗原成分を、ポリヌクレオチドとして提供できる。Rv1196タンパク質の特定の免疫原性誘導体としては、配列番号1に対して少なくとも70の同一性を有する配列、例えば少なくとも80、特に少なくとも90、特別に少なくとも95、例えば少なくとも98、例えば少なくとも99の同一性を有する配列を含む融合タンパク質が挙げられる。Rv1196タンパク質を含有する例示的な融合タンパク質としては、M72及びその変異体、例えばN末端に追加的なHis残基を持つものN末端に追加的なHis残基を持つMtb72fタンパク質のように、M72において突然変異されている元のセリン残基を含有するMtb72fが挙げられる。特定の実施形態において、Rv1196関連抗原は、配列番号5に対して少なくとも90の同一性を有する配列、特別に少なくとも95、例えば少なくとも98、例えば少なくとも99の同一性を有する配列を含む、例えばそれからなる。他の実施形態において、Rv1196関連抗原は、配列番号7に対して少なくとも90の同一性を有する配列、特別に少なくとも95、例えば少なくとも98、例えば少なくとも99の同一性を有する配列を含む、例えばそれからなる。非経口投与の場合、溶液が細胞の変形又は溶解を避けるために製薬上許容できるモル浸透圧濃度を有するべきであることは周知である。製薬上許容できるモル浸透圧濃度とは、溶液がほぼ等張又は少し高張であるモル浸透圧濃度を有することを一般に意味している。適切には、本発明の免疫原性組成物は、250~750mOsmkgの範囲のモル浸透圧濃度を有し、例えばそのモル浸透圧濃度は、250~550mOsmkgの範囲、例えば280~500mOsmkgの範囲であり得る。モル浸透圧濃度は、市販の浸透圧計、例えばAdvancedInstrumentsInc製AdvancedModel2020の使用によってなど、当該技術分野において公知の技術によって測定できる。等張化剤とは、生理的に許容され、製剤に適切な張度を付与して、その製剤と接触している細胞膜を跨いだ正味の水の流れを防止する化合物である。一般に、塩化ナトリウムが等張化剤として使用される。本発明者らは、溶液中にあるタンパク質が、高濃度の塩を含有する溶液中にある場合に凝集又は凝固する工程である塩析に対して、Rv1196関連抗原が特に感受性であることを初めて示した。したがって、本発明の免疫原性組成物が製薬上許容できるモル浸透圧濃度を有することを確保するために、代替手段が提供される。特定の実施形態において、非イオン性等張化剤を更に含む免疫原性組成物が提供される。免疫原性組成物に使用するための非イオン性等張化剤は、それ自身が製薬上許容できるものである必要があり、例えばヒトでの使用に適しており、Rv1196関連抗原と適合性があり更に免疫賦活薬など他の成分とも適合性がある必要がある。本発明の一実施形態において、適切な非イオン性等張化剤は、多価アルコール、糖又はグリシンなどのアミノ酸である。一実施形態において、多価アルコールは、糖アルコール、特にC3~6糖アルコールである。例示的な糖アルコールには、グリセロール、エリトリトール、トレイトール、アラビトール、キシリトール、リビトール、ソルビトール、マンニトール、ズルシトール及びイジトールがある。この実施形態の具体例において、適切な非イオン性等張化剤はソルビトールである。当業者は、異なる等張化剤の混合物を使用することにより、適切なモル浸透圧濃度を得られることを認識する。本発明の特定の実施形態において、本発明の組成物中の非イオン性等張化剤は、スクロース及び又はソルビトールを組み込んでいる。一実施形態において、免疫原性組成物中の多価アルコールの適切な濃度は、約25~約15、特に約25~約10、例えば約3~約7、約4~約6などである。この実施形態の具体例において、多価アルコールはソルビトールである。別の実施形態において、免疫原性組成物は、スクロース及びソルビトールを含む。そのような状況において、免疫原性組成物は、約25~約15スクロース及び約25~約15ソルビトール、特に約25~約10スクロース及び約25~約10ソルビトール、例えば、約3~約7スクロース及び約3~約7ソルビトール、例えば約4~約6スクロース及び約4~約6ソルビトールを適切に含有し得る。免疫原性組成物のpHは、非経口投与に適切であるべきである。典型的には、pHは60~90の範囲である。適切には、pHは70~90の範囲、特に725~875、例えば75~85、特にpH775~825である。約80のpHは、特に興味深い。pHは、例えばTris又はリン酸塩緩衝液を含めた緩衝液を使用することによって制御し得る。本発明の特定の実施形態において、免疫原性組成物は1以上の免疫賦活薬を含む。一実施形態において、免疫賦活薬はサポニンであってよい。本発明に使用するのに特に適切なサポニンは、QuilA及びその誘導体である。QuilAは、南米の樹木キラジャサポナリアモリナから単離されるサポニン調製物であり、Dalsgaardら、1974によってアジュバント活性を有することが最初に記載された。QuilAの精製画分、例えばQS7及びQS21がHPLCによって単離され、この画分はQuilAに関連する毒性無しにアジュバント活性を保持していた。QS21はキラジャサポナリアモリナの樹皮から得られる天然のサポニンであり、CD8細胞障害性T細胞、Th1細胞及び優勢IgG2a抗体応答を誘導する。QS21は、本発明において好ましいサポニンである。本発明の適切な形態において、免疫原性組成物中のサポニンアジュバントは、サポナリアモリナQuilA誘導体、特にQS17又はQS21、適切にはQS21などQuilAの免疫学的な活性画分である。望ましくは、QS21は反応原性が低い組成物中に提供され、例えばコレステロールなど外因性ステロールで失活する。コレステロールでQS21が失活する反応原性が低い組成物のいくつかの特定の形態が存在する。特定の実施形態において、サポニンステロールは、リポソーム構造の形態をとる。この実施形態において、リポソームは中性脂質、例えばホスファチジルコリンを適切に含有し、これは適切には室温で非晶質であり、例えば卵黄ホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン又はジラウリルホスファチジルコリンである。リポソームは、飽和脂質から構成されるリポソームのリポソームQS21構造の安定性を高める荷電脂質を含有することもできる。これらの場合、荷電脂質の量は1~20ww、例えば5~10が適切である。ステロールのリン脂質に対する比率は、1~50、最適には20~25である。適切なステロールには、βシトステロール、スチグマステロール、エルゴステロール、エルゴカルシフェロール及びコレステロールがある。特定の一実施形態において、免疫原性組成物はステロールとしてコレステロールを含む。これらのステロールは当技術分野で周知であり、例えば、コレステロールは、動物性脂肪に見られる天然に存在するステロールとしてMerckIndex、第11版、341頁に開示されている。活性サポニン画分がQS21である場合、QS21ステロールの比率は、典型的には1100~11、適切には110~11、特に15~11程度である。適切には、過剰なステロールが存在し、QS21ステロールの比は少なくとも12である。一実施形態において、QS21ステロールの比は、15である。ステロールは、適切にはコレステロールである。別の実施形態において、免疫原性組成物はToll様受容体4作動薬である免疫賦活薬を含む。TLR作動薬とは、直接的なリガンドとして、又は内因性若しくは外因性リガンドを生成することによって間接的に、TLRシグナル伝達経路を通じてシグナル応答を引き起こすことが可能な成分を意味している。TLR4作動薬は、TLR4シグナル伝達経路を通じてシグナル応答を引き起こすことが可能である。TLR4作動薬の適切な例には、リポ多糖類、適切には脂質Aの非毒性誘導体、具体的にはモノホスホリルリピドA又はより具体的には3脱Oアシル化モノホスホリルリピドAがある。3DMPLはGlaxoSmithKlineBiologicalsNAからMPLという名称で販売されており、本文書の全体にわたってMPL又は3DMPLと呼ぶ、例えば、米国特許第4436727号第4877611号第4866034号及び第4912094号を参照のこと。3DMPLは、主にIFNγ表現型を伴うCD4T細胞の応答を促進する。3DMPLは、英国特許出願第2220211A号に開示されている方法に従って作製できる。化学的には、それは、3、4、5又は6個所アシル化された鎖を持つ3脱Oアシル化モノホスホリルリピドAの混合物である。本発明の組成物において、小粒子3DMPLを使用して、免疫原性組成物を調製することができる。小粒子3DMPLは、022μmフィルタを通して濾過滅菌できるような粒径を有する。そのような調製物は、国際公開第9421292号に記載されている。適切には、粉末状の3DMPLを使用して、本発明の免疫原性組成物を調製する。使用できる他のTLR4作動薬は、国際公開第9850399号若しくは米国特許第6303347号に開示されているものなどアルキルグルコサミニドリン酸、適切にはRC527若しくはRC529又は米国特許第6764840号に開示されているAGPの製薬上許容できる塩である。いくつかのAGPはTLR4作動薬であり、いくつかはTLR4拮抗薬である。他の適切なTLR4作動薬は、国際公開第2003011223号及び同第2003099195号に記載されており、例えば国際公開第2003011223号の4~5頁又は同第2003099195号の3~4頁に開示されている化合物I、化合物II及び化合物III、並びに特にER803022、ER803058、ER803732、ER804053、ER804057mER804058、ER804059、ER804442、ER804680及びER804764として国際公開第2003011223号に開示されている化合物である。例えば、一つの適切なTLR4作動薬はER804057である。特定の実施形態において、免疫原性組成物はサポニン及びTLR4作動薬の両方を含む。具体的な例において、免疫原性組成物はQS21及び3DMPLを含む。3DMPLなどのリポ多糖類などTLR4作動薬は、免疫原性組成物のヒト用量当たり1~100μgの量で使用できる。3DMPLは約50μgのレベル、例えば、40~60μg、適切には45~55μg又は49~51μg又は50μgのレベルで使用できる。更なる実施形態において、免疫原性組成物のヒト用量は約25μgのレベル、例えば、20~30μg、適切には21~29μg又は22~28μg又は23~27μg又は24~26μg又は25μgのレベルで3DMPLを含む。QS21などのサポニンは、免疫原性組成物のヒト用量当たり1~100μgの量で使用できる。QS21は約50μgのレベル、例えば、40~60μg、適切には45~55μg又は49~51μg又は50μgのレベルで使用できる。更なる実施形態において、免疫原性組成物のヒト用量は約25μgのレベル、例えば、20~30μg、適切には21~29μg又は22~28μg又は23~27μg又は24~26μg又は25μgのレベルでQS21を含む。TLR4作動薬及びサポニンの両方が免疫原性組成物中に存在する場合、サポニンに対するTLR4作動薬の重量比率は、適切には15~51、適切には12~21、例えば約11である。例えば、3DMPLが50μg又は25μgの量で存在する場合、適切にはQS21も免疫原性組成物のヒト用量当たりそれぞれ50μg又は25μgの量で存在できる。本発明の特定の免疫原性組成物は、ヒト用量当たり各々1~100μgの量、例えばヒト用量当たり各々10~75μgの量でQS21及び3DMPLを含む。本発明の免疫原性組成物は、ヒト用量当たり各々15~35μgの量で、例えばヒト用量当たり各々20~30μgの量でQS21及び3DMPLを適切に含むことができる。一実施形態において、免疫賦活薬は、例えば国際公開第2008142133号に提示されているTLR9作動薬である。具体的な例において、前記TLR9作動薬は免疫賦活性オリゴヌクレオチド、特に非メチル化CpGモチーフを含有するオリゴヌクレオチドである。そのようなオリゴヌクレオチドは周知であり、例えば、国際公開第9602555号、同第9933488号及び米国特許第5865462号に記載されている。本明細書に記載されている免疫原性組成物に使用される適切なTLR9作動薬は、CpG含有オリゴヌクレオチドであり、場合によっては少なくとも3個、適切には少なくとも6個以上のヌクレオチドによって分離されている、二つ以上のジヌクレオチドCpGモチーフを含有している。CpGモチーフとは、シトシンヌクレオチドとその後に続くグアニンヌクレオチドである。一実施形態において、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチド間結合は、ホスホロジチオエート、場合によってホスホロチオエート結合であるが、混合したヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチドを含めて、ホスホジエステル及び他のヌクレオチド間結合も使用できる。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド又はホスホロジチオエートを作製する方法は、米国特許第5666153号、米国特許第5278302号及び国際公開第9526204号に記載されている。異なるヌクレオチド間結合を含むオリゴヌクレオチドが意図されており、例えば混合ホスホロチオエートホスホジエステルである。オリゴヌクレオチドを安定化する他のヌクレオチド間結合が使用できる。本明細書に記載されている免疫原性組成物に含めるのに適しているCpGオリゴヌクレオチドの例は、以下の配列を有している。一実施形態において、これらの配列はホスホロチオエート修飾ヌクレオチド間結合を含有する。オリゴ1TCCATGACGTTCCTGACGTTオリゴ2TCTCCCAGCGTGCGCCATオリゴ3ACCGATGACGTCGCCGGTGACGGCACCACGオリゴ4TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTオリゴ5TCCATGACGTTCCTGATGCT代替のCpGオリゴヌクレオチドは、上記の配列中に、重要度が低い欠失又は付加を有する配列を含み得る。一実施形態において、免疫賦活薬はトコールである。トコールは、当技術分野で周知であり、欧州特許第0382271号に記載されている。特定の実施形態において、トコールはαトコフェロールスクシネートなどαトコフェロール又はその誘導体である。本発明は、本発明の免疫原性組成物を作製する方法であって、aRv1196関連抗原を凍結乾燥するステップと、bステップaの凍結乾燥したRv1196関連抗原を水溶液を用いて再構成するステップであって、該溶液の導電率が13mScm以下である、ステップとを含む方法も提供する。特定の実施形態において、水溶液の導電率は、12mScm以下、例えば10mScm以下、8mScm以下、6mScm以下、5mScm以下、4mScm以下又は3mScm以下である。特定の実施形態において、水溶液の導電率は、25mScm以下、例えば225mScm以下又は20mScm以下である。適切には、水溶液の導電率は、凍結乾燥した抗原が再構成されるときに得られる溶液が13mScm以下、例えば12mScm以下、例えば10mScm以下、8mScm以下、6mScm以下、5mScm以下、4mScm以下又は3mScm以下の導電率を有するものである。特定の実施形態において、得られる溶液の導電率は、25mScm以下、例えば225mScm以下又は20mScm以下である。更に、本発明の免疫原性組成物を作製する方法であって、aRv1196関連抗原を凍結乾燥するステップと、bステップaの凍結乾燥したRv1196関連抗原を水溶液を用いて再構成するステップであって、該溶液中の塩濃度が130mM以下である、ステップとを含む方法が提供される。特定の実施形態において、前記水溶液中の塩濃度は、100mM以下、例えば、90mM以下、80mM以下、70mM以下、60mM以下、50mM以下又は40mM以下である。特定の実施形態において、前記水溶液中の塩濃度は、35mM以下、例えば30mM以下又は25mM以下である。適切には、水溶液中の塩濃度は、凍結乾燥した抗原が再構成されるときに得られる溶液が、130mM以下、例えば100mM以下、例えば90mM以下、80mM以下、70mM以下、60mM以下、50mM以下又は40mM以下の塩濃度を有するものである。特定の実施形態において、得られる溶液中の塩濃度は、35mM以下、例えば30mM以下又は25mM以下である。加えて、本発明の免疫原性組成物を作製する方法であって、aRv1196関連抗原を凍結乾燥するステップと、bステップaの凍結乾燥したRv1196関連抗原を水溶液を用いて再構成するステップであって、該溶液中の塩化ナトリウム濃度が130mM以下である、ステップとを含む方法が提供される。特定の実施形態において、前記水溶液中の塩化ナトリウム濃度は、100mM以下、例えば、90mM以下、80mM以下、70mM以下、60mM以下、50mM以下又は40mM以下である。特定の実施形態において、前記水溶液中の塩濃度は、35mM以下、例えば30mM以下、20mM以下又は15mM以下である。適切には、水溶液中の塩化ナトリウム濃度は5mM又はそれ未満である。適切には、水溶液中の塩化ナトリウム濃度は、凍結乾燥した抗原が再構成されるときに得られる溶液が、130mM以下、例えば100mM以下、例えば90mM以下、80mM以下、70mM以下、60mM以下、50mM以下又は40mM以下の塩化ナトリウム濃度を有するものである。特定の実施形態において、得られる溶液中の塩化ナトリウム濃度は、35mM以下、例えば30mM以下又は25mM以下である。一実施形態において、ステップbの水溶液は、サポニン及び又はTLR4作動薬、例えばQS21及び又は3DMPLを含む。更なる実施形態において、サポニン及び又はTLR4作動薬はリポソーム製剤中にある。一実施形態において、水溶液はリポソーム製剤中のTLR4作動薬及びサポニン、並びに多価アルコールなど本明細書に記載の非イオン性等張化剤を含む。特に、水溶液は、ソルビトールを含み得る。また、a凍結乾燥したRv1196関連抗原と、b溶液の導電率が13mScm以下である、水溶液とを含むキットが提供される。特定の実施形態において、水溶液の導電率は、12mScm以下、例えば10mScm以下、8mScm以下、6mScm以下、5mScm以下、4mScm以下又は3mScm以下である。特定の実施形態において、水溶液の導電率は、25mScm以下、例えば225mScm以下又は20mScm以下である。適切には、水溶液の導電率は、凍結乾燥した抗原が再構成されるときに得られる溶液が、13mScm以下、例えば12mScm以下、例えば10mScm以下、8mScm以下、6mScm以下、5mScm以下、4mScm以下又は3mScm以下の導電率を有するものである。特定の実施形態において、得られる溶液の導電率は、25mScm以下、例えば225mScm以下又は20mScm以下である。加えて、a凍結乾燥したRv1196関連抗原と、b溶液中の塩濃度が130mM以下である、水溶液とを含むキットが提供される。特定の実施形態において、前記水溶液中の塩濃度は、100mM以下、例えば、90mM以下、80mM以下、70mM以下、60mM以下、50mM以下又は40mM以下である。特定の実施形態において、前記水溶液中の塩濃度は、35mM以下、例えば30mM以下又は25mM以下である。適切には、水溶液中の塩濃度は、凍結乾燥した抗原が再構成されるときに得られる溶液が、130mM以下、例えば100mM以下、例えば90mM以下、80mM以下、70mM以下、60mM以下、50mM以下又は40mM以下の塩濃度を有するものである。特定の実施形態において、得られる溶液中の塩濃度は、35mM以下、例えば30mM以下又は25mM以下である。更に、a凍結乾燥したRv1196関連抗原と、b溶液中の塩化ナトリウム濃度が130mM以下である、水溶液とを含むキットが提供される。特定の実施形態において、前記水溶液中の塩化ナトリウム濃度は、100mM以下、例えば、90mM以下、80mM以下、70mM以下、60mM以下、50mM以下又は40mM以下である。特定の実施形態において、前記水溶液中の塩濃度は、35mM以下、例えば30mM以下、20mM以下又は15mM以下である。適切には、溶液中の塩化ナトリウム濃度は5mM又はそれ未満である。適切には、水溶液中の塩化ナトリウム濃度は、凍結乾燥した抗原が再構成されるときに得られる溶液が、130mM以下、例えば100mM以下、例えば90mM以下、80mM以下、70mM以下、60mM以下、50mM以下又は40mM以下の塩化ナトリウム濃度を有するものである。特定の実施形態において、得られる溶液中の塩化ナトリウム濃度は、35mM以下、例えば30mM以下又は25mM以下である。キットは、ヒト単回用量など、免疫原性組成物の単回用量又は免疫原性組成物の複数回用量を提供するように適合してよい。本発明のキットで使用される水溶液は、本明細書で定義されるいずれかの水溶液でよい。本発明の特定の実施形態において、水溶液は、リポソーム形態におけるTLR4作動薬及び又はサポニンを含む。特定の実施形態において、TLR4作動薬は3DMPLであり、サポニンはQS21である。本明細書において使用される水溶液は、等張化剤、例えばソルビトールなどの多価アルコールを含むことができる。上述したキット及び本発明の免疫原性組成物を作製する方法に関して、免疫賦活薬及び等張化剤を、抗原と一緒に共凍結乾燥させる又は要望通り水溶液に含有させることができることに留意されたい。水溶液は単なる注射剤用の水であってよく、免疫原性組成物の他の全ての成分が抗原と一緒に共凍結乾燥される。典型的には、少なくともいくつかの免疫賦活薬及び等張化剤が水溶液で提供され、これはリポソームなど特定の成分が凍結乾燥に適合していない場合に、特に適している。一実施形態において、水溶液は免疫賦活薬を含む。第二の実施形態において、水溶液は等張化剤、例えば多価アルコールなどの非イオン性等張化剤、特にソルビトールを含む。第三の実施形態において、水溶液は免疫賦活薬及び等張化剤、例えば多価アルコール、特にソルビトールを含む。キットは、水溶液を使用する凍結乾燥したRv1196関連抗原の再構成を指示する説明書を更に含むことができる。本発明による免疫原性組成物は、医薬で、特にヒト型結核菌による感染などマイコバクテリウムによる感染を予防、治療又は改善するために使用され得る。免疫原性組成物は、ウシへの投与用など獣医学でも有用であり得るが、一般にヒトへの投与用に提供される。医薬品、特にヒト型結核菌による感染などマイコバクテリウムによる感染を予防、治療又は改善するための医薬品の製造における、本発明による免疫原性組成物の使用が提供される。本発明による免疫原性組成物の安全且つ有効な量を投与することを含む、ヒト型結核菌による感染などマイコバクテリウムによる感染を予防、治療又は改善する方法も提供される。免疫原性組成物は、活動性結核を治療する目的例えば感染していない被験体又は潜伏感染している被験体に投与することによって活動性結核を予防する目的潜伏結核を治療する目的例えば感染していない被験体に投与することによって潜伏結核を予防する目的又は例えば月、年の間、更には無期限に、結核の再活性化を防止又は遅延させる、特にTBの再活性化を遅延させる目的で提供され得る。用語活動性感染とは、発現した疾患の症状及び又は病変を伴う、適切には発現した疾患の症状を伴う感染、例えばヒト型結核菌による感染を意味している。用語不活性感染、休止感染又は潜伏感染とは、発現した疾患の症状及び又は病変が無い、適切には発現した疾患の症状が無い感染、例えばヒト型結核菌による感染を意味している。適切には、潜伏感染被験体とは、例えばPPD又はT細胞に基づくアッセイによって感染に陽性反応を示すが、活動性感染に関連する疾患の症状及び又は病変を示していない被験体である。用語初感染結核とは、臨床的疾患、例えば感染直後の疾患の症状の発現を意味している。HarrisonsPrinciplesofInternalMedicine、第150章、953~966頁を参照のこと。用語二次結核又は初感染後結核とは、休止、不活性又は潜伏感染の再活性化を意味している。HarrisonsPrinciplesofInternalMedicine、第150章、953~966頁を参照のこと。用語結核再活性化とは、感染に陽性反応を示すが明瞭な疾患の症状が無い個体において、後から疾患の症状が現れることを意味している。適切には、その個体は感染に再曝露されていない。陽性診断試験は個体が感染していることを示すが、その個体は、十分に治療されて結核が不活性又は潜伏状態になっている、以前に発現した活動性の疾患の症状を有する又は有さない可能性がある。適切には、免疫原性組成物は、ヒト型結核菌による感染などマイコバクテリウムによる感染が無い又は潜伏感染している被験体に投与される。投与される免疫原性組成物の容量は、特定の送達経路など他のいくつかの因子によって変わり得る。典型的には、ヒトに対する単回注射において投与される容量は、50μL~1mLの範囲、例えば100μL~750μL、特に400~600μLなど、例えば約500μLである。単回用量中に含有されるRv1196関連抗原の量は、臨床的な必要性によって決まるが、ヒトの単回用量は典型的には1~100μgの範囲、例えば5~50μgなど、例えば5~20μgである。ヒト単回用量は、約10μgのRv1196関連抗原を含有し得る。適切には、本発明の組成物は安定であり、安定とは、25°Cで24時間貯蔵している間に本明細書に記載されている技術で測定した抗原性が、貯蔵前の抗原性の少なくとも80残っていることを意味している。望ましくは、抗原性が、25°Cで24時間貯蔵した後に少なくとも85、例えば少なくとも90、特に少なくとも95残っている。特に興味深い組成物の場合、30°Cで24時間貯蔵した後に、組成物の抗原性の少なくとも80、例えば少なくとも85、少なくとも90、特に少なくとも95が残っている。本発明は、ここで以下の非限定的な実施例によって更に記載される。実施例1アジュバント組成物ASAの調製等張化剤としてソルビトールを使用して、3脱Oアシル化モノホスホリルリピドA及びQS21をリポソーム製剤に含むアジュバント組成物を調製した。これは、以下の通りに調製されたAリポソームの調製方法有機溶剤中にある脂質、コレステロール及び3脱Oアシル化モノホスホリルリピドAの混合物を真空下で乾燥させた。次いで水溶液を添加し、全ての脂質が懸濁されるまで容器をかき混ぜた。次いでこの懸濁液を、高剪断ミキサーを用いてプレホモジナイズし、次いでDLSによる測定でリポソームサイズがおよそ90nm±10nmに減少するまで高圧でホモジナイズした。次いでリポソームを濾過滅菌した。BASA製剤ステップ1濃縮リポソームの希釈10倍に希釈した場合、Na2Kリン酸緩衝液100mMpH61を注射用の水に添加して、最終製剤において10mMリン酸緩衝液濃度にした。次いで注射用の水中の30ソルビトール溶液を添加して、最終製剤において47の濃度にし、これを室温で15~45分間撹拌した。次いで濃縮リポソームを混合物に添加して、最終製剤において3DMPLを100μgmLの濃度にした。その後、混合物を室温で15~45分間、撹拌した。ステップ2QS21の添加蠕動ポンプを使用して、希釈したリポソームにQS21バルクストックを磁気撹拌しながら添加して、最終製剤において100μgmL濃度にした。混合物を15~45分間、撹拌した。最終的なASA製剤は、2mgDOPCmL、500μgコレステロールmL、100μg3DMPLmL及び100μgQS21mL、47ソルビトール並びに5mM塩化ナトリウム及び10mMリン酸塩を含有した。ステップ3pHを、61±01になるよう確認した。ステップ4濾過滅菌PALLCorporation製ポリエーテルスルホンフィルタを使用して、濾過滅菌を実施した。ステップ52°C~8°Cでの貯蔵リポソーム製剤中に3脱Oアシル化MPL及びQS21を含み、等張化剤としてソルビトールを含有する、得られたアジュバント組成物と呼ぶを、次いで4°Cで貯蔵した。実施例2アジュバント組成物ASAの調製等張化剤として塩化ナトリウムを使用して、3脱Oアシル化モノホスホリルリピドA及びQS21をリポソーム製剤に含むアジュバント組成物を調製した。Aリポソームの調製方法有機溶剤中にある脂質、コレステロール及び3脱Oアシル化モノホスホリルリピドAの混合物を真空下で乾燥させた。次いでリン酸緩衝食塩水を添加し、全ての脂質が懸濁されるまで容器をかき混ぜた。次いでこの懸濁液を、高剪断ミキサーを用いてプレホモジナイズし、次いでDLSによる測定でリポソームサイズがおよそ90nm±10nmに減少するまで高圧でホモジナイズした。次いでリポソームを、022μmPES膜で濾過滅菌した。BASA製剤ステップ1濃縮リポソームの希釈10倍に希釈した場合、Na2Kリン酸緩衝液100mMpH645及びNaCl15Mを注射用の水に添加して、最終製剤においてそれぞれリン酸塩10mM及びNaCl150mMの濃度にした。この混合物を室温で5分間、撹拌した。次いで濃縮リポソームを混合物に添加して、最終製剤において3DMPLを100μgmLの濃度にした。その後混合物を室温で5~15分間、撹拌した。ステップ2QS21の添加希釈したリポソームにQS21バルクストックを磁気撹拌しながら添加して、最終製剤において100μgmL濃度にした。混合物を室温で撹拌した。ステップ3pHを、61±01になるよう確認した。ステップ4濾過滅菌PALLCorporation製ポリエーテルスルホンフィルタを使用して、濾過滅菌を実施した。ステップ52°C~8°Cでの貯蔵ASAの最終組成は、1mL当たり、2mgDOPC、500μgコレステロール、100μg3脱Oアシル化MPL、100μgQS21、並びに10mMリン酸塩及び150mMNaClであった。実施例3QS21の溶解活性QS21は、赤血球を溶解させることが公知である。実施例1の通り調製したASAアジュバント組成物を試験して、QS21溶解活性を、150mMNaClを含む同等アジュバント組成物で見られるのと同じ様に失活させたことを確認した。ニワトリ赤血球を使用する溶血アッセイによってQS21溶解活性を測定した。RBCを4°C、550gで遠心分離した。上清を廃棄した。ペレットを慎重にPBS緩衝液に再懸濁して、当初の体積にし、上清が赤くなくなるまで同じ操作を繰り返した。直ちに使用しない場合、ペレットを4°Cで最大3~4日間貯蔵した、又は同じ日に使用する場合、緩衝液で約10倍に希釈した。QS21用量範囲曲線を、ASA緩衝液で用時作製し、アジュバントサンプルを調製した。適切な緩衝液を用いて、標準及びサンプルの最終容量を900μLに調整した。ASAは乳白色のため、光学密度に干渉する。したがって、ASAブランクを調製し、そのODをASA試験したサンプルのODから減算した。これらのブランクはサンプルにおいて試験された体積と同じASA体積に相当したが、緩衝液を用いて1mLに調整した。これらのブランクにRBCは添加しなかった。次いで標準及びサンプルを、RBCと一緒に室温で30分間インキュベートした。次いでサンプルを900gで5分間遠心分離した。遠心分離後に540nmでの光学密度を測定した。限界試験によって溶解活性の決定を実施した。1検出限界は、基準レベルより高くOD緩衝液より約3倍高く曲線の上昇部分にあり各試験について決定される、ODをもたらすQS21の最低濃度として定義された。2アジュバントサンプルに対するODがODLODより大きい場合、QS21溶解活性はアジュバントサンプル中で陽性に保持された。上記のデータを、図1にグラフで示している。このアッセイにおける検出限界は、09μgQS21及びOD012である。150mM塩化ナトリウムを含むアジュバント組成物のQS21失活は、試験した50μgQS21の同等物について982を上回ると推定された。試験した90μgの同等物の場合、判定は99を超えている。次いでQS21の失活を、ソルビトール及びわずかに5mMの塩化ナトリウムを含む同等アジュバント組成物と比較した。ASAを4°Cで貯蔵した後、又は安定性を促進させた後にデータを生成した。ソルビトール中のASAの場合、ソルビトール含有緩衝液においてQS21標準曲線を実現した。QS21は低塩化ナトリウム緩衝液中において十分に失活したと結論された。実施例4MPL同族体化学的には、3DMPLは、主に4、5又は6個所アシル化された鎖を持つ3脱Oアシル化モノホスホリルリピドAの混合物である。別々の各3DMPL分子は同族体と呼ばれる。同族体の組成は、同族体の比率に変化がなく一定のままであることが重要である。使用されるいずれの緩衝液によっても、同族体の組成が、アジュバント組成物を作製するために使用される濃縮リポソーム中の組成と同じになることができる、ということも重要である。図2に示すように、3DMPL濃縮リポソーム、150mMNaCl緩衝液中に3DMPLリポソームとQS21を含むアジュバント組成物、第二カラム、並びにソルビトール及び5mMNaCl緩衝液中に3DMPLリポソームとQS21を含むアジュバント組成物、第三~七カラムにおいて、同族体の組成を検査した。同族体の組成を、0日目及び調製してから37°Cで7日間維持した後に、二つのロットのASAアジュバントにおいても検査して、経時的な漸進的変化が無いことを確認した。濃縮リポソーム又はASAサンプル中にあるMPLのテトラ、ペンタ及びヘキサアシル化同族体の相対的な配分をIPHPLCFluo検出によって決定した。標準及びサンプル両方を、ダンシルヒドラジンを用いて誘導体化し、二糖類主鎖にFluo活性がある発色団を誘導した。誘導体化したサンプルを、イオン対試薬として水酸化テトラブチルアンモニウムを使用して、C18逆相カラムで分析した。脂肪族アシル基を同数含有する同族体は、はっきりと異なる基に溶出された。全てのMPL同族体の合計ピーク面積と各基のピーク面積を比較することによって、同族体の配分が導き出される。各同族体のパーセンテージを図2に示す。アジュバント緩衝液間で同族体組成に著しい相違は見られず、同族体組成はソルビトール緩衝液中で経時的に一定であった。実施例5アジュバント組成物ASAの調製等張化剤としてソルビトールを使用して、リポソーム製剤に実施例1に比べて少ないレベルで3脱Oアシル化モノホスホリルリピドA及びQS21を含む、アジュバント組成物を調製した。これは、以下の通りに調製されたアジュバントは、10mMリン酸塩、5mMNaCl、47ソルビトールpH61を含有する溶液を用いて実施例1に従って調製されたASAを11に希釈することによって、調製された。最終的なASA製剤は、1mgDOPCmL、250μgコレステロールmL、50μg3DMPLmL及び50μgQS21mL、47ソルビトール並びに5mM塩化ナトリウム及び10mMリン酸塩を含有した。実施例6アジュバント組成物ASAの調製等張化剤としてソルビトールを使用して、リポソーム製剤に実施例1に比べて少ないレベルで3脱Oアシル化モノホスホリルリピドA及びQS21を含む、アジュバント組成物を調製した。これは、以下の通りに調製されたAリポソームの調製方法有機溶剤中にある脂質、コレステロール及び3脱Oアシル化モノホスホリルリピドAの混合物を真空下で乾燥させた。次いで水溶液を添加し、全ての脂質が懸濁されるまで容器をかき混ぜた。次いでこの懸濁液を、高剪断ミキサーを用いてプレホモジナイズし、次いでDLSによる測定でリポソームサイズがおよそ90nm±10nmに減少するまで高圧でホモジナイズした。次いでリポソームを濾過滅菌した。BASA製剤ステップ1濃縮リポソームの希釈10倍に希釈した場合、Na2Kリン酸緩衝液100mMpH61を注射用の水に添加して、最終製剤において10mMリン酸緩衝液濃度にした。次いで注射用の水中の30ソルビトール溶液を添加して、最終製剤において47の濃度にし、これを室温で15~45分間撹拌した。次いで濃縮リポソームを混合物に添加して、最終製剤において3DMPLを50μgmLの濃度にした。その後、混合物を室温で15~45分間、撹拌した。ステップ2QS21の添加蠕動ポンプを使用して、希釈したリポソームにQS21バルクストックを磁気撹拌しながら添加して、最終製剤において50μgmL濃度にした。混合物を15分間、撹拌した。最終的なASA製剤は、1mgDOPCmL、250μgコレステロールmL、50μg3DMPLmL及び50μgQS21mL、47ソルビトール並びに25mM塩化ナトリウム及び10mMリン酸塩を含有した。ステップ3pHを、61±01になるよう確認した。ステップ4濾過滅菌PALLCorporation製ポリエーテルスルホンフィルタを使用して、濾過滅菌を実施した。ステップ52°C~8°Cでの貯蔵リポソーム製剤中に3脱Oアシル化MPL及びQS21を含み、等張化剤としてソルビトールを含有する、得られたアジュバント組成物と呼ぶを、次いで4°Cで貯蔵した。実施例7アジュバント組成物ASAの調製等張化剤として塩化ナトリウムを使用して、リポソーム製剤に実施例2と比べて少ないレベルで3脱Oアシル化モノホスホリルリピドA及びQS21を含むアジュバント組成物を調製した。これは、以下の通りに調製されたAリポソームの調製方法有機溶剤中にある脂質、コレステロール及び3脱Oアシル化モノホスホリルリピドAの混合物を真空下で乾燥させた。次いでリン酸緩衝食塩水を添加し、全ての脂質が懸濁されるまで容器をかき混ぜた。次いでこの懸濁液を、高剪断ミキサーを用いてプレホモジナイズし、次いでDLSによる測定でリポソームサイズがおよそ90nm±10nmに減少するまで高圧でホモジナイズした。次いでリポソームを、022μmPES膜で濾過滅菌した。BASA製剤ステップ1濃縮リポソームの希釈10倍に希釈した場合、Na2Kリン酸緩衝液100mMpH645及びNaCl15Mを注射用の水に添加して、最終製剤においてそれぞれリン酸塩10mM及びNaCl150mMの濃度にした。この混合物を室温で5分間、撹拌した。次いで濃縮リポソームを混合物に添加して、最終製剤において3DMPLを50μgmLの濃度にした。その後混合物を室温で5~15分間、撹拌した。ステップ2QS21の添加希釈したリポソームにQS21バルクストックを磁気撹拌しながら添加して、最終製剤において50μgmL濃度にした。混合物を室温で撹拌した。ステップ3pHを、61±01になるよう確認した。ステップ4濾過滅菌PALLCorporation製ポリエーテルスルホンフィルタを使用して、濾過滅菌を実施した。ステップ52°C~8°Cでの貯蔵ASAの最終組成は、1mL当たり、1mgDOPC、250μgコレステロール、50μg3脱Oアシル化MPL、50μgQS21、並びに10mMリン酸塩及び150mMNaClであった。実施例8pH61、75及び85において異なる塩濃度を持つRv1196を含む組成物における塩析の検討塩化ナトリウム濃度及びpHのRv1196抗原安定性に対する影響を、サイズによる評価として検討した。方法Rv1196タンパク質をCorixaCorporationから得て、最終塩化ナトリウム濃度0、150及び450mMを含有する異なる三種の緩衝液中に100μgmLの濃度になるよう希釈した。サンプルを分析の前に4°C又は25°Cで24時間貯蔵した。比濁法は、ThermoFischerScientificから市販されているNepheloskanAscentを使用して実施された。分析は、CorningIncから市販されている紫外線を透過するCostarマイクロプレート中で実施された。WyattInstruments製のDynaproPlateReaderを使用して、DLSを実施した。機器を、レーザ波長830nm及び50mWの出力を使用して動作させた。散乱光を、150°で22°Cの温度で検出した。平均流体力学直径及び多分散性指数は、機器のソフトウェアで算出される。結果この実験の成果を図3及び4に提示する。比濁法は、塩濃度の増加に伴う透明度の減少の一般的傾向を実証し、これはRv1196が塩濃度に対して感受性であることを示している。DLSサンプルの大多数において、測定器は具体的な粒径を決定できなかった。にもかかわらず、比較可能なデータが得られた場合には、塩化ナトリウム濃度が、Rv1196免疫原性組成物において測定される粒径に影響を与えることが明らかである。実施例9タンパク質抗原の調製二つのN末端His残基を持つM72M72発現ベクターの構築N末端に追加的な6Hisタグを持つMtb72fのアミノ酸配列をコードしているプラスミドは、Mtb32aのC末端断片をコードしているオープンリーディングフレームを、C末端にMtb32aのN末端部分が続く完全長Mtb39aORFに一列に連続して結合することによって生成した。これは、ヒト型結核菌H37Rv株由来のゲノムDNAのポリメラーゼ連鎖反応に際して、唯一の制限部位を含有し、C末端に停止コドンを欠いた配列特異的オリゴヌクレオチドを使用することにより達成した。鋳型としてのこのベクターを使用して、Ser706からAlaへの変異を部位特異的突然変異誘発によって実施した。挿入断片の正しい方向並びにSer706Ala変異を、DNA配列決定によって確認した。N末端に二つだけHis残基を有するM72をコードするベクターを得るために、市販の部位特異的突然変異誘発システムを使用して四つのHisを欠失させた。配列を確認した後、M72コード配列を酵素反応によってプラスミドから切り出し、ゲル精製し、pETベクターにライゲーションした。次いで組換えプラスミドを配列確認した。このプラスミドは、T7プロモータの制御下にM72をコードしている。T7RNAポリメラーゼの発現は、発現宿主中のゲノム成分から駆動され、ラクトースオペロンに基づくシステム及びIPTG化学的誘発シグナルを使用して誘導される。発現プラスミドは、カナマイシン耐性を備えている。T7プロモータの制御下にM72融合タンパク質をコードしているプラスミドを、エレクトロポレーション法を用いて大腸菌HMS174株に形質転換した。M72挿入断片のコード配列及びフランキング領域を両方の鎖について配列決定し、元々のプラスミド構築物から決定した配列と同一であることを認めた。発酵ペレット化したワーキングシードのバイアルを、室温で解凍した。前培養培地49mLとワーキングシードを混合することによって、前希釈物を調製した。前希釈物1mLを使用して、50mgL硫酸カナマイシン及び10gLグルコースを補充した前培養培地400mLからなる液体前培養物を植菌した。前培養を、2リットルの振とうフラスコでOD650nmが2~4の値に達するまで、かき混ぜながら30°Cでインキュベートした。その段階で、34mgL硫酸カナマイシンを補充した45リットルの培養培地を含有する72リットルの発酵槽を、52mLの液体前培養物を用いて植菌した。増殖期の間、25NH4OH及び25H3PO4を定期的に添加することによって、pHを68±02に維持した。30°Cで16時間インキュベーションした後、流加培地を用いて流加回分培養を開始した。更に2時間温度を30°Cに維持し、次いで発酵が終了するまで37°Cに上昇させた。気流を75L分で一定に設定し、溶存酸素量を、かき混ぜ及び圧力のフィードバック制御によって17飽和に保った。小量の消泡剤溶液を必要に応じて自動的に添加した。OD650nmが50の値に達するまでに、1mMイソプロピルβDチオガラクトピラノシドを添加して、M72の発現を誘導した。誘導開始時点から5時間後に発酵を終えた。細胞培養物を、わずかにかき混ぜながら15°Cまで冷却し、遠心分離して細胞ペレットを得て、その後それを一定分量で20°Cで貯蔵した。封入体の単離集菌物から捕集した細胞ペレットを室温で解凍し、高圧ホモジナイザを用いて溶解緩衝液中で破壊した。その後、細胞溶解物を遠心分離し、得られた細胞ペレットを尿素、Tris及びNaClを含有する洗浄緩衝液を用いて洗浄した。IBを、8M尿素を含有する可溶化緩衝液で可溶化し、02μm膜を通して濾過した。このろ液を、QSepharoseFastFlowカラムを使用する陰イオン交換クロマトグラフィーによって先ず精製した。6M尿素、20mMビストリスプロパン、90mMNaCl、pH70溶液を用いて、M72の溶出を行う。捕集したM72をハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーによって更に精製し、6M尿素、20mMビストリスプロパン、250mMNaCl、pH70溶液を用いてそこから溶出させた。捕集した画分を、30kDaの膜カセットを用いて濃縮し、20mMTris、pH75に対して限外濾過した。次いでM72を022μmフィルタを通して滅菌した。次いで精製したバルクを等分し、70°Cで貯蔵した。実施例10pH61、75及び85において異なる塩濃度を持つM72を含む組成物における塩析の検討塩化ナトリウム濃度及びpHのM72抗原安定性に対する影響を、サイズ及び抗原性による評価として検討した。方法精製したバルク抗原を、最終塩化ナトリウム濃度0、50、150、300及び450mMを含有する異なる三種の緩衝液中に100μgmLの濃度になるよう希釈した。サンプルを、直ちに分析した、分析の前に4°Cで一晩貯蔵した、又は分析の前に25°Cで24時間貯蔵した。MalvernInstruments製のMalvernZetasizerNanoZSを使用して、DLSを実施した。機器を、レーザ波長633nm及び4mWの出力を使用して動作させた。散乱光を、173°で22°Cの温度で検出した。Z平均直径及び多分散性指数は、機器のソフトウェアで算出される。比濁法は、ThermoFischerScientificから市販されているNepheloskanAscentを使用して実施された。分析は、CorningIncから市販されている紫外線を透過するCostarマイクロプレート中で実施された。抗原性をサンドイッチELISAによって定量化した。このELISAにおいて、抗原はM72特異的ウサギポリクローナル抗体に捕捉され、その後M72特異的マウスモノクローナル抗体によって示される。全ての測定値は、試験された製剤を調製するために使用した精製バルクタンパク質に基づいて期待される抗原性と比較して提示されている。結果この実験の成果を図5~7に提示する。本結果は、Rv1196関連抗原、特にM72を含有する溶液の安定性がpH及び塩化ナトリウム濃度の両方に感受性であることを、初めて実証している。抗原サイズ及び抗原性に対する塩化ナトリウムの影響は、pHが低下するにつれていっそう顕著になる。抗原サイズ及び抗原性は、塩化ナトリウムが無くてもpH61において不安定である。pH61で50mM塩化ナトリウムを添加することにより、35nmから最大58nm又は25°Cで24時間後に79nmまでサイズが増加した。抗原サイズ及び抗原性は、pH75又は85では、特に塩化ナトリウムが無い若しくは50mM塩化ナトリウム濃度において、25°Cで24時間にわたって比較的安定である。にもかかわらず、塩化ナトリウムの濃度を150mM以上に高めることにより、抗原サイズの明らかな増加及び抗原性の減少がもたらされる。したがって、本発明の利点は、Rv1196抗原配列自体のみではなく、Rv1196関連抗原を含有する配列に拡張される。実施例11M72及び免疫賦活薬を含み、等張化剤としてソルビトールを使用している組成物における塩析の防止150mMNaClを含有する免疫原性組成物の安定性を、等張化剤としてソルビトールを使用している組成物と比較するために、いくつかのサンプルを、SECHPLC及びELISAを使用してモニタリングした。方法実施例5及び7の適切なアジュバント製剤と併用したときに所望のpHが得られるような三つの異なる凍結乾燥ケーキを調製した二つのN末端His残基を持つM72再構成されたワクチンにおいて標的pH851575スクロース溶液を注射用の水に添加して、スクロース濃度を63にした。3Tween80溶液を次いで添加して、濃度を0025にした。1MTrisHCl緩衝液pH88を次いで添加して、50mMTris緩衝液濃度にした。混合物を、室温で5分間、磁気的に撹拌した。精製したバルク抗原を次いで添加して、タンパク質濃度を25μgmLにした。混合物を、室温で10分間、磁気的に撹拌した。pHを点検し、88であることを認めた。得られた混合物05mLを3mLガラスバイアルに充填し、次いで凍結乾燥した。二つのN末端His残基を持つM72再構成されたワクチンにおいて標的pH801575スクロース溶液を注射用の水に添加して、スクロース濃度を63にした。3Tween80溶液を次いで添加して、濃度を0025にした。1MTrisHCl緩衝液pH88を次いで添加して、20mMTris緩衝液濃度にした。混合物を、室温で5分間、磁気的に撹拌した。精製したバルク抗原を次いで添加して、タンパク質濃度を25μgmLにした。混合物を、室温で10分間、磁気的に撹拌した。pHを点検し、88であることを認めた。得られた混合物05mLを3mLガラスバイアルに充填し、次いで凍結乾燥した。二つのN末端His残基を持つM72再構成されたワクチンにおいて標的pH751575スクロース溶液を注射用の水に添加して、スクロース濃度を63にした。3Tween80溶液を次いで添加して、濃度を0025にした。1MTrisHCl緩衝液pH88を次いで添加して、125mMTris緩衝液濃度にした。混合物を、室温で5分間、磁気的に撹拌した。精製したバルク抗原を次いで添加して、タンパク質濃度を25μgmLにした。混合物を、室温で10分間、磁気的に撹拌した。pHを点検し、88であることを認めた。得られた混合物05mLを3mLガラスバイアルに充填し、次いで凍結乾燥した。上述の凍結乾燥ケーキを、実施例5及び7において調製した625μLのアジュバント溶液を用いて再構成した。アジュバント溶液を用いる再構成によって以下の免疫原性組成物が得られた二つのN末端His残基を持つM72ASApH8510μg抗原5wvスクロース40mMTris002wvTween80500μgDOPC125μgコレステロール25μg3DMPL25μgQS21150mMNaCl10mMリン酸塩pH85二つのN末端His残基を持つM72ASApH8010μg抗原5wvスクロース16mMTris002wvTween80500μgDOPC125μgコレステロール25μg3DMPL25μgQS21150mMNaCl10mMリン酸塩pH80二つのN末端His残基を持つM72ASApH7510μg抗原5wvスクロース125mMTris002wvTween80500μgDOPC125μgコレステロール25μg3DMPL25μgQS21150mMNaCl10mMリン酸塩pH75二つのN末端His残基を持つM72ASApH8510μg抗原5wvスクロース40mMTris002wvTween80500μgDOPC125μgコレステロール25μg3DMPL25μgQS215mMNaCl47wvソルビトール10mMリン酸塩pH85二つのN末端His残基を持つM72ASApH8010μg抗原5wvスクロース16mMTris002wvTween80500μgDOPC125μgコレステロール25μg3DMPL25μgQS215mMNaCl47wvソルビトール10mMリン酸塩pH80二つのN末端His残基を持つM72ASApH7510μg抗原5wvスクロース125mMTris002wvTween80500μgDOPC125μgコレステロール25μg3DMPL25μgQS215mMNaCl47wvソルビトール10mMリン酸塩pH75サンプル分析上述の再構成された免疫原性組成物が、25°C又は30°Cで貯蔵された後に特徴付けられた。SECHPLC分析を、20mMTris緩衝液pH85で平衡化したTOSOHTSKGel5000Pwxlへの注入、210nmの紫外線による検出、流速05mL分により実施した。抗原性をサンドイッチELISAによって定量化した。このELISAにおいて、抗原はM72特異的ウサギポリクローナル抗体に捕捉され、その後M72特異的マウスモノクローナル抗体によって示される。全ての測定値は、試験された製剤を調製するために使用した精製バルクタンパク質に基づいて期待される抗原性と比較して提示されている。結果結果を、図8a~8d及び9に示す。各pHで、等張化剤としてソルビトールを使用している低塩組成物中に再構成した後では、SECHPLCプロファイルは安定している。これは150mMNaClを含有する免疫原性組成物のSECHPLCプロファイルと対比されることができ、得られた初期プロファイルと25°C又は30°Cで貯蔵した後のそれとの間に明らかな変化を示している。150mMNaCl組成物のpHが低下するとき、この漸進的変化はより強くなる。各pHで、等張化剤としてソルビトールを使用している低塩組成物中に再構成した後、30°Cで最大24時間まで回収物は大部分が安定なままであり、抗原性に関して同じ結論を導き出すことができる。実施例12本発明の免疫原性組成物の導電率の決定本発明による一連の免疫原性組成物の導電率を測定し、対照塩化ナトリウム溶液の導電率と及び通常量の塩化ナトリウムを含有する免疫原性組成物と比較した。方法1500mM塩化ナトリウム原液から注射用の水に希釈することによって、0、75、100、150、250及び300mMの塩化ナトリウム濃度を有する一連の標準液を調製した。免疫原性組成物を、実施例9に提供される手順に従って二つのN末端His残基を持つM72を使用して調製した。精製したバルク中の抗原自体及びあらゆる残留物の寄与を検討するために、抗原成分を除くことによるプラセボ凍結乾燥ケーキも調製した。MalvernZetasizerNano及び折り曲がったキャピラリーセル中の各15mLのサンプルを使用して、30~150Vの電圧を印加し、導電率を決定した。結果このデータに基づく標準曲線を、図10に提示する。上記のデータから分かるように、150mMNaClを利用している溶液の導電率は、最小限のNaClを使用する溶液の導電率より著しく大きい。プラセボ調製物が、Rv1196関連抗原を含有する対応物と同等の導電率を有するので、抗原及び精製されたバルク中にある任意の成分の影響は最小限である。実施例13本発明の免疫原性組成物の免疫原性試験この実施例の目的は、タンパク質の安定性を改善する目的で本発明の免疫原性組成物中の塩の量を減らす製剤の変化が、invivo免疫原性に影響を与えるか否か、決定しようとするものであった。方法四種の免疫原性組成物を評価した1二つのN末端His残基を持つM72pH85ASA2二つのN末端His残基を持つM72pH85ASA3二つのN末端His残基を持つM72pH8ASA4二つのN末端His残基を持つM72pH75ASA。これら抗原を含有する組成物の免疫原性を、C57BL6マウスにおいて評価した。四種の各組成物について、30匹のC57BL6マウスに、50μLのアジュバント溶液中に1μgの抗原を用いて0、14及び28日目の3回、筋肉内に注射した。誘発されたM72特異的T細胞応答を、最後の免疫化の6日後に測定した。M72特異的細胞応答を決定するために、30匹マウス群から末梢血リンパ球を採血し、プールした。invitroで細胞を播種する前に、赤血球溶解を実施した。M72配列をカバーする重複ペプチドのプールを用いて、細胞をinvitroで再刺激した。培地中に残っている細胞を使用してバックグラウンド応答を決定した。ペプチドプールと一緒に2時間共培養した後に、ブレフェルジンAをウェルに添加し、細胞を4°Cで一晩貯蔵した。細胞を、その後以下のマーカーに対して染色したCD4、CD8、IL2、IFNγ及びTNFα。結果図11及び12内の各データポイントは、三次免疫の6日後の5匹のマウスに由来する末梢血リンパ球のプールの、バックグラウンドを減算したM72特異的CD4又はCD8T細胞応答をそれぞれ表している。応答は、M72ペプチドプールを用いた刺激に応答してIFNγ及び又はIL2及び又はTNFαを産生するCD4T細胞のパーセンテージとして表示されている。棒は、各群について応答の中央値を表している。図11及び12の結果は、各試験製剤を用いて3回免疫化した後に、同程度のCD4及びCD8T細胞応答が誘導されることを示している。したがって、本発明の免疫原性組成物中に存在する塩の量の減少は、誘導されるT細胞応答に障害をもたらさないと結論できる。実施例14pH61及び80でCaCl2又はMgSO4を含んだM72を含む組成物における塩析の検討M72抗原安定性に対する他の塩の影響を検討するために、溶液を、異なるpHレベルにおいて一連のCaCl2又はMgSO4濃度で調製した。目視検査を、安定性の示度として使用した。方法精製したバルク抗原を、指定量の塩を含有する異なる二種の緩衝液に100μgmLの濃度になるよう希釈した。サンプルは、調製後直ちに分析された。MettlerToledo導電率計及びシリコン処理していないガラスバイアル中の各サンプル6mLを使用して、導電率を決定した。結果結果は、Rv1196関連抗原を含有する溶液が、塩化ナトリウム以外の塩に対して感受性になり得ることを実証している。CaCl2又はMgSO4の影響は、同等の濃度又は導電率の塩化ナトリウムより顕著であるように見える。実施例15pH61、75及び85において異なる塩濃度を持つMtb72fを含む組成物における塩析の検討塩化ナトリウム濃度及びpHのMtb72f抗原安定性に対する影響を、サイズによる評価として検討した。方法精製したバルク抗原を、最終塩化ナトリウム濃度0、150及び450mMを含有する異なる三種の緩衝液中に100μgmLの濃度になるよう希釈した。サンプルを、分析の前に4°C又は25°Cで24時間貯蔵した。比濁法は、ThermoFischerScientificから市販されているNepheloskanAscentを使用して実施された。分析は、CorningIncから市販されている紫外線を透過するCostarマイクロプレート中で実施された。WyattInstruments製のDynaproPlateReaderを使用してDLSを実施した。機器を、レーザ波長830nm及び50mWの出力を使用して動作させた。散乱光を、150°で22°Cの温度で検出した。平均流体力学直径及び多分散性指数は、機器のソフトウェアで算出される。結果この実験の成果を、図13及び14に提示する。Mtb72fが、前の実施例に示されるM72と類似の方式で塩濃度及びpHに対して感受性であるという一般的な傾向を、DLS及び比濁法の両方が実証している。したがって、本発明の利点は、Rv1196配列自体だけでなくRv1196関連抗原にも適用される。いくつかのDLSサンプルにおいて、測定器は具体的な粒径を決定できなかった。実施例16M72と免疫賦活薬を含み、等張化剤としてソルビトールを使用している組成物における塩析の防止150mMNaClを含有する免疫原性組成物の安定性を、等張化剤としてソルビトールを使用している組成物と比較するために、サンプルを別のELISAを使用してモニタリングした。方法実施例7由来の適切なアジュバント製剤と併用したときにpH85が得られるような凍結乾燥ケーキを、実施例11に記載の通り調製した。上述の凍結乾燥ケーキを、実施例7において調製した625μLのアジュバント溶液を用いて再構成した。アジュバント溶液を用いる再構成によって、以下の免疫原性組成物が得られた二つのN末端His残基を持つM72ASApH8510μg抗原5wvスクロース40mMTris002wvTween80500μgDOPC125μgコレステロール25μg3DMPL25μgQS21150mMNaCl10mMリン酸塩pH85二つのN末端His残基を持つM72ASApH8510μg抗原5wvスクロース40mMTris002wvTween80500μgDOPC125μgコレステロール25μg3DMPL25μgQS215mMNaCl47wvソルビトール10mMリン酸塩pH85上述の再構成された免疫原性組成物は、30°Cで貯蔵された後に特徴付けられ、用時調製されたサンプルと比較された。抗原性を間接サンドイッチELISAによって定量化した。このELISAにおいて、抗原はM72特異的ウサギポリクローナル抗体に捕捉され、その後M72特異的マウスモノクローナル抗体によって示される。簡潔には、プレートを、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水に18000希釈した抗M72ウサギポリクローナル抗体を用いて4°Cで一晩コーティングし、4回洗浄した後、プレートを飽和緩衝液を用いて37°Cで1時間ブロッキングした。洗浄ステップの後、タンパク質標準、内部対照及びサンプルを、およそ025μgmLの濃度でプレートの第一列からウェルにロードし、次いでウェル1から12へと飽和緩衝液に2倍連続希釈を実施し、37°Cで1時間30分間インキュベートする。洗浄ステップの後、免疫複合体を、次いで飽和緩衝液に11000希釈した抗M72マウスモノクローナル抗体と一緒に37°Cで1時間インキュベートする。4回洗浄した後、ビオチン化ウサギ抗マウスポリクローナル抗体を、飽和緩衝液に11000希釈で添加した。4回洗浄した後、飽和緩衝液に14000希釈したストレプトアビジンホースラディッシュペルオキシダーゼを添加することによって、シグナルを増幅した。4回洗浄した後、室温で15分間、oフェニレンジアミン二塩酸塩によってシグナルを呈し、1MHClを添加することにより反応を停止させた。呈色は、結合している抗M72抗体の量に比例しており、490nm及び620nmで測定される。全ての洗浄ステップは、PBS、0025Tween20を使用して実施された。全ての測定値は、試験された製剤を調製するために使用した精製バルクタンパク質に基づいて期待される抗原性と比較して提示されている。結果結果を、図15に示す。ひし形は、三つの試験サンプル各々に固有の測定値を示しており、線は平均値を示している。抗原回収率は、pH85で、等張化剤としてソルビトールを使用している低塩組成物中に再構成した後、30°Cで最大24時間までほぼ安定している。24時間後のASAの回収率は、835であったが、24時間後のASAの回収率は545であった。要約すると、実施例8は、Rv1196関連抗原を含有する免疫原性組成物の安定性に対するpH及びNaCl濃度に起因する有害な影響を、初めて実証している。実施例14はこの研究を拡大して、他の塩にも、Rv1196関連抗原を含有する免疫原性組成物の安定性に対する有害な影響が有り得ることを示しており、実施例10、11、12、15及び16は、その効果が他の配列にも適用できることを実証している。非イオン性等張化剤を用いる免疫原性組成物の組成変更は、抗原安定性の問題を解決する。加えて、実施例3、4、13及び16は、実質的に全てのNaClを免疫原性製剤から除去すること及びNaClを等張化剤であるソルビトールと置きかえることが、T細胞応答の刺激に対して有害な影響を持たないことを実証している。免疫原性組成物の安定性は重要であり、冷凍が容易に利用できない遠隔地の場合は特に困難になる場合がある。免疫原性組成物中の塩の存在量を減少させることによって、本発明者らは、免疫原性組成物を貯蔵するときに観察される変化の程度を減少させることができた。本明細書及びそれに続く特許請求の範囲全体にわたって、文脈上別段の解釈を要する場合を除き、含むという単語、並びに含む及び含んでいるなどその変化形は、記載されている整数、ステップ、整数の群又はステップの群を包含するが、他のどんな整数、ステップ、整数の群又はステップの群も除外しないことを意味すると理解される。特許及び特許出願を含めて本明細書において引用される全ての文書は、その全体を参照により組み込む。