土居雅夫京都大学大学院薬学研究科医薬創成情報科学専攻システムバイオロジ一分野Key words：体内時計、オーファンGタンパク質共役受容体、視交叉上核、N型糖鎖修飾、一塩基遺伝子多型
箱 富
生体リズムの異常で生じる睡眠障害やその他の病気を根本的に是正するためには、体内時計の最高位中枢器官である脳内の視交叉上核（SCN）を標的とした創薬科学が重要である［1，2］。私共は今回、この中枢時計の計時機能を制御するGタンパク質共役型受容体（GPCR）についての研究成果を報告する［2．3］。10万人規模のゲノムワイド相関解析の中でN型糖鎖修飾酵素ALG10Bの一塩基多型（SNP）がヒトの朝型／夜型クロノタイプと有意な相関があることが報告され[4] 、N型糖鎖修飾の役割が注目される中、今回、私共はSCN に発現するオーファン受容体Gpr176がN型糖鎖修飾を受けることを見出した［3］。この受容体は2016年に私共がSCNにおいて発現を見出したオーファン受容体であり、ノックアウトマウスの解析からサーカディアンリズムの周期長調節への関与が認められるため、その生化学的特性の理解が待たれていた[5] 。本研究ではGpr176のN型糖鎮修飾の役割を明らかにするとともに、ヒトのGPR176 N型糖鎖修飾に影響を与えるSNPの存在についても報告する［2, 3］。
方 坂
Gpr176欠損マウスは（Acc. No. CDB0672K : http://www.cdb.riken.jp/arg/mutant%20mice%20list.html）はRIKEN CDB（Kobe、Japan）において作製し使用した［5］。Gpr176タンパク質の検出は視床下部SCNあるいはヒトFlp-In TREx293 細胞（Thermo Fisher Scientific）より抽出した細胞膜画分をN型糖鎖消化酵素PNGase FもしくはOglycosidase（どちらもNew England BioLabs）により処理した後Gpr176抗体[5]を用いたウェスタンプロットにより行った。Gpr176の細胞内局在はGFPタグを用いた蛍光顕微観察により行った。小胞体の位置はER- Tracker Red (Thermo Fisher Scientific)を用いた染色により可視化した。プロテアソーム阻害薬にはMG132 (Sigma)を用いた。細胞内cAMP濃度の測定はcAMPバイオセンサー（GloSensor, Promega）を発現する細胞株を用いてFDSS/ μ CELL plate reader  (Hamamatsu Photonics)により行った。ヒトのN型糖鎖修飾サイトSNPを有するGPR176の発現コンストラクトはPCRを用いた点変異導入により作製した（ dbSNP , https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/） [5] 。
箱　果
Gpr176にはN末端領域に進化的に保存されるN型糖鎖修飾モチーフがあり、SCNに発現するGpr176が実際に同修飾を受けることをN型糖鎮消化酵素PNGase F により同定した（図1）。次いで、ヒトFlp-In TREx293 細胞を用いた異所発現系において同修飾がGpr176の細胞内の効率的なタンパク質発現に必須であり（図2）、同修飾を欠くと細胞膜への移行ができず小胞体プロテアソーム系により分解されることを見出した（図3）。Gpr176はリガンド／アゴニスト非依存的にcAMP 合成を低下させる基礎活性をもつ (図4a～d) ［5］。糖鎮修飾の欠失はこの受容体固有の基礎活性には影響を与えないものの（図5）、結果として生じるタンパク質発現量の減少に伴い細胞内cAMP抑制活性の有意な減少が認められた（図4e～g）。同様の結果はヒトのGPR176にもみられ（図6a～f）、N型樹鎖修飾部位の 非同義SNPはヒトのGPR176の細胞内タンパク質発現量とcAMP抑制活性の低下をもたらした（図6g～j）。つまり、N型糖鎖は機能的なGPR176のタンパク質発現に必須の翻訳後修飾であることがわかった。図1.マウス視床下部SCNにおいてGpr176はN型糖鎖修飾を受けるa）マウス、ラット、ヒヒ、ヒトのGpr176のN末端領域と第3細胞外ループ（ECL3）のアミノ醸樋列比較とマウスGpr176のスネークプロット。赤色の背景で示すアミノ敵は種間で保存されるN型糖鎖修飾モチーフ（N-X-S/T,  X≠P）。 b）野生型および Gpr176欠損マウス視床下部SCNに対するGpr176抗体をウェスタンプロット。Gpr176は野生型で75 kDa付近にプロードなバンドとして検出される。 c）野生型SCNライセートを脱糖類酵素であるPNGase FまたはO –glycosidase （O - glyc）もしくはVehicleにて処置したサンプルのウェスタンプロット。 PNGase F処理により見かけの分子量が小さくなったGpr176（*）が50 kDa付近に現れる。図2.   N型糖鎮修飾はGpr176の細胞内の効率的なタンパク質発現に必要であるGpr176はFlp-In TREx293細胞においてもN型糖鎮修飾される。Gpr176発現細胞をa)用いたウェスタンプロット。PNGase F処置によりGpr176の見かけサイズ強少。 Dox誘導型の正常および変異型Gpr176 (N-ter、ECL3、N-ter/ECL3)発現Flp-In b) TREx293細胞のウェスタンプロット。黒矢頭は50 kDa付近に現れるN-ter変異体白矢頭は野生型Gpr176の微量に検出される未成熟フォーム、*は非特異的バンド。 c、d）Doxにより発現誘導した正常および変異型Gpr176の相対的mRNA量と相対的タンパク質発現量。mRNA量はqRT-PCRにより測定した（平均土標準偏差、n＝4）。相対的タンパク質発現量はバンド強度から求めた（平均土標準偏差、n=3）。***P<0.0001 vs WT, one-way ANOVA with Bonferroni post hoc test, a) b)野生型Gpr176-GFP（上）およびN-ter mut Gpr176-GFP（下）発現細胞の共焦点顕微鏡像。マージ社GFP（緑）とDAPIにより染色した核（青）を示す。  N-ter mut Gpr176は発現が低いため、蛍光観察条件を変えて振像した。スケールバー：10 μ m。 N-ter mut Gpr176-GFPが小胞体に蓄積することを示す共焦点顕微鏡像。小胞体はER- Tracker（赤）にて染色した。スケールバー：10 μ m。 c、d）野生型Gpr176-GFPおよびN-ter mut Gpr176-GFPのタンパク質発現に対するMG132とbafilomycin A1の効果を示すウェスタンプロット。図中に示した濃度のMG132またはbafilomycin A1を細胞に６時間与えた。N-ter mut Gpr176-GFPは発現が低いため野生型の５倍量ロードした。MG132処置した細胞でのみN-ter mut Gpr176-GFPの発現の回復が認められた。図4.  Gpr176のN型糖鎖修飾変異体はタンパク質の発現レベルの低下に伴い細胞内での基礎活性量も減弱するFlp-In TREx293細胞を用いたGloSensor-cAMPアッセイの実験モデル。 a) Dox処置（+）もしくは未処置（−）のFlp-In TREx293-Gpr176 (tet-on) /GloSensor (constitutive)細胞におけb)るフォルスコリン(Fsk)投与後のGloSensorルシフェラーゼ活性の変化プロファイル(平均土標準偏差、n＝9) 。矢印はFskの投与点。 bのグラフの曲線下両積(AUC)の相対値(平均土標準偏差、n=9) 。*** P< 0.0005, two-tailed unpaired t-test。 c)酵素免疫測定法（EIA）を用いて測定した同細胞のcAMP濃度（平均土標準偏差、n＝9）。*P< 0.05、 d) two tailed unpaired t-test。 e, f) N-termutもしくはECL3mutのFlp-InTREx293Gpr176 (tet-on) /GloSensor (constitutive)細胞のGloSensor活性プロファイル(平均土標準偏差、n＝9)。挿入図は相対AUC。** P< 0.001、*** P< 0.0005、 two-tailed unpaired t test。 g)野生型Gpr176のcAMP抑制活性を100％とした時のN-ter mut Gpr176およびECL3 mutの抑制活性。 *** P<0.0005 vs WT、one way ANOVA with Bonferroni post hoc test (N.S. : not significant) 。図5.   PNGase Fによって糖鎖を酵素的に除去しても細胞に発現するGpr176のcAMP抑制活性は保たれる脱糖鎖処理を施した細胞懸満液を用いたGloSensorアッセイの実験デザイン。Dox処置もしくは未処置のa)細胞をHBSSに懸濁し、PNGase Fの存在下もしくは非存在下で1時間インキュベートした後、GloSensorアッセイに供した。 b) Dox処置（+）と未処置（一）のFlp-In TREx293-Gpr176（tet-on）／GloSensor（constitutive）細胞懸濁液におけるFsk投与後のGloSensor活性プロファイル（平均土標準偏差、n＝9）。挿入図は相対AUC。 *** P<0.0005、two tailed unpaired t-test。 c) b）で用いたPNGase F処置および未処置細胞におけるGpr176のウェスタンプロット像。Hsp70はローディングコントロール。図6. ヒトGPR176  (hGPR176) のN型糖鎖修飾に影響する非同義SNPの同定a) b) hGPR176の糖鎖修飾モチーフ部位のSNP。 N型糖鎖修飾モチーフ: N-X-S。 hGpr176発現Flp-In TREx293細胞を用いたウェスタンプロット。PNGase FによりhGpr176の見かけの分子サイズが減少。*は非特異的バンド。 Dox誘導型の正常およびN-ter mut（N4Q;N11Q;N17Q;N27Q）hGpr176発現Flp-In TREx293細胞のウェスタンプロット。N ter mutではサイズと発現量が低下する。 c) d) e) f)野生型もしくはN-ter mut hGPR176をDox依存的に発現するFlp-In TREx293細胞におけるFsk投与後のGloSensorプロファイル（平均土標準偏差、n＝3）。野生型およびN-ter mut hGPR176の相対タンバク質発現量（平均土標準偏差, n＝3）。****P< 0.0001、 unpaired t-test。野生型に対するN-ter mut hGPR176のcAMP抑制活性の割合(%、平均土標準偏差、n=3) 。*** P< 0.001、 unpaired t-test。 g)ヒトSNP変異体のウェスタンプロット。*は非特異的バンド。 h) i）先祖型に対するSNP変異体の相対タンパク質発現量（平均土標準偏差、n＝3）。先祖型に対するSNP変異体のcAMP抑制活性割合(%、平均土標準偏差、n=3) 。** P< 0.001、* P< 0.01、 vs WT, one way ANOVA with Bonferroni post hoc test,先祖型およびSNP変異体のタンバク質発現量（x軸）とcAMP抑制活性（r軸）の相関図。相関係数（x）とP値はピアソンの積率相関係数解析により求めた。 j)
青
東
生体リズム調節薬の標的となりうるオーファン受容体Gpr176がN型糖鎖修飾を受けること、さらにはこの修飾によってGpr176の細胞内における基礎活性が制御されることがマウス及びヒトのGPR176に対して証明された［3］。リガンド未定のオーファンGPCRの糖鎖修飾はこれまで殆ど解析が進んでおらず、今回のGpr176の例によって初めて、オーファン受容体の基礎活性が翻訳後修飾によって巧妙に制御される可能性を示すことができたといえる[2, 3]。 Gpr176 は、今回の朝型相関 SNP に関連する N型糖鎖修飾のみならず、同様に朝型遺伝子として報告されているGタンパク質制御因子RGS16 [4]やニューロペプチドVIP [4]が介するシグナル伝達系とも深く関与することを我々はこれまでに報告してきた［2, 5］。すなわち、ALG10B、RGS16、VIPに共通して関連するGpr176シグナルは、ヒトのクロノタイプの調節に向け、今後極めて有効なドラッグターゲットになる可能性があると考えられる。
数辞
本研究に助成のご支援を賜りました公益財団法人上原記念生命科学財団に心より御礼申し上げます。
文 歓
1) Doi M, Shimatani H, Atobe Y, Murai I, Hayashi H, Takahashi Y, Fustin JM, Yamaguchi Y, Kiyonari H, Koike N, Yagita K, Lee C, Abe M, Sakimura K, Okamura H. Non-coding cis-element of Period2 is essential for maintaining organismal circadian behaviour and body temperature rhythmicity. Nat Commun. 2019 Jun 12;10(1):2563. PMID: 31189882 DOI: 10.1038/s41467-019-10532-2. 2) Nakagawa S, Nguyen Pham KT, Shao X, Doi M. Time-Restricted G-Protein Signaling Pathways via GPR176, Gz, and RGS16 Set the Pace of the Master Circadian Clock in the Suprachiasmatic Nucleus. Int J Mol Sci. 2020 Jul 17;21(14):5055. PMID: 32709014 DOI: 10.3390/ijms21145055 3) 4) Wang T, Nakagawa S, Miyake T, Setsu G, Kunisue S, Goto K, Hirasawa A, Okamura H, Yamaguchi Y, Doi M. Identification and functional characterisation of N -linked glycosylation of the orphan G protein-coupled receptor Gpr176. Sci Rep. 2020 Mar 10;10(1):4429. PMID: 32157140 DOI: 10.1038/s41598-020-61370-y. Hu Y, Shmygelska A, Tran D, Eriksson N, Tung JY, Hinds DA. GWAS of 89,283 individuals identifies genetic variants associated with self-reporting of being a morning person. Nat Commun. 2016 Feb 2;7:10448. PMID: 26835600 DOI: 10.1038/ncomms10448. 5) Doi M, Murai I, Kunisue S, Setsu G, Uchio N, Tanaka R, Kobayashi S, Shimatani H, Hayashi H, Chao HW, Nakagawa Y, Takahashi Y, Hotta Y, Yasunaga J, Matsuoka M, Hastings MH, Kiyonari H, Okamura H.Nat Commun. Gpr176 is a Gz-linked orphan G-protein-coupled receptor that sets the pace of circadian behaviour. 2016 Feb 17;7:10583. PMID: 26882873 DOI: 10.1038/ncomms10583