高橋達郎九州大学大学院理学研究院染色体機能学講座Key words：ミスマッチ修復、相同組換え、DNA二重鑽切断相傷、ツメガエル卵种出出液
箱 青
ワトソン・クリック塩基対は、遺伝情報の複製やDNA損傷修復を支える、生命の必須動作基盤である。ところが染色体上では、さまざまな原因によりワトソン・クリック塩基対の破綻、すなわち塩基ミスマッチが生じる。興味深いことに、塩基ミスマッチに対する適切な対応は、それらが生じた原因によって大きく異なる。DNA複製の誤りによって生じるミスマッチは、新生DNA鎖上の塩基を修正することで正しく解消される。一方、類似するが同一ではない配列間での組換えによってもミスマッチ塩基が生じるが、これに対する適切な対応は複雑である。たとえば対立遺伝子座間の正しい組換えにおいても、多型由来の少数のミスマッチが生じることがある。この場合、組換えそのものは適切な遺伝子座で起こっているので、多型に由来するミスマッチを修復することにより、組換えを完了させることが適切である。ところが、配列が類似するが座位が異なる領域間での組換えは、転座や欠失、染色体再編のリスクを伴う。この場合、そもそも組換え試行自体が誤っているので、組換えの中間体を解消し、正しい遺伝子座間での組換えを再試行するのが適切な対応となる。ミスマッチに対するこれらの異なった応答は、主としてミスマッチ修復（MMR）システムが統御していることが分かっている［1］。MMRの最初の反応は、MutS複合体（真核生物ではMutS αおよびMutS β）によるミスマッチ塩基の認識である。その後、MutSはスライディングカランプに変化し、DNA上を移動しつつ、DNA複製エラ一修復や組換え時のミスマッチ修正のためにはヌクレアーゼを、誤った組換えの抑制のためにはヘリカーゼを呼び込むこと考えられている[2～4]。MMR遺伝子の変異やサイレンシングは10～40%程度の孤発性がんに見られ、またMMR遺伝子の遺伝性久損は家族性高発がん症候群であるリンチ症候群を引き起こす[5]。従って、MMRシステムによるゲノム品質管理は生物学的興味の対象であるにとどまらず、ヒトの健康と医療にも密接に関係している。本研究では、ツメガエル明核質抽出液を利用して一本鎖アニーリング（SSA）経路による相同性依存的修復を試験管内再現することに成功し、類似配列間でのSSAがMutS αに依存して抑制される事を示した。この抑制は、アニーリング反応の著しい速度低下を伴っていたことから、MutS αは相同性依存的なアニーリング反応と拮抗して類似配列間のSSAを抑制しているものと考えられた。
方　炭
1.ツメガエル卵検賞抽出液の作製
ツメガエル卵核質抽出液（NPE）の作製はWalterらの方法[6]に従った。以下に概要を簡潔に述べる。ツメガエル卵を採卵し、ゼリー層をシステインによって還元して除去した後、遠心分離によって細胞質粗抽出液（LSS）を得た。 LSSにツメガエル精子核を加え、ATP存在下で90分から120分、22℃で保温して疑似核を形成させた。疑似核を遠心分離によって集めて回収し、さらに超遠心分離によってクロマチン、核酸成分と核質タンパク質を分離し、核質タンパク質層（NPE）を回収、液体窒素によって凍らせ、一80℃に保存した。ツメガエルの飼育および扱いについては、九州大学の動物実験規定に従った。
2. 一本衡アニーリング(SSA) 反応の幹酸管内再現系
相同領域をタンデムに持つプラスミドDNAを作製し、これをNPEに20 ng  μ1¬1となるように加えて22℃で保温した。一定時間後にサンプリングし、Proteinase K処理およびPhenol／Chloroform抽出によってDNAを精製した。精製DNAはTBEアガロースゲル電気泳動によって分離し、SYBR Goldによって染色した後Amersham Typhoon imagerを用いて解析した。電気泳動像解析にはImage Jソフトウェアを使用した。
格　果
1. SSAの計験管内再現
SSAは相同性依存的修復の一経路であり、相同領域がタンデムに存在する場合、相同領域の間での二重鎖切断損傷を修復する際に起こる。出芽酵母においては、類似配列間のSSAがMutS α依存的に抑制される事が知られており[3]、類似配列間の相同性依存的修復モデル系としての有用性が実証されている。また、ツメガエル明抽出液中でSSAを再現した報告がある[7]。そこで420 bpの相同領域をタンデムに持つプラスミドDNAを作製し、リピートの間で切断した後NPEに加え、DNAに起こる変化を観察した。結果の一例を図1に示す。非相同未端結合（NHEJ）によって再結合された分子に加え、もとの分子よりも分子量の小さい分子が観察された。この分子はリピートを一個失っていることから、SSAによって生じたものと考えられた。詳細な解析から、このモデル基質の修復経路の約60%程度がSSAによるものであることが分かった。
図1. SSAの試験管内再現
EcoRV制限酵素サイトをはさんで420bpのリビートを有する3.2kbのプラスミドDNAをEcoRVで切断し、NPEに加えて保温した後、DNAを精製し、アガロースゲル電気泳動によって解析した。末端再結合によって生じた分子が親察され、分子量からその一部はSSAによるものと推定された。
2.類似配列間のSSAはMutSaによって抑制される
類似配列間のSSAを再現するため、リピートのひとつに約8%の塩基置換を導入したところ、SSA効率の大幅な減少が観察された。この減少が単に相同性の低下によるSSA効率の低下によるものか、それともミスマッチ修復システムの制御下にあるものかを区別するため、NPEからMsh6特異的抗体を用いてMutS α複合体を免疫除去したところ、類似配列問SSAの効率が回復した。この回復は昆虫細胞で発現、精製した組換えMutSα複合体を系に加え戻すことで失われたことから、MutS αに依存した反応によって類似配列間のSSAが抑制されていることが示された。
3.類似配列間のSSA抑制は反応の大幅な速度低下を伴う
この反応の分子メカニズムを解析するため、SSA産物DNAを制限酵素によって処理し、抑制中に生じるDNA分子種を解析した。SSAの抑制が起こっている反応中では、SSAの完成産物よりもアガロースゲル電気泳動でわずかに遅く泳動される分子種が特異的に蓄積していた。この産物は一本鎖特異的エンドヌクレアーゼに感受性であったことから、構造の主要部分に一本鎖DNAを含む、組換え中間体であると考えられた。またこの分子種の出現はMutSαに依存していた。これと対応し、SSA完成産物の出現は同一配列間のSSAと比して著しく遅れること、この遅れはMutSαに依存することも分かった。これらの結果から、MutS αはSSAの、特にアニーリング反応と拮抗して類似配列問SSAを抑制するものと考えられた。
き祭
類似配列間の相同組換えがミスマッチ修復経路によって阻害されることは、特に出芽酵母の遺伝学的胸析から解明されてきた。一方で、その分子メカニズムはほとんどわかっておらず、この主たる理由として類似配列間の組換え抑制を再現する試験管内系が無かったことが挙げられる。本研究では、ツメガエル卵抽出液中での一本鎖アニーリングをモデル系に、MutS αに依存した類似配列問SSAの抑制反応を初めて試験管内再現し、その分子機構を解析した。中間体解析から、類似通列間SSA抑制が起こる際には組換え中間体の蓄積と組換え反応の大幅な速度低下が観察された。このことは、MutSαに依存した経路によってアニーリング反応が持拮抗的に阻害を受けるというモデルでうまく説明できる。出芽酵母においてはRecQヘリカーゼであるSgs1が類似配列間組換えの抑制に必要であることが分かっている。これとよく対応し、本研究者らも類似配列問組換えを抑制するヘリカーゼ候補を既に得ている。MutS αはDNAヘリカーゼをSSA中間体に呼び込み、鎖の引きはがし反応を促進すると考えると、観察結果を整合性よく説明することができる。ミスマッチ修復因子MutSαはさまざまな因子の足場となっていることが既に分かっており、本研究者らもクロマチンリモデリング因子Smarcad1がMutS αによってDNA上にリクルートされ、クロマチン上でのMMRを促進することを既に発見、報告している［8］。Smarcad1は相同組換え反応の促進因子としても報告されており、クロマチン上で二重鎮切断未端の削り込みを促進すると考えられている［9］。出芽群母Smarcad1はMutS α相互作用因子である事も報告されている［10］。今後、Smarcad1を含め、どのような因子が類似配列間のSSA阻害に寄与するのかを解明すると共に、それらの因子が中間体蓄積にどのような役割を果たすかを明らかにすることで、MMR系による相同組換え品質管理メカニズムの全貌が見えてくると期待される。