1. はじめに
酒造楽における醸造過程の醍酵制御・管理は，製品の品質を保つために重要な要素である．このため最近では，酸酸に関与する酵母菌や乳酸菌の状態を，酸造工程内でオンラインかつリアルタイム計測する試みがなされている．酵母をはじめとする微生物が，絶緑体である細胞膜の中に導電性の細胞質が含まれている誘竜体であることに箸眼し，酵母懸濁液のੌ酔過程を常時モニタリングできる誘電計測プロープの研究開発成果が報告されている¹. ²).しかしながらこれらの計測法は，酵母を含んだ懸濁液自体の誘電率を評価する手法であり，分析原理上，大量の試料が必要（数百mLオーダー）となる．また現時点で，リアルタイム制御のシステム構築には至っていない.一方，半導体製造技術などを応用した微細加工によるマイクロセルを用いた誘電泳動研究も盛んであり,誘電泳動力による生体分子ハンドリング³ﾂまたは誘電泳動インピーダンス計測(Dielectrophoretic Impedance Measurement, DEPIM）による微生物モニタリング法について種々の報告がなされている46.これらの特徴として，対象となる微生物などを微細な電極セル上に捕集することにより，マイクロスケールでの定量・定性測定が可能となる点が挙げられる.さらに誘電泳動力のみでなく，抗原抗体反応原理を併用し，電極セル間で標的菌のみを選択的に保持させる方法りや,竜極を立体的に組み合わせた簡易型フローサイトメトリーの開発 §など，その内容は多岐にわたる．その他にも，生死細胞の分離法としての誘電泳動用電極セルも研究されている9-12).ところで我々は，現在までに幾つかの電極パターンを有するマイクロセルを作製し, DEPIM法を用いて微生物に対する濃縮特性を評価している139.これらの実験結果から,我々は,先に述べた酵母の酸酸状態に代表される微生物の代謝活性を評価する手段として，マイクロスケールDEPIM法による検査法が，極めて有効であると考えている.これらを踏まえ，本研究では，今までに得られたマイクロセルによる微生物濃縮技術に加え，微生物の代謝活性状態をリアルタイムで計測できるDEPIM法を確立することを目的としている．本報では，大腸菌（Eschericia coli）に加温処理を施すことによって，実験的に菌状態に変化を与え，その状態の相達をマイクロセルによるDEPIM法で評価した結果を加温処理ストレスは，微生物の細胞質膜，細胞質のタンパク質，酵素を損傷及び失活させることが知られている 14, 15).これらのことは，微生物の代謝活性に影響を与えることを示唆しており，今回の実験で得られたコンダクタンス値から菌の代謝活性状態の相達が間接的に確認されたと推測される.これらの研究成果は，従来法では見られないような，省電力，低竜圧，迅速，高性能などの特徴を有する小型簡易管理システムを構築することが充分可能であることを示唆している。
2. 誘電泳動理論
誘電泳動法とは，電界勾配と粒子との分極を利用し，液体中の粒子を操作する手法である16, 17).媒質の誘電率ε」,導電率σ」,粒子の誘電率ε,導電率σ,として，それぞれの複素誘電率を
とおくと，不均一電界での誘電泳動力Fは,次式（2)
ただし, Rは粒子半径, Eは電界である.ここでÎ(ω)は,
で与えられる，交流電界でのClausius-Mossotti関数である.上式より明らかなように，誘電泳動力は，電界分布，電界周波数，粒子及び懸濁液の複素誘電率，粒子体積に強い依存性を示す.誘電泳動現象により，細菌等を濃縮し,それら濃縮した細菌群を電気インピーダンスとして検出する方法を,一般に誘電泳動インピーダンス計測（DEPIM）法と呼ぶ18).
3. 実験方法
誘電泳動電極
3.1
竜泳動竜極を用いたマイクロセルをFig  1に示す. マイクロセルは，誘竜泳動竜極セル，流路，竜極セルホルダーからなる.竜極セルにおける微生物捕集部竜極パターンをFig 2に示す. 一本の電極は5.0 mm(L)×0.1 mm(W)である.  10本の竜極を等間隔に並列配置しており,同形の竜極10本を対面から交互に組み合わせる事によって,櫛形電極群を配置した.各電極の間隔は，10 μ mである。また，流路の材質として，軟性ポリジメチルシロキサン（PDMS）を採用した.  PDMSには，液体試科が竜極セル表面に接するように，55 mm(L)×
( 3 ) 3 mm(W)×0.5 mm(T)の流路を形成した.各配管は, 1.0 mm× 2.0 mmのテフロンチュープを使用した.チュープコネクターには，テフロン製フランジレスナットを採用した.
電極セル作製方法
3.2
60 mm(L)×20 mm(W)×1.0 mm(T)の石英ガラスにCrを0.1 μ m全面皮膜したのち, Cr成膜基板にフォトレジストを塗布した．櫛形電極形に成形されたフォトマスクを使用しての露光・現像処理を行い，硝酸第二セリウムアンモニウムによるCrエッチングを実施した.最終的に99.9 %アセトン溶液でフォトレジストを剥離することによって櫛形電極のパターニングを行った.電極表面上には絶緑層として, SiOを0.3 μm成藤した．加えて，竜極表面における微生物，細胞などの非特異的反応（吸着）を抑制する効果を有する界面親和剤199 （主成分：りん脂質）を竜極表面に吸着させた. この吸着条件は実験的に確立した. Photograph of the assembled DEPAM micro-cell
実験菌種及び調整方法
3.3
実験菌種は, Eschericia coli K1株 ATCC 11775 (以下, E. coli)を用いた.  E.coliは,大きさ1－1.5×2－6  μ mの通性嫌気性グラム陰性桿菌である‰.まず, E.coli K1標準菌株(Culti-Loops, Remel)を，標準寒天培地（日本製薬)上に途布し, 309.15 K (36 ℃) , 24 hの条件で増菌培養した.培養後，滅菌済み0.1 M  D-マンニトール（DM）溶液１ mLに, E. coliを適量混和させた後，遠心分瞳（6000 rpm×10 min）を行い，分離沈殿したE. coliを同DM溶液で２回洗浄した．洗浄済みE. coliを,あらたなDM溶液に混和したものを懸濁原液とし，混釈平板培養法によって懸濁原液の菌濃度を計測した．懸濁原液のE. coli濃度は約1.1×108 CFU/mLであった．このとき使用した培地及び培養条件は上記と同様である．実験期間中，懸濁原液は菌の増殖，減少等を制御するため, 277.15 K (4 ℃)で保管した.
3.4     菌の加温処理
本実験では，代謝活性能力の異なるE. coliを作製する手段として，熱処理によるストレス負荷を用いた²¹). 277.15 Kで保管されていた懸濁原液１ mLを，滅菌済みスクリューキャップチュープに分取した後，水温を288.15 K (15 ℃) , 300.15 K (27 ℃), 309.15 K (36 ℃), 320.15 K (47 ℃)及び353.15 K (80 ℃)に設定したウォーターバス内でそれぞれ15 min加温した.同時に,低温保管によるE. coliの代謝活性変化を確認するため，277.15 K（4 ℃）で保管したサンプルについても実験を行った．また，加温処理による活性E. coli変化量を調査するため，DM溶液で10 − 10倍希釈した各処理サンプル1 mLを，減菌済みベトリ皿２枚ずつに分注し，混釈平板培養法によって生育するコロニ一数を計測した.培地及び培養条件は,上記3.3と同様とした.なお,誘電泳動実験は行っていないが，追加で333.15 K（60 ℃）の温度でも加温処理を実施し，コロニー生育数を計測した. 3.5加温処理を施した各サンプルに対し誘電泳動実験を行い,どのような挙動特性を有するか調査した．誘竜泳動実験系概略をFig. 3に示す. 竜極セルへの竜圧印加にはファンクションジェネレータ（AFG3022, Tektronix）を使用し，その印加電圧をオシロスコープ（TDS3052B, Tektronix）で連続測定した．実験では，正弦波電圧設定値の電圧幅を10 Vp-pに固定し，周波数を100 kHz及び1.0 MHzとした．竜極セルへの送液には送液ポンプ（PSM050DA, Advantec）を使用した.流速は60 mL/hとした.電極セルにおける微生物捕集状況は,光学顕微鏡(LV100, Nikon)を用いてリアルタイムで観察し,それらの様子は,画像・映像処理装置を用いて適時記録した.また，回路中に抵抗器（430 Ω）を設置し，そこにかかる電圧変動をロックインアンプ（Model-SR844, SRS）で連続測定することによって，間接的に竜極間のコンダクタンスを算出した．ロックインアンプからの出力は，データロガー (EZ5840, NF)を介して，データ処理装置へ連続的に取り込んだ.データの採取手順として，送液ポンプ稼動と同時に印加を開始し, 90 sec後に加温処理したE. coliサンプルをDM溶液入りサンプルビンに注入した.最終E. coli懸濁液濃度は,約1.1 × 10 7 CFU/mLとなるようにした.加温処理から誘電泳動実験実施までの時間は３minとした.印加開始900 secに達した時点で印加を停止した.
4. 実験結果及び考察
4.1
加温処理による菌の生育特性
加温処理温度とE. coliコロニー生育数との関係をFig. 4に示す.ここでは, 277.15 K処理時のコロニ一数(Ct277.15)を基準とし，各処理温度によるコロニー数を相対値(C / Ct277.15)で示した.加温処理温度が277.15 K −309.15 Kの範囲では，コロニー生育数に大きな差異は見られないが， 320.15 K (47  ℃)での発育数は277.15 K時と比較してほぼ半滅し，それ以上の温度になると，E. coliは寒天培地上に生育しなかった.一般に，微生物は加熱によって強いストレス負荷を受けると，細胞の一部が毀損し，菌はいわゆる損傷菌と呼ばれる状態となる.損傷菌は,加熱だけでなく冷蔵,冷凍,コールドショックなどによるストレス要因によっても発生することが知られており²²，さらに，単純に処理温度だけではなく，今回の実験のように，277.15 K（4 ℃）で保管したサンプルをウォーターバスで急速に加温することによっても,菌の状態に多大な影響を及ぼすことが報告されている²³).これらのことから，比較的低温領域においても，条件によって損傷菌が形成されるものと推測される. これらの菌は,損傷の程度によって，今回用いた標準寒天培地などの非選択培地上において回復し，生育できることが報告されている221.すなわち,今回333.15 K (60 ℃)以上の温度で処理されたE. coliが充分に発育出来なかったのは，細胞質膜等のタンパク質の熱変性，或いは細胞表面全体の著しい損傷によって代謝括性機能を失ったため，回復することが出来なかったものと推測される.
加温処理による誘電泳動特性の計測
4.2
印加時間と印加開始時からのコンダクタンス変化量( △ G)との関係例をFig. 5に示す.印加開始[1]から90 sec後にE  .coliサンプルを注入したところ[2],約100 sec付近から電極間にE. coliが捕捉され始めるのと同時にコンダクタンスの上昇が見られ[3], Fig. 6 (b)に示すとおり電極問にパールチェーンが形成された.パールチェーンは,流れ方向にスライドし，最終的には電極下流部に集結した．印加停止[4]と同時に捕捉されていたE. coliが瞬時に放出された．また，界面親和剤の効果により，電極間に残存するE. coliは極めて少なく, Fig. 6 (c)のとおり電極への付着も殆ど確認されなかった. Fig  7に，周波数100 kHz時における加温処理温度とΔ Gとの関係を示す.ここでは，印加開始300, 600及び900 sec時点の△Gをプロットした. この図から，処理温度の上昇に伴い最終的な△Gは高くなり，300.15 K (27 ℃)付近で最も高い値を示すことが分かる．ただしそれ以降，加温処理温度の上昇と共に△Ｇは低下し，完全に失活したと思われる353.15 K (80 C)では, 300 sec時の△Gは高いものの, G [ μ Fig. 5  Relationship between ∆G and test time. (Applied voltage:10 Vp-p, Frequency:1.0 MHz, Heat treatment  temperature:320.15  K)加温処理温度とΔGの関係(周波数: 100 kHz,図7印加電圧：10 Vp-p) Fig. 7  Relationship between ∆G and heat treatment temperature at 100 kHz and 10 Vp-p最終的に大きな△Gの上昇は見られなかった.  △Gの変動の差異は,測定時間内におけるE. coli捕集量及びパールチェーンの形成状況が，周波数及び加温処理条件によって変化したことに起因するものと考えられる。また，電極問のほか，電極エッジ部にE. coliが捕捉される現象が確認された.これはエッジ部にも強力なF orが作用したためと考えられる.また, 277.15  K − 309.15  Kの範囲における△G変動傾向とFig.  4のE. coliコロニー生育数を比較した場合，特に明確な相関は見られないことが分かる.一方, Fig. 8に示したとおり,周波数1.0  MHz時の場合, 277.15  K −320.15  Kの範囲において△Gに大きな変動は見られなかった．また，100 kHz時とは異なり，353.15 KでのΔG上昇は全く見られなかった．この場合，測定中，竜極間にE. coliは殆ど保持されず，パールチェーンの形成も見られなかったことが確認された．通常，生細胞と死細胞では誘竜泳動特性が大きく異なることが知られており，この性質を利用して，生・死菌を分離する研究報告がなされているが9-12),今回の実験でも活性（生死）状態の相達による誘電泳動特性の変化が確認されたといえる.代謝活性とコンダクタンス変化の相関検討4.3 ２節で示した式（３）について， τ мw をMaxwell-Wagnerの誘電緩和時間として
とおくと， Clausius-Mossotti関数は,
加温処理温度とΔGの関係(周波数: 1.0  MHz,区区８印加電圧: 10 Vp-p) Fig. 8 Relationship between ΔG and heat treatment temperature at 1.0 MHz and 10 Vp-p
これらのことから，誘電泳動による力の方向と大きさの関係は，低周波数ではクレおよびク,の大小に依存し，高周波数ではε」およびε,の大小に依存することが分かる. つまりこれらの関係から，処理温度変化による， σ / εの変動を見極めることができる.菌体内或いは細胞内などの生体内では,各種態,アミノ酸,脂質などが互いに密接な関連性を持ち，それぞれ独自の代謝経路を経て一定の速度を保ちながら代謝される．この代謝活動は，各代謝系に関与する酵素活性によるものであること,また代謝調節は，生体内酵素活性変化及び酵素量の増減に依存することが知られている²².酵素は特異的な立体構造を持つタンパク質であるが，タンパク質は温度によって構造が変化するうえ，酵素反応速度は，pH，温度との相関が高い.ここで，先述のとおり，加温処理によるストレス負荷は, E. coli外層の細胞壁あるいはその内側にある細胞質膜を構成するタンパク質の変性或いは破損を引き起こすという報告がある。それと同時に，このような状態では菌体内の各種イオンまたは核酸関連物質の漏洩，結及びアミノ酸の基質輸送能の低下，菌体内でのタンバク質延集，各種酵素の失活などの諸現象が生じることが知られている¹5).さらに,微生物の致死効果は，熱による一次的作用だけではなく，熱による細胞12く発生し，それによって酸化的損傷が発生して死に至る場合があるとの報告がある19.このことから，熱処理によって,呼吸活性が低下し，呼吸系代謝経路に何らかの影響を与えている可能性があるといえる.これら要因の複合的作用により, E. coliの代謝活性状態は変動し，さらにE. coliのσ及びεはストレス負荷の強度によって大きく変動すると考えられる.今回の実験では，周波数100 kHzの場合，加温処理条件の相達によって，△Ｇの値に大きな変動が見られた一方で，1.0 MHz時では，死菌状態となった353.15 K (80 ℃)時以外で，殆ど△Gの変動が見られないという現象が確認された．これは,加温処理によるストレス負荷に起因する。及びεの各変動量を比較した場合，前者の方がより支配的であったため，低周波での△ G変動が顕著に現れたものと推測される.今回, σが大きく変動した要因は,おそらく菌体内イオン流失量あるいは菌のDMに対する吸収・分解能力の相達によるものと考えられる.
5.まとめ
今回我々は，E. coliに加温処理を施すことによって，実験的に菌状態に変化を与え，その状態の相達をマイクロセルおよびDEPIM法で評価することを試みた．本実験結果は，将来的に，菌の代謝活性状態をリアルタイムでモニタリングできる可能性を示唆している．今後更に竜極セルの形状，竜極パターンなどを見直すこと，また得られた情報から温度制御などを行うためのフィードバック機構を開発することにより,将来，精度の高い製造ライン管理システムを構築することが出来るものと期待できる.本実験では加温処理によって菌の代謝活性状態を調整したが，他の加温条件，或いは他の手法（例えば薬剤投与，pH変動等）を用いて菌の代謝活性状態を変化させた場合に，どの様な誘電泳動特性を示すかについても追加確認したい．今回の実験結果は，加温処理によるストレス負荷が，特にE. coliの導電率を大きく変化させたことを示唆している.これは, E.coli菌体のタンパク質変性，あるいは菌体内からのイオン物質の漏洩現象などに起因していると推測されるが，今回の実験結果からは，具体的な代謝活性変動の特定には至っておらず，更なる調査が必要であると思われる．今後，処理を施した菌の損傷度合いを評価するためにSEM及び染色法等での外観観察を実施する予定である。また，菌体内物質変化を直接評価する方法として，熱或いは低温ショック応答によるRNA変性調査などを行うことによって,各種ストレスと代謝活性の関連性について調査を進めていく．また今回は，比較的扱いが容易なE. coliを実験菌株として用いたが，今後，実際の醸造工程を想定し，顧酵に関与する酵母についての代謝活性モニタリング実験を行う予定である.