DNA metilasyonu

DNA metilasyonu DNA'nın bir kimyasal değişimdir, kalıtsal olup sonradan ilk dizi geri gelecek şekilde çıkartılabilir. Bu özelliği nedeniyle epigenetik koda aittir ve en iyi karakterize edilmiş epigenetik mekanizmadır. Metilasyon tüm virüslerde görülen, öz ile öz-başka (İng. self/non-self) ayrımına yarayan bir yetenek olduğu için epigenetik kodun, kadim viral enfeksiyon olaylarından kalma bir mekanizma olabileceği öne sürülmüştür.

DNA metilasyonu, DNA'ya bir metil grubunun eklenmesidir; örneğin sitozindeki pirimidin halkasının 5 numaralı karbonuna eklenmesi durumunda gen ifadesinin azalır. Sitozinin C-5 pozisyonunda DNA metillenmesi her omurgalı hayvanda gözlemlenmiştir. Erişkin somatik dokularda DNA metilasyonu tipik olarak CG dinükleotit dizilerinde meydana gelir. CpG dışı metilasyon embriyonik kök hücrelerde hakimdir.

Bitkilerde sitozinler hem simetrik (CpG veya CpNpG; N, guanin haricinde herhangi bir nükleotittir) hem de asimetrik (CpNpNp) olarak metillenebilir. Bazı organizmalarda, örneğin meyve sineklerinde, hemen hiç DNA metilasyonu görülmez.

Memelilerde CpG'lerin %60-90'ı metillenmiştir. Metillenmemiş CpG'ler CpG adaları olarak adlandırılan kümeler halinde gruplanırlar, bunlar çoğu genin 5' düzenleyici bölgelerinde bulunurlar. Kanser gibi çoğu hastalık sürecinde gen promotöründeki CpG adaları anormal aşırı metilasyona (hipermetilasyona) uğrarlar, bunun sonucu kalıtlanabilen transkripsiyon susturması olur. DNA metilasyonu gen transkripsiyonunu iki şekilde etkileyebilir. Birincisi, DNA'nın metillenmesi transkripsiyon faktörlerinin bağlanmasını engelleyebilir, ikincisi metillenmiş DNA metil-CpG'ye-bağlanıcı bölge proteinleri (İng. methyl-CpG-binding domain proteins; MBD) tarafından beğlanır. MBD proteinleri, diğer proteinler de (histon deasetilazlar ve histonları modifiye edebilen başka kromatin şekillendirici proteinler gibi) seferber ederek, sessiz kromatin olarak adlandırılan, kompakt ve inaktif bir kromatin yapısı oluşmasını sağlar. DNA metilasyonu ile kromatin yapısı arasındaki bu ilişki çok önemlidir. Özellikle, metil-CpG-bağlayıcı protein 2 (MeCP2) yokluğu Rett sendromu ile ilişkilidir, MBD2 proteini de kanserde hipermetillenmiş (aşırı metillenmiş) genlerin transkripsiyonlarının susturulmasına aracılık eder.

Sürdürme metilasyonu, her DNA ikileşme döngüsünün ardından DNA metilasyon durumunu korumak için gereklidir. DNA metiltransferaz (DNMT) olmazsa, ikilenme mekanizmasının oluşturacağı yavru iplikler metillenmemiş olur ve zaman içinde bu, pasif demetilasyona yol açar. DNMT1, DNA ikilenmesi sırasında DNA metilasyon örüntüsünün yavru DNA ipliklerine kopyalanmasından sorumlu olan sürdürücü metiltransferaz enzimidir. Gelişimde DNMT'ye gereksinim vardır, farelerde DNMT1'in her iki kopyası da silindiği zaman, gelişimin 9. gününde embriyo ölür.

DNMT3a ve DNMT3b enzimlerinin gelişim sırasında DNA metilasyon örüntülerini oluşturan de novo (yeni baştan) metiltransferazlar olduğu düşünülmektedir. DNMT3L, diğer DNMT3 enzimlerine homolog olan ama katalitik etkinliği olmayan bir proteindir. Bunun yerine, DNMT3L de novo metiltransferazların DNA'ya bağlanma yeteneğini artırarak ve onların aktivitesini güçlendirerek onlara yardım eder. Ayrıca, DNMT2 (TTRDMT1) bir DNA metiltransferaz homoloğu (benzeri) olarak teşhis edilmiştir, çünkü tüm DNA metiltransferazlarda ortak olan 10 dizi motifine sahiptir; ancak DNMT2 (TRDMT1) DNA'yı metillemek yerine aspartik asit tRNA'sının antikodon ilmiğindeki sitozin-38'i metillendirir..

Karsinogenez sırasında çoğu tümör baskılayıcı gen DNA metilasyonu ile susturulduğu için bu genlerin tekrar etkinleştirilmesi için DNMT'leri inhibe edilmesi denenmiştir. 5-aza-2'-deoksisitidin (desitabin) bir nükleozit analoğudur, katalizdeki bir β-eliminasyon adımını engelleyerek DNMT'leri DNA ile bir kovalent kompleks olarak kilitler ve onları çalışmaz hale getirir; bunun sonucu bu enzimler yıkıma uğrar. Ancak, desitabin'in etkin olabilmesi için onun hücre genomuna dahil edilmesi gerekmektedir. Bunun sonucu mutasyonlar meydana gelir. Üstelik desitabin kemik iliği için toksiktir, bu yüzden tedavi amaçlı kullanımını sınırlıdır. Bu sorunlar yüzünden DNMT'leri hadefleyen anti-anlam terapilerilerinin geliştirilmesine yönelinmiştir, bu yöntemle mRNA yıkımı ve dolayısıyla protein üretiminin engellenmesi amaçlanmıştır. Ancak, DNMT1'in tek başına hedeflenmesinin, DNA metilasyonu ile susturulmuş olan tümör baskılayıcı genleri tekrar etkinleştirmeye yeterli olduğu halen kesinleşmemiştir.

ICF sendromu: Kromozom 1, 9 ve 16’nın satellit bölgelerinin hipometilasyonuyla karakterize edilmesi ve kromozom kararsızlığı sonucu oluşur. Son zamanlarda, de novo DNA metiltransferaz geni DNMT3B’deki mutasyonların bu sendromla bağlantısı olduğu bulunmuştur.

X-bağımlı Alfa Talasemi / Zeka Geriliği Sendromu: ATRX geni alfa talasemi, çeşitli zeka gerilikleri, fasiyal dimorfizm ve üregenital anomalileri içeren bir hastalıkla ilişkilidir. ATRX’deki mutasyonlar, rDNA dizileri ve subtelomerik tekrarlar gibi fazla miktarda tekrarlanan dizilerin metilasyon örüntülerinde değişikliklere neden olur. Bu nedenle ATRX’in görevini kaybetmesi gen ifadesinin düzenlenmesinin de kaybını içerebilir.

Bitkilerde, özellikle model organizma Arabidopsis thaliana 'da, DNA metilasyonunun anlaşılmasında önemli ilerleme kaydedilmiştir. Memelilerde metilasyonun CpG dizilerindeki sitozinde metillenmesine karşın, bitkilerde sitozin CpG, CpNpG ve CpNpN dizilerinde de metillenir (burada N, guanin dışında her nükleotit anlamına gelir).

Arabidopsis ’teki esas DNA metiltransferaz enzimleri DRM2, MET1 ve CMT3'dür. DRM2 ve MET1 proteinleri, memeli metiltransferazları olan, sırasıyla, DNMT3 ve DNMT1 ile önemli derecede homoloji gösterirler, CMT3 ise bitki âlemine hastır. DNA metiltransferazların iki sınıfı vardır: 1) de novo sınıfı, yani DNA'da yeni metil grupları ekleyen enzimler, ve 2) sürdürücü (ing. maintenance) sınıfı, DNA ikilenmesi sırasında ana moleküldeki metil gruplarını tanıyıp yavru ipliklerde aynı konumlarda metil grupları ekleyen enzimler. DRM2, de novo DNA metiltransferaz olduğu gösterilmiş tek enzimdir. DRM2 ayrıca, MET1 ve CMT3 ile birlikte, DNA ikilenmesi sırasında metilasyonun korunmasını sağladığı da gösterilmiştir. Bitkilerde başka DNA metiltransferazlar da ifade edilmektedir ama işlevleri bilinmemektedir (bkz Kromatin Veritabanı).

Halen de novo metilasyon yerlerinin nasıl belirlendiği bilinmemektedir. Çoğu (ama her değil) konumda RNA yönlendirmeli DNA metilasyonu (İng. RNA-directed DNA methylation; RdDM) olduğuna dair bulgular vardır. RdDM'de, spesifik RNA transkriptleri çift iplikli yapılar oluştururlar. İki iplikli RNA'lar, ya küçük enterferans RNA (siRNA) ya da mikroRNA (miRNA) yolakları aracılığıyla, RNA'yı üreten orijinal genom bölgesi için de novo DNA metilasyonunu yönlendirirler. Bu mekanizmanın RNA virüslerine ve/veya transpozonlara karşı hücresel savunmada önemli olduğu düşünülmektedir, çünkü bunların her ikisi de konak genomda mutasyonlara yol açabilecek çift iplikli RNA oluştururlar. Henüz iyi anlaşılmayan bir mekanizmayla bu zararlı bölgelerin metillenmesi sonucu, bunların ifadesi sonlandırılır ve mutagenik etkilerinden korunulmuş olur.

Çoğu mantarda düşük düzeyde (% 0,1 ila 0,5 arası) sitozin metillenmesi olmasına karşın, bazı mantarların genomları %5 oranında metillenir. Bu oran, hem türler arasında hem de aynı türün farklı izolatları arasında, çeşitlilik gösterir. Mantarlarda belli fizyolojik şartlarda gen ifadesinin kontrolünde de DNA metilasyonun rol oynadığına dair belirtiler vardır.

Ekmek mayası (Saccharomyces cerevisiae) ve fisyon mayasında (Schizosaccharomyces pombe) çok az DNA metilasyonu olsa da, ipliksi mantar Neurospora crassanın iyi karakterize edilmiş bir metilasyon sistemi vardır. Neurospora'da metilasyonu kontrol eden birkaç gen vardır ve DNA metiltransferaz dim-2 'nin mutasyonu Nörospora'da tüm DNA metilasyonu yok eder ama büyüme veya üremeye etki etmez. Neurospora genomunda çok az tekrarlıyan DNA'bulunmasına karşın, metilasyonun yarısı tekrar eden DNA dizilerinde (transpozon kalıntıları ve sentromer DNA'sı dahil olmak üzere) gürülür. DNA metilasyonunun olmadığı bir genetik geriplanda (İng. genetic background) diğer önemli süreçlerin değerlendirilebilmesinin mümkün olması Neurospora'yı DNA metilasyonun araştırılması için değerli bir sistem kılar.

Adenin ve sitozin metilasyonu çoğu bakteride restriksiyon modifikasyon sisteminin parçasıdır. Bu sistemde çalışan bir metilaz belli bir DNA dizisini tanır ve bu dizi içinde veya yakınındaki bir bazı metiller. Bu şekilde metillenmemiş olan yabancı DNA'lar hücre içine girdiklerinde diziye spesifik restriksiyon enzimleri tarafından parçalanır. Bakterinin kendi DNA'sı metillenmiş olduğu için bu restriksiyon enzimleri tarafından tanınmaz. İçsel DNA'nın metilasyonu ilkel bir bağışıklık sistemi olarak çalışır, onun sayesinde bakteriler bakteriyofaj enfeksiyonundan kendilerini korurlar.

E. coli DNA adenin metiltransferaz (Dam), yaklaşık 32 kDa büyüklüğünde bir enzimdir ve bir restriksiyon/modifikasyon sistemine ait değildir. E. coli Dam'ın hedef dizisi GATC'dir. Bu dizinin iki yanındaki üçer baz çifti de DNA-Dam bağlanmasına etki eder. Dam, çeşitli süreçlerde rol oynar, bunlar arasından yanlış eşleşme tamiri, DNA ikileşmesinin zamanlaması ve gen ifadesi vardır. DNA ikilenmesinden evvel GATC konumlarındaki iki ipliğin her biri adenin bazında metillenmişken, ikileşmenin ardından bunlardan sadece biri metillenmiş durumda kalır. Bunun nedeni, yeni ipliğe dahil olan adenin bazının metillenmemiş olmasıdır. Tekrar metillenme, ikileşmeden 2-4 saniye sonra olur, bu arada ikileşme sırasında yeni iplikteki meydana gelen dizi hataları onarılır. DNA ipliklerinden birinin metillenmemiş olması, hücrenin tamir sisteminin o ipliği yeni sentezlenmiş iplik olarak tanımasını sağlar. Bakterilerde Dam sistemin bozulması, kendiliğinden olan (spontan) mutasyon oranının artmasına neden olur. Başka DNA tamir enzimleri de olmayan dam mutantlarında yaşayabilirliğin tehlikeye düşmesi, Dam sisteminin hayatiyetini gösterir.

Bakteri kromozomundaki ikileşme orijininde çok sayıda GATC konumu olduğu için orası ikileşme sonrası yarı-metillenmiş durumunu daha uzun süre korur. DNA ikileşmesinin zamanlamasında bunun merkezî bir önemi vardır. SeqA proteini ikilenme orijinine bağlanarak onu tecrit eder ve metillenmesini engeller. Yarı metillenmiş ikilenme orijinleri inaktif olduklarından bu mekanizma hücre döngüsü sırasında DNA ikileşmesinin tek bir kere olmasını sağlar.

Bazı genlerin ifadesi, örneğin E. coli 'de pilus proteinlerini kodlayanların ifadesi, gen operonunun promotör bölgesindeki GATC konumlarının metillenmesi ile düzenlenir. DNA ikileşmesinin hemen sonrasındaki çevresel şartlar, bu promotör bölgesinin yakınındaki ve uzağındaki iki bölgeden birinin metilasyonu bloke edebilir. Metilasyon şekli oluştuktan sonra pilus gen transkripsiyonu DNA tekrar ikilenene kadar ya etkin ya da inhibe durumda kitli kalır. E. coli 'de pilus operonlarının idrar yolu enfeksiyonlarındaki virülansı belirlemekte önemli bir rol oynar. Bu yüzden Dam inhibitörlerinin antibiyotik olarak çalışabileceği önerilmiştir.

Metilasyon spesifik PCR, sodyum bisülfitin DNA ile kimyasal tepkimesi sonucu metillenmemiş sitozinin urasile dönüşmesi reaksiyonu ve bunun ardından geleneksel PCR yapılması esasına dayalıdır. Metillenmiş sitozinler bu tepkimede urasile dönüşmezler, durumu merak edilen CpG konumu ile örtüşen primerler kullanılarak orasının metillenip metillenmediği anlaşılır.

Çip üzerine kromatin immün çöktürme yöntemi, metillenmiş DNA'ya spesifik proteinlere (MCP2 gibi) bağlanan antikorlarlar kullanılarak çökeltilen DNA'nın DNA dizilimlerine bağlanması esasına dayalıdır.

Restriksiyon tespit noktası genom taraması Karmaşık olmasından dolayı artık ender kullanılan bir testtir, restriksiyon enzimlerinin metillenmiş ve metilenmemiş CpG konumlarını farklı derecede tanıyıp kesme esasına dayaslı olması bakımından, HELP testine benzer.

Metillenmiş DNA immün çöktürmesi (İng. Methylated DNA immunoprecipitation; MeDIP), kromatin immün çöktürmesine benzer, metillenmiş DNA parçaları immün çöktürme ile saflaştırılır, ardından DNA mikrodizilim veya DNA dizilemesi gibi DNA saptama yöntemlerine girdi olarak kullanılır.