Lチロシンを生産する代謝経路を有するイソキノリンアルカロイド非生産性細胞に、チロシナーゼまたはチロシナーゼおよびそのアダプタータンパク質、LDOPA特異的デカルボキシラーゼ、モノアミンオキシダーゼ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6Oメチルトランスフェラーゼ、コクラウリンNメチルトランスフェラーゼならびに3ヒドロキシNメチルコクラウリン4Oメチルトランスフェラーゼからなる群より選択される少なくとも1つのタンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子が導入されてなる、チロシナーゼまたはチロシナーゼおよびそのアダプタータンパク質、LDOPA特異的デカルボキシラーゼ、モノアミンオキシダーゼ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6Oメチルトランスフェラーゼ、コクラウリンNメチルトランスフェラーゼならびに3ヒドロキシNメチルコクラウリン4Oメチルトランスフェラーゼを発現する組換え宿主細胞を提供する工程、および該組換え宿主細胞を、炭素源としてグルコース、フルクトース、ガラクトース、スクロース、ラクトースおよびマルトースからなる群より選択される1種以上の糖および/またはグリセロールを含む培地において培養する工程、を含む、レチクリンを生産する方法。組換え宿主細胞が、tyrR遺伝子を有しないかまたはその機能が欠損しているものである、請求項1に記載の方法。組換え宿主細胞が、さらにフィードバック阻害耐性の3デオキシDアラビノヘプツロソン酸7リン酸シンターゼおよび/またはフィードバック阻害耐性のコリスミ酸ムターゼプレフェナートデヒドロゲナーゼを発現するものである、請求項1または2に記載の方法。組換え宿主細胞が、さらにトランスケトラーゼおよび/またはホスホエノールピルビン酸シンテターゼを過剰発現するものである、請求項1~3のいずれかに記載の方法。Lチロシンを生産する代謝経路を有するイソキノリンアルカロイド非生産性細胞に、フィードバック阻害耐性の3デオキシDアラビノヘプツロソン酸7リン酸シンターゼ、フィードバック阻害耐性のコリスミ酸ムターゼプレフェナートデヒドロゲナーゼ、トランスケトラーゼ、ホスホエノールピルビン酸シンテターゼ、チロシナーゼまたはチロシナーゼおよびそのアダプタータンパク質、LDOPA特異的デカルボキシラーゼ、モノアミンオキシダーゼ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6Oメチルトランスフェラーゼ、コクラウリンNメチルトランスフェラーゼならびに3ヒドロキシNメチルコクラウリン4Oメチルトランスフェラーゼからなる群より選択される少なくとも1つのタンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子が導入されてなる組換え宿主細胞であって、フィードバック阻害耐性の3デオキシDアラビノヘプツロソン酸7リン酸シンターゼ、フィードバック阻害耐性のコリスミ酸ムターゼプレフェナートデヒドロゲナーゼ、トランスケトラーゼ、ホスホエノールピルビン酸シンテターゼ、チロシナーゼまたはチロシナーゼおよびそのアダプタータンパク質、LDOPA特異的デカルボキシラーゼ、モノアミンオキシダーゼ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6Oメチルトランスフェラーゼ、コクラウリンNメチルトランスフェラーゼならびに3ヒドロキシNメチルコクラウリン4Oメチルトランスフェラーゼを発現し、かつ、tyrR遺伝子を有しないかまたはその機能が欠損している組換え宿主細胞を提供する工程、および該組換え宿主細胞を、炭素源としてグルコース、フルクトース、ガラクトース、スクロース、ラクトースおよびマルトースからなる群より選択される1種以上の糖および/またはグリセロールを含む培地において培養する工程、を含む、レチクリンを生産する方法。得られるレチクリンが、実質的にレチクリンを含まないものであることを特徴とする、請求項1~5のいずれかに記載の方法。イソキノリンアルカロイド非生産性細胞が、大腸菌、酵母、枯草菌および糸状菌からなる群より選択される、請求項1~6のいずれかに記載の方法。組換え宿主細胞に、LDOPA特異的デカルボキシラーゼ以外の芳香族Lアミノ酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子が導入されていないことを特徴とする、請求項1~7のいずれかに記載の方法。Lチロシンを生産する代謝経路を有するイソキノリンアルカロイド非生産性細胞に、チロシナーゼまたはチロシナーゼおよびそのアダプタータンパク質、LDOPA特異的デカルボキシラーゼ、モノアミンオキシダーゼ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6Oメチルトランスフェラーゼ、コクラウリンNメチルトランスフェラーゼならびに3ヒドロキシNメチルコクラウリン4Oメチルトランスフェラーゼからなる群より選択される少なくとも1つのタンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子が導入されてなる、チロシナーゼまたはチロシナーゼおよびそのアダプタータンパク質、LDOPA特異的デカルボキシラーゼ、モノアミンオキシダーゼ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6Oメチルトランスフェラーゼ、コクラウリンNメチルトランスフェラーゼならびに3ヒドロキシNメチルコクラウリン4Oメチルトランスフェラーゼを発現する組換え宿主細胞。tyrR遺伝子を有しないかまたはその機能が欠損しているものである、請求項9に記載の組換え宿主細胞。さらにフィードバック阻害耐性の3デオキシDアラビノヘプツロソン酸7リン酸シンターゼおよび/またはフィードバック阻害耐性のコリスミ酸ムターゼプレフェナートデヒドロゲナーゼを発現するものである、請求項9または10に記載の組換え宿主細胞。さらにトランスケトラーゼおよび/またはホスホエノールピルビン酸シンテターゼを過剰発現するものである、請求項9~11のいずれかに記載の組換え宿主細胞。Lチロシンを生産する代謝経路を有するイソキノリンアルカロイド非生産性細胞に、フィードバック阻害耐性の3デオキシDアラビノヘプツロソン酸7リン酸シンターゼ、フィードバック阻害耐性のコリスミ酸ムターゼプレフェナートデヒドロゲナーゼ、トランスケトラーゼ、ホスホエノールピルビン酸シンテターゼ、チロシナーゼまたはチロシナーゼおよびそのアダプタータンパク質、LDOPA特異的デカルボキシラーゼ、モノアミンオキシダーゼ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6Oメチルトランスフェラーゼ、コクラウリンNメチルトランスフェラーゼならびに3ヒドロキシNメチルコクラウリン4Oメチルトランスフェラーゼからなる群より選択される少なくとも1つのタンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子が導入されてなる組換え宿主細胞であって、フィードバック阻害耐性の3デオキシDアラビノヘプツロソン酸7リン酸シンターゼ、フィードバック阻害耐性のコリスミ酸ムターゼプレフェナートデヒドロゲナーゼ、トランスケトラーゼ、ホスホエノールピルビン酸シンテターゼ、チロシナーゼまたはチロシナーゼおよびそのアダプタータンパク質、LDOPA特異的デカルボキシラーゼ、モノアミンオキシダーゼ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6Oメチルトランスフェラーゼ、コクラウリンNメチルトランスフェラーゼならびに3ヒドロキシNメチルコクラウリン4Oメチルトランスフェラーゼを発現し、かつ、tyrR遺伝子を有しないかまたはその機能が欠損している、組換え宿主細胞。大腸菌、酵母、枯草菌および糸状菌からなる群より選択される、請求項9~13のいずれかに記載の組換え宿主細胞。LDOPA特異的デカルボキシラーゼ以外の芳香族Lアミノ酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子が導入されていないことを特徴とする、請求項9~14のいずれかに記載の組換え宿主細胞。本発明の目的は、ドーパミン等の比較的高価な出発物質を用いず、安価で入手しやすい基質からベンジルイソキノリンアルカロイドを生産するシステムを確立することにある。このたび、本発明者は、植物および微生物の代謝に関わる遺伝子を組み合わせて、ベンジルイソキノリンアルカロイドの生合成経路を微生物において再構築することにより、所望のベンジルイソキノリンアルカロイドを生産することが可能な微生物系を確立した。具体的には、本発明者は、ベンジルイソキノリンアルカロイドの生合成経路における分岐点中間体として重要なレチクリンを、その生合成に必要な酵素を発現する形質転換微生物の培養によって合成することに成功した。すなわち、本発明は、Lチロシンを生産する代謝経路を有するイソキノリンアルカロイド非生産性細胞に、チロシナーゼおよびそのアダプタータンパク質、LDOPA特異的デカルボキシラーゼ、モノアミンオキシダーゼ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6Oメチルトランスフェラーゼ、コクラウリンNメチルトランスフェラーゼならびに3ヒドロキシNメチルコクラウリン4Oメチルトランスフェラーゼからなる群より選択される少なくとも1つのタンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子が導入されてなる、チロシナーゼおよびそのアダプタータンパク質、LDOPA特異的デカルボキシラーゼ、モノアミンオキシダーゼ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6Oメチルトランスフェラーゼ、コクラウリンNメチルトランスフェラーゼならびに3ヒドロキシNメチルコクラウリン4Oメチルトランスフェラーゼを発現する組換え宿主細胞を提供する工程、および該組換え宿主細胞を、炭素源としてグルコース、フルクトース、ガラクトース、スクロース、ラクトースおよびマルトースからなる群より選択される1種以上の糖および/またはグリセロールを含む培地において培養する工程を含む、レチクリンを生産する方法を提供する。また、本発明は、Lチロシンを生産する代謝経路を有するイソキノリンアルカロイド非生産性細胞に、フィードバック阻害耐性の3デオキシDアラビノヘプツロソン酸7リン酸シンターゼ、フィードバック阻害耐性のコリスミ酸ムターゼプレフェナートデヒドロゲナーゼ、トランスケトラーゼ、ホスホエノールピルビン酸シンテターゼ、チロシナーゼおよびそのアダプタータンパク質、LDOPA特異的デカルボキシラーゼ、モノアミンオキシダーゼ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6Oメチルトランスフェラーゼ、コクラウリンNメチルトランスフェラーゼならびに3ヒドロキシNメチルコクラウリン4Oメチルトランスフェラーゼからなる群より選択される少なくとも1つのタンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子が導入されてなる組換え宿主細胞であって、フィードバック阻害耐性の3デオキシDアラビノヘプツロソン酸7リン酸シンターゼ、フィードバック阻害耐性のコリスミ酸ムターゼプレフェナートデヒドロゲナーゼ、トランスケトラーゼ、ホスホエノールピルビン酸シンテターゼ、チロシナーゼおよびそのアダプタータンパク質、LDOPA特異的デカルボキシラーゼ、モノアミンオキシダーゼ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6Oメチルトランスフェラーゼ、コクラウリンNメチルトランスフェラーゼならびに3ヒドロキシNメチルコクラウリン4Oメチルトランスフェラーゼを発現し、かつ、tyrR遺伝子を有しないかまたはその機能が欠損している組換え宿主細胞を提供する工程、および該組換え宿主細胞を、炭素源としてグルコース、フルクトース、ガラクトース、スクロース、ラクトースおよびマルトースからなる群より選択される1種以上の糖および/またはグリセロールを含む培地において培養する工程を含む、レチクリンを生産する方法を提供する。さらに、本発明は、Lチロシンを生産する代謝経路を有するイソキノリンアルカロイド非生産性細胞に、チロシナーゼおよびそのアダプタータンパク質、LDOPA特異的デカルボキシラーゼ、モノアミンオキシダーゼ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6Oメチルトランスフェラーゼ、コクラウリンNメチルトランスフェラーゼならびに3ヒドロキシNメチルコクラウリン4Oメチルトランスフェラーゼからなる群より選択される少なくとも1つのタンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子が導入されてなる、チロシナーゼおよびそのアダプタータンパク質、LDOPA特異的デカルボキシラーゼ、モノアミンオキシダーゼ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6Oメチルトランスフェラーゼ、コクラウリンNメチルトランスフェラーゼならびに3ヒドロキシNメチルコクラウリン4Oメチルトランスフェラーゼを発現する組換え宿主細胞を提供する。本発明によると、ベンジルイソキノリンアルカロイドの生合成に必要な遺伝子を発現させた組換え宿主細胞を、微生物の培養に通常用いられる培地中で培養することにより、目的のベンジルイソキノリンアルカロイド、特にレチクリンを高効率で生産することができる。すなわち、本発明によれば、微生物用の培地を構成する安価かつ容易に入手可能な基質からベンジルイソキノリンアルカロイドを生産することができ、出発物質として追加の基質を用いる必要がない。したがって、本発明の微生物系は、希少なベンジルイソキノリンアルカロイドを生産するコストを劇的に減少させることが可能な、簡便かつ費用効率の高いシステムである。本発明により、多様な有用化合物生産のための素材であるベンジルイソキノリンアルカロイドが大量に生産できる基盤が構築されるとともに、さらなる代謝変換により、新たなる創薬資源の開発が可能となる。さらに、本発明の微生物系は、新規なイソキノリンアルカロイドの生産のための新規経路を開発するためにも有用である。また、本発明の微生物系において再構築されるベンジルイソキノリンアルカロイド生合成経路の個々のステップは、いずれも既知かつ制御可能なものである。したがって、個々の生合成遺伝子の発現レベルを最適化することおよび経路の流れを改良することによって、さらに効率的な生産を達成することが可能となりうる。本発明は、Lチロシンを生産する代謝経路を有するイソキノリンアルカロイド非生産性細胞に、チロシナーゼおよびそのアダプタータンパク質、LDOPA特異的デカルボキシラーゼ、モノアミンオキシダーゼ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6Oメチルトランスフェラーゼ、コクラウリンNメチルトランスフェラーゼならびに3ヒドロキシNメチルコクラウリン4Oメチルトランスフェラーゼからなる群より選択される少なくとも1つのタンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子が導入されてなる、チロシナーゼおよびそのアダプタータンパク質、LDOPA特異的デカルボキシラーゼ、モノアミンオキシダーゼ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6Oメチルトランスフェラーゼ、コクラウリンNメチルトランスフェラーゼならびに3ヒドロキシNメチルコクラウリン4Oメチルトランスフェラーゼを発現する組換え宿主細胞を提供する工程、および該組換え宿主細胞を、炭素源としてグルコース、フルクトース、ガラクトース、スクロース、ラクトースおよびマルトースからなる群より選択される1種以上の糖および/またはグリセロールを含む培地において培養する工程、を含む、レチクリンを生産する方法を提供する。かかる方法によれば、特定の酵素を発現する組換え宿主細胞を、微生物の培養に通常用いられる培地において培養することにより、グルコースおよびグリセロール等の安価で入手容易な基質から、インビボにおいてレチクリンを効率的に生産することが可能となる。好ましくは、本発明の方法によって得られるレチクリンは、実質的にレチクリンを含まないものである。本発明の方法において用いる組換え宿主細胞は、tyrR遺伝子を有しないかまたはその機能が欠損しているものであることが好ましい。tyrR遺伝子の産物は芳香族アミノ酸の生合成に関与する遺伝子の発現を抑制する機能を有しているため、例えばtyrR遺伝子を有しない宿主細胞を用いることやtyrR遺伝子の機能を喪失させることにより、本発明の方法において再構築される生合成経路において重要なLチロシンの生合成に対する抑制を解除することができる。本発明の方法において用いる組換え宿主細胞は、フィードバック阻害耐性の3デオキシDアラビノヘプツロソン酸7リン酸シンターゼおよび/またはフィードバック阻害耐性のコリスミ酸ムターゼプレフェナートデヒドロゲナーゼを発現するものであることが好ましい。かかる酵素の発現により、該組換え宿主細胞においてLチロシンの生産効率が向上し、レチクリンの収量を増大させることができる。本発明の方法において用いる組換え宿主細胞は、トランスケトラーゼおよび/またはホスホエノールピルビン酸シンテターゼを過剰発現するものであることが好ましい。かかる酵素の過剰発現により、該組換え宿主細胞においてシキミ酸経路の出発物質であるエリトロース4リン酸および/またはホスホエノールピルビン酸の量が増加し、Lチロシン生産量の増大を経て、レチクリンの収量を増大させることができる。したがって本発明は、Lチロシンを生産する代謝経路を有するイソキノリンアルカロイド非生産性細胞に、フィードバック阻害耐性の3デオキシDアラビノヘプツロソン酸7リン酸シンターゼ、フィードバック阻害耐性のコリスミ酸ムターゼプレフェナートデヒドロゲナーゼ、トランスケトラーゼ、ホスホエノールピルビン酸シンテターゼ、チロシナーゼおよびそのアダプタータンパク質、LDOPA特異的デカルボキシラーゼ、モノアミンオキシダーゼ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6Oメチルトランスフェラーゼ、コクラウリンNメチルトランスフェラーゼならびに3ヒドロキシNメチルコクラウリン4Oメチルトランスフェラーゼからなる群より選択される少なくとも1つのタンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子が導入されてなる組換え宿主細胞であって、フィードバック阻害耐性の3デオキシDアラビノヘプツロソン酸7リン酸シンターゼ、フィードバック阻害耐性のコリスミ酸ムターゼプレフェナートデヒドロゲナーゼ、トランスケトラーゼ、ホスホエノールピルビン酸シンテターゼ、チロシナーゼおよびそのアダプタータンパク質、LDOPA特異的デカルボキシラーゼ、モノアミンオキシダーゼ、ノルコクラウリンシンターゼ、ノルコクラウリン6Oメチルトランスフェラーゼ、コクラウリンNメチルトランスフェラーゼならびに3ヒドロキシNメチルコクラウリン4Oメチルトランスフェラーゼを発現し、かつ、tyrR遺伝子を有しないかまたはその機能が欠損している組換え宿主細胞を提供する工程、および該組換え宿主細胞を、炭素源としてグルコース、フルクトース、ガラクトース、スクロース、ラクトースおよびマルトースからなる群より選択される1種以上の糖および/またはグリセロールを含む培地において培養する工程、を含む、レチクリンを生産する方法をさらに提供する。また、本発明は、Lチロシンを生産する代謝経路を有するイソキノリンアルカロイド非生産性細胞に、fbrDAHPS、fbrCMPDH、TYRおよびそのアダプタータンパク質、DODC、MAO、NCS、6OMT、CNMTならびに4OMTからなる群より選択される少なくとも1つのタンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子が導入され、かつ、TKTおよびPEPSをコードする遺伝子が導入されてなる組換え宿主細胞であって、fbrDAHPS、fbrCMPDH、TYRおよびそのアダプタータンパク質、DODC、MAO、NCS、6OMT、CNMTならびに4OMTを発現し、TKTおよびPEPSを過剰発現し、かつ、tyrR遺伝子を有しないかまたはその機能が欠損している組換え宿主細胞を提供する工程、および該組換え宿主細胞を、炭素源としてグルコース、フルクトース、ガラクトース、スクロース、ラクトースおよびマルトースからなる群より選択される1種以上の糖および/またはグリセロールを含む培地において培養する工程、を含む、レチクリンを生産する方法を提供する。また、本発明によれば、レチクリンを出発物質として作用するイソキノリンアルカロイド生合成酵素をコードする遺伝子を組換え宿主細胞にさらに導入することによって、安価で入手容易な基質から、インビボにおいてイソキノリンアルカロイドを生産することも可能である。すなわち、本発明は、Lチロシンを生産する代謝経路を有するイソキノリンアルカロイド非生産性細胞に、TYRおよびそのアダプタータンパク質、DODC、MAO、NCS、6OMT、CNMT、4OMTならびにレチクリンを出発物質として作用するイソキノリンアルカロイド生合成酵素からなる群より選択される少なくとも1つのタンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子が導入されてなる、TYRおよびそのアダプタータンパク質、DODC、MAO、NCS、6OMT、CNMT、4OMTならびにレチクリンを出発物質として作用するイソキノリンアルカロイド生合成酵素を発現する組換え宿主細胞を提供する工程、および該組換え宿主細胞を、炭素源としてグルコース、フルクトース、ガラクトース、スクロース、ラクトースおよびマルトースからなる群より選択される1種以上の糖および/またはグリセロールを含む培地において培養する工程、を含む、イソキノリンアルカロイドを生産する方法を提供する。レチクリンを出発物質として作用するイソキノリンアルカロイド生合成酵素の例としてはコリツベリンシンターゼ以下、CYP80G2とも称するおよびベルベリン架橋酵素以下、BBEとも称するが挙げられ、CYP80G2を発現させることによりコリツベリンを介してマグノフロリンを合成することができ、BBEを発現させることによりプロトベルベリンアルカロイドであるスコウレリンを合成することができる図5。また、CYP80G2を発現させる場合には、NADPHシトクロームP450レダクターゼを共に発現させるのが好ましい。また、本発明は、Lチロシンを生産する代謝経路を有するイソキノリンアルカロイド非生産性細胞に、TYRおよびそのアダプタータンパク質、DODC、MAO、NCS、6OMT、CNMTならびに4OMTからなる群より選択される少なくとも1つのタンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子が導入されてなる、TYRおよびそのアダプタータンパク質、DODC、MAO、NCS、6OMT、CNMTならびに4OMTを発現する組換え宿主細胞を提供する。本発明の組換え宿主細胞は、以下のからのうち1以上の性質を有していることが好ましい:tyrR遺伝子を有しないかまたはその機能が欠損しているものであること、fbrDAHPSおよび/またはfbrCMPDHを発現するものであること、TKTおよび/またはPEPSを過剰発現するものであること。これらの性質を有することにより、該組換え宿主細胞におけるLチロシンの生産性が向上し、レチクリンないし他のイソキノリンアルカロイドの収量を増大させることができる。したがって本発明は、Lチロシンを生産する代謝経路を有するイソキノリンアルカロイド非生産性細胞に、fbrDAHPS、fbrCMPDH、TKT、PEPS、TYRおよびそのアダプタータンパク質、DODC、MAO、NCS、6OMT、CNMTならびに4OMTからなる群より選択される少なくとも1つのタンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子が導入されてなる組換え宿主細胞であって、fbrDAHPS、fbrCMPDH、TKT、PEPS、TYRおよびそのアダプタータンパク質、DODC、MAO、NCS、6OMT、CNMTならびに4OMTを発現し、かつ、tyrR遺伝子を有しないかまたはその機能が欠損している組換え宿主細胞をさらに提供する。また、本発明は、Lチロシンを生産する代謝経路を有するイソキノリンアルカロイド非生産性細胞に、fbrDAHPS、fbrCMPDH、TYRおよびそのアダプタータンパク質、DODC、MAO、NCS、6OMT、CNMTならびに4OMTからなる群より選択される少なくとも1つのタンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子が導入され、かつ、TKTおよびPEPSをコードする遺伝子が導入されてなる組換え宿主細胞であって、fbrDAHPS、fbrCMPDH、TYRおよびそのアダプタータンパク質、DODC、MAO、NCS、6OMT、CNMTならびに4OMTを発現し、TKTおよびPEPSを過剰発現し、かつ、tyrR遺伝子を有しないかまたはその機能が欠損している組換え宿主細胞を提供する。また、本発明においては、上記のTYRおよびそのアダプタータンパク質に代えて、その活性を示すためにアダプタータンパク質を必要としないTYR、例えばRalstoniasolanacearum由来のTYRを用いることもできる。したがって、本発明は、Lチロシンを生産する代謝経路を有するイソキノリンアルカロイド非生産性細胞に、Ralstoniasolanacearum由来のチロシナーゼ以下、RsTYRとも称する、DODC、MAO、NCS、6OMT、CNMTならびに4OMTからなる群より選択される少なくとも1つのタンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子が導入されてなる、RsTYR、DODC、MAO、NCS、6OMT、CNMTならびに4OMTを発現する組換え宿主細胞を提供する工程、および該組換え宿主細胞を、炭素源としてグルコース、フルクトース、ガラクトース、スクロース、ラクトースおよびマルトースからなる群より選択される1種以上の糖および/またはグリセロールを含む培地において培養する工程、を含む、レチクリンを生産する方法をさらに提供する。同様に、本明細書に記載される様々な本発明のレチクリンを生産する方法および組換え宿主細胞においてTYRおよびそのアダプタータンパク質に代えてRalstoniasolanacearum由来のTYRRsTYRを用いる態様も、本発明の好ましい態様として提供される。なお、本明細書において、RsTYRとの用語はRalstoniasolanacearum由来のTYRを意味するが、単にチロシナーゼTYRと表記した場合には、その由来に関わらずあらゆるTYRが該用語に包含されるものとする。ここで、ベンジルイソキノリンアルカロイドを生産する植物における、Lチロシンからレチクリンに至る生合成経路を図4に示す。一方、本発明の方法において再構築される生合成経路は、MAOを用いることによってドーパミンから34DHPAAを合成し、該34DHPAAとドーパミンをNCSの作用を介してカップリングさせることによりノルラウダノソリンを生成させるものである図1。これにより、植物の生合成経路におけるNメチルコクラウリン3ヒドロキシラーゼ以下、CYP80Bとも称するによる水酸化の工程図4参照を省略することができる。しかし、芳香族Lアミノ酸デカルボキシラーゼが本発明の方法において再構築される生合成経路中に存在すると、該芳香族Lアミノ酸デカルボキシラーゼの作用によって芳香族Lアミノ酸が脱炭酸されて芳香族アミンが生成し、これがMAOと反応してしまうため好ましくない。特に、Lチロシンが脱炭酸されるとチラミンが生成し、MAOはドーパミンよりもチラミンに対し高い選択性を示すすなわちチラミンと優先的に反応するため、本発明の方法が意図しない4HPAAが生成されてしまう。該4HPAAはNCSの作用によりドーパミンとカップリングし、ノルコクラウリンが生成される。この場合、該ノルコクラウリンからレチクリンを得るためには、6OMT、CNMT、4OMTに加えてCYP80Bを用いる必要があるが図4、該CYP80BはチトクロームP450酵素であるため、微生物内ではうまく機能しないことが多い。そこで、本発明の方法においては、LDOPA特異的デカルボキシラーゼを宿主細胞に導入して発現させる。具体的には、本発明の方法は、ベンジルイソキノリンアルカロイド生合成経路の再構築において、Lチロシンを脱炭酸する芳香族Lアミノ酸デカルボキシラーゼを用いることを避け、その代わりにチロシナーゼまたはチロシナーゼおよびそのアダプタータンパク質を発現させてLチロシンからLDOPAへの変換経路を作り、さらにLDOPA特異的デカルボキシラーゼを発現させてLDOPAからドーパミンへの変換経路を作ることを特徴とする。したがって、本発明の組換え宿主細胞および本発明の方法において用いる組換え宿主細胞は、LDOPA特異的デカルボキシラーゼ以外の芳香族Lアミノ酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子が導入されていないものであることが好ましい。これにより、宿主細胞へ導入する遺伝子にコードされる酵素によってLチロシンからチラミンが生成されることは無く、その一方でTYRまたはTYRおよびそのアダプタータンパク質ならびにDODCの発現によってドーパミンが高い効率で生産される。その結果、ドーパミンと34DHPAAとのカップリングによるノルラウダノソリンの生成を経てレチクリンに至る経路へと代謝フローを効率的に流すことが可能となる図1。なお、植物および動物においては、LDOPAは主にチロシンヒドロキシラーゼTH、EC114162によってLチロシンから合成され、かかる反応には補因子としてテトラヒドロビオプテリンが必要である。しかし、本発明の方法において好適に用いられる大腸菌細胞は、該テトラヒドロビオプテリンを合成することができない。そこで、本発明の方法においては、LチロシンからLDOPAへの変換のために、銅およびアダプタータンパク質以外の補因子を必要としない、細菌のチロシナーゼを用いることが好ましい。また、アダプタータンパク質を必要としないRalstoniasolanacearum由来のTYRも好適に用いることができる。本発明に係る組換え宿主細胞は、通常、Lチロシンを生産する代謝経路を有するイソキノリンアルカロイド非生産性細胞に、TYRまたはTYRおよびそのアダプタータンパク質、DODC、MAO、NCS、6OMT、CNMTならびに4OMTからなる群より選択される少なくとも1つのタンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子を導入することによって得ることができる。例えば、Lチロシンを生産する代謝経路を有するイソキノリンアルカロイド非生産性細胞が、TYRまたはTYRおよびそのアダプタータンパク質、DODC、MAO、NCS、6OMT、CNMTならびに4OMTからなる群より選択されるタンパク質をコードする1つ以上の遺伝子を既に有している場合には、当該群に含まれる他の全ての遺伝子を該細胞に導入することにより、TYRまたはTYRおよびそのアダプタータンパク質、DODC、MAO、NCS、6OMT、CNMTならびに4OMTの全てを発現する本発明の組換え宿主細胞を得ることができる。また、Lチロシンを生産する代謝経路を有するイソキノリンアルカロイド非生産性細胞がTYRまたはTYRおよびそのアダプタータンパク質、DODC、MAO、NCS、6OMT、CNMTならびに4OMTをコードする遺伝子のいずれも有していない場合には、TYRまたはTYRおよびそのアダプタータンパク質、DODC、MAO、NCS、6OMT、CNMTならびに4OMTをコードする遺伝子の全てを該細胞に導入することにより、本発明の組換え宿主細胞を得ることができる。本発明に係る組換え宿主細胞を得るために遺伝子を導入する宿主細胞は、Lチロシンを生産する代謝経路を有するイソキノリンアルカロイド非生産性細胞であれば特に限定されないが、より効率的なレチクリン生産のためには、Lチロシンを大量に生産する能力を有する宿主細胞であることが好ましい。Lチロシンを大量に生産する能力は、典型的には、以下の~から選択される1以上の方法によって宿主細胞に付与することができる:宿主細胞が有するtyrR遺伝子の機能喪失またはtyrR遺伝子の発現抑制ここにいう機能喪失には、完全な機能喪失と部分的な機能喪失が含まれる;fbrDAHPSおよび/またはfbrCMPDHをコードする1以上の遺伝子の宿主細胞への導入および宿主細胞における発現;TKTおよび/またはPEPSをコードする1以上の遺伝子の宿主細胞への導入および宿主細胞における過剰発現。ここで、tyrR遺伝子の機能は、当該技術分野における公知の手段、例えば相同組換えを利用したノックイン/ノックアウト、トランスポゾン等の転移因子の転移を利用した遺伝子破壊等によって喪失させることができる。また、tyrR遺伝子の発現は、当該技術分野における公知の手段、例えばコサプレッション、アンチセンス法、RNAiなどによって抑制することができる。tyrR遺伝子を有しないかまたはその機能が欠損している本発明の組換え宿主細胞は、例えば以下の方法によって得ることが可能である:tyrR遺伝子を有しないかまたはその機能が欠損している宿主細胞に、TYR等の必要な遺伝子を導入すること、宿主細胞が有するtyrR遺伝子の機能を喪失させた後、該宿主細胞にTYR等の必要な遺伝子を導入すること、または宿主細胞にTYR等の必要な遺伝子を導入した後、該宿主細胞が有するtyrR遺伝子の機能を喪失させること。fbrDAHPSおよび/またはfbrCMPDHを発現している細胞や、TKTおよび/またはPEPSを高レベルで発現している細胞等を、本発明に係る組換え宿主細胞を得るために遺伝子を導入する宿主細胞として用いてもよい。fbrDAHPS、fbrCMPDH、TKT、PEPS、TYRまたはTYRおよびそのアダプタータンパク質、DODC、MAO、NCS、6OMT、CNMTならびに4OMTを発現する本発明の組換え宿主細胞は、例えば以下の方法によって得ることが可能である:これら全ての遺伝子を宿主細胞に導入すること、またはfbrDAHPS、fbrCMPDH、TKT、PEPS、TYRまたはTYRおよびそのアダプタータンパク質、DODC、MAO、NCS、6OMT、CNMTならびに4OMTからなる群より選択されるタンパク質をコードする1つ以上の遺伝子を有している宿主細胞に、当該群に含まれる他の全ての遺伝子を導入すること。好ましい態様において、本発明の組換え宿主細胞は、例えば、tyrR遺伝子の機能を喪失させた宿主細胞に、fbrDAHPS、fbrCMPDH、TKT、PEPS、TYRまたはTYRおよびそのアダプタータンパク質、DODC、MAO、NCS、6OMT、CNMTならびに4OMTをコードする遺伝子の全てを導入することによって得ることができる。また、上記の方法に限らず、自然に生じる突然変異または公知の突然変異誘発法などによってLチロシンを大量に生産する能力を獲得した突然変異株を、本発明に係る組換え宿主細胞を得るために遺伝子を導入する宿主細胞として用いてもよい。本発明の方法において遺伝子を導入する宿主細胞としては、イソキノリンアルカロイド非生産性細胞であれば特に限定されないが、例えば大腸菌、酵母、枯草菌および糸状菌などが挙げられ、中でも大腸菌が特に好ましい。宿主細胞に遺伝子を導入する場合、遺伝子を直接導入してもよいが、遺伝子が組み込まれたベクターを宿主に導入するのが好ましい。導入遺伝子はすべて同一のベクターに組み込んでもよいし、2以上の別々のベクターに分けて組み込んでもよい。導入遺伝子を組み込むベクターとしては、宿主細胞内で自律的に複製しうるプラスミドまたはファージから遺伝子組換え用として構築されたものが適している。ベクターは、導入される宿主細胞に適合した複製開始起点、選択可能なマーカー、プロモーター等の発現制御配列、およびターミネーター配列を含むものが好ましい。プラスミドベクターとしては、例えば大腸菌で発現させる場合は、pETベクター系、pQEベクター系、pColdベクター系などが挙げられ、酵母で発現させる場合は、pYES2ベクター系、pYEXベクター系などが挙げられる。選択可能なマーカーとしては、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。その内部に組み込まれた導入遺伝子を発現させるベクター以下において、発現ベクターと称するは、発現制御配列を含むものが好ましい。発現制御配列とは、DNA配列に適切に連結した場合、宿主細胞において、そのDNA配列からなる遺伝子の発現を制御すること、すなわち、該DNA配列のRNAへの転写を誘導および/または促進すること、あるいは抑制することができる配列を意味する。発現制御配列には少なくともプロモーターが含まれる。プロモーターは構成的プロモーターであっても誘導可能なプロモーターであってもよい。さらに該発現ベクターには転写終結シグナル、即ちターミネーター配列が含まれることが好ましい。本発明に用いる発現ベクターは、上記遺伝子の末端に、常法により適当な制限酵素認識部位を付加することにより作成することが出来る。発現ベクターの宿主細胞への形質転換方法としては、従来公知の方法を用いることが出来、例えば、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法、ヒートショック法などが挙げられる。組換え宿主細胞の培養条件は、該組換え宿主細胞が良好に生育し、かつ、目的とする一群のタンパク質、例えばTYRまたはTYRおよびそのアダプタータンパク質、DODC、MAO、NCS、6OMT、CNMTならびに4OMTやfbrDAHPS、fbrCMPDH、TKT、PEPS、TYRまたはTYRおよびそのアダプタータンパク質、DODC、MAO、NCS、6OMT、CNMTならびに4OMTが全て発現し、それぞれの機能または酵素活性が発揮される条件であれば特に限定されない。具体的には、培養条件は、宿主の栄養生理学的性質を考慮して適宜選択すればよく、通常、液体培養で行われる。組換え宿主細胞の培養に用いる培地の炭素源としては、宿主細胞が利用できる物質であれば特に限定されないが、糖およびグリセロールが挙げられ、特に好ましくはグリセロールである。糖の例としては、単糖、例えばグルコース、フルクトース、ガラクトース等、および二糖、例えばスクロース、ラクトース、マルトース等が挙げられ、その中でもグルコースが好ましい。また、グリセロールを炭素源として用いて培養すると、グルコースを用いる場合よりもレチクリンの生産効率が高くなる。また、窒素源としては硫酸アンモニウム、カザミノ酸などが挙げられる。その他、塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどを所望により使用できる。例えば、大腸菌を培養する培地としては、LB培地、2×YT培地、M9最少培地が挙げられ、酵母を培養する培地としては、SC培地、SD培地、YPD培地が挙げられる。培養温度は、宿主細胞が成育し、目的の酵素を発現し、その活性が発揮される範囲で適宜変更できるが、例えば、大腸菌の場合、温度25°C、80時間、pH70の培養条件を用いることができる。酵母の場合、例えば、温度30°C、60時間、pH58の培養条件を用いることができる。レチクリンを含む目的のイソキノリンアルカロイドの生産は、当業者に周知のあらゆる手段によって確認することが出来る。具体的には、反応生成物と目的のイソキノリンアルカロイド標品とを、LCMSに供し、得られるスペクトルを比較することによって同定することが出来る。また、反応生成物と目的のイソキノリンアルカロイド標品とのNMR分析による比較によっても確認することが出来る。本明細書において、特定の遺伝子を発現するとは、該遺伝子を構成する核酸分子が少なくともRNA分子へ転写されることをいい、ポリペプチドをコードする遺伝子の場合には、該遺伝子を構成する核酸分子がRNA分子へ転写され、該RNA分子がポリペプチドに翻訳されることをいう。遺伝子の発現レベルは、当該技術分野における公知の方法、例えばノーザンブロット、定量的PCRなどによって確認することができる。本明細書において、特定の酵素を発現するとは、該酵素のポリペプチドをコードする核酸分子からRNA分子への転写および該RNA分子からポリペプチドへの翻訳が正常に行われ、活性を有する酵素タンパク質が生み出されて細胞内または細胞外に存在する状態となることをいう。酵素の発現レベルは、その酵素活性のアッセイにより確認できる。即ち、目的酵素の基質から生成物への変換をアッセイすることにより確認することが出来る。また、ウエスタンブロット、ELISAなど公知の手法を用いて酵素タンパク質を検出および定量することによっても確認することができる。本明細書において、特定の遺伝子または酵素を過剰発現するとは、該特定の遺伝子または酵素に相当する内在性の遺伝子または酵素を宿主細胞が有している場合には、該内在性遺伝子または酵素の発現レベルと、導入された該特定の遺伝子またはそれにコードされる酵素の発現レベルとを合わせて、該宿主細胞の通常の状態における該内在性遺伝子または酵素の発現レベルを超える遺伝子または酵素の発現レベルを該宿主細胞内において達成することをいう。また、特定の遺伝子または酵素に相当する内在性遺伝子または酵素を宿主細胞が有していない場合には、該特定の遺伝子または酵素を過剰発現するとは、導入された該特定の遺伝子またはそれにコードされる酵素について、常套の検出方法によって検出できるレベルの発現を該宿主細胞内において達成することをいう。本明細書において、生合成経路を再構築するとは、所望の化合物を天然には生産しない宿主細胞中において、該所望の化合物が得られるよう、該化合物を生合成するために必要な1または複数の反応を触媒する1または複数の酵素を発現させて、該化合物へと繋がる代謝経路を作り出すことをいう。かくして宿主細胞内に再構築される生合成経路は、該細胞が天然には有していないものである。本発明の方法において、典型的には、所望の化合物はイソキノリンアルカロイド、特にレチクリンであり、必要な酵素の発現は、該酵素をコードする遺伝子を宿主細胞に導入することによって達成することができる。本明細書において、本発明の方法によって得られるレチクリンが実質的にレチクリンを含まないとは、レチクリンに対するレチクリンのエナンチオマー過剰率が少なくとも80以上、好ましくは90以上、最も好ましくは100であることをいう。本発明において用いられるチロシナーゼは、Lチロシンのベンゼン環の3位を水酸化してLDOPAに変換する反応を触媒する酵素活性を有するものであれば特に限定されない。また、TYRの由来は特に限定されないが、微生物由来のものであることが好ましく、例えばStreptomycescastaneoglobisporus由来のものが挙げられる。本発明の方法においては、例えば、配列番号6に示すヌクレオチド配列にコードされるScastaneoglobisporus由来のTYRを好適に用いることができる。また、TYRとしてRalstoniasolanacearum由来のTYRRsTYRを用いることもでき、本発明においては、例えば配列番号36または37に示すヌクレオチド配列にコードされるRsTYRを好適に用いることができる。RsTYRは、その酵素活性を示すのにアダプタータンパク質を必要としない。したがって、TYRとしてRsTYRを用いる場合には、後述のアダプタータンパク質を発現させる必要はない。また、TYRは通常、LDOPAまたはドーパミンをそのキノン誘導体に変換する能力oジフェノラーゼ活性を有するが、配列番号36または37に示すヌクレオチド配列にコードされるRsTYRは、かかるoジフェノラーゼ活性が低いHernandezRomeroDetalFEBSJournal273257270。したがって、配列番号36または37に示すヌクレオチド配列にコードされるRsTYRを用いることにより、ドーパミンの生産量を増大させ、レチクリンの生産効率を向上させることができる。本発明において用いられるチロシナーゼのアダプタータンパク質、例えばORF378タンパク質は、TYRの触媒中心への2価の銅イオンCuの輸送を補助するタンパク質である。少なくとも、Streptomyces属の細菌に由来するTYRについては、該TYRが完全な触媒活性を示すためにアダプタータンパク質が必要とされる。例えば、Scastaneoglobisporusの染色体上においては、TYR遺伝子とORF378が直列に並んでメラニン合成酵素遺伝子オペロンを構成しており、TYRおよびORF378タンパク質の両方が発現することによってTYRが活性を示すKIkedaetalApplMicrobiolBiotechnol458085YMatobaetalJBiolChemVol281No13pp89818990。TYRのアダプタータンパク質の例としては、Scastaneoglobisporus由来のORF378タンパク質やStreptomycesantibioticus由来のORF438タンパク質が挙げられ、本発明においては、例えば、配列番号7に示すヌクレオチド配列にコードされるScastaneoglobisporus由来のORF378タンパク質を好適に用いることができる。本明細書中でTYRのアダプタータンパク質について用いる用語に関し、ORF378を例にとると、ORF378との用語は、TYRのアダプタータンパク質であるORF378タンパク質をコードする遺伝子またはオープンリーディングフレームを意味し、アダプタータンパク質ORF378またはORF378タンパク質との用語は、ORF378によりコードされるタンパク質を意味するものとする。本発明において用いられるLDOPA特異的デカルボキシラーゼは、LDOPAからカルボキシル基を脱離させてドーパミンに変換する反応を触媒する酵素活性を有し、LDOPA以外の他の芳香族Lアミノ酸に比して少なくとも10倍、好ましくは100倍、より好ましくは1000倍以上のLDOPA選択性を示す、芳香族Lアミノ酸脱炭酸酵素をいう。DODCの由来は特に限定されないが、例えば微生物、例えばPseudomonasputida由来のものが挙げられる。本発明の方法においては、例えば、配列番号8に示すヌクレオチド配列にコードされるPputida由来のDODCを好適に用いることができる。本発明において用いられるモノアミンオキシダーゼは、ドーパミンを34DHPAAに変換する反応を触媒する酵素活性を有するものであれば特に限定されない。MAOの由来としては、例えば微生物、例えばMicrococcusluteus、Escherichiacoli、Arthrobacteraurescens、Klebsiellaaerogenesが挙げられるが、Micrococcusluteus由来のものを用いるのが好ましい。本発明の方法においては、例えば、配列番号9に示すヌクレオチド配列にコードされるMluteus由来のMAOを好適に用いることができる。本発明において用いられる、ノルコクラウリンシンターゼはドーパミンと34DHPAAから3ヒドロキシノルコクラウリン以下、ノルラウダノソリンとも称するを得る反応、ノルコクラウリン6Oメチルトランスフェラーゼは3ヒドロキシノルコクラウリンから3ヒドロキシコクラウリンを得る反応、コクラウリンNメチルトランスフェラーゼは3ヒドロキシコクラウリンから3ヒドロキシNメチルコクラウリンを得る反応、3ヒドロキシNメチルコクラウリン4Oメチルトランスフェラーゼは3ヒドロキシNメチルコクラウリンからレチクリンを得る反応をそれぞれ触媒する酵素活性を有するものであれば特に限定されない。また、NCS、6OMT、CNMTおよび4OMTは、特に限定されないが、イソキノリンアルカロイド生産性植物由来のものが好ましい。イソキノリンアルカロイド生産性植物としては、ハナビシソウ、ケシ、エンゴサク等のケシ科植物、メギ等のメギ科植物、キハダ等のミカン科植物、コブシ等のモクレン科植物、オオツヅラフジなどのツヅラフジ科植物、ならびにオウレン等のキンポウゲ科植物などのイソキノリンアルカロイド産生植物などが挙げられ、好ましくはオウレンである。本発明の方法においては、例えば、配列番号11、12、13および14に示すヌクレオチド配列にコードされる、いずれもオウレン由来のNCS、6OMT、CNMTおよび4OMTを好適に用いることが出来る。本発明において用いられるレチクリンを出発物質として作用するイソキノリンアルカロイド生合成酵素は、レチクリンを出発物質として目的のイソキノリンアルカロイドを得る経路を構成する1または複数の酵素であり、それぞれの経路の反応を触媒する酵素活性を有するものであれば特に限定されない。また、レチクリンを出発物質として作用するイソキノリンアルカロイド生合成酵素は、特に限定されないが、イソキノリンアルカロイド生産性植物由来のものであるのが好ましい。一方、イソキノリンアルカロイド生合成酵素としてシトクロームP450の1種であるCYP80G2を用いる場合に、共に用いるのが好ましい、NADPHシトクロームP450レダクターゼの由来は、特に限定されないが、酵母、植物、哺乳類が挙げられる。本発明の方法においてマグノフロリンを生産する場合、レチクリンからコリツベリンへの反応を触媒する酵素、およびコリツベリンからマグノフロリンへの反応を触媒する酵素を用いればよく、かかる反応を触媒する酵素活性を有するものであれば特に限定されない。例えば、レチクリンからコリツベリンへの反応を触媒する酵素として、配列番号15に示すヌクレオチド配列にコードされるCYP80G2を好適に用いることができ、これと共に配列番号16に示すヌクレオチド配列にコードされるP450レダクターゼを用いることができる。また、コリツベリンからマグノフロリンへの反応を触媒する酵素として、例えば、配列番号13に示すヌクレオチド配列にコードされるCNMTを好適に用いることができる。本発明の方法においてスコウレリンを生産する場合、レチクリンからスコウレリンへの反応を触媒する酵素を用いればよく、かかる反応を触媒する酵素活性を有するものであれば特に限定されない。具体例として、配列番号17に示すヌクレオチド配列にコードされるBBEを好適に用いることが出来る。さらに、ベルベリンを生産する場合、レチクリンからスコウレリンを介してベルベリンに至る経路を構成する酵素を用いればよく、各段階の反応を触媒する酵素活性を有するものであれば特に限定されない。例えば、BBE、SMTを用いるとよい。BBEとしては、配列番号17に示すヌクレオチド配列にコードされるものが好適に用いられる。SMT、CYP719A1、THBOの配列情報については、NCBINationalCenterforBiotechnologyInformationの提供するGenBankから得ることが出来る。本発明において宿主細胞を改変するために用いることができるtyrR遺伝子は、芳香族アミノ酸の生合成や輸送に関わる複数の遺伝子の発現を調節する機能を有するDNA結合性転写調節因子をコードしており、該tyrR遺伝子にコードされる転写調節因子は、Lチロシンを生合成するいわゆるシキミ酸経路において機能する、3デオキシDアラビノヘプツロソン酸7リン酸シンターゼをコードするaroG遺伝子およびコリスミ酸ムターゼプレフェナートデヒドロゲナーゼをコードするtyrA遺伝子の発現を抑制するAJPittardetalMolMicrobiol515851592。したがって、本発明において宿主細胞を改変するために利用することができるtyrR遺伝子は、少なくともaroG遺伝子および/またはtyrA遺伝子の発現を抑制する機能を有するものであれば特に限定されない。本発明において用いる宿主細胞がtyrR遺伝子を有するか否かは、既知のtyrR遺伝子の配列情報、例えば大腸菌K12DH10B株のtyrR遺伝子の配列情報配列番号1、EMBL受入番号ACB02543、KEGG登録番号ECDH10B1442をもとに、該宿主細胞のゲノム配列等に対して配列相同性検索を行うことによって推定できる。相同な遺伝子いわゆるホモログの存在が推定される場合、当該相同な遺伝子の配列情報をもとに行うPCR増幅および配列決定等の手法によってその存在を確認できる。あるいは、既知配列からなるtyrR遺伝子の核酸分子とのハイブリダイゼーションによって、直接的にtyrR遺伝子の核酸分子を取得することも可能である。宿主細胞にtyrR遺伝子が存在する場合、取得したtyrR遺伝子の配列情報あるいは核酸分子をもとに、人工的核酸合成あるいはクローニング後の突然変異導入などの手法によって、遺伝子破壊または発現抑制用の核酸を取得することができ、該核酸を用いて、相同組換えやRNAiなど公知の手段によって宿主細胞が有するtyrR遺伝子の機能を喪失させるかまたはtyrR遺伝子の発現を抑制することが可能である。相同性検索は、公知の手段、例えばBLASTアルゴリズム、FASTAアルゴリズムなどを利用して行うことができる。本発明において、宿主細胞を改変するために用いることができるfbrDAHPSは、エリトロース4リン酸とホスホエノールピルビン酸から、3デオキシDアラビノヘプツロソン酸7リン酸を生成する反応を触媒する酵素活性を有し、フェニルアラニンによるフィードバック阻害を受けないものであれば特に限定されない。ここで、フェニルアラニンによるフィードバック阻害を受けないフィードバック阻害耐性であるとは、フェニルアラニンによってDAHPSの酵素活性が全く阻害されないか、またはフェニルアラニンによる酵素活性の阻害の程度が野生型のDAHPSと比較して有意に小さいことをいう。fbrDAHPSは、フェニルアラニン存在下での酵素活性が同非存在下での酵素活性と同等またはそれ以上であることが好ましい。また、fbrDAHPSは、特に限定されないが、微生物由来のものであるのが好ましく、大腸菌由来のものであるのがより好ましい。本発明において、例えば、配列番号2に示すヌクレオチド配列にコードされる、大腸菌由来のfbrDAHPSを好適に用いることが出来る。本発明において、宿主細胞を改変するために用いることができるfbrCMPDHは、コリスミ酸からプレフェン酸を生成する反応およびプレフェン酸から4ヒドロキシフェニルピルビン酸を生成する反応を触媒する酵素活性を有し、チロシンによるフィードバック阻害を受けないものであれば特に限定されない。ここで、チロシンによるフィードバック阻害を受けないフィードバック阻害耐性であるとは、チロシンによってCMおよびまたはPDHの酵素活性が全く阻害されないか、またはチロシンによる酵素活性の阻害の程度が野生型のCMPDHと比較して有意に小さいことをいう。fbrCMPDHは、チロシン存在下での酵素活性が同非存在下での酵素活性と同等またはそれ以上であることが好ましい。また、fbrCMPDHは、特に限定されないが、微生物由来のものであるのが好ましく、大腸菌由来のものであるのがより好ましい。本発明において、例えば、配列番号3に示すヌクレオチド配列にコードされる、大腸菌由来のfbrCMPDHを好適に用いることが出来る。本発明において、宿主細胞を改変するために用いることができるTKTは、カルボニル基を含む構造、例えばCCH2OHで表される構造を、ある糖から別の糖へ転移させる反応を触媒する酵素活性を有するものであれば特に限定されない。また、TKTは、特に限定されないが、微生物由来のものであるのが好ましく、大腸菌由来のものであるのがより好ましい。本発明において、例えば、配列番号4に示すヌクレオチド配列にコードされる、大腸菌由来のTKTを好適に用いることが出来る。本発明において、宿主細胞を改変するために用いることができるPEPSは、ピルビン酸からホスホエノールピルビン酸を生成する反応を触媒する酵素活性を有するものであれば特に限定されない。また、PEPSは、特に限定されないが、微生物由来のものであるのが好ましく、大腸菌由来のものであるのがより好ましい。本発明において、例えば、配列番号5に示すヌクレオチド配列にコードされる、大腸菌由来のPEPSを好適に用いることが出来る。即ち、本発明に使用される酵素としては、これらに限定されないが、以下のまたはのタンパク質が挙げられる:配列番号2、3、4、5、6もしくは36もしくは37、7、8、9もしくは10、11、12、13、14、15、16または17のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質;配列番号2、3、4、5、6もしくは36もしくは37、7、8、9もしくは10、11、12、13、14、15、16または17のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、fbrDAHPS、fbrCMPDH、TKT、PEPS、TYR、ORF378、DODC、MAO、NCS、6OMT、CNMT、4OMT、CYP80G2、P450レダクターゼまたはBBEの酵素活性を有するタンパク質。本発明に使用されるタンパク質としては、以下ののタンパク質も挙げられる。配列番号2、3、4、5、6もしくは36もしくは37、7、8、9もしくは10、11、12、13、14、15、16または17のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列に対して、70以上、好ましくは80以上、より好ましくは90以上、さらに好ましくは95以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、fbrDAHPS、fbrCMPDH、TKT、PEPS、TYR、ORF378、DODC、MAO、NCS、6OMT、CNMT、4OMT、CYP80G2、P450レダクターゼまたはBBEの酵素活性を有するタンパク質。上記の、のタンパク質は、fbrDAHPS、fbrCMPDH、TKT、PEPS、TYR、ORF378、DODC、MAO、NCS、6OMT、CNMT、4OMT、CYP80G2、P450レダクターゼまたはBBEの酵素活性を有するというのタンパク質の機能が失われない程度にアミノ酸変異欠失、置換、付加が起こっているタンパク質である。このような変異には、自然界において生じる変異の他に、人為的な変異も含まれる。人為的な変異を生じさせる手段としては、部位特異的突然変異誘発法NucleicAcidsRes10648765001982が挙げられるがこれに限定されるわけではない。変異欠失、置換、付加したアミノ酸の数は、上記のタンパク質の酵素活性が失われない限りその個数は制限されないが、好ましくは50アミノ酸以内であり、さらに好ましくは30アミノ酸以内である。のタンパク質も、fbrDAHPS、fbrCMPDH、TKT、PEPS、TYR、ORF378、DODC、MAO、NCS、6OMT、CNMT、4OMT、CYP80G2、P450レダクターゼまたはBBEの酵素活性を有するというのタンパク質の機能が失われない程度ののタンパク質に対する相同性を有するタンパク質である。相同性は、70以上が好ましく、90以上が特に好ましい。本発明において相同性とは、2つのポリペプチドあるいはポリヌクレオチド間の配列の類似の程度を意味し、比較対象のアミノ酸配列または塩基配列の領域にわたって最適な状態配列の一致が最大となる状態にアラインメントされた2つの配列を比較することにより決定される。相同性の数値は、アラインメントされた両方のアミノ酸または塩基配列において同一のアミノ酸または塩基が存在する部位の数を決定し、次いで当該部位の数を比較対象の配列領域内のアミノ酸または塩基の総数で割り、得られた数値に100をかけることにより算出される。最適なアラインメントおよび相同性を得るためのアルゴリズムとしては当業者が通常利用可能な種々のアルゴリズム例えば、BLASTアルゴリズム、FASTAアルゴリズムなどが挙げられる。アミノ酸配列の相同性は、例えばBLASTP、FASTAなどの配列解析ソフトウェアを用いて決定される。塩基配列の相同性は、BLASTN、FASTAなどのソフトウェアを用いて決定される。タンパク質がfbrDAHPS、fbrCMPDH、TKT、PEPS、TYR、ORF378、DODC、MAO、NCS、6OMT、CNMT、4OMT、CYP80G2、P450レダクターゼまたはBBEの酵素活性を有するか否かは、該タンパク質調製物にそれぞれの反応基質を添加し、それぞれの酵素の反応生成物が生成したか否かを調べることにより判定することが出来る。fbrDAHPSについてはエリトロース4リン酸およびホスホエノールピルビン酸を添加し、3デオキシDアラビノヘプツロソン酸7リン酸が生成したか、fbrCMPDHについてはコリスミ酸を添加し、4ヒドロキシフェニルピルビン酸が生成したか、TKTについては例えばリボース5リン酸およびキシルロース5リン酸を添加し、グリセルアルデヒド3リン酸およびセドヘプツロース7リン酸が生成したか、PEPSについてはピルビン酸を添加し、ホスホエノールピルビン酸が生成したか、TYRまたはTYRおよびORF378についてはLチロシンを添加し、LDOPAが生成したか、DODCについてはLDOPAを添加し、ドーパミンが生成したか、MAOについてはドーパミンを添加し、34DHPAAが生成したか、NCSについてはドーパミンと34DHPAAを添加し、3ヒドロキシノルコクラウリンが生成したか、6OMTについては3ヒドロキシノルコクラウリンを添加し、3ヒドロキシコクラウリンが生成したか、CNMTについては3ヒドロキシコクラウリンを添加し、3ヒドロキシNメチルコクラウリンが生成したか、4OMTについては3ヒドロキシNメチルコクラウリンを添加し、レチクリンが生成したかを調べることにより、その活性の有無を判定することが出来る。また、CYP80G2およびP450レダクターゼについては、それらの共存下でレチクリンを添加し、コリツベリンが生成したか、そしてBBEについては、レチクリンを添加し、スコウレリンが生成したかを調べることによりその活性の有無を判定することが出来る。なお、コリツベリンからマグノフロリンの反応を触媒するCNMTは、3ヒドロキシコクラウリンから3ヒドロキシNメチルコクラウリンの反応を触媒するCNMTと同じものを用いることが出来るが、コリツベリンからマグノフロリンへの反応を触媒するか否かを、コリツベリンを添加し、マグノフロリンが生成したかを調べることによりその活性の有無を判定するとよい。fbrDAHPSがフィードバック阻害耐性であるか否かは、フェニルアラニンの存在下および非存在下それぞれにおいて酵素活性を測定し、同条件における野生型のDAHPSの酵素活性と比較することによって確認することができる例えば、KikuchiYetalApplEnvironMicrobiol63761762参照。同様に、fbrCMPDHがフィードバック阻害耐性であるか否かは、チロシンの存在下および非存在下それぞれにおいて酵素活性を測定し、同条件における野生型のCMPDHの酵素活性と比較することによって確認することができる例えば、LutkeEverslohTandStephanopoulosGApplEnvironMicrobiol7172247228参照。反応生成物が、3デオキシDアラビノヘプツロソン酸7リン酸、4ヒドロキシフェニルピルビン酸、グリセルアルデヒド3リン酸、セドヘプツロース7リン酸、ホスホエノールピルビン酸、LDOPA、ドーパミン、34DHPAA、3ヒドロキシノルコクラウリン、3ヒドロキシコクラウリン、3ヒドロキシNメチルコクラウリン、レチクリンあるいは目的のイソキノリンアルカロイド例えば、マグノフロリン、スコウレリン、ベルベリン等であるか否かは、当業者に周知のあらゆる手段によって確認することが出来る。具体的には、反応生成物と3デオキシDアラビノヘプツロソン酸7リン酸、4ヒドロキシフェニルピルビン酸、グリセルアルデヒド3リン酸、セドヘプツロース7リン酸、ホスホエノールピルビン酸、LDOPA、ドーパミン、34DHPAA、3ヒドロキシノルコクラウリン、3ヒドロキシコクラウリン、3ヒドロキシNメチルコクラウリン、レチクリンまたは目的のイソキノリンアルカロイドのそれぞれの標品とを、LCMSに供し、得られるスペクトルを比較することによって同定することが出来る。また、生成物と対応する標品とのNMR分析による比較によっても確認することが出来る。次いで、本発明に利用できるfbrDAHPS、fbrCMPDH、TKT、PEPS、TYR、ORF378、DODC、MAO、NCS、6OMT、CNMT、4OMTまたはレチクリンを出発物質として作用するイソキノリンアルカロイド生合成酵素をコードする遺伝子について説明する。本発明において好適に使用される、fbrDAHPS、fbrCMPDH、TKT、PEPS、TYR、ORF378、DODC、MAO、NCS、6OMT、CNMT、4OMT、またはイソキノリンアルカロイド生合成酵素の具体例であるCYP80G2、P450レダクターゼもしくはBBEをコードする遺伝子としては、例えば、それぞれ配列番号2、3、4、5、6もしくは36もしくは37、7、8、9もしくは10、11、12、13、14、15、16または17に示すヌクレオチド配列からなる遺伝子が挙げられる。即ち、本発明に使用される遺伝子は、これらに限定されないが、好ましくは、以下のまたはのDNAである遺伝子である:配列番号2、3、4、5、6もしくは36もしくは37、7、8、9もしくは10、11、12、13、14、15、16または17のヌクレオチド配列からなるDNA;のヌクレオチド配列からなるDNAと相補的なヌクレオチド配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、fbrDAHPS、fbrCMPDH、TKT、PEPS、TYR、ORF378、DODC、MAO、NCS、6OMT、CNMT、4OMT、CYP80G2、P450レダクターゼまたはBBEの酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA。さらに、本発明に使用される遺伝子としては、以下ののDNAである遺伝子も挙げられる:配列番号2、3、4、5、6もしくは36もしくは37、7、8、9もしくは10、11、12、13、14、15、16または17のヌクレオチド配列に対して、70以上、好ましくは80以上、より好ましくは90以上、さらに好ましくは95以上の相同性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、fbrDAHPS、fbrCMPDH、TKT、PEPS、TYR、ORF378、DODC、MAO、NCS、6OMT、CNMT、4OMT、CYP80G2、P450レダクターゼまたはBBEの酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA。ここで、ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが起こり、非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件をいう。このような条件は、通常、6M尿素、04SDS、05xSSC程度である。ハイブリダイゼーションにより得られるDNAはのヌクレオチド配列からなるDNAと70以上の高い相同性を有することが望ましく、さらに80以上の相同性を有することが好ましい。ここで相同性については上記したとおりである。上記遺伝子によってコードされるタンパク質がfbrDAHPS、fbrCMPDH、TKT、PEPS、TYR、ORF378、DODC、MAO、NCS、6OMT、CNMT、4OMT、CYP80G2、P450レダクターゼまたはBBEの酵素活性を有するか否かの確認方法は、タンパク質について上記したとおりである。上記遺伝子は、当業者に周知のPCRまたはハイブリダイゼーション技術によって取得することが可能であり、あるいはDNA合成機などを用いて人工的に合成してもよい。配列の決定は常套方法により配列決定機を用いて行うことが出来る。材料全ての合成遺伝子は、GenScriptIncから入手した。ノルラウダノソリンは、AcrosOrganicsから購入した。Lチロシン、LDOPAおよびドーパミンは、SigmaAldrichから購入した。レチクリンは、三井化学株式会社から寄贈されたものを使用した。発現ベクターの構築tyrAfbraroGfbrtktAppsApCOLADuet1の構築Lチロシンを過剰生産する宿主細胞を作出するために、以下の4つの遺伝子を含む発現ベクターを構築した:tyrAfbrfbrCMPDH、aroGfbrfbrDAHPS、tktATKTおよびppsAPEPS。まず、pUC57にクローニングされたtyrAfbrおよびaroGfbr遺伝子を、GenScriptIncから購入した。該プラスミドにおいて、tyrAfbrはNcoIおよびEcoRI制限酵素の認識サイトに隣接しており、aroGfbrは、T7プロモーターに連結していた。また、EcoRI部位が該T7プロモーターの上流に位置しており、SacI部位がaroGfbrの下流に位置していた。tktAおよびppsA遺伝子を、大腸菌K12MG1655のゲノムDNAから、それぞれNdeItktAF配列番号18とtktAXhoIR配列番号19のプライマーセットおよびNdeIppsAF配列番号20とppsAXhoIR配列番号21のプライマーセット表1を用いて増幅した。NdeIXhoIを用いた制限酵素消化の後、tktAおよびppsA遺伝子を個別に、それぞれpET41aNovagenおよびpCOLADuet1MerckのNdeIXhoI部位へクローニングした。上記4つの遺伝子を含む発現プラスミドを構築するため、tyrAfbr遺伝子を含むDNA断片をNcoIおよびEcoRIを用いてtyrAfbrpUC57から切り出し、その後、pCOLADuet1のNcoIEcoRI部位へクローニングした。次に、aroGfbrpUC57のEcoRISacI断片T7プロモーターに結合したaroGfbr遺伝子を含むを、tyrAfbrpCOLADuet1のEcoRISacI部位へクローニングした。かくして、tyrAfbraroGfbrの発現ベクターtyrAfbraroGfbrpCOLADuet1を得た。次いで、T7プロモーターの制御下にあるtktAを、tktApET41aから、プライマー5SacT7配列番号22および3NottktA配列番号23表1を用いて増幅した。次いで、該tktAおよびT7プロモーターを、tyrAfbraroGfbrpCOLADuet1のSacINotI部位へクローニングし、tyrAfbraroGfbrtktApCOLADuet1を得た。最後に、NotIおよびXhoIを用いてppsApCOLADuet1を消化し、ppsA遺伝子およびT7プロモーターを含む断片を得た。次いでこの断片をtyrAfbraroGfbrtktApCOLADuet1のNotIXhoI部位へクローニングしてtyrAfbraroGfbrtktAppsApCOLADuet1を得図8、その配列を確認した。NCSORF378TYRDODCoptMAOpKK2233の構築ノルラウダノソリンの合成経路を再構築するため、以下の4つの酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクターを構築した:StreptomycescastaneoglobisporusのチロシナーゼTYRの完全な活性のため、TYRおよびそのアダプタータンパク質ORF378を共発現させる、PseudomonasputidaのLDOPA特異的デカルボキシラーゼDODC、MicrococcusluteusのモノアミンオキシダーゼMAOおよびオウレンのノルコクラウリンシンターゼNCS。まず、特開2009-225669号公報およびMinamiHetalProcNatlAcadSciUSA10573937398に記載される方法に従って、MicrococcusluteusのMAO遺伝子配列番号9およびオウレンのNCS遺伝子配列番号11を含む発現ベクターpKK2233NCSMAOpKK2233を作成した。ここで、天然のMAOは大腸菌における発現レベルが低いため、本発明者らはコドンを最適化したMAO配列番号10、以下、optMAOと称するを用いることとした。具体的には、pGS21aプラスミドにクローニングされたoptMAO遺伝子をGenScriptIncから購入し、上記NCSMAOpKK2233中に含まれるMAO遺伝子を、T7プロモーターに駆動されるoptMAO遺伝子によって置き換えた。当該置換は、上記購入したoptMAO遺伝子を含むpGS21aプラスミドから、プライマー5BamT7配列番号24および3oMAO配列番号25表1を用いるPCRによってoptMAO遺伝子およびT7プロモーターを含むBamHIHindIII断片を生成し、該断片をNCSMAOpKK2233のBamHIHindIII部位へ組み込むことによって達成され、その結果NCSoptMAOpKK2233を得た。PseudomonasputidaKT2440株のLDOPA特異的デカルボキシラーゼDODC;EC41128に属する芳香族Lアミノ酸デカルボキシラーゼの遺伝子配列番号8を、同株のゲノムDNAからプライマー5NdeDODC配列番号26および3BamDODC配列番号27表1を用いてPCRにより増幅した。当該PCR産物をNdeIBamHIで消化した後、pET3aNovagenのNdeIBamHI部位へ連結することにより、DODCpET3aを得た。かかるDODCは、他の芳香族アミノ酸に比して103倍を超えるLDOPA選択性を示すデカルボキシラーゼである。次いで、T7プロモーターを伴うDODC遺伝子を、該DODCpET3aからプライマー5BamSacRVT7配列番号28および3BamDODC配列番号27表1を用いて増幅し、これをNCSoptMAOpKK2233のBamHI部位へクローニングしてNCSDODCoptMAOpKK2233を得た。pGS21a中に直列にクローニングされ、各々が独立してT7プロモーターに駆動されている、StreptomycescastaneoglobisporusのTYR遺伝子配列番号6およびORF378配列番号7を、GenScriptIncから購入した。このコンストラクトにおいては、両遺伝子のコドン使用頻度が最適化されている。プライマー5SacT7配列番号22および3pGSEcoRV配列番号29表1を用いて増幅された、TYR遺伝子およびORF378を含むPCR産物SacIEcoRV断片を、NCSDODCoptMAOpKK2233のNCSとDODCの間に位置するSacIEcoRV部位に連結し、NCSORF378TYRDODCoptMAOpKK2233を得た。NCSORF378TYRDODCoptMAOpET21dの構築骨格の異なるプラスミドを有する宿主細胞の間で生産を比較するために、pET21dNovagenプラスミドに基づくベクターを作成した。まず、NCSに結合したT7プロモーターを含む断片を、NCSMAOpKK2233から、プライマー5BglIIT7配列番号30および3NCSBamSacRV配列番号31表1を用いて増幅した。次いで、該断片を、pET21dのBglIIBamHI部位へ連結した。DODCおよびoptMAO遺伝子を含む、NCSDODCoptMAOpKK2233のSacIHindIII断片を、NCSpET21dのSacIHindIII部位へ連結して、NCSDODCoptMAOpET21dを得た。最後に、TYR遺伝子およびORF378を含む上記のPCR産物SacIEcoRV断片を、NCSDODCoptMAOpET21dのSacIEcoRV部位に連結して、NCSORF378TYRDODCoptMAOpET21dを得た図8。NCSRsTYRDODCoptMAOpKK2233およびNCSRsTYRDODCoptMAOpET21dの構築pGS21a中にクローニングされた、RalstoniasolanacearumのTYRRsTYR遺伝子配列番号37を、GenScriptIncから購入した。このコンストラクトにおいては、RsTYR遺伝子のコドン使用頻度が最適化されている。上記のNCSORF378TYRDODCoptMAOpKK2233およびNCSORF378TYRDODCoptMAOpET21dの構築と同じ手順に従いプライマーも同一のものを使用、StreptomycescastaneoglobisporusのTYR遺伝子およびORF378の代わりに該RsTYR遺伝子配列番号37の配列を用いて、NCSRsTYRDODCoptMAOpKK2233およびNCSRsTYRDODCoptMAOpET21dを作成した図11、後者のコンストラクトのみを示す。振盪フラスコ培養を用い、pET21dおよびpKK2233プラスミドコンストラクトを有する組換え宿主細胞の間で生産性を比較したところ、pKK2233よりもpET21dに基づくプラスミドを有する組換え宿主細胞の方が、わずかにレチクリンの生産レベルが高いという結果を得たデータ示さず。したがって、本発明者らはNCSORF378TYRDODCoptMAOpET21dおよびNCSRsTYRDODCoptMAOpET21dを、ノルラウダノソリン合成経路の酵素を発現させるためのプラスミドとして選択した。6OMT4OMTCNMTpACYC184の構築ノルラウダノソリンからレチクリンを合成する経路を再構築するため、前述の特開2009-225669号公報およびMinamiHetalProcNatlAcadSciUSA10573937398に記載される方法に従って、オウレンの6OMT、4OMTおよびCNMT遺伝子を含む発現ベクターpACYC1846OMT4OMTCNMTpACYC184を構築した図8。本実施例において用いた代表的なPCR条件を以下に示す最初の変性工程、94°C、2分94°C、15秒の変性、50°C、30秒のアニーリングおよび68°C、90秒のDNA伸長からなるサイクルを30サイクル;そして最後の68°C、5分の伸長;これにはKODplusDNAポリメラーゼを用いた。本実施例において、PCRは、鋳型とするDNA配列およびプライマーの長さ、Tm値などに応じて適宜条件を変更して行った。PCR条件を最適化することは、当業者に周知の手法である。レチクリン生産株の作出まず、Lチロシンを過剰生産する宿主細胞を作出するため、LutkeEverslohTandGregoryStephanopoulosGApplMicrobiolBiotechnol75103110に記載されているLチロシンを過剰生産する大腸菌株の遺伝的構成を採用した。具体的には、tyrR遺伝子中にノックアウト突然変異を有し、tyrAfbr、aroGfbr、tktAおよびppsAを発現するプラスミドを有する大腸菌株を作出した。tyrR遺伝子の欠失は、QuickEasyEcoliGeneDeletionKitGeneBridgesを用いて、PCR産物との組換えによって達成した。具体的には、該キットに含まれるFRTPGKgb2neoFRTの配列を有するプラスミドを鋳型とし、tyrR遺伝子と相同な配列を5末端に有するプライマーdtyrRSmF配列番号32およびdtyrRSmR配列番号33表1を用いてFRT配列を有するカナマイシン耐性遺伝子カセットをPCR増幅することにより、FRT配列を有するカナマイシン耐性遺伝子カセットの両端にtyrR遺伝子と相同な配列を有するDNA断片を得た。次いで、該断片を用いて大腸菌BL21DE3を形質転換し、相同組換えによってFRT配列を有するカナマイシン耐性遺伝子カセットをtyrR遺伝子内部に導入した。その後、FLP発現ベクター708FLPeGeneBridgesを用いて該大腸菌BL21DE3を形質転換し、FLPリコンビナーゼの作用によってカナマイシン耐性遺伝子カセットを除去した。最後に、tyrRnull変異を、プライマー5tyrRKOcheck配列番号34および3tyrRKOcheck配列番号35表1を用いて、PCRによって確認した。上記tyrRnull変異を有する大腸菌BL21DE3を、tyrAfbraroGfbrtktAppsApCOLADuet1図8を用いて形質転換し、Lチロシン過剰生産株を得た。次いで、該Lチロシン過剰生産株を、NCSORF378TYRDODCoptMAOpET21dおよび6OMT4OMTCNMTpACYC184図8を用いて形質転換して、レチクリン生産株を得た本明細書において、かかる株を組換え生産株Aと称する。また、Lチロシンの生産に関して上記の改変tyrRnull変異およびtyrAfbraroGfbrtktAppsApCOLADuet1の導入がなされていない大腸菌BL21DE3株をNCSORF378TYRDODCoptMAOpET21dおよび6OMT4OMTCNMTpACYC184を用いて形質転換して組換え大腸菌株を得た本明細書において、かかる株を組換え生産株Bと称する。さらに、上記Lチロシン過剰生産株tyrRnull変異を有し、かつ、tyrAfbraroGfbrtktAppsApCOLADuet1で形質転換されている大腸菌BL21を、NCSRsTYRDODCoptMAOpET21d図11および6OMT4OMTCNMTpACYC184を用いて形質転換して、レチクリン生産株を得た本明細書において、かかる株を組換え生産株Cと称する。これら組換え生産株A、BおよびCを、レチクリン生産のために使用した。本実施例において用いたプライマーの配列を、以下に示す。培養条件宿主細胞を液体LB培地中において37°Cで終夜培養し、10mLの細胞培養物を、1Lの改変した常套の培地3LのジャーファーメンターBMS03PI、ABLE中において、1リットルあたり以下を含む:476gのTurboBrothAthenaEnzymeSystem、16gのNH4Cl、249mgのCuSO45H2O、3gのグルコースまたは5gのグリセロール、50mgのアンピシリン、25mgのカナマイシン、および50mgのクロラムフェニコールに接種した。28のNH4OHおよび1MのHClを自動添加することにより、pHを71に維持した。接種時における撹拌速度は100rpmであり、溶存酸素レベルは、1vv1m1の連続的通気を用いて、酸素飽和度10まで低下させた。グルコース濃度は、05gmLのグルコース溶液の添加によって、01から7gLの間に維持した。グリセロール濃度は、1gmLのグリセロール溶液の添加によって、01から6gLの間に維持した。必要に応じ、OD600が10炭素源としてグルコースを用いる培地における培養の場合または15炭素源としてグリセロールを用いる培地における培養の場合に達した時点で、ベクター付属の説明書等において示された、あるいは指定された濃度最終濃度のIPTGを培養物に添加して発現誘導を行った。化合物の検出および定量製造元の説明書に従い、グルコースCII-テストワコー和光純薬工業株式会社を用いてムタロターゼ-グルコース法によって培地中のグルコースを解析した。製造元の説明書に従い、GlycerolAssayKitCaymanChemicalCoを用いて培地中のグリセロールを解析した。培地中におけるレチクリン以外の芳香族化合物は、DiscoveryHSF5カラムSupelcoを備えるHPLCによって解析した。05mL分の流速で、10mMのギ酸アンモニウムpH30中におけるアセトニトリル濃度を3から20まで増大させることにより、化合物をカラム上で分離した。280nmにおける吸光度を測定することにより、化合物の溶出をモニターした。生産されたレチクリンを測定するため、様々な時点で培養上清を回収し、2のトリクロロ酢酸を用いてタンパク質を沈殿させた。上清を、AgilentHPLCsystem上で分離した後、LCMS3200QTRAP、AppliedBiosystemsJapanLtdによって解析した。HPLCの条件は以下の通りであった:カラム、TSKgelODS80Ts46×250mm;東ソー株式会社;溶媒系、A:01酢酸水溶液、B:01の酢酸を含有するアセトニトリル溶液;グラジエントモード:90のA05分、90から60のA520分、10のA2030分;流速、05mL分、温度:40°C。レチクリンを、LCタンデムMSLCMSMSにおける断片化スペクトルについて標準レチクリン研究室ストックと比較することによって同定した。Analyst141ソフトウェアを用いて、検量線μmol対ピーク面積からレチクリンの量を推定した。生産されたレチクリンを、AgilentHPLCsystem上で分離した後、LCMSに供することによって、該レチクリンの立体選択性を解析した。HPLCの条件は以下の通りであった:カラム、CHIRALCELODH46×250mm、ダイセル化学工業株式会社;溶媒系、ヘキサン2プロパノールジエチルアミン72:28:01;流速、055mL分、温度:40°C。レチクリンの精製OasisHLB固相抽出カートリッジWatersおよびHPLCにより、培養上清からレチクリンを精製した。培養上清をロードする前に、該カートリッジを水で前平衡化した。カートリッジを5のメタノールで洗浄し、その後100のメタノールを用いてレチクリンを溶出した。溶出液を、上記の条件において、TSKgelODS80Tsカラムを備えるHPLCに供試した。レチクリンに相当するピーク画分を回収し、その後、精製の程度をMS解析によって確認した。結果組換え宿主細胞によるレチクリンの生産上記の通りに作出した2種の組換え大腸菌株tyrRnull変異を有し、発現プラスミドtyrAfbraroGfbrtktAppsApCOLADuet1、NCSORF378TYRDODCoptMAOpET21dおよび6OMT4OMTCNMTpACYC184を有する組換え生産株A、および、Lチロシンの生産に関わる代謝経路が改変されておらず、発現プラスミドNCSORF378TYRDODCoptMAOpET21dおよび6OMT4OMTCNMTpACYC184を有する組換え生産株Bを、炭素源としてグルコースを含む培地を用いてジャーファーメンター中において培養し、レチクリンの生産を測定するために培地を様々な時点において回収した。液体クロマトグラフィー質量分析LCMSの結果、組換え生産株Bは80時間のうちに培地中のグルコースからレチクリンを培地1Lあたり053mgの収量で生産し、一方、組換え生産株Aは、80時間のうちに培地中のグルコースからレチクリンを培地1Lあたり22mgの収量で生産したことが示された図2。また、グルコースを含まない培地においては、組換え生産株Aによるレチクリンの収量は80μgLと極めて低かった図2。これらの結果は、単純な炭素源であるグルコースからレチクリンが得られたことを示す。また、上記組換え生産株Aにおいては、IPTGによる誘導がなくとも、導入した生合成遺伝子のリーク発現によってレチクリンが生産された図3。これは本発明によるレチクリンの生産コストを実質的に減少させることが可能であることを意味する。さらに、炭素源としてグリセロールを含む培地を用いて組換え生産株Aを培養した場合には、80時間におけるレチクリンの収量は培地1Lあたり62mgにまで増大し図9、これは炭素源としてグルコースを用いた培地における生産量よりもおよそ3倍高いものであった。別の実験として、上記組換え生産株AおよびCを、炭素源としてグリセロールを含む培地において培養し、レチクリン生産量を測定した。その結果、組換え生産株Cにおいては、同条件において組換え生産株Aを用いた場合の収量のおよそ7倍にあたる、培地1Lあたり最大46mg3回の独立した実験の平均として405±48mgLのレチクリンが生産された図12。かかる結果は、RsTYRの採用によってアダプタータンパク質を用いることなくレチクリンの生産を達成でき、かつ、レチクリン生産量を増大させ得ることを実証したものと言える。RsTYRを用いたドーパミン生産株上記Lチロシン過剰生産株にRsTYRおよびDODCを導入した株が、ScastaneoglobisporusのTYRを用いたドーパミン生産株上記Lチロシン過剰生産株にScastaneoglobisporusのTYRおよびDODCを導入した株のほぼ4倍の収量にあたる105±005gL685±030mMのドーパミンを生産したことからデータ示さず、ドーパミンの生産能力の増大が、組換え生産株Cにおけるレチクリン生産の増大に寄与している可能性が考えられる。インビボでレチクリンを生産するための公知の方法特許文献1および2、非特許文献14においてはラセミ体としてレチクリンが生産されるのに対し、本発明の上記組換え生産株Aを用いる方法においては、レチクリンのみが生産された図6。また、該組換え生産株Aの培養中、静止期においては中間体としてLチロシンが蓄積したが、培養期間全体においてLDOPAおよびドーパミンの蓄積は観察されなかった図7。ドーパミンが全く蓄積しないことにより、体特異的にノルラウダノソリンを生成するNCSの触媒作用によらないでドーパミンと34DHPAAとが自発的縮合反応を起こすことが妨げられる。その結果、ラセミ混合物としてノルラウダノソリンが生成されることはなく、レチクリンのみが得られるものと考えられる。