熊本大学大学院生命科学研究部細胞病理学分野原章雄藤Advanced glycation end-products (AGEs), were known as major hydrolysate of glycated collagen. Subsequently, AGEs was also detected in human serum, and its level in patients with diabetes was found to be higher than in normal subjects. Furthermore, it is known that AGEs-collagen induces apoptosis in fibroblasts through activation of reactive oxygen species and MAP kinases. Therefore, treatment with AGEs inhibitors may be a potential strategy for the prevention of clinical diabetic complications and skin aging. In the present study, we investigated the inhibitory effect of Syakuyaku extract and compounds contained in Syakuyaku on N "-(carboxymethyl) arginine (CMA) formation to discover the candidate agents for the new AGEs inhibitor. As a result, Syakuyaku extract and pentagalloylglucose isolated from Syakuyaku extract showed significant inhibitory effect on CML and CMA formation during incubation of collagen with ribose, thus Syakuyaku and pentagalloylglucose may be candidate agents for the new AGEs inhibitors.
1.緒
fun
我々は、健康維持や疾病予防に有効な「機能性天然薬物」の探索研究を行なっており、これまでに抗動脈硬化作用を有する天然化合物やマクロファージの活性化制御作用を有することでガン免疫療法に有効な天然化合物を発見してきた1 − 6 )さらに近年、この研究の一環として、糖尿病合併症や動脈硬化症、皮膚老化などの老化性疾患の発症や進展に関与するadvanced glycation end-products (AGEs)の生成を阻害する天然化合物の探索を行なっている。AGEsとは還元糕とタンバク質の非酵素的な反応であるメイラード反応によって生じる最終生成物の総称であり、このメイラード反応はグルコースなどの還元税とタンパク質のアミノ基が反応してアマドリ転位物を形成する前期反応と、アマドリ転位物が酸化、脱水、縮合、転位などの反応を経てAGEs構造体へと変化する後期反応からなる。現在、様々なAGEs構造体が知られており、その中でも、様々なタンパクで生成する主要なAGEs構造体であるN c -  (carboxymethyl) lysine（CML）は、糖尿病合併症の病変部位や動脈硬化症のみならず、賄線維症の肺胞マクロファージなどでも蓄積することが知られている7 。また、コラーゲンに特異的に生成するAGEsとしてはN - (carboxymethyl) arginine (CMA)が知られている"。さらに、コラーゲンに生成するAGEsと病態との関連についても、様々な報告がなされIdentification of compounds inhibiting AGEs formation in Syakuyaku Yukio Fujiwara Department of Cell Pathology, Graduate School of Medical Sciences, Kumamoto Universityており、例えば、AGEs化コラーゲンは骨を形成する骨芽細胞のアポトーシスを誘導することで骨形成を阻害し、この現象は骨粗鬆症の原因の一つであると考えられている91 。また、コラーゲンのAGEs化は、表皮に存在するケラチノサイト（角化細胞）の遊走やコラーゲンへの接着能を低下させることから、糖尿病患者の創傷治癒の遅延にはコラーゲンのAGEs化が関与していることが示唆されている109 。コラーゲンは、皮膚の真皮において線維芽細胞から産生され、真皮の70％以上を構成するタンパク質であり、このコラーゲンが線維芽細胞に引っ張られることで肌の張りが保たれている。しかし、コラーゲンがAGEs化すると、 AGEsコラーゲンによるRAGE (receptor for AGE)を介したsignalingにより線維芽細胞のアポトーシスが引き起こされ9. 11)、その結果、肌の張りの低下といった皮膚老化が促進すると考えられている。そこで、本研究では、皮膚老化予防に対する新たなターゲット分子としてAGEsに注目し、生薬「芍薬」のAGEs生成阻害作用の検討および芍薬に含まれるAGEs生成阻害化合物の探索を行なった。
2.実験
2.1
試験サンプル
本研究で用いた生薬抽出エキスは、各種生薬をMeOHで24時間温浸することで調製した。また、試験化合物は生薬「芍薬」から各種クロマトグラフィーにて単離・精製したものを用いた。
2.2  AGEs生成阻害試験
リボース(30mM)とゼラチン(2mg/ml)もしくは、 I型コラーゲン(1.5mg/ml)の混合溶液を37℃で７日間インキュベートすることで、AGEsであるCMLとCMAが生成する条件下に、DMSOで溶解した試験サンプルを添加し、CML生成およびCMA生成に対する阻害作用を、抗CML抗体ならびに抗CMA抗体を用いたELISA法にて評価した。
2.3 ELISA
ELISAによるCMLおよびCMA含量の評価は、Nagaiらの方法に準じて行った129。リボース–ゼラチン混合液(10μg/ml)を96穴プレートにコーティングし、0.05% Tween 20を含むPBS（washing  buffer）で3回洗浄後、 0.5%ゼラチンにてプロッキングを行った。各wellをwashing bufferにて洗浄し、抗CML抗体もしくは抗CMA抗体を添加後、１時間インキュベートした。各wellをwashing  bufferにて洗浄後、HRP標識抗マウスIgG抗体にて１時間インキュベートし、最後にOPDにて発色反応後、 1 M硫酸にて反応を停止した。各wellの450nmにおける吸光度をmicro-ELISA plate readerにより測定した。
2.4 線維芽細胞の3次元培養
ヒト真皮線維芽細胞は、JCRB細胞バンクより購入した。ヒト真皮線維芽細胞(4.0 × 10 5 cell/well)を培地で懸濁させた溶液に、 I型コラーゲン溶液を加え、塔菱チャンバー内で培養することで、 I型コラーゲンマトリックスに線維芽細胞を包埋した。２日後に凝固したマトリックスを培養チャンバーより剥離し、８日間培養することで、正常に収縮するマトリックスを形成させた。
2.5ウエスタンブロット法
ウエスタンプロットによるMAPキナーゼの活性化の評価は、これまでの報告に準じて行った119。37℃で７日間インキュベートした各種コラーゲン溶液（Ｉ型コラーゲン溶液、リボース－Ｉ型コラーゲン溶液、天然化合物を添加したリボース－Ｉ型コラーゲン溶液）にて、３時間刺激したヒト真皮線維芽細胞を回収し、lysis bufferを用いて細胞を溶解させた。電気泳動には、10％ポリアクリルアミドゲルを用いた。また、１次抗体は、Rabbit monoclonal anti-Phospho-p38 antibody,  Rabbit polyclonal anti- Phospho- (JNK1+JNK2) antibody,  Mouse monoclonal anti- β -actin antibodyを用いて行った。
2.6 免疫組織化学染色
37℃で７日間インキュベートした各種コラーゲン溶液( I型コラーゲン溶液、リポース– I型コラーゲン溶液、天然化合物を添加したリボース– Ｉ型コラーゲン溶液）にて刺激したヒト真皮線維芽細胞を４％パラホルムアルデヒドにて固定後、バラフィンにて包埋した。続いて、バラフィン切片を作成後、定法により抗CML抗体、抗CMA抗体およびRabbit polyclonal anti-cleaved caspase-3 antibodyを用いた免疫染色を行った。
3.結果
3.1
作用
芍薬のAGEs生成阻害作用を評価するために、芍薬のMeOH抽出エキスを調製し、まずは、コラーゲンに特異的に生成するAGEsであるCMAに対する阻害作用を評価した。その結果、Fig.1 Aに示すようにMeOH抽出エキスはCMAの生成を有意に抑制した。また、MeOH抽出エキスをDiaion  HP-20カラムにて分画した画分を用いて評価を行なったところ、50% MeOH溶出面分にのみ顕著なCMA阻害作用が認められた(Fig.1B)。続いて、阻害効果の認められた50% MeOH溶出画分をWako gelカラムを用いて分画し、得られた４つの画分の阻害作用を評価したところ、Fraction １ならびにFraction 3に顕著なCMA阻害作用が認められた(Fig.1C)。ゆえに、これらフラクションに活性本体が含まれていることが示唆された。
3.2  芍薬抽出画分からの化合物の単離
Fig.1Cで顕著なCMA生成阻害作用が認められたfraction 1およびfraction 3を各種クロマトグラフィー (シリカゲルカラム、逆相シリカゲルカラム、HPLC)により分離精製を行なった。単離した化合物を核磁気共鳴(NMR)および質量分析により構造解析を行なったところ、Fig. 2に標造を示す化合物(Methylgallate, Galloylpaeoniflorin, Trigalloylglucose, Tetragalloylglucose, Pentagalloylglucose)を同定した。 AGEs生成阻害試験系にて、単離した化合物の阻害作用を評価した。その結果、すべての化合物に有意なCMAの生成阻害作用が認められ、GPを除く、すべての化合物にCMLの生成阻害作用が認められた(Fig.3A)。次に、リボースとＩ型コラーゲンを用いたAGEs生成阻害試験系にて同様に評価を行った。その結果、すべての化合物に有意なCMAの生成阻害作用が認められ、TRGG, TEGG, PGGに有意なCMLの生成阻害作用が認められた(Fig.3B)。また、これら化合物はCMLよりもCMAの生成をより強く抑制することが明らかとなった(Fig.3)。
3.4 線維芽細胞の三次元培養を用いたAGEs阻害作
用を有する芍薬由来化合物の評価の検討
肌の張りは、真皮中に存在する線維芽細胞がコラーゲンを引っ張ることで保たれている。通常、正常なコラーゲンマトリックス中で線維芽細胞を培養すると、線維芽細胞がI型コラーゲンを引っ張り引き締めることで弾力のある真皮類似構造を形成し、マトリックスの収縮が観察されるが、 AGEs化コラーゲンマトリックス中では、その収縮率が低下する。そこで、CMA生成阻害作用の認められた
3.3
AGEs生成を阻害する芍薬の活性本体を同定する目的で、まず、リボースとゼラチン（可溶性コラーゲン）を用いたPentagalloylglucose (PGG)を添加したコラーゲンを用いて、マトリックスの収縮に対する効果を検討した。方法としては、ヒト線維芽細胞を培地で懸濁させた溶液に、native- collagen溶液、AGEs-collagen溶液(riboseとnative-collagenの混合液を７日間インキュベートしたもの)もしくは、PGGを添加したcollagen溶液 (AGEs-collagen溶液を調製する際にPGGを添加したもの）を加え、培養チャンバー内で培養することで、コラーゲンマトリックスに線維芽細胞を包埋した。２日後、凝固したマトリックスを培養チャンバーより剥離し、８日間培養後にマトリックスの収縮を観察した。その結果、AGEs-collagenを用いたマトリックスではnative-collagenを用いた場合に比べて、その収縮率が低下Syakuyaku on AGEs formation. Gelatin and ribose were incubated with indicated concentration of compounds (GP; Galloylpaeoniflorin, MG; Methylgallate, TRGG; Trigalloylglucose, TEGG; Tetragalloylglucose, PGG; Pentagalloylglucose) in phosphate buffer for 7 days followed by determination of CMA and CML by noncompetitive ELISA as described under Material and Methods (A). Type-I collagen and ribose were incubated with indicated concentration of compounds (GP; Galloylpaeoniflorin, MG; Methylgallate, TRGG; Trigalloylglucose, TEGG; Tetragalloylglucose, PGG; Pentagalloylglucose) in phosphate buffer for 7 days followed by determination of CMA by noncompetitive ELISA as described under Material and Methods (B). Data are presented as the mean ± SD. *, P<0.01; **, P<0.005; *, P<0.05; **, P<0.01 versus control.し、その収縮率の低下はPGGにより改善した(Fig. 4)。前述したように、PGGは、コラーゲンのCMA化により低下したマトリックスの収縮率を改善したため、その改善作用がCMA生成阻害作用によるものであるかを確認するために、マトリックス中のCMA含量を、抗CMA抗体を用いた免疫染色により評価した。その結果、マトリックスの収縮率が低下したコントロールではCMAの蓄積が確認でき、その蓄積はPGGの添加により抑制された(Fig.5A)。ゆえに、PGGによるマトリックス収縮改善作用は、これら化合物のCMA生成阻害作用によることが示唆された。また、マトリックス中の線維芽細胞の形態を、HE染色により確認したところ、CMA化コラーゲン中では、線維芽細胞の形態が丸くなりNative collagenと比較して、明らかに細胞死が誘導されていた(Fig.5B)。一方、CMA生成阻害化合物であるPGGを添加したマトリックス中の線維芽細胞は、Native collagenと比較して、変化のない正常な形態であった(Fig.5B)。さらに、カスパーゼ３の活性化を免疫染色により評価したところ、CMA-collagenでは、カスバーゼ３の活性化が認められ、その活性化はPGGにより抑制された(Fig.5C)。ゆえに、CMA生成阻害化合物であるPGGによるマトリックスの収縮率の改善は、PGGがコラーゲンのCMA化を阻害したことによる線維芽細胞のアポトーシスの抑制であることが示唆された。
3.5 CMA生成阻害化合物による線維芽細胞のアポト
ーシス抑制メカニズム
次に、CMA阻害化合物であるPGGが線維芽細胞のアポトーシスを抑制するメカニズムを解明することにした。これまでに、CMAの類似構造を有するAGEs構造体であるCML化したタンバクは、RAGEを介してJNKやp38などのMAP kinaseを活性化させることで、細胞をアポトーシスに導くことが報告されている9. 11)。そこで、本研究ではCMA化コラーゲンによるJNKやp38の活性化ならびにPGGのJNKやp38の活性化に対する作用を検討した。方法としては、ヒト線維芽細胞にCMA化コラーゲンまたはPGGで処理したコラーゲンを3時間添加後のphosphorylated-p38およぴphosphorylated-JNKの発現量をウエスタンプロット法にて評価した。その結果、PGGはCMA化コラーゲンによるp38およびJNKの活性化を頭者に抑制した(Fig. 6)。ゆえに、CMA生成阻害化合物は、コラーゲンのCMA化を抑制することで、CMA化コラーゲンによるp38およびJNKの活性化を抑制し、結果的に級維芽細胞のアポトーシスを抑制することで、三次元培養におけるマトリックスの収縮率の低下を改善したものと考えられた。
4.考祭
本研究により芍薬のAGEs生成阻害作用が明らかとなり、その活性本体は化学構造中にガロイル基を有するMethylgallate, Galloylpaeoniflorin, Trigalloylglucose, Tetragalloylglucose, Pentagalloylglucoseであることが明らかとなった。また、構造活性相関として、ガロイル基を
A
B
Native collagen
CMA collagen
PGG-treated collagen
C
Native collagen
PGG-treated collagen
Fig.5 Effect of PGG on CMA Accumulation and Cell Viability in Collagen Matrix. CMA accumulation (A).  HE staining of Fibroblast (B).  Caspase-3 activation (C).多くもつPentagalloylglucose (PGG)が最も阻害活性が強く、ガロイル基の数が減少していくにつれ活性が低下する傾向が認められたことから、ガロイル基の数がCMAの阻苦活性に関与する可能性が示唆された。また、PGGは線維芽細胞の三次元培養において、コラーゲンのCMA化に俳うコラーゲンマトリックスの収縮率の低下を改善した。この収縮率改善メカニズムは、CMA生成阻害化合物がコラーゲンのCMA化を抑制することで、結果的にCMAコラーゲンにより誘導されるアポトーシスシグナルの一つであるMAP kinase (JNK, p38)シグナルの抑制を介した線維芽細胞のアポトーシス抑制によるものであることが明らかとなった。本研究にて、生薬「芍薬」および、芍薬に含まれる成分の皮膚老化改善作用および、その作用メカニズムを解明したことで、CMAが皮膚老化改善作用における新たなターゲット分子として重要であることが示された。本研究ではCMAコラーゲンが引き起こすと考えられる病憲や老化症状のうち、特に皮膚老化に注目して研究を行ったがCMAコラーゲンは皮膚老化のみならず骨粗鬆症や糖尿病合併症の原因物質であることも考えられているため、今後さらにCMAの生体に及ぼす影響が明らかになることで、CMA阻害剤の重要性が高まり、本研究で得られた知見やCMA阻害化合物の社会的利用価値が高まることが期待される。当該研究テーマおよび関連テーマの実施に際して、グラントサポートを賜りました公益財団法人コスメトロジー研究振興財団に深謝します。 1) Fujiwara Y, Kiyota N, Hori M, Matsushita S, Iijima Y, Aoki K, Shibata D, Takeya M, Ikeda T, Nohara T, Nagai R, : Esculeogenin A, a new tomato sapogenol, ameliorates hyperlipidemia and atherosclerosis in ApoE-deficient mice by inhibiting ACAT., Arterioscler Thromb Vasc Biol, 27, 2400-2406, 2007. 2) Fujiwara Y, Hayashida A, Tsurushima K, Nagai R, Yoshitomi M, Daiguji N, Sakashita N, Takeya M Tsukamoto S, Ikeda T, : Triterpenoids Isolated from Zizyphus jujuba Inhibit Foam Cell Formation in Macrophages. J Agric Food Chem , 59 , 4544552, 2011. 3) Fujiwara Y, Kiyota N, Tsurushima K, Yoshitomi M, Horlad H, Ikeda T, Nohara T, Takeya M, Nagai R, : Tomatidine, a tomato sapogenol, ameliorates hyperlipidemia and atherosclerosis in apoE-deficient mice by inhibiting ACAT. J Agric Food Chem. 60, 2472-2479, 2012. 4) Fujiwara Y, Komohara Y, Ikeda T, Takeya M, : Corosolic acid Inhibits Glioblastoma Cell Proliferation by Suppressing the Activation of STAT3 and NF- κ B in Tumor Cells and Tumor-associated Macrophages, Cancer Sci. 102, 206-211, 2011. 5) Fujiwara Y, Komohara Y, Kudo R, Tsurushima K, Ohnishi K, Ikeda T, Takeya M, : Oleanolic acid inhibits macrophage differentiation into the M2 phenotype and glioblastoma cell proliferation by suppressing the activation of STAT3. Oncol Rep , 26 , 1533-1537, 2011. 6) Horlad H, Fujiwara Y, Takemura K, Ohnishi K, Ikeda T, Tsukamoto H, Mizuta H, Nishimura Y, Takeya M, Komohara Y : Corosolic acid impairs tumor development and lung metastasis by inhibiting the immunosuppressive activity of myeloid-derived suppressor cells. Mol Nutr Food Res. in press. 7) Matsuse T, Ohga E, Teramoto S, Fukayama M, Nagai R, Horiuchi S, Ouchi Y, : Immunohistochemical localisation of advanced glycation end products in pulmonary fibrosis. J Clin Pathol. 51, 515-519, 1998. 8) Shimasaki S, Kubota M, Yoshitomi M, Takagi K, Suda K, Mera K, Fujiwara Y, Nagai R, : N " -(carboxymethyl) arginine Accumulates in Glycated Collagen and Klotho-deficient Mouse Skin. Anti-Aging Medicine, 8, 82-87, 2011. 9) Alikhani Z, Alikhani M, Boyd CM, Nagao K, Trackman PC, Graves DT, : Advanced glycation end products enhance expression of pro-apoptotic genes and stimulate fibroblast apoptosis through cytoplasmic and mitochondrial pathways. J Biol Chem , 280 , 12087- 12095, 2004. 10) Morita K, Urabe K, Moroi Y, Koga T, Nagai R, Horiuchi S, Furue M, : Migration of keratinocytes is impaired on glycated collagen I. Wound Repair Regen. 13, 93-101. 2005. 11) Alikhani M, Maclellan CM, Raptis M, Vora S, Trackman PC, Graves DT, : Advanced glycation end products induce apoptosis in fibroblasts through activation of ROS, MAP kinases, and the FOXO1 transcription factor. Am J Physiol Cell Physiol. 292, C850-856. 2007. 12) Nagai R, Ikeda K, Higashi T et al, Hydroxy radical mediates N epsilon-(carboxymethyl) lysine formation from amadori product. Biochem Biophys Res Commun. 1997; 234 : 167-172.