マニュアル(第５版) 1010-1805
I 製品説明
アガラーゼは、融解させた(ゾル化させた)アガロースをneoagaro -oligosaccharidesに分解する酵素で、分解後のアガロース溶液は再びゲル化しなくなります。この性質を利用し、アガラーゼはアガロースゲルからの核酸抽出に応用されています。アガラーゼによる核酸抽出のメリットは、①操作が簡単、②有害な試薬を使用しない、③大きなDNA断片でも比較的傷つけることなく回収できる、ことが挙げられます。本品は、耐熱性微生物に由来するアガラーゼであり、従来のアガラーゼと比較して極めて耐熱性に優れています。
＜特長＞
●簡単＆短時間な操作●至適反応温度が高く、スタンダードタイプのアガロースにも使用可能。 ●ゲル分解液をそのままクローニングや制限酵素反応等に使用可能。 ●大きなDNA断片もせん断の影響が少なく回収可能。本酵素は国立研究開発法人海洋研究開発機構、海洋・極限環境生物圏領域における研究により、有人潜水闘査船「しんかい6500」を用いて深海から採取された耐熱性微生物に由来しています。詳しくは、シーエムシー出版『酵素開発・利用の最新技術』第5章深海微生物からの有用酵素の探索p.41-52(著者:秦田勇二、大田ゆかり、日高祐子、能木裕一）をご参照下さい。提供: (国研)海洋研究開免機構
製品内容
II
構成： Thermostable β -Agarase （30 units / 300 units） ×   1本活性: 1 unit/ μl形状: 50 mmol/l NaCl, 20 mmol/l Tris-HCl (pH7.5)単位の定義: 1unitは、60℃で1分間当たり1 μmolのD-ガラクト一スに相当する量の還元糖をアガロースゲルから生成する酵素活性とする。
■保存条件
保存温度: 冷蔵(2～10℃)
IVプロトコール
基本プロトコール①　切り出したアガロースゲルブロック200 mg (~200 μl)をチューブに入れる。 ↓ ② 5～10分間加熱し、アガロースゲルを完全に融解する。 1 1 ③アガロースゲルが融解したことを確認し、50～65℃の恒温橋に移す(30～60秒ほど放置し冷ます)。* ④ 6 units (6 μl)のThermostable β - Agaraseを添加し、混和する。 4 ⑤ 50～65℃で5～10分間保温し、アガロースを分解する。 5 1 ⑥氷上に静置し、再凝固しないことを確認する。 6 (必要に応じてアルコール沈殿・精製を行う) 7
*1アガロースやバッファーの種類によってゲル融点は異なる。
*2  Thermostable β - Agaraseは50～60℃で最大活性を示す（左図）。また、Thermostable  β -Agaraseは70°Cで30分間加温しても10%以上活性が維持される(右図:矢印)。 *3 低融点タイプアガロース(ゲル融点65℃以下、TAE使用)の場合、このステップ②・③を省くことができる。 *4 使用する酵素量は減らすことができる(英面VI Q&A参照)。 *5 アガロースゲルブロックの量や容器の大きさ、Thermostable β - Agaraseの添加量によって反応時間が異なる。 *6 氷冷で再凝固しなければアガロースが完全に分解されたと判断できる。回収したDNA溶液を電気泳動したい場合、酵素を熱処理(90℃、5分間）で失活させるか、フェノール・クロロホルム処理をしてから用いる。 *7 未分解ゲルが残ってしまった場合、遠心分離により除去するか、再度プロトコールのはじめから反応を行う。必要であればアルコール沈殿・精製を行う。トラブルと対策
未分解ゲルが残る
Thermostable  β - Agaraseの反応が不十分であることが予想される。 1.基本ブロトコールのステップ②(ゲル溶解反応)で、ゲルが完全に融解していることをピペッティングなどで確認をしてから Thermostable  β - Agaraseを添加する。 2. Thermostable β - Agaraseの添加量を増やす。 3. Thermostable β -Agaraseを添加した後のゲル分解反応時間をのばす。回収したDNAの続度が低い高分子量のアガロース分解物が溶液中に残存していることが予想される。 1.完全にゲルを分解する。 2. 遠心分離により未分解物を沈殿させ、上清をDNA 洛液として使用する。 3.アルコール沈殿・精製を行う。さらに純度を高めたい場合はフェノール・クロロホルム処理を行う。回収したDNAを電気泳動するとウェル周辺のゲルが薄くなるThermostable β -Agaraseの活性が残存していることが予想される。 1. 90°C以上で5分以上の熱処理をすることで失活させる。 2.フェノール・クロロホルム処理を行う。 VI Q & A
Q1.使用する酵素量は減らすことができますか？
A1. Thermostable  β - Agaraseの基本プロトコールで推奨する酵素量は、 200 mgのゲルブロックに対して６μl（６ units）ですが、ゲルの濃度や反応
Q2. DNAの回収率はどのくらいですか？ A2.原理上、切り出したゲル中のDNAは全量回収されます。 Q3. 反応液の最終溶液量はどれくらいになりますか？ A3. 200 mgのアガロースゲルを用いた場合、最終落液量は約200 μlになります。
Q4.反応液を濃縮するにはどうすればよいですか？
A4.アルコール沈殿を行なって下さい。例）得られたDNA溶液(ゲル分解液)に対して0.1倍量の3 mol/l Sodium acetateを添加する（必要に応じて共沈剤のEthachinmateも添加し混合する)。0.8～1倍量のイソプロパノール（または2.5倍量のエタノール)を添加して混合し、室温で2～10分間静置後、遠心分離(12K×g, 10分間)して上清を除去する。沈殿を残したチューブに70%エタノールを1 ml程度加え、遠心分離(12K×g, 5分間)して上清を除去する。沈殿を室温で15分間放置して乾燥後、適当量のTEバッファーにて溶解する。 Q5. 分子量の大きいDNA断片を回収することができますか？ A5. Thermostable  β - Agaraseは大きなDNA断片も物理的なせん断の少ない状態で回収することができることを確認しております。 (数十bp ～ 166 kbpのDNAフラグメントを回収して確認）ただし、取り扱うDNAのサイズが大きくなればなる程、アガロースゲル電気泳動での分離が困難になり、ピペッティング等の操作でもせん断されやすくなります。
Q6. 反応液はPCR反応に使用できますか？
A6.  PCR反応液に対し、Thermostable  β -Agaraseを用いたアガロース分解溶液の添加量を1/8倍量以下にすることで使用できることを確認しております。例） PCR反応液の容量が20 μlであれば、アガロース分解溶液の添加量を2.5 µl以下にする。
Q7.反応液はクローニングに使用できますか？
A7.  Thermostable  β -Agaraseで回収したDNA落液を、そのままライゲーション反応と形質転換に使用できることを確認しております。 (Ligation  - Convenience Kit とECOS™ Competent E. coli DH5 αを使用して確認）
Q8.反応液は転写反応に使用できますか？
A8. Thermostable  β - Agaraseで回収したDNA落液を、そのまま転写反応に使用できることを確認しております。 ( CUGA 7® in vitro Transcription Kitを使用して確認）
Q9. 反応液はシークエンスに使用できますか？
A9. Thermostable  β - Agaraseで回収したDNA落液を、そのままシークエンスに使用できることを確認しております。 (ABI社377シーケンサーを使用して確認）ただし高濃度・高分子量のアガロース分解物が混入すると、解析機器の機種によっては故障の原因につながる可能性があります。高分子量のアガロースゲル分解物は遠心分離やフェノール・クロロホルム処理で除くことができます。 Q10. 変性アガロースゲルからのRNA抽出に使用できますか？ A10.使用できますが、変性アガロースゲルブロックに含まれるホルムアルデヒドが酵素活性を阻害するため、添加する酵素量を増やす必要があります。例） 100 mgの1.5%アガロースS変性ゲルブロックを90℃、5分間でゲルを融解した後、8 μl (8 units)の酵素を添加し、60 ℃、10分間の反応でアガロースを分解する。実験例など詳細についてはニッポンジーンのホームページをご覧下さい。株式会社ニッポンジーン 遺伝子工学研究用試薬https://www.nippongene.com/siyaku/
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(生意)
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