村山正承関西医科大学附属生命医学研究所モデル動物部門Key words :変形性関節症,軟骨細胞, CTRP3, CTRP6
箱 富
変形性関節症は関節軟骨の損傷により生じる骨組織の変性や変形が特徴的な骨代謝疾患である。その治療には主に保存療法や手術療法が選択されるが、再生医療研究の発展に伴い再生医療技術による治療法の開発も進んでいる。関節表面を覆う関節軟骨は、コラーゲンやプロテオグリカンなどの細胞外マトリックスとこれらを産生する軟骨細胞から成る。軟骨細胞は同化作用だけでなく、マトリックスメタロプロテアーゼを産生することで異化作用も行うことから、軟骨組織の恒常性の維持に軟骨細胞の代謝制御は重要である。そのため、軟骨細胞は変形性関節症に対する幹細胞医療や治療薬・治療法の開発において重要な研究対象である。 CTRPファミリーはadipokineとして知られ、代謝内分泌において類似した役割を果たす。しかし、CTRPファミリ一分子の受容体についてはほとんど報告がない。CTRP3は軟骨細胞増殖因子として同定され精力的な研究が行われたが、CTRP3受容体は明らかでなかった。研究代表者らはCTRP3欠損マウスを作製し、関節リウマチをはじめとする自己免疫疾患の発症に関与することを報告している[1]。本研究ではCTRP3受容体の同定に成功し、さらに他のCTRP分子も軟骨細胞増殖因子であることを見出した。本研究成果は変形性関節症に対する新たな治療薬・治療法の開発に繁がることが期待される。
方法および結果
1.軟骨細胞株ATDC5
軟骨細胞増殖におけるCTRP3の受容体を同定するため、軟骨細胞株ATDC5を用いた。ATDC5細胞は理化学研究所バイオリソース研究センターから購入した。ATDC5細胞は5％血清、1％ペニシリンーストレプトマイシンを含むHAM's F-12培地にて維持し、80～90％程度でトリプシン／EDTAを用いて継代を行った。
2.軟骨細胞におけるPAQR受容体ファミリーの発現解析
CTRPファミリー分子であるadiponectinはPAQR1, PAQR2, PAQR3を受容体として生理機能を発揮する。また、これら三つの受容体とPAQR4を含んだ四つの受容体がクラスI PAQRファミリーである［2］。軟骨細胞における11あるPAQRファミリーの発現強度を検討するため、次のプライマーセットを用いてリアルタイムPCR解析を実施したGapdh : 5'- TTCACCACCATGGAGAAGGC-3', 5'- GGCATGGACTGTGGTCATGA-3' Pagr1 : 5'- AGACAAGAGCAGGAGTGTTCCT-3', 5'- GGTGATGTACATCACAGCCATG-3' Pagr2 : 5'- GGACACATCTCCTAGGTTGTGT-3', 5'- TGGCAGTACACCGTGTGGAAGA-3' Paqr3 : 5'- TTCCAGGTCTGCATGCTTTGCT-3', 5'- AGACATAGCAGCCCAGTATTCC-3' Pagr4 : 5'- AACATCTACACACGGGCTAG-3', 5'- AGAGGTGATACAGCACAGAGGC-3' Paqr5 : 5'- TTCTACAGGCTCTTCCTGTTCC-3', 5'- GTGACTGTGGCCAATGTAGTCA-3' Pagr6 : 5'- TTCTACAGGCTGCGGCTGTT-3', 5'- TGGTGGCTGTGGCCAATATAGT-3' Paqr7 : 5'- ATCGTCTTGGCCTCCTTCACCT-3', 5'- CAGGACGGCTCTATGGCATAGT-3' Paqr8 : 5'- AGAAGCACAACGAGGTGGTCAA-3', 5'- CAAGAGGCTGCAGGTGAGGTAA-3' Paqr9 : 5'- AGTGCTTCATCCTGTCCGGCTA-3', 5'- GCAGAACTTACTGAGGAACAGC-3' Pagr10 : 5'- CACCTCAGGATGGTAGAGCACT-3', 5'- TGATCCACACCAGCCAGCGCAT-3' Pagr11 : 5'- TGCTACACACGCATTTCATG-3', 5'- AGTAGATGACCATCCGATCGCA-3'リアルタイムPCR解析の結果、他のPAQR受容体と比較してクラスI PAQR受容体の発現が高いことがわかった(図1)。図1. 軟骨細胞におけるPAQR受容体ファミリーの遺伝子発現軟骨細胞株ATDC5におけるPAQR受容体ファミリーに遺伝子発現強度をリアルタイムPCRにて評価した。それぞれの遺伝子はGapdhに対する相対的な発現強度であり、△ △ Ct法で評価した。N=3の平均値を図示した。
3. RNA干渉によるクラスI PAQR受容体の遺伝子発現制御
CTRP3による軟骨細胞増殖制御におけるクラスI PAQR受容体の役割を解明するため、これら4受容体の遺伝子発現を次の配列を用いてRNA干渉により制御することとした。 S: sense sequence、AS: anti-sense sequence Negative control-1: S; GUGCGCUGCUGGUGCCAACCCTT, AS; GGGUUGGCACCAGCAGCGCACTT PagrI: S; GAGACUGGCAACAUCUGGACATT, AS; UGUCCAGAUGUUGCCAGUCUCTT Pagr2 S; GCUUAGAGACCUGUUUGUUTT, AS; AACAAACAGGUGUCUCUAAGCTT Negative control-2: S; CGUUAAUCGCGUAUAAUACGCGUAT, AS; CAGCAAUUAGCGCAUAUUAUGCGCAUA Pagr3 S; GGCAUUGGAUUAUGCAGGAAUUCT, AS; AGAAAUUCCUGCAUAAUCCAAUGCCAU Paqr4 S; ACAUUGGUCCUGCUUGUAUCAUCTG, AS; CAGAUGAUACAAGCAGGACCAAUGUCC四つのクラスI PAQR受容体に対するRNA干渉を行った結果、コントロール配列に比べいずれの遺伝子発現も顕著に抑制することが出来た（図2)。図2. クラスI PAQR受容体に対するRNA干渉ADTC5細胞におけるクラスI PAQR受容体の遺伝子発現をRNA干渉にて制御した。Gapdhに対する相対的な遺伝子発現強度を、△△Ct法で評価することでRNA干渉による遺伝子発現効率を評価した。
4. CTRP3による軟骨細胞増殖におけるクラスI PAQR受容体の役割の解明
最後にクラスI PAQR受容体遺伝子発現制御下にて、軟骨細胞に対するCTRP3の効果を検討した。RNA干渉により遺伝子発現を制御した1×10 4個のATDC5細胞を48-well plateにて培養し組換え体CTRP3を添加し、細胞の増殖を評価した。その結果、CTRP3による軟骨細胞の増殖はPAQR2遺伝子発現制御下でのみ抑制された（図3)。図3.  RNA干渉下におけるCTRP3の細胞増殖能の評価RNA干渉にて遺伝子発現を誘導したATDC5に対する組換え体CTRP3の細胞増殖活性を評価した。□CTRP3なし、■CTRP3あり（50 ng/ml)。平均値土標準誤差を示した。t検定による有意差（n=4）: ***P<0.001。
有祭
本研究によりこれまで受容体が明らかでなかったCTRP3の受容体を明らかにすることが出来た[3]。また、他のCTRPファミリー分子も軟骨細胞増殖活性を有していることを明らかにしており（未発表）、軟骨細胞代謝にてCTRPファミリー分子が重要な役割を担っていることが明らかとなった。これらの成果よりCTRPファミリー分子が変形性関節症に対する重要な研究標的であると考えられる。
本研究は上原記念生命科学財団の支援のもと実施し、研究成果の一部をTranslational and Regulatory Sciences誌にて発表することが出来ました。この場を借りて深く御礼申し上げます。
文 飲
1) 2) Murayama MA, Kakuta S, Haruhashi T, Shimizu K, Seno A, Kubo S, Sato N, Saijo S, Hattori M, Iwakura Y. CTRP3 plays an important role in the development of collagen-induced arthritis in mice. Biochem Biophys Res Commun. 2014 Jan 3;443(1):42-8. Epub 2013 Nov 20. PMID: 24269820 DOI: 10.10165.bbrc.2013.11.040. Tang YT, Hu T, Arterburn M, Boyle B, Bright JM, Emtage PC, Funk WD. PAQR proteins: a novel membrane receptor family defined by an ancient 7-transmembrane pass motif. J Mol Evol . 2005 Sep;61(3):372-80. DOI: 10.1007/s00239-004-0375-2. 3) Murayama MA, Iwakura Y. C1q/TNF-related protein 3 regulates chondrogenic cell proliferation via adiponectin receptor 2 (progestin and adipoQ receptor 2). Translat Regulat Sci. 2(1): 19–23, 2020; doi: 10.33611/trs.2_19