1.
試験項目外来アミラーゼの検出適用する検体2.はちちみつ
分析法の概要
3.
検体をリン緩衝生理食塩水に溶解後，限外ろ過により糖を除去し，Native-PAGEに供する。泳動後，ゲルをデンプン溶液に浸して40℃で反応させた後、ヨウ素溶液でアミラーゼ活性を検出する。
4.
器具及び装置
遠心チューブ(樹脂製：50 mL, 15 mL, 2 mL),ビーカー(100 mL),駒込ピペット,メスシリンダー,パスツールピペット,限外ろ過膜(Amicon Ultra-15, 10kDa),ゲル作製用器具（ガラスプレート,コーんなど）汎用天秤,マイクロピペット,ボルテックスミキサー,遠心分離機,電気泳動槽(ミニプロティアンTetraセル，BIO-RADなど)，パワーサプライ，恒温器
5.
試薬及び試液
5. 1
試薬リン酸緩衝生理食塩水（PBS : Dulbecco’s PBS,ナカライもしくは同等品）, Native Sample Buffer (BIO-RAD), TGX FastCastアクリルアミド溶液キット12% (BIO-RAD), TEMED (BIO-RADもしくは同等品)，過硫酸アンモニウム(APS) (BIO-RADもしくは同等品)，マルトデキストリン(DE 4.0-7.0: SIGMA)，可溶性でんぷん（Wakoもしくは同等品）， 10×トリスグリシンバッファー(Wakoもしくは同等品), α-Amylase from Aspergillus oryzae (SIGMA 10065-10G, >30 U/mg) , α-Amylase from Bacilus licheniformis (SIGMA A3403-500KU, Type XII-A, saline solution, ≥500 units/mg protein (biuret))  , 0.05 mol/Lよう素溶液（Wakoもしくは同等品）,酢酸ナトリウム3水和物,酢酸，塩化ナトリウム，ヨウ化カリウム，ヨウ茶（以上，試薬特級） 5.2   試液5.2.1    2%マルトデキストリン含有Native-PAGE用ゲルの作製①　ゲル作製キット各社でガラス板の大きさが異なるなど，共通では使用できない。よって，以下の点に留意して，作製する。 ・ゲルの厚さ: 1 mm,コームの幅：5 mm前後,濃縮ゲル：コーム先端から3 mm ②　ゲルの作製キットの取り扱い説明書に従いゲルを作製する。その際に濃縮ゲル及び分離ゲルに20%マルトデキストリン水溶液を1/10量添加する。コームはBI0-RAD製品の場合， 10サンプル用を使用する。作製したゲルは，濡れタオルで包んでチャック付きポリ袋に入れて冷蔵保管可能(4℃, 4週間)永動バッファー
5. 2. 2
10 ×トリスグリシンバッファーを水で10倍希釈する。使用前に氷水中で1時間程度冷やしておく。調製量の目安は、BI0-RADの泳動槽の場合、ゲル1枚の場合は800 mL、 2枚の場合は1000 mL。百酸級衝液5. 2. 3酢酸ナトリウム3水和物17.4 gを水約80 mLに溶かし，酢酸(原液)でpH5.3に調整した後，水で100 mLにする。 * ：水を入れるとpHが下がるので，pHを確認しながらビーカーの目盛りで100 mLに合わせたほうがよい。
5. 2. 4
塩化ナトリウム溶液塩化ナトリウム2.9 gを水に溶かし，100 mLとする。 5. 2. 5でんふん溶液（反応液）可溶性でんぷんに10%になるように水を加えて電子レンジで加熱し溶解する(10%デンプン溶液)。 10%デンプン溶液5 mL,酢酸線衝液5 mL,塩化ナトリウム溶液3 mLを混合し50 mLにする。使用時はあらかじめ40℃で1時間程度加温する。 5. 2. 6
ヨウ泰原液
ヨウ素2.2 gをビーカーに量り取る。ヨウ化カリウム5.5 gを薬包紙に量り取り，ヨウ素が入ったビーカーに入れ，薬包紙を水10 mL程度で洗いこむ。さらに水20 mL程度を加えて溶解した後，水で250 mLに定容する。 ＊ :ヨウ素は直接手に触れないよう，使い捨て手袋を使用して量りとる。 5. 2. 7ヨウ素溶液①ヨウ化カリウム2 gを水に溶解し，ウ素原液0.5 mLを加え水で50 mLにする。ヨウ素溶液② 5.2.8ョウ化カリウム2 gを水に溶解し，市販の0.05 mol/Lよう素溶液0.35 mLを加え，水で50 mLとすなる。 5. 2. 9
陰性コントロール
市販はちみつ（国産が望ましい）を購入し、ジアスターゼ活性（分析法：A0AC 958.09)が8以上であること，外来アミラーゼが検出しないこと（分析法：本法）を確認する。このはちみつを用いて試験溶液を調製し，陰性コントロールとする（使用期限：冷蔵, ６ヵ月)。
5.2.10　陽性コントロール
α-Amylase from Aspergillus oryzae, α-Amylase from Bacilus licheniformisを以下のように調製する。 ①  α-Amylase from Aspergillus oryzae 0.01 g (300 U相当量)を水1 mLに溶解して1 % (300 U/mL)溶液を作製した後，水で10倍(100 μL +水900 μL)希釈(30 U/mL)する(使用期限:冷蔵, 6ヵ月)。 ②  α-Amylase from Bacilus licheniformisの力価を確認し，水で希釈し２ units/mLを調製する(訳薬の試験成績書の記載が, 1,047 units/mg,21.5 mg/mLの場合, 1,047×21.5=22,510.5 units/mL ≒20, 000 units/mLなので， 10,000倍希釈する(10 μL+水990 μL⇒110 μL+水990 μL)する)。 (用時調製)。 ③   ①50 μL,  ②400 μL, 水550 μLを混合して陽性コントロールとする (α-Amylase from Aspergillus oryzae : 1.5 U/mL, α-Amylase from Bacilus licheniformis : 0.8 units/mL) (用時調製)。
6.
試験方法
6. 1試料の調製はちみつをスパーテル等で十分に混合する。 6. 2試験溶液の調製（フローチャート参照） ①　試料4 gを50 mL容遠心チューブの採取し, PBSを10 mL加える。ボルテックスもしくは振とうして溶解する。 2) (3) PBSで20 mLに定容（遠心チューブの標線）する。 4遠心分離（15,000 ×g，10分または2,600 ×g，20分，10℃）する。のの上澄み液10 mL分取し，限外ろ過用チューブに入れる。 (6)限外ろ過(5,000 ×g, 30分または2,600 ×g, 40分, 10℃)する*。濃縮液（300～600 μL）にPBS10 mLを加えて混和のつ(8)限外ろ過(5,000 ×g, 30分,または2,600 ×g, 40分, 10℃)する*。 (9)濃縮液（300〜600 μL）にPBS10 mLを加えて混和する。 (10)限外ろ過(5,000 ×g, 20分,または2,600 ×g, 30分, 10℃)する*。 (1)濃縮液を2 mL又は15 mL容遠心チューブ移し，水で2 mLに定容する。 (12)遠心分離（15,000 ×g，10分または2,600 ×g，20分，10℃）し，上澄み液を試験溶液とする。 *：濃縮液量が600 μLを超える場合は，追加で遠心分離を行う。
6.3   Native-PAGE
①　電気泳動槽を取扱説明書に従い組み立てる。 ②）冷やした泳動バッファーを図の⑦がいっぱいになるまで注ぎ，残りを⑦に注ぎ，5分程度放置して⑦からの漏れがないこと確認した後,電気泳動槽を水水の入った容器に入れる(低温室で実施する場合は,そのまま放置)。 * :泳動槽の組み立てが甘いとバッファーが漏れるときがある。そのときは途中でバッファーを足しながら永動を行う。 ③　試験溶液11 μLとNative Sample Buffer11 μLを混合し, 10 μLを電気泳動に供する。 ④　①の泳動バッファーに棒状温度計を入れ,温度が5℃になったら200 Vの定電圧で90分間泳動する。 ⑤　ガラス板からゲルを剥がし水で洗浄後，反応液に漬けて40℃で30分間インキュベートする。ゲルには菓表分かるように端に切り込みを入れることを推奨する。 ⑥　反応液を捨てよく水で洗浄する。ヨウ素溶液①または②を加えて30分間室温で放置し，バンドを確認する。 ①　ゲルをポリ袋等でカバーして，カラーコピーもしくは写真撮影を行う。
7. 結果の判定
取込み画像において，基本的には陽性コントロールと同じ位置にバンドが確認されたら陽性とする（陽性コントロールよりも色が薄くても明確なバンドがあれば陽性と判断する。)。位置が異なるバンドが検出された場合はLC-QTOF/MSを用いてタンパク質の解析を行い，由来を確認してミツバチ以外のアミラーゼであれば陽性とする。結果例N：陰性コントロールP :陽性コントロール(Bacilus licheniformis由来アミラーゼはGeobacillus由来と同じ位置に検出する) 1 : Geobacilus由来アミラーゼの位置に明確なバンドがあるので陽性2 : Aspergillus由来アミラーゼの位置に明確なバンドがあるので陽性3 : Geobacilus由来アミラーゼの位置に明確なバンドがあるので陽性4 : Aspergillus由来アミラーゼの位置に明確なバンドがあるので陽性5 : Geobacilus由来アミラーゼの位置に明確なバンドがあるので陽性6 : Aspergillus由来アミラーゼの位置に明確なバンドがあるので騎性7：バンドがないので陰性8：やや薄いがAspergillus由来アミラーゼの位置に明確なバンドがあるので腸性8. 参考ミツバチ由来アミラーゼは基本的に原点に留まるが，含量が多い場合は帯状のバンドが形成され, Geobacilus由来アミラーゼと分別が困難なケースがある。一方で， Geobacilus由来アミラーゼは耐熱性であるため，試験溶液を80℃， 15分間加熱しても残存するため，この操作を加えることにより分別が可能である。 ①アスペルギルス②アスペルギルス80°C15分③アスペルギルス80°C30分④ミツバチ⑤ミツバチ80°C15分6ミツバチ80°C30分①ゲオバチルス⑧ゲオバチルス80°C15分⑨ゲオバチルス80°C30分各検液50 μLを加熱ゲオバチルスのミツバチの分別は， 80°C， 15分加熱後の試験溶液で可能。
以
【抽出】
試料4 gを50 mL容遠心チューブの採取□ |  +リン酸緩衝生理食塩水(Dulbecco’s PBS) 10 mL □ボルテックスもしくは振とうして溶解 □リン酸緩衝生理食塩水で20 mLに定容□遠心分離（15,000 ×g, 10分または2,600 ×g, 20分, 10℃）口上澄み液10 mL分取□限外ろ過(Amicon Ultra-15, 10kDa, 5,000 ×g, 30分または2,600 ×g, 40分, 10℃) *口濃縮液（約600 μL）にリン酸緩衝生理食塩水10 mLを加えて混和口限外ろ過(5,000 ×g, 30分または2,600 ×g, 40分, 10℃) *口濃縮液（約600 μL）にリン酸緩衝生理食塩水10 mLを加えて混和口限外ろ過(5,000 ×g, 20分または2,600 ×g, 30分, 10℃) *口濃縮液を水で2 mLに定容　 □遠心分離（15,000 ×g, 10分または2,600 ×g, 20分, 10℃）口上澄み液 □ *：濃縮液量が600 μLを超える場合は，追加で遠心分離を行う。
【電気氷動】
抽出液（11 μL） + サンプルバッファー（11 μL） □泳動バッファーの温度が5℃であることを確認 □ l泳動（定電圧200 V, 90分）口反応液に浸す（40℃, 30分）口染色液に浸す（室温， 30分）口