PD-1 and LAG-3 as early prognostic markers in the treatment of patients with chronic lymphocytic leukemia

<jats:p><jats:bold>Background. </jats:bold>Recently, studies have been conducted all over the world to study the role of immune checkpoints in the pathogenesis of chronic lymphocytic leukemia (CLL) and the possibility of their use as prognostic markers. Of greatest interest are PD-1 (programmed cell death-1) and LAG-3 protein (lymphocyte-activation gene 3).</jats:p><jats:p><jats:bold>Aim. </jats:bold>To study the features of PD-1 (CD279) and LAG-3 (CD223) expression on blood B-cells of CLL patients and the possibility of their use as early markers for predicting the hematological response to therapy.</jats:p><jats:p><jats:bold>Materials and methods. </jats:bold>The blood of 30 patients with CLL in stage C according to Binet and 20 healthy individuals was studied by 10-color flow cytometry.</jats:p><jats:p><jats:bold>Results. </jats:bold>In patients with CLL, there were significant differences in the initial lymphocytes level, PD-1 and LAG-3 expression on B-lymphocytes, both with persons in the control group and among themselves with different hematological responses to therapy with rituximab according to the results of minimal residual disease monitoring.</jats:p><jats:p><jats:bold>Conclusion. </jats:bold>PD-1 and LAG-3 can be used as early markers for predicting the response of CLL patients to therapy. The combined use of initial lymphocytes level and PD-1 and LAG-3 expression on CD19+ blood cells has a greater prognostic value. New data obtained from the study of immune checkpoints PD-1 and LAG-3 may be useful in the development of targeted therapeutic agents.</jats:p>

section_content: For citation: Selyutina O. n., lysenko I. b., guskova n. K. et al. PD-1 and lag-3 as early prognostic markers in the treatment of patients with chronic lymphocytic leukemia. Onkogematologiya = Oncohematology 2023;18(4):156-62. (In russ. ). DOI: https://doi. org/10. 17650/1818-8346-2023-18-4-156-162

section_content: Хронический лимфолейкоз (ХЛЛ) -Вклеточная опухоль из малых Влимфоцитов, для которых харак терны яркая экспрессия CD19, CD5, CD23, CD43, слабая экспрессия CD20 и CD22 и отсутствие экспрес сии FMC7 [1, 2]. ХЛЛ демонстрирует клиническую гетерогенность, начиная от вялотекущего заболевания, не требующего лечения у одних пациентов, до быст рого прогрессирования процесса с развитием после дующей рефрактерности к лечению у других [3]. Таким образом, важнейшим этапом при первичной диагно стике ХЛЛ является оценка риска развития прогрес сирования заболевания, что позволит своевременно начать специфическую терапию, при необходимостиосуществлять коррекцию лечения [4]. 

При оценке эффективности лечения ХЛЛ необхо димо проводить количественное определение показа теля минимальной остаточной болезни (МОБ) наряду с традиционными клиническими, инструментальными и лабораторными данными. Технология выявления остаточных клональных злокачественных клеток эво люционировала наряду со своей номенклатуройот «остаточной болезни» к «минимальной остаточной болезни» до термина «измеримая остаточная болезнь», установленного Международным руководящим коми тетом (ISC) по МОБ ХЛЛ [5]. Величина остаточной болезни при ХЛЛ, оцениваемая во время и после ле чения, измеряема и используется в рутинной практи ке в качестве прогностического инструмента, терапев тической цели и потенциального триггера для раннего вмешательства [6]. Остаточная популяция опухолево го клона ХЛЛ в крови в количестве <0,01 % является предиктором высокой вероятности длительной ремис сии более 5 лет. МОБ от 0,01 до 0,90 % наблюдается у больных ХЛЛ с медианой выживаемости без прогрес сирования около 3 лет, что дает возможность проводить поддерживающую терапию. МОБ >1 % может свиде тельствовать о возможности развития раннего реци дива, а также служить основанием для изменения терапевтической тактики [7]. Для повышения прогно стической ценности МОБ в оценке течения опухоле вого процесса и ответа больных на терапию проводит ся активный поиск новых маркеров, используемых для стратификации больных на группы риска еще до начала лечения. 

Самыми изучаемыми в этом аспекте являются им мунные контрольные точки, которые исследуются во всем мире при различных опухолевых процессах. Наибольший интерес представляют рецепторы про граммируемой клеточной гибели PD1 (programmed cell death1; CD279) и LAG3 (lymphocyteactivation gene 3; CD223). J. H. Li и соавт. выявлена высокая экс прессия PD1 на Bклетках (CD19 + ) периферической крови пациентов с ХЛЛ в сравнении со здоровыми донорами. Отмечена роль экспрессии PD1 в прогно зировании течения ХЛЛ [8]. В исследованиях M. Rusak и соавт. показано, что у пациентов с высоким уровнем экспрессии PD1 проходит меньше времени до начала 1й линии терапии, чем у пациентов с низким уровнем рецептора [9]. Согласно данным M. Shapiro и соавт., высокие уровни экспрессии LAG3 также связаны с более короткой медианой времени от постановки диагноза до начала терапии, вместе с тем, по мнению авторов, LAG3 может служить терапевтической мишенью при таргетной терапии [10]. Ранее нами установлена экспрессия LAG3 на поверхности Влимфоцитов у больных ХЛЛ в отличие от здоровых лиц, при этом более высокий уровень экспрессии отмечен у пациен тов с неблагоприятным течением заболевания [11]. 

В связи с этим изучение особенностей экспрессии PD1 и LAG3 на Вклетках в зависимости от ответа больных ХЛЛ на терапию и в ассоциации указанных показателей с уровнем МОБ является перспектив ным. 

Цель исследования -изучить особенности экспрес сии PD1 (CD279) и LAG3 (CD223) на Вклетках кро ви больных ХЛЛ и возможность их применения в ка честве ранних маркеров прогноза гематологического ответа на терапию.
section_name: Введение

section_content: В исследование включены 30 больных (18 мужчин, 12 женщин) с впервые установленным диагнозом ХЛЛ стадии С по классификации Binet (основная группа), получавшие лечение в отделении онкогематологии НМИЦ онкологии (РостовнаДону) в период с 2020 по 2022 г. Средний возраст больных составил 66,8 ± 2,3 года. В контрольную группу вошли 20 здоровых лиц соответствующего возраста и пола без злокачественных заболеваний на момент включения в исследование. 

В крови больных до лечения и лиц контрольной группы исследовали уровень лимфоцитов, иммунофе нотип Вклеток (CD19 + ), экспрессию PD1 и LAG3 (подсчет производили в процентах от всех лимфо цитов). В группе больных после 6 курсов противо опухолевой терапии с ритуксимабом оценивали эф фект лечения по количеству оставшихся аберрантных CD19 + клеток, т. е. по величине МОБ (в процентах от всех ядросодержащих клеток). 

Исследования проводили в венозной крови в раство ре антикоагулянта К 2 ЭДТА (дикал этилендиаминтетра уксусная кислота) с применением метода 10цветной

Фундаментальные исследования в практической медицине на современном этапе проточной цитофлуориметрии (Navios 10 / 3, Beckman Coulter, США). Используемая комбинация монокло нальных антител, меченных флуорохромами, включа ла: CD45 PB, CD19 ECD / PC7 / APC, CD5 PC7 / APC, CD10 PC5, CD20 PC5. 5 / PC7, CD22 PE, CD23 FITC / PE, CD38 FITC / PB, CD43 APCA700, FMC7 FITC, CD3 PC7 / APC, CD223 PE, CD279 (РС7), kappa FITC, lambda PE (Beckman Coulter, BD Biosciences, США). Данные иммунофенотипирования анализиро вали с использованием программного обеспечения Kaluza v2. 1 (Beckman Coulter, США). Стратегию гей тирования строили в соответствии с международным стандартизованным протоколом [12]. 

Выделены 2 группы больных: 1я -с хорошим ге матологическим ответом на терапию (МОБ 0-0,9 %), 2я -с неудовлетворительным ответом (МОБ ≥1 %). 

Статистическую обработку результатов исследова ния выполняли в программе Statistica 13. 0 с примене нием критерия Шапиро-Уилка для малых выборок. Выборки соответствовали нормальному распределению. Данные представлены в виде M ± m, где M -среднее арифметическое значение; m -стандартная ошибка среднего. Сравнение количественных данных в группах (независимые выборки) выполняли с использованием параметрического tкритерия Стьюдента. За уровень статистической значимости принимали p <0,05. 

Сбор клинической информации, биологического материала, соблюдение правовых норм и правил вы полняли согласно разработанным алгоритмам дейст вий подразделений исследовательских и клинических групп НМИЦ онкологии [13].
section_name: Материалы и методы

section_content: Результаты иммунофенотипирования больных ХЛЛ, проведенного до начала терапии, свидетельст вуют об экспрессии на Влимфоцитах (CD19 + ) PD1 и LAG3 разной степени выраженности. В среднем уровень экспрессии PD1 составил 40,81 ± 3,81 %, LAG3 -24,62 ± 2,50 % от всех лимфоцитов (табл. 1). В контрольной группе экспрессия исследуемых моле кул на Влимфоцитах не установлена. 

При оценке значений МОБ выявлены статистиче ски значимые различия среди больных ХЛЛ с разным ответом на терапию. В связи c этим выделены 2 груп пы: 1я (n = 19) -с хорошим ответом на терапию, МОБ составила 0,15 ± 0,03 %; 2я (n = 11) -с неудовлетво рительным ответом, МОБ -12,25 ± 3,23 %, что в 81,2 раза больше по сравнению с 1й группой (р <0,001) (табл. 2, рис. 1). 

Результаты мониторинга значений МОБ в выде ленных группах больных оценивали в сопоставлении с исходным уровнем экспрессии PD1, LAG3 и уров нем лимфоцитов. 

Согласно полученным данным, более низкие ис ходные уровни экспрессии PD1 и LAG3 отмечены у больных 1й группы с наименьшим остаточным опу холевым клоном (МОБ) (рис. 2). Так, уровень экспрес сии PD1 и LAG3 в 1й группе ниже, чем во 2й, в 2,6 (p <0,001) и 2,9 (p <0,001) раза соответственно. 

Отмечены различия и в уровне лимфоцитов: в 1й группе показатель в 1,8 раза ниже, чем во 2й (р <0,001). Обращало внимание, что при исходном вы соком уровне всех показателей -лимфоцитов, экс прессии PD1 и LAG3 на Влимфоцитах -у ряда больных 2й группы после лечения отмечалась МОБ позитивность со значительным содержанием клеток ХЛЛ -до 36,2 %. 

Неудовлетворительный гематологический ответ на терапию установлен при уровне лимфоцитов ≥67,11 %, экспрессии PD1 (CD279) ≥40,81 % и LAG3
section_name: Результаты

section_name: Таблица 1. Уровень лимфоцитов, экспрессии PD-1 (CD279) и LAG-3 (CD223) на CD19 + -клетках у больных хроническим лимфолейкозом, М ± m

section_name: Table 1. The lymphocytes level, PD-1 (CD279) and LAG-3 (CD223) expression on CD19 + cells in patients with chronic lymphocytic leukemia, М ± m

section_content: Current basic research in practical medicine (CD223) ≥24,62 % на CD19 + клетках, хороший ответпри значениях показателей ниже приведенных. Также установлено, что до начала терапии у боль ных 1й группы максимальные значения уровня лим фоцитов достигали 66,2 %, экспрессии на Влимфо цитах PD1 -36,2 %, LAG3 -19,6 %, в то время как во 2й группе минимальные значения тех же по казателей составили 88,3; 56,2 и 34,3 % соответствен но, что свидетельствует о явных межгрупповых разли чиях (рис. 3). Полученные результаты демонстрируют четкое разграничение больных на группы с высоким и низким уровнем лимфоцитов, экспрессии PD1 и LAG3 на опухолевых Влимфоцитах, что позволяет рассматривать данные показатели в качестве маркеров прогноза гематологического ответа больных ХЛЛ на те рапию еще до ее начала. 

В связи с этим нами разработан способ прогнози рования течения ХЛЛ, который применим для стра тификации больных ХЛЛ на группы риска с учетом данных маркеров [14].
section_name: Группа

section_content: Установленные в процессе проведенного исследо вания высокие уровни экспрессии LAG3 и PD1, на наш взгляд, обусловлены биологическими свойст вами этих молекул. Так, LAG3 обладает антиапопто тическими свойствами, что способствует повышению выживаемости опухолевых Вклеток у больных ХЛЛ [10, 15, 16]. Это объясняет эффект сохранения значи тельной доли МОБ после терапии у пациентов с гипер экспрессией LAG3 на опухолевой популяции Влим фоцитов до начала лечения. Повидимому, отмеченное нами отрицательное прогностическое значение экс прессии LAG3 носит универсальный характер, по скольку оно описано и при других злокачественных процессах: меланоме [16], немелкоклеточном раке легкого [17], раке молочной железы [18], светлокле точном раке почки [19] и др. 

Вместе с тем описана связь LAG3 с гиперэкспрес сией PD1. Выявлено взаимодействие PD1 и LAG3, которое усиливает ингибирующее действие Тклеток либо влияет на терапевтический эффект путем бло кирования одной из этих молекул. В частности, ак тивация LAG3 может препятствовать эффективности антиPD1 / B7H1терапии при раке печени [20]. Также известно, что PD1 экспрессируется на Вклет ках памяти, наивных и активированных, при этом регулируя их неконтролируемую активацию [21, 22]. У пациентов с ХЛЛ в стадии прогрессии после имму нохимиотерапии отмечена более высокая доля PD1 + Вклеток по сравнению с больными, не получающи ми лечение [23]. На наш взгляд, при совместной гиперэкспрессии PD1 и LAG3 опухолевые Влим фоциты приобретают особые свойства, что делает их более устойчивыми к воздействию терапии за счет
section_name: Обсуждение

section_content: PD1 и LAG3 могут быть использованы как ран ние маркеры прогноза ответа больных ХЛЛ на тера пию. Большей прогностической ценностью обладает сочетанное использование показателей исходного уровня лимфоцитов и экспрессии PD1 и LAG3 на CD19 + клетках крови больных. Новые данные, по лученные при изучении иммунных контрольных точек PD1 и LAG3, могут быть полезны при разработке целевых терапевтических агентов. Лимфоциты, % от лейкоцитов / Lymphocytes, % from leukocytes CD19 + / LAG-3 +, % от лимфоцитов / CD19 + / LAG-3 +, % from lymphocytes
section_name: Заключение

section_name: Рис. 2. Уровень лимфоцитов, экспрессии PD-1 и LAG-3 на CD19 + -клетках у больных хроническим лимфолейкозом

section_name: Фундаментальные исследования в практической медицине на современном этапе