富田　泰史弘前大学大学院医学研究科循環器腎臓内科学講座Key words：冠撃縮、カルシウム、Aキナーゼアンカータンパク
箱 富
冠撃縮性狭心症は冠動脈平滑筋の収縮刺激に対する過剰反応を特徴とする。平滑筋の収縮に重要なPhospholipase C (PLC)が活性化されると、細胞内カルシウムイオン濃度が上昇する。我々はこれまでにPLC-delta1に焦点を当て、様々な視点から冠撃縮のメカニズムについて研究を行ってきた［1～4］。さらに、冠撃縮性狭心症患者の遺伝子解析により、PLC-delta1活性を亢進させる遺伝子変異（R257H）を見出し、変異型PLC-delta1を血管平溶筋特異的に過剰発現させたマウス（PLC-TGマウス）を作製した。このマウスにアゴニスト（エルゴノピン）を投与すると、体表面心電図にてST上昇が観察され、またアゴニスト刺激による冠動脈撃縮が観察された。これらから、このPLC-TGマウスは臨床例に即した冠撃縮性狭心症動物モデルであることを報告した[5]。 Aキナーゼアンカータンパク（A kinase anchoring proteins, AKAP）、特にAKAP79/150は、シグナル伝達経路においてPLCの下流に位置するプロテインキナーゼC（PKC）に結合し、細胞外からのカルシウムイオン流入調節に重要な役割を担っている[6]。我々はAKAP79/150の冠撃縮における役割を検討するため、PLC-TGマウスとAKAPノックアウト(KO)マウスを交配し、PLC過剰発現かつAKAP79/150蛋白が発現していないマウス(PLC-AKAP-KO)を作製した。予想に反し、PLC ·AKAP ·KOマウスではエルゴノピン投与によるST上昇が全く抑制されず、さらにAKAP-KOマウスにおいてもPLC-TGマウスと同様のST上昇が観察された。重要な知見として、AKAP-KOマウスの大動脈平滑筋細胞では、アゴニスト刺激による細胞内カルシウム濃度の上昇は野生型マウスの平滑筋細胞と同等であり、全く亢進していなかった。すなわち、AKAP-KOマウスでは細胞内カルシウム濃度上昇の亢進を伴わずに、カルシウム感受性の亢進により冠撃縮が誘発された可能性が考えられた。さらにβ遮断薬であるカルベジロールは、カルシウム感受性の主要な物質であるカルモジュリンキナーゼⅡ（CaMKⅡ）を抑制すると報告されている[7]。臨床現場では冠撃縮性狭心症患者にβฤ斯薬の単独投与は禁忌であるが、カルベジロールの冠撃縮に対する効果は全く検討されていない。本研究では冠撃縮におけるカルシウム感受性亢進の関与を明らかにし、さらにカルベジロールの冠撃縮に及ぼす影響について検討した。
方炭
1. AKAP-KOマウスにおける冠準縮の誘発
AKAP-KOマウスに経静肌的にエルゴノピン（30mg/kg）を投与し、体表面心電図による心電図変化（心拍数やST T変化、房室プロック）により冠撃縮誘発の有無を検討した。 2. 細胞内カルシウム濃度ならびにCaMKII発現の検討野生型マウスとAKAP -KOマウスの大動脈を速やかに摘出し、Explant法により血管平滑筋細胞を培養した。アセチルコリン刺激による細胞内カルシウム濃度上昇をFura 2により測定した。さらにカルシウム感受性関連物質であるCaMK IIの遺伝子発現ならびに蛋白発現をReal-time RTPCR法ならびにWestern blot法にて検討した。
3. AKAP -KOマウスにおける冠準縮に及ぼすカルベジロールの影響
AKAP-KOマウスを用いて、経静肌的エルゴノビン（30 mg/kg）投与により誘発された冠撃縮が、カルベジロール(19 mg/kg/日、ミニポンプAlzet model 2002、DURECTにより14日間投与）により抑制されるかどうかを、三種混合麻硝薬（塩酸メデトミジン＋ミダゾラム＋酒石酸プトルファノール）による麻酔下で、体表面心電図による心電図変化により検討した。さらにCaMK II抑制作用を有さない他のβ遮断薬（プロプラノロール10 mg/kg/日、Alzet model 2002により14日間投与)を用いて同様の実験を行い、β適斯薬による冠撃縮抑制がカルベジロール特有の効果である可能性を検討した。
4. AKAP6遺伝子変異の検討
冠蝶縮性狭心症患者より得られたゲノムDNAを使用し、AKAP5 (マウスのAKAP79/150に相当)の遺伝子変異を検討した。AKAP5遺伝子は1,282塩基のエクソン1個からなり、3個のprimer setにてAKAP遺伝子エクソンの全領域を検討可能である。直接DNAシーケンス法にて、冠蝶縮性狭心症患者群ならびにコントロール群で遺伝子変異の有無を比較検討した。変異が存在した場合には、アミノ酸置換を伴う遺伝子変異（non-synonymus substitution）かどうかを検討した。
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1. AKAP・KOマウスにおける冠帯縮の誘発
AKAP-KOマウスにエルゴノピンを投与したところ、体表面心電図にてST上昇が観察された（5匹中4匹でST上昇あり） (図1)。一方、野生型マウス（n=5）では全てのマウスにおいてST上昇は観察されなかった（p<0.05 カイ2汞検定)。図1.  AKAP-KOマウスにおけるエルゴノビン投与によるST上昇エルゴノビン投与前མ)エルゴノビン投与後のST上昇（赤）とPQ延長（黒） b)
2. 細胞内カルシウム濃度ならびにCaMKII発現の検討
AKAP-KOマウス由来の血管平滑筋細胞では、アセチルコリン刺激による細胞内カルシウム濃度の上昇は、野生型マウス由来の血管平滑筋細胞と同等であった（AKAP-KO110±14 nM vs野生型111±19 nM、n =5、p =ns)。 AKAP -KOマウスの血管平滑筋細胞におけるCaMKIIの遺伝子ならびに蛋白発現は、野生型マウスと比較していずれも有意に増加していた（図2）。図2.  AKAP-KOマウス由来の血管平滑筋細胞におけるCaMK II発現a) CaMKII遺伝子発現b) CaMKII®白発現2群問の比較は、unpaired Student's t testで行った。
3. AKAP-KOマウスにおける冠準箱に及ぼすカルベジロールの影響
カルベジロールをAKAP-KOマウスに投与し冠撃縮を誘発したところ、6匹中3匹でST上昇が抑制された。一方、 β遮断薬であるプロプラノロールをAKAP-KOマウス（n＝5）に投与しても、全てのマウスにおいてST上昇が抑制されなかった(p < 0.05カイ2乗検定)。
4. AKAPが遺伝子変異の検討
冠撃縮性狭心症患者62名ならびにコントロール群64名より得られたゲノムDNAを使用し、AKAPsの遺伝子変異を検討した。冠撃縮性狭心症患者7名ならびにコントロール群5名に203番目のアミノ酸置換を伴うヘテロ遺伝子変異（イソロイシン→スレオニン）を認めた（図3）。さらにコントロール群１名では、同部位のホモ遺伝子変異を認めた(2群問にはカイ二乗検定による有意差なし)。さらに、遺伝子変異を伴う冠撃縮性狭心症患者では71％ (7名中５名)に多枝冠撃縮を認めたが、遺伝子変異を伴なわない冠撃縮性狭心症患者では51％（55名中28名）に認めるのみであつた。
図3. AKAP5遺伝子解析
a）野生型では608番目の塩基はTである。203番目のアミノ酸はイソロイシンである。 b） 608番目の塩基がT→Cに変異している。203番目のアミノ酸置換を伴うヘテロ遺伝子変異(イソロイシン→スレオニン)を認めた。
AKAP蛋白は細胞内カルシウム動態ならびに血管トーヌスに関与している。 AKAP KOマウスの血管平滑筋細胞では、アセチルコリン刺激による過剰な細胞内カルシウム濃度の上昇は観察されなかった。一方、カルシウム感受性関連物質であるCaMK IIは過剰に発現していた。すなわち、AKAP KOマウスでは過剰なCaMK IIの発現によってカルシウム感受性が亢進し、結果として冠撃縮が引き起こされるという新たな機序が示唆された。カルベジロールはCaMK II活性を抑制することが報告されている[7]。AKAP-KOマウスで誘発された冠撃縮が、細胞外からのカルシウム流入増加を伴わずに CaMKII活性亢進に依存するとすれば、理論上カルベジロールは有効である。本研究では、カルベジロール投与により冠撃縮誘発が抑制され、一方、カルシウム感受性抑制作用を有さないβ遮断薬であるプロプラノロール投与では、冠撃縮は抑制されなかった。これまでカルベジロールの冠撃縮に対する効果は全く検討されておらず、本研究の成果は新しい作用機序に基づく新たな治療法の開発に寄与する可能性がある。臨床的にもカルシウム拮抗薬抵抗性の離治性冠壊縮性狭心症患者は少なくなく、その機序解明ならびに治療法の開発への応用が今後期待される。 AKAP5の遺伝子解析では、203番目のアミノ酸置換を伴う変異が同定された。しかし、冠蝶縮性狭心症群とコントロール群において、同遺伝子変異の頻度に有意差を認めず、AKAP5遺伝子変異の冠撃縮への直接的な関与の可能性は低いのかもしれない。しかしこの遺伝子変異は、突然死のリスク因子である多枝撃縮に関与している可能性が考えられた。冠撃縮による突然死予防は、臨床的にも極めて重要であり、さらなる解析を進めている。本研究の共同研究者は、弘前大学大学院医学研究科循環器腎臓内科学講座の花田賢二助教、西崎公貴、成田憲紀であ☆ 1) Okumura K, Osanai T, Kosugi T, Hanada H, Ishizaka H, Fukushi T, Kamada T, Miura T, Hatayama T, Nakano T, Fujino Y, Homma Y. Enhanced phospholipase C activity in the cultured skin fibroblast obtained from patients with coronary spastic angina: possible role for enhanced vasoconstrictor response. J Am Coll Cardiol. 2000 Nov 15;36(6):1847-52. PMID: 11092655 DOI: 10.1016/S0735-1097(00)00966-9 2) Nakano T, Osanai T, Tomita H, Sekimata M, Homma Y, Okumura K. Enhanced activity of variant phospholipase C-delta1 protein (R257H) detected in patients with coronary artery spasm. Circulation. 2002 Apr 30;105(17):2024-9. PMID: 11980680 DOI: 10.1161/01.CIR.0000014613.36469.3F 3) Tomita H, Sasaki S, Osanai T, Nakano T, Higuma T, Yokoyama J, Hanada H, Yasujima M, Okumura K. Mutational analysis of Kir6.1 in Japanese patients with coronary spastic angina. Int J Mol Med. 2006 Oct;18(4):589-91. PMID: 16964409 DOI: 10.3892/ijmm.18.4.589 Murakami R, Osanai T, Tomita H, Sasaki S, Maruyama A, Itoh K, Homma Y, Okumura K. p122 protein 4) enhances intracellular calcium increase to acetylcholine: its possible role in the pathogenesis of coronary spastic angina. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2010 Oct:30(10):1968-75. PMID: 20634475 DOI: 10.1161/ATVBAHA.110.203083 5) Shibutani S, Osanai T, Ashitate T, Sagara S, Izumiyama K, Yamamoto Y, Hanada K, Echizen T, Tomita H, Fujita T, Miwa T, Matsubara H, Homma Y, Okumura K. Coronary vasospasm induced in transgenic mouse with increased phospholipase C-61 activity. Circulation. 2012 Feb 28;125(8):1027-36. PMID: 22265909 DOI: 10.1161/CIRCULATIONAHA.111.064303 4 6) Scott JD, Santana LF. A-Kinase Anchoring Proteins: Getting to the heart of the matter. Circulation. 2010 Mar 16;121(10):1264–1271. PMID: 20231544 DOI: 10.1161/CIRCULATIONAHA.109.896357 7) Li X, Matta SM, Sullivan RD, Bahouth SW. Carvedilol reverses cardiac insufficiency in AKAP5 knockout mice by normalizing the activities of calcineurin and CaMKII. Cardiovasc Res. 2014 Nov 1;104(2):270-9. doi: 10.1093/cvr/cvu209