"マウス染色体由来の天然型セントロメア、セントロメア近傍のマウス染色体長腕の部位から長腕遠位を削除したマウス染色体由来の長腕断片、及びテロメア配列を含むこと、ならびに、哺乳類の細胞及び組織において安定に保持されることを特徴とする、マウス人工染色体ベクター。マウス染色体が1~19番染色体のいずれか1つである、請求項1記載のマウス人工染色体ベクター。マウス染色体由来の長腕断片が、マウス1~19番染色体のいずれか1つの長腕からその全内在性遺伝子数の少なくとも99.5が削除された残部からなる、請求項1又は2記載のマウス人工染色体ベクター。寄託細胞株DT40B6bT-1FERMBP-11128に含まれるマウス人工染色体を基本構造として含む、請求項1~3のいずれか1項記載のマウス人工染色体ベクター。哺乳類がげっ歯類である、請求項1~4のいずれか1項記載のマウス人工染色体ベクター。げっ歯類がマウス、ラット又はハムスターである、請求項5記載のマウス人工染色体ベクター。1つ又は複数のDNA配列挿入部位をさらに含む、請求項1~6のいずれか1項記載のマウス人工染色体ベクター。DNA配列挿入部位が、部位特異的組換え酵素の認識部位である、請求項7記載のマウス人工染色体ベクター。DNA配列挿入部位が、loxP配列、FRT配列、φC31attB及びφC31attP配列、R4attB及びR4attP配列、TP901-1attB及びTP901-1attP配列、或いはBxb1attB及びBxb1attP配列である、請求項7又は8記載のマウス人工染色体ベクター。レポーター遺伝子、選択マーカー遺伝子又はその両方をさらに含む、請求項1~9のいずれか1項記載のマウス人工染色体ベクター。外来DNA配列をさらに含む、請求項1~10のいずれか1項記載のマウス人工染色体ベクター。外来DNA配列のサイズが200kb以上である、請求項1~11のいずれか1項記載のマウス人工染色体ベクター。外来DNA配列がヒトDNA配列である、請求項11又は12記載のマウス人工染色体ベクター。外来DNA配列が、薬物代謝関連遺伝子のDNA配列である、請求項11~13のいずれか1項記載のマウス人工染色体ベクター。薬物代謝関連遺伝子が、第一相反応又は第二相反応に関わる酵素をコードする遺伝子である、請求項14記載のマウス人工染色体ベクター。第一相反応に関わる酵素が、CYP1A、CYP1B、CYP2A、CYP2B、CYP2C、CYP2D、CYP2E、CYP2J、CYP3A、CYP4A、CYP4B及びそれらのサブファミリーなどのCYP、並びにCES、からなる群より選択される少なくとも1つの酵素をコードするものである、請求項15記載のマウス人工染色体ベクター。第二相反応に関わる酵素が、UGT1及びUGT2からなる群より選択される少なくとも1つの酵素をコードするものである、請求項15記載のマウス人工染色体ベクター。薬物代謝関連遺伝子が、トランスポーターをコードする遺伝子である、請求項14記載のマウス人工染色体ベクター。トランスポーターをコードする遺伝子が、MDR1、MDR2、MRP2、OAT、OATP、OCT及びBCRPからなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子をコードするものである、請求項18記載のマウス人工染色体ベクター。薬物代謝関連遺伝子が、核内受容体をコードする遺伝子である、請求項14記載のマウス人工染色体ベクター。核内受容体をコードする遺伝子が、PXR、AhR、CAR及びPPARαからなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子をコードするものである、請求項20記載のマウス人工染色体ベクター。外来DNA配列が、ヒト染色体の長腕又は短腕のDNA配列である、請求項11~13のいずれか1項記載のマウス人工染色体ベクター。外来DNA配列が、第一相反応に関わる酵素をコードする遺伝子、第二相に関わる酵素をコードする遺伝子、トランスポーターをコードする遺伝子及び核内受容体をコードする遺伝子からなる群より選択される少なくとも2つの遺伝子の配列を含む、請求項11~21のいずれか1項記載のマウス人工染色体ベクター。ヒト染色体が、疾患遺伝子の原因領域を含む、ヒト染色体の長腕又は短腕のDNA配列である、請求項22記載のマウス人工染色体ベクター。外来DNA配列が、サイトカイン類、ホルモン類、成長因子類、栄養因子類、造血因子類、血液凝固溶解因子類、イムノグロブリン類、G蛋白質共役型受容体類、酵素類などのポリペプチド類をコードする遺伝子又はDNAの配列、或いは、腫瘍、筋ジストロフィー、血友病、神経変性疾患、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、遺伝性疾患などの疾患に関連する治療用遺伝子又はDNAの配列である、請求項11~13のいずれか1項に記載のマウス人工染色体ベクター。細胞が、肝細胞、腸細胞、腎細胞、脾細胞、肺細胞、心臓細胞、骨格筋細胞、脳細胞、骨髄細胞、リンパ球細胞、巨核球細胞、精子又は卵子である、請求項1~25のいずれか1項記載のマウス人工染色体ベクター。組織が、肝臓、腸、腎臓、脾臓、肺、心臓、骨格筋、脳、骨髄、精巣又は卵巣由来の組織である、請求項1~25のいずれか1項記載のマウス人工染色体ベクター。請求項1~27のいずれか1項記載のマウス人工染色体ベクターを保持する細胞。細胞が、体細胞、非ヒト生殖系列細胞、幹細胞及び前駆細胞からなる群から選択される、請求項28記載の細胞。幹細胞が、胚性幹ES細胞又は人工多能性幹iPS細胞である、請求項29記載の細胞。細胞が、初代培養細胞、継代細胞又は株化細胞である、請求項28~30のいずれか1項記載の細胞。細胞がヒト抗体産生を可能にする細胞である、請求項28~31のいずれか1項記載の細胞。疾患治療用の外来DNA配列を含むマウス人工染色体ベクターを保持する請求項28~32のいずれか1項記載の細胞を含む医薬組成物。請求項1~27のいずれか1項記載のマウス人工染色体ベクターを保持することを特徴とする、非ヒト動物。疾患モデル動物である、請求項34記載の非ヒト動物。外来のヒト薬物代謝関連遺伝子を発現可能にする動物である、請求項34記載の非ヒト動物。ヒト抗体を産生可能にする動物である、請求項34記載の非ヒト動物。マウス人工染色体ベクターに含まれる外来DNAに対応する内在遺伝子が破壊されている又は内在遺伝子の発現が低下している、請求項34~37のいずれか1項記載の非ヒト動物。外来DNA配列を含むマウス人工染色体ベクターを保持する請求項28~32のいずれか1項記載の細胞を培養し、産生された該DNAによってコードされるタンパク質を回収することを含む、タンパク質の生産方法。ヒト抗体遺伝子を含むマウス人工染色体ベクターを保持する請求項37又は38記載の非ヒト動物を用いてヒト抗体を産生し、該ヒト抗体を回収することを含む、ヒト抗体の製造方法。疾患モデル動物である請求項35記載の非ヒト動物に候補薬剤を投与し、該薬剤の治療効果を評価することを含む、該疾患を治療するのに有効な物質をスクリーニングする方法。ヒト薬物代謝関連遺伝子を含むマウス人工染色体ベクターを保持する請求項36又は38記載の非ヒト動物或いは該動物由来の細胞、器官又は組織に、薬物又は食品を投与し、該薬物又は食品の薬理作用及び/又は代謝及び/又は毒性を測定することを含む、薬物又は食品の薬理作用及び/又は代謝及び/又は毒性の試験方法。ヒト薬物代謝関連遺伝子を含むマウス人工染色体ベクターを保持する請求項36又は38記載の非ヒト動物から得られたミクロソーム又はミクロソーム画分S9を、培養細胞若しくは細菌と、薬物及び/若しくは食品と共に培養し、薬物又は食品が該細胞又は細菌に及ぼす影響を測定することを含む、薬物又は食品の毒性の試験方法。請求項1~27のいずれか1項記載のマウス人工染色体ベクターを使用して、200kb以上の大サイズの外来DNAをげっ歯類細胞又はげっ歯類個体内で90以上の保持率で安定に維持させることを含む、細胞又は個体内での大サイズDNAの安定化方法。これまでに報告された哺乳類人工染色体の多くがヒト人工染色体特開2005-230020;特開2008-54501;特開2007-306928;特開2007-295860であるが、マウス人工染色体についての報告もごくわずかながら存在し、この人工染色体ではマウスセントロメアの一部の配列を利用することを特徴としているS.Stewartetal.2002GeneTherapy9:719-723。天然のヒト染色体断片をマウス細胞に移入すると、前述のとおり、ヒト染色体断片はマウス細胞内で不安定である例えば、Shinoharaetal.2000ChromosomeResearch,8:713-725。これはマウス個体内でも同様で、マウス各組織においてヒト人工染色体は不安定であり、マウス組織細胞で保持されているヒト人工染色体の割合保持率が低下する傾向にあり、マウス組織細胞の保持率が一定ではなくなる。あるいは、マウス個体間においても同様で、マウス個体間でのヒト人工染色体の保持率が一定ではなくなる。このようなマウス組織間や個体間での不均一な保持率によって、ヒト人工染色体によって目的遺伝子群を導入したマウス細胞あるいはマウス個体を用いて導入遺伝子の詳細かつ正確で再現性の高い解析を行うことが困難である。マウスを含めたげっ歯類由来の人工染色体については、上記のとおり、それに関連する報告は非常に少ないうえに、げっ歯類細胞内又は個体内で安定に維持される人工染色体は存在しない。本発明の目的は、導入される目的遺伝子群がげっ歯類細胞内又はげっ歯類個体内で安定に維持され、それにより詳細かつ正確で再現性の高い解析を可能にするマウス人工染色体ベクターを提供することにある。本発明は、要約すると、以下の特徴を包含する。1マウス染色体由来の天然型セントロメア、セントロメア近傍のマウス染色体長腕の部位から長腕遠位を削除したマウス染色体由来の長腕断片、及びテロメア配列を含むこと、ならびに、哺乳類の細胞及び組織において安定に保持されることを特徴とする、マウス人工染色体ベクター。2マウス染色体が1~19番染色体のいずれか1つである、上記1記載のマウス人工染色体ベクター。3マウス染色体由来の長腕断片が、マウス1~19番染色体のいずれか1つの長腕からその全内在性遺伝子数の少なくとも99.5が削除された残部からなる、上記1又は2記載のマウス人工染色体ベクター。4寄託細胞株DT40B6bT-1FERMBP-11128に含まれるマウス人工染色体を基本構造として含む、上記1~3のいずれか記載のマウス人工染色体ベクター。5哺乳類がげっ歯類である、上記1~4のいずれか記載のマウス人工染色体ベクター。6げっ歯類がマウス、ラット又はハムスターである、上記5記載のマウス人工染色体ベクター。71つ又は複数のDNA配列挿入部位をさらに含む、上記1~6のいずれか記載のマウス人工染色体ベクター。8DNA配列挿入部位が、部位特異的組換え酵素の認識部位である、上記7記載のマウス人工染色体ベクター。9DNA配列挿入部位が、loxP配列、FRT配列、φC31attB及びφC31attP配列、R4attB及びR4attP配列、TP901-1attB及びTP901-1attP配列、或いはBxb1attB及びBxb1attP配列である、上記7又は8記載のマウス人工染色体ベクター。10レポーター遺伝子、選択マーカー遺伝子又はその両方をさらに含む、上記1~9のいずれか記載のマウス人工染色体ベクター。11外来DNA配列をさらに含む、上記1~10のいずれか記載のマウス人工染色体ベクター。12外来DNA配列のサイズが200kb以上である、上記1~11のいずれか記載のマウス人工染色体ベクター。13外来DNA配列がヒトDNA配列である、上記11又は12記載のマウス人工染色体ベクター。14外来DNA配列が、薬物代謝関連遺伝子のDNA配列である、上記11~13のいずれか記載のマウス人工染色体ベクター。15薬物代謝関連遺伝子が、第一相反応又は第二相反応に関わる酵素をコードする遺伝子である、上記14記載のマウス人工染色体ベクター。16第一相反応に関わる酵素が、CYP1A、CYP1B、CYP2A、CYP2B、CYP2C、CYP2D、CYP2E、CYP2J、CYP3A、CYP4A、CYP4B及びそれらのサブファミリーなどのCYP、並びにCES、からなる群より選択される少なくとも1つの酵素をコードするものである、上記15記載のマウス人工染色体ベクター。17第二相反応に関わる酵素が、UGT1及びUGT2からなる群より選択される少なくとも1つの酵素をコードするものである、上記15記載のマウス人工染色体ベクター。18薬物代謝関連遺伝子が、トランスポーターをコードする遺伝子である、上記14記載のマウス人工染色体ベクター。19トランスポーターをコードする遺伝子が、MDR1、MDR2、MRP2、OAT、OATP、OCT及びBCRPからなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子をコードするものである、上記18記載のマウス人工染色体ベクター。20薬物代謝関連遺伝子が、核内受容体をコードする遺伝子である、上記14記載のマウス人工染色体ベクター。21核内受容体をコードする遺伝子が、PXR、AhR、CAR及びPPARαからなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子をコードするものである、上記20記載のマウス人工染色体ベクター。22外来DNA配列が、ヒト染色体の長腕又は短腕のDNA配列である、上記11~13のいずれか記載のマウス人工染色体ベクター。23外来DNA配列が、第一相反応に関わる酵素をコードする遺伝子、第二相に関わる酵素をコードする遺伝子、トランスポーターをコードする遺伝子及び核内受容体をコードする遺伝子からなる群より選択される少なくとも2つの遺伝子の配列を含む、上記11~21のいずれか記載のマウス人工染色体ベクター。24ヒト染色体が、疾患遺伝子の原因領域を含む、ヒト染色体の長腕又は短腕のDNA配列である、上記22記載のマウス人工染色体ベクター。25外来DNA配列が、サイトカイン類、ホルモン類、成長因子類、栄養因子類、造血因子類、血液凝固溶解因子類、イムノグロブリン類、G蛋白質共役型受容体類、酵素類などのポリペプチド類をコードする遺伝子又はDNAの配列、或いは、腫瘍、筋ジストロフィー、血友病、神経変性疾患、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、遺伝性疾患などの疾患に関連する治療用遺伝子又はDNAの配列である、上記11~13のいずれか記載のマウス人工染色体ベクター。26細胞が、肝細胞、腸細胞、腎細胞、脾細胞、肺細胞、心臓細胞、骨格筋細胞、脳細胞、骨髄細胞、リンパ球細胞、巨核球細胞、精子又は卵子である、上記1~25のいずれか記載のマウス人工染色体ベクター。27組織が、肝臓、腸、腎臓、脾臓、肺、心臓、骨格筋、脳、骨髄、精巣又は卵巣由来の組織である、上記1~25のいずれか記載のマウス人工染色体ベクター。28上記1~27のいずれか記載のマウス人工染色体ベクターを保持する細胞。29細胞が、体細胞、非ヒト生殖系列細胞、幹細胞及び前駆細胞からなる群から選択される、上記28記載の細胞。30幹細胞が、胚性幹ES細胞又は人工多能性幹iPS細胞である、上記29記載の細胞。31細胞が、初代培養細胞、継代細胞又は株化細胞である、上記28~30のいずれか記載の細胞。32細胞がヒト抗体産生を可能にする細胞である、上記28~31のいずれか記載の細胞。33疾患治療用の外来DNA配列を含むマウス人工染色体ベクターを保持する上記28~32のいずれかに記載の細胞を含む医薬組成物。34上記1~27のいずれか記載のマウス人工染色体ベクターを保持することを特徴とする、非ヒト動物。35疾患モデル動物である、上記34記載の非ヒト動物。36外来のヒト薬物代謝関連遺伝子を発現可能にする動物である、上記34記載の非ヒト動物。37ヒト抗体を産生可能にする動物である、上記34記載の非ヒト動物。38マウス人工染色体ベクターに含まれる外来DNAに対応する内在遺伝子が破壊されている又は内在遺伝子の発現が低下している、上記34~37のいずれか記載の非ヒト動物。39外来DNA配列を含むマウス人工染色体ベクターを保持する上記28~32のいずれか記載の細胞を培養し、産生された該DNAによってコードされるタンパク質を回収することを含む、タンパク質の生産方法。40ヒト抗体遺伝子を含むマウス人工染色体ベクターを保持する上記37又は38記載の非ヒト動物を用いてヒト抗体を産生し、該ヒト抗体を回収することを含む、ヒト抗体の製造方法。41疾患モデル動物である上記35記載の非ヒト動物に候補薬剤を投与し、該薬剤の治療効果を評価することを含む、該疾患を治療するのに有効な物質をスクリーニングする方法。42ヒト薬物代謝関連遺伝子を含むマウス人工染色体ベクターを保持する上記36又は38記載の非ヒト動物或いは該動物由来の細胞、器官又は組織に、薬物又は食品を投与し、該薬物又は食品の薬理作用及び/又は代謝及び/又は毒性を測定することを含む、薬物又は食品の薬理作用及び/又は代謝及び/又は毒性の試験方法。43ヒト薬物代謝関連遺伝子を含むマウス人工染色体ベクターを保持する上記36又は38記載の非ヒト動物から得られたミクロソーム又はミクロソーム画分S9を、培養細胞若しくは細菌と、薬物及び/若しくは食品と共に培養し、薬物又は食品が該細胞又は細菌に及ぼす影響を測定することを含む、薬物又は食品の毒性の試験方法。44上記1~27のいずれか記載のマウス人工染色体ベクターを使用して、200kb以上の大サイズの外来DNAをげっ歯類細胞又はげっ歯類個体内で90以上の保持率で安定に維持させることを含む、細胞又は個体内での大サイズDNAの安定化方法。本発明により、DNA配列挿入部位を設けたマウス人工染色体ベクターは、目的遺伝子群をげっ歯類細胞内又はげっ歯類個体内に導入する場合に、従来困難であったすべての細胞あるいは組織において目的遺伝子群を安定にかつ同一の保持率で保持させることが可能となり、また目的とする外来のDNA配列や遺伝子と共にレポーター遺伝子を挿入することができるのでベクター導入細胞を可視化でき、詳細かつ正確で再現性の高い解析又は発現産物の効率的な回収を可能にする。本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2010-1425号の明細書及び/又は図面に記載される内容を包含する。本発明をさらに詳細に説明する。上記のとおり、本発明は、その第1の態様において、マウス染色体由来の天然型セントロメア、セントロメア近傍のマウス染色体長腕の部位から長腕遠位を削除したマウス染色体由来の長腕断片、及びテロメア配列を含むこと、ならびに、哺乳類の細胞及び個体組織において安定に保持されることを特徴とする、マウス人工染色体ベクターを提供する。本明細書中で使用するマウス染色体由来の天然型セントロメアという用語は、いずれか1つのマウス染色体のセントロメア全体完全なセントロメアを指す。したがって、このようなセントロメアには、マウス染色体のセントロメア配列の一部を用いて偶発的又は人工的に得られたセントロメア機能を有する構造体、及び、他の動物種の染色体のセントロメアは含まれない。本明細書中で使用するマウス人工染色体又はマウス人工染色体ベクターはトップダウンアプローチで構築された人工染色体であり、ボトムアップアプローチで構築された人工染色体ではない。トップダウンアプローチとは、自然染色体から遺伝子領域を染色体改変により削除し天然セントロメアを人工染色体ベクターとして構築する方法である。ボトムアップアプローチとは、セントロメア配列の一部をクローン化DNAとして取得し、哺乳類細胞にトランスフェクションすることによりセントロメア機能を有する人工染色体を構築する方法である。本明細書中で使用するセントロメア近傍のマウス染色体長腕の部位から長腕遠位を削除したマウス染色体由来の長腕断片は、本発明のベクターがマウスの細胞又は個体組織において安定に保持されるように、かつマウスの個体発生と子孫伝達の妨げにならないように、可能な限り内在遺伝子の影響を排除することが望ましく、そのために、マウス染色体の長腕中の内在遺伝子を除去するようにセントロメアに近い長腕部位で削除して得られる長腕断片を指す。これは全内在遺伝子数の少なくとも99.5、好ましくは少なくとも99.7、より好ましくは少なくとも99.8、最も好ましくは99.9~100が除去されるようにセントロメアに近い長腕部位で削除して得られる長腕断片を指す。本明細書中のDNAは、特に断らない限り、遺伝子若しくは遺伝子座、cDNA、化学修飾DNAを含むすべての種類のDNA核酸に対し使用するものとする。本明細書中で使用する保持率とは、培養細胞、又はマウスの組織細胞の中で人工染色体が存在している細胞の割合を指す。本発明の染色体ベクターが安定に保持されるとは、細胞分裂の際に該染色体ベクターの脱落を起こし難く、すなわち、分裂後であっても細胞内で安定に保持されること、それゆえに、該染色体ベクターが娘細胞や子孫マウスに効率よく子孫伝達されることを意味する。マウス染色体は、マウス染色体1~19、X及びYのいずれでもよいが、好ましくは1番~19番染色体のいずれかである。後述の実施例では、11番染色体を例示しているが、上記の構成を有するかぎり、他の染色体であっても同様にマウス人工染色体ベクターを作製することが可能である。マウス11番染色体断片由来の人工染色体ベクターの場合には、前記長腕断片は、非限定的に例えば、該11番染色体の長腕のAL671968、或いはBX572640AL671968よりセントロメア側に位置する。、CR954170AL671968及びBX572640よりセントロメア側に位置する。又はAL713875AL671968よりセントロメア側に位置する。、よりも遠位の領域が削除された長腕断片からなる。あるいは、前記長腕断片は、本明細書中でのDT40MACである、寄託細胞株DT40B6bT-1FERMBP-11128に含まれるマウス人工染色体を基本構造として含んでもよい図1,3,4参照。その他、例えばマウス15番染色体断片由来の人工染色体ベクターの場合、前記長腕断片は、非限定的に例えば、AC121307、AC161799などの位置よりも遠位の領域が削除された長腕断片からなる。マウス16番染色体断片由来の人工染色体ベクターの場合、前記長腕断片は、非限定的に例えば、AC127687、AC140982などの位置よりも遠位の領域が削除された長腕断片からなる。これらの基本構造には、外来DNA又は遺伝子を挿入するためのloxPなどのDNA配列挿入部位をさらに含むことができる例えば、MAC1,MAC2,MAC3,MAC4など;図1,3,4参照。本発明のベクターは、外来DNA又は遺伝子配列を挿入するための部位を含むことができるため、この部位に、目的の外来DNA又は遺伝子を組み込むことによって、該ベクターが任意の細胞に導入されたときに該目的の外来DNA又は遺伝子を発現することが可能となり、したがって、タンパク質生産、治療用薬剤のスクリーニング、薬物代謝試験、DNAの機能解析、iPS細胞の誘導、遺伝子治療、有用な非ヒト動物の作製などへの応用に使用することが可能である例えば、CYP3A-MAC,GFP-MACなど;図2,5参照。本発明のベクターはまた、マウス染色体を改変し、マウス由来の天然型セントロメアをそのままベクターの作製のために利用している。従来公知のマウス人工染色体ベクターとしては、セントロメア配列の一部を利用して作製されたサテライトDNAベースの哺乳類人工染色体Aces及びSATACと称されるが知られているが、マウス染色体のセントロメア全体を利用して作製されたマウス人工染色体は、これまで作製されたことがない。また、上記哺乳類人工染色体はHACベクターと同様にマウス個体の組織で保持率がばらつき安定ではないCoDoら,ChromosomeRes.2000;83:83-91。本発明のベクターの有用なかつ意外な特性として、マウス、ラット、ハムスターなどのげっ歯類を含む哺乳類の細胞又は個体組織において保持率が向上し、これによって細胞内で安定に保持され、したがって目的遺伝子群を長期間安定に保持することができ、げっ歯類の個体間又は組織間において導入遺伝子量にバラつきがなく長期間発現させることができ、また、分化多能性細胞例えばES細胞、iPS細胞、等を介したげっ歯類の個体発生及び子孫伝達の効率を向上させうる、などの特性を挙げることができる。ヒト人工染色体HACと比較される興味深い特性として、HACの保持率が20未満と非常に低い血液系組織を含めて、組織間のばらつきが極端に少なく、保持率は、試験したどの組織例えば、肝臓、腸、腎臓、脾臓、肺、心臓、骨格筋、脳又は骨髄由来の組織でも90以上であるし、また、本発明のマウス人工染色体は、HACと比べて効率よく繁殖可能であり、HACでは不可能であった、細胞での複数多コピーの保持を可能にする。定義:本明細書で使用する用語の定義は、当業界で使用される一般的な意味に加えて、具体的に以下の意味を包含するものとする。本明細書中でマウス人工染色体又はマウス人工染色体ベクターと称する場合、この用語は、上記例示のようなマウス由来の染色体断片から作製された上記特徴を有する人工染色体を指し、トップダウンアプローチで構築された人工染色体であり、ボトムアップアプローチで構築されていない。繰り返しになるが、トップダウンアプローチとは、自然染色体から遺伝子領域を染色体改変により削除し天然セントロメアを人工染色体ベクターとして構築する方法である。一方、ボトムアップアプローチとは、セントロメア配列の一部をクローン化DNAとして取得し、哺乳類細胞にトランスフェクションすることによりセントロメア機能を有する構造体を構築する方法である。人工染色体は、導入すべき細胞本来の染色体から独立した染色体として安定に複製及び分配が可能である。マウス由来の染色体断片は、マウスの1~19番、X及びY染色体のうちの任意の染色体の断片長腕の全内在遺伝子数の少なくとも99.5が削除された長腕断片であり、該断片には、上で定義したような、セントロメア近傍のマウス染色体長腕の部位から長腕遠位が削除された長腕断片が含まれる。本発明の人工染色体の作製については、後述の実施例、特に実施例1~5、図1~図4に記載されており、マウス11番染色体断片から人工染色体を作製する手法が例示されている。他の染色体断片からのマウス人工染色体の作製もまったく同様に実施しうる。マウスの染色体の配列情報は、DDBJ/EMBL/GenBank、SantaCruzBiotechnology,Inc.などのChromosomeDatabasesから入手可能である。本明細書中の染色体の長腕とはマウス染色体のセントロメア側から遺伝子領域を含む染色体領域を指す。一方、マウス染色体には、短腕がほとんど存在しない。本明細書中の遠位とは、セントロメアから遠い領域すなわち、テロメア側を意味する。反対に、セントロメアに近い領域すなわち、セントロメア側は近位と称する。長腕遠位は、長腕の特定部位よりもテロメア側に位置する領域を意味し、長腕近位は、長腕の特定部位よりもセントロメア側に位置する領域を意味する。この特定部位は、マウス由来の1つの染色体の長腕に存在する全内在遺伝子数の少なくとも99.5、好ましくは少なくとも99.7、より好ましくは少なくとも99.8、最も好ましくは99.9~100が削除される位置である。本明細書中の保持率とは、培養細胞、又はマウスの組織細胞の中で人工染色体が存在している細胞の割合を指す。本明細書中のDNA配列挿入部位とは、人工染色体における、目的DNA遺伝子を含む配列を挿入できる部位、例えば、部位特異的組換え酵素の認識部位等を意味する。このような認識部位には、非限定的に、例えばloxPCreリコンビナーゼ認識部位、FRTFlpリコンビナーゼ認識部位、φC31attB及びφC31attPφC31リコンビナーゼ認識部位、R4attB及びR4attPR4リコンビナーゼ認識部位、TP901-1attB及びTP901-1attPTP901-1リコンビナーゼ認識部位、或いはBxb1attB及びBxb1attPBxb1リコンビナーゼ認識部位などが含まれる。本明細書中の部位特異的組換え酵素とは、これら酵素の認識部位で特異的に目的のDNA配列と組換えを起こすための酵素である。その例は、CreインテグレースCreリコンビナーゼとも称する。、φC31インテグレース、R4インテグレース、TP901-1インテグレース、Bxb1インテグレースなどである。本明細書中のテロメア配列は、同種又は異種の天然テロメア配列、或いは、人工テロメア配列である。ここで、同種とは、人工染色体ベクターの染色体断片が由来するマウスと同種の動物を意味し、一方、異種とは、該マウス以外の哺乳動物これには、ヒトを含むを意味する。また、人工テロメア配列は、TTAGGGn配列nは、繰り返しを意味する。などの人工的に作製されたテロメア機能を有する配列を指す。人工染色体へのテロメア配列の導入は、例えば国際公開WO00/10383に記載されるようなテロメアトランケーションテロメア配列の置換によって行うことができる。テロメアトランケーションは、本発明の人工染色体の作製において染色体の短縮のために使用することができる。本明細書中の外来遺伝子又は外来DNAとは、ベクターの遺伝子挿入部位に挿入する、ベクターに搭載する目的の遺伝子又はDNAであり、対象とする細胞内に本来的には存在しない、対象とする細胞内で発現させるべき遺伝子又はDNA、或いはそれらの配列、を意味する。本明細書中の哺乳動物という用語は、ヒト、サル、チンパンジーなどの霊長類、マウス、ラット、ハムスター、モルモットなどのげっ歯類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギなどの有蹄類などを含むが、これらに限定されない。本明細書中の胚性幹細胞又はES細胞は、哺乳動物由来の受精卵の胚盤胞の内部細胞塊から樹立された分化多能性と半永久的増殖能とを備えた幹細胞であるM.J.EvansandM.H.Kaufman1981Nature292:154-156;J.A.Thomsonetal.1999Science282:1145-1147;J.A.Thomsonetal.1995Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:7844-7848;J.A.Thomsonetal.1996Biol.Reprod.55:254-259;J.A.ThomsonandV.S.Marshall1998Curr.Top.Dev.Biol.38:133-165。この細胞と同等の性質をもつ、体細胞の再プログラミングによって人工的に誘導された細胞が人工多能性幹細胞又はiPS細胞であるK.TakahashiandS.Yamanaka2006Cell126:663-676;K.Takahashietal.2007Cell131:861-872;J.Yuetal.2007Science318:1917-1920。マウス人工染色体ベクターの作製及び用途:以下に、本発明のマウス人工染色体ベクターの作製及びその用途について説明する。具体的には、後述の実施例1~5図1~4にその手順が記載されている。1マウス人工染色体ベクターの作製本発明の人工染色体ベクターは、以下の工程a~c:aマウス染色体を保持する細胞を得る工程、b内在遺伝子数の大部分99.5以上100以下を含まないようにマウス染色体の長腕遠位を削除する工程、及びc長腕近位に1つ以上のDNA配列挿入部位を挿入する工程を含む方法によって作製することができる。ここで、工程b及びcの順序は逆であってもよい。工程a:本発明の人工染色体ベクターを作製するには、まず、マウス染色体を保持する細胞を作製する。例えば、薬剤耐性遺伝子例えば、blasticidinSregistancegeneBSrで標識されたマウス染色体を保持するマウス線維芽細胞であるmouseembryonicfibroblastmChr11-BSrとG418耐性遺伝子であるneo遺伝子を導入したマウスA9細胞ATCCVA20110-2209であるmouseA9neoと細胞融合し、薬剤耐性遺伝子で標識されたマウス染色体を保持するマウスA9雑種細胞であるmouseA9xmouseembryonicfibroblastneo;mChr11-BSrから、その染色体を相同組換え率の高い細胞に移入することにより作製することができる。マウス繊維芽細胞は、文献記載の方法に基づいて入手することが可能であり、例えば、マウス繊維芽細胞は日本クレアより入手可能なC57B6系統のマウスより樹立可能である。相同組換え率の高い細胞としては、例えば、ニワトリDT40細胞Diekenetal.,NatureGenetics,12:174-182,1996を利用できる。さらにまた、上記移入は、公知の染色体移入法、例えば、微小核細胞融合法Koietal.,Jpn.J.CancerRes.,80:413-418,1973によって行うことができる。工程b:マウス由来の単一の染色体を保持する細胞において、該マウス染色体の長腕遠位を削除する。このとき、重要なことは、長腕上に存在する内在遺伝子の大部分を削除又は、除去もしくは欠失しマウスセントロメアを保持する人工染色体を構築することである。これは長腕上に存在する全内在遺伝子の少なくとも99.5、好ましくは少なくとも99.7、より好ましくは少なくとも99.8、最も好ましくは99.9~100を削除又は、除去もしくは欠失するように切断位置を決定することである。そうすることによって、人工染色体が導入された、げっ歯類などの哺乳動物由来の、好ましくはマウス由来の、細胞、組織又は個体において安定かつ高保持率で保持され、目的遺伝子群の正確な解析、物質生産などに用いるすることができる。上記内在遺伝子の削除は、例えば、WO00/10383号に記載のテロメアトランケーションにより行うことができる。具体的には、マウス染色体を保持する細胞において、人工テロメア配列を保持するターゲティングベクターを構築し、相同組換えにより染色体上の所望の位置に人工テロメア配列が挿入されたクローンを取得し、これによってテロメアトランケーションにより欠失変異体が得られる。すなわち、所望の位置又は、部位が削除すべき長腕遠位の切断位置であり、この位置に人工テロメア配列が相同組換えにより置換、挿入されて長腕遠位が削除される。この位置は、ターゲティングベクターを構築する際の標的配列の設計により、適宜設定できる。例えば、後述の実施例では、マウス11番染色体長腕のAL671968GenBank登録番号のDNA配列に基づいて標的配列を設計し、その標的配列よりもテロメア側でテロメトランケーションが起こるように設定されている図9参照。これにより、内在遺伝子の大部分が削除されたマウス11番染色体断片が得られる。他の染色体の場合にも同様にテロメアトランケーションを実施できる。工程c:DNA配列挿入部位として、好ましくは部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入することができる。すなわち、ある種の酵素が特定の認識部位を認識して特異的にその認識部位でDNAの組換えを起こす現象が知られており、本発明のマウス人工染色体ベクターでは、このような酵素とその酵素の認識部位からなる系を利用して、目的とする遺伝子又はDNA配列を挿入、搭載できる。このような系として、例えば、バクテリオファージP1由来のCre酵素と、その認識部位であるloxP配列の系Cre/loxP系;B.SauerinMethodsofEnzymology;1993,225:890-900や、出芽酵母由来のFlp酵素と、その認識部位であるFRTFlpRecombinationTarget配列の系Flp/FRT系や、ストレプトミセスファージ由来のφC31インテグレースと、その認識部位であるφC31attB/attP配列の系、R4インテグレースと、その認識部位であるR4attB/attP配列の系、TP901-1インテグレースと、その認識部位であるTP901-1attB/attP配列の系、Bxb1インテグレースと、その認識部位であるBxb1attB/attP配列の系、などを挙げることができるが、DNA配列挿入部位として機能しうるのであれば、上記の系に限定されないものとする。このような部位特異的組換え酵素の認識部位の挿入のためには、公知の方法、例えば、相同組換え法が利用でき、挿入位置及び数は、長腕近位及び短腕近位内に適宜設定することができる。本発明においては、1つの種類の認識部位又は異なる種類の認識部位を1つ挿入することも可能である。認識部位の設定により、外来遺伝子又は外来DNAの挿入位置を特定することができるので、挿入位置が一定となり、想定外の位置効果positioneffectを受けることもなくなる。後述の実施例に例示されるマウス人工染色体の場合には、マウス11番染色体上のBX572640に挿入されている部位特異的組換え酵素の認識部位loxP配列において挿入された遺伝子を組織特異的に発現させることを可能にする図11、図20、図24。本発明の、DNA配列挿入部位を有するマウス人工染色体ベクターには、好ましくは、目的とする遺伝子又はDNA配列の挿入部位を残して、レポーター遺伝子をあらかじめ挿入しておいてもよい。レポーター遺伝子としては、特に限定するものではないが、例えば、蛍光タンパク質例えば、緑色蛍光タンパク質GFP又はEGFP遺伝子、黄色蛍光タンパク質YFP、等、タグタンパク質コードDNA、β-ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子などが挙げられるが、GFP又はEGFPが好ましい。本発明のマウス人工染色体ベクターにはさらに、選択マーカー遺伝子を含んでもよい。選択マーカーは、該ベクターで形質転換された細胞を選別する際に有効である。選択マーカー遺伝子としては、ポジティブ選択マーカー遺伝子及びネガティブ選択マーカー遺伝子のいずれか、又はその両方が例示される。ポジティブ選択マーカー遺伝子には、薬剤耐性遺伝子、例えばネオマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ブラストサイジンSBS耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ゲネチシンG418耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子などが含まれる。また、ネガティブ選択マーカー遺伝子には、例えば単純ヘルペスチミジンキナーゼHSV-TK遺伝子、ジフテリアトキシンA断片DT-A遺伝子などが包含される。一般に、HSV-TKは、ガンシクロビル又はシクロビルと組み合わせて使用される。本発明のマウス人工染色体ベクターに、レポーター遺伝子又は目的の外来遺伝子もしくはDNAを挿入する手法としては、相同組換え法を好ましく使用できる。相同組換えは、マウス染色体上の挿入位置の5’側領域及び3’側領域の塩基配列各々約1~4kb、好ましくは約2~4kbと相同な両配列5’arm及び3’armの間に、挿入すべきDNAカセットを連結して得られたターゲティングベクターを用いて行うことができる。この目的で使用されるベクターとしては、例えばプラスミド、ファージ、コスミド、ウイルスなどが挙げられ、好ましくはプラスミドである。ターゲティングベクター構築のための基本プラスミドの例は、V907又はV913LexiconGeneticsなどであるが、これらに限定されない。基本ベクターには、プロモーター、エンハンサー、選択マーカー遺伝子、複製開始点などの、ベクター構築において一般的に挿入される1つ又は2つ以上の配列又はエレメントが含まれていてもよい。上記の手法で作製されたマウス人工染色体は、マウス由来の染色体断片これには、天然型セントロメア、少なくとも99、好ましくは少なくとも99.5、の内在遺伝子が削除された長腕断片、及び存在する場合の短腕が含まれる。と、人工テロメア配列とを含む。また、上記セントロメアは、人工染色体の作製のために利用されたマウスの染色体のセントロメア構造の全体である。本発明のマウス人工染色体ベクターの例は、後述の実施例で作製されたマウス人工染色体ベクターであり、この人工染色体は、マウス11番染色体において長腕遠位をAL671968において削除して得られたベクターである図1、図3、図4、図9、図10。このベクターは、本明細書中でのDT40MACである、寄託細胞株DT40B6bT-1FERMBP-11128に含まれるマウス人工染色体を基本構造として含む。基本構造であることから、このDNA構造中に以下のようなDNA配列挿入部位、選択マーカー遺伝子、外来遺伝子又は、DNAなどを挿入することができる。上記マウス人工染色体ベクターには、好ましくは、1つ又は複数のDNA配列挿入部位、例えば部位特異的組換え酵素の認識部位例えばCre酵素認識部位であるloxP配列を含む図1、図3、図4、図11、図20、図24。ここで、部位特異的組換え酵素の認識部位は、例えばGFP-PGKneo-loxP-3’HPRTタイプのloxP配列であるか、或いは、5’HPRT-loxP-hygタイプであるか、或いはPGKneo-loxP-3’HPRTタイプのloxP配列或いはGFP-5’HPRT-loxP-PGKhygタイプのloxP配列であるが、これらに限定されない。ここで、GFPは、緑色蛍光タンパク質遺伝子であり、PGKneoは、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター/ネオマイシン耐性遺伝子カセットであり、HPRTは、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子であり、hygはハイグロマイシン耐性遺伝子である。上記マウス人工染色体ベクターにはさらに、レポーター遺伝子、選択マーカー遺伝子ポジティブ選択マーカー遺伝子、ネガティブ選択マーカー遺伝子などを含むことができる。該ベクターにはさらに、目的の外来遺伝子又はDNA配列を含んでもよい。本発明のマウス人工染色体ベクターの利点としては従来の人工染色体ベクターの利点である、1宿主染色体に挿入されず独立して維持されることから、宿主遺伝子を破壊しない、2一定のコピー数複数多コピー可能で安定に保持され、宿主細胞の生理的発現制御を受けることから、挿入された遺伝子の過剰発現や発現消失が起きない、3導入可能なDNAサイズに制約がないことから、発現調節領域を含む遺伝子や複数遺伝子/アイソフォームの導入が可能となることに加え、げっ歯類細胞或いはげっ歯類個体中における保持率が従来の人工染色体に比べて向上すること、導入遺伝子の長期間における安定発現を実現し、かつ子孫伝達率が向上することで遺伝子導入マウスの作製効率が向上する、4ベクター導入後の組織間のばらつきが少なく、すなわち保持率はどの組織でも90以上であり、HACの場合20未満の保持率である血液系組織でさえも90以上の保持率である、などの利点が挙げられる。2外来遺伝子又はDNAの導入本発明のマウス人工染色体ベクターには、外来遺伝子又はDNAを導入することができる。外来遺伝子又はDNA配列のサイズは、特に制限されず、20kb以下であってもよいし、或いは20kbを超えてもよく、例えば50kb以上、100kb以上、200kb以上、500kb以上、700kb以上、1Mb以上、10Mb以上、20Mb以上、30Mb以上、40Mb以上、又は50Mb以上である。本発明のベクターは、HACベクターと同様に、BAC、PAC、YACなどの人工染色体ベクターでは困難なサイズ、すなわち1Mb以上の外来DNA染色体断片を搭載可能である。そのうえ、本発明のベクターは、そのように200kb以上、例えば1Mb以上、の大サイズの外来遺伝子又はDNAをHACよりも安定にかつ高保持率90以上で哺乳類の細胞内、組織内又は非ヒト動物個体内、好ましくはげっ歯類の細胞内、組織内又は個体内、に保持することを可能にする。本発明の実施形態の一つとして、本発明は、200kb以上の巨大なサイズの外来遺伝子又はDNAをげっ歯類細胞またはげっ歯類個体で90以上の保持率で安定に維持させることが可能なベクター、並びに、該ベクターを作製する方法を提供する。外来遺伝子又はDNAは、対象となる細胞にとって外部から導入される核酸配列であり、特に限定されるものではなく、任意の生物種由来の或いは任意の組織又は細胞由来の遺伝子又はDNAであり、好ましくは哺乳動物由来の遺伝子又はDNA、より好ましくはヒト由来の遺伝子又はDNAである。そのような遺伝子又はDNAには、サイトカイン類、ホルモン類、成長因子類、栄養因子類、造血因子類、イムノグロブリン類、G蛋白質共役型受容体類、酵素類などのポリペプチド類をコードする遺伝子又はDNA、その他、腫瘍、筋ジストロフィー、血友病、神経変性疾患例えばアルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、等、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、遺伝性疾患などを含む種々の疾患に関連する治療用遺伝子又はDNA、ヒト薬物代謝酵素の遺伝子群又はDNAやヒト薬物代謝関連遺伝子、ヒト染色体の長腕又は短腕のDNA、ヒトゲノムライブラリーなどが含まれるが、これらに限定されない。サイトカイン類には、例えば、インターフェロン類例えばIF-α,IF-β,IF-γ等、インターロイキン類例えばIL-1,IL-2,IL-4,IL-6,IL-11,IL-12等、腫瘍壊死因子例えばTNF-α,TNF-β、TGF-βファミリータンパク質例えば骨形成促進タンパク質BMP、等などが含まれる。ホルモン類には、例えば、成長ホルモン、、ヒト絨毛性ゴナドトロピンhCG、ヒト胎盤性ラクトゲンhPL、ヒト下垂体性性腺刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモンTSH、黄体形成ホルモン放出因子、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、プロラクチンなどが含まれる。成長因子類又は栄養因子類には、例えば、インスリン様増殖因子、脳由来神経栄養因子BDNF、アルブミン融合絨毛様神経栄養因子、血小板由来神経栄養因子PDNF、形質転換成長因子、神経成長因子NGF、TNF成長因子などが含まれる。血液凝固溶解因子類には、例えば、第VII因子、第VIII因子、第X因子、t-PAなどが含まれる。造血因子類には、例えば、エリスロポエチン、顆粒球コロニー形成刺激因子、トロンボポエチンなどが含まれる。イムノグロブリン類には、例えば、各種抗原に対するヒト抗体類、ヒト化抗体類、キメラ抗体類、合成抗体などの組換え抗体類などが含まれる。G蛋白質共役型受容体類には、アドレナリン受容体、ムスカリン性アセチルコリン受容体、アデノシン受容体、GABA受容体B型、アンギオテンシン受容体、コレシストキニン受容体、ドパミン受容体、グルカゴン受容体、ヒスタミン受容体、嗅覚受容体、オピオイド受容体、セクレチン受容体、ソマトスタチン受容体、ガストリンの受容体、P2Y受容体などが含まれる。酵素類には、例えば、アスパラギナーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、ウリカーゼ、ストレプトキナーゼ、ドパミン合成酵素、アデノシンデアミナーゼなどが含まれる。腫瘍、筋ジストロフィー、神経変性疾患例えばアルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、等、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、遺伝性疾患などを含む種々の疾患に関連する治療用遺伝子には、例えばジストロフィン遺伝子、IL-12遺伝子、TNF-α遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、ドパミン合成系酵素遺伝子、遺伝性欠損酵素の遺伝子類、などが含まれる。薬物代謝酵素は、薬や毒物などの異物を分解排出するための代謝反応に関わる酵素であり、第一相反応酸化、還元、加水分解に関わる酵素及び第二相反応抱合に関わる酵素を含む。第一相反応に関わる酵素には、例えばチトクロムP450CYPなどの公知の酵素、具体的にはCYP1A、CYP1B、CYP2A、CYP2B、CYP2C、CYP2D、CYP2E、CYP2J、CYP3A、CYP4A、CYP4B及びそれらのサブファミリー、並びにCES、などが含まれる。CYPサブファミリーとしては、例えばCYP3AのサブファミリーにはCYP3A4,CYP3A43,CYP3A5,CYP3A7などが含まれるし、また、CYP2CのサブファミリーにはCYP2C8,CYP2C9,CYP2C18,CYP2C19などが含まれる。ちなみに、後述の実施例に記載されるCYP3A-MACは、CYP3Aクラスターを意味しており、CYP3A4,CYP3A43,CYP3A5及びCYP3A7からなる。一方、第二相反応抱合に関わる酵素には、例えばUGT1及びUGT2などが含まれる。薬物代謝関連遺伝子には、例えばトランスポーターをコードする遺伝子、核内受容体をコードする遺伝子などが含まれる。トランスポーターをコードする遺伝子の例は、MDR1,MDR2,MRP2,OAT,OATP,OCT,BCRPなどであり、核内受容体をコードする遺伝子の例は、PXR,AhR,CAR,PPARαなどである。このように、本発明のベクターに導入可能な、薬物代謝に関係する外来DNA配列は、第一相反応に関わる酵素をコードする遺伝子、第二相に関わる酵素をコードする遺伝子、トランスポーターをコードする遺伝子及び核内受容体をコードする遺伝子からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子の配列、或いは、少なくとも2つの遺伝子の配列を含むことができる。本発明のマウス人工染色体ベクターにおける外来遺伝子又は外来DNAの挿入部位の近傍又は挿入部位の両側には、少なくとも1つのインスレーター配列を存在させることができる。インスレーター配列は、エンハンサーブロッキング効果すなわち、隣り合う遺伝子が互いに影響を受けない又は染色体バウンダリー効果遺伝子発現を保証する領域と遺伝子発現が抑制される領域を隔て区別するを有する。このような配列には、例えばヒトβグロビンHS1~HS5、ニワトリβグロビンHS4などが包含される。外来遺伝子又はDNAの導入は、上記のDNA配列挿入部位として挿入されている、上で例示されるような部位特異的組換え酵素の系を利用して行うことができる。例えば、Cre酵素の認識部位であるloxP配列と外来遺伝子又はDNAを保持するターゲティングベクター或いは、Cre酵素の認識部位であるloxP配列を挿入した外来遺伝子又はDNAを保持する染色体断片を構築し、本発明のマウス人工染色体ベクターを保持する細胞内でCre酵素を発現させることにより、loxP配列において該ターゲティングベクター或いは該染色体断片との部位特異的組換えにより、外来遺伝子又はDNAを導入できる。本発明のマウス人工染色体ベクターには、部位特異的組換え酵素の認識部位例えばloxP配列、FRT配列などを保持する環状DNAを挿入することもでき、大腸菌を宿主としたプラスミドや、酵母を宿主とした環状YAC等の既存のベクターによりクローン化されたDNAも挿入できる。好適なloxP配列はP1ファージに由来する野生の配列であり、Cre酵素による人工染色体ベクター上のloxP配列への環状インサートの挿入反応は可逆的である。一旦環状インサートが挿入されると、人工染色体ベクター上に2つのloxP配列が残る。このため再度Cre酵素を発現させると環状インサートを切り出す逆反応が起きる可能性もあり、二次的にインサートを挿入するようなさらなる人工染色体ベクターの改変が困難となる。しかし、塩基置換を行った変異loxP配列やφC31インテグレースの認識部位であるattB/attP配列の組み合わせ等によっては、逆反応を起こさず、複数の環状インサートを逐次挿入する系も構築できる。3マウス人工染色体ベクターの細胞への移入及び非ヒト動物の作出本発明のマウス人工染色体ベクター、或いは、外来遺伝子若しくはDNAを含む本発明のマウス人工染色体ベクターは、任意の細胞に移入又は導入することができる。そのための手法には、例えば、微小核細胞融合法、リポフェクション、リン酸カルシウム法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどが含まれるが、好ましい手法は微小核細胞融合法である。微小核細胞融合法は、本発明のマウス人工染色体ベクターを含有する微小核形成能を有する細胞例えばマウスA9細胞と、他の所望の細胞との微小核融合によって該ベクターを該他の細胞に移入する方法である。微小核形成能を有する細胞は、倍数体誘発剤例えばコルセミド、コルヒチンなどで処理して微小核多核細胞を形成し、サイトカラシン処理により微小核体を形成する処理を行ったのちに、所望の細胞との細胞融合を行う。上記のベクター導入可能な細胞は、動物細胞、好ましくはヒト細胞を含む哺乳動物細胞、例えば卵母細胞、精子細胞などの生殖系列細胞、胚性幹ES細胞、精子幹GS細胞、体性幹細胞などの幹細胞、体細胞、胎児細胞、成体細胞、正常細胞、疾患細胞、初代培養細胞、継代細胞又は株化細胞など、を包含する。幹細胞には、例えばES細胞、胚性生殖EG細胞、胚性癌腫EC細胞、mGS細胞、ヒト間葉系幹細胞などの多能性幹細胞、人工多能性幹iPS細胞、核移植クローン胚由来胚性幹ntES細胞などが含まれる。好ましい細胞は、哺乳動物好ましくは、マウスを含むげっ歯類由来の体細胞、非ヒト生殖系列細胞、幹細胞及び前駆細胞からなる群から選択される。細胞がげっ歯類などの哺乳類由来の細胞である場合、本発明のベクターが導入された哺乳類例えばマウスなどのげっ歯類の細胞又は組織において、ベクターがより安定に保持される、すなわち細胞からのベクターの脱落が有意に低下する、又は脱落が起こらない。細胞は、例えば、肝細胞、腸細胞、腎細胞、脾細胞、肺細胞、心臓細胞、骨格筋細胞、脳細胞、骨髄細胞、リンパ球細胞、巨核球細胞、精子、卵子などである。組織は、例えば肝臓、腸、腎臓、脾臓、肺、心臓、骨格筋、脳、骨髄、精巣、卵巣などの組織である、ES細胞は、対象動物の受精卵の胚盤胞から内部細胞塊を取出し、マイトマイシンC処理マウス胎仔線維芽細胞をフィーダーにして樹立し維持することができるM.J.EvansとM.H.Kaufman1981Nature292:154-156。iPS細胞は、体細胞体性幹細胞を含むに、ある特定の再プログラム化因子DNA又はタンパク質を導入し、適当な培地にて培養、継代培養することによって約3~5週間でコロニーを生成する。再プログラム化因子は、例えばOct3/4、Sox2、Klf4及びc-Mycからなる組み合わせ;Oct3/4、Sox2及びKlf4からなる組み合わせ;Oct4、Sox2、Nanog及びLin28からなる組み合わせ;あるいは、Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog及びLin28からなる組み合わせなどが知られているK.TakahashiandS.Yamanaka,Cell126:663-6762006;WO2007/069666;M.Nakagawaetal.,Nat.Biotechnol.26:101-1062008;K.Takahashietal.,Cell131:861-8722007;J.Yuetal.,Science318:1917-19202007;J.Liaoetal.,CellRes.18,600-6032008。培養例は、マイトマイシンC処理したマウス胎仔線維芽細胞株例えばSTOをフィーダー細胞とし、このフィーダー細胞層上でES細胞用培地を用いて、ベクター導入体細胞約104~105細胞/cm2を約37°Cの温度で培養することを含む。フィーダー細胞は必ずしも必要ではないTakahashi,K.etal.,Cell131:861-8722007。基本培地は、例えばダルベッコ改変イーグル培地DMEM、ハムF-12培地、それらの混合培地などであり、ES細胞用培地は、マウスES細胞用培地、霊長類ES細胞用培地リプロセル社などを使用することができる。ES細胞及びiPS細胞は、生殖系列に寄与することが知られているので、目的の遺伝子又はDNAを含む本発明のマウス人工染色体ベクターを導入したこれらの細胞を、該細胞が由来する同種の哺乳動物の胚の胚盤胞に注入し、この胚を仮親の子宮に移植し、出産させることを含む手法によって、非ヒト動物又は、トランスジェニック動物ヒトを除くを作出することができる。さらにまた、得られた雌雄のトランスジェニック動物を交配することによって、ホモ接合性動物、さらにその子孫動物を作出することができる。本発明のマウス人工染色体ベクターを介してES細胞やiPS細胞などの分化多能性細胞、その他の上記細胞類に、ヒト抗体遺伝子、疾患治療用遺伝子、薬物代謝関連遺伝子などの外来の遺伝子若しくはDNAを導入することによって、ヒト抗体を産生可能にする細胞や非ヒト動物を作製することができるし、また、治療用タンパク質を産生可能にする細胞を作製することができるし、さらにまた、薬物代謝関連疾患などの疾患モデル非ヒト動物を作製することができる。そのような非ヒト動物では、マウス人工染色体ベクターに含まれる外来遺伝子に対応する内在遺伝子が破壊されている又は内在遺伝子の発現が低下していることが好ましい場合もある。破壊の方法には、ジーンターゲティング法を使用することができる。内在遺伝子の発現の低下法には、RNAi法を用いることができる。例えば、そのような外来遺伝子の例には、薬物代謝関連遺伝子、ヒト抗体遺伝子などが挙げられる。内在遺伝子が破壊された非ヒト動物は、外来遺伝子を含むマウス人工染色体ベクターを保持するキメラ非ヒト動物若しくはその子孫と、対応する内在遺伝子をクラスターごと欠失させたキメラ動物若しくは子孫とを交配させて得られた該内在遺伝子がヘテロに欠失した動物同士をさらに交配させることによって作出することができる。上記の手法によって、マウス人工染色体ベクターを保持する細胞及びトランスジェニック非ヒト動物を作製することができる。具体的な非ヒト動物の例は、マウス人工染色体ベクターを保持する、マウスやラットなどのげっ歯類である。すなわち、本発明は、マウス人工染色体ベクターを保持することを特徴とする、細胞及び非ヒト動物を提供する。さらにまた、本発明の非ヒト動物から得られる細胞、組織又は器官は、それらから、外来遺伝子によって発現されたタンパク質を産生する細胞株を作製するために使用することも可能である。4有用なタンパク質の生産法本発明はさらに、外来DNA配列を発現可能に含むマウス人工染色体ベクターを保持する細胞を培養し、産生された該DNAによってコードされるタンパク質を回収することを含む、タンパク質の生産方法を提供する。タンパク質として、例えば上記の医療上、農業上などの産業上有用なタンパク質又はポリペプチド類が挙げられる。これらのタンパク質又はポリペプチド類をコードするDNAを、プロモーター及び必要であれば、エンハンサーの存在下で発現可能となるようにマウス人工染色体ベクターに挿入し、適当な細胞を形質転換若しくはトランスフェクションする。得られた細胞を培養し、該DNAを発現させて該タンパク質又はポリペプチドを産生させ、これを、細胞又は培地から回収する。細胞は、哺乳動物細胞の他に、Sf細胞などの昆虫細胞、鳥類細胞、酵母細胞、植物細胞などの真核細胞の使用も可能である。培地を含む培養条件は、細胞の種類に応じて選択され、培養条件として公知の条件を使用しうる。例えば、動物細胞の培地としては、MEM培地、DMEM培地、Ham’sF12培地、Eagle’sMEM培地、イスコフEME培地、RPMI1640培地、これらの混合培地などが含まれる。タンパク質又はポリペプチド類の回収又は、単離は、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、HPLC、FPLCなどのクロマトグラフィー法、塩析法、硫安沈殿法、有機溶媒沈殿法、限外ろ過法、結晶化などの公知の手段を単独で又は組み合わせて実施しうる。5ヒト抗体の製造法本発明はさらに、ヒト抗体遺伝子を含むマウス人工染色体ベクターを保持する上記の非ヒト動物を用いてヒト抗体を産生し、該ヒト抗体を回収することを含む、ヒト抗体の製造方法を提供する。ヒト抗体遺伝子は、ヒトIgG,IgM,IgA,IgD,IgEのいずれかのクラス、或いは、ヒトIgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA1,IgA2のいずれかのサブクラスをコードする遺伝子である。好ましいヒト抗体遺伝子は、IgGクラス及びそのサブクラスである。ヒト抗体は、2本の同一配列の重鎖Hと2本の同一配列の軽鎖Lから構成されており、H鎖もL鎖もともに、可変領域と定常領域から構成されている。ヒトH鎖及びL鎖の可変領域はともに、3つの超可変領域N末端側からC末端側にCDR1,CDR2,CDR3の順番と4つのフレームワーク領域N末端側からC末端側にFR1,FR2,FR3,FR4の順番からなり、ヒトH鎖及びL鎖のそれぞれ3つずつのCDR配列によって抗体の特異性が決まる。ヒトIgG抗体の場合、重鎖であるμ鎖と、軽鎖であるλ鎖若しくはκ鎖とによって構成されており、これらの抗体鎖遺伝子はそれぞれ、ヒト14番染色体、22番染色体、2番染色体上に存在する。本発明で使用するヒト抗体遺伝子としては、各抗体遺伝子座を含むヒト染色体断片を使用し、これらを異なる又は同一のマウス人工染色体に組み込む。抗体遺伝子配列は、NCBI米国のデータベースなどから入手可能である。この一連の手法は、例えば特開2005-230020号公報に記載される技術の改良である。完全ヒト抗体を生産可能な非ヒト動物は、ヒトμ鎖遺伝子座を含むマウス人工染色体ベクターを保持する非ヒト動物と、ヒトλ鎖遺伝子座及び/又はヒトκ鎖遺伝子座を含むマウス人工染色体ベクターを保持する同種の非ヒト動物とを交配することによって、両方のH鎖及びL鎖遺伝子座を保有するキメラ非ヒト動物及びその子孫動物を得ることが可能である。このようにして作製された完全ヒト抗体産生可能な非ヒト動物例えばマウスなどのげっ歯類に、ある特定の抗原ペプチド若しくは抗原ポリペプチドを免疫し、該動物の血液からヒト抗体を分離することを含む方法により、ヒト抗体を生産することができる。或いは、ある特定の抗原で免疫した非ヒト動物の脾臓を摘出し、ミエローマ細胞と融合させ、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることも可能である。6治療物質のスクリーニング法本発明はさらに、疾患モデル動物である上記非ヒト動物に候補薬剤を投与し、該薬剤の治療効果を評価することを含む、該疾患を治療するのに有効な物質をスクリーニングする方法を提供する。疾患モデル非ヒト動物は、ある種のタンパク質の欠損、変異などによる生物機能異常、薬物代謝異常、染色体異常などの異常を原因とする疾患を持つ人工的に作製された動物である。染色体異常をもつモデル非ヒト動物の例は、以下に限定されないが、ヒト18番又は21番染色体トリソミーをもつ動物である。このような非ヒト動物は、遺伝子又は染色体に上記のような異常を含む遺伝子又は染色体断片を作製し、これを本発明のマウス人工染色体ベクターに組み込み、ES細胞又はiPS細胞に導入し、受精卵の胚盤胞に注入し、この細胞を非ヒト動物の仮親の子宮に移植し、出産させることを含む方法によって作出することができる。上記のようにして作製された非ヒト動物に、候補薬剤を投与し、該薬剤の治療効果を評価することによって、該疾患を治療するのに有効な物質をスクリーニングすることができる。候補薬剤は、非限定的に、例えば、低分子化合物、高分子化合物、糖タンパク質、ペプチド、リン又は糖脂質、糖類、などである。7薬物又は食品の薬理作用、代謝又は毒性の試験方法本発明の実施形態によれば、本発明はまた、ヒト薬物代謝関連遺伝子を含むマウス人工染色体ベクターを保持する上記非ヒト動物或いは該動物由来の細胞、器官又は組織に、薬物又は食品を投与し、該薬物又は食品の薬理作用及び/又は代謝及び/又は毒性を測定することを含む、薬物又は食品の薬理作用及び/又は代謝及び/又は毒性の試験方法を提供する。本発明はまた、ヒト薬物代謝関連遺伝子を含むマウス人工染色体ベクターを保持する上記非ヒト動物から得られたミクロソーム又はミクロソーム画分S9を、培養細胞若しくは細菌及び薬物若しくは/及び食品と共に培養し、薬物又は食品が該細胞又は細菌に及ぼす悪影響例えば変異、等を測定することを含む、薬物又は食品の毒性の試験方法を提供する。ヒト薬物代謝関連遺伝子は、上に例示したものである。また、非ヒト動物の作出方法も上に記載したものと同様である。ヒト薬物代謝関連遺伝子を有するマウス人工染色体ベクターを保持する上記の非ヒト動物を用いる上記方法では、例えば、該動物の状態の観察、臓器や染色体に及ぼす影響の試験などによって、薬物又は食品の薬理作用、代謝又は毒性を判定することができる。本発明のもうひとつの方法では、該非ヒト動物から得られたミクロソーム若しくはミクロソーム画分S99000g画分であって加水分解、還元、酸化、結合などを触媒する多数の酵素を含む画分を、培養細胞特に、動物細胞、好ましくは哺乳類細胞又は細菌好ましくは、サルモネラ菌と一緒に、薬物及び/又は食品の存在下で培養する。薬物又は食品の、細胞に対する毒性の検出は、エイムス試験又は小核試験によって行うことができる。エイムス試験では、サルモネラ菌の変異に基づいて毒性を判定する。小核試験では、細胞核の染色体の異常に基づいて毒性を判定する。これらの試験法はよく知られており、本発明の方法で使用しうる。以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらの具体例に限定されるものではない。[実施例1]マウス人工染色体ベクターMACの構築マウス染色体にテロメアトランケーションを行うことで内在遺伝子を含まないマウス人工染色体MAC[DT40B6bT]を構築する図1。[A]A9細胞とマウス線維芽細胞neo;mChr11-BSrのハイブリッド細胞樹立薬剤耐性遺伝子Bsr遺伝子で標識されたマウス11番染色体を含有するマウス線維芽細胞であるmouseembryonicfibroblastmChr11-BSrと公知のマウスA9細胞にG418耐性遺伝子であるneo遺伝子を挿入したmosueA9neoと細胞融合し、薬剤耐性遺伝子で標識されたマウス染色体を保持するマウスA9雑種細胞であるmouseA9xmouseembryonicfibroblasthybridneo;mChr11-BSrを樹立する。薬剤耐性遺伝子で標識されたマウス染色体を微小核細胞融合法により相同組換頻度の高いニワトリDT40細胞へ導入するために、微小核形成率が高いことが知られているマウスA9細胞に薬剤耐性遺伝子で標識されたマウス染色体を細胞融合によって導入する。[A.1]細胞融合及び二重薬剤耐性クローンの単離日本クレアより入手可能なC57B6系統のマウス胎仔より樹立し、薬剤耐性遺伝子Bsr遺伝子をマウス染色体上に挿入したマウス繊維芽細胞であるmouseembryonicfibroblastmChr11-BSrと、G418耐性遺伝子であるneo遺伝子が挿入されているマウスA9細胞であるmosueA9neoをそれぞれPBS-で細胞表面を洗浄後、トリプシン添加によって細胞を分散し、培養液10FBS、DMEMに懸濁し、それぞれの細胞1x106個を培養用フラスコ25cm2に同時に植え込み、一日間培養する。PBS-で細胞表面を2回洗浄した後に3mlのPEG1:1.4溶液[5g,PEG1000,cat:165-09085,wakoを無血清DMEM6mlに溶解させ、ジメチルスルホキシド1mlを加えて濾過滅菌する]で1分間処理し、さらに3mlのPEG1:3溶液[5g,PEG1000,cat:165-09085,wakoを無血清DMEM15mlに溶解させて濾過滅菌する]に換えて1分間処理した。PEG溶液を吸引後、無血清DMEMで3回洗浄し、通常の培養液10FBS、DMEMで一日間培養した。PBS-で細胞表面を洗浄後、トリプシン添加によって細胞を分散し、G418800μg/ml及びブラストサイジンS4μg/mlを含む二重選択培養液10FBS、DMEMに懸濁した細胞をプラスチック培養皿に植え込み、2~3週間選択培養した。2回の細胞融合で得た合計3個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以降の解析を行ったクローン名:mouseA9xmouseembryonicfibroblasthybridneo;mChr11-BSr。[A.2]雑種細胞の選択[A.2.1]PCR二重薬剤耐性クローンからゲノムDNAを抽出して、以下のプライマーを用いてPCRを行い、薬剤耐性遺伝子Bsr遺伝子で標識されたマウス染色体が保持されていることを確認した。PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはAmpliTaqGoldAppliedBiosystemsを用い、バッファーやdNTPsdATP,dCTP,dGTP,dTTPは添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は95°C10分の熱変性後、94°C30秒、60°C30秒、72°C30秒を35サイクル行った。PCRの結果、3クローン中3クローンが陽性であった。[A.2.2]キナクリンヘキスト二重染色上記PCR解析によって陽性であったクローンについて、キナクリンヘキスト二重染色を行った。キナクリンヘキスト二重染色は、まず、50mlのマキルベン溶液[クエン酸一水和物11.18gとリン酸水素二ナトリウム13.29gを1Lの水に溶解させ、オートクレーブする]に染色体スライドを浸し、ついで50mlのマキルベン溶液に60μg/mlになるようにキナクリン[cat:Q2876,SIGMA]を溶解したものに20分間浸し、水道水で染色体スライドの裏面を洗浄後、マキルベン溶液に浸し、50mlのマキルベン溶液に0.5μg/mlになるようにヘキスト[cat:B-2883]を溶解したものに15分浸したあとに、カバーガラスで覆った。蛍光顕微鏡により観察したところ、3クローンすべてにおいて通常の核型が2nのところが大半の核型が4n以上になっていた。特に、クローンA921-B6b7において薬剤耐性遺伝子Bsr遺伝子で標識されたマウス染色体を保持するマウス線維芽細胞と、G418耐性遺伝子であるneo遺伝子が挿入されているマウスA9細胞が一対一で細胞融合したことがわかった図6。以上の結果から、mouseA9xmouseembryonicfibroblasthybridneo;mChr11-BSrにおいて、標識されたマウス染色体を保持していると結論付けた。[B]薬剤耐性遺伝子で標識されたマウス染色体のDT40細胞への導入薬剤耐性遺伝子で標識されたマウス染色体を含有するマウスA9雑種細胞であるmouseA9xmouseembryonicfibroblasthybridneo;mChr11-BSrから薬剤耐性遺伝子で標識されたマウス染色体をニワトリDT40細胞であるDT40へ導入する。マウス染色体番号の同定、及び人工テロメアの挿入による染色体部位特異的切断であるテロメアトランケーション、及び相同組換によりマウス染色体にDNA配列挿入部位であるloxP配列の挿入を効率的に行うために、薬剤耐性遺伝子で標識されたマウス染色体を微小核細胞融合法により相同組換頻度の高いニワトリDT40細胞であるDT40へ導入する。[B.1]微小核細胞融合及び薬剤耐性クローンの単離染色体同定と染色体改変を効率的に行うために、マウス染色体をA9雑種細胞クローンであるA9xmouseembryonicfibroblasthybridneo;mChr11-BSr7から相同組換え頻度の高いニワトリDT40細胞であるDT40へ移入した。フラスコ×24で培養していたドナー細胞であるA9xmouseembryonicfibroblasthybridneo;mChr11-BSr7がそれぞれのフラスコにおいて70コンフルエントになった時点で、コルセミド処理コルセミド0.05μg/ml、20FCS、DMEMを37°C5CO2の条件下にて48時間行った。コルセミド処理が終了したら、フラスコ内のmediumをアスピレートし、そのフラスコの9分目までをサイトカラシンBで満たした。フラスコを大型高速遠心機BECKMAN専用の容器に挿入し、温湯34°Cをフラスコが隠れない程度に加え、遠心RortorID10.500、8,000rpm、1h、34°Cをした。遠心終了後、サイトカラシンBを回収し、各フラスコ内のペレットを、それぞれ2mlの無血清培地DMEMにて15mlチューブに回収した。8μm→5μm→3μmフィルターの順にゆっくりとフィルトレーションした後、それぞれのチューブを遠心1,200rpm5分R.Tし、上清をアスピレートした後、各チューブのペレットをまとめて5mlの無血清培地DMEMに回収、懸濁し、遠心2000rpm5分をした。レシピエント細胞であるDT40細胞は浮遊細胞であるため、一度付着状態にする必要がある。DT40を6穴プレートNuncのうちの1穴に付着させるために50μg/mlに調整したポリ-L-リジンSIGMA1.5mlで1穴を37°C、オーバーナイトでインキュベートすることでコーティングした。ポリ-L-リジンを回収し、プレートをPBS‐で洗浄し、約1x107個のDT40細胞を2mlの無血清培養液DMEMでプレートに静かに播種した。プレートごと遠心機Beckmanにセットし、37°C、1200rpm、3分間遠心して付着DT40にした。精製した微小核細胞をPHA-PSIGMAを含む無血清培養液2mlに再度懸濁し、無血清培養液DMEMを除去した付着DT40上に静かに播種した。プレートを37°C、1200rpm、3分間遠心した。上清を除去し、PEG1000Wako[5gのPEG1000を無血清DMEM培地に完全に溶解し、ジメチルスルホキシドを1ml添加して濾過滅菌する]溶液を1mlで正確に1分間融合した。無血清培養液DMEMを4mlで4回洗浄し、通常のDT40の培養液3mlでピペッティングして、付着DT40を浮遊状態に戻し、37°C、24穴プレート2枚に播種し、オーバーナイトでインキュベートした。ブラストサイジンSを1500μg/mlになるように加え、3~4週間選択培養した。1回の微小核細胞融合で得た合計2個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以降の解析を行ったクローン名:DT40mChr11-BSr[B.2]薬剤耐性クローンの選別[B.2.1]FISH解析上記で得られたDT40mChr11-BSrのクローンについてShinoharaらの報告HumanMolecularGenetics,10:1163-1175,2001に記された方法でマウスCot-1DNAをプローブにしたFISH解析を行ったところDT40mChr11-BSr-1において、95で正常核型2nあたりのマウス染色体数が1コピーであったため、以降の解析を行った図7。[B.2.2]DT40に導入され、薬剤耐性遺伝子で標識されたマウス染色体の同定KaiらCellRes,19:247-58,2009の報告に記された方法でSKY-FISHを行ったところ、ニワトリDT40細胞に導入されたマウス染色体はマウス11番染色体であることがわかった図8。[C]ニワトリDT40細胞内におけるマウス11番染色体領域AL671968から遠位のテロメアトランケーションによる部位特異的切断マウス人工染色体ベクターとして導入目的遺伝子以外の内在遺伝子は少ない方が実験系に及ぼす影響が軽減され、かつ内在遺伝子のうちインプリント遺伝子のようにマウス個体発生に遺伝子発現量の変化による影響を及ぼす遺伝子を極力残さないことが必要であるので、マウス長腕の大部分を削除する。[C.1]テロメアトランケーションベクター作製短腕近位部位特異的切断用の基本ベクターにはpBS-TEL/puroコンストラクトKuroiwaetal.NatureBiotech2002を用いた。GenBankデータベースより得たマウス11番染色体長腕近位の塩基配列AL671968から相同組換え標的配列を設計した。DT40mChr11-BSrからゲノムDNAを抽出して鋳型とし、相同組換え標的配列をPCR増幅するためのプライマーの配列を以下に示す。PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはLATaqTAKARAを用い、バッファーやdNTPsdATP,dCTP,dGTP,dTTPは添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は94°C1分の熱変性後、98°C10秒、65°C8分を35サイクル行ったPCR産物をBamHITAKARAで消化して、アガロースゲルにより分離し精製後、pBS-TEL/puroのBamHIサイトにクローニングしたベクター名:pBS-TEL/puro_MAC。ターゲティングベクター、標的配列、及び相同組換えにより生じる染色体アレルを図9に示した。[C.2]相同組換体の選別マウス11番染色体領域AL671968から遠位において部位特異的切断を行うベクターは上述のpBS-TEL/puro_MACを用いてトランスフェクションを行い、ピューロマイシン耐性及びブラストサイジンS非耐性クローンの単離及び相同組換え体の選別を行った。その結果、マウス11番染色体領域を切断できた5クローンを確認したクローン名:DT40MAC。ターゲティングベクター、標的配列、及び相同組換えにより生じる染色体アレルを図9に示した。[C.3]mono-colorFISH解析による薬剤耐性クローンの選別上記で得られたDT40MACの5クローンについてShinoharaらの報告HumanMolecularGenetics,10:1163-1175,2001に記された方法でマウスCot-1DNAをプローブにしたFISH解析を行ったところ5クローンうち2クローンにおいてマウス11番染色体の長腕部分がセントロメア近傍で切断されていることを確認した図10。以上の結果から、余分なマウス染色体長腕が切除されたマウス人工染色体MACが構築できたと結論付けた。マウス人工染色体ベクターMACを保持するニワトリDT40細胞であるDT40MAC-1は、識別名称をDT40B6bT-1として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6に平成21年2009年5月14日付けでブダペスト条約の規定に基づいて国際寄託され、受託番号FERMBP-11128が与えられた。[実施例2]マウス人工染色体ベクターMAC1の構築マウス人工染色体MACにDNA挿入配列としてGFP-PGKneo-loxP-3’HPRTタイプのloxP配列を挿入することでマウス人工染色体ベクターMAC1を構築し、MAC1のマウスES細胞での安定性を検証し、さらにMAC1を導入した子孫伝達マウスを作製することで、個体組織での安定性を検証する。[A]マウス人工染色体ベクターMACへのGFP-PGKneo-loxP-3’HPRTタイプのloxP配列の挿入[A.1]GFP-PGKneo-loxP-3’HPRTタイプのloxPターゲティングベクター作製DT40MACにloxP配列を挿入するための基本プラスミドにはV913Lexicongeneticsを用いた。loxP挿入部位であるマウス11番染色体のDNA配列はGenBankデータベースより得たBX572640.9。薬剤耐性クローンからゲノムDNAを抽出して鋳型とし、相同組換えの二つの標的配列の増幅に用いたプライマーの配列を以下に示す。PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはLATaqTAKARAを用い、バッファーやdNTPsdATP,dCTP,dGTP,dTTPは添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は94°C1分の熱変性後、98°C10秒、68°C5分を35サイクル行った。それぞれのPCR産物をBglIITAKARAで消化して、アガロースゲルにより分離し精製後、V913のBglIIあるいはBamHIサイトにクローニングしたベクター名:VH21-12。3’HPRT-loxPはV820LexicongeneticsのXbaIサイトにオリゴ合成したloxP配列をクローニングした。HPRT遺伝子の3番目から9番目のエクソンである3’HPRT-loxPをV907LexicongeneticsのEcoRIとAscIにクローニングしたベクター名:X3.1。さらにX3.1のKpnIサイトとEcoRIサイトにKpnIとNotIにより切り出したPGKneo配列をクローニングしたベクター名:X4.1。X4.1からKpnIとAscIにより切り出したPGKneo-loxP-3’HPRTをV913のKpnIサイトとAscIサイトにクローニングしたベクター名:pVNLH。pVNLHのEcoRVサイトにNotIとSalI消化後に平滑化をおこなったHS4-CAG-EGFP-HS4大阪大学、岡部博士及びNIH、Felsenfeld博士より分与をクローニングしたベクター名:pVGNLH。pVGNLHからSalIとAscIにより切り出したGFP-PGKneo-loxP-3’HPRTカセットをVH21-12のXhoIサイトとAscIサイトにクローニングしたベクター名:pMAC1。ターゲティングベクター、標的配列および相同組換えにより生じる染色体アレルを図11に示す。[A.2]トランスフェクションおよびG418耐性クローンの単離ニワトリDT40細胞の培養は10ウシ胎仔血清ギブコ、以下FBSで記す、1ニワトリ血清ギブコ、10-4M2-メルカプトエタノールシグマを添加したRPMI1640培地ギブコ中で行った。DT40MAC-1の約107個の細胞を無添加RPMI1640培地で一回洗浄し、0.5mlの無添加RPMI1640培地に懸濁し、制限酵素NotITAKARAで線状化したターゲティングベクターpMAC1を25μg加え、エレクトロポレーション用のキュベットバイオラッドに移し、室温で10分間静置した。キュベットをジーンパルサーバイオラッドにセットし、550V、25μFの条件で電圧印加した。室温で10分間静置後、24時間培養した。G4181.5mg/mlを含む培地に交換し、96穴培養プレート2枚に分注して約2週間の選択培養を行った。2回のトランスフェクションで得た合計14個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行ったクローン名:DT40MAC1[A.3]相同組換体の選別[A.3.1]PCR解析G418耐性株のゲノムDNAを抽出して鋳型として組換え体を選別するため、以下のプライマーを用いてPCRを行い、マウス11番染色体上で部位特異的に組換え起こっているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはLATaqTAKARAを用い、バッファーやdNTPsdATP,dCTP,dGTP,dTTPは添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は94°C1分の熱変性後、98°C10秒、68°C7分を35サイクル行った。PCRの結果、88クローンのうち、2クローンが全てのプライマーのセットで陽性であったため、この2クローンで以降の解析を行った。[A.3.2]two-colorFISH解析上記から得られたDT40MAC1-52とDT40MAC1-58において、two-colorFISH解析を松原らFISH実験プロトコール、秀潤社、1994に従い行った。マウスcot-1DNAおよびGFP-PGKneo-loxP-3’HPRTカセットをプローブにしてFISH解析を行ったところ、loxP配列がターゲティングされたマウス11番染色体断片のセントロメア付近にプローブ由来のFITCシグナルが検出され、かつネガティブコントロールのターゲティングする前のマウス11番染色体断片例えばDT40MAC-1では現れなかったシグナルが検出されたことから、部位特異的に組換えが起こったことが視覚的に確かめられた図12。これらの結果から、マウス人工染色体ベクターMAC1を保持するDT40細胞クローンが得られたと結論できた。[B]マウス人工染色体ベクターMAC1含有DT40細胞からMAC1のCHO細胞への導入CHO細胞を介してマウス人工染色体ベクターMAC1をマウスES細胞に導入するため、或いはCHO細胞内でマウス人工染色体ベクターMAC1のDNA配列挿入部位であるloxPを介して安定に目的遺伝子群等、例えばCYP3Aクラスターなどを挿入するため、CHO細胞に導入する。[B.1]微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離レシピエント細胞であるDT40MAC152及び58を用いて、上記と同様にCHOhprt欠損細胞ヒューマンサイエンス研究資源バンクより入手、登録番号JCRB0218であるCHOHPRT-に微小核細胞融合法を行った。2回の微小核細胞融合で得た合計24個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以降の解析を行ったクローン名:CHOHPRT-;MAC1[B.2]薬剤耐性クローンの選別[B.2.1]PCR解析G418耐性株のゲノムDNAを抽出して鋳型として組換え体を選別するため、以下のプライマーを用いてPCRを行い、マウス人工番染色体MAC1がCHO細胞に導入できているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはLATaqTAKARAを用い、バッファーやdNTPsdATP,dCTP,dGTP,dTTPは添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は94°C1分の熱変性後、98°C10秒、68°C7分を30サイクル行った。PCRの結果、24クローンのうち、20クローンが全てのプライマーのセットで陽性であり、この20クローンで以降の解析を行った。[B.2.2]mono-colorFISH解析上記で得られたCHOHPRT-;MAC1の20クローンについてShinoharaらの報告HumanMolecularGenetics,10:1163-1175,2001に記された方法でマウスCot-1DNAをプローブにしたFISH解析を行ったところ20クローン中、5クローンで95の割合でマウス人工染色体ベクターMAC1がCHO細胞に導入されていることを確認した図13。以上の結果から、マウス人工染色体ベクターMAC1がCHO細胞に導入できたと結論付けた。[C]マウス人工染色体ベクターMAC1含有CHO細胞からマウスES細胞へマウス人工染色体ベクターMAC1の導入マウスES細胞及びマウス個体内でのマウス人工染色体ベクターMAC1の安定性を検証するために、マウス人工染色体MAC1をマウスES細胞に導入し、マウス人工染色体ベクターMAC1含有キメラマウスならびに子孫伝達マウスを作製する。[C.1]微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離レシピエント細胞であるCHOHPRT-;MAC1-3,5,8,22を細胞培養皿で培養し、コンフルエントになった時点で20FBS、0.1μg/mlコルセミドを添加したF12培地に交換し、さらに48時間培養後に20FBS、0.1μg/mlコルセミドを添加したF12培地で培地交換し、さらにオーバーナイトでインキュベートしてミクロセルを形成させた。培養液を除去し、予め37°Cで保温したサイトカラシンB10μg/ml,シグマ溶液を遠心用フラスコに満たし、34°C、8000rpm、1時間の遠心を行った。ミクロセルを無血清DMEM培地に懸濁し、8μm,5μm,3μmフィルターにて精製した。精製後、2000rpm,10分間遠心し、無血清DMEM培地5mlに懸濁した。ミクロセルを5mlの無血清DMEM培地に懸濁し、8μm,5μm,3μmフィルターにて精製した。精製後、2000rpm,10分間遠心した。ドナー細胞にはC57B6系統マウスのES細胞であるB6-ES、及びB6-ES細胞に6TG処理を行ったHPRT欠損株であるB6HPRT-、及びC57B6xCBA系統F1マウスのES細胞であるTT2F、及びTT2F細胞に6TG処理を行ったHPRT欠損株であるKO56HPRT-を用いた。培養には、DMEMDulbecco’sModifiedEagle’sMedium-highglucose:SIGMAに、10FCS、LIFMuerinLeukemiaInhibitoryFactor、1×10-5M2-ME2-メルカプトエタノール:SIGMA、L-グルタミン3.5g/ml:GIBCO、Sodiumpyruvatesolution3.5g/ml:GIBCO、MEMNonessentialaminoacid0.125mM:GIBCOを添加し、5CO2、37°Cにて培養をおこなった。マウスES細胞をPBS-で細胞表面を2回洗浄後にトリプシン処理により細胞を分散させ、DMEM培地に10FBSを添加した培養液で回収し、1500rpmで遠心し、上清を除去し、無血清培養液5mlに再度懸濁し、ミクロセルの遠心後のペレットを含む無血清培地に静かに添加し、さらに1200rpmで遠心した。上清を除去し、PEG1000Wako溶液[5gのPEG1000を無血清DMEM培地に完全に溶解し、ジメチルスルホキシドを1ml添加して濾過滅菌する]を0.5mlで正確に1分30秒間融合した。13mlの無血清培養液DMEMを静かに添加し、1200rpmで遠心した。上清を除去し、通常のマウスES細胞の培養液を添加し、マイトマイシン処理したG418耐性マウス胎生線維芽細胞をフィーダー細胞として使用し、直径10cm細胞培養皿2枚に播種し、オーバーナイトでインキュベートした。G418を250μg/mlになるように加え、3~4週間選択培養したクローン名:B6-ESMAC1及びB6HPRT-;MAC1及びKO56HPRT-;MAC1。B6-ESMAC1及びB6HPRT-;MAC1及びKO56HPRT-;MAC1については、それぞれ2回の微小核細胞融合で得た合計32個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以降の解析を行った。TT2FMAC1については、4回の微小核細胞融合で得た合計30個の耐性コロニーを単離し増殖させ、FISH解析以降の解析を行った[C.2]薬剤耐性クローンの選別[C.2.1]PCR解析G418耐性株のゲノムDNAを抽出して鋳型として組換え体を選別するため、以下のプライマーを用いてPCRを行い、マウス人工番染色体MAC1がマウスES細胞に導入できているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはLATaqTAKARAを用い、バッファーやdNTPsdATP,dCTP,dGTP,dTTPは添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は94°C1分の熱変性後、98°C10秒、68°C10分を30サイクル行った。PCRの結果、32クローンのうち、30クローンが全てのプライマーのセットで陽性であり、このうち14クローンで以降の解析を行った。[C.2.2]mono-colorFISH解析上記で得られたB6-ESMAC1及びB6HPRT-;MAC1及びKO56HPRT-;MAC1のクローンについてShinoharaらの報告HumanMolecularGenetics,10:1163-1175,2001に記された方法でマウスminorsatelliteDNAをプローブにしたFISH解析を行ったところ14クローン中、全てのクローンで85以上の割合でMAC1がマウスES細胞に導入されていることを確認した。また、正常核型である内在マウス染色体の本数がB6-ESの場合40本、またはKO56の場合39本であることを確認した。B6HPRT-;MAC1の場合、40本の核型クローンは得られなかった。また、同様にTT2FMAC1については、7クローンについて解析し、7クローン中全てのクローンで、90以上の割合で導入されていることを確認した。また、また、正常核型である内在マウス染色体の本数が39本であることを、7クローン中3クローンについて確認した。以上の結果から、マウス人工染色体ベクターMAC1がマウスES細胞に導入できたと結論付けた図14。[実施例3]マウス人工染色体ベクターCYP3A-MACの構築マウス人工染色体ベクターMAC1にヒト薬物代謝酵素遺伝子群であるCYP3AクラスターをCre/loxPシステムを用いて転座クローニングを行い、CYP3A-MACを構築する。また、CYP3A-MACのマウスES細胞での安定性を検証し、さらにCYP3A-MACを導入した子孫伝達マウスを作製することで、個体組織での安定性を検証する。また、子孫伝達マウスにおいて、CYP3A遺伝子の組織特異的遺伝子発現を検証する図2。[A]ヒト7番染色体のAC004922へのloxP配列の部位特異的挿入マウス人工染色体ベクターMAC1にloxP配列を介して転座挿入するために、DT40細胞内でヒト7番染色体hChr7のCYP3A遺伝子クラスターの近位のAC004922へloxP配列を挿入する。[A.1]ターゲティングベクターpMPloxPHygの作製ヒト7番染色体上のCYP3A遺伝子座のごく近傍かつセントロメア側約300Kbセントロメア側に位置するAC004922領域にCre組換え酵素の認識配列loxPを挿入するためのターゲティングベクターpMPloxPHygを以下のようにして作製した。まず、AC004922ゲノム領域を以下のプライマーを用いてPCRにより増幅した。loxP配列を挿入するための基本プラスミドにはV901Lexicongeneticsを用いた。PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはLATaq宝酒造を用い、バッファーやdNTPsdATP,dCTP,dGTP,dTTPは添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は94°C1分の熱変性後、98°C20秒、68°C7分を35サイクル行った。PCR産物をプロテネースKギブコ処理した後、CHROMASPIN-TE400クローンテックでゲル濾過した。その後、制限酵素BamHIベーリンガーおよびEcoRIニッポンジーンおよびBglIIニッポンジーンで切断しCHROMASPIN-TE1000クローンテックでゲル濾過した。このPCR断片3.7kbおよび3.0kbをV901プラスミドのEcoRIとBamHI又はBglIIサイトにクローニングしたベクター名:V901-NP21。次に、V901-NP21を制限酵素AscINEBならびにKpnIで切断し、カセットベクター5’HPRT-loxP-Hyg-TKKazukiら,GeneTherapy:PMID:21085194,2010から、制限酵素AscIおよびKpnIでloxPを含むDNA断片を切り出し、ライゲーションした。loxP配列の方向がクローニングしたAC004922ゲノム断片と同方向のものをターゲティングベクターpMPloxPHygとした。最終的なloxP挿入コンストラクトのサイズは12kbである。ターゲティングベクター、標的配列および相同組換えにより生じる染色体アレルを図15aに示す。[A.2]トランスフェクションおよび薬剤耐性クローンの単離上述と同様に、上記で作製したターゲティングベクターpMPloxPHygを制限酵素NotITAKARAで線状化後、WO01/011951に記載された方法で作製されたヒト7番染色体断片AF006752座で部位特異的に切断されているを保持するニワトリDT40細胞クローンDF141にトランスフェクションし、ハイグロマイシンB1.5mg/mlを含む培地に交換し、96穴培養プレート3枚に分注して約2週間の選択培養を行った。5回のトランスフェクションで得た合計96個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行ったクローン名:DT40hChr7-loxP。[A.3]相同組換え体の選別[A.3.1]PCR解析ハイグロマイシン耐性クローンからPuregeneDNAIsolationKitGentraSystem社を用いてゲノムDNAを抽出して、以下の2組のプライマーを用いたPCRにより相同組換え体の同定を行った。以下の2組のプライマーを用いたPCRにより相同組換え体の同定を行った。PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはLATaqTAKARAを用い、バッファーやdNTPsdATP,dCTP,dGTP,dTTPは添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は94°C1分の熱変性後、98°C10秒、68°C4分を35サイクル行った。96クローンをスクリーニングした結果、36クローンが相同組換え体として同定された。[A.3.2]サザンブロット解析上記PCR解析にて組換えを確認した6クローンについて以下のようにサザンブロット解析を行った。このゲノムDNAを制限酵素EcoRITAKARAで処理し、0.8アガロースゲル中で電気泳動し、GeneScreenPlusTMハイブリダイゼーショントランスファーメンブレンNENTMLifeScienceProducts,Inc.へアルカリブロッティングした。このフィルターに対してAC004922中の遺伝子配列をPCRにより増幅したMPpプローブを用いてサザンハイブリダイゼーションを行い相同組換え体の同定を行った。MPpプローブの作製は以下のプライマーを用いDF141のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行い、そのPCR産物を鋳型としてランダムプライミングによる32P標識DNAプローブを作製したアマシャム、添付のプロトコールに従った。MPpプローブ作製用プライマー:PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはEXTaqTAKARAを用い、バッファーやdNTPsdATP,dCTP,dGTP,dTTPは添付のものを推奨条件に従って用いた。温度、サイクル条件は、93°C5分の熱変性後、93°C1分、54°C1分、72°C1分を1サイクルとして35サイクルで行った。サザンハイブリダイゼーションにより、非相同組換え体では約10.9kb、相同組換え体では約8.9kbのバンドが検出されると予測された図15b。サザンハイブリダイゼーションの結果、6クローン中すべてのクローンが目的の相同組換え体であった。[A.3.3]two-colorFISH解析FISH解析は松原らFISH実験プロトコール、秀潤社、1994に従い行った。上記で組換えを確認したクローンのうち6クローンをヒトcot-1DNAおよびハイグロマイシンをプローブにしてFISH解析を行ったところ、ヒト7番染色体は全てのクローンで宿主染色体に転座することなく、7q22付近にハイグロマイシン由来のシグナルが検出されたことから部位特異的に組換えが起こったことが確かめられた。以上の結果から、ヒト7番染色体断片に遺伝子導入部位であるloxP配列が部位特異的に挿入されたと結論づけた。[B]hChr7-loxPにおけるヒト7番染色体領域AC073842での部位特異的切断WO2009/063722PCT/JP2008/068928にあるように、ヒト7番染色体のCYP3A遺伝子クラスターから遠位側のマウス個体の発生に強く関わる遺伝子を削除するために、部位特異的染色体削除であるテロメアトランケーションを行う。[B.1]ターゲティングベクターpTELhisD-PTの作製ヒト7染色体上のCYP3A遺伝子座のごく近傍かつテロメア側約150Kbテロメア側に位置するAC073842領域にヒトテロメア配列を挿入するためのターゲティングベクターpTELhisD-PTを以下のようにして作製した。まず、AC073842ゲノム領域を以下のプライマーを用いてPCRにより増幅した。PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはLATaqTAKARAを用い、バッファーやdNTPdATP,dCTP,dGTP,dTTPは添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は94°C1分の熱変性後、98°C20秒、68°C8分を35サイクル行った。PCR産物をプロテネースKギブコ処理した後、CHROMASPIN-TE400クローンテックでゲル濾過した。その後、制限酵素BamHIベーリンガー及びBglIIニッポンジーンで切断し、CHROMASPIN-TE1000クローンテックでゲル濾過した。このPCR断片をプラスミドpTELhisDKuroiwaら,NatureBiotech.,20:88,2002のBamHI部位にクローニングした。AC073842ゲノムシークエンスの方向はテロメア→セントロメアなので、クローニングされたAC073842ゲノム断片がヒトテロメア配列と同方向のものを目的のターゲティングベクターpTELhisD-PTとした。最終的な長腕近位部位特異的切断用コンストラクトのサイズは14.4kbである。ターゲティングベクター、標的配列、及び相同組換えにより生じる染色体アレルを図16に示した。[B.2]トランスフェクション及びヒスチジノール耐性クローンの単離上述と同様に、上記で作製したターゲティングベクターpTELhisD-PTを制限酵素SrfI東洋紡で線状化後、上記で作製したクローンDT40hChr7-loxP122にトランスフェクションし、ヒスチジノール0.5mg/mlを含む培地に交換し、96穴培養プレート10枚に分注して約2週間の選択培養を行った。5回のトランスフェクションで得た合計335個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行ったクローン名:DT40hChr7-loxP-tel。[B.3]相同組換え体の選別[B.3.1]PCR解析ヒスチジノール耐性株のゲノムDNAを鋳型として組換え体を選別するため一次スクリーニングとして切断部位よりテロメア側に位置する以下のプライマーを用いてPCRを行い、部位特異的切断が起こっているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはAmpliTaqGoldAppliedBiosystemsを用い、バッファーやdNTPsdATP,dCTP,dGTP,dTTPは添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は95°C10分の熱変性後、95°C20秒、55°C30秒、72°C30秒を30サイクル行った。PCRの結果、433クローン中2クローンが陽性であった。次に上記プライマーで検出されなかった433クローンのうちの2クローンについて以下のプライマーを用いて部位特異的相同組換えが起こっているかをPCRにて確認した。配列は以下のとおりである。上記プライマーによりPCRはLATaq宝酒造を用い、バッファーやdNTPsdATP,dCTP,dGTP,dTTPは添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は94°C1分の熱変性後、98°C20秒、68°C8分を35サイクル行った。部位特異的に組換えが起こった2クローンでのみ約8kbのバンドが検出された。ネガティブコントロールのDT40、DT40hChr7-loxPではバンドは検出されなかった。[B.3.2]two-colorFISH解析FISH解析は松原らFISH実験プロトコール、秀潤社、1994に従い行った。上記で組換えを確認したクローンのうち2クローンをヒトcot-1DNA及びヒスチジノールをプローブにしてFISH解析を行ったところ、loxP配列が挿入されたヒト7番染色体は全てのクローンで宿主染色体に転座することなく、ヒト7番染色体断片末端にヒスチジノール由来のシグナルが検出されたことから部位特異的に組換えが起こったことが確かめられた。以上の結果から、クローンDT40hChr7-loxP-tel608及び748において、CYP3A遺伝子クラスター領域よりテロメア側のAC073842から遠位において切断できたと結論付けた。[C]hChr7-loxP-tel含有DT40からhChr7-loxP-telのMAC1含有CHO細胞への導入。CHO細胞内でマウス人工染色体ベクターMAC1にloxP配列を介してヒトCYP3A遺伝子クラスター領域を転座挿入するために、hChr7-loxP-telをマウス人工染色体ベクターMAC1含有CHO細胞に導入する。[C.1]微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離レシピエント細胞であるDT40hChr7-loxP-tel608及び748を用いて、上記と同様にMAC1含有CHOhprt欠損細胞ヒューマンサイエンス研究資源バンクより入手、登録番号JCRB0218である、CHOHPRT-;MAC1に微小核細胞融合法を行った。5回の微小核細胞融合で得た合計48個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以降の解析を行ったクローン名:CHOHPRT-;MAC1,hChr7-loxP-tel。[C.2]薬剤耐性クローンの選別[C.2.1]PCR解析ハイグロマイシン耐性株のゲノムDNAを抽出して鋳型として組換え体を選別するため、以下のプライマーを用いてPCRを行い、ヒト7番染色体断片がMAC1含有CHO細胞に導入されているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはLATaqTAKARAを用い、バッファーやdNTPsdATP,dCTP,DGTP,dTTPは添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は94°C1分の熱変性後、98°C10秒、68°C7分を30サイクル行った。PCRの結果、48クローンのうち、19クローンが全てのプライマーのセットで陽性であり、このうち陰性1クローンを含む20クローンで以降の解析を行った。[C.2.2]two-colorFISH解析上記で得られたCHOHPRT-;MAC1,hChr7-loxP-telの19クローンについてShinoharaらの報告HumanMolecularGenetics,10:1163-1175,2001に記された方法でマウスCot-1DNA及びヒトCot-1DNAをプローブにしたFISH解析を行ったところ、上記陰性の1クローンを除いた18全てにおいてMAC1ならびにhChr7-loxP-telがCHO細胞に1コピーもしくは2コピーで導入されていることを確認した図17。以上の結果から、hChr7-loxP-telがマウス人工染色体ベクターMAC1含有CHO細胞に導入できたと結論付けた。[D]CHOHPRT-;MAC1,hChr7-loxP-telクローンにおけるヒトCYP3A遺伝子クラスター領域周辺AC004922-ヒトCYP3A遺伝子クラスター-AC0738421MbのMAC1ベクターへの部位特異的転座1MbサイズのDNAであるヒトCYP3A遺伝子クラスターをマウス個体内で安定に維持させるために、マウス人工染色体ベクターMAC1に転座挿入する図18。[D.1]トランスフェクション及びHAT耐性クローンの単離上記で得られたCHOHPRT-;MAC1,hChr7-loxP-tel-6、9、12、47にリポフェクション法を用いて遺伝子導入を行い、90コンフルエント状態になった6wellの細胞に対して、Cre3μgを市販インビトロジェンのプロトコールに従い導入した。HAT選択培養下で2週間培養すると、耐性コロニーが出現し、4回の導入で得た合計42個のコロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行ったクローン名:CHOCYP3A-MAC1,hChr7-ΔCYP3A。[D.2]薬剤耐性クローンの選別[D.2.1]PCR解析HAT耐性株のゲノムDNAを抽出して鋳型として相互転座クローンを選別するため、以下のプライマーを用いてPCRを行い、ヒト7番染色体断片とMAC1上で染色体相互転座が起こっているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはLATaqTAKARAを用い、バッファーやdNTPsdATP,dCTP,dGTP,dTTPは添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は94°C1分の熱変性後、98°C10秒、68°C7分を30サイクル行った。PCRの結果、42クローンのうち、27クローンが全てのプライマーのセットで陽性であり、この27クローンで以降の解析を行った。[D.2.2]two-colorFISH解析上記で得られたCHOCYP3A-MAC1,hChr7-ΔCYP3Aの27クローンについてShinoharaらの報告HumanMolecularGenetics,10:1163-1175,2001に記された方法でマウスCot-1DNA及びヒトCot-1DNAをプローブにしたFISH解析を行ったところ27クローン中、25クローンで50以上の割合でloxP配列を含むマウス11番染色体断片からなるMAC1上にヒト7番染色体由来によるシグナルが観察されていることを確認した図19。以上の結果から、loxP配列が挿入されヒト7番染色体断片上のCYP3Aクラスター1Mbがマウス人工染色体ベクターMAC1に相互転座によるクローニングができたと結論付けた。[実施例4]マウス人工染色体ベクターMAC2の構築マウス人工染色体ベクターMACにDNA挿入配列として5’HPRT-loxP-PGKhygタイプのloxP配列を挿入したマウス人工染色体ベクターMAC2を構築する図3。5’HPRT-loxP-PGKhygタイプのloxP配列は、Kazukiらの報告GeneTherapy:PMID:21085194,2010に記載された21番染色体由来のGFP搭載HACベクター21HAC2に挿入されており、HACとMACの遺伝子発現を同じベクターで比較することができる。また、21HAC2への挿入のための遺伝子導入ベクターがベクター作製のステップを経ることなく、そのまま利用可能である。[A]マウス人工染色体MACへの5’HPRT-loxP-PGKhygタイプのloxP配列の挿入[A.1]5’HPRT-loxP-PGKhygタイプのloxPターゲティングベクター作製loxP配列を挿入するための基本プラスミドには上記で作成したVH21-12を用いた。上記X6.1からKpnIとAscIにより切り出した5’HPRT-loxP-PGKhygroカセットをV907LexicongeneticsのKpnIとAscIサイトにクローニングしたベクター名:pV907-AML。さらにpV907-AMLから5’HPRT-loxP-PGKhygroカセットをXhoIとSalIにより切り出してVH21-12のXhoIサイトにクローニングしたベクター名:pMAC2。ターゲティングベクター、標的配列および相同組換えにより生じる染色体アレルを図20に示す。[A.2]トランスフェクションおよび薬剤耐性クローンの単離上述と同様に、上記で作製したターゲティングベクターpMAC2を制限酵素NotITAKARAで線状化後、上記で作製したクローンDT40MACにトランスフェクションし、ハイグロマイシン1.5mg/mlを含む培地に交換し、96穴培養プレート2枚に分注して約2週間の選択培養を行った。1回のトランスフェクションで得た合計45個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行ったクローン名:DT40MAC2。[A.3]相同組換体の選別[A.3.1]PCR解析ハイグロマイシン耐性株のゲノムDNAを抽出して鋳型として組換え体を選別するため、以下のプライマーを用いてPCRを行い、マウス人工染色体ベクターMAC上で部位特異的に組換え起こっているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはLATaqTAKARAを用い、バッファーやdNTPsdATP,dCTP,dGTP,dTTPは添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は94°C1分の熱変性後、98°C10秒、68°C7分を35サイクル行った。PCRの結果、45クローンのうち、8クローンが全てのプライマーのセットで陽性であったため、この8クローンからランダムに選んだ6クローンで以降の解析を行った。[A.3.2]two-colorFISH解析上記から得られたDT40MAC2の6クローンにおいて、two-colorFISH解析を松原らFISH実験プロトコール、秀潤社、1994に従い行った。マウスcot-1DNAおよび5’HPRT-loxP-PGKhygroカセットをプローブにしてFISH解析を行ったところ、ネガティブコントロールのターゲティングする前のマウス11番染色体断片であるマウス人工染色体ベクターMACにおいては、明らかにプローブ由来のシグナルが検出された割合が10であったのに対し、DT40MAC2の6クローンでは、50以上の割合でプローブ由来のシグナルが検出されたことから、上記6クローンにおいて、部位特異的に組換えが起こったことが視覚的に確かめられた図21。これらの結果から、マウス人工染色体ベクターMAC2を保持するDT40細胞クローンが得られたと結論できた。[B]マウス人工染色体ベクターMAC2含有ニワトリDT40細胞からMAC2のCHO細胞への導入マウス人工染色体ベクターMAC2をマウスES細胞へ安定に導入するために、CHO細胞へ導入する。またマウス人工染色体ベクターMAC2のDNA配列挿入部位であるloxPを介して安定に目的遺伝子等例えばGFP遺伝子などを挿入するためにCHO細胞に導入する。[B.1]微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離レシピエント細胞であるDT40MAC2-5及び17を用いて、上記と同様にCHOhprt欠損細胞ヒューマンサイエンス研究資源バンクより入手、登録番号JCRB0218であるCHOHPRT-に微小核細胞融合法を行った。2回の微小核細胞融合で得た合計44個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以降の解析を行ったクローン名:CHOHPRT-;MAC2。[B.2]薬剤耐性クローンの選別[B.2.1]PCR解析ハイグロマイシン耐性株のゲノムDNAを抽出して鋳型として組換え体を選別するため、以下のプライマーを用いてPCRを行い、マウス人工染色体ベクターMAC2がCHO細胞に導入できているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはLATaqTAKARAを用い、バッファーやdNTPsdATP,dCTP,dGTP,dTTPは添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は94°C1分の熱変性後、98°C10秒、68°C7分を30サイクル行った。PCRの結果、44クローンのうち、14クローンが全てのプライマーのセットで陽性であり、この14クローンからランダムに選んで以降の解析を行った。[B.2.2]two-colorFISH解析上記で得られたCHOHPRT-;MAC2の14クローンからランダムに選んだ9クローンについて松原らFISH実験プロトコール、秀潤社、1994に従った方法でマウスCot-1DNAと5’HPRT-loxP-PGKhygroカセットをプローブにしたFISH解析を行ったところ9クローン中、8クローンで95の割合でMAC2がCHO細胞に導入されていることを確認した図22。以上の結果から、マウス11番染色体由来の染色体断片であるマウス人工染色体MACに遺伝子挿入部位であるloxP配列が挿入されたマウス人工染色体ベクターMAC2がCHO細胞に導入できたと結論付けた。[C]マウス人工染色体ベクターMAC2含有CHO細胞からマウスES細胞へのマウス人工染色体ベクターMAC2の導入[C.1]微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離レシピエント細胞であるCHOHPRT-;MAC2-13,18を細胞培養皿で培養し、コンフルエントになった時点で20FBS、0.1μg/mlコルセミドを添加したF12培地に交換し、さらに48時間培養後に20FBS、0.1μg/mlコルセミドを添加したF12培地で培地交換し、さらにオーバーナイトでインキュベートしてミクロセルを形成させた。培養液を除去し、予め37°Cで保温したサイトカラシンB10μg/ml,シグマ溶液を遠心用フラスコに満たし、34°C、8000rpm、1時間の遠心を行った。微小核細胞ミクロセルともいうを無血清DMEM培地に懸濁し、8μm,5μm,3μmフィルターにて精製した。精製後、2000rpm,10分間遠心し、無血清DMEM培地5mlに懸濁した。ミクロセルを5mlの無血清DMEM培地に懸濁し、8μm,5μm,3μmフィルターにて精製した。精製後、2000rpm,10分間遠心した。ドナー細胞には日本クレアより入手したC57B6系統マウスのES細胞であるB6-ES、及び該ES細胞に6TG処理を行ったHPRT欠損株であるB6HPRT-、及びTT2F細胞のHPRT欠損株であるKO56HPRT-を用いた。培養には、DMEMDulbecco’sModifiedEagle’sMedium-highglucose:SIGMAに、10FCS、LIFMuerinLeukemiaInhibitoryFactor、1×10-5M2-ME2-メルカプトエタノール:SIGMA、L-グルタミン3.5g/ml:GIBCO、Sodiumpyruvate溶液3.5g/ml:GIBCO、MEM非必須アミノ酸0.125mM:GIBCOを添加し、5CO2、37°Cにて培養をおこなった。マウスES細胞をPBS-で細胞表面を2回洗浄後にトリプシン処理により細胞を分散させ、DMEM培地に10FBSを添加した培養液で回収し、1500rpmで遠心し、上清を除去し、無血清培養液5mlに再度懸濁し、ミクロセルの遠心後のペレットを含む無血清培地に静かに添加し、さらに1200rpmで遠心した。上清を除去し、PEG1000Wako溶液[5gのPEG1000を無血清DMEM培地に完全に溶解し、ジメチルスルホキシドを1ml添加して濾過滅菌する]を0.5mlで正確に1分30秒間融合した。13mlの無血清培養液DMEMを静かに添加し、1200rpmで遠心した。上清を除去し、通常のマウスES細胞の培養液を添加し、マイトマイシン処理したG418耐性マウス胎生線維芽細胞をフィーダー細胞として使用し、直径10cm細胞培養皿2枚に播種し、オーバーナイトでインキュベートした。ハイググロマイシンを250μg/mlになるように加え、3~4週間選択培養した。2回の微小核細胞融合で得た合計28個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以降の解析を行ったクローン名:B6-ESMAC2及びB6HPRT-;MAC2及びKO56HPRT-;MAC2。[C.2]薬剤耐性クローンの選別[C.2.1]PCR解析ハイグロマイシン耐性株のゲノムDNAを抽出して鋳型として組換え体を選別するため、以下のプライマーを用いてPCRを行い、マウス人工番染色体MAC2がマウスES細胞に導入できているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはLATaqTAKARAを用い、バッファーやdNTPsdATP,dCTP,dGTP,dTTPは添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は94°C1分の熱変性後、98°C10秒、68°C10分を30サイクル行った。PCRの結果、28クローンのうち、27クローンが全てのプライマーのセットで陽性であり、この27クローンの中からランダムに選んだ3クローンで以降の解析を行った。[C.2.2]mono-colorFISH解析上記で得られたmouseESMAC2のクローンについてShinoharaらの報告HumanMolecularGenetics,10:1163-1175,2001に記された方法でマウスminorsatteliteDNAをプローブにしたFISH解析を行ったところ3クローン中、1クローンで80以上の割合でMAC2がマウスES細胞に1コピーで導入され、かつKO56細胞の通常核型である内在マウス染色体の本数が39本であることを確認した。以上の結果から、マウス11番染色体由来の染色体断片であるマウス人工染色体MACに遺伝子挿入部位であるloxP配列が挿入されたマウス人工染色体ベクターMAC2がマウスES細胞に導入できたと結論付けた図23。[D]実施例8記載のように、マウス人工染色体ベクターMAC2を保持するマウスES細胞を用いて、invitroの安定性を検証できる。また、上記ES細胞からキメラマウスを作製し、MAC2が子孫伝達されたマウス系統TCMAC2をを作製できる。また、上記TCMAC2マウス系統を用いて、体細胞におけるMAC2の安定性を検証できる。[実施例5]マウス人工染色体ベクターMAC3の構築マウス人工染色体MACにDNA挿入配列としてPGKneo-loxP-3’HPRTタイプのloxP配列を挿入したマウス人工染色体ベクターMAC3を構築する図4。マウス人工染色体ベクターMAC3のマウスES細胞での安定性を検証し、さらにMAC3を導入した子孫伝達マウスを作製することで、個体組織での安定性を検証する。[A]マウス人工染色体MACへのPGKneo-loxP-3’HPRTタイプのloxP配列の挿入[A.1]PGKneo-loxP-3’HPRTタイプのloxPターゲティングベクターの作製loxP配列を挿入するための基本プラスミドには上記で作成したVH21-12を用いた。pVNLHからSalIとAscIにより切り出したPGKneo-loxP-3’HPRTカセットをVH21-12のXhoIサイトとAscIサイトにクローニングしたベクター名:pMAC3。ターゲティングベクター、標的配列および相同組換えにより生じる染色体アレルを示す図24。[A.2]トランスフェクションおよびG418耐性クローンの単離ニワトリDT40細胞の培養は10ウシ胎仔血清ギブコ、以下FBSで記す、1ニワトリ血清ギブコ、10-4M2-メルカプトエタノールシグマを添加したRPMI1640培地ギブコ中で行った。DT40MAC-1の約107個の細胞を無添加RPMI1640培地で一回洗浄し、0.5mlの無添加RPMI1640培地に懸濁し、制限酵素NotITAKARAで線状化したターゲティングベクターpMAC3を25μg加え、エレクトロポレーション用のキュベットバイオラッドに移し、室温で10分間静置した。キュベットをジーンパルサーバイオラッドにセットし、550V、25μFの条件で電圧印加した。室温で10分間静置後、24時間培養した。G4181.5mg/mlを含む培地に交換し、96穴培養プレート2枚に分注して約2週間の選択培養を行った。2回のトランスフェクションで得た合計14個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行ったクローン名:DT40MAC3[A.3]相同組換体の選別[A.3.1]PCR解析G418耐性株のゲノムDNAを抽出して鋳型として組換え体を選別するため、以下のプライマーを用いてPCRを行い、マウス11番染色体上で部位特異的に組換え起こっているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはLATaqTAKARAを用い、バッファーやdNTPsdATP,dCTP,dGTP,dTTPは添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は94°C1分の熱変性後、98°C10秒、68°C9分を35サイクル行った。PCRの結果、17クローンのうち、16クローンが全てのプライマーのセットで陽性であったため、この16クローンの中からランダムに2クローンを選んで以降の解析を行った。[A.3.2]mono-colorFISH解析上記で得られたDT40MAC3の2クローンについてShinoharaらの報告HumanMolecularGenetics,10:1163-1175,2001に記された方法でマウスCot-1DNAをプローブにしたFISH解析を行ったところすべてのクローンで染色体転座等が起きずに90以上の割合で独立に保持されていた。[A.3.3]two-colorFISH解析上記からランダムに選んだDT40MAC3-160及び187において、two-colorFISH解析を松原らFISH実験プロトコール、秀潤社、1994に従い行った。マウスcot-1DNA及びマウスminorsatelliteDNAをプローブにしてFISH解析を行ったところ、マウス人工染色体MAC3が1コピーで独立に存在していることがわかった図25。これらの結果から、DNA挿入配列としてloxP配列をマウスセントロメア付近に挿入したマウス人工染色体ベクターMAC3を保持するDT40細胞クローンが得られたと結論付けた。[B]マウス人工染色体ベクターMAC3含有ニワトリDT40細胞からMAC3のCHO細胞への導入マウス人工染色体ベクターMAC3のDNA配列挿入部位であるloxPを介して安定に目的遺伝子等例えばGFP遺伝子などを挿入するためにCHO細胞に導入する。[B.1]微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離レシピエント細胞であるDT40MAC3-160を細胞培養皿で培養し、コンフルエントになった時点で20FBS、1ニワトリ血清、10-4M2-メルカプトエタノール、0.05μg/mlコルセミドを添加したRPMI1640培地に交換し、さらに12時間培養してミクロセルを形成させた。培養液を24mlの無血清DMEM培地に置換し、予め100μ/mlのポリL-リジンでコートした遠心用25cm2フラスコ12本コーニングに2mlずつ分注し、37°Cで30分培養し、細胞をフラスコの底に付着させた。上清を除去し、予め37°Cで保温したサイトカラシンB10μg/ml,シグマ溶液を遠心用フラスコに満たし、34°C、8000rpm、1時間の遠心を行った。ミクロセルを無血清DMEM培地に懸濁し、8μm,5μm,3μmフィルターにて精製した。精製後、1700rpm,10分間遠心し、無血清DMEM培地5mlに懸濁した。ドナー細胞にはCHOhprt欠損細胞ヒューマンサイエンス研究資源バンクより入手、登録番号JCRB0218であるCHOHPRT-を用いた。精製した微小核をPHA-PSIGMAを含む無血清培養液2mlに再度懸濁し、培養上清液[10FBS添加F12培地invitrogen]を除去したCHO細胞上に静かに播種した。プレートを37°C、15分間インキュベートした。上清を除去し、PEG1000Wako溶液[5gのPEG1000を無血清DMEM培地に完全に溶解し、ヂメチルスルホキシドを1ml添加して濾過滅菌する]を1mlで正確に1分間融合した。無血清培養液DMEMを4mlで4回洗浄し、通常のCHO細胞の培養液5ml加えてオーバーナイトでインキュベートした。PBS-で細胞表面を2回洗浄後にトリプシン処理により細胞を分散させ、直径10cm細胞培養皿5枚に播種し、G418を800μg/mlになるように加え、3~4週間選択培養した。2回の微小核細胞融合で得た合計12個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以降の解析を行ったクローン名:CHOHPRT-;MAC3。[B.2]薬剤耐性クローンの選別[B.2.1]PCR解析G418耐性株のゲノムDNAを抽出して鋳型として組換え体を選別するため、以下のプライマーを用いてPCRを行い、マウス人工染色体ベクターMAC3がCHO細胞に導入できているかをを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはLATaqTAKARAを用い、バッファーやdNTPsdATP,dCTP,dGTP,dTTPは添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は94°C1分の熱変性後、98°C10秒、68°C10分を30サイクル行った。PCRの結果、7クローンのうち、6クローンが全てのプライマーのセットで陽性であり、この6クローンで以降の解析を行った。[B.2.2]mono-colorFISH解析上記で得られたCHOHPRT-;MAC3の6クローンについてShinoharaらの報告HumanMolecularGenetics,10:1163-1175,2001に記された方法でマウスCot-1DNAをプローブにしたFISH解析を行ったところ6クローン中、3クローンで90以上の割合でCHO細胞にMAC3が導入されていることを確認した図26。以上の結果から、マウス人工染色体ベクターMAC3がCHO細胞に導入できたと結論付けた。[C]マウス人工染色体ベクターMAC3含有CHO細胞からMAC3のマウスES細胞への導入マウスES細胞及びマウス個体内でのマウス人工染色体ベクターMAC3の安定性を検証するために、マウス人工染色体MAC3をマウスES細胞に導入し、マウス人工染色体ベクターMAC3含有キメラマウスならびに子孫伝達マウスを作製する。[C.1]微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離レシピエント細胞であるCHOHPRT-;MAC3-1,6を細胞培養皿で培養し、コンフルエントになった時点で20FBS、0.1μg/mlコルセミドを添加したF12培地に交換し、さらに48時間培養後に20FBS、0.1μg/mlコルセミドを添加したF12培地で培地交換し、さらにオーバーナイトでインキュベートしてミクロセルを形成させた。培養液を除去し、予め37°Cで保温したサイトカラシンB10μg/ml,シグマ溶液を遠心用フラスコに満たし、34°C、8000rpm、1時間の遠心を行った。ミクロセルを無血清DMEM培地に懸濁し、8μm,5μm,3μmフィルターにて精製した。精製後、2000rpm,10分間遠心し、無血清DMEM培地5mlに懸濁した。ミクロセルを5mlの無血清DMEM培地に懸濁し、8μm,5μm,3μmフィルターにて精製した。精製後、2000rpm,10分間遠心した。ドナー細胞には日本クレアより入手したC57B6系統マウスのES細胞に6TG処理を行ったHPRT欠損株であるB6HPRT-を用いた。培養には、DMEMDulbecco’sModifiedEagle’sMedium-highglucose:SIGMAに、10FCS、LIFMuerinLeukemiaInhibitoryFactor、1×10-5M2-ME2-メルカプトエタノール:SIGMA、L-グルタミン3.5g/ml:GIBCO、Sodiumpyruvatesolution3.5g/ml:GIBCO、MEMNonessentialaminoacid0.125mM:GIBCOを添加し、5CO2、37°Cにて培養をおこなった。マウスES細胞をPBS-で細胞表面を2回洗浄後にトリプシン処理により細胞を分散させ、DMEM培地に10FBSを添加した培養液で回収し、1500rpmで遠心し、上清を除去し、無血清培養液5mlに再度懸濁し、ミクロセルの遠心後のペレットを含む無血清培地に静かに添加し、さらに1200rpmで遠心した。上清を除去し、PEG1000Wako溶液[5gのPEG1000を無血清DMEM培地に完全に溶解し、ジメチルスルホキシドを1ml添加して濾過滅菌する]を0.5mlで正確に1分30秒間融合した。13mlの無血清培養液DMEMを静かに添加し、1200rpmで遠心した。上清を除去し、通常のマウスES細胞の培養液を添加し、マイトマイシン処理したG418耐性マウス胎生線維芽細胞をフィーダー細胞として使用し、直径10cm細胞培養皿2枚に播種し、オーバーナイトでインキュベートした。G418を250μg/mlになるように加え、3~4週間選択培養した。2回の微小核細胞融合で得た合計28個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以降の解析を行ったクローン名:B6HPRT-;MAC3。[C.2]薬剤耐性クローンの選別[C.2.1]PCR解析G418耐性株のゲノムDNAを抽出して鋳型として組換え体を選別するため、以下のプライマーを用いてPCRを行い、マウス11番染色体上で部位特異的切断が起こっているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはLATaqTAKARAを用い、バッファーやdNTPsdATP,dCTP,dGTP,dTTPは添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は94°C1分の熱変性後、98°C10秒、68°C10分を30サイクル行った。PCRの結果、28クローンのうち、27クローンが全てのプライマーのセットで陽性であり、この27クローンで以降の解析を行った。[C.2.2]mono-colorFISH解析上記で得られたB6HPRT-;MAC3のうち16クローンについてShinoharaらの報告HumanMolecularGenetics,10:1163-1175,2001に記された方法でマウスminorsatelliteDNAをプローブにしたFISH解析を行ったところ16クローン中、5クローンで95以上の割合でMAC3がマウスES細胞に導入されていることを確認した。以上の結果から、マウス人工染色体ベクターMAC3がマウスES細胞に導入できたと結論付けた図27。[D]マウス人工染色体ベクターMAC3のマウスES細胞における安定性上記で得られたマウスESクローン例えばB6HPRT-;MAC3-3,-s6、上記[C]で取得について0~100PDLの非選択培養下での長期培養後におけるFISH解析によるMAC1保持細胞の割合を計測した結果、100PDLにおいても95以上の保持率であった図28。以上の結果、マウス人工染色体ベクターMAC3はマウスES細胞invitroにおいて、95以上の割合で非常に安定に維持されることが確かめられた。[E]マウス人工染色体ベクターMAC3を保持するキメラマウスの作製上記で得られたES細胞クローンを用いてジーンターゲティング、実験医学、1995の手法に従い、キメラマウスを作製した。宿主としてはMCHICR白色、日本クレア社より購入の雌雄交配により得られる桑実胚を用いた。注入胚を仮親に移植した結果生まれる仔マウスは毛色によりキメラであるかどうか、またICRの胚細胞に対してES細胞が個体を形成する細胞の中での寄与率としてキメラ率を判定できる。B6HPRT;MAC3クローン例えばB6HPRT;MAC3-ESMAC3-s6上記で取得を注入した60個の胚を仮親に移植した結果、8匹のキメラマウス毛色に濃茶色の部分の認められるが誕生した。8匹のうち、2匹は雄で10キメラマウスが1匹、5キメラマウスが1匹生まれ、6匹は雌で10キメラマウスが4匹、5キメラマウスが2匹生まれた。すなわち、マウス人工染色体MAC3を保持するES細胞株B6HPRT-/-株はキメラ形成能を保持している、すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが示された。[F]実施例8記載のように、マウス人工染色体ベクターMAC3を保持するキメラマウスと野生型マウスと交配させてMAC3が子孫伝達されたマウス系統TCMAC3をを作製できる。また、上記TCMAC3マウス系統を用いて、体細胞におけるMAC3の安定性を検証できる。[実施例6]マウス人工染色体ベクターGFP-MACの構築マウス人工染色体ベクターMAC3に有用タンパク質をコードする遺伝子の例として、蛍光遺伝子であるEGFPをCre/loxPシステムを用いて挿入し、機能タンパク質の発現と長期安定性を検証する図5。[A]マウス人工染色体ベクターMAC3ベクター含有CHO細胞における特定の遺伝子例えばGFPのCre/loxPシステムによるマウス人工染色体ベクターMAC3への挿入マウス人工染色体MACにDNA挿入配列としてPGKneo-loxP-3’HPRTタイプのloxP配列を挿入したマウス人工染色体ベクターMAC3においてloxPが稼働しプラスミドDNAが部位特異的に挿入できるかどうか検証する。[A.1]EGFP挿入ベクターの作製loxP配列を挿入するための基本プラスミドにはV913Lexicongeneticsを用いた。5’HPRT-loxPはV820LexicongeneticsのXbaIサイトにオリゴ合成したloxP配列をクローニングした。5’HPRT-loxPをV907LexicongeneticsのClaIとAscIにクローニングし、PGKhygroをClaIとKpnIサイトにクローニングしたベクター名:pX6.1。さらにX6.1のNotIサイトとSalIサイトにNotIとSalIにより切り出したHS4-CAG-EGFP-HS4大阪大学、岡部博士及びNIH、Felsenfeld博士より分与をクローニングし、HPRT再構築系のGFP挿入コンストラクトとしたベクター名:pX6.1EGFP。Cre/loxPシステムによるHPRT再構築系のGFP挿入により生じる染色体部位特異的DNA挿入を図29に示す。[A.2]トランスフェクション及びHAT耐性クローンの単離遺伝子導入はリポフェクション法を用いて行い、90コンフルエント状態になった6wellの細胞に対して、Cre1μgとGFP挿入ベクター2μgを市販インビトロジェンのプロトコールに従い導入した。HAT選択培養下で2週間培養すると、耐性コロニーが出現し、2回の導入で得た合計22個のコロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行ったクローン名:CHOGFP-MAC。[A.3]薬剤耐性クローンの選別[A.3.1]蛍光顕微鏡観察によるGFP挿入体の確認クローニングした22個のコロニーを蛍光顕微鏡下にて観察したところ、全てのクローンにてGFP陽性細胞が観察され、その陽性率はほぼ100であった。[A.3.2]PCR解析HAT耐性株のゲノムDNAを鋳型として組換え体を選別するため以下のプライマーを用いてPCRを行い、部位特異的にGFP遺伝子の挿入が起こっているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはAmpliTaqGoldAppliedBiosystemsを用い、バッファーやdNTPsdATP,dCTP,dGTP,dTTPは添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は94°C10分の熱変性後、94°C30秒、60°C30秒、72°C30秒を35サイクル行った。PCRの結果、22クローン全てが陽性であり、この22クローンで以降の解析を行った。[A.3.3]two-colorFISH解析上記から結果からランダムに選んだ6クローンにおいて、two-colorFISH解析を松原らFISH実験プロトコール、秀潤社、1994に従い行った。マウスcot-1DNA及びX6.1EGFPをプローブにしてFISH解析を行ったところ、6クローンのうち、3クローンにおいて50以上の割合でGFP-MACが1コピー保持され、さらにX6.1EGFP由来のシグナルが現れ、ネガティブコントロールであるEGFPを部位特異的挿入する前のMAC3上にはシグナルが検出されなかったことから、部位特異的にEGFPが挿入されたことが確かめられた図30。以上の実験によりマウス人工染色体MAC3上にGFP遺伝子を搭載することにより、GFP発現が観察され、マウス人工染色体ベクターGFP-MACを保持するCHO細胞を得られたことが確認できた。[B]マウス人工染色体ベクターGFP-MAC含有CHO細胞からGFP-MACのマウスES細胞への導入[B.1]微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離レシピエント細胞であるCHOGFP-MAC-4、10、12を細胞培養皿で培養し、コンフルエントになった時点で20FBS、0.05μg/mlコルセミドを添加したF12培地に交換し、さらに48時間培養後に20FBS、0.05μg/mlコルセミドを添加したF12培地で培地交換し、さらにオーバーナイトでインキュベートしてミクロセルを形成させた。培養液を除去し、予め37°Cで保温したサイトカラシンB10μg/ml,シグマ溶液を遠心用フラスコに満たし、34°C、8000rpm、1時間の遠心を行った。ミクロセルを無血清DMEM培地に懸濁し、8μm,5μm,3μmフィルターにて精製した。精製後、2000rpm,10分間遠心し、無血清DMEM培地5mlに懸濁した。ミクロセルを5mlの無血清DMEM培地に懸濁し、8μm,5μm,3μmフィルターにて精製した。精製後、2000rpm,10分間遠心した。ドナー細胞には日本クレアより入手したC57B6系統マウスのES細胞から樹立した野生型B6細胞及び、野生型TT2F細胞のマウスES細胞を用いた。培養には、DMEMDulbecco’sModifiedEagle’sMedium-highglucose:SIGMAに、10FCS、LIFMuerinLeukemiaInhibitoryFactor、1×10-5M2-ME2-メルカプトエタノール:SIGMA、L-グルタミン3.5g/ml:GIBCO、Sodiumpyruvatesolution3.5g/ml:GIBCO、MEMNonessentialaminoacid0.125mM:GIBCOを添加し、5CO2、37°Cにて培養をおこなった。マウスES細胞をPBS-で細胞表面を2回洗浄後にトリプシン処理により細胞を分散させ、DMEM培地に10FBSを添加した培養液で回収し、1500rpmで遠心し、上清を除去し、無血清培養液5mlに再度懸濁し、ミクロセルの遠心後のペレットを含む無血清培地に静かに添加し、さらに1200rpmで遠心した。上清を除去し、PEG1000Wako溶液[5gのPEG1000を無血清DMEM培地に完全に溶解し、ジメチルスルホキシドを1ml添加して濾過滅菌する]を0.5mlで正確に1分30秒間融合した。13mlの無血清培養液DMEMを静かに添加し、1200rpmで遠心した。上清を除去し、通常のマウスES細胞の培養液を添加し、マイトマイシン処理したG418耐性マウス胎生線維芽細胞をフィーダー細胞として使用し、直径10cm細胞培養皿2枚に播種し、オーバーナイトでインキュベートした。G418を250μg/mlになるように加え、3~4週間選択培養した。2回の微小核細胞融合で得た合計36個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以降の解析を行ったクローン名:TT2FGFP-MAC及びB6-ESGFP-MAC。[B.2]薬剤耐性クローンの選別[B.2.1]PCR解析G418耐性株のゲノムDNAを抽出して鋳型として組換え体を選別するため、以下のプライマーを用いてPCRを行い、マウス11番染色体上で部位特異的切断が起こっているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはLATaqTAKARAを用い、バッファーやdNTPsdATP,dCTP,dGTP,dTTPは添付のものを推奨される条件に従って用いた。TRANSL1/R1の温度、サイクル条件は94°C1分の熱変性後、98°C10秒、68°C1分を35サイクル行った。TRANSL1/m116Rの温度、サイクル条件は94°C1分の熱変性後、98°C10秒、68°C7分を35サイクル行った。PCRの結果、36クローンのうち、34クローンが全てのプライマーのセットで陽性であり、この中からランダムに24クローンを選らんで以降の解析を行った。[B.2.2]キナクリンヘキスト二重染色上記PCR解析によって陽性であったクローンについて、上述の方法と同じようにキナクリンヘキスト二重染色を行った。キナクリンヘキスト二重染色したクローンの染色体像を蛍光顕微鏡により観察したところ、24クローン中、18クローンにおいて100の割合でマウス人工染色体GFP-MACが保持されていることがわかった。以上の結果から、マウス人工染色体GFP-MACを導入したマウスES細胞は通常核型で長期培養及びキメラマウス作製に用いることが可能であると結論付けた。[B.2.3]two-colorFISH解析上記で得られたマウスESGFP-MACのクローンについてShinoharaらの報告HumanMolecularGenetics,10:1163-1175,2001に記された方法でマウスminorsatelliteDNA及びpX6.1EをプローブにしたFISH解析を行ったところ12クローン中、6クローンで95以上の割合でGFP-MACがマウスES細胞に導入されていることを確認した。以上の結果から、マウス人工染色体ベクターGFP-MACがマウスES細胞に導入できたと結論付けた。[C]マウス人工染色体ベクターGFP-MACのマウスES細胞における安定性上記で得られたマウスESクローン例えばB6-ESMAC3-9、上記[B]で取得について0~100PDLの非選択培養下での長期培養後におけるFISH解析によるGFP-MAC3保持細胞の割合を計測した結果、100PDLにおいても95以上の保持率であった図31、図32。また、コロニーを蛍光顕微鏡下にて観察したところ、全てのクローンにてGFP陽性細胞が観察され、その陽性率はほぼ100であった。以上の結果から、マウス人工染色体ベクターMAC3に、Cre/loxPシステムにより、20kb以下の外来遺伝子EGFP遺伝子などを部位特異的に効率的に挿入可能であり、また、外来遺伝子を搭載したMAC3はマウスES細胞において非常に安定であり、MAC3上の外来遺伝子の発現も長期間安定であると結論付けた。[D]マウス人工染色体ベクターGFP-MACを保持するキメラマウスの作製上記[B]で得られたES細胞クローンを用いてジーンターゲティング、実験医学、1995の手法に従い、キメラマウスを作製した。宿主としてはMCHICR白色、日本クレア社より購入の雌雄交配により得られる桑実胚及び8細胞期胚を用いた。注入胚を仮親に移植した結果生まれる仔マウスは毛色によりキメラであるかどうかを判定できる。野生型雄B6GFP-MACクローン及び野性型GFP-MACTT2F雌クローン例えばB6-ESGFP-MAC4および18、TT2FGFP-MAC-12上記で取得をそれぞれ注入した胚野生型雄B6GFP-MACクローン260個及び野性型雌TT2FGFP-MACクローン180個を仮親に移植した結果、キメラマウス毛色に濃茶色の部分の認められるが誕生した。雄野生型B6GFP-MACクローン由来のキメラマウスは42匹生まれ、そのうち20匹は雄マウスであり、GFP陽性50キメラマウスが1匹、40キメラマウスが5匹、30キメラマウスが1匹、20キメラマウスが7匹、10キメラマウスが3匹、5キメラマウスが3匹生まれた。また野性型TT2FGFP-MACクローン由来のキメラマウスは14匹生まれ、そのうち1匹は白色の部分がほとんど観察できないキメラ率約100かつGFP陽性の個体であった。以上のことから、マウス人工染色体ベクターGFP-MACを保持するES細胞株B6及びTT2Fはキメラ形成能を有している、すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが示された。[E]マウス人工染色体ベクターGFP-MACを保持するキメラマウスからのマウス人工染色体の子孫伝達上記[D]で作製された雌キメラマウスキメラ率約100をC57B6黒色、日本クレア社より購入雄マウスと交配したキメラマウスより誕生した4匹の仔マウスのうち、3匹がES細胞由来のGFP-MACの優性遺伝形質である、GFPの蛍光が観察された。また3匹のうち1匹の仔マウスについては、全身でGFPの蛍光が観察され、マウス個体においてもマウス人工染色体が安定であることが示された図33。GFP-MACが子孫伝達されたマウス系統をTCGFP-MACと呼ぶ。また、実施例8記載のように、上記TCGFP-MACマウス系統を用いて、体細胞におけるGFP-MACの安定性を検証できる。[実施例7]マウス人工染色体ベクターMAC1の安定性[A.1]マウス人工染色体ベクターMAC1のCHO細胞における安定性上記で得られたCHOクローン例えばCHOHPRT-;MAC1-8,22、上記実施例2で取得について0~25PDLの非選択培養下での長期培養後におけるFISH解析によるMAC1保持細胞の割合を計測した結果、25PDLにおいても90以上の保持率であった。一方、Kazukiら報告GeneTherapy:PMID:21085194,2010に記載された21番染色体由来のGFP搭載HACベクター21HAC2を保持するCHO細胞では、25PDLにおいては70以下の保持率であった。その代表的な結果を図34に示す。[A.2]マウス人工染色体ベクターMAC1のマウスES細胞における安定性上記で得られたマウスESクローン例えばKO56MAC1-5およびTT2FMAC1-23、上記実施例2で取得について0~75PDLの非選択培養下での長期培養後におけるFISH解析によるMAC1保持細胞の割合を計測した結果、75PDLにおいても90以上の保持率であった。一方、Kazukiらの報告GeneTherapy:PMID:21085194,2010に記載された21番染色体由来のGFP搭載HACベクター21HAC2を保持するマウスES細胞では、75PDLにおいては70以下の保持率であった。その代表的な結果を図35に示す。[A.3]マウス人工染色体ベクターMAC1を保持するキメラマウスの作製上記実施例2で得られたES細胞クローンを用いてTomizukaらの方法NatureGenet.16:133,1997でキメラマウスを作製した。宿主としてはMCHICR白色、日本クレア社より購入の雌雄交配により得られる8細胞期胚を用いた。注入胚を仮親に移植した結果生まれる仔マウスは毛色によりキメラであるかどうかを判定できる。MAC1保持ESクローン例えばKO56MAC1-5およびTT2FMAC1-4、上記実施例2で取得を注入した1620個の胚を仮親に移植した結果、56匹のキメラマウス毛色に濃茶色の部分の認められるが誕生した。うち13匹は白色の部分がほとんど観察できないキメラ率約100の個体であった。すなわち、マウス人工染色体ベクターMAC1を保持するES細胞株KO56およびTT2Fはキメラ形成能を保持している、すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが示された。[A.4]マウス人工染色体ベクターMAC1を保持するキメラマウスからのMAC1の子孫伝達上記[A.3]で作製された雌キメラマウスキメラ率約1002匹をMCHICR白色、日本クレア社より購入雄マウスと交配した。キメラマウスより誕生した18匹の仔マウスのうち、13匹がES細胞由来の優性遺伝形質を保持することを示す濃茶色であった。すなわちMAC1を保持するES細胞株は雌キメラマウスにおいて機能的な卵細胞に分化したことが示された。また、GFP蛍光によりMAC1の保持を検討した結果、13匹中6匹46においてGFP陽性であり、キメラマウス子孫におけるMAC1の保持が確認された。すなわち、メンデル遺伝の法則従い、MAC1形質が約50の頻度で出現したことが確かめられ、卵子におけるMAC1の保持率が100に近いことが示された。MAC1が子孫伝達されたマウス系統をTCMAC1と呼ぶ。[A.5]TCMAC1マウス系統の体細胞におけるMAC1の安定性[A.5.1]実体蛍光顕微鏡観察上記で得られたTCMAC1マウスのうち雄5および雌21匹ずつについて脳、胸腺、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、小腸、筋肉、精巣または卵巣を実体蛍光顕微鏡観察下にて観察したところ、全ての組織にてGFP陽性が観察され、その陽性率は100であった。その雌5の代表的な結果を図36に示す。[A.5.2]血液系細胞のFACS解析B細胞CD19、T細胞CD4,CD8、巨核球CD41に対する特異的抗体Becton,DickinsonandCompanyを用いて、骨髄ならびに脾臓細胞におけるGFP陽性率を検討した結果、全ての組織で、陽性率は95以上であった。一方、Kazukiらの報告GeneTherapy:PMID:21085194,2010に記載された21番染色体由来のGFP搭載HACベクター21HAC2を保持するマウスでは、全ての組織で、陽性率は15以下であった。その代表的な結果を図37、図38に示す。[A.5.3]蛍光insituハイブリダイゼーションFISH解析また上記と同様の個体から調製した尻尾繊維芽細胞を用いて、Shinoharaらの報告HumanMolecularGenetics,10:1163-1175,2001に記された方法でマウスminorsatelliteDNAをプローブにしたFISH解析を行ったところ、視覚的にMAC1の存在を確認し、マウス染色体とは独立に95以上の細胞でMAC1が存在していることが確かめられた図39。以上の結果、マウス人工染色体ベクターMAC1は、マウスES細胞invitroならびにマウス組織invivoにおいて、90以上の割合で非常に安定に維持されることが確かめられた。[実施例8]マウス人工染色体ベクターCYP3A-MAC保持マウスの作製と安定性[A]CHO細胞からのCYP3A-MACのマウスA9細胞への移入CYP3A-MACを保持するマウスES細を作製するために、上記実施例3で得られたCYP3A-MACを保持するCHO細胞CHOCYP3A-MAC,hChr7-ΔCYP3A22,26,34,35などからマウスA9細胞へミクロセル形成能の高いマウスA9細胞へ微小核細胞融合法により導入した。8回の微小核細胞融合で得た合計25個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以降の解析を行ったクローン名:A9CYP3A-MAC。その結果、CYP3A-MAC領域のみを検出する前出のプライマーを用いたPCRで陽性であるクローンが6クローンあった。さらに、CYP3A-BACRP11757A13CHORIならびにマウスminorsatelliteDNAプローブを用いてFISH解析Tomizukaら,NatureGenet.16:133,1997を行った結果、上記プローブにより特異的に検出されるCYP3A-MACの存在が6クローン中、3クローンで確認された図40。以上のことから、CYP3A-MAC保持A9細胞が3クローン得られたと結論付けた。[B]A9細胞からのCYP3A-MACのマウスES細胞への移入CYP3A-MACを保持するキメラマウスを作製するために、上記[A]で得られたCYP3A-MACを保持するA9細胞からマウスES細胞野性型TT2Fへ微小核細胞融合法により導入した。TomizukaらNatureGenet.16:133,1997の方法に従い、約108個のCYP3A-MACを保持するA9細胞A9CYP3A-MAC8,9などからミクロセルを精製し、DMEM5mlに懸濁した。約107個のマウスES細胞TT2Fをトリプシン処理により剥がし、DMEMで3回洗浄後DMEM5mlに懸濁し、遠心したミクロセルに加え、1250rpmで10分間遠心し、上清を完全に取り除いた。沈殿をタッピングにより十分ほぐし、1:1.4PEG溶液[5gPEG1000和光純薬、1mlDMSOシグマをDMEM6mlに溶解]0.5mlを加え、約1分30秒間、十分攪拌した。その後、DMEM10mlをゆっくり加え、1250rpmで10分間遠心し、30mlのES培地に懸濁し、予めフィーダー細胞をまいた直径100mmシャーレコーニング3枚に分注し、培養した。24時間後、300μg/mlのG418を含む培地に交換し、約1週間選択培養した。その結果、合計34個のコロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った。A9CYP3A-MAC8からは14クローン、A9CYP3A-MAC9からは7クローンがCYP3A-MAC領域のみを検出する前出のプライマーを用いたPCRで陽性であった。さらに、上記のうち20クローンについて、CYP3A-BACRP11-757A13CHORI由来のDNAを用いてFISH解析Tomizukaら,NatureGenet.16:133,1997を行った結果、上記プローブにより特異的に検出され、かつマウスの核型が正常なクローンは8クローンであった図41。以上のことから、CYP3A-MAC保持TT2F細胞が8クローン得られたと結論付けた。[C]CYP3A-MACのマウスES細胞における安定性上記[B]で得られたマウスESクローン例えばTT2FCYP3A-MAC8-5,8-22,9-4,9-7,9-9,上記[B]で取得について0~100PDLの非選択培養下での長期培養後におけるFISH解析によるCYP3A-MAC保持細胞の割合を計測した結果、100PDLにおいても95以上の保持率であった。図42。[D]CYP3A-MACを保持するキメラマウスの作製上記[B]で得られたCYP3A-MAC保持ES細胞クローンを用いてTomizukaらの方法NatureGenet.16:133,1997でキメラマウスを作製した。宿主としてはMCHICR白色、日本クレア社より購入の雌雄交配により得られる8細胞期胚を用いた。注入胚を仮親に移植した結果生まれる仔マウスは毛色によりキメラであるかどうかを判定できる。MAC1保持ESクローン例えばTT2FCYP3A-MAC8-5,8-16,8-22,9-4,9-7,9-9,9-10など,上記[B]で取得を注入した840個の胚を仮親に移植した結果、28匹のキメラマウス毛色に濃茶色の部分の認められるが誕生した。うち5匹は白色の部分がほとんど観察できないキメラ率約100の個体であった。すなわち、マウス人工染色体ベクターCYP3A-MACを保持するES細胞株TT2Fはキメラ形成能を保持している、すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが示された。[E]CYP3A-MACを保持するキメラマウスからのCYP3A-MACの子孫伝達上記[D]で作製された雌キメラマウスキメラ率約1005匹をMCHICR白色、日本クレア社より購入雄マウスと交配した。キメラマウスより誕生した60匹の仔マウスのうち、50匹がES細胞由来の優性遺伝形質を保持することを示す濃茶色であった。すなわちCYP3A-MACを保持するES細胞株は雌キメラマウスにおいて機能的な卵細胞に分化したことが示された。また、GFP蛍光によりCYP3A-MACの保持を検討した結果、50匹中29匹58においてGFP陽性であり、キメラマウス子孫におけるCYP3A-MACの保持が確認された。すなわち、メンデル遺伝の法則従い、CYP3A-MAC形質が約50の頻度で出現したことが確かめられ、卵子におけるCYP3A-MACの保持率が100に近いことが示された。CYP3A-MACが子孫伝達されたマウス系統をTCCYP3A-MACと呼ぶ。[F]TCCYP3A-MACマウス系統の体細胞におけるCYP3A-MACの安定性[F.1]実体蛍光顕微鏡観察上記で得られたTCCYP3A-MACマウスのうち雄21匹、雌141匹について脳、胸腺、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、小腸、筋肉、精巣を実体蛍光顕微鏡観察下にて観察したところ、全ての組織にてGFP陽性が観察され、その陽性率は100であった。その雄2の代表的な結果を図43に示す。[F.2]血液系細胞のFACS解析B細胞CD19、T細胞CD4,CD8、巨核球CD41に対する特異的抗体Becton,DickinsonandCompanyを用いて、骨髄におけるGFP陽性率を検討した結果、全ての組織で、陽性率は94以上であった。一方、WO2009/063722PCT/JP2008/068928に記載された14番染色体由来のHACベクターCYP3A-HACΔを保持するマウスでは、全ての組織で、陽性率は20以下であった。その代表的な結果を図44に示す。[F.3]蛍光insituハイブリダイゼーションFISH解析また上記と同様の個体や組織において、Shinoharaらの報告HumanMolecularGenetics,10:1163-1175,2001に記された方法でCYP3A-BACRP11-757A13DNAをプローブにしたFISH解析を行ったところ、視覚的にCYP3A-MACの存在を確認し、90-98の細胞でCYP3A-MACが存在していることが確かめられた。一方、WO2009/063722PCT/JP2008/068928に記載されたヒト14番染色体由来のHACベクターCYP3A-HACΔを保持するマウスでは、全ての組織で、陽性率は56-97であった。その代表的な結果を図45に示す。[F.4]TCCYP3A-MAC系統の伝達率TCCYP3A-MAC雌マウス8匹とMCHICR白色、日本クレア社より購入雄マウス8匹を交配することで伝達率を検討した。81匹の仔マウスが得られ、38匹がGFP陰性、43匹がGFP陽性個体であった伝達率は53。すなわち、伝達率はメンデル遺伝の法則に合致しており、CYP3A-MAC形質が約50の頻度で出現したことが確かめられ、卵子におけるCYP3A-MACの保持率が100に近いことが示された。[F.5]CYP3A-MACが2本保持されたTCCYP3A-MACホモ系統の作製と伝達率上記で得られたTCCYP3A-MAC雄マウスとTCCYP3A-MAC雌マウスを交配し、CYP3A-MACが2本保持されたTCCYP3A-MACホモ系統の樹立を試みた。18匹の仔マウスの尻尾繊維芽細胞を用いて、Shinoharaらの報告HumanMolecularGenetics,10:1163-1175,2001に記された方法でCYP3A-BACRP11757A13DNAをプローブにしたFISH解析を行ったところ、視覚的にCYP3A-MACの存在を確認した。4x36の系統では、12匹の仔マウスのうち、3匹は2コピー、5匹は1コピー、4匹は0コピーであった。24x37の系統では、6匹の仔マウスのうち、1匹は2コピー、3匹は1コピー、2匹は0コピーであった。合計18匹が得られ、CYP3A-MACの2コピー4匹、1コピー8匹、0コピー6匹の比率は、1:2:1.5であり、メンデル遺伝の法則にほぼ合致していた。その代表的な結果を図46に示す。以上の結果、CYP3A-MACは、マウスES細胞invitroにおいて、95以上の割合で非常に安定に長期間維持され、マウス組織invivoにおいて、90以上の割合で非常に安定にかつホモ系統で維持されることが確かめられた。[G]TCCYP3A-MACマウス系統における組織特異的CYP3A遺伝子クラスターの遺伝子発現上記でTCCYP3A-MACマウスのうち雄2および雌141匹ずつについて、脳、胸腺、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、小腸、筋肉において、トータルRNAを市販のプロトコールQIAGENに従い抽出後、市販のプロトコールinvitrogenに従い、cDNA合成を行い、それを鋳型としてPCRを行い、ヒトCYP3A遺伝子クラスターおよびマウスCyp3a遺伝子クラスターの発現を検出した。そのプライマー配列を以下に示す。ヒトCYP3A遺伝子クラスター発現検出用プライマー:マウスCyp3a遺伝子クラスター発現検出用プライマー:コントロール遺伝子発現検出用プライマー:PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはEXTaq宝酒造を用い、バッファーやdNTPdATP,dCTP,dGTP,dTTPは添付のものを推奨条件に従って用いた。温度、サイクル条件は、93°C5分の熱変性後、93°C1分、56°C1分、72°C1分を1サイクルとして35サイクルで行った。その結果TCCYP3A-MACを保持するマウスにおいて、CYP3A4は肝臓と小腸でのみ、CYP3A5は肝臓と小腸と肺でのみ、CYP3A7は肝臓と小腸と腎臓と肺でのみ、CYP3A43は肝臓と小腸と腎臓でのみ、Cyp3a11は肝臓と小腸でのみ、Cyp3a13は肝臓と小腸でのみ発現を検出できた。また、コントロールのGAPDHは全ての組織で検出された。その雌14の代表的な結果を図47に示す。このようにヒトでみられるよう組織特異的発現が認められ、ヒト型化になったことが示された。[H]TCCYP3A-MACマウス系統における時期特異的CYP3A遺伝子クラスターの遺伝子発現GFP陽性のTCCYP3A-MACマウスの雄および雌の胎齢14.5日、胎齢16.5日、胎齢18.5日、生後0日、4週齢、6週齢、12週齢、24週齢における肝臓からのトータルRNAを市販のプロトコールQIAGENに従い抽出後、市販のプロトコールinvitrogenに従い、cDNA合成を行い、それを鋳型としてPCRを行い、上述のヒトCYP3A遺伝子クラスター発現およびマウスCyp3a遺伝子クラスター発現を検出するプライマーを用いて発現を検出した。その結果、成体型発現のヒトCYP3A4、ヒトCYP3A5、マウスcyp3a11、マウスCyp3a13は成体期において、胎児型のCYP3A7は胎児において強く発現していることが確かめられた。また、コントロールのGAPDHは全ての胎齢、週齡で同程度の発現量が検出された。その代表的な結果を図48に示す。このようにヒトでみられるような時期特異的発現が認められ、ヒト型化になったことが示された。[実施例9]TCCYP3A-MAC/Δcypマウス系統の作製[A]CYP3A-MACを保持し、かつ内因性Cyp3a遺伝子群の両アレルが共に破壊されたマウス系統の構築上記実施例8で作製されたTCCYP3A-MACを、WO2009/063722PCT/JP2008/068928の実施例7で作製されたΔcyp系統に戻し交配し、得られたGFP陽性マウス個体について、上記記載のPCR法を用いて遺伝子型の解析を行った。交配して得られた仔マウス51匹中の尻尾を一部切り取り、その試料よりゲノムDNAを調製した。得られたDNAについてCYP3A-MAC検出用プライマーおよびWO2009/063722PCT/JP2008/068928の表1記載のプライマーを用いたPCRを前記と同様に行い、CYP3A-MACの保持およびCyp3a遺伝子クラスターのKOを検討した結果、24匹においてCYP3A-MACを保持し、かつ内因性Cyp3a遺伝子群の片方のアレルが破壊されたヘテロKOマウス系統であることが確認された。さらにこのヘテロにCyp3a遺伝子群が破壊され、かつCYP3A-MACを保持するマウスとΔcyp系統に戻し交配し、得られたGFP陽性マウス38匹中の尻尾を一部切り取り、その試料よりゲノムDNAを調製し、上記と同様のPCR法を用いて遺伝子型の解析を行った。その結果18匹においてCYP3A-MACを保持し、かつ内因性Cyp3a遺伝子群の両方のアレルが破壊されたホモKOマウス系統であることが確認された。以下、TCCYP3A-MAC/Δcypと記す。[B]TCCYP3A-MAC/Δcypマウス系統における代謝解析TCCYP3A-MAC/Δcypマウス、Δcypマウス個体の肝臓ミクロソームをOmuraらJ.Biol.Chem.,239,2370,1964に従い、CYP3A4で代謝されることがわかっているトリアゾラムTriazolam200μMと混合し、その代謝物であるα-OH-triazolamおよび4-OH-triazolamを測定できる。WO2009/063722PCT/JP2008/068928に記載のように、TCCYP3A-MACΔ/Δcypマウスにおいて、同系統のマウスやヒトHLM:humanlivermicrosomeと活性が同程度であることを確かめられる。以上のことから、TCCYP3A-MAC/Δcypマウス系統においてCYP3A-MAC上のヒトCYP3A遺伝子が機能的でかつヒトと同等であることが確かめられる。[C]従って、TCCYP3A-MAC/Δcypマウス系統由来の肝臓ミクロソームは医薬品開発における第一相反応の薬効毒性を調べるための試料として利用できる。また、TCCYP3A-MAC/Δcypマウス系統はヒトの薬物代謝を再現できるので、医薬品開発における第一相反応の薬効毒性を調べるためのinvivo試験用のモデルマウスとして利用できる。[実施例10]マウス人工染色体ベクターCYP3A-MAC保持ラットの作製[A]A9細胞からのCYP3A-MACのラットES細胞への移入CYP3A-MACを保持するキメララットを作製するために、上記実施例8で得られたCYP3A-MACを保持するA9細胞から、子孫伝達可能なラットES細胞であるrESWIv3i-1Hirabayashietal.,MolReprodDev.2010Feb;772:94.へ微小核細胞融合法により導入した。TomizukaらNatureGenet.16:133,1997の方法に従い、約108個のCYP3A-MACを保持するA9細胞A9CYP3A-MAC8,9などからミクロセルを精製し、DMEM5mlに懸濁した。約107個のラットES細胞rESWIv3i-1をトリプシン処理により剥がし、DMEMで3回洗浄後DMEM5mlに懸濁し、遠心したミクロセルに加え、1250rpmで10分間遠心し、上清を完全に取り除いた。沈殿をタッピングにより十分ほぐし、1:1.4PEG溶液[5gPEG1000和光純薬、1mlDMSOシグマをDMEM6mlに溶解]0.5mlを加え、約1分30秒間、十分攪拌した。その後、DMEM10mlをゆっくり加え、1250rpmで10分間遠心し、30mlのES培地に懸濁し、予めフィーダー細胞をまいた直径100mmシャーレコーニング3枚に分注し、培養した。24時間後、300μg/mlのG418を含む培地に交換し、約1週間選択培養した。その結果、合計10個のコロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った。A9CYP3A-MAC8からは2クローン、A9CYP3A-MAC8からは3クローンがCYP3A-MAC領域のみを検出する前出のプライーマーを用いたPCRで陽性であった。さらに、上記の5クローンについて、CYP3A-BACRP11-757A13CHORIならびにマウスCot-1DNAを用いてFISH解析Tomizukaら,NatureGenet.16:133,1997を行った結果、上記プローブにより特異的に検出され、かつラットの核型が正常なクローンは3クローンであった図49。以上のことから、CYP3A-MAC保持ラットES細胞が3クローン得られたと結論付けた。[B]実施例8記載のように、マウス人工染色体ベクターCYP3A-MACを保持するラットES細胞を用いて、invitroの安定性を検証できる。また、上記ES細胞からキメララットを作製し、ラットが子孫伝達されたラット系統rTCCYP3A-MACを作製できる。また、上記rTCCYP3A-MACラット系統を用いて、体細胞におけるCYP3A-MACの安定性を検証できる。また、rTCCYP3A-MACラット系統由来の肝臓ミクロソームは医薬品開発における第一相反応の薬効毒性を調べるための試料として利用できる。また、rTCCYP3A-MACラット系統はヒトの薬物代謝を再現できるので、医薬品開発における第一相反応の薬効毒性を調べるためのinvivo試験用のモデルラットとして利用できる。[実施例11]マウス人工染色体ベクターhChr21q-MACの構築ダウン症候群モデルマウスを作製するため、マウス人工染色体ベクターMAC1にヒト21番染色体長腕のAP001657よりも遠位の領域33Mbを含むDNA配列をCre/loxPシステムを用いて転座クローニングを行い、実施例3と同様にして、hChr21q-MACを構築する。[A]hChr21-loxP含有DT40からhChr21-loxPのMAC1含有CHO細胞への導入CHO細胞内でマウス人工染色体ベクターMAC1にloxP配列を介してヒト21番染色体長腕のAP001657よりも遠位の領域を転座挿入するために、loxP配列をAP001657に挿入したヒト21番染色体であるhChr21-loxPをマウス人工染色体ベクターMAC1含有CHO細胞に導入する。[A.1]微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離レシピエント細胞であるhChr21-loxP含有DT40細胞、DT40kk139特開2007-295860用いて、上記と同様にMAC1含有CHOhprt欠損細胞ヒューマンサイエンス研究資源バンクより入手、登録番号JCRB0218である、CHOHPRT-;MAC1に微小核細胞融合法を行った。14回の微小核細胞融合で得た合計114個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以降の解析を行ったクローン名:CHOHPRT-;MAC1,hChr21-loxP。[A.2]薬剤耐性クローンの選別[A.2.1]PCR解析ハイグロマイシン耐性株のゲノムDNAを抽出して鋳型として組換え体を選別するため、上記114クローンのうちの60クローンについて、以下のプライマーを用いてPCRを行い、ヒト21番染色体断片がMAC1含有CHO細胞に導入されているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはLATaqTAKARAを用い、バッファーやdNTPsdATP,dCTP,dGTP,dTTPは添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は94°C1分の熱変性後、98°C10秒、68°C7分を30サイクル行った。PCRの結果、60クローンのうち、11クローンが全てのプライマーのセットで陽性であり、この11クローンで以降の解析を行った。[A.2.2]two-colorFISH解析上記で得られたCHOHPRT-;MAC1,hChr21-loxPの11クローンのうち6クローンについてShinoharaらの報告HumanMolecularGenetics,10:1163-1175,2001に記された方法でマウスCot-1DNA及びヒトCot-1DNAをプローブにしたFISH解析を行ったところ6クローン中、1クローンで70の割合でMAC1ならびにhChr21-loxPがCHO細胞に1コピーで導入されていることを確認した図50。以上の結果から、hChr21-loxPがマウス人工染色体ベクターMAC1含有CHO細胞に導入できたと結論付けた。[B]CHOHPRT-;MAC1,hChr21-loxPクローンにおけるヒト21番染色体長腕のAP001657よりも遠位の領域33MbのMAC1ベクターへの部位特異的転座33MbサイズのDNAであるヒト21番染色体長腕のAP001657よりも遠位の領域をマウス個体内で安定に維持させるために、マウス人工染色体ベクターMAC1に転座挿入する図51。[B.1]トランスフェクションおよびHAT耐性クローンの単離上記で得られたCHOHPRT-;MAC1,hChr21-loxP-37にリポフェクション法を用いて遺伝子導入を行い、90コンフルエント状態になった6wellの細胞に対して、Cre3μgを市販インビトロジェンのプロトコールに従い導入した。HAT選択培養下で2週間培養すると、耐性コロニーが出現し、2回の導入で得た合計2個のコロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行ったクローン名:CHOhChr21q-MAC,hChr21-hChr21q。[B.2]薬剤耐性クローンの選別[B.2.1]PCR解析HAT耐性株のゲノムDNAを抽出して鋳型として相互転座クローンを選別するため、以下のプライマーを用いてPCRを行い、ヒト21番染色体断片とMAC1上で染色体相互転座が起こっているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはLATaqTAKARAを用い、バッファーやdNTPsdATP,dCTP,dGTP,dTTPは添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は94°C1分の熱変性後、98°C10秒、68°C7分を30サイクル行った。PCRの結果、2クローンのうち、2クローンが全てのプライマーのセットで陽性であり、この2クローンで以降の解析を行った。[B.2.2]two-colorFISH解析上記で得られたCHOhChr21q-MAC,hChr21-hChr21qの2クローンについてShinoharaらの報告HumanMolecularGenetics,10:1163-1175,2001に記された方法でマウスCot-1DNA及びヒトCot-1DNAをプローブにしたFISH解析を行ったところ2クローン中、2クローンで90以上の割合でMAC1上にヒト21番染色体由来によるシグナルが観察されていることを確認した図52。以上の結果から、ヒト21番染色体長腕のAP001657よりも遠位の領域33Mbがマウス人工染色体ベクターMAC1に相互転座によるクローニングができたと結論付けた。[C]CHO細胞からのhChr21q-MACのマウスES細胞への移入hChr21q-MACを保持するキメラマウスを作製するために、上記[B]で得られたhChr21q-MACを保持するCHO細胞からマウスES細胞野性型TT2Fへ微小核細胞融合法により導入した。TomizukaらNatureGenet.16:133,1997の方法に従い、約108個のhChr21q-MACを保持するCHO細胞CHOhChr21q-MAC,hChr21-hChr21q1,2からミクロセルを精製し、DMEM5mlに懸濁した。約107個のマウスES細胞TT2Fをトリプシン処理により剥がし、DMEMで3回洗浄後DMEM5mlに懸濁し、遠心したミクロセルに加え、1250rpmで10分間遠心し、上清を完全に取り除いた。沈殿をタッピングにより十分ほぐし、1:1.4PEG溶液[5gPEG1000和光純薬、1mlDMSOシグマをDMEM6mlに溶解]0.5mlを加え、約1分30秒間、十分攪拌した。その後、DMEM10mlをゆっくり加え、1250rpmで10分間遠心し、30mlのES培地に懸濁し、予めフィーダー細胞をまいた直径100mmシャーレコーニング3枚に分注し、培養した。24時間後、300μg/mlのG418を含む培地に交換し、約1週間選択培養した。その結果、合計24個のコロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った。CHOhChr21q-MAC,hChr21-hChr21q1からは2クローン、CHOhChr21q-MAC,hChr21-hChr21q2からは6クローンがhChr21q-MAC領域のみを検出する前出のプライーマーを用いたPCRで陽性であった。さらに、上記のうち8クローンについて、ヒトCot-1DNAならびにマウスminorsatelliteDNAを用いてFISH解析Tomizukaら,NatureGenet.16:133,1997を行った結果、上記プローブにより特異的に検出され、かつマウスの核型が正常なクローンは2クローンであった図53。以上のことから、hChr21q-MAC保持TT2F細胞が2クローン得られたと結論付けた。[D]hChr21q-MACのマウスES細胞における安定性上記で得られたマウスESクローン例えばTT2FhChr21q-MAC22、上記[C]で取得について0~50PDLの非選択培養下での長期培養後におけるFISH解析によるhChr21q-MAC保持細胞の割合を計測した結果、50PDLにおいても95以上の保持率であった。図54。[E]hChr21q-MACを保持するキメラマウスの作製上記[C]で得られたhChr21q-MAC保持ES細胞クローンを用いてTomizukaらの方法NatureGenet.16:133,1997でキメラマウスを作製した。宿主としてはMCHICR白色、日本クレア社より購入の雌雄交配により得られる8細胞期胚を用いた。注入胚を仮親に移植した結果生まれる仔マウスは毛色によりキメラであるかどうかを判定できる。MAC1保持ESクローン例えばTT2FhChr21q-MAC20,22など,上記[C]で取得を注入した220個の胚を仮親に移植した結果、18匹のキメラマウス毛色に濃茶色の部分の認められるが誕生した。うち2匹は白色の部分がほとんど観察できないキメラ率約100の個体であった。また、うち1匹はGFPが陽性の個体であった図55。すなわち、マウス人工染色体ベクターhChr21q-MACを保持するES細胞株TT2Fはキメラ形成能を保持している、すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが示された。[F]実施例8記載のように、マウス人工染色体ベクターhChr21q-MACを保持するキメラマウスから、hChr21q-MACが子孫伝達されたマウス系統TChChr21q-MACをを作製できる。また、上記TChChr21q-MACマウス系統を用いて、体細胞におけるhChr21q-MACの安定性を検証できる。また、TChChr21q-MAC系統はダウン症候群のモデルマウスとして利用でき、ダウン症候群の症状発症のメカニズム解明や症状改善のための治療薬開発に利用できる。[実施例12]マウス人工染色体ベクターhChr21q22.12-MACの構築ダウン症候群も出るマウスを作製するため、マウス人工染色体ベクターMAC1にヒト21番染色体長腕のAP00172よりも遠位の領域を含むDNA配列をCre/loxPシステムを用いて転座クローニングを行い、実施例3と同様にして、hChr21q22.12-MACを構築する。[A]ヒト21番染色体のAP001721へのloxP配列の部位特異的挿入マウス人工染色体ベクターMAC1にloxP配列を介して転座挿入するために、DT40細胞内でヒト21番染色体hChr21のDSCRダウン症候群疾患原因領域クラスターの近位のAP001721へloxP配列を挿入する。[A.1]ターゲティングベクターpCKloxPHygの作製ヒト21番染色体上のAP001721のごく近傍かつセントロメア側約50Kbセントロメア側に位置するダウン症候群原因遺伝子領域DSCRにCre組換え酵素の認識配列loxPを挿入するためのターゲティングベクターpCKloxPHygを以下のようにして作製した。まず、AP001721ゲノム領域を以下のプライマーを用いてPCRにより増幅した。loxP配列を挿入するための基本プラスミドにはV901Lexicongeneticsを用いた。PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはLATaq宝酒造を用い、バッファーやdNTPsdATP,dCTP,dGTP,dTTPは添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は94°C1分の熱変性後、98°C20秒、68°C5分を35サイクル行った。PCR産物をプロテネースKギブコ処理した後、CHROMASPIN-TE400クローンテックでPCR断片2.9kbおよび2.0kbをゲル濾過した。その後、制限酵素EcoRIニッポンジーンおよびBglIIニッポンジーンで切断しCHROMASPIN-TE1000クローンテックでゲル濾過した。次にMC1-TK配列を、V830LexicongeneticsからRsrIINEBにより切り出し、V901プラスミドの制限酵素HindIIIの認識部位にクローニングしたV901T-1。上記PCR断片2.9kbおよび2.0kbをV901T-1プラスミドのEcoRIとBglIIサイトにクローニングしたV901T-1HR2。次にKazukiらの報告GeneTherapy:PMID:21085194,2010に記載された5’-HPRT-loxP-Hyg-TKベクターから5’-HPRT-loxP-HygをKpnIとAscIで切り出し、V901T-1HR2のAscIとKpnIサイトにクローニングpCKloxPHyg。最終的なloxP挿入コンストラクトのサイズは11.2kbである。ターゲティングベクター、標的配列および相同組換えにより生じる染色体アレルを図56に示す。[A.2]トランスフェクションおよびハイグロマイシン耐性クローンの単離上述と同様に、上記で作製したターゲティングベクターpCKloxPHygを制限酵素NotITAKARAで線状化後、ヒト21番染色体を保持するDT40雑種細胞Kazukietal.BBRC2004,DT4021-2-3にトランスフェクションし、ハイグロマイシンB1.5mg/mlを含む培地に交換し、96穴培養プレート3枚に分注して約2週間の選択培養を行った。4回のトランスフェクションで得た合計178個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行ったクローン名:DT40hChr21q22.12-loxP。[A.3]相同組換え体の選別[A.3.1]PCR解析ハイグロマイシン耐性クローンからPuregeneDNAIsolationKitGentraSystem社を用いてゲノムDNAを抽出して、以下の2組のプライマーを用いたPCRにより相同組換え体の同定を行った。以下の2組のプライマーを用いたPCRにより相同組換え体の同定を行った。PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはLATaqTAKARAを用い、バッファーやdNTPsdATP,dCTP,dGTP,dTTPは添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は94°C1分の熱変性後、98°C10秒、68°C4分を35サイクル行った。178クローンをスクリーニングした結果、71クローンが相同組換え体として同定された。[A.3.2]サザンブロット解析上記PCR解析にて組換えを確認したうちの10クローンについて以下のようにサザンブロット解析を行った。このゲノムDNAを制限酵素EcoRITAKARAで処理し、0.8アガロースゲル中で電気泳動し、GeneScreenPlusTMハイブリダイゼーショントランスファーメンブレンNENTMLifeScienceProducts,Inc.へアルカリブロッティングした。このフィルターに対してAP001721中の遺伝子配列をPCRにより増幅したSP7プローブを用いてサザンハイブリダイゼーションを行い相同組換え体の同定を行った。SP7プローブの作製は以下のプライマーを用いDT4021-2-3のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行い、そのPCR産物を鋳型としてランダムプライミングによる32P標識DNAプローブを作製したアマシャム、添付のプロトコールに従った。SP7プローブ作製用プライマー:PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはExTaqTAKARAを用い、バッファーやdNTPsdATP,dCTP,dGTP,dTTPは添付のものを推奨条件に従って用いた。温度、サイクル条件は、93°C5分の熱変性後、93°C1分、54°C1分、72°C1分を1サイクルとして35サイクルで行った。サザンハイブリダイゼーションにより、非相同組換え体では約7.5kb、相同組換え体では約9.4kbのバンドが検出されると予測された図56。サザンハイブリダイゼーションの結果、10クローン中すべてのクローンが目的の相同組換え体であった。その代表的な結果を図57に示す。[A.3.3]two-colorFISH解析FISH解析は松原らFISH実験プロトコール、秀潤社、1994に従い行った。上記で組換えを確認したクローンのうち10クローンをヒトcot-1DNAおよびハイグロマイシンをプローブにしてFISH解析を行ったところ、ヒト21番染色体は全てのクローンで宿主染色体に転座することなく、21q22付近にハイグロマイシン由来のシグナルが検出されたことから部位特異的に組換えが起こったことが確かめられた図58。以上の結果から、ヒト21番染色体断片に遺伝子導入部位であるloxP配列が部位特異的に挿入されたと結論づけた。[B]hChr21q22.12-loxP含有DT40からhChr21q22.12-loxPのMAC1含有CHO細胞への導入CHO細胞内でマウス人工染色体ベクターMAC1にloxP配列を介してヒト21番染色体長腕のAP001721よりも遠位の領域を転座挿入するために、loxP配列をAP001721に挿入したヒト21番染色体であるhChr21q22.12-loxPをマウス人工染色体ベクターMAC1含有CHO細胞に導入する。[B.1]微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離レシピエント細胞であるhChr21q22.12-loxP含有DT40細胞、DT40hChr21q22.12-loxP47を用いて、上記と同様にMAC1含有CHOhprt欠損細胞ヒューマンサイエンス研究資源バンクより入手、登録番号JCRB0218である、CHOHPRT-;MAC1に微小核細胞融合法を行った。15回の微小核細胞融合で得た合計140個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以降の解析を行ったクローン名:CHOHPRT-;MAC1,hChr21q22.12-loxP。[B.2]薬剤耐性クローンの選別[B.2.1]PCR解析ハイグロマイシン耐性株のゲノムDNAを抽出して鋳型として組換え体を選別するため、上記140クローンのうちの20クローンについて、以下のプライマーを用いてPCRを行い、ヒト21番染色体断片がMAC1含有CHO細胞に導入されているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはLATaqTAKARAを用い、バッファーやdNTPsdATP,dCTP,dGTP,dTTPは添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は94°C1分の熱変性後、98°C10秒、68°C7分を30サイクル行った。PCRの結果、20クローンのうち、13クローンが全てのプライマーのセットで陽性であり、この13クローンで以降の解析を行った。[B.2.2]two-colorFISH解析上記で得られたCHOHPRT-;MAC1,hChr21q22.12-loxPの13クローンのうち6クローンについてShinoharaらの報告HumanMolecularGenetics,10:1163-1175,2001に記された方法でマウスCot-1DNA及びヒトCot-1DNAをプローブにしたFISH解析を行ったところ6クローン中、2クローンで75の割合でMAC1ならびにhChr21q22.12-loxPがCHO細胞に1コピーで導入されていることを確認した図59。以上の結果から、hChr21q22.12-loxPがマウス人工染色体ベクターMAC1含有CHO細胞に導入できたと結論付けた。[C]CHOHPRT-;MAC1,hChr21q22.12-loxPクローンにおけるヒト21番染色体長腕のAP001721よりも遠位の領域12MbのMAC1ベクターへの部位特異的転座12MbサイズのDNAであるヒト21番染色体長腕のAP001721よりも遠位の領域をマウス個体内で安定に維持させるために、マウス人工染色体ベクターMAC1に転座挿入する図60[C.1]トランスフェクションおよびHAT耐性クローンの単離上記で得られたCHOHPRT-;MAC1,hChr21q22.12-loxP-12,13にリポフェクション法を用いて遺伝子導入を行い、90コンフルエント状態になった6wellの細胞に対して、Cre3μgを市販インビトロジェンのプロトコールに従い導入した。HAT選択培養下で2週間培養すると、耐性コロニーが出現し、2回の導入で得た合計19個のコロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行ったクローン名:CHOhChr21q22.12-MAC,hChr21-hChr21q22.12。[C.2]薬剤耐性クローンの選別[C.2.1]PCR解析HAT耐性株のゲノムDNAを抽出して鋳型として相互転座クローンを選別するため、以下のプライマーを用いてPCRを行い、ヒト21番染色体断片とMAC1上で染色体相互転座が起こっているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはLATaqTAKARAを用い、バッファーやdNTPsdATP,dCTP,dGTP,dTTPは添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は94°C1分の熱変性後、98°C10秒、68°C7分を30サイクル行った。PCRの結果、19クローンのうち、8クローンが全てのプライマーのセットで陽性であり、この8クローンで以降の解析を行った。[C.2.2]two-colorFISH解析上記で得られたCHOhChr21q22.12-MAC,hChr21-hChr21q22.12の8クローンについてShinoharaらの報告HumanMolecularGenetics,10:1163-1175,2001に記された方法でマウスCot-1DNA及びヒトCot-1DNAをプローブにしたFISH解析を行ったところ8クローン中、8クローンで85以上割合でMAC1上にヒト21番染色体由来によるシグナルが観察されていることを確認した図61。以上の結果から、ヒト21番染色体長腕のAP001721よりも遠位の領域12Mbがマウス人工染色体ベクターMAC1に相互転座によるクローニングができたと結論付けた。[D]CHO細胞からのhChr21q22.12-MACのマウスES細胞への移入hChr21q22.12-MACを保持するキメラマウスを作製するために、上記[C]で得られたhChr21q22.12-MACを保持するCHO細胞からマウスES細胞野性型TT2Fへ微小核細胞融合法により導入した。TomizukaらNatureGenet.16:133,1997の方法に従い、約108個のhChr21q-MACを保持するCHO細胞CHOhChr21q22.12-MAC,hChr21-hChr21q22.121,12などからミクロセルを精製し、DMEM5mlに懸濁した。約107個のマウスES細胞TT2Fをトリプシン処理により剥がし、DMEMで3回洗浄後DMEM5mlに懸濁し、遠心したミクロセルに加え、1250rpmで10分間遠心し、上清を完全に取り除いた。沈殿をタッピングにより十分ほぐし、1:1.4PEG溶液[5gPEG1000和光純薬、1mlDMSOシグマをDMEM6mlに溶解]0.5mlを加え、約1分30秒間、十分攪拌した。その後、DMEM10mlをゆっくり加え、1250rpmで10分間遠心し、30mlのES培地に懸濁し、予めフィーダー細胞をまいた直径100mmシャーレコーニング3枚に分注し、培養した。24時間後、300μg/mlのG418を含む培地に交換し、約1週間選択培養した。その結果、合計13個のコロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った。CHOhChr21q22.12-MAC,hChr21-hChr21q22.121からは1クローン、CHOhChr21q22.12-MAC,hChr21-hChr21q22.1212からは1クローンがhChr21q22.12-MAC領域のみを検出する前出のプライマーを用いたPCRで陽性であった。さらに、上記のうち2クローンについて、ヒトCot-1DNAならびにマウスminorsatelliteDNAを用いてFISH解析Tomizukaら,NatureGenet.16:133,1997を行った結果、上記プローブにより特異的に検出され、かつマウスの核型が正常なクローンは1クローンであった図62。以上のことから、hChr21q22.12-MAC保持TT2F細胞が1クローン得られたと結論付けた。[E]hChr21q22.12-MACのマウスES細胞における安定性上記で得られたマウスESクローン例えばTT2FhChr21q22.12-MAC8、上記[D]で取得について0~50PDLの非選択培養下での長期培養後におけるFISH解析によるhChr21q22.12-MAC保持細胞の割合を計測した結果、50PDLにおいても95以上の保持率であった。図63。[F]hChr21q22.12-MACを保持するキメラマウスの作製上記[D]で得られたhChr21q22.12-MAC保持ES細胞クローンを用いてTomizukaらの方法NatureGenet.16:133,1997でキメラマウスを作製した。宿主としてはMCHICR白色、日本クレア社より購入の雌雄交配により得られる8細胞期胚を用いた。注入胚を仮親に移植した結果生まれる仔マウスは毛色によりキメラであるかどうかを判定できる。hChr21q22.12-MAC保持ESクローン例えばTT2FhChr21q22.12-MAC8,上記[D]で取得を注入した80個の胚を仮親に移植した結果、43匹のキメラマウス毛色に濃茶色の部分の認められるが誕生した。うち3匹は白色の部分がほとんど観察できないキメラ率約100の個体であった。すなわち、マウス人工染色体ベクターhChr21q22.12-MACを保持するES細胞株TT2Fはキメラ形成能を保持している、すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが示された。[G]実施例8記載のように、マウス人工染色体ベクターhChr21q22.12-MACを保持するキメラマウスから、hChr21q22.12-MACが子孫伝達されたマウス系統TChChr21q22.12-MACを作製できる。また、上記TChChr21q22.12-MACマウス系統を用いて、体細胞におけるhChr21q22.12-MACの安定性を検証できる。また、hChr21q22.12-MAC系統はダウン症候群のモデルマウスとして利用でき、ダウン症候群の症状発症のメカニズム解明や症状改善のための治療薬開発に利用できる。また、TChChr21q-MACマウス系統とTChChr21q22.12-MACマウス系統の表現型を比較することで、ダウン症候群の原因遺伝子領域を同定できる。[実施例13]マウス人工染色体ベクターMAC2の安定性[A]マウス人工染色体ベクターMAC2のCHO細胞における安定性上記で得られたCHOクローン例えばCHOHPRT-;MAC2-13,18、上記実施例4で取得について0~25PDLの非選択培養下での長期培養後におけるFISH解析によるMAC2保持細胞の割合を計測した結果、25PDLにおいても90以上の保持率であった。一方、Kazukiら報告GeneTherapy:PMID:21085194,2010に記載された21番染色体由来のGFP搭載HACベクター21HAC2を保持するCHO細胞では、25PDLにおいては70以下の保持率であった。その代表的な結果を図64に示す。[実施例14]マウス人工染色体ベクターFVIII-MACの構築マウス人工染色体ベクターMAC2に有用タンパク質をコードする遺伝子の例として、血友病Aの原因遺伝子である第八因子FVIIIをCre/loxPシステムを用いて挿入し、機能タンパク質の発現と長期安定性を検証する。[A]マウス人工染色体ベクターMAC2ベクター含有CHO細胞における特定の有用タンパク質をコードする遺伝子例えばFVIIIのCre/loxPシステムによるマウス人工染色体ベクターMAC2への挿入マウス人工染色体MACにDNA挿入配列として5’HPRT-loxP-PGKhygタイプのloxP配列を挿入したマウス人工染色体ベクターMAC2においてloxPが稼働し環状DNAが部位特異的に挿入できるかどうか検証する。[A.1]FVIII挿入ベクターの作製pCAGGS大阪大学、岡部博士より分与のプロモーターとpolyAの領域をSalIとPstIサイトにて切断し、pBluescriptKS-Stratageneマルチクローニングサイトを改変したpB3のSalIとPstIサイトにクローニングしたpB-CAG。pKF17Kプラスミド中のBドメイン欠損FVIIIcDNA自治医科大学、坂田教授より分与をXhoIとSalIサイトにて切断し、pB-CAGにおけるプロモーターとpolyAの間にあるEcoRIサイトへクローニングしたpB-CAGF8。pB-CAGF8のCAG-F8-pA領域をSalIとAvrIIサイトにより単離し、pB3ins2上の2つのHS4インスレーター配列にはさまれるようにSalIとAvrIIサイトへクローニングしたpB3-F8ins2。次にpPAC4Children’sHospitalOaklandResearchInstituteCHORI,BAC/PACResourcesを3’HPRT-loxP配列を組み込んだベクターへ導入した。pB3-F8ins2上のAscIとFseI領域であるFVIII発現カセットHS4-CAG-F8-pA-HS4をpPAC4のAscIとFseIサイトへクローニングし、HPRT再構築系の1コピーFVIII挿入コンストラクトとしたベクター名:pPAC4F8ins2H3-91コピーFVIII-PAC図65。AvrIIサイトとNheIサイトのcompatiblecohesiveendの特徴を利用し、1コピーFVIII-PACにおけるAscIからAvrII1の1発現カセット領域を同ベクターにおけるAscIからNheIサイトへの再クローニングにより2発現カセットをもつ2コピーFVIII-PACを得た。また同様に挿入カセットをAscIとAvrII、ベクター側をAscIとNheIサイトにて再クローニングすることにより2、4、8、16コピーまでのFVIII発現カセットをもつPACベクターを作製した図66。[A.2]トランスフェクションおよびHAT耐性クローンの単離遺伝子導入はリポフェクション法を用いて行い、90コンフルエント状態になった6wellの細胞に対して、Cre1μgと1コピーFVIII-PACベクター10μgを市販インビトロジェンのプロトコールに従い、上記CHOHPRT-;MAC2-13およびKazukiらの報告GeneTherapy:PMID:21085194,2010に記載されたCHOHPRT-;21HAC2へ導入したクローン名:CHOFVIIIx1-MACおよびCHOFVIIIx1-HAC。また、Cre1μgと16コピーFVIII-PACベクター10μgを市販インビトロジェンのプロトコールに従い、上記CHOHPRT-;MAC2-13へ導入したクローン名:CHOFVIIIx16-MAC。HAT選択培養下で2週間培養すると、耐性コロニーが出現し、4回の導入で得たそれぞれCHOFVIIIx1-MACについては46クローン、CHOFVIIIx16-MACについては18クローン、CHOFVIIIx1-HACについては19クローン、合計83個のコロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った。[A.3]薬剤耐性クローンの選別[A.3.1]PCR解析HAT耐性株のゲノムDNAを鋳型として組換え体を選別するため以下のプライマーを用いてPCRを行い、部位特異的にFVIII遺伝子の挿入が起こっているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはExTaqAppliedBiosystemsを用い、バッファーやdNTPsdATP,dCTP,dGTP,dTTPは添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は94°C10分の熱変性後、94°C30秒、60°C30秒、72°C1分を35サイクル行った。PCRの結果、CHOFVIIIx1-MAC由来については4クローン、CHOFVIIIx1-HAC由来については17クローン、CHOFVIIIx16-MAC由来については3クローン、において陽性であり、この24クローンで以降の解析を行った。[A.3.2]mono-colorFISH解析上記の結果から7クローンにおいて、mono-colorFISH解析を松原らFISH実験プロトコール、秀潤社、1994に従い行った。マウスcot-1DNAまたはヒトcot-1DNAをプローブにしてFISH解析を行ったところ、CHOFVIIIx1-MAC由来については1クローンが90以上の割合でFVIII-MACが保持され、CHOFVIIIx1-HAC由来については2クローンが90以上の割合でFVIII-HACが保持され、CHOFVIIIx16-MAC由来については1クローンが90以上の割合でFVIII-HACが保持されていた。[B]CHO細胞におけるFVIII遺伝子の遺伝子発現解析上記のFVIIIx1-MACが保持されているCHOFVIIIx1-MAC1-3およびFVIIIx1-HACが保持されているCHOFVIIIx1-HAC1-2およびFVIIIx16-MACが保持されているCHOFVIIIx16-MAC16-1,16-2,16-3を用いて、FVIIImRNAが発現しているかどうかを検討するため、上記記載に従い、RNAを抽出し、そのRNAを鋳型としてcDNA合成し、さらに以下のプライマー前出を用いてPCRを行った。温度、サイクル条件は94°C10分の熱変性後、94°C30秒、60°C30秒、72°C1分を25サイクル行った。その結果、CHOFVIIIx1-MACおよびCHOFVIIIx1-HACでは同等に発現しており、CHOFVIIIx16-MACでは、前記CHOFVIIIx1-MACおよびCHOFVIIIx1-HACよりも高く発現していた。[C]CHO細胞におけるFVIII遺伝子の遺伝子機能解析上記、FVIIImRNAの発現が確認されたCHOFVIIIx1-MAC1-3およびCHOFVIIIx1-HAC1-2におけるFVIIIタンパク発現が機能的か否かを検証するためClottingassayコスモバイオを添付のプロトコールに従い、行った。0PDLおよび非選択培養で25PDLまで培養した上記細胞を6ウェルディッシュに培養し100コンフルエント状態から新しいメディウムに交換した。24時間後培養上清を回収しFVIII活性によるFVIIIの活性化度合いを測定した。その結果、0PDLではCHOFVIIIx1-MAC1-3およびCHOFVIIIx1-HAC1-2に活性の差はほとんど見られなかった。一方、CHOFVIIIx1-MAC1-3では25PDLにおいても活性が1.8倍に上昇していたのに対し、CHOFVIIIx1-HAC1-2では25PDLにおいては活性が1/6倍に低下していた図67。また、CHOFVIIIx1-MAC1-3に比べ、CHOFVIIIx16-MAC16-1,16-2,16-3の活性は約10倍に上昇しており、コピー数依存的に活性が上昇することが確かめられた図68。以上の実験によりマウス人工染色体MAC2ベクター上にFVIII遺伝子を搭載することにより、FVIII遺伝子の機能的な発現が観察され、さらにFVIII-MACを保持するCHOではFVIII-HAC保持するCHOよりも長期間安定に機能的発現を呈することが確かめられた。また、PACベクターによって、200kb以内の有用タンパク質をコードするDNAが挿入可能である。[実施例15]複数遺伝子の導入が可能なマウス人工染色体ベクターMI-MACの構築マウス人工染色体ベクターMAC2に複数の遺伝子を搭載できる例として、5つの部位特異的組換え酵素認識部位ΦC31attP、R4attP、TP901-1attP、Bxb1attP、FRTを持つmulti-integraseplatformをCre/loxPシステムを用いて挿入し、複数遺伝子の導入発現を検証する。[A.1]複数遺伝子搭載部位multi-integraseplatformカセットの作製マウス人工染色体ベクターに複数の遺伝子を導入するための複数遺伝子搭載部位を持つカセットをMultisite-GatewaykitInvitrogenを用いて、以下のようにして作製した。まず、PGK-hygClontechをテンプレートとして、遺伝子導入部位であるΦC31attPsite、R4attPsite、TP901-1attPsite、Bxb1attPsite、FRTsiteをfirstPCR以下の各primerpairF1-R1によりPGKpromoter配列に付加した。PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはkodplusToyoboを用い、バッファーやdNTPsdATP,dCTP,dGTP,dTTPは添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は94°C2分の熱変性後、94°C15秒、68°C30秒、72°C90秒を20サイクル行った。PCR産物をプロテネースKギブコ処理した後、CHROMASPIN-TE400クローンテックで精製した。こうして得られたfirstPCR断片をテンプレートに、Multisite-GatewayBPreactionに必要なgatewayattB配列を付加するsecondPCR以下の各primerpairF1-R2、ΦC31のみF2-R2を行った。PCR条件等は、サイクル数を25サイクルとした以外は上記と同様である。また、primerF1の配列についても上記のとおりである。これらのPCR断片と対応するgatewayattP配列を持つdonorvectorInvitrogen:pDONR221P1-P5r、pDONR221P5-P4、pDONR221P4r-P3r、pDONR221P3-P2を混合し、BPclonaseを用いた試験管内組換え反応BPreactionにより、entryvectorpENTRL1-FRT-PGK-ΦC31-R5、pENTRL5-PGK-R4-L4、pENTRR4-PGK-TP901-1-R3、pENTRL3-PGK-Bxb1-L2を作製した図69。BPreactionは、推奨される条件に従って行った。次に、これらの遺伝子導入部位をマウス人工染色体ベクターに導入するために必要な、3’HPRT-loxP配列を組み込んだplasmidを以下の手順で作製した。上記X3.1をテンプレートとして、以下のプライマーを用いて増幅した。PCR条件は、上記の条件サイクル数25と同様である。このPCR断片とDESTcassetteInvitrogen:R1-ccdB-Cm-R2をブラントライゲーションし、pDESTとした。次に、このpDESTと上記で作製したentryvectorpENTRL1-FRT-PGK-ΦC31-R5、pENTRL5-PGK-R4-L4、pENTRR4-PGK-TP901-1-R3、pENTRL3-PGK-Bxb1-L2を混合し、LRclonaseを用いた試験管内組換え反応LRreactionにより、複数遺伝子搭載部位multi-integraseplatformカセットを作製した図70。LRreactionは、推奨される条件に従って行った。[A.2]複数遺伝子搭載部位multi-integraseplatformカセットのマウス人工染色体ベクターへの搭載複数遺伝子搭載部位multi-integraseplatformカセットは上述のCHOHPRT-;MAC2や下記記載のCHOHPRT-;MAC4に上述のようにCre-loxP組み換え後、HAT耐性クローンを取得することでマウス人工染色体ベクターMAC2やMAC4に挿入できるMI-MACとよぶ図71。[A.3]遺伝子導入カセットの作製multi-integraseplatformに外来遺伝子を導入するためのカセットベクターを以下のように作製した。まず、薬剤選択のために必要なPromoterlessのNeomycin-resistantgeneをpIRESNeo2Clontechをテンプレートに、以下のプライマーを用いて増幅した。PCR条件は、上記の条件サイクル数25と同様である。その後、制限酵素EcoRVとSmaIサイトで切断したSLRtestToyoboに、このPCR断片をブラントクローニングし、pNeoを作製した。次に、各attPsiteまたはFRTsiteに対応する組換え配列ΦC31attB、R4attB、TP901-1attB、Bxb1attB、FRTをdenovo合成したΦC31、Bxb1、FRT:IntegratedDNAtechnologiesInc.、R4、TP901-1:Invitrogen。pNeoを制限酵素SalIで切断し、上記の合成したベクターから制限酵素SalIでΦC31attBまたはR4attBを含むDNA断片を切り出し、ライゲーションしたpNeo-ΦC31attB、pNeo-R4attB。同様に、pNeoを制限酵素ClaIで切断し、上記の合成したベクターから制限酵素ClaIでTP901-1attBまたはFRTを含むDNA断片を切り出し、ライゲーションしたpNeo-TP901-1attB、pNeo-FRTや、pNeoを制限酵素NheIで切断し、上記の合成したベクターから制限酵素NheIでBxb1attBを含むDNA断片を切り出し、ライゲーションしたpNeo-Bxb1attBを作製した。これらのベクターはBamHIサイトに任意の外来遺伝子を挿入でき、それを、複数遺伝子搭載部位を持ったマウス人工染色体に搭載できるカセットベクターとなっている図72。[A.4]部位特異的組換え酵素発現ベクターの作製各々対応したattB-attP間の組換えを起こす部位特異的組み換え酵素ΦC31integrase、R4integrase、TP901-1integrase、Bxb1integraseGenBankaccessionnumbers:ΦC31,CAA07153;R4,BAA07372;TP901-1,CAA59475;Bxb1,AAG59740をdenovo合成したΦC31:Codondevice、他:Invitrogen。これらのintegraseは哺乳類細胞での高発現を行うよう、codonusageを哺乳類に最適化して合成したものである。この合成したベクターから制限酵素KpnI-XbaIでΦC31integraseを含むDNA断片を切り出し、制限酵素KpnI-XbaIで切断したpVAX1InvitrogenにライゲーションしたpCMV-ΦC31や、制限酵素NheI-XhoIでR4integrase、あるいはTP901-1integrase、Bxb1integraseを含むDNA断片を切り出し、制限酵素NheI-XhoIで切断したpVAX1InvitrogenにライゲーションしたpCMV-R4、pCMV-TP901-1、pCMV-Bxb1を作製した図72。[A.5]MI-MACベクターへの遺伝子導入Cre発現ベクターの代わりに上述の各種部位特異的組換え酵素発現ベクターと、FVIII挿入ベクターの代わりに遺伝子導入カセットを導入することで、複数1~5個の遺伝子をマウス人工染色体ベクターMI-MACベクター上へ挿入することができる。また、複数遺伝子搭載部位multi-integraseplatformカセットをマウス人工染色体MACベクター上に複数搭載することも可能であるので、無制限に遺伝子を挿入することもできる図72。[実施例16]マウス人工染色体ベクターPXR-MACの構築マウス人工染色体ベクターMAC3に核内受容体であるヒトPXRをCre/loxPシステムを用いて挿入し、PXR-MACを構築する。[A.1]ヒトPXR挿入ベクターの作製ヒトPXR遺伝子およびloxP配列を挿入するための基本BACベクターにはヒトPXR遺伝子全長を含むRP11-169N13CHORIを用いた。YamadaらJHumGenet.2008;535:447-53の方法に従い、上記BACベクター上のカナマイシン耐性遺伝子領域にマウス人工染色体ベクターMAC3に挿入するためのAmp-5’HPRT-loxP配列を相同組み換えにより挿入したベクター名:PXR-loxP。Cre/loxPシステムによるHPRT再構築系によるヒトPXR挿入により生じる部位特異的DNA挿入を図73に示す。[A.2]トランスフェクションおよびHAT耐性クローンの単離遺伝子導入はリポフェクション法を用いて行い、90コンフルエント状態になった6wellの細胞に対して、Cre1μgとPXR-loxPベクター2μgを市販インビトロジェンのプロトコールに従い導入した。HAT選択培養下で2週間培養すると、耐性コロニーが出現し、2回の導入で得た合計11個のコロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行ったクローン名:CHOPXR-MAC。[A.3]薬剤耐性クローンの選別[A.3.1]PCR解析HAT耐性株のゲノムDNAを鋳型として組換え体を選別するため以下のプライマーを用いてPCRを行い、部位特異的にPXR遺伝子の挿入が起こっているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはAmpliTaqGoldAppliedBiosystemsを用い、バッファーやdNTPsdATP,dCTP,dGTP,dTTPは添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は94°C10分の熱変性後、94°C30秒、60°C30秒、72°C30秒を35サイクル行った。PCRの結果、11クローンのうち、6クローンが全てのプライマーで陽性であり、この6クローンで以降の解析を行った。[A.3.3]two-colorFISH解析上記から結果から選んだ6クローンにおいて、two-colorFISH解析を松原らFISH実験プロトコール、秀潤社、1994に従い行った。マウスcot-1DNAおよびヒトPXR-BAC由来のDNARP11-169N13CHORIをプローブにしてFISH解析を行ったところ、6クローンのうち、5クローンにおいて60以上の割合でPXR-MACが保持され、さらにPXR-BAC由来のシグナルが現れ、ネガティブコントロールであるPXR-BACを部位特異的挿入する前のMAC3上にはシグナルが検出されなかったことから、部位特異的にヒトPXR遺伝子が挿入されたことが確かめられた図74。以上の実験によりマウス人工染色体MAC3上にヒトPXR遺伝子を搭載することにより、マウス人工染色体ベクターPXR-MACを保持するCHO細胞を得られたことが確認できた。[B]マウス人工染色体ベクターPXR-MAC含有CHO細胞からマウスES細胞へマウス人工染色体ベクターPXR-MACの導入PXR-MACを保持するキメラマウスを作製するために、上記[A]で得られたPXR-MACを保持するCHO細胞からマウスES細胞野性型TT2Fへ微小核細胞融合法により導入した。TomizukaらNatureGenet.16:133,1997の方法に従い、約108個のPXR-MACを保持するCHO細胞CHOPXR-MAC7,9,10などからミクロセルを精製し、DMEM5mlに懸濁した。約107個のマウスES細胞TT2Fをトリプシン処理により剥がし、DMEMで3回洗浄後DMEM5mlに懸濁し、遠心したミクロセルに加え、1250rpmで10分間遠心し、上清を完全に取り除いた。沈殿をタッピングにより十分ほぐし、1:1.4PEG溶液[5gPEG1000和光純薬、1mlDMSOシグマをDMEM6mlに溶解]0.5mlを加え、約1分30秒間、十分攪拌した。その後、DMEM10mlをゆっくり加え、1250rpmで10分間遠心し、30mlのES培地に懸濁し、予めフィーダー細胞をまいた直径100mmシャーレコーニング3枚に分注し、培養した。24時間後、300μg/mlのG418を含む培地に交換し、約1週間選択培養した。その結果、合計34個のコロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った。CHOPXR-MAC7からは2クローン、CHOPXR-MAC9からは2クローン、CHOPXR-MAC10からは12クローンがPXR-MAC領域のみを検出する前出のプライマーを用いたPCRで陽性であった。さらに、上記の16クローンについて、ヒトPXR-BAC由来のDNARP11-169N13CHORIを用いてFISH解析Tomizukaら,NatureGenet.16:133,1997を行った結果、上記プローブにより特異的に検出されたクローンは16クローンのうち、4クローンであった。以上のことから、PXR-MAC保持TT2F細胞が4クローン得られたと結論付けた図75。[C]実施例8記載のように、マウス人工染色体ベクターPXR-MACを保持するマウスES細胞からキメラマウスを作製し、PXR-MACが子孫伝達されたマウス系統TCPXR-MACを作製できる。また、上記TCPXR-MACマウス系統を用いて、体細胞におけるPXR-MACの安定性を検証できる。また、TCPXR-MACマウス系統はヒトにおける薬物によるCYP遺伝子発現誘導を再現できる。また、上記TCCYP3A-MACマウス系統との交配により、TCCYP3A-MAC/PXR-MAC系統を作製でき、医薬品開発における薬効毒性を調べるためのinvivo試験用のモデルマウスとして利用できる。[実施例17]マウス人工染色体ベクターMAC4の構築マウス人工染色体MACにDNA挿入配列としてGFP-5’HPRT-loxP-PGKhygタイプのloxP配列を挿入したマウス人工染色体ベクターMAC4を構築する。5’HPRT-loxP-PGKhygタイプのloxP配列は、Kazukiらの報告GeneTherapy:PMID:21085194,2010に記載された21番染色体由来のGFP搭載HACベクター21HAC2に挿入されており、HACとMACの遺伝子発現を同じベクターで比較することができる。また、21HAC2への挿入のための遺伝子導入ベクターがベクター作製のステップを経ることなく、そのまま利用可能である。[A]マウス人工染色体MACへのGFP-5’HPRT-loxP-hygタイプのloxP配列の挿入[A.1]GFP-5’HPRT-loxP-hygタイプのloxPターゲティングベクターの作成loxP配列を挿入するための基本プラスミドには上記で作成したpMAC2を用いた。NotIとSalIにより切り出したHS4-CAG-EGFP-HS4大阪大学、岡部博士及びNIH、Felsenfeld博士より分与を平滑化し、上記pMAC2をXhoI切断ならびに平滑化後にクローニングしたベクター名:pMAC4。ターゲティングベクター、標的配列および相同組換えにより生じる染色体アレルを図76に示す。[A.2]トランスフェクションおよび薬剤耐性クローンの単離上述と同様に、上記で作製したターゲティングベクターpMAC4を制限酵素NotITAKARAで線状化後、上記で作製したクローンDT40MACにトランスフェクションし、ハイグロマイシン1.5mg/mlを含む培地に交換し、96穴培養プレート2枚に分注して約2週間の選択培養を行った。1回のトランスフェクションで得た合計36個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行ったクローン名:DT40MAC4[A.3]相同組換体の選別[A.3.1]PCR解析ハイグロマイシン耐性株のゲノムDNAを抽出して鋳型として組換え体を選別するため、以下のプライマーを用いてPCRを行い、マウス染色体ベクターMAC上で部位特異的に組換えが起こっているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはLATaqTAKARAを用い、バッファーやdNTPsdATP,dCTP,dGTP,dTTPは添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は94°C1分の熱変性後、98°C10秒、68°C7分を35サイクル行った。PCRの結果、36クローンのうち、5クローンが全てのプライマーのセットで陽性であったため、この5クローンで以降の解析を行った。[A.3.2]two-colorFISH解析上記から得られたDT40MAC4の5クローンにおいて、two-colorFISH解析を松原らFISH実験プロトコール、秀潤社、1994に従い行った。マウスcot-1DNAおよびGFP-5’HPRT-loxP-hygカセットをプローブにしてFISH解析を行ったところ、ネガティブコントロールのターゲティングする前のマウス人工染色体ベクターMACにおいては、プローブ由来のシグナルが検出されなかったのに対し、DT40MAC4の5クローンでは、65以上の割合でプローブ由来のシグナルが検出されたことから、上記5クローンにおいて、部位特異的に組換えが起こったことが視覚的に確かめられた図77。これらの結果から、マウス人工染色体ベクターMAC4を保持するDT40細胞クローンが得られたと結論できた。[B]マウス人工染色体ベクターMAC4含有ニワトリDT40細胞からMAC4のCHO細胞への導入[B.1]微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離レシピエント細胞であるDT40MAC4-B1-5及びB1-74及びB2-3及びB2-4を用いて、上記と同様にCHOhprt欠損細胞ヒューマンサイエンス研究資源バンクより入手、登録番号JCRB0218であるCHOHPRT-に微小核細胞融合法を行った。4回の微小核細胞融合で得た合計23個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以降の解析を行ったクローン名:CHOHPRT-;MAC4[B.2]薬剤耐性クローンの選別[B.2.1]PCR解析ハイグロマイシン耐性株のゲノムDNAを抽出して鋳型として組換え体を選別するため、以下のプライマーを用いてPCRを行い、マウス人工染色体ベクターMAC4がCHO細胞に導入できているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはLATaqTAKARAを用い、バッファーやdNTPsdATP,dCTP,dGTP,dTTPは添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は94°C1分の熱変性後、98°C10秒、68°C7分を30サイクル行った。PCRの結果、23クローンのうち、7クローンが全てのプライマーのセットで陽性であり、この7クローンを用いて以降の解析を行った。[B.2.2]mono-colorFISH解析上記で得られたCHOHPRT-;MAC4の7クローンについてShinoharaらの報告HumanMolecularGenetics,10:1163-1175,2001に記された方法でマウスCot-1DNAをプローブにしたFISH解析を行ったところ7クローン中、4クローンで95以上の割合でCHO細胞にMAC4が導入されていることを確認した図78。以上の結果から、マウス人工染色体ベクターMAC4がCHO細胞に導入できたと結論付けた。[C]実施例8記載のように、マウス人工染色体ベクターMAC4を保持するマウスES細胞を作製し、そのES細胞を用いてinvitroの安定性を検証できる。また、上記ES細胞からキメラマウスを作製し、MAC4が子孫伝達されたマウス系統TCMAC4を作製できる。また、上記TCMAC4マウス系統を用いて、体細胞におけるMAC4の安定性を検証できる。[実施例18]マウス人工染色体ベクターUGT2-MACの構築マウス人工染色体ベクターMAC4にヒト薬物代謝酵素遺伝子群であるUGT2クラスターをCre/loxPシステムを用いて転座クローニングを行い、実施例3と同様にして、UGT2-MACを構築する。また、UGT2-MACのマウスES細胞での安定性を検証する。[A]ヒト4番染色体上のAC125239における部位特異的切断ヒト4番染色体のUGT2遺伝子クラスターから遠位側の遺伝子を削除するために、部位特異的染色体削除であるテロメアトランケーションを行う。[A.1]ターゲティングベクターpTELpuro-UGT2の作製ヒト4染色体上のUGT2遺伝子座のごく近傍かつテロメア側約150Kbテロメア側に位置するAC125239領域にヒトテロメア配列を挿入するためのターゲティングベクターpTELpuro-UGT2を以下のようにして作製した。まず、AC125239ゲノム領域を以下のプライマーを用いてPCRにより増幅した。PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはLATaqTAKARAを用い、バッファーやdNTPdATP,dCTP,dGTP,dTTPは添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は94°C1分の熱変性後、98°C20秒、68°C8分を35サイクル行った。PCR産物をプロテネースKギブコ処理した後、CHROMASPIN-TE400クローンテックでゲル濾過した。その後、制限酵素PstIニッポンジーンおよびBglIIニッポンジーンで切断し、CHROMASPIN-TE1000クローンテックでゲル濾過した。このPCR断片をプラスミドpTELpuroKuroiwaら,NatureBiotech.,20:88,2002のPstIおよびBamHI部位にクローニングした。AC125239ゲノムシークエンスの方向はセントロメア→テロメアなので、クローニングされたAC125239ゲノム断片がヒトテロメア配列と同方向のものを目的のターゲティングベクターpTELpuro-UGT2とした。最終的な長腕近位部位特異的切断用コンストラクトのサイズは11.9kbである。ターゲティングベクター、標的配列、および相同組換えにより生じる染色体アレルを図79に示した。[A.2]トランスフェクションおよび薬剤耐性クローンの単離Kazukietal.BBRC2004に記載された方法で、ヒト4番染色体を保持するA9KM64-4Kugohetal.DNAresearch1999からヒト4番染色体を保持するニワトリDT40細胞を作製したクローン名:DT40hChr4。次に上述と同様に、上記で作製したターゲティングベクターpTELpuro-UGT2を制限酵素PstIニッポンジーンで線状化後、上記で作製したクローンDT40hChr41にトランスフェクションし、ピューロマイシン0.3ug/mlを含む培地に交換し、96穴培養プレート10枚に分注して約2週間の選択培養を行った。4回のトランスフェクションで得た合計96個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行ったクローン名:DT40hChr4-tel。[A.3]相同組換え体の選別[A.3.1]PCR解析ピューロマイシン耐性株のゲノムDNAを鋳型として組換え体を選別するため一次スクリーニングとして切断部位よりテロメア側に位置する以下のプライマーを用いてPCRを行い、部位特異的切断が起こっているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはAmpliTaqGoldAppliedBiosystemsを用い、バッファーやdNTPsdATP,dCTP,dGTP,dTTPは添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は95°C10分の熱変性後、95°C20秒、55°C30秒、72°C30秒を30サイクル行った。次に上記プライマーで検出されなかった2クローンについて以下のプライマーを用いて部位特異的相同組換えが起こっているかをPCRにて確認した。配列は以下のとおりである。上記プライマーによりPCRはLATaq宝酒造を用い、バッファーやdNTPsdATP,dCTP,dGTP,dTTPは添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は94°C1分の熱変性後、98°C20秒、68°C8分を35サイクル行った。部位特異的に組換えが起こった2クローンでのみ約8kbのバンドが検出された。ネガティブコントロールのDT40、DT40hChr41ではバンドは検出されなかった。[A.3.2]two-colorFISH解析FISH解析は松原らFISH実験プロトコール、秀潤社、1994に従い行った。上記で組換えを確認したクローンのうち2クローンをヒトcot-1DNAおよびピューロマイシンDNAをプローブにしてFISH解析を行ったところ、ヒト4番染色体は全てのクローンで宿主染色体に転座することなく、ヒト4番染色体断片末端にピューロマイシン由来のシグナルが検出され、目的部位で切断されていたことから部位特異的に組換えが起こったことが確かめられた図80。以上の結果から、クローンDT40hChr4-tel35及び73において、UGT2遺伝子クラスター領域よりテロメア側のAC125239から遠位において切断できたと結論付けた。[B]ヒト4番染色体のAC074378へのloxP配列の部位特異的挿入マウス人工染色体ベクターMAC4にloxP配列を介して転座挿入するために、DT40細胞内でhChr4-telのUGT2遺伝子クラスターの近位のAC074378へloxP配列を挿入する。[B.1]ターゲティングベクターpUGT2loxPneoの作製ヒト4番染色体上のUGT2遺伝子座のごく近傍かつセントロメア側約300Kbセントロメア側に位置するAC074378領域にCre組換え酵素の認識配列loxPを挿入するためのターゲティングベクターpUGT2loxPneoを以下のようにして作製した。まず、AC074378ゲノム領域を以下のプライマーを用いてPCRにより増幅した。loxP配列を挿入するための基本プラスミドにはV907Lexicongeneticsを用いた。PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはLATaq宝酒造を用い、バッファーやdNTPsdATP,dCTP,dGTP,dTTPは添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は94°C1分の熱変性後、98°C20秒、68°C7分を35サイクル行った。PCR産物をプロテネースKギブコ処理した後、CHROMASPIN-TE400クローンテックでゲル濾過した。その後、制限酵素KpnIニッポンジーンおよびEcoRIニッポンジーンおよびBglIIニッポンジーンで切断しCHROMASPIN-TE1000クローンテックでゲル濾過した。このPCR断片2.7kbおよび2.6kbをV907プラスミドのKpnI又はEcoRIとBglIIサイトにクローニングしたベクター名:V907-UGT2HR2。次にloxP-FRT-pGKneo-FRT-loxPカセットであるpNT1.1大阪大学、遺伝情報実験センターより分与からFRT-pGKneo-FRTをEcoRIとBamHIで切り出し、上記X3.1のBglIIサイトにクローニングしたベクター名:X3.1-FRT-pGKneo-FRT。次に、V907-UGT2HR2を制限酵素EcoRIで切断し、上記X3.1-FRT-pGKneo-FRTから、制限酵素EcoRIでloxPを含むDNA断片を切り出し、ライゲーションした。loxP配列の方向がクローニングしたAC074378ゲノム断片と同方向のものをターゲティングベクターpUGT2loxPneoとした。最終的なloxP挿入コンストラクトのサイズは11.1kbである。ターゲティングベクター、標的配列および相同組換えにより生じる染色体アレルを図81に示す。[B.2]トランスフェクションおよび薬剤耐性クローンの単離上述と同様に、上記で作製したターゲティングベクターpUGT2loxPneoを制限酵素NotITAKARAで線状化後、ヒト4番染色体を保持するニワトリDT40細胞クローンDT40hChr4-tel35にトランスフェクションし、ネオマイシン1.5mg/mlを含む培地に交換し、96穴培養プレート3枚に分注して約2週間の選択培養を行った。2回のトランスフェクションで得た合計12個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行ったクローン名:DT40hChr4-tel-loxP。[B.3]相同組換え体の選別[B.3.1]PCR解析ネオマイシン耐性クローンからPuregeneDNAIsolationKitGentraSystem社を用いてゲノムDNAを抽出して、以下の2組のプライマーを用いたPCRにより相同組換え体の同定を行った。以下の2組のプライマーを用いたPCRにより相同組換え体の同定を行った。PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはLATaqTAKARAを用い、バッファーやdNTPsdATP,dCTP,dGTP,dTTPは添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は94°C1分の熱変性後、98°C10秒、68°C4分を35サイクル行った。12クローンをスクリーニングした結果、5クローンが相同組換え体として同定された。[B.3.2]two-colorFISH解析FISH解析は松原らFISH実験プロトコール、秀潤社、1994に従い行った。上記で組換えを確認したクローンのうち4クローンをヒトcot-1DNAおよびネオマイシンDNAをプローブにしてFISH解析を行ったところ、ヒト4番染色体は全てのクローンで宿主染色体に転座することなく、4q13付近にネオマイシン由来のシグナルが検出されたことから部位特異的に組換えが起こったことが確かめられた図82。以上の結果から、ヒト4番染色体上のAC074378に遺伝子導入部位であるloxP配列が部位特異的に挿入されたと結論づけた。[C]hChr4-loxP-tel含有DT40からhChr4-loxP-telのMAC4含有CHO細胞への導入。CHO細胞内でマウス人工染色体ベクターMAC4にloxP配列を介してヒトUGT2遺伝子クラスター領域を転座挿入するために、hChr4-loxP-telをマウス人工染色体ベクターMAC4含有CHO細胞に導入する。[C.1]微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離レシピエント細胞であるDT40hChr4-loxP-tel5及び10を用いて、上記と同様にMAC4含有CHOhprt欠損細胞ヒューマンサイエンス研究資源バンクより入手、登録番号JCRB0218である、CHOHPRT-;MAC4に微小核細胞融合法を行った。3回の微小核細胞融合で得た合計22個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以降の解析を行ったクローン名:CHOHPRT-;MAC4,hChr4-loxP-tel。[C.2]薬剤耐性クローンの選別[C.2.1]PCR解析ネオマイシン耐性株のゲノムDNAを抽出して鋳型として組換え体を選別するため、以下のプライマーを用いてPCRを行い、ヒト4番染色体断片がMAC4含有CHO細胞に導入されているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはLATaqTAKARAを用い、バッファーやdNTPsdATP,dCTP,dGTP,dTTPは添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は94°C1分の熱変性後、98°C10秒、68°C7分を30サイクル行った。PCRの結果、22クローンのうち、5クローンが全てのプライマーのセットで陽性であり、この5クローンで以降の解析を行った。[C.2.2]two-colorFISH解析上記で得られたCHOHPRT-;MAC4,hChr4-loxP-telの5クローンについてShinoharaらの報告HumanMolecularGenetics,10:1163-1175,2001に記された方法でマウスCot-1DNA及びヒトCot-1DNAをプローブにしたFISH解析を行ったところ、1クローンにおいて90以上のMAC1ならびにhChr4-loxP-telがCHO細胞に1コピーもしくは2コピーで導入されていることを確認した図83。以上の結果から、hChr4-loxP-telがマウス人工染色体ベクターMAC4含有CHO細胞に導入できたと結論付けた。[D]CHOHPRT-;MAC4,hChr4-loxP-telクローンにおけるヒトUGT2遺伝子クラスター領域周辺AC074378-ヒトUGT2遺伝子クラスター-AC1252392MbのMAC4ベクターへの部位特異的転座2MbサイズのDNAであるヒトUGT2遺伝子クラスターをマウス個体内で安定に維持させるために、マウス人工染色体ベクターMAC4に転座挿入する図84。[D.1]トランスフェクションおよびHAT耐性クローンの単離上記で得られたCHOHPRT-;MAC4,hChr4-loxP-tel8にリポフェクション法を用いて遺伝子導入を行い、90コンフルエント状態になった6wellの細胞に対して、Cre3μgを市販インビトロジェンのプロトコールに従い導入した。HAT選択培養下で2週間培養すると、耐性コロニーが出現し、2回の導入で得た合計6個のコロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行ったクローン名:CHOUGT2-MAC,hChr4-ΔUGT2。[D.2]薬剤耐性クローンの選別[D.2.1]PCR解析HAT耐性株のゲノムDNAを抽出して鋳型として相互転座クローンを選別するため、以下のプライマーを用いてPCRを行い、ヒト4番染色体断片とMAC4上で染色体相互転座が起こっているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはLATaqTAKARAを用い、バッファーやdNTPsdATP,dCTP,dGTP,dTTPは添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は94°C1分の熱変性後、98°C10秒、68°C7分を30サイクル行った。PCRの結果、6クローンのうち、全てのクローンが全てのプライマーのセットで陽性であり、この6クローンで以降の解析を行った。[D.2.2]two-colorFISH解析上記で得られたCHOUGT2-MAC,hChr4-ΔUGT2の6クローンについてShinoharaらの報告HumanMolecularGenetics,10:1163-1175,2001に記された方法でUGT2-BACRP11-643N16CHORIDNA及びマウスCot-1DNAをプローブにしたFISH解析を行ったところ6クローン中、2クローンで50以上の割合でMAC4上にヒトUGT2由来によるシグナルが観察されていることを確認した図85。以上の結果から、ヒト4番染色体断片上のUGT2クラスター2Mbがマウス人工染色体ベクターMAC4に相互転座によるクローニングができたと結論付けた。[E]CHO細胞からのUGT2-MACのマウスA9細胞への移入UGT2-MACを保持するマウスES細を作製するために、上記[D]で得られたUGT2-MACを保持するCHO細胞CHOUGT2-MAC,hChr4-ΔUGT24,5からマウスA9細胞へミクロセル形成能の高いマウスA9細胞へ微小核細胞融合法により導入した。4回の微小核細胞融合で得た合計16個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以降の解析を行ったクローン名:A9UGT2-MAC。その結果、UGT2-MAC領域のみを検出する前出のプライマーを用いたPCRで陽性であるクローンが5クローンあった。さらに、UGT2-BACRP11-643N16CHORI及びマウスminorsatelliteDNAプローブを用いてFISH解析Tomizukaら,NatureGenet.16:133,1997を行った結果、上記プローブにより特異的に検出されるUGT2-MACの存在が5クローン中、全てのクローンで確認された図86。以上のことから、UGT2-MAC保持A9細胞が5クローン得られたと結論付けた。[F]A9細胞からのUGT2-MACのマウスES細胞への移入UGT2-MACを保持するキメラマウスを作製するために、上記[E]で得られたUGT2-MACを保持するA9細胞からマウスES細胞野性型TT2Fへ微小核細胞融合法により導入した。TomizukaらNatureGenet.16:133,1997の方法に従い、約108個のUGT2-MACを保持するA9細胞A9UGT2-MAC13,15などからミクロセルを精製し、DMEM5mlに懸濁した。約107個のマウスES細胞TT2Fをトリプシン処理により剥がし、DMEMで3回洗浄後DMEM5mlに懸濁し、遠心したミクロセルに加え、1250rpmで10分間遠心し、上清を完全に取り除いた。沈殿をタッピングにより十分ほぐし、1:1.4PEG溶液[5gPEG1000和光純薬、1mlDMSOシグマをDMEM6mlに溶解]0.5mlを加え、約1分30秒間、十分攪拌した。その後、DMEM10mlをゆっくり加え、1250rpmで10分間遠心し、30mlのES培地に懸濁し、予めフィーダー細胞をまいた直径100mmシャーレコーニング社3枚に分注し、培養した。24時間後、300μg/mlのG418を含む培地に交換し、約1週間選択培養した。その結果、合計25個のコロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った。A9UGT2-MAC13からは5クローン、A9UGT2-MAC15からは4クローンがUGT2-MAC領域のみを検出する前出のプライマーを用いたPCRで陽性であった。さらに、上記のうち9クローンについて、UGT2-BACRP11-643N16CHORIならびにマウスminorsatelliteDNAを用いてFISH解析Tomizukaら,NatureGenet.16:133,1997を行った結果、上記プローブにより特異的に検出され、かつマウスの核型が正常なクローンは7クローンであった図87。以上のことから、UGT2-MAC保持TT2F細胞が7クローン得られたと結論付けた。[G]UGT2-MACのマウスES細胞における安定性上記で得られたマウスESクローン例えばTT2FUGT2-MAC9,10,19、上記[F]で取得について0~50PDLの非選択培養下での長期培養後におけるFISH解析によるUGT2-MAC保持細胞の割合を計測した結果、50PDLにおいても95以上の保持率であった。図88。[H]実施例8記載のように、マウス人工染色体ベクターUGT2-MACを保持するマウスES細胞からキメラマウスを作製し、UGT2-MACが子孫伝達されたマウス系統TCUGT2-MACを作製できる。また、上記TCUGT2-MACマウス系統を用いて、体細胞におけるUGT2-MACの安定性を検証できる。また、TCUGT2-MACマウス系統はヒトの薬物代謝を再現できるので、医薬品開発における第二相反応の薬効毒性を調べるためのinvivo試験用のモデルマウスとして利用できる。[実施例19]マウス人工染色体ベクターCYP2C-MACの構築マウス人工染色体ベクターMAC4にヒト薬物代謝酵素遺伝子群であるCYP2CクラスターをCre/loxPシステムを用いて転座クローニングを行い、実施例3と同様にして、CYP2C-MACを構築する。[A]ヒト10番染色体上のAL157834における部位特異的切断ヒト10番染色体のCYP2C遺伝子クラスターから遠位側の遺伝子を削除するために、部位特異的染色体削除であるテロメアトランケーションを行う。[A.1]ターゲティングベクターpTELpuro-CYP2Cの作製ヒト10染色体上のCYP2C遺伝子座のごく近傍かつテロメア側約150Kbテロメア側に位置するAL157834領域にヒトテロメア配列を挿入するためのターゲティングベクターpTELpuro-CYP2Cを以下のようにして作製した。まず、AL157834ゲノム領域を以下のプライマーを用いてPCRにより増幅した。PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはLATaqTAKARAを用い、バッファーやdNTPdATP,dCTP,dGTP,dTTPは添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は94°C1分の熱変性後、98°C20秒、68°C8分を35サイクル行った。PCR産物をプロテネースKギブコ処理した後、CHROMASPIN-TE400クローンテックでゲル濾過した。その後、制限酵素BamHIニッポンジーンおよびBglIIニッポンジーンで切断し、CHROMASPIN-TE1000クローンテックでゲル濾過した。このPCR断片をプラスミドpTELpuroKuroiwaら,NatureBiotech.,20:88,2002のBamHI部位にクローニングした。AL157834ゲノムシークエンスの方向はセントロメア→テロメアなので、クローニングされたAL157834ゲノム断片がヒトテロメア配列と同方向のものを目的のターゲティングベクターpTELpuro-CYP2Cとした。最終的な長腕近位部位特異的切断用コンストラクトのサイズは11.6kbである。ターゲティングベクター、標的配列、および相同組換えにより生じる染色体アレルを図89に示した。[A.2]トランスフェクションおよび薬剤耐性クローンの単離Kazukietal.BBRC2004に記載された方法で、ヒト10番染色体を保持するA9KM32-2およびA9KM26-3Kugohetal.DNAresearch1999からヒト10番染色体を保持するニワトリDT40細胞を作製したクローン名:DT40hChr10。次に上述と同様に、上記で作製したターゲティングベクターpTELpuro-CYP2Cを制限酵素PstIニッポンジーンで線状化後、上記で作製したクローンDT40hChr101,42にトランスフェクションし、ピューロマイシン0.3ug/mlを含む培地に交換し、96穴培養プレート10枚に分注して約2週間の選択培養を行った。4回のトランスフェクションで得た合計96個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行ったクローン名:DT40hChr10-tel。[A.3]相同組換え体の選別[A.3.1]PCR解析ピューロマイシン耐性株のゲノムDNAを鋳型として組換え体を選別するため一次スクリーニングとして切断部位よりテロメア側に位置する以下のプライマーを用いてPCRを行い、部位特異的切断が起こっているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはAmpliTaqGoldAppliedBiosystemsを用い、バッファーやdNTPsdATP,dCTP,dGTP,dTTPは添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は95°C10分の熱変性後、95°C20秒、55°C30秒、72°C30秒を30サイクル行った。次に上記プライマーで検出されなかった3クローンについて以下のプライマーを用いて部位特異的相同組換えが起こっているかをPCRにて確認した。配列は以下のとおりである。上記プライマーによりPCRはLATaq宝酒造を用い、バッファーやdNTPsdATP,dCTP,dGTP,dTTPは添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は94°C1分の熱変性後、98°C20秒、68°C8分を35サイクル行った。部位特異的に組換えが起こった2クローンでのみ約8kbのバンドが検出された。ネガティブコントロールのDT40、DT40hChr101,42ではバンドは検出されなかった。[B.3.2]two-colorFISH解析FISH解析は松原らFISH実験プロトコール、秀潤社、1994に従い行った。上記で組換えを確認した3クローンをヒトcot-1DNAおよびピューロマイシンDNAをプローブにしてFISH解析を行ったところ、ヒト10番染色体は全てのクローンで宿主染色体に転座することなく、ヒト10番染色体断片末端にピューロマイシン由来のシグナルが検出され、目的部位で切断されていたことから部位特異的に組換えが起こったことが確かめられた図90。以上の結果から、クローンDT40hChr10-tel5及び98及び101において、CYP2C遺伝子クラスター領域よりテロメア側のAL157834から遠位において切断できたと結論付けた。[B]ヒト10番染色体のAL138759へのloxP配列の部位特異的挿入マウス人工染色体ベクターMAC4にloxP配列を介して転座挿入するために、DT40細胞内でhChr10-telのCYP2C遺伝子クラスターの近位のAL138759へloxP配列を挿入する。[B.1]ターゲティングベクターpCYP2CloxPneoの作製ヒト10番染色体上のCYP2C遺伝子座のごく近傍かつセントロメア側約300Kbセントロメア側に位置するAL138759領域にCre組換え酵素の認識配列loxPを挿入するためのターゲティングベクターpCYP2CloxPneoを以下のようにして作製した。まず、AL138759ゲノム領域を以下のプライマーを用いてPCRにより増幅した。loxP配列を挿入するための基本プラスミドにはV907Lexicongeneticsを用いた。PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはLATaq宝酒造を用い、バッファーやdNTPsdATP,dCTP,dGTP,dTTPは添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は94°C1分の熱変性後、98°C20秒、68°C7分を35サイクル行った。PCR産物をプロテネースKギブコ処理した後、CHROMASPIN-TE400クローンテックでゲル濾過した。その後、制限酵素SacIIニッポンジーンおよびEcoRIニッポンジーンおよびBamHIニッポンジーンで切断しCHROMASPIN-TE1000クローンテックでゲル濾過した。このPCR断片1.5kbおよび3.0kbをV907プラスミドのSacIIとEcoRI又はEcoRIとBamHIサイトにクローニングしたベクター名:V907-CYP2CHR2。次に、V907-CYP2CHR2を制限酵素EcoRIで切断し、上記X3.1-FRT-pGKneo-FRTから、制限酵素EcoRIでloxPを含むDNA断片を切り出し、ライゲーションした。loxP配列の方向がクローニングしたAL138759ゲノム断片と同方向のものをターゲティングベクターpCYP2CloxPneoとした。最終的なloxP挿入コンストラクトのサイズは10.3kbである。ターゲティングベクター、標的配列および相同組換えにより生じる染色体アレルを図91に示す。[B.2]トランスフェクションおよび薬剤耐性クローンの単離上述と同様に、上記で作製したターゲティングベクターpCYP2CloxPneoを制限酵素NotITAKARAで線状化後、ヒト10番染色体を保持するニワトリDT40細胞クローンDT40hChr10-tel1-98にトランスフェクションし、ネオマイシン1.5mg/mlを含む培地に交換し、96穴培養プレート3枚に分注して約2週間の選択培養を行った。2回のトランスフェクションで得た合計15個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行ったクローン名:DT40hChr10-tel-loxP。[B.3]相同組換え体の選別[B.3.1]PCR解析ネオマイシン耐性クローンからPuregeneDNAIsolationKitGentraSystem社を用いてゲノムDNAを抽出して、以下の2組のプライマーを用いたPCRにより相同組換え体の同定を行った。以下の2組のプライマーを用いたPCRにより相同組換え体の同定を行った。PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはLATaqTAKARAを用い、バッファーやdNTPsdATP,dCTP,dGTP,dTTPは添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は94°C1分の熱変性後、98°C10秒、68°C4分を35サイクル行った。15クローンをスクリーニングした結果、1クローンが相同組換え体として同定された。[B.3.2]two-colorFISH解析FISH解析は松原らFISH実験プロトコール、秀潤社、1994に従い行った。上記で組換えを確認したクローンのうち1クローンをヒトcot-1DNAおよびネオマイシンをプローブにしてFISH解析を行ったところ、ヒト10番染色体は全てのクローンで宿主染色体に転座することなく、10q24付近にネオマイシン由来のシグナルが検出されたことから部位特異的に組換えが起こったことが確かめられた。以上の結果から、ヒト10番染色体上のAL138759に遺伝子導入部位であるloxP配列が部位特異的に挿入されたと結論づけた。[C]hChr10-loxP-tel含有DT40からhChr10-loxP-telのMAC4含有CHO細胞への導入。CHO細胞内でマウス人工染色体ベクターMAC4にloxP配列を介してヒトCYP2C遺伝子クラスター領域を転座挿入するために、hChr10-loxP-telをマウス人工染色体ベクターMAC4含有CHO細胞に導入する。[C.1]微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離レシピエント細胞であるDT40hChr10-loxP-tel7を用いて、上記と同様にMAC4含有CHOhprt欠損細胞ヒューマンサイエンス研究資源バンクより入手、登録番号JCRB0218である、CHOHPRT-;MAC4に微小核細胞融合法を行った。3回の微小核細胞融合で得た合計8個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以降の解析を行ったクローン名:CHOHPRT-;MAC4,hChr10-loxP-tel。[C.2]薬剤耐性クローンの選別[C.2.1]PCR解析ネオマイシン耐性株のゲノムDNAを抽出して鋳型として組換え体を選別するため、以下のプライマーを用いてPCRを行い、ヒト10番染色体断片がMAC4含有CHO細胞に導入されているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはLATaqTAKARAを用い、バッファーやdNTPsdATP,dCTP,dGTP,dTTPは添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は94°C1分の熱変性後、98°C10秒、68°C7分を30サイクル行った。PCRの結果、8クローンのうち、全てのクローンが全てのプライマーのセットで陽性であり、この8クローンで以降の解析を行った。[C.2.2]two-colorFISH解析上記で得られたCHOHPRT-;MAC4,hChr10-loxP-telの8クローンについてShinoharaらの報告HumanMolecularGenetics,10:1163-1175,2001に記された方法でマウスCot-1DNA及びヒトCot-1DNAをプローブにしたFISH解析を行ったところ、2クローンにおいて90以上の割合でMAC1ならびにhChr10-loxP-telがCHO細胞に1コピーもしくは2コピーで導入されていることを確認した図92。以上の結果から、hChr10-loxP-telがマウス人工染色体ベクターMAC4含有CHO細胞に導入できたと結論付けた。[D]CHOHPRT-;MAC4,hChr10-loxP-telクローンにおけるヒトCYP2C遺伝子クラスター領域周辺AL138759-ヒトCYP2C遺伝子クラスター-AL157834380kbのMAC4ベクターへの部位特異的転座380kbサイズのDNAであるヒトCYP2C遺伝子クラスターをマウス個体内で安定に維持させるために、マウス人工染色体ベクターMAC4に転座挿入する図93。[D.1]トランスフェクションおよびHAT耐性クローンの単離上記で得られたCHOHPRT-;MAC4,hChr10-loxP-tel1及び5にリポフェクション法を用いて遺伝子導入を行い、90コンフルエント状態になった6wellの細胞に対して、Cre3μgを市販インビトロジェンのプロトコールに従い導入した。HAT選択培養下で2週間培養すると、耐性コロニーが出現し、2回の導入で得た合計11個のコロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行ったクローン名:CHOCYP2C-MAC,hChr10-ΔCYP2C。[D.2]薬剤耐性クローンの選別[D.2.1]PCR解析HAT耐性株のゲノムDNAを抽出して鋳型として相互転座クローンを選別するため、以下のプライマーを用いてPCRを行い、ヒト10番染色体断片とMAC4上で染色体相互転座が起こっているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはLATaqTAKARAを用い、バッファーやdNTPsdATP,dCTP,dGTP,dTTPは添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は94°C1分の熱変性後、98°C10秒、68°C7分を30サイクル行った。PCRの結果、11クローンのうち、9クローンが全てのプライマーのセットで陽性であり、この9クローンで以降の解析を行った。[D.2.2]two-colorFISH解析上記で得られたCHOCYP2C-MAC,hChr10-ΔCYP2Cの9クローンについてShinoharaらの報告HumanMolecularGenetics,10:1163-1175,2001に記された方法でCYP2C-BACRP11-466J14CHORIDNA及びマウスCot-1DNAをプローブにしたFISH解析を行ったところ9クローン中、3クローンで50以上の割合でMAC4上にヒトCYP2C由来によるシグナルが観察されていることを確認した図94。以上の結果から、ヒト10番染色体断片上のCYP2Cクラスター380kbがマウス人工染色体ベクターMAC4に相互転座によるクローニングができたと結論付けた。[E]CHO細胞からのCYP2C-MACのマウスA9細胞への移入CYP2C-MACを保持するマウスES細を作製するために、上記[D]で得られたCYP2C-MACを保持するCHO細胞CHOCYP2C-MAC,hChr10-ΔCYP2C2,8,10からマウスA9細胞へミクロセル形成能の高いマウスA9細胞へ微小核細胞融合法により導入した。4回の微小核細胞融合で得た合計4個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以降の解析を行ったクローン名:A9CYP2C-MAC。その結果、CYP2C-MAC領域のみを検出する前出のプライマーを用いたPCRで陽性であるクローンが4クローンあった。さらに、CYP2C-BACRP11-466J14CHORIならびにマウスminorsatelliteDNAプローブを用いてFISH解析Tomizukaら,NatureGenet.16:133,1997を行った結果、上記プローブにより特異的に検出されるCYP2C-MACの存在が4クローン中、2クローンで確認された。以上のことから、CYP2C-MAC保持A9細胞が2クローン得られたと結論付けた。[F]実施例8記載のように、マウス人工染色体ベクターCYP2C-MACを保持するマウスES細胞を作製し、そのES細胞を用いてinvitroの安定性を検証できる。また、上記ES細胞からキメラマウスを作製し、CYP2C-MACが子孫伝達されたマウス系統TCCYP2C-MACを作製できる。また、上記TCCYP2C-MACマウス系統を用いて、体細胞におけるCYP2C-MACの安定性を検証できる。また、TCCYP2C-MACマウス系統由来の肝臓ミクロソームは医薬品開発における第一相反応の薬効毒性を調べるための試料として利用できる。また、TCCYP2C-MACマウス系統はヒトの薬物代謝を再現できるので、医薬品開発における第一相反応の薬効毒性を調べるためのinvivo試験用のモデルマウスとして利用できる。[実施例20]マウス人工染色体ベクターMDR1-MACの構築マウス人工染色体ベクターMAC4にヒト薬物代謝酵素遺伝子群であるMDR1遺伝子をCre/loxPシステムを用いて転座クローニングを行い、実施例3と同様にして、MDR1-MACを構築する。[A]ヒト7番染色体のAC005045へのloxP配列の部位特異的挿入マウス人工染色体ベクターMAC4にloxP配列を介して転座挿入するために、DT40細胞内でヒト7番染色体hChr7のMDR1遺伝子の近位のAC005045へloxP配列を挿入する。[A.1]ターゲティングベクターpMDR1loxPbsの作製ヒト7番染色体上のMDR1遺伝子座のごく近傍かつセントロメア側約50Kbセントロメア側に位置するAC005045領域にCre組換え酵素の認識配列loxPを挿入するためのターゲティングベクターpMDR1loxPbsを以下のようにして作製した。まず、AC005045ゲノム領域を以下のプライマーを用いてPCRにより増幅した。loxP配列を挿入するための基本プラスミドにはV901Lexicongeneticsを用いた。PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはLATaq宝酒造を用い、バッファーやdNTPsdATP,dCTP,dGTP,dTTPは添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は94°C1分の熱変性後、98°C20秒、68°C7分を35サイクル行った。PCR産物をプロテネースKギブコ処理した後、CHROMASPIN-TE400クローンテックでゲル濾過した。その後、制限酵素BglIIニッポンジーンで切断しCHROMASPIN-TE1000クローンテックでゲル濾過した。このPCR断片2.5kbおよび5.3kbをV901プラスミドのBglIIとBamHIサイトにクローニングしたベクター名:V901-MDR1HR2。次に、V901-MDR1HR2を制限酵素AscINEBならびにKpnIで切断し、カセットベクターBs-loxP-3’HPRTHoshiyaら,MolTher.2009;172:309-17から、制限酵素AscIおよびKpnIでloxPを含むDNA断片を切り出し、ライゲーションした。loxP配列の方向がクローニングしたAC005045ゲノム断片と同方向のものをターゲティングベクターpMDR1loxPbsとした。最終的なloxP挿入コンストラクトのサイズは13.0kbである。ターゲティングベクター、標的配列および相同組換えにより生じる染色体アレルを図95に示す。[A.2]トランスフェクションおよび薬剤耐性クローンの単離上述と同様に、上記で作製したターゲティングベクターpMDR1loxPbsを制限酵素NotITAKARAで線状化後、WO01/011951に記載された方法で作製されたヒト7番染色体を保持するニワトリDT40細胞クローンDT40-7にトランスフェクションし、ブラストサイジンS15μg/mlを含む培地に交換し、96穴培養プレート3枚に分注して約2週間の選択培養を行った。2回のトランスフェクションで得た合計9個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行ったクローン名:DT40hChr7M-loxP。[A.3]相同組換え体の選別[A.3.1]PCR解析ブラストサイジンS耐性クローンからPuregeneDNAIsolationKitGentraSystem社を用いてゲノムDNAを抽出して、以下の2組のプライマーを用いたPCRにより相同組換え体の同定を行った。以下の2組のプライマーを用いたPCRにより相同組換え体の同定を行った。PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはLATaqTAKARAを用い、バッファーやdNTPsdATP,dCTP,dGTP,dTTPは添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は94°C1分の熱変性後、98°C10秒、68°C4分を35サイクル行った。9クローンをスクリーニングした結果、3クローンが相同組換え体として同定された。[A.3.3]two-colorFISH解析FISH解析は松原らFISH実験プロトコール、秀潤社、1994に従い行った。上記で組換えを確認した3クローンをヒトcot-1DNAおよびブラストサイジンDNAをプローブにしてFISH解析を行ったところ、ヒト7番染色体は全てのクローンで宿主染色体に転座することなく、7q21付近にネオマイシン由来のシグナルが検出されたことから部位特異的に組換えが起こったことが確かめられた。以上の結果から、ヒト7番染色体上のAC005045に遺伝子導入部位であるloxP配列が部位特異的に挿入されたと結論づけた。[B]ヒト7番染色体上のAC003083における部位特異的切断ヒト7番染色体のMDR1遺伝子から遠位側の遺伝子を削除するために、部位特異的染色体削除であるテロメアトランケーションを行う。[B.1]ターゲティングベクターpTELpuro-MDR1の作製ヒト7染色体上のMDR1遺伝子座のごく近傍かつテロメア側約50Kbテロメア側に位置するAC003083領域にヒトテロメア配列を挿入するためのターゲティングベクターpTELpuro-MDR1を以下のようにして作製した。まず、AC003083ゲノム領域を以下のプライマーを用いてPCRにより増幅した。PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはLATaqTAKARAを用い、バッファーやdNTPdATP,dCTP,dGTP,dTTPは添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は94°C1分の熱変性後、98°C20秒、68°C8分を35サイクル行った。PCR産物をプロテネースKギブコ処理した後、CHROMASPIN-TE400クローンテックでゲル濾過した。その後、制限酵素EcoRIニッポンジーンおよびPstIニッポンジーンで切断し、CHROMASPIN-TE1000クローンテックでゲル濾過した。このPCR断片をプラスミドpTELpuroKuroiwaら,NatureBiotech.,20:88,2002のEcoRIおよびPstI部位にクローニングした。AC003083ゲノムシークエンスの方向はセントロメア→テロメアなので、クローニングされたAC003083ゲノム断片がヒトテロメア配列と同方向のものを目的のターゲティングベクターpTELpuro-MDR1とした。最終的な長腕近位部位特異的切断用コンストラクトのサイズは13.1kbである。ターゲティングベクター、標的配列、および相同組換えにより生じる染色体アレルを図96に示した。[B.2]トランスフェクションおよび薬剤耐性クローンの単離上述と同様に、上記で作製したターゲティングベクターpTELpuro-MDR1を制限酵素EcoRIニッポンジーンで線状化後、上記で作製したクローンDT40hChr7M-loxP8,9にトランスフェクションし、ピューロマイシン0.3ug/mlを含む培地に交換し、96穴培養プレート10枚に分注して約2週間の選択培養を行った。4回のトランスフェクションで得た合計96個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行ったクローン名:DT40hChr7M-loxP-tel。[B.3]相同組換え体の選別[B.3.1]PCR解析ピューロマイシン耐性株のゲノムDNAを鋳型として組換え体を選別するため一次スクリーニングとして切断部位よりテロメア側に位置する以下のプライマーを用いてPCRを行い、部位特異的切断が起こっているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはAmpliTaqGoldAppliedBiosystemsを用い、バッファーやdNTPsdATP,dCTP,dGTP,dTTPは添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は95°C10分の熱変性後、95°C20秒、55°C30秒、72°C30秒を30サイクル行った。次に上記プライマーで検出されなかった3クローンについて以下のプライマーを用いて部位特異的相同組換えが起こっているかをPCRにて確認した。配列は以下のとおりである。上記プライマーによりPCRはLATaq宝酒造を用い、バッファーやdNTPsdATP,dCTP,dGTP,dTTPは添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は94°C1分の熱変性後、98°C20秒、68°C8分を35サイクル行った。部位特異的に組換えが起こった3クローンでのみ約8kbのバンドが検出された。ネガティブコントロールのDT40、DT40hChr7M-loxP8,9ではバンドは検出されなかった。[B.3.2]two-colorFISH解析FISH解析は松原らFISH実験プロトコール、秀潤社、1994に従い行った。上記で組換えを確認した3クローンをヒトcot-1DNAおよびピューロマイシンDNAをプローブにしてFISH解析を行ったところ、ヒト7番染色体は全てのクローンで宿主染色体に転座することなく、ヒト7番染色体断片末端にピューロマイシン由来のシグナルが検出され、目的部位で切断されていたことから部位特異的に組換えが起こったことが確かめられた図97。以上の結果から、クローンDT40hChr7M-loxP-tel10及び12及び70において、MDR1遺伝子領域よりテロメア側のAC003083から遠位において切断できたと結論付けた。[C]hChr7M-loxP-tel含有DT40からhChr7M-loxP-telのMAC4含有CHO細胞への導入。CHO細胞内でマウス人工染色体ベクターMAC4にloxP配列を介してヒトMDR1遺伝子領域を転座挿入するために、hChr7M-loxP-telをマウス人工染色体ベクターMAC4含有CHO細胞に導入する。[C.1]微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離レシピエント細胞であるDT40hChr7M-loxP-tel10及び70を用いて、上記と同様にMAC4含有CHOhprt欠損細胞ヒューマンサイエンス研究資源バンクより入手、登録番号JCRB0218である、CHOHPRT-;MAC4に微小核細胞融合法を行った。4回の微小核細胞融合で得た合計15個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以降の解析を行ったクローン名:CHOHPRT-;MAC4,hChr7M-loxP-tel。[C.2]薬剤耐性クローンの選別[C.2.1]PCR解析ブラストサイジンS耐性株のゲノムDNAを抽出して鋳型として組換え体を選別するため、以下のプライマーを用いてPCRを行い、ヒト7番染色体断片がMAC4含有CHO細胞に導入されているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはLATaqTAKARAを用い、バッファーやdNTPsdATP,dCTP,dGTP,dTTPは添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は94°C1分の熱変性後、98°C10秒、68°C7分を30サイクル行った。PCRの結果、15クローンのうち、6クローンが全てのプライマーのセットで陽性であり、この6クローンで以降の解析を行った。[C.2.2]two-colorFISH解析上記で得られたCHOHPRT-;MAC4,hChr7M-loxP-telの6クローンについてShinoharaらの報告HumanMolecularGenetics,10:1163-1175,2001に記された方法でマウスCot-1DNA及びヒトCot-1DNAをプローブにしたFISH解析を行ったところ、2クローンにおいて80以上の割合でMAC1ならびにhChr7M-loxP-telがCHO細胞に1コピーもしくは2コピーで導入されていることを確認した図98。以上の結果から、hChr7M-loxP-telがマウス人工染色体ベクターMAC4含有CHO細胞に導入できたと結論付けた。[D]CHOHPRT-;MAC4,hChr7M-loxP-telクローンにおけるヒトMDR1遺伝子領域周辺AC005045-ヒトMDR1遺伝子-AC003083210kbのMAC4ベクターへの部位特異的転座210kbサイズのDNAであるヒトMDR1遺伝子をマウス個体内で安定に維持させるために、マウス人工染色体ベクターMAC4に転座挿入する図99。[D.1]トランスフェクションおよびHAT耐性クローンの単離上記で得られたCHOHPRT-;MAC4,hChr7M-loxP-tel7及び15にリポフェクション法を用いて遺伝子導入を行い、90コンフルエント状態になった6wellの細胞に対して、Cre3μgを市販インビトロジェンのプロトコールに従い導入した。HAT選択培養下で2週間培養すると、耐性コロニーが出現し、2回の導入で得た合計10個のコロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行ったクローン名:CHOMDR1-MAC,hChr7-ΔMDR1。[D.2]薬剤耐性クローンの選別[D.2.1]PCR解析HAT耐性株のゲノムDNAを抽出して鋳型として相互転座クローンを選別するため、以下のプライマーを用いてPCRを行い、ヒト7番染色体断片とMAC4上で染色体相互転座が起こっているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。PCRは、サーマルサイクラーとしてPerkin-Elmer社製のGeneAmp9600を、TaqポリメラーゼはLATaqTAKARAを用い、バッファーやdNTPsdATP,dCTP,dGTP,dTTPは添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は94°C1分の熱変性後、98°C10秒、68°C7分を30サイクル行った。PCRの結果、10クローンのうち、6クローンが全てのプライマーのセットで陽性であり、この6クローンで以降の解析を行った。[D.2.2]two-colorFISH解析上記で得られたCHOMDR1-MAC,hChr7-ΔMDR1の6クローンについてShinoharaらの報告HumanMolecularGenetics,10:1163-1175,2001に記された方法でMDR1-BACRP11-784L5CHORIDNA及びマウスCot-1DNAをプローブにしたFISH解析を行ったところ6クローン中、3クローンで60以上の割合でMAC4上にヒトMDR1由来によるシグナルが観察されていることを確認した図100。以上の結果から、ヒト7番染色体断片上のMDR1遺伝子210kbがマウス人工染色体ベクターMAC4に相互転座によるクローニングができたと結論付けた。[E]CHO細胞からのMDR1-MACのマウスA9細胞への移入MDR1-MACを保持するマウスES細を作製するために、上記[D]で得られたMDR1-MACを保持するCHO細胞CHOMDR1-MAC,hChr7-ΔMDR11,2,4からマウスA9細胞へミクロセル形成能の高いマウスA9細胞へ微小核細胞融合法により導入した。4回の微小核細胞融合で得た合計7個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以降の解析を行ったクローン名:A9MDR1-MAC。その結果、MDR1-MAC領域のみを検出する前出のプライマーを用いたPCRで陽性であるクローンが5クローンあった。さらに、MDR1-BACRP11-784L5CHORIならびにマウスminorsatelliteDNAプローブを用いてFISH解析Tomizukaら,NatureGenet.16:133,1997を行った結果、上記プローブにより特異的に検出されるMDR1-MACの存在が5クローン中、3クローンで確認された。以上のことから、MDR1-MAC保持A9細胞が3クローン得られたと結論付けた。[F]実施例8記載のように、マウス人工染色体ベクターMDR1-MACを保持するマウスES細胞を作製し、そのES細胞を用いてinvitroの安定性を検証できる。また、上記ES細胞からキメラマウスを作製し、MDR1-MACが子孫伝達されたマウス系統TCMDR1-MACを作製できる。また、上記TCMDR1-MACマウス系統を用いて、体細胞におけるMDR1-MACの安定性を検証できる。また、TCMDR1-MACマウス系統はヒトにおける薬物の輸送等を再現できる。また、上記TCCYP3A-MACマウス系統との交配により、TCCYP3A-MAC/MDR1-MAC系統を作製できるので、医薬品開発における薬効毒性を調べるためのinvivo試験用のモデルマウスとして利用できる。"