"候補化合物の生物学的活性度を測定する方法であって、標本ウェル内の観察エリア内に細胞の集団を設置する工程と、前記細胞の集団を前記化合物に曝露する工程と、前記細胞の集団を電界に曝露して前記細胞の集団の膜内外電位の変化の制御を生じさせる工程であり、前記電界は第1のパルスの連続と第2のパルスの連続との間には一時停止がある第1のパルスの連続および第2のパルスの連続を含んでいる工程と、前記第1のパルスの連続および前記第2のパルスの連続の少なくとも一部の間に前記細胞の集団の膜内外電位の変化をモニタリングする工程とを含む方法。モニタリングは光学的モニタリングを含む請求項1に記載の方法。光学的モニタリングには、前記細胞集団を含んだ観察エリアからのFRETベースの電圧センサの蛍光放出を検出する工程を含む請求項2に記載の方法。前記第1のパルスの連続から収集したデータを前記第2のパルスの連続から収集したデータとを比較する工程をさらに含む請求項1に記載の方法。内外膜電位の変化は前記化合物によるブロックからのイオンチャネル回復を表す請求項1に記載の方法。前記一時停止は前記第1のパルスの連続における任意の2つのパルス間の時間間隔の少なくとも2倍長い持続時間を有する請求項1に記載の方法。候補化合物の生物学的活性度を測定する方法であって、標本ウェル内の観察エリア内に細胞の集団を設置する工程と、前記細胞の集団を前記化合物に曝露する工程と、前記細胞の集団を電界に曝露して前記細胞の集団の膜内外電位の変化の制御を生じさせる工程であり、前記電界はパルスの連続を含んでいる工程と、前記細胞の集団の膜内外電位の変化をモニタリングする工程と、前記パルスの連続の第1の部分の前記電界に対する膜内外電位反応の濃度依存性を、前記パルスの連続の第2部分の前記電界に対する膜内外電位反応の濃度依存性とを比較する工程とを含む方法。モニタリングは光学的モニタリングを含む請求項7に記載の方法。光学的モニタリングには、前記細胞集団を含んだ観察エリアからのFRETベースの電圧センサの蛍光放出を検出する工程を含む請求項8に記載の方法。内外膜電位の変化は前記細胞の集団におけるイオンチャネルの使用依存性ブロックを表す請求項7に記載の方法。パッチクランプの使用と比較して、光学的分析法は、本来的に、細胞の膜内外電位差を調整したりクランプしたりする能力を備えていない。クランプ法は極めて高度で融通性に富むイオンチャネル測定を提供するものであるので、非常に望ましいものである。したがって、光学的分析法と両立し、高い処理量を得られる生態細胞の膜電位を調整する確実で特定の方法に対する需要が存在する。発明の概要いくつかの実施形態では、候補化合物の生物学的活性度を特徴付ける方法は、細胞の集団をサンプルウェルの観察エリア内に設置する工程と、細胞の集団を化合物に曝露する工程と、細胞の集団を電界に曝露して細胞の集団の膜内外電位の変化の制御を生じさせる工程であり、電界は第1のパルスの連続と第2のパルスの連続との間には一時停止がある第1のパルスの連続および第2のパルスの連続を含んでいる工程と、第1のパルスの連続および第2のパルスの連続の少なくとも一部の間に細胞の集団の膜内外電位の変化をモニタリングする工程とを含む。いくつかの有利な実施形態では、モニタリングは細胞の集団を含む観察エリアからのFRETベースの電圧センサの蛍光放出を検出することによるなどの光学的モニタリングを含む。いくつかの有利な実施形態では、さらに第1のパルスの連続から収集されたデータと第2のパルスの連続から収集されたデータとを比較する工程を含む。いくつかの有利な実施形態では、膜内外電位の変化は化合物による遮断からのイオンチャネル回復を表すものである。いくつかの実施形態では、一時停止は第1のパルスの連続における任意の2つのパルス間の時間間隔の少なくとも2倍長い持続時間を有する。他の実施形態では、候補化合物の生物学的活性度を特徴付ける方法は、細胞の集団をサンプルウェルの観察エリア内に設置する工程と、細胞の集団を化合物に曝露する工程と、細胞の集団を電界に曝露して細胞の集団の膜内外電位の変化の制御を生じさせる工程であり、電界はパルスの連続を含んでいる工程と、細胞の集団の膜内外電位の変化をモニタリングする工程と、パルスの連続の第1の部分の電界に反応する膜内外電位の濃度依存性を、パルスの連続の第2の部分の電界に反応する膜内外電位の濃度依存性と比較する工程とを含む。いくつかの有利な実施形態では、モニタリングには、細胞の集団を含む観察エリアからのFRETベースの電圧センサの蛍光放出を検出することによるなどの光学的モニタリングを含む。いくつかの有利な実施形態では、膜内外電位の変化は細胞の集団のあるイオンチャネルの頻度依存性遮断を表す。図面の簡単な説明図1はディッパー電極アレイの一実施形態を示す。図2は表面電極を備えているマルチウェルプレートのいくつかの実施形態を示す。図3は電気刺激装置の一実施形態のブロック図を示す。図4は電圧に依存するナトリウムチャネルを発現する細胞上での繰り返し外部電界のシミュレートされた効果を示す。上側のパネルは加えられた電界を示し、中間のパネルは細胞内へのシミュレートされたナトリウム電流を示し、下側のパネルはシミュレートされた平均膜内外電位差を示す。図5は方形波の概略図を示す。図6は種々の波カーネルの例を示す。図7は直径6.2mmの円形ウェル内の種々の電極組立体の計算された電界プロファイルを示す。破線円は、直径3mmのビューウィンドウである。白い領域において、電界の強さは、ビューウィンドウ内の平均電界強度の10より小さい。灰色領域では、電界の強さは、ビューウィンドウ内の平均電界強度の10の範囲内である。黒い領域では、電界の強さは、ビューウィンドウ内の平均電界強度の10超である。図8はさし渡し6.2mmの円形および正方形のウェル内の種々の電極組立体の計算された電界プロファイルを示す。破線円は直径3mmのビューウィンドウである。白い領域では、電界の強さは、ビューウィンドウ内の平均電界強度の1より小さい。灰色領域では、電界強さは、ビューウィンドウ内の平均電界強度の1の範囲内である。黒い領域では、電界の強さは、ビューウィンドウ内の平均電界強度の1超である。図9は円形ウェル内の電界の一様性を改善するための種々の電極および絶縁体の設計を示す。図10は野生型CHO細胞における電気刺激の時間経過にわたる変化するパルス振幅における電気刺激プロトコルの効果を示す図である。図11は野生型CHO細胞に対する電気刺激中の最大細胞反応と加えられたパルス振幅との間の関係を示す。データは、約5秒後に図10からとられたものである。図12は野生型CHO細胞におけるTTXの効果に対する用量反応曲線を示す。刺激パラメータは、3秒間にわたって33V/cm、50Hzであり、二相方形波カーネルであった1相フェーズあたり5ms。実線は、EC50=9nMおよびヒル係数1.47のデータへのヒル関数へのフィッティングである。図13は電気刺激中の野生型CHO細胞のパルス持続時間および周波数と細胞反応との間の関係を示す。電界強さは常に25V/cmであった。刺激は、変化する持続時間および周波数の二相パルスの3秒バーストであった。実線は形へのフィッティングである。図14は種々の電界強さにおいて電気的に刺激されたNaV2ナトリウムチャネル細胞を発現するCHO細胞の時間トレースを示す。細胞は、96ウェルプレート内で、20Hz、3秒長で継続する二相、5ms/相の電圧パルスにより刺激された。刺激はグラフの陰影を施された部分中に生じた。この実験では、細胞は、20μMCC2-DMPEおよび63nMDiSBAC63で染色された。この染料の組合せは、時定数が2msで、膜内外電位差を正確に追跡する。反応の立上り時間と立下り時間は指数関数的減衰関数にフィットし、τrise=200msおよびτfall=850msであることが判明した。図15は電界強さと電気刺激の4秒後正方形および10秒後円形に測定された細胞反応との間の関係を示す。線は、データへのボルツマンフィッティングBoltzmanfitを示す。図16はNaV2ナトリウムチャネルを発現するCHO細胞の細胞反応へのパルス持続時間と刺激周波数の影響を示す。図17は刺激の持続時間に対して描かれた図16のデータへのフィッティングからの膝knee時間パラメータT0の影響を示す。図18は電気刺激中のNaV3ナトリウムチャネルを発現するHEK-293細胞の時間的反応を示す。図19はNaV3ナトリウムチャネルを発現するHEK-293に対するテトラカイン図19Aおよびテトロドトキシン図19Bに対する用量反応曲線を示す。電気刺激条件は、E=33V/cm、10ms/相の二相刺激、1.5秒間の15Hzバーストであった。図20はNaV4イオンチャネルを発現するHEK-293に対するテトラカインに対する用量反応曲線を示す。この実験のために、電気刺激パラメータは、E=33V/cm、10ms/相の二相刺激、1.5秒間の15Hzバーストであった。図21は野生型HEK-293細胞の電気刺激の全プレート図を示す。個々の各パネルは、96ウェルプレート内の単一のウェルの正規化された蛍光比の時間トレースを表す。垂直行内の各ウェルは、同じ電界強さで同時に刺激された。電界強さは左から右へ増大する。列6~8は、電圧依存カリウムチャネルをブロックするために10mMのTEAを含んでいた。図22は野生型HEKに対する刺激電界の関数としての細胞反応を示す。誤差バーは標準偏差である。白抜き記号:添加されたブロッカーなし。塗りつぶされた記号:カリウムチャネルをブロックするために10mMのTEAを添加。図23はNaV2ナトリウムチャネルを発現するCHO細胞における、ナトリウムチャネルブロッカーであるテトロドトキシンTTX図23Aおよびテトラカイン図23Bの選択された濃度に対する時間反応トレースを示す。図24はNaV2ナトリウムチャネルのTTXおよびテトラカイン阻害に対する用量反応曲線を示す。図25はランダムTTXスパイキング実験を示す。この11×8アレイ中の小さい箱は、96ウェルプレートの対応する位置におけるウェルの10秒間時間トレースを含む。12行目は、バックグラウンド除去のために使用される細胞なしの対照ウェルcontrolwellであったので、示されていない。ウェル1,1、2,2、3,3などは、TTXのブロッキング濃度を含んでいた。図26は図25に示されたランダムTTXスパイキングデータの分析を示す。データ点は、刺激バーストの開始すなわち、反応のピークの1.8~2.4秒後からの時間ウィンドウ内の比率測定反応である。黒丸点は、1μmTTXでスパイクされており、白丸ではブロッカーは添加されていない。図27は電気的に刺激されたHL5心筋細胞の全プレート図を示す。個々の各パネルは、96ウェルプレート内の単一のウェルの正規化された蛍光比の時間トレースを表す。垂直列の各ウェルは、同じ電界の強さで同時に刺激された。電界の強さは、左から右へ増大する。列5と6は、電圧依存ナトリウムチャネルを部分的にブロックするために10μMのTTXを含んでいた。列7と8は、電圧依存カリウムチャネルを部分的にブロックするために、10mMのTEAを含んでいた。図28は加えられた電界の強さの関数としての、HL5細胞の反応を示す。黒点は、化合物が加えられていない4つのウェルの反応の平均である。実線は、E50=22V/cmであるデータへのボルツマンフィッティングである。点は、スクリーニングウィンドウ:すなわち、反応の標準偏差に正規化された、反応と刺激されない反応との差である付録A3参照。図29は表面電極を用いた3つの別々の刺激サイクルの後の、カリウムチャネルとNaV3ナトリウムチャネルを発現するCHO細胞の、典型的な電圧反応である。図30は表面電極を介して、変化する電界強さの単相刺激で刺激された96ウェルマルチウェルプレート内で成長させられた細胞の集団の平均比率測定反応を示す。このカーブ中の点は、同じ培養地上での4つの刺激の平均ピーク反応である。図31は野生型RBLに対する刺激電界の関数としての細胞反応を示す。誤差バーは標準偏差である。白抜き記号:ブロッカーは添加されていない。塗りつぶされた記号:IRK1チャネルをブロックするために、400μMのTEAが添加されている。図32は1Hzで20秒間の電圧刺激の反復を用いた異なる化合物の種々の濃度の使用依存性効果を示す。図32Aは4つの化合物の結果を示し、図32はテトラカインとTTXとを重ね合わせて、使用依存性と使用非依存性化合物との区別を示している。図33は1Hzで20秒間の電気刺激の反復を用い、かつ第1および第20のピーク応答を比較する異なる4つの化合物の使用依存性効果を示す。図34Aは使用非依存性ブロックおよび使用依存性ブロックからのチャネルの回復を試験するためのシミュレーションプロトコルを示す。図34Bは0.5秒の列間隔におけるテトラカインおよびラモトリジンブロックからの濃度依存性回復を示す。図35ラモトリジンブロックおよびテトラカインブロックからのチャネルの回復の濃度依存性を示す。図36Aは異なる時間間隔についての50μMにおけるラモトリジンの結果を示し、図36Bは異なる時間間隔についての4μMにおけるテトラカインの結果を示す。図37はテトラカインとラモトリジンとの間の回復時間の対照を示す。図38はAδ型またはC型ニューロンのスライス標本を用いたブピバカインおよびリドカインによる発射周波数の低減を示す。図39はNav1.8発現細胞の誘起された自発的発射がラモトリジンおよびリドカインによって遅くなることを示している。図40はヘキシルアッセイを用いたミベフラジルの使用依存性の検出を示す。図41はラモトリジンおよびテトラカインによるナトリウムチャネルブロックに対するカリウム濃度の上昇の効果を示す。図42はニフェジピンおよびニモジピンによるL型カルシウムチャネルのブロックを示す。好適な実施形態の詳細な説明一般に、本明細書で使用する用語、および以下に記述する蛍光、コンピュータ、検出、化学および実験室手法の多くは、この技術分野において周知のものであって、一般的に採用されているものである。標準的な技術が、化学合成、蛍光、光学、分子生物学、コンピュータソフトウェアおよび統合化において、一般に用いられている。一般に、化学反応と細胞測定と酵素反応とは、適切な場合には、製造者の仕様に従って実行される。技術および手順は、一般に、本明細書に援用した、当該分野、および下記のものを含めた種々の一般的な参考文献における通常の方法に従って行われる。蛍光技術に関し:Lakowicz,J.R.TopicsinFluorescenceSpectroscopy、3volumesNewYork:PlenumPress1991、およびLakowicz,J.R.EmergingapplicationsoffluorescenceSpectroscopytocellularimaging:lifetimeimaging,metal-ligandprobes,multi-photonexcitationandlightquenching.ScanningMicroscSupplVol.101996、213-224。分子生物学的方法に関し:Sambrookら、MolecularCloning:ALaboratoryManual、第2版、1989ColdSpringHarborLaboratoryPress、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー。細胞生物学的方法に関し:Cells:ALaboratoryManual、第1版1998ColdSpringHarborLaboratoryPress、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー。一般的な光学的方法に関し:OpticsGuide5MellesGriotIrvineCA、OpticalWaveguideTheory、SnyderLovepublishedbyChapmanHall。一般的な電気生理学的方法およびイオンチャネルの諸特性について:Hille,B.IonicChannelsofExcitablemembranes、第2版1992SinauerAssociates,Inc.、Sunderland、Mass。電子回路に関して:HorowitzandHill、TheArtofElectronics、第2版1989CambridgeUniversityPress、Cambridge、U.K.。下記の定義は、ここで本発明を説明するために用いられる種々の用語の意味および範囲を示し、定義するために記述している。活性化という用語は、イオンチャネルの休止している非導通状態から活性化された導通状態への遷移を指す。活性化閾値という用語は、それより上ではチャネルの測定可能な開通が起きるような最低電位を指す。アノードという用語は、外部電源によりアースに対して正電位へ駆動されたときの電極を指す。細胞刺激領域という用語は、対象とする細胞がその中に置かれているような、大きな電気刺激通常、5V/cm以上高いを受けている2個の電極により画定される領域を意味する。通常、細胞刺激領域は観察領域よりも大きいか、または等しい。標準の96ウェルをベースとする測定のためには、細胞刺激領域は、通常、約16mm2である。観察領域という用語は、その上で測定が行われているような、システムの部分を意味する。観察領域は、マルチウェルプレートに基づく測定のためには、最低0.5mm2の領域である。生物発光タンパク質という用語は、化学反応の触媒作用によって光を生じさせることができるタンパク質を指す。この用語は、ルシフェリンを酸化させるなどの生物発光反応または化学発光反応を触媒するタンパク質を包含する。生物発光タンパク質という用語は、天然に存在する生物発光タンパク質のみでなく、変更されたスペクトルまたは物理的特性を示す突然変異体も含む。二相的biphasicという用語は、各々逆の極性を有する2つの部分を有するパルスを指す。ボルツマン関数という用語は、S字形sigmoidalすなわち、階段様steplike反応関数をいう。上式中、yは独立変数、y0はx→∞となったときの関数の極限に等しい調整可能なパラメータ、Aはステップサイズstepsizeに等しい調整可能なパラメータ、x50はステップの中点に関連する調整可能なパラメータ、Δxはステップの幅を記述する調整可能なパラメータである。カソードという用語は、外部電源によりアースに対して負電位へ駆動されたときの電極を指す。消極depolarizeという用語は、細胞の膜内外電位差をゼロに接近させるようにすることを意味する。通常時には負の休止電位にある細胞の場合には、この用語は、膜内外電位差が正の向きに変化することを意味する。有効濃度50またはEC50とは、ある薬理学的化合物のその高い濃度における最大効果と比較して、その化合物が半分の効果を持つような濃度を指す。電気的に励起可能であるという用語は、活動電位を発生することによるある閾値を超える電気刺激に対して反応する細胞または組織を指す。電気的に励起可能な細胞は、内向きの電流を発生する少なくとも1つの電圧依存イオンチャネル型と、外向きの電流を発生する少なくとも1つの依存イオンチャネル型とを含む。電気刺激という用語は、細胞外の電流パルスを用いて細胞中に電圧変化を開始させることを意味する。電極という用語は、機器と試験システムとの間の制御可能な伝導性インターフェースを指す。電気的透過という用語は、膜に形成されている水和した孔hydratedporeが、水分子および小さい単原子イオンを通すのにだけ十分な大きさであるような、適度なエレクトロポレーションを指す。エレクトロポレーションという用語は、細胞の膜に大きな電位を印加するとその膜が絶縁破壊して、水和した通路が膜に形成される現象を指す。蛍光成分という用語は、光を吸収し、その後でそのエネルギーの少なくともある割合をある時間にわたって光として再放出することができる成分を指す。この用語は個別化合物、分子、天然の蛍光タンパク質および高分子錯体、または、蛍光および非蛍光化合物または分子の混合物を含む。蛍光成分という用語は、光を吸収して、その後で何ミリ秒にもわたってエネルギーを再放出する、有機配位子増感体を添加されたランタニドイオンおよびランタニド錯体などの、減衰時間が長い蛍光を示す化合物も含む。FRETという用語は、蛍光共鳴エネルギー伝達を指す。本発明の目的のために、FRETは、2つの蛍光成分の間、蛍光成分と非蛍光成分の間、ルミネッセント成分と蛍光成分の間およびルミネッセント成分と非蛍光成分の間で起きるエネルギー伝達過程を含む。本明細書で使用する遺伝子ノックアウトという用語は、当業者には熟知された任意のようなトランスジェニック技術によっても達成されている、機能の完全喪失を伴うinvivoでの遺伝子を目標にした破壊を指す。一実施形態では、遺伝子ノックアウトを持つトランスジェニック動物は、相同的組換えによって機能しないようにされた遺伝子を目指した挿入によって、ターゲット遺伝子が機能しないようになされた動物である。ヒル関数という用語は、S字形すなわち、階段様反応関数をいう。上式中、yは独立変数、y0はx→∞での関数の極限に等しい調整可能なパラメータ、Aはステップサイズに等しい調整可能なパラメータ、x0はステップの中点に関連する調整可能なパラメータ、nはステップの鋭さsteepnessを記述する調整可能なパラメータである。ヒル係数という用語は、ヒル関数中のパラメータnを指す。ヒットという用語は、アッセイにおいて所望の特性を示す試験化合物を指す。同族体は、ALIGNプログラムを用いて最適に整列させられたときに、75同一超であるか、それに等しい2つの配列またはそれの部分を指す。相同すなわち配列同一性は下記の事柄を指す。2つのアミノ酸配列は、それらの配列の間に部分的な同一性または完全な同一性が存在する場合、相同である。例えば、85の相同は、2つの配列が最大限一致して整列されているとアミノ酸の85が同一であることを意味する。ギャップ一致させられている2つの配列のいずれかにおけるは、最大限の一致において、許される。5以下のギャップ長さが好ましく、2以下ではもっと好ましい。あるいは、好適には、突然変異データマトリックスと6またはそれより大きいギャップペナルティでもって、プログラムALIGNを用いて、2つのタンパク質配列または、長さが少なくとも30アミノ酸であるタンパク質から得られたポリペププチド配列が5標準偏差単位でより大きい整列スコアを持つならば、ここでこの用語が使用されているように、それらは相同である。Dayhoff,M.O.、inAtlasofProteinSequenceandStructure、1972、第5巻、NationalBiomedicalResearchFoundation、101-110およびその巻のSupplement2、1-10参照。過分極という用語は、細胞の膜内外電位差をゼロからさらに大きく動かすことを意味する。通常時は負の休止電位にある細胞の場合には、この用語は、膜内外電位差が負の向きに変化することを意味する。不活性化という用語は、イオンチャネルが不活性化された状態に動くことを意味する。活性でなくなったという用語は、特定の非導通のコンホメーション状態にある電位依存イオンチャネルを指す。活性でなくなった状態への、およびそれからの遷移は、他のコンホメーション状態の間の遷移より一般に遅い。活性でなくなった状態は、高くされた膜内外電位差においては、通常、好ましい状態である。低い膜内外電位差では、活性でなくなった状態は不安定で、休止状態に緩和する。カーネルkernelという用語は、1つまたは複数の他の時間的に変化する関数で畳み込まれることを意図されている数学的関数を意味する。理論的には、カーネルは、独立変数が±∞に接近するにつれてゼロになるような任意の関数とすることができる。実際には、カーネルは、任意の波形関数発生器にプログラムでき、またはコンピュータで制御されるデジタル-アナログD/A変換器により発生できる、任意の波形とすることができる。ルミネッセント成分という用語は、電気的エネルギー例えばエレクトロルミネッセンス、化学的エネルギー例えば化学発光または音響エネルギーなどのエネルギーを吸収でき、その後でそのエネルギーの少なくとも一部分を光としてある時間にわたって放出できる成分である。成分という用語は、光を放出させる個別化合物、分子、生体発光タンパク質および高分子錯体、またはルミネッセントおよび非ルミネッセント化合物または分子の混合物を含む。膜内外電位差モジュレーターtransmembranepotentialmodulatorという用語は、細胞区画または細胞下区画の休止または刺激された膜内外電位差を変更できる成分を指す。この用語は、個別化合物、イオンチャネル、受容体、孔を形成するタンパク質、またはそれらの成分の任意の組合せを含む。膜時定数membranetimeconstantまたはτMという用語は、膜抵抗RMと容量CMの積を意味する。単相的monophasicという用語は、極性が逆の極性に変化しないようなパルスを指す。天然蛍光タンパク質という用語は、タンパク質内の内部アミノ酸の環化または酸化により、あるいは蛍光コファクターの酵素添加により、高蛍光、固有発色団を形成できるタンパク質を指す。この用語は、野生型蛍光タンパク質および変更されたスペクトルまたは変更された物理的特性を示す人工的な突然変異体を含む。この用語は、タンパク質内の修飾されていないチロシン基、トリプトファン基、ヒスチジン基およびフェニルアラニン基の蛍光寄与によってのみ弱い蛍光を示すタンパク質は含まない。天然に存在するという用語は、人工的な遺伝修飾またはその他の修飾がないときにその細胞により発生される成分を指す。マルチウェルプレートという用語は、ほぼ平らな表面上に配置されているアドレス可能なウェルの二次元アレイを指す。マルチウェルプレートは、任意の数の個別のアドレス可能なウェルを含むことがあり、かつ任意の幅および任意の深さのアドレス可能なウェルを含む。マルチウェルプレートの一般的な例は、96ウェルのプレートと、384個のウェルのプレートと、3456個のウェルのNanoplates商標とを含む。操作可能にリンクされているという用語は、そのように記述されている構成要素が意図されているやり方で機能できるようにする関係に、それらの構成要素があるような並置を指す。コーディング配列に操作可能にリンクされている制御配列が、制御配列が共存している状況下でコーディング配列の発現が達成されるような方法で連結される。分極された細胞という用語は、それの細胞膜を横切って電位差を持つ細胞を意味する。整流という用語は、コンダクタンスが非直線的であって、好適な向きを持つことを意味する。不活性からの解放という用語は、不活性にされている閉じられているチャネルの、今や開くことができる休止して閉じられているチャネルへの転換を指す。繰り返しという用語は、最低2回繰り返すことを意味する。再分極という用語は、細胞の膜内外電位差をそれの休止電位に接近させることを意味する。休止または休止状態という用語は、電位依存イオンチャネルが閉じられているが、不活性ではないことを指す。細胞に対する休止電位という用語は、外部からの影響を受けていないときの細胞の平衡膜内外電位差を指す。特定のイオンに対する逆電位reversalpotentialという用語は、そのイオンの内向きフラックスと外向きフラックスが等しいような膜内外電位差を指す。実質的に平行であるという用語は、相互に面している2つの物体の表面の間の距離が、各物体の関連する表面上のあらゆる点において測定されたときに、10より小さく、好適には5より小さいだけ異なることを意味する。目標にできるという用語は、ある条件の下で特定の場所に局在化される能力を持つ成分を指す。例えば、2カ所以上の場所に存在でき、ある条件の下で定められている場所に転移することができる能力を有するタンパク質は、その場所を目標にできる。一般的な例は、細胞の活性化の際のプロテインキナーゼCの原形質膜への転移や、タンパク質を含んでいるSH2ドメインのホスホリル化されているチロシン残基への結合を含む。この用語は、ほとんどの条件の下では、1つの特定の場所すなわちサイトに永続的に関連付けられている成分を含む。閾値エレクトロポレーション電位という用語は、生態細胞の検出可能なエレクトロポレーションがそれより上で起きるような外部から加えられる電界の強さを指す。試験化合物という用語は、推定上のモジュレーターとして本発明の1つまたは複数のスクリーニング法によって試験すべき化学物質を指す。試験化合物は、無機化合物、有機化合物、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質またはそれらの混合物などの任意の化学物質とすることができる。通常は、スクリーニングのために、0.01マイクロモル、1マイクロモル、10マイクロモルなどの、種々の所定の濃度の試験化合物が使用される。試験化合物の対照群にはは、試験化合物が存在しないときの信号の測定、またはターゲットを変調することが知られている化合物との比較を含むことができる。転換されたという用語は、組み換え核酸技術により、異型核酸分子が中に入れられているような細胞またはそれの子孫を指す。トランスジェニックという用語は、それのすべての細胞内の外因性遺伝物質を含む有機体を記述するために、用いられる。この用語は、初期の胚すなわち受精卵のinvitro操作によって、またはトランスジェニック技術によってゲノムが変化させられて特定の遺伝子ノックアウトを生ずるような任意の有機体を含む。トランス遺伝子transgeneという用語は、細胞中に人工的に挿入されて、その細胞から展開される生体のゲノムの一部すなわち、安定に統合された、または安定な染色体外要素になるようなDNAの任意の断片である。そのようなトランスジェンは、トランスジェニック生体に対して部分的または全面的に非相同であるすなわち外来遺伝子を含むことがあり、または生体の内因性遺伝子と相同な遺伝子を表すことがある。この定義には、DNAに転写されてその後でゲノムに包含されるRNA配列を供給することによって形成されるトランスジェンが含まれる。本発明のトランスジェンは、トランスジェニック非ヒト動物で発現されることができる蛍光タンパク質または生体発光タンパク質をコードするDNA配列を含む。トランジスタ-トランジスタロジックすなわちTTLという用語は、ほぼ5Vの電圧が真TRUEで、ほぼ0Vの電位が偽FALSEであるような電子論理システムを指す。一様な電界とは、任意の時刻に、観察領域内の平均強さからの電界の変動が15を超えないような電界を意味する。電圧センサという用語は、膜内外電位差を指示できる、FRETをベースとする電圧センサ、エレクトロクロミック膜内外電位差染料、膜内外電位差再分配染料、細胞外電極、電界効果トランジスタ、放射性イオン、イオン感応性蛍光染料またはイオン感応性ルミネッセント染料、およびイオン感応性蛍光タンパク質またはイオン感応性ルミネッセントタンパク質を含む。以下の用語、すなわち、基準配列、比較ウィンドウ、配列同一、ある配列との同一の百分率、および実質的同一は、2つ以上のポリヌクレオチドの間の配列関係を記述するために用いられる。基準配列とは配列比較のための基準として用いられるための定められた配列である。基準配列は、大きな配列のサブセット、例えば全長cDNA配列または遺伝子配列のセグメントとすることができ、あるいは、完全なcDNA配列または遺伝子配列を含むことがある。一般に基準配列は、長さが少なくとも20ヌクレオチド、多くの場合、長さが少なくとも25ヌクレオチドであって、たいていは長さが少なくとも50ヌクレオチドである。2つのポリヌクレオチドは、それぞれ、12つのポリヌクレオチドの間で類似する配列すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部を備えることができ、22つのポリヌクレオチドの間で異なる配列をさらに備えることができるので、2つのポリヌクレオチドの配列を比較ウィンドウ上で比較して、配列の類似性の局部的な領域を同定し比較することによって、2つまたはそれより多いのポリヌクレオチドの配列の配列比較が通常は実行される。本明細書で使用されるような比較ウィンドウは、ここで使用されるように、少なくとも20の連続するヌクレオチド位置の概念的なセグメントを指し、ここでは、あるポリヌクレオチドの配列を少なくとも20の連続するヌクレオチドの基準配列と比較でき、かつ比較ウィンドウ内のポリヌクレオチド配列の部分は、2つの配列の最適な整列のために基準配列これは付加または削除を含まないと比較して、20パーセントまたはそれより少ない付加または削除すなわち、ギャップを備えることができる。比較ウィンドウを整列するための配列の最適な整列は、SmithおよびWaterman1981Adv.Appl.Math.、2:482のローカル相同アルゴリズムにより、NeedlemanおよびWunch1970J.Mol.Bio.、48:443の相同整列アルゴリズムにより、PearsonおよびLipman1988Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.、85:2444の類似性検索法により、それらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装WisconsinGeneticsSoftwarePackageRealease7.0、GeneticsComputerGroup、575ScienceDr.、Madison、WIにおけるGAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTAにより、または検査により行うことができ、種々の方法によって発生される最良の整列すなわち、比較ウィンドウ上で相同の最高の百分比となるが選択される。配列同一という用語は、2つのポリヌクレオチド配列が比較ウィンドウの上で同一であるすなわち、ヌクレオチドごとを基にしてことを意味する。配列との同一の百分率という用語は、2つの最適に整列されている配列を比較ウィンドウ上で比較し、同一の核酸塩基すなわち、A、T、C、G、UまたはIが両方の配列で生じた位置の数を求めて、一致した位置の数を求め、一致した位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数すなわちウィンドウサイズで除算し、その結果に100を乗じて配列一致の百分比を得ることによって計算される。本明細書で使用する実質的な一致という用語は、ポリヌクレオチド配列の特性を示すものであって、ポリヌクレオチドは、少なくとも20ヌクレオチド位置の比較ウィンドウ上の、しばしば少なくとも25~50ヌクレオチド位置のウィンドウ上の基準配列と比較して、少なくとも30パーセント配列一致、好適には少なくとも50または60パーセント配列一致、もっと普通には少なくとも60パーセント配列一致を有する配列を含む。ここで、配列主体の百分率は、基準配列を、比較ウィンドウ上の基準配列の全部で20パーセント以下である削除または付加を含むことがあるポリンクレオチド配列と比較することによって計算される。ポリペプチドに適用されるときは、実質的一致という用語は、2つのペプチド配列が、デフォールトのギャップ重量を用いるプログラムGAPまたはBESTFITによるなどして最適に整列させられたときに、少なくとも30パーセント配列一致、好適には少なくとも40パーセント配列一致、より好適には少なくとも50パーセント配列一致、およびもっと好適には少なくとも60パーセント配列一致を共有することを意味する。好適には、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換だけ異なる。保存的アミノ酸置換は、同様な側鎖を持つ残基の互換可能性を指す。例えば、脂肪族側鎖を持つアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンであり、脂肪族-ヒドロキシル側鎖を持つアミノ酸の群はセリンおよびトレオニンであり、アミド含有側鎖を持つアミノ酸の群はアスパラギンおよびグルタミンであり、芳香族側鎖を持つアミノ酸の群はフェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンであり、塩基性側鎖を持つアミノ酸の群はリシン、アルギニンおよびヒスチジンであり、硫黄含有側鎖を持つアミノ酸の群はシステインおよびメチオニンである。好適な保存的アミノ酸置換群は、バリン-ロイシン-イソロイシン、フェニルアラニン-チロシン、リシン-アルギニン、アラニン-バリン、グルタミン酸-アスパラギン酸、およびアスパラギン-グルタミンである。技術および科学用語のリストはすべてを包含することはできないので、定義されていない用語はどのようなものであっても、本発明が属する技術分野の当業者によって普通に理解されているのと同じ意味で解すべきである。さらに、単数形a、anおよびtheは、異なることを文脈で明確に述べていなければ、複数の対象物を含む。例えば、制限酵素または高忠実度酵素についての言及は、そのような酵素、および述べられている基準に適合するその他の酵素の混合物を含むことがあり、方法についての言及は、当業者に知られているであろう、あるいはこの明細書を読んだときに当業者にはわかるであろうcDNA配列を得るための1つまたは複数の方法への言及を含んでいる。1.緒言本発明は、少なくとも1つの電圧が規制されたイオンチャネルを含んでいる無損傷の生態細胞の膜内外電位差が、それらの細胞を浸している流体に電気刺激パルスを繰り返し加えることによって、精密に変調できることを最初に認識した。本発明は、無損傷の生態細胞の本来の完全性を大きく乱すことなく、それらの細胞の膜内外電位差の正確かつ確実な変調をもたらすための装置および方法を含む。本発明の広がりについての非限定的前置きとして、本発明は下記のものを含めたいくつかの一般的かつ有用な態様を含んでいる。1水溶液中の生態細胞の培養基に一様な電界を確実に発生するための電極と、電極アレイを含んでいる装置。2高いスループットおよび小型化された刺激のための、イオンチャネルまたは細胞の活性度の分析のための表面電極を有しているマルチウェルプレート。3イオンチャネルおよび細胞の活性度の高スループット分析のための、および薬剤発見、分析、スクリーニングおよびプロファイリングのためのシステム。4繰り返し電気刺激の使用による、生態細胞の膜内外電位差を変調する方法。5電圧が規制されているまたは電圧が規制されていないイオンチャネルの活性度、トランスポーターおよび漏れ電流に対する試験化合物の作用をスクリーニングする方法。イオンチャネルおよびトランスポータータンパク質に対する化合物の状態に依存する薬理学的活性の決定を含む。6電気刺激に対する細胞またはクローンの反応に基づく、それら細胞またはクローンをプロファイルリングし選別する方法。7細胞およびイオンチャネルパラメータを高いスループット態様で定量的に決定し、それらのパラメータに対する化合物の薬理学的作用を定量化する方法。8細胞の細胞間空間中への外因性化合物exogeneousの導入方法。9細胞内オルガネラの膜内外電位差を変調し、それらのオルガネラにおけるイオンチャネルに対して試験化合物をスクリーニングする方法。10遺伝子発現、酵素機能、タンパク質活性およびリガンド結合を含めた、生理学的および生化学的反応の機能および調整に対する膜内外電位差の生理学的作用を特徴付けする方法。11特定の機能または論理的反応のための適応ニューロネットワークまたはバイオコンピュータをプログラミングし、あるいは訓練する方法。12ヒトを含めた動物に埋め込まれた補綴装置のための効率的な神経インターフェースを提供する方法。ここで説明する本発明のそれらの態様およびその他の態様は、ここで説明する方法および装置を用いて達成できる。本発明の範囲を十分に正しく理解するために、本発明の種々の様相を組み合わせて本発明の望ましい実施形態を得ることができることが、さらに理解されるであろう。そのような組合せによって、本発明の特に有用で強固な実施形態が得られる。2.電極および電極アレイ一実施形態では、本発明は、観察領域にわたって電界を発生するために、電極および電極アレイを含む。通常は、これは1対の導電性電極を使用することによって達成される。重要な設計上の特徴は、電極対が良く特定された電界を生ずることである。好適な電極の設計は、観察下の細胞が受ける電界の一様性を最大にする電極配置を含む。観察領域にわたって一様な電界を発生することは、いくつかの理由から、電気刺激のために重要である。まず、細胞の反応は局部的な電界の大きさに敏感であるから、一様でない電界は、通常、異なる領域に一様でない反応を起こさせて、結果のばらつきを大きくする。第2に、電気的浸透性electropermeablizationのしきい値は、通常、電気刺激膜のために要する膜内外電位差よりも2または5倍大きいだけであるTeissieおよびRols、1993、Biophys.J.、65:409-413参照。したがって、電界が非常に不均一である場合、観察領域内の細胞のいくらかを電気的に浸透もさせることなく、それらの細胞のすべてを刺激することが可能ではないことがある。固定された領域における電界の一様性は、1領域内の平均電界大きさで除した電界の大きさの標準偏差、および2領域内の平均電界大きさに対して正規化した、最高電界大きさと最低電界大きさの間の差の2通りのやり方で記述できる。a.電極の設計導電性媒体内に一様な電界を発生する最も簡単なやり方は、相互にほぼ平行に整列されている表面を持つ2つの同一の平らな電極を使用することである。一般的には、電極がそれの横方向の幅に対して互いにより接近するにつれて、電界の一様性はより大きくなる。しかし、典型的な円形マルチウェルプレートのウェルは、ウェル内に挿入できる電極の幅を制限するとともに、かつ電界の一様性を減ずる2つの他の作用ももたらす。ウェルが丸いために、2つの電極で1つの向きを指す一様な電界を形成するということが難しくなるという問題が生じ、電極の間の塩化ナトリウム水溶液の幅は定常的に変化する。さらに、水の高い表面張力が、ディッパー電極dipperelectrodeが挿入されたときに、ウェルを横切る塩化ナトリウム水溶液の高さを変化させる。湾曲した表面すなわちメニスカスは、ウェルの容積全体にわたって電界の強さを乱すことがある。96個ウェルプレート内の100μLの塩化ナトリウム水溶液の深さは、ウェルの中心部で通常約3.0mm深さであって、ウェルの縁部で約2.9mm深さである。2枚のステンレス鋼製の平行平板電極が挿入されると、塩化ナトリウム水溶液が電極の間に吸い上げられ、ウェルの壁が観察領域にわたって深さを変化させ、塩化ナトリウム水溶液の容積全体にわたる電流経路が中心の周囲で曲がって、電界を一様でなくすることを示唆する。一態様では、本発明は改良した電極設計と、観察領域にわたってほぼ一様な電界を生ずるためにそれらの問題に対処する電気刺激のための装置とを含む。一実施形態図9Aでは、電極対はその電極対に取り付けられて画定された領域へ電流が流れることを制限する電気絶縁体を含む2個のほぼ平行な電極を有し、これにより、極めて一様な電界を生ずる。別の実施形態図9Bでは、電極対は、さらに、より一様な電界を生成するためのサテライト電極を含む。別の実施形態図9Dでは、電極対は薄い絶縁分割体によって分離されたいくつかの片に細分化されている。この場合には、各電極に印加される最も中心の片に印加された電位に対する部分割合として表される電位は、個々に調整されて、観察領域内の電界一様性を最大にできる。他の態様では、本発明は、メニスカス効果の解消または減少によって観察領域にわたる改善された電界一様性を示す改良された電極設計図9Cを含む。他の態様では、多数の電位センサをマルチウェルプレートにおけるウェルの表面あるいは壁に造り込むことができ、またはこの多数の電位センサは、ディッパー電極組立体にアレイとして取り付けられる。電界の一様性を最大にするように、個々の電極を手動または自動的に調整するために、それらのセンサを監視できる。この構成は、刺激電極アレイが、ウェルの形状、塩化ナトリウム水溶液の体積、電極製造プロセスにおけるばらつき、電極組立体に対する損傷等の変化や不完全さを補償できるようにするので有用であろう。b.ウェル内の電極の配置ディッパー電極については、一様な電界の形成の点で理想的な状況は、電極の底をウェルの底に接触させることである。このやり方では、垂直電流路に関連する縁部電界または電界の不均一はない。しかし、取り外し可能な構造の場合には、電極が表面に接触することを求めることは望ましくない。プレートの形状の小さいずれが、ある電極を表面に押し付けて、プレート、細胞または電極に損傷を及ぼすことがある。また、あるウェルでは、電極は表面まで延びないことがある。これらの理由から、電極の底とウェルの底との間に小さい隙間を設けることが望ましいことがある。したがって、1つの態様では本発明は、ウェルの中間にある観察領域がウェルの周縁部の周囲の、電極が置かれる領域に対して、持ち上げられるようになっているマルチウェルプレートを含む。縁部電界は、電極の底とウェルの底の間のギャップにほぼ等しい電極間距離にわたって、不均一を引き起こす。したがって、このギャップは、実際上可能なまでに小さく、好適には0.1~0.5mmの範囲に保たなければならず、通常、観察領域は電極からこの距離以内にあるウェルのどの部分も含んではならない。c.電極の作製任意の導電性物質を電極として使用できる。好適な電極材料は、次の特性の多くを有する。1それらは塩化ナトリウム水溶液で腐食されない、2それらは有毒なイオンを発生または放出しない、3それらは可撓性で強い、4それらは比較的安価に製作される、5それらは多孔質でない、6それらは容易に清浄にされる。好適な材料には、貴金属金、白金およびパラジウムを含む、耐熱金属チタン、タングステン、モリブデンおよびイリジウムを含む、耐食性合金ステンレス鋼を含むおよび炭素その他の有機導電体黒鉛およびポリピロールを含むが含まれる。多くの実施形態ではステンレス鋼が好適な電極材料である。この材料は、安価で、機械加工が容易であり、かつ塩化ナトリウム水溶液中で非常に不活性である。ステンレス鋼は、塩化ナトリウム水溶液中で電流が流れたときに徐々に酸化して酸化鉄を生ずるが、これは装置の性能に影響を及ぼすようにはみえない。酸化鉄は水中での溶解度が非常に低く、毒性レベルの鉄が放出されるようには見えない。また、どのような酸化鉄堆積物も、10硝酸水溶液中に2時間浸し、その後で蒸留水で完全に水洗いすることによって、容易に除去できる。固体の銅電極と銀電極はいくつかの用途で使用できるが、それらは塩化ナトリウム水溶液中で迅速に腐食されるので、ルーチン使用には好ましくない。金めっき銅電極は、比較的不活性であるが、長期間の電気刺激中に金めっきが失われるようである。電極の表面をゼラチン、ポリアクリルイミドまたはアガロースゲルなどの保護膜で被覆することにより、電解生成物を抑制しまたはなくすことができる。その他の潜在的に有用な電極材料は、銀/塩化銀電極などの、電気化学的半電池である。d.電極アレイディッパー電極は、通常、マルチウェルプレートの1つまたは複数のウェルの中に、かつそれから、抜き出し可能に動かすことができるアレイ中に配置されている1つまたは複数の電極対で構成される。ディッパー電極は、プレートの様式および密度に合致するアレイに合わせることができるが、任意の形状または向きのアレイにできる。例えば、標準の96個ウェルプレートでは、1つまたは複数の行または列を同時に選択的に励起するための電極アレイ構成をおそらく含む、何種類かの電極形状が可能である。この種の電極アレイの一実施形態の一例が図1に示されている。この例では、12×8の電極対のアレイが、標準の96ウェルマルチウェルプレートに適合するように、形成されている。この場合には、電極10は、おおよそ、幅が4mm、長さが1cm、厚さが0.2mmであって、スイッチを介して大電力関数発生器の出力段の一方の側に接続されている導電性櫛50から延びている。電極は、4mm離れて、その間に非導電性ナイロンスペーサー20を挟んで、相互に平行に装着されている。この場合には、スイッチ330は、96ウェルプレートの1つの行を一度に選択的に刺激できるようにするが、スイッチング、結線および電力関数発生器の適切な構成が与えられるならば、刺激プロトコルのいかなる時間的または空間的組合せも潜在的に可能である。電極アレイの全体は、各電極対を正しく隔てられるように維持して標準の96ウェルマルチウェルプレートの配置に正確に一致させる、強固な非導電性部材30により、正確に位置合わせ状態に保たれる。非導電性部材30は、マルチウェルプレートとの位置合わせを正確に維持しつつ、電極を上下に動かせるようにする。電極アレイのマルチウェルプレートとの正確な位置合わせを行うために、電極組立体は、オプションとして、標準の96ウェルマルチウェルプレートを収容できて正確なプレート位置合わせを可能にする外枠すなわちフランジ40を備えることができる。いくつかの実施形態では、枠40は、あいまいでないプレート位置合わせを行うために、位置合わせノッチすなわちくぼみ80をさらに含むことができる。好適な実施形態図1Aにも示すでは、電極アレイは、さらに、電極アレイをマルチウェルプレートのウェル内に引き抜き可能に挿入する手段を備えている。この構成の一実施形態では、電極アレイは、さらに、電極10が取り付けられる上側の可動支持部材90を備えている。可動支持部材90は、4本のアライメントピン70上で滑ることによって、非導電性部材30に対して、上下動できる。それらの図には示されていないが、下向きの力がもはや加えられないときに可動支持層90が上側位置に自動的に戻ることができるようにするスプリングがある。スペーサー60が、可動支持層90と電極10を完全に低い方の位置に固定することができるようにする。この装置によって電気刺激器を手動スクリーニングモードおよび/または自動スクリーニングモードで使用できるようにされる。3.電気刺激のためのマルチウェルプレート本発明のマルチウェルプレートは、細胞の効率的な電気刺激を行うと同時に、膜内外電位差変化の光学的分析を可能にするように主として設計されている。これを行うために、導電性表面電極をマルチウェルプレートの壁、底またはふたの中または上に配向させることができる。一般に、そのようなマルチウェルプレートは、正方形、長方形、円形、長円形、三角形、豆形kinneyまたはその他の幾何学的もしくは非幾何学的な形状などの、任意の形状または任意の寸法のフットプリントfootprintを持つことができる。そのフットプリントは、標準の96ウェルマイクロタイタープレートなどの既存のマルチウェルプレートのフットプリントにほぼ類似する形を持つことができる。マイクロタイタープレートのフットプリントは、おおよそ、幅85.5mm、長さ127.5mmであり、または現行または将来の工業規格を表すその他の寸法であるT.Astle、StandardsinRoboticsandInstrumentation、J.ofBiomolecularScreening、1巻、163-168、1996を参照。このフットプリントを持つ本発明のマルチウェルプレートは、この技術分野で知られているマルチウェルプレートトランスロケーターおよびリーダーなどのロボティックスおよびインスツルメンテーションに適合できる。典型的に、ウェルはマルチウェルプレート上に二次元直線形アレイとして配置される。しかし、ウェルは、幾何学的アレイまたは非幾何学的アレイなどの、任意の種類のアレイとして提供できる。マルチウェルプレートは、任意の数のウェルを有することができる。大きな数のウェルあるいは高められたウェル密度は、添付の特許請求の範囲に記載された本発明の方法を用いて、容易に受け入れることができる。一般的に用いられるウェルの数は、6、12、96、384、1536、3456および9600を含む。ウェルの容積は、典型的にはウェルの深さと断面積に応じて変化できる。ウェルの容積は、約0.1マイクロリットル~約500マイクロリットルであることが好ましい。ウェルは、正方形、円形、六角形、その他の幾何学的形状または非幾何学的形状、およびそれらの組合せウェル内およびウェル間を含めた任意の断面形状平面図でで製作できる。好適なものは、底が平らな正方形または円形のウェルである。壁は面取り例えば、抜き勾配を有するできる。好適には、角度は約1度~10度、より好適には約2度~8度、最も好適には約3度と5度の間である。ウェルは、ウェルの中心間距離を約0.5mm~約100mmにできるような構成で置くことができる。ウェルは、直線-直線アレイなどの任意の配置、または六角形パターンなどの幾何学的パターンで置くことができる。ウェルからウェルまでの距離は、96ウェルプレートの場合には、約9mmとすることができる。より小さい容積の場合には、より小さいウェルの中心間距離が好ましい。ウェルの深さは約0.5mm~100mmにできる。好適には、ウェルの深さは約1mm~100mm、より好適には約2mm~50mm、最も好適には約3mm~20mmである。ウェルの直径ウェルが円形の場合または最大対角線距離ウェルが円形でない場合は、約0.2mm~100mmにできる。好適には、ウェルの直径は約0.5mm~100mm、より好適には約1mm~50mm、最も好適には約2mm~20mmである。マルチウェルプレートは、通常は、電気的に非導電性材料で構成でき、ウェルの壁またはウェルの底を通じて、光などの放射の透過を妨げることができる光学的に不透明な材料で構成できる。そのような光学的に不透明な材料は、光学的検出法に関連するバックグラウンドを減少できる。光学的に不透明な材料は、染料、顔料またはカーボンブラックなどのこの技術分野で知られているもの、または将来開発されるどのようなものでもよい。光学的に不透明な材料は、アッセイの感度および確度を高くするように、1つのウェルから他のウェルへ放射が通ることを阻止でき、またはウェルの間のクロストークを阻止する。光学的に不透明な材料は、薄い金属層、鏡被覆または鏡面研磨などの、この技術分野で知られているような反射性とすることもできる。光学的に不透明な材料は、マルチウェルプレートのどのような表面にも誘導でき、またはプレートや底が製作される際にそれらと一体部分とすることができる。光学的に不透明な材料は、入射光の約100~約50の間、好適には約80~95超、より好適には99超の透過を阻止できる。ほとんどの測定は、通常、ウェルの壁を光が透過することを通常要しないので、ポリマーなどの物質は、ウェルの壁を黒くしあるいは光を吸収する顔料を含むことができる。顔料をそのように添加することは、バックグラウンド蛍光を減少させやすくするであろう。顔料は、材料の製造中またはマルチウェルプレートの製作中に、被覆あるいは混合するなどのこの技術分野で知られているいかなる手段によっても導入できる。顔料の選択は、ポリマーに固有のすべてのバックグラウンドを減少する顔料の混合物、または所望の波長で光をフィルタしまたは吸収するために選択された単一の顔料または顔料の組合せに基づいて行うことができる。顔料はカーボンブラックを含むことができる。表面電極は、種々の形態や配置で、例えばいくつかの狭い垂直電極帯verticalelectrodestripとして、壁に埋め込まれ、それ以外の場合は取り付けることができる。各帯の相対的な電位を適切に調整することによって、観察領域内に一様な電界を発生できる。さらに、円形インサートを用いて、または垂直帯状電極をウェルの全周に埋め込むことにより、ウェルを横切って任意の向きの一様な電界を発生できる。1つの向きに一様な電界を発生し、それに続いて別の向きの一様な電界を発生することも可能である。これは、神経細胞または筋肉細胞などの電気的特性が異方性であるような細胞タイプ、または大きな縦横比を持つ細胞タイプにとって有用なことがある。各ウェルは、高い透過率部分を有する底とともに、かつ前記底の厚さの少なくとも90のポリスチレンより少ない蛍光を生ずる底を有する。この特性は、適切な対照底材料の蛍光を試験物質の蛍光と比較することによって決定できる。それらの手順は、周知の方法を用いて実行できる。底は、この技術分野でそれらの項が知られているので、好適には、プレートまたは膜である。底の厚さは、特定の用途で指定されることがあるプレート底に求められる全体としての特性に依存して、変化できる。そのような特性は、プレートに使用される材料に関連する固有蛍光の量と、剛性と、破壊強さおよび製作上の要求を含む。ウェルの底は、通常、約10μmと約1000μmの間の厚さを有する。好適には、ウェルの底のは約10μm~450μm、より好適には約15μm~300μm、最も好適には約20μm~100μmの厚さを有する。ウェルの底は、高い透過率の部分を持つことができ、通常は、ウェルの底のすべてまたは一部が光を透過できることを意味する。底は、円形、正方形、長方形、豆形kidneyshaped、多角形、またはその他の幾何学的形状あるいは非幾何学的形状、もしくはそれらの組合せなどの、任意の形の光学的に不透明な部分と高い透過性の部分を持つことができる。好適には、マルチウェルプレートの底は十分平らにでき、例えば、表面のテクスチャ平坦さが約0.001mm~2mm、好適には約0.01mm~0.1mmにできるSurfaceRoughness、Waviness,andLay、Am.Soc.ofMech.Eng.ANSIASMEB46.1-29851986を参照。底が実質的に平らでないとすると、底とウェルの光学的性質が、一方または両方の変化した光学的および物理的特性のために、低下することがある。表面電極の実施形態では、底は、好適には、マルチウェルプレートのウェルの縁部に重なり合い、ウェルの内容物に電気的に接触する、導電性材料の帯または被覆を有する。導電性帯は、通常、以前に述べた大電力関数発生器の出力段への容易な取り付けを可能にする電気コネクタで終端する。導電性帯が、それの長さ全体にわたる過大な電圧降下なしに刺激電流を運ぶことができるように、導電性帯の抵抗値は十分に低くなければならない。コネクタ端部から最も遠いウェル端部までの抵抗値は10Ωより低くなければならず、より好適には1Ωより低くなければならず、さらに好適には0.1Ωより低くなければならない。導電性帯の断面積は、抵抗値に対する要求を満たすために十分大きくなければならない。一般的に採用されている導電体の場合には、この断面積は、少なくとも104mm2、より好適には少なくとも103mm2でなければならない。実際には、どのような導電性材料でも、塩化ナトリウム水溶液に不活性な導電性材料がそれにかぶせられる限り、使用できる。それらの材料には、貴金属金、白金およびパラジウムを含むおよび耐火金属クロム、モリブデン、イリジウム、タングステン、タンタルおよびチタンを含むならびにそれらの合金が含まれる。表面電極用の導電性材料として好適な材料には、透明な底層に容易に埋め込むこと、または透明な底層の表面に容易に電着できる、クロム、銅、金およびインジウム-すず-酸化物の組合せが含まれる。電解生成物は、電極の表面を、ゼラチン、ポリアクリルイミドまたはアガロースゲルなどの保護膜で被覆することにより、抑制しまたは除去することができる。他の潜在的に有用な電極材料は、銀/塩化銀電極などの電気化学的半電池である。導電性材料被覆または表面改質は、真空蒸着、電着、印刷、吹付け、放射エネルギー、イオン化技術または浸漬を含めた、この技術分野で知られている任意の適当な方法を用いて、底に導入できる。表面改質は、マルチウェルプレートの製作の前、最中または後にポリマーまたはガラスや石英などのその他の材料を適切に誘導し、また、適切な誘導されたポリマーまたはその他の材料を底層中に含めることによって導入することもできる。その後で、誘導されたポリマーまたはその他の材料を、プレートの取り付けに使用される化学的部分と反応させることできる。化学的部分との反応の前に、そのようなポリマーまたはその他の材料は、ポリマーまたはその他の材料の上に共有結合または非共有結合サイトを設けることができる。ポリマーまたはその他の材料の表面内または表面上のそれらのサイトは、導電層をプレートに取り付けるために使用できる。誘導されたポリマーまたはその他の材料の例には、米国特許第5583211号Coassinらに記載されたもの、この技術分野で知られている他のもの、または今後開発されるものが含まれる。a.材料および製作マルチウェルプレートを製作する材料は、通常、ポリマー材料である。その理由は、これらの材料が大量生産技術に向いているからである。しかしながら、ガラスや石英などのその他の材料も、マルチウェルプレートの底を製作するために使用できる。底は、同じ材料または異なる材料で製作でき、かつ底は、ポリスチレンまたはその他の材料を含むことができる。好ましくは、低い蛍光性と高い透過率を持つポリマーを選択する。ポリマー材料は、インサート成型や射出成型などの、この技術分野で知られている成型法および将来開発される成型法によって、プレート製作を特に容易にできる。本発明のマルチウェルプレートは1つまたは複数の部品で製作できる。例えば、プレートおよび底は1つの個別部品として製作できる。あるいは、プレートを1つの個別部品とし、底を第2の個別部品とすることができ、それらを組み合わせてマルチウェルプレートを構成する。この場合には、プレートと底を、接着剤、音波溶接、加熱溶接、融解、インサート射出成型またはこの技術技術で知られているもの、または将来開発されるものなどの、封止手段によって相互に取り付けることができる。プレートと底は同じ材料または異なる材料で製作できる。例えば、プレートはポリマーで製作でき、底は、ポリスチレン、シクロオレフィン、Aclar、ガラスまたは石英で製作できる。微小化した表面電極の設計が、標準的なプレート構成96、384、1536および3456以上の高いプレート密度で可能である。そのような装置のスループットは潜在的に極めて高い。例えば、おのおの3456個のウェルが設けられているプレートが1時間当たり30枚スクリーニングされると仮定すると、1日8時間当たりの全体の処理数は約800,000のウェルに相当し、これは、プレート読出し時間が等しいと仮定して、現在利用できるものよりもおよそ8倍速い。表面電極を有するマルチウェルプレートの一実施形態の一例を図2Aに示している。この例では、導電帯200の対が、ガラス、またはCOC1999年6月8日に発行された米国特許第5910287号参照などのプラスチックなどの光学的に透明な底層210に平行に、96ウェルプレート構成で取り付けられている。この例では、導電材料の帯200は、概ね、幅が2mm、厚さが10μmであって、電極の間で光学的に透明な底層210を通じて、ウェル220内に配置されている細胞の光学的分析を行えるようにするために、約4mmの距離だけ隔てられている。他の実施形態では、導電材料の帯は、ステンレス鋼ワイヤ直径が約0.001~約0.010を有することができる。光学的に透明な底層210は、96ウェルマルチウェルプレートアレイ230に取り付けられて、通常のプレート底を置き換える。導電材料の帯200は、96ウェルマルチウェルプレートのウェル220の周縁に重なって、ウェルの内容物に電気的に接触する。導電材料帯200は電気接点で終端して、以前に述べた大電力関数発生器の出力段への容易な取り付けを可能にする。この例では、行の最初のウェル中の8ウェル列当たり2つの電極接点がある。これによって、細胞の培養中の取扱いをより簡単にするために、標準の96ウェルプレートの配列を使用できるようにされる。それらのウェルの内部には細胞または塩化ナトリウム水溶液は入れられない。この設計によって、単一の列中の7つのウェルを同時に刺激できる。アッセイ中は、オペレータまたはロボットは、例えば、プッシュピン試験電極で、ワイヤを接点に一時的に取り付ける。表面電極を持つマルチウェルプレートの別の実施形態を図2bに示している。この実施形態では、透明な底層210がマルチウェルプレート230の縁部を越えて延長している。この構成では、すべてのウェルは細胞および化合物で使用するために利用可能である。さらに、接点240への外部の結線の取り付けが簡単にされる。プッシュピン接点、回路基板のエッジコネクタ、またはゼロインサーションフォースソケットzero-insertionforcesocketsを電極との接触を形成するために使用できる。延長させられている底層210は、ルーチンの使用中に取扱いを不便にすることがある。これは、製作作業中に電極トレース200を底層210の底の反対側にもっていくことによって解決できる。これはいくつかの方法によって行うことができる。例えば、接触領域を形成するために2側面処理を用いてスルーホールが作製され、電解めっきされ、または導電性トレースを底層の縁部の周囲に巻き付けることができる。他の例として、底層を可撓性の絶縁材料で製作できる。そして、図2Bに示されているような構造を製作した後で、底層のうちプレートの縁部から突き出ている部分を折り曲げてプレートの下側に取り付けることができる。表面電極を有するマルチウェルプレートの他の実施形態を図2Cに示している。この実施形態では、電極200は、細いビア線205で接点パッド240に取り付けられている。これによって、細胞の培養中の取扱いをより簡単にするために、標準の96ウェルプレート配列を使用できるようにされる。この実施形態では、一方の極性の電極のすべては一緒に短絡されている。1つの列の選択は、電流パルスを他の極性のただ1つの電極に供給することにより行われる。この実施形態では、細胞、塩化ナトリウム水溶液または化合物は、接点パッドがある最後の列内には置かれない。アッセイ中は、オペレータまたはロボットは、例えばプッシュピン試験電極を用いて、ワイヤを接点に一時的に取り付ける。表面電極を持つマルチウェルプレートの他の実施形態を図2Dに示している。この実施形態では、電極200は、96ウェルプレートの長辺に平行に並べられている。この設計は、行中の11のウェルが同時に刺激されることを除いて、図2Aに示されている設計にほぼ類似する。表面電極用の導電性材料に好適な材料には、透明な底層に容易に埋め込むこと、取り付けること、または電着することができる、クロム、銅、金およびインジウム-すず-酸化物の組合せが含まれる。実際には、どのような導電性材料でも、塩化ナトリウム水溶液に不活性な導電性材料がそれにかぶせられる限り、使用できる。それらの不活性な材料には貴金属金、白金およびパラジウムを含む、耐火金属クロム、モリブデン、イリジウム、タングステン、タンタルおよびチタンを含む、耐蝕性合金ステンレス鋼を含む、および炭素またはその他の有機導電体黒鉛およびポリピロールを含むならびにそれらの材料の組合せまたは合金が含まれる。4.電気刺激および分光測定のための装置本発明は、少なくとも1つの電極組立体と、電気刺激のための手段と、光検出器と、電気刺激の発生、データの収集およびマルチウェルプレートの動きを調整するコンピュータ制御手段とを備えている、自動化された電気刺激および分光測定装置を含む。この装置は、流体添加のための手段も有する。1つの態様では、それらの装置は、生態細胞の表面の内部または上部に存在するイオンチャネル、トランスポーター、漏れ電流の活性度を変調し、特徴付けし、かつ測定し、チャネルまたは細胞の活性度に対する試験化合物の効果を迅速にスクリーニングするように、設計されている。本発明は、また、本発明のワークステーションの動作によって発生または発見された化学的実体および情報例えば、モジュレーター、あるいは化学薬品の化学的または生物学的活性度にも向けられている。図3は自動化された電気刺激および分光測定装置の一実施形態のための主要な電気的および光学的構成要素のブロック図を示す。この例では、電気刺激のために、96ウェルマルチウェルプレートディッパー電極アレイ図1を用いた。本願出願人が所有する、1998年7月24日に出願された米国特許出願第09/118728号に詳細に記述されているように、刺激器電極アレイに加えて、この装置はいくつかの付加的な電気的、光学的および機械的部品を有する。この実施形態では、コンピュータ300に組み込まれているNationalInstruments社テキサス州オースチンAustin、TXのPC-DIO24デジタル入力/出力カードが、1対12スイッチ330NationalInstrumentsER-16における適切なチャネルを設定するために使用される。蛍光プレートリーダーを制御しているコンピュータ300は、刺激を開始するようにプログラムされるときにTTL信号を送り出して、関数発生器310を駆動させる。刺激信号は2つの任意波形発生器310によって発生される。関数発生器は、Tektronix社オレゴン州ビーバートンの型番AFG310である。最初のものは第2のものへの一連のTTLパルスを駆動させ、第2のものは、個々の刺激波形でプログラムされている。多数の波形発生器を直列におよび/または並列に接続することによって、一層複雑な波形列を発生できる。それらの波形発生器は、コンピュータが発生したTTLパルスによって駆動され、または相互に駆動される。あるいは、コンピュータに組み込まれているA/D変換器またはサウンドカードを用いて、刺激列を発生できる。この場合には、市販されているソフトウェアまたはカスタムソフトウェアを用いて、波形列をプログラムでき、またはその列中の波形を変化できる。刺激列は、大電力増幅器320とスイッチ330とを介して、刺激器ヘッド370に送られる。この場合、増幅器は、APEXPA93チップApexMicrotechnologyCorp.、アリゾナ州タスコンTuscon、AZを用いて、製作会社により提供された回路に従って製作された。この用途に好適な増幅器は、通常、次の仕様を満たしまたはそれを超える。入力±100VDC、入力インピーダンス100GΩ、電圧利得20倍、出力±90V、出力±3A、出力インピーダンス10Ω。電流の多数が、通常はある時刻に微量滴定プレート350の単一の8ウェル列中の、電極の間の塩化ナトリウム水溶液を通って流れる。400±7.5nmの励起光が、染色された細胞を下から照明し、放出された蛍光が検出器モジュール340で、460±20nmの青と580±30nmの橙色の2組の波長で測定されるGonzalezら、DrugDiscoveryTody4:431~439、1999を参照。細胞の列が一旦刺激されると、コンピュータ300はモーター360を駆動させて、マルチウェルプレート350を、次の刺激のために準備されている位置へ動かす。典型的な96ウェルマルチウェルプレートでは、電極の幅は4mm、ギャップgは4mmである。刺激は、通常、ウェル内の100μLの体積の生理食塩水中で行われる。この食塩水の体積では、深さは平均約3.0mmであるこの深さは、メニスカス効果のために、ウェルを横切って20も変化する。電極はウェルの底から約0.5mm離れて位置する。細胞に加えられる電界Eは、電極に加えられている電圧V0を電極ギャップgで除算したものとして、すなわちE=V0/gとして表される。これは実際の電界よりも大きく過大評価される。その理由は、約1.5Vを消費する各電極における電気化学的反応の影響のためである。刺激のために用いられる典型的な電圧範囲10~60V/cmでは、この過大見積もりはほぼ約10である。電界の正確な測定と較正は、電流が流されたときにウェル内の電位をマッピングすることによって実行できる。本発明は、各ワークステーションにおける処理時間を最短にするためにプログラム可能に制御され、電気刺激および分析のために液体試料の処理時間を最短にするために統合できる、自動化されたワークステーションも含む。通常、本発明の装置は、次のものを1つまたは複数個含む:Aアドレス可能な化学ウェル内部の溶液中の複数の化学薬品を保存するための保管場所と、化学ウェル検索器とを備え、アドレス可能な化学ウェルのプログラム可能な選択および検索を有し、かつ少なくとも100,000のアドレス可能なウェルのための記憶容量を有する、記憶および検索モジュール、B選択されたアドレス可能な化学ウェルから溶液を吸い出しまた分配する液体ハンドラを備えた試料分配モジュールであって、この化学薬品分配モジュールは、選択されたアドレス可能な化学ウェルのプログラム可能な選択とその化学ウェルからの吸い出しと、選択されたアドレス可能なサンプルウェル内へのプログラム可能な分配平方センチメートル当たりのアドレス可能なウェルの種々の密度でのアドレス可能なウェルのアレイ中への分配を含めてとを有する試料分配モジュール、C選択されたアドレス可能な化学ウェルを試料分配モジュールへ輸送するとともに、オプションとして、選択されたアドレス可能な化学ウェルの輸送のプログラム可能な制御適応経路指定および並列処理を含めてを行う試料トランスポーター、Dマルチウェルプレート内の細胞を自動的に洗浄し、染色し、時宜にかなった培養を行う装置、E細胞プレートと試験化合物プレートを種々のワークステーションの間で自動的に輸送する装置、F自動化した電気刺激と分光測定のための装置、およびデータ処理および統合モジュール、G上記サブシステムのいずれかの動作を調整するマスター制御装置。記憶および検索モジュールと、試料分配モジュールと、自動化した電気刺激および分光測定装置とは、データ処理および統合モジュールによって統合され、プログラム可能に制御される。記憶および検索モジュールと、試料分配モジュールと、試料トランスポーターと、自動化した電気刺激および分光測定装置と、データ処理および統合モジュールとは、アドレス可能なサンプルウェルの迅速な処理を容易にするために動作可能に結合されている。通常、本発明の装置は、少なくとも100,000のアドレス可能なウェルを24時間で処理できる。この種の装置は1999年11月16日に発行付与された米国特許第5985214号に記述されている。a.微小流体装置本発明は、微小流体チップに組み込まれて、高度に微小化された電気刺激および分析のために設けられている電極の使用も含む。そのような装置は、例えば、Chowらへの1998年9月1日に発行された米国特許第5800690号、Percらによって1997年5月5日に出願されたヨーロッパ特許出願第0810438A2号、およびParceらによって1997年6月24日に出願されたPCT出願第98/00231号に記載されているものを含む。それらの装置は、通常、ガラスまたはシリコンチップに存在する微小毛管内の小さい流体体積を取り扱うために、起電性の流体運動を使用する。これらの微小流体チップをベースとする分析装置は、微小化された分析を多数並列に行うことができる。そのような装置は、微小化された分析を要するいくつかの場合における好適な分光測定装置である。例えば、FuらNatureBiotechnology17:1109-11、1999によって記載されている超小型に製作された蛍光活性化細胞分類機は、光学的質問領域内にまたはその近くに置かれた1対の電極を有するように、容易に変更できる。ここで説明している方法を用いて、個々の細胞は、電気的に刺激でき、かつ刺激に対するそれら細胞の反応を基にして個々に分類できる。この方法は、チャネルの所望の発現を含んでいる安定なクローンを得る過程を極めて簡単にする。他の態様では、単細胞における試験化合物のスクリーニングは、1つまたは複数の追加の流体注入ポートが設けられている微小流体装置と、ここで説明している方法を基にして組み立てられ、かつ動作させられる1つまたは複数の埋め込まれた電気刺激装置とによって、実行できる。5.電気刺激法a.諸言本発明者らは、どのような作用機序にも結び付けられることなしに、細胞の膜内外電位差に対する電気刺激の作用についての下記の説明を行う。典型的な電位依存イオンチャネルは、細胞の局部的な相対的膜内外電位差によって規制される各種の導通状態および非導通状態を持つ。外部電界を細胞に適切に加えることによって、細胞膜の部分を任意の所望の膜内外電位差へ駆動でき、それによって細胞内に存在する電位依存イオンチャネルの導通状態の規制を可能にする。加えられる電界が適切に変えられるならば、ほとんどのイオンチャネルのいくつかの導通状態をサンプルすることが可能であり、それによってそれらを休止状態、活性化状態、不活性状態の間で循環させる。問題のイオンチャネルに依存して、イオンチャネルの活性化は、細胞の全体的な膜内外電位差変化をもたらすことがある細胞内へのイオンの解放または取込みを導くことができる。膜時定数より小さい時間間隔によって隔てられている、電気刺激の繰り返し列を加えることによって、大きな持続した膜電圧変化を、イオンの階段状の蓄積または消失を通じて生じさせることができる。この過程によって、多数のイオンチャネルの直接測定が行えるようにされ、細胞の膜内外電位差を外部から制御できる容易な方法を提供する。したがって、このやり方は高スループットスクリーニングに適合できる、改良した薬剤発見法を提供する。b.典型的な刺激プロトコルの概要電圧で活性化するナトリウムチャネルを発現するある細胞系統への典型的な二相電気刺激プロトコルのシミュレーションによる作用を、以下に簡略化した形式で示す。以下の説明は、細胞系統が他のイオンチャネルの大きい発現を持たないこと、および細胞の休止膜内外電位差が、問題としているナトリウムチャネルの不活性化のための閾値より上であることを仮定している。図4において、上のパネルは、加えられた電界Eの時間的経過を示し、中間のパネルは加えられた電界に反応するシミュレーションされた内向きナトリウム電流INaを示し、下のパネルは、細胞の理想化した平均膜内外電位差Vmを示す。この例では、それらの記録は、加えられた電界の中央に置かれている単細胞が、通常、電気刺激波列中に経験することを予測されるそれらのパラメータの変化に関連する。最初のパルスを参照して、最初の電界を形成すると、電界に最も近い細胞の縁部に、細胞の休止膜内外電位差に関して、細胞にまたがる最大の電位降下が生じるHibinoら、BiophysicalJournal64:1789-1800、1993;Grossら、1986、Biophys.J.、50:339-348を参照。理想化した球状細胞の膜の所与の点における、電界によって誘起された膜内外電位差の変化ΔVmの大きさは、下記式によって記述できるEhrenbergら、Biophys.J.、51:833-837、1987。式1において、fは膜の導電度に依存する係数、gはオーダー1の幾何学的係数、rは電界に平行な細胞の直径の半分、Eは電界の局所的な大きさ、θは電界の局所的な向きと細胞の中心から表面の考察されている点まで引いた線との間の角度である。ほとんどの完全なintact哺乳動物細胞では、膜導電度は、細胞を浸している溶液の導電度と比較して非常に低く、係数はf≒1である。実際には、細胞は基質に付着したときには球状であることはまれであり、電界が誘起した膜内外電位差変化の実際の大きさの正確な評価は、経験的に決定できる。加えられた電界の結果として、アノードに最も近い側の膜は負に駆動され、カソードに最も近い側の膜は正に駆動される。1つの縁部が十分負に駆動されて膜内外電位差を問題としているイオンチャネルに対して不活性の解放のための閾値電位より低く局所的に下げるような細胞では、加えられた電界は、この縁部に配置されているナトリウムチャネルを休止状態に入らせる。細胞の他の側では、膜内外電位差は、休止電位の正側に駆動される。細胞の休止膜内外電位差は不活性のための閾値より上であると仮定されているので、細胞のこの側のナトリウムチャネルは不活性にされたままであって電流を通さない。その代わりにもし、休止膜内外電位差が不活性化閾値より下であるならば、細胞のこの側のチャネルは活性になって電流を通す。加えられている電界が反転すると、膜内外電位差変化のプロファイルも逆になる。細胞の最も端の縁部における膜のパッチでの電界により誘起された膜内外電位差変化は、極性を変える。最初の刺激段階中に負へ駆動された側のチャネルは、今や、正へ駆動される。刺激パラメータが適正に選択されるとすると、それらのチャネルは、今度は、活性化電位より上に駆動されてナトリウムイオンの流れ込みを許し始める。これが、細胞内へのナトリウムの流れの最初のより小さいピークとして、図4に示されている。ナトリウムチャネルは特性時間の後で迅速に不活性になる。その間に、細胞の他の側では、ナトリウムチャネルが不活性から解放されて休止状態に動くように、膜内外電位差は負へ駆動される。第2の刺激段階が終わると、膜のすべての部分は、新しい平均膜内外電位差へ迅速に戻る。平均膜内外電位差が、今は、ナトリウムチャネルの活性電位より上であるとすると、第2の刺激段階中に負へ駆動された細胞の側のチャネルは、活性化して、ナトリウムイオンの流れ込みを許し始める。これが、細胞内へのナトリウムの流れ込みの第2のより大きいピークとして、図4に示されている。ナトリウムチャネルは特性時間の後で迅速に不活性になる。この場合には、ナトリウムの流れ込みは、第1の側より第2の側からの方が通常大きい。その理由は、膜のこの部分が電界により一層正に駆動されるときに、ナトリウム流れ込みのための駆動力が大きいからである。ナトリウムチャネル流れ込みの各パルスは、細胞の平均膜内外電位差を高くする図4の下のパネル。膜内外電位差のこの上昇は、ここで説明している方法のいずれによっても検出できるが、FRETをベースとする電圧感応性染料の蛍光放出比変化によって測定する方が便利である。すべての細胞に存在する漏れ電流のために、この平均膜内外電位差のシフトは、元の休止膜内外電位差へ指数関数的に減少する。この反応の時間依存性すなわち膜の時定数τmは、膜の容量と膜の抵抗値に依存し、1つの細胞タイプと別の細胞タイプとの間で極めて変化し得る。例えば時定数は、セルの種類次第で、100マイクロ秒から1秒を越えるまで変化することがある。通常、膜の時定数はほとんどの工作された細胞系統ではほぼ100msである。ナトリウム流れ込みの正味の累積を行うために、膜内外電位差が休止膜内外電位差まで減少する時間に達する前に、刺激パルスは繰り返される。電気刺激の引き続くラウンドround中、正電荷が細胞中に着実に蓄積されて平均膜内外電位差を電気刺激の各繰り返しごとにほぼ階段状に上昇させる。電気刺激の各パルスの後で、平均膜内外電位差がナトリウムイオン反転電位に接近するにつれて、ナトリウムイオンの流れ込みの大きさは着実に小さくなる。最後には、細胞からの電流の漏れが電気刺激による電流の流れ込みに等しいような平衡膜内外電位差が起きる。c.刺激波形のための調整可能なパラメータ本発明は、生きている細胞中のイオンチャネルを選択的に活性化できる任意の繰り返し手順を有する任意の波形カーネルの使用を含む。カーネルは、刺激列の基礎を形成する繰り返し可能な構造である。図4において、カーネルは二相方形パルスであるが、原則的には、時間が限定された任意の波関数である。カーネルの持続時間は、それが繰り返すことができる最高速度を設定する。繰り返し手順は、カーネルがどのようにして、かついつ試料に提示されるかを支配する。図4において、繰り返し速度は固定され、全部で10サイクル継続する。しかしながら、繰り返し速度は固定される必要はない。また、刺激列中にカーネルを変更できるので、繰り返し手順が刺激パルスを呼び出すたびに、異なる波関数を使用できる。さらに、カーネルおよび/または繰り返し手順を装置の測定された応答を基にして変更するために、フィードバック機構を使用できる。刺激カーネルと刺激列を発生するために任意の波形発生器を使用することにより、電気刺激を特定の細胞タイプまたは特定のイオンチャネルに合わせるために、波形をほぼ制限なしに変化できる。パルス列は、いくつかの別々に制御可能な成分の変化を通じて、容易に変調できる。i.個々のパルスの形刺激列中に繰り返される波形カーネルは、TektronixAFG310などの任意のデジタル波形発生器を用いて、ほぼ無限の順列で変化できる。図5は、変調できる変数のいくつかを示すための二相方形波形の概略図を示している。図5においてパルス列は、時間t1の間持続する出発電界E1400と、時間t3の間持続する第1の刺激電界E2420に達するまでの、時間t2を要する電位の急速な上昇410と、時間t5の間持続する第2の刺激電界E3440に達するまでの、時間t4を要する電位の急速な降下430と、サイクルが繰り返されるまで時間t7の間持続する終了電界E4470に達するまでの、時間t6を要する電位の急速な上昇460とで構成されている。電界E1~E4の大きさと極性は別々に制御可能であり、下記のように、静的および動的に変化できる。電位が細胞に加えられる時間すなわち時間t1、t3、t5およびt7も別々に制御可能であり、波形列中において0と10秒の間に下記のように静的および動的に変化できる。最後に、時間t2、t4およびt6にわたって生ずる電位の変化は、0と100ミリ秒の間の可変の時間期間にわたって起きることがあり、かつ可変形の波形を生ずるために、直線形または非直線形のことがある。波形の変化のそれらのタイプのいくつかの例が、図6に示されている。a図5に示されているように、速度fで繰り返される二相波形。b変更された二相波形。その波形列の刺激段階の間に短いインターバルが付加されている。これによって、第1のパルス中に不活性から解放されたチャネルを通じて電流が流れるようにされる。c単相波形。細胞のアノードに面している側にあるチャネルのみが不活性から解放される。dランプ波形rampedwaveform。アノードに面しているチャネルが方形波により不活性から解放される。それらのチャネルは活性化して傾斜中に電流を流す。傾斜部によってより負の局部電位においてチャネルは開いて、電流を流すことができるようにされるので、細胞がナトリウムイオンに対する反転電位に近いときでさえも、大きい電流が依然として流れることができる。チャネルが開く点である傾斜部に沿う点は変化する。e二相三角波形または鋸歯状波形。傾斜によって状態間の電位依存遷移が、全体的な膜電位が変化するにつれて、より一様に起きるようにすることができる。単相三角波形も可能である。f正弦波形。この種の波形は、高周波刺激中に電気的ノイズを減少させることができる。g正弦波形の短いバースト。hおのおの異なる基本周波数を持つ、正弦波形のバースト。この種の刺激は可塑性効果plasticityeffectを研究するために有用であることが判明することがある。第1のバーストは、装置を訓練するためまたはプロセスを開始するために用いられ、以後のバーストは装置をアッセイするために用いられる。波形の変形は、パルス列中の固定された刺激条件を維持するのに有用であることがある。例えば、高度に分極されている細胞が経験する膜内外電位差の行程は、刺激サイクルの開始時のほぼ-90mVからいくつかの繰り返し刺激サイクルの後の60mVまで、それの平均膜内外電位差変化として、変化する。その結果、イオンチャネルを不活性状態から効率的に解放するために要する印加電界は、いくつかの刺激サイクルの行程中に細胞の平均電位が変化するにつれて、変化する。この効果を考慮に入れると、ある環境の下では、波形列が進むにつれて刺激の正E2段階と負E3段階の間の相対的平衡を変化すると有用なことがある。いくつかの細胞系統、例えばHEK-293は、電圧で活性化させられるいくつかのナトリウムチャネルの活性化閾値より下の休止平均膜内外電位差を有する。それらの細胞では、ナトリウムイオン流れ込みの結果として刺激中に膜内外電位差が上昇するにつれて、加えられている電気刺激とは独立に、ナトリウムチャネルを開くことができる。これは傾斜を有する電流パルスを用いることによりすなわちt2とt4での上昇により改良できる。その後で、チャネルは、活性電圧のすぐ上で定められた時間の間に、細胞の平均膜内外電位差とは独立に、電流を流すことができる。ii.個々のパルスの全体の振幅E2とE3パルス振幅の大きさと極性は、刺激パルス中に細胞が経験する相対的な膜内外電位差行程を制御する。下でより詳細に説明するように、種々のチャネルと細胞タイプとに適応できるようにするために、パルス振幅は全体の列に対して、または個々のパルスに対して変更できる。一般に、E2とE3の大きさは、各刺激サイクル中において、対象とするイオンチャネルが効率的に活性化され、不活性から解放されることを確実にするように、同時に、細胞の不可逆的エレクトロポレーションを引き起こすほどの大きさでないことを確実にするように、選択される。E2とE3の好適なパルス振幅は、通常、平均寸法が10~25μmである励起できない哺乳動物の細胞で発現されるときは、ほとんどのイオンチャネルに対して5~60V/cmの範囲にあり、アースに対して正または負に変化することがある。上記のように、刺激の振幅は、平均膜内外電位差が変化しても安定な刺激条件を維持するために、パルス列中で変化することができる。好適なパルス振幅は、平均細胞寸法に逆依存する。したがって、パルス振幅を変化することによって、10~25μmより小さいか大きい細胞に対して、この技術を使用することもできる。iii.個々のパルスの持続時間t3とt5多くのチャネルは、開通する前に、不活性からそれらを解放するために、膜内外電位差を延長された時間期間の間変更することを求める。例えば、多くの電位依存ナトリウムチャネルは、一般に、それらが不活性から解放される前に、-90mVより低い膜内外電位差を何ミリ秒間か経験することを必要とする。したがって、電気刺激プロトコルの効率的な使用は、通常、パルスの持続時間t3とt5が、対象とするイオンチャネルに対して不活性からの完全なまたはほとんど完全な解放を可能にするために十分であることを要求する。ある場合には、いくつかのイオンチャネル型を発現する細胞における1つのクラスの不活性化からの選択的解放を可能にするが他のクラスのイオンチャネルではそうではないように、t3とt5の大きさを調整することが必要なことがある。他の場合には、チャネルの不活性からの解放のレベルが低くなるように、t3とt5を非常に小さくすることが望ましいことがある。通常は、好適なパルス持続時間は、対象とするイオンチャネルの所望の電位依存状態の間の遷移のための特性時間に合致させられ、それらは、通常は、ほとんどのイオンチャネルに対しては約0.1または100ミリ秒の範囲にある。水の過剰な電気分解とそれに伴う気泡発生を避けるために、t3とt5の持続時間はできるだけ短く保たなければならず、しかも所望の電気刺激を依然として達成しなければならない。金属/水界面における水の電気分解は、通常、金属と水の間の電圧差の大きさが約0.8Vを超えたときに起きる。ある場合には、細胞刺激を起こすために求められる刺激パラメータも、水の電気分解を引き起こす。電極における気体のいくらかの発生は、単一のパルスの任意の単一極性中に供給される電極/水界面の単位面積当たりの電荷が約100μC/mm2より少ない限り、通常、受け入れられる。この限度を超えると、通常、電界の一様性に大きく影響する気体放出と気泡形成が引き起こされる。電極表面での気泡の存在は、電極のその部分をふさいで、電界の一様性を変化させることがある。大量の気体の発生は、ウェル内の細胞および染料に酸化性の損傷を与えることもある。抵抗率が70Ωcmである生理食塩水100μLを含んでいる96ウェルプレートでは、ウェル内にウェルの底から0.5mm以内に挿入されている、間隔ギャップが4mmである2つの平行平板電極の間の食塩水の抵抗値は、約230Ωである。各電極は、食塩水に対する約24mm2の接触面積を有する。したがって、刺激プロトコルの任意の単一極性位相は、約2.4mCを超える電荷を供給してはならない。プレートの間に加えられる約10Vの電圧差は、食塩水中に約25V/cmの電界を発生する。この電圧は、約43mAの電流を引き出す。したがってこの電極構成に対して、電荷を2.4mCより少なく制限するためには、方形波、単一極性パルスは、持続時間において約55ミリ秒を超えてはならない。iv.引き続く刺激の間の間隔t1とt7列に対してt1とt7の値を全体的に変えること、または列中の個々の各パルスに対してそれを調整することは、特定のイオンチャネルに対する刺激プロトコルを最適にするために有用である。またこのやり方は、チャネル開放時間とチャネルの活性化および不活性化の時間的経過を含めた、ある細胞特性およびあるチャネル特性を決定するために有用でもある。例えば、電圧規制されたナトリウムチャネルを含んだアッセイのために、平均開放ナトリウムチャネル時間に等しいか、それより短いパルス間遅延時間t1t7の挿入によって、チャネルの不活性化運動の定量的測定を行えるようにされる。不活性化運動は、平均開放チャネル時間に直接関連付けられる。したがって、短いパルス間間隔を用いるアッセイによって、主要な作用が不活性化反応速度に対するものであるような化合物の検出を行えるようにされる。不活性化運動は、これ以外の場合には、高スループット技術を用いては到達できない機構である。ほとんどの場合、引き続く刺激の間の遅延時間は、膜内外電位差を持続して上昇させるためには膜の時定数よりも小さい。通常は、刺激の最適周波数fは、τM1≦f≦τb1の範囲内である。ここで、τMは膜内外電位差変化の減衰に対する時定数、τbは平均チャネル開放時間である。いくつかのチャネルは不活性にならず、それらの細胞に対しては刺激周波数は経験的に決定されることがある。また、刺激周波数fは、刺激カーネルの持続時間の逆数を超えることはできない。また、ある細胞タイプに対しては、よりゆっくりと刺激することが望ましいことが判明することがある。例えば、高いチャネル密度を持つ細胞に対して、またはより高い薬理学的感度が求められるアッセイのためには、刺激頻度は低いことが好適なことがある。あるいはこれらの場合に対しては、単極刺激を使用できる。これは、細胞の1つの側におけるナトリウムチャネルを不活性から解放するだけであるが、刺激の最高周波数は2倍になり得る。v.パルス列の持続時間、または列中のパルスの数細胞およびチャネルの特性は、動的モードすなわち、立上りおよび立下り時間、反応形状における変化などおよび静的モードでアッセイできる。両方のモードは、対象とするすべての事象を調べるために十分長いが、アッセイを終了するために必要なものよりも長くない、刺激列持続時間を必要とする。典型的な刺激時間は、20Hzの周波数で3秒間にわたって繰り返される、25V/cmで10msecのパルスを有する。これらのパラメータを調整することによりアッセイ時間を短縮でき、または高速および低速時間スケールでプロセスを調べることができるようにされる。vi.多数パルス列ある場合には、パルス列を繰り返すこと、または同じ細胞に対して2つの異なるパルス列を用いて測定することが、有用である。1つの例は、多数の刺激列を受ける細胞の単一プレートを用いて、刺激周波数および持続時間の関数としての反応を測定することにより、チャネルの諸特性を完全に特徴付けすることである。他の例は、反応の柔軟性すなわち、反応の活性依存する変化を調べることである。1つまたは複数の刺激列が反応を整え、一方、整える前または後の測定列の組が、活性に起因する変化を決定する。vii.反応の動的測定を基づいた刺激パラメータのフィードバック本発明は、平均膜内外電位差を予め設定されている値に維持するために動的帰還ループを用いることにより、電圧クランプ装置を形成するためにも使用することができる。下で説明するように、高速蛍光出力を用いて膜内外電位差を測定し、その後で膜内外電位差のいかなる変化も補償するように刺激パラメータを変化することにより、細胞の膜内外電位差を動的に制御することが可能である。そして、その電位を維持するために必要な電流は、刺激パラメータのコンピュータ制御によって決定される。viii.電気分解を避けるための高周波数刺激の使用典型的な刺激パラメータ中、約50mAのピーク電流が、電極の間の溶液中を流れる。この時間中、種々の電気化学的反応が起こり、それらの電気化学的反応は、通常、細胞にとって有毒な化学種を発生する。予備実験によって、ほとんどの哺乳動物の細胞が、通常は、ステンレス鋼電極を使用しての約2分間の電気刺激に対して正常に反応することが示されている。しかし、より長い時間にわたる延長された刺激は、細胞の健全さと生存能力を損なうことをもたらすようである。十分に高いパルス周波数では、金属-食塩水界面が水の電気分解のための電位食塩水中のステンレス鋼に対しては約±1Vに達しないように、電流を容量的に流すことができ、それにより有毒な生成物は発生しないだろう。各電極の食塩水に接触している面積が約24mm2である、図1に示されている電気刺激器では、電極当たりの容量は約1~10μFであるRobinson、1968、Proc.IEEE、56:1065-1071。50mAでは、この容量は、約20~200マイクロ秒で1Vまで充電する。これは、有用なパルス持続時間の下限である。あるいは、電解生成物を発生することなく電気刺激を行うことが可能である。金属-食塩水界面の容量を2~100倍だけ増加できるいくつかの処理を利用できる。それらは表面を粗くする、白金黒または金黒での電気めっき、イリジウム/イリジウム酸化物、チタン/チタン窒化物、またはポリピロール膜の付着および活性化を含む。不可逆電気化学反応を避ける刺激パラメータを用いると、それらの表面処理は、電流が流れても劣化しない。6.イオンチャネルの発現a.細胞タイプの選択本発明は、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、バクテリア細胞、酵母および哺乳動物細胞を含めて、任意のタイプの細胞で使用できる。ヒトの治療のためのスクリーニングには、哺乳類の細胞系統が好ましく、そのような細胞系統は、比較的容易に成長でき、かつ高い効率で容易にトランスフェクションできる組織培養細胞系統を含む。多くの組織細胞系統は、AmericantypeculturecollectionATCChttp://www.atcc.orgを参照、およびEuropeancollectionofcellculturesECACChttp://www.camr.org.ukを参照を通じて商業的に入手できる。またある場合には、固有の生理学的コンテキストにおいて対象とするイオンチャネルの反応を表すまたは測定することを求められたときに、1次細胞系統または組織切片sliceがスクリーニングのためにまた好適なことがある。この手法は、候補治療の特異性、選択性、毒性をスクリーニングするための第1のスクリーニングまたは第2のスクリーニングとして有用なことがある。これについてはX節で詳しく述べる。培養された細胞系統に対して行われるアッセイに関し、主な選択基準は、細胞系統の休止膜内外電位差、および内生的に発現されたイオンチャネルの存在である。対象とする特定のイオンチャネルについての適切な細胞系統の選択は、対象とするイオンチャネルの電位依存特性とイオン選択性に依存する。それらの考察は、VIII刺激プロトコルにおいて、いくつかのイオンチャネルについて詳細に再検討する。ある場合には、他のイオンチャネルの検出可能な内生的発現を持たないまたは非常にわずかに有する細胞系統を使用することが望ましい。このタイプの細胞は、CHO-K1細胞、CHL細胞、およびLTK-細胞を含む。それらの細胞は10~-30mVの範囲の休止電位を本来有する。それはほとんどの電位依存チャネルの活性閾値および不活性閾値より上である。それらの細胞系統を使用することは、スクリーニングアッセイデータが一般に容易かつあいまいでなく解釈されるように、対象とするイオンチャネルが細胞内の膜内外電位差の大きなモジュレーターである、という利点を有する。ある場合には、他のイオンチャネルを持たない細胞系統は、実行可能なアッセイを行うためには実際的ではないようである。例えば、電圧を規制されたイオンを高度に分極された膜内外電位差に維持することが必要かもしれない。この場合には、2次イオンチャネルの発現を通じて膜内外電位差を制御することが必要である。例えば、休止状態にあるラットの脳タイプIIaナトリウムチャネルをアッセイするためには、膜内外電位差をナトリウムチャネルの閾値活性電位、この場合にはおよそ-60mVより下に維持することを要する。これを行うためには、細胞の休止膜内外電位差をほぼ-90mVに維持できる、カリウム内向きレクチファイヤrectifierなどのイオンチャネルを共発現co-expressすること、または類似のイオンチャネルを内生的に発現する細胞系統を特定することが必要である。このタイプの細胞タイプは、RBL細胞およびHEK-293細胞を含む。他の場合には、対象とする1次イオンチャネルのアッセイを可能にするために、細胞膜を特定の膜内外電位差へ駆動する電気刺激とともに、2次イオンチャネルの発現を使用することが必要なことがある。この状況の例は、配位子ゲートチャネルなどの電圧が規制されていないイオンチャネルをアッセイするときに起きる。電圧を規制されているナトリウムチャネルの共発現を、例えばば電気刺激とともに用いて、膜内外電位差を約10~60mVの間の膜内外電位差に設定することができる。比較すると、電気刺激と共同しての電圧を規制されているカリウムチャネルの共発現は、膜内外電位差を約-90~-30mVの間の膜内外電位差に設定することができる。したがって、これらの手法は、膜内外電位差を比較的広い範囲にわたって実効的に取り扱うことを可能にし、それによりほぼどのようなイオンチャネルの分析も可能にする。通常、この共発現手法を用いると、両方のイオンチャネルを共発現している細胞系統と、膜内外電位差を設定するために用いられるイオンチャネルのみを発現している細胞系統とで得られるどのヒットも再スクリーニングする必要がある。これによって、この2次イオンチャネルに影響を及ぼす薬品を、対象とするイオンチャネルに実際に影響を及ぼす薬品から識別可能にする。あるいは、TTXなどの選択性毒素を用いて、1つのクラスのイオンチャネルを選択的に阻害することができる。b.イオンチャネルのトランスフェクション対象とするイオンチャネルの発現のために配列符号で細胞をトランスフェクトするために用いられる核酸は、通常、チャネルの発現のためのヌクレオチド配列からなるコーディング領域に作動的機能的にリンクされている発現制御配列を含めた発現ベクターの形態である。使用されているように、チャネルの発現のためのヌクレオチド配列コーディング領域という用語は、mRNAの転写および翻訳により、チャネルを生ずる配列を指す。これは、例えばイントロンを包含している配列を含んでいる。ここで使用しているように、発現制御配列という用語は、それが作動的にリンクされている核酸配列の発現を規制する核酸配列を指す。発現制御配列は、発現制御配列が核酸配列の転写と適切であれば翻訳とを制御および規制するときに、核酸配列に作動的にリンクされる。したがって、発現制御配列は、適切なプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、タンパク質をコードする遺伝子の前の出発コドンすなわちATG、イントロンのための切り継ぎ信号、mRNAの適切な翻訳を許すためのその遺伝子の正確な読出しフレームの維持、および終止コドンを含むことができる。この技術分野の当業者に周知の方法を、適切な局所化ドメインまたは目標とするドメインおよび適切な転写/翻訳制御信号に作動的に結合されている、イオンチャネルをコードする配列を含んでいる発現ベクターを構成するために使用できる。例えば、配列取得番号を参照して、または表1または表3を参照して、この技術分野の当業者は、対象とするイオンチャネルの配列を特定できる。それらの方法はinvitro組換えDNA技術、合成技術およびinvivo組換え/遺伝子組換えを含む。例えば、Maniatisら、MolecularCloning、ALaboratoryManual、ColdSpringHarborrLaboratory、N.Y.1989を参照。多数の商業的に入手できる発現ベクターを、Clontech社カリフォルニア州パロアルト、Stratagene社カリフォルニア州サンディエゴSanDiego、CA、およびInvitrogen社カリフォルニア州サンディエゴ、ならびにその他の多数の企業から入手できる。この方法の意図されている変更例は、例えば、チャネルの発現を誘導することにより、対象とするイオンチャネルの発現において急増を生ずるために、誘導可能な制御ヌクレオチド配列を使用することである。誘導可能な装置の例は、Bujardおよびその協力者により最初に発表されたテトラサイクリン誘導可能な装置GossenandBujard、1992Proc.Natl.Acad.Sci.USA、89、5547-5551;Gossenら、1997Science、268、1766-1769および米国特許第5464758号に記述されている。組換え体DNAを持つ宿主細胞の形質転換は、この技術分野の当業者に周知の従来の技術により行うことができる。宿主がE.coliなどの原核生物である場合には、DNA取込みができる能力細胞を、指数的成長期の後に収穫し、その後で、この技術分野で周知のCaCl2法により処理された細胞から用意できる。あるいは、MgCl2またはRbClを使用できる。形質転換は、宿主細胞の原形質体を形成した後で、またはエレクトロポレーションにより、実行することもできる。宿主が真核生物であると、リン酸カルシウム共沈体などのDNAのトランスフェクション法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポゾーム中に入れられているプラスミドの挿入、またはウィルスベクターなどの従来の機械的な手順を使用できる。真核生物細胞は、イオンチャネルをコードするDNA配列と、単純性疱疹チミジンキナーゼ遺伝子などの、選択可能な発現型をコードする第2の外部DNA分子とコトランスフェクトすることもできる。他の方法は、サルウィルス40SV40または牛乳頭腫瘍ウィルスなどの、真核生物ウィルスベクターを用いて、真核生物細胞を一時的に感染または形質転換することである。EukaryoticViralVectors、ColdSpringHarborLaboratory、Gluzmaned.、1982。好ましくは、真核生物宿主はここで説明するように宿主細胞として利用する。安定なクローンの選択は、通常、対象とするイオンチャネルの容易な検出を可能にする十分なレベルにおいてそのイオンチャネルの成功した発現を基にして行われる。多くの場合には、この分析は、対象とするクローンの発現と一致する適切な電気生理学的諸特性を示すものを特定するために、個々のクローンの機能的な特徴付けを要する。この分析は、パッチクランプの使用を通じて、または下で説明するように膜内外電位差感応性染料を用いる膜内外電位差の測定を通じて完了できる。この後の方法を使用することの利点は、蛍光で活性化された細胞分類に適合でき、1秒間に何千もの個々のクローンを迅速に分析できることである。休止している細胞でナトリウムチャネルが電気的に静止している場合には、発現の確認を、天然のイオンチャネルに対して育てられた抗体を用いる免疫化学法で、または上で説明したように、分子技術を介してイオンチャネル中に導入された定められたエピトープを用いて、容易に達成することもできる。対象とする1次イオンチャネルと、膜内外電位差を設定する2次イオンチャネルとで細胞がトランスフェクトされている場合には、両方のイオンチャネルの相対的な発現の最適化が重要である。通常、2つのイオンチャネルの最適な相対的発現は、クローンのうち、クローンの反応中で最大のダイナミックレンジと最小の統計的な変動を与えるクローンを選択することによって、経験的に決定される。7.膜内外電位差の測定本発明の使用による膜内外電位差変化と特定のイオンチャネルのコンダクタンスの測定とは、膜内外電位差またはイオンの運動の既知の測定手段のいずれかを用いて検出できる。それらの方法は、例えば、パッチクランピングHamilleら、PfluegersArch.、391:85-100、1981、FRETをベースとする電圧センサ、エレクトロクロミック膜内外電位差染料Cohenら、AnnulReviewsofNeuroscience、1:171-82、1978、膜内外電位差再分配染料FreedomandLaris、SpectroscopicmembraneprobesCh16、1968、細胞外電極Thomasら、Exp.CellRes.、74:61-66、1972、電界効果トランジスタFromherzら、Science、252:1290-1293、1991、放射性フラックスアッセイ、イオン感応性蛍光またはルミネッセント染料、イオン感応性蛍光またはルミネッセントタンパク質、内生タンパク質の発現またはリポーター遺伝子または分子の使用を含む。高スループットスクリーニングの好適な分析法は、膜内外電位差、またはイオンチャネルコンダクタンスの光学的読出しの使用を含む。これらの方法は、イオンチャネルコンダクタンスや膜内外電位差の変化の結果として蛍光特性またはルミネッセント特性の変化を通常示す、膜内外電位差またはイオン感応性染料または分子の使用を含む。本発明に使用する好適な光学的分析法が、米国特許第5661035号1997年8月26日発行に記述されている。このやり方は、通常、エネルギー伝達を行って膜内外電位差に依存する比率測定法蛍光読出しを行う2種類の試薬を備えている。通常、このやり方は電圧感応性脂肪親和性染料と、細胞膜に関連させられている電圧を感知しない蛍光団とを使用する。Gonzalezら、DrugDiscoveryToday、4:431-439、1999を参照。一実施形態では、2種類の染料分子、すなわちクマリンにリンクされたホスホリピドCC2-DMPEおよびビス-1,2-ジブチルバルビツール酸トリメチンオキシノール[DiSBAC43]のようなオキシノール染料が、細胞の原形質膜内にロードされる。CC2-DMPEは原形質膜の外側葉状部outerleaflet内に区画し、そこでそれは、動きうる電圧感応性オキシノール受容体への固定されたFRETドナーとして動作する。内側が比較的負の電位である細胞は負に帯電しているオキシノールを原形質膜の外側葉状部へ押して、効率的なFRETの結果となるすなわち、クマリンドナーのクエンチングおよびオキシノール受容体の励起。消極によってオキシノールは原形質膜の内面へ迅速に移動して、FRETを減少する結果となる。FRETは100オングストロームより小さい距離にわたって起きることができるだけであって、クマリンが励起されると原形質膜内のオキシノールの動きの特定のモニタが行われる結果となる。それらのアッセイのための反応時間は、オキシノールの疎水性を増加または減少することによって容易に変化する。例えば、疎水性が高いジブチルオキシノールDiSBAC43は約10msの時定数を持つ。これは疎水性が小さいジエチルオキシノールDiSBAC23より非常に速い。染料のローディングは、通常、膜内外電位差の測定の開始前に室温で行われる。通常、細胞にはクマリン脂質が、それに続いてオキシノールが、順次ロードされる。クマリン脂質の典型的なローディング濃度は約4から15μM最終濃度の範囲で、染色溶液は、通常、ほぼ7.2から7.4のpHで、10mMのHEPES、2g/Lのグルコースおよび約0.02のPluronic-127のHanksBalanced塩溶液中で用意される。ローディングは、通常、約30分のインキュベーションの後で許容でき、その後で所望により過剰の染料を除去できる。オキシノール染料は、通常、室温において2と10μMの間の濃度で25分間ロードされ、より高い疎水性のDiSBAC43は、通常、2~3μMのPluronic-127の存在下でロードされる。最適なローディング濃度は細胞タイプ間で変わり、ルーチンの実験によって経験的に決定できる。通常、そのような最適化実験は、第1の試薬の濃度を系統的に滴定し、その後で試験された各濃度に対して、第2の試薬の濃度を滴定することによって実施される。このようにすると、各試薬についての両方の最適なローディング濃度と、最適な相対比を得て、最高の信号対ノイズ比を達成可能である。例えば、本願出願人が所有している、1998年7月17日付で出願された米国特許出願第09/118497号、1998年7月21日付で出願された米国特許出願第09/120516号、1998年7月23日付で出願された米国特許出願第09/122477号に記述されているように、ある場合には、望ましくない光放出を減少するために、1つの、またはほとんどのFRET試薬に1つまたは複数の光吸収物質を添加またはロードすることが好ましいことがある。FRETをベースとする電圧センサは、他の膜を目標とされている発蛍光団の使用から、可動性の疎水性のドナーまたは受容体とともに得ることもできる。他のそのような組成が、例えば、1999年12月13日に出願された米国特許出願第09/459956号に記述されている。光学的方法により膜内外電位差の変化を測定するのに適した装置は、顕微鏡、マルチウェルプレート読み取り器、および迅速かつ感度の高い比率測定法蛍光検出が可能な他の装置を含む。この種の好適な装置が、1998年6月17日に出願された米国特許出願第09/118728号に記載されている。この装置電圧/イオンプローブ読取り器またはVIPR商標は96個またはそれより多いウェルのマルチウェルプレート用の統合された液体ハンドラhandlerおよび反応速度蛍光読取器である。VIPR商標読取器は、8チャネル液体ハンドラと、マルチウェル配置ステージと、光ファイバ照明および検出装置とを統合している。この装置は、他の微量滴定プレートまたはトラフから得られた液体試料を入れる前、最中および後に、8ウェルの行からの蛍光を同時に測定するように設計されている。VIPR商標読取器は、8つの三つ又に分かれている光バンドル各ウェルごとに1本のバンドルを採用することによって、マルチウェルプレートの底からの発光信号を励起し、検出する。三つ又に分かれているファイバの1つの脚が励起源として用いられ、三つ又に分かれているファイバの他の2つの脚が蛍光放出を検出するために用いられる。ファイバの端部に設けられている球面レンズが光の励起および収集の効率を高める。二又に設けられている発光ファイバによって読取器が2つの発光信号を同時に検出できるようになり、かつそれらはFRETをベースとする電圧染料によって発生された迅速信号に適合する。その後で光電子増倍器が放出蛍光を検出し、秒以下での発光比検出を可能にする。8.刺激プロトコル1つの様相では、本発明は、生きている細胞の膜内外電位差を電気刺激を通じて変調する方法と、ほぼ任意のイオンチャネルまたはトランスポーターシステムの活性度をアッセイするためにそれらの方法を使用することを含む。a.特定のチャネルのコンダクタンスの測定i.ナトリウムチャネルのアッセイ哺乳類の電位依存ナトリウムチャネルの各種のアイソフォームisoformが特定され、下の表1に要約されている。これらのチャネルは3つの主な群に分類できる総説として、Goldwin、AnnalsN.Y.AcademyofSciences868:38-50、1999を参照。表1の電位依存ナトリウムチャネルの電位依存性と、不活性および活性化キネティクスとは、大きくばらついている。電圧ゲートナトリウムチャネルは、多くの異なるコンホメーションを有する。それらは3つの状態に分類できる。1休止状態。この状態ではチャネルは閉じられて電流は流れることができない。これは、ナトリウムチャネルが、休止膜内外電位差が約-60mVより下である細胞で発現されるときの典型的な状態である。チャネルは、消極により、開放状態、通常は約-50mVより上の膜内外電位差へと迅速に駆動できる。2活性化された状態。この状態ではチャネルは開き、イオンは通ることができる。ナトリウムの細胞内濃度は、正常な休止している細胞では低く、細胞外濃度は高いので、ナトリウムイオンは細胞内に流れ込み、膜内外電位差をより一層正に駆動する。開放状態の寿命は短く、一般に1ミリ秒のオーダーである。その後でそれは不活性状態に入る。3不活性状態。この状態ではチャネルは閉じられていてイオンはチャネルを通ることができない。チャネルはひとたび不活性状態になると、直接は開くことはできない。それはまず休止状態になる。これは、膜内外電位差が数ミリ秒の間、非常に負一般に-80mVより下に保持されると起きる。それら3つの状態の間の遷移のための時定数と閾値電位とは、チャネルのサブタイプの間で非常に大きく変化する。それらの実験の最中、反応が活性チャネルを持つ細胞に対して、およびチャネルが薬理学的にブロックされている細胞に対して比較される。適切な薬理学的試薬を利用できない場合は、ブロックされた状態をトランスフェクトされていない細胞系統でエミュレートできる。最適な刺激パラメータは、2つの細胞の集団の信号の差における変化の最小係数を与える。a不活性状態にある電位依存ナトリウムチャネルのアッセイ好適な細胞は、対象とするイオンチャネルの活性閾値より上の休止膜内外電位差を持つものを含み、そのような細胞では、他のイオンチャネルは発現されない。これらの基準に合致する細胞は、CHL細胞とLTK-細胞を含む。目標イオンチャネルを選択した後で、細胞は、トランスフェクトされクローンがIII節で説明したように選択される。あるいは、対象とするチャネルと低レベルでの他のチャネルとを内生的に発現する細胞系統を使用できる。例えば、CHO-K1細胞系統は電圧ゲートナトリウムチャネルと、非常に低いレベルの他のチャネルとを発現する。細胞は、IV節に説明されているように、電気刺激を開始する前に、マルチウェル微量滴定プレートに付着され、培養され、電圧感応性染料で染色される。最初の実験は、通常、各ウェル内に等しい数の細胞を有する96ウェルマルチウェルプレートで行われる。一般に、8個のウェルの行が同一の条件の下に同時に電気的に刺激されて、細胞の反応の変化について統計的に重要なデータを提供する。最適な電気刺激プロトコルが、多数の細胞の原形質膜の部分を、活性化消極を行う前に、細胞をエレクトロポレートすなわち殺すことなく、ナトリウムチャネルを不活性状態から解放するために十分長く、過分極すべきである。通常、これには、約0.5から約20msまでの範囲の期間にわたって、約-60ないし-80mVの持続される膜内外電位差を細胞内に生ずることを要する。この効果を達成する好適な刺激プロトコルは二相であるので、細胞の両方の端縁部にあるイオンチャネルは、二相波形が極性を反転するにつれて不活性から解放される。通常、一相当たり5ミリ秒で、振幅が25V/cmである二相方形波カーネルbiphasicsquarewavekernelを用いる最初の条件からスタートする。カーネルは、約3秒の総列持続時間の間、約20Hzの一定の率で反復される。その後で、パルス振幅最大約60V/cmまでと、持続時間0.1または50msの範囲と、それから周波数0または1kHzの範囲とを最適にする。必要があれば、それらで一層効率的な電気刺激を行えるかどうかを判定するために、パルスの形の変化を調べることもできる。最適な刺激パラメータは、最低の電界強さと、電極を流れる電流の最小デューティサイクルとにおいて、異なる試験ウェルの間の信号の変化の最小係数で最大細胞刺激チャネルがブロックされているか、存在しないような細胞と比較してを生ずる。特定のパラメータの組が選択された後で、信号のサイズと反応の変化係数とをさらに最適にするために、電圧センサ染料の染色濃度の滴定を上記のようにして行うべきである。それらの手順染料濃度、電界の強さ、および刺激の持続時間と周波数は、信号を一層最適にするために反復できる。b通常は休止状態にあるナトリウムチャネルのアッセイ好適な細胞は、対象とするイオンチャネルの活性化閾値より下の休止膜内外電位差を持つものを含み、その細胞では、他のイオンチャネルの発現は少数の特徴付けされているイオンチャネルタイプに大きく限られる。このタイプの細胞は、HEK-293細胞およびRBL細胞と、F11細胞とHL5細胞を含む。目標とするイオンチャネルの選択の後、上述したように、細胞は、対象とするイオンチャネルでトランスフェクトされ、クローンが選択される。あるいは、F11細胞とHL5細胞の場合におけるように、内生的なナトリウムチャネルを使用できる。選択および特徴付けの後で、上記のように細胞クローンがマルチウェル微量滴定プレートに付着され、電圧感応性染料で染色される。前のように、最初の実験は、典型的には、各ウェルに等しい数の細胞がある、96ウェルマルチウェルプレートで行われる。一般に、8つのウェルの行が同一の条件の下で同時に刺激されて、細胞の反応の変化についての統計的に重要なデータを提供する。いくつかのアッセイ手法が、細胞内の対象とするナトリウムチャネルの発現レベルに依存して可能である。高レベルの電位依存ナトリウムチャネルの発現については、ナトリウム電流は、単一チャネル活性化/不活性化シーケンスの後で大きな膜内外電位差変化を生ずるのに十分大きくなることができる。それらの場合には、電気刺激で生じさせられる膜内外電位差の小さい正の乱れは、以後のナトリウムイオンの入り込みが細胞全体を消極するのに十分なナトリウムチャネルを活性化することによりすべてのナトリウムチャネルを活性化するのに十分なことがある。刺激電界は、チャネルを活性化するために、通常、十分長く加えるべきであるが、以後のイオン流を妨害するほど長くてはならない。細胞の膜内外電位差が再分極された後で、刺激手順は反復できる。引き続く刺激事象は、最初のものと同一にでき、または、チャネルの時間依存特性を調べるために変更できる。通常、一相当たり500μsで、振幅が10V/cmである二相方形波カーネルを用いる初期条件からスタートする。その後で、パルス振幅5および60V/cmの間と、持続時間0.1および1msの範囲を最適にする。必要があれば、それらで一層効率的な電気刺激を行えるかどうかを判定するために、パルス形状の変化を調べることもできる。最適な刺激パラメータは、最低の電界強さと、電極を流れる電流の最小デューティサイクルとにおいて、異なる試験ウェルの間の信号の変化の最小係数で最大細胞刺激を生ずる。特定のパラメータの組が選択された後で、信号のサイズと反応の変化係数とをさらに最適にするために、電圧センサ染料の染色濃度の滴定を上記のようにして行うべきである。それらの手順染料濃度、電界の強さ、および刺激の持続時間と周波数は、信号を一層最適にするために反復できる。低すぎて許容信号サイズを単一の刺激から与えることができないようなナトリウムチャネルの発現を有する細胞を使用することがしばしば必要であろう。また、引き延ばされた時間期間にわたって大きな信号を維持することが望ましいこともある。それらの場合には、活性化電位より上に維持されているチャネルについて述べたように、細胞にパルス列を与えることができる。二相刺激パルスで、ナトリウムチャネルを開始膜内外電位差とは独立に活性化できる。パルス間の間隔を膜時定数より短く保つことによって、内向き電流と外向き電流の間に平衡が成り立つまで、各刺激は電流を細胞中へ駆動する。この電圧の偏移は、刺激列が継続している限り維持される。この場合の刺激プロトコルは、不活性化閾値より上の休止電位をもつ細胞について説明したのとほとんど同じである。一般に、最初の一連の実験が、固定されている列持続時間で一定の頻度で反復される二相方形波カーネルを用いて行われる。パルスの持続時間は約1μsから約1秒まで、より好ましくは約100μsから約20msまで変化する。パルス振幅は、約0V/cmから約60V/cmまで、より好ましくは約10V/cmから約50V/cmまで変化する。刺激の周波数は、0Hzすなわち単一パルスと100kHzの間で、より好ましくは0Hzから約1kHzまでの間で変化する。パルス列は0sすなわち、単一パルスと約100sの間で、より好ましくは0sと10sの間で変化する。最適な刺激パラメータは、最低の電界強さにおいて、最大膜内外電位差変化チャネルがブロックされているまたは存在しない細胞と比較してと試験ウェルの間の信号の変化の最小係数を生ずる。特定のパラメータの組が選択された後で、通常、信号のサイズと反応の変化係数とをさらに最適にするために、電圧センサ染料の染色濃度の滴定が上記のようにして行われる。それらの手順染料濃度、電界の強さ、および刺激の持続時間と周波数は、信号を一層最適にするために反復できる。ii.カリウムチャネル電位依存カリウムチャネルは、動作電位消極の後で、神経細胞および筋肉細胞を再び分極する。それらは、神経、筋肉、分泌器官および排出器官においても重要な調整役割を演じる。ほとんどの細胞は、高い細胞内カリウム濃度を積極的に維持するので、カリウムに対する反転膜内外電位差は、およそ-90mVである。カリウムは、通常、細胞から流れ出るので、よりカリウム選択性のチャネルを開くと、膜内外電位差を一層正へと通常は駆動するナトリウムチャネルの開放と対照的に、膜内外電位差を一層負へと駆動しようとする。数多くのカリウムチャネルのサブタイプの概要を下の表2に示す。カリウムチャネルは、活性化および不活性化時定数と電位依存性の面で、数多くの多様性を示す。一般には、電位依存カリウムチャネルは、ナトリウムチャネルに類似する電位依存性を示し、非常に負の電位で閉じられ、ある閾値より上で開く。カリウムチャネルは、多数の休止状態と、多数の不活性状態と、通常は単一の活性状態とを有する。電位依存ナトリウムチャネルとは異なって、遷移は、ほとんどの状態の間で許される。それらの遷移は、活性化休止から開放状態へ動くと、脱活性化開放状態から休止状態へ動くと、不活性化休止状態または開放状態から不活性状態に動くと、不活性からの解放不活性状態から休止状態へ動くと、フリッカーリング不活性状態から開放状態へ動くとである。遷移の閾値と遷移速度の電位依存性とには大きな多様性がある。活性化時定数は、0.1から1000msの範囲であり、閾値活性化電位は-80から20mVの範囲である。不活性化時定数は、0.1から無限すなわち不活性化しないの範囲であり、閾値電位は-60から0mVの範囲である。不活性からの解放のための時定数は、0.5msから100msの範囲であり、閾値電位は-70から0mVの範囲である。測定可能なチャネル依存信号を得るために必要な刺激プロトコルは、問題のチャネルの特定の性質にいくらか依存する。電位依存カリウムチャネルにおけるパラメータの多様性のために、電気刺激プロトコルの最適化は、いくつかの反復を取ることがある。それらの実験中に、活性チャネルを持つ細胞と、チャネルが薬理学的にブロックされている細胞とで、反応が比較される。適切な薬理学的試薬を利用できないときは、ブロックされた状態を、トランスフェクトされない細胞系統でエミュレートできる。最適な刺激パラメータは、2つの細胞の集団の信号の差における変化の最小係数を生ずる。aカリウムチャネルの直接刺激を用いるアッセイi電圧規制されたカリウムチャネルカリウムチャネルは外向き電流を生ずるので、チャネルの活性化は、負の膜内外電位差変化を生じる。生理学的諸条件の下では、カリウムの反転電位は-90mVくらいである。電位依存カリウムチャネルのみを発現している細胞は、活性化閾値に近い休止電位を一般に有するので、直接刺激は、約-50mVより上の活性化閾値を持つそれらの電位依存カリウムチャネルに対して働きかけねばならない。膜内外電位差の小さな負の偏移40mVの変化より小さいをFRET電圧感応性染料を用いて確実に検出できるが、より大きい信号で高いスループットのスクリーニングを行うことがしばしば好ましい。好適な細胞タイプは、CHO-K1、CHLおよびLTK-などの、最小レベルの他のイオンチャネルを発現する細胞を含む。対象とするイオンチャネルを発現するクローンのトランスファクションと選択は、通常は休止状態にあるナトリウムイオンチャネルについて、上で説明したようにして、一般に、実行される。あるいは、対象とするチャネルを内生的に発現する細胞系統を使用できる。膜内外電位差染料での細胞のラベル付けおよび測定は、通常は休止状態にあるナトリウムイオンチャネルについて、上で説明したようにして、一般に、実行される。刺激プロトコルは、原形質膜の部分を、電位依存カリウムチャネルを活性化するために十分長く消極するので有利である。電位依存ナトリウムチャネルの場合とは異なって、電位依存カリウムチャネルは、刺激パルスの消極段階中に、通常、電流を流す。細胞のうち膜内外電位差が負の向きに駆動される側では、カリウムチャネルは不活性状態から解放される問題のチャネルが電位依存不活性を経験するならば。細胞のうち膜内外電位差が正の向きに駆動される側では、カリウムチャネルは活性化して外向き電流を流す。したがって、刺激パルスの持続時間は、不活性時間を大幅に越えてはならない。カリウム電流は、休止電位よりも負へと平均膜内外電位差を駆動しようとする。刺激パルスの後で、膜内外電位差は、休止電位へ指数関数的に緩和する。膜の時定数より短い時間の後で刺激を繰り返すことにより、平均細胞膜をさらに負へ駆動できる。刺激列を用いて、大きな持続された信号を得ることができる。この効果を達成する好適な刺激プロトコルは二相的であるので、細胞の両端部に存在するイオンチャネルは、カリウムイオンの動きを可能にすることに関与できる。通常、一相当たり5ミリ秒で、振幅が25V/cmの二相方形波カーネルを用いる初期条件で着手する。カーネルは、約3秒の総列持続時間にわたって約20Hzの一定のレートで反復する。その後で、パルスの振幅、持続時間、およびその後で周波数を最適にする。必要があれば、パルスの形状がより効率的な電気刺激となるかどうかを判定するために、パルスの形状の変化を調べることもできる。最適な刺激パラメータは、最低の電界強さと、電極を流れる電流の最小デューティサイクルとにおいて、異なる試験ウェルの間での信号の変化の最小係数で最大平均膜内外電位差変化チャネルがブロックされているか存在しないような細胞と比較してを生ずる。特定のパラメータの組が選択された後で、信号のサイズと反応の変化の係数とをさらに最適にするために、電圧センサ染料の染色濃度の滴定を上記のようにして行うべきである。それらの手順染料濃度、電界の強さ、および刺激の持続時間と周波数は信号を一層最適にするために反復できる。b内向きレクチファイヤカリウムチャネルそれの名称とは反対に、内向きレクチファイヤチャネルの機能は、カリウムを細胞内に入れないようにすることである。カリウムの内向きの流れは、1膜内外電位差がカリウム平衡電位より下に降下したとき、または2細胞外部のカリウム濃度が上昇するとき、にのみ生ずることができる。いずれの状況も通常は起きない。その理由は、1正常な生理学的諸条件の下では、カリウムは最も負の反転電位を持つイオンであるので、どのイオン電流も電位をカリウム反転電位よりも一層負に駆動できず、2病理学的諸条件下を除いて、細胞外部のカリウム濃度は厳しく制御される、からである。しかし、電気刺激を用いると、細胞膜の部分をVKより下に駆動できて、カリウムイオンの細胞内への入り込みを促進する。これによって膜内外電位差は正味の正変化を起こさせられ、それは正信号として検出できる。内向きレクチファイヤのブロッカーについてのアッセイを行いかつ最適にするために、したがって、下記の手順に従うことができる。好適な細胞タイプは、CHO-K1、CHLおよびLTK-などの、最小レベルの他のイオンチャネルを発現する細胞を含む。対象とするイオンチャネルを発現するクローンのトランスフェクションと選択は、通常は休止状態にあるナトリウムイオンチャネルについて上で説明したようにして、一般に実行される。あるいは、対象とするチャネルを内生的に発現する細胞系統を使用できる。膜内外電位差染料での信号のラベル付けおよび測定は、通常は休止状態にあるナトリウムイオンチャネルについて上で説明したようにして、一般に実行される。好適な刺激プロトコルは二相カーネルを用いるので、細胞の両端部に存在するイオンチャネルが関与する。通常、一相当たり5ミリ秒で、振幅が25V/cmの二相方形波カーネルを用いる初期条件で着手する。カーネルは、約3秒の総列持続時間にわたって約20Hzの一定のレートで反復される。その後でパルスの振幅、持続時間、およびその後で周波数を最適にする。必要があれば、パルスの形状がより効率的な電気刺激となるかどうかを判定するために、パルスの形状の変化を調べることもできる。最適な刺激パラメータは、最低の電界強さと、電極を流れる電流の最小デューティサイクルとにおいて、異なる種々の試験ウェル間の信号の変化の最小係数で最大細胞刺激チャネルがブロックされているか存在しないような細胞と比較してを生ずる。特定のパラメータの組が選択された後で、信号のサイズと反応の変化係数とをさらに最適にするために、電圧センサ染料の染色濃度の滴定を上記のようにして行うべきである。それらの手順染料濃度、電界の強さ、および刺激の持続時間と周波数は信号を一層最適にするために反復できる。c電位依存ナトリウムカウンターチャネルを用いるアッセイこの方法は、対象とする電位依存カリウムチャネルを発現し、かつ電位依存ナトリウムチャネルも発現する細胞系統の使用を含む。この方法では、やり方は、電位依存ナトリウムチャネルを特に活性化するために構成されている電気刺激プロトコルを使用することである。この場合には、電気刺激は、ナトリウムイオンを細胞内に入らせて、正電圧変化を起こさせる。対象とするカリウムチャネルが存在することにより、カリウムイオンが細胞を離れることができるようにすることによって、ナトリウムチャネルの正の反応が抑制される傾向が生じる。アッセイは、試験化学薬品がカリウムチャネルをブロックするときに外向き電流が存在しないことを利用することにより、ナトリウムチャネルの活性化により通常引き起こされる大きな正電圧反応を回復する。電流の平衡の最適化は、アッセイがカリウムチャネルの閉塞に敏感であることを確保するために、この方法では重要である。ナトリウム電流がカリウム電流に対して小さすぎるとすると、カリウムチャネルブロッカーについての服量反応曲線は、より高い濃度へ向かってシフトする。例えば、カリウム電流がナトリウム電流より100倍大きいという極端な場合には、ナトリウム電流から50の反応を得るためには、カリウムシャネルの99をもブロックしなければならない。この方法は、電位依存ナトリウムチャネルを繰り返しパルスで駆動することを含むので、プロトコル展開は、電圧で活性化される不活性状態にあるナトリウムチャネルについて上で述べたことと、本質的に同じである。通常、一相当たり5ミリ秒で、振幅が25V/cmの二相方形波カーネルを用いる初期条件で着手する。カーネルは約3秒間の総列持続時間にわたって約20Hzの一定のレートで反復される。その後でパルスの振幅、持続時間、およびその後で周波数を最適にする。必要があれば、パルスの形状がより効率的な電気刺激となるかどうかを判定するために、パルスの形状の変化を調べることもできる。最適な刺激パラメータは、最低の電界強さと、電極を流れる電流の最小デューティサイクルとにおいて、異なる試験ウェル間での信号の変化の最小係数で最大細胞刺激チャネルがブロックされているか、存在しないような細胞と比較してを生ずる。特定のパラメータの組が選択された後で、信号のサイズと反応の変化の係数とをさらに最適にするために、電圧センサ染料の染色濃度の滴定を上記のようにして行うべきである。それらの手順染料濃度、電界の強さ、および刺激の持続時間と周波数は信号を一層最適にするために反復できる。このアッセイの形態では、理想的には、チャネルブロックが存在しない中での刺激に対する反応は存在しないまたは非常に小さい。その理由は、カリウム電流がナトリウム電流を打ち消すからである。したがって、刺激条件を最適にするためには、カリウムチャネルの活動が存在するときおよびしないときの反応を比較する必要がある。理想的には、これはカリウムチャネルの選択性ブロッカーを用いて行われる。そのようなブロッカーがまだ知られていない場合には、ナトリウムカウンターチャネルのみを含んでいる細胞系統を使用することが可能である。このアッセイの形態は2つのイオンチャネルを含むので、いずれかのチャネルのモジュレーターが電圧反応に影響する。この場合には、ヒットカリウムチャネルのブロッカーが電圧反応を回復する。スクリーニングの形態は、ナトリウムチャネルのみをブロックする化合物を自動的に無視する。しかし、両方のチャネルをブロックする化合物が存在する中での細胞の刺激によって、電圧が偏移しない結果ももたらされて、化合物が機能しないことを示唆する。この種の化合物は興味のあることがあるので、それらをあらわにする方法も使用できる。ナトリウムチャネルは含むがカリウムチャネルは含まない親細胞系統を用いて同一の化合物スクリーニングを行うことによって、ナトリウムチャネルのブロッカーを見つけることができる。ナトリウムチャネルをブロックすることが見出された化合物は、それらがカリウムチャネルに対して活性を持つかどうかを調べるために、後で別々に試験できる。ii.カルシウムチャネルのアッセイカルシウムチャネルは、多くの細胞内で一般に見出され、その細胞内では、他の機能のうちで、信号形質導入という重要な役割を演ずる。励起可能な細胞では、細胞内のカルシウムは、長い消極反応のために維持された内向き電流を供給し、消極機構とその他の細胞内部信号形質導入機構との間のリンクとして作用する。電圧ゲートナトリウムチャネルのように、電圧ゲートカルシウムチャネルは、多数の休止、活性および不活性状態を有する。多数のタイプのカルシウムチャネルが、骨格筋肉、心臓筋肉、肺、平滑筋および脳を含めた種々の組織からの哺乳類の細胞内で特定されている[例えば、Bean,B.P.1989Ann.Rev.Physiol.51:367-384およびHess,P.1990、Ann.Rev.Neurosci.56:337を参照]。異なる型のカルシウムチャネルが、電流のキネティクス、保持電位感度、カルシウムチャネルアゴニストおよび拮抗体に対する感度によって識別されるL-、T-、N-およびP-型の4つのクラスに大きく分類されている。神経電位依存カルシウムチャネルの4つのサブタイプが提案されているSwandulla,D.ら、TrendsinNeuroscience、14:46、1991。ラビットの骨格筋肉カルシウムチャネルのα1、α2、βおよびγのサブユニットのcDNAおよび対応するアミノ酸配列が決定されている[Tanabeら、1987Nature、328:313-318;Ruthら、1989Science245:1115-1118;および米国特許第5386025号を参照]。また、ラビットの心臓筋肉[Mikami,A.ら1989Nature、340:230-233]および肺[Biel,M.1990FEBSLetters269:409-412]のα1サブユニットカルシウムチャネルのcDNAおよび対応するアミノ酸配列が決定されている。また、ラビットの脳カルシウムチャネルをコードするcDNAクローンBIチャネルと命名されているが分離されている[Mori,Y.ら1991Nature350:398-402]。カルシウムチャネルα1サブユニットのいくつかの異なるサブタイプの部分をコードする部分cDNAクローンラットの脳クラスA、B、C、Dと呼ばれているが、ラット脳cDNAライブラリから分離されている[Snutch,T.ら1990Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:3391-3395]。もっと最近、全長ラット脳クラスA[Starr,T.ら1991Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:5621-5625]およびクラスC[Snutch,T.ら1991Neuron7:45-57]のcDNAクローンが分離されている。ラットの脳クラスCのDNAにコードされたアミノ酸配列は、ラビットの心臓筋肉カルシウムチャネルα1サブユニットをコードするDNAによるものに約95同じであるが、ラットの脳クラスAのDNAがコードするアミノ酸配列は、わずかに33の配列同一性を、ラビットの骨格または心臓筋肉α1サブユニットをコードするDNAがコードするアミノ酸配列と共有するだけである。別のラットの脳カルシウムチャネルα1サブユニットをコードするcDNAクローンも得られている[Hui,A.ら1991Neuron、7:35-44]。このクローンによりコードされたアミノ酸配列は、ラビットの骨格および心臓筋肉カルシウムチャネルDNAがコードするタンパク質にほぼ70相同である。ラットの脳クラスCα1サブユニットをコードするcDNAに緊密に関連するcDNAと、明らかに異なるカルシウムチャネルα1サブユニットをコードする他の部分cDNAクローンに緊密に関連する部分cDNAクローンの配列も分離されている[Snutch,T.ら1991Neuron7:45-57;Perez-Reyes,E.ら1990J.Biol.Chem.265:20430;およびHui,A.ら1991Neuron7:35-44を参照]。特徴付けされた既知のカルシウムチャネルについては、活性化時定数は、閾値電位-80から-20mVで、0.1から10msまでの範囲である。不活性化時定数は、閾値電位-60から-20mVで、0.1から∞すなわち不活性でないまでの範囲である。不活性からの解放のための時定数は、閾値電位-70から-40mVで、0.5から100msまでの範囲である。細胞系統の選択と電位依存カルシウム電流の導入は、ナトリウムチャネルについて上で説明した一般的なガイドラインとやり方を用いて行われる。好適な細胞タイプは、CHO-K1、CHLおよびLTK-などの最低レベルの他のイオンチャネルを発現する細胞を含む。対象とするイオンチャネルを発現するクローンのトランスフェクションと選択は、通常は休止状態にあるナトリウムイオンチャネルについて上で述べたようにして、一般に行われる。あるいは、対象とするチャネルを内生的に発現する細胞系統を使用できる。膜内外電位差染料での細胞のラベル付けと測定は、通常は休止状態にあるナトリウムイオンチャネルについて上で述べたようにして、一般に行われる。あるいは、細胞にCalciumGreen、fluo3-AM、またはindo-1などのカルシウム感応性蛍光染料をロードできる。小さなバックグラウンド電流を有する細胞では、チャネルを不活性から解放するために十分負である膜の部分を駆動することにより、強い内向きのカルシウム電流を発生できる。その後で、外部電界を反転またはなくすことにより、チャネルはチャネルを活性化する電位に曝されて、カルシウム電流が細胞に流れ込むことができるようにする。ほとんどの細胞におけるカルシウムの反転電位は、一般に、60から100mVであるので、カルシウムの流れ込みに起因する大きな電圧変化が可能である。メンブレンに結び付けられた電圧感応性染料または細胞内カルシウム染料のいずれかを用いて、細胞の活性度をモニタできる。カルシウムおよびナトリウムチャネルの性質の類似性により、ナトリウムチャネルについて概略を述べたのと同じ一般的なアッセイ最適化手順が、カルシウムチャネルに適用される。通常、一相当たり5ミリ秒で、振幅が25V/cmの二相方形波カーネルを用いる初期条件で着手する。カーネルは約3秒間の総列持続時間にわたって約20Hzの一定のレートで反復される。その後で、パルスの振幅、持続時間およびその後で周波数を最適にする。必要があれば、パルスの形状がより効率的な電気刺激となるかどうかを判定するために、パルスの形状の変化を調べることもできる。最適な刺激パラメータは、最低の電界強さと、電極を流れる電流の最小デューティサイクルとにおいて、異なる試験ウェル間での信号の変化の最小係数で最大細胞刺激チャネルがブロックされているか、存在しないような細胞と比較してを生ずる。特定のパラメータの組が選択された後で、信号のサイズと反応の変化係数とをさらに最適にするために、電圧センサ染料の染色濃度の滴定を上記のようにして行うべきである。それらの手順染料濃度、電界の強さ、および刺激の持続時間と周波数は信号を一層最適にするために反復できる。それらの実験中は、活性チャネルを持つ細胞と、チャネルが薬理学的にブロックされている細胞とに対する反応が、比較される。適切な薬理学的試薬を使用できないときには、ブロックされた状態は、トランスフェクトされない細胞系統でエミュレートできる。最適な刺激パラメータは、2つの細胞集団の信号の差における変化の最小係数を生ずる。iii.電位依存塩化物チャネルのアッセイ塩化物チャネルは、体内のほぼあらゆる細胞の原形質膜中で見出される。塩化物チャネルは、膜内外電位差の規制と、上皮膜を横切るイオンの吸収および分泌を含めた、各種の細胞機能を仲介する。ゴルジ装置および細胞内分裂小嚢の細胞内膜中に存在するときは、塩化物チャネルは、細胞小器官pHの調整もする。総説として、Greger,R.1988Annu.Rev.Physiol.50:111-122を参照。3つの異なるクラスの塩化物チャネルが、それらの調整および構造コンホメーションのタイプ表3に基づいて明らかである。第1のクラスは、GABAおよびグリシン受容体スーパーファミリーを含み、第2のクラスは、CFTR嚢性小器官トランスメンブレンコンダクタンスレギュレーターを含み、第3のクラスは、電圧規制された塩化物チャネルを含む。ナトリウムに似たイオン、特にカルシウムとは対照的に、原形質膜を横切る塩化物の電気化学的勾配は、一般に、平衡とは遠くない。したがって、細胞の休止電位においては、塩化物チャネルが開いても原形質膜電圧の大きな行程または細胞内塩素濃度の劇的な変化を生ずることはない。電気刺激は、通常、細胞膜を横切る対称的な電圧変化を生ずるので、チャネルの導電度が非線形でなければ、正味の塩素流れを発生できない。線形な漏れコンダクタンスのために、一様な電界は、塩素を一方の側では細胞の内部へ、他方の側では細胞の外部へと駆動する。非線形コンダクタンス曲線レクチファイヤまたは電圧で起動させられるゲーティングを有する塩化物チャネルの直接電気刺激が、正味のイオン流れを発生できる。これは、検出可能な膜内外電位差変化を生じさせる。コンダクタンスおよびゲーティングの電位依存性に応じて、膜内外電位差変化は正または負のことがある。典型的な塩化物チャネル上昇させられた電位で活性化し、より負の電位で閉じるおよび外向きレクチファイヤに対しては、塩素は、細胞内に流れ込んで膜内外電位差を負に駆動する。内向きレクチファイヤに対しては、塩素は、細胞から押し出されて膜内外電位差は正に駆動される。塩素反転電位と休止膜内外電位差の間の小さい差のために、電圧ゲート塩素チャネルの直接刺激によって、不十分な膜内外電位差変化となることがある。内向き電流と外向き電流を発生するために、ナトリウムまたはカルシウムカウンタチャネルの共発現および電気刺激を用いて、それらのイオンチャネルのアッセイを展開できる。その後で、カウンタチャネルが電気的に刺激されたときに、膜内外電位差変化の不在または存在によって、塩素電流の存在または不在を決定できる。好適な細胞タイプは、CHO-K1、CHL、LTK-などの最低レベルの他のイオンチャネルを発現する細胞を含む。対象とするイオンチャネルを発現するクローンのトランスフェクションと選択は、通常は休止状態にあるナトリウムイオンチャネルについて上で述べたようにして、一般に行われる。あるいは、対象とするチャネルまたはカウンタチャネルを内生的に発現する細胞系統を使用できる。膜内外電位差染料での細胞のラベル付けと測定は、通常は休止状態にあるナトリウムイオンチャネルについて上で述べたようにして、一般に行われる。通常、一相当たり5ミリ秒で、振幅が25V/cmの二相方形波カーネルを用いる初期条件で着手する。カーネルは、約3秒間の総列持続時間にわたって約20Hzの一定のレートで反復される。その後でパルスの振幅、持続時間、およびその後で周波数を最適にする。必要があれば、パルスの形状がより効率的な電気刺激となるかどうかを判定するために、パルスの形状の変化を調べることもできる。最適な刺激パラメータは、最低の電界強さと、電極を流れる電流の最小デューティサイクルとにおいて、種々の試験ウェル間での信号の変化の最小係数で最大細胞刺激チャネルがブロックされているか、存在しないような細胞と比較してを生ずる。特定のパラメータの組が選択された後で、信号のサイズと反応の変化係数とをさらに最適にするために、電圧センサ染料の染色濃度の滴定を上記のようにして行うべきである。それらの手順染料濃度、電界の強さ、および刺激の持続時間と周波数は信号を一層最適にするために反復できる。aそれらの実験中は、活性チャネルを持つ細胞と、チャネルが薬理学的にブロックされている細胞とに対して、反応が比較される。適切な薬理学的試薬を使用できないときは、ブロックされた状態は、トランスフェクトされていない細胞系統でエミュレートできる。最適な刺激パラメータは、2つの細胞の集団の信号の差における変化の最小係数を生ずる。v.配位子依存チャネルの検定配位子依存イオンチャネルファミリーは大きくて多様である。配位子依存イオンチャネルは、特定の分子の結合に反応して開く。それらは、典型的には、ニューロンの間と、ニューロンから筋肉細胞へとの高速シナプス伝達を仲介する。それらは低速シナプス伝達も仲介し、種々の調整機構を制御する。配位子ゲートイオンチャネルは、一般に、電荷選択的なだけである。すなわち、それらはある範囲のアニオンまたはカチオンの流れを許すが特異性は持たない。それらは活性、脱活性、および感度低下キネティクスにおいて数多くの変形を有し、それらのすべてはミリ秒以下から秒までの時定数まで変化できる。配位子がチャネルの受容体に結合すると、チャネルは1つまたは複数のコンホメーション変更を行ってチャネルを活性化する。配位子が食塩水浴から除かれると、結合されている配位子が解離してチャネルは閉じる。配位子が食塩水浴中に留まっているならば、いくつかの配位子を保持することによりチャネルは感度を下げるが、チャネルが閉じられる状態である異なるコンホメーション状態へ動く。活性化状態と、脱活性化状態と、感度を低下させられている状態との間の平衡分布は、チャネルの間で非常に大きく変動する。現在のアッセイの形態では、細胞の膜内外電位差は、配位子が加えられている間にモニタされる。チャネルが開いたときのコンダクタンスの急上昇によって、膜内外電位差は新しい反転電位へ向かって駆動される。不幸なことに、多数の配位子ゲートチャネルに対しては、新しい反転電位は、通常、休止電位の15mVの範囲内である。この小さい変化は、細胞内で信号伝達するために使用するのには十分であるが、それは薬理学的アッセイを困難にする。配位子ゲートイオンチャネルの電気刺激アッセイにおいて、1つのやり方は、電圧ゲートナトリウムカウンタチャネルを対象とする配位子ゲートイオンチャネルと共発現させることである。このやり方によって、電気刺激を通じて膜内外電位差を変調できる。電気刺激の最中またはそれに先立って試験化合物が加えられるとすると、この方法は、配位子ゲートチャネルが開かれているか、閉じられているかの分析を可能にする。配位子ゲートチャネルが開いているとすると、細胞の高い休止コンダクタンスが電気刺激に対する電圧反応を抑制する。しかし、配位子ゲートチャネルがブロックされているとすると、細胞は電気刺激に対して大きな反応を行う。電気刺激パラメータにおける大きな柔軟性のために、休止コンダクタンスを広い範囲にわたってアッセイできるようにされる。これは、配位子ゲートチャネルの場合に重要である。その理由は、配位子が存在する場合の休止コンダクタンスが、平衡感度低下に非常に敏感だからである。感度低下とチャネル発現の変化を考慮に入れて、10MΩから10GΩのどの範囲にも及ぶ休止膜抵抗値を持つことがある。カウンタチャネルとしてのラットの脳型IIaナトリウムチャネルでによって、この全範囲をカバーできる。アゴニストと拮抗体の両方をスクリーニングすることも可能でなければならない。反応が半分の大きさであるように刺激パラメータを選択することにより、アゴニストは反応を減少し、一方、拮抗体はそれを増加する。より高いアゴニストアッセイまたはより低い拮抗体アッセイ周波数で刺激することによって、より良いスクリーニングウィンドウを得ることができる。なお、チャネルコンダクタンスのモジュレーター、開放時間、感度低下、および不活性化は、すべて検出できることに注目されたい。好適な細胞タイプは、CHO-K1、CHLおよびLTK-などの最低レベルの他のイオンチャネルを発現する細胞を含む。対象とするイオンチャネルを発現するクローンのトランスフェクションと選択は、通常は休止状態にあるナトリウムイオンチャネルについて上で述べたようにして、一般に行われる。あるいは、対象とするチャネルまたはカウンタチャネルを内生的に発現する細胞系統を使用できる。膜内外電位差染料での細胞のラベル付けと測定は、通常は休止状態にあるナトリウムイオンチャネルについて上で述べたようにして、一般に行われる。通常、一相当たり5ミリ秒で、振幅が25V/cmの二相方形波カーネルを用いる初期条件で着手する。カーネルは約3秒の総列持続時間にわたって約20Hzの一定のレートで反復される。その後でパルスの振幅、持続時間、およびその後で周波数を最適にする。必要があれば、パルスの形状がより効率的な電気刺激となるかどうかを判定するために、パルスの形状の変化を調べることもできる。最適な刺激パラメータは、最低の電界強さと、電極を流れる電流の最小デューティサイクルとにおいて、異なる試験ウェル間の信号の変化の最小係数で最大細胞刺激配位子ゲートチャネルがブロックされているか、存在しないような細胞と比較してを生ずる。特定のパラメータの組が選択された後で、信号のサイズと反応の変化係数とをさらに最適にするために、電圧センサ染料の染色濃度の滴定を上記のようにして行うべきである。それらの手順染料濃度、電界の強さ、および刺激の持続時間と周波数は信号を一層最適にするために反復できる。それらの実験中は、活性チャネルを持つ細胞と、チャネルが薬理学的にブロックされている細胞とに対して、反応が比較される。適切な薬理学的試薬を使用できないときは、ブロックされた状態は、トランスフェクトされていない細胞系統でエミュレートできる。最適な刺激パラメータは2つの細胞集団の信号の差における変化の最小係数を生ずる。vi.受動チャネルの検定多くのチャネルは、遅い、または電圧で活性化されないコンダクタンス変化を有する。主要な例は、包嚢繊維症に関連させられているチャネルのいくらか、特に包嚢繊維症トランスメンブレンレギュレーターCFTR、塩素チャネル、上皮ナトリウムチャネルENaCおよび4TMカリウムチャネルファミリーメンバーWangら、Ann.N.Y.Acad.Sci.868:286-303、1999である。それらのチャネルのいずれかにアゴニストとして作用する小さい分子は、包嚢繊維症を緩和する薬品の候補である。現在、この型のチャネルに対する便利に動作できる高スループットのスクリーニング法はない。この型の対象とするイオンチャネルのための提案されているアッセイ形態は、電位依存ナトリウムチャネルも発現する細胞中の対象とする漏れチャネルを発現する細胞を含む。対象とするチャネルは、電位依存ナトリウムチャネルを持つ細胞中にクローンされる。細胞が刺激されたときは、受動電流の存在がナトリウムチャネルの正の反応を抑制する。受動チャネルをブロックすると、大きな正の電圧反応が回復する。この方法では電流の平衡の最適化が重要である。野生型CHO細胞はこの目的には有用なことがあるが、より大きいナトリウム電流を持つ細胞内生の、または処理されたが好ましい。ナトリウム電流がカリウム電流に対して小さすぎるとすると、受動チャネルブロッカーの服量反応曲線は、より高い濃度へ向かってシフトする。例えば、受動チャネルがナトリウム電流より100倍も大きいという極端な場合には、ナトリウムチャネルから50の反応を得るために、受動チャネルの99をブロックしなければならないであろう。好適な細胞型は、CHO-K1、CHLおよびLTK-などの最低レベルの他のイオンチャネルを発現する細胞を含む。対象とするイオンチャネルを発現するクローンのトランスフェクションと選択は、通常は休止状態にあるナトリウムイオンチャネルについて上で述べたようにして、一般に行われる。あるいは、対象とするチャネルまたはカウンタチャネルを内生的に発現する細胞系統を使用できる。膜内外電位差染料での細胞のラベル付けと測定は、通常は休止状態にあるナトリウムイオンチャネルについて上で述べたようにして、一般に行われる。好適な刺激プロトコルは二相カーネルを使用する。一般に、最初の一連の実験が、固定されている列持続時間の間に一定の率で繰り返される二相方形波カーネルを用いて行われる。パルスの持続時間は約1μsから約1sまで変化し、より好ましくは約100μsから約20msまで変化する。パルスの振幅は0V/cmから約60V/cmまで変化し、より好ましくは10V/cmから50V/cmまで変化する。刺激の周波数は、0Hzすなわち単一パルスと100kHzの間で変化し、より好ましくは0Hzから約1kHzまで変化する。パルス列は0sすなわち単一パルスと約100sの間で変化し、より好ましくは0sと約10sの間で変化する。通常、一相当たり5ミリ秒で、振幅が25V/cmの二相方形波カーネルを用いる初期条件で着手する。カーネルは約3秒の総列持続時間にわたって約20Hzの一定のレートで反復される。その後でパルスの振幅、持続時間、およびその後で周波数を最適にする。必要があれば、パルスの形状がより効率的な電気刺激となるかどうかを判定するために、パルスの形状の変化を調べることもできる。最適な刺激パラメータは、最低の電界強さと、電極を流れる電流の最小デューティサイクルとにおいて、異なる試験ウェル間で信号の変化の最小係数で最大細胞刺激配位子依存性チャネルがブロックされているか、存在しないような細胞と比較してを生ずる。特定のパラメータの組が選択された後で、信号のサイズと反応の変化係数とをさらに最適にするために、電圧センサ染料の染色濃度の滴定を上記のようにして行うべきである。それらの手順染料濃度、電界の強さ、および刺激の持続時間と周波数は信号を一層最適にするために反復できる。アゴニストと拮抗体の両方をスクリーニングすることも可能でなければならない。反応が最大の半分であるように刺激パラメータを選択することにより、アゴニストは反応を減少し、一方、拮抗体はそれを増加する。より高いアゴニストアッセイまたはより低い拮抗体アッセイ周波数で刺激することによって、より良いスクリーニングウィンドウを得ることができる。それらの実験中は、活性チャネルを持つ細胞と、チャネルが薬理学的にブロックされている細胞とに対して、反応が比較される。適切な薬理学的試薬を使用できないときは、ブロックされた状態は、トランスフェクトされていない細胞系統でエミュレートできる。最適な刺激パラメータは、2つの細胞の集団の信号の差における変化の最小係数を生ずる。本発明は、細胞およびイオンチャネルパラメータの定量的に測定する方法と、電気刺激を用いてそれらのパラメータに対する試験化合物の薬理学的効果を定量化する方法も含む。b.膜抵抗値の定量的測定電気刺激が終わった後で、細胞の膜内外電位差は新しい休止電位に緩和する。電位依存チャネルのアッセイでは、チャネルは、一般に、閉じているか不活性であり、最終的な休止平衡電位は、刺激前と同じである。ほとんどの場合には、膜容量に蓄積される電荷は、膜の抵抗値を通じて指数関数的に散逸する。膜の時定数は、簡単にいえば、膜の容量と膜の抵抗値との積、すなわちτm=RmCmである。それは、膜の容量と膜の時定数を測定することにより容易に決定できる。これらのアッセイで一般に使用される細胞の平均の膜容量は、外因性のチャネルとは独立であり、パッチクランプ法によって容易に測定できる。膜の時定数は、膜内外電位差の減衰率を測定し、このデータを指数減衰関数にフィッティングすることによって容易に測定され得る。したがって、所与の細胞タイプに対して膜の時定数を平均膜容量で除算することにより、休止膜抵抗値すなわち漏れ膜抵抗値を定量的に決定できる。電圧に依存するチャネルが開かれている間に、膜抵抗値を定量的に測定するために、同様の解析を行うことができる。電気刺激の間に、膜内外電位差は、新しい平衡電位へ向かってほぼ指数関数的に緩和もする。したがって、刺激の開始時における電圧変化の膜時定数は、時間的に平均された膜抵抗値の測定値を構成する。チャネルが実際に開いている時間部分を考慮に入れるために適切なスケーリング係数を用いると、チャネル開放膜抵抗値の定量的測定を行うことができる。i.不活性からの解放の時定数の測定不活性イオンチャネルを開くには、膜内外電位差を閾値より下に数ミリ秒のオーダーの時間、保持することを要する。この不活性からの解放は、重要な生理学的意味を持つ。例えば、不活性からの解放は、動作電位の後戻り伝播を阻止する御し難い期間を強制して、ニューロンの最高興奮率を制限する。この性質の薬理学的取扱いは治療的に関連する。c.繰り返し電気刺激を用いて、不活性からの解放の平均の時間を定めることができる。これは可変幅の電界パルスを用いて行うことができる。パルス幅が、不活性からの解放の時間より短くなると、より少ないチャネルが活性化されて、刺激に反応する膜内外電位差の上昇が低下する。d.開放チャネル時間の測定開放チャネル時間τopenは、チャネルの不活性特性の関数である。非常に高い周波数で刺激することにより、このパラメータの薬理学的取扱いを、中から高程度のスループットモードで検出できる。例えば、多重刺激法を用いる電位依存ナトリウムチャネルのアッセイについて考えることにする。定常レートで繰り返される固定した単相方形波刺激カーネルでは、電圧反応は、刺激繰り返し率が高くなるにつれて増加する。その理由は、より高い周波数では、ナトリウムチャネルが、開放している時間をより多く過ごすからである。しかし、パルス同士の間隔がチャネル開放時間よりも短くなるとすると、活性化されたナトリウムチャネルは負へ駆動されるので、以後の刺激パルスによって不活性にされる。反応が平坦になる刺激バースト周波数はチャネル開放時間に関連する。e.細胞外電流クランプ装置としての電気刺激全細胞記録において、電流クランプは、膜内外電位差を記録している間に指令電流を細胞内へ駆動できるようにするモードである。パッチクランプ記録は極めて正確ではあるが、スループットが非常に小さい技術である。完全な条件の下における絶対最大数で、高度に訓練された科学者は、細胞のパラメータを1時間当たり細胞10個の率で決定できる。しばしば、パッチクランプ技術で得られる詳細のレベルは、薬品のスクリーニングのためには必要ではないが、その詳細さを速さと置き換える方法は現在のところない。大規模な化合物ライブラリをスクリーニングするためには、高い速度は絶対に重要である。ここで説明している電界刺激技術によって、我々が細胞外電流クランプと呼ぶ新規な種類の電流クランプ電気生理学技術が得られる。指令電流を細胞培養体中に駆動して、いくつかの細胞およびチャネル特性を決定できるようにするために、電位依存チャネルを使用できる。細胞外電流クランプのスループットは非常に高いので、特定の対象とするイオンチャネルに対する化合物ライブラリの薬理学的効果の高い情報内容を得ることが可能である。チャネルの薬理学および生理学を直接調べることができ、またはそのチャネルを細胞膜自体または第2のイオンチャネルの研究のための電流発生器として使用できる。細胞外電流クランプで得ることができる顕微鏡的パラメータの最終的な確度は、まだパッチクランプ法には達していないが、今や、スループットのために情報内容を交換できる能力を有する。すなわち、測定を行う確度は任意に設定できる。刺激パラメータの単一の組で、大きなライブラリを潜在的な興味ある化合物のためにスクリーニングできる。化合物濃度の滴定を用いる中間的なスループットの第2のスクリーニングをヒットに対して実行して効能と特異性を決定できる。最後に、化合物の存在する中で刺激パラメータを変更することにより、使用依存性および動作の機構などの治療に関連する諸特性を決定できる。あらゆる段階で、測定は多数の細胞にわたって自動的に平均されて、細胞間の可変性に関連する不確定さを大きく減少する。パッチクランプ分析と比較して、細胞外電流クランプには、最低2つのさらなる利点がある。まず、細胞膜の完全性が電界刺激中に変更されない。細胞内流体は全細胞パッチクランプ記録中にピペット溶液で完全に置換される。細胞内の、イオンチャネルを含めた、多数のタンパク質は、モジュレーター、細胞内メッセンジャー、およびイオン環境に極めて敏感である。細胞質の成分は不完全に知られているだけであるので、細胞内部空間内の可溶性成分は常に変更される。したがって、細胞の正常な生理学的状態は、全細胞パッチクランプ分析中に近似されるだけであるが、細胞外電流クランプを使用するときは、完全に保たれる。第2に、ほとんどの細胞は、他の細胞に接触したときに遺伝子発現と挙動の劇的な変更を経験する。ほとんどの細胞は、また、近くの細胞と間隙接合接続を行うので、全細胞パッチクランプ分析は、細胞が相互に完全に分離されているときに信頼できるだけである。細胞外電流クランプは、細胞の集合度とは独立に細胞に対して使用できる。細胞は、生理学的により関連している。チャネル電気生理学において細胞と細胞の接触のいかなる影響があるかどうかを見出すために、細胞外電流クランプを使用できる。その後で、遺伝子発現分析に関連して、それらの変化を細胞の調整成分に関連できる。f.細胞外電圧クランプ装置としての電気刺激電圧クランプでは、細胞の膜内外電位差は、電流の流れをモニタしている間に制御される。電圧クランプは、フィードバックループを電流クランプ回路に加えることによって、一般に達成される。全細胞法の場合には、これは、同じ細胞に同時に取り付けられている2つのピペットを用いて容易に達成できる。1つのピペットは指令電流を通し、他方は電圧を検出する。フィードバック回路が測定電圧を指令電圧と比較し、それに従って指令電流を調整する。一般に、細胞膜抵抗値はピペットのアクセス抵抗値と比較して高いので、同じピペットを用いて電流を指令し、電圧を測定できる。電流クランプと比較して、電圧クランプは、一般に、電気生理学的分析のためのより強力な方法である。イオンチャネルは膜内外電位差に極めて敏感であるので、データの分析は、固定されている電圧での電流測定を取り扱うときには、はるかに直接的である。細胞外電流クランプは、電圧測定センサ染料の蛍光と電流発生器刺激パラメータの間にフィードバックループを加えることによって、電圧クランプ法に転換できる。この場合、十分な速さを持つ膜内外電位差染料が求められる。染料の組合せCC2-DMPE/DiSBAC63は、サブミリ秒の時定数を持ち、最速の細胞事象を除いてすべてを捕捉するために十分に速くあるべきである。指令電圧と膜内外電位差測定の差に基づいて、コンピュータが刺激パラメータを変更する。刺激パラメータは、細胞中に駆動される電流に関連しているので、電流の時間的経過を指令電圧の関数として決定できる。この方法は、イオンチャネルターゲットに対する薬理学的試薬の作用機構の決定に有用であることが、証明されるであろう。g.細胞内区画のアッセイここで説明している刺激法は、ミトコンドリアおよび核を含めて、リン脂質膜を有する細胞内オルガネラの膜内外電位差を変調するために使用することもできる。これは、電気的透過性により、またはバリノマイシンあるいはグラミシヂンAなどのイオン透過担体を加えることにより、まず原形質膜のコンダクタンスを上昇させることにより達成できる。そうすると、細胞内空間が、もはや、加えられている電界から分離されない。これによって、食塩水に加えられた電界は、細胞内オルガネラの膜を横切って膜内外電位差の変化を生じさせることができるようになる。その後で、イオン濃度または膜内外電位差に敏感で、対象とする特定のオルガネラ膜にのみターゲットにされている染料で細胞を染色することにより、ここに提示した方法を用いて、それらのオルガネラのイオンチャネルを変調およびアッセイできる。ターゲットにすることは、例えば、この技術で知られている適切な細胞下位置信号を含んでいる天然の蛍光タンパク質の使用を通じて達成できる。2.外因性分子の導入哺乳類の細胞膜の絶縁破壊は、膜の両側の電位が約200mVを超えると起きるTeissieandRols、1993、Biophys.J.65:409-413。膜が絶縁破壊すると、膜を通じて孔が形成されて、細胞内部空間と細胞外部空間を結び付ける。孔の数と大きさは膜内外電位差の上昇とともに増大するKinoshitaandTsong、1977、Nature268:438-441。典型的な哺乳類の細胞系統に加えられる電界の強さが約60V/cmより強くなると、細胞は電気的に透過できることになる。比較的低い電界では、小さいイオンを通すのに明らかに十分大きいが、DNAほどの大きさの分子を通すには十分大きくない、小さな穴が細胞膜に形成されるTsong、1991、Biophys.J.60:297-306。これらの孔は、細胞を全面的に消極して、膜内外電位差をゼロ近くに駆動する。細胞を電気的に透過できるようにし、電圧感応性染料で膜内外電位差の変化をモニタすることによって、本発明は、細胞の休止膜内外電位差を決定するために使用できる。これは、一次スクリーニングまたは二次スクリーニングとして、細胞またはイオンチャネルとの薬理学的相互作用を決定するのに有用である。例えば、電位依存ナトリウムチャネルに対する化合物スクリーニングにおいて、チャネルの活性度を決定するために、多数の刺激プロトコルを実行できる。その後で、透過プロトコルで従うことによって、細胞膜が化合物が存在する中で正常な休止電位を持っていたか否かを決定できる。また、RBL細胞などの高度に分極された細胞系統を用いて、電圧感応性染料は電気的透過化electropermeablizationによって容易に較正できる。種々の条件例えば、細胞外カリウムの種々の濃度の下における出発膜内外電位差と、電気的透過化の後の最後の膜内外電位差とはゼロである。また、電気的透過化により形成された孔の寸法は、加えられた電界の関数として増大する。50V/cmより下では、孔は形成されない。約60V/cmと100V/cmの間では、一価イオンを通すのに十分な大きさの孔が形成される。約600V/cmより上では、DNAを通すために十分に大きい孔が形成されるTsong、1991、Biophys.J.60:297-306。したがって、本発明は、細胞膜に定められた大きさの孔を、高いスループットの形態で形成するために使用できる。これは、透過しないイオン、透過しない試験化合物またはその他のモジュレーター、過渡的トランスフェクションまたは安定なトランスフェクションのためのDNAまたはRNA、および蛍光その他の指示染料、の細胞内空間への送り出しを含めて、多数の用途のために有用なことがある。3.薬品発見およびスクリーニングa.薬品スクリーニング本発明は、従来のアッセイ装置よりもはるかに多用途でロバストな、イオンチャネル機能を変調する試験化合物の確実な検出を行う。重要なことに、本発明は、パッチングクランピングにおけるような、薬理学的試薬、または膜の破壊、および細胞内内容物の喪失の要求なしに、損なわれていない細胞内の膜内外電位差を変調する性能を提供する。生きている細胞の膜内外電位差を外部で変調する性能を提供することにより、本発明は広範囲なイオンチャネルのアッセイを可能にする。さらに、イオンチャネルの電位依存状態を正確に変調するこの性能は、1つの状態と選択的に相互作用する化合物すなわち、用途に依存するブロッカーをスクリーニングする機会を提供するという、薬品の発見のために大きな利点を有する。例えば、いくつかの既知の治療に有用な薬品抗不整脈剤、抗けいれん剤、および局部麻酔薬を含むが、電圧に依存するナトリウムチャネルおよび/またはカリウムチャネルの用途に依存するブロッカーとして機能することが知られている。各場合に、目標とされたチャネルの全面的なブロックは、死をもたらす結果となることが普通である。慢性の痛み、不整脈、およびけいれんなどのある状態は、細胞が過度な活性状態になった場合に起きる。これらの条件は、細胞が余りにしばしば開き始めるならば、チャネルをブロックすることにより、軽減または解消できる。チャネルをブロックできるが、休止状態ではなくてむしろ活性状態または不活性状態に選択的に結び付く化合物は、筋肉およびニューロンの興奮性を低下できる。それらの薬品は効果がある。その理由はそれらが正常な環境にあるチャネルに作用せず、過度の興奮性を阻止する必要がある場合にのみチャネルをブロックするからである。しかし、高スループットスクリーニングに適合する既存の分析法は、イオンチャネルの活性状態を実時間でルーチンに制御する性能は提供しない。特に、本発明は、細胞内の定められた機能状態にあるイオンチャネルに対する試験化合物の作用をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、対象とするイオンチャネルの活性化サイクルを通じてそのイオンチャネルを循環させ、膜内外電位差を特定の活性状態または状態の間の遷移に適切な所望のレベルに設定するために、電気刺激を繰り返し使用することにより、細胞の膜内外電位差を変調することを含む。そして、このプロセスの最中または後で試験化合物を細胞に加え、膜内外電位差を測定する。通常は、試験化合物が存在する中で得られた結果を、試験化合物が存在しないときに培養された対照群試料と比較する。対照測定は、推定される薬品を除いた試験試料に関し、すべての成分を含んでいる試料を用いて同じ刺激条件の下で行われる。追加の対照研究を、状態に特有の試験化合物を特に特定するために、他の電位依存状態にあるイオンチャネルで行うことができる。対照群に対する、試験試薬の存在する中で膜内外電位差の変化を検出することにより、試験試薬がその状態にある、または1つの状態から別の状態へ遷移している最中のイオンチャネルに対して活性を有して特効性を有することが示される。膜内外電位差は、既知の活性を持つ薬理学的試薬すなわち、標準試薬または推定上の活性を持つ薬理学的試薬すなわち、試験試薬が存在する中または存在しない中で、決定することもできる。ここで開示している方法により検出された膜内外電位差の違いによって、試験試薬の活性を標準試薬のそれと比較できる。薬品スクリーニングプロトコルの多数の順列組合せが当業者に知られており、それらは、イオンチャネルおよび/または膜内外電位差に作用を与える化合物を特定するため、ここで開示している本発明とともに使用するように容易に適合できようにすることができることを理解されよう。そのような方法のすべてと組み合わせて本発明を使用することは、本発明により意図されていることである。本発明の他の様相は、休止膜内外電位差または刺激された膜内外電位差を所定の値に設定することにより対象とする第1のイオンチャネルをアッセイできるようにするために、ここで開示している電気刺激法と併せて第2のイオンチャネルを使用することを含む。一実施形態では、第2のイオンチャネルは、持続されている正の膜内外電位差の発生を可能にする、電圧を規制されているナトリウムチャネルまたはカルシウムチャネルである。他の実施形態では、第2のイオンチャネルは電圧を規制されているカリウムチャネルであって、負の膜内外電位差の発生を可能にする。それら第2のイオンチャネルを使用することにより、膜内外電位差をほぼ任意の所定レベルに設定するために、この電気刺激法を使用できる。このアッセイ形態は2つのイオンチャネルを使用するので、いずれかのチャネルのモジュレーターが電圧反応に影響を及ぼす。この場合には、膜内外電位差を設定するために使用される第2のイオンチャネルのみを発現する母細胞系統で追加の対照群研究を行うことができる。第1のイオンチャネルをブロックする化合物が2次イオンチャネルに対して活性を持つかどうかを見出すために、次いでそれらの化合物を別々に再試験できる。通常、スクリーニングされる試験化合物は、関連する化合物または多様な化合物のライブラリに存在する。そのライブラリは個々に試験され、または組合せで試験される個々のメンバーを有することができ、またはライブラリは個々のメンバーの組合せとすることができる。そのようなライブラリは、最低2つのメンバー、好ましくは約100以上のメンバーまたは約1,000以上のメンバー、より好ましくは約10,000以上のメンバー、最も好ましくは約100,000または1,000,000以上のメンバーを持つことができる。i.候補モジュレーターの選択性および毒物学ひとたび特定されると、候補モジュレーターは、選択性および毒性作用を既知の方法を用いて評価されることができるLu、BasicToxicology,Fundamentals,TargetOrgans,andRiskAssessment,HemispherePublishingCorp.、Washington1985;Culbrethに付与された米国特許第5196313号1993年3月23日発行およびBenetに付与された米国特許第5567952号1996年10月22日発行を参照。例えば、対象とするイオンチャネルのその自然の生理学的状況において、そのイオンチャネルの反応に対する候補モジュレーターの影響をスクリーニングするために、1次細胞系統または組織切片を用いることができる。例えば、心臓細胞に対する特定および/または選択性な作用を示す薬品をスクリーニングするために、ミオサイトまたはその他のinvitro細胞培養モデル細胞系統を使用することが好ましいことがある。この場合には、1次スクリーニングは、ミオサイトから導出した細胞系統で完了して、電気的に誘導された活動電位を短くする、長くする、またはブロックする化合物を特定できる。その後で、体に及ぼす潜在的な悪影響を示す化合物を特定するために、2次スクリーニングが設計される。例えば、これは、心臓組織または神経組織、あるいはそれらの組織から抽出した不死化された細胞培養などの電気的に刺激できる組織に対する候補薬品の作用をスクリーニングすることにより、行うことができる。それらの組織は、有機体内で重要な役割を演じ、電気的に刺激すべきそれらの組織の能力に対する候補薬品の望ましくないいかなる作用も、与えられたときに潜在的な重大な副作用を生ずるものと予測される。その結果、それらの組織が機能する能力をまた損なった活性化合物は、初期の段階で薬品候補としての考察から除去でき、または副作用を減少するために実施される医学的化学的方法を有する。哺乳類ヒトが好ましいの細胞系統などの細胞系統に対する生体外invitro毒性を判定することによって、候補モジュレーターの追加の毒物学的分析を行うことができる。候補モジュレーターは、本願出願人が特許を受ける権利を有する、1999年4月28日に出願された米国特許出願第09/301525号、1999年4月28日に出願された米国特許出願第09/301395号、1999年12月10日付の米国特許出願第09/458927号に記述されているように、全生物体により代謝された後で、またはチトクロムP450システムによって劣化させされるべき能力を介して、化学物質の増加させられまたは減少させられた毒物学的諸特性を判定するために、ミクロソーム標本などの肝臓の標本などの組織抽出物で処理できる。それらのタイプの研究の結果は、ヒトを含めた哺乳類などの動物における化学物質の毒物学的諸特性をしばしば予測する。毒物学的活性は、毒物学的活動中に活性化されるリポーター遺伝子を用いて、または細胞溶菌により、測定できる1998年4月2日に発行された国際特許98/13353参照。好適なリポーター遺伝子は蛍光またはルミネッセント並進生成物例えば、緑蛍光タンパク質1998年4月29日に発行のTsienらに付与された米国特許第5625048号、1998年7月7日に発行のTsienらに付与された米国特許第5777079号、1996年8月8日に発行のTsienの国際特許96/23810、1997年8月7日に発行の国際特許97/28261、1997年7月16日に出願されたPCT/US97/12410、1997年8月15日に出願されたPCT/US97/14595を参照、または、酵素劣化生成物などの蛍光生成物あるいはルミネッセント生成物例えば、ベータ-ラクタマーゼなど1998年4月21日に発行されたTsienに付与された米国特許第5741657号、および1996年10月3日に発行された国際特許96/30540を参照を生成できる並進生成物を生成する。細胞溶菌は、本発明において、少なくとも1種類の光子還元試薬の存在する中で細胞内の少なくとも1種類の光子発生試薬からの蛍光信号における減少として検出できる。そのような毒物学的判定は、1994年1月21日に出願されたPCT/US94/00583国際特許94/17208、1997年11月25日に発行されたドイツ特許No.69406772.5-08、1994年11月12日に発行されたEPC0680517、1996年12月31日に発行された米国特許第5589337号、1998年1月14日に発行されたEPO651825、および1996年12月17日に発行された米国特許第5585232号に記述されているものなどの、原核生物細胞または真核生物細胞を用いて、オプションとして毒物学的分析手法を用いて、行うことができる。あるいは、またはそれらのinvitro研究に加えて、マウス、ラット、ラビットまたはサルなどの動物モデルにおける候補モジュレーターの生物学的使用可能性および毒物学的諸特性を、確立されている方法を用いて判定できるLu、前掲1985;およびCreasey、DrugDispositioninHumans、TheBasisofClinicalPharmacology、OxfordUniversityPress、Oxford1979;Osweiler、Toxicology、WilliamsandWilkins、Baltimore、MD1995;Yang、ToxicologyofChemicalMixtures;CaseStudiesMschanisms,andNovelApproaches、AcademicPress,Inc.、SanDiego、CA1994;Burrelら、ToxicologyoftheImmuneSystem;AhumanApproach、VanNostarndReinhld,Co.1997;Niesinkら、Toxicology;PrinciplesandApplications、CRCPress、BocaRaton、FL1996を参照。候補モジュレーターの毒性、ターゲット器官、組織、遺伝子座、推定機構に依存して、当業者は、候補モジュレーターの毒物学的諸特性を決定するために適切である、適切な用量、LD50値、投与経路および管理を決定するという負担は負わされない。動物モデルに加えてヒトの臨床試験を、合衆国食品医薬品局USFDAまたはそれと同等のその他の政府機関により規定されているものなどの、規定の手順に従って実行できる。それらの毒性研究は、生体内invivoでの候補モジュレーターの治療の有用性を判定する基礎を提供する。ii.候補モジュレーターの有効性候補モジュレーターの有効性は、生体外invitro法、動物モデルまたはヒトの臨床試験などのこの分野で認識されているいくつかの方法を用いて確立できるCreasey、前掲1979を参照。認識されている生体外モデルは、いくつかの疾患すなわち異常に対して存在する。例えば、HIVに感染している生体外の細胞の寿命を延長するための化学薬品の効能は、HIV感染すなわちエイズを治療するために効果があると予測される化学薬品を特定するための許容できるモデルとして認識されているDalugeら、Antimicro.AgentsChemother.41:1082-10931995を参照。さらに、生体外のT細胞の増殖を阻止するためのシクロスポリンACsAの効能は、免疫抑制剤として効果があることが予測される化学薬品を特定するために許容できるモデルとして確立されている。Sauthanthiranら、前掲1996を参照。ほとんどあらゆる種類の治療、疾患または症状に対して、許容できる生体外モデルまたは動物モデルを利用できる。それらのモデルは、例えば、胃腸の異常、癌、心臓学、神経生物学、および免疫学のために存在する。また、それらの生体外法は、候補モジュレーターに対する代謝の影響の確実な指標を与えるために、ミクロソーム標本などの肝臓の標本などの、組織抽出物を使用できる。同様に、許容できる動物モデルを種々の疾患および症状を治療する化学薬品の有効性を確立するために使用できる。例えば、ラビットの膝は、関節炎の治療に有効な化学薬品を試験するための受け入れられるモデルであるShawandLacy、J.BoneJointSurg.、Br55:197-2051973を参照。関節炎の治療のためにヒトに使用することが承認されているヒドロコルチゾンは、このモデルの有効性を裏付けるこのモデルにおいて有効であるMcDonough、Phys.Ther.62:835-8391982を参照。候補モジュレーターの有効性を判定するために適切なモデルを選択する場合は、当業者は、適切なモデル、用量、投与経路、養生法および終点を選択するために、技術の現状を頼りにすることができ、したがって、過度に負担が掛かることはない。動物モデルに加えて、ヒトの臨床試験を、ヒトにおける候補モジュレーターの有効性を判定するために使用できる。USFDAまたはそれと同等の政府機関がそのような研究の手順を設定しているwww.fda.govを参照。iii.候補モジュレーターの選択性上記のinvitro法およびinvivo法は、候補モジュレーターの選択性をも定める。本発明は、候補モジュレーターの特効性を判定する迅速な方法を提供するものである。例えば、関連するイオンチャネルファミリーメンバーを含んでいる細胞系統を用いて、関連するイオンチャネルを阻害する効能と、イオンチャネルの異なる電位依存状態を変調する相対的な性能との両方に関して、試験化学薬品の選択性を迅速にプロファイリングすることができる。そのような装置は、最初に、簡単で微小化された高スループット態様で、候補モジュレーターのイオンチャネル選択性を系統的に評価するために、多数の試験化学薬品を迅速にプロファイルする性能を提供する。iv.特定された化学薬品、モジュレーターまたは治療および組成物本発明は、新規な化学物質などの組成品と、ここで説明している方法、装置または成分の実施による活性を有するものとして本発明の少なくとも1つの方法により特定される治療とを含む。新規な化学物質は、ここで使用されているように、この出願の出願日における技術で既に公然と知られている化学物質は含まない。通常は、化学物質は、本発明を使用することから活性を有することが示され、その後で化学構造の専用のあるデータベースからその構造が明らかにされ、または質量分光分析などの分析技術からその構造が決定される。本発明の一実施形態は、上で説明した方法によって特定される化学物質を有する、有用な活性を持つ化学物質である。そのような組成物は、小さな有機分子と、核酸と、ペプチドと、この技術分野で利用できあるいは将来開発される技術で容易に合成できるその他の分子を含む。例えば、次の組合せ化合物がスクリーニングに適する:ペプトイドPCT公開No.国際特許91/19735、1991年12月26日、エンコードされたペプチドPCT公開No.国際特許93/20242、1993年10月14日、ランダムなバイオオリゴマーPCT公開No.国際特許92/00091、1992年1月9日、ベンゾジアゼピン米国特許第5288514号、ヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチドなどのジバーソマーHobbsDeWitt,S.ら、Proc.Nat.Acad.sci.USA90:6909-69131993、ビニルロガスポリペプチドHagiharaら、J.Amer.Chem.Soc.114:65681992、β-D-グルコースのスカフォールディングを有するノンペプチダルペプチドミメチックHirschmann,R.ら、J.Amer.Chem.Soc.114:9217-92181992、小規模な化合物ライブラリの類縁有機合成Chen,C.ら、J.Amer.Chem.Soc.116:26611994、オリゴカルバメイトCho,C.Y.ら、Science261:13031993および/またはペプチジルホスホナートCampbell,D.A.ら、J.Org.Chem.59:6581994。一般に、Gordon,E.M.ら、J.Med.Chem.、37:13851994を参照されたい。前記公開公報のすべての内容は参照により本明細書に組み込まれている。本発明は、貯蔵およびそれに引き続く投与のために用意されている薬学的に受け入れることができる担体を含む薬学的組成物における、特定された組成物をも包含する。それは、上記に開示された製品の薬学的に有効な量を、薬学的に受け入れることができる担体または希釈剤中に有する。治療に使用するための受け入れることができる担体または希釈剤は、薬学分野において周知であって、例えば、Remington’sPharmaceuticalSciences、MarkPublishingCo.A.R.Gennaro、edit.、1985に記載されている。防腐剤、安定剤、染料および芳香剤さえも、薬剤組成物中に含めることができる。例えば、安息香酸ナトリウム、アスコルビン酸、およびp-ヒドロキシ安息香酸のエステルを防腐剤として添加できる。また、酸化防止剤および懸濁化剤を使用できる。本発明の組成物は調合でき、経口投与のために錠剤、カプセルまたはエリキシルとして、直腸投与のための座薬として、注射投与のための滅菌溶液、懸濁液として、などとして使用できる。注射可能薬は、溶液または懸濁液として、注射前に液体に溶解または懸濁させるのに適する固体の形として、またはエマルジョンとして、従来の形態で製造できる。適切な賦形剤は、例えば、水、食塩水、デキストロース、マンニトール、乳糖、レシチン、アルブミン、グルタミン酸ナトリウム、塩酸シスチンなどである。また、所望によっては、注射できる薬剤組成物は、湿潤剤、pH緩衝剤などの毒性のない補助物質を少量含むことがある。所望によっては、吸収増進製品例えば、リポソームを利用できる。1用量として求められる組成物の薬学的に有効な量は、投与経路と、治療される動物の種類と、考察している特定の動物の身体特性とに依存する。1用量は、所望の効果を達成するために調整できるが、体重、食事、同時に投薬されている医薬、および医学分野における当業者が認識しているその他の要因などの諸要因に依存する。本発明の方法の実施に際しては、製品または組成物は単独で、または相互に組み合わせて、あるいは、他の治療剤や診断薬との組合せで使用できる。それらの製品は生体内invivoで、通常は、哺乳類内、好ましくはヒト内で、または生体外invitroで利用できる。それらを生体内で採用するには、製品または組成物は、各種の用量形態を採用して、非経口的に、静脈注射で、皮下注射で、筋肉注射で、結腸的に、直腸的に、鼻でまたは腹膜内を含めて、種々のやり方で哺乳類に投与される。それらの方法は、生体内の化学物質の活性を試験するために適用することもできる。当業者には容易に明らかになるであろうが、投与すべき有用な生体内用量および特定の投与態様は、年齢、体重および治療される哺乳類の種、採用される特定の化合物、およびそれらの化合物を採用する特定の使用法に依存して変化する。効果的な用量水準、すなわち所望の結果を達成するために必要な用量水準の決定は、ルーチンの薬学的方法を採用する当業者によって達成できる。通常、製品のヒト臨床応用は、低い用量水準で開始され、所望の効果が達成されるまで用量水準を高めて行く。あるいは、確立されている薬学的方法を用いるこの方法により特定された組成物の有用な用量および投与経路を定めるために、許容できる生体外研究を使用できる。ヒト以外の動物の研究においては、見込みのある製品の適用は、より高い用量水準で開始され、所望の効果がもはや達成されないか、悪い副作用が消えるまで用量を減少する。本発明の製品の用量は、所望の作用と治療指針に依存して、広い範囲にわたることができる。通常、用量は、約10μg/kg体重と100mg/kg体重の間、好ましくは約100μg/kg体重と10mg/kg体重の間とすることができる。投与は、毎日経口とすることが好ましい。正確な調合、投与経路および用量は、患者の状態を考慮して個々の医師が選択できる。例えば、Finglら、inThePharmacologicalBasisofTherapeutics、1975を参照。なお、付き添いの医師は、毒性または器官の機能障害のために、投与の中止、中断または調整をいつどのようにして行うかを知っている。逆に、付き添いの医師は、臨床反応が適切でないならば毒性を排除して、治療をより高い水準へ調節することをも知っている。対象とする障害の管理における投与される用量の大きさは、治療すべき状態の厳しさと、投与経路とともに変化する。状態の厳しさは、例えば、標準予後評価法によって、部分的に、評価できる。さらに、用量とおそらく服用頻度は、年齢、体重および個々の患者の反応に従ってまた変化する。上で述べたプログラムに匹敵するプログラムを獣医学で使用できる。治療されている特定の状態に応じて、そのような薬剤を系統的にまたは局所的に調合および投与できる。調合および投与の技術は、Remington’sPharmaceuticalSciences、18thEd.、MackPublishingCo.、Easton、PA1990で見出すことができる。適切な経路は、口、直腸、皮膚、腟、粘膜または腸管を経由する投与;筋肉内注射、皮下注射、髄内注射や、クモ膜下注射、直接心室内注射、静脈注射、腹腔内注射、鼻内注射または眼内注射を含めた非経口投与を含むことができる。注射のために、本発明の薬剤は、水溶液中で、好ましくはHanksの溶液、リンゲル溶液、または生理食塩水緩衝液などの生理学的に適合する緩衝液中で調合できる。そのような粘膜を通じる投与の場合には、浸透させられるバリアに適切な浸透剤が調合に使用される。そのような浸透剤は、この技術分野において一般に知られている。本発明の実施のためにここで開示されている化合物を系統的な投与のために適する用量に調合するために、薬学的に許容できる担体を使用することは、本発明の範囲内である。担体と適切な製造技術とを適切に選択すると、本発明の組成物、特に、溶液として調合されているものは、心室内注射などのように、非経口的に投与できる。化合物は、この技術で周知の薬学的に許容できる担体を用いて、経口投与に適する用量に容易に調合できる。そのような担体によって、本発明の化合物を、治療を要する患者の経口摂取のための錠剤、丸薬、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁などとして調合可能にする。細胞を通じて投与すべき薬品は、当業者に周知の技術を用いて投与できる。例えば、そのような薬品は、リポソーム中に封入でき、その後で上記のように投与される。リポソーム形成時に水溶液中に存在するすべての分子は、水を含んでいる内部に包含される。リポソーム内容物は、外部の微小な環境から保護され、かつ、リポソームは細胞膜に融着するので、細胞質中に効率的に送り込まれる。また、それらの疎水性のために、小さい有機物分子を細胞内に直接投与できる。本発明に使用するのに適する薬学的組成物は、活性成分が、それの意図されている目的を達成するために効果的な量だけ含まれているような組成物を含む。その効果的な量の決定は、特にここで提供されている詳細な開示にかんがみて、当業者の能力の十分な範囲内である。活性成分に加えて、それらの薬学的組成物は、薬学的に使用できる製品に活性化合物を入れる処理を容易にする賦形剤および補助物質を含む適切な薬学的に許容できる担体を含むことがある。経口投与のために調合された製品は、錠剤、糖衣錠、カプセルまたは溶液の形とすることができる。本発明の薬学的組成物は、それ自体知られているやり方、例えば、従来の混合法、溶解法、顆粒化法、糖衣錠製造法、空中浮揚levitating法、懸濁化法、カプセル封入法、エントラップentrapping法、凍結乾燥法により、製造できる。非経口的な投与のための薬学的調合は、水に溶解できる形態での活性化合物の水溶液を含む。また、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射懸濁液として製造される。適切な親油性溶剤すなわち媒体は、ごま油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルまたはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームを含む。水性注射懸濁液は、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランなどの懸濁液の粘度を高める物質を含むことがある。所望によっては、懸濁液は、高濃度の溶液の製造を行えるようにするために、化合物の溶解度を高くする適切な安定剤や試薬を含むこともできる。経口使用のための薬学的調製品は、活性化合物を固体賦形剤に組み合わせ、所望によってはその結果得られた混合物を粉砕し、所望により適切な補助剤を添加した後で、錠剤または糖衣錠のコアを得るために顆粒物の混合物を処理することにより、得ることができる。適切な賦形剤は、特に、乳糖、ショ糖、マンニトールまたはソルビトールを含む糖類などの増量剤、例えば、とうもろこし澱粉、小麦澱粉、米澱粉、馬鈴薯澱粉、ゼラチン、トララガントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル-セルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロースおよび/またはポリビニルピロリドンPVPなどのセルロース製品である。所望によっては、架橋結合しているポリビニルピロリドン、寒天またはアルギン酸またはナトリウムアルギン酸塩などのそれの塩などの、崩壊剤を添加できる。糖衣錠のコアには適切な被覆が設けられる。このために、濃縮された砂糖溶液を使用できる。その砂糖溶液は、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル、ポリエチレングリコールおよび/または二酸化チタンと、ラッカー溶液、および適切な有機溶剤または溶剤混合物とを所望により含む。活性化合物用量の種々の組合せの特定または特徴付けのために、染料または顔料を錠剤や糖衣錠の被覆に添加できる。このために濃縮砂糖溶液を使用できる。濃縮砂糖溶液は、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル、ポリエチレングリコールおよび/または二酸化チタンと、ラッカー溶液、および適切な有機溶剤または溶剤混合物を所望により含む。活性化合物用量の種々の組合せの特定または特徴付けのために、染料または顔料を錠剤や糖衣錠の被覆に添加できる。そのような調合は、この技術で知られている方法を用いて行うことができる例えば、米国特許第5733888号注射できる組成物、第5726181号貧水溶性化合物、第5707641号治療に活性なタンパク質またはペプチド、第5667809号親油性の物質、第5576012号可溶性ポリマー物質、第5707615号抗ウィルス製剤、第5683676号微粒子状薬物、第5654286号局所剤、第5688529号経口懸濁液、第5445829号徐放性製剤、第5653,987号液体製剤、第5641515号放散が制御された製剤および第5601845号球状製剤参照。V.実施例本発明は添付した実施例を参照すると一層良く理解できる。それらの実施例は示すことだけを目的とするものであって、ここに添付されている特許請求の範囲で定められている本発明の範囲を限定するものとは、いかなる意味においても解してはならない。1.実施例1:標準丸形ウェル内の平行プレート電極の電界の一様性の解析種々の電極とウェルの設計との作用を解析するために、電界の一連の二次元数値シミュレーションを、ソフトウェア解析パッケージQuickfield商標4.1Student’sVersion、TeraAnalysis、http://www.tera-anaiysis.comを用いて生成した。このソフトウェアパッケージは、二次元での有限要素解析法でポアソンの方程式を解くことによって目の粗い網型の電界強度マップを生ずる。この解析のために、電界の底とウェルの底の間の間隙に起因する端効果は無視し、電極から食塩水までの電圧降下も無視できるものと仮定した。モデルの空間分解度は約0.5mmである。図7Aは、96個の標準の円形ウェルの内部に配置されている、間隙が4mmで、標準電位差が2Vである4mm幅の平行プレート電極710を用いたシミュレーションの結果を示す。この図では、外側の円700はウェルの縁部で、2本の垂直線710は電極であり、中間の破線の円720は観察領域である。灰色の領域740は、電界が観察領域内の平均電界の±10以内に維持される領域である。白い領域730では、電界は平均の10よりも小さく、黒い領域750では、電界は平均電界の10よりも大きい。観察領域内では、電界の強さの標準偏差は平均の2であり、最大電界と最小電界の間の差は平均の10である。したがって、この構成は本発明に使用するための電界一様性について述べた諸要求を満たす。2.実施例2:標準円形ウェル内のピン電極の電界一様性の解析標準の直径6.2mmのウェル内部に置かれて、4.0mmの距離で隔てられている、直径1.0mmの2本の丸ピン電極について予測される電界の一様性を決定するために、実施例1において説明したのと同じ条件および同じ仮定でシミュレーションを行った。図7Bで、外側の実線の円705はウェルの縁部で、2つの小さい円715は電極であり、中間の破線の円は観察領域である。灰色の領域745は、電界が観察領域内の平均電界の±10以内に維持される領域である。白い領域735では、電界は平均の10よりも小さく、黒い領域755では、電界は平均電界の10よりも大きい。観察領域725内では、電界の強さの標準偏差は平均の15であり、最大電界と最小電界の間の差は平均の87である。したがって、この構成は一様な電界を生ぜず、その結果、本発明での使用には適さない。3.実施例3:正方形ウェル内の平行プレート電極の電界一様性の解析図8Aは、6.2mmの正方形ウェル内部の4mmの間隙を持つ2枚の6mm幅の平行プレート電極の電界プロファイルのシミュレーションを示す。この図で、外側の正方形800はウェルの縁部である。2本の垂直線810は電極である。中間の破線の円820は観察領域である。特に注目すべきことは、電界の強さの変化に対比を付けるために、図8の電界のスケールが、図7と比較して非常に大きくされていることである。灰色の領域840は電界が観察領域内の平均電界の±1以内に維持される領域である。白い領域830では、電界は平均の1よりも小さい。このシミュレーションでは、平均電界の1よりも大きい電界のある点はない。観察領域内では、電界の強さの標準偏差は平均の0.02であり、最大電界と最小電界の間の差は平均の0.12である。したがって、この構成は電界の一様性を極めて大きく改善する。シミュレーションの結果は、図7Aに示されている平行プレート系における電界の非一様性の主な源が、ウェルの丸くされている壁から得られることを示す。円形断面を有する標準ウェルでは、電流密度が一方の電極から他方の電極へ通るにつれて広がり、その後で縮み、この広がりが非一様性を生ずる。これは正方形ウェルを持つマルチウェルプレートを用いて修正できる。4.実施例4:ウェルの丸くされている領域を覆い隠すための絶縁体要素の付加の影響の解析図8Bは、図1において説明した標準の状態と解析手順を用いて、6.2mmの直径の円形ウェル内部の4mmの間隙を持つ2枚の4mm幅の平行プレート電極の電界プロファイルのシミュレーションを示す。図9Aに示されているように、絶縁体が電極に取り付けられて、電極の間のウェルの丸くされている領域を覆い隠す。図8Bで、外側の円802はウェルの縁部である。2本の垂直線812は電極である。中間の破線の円822は観察領域である。クロスハッチされている領域862は電極に取り付けられている絶縁体である。灰色の領域842は、電界が観察領域内の平均電界の±1以内に維持されている領域である。白い領域832内では、電界は平均の1よりも小さい。このシミュレーションでは、平均電界の1よりも大きい電界のある点はない。観察領域内では、電界の強さの標準偏差は平均の0.2であり、最大電界と最小電界の間の差は平均の1.0である。したがって、この構成は、絶縁体が使用されていない場合よりも電界の一様性を極めて大きく改善するが、正方形ウェルの場合におけるほど大きくはない。この結果は、標準的な円形ウェルプレートにおける電界の一様性は、電極により定められている領域の外側の領域に絶縁物質を充填することにより、極めて大きくできることを示している。実際には、ナイロン、テトラフロロエチレン、ポリカーボネートまたはその他の任意の非多孔質ポリマーなどの不活性なプラスチック、またはガラスが水溶液に対して比較的安定で、容易に製造でき、好ましくは非蛍光発光性でないならば、それらの物質を絶縁体物質として使用できる。絶縁体は、通常、電極に取り付けられ、電極により定められる領域のいずれも見えなくすることはない。5.実施例5:電界の一様性に及ぼすサテライト電極の影響の解析ウェルの湾曲している縁部内への電流の損失をサテライト電極の使用によって補償することが可能かどうかを試験するために、各種の電極構成でシミュレーションを行った。図9Bはこの概念の1つの可能な実施形態を示し、図8Cはこの構成が、実施例1で説明したQuickfield商標を用いて解析されたときの電界プロファイルを示す。この実施例では、余分の0.7mm幅の平行平板電極の2対を2mm間隙をおいて設けた。それらの電極は観察領域の外部にあって、それの親電極の電位の半分に保たれていた。図8Cで、外側の実線円804はウェルの縁部である。2本の長い実線垂直線814は親電極であり、4本の短い実線垂直線816はサテライト電極である。中間の破線の円824は観察領域である。灰色の領域844は、電界が観察領域内の平均電界の±1以内に維持される領域である。白い領域834内では、電界は平均の1よりも小さく、黒い領域854内では、電界は平均電界の1よりも大きい。観察領域内では、電界の強さの標準偏差は平均の0.2であり、最大電界と最小電界の間の差は平均の1.2である。したがって、この構成は、絶縁体が使用されていない場合より電界の一様性を極めて大きく改善するが、正方形ウェルの場合におけるほど大きくはない。この実施例は、特定の構成において4つのサテライト電極を使用することを示している。観察領域の外部により多くのサテライト電極を付加することにより、かつそれらの電極の電位を親電極に加えられている電位の関数として適切に割当てることによって、電界の一様性を原理的に任意の精度まで改善できる。例えば、円形ウェル構成では、観察領域の中心における電界の一様性は、平行平板電極を、図9Dに示されているように、薄い絶縁分割要素により分離されているいくつかの片に分割することによって改善できる。各電極に加えられる電位最も中心の片に加えられている電位に対する分数比のとして表されているを個々に調整して、観察領域内の電界の一様性を最高にできる。この概念は、各々独立に制御できるいくつかの垂直導電性条を有する、平行でないディッパー電極の使用を許すために拡張できる。6.実施例6:電界の一様性に及ぼすメニスカスの影響の解析ウェル内に挿入されたときにディッパー電極により形成されるメニスカスは、観察領域にわたってほぼ10の生理的食塩水の深さを変化させる。そうすると観察領域にわたってほぼ10の電界変化が生ずる。それらの変化は、電極の設計が完全な電界一様性を生ずると予測されていたとしても存在する。したがって、メニスカス効果を解消すると実際の電界一様性が改善される。これを行う1つの可能な方法は、電極の間に絶縁バリアを付加することである。図9Cは、1つのそのような実施形態を示すものであって、絶縁バリアが、ウェル内の液体に対して平らな上表面を形成するために用いられている。このバリアの底が、電極がウェル内に挿入されたときに、ウェルの底の約2.5mm上に位置するように設計されている。したがって、バリアは、生理食塩水中に部分的に浸され、それの底面が、導電性の室の上部を平らに、かつ電極表面に垂直に画定する。このようにして電界は、導電性容積の表面の凹凸によって乱されることはない。7.実施例7:ディッパー電極電気刺激器の製造電気刺激器の一実施形態では、装置は、ディッパー電極を96ウェルマルチウェルプレート形態におけるウェルのアレイ中に配置する自己位置決めフレームで構成されている図1。図1は電極アレイの挿入された位置を示す。この例では、電気刺激装置は、3つの機能部品から製作できる。第1の部品は、装置をプレートウェルに対して配置する位置決めフレーム40である。このフレームは金属で製作され、マルチウェルプレートにぴったりはめ込まれる。このフレームは、装置の第2の機能部品すなわち引き込み機構の位置決め基準として機能する。引き込み装置は、肩ボルト70と復帰スプリング見えないで構成されている。スプリングは、肩ボルトの周囲に巻き付けられ、位置決めフレーム40と絶縁カバー90の底を押す。復帰スプリングは、電極がプレートウェル内に下げられるまで、電極組立体を引き込まれた位置に保持する。引き込み機構は、装置の第3の機能部品、すなわち電極アレイの位置を決定する。装置の第3の機能部品は、電極アレイである。電極アレイは8対の同一の電極くし10で構成されている。電極くしは、ステンレス鋼で製作され、歪みを避けるために精密レーザ切断されている。各くしは、マルチウェルプレートウェルの直径をほぼさし渡すのに十分な幅のタブを8つ有する。くしのバックボーンは、タブ50への電気接続を構成している。それらのくしのうちの2つが、8つのウェルの行内に挿入される電極対を形成している。くしは、電極を位置決めフレームに対して配置する、精密に孔あけされている絶縁プレート30により相対的に配置されている。絶縁スペーサー20が電極の分離している状態を維持し、ピンにより留められているインターフェースにより、くしに対し、孔が開けられているプレートに対する位置を指示する。第2の組のスペーサー25が、プレート30に対する電極10の精密な位置決めを確実に行う。安定性を一層高めるために、アライメント軸15がスペーサー20と電極くし10に設けられているアライメント穴に挿入されている。くしとスペーサーは、絶縁カバー90により、孔あけされているプレートに対して所定の場所に保持されている。装置をマルチウェルプレートの上に置き、電極組立体に対して押し下げて電極をウェルの内部に降ろすというようにして、装置を手動で使用できる。電極が十分に延ばされると、1対の固定バー60が挿入されて電極をウェル内部に延ばされた状態に保持する。あるいは、この技術で知られている標準的な機械的制御装置あるいはロボット制御装置を用いて、ウェルに対する電極の出し入れを自動的に行うこともできる。図3は主な電気部品と光学部品のブロック図を示す。電気刺激は、1対のデジタル関数発生器380、310により駆動される大電力増幅器320で発生される。一実施形態では、スイッチ330は、VIPR商標読取器制御コンピュータ300に挿入されているNationalInstruments社AustinTXPC-DIO24デジタル入力/出力カードにより制御されるNationalInstrumentsER-16であった。スイッチ330は、96ウェルプレート内の定められたウェルを、任意の与えられた時間プロトコルで電気的に刺激するようにさせた。この場合には、1つの8ウェル行が同時に刺激された。増幅器320は、APEXPA93チップApexMicrotechnologyCorp、Tuscon、AZを用い、製造者により提供された回路に従って組み立てられた。この増幅器は次のような仕様であった:入力±100VDC、入力インピーダンス100GΩ、電圧ゲイン20倍、出力±90V、出力±3A、出力インピーダンス10Ω。関数発生器は、TektronixBeaverton、ORAFG310型であった。第1の関数発生器380は、刺激パルス列が開始を求められたときに、VIPR商標読取器ソフトウェアにより駆動され、一連のTTLパルスを発生して第2の関数発生器310を駆動させた。第2の関数発生器は、刺激波形カーネルでプログラムされた。8.実施例8:電気刺激の電位依存性野生型のチャイニーズハムスターの卵巣細胞CHO細胞は、電位依存ナトリウムチャネルを内生的に発現し、電気刺激パラメータの妥当性検証と最適化のために便宜に使用できる。このナトリウムチャネル以外に、それらの細胞は、付近の細胞との間の間隙接合接続と、非常に小さい~20pA電位依存外向き電流を有するように見える。これらの細胞における電位依存ナトリウムチャネル以後NaV1と呼ぶは、ラットの脳型IIaナトリウムチャネルに類似する電気生理学的特性を有する。このチャネルの電流/電圧特性を標準の電気生理学で解析すると、典型的な野生型CHO細胞は-20mVにおいて細胞当たり100pAの平均ピーク電流を有することが明らかになった。これは、約800MΩの膜抵抗率RNaに相当する。単一チャネルのコンダクタンスが10pSであると仮定すると、これは、細胞当たりたった~125個のナトリウムチャネルが存在することを示唆する。我々の場合には、CHO細胞は、典型的には、休止膜内外電位差Rmが約-35mV、休止膜抵抗値が>10GΩ、細胞膜容量Cmが15pFであることを示す。電気刺激の電位依存性を試験するために、野生型CHO細胞を96ウェル微量滴定プレート内に播種、成長媒体中で24~48時間培養した。その後で、それらを浴溶液1中でリンスし、それぞれ、10μMCC2-DMPEクマリンと、その後で3μMDiSBAC23付録A1に記載されているようにエチルオキソノールとでそれぞれ30分間染色した。96対のステンレス鋼電極幅4mm、間隙4mmを持つ刺激器組立体が、実施例7で記述されているように、アッセイプレートの上に置かれた。電極は、細胞を覆っている食塩水の上に降ろされ、ウェルの底から0.5mmの所に保持された。上記のように、電気刺激中に、比率測定法蛍光測定をVIPR商標読取器を用いて行い、データを付録A2中の手順に従って分析した。任意の1時刻には、8ウェル行のたった1つの行をアッセイした。残りのウェルは、励起光または電気刺激を受けなかった。各プレートをアッセイした後で、電極を蒸留水で完全に洗浄し、圧縮空気で乾燥して、プレートの間の相互汚染cross-contaminationを避けた。電気刺激の結果として細胞中に起きる膜内外電位差の変化を測定するために、細胞を含んでいるマルチウェルプレートをVIPR商標読取器で分析した。電極間の中間に位置する直径が3mmの観察領域内の細胞を400±7.5nmの光で励起した。その光は、300Wのキセノンアーク灯で発生されたもので、正確な励起波長を選択するために、1対の誘電体干渉帯域通過フィルタの対を通された。光は三つ又に分けられた光ファイバケーブルを介して細胞へ向けられ、細胞から戻された。その光ファイバケーブルのうち1本を励起光のために使用し、他の2本を蛍光放出のために使用した。青460±20nm信号と橙580±30nm信号の同時測定を各ウェルから50Hzで記録し、デジタル化してコンピュータに保存した。最初のアッセイには15秒間を要し、それは、示されている電気振幅での2秒間で始まる、6秒間の刺激繰り返し90Hz繰り返し頻度二相5ms/相方形波刺激で構成されていた。刺激バーストの2秒前および7秒後の間は、電流は電極を流れない。図10は、32V/cmまでの種々の電界強さにおける比率測定反応を示す。この場合には、記録されている反応の見掛けの立上り時間は、反応時定数がおよそ1秒であるDiSBAC23の反応時間によって制限される。10V/cmより小さいパルス振幅では、反応は検出できない。20V/cmより上では、反応はしっかりしていて、電圧が32V/cmまでさらに上昇させられるにつれてわずかだけ増大する。図11に示されているように、より高い電圧では、ピーク反応約5秒後に測定されたは、反応におけるさらに少しだけの増加を示す。図11のデータは、ボルツマン関数にフィッティングできる。ボルツマン関数の中点は、18.0V/cmで、幅が2.0V/cmである。出だしが鋭いことと、高い電界における反応の平坦さは、閾値現象を強く示唆するものである。反応が最大の半分18V/cmである電界は、以前に公開された式式1、Tsong、1991、Biophys.J.60:297-306を参照;細胞の平均直径が30μmであると仮定しているを用いて、細胞の最も端における膜内外電位差の約±30mVの偏差に対応する。したがって、これは、通常は不活性状態にある電圧ゲートナトリウムチャネルについて上で述べた刺激機構と、定量的に調和する。高い強さの電界では、細胞膜がエレクトロポレーションを生じて膜内外電位差が大きな比較的特異でない変化をするTsong、1991、Biophys.J.60:297-306。これがここで用いられているより低い電界強さに対する細胞の反応における大きな要因でもあるか否かを判定するために、ナトリウムチャネルに特有の毒素であるテトロドトキシンTTXで実験を行った。電気刺激の作用を毒素でブロックできるものとすると、これは、電気刺激の作用がナトリウムチャネルの活動によって主として媒介されることを示唆する。この実験の結果を図12に示す。データは33V/cmの電界の強さで得たもので、TTXは電気刺激の作用を完全にブロックできることを示しており、典型的な薬学的特性はナトリウムチャネルのブロックに一致している。このデータへのフィッティングからのEC50は9nMであって、ラットの脳型IIaにおけるTTXについて報告された値8nM、Westら、1992、Neuron、8:59-70に類似する。この信号がTTXによりブロックされるという通常の薬学での事実は、電気刺激により発生された信号がほとんど完全にNaV1に起因することの強力な証拠である。9.実施例9:刺激パルスの幅および周波数の変化に対する細胞の反応の変動刺激パルスの幅と周波数が変えられた際の細胞反応の挙動を調べるために、上で実施例8において説明したように野生型CHO細胞を用いて、一定の電界強さ25V/cmで、パルスの持続時間と周波数を変化させて実験を行った。その結果が図13に示されている。各データ点は、野生型CHO細胞の5枚の別々のプレートから得た実験からの同時に刺激された8つのウェルの平均を表す。結果は、刺激の周波数が高くなるにつれて反応の大きさが増大することを全体として示している。膜内外電位差がナトリウムの反転電位VNaまで駆動されるにつれてこの作用は飽和するに違いないことを予測されるであろう。この場合には、ナトリウムチャネル密度が低すぎるためにこれは起きない。パルスの持続時間を長くすると、約10msまでのより低い刺激周波数において相対的な電気刺激の度合いがより高くなる結果となる。その約10msを超えるとそれ以上の増大は顕著でなくなる。非常に短いパルス持続時間1msより短いでも反応が制限される。その理由は明らかに、チャネルが不活性から実効的に解放されないためである。大きな細胞反応を効果的に引き起こすために、最良の刺激パラメータでは、通常は、パルス持続時間は、不活性を回復するための時定数より大きいか等しい範囲内にあり、かつ刺激の周波数は膜の時定数よりも大きいように、十分に小さい。また、刺激の最適周波数は、通常は、平均チャネル開放時間の逆数より小さい。これらの実験は、電気刺激は、比較的低いレベルの電位依存チャネルを発現する細胞においてさえもうまく使用できることを示し、かつ大きなエレクトロポレーションすなわち細胞の死をもたらさない諸条件の下でうまく終了できることを示す。これらの実験は、所望の大きさの反応を生ずるために、刺激パルスの持続時間と繰り返し周波数を最適にできる方法も示す。10.実施例10:外因性ナトリウムチャネルを発現するCHO細胞の分析VI節で説明したように、電位依存ナトリウムチャネル以後、NaV2と呼ぶをコードするプラスミドでチャイニーズハムスターの卵巣細胞を安定にトランスフェクトした。電気刺激による分析前に、このチャネルの電気生理学的特性および薬学的特性を確認するために、細胞全体のパッチクランプ分析を用いた。-20mVにおけるピーク過渡ナトリウム電流は、600±300pAN=5で、平均細胞膜容量は15±5pFであると測定された。静止細胞膜抵抗値は、高すぎて正確に測定することができなかったRL>10GΩ。休止膜内外電位差は-31±3mVであった。刺激の閾値電界を決定するために、ナトリウムチャネルを安定して発現する細胞は96ウェルプレート内に塗布され、付録A1のプロトコルに従って染色された。電気刺激プロトコルは、可変電界強さでの、実施例7で述べた電気刺激器を用いた、20Hz、二相刺激5ms/相の3秒間のバーストを含んでいた。図14は種々の電界強さにおける代表的な時間トレースを示す各カーブは8つの細胞の平均である。低い電界強さでは、検出可能な細胞反応はなく、平均膜内外電位差変化が約1mVより小さいことを示唆する。35V/cmと90V/cmの間では、反応は定型的なものであって、形と振幅が固定されている。90V/cmより上では、ピーク反応は比較的一定のままであるが、刺激が除かれた後の反応減衰時間はかなり引き延ばされたものになる。図8に示されている実験に一致して、85V/cmまでの電界強さにより引き起こされる反応はTTXにより阻害できるが、90V/cmより上で刺激された細胞から得られた反応は、そうはできないデータは示されていない。したがって、速い反応は、上で概説したナトリウムチャネル開放機構によるものであるが、遅い反応は電界による膜の電気的透過化により主として引き起こされるものと、結論される。この効果は、電界強さを増大させながら、速い反応の挙動刺激の4秒後と遅い反応刺激の10秒後を比較することにより、より容易に知られる。このデータが図15に示されている。速い反応をボルツマン関数にフィッティングすると、速い反応の中点がE50=26V/cmで、幅がΔE=3.5V/cmであった。反応は、40と80V/cmの間の電界強さとは独立しており、電気的透過化が90V/cmより上に設定されたときに、わずかかに増加した。透過化に起因するより遅い反応は、90V/cmで最初に検出可能であって、それ自体は、ある用途では潜在的に有用であった。例えば、透過化は、膜内外電位差をゼロにリセットするために使用でき、または透過化が特定のイオンに対して選択性であるならば、膜内外電位差をそのイオンの平衡値にリセットするために使用できる。これは、例えば、膜内外電位差を設定するチャネルのアッセイにおいて有用である。例には、カリウム漏れチャネルおよび塩化物漏れチャネル、カリウム内向きレクチファイヤ、および低電圧で活性化された電圧ゲートカリウムチャネルが含まれる。このような結果は、細胞タイプには依存せずに、電気的透過化がおよそ±200mVの閾値膜内外電位差で始まるという、刊行されている諸研究に従うものであるTeissieandRols、1993、Biophys.J.65:409-413。その論文で報告されかつ文献において広く引用されている式に基づいて、平均直径が30μmのCHO細胞は、90V/cmの細胞外電界を受けたときに、±200mVの膜内外電位差変化を経験する。11.実施例11:不活性からの解放の実効的な時間の決定と、実効的な開放チャネルナトリウムコンダクイタンスいかなる特定の作用機構にもしばられることなく、不活性からの解放の実効的な時間および開放チャネルコンダクタンスの定量的な評価を行うために、実験的検証のために下記の理論を発展させた。開放の後では、ナトリウムチャネルは、1ミリ秒のオーダーの電位依存時定数で不活性になる。開いているナトリウムチャネルを通る電流は、電圧と時間に強く依存しているので、1回の刺激の後での電圧変化に対する解析的表現を発生することは可能ではない。しかし、いくつかの簡略化した近似を行うことにより、平均の理想化した反応をモデル化して試験可能な理論を構成できる。ここでの目的のために、開いたときにナトリウムチャネルは、反転電位がENa=60mVのときに、Vt=-40mVより上で、直線形のコンダクタンスとして挙動すると仮定する。コンダクタンスgNaは、全細胞パッチクランプ実験において、-20mVで得られる最大電流として決定される。ナトリウムチャネルコンダクタンスの時間依存性は、チャネルが活性化すると固定されている時間τNa=1.0msに対して固定されたコンダクタンスgNa=1/RNaを有すると仮定することにより、簡略化される。その時間の後で、チャネルは不活性になる。二相方形波刺激カーネル各相は時間t1を有し、周波数f=1/Tで繰り返されるを用いて、期間Tの間に細胞に入る全電流は、となる。ここに、τNaは、ナトリウムチャネルが開いている時間である。RNa=1/gNaは、ナトリウムチャネルが開いているときの膜抵抗値である。RLは、通常の漏れ膜抵抗値である。VLは、漏れ反転電位すなわち休止膜電位である。VNaは、ナトリウム反転電位である。τrは不活性から回復するための時定数である。これは実際には、パルス中に達成される過分極電圧の関数であるが、ここではそれが定数であると仮定する。実際には、細胞の異なる部分からのナトリウムチャネルは、異なる膜電位変化を経験し、パラメータτNa、τrおよびRNaは、膜電位に強く依存している。完全なモデルは、細胞のモルホロジーと、細胞の向きのランダムな分布と、それらのパラメータの電位および時間に対する依存性を考慮に入れる。そうすると、それらの依存性を畳み込んでそれらのパラメータの実効値を生ずることが可能である。それらの手順も、ここでの説明のために含まれる。その代わりに、それらの式へのフィッティングから抽出された値が、その基礎をなしているチャネルの諸特性の複雑な平均を表すことを認識する。式2を刺激V-VL中の膜内外電位差変化について解くと、が得られる。新しい膜内外電位差に達するように、十分に長い時間にわたって刺激が行われるすると、定常状態式はである。不活性からの解放の実効的な時間および開放チャネルコンダクタンスを決定するために、変化する周波数での一定振幅43V/cmで、20ms、10ms、5ms、2msおよび0.3msのパルス持続時間を有する二相方形波カーネルを用いて、実施例8で説明したように実験を行った。図16に示されるように、その結果が、いくつかのパルス持続時間に対する刺激周波数の関数としての反応を示す。この場合には予測されるように、反応は、膜内外電位差がナトリウム反転電位に明らかに接近するにつれて、高い周波数で飽和する。不活性からの解放の実効時間およびチャネル開放時間を決定するために、反応Rが、下の修正されたヒルHill方程式に対してフィッティングされた。式5は、膜内外電位差変化がない場合に対して比率測定反応がR=1であること、およびそれが較正されていない比例定数Aを有して膜内外電位差変化に直線形であることを認識することにより、式4から導出することができる。式5において、Aとf0は調整可能なパラメータである。フィッティングは、Origin6.0ソフトウェアMicrocal、NorthamptonMAを用いる非線形最小二乗解析を用いて行った。上の式5からのパラメータT0=1/f0は、それらのフィッティングから得られたもので、パルス持続時間に対してプロットされ、図17に示されている。この図の線は、指数関数的減衰へのフィッティングであり、このフィッティングから、不活性からの解放の時定数τrがτr=5.7msであり、RLτNa/RNa=0.314が導かれる。τNa=1msおよびRL=45GΩであると仮定すると、RNa=140MΩとなる。これは、ピークナトリウムコンダクタンスが100mV/140MΩ=700pAとなることを意味する。これは全細胞パッチクランプで測定された値に極めて良く一致する。12.実施例12:他の内因性イオンチャネルを持つ細胞系統における外因性ナトリウムチャネルの分析野生型HEK-293細胞は、通常、種々の内因性のカリウム電流および塩化物電流を発現するのでZhuら、1998、J.Neurosci.Meth.81:73-83、それらの細胞の休止膜抵抗は5~10GΩである。その結果、それらの細胞の膜時定数は、対応してより小さいために、細胞を最適に刺激するためには、匹敵する信号を発生するために、内因性カリウムチャネルのない細胞と比較して、電気刺激プロトコルを比較的より高い周波数で繰り返すべきであることが予測される。この細胞バックグラウンドにおいて、電圧規制されたナトリウムチャネルを本発明を用いて効率的に電気刺激できるかどうかを試験するために、HEK-293細胞を、以後NaV3と称する電位依存ナトリウムチャネルで、安定にトランスフェクトした。細胞をVI節において説明したようにトランスフェクトおよび選択し、かつ実施例8で述べたようにFRET染料でラベル付けした。細胞を付着させ、15μMのCC2-DMPEおよび2μMのDiSBAC63でロードし、その後で25V/cmの、90Hzの周波数で繰り返される、パルス持続時間が5ms/相である二相刺激列を加えた。刺激パルス列は、3秒の全持続時間の間生じ、データ収集のためのデジタル化レートは50Hzであった。時間の関数としての反応図18は、約40msの時定数で安定なプラトーplateauまで減衰する迅速な<20ms立上り時間初期段階を示す。スパイクとプラトーの間にも小さいはね返りrebound電位の変化も存在する。我々は、この挙動を、最初の刺激パルスの後で起きる内因性電位依存カリウムチャネルKVの活性化によるものと解釈する。実験データと一致するように、それらの内因性カリウムチャネルの活性化は、カリウムが細胞を離れるにつれて、膜内外電位差の低下をもたらすことが予測される。電気刺激が続行されると、膜内外電位差が、細胞へのナトリウムの流入と細胞からのカリウムの流出のバランスにより設定される新たな平衡に達する。刺激が終わったときに、反応の減衰時定数は約143msであって、約9GΩの漏れ抵抗値に対応する。この全体的なより小さい反応を薬品発見のために確実に使用できるかどうかの判定を行って、TTXまたはテトラカインtetracaineの作用を正確に特徴付けすることができるかどうかの判定を行った。図19に示されている結果は、本発明を用いるそれらの薬品の薬理学的阻害プロファイルが、これらの試薬でのNAV3ナトリウムチャネルの既知の挙動に一致することを示す。TTXについての用量反応曲線を、EC50=25nMおよびヒル係数1.1のヒル関数Hillfunctionにフィッティングできる。テトラカインについての用量反応曲線を、EC50=11μMおよびヒル係数0.97のカーブにフィッティングできる。それらの結果は、反応がナトリウムチャネルの活性により引き起こされること、および既知および未知の化合物についての薬理学的情報をこの方法を用いて得ることができることを示唆する。13.実施例13:NaV4ナトリウムチャネルを発現するHEK-293細胞の分析この方法を広い範囲の種々のナトリウムチャネルに一般に適用できるかどうかを判定するために、HEK-293細胞を別の電位依存ナトリウムチャネル、以後NAV4と呼ぶ、で安定にトランスフェクトした。それらの細胞をVI節および実施例8で説明したように、トランスフェクトし、選択し、FRET染料でロードした。このチャネルでのテトラカインについての用量反応曲線の結果を図20に示す。ここでは、データ点は、8つのウェルでの平均と標準偏差であり、実線は、見積もられたEC50=35μMおよびヒル係数1.35でのヒル関数へのフィッティングである。それらの結果は、このイオンチャネルの既知の薬理学と矛盾せず、細胞反応が主としてナトリウムチャネルの活性により引き起こされることを再度示している。14.実施例14:電圧活性化された塩化物チャネルとカリウムチャネルの混合を発現するHEK-293細胞の分析電位依存塩化物チャネルと電位依存カリウムチャネルの直接刺激の実証を野生型HEK-293細胞を用いて行った。それらの細胞は、いくつかの電圧で活性化された塩化物チャネルおよびカリウムチャネルの混合したものを内生的に発現するZhu,Zhangら、1998。野生型細胞は、96ウェル微小滴定プレート内で成長させられ、付録A1におけるプロトコルに従って、FRET染料で染色された後、コンフルエンスでatconfluenceでアッセイされた。最初の刺激パラメータは、20Hzでの、パルス持続時間が約5ms/相の二相方形波刺激電気カーネルでの3秒の長さの電気刺激を含んでいた。刺激は、変化する電界強度で行って、カリウムチャネルブロッカーが存在する間または存在しない間に、測定可能な細胞反応についての閾値電界強さを決定した。図21は、この実験中に得られた細胞電圧反応を示す。この図では、各パネルは、単一のウェルについての反応の10秒時間トレースを含む。パネルは、プレート上でのそれらの相対位置に合致するように配置されている。各パネルの垂直軸は、FRET電圧感応性染料の組合せCC2-DMPE/DiSBAC23の、バックグラウンドを除去して正規化した蛍光比である。この量の変化は、膜電位の変化にほぼ比例する。各列は、同一の刺激条件を有し、プレートを横切って左から右へ電界の強さが増大している。96ウェルプレートの12列目示されていないは細胞を含んでおらず、バックグラウンド除去のために使用された。行6~8は、電位依存カリウムチャネルをブロックするために、10mMのTEAを含んでいた。試験した最小の電界強さでは、検出可能な反応はなかった。中間の電界では、刺激が除去されたときに、迅速に減衰する負電圧反応を見ることができる。最高電界では、大きな正の反応が顕在化している。この挙動は、50V/cmより上で始まる。これは、NaV1を発現するCHO細胞で見られる電気透過化閾値実施例8に類似する。図22は、刺激の4.5秒と5.0秒の間で電界強度の関数として平均化された反応を示す。チャネル依存負反応を示すために、60V/cmより上の大きな正の反応は除外されている。反応の変動の係数は一般に極めて小さく、例外的に大きなスクリーニングウィンドウを生ずる付録A3参照。20~40V/cmに対するブロックされていないデータに対しては、刺激されたウェルと刺激されないウェルとの間の違いは、20標準偏差以上である。周知のカリウムチャネルブロッカーHille、1992、IonicChannelsofExicitableMembranesであるテトラエチルアンモニウムTEAを、10mMの完全にブロックする濃度で行6、7、8に加えた。この処置は、反応を部分的にブロックする。この結果は、電気刺激に反応するそれらの細胞中のカリウムチャネルTEAにより遮断されると塩化物チャネルTEAにより作用されないの存在に合致する。カリウムチャネルの作用は、4,4’-ジイソチオシアノスチルベン-2,2’-ジスルホン酸DIDSまたは4-アセタミド-4-イソチオシアノスチルベン-2,2’-ジスルホン酸SITS;Hille、1992、IonicChannelsofExicitableMembranesを参照で塩化物チャネルを遮断することにより、分離できる。その後で、同じ細胞系統を用いて2つのチャネルクラスをスクリーニングできる。15.実施例15:状態依存ブロッカーの特定提案されているいかなるスクリーニング装置も、受け入れられた方法により決定された既知化合物の薬理学を再現することができるべきであることが好ましい。これが本発明の場合であったことを検証するために、定められた活性の一連の試験化合物を、NaV2チャネルを発現するCHO細胞系統を用いて分析した。これを行うために、細胞を96ウェルプレートで培養し、付録A1に述べられているように電圧感応性染料で染色した。試験化合物をオキシノールローディング緩衝液とともに細胞に加えた。特に記載がなければ、化合物は、アッセイプレートの11の列にまたがって1/3希釈して、8の繰り返しとして試験した。図23は、ナトリウムチャネルブロッカーであるテトロドトキシンTTXおよびテトラカインの選択された濃度に対する時間トレースを示している。テトロドトキシンは、強力な、可逆であって、状態に特有でないナトリウムチャネル拮抗体である。これと比べるとテトラカインは、種々のナトリウムチャネル状態とは異なる親和性を示す、用途依存のナトリウムチャネルブロッカーである。結果は、本発明が、試料の間またはプレートの間で変化することが比較的少なくて、再現性が高い結果を提供することを示す。図23において、TTXの作用を、反応の形状が大きく変化することなく反応が次第に低下して行くこととして、見ることができる。テトラカインと比べると、反応は低下するばかりでなく、濃度が変化するにつれて形が変化する。それらの実験のためのC.V.は、同じ電圧染料を用いる典型的なCVと比較して、10TTXおよび9テトラカインであった。ただし、伝統的な液体添加は、16TTXおよび18テトラカインであった。重要なことに、それらの結果は、本発明がテトラカインによるナトリウムチャネルの状態依存ブロックを特定できることも示す。テトラカインの使用依存ブロックは、図24に示されている用量反応曲線では一層明らかである。TTXに対しては、チャネルブロックは、反応の計算のために用いられる時間ウィンドウとは独立している。しかし、テトラカインに対しては、ブロックは、1秒におけるよりも3秒において1桁強い。同じ刺激条件の下で、他の使用依存ブロッカーリドカインおよびブピビカインは、用量反応曲線のより小さいシフトを示した。リドカインに対する電気刺激プロトコルによって得られたEC50値は、文献表4参照に報告されている高周波値に類似していた。これは、リドカインおよびブピビカインが、ここで使用されている20Hz刺激において完全に飽和させられるのに十分に速い使用依存性を有することを示唆している。これはまた、刺激周波数を変えることにより、局部麻酔の使用依存特性を開発できることを示唆している。表4はいくつかのナトリウムチャネル拮抗体についてのブロッキング濃度を掲げたものである。報告されている文献値は、すべて、全細胞パッチクランピングを用いて測定されたものであるので、ナトリウムチャネル電流の直接測定に基づいている。表4において、表のエントリは、各アッセイからの用量反応曲線へのフィッティングのためのEC50値マイクロモルでである。各実験は2回行われ、実験ごとの薬品濃度当たり、4つのウェルを用いた。各実験において、11種類の濃度を使用し、濃度範囲は5桁にまで及んだ。報告された値は、各実験からの計算されたEC50の平均である。使用依存ブロッカーの場合には、記録された最小の値は引用されたものである。WIN-17317およびTTXは、各種のナトリウムチャネルの強力なトニックブロッカーである。それらの化合物は、電気刺激形態を用いて検出できる。それは文献値に近いブロッキング効果を生ずる。初めの4つの薬品リドカイン、ブピビカイン、テトラカインおよびフェニトインは、使用依存のブロッカーである。すなわちそれらは、チャネルの種々の状態に対して種々の親和性を持つ。それらは、大きな治療関連性のものである。その理由は適切な濃度で、それらは損傷を与えるような神経細胞と筋肉細胞の繰り返しバースティングをブロックでき、しかも正常な低周波活性を影響を受けないままにするからである。すべての場合に、電気刺激で測定された実測ブロッキング濃度は、報告された文献濃度に近い。電気刺激アッセイ形態は、アゴニスト、拮抗体および使用依存ブロッカーを含めたナトリウムチャネルのすべてのモジュレーターを検出する信頼できる唯一の高スループット法である。15A.実施例15A:状態依存性ブロッカーのさらなる特定我々は1Hzの刺激周波数でチャイニーズハムスター卵巣細胞CHOに対する内在性NaVチャネルに対するいくつかの知られたチャネルブロッカーの使用依存性効果の特徴付けを実証する。我々のデータは電界刺激と高速電圧感受性染料とを組み合わせれば、使用依存性ブロックを引き起こして、測定する有効なアプローチが得られることを裏付けるものである。さらに、この方法により決定された試験化合物の力価および使用依存特性は、パッチクランプ技術を用いた同じチャネル型について報告されたものと一致する。この新しい技術は新規の使用依存性化合物の検出および特徴付けの高速化を可能にする。図32Aは蛍光比反応に対する使用依存性効果を例証するために用いられる4つの化合物からのデータを示している。反応比の代表的なトレースは、各々TTX、テトラカインTetracaine、テミゾールAstemizole、およびリドカインlidocaineの存在下で1Hzで20秒間送出される電気刺激を反復することによって引き出した。示したように、このような実験では、広範な濃度範囲を包含するために各々カラム1から10までの滴定の4つの複製を有する、2つの化合物で各96ウェルプレートを処理した。カラム11の細胞は対照として使用した。ブロッカーの不存在下のピーク比の反応は、典型的には、刺激反復の終了時の新しい定常状態レベルに対し20~30だけ時間依存性の低下が速いことを示した。化合物の最も高い濃度にて観察される小さなインパルス様の反応は、電界によってもたらされた一時的な膜の容量生電流によるものと思われる。テトラカインまたはアステミゾールの存在下で観察されるように、試験化合物による内在性Navチャネルの使用依存性ブロックの特徴は、特定の濃度範囲における最初のピーク反応に対する最後のピーク反応の比が低下していることである。対照的にリドカインまたはTTXによる使用依存性ブロックはごくわずかなものであるか、またはまったくないことが観察され、両ブロッカーはこの周波数の内在性Navチャネルに対して使用依存性が比較的弱いことを示している。図32Bは、3.125μMのテトラカインおよび6.25nMのTTXの存在下および不存在下における比反応のトレースを重ね合わせたものであり、2つのブロッカー型の間のブロックの発現を示している。挿入図に見られるように、テトラカインはTTXよりもさらに付加的なブロックを誘起しているが、後者は最初の反応を抑制することにより大きな力価を示している。このような結果は、我々のスクリーニングシステムが化合物の使用依存性を容易に特定することができることを示しているのは明らかである。図33は図32Aに示したデータからの最初のピークおよび最後のピーク比反応の断片的なブロックの濃度依存性をまとめたものである。第1および第20のピーク反応それぞれについて測定した2つのIC50間のずれは、所与の化合物の使用依存性を推定する。ここで、我々は使用依存性指数UDIとして表したIC50第1の反応とIC50第2の反応の比を用いて、被試験化合物の使用依存性を比較する。種々の濃度のブロッカーの不存在下および存在下で第1および第20のピーク反応を測定した。所与のブロッカーの存在下のピーク反応とそのブロッカーの不存在下のピーク反応との比としてデータをグラフ化した。データポイントは4つの複製の平均±標準偏差を表す。IC50パルス20に対するIC50パルス1の比は1Hzの所与のブロッカーの使用依存性に比例する。力価測定をミカエリス-メンテンの式:R/R0=[ブロッカー]n/[ブロッカー]nIC50nに当てはめる。R0はブロッカーの不存在下で得られた正規化された反応を表し、nは適合曲線の勾配であり、IC50はブロッカーの半阻害濃度である。表5は試験した8つの化合物についての使用依存性の結果を示しており、それら化合物についての濃度反応の最適な値の関係をまとめたものである。UDIのランクはテトラカイン>ヨヒンビンyohimbine>アミトリプチリンamitlyptyline>メキシレチンmexiletine>ジブカインdibucaine>アステミゾール>リドカイン>TTXであり、我々の実験では、テトラカインおよびTTXは1Hzの刺激周波数での最大および最小の使用依存性化合物であることを示唆している。最初のピーク比反応について測定されたIC50は、より負の保持電位における同じチャネル型のパッチクランプ技術を用いて得られたものと遜色ない。後者の条件は細胞をその休止膜電位からから刺激した我々の試験条件-60mV、データは図示せずと類似する。16.実施例16:高スループットスクリーニングの応用可能性高スループットスクリーニングの目的のためには、反応は、活性化合物と不活性化合物との間の違いを確信をもって語るために十分に信頼できるものでなければならない。これは、同一の刺激条件の下で得た反応の分布を調べ、元のチャネルを完全にブロックされたチャネルと比較することによって定量化できる。実験上の不確定性と装置内の雑音のために、反応にいくらかの乱れが存在するであろう。我々はこの乱れを統計的に定量化し、偽陽性または偽陰性として反応を誤って識別する確率を予測するためにそれを使用したい。それを行うために、NaV2電位依存ナトリウムチャネルを発現する細胞のプレートが、FRET染料でロードされた。1列当たり1つのウェルが、1μMのTTXすなわち半遮断濃度の約200倍で、無作為にスパイクspikeされた。細胞は、20Hz、25V/cmの3秒バースト、5ms/相、二相刺激でアッセイされた。結果が図25に示されている。TTXでスパイクされたウェルは検出できる反応をほとんど、またはまったく生じないので、肉眼で容易に判別できる。刺激が始まってから2秒後の比率測定反応を図26に示す。2つの集団ブロックされているものとブロックされていないものは、容易に識別できる。平均のブロックされた反応は1.011±0.004であり、平均のブロックされていない反応は2.67±0.21であった。ブロックされていない反応に対する変動の係数は13である。スクリーニングウィンドウすなわち、標準偏差に対して正規化された集団の間の差、付録A3参照は7.8σ1σ2である。ここにσ1=0.21はブロックされていない反応の標準偏差であり、σ2=0.004はブロックされている反応の標準偏差である。ブロッカーを非ブロッカーから区別するためのカットオフ点を、集団の間の中間1.042に取るものとすると、正規分布を仮定して統計的な偽陰性と偽陽性の率は1-prob7.75=1014である。これは、大きな化合物ライブラリ108種類の化合物のスクリーニング中に、全体のスクリーニングにおける単一の偽陽性または偽陰性に遭遇する確率は100万中のたった1つであることを示唆する。比較のために、集団の間の違いがわずかに3で、カットオフが最適に置かれていたとすると、偽陽性/陰性の率は、0.3すなわち1011高いファクタとなる。完全なブロックを与えない化合物もヒットとして含めたいような実際のスクリーニングに対しては、弱い薬理学的活性の検出と偽陽性の率との間に二律背反性が存在する。例えば、偽陽性の率として0.1を希望したとすると、このスクリーニングでは、スクリーニングのカットオフをブロックされていない反応の平均より3.3標準偏差下、すなわち1.97に置くことができる。この場合には、偽陰性の率は実効的にはゼロで、反応の50だけをブロックする化合物はヒットとして識別される。数学的には、ブロックされた集団とブロックされていない集団とが非常に少ししか重なり合わない2つの理由がある。第1に、ブロックされていない反応の変動の係数が比較的小さいことである。すなわち各反応は、他のあらゆる反応とほぼ同一である。第2に、そしておそらくより重要なことに、ブロックされたウェルからの反応は、絶対的に検出できないことである。ブロックされたウェルからの散乱はしたがって極めて小さいために、集団を区別するために境界を非常に低く置くことができる。液体添加プロトコルを用いて刺激が行われるアッセイでは、一般に、追加のアーティファクトが、いくらかの小さい反応を与え、それに散乱が伴う。ブロックされた反応の散乱は、スクリーニングウィンドウを小さくして、偽陽性および偽陰性の確率を高くし、スクリーニング者の部分ブロッカーを特定する能力を限定する。17.実施例17:複雑な細胞系統におけるスクリーニング多数のチャネルを発現する細胞の電気刺激の可能性は、HL5細胞系統の培養を用いて示された。それらの細胞は、心筋細胞を不死化することにより発生されたClaycombら、1998、PNAS95:2979-84。それらは電圧で活性化されるいくつかのナトリウム、カルシウムおよびカリウムチャネルと、内向きの強い整流のカリウム電流と、カリウムおよび塩化物漏れ電流を含む。細胞は96ウェル微少滴定プレート内で成長させられ、コンフルエンスでアッセイされた。それらは、付録A1におけるプロトコルに従って染色された。電気刺激中に、上記のようにVIPR商標を用いて比率測定法蛍光測定を行い、データを付録A2における手順に従って解析した。刺激パラメータを:パルス持続時間が5ms/相である二相方形波刺激カーネルで、10Hzの3秒長さのバースト、であるように随意に選択した。刺激は、閾値電界を決定するために、変化する電界で行った。2行のウェルが心臓ナトリウムチャネルを部分的にブロックするために10μMのTTXを含んでおり、2行が電位依存カリウムチャネルをブロックするために、10mMのTEAを含んでいた。図27は、各ウェルの正規化された反応を示す。一般に、電界の強さが増大するにつれて、細胞の反応は大きくなる。最後の3つの列は、電圧が上昇し続けるにつれて電気的透過化の符号を示す。列6、7、8では、比は実際には出発比よりも下にはね返り、後過分極電位依存カリウムチャネルのゆっくりとした閉鎖により引き起こされる現象を示唆する。細胞反応の速さは極めて速く、膜内で迅速に再分配するためのエチルオキソノールの能力により明らかに制限されることがある。迅速な反応は、漏れ電流に起因する細胞の高い休止コンダクタンスおよびカリウム内向きレクチファイヤチャネルの発現に一致する。TTXは、正の反応を部分的にブロックする。これは、それが少なくとも部分的には電位依存ナトリウム電流に起因することを示す。図28は処理されていない細胞行1~4の反応を加えられた電界の関数として示す。反応は電界に応じてS字形に増大する。50V/cmより上では、TTXにより影響を受けない持続信号が存在する。既に述べたようにこの挙動は、高い電界強さにおける細胞膜の電気的透過化に合致する。また図28に示されているのは、刺激での関数としてのスクリーニングウィンドウである付録A3参照。これらの結果は、電気刺激技術を用いてHL5細胞を効果的にアッセイできることを示す。種々のイオンチャネルを修飾することが知られている化合物は、反応に検出可能な変化を引き起こす。それらのイオンチャネルは心臓により発現されているイオンチャネルと同一であるので、そのようなアッセイは、2次スクリーニングとして有用であり、正常な心臓機能を妨害するかもしれないそれらの化合物による修飾をなくすか、目立たせる。心臓イオンチャネルのいずれか1つまたは組合せに望ましい作用を及ぼすことがある化合物を発見する。18.実施例18:表面電極を用いる細胞培養の電気刺激表面に装着されている電極は、クロム付着層および金導電層によって誘導されたガラスカバーリップ上に用意された。金属を誘導されたカバーリップは、ThinFilmDevices,Inc.社カリフォルニア州アナハイムにより特注で製作された。カバーリップは、1インチ25.4mm四方で、厚さ0.17mmのCorning7059ガラス製であった。金属付着は空スパッタリング付着により行われた。クロム層の厚さは約1000オングストロームで、付着層として機能した。金層の厚さは約5000オングストロームで、導電層として機能した。付着された金属の抵抗率は、0.1Ω/平方より小さかった。耐薬品性ポリマーS1400-27、ShipleyCo.、MarlboroughMAによって金属の表面を手作業で覆い、その後、金エッチング剤TFAで金属層を5分間エッチングし、それに続いてクロムエッチング剤TFDTranseneCo.、マサチューセッツ州ダンバースで5分間エッチングすることにより、金属に4mmの間隙をエッチングで形成した。カバーリップは、96ウェルプレートの底にシリコーンエラストマーSylgard184Corning、70°Cで90分間硬化したで取り付けられた。30分間の365nmのUV放射で滅菌し、細胞付着分子ポリ-D-リシンを付着した後で分子量300,000、Dulbeccoのリン酸塩で緩衝された食塩水中で1mg/mLで30分間浸し、その後で蒸留水で3回リンスした、生きている細胞を電極表面上で成長および培養することに成功した。表面電極刺激器を有効にするために、約1000細胞/mm2の初期密度のCHO細胞を96ウェルプレートのウェル内に付着させ、そのまま約16時間放置した。それらの細胞をトランスフェクトして、カリウムチャネル、それは膜内外電位差をほぼ-80mVに設定した、NaV3ナトリウムチャネルを発現した。コンフルエンスに達した後で、付録A1に述べられているように、電圧感応性FRET染料の組合せであるCC2-DMPEとDiSBAC23を細胞にロードした。金属表面電極をパルス発生器の出力端子に接続した。パルス発生器は、この場合には指数関数的に減衰するエレクトロポレータGenePulserII、Bio-RedCorp.、カリフォルニア州ハーキュリーズであった。75Wのキセノンアーク灯光源を装着されているZeissAxiovertTV顕微鏡で、比率測定法蛍光画像形成を行った。405±10nm誘電体干渉フィルタおよび445DXCRダイクロイックミラーを用いて、励起光をフィルターした。放出光を第2の525XRダイクロイックミラーで分割し、1対の浜松HC124光電子増倍管PMTで測定した。一方のPMTは、その前面に475±40nmの誘電体干渉フィルタを設けて青色の蛍光信号をモニタした。第2のPMTは、その前面に580±35nmの誘電体干渉フィルタを設けて、橙色の蛍光信号をモニタした。光学フィルタおよびダイクロイックミラーは、ChromaTechnologyCorp.社:バーモント州バトルボロー所在から購入した。比率測定法蛍光画像形成を約100の細胞を含んでいる視野について行った。バックグラウンド蛍光の修正を、細胞を含んでいない視野内で青信号と橙信号を測定し、その後でそれらを細胞から得た信号から差し引くことによって行った。そして、膜内外電位差変化に比例する比率測定法信号を付録A2に述べられているようにして計算した。刺激プロトコルは、振幅が可変である単一の一相電界パルスを使用した。パルスは、指数関数的に減衰する波形のもので、その減衰時定数は4.3msであった。パルスの開始時の振幅は、ゼロから56V/cmまで変化させられた。3つの別々の45V/cm刺激反応の後でのカリウムチャネルとNaV3ナトリウムチャネルを発現するCHO細胞の典型的な電圧反応が、同じ細胞野について図29に示されており、反応の反復可能性を示している。この場合の反応の速さは動きやすい疎水性の染料の反応時間によって主として制限される。その反応時間は使用されるエチルオキソノールでは約0.5秒である。電界の強さが変化する一相刺激で刺激される96ウェルマルチウェルプレート内で成長させられた細胞の集団の平均比率測定反応を図30に示している。この曲線中の点は、同じ培養体における4つの刺激の平均ピーク反応である。活動電位型の反応カーブから予測されるように、約18V/cm以下では検出可能な反応はない。閾値領域は比較的狭い。約20V/cmと約40V/cmの間では、電界の強さが増すにつれて反応は増す。40V/cmを超えると反応は平坦である。19.実施例19:IRK1を発現している野生型RBL細胞の分析ラット好塩基球性白血病RBL細胞は、カリウム内向きレクチファイヤチャネルIRK1を内生的に発現するWischmeyerら、PflugerArch.429:809-819、1995。このチャネルは、カリウムイオンを選択的に導き、高い非線形コンダクタンス特性を持つ。コンダクタンスはカリウムの反転電位VK以下ではほぼ直線形であり、VKよりおよそ10mV正で始まってゼロ近くまで降下する。多数の内向きレクチファイヤチャネルを発現している細胞は、VKの数ミリボルト以内である休止膜内外電位差を有する傾向にある。IRK1と少数の他のイオンチャネルを発現している細胞に加えられる外部電界により膜内外電位差が正に駆動される細胞側では、IRK1チャネルは急速に閉じて導通を止める。細胞のうち、膜内外電位差が負に駆動される側では、IRK1チャネルは開いてカリウム電流を流す。細胞のこの側が十分負に駆動されて、局部的な膜内外電位差がVKよりも一層負にされるものとすると、正味の内向きカリウム電流が存在する。この電流は、正の全体としての膜内外電位差変化を生じさせる。IRK1チャネルは不活性ではないので、この電流は外部電界が加えられている限り持続するはずである。付録A1に述べられているように、付着性のRBL細胞が96ウェルプレート内に播種されて、FRET染料をロードされた。3行のウェルが、IRK1チャネルをブロックするために400μMの塩化バリウムを含んだ。VIPR商標読取器を用いて、パルス持続時間が5ms/相で、50Hzの周波数で繰り返される二相刺激列で電気的に刺激しながら、プレートを分析した。刺激パルス列は、全持続時間の5秒間にわたって生じ、データ収集のためのデジタル化速度は50Hzであった。加えた電界を8つのウェルの各列に対して固定し、7.2V/cmから72V/cmまで変化した。データを付録A2に述べられている手順に従って解析した。3秒間の刺激の後での正規化された比を計算し、2つのウェルの集団バリウムブロックのあるものとないものについて平均し、図31において、加えられた電界の関数としてプロットした。誤差バーは、反応の標準偏差である。白い四角は、バリウムブロックなしの反応であり、黒丸がバリウムブロックを伴う反応である。バリウムブロックを伴う細胞からのデータは、電界が80V/cmに達するまでの刺激中は検出可能な電圧変化がないことを示している。80V/cmでは電気的透過化がいくらか起きている。ブロックされていないウェルは、ほぼ20V/cmである閾値より上ではほぼ直線的な反応を示している。この例は、本発明を、刺激パラメータおよび細胞により発現されているイオンチャネルの特性に依存して、膜内外電位差を正の向きまたは負の向きに変調するために使用できることを明らかに示している。20.実施例20:候補イオンチャネルモジュレーターのスクリーニングおよび生物物理学的特徴付けのためのパルス対刺激プロトコル多くの電気生理学的試験では、パルス対実験を用いて電圧不活性化からのおよびチャネルブロッカーのブロッケードからの電圧ゲートイオンチャネルの回復が特徴付けられてきた。典型的には、電圧ゲートチャネルは、数ミリ秒~数十秒の種々の中間パルス間隔すなわち回復時間によって分割された2つの連続的な活性化電圧段階の連続によって活性化される。次いで、不活性化チャネルからのブロッカーの解離速度は、第1および第2のパルス段階に関する不活性化された2つのピーク電流と回復時間tとの比から推定することができる。この関係は一般に、単一または2つの指数方程式と最も適合する:第2のパルスのINa/第1のパルスのNa=A1指数-t/τfastA2指数-t/τslowA3式中、A1、A2、A3は定数を表し;τfastおよびτslowは早い回復および遅い回復についの時定数である。回復相を減衰させるために、臨床的に用いられる数多くのイオンチャネルモジュレーターが見出され、このことはそれらの作用が重要な機序であることを示している。高速反応染料および電界刺激を利用する我々の新規な方法は、そのような薬剤すなわち試験化合物-チャネルタンパク質の相互作用を従来のパッチクランプ技術に比べより高いスループットフォーマットで特徴付ける新たなアプローチを提供した。次のパラメータを我々の方法から推定することができる:a.試験化合物の解離定数b.以下のブロックからの化合物の回復の周波数依存性使用非依存性ブロック使用依存性ブロックc.化合物の回復の濃度依存性図34および35はNaVsおよび知られている使用依存性のNaV拮抗体を用いたパルス対プロトコルの適用を示している。図34Aは使用非依存性ブロックおよび使用依存性ブロックからのチャネルの回復を試験するための刺激プロトコルの一例を示している。Δtは2つのパルス列間の時間間隔を表す。図34Bはパルス列の時間間隔が0.5秒におけるテトラカインTetracaineおよびラモトリジンLamotrigineからの濃度依存性の回復を示す。0.5秒の休止期間によって分けられた10Hzの2つの単相パルス列を用いて、Nav1.8を発現する細胞を刺激した。各パルス列は3ms、80Vp-p単相パルスとした。ブロックからのチャネルの回復は、パルス列の各々によって誘起される2つの第1のピーク蛍光反応の比によって決定した第2ピーク/第1ピーク。1は完全な回復を示す。このデータはラモトリジンブロックからのチャネルの回復は0.5秒Δtで試験したラモトリジンの濃度に大きく依存しているわけではないことを証明している。対照的に、テトラカインからのチャネルの回復は、図35に示したテトラカインの濃度に強く依存していることを示している。21.実施例21:種々の時間間隔を用いたパルス対刺激プロトコル異なる時間間隔Δtを用いたブロックからのチャネルの回復もラモトリジンおよびテトラカインについて考察した。図36Aは時間間隔が異なる50μMにおけるラモトリジンブロックの結果を示し、図36Bは時間間隔が異なる4μMにおけるテトラカインブロックの結果を示す。ラモトリジンおよびテトラカインの濃度は、それぞれ50μMおよび4μMであることがこれまでの実験から決定された約IC50値に設定した。図示のように、各カラムのプレートにおいて10Hzの2つのパルス列間の時間間隔を0.1秒~4秒まで変化させた。50μMのラモトリジン存在下では、2つの第1のピークの蛍光比反応の比は、Δtを大きくすることによっては有意には変化せず、ラモトリジンブロックからのチャネルの回復時間が早いことを示す。対照的に、テトラカインブロックからのチャネルの回復時間は非常にゆっくりで、これは4秒もの休止時間を必要とする。このことはテトラカイン結合のオフレートがラモトリジンよりも著しく遅いことを示唆している。図37に示すように、4μMのテトラカインは使用依存性ブロックから回復するには、約1000ミリ秒すなわち1秒を必要とする。これは非常に速く回復するラモトリジンとは対照的である。22.実施例22:作動電位の発射周波数および反復性の電圧過渡現象を弱め、低減し、かつ変調する使用依存性化合物のための同期電圧振動の刺激および薬剤スクリーニングの方法図38はAδ型またはC型ニューロンのスライス標本においてブピバカインおよびリドカインによって発射周波数が低減することを示している。ブピバカインおよびリドカインによるTTX抵抗性のNavチャネルの使用依存性ブロックのために、ニューロンのスライス標本では発射速度は遅くなっているScholzら、1998。この効果は高周波数の単相パルスを用いた非興奮細胞の光学的ヘキシルオキソノールアッセイによって再現することができる。図39はNav1.8発現細胞の自然発生的な発射の誘起はラモトリジンおよびリドカインによって遅くなることを示している。代表的な蛍光比は、15.6μMのリドカインまたは125μMのラモトリジンの非存在下および存在下の90Hz、50V、1msの単相パルスによって誘起されたNav1.8細胞から反応する。Navブロッカーが存在しない場合、高周波数の単相刺激は6~10Hzの周波数において蛍光反応の自然発生的振動を誘起した。リドカインまたはラモトリジンを加えることにより、インタースパイクの間隔は緩除に増大しすなわち発射周波数は低減、ピーク反応の低減を伴った。この挙動はこのようなブロッカーの主要なニューロンに対する使用依存性効果と類似するものである。23.実施例23:方法を用いたCaVの使用依存性ブロッカーの検出電圧ゲートCaターゲットのための使用依存性化合物を検出するために、DISBAC63およびCC2-DMPEなどの電圧感受性FRETプローブなどの高速の膜電位センサを用いてアッセイを開発することもできる。以下の例示的な実施例は、96ウェルプレートと互換性のあるハードウェアを用いたN型カルシウムチャネルについてのものである。10mMのDMSOに溶解させたCC2DMPEおよび10mMのDMSOに溶解させたDISBAC63を等量のDMSOに溶解した10プルロニックと攪拌して2XCC2DMPEおよびDISBAC63溶液を調整する。所定量の槽で攪拌する。各セルプレートにはこの溶液5mlが必要となる。プレートをプレート洗浄機で洗浄して、50μL/ウェルの量を残す。2XCC2DMPE50μLをウェルに添加する。得られる染料の濃度はCC2-DMPEが4μMおよびDISBAC63が1.25μMとなる。暗所にて室温で30分間染色する。試験化合物を、細胞外のリンゲル液の2X濃度で調整し、染色した細胞を入れたウェルに添加する。刺激周波数、パルス持続時間、刺激電圧などの刺激パラメータは、所望の反応を引き出すために容易に操作することができる。図40はこのヘキシルアッセイを用いてミベフラジルmibefradilなどの使用依存性化合物をどのように検出できるかを示す一例である。5μMの化合物で反応線形が変化していることは、使用依存性ブロックがあることを表している。24.実施例24:異なる外部のカリウム濃度の存在下で刺激装置および光学的方法を用いて、電位依存性化合物使用依存性活性のサブセットを調べるための技術我々は後根神経節ニューロンにおけるナトリウムチャネルの電位依存性ブロッカーの検出および定量化を可能にする光学的検出プラットフォームを用いた電気刺激に基づいた、後根神経節DRGニューロンアッセイを開発した。neoratal子ラットからDRGニューロンを切り離し、FRET電圧検出用染料で染色した。次いで、このニューロンを96ウェルプレートのウェルの中央に置き、種々の濃度の試験化合物とともに事前にインキュベートした。電気刺激を与え、得られた反応をプレート読取器で記録した。次いで、試験した化合物の各々について容量反応グラフを作成した。濃度を上げたカリウムを添加してニューロンを脱分極し、さらに多くのナトリウムチャネルを不活性化状態にした。濃度を上げてカリウムを添加した前後の容量反応グラフは、関係が左方向にずれ、相応してIC50が低減していることを示している。これにより上記化合物に関する電圧または状態依存性の程度が推察される。図41は周知の2つの電位依存性ナトリウムチャネルブロッカーであるテトラカインおよびラモトリジンの、16mMのカリウムを添加した前後のデータを示している。図示のように、高カリウム濃度は細胞を脱分極させる。この化合物のブロックは電位依存性で、使用依存性活性のタイプである。左方向にずれた容量反応曲線に示したように、この化合物は脱分極した膜電位においてより高い親和性でブロックする。この例は主要なニューロンを用いたこの方法の使用も示している。25.実施例25:電気刺激およびFRET電圧検出用染料を用いたL型カルシウムチャネル拮抗体アッセイL型カルシウムチャネルは心収縮および血管平滑筋緊張において重要な役割を担う。この標的の拮抗体は高血圧および不整脈において有用であることが明らかとなっている。他の指示薬のための薬剤開発化合物はL型カルシウムチャネルのブロックを回避して、心血管の副作用を最小化しなくてはならない。我々は、DISBAC23およびCC2-DMPE電圧感受性FRETプローブ存在下での電気刺激を組み入れた、L型カルシウムチャネルの拮抗体用の96ウェルプレートアッセイを開発した。以下のプロトコルを用いた。プレート洗浄機でプレートを洗浄後、細胞を暗所にて室温で30分間、所定の槽溶液中で10μMのCC2-DMPEで染色した。次いで、プレートを洗浄し、500μMのVABSC1を溶液に含んだ3μMのDISBAC23で染色した。第2の染色溶液に化合物を加えた。最適化された電気刺激プロトコルを用いてこの細胞をハードウェアプラットフォームで試験した。図42は強力なジヒドロピリジンニフェジピンおよびニモジピンでL型カルシウムチャネルをブロックすることを示している。本発明は電気刺激の適用可能性を、大きなエレクトロポレーションを引き起こすことなしに膜内外電位差の効果的かつ段階的な制御を可能にする装置および方法を得ることにより、励起できない細胞を包含するまで拡張するものである。本発明は、細胞を囲んでいる媒体に加えられる極めて一様な、繰り返し電気刺激パルスを使用することにより、この結果を達成する。加えられる電界は、通常は、細胞の平均膜内外電位差を直接に変化させることはないが、その代わりに、細胞のうちカソードとアノードにそれぞれ面している側に、対称的な正と負の膜内外電位差変化を生ずる。このやり方は、イオン選択性と、電位依存性イオンチャネルの非線形ゲーティングおよびコンダクタンス特性を利用する。このやり方は、典型的な無損傷の細胞が膜内外電位差変化の減衰に関して長い時定数を有するという事実も利用する。単一の刺激パルスにより細胞内に注入される電荷が小さすぎて確実に検出できない場合でも、適切に加えられた多数の刺激パルスが、大きな正味での膜内外電位差行程を構成することができる。パルスの数、持続時間、形および振幅を変えることにより、生きている細胞の膜内外電位差を、パッチクランピングに類似するやり方で、人為的に設定しまたは変えることが可能である。古くは電位依存であるとは考えられていなかった他のチャネル、漏れ電流またはトランスポーターを、第2の電位依存チャネルを用いて膜内外電位差の変化を誘起させ、ターゲットチャネルまたはトランスポーターの活性化の結果として電流の流れまたは膜内外電位差変化を検出することにより、アッセイすることもできる。この方法は、ロバストであって、光学的検出方法に適合でき、薬品発見に使用するための高スループットスクリーニングを含めた広範囲の潜在的な用途に対応できるように容易に修正できる。多くのアッセイ形態では、直接電気刺激が液体添加の要求を避けて、アッセイを容易にしている。膜内外電位差の複雑な取扱いを、刺激プロトコルにおける変更を用いて、容易に達成できる。したがって、非活性化状態または電位依存状態とは無関係に、ほとんどすべての電位依存性チャネルを開かせることができる。高スループットでの薬品発見のために、これは特殊化された細胞タイプに対する要求を緩め、容易に入手できる細胞系統でアッセイを迅速に実行できるようにする。本願明細書に引用した刊行物および特許文書はすべて、各個々の刊行物および特許文書が個々に示されるのと同程度にその全体を援用した。VI.付録A1.電圧FRET染料の染色プロトコル1.試薬aアッセイ緩衝液1140mMNaCl4.5mMKCl2mMCaCl21mMMgCl210mMHEPES10mMグルコースpH7.40、330mOs/kgbプルロニックストック1000倍乾燥DMSO中の100mg/mLpluronic127cオキソノールストック3333倍乾燥DMSO中の10mMDiSBAC23dクマリンストック1000倍乾燥DMSO中の10mMCC2-DMPEeESS-CY4ストック400倍水中の200mMESS-CY42.ローディングおよびアッセイプロトコル:1.CC2-DMPEローディング緩衝液の用意。通常は、96ウェルプレートに対して、10mLの染色溶液をプレートごとに用意する。i等量10μLのクマリンストックとプルロニックストックとを試験管内で混合する。ii試験管内を緩やかにかきまぜながら、10mLのアッセイ緩衝液1を試験管に加える。ローディング濃度:10μMのCC2-DMPEおよび0.1μg/mlのプルロニック。2.オキソノールローディング緩衝液の用意:i等体積3.3μLのオキソノールストックとプルロニックストックとを試験管内で混合する。ii試験管内を緩やかにかきまぜながら、10mLのアッセイ緩衝液1を試験管に加える。iiiかきまぜながら25μLのESS-CY4を加える。ローディング濃度:3μMのDiSBAC23、0.2μg/mlのプルロニックおよび0.5mMのESS-CY4。iv要求があれば、このときに試験化合物にローディング緩衝液を加える。3.細胞をアッセイ緩衝液1で2回すすぎ、そのたびにウェルからすべての流体を除去する。4.100μLのCC2-DMPEローディング緩衝液を各ウェルに加える。室温で30分間インキュベートする。明るい光を避ける。5.細胞をアッセイ緩衝液1で2回リンスし、そのたびにウェルからすべての流体を除去する。6.100μLのオキソノールローディング緩衝液を各ウェルに加える。7.明るい光を避けて室温で30分間インキュベートする。直ちに使用する。A2.VIPR商標読取器データの解析データは、460nmと580nmチャネルで測定された強度の正規化された比として、解析および報告された。それらの比を計算する過程は、以下のようにして行われた。すべてのプレートにおいて、列12は、細胞プレートで用いられている濃度と同じDiSBAC23およびESS-CY4濃度のアッセイ緩衝液1を含んでいたが、列12には細胞は含まれていなかった。各波長における強度値は、最初の刺激前ウィンドウと最後の刺激後ウィンドウで平均された。それらの平均値は、すべてのアッセイウェルにおいて、同じ時間期間にわたって平均された強度値から差し引かれた。最初のウィンドウの標本Riと最後のウィンドウの標本Rfとから得られる比は、次のように定義される:最後のデータを各ウェルの開始比に正規化し、Rf/Riとして報告した。A3.スクリーニングウィンドウ反応に対するスクリーニングウィンドウWは、次のようにして定義される。同一の刺激条件における多数のウェルからのデータが求められる。対照ウェルは、薬理学的に遮断されているものか、またはフル電界で刺激された、トランスフェクトされていない細胞である。あるいは、刺激されていないトランスフェクトされた細胞を使用するかもしれない。実験ウェルおよび対照ウェルからの反応が測定される。実験ウェルにおける反応の平均および標準偏差R±ΔRと、対照ウェルC±ΔCにおける反応の平均および標準偏差が計算される。スクリーニングウィンドウは、標準偏差の和に正規化された、実験信号と対照信号の間の差として定義される。許容できるスクリーニングウィンドウに対する、一般的な親指法則はW>3である。これによって、偽陰性/陽性の比が1より小さいことを確実にする、対照反応と実験反応の間の中間のカットオフ線を選択できるようになる。正規分布を仮定すると、スクリーニングウィンドウWの関数としての偽陽性/陰性の率は、となる。表A3.1.偽陽性/陰性の比PWを、式A3.1に定めたスクリーニングウィンドウWの関数として示す。この計算からは、あるヒットの特定のためのカットオフは、陽性および陰性の対照応答から離れた等しい数の標準偏差にされることが仮定される。"