Kalsiyum görüntüleme

Kalsiyum görüntüleme tekniği hücre, doku ya da ortamdaki kalsiyum (Ca2+) durumunu görüntülemek amacıyla kullanılan bir bilimsel teknik. Kalsiyum görüntüleme teknikleri floresan özelliği taşıyan, fakat Ca2+ ile bağlandığında floresan özelliği değişen kalsiyum belirteçlerinden faydalanır. İki temel tip kalsiyum belirteci mevcuttur: kimyasal belirteçler ve genetik olarak kodlanmış belirteçler. Kalsiyum görüntüleme, canlı hayvanlarda hücre içi kalsiyumu optik olarak görüntülemek için kullanılabilir. Bu teknik geniş çapta hücre tipinin ve sinir devrelerindeki yüzlerce gliya hücrelerinin ve sinir hücrelerinin sinirsel aktivite görüntüleme çalışmalarına izin verir.

Kimyasal belirteçler kalsiyum iyonları ile şelat oluşturabilen küçük moleküllerdir. Tüm bu moleküller BAPTA olarak bilinen EGTA homoloğunu magnezyum (Mg2+) iyonlarına karşı yüksek kalsiyum (Ca2+) seçiciliğini temel alır.

Bu boyalar sık sık asetoksimetil ester olarak maskelenen şelatör karboksil gruplar ile kullanılır, böylece molekül lipofilik olur ve hücreye girişi kolaylaşır. Bu haldeki belirteç hücreye girdikten sonra hücresel esterazlar karboksil grupları serbest bırakır ve belirteç kalsiyuma bağlanabilir. Boyaların serbest asit formu (asetoksimetil ester modifikasyonu olmayan hali) mikroelektrot veya mikropipet yardımıyla hücrelere doğrudan enjekte edilebilir, böylece hücrelerin hangi bölümünün boya tuttuğuyla ilgili belirsizlikler giderilebilir (asetoksimetil ester ayrıca endoplazmik retikulum ve mitokondriye de girer). Ca2+ iyonunun floresan belirteci moleküle bağlanması floresanın kuantum veriminde artışa ya da ışıma/uyarım dalga boyunda kaymaya sebep olur. Tekil kimyasal Ca2+ floresan belirteçleri çeşitli hücresel hazırlıklarda sitozolik kalsiyum ölçümleri için kullanılır. İlk gerçek zamanlı (video hızı) Ca2+ görüntülemesi 1986 yılında kalp hücrelerinde yoğun video kameralar kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Tekniğin bir sonraki gelişiminde lazer tarayıcılı konfokal mikroskoplar kullanılarak hücre altı Ca2+ sinyallerinin Ca2+ kıvılcımları ve Ca2+ biplemesi ürettiği ortaya çıkmıştır. Kimyasal Ca2+ floresan belirteçlerin kombinasyonundan alınan göreceli yanıtlar ayrıca mitokondri gibi hücre içi organellerdeki geçici kalsiyum miktarını belirlemek için kullanılmıştır.

Kalsiyum haritalama olarak da bilinen kalsiyum görüntüleme, ayrıca miyokardiyal doku üzerinde araştırma yapmak için de kullanılır. Kalsiyum haritalama bütün olarak fare, sıçan ve tavşan gibi türlerin izole kalpleri üzerinde uygulanabilen bir tekniktir.

Bu belirteçler, yeşil floresan protein (GFP) veya onun türevlerinin (örneğin dairesel değiştirilmiş GFP, YFP, CFP), kalmodulin (CaM) ve CaM'e bağlanabilen miyozin hafif zincir kinazın M13 etki alanı ile iç içe geçmesi ile türetilmiş floresan proteinlerdir. Alternatif olarak, GFP türevleri kalsiyum bağlayıcı protein troponin C (TnC) ile iç içe geçer ve FRET (Förster Rezonans Enerji Transferi) mekanizmasını sinyal modülasyonu amacıyla kullanır.

Genetik olarak kodlanmış belirteçlerin hücreler üzerine yüklenmesine gerek yoktur, bunun yerine bu proteinleri okuyan genler kolayca hücre hatlarından hücre içine alabilir. Ayrıca boyanın tüm hücrelerde gösterilmesini ya da seçici olarak belli hücre alt tiplerinde gösterilmesini sağlayan transgenik hayvanların üretimi de mümkündür. GECIler nöron, T-hücreleri, kardiyomiyositler, vb. çalışmalarda kullanılmaktadır.

Belirteç türü ne olursa olsun görüntüleme prosedürü genellikle çok benzerdir. Belirteçle yüklü ya da GECI durumunda gösteren hücreler floresan mikroskobu ile gözlemlenebilir ve bir CCD kamera ile kaydedilebilir. Konfokal ve iki fotonlu mikroskoplar geliştirilmiş kesit alma yeteneği sağlayabilir, böylece kalsiyum sinyalleri mikro etki alanında ya da (örneğin) sinaptik butonlarda çözümlenebilir. Görüntüler floresan yoğunluğu değişimlerinin tek ya da çift dalgaboyunda oransal olarak (oransal belirteçler) gösterdiklerinin ölçülmesiyle analiz edilir. Türetilmiş floresan yoğunlukları ve oranları, bilinen Ca2+ düzeylerinin kalibre edilmiş oranlarına karşı çizilir ve Ca2+ konsantrasyonu öğrenilir. Işık alan mikroskopi yöntemleri 3D birimlerde sinirsel aktivite kapasitesinin fonksiyonel okunumuna kadar genişler.