株
俊　亨(伊藤忠飼料株式会社研究所)*腰分離した多数の H. parasuis分離株についてその薬剤感受性とプラスミドを検討し，いくつかの知見を得たので報告する。
材料と方法
1.供試菌株
1987年10月から1989年11月の間に，東北，関東および九州地方の16農場で飼育されていた発症豚, 健康豚および輸入豚から分離した H. parasuis計174株を供試した。分離部位別では県腔由来株が111株，病巣由来株が63株，PAGE辺別ではPAGE-I型菌が74株，PAGE-II型菌が100株, 血満型別では1型菌4株, 2型菌9株, 4型菌24株，5型菌15株であり，残り122株は1から５型の抗血消と反応しなかった型別不能株であった。また，今回供試した株の中で３型に型別された株は無かった。
2. 薬剤感受性試験
供試した薬剤はTable 1に示した計13薬剤である。各分離株の薬剤感受性はおおむね家畜抗菌剤研究会標準法に準じ，寒天平板希釈法により扱少発育阻止濃度(MIC)を測定し決定した。しかし，β-NADHや血消を添加しても，感受性試験測定用塔地上の H. parasuisの発育が非常に悪く判定が困難であったので，今回の測定ではS寒天婚地”を用いた。なお，同婚地を用いるに先だって大腸菌ML-1410株とブドウ球菌FDA-209P株を用い，これらの菌で両歯地のMIC値に差が無いことを確認した。菌の接種はミクロプランター（佐久間製作所）でおこない，今回はカルバドックス(CBD)を含Haemophilus parasuisは豚のいわゆるグレーザー病の原因菌である。グレーサー病は欧米では特にSPF 豚群に多発し，いったん発生すると装急性の症状と高い死亡淘汰率を示す経済的被害の大きい疾病として知られている。しかしSPF 豚の普及率の低いわが国においては，コンペンショナル豚群における散発例の報告はあるものの， SPF豚群の本病についてはあまり知られておらず，またわが国で分離されるH. parasuisの詳細な性状も検討されていなかった。先にわれわれは，わが国の SPF 豚群におけるグレーサー病の発生例に遭遇し，発症再現試験と投潔による予防試験，そして分離されたH. parasuisの性状について報告した*,¹⁰’。本病の予防には不活化ワクチンが有効であ'$,11,15'。不活化ワクチンは欧米ではすでに市販されているが，わが国では1992年8月に製造が承認された段階にある。したがって，現状ではその予防は投薬に頼る部分が大きく本菌の薬剤感受性を知ることは重要である。一般的に本菌は多くの薬剤に感受性が高いといわれている。しかし,わが国で分離されるH. parasuisの多数株について薬剤感受性を検討したのは加藤らがの，またブラスミドについては両角ら‘’’の報告以外に見当たらない。近年，数種の豚病原因菌について薬剤耐性菌の存在や増加が報告されており，H. parasuisについても同様の現象が起きていることが懸命される。そこでわれわれは， 1987年から1989年の間に
むすべての薬剤について37°C 24時間好気皆養後に判定し，Table 1に示したbreak point以上のMIC値を示した菌株を当該薬剤に対する耐性菌と判定した。電気泳動法により検出した。
成
糖
プラスミドの検出
3.
Sブロース”で37°C一夜塔養し，柴菌したものを出発材料とした。プラスミドはKado and Lius'の方法にしたがって抽出し，1％アガロースゲルH. parasuis分離株174株の薬剤感受性試験成編をTable 1に示した。 MIC分布曲線のピークはクロラムフェニコール(CP)では0.39 μg/ml,ベニシリン(PCG),アンピシリン(ABPC),ゲン
1.
H. parasuis分離株の薬剤感受性

20 節物抗菌会報(1993)
タマイシン(GM),テトラサイクリン(TC)およびナリジクス酸(NA)では1.56 μg/ml,オキシテトラサイクリン(OTC)およびコリスチン(CL)では3.13 pg/ml,ストレプトマイシン(SM),カナマイシン(KM)およびフラジオマイシン(FM)では6.25 pg/ml,リンコマイシン(LCM)およびCBDでは12.5 μg/mlを示した。OTCおよびCLに対するMIC値は比較的広い範囲に分布した。 β−ラクタム系の全2薬剤とアミノグリコンド系の3薬剤(KM, FMおよびSM)の分布曲線は不完全ながら二峰性を示した。分離株の薬剤耐性ベターンをTable 2に示した。合計46株(26.4%)が何らかの業剤に耐性と判定され，４剤耐性が３株，３剤耐性が４株，２剤耐性が16株に認められ，残り23株は単剂耐性であった。また，β−ラクタム系２薬剤に対する耐性菌のうち13株とアミノグリコンド系の2薬剤(KMおよびFM)に対する耐性菌のすべてがそれぞれの両薬剤に耐性であった。
2.  H. parasuis分離株のプラスミドについて
Table 3にH. parasuis分離株のプラスミド検出成績を，既知の性状と比較して示した。少なくとも5農場由来の9ﾎ(5.2%)が少なくとも6種類の比較的分子量の小さなプラスミドを保有していた。これら９株はすべて鼻腔由来のPAGE-I型菌で，血消型別不能枠であった。また，６株は薬剤耐性菌であった。
考
終
H. parasuisは比較的多くの薬剤に感受性が高いといわれていた。しかし，国内外を問わず多数の H. parasuis菌株の薬剤感受性について検討した文献は見当たらない。阿部ら¹’はグレーサー宛豚から分離した４株についてディスク法で薬剤感受性試験を行い，これらの株は10薬剤に対して高度に感受性であったがスピラマイシンとバシトラシンに耐性であり，また１株はSMに耐性であったと報告した。平澤ら**は別々の症例から分離した計５株について薬剤感受性を調べ，これらは今回われわれが供試した8薬剤を含む13薬剤に高度に感受性であったと報告した。一方 Hannanら²²は2株の H. parasuis についてキノロン系6薬剤とGMおよびOTCを含む4抗生物質に対するMICを調べた。その結果キノロン系薬剤に対するMIC値は0.25 μg/mlかそれ以下であり，またGMに対して1.0 pg/ml, OTCに対して2.0 μg/mlであったと報告した。これらの報告と今回のわれわれの成績は方法が興なっており，直接の比較はできないが今回の成模では予想以上に多剂耐性菌を含む多数の耐性菌が見いだされ，罰性菌の増加が推察される成績となった。また，野外で汎用されているβ−ラクタム系およびアミノグリコンド系薬剤に対する耐性菌が多く交差耐性も認められたことから，本病予防
1) All the 9 strains were derived from the nasal cavities of pigs, and belonged to PAGE type I and unknown serotypes other than 1 to 5.森肢俊平/H. parasuisの薬剤感受性とプラスミド/1998  21のためには慎重な薬剤の選択が必要と考えられた。われわれは先に，テトラサイクリン系樂剤で本病が良好に予防されることを報告した。今回の実験ではTCおよびOTCに対するMIC分布曲線のピークは比較的低く，また耐性菌も少なかった。この結果は，野外におけるテトラサイクリン系薬剤の効果を説明するひとつの理由になるものと考えられる。つぎに両角ら¹¹は，H.  parasuis 供試菌株の27%に7および10 Mdalのプラスミドが検出され，プラスミド保有枠はすべてPAGE-I型菌で血消型は３または型別不能枠であったと述べた。との報告と比べ，今回のわれわれの成績ではブラスミドの検出率が低く，またブラスミドの分子量も小さいものであった。また，今回のわれわれの供試菌株には血滑型3型菌は含まれていなかったので，３型菌におけるプラスミドの有無については不明であった。しかし，今回の成績ではプラスミド保有株はすべてPAGE-I型菌で血潜型別不能株であり，この点については先の両角ら'''の報告と一致する成績であった。病巣から分離されるH. parasuisはほとんどがPAGE-II型であり*,*,*,また実験的にもPAGE- I型菌よりPAGE-II型菌の方が病原性が強いといわれている。これまでプラスミドが検出されているのはPAGE-I型菌のみであるので，したがって本菌の場合プラスミドは病原性と関係がないとする両角らの意見をわれわれも支持するものであネ。一方，薬剤菌性の機序を知る目的でプラスミド保有株のプラスミド・プロフィルと薬剤耐性の関逛を調べたが，明瞭な相関は認められなかった。よって，現在のところ本菌の楽剤耐性にプラスミドが関与している可能性は少ないものと考えられた。最後に，本研究の実施にあたり賞重なご助言を頂いた農林水産省家畜衛生試験場の両角徹博士に深謝します。 1）阿部民也,岩崎正宰,吉川恵郷ほか. 1982. Hae- 2) mophilus parasuisによる際Glasser病の発生例.家畜衛賦研究報告, 84: 13-17. Hannan, P. C. T., O'Hanlon, P. J., and Rogers, N. H. 1989. In vitro evaluation of various quinolone antibacterial agents against veterinary mycoplasmas and respiratory bacterial pathogens. Res. Vet. Sci., 46: 202-211. 3)平澤博一，佐藤良彦，両角吉三ほか。 1987. 化膜性線雑素性髄膜炎を主微とした際の Haemophilus parasuis感染症例.日歌会誌, 40: 519-522.平澤博一，佐藤良彦，太田俊明ほか、1985.  [家のHaemophilus  parasuis 感染症の1例. 日級会誌, 38: 802-805. Kado, C. I., and Liu, S-T. 1981. Rapid pro¬ 4) 5) 6) cedure for detection and isolation of large and small plasmids. J. Bacteriol, 145: 1365-1375.加藤和好，両角徽雄。1977.  Haemophilus parasuisおよび Haemophilus parahaemolyticusの抗生物質に対する試験管内感受性。第83回日本欧医学会牌演要旨，42. 7) Kume, K., Sawata, A., and Nakase, Y. 1978. Haemophilus infections in chickens. 1. Charac• terization of Haemophilus paragallinarum iso¬ lated from chickens affected with coryza. Jpn. J. Vet. Sci., 40: 65-73. 8) Morikoshi, T., Kobayashi, K., Kamino, T., et 1990. Characterization of Haemophilus al. parasuis isolated in Japan. Jpn. J. Vet. Sci., 52: 667-669. 9）森藤俊平,小林一彦,神野太一ほか. 1988. SPF隊のグレーサー病に関する研究I一再現試験及び投後による予防試験．第106回日本歐医学会講演要官, 168. 10)森勝俊亨，小林一彦，神野太一ほか、1988.  SPF隊のグレーサー病に関する研究II一分離菌株の性状。第106回日本歌医学会歌演要旨，169. 11)両角徹雄,竹内正太郎,小林良則. 1987. Hae- mophilus parasuisのplasmid DNAについて.第103回日本歌医学会贈演要旨，115. 12) Nicolet, J., and Krawinkler, M. 1981. Poly- acrylamide gel electrophoresis, a possible taxono- mical tool for Haemophilus, pp. 205-212. In: Haemophilus, Pasteurella and Actinobacillus (Kilian, M., Frederiksen, W., and Biberstein, E. L., eds.), Academic Press, London. 13) . Nielsen, R., and Danielsen, V.  1975.  An out- breaks of Glasser's disease, studies on etiology, Nord. serology and the effect of vaccination. Vet. Med., 27: 20-25. 14) Riising, H. J. 1981. Prevention of Glasser's Haemophilus to disease through immunity parasuis. Zbl. Vet. Med. B., 28: 630-638. Smart, N. L., and Miniats, O. P. 1989. Pre¬ 15) liminary assesment of a Haemophilus parasuis bacterin for use in specific pathogen free swine. Can. J. Vet. Res., 53: 390-393. Toshimichi MORIKOSHI (Research Laboratory of C. Itoh Feed Mill Co., Ltd.) In vitro susceptibility to 13 antimicrobial drugs and plasmid profiles of 174 isolates of These strains were isolated from 1987 to 1989 from Haemophilus parasuis were examined. pigs reared at 16 farms in Tohoku, Kantoh and Kyushu districts in Japan. Of them, 46 (26.4%) strains were judged to be resistant to one or more kinds of drugs. In the drug resistant strains, 3 were quadruple resistant, 4 were triple, 16 were double and 23 were single. A typical cross resistance was observed in ft-lactams (penicillin and ampicillin) and aminoglicosides (kanamycin andf radiomycin). In 174 strains, 9 strains carried at least 6 kinds of small plasmid. All the plasmid-mediated strains were derived from nasal cavities of pigs, belonged to PAGE type I and unknown serotype. From these results, it was suggested that the number of the drug resistant strains of H. parasuis tended to increase. And it is alo suggested that the plasmids of H. parasuis did not control PAGE types and pathogenicity of the strains. On the other hand, a clear correlation between drug resistance and plasmid pofiles was not recognized, so the mecha¬ nisms of the resistance were not elucidated in this study.質問（阪野哲也，全農家衛研） 2週間程度の抗菌剤投与で，以後の発症をも抑制しているがその機序は,投薬期間中に軽度な菌の感染をうけ,それにより産生される抗体により以後の発症が防御されていると考えてよいか。落（森阪俊学）投楽しても感染を防御できない。また，導入豚はCF抗体(ー)→(+)になることによって質問の通りと考えられるが，導入駅の農場はHps PAGE-I型猶で汚染されている。よってCFでは検出されない患の抗体を持っている可能性があり，抗体の量とともに質（抗 PAGE-II型抗体？）も大事ではないかと推察している。質問(沢田拓士,日歌畜大)農場別で薬剤毎のMICに差があるということで, 1)きめ細い対策をたてられておりますが，これは現在も続けられていますか。その効果は如何ですか。 2)  PAGE-II型菌は耐性株がありますか。II型菌はプラスミドを持たないということですので，もし酎性であればこれはプラスミドによらないということですか。答（亲腰俊卒）続けており，有効であります。 1) 2)   PAGE-II型にもI型菌と同様に耐性菌は有りますが，プラスミドを持っていないのでプラスミド性ではないと思います。