森岡　徳光広島大学大学院医歯薬保健学研究科薬効解析科学Key words：慢性疼痛、アストロサイト、REV-ERB、核内受容体、鎖痛薬
箱 富
神経障害性移痛、がん性移痛、糖尿病性移痛、带状疱疹後痛などの移痛は慢性かつ離治性である。その理由として、慢性移痛は発症から維持過程において多様な機構が関与しているため、既存の鎮痛薬が泰功しないことが挙げられる。それ故、慢性塔痛の発症に関わる多くのメカニズムを明らかにするとともに、新たな作用機序を有する鎮痛薬の創製が必要不可欠である。痛みの伝達の最重要部位である脊髄後角ではミクログリアやアストロサイトなどのグリア細胞が神経シナプスを取り囲むように存在し、シナプス伝達の制御や神経回路網の再構築などに関わっている。これまでに、慢性化した痛みの伝達には、グリア細胞の活性化が寄与していることが明らかとなっている［1］。それ故、脊髄ミクログリアやアストロサイトの機能異常による痛み伝達の変調を改善するメカニズムを明らかにすることが、有効な鎮痛薬開発に向けた重要な戦略と言える。痛みの伝達経路における炎症反応は、慢性移痛を惹起する重要な機構の１つである。慢性移痛時における脊髄後角では、活性化されたグリア細胞から炎症性サイトカインやケモカインの産生が亢進し、慢性的な炎症反応が生じていることが知られている［1］。一方で、非ステロイド性抗炎症薬（NSAIDs）は鎮痛薬として繁用されるが、神経障害性药痛などの慢性移痛には著効しない。これらの知見はNSIADsの作用機序とは異なるメカニズムを介して炎症反応を緩和させる薬物が、新たな鎮痛薬候補となりうる可能性を示唆している。我々は、慢性移痛を緩和する新たな創薬ターゲットとして核内受容体であるREV-ERBに着目した。核内受容体は、様々な疾患に対する新たな創薬標的として注目を集めている。例えば、糖尿病治療薬ピオグリタゾンや脂質異常症治療葉ベザフィプラートは核内受容体peroxisome proliferator activated receptorに作用することで、糖や指質代謝に関連する遺伝子発現を調節することで治療効果を発揮する。一方で、REV-ERBは、炎症反応の制御に関わる核内受容体である[2]。REV-ERB作動薬がREV-ERBに結合することで複合体を形成し、これがさらに特定遺伝子のプロモーター領域に結合することで、遺伝子発現を転写レベルで抑制することが知られている。さらに、炎症が病態の基盤となる脂質異常症やアテローム性動脈硬化などのモデル動物において、合成REV-ERB作動薬がマクロファージからの炎症性物質産生を抑制することで、病態の改善効果を有していることが報告されている［2, 3］。以上の知見に基づき、我々はREV-ERBを介した炎症制御機構が慢性疼痛緩和への有望な創薬ターゲットとなる可能性に着目した。先行研究において我々は、アストロサイト細胞株であるC6細胞において、合成REV-ERB作動薬処置により炎症性物質産生が転写レベルで抑制されることを明らかにし、中枢神経系細胞でのREV-ERB作動薬の抗炎症効果を報告している［4］。一方で、疼痛制御に対するREV-ERBの関与については全く検討が行われていなかった。本研究では、培養脊髄アストロサイトおよび慢性疼痛モデルマウスを用いて、REV-ERB作動薬であるSR9009の鎖痛効果ならびにその作用メカニズムについて検討を行ったところ、SR9009は脊髄アストロサイトにおける疼痛誘発物質産生を抑制することで疼痛緩和効果を有することが明らかとなった[5]。
1. 培養育髄アストロサイトの作製およびそれらを用いた解析
Wistar系ラット新生仔（生後１日）より脊髄を摘出し、酵素処理分散法にて混合グリア細胞を作製した。これらを約３週間培養後、激しく振とうすることでミクログリア等を除去することによりアストロサイトを調製した。疼痛誘発物質のmRNA発現量はreal-time PCR法、タンパク発現量はELISA法にてそれぞれ測定した。マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）-9の酵素活性はgelatin zymographyにて測定した。REV-ERBのknockdownはRNA干渉法により行った。
2. 疼痛モデルの作製とそれらを用いた解析
雄性ddy系マウス(5週齢)を用いて慢性移痛モデルを作製した。炎症性移痛モデルとしてlipopolysaccharide (LPS)脊髄くも膜下腔内投与モデル（LPSモデル）およびcomplete Freund'  s adjuvant足底投与モデル（CFAモデル）、神経障害性疼痛モデルとして、坐骨神経部分結紮によるpartial sciatic nerve ligation (PSNL)モデル、抗がん薬paclitaxel全身投与モデル(PTXモデル)、streptozatocin全身投与による糖尿病性移痛モデル(STZモデル)をそれぞれ用いた。これらの機械的刺激に対する逃避関値をvon Frey filamentsにより測定することで移痛反応を評価した。脊髄後角のアストロサイトの活性化は、アストロサイトの活性化マーカーであるglial fibrillary acidic protein（GFAP）の発現量を免疫組織化学法により測定することで評価した。脊髄後角の疼痛誘発物質のmRNA発現量はreal-time PCRにより測定した
参
1.  培養育髄アストロサイトにおける疾痛肺発物質産生に対するREV-ERB作動薬の効果
培養脊髄アストロサイトにLPSを処置すると、疼痛誘発物質（interleukin -1 β（IL-1 β）、interleukin -6（IL-6）及びMMP-9)の発現がmRNA及びタンパク質レベルで増大した。LPSによるIL-1 β  mRNA, IL-6mRNA及びMMP- 9 mRNA発現の増大反応は、REV-ERB作動薬であるSR9009を前処置することにより濃度依存的に有意に抑制された（図1）。SR9009を単独で処置することによっては疼痛誘発物質の発現に対して影響は認められなかった。またSR9009はtumor necrosis factor（TNF）処置によるIL-1 β  mRNA、IL-6 mRNA及びMMP-9 mRNA発現の増大反応に対しても有意な抑制効果を示した。加えて、LPSによるIL-1 β、IL-6及びMMP-9のタンパク質レベルでの増大に対してもSR9009は有意な抑制効果を示した。疼痛誘発物質の発現増大に対するSR9009の抑制効果へのREV- ERBの関与を確認する目的でRNA干渉法を用いて検討を行ったところ、REV-ERBのknockdownによりSR9009の抑制効果は有意に低下した。図1. 培養育髄アストロサイトにおけるLPSによる塔痛誘発物質発現に対するSR9009の効果培養脊髄アストロサイトに対してそれぞれの濃度のSR9009を30分間前処置した後、LPSを24時問処置した後の疼痛誘発物質のmRNA発現変化を示す。統計処理はTukey-Kramer法により行った。**P < 0.01 vs. vehicle、† †P < 0.01 vs. LPS alone近年、REV-ERBによる遺伝子発現抑制作用にhistone deacetylase 3（HDAC3）が関与している可能性が示唆されている[4]。そこで疼痛誘発物質の発現増大に対するSR9009の抑制効果へのHDAC3の関与を検討した。その結果、 HDAC3選択的阻害薬であるRGFP966を前処置したところ、LPSによるIL-1 β  mRNA及びIL-6 mRNA発現増大に対するSR9009の抑制効果は有意に低下したものの、MMP-9 mRNA発現増大に対するSR9009の抑制効果に対しては無影響であった。
2. 疼痛モデルマウスの疼痛反応に対するREV-ERB作動薬の効果
マウス脊髄くも膜下腔内にLPSを投与すると (LPSモデル)、1時間後より機械的刺激に対する逃避閥値の有意な低下が認められ、この反応は24時間持続した（図2）。これらに対してSR9009を脊髄くも膜下腔内に前処置することにより、LPSによる機械的刺險に対する透距閥値の低下は有意に抑制された（図2）。LPSモデルにおいて、脊髄後角でのIL-1 β mRNA及びIL-6 mRNA発現の有意な増大が認められたが、MMP-9 mRNA発現に変化は認められなかった。さらにLPSモデルの脊髄後角におけるIL-1 β  mRNA及びIL-6 mRNA発現の増大反応は、SR9009を前処置することにより有意に抑制された。またLPSモデルにおいて、脊髄後角でのGFAP発現の増大が認められたが、この反応はSR9009を前処置することにより有意に抑制された。図2.  LPS誘発性疼痛に対するSR9009の鎖痛効果マウス脊髄くも膜下腔内に各用量のSR9009を投与し、1時間後にLPSを脊髄くも膜下腔内に投与した。その後、経時的に機械的刺激に対する透聴関値を測定した。統計処理はtwo way repeated- measures ANOVA及びTukey-Kramer法により行った。*P< 0.05、**P< 0.01 vs. vehicle-vehicle、 †P< 0.05、††P< 0.01 vs. vehicle-LPS炎症性疼痛モデルであるCFAモデルならびに神経障害性疼痛モデルであるPSNLモデル、PTXモデルおよびSTZモデルの機械的刺激に対する逃避関値の低下に対するSR9009の効果を検討したところ、SR9009を脊髄くも膜下腔内に投与することによりすべてのモデルの疼痛反応が有意に抑制された。さらに、PSNLモデルの脊髄後角で認められるGFAP発現の増大は、SR9009を前処置することにより有意に抑制された。
物 繁
痛みの慢性化には脊髄アストロサイトの活性化が寄与しており、さらにアストロサイト阻害薬が鎖痛効果を示すことが報告されていることから、脊髄アストロサイト活性の制御が鏡痛作用メカニズムとして有望な候補である可能性が示唆されている。REV-ERBはマクロファージなどの炎症性細胞の活性を抑制することが報告されているが[2]、アストロサイト活性に対する役割や移痛制御への関与については全く検討がなされていなかった。本研究結果より、REV-ERB作動薬はLPSおよびTNFといった炎症性刺激による疼痛誘発物質の発現増大を著明に抑制したことから、REV-ERBは特定の刺激に対して限定的な作用を示すのではなく、炎症刺激に伴う遺伝子発現変化に影響を及ぼす可能性が示唆された。本研究で使用したSR9009はREV-ERB以外の核内受容体に親和性を示さないことが報告されている[3]。さらに、脊髄アストロサイトにおけるREV-ERBをknockdownすることによりSR9009の効果が有意に消失したことから、 SR9009による疼痛誘発物質発現の抑制作用はREV-ERB依存的である可能性が示唆された。REV-ERBにはREV- ERBα及びREV-ERB βが存在しており、細胞種により役割が異なる可能性が知られている［6］。本研究において、両サプタイプをknockdownすることでSR9009の効果は消失したが、REV-ERBサプタイプを個々にknockdownすることによってはSR9009の抑制効果に対して無影響であったことから、脊髄アストロサイトにおける疼痛誘発物質の発現制御にはREV-ERB α及びREV-ERB βの両サプタイプが関与していることが示唆された。 REV-ERBはHDAC3をリクルートさせることでヒストン脱アセチル化を促進し、遺伝子転写を抑制することが知られている。本研究では、脊髄アストロサイトにおけるLPS誘発性IL-1 β  mRNA及びIL-6 mRNA発現に対するSR9009の抑制効果はHDAC3を介していることが示された。一方で、脊髄アストロサイトでのREV-ERBによるMMP-9 mRNA発現制御に関してはHDAC3が介在しておらず、遺伝子によりREV-ERBを介した発現制御メカニズムが異なる可能性が示唆された。疼痛モデルマウスを用いてSR9009の鎖痛効果を検討したところ、複数タイプの疼痛モデルに認められる機械的刺激に対する疼痛関値の低下反応が抑制され、これらの効果には脊髄アストロサイト活性化の抑制に伴う疼痛誘発物質産生の低下が寄与している可能性が示唆された。本研究でのREV-ERB作動薬の効果についてはIL-1 β及びIL-6発現に対してのみの検討であったが、これら以外の核痛誘発物質の発現制御にも関与している可能性があり、今後検討が必要である。また現在、慢性移痛発症に重要な役割を担うミクログリアの機能に対するREV-ERB作動薬の効果についても検討を進めている。今後、REV-ERBによる疼痛制御メカニズムの全貌を明らかにすることで、新たな鎮痛薬候補としてのREV-ERB作動薬の可能性を提示したいと考えている。
文 欧
1) Grace, P.M., Hutchinson, M.R., Maier, S.F., Watkins, L.R., Pathological pain and the neuroimmune interface. Nat Rev Immunol, 2014, 14, 217-231. PMID: 24577438 DOI: 10.1038/nri3621. 2) 3) Sato, S., Sakurai, T., Ogasawara, J., Takahashi, M., Izawa, T., Imaizumi, K., Taniguchi, N., Ohno, H., Kizaki, T., A circadian clock gene, Rev-erba, modulates the inflammatory function of macrophages through the negative regulation of Ccl2 expression. J Immunol, 2014, 192, 407-417. PMID: 24307731 DOI: 10.4049/jimmunol.1301982. Solt, L.A., Wang, Y., Banerjee, S., Hughes, T., Kojetin, D.J., Lundasen, T., Shin, Y., Liu, J., Cameron, M.D., Noel, R., Yoo, S.H., Takahashi, J.S., Butler, A.A., Kamenecka, T.M., Burris, T.P., Regulation of circadian behaviour and metabolism by synthetic REV-ERB agonists. Nature, 2012, 485, 62-68. PMID: 22460951 DOI: 10.1038/nature11030. 4) Morioka, N., Tomori, M., Zhang, F.F., Saeki, M., Hisaoka-Nakashima, K., Nakata, Y., Stimulation of nuclear receptor REV-ERBs regulates tumor necrosis factor induced expression of proinflammatory molecules in C6 astroglial cells. Biochem Biophys Res Commun, 2016, 469, 151-157. PMID: 26616049 DOI: 10.1016/j.bbrc.2015.11.086. 5) Morioka, N., Kodama K., Tomori, M., Yoshikawa K., Saeki, M., Nakamura Y., Zhang, F.F., Hisaoka- Nakashima, K., Nakata, Y., 2016. Stimulation of nuclear receptor REV-ERBs suppresses production of pronociceptive molecules in cultured spinal astrocytes and ameliorates mechanical hypersensitivity of inflammatory and neuropathic pain of mice. Brain Behav Immun, in press. PMID: 30682503 DOI: 10.1016/j.bbi.2019.01.014. 6) Ramakrishnan, S.N., Lau, P., Burke, L.J., Muscat, G.E., Rev erbbeta regulates the expression of genes involved in lipid absorption in skeletal muscle cells: evidence for cross-talk between orphan nuclear receptors and myokines. J Biol Chem, 2005, 280, 8651-8659. PMID: 15623503 DOI: 10.1074/jbc.M413949200.