山田
北海道大学大学院薬学研究院医療薬学専攻医療薬学分野薬剤分子設計学研究室Key words：ミトコンドリア，Drug delivery system（DDS），ミトコンドリア病，ナノ医薬品，創薬
精 官
ミトコンドリアは多彩な機能を有した細胞内小器官であり、その機能異常によって様々な症状を呈するミトコンドリア病および関連疾患（神経変性疾患、心筋症、など）を発症する。代表的なミトコンドリア病として報告されているMitochondrial myopathy, encephalopathy, lactic acidosis, and stroke-like episodes （MELAS）は、ミトコンドリアtRNA（ロイシン） (Mt-tRNA lee) のタウリン修飾の欠損に伴うミトコンドリア翻訳阻害が原因となり、ミトコンドリア機能障害を誘発し病態を呈すると考えられている。2019年に「タウリン」がミトコンドリア病に対する治療薬として保険適用され、有効な治療法が確立されていない本疾患の治療方針として非常に明るい話題となった。一方で、薬物療法に用いられる薬物は、疾患細胞への細胞導入能が乏しく、ミトコンドリア移行性が無いため、継続的に大量投与する対症療法が主流である。既存のミトコンドリアを標的としたDrug Delivery System（DDS）は、送達分子の物性やサイズを制限するため治療用分子のミトコンドリア送達は困難であった。研究代表者らはミトコンドリア膜との膜融合を介して内封物質を送達するMITO-Porterを開発し、培養細胞ミトコンドリアへの機能性分子送達に成功している[1, 2]。本戦略は、 「隣融合を介して内封分子をミトコンドリアへ送達する」ため、送達分子の物性やサイズを制限しない。研究代表者は、 MITO-Porterシステムに疾患細胞への細胞導入能を付加した「疾患細胞ミトコンドリアを標的としたDDSを構築」することで、ミトコンドリア病の革朝的治療が可能になると考え、本研究の提案に至った。本研究では、「疾患細胞ミトコンドリアを標的としたDDS」を構築し、ミトコンドリア標的型DDSによる疾患治療の有用性を実証する。治療戦略の検証のために、代表的なミトコンドリア病として報告されているMELASを含む患者由来細胞を使用し、送達治療分子としては、MELASの治療薬として保険適応されているタウリン、抗酸化能・ミトコンドリア電子伝達系補酵素であるコエンザイムQ 1 0（CoQ）を選定し、ミトコンドリア標的型DDSへの内封を検討した。本研究では、「疾患細胞標的型MITO-Porterの構築」、「疾患細胞を用いた細胞内動態の最適化および治療効果の検証」および「動物を用いた毒性試験」の順に研究を進めた。
方炭
1. 疾患細胞膜的型MITO-Porterの構築
1)  RP/KALA-MITO-Porterの調製疾患細胞のミトコンドリアは機能異常（膜電位低下など）のため、正電荷を有するミトコンドリア移行性素子を用いた従来の静電的相互作用を利用するミトコンドリア送達戦略は疾患細胞への適応は不可能である。研究代表者は、静電的相互作用によらないミトコンドリア輸送機構を有するミトコンドリア移行性RNAアプタマーなどに着目し、MITO- Porterシステムにミトコンドリア輸送能を付加させることで、今までは不可能であった疾患細胞の異常ミトコンドリアへの薬物送達が可能となると考えた。本研究では、表面には竜位非依存性ミトコンドリア移行能茶子 RPアプタマー [3]およびミトコンドリア融合能を有するペプチドKALA (WEKLAKALAKALAKHLAKALAKALKA-NH 2 )を配置した疾患細胞標的型MITO-Porterの構築を検討した。
2）マイクロ流体デバイスを利用した薬剤封入の検討
本研究では、実用化を見据え、均一性の高いナノ粒子を無菌的に大量調製が可能なマイクロ流体デバイスを利用した薬剤封入粒子調製を試みた。以下に、CoQをオクタアルギニン(R8)が付与されたR8-MITO-Porterに内封したR8-MITO-Porter（CoQ）の調製について説明する。図１に示す共同研究者である北海道大学大学院工学研究院の渡慶次学教授、真栄城正寿助教が開発したマイクロ流体デバイス(invasive lipid nanoparticle production (iLiNP) device)を用いて、エタノール希釈法の原理を利用したCoQの封入を検討した［4］。 iLiNPによって脂質悪濁液（CoQを含む）と綾御夜を急速混合することで均一な粒子調製、連続調製が可能となる。調製の過程は、1.粒子形成、2.透析の順に行う。 iLiNPを用いた脂質粒子調製では、①脂質相の組成、②水相の種類、③総芯速、④流速比を変化させることにより多彩な粒子設計が可能となる。①脂質相の組成には、R8-MITO-Porterを構成するナノカプセル材料およびCoQを含有するエタノール懸濁液を、②水相には、phosphate buffered saline（PBS）（−）を用いて、③総流速は500 μ L/minに固定し、④流速比は、EtOH希釈濃度が10%、20%、30%、40%となるように設定して検討を進めた。最終工程として、iLiNPで調製したMITO-Porter溶液は、透析（2時間、4℃）を行い含有するエタノールを除去した。 3)粒子物性の評価前項までに記載したMITO-Porterの粒子径、PdI（均一性の指標であり、値が小さい方が均一性が高い）、ゼータ電位（表面電位）を測定した。粒子径およびPdIは動的光散乱法を、ゼータ電位は電気泳動法を利用した原理に基づき、 Zetasizer Nano ZS    (Malvern Instruments Ltd., Malvern、WR、UK) を用いて測定した。
2.疾患細胞を用いた細胞内動態の最適化および治療効果の検証
1）自主臨床研究の整備ミトコンドリア病患者由来細胞を用いた研究を実施するため、自主臨床研究 『ミトコンドリア病に対する薬物治療法確立に向けた検討』の承認を得てG625A細胞を、自主臨床研究『ミトコンドリア病に対する医療用ナノカプセルの創製に向けた検討』の承認を得てMELAS細胞、LSND³細胞を用いた実験準備を整えた。 2）疾患細胞を用いた細胞内動態観察RP/KALA-MITO-Porter（G625A細胞）およびR8-MITO-Porter（LSND3細胞）の細胞内動態（細胞取り込み能評価、蛍光類微鏡観察）を評価した。細胞取り込み評価については、蛍光標識を施した粒子を細胞に添加し、細胞に取り込まれた粒子の蛍光量をフローサイトメトリー（Gallious; Beckman Coulter Inc., Pasadena, MA, USA）を用いて平均蛍光強度を測定し、細胞取り込み能を算出した。蛍光顕微鏡観察については、蛍光標識粒子（緑色）を細胞に添加し、ミトコンドリアを赤色に染色した後、細胞内局在を、共焦点レーザ一顕微鏡を用いて観察した。 3）ミトコンドリアの機能評価粒子添加時のミトコンドリア機能を評価するために、ミトコンドリア酸茶消費量（OCR）をAgilent Seahorse XFp extracellular flux analyzer  （Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA）を用いて評価した。ミトコンドリア機能の指標として基礎呼吸能（mitochondrial basal respiration）および最大呼吸能（Maximal respiration）を計測した。本評価の詳細な方法は既報を参考にして頂きたい[5]。
3.動物を用いた毒性肺腺
静脈内投与し、24時間後に血液を採取し生化学マーカーの値を測定し、毒性を評価した。
結果および美容
1.疾患細胞標的型MITO-Porterの標業
1)  RP/KALA-MITO-Porterの調製単純水和法を利用してミトコンドリア融合能を有するペプチドKALA (IE電荷)を表面修飾したKALA MITO Porterを調製した。その後、異なる比率でRP（負電荷）を修飾したRP/KALA-MITO-Porterを調製し、ゼータ電位（表面電位の指標）を測定した（図2)。RP修飾量の増加に伴い、表面電位が正から負に反転する様子が確認され、RPが修飾された負電荷のRP/KALA-MITO-Porterが調製可能であることを確認した。 KALA-MITO-Porterに異なる比率でRPを修飾し、ゼータ電位を測定した。データは平均値土標準偏差で示す（n=3）。
2）マイクロ流体デバイスを利用した薬剤封入の検討
iLiNPを用いたCoQ内封粒子（R8-MITO-Porter（CoQ）の調製において、流速比（水相/脂質相の流速の比率＝ EtOH希釈濃度に相当)の条件を検討した(タウリン内封の検討も行ったが、特許出願準備中のためここでは割愛する)。流速比は、エタノール希釈濃度の低下に依存して粒子径が小さくなった（図3A）。エタノール希釈濃度が20～30％の時、PdIは約0.12と単分散であったが、エタノール希釈濃度10％では他の希釈濃度よりも多分散であった。最終工程として、iLiNPで調製したR8-MITO-Porter（CoQ）溶液を透析した際の粒子物性を図3Bに示す。粒子径は小さくなる傾向を認めたが、PdIについては増加が認められた。ここまでの検討より、流速比を20％に設定しR8-MITO-Porter (CoQ)を調製する事とした[4]。iLiNPを用いることにより粒子径は約50 nmと従来技術より1/2倍小さな粒子となった。
2.疾患細胞を用いた細胞内動態の最適化および治療効果の検証
1）自主臨床研究の整備自主臨床研究の承認後、ミトコンドリア病患者の皮膚生検より得た線維芽細胞の樹立・雑代に成功した。G625A細胞は、mtDNAのtRNAphe上にG625A変異を有しており、臨床症状として、てんかんや進行性離聴が認められている。 LSND³細胞は、ミトコンドリアの呼吸鎖複合体Iを構成するND3タンパク質に点変異（T10158C）を有するmtDNAを保有するLeigh 脳症患者の皮膚線維芽細胞である。MELAS細胞は、Mt-tRNA™上に点変異（A3243G）を有するmtDNAを保有するMELAS患者の皮膚線維芽細胞である。 2）疾患細胞を用いた細胞内動態観察RP/KALA-MITO-Porter (G625A細胞) :異なる比率でPRアプタマーを修飾したRP/KALA-MITO-PorterをG625A変異細胞に添加し、細胞内導入量を評価した。その結果、4 mol％ RPアプタマーを修飾したRP/KALA-MITO-Porterは、KALA単独修飾体よりも有意に高い核酸導入能を示した（図4A）。さらに、その細胞内局在を観察したところ、 RP/KALA-MITO-Porterは、赤色に染色したミトコンドリアと緑色で示したpDNAとの共局在を示す黄色のドットが観察された (図4B)。以上より、RP/KALA-MITO-Porterは、静電的相互作用によらない疾患細胞ミトコンドリアへの分子送達が可能であることが示唆された（図4にはpDNAをトレーサーとして用いた実施例を提示［6］）。図4.  RP/KALA-MITO-Porter （CoQ）の細胞内動態観察A） 細胞取り込み評価:データは平均値土標準偏差で示す(n＝3)。有意差はANOVA (bonfferoni test、vs KALA-MITO-Porter （青色バー））を用いて検出した(** p<0.01) 。 B) 4 mol% RP/KALA-MITO-Porterの蛍光顆微鏡観察像(スケールバー :30 μ m) 。 R8-MITO-Porter　(LSND3細胞)：LSND3細胞にR8-MITO-Porterを添加し、細胞内局在を顕微鏡で観察したところ疾患細胞ミトコンドリアへ粒子が移行している様子が観察された[7]。
3）ミトコンドリアの機能評価
R8-MITO-Porter（CoQ）をMELAS細胞に添加し、その後にミトコンドリア機能の指標としてミトコンドリア基礎呼吸能およびミトコンドリア最大呼吸能を計測した。特許出願準備中のため、詳細は開示できないが、構成を最適化したR8-MITO-Porter (CoQ)を用いた際には、CoQ単独投与では観察されなかったミトコンドリア機能の向上が確認されている。現在、タウリン内封粒子およびRP/KALA-MITO-Porterでの検討も進めている。
3.動物を用いた事性的験
RP/KALA-MITO-Porter投与後の血液検査の結果、腎障害マーカー (BUN、CRE)、肝障害マーカー (ALT、LDH)、膵膵若マーカー（AMY）のいずれにおいても緩衝液投与群と同程度の値を示し、これらの項目における毒性は観察されなかった（表1）。
HEPES緩衝液およびRP/KALA-MITO-Porterを尾静脈投与し、24時間後に血液を採取し腎障害（BUN : blood urea nitrogen、CRE : creatinine）、肝障害（ALT : alanine aminotransferase、LDH : lactate dehydrogenase）、膵膵苦（AMY : amylase）のマーカー分子を測定した。データは平均値土標準偏差で示す（n＝3）。
有 東
本報告書では、以下の内容を報告した。 1.負電荷を有するRP/KALA-MITO-Porterを情楽する事に成功した。また、マイクロ流路デバイスを利用してCoQを封入する方法を確立した。 2.自主臨床研究を整備し、3種のミトコンドリア疾患細胞を用いた実験を実施する環境を整えた。また、調製したMITO- Porterが疾患細胞ミトコンドリアにアクセス可能であることを示した。 3. RP/KALA-MITO-Porterを静脈内投与した際に肝臓、腎臓、膀膜に対する毒性を示さなかった。本研究では、疾患細胞ミトコンドリアに治療分子（CoQ）を、DDSを用いて送達することで、ミトコンドリア機能が改善されることを示した。現在は、タウリンを含む既存薬を用いた検討を進めており、既存薬物に疾患細胞ミトコンドリア送達能を付加し、ミトコンドリア治療薬剤としてDrug Repositioning（既存薬の新しい薬効の発見・再利用）する可能性を示していきたいと考えている。また、RP/KALA-MITO-Porterの表面には静電的相互作用非依存的にミトコンドリアと結合する紫子を配置するため、膜電位が消失した重篤な疾患細胞ミトコンドリアへのアクセスも可能であり、種々の病態を呈するミトコンドリア病での適応範囲が広い。今後は、これまで培ってきたナノDDS技術を活用し、局所投与型DDS、臓器移行性を付与した静脈投与型DDS、経口投与型DDSへと発展させる予定である。本研究は、ミトコンドリア病に対する新たな治療戦略を提供するとともに、ミトコンドリアを標的とした創薬開発を一気に加速させると確信している。
道辞
ここで紹介した研究成果は北海道大学大学院薬学研究院医療薬学専攻医療薬学分野薬剤分子設計学研究室【Team Mitochondria】に所属する学生諸氏の日々の努力の賜物であり、学生各位に心より感謝する。また、本研究を遂行するにあたり、公益財団法人上原記念生命科学財団のご支援を頂きましたことに深く御礼申し上げます。