図6に示した配列において残基527から623の配列、および図28に示した配列アラインメントで同定された保存配列からなる群より選択されたアミノ酸配列を含むか、または前記選択されたアミノ酸配列から成る、単離されたポリペプチド。前記保存配列が以下の配列からなる群より選択される請求項1に記載の単離されたポリペプチド。QHSSDIKTLKNVEEGLLDLSGRLIDQKADLTKDIKNVEEGLLDLSGRLIDQKADIAKNQADIAQNQTDIQDLAAYNELQDQTEAIDALNKASSTAELGIAENKKDAQIAKAQANENKDGIAKNQADIQLHDKKITNLGILHSMVARAVGNNTQGVATNKADIAKNQADIANNIKNIYELANQADIANNINIYELA切断型UspA1タンパク質である請求項1または請求項2に記載の単離されたポリペプチド。CEACAM受容体に結合する請求項1から請求項3のいずれか1項に記載の単離されたペプチド。請求項1から請求項4のいずれか1項に記載のポリペプチドと、1以上の薬剤的に容認可能な補助剤、媒介物、賦形剤、結合剤、担体または防腐剤とを含む薬剤。感染症の治療または予防のための請求項5に記載の薬剤の使用。病気を引き起こす病原体の細胞標的化にCEACAM受容体が関与する病気の治療または予防のための請求項5に記載の薬剤の使用。感染症、呼吸器疾患、腫瘍性疾患およびその関連症状、血管新生、虫歯および歯茎疾患の治療または予防のための請求項7に記載の使用。前記感染症が粘膜の感染症、または粘膜を介して生じる感染症である請求項6から請求項8のいずれか1項に記載の使用。前記感染症がNeisseriameningitidis、HaemophilusinfluenzaeまたはMoraxellacatarrhalisにより引き起こされる感染症である請求項9に記載の使用。前記感染症がFusobacteriumnucleatumにより引き起こされる感染症である請求項9に記載の使用。中耳炎の予防または治療のための請求項5に記載の使用。治療薬として用いるための新たな阻害試薬の特定のためのスクリーニング法における請求項1から請求項4のいずれか1項に記載のポリペプチドの使用であって、前記ポリペプチドを擬態する能力について、または前記ポリペプチドとの相同性について、潜在的治療薬をスクリーニングすることを含む使用。請求項1から請求項4のいずれか1項に記載のポリペプチドと、1以上の薬剤的に容認可能な補助剤、媒介物、賦形剤、結合剤、担体または防腐剤とを含むワクチン。それを必要としている個体における感染症を治療または予防する方法であって、請求項5に記載の薬剤の有効量を投与することを含む方法。実質的に添付図面の図6を参照して明細書中で説明し、かつ前記図に示されたポリペプチド。請求項16のポリペプチドを含む、実質的に明細書中に記載された薬剤。病気を引き起こす病原体の細胞標的化にCEACAM受容体が関与する病気の治療または予防のための薬剤の製造におけるCEACAM受容体結合リガンドの使用であって、前記リガンドが、図6に示した配列において残基527から623の配列、および図28に示した配列アラインメントで同定された保存配列からなる群より選択されたアミノ酸配列、またはCEACAM受容体結合能を保持するそれらの断片もしくは機能的な等価体を含むか、またはこれらから成る使用。保存された配列が以下の配列からなる群より選択される請求項18に記載の使用。QHSSDIKTLKNVEEGLLDLSGRLIDQKADLTKDIKNVEEGLLDLSGRLIDQKADIAKNQADIAQNQTDIQDLAAYNELQDQTEAIDALNKASSTAELGIAENKKDAQIAKAQANENKDGIAKNQADIQLHDKKITNLGILHSMVARAVGNNTQGVATNKADIAKNQADIANNIKNIYELANQADIANNINIYELA前記病気が感染症、呼吸器疾患、腫瘍性疾患およびその関連症状、血管新生、虫歯および歯茎疾患から成る群より選択される請求項18または請求項19に記載の使用。前記病原体が粘膜に感染する、または粘膜を介して侵入する請求項18から請求項20のいずれか1項に記載の使用。前記病気を引き起こす病原体が、Neisseriameningitidis、Haemophilusinfluenzae、およびMoraxellacatarrhalisから成る群から選択される請求項18から請求項21のいずれか1項に記載の使用。前記病気を引き起こす病原体がFusobacteriumnucleatumである請求項18から請求項21のいずれか1項に記載の使用。前記病気が中耳炎である請求項22または請求項23に記載の使用。[実施例1]MoraxellacatarrhalisはUspA1タンパク質を介してヒトCEACAM1Fcに結合する。本実験に用いたMoraxellacatarrhalisは、AmericanTypeCultureCollectionから購入した参考株はもちろん、臨床分離株を含む。受容体オーバーレイ測定法により、MxはCEACAM1Fc受容体コンストラクトに結合すること示される。McatarrhalisとCEACAM1の相互作用を評価するため、細菌をニトロセルロースに塗布し、空気乾燥し3BSAPBSTにて非特異的な結合部位をブロッキングした。ニトロセルロース片を、CEACAM1Fcのみ、またはCEACAM1FcとCEACAM1Ndomain抗体YTH713で覆った。CD33Fcをネガティブコントロールとして用いた。キメラのタンパク質コンストラクトを以前に記述された方法11に従って作製した。キメラの受容体の結合を、西洋わさびペルオキシダーゼまたはアルカリフォスファターゼが融合したヤギの抗ヒトFc抗体によって検出した。ブロットは、ジアミノベンジデンと過酸化水素、またはニトロブルーテトラゾリウムと5ブロモ4クロロ3インドイルフォスフェートを、それぞれ基質に用いて現像した。Mxの全ての株においてCEACAM1Fcに結合したが、CD33Fcには結合しなかった図1。受容体の結合は、モノクローナル抗体YTH713の存在下で阻害され、これより菌株は受容体のN末端ドメインに結合することが示唆された。したがって、全ての株が等しく、CEACAM1のNドメインのみを含んだ切断型NFcコンストラクトによく結合するデータは示していない。McatarrhalisのCEACAM1Fc結合タンパク質の特定Mx約3x107のホールセルライセートを、前もって熱処理を行わないものと100°Cで10分間熱処理したものを、それぞれ10ビストリスポリアクリルアミドゲルの個々のレーンに供し、180Vで45分間電気泳動を行った。標準的なブロット条件により、ゲルからタンパク質をニトロセルロース膜に転写した。ニトロセルロース膜は上述したとおりの可溶性のキメラコンストラクトで覆った。それぞれの場合において、一つのタンパク質がCEACAM1Fcに特異的に結合する結果が得られた。ゲルにおけるタンパク質の移動度から、MxのUspA1タンパク質であることが示唆された。というのは、細菌のライセートを熱処理せずに泳動した場合、CEACAM1結合タンパク質は見かけの分子量が200kDa以上となり、ライセートをあらかじめ熱処理すると、CEACAM1結合タンパク質は分子量が約92kDaに小さくなったからである図2。UspA1に対する抗体はMxのCEACAM1Fc結合タンパク質に結合するが、類似タンパク質UspA2に対する抗体はそうならない。公表されているMcatarrhalisのUspA1の配列にしたがって、ペプチドを設計した。すなわち、ETNNRQDQKIDQLGYALKEQGQHFNNR、そしてKDEHDKLITANKTAIDANKASである。ペプチドは、組み込まれたN末端システイン残基を介してKLHに結合され、14日ごとにウサギに免疫した。このとき、初めにフロイント完全アジュバントにて行い、その後フロイント不完全アジュバントにて行った。免疫化0日目と、免疫化以降の14日ごとに、ウサギから採血した。ポリクローナル抗体を、対応するペプチドを結合させたAminoLinkPlusカラムを用いて精製した。UspA特異的抗体を110μgmlの濃度にてウエスタンブロットに用い、アルカリフォスファターゼが融合したヤギの抗ウサギ二次抗体にて検出した。ブロットは先に述べた方法により現像した。Mxの3株のSDSPAGEによるCEACAM1Fc結合タンパク質の移動度は、UspA1抗体の結合タンパク質と同じであったが、UspA2抗体の結合タンパク質とは異なった図3。CEACAM1Fcと共沈降するMcatarrhalisのリガンドはUspA1と特定された。一晩培養した細菌を、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含み、100mMオクチルβDグルコピラノサイドの入ったPBSBに懸濁した。サンプルは4°Cで一晩回転させて混合した。その間、100μlのプロテインAが結合したセファロースCL4Bを、20μgのCEACAM1FcまたはCD33Fcコントロールとともに、4°Cで一晩インキュベートし、その後PBSBにて3度洗浄して結合しなかった受容体を除いた。細菌の不溶性物質は、15000gで30分間遠心分離することで除いた。可溶性抽出物は、それぞれの受容体プロテインAセファロース複合体と4°Cで2時間インキュベートした。50mMオクチルβDグルコピラノサイドとPBSBにより十分に洗浄した後、変性条件下でのSDSPAGE電気泳動とウエスタンブロッティングにより分析した。CEACAM1Fcとの共沈降実験において、MX4では約97kDaのタンパク質が強く染色され、MX3では約92kDaのタンパク質が相対的に弱く染色された。共沈降されたタンパク質の分子量は、受容体オーバーレイ実験図3でみられたそれに対応した。CD33Fcによって共沈降したタンパク質はなかった。共沈降したタンパク質はさらに、抗UspA1ペプチド抗体に結合したことから、UspA1と特定された。加えて、ゲルから切断して、MX4のタンパク質をMALDITOF質量分析に供した以降参照。MALDITOF質量分析によるCEACAM1リガンドの特定ウエスタンオーバーレイサンプル。MX2とMX3のホールセルライセートをトレンチゲルのSDSPAGEに供し、CEACAM1Fc結合リガンドに対応するタンパク質バンドをゲルから電気溶出した。サンプルを濃縮し、2つめのゲルの1レーンに移し電気泳動を行った後、タンパク質のゲル内トリプシン消化を行った。生成したペプチドをMALDITOF質量分析によって分析した。MX2のCEACAM結合タンパク質のマススペクトルの1例を示した図4a。得られたペプチド分子量をProFoundタンパク質特定サイトに入力し、このタンパク質に対する結果を得た。この場合、10個のペプチドの分子量が、McatarrhalisのUspA1のトリプシン処理による予想されるペプチドの分子量と一致し、それはタンパク質の約18に及んだ図4d。234というZスコアの推定値は、UspA1であることを強く示唆する165より大きいZスコアは、95以上である。http1298519192profoundbinwebProFoundexe。加えて、その他のMX2の非結合性の高分子量のバンドは、同様の分析によりUspA2と特定された。MX3も同様にし、CEACAM1結合、非結合タンパク質は、それぞれUspA1とUspA2と特定された。共沈降サンプル:MX4においてもまた、CEACAM1Fc共沈降タンパク質上述のとおりはMALDITOFMSにより全分類検索においてZスコア227を示して、UspA1と特定された。それゆえ、本研究において、Moraxellacatarrhalisは、記述したような参考株と臨床株において、高分子量タンパク質UspA1を介してヒトのCEACAM1を標的とすることを特定した。UspA1の酵素分解と組み替えペプチドUspA1のトリプシン処理ペプチドはCEACAM1Fcに結合する。MX2細菌懸濁液を011mgmlの濃度のトリプシンにて処理し、37°Cで14時間インキュベートした。分解したライセートをSDSPAGE緩衝液にて分離し、煮沸し電気泳動した。ニトロセルロースに転写した後、ブロットを受容体コンストラクトCEACAM1Fcで、またはアフィニティ精製した抗UspA1ペプチド抗体で覆った。受容体と反応した小断片は抗UspA1特異抗体とも結合した図5。McatarrhalisMX2株のUspA1のCEACAM結合ドメインの位置MX2細菌懸濁液を1mgmlのトリプシンにて37°Cで10分間処理した。トリプシン処理したサンプルをSDSPAGEゲルで泳動した。染色後、50kDaの領域を一晩電気溶出した。電気溶出したタンパク質を凍結乾燥し緩衝液に再懸濁し、二つ目のゲルに供した。ゲルの一部をニトロセルロースにブロットし、CEACAMと反応するペプチドをCEACAM1Fcを用いたウエスタンブロッティングにて特定した図7。約50kDaと約150kDaに相当するペプチドバンドをN末端配列決定に供した。N末端の配列はALESNVEEGLとALESNVであった。150kDaのタンパク質は、同じN末端配列を有すことから、おそらく50kDaのタンパク質の三量体と考えられた。MX2のUspA1のこのペプチドのN末端配列は図8に示した。組み換えペプチド図6に示した配列の残基1から449のアミノ酸配列を含むよう構築されたN末端組み換えMX2ペプチドはCEACAMに結合しない。このことはさらに、図8に示した残基463から863のアミノ酸配列を含み、N末端配列がALESNVEEGLである約50kDaのトリプシン処理ぺプチドがCEACAM結合ドメインを含むことを意味する。[実施例2]粘膜性病原体の多重病原性の決定因子における受容体結合ドメインの特定NmeningitidisとHinfluenzaはリガンドを介してヒトのCEACAM分子をターゲッティングするが、CEACAMのオーバーラップする配列に対して結合する。本発明のMxリガンドもまたNドメインをターゲッティングする。これらの発見は、いくつかの粘膜性病原体のリガンドにおいて同様な特徴が、受容体のターゲッティングに関与するという刺激的な可能性を指し示す。NmとHiのCEACAMとの相互作用は表面に発現する可変ドメインの構造的特徴に影響されることから、それらが空間的形状にとって決定的な同様のアミノ酸配列を含み、受容体に結合可能となり、それらがその他の可変性タンパク質に保存されていることが示唆される。たしかに我々や我々以外の研究から、Opaの2つの高度可変性ループがCEACAMのターゲッティングに関与することが示唆されている918。リガンドと受容体間の相互作用の考えられる決定因子を特定できる力強い技術のひとつに、アプタマーリガンド結合を阻害する本来の構造により強く関連した配列20はもちろんミモトープ結合ドメインを擬態するランダムな配列19を特定可能なファージディスプレイ法がある。また、CEACAMsに結合するMxリガンドのドメインがその他のCEACAM結合する粘膜性病原体を擬態し、このリガンドの構造的特徴が、NmとHiのリガンドのCEACAMのNドメインターゲッティングに必要な顕著な特徴を特定するために役立つようになることが、本発明により現実的なものとなる可能性が高い。Mxドメインに対する抗体は、受容体の同一、同様または近い位置の領域をターゲッティングできるようなその他のリガンドを特定できる可能性を秘めている。MX2のUspA1の最小限のCEACAM1結合ドメインの特定は既知のタンパク質工学と組み替えDNA技術を用いて行われている。組み換えペプチドは、受容体に結合するMX2のドメインを特定するような上述した受容体オーバーレイ法によってinvitroで検索することが可能である。Hisタグ付加ペプチドはニッケルカラムにより分離可能であり、Hisタグは必要に応じて切り離しでき、さらなる研究のための抗体を得る目的でウサギやマウスを免疫化することに用いられる。生物学的用途のためのペプチドの最適な長さは、受容体結合の抑制といった機能のほかに、免疫学的刺激特性の試験により決定される。[実施例3]リガンドとの相互作用に必要な受容体の顕著な特徴CEACAMのNドメインはOpaタンパク質との相互作用を行うのに十分であるため、本発明者らはCEACAMのNドメインの接着性のエピトープをさらに調べるためファージディスプレイ法を用いている。本発明者らにより研究された受容体のアラニンスキャニング突然変異誘発により得られた、受容体におけるリガンド結合領域の知識は、本研究を後押しした。この場合においてもまた、リガンドオーバーレイ法が、受容体配列をもつキメラファージのバイオパニングに用いることが可能である。受容体の相同体は、生産するOpaの型とは無関係に多数の種を抑制する可能性を秘めている。というのは、我々の研究から、病原体の違いに関わらず、異なるOpaタンパク質が初期の接着において受容体の共通した特徴を必要とすることがすでにわかっているためである9。CEA抗原が腸粘膜から放出され、CEACAMsを標的とすることで知られるEcoliの接着を阻害するということはまた興味深い。これは、生得免疫と腸内病原体が対抗する機構と提案されている12。このように、これらの受容体相同体は治療薬として機能する。[実施例4]組み換えCEACAM結合MoraxellacatarrhalisUspA1ペプチドの生産概要UspAの全長に沿ったいくつかの断片のPCR増幅は、図9に示したプライマーを用いて行った。組み換えタンパク質を後述する方法にて得た。一巡目にて、CEACAM1に結合する組み換えペプチドは、プライマーP4とP8にて増幅されたDNAにコードされ、P1とP5間の領域にはコードされないことがわかった。そのうえ、組み換えP4P7はCEACAMに結合するがP6P8は結合しなかった。追加のプライマーをP4とP7の領域に用いた。領域D7はCEACAM結合能を保持した。断片47の配列を図10に示した。組み換えUspA1ペプチドの一般的クローニング、発現、精製方法UspA1断片15はpBADシステムを用いて作製した。必要なPCR産物をpBADベクターにTAクローニングし、EcoliのTOP10株にて増幅した。残りの手順は、pBADをアラビノースにより誘導する例外を除いて、図11に示した。断片47は、pBADとpQE30図11システムの両方をもちいて作製し、同様にCEACAM結合能をもつ産物を得た。残りの断片は図11に示した方法を用いて作製した。ベクターとpQE30発現システムベクターpQE30図12を、EcoliM15株と組み合わせて用いた。M15はpQE30に組み込まれたDNAの転写を制限するリプレッサーをコードするpREP4プラスミドを保持している。1mMのIPTGの添加にて、このリプレッサーの発現が抑えられ、そのためpQE30内のクローン化した断片の転写が行われる。クローニング方法まず、PCRアンプライマーをpCR21に組み込んだ。これにより、制限酵素による切断によりアンプライマーが復帰するような、安定したホストが得られ、遺伝子断片の両端が切断されることを保証する。pQE30を同様に切断しゲル精製により回収し、これにより制限酵素サイトの両方が切断されたこともまた保証された。切断したpQE30とUspA1アンプライマーをT4DNAリガーゼで、16°Cで一晩結合させ、CaCl2コンピテントEcoliM15に形質転換した。形質転換体をアンピシリンとカナマイシンを添加したLB寒天培地にて選択した。48コロニーをひろい、抗生物質を含んだLB培地にて生育した。34mlの培養液の細菌を遠心分離により回収しアルカリ溶解ミニプレップ法に供した。精製したベクターを上記方法にて切断しuspA1が組み込まれていることを確認した。正しいサイズの挿入部位を含むpQE30をもった細菌を50ml培養液にて生育し、IPTGにより誘導をおこなった下記参照。そして、ウエスタンブロッティングにより組み替えタンパク質の生産を調べた。加えて、挿入部位がDNAの正しい領域であることの決定と何らかの配列エラーがないかを調べるため、ベクターの列決定を行った。発現と精製pQE30uspA1コンストラクトを持つM15をLB培地にてOD60005になるまで振盪し、その後1mMになるようIPTGを加えた。培養液をさらに34時間インキュベートし、細菌を遠心分離により回収した。細菌のペレットを緩衝液Bにて13時間可溶化し、膜画分を20000gで20分遠心分離することで除いた。上清をニッケルレジンと、ロータリーミキサーにて12時間インキュベートし、ポリプロピレンカラムに通した。保持されたレジンを510mlの緩衝液Bにて洗浄し、結合タンパク質を100mMイミダゾールを加えた緩衝液B05mlにて溶出した。溶出タンパク質は、SDSPAGEにて確認した後、透析にて尿素やその他の塩を除いた。組み換え断片A断片15と18。pBADシステムで作製したこれらの断片は、CEACAM1に対して、15は結合しなかったが、48は結合した。BpQE30システムを用いて作製した、断片48、48T、47、68。断片48は、rUspA1の最初に作製した断片であり、ブロットオーバーレイ法により高い親和性にてCEACAM1に結合することがわかった。全長の48rUspA1ペプチドに加えて、より小さい切断型のタンパク質がみつかった。このペプチド4Tと命名もまた、CEACAM1に結合し48より低いレベルで発現するようであった図13。pQE304Tの配列分析から、ミスマッチCAAからTAAにより、Q624残基の位置に停止コドンが入っていることがわかった図10参照。ペプチド47と68は、68に二つ目のCEACAM結合サイトが生じているという可能性を排除するために作製した。4Tペプチドから予想されたように、47はCEACAM結合を示したが図13、68はしめさなかった図14。CpQE30システムを用いて作製した、断片D8、D7。rUspA1のD8図15とD7データは図示せずの両断片ともCEACAM1結合を示した。組み換えペプチド47の生物学的活性McatarrhalisのMX1株と、HinfluenzaのRd株は、CEACAM1を形質転換したチャイニーズハムスターの卵巣細胞に結合する。それらの結合は、McatarrhalisのUspA1組み換えペプチド47により阻害されたが、コントロールペプチドには阻害されなかった図17。さらなる実験から、組み換えペプチドD7が、同種、異種両方の細菌のCEACAM1を発現する形質転換CHO細胞への結合を阻害することがわかったしかし、組み替え68、すなわちMX2のUspA1のE659K863残基は阻害しなかった図23。ペプチドを含まないカラム1、コントロールペプチド2μgml、カラム2、D72μgml、カラム3による前培養の後、細菌を加え1時間培養後、非接着の細菌を洗浄にて除いた。そして、細胞と相互作用した細菌を個々の種に対する抗血清とローダミン融合型二次抗体にて検出した。MxMorazellacatarrhalis、NmNeisseriameningitidis、HiHaemophilusinfluenzae[実施例5]CEACAM1結合ペプチドの特徴決定ペプチドD7が最も結合力のある組み換えペプチドであることがわかった。それゆえ、MX2の領域D7にCEACAM1結合情報が含まれる。切断型ペプチド4Tは弱い結合を保持する図13。それゆえ領域DTはCEACAM1結合能の領域が含まれる。D7におけるK560Iの1アミノ酸置換によりCEACAM1結合がほとんど消失することがわかった。ペプチドD8の571632領域が欠失したペプチドD8Δは、CEACAM1に結合できなかった。DT領域にまたがる線状にオーバーラップするペプチド図19を作成し、CEACAM1への結合能を調べた。どれもCEACAM1に結合しなかった。円偏光二色性分光法ペプチドD7と変異型D7を円偏光二色性分光法にて分析した。円偏光二色性スペクトルは、室温にてJobinYvonCD6spectropolarimeterにて得た。01mgmlの組み換えD7とD7のスペクトルを石英キュベットにて測定した。全てのスペクトルはタンパク質の入ってない緩衝液のスペクトルを減算した8回のスキャンの平均であり、Excelにてプロットした。得られたスペクトルから、D7はαへリックス構造をもち、D7はランダムコイル構造をとることがわかった図18。何らかの特別な理論により結合することを考えないとすると、MxのUspA1のCEACAM1結合には、αへリックスベースの構造、特にコイルドコイル構造が必要とされることが提案される。概要上述した結果から、発明者らはMxのUspA1のCEACAM1結合は、αへリックスベースの構造、特にコイルドコイル構造に加えて、D7の領域が必要であると結論した。MxのUspA1のCEACAM1結合ドメインがαへリックスベースの高次構造をとり、それが受容体結合に必要であるという発見は、非常に興味深い。Opaタンパク質は、異なった表面露出のループ構造に生じるCEACAM結合ドメインの提示の慎重な認識を必要とする。本発見からD7が自発的にリフォールディングを行い、CEACAM結合能を持つことが示唆される。D7において、コイルド構造は球状のサブユニット構造をもちCEACAM1結合のために適切な高次構造を維持している。D7ペプチドのこの有利な特徴は、ペプチド、その誘導体、相同体、または断片が、サブユニットワクチンとしての特別な有用性、または治療上の特別な有用性を持ちうる。必要とされるαへリックスベースの高次構造を持つD7ペプチドの誘導体は、円偏光二色性分光法での固有な指紋スペクトルにて特定できるであろう。[実施例6]配列分析Mx10株UspA1タンパク質のアミノ酸配列のD7領域のアラインメントを図20に示した。10株のうち6株が配列決定した領域全体で同一であった。株MX3とMX4では、D7領域のわかりうる配列全体にわたって100同一であり、全体の同一性はそれぞれ9085と8803である。ここにおいて、決定されていなかったMX3とMX4のN末端のそれぞれ13と17アミノ酸を含めて評価している。残りのTTA37とO35Eの2種は図20に示すとおり、DT領域に欠失がある。D7において欠落を含んだ全体の同一性がそれぞれ704と50である。手作業で並べて比べると、TTA37は残りの領域の100アミノ酸で同一であり、O35Eは72アミノ酸中71アミノ酸が同一である図21。O35EはCEACAM1に結合しないことがわかっている。TTA37はその確認をすることができない。[実施例7]D7の接着阻害能結果Mx、Nm、Ng、Hiの同種と異種に対する抗接着薬剤としてのD7の可能性を、可溶性の受容体を用いて最初に試験した。CEACAM1FcをD7とプレインキュベートし、ニトロセルロースに転写した2種のMxのホールセルライセートに反応させた。組み換えD7は、異種株MX1と同種株MX2に対するCC1Fcの結合を濃度依存的に特異的に阻害した図24a。阻害は有意で001μgml以上にてプラトーに達した。CEACAM1に結合しないことがわかった実施例5コントロールペプチドD8Δではそのような阻害は見られなかった。そのうえ、多数の細菌種に対する阻害効果もわかった。用いた株の大多数が世界中からの臨床分離株である方法参照。有意で特異的な阻害が、D7ではみられたがD8Δではみられなかった図24b。そしてD7の遮断効果をC、EACAM1を形質移入したチャイニーズハムスターの卵巣細胞を用いて調べた。可溶性受容体と同様に、Mx、Nm、Hi、のCHOCEACAM1細胞に対する結合の阻害がD7とのプレインキュベーションを行うことでみられたが、コントロールペプチドとのインキュベーションの場合にはみられなかった図25ab。細菌のCHOCEACAM1細胞に対する結合の阻害は濃度依存的であり、MxとHiでは01μgml以上、Nmでは02μgml以上にて有意であった図25b。ほぼ完全な細菌のCHOCEACAM1細胞に対する結合の抑止が、約2μgmlの濃度にて得られた図25ab。得られた阻害の度合いから、仮に本実験で用いた細菌のCEACAM相互作用の特異性が、NmMxHiであることが示唆される。CEACAM1に加えて、Nmeningitidisは、上皮のCEAやCEACAM6を含む、その他のヒトCEACAMファミリーのメンバーを標的化することがわかっている9。これは、CEACAM1を優先してターゲッティングする傾向のあるいくつかのMx株やHi株においても同じであるデータは示していない。D7とのプレインキュベーションを行った場合、CEACAM1、6そしてCEAを発現する形質転換HeLa細胞に対するNmの結合の阻害が確認された。D7の有効性をさらにHeLaCC1Hを用いて調べた。HeLaCC1Hは、高いレベルでCEACAM1を発現する細胞株で、invivoの上皮細胞の炎症状態をある程度擬態できる。高い受容体の密度により、カプセルの存在にも関わらず、Opaを発現する細菌は標的細胞に接着できる7。それゆえ、このモデルにより、invivoでカプセルに覆われピリ繊毛をもち外膜タンパク質のOpcはもちろんOpaを発現するといった表現型を示すNmを用いることもできる1525。まず、h1818由来のOpa欠損株のHeLaCC1H結合を調べたところ、相対的に低い1細胞当り1020細菌ことがわかり、この結合はピリ繊毛の発現のおかげであった。予想通り、h1818のHeLaCC1H結合は非常に強まり1細胞当り100150細菌、D7を事前に、もしくは常に処理すると、ピリ繊毛の寄与にも関わらず、h1818の細胞接着は非常に減少した図25d。それに加え、D7をCEACAMsを発現することで知られる26ヒト肺上皮細胞株A549において調べた。この細胞はその他のMxリガンドの受容体も発現する27ことから選択した。D7の細菌の減少の効果を調べた。D8Δではなく、D7存在下において、Nm、HiとA549細胞の相互作用の劇的な減少がみられた図25e。結合の減少は、Mx種においてもみられ、比較して相対的に低いものの、有意であった図25e。方法細菌分離株と培養MxとNmは10の加熱したウマ血液を添加したBHI寒天上にて培養し、一方HiはLevinthalbase添加のブレインハートインフュージョン寒天上にて培養した。Ng種はGC寒天にて培養した。全ての細菌は、CO2インキュベーターにて37°Cで16時間以上培養した。Mx種は、中耳炎とCOPDの症例から得た臨床分離株といくつかの国からの代表的な分離株であった。Eagen、c1、f1はそれぞれb、c、f型のカプセルを持ったHiの株で、Rdはd型由来のカプセルのない株である。A930065とNT1株はNTHiである。A3、F2087、F3035、F1947株は、Hi生物群のアエジプチウス分離株である。Nm分離株C751A、C751B、C751Dは血清型AのC751株の異なる3種のOpaを発現する分離株である。その他の分離株は続く血清型であるPMC17、C311とMC58、C114、PMC2、PMC4、PMC10。Ng分離株P913、16、35はP9の株内のOpa変異株であり、その他の臨床分離株は世界各国から集めた。本実験で用いた大多数の株は、以前に記述している102628。抗体抗ポリヒスチジンのマウスモノクローナル抗体はQiagenから購入し02μgmlで用いた。Mx、Nm、Hiに対するポリクローナル抗血清は標準的プロトコールに沿って多数の種のホールセルライセートを抗原として用いて、ウサギで産生した。本実験にて用いた抗UspA1抗体は実施例1と参考文献26に示したとおりである。D7に対するポリクローナル抗血清はNiNTAレジンQiagen一回の免疫化当りペプチド100200μgに結合させたペプチドにより免疫化することで作製した。補体は56°Cで30分間抗血清を熱処理することにより不活性化した。抗D7抗体はペプチドD7を結合させたAminoLinkPlusカラムにて、製品プロトコールに従ってアフィニティー精製した。可溶性受容体コンストラクトと細胞株本実験で用いた可溶性CEACAMFcとCEACAM1を形質転換したCHO細胞は以前に記述されている119。一連のCEACAM分子を発現するHeLa細胞はWolfgangZimmerman教授とScottGrayOwen博士からいただき、10ウシ胎児血清を含むRPMI1640にて培養した。A549ヒト肺癌細胞は10FCSを含むF12Ham培地にて培養した。CEACAMを高いレベルで発現するHeLa細胞は、TetOn遺伝子発現システムにて作製した。ceacam1遺伝子はpTRE2hyg応答プラスミドに組み込み、制御遺伝子をもったHeLa細胞にFugene6を用いて形質転換した。形質転換体を400μgmlのハイグロマイシンを用いて選択した。CEACAM発現を行うそれらの形質転換体を、FACSと限界希釈にて選択した。025μgmlドキシサイクリン下のHeLaCC1Hクローンが最も高い受容体発現を示した。受容体オーバーレイ法これらの実験は以前に記述された方法9をもとに以下に示す変更を加えて行った。阻害実験のためにCEACAM1FcをD7またはコントロールペプチドと室温で1時間プレインキュベートした。続いてブロットにCEACAM1Fcを単独、または記述したペプチドとCEACAM1Fcをプレインキュベートして反応させた。または、ブロットを精製したウサギの抗D7抗体で1時間反応させた後、受容体を反応させた。いずれの場合も、受容体結合の度合いをNIHScionImageプログラムを用いた濃度分析にて検出した。ペプチドD7による、細菌のCEACAM発現細胞への接着の阻害集密的な一層の細胞を、2ウシ胎児血清を添加した199培地にて、ペプチドD7またはコントロールペプチド存在下、3060分間37°Cで前培養した。一層の細胞は続くペプチドとのプレインキュベーションにて細胞に有害な影響が生じないことを確認した。続いて、一層の細胞を、2ウシ胎児血清を添加した199培地にて、細胞当り約100200の割合の細菌を添加して37°Cで1時間インキュベートした。非接着の細胞を199培地で4回洗浄して除き、一層の細胞を免疫蛍光検出または、1サポニンにて溶解し以前に記述されたとおり25に細菌を希釈してプレートアウトしてコロニー形成ユニットを検出した。免疫蛍光検出には、細胞を無水メタノールにて10分間固定し、1ウシ血清アルブミン、005Tweenを含むPBSにて1時間洗浄とブロッキングを行った。接着した細菌は、抗細菌抗血清とローダミン融合二次抗体にて検出した。HeLaCEACAM発現細胞に接着した細胞の数はオリンパスIX70顕微鏡を拡大率400倍にて直接カウントした。重複した実験からランダムに選んだ20細胞に接着した細菌を数えた後、平均値を求めた。HeLaCC1Hへの細菌の接着は上述したcfu分析にて検出した。[実施例8]抗D7抗体がMxCEACAM1相互作用を阻害する結果D7に対するウサギ抗血清は、ホールセルライセートのウエスタンブロットオーバーレイにて、いくつかのMx株のUspA1に交差反応する抗体を含んでいたデータは示していない。アフィニティー精製した抗体を用いたウエスタンブロッティングから、抗D7はNmのOpaもしくはHiのP5に結合しないことがわかったデータは示していない。一連のMx株のホールセルライセートと抗D7をインキュベートした後、CC1Fcを反応させると、大多数の株で受容体結合に80を超える顕著な阻害が起こった図26。しかしながら、同様の実験でHi、Nm、Ng株では低いレベルの阻害しかみられなかった。このようにD7に対する抗体はMx感染に対する作用をもつ一方、D7は幅広いCEACAM標的細菌に対してより一般的な抗細菌ペプチドとなりうる。[実施例9]ペプチドD7による、CEACAM発現ヒト内皮細胞への細菌接着の阻害内皮細胞におけるD7の効果を評価するため、集密した一層のHMEC1細胞を用いた。ヒト毛細血管内皮細胞をD7または組み換えコントロール分子にて60分間プレインキュベートした。細菌NmeningitidisのOpaD発現分離株を細胞当り細菌100個の感染の割合で加え37°Cで1時間培養した。その後、非接着の細菌を洗浄にて除き、一層の細胞をメタノールにて室温10分間固定した。接着した細菌はNmeningitidisに対するウサギポリクローナル抗血清と、それに続く抗ウサギTRITC融合二次抗体により検出した。大部分の内皮細胞はペプチドがない場合、接着する細菌は細胞当り30以上であった。コントロールペプチド存在下では、細菌結合の阻害はまったくみられなかった。しかしながら、D7存在下では、時折12個の細菌が結合した細胞があるものの、実質結合は抑止された。このように、D7は上皮細胞のみでなく内皮細胞に対してもNmeningitidisの接着を仲介するOpaCEACAMを阻害することができる。[実施例10]既知のUspA1タンパク質配列の中の断片4T配列の保存性すべての全長タンパク質の配列でマルチプルアラインメントを行い、その他の株の対応する断片を特定したこれらの断片のマルチプルアラインメントは図28に示してある。同一性のパーセンテージは以下に示す。領域D7に関して実施例6で示したとおり、上記の結果から、領域4Tは異なる種間で高い保存性があり、O35Eを除いて、調べた全ての株において95以上の配列同一性であることがわかった。以前に述べたように、O35EはCEACAMに結合しない。従って、図28に示したような配列4Tの保存領域を含むか、または前記保存領域から成るペプチドは、病気、特にCEACAM受容体が関係する病気の治療または予防への使用という本発明において望ましいペプチドである。[参考文献]1CartwrightKetal1995InMeningococcalDiseaseJohnWileySons2vanAlphenLvanHamSM1994RevMedMicrobiol52453FoxwellARetal1998MicrobiolMolBiolRev622944vanAlphenLetal1995AmJRespirCritCareMed15120945KaralusRetal2000MicrobesInfection256KraftM2000ClinChestMed213017VirjiMetal1996MolMicrobiol229298VirjiMetal1996MolMicrobiol229419VirjiMetal1999MolMicrobiol3453810VirjiMetal2000MolMicrobiol3678411HillDetal2001MolMicrobiol3985012HammarstroemS1999CancerBiol96713StephensDS1989ClinMicrobiolRev2S10414VirjiMetal1991MolMicrobiol5183115AchtmanM1995TrendsMicrobiol318616MerzAJSoM2000AnnuRevCellDevBiol1642317WoodsJPCannonJG1990InfectImmun5856918WangLFYuM1996InMethodsMolBiol66269HumanaPress19ColmanLerner2000TrendsGuidep5620BeaucheminNetal1999ExpCellRes25224324921BoultonICGrayOwenSD2002NatImmunol32293622ChenTetal2001JLeukocBiol703354023LafontaineERetal2000JBacteriol1821364137324VirjiM2001TrendsinMicrobiology925825925VirjiMetal1995MolMicrobiol1874175426HillDJVirjiM2003MolMicrobiol4811712927HolmMMetal2004InfectImmun721906191328VirjiMetal1990MicrobPathog944145029LangermannSetal1997Science27660761130OfekIetal2003FEMSImmunolMedMicrobiol3818119131SimonPMetal1997InfectImmun6575075732IdanpaanHeikkiliIetal1997JInfectDis17670471233KellyGCetal1999NatBiotechnol17424734GanBSetal2002JInfectDis1851369137235ReidGBurtonJ2002MicrobesInfect431932436PinyonRAetal2004JInfectDis1891547155537ReidGetal2001TrendsMicrobiol942442838TolemanMetal2002CellMicrobiol3334439BudtMetal2002BiolChem383803812