1．はじめに
アメーバ運動は接着性真核細胞が一般に行う運動株式であり株々な生命現象において重要であることが分かっている。実際，原生動物アメーバの移動だけでなく，多細胞生物の発生過程(Jaglarz & Howard 1995, Blaser et al. 2006, Terayama et al. 2013)やや,外傷の修復(Nuccitelli 2003, McCaig et al. 2009, Zhao 2009), 免疫細胞の移動(Lin et al. 1998, Loosley et al. 2015), 癌の転移(Friedl & Wolf 2003, Sahai & Matshall 2003, Wolf et al. 2003, Pinner & Sahai 2008) などでこの運動が観察されている。これまで，アメーバ運動の駆動力は伸長中の仮足前端でのアクチン重合による(アクチン重合駆動型アメーバ運動)と考えられてきた(図1A: Mitchison & Cramer 1996, Ridley et al. 2003,  A Parent 2004, Pollard & Borisy 2003)。しかしながら近年,アクチンダイナミクスに依らない運動様式が発見された(図 1B: Charras et al. 2008, Fackler & Grosse 2008, Paluch & Raz 2013)。この運動様式はプレプ駆動型アメーバ運動といわれ，三次元マトリックスや組織中を移動する細胞でしばしば観察され,好中球(Mandeville et al, 1997) や癌細胞(Sahai & Mashall 2003, Wolf et al. 2003),始原生殖細胞(Blaser el al. 2006)等の移動において重要であるという報告がなされている。本稿ではこのプレプ駆動型アメーバ運動機構メカニズムに関して近年,我々が開発した試験管内再構築系の話題も含めて説明する。
2．ブレブ形成と細胞機能
プレプとは細胞表層部のアクトミオシンの収縮力によって形成される, “細胞膜の球形の突出”を指す。現在，プレプ形成の機構は下記の様に考えられている(図2: Charras & Paluch 2008, Fackler & Grosse 2008)。(1)細胞表層部分に存在するアクチンとミオシン(アクトミオシンコーテY. Nishigami, H. Ito, & M. Ichikawa-1ックス)が収縮することで細胞内静水圧を上昇させ(1)る。(2)予定突出部位でアクトミオシンコーテックスが細胞膜から乖離する(Cunningham 1995)。もしくはアクトミオシンコーテックスの一部が破壊される(Keller & Eggli 1998, Paluch et al. 2005)。 (3)(2)により強(3)度が低下した部分に(1)の静水圧によって細胞質が(4)流入し，細胞膜が押し延ばされ細胞膜が突出する。 (4)突出後の細胞膜にアクトミオシンコーテックスを再構築後，突出が縮退する。このようにプレプは葉状仮足や糸状仮足(アクチン重合により駆動される)などのよく知られた細胞膜突出構造とは異なる形成機構を持つ。プレプ形成は細胞分裂(Tokumitsu  & Maramorosch 1967, Fishking et al. 1991, Hickson et al. 2006, Sedzinski et al. 2011) や細胞伸展(Erickson & Trinkaus 1976, Bereiter-Hahn et al. 1990),  ウイルスに感染した細胞(Mercer & Helenius 2008),アポトーシスのexecution phase(Robertson et al. 1978),高浸透圧ショックを与えた細胞(Ruan et al. 2015),一様な化学誘引物質溶液中の細胞性粘菌(Langridge & Kay 2006)など様々な細胞で確認されており,いくつかの過程では重要な役割を果たしている事が分かっている。例えば，細胞分裂においてはプレプ形成によって，細胞表層の収縮力を弱めることで分裂装置を赤道面に保持する事に役立っている(Sedzinski et al. 2011)。また，高浸透圧ショックを受けた際には，プレプ形成を起こすことで細胞の浸透圧耐性を上昇させる(Ruan et al. 2015)。
3.ブレブ駆動型アメーバ運動
3 – 1 . 運動機構
プレプ形成と同様の機構で細胞の重心が移動する場合をプレプ駆動型アメーバ運動と呼ぶ(通常のプレプ形成と異なり，上述の過程(4)膜突出縮退過程はない)。このような機構は原生生物アメーバの運動機構として20世紀初頭から提唱されてきた。Mast (1926)は大型の自由生活型アメーバであるAmoeba proteus (〜500 μ m)やChaos carolinense (〜5000 μ m)を用いて,その細胞内流動の観察や仮足形成部位での細胞表層構造(プラズマゲルシート)の崩壊と再構築を観察し、プレプ駆動型アメーバ運動と同様の機構でアメーバが動いている事を提唱している。電子顕微鏡 (Stockem  et  al.  1982) や蛍光修飾アクチンを用いた研究 (Pomorski  et  al. 2007)からも同様の事が示唆されており，運動が細胞内静水圧によって駆動されている事も示されている(Kamiya 1964, Yanai et al. 1996)。また，ヒトに対して病原性を持つアメーバEntamoeba histolytica (Maugis et al. 2010)や，アクチン駆動型アメーバ運動研究のモデル生物として用いられてきた細胞性粘菌においても，プレプ駆動型のアメーバ運動機構の存在が知られている(Yoshida & Soldati 2006)。この運動機構は単細胞生物のアメーバ運動だけでなく，多細胞生物における細胞運動でもY. Nishigami, H. Ito, & M. Ichikawa-2親察される。発生において始原生殖細胞が生殖腺へ移動する事はよく知られているが，この細胞を単離するとプレプ駆動型の仮足形成をみせる(Terayama et al. 2013)。また，胚における始原生殖細胞の動きをライプ観察することで，生体内でもこの機構が重要である事が示されている(Blaser et al. 2006)。ショウジョウバエを用いた実験でも良く似た結果が得られている(Jaglarz & Howard 1995)。この過程では，プレプ駆動型アメーバ運動に加えアクチン重合駆動型の運動も確認されており(Trinkaus 1973, Diz-Muñoz et al. 2010),発生段階ではこれら二つの機構を使いながら細胞の移動は起こっていると考えられている(Paluch et al. 2013)。癌の浸潤や転移には癌細胞の運動能力が重要である。癌細胞は細胞外マトリクス中をアメーバ運動で移動することが分かっている(Friedl & Wolf 2003)が，その運動様式はアクチン重合によるもの(Cramer 1999, Rohatgi et al. 1999)とプレプ駆動によるもの(Sahai & Marshall 2003, Wolf et al. 2003, Pinner & Sahai 2008) の二つが存在している。特にこの癌細胞におけるプレプ駆動型アメーバ運動は抗がん剤処理した細胞で確認されている(Friedl & Wolf 2003, Sahai & Marshall 2003, Wolf et al. 2003, Pinner & Sahai 2008)。また，一部の細胞では基質との結合に接着班を持たず細胞膜全体で接着しているものも確認されている(Bergert et al. 2015)。上述したように単純なプレプ形成とプレプ駆動型アメーバ運動の違いは，後者には膜突出後の縮退過程がなく，そのまま重心の移動が起こるという点である。このような事が起こるためには突出した細胞膜にアクトミオシンコーテックスが再構築されない。もしくは再構築されても一度破壊されると再破嫌がおこりやすいという性質を持つ必要がある(Charras & Paluch 2008, Paluch & Raz 2013)。この原因となる細胞内の不均一性因子としてはこれまでに細胞外からのカルシウムイオンの部分的な流入(Blaser et al. 2006)や細胞内のERMタンパク質(ezrin, radixin, moesin )等のアクチンと細胞膜を結合させるタンパク質の局在(Rossy et al. 2007, Martinelli et al. 2013) などが報告されている。
3−2．試験管内再構築系を用いた研究
3 − 2 − 1. 細胞膜を持たない試験管内再構築系上述のようにプレプ駆動型アメーバ運動は様々な細胞で観察され，多くの生命現象において重要であることが分かっているが，その機構の詳細に関しては不明な点が多い。この理由としてはこの運動が細胞全体の関与する複雑な運動であるという事が挙げられる。この複雑なプレプ駆動型アメーバ運動の本質を取り出して，その機構を理解することを目的に，筆者らはこの運動を試験管内で再構築することを試みた。これまでに，プレプ駆動型アメーバ運動の駆動力源であるアクトミオシン系を脂質二重層(リポソーム)に封入した系は存在するが(Takiguchi et al. 2008, 2011, Tsai et al. 2011, Carvalho et al. 2013),これらの系は活発に変形する事はなかった。我々は常にプレプ駆動型アメーバ運動で移動する自由生活型アメーバAmoeba proteus由来のミオシンを用いることで，アクトミオシン系で活発に運動する試験管内再構築系を初めて作製する事に成功した(Nishigami et al. 2013)。この系ではアクトミオシン懸濁液を細胞抽出液中に注入することでアクトミオシン懸濁液がアメーバ様の運動を行った(図3)。電子顕微鏡観察，アクチンの蛍光観察の結果，アクトミオシン懸濁液と細胞抽出液の界面にアクトミオシンが高密度に凝集・収縮し，この構造の破漿によって仮足様構造の形成が誘導され，重心移動が起こることが分かった。このような事から，この再構築系は前述のプレプ駆動型アメーバ運動とよく似た機構で動いているという事が分かった。 ✓懸濁液を細胞抽出液中に注入するとアクトミオシン懸濁液がアメーバ様の運動を行う。赤・黄・青はの順番で形成された仮足様構造を色ものである。 m. Nishigami et al. (2013)より改変し
3-2-2.細胞質ゾル-ゲル分布機構
プレプ駆動型アメーバ運動に伴い，細胞は新たに伸長する仮足に細胞質を流動させる必要がある。したがって細胞質ゲルは部分的にプル化する必要がある。大型の原生生物アメーバでは運動に伴い明確な細胞質内のゾル-ゲル分布が確認される(Mast 1926, Allen 1973, Bovee & Jahn 1973)。この細胞の細胞質ゲルは細胞表層部分に分布し，その内部を細胞質ソルが仮足伸長方向へ活発に流動する(図4)。流動したゾルは仮足前端部分においてはゲルに変換される。このように，プレプ駆動型アメーバ運動においては細胞質ブルとゲルの分布が移動方向や外部の環境等に応じて時空間的に正確な制御を受けていることが重要である。もし細胞質が均質であれば細胞はアメーバ運動を行うことができない。さらに，細胞質のブル-ゲル状態はカルシウムイオンによって担われている事が試験管内の実験より明らかになっていいろ(Janson & Taylor 1993)。これらのことから，生体くの細胞管ノル-ゲル分布細胞表層部に細胞質ゲルが分布し,その内部を細胞質ゲルが運動方向へ流動していく内においてもこの制御機構にはカルシウムイオンが重要であると考えられてきた。しかしながら，大型アメーバの生体内におけるカルシウムイオンの分布に関しては統一した見解が得られていない。実際，細胞後端部分でカルシウムイオン濃度が高いという報告(Gollnick et al. 1991, Kuroda et al. 1998, Taylor et al. 1980),や前端部分で高いという報告(Taylor et al. 1980),細胞全体で低濃度である(Cobbold, 1980)といった種々の報告がある。そこで,我々はプル-ゲル変換の制御に関して，上述の試験管内再構築系を用いてタンパク質物性という異なる側面からの解明を試みた。細胞を模したサプミリメートルオーダーの細い流路中で再構築系の運動を制御し,その際のアクトミオシン懸濁液の動きを解析した。その結果，一様なアクトミオシン懸濁液を流動させているにも関わらず, Y. Nishigami, H.部分に滑り面が流速が下見す(2013)上り改家流路の中心部分のみがゾルとして流動し，流路の壁近傍付近はゲル様の振る舞いをみせるという事がわかった(図5)。つまりアクトミオシン懸濁液におけるプル-ゲルの分布は，カルシウムイオン濃度が一様であっても，そこにかかるずり応力だけで細胞様に自律制御されうることが示唆された。また，細胞内においても同様に流動特性を測定すると，モデル系と相似な流動パターンがみられ，さらにノル化が起こる部分のずり歪の値も再構築系より測定された値に近いものが得られた。従って，生体内においても，“応力によるプル化”というプル-ゲル変換が起こっていることが示唆された。この仮説は従来の細胞内シグナリングを介した細胞質のゾル-ゲル変換という概念とは異なり，細胞に加わる局所的な応力に対して、タンパク質構造体の物理化学的な応答を利用してプル-ゲル変換を行うという新しい概念である。
3-2-3. 脂質一重膜を持つ試験管内再構築系
上述の系では細胞膜非存在下でプレプ駆動型アメーバ運動様の動きを誘導することに成功した。この運動はアクトミオシン懸濁液の表面に高濃度のアクチンフィラメントが集積し実現したと考えられるが、実際の細胞では細胞膜に結合するアクチンコーテックスがこの役割を果たしていると考えられる。そこで細胞サイズの脂質一重層(ドロップレット)にアクトミオシンを封入した。条件検討の結果，脂質一重層が収縮と緩和を繰り返す(振動モード)系を作製することに成功した(図6: Nishigami et al. 2015)。揺らぎ解析よりこの膜変形は熱揺らぎとは著しく異なる性質を持っていた。振動モードは10秒程度の短い時間スケールで起こる現象である一方で，この系トミオシンんを封入すると界面が振動し·乱層に'目'自見られた(矢じり)。この運動は10秒程度の時間スクBar = 10 um.を10分程度の長い時間スケールでみると，振動モードとは異なる，脂質一重層のしわ構造が成長するモードが存在する事が分かった。この変形モードは脂質一重層の表層と結合したコーテックスの収縮によって駆動されており，プレプ駆動型アメーバ運動とよく似た駆動力発生機構を持っている。このしわ構造と脂質一重層ドロップレットのサイズを比較すると，その凹み幅はドロップレットのサイズに正の相関があり，凹み深さは負の相関がある事が分かった(図7: Ito et al. 2015)。この変形は，コーテックスの弾性と収縮性を考慮した物理モデルを用いて説明する事が出来た。以上の0 s 300 s 600 s 1800 s結果は，膜直下でアクトミオシンコーテックスが収縮した場合，その構造が置かれた場の形状に応じて，最終的に発現する形状が変化する事を示している。つまり，細胞で考えると、コーテックスの物理的性質として，細胞の局所形状に応答し分程度の長い時間文指導一重層にアク( )ルでは、界面に凹凸が出来る現象が見られた。 Bar = 10 um. Ito et al. (2015) より改変して転載。て収縮形状が決まっていく可能性が示唆される。このことは，従来の細胞内シグナリングにY. Nishigami, H. Ito, & M. Ichikawa-5よる運動制御に加えて，細胞の曲率や形状といった物理的なパラメータが運動性という機能に直接かかわっている可能性を示しており，まったく新しい切り口と言えるだろう。
4.おわりに
プレプ駆動型アメーバ運動は様々な細胞で行われており，多くの生命現象において重要であることが分かってきた。しかしながらこの機構が複雑であるために,依然不明な点が多い。我々はこの運動の試験管内再構築系を作製し，運動の本質を取り出した単純な系を用いてこの運動機構の理解を深めることに成功した。また，これらの系の解析から新規のソル-ゲル変換機構やアクトミオシン系が場の形状依存的に変形を起こすことが明らかにした。今後は,実際の生細胞の細胞形状とその時間発展を詳細に調べることで，これらの実験から得られた物理モデルが生細胞に如何に寄与しうるかを検証する必要がある。本稿で紹介した試験管内再構築系を用いたアプローチを通じて，細胞が不定形の不可思議な形をしながらその形状を外的・内的環境に応じて変化させ，さらに一つの生命として統合され生きている原理を知ることが出来ると期待している。
5．引用文献
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