Yüksek performanslı sıvı kromatografisi

Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC yaygın adıyla bilinir) bir analitik kimya yöntemidir. Karışımlardaki bileşenlerin, ayrıştırılmasında, nitelik ve niceliklerinin belirlenmesinde kullanılan bir analiz tekniğidir. Bu teknikte pompalar ile pompalanan yüksek basincli sıvı faz aracılığıyla taşınan analitler, kromatografik kolona ulaşır. Kolona ulaşan analitler, kolon ile farklı şekillerde etkileşip, farklı zamanlarda detektöre ulaşırlar. Burada, kolon katı bir adsorbent maddeyle doludur ki bu maddenin özellikleri sayesinde kromatografik ayrışma gerçekleşir.

HPLC üretim alanında (örneğin farmasötik ve biyolojik ürünlerin üretiminde), adli durumlarda (idrar tahlili vasıtasıyla performans artırıcı madde veya uyuşturucu bulgularında), araştırma alanında (örneğin kompleks biyolojik örneklerin ayrıştırılmasında veya sentetik kimyasalların ayrıştırılmasında) ve tıbbi alanda (örneğin kan serumundaki D vitamini tayininde) kullanılır.

Kromatografi, tanımına bakıldığında adsorpsiyon içeren bir kütle transfer prosesi olarak düşünülebilir. HPLC'de önceden bahsedildiği gibi, pompalarla numunelerin bir kolona gönderilip ayrıştırılması hususuna dayanır. Kromatografik kolonun aktif bileşeni (adsorbent) genellikle granüler yapıda olan, katı partiküllü (silicon veya polimerik yapıda olabilir) bir maddedir. Bu partiküller 2–50 μm boyutundadır. Kolona gelen karışımın bileşenleri bu partiküllerle olan farklı derecedeki kimyasal veya fiziksel etkilesimden dolayı birbirinden ayrılırlar. Bu karışımları taşıyan sıvılar genellikle yüksek basınç altındadırlar ve genelde birkaç solventin (çözgen) bileşiminden oluşurlar. Bu çözgenler genel olarak su, asetonitril, metanöldur. Analitleri taşıyan bu sıvıya sıvı faz denir. Sıvı fazın (veya likit faz) genel bileşimi (yani hangi solventlerden oluştuğu) ve sıcaklığı analitlerin ayrışma prosesinde önemli bir rol oynar. Bunun sebebi ise bu faktörlerin analit ve kolon (adsorbent) arasındaki etkileşimi direkt olarak etkilemesidir. Bu etkileşimler genellikle fiziksel etkileşimlerdir ve örnek vermek gerekirse hidrofobik (dispersif), dipol-dipol ve iyonik, genellikle bunların bileşimi şeklinde olabilir.

HPLC geleneksel (düşük basınçlı) sıvı kromatografisinden ayrılır. Bunun en önemli sebebi ise kullanılan basınç değerlerinin ciddi bir derecede fazla olmasıdır (50-350 bar). Geleneksel kromatografi genellikle yerçekimi gibi çok düşük basınç kullanırken, HPLC bahsedildiği gibi çok yüksek basınçlarda işlem yapar. HPLC'de ayrıştırılan madde miktarı çok düşük olduğu için, tipik kolon boyutları 2.1-4.6 mm çap, 20–250 mm uzunluğundadır. Ek olarak, HPLC kolonlarında kullanılan partiküllerin büyüklüğü genel olarak 2-50 μm arasındadır. Bu partikül boyutları HPLC'yi etkili ve popüler bir kimyasal ayrıştırma ya da analiz tekniği olmasını sağlar.

HPLC cihazları tipik olarak degasser, enjektör, pompa, kolon ve detektörden oluşur. Enjektörün örnek karışımını (numuneyi) mobil faza enjekte etmesiyle, analitler kolona taşınır. Kolon da içindeki sabit faz yardımıyla bu analitleri ayrıştırarak detektöre gönderir. Detektöre gelen analitler de miktarlarına ve hatta özelliklere göre sinyaller üretir. Bu sinyaller de mikroprosesörler ve veri analizi programlarıyla analizlenir. Bu veri analizi sayesinde kalitatif ve kantitatif analiz tamamlanmış olur. Modern kromatograflarda, pompalar değişik oranlardaki solventleri, zamana da bağlı olarak karıştırıp mobil fazlar üretebilir. Detektör olarak da genellikle UV/Vis detektörü, fotodiyot detektörü (PDA) veya kütle spektrometresi kullanılır. Çoğu HPLC cihazlarında, kolonun bulunduğu bir kolon bölümü (kolon fırını veya kolon kompartmanı da denir) bulunur ve bu bölüm kolon sıcaklığını değiştirerek, analitler ile kolonun içindeki sabit fazın etkileşimini etkiler. Bu etkileşim farklılaşması sayesinde analitlerin ayrışması sağlanır.

Ayrışacak veya analizlenecek numune, cihaza çok küçük hacimlerde (tipik olarak mikrolitre seviyesinde) kromatograftaki mobil faz akışına verilir. Akan mobil faz, bu maddeleri kolona taşır. Numunenin içindeki analitler türlerine göre farklı hızlarda hareket ederler ve bu hız farkının belirlenmesinde sabit faz-analit etkileşimi (fiziksel etkileşimler) önemli bir rol oynar. Analitlerin taşınma hızı, analitlerin kimyasal doğasına, sabit fazın (kolon) kimyasal yapısına ve de mobil fazın bileşimine bağlıdır. Analitin kolondan çıkma süresine alıkonma zamanı (genelde RT ile gösterilir) denir. Alıkonma zamanı genelde analizdeki analitin karakterini belirlemede kullanılan önemli bir bilgidir.

Çok çeşitli HPLC kolonları piyasada mevcuttur. Bir HPLC kolonun niteliğini bir takım özellikleri belirler ve bu özelliklerden en önemlisi sabit fazının kimyasal yapısı, bir başka deyişle bu sabit fazı oluşturan partiküllerin türü ve büyüklüğüdür. HPLC kolonlarında partiküllerin boyutunun küçük olması kolondan gelen geri basıncı (ing. backpressure) artırır,. Kısacası partikül boyutunun düşmesi, geri basıncı da doğru orantılı olarak artırır. Tipik olarak, kolondaki küçük boyutlu partiküller, yüzey alanını artırdığından beraberinde analitlerin daha etkili bir biçimde ayrılışmasını (resolusyon) sağlar. Resolüsyon, kromatografide elde edilen ardışık analit piklerinin ayrışma derecesi olarak tanımlanabilir. Ek olarak, bu sorbent partikülleri hidrofobik veya polar olabilir.

Mobil fazlar incelendiğinde, genel olarak su ve suyla çözünebilen organik bir solvent kullanılır. Bu solventlerden de en yaygın olarak kullanılanları metanol ve asetonitrildir. Bazı HPLC teknikleri içinde suyun bulunnmadığı mobil fazlar da kullanılır (Normal faz sıvı kormatografisi). Genellikle mobil fazın içerisinde formik asit, fosforik asit veya trifloroasetik asit gibi veya bazı tuzlar da eklenir. Bu eklenen kimyasallar kromatografi operasyonuna, yani analitlerin ayrışmasına yardımcı olur. Mobil fazın bileşimi analiz sırasınca sabit tutulabilir ve bu işleme isokratik elüsyon denir. Mobil faz bileşiminin zamana bağlı değiştiği analizlere de gradyan elüsyon denir. İsokratik analizler genellikle kimyasal özellikleri tamamen farklı veya sabit faza farklı derecelerde ilgi gösteren molekülerin bulunduğu karışımları ayırmada kullanılır. Gradiyent analizlerde analitlerden elüsyon kuvveti az olandan çok olana doğru bir moleküler ayrışma gözlenir. Bir başka deyişle, analitler sabit faza yüksek afinite gösterdiklerinde, sabit fazla daha çok etkileşirler ve kolon içerisinde daha çok zaman geçirerek detektöre daha geç ulaşırlar, fakat bazı analitler de sabit fazla fazla etkileşmez ve daha hızlı bir biçimde detektöre ulaşırlar. Bu farklılık, farklı zamanlarda elde edilen sinyallere neden olur ve bu ilgili analitlerin kromatografik pikleri, kromatogramda farklı zamanlarda çıkar. Tipik bir ters faz kromatografi gradyan analizi %5 asetonitrile ile başlar ve doğrusal olarak 5-25 dakika içerisinde, %95'e kadar çıkar. Mobil fazın bileşimin değsımediği periyotlar da analiz profilinde yer alabilir. Örneğin, mobil faz 1-3 dakika boyunca %5 asetonitril seviyesinde kalabilir ve daha sonra doğrusal olarak ilerleyen dakikalarda %95'e çıkabilir.

Bu hususta, mobil fazın bileşiminin belirlenmesinde, mobil faz analit etkileşimi ve analit sabit faz (kolon) etkileşimleri göz önünde bulundurulur. Örneğin ters faz HPLC'de hidrofobik etkileşimler görülür. Analitlerin mobil faz ve sabit faza olan ilgisi (affinıtiesi) ve farklı analitlerin farklı derecelerde olan etkileşimleri sonucunda kromatografik ayrışma gerçekleşir. Bir başka deyişle, analitlerin sabit faz ve mobil fazdaki partisyonu kromatografik ayrışmada önemli rol oynar. Sıvı-sıvı ekstraksiyonunda da benzer prensip görülse de HPLC de bu işlem süreklidir, ekstraksiyonda ise adımlar şeklindedir. HPLC örneğinde, su/asetonitril mobil fazi kullanıldığında, hidrofobisitesi yüksek olan analitler kolondan daha geç ayrılacaklardır. Bunun sebebi ise, gradiyen bir metod kullanıldığı var sayıldığında, mobil fazdaki asetonitril miktarı zamanla artacaktır ve sonucunda da analitler kolonla daha çok etkileşeceklerdir. Mobil faz bileşenlerinin belirlenmesi, eklenmesi gereken tuz ve asitlerin seçilmesi, kolon seçimi, gradiyen zamanlarının belirlenmesi analizlerden önce dikkatle belirlenir ve bu aşamaya metod geliştirme denir.

Bilim adamları, HPLC'den önce genel olarak standart sıvı kromatografisi tekniklerini kullanmaktaydı. Fakat sıvı kromatografisi, mobil fazın akış hızının yer çekimine bagli olmasından dolayı yeterince verimli değildi. Kimyasal ayrışmalar kimi zaman saatler hatta günler sürmekteydi. Gaz kromatografisi (GC) her ne kadar o günlerde sıvı kromatografisinden daha etkili olsa da, gaz fazındaki ayrışmaların ve yüksek molekül ağırlıklı polar molekullerin analizinin imkânsız olduğu düşünülmekteydi. GC biyokimyacılar için de yeterince etkili değildi ve bunun nedeni de, analizlenmek istenen moleküllerin termal kararlığa sahip olmamasıydı. Sonuç olarak, alternatif analiz yöntemleri ortaya sürüldü ve bu çalışmalar HPLC'nin gelişmesi ile sonuçlandı.

1941'de Martin ve Synge'in sıvı kromatografisi üzerine yaptığı çalışmalar genel olarak bu konudaki ilerleyen yıllardaki çalışmalara öncülük etmiştir. 60'li yıllarda Cal Giddings, Josef Huber ve diğer bilim adamları sıvı kromatografisinin, kolonlardaki partikül boyutunun küçülmesiyle çok daha etkili bir ve yüksek verimli bir biçimde çalışacağını öngördü. Burada bahsi geçen partiküller genel olarak 150 μm boyutundaydi ve bu partiküllerin küçülmesi ayni zamanda mobil fazın partiküller arasından akıp geçmesi için gerekli olan basıncı da kayda değer bir biçimde yükseltecekti. Bu tahminlere bağlı olarak, bilim adamları 60'li ve 70'li yillarin basinda bu konuları cok sayıda deneyler ile test edip bazı sonuçlara ulaştılar. Bunu sonucunda da, bahsi geçen büyük partiküllerin küçültülmesi amacıyla yeni partiküller geliştirilmeye başlandı. Zipax adında yapay olarak porlu partiküllerin HPLC kolon teknolijisi için gelecek vadeden bir buluş olduğu sonucuna varıldı.

1970'lerde HPLC donanımı ve enstrumentasyonu alanında birçok gelişme yaşandı. Araştırmacılar pompa ve enjektörler kullanarak ilk HPLC dizaynını tasarlayıp hayata geçirdiler. Gaz kullanarak yüksek basınca ulaşabilen pompalar kullanılan ilk pompalardandı. Bu tarz pompların ideal olmanın sebebi de sabit bir mobil faz akışı sağlayıp ve verimli derecede nicel analizde kullanılması için, sabit basınçta çalışabilmeleri, sızıntı yapmayan conta gereksinimine ihtiyaç duymaması gösterilebilir. Dupont (Endüstriyel Polimerler Bölümü) septumlu enjektör kısmını, sabit hacimli bir hazneye sahip bir enjeksiyon vanasıyla değiştirerek, daha verimli bir cihaz geliştirdi. Bu cihazda bekleme zamanı, yani hazırlanan mobil fazın kolona ulaşma zamanı (dwell) düşüktür ve bu nicel analizde önemli bir avantajdır.

Her ne kadar donanımsal gelişmeler çok önemli olsa da, HPLC'nin gelişimi genel olarak kolonlardaki kullanılan partiküllerin gelişimi ve evrimi etrafında şekillenmiştir. Bu konuda kolon, kimyasal ayrışmanın yer aldığı ünite olduğundan, bazen kromatografın kalbi olarak da bahsedilebilir. Sonuç olarak kolon da bir takım partiküllerden oluştuğu için, bu araştırmalar HPLC'nin gelişiminde çok önemli bir rol oynar. Porlu partiküllerin keşfinden sonra, bu partiküllerin boyutunu düşürmek için ciddi bir çaba harcanmış ve bu araştırmalar uzun süre devam etmiştir ve hatta günümüzde de devam etmektedir. Fakat, bu partikül boyutlarının küçülmesi yanında bir takım sorunları da getirmiştir. Bu sorunlardan birisi, mobil fazın basıncındaki oluşan dalgalanmalar, ani basınç düşmeleridir ki sabit basınç HPLC'de önemli bir parametre olarak gösterilir. Diğer bir problem de bu materyallerin kolona tekdüze ve homojen bir biçimde yerleştirilmesinin zor olmasıdır. Genellikle, ne zaman partikül boyutları ciddi bir bicimde düşürülse, buna uygun olan cihaz parçaları geliştirilir ve bunun en önemli sebebi de yüksek basınç gereksinimleridir.

Partisyon kromatografisi, kimyagerlerin geliştirdiği ilk kromatografi türlerinden biriydi. Partisyon katsayısı prensibi, kağıt kromatografisi, ince tabaka kromatografisi, gaz fazı ve sıvı-sıvı ayırma uygulamalarında uygulanmıştır. 1952 Nobel kimya ödülü amino asitleri ayırmak için kullanılan tekniği geliştirdikleri için Archer John Porter Martin ve Richard Laurence Millington Synge tarafından kazanıldı. Partisyon kromatografisinde, kağıt kromatografisinde olduğu gibi bir "inert" katı destekleyici matrisin yüzeyinde veya taneleri veya lifleri içinde tutulan bir çözücü kullanılır; veya sabit faz ile bazı kulombik ve / veya proton verici etkileşimlerinden yararlanır. Tıpkı hidrofilik etkileşim kromatografisinde (HILIC; HPLC içinde bir alt teknik) olduğu gibi, bu yöntem, analitleri polaritelerindeki farklılıklara göre ayırır. HILIC'de çoğunlukla güçlü bir bileşen olarak bağlı bir polar sabit faz ve genel olarak su ile asetonitrilden yapılmış bir mobil faz kullanır. Partisyon kromatografisi, geçmişte bağlı olmayan silika veya alümina desteklerde kullanılmıştır. HILIC, sabit fazları (kolonları), asidik, bazik ve nötr çözünenleri tek bir kromatografik çalışmada ayırma avantajına sahiptir.

Polar analitler, polar sabit faz ile ilişkili sabit bir su tabakasında dağılır ve böylece buraya tutunur. Polar analit ve polar sabit faz (mobil faza göre) arasındaki etkileşimler ne kadar güçlü olursa, elüsyon süresi de o kadar uzun olur. Etkileşim mukavemeti, daha fazla polarize olan grupla (örn., Hidroksil-) ve daha fazla tutunma sağlayan hidrojen bağlayabilen gruplarla, analit moleküler yapısının fonksiyonel gruplar kısmına bağlıdır. Kulombik (elektrostatik) etkileşimler de tutunmayı artırabilir. Mobil fazda daha fazla polar çözücünün kullanılması analitlerin alıkonma süresini azaltırken, daha hidrofobik çözücüler alıkoyma sürelerini artırma eğilimindedir.

Normal faz kromatografisi, kimyagerlerin geliştirdiği ilk HPLC türlerinden biriydi. Normal fazlı HPLC (NP-HPLC) olarak da bilinen bu yöntem, analitleri, silika gibi bir polar sabit faza olan ilgilerine dayanarak ayırır, bu nedenle analitin polar etkileşimlere (hidrojen bağı veya dipol- dipol etkileşimler) ile sabit faz arasindaki etkileşim önemli bir rol oynar. NP-HPLC, apolar, sulu olmayan bir mobil faz (örn., Kloroform) kullanır ve apolar çözücülerde kolayca çözünür olan analitlerin ayrılması için de etkili bir yöntemdir. Analit, polar sabit faza tütünür aynı adsorbsiyon gözlenir. Adsorpsiyon kuvvetleri, artan analit polaritesi ile artar. Etkileşim gücü, sadece analit molekülünün yapısında bulunan fonksiyonel gruplara değil, aynı zamanda sterik etkiye de bağlıdır. Sterik engellemenin etkileşim gücü üzerindeki etkisi, bu yöntemin yapısal izomerleri ayırmasını sağlar.

Mobil fazda daha fazla polar çözücünün kullanılması, analitlerin tutulma süresini arttırır, oysa daha hidrofobik çözücüler daha hızlı elüsyon (daha düşük tutma süreleri) eğilimindedir. Hareketli fazdaki eser miktardaki su gibi çok polar çözücüler, sabit fazın katı yüzeyine adsorbe etme eğilimindedir, bu da tutmada aktif bir rol oynadığı düşünülen sabit (su) bir tabaka oluşturur. Bu davranış normal faz kromatografisine özgüdür denilebilir, çünkü neredeyse sadece tek bir adsorptif mekanizma tarafından yönetilir (yani analitler, sorbent yüzeyine bağlı bir ligandın solvatlanmış tabakası yerine katı bir yüzeyle etkileşime girer). Adsorpsiyon kromatografisi, aktif (kurutulmuş) silika veya alümina destekleri üzerinde hem kolon hem de ince tabaka kromatografi formatlarında yapısal izomer ayrımları için hala yaygın olarak kullanılmaktadır.

Silika veya alümina kromatografik sabit fazının (kolon) yüzeyinde su veya protik bir organik çözücü tabakasının varlığı nedeniyle ayrıca tutma sürelerinin tekrarlanabilirliğinin düşük olması sebebiyle, 1970'lerde NP-HPLC, ters fazlı HPLC'nin (RP-HPLC) gelişmesiyle gözden düşmüştür. Bu polar katman, hareketli fazın bileşimindeki herhangi bir değişiklikle (ör., Nem seviyesi) kolayca değişerek sürüklenme tutma sürelerine neden olur. Diğer bir çıkarım da, bu yöntemin tekraralanabilirlği bu sebepten dolayı bazi uygulamalarda düşebilir.

Son zamanlarda, partisyon kromatografisi, iyi tekrarlanabilirlik göstermesi, tekniğin kullanışlılığının daha iyi anlaşılması ve yeni HILIC sabit fazlarının geliştirilmesi ile yeniden popüler hale gelmiştir.

Yer değiştirme kromatografisinin temel prensibi şöyledir: Kromatografi matrisi (yer değiştirici) için yüksek afiniteye sahip bir molekül, bağlanma bölgeleri için etkili bir şekilde rekabet eder ve böylece az afinite gosteren diger molekuller ile yer değiştirir. Yer değiştirme ve elüsyon kromatografisi arasında belirgin farklılıklar vardır. Elüsyon modunda, maddeler tipik olarak dar, Gaussian piki şeklinde kromatogramda gözlenir. Maksimum saflaştırma elde etmek için piklerin, tercihen taban çizgisinde geniş bir şekilde ayrılması arzu edilir. Bir karışımın herhangi bir bileşeninin elüsyon modunda kolondan aşağıya inme hızı birçok faktöre bağlıdır. Ancak iki maddenin farklı hızlarda hareket etmesi ve çözülmesi için, biyomoleküller ve kromatografi matrisi arasındaki bazı etkileşimlerde önemli farklılıklar olmalıdır. Tekniğin çalışma parametreleri, bu farkın etkisini en üst düzeye çıkarmak için ayarlanır. Birçok durumda, piklerin taban çizgisi (ing. baseline) ile ayrılması sadece gradiyen elüsyonu ve düşük kolon yüklemeleri ile gerçekleştirilebilir. Bu nedenle, özellikle preparatif ölçekte elüsyon modu kromatografisinin iki dezavantajı vardır: Gradiyen çözücü pompalaması nedeniyle operasyonel karmaşıklık ve düşük kolon yüklemeleri nedeniyle düşük verimdir. Yer değiştirme kromatografisi, bileşenlerin “pikler” yerine ardışık saf madde bölgelerine ayrılması nedeniyle elüsyon kromatografisine göre avantajlara sahiptir. Bu işlem, izotermlerin doğrusal olmama özelliğinden yararlandığından, daha büyük bir kolon beslemesi, belirli bir kolon üzerinde, daha yüksek konsantrasyonda geri kazanılan saflaştırılmış bileşenler ile ayrılabilir.

Boyut dışlama kromatografisi veya jel filtrasyon kromatografisi olarak da bilinen bu yöntem, parçacıkları moleküler boyut temelinde (parçacıklarin Stokes yarıçapıyla) ayırır. Genellikle düşük çözünürlüklü bir kromatografik yöntemdir ve bu nedenle genellikle saflaştırmanın son "cilalama" aşamasına ayrılır. Saflaştırılmış proteinlerin tersiyer yapısını ve kuaterner yapısını belirlemek için de yararlıdır. SEC öncelikle proteinler veya polimerler gibi büyük moleküllerin analizi için kullanılır. SEC, bu küçük molekülleri bir parçacığın gözeneklerinde yakalar. Daha büyük moleküller, gözeneklere girmek için çok büyük oldukları için gözeneklerden geçer. Bu nedenle daha büyük moleküller kolondan daha küçük moleküllere göre daha hızlı akarlar, yani molekül ne kadar küçük olursa tutma süresi de o kadar uzun olur.

Bu teknik, polisakkaritlerin moleküler ağırlık tayini için yaygın olarak kullanılmaktadır. SEC, piyasada bulunan farklı düşük molekül ağırlıklı heparinlerin moleküler ağırlık karşılaştırması için resmi tekniktir (Avrupa farmakopisi tarafından önerilmektedir).

İyon değiştirici tipleri arasında polistiren reçineleri, selüloz ve dekstran iyon değiştiricileri (jeller) ve kontrollü gözenekli cam veya gözenekli silika bulunur. Polistiren reçineler zincirin stabilitesini artıran çapraz bağlanmaya izin verir. Daha fazla çapraz bağ içeren reçinelerde, denegelenme zamanını artiran ve sonuçta seçiciliği geliştiren dönmeyi azaltır. Selüloz ve dekstran bazlı iyon değiştiriciler, daha büyük gözenek boyutlarına ve düşük yük yoğunluklarına sahiptirler ve bu da proteinlerin ayrılması için uygundur.

Karşı iyondaki (pozitif ya da negatif) bir artış (reçinelerdeki fonksiyonel gruplara göre) tutma süresini azaltır. pH değerindeki bir azalma katyon değişimindeki alıkonma süresini azaltırken pH'daki bir artış anyon değişimindeki alıkonma süresini azaltır. Bir katyon değiştirme kolonundaki çözücünün pH'ının düşürülmesi ile, örneğin, anyonik sabit fazdaki konumlar için rekabet edebilecek, böylece zayıf bağlanmış katyonları çıkaracak daha fazla hidrojen iyonu mevcuttur.

Bu kromatografi formu, şu uygulamalarda yaygın olarak kullanılmaktadır: su saflaştırma, eser bileşenlerin önceden konsantre edilmesi, ligand değişim kromatografisi, proteinlerin iyon değişim kromatografisi, karbohidratların ve oligosakkaritlerin yüksek pH anyon değişim kromatografisi vb.

Bu kromatografik işlem, kararlı, spesifik ve geri dönüşümlü kompleksler oluşturmak için biyolojik olarak aktif maddelerin özelliğine dayanır. Bu komplekslerin oluşumu, Van der Waals etkileşimi, elektrostatik etkileşim, dipol-dipol etkileşimi, hidrofobik etkileşim ve hidrojen bağı gibi ortak moleküler kuvvetlerin katılımını içerir. Etkin, biyospesifik bir bağ ve tamamlayıcı bağlanma bölgelerindeki bu kuvvetlerin birçoğunun eşzamanlı ve uyumlu bir eylemiyle oluşur.

Mobil faz kompozisyonunun prosedür boyunca sabit kaldığı bir ayırmaya izokratik (sabit kompozisyon) denir. Bu kelime, HPLC'nin öncülerinden biri olan Csaba Horvath tarafından ilk kez kullanıldı.

Mobil faz kompozisyonunu her zaman sabit kalmayabilir. Ayırma işlemi sırasında mobil faz kompozisyonunun değiştirildiği bir ayırma, gradyan elüsyon denir. Örneğin,% 10 metanolde başlayan ve 20 dakika sonra% 90 metanolde biten bir analize gradyan elusyon denilebilir. Hareketli fazın iki bileşeni tipik olarak "A" ve "B" olarak adlandırılır; A, çözünen maddenin sadece yavaş yavaş elüte olmasına izin veren "zayıf" çözücüdür ki genelde sudur, B ise çözünen maddeleri kolondan hızla elüte eden "güçlü" çözücüdür. Ters fazlı kromatografide (RP-HPLC) çözücü A genellikle su veya sulu bir tampondur, B ise asetonitril, metanol, THF veya izopropanol gibi suyla karışabilen organik bir solventtir.

İzokratik elüsyonda, piklerin tepe genişliği, teorik plakaların sayısı olan N denklemine göre doğrusal olarak tutma süresi ile (retensiyon zamani) artar. Bu, geç cikan piklerin çok düz ve geniş olması bir dezavantajdır.

HPLC'deki kromatografik ayrışmalar, bir UV detektörü veya bir kütle spektrometresi gibi bir cihaz ile tespit edildiğinde, bileşenlerin sinyal piklerine ayrılmasını tanımlamak için teorik parametreler ve denklemler kullanılır. Bu parametreler büyük ölçüde iki kromatografik teori setinden türetilir: plaka teorisi (Partisyon kromatografisinin bir parçası olarak) ve Van Deemter denklemi. Van Deemter denklemi daha doğru teori olarak kabul edilmesine rağmen, HPLC kromatogramlarının analizinde genelde ikisinden de yararlanılır.

HPLC'de ayrışma tıpkı kağıt kromatografisindeki ayrışan piklerle yapılan retensiyon faktörünün hesaplanmasına benzer. HPLC parametreleri şunlardır: verimlilik faktörü (N), retensiyon faktörü (kappa prime) ve ayırma faktörü (alfa). Faktörler birlikte, iki pikin tepe noktalarının birbirinden ne kadar iyi ayrıldığını veya örtüştüğünü açıklayan bir çözünürlük denklemindeki değişkenlerdir. Bu parametreler çoğunlukla sadece RP-HPLC ve NP-HPLC ayrımlarını tanımlamak için kullanılır, çünkü bu ayrımlar diğer HPLC türlerinden (ör. İyon değişimi ve jel permeasyon) daha küçük olma eğilimindedir.