"炎症性腸疾患の治療における、非経口投与のための医薬の製造における、哺乳動物のベータディフェンシンの使用。前記哺乳動物のベータディフェンシンが、皮下又は静脈内投与される、請求項1に記載の使用。前記哺乳動物のベータディフェンシンが、約0.001mg/kg体重~約10mg/kg体重、好ましくは約0.01mg/kg体重~約10mg/kg体重の一日用量で投与される、請求項1又は2に記載の使用。前記哺乳動物のベータディフェンシンが、ヒトベータディフェンシンである、請求項1~3のいずれか一項に記載の使用。前記哺乳動物のベータディフェンシンが、配列番号1、配列番号2、配列番号3、又は配列番号4のアミノ酸配列と少なくとも80の同一性を有する、請求項1~4のいずれか一項に記載の使用。前記ヒトベータディフェンシンが、ヒトベータディフェンシン1、ヒトベータディフェンシン2、ヒトベータディフェンシン3、又はヒトベータディフェンシン4である、請求項1~5のいずれか一項に記載の使用。前記哺乳動物のベータディフェンシンが、配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも80の同一性を有する、請求項1~6のいずれか一項に記載の使用。前記哺乳動物のベータディフェンシンが、ヒトベータディフェンシン2である、請求項1~7のいずれか一項に記載の使用。前記治療がなされた組織中において、TNF-アルファ活性が減少する、請求項1~8のいずれか一項に記載の使用。治療を必要とする対象へ、有効量の哺乳動物のベータディフェンシンを非経口投与することを含む、炎症性腸疾患の治療方法。前記有効量が、前記治療がなされた組織中において、TNF-アルファ活性を減少させるために効果的である、請求項10に記載の方法。前記ヒトベータディフェンシンが、皮下又は静脈内投与される、請求項10に記載の方法。前記哺乳動物のベータディフェンシンが、約0.001mg/kg体重~約10mg/kg体重、好ましくは約0.01mg/kg体重~約10mg/kg体重の一日用量で投与される、請求項10に記載の方法。前記哺乳動物のベータディフェンシンが、ヒトベータディフェンシンである、請求項10に記載の方法。前記哺乳動物のベータディフェンシンが、配列番号1、配列番号2、配列番号3、又は配列番号4のアミノ酸配列と少なくとも80の同一性を有する、請求項10に記載の方法。前記哺乳動物のベータディフェンシンが、配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも80の同一性を有する、請求項10に記載の方法。前記ヒトベータディフェンシンが、ヒトベータディフェンシン1、ヒトベータディフェンシン2、ヒトベータディフェンシン3、又はヒトベータディフェンシン4である、請求項10に記載の方法。一の実施形態において、本発明の哺乳動物のベータディフェンシンは、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、及び/又は配列番号6のいずれかと少なくとも80、好ましくは少なくとも85、より好ましくは少なくとも90、そして最も好ましくは少なくとも95の同一性度を有する。好ましい実施形態において、本発明の哺乳動物のベータディフェンシンは、配列番号1、配列番号2、配列番号3、及び/又は配列番号4のいずれかと少なくとも80、好ましくは少なくとも85、より好ましくは少なくとも90、そして最も好ましくは少なくとも95の同一性度を有する。より好ましい実施形態において、本発明の哺乳動物のベータディフェンシンは、ヒトベータディフェンシン1配列番号1、ヒトベータディフェンシン2配列番号2、ヒトベータディフェンシン3配列番号3、ヒトベータディフェンシン4配列番号4、ヒトベータディフェンシン4のバリアント配列番号5、及び/又はマウスベータディフェンシン3配列番号6から成る。さらにより好ましい実施形態において、本発明の哺乳動物のベータディフェンシンは、ヒトベータディフェンシン1配列番号1、ヒトベータディフェンシン2配列番号2、ヒトベータディフェンシン3配列番号3、及び/又はヒトベータディフェンシン4配列番号4から成る。別の実施形態において、本発明の哺乳動物のベータディフェンシンは、配列番号2のアミノ酸配列と、少なくとも80、好ましくは少なくとも85、より好ましくは少なくとも90、そして最も好ましくは少なくとも95の同一性度を有する。好ましい実施形態において、本発明の哺乳動物のベータディフェンシンは、ヒトベータディフェンシン2配列番号2から成る。さらに別の実施形態において、本発明の哺乳動物のベータディフェンシンは、ヒトベータディフェンシン、及び/又はマウスベータディフェンシン、並びに機能的に等価なそのバリアントから成る。好ましくは、哺乳動物のベータディフェンシンは、ヒトベータディフェンシン1、ヒトベータディフェンシン2、ヒトベータディフェンシン3、ヒトベータディフェンシン4、及びマウスベータディフェンシン3、並びに機能的に等価なそのバリアントから成る。より好ましくは、本発明の哺乳動物のベータディフェンシンは、ヒトベータディフェンシン2、及び機能的に等価なそのバリアントから成る。本発明の哺乳動物のベータディフェンシンは、好ましい実施形態の化合物とも呼ばれる。本発明に関して、哺乳動物の例えばヒトのベータディフェンシンの機能的に等価なバリアントは、炎症性腸疾患において、親の哺乳動物の例えばヒトのベータディフェンシンとほぼ同じ効果を示す、修飾された哺乳動物の例えばヒトのベータディフェンシンである。好ましくは、それはまた、TNF-アルファ活性において、哺乳動物の例えばヒトのベータディフェンシンとほぼ同一の効果を示す。本発明に従って、哺乳動物の例えばヒトのベータディフェンシンの機能的に等価なバリアントは、哺乳動物の例えばヒトのベータディフェンシンアミノ酸配列と比較して、1~5個のアミノ酸修飾、好ましくは1~4個のアミノ酸修飾、より好ましくは1~3個のアミノ酸修飾、最も好ましくは1~2個のアミノ酸修飾、及び特に1個のアミノ酸修飾を含み得る。本明細書において、用語修飾は、哺乳動物の例えばヒトのベータディフェンシンの任意の化学修飾を意味する。1又は2以上の修飾は、1又は2以上のアミノ酸の置換、欠失、及び/又は挿入、並びに1又は2以上のアミノ酸側鎖の交換;又は当該アミノ酸配列において類似の特性を有する非天然のアミノ酸の使用であり得る。特に、1又は2以上の修飾は、アミド化、例えばC末端のアミド化であり得る。好ましくは、アミノ酸の修飾は小さい性質のものであり、そしてそれは、ポリペプチドのフォールディング及び/又は活性に大きな影響を与えない保存的アミノ酸置換又は挿入;単一の欠失;小規模なアミノ末端又はカルボキシル末端の伸長;約20~25残基までの小さいリンカーペプチド;又は正味電荷を変更することによって精製を容易にする小規模な伸長、或いは別の機能のもの、例えばポリ-ヒスチジンタグ、抗原性エピトープ、又は結合ドメインである。保存的置換の例は、塩基性アミノ酸アルギニン、リシン、及びヒスチジン、酸性アミノ酸グルタミン酸及びアスパラギン酸、極性アミノ酸グルタミン及びアスパラギン、疎水性アミノ酸ロイシン、イソロイシン、及びバリン、芳香族性アミノ酸フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン、並びに小さいアミノ酸グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、及びメチオニンの群の内で存在する。特異的な活性を通常変更しないアミノ酸置換は、例えば、H.NeurathandR.L.Hill,1979,In,TheProteins,AcademicPress,NewYorkに記載されている。最も一般的に生じる交換は、Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、及びAsp/Glyである。20個の標準的アミノ酸に加えて、非標準的アミノ酸例えば、4-ヒドロキシプロリン、6-N-メチルリシン、2-アミノイソ酪酸、イソバリン、及びアルファ-メチルセリンは、野生型ポリペプチドのアミノ酸残基と置換され得る。限定された数の非保存的アミノ酸、遺伝子コードをコードしないアミノ酸、及び非天然アミノ酸は、アミノ酸残基と置換され得る。非天然アミノ酸は、タンパク質合成後に修飾され、及び/又は1又は2以上の側鎖において標準的アミノ酸のものとは異なる化学構造を有する。非天然のアミノ酸は、化学的に合成され得、そして好ましくは、市販されており、そしてピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、3-及び4-メチルプロリン、並びに3,3-ジメチルプロリンを含む。哺乳動物のベータディフェンシンにおける必須のアミノ酸は、当技術分野で既知の手順、例えば部位特異的変異誘発、又はアラニン走査変異誘発alanine-scanningmutagenesisCunninghamandWells,1989,Science244:1081-1085に従って同定され得る。後者の技術において、単一のアラニンの変異は分子内における全ての残基に導入され、そして生じた変異分子は、生物学的活性すなわち、炎症性腸疾患に対する活性及び/又はTNF-アルファ活性の抑制を試験され、当該分子の活性に重要なアミノ酸残基を同定する。Hiltonetal.,1996,J.Biol.Chem.271:4699-4708も参照のこと。必須のアミノ酸の同一性は、哺乳動物のベータディフェンシンに関連するポリペプチドとの同一性の分析からも推測され得る。単一の又は複数のアミノ酸の置換が、既知の方法の変異誘発、組み換え及び/又はシャッフリングを用いてなされ得、及び試験され得、その後、関連性スクリーニング手順、例えばReidhaar-OlsonandSauer,1988,Science241:53-57;BowieandSauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2152-2156;国際公開第95/17413号;又は国際公開第95/22625号に開示されたものが行われ得る。使用され得る他の方法は、エラープローンPCR、ファージディスプレイ例えば、Lowmanetal.,1991,Biochem.30:10832-10837;米国特許第5,223,409号明細書;国際公開第92/06204号、及び領域特異的突然変異誘発region-directedmutagenesisDerbyshireetal.,1986,Gene46:145;Neretal.,1988,DNA7:127を含む。本発明のポリペプチドのN末端の伸長は好適には、1~50個のアミノ酸、好ましくは2~20個のアミノ酸、特に3~15個のアミノ酸から成り得る。一の実施形態において、N末端ペプチドの伸長は、ArgRを含まない。別の実施形態において、N末端の伸長は、以下にさらに定義されるkex2又はkex2様切断部位を含む。好ましい実施形態において、N末端伸長は、少なくとも2つのGluE及び/又はAspDアミノ酸残基を含むペプチドであって、例えばN末端伸長は以下の配列の一つを含む:EAE、EE、DE及びDD。方法、及び用途ヒトベータディフェンシン2は、10日間デキストラン硫酸ナトリウムDSSで誘導された大腸炎モデルマウスにおいて、疾患パラメーターの深刻度を著しく減少させ;したがって、炎症性腸疾患、例えば潰瘍性大腸炎及びクローン病の治療のための医薬として、強力な活性を示すことが判明した。本発明はしたがって、炎症性腸疾患の治療方法を提供し、当該治療は、有効量の哺乳動物のベータディフェンシン、例えばヒトベータディフェンシン2を、医薬組成物の形態で、当該治療を必要とする対象へ非経口投与することを含む。非経口投与のための医薬の製造のための、哺乳動物のベータディフェンシン、例えばヒトベータディフェンシン2がまた、提供され、及び、炎症性腸疾患の治療のための、非経口投与のための医薬、例えば医薬組成物の製造のための、哺乳動物のベータディフェンシン、例えばヒトベータディフェンシン2の使用がまた、提供される。治療は、存在する疾患又は障害の治療、及び疾患又は障害の予防防止を含む。実施形態において、当該治療は、治療がなされた組織におけるTNF-アルファ活性の減少をもたらし、好ましくはTNF-アルファ活性の減少、及びIL-10活性の増大をもたらす。哺乳動物のベータディフェンシンは、経腸例えば口腔、経口、経鼻、直腸、非経口例えば静脈内、頭蓋内、腹腔内、皮下、若しくは筋肉内、又は局所例えば、皮膚上、鼻腔内、若しくは気管内を含む、任意の従来の経路による投与のために製剤化された組成物で、治療において使用され得る。他の実施形態において、本明細書に記載された組成物は、持続放出インプラントの一部として投与され得る。さらに他の実施形態において、好ましい実施形態の組成物は、凍結乾燥物としての安定性を提供する好適な賦形剤を用いて、凍結乾燥物として製剤化され得、その後に再水和される。哺乳動物のベータディフェンシン、例えばヒトベータディフェンシンを含む医薬組成物は、従来法に従って、例えば混合、整粒、被覆、溶解、又は凍結乾燥工程によって製剤化され得る。好ましい実施形態の医薬組成物は、哺乳動物のベータディフェンシン、例えばヒトベータディフェンシン、並びに医薬として許容される担体、及び/又は希釈剤を含む。哺乳動物のベータディフェンシン、例えばヒトベータディフェンシンは好ましくは、炎症性腸疾患における治療のために有効である量で、好ましくは患者において許容される毒性で、医薬組成物において使用される。かかる治療のために好適な投与量は当然、例えば、使用される本発明の化合物の化学的性質及び薬物動態データ、個々の宿主、投与様式、並びに処置される健康状態の性質及び深刻度によって変化し得る。しかし一般的に、大型哺乳動物、例えばヒトにおける満足な結果のために、望ましい一日用量は、好ましくは約0.001g~約1.5g、より好ましくは約0.01g~1.0g;又は約0.001mg/kg体重~約20mg/kg体重、好ましくは約0.01mg/kg体重~約20mg/kg体重、より好ましくは約0.1mg/kg体重~約10mg/kg体重であり、例えば、1日に1回、2回、3回、又は4回の分割量で投与される。好ましい実施形態の化合物は、大型哺乳動物、例えばヒトへ、従来使用されているものと同様の投与様式で、同様の投与量で投与され得る。特定の実施形態において、好ましい実施形態の医薬組成物は、哺乳動物のベータディフェンシン、例えばヒトベータディフェンシンを、投与経路に依存して、単位剤形につき、約0.5mg以下~約1500mg以上の量で含み得、そしてそれは、好ましくは約0.5、0.6、0.7、0.8、又は0.9mg~約150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、又は1000mgで、及びより好ましくは約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、又は25mg~約30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、又は100mgで含み得る。しかし、特定の実施形態において、上記のものより低い又は高い投与量が好ましいものであり得る。好適な濃度及び投与量は、当業者によって容易に決定され得る。医薬として許容される担体及び/又は希釈剤は、当業者に既知である。液体溶液として製剤化された組成物に関して、許容される担体及び/又は希釈剤は、生理食塩水及び滅菌水を含み、並びに場合により抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び他の一般的な添加剤を含み得る。当該組成物はまた、丸剤、カプセル、顆粒、タブレット被覆された、又は被覆されていない、注射可能溶液、固溶体、懸濁液、分散液、固体分散体例えばアンプル、バイアル、クリーム、ゲル、ペースト、吸入製剤、粉末、フォーム、チンキ剤、リップスティック、ドロップ、スプレー、又は坐剤の形態として、製剤化され得る。当該製剤は、哺乳動物のベータディフェンシン、及び他の追加の活性成分に加えて、担体、賦形剤、砕解剤、フローコンディショナーflowconditioner、糖類及び甘味剤、香料、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、可溶化剤、浸透圧調節用の塩、緩衝剤、希釈剤、分散剤及び界面活性剤、結合剤、滑剤、並びに/又は当技術分野で既知の他の医薬用賦形剤を含み得る。当業者はさらに、好適な方法で、及び慣例に従って、例えば、Remington’sPharmaceuticalSciences,Gennaro,Ed.,MackPublishingCo.,Easton,PA1990に記載された方法で、哺乳動物のベータディフェンシンをさらに製剤化し得る。哺乳動物のベータディフェンシン、例えばヒトベータディフェンシンは、単剤で、又は1、2若しくは3以上の他の医薬化合物若しくは薬剤物質を用いた併用療法で、及び/又は1若しくは2以上の医薬として許容される賦形剤と共に使用され得る。インビトロにおける合成哺乳動物のベータディフェンシンは、当技術分野で既知の従来法を用いて、インビトロにおける合成によって製造され得る。種々の市販の合成装置が利用可能であり、例えばAppliedBiosystemsInc.、BeckmanInc.などの自動合成機がある。合成機を用いることによって、天然に存在するアミノ酸は、非天然のアミノ酸、特にD-異性体又はD体、例えばD-アラニン、及びD-イソロイシン、側鎖が異なる長さ又は官能基を有するジアステレオマーなどと置換され得る。特定の配列及び製造方法は、簡便性、経済性、必要とされる純度などによって決定され得る。結合のために好都合な官能基、例えば、アミドのための、又は置換アミン形成、例えば還元的アミノ化のためのアミノ基、チオエーテル又はジスルフィド形成のためのチオール基、アミド形成のためのカルボキシル基などを含む種々のペプチド又はタンパク質に、化学結合が提供され得る。必要に応じて、種々の基が、合成中又は発現中にペプチドへと導入され得、そしてそれらは、他の分子又は表面への結合を可能とする。したがって、システインは、チオエーテルを製造するために使用され得、ヒスチジンは、金属イオン錯体と結合するために使用され得、カルボキシル基はアミド又はエステルを形成するために使用され得、アミノ基はアミドなどを形成するために使用され得る。哺乳動物のベータディフェンシン、又はその機能的等価体はまた、組み換え合成の従来法に従って、単離され且つ精製され得る。溶解物は、発現宿主から調製され得、そして当該溶解物は、HPLC、排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、又は他の精製技術を用いて精製され得る。本発明は、本発明の範囲を限定するものであるとして解釈されるべきではない、以下の実施例によってさらに説明される。実施例hBD2の免疫調節効果に関する試験を通じて、hBD2が、抗炎症性における大きな潜在力を有することが予想外にも観察された。本明細書において、我々は、hBD2が、マウスへデキストラン硫酸ナトリウムDDSを経口投与することによって誘導された炎症性腸疾患結腸炎の治療に大きな効果があることを示した。我々はまた、hBD2が、TNF-アルファに対する下方制御潜在力を有することを示した。実施例1ヒトベータディフェンシン2hBD2の産生hBD2を組み換えで産生した。hBD2をコードする合成DNA断片DNA2.0を、pET-32発現ベクターNovagenへとクローン化した。生じたプラスミドは、N末端チオレドキシン部位、その後にhis-タグ、エンテロキナーゼ切断部位、及び最後にhBD2ペプチドを含む、翻訳用融合ペプチドをコードした。発現プラスミドを、E.coli株BL21へと形質転換した。この株の一晩培養物を、100μg/mlのアンピシリンを含有するTB-グリセロールで100倍に希釈し、そして37°Cにて約8のOD600となるように増殖させ、そして0.5mMのIPTGで3時間誘導し、その後細胞を遠心分離で採取した。his-タグされたtrx-hBD2融合ペプチドを、標準的手順を用いて、Ni-NTAビーズQIAGEN上で精製した。his-タグ精製された融合ペプチドをその後、エンテロキナーゼ緩衝液50mMtris-HClpH7.5,1mMCaCl2中にて一晩透析し、そしてエンテロキナーゼで切断して成熟hBD2を放出した。hBD2ペプチドを、Source15SmatrixAmershamBiosciencesを用いた陽イオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製した。hBD2の正確な分子量を、MALDI-TOF質量分析を用いて確認した。mBD3実施例7参照の産生を、同一の手順を用いて行った。hBD2の適切なフォールディング及びジスルフィド架橋形態をその後、LC-MS及びNMR分光法と連動したトリプシン消化を用いて確認した。エンドトキシンを分取RP-HPLCによって低pHにて除去し、そしてエンドトキシンの含有量をLALアッセイEndosafeKTA2によって決定し、そして当該レベルは、当該アッセイの検出限界0.05EU/mg未満であることが分かった。エンドトキシンアッセイの検出限界未満のレベルが、PBMCを刺激することができないことを確定するために、非常に強力なリポ多糖E.coli,O111:B4,SigmaL4391を用いた刺激の滴定曲線を行った。非常に低レベルのこのLPS0.06ng/mlは、検出可能なサイトカイン産生へとPBMCを刺激することができた。実施例210日間デキストラン硫酸ナトリウムDSSで誘導された結腸炎マウスモデル以下の試験の目的は、マウスへデキストラン硫酸ナトリウムDSSを投与することによって誘導された、炎症性腸疾患結腸炎の急性10日間モデルにおける、ヒトベータディフェンシン2の抗炎症活性を決定することであった。Kawadaetal.Insightsfromadvancesinresearchofchemicallyinducedexperimentalmodelsofhumaninflammatoryboweldisease,WorldJ.Gastroenterol.,Vol.1342,pp.5581-55932007;及び、WirtzandNeurathMousemodelsofinflammatoryboweldisease,AdvancedDrugDeliveryReviews,Vol.5911,1073-10832007に記載されている通り、DSS結腸炎マウスモデルは、炎症性腸疾患の試験のための、十分に認識されているモデルである。材料試験品目ヒトベータディフェンシン2hBD2;上の実施例1を参照メチルプレドニゾロン21-ヘミサクシネートプレドニゾロンPBS緩衝液GIBCO実験動物雄のC57BL/6マウスHarlanlnterfaunaIberica,Barcelona,Spainを試験で使用した。これが、2DDSの飲料水溶液を10日間投与したときに、結腸の著しい炎症を引き起こすことが実証されている種及び性別であるためである。識別尾に書かれた数字及び文字コードで動物を識別した。さらに、動物の数及び性別、試験品目又は名前、投与量レベル、投与経路、処置期間、グルーブ番号、試験コード、及び試験監督者の名前を表示した、色コードされたカードによって各々のケージを識別した。体重試験開始日における動物の平均体重は22.4±0.16gであった。順応隔離所試験開始前最低7日間、主要な試験と同じ条件下に置いた。収容到着時、動物を分けて、ステンレス製の蓋を有するポリカーボネート製のケージE-Type,CharlesRiver,255×405×197mmにランダムに収容した。動物は、性別に従って、1ケージあたり5匹の動物のグループで収容され、動物の部屋内は、調節された温度22±2°C、照明12/12時間の光/暗闇、空気圧、空気の入れ替え数、及び相対湿度30~70であった。全てのケージは、敷物として床上におがくずLignocel3-4;HarlanInterfaunaIberica,Spainを有した。食餌及び水全てのマウスは、乾燥したペレット型の標準的齧歯動物用の食餌TekladGlobal2014;HarlanlnterfaunaIberica,Spainを自由に食べることができた。水はボトル中で自由に提供された。動物の部屋へのタップ水供給は、その組成を確認するために、及び可能のある汚染物質化学物質及び微生物性のものを検出するために、定期的に分析された。装置及び材料装置動物はかり、SartoriusMod.BP2100外科的解剖装置Eppendorf5415C遠心分離機NikonEclipseE600FN顕微鏡HookTuckerinstrumentsrotamixerIKAUltraTurraxホモジナイザーSartoriusMod.BP221S化学天秤ELISAマイクロプレートリーダーLabsystemsMultiskanEX材料及び試薬:滅菌使い捨てシリンジ1ml滅菌Butterfly25G輸液セット麻酔剤ケタミン/キシラジン局所麻酔用クリームEMLA,AstraZenecaデキストラン硫酸ナトリウム30.000~50.000DaMPBiomedicalsリン酸緩衝生理食塩水PBS;Sigma中性緩衝ホルマリンVWRウシ血清アルブミンSigmaプロテアーゼ阻害剤カクテルSigmaマウスTNF-αELISAキットGEHealthcare実験手順試験設計動物を5つの実験グループへと分けた。各々のグループは、10匹のオスから成った:グループA:コントロールビヒクルPBS、i.v.で処理グループB:hBD20.1mg/kgi.v.で処理グループC:hBD21mg/kgi.v.で処理グループD:hBD210mg/kgi.v.で処理グループE:メチルプレドニゾロン1mg/kgp.o.で処理全実験グループへの動物の割り当てをランダムに行った。指令86/609/EECに従って、最大で5匹のマウスを各々のケージに収容した。試験品目の投与に先立ち、全ての動物について、研究所に到着時に体重を測定した。試験物質の投与コントロールビヒクル及びhBD2を、滅菌針25Gを用いて、尾の静脈を通じて静脈内に、投与量5ml/kg体重でゆっくりとボーラス投与した。動物は、対応する試験品目hBD2、プレドニゾロン、又はコントロールビヒクルの一回投与量を、毎日24時間毎に、10日間連続して受けた。プレドニゾロンは、hBD2と同一の投与計画で、1mg/kg体重の投与量で、5ml/kg体重の投与体積で経口投与された。実験手順結腸炎の誘導DDS2含有飲料水を7日間補給することによって、結腸炎をマウスで誘導した。1日目に全てのマウスの体重を測定し、実験グループに従って印をつけた。各々のケージの飲料容器をDDS溶液で満たし、全ての容器の蓋が適切に取り付けられていること、及び過度に詰め込まれていないことを確認した。3日目に容器中に残存する溶液を空にし、そして再度新鮮なDSS溶液で満たした。この手順を5日目に再び繰り返した。8日目に、残存する溶液を捨て、そしてオートクレーブされた水と置換した。2日経過後の10日目に、動物を屠殺した。臨床的評価疾患活動性インデックス以下のパラメーターに従って、0~4の範囲で、有効な臨床疾患活性インデックスDAIの計算を行い、DSS処理された動物の毎日の臨床的評価を行った:便の硬さ、直腸出血の存在、又は不在、及び体重減少:体重減少を、元の体重1日目と各々の実験日2日目~10日目における体重との間のパーセント差としてとして計算した。下痢の外観は、肛門に着いた粘液糞便物質として定義された。直腸出血は、目に見える血/粘液、又は直腸全体の出血を含む、下痢として定義された。各々の日における、DAIの最大スコアは12である。血液採取試験期間中における2つの離れた時期:1日目と5日目において、2つの血液試料を各々の動物から得た。血液試料を各々の時期において、試験品目の投与後2時間で、伏在静脈の穿刺によってMicrovetteCB-300ミクロチューブに採った。この血液採取法は、麻酔剤又は鎮痛剤を必要とせず、そして動物に最小限のストレスを与えるHemetal.,1998。さらに、試験の最終日において、試験品目投与後2時間で、全ての動物から最終的な血液試料を、腹部大静脈から得た。血液試料を凝固し、その後3000rpmで10分間遠心分離し、そして血清を-80°Cで貯蔵のために凍結した。安楽死及び結腸試料の回収10日目において、コントロールビヒクル、hBD2又はプレドニゾロンの最後の投与後2時間で、動物を過剰量の麻酔剤で殺した。それらの結腸を取り除き、そして盲腸の除去後、それらの長さ及び重量を測定した。結腸の2つの切片近位部及び遠位部を各々の動物から取り除き、そして以下のスコアリングシステムに従う、その後の組織学分析ヘマトキシリン及びエオシン染色のために、中性緩衝ホルマリンで保存した:結腸組織試料におけるTNF-アルファ濃度の決定結腸の追加の試料を各々の動物から得、そして1ウシ血清アルブミンBSA及びプロテアーゼ阻害剤カクテル1ml/20g組織含有PBS100mg組織/mlPBS中でホモジナイズした。ホモジネートをその後、1400rpmで10分間遠心分離し、そして上清を、特異的酵素免疫アッセイELISAによる、その後のTNF-α濃度の決定のために、-20°Cで貯蔵した。結果疾患活動性インデックススコア表1.1日目~10日目における疾患活動性インデックスDAIスコアの経過。所定の日におけるコントロールビヒクルグループからの有意差を、p<0.05;p<0.01非母数データのためのクラスカルワリス検定Kruskal-WallisTestとして示す。組織学評価結腸の2つの切片近位部及び遠位部を各々の動物から取り除き、組織学分析ヘマトキシリン及びエオシン染色を行い、そして上記のスコアリングシステムに従って盲検化観察者によってスコアリングした。結腸組織試料におけるTNF-α濃度の決定結腸の追加の試料を各々の動物から得、そして1ウシ血清アルブミンBSA及びプロテアーゼ阻害剤カクテル1ml/20g組織含有PBS100mg組織/mlPBS中でホモジナイズした。ホモジネートをその後、14000rpmで10分間遠心分離し、そして上清を、特異的酵素免疫アッセイELISAによる、その後のTNF-α濃度の決定のために、-20°Cで貯蔵した。表3.組織学スコア、結腸の重量及び長さ、並びに結腸のTNF-α濃度。コントロールビヒクルグループからの組織学スコアにおける差をp<0.05;p<0.01非母数データのためのクラスカルワリス検定Kruskal-WallisTestとして示す。統計学的分析結果の統計的有意性を、統計プログラムGraphpadInstat3を用いて評価した。疾患活動性インデックスと組織学スコアとの間の差を、対応のないデータのためのクラスカルワリス検定、及び多重比較を可能とするためのDun事後検定によって評価した。p<0.05の値を有意とした。結論試験された最低投与量0.1mg/kgi.v.のhBD2は、DDS投与によって誘導された疾患活動性インデックスにおける増加を、7日目1.44±0.38試験品目vs.4.1±0.69ビヒクル;p<0.01、8日目2.11±0.2試験品目vs.5.9±1.26ビヒクル;p<0.05、9日目3.89±0.35試験品目vs.8.9±1.02ビヒクル;p<0.01及び10日目6.44±0.85試験品目vs.10.9±0.62試験品目;p<0.05において、有意に減少させることを実証した。hBD2の中等度の投与量1mg/kgi.v.で連続10日間処置することにより、疾患活動性インデックススコアが明らかに減少したが、これは10日目においてのみ有意であった6.44±1.08試験品目vs.10.9±0.62ビヒクル;p<0.05。10日目における疾患活動性インデックスで得られた結果と同様に、各々の動物の近位結腸の組織学分析は、hBD2の低用量での処理によって、組織学的損傷スコアが非常に有意に減少することを明らかとした2.22±0.43試験品目vs.4.2±0.25ビヒクル;p<0.01。さらに、組織学的損傷の有意な減少はまた、中等度用量のhBD2、高用量のhBD2、及びプレドニゾロンを用いた場合に観察された各々、2.89±0.35;2.89±0.39及び2.8±0.5;p<0.05。対照的に、遠位結腸において、組織学的損傷の明らかな減少が低用量のhBD2、中等度用量のhBD2、及びプレドニゾロンで処理された動物で観察されたが、これは統計学的に有意ではなかった。高用量のhBD2で処理された動物において、減少は観察されなかった。同様に、低用量、及び中等度用量のhBD2を用いた処理により、結腸のTNF-アルファレベルが明らかに減少したが、この明らかな減少は統計的に有意ではなかった。本試験で得られた結果は、10日間の処理期間後、マウスにおいて誘導されたDDS結腸炎モデルにおける、hBD2の抗炎症活性を実証している。しかし、この抗炎症活性は、より低用量のhBD20.1mg/kg/日i.v.が使用されたときにより顕著であり、そして本試験で使用された最高用量10mg/kg/日i.v.まで、投与量を増大するにつれて徐々に失われるように思われる。さらに、hBD2の最低用量の抗炎症効果は、1mg/kg/日p.o.でのプレドニゾロンにおける効果と同等か、又はそれよりもさらに大きい例えば組織学スコア。実施例310日間デキストラン硫酸ナトリウムDSSで誘導された結腸炎マウスモデル基本的に実施例2に記載された通りに、実施例3を行った。違いを以下に示す。体重試験開始日における動物の平均体重は19.74±0.09g平均±SEMであった。試験設計動物を5つの実験グループへと分けた。各々のグループは、10匹のオスから成った:グループA:コントロールビヒクルPBS、i.v.で処理グループB:hBD21mg/kgi.v.で処理-1日1回グループC:hBD20.1mg/kgi.v.で処理-1日1回グループD:hBD20.01mg/kgi.v.で処理-1日1回グループE:hBD20.001mg/kgi.v.で処理-1日1回グループF:hBD20.1mg/kgi.v.s.c.で処理-1日2回グループG:hBD20.1mg/kgi.v.で処理-2日毎グループH:メチルプレドニゾロン1mg/kgp.o.で処理グループJ:メチルプレドニゾロン10mg/kgp.o.で処理全実験グループへの動物の割り当てをランダムに行った。指令86/609/EECに従って、最大で5匹のマウスを各々のケージに収容した。試験化合物及びレファレンス化合物の投与に先立ち、全ての動物は、研究所に到着時に体重を測定された。試験品目の投与コントロールビヒクル及びhBD2を、滅菌針25Gを用いて、尾の静脈を通じて静脈内に、投与量5ml/kg体重でゆっくりと15秒かけてボーラス投与した。グループA~Eの動物は、対応する試験品目hBD2、プレドニゾロン、又はコントロールビヒクルの一回投与量を、毎日24時間毎に、10日間連続して受けた。グループFの動物は、対応する試験品目の一回投与量をi.v.で、及び別の投与量をi.v.投与後12時間でs.c.で、10日間連続して受けた。グループGの動物は、対応する試験品目の一回投与量を2日毎に、10日間連続して受けた。メチルプレドニゾロンは、1mg/kgグループH及び10mg/kgグループJの投与量で、5ml/kg体重の投与体積で、1日1回、10日間連続して経口投与された。血液採取試験の最終日において、試験品目投与後2時間で、全ての動物から最終的な血液試料を、腹部大静脈から得た。血液試料を凝固し、その後3000rpmで10分間遠心分離し、そして得られた血清をその後の分析のために-80°Cで凍結した。結果疾患活動性インデックススコア表4.1日目~10日目における疾患活動性インデックスDAIスコアの経過。所定の日におけるコントロールビヒクルグループからの有意差をp<0.05;p<0.01非母数データのためのクラスカルワリス検定Kruskal-WallisTestとして示す。6日目~10日目を次のページに示す。組織学評価結腸の2つの切片近位部及び遠位部を各々の動物から取り除き、組織学分析ヘマトキシリン及びエオシン染色を行い、そして上記のスコアリングシステムに従って盲検化観察者によってスコアリングした。表5.組織学スコア、結腸の重量及び長さ、並びに結腸のTNF-α濃度。コントロールビヒクルグループの値からの組織学スコアにおける差をp<0.05;p<0.01非母数データのためのクラスカルワリス検定Kruskal-WallisTestとして示す。統計学的分析結果の統計的有意性を、統計プログラムGraphpadInstat3を用いて評価した。疾患活動性インデックスと組織学スコアとの間の差を、対応のないデータのためのクラスカルワリス検定、及び多重比較のためのDun事後検定によって評価した。p<0.05の値を有意とした。上の表において、対応するコントロールビヒクルグループに対する有意差をp<0.05、p<0.01、p<0.001として表示する。結果本試験の目的は、マウスへのデキストラン硫酸ナトリウムDDS、2経口投与によって誘導された炎症性腸疾患結腸炎の急性10日間モデルにおける、hBD2の抗炎症活性を決定することであった。本試験において得られた結果は、10日間の処置期間後、マウスにおいて誘導されたDDS結腸炎モデルにおける、hBD2の抗炎症活性をさらに実証している。この抗炎症活性は、1日2回12時間毎の、静脈内投与及び皮下投与の両方で、0.1mg/kgの投与量での、hBD2の投与後においてより顕著であり得る。さらに、このhBD2の投与量で観察された抗炎症効果は、プレドニゾロンを1mg/kg又は10mg/kgの用量で経口投与したときの効果と同等又はさらに大きかった疾患活動性インデックス及び組織学的スコアの両方。実施例4ヒトベータディフェンシン2hBD2の抗炎症活性ヒトPBMC培養中において、hBD2を用いた処置が、LPS、LTA又はペプチドグリカン刺激された培養のサイトカインプロファイルにおいて大きな影響を有することが観察された。hBD2が炎症性サイトカイン、並びに、ケモカインIL-6、IL-1β、RANTES、IP-10及びIL-8を誘導することができることは以前に観察されているNiyonsabaetal.2007,BoniottoM.etal.2006。本明細書において我々は、hBD2が2つの炎症性サイトカイン、TNF及びIL-1βに対する下方制御潜在力を有することを、そしてhBD2がまた、リポポリ多糖LPS、リポタイコ酸LTA、又はペプチドグリカンPGNを用いた炎症性刺激時において、IL-10を誘導することを示した。IL-10は、潜在的な抗炎症性サイトカインであり、したがって、hBD2のもたらす効果は抗炎症性である。これは、ヒトPBMC、単球細胞株、及び樹状細胞株dendritoidcelllineにおいて観察された。hBD2は、実施例1に記載された通りに調製された。PBMCの単離及び刺激デンマークの関連倫理委員会から認定されている健常者から末梢血を採取した。ヘパリン添加血液をRPMIで1/1v/vで希釈し、そして2時間以内のFicoll密度遠心にかけた。血漿を個々のドナーの上清から回収し、そしてそれが培養培地自家培養培地中2で使用されるまで、氷上で保存した。単離されたPBMCを自家培養培地中で再度懸濁し、そして96ウェル培養プレートに、1ウェルあたり255.000個の細胞で、全体で200μlとなるようにまいた。100、10、又は1μg/mlのhBD2を、それ単体で、或いは、0.6ng/ml若しくは20ng/mlE.coli,O111:B4,SigmaL4391のLPS、1.25μg/mlのリポタイコ酸LTAB.サブチリスsubtilis由来,SigmaL3265、又は40μg/mlのペプチドグリカンPGNS.アウレウスaureus由来,Sigma77140と共に用いて、同一ドナー由来のPBMCを刺激した。刺激のために使用される濃度は、実験初期に3人の異なるドナーにおいて最適化され、LPSに関しては、2つの異なる濃度が使用されて、調節可能なサイトカインレベル上にあることを確実なものとした。幾つかの実験において、デキサメサゾン及びインドメタシンを、単剤で、及び炎症性サイトカインの下方制御のコントロールとしてのLPS又はLTAを共に用いてPBMCを処置した。37°Cで24時間のインキュベーション後に上清を回収し、そしてサイトカインの測定まで-80°Cで貯蔵した。全ての実験において生存率をAlamarBlueBiosource,DALL1100によって測定し、そして幾つかの場合においてはMTSPromegaによって製造業者の使用説明に従って測定し、そして幾つかの実験において、Nucleocounterによって細胞数をカウントすることによって判断した。MUTZ-3の培養及び刺激ヒト骨髄性白血病由来の細胞株MUTZ-3DSMZ,Braunschweig,Germanyを、a-MEMSigmaM4526中で維持し、20[v/v]ウシ胎仔血清SigmaF6178、及び40ng/mlrhGM-CSFRDSystems215-GM-050を追加した。これらの前駆細胞は以下に示す単球細胞株中に存在し、そしてこれらの単球を、100、10又は1μg/mlのhBD2を、単剤で、又はLPS若しくはLTAと共に用いて刺激した。樹状細胞の分化樹状細胞株を生じさせるために、rhGM-CSF150ng/ml及びrhlL-450ng/mlの存在下で、ヒト骨髄性白血病細胞株MUTZ-31×105細胞/mlを、7日間かけて分化させて未熟DCとした。2~3日毎に培地を交換した。分化された細胞株を、LPS又はLTAのいずれかを用いて、hBD2の存在下で及び不在下でさらに刺激して、樹状細胞におけるhBD2の効果を調べた。サイトカインの測定上清中におけるサイトカイン産生を、FACSアレイフローサイトメーター上で、ヒト炎症サイトメトリックビーズアレイCBAを用いたフローサイトメトリーによって、製造業者の使用説明BDに従って測定した。以下のサイトカインを測定した:IL-8、IL-1β、IL-10、TNF、IL-12p70、IL-6。幾つかの実験において、RDsystemsのELISAキットIL-10、TNF-α、IL-1βによって、製造業者の使用説明に従って、サイトカインを測定した。データ分析代表的結果が示されるように、全ての実験を少なくとも2回行った。得られたデータを、平均±標準偏差SDとして表現した。表の説明文に記載されたように、変数が処置hBD2、デキサメサゾンなど及び刺激LPS、LTA、ペプチドグリカンなどである2-wayANOVAを行い、その後、Bonferroni事後検定を行うことによって統計的有意性を決定した。差は、p<0.05で有意であると見なされた。結果LPS及びLTAで、処理された及び無処理のヒトPBMCで、hBD2の効果を試験した表6、7及び8。hBD2を用いた処理により、全3つの試験された濃度に関して、刺激された培養においてTNFの有意な下方制御がなされ表6、当該下方制御は、0.6ng/mlのLPSに関して、及びLTAに関して用量依存的であった。IL-1βに関して、主に最高用量で下方制御が観察された表7。興味深いことに、IL-10は有意に且つ用量依存的に上方制御された表8。炎症性サイトカインの下方制御、及び抗炎症性サイトカインの誘導は、hBD2の非常に強い抗炎症潜在力を示す。hBD2の抗炎症効果が細胞毒性効果によるものであることを排除するために、生存率を2つの異なるアッセイで測定した。hBD2は、細胞において細胞毒性を有さず、観察される効果は、細胞増殖をもたらす、LPS又はLTAの刺激による刺激効果であることが、表9及び10において見られる。したがって、hBD2は、これらの細胞において細胞毒性効果を有さない。表11、12及び13において、別のドナーからの上清は、フローサイトメトリーによるサイトメトリックビーズアッセイの代わりに、ELISAによって、サイトカインに関して分析され、同一のことが観察されたが、アッセイの感度がより低く、そして検出限界が非常により高いため、当該効果が有意なものではなかった。さらに別のToll様受容体リガンドを試験するために、ペプチドグリカンで刺激されたPBMCにおけるhBD2の効果が調べられた表14及び15。同一のことが観察された:TNFは用量依存的に下方制御され、そしてIL-10は用量依存的に誘導された。TNFの下方制御のポジティブコントロールとして、2つの抗炎症性化合物、デキサメタゾン及びインドメタシンを、アッセイにおいて試験した。当該化合物が毒性ではなく、且つ培地への溶解性のために達成可能な濃度であるように、濃度は選択された。LTAを用いた刺激後にのみ、インドメタシンはTNFを阻害したが表16、デキサメタゾンは、TNF産生を効果的に下方制御し、同一のことがIL-1βに関して観察された表18。インドメタシンは、COX-1及びCOX-2阻害剤であり、軽度~中等度の痛みを治療するために使用される非ステロイド系抗炎症剤であり、関節炎症状を緩和するために有用であり、並びにデキサメタゾンは炎症性疾患の治療において第一に使用される合成グルココルチコイドであり、そしてそれは、非常に低用量で、炎症性サイトカインに対して非常に強力な下方制御効果を有しRowlandetal.1998、そしてそれを我々は、TNF-α及びIL-1βに関しても観察した。hBD2は、2つの抗炎症性化合物と同じくらい、またはそれらよりも効果的であった。表19及び20において、単球細胞株、及び樹状細胞においてTNFを下方制御する、hBD2の効果が示され、同じことがPBMCに関して観察された。IL-10はまた、hBD2且つLPS、又はhBD2且つLTAで刺激された樹状細胞に関して誘導された結果は示さず。LPS又はLTAへのhBD2の結合がTNF及びIL-1βの下方制御を引き起こすことを排除するために、合成リガンドPam3CSK4TLR2-TLR1リガンド,InvivoGentlrt-pmsを用いたPMBCの刺激に対するhBD2の効果を試験した。このリガンドを用いた刺激後においても、hBD2は下方制御することができ、このことは、LPS又はLTAの中和が、観察される効果に関与しないことを示している結果は示さず。さらに、TNF-α及びIL-αを含有するサイトカインカクテル、並びにhBD2を用いた樹状細胞の刺激は、サイトカインカクテル単体を用いた刺激と比較して、IL-1β、及びIL-8、及びIL-6の下方制御効果を有した。TNF-αを用いた刺激のために、TNFに対する効果を明白に分析することができなかった結果を示さず。表6.LPS又はLTAを用いた、hBD2を用いた及び用いない処置後における、ヒト末梢血単核細胞PBMCからのTNF産生。全ての試料は同一のドナーで試験された。5人のドナーからの代表的実験。TNFはFACSアレイ上でのサイトメトリックビーズアレイCBAによって測定された。p<0.001、各々のコントロール太字と比較、2-wayANOVAによって分析各々のデータセットに関してN=約200。表7.LPS又はLTAを用いた、hBD2を用いた及び用いない処置後における、ヒト末梢血単核細胞PBMCからのIL-1β産生。全ての試料は同一のドナーで試験された。5人のドナーからの代表的実験。IL-1βはFACSアレイ上でのサイトメトリックビーズアレイCBAによって測定された。p<0.001、2-wayANOVAによって分析各々のデータセットに関してN=約200。表8.LPS又はLTAを用いた、hBD2を用いた及び用いない処置後における、ヒト末梢血単核細胞PBMCからのIL-10産生。全ての試料は同一のドナーで試験された。5人のドナーからの代表的実験。IL-10はFACSアレイ上でのサイトメトリックビーズアレイCBAによって測定された。p<0.001,p<0.01,p<0.5、2-wayANOVAによって分析各々のデータセットに関してN=約200。表9.MTSアッセイによって測定された、刺激の24時間後におけるPBMC生存率。横列中、異なる下付き文字を有する値は有意差があり、2-wayANOVA、その後Bonferroni事後検定を行うことで検定された。表10.AlamarBlueによって測定されたPBMC生存率、5人の異なるドナーからの、5つの実験からの、1つの代表的実験。横列中異なる上付き文字を有する値、及び縦列中異なる上付き文字を有する値は有意差があり、2-wayANOVA、その後Bonferroni事後検定を行うことで検定された。表11.hBD2、LTA、LPS又はそれらの組み合わせを用いた刺激後における、PBMCからのTNF-アルファ分泌。TNF-アルファはELISAによって測定された。nd:検出不能、アッセイにおける検出限界0.01ng/ml、p<0.05、各々のコントロールと比較;p<0.01、各々のコントロールと比較。表12.hBD2、LTA、LPS又はそれらの組み合わせを用いた刺激後における、PBMCからのIL-10分泌。TNF-アルファはELISAによって測定された。nd:検出不能、アッセイにおける検出限界0.03ng/ml。表13.hBD2、LTA、LPS又はそれらの組み合わせを用いた刺激後における、PBMCからのIL-1β分泌。TNF-アルファはELISAによって測定された。nd:検出不能、アッセイにおける検出限界0.016ng/ml、p<0.01、各々のコントロールと比較。表14.PGNを用いた、hBD2を用いた及び用いない処置後における、ヒト末梢血単核細胞PBMCからのTNF産生。全ての試料は同一のドナーで試験された。TNFはFACSアレイ上でのサイトメトリックビーズアレイCBAによって測定された。p<0.001、各々のコントロールと比較、2-wayANOVAによって分析各々のデータセットに関してN=約200。表15.PGNを用いた、hBD2を用いた及び用いない処置後における、ヒト末梢血単核細胞PBMCからのIL-10産生;全ての試料は同一のドナーで試験された。TNFはFACSアレイ上でのサイトメトリックビーズアレイCBAによって測定された。p<0.001、各々のコントロールと比較、2-wayANOVAによって分析各々のデータセットに関してN=約200。表16.LPS又はLTAを用いた、hBD2又はTNF阻害のための2つの異なるコントロールデキサメタゾン及びインドメタシンを用いた及び用いない処置後における、ヒト末梢血単核細胞PBMCからのTNF産生;全ての試料は同一のドナーで試験された。TNFはFACSアレイ上でのサイトメトリックビーズアレイCBAによって測定された。下線の引かれた値は各々のコントロール太字と比較して有意に減少した。2-wayANOVAによって分析された各々のデータセットに関してN=約200。表17.LPS又はLTAを用いた、hBD2又は抗炎症効果のための2つの異なるコントロールデキサメタゾン及びインドメタシンを用いた及び用いない処置後における、ヒト末梢血単核細胞PBMCからのIL-10産生;全ての試料は同一のドナーで試験された。IL-10はFACSアレイ上でのサイトメトリックビーズアレイCBAによって測定された。下線の引かれた値は各々のコントロール太字と比較して有意に増加した。2-wayANOVAによって分析された各々のデータセットに関してN=約200。表18.LPS又はLTAを用いた、hBD2又は抗炎症効果のための2つの異なるコントロールデキサメタゾン及びインドメタシンを用いた及び用いない処置後における、ヒト末梢血単核細胞PBMCからのIL-1β産生;全ての試料は同一のドナーで試験された。IL-1βはFACSアレイ上でのサイトメトリックビーズアレイCBAによって測定された。下線の引かれた値は各々のコントロール太字と比較して有意に減少した。2-wayANOVAによって分析された各々のデータセットに関してN=約200。表19.LPS又はLTAを用いた、hBD2を用いた及び用いない処置後における、ヒト単球細胞株MUTZ-3の上清におけるTNF産生。TNFはFACSアレイ上でのサイトメトリックビーズアレイCBAによって測定された。各々のコントロールと比較してp<0.05、p<0.01、各々のコントロールと比較、2-wayANOVAによって分析各々のデータセットに関してN=約200。表20.成熟DCを生じさせるためにLPS又はLTAを用いた、hBD2を用いた及び用いない処置後における、未成熟樹状細胞の上清におけるTNF産生。TNFはFACSアレイ上でのサイトメトリックビーズアレイCBAによって測定された。各々のコントロールと比較して有意に減少、p<0.05、各々のコントロールと比較して有意に減少、p<0.01、2-wayANOVAによって分析された各々のデータセットに関してN=約200。実施例5hBD1、hBD2、hBD3、及びhBD4バリアントの抗炎症活性基本的に実施例4に記載された通りに実施例5を行った。下の表に示した通り、化合物rhBD2は組み換えhBD2であり、そしてそれは実施例4において使用されたhBD2と同一である。下の表に示した通り、化合物hBD1、hBD2、hBD3、及びhBD4バリアントは、化学合成を用いて調製され、そしてPeptideInstituteInc.から得た。組み換えhBD2rhBD2のアミノ酸配列は、化学合成により調製されたhBD2のアミノ酸配列と同一である。下の表で示されたhBD4バリアントは、hBD4のアミノ酸3~39から成り、そして当該アミノ酸の配列は配列番号5に示した通りである。各々の表において、全ての試料は同一のドナーで試験された。SDは標準偏差を意味する。結果表21.LPSを用いた、ヒトベータディフェンシン、デキサメタゾン、又はインフリキシマブを用いた及び用いない処置後における、ヒト末梢血単核細胞PBMCからのTNF産生。TNFはFACSアレイ上でのサイトメトリックビーズアレイCBAによって測定された。p<0.05、p<0.01、p<0.001、2-wayANOVAによって分析、及びBonferroni事後検定によって未処置細胞と比較。表22.LPSを用いた、ヒトベータディフェンシン、デキサメタゾン、又はインフリキシマブを用いた及び用いない処置後における、ヒト末梢血単核細胞PBMCからのIL-10産生。IL-10はFACSアレイ上でのサイトメトリックビーズアレイCBAによって測定された。p<0.05、p<0.01、p<0.001、2-wayANOVAによって分析、及びBonferroni事後検定によって未処置細胞と比較。表23.LPSを用いた、ヒトベータディフェンシン、デキサメタゾン、又はインフリキシマブを用いた及び用いない処置後における、ヒト末梢血単核細胞PBMCからのIL-1β産生。IL-1βはFACSアレイ上でのサイトメトリックビーズアレイCBAによって測定された。p<0.001、2-wayANOVAによって分析、及びBonferroni事後検定によって未処置細胞と比較。hBD1、hBD2、hBD3、及びhBD4バリアントの効果を、LPSで処置された及び処置されていないヒトPBMCで試験した表21、22及び23。比較のために、rhBD2を各々の設定に含めた。全てのディフェンシンに関して、TNFは下方制御された。IL-1β分泌の減少は、TNFと同等であったが、TNFほど顕著ではなかった。hBD2及びhBD4バリアントに関して、IL-10の分泌は、有意に且つ用量依存的に上昇した。hBD3は10μg/ml及び40μg/mlで試験され、並びにhBD4バリアントは40μg/mlで試験された;しかし、これらの濃度においていずれの分子も毒性であったために、毒性効果と抗炎症性効果とを区別することができなかった。TNFの下方制御のポジティブコントロールとして、2つの抗炎症性化合物、デキサメタゾン及びインフリキシマブが当該設定中に含まれた。結論全ての試験されたヒトベータディフェンシンは、抗炎症潜在力を示した。実施例6ヒトの単球由来樹状細胞及びヒトPBMCの、IL-23の減少実施例6は、ヒトPBMCに関して基本的に実施例4で記載された通りに行われた;しかし、読み出しはTNF、IL-1β、及びIL-10の代わりにIL-23であった。さらに、ヒトの単球由来樹状細胞におけるrhBD2の効果が同様に調べられた。単球由来樹状細胞DCの生成DCは、Romanietal.によって初めに記載された改良手順に従って調製された。簡潔に述べると、末梢血単核細胞PBMCは、Ficoll-paqueGE-healthcareグラジエントをかけた遠心分離によって、健常なドナーの軟膜から精製された。製造業者の使用指示に従った、マグネティックビーズDynal,Invitrogenによる、CD14細胞の正の選択によって、単球をPBMCから単離した。CD14単球を、RPMI/2ヒトAB血清、組換え型ヒト顆粒球マクロファージ刺激因子GM-CSF、20ng/ml、及びIL-420ng/mlPeproTech中で6日間、6ウェルプレート中で培養し、2日後、及び5日後に培地/サイトカインを再補充した。培養6日後、未熟DCを96ウェルプレート中で1×106細胞/mlの濃度で再度培養し、そしてさらに24時間、カクテル、及び/又はhBD2で、処置されなかったか、又は処置された。hBD2を4つの濃度で、4通りで試験した。LPS100ng/ml及びIFN-γ20ng/mlを含む炎症性カクテルを用いて、hBD2は、炎症性フェノタイプへのhDC成熟を抑制するその能力を分析された。デキサメタゾンを加え、20時間後に当該カクテルを、臨床的抗炎症活性を有することが証明されている化合物のためのポジティブコントロールとして加えた。hBD2とのインキュベーションを行い、4時間後にカクテルを加えた。サイトカインELISA細胞培養上清を回収し、-80°Cで保存した。製造業者の手順eBioscienceに従って、市販の抗体及びスタンダードを用いた標準的サンドイッチELISAによって、IL-23の量を測定した。MTTアッセイビヒクル、カクテル、又はhBD2を用いた処置によって任意の細胞が大幅に影響を受けるか否かを評価するために、48時間後の細胞の生存の測定において、MTT系細胞増殖決定キットを使用し、製造業者の手順Sigmaに従って行った。統計学的分析全ての実験は少なくとも2回行われ、代表的な結果を示す。示されたデータは、平均±標準誤差SEMとして表現された。表の説明文に記載されたように、変数が処置hBD2、デキサメタゾンなど及び刺激LPS、LTA、ペプチドグリカンなどである、2-wayANOVAを行い、その後Bonferroni事後検定を行うことによって、統計的有意性を決定した。差はp<0.05で有意であると考えられた。結果表24.培地未刺激、又はLPS及びIFN-γのいずれかで刺激され、培地未処置、hBD2、又はデキサメタゾンのいずれかで処置された、ヒトCD14単球由来樹状細胞の上清中のIL-23pg/ml、平均SEM、N=4、3人の内1人の代表的ドナー。p<0.05、p<0.01、p<0.001、2-wayANOVAによって分析、Bonferroni事後検定によって未処置細胞と比較。nd:検出されず検出限界未満。表25.培地コントロール、0.6ng/mlLPS、20ng/mlLPS、又は5μg/mlLTAのいずれかで刺激され、hBD2、デキサメタゾン、又はインフリキシマブで処置された、ヒトPBMCの上清中のIL-23pg/ml、平均SEM。p<0.05、p<0.01、p<0.001、2-wayANOVAによって分析、Dunnett多重比較事後検定によって未処置細胞と比較。表24に示された通り、hBD2は、有意に且つ用量依存的に、ヒトCD14単球由来樹状細胞からのIL-23分泌を抑制した。ヒトPBMCに関して、IL-23分泌はまた、有意に抑制された表25。これらの細胞において、逆の用量依存性が存在し、そしてそれは、より低用量のhBD2を試験したとき、鐘形の用量-反応阻害曲線であることが分かったデータを示さず。これは、IL-23分泌の抑制によって、hBD2が慢性自己免疫状態の抑制効果を有し、したがってIL-23が、炎症性応答において重要な役割を果たすことを示している。Th17細胞は、それらの生存及び増殖に関して、IL-23に依存しており、そしてTh17細胞は、幾つかの自己免疫疾患、例えばクローン病、潰瘍性大腸炎、乾癬、及び多発性硬化症の病因であることが示されている。実施例7マウスベータディフェンシン3mBD3を用いた、PBMCからのTNF分泌の減少実施例7は基本的に、ヒトPBMCに関して、実施例4に記載された通りに行われた。実施例1においてhBD2の産生のために使用された手順と同一のものを使用して、マウスベータディフェンシン3mBD3を調製した。mBD3のアミノ酸配列は配列番号6に示される。マウスPBMCを、以下に記載した通りに調製した。マウス末梢血単核細胞PBMCの単離及び刺激マウス末梢血単核細胞を、10匹のNMRIマウスの血液から単離した。要約すれば、ヘパリン添加血液をRPMIで1/1v/vで希釈し、そして2時間以内でFicoll密度遠心分離にかけた。血漿を上清から回収し、そして廃棄された。単離されたPBMCを培養培地RPMI1640Gibco,42401w/1ペニシリン及びストレプトマイシン並びに1L-グルタミン中で再度懸濁し、そして96ウェル培養プレートに、1ウェルあたり155.500個の細胞で、全体で200μlとなるようにまいた。100、10、又は1μg/mlのhBD2又はmBD3マウスベータディフェンシン3を;それ単体で、又は、20ng/mlのLPSE.coli,O111:B4,SigmaL4391と共に用いて、同一のドナーからのPBMCを刺激した。LPS刺激をした及びしていない培地へ、デキサメサゾンを3.5ng/ml加えた。37°Cで24時間インキュベーション後に上清を回収し、そしてサイトカインの測定まで-80°Cで貯蔵した。FACSアレイフローサイトメーターにおける製造業者の使用説明に従って、マウス炎症サイトメトリックビーズアレイCBAを用いたフローサイトメトリーによって、上清におけるサイトカインの産生を測定した。上清を回収後、生存率をAlamarBlueBiosource,DALL1100によって測定した。結果表26.LPSを用いた、hBD2を用いた及び用いない処置後における、ヒト末梢血単核細胞PBMCからのTNF産生。全ての試料を同一のドナーで試験された。2人のドナーからの代表的実験。TNFはFACSアレイ上でのサイトメトリックビーズアレイCBAによって測定された。p<0.001、各々のコントロールと比較。2-wayANOVAによって分析N=2。表27.LPSを用いた、mBD3を用いた及び用いない処置後における、マウス末梢血単核細胞PBMCからのTNF産生。2匹のドナーからの代表的実験。TNFはFACSアレイ上でのサイトメトリックビーズアレイCBAによって測定された。p<0.001、各々のコントロールと比較。2-wayANOVAによって分析N=2。表26に示された通り、マウスベータディフェンシン3mBD3は、ヒトPBMCからのTNFの分泌を、hBD2及びデキサメタゾンと同程度まで下方制御した。mDB3はまた、マウスPBMCからのTNFの分泌を下方制御した表27。したがってこの設定において、mBD3は、すぐれた抗炎症活性を示した。"