Polihistidin etiketi

Polihistidin etiketi genellikle proteinlerin N- veya C- sonunda bulunan, en az 6 histidin (His) amino asidinden meydana gelen bir amino asit motifi. Aynı zamanda hekza histidin etiketi, 6xHis etiketi, His6 etiketi ve marka ismiyle His etiketi (EMD Biosciences tarafından literatüre sokulmuştur) olarak bilinir. Etiket Roche tarafından icat edilmiş olmasına rağmen Histidinlerin kullanımı ve vektörlerinin dağıtımı Qiagen tarafından gerçekleştirilir. Qiagen, Sigma, Thermo Scientific, GE Healthcare, Macherey-Nagel, Clontech, Bio-Rad ve diğer şirketler çeşitli histidin-etiketli protein saflaştırma kitlerini edinmeyi mümkün kılar. Etiketin bilimsel amaçlı kullanımı sınırsız iken ticari kullanıcılar Roche' ye telif hakkı ödemesi yapmak zorundadır. Orijinal patent 11 Şubat 2003' te sona erdi. Bundan dolayı şimdi kamu malı olarak ele alınmalıdır. Bazı etiket dizilerinin serbest ticari kullanımı serbesttir. Örneğin; MK(HQ)6 E. coli de güçlendirilmiş anlatımda ve etiket kaldırılmasında kullanılabilir. Etiketteki toplam His sayısı değişebilir. N- veya C-terminal his-etiketleri polihistidin etiketinin -endopeptidazlar tarafından- kaldırılmasını kolaylaştıracak müsait amino asit dizilerinin öncesinde veya sonrasında yer alabilir. Bu fazladan diziler His etiketi N-terminalden, ekzopeptidaz kullanımı ile, kaldırıldığında önem ifade etmezler. Bunun da ötesinde, endoproteaz temelli etiket kaldırılma yönteminin kullanımında spesifik olmayan kesimlere ortaya çıkar. Ekzopeptidazlar bu sorunun ortadan kalkmasına sağlayabilir. Polihistidin-etiketler genellikle genetik olarak değiştirilmiş olan proteinler ve afinite saflaştırması için tercih edilir.

Genelde, proteinler az ya da çok yüzeylerinde metal iyonlarını koordine edebilme yeteneğine sahiptir ve bu koordinasyonun afinitesindeki farklılık kullanılarak kromatografi ile proteinleri birbirinden ayırmak mümkündür. Bu sabitlenmiş metal iyon afinite kromatografisi 1975' te ilan edilmiştir. Hemen ardına yapılan çalışmalar proteinleri oluşturan amino asitler arasında histidinin metal iyonları ile güçlü bağlar kurabildiği anlaşıldı. Yani, genetik mühendisliği ile proteinin sonuna birkaç histidin eklenirse proteinin metal iyonlarına karşı afinitesi kaile alınır biçimde yükselir ve bu afinite kullanılarak genetik olarak modifiye edilmiş hedef protein saflaştırılabilir, temel fikir budur. His etiketine sahip protein pH 8 veya daha bazik durumlarda yüzeye sabitlenmiş olan nikel gibi bir taşıyıcı ile etkileştiğinde, histidin metal iyonları ile etkileşir ve taşıyıcıya bağlanır. Diğer proteinler ya bağlanmayıp ya da çok zayıf bir şekilde bağlandığından taşıyıcı uygun tampon çözelti ile yıkandığında bunlardan kurtulunmuş olunur. Sonra ise imidazol veya benzeri madde taşıyıcıdan ayırarak proteinleri yüksek saflıkta elde etmek mümkündür.

Ni - NTA (nikel - nitrilotriasetik asit) gibi çeşitli ürünler piyasada mevcuttur. Kolonun içinde paketlidir ve santrifüj ve bir test tübünde manyetik ayrım ile kombine edilebilir.

Mtal iyonlarının afiniteleri bakır, nikel çinko ve kobalt sırasınca azalır. Nikel genel amaçlar için sıkça tercih edilirken kobalt ise saflaştırmanın saflığı azaltılmak istendiğinde tercih edilir.

Taşıyıcıdan His etiketli proteini ayrımak için birçok metot vardır ve amaca göre seçim yapılabilir. Proteinlerin denturasyonundan kaçınmak için imidazol kullanımı iyi bir seçenek olarak ele alınır.

Bir bileşik hisitidine benzer bir yapıya sahipse ve ortamda bolca mevcutsa proteinler ile arasında metal iyonlarına bağlanmak için bir rekabet oluşur. ve proteinler taşıyıcıdan ayrılır. Bu kimyasallardan biri imidazoldur. İmidazol histidinin yan zincirini oluşturan bileşiktir. Genelde 150mM veya daha fazla konsantrasyonda kullanılır. Bazı koşullarda ise histidin (proteinin yapısından bağımsız bir şekilde yalnız amino asit olarak) veya histamin aynı amaçla kullanılabilir.

Güçlü bir şelator ajanı eklendiğinde, protein taşıyıcıdan düşer çünkü taşıyıcıdaki sabitlenmiş metal iyonları kaybedilir. Bu amaçla EDTA bir hayli yaygın kullanılır.

Polihistidin-etiketleri sıklıkla E. Coli' de ve diğer prokaryotik anlatım sistemlerinde, anlatımı gerçekleştirilmiş polihistidin-etiketli rekombinant proteinlerin afinite saflaştırması için kullanılır. Bakteri hücreleri santrifüj edilir ve elde edilen hücre peletleri ya fiziksel ya da detejanlar ve enzimler(lizozim gibi) veya bunların kombinasyonu ile lize edilir. Bu adımda lizat rekombinant proteinlerin yanında aynı zamanda bakteriyal hosttan gelen proteinleri de içerir. Karışım divalent nikel veya kobalt iyonlarının bağlı olarak bulunduğu afinite rezininde bekletilir. Afinite rezininin farklı çeşitleri ticari olarak mevcuttur. Nikel ve kobalt benzer özelliklere sahiptir, ikisi de 4. periyod geçiş metallerine komşudur. Rezin genelde sefaroz/agarozdur. Rezin bir şelator (Nikel için iminodiasetik asit (Ni-IDA) ve nitrilotriasetik asit (Ni-NTA), kobalt için ise karboksilmetilaspartat (Co-CMA)) ile işlev kazanır. Şelator polihistidin-etikete mikromolar afinite ile bağlanır. Ardından nikel veya kobalta sipesifik olarak bağlanmamış olan proteinleri kaldırmak amaçlı rezin fosfat tamponu yıkanır. Nikel temelli yöntemlerde, yıkamanın verimini arttırmak amacı ile tampona 20 mM imidazol (genelde 150-300 mM imidazolde proteinler elenmiş olur) ilave edilir. Genelde nikel kullanan rezinler daha yüksek bağlanma kapasitesine sahip olurken kobalt temelli rezinler yüksek saflık vadeder. Proteinin saflığı ve miktarı SDS-PAGE veya Western blot ile öğrenilebilir.

Polihistidin etiketi kullanılarak yapılan afinite saflaştırmaları, rekombinant protein prokaryot bir organizmadan elde edilmiş ise, saf protein eldesi ile sonuçlanır. Sonraki adımdaki yapılacak uygulamaya(protein ilişkilerinin çalışılması için protein komplekslerinin izolasyonu, mantar veya diğer yüksek ökaryot organizmalardan yapılacak saflaştırmalar gibi) göre değişmekle beraber -saflığı yükseltmek amaçlı iki etiket kullanan- ardışık afinite saflaştırmaya ihtiyaç duyulabilir. Alternatif olarak, nikel iyonları yerine kobalt iyonları sabitlenmiş rezini kullanan tek-adımda saflaştırma yöntemi saflıkta önemli ölçüde yükselme sağlarken his-etiketli proteinlerin elenmesinde kullanılan imidazol miktarını da düşürür.

Polihistidin-etiketleme çalışma prensibi gereğince proteinlere sadece ve sadece birincil yapısına bağlı olarak etkir. Bundan dolayı denature edici koşullarda bulunan rekombinant proteinlerin saflaştırılması için bir seçenek haline gelir. Örneğin, yoğun bir biçimde bir içerme kesinde eksprese olan ve çözünür olarak elde edilemeyen rekombinant proteinler bile üre veya guanidin hidroklorür ile denaturasyon ile saflaştırılabilir. Bunun gibi denature edici durumlarda histidin bağlanması imidazol bağlanması yerine pH kullanılarak titre edilir. Yüksek pH' da histidin nikel veya kobalta bağlanabilirken düşük pH' da (kobalt için ~6, nikel ~4) bağlanma gerçekleşmeş çünkü histidin protone olur. GST saflaştırması ve antikor saflaştırılmasının uygulanması için proteinin katlanmış halde olmasını gerekir. Diğer yandan, His etiketi diğer etiketlere göre toplanmaya ve çözünürlüğünü kaybetmeye daha çok eğilimlidir.

Polihistidin-etiket sütunun bazı proteinleri safsızlık olarak barındırır. Bu safsızlıklardan biri yaklaşık 25kDa ağırlığındaki FKBP-tipi peptidil prolil izomerazdır (SlyD). Sıklıkla, safsızlıklardan kurtulmak için ya ikinci bir kromatografik teknik kullanılır veya rekombinant proteinin anlatımı SlyD- yoksunu bir E.koli sujunda gerçekleştirilir. Başka bir çözüm ise kobalt rezinin SlyD' ye (E. coli) karşı afinitesinin daha düşük olması sebebi ile tercih edilmesidir, bazı durumlarda faydalı olduğu belirtilmiştir.

Farklı sayıda polihistidin etiketine sahip proteinler nikel afinite rezininde farklı olarak elenirler. Bir hekzahistidin etiketine sahip proteinler 75 mM imidazol ile Ni-NTA rezinde elenirler. İki etikete sahip olanlar ise elenmek için 100 mM imidazole ihtiyaç duyar. Bu adım adım eleme spesifik bir karışımdan protein parçalarının izolasyonunda kullanılabilir. Mesela tanımlanmış heteromultimerler (AA ve BB homodimerlerini içeren bir karışımdan,eğer sadece B polihistidin etiketine sahip ise, AB heterodimerinin izolesi gibi). bu şekilde izole edilebilir. Benzeri bir yaklaşım monovalent streptavidin izolasyonunda da kullanılır.

Polihistidin-etiketleme, çekme-itme tahlili ile aynı biçimde protein-protein etkileşimlerini belirlemek için kullanılabilir. Ancak bu teknik-bu iş için- daha az hassas olarak ele alınır ve fazlaca titizlik isteyen bölümlerinden dolayı kullanıcıyı sınırlar. Örneğin; indirgen koşullar kullanılamaz, bu da EDTA ve birçok çeşit deterjanın kullanımının mümkün olmadığı anlamına gelir. Dual polarizasyon interferometrisindeki yeni gelişmeler EDTA ve birçok kimyasalın kullanımın bu yöntemde kullanımının yolunu açtı ve böyle taraf-spesifik etiketlerin kullanımı konformasyonal değişim ile ilişkili direkt ölçümleri büyük oranda kolaylaştırdı.

Hekzahistadin CyDye etiketleri geliştirilmiştir. Bunlar floroforlara bağlı EDTA ile ile kovalent koordinasyonda olan nikeli kullanır, polihistidin-etiket bağlandığında boyanma gerçekleşir. Bu tekniğin protein trafiğini ve göçünü takipte etkili olduğu açıklanmıştır. Yeni gelişmeler bu tekniğin Floresans Rezonans Enerji Transferi yardımı ile uzaklık ölçümünde etkili olabileceğini gösterdi.

Poliflorohistidin etiket in vitro translasyon sistemlerinde kullanım için raporlanmıştır. Bu sistemde, bir genişletilmiş genetik kod kullanılır. Bu kodda histidin yerine 4-florohistidin kullanılır. Florlanmış analog, histidin-tRNA ligazın gevşemiş subsrat spesifitesi ile, peptitlere dahil olur ve etiketin toplam pKa değerinin düşmesine sebep olur. Bu durum poliflorohistidin etiketli peptidlerin -geleneksel polihistidin etiketlerinin komplex karışımı varlığında- yıkama tamponlarının pH' ı değiştirilerek seçici zenginleştirilmesine izin verir.

En yaygın polihistidin etiketler 6 histidinden ibarettir. Metiyonini takip edecek şekilde ilgili proteini kodlayan genin N-terminusuna eklenir ve hemen durma kodonundan önce sona erer. His etiketinin hangi terminusa ekleneceği temel olarak proteinin karakteristiğine ve etiketi kaldırmada kullanılacak olan metoda bağlıdır. Bazı uçlar proteinin hidrofobik çekirdeğine gömülüdür ve bu gömülü kısımlar proteinin işlevselliği veya yapısı için önem ifade eder. Bu durmlarda seçenekler sadece diğer uç ile sınırlıdır. Buna ilave olarak çoğu ekzopeptidazlar sadece N ucundan etiket kaldırabilir. C ucundan etiket kaldırmak ise başka metodlar gerektirir. Yöntem seçiminde bilgisayar simulasyonlarını(moleküler dinamik ile) hesaba katmak seçenekler arasında seçim yapmak için önemlidir. Örneğin; His etiketi sindirilmek zorunda mı yoksa N- veya C ucuna göre modifiye mi edilmeli ikileminde bilgisayar simulasyonları seçim konusunda yardımcı olabilir.

Polihistidinleri eklemenin iki yolu vardır. En kolayı proteini kodlayan DNA parçasını His etiketi kodlayan vektöre entegre etmektir. Diğer seçenek ise başlama kodonuna veya durma kodonuna yanına tekrar eden histidin kodlayan kodonlar (CAT veya CAC) barındıran primerler ile PCR yapmaktır.

Polihistidin etiketi,anti-polihistidin-etiketli antikorları kullanımı veya alternatif olarak metal iyonları taşıyan floresan problar ile jelde boyama(SDS-PAGE) ile proteinleri tanılamak için kullanılabilir. Bu hücrealtı lokalizasyonda, ELISA, Western blot ve diğer immüno-analitik metodlarda kullanışlı olabilir.

Polihistidin etiketi proteinlerin bir yüzeye sabitlenmesinde başarılı biçimde kullanılabilir. Bu yüzey nikel veya kobalt kaplı mikrotiter tabak veya bir protein sırası(array) olabilir.

Histidine and asparajin birbirine değişerek devam ettiği peptid etiketleri (HNHNHNHNHNHN) mevcuttur ve proteinin yüzeyinde bulunması His etiketinde bulunmasından daha olağandır. Sabitlenmiş metal iyonlarına His etiketinden daha verimli bağlanır.

Bu peptit etiketi (KDHLIHNVHKEEHAHAHNK) tavuk laktat dehidrogenazdan türetilmiştir. His etiketi yük dağılımında sapma gösterirken bu etiket bu tür bir davranız sergilemez ve suda çözünür bir protein olma eğilimindedir. Histidinin düzeni His etiketinden olduğundan daha sterik hale gelir ve sabitlenmiş metal iyonuna daha verimli bağlanır.