荻原　秀明国立がん研究センター研究所がん治療学研究分野Key words：がんゲノム医療、肺がん、若年性がん、クロマチン制御異常、合成致死性
箱 富
がんの遺伝子変異に基づいた分子標的治療法は、がん遺伝子の活性化を起因とするがんに対して、その活性化した遺伝子産物（タンパク質）を標的とする。一方で、がん抑制遺伝子などの機能喪失異常を起因とするがんでは機能喪失ゆえにそれを単純には阻害できない。このようながんを治療するには機能喪失した遺伝子との合成致死性因子を発見し、それを創薬標的とする必要がある。 “合成致死性”とは1つの遺伝子だけが機能阻害されても細胞の生存に影響はないが2つの遺伝子の機能が両方阻苦されたときに細胞が致死となる現象である。ある遺伝子Ａが機能喪失変異したがん患者がいた場合、この患者に遺伝子Aとの合成致死因子Bの阻害薬を用いて治療したとする。がん細胞では遺伝子Aの機能喪失に加えてBも阻害することで合成致死となる。一方で、がん細胞以外の全身の正常細胞では、Aは正常なためBだけを阻害しても正常細胞の生存への影響は少ないと考えられる。このように合成致死性を利用したがん治療法（合成致死治療法）は、がん特異性が高く、副作用の少ない治療が期待できる。これまでに研究代表者らはクロマチン制御遺伝子が徐々ながんで高頻度に機能喪失性の遺伝子変異があることに着目してきた。それらの中で、クロマチン制御遺伝子BRG1、CBP、ARID1Aは、がんの中でも離治がんである肺腺がん、小細胞肺がん、卵巣明細胞がんで高頻度に機能喪失性変異がある。そのような状況の中で研究代表者らは、これらの遺伝子との合成致死標的を探索し、BRM、p300、GCLCをそれぞれ同定し、合成致死性のメカニズムを解明し、クロマチン制御遺伝子欠損がんにおける合成致死治療法を提唱してきた[1～3]。 SWI/SNFクロマチンリモデリング複合体は、BRG1を含む複合体とBRM含む複合体が相互排他的に別々に存在する。今までに研究代表者らはBRG1欠損がんでBRMを抑制するとがん細胞が合成致死となることを明らかにしてきた[3]。この結果は、BRG1欠損がん細胞はBRM（を含む複合体）がないと生きられないということを意味する。ところがBRG1とBRMの両方が欠損したがんも存在することが分かった。我々のデータでは非小細胞肺がん症例103例においてBRG1単独欠損患者は10％だったがBRG1・BRM両方欠損患者が6％も存在した。さらには他のグループからも同様の報告が追随して報告された。BRG1およびBRMが両方欠損した症例は非小細胞肺がん（10％）、肺大細胞がん (31%)、肺多形がん (23%)、小細胞卵巣がん・胸部肉腫 (100%)でも存在した [4～7]。このようにBRG1とBRMの両方が欠損したがん（SWI/SNF欠損がん）が存在しうる。 SWI/SNF欠損がんはいずれのがん種においても未分化がんであり悪性度が高く予後の悪いがんである。とくに難治がんである肺腺がんは毎年50万人以上の死因となる。そして肺腺がんの10％（5万人以上）でBRG1とBRMが両方欠損している。そこで本研究では、SWI/SNF欠損がんにおける有望な治療標的を同定することで、SWI/SNF欠損がんを対象とした合成致死治療法の開発を目指す。まずSWI/SNF欠損がんにおける合成致死標的を同定する。そして合成致死性のメカニズムを解明することで創薬開発および臨床応用の基盤となる科学的根拠を明らかにする。最終的には、その成果を製薬会社へ橋渡しすることで、共同研究としてSWI/SNF欠損がんに有望な標的に対する阻害薬の創薬開発を目指す。本研究の成果は、一般がんである肺がんにおける治療法を確立させた上で、希少がんである卵巣小細胞がんや胸部肉腫等の治療法の確立へと発展させることが期待できる。

1. SWI/SNF欠損がんの依存性クロマチンリモデリング複合体の探索
SWI/SNF欠損がんが依存するクロマチンリモデリング複合体を探索するために、ヒト細胞で20種類ほど存在するクロマチンリモデリング複合体のATP加水分解酵素因子（複合体の機能に必須因子）をsiRNAでノックダウンしたときに、SWI/SNF 欠損型細胞株で選択的に致死性を示す複合体因子のsiRNA スクリーニングを行った。その結果、各複合体を抑制した時にSWI/SNF複合体正常型細胞株（WT）の生存率には影響がなく、SWI/SNF複合体欠損型細胞株（SWI/SNF-）において生存率が顕著に低下する因子として、X（複合体）とY（複合体）を同定した（図1)。図1. SWI/SNF欠損がんの依存性クロマチンリモデリング複合体の探索SWI/SNF複合体正常型細胞株（WT）およびSWI/SNF複合体久損型細胞株(SWI/SNF-)において、クロマチンリモデリング複合体のATPaseサプユニット遺伝子をノックダウンした後、6日後の生存率をヒートマップで示した。
2.細胞株パネルにおけるXとYの抑制による合成致死性の検証
次に、上記のスクリーニングの結果を検証するために細胞株パネルにおいて、XあるいはYをsiRNAでノックダウンしたときの生存率への影響を調べた。XあるいはYをノックダウンしたとき、正常型細胞株(WT : BRG1 + /BRM + )にはほとんど影響が認められなかったが、SWI/SNF欠損型（BRG1-/BRM-）細胞株群で特異的に細胞増殖が顕著に抑制された（図2a）。また、XあるいはYをsiRNAでノックダウンすると、SWI/SNF欠損型（BRG1-7BRM-）細胞で選択的にコロニー形成が抑制された（図2b）。しかし、BRG1単独欠損細胞株（BRG1-/BRM+）では、XあるいはYをsiRNAでノックダウンしても、細胞増殖の抑制は部分的であった（図2a）。これらの結果から、BRG1とBRMが両方を欠損した細胞株において、XあるいはYを抑制すると選択的に致死性を示すことが考えられた。 2図2.細胞株パネルにおけるXとYの抑制による合成致死性の検証a） SWI/SNF 複合体正常型細胞株（WT）および SWI/SNF 複合体欠損型細胞株(BRG1-/BRM-) 、BRG1久損細胞株（BRG1-/BRM+）において、クロマチンリモデリング複合体因子XあるいはYをノックダウンした後、6日後の生存率を示した。 b)  SWI/SNF 複合体正常型細胞株（WT）および SWI/SNF 複合体欠損型細胞株(BRG1-/BRM-) 、BRG1欠損細胞株(BRG1-・BRM-)において、クロマチンリモデリング複合体因子XあるいはYをノックダウンした後、14日後のコロニー形成を示した。
3.  X/Yの抑制による合成致死性はBRG1とBRMの両方の欠損に特異的である
SWI/SNF欠損型（BRG1-7BRM-）細胞において、XあるいはYを抑制することで細胞が死ぬ現象が、BRG1とBRMの両方が欠損していることに特異的な現象であるかを検討した。まず、SWI/SNF欠損型細胞株(BRG1-/BRM-)  SBC-5にBRG1のcDNAをレンチウイルスで導入し、薬剤選択された細胞株をクローン化した細胞株を樹立した。BRG1の導入によるタンパク質の発現を確認するためにウエスタンプロッティング法によって、 SWI/SNF複合体欠損型細胞株（BRG1~/BRM~）SBC-5におけるBRG1のcDNAを導入した細胞株（+BRG1）と未導入細胞株(−BRG1)のBRG1の発現を確認した。その結果、SWI/SNF複合体欠損型細胞株(BRG1−/BRM−) SBC- 5におけるBRG1導入細胞株を樹立に成功した（図3a）。そこで、SWI/SNF複合体欠損型細胞株（BRG1-/BRM-） SBC-5におけるBRG1のcDNAを導入した細胞株（+BRG1）と未導入細胞株（−BRG1）において、XあるいはYを抑制した時の生存率への影響を検討した。SWI/SNF欠損型（BRG1-/BRM-）細胞は、XあるいはYのsiRNAによるノックダウンによって、致死性を示したが、その致死性はBRG1を導入した細胞株で救済された（図3)。これらの結果から、BRG1とBRMの両方が欠損した細胞で、XあるいはYを抑制すると致死となることが考えられた。図3. X/Yの抑制による合成致死性はBRG1とBRMの両方の欠損に特異的であるSWI/SNF複合体欠損型細胞株（BRG1-/BRM-）SBC-5におけるBRG1のa) cDNA を導入した細胞株（+BRG1）と未導入細胞株（−BRG1）のウエスタンプロッティング法によるBRG1の発現を確認した。ローディングコントロールとしてβ -Actinを検出した。 b、c） SWI/SNF複合体欠損型細胞株（BRG1-7/BRM-）SBC-5のBRG1のcDNAを導入した細胞株（+BRG1）と未導入細胞株（−BRG1）において、クロマチンリモデリング複合体因子X（a）あるいはY（b）をノックダウンした後、 6日後の生存率を示した。
村 東
肺がんは5年生存率が40%ほどの離治がんである。肺がん患者の中で分子標的治療法が適用されるのはEGFRやALK遺伝子変異患者に限定される。これらの遺伝子変異のない患者と相互排他的にSWI/SNF欠損がん患者が存在する。つまり、SWI/SNF欠損がん患者は治療法が確立されていない。本研究では、SWI/SNF欠損がんに有望な治療標的としてクロマチンリモデリング複合体因子であるXおよびYを同定した。今後の研究を発展させて、X阻害薬やY阻害薬を創薬開発することで、これまでに治療法がなかったSWI/SNF欠損型の離治性がん患者に対する治療の可能性が期待できる。本研究で同定した治療標的XおよびYは、クロマチンリモデリング複合体の機能に必須なATP分解释茶活性を持つ。現在までにクロマチンリモデリング複合体の機能を阻害する薬剤は臨床応用されていない。しかし、BRG1やBRMは、ATP分解酵素であり、BRG1/BRM阻害薬の既存薬も存在する。XおよびYの阻害薬としての標的ドメインはATPaseドメインであり、ATPとの競合的な低分子阻害薬の開発が想定される。クロマチンリモデリング複合体は、複数の因子から構成されるため、in vitroアッセイ系の構築には複数のサプユニットタンパク質の中からXあるいはYを中心としたコアとなる教個のタンパク質を精製し、in vitroで複合体を構成し、ATPase阻害活性を評価するヘイスループットスクリーニング系を構築する。また、X複合体とY複合体の構造解析の報告があることから、in silico解析により、XとYの基質であるATPポケットに適合するような候補化合物の構造展開解析が可能である。したがって、X阻害薬やY阻害薬の創薬開発も実現可能であると考えられる。実際の臨床応用を想定したとき、患者数の多い一般がんの肺腺がんの中でSWI/SNF欠損がんに有望である治療標的Xの阻害薬を製薬企業との共同で創薬開発する道筋になる。第一目標はクロマチンリモデリング因子X阻害薬を肺腺がんの治療薬として臨床応用を目指し、肺腺がんでの承認を目指す。それを基盤に、希少がんでかつ若年性がんである胸部肉腫、卵巣小細胞がん等への適応拡大を目指すことで、治療法のない患者のアンメットメディカルニーズへの貢献が期待できる。
本研究は、国立がん研究センター研究所がん治療学研究分野で行われた研究である。研究に協力して頂いた研究員の佐々木麻里子博士、特任研究員の小松崎理絵氏に御礼申し上げます。
文 欧
Ogiwara H, Takahashi K, Sasaki M, Kuroda T, Yoshida H, Watanabe R, et al. Targeting the Vulnerability of 1) Glutathione Metabolism in ARID1A-Deficient Cancers. Cancer Cell. 2019;35(2):177-90 e8. Epub 2019/01/29. doi: 10.1016/j.ccell.2018.12.009. PubMed PMID: 30686770. Ogiwara H, Sasaki M, Mitachi T, Oike T, Higuchi S, Tominaga Y, et al. Targeting p300 Addiction in CBP- 2) Deficient Cancers Causes Synthetic Lethality by Apoptotic Cell Death due to Abrogation of MYC Expression. Cancer Discov. 2016;6(4):430-45. Epub 2015/11/26. doi: 10.1158/2159-8290.CD-15-0754. PubMed PMID: 26603525. Oike T, Ogiwara H, Tominaga Y, Ito K, Ando O, Tsuta K, et al. A synthetic lethality-based strategy to treat 3) cancers harboring a genetic deficiency in the chromatin remodeling factor BRG1. Cancer Res. 2013;73(17):5508-18. Epub 2013/07/23. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-12-4593. PubMed PMID: 23872584. 4) Marquez SB, Thompson KW, Lu L, Reisman D. Beyond Mutations: Additional Mechanisms and Implications of SWI/SNF Complex Inactivation. Front Oncol. 2014;4:372. Epub 2014/01/01. doi: 10.3389/fonc.2014.00372. PubMed PMID: 25774356; PubMed Central PMCID: PMCPMC4343012. 5) Yoshimoto T, Matsubara D, Nakano T, Tamura T, Endo S, Sugiyama Y, et al. Frequent loss of the expression of multiple subunits of the SWI/SNF complex in large cell carcinoma and pleomorphic carcinoma of the lung. Pathol Int. 2015;65(11):595-602. Epub 2015/09/09. doi: 10.1111/pin.12350. PubMed PMID: 26345631. 6) Karnezis AN, Hoang LN, Coatham M, Ravn S, Almadani N, Tessier Cloutier B, et al. Loss of switch/sucrose non-fermenting complex protein expression is associated with dedifferentiation in endometrial carcinomas. Mod Pathol. 2016;29(3):302-14. Epub 2016/01/09. doi: 10.1038/modpathol.2015.155. PubMed PMID: 26743474; PubMed Central PMCID: PMCPMC4980656. 7） Yoshida A, Kobayashi E, Kubo T, Kodaira M, Motoi T, Motoi N, et al. Clinicopathological and molecular characterization of SMARCA4-deficient thoracic sarcomas with comparison to potentially related entities. Mod Pathol. 2017;30(6):797-809. Epub 2017/03/04. doi: 10.1038/modpathol.2017.11. PubMed PMID: 28256572.