深田　俊幸徳島文理大学寒学部寒学科Key words：必須微量金属、亜鉛シグナリング、亜鉛トランスポーター、骨格筋、皮膚
精 官
本研究の動機は、亜鉛トランスポーターから放出される亜鉛イオンが、カルシウムイオンのように細胞内シグナル因子として機能すること（亜鉛シグナリング）[1]、この亜鉛シグナリングが、骨格筋と皮膚の維持に重要であることの発見にある。具体的には、転移がんの増殖拡大に伴って産生される炎症性サイトカインによって、亜鉛トランスポーターZIP14が骨格筋で発現し、ZIP14の亜鉛シグナルが筋萎縮（がん悪液質）をもたらすことを見出した。この結果は、 ZIP14の亜鉛シグナルが「がん悪液質の病態形成に関与する」ことを示している［2］。一方、亜鉛トランスポーター ZIP10を介する亜鉛シグナルが表皮の形成に必須であること、アトピー性皮膚炎患者の皮膚では、ZIP10の発現が顕著に減少していることを発見した［3］。すなわち、ZIP10の亜鉛シグナルが「機能的な表皮の形成に必要である」ことを示唆している。上記の知見は、亜鉛シグナリングが骨格筋と皮膚の維持に関与することを明示している。実際に、成人の総亜鉛量の約 70%が背格筋と皮膚に存在し、その量は加齢に伴って減少して、亜鉛の減少とサルコペニアや褥瘡等の老齢性疾患との関連性が報告されている。しかしながら、「亜鉛シグナリングはどのように骨格筋や皮膚の維持に貢献し、その異常はどのように病気を発症させるのか」については、まだ十分に解明されていない。一方、高齢化が進む日本では、有効な治療法が少ないロコモティプ症候群等の運動機能障害や、皮膚脆弱化によるQOLの低下が問題視されている。すなわち、骨格筋および皮膚の形成と維持の機序解明と、既歯疾患の予防と治療に係る方法の開発は、今後迎える超高齢化に備えるべき急務な課題であると考えた。以上を背景として、骨格筋と皮膚に関連する事象の理解とそれらの病気の治療戦略に対し、亜鉛シグナリングという従来とは異なるアプローチから挑むことを目的として本研究を遂行した。現時点において、ZIP10またはZIP14を発現する細胞を追跡できる遺伝子改変マウスを完成した。さらに、亜鉛シゲナリングの標的分子を単離する実験系を構築した。加えて、亜鉛シグナリングに影響を及ぼす化合物のスクリーニング系を確立した。これらの研究資材は、骨格筋と皮膚の理解と疾患の治療法開発に新しい知見をもたらす可能性があると考える。
方　炭
1. 筋装縮におけるZIP14の役割解明
筋萎縮におけるZIP14の役割を解明するために、ZIP14発現細胞の特徴と、ZIP14を介する亜鉛シグナリングの機序を解析した。ZIP14発現細胞の特徴を解析するために、EGFP-IREScreERT2遺伝子カセットをZip14プロモーター下流に挿入（KI）したZip14-GFPKIマウスを作製した。 ZIP14を介する亜鉛シグナリングの機序を解明するために、Zn 2+  conditional proteomics法（AIZin-2試薬を用いて亜鉛イオンと相互作用するタンパク質をFITCで標識する）を薬剤誘導性ZIP14発現HEK293細胞に適用した。具体的には、ZIP14の発現に依存して細胞内に導入した亜鉛イオンと相互作用するタンパク質を検出するために、AIZin-2試薬を用いたZn 2+ conditional proteomics法を薬剤誘導性ZIP14発現HEK293細胞に適用して、ZIP14の発現に依存した細胞内の蛍光発色の検出を試行した。
2. 表皮形成におけるZIP10役割解明
表皮形成におけるZIP10の役割を解明するために、ZIP10発現細胞の特徴を解析した。具体的には、Zip10プロモーター下流に EGFP-IRES-CreERT2違伝子カセットをKIした Zip10-GFPKIマウスを作製した。ZIP10発現細胞とその子孫細胞を可視化するために、Zip10-GFPKIマウスとtdTomatoKIマウスを交配してZip10-GFP?TomatoKIマウスを作製した。本マウスのZIP10発現細胞には、タモキシフェン依存的に活性化するCreERT2が発現するため、当該マウスをタモキシフェンで処理すると、ZIP10発現細胞では遺伝子組換えが生じてTomatoを発現する。従って、本マウスを用いることにより、ZIP10発現細胞の子孫細胞を赤色に発光させることが可能となる。本マウスにタモキシフェンを投与し、皮膚におけるGFPとTomatoの発現を免疫染色法で解析した。
3.倉庫購達研究
薬剤誘導性ZIP14発現HEK293細胞を適用して、ZIP14の発現に依存した亜鉛導入に伴う細胞増殖能の変化を指標にした化合物スクリーニング系の構築を試行した。
結果および考察
1.筋装糖におけるZIP14の役割解明
1) ZIP14発現細胞の特徴解析Zip14-GFPKIマウスを作製し(図1a)、このZip14-GFPKIマウスに由来する細胞を用いてGFPの発現状況を精査した。具体的には、ZIP14を高発現することが知られている肝臓由来の初代培養肝細胞におけるGFPの発現状況をFACSで解析した。その結果、Zip14-GFPKIマウス由来の肝細胞では、GFP陽性の細胞集団が確認された(図1b)。現在、Zip14-GFPKIマウスとtdTomato KIマウスを交配してZip14-GFP/Tomato KIマウスを作製している。 Zip14- GFP/Tomato KIマウスは、がん悪液質の病態形成時におけるZIP14発現細胞の特徴と連命系譜の解析に適用する。図1. Zip14-GFPKIマウスの作製と初代培養肝細胞におけるGFPの発現a） Zip14-GFPKIマウスのZip14豊伝子座の構造を示す。 EGFP-IRES-creERT2遺伝子カセットをZip14遺伝子座のエクソン3（ex3）に挿入した。 b） Zip14-GFPKIマウス由来の初代培養肝細胞におけるGFPの確認
2)  ZIP14を介する亜鉛シグナルの機序解明
ZIP14 を介する亜鉛シゲナルの機序を解明するために、Zn 2+conditional proteomics 法を薬剤誘導性 ZIP14 発現HEK293細胞に適用して、ZIP14依存的に導入した亜鉛イオンと相互作用するタンパク質の検出を試行した。具体的には、AIZin 2試薬で薬剤誘導性ZIP14発現HEK293細胞を処理し、ZIP14の発現誘導に依存した細胞内の蛍光発色を検出した（図2）。図2. ZIP14依存的に導入された亜鉛イオンと相互作用する分子の検出a）テトラサイクリン(Tet)を処理した薬剤誘導性ZIP14発現HEK293細胞に発現誘導されるZIP14をFACSで検出した。 b） ZIP14の発現依存的に細胞内に導入した亜鉛イオンをFluozin 3で検出した。 c） AIZin-2武薬を適用して、ZIP14依存的に亜鉛イオンと相互作用するタンパク質を検出した。
2. 表皮形成におけるZIP10役割解明
ZIP10発現細胞の子孫細胞を可視化するために、Zip10-GFPKIマウスとtdTomatoKIマウスを交配してZip10- GFP/Tomato-KIマウスを作製した（図3a）。本マウスのZIP10発現細胞には、タモキシフェン依存的に活性化されるCreERT2が発現する。当該マウスをタモキシフェンで処理すると、処理期間以降に遺伝子組換えが生じて、ZIP10発現細胞の子孫細胞はTomatoを発現して赤色発光する（図3b）。したがって、本マウスはZIP10発現細胞とその子孫細胞の可視化に有効である。本マウスにタモキシフェンを投与し、皮膚におけるGFPとTomatoの発現を免疫染色法で解析した。その結果、タモキシフェンで処理した本マウスの皮膚では、本来ZIP10が発現する毛包外根鞘（図3c右、 3d左）とは異なる部位に、Tomatoの発現を確認した（図3d右）。すなわち、ZIP10発現細胞の子孫細胞が、毛包外根籍以外の部位に移動していることが示唆された。 a） Zip10-GFPKIマウスおよびZip10-GFP/Tomato KIマウスの遺伝子座の構成を示す。 Zip10- GFPKIマウスは、EGFP-IRES creERTz遺伝子カセットをZip10遺伝子座のエクソン2 (exon2)に挿入して作製した（上）。 b）タモキシフェン（Tamox）処理によるTomatoの発現機構c） Zip10-GFPKIマウスの毛包外根鞘におけるGFPの発現d) Zip10-GFPTomatoKIマウスの皮膚におけるGFPの発現（左）とTomatoの発現（右）皮膚の広域な部位にZIP10発現細胞の子孫細胞（Tomato発現細胞）が存在することが示されたことから、ZIP10発現細胞の子孫細胞が皮膚組織の形成や維持に多様な役割を持つことが示唆された。実際に、ZIP10はB前駆細胞に発現することが示されており、Tomatoを発現するZIP10発現細胞の子孫細胞は血球系細胞である可能性も考えられた。今後は、Zip10-GFPTomatoKIマウスからGFPとTomatoを指標にしてZIP10発現細胞とその子孫細胞を単離し、 RNA-sequenceやsinge cell analysisで遺伝子発現を精査して、ZIP10発現細胞とその子孫細胞の特徴を解析する。
3.創業関連研究
ZIP14の発現に依存した亜鉛導入を確認するとともに (図2b)、ZIP14を介した亜鉛の導入による細胞増殖抑制作用を確認した（図4)。薬剤誘導性ZIP14発現HEK293細胞を用いることにより、ZIP14に依存した亜鉛の過剰導入による細胞増殖障害作用を指標にしたZIP14阻害剤のスクリーニング系の構築が可能になると考える。図4. 薬剤誘導性ZIP14発現HEK293細胞におけるZIP14の発現依存的な亜鉛導入と細胞増殖抑制効果薬剤（Tet）誘導性ZIP14発現HEK293細胞を適用して、ZIP14を介した亜鉛導入による細胞増殖抑制作用を確認した。Student's t-testにより解析し、p＜0.01の場合に**を表示した。
本研究は、京都大学大学院工学研究科合成・生物化学専攻生物化学講座の浜地格教授、高知大学医学部皮膚科学講座の佐野栄紀教授、徳島文理大学薬学部薬学科の原貴史講師との共同研究である。
文 歓
1) Zinc Signaling, second edition (edited by Fukada T, and T. Kambe), Springer Nature, Singapore, 2019. doi: 10.1007/978-981-15-0557-7, ISBN 978-981-15-0557-7 2） Wang G, A. Biswas, W. Ma, M. Kandpal, C. Coker, P. Grandgenett, M. Hollingsworth, R Jain, K Tanji, S Lopez- Pintado, A. Borczuk, D. Hebert, S. Jenkitkasemwong, S. Hojyo, R. Davuluri, M. Knutson, T. Fukada, S. Acharyya1. Metastatic cancers promote cachexia through ZIP14 upregulation in skeletal muscle. Nature Medicine 24: 770–781, 2018. doi: PubMed PMID: 29875463, PubMed Central PMCID: PMC6015555. 3) Bin BH, J. Bhin, M. Takaishi, K. Toyoshima, S. Kawamata, K. Ito, T. Hara, T. Watanbe, T. Irie, T.Takagishi, SH. Lee, HS. Jung, S. Rho, J. Seo, DH. Choi, D. Hwang, H. Koseki, O. Ohara, S. Sano, T. Tsuji, K. Mishima, T. Fukada. Requirement of zinc transporter ZIP10 for epidermal development: Implication of the ZIP10–p63 axis in epithelial homeostasis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 114: 12243-12248, 2017. doi: 10.1073/pnas.1710726114. PubMed PMID: 29078349; PubMed Central PMCID: PMC5699059