谷口敦彦東京薬科大学薬学部薬品化学教室Key words :コンジュゲート,触媒,光酸茶化,ペプチド,マイオスタチン

トランスフォーミング増殖因子β （transforming growth factor - β : TGF- β ）スーパーファミリーに属するタンパク質であるマイオスタチンは、II型アクチビン受容体に結合して、細胞内ヘシグナル伝達することで、筋肉量を負に制御している［1］。よって、この受容体シゲナルを抑制することは筋肉量の増大につながり、筋ジストロフィー、カヘキシア、サルコペニア、廃用性筋萎縮等の筋萎縮性疾患の治療戦略として注目されている［2, 3］。したがって、本受容体シグナルを制御できるツールは有意義であると考えられる。我々は、マイオスタチン前駆体タンパク質のN末端にあるプロドメイン部分が、マイオスタチンと相互作用していることに着目し、マウス由来プロドメイン配列よりマイオスタチンに親和性を有する23残基のペプチド１ (図1a)を見出している［4］。ペプチド１はマイオスタチンに対して弱い阻害作用を示し、マイオスタチンと可逆的に結合していると考えられた。そこで、このマイオスタチン親和性ペプチド１を利用して、マイオスタチンの光酸素化を基盤とした、光照射に応答して受容体シグナルを制御する手法の開発を目指した。本研究では、マイオスタチン親和性ペプチド1に光酸茶化触媒2 [5]を担持したコンジュゲート8を合成し(図1)、これを用いてマイオスタチンを光酸素化及び不活化させた。コンジュゲート3をマイオスタチンに添加した際は、マイオスタチン活性による受容体シグナルが誘導された一方、8とマイオスタチンに光を照射することで、本受容体シグナルは誘導されなかった。これは、光照射によって受容体シグナルを制御できる可能性を示唆する［6］。 a) H-WRONTRYSRIEAIKIQILSKLRI myostatin-binding peptide 1図1.マイオスタチン親和性ペプチド1、光酸茶化触媒2、及び触媒ーペプチドコンジュゲート3 a）マイオスタチン親和性ペプチド1のアミノ酸樋列と光酸素化触媒2の化学構造。 b）光酸茶化触媒ーペプチドコンジュゲート3の化学構造と合成スキーム。
1.光酸素化燃媒ーペプチドコンジュゲートのデザインと合成
当研究室では、マイオスタチン親和性ペプチド１の詳細な構造活性相関研究によって、12位アラニン側鎖(図1a)の置換許容性が大きいことを既に明らかにしている［7］。よって、この12位に光酸茶化触媒を導入することとした。一方、ペプチド1は、1位にトリプトファン残基（図1a）を有しているが、トリプトファンは非常に光酸素化されやすいアミノ酸であるため、本研究では問題となる可能性が予想された。よって、ペプチド１の構造活性相関研究において代替可能と分かっていた3,3·ジフェニルプロピオン酸を適用した[8]。すなわち、12位にアルキンを有したペプチド4 （図1b）を通常のFmoc固相ペプチド合成法を用いて得た。一方、光酸茶化触媒としては、標的分子に結合した時にのみ光酸茶化活性を発現する分子2 (図1a)を採用した[5]。この触媒２は、組織透過性が高く、且つ障害性も低い近赤外光（波長：～800 nm）で励起可能であるため、生体適用性が高い。触媒2をペプチドと連結するために、既存の合成方法に倣って、アジドを有する触媒6 （図1b）を合成した。最後に、ペプチド4 (1 eq)と触媒5 (1.1 eq)を、ジメチルホルムアミド／メタノール(1 : 1)中、[Cu(CHsCN)4]PF6 (>40 eq)、tris[(1-benzyl-1H-1.2.3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA、4 eq)、及びL-ascorbicacid (24 eq)存在下、 1時間撹拌することで、ヒュースゲン環化付加反応によりコンジュゲート３を得た（図1b）。
2.マイオスタチンの光酸茉化
リン酸緩衝液（10 mM、pH 7.4）中、光酸素化触媒ーペプチドコンジュゲート3（3 μ M）をマイオスタチン（1 μ M）に添加し、LEDパネル（730 nm、14 mW）を用いて、37℃下90分間光照射を行った。ジチオスレイトールによるジスルフィド還元、続くリシルエンドペプチダーゼによる酵素消化の処理後、 MALDI-TOF MS を用いて酸素化されたマイオスタチンフラグメントを分析した (図2)。
3.酸薬化マイオスタチンの受容体に対する活性
マイオスタチンの受容体に対する活性は、HEK293細胞を用いたin vitroルシフェラーゼレポーターアッセイを用いて評価した（図3）[7, 8]。本評価系では、細胞にSmad応答性ルシフェラーゼレポーター遺伝子を導入しており、マイオスタチンが受容体に結合することで誘導されるSmadシグナルに依存してルシフェラーゼが発現することから、そのルシフェラーゼ活性を指標とした。本系に酸素化処理を施したマイオスタチン（終濃度: 0.6 nM）を添加し、 ８時間インキュベートした後、その細胞溶解液におけるルシフェラーゼ活性を測定した。
結果および考察
1. 光酸茶化燃媒ーペプチドコンジュゲートの合成
ペプチド4は、Fmoc固相ペプチド合成、脱樹脂、逆相HPLC精製を経て、白色粉末（トリフルオロ酢酸塩、収率: 24%)として得た。一方、触媒5は、全7工程を経て濃紺色固体として得た。その後、ペプチド4のアルキンと触媒５のアジドから、鋼触媒存在下ヒュースゲン環化付加反応にて1,2,3-トリアゾールを形成した。さらに、 HPLC精製を経て、コンジュゲート8を濃紺色粉末（トリフルオロ酢酸塩、収率：35％、純度：＞95％）として獲得した（図1b）。
2.マイオスタチンの光酸茶化
光酸茶化触媒—ペプチドコンジュゲート8をマイオスタチンに添加し、生理的条件下（pH 7.4、37℃）で光照射を行った。光照射前は、マイオスタチン79～90フラグメントのMSピークが観測された（図2a）。これに対して、光照射後ではそのピークが減少し、代わりに16、32、48 Da増加したピークが検出された（図2b）。これは、マイオスタチン79〜90フラグメント中の79及び84位メチオニン側鎖のスルフィドがスルフォキシド又はスルフォンに酸素化修飾されたことを示唆する。この酸素化は、コンジュゲート3を添加しなかった場合、又は光照射しなかった場合では認められなかった。さらに、脱気処理済みの緩衝液中では、この酸素化が抑制された。以上より、マイオスタチンはコンジュゲート3によって光酸素化されたことが示された。
3.酸素化マイオスタチンの受容体に対する活性
In vitroルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて、マイオスタチンを細胞に添加した時、ルシフェラーゼ活性が認められ、この値を100とした（図3、レーンe)。光酸素化触媒ーペプチドコンジュゲート3のみ又は光照射のみで処理した場合は、同程度のルシフェラーゼ活性が観測された一方（レーンf、g）、コンジュゲート3と光照射の両方で処理した場合のみ、顕著なルシフェラーゼ活性の低下が見られた（レーンh)。これは、マイオスタチンが光酸素化によって失活したことを示唆する。また、コンジュゲート3のみでマイオスタチン活性の阻害が認められなかった理由は、コンジュゲート3とマイオスタチンの結合が可逆的であるため、コンジュゲート3の濃度が低い環境下においては（終濃度：1.7 nM）、十分な阻害効果が得られなかったものと考えられる。以上の結果より、コンジュゲート3によるマイオスタチンの光酸茶化を利用することで、光照射によって受容体シグナルを制御できる可能性が示された。図2.コンジュゲート3によるマイオスタチンの光酸素化a）光照射前とb）光照射後のMALDI-TOF MSスペクトル。図3. 光酸素化によるマイオスタチンの不活化HEK293細胞を用いたin vitroルシフェラーゼレポーターアッセイ。 (n=3、mean±s.d.、***p<0.001 in the indicated lanes by Tukey's test)。本研究の遂行にあたり、ご助言頂いた東京薬科大学薬学部薬品化学教室の林良雄教授、高山健太郎講師(現京都薬科大学椎教授)を始め、ご協力頂いた当研究室の学生の皆様にこの場を借りて深謝したい。
文 歌
1) 2) 3) McPherron AC, Lawler AM, Lee SJ. Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGF- β  superfamily member. Nature. 1997 May 1;387(6628):83-90. PMID: 9139826 DOI: 10.1038/387083a0 Bogdanovich S, Krag TO, Barton ER, Morris LD, Whittemore LA, Ahima RS, Khurana TS. Functional improvement of dystrophic muscle by myostatin blockade. Nature. 2002 Nov 28;420(6914):418·21. PMID: 12459784 DOI: 10.1038/nature01154 Latres E, Pangilinan J, Miloscio L, Bauerlein R, Na E, Potocky TB, Huang Y, Eckersdorff M, Rafique A, Mastaitis J, Lin C, Murphy AJ, Yancopoulos GD, Gromada J, Stitt T. Myostatin blockade with a fully human monoclonal antibody induces muscle hypertrophy and reverses muscle atrophy in young and aged mice. Skelet Muscle. 2015 Oct 9;5:34. eCollection 2015. PMID: 26457176 PMCID: PMC4600334 DOI: 10.1186/s13395-015- 0060-8 4) 5) 6) 7) 8) Takayama K, Noguchi Y, Aoki S, Takayama S, Yoshida M, Asari T, Yakushiji F, Nishimatsu S, Ohsawa Y, Itoh F, Negishi Y, Sunada Y, Hayashi Y. Identification of the minimum peptide from mouse myostatin prodomain for human myostatin inhibition. J Med Chem. 2015 Feb 12;58(3):1544-9. Epub 2015 Jan 21. PMID: 25569186 DOI: 10.1021/jm501170d Ni J, Taniguchi A, Ozawa S, Hori Y, Kuninobu Y, Saito T, Saido TC, Tomita T, Sohma Y, Kanai M. Near infrared photoactivatable oxygenation catalysts of amyloid peptide. Chem. 2018 Apr 12;4(4): 807-20. Epub 2018 Mar 15. DOI: 10.1016/j.chempr.2018.02.008 Okamoto H, Taniguchi A, Usami S, Taguchi A, Takayama K, Hayashi Y. Inactivation of myostatin by photo- oxygenation using catalyst-functionalized peptides. Chem Commun (Camb). 2019 Aug 11;55(62):9108·11. Epub 2019 Jul 12. PMID: 31298230 DOI: 10.1039/c9cc04368c Takayama K, Rentier C, Asari T, Nakamura A, Saga Y, Shimada T, Nirasawa K, Sasaki E, Muguruma K, Taguchi A, Taniguchi A, Negishi Y, Hayashi Y. Development of potent myostatin inhibitory peptides through hydrophobic residue-directed structural modification. ACS Med Chem Lett. 2017 Jun 6;8(7):751-756. eCollection 2017 Jul 13. PMID: 28740611 PMCID: PMC5512132 DOI: 10.1021/acsmedchemlett.7b00168 Takayama K, Nakamura A, Rentier C, Mino Y, Asari T, Saga Y, Taguchi A, Yakushiji F, Hayashi Y. Effect of N- terminal acylation on the activity of myostatin inhibitory peptides. ChemMedChem. 2016 Apr 19;11(8):845-9. Epub 2016 Mar 8. PMID: 26954624 DOI: 10.1002/cmdc.201500533