(公財)微生物化学研究会微生物化学研究所国立大学法人東京大学平成27年6月2日
ポイントO高等生物のオートファジーの始動に必須の因子であるAtg101の立体構造を解明しました。 Oオートファジーの過程でAtg101が別の必須因子Atg13の安定化に寄与するとともに、他のAtg因子群の集積にも関与することを解明しました。 O本成果は、哺乳類などの高等生物におけるオートファジーの始動機構を解明するための基盤的知見であり、今後オートファジーの始動機構の全容解明やオートファジーの制御剤開発につながることが期待されます。
■サス
生物が生きるためには、細胞内において必要な成分を合成するだけでなく、不要なもの、有害なものを分解することも非常に重要です。オートファジーはこのような細胞の機能を維持するために酵母からヒトにいたる真核生物において広く保存された分解システムの一つです。ヒトにおいては、オートファジーの異常により神経変性疾患などの重篤な疾患を引き起こすと考えられています。これまでモデル生物である出芽酵母を用いてオートファジーに関わる多くのタンパク質因子群（Atg因子群）が同定され、オートファジーのメカニズムが徐々に解明されてきました。ヒトなどの高等生物においてもこれらAtg因子の多くは保存されており、オートファジーの制御に関わっていますが、一方で高等生物は出芽酵母にない固有の因子もオートファジーの制御に用いています。したがって高等生物におけるオートファジーのメカニズムを解明するためにはそれら高等生物固有の因子の解析も必要不可欠です。出芽酵母においては、Atg1複合体（Atg1、Atg13、Atg17、Atg29、Atg31の5つの因子からなる複合体）がオートファジーの始動を担っていると考えられています。ヒトなどの高等な生物においてこれに対応する分子群がULK複合体で、ULK1/2 (Atg1の相同分子)、Atg13、FIP200 (Atg17の機能類緑体)とAtg101の４者で構成される複合体です。つまり、高等な生物には出芽酵母におけるAtg29とAtg31が存在せず、かわりにAtg101という固有の因子が存在します。Atg101はAtg13に結合してその安定化に関わることが報告されていましたが、それ以外の機能についてはほとんどわかっていませんでした。
■研究手法と成果
当研究所の野田展生主席研究員、鈴木浩典博士研究員は東京大学大学院医学系研究科の水島昇教授、貝塚剛志特任研究員のグループと共同で、高等生物のオートファジーにおける固有の因子であるAtg101の立体構造をAtg13との複合体状態でX線結晶構造解析法により明らかにしました。さらに立体構造情報に基づいて、Atg101 がオートファジーにおいて担う機能を世界で初めて解明しました。研究グループは出芽酵母よりも進化上哺乳類に近く、Atg101を保存している分裂酵母に着目し、分裂酵母由来のAtg101とAtg13の複合体を大腸菌を用いて大量に調製し結晶化を行いました。結晶からの回折像の測定には、大型放射光施設SPring-8 BL41XUの強力なX線を使用し、3.0 Å分解能での構造決定に成功しました。構造解析の結果、Atg101はHORMAドメイン（注1）構造をとり（図1）、Atg13もHORMAドメイン構造をとることで、HORMA-HORMAの複合体を形成していることが分かりました。これまでに、出芽酵母の近縁種由来のAtg13の構造が報告されており、それもまた類似のHORMAドメイン構造を有しています。しかしながら、出芽酵母の近縁種由来のAtg13ではタンパク質の一部が“帽子”のような構造をとり、帽子がHORMAドメイン構造に被さることで分子全体が固まった構造をとる（＝安定）のに対して、分裂酵母由来のAtg13では帽子のような構造を持たず、分子全体が不安定な状態であることがわかりました（図2)。またアミノ酸配列の比較から、ヒトなど高等生物のAtg13でも、“帽子”に相当する領域が存在しないことがわかりました。このことから、高等生物においてはAtg13は不安定であり、安定化する因子としてAtg101を必要とすると考えられます。実際、Atg101は1150 Å²と比較的広い面（Atg13結合面）を用いてAtg13と相互作用し、Atg13の安定化に寄与していることが構造科学的に明らかとなりました。また、細胞を用いた解析から、Atg13結合面はAtg101自身がULK複合体に組み込まれることに重要であることが明らかとなりました。またAtg101のAtg13結合面とは反対の面には、他のHORMAドメインタンパク質には見られない、特徴的なループ構造が存在していました。このループ領域には、トリプトファン(Trp; W)およびフェニルアラニン(Phe; F)という疎水性の強いアミノ酸残基が外側に突き出て存在しており、これらのアミノ酸はすべての生物種のAtg101に保存されていました（WFフィンガーと命名）。哺乳類細胞を用いてヒトAtg101の機能を解析したところ、Atg101がオートファジーに働くためにはWFフィンガーが必須であり、 WFフィンガーを用いて他のAtg因子群の集積に重要な役割を果たすことが明らかとなりました（図3)。ULK複合体はオートファジーが進行する場に最初に来る因子であることがこれまでの研究でわかっています。すなわちULK複合体の構成因子であるAtg101は、他のAtg因子群をオートファジー進行の場へと連れてくることで、オートファジーの始動を引き起こすことが明らかとなりました。
(注1) HORMAドメイン
HORMAドメインは、DNA修復や細胞周期を制御するHop1, Rev7, Mad2という三種類のタンパク質に共通してみられるドメインであり、それらにちなんで命名された。螺旋状構造（αヘリックス）と平面状構造（βシート）が並んで配置する構造をとり、一般的に他のタンパク質の認識に関わる。
■今後の期特
本研究の成果は、哺乳類などの高等生物におけるオートファジーの始動機構を解明する上での基盤的知見であり、オートファジーの始動機構の全容解明に向けた研究が加速することが期待されます。オートファジーの始動機構が明らかになることで、オートファジーを特異的に制御する薬剤開発にも道が拓けることが期待されます。
■発表雑誌
◆雑誌名:   Nature Structural & Molecular Biology ◆論文タイトル:  Structure of the Atg101–Atg13 complex reveals essential roles of Atg101 in autophagy initiation ◆著者:   Suzuki, H., Kaizuka, T., Mizushima, N. and Noda, N. N. ◆DOI番号： doi:10.1038/nsmb.3036 X線結晶構造解析により新規に決定したAtg101（左）とHORMAドメインタンパク質の代表例であるMad2（右）の立体構造。螺旋状構造（αヘリックス；赤）と平面状構造（βシート；黄）の構成がよく似ている。図 2 : Atg101-Atg13複合体の立体構造(左)分裂酵母のAtg101-Atg13複合体の全体構造。Atg101をオレンジ、Atg13を青で示している。他のAtg因子の集積に関わるWFフィンガー内の2つの残基(トリプトファン(Trp),フェニルアラニン(Phe))をスティックモデルで示す。 (右)出芽酵母の近縁種（耐熱酵母）由来Atg13(PDB ID 4J2G)の立体構造。Atg13の構造を安定化する“帽子”（黄色）を持っている。 (左)出芽酵母Atg1複合体のモデル。Atg13は自身の“帽子”部分で安定化し、独立にまたはAtg29-Atg31と協働で他のAtg因子群の集積に関与する。 (右)哺乳類など高等生物ULK複合体のモデル。Atg101はWFフィンガーを用いて他のAtg因子群の集積に関与する。その際Atg101により安定化したAtg13が協働的に働く可能性がある。
■本研究への支援
本研究は JSPS 科研費新学術領域研究「オートファジーの集学的研究:分子基盤から疾患まで」研究領域（水島　昇　領域代表）における研究課題「オートファジーを担うAtgタンパク質群の構造基盤」（研究代表者:野田 展生、課題番号25111004）、「オートファジーの生理・病態生理学的意義とその分子基盤」（研究代表者:水島昇、課題番号25111005）、および科学技術振興機構(JST)の戦略的創造研究推進事業チーム型研究(CREST)「ライフサイエンスの革新を目指した構造生命科学と先端的基盤技術」研究領域（田中啓二研究総括）における研究課題「オートファジーの膜動態解明を志向した構造生命科学」（研究代表者:野田展生)の助成を受けて行われたものです。また本成果は、文部科学省創薬等支援技術基盤プラットフォーム事業の支援により得られました。