和泉宏謙¹、出村舞奈¹、今井彩子¹、吉田知之¹、小川良平²、森寿¹分子神経科学¹、放射線診断・治療学²) （富山大学医学部IZUMI Hironori, DEMURA Maina, IMAI Ayako, YOSHIDA Tomoyuki, OGAWA Ryohei, MORI Hisashi : Risk assessment of developmental neurotoxicity of the herbicide glufosinate-ammonium Pesticides including herbicides are used to protect crops against unwanted species. However, exposure to pesticides is potentially associated with developmental disorders in mammals including humans, because the developing brain in perinatal and childhood periods is thought to be vulnerable to adverse effects of pesticides. We previously developed transgenic (Tg) mouse strain named Arc-Luc Tg Hairless (HL) for visualizing neuronal activity-dependent Arc expression in vivo. In this study, we examined the effects of glufosinate- ammonium (GLA), one of herbicides used in a variety of crops, on neuronal activity using this Tg mice and detected a decrease in bioluminescence signal during developmental stages after chronic treatment with GLA. Because Arc involved in synapse regulation, we next examined the effects of GLA on synapses formation with synapse organizer-coated beads. We found disturbance of pre-synaptic differentiation in cultured neurons from maternally GLA-exposed mouse embryos. Our results suggest advantage of Arc-Luc Tg HL mice & synapse organizer-coated beads for risk assessment of developmental neurotoxicity, and the effects of GLA on the formation and maintenance of neural circuits through the changes in neuronal activity and synapse formation.
1.目的
農薬は、農作業労働を軽減し、農作物の生産性を向上させ、安定した供給に結び付けるための資材である。しかし、近年において、農薬嚥露と神経発達障害に相関性を示す疫学調査の報告が増えており、胎児期～発達期における農薬への曝露が発達障害の一因と考えられるようになっている。このことから、農薬曝露による発達神経毒性をより詳細に正しく評価することが求められている。今回、除草剤の一種であるグルホシネート(GLA)による中枢神経系の発達への影響評価として、我々がこれまでに構築した１） Arc 遺伝子レポーターマウス系統1 〉、2 ）シナプスオーガナイザービーズ法2 〉を用いて、神経活動とシナプス形成における変化の定量的な解析を行ったので報告する。
2.方法
１）発達期におけるGLA曝露の影響評価実験には、神経活動の指標とされるArc遺伝子を個体レベルで可視化できるルシフェラーゼトランスジェニックヘアレスマウス（Arc-Luc Tg HLマウス）を用いた。このTgマウスに対し、生後28日齢（P28）からP56までGLA（8 mg/kg）を投与し、コントロール群には同量の生理食塩水を投与した。イソフルラン麻酔下(1.5 %) のArc-Luc Tg HLマウスに発光基質であるルシフェリン(200 mg/kg)を投与し、CCDカメラで発光シグナルを測定した。発光イメージングは一週間ごとに実施し、両群の発光シグナル強度を比較した。実験操作の流れを図１ａに示す。 2）胎児期におけるGLA曝露の影響評価妊娠マウスに対して、胎児の神経管が閉じて領域化の直前（脳胞期）である妊娠10.5日目(GD10.5)からGLA (0.8mg/kg/）を２日毎に投与した。コントロール群には同量の生理食塩水を投与した。妊娠18.5日目に帝王切開で得られた胎児から初代培養神経細胞を調製し、シナプス形成の評価に用いた。培養13日目(DIV13)にて、培地にシナプスオーガナイザービーズを添加し、 24時間後に神経細胞を固定した。Active zoneに局在するBassoon (シナプス前終末マーカー)の免疫染色を行い、蛍光シグナルを測定・比較した。実験操作の流れを図1 bに示す。
3.結果
(1) GLA曝露に伴うArc-Lucシグナルの減少発達期における GLA 曝露の中枢神経系への影響評価として、Arc-Luc Tg HLマウスに対して、P28からP56までGLA を投与し、発光イメージングを行った（図2） ³¹。コントロール群において、P28からP56にかけて発光シグナル強度の減少を示した。これは、発達依存的なArc遺伝子の発現変化を反映していると考えられた1 〉。 2元配置分散分析の結果、GLA投与×日齢の交互作用は見受けられなかったが（p = 0.33)、各因子に対しては有意な差を示した(GLA投与  p = 0.02、日齢p = 3.2×10 -7 )。 Arc-LucTg HLマウスに対して、低濃度のGLAを長期曝露した場合（下段）、同量の生理食塩水を投与した場合(上段)に比べて、P49とP56におけるマウス脳の発光シグナルの減少が大きい。スケールバー：10 mm。 (2) GLA曝露によるシナプス形成の減少発達期におけるGLA 曝露によって神経活動が変化すること、またArcはシナプス調節を担う分子であることを踏まえ、GLA曝露によるシナプス形成への影響が考えられた。そこで、胎児期にGLA曝露を施した初代培養神経細胞とシナプスオーガナイザービーズ間でのシナプス形成量の変化の有・無について検討を行った（図３）。コントロールと比較し、GLA 曝露を施した神経細胞では、シナプスオーガナイザービーズ上に集積したBassoonが相対的に少なくなることが分かった(p < 0.05)。
4.考察
今回、グルホシネート嚥露による中枢神経系の発達への影響を評価するために、Arc-Luc Tg HLマウスとシナプスオーガナイザービーズを用いて、神経活動とシナ図３. GLAの胎児期曝露によるシナプス形成への影響aシナプスオーガナイザービーズへの培養神経細胞のシナプス前終末の分化誘導の模式図。bシナプスオーガナイザービーズ（緑）に集積したBassoon（シナプス前終末マーカー、マゼンタ）の染色像（コントロール群：上段、胎児期GLA曝露群：下段）。プス形成の変化を定量的に解析した。Tgマウスでは、グルホシネート嚥露によるArc発現の低下が考えられた。この結果に一致するように、GLA曝露を施した神経細胞では、シナプスオーガナイザービーズに対するシナプス形成量の低下を示した。これらを踏まえ、今回用いた方法は新たな発達神経毒性評価法として非常に有効であると考えられた。マウスを用いた行動解析の報告として、GLA爆露による記憶障害や自閉症で見られるような行動障害の報告がある。今回の結果を踏まえると、発達期における神経回路の形成・維持に異常が生じることで行動障害に至ると考えられるが、神経回路レベルでの変化についての検討が必要である。本研究を遂行するにあたり、ご指導くださいました富山大学・医学部・分子神経科学講座のスタッフの皆様、同大学・生命科学先端研究センター・田渕圭章先生、高雄啓三先生、松尾美奈さん、高崎健康福祉大学・福地守先生に深謝いたします。本研究は、JSPS科研費JP19K19407の助成を受けたものです。 1) Izumi et al., Application of hairless mouse strain to bioluminescence imaging of Arc expression in mouse brain. BMC Neurosci., 2017, 18: 18. 2) Yoshida et al., Canonical versus non-canonical transsynaptic signaling of neuroligin 3 tunes development of sociality in mice. Nat. Commun., 2021 , 12: 1848. 3) Izumi et al., Bioluminescence imaging of Arc expression in mouse brain under acute and chronic exposure to pesticides. Neurotoxicology, 2019, 71, 52-59.