ABSTRACT

1.はじめに
新型コロナウイルスの感染拡大に伴い，安全かつ低コストでのウイルス不活化技術の早期確立は喫緊の課題である.圧水銀放電ランプから放射される液長254 nmの紫外放射は強い殺菌力を持ち，これまでに菌類の殺菌やウイルス等の不活化に広く用いられている.しかし,ヒトに照射すると皮膚ガンや白内障を生じさせるという欠点を有するため¹-³¹,لدトを含む動物等に直接照射されない場所で利用されている.一方,近年254 nmよりも波長の短い207 nm, 220 nmや222 nmに発光ビークを持つエキシマランプが開発された.これらのランプから放射される紫外放射も波長254 nmに発光ビークを持つランプからの紫外放射と同様にDNAやRNA,そしてタンバク質等に直接損傷を引き起こすため,菌類の殺菌,ウイルス等の不活化の作用を有する.また紫外放射はその波長特性から、波長が短くなるに従いヒトや動物の表皮細胞の内部まで透過しないことが報告されている4-6 .そのため、液長の短い紫外放射は組織内のDNAやRNAに損傷を引き起こさず，皮膚ガンや目の障害が著しく抑えられ.有人環境下での新たな菌類の殺菌やウイルスの不活化のための技術として落目されている.しかし一方で,波長222 nmに発光ビークを示すエキシマランプからの紫外放射を植物（シロイヌナズナ）に照射すると，葉の表皮に存在する孔辺細胞（気孔）が直接障害を受けることで、葉の白化や表皮細胞の破壊が波長254 nmにピークを示す低圧水銀放電ランプの照射の時よりも顕著に見られ、重篤な障害を引き起こすことが報告されている71.したがって、波長254 nmよりも短波長の紫外放射を照射するランプを利用したウイルス等不活化技術の確立，実用化には，様々な生物種に対する影響評価の検証も必要であり、更なる時間を要すると考えられる.これまでに我々は，会議室や商業施設の個室などの無人環境での，安全，低コスト，短時間での効率的なウイルス等不活性化技術の早期確立のために，254 nmに発光ビークを持つ全長1,000 mmの石英ガラス製低圧水銀放電ランプを利用し、オゾンを発生しないオゾンレスタイプの紫外照射装置を開発した.そこで，様々な広さの商業施設の個室をモデルルームとして，紫外照射装置を設置し，一定時間紫外放射を照射した際の室内の壁，天井等における殺菌効果を，大腸菌の不活化率から評価し、新たに開発した紫外照射装置の性能を検証したので報告する.
2.紫外照射装置の開発と検証方法
2.1 紫外照射装置の開発
無人環境の会議室,飲食店の個室,カラオケルーム等の娯楽施設の個室等の殺菌・ウイルス等の不活化には、短時間で、かつ容易、そして効率的に実施されることが期待される.そこで我々は，標準的な天井の高さ2,500 mmを基本としたモデルルームを，出来る限り少ない本数の低圧水銀放電ランプを使用し、効率的に壁、床、天井に付着した菌、ウイルス等が不活化できる紫外照射装置の開発を目指した.全長1,000 mmの1本の低圧水銀放電ランプが基底部から垂直に搭載され、点灯時は紫外放射が室内全空間に照射出来る構造の移動式紫外照射装置を作製した.開発した紫外照射装置を図1に示す.本装置は,全長1,000 mmの直管形の低圧水銀ランプ(GLM-078/A-9.2S,電力約70 W,オーク製作所）およびランプ破損防止構造を備える.ランプ破損防止構造は，ランプと同軸の円筒状に設置される略円柱状の格子標造を有し、縦方向の格子材の太さは2 mmで、ランプから格子材への距離は30 mmである.また,格子材と格子材との間の間隔は，13.5 mmである。したがって，本装置のランプ照射時は，ランプから発せれられる紫外放射は，室内全空間に照射される。この装置は稼働時間を設定できるタイマーと，誤って稼働中にヒトが近づくと停止する人感センサーも装備されている.
2.2 検証実験
2.2.1光源スペクトル,および紫外放射照度の測定紫外照射装置から放射されるスペクトルは、分光放射照度計（大塚電子株式会社, MCPD-3000）を用いて測定し, (a)紫外照射装置の実物写真,  (b), (c)紫外照射装置図面a: (正面),  b: (背面).  (d)格子部拡大図面.  (e)紫外照射装置上部拡大図面. (f)紫外照射装置基部拡大図面. Fig.  1    Overview of the UV irradiation device. (a) Photographs of the actual UV irradiation device. (b), (c) Drawings of the UV irradiation device. a: (front), b: (back). (d) En- larged drawing of the grating. (e) Enlarged drawing of the upper part of the UV irradiation device. (f) Enlarged drawing of the base of the UV irradiation device. 254 nmに発光ビークがあることを確認した（図2）、次に作製した紫外照射ランプからの距離，床からの高さと照度の関係（配光分布）を調べた（表1）。紫外照射装置を室内に,ランプの中央が床から1,220 mmとなるように壁と平行に設置した。ランプから壁までの距離(X)を変化させ，壁の床からランプ中央の位置にあたる1,220 mmから鉛直上方向の位置（高さ：Y [1,220～2,530 mm]）で紫外放射照度を測定した.なお,紫外放射照度は,紫外放射照度計(オーク製作所,表示部：UV-M03A,受光部：UV-SN25）を用いて,センサーの受光部を壁と平行に設置し測定した.ただし、センサー受光部の斜め入射光特性は、入射角度が大きくなると理想的な特性からマイナス方向にずれている（UVM03A取扱説明書,オーク製作所).このため,測定値は実際の紫外放射照度よりも小さな値を示すと考えられる.その結果,ランプ中央と同じ高さ（床から1,220 mm）の壁の位置での紫外放射照度は，壁からの距離に関係なく最も高くなった．まランプ中央の位置から壁に沿って鉛直上方に向かうにた.従い，紫外放射照度は徐々に低下した．しかし，床からの高さが2,530 mmの位置では、壁とランプの距離が1,450から4,000 mmへと離れても、距離に応じて紫外放射照度は低下しておらず，0.005～0.009 mW/cm²と低く検出された.図2　紫外照射装置から放射されるスペクトルランプ管中央から100 mmの距離で、分光放射照度計（大塚電子株式会社, MCPD-3000）を用いて放射されるスペクトルを測定したFig. 2 Radiation spectrum of lamps installed in the UV irra- diation device. The emitted spectrum was measured at a distance of 100 mm from the center of the lamp tube using a spectrora- diometer (Otsuka Electronics Co., Ltd., MCPD-3000). 2.2.2　使用した大腸菌と大腸菌生存率の測定方法我々はこれまでに，低圧水銀放電ランプを使って99.00%のPlファージウイルスを不活化させるのに必要な紫外照射量は，大腸菌を99.99%不活化させるのに必要な紫外照射湿（12 mJ/cm²）と同じであることを報告している（図3) 7.そこで我々はカラオケルーム内でPlファージウイルスの99.00%を不活化させる条件を検討するために、Plファージウイルスよりも扱いやすい大腸菌を用いて検証することにした野生型大腸菌（AB1157）のシングルコロニーを37℃で一夜塔楽し,その塔粪液の原液(4.2×10 8 cells/ml), 10~ 2希釈,図３ 野生型大腸菌（E. colí）とP1ファージ（P1 phage）の低圧水銀放電ランプから放射される紫外放射の照射量に対する生存曲線直線は野生型大腸菌（AB1157)，点線はP1ファージの生存曲線を示す.結果は3回実験した平均を,エラーバーは標準誤差を示している.赤線はP1ファージの生存率が1%（不活化率99%）になるときの紫外照射量を示している（120 J/m²= 12 mJ/cm²). このグラフはOtake et al. Photochemical & Pho- tobiological Sciences, vol. 20, p. 1675–  (2021)のデータを元に作製した. Fig. 3   Survival curve of E. coli and P1 phage in response to UV irradiation. Solid line and dotted line indicate wild type E. coli (AB1157) and P1 phage, respectively. The values are the means of three experiments. The error bars indicate the SEs of three biological replicates. Red line indicates the dose which kills 99% of P1 phage (120 J/m²=12 mJ/cm²). This graph is made from data in Otake's paper (Otake et at. Photochemical & Photobiological Sciences, vol. 20, p. 1675– (2021))
図中のプレートと番号は，設置場所の番号を示し，表2, 3, 4の番号と一致する．赤丸は紫外照射装置の設置場所を示す．：Lルームは照射装置を２回に分けて設置したが，紫外照射装置を最初に設置した場所をA,二回目に設置した場所をBで示した.各部屋に設置してある家具の大きさは以下のとおりである.机のサイズ：H620×W900×D 500 mm,椅子座面の高さ：380 mm,スピーカーの大きさ： H205×W 361×D233 mm.プレート6, 23, 26, 36, 39, 42に関しては，ソファーの産面に，プレート表面が紫外照射装置に向くように設置した. Fig. 4   Overview of the model rooms (a: S-room, b: M-room, c: L-room) where the verification tests were conducted and the loca- tions of the E. coli plates. The plates and numbers in the figure indicate the numbers of the installation places and correspond to the numbers in Tables 1, 2, and 3. Red circle indicates the position of UV irradiation device. A and B indicate first position and second position, respectively. The size of each furniture is as follows. Table: H620×W900×D 500 mm, Sofa seat height: 380 mm, speaker: H205×W 361×D233 mm. Plate 6, 23, 26, 36, 39, 42 were placed on the seat surface of the sofa so that the surface of the plate faced the UV irradiation device. 10~希釈した３種類それぞれ100 µ1を、1枚のLBプレートを3分割して塗布した.そのプレートは、両面テープでカラオケルームの様々な位置に，蓋を取った状態で，壁や天井に対して平行に設置した.部屋の角は壁2面を使って,プレート表面が紫外照射装置の方向に向くよう設置した(図4).紫外放射を照射後,プレートは37℃で一晩培養し,翌日コロニーを数えて生菌数を計算した(図5).紫外放射照射後の大腸菌の生存率は，［紫外放射を照射後の生菌数］÷［紫外放射を照射しない大腸菌の生菌数]×100(%)により求めた.また不活化率は100(%)−生存率(%)の計算式により求めた. 2.2.3 検証実験に利用したモデルルーム検証実験のモデルルームとして、株式会社コシダカが所有する３種類の広さのカラオケルーム(まねきねこ渋谷本店). Sルーム：幅2,001×奥行2,166×高さ2,500 mm, Mルーム：幅1,989×奥行4,042×高さ2,500 mm, Lルーム幅3,172奥行× 7,889×高さ2,700 mmを使用した（図4）壁，天井はプラスターボードがベージュ色のビニールクロスで覆われたものである. 2.2.4 検証方法紫外照射装置は，Sルーム，およびMルームにおいては、部屋の中央となる机（高さ620 mm）の上に設置した(図4).またＬルームにおいては,部屋の床面積が広いため,図4C中のAの位置に設置し, 1回照射した後, Bの位置に移動し、再び照射することにした.なお, Lルームも, Sルーム,およびＭルームと同様に紫外照射装置は机（高さ620 mm）の上に設置した.各部屋における紫外照射装置による照射時間は、SルームとＭルームでは，照射装置のランプ中央から天井と２面の壁との接点までの距離，Ｌルームでは照射装置のランプ中央から天井と２面の壁との近い方の接点までの距離での紫外放射照度を，表1に示した結果から見積もり，ランプ中央から最も距離が遠い地点で大腸菌を99.99%不活化させるために必要な照射量である12 mJ/cm²から算出した.なお、ランプ点灯後からの照度推移測定から、ランプが点灯してから紫外放射照度が安定するまでには2分の時間を要することがわかった.そこで,ランプ点灯から照度が安定するまでの2分間と、安定してから2分間の積算光量から、積算光量の比率を算出した.その結果,照度が安定するまでの2分間の光量の比率は平均73%であったため、開発した紫外照射装置による照射量は，紫外放射照度×120秒(2分)×定数（0.73)+紫外放射照度×Y秒（照射時間−2分）の和として算出した.その結果, Ｓルームでは７分, Ｍルームでは10分,そしてＬルームではまずＡの位置で15分照射した後, Ｂに移動して15分照射することに決定した.照射後、大腸菌のプレートを回収し、大腸菌の不活化率を測定した.また,大腸菌のプレートを設置した場所における紫外放射照度を紫外放射照度計（オーク製作所,表示部： UV-M03A,受光部：UV-SN25）を用いて測定した. (a) Survival of E. coli in the plate without UV irradiation. (b) Survival of E. coli after UV irradiation and overnight incubation at 37°C in plate #5 in Fig. 4a. The numbers in the figure indicate the number of E. coli on the plate.
3.結果
3.1 Sルームでの検証結果図4aと表2には、Sルームにおいて検証実験用の大腸菌プレートを設置した場所と，各プレートの設置場所における紫外放射照度, 7分間における照射量,および大腸菌の不活化率の結果を示した. Sルームでは、部屋の中心に設置した紫外照射装置から最も遠い場所（プレート番号1, 4, 7, 10）で実測された紫外放射照度から算出した照射量は,それぞれ8.1, 8.5, 1.9, 3.1 mJ/ cm²であった.番号7と10において照射量が低かったのは,紫外照射装置と大腸菌プレートを結ぶ直線上にスピーカーが設置されており，スビーカーにより紫外照射装置からの直達光が造られたためである.しかし、周辺の壁や天井からの反射光がわずかに到達していたと考えられた.また,番号15は、テープルにより紫外照射装置からの直達光が造られる場
所であった.他の大腸菌プレートは,紫外照射装置から紫外放射が直接照射される場所であり，7分間での照射量は，スビーカーや椅子などで紫外放射の直達光が造られる場所を除き，およそ8～62 mJ/cm²であった.図5aは、紫外放射を当てなかった大腸菌プレートを一晩37℃で培養したプレートの写真を示し、図5bは,ルームＳの５番の位置に設置し、７分間紫外放射を当てた大腸菌プレートを37°Cで一晩塔楽した後のプレートの写真を示した. 5番の位置での照射量は、36 mJ/cm²であった.この条件下では、大腸菌の原液を塗布した培地上では大腸菌の生存が確認できたものの、10~²希釈。10~*希釈培養液を塗布した培地上には，大腸菌のコロニーは検出できなかった.各大腸菌濃度でのコロニー数を計測し、大腸菌の不活化率を計算したところ，プレート番号3,4,9で99.98%，それ以外の場所（プレート番号1, 2, 5, 6, 8, 11～14）では，設計通り99.99%以上であった.また，紫外照射装置からの直達光がスピーカーで造られた場所（プレート番号7, 10）でも、99.5%以上の不活化率となり，想定以上の大腸菌の不活化効果が認められた.
3.2  Mルームでの検証結果
Mルームでの検証結果を表るに示した.  Mルームにおいても、スピーカーや椅子、テープルで紫外照射装置からの直達光放射が造られる箇所では（プレート番号24, 27)。紫外放射照度は低く照射量は著しく減少していた.一方.スピーカー等で紫外放射の直達光が造られない箇所での照射量は, 12〜33 mJ/cm²と大腸菌の不活化率が99.99%以上となる条件であった.大腸菌の不活化率は，紫外照射装置に対してスピーカーの英側（番号24, 27),椅子の影となる場所(番号30),スピーカーとスピーカーの間(番号33),さらに装置の真上となる(番号32)を除いて99.9%以上であった.一方、紫外放射照度計による紫外放射照度は測定下限以下であった番号24, 27の位置における大腸菌の不活化率はそれぞれ47.11%, 64.05%であり，柴外放射の照射による不活化効果が弱かった.
3.3 Lルームでの検証結果
Lルームでの検証結果を表4に示した. Lルームは部屋の4隅上方すべてにスピーカーが設置されていることから,  S, Mルーム同様に紫外照射装置に対してスピーカーの要側となる位置（番号34, 37, 43, 46）での紫外放射照度の測定値は測定下限以下であった.また,椅子やテープル等により照射装置からの直達光が造られる位置（番号52, 53, 54）も同様に黎外放射照度は，著しく低い，または測定下限以下であった.それら以外の位置での照射量は，6.8～41 mJ/cm²であった.このような条件下で大腸菌の不活化率を測定すると、スビーカーや家具等で紫外放射が造られる場所を除いては, 99.90%以上の不活化率であった.一方,スピーカーの影になるプレート番号34,37,43,46に関して、番号37では不活性化率が54.27%であったものの、他の３か所では97.00%以上の不活化率となった.他のS, Mルームでも同様に紫外照射装置からの直達光放射が届いていない場所での大腸菌の不活化率は，直達光放射が届いている場所よりも低かった.しかし、Lルームの方がSまたはＭルームよりもその不活性化率は高かった.
4.まとめ
本研究では，新たに開発した紫外照射装置を用いて，実際に利用されているカラオケルームをモデルルームとし、細菌やウイルスの不活化の検証実験を，大腸菌の不活化率を指標に行った.これらの結果は,会議室や商業施設など不特定多数の人々が利用した部屋の細菌やウイルスを，紫外照射装置を用いることで，安全かつ短時間で効率的に不活化するための知見を示した.実験室内での結果により，大腸菌を99.99%不活化させる
表4　Lルームに設置した大腸菌ブレートの位置における黎外放射照度，照射量，および不活化率、なお，各プレートの番号は，図4c中の番号を示すTable 4   UV irradiance, approximate integrated UV radiation intensity, and inactivation rate of the E. coli
には，低圧水銀放電ランプからの紫外放射を12 mJ/cm²照射することが必要であると算出した.そして本検証実験によって，モデルルームといった空間においても，殺菌したい場所に付着した大腸菌を99.99%不活化させるためには, 12 mJ/cm²照射すれば良いことを明らかにした.検証実験に使用した部屋には，スピーカー，椅子，机といった設備や什器が設置されていた.これらの設備や什器の影となる部分は紫外照射装置からの直達光放射が造られ、紫外放射照度は著しく低かった.そのような場所では,大腸菌を99.99%以上不活化させる効果は得られず，最も効果が低かった場所では47.11%（Mルーム）であった.しかし.大腸菌の不活化率は，紫外放射照度測定値より算出した照射量から考えられる値よりは高い値を示した.これらの設備や什器の影となる場所には周辺の壁などから反射された紫外放射が到達している．一方，紫外放射照度計測に使用した紫外放射照度計の斜め入射光特性から、紫外放射の入射角度が大きい場合.すなわち本実験のように反射された紫外放射が斜め方向から入射する場合は、実際の放射照度よりも低く測定される.紫外放射照度計は紫外放射装置に向けて設置したため，これが原因であると考察した. Lルームの紫外放射が直接照射されない場所での大腸菌の不活化率は、ＳルームおよびＭルームの直接照射されない場所と比較して高い傾向が認められた.その理由は,先に考察した紫外放射照度計の斜め入射光特性によるものに加えて,照射時間15分間を2回照射したため、放射照度計での測定下限以下の紫外放射照度が長く照射されたためと考察した.本装置は,新型コロナウイルス(SARS-CoV-2)感染防止対策機器の一つとして開発した.しかし.現時点において.対象空間における感染経路,存在状態や密度,空気中での生存期間など，詳細な実態が把握できていない．また，本研究では浮遊するウィルスに対する効果は評価しておらず、物の表面に付落したウィルスの不活化効果についての実験結果をまとめたものである.これまでの研究報告によると，低圧水銀放電ランプなどを用いてSARS-CoV-2を不活化するために必要な照射量は，その存在状態やその密度によって3～1,000 mJ/cm²と大きく異なる8-11).しかし、感染多重度が1,000という高い条件下で$ 16.9 mJ/cm²以上の254 nmに発光ビークを持つ低圧水銀放電ランプの照射で完全に不活化出来ることが実験室内での結果として報告されている121.本検証実験では大腸菌の不活化に必要な照射量は実験室内での照射量と同じであることを明らかにした.以上のことから.開発した紫外照射装置を用いて，殺菌対象の表面に，少なくとも16.9 mJ/cm²以上照射するように設定すれば.その表面に付落しているSARS-CoV-2を99.99%以上不活化可能と考える.さらに本紫外照射装置は，たとえ広い部屋においても複数箇所で点灯させれば,アルコールを用いた表面除菌作業と組み合わせることで，効果的に表面不活化処理を行うことが可能と考える.本研究結果が，より高効率な不活化処理装置および，効果的な除菌作業方法の開発の一助となることを期待する. 1) Sliney, D.: Balancing the Risk of Eye Irritation from UV-C with Infection from Bioaerosols, Photochem. 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