1.はじめに
今日までに、多くの生物において形質転換法が開発され、遺伝子改変が可能となってきている。しかしながら、目的としないゲノム部位へのDNAの挿入や組換え効率の低さが課題であった。これらの課題を解決するため、近年、細菌のヌクレアーゼを利用したゲノム編集技術が複数確立された。なかでも、Streptococcus属のエンドヌクレアーゼCas9を用いたCRISPR/Cas9システムは最も簡便な手法であり、動物や植物など多くの生物において利用されている[1]。 CRISPR/Cas9 システムによるゲノム編集の原理を図１に示す。まず、ゲノム上の標的とする DNA 配列に相補的に結合するガイドRNA、およびその配列の直後に存在するProtospacer-associated motif（PAM）配列(NGG)に依存して、Cas9が標的配列にリクルートされる。その後、DNA二本鎖が切断され、これが非相同末端結合(non-homologous end joining: NHEJ)によって修復される際に変異が導入される。趙菌Aspergillus oryzaeは、永年にわたり日本酒・蜂油・味噌などの醸造に使用されている糸状菌（カビ）である。趨菌の遺伝子改変は、非相同組換えに関わる因子の欠損株の取得により、効率的に行われるようになった[2-4]。しかし、このような遺伝子改変は、主にゲノム解読に使用された野生株RIB40 [5]に限られ、実際に醸造で用いられる趣菌株で行うには多大な労力が必要である。我々はこの問題の解決のため、 CRISPR/Cas9システムを用いたゲノム編集技術が有効な手段であると考えられた。つい最近、他の糸状菌において、この技術による遺伝子変異株の取得が可能であることが報告された[6,7]。本研究で我々は、趨菌におけるCRISPR/Cas9システムを用いたゲノム編集技術の確立を目指した。図1. CRISPR/Cas9システムによるゲノム編集
2.方法
Cas9タンパク質を安定して発現させるため、これをコードするcas9遺伝子について、A. oryzaeの全遺伝子の中で最も発現量の多いtef1遺伝子を参考にコドン改変を行った。また、ガイドRNAにキャップ構造やポリA 鎖の付加が起こらないようにするため、この発現には核内低分子RNA (small nuclear RNA: snRNA)をコードするU6のプロモーターとターミネーターを用いた。コドン改変cas9遺伝子とガイドRNAを発現するよう精築したプラスミドにより、A. oryzaeの野生株RIB40に由来する実験室株niaD300を形質転換した。得られた形質転換体における標的配列中の変異の有無、および表現型の解析により、A. oryzaeにおけるCRISPR/Cas9システムの性能を評価した。
3.結果と考察
(1) 施蘭におけるCRISPR/Cas9システムによる遺伝子
変具株の取得
最初に、分生子（無性胞子）の色素合成に必要なwAを標的遺伝子とし、その標的配列を含むガイドRNAをcas9 遺伝子とともに発現するためのプラスミドを構築した。そして、このプラスミドにより、A. oryzae niaD300株を形質転換した。取得した形質転換体におけるwA遺伝子の標的配列を解析したところ、変異が導入された株が得られた。表現型を調べた結果、元の株の分生子は緑色であるが、取得したwA変異株の分生子は白色であったことから、色素合成能の欠損が確認された。次に、分生子の色素合成に関与する別の遺伝子yAを標的遺伝子として解析を行った。その結果、標的配列に変異が導入された株が得られ、この変異株が形成した分生子は黄色であったことから、緑色色素の合成ができなくなったことが確認された。さらに、ウリジン/ウラシル生合成に必要なpyrGを標的遺伝子として、栄養要求性株が得られるかを検討した。その結果、pyrG遺伝子に変異が導入された株が取得され、予想どおりウリジン/ウラシル要求性を示した。以上の結果から、CRISPR/Cas9システムにより、各遺伝子の変異株が取得され、それぞれの変異株は期待されたとおりの表現型を示した。
(2)変興導入効率と変異のパターン
今回行った実験において、変異株の取得率は10-20%であった。また、導入された変異のパターンについては、1塩基欠失または1塩基挿入が最も多く見られたが、一部の株で数塩基から20塩基以上の欠失も確認された。したがって、欠失や挿入によりフレームシフトが起こることで、標的遺伝子が機能しなくなったことが確認された。
4.今後の最望
本研究では、趙菌A. oryzaeの実験室株において、 CRISPR/Cas9システムを用い、複数の遺伝子を標的として変異株を取得することに成功した。よって、この技術は趨菌の様々な遺伝子の変異株取得に有効であると考えられた。現在、醸造で用いられる趨菌株において、CRISPR/Cas9システムによるゲノム編集技術が利用可能であるかどうかの検討を行っている。また、趨菌をはじめとする糸状菌は、日本の醸造と密接な関わりがある。たとえば、焼酎の製造では白麹菌と呼ぼれるAspergillus kawachii、泡盛では黒麹菌と呼ぼれるAspergillus luchuensis、醤油ではA. oryzaeのほかにAspergillus sojaeが使用されている。すなわち、日本では醸造生産物によって使用する糸状菌が様々であると言える。今後、本研究で確立したゲノム編集技術が醸造に使用されている他の糸状菌に波及すれば、より有用で多様な株の育種につながり、高品質や高機能性など従来にない醸造生産物の開発が可能になることが期待される。 [1] Doudna JA, and Charpentier E: Science, 346, 1258096 (2014) [2] Takahashi T, et al. : Mol. Genet. Genomics, 275, 460-470 (2006) [3] Mizutani O, et al. : Fungal Genet. Biol. 45, 878-889 (2008) [4] Maruyama J, and Kitamoto K: Biotechnol. Lett., 30, 1811-1817 (2008) [5] Machida M, et al.: Nature, 438, 1157-1161 (2005) [6] Arazoe T, et al .: Biotechnol. Bioeng., in press [7] Nødvig CS, et al : PLoS One, e0133085 (2015)
河部　誠・Ahmed Askora・川崎　健・藤江　誠・山田　隆広島大学大学院先端物質科学研究科  分子生命機能科学専攻  生命分子情報学G 〒739-8530 東広島市競山1－3－1   電話: 082-424-7752 Fax: 082-424-7752  E-mail: tayamad@hiroshima-u.ac.jp病原菌を自然界の天敵ファージを用いて駆除する技術（ファージセラピー、ファージバイオコントロール）の研究・技術開発が急激に進展している。すでにファージを用いた多剤耐性菌感染症治療の成功例が苦積している。農業分野でも化学農薬に代わる持続的サポート技術としてファージ剤が開発されている。本研究では、柑橘類における病害「カンキツかいよう病」の病原菌 Xanthomonas  citriを対象とした、ファージバイオコントロール技術開発を目指している。自然界より分離した多数のファージの中の一種XacN1は、巨大なMyovirusであり、そのdsDNAゲノムはPFGE解析で約390kbpのサイズを示した。このサイズは入ファージの８倍、T4ファージの2.3倍に相当し、約400個もの遺伝子をコードできる。この新規ファージについてゲノミックス、粒子プロテオミクス、ウイルス感染特性、宿主域等の解析結果を報告する。特に、バイオコントロール剤としての有用性に言及する。カンキツかいよう病は、細菌感染症であり、レモン、オレンジ等多種のカンキツ類の果実、葉、茎に病斑を形成し、商品価値を低下させると同時に樹勢を劣化させる。感染力が強く、風雨で病原菌が拡散し広く伝染する。特に高級果実には品質を激変させる深刻な病害であり、また大気温暖化に伴い病害の拡大、蔓延が危惧されている。その防除には、従来多量の銅剤の噴霧が行われてきたが、有効散布量の増大、環境汚染、健康への影響、残留農薬等の問題から、見直しを余儀なくされている。ここに病原菌に高い特異性を示す、安全な代替農薬・防除技術の開発が強く望まれている。カンキツかいよう病の病原体は、グラム陰性単極毛の桿菌Xanthomonas citri  (syn. X. axonopodis pv. citri, X. campestris pv. citri)であり、病原性の異なるいくつかの系統が知られている[1]。そこで当研究室ではX citriに高い特異性を示す天敵ファージを種々分離し、バイオコントロール技術に利用することを意図した。これまでに多数のファージを分離し、その全塩基配列の決定やゲノム解析、感染・増殖様式等の特徴付けを行ってきた[2.3]。特に、日本産温州みかんの生鮮果実の条件付対米輸出の解禁条件の一つとなっているファージテスト（43農政Ｂ第345，43農政Ｂ第1901号)に用いられるCp1, Cp2の特性を明らかにし[2]、また、感染により宿主菌の病原性を低下させる議維状ファージXacF1を分離し、ワクチンとしての利用の方向を示した[3, 4]。今回、新たに見いだしたファージXacN1は異例に大きいゲノムを有し、ウイルス学上重要な新規知見をもたらすとともに，高いバイオコントロール効果も期待される。ちなみに、ゲノムが200kbp以上のファージは「ジャンボファージ」と呼ばれ[5]、病原菌との安定的な共存から持続的コントロールの例が知られている[6]. X. ciri (MAFF株)10株を宿主として、瀬戸内海沿岸地域土壌試料からプラークアッセイ法によりファージを分離した。大型ファージ分離には上層寒天濃度0. 45%を用いた。ファージ粒子はCsC1密度勾配超遠心法による精製後、ネガティブ染色−TEM観察を行なった。 (2)ゲノム解析、マイクロアレイ解析ファージXacN1について、PFGE(CHEF)解析を行ないゲノムサイズ約390kbpを決定した。ゲノムDNA塩基配列はPacBio RSIIによって決定した。精製ファージ粒子タンパク質はSDS-PAGE分離後、各バンドを切出し, trypsin消化、LC-MS/MS(LTQ Orbitrap XL, Thermo Fisher Scientific)解析を行なった。 X. ciri (MAFF株)10株を対象に宿主域をスポット法、プラーク法で決定した。MAFF301080株を宿主としてsingle-step感染解析を行なった。レモン若葉を用いた針穿刺、浸透法による細菌感染法を用いた[3]。病班親察にはBiorevo(Keyence)を用いた。 XacN1はアッセイプレート上で明確な透明プラークを形成する。PFGEによるゲノム解析では約390kbpのサイズが得られ、これはBacillus phage G (498kbp) (GenBank JN638751)に次ぐ２番目に大きなファージゲノムサイズである。電顕像は約140nm径の正二十面体頭部と145nmの伸縮性尾部から成る myovirus 型粒子を示し（図１）、ファージとしては非常に大きい。形状はPseudomonas phage φKZ(280kbp)[7]よりもRalstonia  phage  φRSL1 (240kbp)[8]に類似していね。図1．XacN1の電頭像。大型のmyovirus型粒子が観察された。線印=100nm XacN1のゲノム全塩基配列を決定し、コード遺伝子を同定している。多くの未知遺伝子に加えて、粒子構造タンパク質、DNA複製因子、転写因子、タンパク質・核酸、糖鎖等高分子修飾酵素、糖質・脂質・ポリアミン等代謝系酵素、各種転移因子等の遺伝子が見いだされた。いくつかは宿主との特異的相互作用への関与が示唆され興味深い。巨大ファージ粒子の構成を知るためにプロテオミクス解析を行った。SDS-PAGEにより分離した全タンパク質を MS/MS 解析により遺伝子と対応づけた。粒子には300kDaを超える大きなタンパク質が複数種含まれていた。PAS 染色により主要外殻タンパク質と大型タンパク質が糖鎮を有することが判明した。原核ウイルスの樹鎖修飾は極めて珍しい。 XacN1は広い宿主域を示し、検定菌11株中9株に感染した(レモン、ネープル、イヨカン等の病原株に有効であり、Cp1, Cp2の両宿主域をカバーする[2])。 MAFF301080株を宿主とした場合、MOI=0.1の条件で~10¹⁰ pfu/mlのタイターが得られた。MAFF301080株を宿主としたOne-step増殖解析の結果、暗黒期150min、増殖サイクル300min,バーストサイズ25-30pfu/mlの値が得られた。感染サイクルの安定性は極めて高い。ジャンボファージの存在はつい最近知られ始めた。今後、ウイルス学的に新規な知見が多くもたらされるであろう。一般に、ジャンボファージは増殖速度が遅く（宿主増殖より遅い場合もある）、宿主との共存時間が長い。結果的に、持続的な病原菌細胞密度の低レベル維持（病原性発現関値以下）が可能となり，高い病害予防効果が期待できる[6]。大型粒子は環境条件下で比較的安定である。コードする多くの未知遺伝子には宿主との相互作用に働くものが予想される（溶菌酵素、遺伝子発現抑制因子、バイオフィルム分解酵素etc)。今後の詳細な解析によって，カンキツかいよう病菌の病原性のより深い理解と，それを制御する技術の開発につなげたい。カンキツかいよう病で開発されるバイオコントロール技術とその原理は、広く一般に植物病害細菌防除にも適用できる可能性がある。これは化学農薬の使用削減、生産者の省力・低コスト経営、消費者には安全・安心な農作物の提供につながり、次世代持統的農業技術として期待が大きい。 [1] Shiotani H, et al. : J. Bacteriol., 189, 3271-3279 (2007) [2] Ahmad A, et al.: Appl. Environ. Microbiol.80, 77-85 (2014) [3] Ahmad A., et al. : Front. Microbiol., 5, 321.1-321.11 (2014) [4]  特許出願：特願2014-126782 (2014) [5]    Hendrix RW : Curr. Top. Microbiol. Immunol., 328, 229-240. [6] Fujiwara A, et al.: Appl. Environ. Microbiol., 77, 4155-4162 (2011) [7] Mesyanzhinov VV, et al.: J. Mol. Biol., 317, 1-19 (2002) [8]    Yamada T, et al. : Virology, 398, 135-147 (2010)
田代幸寛・淺田実・砂掛愛・酒井謙二九州大学大学院生物資源環境科学府生命機能科学専攻土壌環境微生物学分野〒812-8581　福岡市東区箱崎6-10-1　電話: 092-642-2862 Fax: 092-642-2861  E-mail: kensak@agr.kyushu-u.ac.jp好熱細菌は、分類・生理・遺伝子が特徴的なことから幅広く研究され、産業上有用な酵素の生産菌としても用いられている。我々は、鹿児島市の都市下水終末処理における超高温堆肥化プロセスを研究対象としている。これまでに、余剰汚泥から製造された堆肥試料のみならず、常温処理された原料汚泥試料からも高度好熱細菌が検出・分離されることが明らかになり、その由来や生態分布は非常に興味深い。一方、鹿児島市には、活発な桜島の火山灰が断続的に降灰しており、地熱環境からの灰が広範に拡散していることになる。そこで本研究では、終末処理プロセスや桜島火山灰などにおける高度好熱細菌の生態分布を調査するための高感度定量法の開発を行い、新規高度好熱細菌の分離を行った。その結果、火山灰試料から2種の高度好熱細菌の分離に成功した。好熟細菌とは最適増殖温度が45°C以上または増殖限界温度が55°C以上である極限環境微生物の一種である。特に、増殖限界温度が75°C以上および90°C以上のものはそれぞれ、高度好熱細菌および超好熱細菌と定義づけられている[1]。好熱細菌は、進化系統分類、生理機能・性状、高温適温機構や遺伝子・タンパク質などが活発に調べられている他、PCR用酵素源など産業上の有用な細菌としても知られている。我々は鹿児島市における終末処理プロセス（下水処理および高温堆肥化）に着目しているが [2]、これまでに80–90°C以上の超高温で製造された堆肥肥料から新規な高度好熱菌二種（ Calditerricola satsumensis , Calditerricola yamamuraeと同定した。）が分離・系統分類されている[3]。さらに、先の研究により、常温では通常増殖しない高度好熱細菌（Calditerricola 風、 Thermaerobacter属、Caldicoprobacter属など）が堆肥試料だけではなく、原料汚泥試料（常温で処理）からも分離・検出されることを明らかにした[4, 5]。従って、常温ではほとんど増殖しない高度好熱細菌が汚泥試料に生息していることは大変興味深いが、その由来や分布は不明である。一方、鹿児島湾にある桜島は活発な火山として有名であり、ここ数年では、噴火回数は年間1000回に及ぶことから、鹿児島市には、桜島火山灰が断続的に降灰しており、地熱環境からの灰が拡散していることになる。これまでに、桜島火山灰における高度好熱細菌の生態分布調査や探索に関する報告はないが、有用な新規好熱細菌の分離も期待できる。そこで本研究では、鹿児島市の終末処理プロセスや種々の火山灰における高度好熱細菌の生態分布および分離を目的として、①高感度定量法の開発と環境試料中の高度好熱細菌分布調査への応用、②種々の火山灰からの高度好熱細菌の集積および分離、を検討した。環境試料における細菌の定量法には、直接検鏡法やプレート法があるが、簡便であるものの特異性は低い。また、近年、特異的プライマーを用いたリアルタイムPCR法による高精度定量法が報告されているが、コストが高い、プライマー設計の制限（推奨増幅領域; 80–150 bp) 、DNA抽出のバイアスによるエラーなどの問題がある。我々は、検出感度を上昇するために、最確数法を適用した PCR （MPN-PCR）法に Enrichment cultureを加えた新規eMPN-PCR法を考案した。本研究では、Calditerricola 属細菌をターゲットとして特異的プライマー（増幅領域;約650 bp）を設計した。菌数が既知であるCalditerricola sp.純粋培養液および涙菌堆肥試料に純粋培養液を加えた疑似環境試料における本法の精度および感度を検討し、終末処理プロセス試料、火山灰、温泉水、土壌などの分布調査を実施した。火山灰（桜島、御嶽山）および箱根温泉水を分雕源としてCYS培地を用いて、75°Cで24 h、静置で、集積培養を行い、CYSゲランガムプレートで純粋分離を行った。得られた分離株について、顕微鏡観察、グラム染色試験、16S rRNA遺伝子解析などによる同定・性状解析を行った。異なる菌数のCalditerricola sp.純粋培養液および疑似環境試料を用いてeMPN-PCR法で定量した結果、いずれもプレート法と同数の菌数を示し、高い相関（それぞれR²=0.994、0.999）を示した（図1）。また、本法の検出限界は10~1~10 0 (cells/mlまたはcells/g) であった。よって、環境試料におけるCalditerricola 属細菌を高精度・高感度で検出できる定量法の開発に成功した。さらに、本法を用いて種々の環境試料におけるCalditerricola 属細菌生態分布調査を行った。鹿児島市の汚泥試料（2.2×10¹~1.1×10² cells/g）、堆肥試料（7.3× 10-¹~3.3×10¹ cells/g）に加えて、他の地域の下水汚泥およびし尿処理試料から検出された。同様に、桜島火山灰中にも存在が確認された。一方、御嶽山や雲仙の火山灰からは検出されなかった。分離源に用いた試料の中で、桜島火山灰からのみCYSゲランガムプレートを用いて5株の高度好熱細菌が分離された。 16S  rRNA 遺伝子解析の結果、2 株はThermaerobacter  composti 、 3 株は Thermaerobacter marianensisと相同性を示した。特に、VB2株はT marianensisと98.99%と相同性がやや低く、グラム陽性で胞子形成能を有した。 T. marianensisは桜島火山灰とは地理的に離れたマリアナ海溝深庭泥から分離され、胞子形成能を有さないことから [6]、VB2株は異なる新種である可能性が示唆された。本研究で開発したeMPN-PCR法は高精度・高感度であり、環境試料における高度好熱細菌の正確な生態分布調査には強力なツールとなり得る。また、我々は現在、Thermaerobacter属細菌をターゲットとする高感度定量法の開発も進めている。予想とは異なり、高度好熱細菌は高温でない環境試料でも低濃度ながらも存在することが明らかとなった。鹿児島市終末処理場および桜島火山灰から分離・検出できたCalditerricola 属細菌およびThermaerobacter属細菌に関しては、それらの生態分布に関する研究はほとんど報告されておらず、今後は、対象とする環境試料を拡げてこれら高度好熱細菌の生態学的特徴を明らかにする予定である。これまでに、上記2属の高度好熱細菌の性質はほとんど分かっていない。最近、T. marianensisは耐熱性酵素N-acylhomoserine lactonaseを生産することが明らかとなり[7]、その有用性も認められつつある。さらなる新規高度好熱細菌の分離および性状解析を進め、桜島火山灰由来の高度好熱細菌が産業界に顕現されることを目指したい。 [1] 藤原伸介, et al.:生物工学, Vol.90 No.12, 701-705 (2012) [2] Kanazawa S, et al. : Soil Microorganisms, 58, 105-114 (2003) [3] Moriya T, et al. : Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 61(3), 631-636 (2011) [4] Shiotsuka H, et al.: J. Jpn. Soc. Extremophiles, 9(2), 67-71 (2010) [5] Shiotsuka H, et al. : J. Fac. Agr. Kyushu Univ., 53(2), 471–477 (2008) [6] Takai K, et al : Int. J. Syst. Bacteriol., 49(2), 619-628 (1999) [7]  Morohoshi T, et al.: J. Biosci. Bioeng., 120(1), 1-5 (2015)
鈴木　伸¹ •原　良太郎² •木野　邦器¹ ⁄ ² 1早大・先進理工・応化, 2早大・理工研〒169-8555 東京都新宿区大久保3-4-1  電話: 03-5286-3211 Fax: 03-3232-3889  E-mail: kkino@waseda.jpペプチドやアミド化合物などの有用物質を合成可能な酵素にはATPの加水分解エネルギーを利用するATP依存性酵素が多い。その利用においては高価なATPの供給が課題であり、工業化においては消費されるATPの再生系構築が重要な意味を持つ。ATP依存性酵素はATPの利用の仕方でADP生成型とAMP生成型に大別される。ADP生成型では多くのATP再生系が報告されているが、AMP生成型では複数の酵素が必要で反応系が煩雑になることから利用例が少なく、実用化もされていない。そこで我々は、AMPおよびADPの両方をリン酸化可能なポリリン酸キナーゼ(class III PPK2)に着目し、単一酵素によるシンブルなAMPからのATP再生系を検討した。さらに、本ATP再生系をAMP生成型酵素である非リボソーム型ペプチド合成酵素のアデニル化ドメインによるL-Trp-L-Pro合成反応に共役させた。AMPを初発基質とした場合もL-Trp-L-Proの合成は可能であり、class III PPK2によるAMPからのATP再生の有効性とアミノアシルプロリン合成への適用が可能であることを示した。 ATP依存性酵素は、高エネルギー化合物であるATPの加水分解反応と共役してエステル結合やチオエステル結合、アミド結合といった新しい結合の形成を触媒する酵素である。近年、ATP 依存性酵素を利用した物質生産の研究が広く行われ、ペプチドやアミド化合物をはじめとする有用物質の合成法が開発されている。しかし、多量のATPの添加は高コストとなるため、工業利用のためには反応により消費されるATPを再合成するATP再生系の構築が重要となる。 ATP依存性酵素はATPの利用方法の違いから2種類に大別されるため、それぞれに適したATP再生系を構築する必要がある。一つ目はATPからADPとオルトリン酸を生じるADP生成型であり、ADPからATPを再生する必要がある。酵素反応系においてはこの場合、ポリリン酸キナーゼ(PPK)[1]や酢酸キナーゼ[2]などを利用したATP再生系が数多く報告されている。二つ目はATPからAMPとピロリン酸を生じるAMP生成型であり、AMPからATPを再生する必要がある。この場合にはポリリン酸：AMPホスホトランスフェラーゼ(PAP)とPPKの組み合わせ[3]やPAPとアデニル酸キナーゼの組み合わせ[4]によるATP再生系が知られている。 AMPからのATP再生ではADPからのATP再生に比べて複数の酵素が必要となり、反応制御が煩雑になることが課題である。そのため、物質生産への利用例が少なく、実用化もされていない。最近、単独でAMPからATPを合成可能な酵素が報告された。そこで我々は、この酵素を用いたAMPからのシンプルなATP再生系を構築し、物質生産への利用可能性を検討した。 PPKやPAPが属するポリリン酸キナーゼスーパーファミリーの系統樹解析により、ポリリン酸をリン酸基供与体としてAMPおよびADPの両方をリン酸化可能なポリリン酸キナーゼ (class III PPK2)が報告された[5]。本酵素は単独でAMPからATPを合成可能な二機能酵素であるため、従来のATP再生系の課題であった反応系の複雑化を回避できると考えた。本研究では、class III PPK2のATP合成活性に着目し、当該酵素を用いたAMPからのATP再生と物質生産への利用を検討した。一方、我々は、AMP生成型酵素である非リポソーム型ペプチド合成酵素のアデニル化ドメインの単独利用によって、アミノアシルプロリンの合成が可能であることを報告している[6]。そこで、当該ATP再生系の本反応への適用を試みた(図1)。成class III PPK2の活性が報告されているDeinococcus radiodurans R1由来DR_0132[5]のアミノ酸配列情報をもとに、配列上の類似性とclass III PPK2の保存残基の存在を指標としてホモログタンパク質の探索を行った。その結果、D. proteolyticus MRP由来Deipr_1912を見出すことに成功した。Deipr_1912 遺伝子を大腸菌で高発現させ、His-tag付加型タンパク質として取得した。精製したDeipr_1912を用いてAMPと領長25のポリリン酸を基質としてMg²+存在下でATP合成試験を行った。HPLC分析の結果、ADPを経由したATPの生成が確認され(図2)、Deipr_1912はclass III PPK2活性を有することがわかった。そこで、本酵素によるATP再生系を物質生産に組み込み、その有効性の検証を行った。 Tyrocidine synthetase Aのアデニル化ドメインは芳香族や一部の脂肪族アミノ酸を基質として認識し、対応するアミノアシルプロリンの合成が可能である[6]。そこで、L-Trpを基質としたL-Trp-L-Pro合成反応に上記で精築したDeipr_1912によるATP再生系を共役させ、1 mMのATP或いはAMPを含む反応液で反応を行った。本来L-Trp-L-Proの生成には当量のATPが必要であるが、図3Aに示すようにATP初期添加量以上のl-Trp-l-Proの合成が確認された。また、AMPを初発基質とした場合には、再生系のない条件では反応が進行しないが、再生系を共役させることでl-Trp-l-Proの合成に成功した(図3B)。これらの結果から、class III PPK2によるAMPからのATP再生系の物質生産への有効性が確認できた。本研究では、class III PPK2を用いることで単一酵素によりAMPからATPが再生でき、さらに物質生産へ利用可能であることを示した。AMP生成型のATP依存性酵素としてANLスーパーファミリーが知られている[7]。今回検討した非リボソーム型ペプチド合成酵素のアデニル化ドメインをはじめアシルCoA合成酵素やホタルルシフェラーゼが属するこの酵素群は、カルボキシ基をアデニル化により活性化し、その後の反応でAMPを遊離する。これらAMP生成型酵素を用いた有用物質生産に対しても、本研究において開発した単一酵素によるATP再生系は適用可能であり、ATP利用型バイオプロセスの工業化に貢献できるものと考える。 [1] Sato, M, et al .: J. Biosci. Bioeng., 103, 179-184 (2007) [2] Shih, YS and Whitesides, GM : J. Org. Chem., 42, 4165-4166, (1977) [3] Kameda, A, et al.: J. Biosci. Bioeng., 91, 557-563 (2001) [4] Resnick, SM and Zehnder, AJB: Appl. Environ. Microbiol., 66(5), 2045-2051 (2000) [5]  Motomura, K, et al.: Appl. Environ. Microbiol., 80, 2602-2608 (2014) [6] Hara, R, et al. : Anal. Biochem., 477, 89-91 (2015) Gulick, AM: ACS Chem. Biol., 4, 811-827 (2009) [7]
ナノ近接場での連続酵素反応野北  昂志・一瀬 博文・北岡  卓也九州大学大学院農学研究院〒812-8581 福岡市東区箱崎6-10-1   竜話: 092-642-2994 Fax: 092-642-2994  E-mail: ichinose@agr.kyushu-u.ac.jpグリーンサスティナブルケミストリーの発展において、酵素は低環境負荷での触媒反応を可能にするため、有用物質の合成触媒として注目されている。有用物質生産へ向け、温度やpHなどの外的要因に対して鋭敏に応答する酵素活性を戦略的に制御し、効率的な多段階反応を達成することは生産プロセスの構築へ向けた重要な課題である。セルロース分解性微生物はセルロソームと呼ばれる複合体によって効率的なセルロース分解を行う。セルロソームは中核となるスキャッフォールディンにコードされたコヘシンと、酵素にコードされたドックリンが強固かつ近接場に固定化されている。本研究では、コヘシン−ドックリン間の高い親和性を活かし、コヘシン融合型グリセロールデヒドロゲナーゼとドックリン融合型アセトフェノンレダクターゼの近接固定化による連続反応を試みた。酵素触媒は優秀な基質・反応特異性、温和な化学反応といった特徴を有しており、低環境負荷かつ高効率な合成を志向した触媒として注目を集めている。酵素触媒を用いた有用物質生産へ向け、温度やpHなどの外的要因に対して鋭敏に応答する酵素活性を戦略的に制御し、高効率な多段階反応を達成することは生産プロセスの構築へ向けた重要な課題である。ところで、 Clostridium thermocellumに代表されるセルロース分解性嫌気生物はセルロソームとよばれる複合体によって効率的なセルロース分解を行う。セルロソームは中核となるスキャッフォールディンにコードされたコヘシンと、酵素にコードされたドックリンが特異的に結合している。近年、この相互作用を利用した種々の応用研究が行われている(1)。本研究では、コヘシン−ドックリン間の特異的な相互作用を活かして、グリセロールデヒドロゲナーゼ(GDH)およびアセトフェノンレダクターゼ(APRD)など、至適pHの異なる複数酵素の近接固定化による協調的触媒反応を目指した (Scheme 1)。 Clostridium thermocellumのコヘシンと、Escherichia coli  DH5α由来GDHを融合した配列の遺伝子、ドックリンとGeotrichum candidum由来APRDを融合した配列の遺伝子をそれぞれpETベクターへ導入した。融合タンパクはE. coli BL21 (DE3) starを宿主として発現させ、ヒスチジンタグを用いたクロマトグラフィーにより精製した。GDH, APRD連続反応の活性は、GDH, APRD, CaCl2 (5 mM) を含む綾衡液中で15 minインキュベートした後、基質を加えたバッファー(500 μM glycerol, 500 µM NAD*, 500 µ M acetophenone, 100 µ M (NH4)² SO 4 , pH 7.4)中で、5, 10, 20, 30, 40, 50 min，室温で反応させ、反応後における基質および生成物の消長をHPLCにより定量的に評価した。調製したコヘシン融合型GDHを、グリセロールおよびNAD+の基質を含むバッファー中でインキュベートしたところ、NADHの生成を示す340 nmのピークが経時的に増加した(Fig. 1)。本結果より、コヘシン融合型GDHは活性型酵素として発現していることが示された。融合型の活性を測定したところ、フリー酵素と同等の活性を保持していた(データ未掲載)。精製したドックリン融合型APRDを用いて酵素活性を評価した。ドックリン融合型APRDは基質であるアセトフェノン, NADHの存在下で酵素活性を示した。 APRDも同様にフリー酵素と同等の活性を保持していこれらの結果、融合したコヘシンまたはドックリン領域が短いペプチド鎖であるため、共有結合法にと比較して酵素の活性を阻害することなく異種発現できたことを示唆した。続いてGDH, APRD複合体の酵素活性をHPLCにより評価した (Fig. 3)。50 min後、Ca²+含有バッファーと非含有バッファーの最終生成物量を比較すると、Ca²+含有バッファーでのみ連続反応が進行した。Ca²+添加により、コヘシン-ドックリン相互作用が誘発され、酵素同士がナノスケールの近接場に固定化されることで、基質チャネリング効果が発現して、連続反応効率が上本研究では、セルロース分解性微生物のセルロソーム機能を模倣して、酵素を近接固定化させた。ナノメートルオーダーで異なる酵素を固定化した結果、至適条件の全く異なる酵素連続反応の高効率化に成功した。開発した酵素複合化技術は、近接させる酵素種や酵素間距離もデザイン可能である。加えて、セルロソーム中には、不溶性セルロースに高い親和性をもつセルロース結合モジュール(CBM)が存在しており③、CBMを更に融合させ、濾紙などのセルロースマトリックス上に固定化することで、リサイクル能を有した固定化触媒としての活用も期待できる。今後、本研究は、種々の酵素連続反応を劇的に高効率化することができる新技術として、大量エネルギー消費型の製造プロセスに代わるクリーンな反応プロセスの実現に貢献すると期待される。 [1] Chun Y., et al., ACS Synth. Biol. , 2, 102 (2013). [2] Katchalski-Katzir E., et al., Trends Biotechnol , 11, 471 (1993). [3] Krauss J., et al., Appl. Environ. Microbiol., 78, 4301 (2012).
加藤　晃代¹,²・永井　里美²・中野　秀雄² ¹（公財）科学技術交流財団　知の拠点あいち重点研究プロジェクト2 ²名古屋大学大学院生命農学研究科生命技術科学専攻分子生物工学研究分野〒470-0356 愛知県豊田市八草町秋合1267-1   竜話: 0561-76-8377 Fax: 0561-76-8379  E-mail: teruyo.ojima@gmail.com; hnakano@agr.nagoya-u.ac.jp大腸菌や酵母による組換えタンパク質発現は日常的な技術となった。しかし、発現させたいタンパク質によっては、発現量そのものが少なく、可溶性・不溶性画分にもほとんど合成がみられない場合がある。通常、発現量が少ない場合は、コドン変換、他のタンパク質と融合発現、発現系や培地の変更などの手間のかかる検討を要する。そこで我々は、N末端開始コドン直後に４アミノ酸から成るSKIKペプチドタグの挿入することにより、難発現タンパク質の発現量を向上可能な簡便な方法を開発した。本法により、大腸菌生細胞発現系のみならず大腸菌無細胞タンパク質合成系および酵母発現系において数倍〜100倍程度の発現量増大が可能であった。大腸菌や酵母による組換えタンバク質発現は、研究のみならず産業においても必須な技術のひとつである。しかしながら、発現させたいタンバク質によっては、発現量そのものが少なく、可溶性・不溶性面分ともに得られない場合がある。その原因としてコドンバイアスやmRNAの二次構造など、諸説囁かれているが未だ明確にはわかっていない[1]。そのため、目的タンパク質の発現量が少ない場合は、コドン変換、他のタンパク質と融合発現、発現系や培地の変更、シャペロン因子との共発現などの手間と時間のかかる検討を要するのが一般的である[2]。我々のグループでは、動物の末梢血からB細胞を単離し1細胞PCRにより抗体遺伝子を増幅させ、それを大腸菌無細胞タンバク質合成系で迅速にスクリーニングする技術を開発してきた。そして、得られた抗体遺伝子を抗体フラグメントとして大腸菌細胞質内で発現することにより、各種検査デバイスや診断に必要なモノクローナル抗体を安価に提供可能であると考えている。しかしながら、同じ動物種から得られた抗体であっても、クローンごとの発現量バラつきが激しく、中には全く発現しないものも存在することが課題であった。そこで今回我々は、大腸菌による異種発現において2番目のコドン配列が発現量に影響を及ぼすとの報告[3]をヒントに、N末端の数アミノ酸分のコドンを最適化することにより更なる発現量増大効果が得られるのではないかと考えた。そして4アミノ酸から成るSKIKペプチドタグをデザインし、様々なタンパク質のN末端に付加したときの効果を検討した。大腸菌生細胞において難発現性であったタンパク質として、I)マウス由来Fab抗体、2)ウサギ由来scFv抗体および3) 30アミノ酸から成る人工ペプチドLeucine Zipper B (LZB)のN末端にSKIKペプチドタグを付加し、大腸菌生細胞発現系における効果を検証した。さらに大腸菌無細胞タンパク質合成系、酵母発現系における効果を解析した。マウス由来のFab抗体は、もともとSDS-PAGE後のCBB染色にてバンドを確認することができなかったが、SKIKタグ付加により主要バンドとして検出され、約30倍の発現量増大が確認された（図1A)。また、発現性の異なる2種類のウサギscFv抗体にて、SKIKタグおよび11アミノ酸残基から成るT7タグを比較した。もともと低発現であったクローン1は両タグ付加により可溶性不溶性ともに発現量が増大したが、タグ無でも発現量の高かったクローン4はタグの有無に拘わらず高発現を維持していた(図1B)。このことから、SKIKタグは発現量を増大させる効果を有しているが本来問題なく発現するものに対して負の効果を与えないことがわかった。さらに、クローン4はT7タグ付加により抗体の抗原結合活性が低下したのに対し、SKIKタグにおいてはタグ無と同等の活性を示した。人工ペプチドLZBは、従来検出限界以下の発現量であったが、SKIKタグ付加により可溶性タンパク質として検出可能なレベルまで発現量が向上した（図1C）。 (矢印が目的タンバク質) A. マウスFab抗体 (NCはネガティプコントロール) B. ウサギscFv抗体クローン1および4 C. 人工ベプチドLZB (Sは可溶性面分，Wは全細胞面分を表す。左, CBB染色;右, western blotting)以上より、難発現タンパク質のN末端へのSKIKペプチドタグ付加は、大腸菌生細胞発現系における発現量向上に著しい効果を有することが明らかとなった。続いて、大腸菌無細胞タンパク質合成系おけるSKIKタグ付加効果を検討した。puresystemおよびS30抽出物を用いた両方の系において数十～100倍程度の発現量向上が認められた（図2）。図2. 大腸菌無細胞タンパク質合成系におけるSKIKタA. puresystemによるウサギ抗体発現. B. S30系によるウサギscFv抗体発現.酵母細胞内におけるウサギscFvの発現における効果を検証したところ、数倍の発現量向上が認められた(図3)。図3.酵母発現系におけるSKIKタグの効果western blottingによる解析結果. Pはポジティプコントロールとしての精製scFv.+. -はSKIKタグありなしSKIKペプチドタグは４アミノ酸と非常に短い。そのため、1)構築済のタンパク質発現用プラスミドに12塩基を挿入するのみで非常に簡単に実施可能。 2) タンパク質本体に与える影響が極めて低いと考えられる。等の利点を有する。また、これまでの我々の検討によると、様々な宿主ペクター系において利用可能であることが明らかとなっている。今後、難発現性の抗体や酵素等の産業上有用なタンパク質生産において発現量を増大させるための一助となることが期待される。一方で、SKIKタグ付加により発現量そのものは著しく増大するものの、そのメカニズムは全くの謎である。また、大腸菌生細胞発現系においては不溶性の割合が増加する傾向にあることが課題である。今後、これらのメカニズムを解明することにより、難発現タンパク質を可溶性として自由自在に高発現できる時代が訪れることを期待したい。本研究は知の拠点あいち「食の安心・安全技術開発プロジェクト」の一環としておこなった。 [1] Goodman, D.B. et al. : Science. 342, 475 (2013) [2]東端 啓貴,生物工学 第91巻 (2013) [3] Bivona, L. et al. : Protein Expr. Purif. 74, 248 (2010)
後藤真一・矢部公彦・松永貴輝・木下英樹シャープ株式会社〒261-8520  千葉市美浜区中瀬1-9-2   竜話: 043-299-8736 Fax: 043-299-8749  E-mail:hideki.kinoshita@sharp.co.jp抗体医薬は、生合成の過程で、糖鎖修飾などの翻訳後修飾やジスルフィド結合による高次構造形成など、複雑な物理化学的特性が付加された不均一性がある生体高分子である。近年、抗体医薬の高機能化、製造工程の改良、品質管理の観点から、抗体医薬の構造を詳細に解析可能な分析技術、評価方法が要望されている。今回、我々は、抗体医薬の高精度な評価方法を確立することを目的とし、二次元電気泳動法の自動化システム（Auto2D）で用いることができる抗体医薬分析用チップの開発および評価方法を検討した。この結果、本システムにより100分間で、非還元状態の抗体医薬を二次元電気泳動し、分子量分布および電荷不均一性を高精度に解析できた。抗体は、アミノ酸残基に基づく竜荷不均一性、翻訳後の糖鎖構造の違い、ジスルフィド結合による高次構造の形成、および凝集体形成などに起因する不均一性のある高分子タンパク質である。近年、抗体医薬の高機能化、製造工程の改良、品質管理の観点から、抗体医薬の構造を詳細に分離可能な分析技術、評価方法が要望されている¹.²。特に抗体の不均一性を解析するため、①碧鎖欠損体、凝集体および断片化体の有無を解析するための分子量分布の評価技術、②アミノ酸、糖鎖に基づく不均一性を解析するための電荷不均一性の評価技術、の2つの要素技術が要求されている。従来、分子量分布の評価技術として、ポリアクリルアミド電気泳動(PAGE)やSECが利用されている。また電荷不均一性の評価技術としてゲル等電点電気泳動やキャピラリー等電点電気泳動が利用されている。これらの評価技術では、等電点が異なるが分子量が近似したタンパク質、分子量が異なるが等電点が近似したタンパク質の差異を評価するのが困難であった。二次元竜気泳動法は、等電点電気泳動と、ポリアクリルアミド竜気泳動(PAGE)を組み合わせたタンパク質分析技術である。今回、我々は、二次元電気泳動法の自動分析装置を用いて、抗体医薬の分子量分布と電荷不均一性を一度に評価する手法を検討した。従来の二次元電気泳動法では，手作業によるゲルの移動など煩雑な実験操作を必要とし、再現性の点で課題があった。そこで我々は一次元目ゲルを撤送機構により移動させる二次元竜気泳動の自動化システムを開発した。自動化システムは図1に示されるように、次の部材から構成されている。樹脂製の支持体により一次元目電気泳動用ゲルが保持されたIEFチップ、このIEFチップをクリップし搬送する精密搬送機構、あらかじめサンプルや試薬類を添加しておき一次元目の電気泳動および試薬処理を行うための溶液チップ，二次元目の電気泳動を行うためのPAGEチップ、白金線が配線されている竜極チップ、からなる。本自動化システムの工程は次のとおりである。まず事前準備として、溶液チップの規定の溝に，分析サンプル，ゲル膨潤液，平衡化緩衝液を添加，PAGEチップを冷却ステージ上にセットする。この後は、コンピュータ制御により自動的に分析が進められ、①精密運送機構がIEFチップをクリップし、IEFにサンプル導入、 ②IPGゲルの膨潤、③等電点電気泳動、④平衡化、⑤ SDS-PAGEの順で進められる。図1.二次元電気泳動自動化システムの模式断面図精密運送機構がIEFチップをクリップし、Y軸、Z軸に稼働する。本システムはひとつひとつの工程が精密に実施可能であり、二次元竜気泳動パターンの再現性が高いことを確認している34。さらに、本システムの自動分析性能、高再現性を活かし、核酸医薬や抗体医薬の新規評価技術が検討されている。従来、高分子量タンパク質である抗体医薬は、IPGゲルに吸収されにくくサンプル導入効率と、また分解能について改良の余地が残されていた。今回、我々は抗体医薬の電荷不均一性を精度よく評価するため、新たに効率的にタンバク質を吸収し感度、分解能よく等竜点竜気泳動可能なアクリルアミドゲル組成T=3.6%,C=2.7%、pH6-10の抗体医薬分析用IPGゲルを開発した。また、抗体医薬の分子量分布を詳細に分析するため、Dithiothreitol (DTT)など還元剤を添加しない条件（非還元条件）を確立した。新たに開発したIPGゲル、改良したサンプル調整方法のもと、以下の2次元電気泳動条件で抗体医薬を分析した。蛍光標識した10 μLの分析サンプル(抗体医薬)を添加し、①30分間IPGゲルに吸収、②100 μ Lの膨潤液にて５分間膨潤、③等電点電気泳動段階的に200 Vから7000 V (30分問)、④700 μLのSDS平衡化液で5分間平衡化、⑤2  Wの定電力で30分間 SDS-PAGEの工程で進めた。SDS-PAGE後、PAGEゲルを取り出し、蛍光検出装置を用いて、励起波長635  nm、検出波長は660 nmで検出した。二次元竜気泳動により分離された抗体医薬の個々の成分は、図2に示されるようにそれぞれ直径0.5〜2.0 mm程度のスポットとして検出される。そのスポットの位置から等電点と分子量を推定でき、スポットの濃さ（濃度値）からタンバク質の相対的な量を推測することができる。図2の二次元電気泳動画像を解析した結果、分子量分布として、160  kDa付近に目的の抗体医薬スポット群が検出され、300 kDa付近に多量体と考えられるアイソフォーム群が検出された。また、目的の抗体スポットよりも分子量の小さい欠損体（L鎖脱離、襟鎖脱離等）由来と推測されるタンパク質スポットが検出された。また、電荷不均一性の分布として、 Urea及びCHAPSを含み、還元剤を含まない非還元調製バッファを用いることにより、抗体医薬に含まれる多数のグライコフォームや欠損体を高分解能で分離できた。従来技術として等電点のみで分離するキャピラリー等電点電気泳動の検出画像(図2上)と比較すると、本システムではより詳細に抗体医薬を分離可能であることを確認した。今回、二次元竜気泳動自動化システムを利用し、複雑な分子構造をもつ抗体医薬を100分で高精度に分離、解析できた。本システムは自動化装置であるため誰もが簡易に扱えることができ、再現性よく結果を得ることができる。今後、例えば、抗体医薬の製造現場において不純物検査など品質管理や、新たな抗体医薬開発の現場において、樹鎖修飾による高機能化検討など技術応用が期待される。本研究の一部は、経済産業省の「平成25年度個別化医療に向けた次世代医薬品創出基盤技術開発（国際基準に適合した次世代抗体医薬等製造技術)」及び「平成26年度次世代医療・診断実現のための創薬基盤技術開発事業（国際基準に適合した次世代医薬等製造技術）」、及び国立研究開発法人日本医療研究開発機構（AMED）の「次世代医療・診断実現のための創薬基盤技術開発事業」の支援によって行われた。 [1]   Graves P R et al., Microbiol. Mol. Biol. Rev., 66(1), 39-63 (2002) [2]    Nebija et al. , Int. J. Mol. Sci., 15, 6399-6411 (2014) [3]    Hiratsuka et al. , Anal. Chem.,79, 5730-5739 (2007) [4]  Tani Y, et al., J. Proteomics Bioinform.,7(5), 108-111 (2014) [5] Savory N, et al. , Anal. Lett.46, 2954-2963 (2013)
一柳　敬ﾘ・銭　陽介ﾘ・渡辺　文太ﾘ・中津　亨ﾘ・加藤　博章ﾘ・五味　恵子ﾘりキッコーマン株式会社研究開発本部, 2京都大学大学院東学研究科, 3京都大学化学研究所〒278-0037  千葉県野田市野田399   電話: 04-7123-5571 E-mail: aichiyanagi@mail.kikkoman.co.jp近年、糖化ヘモグロビン(HbA1c)が糖尿病の診断および病態管理の生体マーカーとして重要視されている。HbA1cの測定法としては様々な手法が存在するが、酵素を利用した測定法は正確・迅速・簡便な手法であることから、徐々に市場に浸透しつつある。我々は、次世代のHbA1cの酵素測定法の開発を目指し、フルクトシルペプチドオキシダーゼをHbA1cに直接作用するオキシダーゼに改変し、プロテアーゼによるHbA1c分解工程を必要としないHbA1c測定法を開発した。開発した測定法は、従来の測定法の短所を解消したものであり、HbA1cの酵素測定法がより一層普及することが期待される。現在糖尿病患者は増加の一途を辿っており、国際糖尿病連合(IDF)の予測によると 2035年には世界の患者数が5.9億人に達すると見込まれている。糖尿病患者の増加が社会問題化する中、日本では2010年に糖尿病診断基準が改定され、ヘモグロビンA1c (HbA1c)が糖尿病診断の生体マーカーとして重要視されることとなった。HbA1cはヘモグロビンβ鎖のN末端に血中のグルコースが結合して生成する糖化タンパク質であり、血中の総へモグロビンに占めるHbA1cの割合は過去1~2ヶ月の平均血糖値を反映する。これまでに我々は、 HbA1cのβ鎖N末端からプロテアーゼにより襟化ジペプチド(F-VH)を遊離させ、それをフルクトシルペプチドオキシダーゼ (FPOX)の触媒反応を利用してH₂O₂の比色定量系に持ち込むHbA1cの酵素測定法(図1A)を開発し、本測定法は既に市場に受け入れられている[1, 2, 2013年生物工学技術賞]。一方で、測定試薬中のプロテアーゼはFPOXにも作用する。そのため、前述した測定法では、プロテアーゼがFPOXを分解せず、かつHbA1cを効率良く分解する試薬組成を検討する必要が生じる。また、検査項目の一斉測定時に起こるクロスコンタミにより、プロテアーゼが他の検査項目の測定用試薬に含まれる抗体や酵素に作用してしまうことも懸念される。そのため、プロテアーゼを必要としないHbA1c測定法(図1B)の開発が望まれていたが、その実現に欠かせないHbA1cに直接作用するオキシダーゼはこれまで見出されていなかった。そこで我々は、次世代のHbA1cの酵素測定法の開発を目指し、FPOXの基質特異性を改変してHbA1cのβ鎖特異的に作用するFPOXを創出し、プロテアー Coniochaeta属由来FPOXとF-VHアナログとの複合体結晶の構造から、FPOXの基質結合に関わるアミノ酸残基、および基質結合部位への経路を構成するアミノ酸残基を推定し、これらのアミノ酸残基を置換した様々な改変型FPOXを作製した。続いて、モデル基質として、HbAlcのβ鎖N末端の6アミノ酸残基と同一の配列を示す糖化ヘキサペプチド(F-6P)を使用し、作製した改変型FPOXのF-6P酸化活性を測定した。同時に、野生型酵素でも作用する糖化アミノ酸(F-V)の酸化活性も測定し、F-V酸化活性に対するF-6P酸化活性の比率(F-6P/F-V)の高い改変型FPOXを選抜した。 (1)で獲得した改変型FPOXにさらに界面活性剤に対する変異を追加導入した酵素を用いて、HbA1cの定量試験を行った。HbA1cは界面活性剤で変性、可溶化し、 HbA1cを改変型FPOXで酸化した時に生じるH₂O₂は、ペルオキシダーゼと酸化還元発色試薬を利用した比色定量法で定量した。 HbA1cのβ鎖がFPOXの活性部位に結合した場合、6残基目のグルタミン酸はFPOX分子の表面に達するとFPOXの結晶構造から予測されたため、新たにF-6P酸化活性を獲得した改変型FPOXはHbA1cを直接酸化する活性をもまた獲得すると予想された。FPOXはF-VHアナログのC末端をArg62のグアニジノ基で認識しており、Arg62をかさの小さいアミノ酸に置換することで、ペプチド鎮の長い樹化ペプチドの認識が可能となることが示唆された。実際に、Arg62を種々のかさの小さいアミノ酸に置換した結果、FPOXがF-6P酸化活性を新たに獲得することを見出し、特にR62Dの置換により、 F-6P/F-Vの値が最も向上することが分かった。続いて、基質結合部位への経路を構成するアミノ酸残基を対象に変異導入実験を行った結果、L63H、D68N、E102K、 D106K、Q110L、A113K、A355S、A356Tのアミノ酸置換にF-6P/F-V向上効果が確認され、全てのアミノ酸置換を蓄積した9重置換型FPOX (FPOX-H9)では、続いて、FPOX-H9に対して界面活性剤耐性を向上させるアミノ酸置換(2P-033にて報告)を追加で導入し、さらに酵素の安定性を向上させるためにC末端のペルオキシソーム移行シグナル(PKL)を欠失させ、FPOX-DHを作製した。 FPOX-DHを用いて、プロテアーゼを処方せずにHbA1c標準物質の定量試験を行った。その結果、標準物質のHbA1c濃度と吸光度変化量の間に相関が成立した(図3)。FPOX-DHの代わりにF-6Pに作用しない野生型FPOXを用いて定量試験を行った場合には、HbAlc濃度と吸光度変化量の間に相関は成立せず、FPOX-DHはHbA1cを直接酸化し、H₂O₂を生成させることが示された。現在、引き続き酵素と測定試薬組成の改良に取り組み、相関性、感度の向上に成功している。我々の開発した、HbA1cに直接作用するFPOXを利用することで、プロテアーゼを使用せずにHbAlcを測定することが可能となった。これにより、煩雑な試薬組成の検討は不要となり、また、プロテアーゼのクロスコンタミを懸念する必要もなくなり、酵素を利用したHbAlc測定法がより一層身近な測定法になると言える。今後、正確・迅速・簡便なHbA1cの酵素測定法の普及が加速し、糖尿病診断や病態コントロールに貢献することを期待している。 [1] Hirokawa K, et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun., 311, 104-111 (2003) [2] Hirokawa K, et al. , Biotechnol. Lett., 27, 963-968 (2005)
和泉自泰¹²・安藤晃規³⁴・阪本鷹行⁵・光永均²・中尾素直¹・岸野重信⁴・福崎英一郎²・櫻谷英治⁵・島純⁶・小川順³.4・馬場健史¹.2.* ¹九州大学生体防御医学研究所附属トランスオミクス医学研究センター・²大阪大学大学院工学研究科生命先端工学専攻・³京都大学学際融合教育研究推進センター生理化学研究ユニット・4京都大学大学院農学研究科応用生命科学専攻・5徳島大学大学院ソシオテクノサイエンス研究部ライフシステム部門・6龍谷大学農学部植物生命科学科〒812-8582  福岡市東区馬出3-1-1   電話: 092-642-6170 Fax: 052-789-3214  E-mail: bamba@bioreg.kyushu-u.ac.jp現在、主要化成品である繊維や樹脂などのポリマーの原料であるモノマーの大半は石油に由来している。今後、化成品を持続的に生産・供給していくためには、バイオマス資源を有効活用し、微生物変換によって有用な化合物を省エネルギー・高効率に製造する化成品製造プロセスの創出が求められている。糸状菌Mortierella alpinaは、化学工業における基幹合成原料となりうる油脂の生産性が高く、アラキドン酸などの高度不飽和脂肪酸を著量含有することから実生産株として使用されている。我々はM. alpinaのさらなる油脂生産発酵能力の獲得を目指し、メタボローム解析による脂質蓄積機構の解明、及び脂質蓋積の促進に関与する育種ターゲットの探索を進めている。全産業の基幹となる化成品を持続的に生産・供給していくためには、石油由来原料を石油以外の原料へ転換・多様化していくことが必要である。そのためには、汎用的に入手可能な再生可能原料である非可食性植物由来原料等のバイオマスから有用な化合物を省エネルギー・高効率に製造する化成品製造プロセスの創出が必須である。一方で、化学工業における基幹合成原料とは、主にポリマー合成に有用なモノマー原料であり、還元度の高い炭化水素構造を骨格に、重合に必要な分子構造である炭素-炭素不飽和結合、水酸基、カルボキシル基などを有する化合物群である。したがって、バイオリファイナリーと現在の化学工業をうまく連結させるためのキーテクノロジーは、バイオマスから発酵生産的に誘導される高酸化度化合物をモノマー原料などの高還元度化合物へと変換する技術にあるといえる。以上の背景のもと、我々は、高酸化度化合物と高遷元度化合物を連結しうる物質として油脂に着目し、①未利用バイオマスからの油糧微生物によるバイオリピッド生産、②バイオリビッドの生産性の向上、及び、 ③バイオリピッドの生物変換による修飾脂肪酸（水酸化脂肪酸、ジカルボン酸など）の生産、に取り組んでいる。代謝工学・メタボローム解析の融合による高度な油脂生産性を有する油糧微生物の育種株の創製、リピッド修飾反応の探索と開発により、バイオリピッドプラットフォームの基盤技術の構築を目指している。当該研究では、アラキドン酸の工業生産菌として利用されている油糧糸状菌Mortierella alpina [1]のメタボローム解析により、脂質蓄積機構の解明、及び脂質蓄積の促進に関与する代謝経路を探索し、バイオリピッド高生産株の分子育種を進めている（図1)。図1.代謝工学・メタポローム解析の融合による合目的的なパイオリピッド高生産株の分子育種本研究では、M. alpina 1S-4の胞子スクリーニングにより取得したアラキドン酸の生産性がより高いM. alpina 1S-4 優良株（M. alpina 1S-4と同じ遺伝的バックグラウンド）を使用した。ワイドターゲットメタボローム解析は、ガスクロマトグラフィー質量分析（GC/MS）と液体クロマトグラフィー質量分析(LC/MS)により実施した。 M. alpinaは、培養経過とともに菌糸を凝集させ、菌糸ペレットを形成する。そのため、菌体試料への培地成分の混入によって精確な細胞内代謝プロファイル情報の取得が困難であると予想されるが、培地混入の影響はこれまで評価されてこなかった[2, 3]。そこで、糸状菌のメタボローム解析に資する試料調製法について新たに検討した。その結果、培地成分を効果的に除去できる菌体洗浄方法を見出し、集菌・洗浄・代謝クエンチの一連の操作を迅速（30秒以内）に行うことが可能となった。さらに、これまで開発してきたメタボローム測定技術を基に親水性、及び脂溶性代謝物の分析手法、並びにデータ解析手法の高度化を図り、油糧微生物のワイドターゲット代謝プロファイルシステムを構築した。 M. alpina 1S-4 優良株の培地中のグルコース濃度、窒素濃度、及び、菌体重量、細胞内脂質量などを培養経時的に親測することで、菌体内の脂質蓄積が窒素源の枯渇によって誘導されていることが分かった。そこで、 M. alpina 1S-4優良株の窒素制限条件下でのメタボローム解析を実施し、糸状菌では明らかにされていない室素源の枯渇と脂質蓄積との関連性の代謝的評価を実施した。その結果、メタボローム解析により脂質生産が活性化されている際の極めて精確な細胞内の代謝プロファイルの情報を取得し（図2)、脂質高蓄積の代謝制御機構の一部を明らかにした。さらに、糸状菌の脂質生産性に関与する代謝のダイナニズムを理解するために、未だ実施例のない¹³C 6グルコースを用いた糸状菌の代謝ターンオーバー解析を行った。その結果、窒素枯渇時の細胞では、TCA回路中間体の代謝ターンオーバー速度が亢進していることが分かり、脂質生産性向上のための育種ターゲットの提案に成功した。また、当該結果は、これまで酵母において提唱されてきた窒素飢餓時の脂質生産性の増大メカニズムとは大きく異今後は、メタボローム解析により明らかとなった脂質蓋積に関わる代謝主幹経路の酵素遺伝子を対象とした分子育種を行い、リピッド生産性の向上を評価する。また、育種株の細胞成分のプロファイリングと代謝改変株の構築のサイクルを繰り返し行うことにより、脂質生産性の向上が期待できるターゲット遺伝子の絞り込みを行う。さらに、M. alpinaの高度な脂肪酸修飾技術を用いて創製した修飾脂肪酸育種株についてもメタボローム情報を有効活用し、その生産効率を高める。最終的に、再生可能原料（高酸化度化合物）から基幹合成原料（高還元度化合物）への変換を可能とするリピッド生産・リピッド変換技術を核とするバイオリピッドプラットフォームの基盤技術を構築し、社会実装を目指す。本研究は、科学技術振興機構、戦略的創造研究推進事楽先端的低炭素化技術開発（ALCA）の支援を受けて行った。 [1] Sakuradani E, et al. : J. Biosci. Bioeng., 116(4), 417-422 (2013) [2]   Liu X, et al.: Biotechnol. Lett., 34, 2275-2282 (2012) [3]  Madla S, et al. : J Microbial Biochem. Technol., 4(1), 5-9 (2012) [4] Philip AB, et al. : J. General Microbiol., 114, 361-375 (1979) [5] Irnayuli RS, et al. : Biotech. Adv., 32(7), 1336-1360 (2014)
広川安孝・花井泰三九州大学大学院農学研究院生命機能化学部門システム生物学講座合成生物学研究室〒812-8582  福岡市東区馬出3-1-1ウエストウィング804宝　電話: 092-642-6751 Fax: 092-642-6744  E-mail: taizo@brs.kyushu-u.ac.jp微生物に異種生物由来の複数の遺伝子から構成される合成代謝経路を導入することで、宿主が本来生産することのできない化合物の生産が可能となる。近年、大腸菌や酵母といった従属栄養生物ではなく、藻類やシアノバクテリアなどの光合成微生物を宿主とする研究が進められてきている。これらの生物は、光合成により光エネルギーを化学エネルギーに変換し、二酸化炭素を固定することで有機化合物を合成することができるため、合成代謝経路を導入することにより二酸化炭素からの直接的な物質生産が可能となる。当研究室では、シアノバクテリアの１種であるSynechococcus elongatus PCC 7942を用い、iso-propanolを物質生産のモデル化合物として研究を進めている。持続可能社会の実現を目的として再生可能な資源であるバイオマスからの物質生産に関する研究が広く行われてきている。異種生物由来の複数の遺伝子から構成される合成代謝経路を導入することで、宿主が本来生産することの出来ない化合物の生産が可能となる[1]。これまでに大腸菌や酵母といった増殖能が高く、遺伝子導入技術などの技術が確立された微生物が合成代謝経路導入の宿主として扱われてきたが、光合成微生物を利用した研究も行われるようになってきている[2]。光合成微生物であるシアノバクテリアや藻類は、光合成により光エネルギーを化学エネルギーへと変換し、それらを利用することで二酸化炭素を有機化合物へと固定することができる。つまり、これらの微生物を利用する最大の利点は二酸化炭素からの直接的な物質生産が可能となる点にある。これまでに様々な化合物の生産が報告されているが、本研究では、シアノバクテリアであるSynechococcus elongatus PCC 7942を宿主とし、細胞内のacetyl-CoAを出発物質としたiso-propanol (IPA)について研究を進めている。 IPAは、２分子のacetyl-CoAの縮合反応から始まり4段階の反応を経て合成される。脱水縮合を行うことでpropyleneへと変換することができ、汎用性の高いプラスチックの１つであるpoly-propyleneの原料となる有用な化合物である。天然では一部のClostridium属細菌などが生産することが知られており、これらの微生物由来の遺伝子を用いた合成代謝経路の導入により大腸菌での高生産が報告されている[3]。現在、シアノバクテリアを用いての生産量は大腸菌での報告と比べ大きく劣るものとなっているが、化石燃料の使用などにより生じる二酸化炭素を効率的に有用な化合物へと変換する技術の確立は将来的に重要となるものと考えている。 S. elongatus PCC 7942に、thl, atoAD, adc, sadhから構成される生産経路を導入することでIPA生産株(以下、 IPA株）を構築した。IPA株では、光合成条件下での培養と連動したIPA生産を行うことはできなかったため、増殖させた細胞を嫌気・暗条件に曝すこととした。嫌気・暗条件では糖異化が促進されることが報告されており、解糖系下流に位置するacetyl-CoAへの代謝流束が大きくなることが期待された。定常期前期にある細胞を用いることで最大2.42 mM（146 mg/l）のIPAを生産させることができた。これにより、光合成条件下で二酸化炭素を固定し細胞内に貯蔵物質（主にglycogen）として蓋積し、嫌気・暗条件でIPAへと変上述の通り、シアノバクテリアを用いて二酸化炭素からのIPA生産には成功したが、煩雑な作業を回避するためにも光合成条件下での培養と平行した生産が望ましいと考えた。酢酸添加により光合成条件下でもiPAが生産されること、その際に細胞内のacetyl-phosphate濃度が大幅に増加することが確認された。そこで酢酸を生産させる目的でacetyl-CoAをacetyl-phosphateへと変換するPhosphate acetyltransferaseをコードする遺伝子(pta)をIPA株に追加導入することとした（以下、 IPA÷pta株)。野生株にptaを導入することで定常期以降に培地中に酢酸が検出され、導入した遺伝子が正しく機能することが確認できた。IPA+pta株も同様に定常期以降に酢酸を生産したが、培地中にIPAを検出することはできず、揮発により失われていることが考えられた。そこで、定常期に到達したIPA+pta株を、生産されたIPAの揮発を防ぐために密栓可能なフラスコに移し、二酸化炭素を供給するためにNaHCO 3を逐次添加する、という方法をとった。これにより、0.31 mM（18.6 mg/l）のIPAを光合成条件下において生産させることができた。 pta 導入により酢酸を生産させるという代謝改変を行うことで、光合成条件下でのIPA生産に成功した。現在の生産方法ではNaHCOs添加に伴うpH上昇を抑制するためにHClを使用しており、結果的に培地中の塩濃度の上昇を起こしてしまう。S. elongatus PCC 7942では100 mM以上のNaCl添加により生育悪化が起こることを確認しており、ガスストリッピングのような装置を組むことで揮発したIPAを回収することができれば生産量の向上が期待できる。本研究では、シアノバクテリアへの合成代謝経路の導入を行うことで嫌気•暗条件でのIPA生産に成功し、さらに代謝改変を行うことで光合成条件下での生産にも成功した。生産量の向上が課題であり、合成代謝経路における基質となるacetyl-CoAの供給が律速なのではないかと考えている。一般的にシアノバクテリアの代謝流束は炭酸固定を行うCalvin回路で大きく、解糖系やTCA回路では小さいとされている。別種のシアノバクテリアにおいて、転写調節因子の発現により代謝バランスを変化させた報告がある[6]。 S. elongatus PCC 7942においても同様の手法による代謝改変が可能であるのかを検討しており、本会にて報告予定である(3P-089)。また、当研究室ではCalvin回路中の代謝物からの1,3-propanediol生産系も構築しており、IPA以上の生産量を得ている（昨年度本会にて報告、2P-102）。このことから、代謝流束の大きい経路からacetyl-CoAやその周辺の代謝物へと人工的に経路をつなぐことで生産量を向上させることができるのではないかと考えている。本研究は、JST CRESTによる研究助成（藻類・水圏微生物の機能解明と制御によるバイオエネルギー創成のための基盤技術の創出）のもと行われた。 [1] Zhang et al. : Curr. Opin. Chem. Biol., 22, 775-783 (2011) [2] Savakis P. and Hellingwerf KJ: Curr. Opin. Chem. Biol., 33, 8-14 (2015) [3]  Inokuma K., et al. : J. Biosci. Bioeng., 110, 696-701 (2010) [4]    Kusakabe T., et al. : Metab. Eng., 20, 101-108 (2013) [5] Hirokawa Y., et al.: J. Biosci. Bioeng., 119, 585-590 (2015) [6]   Osanai T., et al. : Plant Physiol., 164, 1831-1841 (2014)
原　太志・木村　修一郎・田中　博己・田中　禁之旭硝子株式会社　中央研究所　化学領域グループ　バイオ技術ファンクション〒221-8755 神奈川県横浜市神奈川区羽沢町1150番地  電話: 045-374-7502 Fax: 045-374-8872  E-mail: futoshi-hara@agc.comリンゴ酸は炭素4個からなるジカルボン酸で、微生物発酵による生産法が知られている。報告されているリンゴ酸の発酵速度はいずれも1g/(L・h)未満であり、発酵生産には中和・脱塩工程が必要なため煩雑なプロセスとなる。そこで本研究では上記課題の解決を目的として、耐酸性の強い分裂酵母にリンゴ酸生産遺伝子群を導入し、さらに必須遺伝子と報告されているエタノール生産に関る遺伝子pdc2を削除することで、リンゴ酸を生産する分裂酵母株を得た。この株のリンゴ酸発酵速度は、中和発酵の場合で26.8g/(L・h)と従来法の26倍以上と非常に高い値を示した。この際のリンゴ酸濃度は53.6g/Lであった。また無中和発酵でもリンゴ酸40.7g/Lが5時間で生産された（8.1g/(L・h)）。リンゴ酸は炭素４個からなる光学活性をもったジカルボン酸で、その用途は食品添加物（DL体）や医薬品(L体)等である[1]。また米国エネルギー省は最も重要な15のバイオリファイナリー基幹物質の一つにリンゴ酸を挙げている[2]。工業的な生産法はマレイン酸からの化学合成(DL体)やフマル酸からの酵素変換法(L体）が主流である[3]。一方で、樹を原料とした発酵生産も知られている。 Aspergillus flavusは120g/LのグルコースからL-リンゴ酸113g/Lを192時間で発酵生産する事がBattatらにより報告されており[4]、また遺伝子組換えEscherichia  coliは32.8g/LのグルコースからL-リンゴ酸33.9g/Lを72時間で発酵生産する事がZhangらにより報告されている[5]。しかしながら、これらのリンゴ酸発酵の生産速度は0.5~0.6g/(L・h)で、一般に言われている工業的な乳酸発酵速度2g/(L・h)の1/4程であり、発酵生産には中和・脱塩の工程が必要なため煩雑なプロセスになる。そこで本研究では上記課題の解決を目的として、クラプトリー効果陽性で、耐酸性の強い分裂酵母Schizosaccharomyces pombeをホストとして、遺伝子組換えによってリンゴ酸を高速度で無中和発酵生産する菌株の開発を試みた。分裂酵母S.pombeをホストとし、相同組換えを利用した遺伝子削除法であるLatour法[6]を用いて、必須遺伝子と報告されているピルピン酸脱炭酸酵素遺伝子pdc2 (SPAC1F8.07c) [7]とリンゴ酸酵素遺伝子mae2 (SPCC794.12c)をそれぞれ削除した。さらに染色体組込み型ベクターを用いて、リンゴ酸脱水蒸酵素遺伝子MDHとピルピン酸カルボキシラーゼ遺伝子PYCをそれぞれ導入した（図１）。図1. リンゴ酸生産S.pombe株の代謝図[太矢印：導入遺伝子、細矢印：削除遺伝子]作製した組換え体をYPD培地にて48時間培養し、集菌して菌体を得た。この菌体を36g-dcw/Lとなるよう発酵用培地（100g/Lグルコース、110g/L炭酸カルシウム）に添加して発酵を行い、得られた発酵液中のリンゴ酸量を測定した。さらに炭酸カルシウムを含まない無中和発酵用培地（＝100g/Lグルコース溶液）でも同様に発酵を行い、無中和条件下でのリンゴ酸の生産量を測定した。まずエタノールの生産を抑制するためにpdc2の削除を行った。必須遺伝子であるpdc2が削除された株の増殖速度は野生株の2%程まで低下していた。そこで育種を行った結果、pdc2削除株の増殖速度を野生株の70%程まで回復する事ができた。つぎにリンゴ酸の生産に必要なPYCとMDHを導入し、作製したリンゴ酸生産株をASP4491株と命名した。さらにリンゴ酸を異化するmae2を削除し生産性を高めたASP5235株を作製した。これらの生産株を中和条件下で発酵させた結果(図２）から、S.pombeにおいてはmae2削除によりリンゴ酸の生産量が大きく向上する事が解った。無中和条件下でASP5235株を発酵させたところ、 40.7g/Lのリンゴ酸が5時間で生産された。発酵終了時のpHは2.1であった。これまで無中和条件でのリンゴ酸の発酵生産の報告は無く、本研究が初めての報告となる。また発酵が終了した菌体を再利用して10回の反復発酵を行う事ができた。 ASP5235株の中和条件下でのリンゴ酸の容積あたり生産速度および収率を文献値と比較した（図3)。数値は各文献で最も高い値を用いており、発酵条件はそれぞれ異なる。ASP5235株を用いた手法の生産速度は26.8g/(L・h)でありA.flavusよりも45倍速かった。これは一般的な乳酸の発酵速度と比べても高い値である。一方、ASP5235株を用いた手法の収率は0.72 mol-リンゴ酸/mol-グルコースであり、E.coli組換え体の約半分であった。 ASP5235 株の発酵における主な副生産物はエタノールであったため、これを低減させることによりリンゴ酸収率を改善できると考えられる。我々はこれまでにS.pombe組換え体を用いてL-乳酸やD-乳酸などのC3ジカルボン酸を無中和で発酵生産するプロセスを開発してきた[8]。今回はCO₂を固定する経路を用いてC4ジカルボン酸であるL-リンゴ酸を高速度で無中和発酵生産する菌株が開発できた。本リンゴ酸生産株の次の課題として、リンゴ酸収率の向上や発酵時の菌体再利用などが挙げられる。また、これらのS.pombeを用いた技術は、他の有機酸の発酵生産への展開が期待される。 [1]  化学工業日報社: 15710の化学商品, p1607 (2010) [2]米国エネルギー省: Top Value Added Chemicals from Biomass, Vol.1 (2004) [3] 栃倉辰六郎, et al:発酵ハンドプック, 424-426 (2001) [4]  Battat E, et al. : Biotechnology and Bioengineering, Vol.37., 1108-1116 (1991) [5] Zhang X, et al. : APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, 77(2), 427-434 (2011) [6]  Hirashima K, et al : Nucleic Acids Res., 34(2), e11 (2006) [7]  Kim DU, et al. : Nature Biotech., 28(6):617-23, (2010) [8] 原太志, et al.:特許第5772594号, (2009)など
小里孟¹,² ・森雄太郎¹,² ・織田健り・福田央り・岩下和裕¹,² 1．独立行政法人酒類総合研究所、 2．広島大学大学院先端物質科学研究科〒739-0046   広島県東広島市競山3-7-1   電話: 082-420-0823 Fax: 082-420-0808  E-mail: iwashitact@nrib.go.jp 【目的】　清酒は複雑なメタボライトの混合物であることから、メタボロミクス技術を適用することで清酒製造工程、清酒成分の全体的な関連を理解できると期待されている。このことから当研究室では、精密質量分析（UPLC-Q/TOF MS）による醸造酒メタボライト分析法を開発するとともに、広範な市販清酒を用いて、原料や醸造工程と清酒メタポロームとの関連性について解析を行ってきた。その結果、清酒メタポロームとアルコール添加の有無や酒母工程、原料米の品種や精米歩合との関連性が示唆されている。しかし、市販清酒では細かい製造方法は不明であり、先に示された関連性に直接の因果関係があるかどうかは不明である。そこで、清酒成分との関連性が見られた製造条件を中心に、実際の清酒製造を行うとともに解析を行ったので報告したい。 【方法・結果】　市販清酒の結果を考慮して、掛米の品種や精米歩合、酵母の種類、熱成の有無の各種条件を組み合わせ、小仕込みを行った。まず、一般成分分析により、日本晴は山田錦に比べ、アミノ酸度、エタノール濃度などが高いこと、K1801号酵母は701号に比べ発酵力が強く、酸度が低いことなどが確認された。さらに、醸造酒メタボライト分析法により製成酒を分析し、主成分分析(PCA)を行ったところ、第1主成分として酵母の種類、第2主成分で熟成の有無により分離された。さらに条件を絞り解析を行うと、精米歩合に応じて分離し、70%がやや解離する傾向にあった。すべてのPCAにおけるローディングプロット解析の結果、寄与成分はアミノ酸類が多く見出され、清酒の品質に与える影響が大きいことが示唆された。清酒は様々な味が絡み合い、7色の味わいとも評され複雑な香味を有している。清酒の多種多様な味わいは、様々な代謝物(メタボライト)の組合せにより生じる。清酒中にはこれまでに約300成分が報告されており『これらの清酒メタボライトは、原料米の品種や製造工程の違いなど様々な要因によって生み出される。清酒の研究は、1878年のアトキンソン博士の報告²まで遡るが、100年以上続く醸造研究は、その大半が原料から清酒に至るメタボライトの変換の過程とその関連解析に費やされてきたと言っても過言ではない。しかし、長年に渡るこれまでの解析は、酒類中の１つのメタボライトと１つの醸造工程や微生物の関連など、限定された範囲の解析に留まらざるを得なかった。そのため、例えば吟醸酒の香りを良くする酵母を単離すると、今度は発酵が悪くなるなど、現場で使うためには更なる試行錯誤が必要であった。これは清酒成分の全体像（清酒メタボローム）をつかむことが難しかったことが一因である。しかし近年のメタボローム解析技術の発展により、製造工程と清酒成分全体の関連を解析することが出来る環境が整ってきた3,4,5)。また、メタボローム分析により、原料や製造工程の違いと醸造酒メタボライトの関連をデータペース化することにより、新たな商品開発や微生物育種、工程改善の大幅な効率化が可能となるのではないかと考えられる。そこで、我々のグループでは、GC-MS, LC-Q/TOF MS をはじめとした醸造酒メタボライト分析法を開発するとともに、市販清酒の分析により、清酒の品質と清酒メタボロームの関連や、製造工程と清酒メタボロームとの関連について解析を行ってきた。その中で、品質との相関がみられる清酒メタボライトを明らかにする一方で、清酒メタボライトに大きな影響をあたえる条件なども解析を行ってきている。我々がこれまで行った市販清酒の分析では、清酒の成分への影響が大きい条件として、精米歩合を見出すとともに、アルコール添加の有無や原料米品種と清酒メタボライトとの関連なども見出している。しかし、実際の製造では精米歩合が異なると酵母や麹の造り方、発酵条件など多くのファクターが異なるため、市販清酒の分析だけでは、一概に精米歩合の影響とは言えない。そこで、本研究では精米歩合を中心として清酒メタボライトと工程との関連について解析を行った。 (1)これまでの市販清酒の分析では、精米歩合そのもの以外に使用酵母や発酵経過など様々な条件が異なっていると考えられる。これらの製造条件の中には、精米歩合と連動し変化させるものも存在する。したがって、市販清酒の分析で精米歩合と相関するように見える成分でも、実際には精米歩合以外の製造条件と相関している可能性がある。そこで、条件を制御した小仕込みを行った。同じ圃場から集荷された日本晴と山田錦を用いて、40, 50, 60, 70%の精米歩合の原料米を調整した。掛米の精米歩合、使用酵母（K701またはK1801号）、熟成の有無だけを変動させ、仕込み歩合や麹米などそれ以外の条件は統一して行った。 (2)これらのサンプルを限外ろ過後、醸造酒メタボライト分析法により分析を行い、主成分分析、重回帰分析等により解析を行った。また、精米歩合と関連が見られた成分については、先に分析した市販清酒解析の結果との比較を行った。まずは、得られた清酒について、一般成分分析により、従来の知見を確認するとともに、各仕込みの特徴を比較した。まず、日本晴、山田錦共に70%精米では発酵が早く、日本酒度、エタノール濃度も高く粕歩合が低いというこれまでの知見が確認された。また、日本晴は山田錦に比べ、アミノ酸度、エタノール濃度が高かった。また、K1801号酵母は、いずれの精米歩合においてもK701号に比べ炭酸減量、エタノール濃度は高く、酸度が低かった。設定どおりの清酒が作成できたことから、醸造酒メタボライト解析法による解析を行なった。今回は、掛米の精米歩合、酵母、熟成の有無の条件を変えて小仕込みを行ったが、これらの条件の影響度合いを知るために、初めにPCA解析を行った。その結果、第１主成分では使用酵母、第2主成分では熟成の有無との関連が見られた。つまり、清酒成分の変動には精米歩合よりも酵母や熟成の有無の影響が大きいことが示唆された。そこで、同一酵母で熟成無しの条件で解析を行ったところ精米歩合との相関がみられるようになった。精米歩合と相関する成分を抽出し、市販清酒の解析で得られた結果と比較をしたところ、アルギニンやグルタミン酸、プロリン等、同一の相関がみられるものが見いだされた。一方で、市販清酒の解析で精米歩合との相関がみられたGABAについては、小仕込み実験では精米歩合との相関は見られなかった。このように市販清酒で精米歩合との相関がみられた成分の中には、今回の小仕込みでは相関がみられない物があり、他の製造工程との関連が示唆された。大量のメタボライト情報を得ることが出来るようになった現在、医療などではガンのマーカーになるメタボライトマーカーの探索、あるいは特定の薬等が影響を与えるメタボライトの検索など、特定の関連を解析する事が多い。しかし、食品分野では複数のメタボライトと複数の加工条件との関係を総合的に解析することが重要である。今回、我々は、複数の製造条件により作成された清酒のメタボライトデータを得た。現在は、個々の条件との相関の高い成分を抽出しているのみであるが、任意のメタボライトに影響を与える複数の醸造条件の相互作用や、複数の清酒メタボライト同士の相互作用、さらには各メタボライトとの官能評価(品質)との相互作用など、ネットワークのような広範な相関解析を目指して研究を行う予定である。これらの研究により、任意の品質の清酒をより効率的に設計醸造できるようになることを期待する。 [1]  財団法人醸造協会,醸造物の成分清酒編, 1 (1999) [2] Atokinson, R., Nature , 9 , 521 (1878) [3] Sugimoto M. et al., J. Agric. Food Chem., 58, 374 (2010) [4] Mimura N. et al., J. Biosci. Bioeng., 118 (4), 406 (2014) [5]  Sugimoto M. et al., J. Agric. Food Chem , 60 , 2586 (2012)
根来宏明、小高敦史、堤浩子、佐原弘師、秦洋二月桂冠株式会社　総合研究所〒612-8385 京都市伏見区下鳥羽小柳町101番地 竜話: 075-623-2130 Fax: 075-623-2132  E-mail: negoro@gekkeikan.co.jpこれまでに様々なリンゴ酸高生産清酒酵母が育種されており、その性質についても複数の報告がなされているが、多くは原因となる変異遺伝子の特定には至っていない。そこで本研究では、DMS感受性を指標に取得したリンゴ酸高生産酵母について、全ゲノムシーケンス解析による変異遺伝子の同定を試みた。その結果、ユビキチンリガーゼ複合体のサブユニットをコードするVID24に変異を持つ酵母において、リンゴ酸生成能の上昇とDMS感受性の増強が認められた。このユビキチンリガーゼ複合体は雛新生酵素の分解に関与しており、有機酸を代謝する酵素へのカタボライト抑制に異常が生じたためリンゴ酸高生産になったと推察した。リンゴ酸は清酒に爽快な酸味を与える重要な成分であり、発酵中に酵母（Saccharomyces cerevisiae）によって生産される。清酒の呈味を調整するために、様々なリンゴ酸高生産清酒酵母の育種法が開発されている[1, 2, 3]。近年、リンゴ酸高生産となる機構について、ミトコンドリアの活性低下や、細胞内の酸化還元電位の変化が寄与すると報告されている[4, 5]。一方で、原因となる具体的な変異遺伝子は明らかになっていない。リンゴ酸高生産酵母の多くは変異誘発剤と選抜指標の組み合わせにより取得するため、ゲノム上に多数の変異がランダムに導入されることが、変異遺伝子の同定を困難とする要因の一つであると言える。これまでに我々は、コハク酸ジメチル（DMS）感受性を指標とする育種法により[1]、きょうかい901号（K-901）を親株としてリンゴ酸高生産酵母K-901Hを取得している。本研究では、K-901Hについてリンゴ酸高生産に寄与する変異遺伝子の同定を試みた。さらに、変異遺伝子がリンゴ酸生成能を増強させる機構の解明に取り組んだ。次世代シーケンサーの登場により全ゲノムシーケンスは高速化・低コスト化し、従来よりも簡便にゲノム配列比較を行えるようになっている。そこで、K-901とK-901Hについて全ゲノムシーケンス比較解析を行った。K-901Hのゲノム上に検出した非同義変異のうち、解樹系や樹新生、TCA回路に関与する遺伝子に注目し、遺伝子破壊や点変異導入などの手法を用いて有機酸生成に与える影響を個別に検証した。 K-901Hに検出した150個の非同義変異のうち、いくつかの遺伝子について検証を行った結果、VID24の点変異391G>Aを解析用の酵母に導入した場合にリンゴ酸生産能が上昇した（図1)。加えて、このVID24変異は酵母にDMS感受性を付与することを確認した。これらの結果より、K-901HはVID24変異によりリンゴ酸高生産能とDMS感受性を獲得したと示唆された。また、清酒醸造においてVID24変異導入株とVID24破漿株を比較した結果、同程度の有機酸生成を示したことから、K-901HのVID24点変異はVid24に機能欠損をもたらすと考えられた（図1)。 VID24変異株の有機酸生成特性や態資化性などは、これまでに機構が提唱されているリンゴ酸高生産酵母[4, 5]とは異なる特徴を示したため、別の有機酸制御機構が存在すると考えられた。 Vid24はユピキチンリガーゼ複合体（GID複合体）のサプユニットである。GID 複合体はグルコースの存在に応答して、フルクトース-1,6-ビスホスファターゼ(Fbp1)、ホスホエノールピルピン酸カルボキシナーゼ(Pck1)、細胞質リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（Mdh2)といった襟新生酵素の分解を促進し、VID24破壊株ではこれらの糖新生酵素が酵母菌体内に蓄積することが知られている[6, 7]。 VID24変異株における糖新生酵素のリンゴ酸生産能への影響を検証した結果、MDH2を欠損した場合にVID24変異株のリンゴ酸高生産能上昇が抑制されることが判明した。さらに、VID24変異株では細胞内のリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性が上昇する傾向にあった。以上より、VID24変異株は細胞質中にMdh2が蓋積することでリンゴ酸高生産性を示すと推察した（図2)。清酒醸造においてリンゴ酸の多くは酵母の細胞質で還元的経路により生成すると報告されており、上記の仮説を支持している[8]。グルコースのカタボライト抑制に関与するユビキチンリガーゼが酵母の有機酸生成を制御するという知見は初めて得られたものである。我々は本報告に加えて、 VID24以外のGID複合体関連遺伝子が有機酸生成に及ぼす影響についても検証を進めており、K-901Hとは別の DMS 感受性リンゴ酸高生産酵母の原因遺伝子に示唆を与えている[9]。これまでの酵母育種はリンゴ酸生産性という表現型を指標に行ってきたが、遺伝子型との関連が明らかになったことで、例えばデータベースから得られた遺伝子情報を利用するなどの異なる育種アプローチが可能になると考えられる。清酒醸造の分野以外でも酵母によるリンゴ酸生産の研究が行われており[10]、本報告はこのような研究にも役立つと期待される。また、K-901Hは二倍体であり、VID24変異をヘテロ接合型に有する。今回の解析には一倍体の酵母を用いたため接合型の影響を考慮していないが、このVID24変異は優性もしくは半優性であると推測している。半優勢であると仮定すると、ヘテロ接合性の消失によりホモ接合型とすれば K-901H のリンゴ酸生産能がさらに上昇するのではないかと考えられる。清酒の味の幅を広げるため、リンゴ酸濃度をこれまで以上に制御できるような育種法の開発を進めたい。 [1]相川元庸, et al.: [2] 吉田清, et al.: 醸造協会誌, 88, 645-647 (1993) [3]    Asano T, et al. : J. Biosci. Bioeng., 92, 429-433 (2001) [4]    Oba T, et al. : FEMS yeast Res., 14, 789-796 (2014) [5] Kosugi S, et al.: J. Biosci. Bioeng., 117, 39-44 (2014) [6] Snatt O, et al. : Mol. Biol. Cell., 19, 3323-3333 (2008) [7] Hung G C, et al.: J. Biol. Chem., 279, 49138-49150 (2004) [8] Motomura S, et al.: J. Inst. Brew., 118, 22-26 (2012) [9]根来宏明, et al.:平成27年度日本醸造学会大会講演要旨集[10] Zelle R M, et al. : Appl. Environ. Microbiol., 74, 2766-277 (2008)
林田　真生1、多田　宣紀1、保谷　典子1、菊田　弘和1、片平　悟史2、池内　暁紀2、徳弘　健郎²、大西　徹¹ 1トヨタ自動車、2豊田中研・バイオ〒470-0201　愛知県みよし市黒笹町丸根1099番地トヨタバイオ・緑化研究所Tel: 0561-36-8479 Fax: 0561-36-8469 E-mail: masao_hayashida@mail.toyota.co.jpトヨタでは木質・草本系バイオマスを原料とする第２世代バイオエタノール生産に用いる酵母を開発している。第２世代バイオエタノールの商業化のためには、発酵に用いる酵母のエタノール収率向上とキシロースのエタノールへの高効率変換、および前処理されたバイオマスから生じる発酵阻害物質に対する耐性向上が必要である。これらの課題解決に取り組んだ結果、バイオマス由来の雛化液を用いて、高効率でエタノール生産可能な酵母の開発に成功した。また、開発した酵母の商業利用を見据え、スケールアップ時の生産性を評価するため、大規模発酵試験(46kL)を実施したので報告する。第２世代のバイオエタノールでは、非食物系の木質・草本系バイオマスを前処理し、樹化酵素、発酵菌を用いた砦化発酵によりエタノールを生成する(図1)。弊社では、バイオマス原料として草本系バイオマスであるネピアグラスを使用し、発酵菌として酵母を使用してエタノール製造技術開発を行っている。バイオマスは主にセルロース、ヘミセルロース、リグニン等の成分から構成されている。酵母野生株は、セルロースの主成分であるグルコース等のC6 糖のみエタノールへ変換可能であるが、ヘミセルロースの主成分であるキシロースをエタノール変換することが出来ない。一方、バイオマスから高効率にエタノールを生産するためには、ヘミセルロースに由来するキシロースのエタノールへの変換が重要である。そこで、酵母に遺伝子組換えによりキシロース資化遺伝子を導入し、グルコースとキシロースを同時にエタノールに変換可能な遺伝子組換え酵母を開発し、前処理済バイオマスに含まれる発酵阻害物質への耐性を強化した。弊社の開発した酵母菌が、商業化利用に耐えうるエタノール発酵性能を有し、商業レベルの発酵槽（500- 2500kL）で発酵可能であるかを確かめることを目的として、商業レベルの事前検討となるパイロットプラント規模の大規模発酵試験（46kL）を行った。酵母野生株Saccharomyces cerevisiae OC-2を遺伝子組換えし、キシロース資化性エタノール生産酵母を作製した。まず、白アリ腸内細菌由来のキシロースイソメラーゼ(XI)遺伝子を導入し、キシルロキナーゼ(XKSI)遺伝子とペントースリン酸回路の４遺伝子（RPE1、RKI1、 TKL1、TALI）の発現量を調整した。次に、酢酸資化のためアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子とアルコールデヒドロゲナーゼ（ADHI）遺伝子を過剰発現させ、ADH2遺伝子（エタノールからアルデヒド生成経路）の発現を抑制した。また、ネピアグラス抽出液を用いて進化工学的育種を実施し、バイオマスに含まれる阻害物質への耐性を向上させた。さらに、キシロース代謝経路の遺伝子発現を調整し、今回の大規模発酵試験に用いるキシロース資化性エタノール生産酵母菌を開発した。バイオマス原料は、委託先で作製した糖化液を用いた。ネビアグラス（Pennisetum purpureum Schmach）を乾燥、粉砕後に酸添加し、蒸煮処理したのち、酵素により替化した。酵母の培養はオンサイト培養を想定し、糖蜜培地で培養したのち、3kL希釈樹化液で10時間培養し、目標菌体量（発酵時の植菌量0.2g dry cell/L）を得た。エタノール発酵試験は発酵槽 46kL でバッチ試験を実施し、発酵開始から72時間でエタノール濃度47g/Lに達し（図3)、砦に対するエタノール収率は96%と非常に高収率だった。 ILのジャーファーメンターを用いたラボ試験と比較すると、同等のエタノール濃度、収率であり、スケールアップ条件下においても十分な発酵速度・高収率を確認できた。この結果から、商楽化利用可能なエタノール発酵性能、高阻害物耐性のキシロース資化性酵母を開発できたと判断した。また少ない酵母量(0.2g dry cell/L)でも発酵可能だったことは大きなメリットである(通常0.5- lg/L)。弊社の開発した酵母菌をスケールアップ評価し、実バイオマスを用いた大規模発酵によるエタノール生産に成功した。今後は、実際に各社のプラントで使用される多種多様なバイオマス由来の魅化液を用いて、開発酵母を評価する。バイオマス原料や樹化工程によって樹化液の糖濃度、阻害物濃度が大きく異なる。本報告で用いた糖化液より高い糖濃度、阻害物濃度の糖化液の発酵には、さらなる菌体改良とともに、最適条件の検討が必要である。また、今回用いたキシロース資化性酵母の発酵収率をさらに高めるために菌体開発を継続する。 [1]保谷典子:高効率バイオエタノール製造技術開発一SSCFのための幣化発酵技術一，第63回日本生物工学会, 2013 [2] Tada N, et al . : Development of commercial yeast strain for efficient conversion of lignocellulosic biomass into ethanol. 37th Sympotium on Biotechnology for Fuels and Chemicals, 2015
由里本　博也¹・梅田　涼平¹・井口　博之¹・小山　時隆²・阪井　康能¹ ¹京都大学大学院農学研究科　応用生命科学専攻　制御発酵学分野²京都大学大学院理学研究科生物科学専攻植物学教室形態統御学分科〒606-8502 京都市左京区北白川追分町竜話: 075-753-6387 Fax: 075-753-6454    E-mail: yury@kais.kyoto-u.ac.jpメタンは、二酸化炭素に次ぐ温室効果ガスであり、大気中のメタン濃度上昇が地球の気候変動に大きな影響を与えていると考えられている。メタンは土壌、湿地、湖沼、海洋など様々な環境から放出されるが、人為的な発生源（水田、牧畜など）からの放出量も非常に多く、その削減が課題となっている。自然環境中には、メタンを利用するメタン資化性細菌（メタン酸化菌）が棲息し、環境中でのメタン排出削減のために、このメタン酸化菌を利用することが期待されている。我々は、土壌や水圏におけるメタン酸化菌の分布や生理機能の解析を行い、多様な環境におけるメタン排出削減に利用するために、メタン酸化菌のメタン消費活性を向上させる技術開発を進めている。メタンは、CO₂の約20倍の比活性、約25％の寄与率をもつ温室効果ガスであり、CO₂とともに排出削減の対象となっている。メタンは天然ガスとして地下に埋蔵されているものとは別に、嫌気的な環境におけるメタン生成菌によるメタン発酵により生成し、地球上の多様な環境（土壌・水圏）から放出されているが、水田、家畜（反菊動物）、埋め立て地などの人為的な発生源からの放出量が7割近くを占める。また最近、植物から直接メタンが直接放出されていることが報告され、その放出と消失についての論争が盛んに行われている。自然環境中の様々なメタン発生源には、メタンを炭素源・エネルギー源として利用するメタン資化性細菌（メタン酸化菌）が棲息しており、メタンが大気中に放出される前に消費し、大気中のメタン濃度維持に重要な役割を果たしている。様々な環境におけるメタン排出削減のために、メタン酸化菌のメタン酸化活性を向上させる技術開発が期待されている。我々はこれまでに、土壌、植物試料を含む多様な環境試料からメタン酸化菌を含む微生物コンソーシアムを取得し、メタン酸化菌の分布や単雕した菌株の生理機能解析を行ってきた[1-4]。この過程で、水生植物表面に多様なメタン酸化菌が棲息し、高いメタン消費活性を持つことを見出した[5]。このことから、水生植物表面に棲息するメタン酸化菌は、大気中に放出される前にメタンを消費するフィルターの役割を果たしていると考えられる。本研究では、増殖が速く栽培が容易であり、また炭水化物含量が高いためバイオエネルギ一資源としても期待されているウキクサを対象とし、メタン酸化活性を示すウキクサ試料の取得とこれに棲息するメタン酸化菌の菌叢解析ならびに、ウキクサ試料から単離したメタン酸化菌とウキクサとの共培用系によるメタン消費の解析を行った。 (1)メタン消費搭性をもつメタン酸化菌-ウキクサ共生系の取得とウキクサ上に養息するメタン酸化高いメタン消費活性をもつメタン酸化菌-ウキクサ共生系を取得するため、琵琶湖の様々な地点から採取したウキクサをバイアル瓶に密封し、メタンを注入した後、メタン濃度を経時的に測定した。その結果、採取したウキクサの中に高いメタン消費活性を示す試料を見出した（図1)。一方、湖水ではメタン消費が見られなかったことから、メタン酸化菌がウキクサ上に集積されていることが示唆された。次に採取したウキクサ試料からDNAを抽出し、メタン酸化菌が特徴的に持つメタン酸化酵素遺伝子pmoAのプラスミドライプラリーを構築し、遺伝子配列を決定したところ、多様なメタン酸化菌がウキクサ上に生息していることが明らかになった。メタン消費活性を示したウキクサ試料を用い、メタンを単一炭茶源とする集積培養により、メタン酸化菌Methylomonas sp. BLU1株を単離した。次に、BLU1株を無菌処理したウキクサ（Spirodela polyrhiza)とともにバイアル瓶に密封し、メタン酸化菌-ウキクサ共培養図2に示すように、BLU1株単独の場合に比べ、ウキクサとの共培養時にメタン消費が促進されることを見出した。さらに、ウキクサ単独での培養液にも BLU1株に対するメタン消費促進効果が見られたことから、ウキクサの生産する化合物がメタン資化性細菌のメタン消費促進に寄与していることが示唆された。メタン酸化菌−ウキクサ共培用系を用いることで、ウキクサ増殖によるCO₂削減と同時に、主要なメタン排出源となっている水田などの水圏環境中でのメタン放出削減が期待できる。また我々は、メタン酸化菌のメタン消費を促進する細菌の探索を試み、根粒菌に属する３種の細菌(Rhizobium属など)が、メタン酸化菌の生育とメタン消費を強く促進することを明らかにするとともに、根粒菌が生産するメタン酸化菌生育促進物質の同定を進め、コバラミン（ピタミンB12）が生育促進に関与していることを見出した[2]。ウキクサによるメタン酸化菌のメタン消費促進についても、メタン酸化菌の集積担体としてだけでなく、ウキクサが生産する何らかの化合物が関与する可能性が見出された。このようにメタン酸化菌のメタン消費能力を高める要因を解明することで、二大温室効果ガスであるメタンとCO,間の炭素循環（メタンサイクル）の収支やメカニズムの解明、さらには温暖化ガス排出削減のための技術開発にもつながるものと期待される。 [1] Iguchi H, et al.: Appl. Environ. Microbiol., 77, 8509-8515 (2011) [2] Iguchi H, et al.: Biosci. Biotechnol. Biochem., 76, 1580-1583 (2012) [3]   Iguchi H, et al.: Microorganisms, 3, 137-151 (2015) [4]由里本博也, et al.:生物の科学遺伝, Vol.67 No.5, 591-595 (2013) [5] Yoshida N, et al.: Front. Microbiol., 5, 30 (2014)
中村　雅哉ﾘ・大塚　祐一郎ﾘ・政井　英司ﾘ・敷中　一洋ﾘ・片山　義博ﾘ1)国立研究開発法人　森林総合研究所²)長岡技術科学大学工学部生物系³)東京農工大学工学部4 )日本大学生物資源科学部〒305-8687 つくぼ市松の里１   竜話: 029-819-8282 Fax: 029-873-3797  E-mail: nmasaya@ffpri.affrc.go. jp木材構成成分の約 30%を占めるリグニンは地球上で最も多量に存在する芳香族バイオマスであるが、その複雑な構造から高度な利用技術はほとんど確立されていない。しかしながら、自然界では微生物により分解・資化されている。パルプ工場排水路から単離されたリグニン分解菌 Sphingobium sp. SYK-6株は様々な構造の低分子リグニン化合物を2-ピロン-4,6-ジカルボン酸（PDC）と言う中間体を経て水と二酸化炭素に分解・資化している。我々は低分子リグニン分解・資化酵素遺伝子を再構成してPDCを大量発酵生産し、プラットフォームケミカルとして高分子材料を作成する技術開発を進めている。地球上に存在するバイオマス資源のうち最も多量に存在ものは植物系バイオマスで，その中の90％を木質系バイオマスが占めている(賦存量1兆6,500億トン)。この木質系バイオマス資源に含まれるリグニンは地球上で最も多量に存在する芳香族バイオマス成分で、化石資源に含まれる成分に類似の化合物から構成されているにもかかわらず、その複雑な構造ため均一な成分に分離，精製することが難しく，バルクな利用として分散剤，疑集剤、土壌改良剤，紙・パルプ産業での燃料としてのみの利用にとどまり、ファインケミカルスとしての利用技術は確立されていない。パルプ工場排水路より単離されたリグニン分解微生物Sphingobium sp. SYK-6株は様々な構造のリグニン二量体化合物を分解・資化することができ、各分解・資化過程に関与する酵素遺伝子が片山[1]・政井[2]らにより同定されている。様々な構造のリグニン二量体化合物は中間代謝産物として、プラットフォームケミカルと成り得るジカルボン酸化合物の2-ピロン-4,6-ジカルボン酸（PDC）に収斂して資化されることから(図１)、我々はリグニン分解・代謝酵素遺伝子を再構成することにより均一なプラットフォームケミカルであるPDCに誘導し、高付加価値を持つ新規高機能材料を生産する新しい植物バイオマス利用技術を確立することを目的に研究を進めている。図 1. Sphingobium sp. SYK-6株の低分子リグニン代謝経路と代謝酵素遺伝子Sphingobium sp. SYK-6株からバニリン脱水素酵素遺伝子（ligV)、プロトカテク酸4,5-ジオキシゲナーゼ酵素遺伝子（lig AB) 、4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素遺伝子(ligC)をクローニングした。また、P.putida PpY101株からはバニリン酸デメチラーゼ酵素遺伝子（van AB)をクローニングした。 ligV、vanAB、ligAB、ligCを再構成した発現プラスミドをプロトカテク酸、分解・資化能を欠落した変異株P.putida PpY1100に導入して組換え微生物バイオリアクターを構築してパニリン、パニリン酸、プロトカテク酸を出発物質とした PDC の発酵生産を行った。 PDCはピロン環に２つのカルボキシル基が置換した擬芳香族化合物で，その4,6-位のカルボキシル基を二官能性のモノマーと重縮合して，対応するポリアミドやポリエステル，ポリウレタンなどの高分子へと導くことが可能な有望なプラットフォームケミカルの一つで、石油化学にも例の無い新しい特性が期待される物質である（図2）。PDCは①分極性の強い３つのカルボニル基，②弱アルカリでの分解，生分解を受け易いラクトン部，③共役二重結合の剛直環構造を有することから，PDC骨格を有するポリマーは，剛直環構造からなり親疎水性であると同時に、容易なラクトン環の加水分解開裂，共役二重結合の酸化・水和開裂などが予想される生分解性の高分子材料としての展開が期待出来る。また、有機材料科学の視点から見るとPDCは分子内の電子的push-pull効果は共役二重結合のπ電子系に異方性をもたらすため、高分子材料として分子配向を制御できれば、新しい高屈折率材料や非線形光学材料への利用、新しい圧竜・焦竜材料への利用が可能となる輿味深い物質である。さらに高分子化後の架橋反応などを利用すれば、新しいレジスト材料や光学材料への可能性が考えられる。組換え微生物バイオリアクターを使った低分子リグニン化合物からのPDCの発酵生産技術の確立に取り組んだ。バニリンからのPDC発酵生産量は変換率99％ではあるが、培養液あたり15g/Lと低く、実用化を目指すには改善の余地があった。そこで、細胞密度と細胞活性の最適化のための発酵制御法を検討するため、 PDC発酵生産時のメタポローム解析を行い、発酵過程を物質レベルで解析した。その結果、微量金属と炭素源の欠乏が明らかとなり、基質添加時にこれらの物質の添加も行ったところ、発酵生産性が著しく改善され、 100g/Lを確保するに至った。 PDCの持つカルボン酸の酸クロリド化物と芳香族ジオールとの重縮合を行い、熱可塑性ポリエステルを合成した。得られたポリマーはPDCに直接結合した芳香族の存在に起因すると考えられる高い熱分解温度を示した(Tas≥300 ℃)。 PDCの大量発酵条件は規模を実験室レベルの10L培糞から実用化レベルの小プラント(2,000L規模発酵槽)に拡大しても同様の発酵生産性を示し、大規模化によるスケールメリットからのコストダウンが可能であることが示されている。得られたポリマーは高い熱分解温度を持ちかつ熱成形可能であるため、高機能材料として様々な用途展開が期待されている。 [1] Katayama Y, et al.: Mokuzai Gakkaishi, 33, 77-79 (1987) [2] Masai E, et al. : Biosci. Biotechnol. Biochem., 71, 1 –15 (2007) [3]  Shikinaka K, et al. : J. Soc. Fiber Sci. Technol., 69, 39-47 (2013)
尾島由紘・Nguyen Hong Minh・矢嶋黎輝・田谷正仁大阪大学大学院基礎工学研究科物質創成専攻化学工学領域〒560-8531 豊中市待兼山町1-3   Tel: 06-6850-6854 Fax: 06-6850-6254  E-mail: ojima@cheng.es.osaka-u.ac.jp本研究グループはこれまで.大腸菌のセルロース生合成関連遺伝子であるbcsBの過剰発現により.自発的なフロック形成が誘導されることを報告している．一方．メンブランベシクルとはグラム陰性細菌の外膜が部分的に遊離することで産生される直径20-250 nm程の細胞外小胞であり、バイオフィルムなどの微生物集合体の形成において、重要な役割を果たしている．本研究では．大腸菌フロック形成における主要因子を検索する過程で、メンブランベシクルの関与を示唆するデータを得たことから、その産生量に着目した.微生物フロックは，これまで活性汚泥法に代表される浮遊式生物水処理技術において，産業的に利用されてきたが，その自己凝集メカニズムに関しては明らかとなっていない点が多い.また，フロック形成能力は，活性汚泥等から単離された一部の環境微生物に限られ,発酵生産等で用いられる工業生産菌では報告が少ない.バイオプロセスにおけるフロック形成の利点としては,微生物の固定化や分雕回収が容易となる他，せん断応力など物理的なストレスからの保護が挙げられる.工業生産菌の中でも，大腸菌はアミノ酸やバイオ燃料，組み換えタンパク質生産の宿主細胞として幅広く利用され，遺伝子組換え技術および培養工学技術が最も蓄積した微生物である．大腸菌のフロック形成を誘導する技術としては，カチオン性のポリマー[1]や，ポリ塩化アルミニウムなどの凝集剤の添加が用いられるが，細胞の生存率を著しく低下させるため，不要な微生物の回収・除去には向いているが物質生産プロセスに適用されるものではない.我々は，バイオフィルム形成に与える影響を評価する目的で，セルロース生合成経路の関連遺伝子群[2]を大腸菌に過剰発現させたところ，bcsB遺伝子のみバイオフィルム形成が促進されることを明らかにした．さらに予想外なことに，懸濁培養の対数増殖期において，図1に示すような直径数mm程度の自発的なフロックが形成されることを発見した[3].本研究では，大腸菌の自発的フロック形成におけるメカニズムの解明と、フロック形成現象のバイオプロセスへの応用を目的としている.図1  遺伝子組換えによる大腸菌のフロック形成グルコースを含むLB 培地での培養により形成された大腸菌フロックに対して，セルラーゼ，プロテアーゼ，ヌクレアーゼ等の加水分解酵素で処理したところ，プロテアーゼ処理によって急速に分解することが明らかとなった．同様に強アルカリである水酸化ナトリウム水溶液に対しても分解性を示したため，大腸菌フロックを形成する基本成分はタンバク質性であると考えられた.そこで，大腸菌フロックそのものをSDS-PAGEにより解析したところ，37 kDa付近に特異的な濃いバンドが確認された．そこで，nanoLC-MS/MS解析によりこのバンドに含まれるタンバク質を同定したところ，10種程度のタンパク質の存在が確認され，特に2つの細胞外膜タンパク質OmpAとOmpCが高い存在比率を示すことが明らかとなった. OmpAとOmpCに関しては,大腸菌のメンプランペシクルに特徴的なタンパク質であり，分離されたベシクルの定量評価指標として用いられていることから[4],フロック形成におけるメンプランベシクルの関与が強く示唆された.次に，大腸菌フロックをエポシキ樹脂包埋した後に切片を作製し，透過型電子顕微鏡で観察した(図2).大腸菌がポリマー構造体にトラップされている様子が確認された．さらに拡大して親察したところ，脂質二重層様構造をもつ小胞体の存在が多数確認され，メンプランベシクルである可能性が示された.続いて，これまでにメンプランベシクルの産生が促進(△degP)または抑制される(△dsbA)と報告されている大腸菌の欠損株について[5],  bcsB遺伝子を過剰発現させるなどすることでフロック形成を確認した．フロック形成の傾向と，培養上清から分離したメンプランベシクルの産生量を示すOmpC, F, Aのバンド強度との間に，はっきりとした正の相関が確認された(図3). 以上より，大腸菌のフロック形成においては，メンプランベシクルの産生が寄与していることが示唆された.フロックをはじめとした微生物疑集体のバイオプロセスへの応用としては，凝集性酵母を用いた連続エタノール生産における菌体濃縮操作に関する報告がある[6].凝集性酵母では，短時間に菌体の自然沈降が起きるため，速心分離を行わずとも菌体回収が可能となり，時間とコストの削減が可能となる。モデルケースとして，エタノール生産大腸菌であるKO11株にbcsB遺伝子の過剰発現させたところ，同様にフロックが形成された．現在，KOII株のフロック形成を利用した菌体濃縮操作やリアクター内への固定化に関する検討を進めている. [1] Yang Z. et al., Environ. Sci. Technol., 48, 6867-6873 (2014) [2] Omadjela O. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 110, 17856-17861 (2013) [3] Nguyen M.H. et al., J. Biosci. Bioeng., 118, 400-405 (2014) [4] McBroom A.J. et al., J. Bacteriol., 188, 5385-5392 (2006) [5] Schwechheimer C. et al., J. Bacteriol., 195, 4161-4173 (2013) [6] Morimura S. et al., J. Ferment. Bioeng., 83, 271-274 (1997)
窪　啓太・Nurul Asyifah MUSTAPHA・前田　憲成九州工業大学大学院生命体工学研究科生体機能応用工学専攻環境適応機能分野〒808-0196 北九州市若松区ひびきの2-4   竜話: 093-695-6064 Fax: 093-695-6005  E-mail: toshi.maeda@life.kyutech.ac.jp特殊な分解性を兼ね備えた細菌などを投入するバイオレメディエーションは安価で簡単な手法であるが、投与した菌株が長く作用するケースはほとんどない。本研究では、外来微生物の殺傷に関わる因子確認や外来微生物を殺傷する菌の単離などを行い、外来微生物に対する微生物コンソシアームの相互作用を解明することを目的とした。下水汚泥中にGFP発現大腸菌を外来微生物として接種して、投入したGFP大腸菌の動態を調べたところ、減菌済汚泥のほうが未滅菌汚泥よりも蛍光強度が大きいことから、未滅菌汚泥中には、接種した菌を殺傷する因子を含んでいることがわかった。汚泥中の微生物コンソシアームから大腸菌殺傷菌としてAcinetbactor sp.を分離・同定したが、この菌株には大腸菌を死滅させる能力はなかった。近年、石油系炭化水蒸、重金属、揮発性有機剤等の汚染物質による土壌汚染・地下水汚染は全国各地で検出され、検出件数が年々増加しており大きな問題となっている[1]。これらの汚染現場を浄化する方法の１つとしてバイオオーグメンテーション技術がある。バイオバイオオーグメンテーション技術は、汚染された土壌や水域等に汚染物質を分解可能な細菌を培養・接種し環境浄化を図る技術であり、環境負荷が少なく、従来の処理技術より低コストで運用できる利点がある。この技術を用いた場合に見込めるコスト改善効果は、米国だけでも、1兆7000億ドルとも報告されている[2]。しかしながら、研究室規模で汚染物質の分解に効果のある細菌を環境中に接種しても、分解能を示さなかったり、一時的に分解はできても長期的に機能し続続けなかったりするケースがほとんどである[3][4]。期待した効果を示さなかった原因として、汚染現場中の微生物コンソシアームの常在細菌による抑制物質の放出、汚染物質の競合、原生生物による細菌の捕食、バクテリオファージの存在の可能性等、微生物コンソシアームと接種した細菌との相互作用が関係していると考えられている[5]。当研究室では、外来微生物として緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現させた大腸菌株、および微生物コンソシアームとして下水汚泥を用いて、外来微生物と微生物コンソシアームが混じり合う模擬ケースを作成し、投与した大腸菌株が減少することなどを明らかにしてきた。本研究では、外来微生物の殺傷に関わると考えられる因子の確認や菌の単離・同定を行い、外来微生物との相互作用を迫究した。下水余剰汚泥は、北九州市の日明浄化センターから採取したものを使用し、接種した微生物を殺傷する因子の確認、および殺傷菌の単雕・同定を行った。採取した余剰汚泥は、遠心分離(8000 rpm, 10分間)して上清を捨て、滅菌水で3回洗浄し、最終汚泥濃度を5 %(v/v)に調整した。EGFPを発現させた大腸菌をLuria-Bertani (LB) 液体培地5 mLに植菌し、37  ℃、120 rpmで15時間培養、大腸菌を遠心分離(5000 rpm, 10分間)により集菌後、PBSで3回洗浄し、最終的には5 mLのPBSで懸濁させた。その懸濁液を調整汚泥100 mL (v/v)に5 mL添加し、コントロールとして大腸菌を添加しない調整汚泥の２つのサンプルを準備した。37 ℃、120 rpmで振とう培養し、0、8、24、48時間ごとにサンプリングを行い、遠心分離(13000 rpm, 1分)後に、その上清をさらに0.2 μmフィルターを用いて除菌処理し、Thermo Scientific Varioskan Flash蛍光分光・吸光分光測定装置を用いてEGFPタンパク質の蛍光強度の測定を行った。 EGFPを発現させた大腸菌をLB液体培地50 mLに植菌し37℃、120 rpmで15時間培養、大腸菌を遠心分離(5000 rpm, 10分間)して集菌した。その後、PBSで３回洗浄し、最終体積を50 mLに調整した。譲菌済み3%アガーを50 mL用意し、調整した菌液と混合し、大腸菌アガープレートを作成し、５％調整汚泥を途布して培養した。この条件下で生育したコロニーを分離し、コロニーPCRを行い、16S rRNA遺伝子のDNA相同性解析を行い、分離した殺傷菌の同定を行った。下水汚泥中の微生物コンソシアームによる投入したGFP発現大腸菌の溶菌度合を上清中に漏れ出たGFPタンパク質の量を定量することで検討した。その際、超音波破砕した際に得られる蛍光強度を100 %とし、溶菌率を評価した。大腸菌を接種した汚泥から採取した上清中には、時間経過とともにGFPの蛍光強度が増加傾向にあった。この結果は、接種した大腸菌が汚泥中の細菌群の相互作用を受け、溶菌していることを示している(図1)。我々の先行研究において、接種した大腸菌の生菌数は汚泥中で減少していくことが明らかとなっていたが、その死滅していく要因が、下水汚泥中に存在している微生物コンソシアームによる溶菌作用であることが示唆された。別の言い方をすれば、汚泥中の微生物コンソシアームが何らかの菌の成長抑制因子、または殺傷因子を放出し、大腸菌の細胞を溶菌していることがわかった。次に、大腸菌を唯一の炭素源とした大腸菌アガープレートを作製し、そこに汚泥を途布することで、大腸菌の死滅に関わる微生物コンソシアーム中の菌株を探索した。結果として、このプレート上に幾つかのコロニーの形成が確認され、そのクローンの同定を行ったところ、 Acinetbactor sp.であることが判明した。 Acinetbactor 属は27の既知の種と名前の定義されていない種が知られており、グラム陰性、非運動性、非発酵、球桿菌の特徴を持つ日和見感染を起こす菌であることが報告されている[6]。今回、大腸菌アガープレートにコロニーを形成したことから、大腸菌を炭素源として利用したことが考えられ、大腸菌を殺傷できる菌の候補として考えた。そこで、単離した菌と大腸菌を純培養し、増殖に影響のない0. 05  %  M9グルコース最少培地を用いて3回洗浄し、各菌液を1：1の割合で共培養を行い、単離した菌が大腸菌の死滅に影響するか試験した。培養条件は、37℃、120 rpm、培養時間は先行研究で生菌数の減少が確認された８時間までとした。その結果、生菌数は緩やかに増加しており、分離菌による大腸菌の死滅は見られなかった。つまり、分離したAcinetbactor sp.は目的の殺傷菌ではない可能性が考えられる。汚泥内の微生物コンソシアームには多くの微生物が混在しており、投入した大腸菌の殺菌が単一菌だけではなく、複合系微生物による複雑な相互作用によるものであることも十分に考えられる。つまり、これらの複合系微生物の機能迫究も進める必要がある。下水汚泥と外来微生物の混合上清中に外来微生物の殺傷因子が含まれていることが確認できたが、大腸菌の溶菌作用を担う菌株の特定にはいたらなかった。今後は、殺傷菌の単離を進めると共に、複合系微生物の中で起こる自然淘汰の仕組みの知見を積み重ねることが重要となってくる。それらの知見が将来のバイオレメディエーション技術の革命、複合系微生物の機能を高度活用した物質生産技術の革新に繋がると信じる。環境省. 2014.環境白書,平成26年度版[1] Louisa WP, et al : Hazardous Materials, 177, 81-89 [2] (2010) [3] Park D, et al .: Bioresource Technology, 99, 2092-2096 (2008) [4] Songzhe FU, et al.: Enviromental Sciences, 21, 1153- 1161 (2009) [5] Tyagi M, et al. : Biodegradation, 22, 231 − 241 (2011) [6]   Azam F, et al.: PLOS ONE, 2012, 7(5): e37024
大嶽　遼子'・傳賓　雄大²・清水　理恵'・Jasmin Wang'・折田　和泉¹・中村　聡¹・福崎　英一郎²・福居　俊昭¹ '東京工業大学大学院生命理工学研究科　生物プロセス専攻²大阪大学大学院工学研究科生命先端工学専攻1〒226-8501 横浜市緑区長津田町4259-B37   電話: 045-924-5766 Fax: 045-924-5766    E-mail: tfukui@bio.titech.ac.jp糖質の微生物変換による有用物質生産では、多くの場合で代謝過程での酸化的脱炭酸反応によりCO₂が放出され、原料に由来する炭素を完全には利用できていない。脱炭酸反応により生じたCO₂を同じ微生物細胞内で固定し再利用することができれば、原料バイオマスの一層の有効利用、目的生成物の炭素収率の向上、ひいては効率的生産による低コスト化が期待される。本研究ではバイオプラスチックであるポリ((R)-3-ヒドロキシブタン酸) [P(3HB)]生合成能を付与した大腸菌に炭酸固定経路であるカルビン回路の酵素群を導入し、そのグルコースからのP(3HB)生合成におよぼす効果について検討した。持続可能な社会の構築を目指し、燃料や基幹物質をバイオマス資源から生産するための技術開発が進められているが、主要なバイオマス資源である多糖類を原料とした有用物質の微生物生産では、多くの場合、替代謝に伴う脱炭酸反応により炭素収率が減少する。カーボンニュートラルであるバイオマス資源では脱炭酸反応が生じても正味の大気中CO2濃度増加には寄与しないが、バイオマス資源の集積・輸送と微生物が利用可能な炭素源に変換する糖化プロセスのコストを考えると、脱炭酸反応によりバイオマス由来炭素が失われることは無駄と言える。ポリヒドロキシアルカン酸(PHA)は微生物細胞内に蓄積される生分解性バイオベースのポリエステルであり、環境低負荷型の高分子材料として期待されている[1-2]。しかし上述のように、糖質を炭素源とした場合では前駆体であるアセチル-CoAをピルピン酸から生成する過程で脱炭酸が生じるため、糖質由来の炭素の1/3は利用されていない。通性化学合成独立栄養細菌Ralstonia eutropha (水蒸細菌）は代表的なPHAであるポリ((R)-3-ヒドロキシプタン酸) [P(3HB)]生産菌としても知られている。カルビン回路は炭酸固定が必要とされない状況では抑制されることが一般的であるが、我々は最近、R. eutrophaにおいては糖質代謝で生じた余剰のエネルギー・還元力を利用してカルビン回路を駆動し、六炭糖から脱炭酸反応で生じる2個のCO2のうち約半分（0.93個）を固定してP(3HB)生合成に再利用していることを示した[3]。このことより、独立栄養生育能を有さない大腸菌Escherichia coliにおいても、カルビン回路を機能させることで脱炭酸反応で放出されたCO2の一部を回収し、物質生産に利用できることが考えられた。本研究ではP(3HB)生合成能を付与したE. coliにR. eutropha由来のカルビン回路酵素遺伝子群を導入することにより、グルコースからのP(3HB)生産効率を向上させることを目指した。 R. eutropha染色体2上のcbbcオペロンの全14遺伝子のうち、カルビン回路とは関連ないとされる最下流のcbbBを除く13遺伝子を低コピープラスミドpMW-Gmへ挿入したpCbbを作製した（図1)。また、カルビン回路に固有のリプロース-1,5-ビスリン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ(Rubisco) (CbbLS)、Rubisco活性化酵素(CbbX)、FBP/SBPase (CbbF)、ホスホリプロキナーゼ（CbbP）と転写制御因子CbbRをコードする6遺伝子を挿入したプラスミドを作製し、pCbb-T2とした。作製したプラスミドは、R. eutropha由来のP(3HB)生合成遺伝子群 phaCAB を保持した E.  coli JM109/pGEM-phaCAB 株に導入した。この組換え株を2% グルコース含有LB培地にて37℃で72 h培養し、 P(3HB)生産量を評価した。
図1. R. eutropha由来cbbcオペロン、pCbb、pCbb-T2の遺伝子配置  灰色はカルビン回路酵素遺伝子を示すコントロール株であるE. coli JM109/pMW-Gm/ pGEM-phaCAB株はグルコースを炭素源として乾燥菌体重量あたり47.6 wt%でP(3HB)を蓄積し、その生産量は2.82 g/Lであった（表1）。pCbbを導入した株ではP(3HB)の蓋積率および生産量は6.0 wt%、0.12 g/Lと大幅に減少した。コントロール株が90%以上のグルコースを消費したのに対してpCbb導入株では40%程度しか消費せず、全菌体重量からP(3HB)量を差し引いた残存菌体重量もコントロール株の2/3以下に減少した。 cbbcオペロンの大部分である13個もの遺伝子導入ではなんらかの要因で捲代謝能が低下したことが推測された。興味深いことに、cbbcオペロン中の6遺伝子を含むpCbb-T2 を導入した株では残存菌体重量がやや減少したものの、P(3HB)蓋積率および生産量は68.6 wt%、5.30 g/Lと顕著に増加した。すなわち、導入プラスミドから発現したCbbLS・CbbF・CbbPによって全体の代謝バランスを大きく乱すことなく、P(3HB)生合成能が向上し
たと言える。その理由として、カルビン回路が実際に確立され駆動することにより襟質代謝過程で放出されたCO₂が固定され、P(3HB)生合成に再利用されたことが考えられる（図2)。しかし上述のR. eutrophaでの結果[3]を考慮すると、pCbb-T2の導入による生産量の増加は、余剰エネルギー・還元力でのCO₂固定で想定される増加量より多い。導入したカルビン回路はCO₂固定だけではなく、樹質代謝全体の強化や副産物生成の本研究にてE. coliなどの従属栄糞生物にカルビン回路を機能させることは物質生産において有利となる可能性が示唆された。現在、13C標識グルコースを炭素源とした培養における代謝物およびP(3HB)への13C取り込みや、副産物の生成について検討を行っている。様々な微生物を用いた物質生産においてカルビン回路の導入による高効率化が確立されれば、原料バイオマスをより一層有効利用できると期待される。 [1]  Madison LL, et al. : Microbiol. Mol. Biol. Rev., 63, 21-53 (1999) [2] Sudesh K, et al.: Prog. Polym. Sci., 25, 1503-1555 (2000) [3]  Shimizu R, et al. : Sci. Rep., 5, 11617 (2015) 37℃, 72 h.  *pMW-Gm :空ベクター
和田　昌憲¹、松浦　勝久²、石川　陽一¹、清水　達也² 1エイプル株式会社開発部、2東京女子医大先端生命医科研究所TWIns 〒162-0812　東京都新宿区西五軒町7-9　電話: 03-3260-0451 Fax: 03-3260-0513    E-mail: wada@able-biott.co.jp大量かつ一定な品質のヒトiPS細胞を得るためには、浮遊搅拌培養が効率の良い方法である。培養橋内の液流が均一かつ細胞に対して低シェアストレスであることがヒトiPS細胞の浮遊培養において重要であり、これを実現するため単細胞を浮遊撹拌して凝集塊の状態で増殖させるバイオリアクターシリーズを開発した。今回我々は、昨年春に販売を開始した液量30mL, 100mLリアクターに新たに500mLリアクターを加え、1000万から10億細胞までの100倍スケールをカバーするスケーラブルなリアクターシリーズを開発した。ヒト人工多能性幹細胞（iPS細胞）は細胞移植治療の実現や疾患研究の精緻化のための強力な細胞源である。必要とされるiPS細胞の数は疾患や研究対象によってさまざまであるが、低コストで一定品質の細胞を大量に調整する手法の開発が重要である。iPS細胞を培養する目的は、対象細胞へ分化誘導することにある。分化誘導は、培養基材上に接着した状態で行う方法と細胞凝集塊の形成を経る方法の２つに大別される。後者の方法は一般的に高密度培養に有利とされるため、さまざまな手法が開発されている。攪拌翼を有する培養槽による浮遊撹拌培養法はスケーラプルであること、培養状態の計測・制御が容易であることから、我々はiPS細胞培養に適した浮遊捜拌バイオリアクターを開発した。今回、基礎から生産技術の研究までの幅広いニーズにこたえるため、到達細胞数が1000万から10億までの100倍スケールをカバーする3つのバイオリアクターを開発した(図1)。ヒトiPS細胞の未分化性を維持しながら浮遊攪拌で増殖培養する場合、均質な細胞凝集塊を多量に作ることが重要となる。ヒトiPS細胞は、タイタープレートのウェル底などの限定的な空間に寄せ集めることで容易に疑集塊を形成するが、浮遊攪拌培養のように開放的な空間で凝集塊を形成させる場合には、細胞に対するせん断応力と槽内の均一混合攪拌とのバランスが重要となる。我々は両者のバランスが最適となるような三角形の撹拌翼を設計した。三角翼は培養槽内壁と中心軸に沿った形状であり、低速で回転したときに層流が強調されるが、培養槽底部と表層とで液速が異なるために乱流も生み出す効果があり、細胞増殖によって沈みやすくなる疑集塊を浮遊させ、同時に液面での気液交換を促す。培養槽底面から屹立し攪拌翼を支える中心軸は、液速がゼロとなる中心軸付近への細胞凝集塊の滞留と合一を防ぐために基部を末広がりとした。均一かつ適度なせん断力をもった液流は粒径のそろった均質な細胞凝集塊の形成を促す。このような設計思想のもと、単回使用のプラスチック製バイオリアクターを開発し、今回3タイプのリアクターによるiPS細胞の未分化維持培養の比較評価を行った。 ーシリーズ（左から液量500mL, 100mL, 30mL) 2014年4月から販売している液量30mLと100mLのリアクターと今回新たに開発した500mLリアクターのiPS細胞の比較培養試験を行った。 iMatrix(ニッピ)上に生育した1231A3株(iPSアカデミア)を酵素で単細胞へ調整し、10 μ MのY27632(和光純薬工業)を含むStemFit AK03(味の素)にmLあたり約10万細胞となるように播種した。それぞれのリアクターを最適回転数で培養し、培養開始2日目と4日目で培養液の一部をサンプリングし、顕微鏡下で細胞凝集塊の個数と直径の計測を行い、酵素で単細胞へ調整した後に生細胞数を計測した。 500mLリアクター培養は、100mLリアクター培養の4日目の細胞凝集塊を全量回収し、酵素で単細胞へ調整した後に同密度で再播種した。詳細な培養条件はポスターに示す。培養の成否は細胞凝集塊の大きさと数、生細胞数および免疫染色による未分化維持状態の解析によって判定した。経験上、細胞凝集塊の大きさがまちまちだったり、形がいびつになると細胞数が伸びなかったり、分化が進んでしまう傾向にある。30mLと100mLリアクターでは、4日間の培養で概ね直径200 μ mの凝集塊がmLあたり600～800個形成し、播種細胞数に対して10倍の増殖を示した。500mLリアクターは、100mLリアクターから継代された細胞数に対して同様に４日間で10倍の増殖を示し10億細胞に到達した。フローサイトメトリーを用いた発現マーカー解析では、いずれの培糞においても未分化性を維持して増殖していることを示していた。詳細な結果はポスターに示す。本検討により3つのバイオリアクターを用いて1000万から10億細胞までの100倍スケールのiPS細胞の増殖培養をカバーすることが可能となった。浮遊搅拌による細胞凝集塊形成を経る iPS 細胞培養の利点は、マイクロキャリアや添加剤を使用しない自己組織形成である点、pHや溶存酸素濃度といった培養環境の計測と制御が容易である点にある。運用上の利点としては、従来から微生物や動物細胞の培養に用いられている装置を使用できるので、専用の装置を必要とせず設備投資を低く抑える事ができる。また、2次元培養に比べて高密度な培養が可能であるので、頻繁な培地交換作業による汚染の危険度は相対的に下がる。灌流培養による連続的な培地交換も容易であり、同一培地であればごく単純なシステムでの無人運転も実現可能である。本システムの最大の特徴はスケーラプルである点にあり、培養条件の検討から試験生産までの培養スケールを相関性よく実現できた。今後は、2次元培養のおける顕微鏡に相当する細胞凝集塊の形成過程をリアルタイムにモニタリングできるデバイスが運用上必要とされてくると考える。 iPS細胞の培養は未分化を維持しながらの増殖ステージと目的細胞への分化誘導ステージとに分けられ、それぞれ培養容器や装置へ求められる要件が異なる。大量に増やせることが目的細胞を得る最短ルートではないことも当然あり、それぞれのステージで目的に合ったデバイスを研究者が自由に選択できることが大切である。我々はこのような研究者のニーズに応えるべく、10万～100万細胞レベルのスクリーニング用の少量多連培養装置や100億細胞を超える生産スケールに対応した培養装置も視野に入れて今後も開発を進めていく。本研究は内閣府により制度設計された「最先端研究開発支援プログラム（FIRSTプログラム）」および科学技術振興機構から支援された「再生医療実現拠点ネットワークプログラム」における東京女子医科大学先端生命医科学研究所との共同研究による成果である。
木原　隆寛¹・野口　拓也¹・田代　幸寛²・酒井　謙二²・園元　謙二²,3 ¹九州大学大学院生物資源環境科学府²九州大学大学院農学研究科 ³九州大学バイオアーキテクチャーセンター 〒812-8581  福岡市東区箱崎6-10-1  竜話:092-642-3019 Fax: 092-642-3019 E-mail: sonomoto@agr.kyushu-u.ac.jp我々は、デザインドバイオマス構想（発酵微生物の機能を最大限に発揮できる適合基質）を提唱し[1]、リグノセルロース系バイオマスの前処理、糖化処理で得られる種々の糖（混合糖）の利用を視野に入れたバイオリファイナリー技術の開発を進めている。混合糖基質を用いた連続培養で高い物質生産性を実現するには、培地中の糖濃度が一定となる定常状態でのカーボンカタボライト抑制(CCR)回避、すなわち混合糖中の全ての糖の同時消費が不可欠であるが、そのような報告は皆無である。そこで我々は、混合糖を用いながらCCRを回避した高効率連続ブタノール生産系の構築を試みた。加速する化石燃料の消費により、温室効果ガスであるCO₂濃度が初めて400 ppmに達した [2]。このような背景から、未利用資源からのバイオ燃料生産が早くから注目されている。アセトン-プタノール-エタノール発酵の主要産物であるプタノールは高エネルギー含量、内燃機関への非腐食性、疎水性などの特徴を有し、優れた燃料特性を有する。以上の理由から、バイオプタノールの実用化に向けた研究が盛んに行われている。リグノセルロース系バイオマスは稲わらを例に25-45%のセルロース、20-30%のヘミセルロースで構成され、酸やアルカリによる前処理、糖化酵素による糖化処理を経てセルロース由来のグルコース、ヘミセルロース由来のキシロースを含む混合糖が得られる。この混合糖を発酵基質に用いると、グルコースの消費がキシロースなどの消費抑制（CCR）を誘発し、培養時間の長期化と糖消費率の低下を招く。我々は、グルコースの代わりにグルコース二量体のセロビオースとキシロースの混合糖を用いて回分・流加培糞で野生株によるCCRを回避したプタノール生産系を構築した[3]。一方、培地の供給と引き抜きを同時かつ連続的に行い物質生産を長時間維持する連続培養では、キシロースを単一の炭素源とした連続的なプタノール生産を近年報告した[4]。しかし、混合糖を用いた連続プタノール生産に関する報告も存在するが、いずれもCCRによる糖消費率の低下が認められ、効率的な発酵プロセスの実現には至っていない[5, 6]。そこで本研究では、バイオマス利活用の実プロセスを見据え、CCRを回避した混合糖からの連続プタノール生産を検討した。本培養と供給用培地にはグルコース（G）とキシロース（X）を各30 g/L、セロピオース（C）とキシロース(X)を各30 g/L含むTY培地（GX30、CX30）を用いて希釈率0.15 h 1で連続培養を行った。その結果、全糖の消費率はGX30を用いた場合に29.0%、CX30を用いた場合に34.0%を示した。CCRの対象となるキシロースの消費率に着目すると、GX30の11.0%に対し、CX30はその3.8倍の41.9%に増加し、CCRの軽減が示された(図1)。この結果は、過去に報告された混合糖を用いた希釈率0.16 h ¹での連続プタノール生産におけるキシロース消費率（21.8%）を上回った[6]。これらの結果より、混合糖中のヘキソースとしてセロビオースを選択することで、世界で初めてCCRを回避した混合樹からの連続プタノール生産系の構築に成功した。前項では、CCRを回避した連続プタノール生産系の精築に成功したが、残セロビオース、残キシロース濃度はそれぞれ22.2、17.4 g/Lと高く、全糖消費率は34.0%に止まり、66.0%も系外へ排出されていたことが課題であった。連続培養技術には中空糸精密ろ過膜を介してろ液のみを引き抜き、菌体を含む培地を発酵槽に還流させることで菌体密度を高く維持するCell-recycling法（高密度連続培養）がある。菌体の高密度化により、糖消費率および生産性の向上が見込まれる。そこで我々は、CX混合糖を用いた条件にCell-recycling法を初めて適用し、高密度菌体とCX混合糖の利用による高効率連続プタノール生産系を検討した。まず、CX30を使用し、希釈率0.15 h ¹で高密度連続培養を行った。その結果、残セロピオース濃度、残キシロース濃度はそれぞれ平均で8.45、7.96 g/Lに低下し、セロビオース消費率、キシロース消費率はそれぞれ71.8%、73.5%に増加した。よって、高密度連続培養でも糖の同時消費、すなわちCCRの回避を実現した（図1)。また、プタノール生産性は通常の連続培養(0.735 g/L/h)と比較して、 1.93倍（1.42 g/L/h）に増加した（図1)。さらに、希釈率0.68 h 1での高密度連続培養では、混合糖の同時消費と高い矯消費率を維持しながら、最終的に通常の連続培養と比較して7.48倍のプタノール生産性(5.50 g/L/h)を達成した（図1)。なお、高密度連続培養でのプタノールの生成濃度と収率は、希釈率の違いによる大きな変化は認められなかった。以上の結果から、CCRの回遵が可能なCX混合糖を用いた高密度連続培養を実施することで、投与した砦の同時・大量消費を一挙に達成し、プタノールを高い生産性で連続的に獲得する極めて高効率なプタノール生産プロセスを実現できた。我々が提唱するデザインドバイオマス構想は微生物の発酵特性を最大限活用できるような基質の選択、創出を目標としている。本成果を実バイオマスへ応用するためには、従来のバイオマス処理とは異なるアプローチ、すなわちグルコースをターゲットとする前処理、糖化処理を改変する必要がある。具体的には、セロビオースやセロオリゴ糖の選択的な獲得を実現する前処理、樹化処理法の条件や樹化酵素の探索が求められる。一方、セロビオースがセルラーゼの活性化因子となる極限環境微生物の発見や[7]、セルロース分解性真菌でセロオリゴ砦がセルラーゼ遺伝子発現を誘導する[8]などの報告がある。セロオリゴ糖を多く含むような少々「粗い」加水分解は、砦化酵素投入コストを減らし、同時襟化発酵の温度を発酵微生物の生育至適温度に設定できるだけでなく、バイオマス構成樹に対して幅広い資化能を有する微生物や育種菌株ライプラリーを最大限活かすことに繋がると考えている。 [1]    Abdel-Rahman MA, et al. : J. Biotechnol., 156(4), 286- 301 (2011) [2]    Howe JP.: Environ. Hist., 20(2), 286-293 (2015) [3]   Noguchi T, et al. : J. Biosci. Bioeng., 116(6), 716-721 (2013) [4]   Zheng J, et al .: Bioresour. Technol., 129, 360-365. (2013) [5] Survase SA, et al .: Appl. Microbiol. Biotechnol., 93(6),2309-2316 (2012) Survase SA, et al .: J. Ind. Microbiol. Biotechnol., [6] 40(2),209-215 (2013) [7]    Bonhage B, et al.: Comput. Aided Chem. Eng., 32, 85-90 (2013) Znameroski EA, et al .: Proc. Natl. Acad.Sci.USA, [8] 109(16), 6012-6017 (2012)
山崎　将太朗・出村　拓・加藤　晃奈良先端科学技術大学院大学　バイオサイエンス研究科〒630-0192 奈良県生駒市高山町8916-5   電話: 0743-72-5461 Fax: 0743-72-5469  E-mail: kou@bs.naist.jp近年の植物バイオテクノロジーの発展は著しく、植物体や培養細胞へ外来遺伝子を導入することで、植物機能の改良（耐病性、各種ストレス耐性、多収性の付与など）や環境浄化等の植物機能の利用、有用物質（生分解性プラスティック、植物性油脂、医療用タンパク質など）の大量生産といった試みが盛んに行われている。しかし、植物へ導入した外来遺伝子の発現レベルは必ずしも高いとは言えないのが現状である。そこで我々は、導入遺伝子の発現をより高めるために、遺伝子発現の「翻訳過程」に着目し、mRNAからの翻訳効率を改良した導入遺伝子高発現系の開発を行っている。転写過程において遺伝子ごとに転写されるmRNA量が大きく異なっている様に、mRNAの翻訳状態はmRNA種によって大きく異なっており、翻訳効率が悪いmRNA種から活発な翻訳が行われているmRNA種まで様々である（図1A)。更にその翻訳状態も植物が置かれた状況によって大きく変化することが知られており、例えば環境ストレス下では多くのmRNAからの翻訳が抑制され(図1B) [1,2]、成長や組織の発達に伴って各mRNAの翻訳状態が変化する。一方、植物へ導入した外来遺伝子もmRNAを経てタンパク質として翻訳されるが、外来遺伝子mRNAの翻訳状態（翻訳効率)については、これまでほとんど考慮されてこなかった。そこで本研究では、mRNAの翻訳状態を規定する大きな要素である5’非翻訳領域（5’UTR）[3, 4]に着目し、植物の成長や発達、環境ストレス条件下においても常に活発に翻訳される内在性 mRNA を同定し、その5’UTRを用いた導入遺伝子高発現系の開発を目指した。細胞内で翻訳されているmRNAはリボソームが結合したポリソーマルRNAとして存在している。そこで、細胞内のすべてのmRNAについてポリソーム／マイクロアレイ解析を行うことで、全mRNAに対するポリソーマルRNAの比率をPolysome  Ratio  (PR) 値として算出し、それぞれの翻訳状態の指標値とした（図2)。解析にはシロイヌナズナを用い、発芽２日目と21日目の植物体、発芽21日目の若い葉と成熟葉、そして培養細胞を熱および塩ストレス処理した場合[1]について PR値を算出した。植物の成長段階や葉の発達、熱・塩ストレスにおける各mRNAの翻訳状態を網羅的に解析した結果、 mRNA種によって翻訳状態は異なっており、更に様々図 1.植物体での翻訳状態。(A) 細胞内での翻訳状態の概念図, (B) 様々な状態での翻訳状態変化の概念図な状況に応じてmRNAの翻訳状態は変化し、その変化の度合いもmRNA種によって大きく異なっていることが明らかとなった。これらの結果を踏まえ、すべての条件で共に高いPR値を持つ候補mRNAを6個選抜し、それらmRNAの5’UTR配列をCap Analysis of Gene Expression (CAGE)により各遺伝子の転写開始点を網羅的に解析することで決定した。選抜した候補5’UTRをレポーター遺伝子に連結した発現ペクターを構築し、一過性発現実験によりその翻訳能力を評価した（図3)。なお植物の転写開始点は必ずしも一つではないことが知られており、主な転写開始点がいくつか存在した候補については、それらいくつかの5’UTRのバリアントを用いて評価した。その結果、侯補D-2 5’UTRが非常に高い翻訳能力を示し、我々が取得した効率の良いターミネーターtHSP[5]と組み合わせることで、一般的に広く用いられるpBI系のベクターと比較して180倍の発現能力を持つ強力な発現ベクターの情築に成功した。今回、高い翻訳能力を示す5’UTRを見出し、それを用いた強力な発現ベクターの構築に成功した。この高発現ベクターは、様々な条件下でも高翻訳能力を発揮する発現系として期待され、現在、形質転換植物を用いて最終的な翻訳能力の検証を行っている。また、我々はin  silico解析を用いた翻訳制御に関わる5’UTRの配列的特徴の解析も行っており、配列情報から翻訳状態が説明できるモデル式の構築を行っている。将来的にはそのモデル式を用いて、5’UTR配列の最適化を行い、より高発現できる系の開発を目指していきたい。 [1] Matsuura, H., et al. : Plant Cell Physiol., 51, 448–462 (2010) [2] Yángüez E., et al. : PLoS One, 8, e71425 (2013) [3] Roy B. and von Arnim A.G. : Arabidopsis Book, 11, e0165 (2013) [4]  Matsuura H., et al. : Plant Cell Physiol., 54, 474-483 (2013) [5] Nagaya S., et al. : Plant Cell Physiol., 51, 328-332 (2010)
良元伸男・木田晶子・黒田俊一大阪大学産業科学研究所生体分子反応科学研究分野〒567-0047　茨木市美穂ケ丘8-1電話: 06-6879-8460    Fax: 06-6879-8464 E-mail: skuroda@sanken.osaka-u.ac.jp従来の概念では、1細胞から増殖したコロニー（細胞塊）は、同じゲノムを有するモノクローナルな集団であるので、その形質は細胞間でバラつくことなく均一であると信じられてきた。しかし、最近の1細胞解析技術の進展に伴い、同一細胞由来でも実際の形質は経時的に細胞間で大きくバラつくこと、つまり確率論的変動（stochastic fluctuation）による異種性（heterogeneity）を示すことが判明してきた。そのため、医薬品生産や再生医療などの細胞工学分野で使用する細胞株の樹立過程では、上記現象を可能な限り抑制して、所望の形質（例、生産能、多分化能）を高度かつ安定に発現する細胞を迅速に選抜し育種する必要性が指摘されている。本発表では、細胞ライブラリーが増殖して異種性を示す前に1細胞レベルで最も望ましい形質を示す細胞を迅速に選抜する「 1細胞育種技術」の意義、同技術を支える「全自動1細胞解析単離装置」の開発経緯を概説する。また、本装置により初めて可能になる様々な1細胞解析についても紹介したい。近年、バイオ医薬品（特に抗体医薬）や再生医療に対する社会的な要求が高まってきており、その生産の中心的な役割を担っている細胞（特にCHO細胞、ハイプリドーマ、幹細胞）について、所望する形質（例、生産能、多分化能）を高度かつ安定に長期間発現している細胞（本発表では「エリート細胞」と定義）を迅速に選抜し育種する必要性が指摘されている。従来、これらの細胞は、細胞ライプラリー（図１の母集団細胞）を段階的に希釈して単細胞化した後、１～２週間かけてコロニー（細胞塊）形成させ、さらに１～２週間かけて膨大な数のコロニーを別々に培養し、機能に基づくスクリーニングを経て、ベストな細胞を選抜していた。この「段階的希釈法に基づく1コロニー育種技術」は現在でも主流であるが、最近の１細胞研究成果によれば、同一細胞由来のモノクローナルなコロニーでも、確率論的変動（stochastic fluctuation）による異種性（heterogeneity）が細胞間に生じ、コロニー形成時に所望する形質が劣化してエリート細胞が埋没することが指摘されている。一方で、製薬会社などで実際に生物製剤の生産に使用されている細胞は、長い時間と莫大なコストをかけて１コロニー育種されており、高生産性と高安定性を兼ね備えているものが多く、中々経時的に劣化しないエリート細胞であることが多い。我々は、このエリート細胞を効率よく多数取得し、高生産性と高安定性を維持する共通した細胞内機構を明らかにすることを目的として、時間と手間がかかる「段階的希釈法に基づく１コロニー育種技術」の代替法である「全自動１細胞解析単離装置を用いる１細胞育種技術」の開発を行っている（図１）[ 1 ]。本研究では、膨大な数の細胞ライプラリーから、増殖前に最も好ましい形質を示す細胞を１細胞単位で単離する必要がある。そのためには、一般的にセルソーターの使用が想定されるが、細胞に対する化学的・物理的ストレスが高く、また陽性頻度0.1%未満の細胞に対しては分離困難である。そこで、我々はアズワン開及び古河電工㈱と共同で、最大40万個のマイクロチャンバーに形成したセルアレイから、目的細胞を培養条件のままで非侵襲的に１細胞単位で単離できるロポット、全自動１細胞解析単雕装置を開発した(図２) [2,3] (2013年 ものづくり日本大賞経済産業大臣賞受賞、これまでタンパク質を分泌生産する細胞の非侵襲的かつリアルタイムな評価法がなかったので、僅か30分で１細胞から分泌されるfg単位の抗体を細胞表層で捕捉し定量するFIA法（CS-FIA法）を開発した［4］。そして、本ロボットと併用して抗体産生ハイプリドーマの1細胞育種を行い、数時間の作業で、親株の10倍以上の産生量を１ヶ月以上も維持するエリート細胞を得ることができた[2]。最近では、CHO細胞でもCS-FIA法による１細胞育種にも成功している［5］。また、マイクロチャンバー自身に抗体を捕捉するFIA法の開発にも成功している（論文投稿中）。一般に使用されている幹細胞は培養過程において多分化能が細胞間で大きくぼらついてくる。そこで、多分化能マーカー（Rex1, Nanog）を指標として、本ロボットでマウスES細胞の1細胞育種を行った。その結果、数時間の作業で、極めて高い多分化能マーカー発現を均一に２ヶ月近くも維持するエリート細胞を得た[2]。また、幹細胞は各種ストレスに弱いので、同じ細胞群をセルソーターで分離して（ただし、最も優秀な細胞の単離は不可能）生存率を比較したところ、本ロポットでは9割以上生存したのに対し、セルソーターでは2割台であった。現在、我々はiPS細胞をはじめ広範囲な幹細胞に対する１細胞育種法の開発を行っている。現在ホットな領域であるバイオ医薬品や再生医療に資するエリート細胞群の樹立に、本ロボットによる１細胞育種が極めて有効であることが判明した。今後は、本ロボットを活用して数多くのエリート細胞を単離し、 DNA, RNA,タンパク質の網羅的解析により、確率論的変動の発生機構（Epigenetic  factorを想定）を明らかにして、偶然的でなく人為的にエリート細胞を樹立する方法を確立する必要がある。また、１細胞育種以外にも本ロボットには、以下の細胞工学分野での用途が開発されており、今なお増え続けている。 ① De novo創薬：上皮成長因子受容体（EGFR；活性型）と構造固定型ペプチドライプラリーを共発現した出芽酵母をアレイ化し、EGFRアゴニスト活性を有する新規ペプチドを発現する酵母を１細胞単離することができた［6］。また、IL5R（インターロイキン5受容体）及びIL6R（インターロイキン5受容体）の出芽酵母における活性型発現にも成功している（論文投稿中）。 ②匂い分子による嗅覚受容体クローニング:マウス嗅上皮細胞にCa指示薬を取り込ませてアレイ化し、遠流装置とタイムラプス機構を搭載したロボットで、任意の匂い分子刺激により応答する嗅神経細胞を単離して、世界ではじめて匂い分子に応答する全嗅覚受容体の網羅的クローニングに成功した（論文投稿中）。本方法は任意リガンドから受容体単離を可能にするもので、味覚受容体、Orphan受容体等の解析に貢献できる。 ③その他:現在、循環がん細胞(Circulating tumor cell; CTC)やがん幹細胞(Cancer stem cell; CSC)は注目されているが、生体試料に極微量にしか含まれないため解析が進んでいない。本ロボットは非侵襲的（生きたまま）の単離回収に貢献できる（現在進行中）。 [1] Yoshimoto N, et al. : J. Biosci. Bioeng., 117, 394-400 (2014) [2]    Yoshimoto N, et al. : Sci. Rep., 3, 1191 (2013) [3]   良元伸男, et al.:生物工学会誌, Vol.89, 72-78 (2011) [4] Kida A, et al. : Anal. Chem., 85, 1753-1759 (2013) [5]  良元伸男,黒田俊一：ファインケミカルシリーズ抗体医薬における細胞構築・培養・ダウンストリームのすべて（大政健史　監修）CMC出版（東京） １細胞育種を実現する全自動１細胞解析単確装置の開発（pp. 55-66） [6] Yoshimoto N, et al. : Sci. Rep., 4, 4242 (2014)
榎本　詢子・福田　淳二横浜国立大学大学院工学府 機能発現工学専攻 物質とエネルギーの創生工学コース〒240-8501　横浜市保土ヶ谷区常盤台79-5化工安工棟5階516号室　電話: 045-339-4008 Fax: 045-339-4008    E-mail: fukuda@ynu.jp様々な細胞の懸濁液の中から特定の細胞を分離、濃縮、回収できる技術は、再生医療やがん研究、創薬などのいくつかの分野において有用である。すでにセルソーター等の開発により、選択的な細胞の分離・回収が行われている。しかしながら、このような技法には適さない細胞種も多数あり、根本的に新しい細胞分離方法の開発が求められている。そこで我々は、独自に開発した電気化学的な細胞脱離法を応用し、選択的な細胞の分離・回収基板の開発に取り組んでいる。薬剤を用いる従来の方法では治療が難しい疾患に対し、細胞そのものを用いる細胞移植や再生医療が新しい医療として注目されている。たとえば、造血幹細胞移植は白血病などの難治性疾患において、すでに世界各国で臨床研究が行われている。しかしながら、造血幹細胞は、骨髄細胞10万個に1個の頻度でしか存在せず、取得が難しい。また、iPS細胞（人工多能性幹細胞）を用いた再生医療では、特定の職器細胞へ分化させた細胞群に未分化な細胞が残存し、体内で腫瘍を形成することが危惧されている。たとえば、200万個の移植細胞にたった20個の未分化細胞が混入すると100%の確率（n=5）でテラトーマ（奇形腫）が発生することがマウスを用いた実験で報告されている[1]。すなわち、必要なあるいは不必要な細胞を分離する技術が細胞移植や再生医療の分野において強く求められている。この技術には、超高精度で目的の細胞を分離できること、分離プロセスが細胞にダメージを与えないこと、治療に必要な大量の細胞を短時間で分離できること、などが求められる。近年、モノクロナール抗体などを結合させた蛍光色素や磁気ビーズを用いたフローサイトメトリーや磁気細胞分離法が細胞分離の有力な手段として注目されている。フローサイトメーターは，市販装置で１秒間に数万個の細胞を分離処理できるレベルに達している。また、高感度かつ定量的な測定や、多重パラメーター解析ができることから、希少細胞の選択的分離に用いることが可能な技術である。しかしながら、抗体を使って標識した細胞を分散状態として用意する必要があり、壁付着性の細胞はその種類によっては分散状態に長時間置かれるとアポトーシスが誘導されるなど、深刻なダメージを受ける。また、抗体を用いるフローサイトメーターと磁気細胞分離法に共通する課題は、目的細胞に特異的に結合する抗体が見つかっていない場合の分離法の確立である。その場合、抗体の代わりにアプタマーが利用できる可能性がある[2]。アプタマーは，Cell SELEXと呼ばれる手法を用いることで、抗体のように動物を用いることなく、対象細胞にのみ結合する塩基配列を見つけ出すことが可能であり，また一定の品質のものを大量に合成することができる。我々は、独自に確立した電気化学細胞脱離法とアプタマーを用いた細胞選択を用いて、細胞を分離・濃縮し、回収する技術の開発に取り組んでいる。筆者らは、電気化学反応を利用して金電極表面に接着した細胞を素早くかつ非侵襲的に脱離する技術をこれまでに報告してきた[3-11]。その原理は、金電極表面にオリゴペプチドの自己組織化単分子膜を形成させ、これを介して細胞を接着させた後に、金表面における電気化学的な反応によってオリゴペプチド層を脱離させることで、細胞も一緒に脱離させるものである（図1)。オリゴペプチドは容易に加水分解されてアミノ酸となるため細胞毒性はなく、さらに電位印加による細胞の生存、増殖への影響はないことを確認している。これまで、オリゴペプチドの片末端には、多くの細胞が認識できる細胞接着アミノ酸配列（RGD）を配置していたが、本研究ではこれに代わり、アプタマーを配置した。これによって、細胞集団の中から特定の細胞を表面に接着させるのである（図2)。ここでは、肝細胞と特異的に結合するアプタマーを結合させた。この基板上に肝細胞と線維芽細胞を同数播種し、接着したそれぞれの細胞数をカウントし、細胞選択性を評価した。そして、金基板に-1.0 V (vs. Ag/AgCl)を5分間印加し自己組織化半分子膜を脱離させることで、接着した細胞を脱離・回収した。オリゴペプチド自己組織化半分子膜のみでは、細胞が全く接着しないことを確認した。そして、ここにアプタマーを修飾したところ、肝細胞が85%の選択率(肝細胞数/肝細胞と繊維芽細胞の総数）で接着した。そして、金基板に-1.0 Vの竜位を5分間印加した結果、基板表面に接着したほぼ全ての細胞を回収可能であった。さらに、この操作を繰り返すことで、肝細胞の濃縮が可能であった（図3）。たとえば、分離前は20%であった肝細胞が3回の分離操作によって97%にまで濃縮できることが示唆された。以上の結果から、アプタマーを利用した分離濃縮システムの開発に向けた基盤技術を確立することができた。電気化学反応を利用した選択的な細胞分雕・脱離技術により、接着依存性の細胞を非侵襲的に分離できることを示した。しかしながら、現在の分離効率では十分であるとは言い難く、さらなる分離効率の向上が求められる。そのための工夫として、マイクロ流路を利用して一定の剪断応力を負荷しながら細胞を通過させることで、表面とのアフィニティーが高い細胞のみを濃縮分離するシステムの確立に取り組む。また、将来的に大量に細胞を調製する必要があることから、分離カラムのような比表面積の大きなシステムの構築も必要である。 [1] Lawrenz B, et al.: Cytotherapy, 6, 212-222 (2004) [2] Guo K T, et al.: Stem Cells, 24, 2220-2231 (2006) [3]   Inaba R, et al. : Biomaterials, 30(21), 3573-3579 (2009) [4] Seto Y, et al. : Biomaterials, 31, 2209-2215 (2010) [5] Sadr N, et al.: Biomaterials, 32(30), 7479-7490 (2011) [6] Fukuda J, et al.: Biomaterials, 32(28), 6663-6669 (2011) [7] Kakegawa T, et al : Tissue Eng, 19(1-2), 290-298 (2013) [8] Mochizuki N, et al .: Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, 7, 236–243 (2013) [9] Kageyama T, et al. : Biofabrication, 6, 025006 (2014) [10] Kang Y, et al .: Acta Biomaterialia, 11, 449-458 (2015) [11] Osaki T, et al .: PLoS ONE, 10(4), e0123735 (2015)
増田兼治、奥村武、種村裕幸、川原弘之、野中浩一、繁田雅之第一三共株式会社　バイオ医薬研究所(次世代バイオ医薬品製造技術研究組合) 〒370-0503　群馬県邑楽郡千代田町大字赤岩字くらかけ2716-1　竜話: 0276-86-7342 Fax: 0276-86-5645  E-mail: nonaka.koichi.k2@daiichisankyo.co.jp佐藤和明,谷内清人第一三共株式会社　バイオ統括部（次世代バイオ医薬品製造技術研究組合）堀内貴之，羅田みち株式会社ちとせ研究所（次世代バイオ医薬品製造技術研究組合）上野智規,後藤希代子株式会社ニッピ　バイオマトリックス研（次世代バイオ医薬品製造技術研究組合）佐伯尚史JX日鉱日石エネルギー株式会社（次世代バイオ医薬品製造技術研究組合）分子標的型治療薬として活用されている抗体医薬は、動物細胞を宿主とした生産系によって製造プロセスが確立されている。一方で、抗体を高効率で生産する（発現させる）ために、様々な技術が開発されているが、単一の技術だけでは将来の商用生産までを見越した生産量に到達することは多くない。そこで、国内にある抗体生産に関わる技術を有する大学、企業等の技術を統合しつつ、さらに必要な技術の開発と容易に使用できるよう整備することを目的として、経産省次世代バイオ医薬品製造技術研究組合の下、細胞基材の構築パッケージの確立を進めている。抗体医薬品は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞発現系により樹立された細胞基材を出発物質とした製造プロセスが確立されている。細胞基材は、宿主細胞および発現ベクターから構成されており、これまでに様々な技術開発[1]が行われているが、これらの技術を使用するには知財に付随して様々な制約がある。 CHO細胞は、Puckらによって樹立されたCHO-K1細胞[2]から派生した細胞がAmerican Type Culture Collection (ATCC)  ➪ European Collection of Cell Cultures (ECACC)等へ寄託されており、これらの機関から分譲された細胞がそれぞれ無血清、浮遊化された後、使用されることになる。また、発現ベクターに関しても、発現構成体に使用されるプロモーター、ターミネーター、5’-/3’-UTR配列、各種DNAエレメント、選択マーカーなど、構成パーツにも多くのライセンスが存在する。目的の遺伝子（Gene of Interest）のCHO細胞への導入においても、従来より利用されているrandom integration 法に加え、近年は染色体上の特定の位置にGOIを導入するsite  specific  integration法が開発され、さらに同一座でGOIのコピー数を特異的に増加させることができる逐次的遺伝子増幅法[3]も開発されている。すなわち、現在利用できる様々な技術を活用し、より高効率な抗体産生CHO細胞を取得するには、これら多くの技術の複雑な権利関係を明確にしながら、自らの目的に最適な技術を選択することが必要となる。我々は、次世代バイオ医薬品製造技術研究組合に参画し、新規の宿主細胞の開発と共に、参加組合員の技術統合によって、日本発の細胞構築技術および最適生産培地の提供を目指し研究を推進している。バイオテクノロジー応用製品（抗体医薬）の製造に利用される細胞基材は、ICH guideline Q5A/Q5Dに示されるように製品へのウイルス汚染を防ぐため、その元となる宿主細胞のウイルス否定に関しても注意を払い宿主細胞を樹立する必要がある。そこで、実験動物として繁殖されたチャイニーズハムスターより卵巣を採取し、小片化した後、牛胎児血清を含む培地で初代培養を実施した。始めに、各種血清、培地の組み合わせを検討し、GIBCO社の血清 (Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved  regions)と DMEM:F12  (1:1) 培地(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, F-12K Medium (Kaighn's Modification of Ham's F-12 Medium) contains 4 mM L-glutamine)によって、上皮細胞の良好な増殖が観察された。繊維芽細胞の混入を抑え、継代培養を注意深く行い、6ヶ月以上の期間、培養が可能になった付着細胞CHO-MK1をちとせ研究所と樹立した(無血清、浮遊化に移行(図1))。フローサイトメトリーでは、流体中に細胞を分散させ、個々の細胞を光学的に分析し、選択的に回収できる。レーザー光を流体に当て、光線から僅かにずれた方向の前方散乱 (Forward Scatter, FSC) と、光線と直角の方向の側方散乱(Side Scatter, SSC)の検出された光の集合から粒子の物理・化学的性質が推定できる。細胞では、FSCからは細胞の大きさが、SSCからは細胞内の密度(核の形、細胞内小器官、膜構造などに由来)が分析できる。FCMによって設定可能な条件から、SSCとFSCを指標に抗体発現ベクターを導入したCHO-O細胞(CHO-K1 ATCC CCL-61™由来)のpool細胞を分画した結果、通常スクリーニングの約4倍の生産量を示す高生産細胞集団の取得に至った(図2)。最終的にモノクローン化によって2.7g/Lの生産量を示すCHO-OT-S01- L003の取得に至り、random integrationとの組み合わせで、簡便かつ迅速な方法で効果的に高生産細胞の濃縮が可能となった[4]。宿主改変への取り組みとして、翻訳装置活性化[5]を誘導する（株）ニッピのspERt技術(Selective Polyribosome assembly on the ER with Three factors) による、GOIの転写後の翻訳機構を強化する技術と組み合わせることによって、1.5g/Lの生産量を2倍に向上させることができた。また、単離したCHO-OT-S01-L003をモデル細胞として、 JX日鉱日石エネルギーとの協業で生産培地の改良を進め、4g/L以上の生産量に向上させている。国産の技術としての細胞、発現ベクター、改良宿主細胞、抗体高産生細胞取得法、抗体生産培地の開発と一連の細胞基材構築までのプロセスがパッケージとして利用できる日は近い。規制科学の面から、また、組合事業において開発が進む装置の面からも構築した細胞基材のモノクローナリティーを担保する一連の抗体産生細胞構築工程として技術の完成を目指している。 [1] Tingfeng L, et al. : Pharmaceuticals, 6, 579-603 (2013) [2] Puck TT, et al. : J Exp Med., 108, 945-956 (1958) [3]  Kamihira M, et al.: J Biosci Bioeng., 113, 381-388 (2012) [4] Okumura T, et al.:J Biosci Bioeng., 120, 340-346 (2015) [5]   Ueno T, et al. : Nucleic Acids Res 40:3006-3017 (2012)
中村祐哉・森宙史・黒川 顕・中島 信孝東京工業大学大学院生命理工学研究科生命情報専攻〒152-8550　東京都目黒区大岡山2-12-1 M6-5　電話: 03-5734-3626 Fax: 03-5734-3591  E-mail: nnakashima@bio.titech.ac.jp現代では、医薬品製造や化成品生産において、酵素タンパク質の利用が不可欠である。新規に必要な有用酵素遺伝子を探索する際、環境などから取得してきた微生物群集を培養せずに、そのDNA/RNAだけを抽出し、ライブラリ化して利用するメタゲノミクスがよく用いられる。しかし従来の方法では、メタゲノムからの遺伝子スクリーニングの過程で、多大な時間と労力を要し、さらに様々な技術上の制約も存在することから、より簡易なスクリーニング方法の開発が求められていた。そこで本研究では、次世代シーケンサーを利用した新たなスクリーニング方法として、大量 RNA 配列経時解析法(TILAMS)を提唱し、レブリン酸代謝関連酵素の探索をテストケースとして開発を進めている。現代の医薬品製造や化成品生産において、酵素タンパク質の利用は欠かせない。また、低炭素社会構築の親点から、石油化学からバイオ化学へのシフトが望まれている。このため、他者に先駆けて、重要な有用酵茶遺伝子を発見することが重要になっている。発見するための方法はいくつか存在するが、有力な一方法として、メタゲノミクスを応用した方法である。これは、環境中の微生物群集からDNA/RNAを抽出してライプラリ化し、DNA/RNA配列の相同性、あるいは組換えタンパク質として発現させた時の酵素活性を指標に、必要な遺伝子をスクリーニングする方法である。また2004年には、Uchiyamaらによって、基質による遺伝子発現誘導性を指標にスクリーニングを行うSIGEX法も開発されている[1]。しかし、これらのスクリーニング方法はいずれも多大な時間と労働力を要し、かつ様々な制約も存在することから（後述）、メタゲノム活用に際してのボトルネックとなっていた。よって、より簡易で制約の少ないスクリーニング方法が求められていた。近年、工業上利用価値の高い基礎化合物として、レプリン酸が注目されている。レプリン酸は米国エネルギー省の発表したtop 12 value-added chemicals from biomassにも選出されている[2]。現在の工業上では、触媒を用いて、化学的にレプリン酸から他の有用化合物に変換されている。一方、レプリン酸を資化する微生物が数件報告されており[3],[4]、それらを利用すれば、酵素タンパク質によるレプリン酸変換も可能になると考えられる。しかし、微生物でのレプリン酸代謝経路は未だ解明されておらず、関与する遺伝子も不明であったため、実現していなかった。そこで本研究では、メタゲノムからの新たなスクリーニング方法として、大量RNA配列経時解析法( TILAMS; Time lapse analysis of massive RNA sequences）を提唱し、レプリン酸代謝酵素の探索を進めた。 TILAMSではまず、環境から取得した微生物群集に、着目する基質を添加した試料としない試料を用意し、両試料から経時的にmRNAを抽出する。そして、次世代シーケンサーを用いて、得られたmRNAを大量に配列解読し（RNA-seq）、基質添加によって量が変動した遺伝子を探し出す。そこに、バイオインフォマティクスによる各種解析を与えることによって、擬陽性の遺伝子を除去し、基質に作用する酵素遺伝子の候補を絞り込む。TILAMSによれば、次世代シーケンサーによって配列解読されたデータを同時に大量解析するため、高スループットでスクリーニングを行うことが可能になる。さらに、従来のスクリーニング方法では、いずれも微生物細胞を宿主として利用するため、扱い可能な遺伝子数に上限があることや、遺伝子プールに予期しない偏りが生じることなどの制約があったが、 TILAMSではその心配はない。従って、TILAMSでは上述したメタゲノムのボトルネックが全て解消されていると言える。多摩川にて採取したサンプルをレプリン酸で集積培糞した。これに対してレプリン酸添加サンプル(LA(+))と不添加サンプル（LA(-)）を用意し、mRNAの経時的抽出を行った。抽出はLA(+)およびLA(-)について、それぞれ6時点とした、その後、獲得したmRNAをcDNAに逆転写し、次世代シーケンサーを用いて配列解読を行った。その結果、約2,200万リードのRNA配列情報を獲得した。獲得したリードに対してアセンプルを行い、各時点について、約1,500~4,000 contigsを獲得した。さらにこれらに対し遺伝子予測を行い、約500~4,000遺伝子が検出された。これらの遺伝子は、塩基配列の相同性を基準に3,947遺伝子に分類された。これを元に、各時点におけるrelative  abundanceを算出し、各遺伝子の発現量の変化を表すグラフを作成した。このグラフからLA(+)において発現量が増加している遺伝子を抽出し、173遺伝子に候補を絞り込むことができた。絞り込んだ侯補遺伝子にBLASTを利用して、KEGGに対して遺伝子機能アノテーションを行い、約90%の遺伝子について機能情報を獲得した。これを元に機能による絞り込みを行い、最終的に24遺伝子に絞り込むことができた。このことから、TILAMS を利用することで、全遺伝子のうち1%未満まで遺伝子の候補を絞り込むことに成功した。我々の開発したTILAMSにより、環境資料から基質特異的に発現している遺伝子の十分な絞り込みを行うことができた。今後の展望としては、絞り込まれた遺伝子について、酵素活性測定などを行うことで、手法の正当性を確認しようと考えている。本手法は、添加する基質を選択することで、レプリン酸以外にも様々な物質で応用することが可能である。このことから、本手法は特定物質の未知代謝経路を探索する基礎研究から、医薬品や化成品製造のための新規酵素探索といった産業応用まで広い範囲で発展に貢啟することが期待される。また、2010年に名古屋議定書が採択され、今後途上国を中心に微生物遺伝資源の採取に関して規制が強化される可能性が高まっている。この改善されたスクリーニングの手法の有効性が実証され、活用されるようになれば、高効率のメタゲノム研究が加速され、英大な遺伝子資源のいち早い獲得につながる。それによって、低炭素社会の実現に寄与することができる。 [1]   Uchiyama T, et al.: Nat Biotechnol. 23, 88-93 (2005) [2] Werpy T, et al. : US Department of Energy, Springfield (2004) [3]  Habe H, et al.: Bioresource Technol. 177, 381-386 (2015) [4] 原田倫夫, et al.:日本農芸化学会誌43, 739-746 (1969)
千葉　靖典¹,³・高橋　佳江¹,³・岩城　隼²,³・石田　秀樹²,³・松崎　祐二²,³・平林　淳¹,³ ¹産業技術総合研究所　創薬基盤研究部門　²東京化成工業株式会社　糖鎖技術部³次世代バイオ医薬品製造技術研究組合〒305-8566 つくば市東１−１−１ 中央第６  電話: 029-861-7883 Fax: 029-861-6083    E-mail: y-chiba@aist.go.jp抗体等バイオ医薬品の製造ブロセス段階において、細胞株の選抜やスケールアップ時の糖鎖構造変化を確認するために、糖鎮をより迅速かつ再現性よく解析する技術が求められている。抗体の糖鎮分析に際しては様々な手法が用いられるが、それらの適合性を担保するには適切な校正物質が不可欠である。本演題では、酵母で生産した抗体Fc領域の雑鎖を酵素的に処理し、化学合成した糖鎖と付け替えることにより、均一な糖鎖構造を有するFcタンパク質を調製する技術について報告する。バイオ医薬品は主に細胞を利用し生産していることから、翻訳後修飾などによる不均一性が課題となっている。特にバイオ医薬品に付加された糖鎖は、その構造に依存してバイオ医薬品の有効性や安全性に大きな影響を及ぼすことが知られている。例えば、α Gal抗原やN-グリコリルノイラミン酸などの異種抗原の混入による安全性の問題がある[1]。加えて、バイオ医薬品の品質管理において詳細に樹鎖構造を調べることが求められており、開発段階から製造過程まで樹鎮構造を常に分析することが一つの課題となっている。よって、糖鎖修飾による分子構造の不均一性や医薬品の特性に影響する糖鎖構造を迅速、簡便、かつ信頼性高く解析する技術の確立が急務となっている。一般的にバイオ医薬品の糖鎖分析においては、タンパク質から糖鎖を切り出した後、糖鎖を標識、高速液体クロマトグラフィーや質量分析により構造を推定する方法が用いられている。しかしこれらの方法には、分析者の手技の熟練度や使用する装置の特性に基づく調差が伴うため、同じ評品を分析しても異なる結果が得られることが示されている[2]。この観点から、糖鎖分析の信頼性を担保するための分析校正用糖タンパク質が求められている。すなわち、糖鎖構造が明確である樹タンパク質を分析サンプルと並行して解析することにより、手技の熟練度や装置の特性に関わらず、得られた結果を校正することができる。バイオ医薬品自身が糖鎖不均一性を有する混合物であるため、現状、適当な校正品となる標品が存在しない。このような問題を解決すべく、特に治療用抗体品の分析の信頼性を担保するため、我々は校正用糖タンパク質の大量調製法を確立することを検討している。本研究では、酵母で生産した抗体Fc領域の糖鎖を化学合成した糖鎖と付け替え、均一な糖鎖構造を有するFcタンパク質の調製技術の開発を進めることとした。抗体のFcタンパク質を糖タンパク質標準品の骨格とし、メタノール資化性酵母Ogataea minuta (lindneri)株により発現を行なった。プロテインAカラムによりFc領域を調製後、エンド-β -N-アセチルグルコサミニダーゼ（ENGase）によりN-型糖鎖を切断した。糖鎖が除去されたFcタンバク質を陽イオン交換カラムで精製した。糖鎖構造としては、治療用抗体によく見られるG0 (GlcNAc2Man3GlcNAc2)、G1 (Gal1GlcNAc2Man3GlcNAc2)、 G2 (Gal 2 GlcNAc 2 Man 3 GlcNAc 2 )の糖鎖構造を選択した。これらの還元末端側をメトキシフェニル化した樹鎖を化学合成し、さらにG0については糖鎖の還元末端側をオキサノリン化した活性型の作製も行ない、評価を進めた。これらの糖鎖をそれぞれFcタンパク質に転移するため、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼの一つであるEndo-MのN175Q変異体を利用した。本変異酵素はグライコシンターゼとも呼ばれ、加水分解活性が非常に低く、糖鎖転移の用途に特に有効である[3]。酵母特異的な糖鎖の合成に関与するOCH1遺伝子を破壊したメタノール資化性酵母 O. minuta 株[4]を用いてヒト抗体のFc領域の発現を行なった。野生型酵母で発現したFc領域の態鎖はENGaseで切断できなかったが、酵母特異的な糖鎖の合成に関与するOCHI遺伝子を破壊した上記変異株で発現したFc領域に付加する糖鎖は切断可能であった。プロテインAカラムによる精製を行なった結果、250 mlの培養液から約10 mgのFc領域を精製することができた。 G0型樹鎖をENGaseで切断後、精製し、常法[5]によりオキサプリン化反応を行なった。またより迅速な処理のため、活性炭カラムを利用した糖鎖の精製法を確立した。このオキサンリン化糖鎖と糖鎖を切断したFcタンパク質を混合し、Endo-M変異体（グライコシンターゼ）を用いて糖鎖の転移を試みた。その結果、反応を繰り返すことにより、抗体未変性条件下でも80%程度の反応収率で結鎖修飾Fcタンパク質を得ることが出来た。さらにより簡便に反応を進めるため、化学合成したG0、G1、G2型樹鎖をドナーとし、グライコシンターゼの弱い加水分解活性を利用して、糖鎖を活性化することなく直接それぞれの糖鎖をFcタンパク質に転移することに成功した。現在、得られた糖鎖付きFcタンパク質の精製の検討を進めているところである。今回、酵母により発現を行なったFcタンパク質を精製後、化学法と酵素法を組み合わせることで、目的の糖鎖構造を有する抗体Fcタンパク質を再現よく調製する方法を確立できた。開発されたこの方法により、分析用校正品として頒布するためのFcタンパク質の安価な大量調製法の確立につながると考えている。糖鎖分析の校正が可能となることで、糖鎖分析の規格化を通して、日本の抗体医薬製造の競争力強化に貢献できる。また糖鎖構造は抗体の薬効や安全性にも影響するため、抗体の碧鎖分析を通して高品質な抗体の供給に貢献することが期待される。加えて、将来的にはこの分析用校正品をインタクトMSなどの糖鎖分析以外も含めたキャリプレーターとして汎用的に使用可能となるようにしていきたい。今後は、コアフコース付加型糖鎖、α Gal抗原やN-グリコリルノイラミン酸などの異種抗原を含む糖鎖などの種類を増やしていくことを検討している。さらにこれらを転移したFcタンパク質を調製、それらを一定の比率で混合して校正用標品とし、実際の糖鎖分析での実証試験を進めていく予定である。 [1] Ghaderi D, et al. : Nat. Biotechnol., 28, 863-7 (2010) [2] Wada Y, et al. : Glycobiology, 17, 411-22 (2007). [3]   Umekawa M, et al.: J. Biol. Chem., 285, 511-21 (2010) [4] Kuroda K, et al. : FEMS Yeast Res., 6, 1052-62 (2006) [5]  Umekawa M, et al. : Biochim. Biophys. Acta, 1800, 1203-9 (2010)
井之上一平¹・石河泰明²・山下一郎²・浦岡行治²・安枝寿¹ 1味の素株式会社イノベーション研究所、²奈良先端科学技術大学院大学物質創成科学研究科〒210-8681 川崎市川崎区鈴木町 1-1  竜話: 044-244-7170 E-mail: ippei_inoue@ajinomoto.com無機物を認識し特異的に結合するペプチドアブタマーは、ナノサイズの構造物構築に利用されてきた。従来、それらのベプチドアプタマーは、様々なベプチド配列を提示したファージを標的となる無機物に結合させたのちに、その結合したファージを無機物から酸処理等で剥離回収することで取得されてきた。今回、我々はそのファージディスプレイ法と電気穿孔法を組み合わせることで、従来法では取得の難しかった高い結合活性を持つペプチドアブタマーの取得方法を開発し、公知の酸化チタン結合ペプチドよりも、二倍以上高い結合活性を示す新規な酸化チタン結合ペプチドの取得に成功した。無機物を認識し特異的に結合したり、また、溶液中の無機物に作用しそれを析出させる活性をもつペプチドアプタマーは、バイオ素材と無機材料の複合化やナノサイズの無機構造物の構築に利用されてきた[1]。従来、それらの多くのペプチドアプタマーは、様々なペプチド配列を提示したM13ファージを標的となる無機物に結合させ、その結合したファージを無機物から酸処理等で剥離回収した後、F因子を持つEscherichia coliに感染、増幅させるファージディスプレイ法[2]を用いて取得されてきた。現在までに、このアプローチを用いて、酸化チタン、カーボンナノチュープ(CNT)、カーボンナノホン(CNH)、酸化亜鉛、斑化ガリウムなどの様々な無機素材を認識できるペプチドアプタマーが取得され、ナノ粒子やナノワイヤの合成、あるいは無機ナノ素材や酵素などを目的位置や特定の電極材表面へ選択的に配置するプロセスに利用されてきた[3] [4]。しかし、このような従来の方法では標的物からファージを剥離し、E. coliに感染させるプロセスに課題があった。すなわち、標的素材に対して非常に高い結合力を持つペプチドアプタマーを提示したファージは通常の酸処理では標的素材から剥雕させることが難しいと考えられていた。また、強い酸処理での剥離はファージ自体にダメージを与え、E. coliへの感染能力を失わせる可能性もあった。さらに、ペプチドアプタマーの中にはファージのE. coliへの感染力を低下させる活性を持つ可能性も指摘されていた。我々は、それらファージディスプレイ法における課題を解決すべく、細胞への遺伝子導入技術として一般的な電気穿孔法をファージディスプレイ法に組み合わせ、標的材料に結合したM13ファージを電気パルスによりE. coliに直接導入させることを試みた（図1)。そして、その結果、このスクリーニング技術により、高い結合活性を持つペプチドアプタマーを簡便に取得することができた。図1.電気穿孔法とファージディスプレイ法を組み合わせたペプチドアプタマー取得技術。 2.方法直径25 nmの酸化チタンナノ粒子に、12残基のランダムなアミノ酸配列からなるペプチドを提示させた一群のファージを吸着させた。その後、酸化チタンへの吸着力が弱いファージを除去するため、界面活性剤を含む緩衝液で数回、その反応物を洗浄した。そのナノ粒子に強く結合したファージを粒子に吸着させたままE. coliと混合し、電気パルスを与えた。電気パルス処理されたE. coliを培養することでE. coli細胞内で増幅されたファージを回収し、それを再度酸化チタンへ吸着させた。この工程を4回繰り返し、標的材料へ高い親和性を持つペプチドアプタマーの取得を検討した。取得されたペプチドの酸化チタンへの結合力やチタン化合物析出活性を評価すべく、取得ペプチドを分子表面に提示したカゴ状タンパク質Dps（Listeria innocua由来）を設計し、これをE. coliにて大量生産した。酸化チタンへの結合力評価には、酸化チタン被膜された水晶をセンサーとした水晶振動子マイクロバランス法（QCM）を用いて、緩衡液中で酸化チタン酸へのタンパク質吸着量変化を測定することで評価した。チタン化合物の析出活性は、水溶性チタン化合物と変異カゴ状タンパク質を混合し、水に不溶な水酸化チタン疑集体の析出量を吸光測定することで評価した。竜気穿孔法とファージディスプレイ法を組み合わせたスクリーニング法にて、新たな酸化チタン結合ペプチドST1(アミノ酸配列: AYPQKFNNNFMS)を取得することができた。このST1ペプチドをC末端に提示したDps (Dps-ST1)の酸化チタンへの解雕定数K ρは21 nMであり、最も優れた酸化チタン結合ペプチドの一つとして知られているminTBP1(アミノ酸配列: RKLPDA[5])を提示したDps (Dps-minTBP1)のK D (56 nM)と比較して二倍以上高い酸化チタン結合活性を示した。また、水溶性チタン化合物を前駆物質とした水酸化チタンの析出量と析出速度においても、Dps-ST1の活性はDps-minTBP1の活性の約２倍であり、ST1ペプチドがminTBP1よりも高いチタンへの親和性を持っていることが分かった。今回、N末端にCNT結合ペプチドNHBP-1（アミノ酸配列：DYFSSPYYEQLF[6]）、C末端にST1ペプチドをそれぞれ提示した Dps（CDTS1）を構築した。そのCDTS1とCNTを水溶液中で混合することで、CNTの周囲特異的にCDTS1を吸着させることができた。その落液に水溶性チタン化合物を添加することで、常温常圧下でCNTの周囲特異的にチタン化合物膜を製膜することができた（図2)。このようなチタン化合物-CNT複合材は、例えば色素増感太陽竜池の酸化チタン竜極の導電フィラー材として活用することができる[7] [8]。図2. (a) CDTS1とCNTの複合体と(b)チタン化合物被膜されたCDTS1-CNT複合体のTEM像。我々の開発した竜気穿孔法とファージディスプレイ法を組み合わせたペプチドアプタマーの新たなスクリーニング技術は非常に簡便であり、そして、原理的に対象となる材料によらないため、酸化チタンのみならず、様々な無機物、有機物そして生体分子に対して選択的な結合性を持つペプチドアプタマーの開発への応用が期待できる。なお、今回取得された酸化チタン結合ペプチドは太陽竜池の竜極材となるナノ複合材料の合成に利用されたが、今後は、これらペプチドを活用したナノレベルでの物質配置技術と薄膜形成技術を、酸化チタン構造体のみならず、例えばナノレベルでの構造制御により機能向上が期待できる蓄電デバイスやバイオセンサーの素材合成や機能改善などに展開していきたい。 [1] Yamashita. I, et al. : Biochim. Biophys. Acta, 1800, 846 (2010) [2] Smith G P.: Science, 228, 1315 (1985) [3] Shiba K.: Curr. Opin. Biotechnol., 21, 412 (2010) [4] Seker U. O. S. et al. : Molecules, 16, 1426 (2011) [5] Sano K., et al.: Langmuir, 21, 3090 (2005) [6] Kase D., et al.: Langmuir, 20, 8939 (2004) [7] Inoue I., et al. : ChemSusChem, 7, 2805 (2014) [8]    Inoue I., et al. : Nanotechnology, 26, 285601 (2015)