生命理をを再取MT部転長2020 80th Anniversar 1939-2019極に1本だけべん毛を形成する: FihFとFihGによる海洋性ビブリオの極べん毛生合成制御機構小州陽飯目名古屋大学大学院理学研究科生命理学専攻May 21, 2020 1 Seiji Kojima (Nagoya University) photo in 2019ピアノ同好会にも入っていました1993年の定期演奏会（中区役所ホール）小嶋誠司（こじませいじ）名古屋市生まれ、今年50歳（1児の父)小学校6年まで大阪府交野市小学校6年で奈良県生駒市へ引っ越し(実家は奈良先端大のすぐ近く)生駒市立上中学校・県立奈良高校卒(バレーボールばかりやっていました)駿台京都校で1年修行この時"物事の理"を知る面白さに気づく名古屋大学理学部に入学(1990) 1991年にベん毛に出会う（今栄先生のラボを訪問）学位を取って留学（University of Utah) 1999-2004 Seiji@junior high (15 years old) Seiji＠high sch. (18 years old) short hair!大を経て200.大学院の時期:出会いを大切に。セーフティネットの意味でも交流は重要。研究室＜生命理学＜名大＜国内＜国外同窓会(理学・生命理学)
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理学研究科での研究:自然の真実を垣間見る基礎研究は芸術・文化自然の論理の美しさ自然の輝きを感じる一瞬の感動(小嶋はこれまでに4回感動のシーンあり)
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Fumio Oosawa “Father of Biophysics” Yasuo Imae Energetics of the flagellar motor discovery of Proton-driven motor (1977) discovery of sodium-driven motor (1981) Michio Homma Molecular biology and biochemistry Identification of stator genes (1997) Stator behaviors (2005, 2009)
生育環境に応じてべん毛の形成位置と本数は厳密に決まっている生体分子の適量・適所配置機構どのようにして極に1本だけべん毛を形成するのか？
運動能が低下した変異株運動能の低下した変異株に多毛のものがあっKusumoto et al (2006)
KK148株の変異部位はflhGにマップされた(Q109 amber) flhG  fliA flhA flhFコレラ菌、緑膿菌で解析が進んでいた(GTPase)  (ATPase) Wild Type AflhF flhG-(KK148) FlhF & GTPase, GTP依存で二量体形成✎大腸菌のFtsY (SRP receptor)に相同✎べん毛の形成位置を決定する♂欠失すると無べん毛になるFlhG (FleN) & ATPase, ATP依存で二量体形成♔大腸菌のMinDに相同✎べん毛遺伝子群発現を抑制する♔欠失すると多べん毛になるKusumoto et al. (2008) 7
a positive regulator that determines flagellar positioning
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FlhF-GFP flagella ◄ flagellated cell pole Host: ΔflhF FlhFは極べん毛基部に局在するKusumoto et al (2008) FlhF-GFP Host: E. coli Δ(flhD-A)べん毛遺伝子を発現しない株FlhFは大腸菌内でも極に局在するintrinsicな極局在能を持つベん毛形成位置を極に決める
Host: AflhF AflhFG FlhF極局在はFlhGがないと強まるIP: anti-FlhF FlhGとFlhFは結合するflhG Host: FIhGはFIhFに関係なく極局在するAflhFG Mono-polar flagellum FIhGが極のFIhF量を制御することでべん毛本数が1本になる(Kusumoto et al, 2018)
Ffh:シグナル認識粒子(SRP) Bacillus subtilis FlhF E. coli FtsY, Ffh FlhFの機能はGTPとどう関わるのがl l l Bange et al (2007)
GTPase FlhFの機能はGTP結合/分解に依存Bacillus subtilis FIhF dimer (2PX3) Kusumoto et al, 2009, Kondo et al, 2017
野生型FlhF (C末にHisタグ) buffer 50 mM Tris-HCl(pH 8.0) 150 mM NaClほとんどのFlhFが低速遠心で沈殿buffer 20 mM Tris-HCl(pH 8.0) 300 mM NaCl 10 mM MgCl2 10 mM KCl 0.5 mM GTP GTPase motif京異体motif  】 ll III IV N C WT G299A G304A K305A T306A K311A D377A e gnn @ gg標海よらの標海よらの標海よらの標海よらのdns

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dns idd FlhFはGTP/GDP存在下で安定な構造を保てる◄FlhF -His6 Kondo et al (20
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FlhFはFlhG存在下でGTPase活性を示す
FlhFはFlhG存在下でGTPase活性を示すGTPを加水分解できなくても、結合できればFlhFは機能するKondo et al (2018)
精製FIhFのゲル濾過クロマトグラフィー (fraction) buffer 20 mM Tris-HCl(pH 8.0) 300 mM NaCl 10 mM MgCl2 1 mM GTP or GDP FlhF dimer size :約114 kDa monomer size :約57 kDa野生型FIhFはGTP存在下で二量体、 GDP存在下で単量体であることが示唆された
Kondo et al (20

ベん毛構築は基部体のMS ring (FliF)形成から始まるFIhFはFliFを極ヘリクルーしているのでは？
vector FlhF co-expression FliF-GFP GFP-FliF FliF-GFP GFP-FliF Host: rpoN欠損株(ベん毛タンパク質を発現しない) FliFはFlhFに依存して極局在する極局在できないFlhFはFliFを極に局在できないFliFの極局在を高める？ MS ringの極での構築を促進？ FlhF (T306A) co-expression FliF-GFP GFP-FliF Terashima et al, submitted; Inoue et al, unpublished
FlhGが極のFlhF量を制御することでべん毛本数が1本になるFIhFはGTPに依存して活性型二量体になり、極へ移行するFliFの極局在を促進してべん毛形成を正に制御
the negative regulator for polar flagellationてい
KK148株の変異部位はflhGにマップされた(Q109 amber) flhG  fliA flhA flhFコレラ菌、緑膿菌で解析が進んでいた(GTPase)  (ATPase) Wild Type AflhF flhG-(KK148) FlhF & GTPase, GTP依存で二量体形成✎大腸菌のFtsY (SRP receptor)に相同✎べん毛の形成位置を決定する♂欠失すると無べん毛になるFlhG (FleN) & ATPase, ATP依存で二量体形成✎大腸菌のMinDに相同&べん毛遺伝子群発現を抑制する♔欠失すると多べん毛になるKusumoto et al. (2008)
HubPは様々なタンパク質を極局在させる“ランドマーク”として働く(Yamaichi et al., 2012) Takekawa et al (2016)海洋性ビブリオ菌でもHubPは極に局在していたコレラ菌では、FlhGはHubPに依存して極局在している海洋性ビブリオ菌では？
FlhG-GFP HubPがないとFlhGは極局在できないwild type Takekawa et al (2016) HubPがないと極に多べん毛を形成△hubP株でFlhGは野生型レベルで発現ベん毛遺伝子群の発現は正常FlhGが極局在できないために多べん毛形成FlhGは極でFlhFを阻害しているのでは？
Ec MinD
270 295 Va FlhG ' D60 D171 ATPaseはMinDの役割に重要であるmembrane binding Ec MinD  K¹¹GGVGK¹¹T Va FIhG K³¹GGVGK³³ deviant walker A motif K31, K36 (K11, K16)：ATPとの結合D60 (D40)：加水分解を触媒D171 (D152)：活性の制御Ec MinD (3Q9L) Gt FlhG (4RZ3) FIhGの機能においてATPaseモチーフが果たす役割とは
WT
(Ono et al., 2015) K31, K36 : ATPとの結合D60 ：触媒部位D171 ：活性制御野生型FlhG極局在する過剰発現により無べん毛になるATPase活性は低い
(Ono et al., 2015) K31, K36 : ATPとの結合：触媒部位D60 D171 ：活性制御ATP結合部位の変異体極局在できない過剰発現しても多べん毛ATPase活性はない
(Ono et al., 2015) K31, K36 : ATPとの結合D60 ：触媒部位D171 ：活性制御ATPase活性制御部位の変異強い極局在過剰発現すると無べん毛高いATPase活性
(Ono et al., 2015) K31, K36 : ATPとの結合D60 ：触媒部位：活性制御D171 D60A/D171A変異体ATPase活性はないが、高いFlhG機能ATPに結合し極で阻害機能を発
Purification (Co-TALON / imidazole) Incubated with 0.5 mM ATP/ADP 10 min Ultracentrifugation to remove aggregates Size exclusion column 20 mM Tris pH8.0 300 mM NaCl 10% (w/v) glycerol 5 mM MgCl。 65 mM Imidazole 0.5 mM ATP/ADP Immunoblot to confirm FIhG
Kojima et al, 2020 Purified FlhG (34.4 kDa)予想に反し、FlhGはATP存在下でも溶液中では単量体で
Kojima et al, 2020 ATPase活性を失った変異体もATP依存的な二量体は形成していないA B
Kojima et al, 2020 ATPase活性の高い変異体は構造が変化している二量体は形成していないMinDとは異なり、単量体で機能する可能性がある
FlhFによるべん毛形成促進はGTP結合型の活性型二量体が担うのか？ FlhGは単量体でFlhF阻害活性を持つのか？ FIhGはMinDと異なり、膜に結合せずHubPに作用して活性化する極でFlhFを阻害しべん毛形成を抑える