Features of immunophenotypic finding B-cell lymphoproliferative diseases by flow cytometry

<jats:p>Aim. To assess the information content of conventional and additional immunophenotypic markers (CD200, CD305) in the differential diagnosis B-cell lymphoproliferative diseases by flow cytometry.&#x0D; Methods. An immunophenotypic study using 4-color flow cytometry was performed in 204 patients with different variants of B-cell non-Hodgkin's lymphomas. The study material included peripheral blood and bone marrow. The expression of CD45, CD19, CD20, CD22, CD79b, CD79a, CD5, CD10, CD23, FMC7, CD43, CD38, CD11c, CD103, CD25, CD 200, CD 305, light chains of immunoglobulins (kappa/lambda) using monoclonal antibodies (Becton Dickinson, USA) was evaluated. The intensity of antigen expression was assessed using mean fluorescence intensity (y. e.).&#x0D; Results. Conventional FMC7-positive expression revealed only half patients with different variants of leukemization of non-Hodgkin's lymphomas, whereas atypical positive expression of CD23 was observed in patients with marginal spleen lymphoma and follicular lymphoma in 27.3 and 28.6% of cases, respectively. In mantle cell lymphoma, expression of CD200 in B-cell was detected in a significantly smaller number of observations, accompanied by a significant decrease in the average intensity of CD200 fluorescence compared to B-cell chronic lymphocytic leukemia (B-CLL) cells. The mean fluorescence intensity (MFI) of CD305 in hairy cell leukemia is significantly higher than in splenic marginal zone lymphoma (SMZL) with villous lymphocytes.&#x0D; Conclusion. Different levels of the information content of some conventional markers were revealed in differential immunophenotypic diagnosis of B-cell lymphoproliferative diseases by flow cytometry; the use of additional markers CD200 and CD305 was highly informative in differential diagnostics between different variants of B-cell lymphoproliferative diseases with similar immunophenotypic and morphological characteristics of lymphoid elements.</jats:p>

section_name: Обмен клиническим опытом

section_content: Methods. An immunophenotypic study using 4-color flow cytometry was performed in 204 patients with different variants of B-cell non-Hodgkin's lymphomas. The study material included peripheral blood and bone marrow. The expression of CD45, CD19, CD20, CD22, CD79b, CD79a, CD5, CD10, CD23, FMC7, CD43, CD38, CD11c, CD103, CD25, CD 200, CD 305, light chains of immunoglobulins (kappa/lambda) using monoclonal antibodies (Becton Dickinson, USA) was evaluated. The intensity of antigen expression was assessed using mean fluorescence intensity (y. e. ). Results. Conventional FMC7-positive expression revealed only half patients with different variants of leukemization of non-Hodgkin's lymphomas, whereas atypical positive expression of CD23 was observed in patients with marginal spleen lymphoma and follicular lymphoma in 27. 3 and 28. 6% of cases, respectively. In mantle cell lymphoma, expression of CD200 in B-cell was detected in a significantly smaller number of observations, accompanied by a significant decrease in the average intensity of CD200 fluorescence compared to B-cell chronic lymphocytic leukemia (B-CLL) cells. The mean fluorescence intensity (MFI) of CD305 in hairy cell leukemia is significantly higher than in splenic marginal zone lymphoma (SMZL) with "villous" lymphocytes. Conclusion. Different levels of the information content of some conventional markers were revealed in differential immunophenotypic diagnosis of B-cell lymphoproliferative diseases by flow cytometry; the use of additional markers CD200 and CD305 was highly informative in differential diagnostics between different variants of B-cell lymphoproliferative diseases with similar immunophenotypic and morphological characteristics of lymphoid elements. Keywords: B-cell lymphoproliferative diseases, flow cytometry, СD200, СD305 markers. Преимущества метода многоцветной проточной цитометрии определяют широкие возможности его использования, прежде всего в диагностике и классификации лимфопролиферативных заболеваний (ЛПЗ) [1], мониторинге остаточного опухолевого клона, оценке факторов прогноза и резистентности к терапии. Традиционное морфологическое исследование при ЛПЗ не позволяет определить принадлежность опухолевых лимфоидных клеток к какой-либо линии (Т-, В-или NK) или стадии дифференцировки. Метод проточной цитометрии позволяет быстро выявить клональность опухолевых В-лимфоцитов, коэкспрессию основных для конкретной опухоли поверхностных и/или цитоплазматических маркёров. Однако не всегда иммунофенотипическая характеристика опухолевых лимфоцитов отдельных пациентов соответствует классической картине того или иного варианта В-ЛПЗ, что затрудняет интерпретацию полученных данных и может привести к неверному диагнозу. 

В некоторых публикациях [2] [3] [4] [5] появились данные об использовании относительно новых моноклональных антител в диагностической панели для иммунофенотипирования В-ЛПЗ. Мы проанализировали информативность традиционных и дополнительных иммунофенотипических маркёров (CD200, CD305) при различных вариантах В-клеточных ЛПЗ. CD200 (OX2) -трансмембранный гликопротеид, относящийся к суперсемейству имму-ноглобулинов, экспрессируется на тимоцитах, покоящихся и активированных Т-лимфоцитах, В-лимфоцитах, дендритных, эндотелиальных клетках, нейронах, но отсутствует на NK-клетках, моноцитах, гранулоцитах, тромбоцитах. Опухолевые В-клетки характеризуются яркой гомогенной экспрессией CD200 при В-клеточном хроническом лимфолейкозе (ХЛЛ), волосатоклеточном лейкозе (ВКЛ), значительно слабее её выраженность при лимфоме клеток мантийной зоны (ЛКМЗ) [4, 5]. Экспрессию CD200 считают неблагоприятным прогностическим признаком при множественной миеломе [6] [7] [8]. 

CD305, или LAIR-1 (от англ. Leukocyte-Associated Ig-Like Receptor-1), -трансмембранный гликопротеид, относится к суперсемейству иммуноглобулинов, экспрессируется на значительной части Т-, В-, NK-лимфоцитов, моноцитах, дендритных клетках, тимоцитах. Экспрессию LAIR-1 отмечают на ранних стадиях дифференцировки В-лимфоцитов, но она отсутствует на плазмобластах и плазмоцитах. Кроме того, LAIR-1 может функционировать как ингибирующий рецептор на Т-и NK-лимфоцитах [9, 10]. 

В рекомендациях Европейского консорциума по проточной цитометрии (EuroFlow) маркёр LAIR-1 включён в дифференциально-диагностическую панель В-ЛПЗ для диагностики ВКЛ (Leukemia, 2012). 

Цель исследования -оценить информативность традиционных и дополнительных имму-нофенотипических маркёров (CD200, CD305) при дифференциальной диагностике В-ЛПЗ методом проточной цитометрии. 

Иммунофенотипическое исследование проведено 204 пациентам с подозрением на В-ЛПЗ в научно-исследовательской лаборатории ГБУЗ МО «Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М. Ф. Владимирского». Также обследована группа из 20 пациентов с реактивным лимфоцитозом, у которых наличие В-ЛПЗ было исключено. Материалом для исследования служили периферическая кровь и костный мозг. 

Исследования были одобрены на заседании независимого комитета по этике ГБУЗ МО «Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М. Ф. Владимирского» (протокол №10 от 15. 10. 2015) и проведены с получением добровольного и информированного согласия пациентов. 

Возраст пациентов варьировал от 30 до 80 лет, средний возраст составил 56±15 лет. 

Иммунофенотипическое исследование проводили методом лазерной проточной цитометрии, применяя четырёхцветный проточный цитофлюориметр FACSCalibur (Becton Dickinson, США) с использованием программного обеспечения CellQwest, моноклональных антител, конъюгированных с флюоресцентными красителями (производство BD Biosciences, США). Использовали следующую панель моноклональных антител: Анти-CD45-FITC, Per-CP или Per-CP-Сy5,5, APC; анти-CD3-FITC, анти-CD19-APC, Per-CP или Per-CP-Сy5,5; анти-CD20-FITC, Per-CP или Per-CP-Сy5,5; анти-CD5, анти-FMC7, анти-CD38, анти-CD103, анти-CD43, анти-sIg kappa, меченные FITC; анти-CD(16+CD56), анти-CD10, анти-CD23, анти-CD56, анти-CD22, анти-CD79b, анти-CD25, анти-CD11c, анти-sIg lambda, меченные PE. Дополнительно в панель были включены моноклональные антитела анти-CD200 -PE (Clone MRC OX-104 BD Pharmingen), анти-CD305-PE (Clone DX26 BD Pharmingen). 

Иммунофенотипическое исследование проводили с применением стандартной методики пробоподготовки. Критерием позитивности считали наличие экспрессии антигена на поверхности или в цитоплазме более чем 20% опухолевых клеток. Оценку интенсивности экспрессии антигенов проводили по параметру средней интенсивности флюоресценции (MFI -от англ. Mean Fluorescence Intensity), выраженной в условных единицах (у. е. ). 

Статистическая обработка полученных результатов проведена с использованием стати-стической программы Statistica 8. 0 c расчётом средней величины и квадратичной ошибки средней (М±m). Для определения статистической значимости различий в средних значениях количественных показателей использовали t-критерий Стьюдента. Частоту антигенов в исследуемых когортах пациентов сравнивали по критерию Фишера. 

Из 204 обследованных пациентов ХЛЛ был диагностирован у 104, у 18 человек -ВКЛ, у 41 пациента -ЛКМЗ, у 34 больных -лимфома маргинальной зоны селезёнки (ЛМЗС), у 7 пациентов -лейкемизация фолликулярной лимфомы. Диагноз ЛКМЗ был подтверждён цитогенетическими исследованиями t(11;14) и/или выявлением экспрессии циклина D1 иммуногистохимическими методами. 

Данные по оценке традиционных иммунофенотипических маркёров при В-ЛПЗ представлены в табл. 1. 

Общий иммунофенотипический признак всех В-ЛПЗ -обнаружение рестрикции мембранных лёгких цепей иммуноглобулинов (kappa-либо lambda-тип), что служит подтверждением клональности В-лимфоцитов при опухолевой трансформации. Оценка интенсивности экспрессии CD20 по параметру MFI позволяет дифференцировать клетки В-ХЛЛ с низкой/слабой (dim) степенью экспрессии от остальных опухолевых клеток В-ЛПЗ, для которых характерна промежуточная (mod), либо высокая/яркая (bright) интенсивность экспрессии данной молекулы, что служит одним из основных традиционных дифференциальнодиагностических критериев, позволяющих отличить ХЛЛ от зрелоклеточных лимфом и ВКЛ. Общепринятым традиционным иммунофенотипическим признаком лейкемизации неходжкинских лимфом и ВКЛ считают позитивность FMC7, который обычно не экспрессирован при ХЛЛ, что также служит дифференциально-диагностическим критерием. 

Иммунофенотип лимфоцитов при ХЛЛ характеризовался классическими признаками: позитивной экспрессией антигенов CD5, CD23, CD43, отсутствием экспрессии CD10, FMC7. Все пациенты с ХЛЛ демонстрировали слабую (dim) экспрессию молекулы CD20, часть пациентов (4,5%) имели нетипичную яркую (bright) экспрессию CD22, у 33,8% пациентов обнаружено отсутствие мембранной экспрессии CD79b. У 14,4% больных не было выявлено рестрикции по мембранным лёгким цепям иммуноглобулинов. Отсутствие молекулы CD79b на поверхности клеток В-ХЛЛ может служить признаком делеции (13) (q14. 3) или нарушения формиро-Обмен клиническим опытом вания В-клеточного рецепторного комплекса [11]. 26% пациентов демонстрировали позитивную экспрессию CD38 на клетках В-ХЛЛ, что расценивают как иммунофенотипический показатель неблагоприятного прогноза и резистентности к терапии [12]. У 73% пациентов с ХЛЛ обнаружена позитивная экспрессия рецептора к интерлейкину-2 (CD25) на опухолевых В-лимфоцитах в диапазоне от 20 до 89% позитивных клеток. По данным литературы, у таких больных отмечают более агрессивное течение заболевания, есть связь с хромосомными аномалиями, стимуляцией Toll-like-рецепторов [13, 14]. По нашим данным, выраженная экспрессия CD25 на клетках В-ХЛЛ уже на этапе первичной иммунофенотипической диагностики служит маркёром высокой вероятности рефрактерности к проводимой терапии и низкого качества ремиссии заболевания, а также может быть показателем прогрессирования или развития рецидива заболевания [15]. 

Иммунофенотипический профиль опухоле вых В-лимфоцитов при лейкемизации ЛКМЗ характеризовался позитивной экспрессией CD5, отсутствием экспрессии CD23, CD43, CD10. У 20 и 15% пациентов с ЛКМЗ выявлена слабая (dim) экспрессия CD20 и CD22 соответственно, у 11,4% пациентов отсутствовала экспрессия CD79b. Позитивная экспрессия FMC7 выявлена только у 57,1% пациентов. 

Особой проблемой при иммунофенотипировании становится дифференциальная диагностика между CD5-позитивными ХЛЛ и ЛКМЗ при вариабельности антигенов CD23, реже CD43, а также при вариабельности интенсивности экспрессии CD20. Использование маркёра СD200 может помочь в разрешении этой проблемы. Оценка экспрессии СD200 у исследованных пациентов представлена в табл. 2 и 3. 

Во всех случаях ХЛЛ и в большинстве случаев реактивного лимфоцитоза выявлена позитивная экспрессия СD200 на В-лимфоцитах. Позитивная экспрессия СD200 обнаружена у пациентов с ЛКМЗ в значительно (p=0,000) меньшем количестве наблюдений, чем при ХЛЛ, что согласуется с данными литературы, хотя доля позитивных по СD200 пациентов с ЛКМЗ несколько выше, чем у других исследо- Для фенотипа опухолевых клеток фол ликулярной лимфомы была характерна яркая (bright) экспрессия всех пан В-клеточных маркёров в 100% наблюдений, позитивность CD10, вариабельность маркёров CD23, CD43 и CD38. В 43% случаев рестрикция лёгких цепей иммуноглобулинов выявлена только при внутрицитоплазматическом окрашивании. Позитивная экспрессия FMC7 обнаружена только у половины обследованных пациентов (57,1%), а позитивная экспрессия CD23 -в 28,6% наблюдений. В последней классификации Всемирной организации здравоохранения (2016) выделен новый вариант преимущественно диффузной CD23-позитивной фолликулярной лимфомы с фенотипом CD10 + bcl-2 + bcl-6 +, характеризующийся более агрессивным течением и del 1p36 [16]. 

Иммунофенотип В-лимфоцитов при ЛМЗС характеризовался преимущественно яркой (bright) экспрессией всех пан В-клеточных маркёров, отсутствием экспрессии CD5, CD10, CD43, CD103 и CD38, вариабельностью CD23, CD25 и FMC7. В частности, не характерная для данной группы пациентов позитивная экспрессия антигена CD23 обнаружена практически у трети (27,3%) больных, а позитивная экспрессия классического традиционного маркёра FMC7 выявлена только у половины (54,5%) пациентов. 

Опухолевые клетки при классической фор ме ВКЛ демонстрировали яркую (bright) экспрессию всех пан В-клеточных маркёров, отсутствие CD5, наличие позитивной экспрессии антигенов FMC7, CD11с, CD103 и CD25. Из 18 пациентов с иммунофенотипически верифицированным диагнозом ВКЛ у 27,7% нами установлена вариантная форма с позитивной Не было обнаружено достоверных различий по содержанию СD305-позитивных клеток между данными группами пациентов, но средняя интенсивность флюоресценции СD305 при ВКЛ была достоверно выше, чем при лейкемизации ЛМЗС (рис. 3). Этот факт может быть использован при иммунофенотипической дифференциальной диагностике этих вариантов В-ЛПЗ со сходной морфологической характеристикой лимфоидных элементов. ВЫВОДЫ 1. Обнаружены некоторые особенности иммунофенотипической характеристики опухолевых клеток у пациентов с В-клеточными лимфопролиферативными заболеваниями. 

2. От 7,5 до 20% пациентов с лейкемизацией лимфомы клеток мантийной зоны и лимфомы маргинальной зоны селезёнки могут демонстрировать нетипичную слабую (dim) интенсивность экспрессии CD20, CD22 и CD79b, что затрудняет дифференциальную диагностику с хроническим лимфолейкозом. 

3. Позитивная экспрессия традиционного маркёра FMC7, характерная для лейкемизации зрелоклеточных лимфом и волосатоклеточного лейкоза, выявлена только у половины пациентов с лимфомой клеток мантийной зоны, фолликулярной лимфомой и лимфомой маргинальной зоны селезёнки. 

4. Обнаружено относительно много наблюдений с нетипичной позитивной экспрессией CD23 у пациентов с фолликулярной лимфомой и лимфомой маргинальной зоны селезёнки (28,6 и 27,3% соответственно). 

5. Позитивная экспрессия СD200 на опухолевых клетках выявлена у пациентов с лимфомой клеток мантийной зоны в значительно (p <0,0001) меньшем количестве наблюдений, чем при хроническом лимфолейкозе и других вариантах В-клеточных лимфопролиферативных заболеваний. 

6. Cтатистически значимое (p <0,001) снижение средней интенсивности флюоресценции СD200 при лимфоме клеток мантийной зоны по сравнению с хроническим лимфолейкозом даёт возможность использования данного критерия в дифференциальной диагностике этих вариантов В-клеточных лимфопролиферативных заболеваний у больных с высоким содержанием СD200-позитивных опухолевых В-клеток. 

7. Показатель средней интенсивности флюоресценции СD305 при волосатоклеточном лейкозе достоверно выше, чем при лейкемизации лимфомы маргинальной зоны селезёнки, что может быть использовано при дифференциальной диагностике этих вариантов В-клеточных лимфопролиферативных заболеваний со сходной морфологической характеристикой лимфоидных элементов. 

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов по представленной статье. 

ЛИТЕРАТУРА
section_name: CD305) in the differential diagnosis B-cell lymphoproliferative diseases by flow cytometry.