1.はじめに
リキッド型エコフィードは加工屑の食品製造副産物や売れ残りなど，いわゆる食品魔棄物のうち有用な食品循環資源を原料にして加工処理されたリサイクル飼料である[1]。平成21年よりリキッド型エコフィードを含むエコフィード認証制度が開始されており[1]，更なる食品循環資源の飼料化の促進と、安心かつ安定的な利用が期待されている。食品循環資源を原料とするリキッド型エコフィードは様々な食材を含む。リキッド型エコフィードには感染症治療を目的として動物用抗菌薬が添加される可能性があるが，その場合に添加された抗菌薬がどの様な影響を受けるのかということに関する情報はほとんど無い。そこで，抗菌葉を製造時期及び成分組成の異なる３種のリキッド型エコフィードに添加し、リキッド型エコフィードが抗菌薬の安定性に及ぼす影響を検証した。
2.材料及び方法
(1)試験材料
家畜が直接摂取する３種類のリキッド型エコフィードを試験に供した。リキッド型エコフィードＡ (以下,エコフィードＡと略す)は米,小麦などの炭水化物を多く含む食品残渣，リキッド型エコフィードＢ (以下,エコフィードＢと略す）はタンパク質を多く含む食品残渣から作成されたものであり，リキッド型エコフィードＣ (以下，エコフィードCと略す）は焼酎粕に市販配合飼料を加えたものである。また，リキッド型エコフィードの原材料の違いによる影響も検証するため，エコフィードA，Ｂ及びＣそれぞれについて製造時期が３週間以上異なり、原材料も異なる３時点（時期I 、時期II及び時期II）で製造されたリキッド型エコフィードを試験に供した。なお，リキッド型エコフィードは分析に供するまで-18℃以下で保存した。試験には予備試験（データ未発表）により安定性への影響が想定された5種類の抗菌薬、即ち酒石酸タイロシン(TS)、アモキシシリン三水和物(AMPC),ミロサマイシン(MRM),ノルフロキサシン（NLFX）及びコリスチン硫酸塩（CL）を供試した。
(2)試験方法
時期I ，時期II及び時期IIで製造されたエコフィードA,  B及びCに抗菌薬を添加して, 添加直後（0時間目）及び20 ～ 25℃で24時間保存後の抗菌薬の濃度を測定した。抗菌薬の添加濃度はTSが400 μ g/g,  AMPCは400 μ g/g,  MRMは100μg/g，NFLXは40μg/g及びCLは200μg/gとした。0時間目及び24時間保存後の測定濃度から抗菌薬の残存率(表1の脚注参照)を算出し,各リキッド型エコフィードが抗菌薬に及ぼす影響を解析した。
(3)抗菌薬の定量方法
抗菌薬濃度の測定は予め添加回収率70 ～ 120％，変動係数15％以内であることを確認した
以下の分析条件で実施した(データ未発表)。なお,抗菌薬の定量は，TS，AMPC，MRM及びCLについては飼料分析基準［2］を参考にした平板法により，NLFXについては食品に残留する農薬,飼料添加物又は動物用医薬品の成分である物質の試験法［3］を参考にした高速液体クロマトグラフ法により行った。 TS：試験試料5 gを採取し，飼料分析基準4号緩衝液-メタノール  (9/1,  v/v)  20 mLを加えて30分間振とうした後，冷却遠心分鐘（5℃，2,900 rpm，5 min）し，上清を得た。これを綿栓ろ過した後,ろ液を飼料分析基準４号緩衝液-メタノール（9/1, v/v)で25 mLの定容とした。これを0.5%Tween含有4号綏衡液-メタノール(9/1, v/v)で100倍希釈し，検液とした。定量は微生物学的手法で実施し，試験菌にはMicrococcus luteus ATCC 9341及び培地にはAntibiotic Medium 4を用いた。 AMPC：試験試料5 gを採取し、80％アセトン20 mLを加えて30分問振とうした後，冷却遠心五十嵐優・坂本倫子・佐竹敦子ら／リキッド型エコフィードに添加された抗菌装の濃度変化／ 33(2011)　69分鐘（5℃，2,900 rpm，10 min）し，上清を得た。残渣に80%アセトン20 mLを加えて15分間振とうした後，冷却遠心分釐(5℃, 2,900 rpm, 10 min）し，上清を得た。先の上清と併せ，綿栓ろ過した後、n-プロパノール15 mLを加えて減圧乾固し，飼料分析基準３号緩衝液5 mLに溶解した。これを飼料分析基準３号緩衝液で10,000倍希釈し、検液とした。定量は微生物学的手法で実施し、試験菌にはBacillus stearothermophilus var. calidolactis C-953及び培地にはStandard Methods Agarを用いた。 MRM：試験試料5 gを採取し，0.1 mol/Lリン酸緩衝液（pH9.5) -メタノール-n-プロパノール(4/5/1,  v/v)  10 mL及びクロロホルム10 mLを加えて10分間振とうした後,冷却遠心分鐘（5℃, 2,900 rpm, 10 min）し，下層を得た。残渣にクロロホルム10 mLを加えて10分間振とうした後、冷却遠心分鐘（5℃，2,900 rpm，10 min）し，下層を得た。先の下層と併せ，減圧乾固し，0.01％ Tween80含有0.1mol/Lリン酸緩衝液 (pH9.5) 5 mLに落解した。これを0.01 % Tween80含有0.1mol/Lリン酸緩衝液(pH9.5)で1,000倍希釈し,検液とした。定量は微生物学的手法で実施し、試験菌にはMicrococcus luteus ATCC 9341及び培地にはAntibiotic Medium 5を用いた。 NLFX:試験試料５ｇを採取し、アセトニトリル-0.2%メタリン酸溶液（2/3,  v/v）30 mLを加えてホモジナイズ後，シャフトをアセトニトリル-0.2%メタリン酸溶液（2/3,  v/v）20 mLで洗浄した。均質化した試料及びシャフト洗浄液をハイフロスーパーセルを敷いたろ紙を用いて吸引ろ過した。ろ紙上の残留物にアセトニトリル-0.2％メタリン酸溶液（2/3,  v/v)  10 mLを加え，吸引ろ過し，先のろ液と合わせた。ろ液にアセトニトリル10 mL及びn-プロパノール10 mLを加えて減圧乾固し，0.05 mol/Lクエン酸水溶液-アセトニトリル (91/9, v/v)  5 mLで溶解した。これを0.05 mol/Lクエン酸水溶液-アセトニトリル  (91/9, v/v）で1,000倍希釈し，検液とした。定量は高速液体グラフ法で実施し，カラムはXBridge C18 (4.6 mm i. d. × 250 mm）を用いた。移動相はA液に0.05 mol/Lクエン酸水溶液，B液にアセトニトリルを用い，ＡとＢの混合比を91/9としたイソクラティック条件とした。検出器には蛍光検出器を用い，励起波長290 nm，蛍光波長455 nmの条件で定量を行った。 CL：試験試料５ｇを採取し，飼料分析基準５号緩衝液20 mLを加えて30分間振とうしたのち後，冷却遠心分釐（10℃，2,800 rpm，5min）し，上清を得た。これを綿栓ろ過した後，ろ液を飼料分析基準5号緩衝液で25 mLの定容とした。これを飼料分析基準5号綏衝液で50倍に希釈し、検液とした。定量は微生物学的手法で実施し，試験菌にはBordetella bronchiseptica ATCC 4617及び培地には飼料分析基準F-9号培地を用いた。
3.結果及び考察
0時間目及び24時間保存後の抗菌薬の測定濃度及び残存率を表1に示す。 TS :エコフィードAは時期I及びIIにおいて残存率が低下したが，時期Ⅲでは影響は小さかった。エコフィードＢでは時期Ｉにおいて残存率が低下し，時期IIにおいてもやや残存率が低下したが時期Ⅲではほとんど影響はなかった。エコフィードCでは全ての時期において残存率が低下した。以上より、TSはエコフィードA及びBでは製造時期の違いによっては残存率が低下し,エコフィードCでは製造時期の違いによらず残存率が低下することが示唆された。 AMPC：エコフィードAの全ての時期において残存率が低下した。エコフィードＢでは時期Ⅲにおいて残存率が低下した。エコフィードCでは時期正において残存率が低下し、時期IIにおいてもやや低下した。時期Iにおける影響は小さかった。以上より，AMPCはエコフィードＡでは製造時期によらず残存率が低下し、エコフィードＢ及びＣでは製造時期の違いによっては残存率が低下することが示唆された。 MRM：全ての試料種において時期Ｉでは残存率が低下したが，それ以外の時期においての影響は小さかった。以上より，MRMはエコフィードA,  B及びC共に，製造時期が残存率に影響することが示唆された。
70   動物抗菌会報33(2011)
NLFX：エコフィードＡ及びＢでは製造時期によらず影響は小さかった。エコフィードCでは時期I及びⅢにおいて残存率が低下し，時期Iにおいてもやや低下した。以上より，NLFXはエコフィードA及びBでは製造時期が残存率に影響することはなく，一方エコフィードCでは製造時期によらず残存率が低下することが示唆された。 CL：エコフィードＡでは時期皿において残存率が低下し、それ以外の時期では影響は小さかった。エコフィードＢでは時期Ｉにおいてやや残存率が低下したが，それ以外の時期では影響は小さかった。エコフィードCでは全ての時期において残存率が低下した。以上より，CLはエコフィードＡ及びＢでは製造時期の違いによっては残存率が低下し，エコフィードCでは製造時期によらず残存率が低下することが示唆された。リキッド型エコフィードは一部の抗菌薬の24時間後の残存率に影響を与える可能性があり，その影響の程度はリキッド型エコフィードの種類.製造時期によって一定ではないことが明らかになった。なお、継時的な減衰については不明であり、今後詳細な検討が必要であると考えられる。リキッド型エコフィードの原材料として製造業者毎に異なる様々な食品循環資源が使われ，また,製造時期によって使われる原材料の種類、割合も異なることが予想されることから，それぞれのリキッド型エコフィードの抗菌薬への影響を事前に確定することは必ずしも容易ではないと考えられた。以上のことから，リキッド型エコフィードへ抗菌薬を添加する場合、可能な限り給与直前に添加し，添加飼料は速やかに使い切るなどの注意が必要であると考えられた。本研究の成果は，（社）日本動物用医薬品協会を実施主体とするJRA助成事業「エコフィード利用安全推進事業」において得られたものである。 1 ) Sugiura K, Yamatani S, Watahara M, Onodera T: Ecofeed, animal feed produced from recycled food waste. Vet Ital, 45, 397-404 (2009) ２）平成20年4月1日付け19消安第14729号農林水産省消費・安全局長通知，飼料分析基準3）平成17年1月24日付け食安発第0124001号厚生労働省医薬食品局食品安全部長通知、食品に残留する農薬，飼料添加物又は動物用医薬品の成分である物質の試験法Remaining Activities of Some Antibiotics Added in Liquid Ecofeed Yu IGARASHI, Noriko SAKAMOTO, Atsuko SATAKE, Kazuyo NOBUHIRA, Yurika KUDOU, Hiroko NAKAMURA, Kumiko ARAKI, Youichi AOKI and Masashi EGUCHI Research Institute for Animal Science in Biochemistry and Toxicology, 3-7-11, Hashimotodai, Midori-ku, Sagamihara-shi, Kanagawa, 252-0132, Japan Though veterinary antibiotics might be added in liquid animal ecofeed processed from recycled food waste for the treatment of infectious diseases, there are few reports about influence of the liquid ecofeed on antibiotics added.  We examined the influence of three kinds of liquid ecofeed processed at three differing time points on several antibiotics. The examined liquid ecofeed affected the remaining activities of antibiotics added at various degrees.  These results indicate that the some kind of liquid ecofeed affect remaining activities of some antibiotics at various degrees and those degrees of influence are not constant at different processing time, if antibiotics were added.