中村孝司北海道大学大学院薬学研究院薬剤分子設計学研究室Key words :ナノDDS、脂質ナノ粒子、がん免疫療法、腫瘍血管内皮
箱 青
最近の免疫チェックポイント阻害療法の成功により、がん治療における免疫療法の有用性が証明された。免疫システムによるがん細胞の排除は「がん免疫サイクル」と呼ばれる時空間的な一連のステップで行われる［1］。腫瘍組織において樹伏細胞ががん抗原を捕食、リンバ節へと移行し、T細胞を活性化する。活性化したT細胞は血管を介して腫瘍内へと浸潤し、がん細胞を排除する。ところが、がん患者ではこのサイクルの一部もしくは複数のステップが阻害されている。 Programmed cell death 1  (PD-1)抗体などは腫瘍内に浸潤したT細胞が、がん細胞に発現するPD-1リガンド(PD-L1）を介して抑制されているのを阻害することでT細胞を再活性化させる。しかしながら、 PD-1抗体が有効な患者は全体の20～30％であり、残りの患者に対する有効性を向上させることが焦点となっている。この治療効果の違いには、腫瘍関連微小環境の免疫ステータスの違いが大きく関連している。免疫細胞が腫瘍内に浸潤しているがプレーキがかかっている腫瘍（hot tumor）と免疫細胞の活性化が起こっていないあるいは免疫細胞が腫瘍内に浸潤できない腫瘍(cold tumor)の２つに大別され[2]、PD-1抗体などはhot tumorに対して有効性を示す。先述した70〜80%のPD-1抗体療法抵抗性の患者のがんの多くはcold tumorであり、cold tumorからhot tumorへ改善することが重要である非常に複複構な機構によりcold tumorが形成されているが、その機構の１つに腫瘍血管内皮細胞(TEC : tumor endothelial cell）による免疫細胞の腫瘍組織への浸潤抑制がある［3］。TEC表面には、免疫細胞の腫瘍組織への浸潤を阻害する分子が発現しており、それらの働きによってcold tumorが形成される。一方でTECは、がん免疫応答を促進する機能も有している。このようにTECは正と負の両面でがん免疫応答に関与していることから、 TECの機能を制御することでcold tumorをhot tumorに変えるだけではなく、がん免疫応答のさらなる増強も期待できる。 TECの様々な機能を制御するためには、低分子阻害剤や中和抗体などの従来の技術を単純に組み合わせるだけでは不可能である。現在のがん免疫療法の開発は、作用の異なる治療法を組み合わせた複合がん免疫療法が主流であるが、薬効の増強に伴い、副作用発現も顕著に増加する。また、低分子阻害剤や中和抗体は全身投与であるため、TECのみを狙うことは困難である。これらを解決するために、本研究ではナノバイオテクノロジーを駆使したキャリア型Drug Delivery System（ナノDDS）を基盤技術とし、TEC標的化能と先述した負の機能の阻害と正の機能の促進を同時に実現する複数の生物活性を有するナノDDSを創製することを最終目的としている。脂質ナノ粒子（LNP : lipid nanoparticle）をベースとし、TEC標的化リガンドを表面に修飾することで細胞塞択性を付与、免疫細胞の浸潤を阻害する分子に対するsiRNAを搭載することで負の機能を阻害、TECのがん免疫応答を強化する分子を搭載することで正の機能を促進させる。我々はLNPを基盤としたがん免疫療法の開発を進めており、抗原やアジュバントを搭載したLNPによるがん免疫応答の促進[4～7]、siRNA搭載LNPによる免疫細胞の機能制御など［8, 9］を報告してきた。さらに、TEC標的化リガンドとしてcyclic RGD（cRGD）ペプチドを用いることでTECへの標的化に成功している［10］。cRGDペプチドはArg-Gly-Asp-D-Phe-Lysからなる環状ペプチドであり、 TEC 表面に特異的に発現しているαν β 3 インテグリンに強い親和性を有している。本報告では、免疫細胞の浸潤を阻害する分子X（標的X）に対するsiRNAを搭載したcRGDペプチド修飾LNP（cRGD-LNP）の構築とTEC株を用いた機能評価、担がんマウスモデルの選定、腫瘍組織における標的遺伝子の抑制効果および抗腫瘍活性の評価を行い、
方　紙
1.  siRNA搭載cRGD-LNPの概製
pH応答性カチオン性脂質YSK05、cholesterol、 1,2-dimirystoyl-sn-glycerol methoxyethyleneglycol 2000 ether (PEG2000-DMG）を含むアルコール溶液（0.4 mL）に対し、siRNAを含むクエン酸酸衝液（0.2 mL）を撹拌下で滴下した。次いで、その混合溶液をクエン酸酸衝衝液（2 mL）に対し、撹拌下で滴下した。PBSを加えて希釈しながら、限外濾過を行い、アルコールをPBSに置換した。その後、cRGDペプチドが結合したN-[N'-(Succinimidyloxy glutaryl) aminopropylpolyoxyethylene  oxycarbonyl]-1,2-distearoyl-sn-glycero-3-  phosphoethanolamine （cRGD-PEG2000- DSPE）を含むクエン酸綾衝液と混合し、60℃で撹拌した。PBSを加えて希釈しながら、限外濾過を行うことでsiRNA搭載cRGD-LNPを調製した。
2.  OSRC-2細胞およびMS-1細胞を用いたaiRNA搭載cRGD-LNPの機能評価
cRGDペプチドのリガンドであるα v βインテグリンを発現している細胞株として、MS-1細胞（マウスTEC）とOSRC-2細胞（ヒト腎がん）を用いた。各細胞に対し、蛍光マーカーであるDiDを修飾したsiRNA搭載cRGD-LNPを作用させ、2.5時間後にフローサイトメーターにより取り込みを評価した。また、MS·1細胞に対してsiRNA搭載cRGD-LNPを作用させ、24時間後に遺伝子ノックダウン効果をRTαPCR法にて解析した。内因性遺伝子として
GAPDHを用いた。
3. 担がんマウスモデルの遺定
B16-F10細胞（マウスメラノ一マ）、CT26細胞（マウス結腸がん）、4T1細胞（マウス乳がん）をマウス皮下に移植し、約500 mm ³に成長した腫瘍を回収した。回収した腫瘍からRNAを抽出し、RTqPCR法にて腫瘍内の標的Xの発現量を比較した。
4.  CT26担がんマウスモデルにおけるsiRNA搭載cRGD-LNPの機能評価
CT26細胞をマウスに皮下移植した。移植から10日後にsiRNA搭載cRGD-LNPを尾静脈内投与し、24時間後に腫瘍を回収した。回収した腫瘍からRNAを抽出し、RTqPCR法にてCD31の遺伝子ノックダウンを評価した。また、CT26細胞をマウスに皮下移植し、７日、11日、15日後にsiRNA搭載cRGD-LNPを尾静脈内投与した。腫瘍体積を測定することにより、抗腫瘍活性を評価した。
結果および考察
1.  siRNA搭載cRGD-LNPの開製および機能評価（in vitro)
我々の以前の報告に基づき、YSK05/cholesterol/ PEG2000-DMG/cRGD-PEG2000-DSPE = 70/30/3/3（mol比）の組成のsiRNA搭載cRGD-LNPを調製した［10］。粒子径およびゼータ電位は100 nm、－23 mVであった。続いて、 TEC標約化リガンドであるcRGDペプチドがTECへの細胞取り込みを促進するかをin vitroの細胞系にて評価した。 DiD標識したsiRNA搭載cRGD-LNPおよびcRGDペプチド未修飾のsiRNA搭載LNPをMS-1細胞とOSRC-2細胞に作用させ、2.5時間後に細胞を回収し、フローサイトメーターを用いて細胞取り込みを解析した。その結果、MS·1細胞およびOSRC·2細胞の両方において、siRNA搭載cRGD·LNPはcRGDペプチド未修飾のsiRNA搭載 LNP と比較して、顕著な細胞取り込みの増加を示した（図 1）。このことから、cRGD ベプチドが機能し、 ανβ 3インテグリンを介した特異的な取り込みが促進されたことが示唆され、siRNA搭載cRGD-LNPの調製に成功した。
2. 担がんマウスモデルの選定
続いて、本研究の戦略を評価するために、担がんマウスモデルの選定を行った。条件として、PD-1抗体療法に抵抗性を示し標的Xの発現が高いこととした。文献情報からPD-1抗体療法に抵抗性を示すモデルとして、B16-F10、 CT26、4T1担がんマウスを選出した。それぞれの細胞をマウス皮下に移植し、500 mm³に成長した腫瘍組織内の標的Ｘの遺伝子発現をRTqPCR法にて評価した。その結果、CT26担がんマウスモデルが最も高く標的Ｘを発現していたことから、CT26担がんマウスをモデルマウスとして選定した。図1.  siRNA搭載cRGD-LNPの細胞取り込み評価MS-1細胞によるsiRNA搭載cRGD-LNPの取り込みを示している（n = 2)。DiDを修飾したsiRNA a)搭載cRGD-LNPをMS 1細胞に作用させ、2.5時間後にフローサイトメーターを用いて解析した。 OSRC-2細胞によるsiRNA搭載cRGD-LNPの取り込みを示している(n＝3)。DiDを修飾したsiRNA b)搭載cRGD-LNPをOSRC-2細胞に作用させ、2.5時間後にフローサイトメーターを用いて解析した。統計処理はunpaired t-testを用いて行った（*P＜0.05)。
CT26担がんマウスを用いたsiRNA搭載cRGD-LNPの機能評価（in vivo)
3.
次に、CT26担がんマウスを用いて、TECにおける遺伝子ノックダウン活性と抗腫瘍活性の評価を行った。CT26細胞の移植から10日後に、血管内皮マーカーであるCD3Iを標的とするsiRNAを搭載したcRGD-LNPを尾静脈内投与し、24時間後に腫瘍組織におけるCD31の遺伝子発現をRTqPCR法を用いて評価した。子想に反して、CD31の遺伝子ノックダウンは全く認められなかった。以前の報告とは使用した担がんマウスモデルが異なったことが原因だと考えられた。そこで、CT26担がんマウスに最適な脂質組成を検討した結果、70%以上の遺伝子ノックダウン活性を示す組成を見出すことに成功した。抗運動騎活性を調べるために、CT26細胞の移植から７日、11日、15日後に標的Xに対するsiRNAを搭載したcRGD-LNPを尾静脈内投与し、腫瘍体積を経時的に測定した。PBS投与群やコントロールsiRNAを搭載したcRGD-LNP投与群では同様の腫瘍増殖を示した（図2)。一方で、標的Xに対するsiRNAを搭載したcRGD-LNP投与群では、初回の投与から腫瘍増殖抑制効果が認められ、終了時点の19日目では有意な腫瘍体積の減少が認められた（図2)。このことから、TECにおける標的Xの阻害が抗腫瘍活性を誘導する可能性が示唆された。図2.  CT26担がんマウスを用いたsiRNA搭載cRGD-LNPの抗腫瘍活性評価CT26細胞の移植から7日、11日、15日後にPBS、コントロールsiRNAもしくは標的Ｘに対するsiRNAを搭載したcRGD-LNPを尾静脈内投与し、腫瘍体積を経時的に測定した（n＝3〜4)。以上の結果から、我々はTECを標的としたナノDDS、cRDG-LNPの開発に成功し、TECに発現する標的XをsiRNAを用いて阻害することにより、抗腫瘍活性を誘導できることを明らかにした。今後は標的Xをノックダウンすることによるがん免疫応答の促進メカニズムの解明とTECのがん免疫応答を強化する分子を送達することで正の機能の促進を行う予定である。本研究は、北海道大学大学院薬学研究院の薬剤分子設計学研究室にて行いました。ご助力頂きました研究室のスタッフならびに学生に厚く御礼申し上げます。 1) 2) 3) 4) Chen DS, Mellman I. Oncology meets immunology: the cancer immunity cycle. Immunity. 2013 Jul 25:39(1):1- 10. PMID: 23890059 DOI: 10.1016/j.immuni.2013.07.012 Sharma P Allison JP. The future of immune checkpoint therapy. Science. 2015 Apr 3:348(6230):56-61. PMID: 25838373 DOI: 10.1126/science.aaa8172 Joyce JA, Fearon DT. T cell exclusion, immune privilege, and the tumor microenvironment. Science. 2015Apr 3;348(6230):74-80. PMID: 25838376 DOI: 10.1126/science.aaa6204 Nakamura T, Moriguchi R, Kogure K, Harashima H. Incorporation of polyinosine-polycytidylic acid enhances cytotoxic T cell activity and antitumor effects by octaarginine modified liposomes encapsulating antigen, but not by octaarginine modified antigen complex. Int J Pharm. 2013 Jan 30;441(1-2):476-81. Epub 2012 Nov 16. PMID: 23159346 DOI: 10.1016/j.ijpharm.2012.11.006. 5) 6) Nakamura T, Yamazaki D, Yamauchi J, Harashima H. The nanoparticulation by octaarginine-modified liposome improves α-galactosylceramide-mediated antitumor therapy via systemic administration. J Control Release. 2013 Oct 28;171(2):216-24. Epub 2013 Jul 13. PMID: 23860186 DOI: 10.1016f5.jconrel.2013.07.004. Nakamura T, Fukiage M, Higuchi M, Nakaya A, Yano I, Miyazaki J, Nishiyama H, Akaza H, Ito T, Hosokawa H, Nakayama T, Harashima H. Nanoparticulation of BCG-CWS for application to bladder cancer therapy. J 28,176:44-53. Feb 24389133 Release. Epub 2013 Control 2014 DOI: Dec 31.  PMID: 10.1016/j.jconrel.2013.12.027. 7) 8) 9) Nakamura T, Miyabe H, Hyodo M, Sato Y, Hayakawa Y, Harashima H. Liposomes loaded with a STING pathway ligand, cyclic di-GMP, enhance cancer immunotherapy against metastatic melanoma. J Control Release. 2015 Oct 28;216:149-57. Epub 2015 Aug 14. PMID: 26282097 DOI: 10.1016/j.jconrel.2015.08.026. Warashina S, Nakamura T, Sato Y, Fujiwara Y, Hyodo M, Hatakeyama H, Harashima H. J Control Release. 2016 Mar 10;225:183-91. Epub 2016 Jan 26. PMID: 26820519 DOI: 10.1016/j.jconrel.2016.01.042. Nakamura T, Kuroi M, Fujiwara Y, Warashina S, Sato Y, Harashima H. Small-sized, stable lipid nanoparticle for the efficient delivery of siRNA to human immune cell lines. Sci Rep. 2016 Nov 28;6:37849. PMID: 27892533 DOI: 10.1038/srep37849. 10)  Sakurai Y, Hatakeyama H, Sato Y, Hyodo M, Akita H, Ohga N, Hida K, Harashima H. RNAi-mediated gene knockdown and anti-angiogenic therapy of RCCs using a cyclic RGD-modified liposomal-siRNA system. J Release. Control 2014 10;173:110·8. PMID: 24120854 Epub 2013 Jan Oct 11. DOI: 10.1016/j.jconrel.2013.10.003.