加熱溶融混練・アニール連続処理による高品質なOTC薬物ナノ結晶製剤調製法の確立千葉大学大学院薬学研究院ぅえだ　けいすけ
植田　圭祐
千葉大学大学院薬学研究院楢田圭祐(〒 260-8675千葉県千葉市中央区亥鼻1-8-1   Tel. 043-226-2866)
妥旨
本研究では、加熱混練法による薬物ナノ結晶形成メカニズムの解明を行い、高品質な薬物ナノ結晶製剤設計指針を得ることを目的として実験を行った。難水溶性モデル薬物としてglibenclamide (GLB)を用い、混練温度及び混錬速度を変化させてPVPとSDSと加熱混練を行うことで各種加熱混純物(HE)を調製した。HE中のGLBの結晶化皮を固体NMR測定により評価した結果、混練回数の増加に伴いGLBの結晶化度が減少した。また、混練温度の増加に伴い、HE中のGLB結晶化度が減少した。混練温度の増加により、試料に加わる熱が増加し、GLBの非晶質化が進行したと考察した。各HEを水に分散しGLBナノ粒子形成能を比較評価した結果、混練回数の増加に伴いHE懸濁液中のGLBナノ粒子濃度が増大した。 GLBは加熱混練中に、熱により可塑化したポリマーへの溶け込みと機械によるせん断力を受ける。そのため、混練回数の増加によりHE中のGLBの結晶径が減少し、水分散後のGLBナノ結晶形成量が増大したと考察した。一方、GLBの結晶化度が20%以下であるHEの懸濁液では、過剰な非晶質GLBの過飽和溶解により、水分散時に急激な結晶成長が引き起こされ、 GLB粒子径が増大した。これらの結果から、薬物非晶質化を抑制しつつ薬物結晶を微細化することが、水分散時のナノ結晶形成に重要であることが明らかとなった。同等のGLB結晶化度を示すHEの比較より、非晶質化を抑制しつつ、GLB結晶の微細化を促進するためには、低い混練温度かつ高いスクリュー回転数を用いて加熱混練処理を行うことが重要であることが示された。本研究結果より、薬物のナノ結晶化メカニズムに基づく加熱混練条件の最適化により高品質な薬物のナノ結晶製剤の調製が可能であることが示され、加熱混練技術による難水溶性OTC医薬品の経口製剤化が期待される。
1 、調査研究目的
近年、多くの薬物が難水溶性を示し、経口投与製剤としての開発が断念されるケースが増加している[1-3]。OTC楽として広く市販されているイププロフェンやエテンザミド等の薬物も低い水への溶解性を示す。そのため、製剤技術による瓣水溶性薬物の溶解性改善が求められており、固体分散体化、界面活性剤による可溶化、co-crystalの調製、ナノ結晶化など様々な手法が提唱され、研究されている。薬物のナノ結晶化は、近年注目されている薬物溶解性改善手法の一つである[4, 5]。粒子サイズの減少に伴う比表面積の増大により、薬物の溶出速度が改善され[6]、粒子サイズが100 nm以下になることで、薬物の溶解度上昇も認められる[7]。現在検討されている薬物ナノ結晶の調製法としては、トップダウン的アプローチとして乾式粉砕法[8, 9]及び湿式粉砕法[10, 11]、ボトムアップ的アプローチとして晶析法[12, 13]が用いられている。既存の薬物ナノ結晶調製法は、その原理・装置の構成からそれぞれ製剤化における問題点を有する。例えば乾式粉砕装置として、ボールミル、ロッドミルが挙げられるが[14]、いずれもバッチ式であるためスケールアップが困難であり実用化が難しい[15]。湿式粉砕装置としてはビーズミル及び高圧ホモジナイザーが主に用いられており[16]、連続式であるため大量生産は可能であるが、得られる試料が懸濁液であるため、水に不安定な物質に適用できない[17]。また、固形製剤を得るために乾燥工程が必要であり、乾燥工程前後における薬物ナノ結晶の凝集が問題となる[18]。ボトムアップ的アプローチでは、薬物の粒子径制御が大変難しいという問題がある[19]。また、有機溶媒を用いる必要があり、有機溶媒を取り除くために高額なコストがかかるため実用的でない[20]。これらの問題点を解決する目的で、当研究室ではこれまでに新規薬物ナノ結晶調製法の開発を行い、加熱溶融混練機を用いた薬物ナノ結晶調製法を確立し、特許を取得した(WO2017098729A1)。加熱混練法は、19世紀にプラスチック産業で発展した技術である。最近では医薬品産業でも注目を集めており、1980年以降から、医薬品に関わる特許数が増加している[21, 22]。製剤化における加熱混純法の主な工程は、供給された薬物と熱可塑性添加剤との混合物を加熱し、混練しながら混練物を輸送、試料を高いせん断力で混練し、用途に合わせた形状をしたダイを通して押し出し成形する[23]。これまでの報告で、粟物/高分子担体/界面活性剤３成分混合物を加熱溶融混錬処理することで、様々な薬物のナノ結晶化に成功している。しかし、加熱溶融混練時に薬物が一部非晶質化することが認められており、加熱溶融混練処理のみでは長期保存安定性を有する高品質な薬物ナノ結晶製剤を調製することができていない。高い薬物結晶性を有し、高い保存安定性を示す薬物ナノ結晶の調製には、加熱混練過程における薬物のナノ結晶化メカニズムにもあづく加熱混練条件の最適化が必要である。本研究では、加熱混練法による薬物ナノ結晶形成メカニズムの解明を行い、高品質な薬物ナノ結晶製剤設計指針を得ることを目的として実験を行った。
2、調査研究方法
2-1.試薬離水溶性薬物のモデルとしてGlibenclamide (GLB; Mw 494.01)を用いた。GLB及びSodium dodecyl sulfate (SDS; Mw 288.38)はWako Chemicals Co., (Tokyo, Japan)から購入した。また、GLBをdichloromethane/methanol = 1:1 (v/v)溶液に5% (w/v)の濃度で溶解させ、90℃で噴霧乾燥を行うことで非晶質GLBを調製した。Polyvinylpyrrolidone K12 (PVP; Mw ≈ 2,500)はBASF (Ludwigshafen, Germany)より提供を受けた。その他の試薬については試薬特級のものを用いた。各化合物の構造式をFigure 1に示す。
2-2.試料調製
2-2-1.加熱混練物(Hot extrudate; HE)
GLB、PVP及びSDSを質量比3:6:1で、ボルテックスミキサーを用いて5分間混合することにより物理的混合物 (PM)を調製した。各PMを調製温度90、115、130及び140°C、スクリュー回転数10及び350 rpm、処理回数1-5回の条件で共回転二軸加熱溶磁混練機(HAKKE Minilab II, Thermo Fisher Scientific, Inc., Karlsruhe, Germany)を用いて加熱混練処理を行った。得られたペレットを4°Cで5分間、振動型ボールミル(MM400, Verder Scientific, Co., Ltd., Haan, Germany)を用いて粉砕し、100メッシュの篩を締過した試料をHEとした。以降の文章では、HE (調製温度,スクリュー回転数,処理回数)と表す。
2-2-1.噴霧乾燥試料(Spray-dried sample; SPD)
GLB単独試料及びPMをdichloromethane/methanol = 1:1 (v/v)溶液に5% (w/v)の濃度で溶解させた。調製した溶液をADL311S (Yamato Scientific Co., Ltd., Tokyo, Japan)を用いて噴霧乾燥を行い、SPDを調製した。噴霧条件は以下の通りである。Inlet temperature: 90°C; atomizing pressure: 0.05 MPa; feeding rate: 5 g/min.
2-3.測定方法
2-3-1.粉末X線回折測定
Bruker D8 ADVANCE (Bruker AXS, Karisruhe, Germany)を用いて粉末X線回折(PXRD)测定を行った。以下の条件において测定を行った。Target: Cu; voltage: 40 kV; current: 40 mA; step size: 0.02°; scanning angle: 5-30°; counting per step: 0.75s.
2-3-2.固体NMR測定
JNM-ECX 400 (JEOL Resonance Co., Ltd., Tokyo, Japan;外部磁場: 9.39 T)を用い、固体13C NMR測定を行った。測定シークエンスは、magic angle spinning (MAS)条件下において、cross polarization (CP)法を用いた。外部標準としてhexamethylbenzeneを用い、メチン基のピークを17.3 ppmとしてケミカルシフト値を算出した。初定条件は以下のとおりである。Contact time: 2 ms; relaxation delay: 4 s; spinning rate: 15 kHz.
2-3-3.粒度分布測定
MICROTRAC 9340-UPA (MicrotracBEL Corp., Japan ; measurement range : 0.0008- 6.5μm）を用いて動的光散乱法により、ナノ粒子の体積平均径(mean volume diameter; MV)を算出した。
2-3-4. GLB溶解度及びナノ粒子形成量の評価
各種懸濁液を100,000 × gで25°C、1時間遠心処理した上滑について、HPLCを用いてGLB溶解度を評価した。また、試料を25°C、1,000及び21,500 × ｇで30分間遠心処理した上清についても同様にHPLCによりGLB量を定量し、ナノ粒子形成量を評価した。
2-3-5. HPLC測定
各種試料溶液をacetonitrileで希釈し、HPLC用の試料とした。移動相にはacetonitrile/ phosphate buffer (pH 6.8) = 1/1 (v/v)を用い、imtakt ODS column (3 mm, 150 mm × 4.6 mm)で分離を行った。試料注入量10μL、流速1 mL/min、及びカラム温度40°Cの条件下でUV検出機(229 nm)を用いてGLB濃度を測定した。 2-3-6.クライオ透過型電子顕微鏡(Cryo-transmission electron microscopy: Cryo-TEM)測定JEM-2100F (JEOL Co., Ltd., Japan)を用い、加速竜圧120 kVでcryo-TEM測定を行った。microperforated copper grid (Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo, Japan)をHDT-400 (JEOL Co., Ltd., Japan)により40秒間親水化処理した後、各種試料液2μLを吸着させた。過剰な溶液を濃紙で吸い取った後、液体窒素の自動供給により温度を約-170°Cにコントロールした液体エタン内で急速凍結させcryo-TEM試料とした。Cryo-TEM試料をGatan 626 cryo-holder (Gatan, Inc., CA, USA)に液体窒素中で装着し、-170℃以下の温度を維持してTEM測定を行った。
3、調査研究成果および考察
3-1.加熱混練物中のglibenclamideの物性評価
加熱混練条件がHE中のGLBの分子状態に及ぼす影響を評価することを目的として、 PXRD測定を行った。Figure 2には各HEのPXRDパターンを示す。全てのHEにおいて、GLB結晶由来の回折ピークが確認された。この結果より、今回調製した全てのHE中にGLB結晶が残存していることが示された。またHE中で確認されたGLB結晶に由来する回折ピークは、PMで確認されるGLB結晶由来の回折ピークと比較して広域化が認められた。薬物結晶の結晶子サイズの減少、非晶質化及びその両方により薬物結晶由来のX線回折ピークが広域化することが報告されている[24, 25]。そのため、加熱混練処理によりPVP中でGLB結晶のサイズ減少、非晶質化あるいはその両方が引き起こされ、結晶由来の回折ピークが広域化したと考察した。 HE中のGLBの更なる詳細な分子状態を評価する目的で固体13C CP/MAS NMR測定を行った。GLB原薬結晶、GLB SPD、PM、HE (90, 350, 1-5)、及びGLB/PVP/SDS SPDについて、低磁場側のカルボニルビークに由来するビークの拡大図をFigure 3に示す。 GLB結晶と比較してGLBを単独噴霧した試料においてはピークのプロード化及び高磁場側シフトが認められた。この変化は、アミド-イミド酸の互変異性を伴うGLBの非晶質化に由来するものと考えられた。一方、すべてのHEにおいてGLB結晶及び非晶質に由来するピークが認められた。この結果から、HE中にGLB結晶と非晶質が混在していることが示された。また、調製条件の違いにより、HE中のGLBのピーク形状に違いが認められた。これは、調製条件の異なるHE中のGLB非晶質量に違いがあるためであると考えられた。PVPのC=Oに由来するピークとGLB非晶質のC=Oに由来するピークの相対強度比からHE中のGLBの結晶化度を算出した。Figure 4には各HE中のGLB結晶化度を示す。調製温度及びスクリュー回転数が同じかつ処理回数が異なるHEのGLBの結晶化度を比較すると、処理回数の増加に伴い、HE中のGLBの結晶化度が減少していることが認められた。また、スクリュー回転数及び処理回数が同じかつ調製温度が異なるHEの結晶化度を比較すると、調製温度の増加に伴い、GLBの結晶化度の減少が認められた。GLBは加熱混練中に、熱により可塑化したボリマーへ溶け込み、機械によるせん断力を受ける。そのため、調製温度や処理回数の増加に伴い、GLBに加わるエネルギーが増加し、非融質化が進行し、GLBの結晶化度が減少したと考察した。
3-2.加熱混練物懸濁液の物性評価
動的光散乱法を用いて各HE懸濁液の粒子径測定を行った。Table １に調製直後及び25°C条件下で4時間静置保存後のPM及びHE懸濁液の体積平均径を示す。PM懸濁液においては、水分散直後から沈殿物の形成が認められた。一方、水分散直後のHE懸濁液では、全ての試料において平均粒子径500 nm以下のナノ粒子の形成が認められた。この結果より、PVPとSDSとの加熱混練によりGLBがナノ粒子化したことが示された。HE (90, 10, 1)、(90, 350, 1-4)、(115, 10, 1)、(115, 350, 1-4)及び(130, 350, 1)懸濁液においては、4時間静置後にも、粒子径に大きな変化は認められず、調製されたナノ粒子の高い分散安定性が認められた。これらのHE懸濁液の粒子径を比較したところ、調製温度及び処理回数の増加に伴い、平均粒子径が減少することが認められた。このことから、GLB結晶は加熱混練中に加わるエネルギーにより、徐々に粒子径が減少していくと考えられた。一方、 HE (90, 350, 5)、 (115, 350 ,4)、 (130, 10, 1)、 (130, 350, 2)及び(140, 350, 1)懸濁液においては、4時間静置保存後に沈殿物の形成が認められた。4時間静置後に沈殿物の形成が確認された試料においては、先ほどの岡体NMR測定の結果から(Figure 4)、HE中のGLBの結晶化度が20%以下であることが認められている。過去の報告においてNifedipine (NIF)/ PVP/SDS混合粉砕物中に含まれるNIFの非晶質により、NIFナノ粒子の形成が不利に働くことが報告されている[26]。これらの結果より、HE中に含まれる過剰な非晶質GLBが水分散後に急激な結晶成長を引き起こし、GLB粒子径が増大したと考えられた。このことから、分散安定性の高いナノ粒子を調製するためには、HE中のGLB非晶質量を制御することが必要であることが示された。こ動的光散乱法で様々なサイズの粒子を含む溶液を測定した際、より小さい粒子は過小評価されるため、粒子サイズ分布や各分画ナノ粒子量の定量的評価が困難である。そのため、遠心分離処理を用いて、各サイズ分画中のGLBナノ結晶の定量を行った。1,000及び21,500 × ｇで遠心分離した後のHE (90 10, 1)懸濁液の粒度分布図をFigure 5に示す。1,000及び21,500 × gで遠心分離したHE懸濁液の粒度分布は、それぞれ150 nm及び50 nmの平均粒子径を示した。1,000 × gで遠心分離したHE懸濁液中にはGLBの溶解成分及び150 nm以下のGLB粒子が含まれている。一方、21,500 × gで遠心分離したHE懸濁液中にはGLBの溶解成分及び50 nm以下のGLB粒子が含まれていることが示された。また、 HE懸濁液を100,000 × gで超惑心分離を行い、上清中から粒子を完全に取り除いた後、 HPLC測定を行い、懸濁液中のGLB溶解濃度を評価した。1,000及び21,500 × gで遠心分離後の上清中のGLB濃度定量とGLB溶解濃度定量の結果を合わせて、各懸濁液中の薬物ナノ粒子分画をそれぞれ定量した(Figure 6)。PM懸濁液において、GLBナノ粒子分画はほとんど認められず大部分のGLBがPM懸濁液中で大きな結晶の沈殷物として分散していることが示された。HE懸濁液においては、混練条件の違いに依存して、HE懸濁液中のGLBナノ粒子濃度に差が認められた。スクリュー固転数及び処理回数が同じであり、調製温度が異なるHEの各分画中のGLB濃度を比較した。調製温度の増加に伴い、多くのHE懸濁液においてGLBナノ粒子濃度の増加が確認された。これは調製温度の増加に伴い、加熱混練中に試料に加わるエネルギーが増大し、HE中のGLB結晶の粒子径減少が進行し、水分散後に形成するGLBナノ結晶形成量の増大をもたらしたと考えられた。しかし、一部のHE懸濁液においては、調製温度の増加に伴い、GLBナノ粒子濃度の減少が認められた。またSPD懸濁液においてもGLBナノ粒子量がHE懸濁液と比較して少ないことが認められた。加熱混練過程において、GLBは新晶径の減少とともに非晶質化も進行しており、過剰なGLB非晶質は急激なGLB結晶成長を引き起こす。特に試料中のGLB結晶性が20％以下の試料においてGLBナノ粒子量の減少が認められた。調製温度の増加に伴い、HE中のGLB非晶質量が増大し、HEの水分散時にGLB結晶径の増大が引き起こされたと考察した。同様にGLBが非晶質状態で存在しているSPDの懸濁液中においてもGLB粒子の急激な成長が起こったと考察した。次に、調製温度及びスクリュー回数が同じであり、処理回数が異なるHEの各分画中のGLB濃度を比較した。処理回数の増加に伴い、多くのHE懸濁液においてGLBナノ粒子濃度の増加が確認された(Figure 5)。これは処理回数の増加に伴い、HE中のGLB粒子径が徐々に減少し、水分散後のGLBナノ結晶形成に寄与したと考えられた。しかし、一部のHE懸濁液においては、処理回数の増加に伴い、各分画中のGLB濃度の減少が認められた。これは処理回数の増加に伴い、HE中のGLB非晶質化が過剰に進行し、水分散時に急激なGLB結晶成長を引き起こしたためと考察した。 HE懸濁液中に分散するGLB結晶の形態を評価する目的でCryo-TEM測定を行った。 HE (90, 350, 1-5)の水分散直後のCryo-TEM像をFigure 7に示す。HE (90, 350, 1)及びHE (90, 350, 5)懸濁液中では、楕円形の粒子が観察された。一方、HE (90, 350, 2-4)懸濁液中には、球形に近い粒子が観察された。また、一部で二次凝集をおこしている粒子も観察された。HE (90, 350, 1-4)懸濁液では、処理回数の増加に伴い、一次粒子径が約300 nmから30 nmまで減少することが認められた。しかし、HE (90, 350, 5)懸濁液においては、 HE (90, 350, 4)懸濁液と比較して一次粒子径の増大が認められた。これは、HE (90, 350, 5)中に含まれる過剰なGLB非晶質が水分散時に一時高い過飽和を形成し、その後急激な結晶化を引き起こし、GLB粒子の一次粒子の成長を促したと考察した
3-3.加熱混錬条件がGLBナノ結晶形成に与える影響の考察
HE中のGLB結晶化度に基づいて、調製温度及びスクリュー回転数がGLBナノ結晶形成に与える影響を評価した。Figure 8には、様々な加熱混練条件により調製した薬物ナノ結晶の形成メカニズムを示す。まず、調製温度がGLBナノ結晶形成に与える影響を評価した。スクリュー回転数及びGLB結晶化度が同等である、HE (90, 350, 2)・HE (115,350, 1)、HE (90, 350, 3)・HE (115 ,350, 2)及びHE (115, 350, 3)・HE (130, 350, 1)の3通りの組み合わせのGLBナノ結晶形成量を比較した(Figure 6)。その結果、すべての組み合わせにおいて、調製温度の低いHEにおいてナノ結晶形成量が多いことが認められた。調製温度の低下に伴い、GLBは可塑化したポリマーへの溶け込みが抑えられ、よりスクリューと添加剤によるせんだん力を受けると考えられる。そのため、調製温度が低い条件では、調製温度が高い条件と比較して、GLBの非晶質化を抑制しつつ、効率よくGLB結晶の微細化が促進したと考えられた。次に、スクリュー回転数がGLBナノ結晶形成に与える影響を評価した。調製温度及びGLB結晶化度が同等である、HE (90, 10, 1)・HE (90, 350, 2)及びHE (115, 10, 1)・HE (115, 350, 2)の2通りの組み合わせのGLBナノ結晶量を比較した(Figure 6)。その結果、すべての組み合わせにおいて、スクリュー回転数の高いHEにおいてナノ結晶形成量が多いことが認められた。スクリュー回転数の増加に伴い、加熱混練中にGLBに加わるせんだん力が増加すると考えられる。そのため、スクリュー回転数が高い条件では、スクリュー回転数が低い条件と比較して、効率よくGLB結晶の微細化が促進したと考えられた。これらの結果より、非晶質化を抑制しつつ、GLB結晶の微細化を促進するためには、低い調製温度かつ高いスクリュー回転数を用いて加熱混錬処理を行うことが亜耍であることが示された。
4、まとめ
加熱溶融混練装置を用いて、GLBナノ結晶の調製に成功した。また、加熱混練条件に依存して、GLB粒子径及びナノ結晶形成量に違いがあることを見出した。HE中の過剰なGLB非晶質は、水分散時に急激なGLB結晶成長を引き起こすことが認められた。そのため、薬物非晶質量を制御した上での薬物結晶の微細化が水分散時のナノ結晶形成に重要であると考察した。また、加熱混練条件がGLBナノ結晶形成量に与える影響を解明した。非晶質化を抑制しつつ、GLB結晶の微細化を促進するためには、低い調製温度かつ高いスクリュー回転数を用いて加熱混練処理を行うことが重要であった。本研究の検討は、加熱溶融混練装置の特性から、既存の薬物ナノ結晶調製法の欠点を克服する調製法となる。今後、更なる薬物及び添加剤を用いることで、様々な薬物のナノ結晶調製が可能になることが期待される。本研究で得られた結果は、OTC製剤を含む速放性を指向した製剤設計に重要な知見を与えると期待される。
5、調査研究発表(口頭または誌上発表)
該当なし(本研究内容について国際投稿論文の投稿準備中である)
6、引用文献
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