http://peptide-soc.jp [研究と笑い] 4月16日未明に本震が発生した熊本地震については現在も余震が続いており，犠牲になられた方々のご冥福をお祈りするとともに，被災された皆さまに心からお見舞いを申し上げます。また,一日も早い復旧を果たされることを願うと同時に，被災野水基義された皆様が平穏な日々を取り戻せるようお祈り申し上げます。研究と笑い,一見全く関係のないこととみられがちである。研究は真剣で笑いは不真面目といったところであろうか。しかし，研究にもっとも必要なものは笑いかもしれない。私は30代にアメリカやカナダで10年ほど大陸浪人をしてきた。渡米した当時，研究に関してはペプチドしか知らなかったが，まわりの人からいろいろな話を聞いてディスカッションをしていくうちにどんどん研究の幅が広がり，目的とする研究内容が変わっていった。このときもっとも大事であったのがコミュニケーションであるが、言語より笑いの方が重要であったと思う。笑いは人と人とのコミュニケーションの最も優れた潤滑剤なのである。ペプチドを使っていろいろな疑問を解決していく,これがペプチド科学のひとつの醍醐味である。ペプチド科学というものは，いろいろな分野との接点が重要で，常にいろいろな分野と対話する必要がある。ペプチドの合成だけを見ても，幅広い有機化学との接点が必須であり、有機化学的な技術の修得も必要である。ペプチドは生体内の活動を制御するもので，ペプチドを使ってバイオロジーを解明したり，薬にしたりと，バイオロジーに直結するものである。幅広いバイオロジーの知識が必要であり，いろいろな分野の研究者とのコミュニケーションが必須である。私は米国NIHに留学したときに，細胞外マトリックスを研究している研究者からいろいろな知識を得た。細胞外マトリックスなど全く知らなかった私が,このコミュニケーションから得た知識でペプチドを用いた細胞外マトリックスの研究を展開することができるようになった。まさにコミュニケーションの中でペプチド科学の研究している様なものである。このように，ペプチド科学の研究にはいろいろな分野の研究者とのコミュニケーションが重要である。さて，私のコミュニケーションに関するキャッチフレーズは「Smile, Cheerful, and Friendly」である。大陸浪人をしていた頃から，常に心がけていることである。日本語に直すと「いつもにこにこ，よいしょで人付き合い」といったところであろうか。決してスマートなものではないかもしれないが，いろいろな人と円滑なコミュニケーションをとるには必要な変勢であると思う。その中でもっとも大事なものは「笑い」である。昔から良い研究には遊び心が必要であるといわれるが，その表現形が笑いであろう。研究者には笑いが必要なのである。笑いと研究，実は密接な関係があり，笑いは研究という木を育てる最良の肥やしなのである。のみず　もとよし東京薬科大学薬学部nomizu@toyaku.ac.jp http://www.ps.toyaku.ac.jp/~nomizu/index.htmlものづくり研究をペプチドで
【はじめに】
先日，「21世紀後半に向けたペプチド科学の展望について」というテーマでペプチドニュースレターに記事を書いてみないかと，東京薬科大学・保住建太郎濤師から打診を受けました。このような機会は貴重と思い,増田民今回答稿させていただくことになりました。このような機会をいただけましたことに御礼申し上げます。私は2012年に京都大学大学院薬学研究科・薬品有機製造学分野（現ケモゲノミクス分野）・藤井信孝教授(当時）のもとで博士学位を取得し,その後早稲田大学先進理工学部・生物分子化学教室・小出隆規教授のもとに助手として就任し，ひきつづき現在は助教として研究・教育に勤しんでいます。以下，私がこれまでに行った研究を紹介させていただきます。私が学生時代から現在の研究に至るまで一貫していることは「ものづくり研究をペプチドで」行っていることです。 【ケモカイン受容体CXCR4の蛍光標識リガンドの開発】ケモカイン受容体CXCR4は通常,白血球に高発現している受容体であり，その内因性リガンドであるSDF-1と相互作用することによって白血球が遊走します¹。一方で，転移性の腫瘍にもCXCR4が高発現しており，SDF-1を多く産生する肺や肝臓，リンバ節といった臓器に，これらが転移しやすいということも知られています²。くわえて，HIVが白血球に感染する際の補助受容体としてもCXCR4が利用されます³。それまで薬品有機製造学分野では,ペプチド性のCXCR4アンタゴニストT140を開発しており、この誘導体が腫瘍の転移やHIVの感染を阻害することを報告していました4.5。そこでまず，CXCR4の蛍光標識アンタゴニストとしてT140の蛍光誘導体を開発することとしました。T140をリードとした構造活性相関研究を行った結果,  D-Lysの側鎖を蛍光標識したT140の誘導体TY14003およびTY14015が.  CXCR4に対して強い結合活性を有していました6（図la）。余談となりますが，まだ研究というものに足を踏み入れたばかりの頃, CXCR4を発現した細胞にこれらのペプチドをかけ，共焦点顕微鏡で観察した時の衝撃は今でも忘れていません。全く珍しくもない染色写真ではありますが，自分が作ったペプチドでこんなにキレイに細胞を染色できるものなのかと，感動したのを鮮明に覚えています(図1b)。つづいて，CXCR4の内因性アゴニストSDF-1の蛍光標識体を開発することとしました。この開発に際しては, 過去のSDF-1のファルマコフォアの解析から，蛍光標識に適した部分としてC末端領域を選択し、クリックケミストリーにより蛍光色素を導入しました。開発した種々のSDF-1誘導体は、 CXCR4に対する結合活性,およびアゴニスト活性を維持していることを確認しました（表1 ) 7。さらに，それまでに開発した蛍光標識アンタゴニスト,およびアゴニストを用いて,これらのリガンドが(b) CXCR4発現HEK293編胞における各ペプチドの
CXCR4と相互作用した際の挙動を観察しました。その結果,蛍光標識アゴニストであるSDF-1（(67-AF488)のみならず，蛍光標識アンタゴニストであるTY14015をCXCR4発現細胞に作用させた際にも、リガンドが細胞の内部に移行している様子が観察され,これらはエンドソームに局在していました（図２)。また、これらのリガンドはCXCR4と共局在していました。この結果は, CXCR4アンタゴニストの腫瘍転移抑制やHIV感染抑制の薬理活性の発現は,  SDF-1やHIVがCXCR4に結合することを競合的に阻害するだけではなく.細胞膜表面からCXCR4を枯渇させることによっても起きていることが示唆されました8。上記の研究で必要な細胞実験を行うにあたっては,京都大学大学院創薬科学分野（現ヤクリゲノミクス分野）の研究室所属の皆様に多大な協力をいただきました。この場を借りて感謝を申し上げます。
【3重らせんベプチドの創薬への応用研究】
３重らせんペプチドはコラーゲンの３重らせん機造を模倣するペプチドで, ３本のペプチド鎖が１残基ずつずれて疑り合わさることで棒状の３重らせん構造を形成します。このペプチドはその調直な構造から，生体内に投与しても安定に存在できることが当研究室の先行研究から示されています?.10。ペプチドが３重らせん構造を形成するために必要な一次配列は、 Xaa-Yaa-Glyの繰り返し配列です（XaaとYaaは任意のアミノ酸ですが,  XaaにPro,  YaaにHyp (4-hydroxyproline)が配置されるとき， 3重らせん構造が安定化されます)。そこで私は，天然に存在する抗菌ペプチドの多くが両親媒性の構造をとっている点に注目し, ３重らせんペプチドの任意となるアミノ酸部位に塩基性アミノ酸や疎水性アミノ酸を導入することで、生体内でも安定で抗菌活性を示す３重らせんペプチドが開発できると考えました。抗菌性３重らせんペプチドの開発にあたっては, ３重らせん構造が独立した３本のペプチド鎮から形成される点を利用し, ３重らせんペプチドのコンビナトリアルライプラリを構築し，その中から抗菌性の３重らせんペプチドを探索することとしました。そのために，まず， Pro-Hyp-Glyの繰り返し構造を持つペプチドのYaaに相当する一部分を，塩基性アミノ酸と疎水性アミノ酸（あるいは中性アミノ酸）に置換し，置換部分を様々に変更した３種類のペプチドをデザインしました（図3a）。この時， 3本のペプチド鎮を混合図３. (a)両親媒性のコンビナトリアル３重らせんペプチドライプラリを構築するための各ペプチド鎮の配列. (b) 3種類のペプチドから生じる27種類の３重らせんペプチトすると， 3重らせん構造を形成する3本のペプチド鎮はそれぞれ非等価であるため， 27種類の３重らせんペプチドが調製されることになります（図3b）。この性質を利用することで，多様なホモトライマーやヘテロトライマーを含む３重らせんペプチドのコンビナトリアルライプラリを構築しました。本研究では,混合するペプチド同士の塩基性アミノ酸と疎水性アミノ酸の組み合わせを固定した各ペプチドプールを調製し,それらの抗菌活性を評価しました。すると，ある特定の組み合わせを持つペプチドプールで活性を確認することができました。続いて,活性が確認されたペプチドプールから構成するペプチドを減らしていった際の活性を比較評価することで,活性本体を探索しました。その結果,  N末端にArgのクラスターを有するホモトライマー R3を同定しました"。さらに，構造活性相関研究によって活性の向上を図った結果、R3と比較してより総電荷と電荷密度が増加した誘導体RR4が，より強力な抗菌活性を示しました（図4a）。RR4は薬剤性菌を含むグラム陽性菌およびグラム陰性菌の双方に抗菌活性が確認されました。また，RR4は血清中でも高い安定性を有しており（６時間後でも70%程度残存している）,かつ低い細胞毒性および溶血活性を示しました。つづいてRR4の抗菌活性機序を調べました。RR4を作用させた大腸菌を観察すると，大腸菌が異常に伸びている様子が観察されました（図4b）。このように菌の伸張を誘導する抗菌ペプチドとしては,  puroindolineやmicrocin J25が知られています¹².¹³。これらのペプチドは，菌内の核酸や酵素と相互作用することで菌の分裂を阻害し，菌の異常な伸張を誘導することが示唆されています。そこで，蛍光標識したRR4を細菌に作用させてみると，細菌の内部まで染色されている様子が観察され， RR4が細菌内へ移行していることが示唆されました。くわえて，RR4の核酸に対する相互作用能をゲルシフトアッセイで評価したところ， RR4がDNAおよぴRNAと相互作用している様子が観察されました。以上の結果から， RR4は細菌の内部に入り，細菌内の核酸と相互作用しうることが示唆されました。それにより細菌の分裂を阻害し，細菌の異常な伸張を誘導した可能性が考えられます¹4。以上の結果より，抗菌性の３重らせんペプチドを開発することに成功しました。今後はRR4のin vivoヘ
RR4: [(RRG)₂(POG)₂PCCY-amide]₃図４. （a）R3およびRR4の配列と立体構造, （b）RR4を作用させた際の大腸菌の様子。の応用を考え,どのような病態に適用できるかを検討していく必要があります。本研究は，薬理活性を３重らせんペプチドに賦与できることを実証した一例だと考えています。現在は,本研究とは異なったアプローチから3重らせんペプチドの創薬研究を行っています。
【最後に】
以上,私がこれまでに行った研究について,紹介させていただきましたが，いただいたテーマである「21世紀後半に向けたペプチド科学の展望について」と関連付けると，ペプチドを利用することで解決できる研究や技術はまだまだ多くあるという印象を受けます。特に創薬といったものづくりにおいては，物性や動態の悪さからこれまで敬遠されてきたペプチドではありますが、それらの問題を回避するような方法も続々と開発されています。中分子創薬の候補として目されているペプチドの,これまでの発展にも勝るこれからの飛躍に期待しています。末筆ではありますが，学生時代にご指導賜りました藤井信孝教授,大野浩章教授,大石真也准教授,ならびに現在の研究を遂行するにあたり多大なご協力を賜ります小出隆規教授に深く感謝申し上げます。
【参考文献】
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ケミストによる
タンパク質性医薬品開発を目指して
1．はじめに
筆者は2015年３月に徳島大学・大高章先生のもとで学位を取得し,同年４月から静岡大学工学部の助教として教育・研究に従事している。学部３年後期に研究室配属される際,大高先生のお人柄と「サイエンスは佐藤美しい」というお言葉に魅了されて同研究室の門をたたいた。配属当初から学位取得までの6年半の間,一貫してタンバク質化学合成研究に携わってきた。第44回若手ペプチド夏の勉強会にて本記事のタイトルで発表した内容をアップグレードして，以下筆者が取り組んできた研究について紹介したいう。
2．タンバク質化学合成の現状と課題
Merrifield先生によるペプチド固相合成法の開発はペプチド合成化学を飛躍的に進展させ, 50残基程度のペプチドであれば迅速に供給可能となった¹。しかし，一般的なタンバク質サイズのものとなると固相法による直接的合成は未だ困難である。そこでタンバク質を化学合成法にて調製する際は，固相法により調製したペプチド領を液相にて縮合する手法がもっぱら採用される。信頼性の高いペプチド鎮縮合反応として,北條先生および相本先生により開発されたチオエステル法²およびKent先生らによって報告されたnative chemical ligation（NCL）法³が挙げられる。 NCL法はペプチドチオエステルとN末端システイン含有ペプチド間の化学選択的縮合反応であり，無保護ペプチド領を中性級衡液中混合するのみで反応が進行することから幅広く利用されている。しかし, 1）必須合成中間体であるペプチドチオエステルの合成が煩雑であること, 2）100残基を超えるタンバク質を合成するには、複数のペプチド領を効率的に縮合可能な信頼性の高い手法が必須であること， 3 ）縮合部位が出現頻度の低いシステイン残基に制限されることなどが課題となっている。
3 .  SEAlideベプチドの開発一ペプチドチオエステ
ル前駆体から等価体へ一
ペプチドチオエステルは塩基性条件に不安定であるため，固相合成法の主流であるFmoc法による直接的合成は困難である。このため筆者の研究室配属当時は，Fmoc法に適用可能なペプチドチオエステル合成法の開発研究が国内外で進められていた4。大高研究室では,当時修士2年であった津田修吾さん（現株式会社ペプチド研究所）によりFmoc法で合成可能なペプチドチオエステル前駆体としてN-sulfanylethylanilide（(SEAlide）ペプチドの開発に成功していた。SEAlideペプチドは適度に活性化されたアニリド結合にチオール基を近接して配置することで，ピペリジン処理に対する安定性とペプチド鎮構築後にチオエステルへと変換可能な反応性を両立した分子である（図l )。筆者は，酸処理（4 M HCl in DMFなど）を引き金として対応するチオエステルへと変換されるというSEAlideペプチドの「チオエステル前駆体」としての性質を利用して，Ｎ末端側からＣ末端側（Ｎ→Ｃ方向）への多成分NCL法の開発に箸手した。すなわち, ペプチドチオエステルとN末端システイン含有SEAlideペプチドを中性条件下NCLにより縮合した後、酸処理によりペプチドチオエステルへと変換しこれを繰り返すことで複数のペプチド領を縮合するというものである（図２）。この合成計画に従い，まずペプチドチオエステルとN末端システイン含有SEAlideペプチドを中性緩衝液中反応させたところ，所望の縮合生成物が得られたものの,予期せぬことにN末端システイン含有SEAlideペプチド由来の環状ペプチドが副生することが明らかとなった。この副反応との遭遇が， SEAlideペプチドの「チオエステル等価体」としての機能を見出す契機となった。中性条件下においてもSEAlideペプチドがチオエステルとして機能することが示唆されたため,モデル実験としてSEAlideペプチドとN末端システイン含有ペプチドを中性条件下反応させたところ，縮合生成物を高純度で得られることが明らかとなった6。反応条件を精査した結果,リン酸塩が反応を促進すること，またリン酸塩非存在下ではほとんど反応が進行しないことを見出した。さらに，リン酸塩による反応促acidic conditions (4 M HCI in DMF)図1.アニリン型補助基とSEAlideペプチド進効果は反応溶液に後からリン酸塩を添加した際にも確認された。ここにSEAlideペプチドがリン酸塩存在下でのみ「ペプチドチオエステル等価体」として機能することが明らかとなった。そこで当初の計画を変更し，リン酸塩の添加をトリガーとする1ポット多成分NCL法を新たに立案した（図３)。すなわち, 初めにペプチドチオエステルとN末端システイン含有SEAlideペプチドをリン酸塩非存在下NCLにより縮合した後,  N末端システインペプチドのリン酸級衡溶液を反応液に加えることで1ポットにて3成分縮合生成物を得るという手法である。新たに計画した合成戦略を適用することで，ヒト心房性ナトリウム利尿ペプチドの1ポット合成を達成した。さらに本反応をアルキルチオエステルとアリールチオエステルの反応性の差を利用した多成分NCL法（KCL法) 'と組み合わせることで，当時は前例のなかったN → C方向の1ポット4成分NCL反応の開発にも併せて成功した6。
4 .  GM2活性化タンバク質の完全化学合成
タンバク質性医薬品の多くは遺伝子組み換え技術を利用して製造されている。しかし，遺伝子工学的手法によるタンバク質調製では，糖鎮付加等の翻訳後修飾を創御し均一な分子種を得ることは困難である。一方，化学合成法は複雑な翻訳後修飾を有するタンバク質であっても均一に調製可能である。医薬品という性格上,品質の均一性を担保し生物起源のコンタミネーションを防ぐという観点からも，化学合成によるタンバク質性医薬品の供給は魅力的である。。 GM2活性化タンバク質（GM2AP）はスフィンゴ糖脂質の一種であるGM2ガングリオシドの代謝に必須のリソソームタンバク質である9。リソソームタンバク質の機能欠損は進行性かつ致死性の疾患を引き起こす。先天性のGM2AP欠損症に対する治療法として，欠損タンバク質補充療法の確立が期待されているものの未だ達成されていない。そこで筆者は，本欠損症に対する実用的補充薬開発のための技術基盤として図2．酸処理をトリガーとした多成分NCL法GM2APの完全化学合成法の確立に取り組んだ。 GM2APは162アミノ酸残基から成るタンバク質で、 32残基目のアスバラギン上にN結合型糖鎮を有する。まずは，糖鎮結合部位のアスバラギンをシステインへと置換した誘導体を合成標的として設定した。このアミノ酸置換によりNCLによる新たな縮合部位を設定できるだけでなく，システイン側鎮上チオールを足掛かりとしたアルキル化反応により穂橋造の導入も可能になると考えたためである10。GM2AP誘導体の合成計画を図４に示す。各ペプチド鎮の収束的縮合を実現するための鏡中間体としてSEAlideペプチドを活用し、５つのペプチド領から合成することとした。合成結果の詳細は割愛するが，縮合反応およびアルキル化による糖ユニット導入はいずれも円滑に進行しモノグリコシド合有システイン置換型GM2AP誘導体の化学合成を達成した11 。続いて，GM2AP糖領結合部位のアミノ酸を置換しない，天然配列のGM2AP合成に取り組んだ。上述の合成でシステインへの置換を要したのは，NCLによるペプチド鎮縮合部位がシステイン残基に制限されるためである。近年この制限を克服する手法として，チオール含有人工アミノ酸を利用したNCL様ペプチド鎮縮合と続く脱硫反応により，形式的にシステイン以外のアミノ酸部位で縮合する手法が開発されている12。本手法を天然型GM2APの合成に適用すべく，βメルカプトN-グリコシル化アスバラギン誘導体を設計・合成した（図４)。本誘導体を誘導体合成時に置換したシステインの代わりに利用し、縮合・脱硫を経て，システイン置換体と同様の合成経路で天然型GM2APの完全化学合成を達成した13。なお，合成したGM2AP誘導体はいずれもリソソーム酵素であるβヘキソサミニダーゼＡ存在下GM2分解補助活性を示し，その活性は大腸菌に遺伝子導入して調製したGM2APと同程度であった。
5.おわりに
筆者がタンバク質化学合成の世界に飛び込んでからこの分野のトレンドは、チオエステル合成法の開発,多成分縮合法の開発を経て，現在は種々のタンバク質合成への応用展開へと変化してきたと認識している。この流れの中で，化学合成可能なタンバク質のサイズ・種類は激増し，近年の国内研究に絞っても，大阪大学・北條先生，川上先生のグループのIL2¹4および修飾ヒストンタンバク質の合成¹,大阪大学・梶原先生のグループの糖鎮修飾型EPOの合成16が達成されるなど、複雑な翻訳後修飾タンバク質でさえ自在に合成可能な時代になりつつある。しかし現状では化学合成されたタンバク質を研究室レベルで評価することは可能であるが、その後の展開を考えるうえで生産量やコストに課題を抱えている。今後一層，発現タンバク質と化学合成ペプチドを組み合わせる半化学合成研究の重要性が増すと考えられる。ペプチド・タンバク質化学の技術を総動員した生理活性タンバク質化学合成の成果と従来の低分子医薬品で蓄積されてきたノウハウが融合し、ケミストによるタンバク質性医薬品創製が実現することを期待したい。本研究を行うにあたり終始ご指導いただきました,徳島大学・大高章教授ならびに重永章壽師，猪熊翼特任助教に深く感謝申し上げます。GM2APに関する研究は徳島大学・伊藤孝司教授，辻大輔助教，北風圭介博士との共同研究の成果であり、この場を借りて感謝申し上げます。現所属である静岡大学工学部化学バイオ工学科・ケミカルバイオロジーグループの渡辺修治教授（現特任教授） 間瀬暢之教授，平川和貴教授，戸田三津夫准教授，鳴海哲夫准教授には，筆者なりのペプチド研究を進めるにあたり多大なご支援を賜りました。最後になりましたが，このような寄稿の機会を与えていただきました編集委員の東京薬科大学・保住建太郎先生に厚く御礼申し上げます。 1. Merrifield, R. B. J Am Chem Soc 1963, 85, 2149–2154. Hojo, H.; Aimoto, S. Bull Chem Soc Jpn 1991, 64, 111–117. 21 Dawson, P. E.; Muir, T. W.; Clark-Lewis, I.; Kent, S. B. H. 3. Science 1994, 266, 776–779.重永 章：佐藤浩平：大高 章 有機合成化学協会誌4. 2010, 68, 911–919. Tsuda, S.; Shigenaga, A.; Bando, K.; Otaka, A. Org Lett 5. 2009, 11, 823–826. 6. Sato, K.; Shigenaga, A.; Tsuji, K.; Tsuda, S.; Sumikawa, Y.; Sakamoto, K.; Otaka, A. ChemBioChem 2011, 12, 1840– 1844. Bang, D.; Pentelute, B. L.; Kent, S. B. H. Angew Chem Int 7. Ed 2006, 45, 3985-3988. Chalker, J. M. Chem Biol Drug Des 2013, 81, 122–135. 8' Kolter, T.; Sandhoff, K. Annu Rev Cell Dev Biol 2005, 21, 9. 81-103. 10.   Davis, N. J.; Flitsch, S. L. Tetrahedron Lett 1991, 32, 6793– 6796. 11. Sato, K.; Shigenaga, A.; Kitakaze, K.; Sakamoto, K.; Tsuji, D.; Itoh, K.; Otaka, A. Angew Chem Int Ed 2013, 52, 7855– 7859. 12. Malins, L. R.; Payne, R. J. Aust J Chem 2015, 68, 521–537. 13. Sato, K.; Kitakaze, K.; Nakamura, T.; Naruse, N.; Aihara, K.; Shigenaga, A.; Inokuma, T.; Tsuji, D.; Itoh, K.; Otaka, A. Chem Commun 2015, 51, 9946–9948. 14. Asahina, Y.; Komiya, S.; Ohagi, A.; Fujimoto, R.; Tamagaki, H.; Nakagawa, K.; Sato, T.; Akira, S.; Takao, T.; Ishii, A.; Nakahara, Y.; Hojo, H. Angew Chem Int Ed 2015, 54,8226-8230. 15. Kawakami, T.; Yoshikawa, R.; Fujiyoshi, Y.; Mishima, Y.; Hojo, H.; Tajima, S.; Suetake, I. J Biochem 2015, 158, 403– 411. 16. Murakami, M.; Kikuchi, T.; Nishihara, M.; Tezuka, K.; Okamoto, R.; Izumi, M.; Kajihara, Y. Sci Adv 2016, 2, e1500678.さとう　こうへい化学バイオ工学系列静岡大学学術院工学領域sato.kohei@shizuoka.ac.jp http://www.ipc.shizuoka.ac.jp/~tnmase/chemical_ biology_group/index.html
私は2011年に東北大学大学院理学研究科で上田実教授の指導で博士の学位を取得し、その後，九州大学大学院理学研究院の大石徹教授のもとで１年間,博士研究員を勤めました。2012年４月から，現在の大阪大学大学院理学研究科の深瀬浩一教授の研究室で助教をしております。この間，天然物（低分子活性物質のみでなく，タンバク質,ペプチド,糖,脂質などを含む）を対象とした研究に携わり，天然物が引き起こす興味深い生命現象に惹かれ，その合成，作用機構解明，また，それらを用いた生物機能制御を行ってきました。ここでは現在行っているがんワクチンの開発とタンバク質の翻訳後修飾糖鎮の合成研究について紹介させていただきます。 ・α-galをアジュバントとして用いた効率的がんワクチン療法の開発α-galエピトープ（Figure 1）は，多くの哺乳類で広く発現しているものの，ヒトはこの糖鎮を持ちません。一方で、腸内フローラなどからの被ばくによl)，α-galに対する抗体（抗Gal抗体）が生成し、その霊はヒトの自然抗体の中で最も多く，激しい免疫反応を引き起します。我々は，この免疫反応に着目し, α-galをワクチンの抗原性を高めるアジュバントとして利用したがんワクチン療法の開発に取り組んでいます。がんの免疫療法は，副作用が少なく，転移や再発を抑制する治療となる可能性を秘めているものの、未だ標準的治療としては確立されていません。これはがん抗原の抗原性が低いことが最大の要因です。そこで，本研究では，がん抗原をα-galで標識することで，生体内に大量に存在する抗Gal抗体を介して抗原の免疫細胞への取り込みを促進し、免疫反応を賦活化することで，効率的ながんワクチン療法の開発を目指しまヤ。本研究では，化学合成したα-galを活性エステル1へと誘導し，これを用いて，さまざまながん抗原をα-galで標識しました（Figure 2）。まず，BSAを抗原のモデルとして実験を行いました。BSAを1で処理することで，α-gal標識BSAを調製し，これをマウスに投与し、その血清中のBSAに対する抗体の量を評価しました。その結果,  α-gal標識によりBSAに対する抗体の産生量が劇的に増加することが分かりました。BSAを用いたモデル実験に成功したので、続いてがん抗原であるMUC1ペプチドを用いて実験を行いました。MUC1は20アミノ酸からなるペプチドで,この繰り返し配列がさまざまながんで高発現しています。MUC1を用いた場合においてもα-galがアジュバントとして機能し,  α-gal標識によりMUC1に対する抗体の産生量が増加しました。これまでにα-galの生合成酵素を利用して抗原をα-galで標識し，α-galをアジュバントとして用いる試みは検討されてきましたが1.2,この方法では,均一性の担保が難しく,また,糖鎮を持たない抗原に対しては利用できないという大きな制限がありました。我々は，化学合成したαgalを化学標識法により抗原と複合化することで，この問題を克服し, α-galのアジュバントとしての利用の幅を大きく広げることができました。 ・コアフコース含有N-グリカンの合成N-結合型糖鎮（N-グリカン）はタンバク質のアスバラギン残基に結合する翻訳後修飾糖鎮で，多様な構造を持ち,それぞれの構造にもとづき,タンバク質の機能を調節します。一方で，糖鎮は多様性に富み，生体内ではそれらが複雑な混合物（グライコフォーム）として存在するため，糖鎮構造と活性の相関は詳細には解明されていません。我々は、N-グリカンの機能解明には，均一構造のN-グリカンを用いることが必須であると考え，その化学合成を行ってきました。ここでは，免疫系やシグナル伝達の制御に関与するコアフコース構造を含有するN-グリカン2の合成について紹介させていただきます（Figure 3）。目的の12糖は還元末端の４糖４に対し、非還元末端の４糖３を２度グリコシル化することで得ようと考えました（Figure 4）。まず，３，４の合成を行いました。このような巨大な糖鎖の合成においては中間体の大量合成が必須です。そこで，精密条件下でのスケールアップが可能なマイクロフロー反応を有効に利用し(Figure 4 ①) 3-7 ,中間体となるフラグメント（2－4糖構造）を10ｇ以上のスケールで合成しました。また，分子が巨大になるにつれ，その反応性が低下することは大きな問題です。我々は, ３の合成に当たり，アミド(-NHAc)をイミド(-NAc 2 )として保護することで，分子間水素結合を切断し，反応性を向上させられるという興味深い現象を見出しました(Figure 4 (2)) 8。上記のようにして効率的に合成した３，４を用いて糖鎖骨格を構築しました（Scheme 1)。 2度のグリコシル化反応において，徹底的に条件検討した結果,溶媒としてエーテルを用いることで,それぞれ88%, 87%の高収率で反応が進行し、７を得ることができました。一方，α/β立体選択性はそれぞれ3/1および1/1と満足のいくものではなく，現在検討中です。最後に，得られた７を脱保護することで，目的の12糖2の合成に成功しました。このようにして純粋なN-グリカンを得ることができましたので，現在，合成糖鎮を用いたレクチンとの相互作用解析，合成穂鎮で修飾したタンバク質の動態解析などを行っています。これらの研究を通して，特定の構造のN-グリカンがタンバク質の活性に及ぼす影響を分子レベルで解明できると考えています。上記のように，私は糖鎮の合成，それを用いた機能解明，生命現象の制御を中心テーマとして研究を進めています。糖鎮研究において，糖鎮が結合しているタンバク質,ペプチドを無視して研究を進めることができないのはもちろんのことですが，約60％のタンバク質は糖領による翻訳後修飾を受けており，ペプチド,タンバク質の機能解析においても糖鎮機能の解明は避けて通れません。今後，私は，糖鎮，ペプチド，タンバク質,さらには脂質まで含めたこれらの生体分子が形成する複雑な生体分子社会を分子レベルで解明し,さらに，それを創御し，新たな創薬研究やバイオプローブへと展開したいと考えています。 1) LaTemple, D. C.; Henion, T. R.; Anaraki, F.; Galili, U. Cancer Res 1996, 56, 3069-3074. 2) Tanemura, M.; Miyoshi, E.; Nagano, H.; Eguchi, H.; Taniyama, K.; Kamiike, W.; Mori, M.; Doki, Y. Cancer Sci 2013, 104, 282–290. 3 )  Uchinashi, Y.; Nagasaki, M.; Zhou, J.; Tanaka, K.; Fukase, K. Org Biomol Chem 2011, 9, 7243-7248. 4 )  Uchinashi, Y.; Tanaka, K.; Manabe, Y.; Fujimoto, Y.; Fukase, K. J. Carbohydrate Chem 2014, 33, 55–67. 5 ) Tanaka, K.; Miyagawa, T.; Fukase, K. Synlett 2009, 1571– 1574. 6 ) Tanaka, K.; Mori, Y.; Fukase, K. J Carbohydr Chem 2009, 28, 1–11. 7 ) Manabe, Y.; Kitawaki, Y.; Nagasaki, M.; Fukase, K. Matsubara, H.: Hino Y.; Fukuyama, T.; Ryu, I. Chem Eur J 2014, 20, 12750-12753. 8 )  Zhou, J.; Manabe, Y.; Tanaka, K.; Fukase, K. Chem Asian J in press.まなべ　よしゆき大阪大学大学院理学研究科manabey12@chem.sci.osaka-u.ac.jp http://www.chem.sci.osaka-u.ac.jp/lab/fukase/大阪大学の武内敏秀と申します。このたび，東京薬科大学の保住建太郎先生からお誘いいただき，奇稿させていただくことになりました。実はペプチドニュースレターには過去に一度，留学体験記を掲載していただいたことがあり（2009年4月武内発行のNo. 72),  今回は２度目の登場となります。この機会を活用し，自己紹介も兼ねて少し自由に書いてみたいと思います。大学卒業から現在までに異動が何回かありましたので，まずはその経緯を紹介したいと思います。私は2008年3月に京都大学大学院薬学研究科（二木史朗教授）を卒業後，スイス・ジュネープ大学理学部化学科(Stefan Matile教授）に留学致しました。スイスでの生活や研究については，前出の留学体験記で簡単に紹介していますので，そちらもぜひご覧ください。２年間の留学の後，東京都小平市にあります，国立精神・神経医療研究センター・神経研究所（永井義隆室長）で３年間ポスドクをした後、出身研究室の京都大学化学研究所（二木史朗教授）に３年間助教として勤めさせて頂きました。その後，本年４月から大阪大学医学系研究科・神経難病認知症探索治療学客附講座に講師として在籍しています。スイス留学中はポリイオン-カウンターイオン物性の物理化学的解析とそれに基づくバイオセンサーの開発,東京の神経センターでは神経変性疾患・認知症に対する病態解明と治療研究，京大化研では薬物送達手法の開発やダイマー制御法の開発に参加させて頂きました。異なる環境・異なる分野に身を置くことで，研究に対する考え方や取り組み方，研究の多様なありようを体験することができ，大変勉強になりました。本稿では，昨年発表した「熱ショック応答の細胞間補儀」に関する研究について紹介させていただき，個体における細胞非自律的な細胞機能制御について考えてみたいと思います。細胞は，生存に適した温度よりも高い温度環境にさらされると，分子シャペロンと呼ばれる防御因子を一過性に発現誘導することで，細胞内タンバク質が変性してしまうのを未然に防ぐことが知られています。これを熱ショック応答といいます。熱ショック応答は,大腸菌から酵母，ほ乳類に至るまで進化的に広く保存されており，この応答を誘導できない変異体細胞は,ストレス負荷に対して極めて脆弱であることから，細胞の生存に必要不可欠なタンバク質恒常性維持機構(プロテオスターシス維持機構）のひとつとして，生命活動の根幹を支えていると考えられています。ところが，多細胞生物の個体内では，必ずしもすべての細胞や組織で一様に熱ショック応答が観察されるわけではなく，然ストレス負荷に対するシャペロン誘導をほとんど示さない細胞も存在します。例えば，脳の海馬ニューロンは然ストレスに対する応答性をほとんど示さない一方で、その近傍に位置するグリア細胞では高い応答性が認められます。実は，このような熱ショック応答性の細胞間・組織間不均衡は、すでに30年以上前から指摘されているものの，その生理的意義はおろか，なぜストレス非応答性細胞が発生過程で満汰されずに存続できるのかさえ，未だによく分かっていません。私たちは，この諺を解明するため，然ショック応答の不均衡状態を擬似的に再現した細胞およびショウジョウバエモデルの解析を行いました。その結果，分子シャペロンがエクソソームと呼ばれる細胞外小胞により細胞から分泌されていること，分泌されたエクソソームを別の細胞が取り込むとその細胞内のシャペロン活性が上昇することが分かりました。これは，それぞれの細胞内でのみ働くと考えられていた分子シャペロンが、個体内では他の細胞・組織においても働くという，細胞非自律的な（間接的な）プロテオスターシス制御機構の存在を示唆するものであり，その分子機序のひとつとしてエクソソームを介した細胞間伝播が重要な役割を担う可能性を示しています。興味深いことに，熱ショック時には分子シャペロンのエクソソーム分泌が顕著に亢進すること、また、たとえ受け手側の細胞がストレス非応答性細胞であっても，別のストレス応答性細胞から分泌されたエクソソームを受け取れば，シャペロン活性が上昇することが分かりました。つまり，ストレス非応答性細胞は,確かにそれ単独では極めて脆弱であるものの，他のストレス応答性細胞が共存していれば,細胞非自律的にストレスから防御され、細胞集団全体の恒常性が維持されるのではないかと考えられます。私たちは，このようなエクソソームを介した細胞間伝播が，熱ショック応答性の細胞間・組織間不均衡を機能的に補償する分子機序のひとつであると提唱し，これを証明する研究を進めています。私は学生時代，二木史朗教授の御指導のもと，細胞移行性ペプチド（Cell-penetrating peptide, CPP）の細胞内移行機序の解明やCPPを用いた薬物送達手法の開発研究を行っていました。CPPといいますと，tatペプチドやpenetratinペプチドがよく知られています。これらのペプチドは，それぞれヒト免疫不全ウイルスのTATタンバク質,およびショウジョウバエのホメオタンバク質Antennapediaが細胞内に移行する性質を有することが見出され，その後に細胞移行性を発揮するコア配列として同定されたものです。tatやpenetratinは、その優れた細胞移行性から、薬物送達のための細胞内デリバリーキャリアとして応用研究が盛んに行われており，ご存知の方も多いと思います。 TATやAntennapediaといったタンバク質は，もともと細胞内で特定のDNA配列に結合して遺伝子の転写を調節する転写調節因子です。1988年にPaboらとLoewensteinらのグループがCell誌においてTATタンバク質の細胞移行性を初めて報告した論文では,培養上清中のTATが細胞内に移行することだけでなく，細胞内移行したTATがHIV-1遺伝子の発現を顕著に活性化し、ウイルス産生を正に制御することが示されています²³。また、ProchiantzらのグループはAntennapediaの細胞移行性および細胞外分泌を見出し4.5. 個体発生初期においてAntennapediaが細胞間を伝播して伝播先の神経細胞で転写制御を行い，神経突起の伸長を創御するという可能性を示しています。これらの報告は，いずれも単に細胞移行性を有するタンバク質が見つかったということだけではなく，ある細胞内で働いているタンバク質が，別の細胞に伝播して機能を発揮することを示し，細胞非自律的な機能制御機構が多細胞生物個体内に存在する可能性を示唆しています。そもそも多細胞生物は，機能の異なるヘテロな細胞樂団であるため，個体として生命活動を維持するためには，細胞同士が各々連携し，適切に情報をやり取りすることが不可欠です。細胞間の情報伝達を担う因子として、例えば神経伝達物質やペプチド・ステロイドホルモンなどがよく知られています。これらの液性因子は，分泌を目的として合成され，ある細胞から分泌された後に，他の細胞膜表面や細胞質内の標的受容体を介して細胞間の情報伝達を媒介します。上述のTATやAntennapediaで見られた細胞非自律的な制御機構は、細胞間の情報伝達を媒介するという点において，神経伝達物質やホルモンなどと同様の役割を個体内で担うと考えられます。しかし、これらはそれ自身が細胞間伝播することにより直接機能例御を行うという様式の違いから，本質的に異なる別の仕組みであると考えられます。実は多細胞生物のなかでも植物個体内では，細胞壁に囲まれた細胞内領域同士をつなぐ原形質連絡（プラズモデスマータ）と呼ばれる孔状構造物が存在し，転写調節因子や核酸などが細胞間を移動することで，細胞非自律的に機能創御を行うことがすでによく知られています。もしかしたら.細胞移行性を発揮するタンバク質配列は，エクソソームなどの細胞外小胞と同様に，細胞間の細胞非自律的な機能制御を可能とするために，多細胞生物の動物個体が独自に進化させた様々な情報伝達戦略のひとつに相当するのかもしれません。 tatやpenetratinなどといった細胞移行性ペプチドは，どのように細胞内に移行するのか，配列や構造上の必要条件は何か,受容体は存在するのか,などといった細胞移行機序に関する基礎的な疑問が解明されつつあり、また薬物送達キャリアへの応用展開も進められています。言うまでもなく，これらの研究を強く支えてきたのは，ペプチド科学です。tatやpenetratinペプチドの細胞内移行現象は，TATやAntennapediaタンバク質が細胞間で行う情報伝達様式の一部分を切り取ったものであることから，ペプチド科学的アプローチが細胞非自律的な細胞機能制御機構の一端を解明することに大きく貢献してきたと考えることができます。今後，ペプチド科学を強力なツールとして活用し、伝播分子機序や生体内における生物学的意義に関する基礎的理解を深めるとともに，個体における細胞非自律的な細胞機能制御機構の全容が解明されることを期待しています。 1. Takeuchi, T.; Suzuki, M.; Fujikake, N.; Popiel, H. A.; Kikuchi, H.; Futaki, S.; Wada, K.; Nagai, Y. Proc Natl Acad Sci U S A 2015, 112, E2497–506. 2.     Frankel, A. D.; Pabo, C. O. Cell 1988, 55, 1189-93. Green, M.; Loewenstein, P. M. Cell 1988, 55, 1179–88. 3. Joliot, A.; Pernelle, C.; Deagostini-Bazin, H.; Prochiantz, A. 4. Proc Natl Acad Sci U S A 1991, 88, 1864-8. 5. Dupont, E.; Prochiantz, A.; Joliot, A. J Biol Chem 2007, 282,8994-9000. Zambryski, P. Science 1995, 270, 1943–4. 6.たけうち　としひで大阪大学大学院医学系研究科神経難病認知症探索治療学寄附講座takeuchi@neurother.med.osaka-u.ac.jp http://www2.med.osaka-u.ac.jp/neurother/ダイマー化によるペプチドの自己集合特性への影響の解析：エラスチンペプチドダイマーのコアセルベーション特性この度，PNJにペプチド研究について掲載する機会を頂いた九州大学基幹教育院・生体分子化学研究室の巣山慶太郎です。私は，九州大学の香月研究室で有機化学を学んだ経験を活かし¹.²，現在では，化学合成した巣山慶太郎ペプチドを用いた研究を行っています。前号のPNJ No.100記念号では，現在までのペプチド研究界を支えてこられた先生方のペプチド科学に触れることができ，個人的に大変感動しておりましたが，その中に，私が博士時代に生物化学の研究でご指導頂いた下束康幸先生（九州大学名誉教授）の記事がありました。下束先生は2016年3月をもって大学を定年・ご退職され，４月末には多くの先生方や門下の方々を集めて記念講演が行われたのが記憶に新しいところです。今回，そうした記念号・記念講演の直後に執筆の機会を頂き嬉しく思います。本稿では私が最近行っている「エラスチンペプチド」の研究についてご紹介したいと思います。 「エラスチン」は血管や皮下組織，離などに含まれる弾性タンパク質であり，組織に弾性・伸展性を与える役割を持ちます。エラスチンは肌のハリ・美肌を保つ成分として注目されており，同様の素材として広く認知されている「コラーゲン」とともに，ここ数年で食品や化粧品，サプリメント医療用素材などの製品に利用されはじめています。エラスチンは，前駆体タンバク質・トロポエラスチンがミクロフィプリルと呼ばれる糖タンバク質の周囲に集合し架橋される，という過程を経て生合成されます。この過程において，エラスチンの特徴的な性質である「コアセルペーション」が重要となります。コアセルペーションとは，温度を上げると凝集し下げると再び解薩するという可逆的な自己集合特性です。エラスチンの均一な水溶液を加熱するとエラスチン分子が自己集合して液滴を形成し，この状態で静置すると平衡溶液とコアセルペート層に分離します。このプロセスは可逆的であり，冷却することで最初の均一な溶液に戻す事ができます。ところで，エラスチンは美肌成分として「美容」の分野に，また血管や靭帯の弾力を補うサプリメントとして「健康」の分野に利用されていますが，コアセルベーション特性を応用することで，薬物送達システムの担体として「医療」の分野への応用も期待されるようになりました。これまでに，コアセルペーションにはエラスチンの内部に存在する特徴的なアミノ酸数残基の繰り返し配列（Val-Pro-Gly-Val-Gly, Gly-Gly-Val-Pro, Gly-Val-Gly- Val-Ala-Proなど）が関与していることが明らかになっています。また，これらのエラスチン由来繰り返し配列を模倣したペプチドも同様に自己集合特性を持つことが報告されており，たとえば，エラスチン由来のポリペプチド(VPGVG)。がコアセルペーションを示すことが明らかとなっています47。エラスチンペプチドは近年，その自己集合能がタンバク質性の分子素材に付与する特性として注目されていること8や生体適合性が高いことから医療分野への応用が期待されています。そのため，DNAを用いて大腸菌などで発現したポリペプチド，固相合成により得られた短鎮のペプチドの双方を用いて、コアセルペーションを示すペプチドについての研究が行われています9. 10。こうした中，我々の共同研究者であり，長年エラスチンについて研究をされてきた前田衣織先生（九州工業大学准教授）は，Val-Pro-Gly-Val-Gly (VPGVG)繰り返し配列の最初のバリン残基を芳香族アミノ酸（Phe, Trp）に置換したペプチド・(FPGVG)。および(WPGVG)』が，15～25残基という極めて小さな分子量でコアセルペーションを示すことを見出しました11.12。我々は，このような低分子でコアセルペーションを示すペプチドが分子素材として有用であるだけでなく、これらの短鎮ペプチドのコアセルペーションの分子機構を検証し、自己集合に関与する構造要因を調べることが，エラスチンそのもののコアセルペーションの分子機構を解明する一助となるのではないかと考えました。そこで，短鎮のエラスチンペプチドがコアセルペーションを示す分子機構の探求の一環として，ペプチドの自己集合性を調節する方法として用いられるダイマー化ペプチド13 14を用いた検証を行うことにしました。今回は，芳香族アミノ酸含有ペプチド・(FPGVG) 5および(WPGVG) 3のダイマーを合成し,そのコアセルペーション特性を調べることにより，自己集合におけるダイマー化の影響および立体構造の解まず，エラスチン由来ペプチド(FPGVG) sの末端にシステイン残基を導入し、システイン側鎮間ジスルフィド結合を形成させることで架橋したダイマーペプチドを調製しました（図１）。合成したペプチドのコアセルペーション能力の評価は濁度測定法（ペプチド洛液の温度変化に伴う濁度変化を追跡し、コアセルペーションに伴って溶液が濁度変化を示した温度を求める分析法）により行いました。濁度測定の結果, (FPGVG) sのモノマーペプチドは安定してコアセルペーションを示すのに30 mg/mlの濃度，38℃の温度を要するのに対し、ダイマーペプチドは10 mg/mlという低濃度においても12～15℃という低温でコアセルペーションを示すことが明らかになりました（図２)。すなわち，ペプチドのダイマー化によってモノマーを2倍量以上用いるよりも自己集合能が増強されることが判明しました。このように短鎮エラスチンペプチドを単純なジスルフィド結合で架橋させたペプチドが高い自己集合活性を示すことを見いだしたことは新規な知見です。さらには，Trp残基を含む(WPGVG) 3のダイマーペプチドは，0.5 mg/mlという極めて低い濃度でもコアセルペーションを示すことが明らかとなり,エラスチン繰り返し配列の自己集合活性を低濃度で観察可能なモデルペプチドとして有用であることが判明しました。エラスチンペプチドの自己集合の駆動力は温度変化に伴う分子間相互作用の変化によるものであると考えられるので，自己集合の前後でその相互作用変化の要因となるペプチド分子の構造変化が存在すると推測されます。そこで，温度変化とペプチドの立体構造の関係について調べるため， (FPGVG) 5および(WPGVG) 3のダイマーのCDスペクトル測定を行いました。その結果,いずれのダイマーのスペクトルも(FPGVG) 5モノマーのスペクトルと類似しており11 ,エラスチンペプチドによく見られるII型βターン様の構造16.17を有することが示唆されました。また，CDスペクトルは温度に依存して可逆的な変化を示し(図３),加えて212 nmに等吸収点（isodichroic point）が観測されました。等吸収点の存在はペプチドが二種類の状態をとることを示すものであり18 ,これよりエラスチンペプチドが溶液中で可溶構造から疎水的構造に遷移していることが示唆されました。エラスチンペプチド(FPGVG) 5 N-dimerのCDスペクトル(a) (b)この温度変化に伴うペプチドの構造変化について検証するため，高い自己集合活性を示す(WPGVG) 3のダイマーペプチドを用いた分子動力学計算による構造解析を行いました。その結果，低温ではペプチド内部に特徴的なβシートとβターンが連続した構造がよく観祭されるのに対し，高温では二次構造が減少してランダムな構造になるという結果が得られました（図４）。この二次構造の変化に伴う各残基の溶媒露出面積の変化を調べると， (WPGVG) 3ダイマーでは疎水性残基の洛媒露出面積の温度上昇に伴う変化が顕著であり，温度上昇によってペプチドがランダム構造に変化することによる疎水性表面の伸長が高いコアセルペーション活性の要因であることが示唆されました。本研究では、エラスチン由来ペプチド(FPGVG) 5および(WPGVG) 3をダイマー化することによってコアセルペーション能が著しく増強されることを明らかにしました。また、CDスペクトル測定およびMD計算の結果,ダイマーペプチドは低温ではII型βターン様構造を含む可溶構造をとり，温度上昇に伴って疎水的なランダム構造に遷移することがコアセルペーションの駆動力となることが示唆されました。これらのダイマーペプチドの中でも(WPGVG) 3ダイマーは極めて低濃度でコアセルペーションを示すため，エラスチンペプチドの自己集合形成過程の精細な評価が可能なモデル分子として，蛍光測定や粒径測定を実施しています。一方，(FPGVG) 5ダイマーはモノマーと比較して高い自己集合活性を持ちながら，比較的高濃度でも水に溶解させることができるため，取り扱いやすい有用な茶材としての利用価値があります。こうして，エラスチンおよびエラスチンペプチドの研究は、エラスチンの自己集合特性の本質を探求する研究とエラスチンを素材として応用するための研究が相互に協調しながら進むことによって，理学的にも工学的にも大きな発展を遂げることのできる分野であると考えています。この興味深い分子を用いた研究がより進展していくため，当研究室では理学の観点からさらなる研究を進めていく予定です。 1. Suyama, K.; Matsumoto, K.; Katsuki, T. Heterocycles 2009, 77, 817–824. Suyama, K.; Sakai, Y.; Matsumoto, K.; Katsuki, T. Angew 2. Chem Int Ed 2010, 49, 797–799. Daamen, W. F.; Veerkamp, J.H.; van Hest, J. C.; van 3. Kuppevelt, T.H. Biomaterials 2007, 28, 4378-4398. Maeda, I.; Taniguchi, S.; Ebina, J.; Watanabe, N.; Hattori, 4. T.; Nose, T. Protein Pept Lett 2013, 20, 905–910. Kaibara, K.; Akinari, Y.; Okamoto, K.; Uemura, Y.; 5. Yamamoto, S.; Kodama, H.; Kondo, M. Biopolymers 1996, 39, 189-198. Maeda, I.; Fukumoto, Y.; Nose, T.; Shimohigashi, Y.; 6. Nezu, T.; Terada, Y.; Kodama, H.; Kaibara, K.; Okamoto, K. J Pept Sci 2011, 17, 735–743. Iwanaga, A.; Endo, M.; Maeda, I.; Okamoto, K. Pept Sci 7. 2007 2006, 290-291. 8. Brigida, B.; Antonietta, P.; Maria, C.; Nicolas, B.; Stepha- nie, Baud.; Manuel D. Soft Matter 2015, 11, 3385–3395. Lakshmanan, A; Zhang, S.; Hauser, C. A. E. Trends 9. Biotechnol 2012, 30, 155–165. 10.   Collier, J. H.; Segura, T. Biomaterials 2011, 32, 4198–4204. 11. 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