Parâmetros produtivos e genéticos da produção in vitro de embriões Nelore no Estado do Acre

<jats:p>Objetivou-se avaliar dados retrospectivos da produção in vitro de embriões (PIV) em Nelore, no Estado do Acre, a fim de estabelecer parâmetros não genéticos e genéticos. Para tanto, dados de 1292 sessões de aspirações foliculares guiadas por ultra som realizadas em 571 doadoras Nelore, distribuídas em dez fazendas no Acre, entre os anos de 2015 e 2018, foram coletados e analisados para estimativa de parâmetros produtivos e não genéticos, utilizando-se o Método de Quadrados Mínimos Generalizados através do Software SAS, e efeitos genéticos pelo Método de Máxima Verossimilhança Restrita, utilizando-se o software MTDFREML. Observou-se número médio de 30,05; 9,82 e 3,03 para oócitos, embriões e gestação por aspiração/vaca, respectivamente; e porcentagens médias de 34,19; 38,39 e 10,68% de taxa de conversão de oócito/embrião, de embrião/gestação e de oócito/gestação, respectivamente. Para os efeitos genéticos, observou-se que a herdabilidade apresentou magnitude baixa a média, indicando variabilidade genética para produção de oócitos, embriões e gestação. As correlações fenotípicas e genéticas entre número total de oócitos, embriões e gestação foram positivas e de alta magnitude, indicando que a seleção para aumento na produção de oócitos resulta em aumento na produção de embriões e na taxa de gestação. Conclui-se que os efeitos não genéticos na PIV devem ser considerados nos modelos de avaliação genética para estas características, e as estimativas de herdabilidade encontradas neste estudo, apesar de serem de magnitudes baixas a moderadas, indicam que existe variabilidade genética aditiva para seleção de doadoras com melhor potencial genético para produção de oócitos, embriões e gestações.</jats:p>

section_content: El objetivo fue evaluar datos retrospectivos sobre la producción de embriones in vitro (PIV) en Nelore, en el Estado de Acre, para establecer parámetros no genéticos y genéticos. Para ello, se recopilaron y analizaron datos de 1292 sesiones de aspiraciones foliculares guiadas por ultrasonido realizadas en 571 donantes Nellore, distribuidas en diez fincas en Acre, entre 2015 y 2018, para estimar parámetros productivos y no genéticos, utilizando -si el Generalizado Método de Mínimos Cuadrados a través del Software SAS, y efectos genéticos a través del Método de Máxima Verosimilitud Restringida, utilizando el software MTDFREML. Se observó un número promedio de 30,05; 9,82 y 3,03 para ovocitos, embriones y aspiración/preñez de vaca, respectivamente; y porcentajes medios de 34,19; 38,39 y 10,68% de conversión ovocito/embrión, embrión/embarazo y ovocito/embarazo, respectivamente. Para los efectos genéticos, se observó que la heredabilidad presentó magnitud baja a media, indicando variabilidad genética para la producción de ovocitos, embriones y gestación. Las correlaciones fenotípicas y genéticas entre el número total de ovocitos, embriones y preñez fueron positivas y de gran magnitud, lo que indica que la selección para aumentar la producción de ovocitos da como resultado una mayor producción de embriones y tasa de preñez. Se concluye que los efectos no genéticos sobre la IVP deben ser considerados en los modelos de evaluación genética para estas características, y las estimaciones de heredabilidad encontradas en este estudio, a pesar de ser de magnitudes bajas a moderadas, indican que existe una variabilidad genética aditiva para la selección de donantes. con mejor potencial genético para la producción de ovocitos, embriones y embarazos. Palabras clave: Ganadería vacuna de carne; Producción de embriones in vitro; Efectos fijos; Heredabilidad; Correlaciones.
section_name: Resumen

section_content: A pecuária de corte é uma das atividades produtivas mais importantes para o agronegócio brasileiro, registrando importantes avanços quantitativos e qualitativos. O melhoramento genético aliado ao uso de tecnologias pode contribuir para o aumento do potencial genético dos animais nos sistemas de produção (Rosa, 2013). Diante disto, as biotecnologias reprodutivas são importantes ferramentas para o avanço do melhoramento genético dos rebanhos (Vieira, 2012). 

As limitações relativas ao progresso genético pela monta natural contribuíram para impulsionar a pesquisa, desenvolvimento e aplicação das biotecnologias reprodutivas. Assim, o uso da inseminação artificial (IA), a transferência de embriões (TE) e a produção in vitro de embriões (PIVE) tem contribuído para redução do intervalo de gerações e consequentemente acelerar o progresso genético dos rebanhos (Viana et al., 2010). A IA foi a primeira biotecnologia reprodutiva a ser utilizada, propiciando melhor aproveitamento do material genético do macho. A seleção de touros com melhor desempenho passou a ser explorado e incrementado aos programas de melhoramento genético com maior intensidade. 

Apesar dos grandes avanços promovidos pela IA, o baixo número de descendentes e o longo intervalo de gerações da espécie bovina dificultam o processo de seleção na população (Vieira, 2012). Desta forma, surgiu a necessidade de aprimorar técnicas reprodutivas para potencializar o aproveitamento do material genético da fêmea (Mello et al., 2016). A partir disto, a PIVE foi gradativamente incorporada aos programas de melhoramento genético e se tornou umas das técnicas mais eficazes para difusão concomitante do material genético de fêmeas e machos (Loiola et al., 2014; Caldas-Bussiere et al., 2021). 

O uso rotineiro da PIVE ainda apresenta dificuldades técnicas, alto custo financeiro e baixo número de embriões viáveis (Scanavez; Campos; Santos, 2013). Um dos motivos desta baixa produção de embriões está relacionado a fatores que influenciam a PIVE, dentre eles, os fatores ambientais, as condições de cultivo da FIV, as condições fisiológicas da doadora, efeito de touro e os fatores genéticos relacionados à PIVE (Peixoto et al., 2006; Mello et al., 2016; Queiroz et al.,2022). 

Diversos autores avaliaram efeitos não genéticos na PIVE, como maior produção de embriões viáveis em doadoras de acordo com a idade (Peixoto et al., 2006) ; menor taxa de produção de embriões (35%) no período mais quente do ano, em relação ao período mais ameno (55%) (Neves et al. 2016) ; efeito do ano e estação de ano na taxa de gestação de doadoras zebuínas (Peixoto et al., 2007) e efeito do touro e do tipo de sêmen sobre a taxa de blastocistos de Nelore e Gir (Morotti et al., 2014). 

Adicionalmente, estudos indicam variação genética aditiva para características relacionadas à produção de oócitos e embriões, estimando a herdabilidade para embriões transferíveis, em Nelore de 0,20 a 0,65 (Peixoto et al., 2004) e em Guzerá, herdabilidade de 0,08 a 0,23 para número de oócitos; de 0,17 para número de embriões clivados e 0,15 para embriões produzidos (Perez et al., 2015). 

Neste contexto, objetiva-se com esse estudo avaliar os parâmetros produtivos e genéticos da produção in vitro de embriões em bovinos Nelore no Acre.
section_name: Introdução

section_content: Este estudo foi realizado com dados coletados em um laboratório comercial de produção in vitro de embriões, In Vitro Acre, localizado em Rio Branco, Estado do Acre. Os dados referem-se a 1. 292 sessões de aspirações foliculares guiadas por ultrassom, realizadas em 571 doadoras Nelore, distribuídas em dez fazendas no Acre entre os anos de 2015 a 2018, mediante pesquisa de campo quantitativa (Pereira et al., 2018). 

Os oócitos foram coletados por meio da técnica de aspiração folicular Ovum Pick-up (OPU), por um só técnico, e encaminhados ao laboratório para maturação in vitro, sendo mantidos em uma incubadora com temperatura de 38,5ºC, com atmosfera de 5% de CO2, por um período entre 20 a 22 horas. Para fertilização in vitro foi utilizado sêmen sexado e convencional obtido das centrais de comercialização de sêmen. O protocolo utilizado baseou-se na técnica de centrifugação através do gradiente descontínuo de Percoll, com concentração espermática de 5x10 6 espermatozoides/mL. A incubação (Complexos Cumulus Oophorus -COCs e espermatozoides) foi realizada em estufa de cultivo intracelular, com atmosfera de 5% de CO2 e temperatura 38,5ºC, por um período de 18 a 21 horas. Para cultivo in vitro, foi retirado as células do cumulus dos zigotos e os mesmos foram mantidos em incubadora com temperatura de 38,5ºC, com atmosfera de 5% de CO2. No dia três (D3), após fertilização in vitro, foi realizada a avaliação da clivagem e dia 17 a inovulação. Todo procedimento laboratorial para a PIVE foi realizado por um só técnico. 

O protocolo de preparação das receptoras para inovulação iniciou-se no dia zero (D0) com a inserção do dispositivo intravaginal com 1g de progesterona (P4 -Reproneo, Biogenesis) e aplicação de 2mL de benzoato de estradiol (BE-Bioestrogen, Biogenesis Bago). No dia oito (D8) foi retirado o implante, aplicando 2mL de prostaglandina (PGF2 -Dcloprostenol: Croniben, Biogenesis Bago), 300UI (1,5mL) de gonadotrofina coriônica equina (eCG -Ecegon, Biogenesis Bago) e 2mL de cipionato de estradiol (CE-Croni-cip, Biogenisis Bago). No dia dezessete (D17) foi realizada a inovulação dos embriões. O diagnóstico de gestação foi realizado em 30 e 60 dias após a inovulação, por meio da ultrassonografia transretal (DP 10 Vet Mindray). 

Para análise estatística foi considerado as seguintes variáveis: total de OPU (NTAF); de COCs (NTOOC), de embriões clivados (NTCLIV), de embriões produzidos (NTEMB), de gestação (NTGEST), e os percentuais de conversão de oócitos para embriões (PCO/E), conversão de embriões para gestação (PCE/G), conversão de oócitos para Gestação (PCO/G) e taxa de clivagem (TXCLIV). 

Para as variáveis relacionadas ao NTOOC foi considerado o número total COCs viáveis; para a variável NTCLIV foi considerado o total de embriões clivados em relação aos COCs viáveis, para a variável NTEMB foi considerado o total de embriões produzidos em relação aos embriões clivados e para a variável NTGEST foi considerado o total de gestação em relação aos embriões produzidos. E os percentuais foram calculados de acordo com as equações:

• A variável de PCO/E foi calculada pela equação:

• A variável de PCE/G foi calculada pela equação:

• A variável PCO/G foi calculada pela equação: Foram avaliados os seguintes efeitos fixos: de fazenda (engloba todas as variáveis relacionadas ao manejo específico da fazenda); idade da doadora (idade da doadora no ano da aspiração, sendo: Classe 1: doadoras até dois anos; Classe 2: 2-3 anos; Classe 3: 3-5 anos; Classe 4: 5-7 anos; Classe 5: 7-9 anos; Classe 6: 9-11 anos; Classe 7: 11-13 anos e Classe 8: doadoras acima de 13 anos); efeito de época do ano sobre a aspiração folicular (época 1: chuvosa, meses de dezembro a abril; época 2: época seca, meses de maio a setembro e época 3: transição seca/chuva, meses de outubro a novembro); tipo de sêmen (sexado e convencional), efeito individual da doadora e do touro (avaliados em relação à variabilidade genética na produção in vitro). 

As estimativas dos componentes de variância e herdabilidade foram obtidas pelo método da Máxima Verossimilhança Restrita (REML), utilizando o programa MTDFREML -Multiple Trait Derivative Free Restricted Maximum Likelihood (Boldman et al., 1995), adotando-se o modelo animal uni-caractere, de acordo com:
section_name: Metodologia

section_content: A média geral de produção de COCs por aspiração folicular/doadora no período estudado foi de 30,05 ± 19,81. Estes Nesse estudo, a média geral de embriões produzidos foi de 9,82 ± 8,10 embriões por aspiração folicular/doadora, sendo similar aos resultados relatados por Baruselli et al. (2006) Os resultados referentes às TXCLIV no presente estudo foram de 66,66%, semelhantes ao observado na literatura que variaram entre 56 a 70% (Ribeiro et al., 2011; Loiola et al., 2014; Silva et al., 2015). 

Na Tabela 1 estão apresentados os resultados médios (+ desvio padrão) das variáveis OPU, total de COCs, clivagens,

embriões produzidos e gestação em cada fazenda estudada, onde se observou que o efeito fazenda influenciou significativamente cada uma das variáveis estudadas (p < 0,05). 

Tabela 1 -Média (+ desvio padrão) de aspiração folicular (NAF), de COCs (NTOOC), de embriões clivados (NTCLIV), de embriões produzidos (NTEMB) e de gestação (NTPREN) por aspiração/vaca em cada Fazenda estudada. Observa-se alta variação na eficiência da PIVE entre as fazendas avaliadas, o que sugere a existência de um conjunto de fatores ambientais não identificáveis inerentes de cada fazenda que conduziu aos diferentes resultados. Na literatura encontram-se descritos fatores ambientais e de manejo que podem influenciar nos índices de PIVE como: receptoras, idade da doadora, ciclo estral, nutrição, escore de condição corporal, sanidade, sazonalidade, técnico, a raça, manejo e ambiente (Costa Filho et al., 2013; Junqueira et al., 2006).
section_name: Resultados e Discussão

section_content: Na Tabela 2 estão dispostos os resultados desse estudo considerando a de idade da doadora, que influenciou todas as variáveis avaliadas (p< 0,05). 

Tabela 2 -Média (+ desvio padrão) de aspiração folicular (NAF), de COCs (NTOOC), de embriões clivados (NTCLIV), de embriões produzidos (NTEMB) e de gestação (NTPREN) por aspiração/vaca de acordo com a faixa etária da doadora. Contudo, vacas de até 13 anos demonstraram PCO/P variando de nove a 14,14%, ressaltando que a efetividade do melhoramento genético é dependente da utilização de genética atual, oriundas de vacas novas de processos seletivos. Neste sentido, vacas acima de 13 anos possuem genética defasada, sendo necessária substituição por vacas de melhor potencial genético e com melhor produção para PIVE (Rosa, 2013).
section_name: FAZENDA

section_content: Efeito significativo para idade da vaca foi relatado por Peixoto et al. (2006), ao avaliarem animais zebuínos ao observarem a maior produção de embriões viáveis em doadoras entre sete e oito anos. Da mesma forma, Mello et al. (2016) verificaram maior número de oócitos recuperados em doadoras da raça Sindi entre 2 a 6 anos. Essas diferenças entre doadoras de diferentes faixas etárias podem estar relacionadas aos processos de recrutamento e atresia folicular presentes em cada ciclo estral, sendo que doadoras mais velhas, geralmente apresentam menor reserva folicular devido às alterações no perfil hormonal (Neves; Marques JR, 2008). 

Observou-se que o NTCLIV e NTGEST (p < 0,05) foi influenciado pela época do ano que a OPU foi realizada na Fazenda (Tabela 4). 

Tabela 4 -Média (+ desvio padrão) de aspiração folicular (NAF), de COCs (NTOOC), de embriões clivados (NTCLIV), de embriões produzidos (NTEMB) e de gestação (NTPREN) por aspiração/vaca de acordo com época do ano. Na época das chuvas observou-se menor média de gestação, uma vez que para o sucesso da gestação há de se considerar a categoria da receptora que é muito afetado pelas condições de ambiente.
section_name: CLASSE

section_content: Não se observou efeito da estação do ano para as variáveis NTOOC e NTEMB (p>0,05). No entanto, ao escolher a época da aspiração folicular deve-se considerar a época mais favorável à conversão de oócitos em gestação. Peixoto et al. (2007) avaliando efeitos na taxa de gestação de doadoras zebuínas, obtiveram efeito significativo para estação de ano, onde a estação do outono conduziu a melhores taxas de gestação. Da mesma forma Neves et al. (2016) ao avaliarem influências climatológicas em vacas Nelore, constatou correlação entre a estação do ano e a taxa de PIVE, onde o período mais quente a taxa de embriões produzidos foi menor. 

Houve efeito significativo para tipo de sêmen para todas as variáveis avaliadas (p<0,05), evidenciando melhor eficiência do sêmen convencional (Tabela 5). 

Tabela 5 -Média (+ desvio padrão) de aspiração folicular (NAF), de COCs (NTOOC), de embriões clivados (NTCLIV), de embriões produzidos (NTEMB) e de gestação (NTPREN) por aspiração/vaca de acordo com o tipo de sêmen utilizado. A utilização do sêmen convencional aumenta aproximadamente 59% de produção de gestação em relação ao sêmen sexado. A diferença entre o sêmen sexado e convencional pode estar relacionada ao processo de sexagem, no qual os espermatozoides são expostos a estresse químicos e físicos diminuindo a sua capacidade de fertilização (Serafim et al., 2018). Os resultados encontrados neste estudo para as características de NTOOC, NTEMB, NTPREN, TXCLIV e os percentuais de PCO/E e PCE/P apresentam herdabilidade baixa a moderada e sugerem a existência de variação genética aditiva para seleção de doadoras para estas características. Peixoto et al. (2004), ao avaliarem fatores genéticos que afetam a resposta superovulatória em doadoras da raça Nelore em um programa MOET, estimou herdabilidade para embriões viáveis que variaram de 0,20 a 0,65. As estimativas de herdabilidade obtidas neste estudo foram semelhantes aos encontrados por outros autores. Em estudo conduzido por Perez et al. (2015), foi relatado valores de herdabilidade para raça Guzerá de 0,08 a 0,23 para número de oócitos, 0,17 para embriões clivados e 0,15 para embriões produzidos. Merton et al. (2009a) obtiveram estimativa de herdabilidade variando de 0,09 a 0,25 para número de oócitos, 0,21 para embriões clivados e 0,07 para embriões viáveis em vacas Holandesas. As estimativas de herdabilidade para embriões em programas de PIVE e MOET variam de 0,03 a 0,26 (Peixoto et al., 2004; Konig et al., 2007; Merton et al., 2009b). Os resultados relacionados à TXCLIV e PCO/g indicam que a variação genética aditiva é praticamente inexistente e as melhorias estão relacionadas principalmente as condições ambientais da técnica de PIVE. Merton et al. (2009a) estimou herdabilidade para taxa de clivagem com valor de 0,07, com magnitude baixa, indicando pouca variabilidade genética para esta característica.
section_name: ÉPOCA

section_content: De modo geral, podem ser observadas correlações fenotípicas e genéticas positivas e significativas entre NTOOC, NTEMB e NTGEST (Tabela 7). A consequência da correlação genética, do ponto de vista de melhoramento genético, é que se duas características economicamente importantes mostram uma correlação altamente positiva, a ênfase na seleção deverá ser apenas nas características de maior facilidade e tempo de medição, reduzindo, desse modo, a complexidade do processo seletivo (Pereira, 2008). De modo geral, as correlações genéticas ocorrem devido ao fenômeno conhecido por pleiotropismo, onde duas ou mais características são influencias por um ou mais genes em comum. A partir das correlações obtidas neste estudo pode-se inferir que há mecanismos genéticos e/ou ambientais que influenciam simultaneamente na produção de oócitos, embriões e gestação.
section_name: SÊMEN

section_content: A eficiência no processo de produção de oócitos, embriões e gestação, obtidos no Acre, nas condições desse estudo, estão de acordo com os índices observados na literatura nacional. Os efeitos não genéticos na produção de oócitos, embriões e gestação devem ser considerados nos modelos de avaliação genética para estas características. 

As estimativas de herdabilidade encontradas neste estudo, apesar de serem de magnitudes baixas a moderadas, indicam que existe variabilidade genética aditiva para seleção de doadoras com melhor potencial genético para produção de oócitos, embriões e gestação. 

As correlações fenotípicas e genotípicas foram positivas, significativas e de alta magnitude, sugerindo que a seleção para aumento na produção de oócitos conduz ao aumento na produção de embriões e de gestação. 

No entanto, estudos complementares sobre os parâmetros produtivos e genéticos da produção in vitro de embriões em bovinos, serão continuadamente desenvolvidos visando incrementar os sistemas de produção de gado de corte, sobretudo aqueles inseridos no Estado do Acre.
section_name: Conclusão