測定後の処理と解析(15N標識Cryj7の場合) 1st draft 2021.11.15 last update 2021.11.28 H. Kumeta
0.7 mM ¹5N labeled Cry j 7 (pH 3.0), 6.9 kDa, pI 8.3 AHIDCDKECN RRCSKASAHD RCLKYCGICC EKCNCVPPGT 40 YGNEDSCPCY ANLKNSKGGH KCP 63 800 MHz NMR(migiSJ), Bruker AVANCE NEO, CPTCI (cryogenic probe) 2
1.測定セットa. 211030_N_Cryj7 b. 211110_N_Cryj7 ①測定データの管理2.測定後の処理① TopSpin ② Sparkyフォーマットへの変換3.解析① Sparkyの使い方②主鎖帰属③　側鎖帰属④構造計算
測定後、すぐに制御PCから解析用PCにコピー理学部600はUSB機器（メモリまたはHDD）北キャン800 & 600の制御PCへのUSB接続は禁止データ取り出し用PC（Linux）を経由または Teamviewer測定生データはfidかserファイルpdataの下に、スペクトル化したファイル（1r、2rr、2ri、2ir、2ii、3rrrなど） (スペクトル化したファイルは、特に多次元測定においてサイズが大きくファイル転送には適していない。プロセスパラメータファイルが残っていれば、それらは再現可能なため、これらのファイルは転送時に一時的に消しても構わない。但しNUS測定は除く) ~/NMR  Data/装置名/の下に置く～　データフォルダ名のルール　～スペースや＠など、メタキャラクラーは使わない方が良い。 (a-z,A-Z,0-9,_のみで記述する)できれば、小数点も使わない。pH7.4とは、pH74としておく。
アカデミックパッケージ（無償版）のTopSpinデータブラウザ右クリックから　Add New Data Dir.. ~/NMR_Data/装置名フォルダ　を選択し、追加するData Dir / ExpNo / ProcNo ExpNoは数字のみ。 pdataフォルダなど必須re / repもしくはダブルクリックなどで読み込みリロードについてRemove Selected Data Dir..について3D以上のNUS処理非対応制御PCで処理する
アカデミックパッケージ（無償版）のTopSpin FT（フーリエ変換） efp / xfb / ftnd (tf3 -> tf2 -> tf1)位相補正  .ph (PHC0 / PHC1)ゼロフィル（HN-HSQCのみ。SIを2 ～ 8倍する）切り抜き（STSI / STSR）折り返しがあるときはdirectの1Hの軸のみ。おまけ：Edit Contour Levels（２次元スペクトル上で右クリックから選択） 7
時間関数を周波数関数に変換するFT-NMRでのフーリエ変換は、FID（Free Induction Decay=自由誘導減衰）データをスペクトルデータに変換することを意味する。
実際のFIDは、理想的なcosineカーブでは取得できない9
スペクトルの見た目で補正する（.ph位相補正モード）位相補正値（PHC0やPHC1など）を保存して位相補正モードを終了する（.sret)
FIDの後ろにゼロデータを追加してスペクトルを滑らかにするゼロフィルしたFIDと、そのFT後のスペクトル線幅や中心は変わらないがピークが滑らかになる
HSQCのSIについて、F2を８倍、F1を４倍した
解析に必要な部分だけ切り抜いて、ファイルサイズを縮小する左上のCursor Informationにある値を読み取るcol値＝横折り返し信号がある場合、15Nの軸は切り抜きをしない
TopSpin上でのスペクトルの見た目を綺麗にするLevel Incrementに1.3、Number of levelsに20を入力Fillして、Applyする
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Sparkyパッケージに含まれる変換ツールを使用するExpNoのディレクトリに移動し、 $> bruk2ucsf input_file output_file
bruk2ucsf pdata/1/2rr Nhsqc.ucsf bruk2ucsf pdata/1/3rrr hnca.ucsf 2rr、3rrrの「r」は、real partの略号（iはimaginary part） ucsfは、Sparkyフォーマットのスペクトルデータを示す拡張子。 (開発元の大学名、University of California, San Franciscoから) bruk2ucsfは測定パラメータや処理パラメータを読み込んでいる。 (acqusやprocsなどのファイル) Guiツールもある。（NMRFAM-Sparkyか、Bruk2ucsfGui） Sparkyフォーマットに変換したファイルは、専用の場所に移動する。 ex.) mv *.ucsf ~/Sparky/Data/
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a. 211030_N_Cryj7 (a set) 1: zgpr
hnca.ucsf Nhsqc.ucsf nnoe.ucsf ntoc.ucsf
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https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/ T. D. Goddard and D. G. Kneller, SPARKY 3, University of California, San Francisco NMRFAM-SPARKY Lee W, Tonelli M, Markley JL. Bioinformatics. 2015 Apr 15; 31(8):1325-7.多次元NMR解析でよく使われているソフトウェア

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[1H-15N] HSQC（Nhsqc）で観測された主鎖信号にアミノ酸種＋残基番号をつける1.スペクトルを開いて見た目を調整する2. Nhsqcに通し番号をつける3.名前のルール4.側鎖信号を見分ける5. hncaに帰属をつける6. nnoe/ntoc 7. CA情報とnnoe/ntocを見ながら連鎖の種を作る8.連鎖の種をつないでクラスターを作る9.クラスターをアミノ酸配列に割り当てる10.帰属できた部分の名前を変更する
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3Dスペクトルは、 ov -> /2のみ残し、originalと/1を消す-> xx -> vd -> /2を消すそのあとで、見た目を調整する
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2. Nhsqcに通し番号をつけるZO F8 is Nhsqcの全体を表示find/add peakモードにする全体を囲んでピークピックし、確認するプロジェクトを保存（Cryj7.proj） terminal上でspx_MC_Nhsqc_save.plを使うSparky上でNhsqc_kume.saveを開く既存ピークを全て消去し、Nhsqc_kume.saveからコピーする(pa -> delete、pa -> oc -> op) Nhsqc kume.saveは不要なので閉じる
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3-②.主鎖帰属3.名前のルールGroup
側鎖の原子名はCYANA書式に揃える（別紙参照）
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4.側鎖信号を見分ける負の信号（half dwell測定）折り返し信号であり、ArgまたはHisの側鎖NHの信号今回はすべてArgのNe-Heなので、Arg1-3, NE-HEに変更するTrpのNe1 HNCAで信号が観測されない。Cryj7にTrpは無いので省略Asn / GInの側鎖NH, ーつのNから二つのHが出ているので、横に並ぶNHHとNDHとで、Nの化学シフト値が異なる。 (NDHは、高磁場側に出る) Cryj7は、Asnが5残基、GInがナシ。AsnはND2-HD21,HD22
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5. hncaに帰属をつけるHNCAはH-N-C αの相関信号が得られる3次元スペクトルNhsqcの信号位置に残基内のC αが観測されるカルボニルの先にあるＣαも弱く観測される（１残基前のＣα）仮帰属の名前ルールC αのAtom名はCA残基内は、Group名を同じMC番号とし帰属1残基前は、MC番号-iで帰属どちらかわからないときは、Atom名をCA1、CA2で帰属
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6. nnoe/ntoc
15N-NOESY
HNに空間的に近いプロトンが交差信号として観測されるHNiとHNi+1からはHαiやHβiが同じ位置に観測される
15N-TOCSY
HNと同じ残基内のプロトンが観測されるHNiから、H α iやH β iが観測される全部を帰属しても良いが面倒。見るだけにする。
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7. CA情報とnnoe/ntocを見ながら連鎖の種を作るhncaのvtにてResonance Panels（vR）をオンにする拡大（zi）を繰り返してCA情報をよく見えるようにするMCxCAとMCy-iCAが近い組み合わせを探すHNxとHNyのnnoe/ntocを見て連鎖を確定させるNhsqcの名前を使って連鎖をメモする→スペクトル上ではMCxN-MCyHNが表示される(x-yが連鎖している＝連鎖の種)
8.連鎖の種をつないでクラスターを作るNhsqcのピークリスト（It）を保存しプリントするクラスターを作るx-y、y-zとあれば、x-y-zでクラスター構築
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9.クラスターをアミノ酸配列に割り当てるアミノ酸を構成する13Cの化学シフト値には、特徴がある(別紙参照)クラスターの中でGlyを探す（CAの化学シフト値が40-46） ProはHNがないので観測されないクラスターをアミノ酸配列に割り当てるex.) X - y -  Z (S56-)K57-G58-G59
10.帰属できた部分の名前を変更するrrで一括変換するアミノ酸配列に帰属済みマークを付けるex.)
ex.) K57, G58, G59は主鎖帰属済みS56はまだHNが見つかっていないので未帰属4 0 AHIDCDKECN RRCSKASAHD RCLKYCGICC EKCNCVPPGT 63 YGNEDSCPCY ANLKNSKGGH KCP
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