Gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu

Gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (gerçek zamanlı PCR), polimeraz zincir reaksiyonuna (PCR) dayanan bir moleküler biyoloji laboratuvar tekniğidir. Hedeflenen bir DNA molekülünün amplifikasyonunu geleneksel PCR'da olduğu gibi sonunda değil, PCR sırasında (yani gerçek zamanlı olarak) izler. Real-time PCR, kantitatif (kantitatif real-time PCR) ve yarı-kantitatif (yani, belirli bir miktarda DNA molekülünün üstünde/altında) olarak kullanılabilir.

Gerçek zamanlı PCR'da PCR ürünlerinin tespiti için iki yaygın yöntem kullanılmaktadır: (1) herhangi bir çift sarmallı DNA ile araya giren spesifik olmayan flüoresan boyalar ve (2) bir flüoresan raportör ile etiketlenmiş oligonükleotitlerden oluşan diziye özgü DNA problarıdır. İkinci metot, yalnızca probun tamamlayıcı dizisi ile hibridizasyonundan sonra algılamaya izin verir.

Kantitatif Gerçek Zamanlı PCR Deneylerinin Yayınlanması için Asgari Bilgi (MIQE) kılavuzları, kantitatif gerçek zamanlı PCR için qPCR kısaltmasının ve ters transkripsiyon-qPCR için RT-qPCR'nin kullanılmasını önermektedir. "RT-PCR" kısaltması, genel olarak ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonunu belirtir, gerçek zamanlı PCR'yi değil. Ancak tüm yazarlar bu sözleşmeye uymaz.

Tüm organizmalardaki hücreler, gen ekspresyonunu gen transkriptlerinin (tek iplikli RNA) devri ile düzenler: Bir hücrede eksprese edilen bir genin miktarı, o genin RNA transkriptinin kopya sayısı ile ölçülebilir. Küçük miktarlarda RNA'dan gen ekspresyonunu sağlam bir şekilde saptamak ve ölçmek için gen transkriptinin amplifikasyonu gereklidir. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), DNA'yı çoğaltmak için yaygın bir yöntemdir; RNA bazlı PCR için RNA numunesinden ilk önce ters transkriptaz ile tamamlayıcı DNA'larının (cDNA) oluşturulması gerekmektedir.

Küçük miktarlarda DNA'yı amplifiye etmek için, bir DNA şablonu, en az bir çift spesifik primer, deoksiribonükleotid, uygun bir tampon solüsyonu ve bir termo-stabil DNA polimeraz kullanılarak geleneksel PCR'deki ile aynı metodoloji kullanılır. Bir işaretli bir madde (florofor) de bu karışıma ilave edilir. PCR işlemi floroforun floresan ışımalarını ölçebilecek sensörler içerir. Yapılan ışıma, üretilen DNA miktarıyla doğru orantıı olacağından, her PCR döngüsünde amplifiye edilmiş ürünün üretim hızının ölçülmesini sağlar. Bu şekilde oluşturulan veriler, birkaç numunede nispi gen ekspresyonunu (veya mRNA kopya sayısını) hesaplamak için bilgisayar yazılımı ile analiz edilebilir Üretilen (amplifiye edilen) DNA miktarı her döngüsünden sonra ölçüldüğünden, dolayısıyla tüpteki çift zincirli DNA molekülünün miktarı zamana bağlı olarak izlenebildiğinden bu yönteme real time PCR (yani anında veya simultane PCR) denir. RNA miktar tayini durumunda şablon ribonükleik asidin (RNA) ters transkripsiyonuyla elde edilen tamamlayıcı DNA'nın (cDNA) oluşturulması şarttır. Bu durumda kullanılan teknik, nicel RT-PCR veya Q-RT-PCR'dir.

Kantitatif (nicel) PCR ve DNA mikrodizisi, gen ekspresyonunu incelemek için kullanılan en modern yöntemlerdendir. mRNA miktarını ölçmek için kullanılan eski yöntemler: Diferansiyel gösterim, RNaz koruma tahlili ve Northern Blot'tur . Northern blot, bir numunedeki mRNA transkriptinin bolluğunu görselleştirerek bir genin ekspresyon seviyesini tahmin etmek için sıklıkla kullanılır. Bu yöntemde saflaştırılmış RNA, agaroz jel elektroforezi ile ayrılır, katı bir matrise (naylon membran gibi) aktarılır ve ilgili gene tamamlayıcı olan spesifik bir DNA veya RNA probu ile problanır. Bu teknik hala gen ekspresyonunu değerlendirmek için kullanılsa da, nispeten büyük miktarlarda RNA gerektirir ve mRNA seviyelerine ilişkin yalnızca kalitatif veya yarı kantitatif bilgi sağlar. Dahası bu yöntemde, DNA bütünlüğü, enzim verimliliği ve diğer birçok faktörün sonucu olarak tahmin hataları görülebilir. olabilir. Bu nedenle bir dizi standardizasyon sistemi (genellikle normalizasyon yöntemleri olarak adlandırılır) geliştirilmiştir. Bazıları toplam gen ekspresyonunu ölçmek için geliştirilmiştir, ancak en yaygın olanı, neredeyse sabit ekspresyon seviyesi için seçilen normalleştirici gen olarak adlandırılan başka bir gen ile ilişkili olarak çalışılan spesifik genin miktarını belirlemeyi amaçlar. Bu genler genellikle temel hücresel hayatta kalma ile ilgili işlevleri normal olarak kurucu gen ekspresyonunu ifade ettiği için house-keeping genlerinden seçilir. Bu, araştırmacıların, seçilen normalleştiricinin ifadesine bölünen ilgili genlerin ifadesi için bir oran rapor etmelerini sağlar. Böylece, mutlak ifade seviyesini fiilen bilmeden öncekinin karşılaştırılmasına izin verir.

Gerçek zamanlı PCR, her numuneyi en az bir belirli dalga boyunda bir ışık huzmesi ile aydınlatma ve uyarılmış florofor tarafından yayılan floresansı tespit etme kapasitesine sahip bir termal döngüleyicide gerçekleştirilir. Termal döngüleyici ayrıca numuneleri hızla ısıtabilir ve soğutabilir, böylece nükleik asitlerin ve DNA polimerazın fizikokimyasal özelliklerinden yararlanır.

PCR işlemi genellikle 25-50 kez tekrarlanan bir dizi sıcaklık değişiminden oluşur. Bu döngüler normalde üç aşamadan oluşur: ilki, yaklaşık 95 °C, nükleik asidin çift zincirinin ayrılmasını sağlar; ikincisi, yaklaşık 50-60 °C derecelik bir sıcaklıkta, primerlerin DNA şablonu ile bağlanmasına izin verir; üçüncü, 68-72 °C arasında, DNA polimeraz tarafından gerçekleştirilen polimerizasyon kolaylaştırılır. Parçaların küçük boyutu nedeniyle, enzim, hizalama aşaması ve denatüre etme aşaması arasındaki değişim sırasında DNA amplikonunu kopyalayabildiğinden, bu tip PCR'de genellikle son aşama atlanır. Ek olarak, dört aşamalı PCR'de floresan, her döngüde yalnızca birkaç saniye süren kısa sıcaklık fazlarında, örneğin 80 °C'lik bir sıcaklıkta ölçülür; bunun nedeni, spesifik olmayan bir boya kullanıldığında primer dimerlerin varlığından kaynaklanan sinyali azaltabilmektir Her döngü için kullanılan sıcaklıklar ve zamanlamalar, DNA'yı sentezlemek için kullanılan enzim , reaksiyondaki iki değerlikli iyonların ve deoksiribonükleotitlerin (dNTP'ler) konsantrasyonu ve primerlerin bağlanma sıcaklığı gibi çok çeşitli parametrelere bağlıdır.

Bir DNA bağlayıcı boya, PCR'deki tüm çift sarmallı (ds) DNA'ya bağlanır ve boyanın floresan kuantum verimini arttırır. Bu nedenle PCR sırasında DNA ürünündeki bir artış, her döngüde ölçülen floresan yoğunluğunda bir artışa yol açar. Ancak, SYBR Green gibi dsDNA boyaları, spesifik olmayan PCR ürünleri (Primer dimer gibi) dahil olmak üzere tüm dsDNA PCR ürünlerine bağlanacaktır. Bu, potansiyel olarak amaçlanan hedef dizinin doğru izlenmesini zorlaştırabilir veya engelleyebilir.

dsDNA boyaları ile gerçek zamanlı PCR'de reaksiyon, floresan dsDNA boyasının eklenmesiyle her zamanki gibi hazırlanır. Daha sonra reaksiyon gerçek zamanlı bir PCR cihazında yürütülür ve her döngüden sonra floresan yoğunluğu bir detektör ile ölçülür; boya sadece dsDNA'ya (yani PCR ürününe) bağlandığında floresan verir. Bu yöntem, amplifikasyonu gerçekleştirmek için yalnızca bir çift primere ihtiyaç duyma avantajına sahiptir, bu da maliyetleri düşürür; farklı boya türleri kullanılarak bir tüp içinde birden fazla hedef dizi izlenebilir.

Floresan raportör probları, yalnızca proba tamamlayıcı diziyi içeren DNA'yı algılar; bu nedenle, raportör probunun kullanılması özgüllüğü önemli ölçüde artırır ve tekniğin diğer dsDNA'ların varlığında bile gerçekleştirilmesini sağlar. Farklı renkli etiketler kullanan floresan problar, aynı tüpte birkaç hedef diziyi izlemek için multipleks tahlillerde kullanılabilir. Floresan raportör problarının özgüllüğü, PCR'da istenmeyen potansiyel yan ürünler olan primer dimerlerin neden olduğu ölçümlerin karışmasını da önler. Bununla birlikte, floresan raportör probları, reaksiyonda istenen ürünlerin birikmesini engelleyen primer dimerlerin inhibitör etkisini engellemez.

Yöntem, bir ucunda bir floresan raportör ve sondanın karşı ucunda bir floresan söndürücü bulunan DNA bazlı bir sondaya dayanır. Muhabirin söndürücüye yakınlığı, floresansının saptanmasını engeller; Taq polimerazın 5' ila 3' eksonükleaz aktivitesi ile probun bozulması, raportör-söndürücü yakınlığını kırar ve böylece bir lazerle uyarıldıktan sonra tespit edilebilen söndürülmemiş floresan emisyonuna izin verir. Bu nedenle, her PCR döngüsünde raportör prob tarafından hedeflenen üründeki bir artış, probun bozulması ve habercinin serbest bırakılması nedeniyle floresanda orantılı bir artışa neden olur.

Yeni bir DNA zincirinin polimerizasyonu primerlerden başlatılır ve polimeraz proba ulaştığında, onun 5'-3'-eksonükleazı probu bozar, floresan raportörünü söndürücüden fiziksel olarak ayırarak floresansta bir artışa neden olur.

Floresans, gerçek zamanlı bir PCR makinesinde saptanır ve ölçülür ve ürünün üstel artışına karşılık gelen geometrik artışı, her reaksiyonda niceleme döngüsünü (<sub id="mwkg">Cq</sub>) belirlemek için kullanılır.

Gerçek zamanlı PCR, spesifik tanımlama, kendi analizi kullanılarak büyütülmüş DNA fragmanları izin erime sıcaklığı (Tm değeri olarak gösterilir). Kullanılan yöntem genellikle spesifik olmayan bağlanmadır. DNA çift zincirli yapısına bağlanan boya genellikle SYBR Green'dir. DNA erime sıcaklığı, amplifiye fragmana özgüdür. Bu tekniğin sonuçları, analiz edilen DNA örneklerinin ayrışma eğrilerinin karşılaştırılmasıyla elde edilir.

Geleneksel PCR'dan farklı olarak, bu yöntem, tüm numunelerin sonuçlarını göstermek için kullanılan elektroforeze ihtiyaç duymaz. Bunun nedeni, kinetik bir teknik olmasına rağmen, kantitatif PCR'nin genellikle farklı bir son noktada değerlendirilmesidir. Bu nedenle teknik genellikle daha hızlı sonuçlar sağlar ve/veya elektroforezden daha az reaktan kullanır. Müteakip elektroforez, yalnızca gerçek zamanlı PCR'nin şüpheli olduğunu gösterdiği numuneleri test etmek ve/veya belirli bir belirleyici için pozitif test edilmiş numuneler için sonuçları onaylamak gerekli olabilir.

Üstel amplifikasyon aşamasında, hedef DNA şablonunun (amplikon) miktarı her döngüde ikiye katlanır. Örneğin, en Cq değeri bir diğerini 3 döngü bakımından geçen bir numune 2 3 = 8 kat daha fazla şablon ihtiva etmektedir. Bununla birlikte, amplifikasyonun verimliliği, primerler ve şablonlar arasında genellikle değişkendir. Bu nedenle, bir primer-kalıp kombinasyonunun verimliliği, her seyreltme ile (<sub id="mwsw">Cq</sub>)' deki değişimin standart bir eğrisini oluşturmak için DNA şablonunun seri dilüsyonları ile bir titrasyon deneyinde değerlendirilir. Lineer regresyonun eğimi daha sonra amplifikasyonun verimini belirlemek için kullanılır, eğer 1:2'lik bir seyreltme 1'lik bir (<sub id="mwtw">Cq</sub>) farkla sonuçlanırsa verim %100'dür. Döngü eşiği yöntemi, reaksiyon mekanizmasının birkaç varsayımını yapar ve amplifikasyon profilinin düşük sinyal-gürültü bölgelerinden gelen verilere güvenir ve veri analizi sırasında önemli farklılıklar ortaya çıkarabilir.

Gen ekspresyonunu ölçmek için ilgili genin DNA veya RNA'sı için elde edilen <sub id="mwvA">(Cq)</sub> değeri aynı deney kurgusunda analizi gerçekleştirilen house-keeping genin DNA veya RNA'sı için ölçülen <sub id="mwvg">(Cq)</sub> değerinden çıkarılır. Bu normalleştirme prosedürüne genel olarak ΔC t- yöntemi olarak isimlendirilir ve ilgili bir genin ifadesinin farklı numuneler arasında karşılaştırılmasına izin verir. Bununla birlikte, böyle bir karşılaştırma için, normalleştirici referans geninin ifadesinin tüm numunelerde çok benzer olması gerekir. Bu kriteri karşılayan bir referans genin seçilmesi bu nedenle çok önemlidir ve çoğu zaman zordur, çünkü sadece çok az gen bir dizi farklı koşul veya dokuda eşit düzeyde ekspresyon gösterir. Döngü eşiği analizi birçok ticari yazılım sistemiyle entegre olmasına rağmen, tekrarlanabilirliğin önemli olduğu durumlarda dikkate alınması gereken amplifikasyon profili verilerini analiz etmenin daha doğru ve güvenilir yöntemleri vardır.

Mekanizma tabanlı qPCR niceleme yöntemleri de önerilmiştir ve niceleme için standart bir eğri gerektirmeme avantajına sahiptir. MAK2 gibi yöntemlerin standart eğri yöntemlerine eşit veya daha iyi nicel performansa sahip olduğu gösterilmiştir. Bu mekanizmaya dayalı yöntemler, orijinal numune konsantrasyonunun tahminlerini oluşturmak için polimeraz amplifikasyon süreci hakkındaki bilgileri kullanır. Bu yaklaşımın bir uzantısı, yüksek sinyal-gürültü verilerinin kullanımına ve analizden önce veri kalitesini doğrulama yeteneğine izin veren tüm PCR reaksiyon profilinin doğru bir modelini içerir.

Ruijter ve arkadaşlarının araştırmasına göre. MAK2, PCR reaksiyonu sırasında sabit amplifikasyon verimliliğini varsayar. Bununla birlikte, MAK2'nin türetildiği polimeraz zincir reaksiyonunun teorik analizi, amplifikasyon etkinliğinin PCR boyunca sabit olmadığını ortaya çıkarmıştır. MAK2 kantifikasyonu, normal qPCR koşulları altında bir numunedeki hedef DNA konsantrasyonunun güvenilir tahminlerini sağlarken, MAK2, rakip ölçüm cihazlarıyla qPCR testleri için hedef konsantrasyonu güvenilir bir şekilde ölçmez.

Laboratuvarda nicel polimeraz zincir reaksiyonunun kullanılabileceği birçok uygulama vardır. Hem teşhis hem de temel araştırma için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Tekniğin endüstrideki kullanımları, gıdalardaki veya bitkisel maddelerdeki mikrobiyal yükün ölçülmesini, GDO'ların (Genetiği değiştirilmiş organizmalar) saptanmasını ve insan viral patojenlerinin miktarının belirlenmesini ve genotiplenmesini içerir.

Geleneksel DNA saptama yöntemleriyle gen ifadesini ölçmek güvenilir değildir. Bir Northern blot üzerinde mRNA veya bir jel veya Southern blot üzerinde PCR ürünlerinin saptanması, kesin nicelemeye izin vermez. Örneğin, tipik bir PCR'ın 20-40 döngüsü boyunca, DNA ürününün miktarı, ilk PCR'deki hedef DNA miktarı ile doğrudan ilişkili olmayan bir platoya ulaşır.

Gerçek zamanlı PCR, nükleik asitleri iki yaygın yöntemle ölçmek için kullanılabilir: nispi nicelik ve mutlak nicelik. Mutlak niceleme, bir kalibrasyon eğrisi kullanılarak DNA standartlarıyla karşılaştırılarak hedef DNA moleküllerinin tam sayısını verir. Bu nedenle örneğin PCR'ının ve standardın aynı amplifikasyon verimliliğine sahip olması önemlidir. Göreceli niceleme, hedef genin ekspresyonundaki kat farklılıklarını belirlemek için dahili referans genlerine dayanır. Kantifikasyon, tamamlayıcı DNA (mRNA'nın ters transkripsiyonuyla oluşturulan cDNA) olarak yorumlanan mRNA'nın ekspresyon seviyelerindeki değişiklik olarak ifade edilir. Çalışılan genin miktarı bir kontrol referans geninin miktarı ile karşılaştırıldığında bir kalibrasyon eğrisi gerektirmediğinden bağıl nicelemenin gerçekleştirilmesi daha kolaydır.

Göreceli nicelemenin sonuçlarını ifade etmek için kullanılan birimler önemsiz olduğundan, sonuçlar bir dizi farklı RTqPCR ile karşılaştırılabilir. Bir veya daha fazla house-keeping geni kullanmanın nedeni, kullanılan RNA'nın niceliği ve kalitesindeki farklılıklar gibi, ters transkripsiyonun ve dolayısıyla tüm PCR sürecinin verimliliğini etkileyebilecek spesifik olmayan varyasyonları düzeltmektir. Ancak sürecin en can alıcı yönü, referans genin kararlı olması gerektiğidir.

Bu referans genlerin seçimi geleneksel olarak moleküler biyolojide RNA jellerinin görsel muayenesi, Northern Blot dansitometrisi veya yarı niceliksel PCR (PCR taklitleri) gibi niteliksel veya yarı niceliksel çalışmalar kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Şimdi, genom çağında, transkriptomik teknolojileri kullanan birçok organizma için daha ayrıntılı bir tahmin yürütmek mümkün. Ancak araştırmalar, mRNA ekspresyonunun nicelleştirilmesinde kullanılan referans genlerin çoğunun amplifikasyonunun deneysel koşullara göre değiştiğini göstermiştir. Bu nedenle, en uygun referans geni seçmek için istatistiksel olarak sağlam bir metodolojik başlangıç çalışması yürütmek gereklidir.

Belirli koşullar altında hangi genin veya genlerin kullanım için en uygun olduğunu tespit edebilen bir dizi istatistiksel algoritma geliştirilmiştir. geNORM veya BestKeeper yazılımlar, farklı referans genler ve dokulardan oluşan bir matris için çiftleri veya geometrik ortalamaları karşılaştırabilir.

Teşhis amaçlı kalitatif PCR, örneğin bulaşıcı hastalıklar, kanser ve genetik anormalliklerin teşhisi için, ilgili hastalıklara özgü olan nükleik asitleri hızlı bir şekilde tespit eder. Niteliksel PCR testlerinin klinik mikrobiyoloji laboratuvarına sunulması, bulaşıcı hastalıkların tanısını önemli ölçüde iyileştirdi Ayrıca, yeni grip ve koronavirüs 'ün teşhis testlerinde de PCR'ın kullanımı büyük öneme sahiptir.

Kantitatif PCR, gıda güvenliği, gıda bozulması ve fermantasyon alanlarında çalışan mikrobiyologlar tarafından ve su kalitesinin (içme ve eğlence suları) mikrobiyal risk değerlendirmesi ve halk sağlığının korunmasında kullanılmaktadır.

qPCR, çevresel örneklerden alınan DNA'daki genlerin taksonomik veya fonksiyonel belirteçlerini amplifiye etmek için de kullanılabilir. İşaretleyiciler, DNA veya tamamlayıcı DNA'nın genetik fragmanları ile temsil edilir. Belirli bir genetik elementin amplifiye edilmesiyle, amplifikasyondan önce numunedeki elementin miktarı ölçülebilir. Taksonomik belirteçlerin (ribozomal genler) ve qPCR'nin kullanılması, bir numunedeki mikroorganizma miktarının belirlenmesine yardımcı olabilir ve belirtecin özgüllüğüne dayalı olarak farklı familyaları, cinsleri veya türleri tanımlayabilir. Fonksiyonel belirteçlerin (protein kodlayan genler) kullanılması, bir topluluk içindeki gen ekspresyonunu gösterebilir ve bu da çevre hakkında bilgi verebilir.

Tarım endüstrisi, ekonomik kayıpları önlemek ve sağlığı korumak için sürekli olarak patojen içermeyen bitki propagülleri veya fideleri üretmeye çalışmaktadır. Oaks ve diğer türleri öldüren bir oomycete olan Phytophthora ramorum'un DNA'sının, konakçı bitkinin DNA'sı ile karıştırılmış küçük miktarlarının saptanmasını sağlayan sistemler geliştirilmiştir. Patojenin DNA'sı ile bitki arasındaki ayrım, her takson için karakteristik olan ribozomal RNA geninin kodlama alanında yer alan aralayıcılar olan ITS dizilerinin amplifikasyonuna dayanır. Bu tekniğin saha tabanlı versiyonları da aynı patojeni tanımlamak için geliştirilmiştir.

DNA tespitinde duyarlılığı ve dinamik aralığı göz önüne alındığında, ters transkripsiyon (RT-qPCR) kullanan qPCR, GDO'ları tespit etmek için kullanılabilir. DNA veya protein analizi gibi alternatifler genellikle daha az duyarlıdır. Transgeni değil, vektörün mühendislik işlemi sırasında kullanılan promotörü, terminatörü ve hatta ara dizileri çoğaltan spesifik primerler kullanılır. Bir transgenik bitki yaratma süreci normal olarak transgenin birden fazla kopyasının eklenmesine yol açtığından, miktarı da yaygın olarak değerlendirilir. Bu genellikle, yalnızca tek bir kopya olarak mevcut olan, tedavi edilen türden bir kontrol geni kullanılarak nispi niceleme yoluyla gerçekleştirilir.

Virüsler, direkt enfeksiyon sonucunda veya klasik tekniklerle tanıyı zorlaştıran ve yanlış prognoz ve tedavi ile sonuçlanabilen, koenfeksiyonlar nedeniyle insanlarda bulunabilmektedir. qPCR kullanımı, Hepatit B virüsü gibi bir virüsün hem nicelleştirilmesine hem de genotiplenmesine (erime eğrileri kullanılarak gerçekleştirilen suşun karakterizasyonu) izin verir. Hastanın dokusunun birimi başına viral genomun kopyaları olarak ölçülen enfeksiyon derecesi birçok durumda önemlidir; örneğin, tip 1 herpes simpleks virüsünün yeniden aktive olma olasılığı, ganglionlardaki enfekte nöronların sayısı ile ilgilidir. Bu miktar analizi, rahim ağzı kanserinin görünümü ile ilişkili HPV (insan papilloma virüsü) varyantları durumunda olduğu gibi, virüsün döngüsünün herhangi bir noktasında insan genomuna entegre olması durumunda meydana geldiği gibi, ters transkripsiyonla veya onsuz gerçekleştirilir Real-time PCR, katı organ veya kemik iliği transplantasyonunu takiben bağışıklığı baskılanmış hastalarda görülen insan sitomegalovirüsünün (CMV) nicelleştirilmesini de beraberinde getirmiştir.