胆汁は，肝美質細胞で生成され，胆嚢で濃縮されて十二指腸内腔へ放出されるり.胆汁の主成分である胆汁酸は，コレステロールの7α-水酸化から始まる数段階の反応を経て生合成される. この反応を触媒する酵素はは,  cytochrome P450 family 7 subfamily A member 1 (CYP7A1)であり，胆汁酸合成の律速酵素でもある²).肝美質細胞で生成された胆汁酸は一次胆汁酸と呼ばれ，一次胆汁酸が腸内細菌で分解されたものは二次胆汁酸と呼ばれる. これらの胆汁酸は,  FXR³)やVDR 4)をはじめとした核内受容体のリガンドとなり、胆汁酸トランスボーターなどの遺伝子発現を制御していることが知られている. 十二指腸に放出された胆汁酸の90％以上は回腸で吸収され,門脈を経て肝臓に戻り,肝美質細胞に取り込まれる(腸肝循環) 91.腸肝循環に乗らなかった胆汁酸は, 蔡便として体外に排泄され,失われた分の胆汁酸が，肝実質細胞で新たに合成されなどCYP7A1が属するP450澄伝子スーパーファミリーは,原核生物から真核生物まで広く存在する61.真核生物のP450は腐タンパク質であり，小胞体膜に局在するものと,ミトコンドリア内膜に局在するものが存在するγ .一方，原核生物のP450は可溶性タンパク質である. P450の立体構造は， 1985年に原核生物型がまず報告され819), 引き続いて2000年に小胞体に局在するミクロソーム型10, さらに2010年にミトコンドリア型11が報告された.  CYP7A1はミクロソーム型のP450であり,その立体構造は2014年に報告された121. これらのP450は，類似した基本構造を持つが，そこに個々の酵素に固有の構造的特徴が加わることで，多様な基質特異性を獲得したと考えられる.本稿では, CYP7A1の基質特異性を規定する構造的特徴を中心に紹介する. CYP7A1の立体構造(図1A)は,  CYP8A1の立体構造'3'と類似していた.  P450の基質は一般に, B'ヘリックスとF/Gループ(FヘリックスとGヘリックスをつなぐループ)を通り抜けて酵素内部に入り込み,基質結合部位に結合すると推定されている14).  CYP7A1では, B'ヘリックスがヘムに対して垂直に位置しており, B'ヘリックスとF/Gループ部分は閉じていた. CYP7A1とコレステロールの共結晶は得られなかったが， B’ヘリックスを構成する104番目のスレオニン残基を疎水性のアミノ酸であるロイシン残基に置換したところ(T104L), 基質cholest-4-en-3-one (図2)との共結晶が得られた(図1B). 基質cholest-4-en-3-oneは,ステロイド核のα側をヘムに向け,ヘムと平行に向き合い，ヘムのピロール環ではなく，プロピオン酸側鎖の上方に位置していた.  Iヘリックスを構成する284番目のトリプトファン残基(W284)と289番目のアスパラギン残基(N289)が活性部位に向かって突き出していることで，基質cholest-4-en-3-oneは,  B'ヘリックス側に押し付けられていた.この結果,ステロイドB環C7位の炭素原子は，ヘムの鉄イオンから5Åの距離に位置していた. 多くのP450では,  Iヘリックスの中央部に保存されたスレオニン残基が存在し¹⁴),  (A/G) GxxTモチーフを形成しているが， CYP7A1では，このスレオニン残基がアスパラギン残基N289に置換しているため, (A/G) GxxTモチーフではなく,  LWAxxxNTというCYP7ファミリーに特有のモチーフを形成していることが判明した. 基質cholest-4-en-3-oneのケト基の酸素原子は, 360番目のセリン(S360), 361番目のロイシン, 485番目のグリシン(G485)などの近傍に位置していた.  T104L変異が存在するB’ヘリックス周辺の構造は,  3DAXと比べてあまり変化しておらず,  A’ヘリックス周辺の構造が大きく変化していた.その結果，基質の進入経路は開いていた(図1B). CYP7A1特異的阻害剤である7-ケトコレステロールと， CYP7A1 T104L変異体の複合体の結晶構造も得られた.タンパク質部分は,リガンドが結合していない野生型CYP7A1と類似した構造を示し，基質の侵入経路も閉じていた. 阻害剤7-ケトコレステロールは, 基質cholest-4-en-3-oneとほとんど同じ位置を占めていた. 7-ケトコレステロールの3β-ヒドロキシ基は,  G485のペプチド結合部分のカルボニル基,およびS360のヒ図1　とトCYP7A1の立体構造(A)野生型ヒトCYP7AIの立体構造(PDB ID：3DAX)をPyMOLで示した. タンバク質の主鎖をcartoon表示で白く，ヘムをsticks表示で黒く示した．また，基質の基質結合部位への進入に関与すると考えられる領域を厌色で示し,  αヘリックスの名前を付した.  F/Gループ領域には,  F’ヘリックスとG’ヘリックスが存在する. (B)基質cholest-4-en-3-one結合ヒトCYP7A1 T104L変異体の立体構造(PDB ID：3SN5)を同様に示した. 基質結合部位を見やすくするため,  B’ヘリックスとF/Gループを消去したが、この部分は3DAXと比較して大きな構造変化はなく，A’ヘリックス周辺の構造が大きく変化していた. 基質cholest-4-en-3-oneを灰色のsticks表示で示した.図2   CYP7A1関連化合物コレステロール(A),  7α-ヒドロキシコレステロール(B),  cholest-4-en-3-one (C)の構造をドロキシ基と水素結合を形成していた.以上,  CYP7A1の基質認識の構造生物学的基盤について概説した. ほかのP450との構造比較, また, ヒト以外の種由来のCYP7A1の構造を明らかにしていくことで， CYP7A1の基質認識機構や触媒機構の理解が深まっていくと期待される. Key words :cytochrome P450, CYP7A1, cholesterol, bile acid, crystal structure, enterohepatic circulation Department of Laboratory Medicine, The Jikei University School of Medicine 3-25-8, Nishi-Shimbashi, Minato-ku, Tokyo, 105-8461, Japan Yoshihiro Mezaki東京慈恵会医科大学臨床検査医学講座目崎　喜弘(2022.9.12受付) The 2.6-A crystal structure of Pseudomonas putida cytochrome P-450. J Biol Chem 260, 16122–16130 9) Graham-Lorence S, Peterson JA (1996) P450s: structural similarities and functional differences. FASEB J 10, 206–214 10) Williams PA, Cosme J, Sridhar V, Johnson EF, McRee DE (2000) Mammalian microsomal cytochrome P450 monooxygenase: structural adaptations for membrane binding and functional diversity. Mol Cell 5, 121–131 11) Annalora AJ, Goodin DB, Hong WX, Zhang Q, Johnson EF, Stout CD (2010) Crystal structure of CYP24A1, a mitochondrial cytochrome P450 involved in vitamin D metabolism. J Mol Biol 396 441-451 12) Tempel W, Grabovec I, MacKenzie F, Dichenko YV, Usanov SA, Gilep AA, Park HW, Strushkevich N (2014) Structural characterization of human cholesterol 7 α -hydroxylase. J Lipid Res 55, 1925–1932 13) Chiang CW, Yeh HC, Wang LH, Chan NL (2006) Crystal structure of the human prostacyclin synthase. J Mol Biol 364, 266–274 14)城宜嗣,祥雲弘文(1998) P450の立体構造：普遍性と個別性.化学と生物36, 461–464 1) Ross MH, Pawlina W (2016) Histology: a text and atlas with correlated cell and molecular biology, 7th ed. Wolters Kluwer, Philadelphia, PA, USA 2) Chiang JYL, Ferrell JM (2020) Up to date on cholesterol 7 alpha- hydroxylase (CYP7A1) in bile acid synthesis. Liver Res 4, 47–63 3) Makishima M, Okamoto AY, Repa JJ, Tu H, Learned RM, Luk A, Hull MV, Lustig KD, Mangelsdorf DJ, Shan B (1999) Identification of a nuclear receptor for bile acids. Science 284, 1362–1365 4) Makishima M, Lu TT, Xie W, Whitfield GK, Domoto H, Evans RM, Haussler MR, Mangelsdorf DJ (2002) Vitamin D receptor as an intestinal bile acid sensor. Science 296, 1313–1316 5)泉井亮,妹尾春樹,金田研司(2012)カラー図解人体の正常構造と機能第４巻肝・胆・膵改訂第２版.日本医事新報社,東京6) Omura T (2010) Structural diversity of cytochrome P450 enzyme system. J Biochem 147, 297–306. 7)榊利之(2019)ビタミンD代謝酵茶の構造と機能に関する研究.ビタミン93, 469–477 8) Poulos TL, Finzel BC, Gunsalus IC, Wagner GC, Kraut J (1985)