はじめに
ビタミンB₂は，細菌，酵母，高等植物で生合成される水溶性ビタミンである.ヒトを含む多くの動物ではde novo経路による生合成ができないため，リボフラビン，フラビンヌクレオチド(FMN)やフラビンアデニンヌクレオチド(FAD)として体外から摂取されるり. ビタミンB2の基本骨格であるリボフラビンのヒトにおける供給源としては，食物や種々の薬剤のほか，大腸内の微生物叢により産生されたものが重要であるり.生体内では，吸収されたリボフラビンから補酵素型のFMNやFADが合成され、これらがミトコンドリアにおける電子伝達系,クエン酸回路,脂肪酸の異化反応などで補酵素として重要な働きを担っているり.主なリボフラビン欠乏症としては，口内炎や脂漏性皮膚炎などが認められる他，がん発症への関与が示唆されている2131一方,リボフラビンが生体の炎症応答を抑制する作用をもつ可能性が示唆されている.マウスの敗血症ショックモデルを用いた研究では，リボフラビンが過剰な炎症を抑制し、その死亡率を低下させることが示されている41.しかし,リボフラビンによる抗炎症作用の詳細なメカニズムは不明であった.最近,リボフラビンの新しい抗炎症メカニズムとして，生体の炎症応答に重要なインフラマソーム依存的なカスパーゼ-1活性の抑制機序が報告されたので5 , 今回トピックスとして紹介したい.
1.生体における炎症応答とインフラマソーム
生体における炎症応答の誘導には，主に病原体の感染などを感知したマクロファージや樹状細胞から産生される炎症性サイトカインが重要な役割を担っている.そのため，マクロファージなどの細胞膜やエンドソーム膜には，病原体の侵入を感知するために必要な受容体が存在する6.この受容体は，病原体に特有の分子パターン(病原体関連分子パターン, pathogen-associated molecular patterns,  PAMPs)を認識するため, パターン認識受容体と呼ばれる.代表的なパターン認識受容体であるToll様受容体(Toll-like receptor,   TLR)-4はグラム陰性細菌のリボ多糖(lipopolysaccharide, LPS)を, TLR-1, 2, 6はグラム陽性菌の細胞壁に由来する分子などの認識に関与し，細胞内で転写因子NF-κBなどの活性化を介して炎症性サイトカインの産生を誘導する6 (図1).このようなパターン認識受容体は，主に細胞外の微生物成分を認識する受容体としての役割を担っている。一方，近年の研究により，宿主細胞の細胞質内に侵入した微生物成分や，細胞自体の傷害を感知する細胞質内の受容体が発見された.このような受容体はヌクレオチド結合性多量体化ドメイン(Nucleotide-bind- ing oligomerization domain,  NOD)を共通にもつため, NOD様受容体(NOD-like receptors,  NLRs)と呼ばれる. NLRsが細胞質内への病原体の侵入や細胞傷害を感知すると，いくつかのNLRsはTLRsと同様，NF-κBの活性化を介して炎症性サイトカインの産生を誘導するが，他のNLRsは異なるシグナル経路を活性化し，通常TLRsを介して産生されることのない炎症性サイトカインIL-1βやIL-18を産生する7 (図1). NLRサプファミリーの1つであるNLRP3は，刺激を受けるとアダプター分子ASCを介してプロテアーゼの一種であるカスパーゼ-1 (不活性状態)をリクルートし，インフラマソームと呼ばれる複合体を形成してカスパーゼ-1を活性化する. さらに, 活性化したカスパーゼ-1は，不活性な状態として細胞質内に存在するIL-1β (前駆体IL-1β)などを切断し、活性型として細胞外へ分泌することで生体の炎症応答を惹起するり. インフラマソームに依存する炎症応答は，病原体に対する感染制御で重要な役割を担っているりとともに,その炎症応答が過剰に惹起された場合,痛風,アルツハ細胞膜やエンドソーム膜上に存在するTLRsなどが，細胞外の病原体などを認識し，炎症性サイトカインを産生する。一方，細胞質内に侵入した病原体や細胞自体の傷害は，細胞質基質に存在するセンサーであるNLRsによって認識される．刺激を受けたNLRsによってタンバク質複合体インフラマソームが形成され,カスバーゼ-1が活性化される.このカスバーゼ-1が前駆体IL-1βを切断することで活性型IL-1βが産生され炎症を惹起する. (詳細は本文参照)イマー病, ２型糖尿病,潰瘍性大腸炎・クローン病などの炎症性腸疾患の発症要因となることが知られている✎.例えば,過剰な炎症応答に起因する疾患の研究モデルとしてマウスを使用した敗血症モデルがあるが，この炎症応答にはインフラマソームが関与することが報告されている910)
2.リボフラビンはインフラマソーム依存的な
カスパーゼ-1活性化を抑制する
リボフラビンはIL-1βを含む炎症性サイトカインの産生を制御することが報告されている.マウスの敗血症ショックモデルを用いた研究では,リボフラビンが過剰な炎症を抑制し，その死亡率を低下させることが示されている4 . これまで，その詳細な機序は不明であったが，リボフラビンがインフラマソーム依存的なカスパーゼ-1の活性化を阻害することで、炎症応答を抑制する可能性が示された51. AhnとLeeは，まずNLRP3インフラマソーム活性化における各種ビタミンの影響を検討した.マウス背節からマクロファージ(背髄由来マクロファージ, BMDMs)を調製し、各種ビタミン(ビタミンB1,  B2, B 3 ,  B 5 ,  B 6およびC)の有無によるNLRP3インフラマソーム活性化を調べた. ここでは，あらかじめLPS刺激したBMDMsをNLRP3インフラマソームの活性化を誘導することが知られるニゲリシン(真菌由来の抗生物質の一種で細胞膜傷害作用がある）で刺激した.インフラマソーム活性化の指標としてはIL-1β産生量をELISA法で測定した. その結果, これまでにインフラマソーム活性化の抑制作用が報告されているビタミンC (アスコルビン酸)に加えて、ビタミンBz (リボフラビン)存在下では，インフラマソーム活性化によるIL-1β産生が抑制された. 一方, その他のビタミンについてはIL-1β産生に対する影響は確認されなかった.さらに，生体レベルでのリボフラビンの抗炎症作用を検討した.痛風の原因として知られる尿酸ナトリウム(monosodium urate, MSU)は, NLRP3インフラマソーム活性化を誘導して生体内でIL-1βなどの炎症性サイトカインを産生し，これが痛風の発症につながる可能性が示唆されている'''.  In vitroでLPS処理したBMDMsにMSU刺激を加えることでカスパーゼ-1活性化,   IL-1βおよびIL-18産生が認められ,  リボフラビン存在下ではこれらが有意に抑制されたことから. MSUをマウス腹腔内に投与して誘導される腹膜炎モデルを用いて検討を行った. 予めリボフラビンを経口投与したマウスに，さらにリボフラビンとともにMSUを腹腔内投与した後，腹腔内IL-1βおよびIL-18濃度を測定した. その結果,  MSU投与によって産生されるIL-1βおよびIL-18がリボフラビン投与によって有意に抑制された.これより、リボフラビンが生体でインフラマソーム活性化を抑制することで，過剰な炎症に伴う疾患の発症を抑える可能性が示された91.リボフラビンがインフラマソーム活性化を抑制する分子メカニズムは，どのようなものであろうか．前述のように，インフラマソームの活性化にはいくつかの過程が存在することが知られている。リボフラビンがNLRP3インフラマソーム活性化のどの段階を抑制しているのか明らかにするため，インフラマソーム複合体によるカスパーゼ-1活性化，ASCの複合体形成を示すダイマー・オリゴマー化，活性型IL-1βの分泌に必要なGasdermin D (分泌の過程に必要な細胞膜孔の形成に関わる分子)活性化に対する,リボフラビンの影響を検討した. その結果,  LPSおよびニゲリシンで誘導される活性型IL-1β産生, カスパーゼ-1活性化,  ASCダイマー・オリゴマー化およびGasdermin D活性化の全ての過程が，リボフラビン存在下で抑制された．また,レコンビナントカスパーゼ-1を用いたin vitro実験系では，リボフラビンがカスパーゼ-1活性化を阻害していることが示された.以上の結果より,リボフラビンはNLRP3インフラマソーム活性化の主要な過程を阻苦する可能性が示された51.病原体の感染や細胞の傷害という生体に対する危険は，マクロファージなどの細胞において，ミトコンドリア障害に起因するミトコンドリアDNA (mitochondrial DNA,  mtDNA)や活性酸素種(mitochondrial reactive ox- ygen species,  mtROS)の細胞質内への遊鑑を誘発し,これがインフラマソーム活性化の重要な契機であることが知られている121.一方、これまでの研究で、リボフラビンが抗酸化作用をもつことが明らかにされている'3'.そこで,リボフラビンがミトコンドリア障害の抑制を介して，NLRP3インフラマソーム活性化を制御する可能性を検討した.まず,ミトコンドリア呼吸鎖の障害を誘導しmtROS産生を誘発するロテノンでBMDMsを処理し，インフラマソーム活性化に対するリボフラビンの影響を観祭した.  LPS刺激したBMDMsをロテノンで処理することで活性型IL-1β産生が誘導されるが、リボフラビン存在下ではそれが有意に抑制された.さらに,リボフラビン存在下では, ATP処理によるBMDMsのミトコンドリアから細胞質へのmtDNA遊離促進が有意に抑制された. 以上の結果より，リボフラビンはミトコンドリア障害を抑制することでインフラマソーム活性化を制御することが示された5).インフラマソーム活性化を誘導するNLRsとしては, NLRP3以外にも重要なものが知られている. そこで, NLRP3以外のNLRsによるインフラマソーム活性へのリボフラビンの影響を検討した.細胞の核から細胞質内へ漏出した二本鎖DNA (細胞傷害が発生したことを意味する），細胞質内へ侵入したフラジェリンタンパク質(細菌の鞭毛成分)およびLPSは，NLRP3とは異なるAIM2 (absent in melanoma 2)インフラマソーム, NLRC4インフラマソーム,またマウスカスパーゼ-11 (ヒトではカスパーゼ-4, -5)が関与する非典型インフラマソームなどの活性化を誘発することが知られている。これらの検討した全てのインフラマソームに起因するIL-1β産生がリボフラビンによって抑制された.さらに，実際の病原体感染においては，リステリア(Listeria monocytogenes) , サルモネラ菌(Salmonella Typhimurium）や大腸菌(Escherichia coli)の感染でAIM2, NLRC4,非典型インフラマソームが活性化することが知られている.これらの細菌感染によるインフラマソーム活性化に起因するIL-1β産生もリボフラビンは有意に抑制した. 以上の結果より，リボフラビンは，NLRP3インフラマソームのみならず，実際の細菌感染によって誘導される複数のインフラマソーム活性化を抑制し，宿主の炎症応答を制御することが示された9.
3.まとめ
生体における炎症応答が適切な役割を果たすためには，過剰な応答を抑えるよう制御することが重要である。今回，リボフラビンのインフラマソーム依存的なカスパーゼ-1活性化の抑制作用による抗炎症機能が示された．一方，病原体の感染における炎症応答は．感染から身を守る上で必須の免疫応答である.これまでの研究で，リボフラビンが哺乳動物の免疫システムを活性化する作用が示されている.例えば、生体が病原体の感染を受けた際,異物の排除に関わるマクロファージや好中球の活性化をリボフラビンが誘導することが知られている14).また，リボフラビンのＴ細胞への影響も確認されている．主要なＴ細胞集団であるCD4 *またはCD8 * T細胞とは異なり，単一の抗原を認識するＴ細胞集団であるMAIT細胞(mucosal-associated invariant T cells)は，細菌などに由来するリボフラビン合成代謝中間体を認識し免疫応答を誘導することで,粘膜免疫に寄与することが示されている15）、炎症や自然免疫の制御という観点から，リボフラビンには免疫応答の活性化と抑制という相反する作用が存在する可能性が示唆されており，リボフラビンがどのような仕組みで生体に適切な炎症が誘導されるよう役割を果たしているのか，生体レベルでの検討が必要であると考えられる.今回の研究の結果,リボフラビンが多様なメカニズムでインフラマソーム活性化を抑制する可能性が示唆された.インフラマソーム活性化は特異性の高い分子間の相互作用によって成立することが知られており，これら全ての相互作用にリボフラビンが作用するとは考えにくい.リボフラビンにおけるインフラマソーム活性化の詳細な抑制作用には未だ不明な点が存在しており，今後の研究に期待したい.成戸丈紘，片根真澄，本問浩，浅野泰久(2021)ビタミンBr.ビタミン・バイオファクター総合事典(日本ビタミン学会編). pp.124-149,朝倉書店,東京2) Saedisomeolia A, Ashoori M (2018) Riboflavin in human health: A review of current evidences. Adv Food Nutr Res 83, 57-81 3) Peterson CT, Rodionov DA, Osterman AL, Peterson SN (2020) B vitamins and their role in immune regulation and cancer. Nutrients 12, 3380 4) Toyosawa T, Suzuki M, Kodama K, Araki S (2004) Effects of in- travenous infusion of highly purified vitamin B 2 on lipopolysac- charide-induced shock and bacterial infection in mice. Eur J Phar- macol 492 , 273-280 5) Ahn H, Lee GS (2020) Riboflavin, vitamin B 2 , attenuates NLRP3, NLRC4, AIM2, and non-canonical inflammasomes by the inhibi- tion of caspase-1 activity. Sci Rep 10, 19091 6) Pandey S, Kawai T, Akira S (2014) Microbial sensing by Toll-like receptors and intracellular nucleic acid sensors. Cold Spring Harb Perspect Biol 7, a016246 7) Babamale AO, Chen ST (2021) Nod-like receptors: Critical intra- cellular sensors for host protection and cell death in microbial and parasitic infections. Int J Mol Sci 22, 11398 8) Strowig T, Henao-Mejia J, Elinav E, Flavell R (2012) Inflamma- somes in health and disease. Nature 481, 278-286 9) Imamura M, Tsutsui H, Yasuda K, Uchiyama R, Yumikura-Fu- tatsugi S, Mitani K, Hayashi S, Akira S, Taniguchi S, Van Rooijen N, Tschopp J, Yamamoto T, Fujimoto J, Nakanishi K (2009) Con- tribution of TIR domain-containing adapter inducing IFN-beta- mediated IL-18 release to LPS-induced liver injury in mice. J Hepatol 51, 333-341 10) Kayagaki N, Wong MT, Stowe IB, Ramani SR, Gonzalez LC, Akashi-Takamura S, Miyake K, Zhang J, Lee WP, Muszyński A, Forsberg LS, Carlson RW, Dixit VM (2013) Noncanonical inflam- masome activation by intracellular LPS independent of TLR4. Sci- ence 341, 1246-1249 11) Martinon F, Pétrilli V, Mayor A, Tardivel A, Tschopp J (2006) Gout-associated uric acid crystals activate the NALP3 inflamma- some. Nature 440, 237-241 12) Pandey A, Shen C, Feng S, Man SM (2021) Cell biology of in- flammasome activation. Trends Cell Biol 31, 924-939 13) Fujiwara C, Muramatsu Y, Nishii M, Tokunaka K, Tahara H, Ueno M, Yamori T, Sugimoto Y, Seimiya H (2018) Cell-based chemical fingerprinting identifies telomeres and lamin A as modifiers of DNA damage response in cancer cells. Sci Rep 8, 14827 14) Peterson CT, Rodionov DA, Osterman AL, Peterson SN (2020) B Vitamins and their role in immune regulation and cancer. Nutrients 12, 3380 15) Kjer-Nielsen L, Patel O, Corbett AJ, Le Nours J, Meehan B, Liu L, Key words :Riboflavin, Vitamin B 2 , inflammasome, inflam- mation, caspase-1 2nd Department of Biochemistry, School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Mukogawa Women's University武庫川女子大学薬学部生化学II講座内山 良介,野坂和人