平成20～22年度厚生労働科学研究費補助金(成育疾患克服等次世代育成基盤研究事業)総合研究報告書
研究分担者藤井知行東京大学産婦人科学准教授研究要旨習慣流産のリスクファクターである抗リン脂質抗体(aPL)の中で、特にβ₂−glycoprotein  I (β 2 GPI)依存性aPLの、血液凝固異常以外の流産発症メカニズムについて、胎盤extravillous trophoblast表面に発現し、invariant natural killer T細胞(iNKT)の標的分子であるCD1d抗原に注目して研究した。β₂GPI 依存性抗カルジオリピン抗体がβ₂GPI  2 分子と結合すること、 CD1dが自己のリン脂質であるphosphatidylserine (PS)を抗原提示すること、またPSがβ 2 GPIと複合体を形成し、細胞表面に存在することがすでに報告されている。本研究では、β 2 GPI依存性抗カルジオリピン抗体がCD1dを介し直接的に絨毛細胞に作用し、サイトカイン分泌を促進することにより流産に関与するのではないかと考え、母体胎児境界における胎児側CD1dと母体 iNKT の相互作用、さらにはこの相互作用にβ 2 GPI 依存性抗力ルジオリピン抗体が及ぼす影響を検討して、この抗体が流産を引き起こす機序を明らかにすることを目的とした。本研究の成果は以下の通りである。1.抗β ₂GPI 抗体が、PS−β ₂GPI 複合体と結合したtrophoblast 表面のCD1dと間接的に結合することを明らかにした。2. 抗β 2 GPI抗体とCD1dとの相互作用によってCD1d架橋反応と同様の反応が起こり、CD1dを発現するtrophoblastからのIL-12誘導が起こることを明らかにした。3.  β2GPI依存性抗カルジオリピン抗体陽性の不育症患者血清でも、CD1dを発現するtrophoblastからのIL−12誘導が起こることを明らかにした。4.ヒト脱落膜iNKT細胞が、CD1dを介して絨毛細胞からの炎症性サイトカインIL−12の産生を誘導することを証明した。5. ヒト脱落膜iNKT細胞とCD1d細胞との相互作用に、抗β , GPI抗体が干渉すると、IL12産生がさらに増加し、IFN – γの産生が増加するが、IL−4産生は増加しないことを明らかにした。以上より、抗β 2 GPI抗体が存在すると、抗β 2 GPI抗体とCD1dの架橋反応様の相互作用で産生されたIL12が脱落膜iNKT細胞を活性化させ、iNKT細胞からのIFN-γ分泌が増加してtrophoblast上のCD1d発現を増加させ、さらにCD1d発現細胞からのIL12分泌を促進するというサイクルが活性化されることがわかった。一方、IL−4の産生は増加しないことから、母体胎児境界においてはTh1/Th2バランスがTh1にシフトすることとなり、局所の炎症が過剰となって、流産を引き起こす可能性が示唆された。これにより、母体胎児境界における局所の炎症が過剰となり、流産を引き起こすことが示唆された。本研究により、β,GPI 依存性抗リン脂質抗体による流産が、絨毛細胞上のCD1dと脱落膜iNKT細胞を介した過剰な炎症によるという新しい機序が示された。不育症の中で、習慣流産は３回以上自然流産を繰り返す状態と定義され,その原因は多岐にわたる。その中で最近注目されているのが、自己免疫異常の1つである抗リン脂質抗体症候群(antiphospholipid syndrome; APS)である。APSは1986年にHughesらによって抗リン脂質抗体(antiphospholipid antibody;  APL)が陽性で、かつ血小板減少症、血栓症、または流産のいずれかの臨床症状を認める症候群として提唱された。周産期領域でもAPSについて様々な臨床研究がなされ、APSが習慣流産のみならず、妊娠10週以降の原因不明の子宮内胎児死亡、妊娠高血圧症候群、また胎児発育不全とも強く関連していることが明らかになってきた。 APSはPhosphatidylserine(PS)などの陰性荷電を持つリン脂質に対する自己抗体の産生により引き起こされるが、APLの真の対応抗原はリン脂質そのものではなく、リン脂質に結合するβ,-glycoprotein I(β₂GPI)などの血漿蛋白である。β₂GPIは細胞膜リン脂質に結合し血液凝固カスケード、血小板凝集やin  vitroで活性化された血小板のプロトロンビナーゼ活性を抑制する因子である。β₂GPI 依存性抗カルジオリピン抗体は、この機能を妨げ凝固能を亢進させて血栓傾向を誘導し、胎盤内の血栓形成を促進させるために胎盤機能不全が生じ流産を引き起こすと考えられてきたが、胎盤血管形成がなされ血流が確立する妊娠9–10週以前の流産についてはそれだけでは説明困難である。絨毛細胞は胎盤付着部位から母体子宮内膜内へと浸潤しつつExtravillous trophoblast(EVT)へと分化していく。その分化の過程において EVT の増殖能、浸潤能など細胞特性がダイナミックに変化してゆくことが知られている。 EVT の増殖、浸潤過程においては、EVTが発現するHLA-G抗原をはじめとするHLA抗原系や、EVTと母体免疫細胞が分泌する多くのサイトカイン、ケモカイン、また血管新生関連因子など、種々の分子が働いていることが明らかになっている。その中で、本研究ではmajor histocompatibility  complex(MHC) I類似の抗原提示分子であるCD1dに注目した。 CD1dは自己、または細菌由来の糖脂質を抗原提示するMHCclass Iに類似した膜たんぱく質である。ヒトVαインバリアントNKT細胞(iNKT)はinvariant Vα24Jα18/Vβ11T cell receptor(iTCR)を発現しており、このiTCRを通じて抗原提示細胞のCD1dを特異的に認識し、活性化される。CD1dを認識し活性化された iNKT 細胞からは interleukin(IL)−4 やinterferon(IFN)-γが急速に分泌され、T helper(Th)1/Th2バランスが調節されるようになる。 ー方CD1d発現細胞からもIL-12、IL-15、IL-4、 IL−10などのサイトカインが分泌されNK細胞を活性化する。またCD1dは近接する複数の分子が架橋されるとNF-kBを通じてCD1d発現細胞内cytoplasmic  tailのチロシン基のリン酸化が誘導される。この反応により、CD1d発現細胞よりIL-12、 IL−10などのサイトカインが急速に分泌されるようになることも知られている。本研究では APS を引き起こす代表的な抗リン脂質抗体であるβ,GPI 依存性抗カルジオリピン抗体が、β 2 GPI 2分子と安定的に結合すること、CD1dが自己のリン脂質であるPSを抗原提示することに着目した。PSがβ,GPIと複合体を形成し、細胞表面に存在することはすでに報告されていることから、 β,GPI依存性抗力ルジオリピン抗体がCD1dを介し直接的に絨毛細胞に作用し、サイトカイン分泌を促進することにより流産に関与するのではないかと考え、母体胎児境界における胎児側CD1dと母体iNKTの相互作用、さらにはこの相互作用にβ 2 GPI 依存性抗カルジオリピン抗体が及ぼす影響を検討して、この抗体が流産を引き起こす機序を明らかにすることを目的とした。
B.研究方法
ヒト絨毛癌由来の細胞株JEGに、CD1d遺伝子、または機能実験における陰性コントロールとして細胞外構造がCD1d、細胞内構造がCD1aであるキメラ分子（細胞内へのシグナル伝達を行わない)CD1d/aを導入し、CD1dあるいはCD1d/aを恒常的に発現するtrophoblast株JEG/CD1dおよびJEG3/CD1d/aを樹立した。次いで、CD1dあるいはCD1d/a、PS、β 2 GPIの細胞表面存在をフローサイトメトリー法によって観察した。またCD1dとPS-β₂GPI 複合体の結合をIP−Western blot法で確認した。JEG/CD1d 、JEG3/CD1d/a、JEGに対して、抗CD1d抗体、コントロールIgGおよびクロスリンカーとしての二次抗体を添加し、CD1d抗原の架橋反応が誘導されるか、炎症性サイトカインである IL-12 の発現を ELISA および定量的RT-PCR 法で検討した。また、生体内ではクロスリンカーとしての二次抗体は存在しないが、抗β,GPI抗体はβ,GPI 2分子と結合することから、抗β 2 GPI 抗体単独でも架橋反応様の反応が生じないかと考え、各trophoblast株培養系に抗β,GPI抗体を単独で添加して、IL-12の発現を検討した。さらに、脱落膜中の母体iNKTと胎児側CD1dの相互作用を検討するため、ヒト脱落膜から脱落膜リンパ球を分離し、iNKT  の増殖誘導剤α GalCerを7日間添加して培養した。添加前後でV α 24V β 11陽性iNKTの細胞数をフローサイトメトリー法で比較した。JEG/CD1dもしくはJEGに、 α GalCer刺激した脱落膜iNKTを加え共培養し、上清中の IL-12 の濃度を測定した。さらに、 JEG/CD1d 、JEG3/CD1d/a 、JEGに、脱落膜iNKTを加えた共培養系に抗β,GPI抗体またはコントロールIgGを添加した群と添加しない群で、炎症性サイトカインIL12、IFN γ 、およびIL−4の産生をELISA法および定量的RT−PCR法で観察した。
(倫理面への配慮)
ヒトから採取した生体試料および臨床情報を使用する研究については、施設研究倫理委員会の承認を得たうえで、文書による同意を得て実施した。
C.研究結果
フローサイトメトリー法では、JEG3/CD1d/、 JEG3/CD1d/aの細胞表面にCD1d発現(CD1d/aの細胞外ドメインはCD1dと同一）が認められ、その発現に一致してPS、β,GPIの存在も認められた。次いで、JEG、JEG3/CD1d細胞のタンパク質を抽出し、抗CD1d抗体を用いて免疫沈降をおこなった。沈殿に対してHRP標識した抗β,GPI抗体あるいは抗AnnexinV抗体(PSを検出)を用いてWesternblot法によりbandを検出した。 JEG3/CD1d細胞においてはβ,GPIおよびPSのband が確認できたが、JEG 細胞では認められなかった。以上より、JEG/CD1d細胞表面において、CD1d、PS、β,GPI が複合体を形成していることが確認された。抗CD1d抗体＋二次抗体による架橋反応では、JEG/CD1dにおいてIL-12誘導能の増加が確認されたが、JEG/Cd1d/aやJEGにおいては確認されなかった。JEG/CD1dにおけるIL-12誘導能の増加は抗β₂GPI抗体単独でも認められ、抗β,GPI抗体は二次抗体なしにCD1dの架橋反応と同様の反応を誘導することがわかった。また、脱落膜リンパ球に対する α GalCer 刺激によりV α 24V β 11陽性のiNKTの細胞数が約15倍に増加し、この細胞を以下の実験で脱落膜iNKTとして使用することとした。脱落膜 iNKT とJEG/CD1dとの共培養では、培養液中のIL12濃度上昇がELISA法で確認されたが、JEGとの共培養では上昇しなかった。すなわち、CD1dと脱落膜iNKTの相互作用でも、IL-12産生が誘導されていることがわかった。次に抗β,GPI 抗体存在下で脱落膜iNKTをJEG/CD1d、JEG/Cd1d/aあるいはJEGと共培養した。抗β₂GPI抗体添加群とコントロールIgG添加群のIL12産生の比をとり各細胞間で比較したところ、JEG/CD1d細胞では、18時間後に抗β,GPI抗体添加群のIL12産生がコントロールIgG添加群の3倍にまで増加した。しかし、JEG/Cd1d/aやJEGでは抗β,GPI抗体存在下でも、IL12産生の増加を認めず、この差は有意であった。次に同様の系でIFN−γおよびIL−4の産生についても、抗β,GPI 抗体添加群とコントロールIgG添加群の比をとり各細胞間で比較した。IL12と異なり全ての細胞の抗β,GPI抗体添加群で、18時間後にIFN-γの産生が増加する傾向にあったが、JEG/CD1d細胞においてのみ有意差を認め、 JEG/Cd1d/aやJEGでは有意差を認めなかった。 IL−4 の産生増加はいずれの細胞でも認められなかった。
D.考察
母体の脱落膜組織に胎児のEVTが適切に浸潤していくことが、胎盤形成が正しく行われる鍵となるが、この過程では局所で厳密にコントロールされた炎症反応が必要である。脱落膜 iNKT とEVT上のCD1dの相互作用により産生されるIL−12 はこの炎症反応に寄与していると考えられる。しかし、この母体胎児境界に抗β,GPI抗体が存在すると厳密にコントロールされた環境が乱される。本研究において、抗β₂GPI抗体が存在すると、PS-β,GPI複合体を介してCD1d分子の架橋反応と同様の反応が誘導され、IL12産生が増加するとともに、CD1d-脱落膜リンパ球間の相互作用によるIL12産生がさらに刺激されることが示された。また特にCD1d発現細胞と脱落膜リンパ球の接する胎児母体境界では抗β,GPI 抗体存在下でIFN-γ産生が増加するもののIL-4産生は増加しないことがわかった。すなわち、抗β,GPI抗体が存在すると、IL12 が母体 IFN-γ産生細胞であるiNKT細胞を活性化させ、iNKT細胞から分泌されたIFN-γがEVT上のCD1d発現を増加させてCD1d発現細胞からさらにIL12分泌が促進されるというサイクルが活性化されることがわかった。一方、IL-4 の産生は増加しないことから、母体胎児境界においてはTh1/Th2バランスがTh1にシフトすることとなり、局所の炎症が過剰となって、流産を引き起こす可能性が示唆された。 E.結論β 2 GPI依存性抗リン脂質抗体による流産が、絨毛細胞上のCD1dと脱落膜iNKT細胞を介した過剰な炎症によるという新しい機序が示された。 F.健康危険情報該当なしG.研究発表1.論文発表投稿中
2.
学会発表
1)岩澤有希、川名敬、藤井知行、永松健、松本順子、三浦紫保、山下隆博、兵藤博信、上妻志郎、武谷雄二:絨毛細胞上に存在するリン脂質抗原提示分子｢ CD1d ｣を介した、 β,glycoprotein I依存性抗リン脂質抗体による新規流産メカニズムに関する検討. 第23回日本生殖免疫学会総会・学術集会・富山. 2008.12岩澤有希,川名敬,藤井知行,永松健,松本順子,三浦紫保,吉田志朗,兵藤博信,山下隆博,上妻志郎,武谷雄二:絨毛細胞上に存在するリン脂質抗原提示分子「CD1d」を介した、β2glycoproteinI 依存性抗リン脂質抗体による新規流産メカニズムに関する検討.第61回日本産科婦人科学会総会・学術講演会,京都, 2009.4 Iwasawa Y, Kawana K, Fujii T, Nagamatsu T, 2) 3) 4) Matsumoto J, Miura S, Yamashita T, Hyodo H, Kozuma S, Taketani Y: A possible pathogenic recurrent mechanism of miscarriage associated with β2 glycoprotein I-dependent antiphospholipid antibody through the function of CD1d. 29th Annual Meeting of The American Society for Reproductive Immunology, Orlando, FL, USA, 2009.6 Iwasawa Y, Kawana K, Miura S, Fujii T: A novel pathogenic mechanism of recurrent miscarriage associated with β2glycoprotein I-dependent antiphospholipid antibody through CD1d on the trophoblast. 14th International Congress of Mucosal Immunology. Boston, MA, USA, 2009.7 H.知的財産権の出願･登録状況(予定を含む。)特許取得1.なし2.実用新案登録なし3.その他なし