マニュアル（第３版）1501HT-2305
プロトコールA :ゲノムDNAの単離
Step 1. 試料の準備（木モジナイゼーション）

②　試料とISOGENOMEが均一になるよう、穏やかに且つ十分に溶解する。 a）組織の場合、酸間に余裕があるガラス・テフロンホモジナイザー（開酸精度: 0.1〜 0.15 mm以上）を用いて手動で5〜10ストローク〈上下〉して組織を完全にホモジナイゼーションする。少量の歓組織の場合、マイクロビベットで繰り返しピベッティングすることで組織を分散および溶解する。 b）接着組胞の場合、ディッシュから培地を取り除いた後、10 cm²あたり（3.5 cmディッシュに相当）1 mlのISOGENOMEを直接加えてマイクロピベットで数回ピベッティングして溶解する。 c）浮逆細胞（細胞沈般または細胞態濁液）の場合、違心して焙地を取り除いた後、 1 × 10細胞（容量＜0.1 ml）あたり1 mlのISOGENOMEを加え、ピベッティングを繰り返して編胞を溶解する。 33 a）の組織および軟組織や夾雑物の多い試料の場合は、ホモジナイズしたサンプル（ホモジネート）を室温で5〜10分間静置する。（DNAの可溶化）
Step 2. 進心分離による不定物の除去（オブション）・2
①　a）組織の場合、ホモジネートを一度造心（10,000×g. 10分間）し、不溶物を沈殿させ②上清を新しいチューブに移す。
Step 3.  DNAの沈職
①）サンプルに添加したISOGENOMEの0.5倍量のエタノール（99.5%）を添加する。 (例: 1 mlのISOGENOMEに対して0.5 mlのエタノール) 20ホモジネートとエタノールが均一な溶液になるよう転倒混和を行う。(目安：5〜8回) B3 1～3分間、静置する。 @新静置後、祈出した繊維状のゲノムDNAをチップの先で混ぜるようにすくい取り、しいチューブに移す。*コ
Step 4.  DNAの法弁
① DNAの入ったチューブに1 mlの75%エタノールを添加する。 BS転倒混和（目安: 3〜6回）でDNAを洗浄。チューブを立てた状態で30秒～1分間静置してDNAを沈殿させ、静かにビベットまたはデカンテーションによってエタノールを除去する。(沈殿が浮いてしまう場合は、違心（1,000 × g. 1～2分間）してDNAを沈殿させた後、エタノールを除去する。） ④）もう一度75%エタノールによる洗浄（①～③）を繰り返す。
Step 5.  DNAの清掃
①）ピペットでチューブの底に残っているエタノールをできる限り除去する。 ** 8 mM NaOHまたはddHzOでDNAを溶解する。*5 BS肝臓や筋肉などの組織から単離したDNA溶液は多糖類などの不溶物を含む場合がある。その場合は、違心（12,000×g, 10分間）によって不溶物を除去する。 ③ 8 mM NaOHで溶解した場合はHEPES溶液などで中和する。** *2 このオブシコン操作を行うことで、不常性の結構販片や加水分類されたRNA、過剰な多糖類を除去できるため、肝臓、筋肉等のサンプルの場合に有効である。 *3 試料のDNAが少量（＜15 pg）の場合、機種状のDNAをチップで固収できないことがある。その場合は、析出したDNAを逸心（5,000×g。5分間）により沈殿させ、上清を除去する。 *4　エタノールが残ったままDNAを溶解させると、その後の反応系に影響を与える可能性がある。必要に応じて室落でエタノールをとばす。完全には乾かさない) *5 8 mM NaOHを使用した方がDNAを溶媒しやすい。添加量の目安は家面＜VI＞を参照。 *6  8 mM NaOH（1 ml）に添加する0.1 Mまたは1 M HEPES溶液の添加量の目安を表面に示す。
l 製品説明
ISOGENOME（アイソゲノム）は、組織や組胞からゲノムDNAを抽出するための試薬です。本品は、グアニジンや界面活性剤を含む溶液であり、RNAを加水分解することによりDNAを選択的に図収することができます。また、簡単な操作でDNAを抽出できるため、スケールアップや多検体処理にも対応できます。さらにRNA抽出用試薬ISOGEN II (Code No. 311-07361)と組み合わせて使用することで、同一サンブルからRNAとDNAを抽出することができます。試料にISOGENOMEを加えて溶解またはホモジナイズした後、エタノール沈殿、エタノール洗浄、溶解することで、短時間でゲノムDNAが抽出できます。
■特長
約30分間でゲノムDNAを抽出新鮮な組織からのゲノム回収率70%以上ISOGEN IIとの併用でRNAとDNAが抽出可能フェノールを含まず、操作中にも使用しない得られたDNAは様々なアプリケーションにそのまま使用可能＜サザンブロッティング、ドットブロットハイブリダイゼ―ション、クローニング、PCRなど＞
ll 製品内容
Code No. 314-08113 • ISOGENOME
100 ml 1物III保存
立場保存
・低温で長時間保存した場合、まれに塩が折出する場合がありますが、品質・性能に問題はありません。このような場合には容器ごと55〜65℃で30〜60分間程、インキュベートと造時混合して、析出物を完全に溶解させてからご使用下さい。
IV　使用上の注意
.本品は、試験研究用試薬ですので、医薬品、その他の目的にはご使用になれません。また、試楽についての基本的な知識のある方以外は取り扱わないで下さい。 ISOGENOMEには対激物が含まれています。皮膚との接触を避けるため取扱いに注意.し、ご使用の際には適切な保護具（手袋、眼鏡等）を着用して下さい。 .本品の取り扱いは、マニュアル記載内容通りに行って下さい。マニュアル記載内容と異なった取り扱いによるトラブルにつきましては、弊社では黄任を負いかねます。安金性データシート（SDS）につきましては、ニッポンジーンWEBベージ. （www.nippongene.com）よりご覧になれます。 V ブロトコール
■ 本晶以外に必要な試病
エタノール（99.5%）、75%エタノール8 mM NaOH（用時規制）*1 1M HEPES（pH調整用） ■ 使用するチューブについて本ブロトコールは、1 mlのISOGENOMEと0.5 mlのエタノールを添加する方法が記載されており、その場合は2.0 ml容量のチューブを必要とします。 1.5 ml容量のチューブを使用する場合は、ブロトコールを0.8倍にスケールダウンして行.って下さい。
■ 操作方法について
全ての操作は室温で行えますが、違心は4〜25℃で行ってください。高分子のゲノムDNAは切断されやすいので、混合の際に激しい振盪やポルテックスは避けて、できるだけ穏やかに且つ十分に行って下さい。 ●1 8 mM NaOHは、関製後1ヶ月以内のものを使用します。関製時は、関射後6ヶ月未満の2〜4 M NьOHの原液から8 mM N=OHを隣設して下さい。 ①）組織25〜50 mg、培養細胞（10 cm²）または〜1×107細胞（容量＜0.1 ml）に対して、 1 mlのISOGENOMEを添加する。
ー般的に、純度（A2sa/A2so）は1.6〜1.9、大きさは20〜100 kbpのゲノムDNAを単離することができる。
プロトコールB : ISOGEN IIと組み合わせたRNA、DNAの単離
ISOGEN II （Code No. 311-07361）は組織および編胞からのRNA抽出用試楽です。これまでのISOGENIEではゲノムDNAを単離することができませんでしたが、ISOGENOMEと組み合わせることによって、同一サンブルからRNAとDNA*7が抽出できるようになりました。DNAは、ISOGEN II溶解液の遠心後に得られる沈酸層から回収することができ、PCRなどの使用に適しています。 •7  ＜プロトコールB＞で得られるDNAは新片化している可能性があります。
Step 1. 試解の推振（木モジナイゼーション）
①　沈殿層を崩さないように静かに残りの上清を除去する。 BS沈殿に対して8〜10倍量のISOGENOMEを添加し、激しく混合して沈殿を溶解する。組織および軟組織や突雑物の多い試料の場合は、沈殿の溶解液を室温で5〜10分間静室B3する。 (DNAの可溶化)
Step 2. 運心分離による不準物の障去（オプション）  *²
①）必要に応じてDNA溶解液を遠心（10,000 × g, 10分間）し、不溶物を沈殿させる。 ②　上清を新しいチューブに移す。
*2表面を参照。
Step 3.  DNAの辻殿
①　沈殿に添加したISOGENOMEの0.5倍量のエタノール（99.5%）を添加する。 (例: 1 mlのISOGENOMEに対して0.5 mlのエタノール) ② DNA溶解液とエタノールが均一な溶液になるように転倒混和を行う。 (日安: 5〜8国) Ci 1〜3分間、静置する。 ④）新出したDNAを遠心（5,000 × g, 5分間）により沈酸させる。 ⑤上清を除去する。
Step 4.  DNAの类外
DNAの入ったチューブに1 mlの75%エタノールを添加する。 Ba転倒混和（目安: 3〜6国）でDNAを洗浄。 ③）チューブを立てた状態で30秒～1分間静置してDNAを沈殿させ、静かにビベットまたはデカンテーションによってエタノールを除去する。（沈殿が浮いてしまう場合は、違心（1,000 × g, 1～2分間〉してDNAを沈殿させた後、エタノールを除去する。） ④）もう一度75%エタノールによる洗浄（①～③）を繰り返す。
Step 5.  DNAの情報
①）ピペットでチューブの底に残っているエタノールをできる限り除去する。*4 ②) 8 mM NaOHまたはddH₂OでDNAを溶解する。 *5肝臓や筋肉などの組織から単離したDNA溶液は多糖類などの不溶物を含む場合がある。その場合は、違心（12,000×g, 10分間）によって不溶物を除去する。 ③ 8 mM NaOHで溶解した場合はHEPES溶液などで中和する。*6
*4,5,6 表面を参照。

■8 mM NaOHまたはddH₂Oの添加量の目安（DNAの溶解） 1 × 10編胞または10〜20 mgの組織から単離したDNAに、0.2〜0.3 mlの8 mM NaOHまたははddHzOを添加することで0.2〜0.3 μg/μlのDNA溶液が得られる。 ■サンブルの保存についてStep 1で得られたホモジネートは、定温で1ヶ月間、4℃またはは－20℃で10ヶ月間保存できる。 Step 4で得られた75%エタノール中のDNAは、室温で少なくとも1週間、4℃で３ヶ月間保存できる。 •記載内容や製品仕様に関しては予告なしに変更する場合があります。株式会社ニッポンジーン研究試楽部　学術営楽課TEL 078 (451) 6548 www.nippongene.comお問い合わせはお電話もしくはWEBフォームより承っております。