マニュアル（第5版）20190305
I 製品説明
ISOGEN II (アイソジェンミ)は、動物組織および培養組胞からのtotal RNAおよびsmall RNA袖出用結案です。本品は、フェノールとグアニジンを含む均一な液体であり、編胞成分との相互作用により、シングルステップでRNAを単離できます。従来法の試薬（ISOGENやISOGEN-LS）ののようにクロロホルムを用いた液相分離の必要がありません。試判にISOGENIIを加えて溶解またはホモジナイズした後、上清水を添加すると、DNA、タンパク質、ポリサッカライド等は沈殿（不治化）するため、遠心分離によって除去できます（右沈殿図）。上清をエタノール沈殿、洗浄、溶解すると、高純度なRNAが単離できます。
■特長
・ RNAの単離にクロロホルムを使用しない。 ・従来法の試楽（ISOGENなど）よりもsmall RNAの抽出効率が良い。 ・高分子RNA（＞ 200 base)とsmall RNA（＜ 200 base)を分面できる（分面しない方法もある)。 ・DNAの混入が少なく、抽出したRNAはそのままRT-PCRや定量RT-PCRに使用できる。 •約1時間でRNAが抽出可能。
II  製品内容
Code No. 317-07363 • ISOGEN II ・マニュアル10 ml 1部皿　保　存片東保存・お買い求めになった日から6ヶ月以内にご使用下さい。 ・本品は室温で送付しております。製品到着後、2〜10℃で保存していただくことにより、問題なくご使用いただけます。
IV　使用上の注意
・本品は、試験研究用試楽ですので、医薬品、その他の目的にはご使用になれません。 ・また、試薬についての基本的な知識のある方以外は取り扱わないで下さい。 ・ISOGEN IIは医薬用外劇物（フェノール製剤）ですので、取り扱いにはご注意下さい。 ・ご使用の際には適切な保護具（予袋、眼鏡等）を着用して下さい。 ・蒸気を吸入しないようにし、換気を十分に行って下さい。 ・目に入ったり皮膚に付着したりした場合は、大量の水で少なくとも15分間は洗い流し、医師の診察を受けて下さい。 ・本品の取り扱いは、マニュアル記載内容通りに行って下さい。 ・マニュアル記載内容と異なった取り扱いによるトラブルにつきましては、弊社では責任を負いかねます。 ・安全性データシート（SDS）につきましては、ニッポンジーンホームベージ( https://www.nippongene.com/siyaku/list.html ）にてご覧いただけます。
V ブロトコール
・本品以外にRNaseフリー水、エタノール、イソプロバノールを用意する。 ・必要に応じて、別途p-Bromoanisole（富士7ｲ払和光純薬㈱, Code No.027-16801）、 Glycogen（富士7ｲﾙﾑ和光純薬掛, Code No.076-06621）を用意する。 ・チューブは透明なポリプロビレン製を用いるとよい。使用前に、遠心分離の強度(12 K×g)とISOGENII （フェノール）に対する耐性があるか確認する。 ・プロトコールでは1 mlのISOGEN IIを添加する方法を記載しており、その場合2.0 ml容量のチューブが必要であるが、抽出スケールを使用する遠心チューブの容量に合わせてもよい。例えば、プロトコールを0.8倍にスケールダウンすると 1.5 ml容量のチューブで使用できる（組織～80 mg＋ISOGENII  0.8 ml＋RNaseフリー水 0.32 mlの混合物を遠心分離して、上清を0.8 ml回収する)。 ・全ての操作は室温で行えるが、遠心は4〜28℃で行うことを勧める。サンプル、目的に応じてAまたはBの方法でRNAを単離する。 A : total RNAの単語（高分子RNAとsmall RNAを別々に単結する場合） A-1 :高分子RNAの単離A-2 : small RNAの単離B : total RNAの単離（高分子RNAとsmall RNAを合わせて単離する場合） A： total RNAの単離（高分子RNAとsmall RNAを別々に単離する場合）
A-1 :高分子RNAの単酸
サンブル* ¹) (組織： ～100 mg、細胞：捨菱ディッシュ（10 cm²）または～107編胞、液体試料： 0.4 ml) 1 ml  ISOGEN II溶解またはホモジナイゼーション*9 0.4 ml（または0.4倍量）　 RNaseフリー水15秒間、激しくシェイクして漫合室温　5〜15分間・3放置違心（12Ｋ×g, 15分間） ↑
清（1 ml :このとき上清は全量取らない）* 9
p-Bromoanisdle 5 μl（または0.5%量） 15秒間、シェイクして漫合オブション・9 C 9室温　3〜5分間　放置違心（12Ｋ×g, 10分間）清+ 75%エタノール　転倒漫和0.4 ml（または0.4倍量）室温　10分間　放置違心（12 K×g, 8分間)
A-2 : small RNAの単語
A-1のエタノール沈殿後に得られた上清・9
もう一図繰り返す
サンブル* ¹〉 (組織： ～100 mg、細胞：培養ディッシュ（10 cm²）または～107編胞、液体試料： 0.4 ml) + 1 ml  ISOGEN II +溶解またはホモジナイゼーション*9 0.4 ml（または0.4倍量）　 RNaseフリー水15秒間、激しくシェイクして漫合室温　5〜15分間・3放置違心（12Ｋ×g, 15分間）* <<< F-清(1 ml :このとき上清は金量取らない) * 9 t p-Bromoanisdleオブション・9
Ad清+ 1 ml (または等倍量)イソブロパノール　転倒混和室温　10分間　放置違心（12 K × g, 10分間) <そ法　殷・7 0.5 ml  75%エタノール*9違心（4 K~8 K×g, 1~3分間） < <法 魚もう一回繰り返すRNaseフリー水* 10 total RNA清液・15
*1）無機の場合、ISOGEN II  1 mlあたり100 mgを上限として、ガラステフロンホモジナイザーまたはポリトロンホモジナイザーでホモジナイゼーションする。突雑物の多い組織（肝殿や降殿など）の場合、ISOGENII  1 mlあたり使用する組織の量は50 mgにする。ブロトコールでは1 mlのISOGEN IIを添加する方法を記載しているが、使用する違心チューブの容量に合わせてもよい。残りのホモジネートは凍結して保存できる。*2）参照鉄着無酸の場合、培養ディッシュから増地を除去し、3.5 cmディッシュ（10 cm²）あたり少なくとも１ mlのISOGENIIを加え、ピペッティングして完全に溶解する。使用するISOGEN Iの量は、細胞数ではなく培養ディッシュの面積をもとにする。理達無酸の場合、造心分離して編胞を沈殿させた後、増地を除去し、107編胞あたり少なくとも1 mlのISOGEN IIを加え、ピペッティングして編胞を溶解する。培養細胞は、トリブシン処理や洗浄などの前処理をすると、RNAの分解が起こる可能性があるため、哈地の除去後すぐにISOGEN IIを加える。また、使用するISOGEN IIの量が試料に対して不十分な場合、単離したRNAにDNAが混入することがある。應体試験の場合、0.4 mlまでの液体試料に対し1 mlのISOGEN IIを加え、溶解する。0.4 mlに満たない少量の液体試料で行う場合は、試料と1 mlのISOGEN IIをいったん混合した後、混合液がトータル1.4 mlになるようにRNaseフリー水を追加する。この後、室温で5～15分間放置する操作に進む。全血の場合、ISOGEN-LSの使用を勧める。農意が多い試料の場合、ホモジネートを一度12Ｋ×ｇで5分間違心する。このとき脂肪はチューブの最上層に集まるので、ビベットやシリンジで脂肪層を貫通して上清を取り、新しいチューブに移す。造心操作を4～10℃で行うと、脂肪層が固まり、操作しやすくなる。 *2）RNAの純度と収量を維持するため、組織の摘出を表早くすることと効果的にホモジナイズすることが重要である。 ・摘出した組織はISOGEN I中ですぐにホモジナイズするか、透やかに液体窒素中で凍結させる、 ・ホモジナイズ方法は、ハイスピードにセットしたポリトロンホモジナイザーで2〜3分破砕する方法が最も効果的である。版サンプルは泡立ちやすいので、ガラステフロン製のホモジナイザーを使用する。 • RNaseを多く含む組織の場合、RNAの分解を防ぐため、冷したISOGEN IIを使用する。 ・結織の重量を測定する際には、チューブにあらかじめISOGEN IIを1～5 ml入れ、電子天称に載せてゼロ合わせする。その中に摘出直後の新鮮な細織または漆結組織を入れて重量を測定し、すぐにホモジナイズする。組織をいったん破砕した後、不足分のISOGEN IIを追加し、再態濁する〈例えば、組織80 mgに対してISOGEN II 1 mlの比率にする〉。 ・ホモジネートは4℃で一晩、－20℃またはは－70℃で少なくとも1年間保存できる。凍結保存していたホモジネートは、37〜40℃で5分間インキュベートすると融解する。 *3）サンブル処理濃度上限の100 mgの組織に1 mlのISOGENIIで処理した場合やDNAが多く含まれるサンブルの場合、15分間放置する。 *4）遠心後、DNA、タンパク質、ポリサッカライド等の多くは、チューブの底に青色の半胸体の沈殿を形成する。RNAは上涛に溶解している。例えば、組織100 mgに対してISOGEN II 1 mlで処理した場合、DNAとタンパク質の沈殿は、ホモジネートと水の混合液のトータル容量の約10%になる（組織80 mgに対してISOGEN I 1 mlであれば、約8%)。 *5）上の方から慎重に上清を1 ml（上清のトータル容量の75%）を取り、新しいチューブに移す。このときの上清には青色が残っている。沈殿にはDNAが含まれているので、沈殿近くの上清は残し、DNAを混入させないように注意する。 *6）このオブション操作を行うことで、混入していたDNA、タンパク質、ポリサッカライド等が沈殿するため、突雑物の多いサンブル（特に肝臓、腎臓、膵臓、筋肉などの組織）の場合に有効である。 *7) RNAの白い沈殿は、チューブの底に付着する。 *8）上清を新しいチューブに移し、small RNAを単離するために4℃または－20℃で保存しておく。このとき高分子RNAの混入を防ぐため、上の方から慎重に上清の85%量を取るようにする。このときの上清には薄く青色が残っている。この上清は、－20℃で少なくとも1年間保存することができる。 *9）この状態で、室温で一晩、4℃で1過間、一20℃または一70℃で1年間保存することができる。 *10)上清をマイクロビペットでできるかぎり取り除いた後、RNA沈殿を適量のRNaseフリー水で治療する。RNA沈殿を乾燥させすぎると、治療性が著しく減少する。RNA沈殿は、使用するポルテックスやビベッティングで溶解させ、室温で2～5分間放置するとよい。チューブはRNaseフリーのものを用意する。 *11）ここで単離したRNAは、200 base以上の高分子RNAで、rRNAとmRNAが含まれる。これらのRNAは、細胞内のRNAの約80〜85%を占める。残りのsmall  RNA露分はプロトコールA-2で単離できる。 *12) Glycogenを添加すると、効率良くsmall RNAを回収することができる。 *13）このときの沈殿はかなり小さく、見えにくいことがあるので注意する。 *14）ここで単離したRNAは、10〜200 baseのsmall RNAである。 *15）ここで単離したRNAは、高分子RNAとsmall RNAを含むtotal RNAである。