# Hibridizacija nukleinskih kiselina

U molekulskoj biologiji, **hibridizacija** je fenomen u kojem se jednostruki polulanci molekula dezoksiribonukleinske kiseline (DNK) ili ribonukleinske kiseline (RNK) različitog porijekla međusobno ostvaruju komplementarne veze, stvarajući kombiniranu DNK ili RNK- Iako je dvostruka DNK sekvenca, u fiziološkim uvjetima, uglavnom stabila, promjena uvjeta u laboratoriji (uglavnom podizanjem temperature okoline) će uzrokovati da se molekule rastaviti na jednostruke niti. Te niti su, naravno, komplementarne jedna drugoj, ali mogu biti komplementarne i za druge sekvence koje su prisutne u njihovom u okruženju. Spuštanje okolne temperature omogućuje molekulama jednostrukih lanaca da se komplementarno "ukrste", tj. hibridiziraju.

Replikacija DNK i transkripcija DNK u RNK se oslanjaju na hibridizaciju nukleotida, pogodnim tehnikama molekularne biologije, uključujući Southern blotove i Northern blotove, u polimeraznoj lančanoj reakciji (PCR) u većini pristupa sekvenciranju DNK.

## Primjena

Hibridizacije je osnovno svojstvo nukleotidnih sekvenci i ima prednost u brojnim tehnikama molekularne biologije. Ukupna genetička srodnost dvije vrste može se odrediti hibridizacijom segmeata njihove DNK (DNK-DNK hibridizacija). Ako se pokušavaju hibridizirati sličnije sekvenca (srodnički usko povezanih organizama), potrebne su više temperature za razdvajanje polulanaca DNK, u odnosu na nesrodnije sekvence. Koristi se mnoštvo različitih metoda hibridizacije koje mogu ukazati na porijeklo uzoraka DNK, uključujući i polimeraznu lančanu reakciju (PCR). Drugom tehnikom, kratke DNK sekvence su hibridizirane sa ćelijskom iRNK za identificiranje ekspresije gena. Farmaceutske kompanije istražuju korištenje *antisens* RNK da se vezuju za neželjene iRNK, sprečavajući ribosome za translaciju iRNK u protein.

## DNK-DNK hibridizacija

**DNK–DNK hbridizacija** općenito se odnosi na molekularno-genetičku tehniku kojom se mjeri stepen genetičke sličnosti između kompariranih fondova DNK sekvenci. Pritom se obično određuje međusobna genetička distanca organizama i/ili populacija. Široko se primijenjuje u filogeniji i taksonomiji.

### Pincipi

Radioaktivno označena DNK jednog organizma se miješa miješa s neoznačenom DNK sa kojom seda se poredi. Mješavina se inkubira kako bi se omogućilo da DNK disocira na polulance i ponovo izduži, te formira hibridni, dvosttruki (dvolančani) niz nukleotida hibridne DNK. Hibridizirane sekvence sa visokim stepenom sličnosti će se povezati čvršće, i zahtijevaju više energije za razdvajanje, tj. one se razdvajaju kada se zagrijavaju na višoj temperaturi nego različitije sekvence. To je proces poznat kao "DNK stapanje" (eng. *DNK melting*).
Za procjenu profila stopljenje hibridizirane DNK, dvostruki DNK je potrebno stavitti u kolonu i smešu grijati u postupnim malim koracima. Na svakom koraku, kolona spere; hibridne sekvence će se u jednom ciklusu spiralizirati i sprati sa kolone. Temperature na kojima označena DNK silazi sa kolone odražavaju količinu sličnosti između sekvenci (a samohibridizirajući uzorak služi kao kontrola). Ovi rezultati se kombiniraju, kako bi se utvrdio stupanj genetičke sličnosti između poređenih organizama.

### Denaturacija

Denaturacija DNK, također zvana i DNK stapanje, je proces kojim dvolančana dezoksiribonukleinska kiselina odvija i razdvaja u jednostruke (polu)niti kidanjem hidrofobnih veza između baza. Oba termina se koriste da se označi proces jer se javlja kada se mješavina grije, iako se "denaturacija" može odnositi i na odvajanje DNK izazvano hemikalijama kao što je urea.

Proces DNK denaturacije može se koristiti za analizu nekih njenih aspekata DNK, jer je uparivanje baza citozin / guanin općenito snažnije od spajanja para adenin / timin. Iznos citozin-guanin u genomu ("GC sadržaj") može se procijeniti mjerenjem temperature na kojoj se genomska DNK stapa. Više temperature su znak visokog sadržaja para G-C.

DNK denaturacija se također može koristiti za detekciju razlika između dvije DNK sekvence. DNK se zagrijava i denaturira u jednodtruko stanje, a zatim se hladi kako bi se omogućilo da se niti hibridiziraju. Hibridna molekula se formira između sličnih sekvenci i bilo kakve razlike između tih sekvenci će rezultirati poremećajem uparivanja baza. Na genomskoj razini, metod se koristi za procjenu genetičke udaljenosti između dvoje vrste, što je proces poznat kao DNK-DNK hibridizacija.

U kontekstu jedne izolirane regije DNK, gradijent denaturacije gelova i temperaturni gradijent gelova se mogu koristiti za otkrivanje prisutnosti malih neusklađenosti između dva niza, što je proces poznat kao temperaturni gradijent gel elektroforeze.

Metode DNK analize koje su zasnovana na temperaturi topljenja imaju nedostatak što za proučavanje služi osnovna sekvencaslijed. Uobičajeno je da se sekvenciranje DNK smatra preciznijom metodom.

Process DNK stapanja se također koristi u tehnikama molekulske biologije, posebno u lančanoj reakciji polimeraze. Iako temperatura stapanja DNK nije određujuća u ovoj tehnici, metode za procjenu  *T* m su važne za određivanje odgovarajuće temperature za primjenu u određenom protokolu. Temperatura DNK stapanja („meltinga“) može se koristiti i kao prednost za izjednačavanje hibridizacijskih strana skupa molekula, npr. oligonukleotidne sonde DNK mikronizova.

* **Faktori koji utiču na denaturaciju**

| Ako se parametar (ispod) povećava | Povećava: | Stabilizira DNK i povećava *Tm* (?)
 |
| --- | --- | --- |
| Chargaffov koeficijet (% GC) | Broj vodikovih veza | Da
 |
| PH ioniziranih fosfata | Elektrostatička odbojnost | Bez denaturacije →
 |
| Koncentracija kationa, ionska jakost | neutralizira opterećenja | Da → Djeluju stabilizirajuće
 |
| Koncentracija urea-formamida | Konkurent vodikovih veza između donjih | Bez denaturacije →
 |
| Koncentracija DNK, aktivnosti vode | Utiče na dielektričnu konstantu | Da → djeluje stabilizirajuće
 |
| Dužina DNK molekula | Broj područja bogatih GC | Da → djeluju stabilizirajuće
 |

### Izduživanje

*Aniling*, u genetici, sredstvo za komplementarnost sekvenci jednostrukog DNK (polulanca) ili RNK uparivanja spreko vodikovih veza do formiraju dvostrko usukanih polnukleotida. Termin se često koristi za opisivanje vezivanja DNK sonde ili vezivanje prajmer na DNK tokom lančane reakcije polimeraze (PCR). Pojam se često koristi i za opisivanje reformacije (renaturalizacije nukleinskih kiselina) komplementarnih niti koje su toplinski denaturirane. U tom procesu mogu pomoći proteini kao što su RAD52.

### Primjena u zoologiji

Kada se nekoliko vrsta komparira na taj način, mjere sličnosti dozvoljavaju da se rekonstruira filogenetsko stablo. Zato je ovo jedan od mogućih pristupa istraživanju molekularne biosistematike. Charles Sibley i Jon Ahlquist, pioniri ove tehnike, koristili su DNK-DNK hibridizaciju da ispitaju filogenetske odnose u Sibley-Ahlquist taksonomiji ptica i Sibley-Ahlquist taksonomiji primata.

### Primjena u mikrobiologiji

DNK-DNK hibridizacije je zlatni standard za razlikovanje bakterijskih vrsta, kada vrijednost sličnosti manja od 70% ukazuje da poređeni sojevi pripadaju posebnim vrstama.

U 2014. godini, kao prag sličnosti od 79% je predložen za razdvajanje bakterijskih podvrsta  *Escherichia coli* , kao i prijedlog za razgraničavanje podvrsta ostalih mikroba.

## Fluorescentna *in situ* hibridizacija

Fluorescentna *in situ* hibridizacija (FISH) ije laboratorijski metod koji se upotrebljava za detekciju i lociranje DNK sekvence, često na pojedinom hromosomu.

Istraživači Joseph Gall i Mary Lou Pardue otkrili su u 1960. Da se molekulska hibridizacija može koristiti za identifikaciju DNK sekvenci položaju *in situ* (tj. u njihovom prirodnom pozicijama unutar hromosoma). U 1969., dva naučnika su objavili rad koji pokazuje da radioaktivne kopija ribosomske DNK sekvence može koristiti za otkrivanje komplementarne DNK sekvence u jezgru žabljeg jajeta. Od tih originalnih zapažanja, veoma su poboljšana i povećana svestranost i osjetljivost postupka u toj mjeri da se *in situ* hibridizacija danas smatra bitnim alatom u citogenetici.

## Dvofazni model termodinamike

Za proračun vrijednosti *Tm* primjenjuje se nekoliko formula.
Za DNK oligonukleotidee, tj. kratke sekvence DNK, termodinamika hibridizacije se može tačno odrediti kao dvostepeni proces. U ovoj aproksimaciji jedan zanemaruje mogućnost intermedijarnih parcijalnih obavezujuće faza u formiranju stanja dvostruke niti od dva odvojena uvijena oligonukleotida. Prema ovoj pretpostavci, mogu se elegantno opisati termodinamički parametari za formiranje dvolančane nukleinske kiseline AB iz jednolančanih nizova nukleinskih kiselina A i B.

AB ↔ A + B
Ravnotežna konstanta za ovu reakciju je WIKINIUM\_MATH\_PH\_0 . Suglasno Van´t Hoff ovoj jednadžbi, relacija između slobodne energije, Δ*G* i *K* is Δ*G°* = -*RT*ln *K*, gdje je *R* idealni zakon plinske konstante, a  *T*  je Kelvinska temperatura reakcije. Za sistem nukleinske kiseline, to daje:
 WIKINIUM\_MATH\_PH\_2 .

Temperatura stapanja, *T*m, javlja se kada polovina dvostruko lančane nukleinske kiseline disocira. Ako nisu prisutne dodatne nukleinske kiseline, tada će [A], [B], i [AB] biti jednake i izjednačene sa inicijalnom koncentracijo dvolančane nukleinske kiseline [AB]inicijalno. To se ispoljava kao stapajuća tačku jednog dupleksa nukleinske kiseline:
 WIKINIUM\_MATH\_PH\_4 .

Jer Δ*G*° = Δ*H*° -*T*Δ*S*°, *T*m je također dat prema:

 WIKINIUM\_MATH\_PH\_6 .

Oznake Δ*H*° i Δ*S*° s obično date za asocijaciju a ne disocijacijsku reakciju. Ova formula tada prelazi u:

 WIKINIUM\_MATH\_PH\_8 , gdje je [B]ukupno < [A]ukupno.

Kao što je pomenuto, ova jednadžba se temelji na pretpostavci da su u stapljenje uključene samo dvije faze: dvostruka zavojnica slučajna zavojnica. Međutim, nukleinska kiselina se može stopiti i preko nekoliko intermedijarnih faza. Za računanje u takvim slučajevima moraju se koristiti komplikovane metode statističke mehanone, što je posebno relevantno za duge sekvence.

## Procjena termodinamskih svojstava sekvenci nukleinskih kiselina

Prethodni podaci pokazuju kakav je međuodnos temperatura stapanja i termodinamičkih parametara (Δ*G* ° ili Δ*H*  ° i Δ *S*°). Posmatranjem temperature stapanja mogu se eksperimentalno odrediti termodinamički parametari. *Vice versa*, i važni za aplikaciju, kada su poznati termodinamički parametri date sekvence nukleinske kiseline, može se predvidjeti temperatura stapanja. Ispostavilo se da se, za oligonukleotide, ti parametri mogu dobro aproksimirati modelom najbližeg susjeda.

### Metod najbližeg susjeda (*nearest-neighbor* metod)

Interakcija između baza na različitim nitima onekle ovisi osusjednoj baz. Umjesto tretiranja DNK spirale kao niza interakcija između parova baza, model najbližeg susjeda tretira DNAK spiralu kao niz interakcija između 'susjednih' parova baza. Tako, na primjer, slijedeća DNK ima najbližeg susjeda interakcije koji je prikazan strelicama.

**↓↓↓↓↓**
 5 **C-G-T-T-G-A** 3
 3 **G-C-A-A-C-T** 5
Slobodne energije formiraju ove DNK iz pojedinačnih niti, Δ*G*°, predstavljeni su (na 37°C), kao:
Δ*G*°37(predikcija) = Δ*G*°37(CG inicijacija) + Δ*G*°37(CG/GC) + Δ*G*°37(GT/CA) + Δ*G*°37(TT/AA) + Δ*G*°37(TG/AC) + Δ*G*°37(GA/CT) + Δ*G*°37(AT inicijacija)

Prvi termin predstavlja energiju prvog baznog para, CG, u odsustvu najbližeg susjeda, Drugi termin uključuje obje slobodne energije formacije drugog baznog para, GC, interakcije slaganja između ova bazna para i prethodnog baznog para. Preostali termini su definirani na sličan način. U principu, slobodne energije formiranja dvostrukih nukleinskih kiselina je:
 WIKINIUM\_MATH\_PH\_10 .
Svaki Δ*G*° termin ima enhalpični, Δ*H*° i entropijski, Δ *S*°, parametar, tako da promjena slobodne energije također data kao:

```
  $K={\frac {[A][B]}{[AB]}} 2 .

```

Vrijednosti Δ*H*° i Δ *S*° su određene za deset mogućih parova interakcije. Date su u narednoj tabeli, zajedno sa vrijednostima Δ*G*° obračunatim za 37°C. Koristeći ove vrijednosti, vrijednost Δ*G*37°, za DNK spirale prikazane iznad, bile su -22.4 kJ/mol. Eksperimentalna vrijednost je -21.8 kJ /mol.

Parametri najbližeg susjeda (*nearest-neighbor*) za DNK/DNK duplekse u 1 M NaCl.
| Sekvenca najbližeg susjeda (5'-3'/3'-5')
 |  WIKINIUM\_MATH\_PH\_14 ° kJ/mol
 |  WIKINIUM\_MATH\_PH\_16 ° J/(mol·K)
 |  WIKINIUM\_MATH\_PH\_18 °37 kJ/mol
 |
| --- | --- | --- | --- |
| AA/TT
 | −33.1 | −92.9 | −4.26
 |
| AT/TA
 | −30.1 | −85.4 | −3.67
 |
| TA/AT
 | −30.1 | −89.1 | −2.50
 |
| CA/GT
 | −35.6 | −95.0 | −6.12
 |
| GT/CA
 | −35.1 | −93.7 | −6.09
 |
| CT/GA
 | −32.6 | −87.9 | −5.40
 |
| GA/CT
 | −34.3 | −92.9 | −5.51
 |
| CG/GC
 | −44.4 | −113.8 | −9.07
 |
| GC/CG
 | −41.0 | −102.1 | −9.36
 |
| GG/CC
 | −33.5 | −83.3 | −7.66
 |
| Terminalni A-T bazni par
 | 9.6 | 17.2 | 4.31
 |
| Terminalni G-C bazni par
 | 0.4 | −11.7 | 4.05
 |

Parametri koji su povezani sa deset grupa susjeda prikazani u u tabeli su određeni iz tački stapanja kratkih oligonukleotidnih dupleksa. Zanimljivo je da ispada da je nezavisno samo osam od deset grupa.
Model najbližeg susjeda može se prodširiti izvan Watson-Crickovih parova ukljujući parametre za interakcije između neusklađenosti i susjednih baznih parova.

Ovo proističe iz procjene termodinamičkih parametara sekvenci koje sadrže izolirana neslaganja kao u onim lkoja su pokazana strelicama:

↓↓↓
5' **G-G-A-C-T-G-A-C-G** 3'
3' **C-C-T-G-G-C-T-G-C** 5'
Ovi parametri su potvđeni eksperimentima stapljanja i u produžetku tabele koji uključuje neusklađenosti koje se mogu naći u literaturi.

Izgleda da je realniji način modeliranja ponašanja nukleinskih kiselina prema imati parametarima koji ovise o susjednim grupama na obje strane jednog nukleotida, dajući podlogu sa stavke kao što su "TCG / AGC". Međutim, to bi značilo postojanje oko 32 grupe; brojni eksperimenati su potrebni i značajni da se u tom pogledu nađu pouzdani podaci za toliko grupa. Zato što se predviđanja metoda najbližeg susjeda razložno slažu s eksperimentalnim rezultatima, dodatni napori u razvoju drugačijih modela ne mogu biti opravdani.

## Reference