"超分岐ポリグリセロールであって:C1-C20アルキル鎖で誘導体化された超分岐ポリグリセロールを含むコア;及びコアのヒドロキシル基に結合した、少なくとも1の親水性置換基を含むシェルであって、少なくとも1の親水性置換基が以下:-NH2、=NH2、-NH3及び-NR3式中、各Rは、R3が窒素と第4級アミンを形成するよう、独立してC1-C6アルキル基であるか、又は1つのRが独立してC1-C6アルキル基で、且つ2つのRが一緒になってC3-C12環状アルキル基を形成するの1以上から選択される少なくとも1の官能基を含むシェルを含み、超分岐ポリグリセロールが、超分岐ポリグリセロール1モル当たり約1~約200モルの、少なくとも1の官能基を含む、超分岐ポリグリセロール。少なくとも1の官能基が-NH2である、請求項1の超分岐ポリグリセロール。少なくとも1の親水性置換基がメトキシポリエチレングリコールMePEG又はポリエチレングリコールPEGである、請求項1又は2の超分岐ポリグリセロール。少なくとも1の親水性置換基がMePEGである、請求項1、2又は3の超分岐ポリグリセロール。少なくとも1の官能基を、超分岐ポリグリセロール1モル当たり約1モル~約100モル含む、請求項1~4のいずれか1項の超分岐ポリグリセロール。少なくとも1の官能基を、超分岐ポリグリセロール1モル当たり約1モル~約40モル含む、請求項1~5のいずれか1項の超分岐ポリグリセロール。少なくとも1の官能基を、超分岐ポリグリセロール1モル当たり約10モル~約40モル含む、請求項1~6のいずれか1項の超分岐ポリグリセロール。少なくとも1の官能基を、超分岐ポリグリセロール1モル当たり約10モル~約30モル含む、請求項1~7のいずれか1項の超分岐ポリグリセロール。C1-C20アルキル鎖がC5-C20アルキル鎖である、請求項1~8のいずれか1項の超分岐ポリグリセロール。C1-C20アルキル鎖がC8-C18アルキル鎖である、請求項1~9のいずれか1項の超分岐ポリグリセロール。C1-C20アルキル鎖がC8-C10アルキル鎖である、請求項1~10のいずれか1項の超分岐ポリグリセロール。生物学的に活性のある部分を更に含む、請求項1~11のいずれか1項の超分岐ポリグリセロール。生物学的に活性のある部分が疎水性薬物である、請求項12の超分岐ポリグリセロール。生物学的に活性のある部分がタキサン又はその類似体である、請求項12の超分岐ポリグリセロール生物学的に活性のある部分がパクリタキセル又はその類似体である、請求項12の超分岐ポリグリセロール。生物学的に活性のある部分がドセタキセル又はその類似体である、請求項12の超分岐ポリグリセロール。生物学的に活性のある部分がバルルビシンである、請求項12の超分岐ポリグリセロール。生物学的に活性のある部分がビンブラスチンである、請求項12の超分岐ポリグリセロール。生物学的に活性のある部分がマイトマイシン又はその類似体である、請求項12の超分岐ポリグリセロール。生物学的に活性のある部分がシスプラチンである、請求項12の超分岐ポリグリセロール。生物学的に活性のある部分がメトトレキセートである、請求項12の超分岐ポリグリセロール。生物学的に活性のある部分がドキソルビシン又はその類似体である、請求項12の超分岐ポリグリセロール。生物学的に活性のある部分がエピルビシンである、請求項12の超分岐ポリグリセロール。生物学的に活性のある部分がゲムシタビンである、請求項12の超分岐ポリグリセロール。生物学的に活性のある部分がエベロリムスである、請求項12の超分岐ポリグリセロール。生物学的に活性のある部分がスラミンである、請求項12の超分岐ポリグリセロール。生物学的に活性のある部分が、部分の組合せである、請求項12の超分岐ポリグリセロール。部分の組合せがメトトレキセート、ビンブラスチン及びドキソルビシンM-VACである、請求項27の超分岐ポリグリセロール。部分の組合せがM-VAC及びシスプラチンである、請求項27の超分岐ポリグリセロール。少なくとも1の親水性置換基の1部がコア中に位置し得る、請求項1~29のいずれか1項の超分岐ポリグリセロール。組織における薬物drup取り込みを増加させるための前処理又は共処理としての使用のための、超分岐ポリグリセロールの使用であって、当該超分岐ポリグリセロールが:超分岐ポリグリセロールを含むコア;及びコアのヒドロキシル基に結合した、少なくとも1の親水性置換基を含むシェルであって、少なくとも1の親水性置換基が以下:-NH2、=NH2、-NH3及び-NR3式中、各Rは、R3が窒素と第4級アミンを形成するよう、独立してC1-C6アルキル基であるか、又は1つのRが独立してC1-C6アルキル基で、且つ2つのRが一緒になってC3-C12環状アルキル基を形成するの1以上から選択される少なくとも1の官能基を含むシェルを含み、当該超分岐ポリグリセロールが、超分岐ポリグリセロール1モル当たり約1~約200モルの、少なくとも1の官能基を含む、使用。コアがC1-C20アルキル鎖で更に誘導体化される、請求項31の使用。少なくとも1の官能基が-NH2である、請求項31又は32の使用。少なくとも1の親水性置換基がメトキシポリエチレングリコールMePEG又はポリエチレングリコールPEGである、請求項31、32又は33の使用。少なくとも1の親水性置換基がMePEGである、請求項31~34のいずれか1項の使用。超分岐ポリグリセロールが、少なくとも1の官能基を超分岐ポリグリセロール1モル当たり約1モル~約100モル含む、請求項31~35のいずれか1項の使用。超分岐ポリグリセロールが、少なくとも1の官能基を超分岐ポリグリセロール1モル当たり約1モル~約40モル含む、請求項31~36のいずれか1項の使用。超分岐ポリグリセロールが、少なくとも1の官能基を超分岐ポリグリセロール1モル当たり約10モル~約40モル含む、請求項31~37のいずれか1項の使用。超分岐ポリグリセロールが、少なくとも1の官能基を超分岐ポリグリセロール1モル当たり約10モル~約30モル含む、請求項31~38のいずれか1項の使用。C1-C20アルキル鎖がC5-C20アルキル鎖である、請求項31~39のいずれか1項の使用。C1-C20アルキル鎖がC8-C18アルキル鎖である、請求項31~40のいずれか1項の使用。C1-C20アルキル鎖がC8-C10アルキル鎖である、請求項31~41のいずれか1項の使用。組織における薬物取り込みを増加させるための前処理又は共処理として使用するための超分岐ポリグリセロールであって、超分岐ポリグリセロールを含むコア;及びコアのヒドロキシル基に結合した、少なくとも1の親水性置換基を含むシェルであって、少なくとも1の親水性置換基が以下:-NH2、=NH2、-NH3及び-NR3式中、各Rは、R3が窒素と第4級アミンを形成するよう、独立してC1-C6アルキル基であるか、又は1つのRが独立してC1-C6アルキル基で、且つ2つのRが一緒になってC3-C12環状アルキル基を形成するの1以上から選択される少なくとも1の官能基を含むシェルを含み、当該超分岐ポリグリセロールが、超分岐ポリグリセロール1モル当たり約1~約200モルの、少なくとも1の官能基を含む、超分岐ポリグリセロール。コアがC1-C20アルキル鎖で更に誘導体化された、請求項43の超分岐ポリグリセロール。少なくとも1の官能基が-NH2である、請求項43又は44の超分岐ポリグリセロール。少なくとも1の親水性置換基がメトキシポリエチレングリコールMePEG又はポリエチレングリコールPEGPEGMePEG,orPEGである、請求項43、44又は45の超分岐ポリグリセロール。少なくとも1の親水性置換基がMePEGである、請求項43~46のいずれか1項の超分岐ポリグリセロール。少なくとも1の官能基を、超分岐ポリグリセロール1モル当たり約1モル~約100モル含む、請求項43~47のいずれか1項の超分岐ポリグリセロール。少なくとも1の官能基を、超分岐ポリグリセロール1モル当たり約1モル~約40モル含む、請求項43~48のいずれか1項の超分岐ポリグリセロール。少なくとも1の官能基を、超分岐ポリグリセロール1モル当たり約10モル~約40モル含む、請求項43~49のいずれか1項の超分岐ポリグリセロール。少なくとも1の官能基を、超分岐ポリグリセロール1モル当たり約10モル~約30モル含む、請求項43~50のいずれか1項の超分岐ポリグリセロール。C1-C20アルキル鎖がC5-C20アルキル鎖である、請求項43~51のいずれか1項の超分岐ポリグリセロール。C1-C20アルキル鎖がC8-C18アルキル鎖である、請求項43~52のいずれか1項の超分岐ポリグリセロール。超分岐ポリグリセロールであって、当該超分岐ポリグリセロールが:C1-C20アルキル鎖で誘導体化された超分岐ポリグリセロールを含むコアであって、グリセロール単位に対するC1-C20アルキル鎖の比が、コアの周縁部と比較して、コアの中心部でより大きいコア;及びコアのヒドロキシル基に結合した、少なくとも1の親水性置換基を含むシェルを含み、当該超分岐ポリグリセロールが、超分岐ポリグリセロール1モル当たり約1~約200モルの、少なくとも1の親水性置換基を含む、超分岐ポリグリセロール。生物学的に活性のある部分を更に含む、請求項54の超分岐ポリグリセロール。生物学的に活性のある部分が疎水性薬物である、請求項55の超分岐ポリグリセロール。生物学的に活性のある部分がタキサン又はその類似体である、請求項55の超分岐ポリグリセロール。生物学的に活性のある部分がパクリタキセル又はその類似体である、請求項55の超分岐ポリグリセロール。生物学的に活性のある部分がドセタキセル又はその類似体である、請求項55の超分岐ポリグリセロール。生物学的に活性のある部分がバルルビシンである、請求項55の超分岐ポリグリセロール。生物学的に活性のある部分がビンブラスチンである、請求項55の超分岐ポリグリセロール。生物学的に活性のある部分がマイトマイシン又はその類似体である、請求項55の超分岐ポリグリセロール。生物学的に活性のある部分がシスプラチンである、請求項55の超分岐ポリグリセロール。生物学的に活性のある部分がメトトレキセートである、請求項55の超分岐ポリグリセロール。生物学的に活性のある部分がドキソルビシン又はその類似体である、請求項55の超分岐ポリグリセロール。生物学的に活性のある部分がエピルビシンである、請求項55の超分岐ポリグリセロール。生物学的に活性のある部分がゲムシタビンである、請求項55の超分岐ポリグリセロール。生物学的に活性のある部分がエベロリムスである、請求項55の超分岐ポリグリセロール。生物学的に活性のある部分がスラミンである、請求項55の超分岐ポリグリセロール。生物学的に活性のある部分が、部分の組合せである、請求項55の超分岐ポリグリセロール。部分の組合せがメトトレキセート、ビンブラスチン及びドキソルビシンM-VACである、請求項70の超分岐ポリグリセロール。部分の組合せがM-VAC及びシスプラチンである、請求項70の超分岐ポリグリセロール。少なくとも1の親水性置換基がメトキシポリエチレングリコールMePEG又はポリエチレングリコールPEGである、請求項54~72のいずれか1項の超分岐ポリグリセロール。少なくとも1の親水性置換基が、-OH、-COOH、-NHS、-SH、-NH2、-NH3又は-NR3式中、各Rは、R3が窒素と第4級アミンを形成するよう、独立してC1-C6アルキル基であるか、又は1つのRが独立してC1-C6アルキル基で、且つ2つのRが一緒になってC3-C12環状アルキル基を形成するである少なくとも1の官能基を含む、請求項54~73のいずれか1項の超分岐ポリグリセロール。少なくとも1の親水性置換基を、超分岐ポリグリセロール1モル当たり約1モル~約100モル含む、請求項54~74のいずれか1項の超分岐ポリグリセロール。少なくとも1の親水性置換基を、超分岐ポリグリセロール1モル当たり約1モル~約40モル含む、請求項54~75のいずれか1項の超分岐ポリグリセロール。少なくとも1の親水性置換基を、超分岐ポリグリセロール1モル当たり約10モル~約40モル含む、請求項54~76のいずれか1項の超分岐ポリグリセロール。少なくとも1の親水性置換基を、超分岐ポリグリセロール1モル当たり約10モル~約30モル含む、請求項54~77のいずれか1項の超分岐ポリグリセロール。C1-C20アルキル鎖がC5-C20アルキル鎖である、請求項54~78のいずれか1項の超分岐ポリグリセロール。C1-C20アルキル鎖がC8-C18アルキル鎖である、請求項54~79のいずれか1項の超分岐ポリグリセロール。C1-C20アルキル鎖がC8-C10アルキル鎖である、請求項54~80のいずれか1項の超分岐ポリグリセロール。少なくとも1の親水性置換基の1部がコア中に位置する、請求項54~81のいずれか1項の超分岐ポリグリセロール。生物学的に活性のある部分の、生物の組織への送達方法であって、当該方法は:生物学的に活性のある部分をロードした超分岐ポリグリセロールを生物の組織に投与することを含み、当該超分岐ポリグリセロールは:C1-C20アルキル鎖で誘導体化された超分岐ポリグリセロールを含むコアであって、グリセロール単位に対するC1-C20アルキル鎖の比が、コアの周縁部と比較して、コアの中心部でより大きいコア;及びコアのヒドロキシル基に結合した少なくとも1の親水性置換基を含むシェルを含む超分岐ポリグリセロールであって、超分岐ポリグリセロールが、超分岐ポリグリセロール1モル当たり約1~約200モルの、少なくとも1の親水性置換基を含む、方法。超分岐ポリグリセロールに生物学的に活性のある部分を組み込むことを更に含む、請求項83の方法。生物学的に活性のある部分が疎水性薬物である、請求項83又は84の方法。生物学的に活性のある部分がタキサン又はその類似体である、請求項83又は84の方法。生物学的に活性のある部分がドセタキセル又はその類似体である、請求項83又は84の方法。生物学的に活性のある部分がパクリタキセル又はその類似体である、請求項83又は84の方法。生物学的に活性のある部分がバルルビシンである、請求項83又は84の方法。生物学的に活性のある部分がビンブラスチンである、請求項83又は84の方法。生物学的に活性のある部分がマイトマイシン又はその類似体である、請求項83又は84の方法。生物学的に活性のある部分がシスプラチンである、請求項83又は84の方法。生物学的に活性のある部分がメトトレキセートである、請求項83又は84の方法。生物学的に活性のある部分がドキソルビシン又はその類似体である、請求項83又は84の方法。生物学的に活性のある部分がエピルビシンである、請求項83又は84の方法。生物学的に活性のある部分がゲムシタビンである、請求項83又は84の方法。生物学的に活性のある部分がエベロリムスである、請求項83又は84の方法。生物学的に活性のある部分がスラミンである、請求項83又は84の方法。生物学的に活性のある部分が、部分の組合せである、請求項83又は84の方法。部分の組合せがメトトレキセート、ビンブラスチン及びドキソルビシンM-VACである、請求項99の方法。部分の組合せがM-VAC及びシスプラチンである、請求項99の方法。生物の組織が粘膜である、請求項83~101のいずれか1項の方法。生物の組織が細胞である、請求項83~101のいずれか1項の方法。生物の組織が膀胱の尿路上皮表面である、請求項83~101のいずれか1項の方法。生物学的に活性のある部分を生物の組織へ送達するための、超分岐ポリグリセロールの使用であって、当該超分岐ポリグリセロールは:C1-C20アルキル鎖で誘導体化された超分岐ポリグリセロールを含むコアであって、グリセロール単位に対するC1-C20アルキル鎖の比が、コアの周縁部と比較して、コアの中心部でより大きいコア;及びコアのヒドロキシル基に結合した、少なくとも1の親水性置換基を含むシェルを含み、当該超分岐ポリグリセロールが、超分岐ポリグリセロール1モル当たり約1~約200モルの、少なくとも1の官能基を含む、使用。生物学的に活性のある部分を生物の組織へ送達するための薬剤を調製するための、超分岐ポリグリセロールの使用であって、当該超分岐ポリグリセロールは:C1-C20アルキル鎖で誘導体化された超分岐ポリグリセロールを含むコアであって、グリセロール単位に対するC1-C20アルキル鎖の比が、コアの周縁部と比較して、コアの中心部でより大きいコア;及びコアのヒドロキシル基に結合した、少なくとも1の親水性置換基を含むシェルを含み、当該超分岐ポリグリセロールが、超分岐ポリグリセロール1モル当たり約1~約200モルの、少なくとも1の官能基を含む、使用。超分岐ポリグリセロール及び生物学的に活性のある部分を含む医薬組成物であって、当該超分岐ポリグリセロールは:C1-C20アルキル鎖で誘導体化された超分岐ポリグリセロールを含むコアであって、グリセロール単位に対するC1-C20アルキル鎖の比が、コアの周縁部と比較して、コアの中心部でより大きいコア;及びコアのヒドロキシル基に結合した、少なくとも1の親水性置換基を含むシェルを含み、当該超分岐ポリグリセロールが、超分岐ポリグリセロール1モル当たり約1~約200モルの、少なくとも1の官能基を含む、医薬組成物。超分岐ポリグリセロールであって、当該超分岐ポリグリセロールは:グリセロールエポキシド及びC1-C20アルキルエポキシド又はC1-C20アルキルグリシジルエーテルから重合された超分岐ポリグリセロールを含むコアであって、すべての、又は実質的にすべてのC1-C20アルキルエポキシド又はC1-C20アルキルグリシジルエーテルが、すべての、又は実質的にすべてのグリセロールエポキシドが重合される前に重合されるコア;及びコアのヒドロキシル基に共有結合的に結合した、少なくとも1の親水性置換基を含むシェルを含み、当該超分岐ポリグリセロールが、超分岐ポリグリセロール1モル当たり約1~約200モルの、少なくとも1の官能基を含む、超分岐ポリグリセロール。グリセロールエポキシドがグリシドールである、請求項108の超分岐ポリグリセロール。C1-C20アルキルエポキシドが1,2-エポキシオクタデカンである、請求項108又は109の超分岐ポリグリセロール。C1-C20アルキルグリシジルエーテルがC8-C10アルキルグリシジルエーテルである、請求項108又は109の超分岐ポリグリセロール。超分岐ポリグリセロールの合成方法であって、当該方法は:グリセロールエポキシド及びC1-C20アルキルエポキシド又はC1-C20アルキルグリシジルエーテルを、すべての、又は実質的にすべてのC1-C20アルキルエポキシド又はC1-C20アルキルグリシジルエーテルが、すべての、又は実質的にすべてのグリセロールエポキシドが重合されて超分岐ポリグリセロールを形成する前に重合されるように重合すること;及び超分岐ポリグリセロールのヒドロキシル基を、少なくとも1の親水性置換基で誘導体化することを含み、、当該超分岐ポリグリセロールが、超分岐ポリグリセロール1モル当たり約1~約200モルの、少なくとも1の官能基を含む、方法。超分岐ポリグリセロールであって、当該超分岐ポリグリセロールは:C1-C20アルキル鎖で誘導体化し、ドセタキセルをロードした超分岐ポリグリセロールを含むコア;及びコアのヒドロキシル基に結合した少なくとも1の親水性置換基を含むシェルを含み、当該超分岐ポリグリセロールが、超分岐ポリグリセロール1モル当たり約1~約200モルの、少なくとも1の官能基を含む、超分岐ポリグリセロール。ドセタキセルを生物の組織へ送達するための、超分岐ポリグリセロールの使用であって、当該超分岐ポリグリセロールは:C1-C20アルキル鎖で誘導体化し、ドセタキセルをロードした超分岐ポリグリセロールを含むコア;及びコアのヒドロキシル基に結合した、少なくとも1の親水性置換基を含むシェルを含み、当該超分岐ポリグリセロールが、超分岐ポリグリセロール1モル当たり約1~約200モルの、少なくとも1の官能基を含む、使用。本明細書中に記載された新規ポリマー類としては、式Iに示されるものが挙げられ、すべてHPGに関連すると考えられる。HPGの合成は、両親媒性コポリマー類及び両親媒性ブロックコポリマー類の製造、様々な官能基での誘導体化並びに/或いはコポリマー類及びブロックコポリマー類の製造エステル結合を通したアルキル基の付加及びポリアルキレングリコール基の付加等を含め、以前に記載されている。HPGの調製を記載した刊行物としては、米国特許第5,112,876号;米国特許6,469,218号;米国特許第6,765,082号;米国特許第6,822,068号;国際公開第2000/77070号;Sunder,A.etal.1999Macromolecules32:4240-46,2000Macromolecules33:309-14,2000Macromolecules33:1330-37,および2000Adv.Mater12:235-239;Knischaka,R.etal.,2000Macromolecules33:315-20;Haag,R.,etal.2000Macromolecules33:8158-66,および2002J.Comb.Chem.4:112-19;Kautz,H.,etal.2001Macromol.Symp.163:67-73;Karger-Kocsis,J.,etal.2004Polymer,45:1185-95;Gao,C.Yan,D.2004Prog.Polym.Sci.29:183-275;及びTziveleka,L.etal.,2006Macromol.Biosci.6:161-169が挙げられる。Sunder,A.etal.,1999Angew.Chem.Int.Ed.38:3552-55には、両親媒性修飾されたHPGの調製及び様々な置換基及び官能基による誘導体化を含め、当該ポリマー類の誘導体化の記載が含まれている。本明細書中に記載のdHPG類としては、C1-C30アルキル鎖又は他の類似したアルキル鎖が挙げられ得る。しかし、本明細書中に記載のdHPG類としては、C1-C20アルキル鎖又は他の類似したアルキル鎖も挙げられ得る。用語アルキルは、当業者に通常理解されているように用いられ、他に定義されない限り、多くの場合、1~20個の炭素原子を有する1価の飽和脂肪族ヒドロカルビル基を指す。炭化水素は直鎖又は分枝鎖のいずれかであり得、環状脂肪族置換基又はアリ-ル置換基を含有し得る。アルキル鎖は、1以上のC1-C20アルキル鎖から選択され得る。或いは、アルキル鎖は1以上のC2-C19又はC3-C18又はC4-C17アルキル鎖から選択され得る。或いは、アルキル鎖は1以上のC5-C16又はC6-C15又はC7-C14アルキル鎖から選択され得る。或いは、アルキル鎖は1以上のC8-C13又はC9-C12又はC10-C15アルキル鎖から選択され得る。或いは、アルキル鎖は1以上のC5-C15又はC5-C10又はC5-C20アルキル鎖から選択され得る。コア用に選択されるアルキル鎖又はアルキル鎖複数は、意図されるdHPGの使用に左右され得る。例えば、パクリタキセルのロードにとっては、C18アルキルはC8/10アルキルほどよく功を奏さなかった。本明細書中に記載のHPG類としては、誘導体化されたHPG類dHPG類が粘膜付着性、より一般的には、生物付着性であるように、官能基を有する置換基で誘導体化されたHPG類が挙げられ得る。本用語の最も一般的な意味においては、dHPG類は生物の組織と結合を形成するか、又は相互作用し、当該組織は細胞又は細胞外マトリクスであり得る。結合又は相互作用は、任意のタイプのものであり得、ファンデルワールス相互作用、水素結合、静電的相互作用、イオン結合又は共有結合が挙げられる。用語粘膜付着又は粘膜付着性は、当業者に通常理解されているように用いられ、多くの場合、ポリマー物質と、細胞表面、細胞表面の粘膜又は粘膜を覆う粘膜-ゲル層が挙げられ得る、生物の組織との間に生じる付着現象を指す。膀胱の尿路上皮表面にはムチンが存在するので、粘膜付着性官能基を含有するdHPG類は、膀胱表面及び他の粘膜へ向けた薬物送達に用いられ得る。一般的に、本明細書中に記載のdHPG類はコアを有し、当該コアはand開始剤例えば、トリメチロイルプロパンTMP及び超分岐ポリグリセロールを含む。1つの実施形態においては、超分岐ポリグリセロールのコアはC1-C20アルキル鎖で誘導体化され得る。1つの実施形態においては、コアはシェル中に内包され得、当該シェルは、コアのヒドロキシル基に結合した少なくとも1の親水性置換基を含み、且つ当該超分岐グリセロールは、超分岐ポリグリセロール1モル当たり約1~約200モルの、少なくとも1の親水性置換基を含む。本明細書中で用いる場合、開始剤は、アルキル成分及び、1以上であるが、好ましくは2以上のヒドロキシル基を含む小分子として定義される。しかし、開始剤は3以上又は4以上のヒドロキシル基を有し得る。開始剤の例はトリメチロイルプロパンTMPである。本明細書中で用いる場合、凝集コアは、グリセロール単位に対するC1-C20アルキル鎖の比率が、コアの周縁部と比較して、コアの中心部で高いコアとして定義される。例えば、C10アルキル鎖は、超分岐構造全体の至る所で、グリセロールに対して一様に分布せず、むしろシェル置換基にじかに隣接するその周縁部付近よりも、超分岐コア構造の中心部例えば、開始剤隣接部で濃縮されるように分布するように、当該構造に組み込まれ得る。コア構造が凝集される程度は、試薬の添加により制御され得る。用語中心部は、体積点が0である正確な中心部であるとして定義され得る。或いは、dHPGは半径rを有し得、グリセロールに対するアルキルの比率が、半径rcを有する中心部体積rc<rである中で、当該dHPG全体中の全般的な、グリセロールに対するアルキルの比率よりも高い。標準regularコア又は通常normalコアに関しては、グリセロールエポキシド超分岐成分のモノマー及びアルキルエポキシドコアに疎水特性を与えるが、反応の間中一定の比率で加えられ得る。凝集コアに関しては、反応の最初期段階で加えられるアルキルエポキシドの割合が高く、反応のより後の段階では低い割合ゼロと同じ位低い割合に低減される。当該低減は、継続してなされてもよく、又は別の段階でなされてもよい最低で2つの段階がある。コアの構造は成分の付加速度の観点から定義することができる。例えば、凝集コアのポリマーは、複数の段階で合成することができ、各段階が所定の比率のコアモノマー1つがグリセロールエポキシドで、他が疎水性のアルキルエポキシドである類を有する。凝集コア分子は、より前の段階において加えられるアルキルエポキシドの比率を、より後か、又は最後の段階にわたって加えられる当該成分の比率と比較してより高くすることにより、作製することができる。或いは、比率は、反応の最初又はより前の時間に、加えるグリセロールエポキシドに対する、アルキルエポキシドの比率を、より後の時間にわたって加えるよりも高くするように、タイムコースにわたって改変することができる。当該アプローチにおいては、反応の間中、グラジエントとして、絶えず比率を変化させることができる。ポリマーの残りのヒドロキシル基は、MePEG又はPEG等の他の親水性置換基で誘導体化されて、ヒドロキシル、カルボキシル、アミン第1級アミン、第2級アミン及び第3級アミンを含む、NHS、エーテル、チオール、ハロ、チオエーテル、エステル、チオエステル、アミド、スクシンイミド及び同様の他の官能基を有する置換基を含む、親水性のシェルを形成し得る。シェルの形成の間に、シェルの置換基の一部を、ポリマーの中心方向に位置するヒドロキシル基と反応させることが可能であり得る。たとえ当該反応が起こっても、コアは、その疎水的特徴を維持する。本明細書中で用いる場合、用語両親媒性又は両親媒性ポリマーは、当業者に通常理解されているように用いられ、多くの場合、1つの分子中に疎水性部分及び親水性部分の両方が存在していることを指す。疎水性は任意の物質又はその部分が極性溶媒中よりも非極性溶媒中で可溶であることを指す。疎水性は、長鎖の飽和又は不飽和脂肪族炭化水素基及び1以上の芳香族基、環状脂肪族基又は複素環基で置換された当該基が挙げられるが、これらに限定されない無極性基を分子中に含有することによって付与され得る。親水性は任意の物質又はその部分が非極性溶媒中よりも極性溶媒中で可溶であることを指す。親水特性は、炭化水素、リン酸、カルボキシル、硫酸、アミノ、スルフヒドリル、ニトロ、ヒドロキシル及び同様の他の基等の、極性基又は帯電基の存在に由来する。親水性部分はMePEG、アミン、カルボン酸又はNHSを含み得る。用語ポリエチレングリコール又はPEGは、当業者に通常理解されているように用いられ、多くの場合、ポリマー鎖中のエチレンオキシド単位数に依存して、分子量が約200~約20,000であるような化合物等を指す。好ましい分子量は約200~約400、約200~約1000及び約200~約2000であるが、分子量約2000~約8000のものも用いられ得る。用語メトキシポリエチレンオキシド又はMePEGは、当業者に通常理解されているように用いられ、多くの場合、ポリマー鎖中のエチレンオキシド単位数に依存して、分子量が約350~約10,000であるような化合物等を指す。好ましい分子量は約350~約550、約350~約750及び約350~約2000であるが、分子量約2000~約5000のものも用いられ得る。句局所送達又は標的送達は、当業者に通常理解されているように用いられ、多くの場合、生物内の標的部位に、化合物を直接送達することを指す。いくつかの実施形態においては、本明細書中に記載のdHPG類は、尿路例えば、尿道及び膀胱、消化管例えば、口、食道及び結腸、気道例えば、鼻及び肺、膣腔及び頸部並びに腹膜腔の適応症の局所治療又は標的治療に用いられ得、癌例えば、膀胱癌、胃癌、食道癌、肺癌、喉頭癌、口腔癌、副鼻腔癌、膣癌又は子宮頸癌、感染例えば、消化管又は気道の感染及び炎症性疾患又は自己免疫疾患例えば、膀胱刺激症状、炎症性大腸炎、或いは慢性又は急性の炎症並びに、薬剤又は他の生物学的に活性のある部分を組織又は細胞に送達することが望まれる他の適応疾患等の適応疾患を治療する。例えば、本明細書中に記載のdHPG類は、筋層非浸潤性の膀胱癌の局所治療又は標的治療に用いられ得る。いくつかの実施形態においては、本明細書中に記載のポリマー類は、本明細書中に列挙される1以上の適応疾患例えば、筋層非浸潤性の膀胱癌の局所治療又は標的治療のための薬剤又は組成物の調製に用いられ得る。本発明のいくつかの態様により、本明細書中に記載のdHPG類及び医薬上許容される賦形剤又は担体を含む組成物が使用される。本明細書中に列挙される1以上の適応疾患例えば、筋層非浸潤性の膀胱癌の治療方法も提供される。当該方法は、本明細書中に記載のdHPG又は本明細書中に記載のdHPGの組成物、或いは有効量の本明細書中に記載のdHPG又は本明細書中に記載のdHPGの組成物dHPGには生物学的に活性のある剤が組み込まれるを、それらを必要とする被験体に投与することを含み得る。いくつかの実施形態においては、本明細書中に記載されたdHPG類は、組織における薬物の取り込みを増加させるための前処理又は共処理として用いられ得る。いくつかの実施形態においては、本明細書中に記載のdHPG類は、尿路例えば、尿道及び膀胱、消化管例えば、口、食道及び結腸、気道例えば、鼻及び肺、膣腔及び頸部並びに腹膜腔の適応症の局所治療又は標的治療に用いられ得、癌例えば、膀胱癌、胃癌、食道癌、肺癌、喉頭癌、口腔癌、副鼻腔癌、膣癌又は子宮頸癌、感染例えば、消化管又は気道の感染及び炎症性疾患又は自己免疫疾患例えば、膀胱刺激症状、炎症性大腸炎、或いは慢性又は急性の炎症並びに、薬剤又は他の生物学的に活性のある部分を組織又は細胞に送達することが望まれる他の適応疾患等の適応疾患の局所治療又は標的治療のための薬物の取り込みを増加させるための前処理又は共処理として用いられ得る。例えば、本明細書中に記載のdHPG類は、筋層非浸潤性の膀胱癌の局所治療又は標的治療のための薬物の取り込みを増加させるための前処理又は共処理として用いられ得る。いくつかの実施形態においては、本明細書中に記載のdHPG類は、組織における薬物取り込みを増加させるための前処理として用いられ得る。いくつかの実施形態においては、本明細書中に記載のdHPG類は、組織における薬物取り込みを増加させるための共処理として用いられ得る。1つの実施形態においては、共処理としてのdHPG類の使用としては、薬物又は生物学的に活性のある部分による処理の間、薬物又は生物学的に活性のある部分が、dHPGにロードされない場合が挙げられ得る。1つの実施形態においては、共処理としてのdHPG類の使用としては、薬物又は生物学的に活性のある部分による処理の間、薬物又は生物学的に活性のある部分の一部又は全部が、dHPGにロードされる場合が挙げられ得る。いくつかの実施形態においては、本明細書中に記載のdHPG類は、組織における薬物取り込みを増加させるための前処理及び共処理として用いられ得る。いくつかの実施形態においては、本明細書中に記載のdHPG類は、前処理又は共処理無しの組織における薬物取り込みに比較して、組織において薬物取り込みを増加させるための前処理又は共処理として用いられ得る。いくつかの実施形態においては、本明細書中に記載のdHPG類は、組織の壊死及び/又は炎症を惹起することなく、組織において薬物取り込みを増加させるための前処理及び共処理として用いられ得る。いくつかの実施形態においては、組織における薬物取り込みを増加させることには、アンブレラ細胞喪失を惹起することが含まれ得る。いくつかの実施形態においては、組織における薬物取り込みを増加させることには、組織の壊死及び/又は炎症を惹起することなく、アンブレラ細胞喪失を惹起することを含み得る。いくつかの実施形態においては、アンブレラ細胞は、膀胱の尿路上皮表面のアンブレラ細胞であり得る。表現薬物取り込みの増加は、当業者に通常理解されているように用いられ、多くの場合、細胞内又は組織内において、薬物の濃度又は蓄積を増加させることを指す。いくつかの実施形態においては、薬物取り込みの増加は、dHPG類を前処理又は共処理として用い、薬物取り込みのCavgの増加を、前処理又は共処理がないときの薬物取り込みのCavgと比較する観点から、測定し得る。当業者は、Cavgは組織の深度の、種々の範囲又は種々のポイントで測定し得ると理解するであろう。例えば、Cavgは0>3350、0>1500、200>3350又は200>1500μmの範囲の組織深度について測定し得る。1つの実施形態においては、dHPG類を前処理又は共処理として用いる、薬物取り込みのCavgは、前処理又は共処理がないときの薬物取り込みのCavgと比較して、1.3~4.0、1.8~2.8、1.3~2.4、2.0~2.6、1.5、1.8、2、2.2、2.4、2.6、2.8、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8又は4.0倍だけ増加し得る。いくつかの実施形態においては、薬物取り込みの増加は、dHPG類を前処理又は共処理として用い、薬物取り込みのCmaxの増加を、前処理又は共処理がないときの薬物取り込みのCmaxと比較する観点から、測定し得る。1つの実施形態においては、dHPG類を前処理又は共処理として用いる、薬物取り込みのCmaxは、前処理又は共処理がないときの薬物取り込みのCmaxと比較して、1.3~4.0、1.8~2.8、1.3~2.4、2.0~2.6、1.5、1.8、2、2.2、2.4、2.6、2.8、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8又は4.0倍だけ増加し得る。いくつかの実施形態においては、薬物取り込みの増加は、dHPG類を前処理又は共処理として用い、薬物取り込みのAUCx-yの増加を、前処理又は共処理がないときの薬物取り込みのAUCx-yと比較する観点から、測定し得る。当業者は、AUCx-yは組織の深度の、種々の範囲又は種々のポイントで測定し得ると理解するであろう。例えば、AUCx-yは0>無限、0>3350、0>1500、200>無限、200>3350又は200>1500μmの範囲の組織深度について測定し得る。1つの実施形態においては、dHPG類を前処理又は共処理として用いる、薬物取り込みのAUCx-yは、前処理又は共処理がないときの薬物取り込みのAUCx-yと比較して、1.3~4.0、1.8~2.8、1.3~2.4、2.0~2.6、1.5、1.8、2、2.2、2.4、2.6、2.8、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8又は4.0倍だけ増加し得る。当業者は、薬物取り込み増加の測定に関しては、例えば、Grabnaretal.InternationalJournalofPharmaceutics2562003167-173中で報告された通り、前処理又は共処理の存在下又は非存在下で、透過性の比として算出される透過性亢進比率Rが、代替法に用いられ得ると理解するであろう。いくつかの実施形態においては、本明細書中に記載のdHPG類は溶媒付加型であり得る。dHPG類は、典型的には重量パーセント又は体積パーセントで表された非化学量論的な量の溶媒、水及び/又は緩衝液と結合し得る。溶媒は、例えば、エタノール、DMSO、プロピレングリコール、グリセロール、PEG200、PEG300、トランスクトール又はソルトールを含む、医薬的に許容可能な溶媒又は他の生体適合性を有する溶媒であり得るが、これらに限定されない。当該実施形態では、本明細書中に記載のdHPG類は、本明細書中に説明又は記載されたものを含む、ありえる全ての立体化学的な代替物を含む。いくつかの実施形態においては、本明細書中に記載のdHPG類は、種々の分岐パターンを有する幾何異性体等の異性体を含む。本明細書中に開示した方法により合成されたdHPG類は、ランダムに分岐したHPG類であり、完全に反応した例、3方向に連結したグリセロールモノマー類又は部分的に反応した、他のモノマーに1又は2方向で連結したグリセロールモノマー類を含有する。各分岐構造の存在は、分析的技術例えば、2DNMRHSQC実験により、確認され得る。本明細書中に記載した、いくつかの実施形態による組成物又はdHPG類は、任意の、様々な公知の経路で投与し得る。dHPG類は、膀胱内投与用溶液として、又は洗い流し液経口洗い流し液、腹膜内洗浄液或いは鼻腔又は膣腔の洗浄液を含む、点眼液、嚥下される経口液、エアロゾル、又はスプレーとして吸入するための溶液、又は粘膜表面等の、生物の組織の近接部に挿入される半固体として機能するよう作り出された、他の組成物中において投与され得る。本明細書中に記載の、薬物又は他の生物学的に活性のある薬剤を組み込んだdHPG類の送達を、薬物送達が望まれる標的組織又は標的細胞に限定することには、恩恵があり得ると理解される。例えば、本明細書中に記載の、生物学的に活性のある薬剤を組み込んだdHPG類の、筋層非浸潤性の膀胱癌に罹患しているか、又は罹患が疑われる被験者中の膀胱尿路上皮表面への選択的送達により、体内の他の組織において深刻な副作用をもたらすことなく、治療効果を提供し得ることが期待される。本明細書中に記載の、タキサンを組み込んだdHPGの投与に好適であり得る方法の例は、膀胱内注入である。膀胱内注入は、本明細書中に記載のdHPGの投与の、組織における薬物取り込みの増加のための前処理又は共処理としての使用のために好適であり得る方法の例でもある。膀胱内注入は、膀胱等の嚢に、溶液を挿入する薬物送達手段である。膀胱への送達においては、典型的には、尿道を通して膀胱へ挿入されたカテーテルによって、溶液が投与される。溶液は注入され、典型的には約1又は約2時間等の時間、膀胱中に保持される。典型的な注入量は、約10~約50mLの範囲である。滞留時間後、当該量の溶液及び溶液を希釈して蓄積したあらゆる尿が排出されて手順が終了する。薬物の大部分は排出段階の間に除去されるので、滞留時間は、膀胱内治療の間の、薬物への最長暴露時間を表す。組織への局所送達を促進する組成物又は方法の他の例は、当業者にとっては明らかである。例えば、本明細書中に記載のdHPG類は、dHPGがタキサン又は他の疎水性薬物を、HPG中へ製剤化することもできる別の薬物とともにdHPGのコア中に含有する医薬組成物中で用いられ得るmaybeusedcouldbeし、又は当該別の薬物は、送達用の溶液中でdHPGと併用され得る。更に、dHPG類は標的化剤例えば、上皮細胞増殖因子受容体膀胱腫瘍において過剰発現するに対する抗体、ハーセプチン、又はVEGFと併用し得る。好適な医薬組成物が、当該技術分野において公知の手段により調製され得、それらの投与態様及び投与量が、技能を持つ実践者により決定され得る。膀胱内注入については、生物学的に活性のある剤を組み込んだdHPGは、水、水を含有する共溶媒システム、通常の生理食塩水又は水中5デキストロース等の等張水溶液又はpHをpH約6~8等の好ましいレベル或いは他の好的な範囲例、pH約4~6又はpH8超に制御するために緩衝化されたシステム等の、注入ビヒクル中に溶解され得る。pHは、薬物放出動態、薬物安定性、最大粘膜付着性、最大溶解度又はそれらの組合せ、の最適化に恩恵を供与するよう、特定の範囲で制御され得る。水溶性薬物の送達システムの投与用に用いられる、他の医薬的に許容可能なビヒクルも検討され得る。当業者に公知の、多くの技術がRemington:theSciencePracticeofPharmacybyAlfonsoGennaro,20thed.,LippencottWilliamsWilkins,2000中に記載されている。本明細書中で用いる場合、医薬組成物の有効量は、治療有効量又は予防有効量を含む。治療有効量は、必要な投与量及び時間で、癌細胞増殖の低下、寿命の増加又は平均余命の増加等の、望まれる治療結果を達成するのに有効な量を指す。生物学的に活性のある薬剤を組み込んだdHPGの治療有効量は、被験者の疾患状態、年齢、性別及び体重並びに生物学的に活性のある薬剤が、被験者において望まれる反応を引き出す能力等の要因によって異なり得る。投薬計画は、最適な治療反応を提供するために調整され得る。治療有効量は、治療の恩恵的効果が、製剤の任意の有毒な又は有害な影響を上回るものでもある。予防有効量は、必要な投与量及び時間で、適応疾患の予防又は適応疾患の進行の予防等の、望まれる予防結果を達成するのに有効な量を指す。典型的には、予防投与量は、被験者において疾患に先立つか、又は疾患の初期段階で用いられる。投与量値は、緩和されるべき疾患の重篤度によって変わり得ることに留意すべきである。任意の個々の被験者については、個々のニーズ及び組成物を投与する人又は投与を監督する人の専門的な判断により、経時的に、特定の投薬計画が調整され得る。組成物の量は、被験者の疾患状態、年齢、性別及び体重等の要因により変わり得る。投薬計画は最適な治療反応を提供するように調整され得る。例えば、1回のボーラス投与であり得るか、経時的に数回に分けて投与され得るか、又は示された危急の治療状況に応じて、投与量を減少又は増大し得る。投与の容易さ及び投与量の均一性のために、組成物を単位投与形態に製剤化することが好都合であり得る。いくつかの実施形態においては、本明細書中に記載のdHPG類は、例えば、他の治療方法と組合せて用いられ得るが、これに限定されない。例えば、生物学的に活性のある部分を組み込んだ、本明細書中に記載のdHPG類は、当業者に公知の他の治療法と組合せて、ネオアジュバント療法他の治療前、補助療法他の治療時及び/又はアジュバント療法他の治療後として用いられ得る。一般的には、本明細書中に記載のdHPG類は、毒性を低減するために用いられ得る。本明細書中に記載のdHPG類の毒性は、標準的な技法、例えば、細胞培養液又は実験動物を試験し、治療の指標例、LD50集団の50の致死量とLD100集団の100の致死量との比を決定することにより、決定され得る。しかし、深刻な疾患状況等のある種の状況下では、組成物をかなりの過剰量投与することが必要であり得る。本発明のある種のdHPG類は、ある濃度では有毒であり得る。有毒な濃度及び無毒な濃度を決定するために、滴定実験が用いられ得る。毒性は、個々のdHPG類dHPG’s又は組成物の特異性を細胞株ごとに検証することにより、評価され得る。ポリマーにより他の組織に何らかの影響がある場合、指標を提供するために動物実験も用いられ得る。本明細書中に記載のdHPG類は、被験者に投与され得る。本明細書中で用いる場合、被験者は、ヒト、非ヒト霊長類、ラット、マウス、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ等であり得る。被験者は、癌又は粘膜表面を有する組織と関連する他の疾患への罹患が疑われていてもよいし、又はそのリスクがあってもよい。当該適応疾患は尿路例えば、尿道及び膀胱、消化管例えば、口、食道及び結腸、気道例えば、鼻及び肺、膣腔及び頸部並びに腹膜腔の適応疾患であり得る。癌例えば、膀胱癌、胃癌、食道癌、肺癌、喉頭癌、口腔癌、副鼻腔癌、膣癌又は子宮頸癌、感染例えば、消化管又は気道の感染或いは炎症性疾患又は自己免疫疾患例えば、膀胱刺激症状、炎症性大腸炎、或いは慢性又は急性の炎症並びに他の適応疾患が、薬剤又は他の生物学的に活性のある部分の送達のための、本明細書中に記載のdHPG類の望まれる標的であり得る。癌、感染症及び炎症性疾患又は自己免疫疾患のための診断方法が、当業者に公知である。例えば、本明細書中に記載のdHPG類は筋層非浸潤性の膀胱癌の治療に用いられ得る。本明細書中に記載のdHPG類は筋層非浸潤性膀胱癌治療用の薬剤の調製に用いられ得る。本明細書中に記載のdHPG類は筋層非浸潤性の膀胱癌を治療する方法において用いられ得る。当該方法は、本明細書中に記載の、生物学的に活性のある部分例えば、タキサンを組み込んだdHPGの有効量を、それを必要とする被験体に投与することを含み得る。例えば、本明細書中に記載のdHPG類は、筋層非浸潤性膀胱癌治療用薬物の取り込みを増加させるための前処理又は共処理として用いられ得る。本明細書中に記載のdHPG類の調製方法又は合成方法は、公知の化学合成の法則との関係を有する当業者に理解されるであろう。例えば、WO2006/130978には、本明細書中に記載のポリマー類の調製のために検討され、好適に適合され得る、好適な合成手順が記載されている。dHPGを化学的に調製するための一般的方法論は、以下の、限定的でない例示的スキーム中に記載されている:段階2、モノマー類の添加は、22時間~24時間にわたるモノマー類添加の速度によって更に規定される。凝集コアのポリマー類については、アルキルエポキシドの添加速度は反応時間の初期段階で速く、グリセロールエポキシド添加速度は、初期段階でより遅いことがあり得る。しかし、成分比が、後期段階に比べて反応の初期段階でアルキル成分を添加することが好都合である限り、添加速度の調整は必要無い。様々な代替の実施形態及び実施例を本明細書に記載する。当該実施形態及び実施例は例示的であり、本発明の範囲を限定すると解釈してはならない。実施例1:誘導体化HPG類の合成及び特性解析化学物質はすべてSigma-AldrichCanadaLtd.Oakville,Canadaから購入し、更なる精製はせずに用いた。溶媒はすべてFisherScientificOttawa,CanadaからのHPLCグレードのものであり、更なる精製はせずに用いた。重合は、攪拌機を備えた三つ口丸底フラスコ中で行った。第2口をデュアルマニホールドのシュレンクラインに接続し、第3口をゴム隔壁で閉じてそこから試薬を加えた。HPG-C8/10-MePEG用の典型的な重合化反応手順は以下の通りである。開始剤のトリメチロイルプロパンTMPをアルゴン雰囲気下フラスコに加え、カリウムメチラートのメタノール溶液20wtを続けて加えた。マグネティックスターバーを用いて15分間混合物を攪拌し、その後真空中で過剰なメタノールを除去した。フラスコは油浴中で95°Cに保ち、シリンジポンプを用いて12時間にわたりグリシドールを滴下して加えた。モノマーの添加完了後、混合物を更に5時間攪拌した。次いでオクチル/デシルグリシジルエーテルを加え、混合物を24時間攪拌してHPG-C8/10を形成した。当該混合物に、12時間にわたってMePEG350を滴下して加え、次いで更に5時間攪拌した。MePEGのメチル基が、モノマーの一端を当該モノマーが2価にならないようにdHPG分子間を架橋することになる保護するので、MePEGはPEGよりも好ましい。合成後に除去し得るものも含め、他の保護基も検討される。このように、HPGは、ペプチド、グリコペプチド及びタンパク質等を含む、他の化学基又は生体分子を加えることにより更に修飾され得る表面上でPEG鎖と共に調製し得る。当該手順は、種々のHPGの合成に変更し得、例えば、グリシドール添加後に1,2-エポキシデカンを混合物に加えてHPG-C18を形成し得る。次いで、生成物をメタノール中に溶解し、それを陽イオン交換カラムAmberlite商標IRC-150に3回通すことにより中和する。未反応のオクチル/デシルグリシジルエーテルはヘキサンによる抽出によって除去する。メタノールを除去し、酢酸セルロース透析管MWCO:1000g/mol,SpectrumLaboratoriesInc.を用いて、1日あたり3回の水交換によりポリマーを3日間、水に対して透析する。次いで、凍結乾燥及び加熱乾燥により、乾燥ポリマーを取得する。当該手順は、アルキル鎖がポリマーの至る所に不規則に位置する標準コアのdHPGではなく、アルキル鎖がポリマーの中心の方へ集中する凝集コアのdHPG類を合成するために変更し得る。ポリマーのコアは、グリセロールエポキシド及びアルキルモノマーを種々の速度及び/又は種々の割合で反応混合物に加えることにより、修飾される。凝集コアdHPGを形成するためには、超分岐構造の外側部分がアルキル成分を全く含有しないように、アルキルモノマー類はすべてグリセロールエポキシド添加の前に加える。アルキル成分は、代わりにHPGのコアの方に配置する。まずHPG-C8/10を上記の通り調製することにより、HPG-C8/10-COOHを形成する。カルボン酸官能基のHPG-C8/10への付加のための反応をスキームIIに示す:HPG-C8/100.5gにピリジン50mLを加え、急速に攪拌してポリマーを溶解した。ジメチルアミノピリジン0.2g,0.0016モルを加え、続けて無水コハク酸12g,0.12モルをゆっくりと加えた。室温約22°Cで一晩、反応物を攪拌した。水100mLを加え、混合物を30分間攪拌した。共沸蒸留によってピリジンの蒸発をよりよくすることを可能にするために周期的に水を加え、回転蒸発によって溶媒を除去した。残渣をメタノール中に溶解し、Spectra/PorDialysismembraneMWCO:3500g/molを用いて、蒸留水に対して16時間透析した。透析媒体を4度交換し、各度にメタノール濃度を高めた。透析媒体の最終組成は蒸留水中、70メタノールであった。回転蒸発により溶媒を除去し、真空オーブンで一晩、ポリマーを乾燥した。HPG-C8/10へのスクシンイミジルカーボネート添加のために試行した初期反応スキームをスキームIIIに示す。簡単に述べると、真空の下110°CでHPG-C8/10を乾燥し、次いで室温で冷却した。アセトニトリル及びDCMを加えてポリマーを溶解した。次いでフラスコにN,N’-ジスクシンイミジルカーボネートDSCを加えた。フラスコを真空にし、次いでアルゴンでパージし、ピリジンを加えた後、室温で一晩、反応を進行させた。反応後、回転蒸発によりほとんどのアセトニトリルを除去した。メチルtert-ブチルエーテルMTBEを加えポリマーを沈殿させた。上清を移し、DCMを加えてポリマーを溶解した。10~15mmのブフナー漏斗を通して物質を濾過し、透明な溶液を得、それを回転蒸発してDCMを除去した。MTBEを加えてポリマーを沈殿させた。真空の下、室温で最終生成物HPG-C8/10-NHSを乾燥した。第1の試行により、-20°Cで保存した場合でも不安定で、マトリクスを架橋してしまうほど反応性に富むHPG-C8/10-NHSが生成されたことが示された後、第二の合成経路を試行した。HPG-C8/10-NHSの生成のために試行した第二の反応のスキームを、スキームIVに示す。合成には、中間体として上記したHPG-C8/10-COOHを生成すること、それに次ぐ、HPG-C8/10-COOH-NHSを生成するためにNHSと更に反応させることが含まれる。HPG-C8/10及び無水コハク酸をピリジン中に溶解し、ジメチルアミノピリジンDMAPを触媒として室温で24時間反応させた。等量の水を加えて反応を終結させ、溶液を回転蒸発することによりピリジンを除去した。HPG-C8/10-COOH水溶液を72時間透析MWCO:3500g/molし、残存溶媒を除去して凍結乾燥した。HPG-C8/10-COOHを、N,N’-ジシクロヘキシルカルボジイミドDCCを触媒として、ジメチルホルムアミドDMF中でN-ヒドロキシスクシンイミドsucciniamide;NHSと24時間、室温で更に反応させた。反応終了時に、回転蒸発によりDMFを除去した。生成物を上記の通り単離した。MTBEで沈殿させ、アセトニトリル中で濾過し、回転蒸発して、乾燥に先立ちMTBEで沈殿させた。スキームV中に要約される以下の手順を用いて、様々なアミン密度を有するHPG-C8/10-MePEG-NH2のバッチを生成した。各バッチに関しては、表1中に記載する、様々な化学量論の試薬を用いた。HPG-C8/10-MePEG4gを15mlの無水1,4-ジオキサン中に溶解した。水素化カリウム0.45gをヘキサンで3回リンスし、真空の下乾燥した。ポリマー溶液をKHと混合し、透明溶液を形成するまで室温で攪拌し、HPG-C8/10-MePEG上のおおよそ20のOH基を脱プロトン化した。一晩攪拌Na2SO4又はMgSO4しながらジクロロメタン中に溶解することにより、N-2,3-エポキシプロピルフタルイミドEPP1.184gを乾燥した。溶液を濾過し、真空の下乾燥してジクロロメタンを除去した。乾燥したEPPを無水1,4-ジオキサン中に溶解し、約85~90°Cで一晩攪拌しながらポリマーに加えた。陽イオン交換樹脂カラムAmberliteIRC-150に3回通すことにより生成物を中和し、次いでエーテルから3回沈殿させて未反応のEPPを除去した。NMRによれば、15.5のフタルイミド基がHPG-C8/10-MePEGに結合した。ヒドラジン分解ヒドラジン一水和物による還流により、フタルイミド官能基の開裂を達成した。ポリマーのメタノール溶液に過剰のヒドラジン一水和物溶液2mLを加え、混合物を48時間還流した。還流後、メタノールを蒸発させ、MWCO:10000g/mol膜を用いて、ポリマーを水に対して48時間透析し、凍結乾燥した。取得したポリマー類を、NMR、FTIR、DSC及びTGAにより特性解析した。NMRは、分岐構造及びポリマーのシェルに付加された表面基の存在の確認に特に有用である。ある種の表面化学に関しては、FTIR解析は、ヒドロキシル基の消費及びヒドロキシル基と他の基との置換であって、当該基の化学がHPG構造の残りとは異なるIRスペクトルを与える置換例えば、C=O結合の付加の確認にも有用である。例えば、FTIRは、表面への-COOH基の付加又はエステル結合を通した基の付加の確認に用いられ得る。実施例2:dHPG類へのパクリタキセル又はドセタキセルの封入パクリタキセル又はドセタキセルは、dHPGと共に少量のアセトニトリル中に溶解し得、オーブン中60°Cで1時間乾燥し得る。次いで窒素気流でフラッシュして微量の有機溶媒を除去し得る。結果生じるdHPG/パクリタキセル又はdHPG/ドセタキセルのマトリクスは10mMのリン酸緩衝生理食塩水pH7.4で水和し、2分間ボルテックスしてオーブン中60°Cで1時間インキュベーションし得る。結果生じる溶液は、一般的には透明である。白色沈殿が観察される場合、溶液を遠心18000g、10分間し、上清を新たな容器に移し、使用するまで冷所に保持し得る。実施例3:dHPG類中でのドセタキセル及びパクリタキセルの安定性dHPG類に組み込まれたドセタキセルDTXの安定性を、DTXの不活性な分解産物への分解、及び生物活性を有するそのエピマー7-epi-DTXへの相互変換の観点から、特性解析する。パクリタキセル及びドセタキセルのエピマー形成は、平衡として起こることが知られるが、不活性な分解産物への分解は不可逆的である。安定性は、様々なdHPG類において記載された通り、超高速液体クロマトグラフィーUPLCを用いて解析した。主要な分解ピークを分離するために、WatersAcquityUPLCBEHC18カラム2.1x50mm,1.7μmを用いた。注入体積は3μLであった。移動相は、0.385gの塩を秤量し、それを500mLのHPLCグレードの水に溶解することにより調製した10mM酢酸アンモニウム溶液であった。pHは酢酸を用いてpH4.0に調整した。DTXのストック溶液2mg/mLはメタノール中に調製し、-20°Cの冷凍庫中に保存した。DTXを含有する標準液一式は、0.5~100μg/mLの範囲にわたり、50/50のメタノール/水中に調製した。検出限界LOD及び定量限界LOQは両方とも1μg/mLであった。1~100μg/mLからの較正曲線は、DTXに関しては、R2が0.9998の直線であった。1/xの重み付けを適用した。方法の精度accuracy及び精度precisionは、LOQ1μg/mL及び中間域10μg/mLで確認した。各ケースにおいて、注入を5回反復した。表2に、当該濃度のDTXについて得られた精度accuracy及び精度precisionを集約する。DTXの強制分解を行って、方法の特異性評価のためのサンプルを生成した。300μLのメタノール、150μLの5水酸化アンモニウム及び50μL50°μLの、アルカリのpHで数分内にDTXに分解するDTXプロドラッグのストックを含有する溶液を調製することにより、DTXの分解を達成した。DTXプロドラッグのDTXへの変換及びDTXの分解は2時間超えでモニターした。トレー上2.2時間室温の後、プロドラッグはすべて有効にDTX及び他の成分へと分解した。上記方法を用いて分解サンプルを分析し、DTXプロドラッグの分解、DTX及び関連する分解物を確認した。上記のUPLCの方法を用いると、DTXは2.99分の溶離液であり、7-epi-DTXは3.15分の溶離液である。クロマトグラフのサンプルを図1中に示す。1.4分と2.0分との間のピークは、DTX及び7-epi-DTXの分解産物である。DTX及び7-epi-DTXのピーク領域は時間の関数として算出し、次いでdHPG中に残存するDTX又は7-epi-DTXのパーセンテージを決定するために用いた。結果を図2中に示す。図2から理解できるように、DTXを含む当該製剤は、HPGポリマーがHPG-C8/10及びHPG-C8/10-MePEGの場合に安定であり、それらはpH7.3に緩衝化したPBS中、72時間にわたり、組み込んだDTXの90超をDTX及び7-epi-DTXとして保持した。残りの量の薬物は不活性成分に分解しており、サンプル全体の2を超えて寄与したものは各々、質量分析MRMの実験によって同定した。当該実験は、公知のDTX分解産物に関連したイオンフラグメントを同定するために行った。HPG-C8/10製剤及びHPG-C8/10-MePEG-NH2製剤中のDTXイオン及び7-epi-DTXイオンHm/z808.5のシングルイオンレコーディングSIRを、図3A及び図3Bにおいて比較する。両方のクロマトグラムにより、7-epi分解物の存在が示されるが、それはHPG-MePEG-NH2のサンプル中により多くの割合で存在する。図3A及び図3Bに関しては、最大ピークがDTXであり、より低いピークが7-epi-DTXである。全イオンクロマトグラムにより、製剤中のポリマー構成成分に起因する、総体的な非常に高いシグナル図4が示されるが、DTX分解物フラグメントに一致することが知られる付加質量Kumaretal2007Isolationandcharacterizationofdegradationimpuritiesindocetaxeldrugsubstanceanditsformulation,Kumaretal.,JournalofPharmaceuticalandBiomedicalAnalysis12March2007434:1228-1235が、最大の分解物ピーク図5に符合して同定された。DTX側鎖からのフラグメントに対応し得る226及び282のm/zが1.5分に観察された。しかし、10-デアセチルバッカチンIIIKに対応する583のm/zが存在した。このことにより、タキサンがコア及び側鎖の両方を含有することが示される。320及び562のM/zも観察された。2分のピークは、それぞれ10-オキソ-10-デアセチルバッカチンIIIK及び10-デアセチルバッカチンIIIKに対応し得る、m/z=581及び583を有した。当該ピーク位置は、クロマトグラムのバッカチン分解物が観察されると期待される領域内でもある。いくつかの製剤の安定性は、製剤のpHを調製することにより、更に増加し得る。例えば、5.5~6.5のpHを得るための割合で緩衝塩を有する水性媒体中に溶解した、DTXを組み込んだHPG-C8/10-MePEG-NH2を含む組成物は、緩衝塩を除いた同一の組成物又は緩衝塩組成を改変した組成物例、7.4のpHをもたらすPBS緩衝液よりも安定である図6。適切な緩衝塩としては、リン酸緩衝塩が挙げられる。或いは、組成物のpHは、組成物にHCl等の酸を加えることにより、低下させ得る。その上、組成物のpHを改変することにより、DTXの分解は有意に減速する。実施例4:dHPG類のInvitroでの生体適合性種々のdHPG製剤がKU7癌細胞を殺傷できるか否かを決定することにより、dHPG類の毒性を測定した。当該実験は、薬剤又は生物学的に活性のある部分を何ら組み込んでいないdHPG類を用いて行った。結果を図7A及び7B中に示す。標準コア製剤及び凝集コア製剤の両方について、HPG-C8/10濃度に応じたKU7細胞の増殖パーセントを図7Aに示す。HPG-C8/10の安定性は、コア構造の変化によっては有意に影響されなかった。標準コア製剤及び凝集コア製剤の両方について、KU7細胞の生存率をHPG-C8/10-MePEG濃度に応じて図7Bに示す。凝集コアを有するポリマー類は、標準コアのポリマーに比べて、細胞生存率について10倍高いIC50を示す。凝集コアを有するdHPG類は、標準コアを有するdHPG類よりも、より細胞に寛容される。両方の製剤とも、1モルのHPG当たり6.5モルのMePEGを含有した。凝集コアの製剤は、標準コアの製剤よりも、KU-7細胞に対する細胞毒性が低かった。図7A及び図7B中に示す製剤を調製するために使用したモノマー類の体積比率を表3に示す。MePEG外部シェルが無いHPG-C8/10ポリマー類が中でも最も寛容されず、MePEGシェルが無ければ、標準コア構造から凝集コア構造へとコアを改変することにより、細胞生存率の向上の観点からは全く恩恵が無いことを図8に示す。HPG-OHは、表面にMePEGが無いHPGであることを表す。しかし、MePEGを加えると、恩恵が顕著となる。TheHPG-C8/10-MePEG6.5の記号HPG当たり6.5molMePEGを有するで、通常コア型で比較した場合、寛容性はHPG-C8/10に似ていることが示されるが、凝集コア構造を用いると、HPG-C8/10-MePEG6.5の寛容性は、シェル内に2倍量のMePEGを有する標準コアHPG-C8/10-MePEG13のレベルに改善する。以前に開示されたHPG-MePEGポリマー類MugabeC.etal.2008BJUI103:978-986も、定量されなかったもののMEPEG量はより多く、>15molと推定され、十分に寛容されていた。実施例5:dHPG類が細胞に運びこまれることを示すinvitroの細胞取り込みアッセイフルオレセインで標識されたHPG-C8/10-COOH-NHS及びHPG-C8/10-COOHのKU7細胞への取り込みを検証した。dHPGを1mg/mLでFBS-フリーの培地中に溶解した。12ウェルの各プレート中、250μLのdHPGをカバーガラス上で細胞に曝露した。PBSでプレートを2回洗浄し、続けてPBS中3.7ホルムアルデヒドで10分固定した。再びPBSでプレートを2回洗浄した。ProlongGold商標を用いてDAPIとともにカバーガラスをマウントした。実際にポリマーがKU-7細胞に取り込まれて、単に細胞表面上に留まっているのではないことを確認するために、HPG-C8/10-COOHのZ-スタックも観察した。見渡したすべての角度で蛍光を観察したので、dHPG類が細胞の内側にあることがわかった。当該結果により、dHPG類は細胞に取り込まれ、細胞内で何ら悪影響を引き起こさないことが示される。Invitroのデータにより、HPG類を細胞に曝露すると、HPG-C8/10-COOH-NHS及びHPG-C8/10-COOHの両方が1時間で取り込まれることが示される。しかし体内では、接触がinvitroでの状況ほど完全ではなく、当該取り込みを促進するためには、曝露を延長することが必要である。実施例6:凝集コアdHGP類及び標準コアdHGPへのタキサンのローディング凝集コアHPG-C8/10-MePEG及び標準コアHPG-C8/10-MePEGの最大薬物ローディングを調査した。薬物濃度0.5、1.0、2.0及び3.0mg/mLを目標にしてDTX及びPTXをHPG-C8/10-MePEGにロードした。THF中100mg/mLのポリマー溶液を調製し、DTX又はPTXを加えた。N2気流の下THFを約2時間乾燥し、次いでフードオーブン中で一晩乾燥した。HPG-C8/10-MePEG/PTX及びHPG-C8/10-MePEG/DTXマトリクスをPBS緩衝液pH7.4で水和した。結果生じる溶液を14000rpmで約15分間スピンダウンした。上清の液体をHPLCで試験し、HPG-C8/10-MePEG中に内包された薬物の濃度を入手した。結果を表4中に示す。PTXについてのローディングより、DTXについてのローディングの方が優れていることがわかった。実施例7:HPG-C8/10及びHPG-C8/10-MePEGの合成及び特性解析報告されたプロトコールKainthan,R.K.,Mugabe,C.,Burt,H.M.,Brooks,D.E.,2008.Biomacromolecules9,886-895に従い、エポキシドの開環重合を基礎とするシングルポットの合成手順でコア修飾HPG類のオクチル/デシルグリセリルエーテルO/DGE,C8/10重合を実施した。化学物質はすべてSigma-AldrichOakville,ONから購入し、溶媒はすべてFisherScientificOttawa,ONからのHPLCグレードのものとした。MePEG350、水酸化ナトリウム及びエピクロロヒドリンの反応からα-エポキシ,ω-メトキシポリエチレングリコール350MePEG350エポキシドを合成した。オクチル/デシルグリシジルエーテル、カリウムメチラート及びトリメチルプロパンTMPはSigma-Aldrichから入手し、更なる精製はせずに用いた。120mgの開始剤TMPを1.5mlのカリウムメチラートのメタノール溶液25,w/vと混合し、アルゴン雰囲気下、三つ口丸底フラスコに加えた。混合物を105°Cで1時間攪拌し、その後過剰メタノールを真空の下で除去し、次いでシリンジポンプを用い、13mlのグリシドール及び9mlのO/DGEの混合物を1.4ml/hの速度で開始剤に注入した。デジタルオーバーヘッド攪拌システムBDC2002を用い、攪拌速度を68rpmに固定した。モノマー添加の完了後、混合物を更に6時間攪拌した。ヘキサンによる抽出で精製ポリマー類を取得し、未反応のオクチル/デシルグリシジルエーテルを除去した。次いで生成物をメタノール中に溶解し、陽イオン交換カラムAmberliteIRC-150,RohmandHaasCo.,Philadelphia,PAに3回通すことにより中和した。真空の下、メタノールを除去し、次いで酢酸セルロース透析管MWCO:1000g/mol,SpectrumLaboratoriesInc.を用いて、1日あたり3回の水交換により、ポリマー水溶液を3日間、水に対して透析した。1HNMRδH075-082082-091116-153246316-38048。種々の量のMePEGを含有するHPG-C8/10-MePEGを調製し、HPG-C8/10-MePEG6.5及びHPG-C8/10-MePEG13と命名して供給口に加えたMePEG量1モルのMePEG当たりそれぞれ6.5mol及び13molを表示した。合成の最終段階において、異なる量のMePEG350エポキシドを反応混合物に加えたこと以外はHPG-C8/10の反応と同様に合成を行った。アルキルRで誘導体化したHPG-C8/10-MePEGのワンポット合成のための反応スキームをスキームVI中に要約する。120mgの開始剤TMPを1.5mlのカリウムメチラートのメタノール溶液25,w/vと混合し、アルゴン雰囲気下、三つ口丸底フラスコに加えた。混合物を105°Cで1時間攪拌し、その後過剰メタノールを真空の下で除去し、次いでシリンジポンプを用い、13mlのグリシドール及び9mlのO/DGEの混合物を1.4ml/hの速度で開始剤に注入した。グリシドール及びO/DGEの混合物をすべて注入した後、反応を約6時間継続した。次いで、フラスコに0.1mlの水素化カリウムKHを加えた。混合物を1時間攪拌し、その後、シリンジポンプを1.4ml/hの速度で用い、ワンポット合成の最終段階として10ml又は20mlのMePEG350エポキシドを加えた。HPGに対する、目標とする密度に応じてMePEG350の量つまり、目標とする6.5molのMePEGについては、1モルのHPGに対し、10mlのMePEG350を加えた。次いで、攪拌速度を90rpmに増大させ、反応を105°Cで一晩、継続して行った。ヘキサンで抽出することにより、微量の未反応オクチル/デシルグリシジルエーテルをいずれも除去した。生成物をメタノール中に溶解し、陽イオン交換カラムAmberliteIRC-150,RohmandHaasCo.,Philadelphia,PAに3回通すことにより中和した。真空の下、メタノールを除去し、次いで酢酸セルロース透析管MWCO10,000g/mol,SpectrumLaboratoriesを用いて、1日あたり3回の水交換により、ポリマー水溶液を3日間、水に対して透析し、未反応MePEGエポキシドを除去した。次いで、凍結乾燥により乾燥ポリマーを取得した。1HNMRδH075-082082-092115-155250315-38032333248。カリウムメチラートを用い、一部脱プロトン化したトリメチルプロパンTMPから、グリシドールの陰イオン性開環多分岐重合によってHPG-C8/10MePEG鎖無しのHPGを調製した。HPG-C8/10は無数の末端ヒドロキシル基を有しており、1分子当たりの数はおおよそ重合化度に等しい。C8/10アルキル鎖でHPG-C8/10コアを誘導体化して疎水性コアを創り出し、薬物、例えばタキサンのローディングを可能にした。MePEG鎖をHPG類のヒドロキシル基に連結した。他の成分反応後に、重合化反応物にMePEG350エポキシドを加えたので、親水性のシェルが形成され、HPG類の水溶性が増加する。NMR実験を行い、HPGポリマー類の構造特性を解析した。MePEGとHPG類上のアルキル鎖との比は、重水素化溶媒CambridgeIsotopeLaboratories,99.8Dを用いて、BrukerAvance400MHzNMR分光計に記録した異核種単一量子コヒーレンスHSQCNMR実験から推定した。化学シフトは残存溶媒のピークを基準にした。SparkyT.D.GoddardandD.G.Kneller,Sparky3,UniversityofCalifornia,SanFranciscoを用いてHSQCスペクトルを解析した。図9及び図10にHPG-C8/10ポリマー類及びHPG-C8/10-MePEGポリマー類の代表的なプロトンスペクトル及び2DHSQCスペクトルを示す。原料スペクトルを開始用参照として用い、ピークをすべてHPG類の構造成分にアサインメントした図10B。プロトンNMRスペクトルは報告されたものKainthan,R.K.,Janzen,J.,Kizhakkedathu,J.N.,Devine,D.V.,Brooks,D.E.,2008.Biomaterials29,1693-1704;Kainthan,R.K.,Mugabe,C.,Burt,H.M.,Brooks,D.E.,2008.Biomacromolecules9,886-895と同様だった。HSQCNMRのデータにより、スペクトルにおいて分岐構造は明らかであり図9及び図10、超分岐ポリマー類としてのHPG類の構造が確認された。各置換基の比は、HSQC実験における体積積分から算出した。MePEGのメトキシ基及びO/DGEのメチル基の積分とTMPのCH3基の積分とを比較することにより、各HPGポリマーについてO/DGE及びMePEGmol/molの比を算出した。HSQCのデータにより、未反応のエポキシドモノマー類が無いことFig.10が示される。このことにより、未反応モノマー類によるポリマーのコンタミネーションが無いことが示される。多角度レーザー光散乱検出によるゲル浸透クロマトグラフィーGPC-MALLSによってdHPGポリマー類の分子量及び多分散性を決定した。分子量は約80,000g/molであった表5。dHPG類の物理化学的特性を表5中に集約する。実施例8:dHPG類の熱特性並びにPTX及びDTXをロードしたdHPG類の物理的安定性及び化学的安定性に対する精製過程の影響示差走査熱量測定法DSC及び熱重量分析TGAにより、dHPG類の熱特性及び分解特性に対する精製過程の影響を評価した。精製dHPG類とは、例えば、未反応C8/10アルキル鎖を除去するための、ヘキサンによる抽出、続く陽イオン交換カラムを通した中和、次いで透析といった様々な精製段階を経たポリマー類を指す。TAInstrumentsDSCQ100及びTGAQ50を用いて熱解析を行った。密封したアルミニウム製パン中、秤量したサンプルを、温度範囲-90°C~85°Cにわたる、10°C/分での加熱-冷却-加熱の循環でサイクルにかけることによりDSCのランを取得した。40ml/minの気流窒素を伴うコンスタントランピングconstantramping温度プログラム20.0oC/minto500oCでTGAのランを行った。重量パーセンテージ及びTGAチャンバーの温度をリアルタイムで記録した。TAUniversalAnalysis2000ソフトウェアVersion4.2E,TAInstrumentsを用いてデータの解析を行い、開始点を見出した。AB104-Sバランスを備えたMettlerToledoDL39KarlFisher電量計を用いた滴定により、dHPG類の水分量を決定した。既知の量のdHPG類を無水メタノール中に溶解し、HYDRANAL登録商標-CoulomatreagentSigmaによって滴定した。無水メタノールからのバックグラウンドの読みを差し引いて最終結果を取得した。MePEG含有量が0HPG-C8/10~4.6molMePEG/HPGに増加するにつれ、HPG-C8/10及びHPG-C8/10-MePEGは-38°C~-55°Cに低下した温度でガラス転移を示した表5。精製過程によっては、dHPG類のTg値には全く影響が観察されず、熱安定性には有意な影響が観察されなかった。精製dHPG類及び未精製dHPG類とも最大300°Cの温度まで安定であり、熱分解の徴候はなかった表6。PTX及びDTXをロードしたHPG-C8/10-MePEGの物理的安定性及び化学的安定性に対する精製過程の影響も評価した。PTX及びDTXを、ともに精製HPG-C8/10-MePEG又は未精製HPG-C8/10-MePEGにロードし、PBSpH7.4からの薬物の沈殿開始を観察することによって、物理的安定性を評価した。LC/MS/MSにより化学的安定性を評価し、PTX及びDTXの量並びにそれらの分解産物量を決定した。PTX及びDTXをロードしたdHPG類の物理的安定性及び化学的安定性は精製過程により影響を受けた。達成可能なPTX及びDTXの最大ロードは未精製ポリマー類の方が多く、当該製剤は精製dHPG類で作製された製剤よりも物理的に安定であることがわかった表6。5w/wのタキサンをロードした未精製ポリマーで調製したサンプルは数日間>3日沈殿しなかったが、5w/wタキサンロードの精製ポリマーで調整したものは、PBS中での構成に際して数時間以内又は即座に沈殿した表6。しかし、未精製dHPG類中では、PTX及びDTXは化学的に不安定であり、大部分のタキサンは製剤調製中に分解することが観察された。約75~80のPTXは、未精製HPG-C8/10-MePEGにおけるロードに続いて、それが乾燥バルクマトリクスであるか、PBSpH7.4中で再構成された後であるかに関わらず、即座に分解した表6。しかし、ひとたび緩衝液中に入れると、更なるPTX分解は全く起きないが、乾燥マトリクス中のPTXは24時間にわたって分解し続けた。図11Bに、PTXに対応するピーク及びいくつかの分解産物の形成に起因する他のピークを伴う、未精製HPG-C8/10-MePEG中のPTXの製剤由来のクロマトグラムを示す。クロマトグラムは、アセトニトリル中に溶解した製剤から、溶媒乾燥直後に取得した例、バルク状態で、PBS中での構成に先立って。LC/MS/MSにより、587及び854のm/z値を有する、2つの主要な分解物をそれぞれ同定した。当該質量及び当該ピークの相対保持時間に基づき、それらの正体はそれぞれバッカチンIIIm/z587,図11A及び7-epi-タキソールm/z854と仮定した。未精製製剤においては、他の分解産物ピークA及びB,図11Bも観察された。それらの相対保持時間、ピーク域及びタキサンの既知の分解機構に基づき、ピークB図11Bは7-エピ-バッカチンIIIであるバッカチンVであると思われ、ピークAは10-デアセチルバッカチンIIIであると思われた。しかし、精製ポリマー類中にロードしたタキサンは異なった挙動を示した。バルク中及び溶液中の両方で、PTXは数日間化学的に安定であることがわかり、製剤調製中に主な分解物は観察されなかった表6及び図12C。未精製HPG類中のPTX及びDTXは迅速に分解することが観察された。これは未精製ポリマー類における塩基性不純物の存在に起因すると思われる。塩基性不純物は、HPG類合成の間に加えた過剰なカリウムメチラート及び水素化カリウムに由来する可能性が最も高い。カリウムメチラート及び水素化カリウムは、ともに強塩基であり、ポリマー中の残存水分と結びついてPTXのC7位におけるエピマー化及びPTXのエステル切断に好都合な環境を創り出し、バッカチンIII又はDTXに関しては10-デアセチルバッカチンIIIを生成するであろう図11A。蒸留水中のdHPGポリマー類のpH測定により、未精製ポリマー類は塩基性のpHであるが、精製ポリマー類は、陽イオン交換樹脂のAmberliteIRC-150による処理に起因してタキサンにとってより安定的な環境である酸性pHであることが示された。タキサンは3~5のpH域で安定性が最大であると報告されているDordunoo,S.K.,Burt,H.M.,1996.Int.J.Pharm.133,191-201;Tian,J.,Stella,V.J.,2010.J.Pharm.Sci.99,1288-1298。精製ポリマー類は当該pH域内であるので表6、ロードしたタキサンの化学的安定性を向上させた。未精製dHPGポリマー類中にロードしたタキサンの、見かけ上のより高い薬物ローディング及びより高い物理的安定性は、ロードした薬物の大部分が、親のタキサンよりも低分子量且つ親水性の分子バッカチンIII及びバッカチンVに分解したという事実により説明され得る。このことにより、分解された当該分子は、より効率的にdHPG類にロードされたことが示唆される。実施例9:dHPG類の熱特性、表面電荷及び粒子サイズに対するMePEG誘導体化の影響粒子サイズ及びゼータ電位の解析は、各解析についてDTS0012disposablesizingcuvetteを用いたMalvernNanoZSParticleSizeanalyzerを用いて行った。濃度15mg/mlのポリマー溶液を1mMNaCl中に調製し、0.22μmのシリンジフィルターPALLAcrodisc13mmwithnylonmembraneで濾過した。サンプルの取得パラメータは:角度173°の後方散乱自動減衰;ラン回数1110秒/ラン;分散剤は25°Cの水粘度0.8872cP及びRI1.330;Mark-HouwinkパラメータはA=0.428及びK=7.67e-05cm2/sとした。dHPG類は、屈折率がポリエチレングリコールと同様RI=1.460及び吸収0.01であると仮定した。最終データはすべてのランの平均を表す。dHPG粒子サイズは一貫して直径10nm未満であり、PTX及びDTXのロードによりHPG-MePEGのサイズに影響は無かったデータ示さず。薬物をロードしたHPG類は、10nm未満の極端に小さなナノ粒子を形成する。以下のゼータポテンシャルの測定:HPG-C8/10=-1.29±0.97mV;HPG-C8/10-MePEG6.5=-0.92±1.68mV;HPG-C8/10-MePEG13=0.18±0.16mVの通り、当該ナノ粒子上の総体的表面電荷は、HPG類表面上でのMePEG鎖の存在によって有意に影響されなかった。MePEG密度増大に伴う、ガラス転移温度に対する影響を観察した。Tgは、HPG-C8/10ポリマーについての-37.5°CからHPG-C8/10-MePEG6.5及びHPG-C8/10-MePEG13についての-45.2及び-55.4°Cにそれぞれ低下した表5。PTX又はDTXによるローディングもTgを減少させた表5。実施例10:dHPG類中のPTX及びDTXのロード、定量及び安定性並びにdHPG類からのPTX及びDTXの放出PTX又はDTX及びdHPG類を4mlバイアル中1mlアセトニトリル溶液中に溶解し、オーブン中60°Cで1時間乾燥し、窒素でフラッシュして微量の有機溶媒を除去した。結果生じるdHPG/タキサンマトリクスを、50°C、1mlの10mM加温リン酸緩衝生理食塩水PBS,pH7.4で水和し、2分間ボルテックスした。結果生じる溶液は一般的に透明であるが、白色粒子が観察される場合は、溶液を遠心18000g、10分間し、上清を新たなバイアルに移した。HPG類に組み込まれたPTX量及びDTX量は、以前に記載Jackson,J.K.,Smith,J.,Letchford,K.,Babiuk,K.A.,Machan,L.,Signore,P.,Hunter,W.L.,Wang,K.,Burt,H.M.,2004.Int.J.Pharma.283,97-109の通り、逆相HPLCにより決定した。100μlのdHPG/PTX溶液又はdHPG/DTX溶液を900μlのアセトニトリル/水60:40,v/vで溶解し、HPLCのバイアルCanadianLifeScience,Peterborough,ONに移した。アセトニトリル、水及びメタノールの混合物58:37:5,v/v/vを含有する移動相を有する対称C18カラムWatersNova-Pak,Milford,MAを用い、流速1ml/minで薬物含有量の解析を行った。注入サンプルの体積は20μlであり、検出はUV検出器を用いて波長232nmで行った。HPG-C8/10の水溶性は限定的であり、タキサンの薬物ローディングは少なくなったデータは示さない。疎水性薬物のロードにとっては、dHPG類におけるアルキルC8/10鎖の存在が重要であるが、それによってdHPG類の水溶性が有意に低下する。HPG類の水溶性を増大させるために、当該分子の合成時の反応終期に、MePEG350鎖を加えた。dHPG類中のMePEG量が比較的少量増加することにより、PTX及びDTXの両方について、HPG-C8/10-MePEG13の薬物ロードの増加がもたらされた。HPG類中のDTXローディングは、PTXに関してよりも多かった。DTXをロードしたdHPG類は、PTX製剤よりも物理的安定性が高いことが示された。HPG-C8/10-MePEG132,w/wにおいて、DTX5,w/wの最大ローディングはPTXに関してよりも高かった。タキサンをロードしたdHPG類の物理的安定性及び化学的安定性を評価した。目視による製剤の透明性の観察によって物理的安定性を評価し、24時間未満で沈殿する場合は物理的に不安定な製剤とみなした。室温でPBS中での再水和直後t=0又は1、3、6、24、48及び72時間にサンプルを観察した。上記の通りのHPLC法により、PTX及びDTXの化学的安定性をモニターした。WatersTQD質量分析計を用いた質量分析法の解析によって分解産物を同定した。電子スプレーイオン源ブロックの温度150°C、脱溶媒和温度350°C、コーン電圧45kV、キャピラリー電圧0.70kV、引出電圧3kV、RF電圧0.1kV、コーンガス流25l/h、脱溶媒和ガス流600l/h及び衝突ガス流0.2ml/minでシステムを作動させた。陽イオンモードにおいて、分子を電子スプレーでイオン化した。透析法によりdHPG類からのPTX及びDTX放出を決定した。100mgのdHPG類HPG-C8/10-MePEG6.5又はHPG-C8/10-MePEG13を秤量して1mlアセトニトリル溶液中で1mgのPTX又はDTXと混合し、15uCiの3H-DTX又は3H-PTX15ulでスパイクし、窒素気流下で乾燥して溶媒を除去した。放射性薬物3H-DTX又は3H-PTXはMoravekBiochemicals及びRadiochemicalsBrea,CAから入手した。dHPG類/タキサンマトリクスを2mlのPBSで水和し、透析バッグに移して100rpmで震盪しながら500mlの人口尿pH4.5又は6.5に対して透析した。透析膜管はSpectrumLaboratoriesRanchoDominguez,CAから購入した。人口尿はBrooksetalの方法Brooks,T.,Keevil,C.W.,1997.Lett.Appl.Microbiol.24,203-206に従い、ぺプトン又はイーストエキストラクトを加えずに調製した。0.1MHClを用いて溶液のpHをpH4.5及び/又はandor6.5に調整した。種々の時点で、透析バッグの体積を測定し、透析バッグ中の残存放射活性の測定用にサンプル10μlを採取し、外部放出媒体全体を新鮮媒体と交換してシンクの状態を維持した。ベータシンチレーションカウンティングBeckmanCoulterCanada,Mississagua,ONにより、各時点において透析バッグ中に残存する3H-DTX又は3H-PTXの濃度を決定した。実験開始時の初期薬物量から各時点で残存する薬物の量を差し引くことにより、放出された薬物累積をパーセントで算出した。データは時間に応じた放出薬物のパーセンテージ累積として表した。データは3回の独立した実験の平均SDを表す。尿のpHは通常酸性であるが、広範囲pH4.5~8にわたって変動することが知られているので、HPG-C8/10-MePEG中にロードしたPTX及びDTXの放出プロファイルに対するpHの影響を評価した。HPG類からのタキサン類放出プロファイルの特徴は、放出が継続的に制御され、且つ放出のバースト期がほとんど無いか、又は無く、その後より緩やかな持続放出期となるということであった。DTXは、PTXよりも迅速にHPG-C8/10-MePEGから放出され2日後、75対50の薬物放出、ほぼすべてのDTXが6~7日で放出されるのに対して、PTXは12~14日であった。これは、DTXの疎水性が非常に大きいためと考えられたが、更に疎水的なPTXは相容性が非常に高くて、HPGコアのアルキル鎖C8/C10との相互作用が非常に強く、薬物放出はより減速される可能性がある。HPG類におけるMePEG密度の増大によっては、薬物放出に影響が無いことを観察した図13A。放出媒体のpH変化pH4.5~pH6.5によっては、HPG-C8/10-MePEGナノ粒子からの薬物放出に影響が無いことを観察した図13B。様々な動態モデル一次モデル、higuchiのモデル及びkorsmeyerのモデルを含むを用いた、PTX及びDTXの、HPGナノ粒子からの放出プロファイルの評価により、一次及びhiguchiの動態が、両方ともr2=0.98~0.99で最もフィットすることが示されたデータ示さず。薬物放出速度の観点からは、製剤間で統計学的な差異は無かったデータ示さず。実施例11:HPG-C8/10-MePEG13のローダミン標識及びローダミン標識HPG-C8/10-MePEG13の細胞取り込みHuangetal.の方法Huang,S.N.,Phelps,M.A.,Swaan,P.W.,2003.J.Pharmacol.Exp.Ther.306,681-687に従い、わずかな変更を伴って、HPG-C8/10-MePEG13をテトラメチルローダミン-5-カルボニルアジドTMRCAで共有結合的に標識した。500mgのHPG-C8/10-MePEG13を5mlの無水1,4-ジオキサン中に溶解した。適量のTMRCAを無水1,4-ジオキサン中に溶解し、最終濃度を1mg/mlとした。当該蛍光プローブのアリコート675μlおおよそ20molのHPGに相当をHPG-C8/10-MePEG13溶液に加え、窒素気流の下5時間攪拌し、油浴中で80°Cに加熱した。透析液が無色になるまで溶液をDMFMWCO12,000~14,000に対して透析し、次いで蒸留水に対して24時間透析した。蛍光標識ポリマーHPG-C8/10-MePEG13-TMRCAを凍結乾燥し、アンバーバイアル中、-80°Cで保存した。KU7細胞を、細胞数おおよそ7×104細胞に相当する~75のコンフルエンスに達するまで、10cmシャーレの底において、何枚かの1cm×1cm顕微鏡カバーガラス上で増殖させた。細胞を含有する当該カバーガラスを加温PBSで3回洗浄し、次いでパラフィンで裏打ちしたシャーレ上に細胞側を上にして静置した。250μlのHPG-C8/10-MePEG13-TMRCA溶液ダルベッコ改変イーグル培地DMEM中に1mg/mlで溶解をカバーガラスに加えた。細胞をHPG-C8/10MePEG13-TMRCAと1、4、8及び24時間インキュベーションした。コントロール用に、KU7細胞を何ら補充の無いDMEM中でインキュベーションした。次いで、カバーガラスをPBS緩衝液で4回激しく洗浄し、過剰PBSを穏やかにふき取り、250μlの3.7のパラホルムアルデヒドを加え細胞を10分間固定した。カバーガラスをPBSで更に3回洗浄し、水中に浸漬した。過剰な液体を拭き取った後、細胞をDAPIMolecularProbes,Invitrogenを伴うProlong登録商標Gold退色防止剤で染色し、カバーグラスを細胞側を下にして顕微鏡スライドガラス上にマウントした。乾燥防止のため、カバーガラスのへりを透明なマニキュア液で封入した。サンプルを暗黒下一晩インキュベーションし、適切な細胞染色を確実に行った。サンプルを、DAPIフィルターλex340~380nm;λem,435~485nm;ダイクロイックスプリッター,400nm及びローダミンフィルターλex530~560nm;λem,590~650nm;ダイクロイックスプリッター,570nmを備えたOlympusFV-1000倒立共焦点顕微鏡下で観察した。直接コントラストDICも行って細胞膜を可視化し、405nmレーザーで励起した。標識ポリマーが細胞内側にあったことを明確に示すため、画像を蛍光及びDICで解析した。ローダミン標識HPG-C8/10-MePEG13HPG-C8/10-MePEG13-TMRCAの細胞取り込みを、共焦点顕微鏡法によりKU7細胞で可視化した。1時間インキュベーション後、KU7細胞へのHPG-C8/10-MePEG13-TMRCAの取り込みが明らかとなった。1時間でのHPG-C8/10-MePEG13-TMRCAの取り込みの代表的な画像を図14中に示す。パネルAにDAPI染色した未処理KU7細胞核を青色画像中は白色として示すに可視化することを可能とするを示す。画像は直接コントラストのシグナル細胞の輪郭を示す並びに核を白色で示す蛍光シグナル及び存在しない他の蛍光のオーバーレイである。パネルBは、HPG-C8/10-MePEG13-TMRCAナノ粒子で1時間インキュベーションしたKU7細胞を示す。核DAPIにより青色に染色周辺のポリマーの赤色蛍光画像中、赤色蛍光は白色部分として示す。画像中、核を囲む赤色蛍光は暗い部分として示す。により、細胞質中にHPG-C8/10-MePEG13-TMRCAが存在することが示される。パネルBと同一の細胞集団のz-スタックによりz-スタックの画像は示さず、赤色蛍光ナノ粒子は、単に細胞膜に接着しているか、又は細胞膜中に存在しているというよりもむしろ、細胞質の至る所に存在することが証明された。いくつかの点状の構造が観察され、それはHPG-C8/10-MePEG13-TMRCAナノ粒子が細胞輸送用小胞にパッケージされたことを示すのであるが、当該ナノ粒子は、細胞質中に一様に分布するように見えた。KU7細胞の核コンパートメント中に検出されたポリマー由来の蛍光は無かった。コントロールの細胞と比較すると、全時点で、HPG-C8/10-MePEG13-TMRCAナノ粒子は、KU7細胞の生存率及び有病率に影響しない。このことは、当該細胞株と当該ナノ粒子は生体適合性が非常に高いことを示す。HPG-C8/10-MePEG13-TMRCAナノ粒子は、1時間のインキュベーションによりKU7細胞に取り込まれ、1、4、8又は24時間の時点で取得した画像間で全く差異は無かった。実施例12:HPG-C8/10-MePEGのInvitroでの細胞傷害性実験上記の通り、既報のプロトコールKainthanRK,MugabeC,BurtHM,BrooksDE.Biomacromolecules,93,886-8952008に従ってHPG-C8/10-MePEGを調製した。1HNMRδH07508208209211515525031538032333248MePEGとHPG類上のアルキル鎖との比は、異核種単一量子コヒーレンスHSQCNMR実験から推定した。化学シフトは残存溶媒のピークを基準にした。多角度レーザー光散乱検出によるゲル浸透クロマトグラフィーGPC-MALLSによってポリマー類の分子量及び多分散性を決定した:分子量=83,000g/mol1.22の多分散性データ示さず。MalvernNanoZSParticleSizeanalyzerを用いて粒子サイズ解析を行った。薬物をロードしたHPG-C8/10-MePEGにより、10nm未満7.5±3.4~7.8±2.7nm,データ示さずのナノ粒子が形成された。PTX又はDTXをロードしたdHPG類は、4mlバイアル中1mlアセトニトリル溶液にPTX1mg又はDTX0.5mg及びHPG-C8/10-MePEG100mgを溶解することによって調製し、オーブン中60°Cで1時間乾燥し、窒素気流でフラッシュして微量の有機溶媒を除去した。パクリタキセルPTX粉末はPolymedTherapeutics,Inc.Houston,TXから入手した。ドセタキセルDTX粉末はNaturalPharmaceuticalsInc.Beverly,MAから入手した。結果生じるHPG-C8/10-MePEG/タキサンマトリクスを、1mlの10mMリン酸緩衝生理食塩水PBS,pH6で水和し、2分間ボルテックスした。逆相HPLCにより、HPG-C8/10-MePEG中に組み込まれたPTX及びDTXの量を決定した。溶媒蒸発法により、高い薬物ローディングそれぞれ、2及び5w/wの最大ローディングでPTX及びDTXをロードできる。市販製剤のタキソール登録商標及びタキソテレ登録商標並びにPTX及び/又はDTXをロードしたHPG-C8/10-MePEG製剤の、KU7-luc細胞株、並びに低悪性度RT4,MGHU3及び高悪性度UMUC3の両方のヒト尿路上皮癌細胞株に対する細胞傷害効果を評価した。タキソール登録商標はBristol-Myers-SquibbPrinceton,NJからのものであった。タキソテレ登録商標はSanofi-AventisCanadaInc.Laval,Quebecから購入した。ヒト膀胱癌細胞株のRT4及びUMUC3は、アメリカンタイプカルチャーコレクションから購入した。10の熱非働化ウシ胎児血清を含有するマッコイ培地Invitrogen,Burlington,ON中で細胞を維持し、加湿5CO2雰囲気中、37°Cで保持した。MGHU3細胞はY.Fradet博士L’Hotel-DieudeQuebec,Quebec,Canadaから、ご好意により寄贈していただき、10ウシ胎児血清及び2mML-グルタミンInvitrogenを添加したMEM中で維持した。KU7はC.Dinney博士MDAndersonCancerCenter,Houston,TX,USAより提供していただき、5ウシ胎児血清含有DMEM中で維持した。可視化目的のため、KU7細胞を、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有するレンチウイルスGraigLogsdon博士M.D.AndersonCancerCenter,Houston,TX,USAによるに感染させ、当該サブクローンを以前報告HadaschikBA,BlackPC,SeaJCetal.BJUInt,1006,1377-13842007した通りKU7-lucと命名した。96-ウェルプレート中、体積100μlの10FBSを添加したマッコイ培地中に5,000細胞/ウェルで細胞をプレーティングし、新たに調製したタキソール登録商標;タキソテレ登録商標;PTXをロードしたHPG-C8/10-MePEG;又はDTXをロードしたHPG-C8/10-MePEGの溶液を加える前に、24時間平衡化させた。細胞を薬物製剤に2時間曝露し、注入療法についての現行の臨床基準を模倣して、以前報告HadaschikBA,terBorgMG,JacksonJetal.BJUInt,10111,1347-13552008した通り、CellTiter96AQueousNon-RadioactiveCellProliferationMTSassayPromega,Madison,WIを用いて、72時間後に細胞の生存率を決定した。各実験を3回繰り返し、すべての細胞株について、MTS値が直線の吸収帯内に収まった。すべての製剤により、試験した細胞株すべての増殖が濃度依存的に阻害された図15。群間で有意差は無かったが、DTX製剤はPTX製剤よりも細胞傷害性が強かったP>0.05,一元配置分散分析。タキソテレ登録商標のIC50はタキソール登録商標のIC50より約2~5倍低かった。PTXをロードしたHPG-C8/10-MePEGナノ粒子及びDTXをロードしたHPG-C8/10-MePEGナノ粒子は、それぞれ市販製剤のタキソール登録商標及びタキソテレ登録商標と同様の細胞傷害性を有することがわかった図15。Cremophor-EL登録商標及びTween80は低濃度であっても細胞毒性を有することが示されたIwaseK,OyamaY,TatsuishiTetal.ToxicolLett,1541-2,143-1482004;Henni-SilhadiW,DeymeM,BoissonnadeMMetal.PharmRes,2412,2317-23262007が、コントロールのHPG-C8/10-MePEGナノ粒子薬物なしは、15-1,500nMの濃度域にわたって細胞傷害性を示さなかったデータ示さず。実施例13:同所性膀胱癌モデルにおける膀胱内PTX製剤及びDTX製剤の有効性マウスの膀胱癌異種移植モデルにおいて、全部で60匹のヌードマウスでinvivoの実験を行い、膀胱内タキソール登録商標1mg/ml,Bristol-Myers-Squibb;タキソテレ登録商標0.5mg/ml,Sanofi-Aventis;PTX1mg/mlをロードしたHPG-C8/10-MePEG;及びDTX0.5mg/mlをロードしたHPG-C8/10-MePEGの有効性を評価した。当該同所性マウスモデルは、MugabeC,HadaschikBA,KainthanRKetal.BJUInt,1037,978-9862009;HadaschikBA,BlackPC,SeaJCetal.BJUInt,1006,1377-13842007;HadaschikBA,terBorgMG,JacksonJetal.BJUInt,10111,1347-13552008に報告されている。動物実験はカナダ動物管理協会に従って行った。11週齢の雌性ヌードマウスHarlan,Indianapolis,INをイソフルランで麻酔した。潤滑化24GJelco血管カテーテルMedexMedicalLtd.,Lancashire,UKを尿道を経て膀胱へ通す前に、6-0ポリプロピレンの巾着縫合を尿道口付近の表層に施した。PBSで膀胱を1回灌注した後、2百万のKU7-luc細胞を、50μlの単一細胞懸濁液として注入し、巾着縫合を2.5時間結紮した。invivoの腫瘍負荷を定量するために、4、11、18、25及び33日目に150mg/kgルシフェリンを腹膜内注射し、15分後に、IVIS200イメージングシステムXenogen/CaliperLifeSciences,Hopkinton,MAにより動物を仰臥位でイメージングした。LivingImagesoftwareXenogenを用いてデータを取得し、解析した。腫瘍接種後5日目に、無作為に、マウスの膀胱を50μlのPBSコントロール;HPG-C8/10-MePEG薬物無し;タキソール登録商標1mg/ml;PTX1mg/mlをロードしたHPG-C8/10-MePEG;タキソテレ登録商標0.5mg/ml;DTX0.5mg/mlをロードしたHPG-C8/10-MePEGで処理した。腫瘍接種後5日目及び19日目に膀胱内治療を行った。生物発光レベルは群間で同等であった;しかし、腫瘍はマウス個体間でばらつきがあるので、統計学的解析のため、処理後の腫瘍の生物発光を、4日目の各マウスにおける初期フラックスに対して正規化した。腫瘍接種後33日目に剖検を行った。膀胱全体を取り出し、10緩衝化ホルマリンで固定し、パラフィン中に包埋した。5μmの切片を作製し、標準法を用いてHEで染色した。スライドは、すべて調査し、BLISSmicroscopeimagingworkstationBacusLaboratoriesInc.,Lombard,IL上で走査した。KU7-luc癌細胞の膀胱内接種後、マウスはすべて膀胱腫瘍を発症した。しかし、マウス2匹が麻酔から回復せず、腫瘍接種日と同日に死亡した。タキソテレ登録商標群のマウス1匹が、イメージングの最終日腫瘍接種後33日目に死亡したことがわかった。当該マウスは以前の測定において、腫瘍が当該群中最大であった。別に、DTXをロードしたHPG-C8/10-MePEGのマウス1匹を、不可逆的な体重減少15体重減少のため、屠殺した。統計解析のために、当該マウスを実験から排除した。全体的に、膀胱内のPTX及びDTX、市販のタキソール登録商標及びタキソテレ登録商標、又はHPG-C8/10-MePEGとも、マウスによって十分寛容され、深刻な毒性又は体重減少は観察されなかった。腫瘍接種後5日及び19日に膀胱内療法を行った。コントロールマウスPBS及び空のHPG-C8/10-MePEGと比較すると、PTX及びDTXをロードしたHPG-C8/10-MePEGにより腫瘍成長が有意に阻害されたP<0.001,二元配置分散分析、ボンフェローニ事後検定図16。タキソテレ登録商標とは異なり、タキソール登録商標1mg/mlにより、コントロール群PBS及び空のHPG-C8/10-MePEGと比較して、腫瘍成長が有意に低下したP<0.01,二元配置分散分析,ボンフェローニ事後検定。しかし、タキソール登録商標及びタキソテレ登録商標の処理群間で有意差は観察されなかった。PTX1mg/ml及びDTX0.5mg/mlの膀胱内注入投与量は、PTXを用いた以前の報告MugabeC,HadaschikBA,KainthanRKetal.BJUInt,1037,978-9862009及びDTXがPTXよりも強力であることを証明するinvitroの細胞傷害性データFig.15に基づいて選んだ。実験の最後で、PTX及びDTXをロードしたHPG-C8/10-MePEGナノ粒子両方における腫瘍成長は、PBSコントロール群と比較して、それぞれ87及び97阻害された。タキソテレ登録商標及びタキソール登録商標により、それぞれ43及び65の腫瘍成長阻害が示された。各処理群における、マウスの代表的な生物発光の画像を経時的に図17中に示す。膀胱組織の組織学的な検証により、KU7-lucの腫瘍は悪性の成長パターン及び高頻度の多病巣性を示したが、腫瘍接種から33日後には、当該処理群における腫瘍の大半が、大抵は固有層に限局し、且つ高悪性度のpT1ステージの疾患と相関したことが示される図18。HPG類のほんの数ナノメートルサイズ域により、当該ナノ粒子の、癌組織を含む膀胱壁へのエンドサイトーシス亢進をもたらす、ムチン鎖間の透過及び尿路上皮のアンブレラ細胞との接触が可能になり得ると考察された。HPG類表面のMePEG鎖は、糖タンパク質ムチンと、鎖の絡み合いを通して相互作用し得、このことにより、当該ナノ粒子がムチン層中に封入されることになって、薬物をロードしたナノ粒子が、膀胱中に滞留する時間の延長がもたらされる可能性もある。PTX及びDTXをロードしたHPG-C8/10-MePEGナノ粒子は、市販製剤のタキソール登録商標又はタキソテレ登録商標よりも2~3倍高い膀胱組織への蓄積を示したことを表7に示す。実施例14:薬物動態膀胱内のPTX製剤及びDTX製剤の薬物動態特性を評価するため、マウスにタキソール登録商標1mg/ml,n=3;タキソテレ登録商標0.5mg/ml,n=4;PTXをロードしたHPG-C8/10-MePEG1mg/ml,n=4;及び/又はDTXをロードしたHPG-C8/10-MePEG0.5mg/ml,n=4のいずれかを注入した。膀胱内注入後0、30及び60分で尾部血液サンプルを採取した。当該時間、マウスは依然、イソフルランで麻酔していた。2時間後、CO2を用いてマウスを窒息させて殺し、心穿刺により血液を更に除去した。血液サンプルをmicro-haematocrittubesFisherScientific,Pittsburg,PA中又はserum-separatortubesBectonDicknson中で遠心し、血清を液体窒素中でさっと凍結した。各マウスの尿及び膀胱も回収し、膀胱は、凍結前に切開して内腔を露出させ、10mlPBSで5回連続で激しく洗浄した。サンプルはすべて-80°Cで保存した。解析に用いたUPLC-MS/MSシステムは、WatersTQD質量分析計を用いた質量分析と共役した、統合化WatersAcquityUPLC分離システムで構成した。電子スプレーイオン源ブロックの温度150°C、脱溶媒和温度350°C、コーン電圧14V、キャピラリー電圧0.70kV、引出電圧3kV、RF電圧0.1kV、コーンガス流25l/h、脱溶媒和ガス流600l/h及び衝突ガス流0.2ml/minでシステムを作動させた。陽イオンモードにおいて、分子を電子スプレーでイオン化した。溶媒/溶媒抽出法によって、マウス血清からDTXを抽出した。96-ウェルプレートにおいて、マウス血漿及び標準液の50μlアリコートをアセトニトリル中の0.1ギ酸150μlと混合し、室温で1分間ボルテックスした。サンプルを4°C、10分間、5,500rpmで遠心したAllegra商標25Rcentrifuge,Beckman-Coulter。次いで上清100μlと蒸留水50μlとを混合し、混合して30秒間ボルテックスした。膀胱組織を計量し、ジルコニアビーズBiospecProducts及びミクロバイアルホルダーを備えたmini-beadbeaterBiospecProductsを用いて0.1ギ酸/メタノール中で60秒間ホモジェナイズした。サンプルを4°Cで2分間、14,000rpmで遠心したAllegra商標25Rcentrifuge,Beckman-Coulter。メタノール中0.1トリフルオロ酢酸150μlをサンプルに加え、混合及び4°Cで15分間、14,000rpmでボルテックスしたAllegra商標25Rcentrifuge,Beckman-Coulter。サンプルの解析は、すべてUPLC-MS/MSを用いて行った。スパイクしたコントロールサンプルからの回収率は97で、DTXの検出限界は10ng/mlであった。いくつかの血清サンプルでは定量不能か、又は検出不能なレベルであった。一般的に、膀胱内注入後のPTX及びDTXの血清中レベルは、両方低かった5~20ng/ml。異群間及び/又は異なる時点の間で、血清レベルには有意差が無かったP>0.05表7。しかし、膀胱組織中のレベルは血清中レベルよりも約100~500倍高かった。PTX及びDTXをロードしたHPG-C8/10-MePEGナノ粒子により、市販の製剤よりも2~3倍高い膀胱組織蓄積が示されたが、その差は統計的に有意では無かったP>0.05,一元配置分散分析,ボンフェローニの多重比較検定。尿中の最終薬物濃度は初期の投与溶液よりも約3~5倍低かった。これは、2時間の膀胱内注入の間の尿希釈に起因した。しかし、PTX及びDTXの尿中最終濃度において、異なる処理群間で有意差は無かったP>0.05,一元配置分散分析。一般的に、膀胱内注入後のPTX及びDTXの血清中レベルは、両方低かった5~20ng/ml。異群間及び/又は異なる時点の間で、血清中レベルには有意差P>0.05が無かった表7。実施例15:HPG-C8/10-MePEG及びHPG-C8/10-MePEG-NH2の合成実施例7に記載したプロトコールに従ってHPG-C8/10-MePEGを合成した。1HNMRδH07508208209211515525031538032333248HPGC810MePEGNH2以下の手順を用いて、様々な目標量でアミン置換を行いHPG-C8/10-MePEG-NH2を合成した。使用した試薬の量を表8中に集約する。目標のアミン置換は、HPG1モル当たりのNH2の目標モル数を表し、HPG-C8/10-MePEG-NH2X式中、xはHPG1モル当たりのNH261、121及び161モルであるにより表示する。15mlの無水1,4-ジオキサン中にHPG-C8/10-MePEGを溶解した。水素化カリウムKHを無水へキサンで3回リンスし、ミネラルオイルを除去して真空下乾燥した。ポリマー溶液をKHと混合し、透明な溶液が形成されるまで室温で攪拌した。一晩攪拌Na2SO4又はMgSO4しながらジクロロメタン中に溶解することにより、N-2,3-エポキシプロピルフタルイミドEPPSigma-Aldrichを乾燥した。溶液を濾過し、真空の下乾燥してジクロロメタンを除去した。乾燥したEPPを無水1,4-ジオキサン中に溶解し、約85~90°Cで一晩攪拌しながらポリマーに加えた。陽イオン樹脂交換カラムAmberliteIRC-150に3回通すことにより生成物を中和し、次いでエーテルから3回沈殿させて未反応のEPPを除去した。ヒドラジン一水和物によるヒドラジン分解により、フタルイミド官能基の開裂を達成した。ポリマーのメタノール溶液に過剰のヒドラジン一水和物溶液2mLを加え、混合物を72時間還流した。還流後、メタノールを蒸発させ、10,000MWCO膜を用いて、ポリマーを水に対して48時間透析し、凍結乾燥した。1HNMRδH075082082092115155250260280315380323。HPG-C8/10-MePEG-NH2製造のための、N-2,3-エポキシプロピルフタルイミドEPPによる、HPG-C8/10-MePEGポリマー上のいくつかのヒドロキシル基10~20の表面修飾と、続くヒドラジン分解による、フタルイミド官能基の開裂用の反応スキームをスキームVII中に要約するR,アルキルC8/C10鎖の混合物ベースの疎水性コアを表す。7,MePEG350ベースの親水性シェルを表す。。薬物ローディング及び動物実験における更なる評価のために、HPG-C8/10-MePEG-NH2121を選択した。NMR及びGPCMePEGとHPG類上のアルキル鎖との比は、重水素化溶媒CambridgeIsotopeLaboratories,99.8Dを用いて、BrukerAvance400MHzNMR質量分析計磁場強度9.4Tに記録した異核種単一量子コヒーレンスHSQCNMR実験から推定した。多角度レーザー光散乱検出によるゲル浸透クロマトグラフィーGPC-MALLSによってポリマー類の分子量及び多分散性を決定した。図19AにHPG-C8/10-MePEGの代表的な2DHSQCスペクトルを示す。N-2,3-エポキシプロピルフタルイミドによるHPG-C8/10-MePEGの表面修飾は、2DHSQC実験によって確認し、芳香族のフタルイミドCH基を同定した1H化学シフト7.2~7.8ppm及び13C化学シフト125~135ppm。遊離アミン基を生成するための、ヒドラジン分解による、フタルイミド基開裂の成功を1DNMR実験及び2DHSQC実験の両方でモニターした。一級アミン基2.60~2.80ppm及び13C化学シフト45ppm,図19Bを生成するためのフタルイミド保護基開裂の成功を示す、HPG-C8/10-MePEG-NH2121の代表的な2DHSQCスペクトルを図19Bに示す。HSQCNMRのデータにより、スペクトルにおいて分岐構造は明らかであり図19、超分岐ポリマー類としてのdHPG類の構造が確認された。C8/10アルキル鎖とdHPG類上のMePEGとのモル比は、HSQC実験におけるシグナルの積分から算出し得る。MePEGのメトキシ基及びオクチル/デシルグリシジルエーテルO/DGEのメチル基の積分とTMPのCH3基の積分とを比較することにより、各dHPGポリマーについてMePEG及びO/DGEmol/molの比を算出した表10。電気伝導度滴定及びフルオレスカミンアッセイHPG-C8/10-MePEGポリマー類上で誘導体化されたアミン基のモル比を、HCl及びNaOHを用いて電気伝導度滴定により測定した。電気伝導度滴定は、YSImodel35コンダクタンスメーター及び白金電極を備えた3403セルで、25°Cで行った。シリンジポンプHarvardInstrumentsを用いて、一定流速0.0102ml/minで希釈NaOH溶液を注入した。典型的な滴定に関しては、おおよそ10mgのHPG-C8/10-MePEG-NH2を蒸留水中に溶解し、まず0.05NHClで滴定し、続けて0.05NNaOHで逆滴定した。30秒ごとに溶液の電気伝導度を測定した。水酸化ナトリウム溶液の標準化用にフタル酸水素カリウム溶液0.05Nを用いた。電気伝導度滴定及び分子量測定に基づいて、HPG1分子当たりのアミン基のモル数を算出した。得られた値は50~119mol/molの範囲であり、HPG-C8/10-MePEG-NH21モル当たりのNH2の目標モル比と一致していた表8及び10。HPG1分子当たりのアミン基のモル数も、蛍光測定及び重量測定を用いて算出され得る。例えば、NH2についての蛍光アッセイが用いられ得る表9。>5mgのHPG-NH2を2mLのLC/MSガラスバイアル中に測り取り、適量の脱イオン化H2Oを加えて濃縮ストックを作製することによりHPG-NH2のサンプルを調製し、次いで混合物を、HPG-NH2が溶解するまでソニケーションした。ストック溶液を、脱イオン化H2Oで1mgのHPG-NH2当たり1mg/mLに希釈した。おおよそ1mgのフェニルアラニンを、アルミ製のマイクロ秤量皿に計り取って20mLガラスバイアルに移し、次いで1mgのフェニルアラニン当たり5mLの脱イオン化H2Oを加え、混合物を、フェニルアラニンが溶解するまでソニケーションした02mg/mLフェニルアラニンストック。60μLの0.2mg/mLフェニルアラニンストックをガラスのLC/MSバイアルに移した。90μL90°μLの脱イオン化H2Oを加え、ボルテックスして溶液を混合した80ng/mLフェニルアラニン作業標準液。40μLの1mg/mLHPG-NH2ストックを96-ウェルプレートに移し、10μL10°μLの脱イオン化H2Oを加え或いは、50μL50°μL、40μL、30μL30°μL、20μL20°μL、10μL10°μL又は0μL0°μLの80ng/mLフェニルアラニン作業標準液を加え、必要な場合は脱イオン化H2Oをつぎ足して50μL50°μLにし;サンプルをピペッティングして混合した。ウェルに12.5μLのホウ酸ナトリウム緩衝液を加え、ピペッティングして混合した。ピペットのチップを0.03フルオレスカミン溶液で2回リンスし、チップをコーティングして水漏れを防止した。12.5μLの0.03フルオレスカミン溶液をサンプルのウェルに加えた。サンプルをピペッティングして混合し、次いでプレート震盪器上に置き、覆いをして1分間震盪した。175μLの脱イオン化H2Oを加え、過剰のフルオレスカミンを反応させてピペッティングして混合し、短時間プレート震盪器上に置いた。サンプルを蛍光プレートリーダー励起波長390nm、蛍光波長475nm並びに励起波長及び蛍光波長の両方についての5nmのバンド幅によって解析した。熱解析DSC及びTGAを用いてdHPG類の熱特性及び分解特性を評価した。TAInstrumentsDSCQ100及びTGAQ50を用いて熱解析を行った。密封したアルミニウム製パン中、秤量したサンプルを、温度範囲-90°C~85°Cにわたる、10°C/分での加熱-冷却-加熱の循環でサイクルにかけることによりDSCのランを取得した。分解過程において、各期の重量減少を等温状態下で観察し、主に、HPG類を500°Cで、重量減少100近くまで熱を通す段階的等温モードで、TGAのランを行った。HPG-C8/10-MePEGサンプル及びHPG-C8/10-MePEG-NH2サンプルの熱的なイベントを表10示す。HPG-C8/10-MePEGサンプル及びHPG-C8/10-MePEG-NH2サンプルは同様のDSC/TGAプロファイルを示した。HPG類は、-45~-58°Cのガラス転移温度を示した。アミン基の存在により、HPG類のTgが少し上昇した。主な分解的イベントは300°Cを超える温度で観察されたが、このことはHPG類の良好な熱安定特性を示す。おそらくは、HPG類中のいくらかの残存溶媒又は残存水に起因して、100°C以下の温度でおおよそ3~5の重量喪失が生じた。想定される熱滅菌法の使用を可能とするために、医薬への適用にとっては、HPG類の良好な熱安定性は望ましい。粒子サイズ決定及びゼータ電位粒子サイズ及びゼータ電位の解析は、各解析についてDTS0012disposablesizingcuvetteを用いたMalvernNanoZSParticleSizeanalyzerを用いて行った。サンプルを0.2μmのインラインシリンジフィルターPALLAcrodisc13mmナイロン膜付で濾過した。サンプルの取得パラメータは:角度173°の後方散乱自動減衰;ラン回数1110秒/ラン;分散剤は25°Cの水粘度0.8872cP及びRI1.330;Mark-HouwinkパラメータはA=0.428及びK=7.67e-05cm2/s。HPG類の屈折率は、ポリエチレングリコールの屈折率RI=1.460及び吸収0.01と同様であると仮定した。最終データはすべてのランの平均を表す。HPG類は、<10nmの流体力学半径を有する小さなナノ粒子である。HPG類は、10nm未満の極端に小さなナノ粒子を形成する。HPG類の粒子サイズ及びゼータ電位の特徴を表10に示す。アミン基でのHPG-C8/10-MePEG表面の誘導体化によっては、粒子サイズは影響されなかったが、ゼータ電位に対しては、有意な影響を観察した。アミンが末端にくるHPGポリマー類のゼータ電位は、低pHで正に高く、塩基性条件においてはやや負の値に変化した。表面電荷における、pH滴定可能な当該変化は、アミン基のプロトン化/脱プロトン化から生じる。生理学的なpH7.4では、HPG類のいくらかのアミン基がイオン化し、従って正のゼータ電位が予想される表10。しかし、8を上回るpH値では実質的にすべてのアミン基が帯電しておらず、従ってpH11ではわずかに負の電荷観察されるおそらく、当該HPG類上に存在する、陰性物質のヒドロキシル基に起因した。HPG類の薬物ローディングによっては、その粒子サイズは有意に影響されず、HPG類は溶液中で単分子ミセルとして十分に分散したままであった。DTXをロードしたHPG類のナノ粒子は物理的に安定であり、室温で1週間の保存中には薬物沈殿又は凝集を観察しなかった。実施例16:粘膜付着特性の評価HPG類の粘膜付着特性を評価するため、ThongborisuteandTakeuchiによって開発されたムチン粒子法Thongborisute,J.;Takeuchi,H.Int.J.Pharm.2008,354,204-209を用いた。当該方法は、サブミクロンサイズのムチンが粘着性ポリマーとムチンとの相互作用の結果として凝集することに起因する、粒子サイズ変化に基づく。サブミクロンサイズのムチンの溶液を、等体積の100mM酢酸緩衝液中HPG類10w/vと混合し、ボルテックスし、37°Cで30分間インキュベーションした。3000HSZetasizerMalvernInstruments,SanBernardino,CAを用いて、光散乱測定により粒子サイズ変化をモニターした。各試験はトリプリケートで実施し、陽性コントロールとしてキトサン溶液1w/vを用いた。ムチンの粒子サイズは、キトサン溶液1w/v又はHPG-C8/10-MePEG-NH2121溶液10w/vのいずれかとのインキュベーション後、有意に増大した図20。HPG-C8/10-MePEG10w/vによっては、ムチン粒子のサイズは影響されなかった。サブミクロンサイズのムチン粒子サイズの増大は、ムチン粒子及びHPG-C8/10-MePEG-NH2ナノ粒子の凝集に起因していて、ムチンと、アミンで置換したHPG類との粘膜付着力が原因であった。広く知られている粘膜付着ポリマーのキトサンを陽性コントロールとして用いた。しかし、高分子量と水溶液における低溶解度のために、キトサンの希釈液1w/vを用いた。当該希釈液ですら、共インキュベーション後に、ムチン粒子サイズの有意な変化を示した。キトサン及びHPG-C8/10-MePEG-NH2の両方の粘膜付着性は、正に帯電したアミン基と、負に帯電したムチン粒子との静電相互作用に起因するが、水素結合、疎水性効果及び鎖の絡み合い等の他の寄与もまた、影響をもたらし得ると考えられている。しかし、HPG-C8/10-MePEGの粘膜付着性の欠如からみて、HPG-C8/10-MePEG-NH2の粘膜付着特性には、主に静電引力が寄与するらしいことが示唆される。実施例17:細胞増殖/結合実験及び取り込み実験細胞増殖96-ウェルプレート中、10FBSを添加した体積100μlのマッコイ培地に5,000細胞/ウェルでKU7-luc細胞をプレーティングし、新たに調製したHPG-C8/10-MePEG及び/又はHPG-C8/10-MePEG-NH2PBS,pH7.4に溶解,0~150μg/ml溶液を加える前に、24時間平衡化させた。細胞をHPG溶液に2時間曝露し、以前記載Mugabe,C.;Hadaschik,B.A.;Kainthan,R.K.;Brooks,D.E.;So,A.I.;Gleave,M.E.;Burt,H.M.BJUInt.2009,103,978-986した通り、CellTiter96AQueousNon-RadioactiveCellProliferationassayPromega,Madison,WIを用いて、72時間後に細胞の生存率を決定した。HPG類のローダミン標識HPG-C8/10-MePEGポリマー類及びHPG-C8/10-MePEG-NH2121ポリマー類を、以前報告Savic,R.;Luo,L.;Eisenberg,A.;Maysinger,D.Science2003,300,615-618した通り、テトラメチル-ローダミン-カルボニル-アジドTMRCAで共有結合的に標識した。テトラメチル-ローダミン-カルボニル-アジドTMRCAは、InvitrogenCanadaInc.Burlington,ONから購入した。簡単に述べると、500mgのHPG類HPG-C8/10-MePEG又はHPG-C8/10-MePEG-NH2121を5mlの無水1,4-ジオキサン中に溶解した。適量のテトラメチルローダミン-5-カルボニル-アジドTMRCA,MW455.47を2mlの無水1,4-ジオキサン中に溶解し、最終濃度を1mg/mlとした。当該蛍光プローブのアリコート675μlおおよそ20molのHPG類に相当をHPG類溶液に加え、窒素気流の下5時間攪拌し、油浴中で80°Cに加熱した。透析液が無色になるまで、DMFMWCO12,000~14,000に対して透析し、次いで蒸留水に対して24時間透析することにより、未反応プローブを除去した。蛍光標識ポリマー類HPG類-TMRCAを凍結乾燥し、アンバーバイアル中、-80°Cで保存した。細胞結合及び取り込みKU7-luc細胞を用いて、ローダミン標識HPG類の結合及び取り込みを評価した。96-ウェルプレート中、10FBSを添加した体積100μlのマッコイ培地に10,000細胞/ウェルで細胞をプレーティングし、24時間平衡化させた。培地を除去し、細胞をローダミン標識HPG類HPG-C8/10-MePEG-TMRCA又はHPG-C8/10-MePEG-NH2121-TMRCA,1.56~200μg/mlと2時間インキュベーションした。インキュベーション時間に続いて細胞をPBSで3回洗浄し、200μlの0.5TritonX-100PBS中pH8で溶解して細胞の蛍光結合量を蛍光分光光度計Synergy4.0により、545/578の励起/蛍光で測定した。TritonX-100及びPBSpH8中のローダミン標識HPG類0.781~6.25μg/mlから標準液を調製した。細胞に取り込まれたか、又は表面に結合したローダミン標識HPG類量を、各ウェルに加えたポリマー全量のパーセンテージとして表した。細胞取り込みの共焦点蛍光解析KU7-luc細胞を、細胞数7×104細胞に相当する~75のコンフルエンスに達するまで細胞増殖させ続けるために、10cmシャーレ中、シャーレの底において、1cm×1cmカバーガラス上で増殖させた。次いで、細胞を含有するカバーガラスを取り出し、加温PBSで3回洗浄した。次いで、カバーガラスを、パラフィルムで裏打ちしたシャーレ中に細胞側を上にして、取り込みアッセイの継続時間中静置した。ローダミン標識HPGポリマー類250μlのHPG-C8/10-MePEG-TMRCA又はHPG-C8/10-MePEG-NH2121-TMRCAを、1mg/mlの濃度でカバーガラス上の細胞に加えた。細胞を1、4、8及び24時間インキュベーションした。各時点の後、カバーガラスをPBS中で4回激しく洗浄した。過剰PBSを穏やかにふき取った後、250μlの3.7のパラホルムアルデヒドを用い、細胞を室温で10分間固定した。次いで、カバーガラスをPBS中で更に3回洗浄し、水中に浸漬し、過剰な液体をふき取り、最後に細胞側を下にしてスライドガラス上に4’,6-ジアミジノ-2-フェニルインドールDAPIを伴うProlonggoldと共にマウントした。サンプルの乾燥を停止するため、透明なマニキュア液を慎重にカバーガラスのへり周辺に用いた。1晩のインキュベーションによりサンプルの適切な硬化を確実にし、次いでイメージングの準備が整った。OlympusFV-1000倒立共焦点顕微鏡で顕微鏡実験を行った。用いたレーザー波長は、ローダミン及びDAPIのイメージングについて、それぞれ568nm及び405nmであった。直接コントラストDICも行って細胞膜を可視化し、その上で405nmレーザーで励起した。一貫した比較を可能にするため、各ポリマー群内で、レーザー出力及び高電圧利得を比較的一定に保持した。標識ポリマーが細胞内側にあることを明確に示すため、画像を蛍光及びDICで解析した。細胞増殖/結合及び取り込み実験HPG-C8/10-MePEG-NH2121-TMRCAナノ粒子は、低濃度で大々的にKU7-luc細胞に結合し、内在化されたが、HPG-C8/10-MePEG-TMRCAナノ粒子に関しては、12.5μg/ml以下の濃度では、細胞結合又は細胞取り込みの証拠は観察されなかった図21A。当該ポリマーの強力な結合プロファイルは、おそらくは正に帯電したHPG-C8/10-MePEG-NH2121ポリマーと負に帯電したKU7-luc細胞膜との静電引力に起因する。しかし、HPG類濃度が上昇するにつれ、HPG-C8/10-MePEG-NH2121-TMRCAナノ粒子の細胞への結合及び細胞取り込みは25μg/mlで飽和点に達した。その一方、HPG-C8/10-MePEG-TMRCAナノ粒子のKU7-lucへの細胞結合及び細胞取り込みは、濃度12.5μg/ml及び50μg/mlの間で観察された直線的関係を伴って濃度依存的であり、続いてポリマー濃度がより高くなると結合及び取り込みがあまり顕著でなくなることがわかった図21A。飽和したHPG-C8/10-MePEG-NH2121-TMRCAナノ粒子の挙動が、その細胞傷害効果に起因したか否かを評価するために、発明者らは、KU7-luc細胞の増殖に対するHPGの影響を評価した。細胞を、空の薬物をロードしていないHPG-C8/10-MePEGナノ粒子及びHPG-C8/10-MePEG-NH2ナノ粒子0~150μg/mlに2時間曝露し、MTSアッセイにより細胞生存率を決定した。HPG-C8/10-MePEGナノ粒子及びHPG-C8/10-MePEG-NH2ナノ粒子は、共に増殖に同様の影響を示し、試験した濃度ではKU7-luc細胞株に生体適合性があった図21B。従って、HPG-C8/10-MePEG-TMRCAナノ粒子及びHPG-C8/10-MePEG-NH2121-TMRCAナノ粒子について観察された、細胞結合及び取り込みの差異は、KU7-luc細胞株に対するそれらの細胞傷害効果には起因しないようである。ローダミン標識HPG類内在化の共焦点蛍光解析共焦点顕微鏡を用い、細胞によりナノ粒子が内在化されたのか、又は単にKU7-lucの細胞膜に結合しただけなのかどうかをモニターした。HPG-C8/10-MePEG-TMRCAナノ粒子及びHPG-C8/10-MePEG-NH2121-TMRCAナノ粒子は、両方とも迅速にKU7-luc細胞によって内在化され、1時間のインキュベーションで完全な取り込みが達成されたデータ示さず。蛍光解析により、細胞質中のローダミン標識HPG類の存在を観察した。HPG-C8/10-MePEG-TMRCAナノ粒子及び/又はHPG-C8/10-MePEG-NH2121-TMRCAナノ粒子は、細胞質の至る所に存在することが観察され、単に細胞膜に接着しているか、又は細胞膜中に存在しているのとは対照的だった。KU7-luc細胞の核コンパートメント中に検出されたポリマー類由来の蛍光は無かった。核コンパートメント中にHPGナノ粒子が無いことは、比較的大きなその分子量<80kDaに起因している可能性がある。全時点で、コントロールの細胞と比較すると、HPG-C8/10-MePEG-TMRCAナノ粒子及びHPG-C8/10-MePEG-NH2121-TMRCAナノ粒子は、KU7-luc細胞の生存率及び有病率に影響しない。全体として、ローダミン標識HPGナノ粒子は、1時間のインキュベーションによりKU7-luc細胞に取り込まれ、1、4、8又は24時間の時点で取得した画像間で全く差異は無かった。実施例18:HPG類におけるDTXのローディング及び定量並びにHPG類からのDTX放出HPG類におけるDTXのローディング及び定量薬物及びポリマーを共通の有機溶媒中に溶解し、溶媒を除去する溶媒蒸発法により、DTXをHPG-C8/10-MePEG及びHPG-C8/10-MePEGNH2121にロードした。結果生じるポリマー/薬物マトリクスを、10mMPBSpH7.4で再構成した。結果生じる溶液は一般的に透明であったが、白色粒子が観察された場合は、溶液を遠心18000g、10分間し、上清を新たな容器に移した。HPG類に組み込まれたDTX量は逆相HPLCにより決定した。アセトニトリル、水及びメタノールの混合物58:37:5,v/v/vを含有する移動相を有する対称C18カラムWatersNova-Pak,Milford,MAを用い、流速1ml/minで薬物含有量の分析を行った。注入サンプルの体積は20μlであり、検出はUV検出器を用いて波長232nmで行った。全ラン時間を5分に設定した。DTXの保持時間は2.9分であった。最大で、HPG1分子当たり約5~6のDTX分子に相当する5w/wの薬物ロードが当該方法により達成された。DTXの水溶解度は7μg/ml程度であるがDu,W.;Hong,L.;Yao,T.;Yang,X.;He,Q.;Yang,B.;Hu,Y.Bioorg.Med.Chem.2007,15,6323-6330;Liggins,R.T.;Hunter,W.L.;Burt,H.M.J.Pharm.Sci.1997,86,1458-1463、DTXのHPG類への組み込みにより、当該薬物の水への溶解度がおおよそ1,000倍増加した。HPG類からのDTX放出透析法により、HPGナノ粒子HPG-C8/10-MePEG及びHPG-C8/10-MePEG-NH2121からのDTX放出を決定した。簡単に述べると、100mgのHPG-C8/10-MePEG又はHPG-C8/10-MePEG-NH2121を秤量して1mlアセトニトリル溶液中で1mgのDTXと混合し、15μCiの3H-DTXでスパイクし、次いで窒素気流下で乾燥して溶媒を除去した。HPG/DTXマトリクスを2mlのPBSで水和し、透析バッグに移して100rpmで震盪しながら500mlの人口尿pH6.5に対して透析した。0.1MHClを用いて溶液のpHを6.5に調整した。ヒト尿の生理学的pHの範囲は、広範囲にわたってばらつき得るpH4.5~pH8が、中央値は6.5なので、それを選択したBrooks,T.;Keevil,C.W.Lett.Appl.Microbiol.1997,24,203-206.。種々の時点で、透析バッグの体積を測定し、透析バッグ中の残存放射活性の測定用にサンプル10μlを採取し、外部放出媒体全体を新鮮媒体と交換してシンクの状態を維持した。ベータシンチレーションカウンティングBeckmanCoulterCanada,Mississagua,ONにより、各時点において透析バッグ中に残存する3H-DTXの濃度を決定した。実験開始時の初期薬物量から各時点で残存する薬物の量を差し引くことにより、放出された薬物累積のパーセントを算出した。データは時間に応じた放出薬物累積のパーセンテージとして表した。HPG類からのDTX放出プロファイルでは、放出のバースト期がほぼ無いか、又は全く無い、継続的な放出制御が特徴であった図22。おおよそ55の初期封入薬物が、インキュベーションの最初の24時間以内に放出された。HPG類表面上でのアミン基の存在によっては、薬物放出は影響されなかった図22。実施例19:同所性膀胱癌モデルにおける膀胱内DTX製剤の評価同所性膀胱異種移植片を有するマウスにおいて、膀胱内の、DTXをロードしたHPG製剤の寛容度及び有効性を評価した。用いた同所性マウスモデルは、Mugabe,C.;Hadaschik,B.A.;Kainthan,R.K.;Brooks,D.E.;So,A.I.;Gleave,M.E.;Burt,H.M.BJUInt.2009,103,978-986;Hadaschik,B.A.;Black,P.C.;Sea,J.C.;Metwalli,A.R.;Fazli,L.;Dinney,C.P.;Gleave,M.E.;So,A.I.BJUInt2007,100,1377-1384;Hadaschik,B.A.;terBorg,M.G.;Jackson,J.;Sowery,R.D.;So,A.I.;Burt,H.M.;Gleave,M.E.BJUInt.2008,101,1347-1355に報告されている。動物実験は、すべてカナダ動物管理協会に従って行われて、動物管理プロトコールは、本発明者らの研究所TheUniversityofBritishColumbiaの動物管理委員会に承認されている。当該モデルにおいては、ルシフェラーゼを発現するKU7-luc癌細胞を用いた。腫瘍接種用に、8週齢の雌性ヌードマウスHarlan,Indianapolis,INをイソフルランで麻酔した。潤滑化24GJelco血管カテーテルMedexMedicalLtd.,Lancashire,UKを尿道を経て膀胱へ通す前に、巾着縫合を尿道口付近の表層に施した。100μlPBSで膀胱を1回灌注した後、2百万のKU7-luc細胞を、50μlの単一細胞懸濁液として注入し、巾着縫合を2.5時間結紮した。その間、マウスの麻酔を維持した。縫合糸を除去した後、マウスをケージ中に留置し、意識を取り戻して通常に排尿するまでモニターした。腫瘍接種後5日目に、以下の処理群:PBSコントロール;タキソテレ登録商標0.5mg/ml及び1.0mg/ml、Tween80中DTX;HPG-C8/10-MePEG中DTX0.5mg/ml及び1.0mg/ml;HPG-C8/10-MePEG-NH2121中DTX1.0mg/mlに従って、マウス26匹を無作為に膀胱内注入処理50μl及び滞留時間2時間した。処理日にマウスを数時間モニターし、その後は日ごとにモニターした。毒性のいかなる兆候特に、体重減少、食物及び水の摂取における変化、不活発状態、猫背の姿勢及び/又はストレスの巨視的兆候も記録した。24時間以内に回復しなかった疼痛又は疾病の徴候を示したマウスは屠殺した。IVIS200イメージングシステムXenogenCorp.,Alameda,CAによるマウスの非侵襲的なイメージングによって、2、8、12及び19日目に腫瘍負荷をモニターした。簡単に述べると、150mg/kgのルシフェリンをマウスに腹膜内注射し、イソフルランで麻酔し、ルシフェリン注射後ちょうど15分で背臥位をイメージングした。LivingImageソフトウェアバージョン2.50Xenogenを用いてデータを取得し解析した。腫瘍接種後2日目には、すべてのマウスに膀胱腫瘍が発症したが、生物発光イメージングにより証明された通り、2匹のマウスには腎臓腫瘍も発症した図23A。全体として、市販のタキソテレ登録商標製剤又はHPG類製剤のいずれかによる膀胱内DTXは、マウスにより十分に寛容された。深刻な毒性は観察されず、マウスは、すべて実験期間の終わりまで生存した。しかし、腫瘍接種後8日目に、何匹かのマウスが体重を約5減少させたが、その後の週に回復した。体重減少は膀胱治療の、及び/又は治療後の日々の食料摂取及び水摂取が非常に少ないことの結果であり得る。しかし、体重減少には、異群間で有意差p>0.05が無かった。0.5及び1.0mg/mlを投与量に選択し、膀胱癌異種移植片を有するマウスにおいて、適切な膀胱内DTXの投薬計画を確立した。1.0mg/mlタキソテレ登録商標、0.5mg/mlのHPG-C8/10-MePEG中DTX、1mg/mlのHPG-C8/10-MePEG及び/又はHPG-C8/10-MePEG-NH2121のいずれかの1回投与で処理したマウスでは、腫瘍成長が強力に阻害された。腫瘍接種後19日目には、タキソテレ登録商標0.5mg/ml処理群を除くすべての処理群で、PBSのコントロールに比較して統計的に有意な腫瘍抑制p<0.001,二元配置分散分析後、事後ボンフェローニ解析が示された。すべての処理群で、タキソテレ登録商標0.5mg/ml処理群に比較して、統計的有意差があった図23B,p<0.05,二元配置分散分析後、事後ボンフェローニ解析。当該ナノ粒子の粘膜付着特性により、おそらくは、密着結合の変化又は尿路上皮の落屑に起因する、膀胱壁への薬物透過性亢進及び取り込み亢進をもたらす尿路上皮との密接な接触が増加すると考えられる。それらの非常に小さなサイズRh<10nmのために、HPG類はムチン糖タンパク質を通して拡散し、膀胱壁又は腫瘍組織への、当該ナノ粒子のエンドサイトーシス亢進をもたらす、尿路上皮のアンブレラ細胞と直接相互作用すると思われる。低めのHPG類中DTX注入投与量の有効性を評価するため、別の実験を行った。当該実験のため、19日目に、IVIS200イメージングシステムによって決定された、見かけ上膀胱癌を有しないか、又は低レベルの生物発光を伴うマウスを用いた。全体で、12匹のマウスが、別の上記腫瘍再接種に好適なことがわかった。以前の実験の100と比較して、腫瘍取り込みは約75であり、マウスに以前に同一細胞株を接種しているため、免疫応答に起因していると思われた使用したのは無胸腺の免疫不全マウスであるが、当該マウスは依然、マクロファージ及びナチュラルキラー細胞が特徴的である固有の局所免疫システムを有する。再接種後膀胱腫瘍を発達させたマウス9匹から、2匹のマウスが更により大きい膀胱腫瘍10~100倍を発達させた。腫瘍再接種後5日目に、膀胱腫瘍を発達させたマウスを無作為に2群に分け、DTX0.2mg/mlをロードしたHPG-C8/10-MePEGn=5又はHPG-C8/10-MePEG-NH2121n=450μlを膀胱内に1回受容させた。腫瘍再接種後5、11及び19日目に、マウスをイメージングした。膀胱内の、DTXをロードしたHPG-C8/10-MePEG-NH2121により、マウス腫瘍の成長は阻害されたが、DTXをロードしたHPG-C8/10-MePEGでは、同じ濃度でそうはならなかった。腫瘍再接種後11及び19日目で、4匹のうち3匹のマウスには、DTX0.2mg/mlをロードしたHPG-C8/10-MePEG-NH2121ナノ粒子による1回の膀胱内処理の後、腫瘍成長の証拠は示されなかったが、DTX0.2mg/mlをロードしたHPG-C8/10-MePEGナノ粒子で処理された5匹のうちの4匹のマウスには、膀胱腫瘍成長の証拠が示され、1匹のマウスには、更に腎臓腫瘍が発症していた図24。再度述べるが、当該製剤はマウスに十分寛容され、これらの実験の間、深刻な毒性又は体重減少は生じなかった。実施例20:invitroの細胞傷害性実験KU7-luc細胞株、並びに低悪性度RT4,MGHU3及び抗悪性度UMUC3の両方のヒト尿路上皮癌細胞株に対する、市販製剤タキソテレ登録商標及びDTXをロードしたHPG製剤の細胞傷害性効果を評価した。タキソテレ登録商標Tween80中DTXはSanofi-AventisCanadaInc.Laval,Quebecから購入した。ヒト膀胱癌細胞株のRT4及びUMUC3は、アメリカンタイプカルチャーコレクションから購入した。10の熱非働化ウシ胎児血清を含有するマッコイ培地Invitrogen,Burlington,ON中で細胞を維持し、加湿5CO2雰囲気中、37°Cで保持した。MGHU3細胞はY.Fradet博士L’Hotel-DieudeQuebec,Quebec,Canadaから、ご好意により寄贈していただいた。10ウシ胎児血清及び2mML-グルタミンInvitrogenを添加したMEM中で維持した。KU7はC.Dinney博士MDAndersonCancerCenter,Houston,TX,USAより提供していただき、5ウシ胎児血清含有DMEM中で維持した。可視化目的のため、KU7細胞を、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有するレンチウイルスGraigLogsdon博士M.D.AndersonCancerCenter,Houston,TX,USAによるに感染させ、当該サブクローンを以前記載HadaschikBA,BlackPC,SeaJC,etal.BJUInt2007;100:1377-84した通りKU7-lucと命名した。96-ウェルプレート中、体積100μlの10FBSを添加したマッコイ培地に5,000細胞/ウェルで細胞をプレーティングし、新たに調製したタキソテレ登録商標溶液或いはHPG-C8/10-MePEG中及び/又はHPG-C8/10-MePEG-NH2PBS,pH7.4中に溶解中のDTXを加える前に、24時間平衡化させた。細胞を薬物製剤に2時間曝露し、注入療法についての現行の臨床基準を模倣して、以前報告MugabeC,HadaschikBA,KainthanRK,etal.BJUInt2009;103:978-86した通り、CellTiter96AQueousNon-RadioactiveCellProliferationMTSassayPromega,Madison,WIを用いて、72時間後に細胞の生存率を決定した。各実験を3回繰り返し、すべての細胞株について、MTS値が直線の吸収域内に収まった。すべてのDTX製剤により、試験した細胞株すべての増殖が濃度依存的に阻害された。より活発且つ迅速に増殖するKU7-luc細胞株が、DTX製剤に最も感受性であった。DTXをロードしたHPG-C8/10-MePEG又はHPG-C8/10-MePEG-NH2の細胞傷害性は、市販製剤タキソテレ登録商標と同様であることがわかった図25。DTX製剤のIC50は、試験した細胞株すべてについて、ほんの数ナノモラー4~12nMの範囲であった。コントロールのHPG類ナノ粒子薬物なしでは、試験した濃度範囲にわたって細胞傷害性が示されなかった15~1,500nM,データ示さず。HPG類へのDTXロードによっては、その細胞傷害性は影響されなかった。実施例21:invivo実験マウス同所性膀胱癌モデルにおける膀胱内DTXの有効性全部で42匹のヌードマウスでinvivoの実験を行い、タキソテレ登録商標0.2mg/ml並びにDTX0.2mg/mlをロードしたHPG-C8/10-MePEG及び/又はHPG-C8/10-MePEG-NH2による1回の膀胱内処理の有効性を評価した。用いた同所性マウスモデルは、HadaschikBA,BlackPC,SeaJC,etal.BJUInt2007;100:1377-84;MugabeC,HadaschikBA,KainthanRK,etal.BJUInt2009;103:978-86;HadaschikBA,terBorgMG,JacksonJ,etal.BJUInt2008;101:1347-55;HadaschikBA,AdomatH,FazliL,etal.ClinCancerRes2008;14:1510-8;HadaschikBA,ZhangK,SoAI,etal.CancerRes2008;68:4506-10に報告されている。動物実験はカナダ動物管理協会に従って行った。11週齢の雌性ヌードマウスHarlan,Indianapolis,INをイソフルランで麻酔した。潤滑化24GJelco血管カテーテルMedexMedicalLtd.,Lancashire,UKを尿道を経て膀胱へ通す前に、6-0ポリプロピレンの巾着縫合を尿道口付近の表層に施した。PBSで膀胱を1回灌注した後、2百万のKU7-luc細胞を、50μlの単一細胞懸濁液として注入し、巾着縫合を2.5時間結紮した。invivoの腫瘍負荷を定量するために、4、11、18及び25日目に150mg/kgルシフェリンを腹膜内注射し、15分後に、IVIS200イメージングシステムXenogen/CaliperLifeSciences,Hopkinton,MAにより動物を仰臥位でイメージングした。LivingImagesoftwareXenogenを用いてデータを取得し、解析した。腫瘍接種後5日目に、無作為に、マウスの膀胱を50μlのPBSコントロール;タキソテレ登録商標0.2mg/ml;DTX0.2mg/mlをロードしたHPG-C8/10-MePEG;及びDTX0.2mg/mlをロードしたHPG-C8/10-MePEG-NH2で1回処理した。生物発光レベルは群間で同等であったが、マウス個体間で腫瘍にばらつきがあるため、各マウスにおいて、統計解析のために処理後腫瘍の生物発光を4日目の初期フラックスに対して正規化した。腫瘍接種後25日目に剖検を行った。膀胱全体を取り出し、10緩衝化ホルマリン中で固定してパラフィン中に包埋した。5μmの切片を作製し、標準法を用いてHEで染色した。スライドは、すべて調査し、BLISSmicroscopeimagingworkstationBacusLaboratoriesInc.,Lombard,IL上で走査した。KU7-luc癌細胞の膀胱内接種後、マウスはすべて膀胱腫瘍を発症した。しかし、DTXをロードしたHPG-C8/10-MePEG-NH2群中のマウス1匹が、処理後4日目に予期せず死亡した。市販のタキソテレ登録商標製剤又はHPG類の製剤のいずれかで膀胱内に投与したDTXは、全体的に、マウスによって十分寛容され、深刻な毒性は観察されなかった。コントロールマウスと比較して、DTXをロードしたHPG類では腫瘍成長が阻害された。しかし、KU7-lucの同所性膀胱癌異種移植片においては、DTXをロードしたHPG-C8/10-MePEG-NH2が、腫瘍成長を阻害する最も有効な製剤であり、PBSコントロール群又はタキソテレ登録商標群のいずれかと比較すると、統計的に有意となった図26,P<0.01,二元配置分散分析後、事後ボンフェローニ解析。実験の最後では、DTXをロードしたHPG-C8/10-MePEG-NH2ナノ粒子の膀胱内注入1回により、PBSコントロール群と比較して、腫瘍成長は88阻害された。当該処理群においてDTXをロードしたHPG-C8/10-MePEGナノ粒子により、54の腫瘍阻害が示された。有効性の当該増大は、DTXをロードしたHPG-C8/10-MePEG-NH2ナノ粒子で処理したマウスの膀胱及び腫瘍組織における薬物取り込み亢進に起因すると思われた。市販製剤タキソテレ登録商標は、当該同所性異種移植モデルにおいて、腫瘍成長を阻害しなかった。各処理群におけるマウスの代表的な生物発光の経時的画像を図26中に示す。膀胱組織の組織学的な検証により、KU7-lucの腫瘍は悪性の成長パターン及び高頻度の多病巣性を示したが、腫瘍接種から25日後には、それらは全般的に固有層に限局し、且つ高悪性度のT1ステージの疾患と相関したことが示される図27。DTX0.2mg/mlでは、PBS処理と比較して、KU7-luc異種移植片において何ら顕著な組織学的変化が引き起こされなかったが、DTX0.2mg/mlをロードしたHPG-C8/10-MePEG及び/又はHPG-C8/10-MePEG-NH2により、腫瘍成長が阻害された。HPG-C8/10-MePEG-NH2にロードしたDTXにより処理された腫瘍は、有意にサイズが減少し、細胞サイズ、核形状及び浸潤する炎症細胞が不均一であった。HPLCにより、生物学的に活性のある部分をdHPGにロードするために用いる技法によって、送達システム中、薬物の目標量の±20を有すると評価され得る製剤を製造できるとも、決定された表11を参照。図28中に示す通り、パクリタキセルPTXを組み込んだ製剤とDTXを組み込んだ製剤とで比較を行った。両方の薬物に関して、それらをHPG-C8/10-MePEG等のdHPGに組み込むことにより、腫瘍の発光減少がもたらされるが、DTXを取り込んだdHPGの方が、パクリタキセルを取り込んだdHPGよりも効果的であった。健康な動物を用い、2つの時点を採用して同様の実験を繰り返した。図29中に示した当該データにより、健康なマウスにおいては、HPG-C8/10-MePEG-NH2を用いると、同量の薬物を送達するためにHPG-C8/10-MePEG又はタキソテレ商標を用いる場合よりも、膀胱中、経時的に見て、保持されるドセタキセルが多いことが証明される。アッセイの定量上限を超えるため、HPG-MePEG-NH2についての結果は半定量的である。タキソテレ商標群及びHPG-C8/10-MePEG群についての結果は定量的である。マウスには各々、体積50μL中50μgの薬物を投与し、50mgのdHPGを用いた1群あたりn=3。実施例22:薬物取り込み実験膀胱内DTX製剤を受けて、膀胱組織中及び血清中の取り込みを評価するために、同所性膀胱腫瘍を有するマウスを、タキソテレ登録商標0.2mg/ml,n=3又はDTX0.2mg/mlをロードした、HPG-C8/10-MePEGn=4及び/又はHPG-C8/10-MePEG-NH2n=4のいずれかで注入した。注入後2時間に、尿、膀胱組織及び血清中のDTX量を測定した。薬物取り込み実験は、樹立したKU7-lucの腫瘍を有する15週齢の雌性ヌードマウス腫瘍接種後33日目で行った。膀胱内注入後0、30及び60分で尾部血液サンプルを採取した。当該時間、マウスは依然、イソフルランで麻酔していた。2時間後、すべてのマウスをCO2を用いて窒息させて殺し、心穿刺により血液を更に除去した。血液サンプルをmicro-haematocrittubesFisherScientific,Pittsburg,PA中又はserum-separatortubesBectonDicknson中で遠心し、血清を液体窒素中でさっと凍結した。各マウスの尿及び膀胱も回収し、膀胱は、凍結前に切開して内腔を露出させ、10mlPBSで5回連続で激しく洗浄した。サンプルはすべて-80°Cで保存した。解析に用いたUPLC-MS/MSシステムは、WatersTQD質量分析計を用いた質量分析と共役した、統合化WatersAcquityUPLC分離システムAcquityBEHC18,1.7μm,2.1X50mmカラムから構成した。電子スプレーイオン源ブロックの温度150°C、脱溶媒和温度350°C、コーン電圧14V、キャピラリー電圧0.70kV、引出電圧3kV、RF電圧0.1kV、コーンガス流25l/h、脱溶媒和ガス流600l/h及び衝突ガス流量0.2ml/minでシステムを作動させた。陽イオンモードにおいて、分子を電子スプレーでイオン化した。以前確立したとおりMugabeC,LigginsRT,GuanD,etal.IntJPharm2011;404:238-49、m/z808.5→527.2の遷移をモニターする複合反応において、DTXを定量した。溶媒/溶媒抽出法によって、マウス血清からDTXを抽出した。96-ウェルプレートにおいて、マウス血漿及び標準液の50μlアリコートをアセトニトリル中の0.1ギ酸150μlと混合し、室温で1分間ボルテックスした。サンプルを4°C10分間、5,500rpmで遠心したAllegra商標25Rcentrifuge,Beckman-Coulter。上清100μlと蒸留水50μlとを混合し、混合して30秒間ボルテックスした。膀胱組織を計量し、ジルコニアビーズBiospecProducts及びミクロバイアルホルダーを備えたmini-beadbeaterBiospecProductsを用いて0.1ギ酸/メタノール中で60秒間ホモジェナイズした。サンプルを4°Cで2分間、14,000rpmで遠心したAllegra商標25Rcentrifuge,Beckman-Coulter。メタノール中0.1トリフルオロ酢酸150μlをサンプルに加え、混合及び4°Cで15分間、14,000rpmでボルテックスしたAllegra商標25Rcentrifuge,Beckman-Coulter。サンプルの解析は、すべてUPLC-MS/MSを用いて行った。スパイクしたコントロールサンプルからの回収率は97で、DTXの検出限界は10ng/mlであった。すべての場合において、ランの精度precisionRSDは15未満の範囲内であった。タキソテレ登録商標で注入したマウスでは、すべての時点で、血清中DTXが検出不能であった。DTXをロードしたHPG-C8/10-MePEG-NH2は、2時間の時点で、血清中最高レベルを示した150.87±34.98対23.97±16.71ng/ml,P<0.01,二元配置分散分析,ボンフェローニ事後検定。しかし、DTXの血清中濃度は、尿及び膀胱組織中の濃度よりも数桁程度低かった表12。DTXをロードしたHPG-C8/10-MePEG-NH2は、タキソテレ登録商標又はDTXをロードしたHPG-C8/10-MePEGと比較して、膀胱組織内蓄積が有意に高くなっていたP<0.001,一元配置分散分析,ボンフェローニの多重比較検定。タキソテレ登録商標処理群とDTXをロードしたHPG-C8/10-MePEG処理群とでは、胱組織蓄積において統計的な有意差は無かったP>0.05,一元配置分散分析。尿中の最終濃度は初期の投与溶液よりも約5~7倍低かった。これは、2時間の膀胱内注入の間の尿希釈に起因した。しかし、DTXの尿中最終濃度において、異なる処理群の間に有意差は無かったP>0.05,一元配置分散分析。各群とも、局所的又は全身的毒性は観察されなかった。実施例23:腫瘍微環境及びローダミン標識HPG類取り込みの評価膀胱腫瘍微環境及び腫瘍組織へのローダミン標識HPG類分布を評価した。HPG類のローダミン標識HPG-C8/10-MePEGポリマー類及びHPG-C8/10-MePEG-NH2ポリマー類を、以前報告SavicR,LuoL,EisenbergA,MaysingerD.Science2003;300:615-8;MugabeC,LigginsRT,GuanD,etal.IntJPharm2011;404:238-49した通り、テトラメチル-ローダミン-カルボニル-アジドTMRCAで共有結合的に標識した。同所性膀胱腫瘍腫瘍接種後33日目を有する15週齢の雌性ヌードマウスをイソフルランで麻酔した。6/0ポリプロピレンの巾着縫合を尿道口付近の表層に施し、膀胱を手で圧縮して空にした。ゲージ24の潤滑化Jelco血管カテーテルを尿道を経て膀胱へ通し、次いで50μlのPBS、遊離型ローダミンTMRCA、HPG-C8/10-MePEG-TMRCA及び/又はHPG-C8/10-MePEG-NH2-TMRCAのいずれかを注入し、巾着縫合を2時間結紮し、その間、マウスの麻酔を維持した。2時間後、巾着縫合を除去し、膀胱を用手圧迫により空にし、150μlのPBSpH6.0で2回洗浄した。マウスを安楽死させ、膀胱を切除してアルミブロック上で凍結し、次いで凍結切片作製のためOCT中に包埋した。膀胱の境界から1、2及び3mmの距離で10μmの凍結切片を切った。切片を室温で乾燥し、10xの対物レンズ0.75μm/ピクセルの解像度を用いて、ローダミン蛍光についてイメージングした。スライドを1:1のアセトン:メタノール溶液中で10分間固定し、特注の毛管現象染色器を用いてCD311:50のハムスター抗CD31抗ハムスターAlexa647二次を伴う及びHoechst33342核染色色素について染色した。CD31及びHoechst33342の蛍光イメージング後、切片をヘマトキシリンで軽くカウンター染色し、マウントして明視野でイメージングした。画像解析:ImageJソフトウェアにおいて扱いやすさを向上させるため、イメージの画像解像度を1.5μm/ピクセルに減少させた。次いで、ユーザー指定のアルゴリズムにより、画像スタックを作り出し、配列させ、腫瘍境界でトリミングしてアーティファクトを除去した。ヘマトキシリン像に基づいて、更に壊死をトリミングした。膀胱内腔を、Hoechst33342像上の腫瘍組織境界に沿って、人為的にトレースした。ユーザー指定の解析マクロを実行し、以下のタイプのデータ:a閾値:陽性の染色を含むが、壊死領域の外側のバックグラウンドを取らないよう、手動で決定した;マクロは、当該閾値を満たすか、又は超える陽性ピクセル数を決定する。腫瘍切片全体についての平均として報告された。b強度:腫瘍組織全体についての平均染色強度或いは二次染色即ち、CD31又は人為的にトレースした境界膀胱内腔からの距離に基づいて選別したピクセルの平均強度として報告された。平均±標準誤差を決定するために算出を行い、マイクロソフトエクセルを用いてグラフ表示を作り出した。Prismv5forMacsソフトウェアを用いて統計解析分散のノンパラメトリック解析クラスカル-ウォリス検定を行った。膀胱腫瘍微環境及び腫瘍組織内のローダミン標識HPG類の分布を評価した。膀胱腫瘍組織には血管が高度に発達しており、直近の血管までの平均距離が40~60μmであった図30A。異群間で有意差P=0.8は見られ無かった。膀胱腫瘍全体の内側の蛍光量を測定した。他の群と比較して、ローダミン標識HPG-C8/10-MePEG-NH2HPG-C8/10-MePEG-NH2-TMRCAが最も高い腫瘍取り込みを示したP=0.037。遊離型ローダミンTMRCAを注入した膀胱とローダミン標識HPG-C8/10-MePEGを注入した膀胱とでは、腫瘍の取り込みに有意差P>0.05は無かった図30B。腫瘍組織へのローダミン取り込みの深さプロファイルを、膀胱内腔からの距離に応じて評価した。内腔からのすべての距離において、HPG-C8/10-MePEG-NH2-TMRCAナノ粒子の腫瘍取り込み亢進が証明され、HPG-C8/10-MePEG-TMRCAナノ粒子よりも5~6倍増加していることが示された図30C。実施例24:HPG-C8/10-MePEG及びHPG-C8/10-MePEG-COOHの合成及び特性解析本発明者らの報告Kainthan,R.K.;Brooks,D.E.BioconjugateChem.2008,19,2231-2238に記載したプロトコール従い、O/DGEコアを修飾したHPG類の重合を実施した。以前報告したプロトコールHaxton,K.J.;Burt,H.M.DaltonTrans.2008,5872-5875に従い、カルボン酸基によるC8/10コア修飾HPG類の機能化を行った。典型的な反応については、5.0gのHPG-C8/10-OH又はHPG-C8/10-MePEG6.5を100mLのピリジン中に溶解し、溶液を窒素雰囲気下に保持し、続けて、HPG類上カルボン酸基の標的量に応じて調整したジメチルアミノピリジン及び無水コハク酸を加えた。最高量のCOOH基でHPGを合成するため、利用可能なすべての遊離ヒドロキシル基を、カルボン酸塩への修飾の標的とした。従って、過剰量のジメチルアミノピリジン0.075g,0.61mmol及び無水コハク酸4.5g,45mmolを反応液に加えた。遊離ヒドロキシル基の理論モル数を算出することにより、HPG1モル当たり348モルの遊離ヒドロキシル基があり、理論的にHPG1モル当たり同数のカルボキシル基があると決定した。従って、結果生じるHPGをHPG-C8/10-MePEG6.5-COOH348と表示した。少量のジメチルアミノピリジン0.015g,0.12mmolと、無水コハク酸0.9g,9mmolを用いることにより、遊離ヒドロキシル基がすべて修飾の標的とされるわけではないHPG類を生成した。反応混合物に加えた無水コハク酸のモル数を算出することにより、HPGに加えたカルボキシレート基の理論数を決定した。従って、当該カルボン酸塩含量が低いHPGをHPGC8/10-MePEG6.5-COOH113と表示した。ジメチルアミノピリジン及び無水コハク酸を加えた後、マグネティックスターバーを用いて、溶液を室温で1晩攪拌した。脱イオン水100mLをフラスコに加え、混合物を30分間攪拌したままにした。共沸蒸留によってピリジンの蒸発をよりよくできるようにするために周期的に水を加え、回転蒸発によって溶媒を除去した。最終生成物をメタノール中に溶解し、酢酸セルロース透析管MWCO10000g/mol,SpectrumLaboratoriesInc.,RanchoDomunguez,CAを用いて、3日間、80:20のメタノール/脱イオン水混合物に対して透析した。8時間ごとに透析媒体を変え、透析媒体が水100である最後の3段階時まで、各回でメタノール濃度を低下させた。凍結乾燥により、ポリマー類を取得した。HPGC810MePEGCOOHの13CNMRδC0147323923324CH2CH2COOH4851498659296419653669987374789380141738417416CH2CH2COOH17592CH2CH2COOH官能基を有するHPG類の調製においては、すべて、MePEG及びCOOH基の目標量を反応混合物に加えた。様々な官能基を有するHPG類のMePEG及びCOOHの目標量を表13中に集約する。多くのカルボン酸塩で官能基化したHPG類及び少ないカルボン酸塩で官能基化したHPG類の反応収率は、それぞれ84及び74であった。HPGポリマー類は、以下の命名法:HPG-C8/10-MePEGA-COOHB式中、HPG-C8/10はアルキルで置換したHPGを表し、Aは、試薬の化学量論MePEGのモル/TMP開始剤のモルに基づく、ポリマーにコンジュゲートされたMePEGの目標含量であり、そしてBは、GPCのデータから算出したポリマーの分子量に基づく、HPGポリマー1モル当たりの予想COOHのモル含量であるによって記載する。NMR解析精製後、HPG類は、すべてNMRにより特性解析した。400MHzBrukerAvanceIIspectrometerBrukerCorporation,Milton,ONを用いてHPGポリマー類のNMRスペクトルを取得した。ポリマー類をDMSO-d6又はメタノール-d4CambridgeIsotopeLaboratories,Andover,MA中に溶解した。一次元のプロトンスペクトル及び炭素スペクトルを取得し、二次元の、多重度編集異核種単一量子コヒーレンスHSQCNMR実験、異核間多結合相関HMBCNMR実験、及びHSQC-TOCSY全相関分光NMR実験も同様にした。化学シフトは残存溶媒のピークを基準にした。SparkyT.D.GoddardandD.G.Kneller,Sparky3,UniversityofCalifornia,SanFranciscoを用いて二次元スペクトルを解析した。HSQCのデータから、HPG類上のCOOHのモル比を、以下の通り推定した:各修飾について、メチレンのプロトン4つに対応するピークを積分し、その積分をプロトン数に関して補正した。当該値を、TMPメチル基の積分プロトン多重度に関して補正で除し、COOHのモル比を得た。図31から、官能基を有するHPG-C8/10-MePEG6.5-COOHポリマー類のピークすべてが、HPG類の構造成分にアサインされたことが理解できるKainthan,R.K.;Mugabe,C.;Burt,H.M.;Brooks,D.E.Biomacromolecules2008,9,886-895;Kainthan,R.K.;Janzen,J.;Kizhakkedathu,J.N.;Devine,D.V.;Brooks,D.E.Biomaterials2008,29,1693-1704;Haxton,K.J.;Burt,H.M.DaltonTrans.2008,5872-5875。HSQC、HMBC及びHSQC-TOCSYを用い、ピーク体積の積分を用いてHPG類上の置換基、C8/10アルキル鎖、MePEG及びCOOHの比を推定した。分岐の程度及び重合化の程度超分岐ポリマー類は、典型的に、以下の方程式:式中、DBは分岐の程度、D、L13及びL14はデンドリティックユニット、リニア1-3ユニット、リニア1-4ユニットの比を表すを用いて、分岐の程度DB及び重合化の程度DPnにより特性解析されるHo ̈lter,D.;Burgath,A.;Frey,H.ActaPolym.1997,48,30-35。超分岐構造中に存在するグリシドールのデンドリティックなリピートユニット及びリニアなリピートユニットの構造を図32中に集約する。更に、当該ポリマー類についての、重合化の程度DPnは、以下:式中、D、L13及びL14は上記の通り定義され、Tはターミナルユニットの比を表し、fcはコア分子の官能基化TMPについては、3であるのように計算するSunder,A.;Hanselmann,R.;Frey,H.;Mu ̈lhaupt,R.Macromolecules1999,32,4240-4246。Dは一次ユニット及び二次ユニットの和によって得られ、Dp及びDs図32を参照、並びにL13、L14及びTは同様に定義される。2DHMBC実験及びHSQC-TOCSY実験の組合せを用いる場合は、一次及び二次のL13、L14、T及びDのユニットを未修飾HPGポリマー基準物質として合成されて、C8/10アルキル成分を含有せず、MePEGの添加又はカルボキシル修飾が無い、データ示さずに関してアサインし、多重度-編集HSQCからのピーク体積を用いてDB及びDPnを算出した。未修飾HPGについて得られた本発明者らの結果は、DB0.51及びDPn14.83であり、構造ユニットについての相対存在量は、リニアユニットについて39、デンドリティックユニットについて20、そしてターミナルユニットについて41である。当該値は、文献の値Sunder,A.;Hanselmann,R.;Frey,H.;Mu ̈lhaupt,R.Macromolecules1999,32,4240-4246;Ho ̈lter,D.;Burgath,A.;Frey,H.ActaPolym.1997,48,30-35とよく一致している。C8/10アルキル鎖で修飾したHPGHPG-C8/10-OHのHSQCスペクトルを未修飾HPGのHSQCスペクトルと比較すると、前者のポリマーコアのスペクトル領域中、2つの新たなピークが見える図33。1つのピークは脂肪族鎖のR-メチレン基にアサインされるが、もう1つのピークは明確にアサインすることができなかった。化学シフトに基づき、当該ピークは、2級ヒドロキシル基に結合した1本のアルキル鎖を伴うTユニットに対応し得るが、この考察は確認できない。HPG-MePEG6.5についても、同様の状況が観察された。MePEGのR-メチレン基からのピークはアサインできたが、未知のピークは明確にアサインできなかった。HPG-C8/10-OHと同様に、新たなピークの化学シフトは、L14様のユニットに類似している。まとめると、DB及びDPnは、シグナルの明確なアサインメントが無いために、NMRデータから算出できなかった。NMRデータにより、リニアユニット又はターミナルユニットの観察を通して遊離ヒドロキシル基を直接的に特性解析すること、並びに予想された分岐パターン及び修飾アルキル、MePEG及びカルボキシルが存在することを、すべて確認することが可能となる。図33でNMRスペクトル中のアサインされた様々なピークを説明し、予想された分岐パターン、MePEG、アルキル鎖及びCOOH基の存在を示す。COOHのモル比COOHで修飾されたすべてのHPGポリマー類について、HSQCNMRスペクトルからCOOHのモル比を推定した。当該方法による、HPGポリマー中のCOOH数は、サンプル中に存在するTMPのメチル基に対して相対的に表現されるため、絶対数ではない。各HPG分子は、TMPを1つだけ含有すると仮定するが、様々なポリマーバッチ中での、HPG1モル当たりのTMP量を、独立して定量してはいない。従って、当該数は、どのくらい多くのヒドロキシル基がCOOHで覆われているかの定性的指標としての役割を果たす。更に、HPG-C8/10-MePEG6.5-COOHポリマー類は、両方同一のHPGC8/10-MePEG6.5のバッチから合成するため、TMP含量は同一と予想し、2つのHPG-C8/10-MePEG6.5-COOHポリマー類における相対的COOH量を決定するために、NMRスペクトルを比較し得る。モル比は、HPG-C8/10-MePEG6.5-COOH113と比較して、HPG-C8/10-MePEG6.5-COOH348中では2.8倍多くのCOOH含量であることを示す。これは2つのポリマー類における目標COOH含量の比の3.1倍とよく一致する。HPG-C8/10-COOHポリマー類及び高カルボニル密度のHPGC8/10-MePEG6.5-COOH348ポリマー類については、リニアユニット又はターミナルユニットに対応するピークは観察されないが、このことは当該ポリマー中にはヒドロキシル基が存在しないことを示す代表的なNMRスペクトルについては、図34を参照。低密度COOHポリマー、HPG-C8/10-MePEG6.5-COOH113については、リニア基及びターミナル基のピークが、新たなピークに加えて観察されるが、このことは、カルボン酸によって、一部のみのヒドロキシル基が飽和しているこを示しているデータ示さず。FT-IR汎用ATRサンプリング装備品を伴うPerkin-ElmerFTIR分光計Perkin-Elmer,Woodbridge,ONを用いて、HPG類のFT-IRスペクトルを取得した。走査範囲は4000~650cm-1で、分解能は4cm-1であった。HPG-C8/10-MePEG6.5、HPG-C8/10-MePEG6.5-COOH348及びHPG-C8/10-MePEG6.5-COOH113のFT-IRスペクトルを図35中に示す。2800~3000cm-1でのピークは、C-H振動と一致しており、すべてのHPG類で生じた。1680~1780cm-1でのピークはCdOバンドから生じたが、このことは、HPG-C8/10-MePEG-COOHポリマー類においてCOOH基が存在することを示す。1200~1400cm-1及び1000~1180cm-1でのピークは、それぞれC-H屈曲及びC-O振動から生じており、従ってそれらは、当該ポリマー類すべてにおいて見出され得る。HPG-C8/10-MePEG6.5、HPG-C8/10-MePEG6.5-COOH113及びHPG-C8/10-Me-PEG6.5-COOH348のFT-IRスペクトルを比較することにより、HPG-C8/10-MePEG-COOHにおけるOHピーク3300~3500cm-1が減少し、CdOピーク1680~1780cm-1が現れることが理解できるが、このことにより、OH基が消費され、COOHに変換されたことが示される。HPG-C8/10-MePEG6.5-COOH348のスペクトルにより、OHピークがほぼ除かれていることが示されたが、このことにより、OH基は大体消費されてCOOHに変換されたことが示される。一方、HPG-C8/10-MePEG6.5-COOH113についてのOHピークは、減少はするが依然明らかであり、NMRの結果と一致した。更に、後者のHPGも小さなCdOピークを示すが、このことにより、HPG-C8/10-MePEG6.5-COOH348と比較してCOOHのモル比が低いことが示される。FT-IRのデータにより、HPG類の官能基化における変化を裏付けるよい証拠が示され、また、精製手順により未反応試薬が除かれたことが確認された。分子量DAWN-EOS多角度レーザー光散乱MALLS検出器を備えたゲル浸透クロマトグラフィーGPCGPC-MALLS及びOptilabRI検出器WyattTechnologyInc.,SantaBarbara,CAによってHPG類の重量平均分子量Mw及び多分散性を決定した。流速0.8mL/minで、0.1Nの硝酸ナトリウム水溶液を移動相として用いた。詳細は以前の報告Kainthan,R.K.;Brooks,D.E.BioconjugateChem.2008,19,2231-2238;Kumar,K.R.;Kizhakkedathu,J.N.;Brooks,D.E.Macromol.Chem.Phys.2004,205,567-573中に記載している。様々なHPG類に関してのdn/dc値は、0.1NNaNO3水溶液中、HPGC8/10-MePEG6.5、HPG-C8/10-MePEG6.5-COOH348及びHPG-C8/10-MePEG6.5-COOH113について、それぞれ0.146、0.165及び0.138と決定し、ポリマー類の分子量の算出に用いた。WyattTechnologyCorp.により提供されたAstraソフトウェアを用いてデータを処理した。MwをPDIで除することにより、ポリマー類の数平均分子量を算出した。当該HPG類の分子量及び多分散性を表13中に示す。官能基化HPG類HPG-C8/10-MePEG6.5-COOHの分子量は、HPG-C8/10-MePEG6.5と比較して増大していることが示された。更に、表面官能基化後には、ポリマー類の多分散性は大きく改変しないことがわかったが、このことにより、表面修飾が比較的一様なことが示される。分子量値は、以前報告したHPG-C8/10-MePEGのものKainthan,R.K.;Mugabe,C.;Burt,H.M.;Brooks,D.E.Biomacromolecules2008,9,886-895;Kainthan,R.K.;Janzen,J.;Kizhakkedathu,J.N.;Devine,D.V.;Brooks,D.E.Biomaterials2008,29,1693-1704;Mugabe,C.;Hadaschik,B.A.;Kainthan,R.K.;Brooks,D.E.;So,A.I.;Gleave,M.E.;Burt,H.M.BJUInt.2009,103,978-986;Kainthan,R.K.;Brooks,D.E.BioconjugateChem.2008,19,2231-2238に類似していた。COOH基の滴定T-50MtitratorMettlerToledo,Mississauga,ONにおいて、COOHを表面移植したHPG類の全濃度を定量するため、電位差/pH滴定を行った。HPG-C8/10-MePEG6.5-COOH348のサンプル及びHPG-C8/10-MePEG6.5-COOH113のサンプルを、10mLの10mMNaOH中に0.2mg/mLで溶解した。各溶液のpHを、0.1MNaOHを加えることにより、手操作で最大おおよそ11に増大させた。次いで、0.01MHClによりサンプルを滴定した。ダイナミックレンジ10~50μL及び注入間の時間間隔30~60秒で注入を設定し、確実に平衡状態を確立した。pHが一旦3.0に到達すると、滴定を終了した。標準的な補外/交差法を用いて、滴定のエンドポイントを決定した。報告したCOOH滴定値は、3回の測定の平均を表す。電位差/pH滴定表13によりHPG類にコンジュゲートしたCOOH基のモル比を測定した。目標モル比及び測定分子量とよく一致していることが示された。例えば、HPG-C8/10-MePEG6.5の数平均分子量6.3×104を、COOH基に帰する分子量カルボン酸塩の分子量101g/molを乗じた、HPG1分子当たりのカルボン酸塩数滴定データから87に等しいと足すことによってもHPG-C8/10-MePEG6.5-COOH113の分子量を算出できる。当該計算に基づくと、HPG-C8/10-MePEG6.5-COOH113の数平均分子量は7.2×104g/molであり、測定値7.0×104g/molとよく一致する。溶解度HPGポリマー類の溶解度特性は、既知の重量のポリマーを様々な水性緩衝液又は蒸留水に溶解することにより評価した。サンプルを穏やかにボルテックスして溶解速度を上げた。濁りの徴候について、ポリマー溶液の550nmの吸光度を、数日間定期的に測定し、ポリマーが溶液中に残存しているか否かを評価した。カルボン酸で誘導体化したHPGポリマー類のいくつかについては、溶液のpHを調整して溶解を促進した。ナノ薬物輸送体の能力が潜在的にあるため、当該ポリマー類の水性媒体中の溶解度特性は重要である。HPG-C8/10-MePEGポリマーの水溶性は、蒸留水、PBS緩衝液pH7.4及び合成尿中で良好である100mg/mLを上回ることがわかった。HPG-C8/10-COOHは、中性pHでのイオン化減少のため、水性媒体又はPBSpH7.4中では実質的に不溶性であり、0.1MNaOH等のアルカリ溶液中でのみ可溶性であることがわかった。HPGコアの疎水性成分アルキル鎖が、溶解度特性を支配するようであった。カルボン酸塩で誘導体化し、MePEG基ともコンジュゲートしたHPG類は、水溶性の増大を示した。従って、HPG-C8/10-MePEG6.5-COOH113は、加熱無しで、100mg/mLの濃度で10mMPBSに完全に溶解し得るが、溶液のpHは7.4から4.5に低下することがわかった。より多量のカルボン酸塩を伴うHPGHPG-C8/10-MePEG6.5-COOH348は、水又はPBS緩衝液における溶解が不十分で、PBS緩衝液の緩衝能を超えて酸性化をもたらし、pHを7.4からおおよそ3.8に低下させた。550nmでの吸光度測定の通り、溶液は有意な濁度を示したデータ示さず。このことにより、ポリマーの不溶性残渣画分が実証される。100mg/mLの濃度及びpH4.25での溶液の透明化を達成するためには、水酸化ナトリウムを加える必要があった。粒子サイズ及びゼータ電位粒子サイズ及びゼータ電位の解析は、disposablesizingcuvetteを用いたMalvernNanoZSParticleSizeanalyzerMalvernInstrumentsLtd.,Malvern,U.K.を用いて行った。濃度15mg/mlのポリマー溶液を1mMNaCl中にpH6.0で調製し、測定前に0.22μmのシリンジフィルターPallLifeSciences,AnnArbor,MIで濾過した。末端がカルボキシルのHPGポリマー類は、粒子サイズが5~10nmの範囲であった表13。ナノ粒子のゼータ電位は、HPG-C8/10-MePEG6.5-COOH113及びHPG-C8/10-MePEG6.5-COOH348について、それぞれ-41.2±3.2mV及び-60.3±2.1mVであり、強い負であった。ゼータ電位の低下は、HPG類表面にコンジュゲートしたカルボキシル基数に起因する。実施例25:HPG類へのシスプラチンの結合0.01MNaOH中10mg/mLのポリマー類溶液を調製することにより、カルボン酸塩で修飾したHPG類へのシスプラチンの結合を評価した。薬物の最終濃度が0.5~4mg/mLの範囲となるように、当該溶液へシスプラチンを加えた。少量の5MNaOHにより、各溶液のpHを6.0に調製した。溶液を50rpmで震盪しつつ、37°Cで一晩インキュベーションした。溶液をNanosep3KOmegacentrifugalfiltrationdevicesPallLifeSciences,AnnArbor,MIに移し、5000rpmで10分間遠心した。少量の濾液10~40μLを0.01MNaOHで400μLに希釈し、以前に記載のo-phenylenediamineOPDAcolorimetricassayHaxton,K.J.;Burt,H.M.DaltonTrans.2008,5872-5875により、濾液中の未結合シスプラチン濃度をアッセイした。HPGに結合したシスプラチンの濃度を、HPGに最初に加えた薬物の濃度から濾液中で見出した未結合シスプラチンの濃度を差し引くことにより決定した。シスプラチンのHPG類への結合は、ポリマー上の末端カルボキシレート基への薬物の配位結合により達成した図36。HPG-C8/10-MePEG6.5-COOH113に関しては、シスプラチンは、ほぼ100の効率で、最大1mg/mL10w/w;図37でポリマーに結合した。当該濃度を上回ると、濾液中に遊離型薬物を検出するが、このことにより、カルボン酸塩の結合部位が飽和し、媒体中に未結合薬物が存在することが示される。濾液中に遊離型薬物が検出される前には、HPG-C8/10-MePEG6.5-COOH348は、100の効率で最大2mg/mLに結合した。当該結合薬物の増加は、カルボキシレート基数の増加、従って、HPG-C8/10-MePEG6.5-COOH113と比較したHPG-C8/10-MePEG6.5-COOH348上のシスプラチン結合部位数の増加に帰するものである。実施例26:invitroでのシスプラチン放出上記した通り、シスプラチンは、ポリマー及びシスプラチンの最終濃度がそれぞれ10mg/mL及び1mg/mLで、カルボン酸塩で修飾したHPG類に結合した。20μLのシスプラチン結合ポリマー溶液又は1mg/mLの遊離型シスプラチン溶液を、7000MWCOSlide-A-LyzerminidialysisunitsThermoScientific,Rockford,ILに加え、サンプルを攪拌しつつ、pH4.5、6.0及び7.4に調整した1mMPBS又はpH7.0の合成尿4Lに対し、37°Cで透析した。合成尿SurineはDyna-TekIndustriesLenexa,KSから購入した。所定の時点で、放出媒体から3つの透析ユニットを取り出し、透析ユニットを3回洗浄し、続けて新鮮な放出媒体で1mLに希釈することにより内容物全体を除去した。OPDA比色アッセイにより、透析ユニット内容物のシスプラチン濃度を決定した。透析バッグ中の実験開始時の初期薬物量から残存する薬物の量を差し引くことにより、放出された薬物のパーセント累積を算出した。データは時間に応じた放出薬物のパーセンテージ累積として表した。PBS中での遊離型シスプラチン放出は迅速であり、7時間以内で100完了したが、このことにより、遊離型薬物の任意の大量放出が膜によって妨げられなかったことが証明される図38。シスプラチン結合HPGのサンプルすべてについて、薬物は制御された態様で、遊離型薬物よりも相当に遅く放出されことがわかった。PBS中では、pHに関係なく、HPG-C8/10-MePEG6.5-COOH113に結合したシスプラチンは、PBS中でほぼ同一の速度最初の2時間で約5放出、1日後に40放出、7日後に最大90放出で放出された。HPG-C8/10-MePEG6.5-COOH348に結合したシスプラチンにより、PBS中、pH6.0及びpH7.4で、同様の速度2hで約3の結合シスプラチン放出、1日で20放出、7日超で最大70で、ほぼ直線的な態様で薬物が放出された。pH4.5での、HPG-C8/10-MePEG6.5-COOH348に結合したシスプラチンについての放出速度は、より高いpHカウンターパートよりも迅速で、放出プロファイルはHPG-C8/10-MePEG6.5-COOH113のものに類似した。シスプラチンの放出速度は、尿存在下では相当速く、放出は2時間で投与量の10を少し上回り、そしてHPG-C8/10-MePEG6.5-COOH113については2日、HPG-C8/10-MePEG6.5-COOH348については3日で、薬物放出が完了した。PBS中での放出と同様に、2つのHPG類間でのシスプラチン放出の違いは、HPG-C8/10-MePEG6.5-COOH348上に存在するカルボキシレート基数が多いことに起因し得る。尿は、いくつかの成分から構成される複雑な混合物なので、HPG類からのシスプラチンの放出増加の原因がどの化合物なのかは不明であるが、当該放出速度増加は、尿による希釈に際して、薬物放出が増加するメカニズムを提供し、好都合であり得る。HPGからのシスプラチンの移動に際し、尿素、尿酸及びクレアチニン等の、尿中の窒素含有化合物が結合し、シスプラチンを不活性化し得る。シスプラチンはある程度、当該化合物と複合体を形成することが示されているが、IV投与後の尿中に存在するシスプラチンの大部分は、元々投与された形態であり、高活性のモノアクア加水分解産物であると決定されたTang,X.;HayesIi,J.W.;Schroder,L.;Cacini,W.;Dorsey,J.;Elder,R.C.;Tepperman,K.Met.BasedDrugs1997,4,97-109。当該知見を踏まえると、尿中でHPG類から放出されたシスプラチンの大部分は、薬理学的に活性のある形態だと思われる。実施例27:細胞傷害性評価MTScellproliferationassayPromega,Madison,WIを用いて細胞傷害性の実験を行った。当該アッセイでは、薬剤の即時の細胞溶解効果は測定されないが、長期間にわたる細胞増殖に対する、ポリマーの影響が測定される。本実験においては、KU-7-luc膀胱癌細胞がM.Tachibana博士KeioUniversity,Tokyo,Japanの好意により提供された。96-ウェルプレート中、10子ウシ血清FBSInvitrogenCanada,Inc.,Burlington,ON、1ペニシリン-ストレプトマイシン、及び1L-グルタミンを添加したダルベッコ改変イーグルDMEM培地InvitrogenCanada,Inc.,Burlington,ON180μLに5,000細胞/ウェルで細胞をプレーティングし、細胞傷害性アッセイ用に、5CO2中、37°Cで24時間増殖させ、おおよそ80のコンフルエントに到達させた。次いで、細胞を0.01~100mg/mLの範囲のHPG類単独、或いは0.01~100μg/mLの範囲の薬物濃度で、遊離型シスプラチン又はシスプラチンをロードしたHPG類と2時間又は72時間インキュベーションした。処理後、細胞をハンクの平衡塩類溶液HBSSで2回洗浄し、180μLの新鮮な培養培地を各ウェルに加え、細胞を72時間増殖させた。当該細胞の増殖を、以前記載したMugabe,C.;Hadaschik,B.A.;Kainthan,R.K.;Brooks,D.E.;So,A.I.;Gleave,M.E.;Burt,H.M.BJUInt.2009,103,978-986通り、CellTiter96aqueousnon-radioactivecellproliferationassayPromega,Madison,WIを用いて測定した。簡単に述べると、180μLのHBSS中3-4,5-ジメチルチアゾール-2-イル-5-3-カルボキシルメトニフェノール-2-4-スルホフェニル-2H-テトラゾリウム10v/v溶液と細胞とを2時間インキュベーションした。マイクロプレートリーダーを用い、620nmを基準にして490nmで吸光度を測定した。KU-7-luc膀胱癌細胞に対する、薬物をロードしていないHPG類及びシスプラチンをロードしたHPG類の阻害効果を、2時間及び72時間のインキュベーション時間について調査した図39。当該インキュベーション時間は、典型的な膀胱内注入時間の模倣を可能にするため及びシスプラチンについて以前決定した阻害濃度と比較するために選択した。2時間のインキュベーションに関して、50の阻害濃度IC50は、HPG-C8/10-OH、HPG-C8/10-MePEG6.5、HPGC8/10-MePEG6.5-COOH348及びHPG-C8/10-MePEG6.5-COOH113について、それぞれ1.3、45.7、47.0及び63.0mg/mLであると決定された。72時間のインキュベーション時間を採用した場合、2時間のインキュベーションで見出されたよりも、ポリマー類の細胞増殖阻害の程度が強かった。HPG-C8/10-OH及びHPG-C8/10-MePEG6.5は、IC50がそれぞれ0.1mg/mL及び0.2mg/mLであった。カルボン酸塩で修飾したHPG類のIC50は、おおよそ10倍減少したが、当該ポリマー類では、依然、おおよそ5mg/mLのIC50値で高度の細胞親和性が示された。HPG-C8/10-MePEG及びHPG-C8/10-MePEG-COOHの、全般的に優秀な生体適合性は、恐らく、既知の細胞の原形質膜との相互作用が、確実にほとんど無いことが既に知られている、MePEG表面の細胞親和性から生じる。カルボキシル化によって加えられた恩恵は、7.4のpHで、当該部分の正味の負電荷から生じ得、細胞表面負電荷との反発力がわずかに成立する。72時間のインキュベーションの後、遊離型シスプラチンは、1μg/mLのIC50でKU-7-luc細胞の増殖を阻害した図40Aが、このことは、当該薬物と細胞の組合せについての以前の報告Hadaschik,B.A.;terBorg,M.G.;Jackson,J.;Sowery,R.D.;So,A.I.;Burt,H.M.;Gleave,M.E.BJUInt.2008,101,1347-1355と一致した。2時間のインキュベーションでは、当該IC50値はおおよそ10μg/mLへと増加した図40B。HPG-C8/10-MePEG6.5-COOHポリマー類に結合した場合、やはり複合体型シスプラチンによってKU-7-lucの増殖が阻害されたが、2時間のインキュベーションについて、72時間のインキュベーションの値おおよそ5μg/mLと比較して高いIC50値おおよそ50μg/mLが観察された。明らかに、2時間及び72時間の両方のインキュベーションに関して、複合体型シスプラチンによる細胞増殖阻害は、遊離型薬物よりもほぼ5倍弱かった。HPG類と複合体化した薬物について、こうしてIC50が増大するのは、ポリマーからの薬物放出速度が遅いためだと思われる。実施例28:前処理無しでの、種々の製剤からのブタ膀胱組織へのDTX及びマイトマイシンFの浸透ブタ膀胱組織への、DTX製剤からのDTXの浸透及びマイトマイシンF製剤からのマイトマイシンFの浸透を評価した。新たに切除したブタ膀胱の切片を、フランツ型拡散セル装置上にマウントし、Tween80、HPG-C8/10-MePEG又はHPG-C8/10-MePEG-NH2中に調製した抗癌剤DTXで2時間処理した。いくつかの実験においては、ブタ膀胱組織をTween80、HPG-C8/10-MePEG又はHPG-C8/10-MePEG-NH2中に調製したDTXで処理する前に、キトサン溶液薬物なし又はHPG-C8/10-MePEG-NH2溶液薬物なしで1時間前処理した。マイトマイシンF製剤については、新たに切除したブタ膀胱の組織切片を、フランツ型拡散セル装置上にマウントし、抗癌剤のマイトマイシンF製剤で2時間処理した。マイトマイシンF製剤で処理する前に、ブタ膀胱組織をHPG-C8/10-MePEG-NH2溶液薬物なしで1時間前処理した。組織内濃度対組織内深さプロファイルを取得し、濃度曲線下面積AUCの算出から、薬物曝露度を取得した。HPLCグレードのアセトニトリル及びジクロロメタンをFisherScientificFairlawn,NJから入手した。液体シンチレーション液のCytoScint商標ESをMPBiomedicalsIrvine,CAから購入した。タイロード塩タイロードは以下:NaCl:8.0、KCl:0.3、NaH2PO4.5H2O:0.093、KH2PO4:0.025、NaHCO3:1.0、Glucose:2.0をg/Lで含有するをSigma-AldrichSt.Louis,MOから購入した。ドセタキセルはNaturalPharmaLangleyBC.Canadaから入手した。市販のタキソテレ登録商標20mg/0.5mLSanofiAventis,Laval,QCはバンクーバー総合病院のBCCancerAgencyから購入した。比活性23.2Ci/mmolのエタノール中トリチウム標識DTXをMoravekBiochemicalsBrea,CAから購入した。実施例10に記載のプロトコールを適合させることにより、HPG-C8/10-MePEGを調製し、実施例18に記載のプロトコールを適合させることにより、HPG-C8/10-MePEG-NH2を調製した。キトサンはNovamatrixFMCが提供した。ブタ膀胱はBritcoInc.Langley,BCから購入した。施設内で、体重90~113kgの6~10月齢の雄性ブタから、膀胱を新たに切除し、取り出した。HPG-MePEG-NH2ポリマー類について、HPG-MePEG-NH21モル当たりのアミンのモル数を、正滴定法、逆滴定法及びフルオレスカミンアッセイを含む種々の方法を用いて測定した表14。DTXをロードしたHPG-C8/10-MePEG製剤、HPG-C8/10-MePEG-NH2製剤及びTween80製剤の調製溶媒蒸発法を用い、HPG-C8/10-MePEG及びDTXをロードしたHPG-C8/10-MePEG-NH2を調製した。DTX及びHPG-C8/10-MePEG又はHPG-C8/10-MePEG-NH2をアセトニトリル中に溶解し、オーブン中60°Cで1時間乾燥し、窒素でフラッシュして微量の有機溶媒を除去した。乾燥前に、ポリマー/薬物溶液を少量アリコートの3HDTXでスパイクした。結果生じるポリマー/薬物マトリクスを、60°Cのタイロード緩衝液pH7.4で再構成し、2分間ボルテックスした。薬物の最終濃度は0.5mg/mLであり、37°Cで用いた。タキソテレ登録商標濃縮液1mL当たり40mgのDTX及び1040mgのTween80を含有をタイロード緩衝液で希釈することにより、DTXをTween80中に調製し、DTXの最終濃度を0.5mg/mLとした。希釈前に、少量の3HDTXを溶液に添加した。マイトマイシンF製剤の調製タイロード緩衝液中でマイトマイシンF分子量=363.4を調製した。AmericanRadiolabeledChemicalsIncStLouis,MOCatART-1689よりそれを受領した。活性は1~10Ci/mmol、エタノール中1mCi/mLであった。50μLのエタノールストックを3mLの緩衝液中に溶解300x希釈することにより、溶液を調製した。前処理として使用するためのキトサン溶液及びHPG-C8/10-MePEG-NH2溶液の調製キトサン溶液を調製するために用いるキトサンは、PROTASAN商標UPCL213製品番号:4210106であり、75~90のアセチル基を除去したキトサンがベースである。当該陽イオンポリマーは高度に精製され、十分に特性解析された水溶性塩化物塩である。典型的に、PROTASAN商標UPCL213の分子量は150000~400000g/molキトサン酢酸塩として測定の範囲である。キトサン溶液は、それを水中に溶解することによって調製し、0.5w/vの溶液濃度とした。前処理として用いるためのHPG-C8/10-MePEG-NH2溶液は、HPG-C8/10-MePEG-NH2をアセトニトリル中に溶解することにより調製した。結果生じる溶液をオーブン中60°Cで1時間乾燥し、窒素でフラッシュして微量の有機溶媒を除去した。結果生じるポリマーを、60°Cのタイロード緩衝液pH7.4で再構成し、2分間ボルテックスした。組織の調製新たに切除したブタの膀胱から、外壁上の過剰脂肪組織を除去し、縦方向に切って左右両側へと広げ、底浅の、炭素源95O2/5CO2で泡立てた37°Cタイロード緩衝液槽中、おおよそ2cmx2cmに細かく切断した。実験はすべて、屠殺後5時間以内に行った。膀胱の小片を、膀胱内腔側の壁を薬物溶液に曝露するように、フランツ型拡散セル装置上にマウントした。当該組織切片は引き伸ばされておらず、厚さはおおよそ2~3mmであった。レセプターチャンバーに10mLの37°Cタイロード緩衝液pH7.4を充填した。余分な組織は拡散セルの周囲周辺でトリミングした。拡散セルのドナーチャンバーに1mLの0.5mg/ml薬物溶液を充填した。組織の曝露面積は0.64cm2であった。各拡散セルを底浅の水層に設置し、37°Cで2時間インキュベーションした。いくつかの実験用には、組織サンプルをDTXやマイトマイシンFをロードした製剤で処理する前に、キトサン溶液薬物無し又はHPG-C8/10-MePEG-NH2溶液薬物無しで1時間前処理した。組織サンプルをタイロード緩衝液で3回洗浄し、未結合の薬物をすべて除去した。組織サンプルをトリミングし、金属プレート上で、ドライアイスベッド上の液体窒素により急速凍結した。組織のクリオトーム切片作製ShandonCryomatrix商標ThemoScientific,Pittsburgh,PAと共に、凍結した膀胱組織をクリオトームの対物ホルダー上にマウントした。R404A冷却システムを伴うShandonCryotomeElectronicThermoElectronCorporation,Cheshire,England上で、ShandonMB35PremierLowGradeMicrotomeBladesThemoScientific,Pittsburgh,PAにより、-20°Cで膀胱組織を切片にした。組織を切片にした。組織切片を、予め計量した1.5mLエッペンドルフチューブ中に入れ、凍結して-20°Cで保存した。組織中の薬物の定量薬物抽出のため、計量した組織切片に200μLのアセトニトリルを加えた。サンプルを、すべての組織切片が抵抗無くアセトニトリル中に浸漬するまでボルテックスし、室温で24時間放置して薬物の完全抽出を確実にした。組織切片をすべて含む抽出サンプルを、シンチレーションバイアルに移し、5mLのシンチレーション液を加えた。液体シンチレーション計測により、3HDTX又は3HマイトマイシンFのカウントを測定し、元のストック液からの較正グラフを用いて定量化した。組織レベルの深さプロファイル解析膀胱壁のすべての層から筋肉にかけて例えば、尿路上皮、固有層及び筋層における平均DTX濃度又はマイトマイシンF濃度について、組織レベルの深さプロファイルを解析した。平均組織レベルは、組織層中で見出した薬物総量を、当該層の組織総重量で除したものとして決定した。組織レベルの深さプロファイル下面積AUCを、直線台形公式を用いて、以下:式中、tはμmでの組織深度、Cはμg/gでの濃度であるの通り算出した。AUC算出のためには、補外法による、0μmでの薬物濃度μg/gの推定が必要であった。前処理無しでの、DTX製剤からブタ膀胱組織へのDTX浸透に関するデータを、図41中に示す。両方のdHPG類により、約1500μmの深さまでは、アミンの含有によって、アミン無しの製剤Tween80製剤タキソテレ登録商標及びアミン官能基を含有しないdHPGを含むと比較して薬物濃度が高くなると評価された。アミン付加の効果は、濃度依存的であることを観察した。図41により、組織、特に約1500μmの深さにおける最高濃度は、最大のアミン含量37mol/molを含有するdHPG製剤を用いて得られたことが示される。表示した組織深度範囲でのAUCを算出した表15a及び15bが、これにより、dHPG製剤では、タキソテレよりも1.3~2.4倍の範囲で向上することが示された。表示した組織深度範囲でのCavg値及びCmax値を算出した表15c。キトサン前処理又はHPG-C8/10-MePEG-NH2前処理を伴う、DTX製剤からブタ膀胱組織へのDTX浸透に関するデータを、図42及び図43中に示す。当該実験の目的は、dHPGポリマーの機能を、やはりアミン官能基を含有するポリマーであるキトサンから区別することである。膀胱内送達において使用するためのポリマーとして、キトサンを検討したが、組織への薬物取り込みを促進するための前処理との関連で、ある組成のdHPG類が優ることが証明された。データにより、キトサン前処理を伴うTween80製剤タキソテレ登録商標によって、すべての組織深度で、膀胱中ドセタキセルの組織中濃度が最低であり、組織浸透が相対的にほとんどもたらされないことが示された。同様に、薬物をHPG-C8/10-MePEGアミン無しビヒクルで投与した場合は、キトサンによる前処理によって、ドセタキセルの組織浸透がやや回復することになるが、これはタキソテレ処理キトサン前処理群にのみ優るだけであった。dHPG類がアミンを含有する37molアミン/molポリマー場合図42及び43においてHPG-C8/10-MePEG-NH2と名付けたに、ドセタキセルの組織浸透において優れた効果を観察した。その上、ドセタキセルをロードしたHPG-C8/10-MePEG-NH2製剤のために、キトサンを前処理として用いた場合は、キトサンにより送達への恩恵はもたらされなかった。組織の深さにわたる組織内濃度図42の濃度曲線下面積AUC,図43全薬物曝露の測定値を測定することにより、各々の成績を比較した。結果により、前処理又は処理で、アミン含有dHPGが利用された場合に、最大曝露度を観察したことが示される。様々な前処理計画後の、様々な製剤からのドセタキセル浸透に関して、組織深度の範囲180~3360umについて算出されたAUC値並びに組織深度の範囲180~1560um及び180~3360umについて算出されたCavg値及びCmax値を、表15d及び15e中に示す。HPG-C8/10-MePEG-NH2前処理を伴うマイトマイシンFのブタ膀胱組織への浸透についてのデータを、図44中に示す。ブタ膀胱のexvivo浸透実験のSEM画像上記実施例28中で観察した薬物浸透効果は、様々な処理への曝露後の膀胱組織の外見と相関した。当該実験に関して、薬物は用いず、膀胱1つ当たり1ビヒクルに1回のみ曝露した。2時間の曝露時間後、膀胱組織を採取し、緩衝液でリンスして4パラホルムアルデヒド及び2グルタルアルデヒドで一晩固定し、1OsO4で後固定し、エタノールで脱水して臨界点乾燥した。膀胱全体を2つに分割し、金蒸着した。全表面をSEMHitachiS4700,3-5kVで検査し、代表的な画像を記録した1サンプル当たり最低3視野。代表的な画像を示す幅約130μmx高さ約100μm。SEM画像により、緩衝液のみで処理した膀胱の尿路上皮で、そしてHPG-C8/10-MePEGアミン無しで処理した膀胱の尿路上皮でも、尿路上皮が無傷か、又はほぼ無傷であること例、アンブレラ細胞の喪失無しが示されることが明らかになった。対照的に、キトサン前処理ビヒクルへの曝露後は、膀胱表面の外見は全く異なっており、尿路上皮の表層アンブレラ細胞が喪失していた図45。溶液中濃度1w/v及び10w/vで10molアミン/molHPGであるHPG-C8/10-MePEG-NH2への曝露後は、尿路上皮からのアンブレラ細胞の一部喪失を観察した図46。対照的に、アミン含量がより多い37mol/molHPG-C8/10-MePEG-NH2を用いると、より多くのアンブレラ細胞の喪失が観察できた。当該影響は濃度依存的であることを観察した。溶液中濃度0.1w/vでは、膀胱表面の外見上の変化はほとんど無かったか、無かったが、濃度が1w/v及び10w/vの溶液で処理した後は、それぞれアンブレラ細胞の一部及び全部の喪失を観察した図46。理論に縛られないが、アミンの効果は膀胱表面を改変し、その薬物透過性の変化をもたらすことであり得ると考えられる。当該効果は、アミン含量及びポリマー濃度に依存することが示された。実施例29:マウス膀胱のinvivo浸透実験マウス膀胱に対する種々の製剤薬物無しの曝露効果を評価した。8~11週例の雌性無胸腺ヌードマウスHarlan,Indianapolis,INを、4イソフルラン及び2L/minO2を用いてディーププレーンdeepplaneに麻酔した。膀胱を十分に圧搾し、外科手術で埋め込んだカテーテルを介して製剤を注入した。ゲージ24の潤滑化Jelco血管カテーテルBDickensonを尿道を経て膀胱へ通す前に、ポリプロピレンの巾着縫合を尿道口付近に施した。50μL量注入し、動物の頭側ををわずかに反転させて巾着縫合を結紮する一方、1回の素早い動作でカテーテルを取り出した。2時間の注入が完了するまで、マウスを1.5~2イソフルラン、2L/minO2で麻酔のままにした。巾着縫合を除去し、動物を回復させた。調製した投与用溶液は無色透明からわずかに琥珀色の溶液であった。ポリマー溶液の濃度は1w/v又は10w/vのいずれかであった。アミン含量の無いHPG-MePEGポリマー、及びHPG1モル当たり8~10mol低及び37mol高のアミンを伴う2種のHPG-MePEG-NH2ポリマー類を用いたHPGの名目上の分子量、65kg/molに基づく。投与用濃度の結果を表16中に集約する。SEM用及び組織学用に、各マウスから膀胱を切除した。動物はすべて、投与後2時間目及び各組織回収前に、死亡及び病的状態に関して観察した。注入部位でのいくらか少量の血液を除いて、死亡又は病的状態の徴候を何ら認めなかった。SEM解析PBSで組織を3回洗浄し、2パラホルムアルデヒドで一晩固定し、次いで0.1Mカコジル酸緩衝液に移した。組織を、1四酸化オスミウム中で1時間、室温で後固定し、次いで水を混合したエタノール中混合物中のエタノールのパーセンテージを増大させていき、30から始めて100に増大させるで脱水した。臨界点での脱水によりサンプルを乾燥し、次いで2回金-白金蒸着した90度で1回及び45度でもう1回。バイオイメージング施設において、サンプルをHitachiS4700走査型電子顕微鏡で検証した。各膀胱は低倍率で観察し、次いで全表面を再び、高倍率で検証した。様々な倍率で複数枚9~10画像撮影した。PBSを2時間注入処理したマウス膀胱表面では、図47中のマウス膀胱表面のSEM像で見られる通り、アンブレラ細胞層は無傷で、褶曲した外見を呈していた。10w/vHPG-MePEG溶液を2時間注入して処理したマウス膀胱の表面では、2時間の注入時間直後は、アンブレラ細胞層は無傷であった。無傷アンブレラ細胞層はHPG-MePEG溶液注入後6時間及び24時間でも観察された図48。図48中に示す通り、細胞表面の外見は平面状であった。10w/vHPG-MePEG-NH210mol/mol溶液を2時間注入して処理したマウス膀胱の表面では、2時間の注入時間直後は、アンブレラ細胞層は無傷であった図49。10w/vHPG-MePEG-NH210mol/mol溶液注入後6時間では、マウス膀胱表面で単一アンブレラ細胞の喪失が示され、上皮層下部が露出していた。同一の注入後24時間では、マウス膀胱表面でアンブレラ表層は無傷であった図49。図50中に示す通り、2時間の1w/vHPG-MePEG-NH237mol/mol溶液注入処理したマウス膀胱表面では、2時間の注入時間直後は、アンブレラ細胞の完全喪失が示され、上皮層下部が露出していた。1w/vHPG-MePEG-NH237mol/mol溶液注入後6時間では、依然として、マウス膀胱表面でかなりのアンブレラ細胞の喪失が示された。1w/vHPG-MePEG-NH237mol/mol溶液注入後24時間では、マウス膀胱表面で表面の一部が無傷であった図50C上部が、アンブレラ細胞は相当喪失していた図50C左下。図51中に示す通り、2時間の10HPG-MePEG-NH237mol/mol溶液注入処理されたマウス膀胱表面では、2時間の注入時間直後は、アンブレラ細胞の完全喪失が示され、上皮層下部が露出していた。10HPG-MePEG-NH237mol/mol溶液注入後6時間では、マウス膀胱表面でやはりアンブレラ細胞の完全喪失が示された。注入後24時間では、マウス膀胱表面でアンブレラ細胞層は無傷であったが、他で観察される無傷層よりも表面細胞が小さく見え、外見があまり平面状でなかった図51。アンブレラ細胞喪失に対する製剤の影響は、dHPGのアミン含量及びdHPGの濃度に依存することが観察された。組織学密着結合、細胞剥離及び炎症細胞の浸潤における変化について、組織を評価した。組織学的解析結果を表18中に集約する。組織学的解析結果から理解できるように、dHPG製剤への曝露後、マウスの膀胱表面に炎症及び壊死の徴候を観察しなかった。尿の分析動物を安楽死させた後、膀胱を露出させ、膀胱穿刺及び25Gニードルを通した回収によりその内容物を取り出した。尿を氷上に保存しかし、凍結させないし、評価のために輸送した。細胞の存在に関して、尿を分析した。数滴の尿を顕微鏡スライドガラス上に静置し、細胞の存在に関して、顕微鏡により観察した。存在するあらゆる細胞を血球計スライドにより計数した。2時間の注入直後、及び膀胱採取時2、6、24時間にマウスから採取した尿中の細胞数を図52中に示す。血液分析CO2吸入の終了時に、臨終の際心穿刺により血液を採取し、おおよそ500~700μLをEDTAmicrotainerチューブに入れた。各チューブを数回転倒させ、血液とEDTAとを確実に一様に混合して凝集を防止した。血液サンプルは、各時点についてすべてのサンプルを回収するまで氷上に保存し、次いで、処理して血漿を生成した。サンプルを2500rpm、4°Cで15分間遠心することにより血漿を生成したrpmはBeckmanGH3.8Arotor,RCFavg200xgに基づく。血漿上清をピペットで吸い、ラベルしたバイアル中に入れ、-80°Cで保存した。MesoScaleplatformandstandardassayキットを用い、TNFαレベルに関して血液を分析した。マウス血液中、様々な製剤による注入後2、6及び24時間での循環TNFαレベルを図53中に示す。あらゆるサンプルでTNFαを検出しなかった。本発明の様々な実施形態を本明細書中に開示するが、当業者に共通する一般知識によって、本発明の範囲内で多くの適合化及び変更がなされ得る。当該変更としては、実質同一の方法で同一の結果を達成すべく、本発明の任意の態様を公知の同等物で置き換えることが挙げられる。数値範囲には、範囲を規定する数値が含まれる。単語comprisingは、本明細書では任意のオープンエンドの用語として使用され、句including,butnotlimitedtoと実質的に同等であり、また単語comprisesは同様の意味を有する。本明細書で使用する場合、単数形のa、an及びtheは、文脈により明らかに別途指示されない限り、複数の指示対象を含む。従って、例えば、athingへの言及は1以上の当該物を含む。本明細書において文献を引用することによって、当該文献が本発明の先行技術であると承認することはないし、当該文書の内容又は日付に関し、何ら承認を構成することもない。本明細書において引用された、任意の優先権文書及びすべての刊行物特許及び特許出願が挙げられるが、限定されないは、参照により、個々の刊行物が具体的に且つ個々に、本明細書中に参照により組み込まれたと、また全体が本明細書中に提示されたかのように、表示されたかのように本明細書中に組み込まれる。本発明は、本明細書中に前記した通りのもの、並びに実施例及び図面を参照したものと実質同一の実施形態及び変更をすべて含む。"