生物資源デノム解析拠点ミュースレタNGRCニュース      No. 12 No. 8 2020年度
巻頭言…
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平茶より生物資源ゲノム解析センターの運営にご支援ご協力を賜りまして厚く御礼申し上げます。ご存じの通り2020年度のセンターにおける活動は、新型コロナウイルス感染症の影響を大きく受けることとなりました。前期には本学がキャンパス閉鎖や教学における完全リモート講義の実施になったことなどを踏まえ、センターの活動もリモートによるデータ解析のみとなりました。そのため、センターを利用した、学内研究、共同利用・共同研究拠点課題の推進も大きく影響をうけました。後期になり、学内での研究活動は回復しつつありますが、解析対象とする生物試料の準備が中断していたことなどにより、センターの再開と研究者側のNGS解析再開のための準備にタイムラグが生じています。一方でセンターとしてもできる範囲で事業継続に務め、拠点事業では前期、後期の課題採択による共同研究の推進、学内利用の受入などを積極的に進めてきました。そして、センター活動に参加いただいた研究者の皆様のご協力を得て、本年度もニュースレターの刊行にこぎ着けることができました。ここに深く感謝申し上げます。世界的な蔓延状況が現在も収まる気配をみせないコロナウイルス感染症ですが、社会が知恵を絞り前に進もうとするなかで、本センターも引き続き農学分野を中心とした過伝情報解析の拠点として学内外の研究者とともに、また学内の教育研究を支援し、発展を目指していく所存です。今後もご支援を賜りますようお願い申し上げます。 (生物資源ゲノム解析センター　センター長　矢嶋俊介)
東京農業大学生物資源ゲノム解析センター 2021 4F 3月号
東京農業大学生物資源ゲノム解析センターは、文部科学省より生物資源ゲノム解析拠点として2019年4月に共同利用・共同研究拠点の再認定を受け、2020年度は第2期・2年目として活動を行いました。本拠点は、次世代シーケンサー (NGS)を利用し、農学分野に貢献する研究の推進、さらには新規研究分野の開拓を目指しています。また、本支援活動では、本学教員と学外の研究者の新たなコミュニティを創成し、新たなアイディアが生み出される機会を提供できるよう努めております。さらには農学分野で遺伝情報解析を介した研究を担う人材育成に貢献することも目指しています。本学教員と連携し、学生のNGS関連の実験指導、解析ソフトウェアの講習会等を開催し農学と情報処理の統合解析可能な人材育成を進めています。当センターは、Illumina社のNGSを4台(HiSeq 2500、NextSeq 500、MiSeq 2台）設置しており、ゲノムリシーケンスやRNA-Seq、ChIP-Seqから、メタゲノム解析に至るまで解析が可能です。獲得したリードデータは、独自に設置している9台のサーバ(総メモリ容量約5TB、総ディスク容量約1PBのシステム）を保有し増え続けるデータ量に対して十分対応可能な設備を整えております。また、ライプラリー調製からシーケンサーのオペレーションを一貫して行える研究員が常勤しています。これらの整備された環境を用いて、各研究員が専門分野を中心に微生物から高等な動植物まで多岐にわたる生物種を対象に、様々な共同研究者の研究課題に対応できる体制となっています。 2020年度は、コロナ禍であり、様々な制約の中での研究活動でありました。このような状況下でありながら、学内・学外の研究者、運営委員会の諸先生方を含め多くの方々の協力があり、27件の研究課題に対して解析支援を実施することができました。今期も、農学分野に関連した植物・微生物・動物の課題を採択しました。これまで通り、幅広い生物種及び基礎から応用研究までを対象に解析支援を行なっております(図1)。果実・野菜・家畜等の有用形質や病気を理解するために、RNA-Seaによる遺伝子発現ネットワークの解明や、原因遺伝子座絞り込を目指したリシーケンスなどの課題が多くを占めました(図2)。 RNA-Seq及びリシーケンス解析は当センターでの主要な解析手法であり、これまでの経験を活かした研究支援が可能となっております。また、昨年度より導入したFlexible  ddRAD-Seqを用いた解析も行いました。今年度は解析サーバーの増強を行い、さらに充実した解析環境となりました。共同利用に於いては、 NGS解析未経験者や、若手研究者の方の支援を目指し、積極的に採用する方針をとっております。引き続き、NGSを用いた共同研究を通して農学分野の研究を共に盛り上げていきたいと考えています。
当センターでは、解析支援業務のほか次世代シーケンサー (NGS)やデータ解析に関する知見を深めること、および研究者コミュニティの拡大を目的として、セミナー開催などを通した積極的な情報発信活動を推進しています。今年度は、コロナウイルスの蔓延により緊急事態宣言が発令された影響もあり、対面ではなくオンラインでのセミナーを開催いたしました。2020年11月にNGSデータの解析手法の習得を目的とした「解析ソフトウェア講習会」を開催いたしました(図1)。株式会社ワールドフュージョンの岡岳彦博士による、NGS解析用ソフトウェアの一つであるCLC  Genomics  Workbenchの使い方を学ぶための、ハンズオンセミナーをWeb会議システムによるオンライン形式にて実施いたしました。セミナー冒頭で、本学、生命科学部・分子微生物学科に所属の藤田信之教授に“DNAシーケンサーの原理と変遷および配列解析で使用されるデータ形式"についてご講演いただき、事前にNGSの原理およびそこから出力されるデータ形式に理解を深めた上で、岡岳彦博士にソフトウェアの利用法についてご講演頂きました。本セミナーには、本学の様々な学科における教員や学生の方々から多数のご参加をいただいたことから、NGSに関連する技術や情報に関するニーズが非常に高まっていることが感じられました。このように、当センターが共同利用・共同研究における解析支援の場となるだけではなく、NGSを基盤とした生命情報科学に対する教育拠点としての役割を担うことにつながればと期待しています。一方で、本年度からの試みとして、これまでNGSに馴染みがなかった方々の拠点事業への新規応募の獲得を目的としたオンライン説明会を実施いたしました(図2) 。Web会議システムを通じて2回にわたって実施し、多くの方々にご参加いただくことができました。社会情勢等により大人数による対面での説明会が難しい状況ですが、今後もWeb会議システムを活用しながら、積極的にセンターの啓蒙活動を行なっていきたいと考えております。 (生物資源ゲノム解析センター　松谷峰之介)東京農業大学・生物資源ゲノム解析センターは、今後も遺伝情報解析による支援活動のほか、セミナー開催等を通して情報発信活動を積極的に推進します。
当センターに所属する研究員は、共同利用・共同研究における解析支援や情報発信活動のほか、各自がテーマを持ち研究活動にも取り組んでいます。対象生物種は、酢酸菌からコケなど多岐にわたります。また、それら研究テーマに対するゴールも異なり、対象生物の生命現象について解明を目的とする基礎研究から、当センター最大の特色である次世代シーケンサー (NGS)を活かした技術開発を目的とする応用研究まで含んでいます。ここでは、今年度に各研究員が取り組んだ研究活動のうち、代表して2つの研究課題について紹介します。 1つ目は、「甲州ブドウのゲノム解読」に成功した話題です。本研究は、山梨大学ワイン科学研究センター果実遺伝子工学研究部門のチームと共同し、日本固有の白プドウ品種「甲州」の全ゲノム情報を解読しました(図1)。その結果、他のワイン用欧州ブドウ品種と比較して機能性が異なると推定される遺伝子が複数発見されました。これら遺伝子は特にポリフェノールや風味に影響を与える物質の代謝に関連していることが明らかになりました。本研究成果は、植物科学雑誌[Frontiers in Plant Science]に2020年11月5日に掲載されました。さらに、本論文発表のニュースリリースに伴い[山梨日日新聞]、「日経新聞」、「朝日新聞」から取材を受けました。各新聞社に本研究に関する記事が掲載され、メディアを通して人々に幅広く情報を発信することができました。 2つ目は、「大気中に飛散する花粉の解析」に取り組んでいる話題です。本研究は、近年注目されている環境DNA解析(土壌、水、大気などの空間中に存在する生物を網羅的に推定するアプローチ) について焦点を当て、大気中に飛散する花粉を解析するシステム展開を目的としています。このシステムでは、大気中に含まれる花粉の由来および飛散元の情報を得て、森林整備戦略や花粉飛散予測への実用化を考えています。花粉の植物種を推定する方法は、当センターのNGSを利用したDNAメタバーコーディング技術を適用できます。一方、飛散元を推定するにはゲノム情報のみでは限界がありました。そこで、本研究は、千葉大学の環境リモートセンシング研究センターの共同利用拠点を通して共同研究申請を行い、大気リモートセンシンゲ技術を活用することで、この限界に挑みました(図2)。研究は現在も進行途中ですが、東京農業大学と千葉大学の拠点間プロジェクトとして分野の垣根を越えた活動がどのようなシーズを生み出せるのか今後の取り組みに期待されます。また、この課題は、株式会社リバネス出版から取材を受け、「研究応援vol.20」にて掲載されました。各研究員が取り組む研究活動には、研究者としてのキャリアアップ形成の推進となるだけでなく、得られた研究結果や培ったノウハウ、さらに広げられた研究者コミュニティが当センターへの還元・アップデートにつながります。今後の共同利用・共同研究における解析支援にも更に貢献していきます。図2  東京農業大学のDNAメタバーコーディングと千葉大学の大気リモートセンシングの2つの技術を融合した研究の取り組み。

○論文発表
● Miyashita M, Mitani N, Kitanaka A, Yakio M, Chen M, Nishimoto S, Uchiyama H, Sue M, Hotta H, Nakagawa Y, Miyagawa H. Identification of an antiviral component from the venom of the scorpion Liocheles australasiae using transcriptomic and mass spectrometric analyses. Toxicon 191:25-37. (2020) ● Tanaka K, Hamaguchi Y, Suzuki S, Enoki S. Genomic characterization of the Japanese indigenous wine grape Vitis sp. cv. Koshu. Front Plant Sci. 11:532211. (2020) ● Seki K, Komatsu K, Hiraga M, Tanaka K, Uno Y, Matsumura H. Identification of two QTLs for resistance to Fusarium wilt race 1 in lettuce ( Lactuca sativa L.）. Euphytica. 216:174. (2020) ● Islam S, Bhor SA, Tanaka K, Sakamoto H, Yaeno T, Kaya H, Kobayashi K. Transcriptome analysis shows activation of stress and defense responses by silencing of chlorophyll biosynthetic enzyme CHLI in transgenic tobacco. Int J Mol Sci. 21(19):7044. (2020) ● Islam S, Bhor SA, Tanaka K, Sakamoto H, Yaeno T, Kaya H, Kobayashi K. Impaired expression of chloroplast HSP90C chaperone activates plant defense responses with a possible link to a disease-symptom-like phenotype. Int J Mol Sci. 21(12):4202. (2020) ● Kurio Y, Koike Y, Kanesaki Y, Watanabe S, Ehira S. The CRP-family transcriptional regulator DevH regulates expression of heterocyst-specific genes at the later stage of differentiation in the cyanobacterium Anabaena sp. strain PCC 7120. Mol Microbiol. 114(4):553-562. (2020) ● Takagi M, Iwamoto N, Kubo Y, Morimoto T, Takagi H, Takahashi F, Nishiuchi T, Tanaka K, Taji T, Kaminaka H, Shinozaki K, Akimitsu K, Terauchi R, Shirasu K, Ichimura K. Arabidopsis SMN2/HEN2 , encoding DEAD-box RNA helicase, governs proper expression of the resistance gene SMN1/RPS6 and is involved in dwarf, autoimmune phenotypes of mekk1 and mpk4 mutants. Plant Cell Physiol. 61(8):1507-1516. (2020) ● Nakamura T, Suzuki-Minakuchi C, Kawano H, Kanesaki Y, Kawasaki S, Okada K, Nojiri H. H-NS family proteins drastically change their targets in response to the horizontal transfer of the catabolic plasmid pCAR1. Front Microbiol. 11:1099. (2020) ● Kanda T, Abiko G, Kanesaki Y, Yoshikawa H, Iwai N, Wachi M. RNase E-dependent degradation of tnaA mRNA encoding tryptophanase is prerequisite for the induction of acid resistance in Escherichia coli. Sci Rep. 10:7128. (2020) ● Kashimoto T, Miyake K, Sato M, Maeda K, Matsumoto C, Ikeuchi M, Toyooka K, Watanabe S, Kanesaki Y, Narikawa R. Acclimation process of the chlorophyll d-bearing cyanobacterium Acaryochloris marina to an orange light environment revealed by transcriptomic analysis and electron microscopic observation. J Gen Appl Microbiol. 66(2):106-115. (2020) ● Sumikawa K, Kosaka T, Udo K, Kanesaki Y, Yoshikawa H, Yamada M. Characteristics of physiology of and genomic mutations in aggregation-enhanced mutants of Methanothermobacter sp. CaT2. Biosci Biotechnol Biochem. 84(5):1047-1055. (2020) ● Nakano Y, Kusunoki K, Hoekenga OA, Tanaka K, Iuchi S, Sakata Y, Kobayashi M, Yamamoto YY, Koyama H, Kobayashi Y. Genome-wide association study and genomic prediction elucidate the distinct genetic architecture of aluminum and proton tolerance in Arabidopsis thaliana. Front Plant Sci.11:405. (2020) ● Matsuzaki R, Suzuki S, Yamaguchi H, Kawachi M, Kanesaki Y, Yoshikawa H, Mori T, Nozaki H. The Rubisco small subunits in the green algal genus Chloromonas provide insights into evolutionary loss of the eukaryotic carbon-concentrating organelle, the pyrenoid. BMC Ecol. Evol. 21(1):11. (2021)

2020年度前期採択課題一覧
1.石丸恵(近畿大学) 「長期貯蔵を目的としたモモ果肉形質の遺伝子多型解析」 2. 日原由香子(埼玉大学) [CRISPRi技術を用いたシアノバクテリアSynechocystis sp. PCC 6803のcyAbrB1転写因子の機能解析」 3. 村上明男(神戸大学) [ソテツ珊瑚根と窒素固定藍藻の共生成立に関わる遺伝子群の探索」 4.中塚貴司(静岡大学) [ストックエバースポーティング原因遺伝子の特定] 5.古久保哲朗(横浜市立大学) [出芽酵母における基本転写因子TFIIDとその類縁複合体SAGAの機能解析] 6. 池田俊太郎(京都大学) [ウシ初期胚におけるメチオニン代謝依存性のヒストン修飾の解析] 7.若林あや子(日本医科大学) [食品添加物ミョウバンによるマウス腸上皮細胞インフラマソーム活性化のトランスクリプトーム解析」 8. 奥村裕(東北区水産研究所) [環境変動が沿岸に生息する水生生物の多様性に及ぼす影響] 9. 今井啓雄(京都大学) [霊長類オルガノイドを用いた食品工学への貢献] 10.伊藤　克彦（東京農工大学大学院） [カイコ黒蛾変異体から迫るチョウ目昆虫体色黒化遺伝子座の実体解明] 11. 榎 真一（山梨大学ワイン科学研究センター） [ブドウ樹内マイクロフローラのメタゲノム解析] 12.増田　誠司（京都大学） [mRNAスプライシング阻害を示す食品化合物の作用機構ならびに構造活性相関解析を用いた新規迅速探索法の開発」 13.藤田知道(北海道大学) [様々な重力環境で育成したヒメツリガネゴケにおける発現変動遺伝子の解析] 14.伊福健太郎(京都大学) [生物学的封じ込めを目指した亜リン酸要求性遺伝子組換え珪藻の作出] 15.秀瀬涼太(神戸大学) 「マルチオミクスデータ解析に基づく藻類バイオマス生産と細胞内油脂蓄積を制御する因子の同定」 16.宇野雄一（神戸大学大学院） [レタス根腐病レース2に対する真性抵抗性機構の解明」 17. 廣田 隆一（広島大学） 「亜リン酸を用いたロバスト且つ封じ込めを可能とする微細藻類の培養技術開発」 〈課題番号順〉
2020年度後期採択課題一覧
1.井澤毅（東京大学大学院） [竹の稗形成に関わる遺伝子の探索一キッコウチク（亀甲竹）を材料に一」 2. 得平茂樹(東京都立大学) [シアノバクテリアAnabaena variabilisにおける休眠細胞形成素過程の解明」 3. 芳賀聡(農研機構) [肝臓のRNA-Seq解析を基軸とした牛伝染性リンパ腫ウイルス感染がウシ代謝機能に及ぼす影響とその機序の解明」 4. 「褐毛和種封入体病の原因遺伝子の探求」 5. 山本ゆき(岡山大学大学院) [暑熱ストレスのウシ子宮内膜細胞における免疫関連物質産生への影響] 6. 福永 健二（県立広島大学） [Flexible ddRAD-seq法によるアワ在来品種遺伝資源の多様性解析」 7.千浦博(東京農工大学) [ベクターパーティクル:新たな遺伝子伝搬機構の解明」 8.宮崎翔(慶応義塾大学) [植物の矮化及び隆起化を引き起こす昆虫化学シグナルと発生メカニズムの解明] 9. 伊原正喜(信州大学) [水田で栽培できる藍色細菌（シアノバクテリア）の進化工学による高温適応株の創出」 10.兼崎友(静岡大学) 「常温性シアノバクテリアの長期高温適応進化実験」 〈課題番号順〉
我が国のモモ果実は、欧米やその他の地域の果実に比べ糖度が高く、酸味や渋み・雑味が少なく、非常に高品質である。さらに、果肉は多汁で柔らかく、きめ細やかである。果実サイズも大きく、和歌山県では400 ～ 550 g前後／果実に達するものが栽培され、流通されている。しかし、貯蔵期間が短い果実として知られており、モモ果実の長期貯蔵はこれまでに実現していない。現在日本で最も多く栽培されている品種は‘あかつき’ (18%)、 ‘自顾’ (16%)、‘川中島自桃’ (13%)、‘日川自桃’ (10%)となっている(平成28年度農水省統計)。 ‘あかつき’は、‘白桃’と‘白鳳’の交配育成種であることから、日本全国で栽培されている殆どの品種は‘自桃’と‘白吸’から脊成された品種ということがわかる(第1図)。現在日本で栽培されている多くの品種の果実形質は‘白桃’および‘白吸’の遺伝形質を明らかにずることで判別可能になると考えられる。本研究は、モモ果実の長期貯蔵を目的とし、果肉形質の異なる主要な栽培品種25品種についてゲノムリシーケンスを行い、既に解析を行った‘白Ｑ’のゲノムと比較ゲノム解析を行う。既に全ゲノム情報が報告されている欧米系の台木品種'Lovell' (Nature genetics, 2013)と'白鳳'の比較ゲノム解析を行ったところ、第3染色体の中間に構造の大きな違いがみられた(第2図)。これらの情報を基に解析を行った25品種の解析を進めている。石丸恵(近畿大学生物理工学部)大和勝幸（近畿大学生物理工学部）共同研究先：馬場正(農学部)吉田美花（農学部）儀澤章久（生物資源ゲノム解析センター）
細菌間に広く保存されているAbrB型板写因子はN末端側にDNA結合ドメインを持つが、シアノバクテリアだけがC末端側にDNA結合ドメインを持つ転写因子を独自進化させている。多くのシアノバクテリアゲノムに、系統樹上の異なるクレードに属する少なくとも2コピーの遺伝子が保存されていることから、我々はA型とB型の2つを持つことに何らかの生理的意幾があるのではないかと考え、その機能解析を行っている。これまでに、単細胞性のモデル種であるSynechocystis sp. PCC 6803（S.6803）の遺伝子破壊株の解析から、B型は窒素源および炭茶源の取り込みと代謝の制御に重要な役割を担う転写因子であること、その欠損が炭素フラックスを変化させ、物質生産にポジティブな影響を与えることなどを見出してきた。また、 Hisタグを付加したA型とB型の組換えタンバク質を、S.6803粗抽出液に加えてプルダウン実験を行うと、互いに共精製されることから、両者の細胞内での相互作用が示唆されている。しかし、A型は生存に必須であるためか、遺伝子の完全破壊株を得ることができず、その機能に関する知見はこれまでほとんど得られていない。そこで本研究では、CRISPRi技術を用いてS.6803においてA型の遺伝子をノックダウンし、RNA-seq解析を実施して遺伝子発現プロファイルへの影響を調べ、その標的遺伝子群を同定することを目的とした。 S.6803野生株にCRISPRiコンストラクトを導入し、sgRNAを持たないコントロール株（control株）、およびA型遺伝子の5'-UTR相補鎖配列をsgRNAとして持つノックダウン株(CRISPR株）を作製した。これらの株をdCas9誘導条件で72時間培養したところ、CRISPR株におけるA型の落積量はcontrol株の20％まで減少した。そこで、この条件下の2株をRNA-seq解析に供し、A型遺伝子ノックダウンにより発現滅少する豊伝子群(CRISPR/controlのRPKM比≤ 0.5、 p<0.05) 、および発現増加する遺伝子群（CRISPR/controlのRPKM比≥ 2.0、p<0.05) をリストした。 A型遭伝子ノックダウンにより発現減少した13遣伝子には、過去にB型欠損により発現変動すると報告された遺伝子は含まれていなかったことから、これらの遺伝子群はB型とは独立に、A型により転写活性化されると考えられる。一方、A型遺伝子ノックダウンにより発現増加した85遺伝子のうち、21遺伝子は過去にB型欠損により発現増加すると報告されており、さらにそのうちの多くが、炭素源の取り込みと代謝に関わる遺伝子群をコードする2つのオペロン上に存在していた(図1)。この2つのオペロンはゲノム上でプロモーター領域を共有して道向きに位置しており、 A型とB型による一括的な発現制御を受けている可能性がある。A型遺伝子をノックダウンしたCRISPR株ではB型蓄積量が増加したこと、およびB型欠損株においてA型の高蓄積が報告されていることをふまえると、これらの遺伝子群は、A型とB型の個々の発現レベルではなく、両者の比によって発現創御されている可能性がある。両者のいずれかが過剰に蓄積した場合に標的遺伝子の発現誘導が起きるという仮説を立て、現在検証実験を行っている。日原由香子（埼玉大学大学院理工学研究科)共同研究先：渡辺 智     (生命科学部)松谷峰之介（生物資源ゲノム解析センター）
裸子植物ソテツ(Cycas revoluta、ソテツ科唯一の日本自生種）は海岸の砂礫地など貧栄養土壌でも長期間安定した生育・成長が可能である。ソテツの地下部からは側根が横に伸長し、ところどころに「珊瑚根」と呼ばれる背地性の特殊な根組織が分化する。この珊瑚根の組織内には登茶固定能をもつ緑色の糸状藍藻(シアノパクテリア)が生育しており、ソテツと藍藻は栄養共生を営んでいると考えられている。臨漢の共生部位は珊瑚根の皮層組織内の一定部位に限定されていることから、共生を可能とする部位が空間的に制御されている可能性が示唆される。このソテツ珊瑚根と共生魔藻の関係は古くから研究が行われている。しかし、珊瑚根共生の生理生態学的な意義、共存する根圏微生物群がこの共生にどのように関わるのか、共生藍藻の安定維持や共生部位の制御の仕組み等は、未解明のことが多く残されている。我々は、広瀬正紀氏（和歌山大学名誉教授）が1977年にソテツ晴蘋根から単離培養し、運動性の細胞ホルモゴニウムの誘導分化および細胞運動（光運動反応）の解析に用いて来られた共生藍藻Nostoc cycadae WK-1の高精度ドラフトゲノム情報を2018年に発表した(Kanesaki et al. (2018) Genome Announcements)。「東京農業大学生物資源ゲノム解析センター生物資源ゲノム解析拠点事業」では、ソテツ細胞組織の遺伝子発現プロファイルの比較解析を通じて珊瑚根に特異的な発現を示す遺伝子群の解明を目指す。また、珊瑚根内に共生する臨藻の遺伝子発現プロファイルの比較から、「ソテツ珊瑚根-登楽固定鑑漢」の共生関係の長期安定維持を可能にする生理適応などの機構解明や関連する遺伝子群の同定を進めていと、村上明男（神戸大学内海域環境教育研究センター）兼崎　友（静岡大学グリーン科学技術研究所）内田博子（神戸大学内海域環境教育研究センター）共同研究先：渡辺 智(生命科学部)田中啓介（生物資源ゲノム解析センター）
ストック(Matthiola incana)は、冬から初春を彩る主要な花卉園芸植物の一つである。ストックの花色は、紫、赤、ピンク、黄色、白など多様であり、当研究室では花色に関わるアントシアニン生合成の制御機構について研究している(Nuraini et al., Planta 251: 61. 2020)。花色以外の花形質として、花型も重要である。ストックの花型には一重咲きと八重咲きの2種類が存在するが、花にボリュームがあり豪華な八重咲きのみが市場で流通している。八重咲きは、雄しべと雌しべが花弁化しており、ABCモデルのCクラスMADS-box遭伝子AGAMOUS (MiAG) の変異により引き起こされていることを明らかにした(Nakatsuka and Koishi, Plant Sci 268: 39-46. 2018)。八重咲きは両性不稔のため種子を獲得することはできず、MiAG/miagヘテロの一重咲きから採取した種子を繁殖に利用している。通常、MiAG/miagヘテロー重咲きの自殖後代においてmiagホモ八重咲きの出現は25%であるが、ストックには50%以上の高効率で八重咲きが獲得できるエバースポーティング系統が存在する(図1)。また、残りの50%の一重咲き個体は、ヘテロ一重咲き個体となり、その自殖後代も一重咲き：八重咲き個体が1 : 1の割合で出現する。このことが[エバースポーティング」の名前の由来となっている。このエバースポーティング系統では、一重咲き遭伝子MiAGと花粉致死遭伝子が連鎖していると考えられている。エバースポーティング系統では、実生の子葉の形態が一重咲き個体と八重咲き個体間でのわずかなに違うことを利用した八重鑑別をすることで、八重咲き個体だけを栽培することが可能となっている。本研究の目的は、ストックの種苗生産にとって重要なエバースポーティングの分子機構を明らかにすることである。本共同研究において、ストック通常系統とエバースポーティング系統の花芽のRNA-seq解析を行うことで、両系統間で発現差異がある遺伝子を抽出する。さらに、エパースポーティング系統の花粉発芽率が通常系統の50%程度しかないことから(図2) 、花粉発芽に影響する遺伝子に焦点を当てる。その後MiAG遺伝子と連鎖関係を手がかりに、原因遺伝子の同定を目指す。本研究を通して、生殖器官が不完全で栄養繁殖でしか増殖ができない園芸植物において、種子紫殖による増殖が可能になる技術の開発が期待される。また、エパースポーティングでは、一重咲き遺伝子は連鎖する花粉致死により雄性伝狼ができない。このことは花粉による遺伝子拡散を抑制する分子機構として利用でき、遺伝子封じ込めなどに応用することが期待できる。中塚賞司（静岡大学学術院農学領域)共同研究先：田崎啓介（農学部)儀簿章久（生物資源ゲノム解析センター）
基本転写因子TFIIDは、TATAボックス箱合タンパク質(TBP) と14種類のTBP随伴因子(Taf1-14) から構成される巨大なタンパク質複合体であり、①コアプロモーター結合能(正しい位置から転写を開始させる能力)及び②転写活性化能（転写調節因子に応答して転写量を調節する能力）を有する。真核細胞においてこれらの両機能を合わせ持つ転写因子はTFIIDのみであることから、その作用機序の解明は極めて重要と考えられる。我々はこれまで主に出芽酵母を用いてTafの生体内機能について解析を進め、Taf1のN末端に存在するTBP機能阻害領域(TAND; Taf1 N-terminal domain)の発見や新規コアブロモーター配列の同定等、様々な知見を報告してきたが、TFIIDの分子機能については未だ不明な点が多い。 TFIID類縁複合体であるSAGA (5種類のTafをTFIIDと共有し、計19種類のサブユニットから成る）はTFIIDと重彼した機能を持つとされているが（ただし自身はコアプロモーターに結合せず、サブユニットの一つであるSpt3を介してTBPの活性制御を行う)、両者の機能分担についてはまだよく分かっていない。従来は、TFIIDが主にTATA-lessプロモーター (全ゲノム中約90%の遺伝子が該当し、転写変動量が小さいハウスキービング型遺伝子のプロモーターが数多く含まれる）を、SAGAは主にTATAボックス含有プロモーター（その他約10%の遺伝子が該当し、転写変動量が大きい遺伝子のプロモーターが数多く含まれる）を転写するとされてきたが（図1) 、新生RNAの定量技術の進展に伴い、最近ではむしろ両者がほぼ全てのプロモーターの転写に関与するというモデルが主流になりつつある。しかしながら、TFIID, SAGAの転写への寄与はプロモーターごとに異なることから、個々のプロモーター上において、これらの転写因子が具体的に何をするのか、両者の役割の違いは何かを解明することが喫緊の課題となっていろ。最近我々は、PGK1プロモーター（解糖系酵素の一つ）のTFIID非依存的な転写を、塩基配列を改変することなく、エビジェネティックにTFIID依存的な転写へとリプログラミングすることに成功した(図2)。具体的には、TFIID変異(温度感受性taf1-N568 △変異）とSAGA変異(spt3 △変異）を一時的に共存させ、その後SAGA変異を除去することにより、 PGK1転写をTFIID非依存性モードからTFIID依存性モードへと変換できることを見出した。またその後の予備実験により、 ① TFIID依存性はTFIID非依存性に対して遺伝学的に優性であること、② TFIID依存性はメンデル遺伝しないこと（ただし通常の体細胞分裂では安定に維持される)、③シャペロン欠失変異の存在下ではTFIID依存性を付与できないこと等が明らかとなった。以上の結果は、シャペロン依存的に生成される未知の相転移産物が、PGK1転写に対してTFIID依存性を後天的に付与した可能性を示している。従来TFIID依存性の有無はプロモーター配列により決定されると考えられてきたことから、同一構造のプロモーターに対してエピジェネティックにTFIID依存性を付与できる可能性が示されたことは大変興味浅い。本研究では、ゲノムワイドなRNA-seq解析を行い、転写モードの切り換えが生じた遺伝子群（プロモーター）の網羅的な同定を試みる予定である。また同定されたプロモーター間の共通性や特徴を詳しく調べることにより、後天的なTFIID依存性付与の分子機構を明らかにしていきたいと考えている。 indecible gene (TATA-conta図１　TBPのコアプロモーター結合過程を制御する二種類の転写因子複合体（TFIID & SAGA）古久保哲朗（横浜市立大学大学院生命医科学研究科）共同研究先：笠原浩司 （生命科学部）志波優(生命科学部)松谷峰之介（生物資源ゲノム解析センター）
哺乳動物の受精後数日の初期胚発生期にはDNAのメチル化やヒストン修飾などのエピジェネティック修飾の変化によるエビゲノムの再構築が行われます。このエビジェネティック修飾のダイナミックな変化ゆえに、栄養などの初期胚を取り巻く環境要因がエピゲノム構築に少なからず影響を及ぼし、初期胚の短期的な発生のみならず、場合によって胎子発育や出生後の個体の成長・健康・疾病にも長期に渡って影響を及ぼすことが考えられます。重要な栄養素の一つに必須アミノ酸のメチオニンがありますが、メチオニンはDNAやヒストンのメチル化修飾に必要なメチル基供与体、S-アデノシルメチオニン(SAM) の前駆物質であり、エピジェネティクスを介して初期胚発生に寄与することが考えられ、実際に私たちは、メチオニンからSAMへの変換を司る酵素(MAT2A)が、ウシ初期胚の正常な発生に必須であることを報告しました。引き続き私たちは、栄養環境がウシ初期胚のエピゲノム構築に及ぼす影響を調べる一環として、MAT2Aの阻害がヒストンのメチル化修飾に及ぼす影響を研究しています。これまでにウシ初期胚における低分子阻害剤によるMAT2Aの阻害が、代表的なヒストンメチル化修飾であるヒストンH3の4番目のリジンのトリメチル化(H3K4me3)、同様の略記になりますがH3K9me3、H3K27me3のいずれのメチル化をも低下させること、特にH3K27me3への影響が大きいことをウェスタンプロッティングレベルで見出していました。本共同研究では、MAT2Aの制御を受ける修飾の種類およびゲノム領域を詳細に明らかにすることを目的としています。休外受籍で作出した8細胞期以上のウシ胚に対して、低分子阻害剤によるMAT2Aの阻害を行い、発生率に影響が出る前の桑美胚期の初期胚に対して、H3K4me3およぴH3K27me3抗体を用いたクロマチン免疫沈降シーケンス(ChIP-seq)解析を行いました。ウシリファレンスゲノムにマッピングすると、既存の桑実胚の遺伝子発現量データとの相関(H3K4me3が上方創御性、H3K27me3が下方削御性）を持つゲノムワイドなプロファイルを得ることができました（図1)。得られたマッピングファイルを用いてピークコールを行ったところ、対照区と阻害区ともに9,900 ～ 16,000のH3K4me3およびH3K27me3のピークを得ました。遭伝子の転写開始点付近でのメチル化の低下の程度はやはりH3K27me3において顕著であり(図2)、MAT2A阻害によって消失したH3K27me3ピーク近傍の遭伝子についてオントロジー解析を行うと、神経や血管、骨格の発達に関わるタームが上位に濃縮されました。これらの結果からMAT2Aはウシ初期胚の正常なエピゲノム形成に必須であり、ゲノムワイドなヒストンメチル化修飾にも寄与することが示唆されました。特にH3K27me3を介して、時宜を得ていない組織分化に関連する遺伝子などの発現を抑制して正常な初期胚発生を制御するとともに、生涯にわたる傾体の形質にも影響を与えるようなエピジェネティック修飾の形成にも関与していることが考えられます。現在解析の例数を重ねることによって解析結果の信頼度を高めるべく研究を継続しています。図1　対照区の桑実胚におけるH3K4me3およびH3K27me3のTSS付近の平均プロファイル既存のウシ桑実胚の遺伝子発現データ（GSM4275384）をもとに遺伝子の発現量毎に3群に分け、それぞれのヒストンメチル化修飾の平均プロファイルを描画した。H3K4me3は発現量の高い遺伝子群ほど、H3K27me3は発現量の低い遺伝子群ほどそれぞれ修飾レベルが高いことがわかる。図2   MAT2A阻害によるH3K27me3修飾の変化(A)対照区とMAT2A阻害区のTSS付近のH3K27me3の平均ブロファイル。Spike-in chromatinによる補正を行いRRPMとして示した。（B）ホメオボックス遺伝子HOXD12付近のH3K27me3のランドスケーブ。ChIP前のInputサンプルに比べChIPによって特異的なH3K27me3のピークが検出された。(A)、(B)いずれにおいてもMAT2A阻害による著しい修飾の低下が起きていることがわかる。池田俊太郎（京都大学大学院農学研究科） (京都大学院農学研究科)太田愛里共同研究先：岩田尚孝（農学部）儀澤章久（生物資源ゲノム解析センター）
インフラマソームは内因性や環境由来の危険因子を感知して形成される細胞質のタンパク分子複合体であり、炎症性サイトカインであるインターロイキン(IL)-1 βやIL-18の分泌と炎症性細胞死(pyroptosis) を誘導する(KV Swanson et al. Nat Rev Immunol 2019)。食生活の乱れや抗生剤摂取による腸内細菌の多様性低下(dysbiosis)は、腸管におけるインフラマソーム活性化と炎症誘導・促進に関与する(N Zmora et al. Mucosal Immunol 2017)。食品添加物である硫酸アルミニウムカリウム(ミョウパン)・硫酸アルミニウムアンモニウム(アンモニウムミョウバン) は現在、膨張剤、煮崩れ防止剤、変色防止剤、かんすいとして、パン・ケーキ・甘露煮・漬け物・中華麺などに汎用されている。驚くべきことにミョウバン・アンモニウムミョウバンは、免疫賦活剤である水酸化アルミニウムと同様に強い免疫賦活作用を有する(Marrack P et al. Nat Rev Immunol 2009, Cruse JM et al. Atlas of Immunology, CRC Press 2010)。我々は最近、ミョウバンをマウスに経口投与すると、腸管上皮の細胞死が著しく誘導されること(図1)、腸管における好酸球浸潤や抗体産生が亢進して食物アレルギーモデルとなることを見いだした。さらに抗生剤(アンピシリン、ネオマイシン、バンコマイシン、メトロニダプール）を予め経口的に与えておくと、ミョウバンによる小腸上皮細胞死はさらに促進した(図2)。アルミニウム粒を添加したマウスマクロファージの炎症性細胞死誘導には細胞内センサー NLRP3が関与するが(SC Elsenbarth et al. Nature 2008)、マウス小腸上皮細胞にはNlrp3発現はみられず、ミョウパンによる腸上皮細胞死に関与する細胞内分子や細胞死の様式は不明である。一方、抗生剤処置したマウス大腸では、TNF-αを含む様々な炎症性サイトカイン遺伝子発現が増加する(L Sun et al. Front Cell Infect Microbiol 2019)。TNF-αは炎症性腸疾患患者の腸管でも増加し(MF Neurath, Nat Rev Immunol 2014)、核内因子κ B (NF- κ B)を活性化してNlrp3やIl18の発現を誘導してインフラマソーム活性化に関わる(MD McGeough et al. J Clin Invest 2017)。しかし抗生剤処置により増加したTNF-αがミョウバンによる腸管上皮細胞死をどのように促進するか分かっていない。今回の共同研究課題では、抗生剤およびミョウバンを経口投与したマウスから分離した腸上皮細胞におけるRNA-seqを行い、発現変動遺伝子を網羅的に解析する。特に、インフラマソーム活性化に関与する遺伝子を中心にトランスクリプトーム解析を行い、腸上皮細胞の炎症性細胞死に特徴的な転写産物をプロファイリングする。食品添加物や抗生剤により発現が変動する遺伝子の解析と腸上皮炎症性細胞死の解明は、食物アレルギーや炎症性腸疾患の予防への発展の礎となり大変意義があると考える。謝辞東京農業大学生物資源ゲノム解析センターの先生方との共同研究の機会をいただけましたこと、厚く感謝申し上げます。図2   抗生剤処置によるマウス小腸上皮細胞死の亢進若林あや子（日本医科大学医学部）森田林平 （日本医科大学大学院医学研究科)共同研究先：岩槻 健（応用生物科学部）田中啓介（生物資源ゲノム解析センター）
地球温暖化や津波などの自然環境変化は、沿岸生態系に影標を及ぼすと推察されている。しかし、海洋調査は長くても100年程度（多くは数十年）で、また自然災害は予測することが難しいため、環境が変化する以前の試料が乏しく、前後の比較をできない場合が多い。一方、DNA試料は数万年前の柱状泥から分析された報告もあり、試料の保存方法についても比較的容易である。そのため、あらかじめ保存することを前提として試料を採取したり、堆積年代が既知の海底柱状泥などを用いたりすれば遺伝子解析により過去の生物群集を把握することができる。 2011年の東日本大震災は東北沿岸に甚大な被害を及ぼした。宮城県沿岸の松島湾でもマガキなどの淺殖施設や船舶が流されるなどの被害があった。津波は海底泥を押し流し、霞災後、底質の有機物量等は減少し、環境が改善された。一方、震災からの復興にあたり、松島湾では2012年以降マガキ餐館は再開されたが、コケムシやヒドロ虫などがマガキに付着し、周囲に泥が継わり付くことで幾死を引き起こした。しかし、震災前の知見か乏しく、有機物量の減少などによる環境変化が松島湾の沿岸生態系に影響を及ぼしたのか、マガキの脱死を引き起こしたコケムシやヒドロ虫の発生が震災前には観察されなかったのかよくわかっていない。そこで本研究では、震災以前から採取し保存していた松島湾海水ろ過試料を用い、微生物を中心に出現状況が変化したのか把握することを目的としな霞災前の2004-2005年、霞災翌年の2012-2016年に松島湾表層水を経時的に採取し(農災後は18測点、基本的に隔月）ろ過後DNAを抽出し、Miseqにより18SrDNA配列を調べた。農災にかかわらず分類群としてSAR (理藻と渦鞭毛藻)が最も検出されており、全体の60％程度を占めていた(図1)。次いで、愛災前はOpisthokonta (外肛動物等含む後生動物)が、震災後はArchaeplastida (プラシノ藻) が多かった。ただし、検出された生物の分類群組成は経時的に大きく変化しており、検出割合の変化が準波による影響か季節変化か、環境因子を加えた解析を進めている。また、ユピヤワコケムシ(Alcyonidium gelatinosum) は愛災以前の2004年にも高頻度で検出されており(図2) 、コケムシやヒドロ虫は松島湾で震災以前から発生していた可能性が高いと考えた。松島湾海水から検出された18SrRNA遺伝子の分類群別割合図2  検出された外肛動物のヒートマップ奥村　裕（水産研究教育機構水産技術研究所）共同研究先：塩本明弘 （生物産業学部）松谷峰之介（生物資源ゲノム解析センター）
食品の評価に味覚は重要な要茶である。味覚シグナルの入り口である味覚受容体は舌の味蕾に含まれる味細胞に主に発現しているが、近年、消化管にも多くの味覚受容体が発現していることがわかってきた。特に、腸管上皮に発現している味覚受容体は、食事における栄養吸収の創御やエネルギー代謝、有害物質への免疫応答など、生命維持のために重要な感知システムを構成していると考えられる。例えば、うま味・甘味受容体のサブユニットであるT1R3は腸管上皮細胞の内分泌細胞に存在し、ホルモン分泌に働くことが知られている。また、苦味受容体T2Rsは消化管の免疫応答に働くTuft細胞、杯細胞やPaneth細胞、内分泌細胞にも存在していることが知られている。味覚受容体と共役するGタンパク質gustducinやPLC β 2、TRPM5がTuft細胞や内分泌細胞で発現していることから、味覚受容体は腸管上皮において、食品成分を含む物質を感知し、ホルモン分泌や免疫応答に関わっていると考えられてきた。これらの知見は主にノックアウトマウス等を用いて得られてきたものであるが、ヒトを含む霊長類では味覚受容体のレパートリーや機能、発現部位に違いがあることがわかっている。すなわち、マウスを用いた研究ではヒトの栄養学や腸内微生物学に直接寄与することは嫌しい。そこで我々は、数年前からヒトに近いアカゲザルおよびニホンザルの腸管オルガノイド樹立を試み、世界で初めて霊長類の腸管オルガノイドの作製に成功した。オルガノイドは、培養下で生体組織の幹細胞から生体組織・器官に類似した立体構造を創出したものであり、発生生物学や創薬研究に至るまで幅広く活用されている。作製したオルガノイドは、生体組織由来の細胞から、自己複製能力および分化能力を用いて、培養下で自己組織化により形成される。In vivoの組織をモデル化できるため、特にサルやヒト等の貴重な組織・器官を実験系として扱う際に有用である。今回の研究では、この勝答オルガノイドを用いた分化誘導による特定の細胞種の濃縮と、それをターゲットとしたRNA-seqによる細胞内発現分子の同定を試みた。大腸オルガノイドにDBZ (Dibenzazepine) を添加することによって内分泌細胞への分化を促進し、内分泌細胞特異的な遺伝子の同定を試みた。また、小腸オルガノイドにIL-13を添加してTuft細胞への分化を促進させることを試み、両因子を加えていないオルガノイドとの遺伝子発現プロファイルの比較を行った。まず、免疫染色の結果、DBZ添加群、IL-13添加群では、それぞれ内分泌細胞とTuft細胞が増加している事が確認できた(図1A、B)。分化に要する時間を最適化した結果、 72時間後のオルガノイドで最も添加群と非添加群の差が大きくなることがわかった。そこで、分化開始後72時間の時点でオルガノイドを回収し、QC後、RNA-seqを実施した(図1C)。その結果、DBZ群では内分泌細胞のマーカーと共にT1Rsの発現が上昇していた。一方、IL-13群ではTuft細胞のマーカーと共にいくつかのT2Rsの発現が上昇していた。今後はこれらの受容体の特性を解析すると共に、内分泌細胞やTuft細胞から出力される分子の解析も、オルガノイドを用いて実施できる可能性がある。今回の研究で腸管上皮細胞に発現している味覚受容体候補や、そのシグナル伝達に関わる可能性のある候補分子を同定したことにより、オルガノイドを用いた食品成分に対する応答機序の解明と食品工学への応用が期待される。今井啓雄（京都大学霊長類研究所）林　美紗（京都大学霊長類研究所）稲葉明彦（京都大学霊長類研究所）共同研究先：岩槻 健（応用生物科学部）田中啓介（生物資源ゲノム解析センター）
昆虫の斑紋は隠蔽色、警告色、擬態など、様々な側面から環境への適応に関与する。このような紋様の変異は他個体の視覚によって議別され淘汰を受けてきた結果として生じた遺伝形質である。それゆえ紋様形成メカニズムを明らかにすることは、昆虫の進化のプロセスを知る上で重要な手がかりとなる。中でもチョウ目昆虫は多様な体色や斑紋を発展させてきた生物種であり、有力な研究対象の一つと言える。我々はこれまで、チョウ目昆虫のモデル生物であるカイコ規の体色に関わる２つの突然変異、体色が黒化する「黒蛾(Black moth: Bm)」と翅の先端が黒化する「クワコツマグロ(Wild wing spot: Ws) |の単離・同定を進め、(1)両遺伝子がカイコの同じ染色体上の極めて近い位置にマップしていること、 (2)その領域が他のチョウ目昆虫で体色や斑紋形成に関与する遺伝子がマップするゲノム領域と対応していることを明らかにしてきた（図1)。「工業暗化」で広く知られるオオシモフリエダシャクのcarbonaria遺伝子座や、誌をもつ種同士が類似した体色を示す「ミュラー型擬態」で有名なドクチョウの斑紋形成遭伝子座（HmYb, HmH）との関係性が強く示唆されており、 BmやWsの原因遺伝子が特定できれば、これら生物学上重要な現象の解明につながると期待される。 2016年、carbonaria変異がcortex遺伝子における発現変動が原因である可能性が報告された。また同時期に、ドクチョウを含めたチョウやガの擬態や保護色にもcortex遺伝子座が関与することが示唆された。これらのcortex遺伝子のカイコ相同遺伝子であるBmcortexは、我々がすでに特定した黒娥Bmの候補領域内に存在していた。そのためBmcortexがBmの原因遭伝子である可能性が考えられた。そこで我々はゲノム編集によるBmcortexの機能解析を行った。すなわち、黒蛾の表現型を示すカイコBm系統に、CRISPR/Cas9システムを用いて、 Bmcortex内に変異を導入した。ところが変異をホモにもつ頻の体色に変化はなく、すべて黒色のままであった。このことから、カイコではBmcortexが成虫体色黒化の原因遺伝子ではない可能性が示唆された。カイコでのゲノム編集解析の結果を受けて、我々は「Bmcortexは体色黒化を説明する真の変異ではなく、別の遺伝子に重要な変異が存在する」という仮説を立てた。本申請では、次世代シーケンス法を活用した発現遭伝子の網羅的解析を通して、この仮説を検証することを目的とした。我々はすでにBmの候補領域をカイコ第17染色体の最上流の約2 Mb内に特定している（図1）。この領域には染色体の遊位が存在しているために組み換えが極めて起こりにくく、これ以上の候補領域の絞り込みは非常に難しい（図2)。そこで、我々はBAC-FISHにより逆位の境界部分を特定し、その近傍のゲノム情報や遺伝子情報を明らかにした（図2)。さらに、カイコ遺伝子データベース検索により、約2 Mbの候補領域内の遊伝子数が77個であることも明らかにしている。本申請において我々は、次世代シーケンサーを用いてBm矛統と標準系統間の想で発現している遺伝子を網羅的に収集し、多型および発現量の比較解析を行った。上記の77個の遺伝子を対象に両系統間で差のある遺伝子のスクリーニングを行ったところ、両系統間で差のあるいくつかの興味深い遺伝子が見つかってきた。今後は、これらについてゲノム編集技術を活用した候補遺伝子変異体の作製またはGAL4/UASシステムによる形質転換体の作出を行い、どの遺伝子がカイコ成虫体色黒化に関わるBmの原因遺伝子であるのかを特定していく予定である。伊藤克彦（東京農工大学大学院農学研究院）共同研究先：櫻井健志（農学部）田中啓介（生物資源ゲノム解析センター）
各産地の醸造用プドウの品種を語る際に「テロワール」という言葉が頻繁に用いられている。テロワールはフランス語であり、その定義は曖昧横糊としている。テロワールとは？という問いに答えるとすれば、「土地、気候、人」の外的要因を総合したブドウ栽培の環境を示す概念であろう。特に土壌において、テロワールが形成される理由を科学的に解明するため多くの研究者が、プドウ果実に与える影響を研究してきた。しかしながら、土壌１gあたり数百万種の細菌が存在し、個体としては数十億に達するほどの細菌が存在すると概算されている(Gans et al., 2005 Science)。また、土壌生息糸状菌においては約5%しか属種が明らかになっておらず、残りの95%は未同定のままである。このように、土壌微生物콩のメタゲノム解析を行うのは困難であり、現在の技術では土壌の性質からテロワールを解桁するめどはたっていない。そこで、土壌微生物識よりもプドウ樹との特殊性・親和性が高く、メタゲノム解析により比較的全体像を把握しやすい[プドウ樹内の微生物콩(樹内マイクロフローラ)」に着目した。人体では腸内細菌澱が人の体調に影響を及ぼすとの数多くの報告が存在する。植物でも同様に植物細胞の代謝を変化させるものが発見されており(Huang et al., 2018 PLoS ONE) 、植物と内在性共生菌との相互依存によって宿主植物の特性が変化する可能性が示唆されている。これらの点から、従来提唱されている３種類の外的要因に加えて、内的要因である樹内マイクロフローラがテロワールの形成に重要な指標ではないかとの着想に至った。樹内マイクロフローラがテロワールに関与していることを証明するために当センターでは、「ブドウ品種により樹内マイクロフローラが異なるか?」という仮説のもと、当該センターが有する品種保存圖場から醸造用プドウ4品種の樹内マイクロフローラのメタゲノム解析を行った。供試品種はシャルドネ、甲州、ピノ・ノワール、カベルネ・ソーヴィニョンの白ワイン用品種2種、赤ワイン用品種2種の計4種で、1、5、8、9月にそれぞれのサンプルを採集し、これらの結果を以下の図1および図2にまとめた。それぞれ冈１は細菌、図２は真菌の門別リード数を集計しており、1サンプルの全リード数を100%としたとき、それぞれの割合を表している。細菌では白ワイン用品種である甲州およびシャルドネの1、5月において、Cyanobacteriaが大きな割合を占めており、他2島種ではほとんど見られなかった。また、気温が上がる5月になるとCyanobacteriaの割合が大きく増加し、8、9月になると全く確認できなくなるなど、菌澱の季節変動が頭者にみられた。一方、赤ワイン用品種であるピノ・ノワール、カベルネ・ソーヴィニョンでもFirmicutesの季節変動が顕著に起こっており、単年度の結果であるものの各品種別に樹内マイクロフローラの季節変動を確認できた(図1)。真菌では、全ての品種において気温の上昇に伴いBasidiomycotaの割合が増加しており、甲州では１月に１０％ほどであったのが5月で30%以上、8、9月では50%に急増している。これに加え、9月の甲州では判別できない真菌が4割近くを占めており、日本固有の醸造品種として他の品種とは異なる樹内マイクロフローラを持つことが示唆された(図2)。ここまでの既存研究で、「ブドウ品種により樹内マイクロフローラが異なる」という結果が得られた。本採択課題では、同一圃場にて20年度の調査を行っており、「一度獲得した樹内マイクロフローラは年次により変動するか？」を検証している。これにより、樹内マイクロフローラがテロワールを説明する新しい指標として認識されることを目指す。図1　ブドウ品種および季節別のバクテリア樹内マイクロフローラ比較KO：甲州、CH：シャルドネ、PN：ピノ・ノワール、 CS：カベルネ・ソーヴィニヨン19Jan：2019年1月、19May：2019年5月、 19Aug : 2019年８月、19Sep : 2019年９月図2   ブドウ品種および季節別の真菌樹内マイクロフローラ比較KO :甲州、CH :シャルドネ、PN :ピノ・ノワール、 CS：カベルネ・ソーヴィニヨン19Jan：2019年1月、19May：2019年5月、 19Aug：2019年8月、19Sep：2019年9月模　真一（山梨大学ワイン科学研究センター）共同研究先：山本総輔（生命科学部）田中啓介（生物資源ゲノム解析センター）
超高齢社会を迎えた現在、日本人の2人に1人はガンを経験し、3人に1人はガンによって死亡している。ガンは初期に発見されれば治療できるが、進行した場合には効果的な治療法のない場合も少なくない。近年、新しいタイプの画期的な治療法としてガン免疫療法が注目されている。加えて、ガンの治療に関して新たな視点をもった抜本的研究も必要であり、食品成分による予防の観点から研究を行っている。近年、抗ガン剤の創薬ターゲットとしてmRNAのスプライシング過程が注目されている。実際に、スプライシング阻害剤であるH3B-8800はガン細胞の増殖を強く抑制することがわかり、骨髄異形成症候群や急性骨髄性白血病、慢性骨髄単球性自血病患者に対して臨床試験が進められている。そこで、 mRNAの成熟過程を標的とした探索系を構築し、食品成分よりmRNAのスプライシング過程を調節する化合物の探索を行っだその結果、食品成分において、大豆中にmRNAスプライシング阻害活性を見出したことに加え、その後活性本体がフラボノイドにあることや、特定の構造を持つ活性フラボノイドに特に強いmRNAスプライシング阻害活性を見出した1)。また正常細胞よりもガン細胞に対して増殖を阻害することを観察した。これらのことから、食品中には様々なmRNAスプライシング阻害成分を含むことを明らかにした。さらに別の食品成分からの探索により、活性化合物を新規同定した。コーヒーからカフェ酸関連化合物、生姜からショウガオールなどである。これら一連の発見は、「食品成分がスプライシング阻害を通してガンに対する有効性を示す」可能性を持つ。そこで見出した活性化合物の作用機構の解明と新たな活性化合物を迅速に探索する系の開発を計画した。特に探索において、これらの化合物の単離精製に多くの時間がかかっており、新たな化合物探索の課題として迅速化が必要であった。そこで単離した化合物の構造を観察すると、これらの化合物の構造に一定の共通点を見出した(図1)。このことから共通の構造を持つ類似化合物はmRNAスプライシング阻害活性を持つことが期待された。新たに見出したmRNAスプライシング阻害活性を持つ食品化合物の作用機構を明らかにする。加えて、mRNAスプライシング阻害活性を示す食品由来の化合物は一定の共通構造を持つと予想されたことから、これらの化合物によるmRNAスプライシング阻害には共通性があるかについてトランスクリプトーム解析を行うことを計画した。現在、結果について解析中である。 1) Kurata M, Fujiwara N, Fujita KI, Yamanaka Y, Seno S, Kobayashi H, Miyamae Y, Takahashi N, Shibuya Y and Masuda S. (2019) Food-Derived Compounds Apigenin and Luteolin Modulate mRNA Splicing of Introns with Weak Splice Sites. iScience, 22, 336-352 • mRNAスプライシング阻害に必要な基本構造は？ •阻害するmRNAは同じか？図1   mRNAスプライシング阻害化合物の構造類似性増田誠司（京都大学大学院生命科学研究科)共同研究先：高橋信之（応用生物科学部）循澤章久（生物資源ゲノム解析センター）
地球上で重力は最も安定した環境要因の１つであり、陸上植物の形態形成は、一定の重力環境を前提として形態形成が行われています。しかし重力環境が変化するとともにこの関係は変化します。たとえば被子植物では、重力の向きや大きさの変化に応じた重力屈性(重力の方向に応じて屈曲する現象)や抗軍力反応(軍力の大きさに応じて体を支え形づくる現象）が知られています。重力屈性はオーキシンの偏差分布を制御するしくみが重要でありその分子機構が近年明らかになってきました。一方、抗重力反応のしくみは細胞骨格や細胞壁合成が重要であることがわかってきましたが、情報は限られておりまだ全体像もよくわかっていません。また被子植物以外の陸上植物における重力屈性や抗重力反応のしくみはまだよくわかっていません。例えば、コケ植物は最初に上陸した陸上植物だと考えられていますが、コケ植物が水中から陸上への重力変化にどのように適応してきたのか、また重力変化にどのように応答するのかについてはあまり研究できていないのが現状です。植物が進化の過程でどのように重力に対する応答性を獲得し、それが成長や形態形成に関わっているのかを明らかにすることは重要であり、そのしくみがどの程度植物間で共通しているのかを理解することも植物の重力応答の普逼性や多様性を理解する上で大切です。そこで私たちは、光を照射し植物を長期間培養できる過重力植物栽培装置を開発し、地上で１ｇよりも大きな重力(過重力）が植物の成長や形態に与える影響を調べることにしました。そのためにモデルコケ植物であるヒメツリガネゴケに注目しました。ヒメツリガネゴケを追重力植物栽培装置により2 ～ 10 gの過重力環境下で1ヶ月間栽培したところ、予想外にも過重力によりヒメツリガネゴケの成長速度が上がり成長量(バイオマス)が増えることを見出しました(Takemura et al. 2017, Journal of Plant Research)。また過重力によりヒメツリガネゴケの形態や器官数が変化し(図)、光合成活性も増加することなどがわかりました。一方、過重力で見出したこのような変化は、1 gを境としてそれより小さな重力下では、どのようになるのでしょうか。私たちはヒメツリガネゴケの背丈が1 cm程度と小さいことから、ヒメツリガネゴケが国際宇宙ステーション(ISS) における小さな植物栽培容器での長期培養実験に適していることに気づきました。そこでヒメツリガネゴケを用いたISS「きぼう」実験棟での宇宙栽培実験を宇宙航空研究開発機構(JAXA)に提案し、これまで2度にわたり長期(1ヶ月)栽培実験を実施しました(図)。こうして微小重力環境（μg）下で培養したサンプルを地上に回収し、これらのサンプルについて成長、形態、光合成、過伝子発現等の解析を開始しています。本研究では、様々な重力の大きさ( μg、1g、2g、10g)で育てたヒメツリガネゴケの地上部(茎葉体)と地下部(仮根)のそれぞれについて発現遺伝子の比較解析を行います。本研究を通じて重力に依存した植物の成長制御の鍵となる未知の遺伝子削御メカニズムを明らかにし、植物の抗重力反応の全体像の理解に迫りたいと考えています。本研究により得られる科学的知見は、今後、月や火星など宇宙空間における植物の新しい成長制御技術にもつながるものと期待しています。藤田知道、久米篤、蒲池浩之、小野田雄介、半場祐子、日渡祐二、唐原一郎；１ｇとは異なる重力環境で植物はどのように育つのだろうか一コケ植物を用いた宇宙実験（スペース・モス）から期待できること一、植物科学最前線(BSJ-Review)、 11:60-74 (2020). DOI: 10.24480/bsj-review.11a6.00178藤田知道（北海道大学大学院理学研究院）共同研究先：坂田洋一（生命科学部）循澤章久（生物資源ゲノム解析センター）
地球温暖化の進行や近い将来の原油の枯渇に備え、微細藻類は次世代のバイオ燃料を初めとする化成品原料の資源として重要である。一方、既存の野生種では環境適応能や生産性に限界があり、変異株や形質転換体の利用による藻類バイオテクノロジーがプレークスルーをもたらす可能性がある。我々は、これまでに漁業資源として広く利用されているツノケイソウ（Chaetoceros gracilis）に着目し、ドラフトゲノム解析、形質転換・ゲノム編集技術、屋外大量培養設備の開発などを行ってきた。これまでに、物質生産のプラットフォームとして、ツノケイソウが速い増殖と高い油脂生産能力を有する優れた実用種であることを認めた(Tokushima et al., Biotechnol. Biofuel 9: 235, 2016)。さらに、簡便かつ高効率な形質転換技術の開発に成功し(Ifuku et al., Photosynth. Res. 123: 203-211, 2015)、珪藻が本来、生合成することができない、プラスチック原料や鎮静剤としての用途がある有用物質・リシノール酸を苦積する形質転換ツノケイソソウの作出にも成功した(Kajikawa et al., Sci. Rep. 6: 36809, 2016)。最近ではゲノム情報を利用してツノケイソウの光化学系の構造解析にも成功し、その光エネルギー変換効率の最適化を目指している（図1)。一方、組換え珪藻を大量培養して利用するには、漏出のリスクに備えるため、何らかの生物学的封じ込めの方策が必要となる。近年、広島大学の原田隆一博士らが、自然界にはほとんど存在しない「亜リン酸」を利用した新規培養系を原核徵生物において確立した。一般的な生物は垂リン酸を利用できないため、亜リン酸存在下では開放増強下における雑菌汚染を回避できるだけでなく、実験室外への遺伝子組換え生物の流出を抑えることができる。すでに亜リン酸を唯一のリン源として資化する大腸菌が作出され、本培養技術の有用性が示された(Hirota et al., Sci. Rep. 7: 44748, 2017)。この技術はシアノパクテリアにも適用され、亜リン酸依存的に増殖予※Synechococcus elongatus PCC 7942が構築された(Motomura et al., ACS Syn. Biol. 7: 2189-2198, 2018)。しかしながら、このシステムを真核生物の微細藻類の生物学的封じ込めに応用した例はない。そこで本研究は、我々が使用しているツノケイソウに、廣田博士らが開発した亜リン酸培養系を応用することを目的する。上記の目的を達成するために、廣田博士との共同研究を開始し、同時に東京農業大学の渡辺智博士とも、次世代シークエンスに関する本共同研究をお願いした。これまでに亜リン酸デヒドロゲナーゼ(ptxD) 遺伝子をツノケイソウに導入し、野生型が利用できない亜リン酸を唯一のリン源とする培地で、形質転換ツノケイソウが増殖できることを認めた（未発表)。しなしながら、生物学的封じ込めのためには亜リン酸資化ツノケイソウのリン酸利用能を破壊する必要がある。そこで本研究では、リン酸飢餓時の遺伝子発現変動データと比較することで、ツノケイソウのリン酸輸送体遺伝子を同定し、それらをゲノム編集で遺伝子破壊することで、亜リン酸存在下でのみ増殖できる形質転換ツノケイソウを作出することを目指している。伊福健太郎（京都大学大学院生命科学研究科)共同研究先：渡辺 智    (生命科学部)松谷峰之介（生物資源ゲノム解析センター）
近年の地球温暖化や化石燃料の枯渇懸念から微細藻類を用いたバイオ燃料生産が注目を集めている。微細藻類は光合成によって二酸化炭素を固定し、細胞内にバイオ燃料の原料となるトリアシルグリセロール等の油脂（オイル）を蓄積する。微細藻類でオイルを生産する際、培地中の窒素源が重要な要素となる。つまり、微細藻類は細胞増殖と共に窒素を消費し、培地中の窒素源が欠乏すると細胞内のオイル蓄積量を増大する。しかしながら、微細藻類の窒素欠乏に応答した炭素分配メカニズムは不明な点が多い。容素欠乏は細胞内にオイルを蓄積させるための有効な培養方法であるが、細胞増殖が著しく抑制されるため、オイルの生産性が頭打ちになる。加えて、栄養肌鏡ストレスにより細胞の状態が悪化するため、特に開放系での培養において雑菌混入のリスクが上昇する。このため、“窒素源存在下”で増殖しながらオイルを高蓄積する微細藻類脊種開発が有効であると考えられる。登茶存在下で増殖と連動してオイル生産を行う事で単位時間あたりのオイル生産性の向上・培養プロセスの簡略化によりパイオ燃料生産コストの大幅な削減が期待できる。そこで申請者らは空薬源存在下でオイルを高蓄積可能な微細藻類変異株の創出と、窒素源存在下でのオイル増産機構の解明を目的としている。これまで、海洋性オイル生産藻類Chlamydomonas sp. KORI株に対して、重イオンピーム( 12 C 5 ) を照射し、多様な形質を有する変異細胞集団を作製した。 変異細胞集団の中から蛍光活性セルソーターを用いて窒素源存在下においてもオイルを高答積する細胞を選抜した。その結果、KOR1株と比較して約2.0倍オイルを高蓋積するKAC1801株の獲得に成功した。窒素存在下でのKAC1801株のオイル生産性は、これまで知られている微細藻類のオイル生産性と比較して極めて高い。現在の取り組みとして、KAC1801株のオイル増産機構を解明するために、トランスクリプトーム解析・メタポローム解析によるマルチオミクス解析を行っている。本研究課題のトランスクリプトーム解析の実施概要として、①窒素源存在下でのKOR1株およびKAC株(KAC1801株を含む) の遺伝子発現プロファイルの比較、②窒素源存在下および窒素欠乏条件下でのKOR1株の遺伝子発現プロファイルの比較を行う。 RNA-seq比較解析で、①及び②で共通して変動する遺伝子を解析し、窒素存在下でオイル搭積に寄与する候補遺伝子を同定する（図1）。 KAC1801株の特異な増殖連動型オイル高酱積のメカニズム解明が、光合成で固定した炭茶の分配機構(細胞増殖と貯蔵)の全体像の解明に資するものと考えている。また、オイル蓄積に関わる原因遺伝子を特定することで、窒素存在下でオイル生産性の向上のための育種戦略構築が可能となり、社会実装に向けた微細藻類によるバイオ燃料生産系が前進する。本研究課題は、学術・産業応用双方に価値があるため、共同研究を進めている。图1共同研究概要秀瀬涼太（神戸大学院科学技術イノペーション研究科）小山智己（神戸大学大学院科学技術イノベーション研究科）加藤悠一（神戸大学大学院科学技術イノベーション研究科）建沼誠久（神戸大学大学院科学技術イノペーション研究科）共同研究先：渡辺 智    (生命科学部)松谷峰之介（生物資源ゲノム解析センター）
レタス根腐病は、フザリウム（糸状菌）が引き起こす土壌病吉であり、露地栽培およびハウス栽培において大規模な発生が世界中で確認されている。土壌狩害は土壌消毒以外に対応策がなく抵抗性品種の導入が望まれるが、既存の抵抗性遺伝子の多くが新しい菌系統（以下レースと呼ぶ）の出現により打破されてしまうリスクにさらされている。生産現場では根腐病を引き起こす3つのレースの存在が確認されている。そのため、複数のレースに対し複合的に抵抗性を示す品種が求められているが、まだそうした品種は脊成されてない。日本で主な被害をもたらしているのはレース１と２である。これまでに申請者らは、レース１と２に抵抗性を示すレタス遺伝資源の探索を行い、耐病性系統「VI185」を見出し、QTL解析から抵抗性に関わる遭伝子座の同定に成功した。本研究では、そのうちレース2抵抗性に対する真性抵抗性機構を解明するため、トランスクリブトーム解析による抵抗性遭伝子本体の同定を目指している。解析の結果、これまでに我々が同定した2つの遺伝子座のうち、一方の遭伝子座では、複数の抵抗性系統において特異的に発現する遺伝子を同定した。より詳細な解析を行ったところ、同定された遺伝子は、罹病性系統において推定の遺伝子領域内にトランスポゾンが挿入されていることで遺伝子発現が消失していることがわかった。もう一方の遺伝子座では、抵抗性系統特異的な多型の見られる2遺伝子を跨ぐ領域が見出された。領域内の2遺伝子に発現差異はなく、アミノ酸置換を俳う機能的変異が疑われた。解析から見出されたこれらの遭伝子は、今後より詳細な機能解析を行うに値する候補遺伝子であると考えている。今回の解析では、フザリウム菌を感染させた植物体からRNAを抽出しており、今後はフザリウム側のトランスクリプトームについても解析を行い、植物体・病原体双方から感染および抵抗性機構の正体に迫りたいと考えている。宇野雄一（神戸大学大学院農学研究科)関 功介（長野県野菜花き試験場）共同研究先：小松憲治（農学部）田中啓介（生物資源ゲノム解析センター）
地球資源の枯渇や温暖化問題などに対する懸念から、微細藻類を活用した再生可能なバイオマス資源の生産が注目されている。微細藻類は光合成により二酸化炭素を直接有用物質に変換することが可能であり、特に有用物質生産能の優れた種の活用が期待されている。有用藻類のポテンシャルの高さに加え、近年急速に発展している遺伝子工学技術を駆使した生産性の更なる強化や新たな代謝系の導入などの分子育種法の開発が微細藻類の産業的利用を後押ししている。一方で、遺伝子組換え生物が外環境へ拡散した際の影響については未知な点が多く、その実用化には安全性の評価や拡散防止策の運用など十分な配慮が求められる。遺伝子組換え生物の環境中への拡散防止措置として、あらかじめ当該組換え体に対して、ある限られた条件でしか生存することができない性質を与えるという「生物学的封じ込め技術」が開発されている。例えば、組換え体の生育を自然界には存在しない(または稀少な)化合物に依存させる手法や、特定の場所以外でのみ致死遺伝子が誘導される仕組みを施す手法があげられる。これらの技術により、組換え生物の生育可能な場所を制限し、「封じ込める」ことが可能になりつつあるが、従来法には稀少化合物のコストの問題や、封じ込めのための遺伝的な改変がきわめて煩雑なために手法としての汎用性が低いなどといった克服すべき点が残されている。我々はこれまでに、還元型リン化合物の一種である亜リン酸(H 3 PO 3 )を利用した新しい生物学的封じ込め技術を開発してきた。リンは核酸や生体膜などの構成要素であるが、多くの生物は酸化数が5価のリン酸(H 3 PO 4 )の状態のリンしか利用できず、還元型リンを代謝する能力を持たない。一方でこれまでに還元型リンをリン酸へと変換し、資化する特殊な微生物が見つかっており、そのゲノムから亜リン酸酸化酵素(PtxD) の遺伝子が見出された。また我々はその微生物からリン酸を取り込まないが亜リン酸を取り込む性質を持つ輸送体(HtxBCDE)を発見した。これらの湿元型リンの代謝に関わる遺伝子を活用し、さらに内在性リン酸輸送体遺伝子を破壊させることにより、リン酸を利用できず亜リン酸のみをリン源として生育するシアノバクテリア株(Synechococcus elongatus PCC 7942) の作出に成功した(Motomura et al. 2018, ACS Synth. Biol.)。通常の環境下に亜リン酸はほとんど存在しないことから、このようなリン代謝系の改変は栄養要求性の付与に相当する生物学的對じ込め手法として機能し、実際高い封じ込め効果を示すことが分かった。また亜リン酸は低コストであるため、その利用は大量培養における障壁にはならない。一方で亜リン酸依存性株ではリン酸条件下の野生株と比べて増殖がやや淫延する傾向が観察されており、亜リン酸依存性の付与に伴って何らかの増殖劇限要因が課せられている可能性が考えられた。本研究では、亜リン酸を活用したシアノバクテリアの培養に伴う細胞への生理学的影響について明らかにすることを目的とし、亜リン酸資化条件における遺伝子発現プロファイルの変動を網羅的に解析している。これまでの予備的な解析により、亜リン酸資化条件ではリン欠乏シグナルが部分的に活性化していることが示唆されており、今後比較対照としてリン飢餓時の遵伝子発現変動データも併せて取得する予定である。これにより、本封じ込め株の持つ特性や有用物質生産に向けた効率的な代謝系の改変策について有用な手掛かりが得られることが期待される。廣田隆一（広島大学院統合生命科学研究科）共同研究先：渡辺 智     (生命科学部)松谷峰之介（生物資源ゲノム解析センター）
竹は世界で最も重要な非木材林業製品の一つであり、1500種類近くの種が知られている。竹は滅多に開花せず、数十年以上に渡って栄養繁殖を続ける。また、竹は程の成長が速く、約２カ月で筍から成竹に成長する。成竹は、例えばモウソウチクでは高さ20mに達する。竹の長期に渡る栄養生殖や、程の迷い成長とスケールの大きさは生物学的に大変興味深い。本研究は、クローナル植物である竹のゲノム多様性を明らかにすること、竹の転移可能なトランスポゾンに関する新たな知見を得ること、そして竹の秤伸長に関わる重要な遺伝子の特定を目的とする。研究材料は、モウソウチクの変種と考えられているキッコウチクを用いる。モウソウチクは日本において最も広く分布している大型の竹であり、1736年に中国から琉球を通じて鹿児島県に導入され、その後全国に広まったと考えられている。一方、亀甲状に秤が連鎖した特異な形状を持つキッコウチクは、モウソウチクの変種と考えられている。キッコウチクの日本への導入年代は不明だが、中国から導入されたと考えられている。亀甲化は比較的起きやすい突然変異で、日本の中でも自発的に亀甲化が生じた記録がある。また、リバータントの出現、つまり、先祖返りが生じることがあることが知られている。リバータントでは、亀甲状の性質がなくなり、モウソウチク同様の稗が出現する(図1)。その為キッコウチクはモウソウチクの変種と考えられているが、未だ分子生物学的な解析は行われていない。竹の分子生物学的な研究は、シロイヌナズナや穀物等と比べると大きく遅れているが、近年になって竹ゲノム解析が数報報告された。2013年にはモウソウチクのドラフトゲノムシークエンスが報告され(Peng et al. 2013)、更に2018年には更にHi-Cという手法が用いられ染色体レベルのゲノム情報が報告された(Zhao et al. 2018) 。本研究では、モウソウチクのゲノム情報をリファレンスゲノムとして用い、NGSデータを駆使した解析で、亀甲化の原因遺伝子の単離を試みる。前述の通り竹は栄養繁殖をするので、同一竹林内は同一ジェネット(クローナル植物において、地下茎等で一つながりになっている同一個体）で、遺伝的な差異は殆どないと考えられる。しかしながら、キッコウチクの竹林においては、リバータントが頻繁に出現する。そこで、同一ジェネットで、通常のキッコウチクと、リバータントと考えられる釋由来の組織の遺伝子を、NGSを用いた全ゲノムで比較することで、両者の少数の遺伝的差異から、程の性状の違いを生み出した遺伝子を特定することを目指していvs同一ジェネット内で、独立してモウソウチク同様の程が出現することがあることから、この現象が、DNA型トランスポゾンが特定の遺伝子あるいはその制御領域から脱離することに起因することを想定している。竹においては、MITEやMariner-likeのトランスポゾンの機能が解析されているが(Zhou et al. 2017, Ming-Bing et al. 2017)、竹に転移可能なトランスポゾンがどの程度存在するかに関しては、未だ解析されていない。キッコウチク林では、こういったトランスポゾンが秤の形態形成に関わる遺伝子から脱落、あるいは挿入されることで、程の形態形成が変化している可能性があり、現在解析を進めている。井澤　毅（東京大学大学院農学生命科学研究科）西山典秀（東京大学院農学生命科学研究科）共同研究先：松本 降（生命科学部）儀澤章久（生物資源ゲノム解析センター）
シアノバクテリアは酸茶発生型光合成を行う細菌であり、葉緑体のもとになったと考えられている。数百の栄養細胞が一列につながった糸状体を形成するAnabaena & Nostocなどの糸状性シアノバクテリアは、複数種類の分化細胞を形成することができる。ヘテロシストは窒素固定に特殊化した細胞であり、酸素により不可逆的に失活してしまう窒素固定酵素ニトロゲナーゼを酸茶から保護し、酸茶を発生する光合成と嫌気的環境を必要とする窒素固定を同時に行うことを可能としている(図1左)。一方、休眠細胞であるアキネートは、環境条件が悪化すると形成され、乾燥や低温に対する耐性が高いことが知られている(図1右)。これまで栄養細胞がヘテロシストへと分化する過程で起こる遺伝子発現の変化およびその動御機構については、多くの研究がなされてきた。しかし、アキネート分化の創御に関しては、その分化をコントロールすることが困難であったため、研究が進んでいなかった。我々は最近、アキネート分化を再現性よく誘導する条件を見つけ出し、さらにアキネートの形成に必須の遺伝子を同定した。本研究では、アキネート形成過程における遺伝子発現の変動をRNA-seq解析により明らかにし、アキネート形成の茶過程を明らかにすることを目指す。また、アキネート形成に必須の遺伝子の破壊株を用いたRNA- seq解析も行い、必須遵伝子の分化制御における役割を解明する。窒素固定細胞ヘテロシスト（左）と休眠細胞アキネート（右）。図中の大きい細胞が分化細胞である。上段：明視野、下段：自家蛍光。得平茂樹（東京都立大学理学研究科)共同研究先：渡辺 智(生命科学部)荷村(松根)かおり(生命科学部) (生物資源ゲノム解析センター)松谷峰之介
家畜伝染予防法の届出伝染病である地方病性牛伝染性リンバ脈(Enzootic Bovine Leukosis: EBL)を引き起こす牛伝染性リンパ服ウイルス(Bovine Leukemia Virus: BLV) は全国に蔓延しており、2009-11年時点においてすでに国内牛飼養質数の約35%がBLVに感染していることが明らかとなっていま予(Murakami et. al. , 2013)。BLVの厄介な特徴として、①感染してもEBL発症率が低くEBL発症に至るまでは外貌上非感染牛と区別困難なこと、②一度感染した牛は生涯BLVキャリアとなること、が挙げられます。そのため多くの生産現場では、①を理由に「BLV感染はあまり気にしない」と過少認識してBLV感染牛を飼い続け、②によりBLV感染を延々と拡大させているという実態があります。ところが近年、EBL発症という目に視える被害に至らずとも、BLV感染そのものが、日和見感染症の増加や繁殖成績、乳生産の低下の潜在的な原因になっていることが分かってきました。つまり、BLV感染牛を抱える生産現場では、BLV感染が無ければ本来得ていたはずの生産性（利益）を知らず知らずのうちに損失し、なおそのリスクを広げ就けていることになります。今やBLV感染拡大は見て見ぬ振りのできない喫緊の課題と認識されるべきです。最近では、牛の生産性を左右する免疫機能や栄養代謝機能に及ぼすBLV感染の影響についても少しずつ分かってきています。例えば、BLVプロウイルス高コピー牛は、低コピー牛や非感染牛と比較して、免疫抑削に働く炎症メディエーターの血中濃度が高く(Sajiki et al. , 2019)、また、BLV感染が牛の消化管内微生物露を変化させエネルギー代謝効率を低下させてしまう可能性がNGS解析データから示されています(Uchiyama et al. , 2020)。一方、栄養代謝中枢器官である肝臓において、ヒトではリンバ脈を引き起こす白血病細胞が肝浸潤し肝機能障害を招くことがありますが、EBL発症牛においても肝腫瘍形成が多々認められます。実験動物では、肝炎ウイルス感染や肝細胞癌進行が肝DNAメチル化異常を起こすことも報告されています。しかし、BLV感染がEBL未発症段階の牛の肝機能に与える影響については分かっていません。そこで我々は、EBL未発症であってもBLV感染レベル(BLVプロウイルスコピー数）の増加により肝組織内浸潤するBLV感染細胞（主にリンパ球）が増え、肝機能を担う様々な遺伝子の発現調節を狂わせ代謝機能に悪影響を及ぼすのではないかと仮説を立てました。すでに我々は、高コピー牛群ほど肝組織中に多くのBLVプロウイルスが存在することを明らかにしています(図)。さらに肝DNAメチル化チップ解析から、低コピー牛群と高コビー牛群の比較において約6600 CpG部位のメチル化状態に差異があること（メチル化率差≥ 0.2）を見出しており、エピジェネティックな影響についても解析中です。以上の進捗を基に本共同研究を開始し、NGSを用いた肝RNA-Seq解析によって、BLV感染の有無およびBLV感染レベル別の牛群間の肝機能関連遺伝子群の発現パターンの差異を探索し、代謝機能に及ぼすBLV感染の潜在的な影響とその機序の解明を目指しています。 BLV感染による牛生産性への影響の実態解明そして戦略的なBLV清浄化方策の提案は、獣医畜産学に課せられた使命です。我々はBLV感染リスクが特に高い放牧飼養管理において、感染リスクを低減する「BLV感染防止放牧コンセプト」を立案し、その有効性の英証にも成功しています。さらに本共同研究により、牛生産性への影響に関して新たなエピデンスを得て、「BLV感染そのものが牛の生産性を奇かすリスクとなるためBLV感染防止こそが牧場生産性の向上には不可欠」であることを、臨床獣医師や家畜保健衛生所等、そして農家など生産現場の最前線に強く啓蒙していきたいと考えています。図  BLVに高レベルで感染している牛群（高コピー牛群）ほど、肝組織からBLVプロウイルスが多く検出される。主に血流を介してBLV感染リンパ球が肝組織内部へ浸潤している可能性がある。左上の写真は試験牛から生検した微芳賀　聡（農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門）石崎　宏（農業・食品産業技術総合研究機構奇産研究部["1)阪谷美樹（農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門）小林栄治（農業・食品産業技術総合研究機構奇産研究部門）共同研究先：小林朋子（農学部）田中啓介（生物資源ゲノム解析センター）
褐毛和種牛は黒毛和種、無角和種、短角和種とならぶ日本固有の肉用牛であるが、生産頭数は少なく、各地でブランド化される希少品種である。いけだ牛はワイン製造と並ぶ北海道池田町の主要特産品であるが、わずか8件ほどの生産者によって雑持されている。褐毛和種封入体病(IBD) は、異常典奮や振戦などの神経症状と脳幹部の神経細胞における細胞質内封入体形成を特徴とする褐毛和極牛特有の神経変性疾患であり、IBDはいけだ牛と、そのルーツである熊本あか牛の2系統でのみ散発的に発生が確認されている。申請者らはIBDの病態解明を目的とし、昨年度より若齢のいけだ牛を対象に調査を実施した。その結果、無症状の若齢牛の脳にもおよそ3-4割の確率で封入体が認められており、発生状況からIBDは遅発性の遺伝性疾患である可能性が高く、特にいけだ牛の血統には高率に何らかの遺伝子変異が浸潤している可能性が示唆された。IBDが致死性の疾患でありながらこれまで問題視されてこなかった理由として、褐毛和稀牛の出荷時期(通例1-2歳例）がIBD顕在化の時期(推定2-5裁齢) より早く、発症前に出荷されていたためと考えられるが、種雄牛や母牛ではその限りではなく、血統維持の観点からもIBDの病態解明と遺伝的形質に関する調査が必要である。神経変性疾患のほとんどは細胞内への変性蛋白の蓄積を特徴とし、病理組織学的手法により酱積蛋白を同定することが病態解明の手がかりとなる。封入体の分布や形状、免疫化学的性状といったIBDの病理学的特徴は、ヒトのパーキンソン病(PD)や筋萎縮性側薬硬化症(ALS)に類似している。また、 IBDの封入体には活性酸素種を分解するSOD1蛋白が多く含まれており、研究当初はsod1豊伝子をターゲットとし、サンガーシーケンスによるIBDの原因遺伝子の推定を試みたが、有用な結果は得られなかった。同様の現象はPDやALSにおいても報告されており、蛋白解析から従来手法により過伝子変異を検出できたものは全体の5-10%であり、残りの約9割については未知の遺伝子あるいは複数遺伝子による多因子疾患と考えられている。こうした症例に対しては次世代シーケンサーを用いた網羅的遺伝子解析が極めて有用であるが、動物種や品種ごとの遺伝的多様性の高さや研究コストなどの問題から動物疾悲への適応は困難であった。そこで、本研究では封入体を認めたいけだ牛36個体と対照個体36個体の脳からDNAを抽出し、バルクセグレガント法により症例群に共通する変異箇所を濃縮し、IBDの原因遺伝子候補のスクリーニングを実施する。高スペックな次世代シーケンサーにより点変異から構造変異の可能性まで幅広く検索することで、病態解明を行うとともにより低コストかつ多検体処理が可能な遺伝的診断法の開発につながる知見が得られると考えている。中請者らは産業動物の自然発生疾患を対象とした病理学的研究を主たる活動としており、地域のNOSAIらと連携し、希少疾患や離診断疾患の解析を行っている。本学は十勝地方という奇座・酪農フィールドを持ち、地域の臨床検休が集積するなど全国的にも恵まれた研究環境にある。一方で申請者らの研究グループは遺伝子解析を行うスキームを有しておらず、疾患と遺伝形質に関するアプローチはほとんど行えていなかった。本拠点事業を通じて次世代シーケンサーを利用した研究技術の基盤を創設し、これまで者目されてこなかった動物疾患にも積極的に応用していきたい。渡邉謙一（帯広畜産大学グローパルアグロメディシン研究センター）共同研究先：平野  賞（農学部）篠澤幸久（生物資源ゲノム解析センター）
近年、地球温暖化による簡易は深刻化しており、家畜に対する暑熱ストレスの影響は緊急の課題として取り扱われている。特に、ウシにおいて器熱ストレスは生殖機能に影響し、夏季の受胎率を低下させる。さらに、分娩後ほぼすべてのウシが子宮内細菌感染による子宮内膜炎を発症するが、夏季に発症した場合、その症状が長期化することが報告されている。子宮内膜炎に対して、子宮内膜上皮および間質細胞は細菌を認識後、 IL-6、IL-8およびMCP1などのケモカインを分泌し、感染部位に免疫細胞を誘引する。この免疫細胞によって細菌は除去され、子宮内膜炎は治癒する。しかし、我々は、暑熱環境下において、子宮内膜上皮細胞からのケモカイン産生は抑制される一方、同算細胞からのケモカイン産生は増強されることを明らかにした。これによって、免疫細胞が子宮内膜間質層に蓄積し、主な感染部位である子宮内殿上皮層まで誘引されない可能性を示した（図1) [Sakai S. et al., Physiol Rep. 2020 Nov;8 (22) :e14640.]。一方で、なぜ暑熱環境下の子宮内膜上皮および問質細胞において、逆の反応を示すのか、そのメカニズムは不明である。本研究では、子宮内膜上皮および間質細胞において暑熱ストレスによって変動する遺伝子を網羅的に解析することで、著熱による子宮内膜上皮および間質細胞におけるケモカイン産生朝御メカニズムを解明するための手掛かりを探ることを目的とした。今回のRNA-seqによる解析から、番熱環境下の子宮内膜上皮細胞において213個、子宮内膜間質細胞において396個の遺伝子の変動が確認された。今後は、変動した遺伝子が関与するカスケードを元に、暑熱環境下の子宮内膜上皮および間質細胞におけるケモカイン産生制御メカニズムを詳細に検討する。山本ゆき（岡山大学大学院環境生命科学研究科）共同研究先：岩田尚孝（農学部）田中啓介（生物資源ゲノム解析センター）
アワは“雑穀類”のひとつである。古くは黄河文明の主食であったと考えられ、日本でも焼畑や常畑で栽培され、モチアワは特に上質なものであるとされていた。世界的に見れば、形想的にもさまざまな品種が知られており、温帯一熱帯、高地一低地などさまざまな環境に適応し、人為選択にさらされ多様化したと考えられる。また、今日でも、岩手県で2014年に交雑育種によりモチアワ品種'ゆいこがね'が育成されるなど作物としての価値は依然高い。また、C4植物であり、将来的に危惧される温暖化や乾燥化に対しても有望な遺伝資源と言える。アワのゲノムシークエンスは2012年に公開されている(Bennetzen et al. 2012, Zhang et al 2012)。上記のように乾燥地農業において重要であることもひとつであるが、2倍体であること、ゲノムサイズが小さいこと(約400 Mb)、栽培が容易であることなどモデル植物としてもすぐれている。本研究では、世界のアワ品種の系統分類、さらに日本品種内の遺伝的な多様性や系統分類を行うことを目的にしている。まず世界的なアワ品種コレクションについて系統解析を行いたい。また日本の品種については、これまでの解析では、沖縄を除く日本の品種は、中国北部の品種に近いとされており、沖縄の品種は台湾の品種と遺伝的に近いことが明らかになっている(福永　2017: Fig.1) が、日本品種は、大陸の品種と台湾からの品種がまじりあっているのではないかという仮説をたてており、今回のようなNGSを使った詳細な遺伝的な解析は是非とも行いたい。本研究のゴールとしては、1）世界の代表的なアワ品種の系統解析2）日本のアワの系譜の詳細な解析を行いたい。合計200品種を予定している。解析としては Flexible  ddRADseqのデータにより、系統解析と集団構造解析を予定している。 Fig.1これまで雑種不稔性やDNAマーカーで示されたアワの系統分類。 A:  雑種不稔性（Kawase and Sakamoto 1987) B: RFLP (Fukunaga et al.2002) C:  rDNAのPCR RFLP (Eda et al. 2013) D: Transposon Display (Hirano et al. 2011)福永健二（県立広島大学生物資源科学部）共同研究先：河瀬眞琴（農学部）田中啓介（生物資源ゲノム解析センター）
自然ウイルス群集中に、従来の遺伝子導入媒体や関連実体とは全く異なる、新規水平遺伝子伝達(HGT)媒体:広宿主城ベクター粒子(VP) を見出した(Chiura, 1997; Chiura, 2019)  [図1]。VPの定義は、元の宿主と系統的に科レベルを超える受容細胞に感染し、遺伝情報や細胞由来物質を移転し、同様の生物特性を備えた娘粒子を出芽生産する実体で、その生物特性は1）粒子UV処理に関係なく、受容体の致死率が約10%と低く、2) 宿主染色体断片(dsDNA、～ 400kb) に加え、プラスミドやタンパク質などの細胞質物質を広い系統範囲(Archaea-Bacteria-Eukarya)の受容体に高い一般型形質導入頼度(～ 1.16 × 10 -2 CFU/VP) で転送し、3)  VP媒介形質導入体が定常期に達成すると「進続形質導入」と名付けた細胞溶解を伴わない自発的粒子出芽生産で娘VP生産を始め、 4）娘粒子はさまざまな艦散的粒度分布を示し、また、5）VP媒介形質導入体からのVP出芽再生産を電子顕微鏡観察で明らかにする以外にVPの確認方法がなく、6）細胞あたりのVP収量は3土2粒子と厳密に創御されている。  [図1]。VPは宿主の耐熱性に影響を与えて宿主の環境適応を強化する単一または複数の遺伝子を伝達する(Chiura、2019)。海洋好冷細菌P. filamentusを至適10℃、ZoBell marine brothで増強するとVP (PfVP)  を出芽生産し、PfVP (~150 kbp)を栄養要求性受容大腸菌に感染させると致死性を示さず、PfEtransと名付けた形質導入体3株を生じた。これらPfEtransは、大腸菌が増殖できないZoBell、10℃で～ 2 × 10 9 cells/mLまで増殖し、生育至適温度30℃、生育許容温度範囲0℃から37℃を示した。VP感染により大腸菌の至適温度が低下し、許容温度範囲が向上し、高浸透圧耐性を獲得した。ゲノム配列を比較すると、形質導入株PfEtransは受容株E. coli  AB1157よりもゲノムサイズが34,415 bp (0.74%) 増加したが、VP供与株P. filamentus遭伝子と相同な配列は見出せなかった。一方、ストレス応答遭伝子および浸透圧調節遭伝子の増強が見られ、リポゾームRNA遺伝子(rrn) および調節領域での高類度の1塩基多型: single nucleotide polymorphism (SNP)と塩基挿入欠失(InDels)が明らかになった。接合伝達による古典遺伝学的手法によって予測したVP生産担当領域の配列は、CP4-6 integraseやInovirus Gp2 resolvaseなどの可動因子タンパク質で構成されており、受容体E. coli  AB1157配列とは異なっていた。これらの存在が、隣接するtRNAにSNPを導入し当該遺伝子の過剰発現を誘発した結果、宿主の環境ストレス下での生育増強や耐性発現が生じた原因と推定した。従来のウイルス媒介による形質導入体は、娘ウイルス粒子を生成できないので、連続形質導入現象は宿主細胞の環境適応に極めて有為な寄与を行ってきただろう。連続形質導入を行うVPの機能と生産機構は、原始細胞間で遺伝子を共有した細胞進化の初期過程から今日まで、全ての細胞に引継がれた不完全な可動因子の痕跡で、補完要素の補填により本来の機能発現が可能になる現象ではなかろうか。図１ 「通常の形質導入」と「連続形質導入」の概略図千浦　博（東京農工大学大学院農学府生物制御科学部門)鈴木誠治（東京海洋大学産学連携施設）森山裕充（東京農工大学大学院農学府生物制御科学部門）中村賢吾（東京農工大学大学院農学府生物制御科学部門）共同研究先：朝井　（生命科学部）松谷峰之介（生物資源ゲノム解析センター）
昆虫フタテンチビョコパイはトウモロコシ、小麦、エンパク、イネなどのイネ科植物を吸汁しワラピー要縮症、すなわち矮化及び集の隆起化を引き起こす病害虫として知られている(図)。この症状は当初フタテンチビョコバイによって媒介されるウイルスによるものであると考えられていたが、虫えい組織からウイルスが検出されないことや、ウイルスを除去したフタテンチビョコバイから症状が誘発されること、吸汁を止めると症状が出なくなることから、ウイルスによって萎縮症が引き起こされる可能性が否定された(Ofori and Francki, Ann. Appl. Biol. 1983) 。また、葉の隆起がフタテンチビョコバイの吸汁部位ではなく、そこから離れた新たに展開した葉で形成されることから、機械的刺激ではなくフタテンチビヨコバイの吸汁時に注入される何らかの化学物質によって引き起こされると示唆されている(Matsukura et al., Naturwissenschaften, 2009)。さらに、フタテンチビョコパイが小麦にワラビー装縮症を引き起こすが、大麦には引き起こさないため、これら植物の染色体を入れ換えることでワラピー要縮症に関する遺伝形質が探索されている。両植物とも７つの染色体を持ち、大麦の染色体を小麦の染色体と替えて実験が行われたところ、大麦の染色体6H、7Hを導入すると矮化が観られなくなり、3Hを導入すると虫えい形成の度合いが刻まり、5Hを導入すると反対に強まる傾向にあることが明らかとなった。このことからフタテンチピョコバイによる矮化と降起は互いに異なる生理的メカニズムに基づいた2つの独立した現象である可能性が示唆されている(Kumashiro et al., Naturwissenschaften, 2013) 。フタテンチビョコバイが形成する葉の隆起は虫えいと呼ばれている。虫えいとは、昆虫などが植物体上に形成する構造であり、植物細胞に肥大や萎縮、多核化など病理的な異常が生じたものである。一般に虫えい内部に虫えい形成昆虫の幼虫が生育しており、外敵や外部環境の変化から保護すること及び虫えい組織自体が幼虫の栄養源となるなど、虫えいは虫えい形成昆虫に利盆をもたらす昆虫の適応的な産物であると見なされている。正常な植物の発生過程では形成されない構造のため、植物側から見れば虫えいは「奇形」と言える。しかし、虫えい形成昆虫は寄主植物の芽や集などの特定の部位に常に決まった形の虫えいを形成するため、昆虫から見れば「正常形」である。昆虫がどのように植物を操作して特異な構造を形成しているのか、その全容は解明されていない。一方、フタテンチビョコバイは虫えい内部で生活しないにも関わらず、吸汁によって隆起した葉のアミノ酸量などが上昇することや、隆起した葉で幼虫の発育速度が早く、生存率が高いことなど植物組織の栄糞的な改変において他の虫えいと類似な点が多いことが明らかとなっている(Matsukura et al., Evol Biol, 2012) 。我々はこの矮化及び降起化を誘導する生物活性物質を生物有機化学的手法により半離・構造決定することを第一の到達目標としている。これまでに、イネを用いた生物試験法を構築し、窒素源が隆起形成に関与していることや植物ホルモンの関与などを示している(Miyazaki et al., Plants, 2020)。本研究課題では、吸汁から矮化及び隆起化が生じるまでの変化をトランスクリプトーム解析で捉え、どのようにイネ植物内で引き起こされるのか解明することで、防除法の基盤構築や有用形質の単離に繋げたいと考えている。 (A)フタテンチビヨコバイ成虫（B)フタテンチビヨコバイの吸汁による矮化と（C、D)隆起化Miyazaki et al., Plants, 9 (10):1270, 2020の図を一部改変して引用した。宮崎　翔（慶應義塾大学理工学部）共同研究先：伊藤晋作（生命科学部）儀澤章久（生物資源ゲノム解析センター）
脱石油への社会的要望は年々高まっており、バイオマスを利用したバイオリファイナリ技術の普及が求められている。そこで注目されている方法の１つが藻類バイオマスからのエタノール生産である。しかし、基礎研究段階ではその有用性が実証されているものの、大量培養の離しさが最重要課題として浮上している。水田など広大な培養池において、ミジンコなど動物性プランクトンの発生は避けられず、微細藻類は速やかに捕食されるためである。捕食動物に対する藻類の対抗策の一つは、多数の個体が集合したコロニーを形成することで、ミジンコの捕食対象のサイズより大きくなることである。そのような藻類として、藍色細菌のNostoc sphaeroides (図1)に注目している。 N. sphaeroidesは、窒素固定能を有する藍色細菌である。直鎖状に増殖して糸状体を形成し、それらが折りたたまり、数センチの立体的なコロニーに成長する(図2)。このコロニーの外側には殻が形成され、捕食動物のみならず乾燥にも耐性を示す。多様な色素を含み、食用や漢方薬に利用されてきたが、近年になって抗炎症効果などの機能性が知られるようになっている。しかし、野生株の成育温度城は25℃以下であり、35℃以上では明らかな生育不良を示すため、夏期での栽培が困難であることが課題であった。藍色細菌は、細胞内に複数コピー（数本～十数本）のゲノムDNAを保持している(図3)。そのため、人為的に突然変異を誘発しても、表現型が顕れにくい。またNostoc風は個々の細胞が連結した糸状性群体として存在するため、特徴的な細胞が出現したとしてもそれを単離することは困難である。以上の性質から進化工学的手法によって、有用な性質(高温適応など)を有する変異体を取得することが困難であった。申請者は、N. sphaeroidesのコロニーをガラスホモジナイザーで破砕し、10 ～ 20細胞からなる群体に断片化した後に、再びコロニーに成長させることに成功している。そこで、断片化した後に、変異原(0.1 ～ 0.5%メタンスルホン酸エチル）に暴露させた後に、培養して娘コロニーを調製した。さらに得られた娘コロニーを群体に断片化してコロニー調製するという操作を３回繰り返して、変異株ライブラリー作製を行った。変異導入時点では、1つの細胞内の複数ゲノムDNAには、それぞれ異なる変異が導入されていると考えられるが、何世代も分裂を繰り返すことで、細胞内のゲノム、およびコロニーレベルでもゲノムがほぼ均一化すると考えられる。これまでに我々はクローン化されたと思われるコロニーライブラリーから、野生株では成育困難な35℃においても良好な生育を示す株を単離することができた。単確できた高温耐性株について、光合成能(二酸化炭素固定速度）を測定したところ野生株と同程度であったが、多糖含有量が有意に高いことが分かった。他のシアノパクテリア種では、ストレス応答の結果として、多糖生産が向上することが知られており、今回の単離株についてもストレス応答関連道伝子の発現上昇が予想される。今回、得られた株の次世代シーケンスデータによって、高温適応獲得機能を明らかにしたいと考えている。また、導入された変異が、細胞内に複数存在するゲノムにどの程度、均一されているか明らかにされることも期待している。野外培養株については、遺伝子組み換え生物の利用が困難であることから、今回のような突然変異導入とスクリーニングによる進化工学的手法による藻類の改良が求められており、本研究のデータは、シアノバクテリア変異ライブラリー作製指針における重要な知見になると考えられる。図3   Nostoc sphaeroidesのコロニー内構造とゲノムDNAゲノムDNAは線状として簡易化伊原正喜（信州大学農学部）共同研究先：高市真一 （生命科学部）松谷峰之介（生物資源ゲノム解析センター）
バクテリアのゲノムには容易に突然変異が生じるが、この突然変異の界積によりバクテリアの生育限界がどこまで変化可能なのかは、生物のゲノムの持つポテンシャルや環境ストレスへの適応能を理解する上で非常に興味深い研究テーマである。近年、大腸菌での長期適応進化の研究例からも長期間の連続培業により際くべき表現型の突然変異株が多数生じ得ることが明らかになってきているが、このようなゲノム上の変異を長期間追跡する実験系は、次世代シーケンサーによるゲノム解析が容易になった現在になってようやく発展できた研究分野の１つである。また、遺伝子組換え実験により人工的に作出された株と違い、突然変異により生じた有用形質株は屋外培養による応用研究への発展が容易といったメリットもある。本研究は、選択圧をかけ続けた長期高温適応進化実験により突然変異を累積させ、常温性シアノバクテリアから好熱性シアノバクテリアのような中等度好熱菌の定義を満たせるほどの高温適応進化株の作出が可能なのかという命題に挑むものであり、そこから藻類の高温適応の分子機構の理解を目指している。これまでに、7年に及ぶ長期高温順化試験により生育上限温度が段階的に上昇したシアノバクテリアSynechococcus elongatus PCC 7942の高温耐性変異株群を取得しており、各段階における次世代シーケンサーを用いた全ゲノムリシーケンス解析による変異部位の同定も進んでいる。経過時間とともにゲノム上の突然変異の累積が緩測され、また表現型の違いも顕著になる。相同組換えを用いた遺伝子破壊実験により、長期高温格養の初期段階で発生した変異の１つが高温適応への関与が大きいことが見えてきた。本共同利用拠点の共同研究では、RNA-seq解析によりこうした変異株での遺伝子発現プロファイルを取得し、それらを比較することを計画している。突然変異により、どのような遺伝子群の発現が変動したかを明らかにし、その変異が代謝や細胞機能、細胞構造レベルでどのような効果を及ぼしたのかについて解明したい。兼崎　友（静岡大学グリーン科学技術研究所）共同研究先：渡辺 智    (生命科学部)松谷峰之介（生物資源ゲノム解析センター） NGRCニュース東京農業大学生物資源デノム解析センター 2021 4F 3月受
1.煙山紀子(応用生物科学部食品安全健康学科) [NASH/NASH-HCCにおける網羅的遺伝子発現解析」 2.岩槻健(応用生物科学部食品安全健康学科) 「ヒト味蕾細胞の性質解析」 3.岩槻健(応用生物科学部食品安全健康学科) [GABAやIL-4が霊長類味蕾機能に及ぼす影響の解析」 4.岩槻健(応用生物科学部食品安全健康学科) 「腸内細菌が消化管および口腔内上皮細胞に及ぼす影響の解析」 5.岩槻健(応用生物科学部食品安全健康学科) 「膵臓オルガノイドを用いた膵管タフト細胞の再生研究」 6.伊藤　晋作(生命科学部　バイオサイエンス学科) 「大豆シスト線虫の孵化時に関与する遺伝子の探索」 7.太治輝昭(生命科学部バイオサイエンス学科) 「ナチュラルバリエーションを利用した植物の環境ストレス耐性の解明」 8.太治輝昭(生命科学部バイオサイエンス学科) 「シロイヌナズナの野生型および変異株のリシークエンス」 9.樋浦仁(生命科学部バイオサイエンス学科) 
「妊娠期の葉酸摂取量が仔の雄性生殖細胞のエビジェネティクスに及ぼす影響」 10. 樋浦 仁(生命科学部 バイオサイエンス学科) 「成長期卵母細胞におけるヒストン修飾解析」 11.山根拓実（応用生物科学部食品安全健康学科) [レプチンシグナルに着目したメタボリックシンドロームにおける皮膚機能脆弱化の分子機構の解明」 12.小川英彦(生命科学部バイオサイエンス学科) 「マウス栄養外胚葉においてCdx2発現を制御する新規分子機構の解明」 13.渡辺智(生命科学部バイオサイエンス学科) 「シアノバクテリアにおける巨大プラスミド維持機構の解明」 14.田中啓介(生物資源ゲノム解析センター) [環境DNAメタバーコーディングと環境リモートセンシングを融合させた大気中に飛散する花粉プロファイリング技術の開発」 15.田中啓介(生物資源ゲノム解析センター) [Microsatellite capture sequencing法を用いた大規模マイクロサテライトデータベースの構築」 16.田中啓介(生物資源ゲノム解析センター) [アシタバ（Angelica keiskei）の新規ゲノム解読」 NGRCニュースレター 17.田中啓介(生物資源ゲノム解析センター) [Flexible ddRAD-seq法を用いた栽培バナナの遺伝的多様性に関する分子遺伝学的研究」 18.渡辺智(生命科学部バイオサイエンス学科) 「酵母リポソーム結合タンパク質の新規機能探索」 19.藤本 尚志(応用生物科学部  酿造科学科) 「貧栄養ダム湖の微生物生態系解析」 20.山本統輔(生命科学部分子微生物学科) 「塩生植物シバナの根圏菌類叢の解析」 21.山本統輔(生命科学部分子微生物学科) 「ナノバブル水で栽培したイチゴの根圏細菌叢の解析」 22.山本統輔（生命科学部分子微生物学科） 「ヤムイモ2品種の根圏微生物叢の解析」 23.山本鉱輔(生命科学部分子微生物学科) 「ヤムイモサンプルの保存方法の差による根圏細菌叢変動の検討」 24.下村健司(生命科学部分子生命化学科) [ Callosobruchus属マメゾウムシのフェロモン受容分子群の推定と比較解析] 25.岩田尚孝（農学部動物科学科) 「高脂質飼料が胚の遺伝子発現に及ぼす影響」 26.須江雅之(応用生物科学部農芸化学科) 「オオムギ耐病性化合物グラミンの生合成に関する研究」 27.朝井計(生命科学部バイオサイエンス学科) 
 「実験進化と合成生物の手法を用いた細菌のエビジェネティクス解析」 28.石川森夫(応用生物科学部  醸造科学科) [16S rRNAメタゲノム解析を適応した熟成チーズの細菌相解析および分離株のde novoシークエンス」 29.鈴木敏弘(応用生物科学部 醸造科学科) 「伝統水産発酵食品「くさや」製造に重要な「くさや汁」中の微生物叢の解析と分離放線菌の二次代謝生合成遺伝子群の比較解析」 30.川崎信治（生命科学部分子微生物学科） 
「微生物の環境ストレス耐性機構と感受性機構に関する研究」 31.川崎 信治（生命科学部分子微生物学科） 「花と昆虫に共生する微生物叢のメタゲノム解析」 32.美谷島 克宏（応用生物科学部  食品安全健康学科） [NASH（非アルコール性脂肪性肝炎（Non-alcoholic steatohepatitis）病態の制御に関連する因子の探索」 33.千葉櫻拓(生命科学部バイオサイエンス学科) 「ヒト染色体複製開始領域におけるサイクリンAとMcm7の相互作用解析」 34.松谷峰之介(生物資源ゲノム解析センター) 「米酢の発酵醸造槽における菌叢の経時変化」 35.篠澤章久(生物資源ゲノム解析センター) 「ヒメツリガネゴケにおける赤色光を介した低温順化制御機構の解析」 36.岩槻健(応用生物科学部食品安全健康学科) [GABAが霊長類味蕾機能に及ぼす影響の解析] 37.福島穂高(生命科学部バイオサイエンス学科) 

「精神疾患の分子メカニズムの同定を目的としたトランスクリプトーム網羅的解析」 38.岩田尚孝（農学部動物科学科） 「マイクロRNAが卵や胚の遺伝子発現に及ぼす影響」 39.高島昌子(農生命科学研究所) 「酵母の多様性獲得の仕組みの解明」 40.相根義昌(生物産業学部食香粧化学科) 「各種ボツリヌス菌のゲノム解析」 41.入江健治(国際食料情報学部国際農業開発学科) [Brassica juncea在来品種の系統解析と亜種識別マーカーの開発」 42.山本統輔(生命科学部分子微生物学科) 「乾燥条件とダイジョの共生細菌叢の関連性に関する研究」 43.山本鉱輔(生命科学部分子微生物学科) [Analysis of Bacterial diversity associated with water yam ( Dioscorea alata L.) affected by the yam dominant endophytic bacterial inoculation.] 44.對馬 誠也（生命科学部分子微生物学科） 「土壌微生物多様性に及ぼすストリゴラクトン処理の影響評価」 45.岩田尚孝（農学部動物科学科) 「多糖類ゲル基質がウシ卵子の体外成熟に及ぼす影響」 46.加藤拓（応用生物科学部農芸化学科) 「コシヒカリおよび酒米ぎんの里の根圏菌類叢の解析」 47.岩槻健(応用生物科学部食品安全健康学科) [IL13が霊長類味蕾機能に及ぼす影響の解析」 48.中村進一(生命科学部バイオサイエンス学科) [アブラナの亜鉛動態を変えるシグナルタンバク質の構造と機能の解析] 49.尾畑やよい(生命科学部バイオサイエンス学科) 
 「体外成長・体外成熟卵母細胞における発生支持能制御因子に関する研究」 50.米澤隆弘(農学部動物科学科) [環境DNAを用いた流行性病原体の自然環境下における感染経路ネットワーク推定」
近年、生活習慣病の肝臓における表現型のひとつとされる非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD)および非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）が増加している。NASHは脂肪肝に加えて肝細胞の風船様腫大・マロリー小体の出現・肝線雑化などを伴い、約７年の経過で５～ 25％が肝硬変に進行し、特に線維化や肝硬変の進行例で高頻度にがん化する可能性が指摘されている。現在のところNASHの治療法には決定打がなく、世界中で様々な動物モデルが開発され、研究が進められている。しかしながら、特にNASH合併肝がんはモデル動物も少なく、その予防ならびに治療法に関する知見が少ないのが現状である。我々は、コリン欠乏メチオニン低減アミノ酸食（CDAA）を改変し、トランス脂肪酸を含有しないショートニングを脂質原料としたコリン欠乏メチオニン低減高脂肪食CDAA-HF-T(-)を開発した。これまでの研究で、CDAA-HF-T(-)の1年3ヶ月の給餌により肝臓において、重度の線雑化と多発性腫瘍がみられ、病理組織学的検査の結果、肝細胞癌、肝細胞腺腫、血管肉腫を含む肝腫瘍を認めた(図1)。 CDAA-HF-T(-)食63週投与群の肝臓試料を用いて線維化や肝腫瘍病変の進展に重要なシグナル因子を探索すべくRNA Seq.、PCA解析およびIngenuity Pathways Analysis® (IPA)解析を行った。病理組織学的検査の結果を踏まえ、基礎食群の肝臓組織と、CDAA-HF-T(-)食群の肝臓非腫瘍部、同群のHCCと肝細胞腺腫による腫瘍部から、それぞれRNAを抽出し、基礎食群肝臓組織（Control)・非腫瘍部・腫瘍部として網羅的遺伝子発現解析をした。 PCA解析においては、第１主成分が30.8%であり、基礎食群由来のControlとCDAA-HF-T(-)食群由来の腫瘍部+非腫瘍部で大きく分かれた。第2主成分は、16.3％であり、CDAA-HF-T(-)食群の腫瘍部と非腫瘍部で分かれた。以上のことから、Control、腫瘍部、非腫瘍部で異なる遺伝子プロファイルが示された（図2)。現在までのところ、NASHにおける線維化の進行や腫瘍性病変に関わるパスウェイ解析の結果が得られつつあり、その詳細について解析中である。このような知見から、将来的にはNASH・肝がん発症の関係性について明らかにし、疾病予防・治療の方策の一端を提案できればと考えている。煙山紀子 （応用生物科学部食品安全健康学科)美谷島克宏（応用生物科学部食品安全健康学科)中江大 （応用生物科学部食品安全健康学科)
腸管は栄養の吸収にとどまらず、食品成分や環境因子の認知、生体防御、バリア機能、ホルモンのコントロールなど様々な機能を有している。腸を健康に保つ事は健全な生活に不可欠であるが、近年、機能性胃腸症、クローン病、潰瘍性大腸炎などの原因不明疾患が増加傾向にあり問題視されている。これら消化管の機能障害の解消には、消化管幹細胞やそこから分化・成熟した上皮細胞が炎症・食品成分・ストレスなどによりどのような影響を受けるかという基礎的理解が必要である。一方で、消化管機能をin vitroにて解析する実験系は限られており、研究のボトルネックとなっていた。しかし、消化管幹細胞が特定され、続いて消化管幹細胞の三次元培養系（オルガノイド培養系）が開発されたことで、これまで困難であったin vitroでの消化管細胞実験が可能となった。本研究では、霊長類の腸管機能の研究ツールとしてサル由来腸管オルガノイド培養系を構築し、腸管上皮に存在するセンサー細胞である味細胞様化学受容細胞への分化誘導系を確立することを目的とした。まず、アカゲザルの小腸を採取し、クリプトを組織から分離しマトリゲルに包埋した後、EGF、 Wnt3a、R-Spondin、Noggin、Nicotinamide、SB202190等含むDMEM/F12培地を重層し培養を開始した。培養１日目には球体状の腸管オルガノイドが観察され（図１、Day 1）、培養３日目でおよそ200 μ m前後に育ち（図1、Day 3）、サル小腸組織においてオルガノイド培養が可能であることが確サル小腸オルガノイドの作製図1クリプト単離後１日目、３日目のオルガノイドの様子。１日目で球状のオルガノイド形成が観察され、 3日目には大きく成長した。Bar: 200 μ m認された。同小陽オルガノイドは継代や凍結も可能であり、現在までに一年以上継代可能であることが確認されている。本培養系では、Wnt3aが常に培養液に添加されているため、オルガノイドを構成する細胞は増殖性の細胞が多くなり、球形を保つとともに、分化した成熟細胞はほとんど観察されない（data not shown)。そこで、作製したサル小腸オルガノイドを分化誘導するため、Wnt3a、Nicotinamide、 SB202190を除いた培地にて96時間培養した。免疫染色を行った結果、Tuft細胞のマーカーであるDCLK1、および内分泌細胞の一つであるクロム親和性細胞のマーカーであるセロトニン（5-HT）を産生する細胞が存在する事が確認された（図2)。この事から、サル腸管オルガノイド培養系においてTuft細胞や内分泌細胞へ分化誘導できることが判明した。また、分化誘導前後にてTotal RNAを採取しトランスクリプトーム解析に供し、主成分解析により遺伝子発現の変化を調べた（図3)。その結果、未分化状態と分化誘導後のオルガノイドでは遺伝子発現に変化が起こっていることが確認された。現在、発現量が有意に変化した遺伝子について解析している。今回、世界に先駆けてサル腸管オルガノイドを作製し、in vitroにおいて成熟細胞への分化誘導が可能であることを確認した。このことで、食品成分や化学物質が霊長類の陽管上皮細胞に与える影響について解析するプラットフォームが完成した。げっ歯類と霊長類では食性や代謝機能が異なることから、栄養茶に対する腸管上皮細胞の応答性が異なることが予想される。今後、本研究で作製したサル腸管オルガノイドが、栄養科学、食品科学、病理学、生理学等へ貢献することを期待する。サル小腸オルガノイドにおけるセンサ図2分化誘導塔地に切り替え96時間後の免疫染色像。左から抗DCLK1抗体、抗5HT（セロトニン）抗体にてそれぞれ検出した。右端はDAPI染色と全ての抗体染色像の重ね合わせ像。 Bar: 100 μ mトランスクリプトーム解析による分化誘導前後の遺伝子発現パターン分化誘導前と後（誘導72時間後）の十二指腸オルガノイドおよび空腸オルガノイドよりそれぞれTotal RNAを精製しRNA-Seq解析に供し主成分解析を行った。Duo:十二指腸、Jej:空腸。謝辞：本研究は京都大学霊長類研究所の共同研究・共同利用制度を利用しサンプルを提供していただいた。この場をお借りして今井啓雄教授および霊長類研の皆様に感謝いたします
掲載論文
Akihiko Inaba, Shunsuke Kumaki, Ayane Arinaga, Keisuke Tanaka, Eitaro Aihara, Takumi Yamane, Yuichi Oishi, Hiroo Imai, Ken Iwatsuki. Generation of intestinal chemosensory cells from nonhuman primate organoids. Biochemical and Biophysical Research Communications. In press (2020)岩槻健（応用生物科学部食品安全健康学科)稲葉明彦（応用生物科学部食品安全健康学専攻)田中啓介(生物資源ゲノム解析センター)
多くの昆虫は、化学シグナルである性フェロモンを介在し生殖行動を行っている。効率的な生殖行動のために、性フェロモンには種特異性が高いことが求められ、近縁種間においても性フェロモンの構造・組成には多様性が生じている。種分化過程において、性フェロモンは構造、もしくは組成を変化させていることが考えられるが、性フェロモンシグナルの多様性がどのように生じるのかは未だによくわかっていない。これまでに鱗翅目城類やショウジョウバエ類を中心に性フェロモンの進化が研究されてきたが、性フェロモン物質の構成比を変化させたり、立体配置を反転させたりしながらゆるやかに進化(gradual evolution)しているケースが大半を示している。一方で、申請者らの研究グループは、鞘翅目昆虫であるCallosobruchus属マメゾウムシにおける同属近縁種内の性フェロモンに関し、その構造に劇的な進化（saltational evolution）が生じていることを明らかにしてきた。しかしながら、雌が分泌する当該性フェロモン構造の劇的な進化（変化）に対し、受容者側（雄）がどのように適応してきたのかは全くの未知である。そこで本研究では、同属４種マメゾウムシの未交尾雌雄から、性フェロモン受容器官である触角由来のRNAを用いたRNA-seqを実施し、それぞれの種の雌雄間及び種間比較によるDEGから、性フェロモン受容に関与する分子群の推定を計画した。近年当該マメゾウムシの１種であるヨツモンマメゾウムシ(C. maculatus)のゲノム情報が公開されたが、嗅覚関連のアノテーション情報は非常に限られていた。そのため、足掛かりとしてヨツモンマメゾウムシから解析に着手し始めた。これまでにde novo RNA-seqと、ゲノムシーケンスに対する嗅覚関連遺伝子のホモロジー検索から、新たに複数の候補遺伝子を推定した。DEGの結果、雌雄間で発現量に顕著な差のみられる遺伝子もあり、性フェロモン受容に関与する可能性が考えられた。今後は候補遺伝子群のRT-gPCRによる発現比較の検証と、機能解析による受容分子の同定を行っていく予定である。下村健司（生命科学部　分子生命化学科) 0•●•●
)•●•●卵子の発育における唯一の外部環境は卵胞液である。卵胞液中には様々な因子が含まれており、これを卵子の体外発育や減数分裂を誘導する成熟培地に添加すると、卵子の受精や発育能力が著しく改善する。卵胞液中にはエキソソームと呼ばれる細胞外小胞が多く含まれている。卵胞液からこのエキソソームを取り除いて、卵子の発育塔地に添加すると、卵胞液の卵子に対する発育支持能力が大きく減退した。そのため細胞外小胞に含まれているmiRNAが何なのかに大きな関心があった。miRNAはターゲットとして非常に多くのmRNAを持っており、ターゲットのmRNAに由来する蛋白もそれぞれが相互作用する。これまでの研究は、単体のmiRNAを培養環境中に外挿し、多くの場合ターゲットと思われるタンパク質を一つ選んで発現を追い報告するような仕事がほとんどで有り、このような方法では効率よく、本来大きな機能を持っているmiRNAを見つけることが難しい。今回の課題ではこのような背景を念頭に、卵子の発育を支持する重要なmiRNAを同定することをブタの卵巣卵子や卵胞液を用いて試みた。最初に卵子の発育を支持するmiRNAの同定のため卵子を取り巻く顆粒唇細胞が卵胞液のmiRNAの影響を受けているという仮説の下、小卵胞から大卵胞に至るまで発育ステージ毎に顆粒唇細胞を採取し、これらの細胞のRNAseqを行い、変動遺伝子から上流因子をIPA解析で推測した。また活性化後に発生能力が高かった卵子と悪かった卵子を取り囲んでいた顆粒層細胞を使って、同様にRNAseqと上流因子推測を行った。これらのmiRNAは顆粒層細胞に働きかけ卵胞発育を促し、さらに良い卵子を得るのに重要な働きをすると考えられる。次に小卵胞から大卵胞に至るまで一貫して高濃度で卵胞液中に含まれるmiRNAをsmallRNAseqで測定した。このmiRNAと上記のIPAで推測したmiRNAを重ねあわせて卵胞発育に重要な働きをするmiRNAを同定した。次にブタの卵巣から初期臨状卵胞（直径0.5-0.7mm）を切り出しここから卵子と顆粒層細胞複合体を取り出し2週間体外発育させた。この時の培地にはエキソソームを除去した卵胞液を添加し、ここに上記の実験で推測して得られたmiRNA（miR-27、17、92a、もしくは145）もしくはコントロールmimicを添加して卵子の発育や活性化後の発生能力を比較した。卵子の能力は卵子の成長、腔形成率、ヒストンのセチル化の亢進、クロマチンの凝集や胚盤胞期胚への発育率で評価した。培養試験の結果これらのmiRNAは卵子の発育を支持することが明らかになった。さらに卵子顆粒層細胞複合体を培養した培養液からエキソソーム分画を抽出して中のRNAをsmallRNAseqしたところ培地中にも推測したmiRNAが検出された。これらの結果から、miRNA（miR-27、17、92a、もしくは145）が卵胞液中に分泌され卵子の発育に重要な働きをすことが分かった。これらの研究は研究室大学院生の井上、宗像とゲノムセンターの篠澤、川原氏と共同で行った研究である。岩田尚孝（農学部　動物科学科) )•●•●
)•●•●葉酸（ビタミンB。）は、生体内で合成することができない必須ピタミンであり、DNAおよびタンパク質の生合成に重要な役割を果たしている。ヒトの場合、妊娠中期に起こる神経管形成過程において葉酸が欠乏することで、二分脊椎症や無脳症などの神経管閉鎖障害(Neural Tube Defects ; NTDs）および先天性欠損症のリスクが増加する。食餌性葉酸摂取量増加によりNTDs発症のリスクを減少させることができるため、妊娠期の葉酸摂取量は日本人成人女性の推奨量の2倍量（1日480 μg）が推奨されている。その一方で、妊娠時の葉酸過剰摂取により、低出生体重児の出産リスク増加、小児におけるインスリン抵抗性の増大およびマウス胎仔の子宮内発育遅延を生じるなど、胎児期の葉酸過剰嚥露が生活習慣病のリスク要因と示唆されている。葉酸は核酸やタンパク質の産生だけでなく、一炭茶転移反応の葉酸回路およびメチオニン回路を経てS-アデノシルメチオニンを産生し、DNAやヒストンにメチル基を供給することでエピジェネティクス制御に寄与している（図1)。エピジェネティクスはDNA配列に依存しない遺伝子発現調節機構であり、『細胞の記憶」として働く。DNAメチル化は発生過程において大規模な動的変化が見られる。生殖細胞系列において、親から受け継いだエピジェネティクスは始原生殖細胞で一旦消去され、自らの性に従って再び獲得される。マウス雄性生殖細胞のDNAメチル化は、新規メチル化酵素によって妊娠中期から出生までの間に再度確立される（図2)。近年、胎児期や乳幼児期の健康や栄養状態が成人期以降の健康および疾病発症に影響するというDevelopmental Origins of Health and Disease（DOHaD）仮説が注目されている。この仮説の分子機構として、子宮内栄養環境によって胎児体細胞のエピジェネティクスに影響を与えることが示唆されている。しかしながら、母体葉酸摂取最が胎児雄性生殖細胞のエピジェネティクスに与える影響を精査した知見は乏しい。本研究では、マウス母獣の食餌性葉酸摂取量が胎仔雄性生殖細胞のDNAメチロームおよびトランスクリプトームに与える影響を明らかにすることを目的とする。妊娠期（F0）食餌性葉酸摂取量モデルマウスの胎仔雄性生殖細胞を用いたPost Bisulfite Adaptor Tagging (PBAT)法によるゲノムワイドなDNAメチル化解析およびRNA-Seq法による遺伝子発現解析を行い、DNAメチル化異常領域の同定および遺伝子発現解析のデータを統合し多層オミックス解析を行うことでエピジェネティクス変化の解析を行う。また、同定されたメチル化異常領域から生物学的機能解析を行い、雑種第１ (F1)世代への影響について評価する。更に、この影響が次世代へ継承されるかを明らかにするため、 F1世代の妊孕性を調査し、F1世代精子およびF2世代新生仔臓器に対しDeep Bisulfite Amplicon Sequencing（DBAS）を用いたメチル化解析を行う予定である。これらの解析からDNAメチル化異常領域を同定し、その生物学的機能解析を行い、妊娠時の食餌性葉酸摂取量が胎仔の生殖細胞に与える影響および孫世代の健康に与える影響を明らかにすることを目指す。
)•●•(我々は遺伝子操作により記憶能力が向上または低下したトランスジェニックマウスや、環境要因を再現したPTSD動物モデルを開発してきた。しかし、これらマウスの脳内でどのような生化学的変化が起こっているかは十分に明らかに出来ていない。そこで、これらゲノム要因と環境要因を再現した動物モデルのトランスクリプトームの網羅的解析を行い、その発現プロファイルを詳細に比較することで、精神病態の分子基盤・病態機序を同定することを目的とした。恐怖体験の記憶（恐怖記憶）の形成は、ヒトを含めた動物が危険を回避するための本能的な生命現象であるが、恐怖記憶制御機構の破綻は心的外傷後ストレス障害（PTSD）などの重篤な精神疾患を引き起こす。現在、PTSDの発症メカニズムは不明であり、根本的な治療薬は存在しない。一方、最近の研究から、ヒトと動物の間において恐怖記憶制御機構の共通性が観察され、モデル動物を用いた基礎研究の成果が、PTSDなどの精神疾患の新規治療方法開発に繋がると期待されている。記憶は遺伝子発現依存的な「固定化」のプロセスを経て長期記憶となる。恐怖記憶の場合、記憶が思い出されると恐怖反応を維持・強化する「再固定化」または恐怖反応を軽減する「消去」のプロセスが誘導される。「再固定化」と「消去」のプロセスは、世界的にげっ菌類のPTSDモデルとして捉えられているものの、両者の分子機構の共通性と多様性は不明な点が多く残されている。そこで本研究では、恐怖記憶制御の分子メカニズムを解明する端緒として、「再固定化」と「消去」のトランスクリプトーム解析を行った。マウスにおける恐怖記憶課題である受動的回避反応課題は、明箱と暗箱に分かれた解析装置を用いる。この課題では、マウスが暗所を好む習性を利用し、明箱から暗箱への移動後に暗箱内で電気ショックを与えること（恐怖体験）により、恐怖記憶を形成させる（条件付け）。この翌日にマウスを再び明箱に入れると（再暴露）、暗箱に対する恐怖記憶が想起されると考えられた。そのため、再暴露を明箱でのみ行った場合は「再固定化」が誘導され、マウスが暗箱へ移動後に電気ショックを与えずに暗箱内に滞在させると、暗箱内が安全であることを再学習し、「消去」が誘導されると予想された。我々は、この仮説に従って、マウス遺伝学的、行動薬理学的、免疫組織学的手法により、再固定化と消去を区別できる解析系を確立し、さらに、再固定化と消去のプロセスを制御する脳領野及び遺伝子群を明らかにしてきた(Fukushima et al., 2014)。さらに、この解析系に改良を重ねることで、 「再固定化」の誘導をキャンセルし、「消去」を誘導するための「新たな記憶プロセス」の存在を発見した (Fukushima et al., 2020)。現在、これまでの我々の研究結果に基づき、「再固定化」または「消去」の誘導に伴う活性化脳領野のトランスクリプトーム解析を試みている。恐怖記憶制御において脳内で中心的な役割を担う前頭前野を解析した（下図)。その結果、恐怖反応を維持・強化する「再固定化」誘導時では205遺伝子の発現変動が認められた。一方、恐怖反応を減弱する「消去」誘導時では327遣伝子の発現変動が観察された。さらに、「新たな記憶プロセス」では、874遺伝子の発現変動が観察された。恐怖記憶制御には扁桃体や海馬も重要な役割を担っているため、今後、これら脳領野も解析していく予定である。福島穂高(生命科学部　バイオサイエンス学科)
●●●高温は作物の生長や収量に大きな影響を及ぼす重大な環境因子である。地球規模ではここ30年の温度上昇により、主要穀物である小麦やトゥモロコシの収量が3-5%も減少したと報告されており、将来的に安定した食糧供給を望む上でも、高温耐性作物の作出および耐性メカニズムの理解が植物科学の重要な課題とされている。植物の高温ストレス応答に関しては、これまでにシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)を含むモデル植物を中心に研究が進められ、高温耐性に必須の遺伝子群の他、高温耐性を付与することの出来る遺伝子が見出されているものの、応用面で十分な成果を得るまで至っていない。興味深いことに、自然界には高いストレス耐性を示す植物が存在する一方で、同じ種であってもそのような耐性が失われている例がある。しかしながらその背景でどのような遺伝子が働いているのかに関しては多くが不明である。シロイヌナズナには世界中に1000種類を超えるaccession（異なった産地由来の近交系統；エコタイプ）が存在し、accession間にはストレス耐性を含む様々な表現型にバリエーションが確認されている。長期的な高温ストレス（37℃ _7日間）に対する耐性を評価したところ、高温耐性に大きな多様性を見出した。このうち、広く研究に用いられる実験accessionのCol-0は比較的高い長期高温耐性を示すaccessionであることが明らかとなった。そこで長期高温ストレス応答に関与する遺伝子の同定を目的に、Col-0種子にエチルメタンスルホン酸（EMS）による突然変異処理を行い、その次世代種子（M2種子）を用いて、長期高温ストレス耐性が欠損した突然変異株のスクリーニングを行った。3000粒のM2種子を用いてスクリーニングを行った結果、11系統の変異株の単離に成功し、 sensitive to long-term heat (sloh)変異株と名付けた。得られたsloh変異株のうち、sloh4は長期高温ストレスに高感受性を示す一方、短期高温ストレス(42℃、50 min)に対しては野生株と同等であることから、長期高温ストレス応答が特異的に欠損した変異株であることが明らかとなった。sloh4の原因遺伝子を同定するために、Col-0と同等の長期高温耐性を示すDa(1) -12とsloh4を交雑した次世代のF2種子を用いて遺伝子マッピングを行った。マッピングの結果、sloh4の原因遺伝子座を第2染色体下腕部、844 kbp間に絞り込むことに成功した。次にsloh4のゲノムシークエンスを行い、原因遺伝子領域のコード領域に生じた変異を検出したところ、MIP3遺伝子の第３イントロン上の3’スプライス部位にのみ変異が認められた。MIP3がsloh4の原因遺伝子であるか検証するために、プロモーターを含む野生型MIP3遺伝子をsloh4に導入した結果、sloh4の高温耐性が野生型と同程度に回復することが明らかとなった。さらに、MIP3のT-DNA挿入変異株であるmip3-1もsloh4同様、長期高温ストレスに高感受性を示すことが明らかとなった。これらの結果より、sloh4の原因遺伝子がMIP3であることが強く示唆された。 MIP3は小胞体膜上でMIP1、MIP2、MAG2と複合体を形成し、小胞体-ゴルジ体間の小胞輸送に関与することが報告されている。そこで、この複合体の長期高温ストレス耐性への関与を検証した。複合体構成因子であるMIP1、MAG2のT-DNA挿入変異株であるmip1-1、mag2-3の高温耐性評価を行った結果、これらの変異株は野生株と同等の長期高温ストレス耐性を示した。この結果より、 MAG2複合体の中でMIP3のみが、長期高温耐性に重要な機能を持つようになったと考えられた（挿人図)。
)•●•●植物には、昆虫や病原菌による傷害・感染に対抗するために、様々な防御機構が備わっている。その代表的なものの一つに「二次代謝化合物による化学的防御」を挙げることができ、例えば、抗菌性化合物を生産することで病原菌侵入や感染成立を阻止する機構を持つ。植物がもつ抵抗性を利用した病害防除では、一般に、化学農薬を利用する場合ほど劇的な効果は得られない一方で、薬剤耐性が生じにくいというメリットがある。そのため、両者を併用した対策を取ることで、より効果的で環境負荷を抑えた作物生産ができると考えられる。二次代謝化合物はspecialized metaboliteとも呼ばれることからも分かるように、それぞれの植物が特有の構造を持った化合物を生産し、これまでに極めて多様な化合物が報告されている。また、その構造的多様性を反映して非常に多岐にわたる生物活性を示し、農業的利用にとどまらず、生薬を始めとした医薬品やそのシード化合物として利用されているものも多い。植物の二次代謝をコントロールする分子的基盤、つまり植物において“どのような化合物”が“どのようにして”生産されるのかを本質的に解明するために、これまで植物二次代謝経路を生合成酵素の面から解析してきた。二次代謝化合物の中には、その生合成経路がまだ不明なものも多く残っている。オオムギの一部品種は、グラミン（Gramine）と呼ばれるインドールアルカロイドを耐病性化合物として生産している。グラミンはアミノ酸のひとつであるトリプトファン（Trp）よりアミノメチルインドール（AMI）を経て生合成されると考えられているが、そのシンプルな構造にも関わらず生合成において鍵となるTrp-AMI間の反応は解明されていない。この経路に関して解明すべき点は、1）グラミン側鎖におけるアミノ基はTrpのアミノ基に由来するのか、2）Trpの側鎖炭素数の減少はどのような反応により進行するのか、の2点である。これまで我々は1）について、安定同位体を用いたトレーサー実験により、Trpのβ-炭茶とアミノ基がグラミン中に保持されることを明らかにしてきた。このことは、 2）の反応ではアミノ基が離れた後に、β-酸化のような炭茶2個単位の除去が起こるのではないことを示しており、アミノ基を保持したまま炭茶が減少する興味深い反応で進行していることを示唆している。この生合成酵素を解明することで、植物二次代謝における新たな知見が得られるものと期待できる。そこで生合成に関与する酵素を特定するため、グラミンを生産する品種としない品種、高濃度で蓄積する部位と少ない部位、などを用いてRNA-seqによるトランスクリプトーム解析を行い、グラミン生産性と相関の見られる遺伝子の特定を行うことにした。今回は、グラミンを生産するものとして、栽培オオムギ（Hordeum vulgare）の一品種ファイバースノウ（FS）と野生オオムギ（H. vulgare subsp. spontaneum）、グラミンを生産しない栽培オオムギのMorex、そしてグラミン蓄積量に大きな差がある葉身と子葉鞘を用いた。その結果、次転写量に差が認められる遺伝子（DEG）を特定することができた。このDEGの中には、グラミン生合成の最終段階（AMIからグラミンへの2段階のメチル基転移反応）に関わるN-メチルトランスフェラーゼが含まれていることも明らかとなった。現在、これらDEGについて精査しており、今後、シロイヌナズナやイネなどに遺伝子を導入することにより、グラミンの生産性、病害抵抗性の評価を行っていく予定である。グラミンの予想生合成経路fold change: >10須恵雅之（応用生物科学部　農芸化学科)
越冬する植物は一定の期間、0-4℃の低温に曝されることで、凍結耐性を獲得することができ、この現象は低温順化と呼ばれる。非熱帯地域では凍結温度まで気温が低下することがあり、農業利用の観点から低温順化を含む低温応答機構の解析がモデル被子植物シロイヌナズナを用いて精力的に行われてきた。低温による障害の主要な要因は細胞膜の損傷である。低温に曝された植物は、遺伝子発現などを介して可溶性等を含む適合溶質や細胞膜損傷を防ぐタンパク質を増大させることで凍結ストレスによる細胞膜の損傷に対して対抗する。凍結耐性獲得と生育はトレードオフの関係にあり、凍結耐性能を増大させたシロイヌナズナの形質転換体は通常生育条件下において、すでに高い凍結耐性を示す一方で、著しい生育遅延を示す。このことから、凍結耐性を適切に制御することが植物の生存戦略として重要であると推察される。近年、低温条件下において刻一刻と変動する外部環境を認識するために光シグナル、とりわけ赤色光を利用し、凍結耐性を最適な状態に保つメカニズムが明らかとなってきた。しかしながら、その背景で働いている遺伝子制御ネットワークについては未だ不明な点が多い現状である。低温順化能力は被子植物だけではなく、藻類から祖先陸上植物にもっとも近縁なモデルコケ植物であるヒメツリガネゴケでも観察される。このことから、この形質は陸上植物の共通祖先によって獲得されたと考えられる。ヒメツリガネゴケを0℃の温度で順化させると光の有無に関係なく凍結耐性が増大する。そのため、コケ植物における順化への光の役割は不明なままであった。我々の研究グループはヒメツリガネゴケの低温順化における光の役割を明らかにするため、幅広い温度において赤色光、青色光、暗黒下で低温順化能を調査した。その結果、赤色光のみ、凍結耐性が阻害される低温処理温度があることを見出し、コケ植物では赤色光が低温順化の阻害因子であることが明らかとなった。このことは、赤色光を介した凍結耐性能の制御メカニズムがコケ植物ですでに出現していることを示している。本研究ではヒメツリガネゴケにおける赤色光に制御される低温応答遺伝子の制御ネットワークの解明を目指し、赤色光及び青色光で処理したヒメツリガネゴケを用いてトランスクリプトーム解析を行うこととした。本研究の成果は、コケ植物の低温顺化機構の理解のみならず、植物における低温顺化の進化プロセスや多様性についての知見を得ることも期待できる。低温順化による凍結耐性獲得までの概略篠澤章久（生物資源ゲノム解析センター）
)•●•●近年、次世代シーケンサーの普及にともない環境中に生息する微生物群集を詳細に解析することが可能となった。しかしながら、淡水資源として重要な位置づけにあるダム湖に対して行った例は少ない。本研究ではダム湖の物質循環に関わる重要な細菌群の消長や鉛直分布を明らかにすることを目的として、神奈川県宮ヶ瀬湖、群馬県ならまた湖、奥利根湖について真正細菌および古細菌をターゲットとした16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンシングを行い、菌察を深さ方向に検討するとともに、主要な構成微生物であるが未培養のActinobacteria綱ac  I系統、Chloroflexi門に属する細菌の推移を明らかにした。供試試料としては、貧栄養ダム湖である宮ヶ瀬湖、ならまた湖、奥利根湖の表層（0.5 m）、中層約(40 m)、底層（約80 m）より採水した水試料を用いた。宮ヶ瀬湖の表層においてVerrucomicrobiae綱、Gammaproteobacteria綱、Bacteroidia綱、 Actinobacteria綱、Alphaproteobacteria綱などが主要な構成微生物であった（Fig. 1）。令和元年度東日本合風の影響と考えられるが、11月以降Gammaproteobacteria綱の割合が高まった。中居においては表層に比べて多様性が高く、表層では割合の低かったAcidimicrobia綱が主要な構成微生物となり、 Alphaproteobacteria綱が減少した。表層と同様に11月以降Gammaproteobacteria綱の割合が増加した。底層では、中層に比べてGammaproteobacteria綱の割合が高まった。１月には表層、中層、底層の菌察が類似していることから、冬季の鉛直混合が起こったものと考えられた。ならまた湖では表層、中層、底層に共通してVerrucomicrobiae綱、Gammaproteobacteria綱、 Bacteroidia綱、Actinobacteria綱、Alphaproteobacteria綱などが主要な構成微生物であった（Fig. 2)。表唇においてBacteroidia綱の割合が高い傾向が見られた。12月には全唇においてGammaproteobacteria綱の割合が著しく高まった。奥利根湖もならまた湖と同様に、表層、中層、底層に共通してVerrucomicrobiae綱、 Gammaproteobacteria綱、Bacteroidia綱、Actinobacteria綱、Alphaproteobacteria綱などが主要な構成微生物であった（Fig. 3)。表層においてActinobacteria綱の割合が高い傾向が見られた。 Chloroflexi門細菌は緑色非硫黄細菌として知られていたが、16S rRNA遺伝子に基づく系統学的比較に基づいて再分類がなされ、この細菌門の系統多様性は拡大を続けている。様々な環境中で存在することが報告されているものの、多くの分離株が嫌気条件下で分離されており、未だ生態の解明が進んでいない部分の多い分類群である。今回の次世代シーケンサーによる解析の結果、宮ヶ瀬湖においてのみ、Chloroflexi門細菌の存在が確認され、奥利根湖、ならまた湖にはほとんど存在していないことが明らかとなった。また宮ヶ瀬湖において総リード数に占める割合が、4月から10月において表層では約0.1%、中層では約5%、底層では約1%で推移した。これにより中層においてChloroflexi門細菌が多く存在している事が示唆された。宮ヶ瀬湖の中層の溶存酸素濃度は約6 mg/Lで推移していることから、宮ヶ瀬湖に存在するChloroflexi門細菌は酸素存在下でも生存可能であることが示唆された。また、解析により得られたChloroflexi門細菌のOTUs  (operational taxonomic unit) の中で主要なものはChloroflexi門Anaerolineae綱の中でもCL-500クラスターに属するクローンと近縁となったことから、今後はこの主要なものの分離培養を試みていく。放線菌のac  I系統は3つのクレードに分けられ、多くの淡水域において最も多く存在している細
NGRCニュースレター
菌群であり、炭茶循環において重要な役割を担っていると考えられている。総リード数に占める割合の平均値（土標準偏差）は、宮ヶ瀬湖では表層で14.5% ± 8.5%、中層で7.6% ± 2.2%、底層で6.8% ± 1.9%、ならまた湖では表層で10.8% ± 4.5%、中層で8.7% ± 3.7%、底層で7.3% ± 3.2%、奥利根湖では表層で16.2% ± 3.6%、中層で10.5% ± 1.8%、底層で9.0% ± 1.3%となり、宮ヶ瀬湖、奥利根湖において表層で高い割合を占めることが明らかになった。また、検出された配列について配列間の相同性が99%以上の場合を同一のOTUとした結果、主要な8OTUsの内、共通して検出されたのは4OTUsであり、その中でNGS_1が3つのダム湖で優占していた。このことから、貧栄養ダム湖において優占するac  I系統は共通であることが考えられた。また、NGS_6は宮ヶ瀬湖のみ、NGS_7、NGS_8は奥利根湖のみで検出されたことから、各ダム湖に特有のac  I系統の放線菌が存在することが示唆された。 ■ D_O__Bacteria;D_1 ■ D_0_ Bacteria;D_1 ■ D_0_ Bacteria;D_1 ■ D_0_ _Bacteria;D_1 ■ D_O e _Bacteria;D_1 ■ D   O     Bacteria;D   1 ■ D_O    Bacteria;D_1 (応用生物科学部藤本尚志(農学研究科　醸造学専攻)大橋陸美関口綾夏(農学研究科　醸造学専攻)松谷峰之介（生物資源ゲノム解析センター）
プラスミドとは、バクテリアや酵母に見出される染色体以外のDNA分子である。染色体とは別に自律的に複製し、分子生物学におけるベクターとして組換え生物の作出に利用される一方、環境中では宿主に新たな代謝機能を与えることも知られている。植物と同様の酸素発生型光合成を行うシアノパクテリアは、光合成のモデル生物として世界中で研究されてきた。藻類の中でも比較的増殖速度が速く、単位面積辺りのCO,固定能が植物に比べ圧倒的に高いこと、遺伝子組換えが容易であることから、近年ではバイオ燃料を始めとする有用物質生産のホストとしても改めて注目されている。淡水性シアノバクテリアSynechocystis sp. PCC 6803（以F Synechocystis）は世界で4番目に全ゲノム配列が決定されたモデルシアノバクテリアである。細胞あたり10~20コピーの染色体を有し、主染色体（3,573 kbp）の他に4つの巨大プラスミド（pSYSA、 103 kbp; pSYSG、44 kbp; pSYSM、119 kbp; pSYSX、106 kbp)を持つ（図）。Synechocystis細胞から巨大プラスミドを排除することはできないことから、巨大プラスミド上には必須機能を有する遺伝子が存在すると考えられている。このような巨大プラスミドはSynechocystis以外にも幅広いシアノバクテリア種で見出されるが、シアノバクテリアの巨大プラスミドがどのように複製され細胞内で維持されているのか、そのメカニズムは不明である。プラスミドDNAの複製開始はRepと呼ばれるタンパク質により制御されるが、その配列はプラスミドごとに異なり多様である。我々はSynechocystisの巨大プラスミドの配列情報よりRep様タンパク質を探索しCyRep (Cyanobacterial Rep-like protein)がpSYSAにコードされていることを新たに見出した。CyRepの欠損株を取得しNGSを用いて染色体と巨大プラスミドの構造を解析した結果、 CyRep欠損株では相同なDNA領域を介してpSYSAが主染色体に取り込まれていることがわかった。この結果よりCyRepはシアノバクテリアの巨大プラスミドpSYSAの複製を担う機能を有することが明らかとなった。これまでにCyRep欠損による顕著な表現型は観察されてはいない。しかしpSYSAには細菌の免疫システムであるCRISPR-casクラスターが３セットも搭載されておりSynechocystisに対しファージ等の外敵に対する防御機構を付与していると考えられる。今後、CyRep欠損株について遺伝子発現解析を行いpSYSAと染色体の融合の影響を解析するとともに、CyRepを利用したベクター系の開発に向けて研究を進めている。図シアノバクテリアSynechocystisのゲノム構造とCyRep欠損により引き起こされる主染色体と巨大プラスミドの統合渡辺  短(生命科学部　バイオサイエンス学科)荷村(松根)かおり（生命科学部　バイオサイエンス学科)
出芽や分裂によって増殖する酵母では、既知種の半数以上は有性生活環が知られていない“無性時代”である。このような“無性時代”酵母は単にクローンとして細胞分裂を繰り返し、突然変異の蓄積だけで種内や種間の多様性を獲得してきたのだろうか？ Peter et al. (2018)は、1000株以上のSaccharomyces cerevisiaeのゲノム解析から自然界では種間ハイプリッドゲノムは特殊な現象ではないと述べている。また株によって差はあるが、ゲノムには過伝子重複等ヘテロザイガスな部分が存在している（例えばShen et al. 2016)。これらを考慮すると、菌類には異質倍数体が起きることを許容する仕組みがあり、これにより生物学的多様性を獲得し環境に適応してきた可能性が考えられる。実際、子養菌酵母Candida albicansは、有性生活環が報告されていないものの、ゲノム中には交配型遺伝子が存在し、接合後4nとなるが縮小して最終的には2nとされている（Berman  &  Hadany  2012)。 Saccharomyces風のハイブリッド株では、減数分裂時のみならず体細胞分裂時のゲノムの自動縮小についてレビューされている（Sipiczki 2018)。今後これらを基盤とする多様性獲得機構や種分化について研究が進むことが推定され、分類学的に注視すべき課題である。そこで、本研究では、同一種内で形態的特徴などの表現型に差がある酵母を用いて、比較ゲノム解析や顕微鏡観察に基づき、株間の差を明らかにして種内多様性を解析するとともに、分類学的意義と理解を加えることを目的とした。今回解析に用いたCutaneotrichosporon cavernicola  (Trichosporonales目、ハラタケ亜門、担子菌類)は、我が国の各地の洞窟土壌から分離された担子菌酵母である（Takashima et al. 2020)。本種は菌糸および分節胞子を形成するが、その形成能の旺盛さは株毎に異なっている。また、一部の株はクランプコネクション様の構造や膨らんだ細胞を菌糸側部や先端に形成する形態を有しており、これらは他のTrichosporonales目の株では見られない表現性状である。Trichosporonales目菌株には、既に3株のハイプリッドゲノムが報告されているため(Sriswasdi et al. 2016、Takashima et al. 2018)、本目内のゲノムの雑持機構も興味がもたれる。加えて、洞窟土壌はリン酸化合物が多く含まれることが特徴であるため、その環境への適応も考察することとした。供試株（C. cavernicola 6株　および近縁株C. spelunceum 1株）からDNAを調製してドラフトゲノFig. 1 解析を行った株のLSU rRNA遺伝子のD1/D2領域およびITS領域に基づく系統学的位置。 (Takashima et al. (2020)のFig. 1 (b)に追記) NGRCニュースレターム解析を行ったところ、1株を除いてゲノムサイズは約20 Mbで、ゲノムが報告されている近緑の種とほぼ同じであった。現在、分子微生物学科におけるロングリードの解析を行っているところであり、ゲノム解析センターでのデータと併せてハイブリッドアセンブリを行い、比較ゲノム解析等を実施し、詳細な解析を行う予定である。