Restriksiyon enzimi

Restriksiyon enzimi veya restriksiyon endonükleazı, çift zincirli DNA moleküllerindeki belli nükleotit dizilerini tanıyan ve her iki zinciri birlikte kesen bir enzim türüdür. Bu özel enzimler, bakteri ve arkelerde bulunurlar ve virüslere karşı bir savunma mekanizmasına aittirler. Konak bakteri hücresinde restriksiyon enzimleri seçici olarak yabancı DNA'ları keserler; konak DNA'yı restriksiyon enziminin etkinliğinden korunmak için bir değiştirme (modifikasyon) enzimi (bir metilaz) tarafından metillenir. Bu iki süreç toplu olarak restriksiyon modifikasyon sistemi olarak adlandırılır. Bir restriksiyon enzimi DNA'yı kesmek için DNA çift sarmalının her şeker-fosfat omurgasından (yani her zincirden) birer kere olmak üzere iki kesme yapar.

İlk restriksiyon enzimi HindIII'ün saflaştırılmasını takiben pek çok başka restriksiyon enzimi keşfedilmiş ve karakterize edilmiştir. 1978'de Daniel Nathans, Werner Arber ve Hamilton Smith restriksiyon enzimini keşiflerinden dolayı Nobel Tıp Ödülünü almışlardır. Bu keşifleri rekombinant DNA teknolojisinin gelişimine öncülük etmiş, bunun sayesinde örneğin insülinin büyük miktarlarda üretimi için E. coli bakterisi kullanılabilmiştir. 3000 üzerinde restriksiyon enzimi detaylı olarak çalışılmıştır, bunlardan 600'den fazlası ticari olarak elde edilebilir. Bu enzimler laboratuvarlarda DNA modifikasyon ve maniplasyonlarında rutin olarak kullanılmaktadırlar.

Restriksiyon enzimleri spesifik bir nükleotit dizisi tanır ve DNA'da çift zincirli bir kesik oluşturur. Tanıma dizilerinin uzunluğu 4 ila 8 nükleotit olup, çoğu palindromiktir, yani DNA'daki azotlu bazların dizisi ileri ve geri aynı okunur. Teorik olarak DNA'da iki çeşit palindromik dizi olabilir. Yansımalı palindrom normal metinlerdeki gibi olur, aynı DNA dizisi üzerindeki dizinin normal ve tersten okunuşu aynı olur (örneğin GTAATG gibi). Evirtik (İng. inverted) tekrarlı palindrom da iki yönden aynı okunur ama ileri ve geri diziler komplemanter dizilerde yer alır. Örneğin GTATAC dizisinde olduğu gibi, bu dizinin komplemanter dizisi tersten okununca CATATG elde edilir. Evirtik tekrarlar restriksiyon enzimlerinde daha yaygındır ve yansımalı palindromik dizilerden daha önemli biyolojik role sahiptir.

Her restriksiyon enzimi için DNA'daki tanıma bölgeleri farklıdır, kesim sonucu meydana gelen yapışkan ucun iplik uzantısının uzunluğu, dizisi ve zincir yönü (5' veya 3' yönünde) farklılıklar üretir.

Aynı diziyi tanıyan farklı tanıma enzimleri neoşimerler olarak bilinir. Bunlar çoğunlukla diziyi iki farklı yerden keserler; eğer hem tanıma dizileri hem de kesme yerleri aynıysa bu enzimler izoşizomer olarak adalandırılır.

Restriksiyon endonükleazlar üç veya dört genel grupta kategorize edilirler (Tip I, II ve III), bileşenleri, enzim kofaktör gereksinimleri, hedef dizilerinin özellikleri ve DNA kesim yerinin hedef diziyle ilişkisine bağlı olarak.

Tanıma bölgesi asimetriktir ve 6-8 nükleotitlik bir boşlukla ayrılan iki kısımdan oluşur, biri 3-4 nükleotit içeren ve diğeri 4-5 nükleotit içeren. S-Adenozil metyonin (AdoMet), adenozin trifosfat (ATP) ve magnezyum iyonları (Mg2+) gibi birkaç enzim kofaktörü bu enzimlerin etkinliği için gereklidir.

Tip I restriksiyon enzimleri, HsdR, HsdM ve HsdS olarak adlandırılan üç altbirime sahiptirler; HsdR kesme için; HsdM konağın DNAsına metil grupları eklemek için; ve HsdS metiltransferaz etkinliğine ek olarak, tanıma bölgesinin kesim özgüllüğü için gereklidirler.

Tip II enzimler tip I enzimlerden birkaç yönden farklıdır. Tek tip proteinden oluşmuş dimer yapıya sahiptirler; tanıma bölgeleri genelde bölünmüş değildir, palindromiktir ve 4-8 nükleotit uzunluktadır; DNA'yı tanıdıkları ve kestikleri yer aynıdır; etkinlikleri için ATP veya AdoMet'e gerek göstermezler, kofaktör olarak genelde sadece Mg2+ gereksinimleri vardır. 1990'lar ve 2000'lerde bu enzim sınıfının tüm özelliklerin taşımayan yeni enzimler keşfedildiği için bu büyük enzim ailesini alt sınıflara ayıran yeni bir adlandırma sistemi geliştirildi. Bu altgruplar bir sonek harf ile belirtilir.

Tip IIB restriksiyon enzimleri (örneğin BcgI and BplI) mültimeriktir, yani birden çok altbirimden oluşur. DNA'yı tanıma dizisinin iki tarafından kesip çıkarırlar. Kofaktör olarak hem AdoMet hem de Mg2+ gereksinirler. Tip IIE restriksiyon endonükleazları (örneğin NaeI) tanıma dizilerinden iki kopyası ile etkileştikten sonra DNA'yı keserler. Bir tanıma dizisi kesme hedefi olarak etkir, öbürü ie enzimin kesme verimini artıran, yani hızlandıran bir alosterik unsur olarak etkir. Tip IIF enzimler (örneğin NgoMIV) Tip IIE enzimlere benzer, onlar da tanıma dizilerinin iki kopyası ile etkileşir, ama ikisi birden keser. Tip IIG enzimler (Eco57I gibi) tek bir altbirime sahiptir, klasik Tip II restriksiyon enzimleri gibi, ama etkin olmak için AdoMet kofaktörüne gerek duyarlar. Tip IIM restriksiyon endonükleazları, DpnI gibi, metillenmiş DNA'yı tanıyıp kesebilirler. Tip IIS restriksiyon enzimleri (FokI gibi) palindromik olmayan asimetrik tanıma dizilerinden beli bir uzaklıkta keserler. Bu enzimler dimer olarak çalışabilir. Benzer olarak, Tip IIT restriksiyon enzimleri (örneğin Bpu10I ve BslI) iki farklı altbirimden oluşur. Bazıları palindromik dizileri tanır, bazılarının tanıma dizileri ise asimetriktir.

Tip III restriksiyon enzimleri (örneğin EcoP15) birbirine dönük olan iki ayrı, palindromik olmayan dizi tanırlar. DNA'yı tanıma yerinden 20-30 baz uzakta keserler. Bu enzimler birden çok altbirime sahiptir; DNA metilasyonu ve restriksiyonu için, sırasıyla, AdoMet ve ATP kofaktörlerine gerek duyarlar.

Tip IV restriksiyon enzimleri metillenmiş DNA'yı keser. Bunlar iki farklı altbirimden oluşur. DNA kesimi için Mg2 ve GTP kofaktör olarak gereklidir. Tanıma yeri iki parçalıdır. Metillenmiş bazlar arasında birden fazla kesim olur.

Yapay restriksiyon enzimleri üretmek için doğal ve tasarımlı bir DNA bağlayıcı bölge ile bir nükleaz bölgesi (genelde FokI restriksiyon enziminin kesme bölgesi) birleştirilir. Bu tür yapay restriksiyon enzimleri arzu edilen DNA dizilerini tanıyabilecek şekilde tasarlanabilir, ayrıca tanıma bölgelerinin uzunluğu 36 baz çifti uzunluğa varabilir. Çinko parmak nükleazlar yapay restriksiyon enzimlerinin en yaygın kulanılanlarıdır, genelde genetik mühendislik ve standart gen klonlama uygulamalarında da Other artificial restriction enzymes are based on the DNA binding domain of TAL effectors. kullanılırlar.

1970'lerde keşfedilmelerinden beri çeşitli bakterilerde yüzlerce restriksiyon enzimi tespit edilmiştir. Her enzim elde edildiği bakteriye göre adlandırılır, bakterinin cinsi, türü ve suşuna dayalı bir adlandırma sistemine göre. Örneğin EcoRI restriksiyon enziminin adı yandaki kutuda açıklandığı şekilde türetilmiştir.

Restriksiyon enzimleri gen klonlaması ve protein ifadesi deneylerinde, plazmit vektörlerlerin içine genler sokmak için kullanılırlar. Gen klonlama deneylerinde kullanılan plazmitlerde genelde kısa bir "çoklu bağlayıcı" dizi (İng. polylinker; çoklu klonlama yeri) bulunur. Gen parçalarını plazmit vektörün içine sokarken bu diziler kolaylık sağlar; genin içinde doğal olarak bulunan restriksiyon yerleri DNA'yı kesmek için kullanılacak endonükleaz seçimini etkiler, çünkü arzu edilen DNA'ya zarar vermeden onun uçlarının kesilmesi gerekmektedir. Bir gen parçasının bir vektörün içine klonlamak için hem plazmit DNA'sı hem de gen parçası aynı restriksiyon enzimi ile kesilir, sonra bunlar DNA ligaz olarak adlandırılan bir enzimle birbirlerine yapıştırılır.

Restriksiyon enzimleri DNA'da bulunan tek baz değişikliklerini (tek nükleotit polimorfizmleri, veya "SNP"leri) spesifik olarak tanıyarak gen alellerini ayırt etmekte kullanılırlar. Bunun için o alelde bulunan bir restriksiyon yerinin bir SNP tarafından değişikliğe uğraması gerekmektedir. Bu yöntemle, bir DNA numunesini dizilemeden, bir retriksiyon enzimi ile onu genotiplemek mümkün olur. Numune önce DNA parçaları oluşturacak şekilde restrilksiyon enzimi ile sindirilir, sonra farklı büyüklükteki parçalar jel elektroforezi ile ayrıştırılır. Genelde, doğru restriksiyon yerine sahip olan aleller jelde iki görünür bant meydana getirir, değişlikliğe uğramış restriksiyon yeri olan parçalar ise kesilmezler ve sadece bir bant oluştururlar. Bant sayısı kişinin genotipini gösterir. Bu işlem bir restriksiyon haritalaması örneğidir.

Benzer şekilde, restriksiyon enzimleri Southern blot yöntemiyle genomik DNA'nın kesilmesinde kullanılır. Bu yöntem ile, bir kişinin genomunda bir genin kaç kopyası (veya paralogu) olduğu belirlenebilir. Bu yöntemin bir diğer uygulamasında belli bir toplulukta kaç tane gen mutasyonu (polimofizmi) olduğu belirlenebilir, buna restriksiyon parçası uzunluk polimorfizmi (İng. restriction fragment length polymorphism, RFLP) denir.