山本恵介東京大学医学部附属病院消化器内科Key words :膵癌,腫瘍微小環境,低栄養,セリン生合成経路,オートファジー
植 官
膵癌は5年生存率が約10％と予後不良の難治癌である。治療選択肢も少なく、現時点では膵癌に対して有効な分子標的薬も免疫療法も存在しないため、患者ごとの膵癌の特性に基づいた新規治療法の開発が喫緊の課題である[1～3]。膵癌は綿排性問質を伴った乏血性の腫瘍を特徴とし、腫瘍内部に高度な低酸素・低栄養環境を生じる。このような微小環境で生存するため、膵癌細胞は膵星細胞や神経細胞から栄養素の供給を受け［4，5］、自身の代謝を改変して適応するなど[1, 6～8]、特徴的な代謝特性を有しており、その理解は新たな治療法の開発に有用と考えられる。セリンは、ヒト膵癌の原発巣腫瘍内部でグルタミンに次いで２番目に不足しているアミノ酸である[9]。セリンは様々な生合成経路の基質であり（図1A）、その確保は細胞の生存・増殖に必須である。通常、細胞は細胞外のセリンを取り込むが、これが不足した場合にはグルコースを基質としてセリンを生合成する（セリン生合成経路SSP ;図1B)。これまで、マウスモデルを用いた検討から、膵癌ではSSPが亢進していると考えられてきたが［10］、我々は予想に反して、ヒト膵癌では約4割の症例がSSPの律速酵素であるPHGDHを欠損していることを発見した[5]。重要なことに、これらSSP欠損膵癌細胞は、セリンを生合成することができないため、セリン完全欠乏培地で死滅する(図1C)。しかしながら、膵癌マウスモデルを用いた検討では、セリン欠乏食餌でのSSP欠損膵癌の増殖は通常食餌の50％程度までの減少にとどまり、腫瘍の完全消失には至らなかった。これは、宿主側の代償機構により血漿中セリン濃度が一定値以下には減少しないため、また腫瘍内へ浸潤した神経細胞から膵癌細胞へセリンが供給されるためであり［5］、セリン欠乏食単独で腫瘍へのセリン供給を完全に適断し、腫瘍を根治することは困難であると判明した。このため、セリン制限との併用治療の開発が必要と考え、SSP欠損膵癌に対するセリン制限による抗腫瘍効果を増強するため、SSP欠損膵癌の代謝特性の解明を目指して研究を行った。図1.膵癌におけるセリン代謝経路とその異常A）セリンを起点とした生合成経路。 B） 主なセリン獲得経路。 ( i )セリン生合成経路(serine synthesis pathway : SSP) 、 (ii)アミノ酸トランスポーターを介した細胞外からの取り込み、（iii）マクロピノサイトーシス、（iv）オートファジー、（v）グリシンからの合成。 C） セリン生合成経路久損膵癌は、セリン欠乏培地で死滅する。
1.細胞培養、培養試薬
マウス膵癌細胞株（KPC）およびヒト膵癌細胞株（AsPC1、PaTu8902、MiaPaCa2、PaTu8988T、PL45）は、グルコース／グルタミン／セリン／グリシン／ピルピン酸ナトリウム不含のDMEM（D9082-01、US Biological社）に、4 mM L-glutamine、2.78 mM glucose、1 mM Sodium pyruvate、10％透析済み胎児ウシ血清を終濃度で添加した塔地を用いた。マクロピノサイトーシスの評価のためには、脂肪酸不含のアルプミン(126609、Sigma)を使用した。
2.   PHGDH遺伝子のノックアウト細胞、および薬剤誘導性PHGDH発現細胞の樹立
CRISPR-Cas9システムを用いた遺伝子ノックアウト(KO)には、guide RNA (gRNA)とCas9を同時に発現できるコントラクトlentiCRISPRv2-hygro（Addgene plasmid#98291）を用いた。本プラスミドは、Brett Stringe博士の好意により提供いただいた。制限酵素処理・ライゲーションによるクローニングにより、マウスPhgdhに対する複数のgRNAないし、non targeting control（sgNTC）を発現するコンストラクトを作製した。ドキシサイクリン(Dox)誘導性PHGDH発現細胞の作製には、pINDUCER20 blast (Addgene plasmid #109334)を用いた。本プラスミドは、Jean Cook博士の好意により、提供いただいた。ヒトPHGDHの完全長cDNAは、 GATEWAYクローニング（Invitrogen）により、pINDUCER20-blastへ組み込んだ。
祐 果
1. SSP欠損マウス膵癌細胞株の作製
前述の通り、ヒト膵癌臨床検体・ヒト膵癌細胞株の約４割がSSPの律速酵素であるPHGDHの発現を欠損している[5]。これとは対照的に、膵癌研究に広く用いられている遺伝子改変膵癌マウスモデル（p48-Cre:LSL-Krasc 1 2 D;p53wellex;KPCマウス）では、PHGDHは過剰発現している［5，10］。そこで、膵癌細胞におけるSSPの欠損によって、癌細胞ならびに腫瘍做小環境の問質細胞において、どのような代償経路が活性化するのかを比較・検討するためには、遺伝的背景が同一な細胞を用いて、SSPをON／OFFに制御できる系が有用である。また、生体内での癌細胞の挙動を、免疫細胞との相互作用も含めて精緻に検討・評価するためには、同系統マウスへの移植が可能なマウス膵癌細胞が有用である。こうした背景から、まずはC57BL/6背景のKPCマウスより樹立した細胞株（KPC細胞）を用いて、SSP経路の律速酵素であるPHGDHの安定KO細胞を作製した。単一細胞に由来するクローンを複数樹立し、それぞれセリン／ゲリシン合有培地（各々400 μ M Ser／Gly）と不含培地（－Ser／Gly）で培養の後、ウエスタンプロットによるタンパク発現評価、クリスタルバイオレット染色による細胞増殖の評価を行った。
図2.  PHGDH-KOマウス膵癌細胞株の樹立
コントロール細胞（sgNTC）では、培地中のセリン／グリシン（Ser／Gly）の有無によらずPHGDHは高発現しており(上段)、また細胞増殖も影響を受けない。一方、PHGDHノックアウト細胞(sgPhgdh)では、セリン／グリシン完全欠乏培地では増殖できない。図２に示す通り、コントロール細胞（sgNTC）においては、培地中のセリン／ゲリシンの有無によらず、PHGDHは恒常的に高発現していた。一方、PHGDH-KO細胞では、塔地中のセリン／ゲリシンの有無によらず、PHGDHの発現が喪失していることを確認した。さらに、クリスタルバイオレット染色を用いた増殖アッセイでは、コントロール細胞（sgNTC）ではセリン／ゲリシン不含培地でも増殖速度は変化せず、SSPを介したグルコースからのセリン生合成により代償されていることが示唆された。一方で、PHGDH -KO細胞の増殖速度は、セリン／ゲリシン含有培地ではコントロール細胞と変わらなかったのに対し、セリン／ゲリシン不含培地では顕著に抑制された。このことから、SSPの律速酵素であるPHGDHのノックアウトにより、セリンの生合成が適切に抑制されていることが示唆された。
2.  ドキシサイクリン師導性にSSPを制御可能なマウス膵癌細胞株の樹立
次に、結果１で樹立したPHGDH -KO膵癌細胞を用いて、ドキシサイクリン誘導性にPHGDHを発現可能な細胞株を樹立した。図３に示すとおり、塔地中のセリン／グリシンの有無によらず、これらの細胞ではPHGDH発現が消失しており、一方でドキシサイクリン投与により、PHGDHの発現が回復することを確認した。さらに、これらの細胞におけるSSP経路の有無と増殖速度をクリスタルバイオレット染色で検討したところ、セリン／グリシン含有培地では、ドキシサイクリン投与によるSSP経路の活性化は細胞増殖に影響を与えなかった。一方で、セリン／グリシン欠之条件下では、SSP経路の活性化により細胞増殖・生存は回復することが確認された。このことから、これらの細胞では、ドキシサイクリン誘導性に、PHGDHの発現を調節することで、SSPを制御できることが確認された。図3. ドキシサイクリン誘導性にSSPを制御可能なマウス膵癌細胞株の樹立A） clone#8、9とも、Dox存在下でのみPHGDHが発現する。 B） Dox投与により、セリン／グリシン欠乏培地での増殖が回復する。一方で、セリン／グリシン存在下では、PHGDH発現回復により細胞増殖は影響を受けない。
3. SSP欠損膵癌におけるセリン獲得経路の評価
SSP欠損膵癌は、グルコースからセリンを合成することができない。このため、セリン獲得経路としては、（ i ）細胞外からの取り込みに加え、(iii)マクロピノサイトーシス、(iv)オートファジー、( v )グリシンからの生合成によりセリンを獲得している可能性が考えられる（図1B)。（v ）については、自験ではグリシンからのセリン生合成はほとんど行われなかったため［5］、主に（iii）マクロピノサイトーシス（iv）オートファジーの関与を評価した。マクロピノサイトーシスとは、細胞外に突出した細胞膜が、細胞外液をつつみこみ、細胞内に取り込む作用を指す。膵癌では、マクロピノサイトーシスを介した細胞外のアミノ酸／タンパク質の取り込みにより、低栄養環境での栄養素の補充を行っている[9]。特に、必須アミノ酸であるグルタミンの欠乏条件下では、膵癌細胞はマクロピノサイトーシスによる細胞外のアルプミンの取り込みとその分解により、グルタミンを補充する[9]。そこで、SSP久損率癌における細胞外セリン欠乏に対し、マクロピノサイトーシスがセリン補充経路となるかどうかを検討した。図４に示すように、様々な濃度の低セリン／グリシン培地において、アルプミン添加はPHGDH-KO細胞の増殖を回復できなかった。また、グルタミン欠乏培地と異なり、セリン／グリシン欠乏培地ではマクロピノサイト一シスに関連した遺伝子の発現上昇も認めなかった。このことから、マクロピノサイトーシスは、SSP欠損膵癌におけるセリン獲得経路としては重要ではないものと考えられた。次に、SSP欠損膵癌におけるオートファジーの寄与を、LC3のウエスタンプロッティングにより評価した。図4に示すとおり、コントロール細胞ではセリン除去によってLC3  II／ I比に変化を認めなかったが、PHGDH KO細胞ではLC3  II／ I比の上昇を認め、オートファジー活性の増強が示唆された。このことから、SSP欠損膵癌は、細胞外セリン濃度の低下に対して、オートファジーを介した基質分解によりセリンを獲得し、生存に寄与している可能性が示唆された図4.セリン欠乏に対するSSP欠損膵癌の応答A)マクロピノサイトーシスはセリン欠乏培地での増殖を回復させることができなかった。 B）SSP野生型膵癌では、セリン欠乏によりオートファジー活性は変化しないが、SSP欠損膵癌ではセリン欠乏によりオートファジ一活性の増強を認めた。
有 #
膵癌の約４割の症例がSSPを欠損しており、こうした症例に対する特異的な治療の開発には、SSP欠損膵癌の代謝特性の理解が不可欠である。本研究では薬剤誘導性にSSPを制御可能な膵癌細胞を作製した。現在、これらの細胞を用いて、SSP経路の多寡・有無によってどのような代償経路が活性化するのかを探索中である。そのような試みの一つとして、細胞外セリンの取り込みにかかわるアミノ酸トランスポーターの同定を目指している。具体的には、(a) SSPのon offに伴う発現変動遺伝子の網羅的比較（RNA-seq）、(b)  CRISPR-KO libraryによる機能的スクリーニング、 (c)阻害剤ライプラリーを用いたスクリーニングから、侯補分子の探索を行っている。生体内では、癌細胞は宿主細胞から様々な代謝産物の供給を受けている[4]。我々は、SSP欠損膵癌が、原発巣では神経細胞からセリンの供給を受けることを報告したが[5]、他臓器への転移巣において、どのような代謝座物のクロストークが存在するかは明らかではない。今回樹立した細胞を用いて、生体内でSSP経路をON／OFFすることで、周囲間質細胞の代謝特性がどのように変化し、その結果どのような代謝産物が磨細胞に供給されるのかを検討中である。 In vitroでの細胞培養環境と異なり、生体内では、セリン／グリシン欠乏食餌下でも、腫瘍内のセリン濃度を完全に遮断することは不可能である。このため、セリン制限食単独ではSSP欠損膵癌の根治は難しく、(セリン欠乏環境での) SSP久損膵癌の生存に必須な経路を同時に阻害することで、根治を目指すのが現実的な治療戦略と考えられる。本研究では、SSP欠損膵癌が、細胞外からのセリン／ゲリシン供給の低下時にオートファジーへの依存度が増加することを見出した。すなわち、オートファジー阻害により、セリン制限食による抗腫瘍効果を増強できる可能性を示唆しており、現在、in vitro、in vivoで検証を進めているところである。