Yeni nesil dizileme

Yeni nesil dizileme; DNA, RNA dizileme ve varyant / mutasyon tespiti için yeni bir teknolojidir. Yeni nesil dizileme aynı zamanda büyük paralel sıralama veya ikinci nesil sıralama olarak da adlandırılmaktadır. Yeni nesil dizileme, DNA fragmanlarını (veya tamamlayıcı DNA'yı) aynı anda sıralamanın bir yöntemidir. Milyonlarca ila milyarlarca DNA nükleotidi paralel olarak sıralanabilmektedir. Giga baz boyutta okumaları oluşturmak için gereken süre yalnızca birkaç gün veya saattir. Parça klonlama yöntemlerine (bkz: Sanger dizilemesi) olan ihtiyacı en aza indirmektedir. Ayrıca, önemli ölçüde daha fazla verim sağlanmaktadır. İlk ticari yeni nesil dizileme teknolojisi, 2004 yılında 454 Life Sciences tarafından tanıtılmış, daha sonra Roche tarafından satın alınmıştır.

Yeni nesil dizileme süreci; DNA / RNA'yı birden fazla parçaya ayırmayı, adaptörler eklemeyi, kitaplıkları dizilemeyi ve bir genomik dizi oluşturmak için yeniden birleştirmeyi içermektedir. Prensip olarak, kapiler elektroforeze benzemektedir. En önemli fark, yeni nesil dizilemenin milyonlarca parçayı büyük ölçüde paralel bir şekilde sıralaması ve sıralamanın maliyetini düşürürken hızı ve doğruluğu artırmasıdır. Yeni nesil dizileme yöntemi, sentez yoluyla dizileme ve DNA zincirlerine dahil edildiklerinde tek bazların tanımlanmasını sağlayan tersinir sonlandırıcılara dayanmaktadır.

Kütüphane hazırlığı: Kan örneğinden alınan genomik DNA (gDNA), ultrasonik kesme yolu ile uzunluğu 200-500 bp olan DNA parçası haline getirilmektedir. 5’ ve 3’ adaptörleri DNA parçalarının her iki ucuna eklenmektedir. Adaptörle bağlanmış fragmanlar PCR ile çoğaltılıp jel ile saflaştırılmaktadır. Böylece sıralama kitaplığı oluşturulmaktadır.

Küme oluşturma: Akış hücresi, DNA parçalarını tutmak için üretilen cam sürgülü bir kanaldır. Tüm dizileme, akış hücresinde gerçekleşmektedir. Kütüphanedeki DNA fragmanları; akış hücresinin içinden geçtiklerinde, yüzey şeritlere rastgele bağlanmaktadır. Her şerit, oligonükleotit olarak da bilinen adaptörlere sahiptir. Oligonükleotitler, DNA parçasının uçlarına eklenen adaptörlerle eşleşmektedir. Eşleşmeden sonra DNA polimeraz ve nükleobazlar DNA fragmanına tutunarak, DNA fragmanının oligonükleotitlere göre tamamlanması sağlanmaktadır. Tamamlanan DNA fragmanları, oligonükleotitlerle köprü oluşturarak PCR yöntemiyle çoğaltılmaktadır. Köprü PCR işleminden sonra her bir DNA fragmanı, tek bir DNA şablonunun birçok kopyasını içeren ilgili konumlarında demetler halinde kümelenmektedir. Kümelenmenin amacı, bir araya gelen DNA fragmanlarının sinyal yoğunluğunu yükseltmektir.

Sıralama: Reaksiyon sistemine DNA polimeraz, bağlayıcı primerler ve baza özgü floresan işaretleyicilere sahip 4 adet nükleobaz eklenmektedir. Nükleobazların 3′-OH'si, sıralama işlemi sırasında bir seferde yalnızca bir bazın eklenmesini sağlayan kimyasal yöntemlerle korunmaktadır. Kullanılmayan tüm serbest nükleobaz ve DNA polimeraz, sentez reaksiyonu bittikten sonra ayrıştırılmaktadır. Daha sonra, floresan uyarımı için gerekli tampon çözeltisi eklenmektedir. Floresan sinyali lazerle uyarıldıktan sonra sinyal optik ekipmanla kaydedilmektedir. Optik sinyal bilgisayar analizi ile sıralama tabanına dönüştürülmektedir. Floresan sinyali kaydedildiğinde, sinyali söndürmek ve nükleobaz 3′-OH koruyucu grubunu çıkarmak için kimyasal bir reaktif eklenmektedir. Böylece, bir sonraki sıralama reaksiyonu gerçekleştirilebilmektedir.

Hizalama ve Veri Analizi: Tanımlanan dizi okumaları bir referans genoma hizalanmaktadır. Tek nükleotit polimorfizmi, ekle-sil tipi mutasyon, yapısal mutasyon, gen kopya sayısı; açıklama ve istatistikler, popülasyon genetiği analizi gibi birçok biyoenformatik analiz varyasyonu mümkündür.