高松　作がん研究会がん研究所病理部Key words：人工知能，大腸癌，予後予測，mRNA，病理組織画像
箱 富
癌治療の進歩により、複数の治療の組み合わせから患者に合ったものを提供するプレシジョン医療の概念が浸透してきている。このプレシジョン医療の基盤の一つである腫瘍のゲノム情報は、治療標的となる癌の特性を表す点で極めて重要であるが、多くの場合、癌の一部の特性を把握するに過ぎず、腫瘍内不均一性を前提とした状況では、治療抵抗性などの理由により、その効果が不十分となる恐れがある。不均一な腫瘍集団を効率的に評価するためには、ある程度広範囲な腫瘍特性の把握が必要となり、病理組織標本のように腫瘍一面を対象とするのが適当と考えられるが、人間が行う従来の組織分類・評価法では定量性に限界があり、かつ再現性の保たれた評価が難しい。人工知能(AI)の活用は、この問題を解決する鍵となる。近年、医療におけるAIの応用は急速に広まりつつある。特に、深層学習を始めとするコンピュータ技術の革新は、医用画像の研究領域に大きな変化をもたらし始めている。病理組織画像もその一つであり、すでに数多くの研究成果が公表されている。ここ数年で、HE染色と特定の遺伝子変異情報をAIに学習させ、肺癌や大腸癌における遺伝子変異確率を組織画像から予測するモデルが公表されている［1，2］。これらの研究は、病理組織画像と既知因子を用いた、 AIによる教師あり学習により、患者の子後や腫瘍の特定の遺伝子変異を予測することで、効率的な医療を実践しようとする大変有益な試みである。ただ、上述のように遺伝子変異解析では腫瘍内不均一性の評価は難しく、遺伝子発現解析を行う方が、より病理組織画像との精密な関連を解析できると考えられる。本研究では、進行大腸癌の病理組織画像と患者予後情報から、それらに関連する形態学的特徴を有する腫瘍細胞集団をAIによって特定し、それらの癌成分の遺伝子発現をパネル解析することにより、第たな視点から進行大腸癌の予後を予測するモデルの確立を試みた。
方法および結果
1.研究対象症例の遺定と大腸癌病理組織スライドのデジタル化
1）研究対象症例子後予測AIモデル構築を行う症例（以下、モデル構築症例）は、がん研有明病院で2007年から2009年に治療された進行大腸癌症例（pT2およびpT3）を対象とした。術前化学療法、内視鏡切除後、多重癌、他院借用検体は除外対象とした。pT2症例とpT3症例の同一期間における症例数の差が大きいため、pT2は2007年～2009年、pT3は2008年～2009年のそれぞれ連続症例とし、前者は151症例、後者は204症例となった（症例群1）。遺伝子発現解析の対象症例（以下、発現解析症例）は、RNAの質担保のため比較的検体の新しい2020年1月から6月末までの連続症例151症例（症例群2）とした。 2）症例群分けモデル構築症例については、A :子後良好群(転移無・5年無再発生存)、B :化療後生存群(転移有・化学療法実施後５年生存)、C :化療後死亡群 (転移有・化学療法実施後５年以内に死亡)の３群とした。子後調査の結果、症例群１から除外した症例は、A群20症例（5年予後追跡不可)、B群3例（化学療法なし、または5年予後追跡不可)、C群2例（化学療法なし）であり、最終的な解析対象はpT2大腸癌 134症例とpT3大腸癌196症例となった。 3）大腸癌組織スライドガラスのデジタル化いずれの症例群も、病変の最大径を含む1～数枚の切片を画像解析対象とし、それらのスライドガラスをデジタルスライドスキャナ（浜松ホトニクス、NanoZoomer）でデジタル化（Whole-slide image：以下WSI）した。WSIファイル数（スライドガラス枚数）は、モデル構築症例で計521個、発現解析症例で210個となった。以降の解析は、 WSIから299 pixel四方のタイル画像を切り出して行った。
2.大腸癌組織面像の抽出と教師あり機械学習
1）大腸癌組織画像の抽出モデル構築症例からランダム抽出した100症例について、組織型をラベル付けしたタイル画像（計248,762枚、うち癌画像は48,503枚）を用いて、教師あり学習（ベースモデル: MobileNetV2）を行い、癌部を抽出する組織分類AIを作製した。このAIモデルを用いて、モデル構築症例全体から癌画像を抽出し、癌判定の確率が0.8以上となるタイル画像を以降の解析対象とした。モデル構築症例のうち、A群は234,252枚、B群は158,583枚、C群は33,866枚の癌部タイル画像が得られた。代表的なタイル画像を図1左に示す。 2）教師あり機械学習と予後予測モデル構築2-1）で得られたタイル画像群に対し、ABC各群の教師ラベルを付与し、教師あり学習によるAIモデル構築を行った。AIモデル精度を向上させるため、学習回数（iteration）と学習強度（learning-rate）を調整した。3群分類であるため、分類精度の最低値は0.333となるが、最終的にモデルの精度は0.510（損失関数：0.985）となった。このAIモデルにより発現解析症例（151症例、WSI 210枚）の癌タイル画像を分類した代表的な画像を図1右に示す。図1．モデル構築症例と発現解析症例におけるABC各群の代表的な組織像発現解析症例についてはAIによる各群予測値の高いタイルを表示している。左半分と右半分は全く別のコホートであるが、AIがABC各群と推定した画像は類似の組織学的特徴を有していることが確認できる。なお、いずれのタイル画像もそれぞれ別の症例から選抜した。タイル画像１片＝300 μ m。
3.発現解析症例の予後予測マップ作製と各群のRNA抽出
1）予後予測マップの作製
2-2）で得られたAIモデルを用いて、発現解析症例151症例を対象としたタイル画像ベースの予後予測マップを作製した。各群の代表的なマップを図2に示す。ABCの各群で出現頻度が高いと予測される同一種類のタイルが集簇しクラスタを形成する症例（以下、A／B／C群子測症例）を、それぞれの群のタイル教の上位から選抜した。A群予測タイルとC群予測タイルは集漿する症例が多くみられたが、B群予測タイルは概して散在する傾向があり、選択的組織ダイセクションでゲノムを収集しうる症例が少なかった。結果として、ダイセクションの対象症例は、A群予測症例は12症例、B群予測症例は6症例、C群予測症例は12症例となった。 2) RNA抽出3-1）で選抜した計30症例について、AIによる子後予測マップを参照しつつ、各群に予測する成分のみをFFPE切片（各症例につき10 μ m厚切片5枚）から選択的組織ダイセクションで回収した。同様に、背景粘膜部分もコントロールサンプルとして８サンプル分回収した。そして、それぞれのFFPEサンプルから全RNAを抽出した（RNeasy for FFPE kit、Qiagen社）。RNAの断片化度合を測定するクオリティチェックはTapeStation（Agilent Technologies社）で行い、mRNA収量を見積もるため、300 nt以上の長さをもつRNAの比率を算出した。結果として、300 nt以上のRNAが40%未満であったコントロールサンプル２検体分を除外し、36検体を対象に以降の発現解析を行った。図2.発現解析症例の予後予測マップ緑色タイル: A群子測、水色タイル: B群子測、赤色タイル: C群子測、灰色タイル:焼以外の組織型。各色のタイルが密に集族している部分を選択的にダイセクションした。ＡはＡ群予測タイルでほぼ占められており、転移再発しないと予測される症例、ＢはＢ群予測タイルが優勢であるが、 AまたはＣ群と予測されたタイルが混在する症例、ＣはＣ群予測タイルで占められる症例で、予後不良と推測される症例。各タイル画像の１片が299ピクセル（約300 μ m相当）。
4. nCounterパネルによるmRNA定量
3で抽出した全RNAについて、300 nt以上のRNAが40%以上を占める検体は150 ng、同40%未満の検体は300 ngのRNA量となるよう濃度調整し、nCounterを用いてPanCancerPanelの770遺伝子についてmRNAのデジタルカウントを行った。解析のクオリティは専用解析アプリケーションであるnSolver 4.0で行った。一部症例でmRNAとプロープのハイプリダイゼーションしたシグナル密度（binding density）が異常高値となる現象（RNAの断片化が一因）が観察されたため、該当サンプルの再検を行った。結果として、RNA断片化による誤計測の影響を低減すべく、B群予測症例1例、C群予測症例4例、背景粘膜1例を以降の解析から除外した。
5. 遺伝子発現の群間比較
計測対象となったすべての遺伝子を対象に階層クラスタリング法により発現解析症例の分類を行った。結果として、 A群と予測した癌成分（n＝12）と、B（n＝5）またはC群（n＝8）と予測した癌成分との間には明瞭な遺伝子発現の差がみられた。特にドライバー遺伝子関連に絞ってクラスタリングを行うと、A、B、C各群それぞれの遺伝子発現パターンに特徴がみられた(図3)。コントロールとした背景粘膜は独立したクラスタを形成した。表に各群間で発現に有意差（p<0.01）のみられた代表的な遺伝子を表に示す。 BまたはＣ群に属するとAIが予測した癌成分は、同Ａ群の成分に比してNOGの発現が有意に高かった（表左上および右下)。他にはFGFやWNT関連遺伝子が、同様の群比較で発現量に有意差を示した。C群を特徴づける発現変化は、NOGおよびFGF1の高発現と、MYBの低発現であった（表1右上）。一方、B群予測成分とC群予測成分の間では有意差を示す成分は少なく、MMP3が最も発現差がみられた(表１左下)。図3. ドライバー違伝子の階層クラスタリングAIがA群と予測した癌成分と、BまたはC群と予測した癌成分とは、明瞭な遺伝子発現バターンの違いがある。またＢ群あるいはＣ群と予測した癌成分の間にも異なる発現パターンを示す遺伝子群がある。

寿　紫
この研究では、不均一な細胞集団である進行大腸癌から、予後情報を教師データとする病理組織画像の機械学習で樹立した予後予測AIによって、類似した形態学的特徴をもつ細胞集団を抽出し、予後に関連するそれらの病理組織画像に対応する遺伝子発現の特徴を統合的に解析した。既報にあるように、病理組織画像から遺伝子変異や融合遺伝子を推定するAIでは、一定の腫瘍集団を選別し、分子標的治療など特定の治療法に結び付ける重要な方法であるが、遺伝子異常のみの評価では腫瘍内不均一性を克服するのは難しいと考えられ、腫瘍内に存在する各成分の発現解析をする方が不均一性をより正確に反映すると考えられる。本研究では、転移再発なし（A）、あり（B、C）群という２群間比較においては、形態学的にも、遺伝子発現解析の結果からも、適切に分類できていると考えられる。発現に差のみられたいくつかの遺伝子は浸潤や転移に関連するものであり、予後不良因子となりうるものであった。例えば、A群に比しB群で高発現を示すFGF10は、大腸癌ではより進行した癌で発現が高いという報告がある[3]。また、A群に比しC群で高発現を示すFGFIは浸潤転移に関連するという報告がある[4]。これらの知見は、転移再発の有無という予後を教師データとした場合に、AIが病理組織画像全体から選別したBまたはC群に特徴的な癌成分が、転移や浸潤に関連していることを示すものであり、AIによる子後予測がそれらの遺伝子発現とも関連することを示すものである。単なる病理組織画像の統計的な出現頻度のみならず、遺伝子学的な背景からも子後予測モデルの根拠を説明しうるという点で、この事実は非常に重要である。また、A群に比してB、C両群で上昇の見られたNoggin (NOG)は、bone morphogenetic protein（BMP）のアンタゴニストであり、前立腺癌の背転移との関連が示唆されているが［5］、大腸癌については判明していない点が多く、子後に影響を与えうる因子として重要かもしれない。一方で、B群とC群の分類については、形態的には差異がみられたものの、遺伝子発現解析においては、A群との比較ほど明確な発現差がみられなかった。これは、C群の機械学習用症例数が比較的少数であった（n＝25）ことも影響していると考えられるが、加えて、手術時に転移がなくその後転移再発した症例と、手術時既に転移があった症例が混在していることもあり、５年以内死亡の有無というエンドポイントでは十分明確に特徴を選別できていなかった可能性がある。それでも、遺伝子発現有意差がみられるものが幾つかみられ、MMP3は大腸癌において癌の進展に関連する因子として報告されており、予後不良因子として重要なものである可能性がある[6]。本研究で得られた知見は病理組織形態と予後、遺伝子発現変化を結びつけるもので、今後他臓器への研究発展により、不均一性を前提とした上皮性腫瘍の特性解析に重要な役割を果たすと考えられる。本研究にあたり、標本薄切、遺伝子発現解析等において、技術的な支援をいただいた、がん研究所病理部の岩越元吉技師、長野裕子技師、馬場郷子技師、朝賀礼美技師に深謝申し上げる。 1) Coudray N, Ocampo PS, Sakellaropoulos T, et al. Classification and mutation prediction from non–small cell lung cancer histopathology images using deep learning. Nat Med. 2018 Oct;24(10):1559-1567. PMID: 30224757 DOI: 10.1038/s41591-018-0177-5. Kather JN, PearsonvAT, Halama N, et al. Deep learning can predict microsatellite instability directly from 2) histology in gastrointestinal cancer. Nat Med . 2019 Jul;25(7):1054-1056. PMID: 31160815 DOI: 10.1038/s41591-019-0462-y. Qazvini FF, Samadi N, Saffari M, et al. Fibroblast growth factor-10 and epithelial-mesenchymal transition in 3) colorectal cancer. EXCLI J 2019 Jul 17;18:530-539. PMID: 31611737 DOI: 10.17179/excli2018-1784. 4) Henriksson, ML, Edin, S, Dahlin, AM, et al. Colorectal cancer cells activate adjacent fibroblasts resulting in FGF1/FGFR3 signaling and increased invasion. Am J Pathol 2011 Mar;178(3):1387-94. PMID: 21356388 DOI: 10.1016/j.ajpath.2010.12.008. 5) AlShaibi HF, Ahmed F, Buckle C, et al. The BMP antagonist Noggin is produced by osteoblasts in response to the presence of prostate cancer cells. Biotechnol Appl Biochem 2018 May;65(3):407-418. PMID: 28981962 DOI: 10.1002/bab.1619. 6) Sipos F, Germann TM, Wichmann B, et al. MMP3 and CXCL1 are potent stromal protein markers of dysplasia- carcinoma transition in sporadic colorectal cancer. Eur J Cancer Prev. 2014 Sep;23(5):336-43. PMID: 24999605 DOI: 10.1097/CEJ.000000000058.