武井智彦*京都大学白眉センター／大学院医学研究科高次脳科学講座神経生物学分野Key words :脊髄小脳路,霊長類,化学遺伝学,遠心性コピー ,運動機能
箱 富
これまでの脊髄損傷に関する研究では、いかに元々の神経連絡や運動機能を「復元」するかということに主眼が置かれてきた。しかし、現段階の技術では完全な神経再生は難しく、また他の神経経路による機能代償も限定的である。そのため、このような不完全な神経回路のもとでは患者自身が「思い通りに動かない身体」を受容してそれに対して自分の行動を適応させること、すなわち運動機能の「復元」ではなく「再獲得」を目指していくことが重要である。この「思い通りに身体が動かない状態」とは、運動制御理論の枠組みでは脳内にある身体の「内部モデル」が実際の身体と乖離した状態と表現できる（図1）。「内部モデル」とは、中枢神経系から発せられた運動指令が、実際にどのような身体運動を引き起こすのかを脳内でシミュレート（予測）するための機構であり（図1a）、その際に受け取る運動指令のコピーは「遠心性コピー」と呼ばれる。脊髄損傷などで運動障害が生じた場合、この「内部モデル」によって「予測された運動」と「実際の運動」の間に誤差が生じてしまうため、正しい運動指令が生成できなくなる（図1b）。そのため、脊髄損傷からの運動機能回復をする場合、新しい身体状態（損傷した神経回路）に合った「内部モデル」を禁早く再学習して、この「誤差」を修正することが不可欠である。問題はこれらの「内部モデル」や「遠心性コピー」が中枢神経系のどこで計算処理されているのかである。従来の研究究によって、頸髄第３節から第４節に存在する脊髄固有ニューロン（proprior spinal neuron：PN）から延髄にある脳幹外側網接核（lateral reticular nucleus : LRN）を介して小脳に投射する間接脊髄小脳経路（PN－LRN経路）が運動指令の「遠心性コピー」を小脳へと伝えているという説が有力である［1］。そこで本研究では、霊長類（マカクザル）を対象として、1．ウィルスベクターを用いてPN-LRN経路を選択的に遮断する技術を確立し、2．機械学習を用いた詳細な行動評価を行い、さらに3.運動制御理論に基づくコンピュータシミュレーションを組み合わせることで、PNー LRN経路が健常状態での運動制御および脊髄損傷からの機能回復過程にどのように貢献しているのかを明らかにすることを目的とした。図1. 「内部モデル」を用いた運動制御理論a）雑常な状態では、「内部モデル」が運動指令のコピー（「遠心性コピー」）を受け取って実際に起こる運動を正確に予測し、適切な運動指令を生成する。 b）一方、脊髄損傷などで運動障害が生じた場合、「子測した運動」と「実際の運動（障害された運動）」の間に「誤差」が発生し、適切な運動指令を生成することができなくなってしまう。
被験体のニホンザルは文科省バイオリソースプロジェクトから入手し、動物の飼養と実験は本学動物委員会の承認を得た上で行った。サルは十分に行動課題を訓練した後、全身麻酔下・無菌的操作によって頭部固定具およびチャンバーを取り付け、MRIおよびCT画像を用いて外側網検核（LRN）の三次元位置を脳定位的に同定し、ガドジアミド水和物の微量の注入によって注入部位を確認した（図2)。図2.  LRNの脳定位的同定ガドジアミド水和物（0.02 M Gadolinium、0.5 μ l）を注入後、MRI撮影を行った（左）。参照したアトラスでのLRNに正確に注入できていることが確認できる（右、赤丸）。行動課題としてはケージから約20 cm離れた距離にあるイモ片（幅約0.5および6.0 cm）を取る課題（到達把握課題）を訓練した。十分に行動課題を訓練した後、全身麻酔下・無菌的操作により脊髄（頭髄第２節から胸髄第１節）の右側中問層へと約1 mm問隔で、hSynプロモーターの下に抑制性人工受容体であるhM4Diと赤色蛍光色素(mCherry)を発現するAAVベクター（AAVDJもしくはAAV2.1）の注入を行った。手術後、発現のために４週間待機してから行動学的実験を開始した。行動学実験では、まずメデトミジンとミダプラムにより導入麻酔を行い、LRNにリガンド注入用のカニューレ(28 G、Hamilton社）を刺入した。その後、hM4Diの高感度リガンドであるDeschloroclozapine (DCZ) [2]を0.5 μ 1注入し、カニューレを取り外した後、サルをケージに戻してメデトミジン拮抗薬(アチパメゾール)を投与した。覚醒後、約120分後に到達把握課題を行い、その動作を、ビデオカメラ（ソニー、FDR-X3000）を用いて120 fpsのフレームレートで撮影した。ビデオ映像から手先の位置情報を解析するため深層学習を用いた姿勢推定システムであるDeepLabCut [3]を用いて動作の解析を行った。実験終了後、導入遺伝子の発現を確認するため組織学的な検討を行った。4％パラフォルムアルデヒド溶液にて灌流固定後、脳幹を取り出して30％スクロース溶液でスクロース置換したのち、スライディングミクロトームにて40 μ mに薄切した。その後、蛍光色素に対する免疫組織染色を行い、さらに対比染色としてニッスル染色による細胞体の染色を行った
まず図３にリガンド注入部位付近での組織切片の写真（左）とその拡大図（右）を示す。左の全体図からわかるように、右の脊髄からの延髄への投射軸索は同側（右側）に選択的であり、特に腹外側部にある外側網様核（LRN）の細胞体の周りに高密度な投射を持っていることが分かった。これはこれまでネコで得られた急性実験及び解剖学的な知見と一致するものであった[4]。図3.免疫染色による脊髄延髄路の投射線維の同定黒色の線淮が蛍光色素への免疫染色したもの。対比染色として細胞体をニッスル染色により赤色に親察される。細胞同側（右側）脊髄から延髄のLRNに豊富な線維投射があることが認められる。続いて、図4に行動学的な解析結果を示す。リガンドであるDCZ溶液の濃度を1 μ Mから1 mMまで変えて、また対象条件としてリガンドの基剤のみを注入する条件（Vehicle条件）と比較した。ビデオ画像からDeepLabCutを用いて手先の位置を測定し、それを三階微分することで動きの滑らかさを示すジャークを算出した。我々のシミュレーションによるパイロット実験から、もし「遠心性コピー」が減少すると小さいターゲットへの到達運動に選択的にジャークが増大する、すなわち運動の滑らかさが損なわれることが確認されている。LRNに高濃度のDCZ溶液（100 μ M）を注入した場合、ジャークが増加する傾向が見られたが、その他の有効濃度とされる1～10 μ Mではジャークおよび他のパラメータに有意な差は認められなかった(t-test、p>0.2)。また同様に、ターゲット大条件においても有意な行動の変化は認められなかった。このように、免疫組織学的な検討によりターゲットである脊髄から脳幹網検核(LRN)への神経細胞に遺伝子を導入し目的タンパクを発現させることに成功した。一方、リガンドの投与によって行動学的な結果が認められなかった。この可能性として２つの原因が考えられる。まず一つ目は発現量が十分でない可能性がある。これに関して、異なるセロタイプによる感染効率の比較やTet-OFFシステムなど［5］による発現量の増幅などを検討する必要がある。二つ目の可能性は、生じている運動障害を現在の運動課題および評価システムで正しく評価出来ていない可能性である。我々のシミュレーションの結果では、遠心性コピーの影響は本研究で使用した外力のない到達運動よりも、外力を加えた運動においてより顕著な障害が認められた。そのため外力に対する運動応答を検討するため、マニピュランダムを用いた運動課題による運動評価の研究を進めている。今回の組織学的及び行動学的な実験の結果は、今後人工受容体による経路運択的な操作法を確立する上で検討すべき要因を特定するための有用な知見を与えた。