下村克己・草野成夫(果樹苗木分場)灰色かび病菌(Botrytis cinerea)胞子を免疫源として、モノクローナル抗体（MAb）を作出した。作出したMAbは, Botrytis誠以外の５歳７種の菌株胞子およびＢ.cinereaを含む８属９種の菊原糸状菌菌糸に対しほとんど反応しないことから、B.cinerea胞子に特殊的に反応すると考えられた。また、BCIP/NBT染色法による染色程度によって、Botrytis鼻の他の３種の異種菌株胞子との判別が可能であった。 [キーワード：绥色かび病菌，モノクローナル抗体，胞子，BCIP/NBT染色法] Production of Monoclonal Antibodies for Detection of Conidia of Botrytis cinerea and its Characteristics. SHI- MOMURA Katsumi,Nario Kusano (FukuokaAgric. Res.Cent.,Chikushino,Fukuoka 818-8549, Japan) Bull.Fukuoka Agric.Res.Cent.17:146-149 (1998) Monoclonal antibodies(MAbs) for detection of conidia of Botrytis cinerea were producted by using whole coni- dia of B.cinerea as an antigen to raise them. The MAbs recognized conidia of B.cinerea , but did not react with coni- dia of 7 fungi species without Botrytis and hyphae of 9 fungi species. These result suggest that our MAbs recognized conidia of B.cinerea specifically. It was possible to distinguish conidia of B.cinerea from 3 other Botrytis species by BCIP/NBT stain method using MAbs. [Key words: Botrytis cinerea, monoclonal antibody, conidium, BCIP/NBT stain method]
緒

植物病原菌の血清学的診断は、血清を利用した凝集反応法や沈降反応法を始めとして広く行われてきた61 。特に，高感度の免疫学的手法である酵素結合抗体法(ELISA)'''等の実用化により，多数の検体について簡易かつ迅速な診断を行うことが可能となった。抗体には、血消中に含まれるポリクローナル抗体 (PAb)と細胞磁合および細胞培養法によって作出されるモノクローナル抗体（MAb) 8'がある。MAbは，単一の抗原決定基とのみ反応するためPAbよりも特異性が高いとされ、ウイルス病では，系統判別にまで利用した報告もある"。また， MAbは、診断に有効な抗体を産生する細胞株を確立すれば，均質な抗体をほぼ永久的にしかも大量に得ることが可能であるという利点もある。血清学的手法による糸状菌病の診断は，一部の糸状菌で試みられている'²'ように、植物組織内の菌糸の検出も可能であり，特殊性の高い抗体が得られれば，実際の診断において大いに役立つと考えられる。しかし，診断における血清学的手法に関する検討は、Phytophthora風腐やPythium威陶等いくつかの威において抗血清を利用した手法が検討されている5'か、細菌病やウイルス病と比較すると非常に少なく、MAbについても、Fusarium属陶やPythium属菌等について複名があるものの少ない1.2.1 2) 。そこで今回は、各種作物の栽培上問題となる病原糸状階として一般的な灰色かび病園（Botrytis cinerea）の診断におけるMAbの利用の可否について検討するために、力価の高い抗体が得られなかった歯糸（下村，未発表）ではなく胞子を抗原としてMAbを作出して、その反応特異性について調査した結果を報告する。
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材料および方法
MAbの作出
免疫薬の調製(1)免疫源は，以下のようにして調製した。まず胞子は、ブドウより分離され当分場で保存したB.cinerea道株をPDA平板培地で３日間培養後、BLBランプを７2hr照射して形成させた。次に，南渡装面を滅া然留水で３回洗浄した後、２層の滅南ガーゼで南糸片等を除いて胞子態濁液を作成し、1.0×10°個/mlに調整し免疫源とした。 (2) MAb作出法定法®に基づいて，まず，０.１mlの免疫源を等量のFre- undの完全アジュバンド（FCA）で乳化して、５頭の生後８週齢のBALB/cマウスの腹腔内に投与した。その後、 10～14日間隔で0.1mlの免疫液を3回追加投与し、最終免疫から３山目に血液中の抗体価をELISA法によって測定した。次に，抗体価の上昇が確認されたマウスの脾厳細胞を摘出し、1.0 × 10 8個に調整した。それと並行して，対数増殖期のマウス由米のミエローマ細胞（P3- X63-Ag8-U1）を1.0 × 107個に調整し、ポリエチレングリコール（分子鼠1,000）でマウスの脾臓細胞と融合させた。その後，融合細胞を対数希釈法により希釈し， NUNC社製の96穴平底マイクロタイタープレート（以下マイクロプレート）に１穴当たり１～２個まき込んだ。その後，コロニーを形成したものをスクリーニングし、クローニングを２～３回行ってMAbを産生する融合細胞株を確立した。 (3)スクリーニング法の検討スクリーニングは、マイクロプレートを利用した直接ELISA法で行った。ELISA法におけるコーティング操作とプロッキング操作の検討は，スクリーニングを行う前に，免疫したマウスから採取した抗血清を100倍希釈して行った。コーティング操作は，マイクロプレートに免疫源を直接固相化する方法と事前にリジン処理を行う方法で検討した。また，ブロッキング操作は，PBSで0.5％に調整したウシアルプミン血清（BSA）とPBSで10倍希釈したブロックエース（UK – B25，大日本製薬）の2種類で検討した。 MAbの特性2 (1) MAbのアイソタイプ作出したMAbのアイソタイプは、ZYMED社製モノクローナル抗体アイソタイピングキットを用いて調査した。 (2) MAbの最適希釈濃度MAbは，融合細胞の培養上消を塩析法'⁰'で精製し, 0.05％アジ化ナトリウムを加えて４℃で保存した。精製したMAb溶液の最適希釈濃度は，500倍，1,000倍， 1,500倍，3,000倍，5,000倍，10,000倍に希釈した抗体液と免疫源を用いてスクリーニング法に準じて調査した。
MAb反応特異性調査法の検討
シ
BCIP/NBT法は，DIBA®やTISSUE  PRINT®で利用される染色法である。DIBA法やTISSUE  PRINT法では、ニトロセルロース製のメンプレンシートに吸着させた抗原に反応した抗体を染色し、その程度によって診断する。したがってこれらの方法も、ELISA法と同様に支持体への抗原吸着の程度が，染色程度に大きく影響するため，今回のB.cinerea胞子に対する抗体の反応特異性調査には適さないと考えられた。そこで，支持体への吸着を必要としない違心操作を利用した染色法を試みた（第1 1対）。
MAbの反応特異性
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(1)供試菌株MAbの反応特異性を検討するにあたっては，農林水産省農業生物資源研究所から分譲された菌株MAFF 410003を標準菌株として，また，九州大学から分譲された薬剤（チオファネートメチル剤）感受性の異なる2南株を供試し、免疫潔以外のB cinerea南株に対する反応を調査した。他威菌株に対する反応は，免疫源のB cinerea胞子と形態が同様のVerticillium属菌を始め形想や色が異なる胞子を有するAlternaria属菌やFusarium厩南等７鳳の病原糸状菌菌株について調査した。また，免疫源と同属界種の資株に対する反応は，簡酵研究所から分譲された３種の南株(B.allii, B.fabae, B.tulipae)について調査した。なお，供試菌株の詳細は以下の通りである。 Botrytis cinerea (苗木分場) Botrytis cinerea (MAFF 410003,農林水産省) Botrytis cinerea TM-S（九州大学） Botrytis cinerea TM-R ( " ) Botrytis allii (IFO No.9430,醜酵研究所) Botrytis fabae (IFO No.7171,魔酵研究所) Botrytis tulipae  (IFO No.5896, 腕静研究所) Alternaria mali (苗木分場) Cladosporium fulvum (苗木分場) Gibberella zeae (苗木分場) Gibberella fujikuroi (苗木分場) Fusarium oxysporum f.sp.asparagi (苗木分場) Fusarium oxysporum f.sp.melongenae (苗木分場) Verticillium sp. (苗木分場) Aspergillus niger  (苗木分場) Sclerotium cepivorum（苗木分場） (2)　各種病原糸状菌菌糸および腔子に対する反応供試した各種病原糸状菌菌糸および胞子の懸濁液は，各種病原糸状菌をPDA平板培地で培養した後，菌糸は採取した困難を超音波破砕して，慰子は免疫頒胞子懸濁液の調製に準じて調製した。そして，その懸濁液を遠心操作を利用したBCIP/NBT法により染色し，MAbの反応特異性を調査した。 BCIP/NBT染色法を用いた灰色かび病菌胞子検出の手順
結
果
1コーティング操作におけるリジン処理は，抗原の吸着を促進する効果があるとされている"。しかし、今回の試験では、リジン処理の検出感度向上に対する効果は,ほとんど認められなかった（第１装）。また，ブロッキング剤の検討では，0.5％BSAは非特異反応が強かったのに対し、10倍希釈プロックエースでは非特異反応が低く抑えられた（第１変）。以上の結果を踏まえたスクリーニング法により、待ら
れた融合細胞から，免疫源のB cinerea胞子に反応するMAbを産生する融合細胞株３株（E12, C72, C7)を選抜した（データ路）。 2
MAbの特性
作用したMAbのアイソタイプは、いずれもIgMタイプであった（データ略）。また、特製したMAb溶液の最適希釈濃度は、E12は1,000～1,500倍，C72は1,000 ～ 1,500倍，C7は1,500～ 3,000倍程度であると考えられた（第２図）。したがって，MAb反応特異性調査については、３株の吸光度で共通して高い値が得られた1,500倍希釈液で検討した。 m
MAb反応特異性調査法の検討
写真１は、E12のMAbを用いた場合のB.cinerea胞子染色像である。MAbを分注した胞子は、対照であるMAb分注なしの胞子と比較して，明らかに強く染色された。このことから、本染色法により作出した抗体の反応特異性を調査することが可能と考えられた。 4
MAbの反応特異性
（1）各種病原糸状菌菌糸に対する反応作IIしたMAbは、B.cinereaを含む８属９種の病原糸状菌菌糸に対しほとんど反応しなかった（第２表）。 (2)他属の病原糸状菌胞子に対する反応作出したMAbは，Botrytis属以外の５属７種の菌株胞子に対しほとんど反応しなかった(第３表) (3)　同属発糠菌株胞子に対する反応BCIP/NBT染色法による染色程度によって，Botrytis威の他の３種の発種菌株との判別が可能であった（第３表)。特に、C7は、E12およびC72と比較して染色程度の違いがより明瞭であった（第３表）。
+++:非常に強く染色された。 + + :強く染色された。 + :寒色された。主:染色されたが薄い。 - :染色されず。

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スクリーニング法の検討
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スクリーニングは，最終的な使用方法に準じて行うのが望ましいとされている。しかし、多数の融合細胞から日的とする抗体を産生する細胞を効率的に遵抜するには、 ELISA法が最も簡便で効率的な場合が多く，実際に広く利用されている。したがって、今回のMAb作用に当たっては，ELISA法でスクリーニングを実施した。一般に，ウイルス等微小な抗原蛋白質をELISA法で検出する場合,そのコーティング操作は，サンプル汁液を直接コーティングする方法が用いられている。しかし、抗原が胞子のように大きな蛋白質組織の場合は、ELISA法における洗浄操作での脱落が懸念される。そこで，リジン前処理による抗原の吸潜向上を図ったが，その効果は認められなかった。この理由としては、B.cinerea艶子の大きさや形状が関与していると考えられるが，この点については，リジン以外の抗原吸着向上法と合わせて今後検討する必要がある。また，ブロッキングは，抗体の非特殊的な吸着を防ぐ上で重要な操作の一つであり，使用に適する試薬は免疫に用いた抗原や手法によって異なるため、その橋度最適な試製を検討する必要がある。今回検討した２剤は，いずれもELISA法では，一般的な薬剤であるが， B cinerea胞子の検出には，PBSで１０倍に希釈したプロックエースが適すると考えられた。
MAbの特性
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抗体は，その大きさからアイソタイプと呼ばれるいくつかのクラスに分けられ，分子種が小さなクラスに属する抗体ほど特異性が高いとされている100 。また，そのアイソタイプは，免疫期間の長短に関係があるとされ，免疫初期はIgE，その後免疫期間が長くなるにつれ，IgMからlgGへとクラススイッチする'⁰'。このことから，今回待られた抗体がすべてlgMタイプであったのは，免疫
期間が約５週間と短かかったためと考えられた。
MAb反応特異性調査法の検討
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BCIP/NBT法により胞子を直接染色する方法は, B.cinerea胞子の同属異極菌株の料定も可能であると考えられ、MAbの反応特異性調査法として十分有効であると考えられた。また，抗体を利用して胞子を染色する方法としては、蛍光抗体法4の利用も可能である。しかし、この方法は，蛍光顕微鏡等特別な器材が必要であり，光学顕微鏡を用いるBCIP/NBT法の方がより簡便で実用性があると考えられた。
MAbの反応特異性
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作出したMAbは，免疫源を含む８區９種の病所系状菌菌糸および免疫激以外の５属７種の病原糸状菌胞子とは反心しなかった。またこのMAbは，B.cinereaのチオファネートメチル耐性，感受性菌（九州大学保存株）およびB.cinerea標準南株（MAFF 410003）た（データ略）。さらにBCIP/NBT染色法による染色程度によって，Botrytis域の他の３種の異種菌株との判別が可能であったことから，作出したMAbは，B.cinerea胞子と特異的に反応し，その特異性は，B.cinerea胞子を判別するのに十分高いと考えられた。以上のことから，MAbの作出と違心操作を利用したBCIP/NBT法による胞子の検出は，B.cinerea酷子を判別するのに十分有効であると考えられ，また，この予法は，他の病原糸状菌にも心用可能であると思われた。