供田　洋洋北里研究所・北里大学薬学部低・中分子創薬講座Key words :非結核性抗酸菌症，天然物，低分子化合物， Mycobacterium avium complex， MAC症
格 官
非結核性抗酸菌（NTM）症は、結核菌以外の抗酸菌により引き起こされる感染症であり、近年世界的にその蔓延が問題となっている。 NTM症のうち、肺に感染した肺NTM症がその80％を占め、重症化しやすく、 10年生存率は20 ～50％程度である[1]。現在NTM症は、公衆衛生上重要なアンメットメディカルニーズの高い感染症として認識されている。NTM症治療には、リファンピシン（RFP)、クラリスロマイシン（CAM)、エタンプトール（EB)など既存の抗結核薬による多剤併用療法がとられているが、1年以上の長期投与の必要性、低い治療効果、また耐性菌出現頻度の増加から、世界レベルで第たな治療薬の開発が求められている。NTM症はアジア人に特に多いことが報告されており［2］、年間の新規罹患者数は日本、アメリカ、EUでそれぞれ約45,000人、30,000人、5,000人であり［3］、日本が最も多いことから、我が国で新たなNTM症治療薬の開発を行う意義は大きい。そこで我々は微生物培養液から新規NTM 症治療薬候補の発見を目的に、スクリーニングの実施及び、以前に発見した創薬シーズと期待する新規 OPMA物質の各種評価を行った。
方法および結果
1. 抗NTM活性物質のスクリーニング
微生物資源は日本各地の土壌及び海洋由来サンプルから分離した放線菌及び真菌を用いた。各微生物の培養液をEtOH抽出し調製した培養抽出液をスクリーニングサンプルとした。抗NTM活性の評価にはMAC症起因菌(Mycobacterium aviumとM. intracellulare) と最も毒性の強いM. abscessusの３種を検定菌とした微量液体希釈法により評価した［4,  5］。本研究期間中に新たに放線菌培養液2,528サンプル及び真菌培養液1,356サンプル、合計3,884サンプルをスクリーニングし、NTMに選択的な抗菌活性を示し、RFP、CAMおよびEBに両性なM. aviumに対しても抗菌活性を示したサンプルは37サンプルであった（表1)。これまでにスクリーニングにより選択した放線菌培養液中からはnicrophorusamideAやtoyocamycin等の既知化合物の他、Streptomycessp. KKTA-0263株の培養液中より新規物質としてkimidinomycinと命名した38員環マクロライド系抗生物質を1成分取得した[6]。真菌からは既知化合物 helvolic acidの他、新規性の高い物質を1成分取得した（図1)。
性を示さなかったサンプル。3次通過基準は薬剤価性 M. aviumに生育阻害活性を示したサンプル。 Kimidinomycin, nicrophorusamide A及びtoyocamycinは放線菌、 helvolic acidは真菌の培養液中より単離した。
2. KKKTA-0263株の培養及びkimidinomycinの単離精製
放線菌 Streptomyces sp. KKTA-0263 株は千葉県君津市の土壌より分離された放線菌である。ISP2寒天培地上に生育したKKTA-0263株のコロニーを可溶性でんぷんを主成分にした種塔地10 mLに植菌し、27℃で3日間浸透培養した。その後、同一の培地組成の生産塔地100 mLに種塔地から1％植菌し、27℃で７日間振濃培養を行い、合計1.0 Lの培養液を得た。取得した培養液に等量のEtOHを加え抽出した後、フィルター濾過を行い、菌体を除去して培養抽出液を得た。培養抽出液からEtOHを留去し、HP20樹脂50 mLに吸着させ、0％、50％、100％MeOH (各150 mL)で溶出し、MeOH 100％溶出画分をロータリーエバポレーターで乾固させ、233 mg の粗精製物を得た。分取HPLC (C18カラムi.d.20×250mm、0.05% TFA入40～60％ CH 3 CN/H 2 O、50分gradient条件）によりkimidinomycin を分取し、凍結乾燥を行い最終的に21 mgのkimidinomycinを取得した[6]。
3.新規OPMA物質の創薬を目指した各種評価
当研究室で2017年に発見した新規抗MAC活性物質であるOPMA物質を用いて各種評価を行った。まず、研究分担者の長光らによりOPMA物質の全合成が達成され、全合成及び半合成によりOPMA類緑体８成分を取得し抗MAC活性評価を行った結果、OPMA物質よりも優れた類緑体は得られなかったため、以降の評価にはOPMA物質を用いた。図2. M. smegmatis感染カイコモデルを用いた OPMA物質の延命効果■ :生理食塩水のみを注入したカイコ、◆ : M. smegmatis (2.5×10 7 CFU/larva)のみ、□ : M. smegmatis +OPMA 3.12 μ g/larva、 ● : M. smegmatis +OPMA 12.5 μ g/larva、 ▲: M. smegmatis  +OPMA 50 μ g/larva。 M. aviumではカイコが感染死しないためM. smegmatisを用いた。 In vivoでの治療効果をアカデミア研究室でも簡易的に評価できる方法として、カイコを用いたNTM感染モデル[4, 7]を開発してきた。すなわち、2.0ｇまで飼育した５齢虫のカイコの背脈管に滅菌シリンジを用いて M. smegmatis (2.5×10 7  CFU/larva、n＝5)を注入後、37℃で飼育することによりカイコは43時間後に全て感染死した。この条件下、M.smegmatis感染直後にOPMA物質を背脈管より投与し、経時的にカイコ生存数をカウントした（図2)。その結果、OPMA物質を投与したカイコは、用量依存的に延命され、50 μ g/larva投与群では最大12時間以上の延命効果を示した。このようにOPMA物質はより高次の動物実験でも治療効果を示すことが期待される。次にOPMA物質の作用機序を明らかとするために、放射標識前駆体の取り込みに対する影響を評価した。すなわち、 OPMA物質の存在下、培養開始時に放射標識前駆体である[³H]チミジン、[³H]ウリジン、[³H] L-ロイシンおよび[³H] N-アセチルグルコサミンを与え、これらの高分子画分を経時的に回収し液体シンチレーションカウンタで測定することにより、DNA、RNA、タンパク質、細胞壁生合成に対するOPMA物質の影響を調べた。その結果、OPMA物質は[³H]チミジンおよび[³H] L-ロイシンの取り込みを強力に阻害した（図3)。図3. OPMA物質の放射標識前駆体の取り込みに対する影響M. aviumが最小培地では生育しなかったため、M. smegmatisを用いた。Ｔ : [³H]チミジン、U : [³H]ウリジン、lle : [³H]L-ロイシン、加えて、半合成により取得したビオチン標識化 OPMA 物質を用いてプルダウンアッセイを行った。すなわち、 M. avium又はM. smegmatisを液体培養後、遠心分離により菌体を回収し、超音波破砕によりライセートを調製した。ビオチン標識化OPMA物質とストレプトアビジンピーズを反応させ、ライセートとインキュベートした。その後ビーズを回収し、結合タンパク質をOPMA物質で競合させ溶出した。溶出液を電気泳動し結合タンパク質を分離した。その結果OPMA物質に特異的に結合するタンパク質として4種を同定した。さらに、OPMA物質に面排なM. aviumを作製し、遺伝子変異部位を調べることで薬剤標的を明らかにしようと試みた。しかし、MICの2倍量のOPMA物質を含んだ寒天培地にM. aviumを塗布してもコロニーを得ることが出来なかった。そこでMICの1／16倍量のOPMA物質を含んだ液体培地で培養し、徐々にOPMA物質の濃度を上げていくことで而挫菌の取得を試みた。最終的に８倍画性菌を３株取得し、得られた耐性菌のゲノム解析を行うことで３株に共通して見られた変異箇所を1箇所同定した。スクリーニングで、M. aviumの薬剤師批性菌にも有効なサンプルは真菌由来のものが多かった理由として、CAMやRFPは放線菌由来の杭生物質を泉適化したものであり、放線菌の生産する活性物質の多くは、CAMやRFPと関連する化合物であり、その標的も同じである可能性が高く、従って耐性菌には効果を示さなかったと推定される。カイコを宿主としたNTM感染モデルを用いたOPMA物質の評価の結果、カイコのNTM感染死を延命させた。このことはOPMA物質はさらに高次のマウスを宿主としたin vivoでのNTM感染系でも、治療効果を示すことを期待させる。また、毒性という観点からも、OPMA物質投与により、カイコが早期に死亡することはなく、少なくとも60時間まではカイコに対して毒性を示さない。これらの結果からOPMA物質は安全性の高い化合物であることが考えられた。現在、臨床分離された複数の薬剤に耐性のM.avium株に対するOPMA物質の効果や、細胞内へのM.aviumの持続感染の評価系でのOPMA物質の有効性を研究中である。 OPMA物質の放射標識前駆体の取り込みに対する影響を評価した結果、チミジンとL-ロイシンの取り込みを強力に阻害したことから、OPMA物質はDNA合成とタンパク質合成に影響を与えていることが推定され、複数の標的を持つことが考えられた。そのため、両性菌の取得実験において、両性菌がほとんど出現しなかったのではないかと考えられる。今後、プルダウンアッセイの結果や、両性菌の変異箇所の結果で得られた標的候補を精査することで、OPMA物質の作用機序を明らかとしていきたい。
共同研究者
本研究の共同研究者は、北里大学大学院東学研究科微生物薬品化学の大城太一教授、同院薬品製造化学教室の長光亨教授である。
文教
1) Namkoong H, Kurashima A, Morimoto K, Hoshino Y, Hasegawa N, Ato M, Mitarai S. Epidemiology of pulmonary nontuberculous mycobacterial disease, Japan. Emerg Infect Dis. 2016 Jun:22(6):1116-7. doi: 10.3201/eid2206.151086. PMID: 27191735; PMCID: PMC4880076. 2) 3) 4) 5) Adjemian J, Olivier KN, Seitz AE, Holland SM, Prevots DR. Prevalence of nontuberculous mycobacterial lung disease in U.S. Medicare beneficiaries. Am J Respir Crit Care Med. 2012 Apr 15;185(8):881-6. doi: 10.1164/rccm.20111-2016OC. Epub 2012 Feb 3. PMID: 22312016; PMCID: PMC3360574. Timmins GS. What are the challenges in commercial non-tuberculous mycobacteria (NTM) drug discovery and Expert Drug Discov. Jan;15(1):7-9. forward? 2020 Opin how should we move doi 10.1080/17460441.2020.1673362. Epub 2019 Sep 30. PMID: 31566439. Hosoda K, Koyama N, Kanamoto A, Tomoda H. Discovery of nosiheptide, griseoviridin, and etamycin as potent anti-mycobacterial agents against Mycobacterium avium complex. Molecules. 2019 Apr 16;24(8):1495. doi: 10.3390/molecules24081495. PMID: 30995807; PMCID: PMC6514863. Hosoda K, Koyama N, Hamamoto H, Yagi A, Uchida R, Kanamoto A, Tomoda H. Evaluation of anti- mycobacterial compounds in a silkworm infection model with Mycobacteroides abscessus. Molecules. 2020 Oct 27;25(21):4971. doi: 10.3390/molecules25214971. PMID: 33121091; PMCID: PMC7663337. 6) Hikima A, Asamizu S, Onaka H, Zhang H, Tomoda H, Koyama N. Kimidinomycin, a new antibiotic against Mycobacterium avium complex, produced by Streptomyces sp. KKTA-0263. J Antibiot (Tokyo). 2022 Feb;75(2):72-76. doi: 10.1038/s41429-021-00494-3. Epub 2021 Dec 23. PMID: 34949834. 7) Yagi A, Uchida R, Hamamoto H, Sekimizu K, Kimura KI, Tomoda H. Anti-mycobacterium activity of microbial peptides in a silkworm infection model with Mycobacterium smegmatis. J Antibiot (Tokyo). 2017 May;70(5):685-690. doi: 10.1038/ja.2017.23. PMID: 28446822.