浜松医科大学皮膚科学講座伊藤泰介Semaphorin 3A (Sema3A) is originally found the nerve guidance molecule. Sema3A can induce growth cone collapse and axon repulsion through interaction with a neuropilin-1/plexin-A receptor complex. In AD patients, Sema3A expression is decreased in epidermis that allows higher skin innervation. In addition to the role of nerve guidance, recent studies indicate sema3A as the immunomodulator in several immune reactions. In this study, we found the novel role of sema3A in trichoimmunology via mast cell stimulation. We established B6- Tg(pK14-Sema3a)/UOEH mouse that express excess Sema3A in epidermis under K14 promotor. Interestingly, this mouse show hair loss lesion mainly on back skin. Histological analysis revealed a large number of mast cells in dermis and around hair follicles of hair loss lesions compared to healthy control and non hair loss lesion. Non hair loss lesion also shows significant infiltration of mast cells in dermis and around hair follicles compared to healthy control. On the other hand, MCP-1+ basophils are rarely found in dermis and around hair follicles. Next, we generate murine bone-marrow (BM) derived mast cells. The presence of Neuropilin-1/Plexin A1 expression was analyzed on FACScan. Furthermore, histamine releasing was studied in BM derived mast cells cultured with sema3A or PBS by ELISA. Sema3A was injected into the back skin after the induction of depilation induced murine hair cycle in order to know the affect of sema3A on murine hair cycle. In wild type C57BL/6 mice, sema3A is strongly expressed on Day8 in the depilation murine hair cycle that indicates the catagen induction by sema3A. In conclusion, sema3A may induce increasing and activation of mast cells with releasing of histamine that result in alopecic lesions in B6-Tg(pK14-Sema3a)/UOEH mouse. This study shows unique face of sema3A in trichoimmunology and skin immune systems, especially to mast cell.
1.緒言
セマフォリンはもともと中枢神経の発達に関わる神経のアクソンのガイドをする因子として報告されてきたり。それだけでなく、細胞走化性、細胞増殖やアポトーシス、心膜や腎組織、眼組織の形態形成に関与することが報告されている。セマフォリン分子群は、膜型と分泌型があり、各群で共通の構造である細胞外領域のSemaドメインがあり、それに続くＣ末端領域の構造上の特徴によって８つのサプクラスに分類されている。 I 、 II型セマフォリンは無脊椎動物に、征型はウイルスにコードされ、ほ乳類は皿から加型のセマフォリンが同定されている。分泌型はII型、 II型、種型セマフォリンであり、それ以外は１回腐貫通型蛋白である。セマフォリンの主な受容体は、plexinファミリーとNeuropilin（Nrp）ファミリーが知られている。plexinファミリーは、plexin-AからDまでの４つのサプクラスに分かれ、細胞外にセマドメインを有している。セマフォリンの多くは Semaドメインを介してplexinと結合するが、皿型セマフォリンの多くはNrp/plexin受容体複合体を介しAnalysis of the role of Semaphorin 3A in the skin and hair follicle immune systems of Sema3A transgenic mouse and exploration of novel treatments with Semaphorin 3 A Taisuke Ito Department of Dermatology, Hamamatsu University School of Medicineてシグナルを伝達する。しかしセマフォリンと受容体の結合は複雑であり、様々な結合が考えられている。plexinが細胞や組織によって様々に結合し、受容体と受容体複合体を形成することで心臓の発生過程における心臓形成、弁形成に関与している²。また骨代謝において破骨細胞の分化に関与する3 。アトピー性皮膚炎では、Sema3Aの発現量が、健常人と比較して表皮内において低下しており、その結果、表皮内に末梢神経が延長しているため、神経密度が健常人と比較して有意に高いとされる1 。そのため、かゆみ過敏や掻爬によるサプスタンスＰなどの神経伝達物質の分泌がされやすい。よってSema3Aはアトピー性皮膚炎の新たな治療薬の候補として考えられている。しかしながら、Sema3Aの皮膚における詳細な働きは未だ不明な点が多い。よって我々は、Sema3Aを過剰発現しているB6-Tg (pK14-Sema3a)/UOEHを用いて皮膚の毛髪免疫に対するSema3Aの影響を検討することとした。
2.実験
マウス：Sema３A過剰発現マウスＢ６-Tg (pK14- 2.1 Sema3a) /UOEHの樹立K14 promoterとmouse Sema3A cDNAを含むtrancegeneをC58BL/6マウスのFIの受精卵の前核に注射した。 2.2皮膚組織B6-Tg (pK14-Sema3a) /UOEHの背部皮膚病変より皮膚組織を採取し、HE染色、免疫染色に供出した。
2.3 IL-3、SCF産生量
mRNAレベルでの産生量をRealtime PCR法にて検討した。
2.4フローサイトメトリー
肥満細胞におけるNeuropilin  1発現をフローサイトメトリーにて検討した。
2.5マウス毛周期誘導
C57BL/ ６週齢マウスを外科用アロンアルファにて強制抜毛することで毛周期を誘導した。
2.6 ギムザ染色
肥満細胞を検討するため、ギムザ染色、MCP-3染色を行い、浸潤する肥満細胞数、好塩基球数を検討した。また好塩基球の浸潤をMCP-3染色にて検討した。
3.結果
3.1    B6-Tg (pK14-Sema3a) /UOEHにおける皮膚症状背部や後頚部に脱毛斑を観察した(図1a)。また同部位におけるSema3A発現は減弱していた(図1b)。
3.2肥満細胞浸潤の検討
脱毛病変部の組織検討では毛組織は萎縮し、その周囲に肥満細胞浸潤を観察した。ギムザ染色にて脱顆粒や大型の肥満細胞を観察した(図２)。
3.3  IL-3、SCF発現の検討
Wild typeのC57BL/6マウスと比較してB6-Tg (pK14- Sema3a) /UOEHでは有意に発現が亢進していた(図３)。
3.4 表皮細胞におけるNrp1発現の検討
フローサイトメトリーによって肥満細胞はNrp1発現をみた。よってSema3AのリガンドであるNrp1は肥満細胞上に発現していることから、Sema3Aが肥満細胞に何等かの影響を与えていることが示唆された(図４)。
3.5 マウス毛周期におけるSema3A発現の検討
健常C57BL/ ６マウスにおけるSema3A発現の組織における検討では、成長期においてその発現が減弱していた。一方、休止期ではその発現が亢進していた(図５)。 3.6毛周期における肥満細胞の変化とSema3Aの影響強制抜毛による毛周期において、肥満細胞は成長期ではその浸潤数が減弱するが(図6a)、そこにSema3Aを投与するとその減弱が阻止された(図6b)。
3.7 肥満細胞のSema3Aによる増殖誘導
マウス骨髓由来の肥満細胞に対してSema3Aを授与すると、その増殖数は有意に上昇した(図７)。
4.考祭
我々の実験から、Sema3Aが過剰発現することによって毛周期が乱れることが示唆された。その原因として肥満細胞の増殖による影響が考えられた。つまり、Sema3Aが過剰発現することによって、Nrp 1発現をしている肥満細胞に影響を与え増殖することがわかった。その理由として、直接的な増殖誘導とともに、表皮細胞からのStem  cell  factorなど肥満細胞増殖因子が影響を与えていると考えられた。実際、強制誘導した毛周期においても成長期にはSema3A発現が減弱していることからも想定される。またSema3Aを投与することによっても肥満細胞の成長期matrix at D3 and D8における減数が阻止されることも合わせてそれを示唆している。以上から、皮膚疾患においてはアトビー性皮膚炎のみならず、脱毛症においてもSema3Aが深く関与していることが大いに示唆された。ヒトにおいては、アトピー性皮膚炎と円形脱毛症の合併が知られているが、Sema3A発現が表皮において減弱しているアトピー性皮膚炎との整合性が問われる所であるが、表皮のみに限って減弱しているとすれば、真皮でのSema3Aの動態は異なるものと理解される。
(文　献)
1) Luo Y, Raible D, Raper JA. Collapsin: a protein in brain that induces the collapse and paralysis of neuronal growth cones. Cell 1993; 75: 217-227. 2) Toyofuku T, Zhang H, Kumanogoh A, et al. Dual roles of Sema6D in cardiac morphogenesis through region-specific association of its receptor, Plexin-A 1, with off-track and vascular endothelial growth factor receptor type 2. Genes Dev. 2004; 18: 435-447. 3) Takegahara N, Takamatsu H, Toyofuku T, et al. Plexin-A1 and its interaction with DAP12 in immune responses and bone homeostasis. Nat Cell Biol 2006; 8: 615-622. 4) Tominaga M, Ogawa H, Takamori K. Decreased production of semaphorin 3A in the lesional skin of atopic dermatitis. Br J Dermatol 2008; 158: 842-844.