製品・技術に関するお問い合わせsupport@nuprotein.jp IN VITRO Transcription / Translation SYSTEM PSS 5100取扱説明書W NUProtein本書の一部または全部を無断転載することを禁じます。 2016-© NUProtein ©株式会社製品・技術に関するお問い合わせsupport@nuprotein.jp
    本取扱説明書は次の製品ラインナップの使用方法、これを使用するための準備に関わる解説をしています。 PSS 5100
TLS 5100
無細胞タンパク質合成試薬キットを用いたタンパク質合成は、次の3段階から構成されています。特長鋳型となるDNAに、転写/翻訳用に設計された塩基配列を2段階PCRにより付加します。これによりN末端、C末端へ自由に、多様なタグの付け替えが可能となっています。各試薬およびプロトコルの最適化により、PCRからタンパク質発現まで24時間以内に実施可能です。本取扱説明書、Primer Listおよび1st PCR Primer設計支援ツールは弊社ホームページからダウンロードできます。 https://nuprotein.jp/knowledge-base/ https://nuprotein.jp/blogでメールアドレスをご登録頂くと新しいプロトコル等、ニュースレターとしてご案内いたします。是非ご登録お願いいたします。
安全上の注意
本製品は研究用試薬です。診断および臨床検査試薬として使用しないでください。また、本製品の使用にあたり実験室での一般注意事項を尊守し、安全に留意してください。関係する実験において、人体に有害な試薬を扱う場合も予想されます。必要に応じて適切な保護具をご使用いただきますようお願いいたします。製品・技術に関するお問い合わせsupport@nuprotein.jp 2021年5月よりキット内容、プロトコルを大幅に変更しています。主な変更点は次のとおりです。 • キット構成を110 μL翻訳系50回から100回に変更•転写鋳型の5'UTR側を短縮することにより、鋳型設計の簡素化を実現旧バージョンの鋳型と同等以上の性能です。 •転写プロトコルの簡素化旧シリーズをご使用の方も新しい転写プロトコルを参照して下さい。
N末端夕グ鋳型DNAの構造N末端夕グ鋳型DNAの構造および各パートの配列は下のとおりです。 tag sequenceは下表からいずれか1つを選んでください。または任意の配列を用意してください。 Linker_Nは適当なプロテアーゼ認識配列に変更可能です。

N末端夕グ鋳型DNA
転写鋳型は1st PCR, 2nd PCRの2段階で作製します。 1st PCRプライマー（N末端夕グ用）の設計要領下のとおり、遺伝子特異的な配列を18-35 mer挿入して、1st PCRプライマーを作製してください。
製品・技術に関するお問い合わせsupport@nuprotein.jp 2nd PCRプライマー（N末端タグ用）の設計要領挿入するタグが下表にある場合、特に設計する必要はありません。以下のとおりのプライマーを用意します。 ３種類のプライマーが必要になります。各種プライマー濃度は、下図のとおりに調整してください。
製品・技術に関するお問い合わせsupport@nuprotein.jp C末端タグ鋳型DNAの構造C末端夕グ鋳型DNAの構造および各パートの配列は下のとおりです。 tag sequenceは下表からいずれか1つを選んでください。または任意の配列を用意してください。 Linker_Cは適当なプロテアーゼ認識配列に変更可能です。
C末端夕グ鋳型DNA転写鋳型は1st PCR, 2nd PCRの2段階で作製します。 1st PCRプライマー（C末端夕グ用）の設計要領下のとおり、遺伝子特異的な配列を18-35 mer挿入して、1st PCRプライマーを作製してください。 Reverse primerはstop codonを除く逆相補鎖を挿入してください。
2nd PCRプライマー（C末端夕グ用）の設計要領挿入するタグが下表にある場合、特に設計する必要はありません。以下のとおりのプライマーを用意します。 ３種類のプライマーが必要になります。各種プライマー濃度は、下図のとおりに調整してください。
PCR酵素キットは、2ステップPCRプログラム対応の酵素キットを推奨します。以下のプロトコルはKOD-Plus-Neo同等キットに対応しています。温度上昇/下降速度の遅いサーマルサイクラーでは、正常に増幅が確認できない場合があります。
1st PCR
1st PCRの反応液組成およびプログラムは下表のとおりです。 Plasmid DNA濃度は1 ng/μLに調整してください。

2nd PCR
2nd PCRの反応液組成およびプログラムは下表のとおりです。
O アガロースゲル電気泳動による1st PCR product, 2nd PCR productの確認1 μL − 2 μLのPCR産物を確認します。各サンプル共、DNAの精製は必要ありません。 1st PCR product完全なシングルバンドであるか確認します。多少の濃淡差は問題ありません。 2nd PCR product完全なシングルバンドで、はっきりと確認できるものを使用してください。確認例#1, #2は種類の違う鋳型DNAの1st PCR産物。 #3-#8, #9-#14はそれぞれ#1, #2の1st PCR産物で2nd PCRを行ったもの。 ０トラブルシューティング
＊１　伸長反応時間は30 sec/kbを推奨していますが、増幅効率の悪い場合は1 min/kbにしてください。 1 kbpまでのDNAに対しては1 minの伸長反応時間が確実です。 *2　2ステップサイクルPCRで、このトラブルが発生した場合のほとんどがプライマーの設計に問題があります。Tm値が低い場合におこりやすくなります。 Forward/Reverse PrimerのTm値を近づける設計をしてください。Tm > 60°C弊社ホームページ上の1st PCR Primer設計支援ツールをご利用ください。 https://nuprotein.jp/knowledge-base/からダウンロード可能です。転写プロトコル○転写反応溶液の調製次のとおり、転写反応溶液を1.5 mLチューブ中で調製して下さい。 2nd PCR Productは未精製物を使用します。
2nd PCR Productは10x Transcription Bufferと直接混合しないように注意して下さい。この転写系から得られるmRNA量は2翻訳に使用します。 ○転写反応1.調製した転写反応溶液の容器を軽くタッピングし、溶液の攪拌後、卓上遠心機で軽く遠心する。 2.溶液の蒸発防止の為、容器の蓋をしっかりとキャップする。 3. 37℃で3時間、ブロックヒーター等によりインキュベートする。 O mRNAの精製1.転写終了後、25 μL溶液に対し4 M酢酸アンモニウムを10 μL加えて混合する。 2. 100 μlの100 %エタノールを加え混合する。 3.卓上遠心機により軽く遠心した後、-20°C ～ -80°Cで10分静置する。 4.遠心分離する。 (1500 G, 15 min, 4°C) 5.上清を除去後、軽くフラッシュし、再度上清を除去する。 6.沈殿物が半乾燥状態になるまで放置する。マイクロチューブの蓋をあけておくため、不純物が混入しないように注意する。 7. 80 μLの超純水を加えてmRNAペレットを溶解する。 ０アガロースゲル電気泳動によるmRNAの確認1 μLサンプルの電気泳動で、はっきりとシングルバンドが出ているのを確認します。エキストラバンドがでているものは正しくPCRができていない可能性があります。〇最適mRNA量の調整最小翻訳溶液量110 μLに対する最適mRNA量は次のとおりです。 25 μL転写から得られる80 μL mRNA溶液のうち40 μLを使用します。金属イオン、補酵素等で翻訳液をカスタマイズする場合、次ページのMilliQ部分を調製してください。翻訳プロトコル○通常翻訳最適mRNA量/ 80 μLに調整されたmRNA solutionを用意する。（前ページ参照） 1. 2.次のとおり、翻訳反応溶液を1.5 mLチューブ中で調製する。
3. 16°Cで10時間 ブロックヒーター等によりインキュベートする。やむを得ない場合、16時間まで延長可能です。
○透析翻訳
通常翻訳よりも収量を増やしたい場合や、発現しにくいタンパク質に対する方法です。下図のような装置が必要となります。 1. 5倍に薄めたAmino Acid Mix (AAMX005)を2 mLタイタープレートへ分注する。 2.タイタープレートの蓋をして、透析カップをセットする。 3.通常翻訳で調整した110 μL溶液を透析カップ内へ分注する。 4.内液と外液の水面を同レベルに微調整する。 5. 16°Cで10時間 インキュベートする。透析装置加工例24 well titer plate φ 9 - 9.5 mm孔空け加工
Oタンパク質の処理
翻訳溶液中にWheat Germ Extract由来の浮遊成分が混入しています。 SDS PAGEへ使用するサンプルとして、特にこれを取り除く必要はありません。翻訳完了後溶液の長時間4℃保存は好ましくありません。液体窒素凍結等、適切な処理を行い保存してください。
Oウエスタンブロットによるタンパク質の検出
確実にタンパク質合成がされているかどうか、ウェスタンプロットでの確認を推奨します。検出例1 N-FLAG no-signal 2 N-FLAG Full Length 3 C-FLAG Full Length製品・技術に関するお問い合わせsupport@nuprotein.jp memo製品・技術に関するお問い合わせsupport@nuprotein.jp memo page 15旧プロトコル）転写鋳型DNAの作製要領2021年4月までの転写鋳型作製要領です。 N末端夕グ鋳型DNAの構造N末端夕グ鋳型DNAの構造および各パートの配列は下のとおりです。 tag sequenceは下表からいずれか1つを選んでください。または任意の配列を用意してください。 Linker_Nは適当なプロテアーゼ認識配列に変更可能です。
N末端タグ鋳型DNA転写鋳型は1st PCR, 2nd PCRの2段階で作製します。 1st PCRプライマー（N末端夕グ用）の設計要領下のとおり、遺伝子特異的な配列を挿入して、1st PCRプライマーを作製してください。 Reverse primerはstop codonを除く逆相補鎖18 merを挿入します。
製品・技術に関するお問い合わせsupport@nuprotein.jp (日プロトコル) 2nd PCRプライマー（N末端夕グ用）の設計要領挿入するタグが下表にある場合、特に設計する必要はありません。以下のとおりのプライマーを用意します。 ３種類のプライマーが必要になります。各種プライマー濃度は、下図のとおりに調整してください。
製品・技術に関するお問い合わせsupport@nuprotein.jp (日プロトコル)
C末端夕グ鋳型DNAの構造
C末端夕グ鋳型DNAの構造および各パートの配列は下のとおりです。 tag sequenceは下表からいずれか1つを選んでください。または任意の配列を用意してください。 Linker_Cは適当なプロテアーゼ認識配列に変更可能です。

C末端夕グ鋳型DNA
転写鋳型は1st PCR, 2nd PCRの2段階で作製します。 1st PCRプライマー（C末端夕グ用）の設計要領下のとおり、遺伝子特異的な配列を挿入して、1st PCRプライマーを作製してください。 Reverse primerはstop codonを除く逆相補鎖18 merを挿入します。
製品・技術に関するお問い合わせsupport@nuprotein.jp (旧プロトコル) 2nd PCRプライマー（C末端タグ用）の設計要領挿入するタグが下表にある場合、特に設計する必要はありません。以下のとおりのプライマーを用意します。 ３種類のプライマーが必要になります。各種プライマー濃度は、下図のとおりに調整してください。
「KOD®」ならびに「KOD-Plus-Neo」は東洋紡株式会社の登録商標または商標です。 「FLAG®」はSigma-Aldrich Co. LLCの登録商標です。 「Slide-A-Lyzer™」はThermo Fisher Scientific Inc.の商標です。その他記載されている会社名・商品名などは、各社の商標および登録商標です。記載の試薬、製品などには、必ずしも商標表示( (R), TM )を付記しておりません。本取扱説明書中記載の転写用鋳型DNA配列の一部は特許出願済です。 【製造元】
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