宇井 彩子東京工科大学応用生物学部疾患ゲノム制御Key words : transcription, DSB (DNA double strand breaks), chromatin remodeling, histone modification, cancer
植 富
転写・DNA修復・クロマチンリモデリングなどDNAの代謝を伴う生命活動において、染色体の構造変化は非常に重要であり、そのメカニズムの解明が進められている。特にクロマチンの構造変化に伴うクロマチンリモデリング・ヒストン修飾に関与する因子は、細胞がん化や細胞老化に関与していることが知られている。我々は今までに、癌で高頻度に変異が検出され上記の様にクロマチン構造変化に関与する因子のBRG1、SNF5、ARID1A/B、CBP/P300、BMI1 (ポリコーム) がDNA二重鎖切断（DNA double strand breaks；DSB）に機能し、染色体安定性維持に重要な役割を果たしていることを明らかにしてきた[1～9]。近年、我々は染色体の構造変化と、転写とDNA二重鎮切断修復における双方の機能を比較・相関できる新たな実験系を構築し、ポリコームがヒストン修飾を介して、クロマチンの構造変化を制御することにより、転写とDNA修復が共役して働き、ゲノム安定性の維持に寄与することを見出した[5] 。そこで、本研究では転写抑制とDSB修復におけるクロマチンリモデリング因子とヒストン修飾の機能の比較・相関を明らかにし、染色体不安定性のメカニズムの解明を目的としている。今回新たに、転写の伸長期に加えて開始期を観察するための実験系を構築した。この新たな実験系により、転写の開始と伸長期においてDSBの誘導したところ、転写の伸長期が抑制が観察され、この抑制にはTrithorax群とPolycomb群によるヒストン修飾の変化が関与することが明らかになった。
方炭
1.転写の活性化
近年、我々はU2OS細胞のゲノムに転写を活性化し、ライプあるいは免疫染色により観察できる実験系を構築した(図1A)。この実験系では、U2OS-19細胞[5]に、プラスミドpCherry tTA-ERとpYFP-MS2をLipofectamin 3000あるいはエレクトロポレーションによりトランスフェクションする。24時間後、pCherry-tTA-ERが発現し細胞質に蓄積したことを確認し、タモキシフェンを処理する。タモキシフェン処理後の直後にpCherry-tTA-ERが細胞質から核内に移動することが観察され、その直後より転写が活性化されることが YFP-MS2が転写部位に結合することにより観察できる(図1B)。pYFP-MS2の代わりにGFPタグをつけた転写因子クロマチンリモデリング因子やヒストン修飾因子をトランスフェクションすることにより、これら因子の転写部位への結合がライプで観察できる。また、ヒストン修飾を観察する際には、タモキシフェン処理より経時的に固定し、免疫染色を行う。さらに、プラスミドのトランスフェクションより二日前にsiRNAとLipofectamin RNAiMAXを用いて関連因子をノックダウンすることにより、これらの因子の発現低下による転写活性化や、転写因子・クロマチンリモデリング因子・ヒストン修飾因子の転写部位への結合の変化を観察できる（図1B）。
2.   I-SceIによるDSBの誘導
転写活性化と同時にDSBを誘導する際には、上記1のプラスミドのトランスフェクションの際にI-SceIを発現するプラスミドを同時にトランスフェクションする。DSBの導入効率に関しては、DSBのマーカーであるy H2AXの免按染色により確認する。
3.がん細胞におけるクロマチンリモデリング因子の発現解析と放射線、抗がん和感受性の測定
RIPA bufferによりがん細胞の細胞抽出液を作成した後、それぞれのクロマチンリモデリング因子の抗体を用いてウエスタンプロットを行った。さらに、クロマチンリモデリング因子の発現低下細胞に関しては、放射線と抗がん剤処理を行い、コロニ一形成アッセイにより感受性を検討した。
楚 具
1. DSBによるクロマチンの構造の経時的変化。
我々のシステムでは、転写を誘導してから、経時的に転写の活性化（伸長）をライプで可視化できる[5]。転写が活性化するステップとして、転写の開始と伸長の時期があるが、我々の構築したシステムでは転写の伸長期しか観察できなかった。そこでDSBが起きた時に転写活性化のどの時期で影響を受けるかを明らかにするために、新たに転写伸長のみならず、転写の開始も検出できる実験系の構築を行った。今回の実験系より、転写の開始期には転写部位に転写開始に関与する因子の結合が観察され、さらにRNApolymerase IIの転写部位への結合に加えてS2のリン酸化は観察されずS5のリン酸化が観察されたため、転写開始がライプで観察できることが確認できた（図1)。この新たな実験系を用いて、ヒストン修飾・クロマチンリモデリングの抗体を用いて、転写活性化部位の近傍でDSBが起きた際に、クロマチン構造の経時的変化を可視化した。ヒストンH3とH4のメチル化の中でもH3K9me3、 H3K27me3 は転写活性化部位の近傍にDSBを発生させると減少傾向にあった（図1C）。さらに、H3K4me2とH3K4me3はDSBの発生により減少することが明らかになった（図1）。また、ポリコームの基質であるH2Aのユピキチン化のH2A K119ubは経時的に上昇することが明らかになった（図1）。このため、DSBの誘導により転写の伸長が抑制され、転写抑制が起きていることが示唆された。今後は、上記のヒストン修飾に関わるヒストン修飾酵素とクロマチンリモデリング因子に蛍光タンパクを付け、転写部位における挙動の経時的変化をライプで可視化する予定である。
2. 染色体の構造変化と、転写活性・DSB修復活性との関連
このシステムでは、ライプで転写活性・DSB修復活性が可視化できる。そこで、上記のクロマチンの構造変化と、これらの機能（転写活性・DSB修復活性）を解析した。上記１で開発した、転写の開始と転写の伸長の両方を誘導し、更にI·SceIを発現させてDSBの誘導を行った。DSBを誘導したところ、転写伸長が抑制されることが明らかになった。現在、DSB修復因子にGFPを付け、DSB部位への集積を観察することにより、どのようなDSB修復が機能しているのかを明らかにする予定である。
3.  DNA二重鎖切断と転写の機能の比較・相関と、ゲノム安定性のメカニズム
さらにDSB誘導時に、転写がどのような影響を受けるのかを、転写因子の举動を観察することにより検討した。その結果、転写の開始に関与する因子はDSB誘導により大きな影響を受けなかった一方、転写の伸長に関与する因子がDSBにより転写部位より一部解離しているのが確認された。また、RNA polymerase IIのリン酸化を観察したところ、転写伸長に関与するpS2のリン酸化がDSBにより減少することが示された。このことより、DSBにより転写伸長が抑制される可能性が考えられた。現在、クロマチンリモデリング因子のノックダウンにより、これらの転写伸長がどのような影響を受けるのかを明らかにしたい。図1. （A）本研究で用いた転写を経時的に観察するシステム（Ui et al., Mol Cell, 2015)。 (B)この実験系を用いてタモキシフェンを処理すると、Cherry-tTA-ERが転写部位に結合して転写を誘導する。その結果、GFPタグをつけた転写因子やRNAに結合するYFP-MS2が転写部位に結合する。 (C)この実験系を用いて転写を活性化させた際にI-ScelによりDSBを誘導すると、ヒストンH2Aのユピキチン化が上昇したが、H3K27のメチル化は減少した。
4. 悲縛胞におけるDNA二重鎮切断修復に関与するクロマチンリモデリング因子の発現量と、DNA二重鎮切断を誘
準する抗がん剤に対する感受性の相関
様々な癌細胞でクロマチンリモデリング因子の変異・欠失・増幅・エピジェネティックな変化などにより、発現量が変化していることが知られているが、特に肺がん細胞において、SWI/SNFクロマチンリモデリング複合体のBRG1の変異が高頻度に観察されている。そこで肺がん細胞を用いて、他のクロマチンリモデリング因子の発現量を観察した。その結果、ISWIクロマチンリモデリング複合体の中でも特に触媒サプユニットのACF1, SNF2Hの発現が一部減少していることが明らかになった。現在、これらの発現低下癌細胞を用いて、放射線或受性と抗がん剤感受性を検討中である。
寺祭
今回の結果より、DSBの誘導により転写の伸長に関わる因子の一部が転写活性化部位から離脱することにより、伸長の時期が抑制されることが明らかになった。また、転写伸長時期のマーカーであるRNApolymerase IIのS2のリン酸化も減少した。このことにより、DSBが起きた際には、転写の開始よりもRNA polymerase IIがRNAを合成している時期である転写伸長期のRNA polymecase IIのリン酸化を制御することにより、RNA polymerase IIのテンプレートDNA上の移動が抑制されるのではないかと考えられた。また、このRNA polymerase IIのリン酸化の変化に伴って、この際に特にH3K4のジメチルとトリメチルが減少すること、それとは反対にH2AK119のユピキチン化が誘導されることが明らかになった。このことにより、DSBの誘導によりTrithorax群に属するMLLの活性が弱まり、一方でPolycomb 群に属する PRC1 の活性が上昇することが明らかになった。このため、RNA polymerase IIのテンプレートDNA上の移動とクロマチン構造の変化が機能的に関連することにより、転写の伸長期が抑制される可能性が示唆された。今後はさらに、Trithorax群とPolycomb群の酵素と、これらのヒストン修飾に影響を与える因子のノックダウンした際の影響を観察することにより、どのようなクロマチンの構造変化が転写の伸長期を抑制しているのかを明らかにしたい。