原著論文（通常論文）
Characterization of Organomercury Compounds Removal by Hg-resistant Bacillus Strains and mer Gene-Cloned Escherichia coli博²,石井系学2成田勝¹西澤Masaru Narita, Hiroshi Nishizawa, Hidenori Ishii介辰³，遠藤英銀朗¹* CHIEH-CHEN H UANG , G INRO E NDO ¹東北学院大学工学部環境土木工学科〒985–8537 宮城県多賀城市中央1–13–1 ²東北大学大学院生命科学研究科 〒980–8577宮城県仙台市青葉区片平2–1–1 ²国立中興大学生命科学部生命科学学科〒40227台中市南区国光路250号,台湾* TEL: 022–368–7493   FAX: 022–368–7070 * E-mail: gendo@tjcc.tohoku-gakuin.ac.jp 1 Laboratory of Environmental Biotechnology, Tohoku Gakuin University, Tagajo, Miyagi 985–8537, Japan ² Graduate School of Life Science, Tohoku University, Sendai, Miyagi 980–8577, Japan ³ Department of Life Science, National Chung-Hsing University, Taichung 40227, Taiwan (原稿受付　2003年5月6日／原稿受理　2003年7月9日) Resistance spectrum and removal characteristics of organomercurial compounds were compared by using three mercury- resistant Bacillus strains ( Bacillus megaterium MB1, Bacillus cereus RC607, and Bacillus cereus VKM684) which possess identical mer operons. Although the three Bacillus strains could remove all of the tested organomercurials, B. cereus RC607 and B. cereus VKM684 showed higher organomercury resistance profiles than that of B. megaterium MB1. To understand the functional roles of three merB genes ( merB1 , merB2 , and merB3 ) possessed by the three Bacillus strains, organomercu- rial removal of recombinant Escherichia coli clones carrying each merB gene was characterized. The recombinant E. coli carrying the merB3 could remove all of the tested organomercurials, while the recombinant E. coli carrying the merB2 and the recombinant E. coli carrying the merB1 could not remove methylmercury. However, the recombinant E. coli carrying the merB3 gene conferred relatively low removal rate of organomercurials than those of wild type strains, B. cereus RC607 and B. cereus VKM684. From these results, it is concluded that wild type strain B. cereus RC607 or B. cereus VKM684 is effective for biological remediation or biological treatment of toxic organomercurials contamination. Key words:  mercury-resistant bacteria, Bacillus , recombinant E. coli , organomercury resistance, removal of organomercuri- alsキーワード：水銀耐性細菌, Bacillus,組み換え大腸菌,有機水銀耐性,有機水銀除去
1. 緒
llu
水銀による環境汚染は世界的に問題視されており，人問への健康や生態系に影響を与えるなど多くの被害をもたらしている²³。特に，メチル水銀やフェニル水銀化合物等の有機水銀化合物は，人体に対して極めて有害な物質であり，環境基準としては検出されてはならない物質とされている29。この高い毒性を持つメチル水銀による水銀中毒事件は，1950年代に熊本県の水俣湾周辺で231, 1965年に新潟県の阿賀野川流域で²²，1971～1972年にはィラクでり,近年ではプラジルで13.17)それぞれ発生してきている。現在，有機水銀などの水銀を含んだ廃水の処理は，イオン交換樹脂や活性炭などによる物理化学的処理方法がとられている。また，生物による有機水銀除去を目的として，水銀除去能のある細菌（水銀耐性細菌）の生態や耐性機構についての研究が進められている。水銀耐性細菌の耐性機構には有機水銀化合物を分解して細菌の生理活性を保つための機構を備えているものが知られている19。このような耐性機構を持つ細菌は，有機水銀化合物を分解するだけでなく，有機水銀化合物の分解によって生じた水銀イオン(Hg²*)を湿元し金属水銀(Hg°)を生成する¶。また,生成されたHg°は細菌細胞外へと気化放出される。この一連の化学反応に関与する機能は，merオペロンと呼ばれる遺伝子群の連携した発現によって獲得されていることが知られている10.19)。merオベロンの構成は，水銀イオンに応答する転写調節遺伝子(merR等),水銀イオンを細胞内へ輸送する水銀輸送遭伝子(merT, merP等),細胞内に輸送された水銀イオンを金属水銀に還元する水銀還元酵素遺伝子(merA)および有機水銀化合物を水銀イオンと有機物へ分解する有機水銀分解酵素遺伝子(merB)などの遺伝子群からなっている1α19。かつて高濃度の水銀に汚染された熊本県の水俣湾庭泥から, Bacillus風やPseudomonas風などの水銀耐性細菌が多数分離され，様々な有機水銀化合物を分解し還元することによって水銀を気化していることが報告されている14-16)これまでの我々の研究において，有機水銀化合物を分解し水銀を無毒化できる水銀耐性細菌を得ることを目的として，メチル水銀に汚染された当時の熊本県の水俣湾庭泥サンプルからグラム陽性の水銀耐性細菌Bacillus megaterium MB1を分離した9。このB. megaterium MB1のmerオベロンの解析を行った結果,アメリカのボストン港庭泥から分離されたBacillus cereus RC607やB. cereus VKM684が保有するmerオペロンと全く同一であることが明らかになった48929。さらに, B. megate- rium MB1のmerオベロンはTnMERI1と命名した染色体のクラスIIトランスポゾン上にシングルコピーとしてコードされていることが明らかになった9。また,このmerオペロンには３つの有機水銀分解酵素遺伝子(merB1, merB2, merB3)がコードされており,これらのmerB 遺伝子問の相同性は極めて低いことが知られていろお。MerBタンバク質（merB遺伝子産物）は，有機水銀の炭素-水銀(C-Hg)結合を切断し分解するために必須の酵素であり²³)，生物学的有機水銀除去技術を開発するためにはこれらの遺伝子を保有する細菌やそのmerB遺伝子産物の有機水銀化合物種に対する分解能の特性を知ることが重要となる。本研究においては，同一のmerオベロンを保有するBacillus属細菌野生株と各merB遺伝子を保有する水銀耐性組み換え大腸菌株を用いて，各種有機水銀化合物に対する耐性と除去の特性を調べることによって，これらの細菌株を用いた有機水銀除去技術への適用の可能性を検討した。
2.材料および方法
2.1.供試菌株およびプラスミド
同一のmerオベロンを保有する野生株としてB. megaterium MB1%, B. cereus RC60724およびB. cereus VKM6849を用いて各種水銀化合物に対する耐性と除去の特性を調べた。これらの３細菌株の保有する mer オベロン構造を図１に示す。また，merオベロンを保有していない水銀感受性細菌Bacillus subtilis 168をコントロールとして用いた。さらに，水銀耐性プラスミドを持つ組み換え大腸菌株Escherichia coli DH5α/pGB3A株, E. coli DH5α/pGR1B2株およびE. coli DH5α/pGMO7株9も使用して各種水銀化合物に対する除去特性を調べた。この際に用いた各水銀耐性プラスミドpGB3A, pGR1B2およびpGMO7は, Ｔベクター pGEM-T Easy (Promega, Madison, Wisconsin)だ，上記のBacillus属細菌野生株が保有するmerオペロンの断片を挿入し作製したプラスミドである。pGB3Aプラスミドは，水銀応答調節遺伝子(merRI),水銀輪送遺伝子群(merE, merT, merP),水銀還元酵素遺伝子(merA)の各遺伝子に加えて，merR1遺伝子の上流側に有機水銀分解酵素遺伝子(merB3)を含む遺伝子群をコードしたプラスミドである。pGR1B2プラスミドは, pGB3Aプラスミドの保有する水銀耐性遺伝子群のうち，merB3遺伝子を含まず，merA遺伝子の下流側に水銀応答調節遺伝子(merR2)と有機水銀分解酵素遺伝子(merB2)を含む遺伝子群をコードしたプラスミドである。pGMO7プラスミドは, pGR1B2プラスミドの保有する水銀耐性遺伝子群に加え，merB2 遺伝子の下流側にもう一つの有機水銀分解酵素遺伝子(merBI)を含む遺伝子群をコードしたプラスミドである。各プラスミドが保有する水銀耐性遺伝子群のクローニング領域を図２に示す。本研究で用いた全ての細菌株は Luria-Bertani  (LB) 液体塔地場で培養を行い，水銀耐性組み換え大腸菌株については，アンビシリンの最終濃度が100 μg/mlになるように調製したLB液体増地で培養を行った。また，本研究で用いた水銀耐性遺伝子群は, E. coli細胞内で発現することが明らかになっており，発現の誘導は前培養液に塩化第二水銀を添加することによって行った。
2.2.水銀化合物
無機水銀化合物1種と有機水銀化合物3種の合計4種の水銀化合物を使用した。塩化水銀(無機水銀) (MC),塩化メチル水銀(MMC), 酢酸フェニル水銀(PMA)は和光純薬(Osaka, Japan),バラクロロ安息香酸水銀(PCMB)はSIGMA (St. Louis, MO.)からそれぞれ購入した。各水銀ストック溶液(1 mg/ml or 10 mg/ml)は，滅菌精製水もしくはジメチルスルホキシド(和光純薬)で作製した。
2.3.   Bacillus属細菌野生株の有機水銀耐性
塩化水銀濃度0.25 μg/mlを含む10 mlのLB液体塔地によって37°Cで一晩皆養された各細菌株の皆養液は,吸光度(OD 600 )で0.060〜0.065になるようにLB液体培地で希釈した。100 μlの各希釈培養液は，様々な水銀濾度に設定した10 mlのLB液体培地に植菌し37°Cで48時間培養した。有機水銀耐性は，各細菌株の各有機水銀化合物に対する最小阻害濃度(minimum inhibitory con- centration;以下MICと述べる)を決定することによって行った。MICは48時間培養後の細菌の増殖による増地の濁度を評価し，細菌の増殖が阻害された最小の水銀濾度の数値として求めた。細菌の増殖がなされたことを判定するための基準は，培地の濁度が OD 600で約0.2以上の場合とした。各水銀化合物の設定濃度(μg/ml)は0.1, 0.25, 0.5, 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50, 80および120とし,  MICの試験は４回繰り返して行った。
Bacillus 属細菌野生株と組み換え大腸菌株の有機
2.4.
水銀の除去
塩化水銀濃度0.25 μg/mlを含む10 mlのLB液体塔地によって37°Cで一晩塔養された各細菌株の塔養液は, OD 600で0.060～0.065になるようにLB液体培地で希釈した。100 μ1の各希釈皆養液は，様々な水銀濃度に設定した10 mlのLB液体培地に植菌し37℃で48時間培養した。有機水銀除去は，還元・気化法によるフレームレス原子吸光計(SP-3D, Nippon Instruments Co., Tokyo, Japan)を使用して培養液中の水銀残存量を測定することによって行った。各水銀化合物の設定濃度（単位はいずれもμg/ml）は，塩化水銀10.0（対象としたB. subtilis 168は3.0),塩化メチル水銀0.1,バラクロロ安息香酸水銀5.0および酢酸フェニル水銀1.0とした。
3.結
果
3.1.   Bacillus属細菌野生株の有機水銀耐性
表1に各 Bacillus 属細菌野生株の有機水銀耐性の比較結果を示す。また，無機水銀化合物であるMCに対する耐性の比較結果も同時に示す。B. megaterium MB1のPMCBとPMAに対するMICは,  B. subtilis 168より２倍高い値を示した。しかしながら，MMCに対するMICは,  B. subtilis 168より低い値を示した。一方, B. cereus RC607とB. cereus VKM684の各種水銀化合物に対するMICは, MMCを除きB. subtilis 168株やB. megaterium MB1に比べ高い値を示した。特に, B. cereus RC607のPCMBに対するMICは,  B. subtilis 168よりも16倍高く, B. megaterium MB1よりも8倍高い値を示した。さらに，B. cereus VKM684のPCMBに対するMICもまた, B. sdubtilis 168よりも10倍高く, B. megaterium MB1よりも5倍高い値を示した。以上の結果から，各細菌株は全く同一のmerオベロンを持つにも拘わらず4924)，それぞれ異なったMICを示した。特にB. cereus RC607とB. cereus VKM684はB.
chloride; PCMB, p -chloromercuribenzoate; PMA, phenylmer- cury acetate. The MICs that increased more than three times are highlighted in boxes. megaterium MB1よりも高いMICを示すことが明らかになった。
3.2.   Bacillus属細菌野生株の有機水銀の除去
図3A～Dに各Bacillus属細菌野生株の有機水銀除去率の比較結果を示す。また，無機水銀化合物であるMCの除去率の比較結果も同時に示す。各細菌株は本研究で用いた全ての有機水銀化合物を除去することができたものの，水銀化合物種によっては除去率に違いが観察された。また，各細菌株は対数増殖期で除去活性が最大となり，48時間培養後は定常期に達した(data not shown)。 MCの除去率において，培養後24時間でB. megate- rium MB1とB. cereus VKM684は約85％を示し、B. ce- reus RC607は約89％を示した。よって，無機水銀イオンの還元気化能力はほぼ同じであることが明らかになった（図3A）。 B. megaterium MB1はMMCに耐性を示さないが(表1 )，培養後４時間で約60％の MMC の除去率を示したのに対して（図3B）,  B. cereus RC607とB. cereus VKM684 は，培養後4時間でほぼ完全に MMC を除去した。よって，これらの３細菌株で MMC の除去率には差が見られた（図3B）。 PCMBの除去率については, ３細菌株ともに培養後24時間で約98％とほぼ完全に除去できることが明らかになった（図3C）。また，３細菌株とも培養後48時間で約50％のPMAの除去率しか示さず, PMAの分解は不十分であった（図3D）。以上の結果から，各細菌株は様々な水銀化合物種を除去できることが明らかになったものの，同一のmerオベロンを保有しているにも拘わらず，水銀化合物種によっては除去率や除去速度に違いがあることが明らかになった。特にB. cereus RC607とB. cereus VKM684はPMA を除く水銀化合物を効果的に除去できることが明らかになった。また，各細菌株の水銀除去は水銀耐性プロファイルの結果（表1 ）と相関を示さなかった。
3.3.組み換え大腸菌株の有機水銀の除去
図4A～D に各組み換え大腸菌株の有機水銀除去率の比較結果を示す。また，無機水銀化合物であるMCの除去率の比較結果も同時に示す。各細菌株は各水銀化合物についてそれぞれ異なる除去能を示した。また,各細菌株は対数増殖期で除去活性が最大となり，48時間培養後は定常期に達した(data not shown)。E. coli DH5α /pGB3A株は，本研究で用いた全ての有機水銀化合物を除去できた（図4A～D）。しかしながら，E. coli  DH5α /pGR1B2株はMCとPMAを除去したものの(図4AおよびD), MMCとPCMBを全く除去できなかった(図4B および C)。また,  E. coli  DH5α/pGMO7 株はMMCを除去できず，それ以外の水銀化合物を除去できた（図4A～D）。 MMCの除去率において, E. coli DH5α/pGR1B2株は全く除去できず，E. coli DH5α/pGMO7株は培養後48時間で約25％だけの除去が観察された（図4B）。それに対しE. coli DH5α/pGB3A株は培養後8時間で約70%の除去率を示した（図4B）。しかしながら，培養後8時間以降の除去活性を示さず，培養直後から8時間の培養までの間に除去を行うことが判明した。以上の結果から, MMCの分解に大きく貢献しているのはMerB3タンバク質（merB3遺伝子産物）であると考えられ, MerB1タンバク質（merB1遺伝子産物）はMMCの分解におずかしか関与しないことが示唆された。 PCMBの除去率において, E. coli DH5α/pGB3A株とE. coli DH5α/pGMO7株は48時間で約80％以上の除去率を示した（図4C）。一方，E. coli DH5α/pGR1B2株は，MMCの除去能と同様に除去活性が全く観察されなかった。また，以前報告したPCMBに対するMICの結果において，E. coli DH5α/pGR1B2株はPCMBに耐性を示さないことが知られている®。よって,各細菌株のPCMBに対する耐性と除去の間には相関があるといえる。以上の結果から，MerB2タンバク質はPCMBの分解とそれへの耐性には関与せず，MerB1タンバク質とMerB3タンバク質の両方がPCMBの分解に関与していろと結論づけられた。各細菌株の培養後48時間のPMAの除去率は約50%前後であった（図4D）。また，E. coli  DH5α/pGR1B2 株はPMAに対して耐性を示さないことが知られているにも拘わらず》,  PMAを除去できた（図4D）。以上の結果から，有機水銀分解酵素である各MerBタンバク質は，有機水銀化合物種に対して異なる分解特性を示し，それらの中のMerB3タンバク質は最も多くの種類の有機水銀化合物を分解できることが明らかになった。
4.考
察
本研究で用いた各Bacillus属細菌野生株は,同一のmerオペロンを保有しているのに拘わらず4924),異なったMICプロファイルを示した（表1 ）。特に、B. cereus RC607とB. cereus VKM684は，B. megaterium MB1よりも高い耐性能を示した。MICプロファイルはこれらの細菌株を実際の水銀除去技術に使用する際には重要なバラメーターとなる。MICプロファイルの結果において，各細菌株のMMCに対するMICは，PCMBやPMAなどの他の有機水銀化合物に比べ低かった(表1 )。しかしながら，各細菌株は MMC を培養後４時間程度で除去できた（図3B）。 Bacillus 属細菌株と同様のグラム陽性の水銀耐性細菌Staphylococcus aureusは，PMAおよびバラヒドロキシ安息香酸水銀(pHMB)に対して耐性を示すものの,塩化エチル水銀(EMC)やチメロサール(TH)などのアルキル水銀化合物に対しては感受性を示すことが報告されているが。しかしながら，EMCやTHを分解し気化できることが明らかにされている²9。この水銀耐性S. aureusのmerオペロンはプラスミドpI258にコードされ，有機水銀分解酵素遺伝子merBを一つ保有している19。この結果は有機水銀化合物に対する耐性と除去の間には相関がないことを示している。また，この結果と共通の結果がグラム除性の水銀耐性Pseudomonas 属細菌にも見られている%。各細菌株の水銀耐性能の違いは，各細菌株における遺伝子発現レベルが異なるためであると考えられる。さらには，細菌細胞膜への水銀化合物の透過性の違いや細胞内のタンバク質や酵素のSH基化合物への水銀イオンの結合の度合いに違いがあることが考えられる。 3つのmerB遺伝子産物の各種有機水銀化合物に対する分解能の特性を調べるために，E. coliを宿主とした水銀耐性組み換え大腸菌株を用いて除去の評価を行った。本実験の結果より, MerB3タンバク質はMMCの分解に大きく関与していると考えられ, MerB1タンバク質とMerB2タンバク質はMMCの分解に関与しない可能性が示唆された。しかしながら, PMAの除去結果では,
RC607 plasmid pKLH6, accession numbers AF138877, AB027307, AB027306 8,9,24 ); MerB d2ss (MerB of Staphy- lococcus aureus RN23 8325 plasmid pI258, accession number L29436 121 ); MerB gou13ss (MerB of Serratia mar- cescens plasmid pDU1358, accession number P08664 7 ). MerB1タンバク質とMerB2タンバク質はPMAを分解でき，有機水銀化合物種によって分解能に違いがあることを示した。この分解能の違いは，各々のMerBタンバク質の各種有機水銀イオンに対する認識と切断効率の度合いの違いが考えられる。 3つの有機水銀分解酵素遺伝子merBを持った水銀耐性細菌は,本研究で用いたB. megaterium MB1, B. cereus RC607およびB. cereus VKM684の他に,ウクライナのカルバチアの土壌から分離されたExiguobac- terium sp. TC38-2b 1に見られている。一方,ロシアの土壌から分離されたB. megaterium MK64-149は, merB3 遺伝子のみを持ち, merB1および merB2 遺伝子を保有していないmerオベロンをコードしていることが知られている。現在まで本研究で用いたBacillus属細菌株由来の３つのmerB遺伝子を含め,少なくとも9種類の merB 遺伝子がグラム陰性とグラム陽性の両方の水銀耐性細菌から発見されている。上記の３つ以外のmerB遺伝子は,グラム除性細菌ではSerratia marcescens (pDU1358)りのmerB遺伝子,  Pseudomonas stutzeri (pPB) 201のmerB遺伝子,  Pseudomonas sp. K-62 (pMR26)の２つの異なるmerB遺伝子(merB1およびmerB2)11),グラム陽性細菌ではS. aureus (pI258)12)のmerB 造伝子, Streptomyces lividans 1326 (染色体上)²²²のmerB遺伝子である。これらの遺伝子産物であるMerBタンバク質のアミノ酸配列の比較から, B. mega- terium MB1株の保有するMerB3タンバク質は,他のMerBタンバク質と比べ,アミノ酸配列レベルでほとんど相同性を示さないことが明らかになっている(表2 ) 89。しかしながら，唯一P. stutzeri (pPB)に保有されているMerBタンバク質とアミノ酸配列レベルで25.5%と低いながら相同性を持つことが明らかにされている®。現在，水銀を含んだ廃水の処理は主として物理化学的処理方法がとられているものの，これらの処理方法には活性炭やイオン交換樹脂の取り替えや莫大な化学薬品の添加によるコスト高などの問題がある。低濃度の水銀汚染の経済的かつ効率的な除去を行うためには，物理化学的処理方法よりも微生物を利用した生物学的処理方法が適していると考えられる。本研究においては，水銀耐性Bacillus属野生細菌株と水銀耐性組み換え大腸菌株の各種有機水銀化合物に対する耐性と除去の特性を調べた。それらの細菌株の中で，野生株であるB. cereus RC607とB. cereus VKM684は，B. megaterium MB1に比べ,  MMC を除く３種の水銀化合物に対し高い耐性を示し，MMCを含めた４種の水銀化合物を効果的に除去できた。したがって，同一のmerオベロンを持つ野生株であっても，それを保有する形態および保有する細菌細胞の特徴によって各水銀化合物の除去特性は異なることが明らかになった。また，組み換え大腸菌株であるE. coli DH5α/pGB3A株は，本研究で用いた全ての水銀化合物を除去できたものの，各水銀化合物の除去率は野生株のB. cereus RC607とB. cereus VKM684のそれらよりも低かった。よって，分子育種微生物による水銀化合物の除去を十分に達成するためには，宿主として用いる細菌と遺伝子とを適切に組み合わせて用いること（例えば，グラム陰性細菌由来の水銀耐性遺伝子を用いて宿主大腸菌かPseudomonas属細菌を育種する等）が重要と考えられる。環境浄化に用いる微生物の生存性や活性の保存とともに,これらの検討が今後の研究課題といえる。
訪
結
本研究を進めるに当たり，B. cereus RC607株を譲渡下さいましたイリノイ大学シカゴ校医学部微生物学免疫学科のSimon Silver教授およびB. cereus VKM684株を譲渡下さいましたロシア科学アカデミーのElena S. Bogdanova博士に深く感謝申し上げます。また，本研究は日本学術振興会(JSPS)の平成13年度および平成14年度の科学研究費による助成を受けてなされたことを付記します。
文
藍
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