Protein fosforilasyonu

1906'da Rockefeller Tıp Araştırma Enstitüsü'nde Phoebus A. Levene, vitellin adlı proteininde fosfat olduğunu buldu ve 1933'te, Fritz Lipmann'la ortak çalışması ile, kazeinde fosfoserin bulunduğunu keşfetti. Ancak, Eugene P. Kennedy tarafından enzimatik protein fosforilasyonunun keşfedilmesine kadar yirmi yıl geçmesi gerekti.

Proteinlerin tersinir fosforilasyonu prokaryot ve ökaryotlarda görülen önemli bir düzenleyici mekanizmadır. Protein kinaz ve fosfataz denen enzimler bu düzenleme sürecinin fosforilasyon ve defosforilasyon kısımlarında rol oynarlar. Fosforilasyon ve defosforilasyon sonucu çoğu enzim ve reseptörün yapısında bir biçim (konformasyon) değişimi olur, bunun sonucu bunlar ya aktifleşir veya inaktifleşir. Ökaryotik proteinlerde fosforilasyonu genelde serin, treonin ve tirozin kalıntılarında olur. Prokaryotlarda bazik amino asitler olan histidin, lizin ve arjininde de fosforilasyon olur. Apolar bir amino asit kalıntısına bir PO4 grubunun eklenmesi, proteinin hidrofobik bir kısmının çok hidrofilik bir hâl almasına neden olabilir. Proteinin bu bölgesinin diğer hidrofobik ve hidrofilik bölgeleriyle etkileşimi değişir ve böylece protein yapısında biçimsel bir değişiklik meydana gelir.

Fosforilasyonun düzenleyici rolüne bir örnek, p53 tümör baskılayıcı proteinidir. p53 proteinin etkinliği çeşitli mekanizmalarla düzenlenir ve 18 farklı fosforilasyon konumu vardır. p53'ün etkinleşmesi hücre döngüsünü durdurur. Hücre hasar gördüğü veya hücrenin normal fizyolojisi bozulduğunda bu etkinleşme olur ve bunun sonucunda apoptozis meydana gelir. Etkinsizleşme sinyalinin ardından protein defosforile olur ve çalışması durur. Bu mekanizma çoğu sinyal transdüksiyonu yolunda görülür. Örneğin retinadaki ışığa duyarlı hücrelere gelen ışığa hücrenin tepki vermesinde de bu süreç vardır.

Na+/K+-ATPaz enziminin fosforilasyonu, sodyum (Na+) ve potasyum (K+) iyonlarının hücre zarından taşınmasını düzenler. Hücrelerde osmotik düzenlemeyi sağlayan bu sistem, vücut suyunun homeostazında rol oynar.

Src adlı tirozin kinazının, Src C-ucu kinaz (C-terminal Src kinase ; Csk) tarafından fosforile edilmesi, enzimin yapısında biçimsel bir değişikliğe neden olur, protein katlanarak kendi kinaz bölgesini kapatır ve çalışmaz hale gelir.

Fagositik hücrelerde bulunan çok alt birimli büyük bir protein olan NADPH oksidaz'ın sitozolik altbirimlerinin fosforilasyonu, bu enzimin protein-protein etkileşimlerinin düzenlenmesinde önemli rol oynar.

Bazı proteinlerin fosforilasyonunun, bunların ATP-bağımlı ubikuitin/proteozom yoluyla yıkımına yol açar. Bu proteinler ancak fosforile oldukları zaman belli ubikuitin ligazlara substrat olurlar.

Sinyalizasyon yolu fosforilasyon olaylarını açığa kavuşturmak zor olabilir. Hücresel sinyal iletiminde, A proteini B proteini fosforile edebilir ve B de C'yi fosforile edebilir. Ama başka bir sinyalizasyon yolunda, protein D, protein A'yı veya protein C'yi fosforile eder. Fosforile olmuş proteinlerin araştırılması olan Fosfoproteomiks, proteomiks'in bir alt sahasıdır. Fosfoproteomiks gibi global yaklaşımlar ve kütle spektrometri yöntemleri kullanılarak fosforile proteinlerdeki zaman bağlı değişiklikler tespit edilip nicellenmektedir. Karmaşık fosforilasyon şebekelerinin anlaşılması için bu teknikler giderek daha fazla önem kazanmaktadır.

Belli bir proteinin belli bir konumunun fosforilasyonu onun işlevini veya lokalizasyonu değiştirebildiği için, hücrenin "hal"inın anlaşılması hücredeki proteinlerin fosforilasyon durumunun bilinmesini gerektirir. Örneğin, AKT proteinin serin-473 ("S473") amino asidinin fosforile olmuşsa, AKT genelde bir kinaz olarak etkinleştirilmiş demektir. S473 fosforile olmamışsa AKT inaktif bir kinazdır.

Bir proteinde fosforilasyon birkaç farklı amino asitte meydana gelebilir. Serin fosforilasyonu en sık görülür, bunu treonin fosforilasyonu izler. Tirozin forforilasyonu nispeten daha enderdir. Ancak, tirozin fosforile proteinlerin antikorlarla saflaştırılması göreli daha kolay olduğu için, tirozin fosforilasyon konumları daha iyi bilinmektedir. Histidin ve aspartat fosforilasyonu prokaryotlarda iki bileşen sinyalizasyonunda ve ökaryotlarda bazı sinyal transdüksiyon yollarında görülür.

Antikorlar bir proteinin belli bir konumda fosforile olup olmadığını tespit etmek için kullanılan etkili gereçlerdir. Antikorlar proteinin fosforile olmaktan kaynaklanan değişik biçimlerine (konformasyonlarına) bağlanabilirler ve böylece bunların varlığını tespitte kullanılabilirler. Böylesi antikorlar fosfo-spesifik antikor olarak adlandırılır; bu tür yüzlerce antikor mevcuttur. Temel araştırmada ve klinik tanı koyma amaçlı testlerde bunlar vazgeçilmez ayıraçlardır.

Çevrim sonrası değişim izoformları İki-boyutlu jel elektroforeziyle kolaylıkla tespit edilebilir. Serin, treonin ve tirozin, fosforile olunca nötür hidroksil gruplarının yerini negatif yüklü fosfat grupları alır. Bu fosfat gruplarının pK'ları 1,2 ve 6,5 dolayındadır, dolayısıyla pH 5,5 altında fosfatlar bir negatif yük ekler, ph 6,5 civarında 1,5 negatif yük, pH 7,5 üzerinde 2 negatif yük eklerler. Her bir izoformun göredeli oranı, 2 boyutlu jeldeki protein beneklerinin göreceli boyanma miktarını ölçerek kolayca belirlenebilir.

Son yıllarda kütle spektrometrisi ile yapılan büyük çaplı analizler ile protein fosforilasyon konumları belirlenmektedir. Bu yöntemle daha evvelden bilinmeyen binlerce fosforilasyon yeri tespit edilmiştir. Kütle spektrometrisi bu tür analizler için idealdir çünkü bir fosfat grubunun eklenmesi proteinin kütlesi artırır. Ancak, bu tür çalışmalar için kütle ölçümlerindeki hata oranının çok düşük olması gerekmektedir, bu yüzden bu teknoloji ancak yüksek kaliteli kütle spektrometresine sahip laboratuvarlarda yapılabilmektedir.

Fosforilasyon konumlarının ayrıntılı bir karakterizasyonu çok zordur ve protein fosforilasyonunun nicelenmesi için dahili izotopik standartlar kullanmak gerekir. Göreceli bir niceleme için çeşitli diferansiyel izotop işaretleme yöntemleri kullanıllabilir.