# Sitogenetik

Sel metafasa positif untuk penyusunan semula BCR/ABL menggunakan FISH
**Sitogenetik** pada dasarnya ialah cabang genetik, tetapi juga merupakan sebahagian daripada biologi sel atau sitologi (subbahagian anatomi manusia), berkenaan cara kromosom berkaitan dengan tingkah laku sel, terutamanya dengan tingkah laku mereka semasa mitosis dan meiosis. Teknik yang digunakan termasuk kariotip, analisis kromosom penjaluran G, di samping teknik jalur sitogenetik lain, serta sitogenetik molekul seperti penghibridan *in situ* (FISH) dan penghibridan genomik perbandingan (CGH).

## Sejarah

### Permulaan

Kromosom pertama kali diperhatikan dalam sel tumbuhan oleh Carl Nägeli pada tahun 1842. Tingkah laku mereka dalam sel haiwan (salamander) telah diterangkan oleh Walther Flemming, penemu mitosis, pada tahun 1882. Nama itu dicipta oleh ahli anatomi Jerman lain, von Waldeyer pada tahun 1888.

Peringkat seterusnya berlaku selepas perkembangan genetik pada awal abad ke-20, apabila diketahui bahawa set kromosom (kariotip) ialah pembawa gen. Levitsky nampaknya menjadi orang pertama yang mentakrifkan kariotip sebagai penampilan fenotip kromosom soma, berbeza dengan kandungan gennya. Penyiasatan terhadap kariotip manusia mengambil masa bertahun-tahun untuk menyelesaikan soalan paling asas: berapa banyak kromosom yang terkandung dalam sel manusia diploid biasa? Pada tahun 1912, Hans von Winiwarter melaporkan 47 kromosom dalam spermatogonia dan 48 dalam oogonia, menyimpulkan mekanisme penentuan jantina XX/XO. Theophilus Painter pada tahun 1922 tidak pasti sama ada bilangan diploid manusia ialah 46 atau 48, dan mula-mulanya memihak kepada 46. Beliau tukar pendapatnya kemudian dari 46 kepada 48, dan beliau dengan betul menegaskan bahawa manusia mempunyai sistem penentuan jantina XX/XY. Memandangkan teknik mereka, keputusan ini agak luar biasa. Dalam buku sains, bilangan kromosom manusia kekal pada 48 selama lebih tiga puluh tahun. Teknik baharu diperlukan untuk membetulkan ralat ini. Joe Hin Tjio yang bekerja di makmal Albert Levan bertanggungjawab mencari pendekatan:

1. Menggunakan sel dalam kultur
2. Prarawat sel dalam larutan hipotonik, menyebabkan sel membengkak dan menyebarkan kromosom
3. Membekukan metafasa mitosis dengan larutan kolkisina
4. Melenyek penyediaan pada slaid, memaksa kromosom terhadap dalam satu satah
5. Memotong fotomikrograf dan menyusun hasilnya menjadi kariogram yang tidak dapat dipertikaikan.

Ia mengambil masa sehingga tahun 1956 untuk diterima bahawa karyotype manusia termasuk hanya 46 kromosom. Kera besar mempunyai 48 kromosom. Kromosom manusia 2 dibentuk melalui penggabungan kromosom nenek moyang, mengurangkan bilangannya.

## Aplikasi sitogenetik

### Kerja McClintock mengenai jagung

Barbara McClintock memulakan kerjayanya sebagai pakar sitogenetik jagung. Pada tahun 1931, McClintock dan Harriet Creighton menunjukkan bahawa penggabungan semula sitologi kromosom bertanda berkorelasi dengan penggabungan semula sifat genetik (gen). Semasa di Institusi Carnegie, McClintock meneruskan kajian terdahulu mengenai mekanisme pecah dan gabungan kromosom dalam jagung. Beliau mengenal pasti peristiwa pecah kromosom tertentu yang sentiasa berlaku di lokus yang sama pada kromosom jagung 9, yang dinamakannya sebagai "*Ds"* atau lokus "disosiasi". McClintock meneruskan kerjayanya dalam sitogenetik, dan mengkaji mekanik dan pewarisan kromosom jagung pecah dan bercincin (bulatan). Semasa kerja sitogenetiknya, McClintock menemui transposon, penemuan yang akhirnya membawa kepada Hadiah Nobel-nya pada tahun 1983.

### Populasi semula jadi Drosophila

Pada tahun 1930-an, Dobzhansky dan rakan sekerjanya mengumpul *Drosophila pseudoobscura* dan *D. persimilis* daripada populasi liar di California dan negeri jiran. Menggunakan teknik Painter, mereka mengkaji kromosom politena dan mendapati bahawa populasi liar adalah polimorfik terhadap penyongsangan kromosom.

Bukti terkumpul dengan cepat untuk menunjukkan bahawa pemilihan semula jadi bertanggungjawab. Dengan kaedah yang dicipta oleh L'Héritier dan Teissier, Dobzhansky membiak populasi dalam *sangkar populasi*, yang membolehkan pemberian makanan, pembiakan dan pensampelan sambil menghalang serangga melarikan diri. Ini mempunyai faedah untuk menghapuskan penghijrahan sebagai penjelasan yang mungkin tentang hasilnya. Stok yang mengandungi penyongsangan dalam frekuensi awal yang diketahui boleh dikekalkan dalam keadaan terkawal. Didapati bahawa pelbagai jenis kromosom tidak turun naik secara rawak seperti yang akan berlaku jika neutral secara selektif, tetapi menyesuaikan dengan frekuensi tertentu di mana ia menjadi stabil. Pada masa Dobzhansky menerbitkan edisi ketiga bukunya pada tahun 1951, beliau telah diyakinkan bahawa morf kromosom dikekalkan dalam populasi dengan kelebihan terpilih heterozigot, seperti kebanyakan polimorfisme .

## Keabnormalan manusia dan aplikasi perubatan

 Translokasi Philadelphia t(9;22)(q34;q11.2) dilihat dalam leukemia mielogen kronik.
Sitogenetik perlembagaan: dalam beberapa gangguan kongenital seperti sindrom Down, sitogenetik mendedahkan sifat kecacatan kromosom: trisomi "ringkas". Keabnormalan yang timbul daripada kejadian tidak bercabang boleh menyebabkan sel memiliki aneuploidi (penambahan atau pemadaman keseluruhan kromosom) dalam salah satu ibu bapa atau dalam janin. Pada tahun 1959, Lejeune mendapati pesakit dengan sindrom Down mempunyai salinan tambahan kromosom 21. Sindrom Down juga dirujuk sebagai trisomi 21.

### Kemunculan teknik penjaluran

 Kariogram mikrograf lelaki manusia.
 Kariogram skematik manusia, dengan jalur beranotasi dan subjalur seperti yang digunakan dalam Sistem Tatanama Sitogenomik Manusia Antarabangsa bagi keabnormalan kromosom. Ia menunjukkan kawasan gelap dan putih di jalur G. Ia menunjukkan 22 kromosom homolog, kedua-dua versi lelaki (XY) dan perempuan (XX) bagi kromosom seks (kanan bawah), serta genom mitokondria (di sebelah kiri bawah).
Pada kewat 1960-an, Torbjörn Caspersson membangunkan teknik pewarnaan kuinakrin (penjaluran Q) yang mendedahkan corak penjaluran unik bagi pasangan kromosom. Ini membolehkan pasangan kromosom yang bersaiz serupa untuk dibezakan berdasarkan corak penjaluran. Corak penjaluran kini digunakan untuk mengetahui titik pemutusan dan kromosom yang terlibat dalam translokasi. Pemadaman dan songsangan dalam satu-satu kromosom juga dapat dikenal pasti dengan lebih baik dengan penjaluran piawai. Penjaluran G (tripsin dan pewarna Giemsa/Wright) dibangunkan pada awal 1970-an, dan membenarkan penampakan penjaluran dengan mikroskop cahaya terang.

### Permulaan sitogenetik molekul

Pada tahun 1980-an, kemajuan telah dibuat dalam bidang sitogenetik molekul. Walaupun prob berlabel radioisotop telah dihibridkan dengan DNA sejak 1969, pergerakan kini dibuat menggunakan prob berlabel pendarfluor. Penghibridannya terhadap persediaan kromosom menggunakan teknik sedia ada dikenali sebagai penghibridan *in situ* pendarfluor (FISH). Perubahan ini meningkatkan penggunaan teknik pengeproban dengan ketara kerana prob berlabel pendarfluor adalah lebih selamat. Kemajuan selanjutnya dalam manipulasi mikro dan pemeriksaan kromosom membawa kepada teknik mikropemotongan kromosom, di mana penyimpangan dalam struktur kromosom boleh diasingkan, diklon, dan dikaji dengan lebih terperinci.

## Teknik

### Kariotip

Analisis kromosom rutin (kariotip) merujuk kepada analisis kromosom metafasa yang telah diikat menggunakan tripsin diikuti oleh Giemsa, Leishmanns, atau campuran kedua-duanya. Ini mencipta corak jalur unik pada kromosom. Mekanisme molekul dan sebab munculnya corak ini tidak diketahui, walaupun ia mungkin berkaitan dengan pemasaan replikasi dan pembungkusan kromatin.

Beberapa teknik penjaluran kromosom digunakan dalam makmal sitogenetik. Penjaluran kuinakrin (penjaluran Q) ialah kaedah pewarnaan pertama yang digunakan untuk menghasilkan corak jalur tertentu. Kaedah ini memerlukan mikroskop pendarfluor dan tidak lagi digunakan secara meluas seperti mana penjaluran Giemsa (penjaluran G). Penjaluran terbalik atau penjaluran R memerlukan rawatan haba dan membalikkan corak hitam-putih biasa yang dilihat dalam jalur G dan jalur Q. Kaedah ini amat membantu untuk mewarnakan hujung distal kromosom. Teknik pewarnaan lain termasuk penjaluran C dan pewarnaan kawasan penyusunan nukleolus (pewarnaan NOR). Kaedah terakhir ini secara khusus mewarnakan bahagian tertentu kromosom. Penjaluran C mewarnakan heterokromatin konstitutif yang biasanya terletak berhampiran sentromer, dan pewarnaan NOR menyerlahkan satelit dan tangkai kromosom akrosentrik.

Penjlauran resolusi tinggi melibatkan pewarnaan kromosom semasa profasa atau metafasa awal (prometafasa), sebelum ia mencapai pemeluwapan maksimum. Oleh kerana kromosom profasa dan prometafasa lebih panjang daripada ketika metafasa, bilangan jalur yang boleh diperhatikan untuk semua kromosom (*jalur per set haploid*, bph; "tahap jalur") meningkat daripada kira-kira 300 ke 450 kepada sebanyak 800. Ini membolehkan pengesanan keabnormalan kurang jelas yang biasanya tidak dapat dilihat dengan penjaluran konvensional.

### Penghibridan *in situ* pendarfluor

 Sel interfasa positif penyusunan semula (9;22)
Penghibridan *in situ* pendarfluor (FISH) merujuk kepada menggunakan prob berlabel pendarfluor untuk menghibridkan kepada persediaan sel sitogenetik.

Sebagai tambahan kepada penyediaan lazim, FISH juga boleh dilakukan pada:

* calitan sumsum tulang
* calitan darah
* persediaan tisu tertanam parafin
* sampel tisu yang dipisahkan enzim
* sumsum tulang tidak dikultur
* amniosit tidak dikultur
* Persediaan sitospin

## Rujukan