寺脇　正剛大阪市立大学大学院医学研究科分子病態学Key words :オートファジー，好中球，炎症
箱 富
好中球は生体内に侵入したバクテリアを食食により取り込み、細胞内で産生される活性酸素やファゴリソソーム内における消化により殺菌することで、感染初期における生体防御を担っている。しかし感染の負荷が非常に高い場合には、好中球はNETosisとよばれる細胞死を誘導し、顆粒内のミエロベルオキシダーゼやエラスターゼとともに自らのクロマチンDNAを放出して細菌を物理的に捕捉するとともに、殺菌していることが報告された［1］。このようにNETbsisは感染初期の生体形側において第一線の役割を担っているが、一方でNETosisにおいて放出されるプロテアーゼとクロマチンDNA複合体（NETs）が、DAMPs（Danger-Associated Molecular Patterns）として認識され、敗血症や自己免疫疾患、血管炎などの炎症性疾患の病態形成や増悪に関与していることが示唆されている［2］。これらNETosisの関与が指摘されている疾患の病態解明や治療法の開発にはNETosisの詳細な分子機序の解明が必要であるが、いまだNETosisの分子メカニズムには不明な点が多い。これまでにNETbsisの進行過程においては活性酸素の産生によるPAD4 (Peptidylarginine Deiminase 4)の活性化がヒストンのシトルリン化を誘導することで、クロマチンDNAがほどけた状態になること［3］、また核膜のみならず全ての細胞内小器官が最終的に消失し、クロマチンDNAが細胞膜を破って放出されるが、この過程にはオートファジーの機構が関わっていることなどが報告されている［4］。我々は抗原提示機能がもっとも高いとされる樹状細胞におけるオートファジーの制御機構について研究を行ってきた。この研究においてマウスの骨髄細胞から液性免疫応答において重要な働きを持つIL-4の存在下で誘導した樹状細胞ではオートファジー活性が亢進しており、MHCクラスII分子への内在性抗原の提示や、プルセラ菌などの細胞内寄生細菌に対するゼノファジーが促進されることを見出した［5］。Rufy4はは隔離膜の伸長やリソソームのトラフィッキングを制御しており、オートファジー活性の亢進はRufy4と既知のオートファジ一誘導機構との相乗作用によるものであると考えられる[6]。一方、好中球ではRufy4はIL-4刺激と関係なく定常的に発現しているが、その生理学的意義は明らかになっていない。Rufy4 は隔離膜伸長促進とリソソームの集積を惹起するという非常にユニークな機能を持っていることから、本研究ではオートファジーの関与が指摘されている細胞死NETosisに著目し（図1）、NETosisにおけるRufy4の生理学的機能、さらには炎症性疾患への関与について検討することを目的として、研究をおこなった図1. NETosisの進行過程において予測されるオートファジーとRufy4の寄与NETosisにおいては最終的に核酸をはじめとした細胞内小器官が全て消失するが、それにはオートファジー機構が関与していることが指摘されている。Rufy4はその機能から大規模な細胞内成分の分解を促進する役割があると予測される。
1.  Rufy4遺伝子欠損好中球におけるNETbsisの誘導
野生型およびRufy4欠損マウスにカゼインを細胞回収の24時間前と4時間前の2回腹陸内投与し、非暖染性の好中球を誘導した。カゼイン投与マウスの腹腔を2% FCS含有PBSにて洗浄し、浮遊細胞を回収した。腹腔枕浄液から遠心にて回収した細胞を63% Percollに重層して密度勾配遠心にて分離したのち、混入した赤血球を溶血させて得られた細胞画分を好中球として単離した。好中球の純度はサイトスピンサンプルのメイギムザ染色により、常に95%以上の純度であることを確認している。この初代培養好中球を無血清RPMI培地に懸濁し100 nMのPMAもしくは25 μ M A23187 (カルシウムイオノフォア）で4時間刺激してNETosisを誘導した。4時間後細胞を4% PFAで固定し、DAPIのみ、もしくは隣委過処理を施した後に抗シトルリン化ヒストン抗体、抗好中球エラスターゼ抗体およびDAPIにて染色し、スライドグラスに封入した。 NETosisの誘導は蛍光顕微鏡によるイメージングにより解析した。
2.  NETs付随エラスタ一ゼ活性の測定によるNETbeisの定量
NETbsisの誘導は不均一であることが知られており、またNETbsisが誘導された好中球をイメージングから定量的に解析するのは難しい。今回我々はNETosisによって放出されるNETsに付随するエラスターゼ活性を生化学的に定量することによりRufy4の欠損がNETosisに与える影響について検討をおこなった。1.と同様にマウスから好中球を単離し、PMAもしくはA23187でNETbsisを誘導した。4時間の葉剤処理後上清を除去し、細胞を2回洗浄して、分泌もしくは通常の細胞死に起因する語雛エラスターゼを除去した。その後S7ヌクレアーゼを含む酵素液を加えてNETsのクロマチンDNAを1時間分解処理したものをNETs付随エラスターゼのサンプルとして得た。このサンプルをエラスターゼの人工基質である(Z-Ala-Ala-Ala-Ala) 2Rh110に加えて反応させ、蛍光強度からエラスターゼ活性を測定した。
箱　具
1.  NETbsisの誘導におけるRufy4欠損の影響
PMAにより刺激された野生型マウス由来の好中球では、クロマチンDNAを大きく放出するNETosisが認められた。 Rufy4久損マウス由来の好中球でも分葉核が消失しNETosis検の細胞死は誘導されるものの、形成されるNETsが顕著に縮小していた（図2A）。一方、A23187で誘導したNETosisでは両者に顕著な差は認められなかった。図2A.  Rufy4欠損好中球におけるNETosisの誘導野生型マウス由来（左）およびRufy4次損マウス由来（右）の好中球を100 nM PMAにより刺激しNETosisを誘導した。NETosisに伴って放出されたNETs（クロマチンDNA）をDAPI染色により可視化した。低頻度で誘導されるNETosis陽性細胞を公正に比較するため低倍率かつシグナルを飽和させて撮影している。スケールバーは、100 μ m。次に細胞染色により、野生型およびRufy4欠損好中球におけるNETosis関連因子の動態について検討をおこなった。その結果、Rufy4欠損好中球ではヒストンH3のシトルリン化が低下しており、大部分のエラスターゼがDNAとともには放出されず、細胞内に残存している様子が観察された（図2B)。野生型（上段）およびRufy4次損（下段）好中球を100nM PMAにより刺激しNETosisを誘導した。細胞は固定後抗シトルリン化ヒストン(CitH3) 抗体、抗好中球エラスターゼ(ELA2)抗体、およびDNAをDAPIにて染色し、共焦点蛍光顕微鏡にて観察した。緑: CitH3、赤: ELA2、青: DAPI。スケールバーは、10 μ m。
2.  NETs付随エラスターゼ活性の測定によるNETbeisの定量
イメージング解析より、Rufy4欠損マウスではNETosisは開始されるものの、放出されるNETsの量が減少していることが示唆された。これを定量的に評価するため、NETsの構成成分であるクロマチンDNAに付随して放出される好中球エラスターゼの活性の測定をおこなった。その結果S7ヌクレアーゼ依存的に検出されるエラスターゼ活性、すなわちNETs付随エラスターゼの活性は、 Rufy4欠損マウスでは有意に減少しており、イメージングのデータで認められたNETosisに伴って放出されるNETsの減少が裏付けられた（図3)。図3.好中球エラスターゼの活性測定によるNETsの定量NETbsisを誘導した野生型（WT）およびRufy4欠損（KO）好中球を洗浄後にS7ヌクレア一ゼ処理を行い（S7+)、 NETsに由来するエラスターゼの人工基質に対する活性を測定した。平均値土S.D.、* P < 0.05、Welch’s t test。 NETosisにおいては、核膜をはじめ最終段階では全ての細胞内小器官が消失することから、大規模分解系の関与が示唆される。これまでの研究でもNETosisの誘導導過程においてはオートファジーにおける隔離膜と同様の脂質二重膜が出現することが報告されており、オートファジーの分子機構がNETosisの進行に寄与していることが強く示唆される。本研究では、免疫系において特異的に機能するオートファジー制御因子Rufy4が好中球においても発現していることから、 Rufy4がNETosisの進行過程において重要な役割を持っているという可能性について検討した。その結果、Rufy4欠損マウスに由来する好中球ではPMA刺激によって分葉核が消失しNETosis様の細胞死は誘導されるものの、放出されるNETsの量は顕著に減少していた（図1、3)。またRufy4欠損好中球ではエラスターゼの放出も抑制されていることから（図2）、Rufy4はNETosisの開始には必要ではないが、 NETsの形成と放出の前段階として必須となる核や細胞内顆粒といった細胞内小器官を形成する酸成分の除去に関与していると推察される。 Rufy4欠損マウスの作製にあたり、東京都医学総合研究所花粉症プロジェクトの廣井隆親先生、および同研究所動物実験開発宝の設楽浩志先生、山口碧様に多大なる御協力を頂きました。また本研究に御支援を賜りました上原記念生命科学財団に深謝申し上げます。 1） Brinkmann V, Reichard U, Goosmann C, Fauler B, Uhlemann Y, Weiss DS, Weinrauch Y, Zychlinsky A. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 2004 Mar 5;303(5663):1532-5. PMID: 15001782 DOI: 10.1126/science.1092385 2)  Jorch SK1, Kubes P.An emerging role for neutrophil extracellular traps in n noninfectious disease. Nat Med. 2017 Mar 7;23(3):279-287. PMID: 28267716 DOI: 10.1038/nm.4294 Wang Y, Li M, Stadler S, Correll S, Li P, Wang D, Hayama R, Leonelli L, Han H, Grigoryev SA, Allis CD, Coonrod 3) SA. Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation. J Cell Biol. 2009 Jan 26;184(2):205-13. doi: Epub 2009 Jan 19. PMID: 19153223 DOI: 10.1083/jcb.200806072 Remijsen Q, Vanden Berghe T, Wirawan E, Asselbergh B, Parthoens E, De Rycke R, Noppen S, Delforge M, 44) Willems J, Vandenabeele P. Neutrophil extracellular trap cell death requires both autophagy and superoxide generation. Cell Res. 2011 Feb;21(2):290-304. Epub 2010 Nov 9. PMID: 21060338 DOI: 10.1038/cr:2010.150 5） Terawaki S, Camosseto V, Prete F, Wenger T, Papadopoulos A, Rondeau C, Combes A, Rodriguez Rodrigues C, Vu Manh TP, Fallet M, English L, Santamaria R, Soares AR, Weil T, Hammad H, Desjardins M, Gorvel JP, Santos MA, Gatti E, Pierre P. RUN and FYVE domain containing protein 4 enhances autophagy and lysosome tethering in response to Interleukin 4. J Cell Biol. 2015 Sep 28:210(7):1133-52. PMID: 26416964 DOI: 10.1083/jcb.201501059 6)  Terawaki S, Camosseto V, Pierre P, Gatti E. RUFY4: Immunity piggybacking on autophagy? Autophagy. 2016;12(3):598·600. PMID: 26760128 PMCID: PMC4836005 DOI: 10.1080/15548627.2015.1136772