Abstract

2.はじめに
探針エレクトロスプレーイオン化質量分析法の元となるエレクトロスプレーイオン化（ESI）は, 2002年ノーベル化学賞受賞者で米国の分析化学者のジョン・ベネット・フェン（John B. Fenn）教授らが開発したイオン化法である（図1）。現在，イオン化法の中で主流のイオン化法となったESIは代謝産物を含む低分子の他，高分子をフラグメント化することなくイオン化できるソフトイオン化法の一つとして知られる.また，マトリックス支援レーザー脱離イオン化法(MALDI)とは対照的に，ESIは多価イオンで検出される特徴がある. 2007年，著者らの共同研究者で，本論文の筆頭著者の山梨大学の平岡先生が探針エレクトロスプレーイオン化法(PESI)を開発された(図1) (Hiraoka et al., 2007;能となっている．さらに，④金属キャピラリーを用いたESI法とは対照的に，PESI法ではイオン化の過程で生じるシークエンシャルな連続分析も可能にしている(Mandal et al., 2011).
3. ディッピング探針エレクトロスプレーイオン化質量
分析法
生物学分野におけるシングルセル分析の多くは，細胞集団を対象に分析されることが多い．しかし，環境ストレス下の植物の生理応答など，組織内の一部の細胞で局所的に起こる細胞間不均一性の現象解明には,特定の細胞に的を絞った分析が求められる．この様なニーズを踏まえ，PESI法の改良版となるディッピング探針エレクトロスプレーイオン化法（Dipping PESI, dPESI）の開発に至った（Usmanov et al., 2018).ン化法山梨大学平岡研究室にて著者撮影.上下の自矢印は自動制御による探針の動きを示す.フィールドやガラス温室などの現場で，1植物細胞等の生体試料に探針を突き刺した後，探針先端を乾燥させる.乾燥後，生体試料の付着した探針を質量分析計のある実験室に持ち込んで（試料採取した場所が遠隔地であれば，実験室まで輸送して），その探針（鍼灸針）を，イオン化部のモーター駆動部に繋がり，上下運動するピン（図2中の白矢印を参照）に垂直に取り付けた後，PESI分析することができる（Usmanov et al., 2018a).  PESI分析のために，50%メタノール等の溶媒を満たしたサンプルチュープを探針直下に設置し，試料の付着した針先端が溶媒に50 msの短時間，浸るように調整・設定し，探針先端がその可動範囲の一番高い位置に到達した時点で，印加電圧をかけるような仕組みになっている．この方法を用いると，試料への買入の目安として,試料表面からの深さ0.5 mmの鍼灸針の導入で分析が可能になる．また，このdPESI法は，組織抽出液などの調整試料を対象にしたバルク分析にも用いることができ,その場合は96ウェルのマイクロプレート上に試料を設置し，鍼灸針を所定の位置に固定し，分析を行う．dPESI法の開発により，疎水性の違いを利用し，用いる溶媒を変えることで，乾燥させた微量試料から納豆などの粘性の高い試料，生体試料及び食品まで幅広く，前処理なしの直接分析が可能になった.
4.シースフロー探針エレクトロスプレーイオン化質
量分析法
試料採取とエレクトロスプレー過程とをそれぞれ独立して行うdPESIに対して，シースフロー探針エレクトロスプレーイオン化質量分析法（Sheath-flow  PESI, sfPESI）は，それらの過程を統合させた分析法として開発された（Usmanov et al., 2018b).  sfPESIでは，直径120 μm，チップ直径～700 nm大の鍼灸針を用い，それをゲルローディングチップに挿入する.さらにサンプル抽出のため，先端から38 mmの位置まで，ゲルローディングチップの内部を40 μLの溶媒で満たす.内部に導入する溶媒は通常，50％メタノール，あるいは，水/メタノール/アセトニトリル混合液（混合比1:1:1)を用いる．dPESIと同様に，ゲルローディングチップ内に収めた鍼灸針(キャピラリー)に印加電圧をかけ， ESI分析できるシンプルな仕様になっている．sfPESIは上記の仕様上，表面試料成分を抽出するのに，キャピラリー先端部で約2 nLの溶媒が必要になる．sfPESI分析時には,分析物のESIは3秒ほど継続し,その間, 40 nLの溶媒を消費する. ESI時にキャピラリー先端部で形成されるTaylorコーン内部では試料の対流が生じると考えられる.これまでのところ, sfPESIを使って,コーヒー豆,イネ玄米,動物試料等で分析事例がある.その他，黒，青，赤，緑色の4色のボールペンで文字等の書かれた紙上に，一色ずつ各色の線上にsfPESIの先端部を一瞬接触させ，直後にESI分析を行った．その結果，それぞれのインクの色を構成する成分の検出にも成功したことから，筆跡鑑定等への応用可能性も見出されている.
5.アジャスタブル・シースフロー探針エレクトロスプレ
ーイオン化(ad-sfPESI)
前節で述べたsfPESI法にタッチセンサーを取り付けることでシステムを自動化したものが，アジャスタプル・シースフロー探針エレクトロスプレーイオン化法( Adjustable sheath-flow PESI , ad-sfPESI )である(Hiraoka et al., 2019).  ad-sfPESI法でも直径120 μmの鍼灸針を用いる.この方法では，約１ mmの貰入深さで針先端を試料に刺した後，針先端をキャピラリー内に収める機能を付与している．ad-sfPESIの試料サンプリングは遠隔で制御できる仕様になっており，dPESI同様，簡便なオンサイトかつ，in situサンプリング法であり，先端の目詰まり等も起こらない．直径120 μmの鍼灸針を用いることで，組織中の一部分を対象にしたサイトスペシフィックなポイント分析が可能になっている．このad-sfPESIについても，果実，野菜類などの植物試料を対象に代謝産物分析の実績がある(Hiraoka et al., 2019).
6.おわりに
以上のように，PESI及びその改良法であるdPESI, sf-PESI，ad-sfPESIでは，従来のESIの発展形として，極微量の試料を採取した直後に，前処理なしに，大気圧下で直接イオン化し，試料中に含まれる化合物を質量分析できる特長がある．著者らは，後述する科研費研究課題において平岡先生のグループと共同研究を行った．共同研究を開始した当初，平岡先生が仰られた， 「ナノリットル以下の超微量試料を対象に，前処理なしに直接，イオン化できる分析法を開発したい．」という強い思いを共有し，精力的に共同研究を推進した日々が懐かしく思い出される．平岡先生との共同研究の過程では，実に多くの課題に挑戦させて頂いた．本稿で述べた平岡先生との PESI 法の改良を通した計測技術の進展の傍ら，著者らの研究室では，植物細胞の水分状態計測器として，1970年代後半から用いてきたプレッシャープロープ（PP）と，精密質量を計測できるオービトラップ質量分析計とを融合させた1細胞スケールの代謝産物計測法，ピコリットル・プレッシャープロープ・エレクトロスプレーイオン化質量分析法(picoPPESI-MS)を開発するに至っている(Nakashima et al., 2016). 現在，picoPPESI-MSを用いて，生きた1植物細胞を対象にオンサイト,かつリアルタイムな1植物細胞・オルガネラの代謝産物計測を実現している(Nakashima et al., 2016; Wada et al., 2019; 2020; 2021; Nakata et al., 2022).本業績は，日本学術振興会科学研究費助成事業の科研費基盤S採択研究課題「細胞膨圧計測－探針エレクトロスプレーによる細胞分子情報計測」（科研費番号20228004，野並浩（研究代表者）・平岡賢三（研究分担者)，2012 -2016年)，科研費基盤S採択研究課題 「オンサイト・リアルタイム細胞分子計測によるスピーキング・セル・アプローチ」（科研費番号24228004,野並浩(研究代表者)・平岡賢三(研究分担者), 2017- 2020年)，科研費基盤 A 採択研究課題「オンサイト・セルスペシフィック解析による水稲高温障害・窒素代謝改善効果の機構解明」（科研費番号16H02533,和田博史(研究代表者)・野並浩・平岡賢三・恩田弥生・中島大賢（研究分担者）, 2016-2019年）及び，科研費基盤B採択研究課題「匂い成分オンサイト質量分析による水稲害虫トビイロウンカの品種選好・増殖特性の解明」 (科研費番号16H04886,松村正哉（研究代表者)・和田博史・平岡賢三・真田幸代（研究分担者），2016-2018年）の研究成果によるところが大きく，日本学術振興会からの支援に心から感謝する. Chen LC, Yu Z, Nonami H, Hashimoto Y, Hiraoka K. (2009) Application of probe electrospray ionization for biological sample measurement. Environmental Control in Biology. 47 (2): 73–86. DOI: https:// doi.org/10.2525/ecb.47.73 Hiraoka K, Ariyada O, Usmanov DT, Chen LC, Ninomiya S, Yoshimura K, Takeda S, Yu Z, Mandal MK, Wada H, Rankin-Turner S, Nonami H. (2020) Probe electrospray ionization (PESI) and its modified versions: dipping PESI (dPESI), sheath-flow PESI (sfPESI) and adjustable sfPESI (ad-sfPESI). Mass Spectrometry. 9(1): A0092, DOI: https://doi.org/10. 5702/massspectrometry.A0092 Hiraoka K, Nishidate K, Mori K, Asakawa D, Suzuki S. (2007) Development of probe electrospray using a solid needle. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 21(18): 3139–3144. DOI: https:// doi.org/10.1002/rcm.3201 Hiraoka K, Rankin-Turner, S, Ninomiya S, Wada H, Nakano H, Matsumura M, Sanada-Morimura, S., Tanaka F, Nonami H. (2019) Component profiling in agricultural applications   using an   adjustable acupuncture needle for sheath-flow probe electrospray ionization/mass spectrometry. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 67: 3275–3283. DOI: https:// doi.org/10.1021/acs.jafc.8b06424 Mandal MK, Chen LC, Yu Z, Nonami H, Erra-Balsells R, Hiraoka K. (2011) Detection of protein from detergent solutions by probe electrospray ionization mass spectrometry (PESI-MS). Journal of Mass Spectrometry. 46 (10): 967–975. DOI: https:// doi.org/10.1002/jms.1977 Nakashima T, Wada H, Morita S, Erra-Balsells R, Hiraoka K, Nonami H. (2016) Single-cell metabolite profiling of stalk and glandular cells of intact trichomes with internal electrode capillary pressure probe electrospray ionization mass spectrometry. Analytical Chemistry. 88 (6): 3049–3057. DOI: https://doi.org/10.1021/ acs.analchem.5b03366 Nakata K, Hatakeyama Y, Erra-Balsells R, Nonami H, (2022) Dynamics and stabilization Wada H. mechanism of mitochondrial cristae morphofunction associated with turgor-driven cardiolipin biosynthesis under salt stress conditions. Scientific Reports. 12: 9727.  DOI:  https://doi.org/10.1038/s41598-022-14164 -3 Usmanov DT, Mandal MK, Hiraoka K, Ninomiya S, Wada H,  Matsumura  M,  Sanada-Morimura  S,  Nonami  H. (2018a) Dipping probe electrospray Ionization/mass spectrometry for direct on-site and low-invasive food analysis, Food Chemistry 260: 53–60. DOI: https:// doi.org/10.1016/j.foodchem. 2018.04.003 Usmanov  DT,  Ashurov  KB,  Ninomiya  S,  Hiraoka  H, Nakano Matsumura H, M, Wada H, H. Sanada-Morimura Nonami (2018b) S, Remote-sampling mass  spectrometry for dry samples: sheath-flow probe electrospray ionization (PESI) using a gel-loading tip inserted with an acupuncture needle. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 32: 407–413. DOI: https://doi.org/ Wada H, Hatakeyama Y, Onda Y, Nonami H, Nakashima T, Erra-Balsells R, Morita S, Hiraoka K, Tanaka F, Nakano H. (2019) Multiple strategies for heat adaptation to prevent chalkiness in the rice endosperm. Journal of Experimental Botany. 70(4): 1299–1311, DOI: https:// doi.org/10.1093/ jxb/ery427 Wada H, Hatakeyama Y, Nakashima T, Nonami H, Erra-Balsells R, Hakata M, Nakata K, Hiraoka K, Onda Nakano H. (2020) On-site single pollen Y, metabolomics reveals varietal differences in phosphatidylinositol synthesis under heat stress conditions in rice. Scientific Reports. 10(1): 2013. DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-020-58869-9 Wada H, Nakata K, Nonami H, Erra-Balsells R, Tatsuki M, Hatakeyama Y, Tanaka F. (2021) Direct evidence for dynamics of cell heterogeneity in watercored apples: Turgor-associated metabolic  modifications and within-fruit water potential gradient unveiled by single-cell analyses. Horticulture Research. 8: 187. DOI: https://doi.org/10.1038/s41438-021- 00603-1