【メタボローム分析最新情報/半網羅分析から成分グループ分析まで】 ～対象試料および対象成分による固相誘導体化法の最適化～株式会社アイスティサイエンス
従来のメタボローム分析の課題
遠心濃縮・凍結乾燥・誘導体化等前処理工程が煩雑で、時間を要し、熟練された技術や経験が必須■多検体の測定について多検体の誘導体化をバッチ処理した場合、各々の検体において誘導体化後から測定までの時間が異なってしまう。固相誘導体化法による迅速化・自動化SPE-GCによる誘導体化から測定までのオンライン化本研究の目的固相誘導体化法を用いたオンラインSPE-GC/MSシステムの開発
TMS化:反応する官能基−OH >-Phenol >-COOH >-NH₂反応するアミンについて: R-NH₂ > R-NH-R参考文献:小川茂,ぶんせき,2006,7,332-336 TMS化により揮発しにくい目的成分を気化しやすい物質に変化させることで、GCMSでの測定が可能となる。 ★アミノ酸のTMS化について■ α炭素にRが結合している場合アミンには１つのTMSしか結合しない。 ■ α炭素にRが結合していない場合アミンには２つのTMSが結合する。
■メトキシム化しなかったらα-ケトグルタル酸
■フルクトースの場合■メトキシム化では2本のピークが出現しやすい環状状構造糖類は多くの異性体を持つため、そのままTMS化するとピークがいくつも出現してしまう。直鎖構造（開環構造）メトキシム化することで環状構造になることを防ぎ、直鎖構造に絞り込むことができる。
試料負荷＆保持洗浄アミノ酸と有機酸をイオ水-ACNで固相に残存ン交換相互作用によりしている非イオン性化固相に保持合物を除去
特許登録：（株）アイスティサイエンス

試料負荷＆保持脱水／１分誘導体化／15分誘導体化／1分溶出試料をアセトニトリルで希釈して水濃度を下げて、固相に負荷する。 ACNで固相に残存している水分を除去メトキシアミンを固相に含侵させて、目的成分を固相中でメトキシム化MSTFAを固相に含侵させて、目的成分を固相中でTMS化特許登録：（株）アイスティサイエンス■試料負荷時の水濃度と固相への保持について
■メトキシアミンによる誘導体化反応時間
120 ■■ Ketoglutaric acid-MO-2TMS   m Xylose-MO-4TMS ■ Arabinose-MO-4TMS ■■ Rhamnose-MO-4TMS ■ Fucose-MO-4TMS ■ Fructose-MO-5TMS-1 ■ Mannose-MO-STMS ■ Galactose-MO-5TMS ■ Glucose-MO-STMS ■ Maltose-MO-8TMS ■ Fructose-MO-5TMS-2 ■■ Lactose-MO-8TMS Fig. 3. Relations of methoxyame derivatization reaction time in sorbent and the relative peak area
■ 本システムによるメタボローム分析オンライン化：前処理と測定機器を接続して一体化する技術測定している間に次の検体を前処理する（併行稼働）ことで多検体を迅速に分析できる。ポイント①前処理から測定まで完全自動化ポイント②自動化による分析精度の向上ポイント③溶出液の全量注入による高感度化ポイントØ固相による精製効果ポイント毎誘導体化してから注入するまでの時間が一定：安定性ポイント6多検体のハイスループット
■アミノ酸/有機酸固相誘導体化反応メトキシム化, 3 min含侵MSTFA-トルエン(3/1)固相誘導体化反応TMS化, 1 min溶出ヘキサンorトルエンGC/MSスプリット1:50
■短鎖脂肪酸
固相誘導体化反応t-BDMS化, 1 min溶出ヘキサンGC/MSスプリット1:20
■糖糖類固相誘導体化反応メトキシム化, 15 min含侵MSTFA-トルエン(3/1)固相誘導体化反応TMS化, 1 min溶出ヘキサンorトルエンGC/MSスプット1:50 ■アミノ酸/有機酸/糖類 Automation合侵10%メトキシアミン-ピリジン固相誘導体化反応メトキシム化, 15 min含侵MSTFA-トルエン(3/1)固相誘導体化反応TMS化, 1 min溶出ヘキサンorトルエンGC/MSスプット1:50 AISTI SCIENCE
アミノ酸/有機酸、
SPE-GC Interface  SPL-M100 (AiSTI Science) SPE Cartridge Sampling Volume Flash-ACXs 50 μL PTV Injector LVI-S250 (AiSTI Science) Insert Type Injector Temp. GC Inlet Mode Flow Mode Pre-Column Column Oven Temp. 310℃(4.7min) Trans. Line Temp. 290℃ MS MS Method SCAN, m/z;70-470
己鎮脂肪酸
SPE-GC Interface  SPL-M100 (AiSTI Science) SPE Cartridge Sampling Volume Flash-AXs 50 μL PTV Injector Insert Type Injector Temp.
Inlet Mode Flow Mode Pre-Column Column Oven Temp. 310℃(4min) Trans. Line Temp. 290℃ MS MS Method SCAN, m/z;70-470 Spiral Insert 220℃(0.5min)-50℃/min-290℃(16min) LVI-S250 (AiSTI Science) Spiral Insert 220℃(0.5min)-25℃/min-290℃(16min)
1.Alanine-2TMS 2. Valine-2TMS 3. Phosphate-3TMS 4. Leucine-2TMS 5. Isoleucine-2TMS 6. Proline-2TMS 7. Glycine-3TMS 8. Succinic acid-2TMS 9. Fumaric acid-2TMS 10. Serine-3TMS 11. Threonine-3TMS 12. Malic acid-3TMS 13. Aspartic acid-3TMS 14. Methionine-2TMS 15. Proline-oxo-2TMS 16. Cytosine-2TMS 17. Aminobutyric acid-3TMS 18. Ketoglutaric acid-3TMS 19. Glutamic acid-3TMS 20. Phenylalanine-2TMS 21. Asparagine-3TMS 22. Putrescine-4TMS 23. Aconitic acid-3TMS 24. Citric acid-4TMS 25. Ornithine-4TMS 26. Adenine-2TMS 27. Lysine-4TMS 28. Tyrosine-3TMS 29. Guanine-3TMS
2 | Arabinose-MO-4TMS 3  Ribose-MO-4TMS Rhamnose-MO-4TMS 4 5 Ribitol-5TMS 7 Fructose-MO-5TMS-1 8 Fructose-MO-5TMS-2 9 |Mannose-MO-5TMS 10 | Galactose-MO-5TMS 12 | Glucopyranose-5TMS 13 Sucrose-8TMS 14 Lactose-MO-8TMS 15 Maltose-MO-8TMS
EPA（エイコサペンタエン酸）をメチル化、TMS化、tBDMS化した時のスペクトル比較tBDMS化はメチル化やTMS化と比較して、高い質量域でフラグメントイオンを持つため、定性が上がり、分析精度が上がる。
Go-Tech合計200成分以上「種類別」および「グループ」の固相誘導体化法の開発アミノ酸20成分アミノ糖10成分ボリアミン5成分カテコール5成分インドール10成分ジペプチド10成分核酸塩基5成分ヌクレオシド10成分有機酸20成分短鎖脂肪酸 20成分長鎖脂肪酸 20成分多価不飽和脂10成分芳香族脂肪酸 20成分高感度化の検討固相保持の検討TMS化&メトキシム化 tBDMS化◆代謝回路に合わせた代謝物の選定◆既に研究報告されているマーカー的代謝物の選定◆実試料で検出された代謝物の選定『Go-Tech事業』(2022～23年度)共同研究機関・アイスティサイエンス・和歌山県工業技術センター ・大阪大学・京都府立医科大学・東京農工大
Go-Tech 【1.新規分析対象成分(代謝物)の固相誘導体化法の開発】 【１－２】スペクトルデータベース作成■【１－１】で得られたスペクトルデータのデータベース化誘導体化が確認できた代謝物120成分のスペクトルをデータベース化血漿を固相誘導体化して得られた成分の定性確認目標データベース作成分数: 200成分以上
生体試料
目的成分

濃度物性
・沸点■弾√ •分子量•安定性
サブテーマ
【２－１】サンプリング／抽出方法の確立【２－２】生体試料中の夾雑成分の除去【２－３】微小量生体試料への応用
①サンプリング/抽出
②「固相誘導体化」から「測定」まで完全自動化
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Go-Tech 【１－１】新規分析対象成分の種類別またはグループ別の固相誘導体化法の開発■選定した代謝物140成分の単成分毎のオンライン固相誘導体化（例:グリシン）溶液の検討固相の選択水・ACN MeOH ACXs:AXとCXの2層AXs C18 pH調整140成分中120成分の代謝物の誘導体化を確認した。 GT-040  Glycine ■本システムによる測定結果TXM : ■スペクトルライブラリ検索による定性雑SCANトータルイオンクロマトグラム
■ M06-2_C18_STR_100uL A: Flash-SPE C18：保持負荷[保持] 試料抽出液100 μL洗液 Syr3 : ACN-水(1/3)乾燥N2ガス添加 Syr1 : D1 : MSTFA-トルエン溶出 Syr5 :トルエンGC-MS :スプリット比 1:50 1. Androsterone-TMS 2. Dehydroepiandrosterone-TMS   7. Testosterone-TMS 8. Pregnenolone-TMS 3. Dihydrotestosterone-TMS 9. Estriol-3TMS 4. Estrone-TMS 10. Progesterone 5. Estradiol-2TMS 6. Androstenedione 11. Cholesterol-TMS 12. Aldosterone-2TMS 13. Stigmasterol-TMS 14. beta-Sitosterol-TMS 15. Lanosterol-TMS
[707ﾄｸﾗﾑ] TIC : 187094208 - 0 [07]ﾌﾟｯﾑ]  TIC : 221057281 - 1 1. Uracil, 2TMS derivative 2.シ. 4. 5. Pyrimidine, 5-methyl-2,4-bis[(trimethylsilyl)oxy]- 4-Pyrimidinamine, N-(trimethylsilyl)-2-[(trimethylsilyl)oxy]- Uracil-5-carboxylic acid, 3TMS derivative Adenine-2TMS allantoic acid, 4TMS 6. 7. 9H-Purine, 9-(trimethylsilyl)-2,6,8-tris[(trimethylsilyl)oxy]- 9H-Purin-6-amine, N,9-bis(trimethylsilyl)-8-[(trimethylsilyl)oxy]-はUridine, 4TMS derivative 9. Uridine, 3TMS derivative 10. 12. 5-Methyluridine, 3TMS 13. Adenosine, 4TMS 14. Guanosine-5TMS
■各グループ毎の内標となる代謝物の選定できるだけ天然になく安価に購入できるものを選定した。
■誘導体化添加や溶出の操作確認のための指標

■安定同位体の選定
各グループの内標として、または変化しやすい代謝物の安定同位体を選定した。
Glutamic Acid MW:273 Pyroglutamic acid-2TMS不安定な成分については安定同位体を用いて補正することを検討した。
バイアル中濃度：アミノ酸,有機酸：2, 5, 10, 20 pmol/μL（μM）
★検量線を作成する時の注意点
イオン交換樹脂は保持できるイオン数が決まっており、椅子取りゲームとなります。濃度が高すぎると・・・（頭打ちになる）混合成分数が多すぎても・・・（頭打ちになる）アミノ酸の混合標準溶液は0.1N HClが含有している場合が多く、pH調整が必要。有機酸の濃度が高いと溶液が酸性となって、解離しなくなるので、pH調整が必要。
マウス血清の分析結果
■マウス血清のSCAN-TIC
① Lactic acid-2TMS ② Alanine-2TMS ③ Valine-2TMS ④ Leucine-2TMS ⑤ Phosphoric acid-3TMS 6 Isoleucine-2TMS ⑦ Proline-2TMS ® Glycine-3TMS ⑨ Succinic acid-2TMS @ Glyceric acid-3TMS ① Serine-3TMS Ø Threonine-3TMS ③ Malic acid-3TMS ® Aspartic acid-3TMS ß Pyroglutamic acid-2TMS ® Glutamic acid-3TMS Ø Phenylalanine-2TMS ß Ornithine-4TMS Ø Citric acid-4TMS ② Lysine-4TMS & Tyrosine-3TMS 69 Gluconic acid-6TMS ■マウス血清の添加回収試験
マウス血清 Lot.1を100回連続測定し、その１週間後マウス血清Lot.2を100回連続測定しました。インサート、ガードチップ、カラム等の交換、イオン源の洗浄等のメンテナンスはしていません。
ピーク面積値（絶対値）の結果です。
内標による補正はしていません。 【参考資料】第15回メタボロームシンポジウムアジレント・テクノロジー杉立氏発表資料（共同研究）

■本法による尿のSCAN-TIC
ACN-水(4/1) 990 μLバイアル尿から高濃度のリン酸とクエン酸、そしてアミノ酸・有機酸を含めた多くの成分が検出された。尿n=4の重ね書きのピークの再現性もよく、良好なクロマトグラムを得られた。
■ピーク面積値（絶対値）

※内標による補正はしていません。
【抽出】 (50 mLの遠沈チューブ)試料採取 10 g凍結粉砕した試料添加水10 mL手振とう添加ACN 20 mL振とう抽出10 min遠心分離 3500 rpm, 3 min分取抽出上澄液500 μL添加ACN 500 μL振とう(37 ℃, 1 min)遠心分離 1400 rpm, 3 min添加0.1N NaOH抽出上澄液ドライアイス凍結粉砕農作物の可食部100~200 gにドライアイスを加えて凍結粉砕する。凍結乾燥ではなく、水分を含んだまま凍結して粉砕する。食品全体の成分を均一化する。水分を含んだ成分濃度の分析。

A.ほうれん草
ホウレンソウにはシュウ酸が多く含まれており、体内でカルシウムと結合し腎臓や尿路に結石を引き起こすことがある。 B.トマトグルタミン酸の濃度が非常に高いためうま味があること、酸味・水分があることから、ケチャップ、トマトソース、ピザソースなどに用いられる。 C.うめ強い酸味が特徴であり、クエン酸をはじめとする有機酸などを多く合む。
編集化法によっ1.  Lactic acid-2TMS 2. Alanine-2TMS 3.  Valine-2TMS 4.   Phosphoric acid-3TMS 5. Leucine-2TMS 6. Isoleucine-2TMS 7. Proline-2TMS 8. Glycine-3TMS 9.   Succinic acid-2TMS 10.Serine-3TMS
13. Aspartic acid-3TMS 14. Methionine-2TMS 15. Pyroglutamic acid-2TMS 16. GABA-3TMS 17. Glutamic acid-3TMS 18. Phenylalanine-2TMS 19. Citric acid-4TMS 20. Lysine-4TMS 21. Tyrosine-3TMS事-盗撮終日
3. Cymene 4. Eucalyptol 5. Terpinolene 6. 1-Allyl-2-isopropyldisulfane 7. Fenchol 8.  Trisulfide, methyl propyl
15. Bisabolene
誘導体化誘導体化誘導体化試薬を含有した溶媒で溶出しながら胃袋型インサートを備えたGC注入口へその溶出液を導入し、インサート中で誘導体化。誘導体化試薬MTBSTFAを溶出溶媒に混液させて、t-BDMS化を行った。におい成分を誘導体化することでこれまで見えていなかった成分が見えてくる。糞便中短鎖脂肪酸分析への応用などいろいろな分析の可能性。