1.はじめに
三重大学に異動して6年が経ち，研究室にも授業にも慣れて参りました。天然由来環状ペプチドの生物有機化学研究を続けるのと並行して，３年ほど前から標題の研究を行っております。未だ荒削りで実用化には程遠い状況ですが,思い切って本ニュースレターにて紹介させて頂きます。
2.薬になる中分子環状ペプチドの特徴と探索法
創薬モダリティとして中分子環状ペプチドが注目されていることは，本ニュースレターの読者には広く知られていることと思います。環状ペプチドは，アミノ酸残基の組み合わせにより無数の種類が存在し，その置換基が環状構造により三次元的に配置されることで，標的分子と特異的に結合します。分子量500 ～ 2000程度の中分子環状ペプチドは，タンパク質表面に結合するのに充分な大きさがあるので，これまで標的にできなかったタンパク質を狙えることが期待されています。また、中分子環状ペプチドの中には、分子サイズが大きいにもかかわらず，受動拡散により細胞膜を透過できるものがあります。その要因の一つとして，アミド結合のNHとC=Oが形成する水茶結合様式の切り替えが指摘されています。即ち，水環境中では水分子と分子間水素結合を形成して溶解し，細胞膜中では分子内水素結合により親水性官能基を内側に向けて膜をくぐり抜けるモデルが提唱されています¹（図1)。受動拡散により膜透過できる中分子環状ペプチド医薬は、細胞内タンパク質を標的とすることや，消化管吸収による経口投与が可能なことが期待でかます。
外ペプチドは，アミノ酸の縮合の繰り返しにより並行合成できることから，化合物ライブラリーを構築することにより活性化合物を探索できます。標的分子と特異的に結合する中分子環状ペプチドの探索法として,固定化ビーズ法,ファージディスプレイ法, mRNAディスプレイ法などが実用化されています。一方で,細胞膜透過性や経口吸収性が高い中分子環状ペプチドの探索はあまり進んでいません。その原因の一つとして，選別した環状ペプチドの同定に用いるタグ部分が，化合物の物性に大きく影響することが考えられます。つまり，タグ部分のサイズが大きかったり，親水性が高かったりすると，分子全体の性質が変わってしまうため、環状ペプチドの膜透過性を正確に評価できなくなるということです。細胞膜透過性および経口吸収性が高い環状ペプチドを探索するには、タグを用いない新規探索法を確立する必要があると考えました。
3.天然物探索の経験からヒントを得た「受動拡散に
より膜透過する中分子環状ペプチドの探索法」
話は変わりますが，三重大学に異動してから天然物の探索研究も行っており，いくつかの生物活性化合物（既知化合物ですが）を単離・構造決定しました。自分で実験を行った感想が二つあります。一つ目は，生物活性化合物を単離する作業も大変ですが，生物活性図１　水素結合様式を切り替えながら脱透過する環状ペプチド（参考文献１より一部改変） 1に関係がないものを取り除く作業も大変だということです。特に，水溶性が高い化合物は有機溶媒で抽出できないため，塩類を除けず挫折しました。そこで，生物活性に関係がない成分を最初から含まない材料を用意すれば，単離操作が楽になると思いました。二つ目の感想は，単離した化合物が全く未知だと構造解析が大変ですが，構造の目星が付けば意外と何とかなるということです。特に，既知化合物は分析データの一致により同定することができ，標品を用意して比較すれば確実です。以上の経験から，アミノ酸残基の種類や数をあらかじめ決めた環状ペプチドライブラリー（つまり、既知化合物のライブラリー）を作れば、タグを用いなくてもヒット化合物を同定できると考えました。もし，分析データの一致に不安があれば，その構造の環状ペプチド標品を合成して，確認できます。以上を踏まえて，タグを用いずに膜透過性環状ペプチドを探索する方法を考案しました（図 2)。即ち，(1)タグがない環状ペプチドライプラリーを化学合成し、(2)膜透過性を指標として選別した後，(3) LC-MS/MSを用いて同定する方法，です。この際，(3)での同定を容易にするために， (1)で合成する環状ペプチドのアミノ酸配列をあらかじめ設計することがポイントとなります。このような研究の前例がないか調べたところ，膜透過性環状ペプチド研究の第一人者であるLokey先生のグループが，split and pool法により96個の環状ペプチド混合物を含むライプラリーを構築し，各化合物の膜透過性を網羅的に解析する研究を行っていました²。最近，東京大学の山東先生・森本先生のグループは，128個の環状ペプチド混合物を含むライプラリーの構築・分析を報告しています³。「良いアイデアを思い付いた！」と思っても，誰かに先を越されていることがよくあります。しかし，同様のアイデアでも自分のやり方で研究を進めていけば、異なる終着点に辿り着くだろうと思い，研究を立ち上げることにしました。
4.環状ヘキサペプチドPF1171Fを用いた探索法の
試行
まず，適当な環状ペプチドを対象として本探索法(図2)を試行し，課題を洗い出すことにしました。最初に試行する対象化合物は，ライプラリーの構築が容易で，膜透過性類緑体が必ずヒットするものがよいと考え，私が以前から研究しているPF1171Fを選択しました。PF1171Fは，子嚢菌OK-128株が生産する環状ヘキサペプチド（Mw: 689）であり，カイコ幼虫に対して経口投与で麻痺を引き起こします*。私はこれまでに，PF1171Fの固相法を用いた全合成を達成しており⁵，これまでに30種類以上の類緑体を合成しています56。さらに，PF1171Fの膜透過性が高いこと，その膜透過性が麻痺活性および経口吸収性に関わっていることを明らかにしています。従って，膜透過性が高い類緑体を発見したときに，カイコを用いて麻痺活性および経口吸収性との関連を迅速に調べることができます。ライプラリーに含まれる類緑体数は100個程度として，探索法の実態を綿密に分析したいと考えました。以上のことを踏まえて，図３に示す探索実験を計画・実行しました。3カ所のアミノ酸残基において5種類のFmocアミノ酸の等量混合物をそれぞれ縮合することにより、～125種類の類緑体ライブラリーを構築しました（図3A）。これを人工膜透過性試験(PAMPA)に供し（図3B)，膜透過後の溶液に含まれる類緑体を化学反応により鎖状化した後（図3C), LC-MS/MSを用いて分離しながら配列を解析しました（図3D）。本稿では結果の詳細を示しませんが，膜透過後の溶液からPF1171Fを含む複数の類縁体が検出され，そのいくつかのアミノ酸配列を決定することに成功しました（図3Dは一例です）。しかしながら，この試行を通して多くの問題が露呈しました。まず，５種類のFmocアミノ酸（Ala，Ile， Gly, Phe, Val)の等量混合物を縮合させると, IleやValを複数含む類縁体の収率が非常に低いことが判明しました。その原因として，縮合や環化反応におけるValやIleの立体障害が考えられます。縮合に用いるFmoc-Ile-OHとFmoc-Val-OHの比率を増やすなどの条件検討を行いましたが、あまり改善していません。ちなみに，改変する３カ所にIle，Val，Valを有する類緑体3種を単一化合物として合成すると，いずれも良い収率で得られました。一般的に，有機合成は単一の化合物を高純度・高収率で合成することを目的としていますが、本研究のように複数の化合物を均等に合成するとなると勝手が違うようです。アミノ酸の種類により縮合収率が異なる問題は，split and pool法によるライプラリーの構築²,3では起きにくいので,導入を検討しています。もう一つの大きな問題は，鎖状体のLC-MS/MS解析が難しいことです。125種類ならばLCである程度分離できると予想していましたが，鎖状体のLCビークはプロードで互いに重なりました。その結果, MS/MSスペクトルが複雑になり，解析が困難でした。環状体の方がLCでの分離がよいですが，環状体のMS/MSフラグメントは複雑であり，配列解析が困難になります（図3C）。この問題について，Lokey先生のグループは解決法を提案しており，環化体のMS/MSフラグメントのパターンから構造を予測する方法を報告しています7。あるいは，分子量が同じに図3ならないように化合物ライプラリーを構築²³すればよいのかもしれません。現在，膜透過性類縁体の選別に用いているPAMPAは，溶媒としてリン酸緩衝液を用いており，余計な夾雑物が混じってこないので，分析が簡単です。今後，より生体に近い探索系（例えば，Caco-2細胞を用いた腸管吸収モデル）への移行や，膜透過した上で標的分子に結合する環状ペプチドの探索を計画していますが，生体分子と区別するのに工夫する必要があります。例えば，ペプチドの側鎖にアルキンを入れておいて，後でクリック反応を用いて検出するようなケミカルバイオロジー的手法8と組み合わせることを考えています。
5.おわりに
以上のように，化合物100個程度のライプラリーで顔いている状況ですが，ペプチド化学を生かしたアイデアを考え，コツコツ続けて参ります。最後になりましたが，本ニュースレターへの寄稿の機会を与えて頂いた九州大学の巣山慶太郎先生に厚く御礼申し上げます。また，本稿で紹介した実験を担当した三重大学大学院生物資源学研究科の井上雄介君に心から感謝致します。 1.   Rezai, T.; Yu, B.; Millhauser, G. L.; Jacobson, M. P.; Lokey, R. S. J Am Chem Soc 2006, 128, 2510–2511. 2.   Hewitt, W. M.; Leung, S. S.; Pye, C. R.; Pon- key, A. R.; Bednarek, M.; Jacobson, M. P.; Lokey, R. S. J Am Chem Soc 2015, 137, 715–721. Hosono, Y.; Morimoto, J.; Sando, S. Org 3. Biomol Chem 2021, 19, 10326–10331. Kuo, Y. H.; Kai, K.; Akiyama, K.; Hayashi, H. 4. 6. Tetrahedron Lett 2012, 53, 429–431. Masuda, Y.; Tanaka, R.; Kai, K.; Ganesan, A.; 5. Doi, T. J Org Chem 2014, 79, 7844–7853. Masuda, Y.; Tanaka, R.; Ganesan, A.; Doi, T. J Org Chem 2017, 82, 11447–11463. 7. Townsend, C.; Furukawa, A.; Schwochert, J.; Pye, C. R.; Edmondson, Q.; Lokey, R. S. Bioorg Med Chem 2018, 26, 1232–1238. Morimoto, J.; Amano, R.; Ono, T.; Sando, S. 8. Org Biomol Chem 2019, 17, 2887–2891.ますだゆういち三重大学大学院生物資源学研究科創薬化学研究室masuda@bio.mie-u.ac.jp https://www.cc.mie-u.ac.jp/~masuda/九州大学・巣山慶太郎先生がらペプチドニュースレター寄稿のお話をいただき，この度本稿を執筆させていただくことになりました。このような貴重な機会をいただきましたことを，厚く御礼申し上げます。「ペプチドと生体膜」とい岩崎崇うテーマに関連した研究ということで，本稿では，当研究室にてこれまでに進めてまいりました「細胞膜透過ペプチド：ポリヒスチジンペプチドを利用したリソソームリソソームは，生体分子を消化・再利用し，細胞の恒常性を維持するために不可欠なオルガネラです¹。約60種類のリソソーム酵素が，ペプチド，核酸，炭水化物，脂質などの高分子の加水分解に関与しています²。一方で，リソソーム酵茶をコードする遺伝子の変異は，リソソーム病（Lysosomal storage disease, LSD）と呼ばれるヒト遺伝性疾患の原因になることが知られています。LSDは、特定のリソソーム酵素の欠損によって引き起こされる代謝異常であり，様々な神経変性疾患，心血管老化関連疾患，および癌と関連しています3,4現在のLSDに対する治療法として，リソソーム中で欠損している酵素を，組換え酵素として細胞外部から補充する「酵素補充療法（Enzyme replacement therapy,  ERT)」が主流となっています5,6。ERTに使用される組換えリソソーム酵素は，リソソーム内へ輸送するために，高密度のマンノース-6-リン酸(M6P)で修飾される必要があります。M6P修飾されたリソソーム酵素は，細胞表面のM6P受容体に結合し，後期エンドソームを介して細胞内リソソームへと輸送されることが知られています8。このように，従来のERTでは，組換えリソソーム酵茶のM6P修飾が必須条件であるのですが，残念ながらM6P修飾リソソーム酵茶の効率的な発現系は，一部のリソソーム酵茶についてしか存在していません。そのため，現在50種類以上のリソソーム酵素が同数のLSDと関連していることが知られている一方で，米国食品医薬品局FDAで承認されているERT用の組換えリソソーム酵茶はわずか9種類（12葉剤）に限定されています910。そこで我々は，上記の問題を解決するために，細胞膜透過ペプチド(Cell-penetrating peptide, CPP）を用いたM6P修飾非依存的なERTの開発を目指しました。我々はこれまでに，新規CPPとしてポリヒスチジンペプチド：H16ペプチド(HHHHHHHHHHHHH-NH₂)を報告しております。このH16ペプチドは，従来のアルギニン・リジンリッチな配列からなるCPPとは異なり，ヒスチジン残基のみから構成されるCPPですが，従来のCPPよりも細胞膜透過効率が高く，また血清中でも安定であることが明らかになっています¹¹。さらに,このH16ペプチドは，細胞膜透過した後にリソソームに効率的に集積するという特徴も有しています。これらの特徴から，H16ペプチドは細胞内リソソームを標的としたDDSキャリアーとして有力であるとともに，M6P修飾非依存的なERTを実現するためのリソソーム酵茶キャリアーとして期待できます。本研究では，このH16ペプチドを用いた簡便な（M6P修飾非依存的な）ERTを開発しましたので，以下に紹介させていただきます。我々は，リソソーム酵素を簡便に細胞内への導入し，リソソームに集積させることを目指し，リソソーム標的型DDSキャリアーであるH16ペプチドをリソソーム酵素に対して簡便に修飾する方法を考案しました。具体的には，リソソーム酵茶の大部分が酸性タンパク質であること（表1）に着目し，H16ペプチドをリソソーム酵素に静電相互作用により容易に結合させる方法を開発しました。正電荷を帯びたポリリジン配列（K10）と細胞膜透過能およびリソソーム集積能を有するポリヒスチジン配列（H16）を連続させたK10GH16ペプチド(KKKKKKKKGHを設計し，混合するだけで酸性リソソーム酵素と結合する方法を考案しました（図1)。本手法では，M6P修飾されていない酸性リソソーム酵茶に対しても簡単にH16ペプチドを結合させることができるため，広範囲の酸性リソソーム酵素をM6P修飾非依存的にリソソームへ輸送することが可能であると考えられます。実際に，我々は酸性リソソーム酵茶の一種であるα-galactosidase A (GLA)をモデル酵素として使用し，GLAとK10GH16ペプチドと混合するだけで， M6P修飾非依存的な細胞膜透過・リソソーム導入を実証しています¹²。具体的には，LSDの一種であるGLA欠損細胞に対してGLA-K10GH16ペプチド複合体を細胞外から投与することで，GLA欠損細胞内のリソソームにGLAを輸送できること，さらにGLA欠損細胞の表現型（正常細胞よりも遅い細胞増殖）を回復させることに成功しています。これらの結果は， K10GH16ペプチドがLSD細胞のリソソーム酵素の不足を補うことを示唆するとともに，K10GH16ペプチドは、M6P修飾非依存的（すなわち簡便な）ERT用のDDSキャリアーとして有用であることを示しています。前述の通り，我々はK10GH16ペプチドを利用したM6P修飾非依存的なERTを開発しました。しかしこの手法は，一度に多数のリソソーム酵素を輸送するには不向きであるという問題点も有していました。そこで次に我々は，一度に多数のリソソーム酵素を輸送できる手法を開発するべく，H16ペプチドを修飾したリポソームをキャリアーとしたERTの開発を目指しました。この手法では，M6P修飾されていないリソソーム酵素であるGLAを内包したリポソーム{Liposome (GLA)}を調製し，さらにN末端にステアリル基(CH 3 (CH 2 ) 16 CO-）を導入したH16ペプチド（Stearl-H16ペプチド）をリポソーム表面に修飾することで，H16ペプチド修飾したGLA内包リポソーム{H16-Liposome (GLA)}を調製しました。このH16-Liposome (GLA)は，GLA欠損細胞に対して細胞膜透過を示し，GLA欠損細胞内のリソソームに集積することが確認されました。さらに, H16-Liposome (GLA)はGLA欠損細胞の低下した細胞増殖を回復させる効果も示しました。この結果から、リソソーム酵素を内包したH16-Liposomeは, LSD細胞のリソソーム酵素の不足を補うことが可能であることが示唆されました。特に，M6P修飾されていないリソソーム酵茶であっても，H16-Liposomeに内包することでLSD細胞のリソソームへ輸送できることから，H16-LiposomeはK10GH16ペプチドと同様にM6P修飾非依存的なERT用DDSキャリアーとして利用可能であることが示されました。さらに表1　リソソーム病に関連する代表的なリソソーム酵素群。Ipはリソソーム酵素の等電点（Isoelectric point）を示す。
改1 (A) K10GH16ペプチドを利用したリソソーム標的型DDSのスキーム。(B) FITC-GLA（1 μM）と混合したK10GH16ペプチド（1 ～ 30 μ M）のGLA欠損細胞における細胞内取り込み。FITC-GLA-K10GH16ペプチド複合体の細胞内取り込みはフローサイトメーターにて定量した。(C) FITC-GLA（1 μ M）とK10GH16ペプチド（30 μ M）の複合体のGLA欠損細胞内の分布。白色スポットは，FITC-GLAと細胞内リソソームの共局在を示す。破線は細胞膜の輪郭を示す。（D）GLA欠損細胞に対するGLA-K10GH16ペプチド複合体のERT効果。GLA（1 μ M）単独，またはGLA（1 μ M）とK10GH16ペプチド（30 μ M）の複合体存在下でGLA欠損細胞を72時間培養し，Cell Counting Kit-8を用いて細胞増殖率を定量した。NTは未処理区を示す。データは平均値±S.D.を表す。異なる文字は有意差を示す（ｐ < 0.05, Turkey's test)。文献12を改変して掲載。 H16-Liposomeを利用した本手法は，一度に多量のリソソーム酵素を補充できるERTの基盤技術になり得ると期待されます13。ここまでに，我々はK10GH16ペプチドやH16ペプチド修飾リポソームを利用したM6P修飾非依存的なリソソーム酵素のDDSを開発してきました。しかしながら，これらの手法は組換えリソソーム酵素を利用するという共通点を有しているため，組換えタンパク質として入手可能なリソソーム酵素以外には利用できないといった問題点がありました。前述のように，リソソーム病に関与しているリソソーム酵茶は50種類以上存在していますが，M6P修飾の有無にかかわらず，組換え酵素として入手可能なリソソーム酵素はごく一部に限られています。すなわち, K10GH16ペプチドやH16ペプチド修飾リポソームを利用したERTでも同様に，輸送可能なリソソーム酵素が限定されるといった問題点が存在していまし図2 test)。文献13を改変して掲載。図3て抱戦。図４　H16ペプチドを利用したLSD細胞に対するM6P非依存的な酵素補充療法（ERT）またはオルガネラ補充療法（ORT）の概略図た。そこで，これらの問題点を克服し，組換え酵素として存在しないリソソーム酵素も輸送可能なERTを開発するために，我々はリソソームそのものを丸ごと，LSD細胞内へ導入する手法を考案しました。 LSD細胞内ヘリソソーム酵素を輸送する手法は酵素補充療法（Enzyme replacement therapy，ERT）と呼ばれていますので，我々はリソソームそのものを丸ごとLSD細胞内へ輸送する手法をオルガネラ補充療法（Organelle replacement therapy，ORT）と（勝手に）命名し，その開発を試みました。原理としては非常にシンプルでありまして、前述のリポソームの代わりに，ヒト正常細胞から単離した正常なリソソーム（リソソーム酵素を全て保有しているリソソーム）にStearl-H16ペプチドを修飾したH16ペプチド修飾リソソーム（H16-Lysosome）を調製して，LSD細胞内へ導入するというものです。前述のリポソームは粒径が約100nmのものを使用していたのに対して，単離リソソームは粒径が約500 ～ 1,000 nmになりますので，サイズ的にH16ペプチドを使ってリソソームを丸ごと細胞内へ導入できるのか？という心配はありましたが，結果的にはまったく問題なく， H16-LysosomeはLSD細胞内に取り込まれ，最終的にLSD細胞の細胞増殖率を回復させるに至りました。これらの結果から，H16ペプチドはかなり大きな物質(この場合は粒径約500 ～ 1,000 nmのリソソーム)も細胞内へ輸送可能であることが示唆されました。また，H16-Lysosomeを利用したオルガネラ補充療法(ORT)という概念を実証することができたと言えます。このH16-Lysosomeを利用することで，多種・多量のリソソーム酵素を一度に細胞内へ補充することが可能になりますので，現在は治療法（ERT）が確立されていないLSDや，複数のリソソーム酵茶の欠損に起因しているLSDなど，幅広いLSDに対応できる汎用的な治療基盤技術が確立できたと考えています¹。今後は，リソソーム以外のオルガネラにもH16ペプチドを修飾して細胞内輸送することも考えておりますが，それはまた別の機会にご紹介できればと思います。以上の研究より，我々の研究室ではK10GH16ペプチド，H16ペプチド修飾リポソーム，H16ペプチド修飾リソソームといった様々な方法を駆使して，LSD細胞内ヘリソソーム酵茶またはリソソームを丸ごと輸送する酵素補充療法（ERT）またはオルガネラ補充療法（ORT）を開発してきました（図4)。これらの手法は，リソソーム酵素のM6P修飾非依存的にLSD細胞の増殖率を回復させることができましたので，従来のLSD治療法の問題点，すなわちM6P修飾リソソーム酵素に依存したERTを改善することができると考えております。現在はまだin vitro実験による概念実証の段階に過ぎませんが，今後はLSDモデル生物を利用したin vivo実験により，さらに実証データを積み重ねていく所存です。本研究は，JSPS科研費（15K18689），野口研究所，加藤記念バイオサイエンス振興財団のご支援を受けて実施しました。この場を借りて御礼申し上げます。また最後になりましたが，本稿執筆の機会を賜りましたペプチドニュースレター編集委員の先生方に厚く御礼申し上げます。 1. 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Molecules 2019, 24, 2995.いわさきたかし14.鳥取大学農学部生体制御化学分野itaka@tottori-u.ac.jp http://muses.muses.tottori-u.ac.jp/faculty/itaka/横浜国立大学大学院工学研究院の川村出と申します。この度は，九州大学の巣山先生から本ペプチドニュースレターの“ペプチドと生体膜”をテーマとした企画へ執筆のご依頼をいただき，大変光栄に存じます。巣山先生や編集委員の先川村出生方に心より御礼申し上げます。私は生体系固体NMR法を駆使した膜タンパク質・膜結合ペプチド・自己組織化ペプチドの構造解析に取り組んでおります。天然においてこれまでに数多くの抗菌性ペプチドが発見され，その立体構造と機能の関係性は抗菌メカニズムの理解とともに，その様な情報は活性の向上を目的としたペプチドのde novoデザインにつながるものであります。本記事では筆者が行ったDアミノ酸含有抗菌ペプチドやナノポアペプチドの構造解析についてご紹介いたします。カエルは自らの皮膚の皮膚線から抗菌ペプチドを含む粘液を分泌させ，化学的な生体防御システムとして利用している¹。ペプチドの産生においては，mRNAから目的ペプチドコード領域を含む前駆体タンパク質が翻訳され，プロセシングと翻訳後修飾ののちに抗菌ペプチドが産生される¹,²。主な翻訳後修飾としてはペプチドの構造安定性に寄与するC末端のアミド化やジスルフィド結合の形成であるが.さらに別な翻訳後修飾として，ペプチド中の特定のアミノ酸残基におけるL体−D体の転移反応がある。この反応はL/D-ペプチジルイソメラーゼによって，基質となるペプチド中のある残基のCα炭茶のプロトンを引き抜き，逆側から新たなプロトンが付与され，その残基のみがD体へ立体転移する³。キバラスズガエル（Bombina variegata）由来の20残基の抗菌ペプチドであるボンビニンH2とH4の生成にもこの反応が関与し，ボンビニンH2の2残基目のL体イソロイシンがD体のアロイソロイシンに変換されることでボンビニンH4となる（ボンビニンH2とH4はジアステレオマーの関係)。一次構造は次の通りである。 Ile-( L -Ile)-Gly-Pro-Val-Leu-Gly-Leu-Val-Gly-Ser- Ala-Leu-Gly-Leu-Leu-Lys-Lys-Ile-NH2 Bombinin H4: Ile-( D-allo-Ile)-Gly-Pro-Val-Leu-Gly-Leu-Val-Gly- Ser-Ala-Leu-Gly-Leu-Leu-Lys-Lys-Ile-NH 2このペプチドは抗リーシュマニア原虫活性を有し，特にD-allo-Ileを有するボンビニンH4はH2より数倍強い活性を示すとともに細胞膜への相互作用が報告されている4,5。そこで，我々は反応場である細胞膜中におけるペプチドのD-allo-Ile2の役割に注目するとともに，マイクロ波アシスト固相ペプチド合成法により化学的にポンビニンH2とH4を合成し，細胞膜との相互作用の解析に利用した6。この際，キラルカラム(CROWNPAK CR-I)を用いても良好なジアステレオマー分離が可能であることも示した7。ペプチドと細胞膜との相互作用を調べるために，リーシュマニア原虫模倣膜リポソームを調製した。その細胞膜の脂賀構成比はホスファチジルエタノールアミン(PE) :ホスファチジルコリン（PC）：ホスファチジルイノシトール（PI）：ホスファチジルセリン（PS）：エルゴステロール（ERG）= 4 : 4 : 2 : 1 : 6としてある4 。 31p NMR測定によって，ペプチド濃度が高い場合(ペプチド:脂質のモル比> 1 : 200以上）に，0 ppm付近に膜小断片を示唆する信号が観測され，ペプチド同士が会合して膜分断が進行することが示唆された(図1)。また，同濃度で黄色プドウ球菌模倣膜と作用させたところ，膜分断活性を示さなかったことから，ボンビニンはリーシュマニア膜に対して特異的な相互作用を示すものと考えている。しかしながら，H2とH4の³¹P NMRスペクトルパターンには大きな違いはみられず，この測定からは活性の強度に差異は見られなかった。続いてN端のコンフォーメーションを比較する目的で振動円偏光二色性分光（vibrational circular dichroism：VCD）を適用し，VCD/IRスペクトルを観測した。この解析によって示されたモデルによれば，ポンビニンH4のN末端側のIle1とD-allo-Ile2の側鎖の関係は主鎖骨格に対してシス型が安定であり、H2はトランス型が安定であった。これは両親媒性の抗菌ペプチドが水–細胞膜界面を経て，脂質二分子膜内の疎水的な環境で働くことを想定すると，ペプチド中の特定アミノ酸残基がD体に置換されることで，その残基の周囲との相互作用によって局所的に疎水的な領域が変化するため，細胞膜とペプチドとの相互作用に変化をもたらすことが期待される。そのため次に分子動力学（MD）シミュレーションにより，ペプチドとリン脂質との相互作用を調査した。ペプチドの初期状態を水溶液中や膜質通状態などに設定し，H2とH4の各シミュレーションを行った。このうち，水溶液中に存在していたペプチドが細胞膜表面と相互作用する際に，H2とH4の吸着挙動に差が見られた。具体的には，H4のN末端側が細胞膜表面に相互作用する際に，Ile1とD-allo-Ile2の側鎖のコンフォメーションはgauche(-)とgauche(-)をとり，Ileのsec-プチル基同士がコンタクトすることで疎水的なアンカーを作り出し，細胞膜中に比較的容易に侵入していくことが見られた（図2)。一方で，H2はシミュレーション期間中(1000 ns)，二つの側鎖の関係がほぼトランス型で存在し，強力な疎水性のアンカーは形成できないことが判明した。これはVCDの結果とも一致しており，ポンビニンの膜結合の分子レベルでのようすを示した初めての報告となった。これらの研究から，2残基目にD体のアミノ酸を配置することによって，N末端の柔軟な構造も助けとなり，前後のアミノ酸側鎖とコンタクトが許され，細胞膜との特異的な相互作用が生じていることが示唆された。この様なN端に疎水性アミノ酸の連続かつ2残基目がD体であるペプチドはいくつか報告されており，抗菌活性との関連は興味深い²。ペプチドの膜攪乱能を評価するために，微細加工技術を利用したマイクロデバイス中に人工の細胞膜を固定化し，そこに抗菌ペプチドを添加してペプチドどうしが会合して細胞膜に孔のような欠損を与えた場合に生じる阻害電流のパターンを計測する。その結果，H2は長い時間をかけてナノサイズの孔を形成するのに対して，H4はそれより早く孔を形成することを観測した。さらに天然ではH2とH4が共存していることが想定されるため，H2とH4を混合させたところ，中間的な機能を示したため， 2種類のペプチドが共同で孔を形成して働いていることを示した。ナノポアは膜タンパク質が生体膜中に形成するナノ細孔であり，このポアを通過する一分子を電気的に検出するナノポアセンシング法が急速に発達している。この方法においては検出対象の分子の大きさや形状によって適切なナノポアを用いる必要がある。これまでに人工設計されたタンパク質やペプチドによるナノポアの構築例10はあるものの，一分子検出に適したサイズのナノポアを作ることは課題であった。このような背景のもと，農工大川野竜司教授を中心に，甲南大臼井健二准教授との共同研究により、ナノポアを形成するペプチドSV28の設計と一分子計測を達成した11。膜中で安定なβストランドを形成する様に1次構造を適切に設計したSV28ペプチドは分子動力学シミュレーションによる解析において，脂質膜中で自発的に会合しベータバレル型のナノポアを形成することを示した。さらに固体NMR測定によって，DOPCリポソームにおけるSV28の[ 13 C] Val10,   [ 13 C] Gly16,および[15N] Val22のNMRシグナルを観測し、それらの化学シフト値はβシートの二次構造に対応しました。加えて，原子間距離測定REDOR法を使用して， SV28のVal10のカルボニル炭素とVal22のアミド窒茶の間の原子間距離を約4.4 Åと推定し，βストランド間の水茶結合の形成を示した（図3)。これにより,膜中でβヘアピン構造が形成されていることを実験的に明らかにした。この様な分子構造を持つペプチドが膜中で会合することによってナノポアを形成することを利用して，分子が通過する際に変化する電流の計測・解析により，SV28ナノポアが一分子DNAやポリペプチドを検出する能力を有していることを実証抗菌ペプチド・ナノポアペプチドと生体膜に関する我々の研究について紹介した。生体膜の内部は誘電率が低い疎水的な環境でありながら，ペプチドとの特異的な結合によって膜内外のイオン・物質輸送を可能にしている。この様な事象はペプチドごとに異なる性質を生み，その理解とシステム化には，ペプチドのde novo設計・巧みな合成技術・様々な構造解析手法と物性評価が重要であります。筆者においてもペプチド学会の学際的なネットワークや様々なサポートなどを利用して，ペプチド–生体膜研究についてのさらなる発展に努めていきたい。最後になりましたが，本研究は愛媛大学佐藤久子教授，東京農工大学川野竜司教授，甲南大学臼井健二准教授に多大なご助力をいただきました。この場を借りて厚く御礼申し上げます。 1. Conlon, J. M. Cell Mol Life Sci 2011, 68, 2303–2315. Iwamuro, S.; Kobayashi, T. Methods Mol Biol 2. Peptidomics (Springer) 2010, 615, 159–176. 3. Jilek, A.; Mollay, C.; Tippelt, C.; Grassi, J.;  Mignogna,  G.;  Müllegger,  J.;  Sander,  V.; Fehrer, C.; Barra, D.; Kreil, G. Proc Natl Acad Sci USA 2005, 102, 4235–4239. 4. Mangoni, M. L.; Papo, N.; Saugar, J. M.;図3測定の結果Barra, D.; Shai, Y.; Simmaco, M.; Rivas, L. Biochemistry 2006, 45, 4266–4276. Marr, A. K.; McGwire, B. S.; McMaster, W. R. 5. Future Microbiol 2012, 7, 1047–1059. Mijiddorj, B.; Kaneda, S.; Sato, H.; Kitahashi, 6. Y.; Javkhlantugs, N.; Naito, A.; Uede, K.; Kawamura, I. Biochim Biophys Acta -Proteins Proteomics- 2018, 1768, 789–798. 7. Kawamura, I.; Mijiddorj, B.; Kayano, Y.; Mat- suo, Y.; Ozawa, Y.; Ueda K.; Sato, H. Biochim Biophys Acta -Proteins and Proteomics- 2020, 1868, 140429. Sekiya, Y.; Shimizu, K.; Kitahashi, Y.; Oyama, 8. A.; Kawamura, I.; Kawano, R. ACS Appl Bio Mater 2019, 2, 1542–1548. 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2022年度日本ペプチド学会「学会賞」候補者を学会賞選考規程および内規に従って募集します。下記の「推薦理由書の作成にあたって」に従って，会長宛の推薦書類（推薦書，業績リスト，主要論文 3編，ペプチド討論会の発表リストからなる）を作成し，日本ペプチド学会事務局まで癖送ください。また，同時に，郵送書類のPDFファイルを電子メールで送付してください。書式（Microsoft Wordファイル）は以下のURLからダウンロードしてください。 https://www.peptide-soc.jp/files/award/forms/ gakkai.docx書類の送付先： 〒 562–0015箕面市稲4–1–2日本ペプチド学会事務局日本ペプチド学会2022年度「学会賞」候補者受付PDFファイルの送付先：日本ペプチド学会事務局E-mail：jps@peptide-soc.jp縮切： 2022年5月31日（郵送分は消印有効）申し込み後１週間経っても事務局から受け取りのメールが届かない場合には，事務局宛に必ず確認のメールをくださるようにお願いいたします。推薦理由書の作成にあたって： 1.  1ページ目様式を含めA4用紙に作成のこと。 2.用紙の余白は上下左右とも2.5cmとり，タイトルを除いて11〜12ポイント程度の活字で印字すること。 3.原稿は横書きとし, •推薦者：所属，会員番号，氏名（捺印） •被推薦者:研究課題，所属，ペプチド学会会員番号，氏名に続いて本文を2,000字程度にまとめること。 4.業績リストならびに主要論文３編までのコピー (各１部)，ペプチド討論会（含ペプチド化学討論会）での発表リスト一覧を添付すること。 5.なお，PDFファイルでは捺印無しのものをご送付下さい。 2022年度日本ペプチド学会「奨励賞」候補者を奨励賞選考規程および内規に従って募集します。下記の「推薦書の作成要領」に従って，会長宛の推廊書類（推薦書および添付の主要論文３編からなる）を作成し，日本ペプチド学会事務局まで郵送ください。また，同時に，郵送書類のPDFファイルを電子メールで送付してください。書式（Microsoft Wordファイル）は以下のURLからダウンロードしてください。 https://www.peptide-soc.jp/files/award/forms/ shorei.docx書類の送付先： 〒 562–0015箕面市稲4–1–2日本ペプチド学会事務局日本ペプチド学会2022年度「奨励賞」候補者受付PDFファイルの送付先：日本ペプチド学会事務局E-mail：jps@peptide-soc.jp締切： 2022年5月31日（郵送分は消印有効）申し込み後１週間経っても事務局から受け取りのメールが届かない場合には、事務局宛に必ず確認のメールをくださるようにお願いいたします。 1.所定の様式に従って，A4判用紙に作成のこと。 2. １頁目に，推薦者および被推薦者とも，日本ペプチド学会会員番号を明記すること。 3. １頁目に，被推薦者の生年月日および年齢を明記し，奨励賞選考規程および内規に準じていることを明示すること。 4.推薦者は１頁目に氏名を記入し，捺印した書類を郵送，送付すること。ただし，PDFファイルでは捺印無しのものを送付しても良い。 5. 「推薦理由」は2,000字程度で記載すること。 6.対象の研究業績リストは，新しい年代のものから順に番号を付して記し，主要論文３編には番号の前に◎印を付すこと。なお，主要論文３編のコピー（各１部）を添付すること。電子メールで送付の書類では，各論文のPDFファイルを同時に添付して送付すること。 7.ペプチド討論会での発表リストは，新しい年代のものから順に番号を付して記し，本人が発表のものには番号の前に○印を付すこと。 We are now calling for Nominations for the Ak- abori Memorial Award 2022.  Please send a set of the relevant documents by June 30, 2022. The re- cipient of the Akabori Memorial Award 2022 is re- quired to give his/her Award Lecture at the 59th Japanese Peptide Symposium, which will be held in Sendai, Japan, from October 26th to 28th in 2022. Please prepare following documents in PDF for- mat and send them by E-mail. 1. A brief statement of nomination (no more than 1,000 words). 2. The nominee’s Curriculum Vitae and List of Publications. 3. One additional recommendation letter in support for the nominee. 4.  No more than 5 selected reprints (PDF files). * Each nominator may propose only one candidate for the Award. The documents should be sent to: The Japanese Peptide Society 4-1-2 Ina, Minoh-shi, Osaka 562-0015 E-mail: jps@peptide-soc.jp June 30, 2022. 2022年4月Peptide Newsletter Japan No. 124発行2022年4月16日(山第110回新旧合同理事会（オンライン） 2022年7月2022年8月8日(月) ～ 10日(水)第54回若手ペプチド夏の勉強会場　所：公益財団法人大学セミナーハウス(またはオンライン開催)世話人：谷口敦彦，田口晃弘，今野翔(東京薬科大) 2022年10月2022年10月25日火)第111回理事会・第40回評議員会合同会議2022年10月26日(水) ～ 28日(金)第59回ペプチド討論会場所：トークネットホール仙台（仙台市民会館）世話人：土井隆行（東北大），今野博行（山形大） 2022年10月27日(村2022年度日本ペプチド学会通常総会2022年10月29日(北日本ペプチド学会市民フォーラム2022 2023年1月Peptide Newsletter Japan No. 127発行2023年１月（予定）第112回理事会《海外関連学会》 2022年5月8日～ 13日14th Australian Peptide Conference Gold Coast Queensland, Australia https://www.apc2022.org/ 2022年6月11日～ 6月16日27th American Peptide Symposium Whistler, BC, Canada https://aps2022.org/ 2022年6月27日～ 28日25th Korean Peptide Protein Society (KPPS) An- nual Symposium Busan, South Korea 2022年8月28日～ 9月2日36th European Peptide Symposium/12th Interna- tional Peptide Symposium Sitges, Spain https://www.eps2022.com/ペプチドニュースレター No.  124号をお届けいたします。本号は「ペプチドと生体膜」をテーマとして，薬物送達システムやペプチド医薬，抗菌活性といった医療とも関わりの深い研究を行っている先生方にご執筆をお願いしました。生体膜とペプチドの相互作用に関する化学は非常に意義深く，精緻な研究の展開に感銘を覚えました。年度末のご多忙な中，ご執筆を頂きました先生方に心より感謝申し上げます。また，本号でも読者アンケートを実施いたしますので，ご協力のほどよろしくお願いいたします。年度が変わろうとしていますが，新型コロナウイルス関連は依然として見通しの立たない状況が続いております。学会等もオンライン開催が浸透しつつある昨今ですが，オンサイトでの開催が少しでも多く叶うことを願ってやみません。本年度が日本ペプチド学会に関わる皆様方にとって，実りある一年になりますよう祈念申し上げます。 124号アンケートフォームURL： https://forms.gle/5BEbbUZfYFV2S1w76 (編集委員：巣山慶太郎) PEPTIDE NEWSLETTER JAPAN編集・発行：日本ペプチド学会〒 562-0015  箕面市稲4-1-2一般財団法人蛋白賀研究奨励会内発　行　日：2022年4月22日編集委員玉村啓和（担当理事） （東京医科歯科大学生体材料工学研究所） TEL 03-5280-8036，FAX 03-5280-8039 E-mail：tamamura.mr@tmd.ac.jp巣山慶太郎（九州大学基幹教育院） TEL 092-802-5849 E-mail：suyama@artsci.kyushu-u.ac.jp矢野義明（武庫川女子大学薬学部） TEL 0798-45-9961 E-mail：yyano@mukogawa-u.ac.jp拓（株式会社ペプチド研究所）吉矢TEL 072-643-4411,   FAX 072-643-4422 E-mail：t.yoshiya@peptide.co.jp児島千恵(大阪公立大学大学院工学研究科) TEL 072-254-8190 E-mail：kojima@chem.osakafu-u.ac.jp (本号編集担当：巣山慶太郎)