杉町　丰史国立病院機構九州がんセンター肝胆膵外科Key words：肝内胆管癌、Hippoシグナル、免疫組織化学染色、TGF-beta
箱 富
胆管癌（肝内・肝門部・遠位胆管癌）はその発症率や死亡率が近年世界的に増加している。中でも肝内胆管癌は黄疸などの症状を来しにくく、早期に転移を来すことから診断・治療が極めて困難な悪性腫瘍である。唯一根治が期待できる肝切除ができた場合で5年生存率が約40%、切除できなかった場合は10%以下と極めて予後が悪い。また、抗腫瘍薬や放射線療法の感受性も低く、離治性高悪性度の癌である。近年、消化器癌の領域においては新規開発された様々な分子標的治療薬が臨床応用され高い抗腫瘍効果を示しているが、胆管癌に効果が証明された薬剤は未だ存在せず新規治療法の開発が切望されている。次世代シークエンサーによるゲノム解析の進歩に伴い、胆管癌を含む胆道癌においても大規模な遺伝子変異の解析が報告されるようになり、変異頻度が高い遺伝子としてBAP1ARID1A、 PBRM1、 IDH1、2等が明らかになってきた[1]。しかし、いまだ胆管癌においてコンセンサスが得られたバイオマーカーや有用な標的治療の対象となりうる分子は未だ明らかになっていない。今回、肝内胆管癌における細胞接着感受性喪失機構の因子の一つであるHippoシグナルに著目した。Hippo経路は器官サイズなどを規定する重要なシグナル伝達系である[2]。Hippoシグナル経路の中核は、MST、LATS、MOB1のキナ一ゼカスケードによって構成されており、これら活性化したキナ一ゼは下流のYAP1 / TAZをリン酸化し、YAP1の核移行を阻害し、細胞増殖に対し負に働く。逆に、Hippo経路が抑制されることによって細胞が増殖することとなり癌化に関わると考えられる。肝細胞でYAP1を過剰発現させると肝細胞や未熟胆管細胞の過形成のために肝腫大、幹細胞・未分化胆管細胞系への分化、肝・胆管発がんを来す。このようにHippo経路は肝・胆管癌発生に重要な役割を果たすことが示唆されている。 Hippoシグナル伝達系は細胞増殖、アポトーシスのみならず細胞分化にも重要な役割を果たすことから、癌の発生・進展における役割が注目を浴びている。 HippoシグナルのうちMob1は、大腸癌、メラノ一マ、乳癌など様々な悪性腫瘍で欠損していることが知られており、がん抑制遺伝子として機能すると考えられている。我々は、Mob1のConditional KOマウスを作製したところYap過剰発現の肝細胞癌ではなく腫瘍形成型肝内胆管癌が多く発生するという知見を得た[3]。したがって、肝内胆管癌におけるHippo経路異常の解析は、新たなバイオマーカーや新規分指標的治療の確立につながると考え本研究を計画した。本研究の目的は研内胆管癌におけるHippoシグナル伝達分子の発現異常を検討し、その機能を解析することにより、Hippo経路分子の胆管発癌への関わりや、疾患予後との関連を解明し、新たな肝内胆管癌治療の発展へつなげることである。
方　紙
1.胆管癌のサンプリング
肝内胆管癌は原発性肝癌の10%以下であり、さらに切除可能な症例が少ないため大規模の症例集積が困離な癌腫である。我々は88例の肝内胆管癌切除症例の切除病理標本、臨床病理学的所見、治療内容、治療反応性・予後の情報を集積した。
2. 免疫組織学的染色
88例の肝内胆管癌切除症例の切除病理標本、臨床病理学的所見、治療内容、治療反応性・子後の情報を集積した。例の腫瘍形成型肝内胆管癌切除標本を用いてHippoシグナル分子の重要経路である抗Yap抗体(Sigma-Aldrich)、抗Mob1抗体 (Cell Signaling Technology)、抗TGF β 2抗体 (Invitrogen)、抗SMAD2抗体 (Santa Cruz)にて免疫組織学的染色を行った。また肝内胆管癌との比較対象として肝細胞癌、混合型肝癌、非癌肝細胞、非癌胆管細胞においても評価を行った。各タンパクの発現強度、核内発現の有無を詳細に検討してスコアリングし、臨床病理学的因子などとの相関を解析した。
3.ゲノム解析
肝内胆管癌切除10症例の切除新鮮標本より、各症例癌部複数箇所3～9ヶ所、非癌部１ヶ所、合計74検体より組織を三次元的に採取した。 Laser microdissectionの手法を用いて確実に腫瘍成分のみを採取し、DNAを抽出した。次世代シークエンサーを使用して、全エクソンのシークエンシングを行い、塩基変化（遺伝子変異、コピー数変化）を同定した。遺伝子変異、コピー数多型データを網羅的かつ統合的に解析した。
姫　果
1.肝内胆管癌におけるYAP1の発現具常
肝内胆管癌88例でYAP1核内強発現を評価した。YAP1の核内異常発現は28例（31.8%）に認められた（図1)。 YAP1強発現群は低発現群と比較して有意に術後生存率が低いことが分かった（p＝0.017） (図2)。図1. 肝内胆管癌におけるYAP1核内異常発現図2.  YAP1発現と予後の相関抗YAP1抗体による免疫組織学的染色にて癌細胞で核内異常発現が見られる。 (log-rank検定)
2.肝内胆管癌におけるMOB1の発現具常
肝内胆管癌88症例においてMOB1の発現低下が42例（47.7%）にみられた。MOB1低発現群は高発現群と比較して有意に術後生存率が低かった（図3)。 MOB1発現とYAP1発現の有意に相関はなかった。次にYAP1発現高・低とMOB1発現高・低によって4群に分けてサプグル一プ解析を行った。YAP1低発現かつMOB1高発現群は他の3群と比較して有意に術後生存率が高いことが示された（図4)。これらの結果によりYAP1強発現やMOB1低発現があれば予後は不良であり、Hippoシグナル構成分子の異常が一つでもあれば重要な予後因子となることが示された。
3. Hippoシグナル経路とTGF βシグナル経路の関係
TGF βとTGF βレセプターが結合するとSMAD経路が活性化され核内シグナル伝達が起こることがわかっている。 YAP1の検内移行により核内でSMAD経路が活性化されることが示されているため、今回TGF β2とSMAD2タンパク発現を肝内胆管癌において検討した。TGF β 2タンパク高発現は34症例（38.6%）、SMAD2タンパク高発現は47症例（57.4%）にみられた。TGF β2とSMAD2の発現は有意な正相関がみられた。SMAD2高発現群では有意にリンパ節転移が多かった（p = 0.014)。TGF β2とSMAD2の発現と予後の相関はなかった。YAPの核内高発現は有意にTGF β経路の核内転写因子であるSMAD2と核内発現が相関しており、両者の相互的な働きが示唆された（図5)。
5.肝内胆管癌のmultiregional samplingによるエクソームシークエンスの結果
肝内胆管癌10症例それぞれの複数箇所よりDNAを抽出し全エクソンのシークエンスを行い遺伝子変異の解析を行った。各症例内でのサンプル間での全て共通した変異（Founder変異）が53%（range 24～74%）、複数箇所で共通した変異（Shared変異）が18%（range 5～40%）、1箇所のみでみられる変異（Unique変異）が29%（range 6～ 54%）見られた（図6)。これらの結果から症例内や症例間での遺伝的不均一性・多様性が見られることがわかった。図6.肝内胆管癌における遺伝子変異解析肝内胆管癌10症例における遺伝子変異の分布。腫瘍内および腫瘍間のheterogeneityが見られる。さらにゲノムのコピー教変化を解析したところ遺伝子変異と同様に症例内・症例間の遺伝的不均一性・多様性があることが明らかになった(図7)。コピー数変異にも腫瘍間、腫瘍内の多様性見られる。
寿　祭
ヒトやマウスの研究成果によりHippo経路は肝癌の発生、中でも癌の幹細胞性、胆管系譜分化に重要な役割を果たすことが示唆されてきた。これまでにノックアウトマウスや臨床検体の解析によって肝癌や肝内胆管癌の発生と進展にHippoシグナル経路が重要な役割を果たしていることが明らかされており、Hippoシグナルは有望な治療標的と考えられている。Hippoシグナル構成因子の中でもYAP1とTAZは転写共役因子として転写因子の活性を調節する重要な分子であり、治療標的として精力的に研究されている。これまでに、YAP1/TAZを抑制する方法として、1. YAP1/ TAZのリン酸化によってその核内移行を抑制する方法、2. YAP1／TAZとTEADの結合を抑制し転写活性を抑制する方法、3. Srcファミリーキナーゼの阻害によるYAP1の核内移行を阻害する方法、などが報告されている。今回の我々の研究結果により肝内胆管癌におけるHippoシグナルの重要性が明らかになった［4］。腫瘍形成型肝内胆管癌に対する治療標的は現状ではまったく確立されていないため、今回の研究を継続することで今後のHippoシグナルを標的とした新たな分子標的治療の開発をする上での非常に重要な基礎的研究となると期待される。また本実験で行ったゲノム解析については、今後はエピゲノム変化やタンパク発現変化も含めた統合解析を行っていくことが次の研究課題である。