"結晶R-E-2-4-2-5-1-3,5-ジクロロピリジン-4-イルエトキシ-1H-インダゾール-3-イルビニル-1H-ピラゾール-1-イルエタノールである化合物。結晶R-E-2-4-2-5-1-3,5-ジクロロピリジン-4-イルエトキシ-1H-インダゾール-3-イルビニル-1H-ピラゾール-1-イルエタノール一水和物である請求項1に記載の化合物。単離された請求項1または請求項2に記載の化合物。前記化合物は、14.65でのピークを含むX線粉末回析パターンCu放射、λ=1.54059Åにより特徴付けられる請求項1から3のいずれか一項に記載の化合物。3.542θ/-0.1°でのピークを更に含む請求項4に記載の化合物。12.512θ/-0.1°でのピークを更に含む請求項4または請求項5に記載の化合物。19.162θ/-0.1°でのピークを更に含む請求項4から6のいずれか一項に記載の化合物。請求項1から7のいずれか一項に記載の化合物を、薬学的に受容可能な担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて含む医薬組成物。本発明は、結晶R-E-2-4-2-5-1-3,5-ジクロロピリジン-4-イルエトキシ-1H-インダゾール-3-イルビニル-1H-ピラゾール-1-イルエタノールを提供する。この結晶は、FGFRの強力な阻害剤であり、大規模処理特性、結晶化による精製容易性、ならびに、製剤過程および保存の条件下での熱力学的安定性を有する上質固体の前形態に関連する有効な特性を提供し得る。一実施形態において、結晶R-E-2-4-2-5-1-3,5-ジクロロピリジン-4-イルエトキシ-1H-インダゾール-3-イルビニル-1H-ピラゾール-1-イルエタノールは、一水和物形態である。また、本発明は、14.65でのピーク、および、3.54、12.51、もしくは19.162θ/-0.1°の一つ以上のピークを有するX線粉末回析パターンCu放射、λ=1.54059Åにより特徴付けられた、結晶R-E-2-4-2-5-1-3,5-ジクロロピリジン-4-イルエトキシ-1H-インダゾール-3-イルビニル-1H-ピラゾール-1-イルエタノールを提供する。本発明は、癌を治療する方法を提供する。ここで、癌は、哺乳類における乳癌、非小細胞肺NSCL癌、膀胱癌、胃癌、膵臓癌、前立腺癌、大腸癌、多発性骨髄腫、肝臓癌、黒色腫、頭頚部癌、甲状腺癌、腎細胞癌、膠芽細胞腫、および睾丸癌からなる群から選択される。この方法は、このような治療を必要とする哺乳類に本発明の化合物または塩を有効量投与する工程を含む。また、本発明は、本発明の化合物または塩を、1つ以上の薬学的に受容可能な担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせて含む医薬組成物を提供する。特定の実施形態において、組成物は、1つ以上の他の治療薬を更に含む。また、本発明は、治療に使用される本発明の化合物または塩を提供する。加えて、本発明は、癌を治療するための薬剤の製造における本発明の化合物または塩の使用を提供する。加えて、本発明は、癌の治療に使用するため本発明の化合物または塩の使用を提供する。具体的には、これらの癌は、乳癌、肺癌、膀胱癌、胃癌、膵臓癌、前立腺癌、大腸癌、多発性骨髄腫AML、肝臓癌、黒色腫、頭頸部癌、甲状腺癌、腎細胞癌、膠芽細胞腫、および睾丸癌からなる群から選択される。より具体的には、癌は、乳癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、胃癌、膵臓癌、前立腺癌、大腸癌、多発性骨髄腫、肝臓癌、黒色腫、頭頸部癌、甲状腺癌、腎細胞癌、膠芽細胞腫、および睾丸癌からなる群より選択される。最も具体的には、癌は、非小細胞肺癌である。最も具体的には、癌は、胃癌である。最も具体的には、癌は、多発性骨髄腫である。更に、本発明は、乳癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、胃癌、膵臓癌、前立腺癌、大腸癌、多発性骨髄腫、肝臓癌、黒色腫、頭頸部癌、甲状腺癌、腎細胞癌、膠芽細胞腫、および睾丸癌からなる群より選択される癌を治療するための医薬組成物を提供する。この医薬組成物は、活性成分として本発明の化合物または塩を含む。本発明の全ての化合物が塩を形成可能であることは、当業者により理解されるだろう。本発明の化合物は、アミンであり、したがって、多くの無機酸および有機酸のいずれかと反応して、薬学的に受容可能な酸付加塩を形成する。このような薬学的に受容可能な酸付加塩およびこれらを調製する一般的な手法は、当該技術分野において周知である。例えば、P.Stahl,etal.,HANDBOOKOFPHARMACEUTICALSALTS:PROPERTIES,SELECTIONANDUSE,VCHA/Wiley-VCH,2008;S.M.Berge,etal.,PharmaceuticalSalts,JournalofPharmaceuticalSciences,Vol66,No.1,1977年1月を参照。本願明細書において用いられる用語単離されたは、99の純度の結晶R-E-2-4-2-5-1-3,5-ジクロロピリジン-4-イルエトキシ-1H-インダゾール-3-イルビニル-1H-ピラゾール-1-イルエタノールを意味する。本発明の化合物は、以下の調製物および実施例に例示されるように基本的に調製され得る。以下の調製物および実施例の命名は、ChemDraw登録商標Ultra10.0の構造=命名機能Struct=Namenamingfeatureを用いて行った。調製物11-3,5-ジクロロピリジン-4-イルエタノール3首の12L丸底フラスコに、テトラヒドロフランTHF,3LおよびジイソプロピルアミンDIPA,315mL,2.24molを加え、-78°Cに冷却する。n-ブチルリチウムヘキサン中の1.6M,1400mL,2.24molをゆっくりと加える。添加が完了した後、温度を-78°Cに落ち着かせ、3,5-ジクロロピリジン296.7g,2.00molの溶液をゆっくりと加える。この溶液は、迅速に黄色溶液を形成し、さび色の懸濁液に変化する。添加が完了した後、温度を-78°Cに落ち着かせ、THF600mL中にアセトアルデヒド230mL,4.05molをゆっくりと加える。-78°Cで攪拌を続ける。3時間後、ドライアイス槽を除き、飽和塩化アンモニウム水溶液1Lを滴下して加えることで反応物をクエンチし始める。反応物を攪拌しながら一晩室温RTに温める。混合物をメチル-tert-ブチルエーテルMTBE,2L、飽和塩化アンモニウム水溶液1Lおよび水2Lで希釈する。有機物を分離し、飽和塩化ナトリウム水溶液ブラインで洗浄する。水相をMTBE1.5Lで抽出する。有機層と合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、真空内で濃縮する。シリカゲルクロマトグラフィー[ヘキサン中の25酢酸エチルEA]により残渣を精製して、標題化合物を赤色油として得る。収率:352g90。MSESm/z192[M1]。調製物2S-1-3,5-ジクロロピリジン-4-イルエタノール調製物1中で得られた立体異性体の混合物を、90ヘプタン/10エタノールで溶出するCHIRALPAK登録商標AD-Hカラム上で分離する。ピーク2は、所望の光学異性体である。絶対配置を確立するために、生成物のサンプルをCDCl3最終濃度100mg/mLに溶解する。BaF2ウィンドウを備え、路長100mmであるIR細胞を含むChiralIRFTVCD分光計BioToolsInc登録商標を用いて、4cm-1の分解能を有する振動円二色性VCDおよび赤外線IRスペクトルを取得する。VCDおよびIRを6時間、150μLのサンプルで収集する。データを平滑化または更なるデータ処理を行うことなく提示する。振動周波数および吸収およびVCD強度を、Linuxクラスター上のB3PW91/6-31Gレベルでのガウスにより最低エネルギー配座異性体を最適化することにより取得し、対応スペクトルをローレンツ帯域幅6cm-1の振動円二色性を用いてシミュレーションする。上述の分析は、生成物がS-異性体になることを示す。収率:84.37g27。MSESm/z192[M1]。調製物3S-1-3,5-ジクロロピリジン-4-イルメタンスルホン酸エチルS-1-3,5-ジクロロピリジン-4-イルエタノール5.02g,26.14mmolをジクロロメタンDCM,100mL中に溶解し、フラスコを氷槽内で冷却する。トリエチルアミンTEA,3.5mL,25.11mmolを加え、その後、塩化メタンスルホニル2.2mL,28.42mmolを滴下して加える。氷槽を除去し、反応物を室温まで温める。4時間後、反応物を水100mLでクエンチし、層を分ける。水層をDCM50mLで抽出し、その後20イソプロピルアルコールIPA/クロロホルム50mLで抽出する。有機抽出物と合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、真空内で濃縮する。収率:7.15g,100.MSESm/z270[M1]。調製物44-ヨード-1-2-テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イルオキシエチル-1H-ピラゾールマグネティックスターラーバー、窒素ブランケットおよび内部温度プローブを備えた1Lの3首フラスコ内で、2-2-ブロモエトキシテトラヒドロ-2H-ピラン34g,156mmolをアセトニトリルACN,400mL中に溶解する。4-ヨードピラゾール29.34g,149.74mmolを加え、その後、炭酸セシウム73.4g,223.02mmolを加える。混合物を室温にて18時間攪拌する。反応混合物をCELITE登録商標で濾過し、濾過ケーキをACNで洗浄し、濾過物を濃縮して金色油にする。これを更なる精製をすることなく使用する。収率:47.819g99。MSESm/z323[M1]。調製物55-tert-ブチルジメチルシリルオキシ-1H-インダゾール10L反応槽をN,N-ジメチルホルムアミドDMF,2.50L、5-ヒドロキシインダゾール150.20g,1.12molおよび1H-イミダゾール114.35g,1.68molで満たす。混合物を0°Cに冷却し、tert-ブチルジメチルクロロシラン253.16g,1.68molを0.5時間にわたって加える。混合物を18°Cで3時間攪拌する。水2.5Lを5°Cの氷槽とともに反応物にゆっくり加えて、内部温度を約20°Cに維持する。混合物を分液漏斗に移し、EA2x2.5Lで抽出する。抽出物を合わせ、水3×2.5Lおよびブラインで洗浄する。有機溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、蒸発させて赤色油にする。この油をシリカゲルパッドに通し、溶離剤ヘキサン中の0から30EAで溶離して、標題化合物を結晶化するオレンジ色油として得る。収率:300g100。MSESm/z249[M1]。調製物65-tert-ブチルジメチルシリルオキシ-3-ヨード-1H-インダゾールDCM4.00L中の5-tert-ブチルジメチルシリルオキシ-1H-インダゾール300.00g,1.21molの溶液を、10Lのジャケット付き反応槽中で10°Cに冷却する。得られる溶液に対してN-ヨードスクシンイミド298.89g,1.33molを0.5時間にわたって少量ずつ加える。混合物を室温で3時間攪拌して、液体クロマトグラフィー質量分析LC-MSおよび薄層クロマトグラフィーTLCにより示されるように完全に変換する。混合物を10°Cに冷却し、水2.5Lでクエンチする。混合物を分液漏斗に移し、水層をDCM2.5L中で抽出する。合わせた有機抽出物を10のチオ硫酸ナトリウム水溶液5Lおよびブラインを用いて洗浄する。有機溶液を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、真空内で濃縮して、標題化合物をオレンジ色の油として得る。収率:388g90。MSESm/z375[M1]。調製物75-tert-ブチルジメチルシリルオキシ-3-ヨード-1-テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル-1H-インダゾール10Lジャケット付き反応槽内でDCM2.50LおよびTHF1.00L中の5-tert-ブチルジメチルシリルオキシ-3-ヨード-1H-インダゾール387.00g,1.08molの溶液を10°Cに冷却する。得られた混合物に対してメタンスルホン酸14.0mL,216.02mmolを加え、その後3,4-ジヒドロ-2H-ピラン296mL,3.24molを0.5時間にわたって加え、わずかな発熱が観察される。混合物を室温にて3時間攪拌する。反応物を10°Cに冷却し、飽和重炭酸ナトリウム水溶液2Lでクエンチする。混合物を水2Lで希釈し、水層をDCM2Lで抽出する。合わせた有機抽出物を水2Lおよびブラインで洗浄する。有機混合物を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、真空内で濃縮する。残渣を、溶離剤0から10のEA/ヘキサンを用いてシリカゲルパッドで溶出して、標題化合物を得る。収率:150g31。MSESm/z459[M1]。調製物8E-1-テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル-3-2-1-2-テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イルオキシエチル-1H-ピラゾール-4-イルビニル-1H-インダゾール-5-オールマグネティックスターラー、温度プローブ、および隔壁を有する凝縮器を備える500mLの3首丸底フラスコ内で、10分間、DMF150mL中の5-tert-ブチルジメチルシリルオキシ-3-ヨード-1-テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル-1H-インダゾール14g,30.54mmolの混合物に窒素を散布する。得られた溶液にトリブチルアミンTBA,6.7g,36.1mmolおよび4,4,5,5-テトラメチル-2-ビニル-1,3,2-ジオキサボロラン7.0g,43.18mmolを加え、散布を10分間継続する。得られた混合物に対してビストリフェニルホスフィン塩化パラジウムII0.45g,0.63mmolを加え、更に0.5時間、散布を継続する。混合物は95-100°Cで18時間加熱する。反応混合物を40°C以下に冷却し、4-ヨード-1-2-テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イルオキシエチル-1H-ピラゾール9.8g,30.42mmolで満たす。得られた混合物に対して、水酸化バリウム八水和物19.3g,60.3mmolおよび水13mLを加え、散布を10分間継続する。1,1’-ビスジフェニルホスフィノフェロセン塩化パラジウムIIDCM複合体1.3g,1.56mmolを反応物に加え、0.5時間、散布を継続する。混合物を窒素下にて95°Cで3時間加熱する。混合物をEAで希釈し、セライトCelite登録商標パッドで濾過する。パッドをブライン400mLで洗浄し、濾過物層を分ける。有機層をブラインで洗浄し、合わせた水層をEAで抽出する。有機溶液を合わせ、濃縮して明るい茶色とする。この油をDCM100mL中に溶解し、シリカゲルパッドに加える。このパッドを溶離剤ヘキサン中の50EA、その後ヘキサン中の70EAで溶出して、明るい茶色の油を得る。MTBE100mLで粉末にして、標題化合物を固体として得る。収率:5g37。MSESm/z439[M1]。調製物95-R-1-3,5-ジクロロピリジン-4-イルエトキシ-1-テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル-3-E-2-1-2-テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イルオキシエチル-1H-ピラゾール-4-イルビニル-1H-インダゾール内部温度プローブ、還流コンデンサー、窒素ブランケットおよびマグネティックスターラーバー、スラリーを備える3首の250mL丸底フラスコ内で、ACN92mL中のE-1-テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル-3-2-1-2-テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イルオキシエチル-1H-ピラゾール-4-イルビニル-1H-インダゾール-5-オール10.0g,22.83mmolおよび炭酸セシウム7.88g,23.94mmolを60°Cに加温する。懸濁液に対して、S-1-3,5-ジクロロピリジン-4-イルエチルメタンスルホネート7.03g、26.02mmolを加え、一晩攪拌する。反応混合物を室温に冷却し、濾過し、固体をACNで洗浄する。濾過物を濃縮し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー2-4メタノール中の2Mアンモニア/DCMにより精製する。生成分画を合わせ、真空内で濃縮して白色泡状物にする。収率:12.5g86。MSESm/z612[M1]。調製物10非晶形R-E-2-4-2-5-1-3,5-ジクロロピリジン-4-イルエトキシ-1H-インダゾール-3-イルビニル-1H-ピラゾール-1-イルエタノール添加漏斗、窒素入口、内部温度プローブおよびマグネティックスターラーを備える3首の250mL丸底フラスコを、メタノール57mLで満たし、氷槽内で冷却する。得られた溶液に対して、塩化アセチル20mL,281.03mmolを添加漏斗を介してゆっくりと加える。溶液に対して、メタノール40mL中に溶解した5-R-1-3,5-ジクロロピリジン-4-イルエトキシ-1-テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル-3-E-2-1-2-テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イルオキシエチル-1H-ピラゾール-4-イルビニル-1H-インダゾール7.1g,11.59mmolを添加漏斗を介して加える。添加が完了した後、氷槽を除き、室温まで温め、混合物を4時間攪拌する。反応混合物を真空内で濃縮して黄色泡状物にする。黄色泡状物をメタノール10mL中に溶解し、飽和重炭酸ナトリウム水溶液120mLをゆっくりと加える。混合物を室温で30分間攪拌する。混合物を濾過し、固体を水100mLで洗浄し、真空下で乾燥させる。固体を高温EA/メタノール/ヘキサンから再結晶化して、標題の化合物を白色固体として得る。収率:2.1g41。MSESm/z444[M1]。実施例1R-E-2-4-2-5-1-3,5-ジクロロピリジン-4-イルエトキシ-1H-インダゾール-3-イルビニル-1H-ピラゾール-1-イルエタノール一水和物形態1:反応槽を窒素でパージし、R-E-2-4-2-5-1-3,5-ジクロロピリジン-4-イルエトキシ-1H-インダゾール-3-イルビニル-1H-ピラゾール-1-イルエタノールおよび11水/アセトニトリルからなる溶媒混合物で満たす。得られた懸濁液を内部温度66~68°Cまで加熱して溶液を精製する。溶液をゆっくりと56-58°Cに冷却し、次いで11水/アセトニトリル混合物中の種晶の懸濁液で播種し、ゆっくり攪拌する。反応混合物をまず48-50°Cに冷却し、次いで19-20°Cに冷却する。生成物を、固体ケーキを通して、少なくとも80の相対湿度を有する窒素流の存在下で濾過により単離する。次いで窒素流における湿度レベルを続いて40に変化させ、乾燥を継続し、標題化合物の生成を得る。種晶が以下と同様に得られることに留意されたい。反応槽を窒素でパージし、R-E-2-4-2-5-1-3,5-ジクロロピリジン-4-イルエトキシ-1H-インダゾール-3-イルビニル-1H-ピラゾール-1-イルエタノールおよび11水/アセトニトリルからなる溶媒混合物で満たす。得られた懸濁液を70°Cの内部温度まで加熱して、溶液を生成する。次いで、溶液をゆっくりと冷却し、結晶化し、濾過し、乾燥させる。この化合物は、FGFRの強力な阻害剤であり、大規模処理特性、結晶化による精製容易性、ならびに、製剤過程および保存の条件下での熱力学的安定性を有する上質固体の前形態に関連する有効な特性を提供し得る。実施例1の化合物、XRPDXRPDパターンを、Optixロングファインフォーカスソースを用いて生成されたCuKa放射λ=1.54059Å電圧:45kVおよびアンペア:40mWを備えたPANalyticalX’Pert商標ProMPDPW3040Pro回折計を使用して収集する。標本を3ミクロン厚フィルムの間に入れ、透過幾何学で分析し、1秒当たり1回転で回転させ、配向統計を最適化する。分析の前に、シリコン標本NIST標準参照材料640cを分析して、シリコン111ピークの位置を検証する。1つのパナリティカルパターンを、この材料について分析し、好ましい配向および粒子統計効果を、単一の結晶解析からの模擬XRPDパターンとの比較によって評価する。楕円形漸変多層膜鏡ellipticallygradedmultilayermirrorを用いて、標本を通し、検出器上に、ソースのCuKaX線をフォーカスする。回折パターンを標本から240mmに位置されたスキャン位置高感度検出器X’Celeratorを用いて収集する。データを、1.01から39.99度2θから収集する。ここで、ステップサイズは0.017度2θであり、スキャンスピードは1.2度/分であり、0.5度の発散スリットであり、0.25度の分散スリットである。ビームストップを用いて、空中分散により生成されたバックグラウンドを最小化する。ソーラースリットを、入射ビームおよび回折ビームに対して用いて、軸方向の発散を最小化する。観察されたピークを表1に示す。5の強度閾値を用いる。したがって、適切に調製された実施例1のサンプルを、表1に示したような回折ピーク2θ値を有するCuKα放射を用いるX線回折パターンにより特徴付け得る。この回折ピークは、具体的には、3.54、12.51、および19.16のピークの1つ以上と共に14.65でのピークを有し、より具体的には、14.65でのピークを有し、0.1度、より好ましくは0.01度の回折角に対する許容度を有する。FGF/FGFR経路の異常調節は、多くの形態のヒト悪性腫瘍に関与している。FGFRおよびFGFは、多くの場合、多数の癌において過剰発現し、それらの発現は、多くの場合、予後不良と相関する。FGFRキナーゼドメインでの活性化突然変異は、乳癌、NSCLC、膀胱癌、胃癌、前立腺癌、大腸癌、および、多発性骨髄腫を含む、いくつかの型の腫瘍で見出されている。また、FGFR遺伝子座のゲノム増幅も、多くの乳癌患者、胃癌患者、および肺癌患者で検出された。また、FGFRまたはFGFの過剰発現も、膀胱癌、多発性骨髄腫、前立腺癌、および、肺癌などの多くの異なるタイプの腫瘍で見出されている。FGFRファミリー経路阻害剤治療による効果を得られ得る他の癌としては、AML、肝臓癌、黒色腫、頭頸部癌、甲状腺癌、膵臓癌、腎細胞癌、膠芽細胞腫、および、睾丸癌が挙げられる。腫瘍形成および進行におけるそれらの役割に加えて、FGFおよびFGFRも、特に腫瘍増殖の間の血管形成の重要な調節因子である。また、FGF/FGFR軸も、癌関連繊維芽細胞などの他の腫瘍間質細胞を増大させる重要な役割を担う。また、FGFの上方調節は、抗血管形成および他の化学療法に対する耐性をもたらす。最終的に、FGFRの小分子阻害剤は、いくつかの前臨床腫瘍モデルで抗腫瘍活性を証明しており、診療所で検討されている。まとめると、FGF/FGFR経路は、癌細胞でのいくつかの重要な細胞プロセスに必須である。これらの理由により、FGFRおよび/またはFGFシグナル伝達を標的とすることに基づく治療は、腫瘍細胞に直接および腫瘍血管形成の両方に影響を与え得る。調製物10は、下記アッセイにおいて以下に説明するように基本的に検査される。アッセイとしては、FGFR1酵素アッセイフィルタ結合、FGFR3酵素アッセイフィルタ結合、RT-112セルベースアッセイにおけるFGF9誘導p-ERKBSAの存在下で、および、ヒト臍帯静脈内皮細胞HUVECセルベースアッセイにおけるERKリン酸化反応Thr202/Tyr204のAlphaScreenSureFire検出が挙げられる。これらのアッセイは、調製物10がFGFRファミリー経路阻害剤であり、抗癌活性を有することを証明する。よって、非晶形のR-E-2-4-2-5-1-3,5-ジクロロピリジン-4-イルエトキシ-1H-インダゾール-3-イルビニル-1H-ピラゾール-1-イルエタノールで得られた結果は、本発明の化合物で得られた結果を示す。化合物の結晶形はさらに有益である。なぜなら、それらは、大規模処理特性、結晶化による精製容易性、ならびに、製剤過程および保存の条件下での熱力学的安定性を有する上質固体の前形態に関連する特性を提供し得るからである。FGFR1およびFGFR3酵素アッセイフィルタ結合FGFR1またはFGFR3キナーゼ0.15ng/μLヒトFGFR1または0.32ng/μLヒトFGFR3を、10mMの4-2-ヒドロキシエチル-1-ピペラジンエタン-スルホン酸HEPESpH7.5、8mMトリスヒドロキシメチルアミノメタントリス-HCl、pH7.5、5.0mMジチオスレイトールDTT、10.0μMアデノシン三リン酸ATP、10mMのMnCl2、150mMのNaCl、0.01のTRITON登録商標X-100、0.5μCi33P-ATP、および0.05μg/μLのポリGlu-Tyrを含有する50μLのバッファ中でインキュベートする。反応を50μLの容量で室温にて30分間実施し、次いで、130μLの10H3PO4を加えてクエンチする。反応物120μLを96ウェルの1.0μmガラス繊維フィルタプレートに移し、室温で20~30分間インキュベートし、次いで、TITERTEK登録商標Zoom上で0.5H3PO4を用いて3回洗浄する。ウェルを風乾し、その後、40μLのMicroScint商標20Packardを加え、次いで、WallacMicobetaカウンタでカウントする。化合物阻害のために、本化合物をジメチルスルホキシドDMSO中の10mMストックとして提供する。化合物を、20DMSO中で1:3に連続希釈して、10点の濃度反応曲線を生成し、反応プレートへと1:54最終DMSO濃度中の20μMから0.001μM最終濃度に希釈する。その後、フィルタプレート中に反応混合物を加えて、化合物活性を決定する。コントロールウェルは、4DMSOのみを含有し、一方で、基準値を、0.1Mエチレンジアミン四酢酸EDTAを含有するコントロールウェルにより確立する。各10濃度についての阻害値率を、各プレート上のコントロールウェルから算出し、その後、10点の濃度反応データを、得られたカーブフィットから推定された4パラメータロジスティック式および絶対IC50値を用いてActivityBaseソフトウェアIDBSを使用することで、分析する。FGFR1およびFGFR3酵素アッセイは、それぞれ、1.38および1.47の推定IC50についての最小有意比MSRを有する。これらのアッセイにおいてFGFR1およびFGFR3についての調製物10のIC50結果を、それぞれ、0.0077および0.0064μMと推定する。このデータは、調製物10が強力なFGFR1およびFGFR3酵素阻害剤であることを証明している。BSAを含むFGF9誘導p-ERKヒトRT112膀胱癌細胞を、CELLBIND登録商標96ウェルプレートCorning3340内で、10ウシ胎仔血清FBS,Gibco10082-147および1のペニシリン/ストレプトマイシン溶液Gibco15140-122が補充された100μLのRPMI1640Gibco11875-085中に、1ウェル当たり5000細胞の密度で播種し、一晩37°Cでインキュベートする。次の朝、増殖培地を除き、20mg/mLウシ血清アルブミンBSAで補充された100μLのRPMI1640と置き換える。37°Cで3時間インキュベートした後、6のDMSO中の20mg/mLのBSAを含むRMPI1640中の20μLの3×連続希釈化合物を、各ウェルに加える。この得られた10点の用量反応曲線は、1のDMSO中で10~0.005μMの範囲に及ぶ。インキュベートを37°Cで1時間継続する。細胞を、血清を含まないRPMI中の50μg/mLのFGF9RDSystems273-F9溶液の50μLで刺激して、最終濃度が500ng/mLのFGF9を得る。細胞を、リン酸緩衝生理食塩水PBS3.7ホルムアルデヒド最終濃度中の25ホルムアルデヒド溶液の30μLを加えることで固定し、室温で30分間インキュベートする。細胞をPBSで3回洗浄し、その後、100μLの冷メタノールを加え、-20°Cで30分間インキュベートする。メタノールを除去し、細胞を、0.1のTRITON登録商標X-100PBSTを含有するPBSで処理し、PBSで3回洗浄し、室温で15分間インキュベートする。次いで、2BSA、0.01ホスファターゼ阻害剤カクテル1SigmaP2850、0.01ホスファターゼ阻害剤カクテル2SigmaP5726、および0.01プロテアーゼ阻害剤カクテルSigmaP8340が補充されたPBS中のp-p44/42MAPK一次抗体CellSignaling9101Sの1:400希釈の50μL中で、軽く揺らしながら、細胞を4°Cで一晩インキュベートする。次の朝、プレートをPBSTで2回洗浄し、PBSで2回洗浄する。その後、1のBSAおよび0.1のホスファターゼ阻害剤カクテル1、0.01のホスファターゼ阻害剤カクテル2、および0.01のホスファターゼ阻害剤カクテルを含むPBS中のAlexaFluor488ヤギ抗ウサギIgGHL二次抗体InvitrogenA11034の1:1000希釈の80μL中で、プレートを、暗所で室温にて1時間インキュベートする。細胞をPBSで3回洗浄し、その後、PBS中のヨウ化プロピジウムPIMolecularProbeP-3566の1:200希釈の100μLを添加し、次いで、暗所で1時間インキュベートする。1ウェル当たりのp-ERK陽性細胞および総細胞を、それぞれ、Alexa488およびPIについて500-530nMおよび575-640nM光学フィルタを用いてACUMENEXPLORER商標TTPLabTechLtdを使用して同定する。その後、Alexa488値を用いるpERK/ウェルについての合計平均強度を、サンプルプレート上で実施した最小MINDMSO中の10μM陽性コントロール化合物および最大MAXDMSOのみコントロールから得られた値を用いて、阻害率に変換する。その後、阻害値率および10点の濃度反応データを、4パラメータS字形用量反応式を使用して分析し、相対IC50値を得られたカーブから推定する。BSAアッセイにより、FGF9誘導p-ERKは、2.7の推定IC50についての最小有意比MSRを有する。このアッセイにおける調製物10についてのIC50は、0.0004μMに推定される。このデータは、調製物10がヒト癌細胞においてFGF9誘導ERKリン酸化反応の強力な阻害剤であることを証明している。ヒト臍帯静脈内皮細胞HUVECにおけるERKリン酸化反応Thr202/Tyr204のAlphaScreenSureFire検出FGF受容体1の阻害に対する化合物の効果を、ヒト臍帯静脈内皮細胞HUVECにおける基本線維芽細胞増殖因子b-FGF刺激に反応するERKpERKのリン酸化反応をモニターすることで測定する。形成されたpERKレベルを、ALPHASCREEN登録商標SUREFIRE登録商標システムTGRBiosciences,TGRES50Kを用いて測定する。これは、リン酸化検体の免疫-サンドイッチ捕捉を利用し、その後、抗体コーティングALPHASCREEN登録商標ビーズPerkinElmerを用いて検出して、増幅シグナルを得る均質アッセイフォーマットである。HUVEC細胞を、10FBS、0.4ウシ脳抽出物、0.1ヒドロコルチゾン、0.1硫酸ゲンタマイシンアンフォテリシンB、および0.1表皮増殖因子、継代7までのヒト組み換えが補充された表皮細胞基礎培地Clonetics,CC-3132からなる増殖培地中で、回収し、維持する。アッセイのために、細胞を標準的な手順により集菌し、その後カウントする。細胞20,000/ウェルを、100μLの増殖培地を含む96ウェルポリ-D-リシンコーティングプレートBD,354640へとプレーティングする。プレートを37°C、5CO2で一晩インキュベートする。アッセイの日に、細胞を、1.5のFBSおよび20mg/mLのBSAを含有する100μLのEBM内皮細胞基本培地中で、37°C、5CO2で3時間、血清飢餓状態にし、その後、37°Cで1時間、飢餓倍中で、20μMの3×連続希釈化合物で処理する。これは、1のDMSO中で10~0.005μMの範囲に及ぶ10点の濃度-反応曲線を生成する。1時間化合物を処理した後、細胞を、37°Cで15分間、50μLのb-FGFSigma,F0291,最終b-FGF濃度50ng/mLで刺激する。細胞および50μL刺激因子b-FGFを含有するウェル内において、最大シグナルを生成し、10μMの陽性コントロール化合物および50μL刺激因子b-FGFを有する細胞が最小を生成する。その後、培地を除去し、50μLの1×SUREFIRE登録商標溶解バッファTGRBiosciencesSUREFIRE登録商標キットコンポーネントをウェルに加え、軽く揺らしながら室温で10分間インキュベートし続ける。pERK検出のために、6μLの溶解物および10μL反応混合物60部の反応バッファ/10部の活性化バッファ/0.6部の各ドナーおよびアセプタービーズ、PerkinElmer、6760617Rを384ウェルproxiplatePerkinElmer、6006280へ移す。このプレートを密封し、軽く揺らしながら室温で2時間インキュベートし、その後、標準的なALPHASCREEN登録商標設定Ex680nmおよびEm520-620nmを用いて、TurboModuleを備えるPerkinElmerEnVisionプレートリーダ上で読み取る。排出データを、各プレートに関する最大DMSOのみおよび最小DMSO中の10μMの陽性コントロール化合物および10点の化合物濃度データから決定された阻害率に変換し、その後、ACTIVITYBASE登録商標4.0を用いて4パラメータロジスティック式にフィッティングし、IC50を推定する。ERKリン酸化反応Thr202/Tyr204アッセイのALPHASCREEN登録商標SUREFIRE登録商標検出は、2.1のIC50についての最小有意比MSRを有する。このアッセイにおける調製物10についてのIC50は、0.0006μMに推定される。このデータは、調製物10がヒト臍帯内皮細胞においてbFGF誘導ERKリン酸化反応の強力な阻害剤であることを証明している。本発明の化合物は、好ましくは、種々の経路で投与される医薬組成物として処方される。最も好ましくは、このような組成物は、経口投与用または静脈内投与用である。このような医薬組成物およびこれらを調製するプロセスは、当該技術分野において周知である。例えば、REMINGTON:THESCIENCEANDPRACTICEOFPHARMACYD.Troy,etal.,eds.,21sted.,LippincottWilliamsWilkins,2005を参照。本発明の化合物は、幅広い投与範囲にわたって一般的に有効である。例えば、1日当たりの投与量は、通常、体重の約0.5mg/kg~約100mg/kgの範囲内にある。場合によっては、上述した範囲の下限以下の投与レベルが、より適切であり得る。一方で、他の場合において、より大きな投与量が、あらゆる有害な副作用を生じない限り利用され得る。したがって、上述した投与範囲は、決して本発明の範囲を限定することを意図しない。実際に投与される化合物の量は、処置される病態、選択された投与経路、実際に投与される化合物、年齢、体重、個々の患者の反応、および、患者の症状の重篤度を含む、関連する状況を考慮した上で、医師により決定されることが理解される。"