Altered balance between proteolysis and antiproteolysis in oncohematologic diseases

<jats:p>Destruction of malignant cell clones and search for markers of the effectiveness of chemotherapy in patients with hematologic malignancies is an urgent direction of research. The purpose of this paper was to study plasma of patients with various forms of blood tumor, the activity of trypsin-like enzymes, matrix metalloproteinases MMP2 and MMP9, content of α1-proteinase inhibitor and α2-macroglobulin before and after the cytotoxic therapy by anthracycline antibiotics, doxorubicin and daunorubicin. It was established that concentration of inhibitors and activity of trypsin-like enzymes increased in patients with acute myeloid leukemia and multiple myeloma against the backdrop of multidirectional changes of proMMP9. Activity of the latter enzyme was reduced to 0,03±0,01 rel. u. in acute myeloid leukemia, and after chemotherapy it increased 7 times. Reducing level of inhibitors and increasing activity of MMP9 were found in chronic lymphocytic leukemia. The presence of the correlation between the α2-macroglobulin and gelatinase activity in the treatment indicates that the inhibitor is an important mechanism for storing of gelatinоlytic potential. Balance between proteolysis and antiproteolysis depends on the type of proliferating cells and the course of the disease. Indicators of tissue destruction may be an additional criterion for monitoring the stage of blood tumors and efficacy of treatment.</jats:p>

section_content: Протеолітичні процеси відіграють надзвичайно важливу роль у життєдіяльності клітини та цілісного організму, забезпечуючи процесинг, дозрівання, оновлення білків, передачу сигналу у клітину та міжклітинні взаємодії. Внутрішньоклітинний протеоліз відбувається у цитоплазмі в лізосомах, які містять велику кількість протеаз, позаклітинний -за дії матрикс-деградувальних ензимів та екскреторних ензимів, що синтезуються у фібробластах, гепатоцитах і клітинах крові (Hultberg and Sjögren, 1980; Rozario and DeSimone, 2010). У разі розвитку онкогематологічних захворювань деякі з внутрішньоклітинних протеаз можуть секретуватись у міжклітинний простір і брати або пряму участь у руйнуванні позаклітинних білків, або опосередковану, внаслідок активації специфічних ензимів шляхом обмеженого протеолізу (Jarovaja, 2005; Wiedow and Meyer-Hoffert, 2005; Mecham, 2012). Особливу увагу серед багатьох протеолітичних ензимів крові привертають матриксні металопротеїнази 2/9 та трипсиноподібні ензими, оскільки ці ферменти здатні руйнувати колаген базальних мембран і сприяти таким чином метастазуванню пухлини (Gajdamaka et al., 2009; Kessenbrock et al., 2010). 

Активність протеолітичних процесів у крові залежить не тільки від кількості та функціональної активності відповідних ензимів, а і від наявності багатьох факторів, що секретуються гепатоцитами, ендотеліоцитами та клітинами крові. Велике значення мають інгібітори протеолітичних ензимів, які також продукуються цими клітинами (Pamyrskyj, 2009). Порушення балансу у системі «протеоліз -антипротеоліз» при онкогематологічних захворюваннях може бути однією з причин злоякісної трансформації клітин і неадекватної відповіді на лікувальні заходи, але дослідження в цьому напрямі обмежені (Veremeenko et al., 2000; Hidalgo and Eckhardt, 2001). 

Мета статті -співставити активність матриксдеградувальних ензимів із кількістю найпотужніших неспецифічних інгібіторів цих ферментів -α 1 -інгібітора протеїназ та α 2 -макроглобуліну при різних типах онкогематологічних захворювань до та після хіміотерапії із застосуванням протипухлинних антибіотиків доксорубіцину та даунорубіцину.
section_name: Вступ

section_content: Активність матрикс-деградувальних ензимів та їх окремих інгібіторів у плазмі крові визначали у пацієнтів із різними видами проліферативних захворювань крові (n = 51), які були розподілені по групах залежно від типу ураження: гострий мієлолейкоз (ГЛМ, n = 15), множинна мієлома (ММ, n = 14) та хронічний лімфолейкоз (ХЛЛ, n = 22). До групи умовно здорових донорів увійшли 20 чоловіків та 12 жінок. 

Для визначення активності трипсиноподібних ензимів (ТПЕ) застосовували модифікацію методу Веремеєнко (Veremeenko et al., 1988), суть якого полягає у розщепленні цими ферментами синтетичного безбарвного субстрату N-бензоїл-DL-аргінін-4-паранітроанілідгідрохлориду (БАНІ) з утворенням п-нітроаніліну жовтого кольору, ступінь забарвлення якого реєстрували за допомогою фотометра Human (Human, Германія) за довжини хвилі 410 нм. Кількісну оцінку ТПЕ здійснювали за допомогою калібрувального графіка, для побудови якого як стандартні розчини використовували різні розведення аніліну, який є кінцевим продуктом розщеплення БАНІ за дії трипсиноподібних ензимів. Питому активність ТПЕ у плазмі крові визначали як кількість міжнародних одиниць в 1 мл крові на мг білка (МО/мл•мг). 

Для визначення відносної активності матриксних металопротеїназ ММП2 та ММП9 застосовували метод желатин-зимографії, який базується на проведенні вертикального електрофорезу у 7,5% поліакриламідному гелі, кополімеризованому з желатиною як субстратом і за присутності додецилсульфату натрію як денатурувального агента (Shevcova et al., 2013). 

α 1 -Інгібітор протеїназ (α1-ІП) та α 2 -макроглобулін (α2-МГ) визначали за мікроваріантом методу Веремеєнко (Veremeenko et al., 1988). 

Статистичну обробку результатів проводили із застосуванням пакетів прикладних програм Statistica 6. 0, Statwin. Аналіз залежності показників проводили за допомогою коефіцієнтів кореляції Пірсона (Glanc, 1999).
section_name: Матеріал і методи досліджень

section_content: В умовах онкогематологічних захворювань мають місце різноспрямовані зміни активності досліджуваних матриксних металопротеїназ (або желатиназ). До лікування антрацикліновими антибіотиками основні зміни активності торкаються латентної форми ММП9. При мієлопроліферації цей показник знижується, а при лімфопроліферативних захворюваннях зазнає різноспрямованих змін: не змінюється при хронічному лімфолейкозі та суттєво підвищується при множинній мієломі (табл. 1). 

Проведені дослідження дозволили також оцінити загальну трипсиноподібну активність плазми крові при означених патологічних станах. Із наведених у таблиці 1 даних видно, що активність ТПЕ у досліджуваних групах до курсу хіміотерапії відрізнялась від норми і, хоча підвищення активності у пацієнтів із ГМЛ і ММ у 1,4 раза було суттєвим, статистично значимих змін не відбувалось. У групі хворих із ХЛЛ активність ТПЕ була аналогічною такій в контрольній групі. 

На фоні терапії при ГМЛ і ХЛЛ спостерігалось суттєве посилення активності трипсиноподібних ензимів порівняно з пацієнтами до лікування. Статистично значуще підвищення активності ТПЕ відмічене лише у групі з ГМЛ. При ХЛЛ, незважаючи на велику різницю між показниками до терапії та після (у 1,5 раза), вірогідних змін не виявлено. Однією з причин цих змін може бути розвиток дефіциту ендогенного інгібітора тромбіну (антитромбіну ІІІ) за впливу хіміотерапії. У результаті різке зростання активності ТПЕ може відбуватись за рахунок підвищення активності тромбіну. З іншого боку однією з вагомих ланок протеолітичного каскаду є серинова трипсиноподібна протеїназа -активатор плазміногену урокіназного типу (uPA), що викликає утворення іншої протеїнази з трипсиноподібною активністю -плазміну (Parfenova et al., 2006). Крім того, злоякісні клітини синтезують специфічну кальцій-залежну цистеїнову протеї-назу, яка отримала назву «раковий прокоагулянт». Ця протеїназа активує фактор зсідання крові Х, що також є трипсиноподібним ензимом (Butylin et al., 2007). 

Дослідження показників антипротеазної системи у хворих із проліферативними захворюваннями крові показало, що до хіміотерапії концентрація α 1 -ІП у плазмі хворих на ГМЛ була вірогідно підвищеною та складала 326,9 ± 13,9 мкмоль/л (рис. 1). Після хіміотерапії вміст цього інгібітора дещо знижувався. Кореляційний аналіз експериментальних даних виявив слабкий зворотний зв'язок між α 1 -ІП та активністю ТПЕ (r = -0,56) у цій групі хворих. Після застосування хіміотерапії кореляції між досліджуваними параметрами не визначалось. У хворих із ММ концентрація α 1 -ІП інгібітора у крові була також збільшена до 268,2 ± 42,7 мкмоль/л порівняно з нормою (229,4 ± 9,6 мкмоль/л), але різниця була недостовірною. Слід зазначити, що хіміотерапія не впливала на рівень цього інгібітора (Shevcova et al., 2014). Характерно, що при ММ зберігається високий коефіцієнт кореляції між α 1 -ІП та активністю ТПЕ, який складає 0,89, після хіміотерапії кореляція практично відсутня. Отже, збільшення ТПЕ при ММ супроводжується збільшенням концентрації інгібітора, а цитостатична терапія спричиняє порушення цього взаємозв'язку. Контроль, n = 32 1,02 ± 0,12 0,99 ± 0,04 1,03 ± 0,05 0,0020 ± 0,0003 до хіміотерапії Гострий мієлолейкоз, n = 15 0,03 ± 0,01 *** 1,01 ± 0,02 1,04 ± 0,04 0,0027 ± 0,0003 Множинна мієлома, n = 14 2,76 ± 0,06 *** 1,14 ± 0,04 *** 0,90 ± 0,01 * 0,0028 ± 0,0007 Хронічний лімфолейкоз, n = 22 0,95 ± 0,07 1,26 ± 0,06 ** 1,04 ± 0,01 0,0021 ± 0,0005 після хіміотерапії Гострий мієлолейкоз, n = 15 0,21 ± 0,06 ***/ § § § 1,79 ± 0,24 */ § § § 1,16 ± 0,03 */ § 0,0036 ± 0,0001 *** / § Множинна мієлома, n = 14 0,17 ± 0,10 ***/ § § § 1,46 ± 0,15 ***/ § § 0,89 ± 0,20 0,0021 ± 0,0001 Хронічний лімфолейкоз, n = 22 0,25 ± 0,10 ***/ § § §,01 ± 0,02 0,88 ± 0,02 */ § § § 0,0032 ± 0,0003 * Примітки: * -статистична значущість відносно контролю Р < 0,05, ** -Р < 0,01, *** -Р < 0,001; § -статистична значущість відносно показників відповідних груп до хіміотерапії Р < 0,05, § § -Р < 0,01, § § § -Р < 0,001; ММП -матриксна металопротеїназа, ТПЕ -трипсиноподібні ензими.
section_name: Результати та їх обговорення

section_content: 1 -до хіміотерапії антрацикліновими антибіотиками, 2 -після хіміотерапії; ** -Р < 0,01, *** -Р < 0,001 -статистична значущість відносно контролю; ГМЛ -гострий мієлолейкоз, ММ -множинна мієлома, ХЛЛ -хронічний лімфолейкоз При ХЛЛ отримані інші дані: до лікування рівень α 1 -ІП у пацієнтів був вірогідно зниженим. Застосування антрациклінових антибіотиків зумовлювало зростання даного показника, але виявлені зміни були невірогідними. При цьому визначався слабкий негативний кореляційний зв'язок рівня α 1 -ІП з активністю ТПЕ (r = -0,59), який, знов-таки, як і в разі ГМЛ і ММ, порушувався після проведення хіміотерапії. 

У пацієнтів із хронічним лімфолейкозом до терапії виявлено вірогідне зниження концентрації α 1 -ІП на тлі зниженої активності ТПЕ, хоча при цьому зберігається баланс між обома процесами. Цитостатична терапія викликала порушення цього балансу в усіх групах пацієнтів, що свідчило про активацію не тільки процесів деградації, а й метаболізму клітин у цілому. Результати визначення α 2 -МГ у вищеперелічених групах наведено на рисунку 2. У хворих із ГМЛ і ММ до хіміотерапії виявлено статистично значиме підвищення вмісту α 2 -МГ, який майже утричі перевищує норму (4,60 ± 0,07 г/л) і відповідно дорівнює 14,25 ± 2,49 та 14,06 ± 0,50 г/л. При ХЛЛ цей показник відповідав контрольним значенням (4,50 ± 0,98 г/л). 

Після застосування антрациклінових антибіотиків вміст α 2 -МГ змінювався залежно від типу захворювання: у разі ГМЛ і ММ він дещо зменшувався, а у випадку ХЛЛ, навпаки, зростав до 6,17 ± 1,89 г/л. Статистично значущі зміни спостерігались лише у пацієнтів із ММ, у яких кількість α 2 -МГ була нижчою у 1,6 раза і дорівнювала 8,66 ± 2,10 г/л. Слід зазначити, що ці зміни корелювали з активністю ТПЕ (r = 0,83).
section_name: Рис. 1. Концентрація α 1 -інгібітора протеїназ у плазмі крові хворих із проліферативними захворюваннями крові:

section_content: При проліферативних захворюваннях крові (гострий мієлолейкоз, хронічний лімфолейкоз, множинна мієлома) за умов проведення хіміотерапії превалюючу роль відіграє α 1 -інгібітор протеїназ. 

Наявність кореляції між α 2 -макроглобуліном і активністю желатиназ у процесі лікування вказує на те, що цей інгібітор -важливий механізм стримування желатинолітичного потенціалу. 

При онкогематологічних захворюваннях баланс у системі протеоліз-антипротеоліз залежить від типу проліферувальних клітин і перебігу захворювань. За впливу антрациклінових антибіотиків цей баланс порушується за рахунок змін як активності протеолітичних ферментів, так і концентрації їх інгібіторів. Butylin, A. A., Panteleev, M. A., Ataullahanov, F. A., 2007 Scand. 207, 105-110. Jarovaja, G. A., 2005. Bioregulirujushhie funkcii i patogeneticheskaja rol' proteoliza. Fiziologicheskaja rol' i bio-
section_name: Висновки

section_name: Бібліографічні посилання