山本大介・李載旼・畠山正統・大石陸生Daisuke S. YAMAMOTO '', Jae Min LEE ®, Masatsugu HATAKEYAMA ® and Kugao OISHI 1.3 : Cloning and characterization of decapentaplegic cDNA in the sawfly, Athalia rosae ruficornis (Hymenoptera)* 11 Department of Biology, Graduate School of Science and Technology, Kobe University, Nada, Kobe, Hyogo 657-8501, Japan 21 Bioengineering Department, National Institute of Bioscience and Human-Technology, Tsukuba, Ibaraki 305–8566, Japan 89 Department of Biology, Faculty of Science, Kobe University, Nada, Kobe, Hyogo 657–8501, Japan Decapentaplegic  (DPP) タンパク質はTGF- βスーパーファミリーの一つであり、同じTGF- βスーパーファミリーの一つであるBMP-4 (Bone morphogenetic protein-4)タンパク質とも高い相同性がみられ、decapentaplegic (dpp)豊伝子のホモログは生物種間で広く保存されている(Hogan et al. , 1994)。キイロショウジョウバエではdppは背腹輪の決定など形態形成に関る遺伝子であることが知られている(Podos and Ferguson, 1999)。現在、昆虫でdpp cDNAの全長がクローニングされているのは双翅目のショウジョウバエ粋４種、鞘翅目のコクヌストモドキTribolium  castaneumの計5種のみである。膜翅目昆虫であるカプラハバチAthalia rosae ruficomisは人為的に単為発生を開始させることができるため、すべての発生段階を通して同一ステージ（胚、幼虫、麹、成虫）の雄を一度に大量に得ることができ（Sawa and Oishi, 1989)、時期特典的な遺伝子の発現の解析を行うためには都合がよい。そこで、われわれはカプラハバチにおけるdppの発現機構とその機能を調べるためにカプラハバチのdpp cDNAのクローニングを行った。最初に、これまでに知られている昆虫のdppでcDNAの全長がクローニングされているうちの３種とcDNAの3’来端のみクローニングされている２種の計５種のエクソン中でよく保存されている領域をもとにプライマーを設計し、カプラハバチのゲノムDNAを練型にPCRを行ったところ、330 bpの断片を得た。この断片の塩蒸配列について相同性検索を行ったところ、既知の昆虫のdppと高い相同性があった。つぎに、dpp mRNAが発現していると予想される発生開始後24時間（細胞性胞蒸期）の胚、約7,000個体からpoly（A）* RNAを抽出・精製し、アダプター結合二本鎮cDNAライプラリーを作製した。先に得られた330 bpの断片をもとにしてプライマーを設計し、cDNAライプラリーを鋳型に用いてRACE  (Rapid amplification of cDNA ends）法を行い、３’末端にpoly（A） +配列をもつdbb cDNA (1,512 bp)の断片をクローニングした。クローニングしたカプラハバチのdpp cDNAには翻訳開始メチオニンから始まる395アミノ酸からなる単一のオープンリーディングフレームがあった。このDNA断片には一般的なpoly（A）付加シグナルであるAATAAAという配列はもたないが、コクヌストモドキのdppについて報告されているpoly（A）付加シグナルと同様のAATATAという配列（Sanchez-Salazar et al. , 1996）が存在した。カプラハバチのdppがコードするアミノ酸配列には今までに知られているDPPやBMP-4と同様に、シグナル配列、プロドメイン配列、マチュアドメイン配列と呼ばれるアミノ酸領域（Hogan et al. , 1994）をもっていた。さらにDPPの機能に必要とされるマチュアドメイン配列中の７個のシステイン残悲の位置が保存されていた(Fig. 1)。以上のことから今回クローニングした配列はカプラハパチdppであり、モルフォゲンとして働くDPPタンパク質としての機能をもっていると考えられる。今後は発生段階を通してのdppの発現時期の解析およびカプラハバチにおけるdφの機能解析を行いたい。
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IPG-TSENSAFRFLFNLSSIPENEVISSAELRLFREQVQQQPD-----NERGFHRINIYEVMKPPAEVV RNIQNPSQHYGLLVEVNGAKTRK---NEHVRLRR-SAGEDEESWTANRPFLFTYTDDGRNEWSSAE0ILERRARRATLR-KN- RNLASPORNYGLLVEVRTVRSLKPAPHHVRLRR-SADEAHERNOHKOPLLFTYTDDGRHKARSTRDVSGGEGGGKGGRHKRHARRPTRROHDDTCRRH 490 RNMQDPKTNHGILTVVYSIGAKKSPPEKHLRLRR---DTAPPQNYQHQPLLFTYTDDGXNQQRTGTELT---------K4RPKRQSSRR-HROLKDPCRRR 274 RNTQEKRSHHGLAVEVVQNORNPVQKGRHARVSRSVHPLPNEERDHVRPLLVTFGHDGKSHPLT- RNTRDKQINHGLAIEVIHLNOTKTHOSKHVRISRSLLPGEDADNSQMRPLLITFSHDGRGHALT---------RRSKRSPK-----QQRPROKKHCRRH 303 RNTREKQPHYGLATEVTHLHQTRTHQOJHVRISR-SLPQ6SGNNAQLRPLLVTFCHDGRCHALT- 395 588 372 489 480 408 Fig. 1