Viral vektör

Viral vektör, moleküler biyologlar tarafından hücre içine genetik malzeme ulaştırmak için kullanılan bir araçtır. Bu işlem canlı organizmanın içinde (in vivo) veya hücre kültüründe (in vitro) yapılabilir. Virüsler, enfekte ettikleri hücrelerin içine genomlarını verimli şekilde taşımak için özelleşmiş moleküler mekanizmalar evrimleştirmiştir. Bir virüs tarafından genlerin aktarımı transdüksiyon olarak adlandırılır, bu yolla enfekte olmuş hücrelerin de transdüklenmiş olduğu söylenir. Moleküler biyologlar bu mekanizmayı ilk defa 1970'lerde kontrol altına almayı becermiştir. Paul Berg bakteriyofaj lambda DNA'sı içeren değiştirilmiş bir SV40 virüsü kullanarak kültürlenmiş maymun böbrek hücrelerini enfekte etmiştir.

Güvenlik: Viral vektörler bazen patojenik virüslerden yaratılmış olsalar da, bu virüsleri kullanmakla ilişkili riskleri en aza indirmek için modifiye edilirler. Bu, genelde viral genomun çoğalma için gerekli olan bir kısmının delesyonu ile yapılır. Böylesi bir virüs hücreleri verimli şekilde enfekte edebilir ama, yeni virion üretimi için bir yardımcı virüse gerek duyar.

Stabilite: Bazı virüsler genetik olarak kararsızdır ve genomları hızla biçim değiştirebilir. Viral vektörün kullanıldığı deneylerin öngörülebilirliği ve tekrarlanabilirliği açısından bu sakıncalıdır, tasarımlarında bundan kaçınılır.

Hücre tipi spesifisitesi: Çoğu virüs vektörleri mümkün olduğunca çeşitli hücre tiplerini enfekte edebilecek şekilde tasarlanır. Ancak, bazen bunun aksi arzu edilir. Viral reseptör modifiye edilerek virüsün belli bir hücre tipine hedeflenmesi sağlanabilir.

Viral vektörler ilk olarak moleküler genetik deneylerinde çıplak DNA ile transfeksiyona alternatif olarak geliştirildiler. Kalsiyum fosfat çökelmesi gibi geleneksel yöntemlere kıyasla, transdüksiyon, hücre yaşayabilirliğini (viabilitesini) etkilemeden hücrelerin neredeyse tamamının enfekte olmasını mümkün kılar.

Buna ilaveten, bazı virüsler hücre genomuna entegre olup kararlı gen ifadesini sağlarlar. Ancak, viral bir vektörün inşası çok daha emek-yoğun bir süreç olduğu için çoğu uygulamada transfeksiyon hâlâ tercih edilmektedir.

Protein kodlayan genler viral vektörler kullanılarak ifade edilebilir, genelde belli bir proteinin işlevini çalışmak için. Belirteç (marker) genleri (yeşil floresan protein gibi) kararlı şekilde ifade eden viral vektörler, özellikle retrovirüsler, hücreleri kalıcı şekilde işaretlemek için kullanılır. Bu şekilde işaretlenmiş hücreler kullanılarak, in vitro enfekte edilmiş hücrelerin bir konak hayvana transfer edildiği ksenotransplantasyon deneylerinde hücreler ve onları yavrularını takip etmek mümkün olur.

Gen ensersiyonu gen nakavtından daha ucuzdur. Ama gen susturması bazen non-spesifiktir ve başka genler üzerinde hedef dışı etkiler gösterebilir, bu yüzden daha az güvenilir sonuçlar verir. Hayvan konak vektörleri de bazen önemli rol oynarlar.

Gelecekte genetik bozuklukları tedavi etmenin bir yolu gen terapisi olabilir. Ciddi Kombine İmmün Yetmezlik, kistik fibrozis ve hatta hemofili A gibi hastalıklar belli genlerin DNA dizisinde mutasyonlardan meydana geldiği için, gen terapi denemelerinde hastanın vücudundaki hücrelerin içine mutasyonsuz gen kopyalarından götürmek amacıyla virüsler kullanılmıştır. Gen terapisi kullanılarak labortuvarda çok sayıda başarılar elde edilmiştir. Ancak, viral gen terapinin yaygın kullanılması için bazı önemli problemlerin çözülmesi gerekmektedir. Virüslere gösterilen bağışıklık tepkisi hedef hücrelere gen ulaştırılmasını engellemekle kalmaz, hasta için ciddi komplikasyonlara yol açar. 1999'da, ilk gen terapi denemlerinden birinde, adenoviral bir vektör ile tedavi edilmekte olan Jesse Gelsinger bu yüzden ölmüştür.

Bazı viral vektörler, örneğin lentivirüsler, konak kromozomlardan birinde genomlarını rastgele konumlara sokarlar, bu durum hücresel genlerin işlevlerini bozup kansere yol açabilir. 2002'de yapılan, Ciddi Kombine İmmün Yetmezlik için retroviral gen terapi denemesinde, hastalardan ikisi tedavinin sonu olarak lösemi geliştirdiler. Adeno-ilişkili virüs-temelli vektörler bu bakımdan çok daha güvenilirdirler çünkü insan genomunda hep aynı konumda entegre olurlar.

DNA aşılamasının mantığından hareketle, patojen protein ifade eden virüsler hâlen bu patojenlere karşı aşı olarak geliştirilmekteler. T-lenfositler hücre-içi parazitleri tanımak için hücre içinde üretilen yabancı proteinleri kullanırlar. T hücresi bağışıklığı viral enfeksiyonlar ve malarya gibi hastalıklardan korunmak için çok önemlidir. Viral bir aşı, patojen proteinlerin konak hücre içinde ifadesini indükler, Sabin Polio aşısı ve diğer zayıflatılmış aşılar gibi. Ancak, viral açılar patojen genlerin sadece ufak bir bölümünü içerdiği için, çok daha güvenlidirler ve aşı yapmakta kullanılan patojen tarafından bir enfeksiyon mümkün değildir. Adenovirüs türü viral aşıların geliştirilmesi aktif bir araştırma konusudur.

Retrovirüsler gen terapisi uygulamalarının ana konularından biridir. Moloney mürin lösemi virüsü gibi rekombinant retrovirüsler, konak genomun içine stabil şekilde entegre olabilirler. Taşıdıkları ters transkriptaz bu virüslerin konak genom ile bütünleşmesini sağlar.

Retroviral vektörler ikileşim-yeterli veya ikileşim-kusurlu olabilirler. İkileşim kusurlu vektörler deneysel çalışmalar için en yaygın seçenektir çünkü viral ikileşme ve paketleme için gerekli genler çıkarılmış veya başka genlerle değiştirilmiştir. Bu virüsler hedef hücrelerini enfekte edebilir ve taşıkdıkları yükü teslim edebilirler ama hücrenin parçalanması ve ölümü ile sonuçlanacak tipik bir litik bir yolak takip etmekten acizdirler.

Benzer şekilde, replikasyon-yetkin viral vektörler virion sentezi için gerekli tüm genlere sahiptirler ve enfeksiyon başlayınca kendilerini çoğaltmaya devam edebilirler. Bu vektörlerdeki viral geno0mlar çok daha uzun olduğu için, hücre içine ulaştırılmak istenen DNA ensersiyonun uzunluğu sınırlıdır, replikasyon kusurlu viral vektörlerdekine kıyasla. Viral vektöre bağlı olarak, maksimum DNA parça uzunluğu genelde 8-10 kB kadardır.. Bu durum çoğu genomik dizinin kullamını kısıtlasa da, cDNA dizileri rahatlıkla sığar.

Lentivirüsler retrovirülerin bir alt grubudur. Bölünmeyen hücrelerin genomlarına entegre olma özellikleri onları diğer retrovirüslerden farklı kılar. Virüs hücre içine girdikten sonra, RNA'dan oluşan viral genom ters transkripsiyona uğrayıp DNA üretir, bu da viral bir entegraz enzimi sayesinde genom içinde rastgele bir yere girer. Bu aşamada provirüs olarak adlandırılan vektör genom içinde kalır ve hücre bölününce yavru hücrelere aktarılır. Entegrasyon yeri öngörülemez olması sorun yaratabilir. Provirüs, hücresel genlerin işlevini bozabilir ve kanser gelişimine yol açan onkogenlerin aktivasyonuna yol açabilir, bu yüzden lentivirüslerin gen terapisi için uygulanmalarına çekince getirebilir. Ancak, lentivirüslerin kansere yol açabilecek yerlere entegre olma eğilimlerinin daha düşük olduğu bulunmuştur, gama-retroviral vektörlere kıyasla. Kansere eğilimli bir fare suşu üzerinde yapılan bir çalışmada lentiviral vektörlerin tümör insidansının artmasına veya tümörlerin daha erken belirmesine neden olmadığı bulunmuştur.. Üstelik, klinik denemelerde, HIV tedavisi için lentiviral vektörle gen terapisi yapıldığında mutagenik veya onkolojik olaylara rastlanmamıştır.

Güvenlik nedenleriyle de lentiviral vektörler çoğalmaları için gerekli olan genler taşımazlar. Bir lentivirüs üretmek için bir paketleme hücre suşu (genelde HEK 293) içine birkaç plazmidin transfeksiyonu yapılır. Paketleme plazmidi olarak adlandırılan bir veya birkaç plazmit, gerekli virion proteinlerini (kapsit ve ters transkriptaz gibi) kodlar. Başka bir plazmit, vektör içine dahi edilmesi gereken genetik malzemeyi taşır. Bu genin transkripsiyonu yapılınca tek iplikli RNA viral genom üretilir ve ψ (psi) dizisini içerir. Bu dizi genomun virion içine paketlenmesini sağlar.

Lentivirüslerden farklı olarak adenoviral DNA genoma içine entegre olmaz ve hücre bölünmesi sırasında ikileşmez. Bu özellik onların temel araştırmada kullanılmasını sınırlar ama adenoviral vektörler bazen in vitro deneylerde kullanılırlar. Bunların başlıca uygulaması gen terapisi ve aşılamadır. Adenovirüsler solunum yolu, sindirim yolu ve göz enfeksiyonlarına yol açar. İnsanlar genelde adenovirüslerle sık sık karşılaştıkları için bu virüsler hızla immün tepkilere yol açar, bunun da potansiyel olarak tehlikeli sonuçları olabilir. Bu problemin üstesinden gelmek için bilim insanları hâlen insanların bağışıklığı olmayan adenovirüsler üzerinde araştırmalarını sürdürmektedir.

Adeno-ilişkili virüs (AİV) insan ve bazı primat türlerini enfekte edebilen küçük bir virüstür. AİV'nin bir hastalığa neden olduğuna dair bir bilgi yoktur ve dolayısıyla çok mülayim bir immün tepkiye neden olur. AİV hem bölünebilen hem de bölünmeyen hücreleri enfekte edebilir ve genomunu konak hücre içine entegre edebilir. Bu özellikler AİV'yi gen terapisinde kullanılacak viral vektör üretimi için cazip bir aday kılmaktadır.