Kan kültürü

Kan kültürü, insan kanında bulunan bakteri veya mantarları tespit etmek amacıyla klinik laboratuvarlarda kullanılan bir testtir. Kan normal şartlar altında mikroorganizma içermez, yani sterildir. Kanda mikroorganizmaların bulunması, bakteriyemi ya da fungemi diye adlandırabileceğimiz kan enfeksiyonunu işaret eder ki bu durum sepsis gibi ciddi durumlara neden olabilir. Kan kültüre edilerek mikroplar ve ayrıca mikropların antibiyotiklere direnci tespit edilir ki bu olay klinisyenin doğru ve efektif tedaviye yönlenmesine yardım eder.

Testi yapmak için, mikroorganizmaların üremesini artıran bir sıvı içeren tüpe kan alınır. Genelde tek kan alımında, oksijene ihtiyaç duyan ve duymayan organizmaları tespit etmek amacıyla iki farklı tüp kullanılır. Bu tüplere kültür seti adı verilir. Bazen tek yerden kan almak yerine çift yerden kan alınması tercih edilir. Yalnız birinde olan üreme bize bu mikroorganizmaların kandan değil deriden kontaminasyon ile geldiğini düşündürür. Test öncesinde antibiyotik kullanımına devam eden hastalarda veya yeteri kadar kan alınamayan hastalarda yanlış negatiflikler gözlenebilir. Bazı mikroorganizmalar ise kanda üreyemez ve özel besiyerlerine ihtiyaç duyarlar.

Tüpler, organizmaların üreyebilmesi için gerekli ortamı sağlayan inkübasyon cihazına yerleştirilir ve birkaç gün beklenir. Mikrobiyal bir büyüme gözlenmesi durumunda, mikroorganizmaların hakkında ön bilgi edinmek ve kimlikliklerini tespit etmek amacıyla gram boyama uygulanır. Koloni ayrımı yaparak tam bir kimlik ayrımı yapmak ve antimikrobiyal testleri uygulamak amacıyla agar plağa yeniden ekim yapılır. Kan enfeksiyonlarında acil tanı ve tedavi endikasyonu olduğu için PCR ve MALDI-TOF MS testleri de kullanılır.

Kan kültürü prosedürleri ilk kez 19. yüzyılın ortalarında yayımlandı ancak bu ilk teknikler yoğun emek isteyen ve günümüz teknikleriyle az benzerliği olan tekniklerdi. Mikrobiyal büyümenin tespit edilmesi, 1970lerde kullanıma sunulan ve mikroorganizmaların ürettikleri gazları tespit eden otomatize sistemlerden önce, yalnızca kültür şişelerinin izlenmesi ile gerçekleştiriliyordu. Bu otomatize sistemler gelişmiş ülkelerde büyük ölçüde ilkel sistemlerin yerini almıştır.

Kan normal şartlar altında sterildir. Kanda bakterilerin varlığı bakteriyemi, mantarların varlığı fungemi diye adlandırılır. Bakteriler,diş fırçalama veya defekasyon gibi durumlar sırasında deri ve muköz membranlardaki küçük sıyrıklardan kana karışabilir ancak bu bakteriler bağışıklık ve retiküloendotelial sistem elemanları tarafından hemen tespit edilir ve yok edilir. Bu yüzden kan kültüründe kana bu ufak bakteri karışmalarının tespit edilmesi nadirdir. Bakteriler kana selülit, üriner sistem enfeksiyonları, pnömoni gibi durumlar sonucunda geçebilirler. Ayrıca vasküler sistemi de içerebilen bakteriyel endokardit ya da intravenöz çizgilenme ile ilişkili enfeksiyonlar da daimi bir bakteriyemiye yol açabilir. Fungemi insanlarda daha çok immün sistemin düzgün işlemediği durumlarda gözlenir. Eğer bakteriler veya mantarlar kandan temizlenemez ise bu mikroorganizmalar diğer organlara ve dokulara yayılabilir ve hatta immün yanıtın uyarması ile hayatı tehdit eden, sistemik inflamatuvar bir durum olan sepsis’e yol açabilir.

Hastada sepsis tespit edildiği takdirde, kültür hazırlayıp mikroorganizmayı tespit etmek ve gerekli antimikrobiyal tedaviyi uygulamak şarttır. Hastaneye yatan ve ateş, düşük vücut ısısı gibi semptomlar, löksitoz veya granülosit sayısı azlığı gibi bulgular kandaki olası bir enfeksiyon riskine karşı kültüre edilir. Kan kültürü aynı zamanda kemoterapi uygulamasının bir komplikasyonu olan febril nötropeni (nötrofil sayısının azlığı ile seyreden ateş) durumunda da uygulanır.Menenjit, septik artrit ve epidural apse durumunda bakterilerin kana geçme olasılığı çok yüksek olduğundan mutlaka ama mutlaka kültür yapılmalıdır. Enfeksiyonun ana oluşum yerinden kültür yapılamadığı durumlarda veya kana geçme riski ve oranı az olsa bile intravasküler enfeksiyonların önlenmesi amacıyla kan kültürü yine yapılmalıdır Nedeni bilinmeyen ateş ve endokardit altında yatan nedenler de kan kültürü yapılarak açığa çıkartılabilir.

Koagülaz negatif stafilokoklara da sıklıkla kanda rastlanabilir ancak normal deri florasının elamanı olan bu mikroorganizmaların kontaminant veya gerçek patojen olup olmadığını ayırt etmek zordur. Yeni doğanlardan ve çocuklardan izole edilen koagülaz negatif stafilokoklar önemli enfeksiyonları işaret edebilir. Kan enfeksiyonlarının epidemiyolojisi mekan ve zamana göre farklılık gösterir ; örneğin Amerika Birleşik Devletleri'nde 1980'ler ve 1990'lar süresince bakteriyemi nedeni olarak gram positif mikroorganizmalar gram negatif mikroorganizmalardan baskın konuma geçmiştir. Ayrıca kemoterapi gibi immünsupresif tedavi alan insan popülasyonun artmasıyla fungemi oranları da ciddi şekilde yükselmiştir. Gram negatif mikroorganizma kaynaklı sepsis Güney Amerika, Doğu Avrupa ve Asya'da ; Kuzey Amerika ve Batı Avrupa'dan daha fazladır. Afrika'daki başlıca sepsis kaynağı ise Salmonella enterica'dır.

Kan kültürüne alınan kan, damar yoluna direkt iğne ile girilerek tüpe çekilir. Yüksek kontaminasyon riski nedeniyle halihazırda bulunan intravenöz kateterler işlem için tercih edilmez. Yalnızca kateter ilişkili kontaminasyonun tespiti için her iki şekilde alınıp karşılaştırılabilir. Kan tüpe çekilmeden önce kontaminasyonu engellemek için tüpün ağzı alkolle silinir. Daha Sonrasında kanın alınacağı bölgedeki deri dezenfekte edilir ve kurumaya bırakılır. Bu işlem için alkol bazı antiseptikle beraber klorheksidin veya iyodin bazlı solüsyonlar önerilmektedir. Eğer kültür testleriyle beraber başka kan testlerinin de uygulanması gerekiyorsa kontaminasyonu en aza indirmek için önce kültür şişeleri doldurulur. Antimikrobiyal tedavilerin mirkoorganizmaların büyümesi yönünden yanlış negatifliklere yol açtığı bilindiğinden, testlerin tedaviye başlanmadan yapılması önerilir. Tabii bu durum kritik hastalar için önemsenmeyebilir.

Tipik bir kan kültürü iki şişeden oluşur ve bu iki şişeye birden kan kültürü seti adı verilir. Bir tüp aerobik mikroorganizmaları, diğer tüp ise anaerobik mikroorganizmaları tespit etmek için kullanılır. Çocuklarda anaerobik bakteriler ile enfeksiyon nadir görüldüğü için alınan kanı minimalize etmek amacıyla tek tüpte kültür yapılabilir. Doğru sonuçlar alabilmek için iki farklı damar yolundan iki farklı kültür seti yapılması önerilir. Bu uygulama enfeksiyonu kontaminasyondan ayırt etmek için kullanılır. Buna ilaveten ne kadar fazla miktarda kan tüpe alınırsa enfeksiyonu saptama imkanı o kadar artar.

Kan kültür şişeleri mikroorganizmaların üremelerini tetikleyen bir besi yeri ve kanın tüp içinde pıhtılaşmasını önleyen antikoagülan içerirler. Mikroorganizmaların büyümesine etki etmemesinden dolayı antikoagülan olarak daha çok Sodium Polietanol Sulfonat (SNS) tercih edilir. Tüplerde kullanılan besi yerleri çeşitlilik gösterebilir. Aerobik şişeler daha çok kalp-beyin infüzyon ve triptik soya suyu gibi besi yeri elemanlarıyla zenginleştirilir ve ayrıca çoğunlukla indirgeyici olarak tioglikolat içerirler. Anaerobik tüplerdeki boş alan oksijen içermeyen bir gaz ile doldurulur.

Çoğu ticari amaçla imal edilmiş kültür şişeleri, mikroorganizmaların büyümesi üzerindeki olumsuz etkilerin önüne geçebilmek amacıyla antibiyotiklerin etkinliğini azaltan reçine içerir. Pediatrik amaçla tasarlanmış şişeler ise daha çok çocuklarda görülen mikroorganizmaların büyümesini destekleyecek ve daha az kan alınarak uygulanabilecek şekilde tasarlanmıştır. Mikobakterileri ve mantarları tespit etmek amacıyla da özelleşmiş başka şişeler kullanılabilir. Gelişmişlik seviyesi düşük ve maddi açıdan daha alt gelir seviyesindeki ülkelerde hazır kültür şişeleri pahalı olduğu için şişeler elle hazırlanmaktadır. Bazı ülkelerde ise kültür şişesi oluşturmak için gerekli olan maddelere hiç ulaşılamadığından kan kültürü yapılması mümkün değildir.

Tüplere ne kadar kan çekildiği önem taşımaktadır. Az ya da çok kan çekilmemelidir. Az kan çekince, kan kültüründe üreyecek mikroorganizma sayısı da az olduğundan yanlış negatiflikler gözlenebilir. Tüpe çok kan çekmek de, besiyeri ile kan miktarı arasındaki oran uyuşmayacağından mikroorganizmaların büyümesi için gerekli olan besinlere ulaşmasını engelleyecektir. İdeal büyüme için kanın kültüre oranı 1:5’ten 1:10’a kadar olmalıdır. Klinik Laboratuvar Standartları Enstitüsü yetişkinlerdeki rutin kültür uygulamaları için iki farklı tüp için iki farklı yerden, 20-30 ml kan alınmasını önermektedir. Çocuklarda ise alınacak kan miktarı çocuğun yaşına ve ağırlığına göre belirlenir. Endokardit şüphesi ver ise 6 tüple kültür de yapılabilir.

Kan tüpe çekildikten sonra mikroorganizmaların daha iyi üreyebilmesi için vücut ısısında beklemeye bırakılır. Kültür otomatize sistemlerde genelde 4-5 gün beklemeye bırakılır ama aslında kanda en sık karşılaşılan patojenler 2 gün içinde tespit edilebilmektedir. Mikroorganizma yavaş büyüyen bir tür -mesela endokardit etkeni bakteriler- ise veya otomatik olmayan metotlar kullanılıyor ise bekleme süresi daha da uzatılabilir. Otomatik olamayan sistemlerde mikroorganizmaların büyümesi çıplak gözle takip edilir. Açığa çıkan gaz, tüpün içinde buğu yapabilir ya da hemoliz dediğimiz eritrositlerin sindirilmesi olayı ile tüpte renk değişimi gözlenebilir. Bazı manuel sistemler büyümenin teşvik edilmesi için gazların üretildiği bölgeye sıvı dolduran kompartmanlara veya periyodik olarak şişeye damlayan agar plaklara sahiptir. İnkübasyon periyodunun sonunda pozitif kültürlerdeki büyümenin atlanmaması amacıyla bir de agar plağa ekilir yani subkültüre edilir.

Gelişmiş ülkelerde bu manuel kültür sistemlerinin yerini devamlı bilgisayar aracılı denetim yapan otomatik sistemler almıştır. BACTEC, BacT/ALERT ve VersaTrek gibi otomatik sistemler kültür şişlerini sürekli karıştıran inkübatör içerirler. Mikrobiyal büyüme sensörler tarafından tüp içindeki gazların -çoğunlukla karbon dioksit- üretimine bağlı saptanır. Çünkü karbondioksit üretimi çoğunlukla mikrobiyal metabolizmanın belirtecidir. Bir alarm veya görsel uyaran Mikrobiyoloji uzmanını kültürün pozitif çıktığı konusunda uyarır. Eğer inkübasyon periyodunun sonunda test negatif çıkar ise subkültüre edilmeden ekartasyon kabul edilebilir.

Lizis-santrifüj adı verilen bir teknik de daha ileri tetkikler yapmak amacıyla veya mantarlar, mikobakteriler, Legionella gibi yavaş büyüyen ve nazlı bakterilerin tespiti amacıyla kullanılır. Bu teknikte esas olan, kanı besiyeri ile karıştırıp bir şişe içinde inkübasyona bırakmak değil; eritrositleri ve lökositleri yıkıma uğratan bir karışım ile yıkıp, sonrasında santrifüj etmektir. Bu prosedür alınan örnekteki diğer içerikleri mikroorganizmaları da içine alacak şekilde konsantre hale getirir ve subkültüre edilmesini büyük oranda kolaylaştırır. Lizis-santrifüj metodu mikroorganizmayı ayırmada daha hassas olmasına rağmen kanın birçok işlemden geçmesine bağlı olarak kontaminasyona açık bir yöntemdir.

Eğer büyüme tespit edilirse mikroorganizmanın ön ayrımı amacıyla, Mikrobiyoloji uzmanı tüpten aldığı örnekle hızlıca Gram boyama yapar. Gram boyama bize bakterinin Gram pozitif veya negatif bir bakteri olduğu bilgisini verdiği gibi,şekilleri hakkında da -dairesel yani kok, ince uzun yani basil ya da spiral şekilli olabilir- bilgi verir.