1.ビタミンＫの変換反応
キノン骨格は２つの酸素原子がカルボニル基としてベンゼン環に結合している，自然界に広く分布する構造である。キノン骨格は動物や植物、菌類に多く認められ，光合成や細胞呼吸などの生物学的に重要な機能を有している. 脂溶性ビタミンであるビタミンKはナフトキノン骨格を基本構造とし，3位に結合する側鎖の違いにより同族体に分類されるり.天然には，緑黄色野菜などの植物に含まれるビタミンK 1 (phylloquinone： PK）や腸内細菌や発酵食品由来のビタミンK 2 (menaquinone：MK-n)が存在し，ヒトが食事から摂取するビタミンKの90％以上はPKである♭. ビタミンKのナフトキノン背格のみを有する合成品であるビタミンK 3 (menadione：MD)は，生体内で抗炎症性，抗腫瘍性，抗マラリア性などを発揮することが認められている².その一方で，MDは両親媒性を有することや分子量が小さいことなどから生体内を自由に拡散し，副作用として細胞毒性をもたらすことが示されていろ3)哺乳類においてMDは，PKが活性型ビタミンKであるMK-4へと変換される際の中間体として生成することが示唆されている41.摂取されたPKは吸収部位である小腸において側鎖が切断され，約5–20％がMDとして遊離されると考えられる4)s）ビタミンKは腸間膜静脈から門脈を経由して，またはリポタンパク質を介してリンパ管経由で吸収されて全身に供給され6 ,各組織に発現するUbiA prenyltransferase domain-containing protein 1 (UBIAD1)によりMK-4へと変換されるり.  PK摂取により生成するMD由来の毒性は，報告されていないため，MK-4に変換されないMDは抱合による解毒代謝されることが考えられる.そこで，MDによる細胞毒性の発生原理および生体内における4種類のMD解毒反応に関してそれぞれ概説する.
2. メナジオン(MD)とQuinone oxidoreductase
MDによる細胞毒性は、MDに対する生体分子のアリール化によるものとレドックスサイクルによる活性酸素種(ROS)の生成に大別される81.  MDのアリール化では，MDは細胞内求核剤と結合し，抗酸化物質である還元型グルタチオンの枯渇やシステイン残基を含むタンパク質の失活を引き起こすことで細胞毒性を誘導する9 10)また，レドックスサイクルにおいて，MDは小胞体に局在するcytochrome P450 reductase (POR)によって1電子還元を受け，semiquinone (SQ)へと変換される101. SQは、その反応性の高さから体内の酸素と反応し、自動酸化される過程でROSのスーパーオキシドを発生させ,細胞毒性を引き起こす").これまでの報告から, MDの愛元反応にはPORの他にNAD (P) H quinone oxidoreductase 1 (NQO1) ,  N-ribosyldihydronicotinamide : quinone reductase 2 (NQO2)の2つが関与する8 (12) 13) NQO1はNAD (P) H,  NQO2はN-ribosyldihydronico- tinamideをそれぞれ補酵素として, MDを2電子還元し, hydroquinone体のmenadiol (MDOH)を生成する8 (図1). Thorらは、MD処理したラット肝細胞において, NQO1阻害剤のdicoumarolを処理するPORによるスーパーオキシド産生が増加し，細胞死が誘導されることを報告した!!!.また, Radjendiraneらによって, NQO1ノックアウトマウスにMDを経口投与すると，血液中のalanine aminotransferase (ALT)濃度が野生型マウスと比較して上昇することが報告され，MDによって肝細胞の細胞死が引き起こされることが明らかとなった¹³）.これらの結果より，NQO1はMDをMDOHへと変換することで細胞を保護する解毒酵素であることが示唆された14)15) NQO1によるMDの解毒の報告に対してNQO2による解毒の報告はされていない。そのため，NQO1またはNQO2, さらにはビタミンK還元酵素であるvitamin K reductase,   ferroptosis suppressor protein-1以外の代謝図1  細胞内におけるMDのレドックスサイクル酵素が関与する可能性が考えられた.ヒトやラットの胆汁や尿中ではMDの抱合体代謝物が検出されていることから，生体内で生成されたMDは第１相代謝に引き続き，第１相代謝において抱合されることにより解毒代謝される可能性が示唆されてい(16)–18) そこで次に，抱合体酵素によるMDの解毒代謝について詳細に説明する.
3.グルクロン酸転移酵素(UGT)によるMDの
抱合反応
ヒトにおける代表的な第I相薬物代謝反応はグルクロン酸抱合である.  MDのグルクロン酸抱合は，UDP- glucuronosyltransferase (UGT)が小腸,肝膜においてUDP-glucuronic acid (UDPGA)を補酵素として，基質であるMDOHにグルクロン酸を転移する反応である.とトUGTには19のアイソフォームがあり，UGT 1A6, 1A7, 1A8, 1A9,および1A10がMDOHのグルクロン酸抱合活性をもつ.その中でも,ヒト肝臓,小腸のミクロソーム画分を用いた検討において，UGT 1A6および1A10はそれぞれ高い活性を示すことが知られており，UGTの発現量は肝臓でもっとも高い191. NishiyamaらはUGTによるMDOHの抱合反応が解毒経路に関与するかヒト胎児腎細胞(HEK293)を用いて検討した201. その結果，野生株と比較しNQO1発現株では有意にROS発生量が増加し細胞生存率が低下したが，NQO1とUGTの共発現株ではMDに対する耐性が示された. また, NQO1活性をdoxycycline (DOX)により抑制した場合には野生株と同様に細胞生存率が低下した.さらに,細胞外培地の代謝物を測定すると，NQO1とUGTの共発現株でのみグルクロン酸抱合体が検出され，経時的に排出量が増加した. Chhourらは，2電子還元酵素であるNQO2とUDP-グルクロン酸転移酵素(UGT1A6)の両方を発現する神経茅腫細胞株を作製し、両酵素の共発現がMD毒性に及ぼす影響を評価した²¹. その結果,  NQO2の過剰発現株は，野生株と比較し，ROSの有意な増加が確認された. 一方,  NQO2およびUGT1A6の共発現株では, UGT1A6およびNQO2それぞれの発現株と比較して, ROSの産生は有意に減少した. このことから,  ROS発生量の増加は，NQO2酵素還元によるMDOHの再酸化に起因することが考えられる.  UGT1A6によるMDの解毒代謝は，NQO2存在下によって促進されることが明らかとなった²¹）.  ChhourらとNishiyamaらによる報告により，解毒経路はNQO1およびNQO2によるMDの2電子還元と，その後に続くUGTによるMDOHのグルクロン酸抱合であることが示唆された. Lositoらは，ラット胆汁において，Hydrochloric Acidとβ-glucuronidaseによる加水分解を受けるグルクロン酸抱合体を検出した16 .また、グルクロン酸抱合体は肝臓から回収された血液中には検出されず、胆汁排泄後の尿中では検出された16 . これらのことから，胆汁排泄を介してグルクロン酸抱合されたMDの一部は腸肝循環に入り，最終的に小腸のリンパ管から吸収され,血液循環に入った後に尿中へ排泄されることで解毒代謝されることが考えられる.ヒトにおける詳細なグルクロン酸抱合体の代謝機構は明らかでないが，脱抱合処理である硫酸・二クロム酸塩化合物処理後のヒト尿中において遊耀型MDが検出されており、実際にMDのグルクロン酸抱合体が尿中排泄されることが示唆されている4)17)
4. 硫酸転移酵素(SULT)によるMDの抱合反応
MDの第II相代謝物としては、グルクロン酸抱合体の他に，硫酸抱合体が挙げられる18). 硫酸抱合は，生体外異物や内因性化合物に対してsulfotransferase (SULT)が,  3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate (PAPS)から水酸基またはアミノ基を含む基質化合物に硫酸基を転移する抱合反応である．硫酸基は通常の細胞条件下では負電荷を帯びており，他の分子からの水素結合を受け入れる酸素原子に富んでいる.これにより硫酸抱合後の分子は水溶性が上がり，疎水性の毒性分子を容易に細胞外あるいは生体外へと排泄する.ヒトには4種類のSULT遺伝子ファミリーに分類される15種類のSULT遺伝子が存在する"'. 薬物, 神経伝達物質，甲状腺ホルモンの水酸基に対しては10種類のSULTIファミリーが，男性ホルモン，女性ホルモンなどのステロイド骨格の水酸基に対しては３種類のSULT2ファミリーが硫酸基を抱合する. また, SULT1およびSULT2ファミリーに含まれないSULT6B1とSULT4A1が存在し，それぞれ硫酸転移酵素活性を持つことが示唆されている．以上のことから， MDはMDOHに還元後，PAPSを補酵素として硫酸抱合されることが示唆されている. Lositoらは, ラット肝臓からの灌流液からarylsulfataseによる分解を受けるMD代謝物の検出を報告しており，硫酸抱合体の存在が示唆されている16）.また,ラット尿中において,硫酸抱合体は経口投与と比較し門脈に投与した場合により多く検出されたため,硫酸抱合の主要組織は肝臓であると思われる16).しかし，尿中排泄された硫酸抱合体量はグルクロン酸抱合体量と比較して少なかったため，ラット肝臓では硫酸抱合よりもグルクロン酸抱合活性が優位であると考えられる. SULT1ファミリーは，ヒト体内において様々な組織に発現している.そのため,ヒトにおいても他の抱合体代謝物と同様に，MDの硫酸抱合体が尿中排泄されることが示唆されている4) 17)
5.グルタチオン転移酵素(GST)によるMDの
抱合反応
肝臓での抱合反応はグルクロン酸抱合，硫酸抱合の他にグルタチオン抱合がある²³)-²³).  MDのグルタチオン抱合はglutathione S-transferase (GST)により，還元型グルタチオン(Glutathione, GSH)が転移される反応である。GSHはグリシン・システイン・グルタミン酸からなるトリペプチドであり，システイン残基におけるチオール部位が求核性を有する.そのため,チオール部位にMDなどの親電子性物質を結合する抱合反応の他，過酸化物やROSなどを消去することで酸化ストレスから細胞を保護する役割を担う.  GSHはROSを湿元すると，自らは酸化され酸化型グルタチオン(Glutathione-S-S-Glutathione, GSSG)となる9124). Loughlinらはラット肝細胞において，MD添加濃度依存的にグルタチオン抱合体量が増加することを示した²⁴ . また，細胞内のMDが増加するとGSSGよりもグルタチオン抱合体が優先的に生成され，GSTがMDの解毒代謝を担う可能性が示唆された.  MDのグルタチオン抱合体はラット血中で報告されている一方で、尿中での報告はされていない. また,  Haenenらはグルタチオン抱合体が尿細管上皮細胞の刷子縁膜を通過せず，細胞内に取り込まれないことを報告している26).これらのことから、グルタチオン抱合体は血中から尿細管へ取り込まれる際に代謝反応を受ける可能性が考えられた. Redegeldらは，腎臓におけるグルタチオン抱合体代謝経路を調べるため，ラット腎臓の灌流実験を行ったﾌﾌﾌその結果，グルタチオン抱合体を灌流液に添加すると腎臓から急速に消失した.一方,細胞膜の外側に存在しGSHをグリシン・システインとグルタミン酸に加水分解するγ-glutamyl cysteine transpeptidase (γ-GT)の阻害剤であるacivicinを灌流液に添加したところ，グルタチオン抱合体のクリアランス(除去速度)が低下した．また，近位尿細管細胞の側底部吸収経路を阻害し，腎臓からの排出を抑制するprobenecidをacivicinとともに加えることで，抱合体のクリアランスはさらに低下した.これらの結果より，腎臓におけるグルタチオン抱合体の代謝は，側底膜におけるprobenecid感受性のorganic anion transporter (OAT)を介した取り込みと，刷子縁膜に発現するγ-GTによる代謝が重要であることが明らかとなった.
6.  N-アセチル転移酵素(NAT)によるMDの
抱合反応
主に肝臓で合成されたグルタチオン抱合体は血中では検出される一方で尿中では検出されず，ラット尿中にはN-アセチルシステイン抱合体(メルカプツール酸)が検出される²81291.  N-アセチルシステイン抱合体は,グルタチオン抱合体がγ-GT, dipeptidase, N-acetyl transferase (NAT)により順番に変換反応を受け生成した代謝物であり,一般的に尿中に排泄される.  Lositoらは,ラット尿中においてβ-glucuronidase,  arylsulfataseのいずれの処理においても分解されない代謝物を報告しており，これらは加水分解処理により分解されないMDのN-アセチルシステイン抱合体である可能性が示唆された17) Michelettiらは、N-アセチルシステイン抱合体が、初代皮膚繊維芽細胞のHDFaと比較して,  HeLa,  SH- SY5Y, SaOS2, U2OS,などの悪性細胞株に対して細胞毒性を示すことを報告している301.また, Katikireddyらは，N-アセチルシステイン抱合体を添加した正常な不死化角膜内皮細胞(HCEnC-21T)では、MDのみを添加した細胞と比較して，細胞死や細胞内ROS産生の有意な減少を報告している³♭. これらの報告は，不明瞭であった生体内におけるN-アセチルシステイン抱合体の生理作用を示唆する結果と言える.
7.おわりに
反応によることが明らかとなった.小腸において遊耀したMDはその大部分がグルクロン酸抱合を受け、毛細リンパ管から胸管へと入り全身へ移行すると考えられる161.また，小腸で抱合されなかったMDや硫酸抱合体の一部は門脈へ入り、肝臓で硫酸抱合またはグルタチオン抱合を受ける²². その後下大静脈から心臓へと入り全身へ移行し、一部は胆汁中へ排泄される。肝臓、腎臓で毒性を示すグルタチオン抱合体は生成後に変換反応を受けN-アセチルシステイン抱合体となり硫酸抱合体，グルクロン酸抱合体と共に尿中へ排出される(図2). Thijssenらは，ヒトにおいて，PK，MK-4の経口摂取後，硫酸・二クロム酸塩化合物処理により遊離する尿中のMD排泄量が大幅に増加することを報告している♭.この効果は摂取後１～２時間以内に増加し，約３時間でビークに達した. 尿中硫酸抱合体とグルクロン酸抱合体の排泄量がビタミンK摂取量を反映する可能性が示唆された16 . また,  Shearerらは, ヒトにおいて尿中のMD排泄量と血中のPK量が同様の挙動を示すことから，MD抱合体排泄量は体内ビタミンK量を反映する指標となる可能性が示唆された41321今後，MD抱合体排泄量と体内ビタミンK量との関ビタミンK中間体であるMDの解毒代謝は主に抱合GST     : glutathione S-transferase UGT  : glucuronosyltransferase図2  予想されるMDの抱合代謝連が明らかになることで，ビタミンK摂取から排泄までの代謝機構のさらなる解明につながることが期待される. Key words :Vitamin K, menadione, toxicity, conjugate, metabolism ' Systems Engineering and Science, Graduate School of Engineering and Science, Shibaura Institute of Technology, Japan ² College of Systems Engineering and Science, Department of Bioscience and Engineering, Shibaura Institute of Technology, Japan ³ Department of Urology, Jichi Medical University Saitama Medical Center, Japan 4 Extension Center, Kobe Pharmaceutical University, Japan 5 Faculty of Engineering, Department of Biotechnology, Toyama Prefectural University, Japan Shintaro Tagami 1 , Satoshi Asano 1 , Kurumi Nakagawa 2 , Ryo Tomioka², Kohei Murata¹, Masashi Oshima¹,³, Maya Kamao 4 , Miyu Nishikawa 5 , Shinichi Ikushiro 5 , Yoshihisa Hirota¹,² '芝浦工業大学大学院理工学研究科システム理工学専攻創薬科学研究システム理工学部²芝浦工業大学生命科学科創薬科学研究³自治医科大学附属さいたま医療センター泌尿器科エクステンションセンター 4神戸薬科大学　薬学部生物工学科²宮山県立大学工学部公志¹ ,中川胡桃²,晋太朗¹，浅野田上房平',大島将¹,³,鎌尾宮岡京²,村田まや4住久¹,²西川美字', 生城真一5, 廣田(2023.7.28受付) 1) Shearer MJ, (1995) Vitamin K. 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