土壌DNA抽出キットISOILニュアル（第3版） Code No.316-06211 NIPPON GENE CO., LTD.

I 製品説明
ISOILは土壌サンプルからDNAを抽出するためのキットです。特別な組成の抽出液により、非火山灰土壌はもちろん、これまで困難とされてきた火山灰土壌からもDNAの抽出が可能です。 ISOILではDNAの抽出方法として界面活性剤存在下での加熱抽出法を採用しています。物理的な力を加えることなく土壌中のDNAを抽出するため、高分子のDNAを得ることができます。したがって、ISOILで抽出した土壌DNAは、メタゲノムライブラリーの構築等、遺伝子資源としての利用に適しています。ただし、強固な細胞壁を持つ微生物等は破砕されない可能性がありますので、あらかじめご了承ください。 PCR-DGGE解析等を用いた土壌微生物の群集構造解析および土壌DNAの定量による土壤バイオマスの推定等には、ビーズ破砕法によるISOIL for Beads Beatingをご使用ください。

II キット内容
*  :   Lysis Solution 20SおよびPurification Solution中に結晶が析出する場合がありますが、品質、性能に問題はありません。このような場合には、容器ごと65℃程度でインキュベートし（ときおり混和する）、結晶を完全に溶解させてからご使用ください。
III 保存
ISOILに含まれる試薬はすべて室温保存が可能です。ただし、Precipitation Solution、 Wash Solution、 Ethachinmateについては、使用時のコンタミネーション（カビや雑菌等の混入）に十分注意し、開封後は低温（2～10℃）で保存することをお奨めします。
IV 使用上の注意
本品は試験研究用試薬ですので、医薬品、その他の目的にはご使用になれません。 .試薬についての基本的な知識のある方以外は取り扱わないでください。 .本品のお取り扱いは、マニュアル記載内容通りに行ってください。 .マニュアル記載内容と異なったお取り扱いによるトラブルにつきましては、弊社では.責任を負いかねます。本品は、東京大学TLOが所有する特許のライセンスを受けて製造販売しております。 .
V プロトコル
＜本品以外に必要な試薬、機器など＞
• 70%エタノール・クロロホルム・マイクロピペット・ピペットチップ・2mlマイクロチューブ・インキュベーター •マイクロ遠心機・ボルテックスミキサー
＜標準プロトコル＞
①　0.5 gの土壌サンプルを２mlチューブに入れる。 ②） 950 μ 1のLysis Solution HEと50 μ 1のLysis Solution 20Sを添加し、転倒混和にて十分に混合した後、65℃で1時間インキュベートする(注1)。 ③　遠心（12,000×g , 1分間,室温）する。 ③　上清600 μ 1を新しいチューブに移し、400 μ 1のPurification Solutionを添加し、十分に混合する。 600 μ 1のクロロホルムを添加し、15秒間ボルテックスした後、遠心(12,000×g, 15分間, ⑤室温）する。 ⑥　中間層を入れないように注意しながら水層800 μ lを新しいチューブに移し、800 μ lのPrecipitation Solutionを添加して十分に混合し、遠心(20,000×g, 15分間, 4℃)する(進2 )。 ⑦）上清を捨て、1mlのWash Solutionを加えて数回転倒混和し、遠心（20,000×g, 10分間, 4℃）する(注2)、(注3)_ ⑧）上清を捨て、1mlの70%エタノールと2 μ 1のEthachinmateを加えてボルテックスした後、遠心（20,000×g, 5分間, 4℃）する(注2)、(注4)。 ⑨　上清を捨て、風乾した後、沈殿を100 μ 1のTE（pH8.0）に溶解する。 (注1）途中で転倒混和することで、土壌DNAの収量が増加します（データ集5参照)。ローテーター等が準備できる場合には、穏やかに回転させながらインキュベートすることをお奨めします。 (注2)　ご使用の遠心機の最大遠心力が20,000×gよりも小さい場合は、遠心機の最大遠心力（だたし12,000×g以上）で遠心してください。 (注3)　できるだけ上清を取り除いて下さい。上清に含まれる箸色物質（腐植物質）はPCRを阻害することが知られています。また、腐植物質のコンタミネーションが少ない場合（クロロホルム処理後の水層の着色が少ない場合）は、⑦の操作を省略しても構いません。 (注4)　70%エタノールにEthachinmateを加えることで、土壌DNAを安定して回収することができます。ただし、何らかの理由でEthachinmateを添加されない場合は、ボルテックスを避け、転倒混和によって穏やかに沈殿を洗浄してください。
＜スケールアップについて＞
ISOILでの土壌DNA抽出はスケールアップが容易です。クローニングやライプラリーの構築等、高分子の土壌DNAが大量に必要な場合には、スケールアップして抽出することをお奨めします。スケールアップの際には以下の点に注意してください。 1. Lysis Solution HEとLysis Solution 20Sの比は必ず95：5にする。 2.標準プロトコル④の遠心上清とPurification Solutionの比は必ず6：4にする。 3.クロロホルムの添加量は標準プロトコル④の遠心上清と等量にする。 4. Precipitation Solutionの添加量はクロロホルム処理後に回収した水層の量と等量にする。
スケールアップ例：土壌5gからのDNA抽出（10倍スケール）
①　5gの土壌サンプルを50ml遠心チュープに入れる。 ② 9.5mlのLysis Solution HEと0.5mlのLysis Solution 20Sを添加し、転倒混和にて十分に混合した後、穏やかに振とうしながら65℃で1時間インキュベートする。 ②遠心（5,000g, 10分間, 25℃）する。 ④　上清6mlを新しいチュープに移し、4mlのPurification Solutionを添加し、十分に混合する。 (5) 6mlのクロロホルムを添加し、転倒混和にて均一になるまで十分に混合した後、遠心(5,000×g, 15分間, 4℃)する。 ⑥　中間層を入れないように注意しながら水層8mlを新しいチューブに移し、8mlのPrecipitation Solutionを十分に混合し、遠心（9,000×g, 30分間, 4℃）する。 ①　上清を捨て、10mlのWash Solutionを加えて数回転倒混和し、遠心(9,000×g, 10分間, 4℃)する。 ⑧　上清を捨て、10mlの70%エタノールと10 μ lのEthachinmateを加えて転倒混和した後、遠心（9,000g, 10分間, 4℃）する（注1）。 ⑨　上清を捨て、風乾した後、沈殿を500 μ 1のTE（pH8.0）に溶解する。 Ethachinmateは最終溶液100 μ 1に対して1〜2 μ 1で十分です。Ethachinmateを添加(注1)しすぎると溶液の粘度が増し、以後の操作に支障をきたす場合があります。

1．各種土壌サンプルからのDNA抽出
本キットを用いて3種類の土壌からDNA抽出を行った結果、いずれの土壌からもDNAを抽出することができた。 Lane 1. OneSTEP Marker 1 （λ / HindIII digest) Lane 2. 東大弥生圃場対照区土壌(アロフェン質黒ボク土/火山灰土壌) Lane 3. 埼玉農試畑土壌(灰色低地土/非火山灰土壌) Lane 4.兵庫農試森林士壌（褐色森林士／非火山灰土壌） 0.5gの土壌から抽出したDNAの1 / 10量を1% Agarose Sで電気泳動した。
2.土壌DNAのサイズ
本キットを用いて抽出した土壌DNAを0.5% Agarose Hで電気泳動した。その結果、抽出された土壌DNAは50kb以上であった。 Lane 1. Marker 7GT  (166, 50, 42, 23, 21, 18, 10, 1.3 kb) Lane 2. 東大弥生圃場対照区土壌から抽出したDNA
３．PCRによる系統群の検出
系統群検出用プライマーを用いて、本キットで抽出した土壌DNAのPCR解析を行った結果、様々な系統群由来のDNA断片が検出された。 Lane 1. OneSTEP Ladder 100 Lane 2.   Bacteria（723 bp） Lane 3. Bacillus species and relatives(600 bp) Lane 4. High-G+C gram-positive bacteria(542 bp) Lane 5. Streptomyces species and related taxa( 1,243 bp) Lane 6. Fungi, protists, and green algae(555 bp) Lane 7.  Plants(597 bp) PCR産物の一部を2% Agarose Sで電気泳動。
プライマー参考文献：
Small-Scale DNA Sample Preparation Method for Field PCR Detection of Microbial Cells and Spores in Soil. Kuske CR, Banton KL, Adorada DL, Stark PC, Hill KK, Jackson PJ. Appl Environ Microbiol. 1998 Jul 1;64(7):2463-72.
4．土壌DNAの制限酵素消化
本キットで抽出した土壌DNAを制限酵素EcoR Iで消化した。 Lane 1. OneSTEP Marker 1 （λ / HindIII  digest) Lane 2. 東大弥生圃場対照区土壌DNA intact Lane 3. 東大弥生圃場対照区土壌DNA / EcoR I Lane 4. 埼玉農試畑土壌DNA intact Lane 5. 埼玉農試畑土壌DNA / EcoR I Lane 6. 兵庫農試森林土壌DNA intact Lane 7. 兵庫農試森林土壌DNA / EcoR I
5．65℃インキュベート中の撹拌と土壌DNAの収量
65℃インキュベート中の撹拌と土壌DNAの収量について検討した結果、インキュベート中に転倒混和することでDNAの収量が上がることがわかった。 Lane 1. OneSTEP Marker 1 （λ / HindⅢ digest) Lane 2. 60分間静置Lane 3. 30分間隔で転倒混和Lane 4. 20分間隔で転倒混和Lane 5. 10分間隔で転倒混和
6．土壌DNAのPCR-DGGE解析
本キットで抽出した土壌DNAを用いてPCR-DGGE解析を行った。 Lane 1.東大弥生圃場対照区土壌Lane 2. 東大田無農場牧草地土壌Lane 3.千葉農試森林土壌Lane 4. 草地試験場永年探草地土壌Lane 5.埼玉農試畑土壌Lane 6.兵庫農試森林土壌データ提供：東京大学大学院農学生命科学研究科応用生命化学専攻頼泰樹博士
土壌は様々な鉱物、粘土などの無機物、様々な植物および植物遺体、腐植物質をはじめとする土壌有機物、そしてそこに生息する多様な微生物から成り立っています。そのため、一つとして同じ土壌はないと言えます。本キットは現在までの試験の結果、日本の数十種類の様々なタイプの土壌からDNAが抽出できることを確認していますが、土壌は極めて多様なサンプルであることから、土壌の種類や状態によっては収量が上がらない可能性があります。本キットで抽出した土壌DNAの収量が少ない場合、試薬や操作上の問題だけでなく、土壌サンプルが他にはない特異な性質を有している可能性も考慮してください。