3P081シリカゲル細孔内のチオフェン二置換体系固溶体の融解挙動(日大院・総合基',日大・文理²,) ○酒井瞬¹，井上侑子²，野口渉¹，名越篤史²，藤森裕基²) Melting behaviors of disubstituted thiophene solid-solution systems in silica-gel nano-pores (Graduate School of Integrated Basic Sciences, Nihon Univ. 1, Department of Chemistry College of Humanities and Sciences 2 ) ○ Shun Sakai 1 , Yuko Inoue 2 , Sho Noguchi 1 , Atsushi Nagoe 2 , Hiroki Fujimori 2 【緒言】チオフェン系の物質は、結晶相においてガラス転移を示す興味深い物質である。平面型のチオフェン二置換体である2,5-dibromothiophene (BBT), 2,5-dichlorothiophene (CCT)の二成分混合系が、固溶体を形成することが以前の研究からわかっている。本研究では、示差走査熱量分析(DSC)により、(BBT)₁.｡(CCT)｡の二成分混合系が、ナノメーターサイズのシリカゲル細孔内においてどのような熱的挙動を示すかを調べた。固溶体の融解において、その吸熱ピークの幅は相分離過程に依存する。各昇温速度における純物質の融解ピーク幅との比較から、それぞれの組成比における融点とその温度幅を見積もり、相図作成、過剰熱力学量の算出、それらの比較を行った。 【実験】 BBT、CCTは和光純薬工業から購入し、減圧下で精留した。二成分系の混合組成比をCCTモル組成x ( x  ＝1.0, 0.72, 0.48, 0.33, 0)に調製し、試料として用いた。富士シリシア化学社製シリカゲルCARiACT Q30 (細孔径27.2 nm)に充填した試料とバルク試料のDSC測定を、パーキンエルマー社製 DSC8500を用いて行った。低温で結晶化させ安定相へ転移させたのち、昇温速度を4 K min 1、10 K min 1、20 K min 1で測定した。試料量は、バルク試料は約7 mg、細孔内試料は約3 mgになるように調製した。 【結果・考察】図1は、バルクの(BBT) ι κ (CCT) ,二成分系の全組成領域におけるDSC測定結果の比較である。各混合比において、昇温速度（4 Kmin 1）、試料量（約7 mg）を固定している。それぞれの混合比において、固溶体の融解にともなう吸熱ピークは１つ観測されず、混合物において固溶体が形成されることが確認された。固溶体の融解ピークは、純物質の融解ピークと比較して、ピークの温度幅が広くなっている。融解熱には大きな差が見られないため、固溶体が融解する際に相分離を引き起こしていることが分かる。また、同様の実験を昇温速度を変えて行った。その結果、昇温速度の増大にともない融解ピークの温度幅の差は小さくなり、固溶体の相分離過程が昇温速度に依存することが示された。図2は、この二成分混合系をシリカゲルQ30に充填した試料のDSC昇温測定結果を示す。バルク試料と同様に測定速度(4 Kmin ')と試料量(3 mg)を、一定とした。細孔内においてもバルク試料と同様に、全混合比において単一の融解ピークを観測し、固溶体が形成されることがわかった。細孔内試料の融解温度は、バルク試料に比べて低温側にシフトした。また、細孔内の純物質の融解ピークは、バルク試料と比較して、よりプロードになった。これは、シリカゲルの細孔径分布に起因すると考えられる。一方、細孔内では、混合物の形成する固溶体の融解ピークは、純物質の融解ピークと比較して大きく変化しなかった。このことは、シリカゲル内では、昇温速度4 Kmin 1でも、ほとんど相分離を起こさないことを示しており、細孔に入れることでほぼ固相、液相の共存領域がなくなることが見出された。このことは、細孔中で分子の拡散運動が抑制されていることを示している。次に、相図より固相－液相間の等ギプズエネルギー温度を見積もり、測定された融解熱から過剰熱力学量の算出を行った。まず、それぞれの混合比におけるバルク状態と細孔内充填時の融解エンタルピーΔrmsHと融解エントロピーΔrmsSを算出した。ΔrmsH、ΔrmsSを比較すると、細孔内に充填した方が低い値をとることがわかった。 ΔfgH, ΔfgSの理想混合の挙動との差を過剰エンタルピーΔH 、過剰エントロピーΔSとして算出した。その結果、細孔中では、ΔH 、 ΔS は大きくなることが見出された。細孔中では、固溶体中の２成分が均一に混ざりにくくなっていると考えられる。最後に、求めた過剰エンタルピーΔH 、過剰エントロピーΔSを用いて、過剰ギプズエネルギーΔGを算出し、比較した。ΔGは、固溶体の安定性の尺度である。その結果、バルク状態と細孔内では、ほぼ等しい値を取ることが見出された。ΔH 、ΔSが異なるのに対し、ΔGが等しい値をとるのは、理由は不明だがとても興味深い結果である。 CO₂分離回収材の反応（４） 核磁気共鳴分光分析(地球環境産業技術研究機構¹／新日鐵住金²)○山田秀尚¹*•後藤和也¹•東井隆行¹•松崎洋市² Reactions of materials for CO 2 separation and capture (4) NMR spectral analysis (RITE¹ / NSSMC²) ○Hidetaka Yamada,¹* Kazuya Goto,¹ Takayuki Higashii,¹ Yoich Matsuzaki²
【緒言】
CO₂回収貯留（Carbon dioxide Capture and Storage: CCS）はは，火力発電所や製鉄所などから放出される燃焼排ガスや高炉ガスから，CO₂を分離回収し，地中等に封入する技術であり，IPCC （気候変動に関する政府間パネル）はCCSを地球温暖化対策のキーテクノロジーとして位置づけている。分離に用いる材料として，吸収液，吸収剤，分離膜などがあるが，特にアミノ基とCO₂との化学的あるいは物理的相互作用を利用する材料が多い。この際，アミノ基の窒素原子とCO₂の炭素原子との結合生成，或いはアミノ基のプロトン受容性がもたらすカルボネートの生成などが， CO₂の分離機構において中心的な役割を果たす[1-3]。アミノ基を持つ化学種,すなわちアミンとCO₂の反応性は,材料がもたらす分子環境,分離過程における温度・CO₂分圧等の諸条件などに支配される。これらを理解する上で，材料に取り込まれたCO,の化学形態を同定することが有益である。そのような目的に適した手法として，¹³C-NMRが挙げられる。ただし，¹³C-NMRではプロトンデカップリングに伴う核オーバーハウザー効果によって，定量性を失う場合があり，高精度の定量測定を行う為には，慎重にパルスパラメータを決める必要がある[4]。本研究では，CO₂ローディングの異なる化学吸収液（アミン水溶液）を対象に，¹³C-NMRによって，溶液中CO₂の化学形態を同定し，高精度定量測定を実施し，CO₂吸収反応機構について議論する。
【方法】
アミン水溶液（試料1）に常温・常圧下で飽和量のCO₂ガスを吸収させ（試料2)，試料1と試料2を混合し、CO₂ローディング（mol CO₂/mol amine）の異なる試料を調製した。二重管内部に試料を，外側にロック溶媒（CoDe）および内部標準（Si(CH 3 )。）を封入し， DRX500 型NMR装置（プルカー・バイオスピン）で分析した。綾和時間測定は反転回復法で，定量測定は逆ゲート付きデカップリングで実施した。
【結果と考察】
図1に,  2-(エチルアミノ)エタノール水溶液（30wt%）にCO₂を吸収させた試料において同定された化学種を，図２には，これらの化学種の定量測定結果を，CO₂ローディングの異なる各試料に対して示す。これら同定された化学種において,炭素13のスピン-核子緩和時間は1 sから12 sの範囲内に測定された。定量測定のパルスパラメータは，その結果に基づき決定されたものである[4]。アミン水溶液によるCO₂吸収は，主にカルバメートイオン生成反応あるいは重炭酸イオン生成反応によることが知られている[5-8]。 2R¹R²NH + CO² ↔ R¹R²NCOO¯ + R¹R²NH²*
R 1 R 2 R 3 N + CO 2 + H 2 O ↔ HCO 3 ¯ + R 1 R 2 R 3 NH +
2-(エチルアミノ)エタノールは2級アミンであり，その水溶液では，カルバメートイオンと重炭酸イオンの生成反応が並行して進行する。本測定の結果から，低ローディング領域では反応(1)が，高ローディング領域においては反応(2)が優勢であり，カルバメートイオン濃度は,ローディング0.5 mol CO 2 /mol amine付近を境に，増加から減少に転じることがわかった（図2 ) 。図1. 2-(エチルアミノ)エタノール/CO₂/H₂O系の化学種さらに，本研究で実施した高精度の測定から，第3の吸収形態として，微量ながらアルキルカルボネートが生成していることが確認された（図１および図２)。 (3) 2RNHCH 2CH 2 OH + CO 2 ↔ RNHCH 2CH 2OCOO¯ + RNH 2 *CH 2CH 2 OHここでRはエチル基を表す。本研究は新エネルギー産業技術総合開発機構(NEDO)プロジェクト｢環境調和型製鉄プロセス技術開発(COURSE50)」において実施した。 [1]山田他, CO₂分離回収材の反応(1)分離技術会年会(2013). [2]山田他, CO₂分離回収材の反応(2)化学工学会第45回秋季大会(2013). [3]山田他, CO₂分離回収材の反応(3)化学工学会第45回秋季大会 (2013). [4] H. Yamada et al. Int. J. Greenhouse Gas Control (2013). [5] H. Yamada et al. J. Mol. Model. (2013). [6] H. Yamada et al. Ind. Eng. Chem. Res. (2010). [7] F. A. Chowdhury et al. Ind. Eng. Chem. Res. (2013). [8] H. Yamada et al. J. Phys. Chem. A (2011). *e-mail address: hyamada@rite.or.jp 3P083水の霧化における第二成分添加効果(日大院・総合基',日大・文理², (株)シンクロン')○原由峰',高安光祐',福地瑠美²,名越篤史¹,藤森裕基¹,山田大介³,税所慎一郎³ Second component doping effects of atomization for water ( Graduate School of Integrated Basic Sciences, Nihon Univ. ¹ SHINCRON　 CO.,LTD.³) Sciences 2, ○ Yutaka Hara ¹ , Kosuke Takayasu ¹ , Rumi Fukuti² , Atushi Nagoe ¹ , Hiroki Fujimori ¹ , Daisuke Yamada ', Shinitirou Saisyo '
【猪言】
超音波振動子（以下、「振動子」とする）による水の霧化現象は加湿器などに利用されている。振動子は、圧電素子と高周波電源から構成され、圧電素子に高周波電界を印加することにより超音波振動する。水中で振動する場合、水はこの振動子の振動エネルギーを受け水面の隆起とともに水柱が発生する。その際、水柱の表面にキャピラリー波と呼ばれる微小な波が起き、その先端部で霧化現象が観測される。この時の振動エネルギーの音圧（P）は振動子から水面までの距離（I）の関数として、（1）および（2）式で表される。（1）式は近距離的性質、（2）式は遠距離的性質の音圧を示す。しかし、これらの式のみでは霧化の詳細な機構を解明することはできない。また、霧化した水滴の平均粒径（ｽ）は振動子の共振周波数（f）に依存しており、(3)式で
(1)式および(2)式における、ρcは固有音響インピーダンス、πα²は振動子の面積、V,は振動速度、えは波長、kは比例定数、yは液体の表面張力、ρは密度である。 (3) 式のkは比例定数であり、その値は研究者により異なり、0.34〜1.0の値をとることが知られている。本研究では振動子を設置するガラス容器サイズ(のを変化せた時の霧化現象を観察し、その時発生する音圧が霧化にどのように影響するかを調べた。また、霧化現象により発生した水滴の大きさ(죄)を、レーザー回折式粒度分布測定装置を用いて測定した。さらに、それらに対する第二成分添加の効果についても調査した。
【実験】
振動子として、本多電子株式会製の超音波霧化ユニットHM303Nを用いた。測定は、ガラス容器の底に振動子を設置し、そこに水を注水してIを変化させた時の水柱の高さ（ね）を測定し、霧化を観察した。本実験での霧化の様子はカシオ計算機株式会社製のデジタルカメラ（ハイスピードエクシリムEX-F1）を使用し撮影した。なお本研究では水として東京都の水道水を用いた。 【結果・考察】 Figure 1はkのl依存性を示す。各記号は�とlを変化させた時の実験結果を表す。hはｌの増加に伴い、いったん増加した後、単調減少している。このことは、Iに伴うPの増減と同様の現象である為、超音波振動により発生する水柱は超音波の音圧によるものであると考えられる。その高さは水面から飛び出す速度に比例し、超音波の音圧の二乗に比例する。したがって、hは以下の式で表されると仮定した。
式に代入し、実験結果とのフィッティングによりb 1 、bを得た。図は、異なる容器サイズにおける実験結果と、(5)式及び（6)式より得られたhのl依存性を示す。実測値と理論値は良い一致を示した。したがってhはPの2乗に比例するという仮定した(4)式は、妥当であると考えられる。また霧化はl＜60 mm、 h＞40 mmで観測された。当日は水の霧化における第二成分添加効果についても議論する。光合成反応中心タンパク質の極低温1分子分光(東工大・理工',阪大・蛋白研',阪大・理') ○近藤徹'武藤梨沙'栗栖源嗣'大岡宏造'藤芳暁'松下道雄' Single molecule spectroscopy of photosynthetic reaction center at cryogenic temperature (1: Dept. Phys., Tokyo Tech.,    2: IPR, Osaka Univ.,    3: Dept. Biol. Sci., Osaka Univ.) ○Toru Kondo 1 , Risa Mutoh 2 , Genji Kurisu 2 , Hirozo Oh-oka 3 , Satoru Fujiyoshi 1 , Michio Matsushita 1 【序】生体内で生じる電子移動反応は高度に最適化されており非常に効率がよい。その原因として電子移動担体の相対配置や化学ポテンシャルなどの静的な因子が考えられており、実験・理論の両面から研究されてきた。一方で、反応に伴う電子移動担体結合サイトの構造変化など動的な因子の重要性も示唆されている[1]。我々は、生体試料を反応中に急冷して、変化した構造をそのままトラップし、極低温で1分子分光を行うことで、補因子の結合サイトの構造変化などを明らかにする。極低温の1分子分光は集団平均や熱揺らぎの影響をほとんど受けずに解析でき、これまでにいくつかのタンパク質で色素結合サイトの構造や物性の評価に成功しており[2-4]、今回の系にも適用できると考えている。本研究の対象は光合成細菌ヘリオバクテリアの反応中心タンパク質（hRC）である。電子移動担体A 1分子のスペクトルを測定し、電子移動反応で誘起される構造変化を調べる。 FA : 4Fe-4S cluster (吸収: 430 nm) hRCの結晶構造は未同定だが、植物やシアノバクテリアの光化学系I型（PS I）RCと高い相同性を持つ。図1にhRCの推A1 : menaquinone定構造を示す。光励起によりP800で電荷分離が生じ、P800 → (吸収: 400 nm) A o → A 1 → F x → F x F x /F b と電子が移動する。このときの量Ao : Chl :子収率はほぼ100 %に達する。hRCは主要色素としてBchl g厨起(吸収：800 nm)を多く持つが、電子移動担体Aとして２つのP800 : Bchl g dimer F& 10 (吸収：800 nm) Chl a (吸収：670 nm)も結合している。吸収波長の違いからChl aはBchl gと区別可能であり、電子移動経路のタンパク質red-Bchl g吸収: 808 nm構造変化をAoのスペクトルから調べられる。Aoを励起すると蛍光: 840 nm)エネルギーは高速でred-Bchl gに移動し蛍光放出されるため、図1 ：光合成細菌ヘリオパクテリア反応中A o  1分子の蛍光励起スペクトルを検出する必要がある。そこ心タンパク質（hRC）の推定構造で可視光領域の波長可変光源と1分子分光顕微鏡を作製し、 A oの励起蛍光スペクトルを測定した。 【実験】図2に作製した光学系を示す。フェムト秒レーザー  750 nm光を焦点距離f=2の非球面単レンズでフォトニック結晶ファイバーにカップルした。広帯域のスーパーコンティニューム(SC)光が発生するので、f=9対物レンズでコリメートした。 f=-100, 500レンズペアでビーム直径を5倍（約17 mm）に拡大し、プリズムで分光した。ビーム径を大きくしたことでプリズムのスペクトル分解能が向上する。プリズムから400 mmの位置にf=400レンズを置いてテレセントリックな配置にし、プリズムで分散した光を光軸平行に揃えた。目的の波長の光をf=-50レンズでコリメートし、 f=9対物レンズでシングルモードファイバー（SMF）にカップルした。電動ステージを走査し500 - 800 nmの範囲で波長を変えられる。ミラー・レンズを配置したベースプレートごと電動ステージで動かすことで、光源出力の安定化を図った。プリズム前にミラーを挿入しSC光をそのまま出力することもできる。 SMFの出力光は2枚の波長板で楕円偏光にし、ビームスプリッター・スキャンミラーの順に反射した。２枚の凹面ミラーを通過後、反射対物レンズで光を集光し試料基板上の1分子を励起する。スキャンミラーを動かして反射対物レンズへの光入射角度を走査し、試料基板上の２Dイメージ像を得る｡２枚の凹面ミラーは4f光学系を形成しており、入射角度を変えても光は対物レンズ瞳を通過する。独自に開発された反射対物レンズは極低温条件下でも回折限界性能で動作し色収差もない[5]。試料からの蛍光(800 nmより長波長）は励起光と同光路を逆に進む。ピームスプリッターを透過するので、APDで光子数をカウントした。 hRC標品はHeliobacterium  modesticaldumから単離・精製した。buffer (50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1% poly vinyl alcohol-EG40, 500 550 0.22 mM β-DDM, 10 mM ascorbate)で17.5 pMまで希釈し、CaF 2基板にスピンコート後、クライオスタット（Optistat SXM, Oxford社）にセットした。 【結果と考察】図3にSMFから出力された励起光スペクトルを示す。波長は677 nm付近に設定した。シャープな励起光を得ることができた。図4にクライオスタット直前で測定した励起光強度とスペクトル幅を示す。強度は最大で24 uW程度であった。これは試料基板表面で約1.2 kW/cm²@ 633 nmに相当し、十分な出力である。スペクトル幅は 1.2 nm程度であった。図5に80 K で785 nm 励起光を用いて測定した2D蛍光イメージ像を示す。励起光はSC光を785 nmバンドパスフィルター（2 nm幅）に通すことで得た。楕円偏光なので遷移双極子モーメントの向きに依らず励起する。観測された輝点はそれぞれが1 hRCに対応する。エアリーディスク半径は720  nm程度と見積もられた。これは理論値667 nmの1.08倍であり、回折限界程度の十分な分解能である。輝点位置に励起光スポットを固定し、励起波長を640 nmから750 nmまでスキャンし蛍光光子数を測定40した。図6Aにスペクトルの時間変化を示す。広い波長30範囲にピークが観測された。40分を境に全てのピークが同時に消えており、1つのhRCに由来するピークである10ことを示唆する。図6Bにピーク消滅前後のスペクトルを示す。赤線と青線はそれぞれ図6Aの赤・青矢印で示す時間領域の積算平均スペクトルに対応する。 642, 658 B nm にシャープなピークが、700-740 nm範囲にはプロードなピークが見える。 Bchl gの吸収ピークには700-740 nmに肩があり、今回親測された700-740 nmのプロード12なピークは1 hRCに多数結合するBchl gのピークが重なって見えていると考えられる。一方、シャープなピークが観測された642, 658 nmはChl aのQy吸収帯に近く、 hRCの電子移動担体A 由来であると考えられる。 [1] McMahon B. H., et al. (1998) Biophys. J., 74, 2567-2587. [2] Oikawa, H., et al. (2008) J. Am. Chem. Soc. , 130, 4580-4581. [3] Fujiyoshi, S., et al. (2011) Phys. Rev. Lett., 106, 078101. [4] Baier, J., et al. (2009) Biophys. J., 97, 2604-2612. [5] Fujiwara, M., et al. (2009) J. Opt. Soc. Am. B , 26, 1395-1399. 3P085　近赤外光励起アンチストークス蛍光イメージングを利用した光合成膜顕微分光(京大院・理¹，科学技術振興機構　さきがけ²，京府大　生命環境³) ○熊崎茂一¹,²,明里将志¹,長谷川慎¹,寺鳴正秀¹,椎名隆³ Anti-Stokes Fluorescence Imaging of Thylakoid Membrane by Near-Infrared Laser Excitation  (1:Grad. Sch. of Sci., Kyoto Univ., 2:JST-PRESTO and 3:Grad. Sch. Life and Environ. Sci., Kyoto Prefectural Univ.) Shigeichi Kumazaki ¹.², Masashi Akari¹, Makoto Hasegawa¹, Masahide Terazima¹ and Takashi Shiina³. [背景]常温葉緑体の自家蛍光では光化学系II（系II）とその光捕集複合体(LHCII)の蛍光が支配的で、光化学系I(系I)とその主な光捕集複合体(LHCI)の蛍光がしばしば無視されるほど弱いことが葉緑体の分光学的な研究が始まって以来の常識であった。系IやLHCIの蛍光を見るためには77K等の低温が用意され、それは確かに狭いエネルギー領域に重なりあう蛍光成分を区別するために有効であった。低温の光合成膜を顕微分光で研究する試みもあり、それは一定の成功を収めてはいるものの、系Iや系IIが関わる光合成膜の生理的な変化を直接に実時間で観察するためには常温で系Iの情報も得られることが望ましい。我々は常温で系I蛍光をとらえて画像化する手法を提案し(文献1,2)、それが実際の細胞分化の途上における光合成膜の変化をとらえることができることを実証してきた(文献3)。今回の講演では、第一の内容として、この文献3で報告した内容について詳細な解説を行う。糸状連結シアノバクテリアで１０－２０個の細胞の内１個で進行する細胞分化を顕微蛍光スペクトルで追跡し、色素タンパク質複合体がある規則性を持って崩壊し、細胞機能が変化していく様相の全貌をとらえることに成功した。第二の内容はアンチストークス蛍光の発生確率に関する基礎研究である。光合成色素ではないが、クロロフィルの吸収極大波長（およそ680nm)よりやや短波長に吸収極大波長(646 nm）を示すレーザー色素溶液(Oxazine 1 in ethanol)について、785nm励起と488nm励起の比較でアンチストークス蛍光発生確率の定量的評価を行った（文献４)。このような定量的評価はまだ例が少なく、今後の一般性理解に向けて有用であると期待される。 [光合成膜が酸素発生を停止して窒素固定と共存できる様式へ転換される生理的変化追跡]糸状シアノバクテリア(Anabaena variabilis)の自家蛍光スペクトルはPEC(蛍光極大619 nm), PC(645 nm), APC(661 nm)と略記されるアンテナ色素複合体と系II(685 nm)、系I(730 nm)の５つの蛍光成分で説明できることが特異値分解とグローバル蛍光成分解析により判明した。成分分解する前の単一細胞の蛍光スペクトル変化を次ページに示す。窒素固定能力を持つに至る異型細胞(Het. :heterocyst)とそれに隣接する栄養細胞（Veg. 1：vegetative cell)の蛍光スペクトルを比較している。栄養細胞においてはPECやPCの成分のみが顕著に減少しているがAPCは維持されており、系II蛍光はわずかに増加すら示す。成分分解により、異型細胞では系II蛍光がAPC蛍光と同時に消失していることが分かった。これらアンテナ色素を見るためには808nmパルスレーザーによる2光子励起を用いたが、785nm連続発振ザー励起アンチストークス蛍光画像の場合、PEC, PC, APC,系IIが劇的に小さくなり、ほぼ系Iのみの信号が得られる。異型細胞分化途上の系I濃度がほぼ一定であるということ、アンテナ色素からのエネルギー移動の影響されず世界で初めて決定することができた。上図下図紙面の都合により、アンチストークス蛍光発生確率の定量的評価については当日詳細を述べる（文献４）。 [文献]  (1) M.Hasegawa, T. Shiina, M. Terazima, and S. Kumazaki,* (2010) Plant Cell Physiol. 51(2), 225 – 238. (2) M. Hasegawa, T. Yoshida, M. Yabuta, M. Terazima andS. Kumazaki* (2011) J Phys. Chem. B,115, 4184 – 4194. (3) S Kumazaki*, M. Akari and M. Hasegawa (2013) Plant Physiology, 161, 1321 – 1333. (4) S Kumazaki* (2013) Chem. Phys. 419, 107–112.
構造化照明を用いた３次元広域ラマンイメージング顕微鏡の開発(台湾国立交通大学・応用化学)  ○島田林太郎、濱口宏夫【序】　広域ラマンイメージング顕微鏡は顕微鏡下の試料に対し、広域に同時に励起光を照射し、試料中に発生するラマン信号光分布を直接検出器上で取得する手法である。顕微ラマンイメージング手法として今日一般的である共焦点ラマン顕微分光法に比べ、試料もしくはレーザースポットの掃引が不要であるため、特に広域の画像取得時間の大幅な短縮化が期待できる。しかしながら、試料中の異なる奥行きから発生した信号光を選別すること無く検出してしまうため、奥行き方向の空間分解能が共焦点顕微分光法に比べ格段に劣るという欠点があった。本報告では、広域ラマンイメージング顕微鏡の奥行き方向分解能の向上を目的とし、近年、広域蛍光顕微鏡や広域レーザー散乱顕微鏡などで開発されてきた構造化照明法[1,2]をラマン顕微鏡に応用した結果について議論する。 【原理[2]】 構造化照明法では焦点面内において構造（例えば縞模様）を持った照明光を励起光をとして用いる。焦点面近傍で発生する信号光強度は照明光の強度分布を強く反映する一方、焦点面から離れた奥行きから発生する信号は照明光の構造がぼけるため、照明光の構造をほとんど反映しないものとなる。構造化照明法では同一の試料について、縞模様の位置をずらしながら画像を複数枚取得し、それらの画像を比較解析することで焦点面付近からの信号光をそれ以外の奥行きからの信号と区別する。 【実験】　（装置）図１に装置図を示す。励起Sample光はNd:YVO,レーザーの第２高調波(532 nm) Objectiveを用いた。レーザー光線を拡散板に通し、顕微鏡外第２対物レンズの焦点面に設置した格子パターンの照明光とした。格子の像は顕微鏡光学系により試料位置へと伝送され、対物レンズFilter焦点面において2 μm周期の正弦波状縞模様として結像された。焦点面において約30 μm 532 nm. 5 W (max)四方の領域が構造化照明によって照射された。試料中で発生したラマン散乱光は対物レンズCCDによって集められ、ノッチフィルタによって励(Acousto-Optical Tunable Filter起光と分離された後、音響光学可変波長フィル装置図図lタ(AOTF)に入力された。AOTFによって特定のラマンシフト信号のみ選別された後、CCD検出器上で画像として検出された。 (測定)ポリスチレンビーズ(直径3 μm)の水懸濁液を試料として用いた。格子パターンを縞模様と直行する方向に漸次移動し、各格子位置においてラマン画像を取得した。一連の画像取得には合計で190秒を要した。試料の奥行き方向位置を変えながら同様の測定を繰り返し、ポリスチレンビーズの異なる深さでの断面像を取得した。ポリスチレンビーズの1001 cm 1バンドを用いラマン画像を取得した。 【結果と考察】　格子パターンを移動しながら得られた一連の画像について、各画素の強度変化を定数成分と正弦波様に変調する成分に分離し画像を再構成した。定数成分は従来の広域ラマン顕微鏡で得られる画像に対応し、正弦波様に変調する成分は焦点面付近からの信号強度のみを抜き出した奥行き方向分解能が向上した画像に対応する。図２に、ポリスチレンビーズの異なる奥行き方向位置の画像から再構成された正弦波成分（上段）および定数成分（下段）の画像を示す。図から明らかなように、変調成分画像では定数成分画像に比べ信号のコントラストが大幅に改善している。ポリスチレンビーズの輪郭がより明確になっているほか、ビーズの内部の信号強度もより均一になっており、３次元断面図を取得できていると考えられる。試料の奥行き位置を大きくずらした場合(-1.5, -2.0 μm)、変調成分画像ではビーズ由来の信号が完全に消失するのに対し定数成分画像では消失せず、奥行き方向の分解能が大きく向上していることがわかる。得られた画像から奥行き方向の分解能を評価し0.4±0.2 μmという結果が得られた。本結果は、構造化照明を用いることで広域ラマンイメージング顕微鏡でも理想的な共焦点ラマン顕微鏡と同等の奥行き分解能を得ることができることを示している。限界性能を持つ反射対物レンズの開発と数Kでの色素1分子イメージングへの応用（東工大院）○稲川博敬、松下道雄、藤芳暁Reflecting Objective with a numerical aperture of 0.97 and its application to single-molecule fluorescent imaging at 1.5 K (Tokyo Tech.) ○Hironori Inagawa, Michio Matsushita, Satoru Fujiyoshi 【序】近年、生化学の発展によりタンパク質の特定の部位に（A）複数の異なる色で光る蛍光色素をつけることが可能になっている[1-2]。もしこれらの色素の三次元相対位置を数nmの精度で決定できれば、タンバク質の立体構造を1分子観測できるはずである。これに向けて我々は2007年に液体He中球面設で動作する球面型反射対物レンズを開発し[3]、温度1.5Kでのタンパク質1分子分光に成功した[4-5]。図1Aに球面反射対物レンズを示す。このレンズは、図の右側から平面波を入射させると球面鏡1、球面鏡2の順に反射し、試料上に集光する。2枚の球面鏡を用いていることと、石英ガラスの界面を2回通し屈折をキャンセルさせていることにより、色収差をゼロにする設計になっている。さらに、2枚の球面鏡の間を熱膨張保数の小さい石英ガラスで満たすことで、温度数Kでも動作する。この球面型反射対物レンズを使用した3次元レーザー走査型顕微鏡でのQdot705の蛍光測定によって、波長635 nmにおいて焦平面(XY)内の位置決定精度3 nm、光軸(Z)方向では18 μmを得た[6]。対してタンパク質分子の大きさは数nmであり、その立体構造を測定するためには主に光軸方向の分解能が不足している。顕微鏡の位置決定精度σには次式が成り立つ[7]。 … (1)ここで、Γは顕微鏡の空間分解能、Nは検出する光子数、Ωは対物レンズの有効立体角、tは積算時間である。すなわち、位置決定精度の改善には、Γを小さく、Ωを大きくすればよく、これらの要求は対物レンズの開口数NAを大きくすることで同時に満足される。これまで用いていた球面型反射対物レンズの開口数NAはHe媒質中で0.53であり、原理限界1と比べると改善の余地を残している。２枚の球面鏡のみでNAを上げようとすると、球面収差が原因で集光効率はむしろ悪化する。そこで非球面鏡を用いた新たな極低温用反射対物レンズを開発し、NA = 0.97に向上したので報告する。 【レンズ開発】図1Bに開発した非球面型反射対物レンズを示す。合成石英で一体成形された非球面鏡と球面鏡で集光する。非球面鏡は２次曲面に８次までのべき級数項を加えたもので、球面鏡による球面収差をキャンセルするように最適化することで、NA = 0.97を有しながらも回折限界性能で集光することが可能である。この設計は、現行の光学研磨技術で実現可能な限界値にしている。 NAを大きくしたことで非球面型の面内(XY)方向の分解能Γ xyは球面型のおよそ1/1.7に、光軸(Ζ)方向の分解能Γ zは1/5.3程度にまで設計上は改善する。さらに分子の蛍光を捕集する有効立体角Ωが5.2倍に向上した効果と相まって、式(1)より分子の位置決定精度はXY方向で見球面型の1/3.9に、 Z方向で1/12に改善すると見込める。一方、非球面鏡を導NA=0.53、外径φ10 mm。(B)非球面型反射対物レンズ。焦点距離1.79 mm、NA=0.97、外径φ30 mm。(C)反射対物レンズの写真。左が球面型、右が非球面型。集光位置を焦点から1 μmずつずらした。ンループ制御でステージをＹ方向に２ μm動かしたときの各軸の動き。(C)フィードバック制御をかけてステージをY方向に2 μm動かしたときの各軸の動き。入したことでコマ収差が顕著になる。図2に集光像の計算結（A）果を示す。原点からわずか1 μmずれただけで像質が著しく悪化し、従来のようにレーザー走査によって蛍光画像を取得することができない。このため、サンプルを低温槽中で３次元走査する機構を構築した。サンプルを動かすために、極低温で動作可能なピエノ素子駆動のステージを導入した。図3Aに示すのがピエノ茶子への印加電圧に対するステージ位置の変化である。ピエノ素子の伸縮は印加電圧に対してヒステリシス特性がある。また、(B)このステージは各軸が非独立でクロストークが大きい。例えば図3Bに示すように、ステージをY方向に動かすと、連動してZ方向にも動く。これらの特性のため、このステージ単体で使用しても正確に変位を制御できない。正確なサンプル走査をおこなうため、ステージの位置をセンサーで測定し、フィードバックをかけるシステムを製作した。図3CにフィードバックをかけてY方向にステージを動かしたときの各軸方向における位置の変化を示す。立ち上がりが遅くなったものの、50 ms以内に各軸とも目標座標に収束した。 【1分子蛍光測定結果と評価】図4に蛍光顕微鏡のセットアップを示す。測定する試料と共に対物レンズ、試料ステージ、位置センサーを低温層の中に配置した。励起光に用いるレーザーをピンホールとレンズで平行光にし、ピームスプリッターで反射させて対物レンズによって基板上の蛍光分子に集光させた。一方、分子が放出した蛍光は対物レンズで集めてビームスプリッターを透過させ、マルチモードファイバーにカップルし、ディテクターでその光子数をカウントした。図4の装置を用いて、10 pMのAlexa Fluor 647色素溶液または270 pM のATTO 647N色素溶液をCaF 2基板にスピンコートしたサンプルについて、波長635 nm励起の1分子蛍光測定をした。測定はArガスによって低温槽中の酸素をパージした状態で、室温でおこなった。図5A, Bにそれぞれ球面型と非球面型の反射対物レンズで取得した蛍光画像およびその強度断面を示す。この結果から得られた面内方向の分解能Γ xyは球面型で0.57 μm、非球面型で0.32 μmだった。図6には焦点の光軸方向の広がりの測定結果を示す。球面型では4.5 μmだった面内方向の分解能Γzは非球面型では1.2μmとなった。表1に球面型と非球面型の分解能と立体角の測定値と計算値をまとめた。 Γ xy、 Γ zともにNAの向上に応じて計算値どおりに改善したことにより、非球面型反射対物レンズが正しく動作したことを確認した。この結果から式1によって非球面型反射対物レンズの分子の位置決定精度を見積もると、面内方向で1 nm、光軸方向で3 nmとなり、タンパク質の立体構造測定が可能な水準に到達した。 【参考文献】 [1] I. Kii et al, Org. Biomol. Chem. ,8 (18), 4051-4055 (2010). [2] S. Ohno et al, J. Biochem. ,141(3), 335-343 (2007). [3] M. Fujiwara et al, J. Opt. Soc. Am. B, 26 , 1395 (2009). [4] S. Fujiyoshi et al, Phys. Rev. Lett. , 100 , 168101 (2008). [5] S. Fujiyoshi et al, Phys. Rev. Lett. , 106 , 078101 (2011). [6] M. Maruo et al, submitted for publication. [7] N. Bobroff, Rev. Sci. Instrum. , 57 , 1152 (1986).
ついてはFWHM値とした。 3P088温度数Ｋの色素分子の３次元イメージング技術の設計と実現東工大院理工'・京大院医'・東工大院生命理工'・東医歯大生材研' ○虎谷泰靖' ・丸尾美奈子' ・稲川博敬'喜井勲' ・林宣広' ・細谷孝充・松下道雄' -藤芳暁' Single-molecule fluorescence imaging of three-dimensional localization of dye molecules at 1.5 K. ¹ Graduate School of Science and Technology, Tokyo Tech •² Graduate School of Medicine, Kyoto University •² Graduate School of Bioscience and Biotechnology, Tokyo Tech ・4 Institute of Biomaterial and Bioengineering, Tokyo Medical and Dental University ○ Y. Toratani ¹ • M. Maruo ¹ • H. Inagawa ¹ • I. Kii ² • N. Hayashi ³ • T. Hosoya ¹ • M. Matsushita ¹ • S. Fujiyoshi ¹生化学的手法の発達により、タンバク質選択的で、高効率な細胞内色素修飾法が提案されている[1]。これを用いれば、複合体形成をする複数のタンバク質に異なる色の色素を修飾したり、1つのタンバク質の観測したい部位に複数の色素を修飾したりできる。もし、光学顕微鏡によって修飾した色素同士の相対位置を数nmの精度で1分子決定すれば、細胞内におけるタンバク質―タンバク質問の複合体の形成課程や、タンバク質自身の立体構造の多様性を１分子レベルで観測することが可能になるはずである。しかし、原理的には色素同士の位置を数nmの精度で決定できるが、色素によるタンバク質の立体構造の１分子観察には誰も成功していない。光学原理から、限界性能を持つ対物レンズを用いても、得られる色素１分子の可視蛍光スポッ図 1.色素1分子から得られる 2 次元トは、図１のような、有限の幅(Γ = 500 nm)を持つ。タンバク質の大き蛍光イメージの模式図.  「はスポッさが数nmであるので、可視光を使って、タンバク質の立体構造の1分子トの直径、σは重心の決定精度を表している.観測は不可能のように思えるが、スポットを綺麗に測定すれば、その重心では、Γよりもはるかに高い精度で決定できる[2]。よって、それぞれの色素の重心を１分子ことに決定することで、タンバク質の立体構造の１分子観測が可能になる。例えば、複合体形成する２つのタンバク質のそれぞれに、色の異なる色素を一つずつ修飾する。励起波長を選択ことで片方ずつ光らせると、図１のように、２つの輝点が見えるはずである。その相対位置を決定することで、タンバク質の複合体構造が１分子観察できるはずである。このような実験の提案は、1999年にS. Weissの総説[3]で提案されているが、実現していない。実現が困難なのは、（１）タンバク質およびその複合体の立体構造を知るには、３次元情報の取得が必要であることと（２）３次元方向に対して数nmの精度を得るためには長時間の積算時間が必要なため、分子を固定する必要があることに由来する。我々はこれら２つの条件を満たす方法として、温度数Ｋにおける色素分子の３次元イメージング技術の開発をおこなっている。試料は、数Kに凍結することで固定する。また、顕微鏡において最も重要な部品である試料と対物レンズの機械的ドリフトを1 nm以下に抑えることに成功している[4]。さらに、数Ｋに凍結することで色素の光退色が抑えられるため、数時間にわたり１分子の測定を続けることが可能になる。一方、これまで我々が開発した顕微鏡[5,6]では、焦(A)平面方向xs, ys（図2参照）の情報しか得られない。そこで、図2のような数Kの3次元レーザー走査型の蛍光顕微鏡を新たに開発したので報告する。開発した顕微鏡は多色解析を可能にするために、反射光学系対物レンフで構成されている。図2Aの左および中央のように、原点に集光した光Azs3を2次元方向に走査するには、入射する角度Δ θを変えれば良い。光学の原理から、対物レンズの焦点をAxs fobiとすると、光の焦点は、Δ x = fobiΔ θ x  (Δ y x = fobi (B) Δ θ๋）の位置に移動する。この時、θが変わってもWedge prizm対物レンズの瞳位置（2個の赤丸で表す）をレーザービームが通るようにする必要がある。一方、z,走査すTo Detectoる場合には、図2A右のように、瞳位置におけるビー To PCムの直径を変えずに、レーザー光の広がり角を変化させる必要がある。これを実現するため、新しい顕微鏡(図2B)では、CM1～CM4の４枚の球面鏡を用いReflectingた。4枚の球面鏡以外は、これまでに開発した反射型Objective共焦点顕微鏡の設計を踏襲している[5,6]。 Cryostat Sample CM1～CM3は同じ焦点距離f α (= 125 mm)のもat 1.5 Kのを用いた。CM4の焦点距離f α 4は任意である。実635 nm際の実験ではfcмs = 2fcмとした。対物レンズ-CM1間の距離を2fcm、CM1-CM2間を2fcm、CM2-CM3間をfcм +fcbj、CM3-CM4間をfcм +fcм4に配置する。この配置でCM4とM1を同時にz ∞方向へ動かすと、 Δz, = Δzcм • (fobj / fcm)² CMTという関係で、焦点が△z¸移動する。また、CM2をXcмまたはy cм方向に移動すると、 Δ x, = Δxcm · (f obj+ Δz,) / f obj, Δy, = Δycu • (fcej+ Δz,) / fcejと、焦点がΔχまたはΔy移動する。この３次元レーザー走査機構を量子ドットQdot705の1分子イメージングにより実証した。 Qdot705は、検査に用いた波長405、532、635 nmの励起光を全て吸収し、波長700 nmで発光する。図３は、１個のQdot705の３次元発光イメージである。また、同様のイメージをz = —3 μmから３ μ mまで1 μm間隔で測定し、フィティングにより第一暗環半径R 1.とzプロファイルの半値全幅「,[7]を求めた。それぞれ、製作した光学顕微鏡のxy方向の分解能、z方向の分解能に対応する。これらの実験値を、光学設計ソフトZemaxにより計算した反射対物レンズ単体の3次元の点像分布関数と比較した。その結果（表1）、最もズレが大きい波長405 nmでも、光学シミュレーションからのズレが10%以内であり、ほぼ理想的な３次元走査が実現した。励起光に532 nmと635 nmを用いた場合の位置決定精度の見積もりをおこなった。Qdot705はどちらの波長も吸収するために、装置の機械的揺れや、有限の信号ノイズ比から来る偶発誤差がなければ、2波長で観測されるスポットは一致するはずである。つまり、２つのスポットの位置ズレの分布が、位置決定精度に対応する。 3次元位置決定では、測定する軸以外は原点に止めて測定した。例えば、z，に対して蛍光強度を測定する時には、 x, = y, = 0  μ mとした。図4Aにz,走査の結果を示す。上段が635  nm励起、下段が532  nm励起の結果である。横軸はzの位置であり、100回の測定を2次元で表している。各データごとにガウス関数でフィティング解析し、各回ごとの中心位置を求めた（図中の実線）。図4Bに、635 nm励起の位置z,(Red)と532 nmのz,(Green)の差、Zgg = z (Red) - z (Green)、をプロットする。これら100回の測定から、z noの平均値<z no>を出した。このような測定をxyz軸に対しておこなった。xyz全ての軸に対しての測定にかかった時間は約１００分であった。これを17個のQdot705に対して測定した。その結果を図4Cにしめす。図4Cの標準偏差が、相対位置の決定精度になる。得られた精度は、x¸方向で2.8 nm、 y,方向で3.1 nm、z,方向で18 nmであった。xy方向はタンバク質の大きさと同程度であり、目標とする精度を達成した。これに対して、z方向は18 nmと目標を達成できなかった。位置決定精度は分解能の１次に比例する[2]。表１のように、zの分解能１は、xyの分解能R 1.よりも1桁悪い。そこで分解能を向上させ、3次元方向に対して数nmの精度を得るため、NA = 0.97という理論限界(= 1)に限りなく近い反射対物レンズの開発をおこなっている[8]。
3P089温度1.5 Kのタンパク質1分子イメージング装置の機械的安定性評価と向上〇若尾佳佑･濱田裕紀･日野原拓也･松下道雄･藤芳暁東工大物理Mechanical stabilization of a microscopic system of the single protein fluorescence imaging at 1.5 K (Department  of  Physics, Tokyo Institute oOf Technology) OKeisuke Wakao, Yuki Hamada, Takuya Hinohara, Michio Matsushita, Satoru Fujiyoshi近年、生化学の進歩により、タンパク質の任意の【序】場所に活性を奪うことなく蛍光色素を付加できるようになった。[1]数 nmの精度で色素の位置を決定できれば、タンパク質の構造を知ることができる。このためには、図１のような共焦点顕微鏡による解析は、有効な手段の一つである。ピンホール１によって、レーザーは波面が整形されるため、対物レンズで集光されたXY平面の極めて狭い範囲だけの色素を励起できる。対物レンズの焦点からＺ方図1 共焦点顕微鏡。光軸をZ軸、それに向にずれて存在する色素の蛍光は、接眼レンズで絞り切れ対し垂直な面をXY平面とする。ずピンホール2を通過できない。結果、三次元方向に対して高い空間分解能で試料中の蛍光像を選択できる。さらに、得られた蛍光像の重心から位置を求めると、その精度を数 nmまで上げられると報告されている[2]。我々は、共焦点顕微鏡を中心に一分子レベルの位置決定精度を持つ光学系を構築している。数 nmの精度を得るには、これと同程度に顕微鏡を安定させる必要がある。2009年、顕微鏡の中で最も安定させなければならない試料-対物レンズペアを、一体型ホルダーに設置してクライオスタットと呼ばれるステンレス製の超流動ヘリウム槽（円筒形でおよそ度面の直径20 cm、高さ120 cm）に沈めることで、相対誤差を標準偏差で1 nm未満に抑えることに成功した[3]。しかし、未だ最大振幅にすると3 nm程で相対位置が揺らいでいる。この揺れは数分の周期を持っており、歪温の変化と同じスケールである。クライオスタット内部の温度は超流動ヘリウムによって外部から隔絶されるので、主に外側の構造変化が揺れに寄与していると思われる。そこで、今回クライオスタットの振動解析を行い、揺れの要因を解析したので報告する。 【クライオスタットの安定性評価方法】　インサートの振動を測定するために、図3(a)の光学系を組み立てた。インサートに試料-対物レンズペアの試料位置に30  μ mピンホールを取り付けてクライオスタット内に挿入し、He-Neレーザー(633 nm)を照射した。拡散されたピンホール像を対物レンズ(f=200 mm)で集め、接眼レンズ(f=200 mm)で焦平面にあるCMOSカメラ(ARTCAM_130MI-BW)のセンサー上に結像した。温度変化や風の外乱によって測定精度が下がらないように、結像系をアルミ製の箱で囲った。対物レンズの焦点距離をf、接眼レンズの焦点距離をf’とすると、CMOS上での像の動きはインサートの揺れに対してf’/f倍となる。 f=f oようにレンズを選択したので、インサートのピンホールの動きを等倍で見る系である。得られる像は図3(b)のようになる。これを撮影しガウスフィットで重心位置を求めた。図3(c)のように、同じ過程を繰り返して重心位置の変化を記録し、クライオスタットの安定性を評価した。系Xは水平方向、Yは鉛直方向である。(b)CMOSカメラ上のピンホール像(c)ピンホール像の重心位置の時間変化【クライオスタットの振動解析】　クライオスタットの環境を変えながら、安定性評価を行った。毎秒114枚(114 FPS)で計1000枚撮影した。これをフーリエ変換し、周波数特性を調べた。白色ノイズが支配的となるが、同じ測定を100回繰り返し、得られたデータの平均をとることで統計的に緩和させた。以上の操作を行い、周波数領域で比較した。結果を図5に示す。(a)～(d)は、測定療境の違いを示す。我々は、(b)の環境で一分子分光を行っている。(a)では、(b)で作動していた除震台の空気ばねの電源を止めた。(c)では、(b)でクライオスタットの真空引きに使用していたポンプの電源を止め、(d)ではそのために用いていたフレキシプルチュープを全て取り外した。 X成分には6  Hz以上に固有のピークがある。 (a)と(b)の結果から、除魔台によって6, 10 Hzの振動は床から伝播している。 (b)と(c)の比較から、25 Hzの振動は主に真空ポンプから伝播している。 (c)と(d)の比較から、14, 16, 17, 21, 23  Hz の振動がポンプの電源を止めた後もフレキシプルチュープから伝播している。壁に穴をあけてフレキシプルチュープを通していることから、同じ壁に取り付けられたエアフィルターの振動が伝播していると考えられる。 (d)の結果から、以上の3つの振動を断つことでピークが消え、振動は標準偏差で0.12 μ m程と安定する。これらは、ソフトベローや除農台によってクライオスタットから構造的に分離できることから十分に対応できる。Y成分に立つピークは、条件を変えてもほぼ変わらない。これらは、CMOSセンサーに由来するノイズであり、振動源によるものでないことを確認した。この時の振動の標準偏差0.13  μ mで安定である。一方、5 Hz未満で緩やかに存在する成分は、振動経路を断っても変わらなかったので、温度変化によるクライオスタットのドリフトであると考える。温度計をクライオスタットの外側に貼り付け、ピンホール像の揺れと温度を同時に測定した。変化の遅い成分を比較するために、撮影速度を15 FPSで10 秒間撮影したデータの平均をとって速い振動成分を落とし、測定時間を100分に伸ばした。結果を図6に示す。スポットの揺れは気温の変化に対してX方向に4.4  μ m/K程で、Y方向に5.6  μ m/K程で追随した。許容される500 nmのドリフトに相当する温度変化はおよそ100 mK程度だが、実験室の気温は２Ｋ以上変動し、空調による温度制御では不十分である。 【アルミ製の箱による温度安定化の評価】以上の議論より、 100 mK程の温度変化が光学系の精度に作用することがわかった。そこで、図3の装置でも用いたアルミ製の箱の効果を定量的に評価した。温度計を2つ使用し、実験室のアルミ製の箱の内部と外部で一日の温度を測定した。結果を図7に示す。青色の線が箱外部の温度、赤色の線が内部の温度を表す。一日の間に箱外部の温度は１Ｋ程揺れるのに対し、箱内部のものは550 mKしか揺れなかった。計測開始から5時間分のデータを拡大したところ、箱によって主に15分周期より短い振動成分が削ぎ落とされ、温度安定化の効果があることがわかった。しかし、依然として500 mK程揺れるので、制御器による温度安定化が必要である。参考文献[1]I.Kii et al, Org. Biomol. Chem. Chem. ,8(18),4051-4055. (2010) [2]A.Bloß et al, J.Microscopy. ,205, 76-85(2002) [3]Hinohara Takuya et al, Chemical Physics. , 419, 246–249(2013)リエ変換。 (b):環境で一分子分光を行っている。  (a) :(b)で作動していた除魔台の空気ぼねの電源を止めた(c): (b)でクライオスタットの真空引きに使用したポンプの電源を止めた(d):(c)からフレキシプルチュープを全て取り外した。(下段)測定結果から振動の伝達経路をまとめた図
栄養欠乏ストレス条件下でのシアノバクテリアSynechococcus sp. PCC7002の励起エネルギー移動過程の観測( ¹神戸大院・理，²神戸大分子フォト，³JST-CREST，⁴神戸大院・工） ○仁木健太¹，横野牧生²³，藍川晋平³⁴，近藤昭彦³⁴，秋本誠志¹²³ 【庁論】シアノバクテリアを利用したバイオリファイナリーが近年注目されている．シアノバクテリアはバイオリファイナリーに必要な大量培養に適した特徴を持つ．例えば，バイオマス生産量が高く，非耕地も利用でき，あらゆる水源で培養できる[1]．海水を用いた大量培養は望ましい形の一つである．海水は淡水と違い地球上に豊富に存在するため，有限な淡水資源を節約できる．それに加え，海水はシアノバクテリアの培養に不可欠なNa*やMg²*といった無機イオンを多量に含むため，コストの面でも優位性を持つ．反面，生育に必要な硝酸イオン，リン酸イオンが不足しているため，海水をそのまま培地として用いることはできない.シアノバクテリアは硝酸イオン，リン酸イオンなどの栄養の欠乏に際し，chlorophyll a (Chl a)やcarotenoid (Car)などの色素組成の変化や酸素発生量の減少などを示すことが知られている[2].しかしながら励起エネルギー移動過程の観測によって，栄養欠乏ストレスが光捕集過程にどのような影響を与えるかを調べた研究はほとんど行われていない. ✉ 1. Synechococcus sp. PCC 7002.本研究では，組成の異なる培地で培養したシアノバクテリアSynechococcus sp. PCC7002 (PCC7002)の細胞(図1)に対して時間分解蛍光スペクトル(TRFS)を測定し励起エネルギー移動過程を追うことで，栄養欠乏条件がシアノバクテリアの光捕集機構ならびにバイオマスの増加にどのような影響を与えたかを検討した．栄養条件に関しては，海洋での効率的な培養を目指し，海洋と類似の組成の培地を比較対象とした. PCC7002の培養に一般的に用いられる培地Medium A (以下A培地)での培養した細胞(A)，海水類似組成の培地であるf/2で培養した細胞 (F)，それら二つの培地をベースに硝酸イオン濃度を入れ替えた培地で培養した細胞(An)・(FN),リン酸イオン濃度を入れ替えた培地で培養した細胞(Ap)・(FP),そしてその両方の濃度を入れ替えた培地で培養した細胞(Aw)・(FW)を用意した(7 days, 50 μmol photons m ² s -1 , 30 °C).これらの細胞に対し，吸収スペクトル，蛍光発光・励起スペクトルならびにピコ秒～ナノ秒時間領域のTRFSの測定 (77 K，400 nm励起，時間相関単一光子計数法) を行った．得られたTRFSに対しグローバル解析を行い，FDAS (Fluorescence Decay-Associated Spectra)を得た．また培養過程でバイオマス量(OD 750 )の測定と，クラーク型酸茶電極による光合成活性を測定した. 【結果と考察】 4–7日後にはOD7sgで見積もったAとFのバイオマス量におよそ2倍の違いが見られた．しかし光合成活性には2倍もの違いはなく，光捕集過程の違いがその要因の一つであることが示唆された.図2に測定したサンプルの吸収スペクトルを示す.スペクトルの規格化は680 nm周辺のChl a Q,帯のピークで行った．F，FN，FP，FWでは400–500 nmにおける吸収強度が強く色素組成におけるCarの比率が高い．しかし，蛍光励起スペクトルより，Carは光捕集には寄与していないことがわかった．図3にグローバル解析の結果得られたFDASを示す. TRFSは6–7の寿命成分で解析された. A, An, Ap, AwとF, FN, FP, FWでいくつかの大きな違いが見られる.例えば第１成分(10–25 ps),第２成分 (30–60 ps) においてChl α蛍光領域 (680 nmより長波長) でA,  An,  Ap,  Awは一つの正のピークを持つのに対し，F, FN, FP, FWでは2つの正のピークを持つ.これは海水中でPCC7002の光捕集機構に通常とは異なるアンテナ色茶タンパク質が存在することを示唆する.また，硝酸イオンやリン酸イオンの欠乏も励起エネルギ一移動へ影響を示した.  AnとAwのFDASでは第１成分,第２成分の700 nmより長波長で大きな振幅があり, Aベース培地での培養において硝酸イオンの欠乏はPSIの低エネルギーChl aへのエネルギー移動を促進させることが考え図3.グローバル解析の結果得られたFDAS. 【参考文献】 [1] A. Parmar, N. K. Singh, A. Pandey, E. Gnansounou and D. Madamwar. Bioresour. Technol. 102, 10163–10172 (2011). [2] J. L. Collier, S. K. Herbert, D. C. Fork and A. R. Grossman. Photosynth. Res. 42 , 173–183 (1994).
(名大院工1 ,名大院工・計算科学センター²,立命館大薬3 ,阪大蛋白研4 ,微化研5 ) ○小嶋秀和1 ，吉井範行2 ，山田篤志1 ，安藤嘉倫1 ，藤本和士3 ，水谷圭佑1 ，岡崎　進¹，中川敦史¹、野本明男⁵ Large-scale all-atom molecular dynamics calculation of viruses using the K-computer. 3. Stable structure of poliovirus capsid in solution (Graduate School of Engineering, Nagoya Univ. 1 , Graduate School of Engineering, Nagoya Univ.², Faculty of Pharmaceutical Sciences, Ritsumeikan Univ.³, Institute for Protein Research, Osaka Univ. 4 , Institure of Mictrovial Chemistry5) ○Hidekazu Kojima¹, Noriyuki Yoshii², Atsushi Yamada¹, Yoshimichi Andoh¹, Kazushi Fujimoto 3 , Keisuke Mizutani ¹ , Susumu Okazaki ¹ , Atsushi Nakagawa ⁴ , Akio Nomoto 5 【はじめに】京コンピュータを用いた水溶液中でのポリオウイルスの全原子シミュレーションの一連の講演(1E04,1E06,3P091,4D10,3P092)において、シミュレーションで得られた安定な構造について、本発表で報告する。これまでにウイルスの様々な研究が行われてきているが、それらのほとんどは分子レベルの解明には至っていない。そこで、ウイルスの分子論を明らかにするために、本研究グループで開発した高並列汎用分子動力学シミュレーションソフトウェアMODYLAS[1]と京コンピュータを用いて溶媒を含む全原子モデルのシミュレーションを行ってきた。ここでの対象は、4種のタンパク質VP 1、VP 2、VP 3、VP 4からなるユニットが60個集合し、計240個のタンパク質からなるポリオウイルスのエンプティカプシド(図1)である。本発表では、平衡化シミュレーションから得られた溶液中でのポリオウイルスカプシドの安定構造について述べる。初期座標として、ポリオウイルスカプシドの結晶構造【計算内容】 (PDB ID: 1HXS[2])を、熱膨張を考慮して各タンパク質の重心を動径方向に0.257 nm拡大したものと、リン酸緩衝生理食塩水と同じイオン強度の溶液を配置した6,480,326原子の系を一辺40 nmの立方体セルに用意した。分子動力学計算はMODYLAS[1]を用いて京コンピュータ上で行った。計算条件は以下の通りである。LJ相互作用のカットオフ半径は1.2 nmとし、長距離クーロン相互作用にはFMM-Ewald法を用いた。水素原子を含む化学結合長の拘束にはSHAKE/ROLL,図1.ポリオウイルスRATTLE/ROLL法を用いた。力場は、タンパク質とイオンにはCHARMM 22 with CMAP、水分子にはTIP3Pを用いた。時間発展は、時間刻み幅を0.5 fs(分子内相互作用)、2 fs(直接分子間相互作用)、4 fs(分子間長距離相互作用)としたmulti-time-stepを用いたRESPA法により解いた。エネルギー最小化と水分子数の調整も含めた平衡化に向けた5.5 nsのNVTアンサンブルでの計算を行った後に、NPT(1 atm、310.15K)アンサンブルで200 nsの計算を行った。 【結果と考察】　図2左は、ウイルス表面の原子位置から求めたカプシド半径を示している。溶液中の半径は、結晶時の14.7 nmから約３％大きく、50 ns以降は15.1 nmで良く収束している。それ以降には大きな構造変化は起こってないと言える。この結果は、電子顕微鏡で得られるカプシド半径である約15 nmと良く一致している。図2右は、初期構造を参照にしたカプシドのRMSDを示している。全主鎖原子のRMSDは100 ns以降に概ね収束しているが、わずかに約0.02 nmの増加がある。その一方で、カプシドの骨格部分に注目した、loopや末端部分を除いたタンパク質重心のRMSDは100 nsで良く収束していおり、またカプシド内の疎水性ポケットに収まっているsphingosineのRMSDは70 nsで収束している。従って、カプシドを形成している骨格部分は平衡に至っていると言える。100 ns以降のトラジェクトリから得られた各アミノ酸残基のRMSFが図3に示されており、これはX線構造解析により得られる温度因子からのもの[2]と良く一致している。以上より、生理食塩水環境下での、安定した状態の構造がシミュレーションにより得られた。ここで得られた平衡状態での安定構造に基づいて、カプシド内の圧力(講演：4D10)およびカプシド内外の水の交換(講演：3P092)が議論されている。図3.平衡状態に至った100－200nsのトラジェクトリから得られた各アミノ酸残基のRMSF。色のついた線がシミュレーションによる結果、黒色の線がX線構造解析の温度因子による値[2]。図下の太い黒色は二次構造の位置を示す。 [参考文献] [1] Y. Andoh, N. Yoshii, K. Fujimoto, K. Mizutani, H. Kojima, A. Yamada, S. Okazaki, K.Kawaguchi, H. Nagao, K. Iwahashi, F. Mizutani, K. Minami, S. Ichikawa, H. Komatsu, S. Ishizuki, Y. Takeda, and M. Fukushima, J. Chem. Theory Comput., 9, 3201 (2013). [2] S.T. Miller, J.M. Hogle, and D.J. Filman, J.Mol.Biol. 307, 499 (2001).
(名大院工1 ,名大院工・計算科学センター²,立命館大薬3 ,阪大蛋白研4 ,微化研5 )〇山田篤志¹，吉井範行²，安藤嘉倫¹，藤本和士³，小嶋秀和¹，水谷圭佑¹，岡崎進¹，中川敦史¹，野本明男⁵ Large-scale all-atom molecular dynamics calculation of viruses using the K-computer 5. Exchange of water molecules across poliovirus capsid (Graduate School of Engineering, Nagoya Univ. ¹ , Graduate School of Engineering, Nagoya Univ.², Faculty of Pharmaceutical Sciences, Ritsumeikan Univ.³, Institute for Protein Research, Osaka Univ. 4 , Institure of Mictrovial Chemistry5) ○Atsushi Yamada¹, Noriyuki Yoshii², Yoshimichi Andoh¹, Kazushi Fujimoto³, Hidekazu Kojima¹, Keisuke Mizutani¹, Susumu Okazaki¹, Atsushi Nakagawa¹, Akio Nomoto³京コンピュータを用いた水溶液中でのポリオウイルスの全原子シミュレーションの一連の講演(1E04,1E06,3P091,4D10,3P092)において、ウイルス殻（カプシド）の内側と外側を水分子が交換する現象が計算の解析から見られたので本発表で報告する。カプシドは4種類のタンパク質VP1, VP2, VP3, VP4およびスフィンゴジンから成る基本ユニットが60個集まった正二十面体の構造を持つ。正二十面体の頂点は、ユニットセルを2回、3回、5回回転させた対称性を持ち、その軸はそれぞれ2回、3回、5回回転対称軸と呼ばれている。カプシド内側には天然ではRNAと水溶液で満たされており、体内の様々な環境下でカプシドがRNAを保護して目的の場所まで移動する。カプシドは、ウイルスが移動する体液中において生じた水圧変化に対して構造を漿すことなく環境に適応できると言える。この環境適応能力の鍵となる仕組に、カプシド内外の水分子の交換が考えられる。水分子の交換が茶早くできれば、ウイルスに外圧が加えられたとしても、ウイルスの含水量のコントロール機構により耐圧力性を発揮できる。本発表では、RNAを含まないポリオウイルス(ワクチン)の平衡状態での長時間分子動力学シミュレーションから得られたカプシドを横切る水分子の交換に関する解析結果を報告する。 1辺40 nmの立方体周期境界セル内にポリオウイルス(PDB ID: 1HXS[1])およびリン酸緩衝生理食塩水濃度となるようなNa+,Cl ,K+を含む水溶液を配置した合計約650万原子の系を用意した。力場にはCHARMM22 with CMAP(タンパク質,イオン)とTIP3P(水分子)を採用した。高並列汎用分子動力学シミュレーションソフトウェアMODYLAS[2]を用いて京コンピュータ上で4096ノードの並列計算を行うことにより、NPTアンサンプルで200nsの軌跡を得た。 (計算方法の詳細は講演3P091を参照)本研究から水分子がカプシド内外を交換する軌跡が得られた。図１に水分子がカプシドの内側から外側へ貫通している20psごとのストロボショットを示す。図１　水分子がカプシドの３回回転対カプシド内外の水分子の交換を定量的に示すため、カプシドの内側と外側の境界面を水の分布が小さい面で定義し、平衡化(100ns)後のある基準の時刻から境界面を透過した水分子の個数を時間に対してプロットした（図2)。まずカプシドの内側から外側と外側から内側への水分子の移動個数がほぼ一致していることから平衡状態になっていることが示された。また双方向に移動個数が1nsに9個と非常に速いことがわかった。この水分子の交換速度だと22 μsあればカプシド内の水がすべて外部水と入れ替わる。したがって、ウイルスに瞬間的な外圧が与えられても、それ相当数の水分子を内水相に取り込むことで内外圧差を素早く調整できることになる。水分子の通過場所を解析した結果、3回回転対称軸上の経路が最も多いことがわかった。この軸上の自由エネルギー曲線を水の分布から計算した結果、8 kJ/mol程度の障壁があることが得られた。2回回転対称軸周辺ではVP2同士の接合面で水分子の通過が見られたが、5回回転対称軸では対称軸付近のキャニオンと呼ばれる結合部位あたりで通過が見られた。これらより、ポリオウイルスの耐圧力のための調整機構は、主に緩やかな障壁を持つ水分子の通過経路である3回回転対称軸で機能すると言える。またこの時、カプシドはイオンを透過させない浸透膜であることも示された。 【参考文献】［1］S.T. Miller, J.M. Hogle, and D.J. Filman, J. Mol. Biol. 307 , 499 (2001). [2] Y. Andoh, N. Yoshii, K. Fujimoto, K. Mizutani, H. Kojima, A. Yamada, S. Okazaki, K. Kawaguchi, H. Nagao, K. Iwahashi, F. Mizutani, K. Minami, S. Ichikawa, H. Komatsu, S. Ishizuki, Y. Takeda, and M. Fukushima, J. Chem. Theory Comput., 9 , 3201 (2013). 3P093独立成分分析tICAによるタンパク賞主鎖二面角の遅い運動の解析(横浜市大院・生命医科学)  O渕上壮太郎Slow dynamics of protein backbone dihedral angles revealed by time-structure based independent component analysis (Yokohama City University)    OSotaro Fuchigami 【序】近年の計算機の目覚ましい発展によって,長時間の分子動力学シミュレーションが実行可能となり,タンパク質の複雑な揺らぎ,中でも機能と関連する可能性が高いタンパク質の遅い運動,を原子レベルで再現できるようになってきた．タンパク質のダイナミクスを理解するためには，計算で得られる膨大なデータの中から目的の情報を適切に抽出することができる解析手法が必要である.そのような手法の一つとして、我々は「時間構造に基づいた独立成分分析(tlCA) 」を提案し、タンパク質の遅い運動を効率的に特定・解析できることを示した．これまでの解析では C。原子のデカルト座標を対象としてきたが,タンパク質の構造変化は主に主鎖二面角¢とψの変化によってもたらされる.そこで,本研究では,タンパク質の主鎖二面角φ, ψに着目し,その遅い運動をtICAによって明らかにすることを試みた. 【分子動力学シミュレーション】本研究では,リジン・アルギニン・オルニチン結合タンパク質(LAO, 238残基)を対象として選び,基質が結合していないLAOの結晶構造(PDB ID: 2LAO,図1)を用いて,水を陽に含んだ系(総原子数は約8万)の全原子分子動力学シミュレーションを行った.シミュレーションの実行には分子動力学シミュレーションソフトウェアMARBLEを使用し, 力場はCHARMM22/CMAPを用いた. 系に周期境界条件を課し、静電相互作用はParticle Mesh Ewald法で計算した．作成した初期構造をエネルギー最小化し,図１：リジン・アルギニン・オルニチン結合タNPTアンサンブルで平衡化を行った後, NVEアンサンブンパク質. ２つのドメイン(青と赤)から成る.ルで本計算を1 μs 実行した. 【tlCAの概略】時系列データx(t)をtlCAによって解析するには,まず共分散行列C = ((x(t) − (x(t)))  t(x(t) - (x(t))) と時間遅れ共分散行列 C = ((x(t) - (x(t)))  t(x(t + to) - (x(t))) を計算し,続いて一般化固有値問題 CF = CFK を解く.ここで, F は固有ベクトル行列, K は固有値行列.本研究では,遅延時間パラメーター toを1 nsとした. tICAでは,固有ベクトルf iは非直交基底をなしており,対となるベクトル g i = Cf iが独立成分の運動方向を表わすモードベクトルとなる.固有値は独立成分の運動の時間スケールを特徴づけている.主鎖二面角の時系列データを解析する場合,座標の周期性のため単純平均が意味をなさず,そのままでは上記の解析を適用することができない.そこで,各二面角θ iを二次元の座標(cosθ i ,sinθ i )に変換し,その時系列データを解析の対象とした. 【tlCAによって特定された遅い運動】LAOのC 。原子のデカルト座標,および,主鎖二面角φ, ψの時系列データそれぞれにtICAを適用して得られた独立成分の時間変化を図２に示す. ２つの解析(C c-tICAとd-tICA)の結果を比べると,上位3つの独立成分(IC1, IC2, IC3)の時間変化はよく似た挙動を示していることがわかる.このことは, LAO主鎖の遅い運動が,座標系に依らず, tICAによって同じように特定できることを示唆している.これまでの解析から, C ｡-tICAで同定された遅い運動は, IC1がD220とG221の間のペプチド結合部分のクランクシャフト運動, IC2がドメインのねじれ運動, IC3がP16周辺における局所的アンフォールディングであることがわかっている.図３には, d-tICAで得られた独立成分における各二面角の変位の大きさを示した. IC1ではD220ψとG221φが大きく動いており， Cα-tICAのIC1と同じ運動を表していることがわかる.一方, IC2 で最も大きく動いているのはF233¢である.この残基はヒンδφ/δψ ofジ領域の裏側に位置しているため,ドメイン運動と相関した運動が生じていると考えられる.それ以外の3 0.4 δφ/δψ of IC2つの大きな変動部分はドメイン運動と関係ない局所0.2的な運動を表していることがわかる.同じように, IC3でも大きく変動する部分がいくつかあるが，Cα-tlCA 0.2のIC3と同様の挙動を引き起こしているのは11~15番目の残基部分であることを確認することができる.以上のように,主鎖二面角を用いたtICAでも, Ca原子のデカルト座標の場合と同じように,タンパク質主鎖の遅い運動を同定・抽出し得ることがわかった. 2成分相対論的時間依存密度汎関数法の解析的エネルギー勾配の開発(岐阜大・地域¹，理研・AICS²)  ○神谷宗明¹²,中嶋隆人² Development of analytical energy gradient for two-component relativistic time-dependent density functional theory (Gifu Univ.¹, RIKEN AICS²)     OMuneaki Kamiya¹,² and Takahito Nakajima² 【序】近年、スピン-軌道相互作用に基づく高性能な光応答材料の開発が行われ、色素増感太陽電池や有機ＥＬ等様々な応用が期待されている。このような分子系における光化学反応や吸収発光スペクトルを理論的に詳細に理解するためには、スピン-軌道相互作用による状態分裂や交換交差を含む、励起状態のポテンシャルエネルギー曲面についての知見が必要不可欠である。そこで電子相関と相対論効果、特にスピン軌道相互作用を考慮できる、高精度な励起エネルギー計算とその解析的エネルギー勾配計算ができる理論的手法が興味を持たれている。相対論的時間依存密度汎関数法は、比較的少ない計算コストで電子相関とスピン軌道相互作用を考慮することができる方法であるため、複数のグループで実装が行われ[1-3]、重原子分子の励起エネルギーに適用されているが、まだ励起状態の解析的エネルギー勾配プログラムは報告されておらず、実在系への適用は限られている。そこで本研究では、2成分スピノルに基づいた2成分スピン軌道時間依存密度汎関数法(SOTDDFT)に、占有軌道から非占有軌道への励起のみを考えるTamm-Dancoff近似(TDA)を適用したSO-TDDFT/TDA法について新たに励起状態の解析的エネルギー勾配の開発を行った。 Tamm-Dancoff近似に基づくSO-TDDFT法において、励起エネルギーωはAX = ωXを解くことにより求めることができる。軌道回転Hessian行列▲はij,を占有スピノル、abを非占有スピノルとしてAra,jb = δijδαb (εα −ει)+(ia|jb)−cι (ij|ab)−cικ (ij|ab)−k + f ia,jbと表される。添字 LR は長距離交換補正汎関数を用いたときの長距離交換積分項である。このSO-TDDFT法ではスピンのα–β間の相互作用を取り扱うためにスピン反転励起を記述できるが、非相対論的極限の三重項状態の三重縮退等の正しい振る舞いを記述するためには交換相関カーネルf πにNoncollinear的扱いが必要であることが報告されている[1-3]。Noncollinear法では閉殻を参照とした場合LDAに対する交換相関カーネルは電子密度ρ、スピン電子密度sから定義されるρt = ρ+ s、ρι= ρ- sとパウリ行列は、 σ,  σ,  σ,を用いて、
と表される。次にSO-TDDFT/TDA法による励起エネルギーの核座標儀分は非相対論的なCIS[4]、TDDFT[5]やTDDFT/TDA[6]の核座標微分と同様に、縮約一次密度行列P,エネルギー加重密度行列W、有効2粒子密度行列にの原子軌道表示を用いて以下のように導出される。
を解くことにより与えられる。ここで右辺のg in,jb,kは２次の交換相関カーネルで、交換相関汎関数の3次偏微分に関係する項を含む。閉殻を参照としたNoncollinear LDAでは
と導出される。本発表では上式に基づくSO-TDDFT/TDA法の励起エネルギーの核座標微分をNTChem2012に実装した。実装の詳細、分子系における計算結果は当日発表する。 【参考文献】 [1] F. Wang, et al. , J. Chem. Phys. 122 204103 (2005) [2] J. Gao, et. al.J.Chem. Phys. 123 054102 (2005) [3] R. Bast, et al. Int. J. Quantum Chem. 109 2091 (2009) [4] J. B. Foresman, et al. J. Phys. Chem. 96 135 (1992) [5] F. Furche and R. Ahlrichs, J. Chem Phys. 117 7433 (2002) [6] T. Petrenko, et al. , J. Chem. Phys. 134 054116 (2011) 2成分相対論的coupled-cluster法の開発と基底・励起状態への適用(理研AICS) ○秋永宜伸,中嶋隆人Two-component relativistic coupled-cluster method for ground and excited states of molecules (RIKEN AICS)  ○ Yoshinobu Akinaga and Takahito Nakajima重原子分子系の定量的電子状態計算では電子相関効果と相対論効果の両方を考慮することが必要である．スピン–軌道 (SO) 相互作用が顕著な系では，2成分スピノルに基づいた2成分法を用いることで，SO相互作用による状態分裂や項間交差等を表現出来る.複数のグループによって２成分または４成分coupled-cluster (CC) 法の開発が行われ,重原子分子系の高精度計算に適用されてきたが,励起状態への適用は少ない.我々はこれまで，分子の励起状態への適用を主眼として，SO相互作用を考慮した2成分スピン–軌道CC (SOCC) 法の開発と実装を行ってきた．本発表では，３電子励起以上の高次電子相関効果を考慮した結果を中心とした報告を行う.基底状態の2成分SOCC波動関数は，2成分SOHF (spin–orbit Hartree–Fock) 波動関数を参照関数とした複素CC波動関数である．スカラー相対論効果とSO相互作用はSOHF波動関数生成の際に考慮される.本研究では基底状態のSOCC方程式に加えて,励起エネルギーおよびイオン化ポテンシャル計算のための2成分CC  Jacobian行列対角化，ならびに電子物性の計算に向けた応答方程式(A方程式, Z方程式)の実装をダイアグラム手法に基づいたコード自動生成[1]を用いて行った. Table 1に示すのはZn, Cd, Hg原子のS-P遷移に由来する12状態 (³Po, ³P₁, ³P₂, ¹P₁) について，DK3-Gen-TK/NOSeC-V-TZP + diffuse基底関数系を用いた2成分SOCCSDおよびSOCCSDT計算で得られた励起エネルギーおよび分裂幅の実験値に対する平均および最大誤差である．特にZn原子について，３電子励起を考慮することによる顕著な改善が見られる.スカラー相対論効果は3次DK法で, SO相互作用はScreened-nuclear SO近似で考慮した. Table 2およびFig. 1には,同様の手法で得られたTIHの垂直励起エネルギーとポテンシャル曲線をそれぞれ示す.  SO相互作用と3電子励起の考慮により，結合距離の広範囲において，正しい挙動を再現することに成功している．当日は，その他の物性値ならびにイオン化スペクトルについても発表する予定である.
参考文献[1] M. Kállay, P. R. Surján, J. Chem. Phys., 115 (2001) 2945.
超並列MP2-F12法による巨大分子の高精度計算(神戸大院システム情報*，分子研**)  ○大西裕也*，石村和也**，天能精一郎* Highly Accurate Calculation of Large Molecules by Massively Parallel MP2-F12 Method (Kobe Univ.*, IMS**) 【背景】有機伝導体として注目を集める様々な有機分子結晶や凝集体では、分子間距離や分子配向といった微視的な構造が、伝導度などの電子的特性を決定する一つの重要な要素となっている。この微視的構造を電子状態計算によって正確に見積もることは、新しい電子デバイスを設計するための有用な指針を与えるものと期待される。本研究では、現実的な計算コストで基底関数極限と同様の結果が得られる露わに相関した二次の摂動論（MP2-F12法）を、京コンピュータのような超並列環境のために実装し、フラーレンやその誘導体といった有機伝導体として広く用いられている大きな分子の分子間相互作用のMP2-F12計算を行った。 【実装】超並列MP2-F12法は当研究室が開発しているGELLANプログラムへ実装した。GELLANに実装されているMP2-F12法は、F12法で必要となる多電子積分を、格子点上で展開した様々な積分や分子軌道から計算する[1]。例えば、式(1)左辺のような三電子積分は、格子点r。上の分子軌道や積分を用いて右辺のように展開される。
MP2-F12エネルギーは上記左辺のような多電子積分を複数個集めることで計算されるため、エネルギーの計算は、右辺の格子点上の分子軌道と各額分の計算、それに続く格子点データの総和による左辺の多電子積分の生成の二段階で行われる。第一段階の格子点上での分子軌道や積分の計算は、MPI並列を用いてノード間に格子点を分散させることによって並列化が実現されている。一般に格子点数は、一原子当たり5000点以上が必要となり大きな分子では数十万点になるが、超並列環境を用いた場合には、各ノードに割り振られる格子点数は高々数十程度になるため、計算コストやメモリ要求量の面では問題にはならない。次の段階では、占有軌道の対でMPI並列を行い、格子点データの総和にDGEMMを用いることでハイブリッド並列が実現されている。DGEMMを高効率で実行するためには、各ノードが多くの格子点データを持つ必要があるので、第一段階と第二段階の間には通信が必要となるが、京コンピュータのような高速通信が可能な計算機環境では、通信による大きな速度低下はない。一方、分子が大きな場合や基底関数が大きい場合には、各ノード上のメモリに全ての格子点データと全分子軌道から成る二次元配列を格納させることが困難な場合がある。このような場合には、全軌道を複数のブロックに分割し、通信を複数回行うことで、消費メモリを節約して計算を行なうように実装した。この場合、ノード間の通信回数が増えることになるが、京コンピュータではそれほど大きな問題にはならないことを確認した。 【計算方法】MP2-F12計算には京コンピュータ上でGELLANプログラムを用い、種々のDFT計算は当研究室が保有するクラスター上でGaussian09を用いて行った。分子間相互作用エネルギーの計算は、 SCS-MP2法やSOS-MP2法などの種々のspin component scaled法[2]でも行った。MP2-F12計算ではaug-cc-pVDZ基底を用い、DFT計算では6-31G(d)基底を用いた。全ての相互作用エネルギーに対してcounterpoiseの補正を行った。 【結果と考察】図１は五員環が向き合ったC 60フラーレン二量体の相互作用エネルギーを、フラーレン中心間距離が9.4から15 Åの領域で調べたものである。分散相互作用を記述できないHF法やDFT(B3LYP)法では、引力性の相互作用を記述できない一方で、経験的な分散相互作用項を付加したDFT(ωB97X-D)法では、中心間距離が10.0 λのところで極小値–0.30 eVの引力性相互作用が見られる。 MP2法はよく知られているようにπ-π相互作用を過大評価する傾向があり、MP2-F12法では中心間距離9.6 λで極小値–0.88 eVを与える。実験で得られた凝集エネルギーから見積もった二分子間の安定化エネルギーは、0.3  eVよりも小さいと考えられるため、MP2-F12法が相互作用の強さを大きく過大評価していることがわかる。一方、小さな分子では CCSD(T)法と同等の分子間相互作用エネルギーを与えることが知られているSCS-MP2-F12法やSOS-MP2-F12法では、MP2-F12法よりも小さな分子間結合エネルギーを与えるものの、最も小さな結合エネルギーを与えるSOS-MP2-F12法でも0.47 eVの分子間結合エネルギーとなり、相互作用を過大評価していることがわかる。これらの結果から、小さな分子に対して最適化されたSCSやSOSのパラメターは、π-π相互作用が大きな分子間相互作用では有効でないことが示唆される。一方で、最安定分子間距離や結合エネルギーの見積もりでDFT(ωB97X-D)法は合理的な結果を導く。そこで、DFT(ωB97X-D)法によるフラーレン二量体のポテンシャルエネルギー曲線を再現するようにspin component scaled法の係数を決定したところ、フラーレン二量体に関しては、opposite spin componentだけをスケールせずに用いることで、別の配向の二量体に関してもDFT(ωB97X-D)法の結果がよく再現された。このOSO (opposite spin only)-MP2法は、しかしながら、ベンゼン二量体のような小さなπ-π相互作用に対しては、相互作用を過小評価する結果となった。また、フラーレン二量体とベンゼン二量体の両方で同時に合理的な結果となるパラメターは得られなかった。このことは、spin component scaled法でπ-π相互作用を記述するためには、π電子の数に依存したパラメターを用いる必要があることを示唆している。実装の詳細やMP2-F12法を他の系に適用した結果については当日発表を行う。 【参考文献】 [1] (a) S. Ten-no, J. Chem. Phys. 121 , 117 (2004).    (b) K. Ishimura and S. Ten-no, Theor. Chem. Acc. 130 , 317 (2011). [2] S. Grimme, L. Goerigk, and R. F. Fink, WIREs Comput. Mol. Sci. 2, 886 (2012). 3P097
Difference Density Matrix Analysis: Application to Substituent Effects and Intermolecular Interactions (II) (Research Organization for Information Science and Technology (RIST)) ○Daisuke Yamaki 【序】計算機の発展により分子軌道計算の対象分子はどんどん巨大化している。こういった分子の比較や解析には、分子軌道の微小な差異を一つ一つ比較する従来の方法は事実上実行不可能である。この事態を解決するため、我々は電子状態の変化のみを抽出し、最小限の情報を可視化できる差密度行列解析法を提案してきた。本発表では、この解析法をベンゼンの置換基効果や、水素結合的な相互作用をする分子等に適用し、本手法の性質、有用性を示す。 【差密度行列解析】本解析法においては、比較する２つの分子の一電子縮約密度行列の差Δρの自然軌道φ,と固有値ε,を利用する（図1 )。このとき両方の密度行列が単一行列式由来の場合、非整数の固有値ε,は、正負で一対一に対応する。このε,の絶対値が同一で符号が異なる二つの軌道は電子状態の変化をあらわす。電子状態の差や変化は、この二つの軌道間の電子励起もしくは移動として解釈でき、絶対値|ε,|は変化した電子数を表す。絶対値|ε,|の大きい軌道対から解析すればよいので、最小限の軌道の可視化により電子状態の比較ができる。また、固有値の小さい軌道も解析すれば、電子状態の詳細な変化も捉えることができる。さらに、一方の分子にしか存在しない不活性な軌道成分は（閉殻系の場合）固有値±2となり解析から除外できるため、変化に直接関与する成分に集中でき、効率よく解析できる。図1差密度行列解析法(電子状態の活性部分の抽出) 【置換基効果への応用】置換基効果による電子状態の変化を解析する例として、ベンゼンの水素をニトロ基に置換した場合の電子状態変化の解析をおこなった。図２に、その主要な電子移動（軌道対）を示す。固有値が最も大きい±0.55の軌道対は、ベンゼンの炭素のσ型の軌道から、ニトロ基の窒素へσ型の軌道への電子移動を示しており、誘起効果に対応した電子状態変化である。固有値が±0.37の２番目の軌道対は、ベンゼン隈のオルトとパラ位のπの軌道から、NO,のヶ軌道へ電子が移動しており、共鳴効果に対応する変化を表している。 【分子間相互作用への応用】水素結合的な相互作用の例として水分子の二量体の解析をおこなった。図３に主要な電子移動（電子対）を示す。図３左下の固有値が±0.14の軌道対は、水分子間の結合の生成を表している。また軌道の分布も、負固有値の軌道では右の水分子に偏っていたものが、正の固有値の軌道は左右ほぼ均等になっており、電子移動の傾向も見られる。図３右の固有値が±0.02の二組の軌道対は周辺の水素原子等から、酸素（p軌道）への電子の移動を示しており、結合の生成に伴う副次的な効果と考えられる。相互作用の解析に密度行列や密度ρの差を用いる場合、二量体のρから単量体２個のρの和を差し引いたものを用いることが多い。しかし、本来は同時に存在できない単量体の個々の電子分布に重なりがあると非物理的な密度が発生する。このような非物理的な密度の発生を避けるため、本解析では、図３左上のような二量体と単量体１個の差を用いた。引き算に含めなかった単量体の寄与は残ることになるが、その不活性な成分は固有値2となり、解析から除外できるため、解析上問題とならない。 【まとめ】差密度行列解析法の置換基効果や水素結合による電子状態の変化への応用をしめした。本解析法により電子状態の変化に直接関係する成分を抽出し解析することができた。水素結合的相互作用のある水二量体の解析では、結合の生成に加え水分子内の電子の移動のような副次的な微小変化も示すことができた。本手法は不活性な成分を分離することが可能なため、タンパク質内の活性部位の解析など、大きな分子への適用の際にも有利である。当日は、差密度行列解析法によるエネルギーの解析についても発表する。 3P098 ( a, b, , c d) a, b c d Development of a molecular orbital program using a script language (RIIT, Kyushu Univ. a , ISEE, Kyushu Univ. b , ISITc) Hiroaki Honda", Yuichi Inadomi 6 , Jun Makic, Takeshi Noro Hartree-Fock Python [1] Ruby Ruby Ruby Fortran C
[2] 2. 3.
) G
CX400 RHF Ruby G FX10 [5] C Ruby C Fortran Ruby RHF 1 2 R Mathematica Ruby G 1 G C 2 MPI 6-31G
) 13.0.1 03 Ruby 1.9.3p429
7.01 G 16 Ruby 85.8% 92.9% [1] "PyQuante: Python Quantum Chemistry," [On line]. Available: http://pyquante.sourceforge.net/. [2] “Numerical Ruby NArray,” [On line]. Available: http://narray.rubyforge.org/index.html.ja. [3] "GSL - GNU Scientific Library," [On line]. Available: http://www.gnu.org/software/gsl/. [4] “Seiya/ruby-mpi,” [On line]. Available: https://github.com/seiya/ruby-mpi. [5] M.Honda et al., J.Chem.Phys., Vol.94, pp.3790-3804, 1991. 3P099 Sapporo基底関数：アクチノイドの内殻電子相関を考慮した相対論的縮約型基底関数の開発(苫駒大',北大院理²,宰工大院工³) ○関谷雅弘¹,野呂武司²,古賀俊勝³ Sapporo basis set: Relativistic segmented contraction basis sets with core-valence correlation effects for actinoid atoms (Tomakomai Komazawa Univ.¹、Hokkaido Univ.²、Muroran Institute Tech.³) ○Masahiro Sekiya¹, Takeshi Noro²,  Toshikatsu Koga³ 【序】 Sapporo基底関数は、コンパクトでありながら高精度なセグメント型縮約Gauss型基底関数(CGTF)である。これまでに第1-3周期のH-Ar原子には非相対論のDZP, TZP, OZP基底関数を、第4-5周期のK-Rn原子については非相対論とDouglas-Kroll-Hess (DKH)近似[1]によって相対論の効果を考慮したDZP, TZP, QZP基底関数を、第6周期のs, p, d, fブロック原子Cs-Rnについて相対論効果を考慮したDZP, TZP, QZP基底関数を開発し公開している[2]。本研究では、アクチノイド Ac-Lrの15原子の基底関数の開発を行なった。 【開発】これまでに開発した他の原子と同様に、3次のDKH近似により相対論の効果を取り入れ、内殻O殻(主量子数n=5)と外殻P, Q殻(n=6,7)の電子相関を考慮してアクチノイドのDZP, TZP, QZPの基底関数を作成した。開発の手順は次の通りである。 1.基底状態のminimal型のHartree-Fock (HF)基底関数を作成する。ただし、 5fn+16d0電子配置が基底状態のときは、6d軌道に対応する関数を生成するため5fʷ6d¹電子配置の最低状態のHF基底関数も作成する。 2.ステップ1.で作成した基底状態のHF基底関数のfrozen coreとなる1s-4s, 2p-4p, 3d, 4d, 4f CGTFおよび比率2.0のeven tempered GTF (初項は5s CGTFの最大の軌道指数)を使用し、理想の原子自然軌道(ANO)を作るための基底関数{953²111/953111/84111/ 81 11/17/16/14 )を作成する。 3. 5fʷ6d¹電子配置の最低状態に対し、O殻の電子相関を考慮したcore-CIとP, Q殻の電子相関を考慮したval-CIをそれぞれ実行し、理想のcore-ANOとval-ANOを作成する。 4. ステップ1.で作成したminimal型のCGTFを占有軌道とし、ステップ3.で求めた理想的なcore-ANO,  val-ANOを相関軌道として、双方を最も良く再現するように、決められた個数および縮約パターンのCGTFで最適化を行う。この際、minimal 型のCGTFは2個もしくは3個に分割し、correlation consistent基底の考え方に従った個数のcore-ANOとval-ANOを使用する。ただし、ステップ4.のCGTFの個数および縮約パターンは、94Pu原子によるテスト計算を実行し、精度とコンパクト性の観点から表１のように決定した。表中の縮約パターンは、各CGTF関数の項数を表し、冪乗は繰り返しを意味する(例えば16は11111)。
【原子計算の結果】開発した基底関数を用いて各原子の5fʷ+16dº電子配置と5fʷ6d¹電子配置からできる最低状態についてcore-CIとval-CI計算を行ない、得られた電子相関エネルギーとANOによる電子相関エネルギーの比較を行なった。表2にTZP基底を用いた94Pu, 95Am, 96Cm, 97Bkの計算結果を示した。表中のEcorrは電子相関エネルギー、再現率はANOによる電子相関エネルギーに対する比率を表わす。
TZPにおける再現率はcore-CIで98%程度、val-CIはほぼ100%である。表には示していないが、DZPではcore-CIが94-96%、 val-CIが95-99%、 QZPはcore-CI、 val-CI共に99%以上の再現率があり、全般的に良好な結果を示している。また、電子配置が異なる二つの状態においてcore-CIやval-CIどちらの場合も再現率はほぼ等しく、この基底関数は状態間のエネルギー差を適切に記述できると期待できる。分子系への応用計算の結果については当日会場で発表する。 [1] Nakajima T, Hirao K  (2000)  J Chem Phys 113:7786; Douglas M, Kroll NM (1974) Ann Phys 82:89; Hess BA  (1986)  Phys Rev A 33:3742 [2] Noro T,  Sekiya M,  Koga T  (2012)  Theor Chem Acc 131:1124;  Sekiya M, Noro T,  Koga T, Shimazaki T (2012) Theor Chem Acc131:1247;  Noro T,  Sekiya M,  Koga T  (2013)  Theor Chem Acc 132:1363;  http://sapporo.center.ims.ac.jp/sapporo/
(筑波大CCS) 〇梅田宏明、塙敏博、庄司光男、朴泰祐Fock matrix calculation with GPGPU for OpenFMO (CCS, Univ. Tsukuba)  OH. Umeda, T. Hanawa, M. Shoji, T. Boku近年、GPUを高性能計算向けの演算加速装置として利用する動きがある。量子化学計算アプリケーションについてもこのようなGPGPUに対応した実装が求められている。そこで我々はHF計算において最も計算量の多いFock行列計算についてGPGPUによる高速化を試みた。ターゲットプログラムとして超並列計算機向けのFMO計算プログラムであるOpenFMO[1]を取り上げ、そのフラグメント計算のHF計算部分だけを切り出したコードについてCUDAによるGPGPU化を行なった。 OpenFMOは九州大学の稲富らが開発している超並列計算機向けフラグメント分子軌道（fragment molecular orbital, FMO)計算プログラムである。このプログラムはC言語で記述されており、CUDA実装でも扱いやすい。またOpenMP/MPIハイプリッド並列による超並列計算機向けの並列化だけでなく、 RPC化などによる耐故障性の検討にも使われるなど次世代の量子化学計算アプリのプラットフォームとしても利用が期待されている。 GPGPU を用いて高性能計算を実現するためには、大量の演算コアを有効に使うことが必要である。このために重要なのがメモリアクセスの効率化とプログラムのSIMD並列化となる。また特にFock行列計算においては各演算コアが計算した二竜子積分をFock行列に加算する操作が存在するため、Fock行列の取り扱い手法についても工夫が必要である。本研究では1)行列加算手法、2)Schwarzの不等式によるスクリーニング、3)動的負荷分散、4)基底関数のソート、5)複数GPU計算、6)CPUとの混合計算の６つの改良を検討した。 1)行列加算手法GPGPU 1台あたり数百もの演算コアが利用可能であるのに対し、利用できるメモリは僅かに数Gバイト程度しかない。このため多くの並列実装で行われているようなFock行列を演算コアが独立に保持する実装は現実的には不可能である。一方でFock行列を複数演算コアで共有する場合にはFock行列への加算にコストの高い排他制御が必要となり、性能が出ないことも知られている。そこで我々はFMO-MO計算のために開発した並列分散共有Fock行列計算アルゴリズム[2]をGPGPUに適用することでアトミック加算を回避する実装を行った。 2) Schwarzの不等式によるスクリーニングホストCPUと違いGPUはSIMD動作をするため、Schwarzスクリーニングによる積分計算の省略のための分岐が効果的に動作しない可能性がある。そこで我々はスクリーニング処理だけを積分計算の前に実行するよう改良を行い、効果的なFock行列計算を試みた。 3)　動的負荷分散GPGPUでは演算コアが多いため静的な負荷分散では十分な負荷バランスが得られない可能性がある。そこでGPUボード内についての動的負荷分散コードを実装し効率の良い並列化を目指した。積分計算そのものの実装についてもSIMD動作を考える必要がある。OpenFMOで利用している小原積分では積分計算において原始シェルペアについての二重ループが存在しており、効果的なSIMD動作のためにはこのループ長を揃えることが望まれる。我々は縮約シェルペアを原始シェルペア長でソートすることにより、これを実現した。 5)　並列化による複数GPUによる計算OpenFMOはOpenMP/MPIのハイプリッド並列化が実装されており、それを利用した複数GPU実行も高速化には有効である。我々は1GPU/1MPIランクの構成で並列実行を可能にした。 6)    CPU-GPU混合計算GPUによる計算中にCPUでも計算を行なう混合計算によりさらなる高速化を実現した。また、GPUでは性能が出ない積分タイプをCPUで計算させるなどの最適化も可能になる。性能評価としてモデルDNA分子(CG)₂のHF/6-31G(d)計算を筑波大のGPGPUクラスタHAPACSを用いて実行した。図は4CPUコア(Intel E5 2.6GHz)と1GPU(M2090)を用いて計算した場合の経過時間である。CPUだけで実行していた場合に比べ、部分的にGPGPU化を行った場合は半分程度の時間で、 CPUとGPUの混合計算を利用した場合には1/3程度の時間で計算が実行できていることがわかる。謝辞: 本研究で使用したHF計算コードは九州大学の稲富らによるOpenFMOプログラムの一部を抜粋して提供していただいている．また本研究の一部は文部科学省特別経費「エクサスケール計算技術開拓による先端学蕨計算科学教育研究拠点の充実」事業，およびJST-CREST研究領域「ポストベタスケール高性能計算に資するシステムソフトウェア技術の創出」，研究課題「ポストペタスケール時代に向けた演算加速機構・通信機構統合環境の研究開発」による. [1] OpenFMO; http://www.openfmo.org/OpenFMO/index.html;本学会講演 1E01. [2] Umeda, H., Inadomi, Y., Watanabe, T., Yagi, T., Ishimoto, T., Ikegami, T., Tadano, H., Sakurai, T. and Nagashima, U., J Comput. Chem., 31, 2381-2388(2010).