静岡県立御殿場南高等学校生物部2年 今田裕貴 市来隼一  杉山大知  加藤遼馬他9名
1研究の動機
本研究は地球環境問題に興味を持ったことがきっかけである。中でも私たちの身の回りにあふれているプラスチックは有限の資源である石油からできおり、容易に分解されないことから環境に悪影響を与えることがある。そこで私たちは生分解性プラスチックに着目した。生分解性プラスチックは微生物に分解されるため、ケミカルサイクルが可能である。さらに、植物由来の原料を利用した場合、分解時に放出される二酸化炭素は植物の光合成によって吸収したものが大気中に戻ると考えることができるため、空気中の二酸化炭素は増加しない。これをカーボンニュートラルという。このように生分解性プラスチックは通常のプラスチックより環境への影響が少ない。昨年は、身近な食物から生分解性プラスチックの作成を試みた。しかし、食べられる物を利用するのはもったいないと考え、発酵によって得られる乳酸を原料としてポリ乳酸（バイオプラスチック）を作成し、廃棄されるものを利用したケミカルサイクルの完成を目指すことにした。
2ポリ乳酸のケミカルサイクル（化学物質の循環）について
植物を食物として利用した後に生じた廃棄物を乳酸発酵させ、発酵液から乳酸を分離し、ポリ乳酸を作成する。使用後に生分解もしくは焼却処分して生じた二酸化炭素は植物が光合成により固定したものなので、地上の炭素の絶対量は変わらず、植物によって再び吸収され光合成に利用される。この一連の地球環境に配慮した循環システムをケミカルサイクルという（図１)。
３　昨年の研究
昨年は、試薬として購入した乳酸から作成したポリ乳酸が環境中で生分解されることを確認した。図1   乳酸のケミカルサイクルまた、ポリ乳酸の原料の乳酸を生成する方法として、廃棄物である米のとぎ汁を発酵させると発酵液中に乳酸が生成されることをHPLC (高速液体クロマトグラフィー）を用いて確認できた。HPLC は横浜薬科大学 生化学研究室にてお借りした。
4 今年の研究
( 1 )乳酸発酵により原料となる乳酸を作成し、発酵液から分離してポリ乳酸を作成することで、乳酸のケミカルサイクルを完成させる。 （２）　研究の流れ今年は、昨年使用した米のとぎ汁より回収や扱いが容易で、産業廃棄物でもある「米ぬか」を使用することにした。米ぬかを選んだのは、ぬか漬けの酸味が乳酸によるものだということを知り、乳酸が得やすいと考えたからである。実験は次の３つに分けて行った。実験1 　ポリ乳酸の作成方法の改良と生分解性の検証実験2 　米ぬかの水溶液から乳酸を効率よく作成する方法の探索実験3　米ぬか発酵液から乳酸を取り出す方法の探索( 3 )    実験1   ポリ乳酸の作成方法の改良と生分解性の検証昨年、試薬の乳酸から作成したポリ乳酸は加水分解を起こしやすく、時間を置くと表面がベたついてしまった。その点を改良するため触媒の添加により固化の促進を試みた。ア 実験１の目的触媒を添加することにより、ポリ乳酸の固化を促進し、作成したポリ乳酸の生分解性を確認する。イ　方法乳酸10mLをアルミカップに取り、触媒としてエチルヘキサン酸すず( II )をそれぞれ1.2.3滴加えた。ホットプレートで段階的に加熱し、重合させた。加熱温度と時間は130℃で2時間、160℃で2時間、220℃で18時間、合計22時間である。作成したポリ乳酸を花壇の土に埋めた。
ウ結果
加熱直後は触媒１滴２滴３滴すべて固化した。図２では割れたポリ乳酸の縁が角張っている様子がわかる。4週間後には触媒１滴のものは表面が加水分解を起こし、べたついていた。触媒3滴ものは、べたつかず固く、縁は尖ったままだった。土に埋め、4週間たったものは、触媒１滴２滴３滴すべて、少しべたべたしたものが残っていたが、ほとんど溶けてなくなっていた（図３）。図2  加熱蛋合直後のポリ乳酸  左から触媒1滴、2滴、3滴H   考察ポリ乳酸の加水分解を防ぐには、エチルヘキサン酸すず(II)は触媒として有効であると考えられる。また、触媒を添加しても生分解性が失われないことを確認できた。 （4） 実験2 米ぬかの水溶液から乳酸を効率よく作成する方法の探索ア　実験２の目的ポリ乳酸の原料となる乳酸を効率よく生成する方法を探索するイ　方法（ア） 直接培養法初めに、ペットボトルに米ぬかと純水を入れて発酵させた。 （イ）基質液交換法直接培養法では発酵液の分離が困難であったため、米ぬかの発酵液から乳酸菌を培養して(図4）乳酸菌ビーズを作り、バイオリアクターとして乳酸発酵を行った。乳酸菌ビーズはアルコール発酵に酵母菌を封入したアルギン酸ナトリウムが利用されることを応用して作成した。三角フラスコに乳酸菌ビーズを入れ、基質液として5％グルコース水溶液、または米ぬか水溶液をろ過した液をそれぞれ200mLずつ加えて４日間培養した（図５）。乳酸菌ビーズが繰り返し使用できることを確認するため同じ乳酸菌ビーズを使い、基質液は4回入れ替えた。
（ウ） 連続滴下法
直接培養法では、発酵液の分離は容易であったが、4日ごとに基質を交換する必要がある。この点を改良したのが連続滴下法である。この方法では乳酸菌ビーズをつめた注射器を作成しバイオリアクターとして利用した。滴下装置はペットボトルの栓にガラス管を付け、ローラークランプを通したシリコンチュープをつなげた。チューブにバイオリアクターをつなげ、注射器から出てくる発酵液を集めた（図６，７)。ローラークランプで滴下速度を調節し1滴／1秒, 1滴／15秒の速さで基質液を滴下した。予備実験で34滴で1 mLだったので1秒1滴では1 mL流すのに34秒、15秒1滴では1 mL流すのに8分30秒かかる。図6
ウ   ポロ果
（ア） 直接塔養法それぞれのペットボトル内の培養液のpHは表1のようになった。ボトルによりpHが下がる様子に差があったが、25日目にはほとんど差はなくなった。発酵液と残った米ぬかの分離は、ろ紙を用いたろ過では完全に分離できなかった。
（イ） 基質液交換法
三角フラスコ内の培養液それぞれのpHは表２のようになった。グルコースは４回とも４日目にはpH=4、米ぬかの水溶液は４回の実験でそれぞれpH＝5～7となった。発酵液の分雕は容易であったが、4日ごとに基質を交換する必要がある。表1   発酵液のpHの変化

（ウ） 連続適下法
グルコース液の場合、1滴／1秒滴下の発酵液はpH6～7、1滴／15秒滴下の発酵液はpH4.5なった。米ぬか水溶液は1滴／15秒滴下の発酵液はpH=5になった。発酵液の分離は容易であり、基質を交換する必要がないため、最も効率の良い方法であるが、基質液を200mL滴下するのに28時間かかり、途中でチューブ内にカビが生えてしまった。 H  考察乳酸菌ビーズは基質液交換法で繰り返し使用しても毎回pH=4の発酵液が得られたことから、バイオリアクターとして利用できることがわかった。基質液交換法では米ぬか液の発酵液のp Hは基質を交換するごとに異なり、連続滴下法でもp H = 4までは下がらなかった。これは米ぬかの中に含まれている乳酸発酵の基質となる物質の含有量が一定ではないことが考えられる。 3つの作成方法のうち、バイオリアクターを用いた連続滴下法が最も効率よく乳酸を得られる可能性がある。ただし、シリコンチュープ内にカビが生えたり、温度条件を一定に保つことが難しい点など装置には改良の余地がある（５）　実験3　米ぬか発酵液から乳酸を取り出す方法の探索ア　実験３の目的米ぬかの発酵液から純粋な乳酸を取り出す方法を探る。イ　方法(ア)    乳酸（カルボン酸）と、アルコール類(ヒドロキシ基)を濃硫酸を触媒にして加数し、脱水縮合させてエステルを生成する。 (イ)アルコール類の選択については分留は沸点122℃の乳酸と沸点の差が大きいほうが効果的であると考え、エタノールとプロパノールを用いたが、エステル化が十分に起こらなかったため、プタノールとペンタノールを追加した（表３）。 (ウ)　エステル化により油層には乳酸エステルが移行し、水層には発酵残渣が残る。 (エ）油層だけを取り出し、純水と濃硫酸を加えて加水分解する。 (オ) 加水分解したものを分留し、純粋な乳酸を得る。表３　炭茶数２～５のアルコールとエステルの沸点
ウ  結果アルコールの種類とエステル化、油層の分離、加水分解、分留について表４にまとめた
エ　追加実験　発酵液のエステルの分析今回の実験では、エステルの生成の確認は油層ができたかどうかと、純乳酸のエステルのにおいを基準に判断した。加水分解の確認は、油層がなくなったことを基準とした。本当にエステル化ができているのか、確認するために、液体クロマトグラフィー／飛行時間型分離装置(TOF  MS)により発酵液のエステルの分析を行った。TOF  MSは国立沼津高専でお借りし、試料の分析をしていただいた。試薬の乳酸で作成したエステルでは、乳酸エステルの分子量である147にピークがあり、自分たちの方法でエステルが生成できていたことが確認できた。発酵液をブタノールでエステル化したものを分析した結果は分子量147も検出されたが不純物も多く検出され、エステル化する前の段階で不純物が多く含まれていたことが考えられる。オ　考察エタノール、プロパノールは乳酸と沸点の差が大きいので、アルコールを先に気化させることで乳酸が残ると考えた。しかし、エステル化はエステル臭がする程度で反応が進まず、乳酸は得られなかった。これは炭素数の小さいアルコールは水溶性のため、脱水縮合（エステル化）と加水分解が可逆的に起こると考えられ、水溶性のエタノール、プロパノールは生成したエステルが加水分解して元に戻ってしまったためと推測される。エステル化と加水分解ができたので、乳酸を分離するためにはブタノールが最も有力な物質であると考えられる。乳酸プチルの生成は分析機器を用いて確認できた。米ぬか発酵液から乳酸プチルを得ることができたことから、米ぬかは乳酸ケミカルサイクルに有効な物質であることがわかった。
5   今後の課題
グルコースと米ぬか液から生成される乳酸を定量的に測定して比較し、米ぬかの基質としての有効性を検証する。発酵液から純粋な乳酸を得るために、エステル化した油層の加水分解を行う前に、不純物を取り除く実験操作を行う。方法としてはシリコンオイルを用いた蒸留を考えていろ。最終的には発酵液から分離した乳酸からポリ乳酸を作成して、乳酸ケミカルサイクルを完成させる。
6 参考文献
公開特許公報2002-128727   乳酸の蒸留精製方法2007–114017　乳酸発酵液からの乳酸成分の分離方法および分離装置入門　生分解性プラスチック　生分解性プラスチック研究会編尿茶を用いた乳酸樹脂の分解処理中村健二（技術研究所）