37.機能ゲノム部位の「世代間エピゲノム継承機構」の解析栗本一基*京都大学大学院医学研究科生体構造医学講座機能微細形態学分野Key words : DNAメチル化、始原生殖細胞、エピゲノムリプログラミング
箱 喜
ゲノム情報は親から子へと伝達され生命の連続性を担保するが、哺乳類ではDNAのメチル化など後成的に付与された情報(エピゲノム)はほとんど遺伝しない。これは、配偶子の起源である始原生殖細胞(primordial germ cells : PGC)におけるエピゲノムの消去と、その後の再構築からなる初期化機構による（エピゲノムリプログラミング)。一方で、父母の環境縁露が代謝などの生理的形質として子孫に伝達されることもよく知られており、世代間の継承機構が存在すると考えられている。伝達因子の候補としてDNAメチル化が有力視され、PGCにおける主要な消去機構は、DNAメチル化維持に必須な因子であるUhrflの発現量が減少し、DNA複製において新規合成されたDNA鎖にメチル化が付与されないことであると考えられている。世代問エピゲノム継承は、栄養源など環境曝露による子孫の形質変化などが盛んに解析されてきた一力で、世代問での継承過程の多くはプラックボックスである。この要因の一つとして、プロモーターなど、反復配列以外の機能ゲノム部位における修飾が、生殖細胞形成過程、特にPGC発生過程においてどのような動態を示すのか（どのようにメチル化情報が消去されていくのか）、および、DNAメチル化消去過程に異常がある場合に、異常が次世代に継承されうる部位がどこであるかが明確ではなかったことが挙げられる。また、DNAメチル化消去過程の異常を効率よく人為的に引き起こして、異常の起きる過程を詳細に調べることも困難であった。報告者を合わグループは、多能性幹細胞からPGCを誘導し、さらにこれを増殖して、エピゲノムリプログラミングを完遂させることができる体外培養系を構築した［1，2］。本研究では、この系におけるリプログラミングと、体内の始原生就細胞形成過程、また前精原細胞への分化過程を解析して、リプログラミング異常が次世代に継承されやすいと考えられる部位を同定すること、さらに、Uhrflの発現量を人為操作してリプログラミングに摂動を与え、世代問エピゲノム雑承の詳細な解析を可能とすることを目的とする。
方法および結果
1. PGCにおけるエピゲノムリプログラミングと、前構原欄胞分化過程におけるDNAメチル化動態
マウスPGCは発生7日ごろに着床後胚のエピプラスト（epiblast）を起源として出現し、発生13.5日までに内在性レトロウィルスを含む反復配列など一部例外を除き、全ゲノムレベルでDNAメチル化を消去する。一方、生殖巣（精巣・卵巣)の体細胞は発生12日目ごろから雌雄それぞれに特異的な性分化を開始し、その影響のもとPGCも発生12.5日ごろには遺伝子発現に明白な性的二型を示す。その後、生殖細胞はは雌雄それぞれの配偶子への分化を続け、雄性生殖細胞はは前精原細胞（prospermatogonia）、雌性生殖硫細胞は一次卵母細胞（primary oocyte）へと分化する。卵母細胞は全体として低メチル化状態を継続するが、前精原細胞は反復配列を除くゲノム全体で急激なメチル化を開始し、後に反復配列がpiRNAによる特異的な機構によってメチル化される。一連の過程において、エピプラストで高度にメチル化され、発生13.5目のPGCで十分に脱メチル化し、その後、前精原細胞への分化過程でメチル化が再獲得されないV再獲得されるのが遅いゲノム部位は、不十分な脱メチル化によってメチル化レベルが高いまま維持された場合に遺伝子発現などの機能的な影響を与えやすいと考えられる。そこで、多能性幹幹細胞（肌胚性幹細胞embryonic stem cells：ESCs）からエピプラスト様細胞（epiblast-like cells）を介し疑集培養の中で誘導したPGC株細胞（PGC-likecells）を、さらに平面培養で増殖させた一連の細胞におけるDNAメチル化[2,  3]、発生9.5〜13.5日の胚内のPGC [4, 5]、発生16.5日の前精原細胞におけるDNAメチル化データ[5] (post bisulfite adaptor tagging : PBATにより定量)から、全遺伝子のプロモーターのメチル化率を抽出した(図1a)。上記のメチル化動態を示す遺伝子を抽出するため、エピプラストにおけるメチル化率が75%以上かつ、DNAメチル化を完遂したd4c7-PGC-like cells (4日の凝集塔養における誘導後[d4],平面塔養で７日間増殖させた[c7]PGC-like cells)、発生13.5日PGC、発生16.5日の前精原細胞の３細胞種の全てにおいてメチル化率10%未満となる遺伝子を探索した。この条件を満たす遺伝子は1.081個同定され、ウェプベースの解析プログラムDAVID 6.8によるgene ontology (GO) 解析の結果、嗅覚受容体（Olfr遺伝子群)、鵜鼻受容体（Vmn遺伝子群)、免疫グロプリン遺伝子群が突出して高い균縮率を示した（図1c)。特に嗅覚受容体遺伝子は解析に含めた1,115個の内241個（22%）、鋤鼻受容体は324個の内25個(8%)が含まれており、遺伝子ファミリー全体として、このカテゴリーに含まれるメチル化動態を示すことがわかった。また、これらの突出した遗縮を示す遺伝子群を除去したGO解析では、Toll様受容体を含む自然免疫や炎症に関わる遺伝子群(GO:0042535、GO:0045087)、アラキドン酸の代謝(エポキシゲナーゼ経路)に関わるシトクロームP450複合体の構成因子（GO:0019373）が有意に濃縮されていた（図1d）。次にこれらの遺伝子の正常な発生過程での脱メチル化が、直接遺伝子発現の制御に関わりうるか否かを解析した。体外培養系におけるエピゲノムリプログラミング過程[2]および、胚内のPGC発生過程(発生9.5～13.5日) [1, 6]をRNA seq解析し、エピプラスト様細胞と比較して、ゲノムワイドな発現動態に対する相対的な発現量を検討した。ゲノムワイドな遺伝子発現パターンは既報の通り、PGCおよび体外培養系のいずれにおいてもDNAメチル化消去の影響をほとんど受けておらず、また上記のプロモーターメチル化カテゴリーに属する遺伝子についても、Ribosomal
Protein L39 Like（Rpl39l）を除き、有意な遺伝子発現変動を示さなかった。
2.  Uhrfl関連因子および、Uhrflタンパク質の分解に関する因子の発現動態
UhrflはPGCの発生直後から発現抑制を受け、継続的に発現レベルが低下し続ける。一方、Uhrflは初期胚やES細胞において、Preferentially Expressed Antigen in Melanoma like7（(Pramel7）を介した経路で、プロテアソームにおける分解による制御を受けることも報告されている[7]。従って、体外培養系およびPGCにおけるUhrfl結合因子(Uhrflbp1、Uhrflbp1l)および、PRAMEファミリー遺伝子群の発現動態を解析した。 Uhrflの発現レベルは既報のとおりPGC発生過程の初期から発生11.5日までは継続的な減少を示したが、性分化を始める発生12.5日以降は逆に増加に転じた。一方、Uhrf1bp1はほぼ一定の発現レベルを示し、Uhrf1bp1lは低いレベルの発現量を維持した(図2)。 PRAMEファミリー遺伝子群はPGC発生過程を通して低い発現量にとどまった。意外なことに初期胚におけるUhrflの分解に寄与するPramel7も、極めて低い発現量にとどまっていた。ES細胞における発現量は、Uhrflのわずか1/500程度であり、体外培養系では検出限界付近でかろうじて検出されるが、胚体内のPGCにおいては検出されなかった。一方で、他のPRAMEファミリー遺伝子の中で、Pramel1は、ES細胞では検出限界以下であったが、PGCの体外培養系では発生の進行に伴い発現量が増加し、胚体内のPGCにおいてはさらに高い発現量を示し、特にUhrflの発現量が増加に転じる発生12.5日と13.5日においては最も高い発現レベルに達した。この発現レベル社同じ発生ステージのUhrflの概ね1/2程度であった。すなわち、Pramel1は、発生初期にはUhrflに対して相補的な、後期にはUhrflと相同の発現動態を示す(図2)。 a） PGC接細胞の体外培養系のスキーム。 b）プロモーターにおけるDNAメチル化レベル。エピプラスト株細胞を横軸に示す。 c)  PGCリプログラミング過程での脱メチル化が前精原細胞で維持されるプロモーターのGO解析。 d）c）から嗅覚受容体、熱鼻受容体、免疫グロプリンを除いた遺伝子群のGO解析。 e）c）で解析した遺伝子群（bで赤色掛で示される）の遺伝子発現パターン。 Uhrf1、Uhrf1bp、Uhrf1bplを左バネルに、PRAMEファミリー遺伝子群を右バネルに示す。各パネルの左側に体外培養系を、右側に胚体内のPGCを示す。本研究ではエピゲノム情報（DNAメチル化）の世代問継承に関与しうるプロモーターの同定と、Uhrf1の代謝に関与しうる遺伝子ファミリーの発現動態解析を行った。PGCにおけるリプログラミング過程で脱メチル化されつつ前精原細胞への分化過程で再メチル化されない遺伝子は、リプログラミングが不十分であった場合にメチル化率が高いまま次世代に引き継がれるリスクが大きいと考えられる。機能的な遺伝子カテゴリー（嗅覚受容体、戀鼻受容体）がまとまって、このような遺伝子群に含まれることは興味深い。また、シトクロームP450は、細胞膜に含まれる脂肪酸アラキドン酸からエポキシエイコサトリエン酸を含む生理活性物質を産生する代謝経路（エポキシゲナーゼ経路）で機能する酵素であり、その構成因子（Cyp2a22、Cyp2c44、Cyp2c68等）が含まれることは、PGCにおけるリプログラミング異常がこれらの代謝経路に影響する可能性を示唆している。これらの遺伝子は成体においては肝臓で最も高い発現を示すが、PGCではほとんど発現しておらず、プロモーターでのメチル化レベルが低く抑えられる意義は、受精後の発生過程における発現に備えたものであると考えられる。現在、これらのプロモーターにおけるUhrf1の過剰発現の影響を調べるため、Rosa26部位からの過剰発現系を構築しており、UhrlfのmRNAの発現に成功している。しかしながらUhrf1の過剰発現は、それ自体がPGCにおける遺伝子発現パターンに影響することも示唆される結果を得ており、より精度の高い発現量調整が必要である。また、本研究では、Uhrflのタンパク質代謝に関わるPramel7のファミリ一遺伝子群の発現を検討した。Pramel7の発現量は極めて低く、これがUhrflタンパク質の代謝に寄与するかどうかは検証の価値がある。また同じファミリーに属するPramel1がUhrf1の動態に対応した興味深い発現変化を示しており、遺伝子破壊などによる機能検証が興味深い。本研究は主に京都大学大学院医学研究科機能微細形態学（斎藤通紀教授）で行った。共同研究者は、斎藤通紀教授、大田浩准教授、学部生の笹田大道氏である。この場を借りて深く感謝申し上げます。 1) 2) Hayashi K, Ohta H, Kurimoto K, Aramaki S, Saitou M. Reconstitution of the mouse germ cell specification pathway in culture by pluripotent stem cells. Cell. 2011;146(4):519-32. Epub 2011/08/09. doi: S0092- 8674(11)00771-9 [pii] 3) 4) 5) Ohta H, Kurimoto K, Okamoto I, Nakamura T, Yabuta Y, Miyauchi H, et al. In vitro expansion of mouse primordial germ cell-like cells recapitulates an epigenetic blank slate. EMBO J. 2017. doi: 10.15252/embj.201695862. PubMed PMID: 28559416. Shirane K, Kurimoto K, Yabuta Y, Yamaji M, Satoh J, Ito S, et al. Global Landscape and Regulatory Principles of DNA Methylation Reprogramming for Germ Cell Specification by Mouse Pluripotent Stem Cells. Dev Cell. 2016;39(1):87-103. doi: 10.1016/j.devcel.2016.08.008. PubMed PMID: 27642137. Seisenberger S, Andrews S, Krueger F, Arand J, Walter J, Santos F, et al. The dynamics of genome-wide DNA methylation reprogramming in mouse primordial germ cells. Mol Cell. 2012;48(6):849-62. Epub 2012/12/12. doi: 10.1016/j.molcel.2012.11.001.. PubMed PMID: 23219530; PubMed Central PMCID: PMC3533687. Kobayashi H, Sakurai T, Miura F, Imai M, Mochiduki K, Yanagisawa E, et al. High-resolution DNA methylome analysis of primordial germ cells identifies gender specific reprogramming in mice. Genome Res. 2013;23(4):616-27. Epub 2013/02/16. doi: gr.148023.112 [pii] 10.1101/gr.148023.112. PubMed PMID: 23410886; PubMed Central PMCID: PMC3613579. 6) 7) Kagiwada S, Kurimoto K, Hirota T, Yamaji M, Saitou M. Replication coupled passive DNA demethylation for the erasure of genome imprints in mice. Embo J. 2013;32(3):340-53. Epub 2012/12/18. doi: emboj2012331 [pii] 10.1038/emboj.2012.331. PubMed PMID: 23241950; PubMed Central PMCID: PMC3567490. Graf U, Casanova EA, Wyck S, Dalcher D, Gatti M, Vollenweider E, et al. Pramel7 mediates ground-state pluripotency through proteasomal-epigenetic combined pathways. Nat Cell Biol. 2017;19(7):763-73. doi: 10.1038/ncb3554. PubMed PMID: 28604677.