マニュアル(第３版)20101124YM-1807
I 製品説明
ISOIL for RNAは土壌サンプルからRNAを抽出するためのキットです。ビーズによる強力な物理的破砕と試薬による溶菌作用を併せることで強固な細胞壁を持つ微生物からもRNAを抽出することができます。さらに、 RNA 抽出液にフッ素化合物を添加することで、非火山灰土壌はもちろん、これまで困難とされてきた火山灰土壌からもRNAの抽出が可能になりました。また、酵素反応を阻害する腐植物質などの夾雑物質を効果的に除去できる精製プロトコールの採用により、簡便に高純度のRNAを精製することができます。得られた土壌RNAはRT PCR-DGGE解析やRT real-time PCRなどに適しています。本品は、日本の土壌からのRNA抽出に最適化したものであり、約4時間で純度の高いRNAを高収量で抽出できます。
さい。別途、2 mlチューブ対応のビーズ式破砕装置をご用意していただく必要があります。 * 2)  「Purification Solution R」の蓋には赤色のシールを、 「Precipitation Solution R」の蓋には緑色のシールを貼付しました。ご使用の際には、お取り間違えのないようにお気を付け下さい。 * 3) Sodium Silicofluoride Solution(ケイフッ化ナトリウム溶液)は、医薬用外劇物ですので取り扱いには十分ご注意下さい。 * 4)  Lysis Solution 20SおよびPurification Solution R中に結晶が析出する場合がありますが、品質、性能に問題はありません。このような場合には、容器ごと65℃で1時間程インキュベートし、結晶を完全に溶解させてからご使用下さい。 * 5） Precipitation Solution RおよびEthachinmateについては、使用時のコンタミネーション(カビや雑菌等の混入)に注意し、開封後は冷蔵(2～10℃)で保存することをお勧めします。Precipitation Solution Rは特に力ビ等が繁殖しやすい落液組成となっていますので、落液中に浮遊物が見られた場合は使用を中止し、新しいキットをご購入下さい。
II使用上の注意
・本品は、試験研究用試薬ですので、医薬品、その他の目的にはご使用になれません。また、試薬についての基本的な知識のある方以外は取り扱わないで下さい。 • Sodium Silicofluoride Solution(ケイフッ化ナトリウム溶液)は、医薬用外劇物ですので、取り扱いにはご注意下さい。 ・ご使用の際には適切な保護具(手袋、眼鏡等)を着用して下さい。 ・本品の取り扱いは、マニュアル記載内容通りに行って下さい。 •マニュアル記載内容と異なった取り扱いによるトラブルにつきましては、弊社では責任を負いかねます。 ・安全性データシート(SDS)につきましては、ニッポンジーンWEBベージ(www.nippongene.com)にてご覧になれます。本品は国立研究開発法人科学技術振興機構(JST)が所有する特許のライセンスを受けて製造販売しております。
IVブロトコール
重要新鮮な土壌を用いて下さい。採取した土壌をすぐにご利用できない場合は、低温(2～10℃)で保存し、できるだけ早くRNA抽出プロトコールにご使用下さい。
く本品以外に必要な試楽、機器など＞
□エタノール、80％エタノール、70％エタノール口クロロホルム□フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール(25:24:1) □ RNaseフリー水□ ビーズ式破砕装置(2 mlチューブ対応のもの) □マイクロピペット(P10～P1000)口ピベットチップ(10 μl〜1000 μl用) □ 1.5 ml～2 ml容マイクロチューブ□インキュベーター(ウォーターバス等)口マイクロ遠心機口ボルテックスミキサー

1. ＜RNA抽出プロトコール＞
土壌サンブル   0.5 g をBeads Tube R に入れる← 120 μl  Sodium Silicofluoride Solution* ¹ﾝ← 420 µl  Lysis Solution R ← 300 μl フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール◄— 60 μl  Lysis Solution 20Sビーズビーティング(5 m/秒間, 30秒間) *²インキュベート(65°C, 2時間)遠心(12,000×g, 5分間,室温) Aい水層* 450 μl を新しい2 ml容チューブに移す* 31 ↑水層↓─ 450 μl  Purification Solution R(赤シール貼付)ボルテックスで混合← 450 μl クロロホルム、ボルテックスで15秒間混合遠心(12,000×g, 20分間,室温) 650 µl を新しい2 ml容チューブに移す*** ← 650 μl  Precipitation Solution R (緑シール貼付) * 51ボルテックスで混合遠心(20,000×g, 15分間, 4°C) * 61 <<<上清を除去し、沈殿を残す*り– 1 ml  70%〜80%エタノール← 2 μl  Ethachinmate、ボルテックスで混合* 8 )遠心(20,000×g, 5分間, 4℃)とも上清を除去したあと、沈殿を風乾** ◄—  155 μl   RNaseフリー水で溶解* 10)核酸落液155 μl  (DNase処理プロトコールへ続く) * ¹¹) * 1) Sodium Silicofluoride Solutionはゾル状態のため、よく懸濁してから、200  μl〜1000  μl用のピペットチップを用いて土壌サンブルへ添加します。 * 2) Beads Tube Rの蓋がしっかり閉まっていることを確認して下さい。蓋のゆるみはビーズビーティング中の液漏れの原因となります。 * 3）土壌サンプルの水分含量が少ない場合、遠心後の上清の容量が450 μlよりも少なくなることがあります。この場合、遠心後の「上清の容量: Purification  Solution  Rの容量:クロロホルムの容量」の比率が、「1 : 1 : 1」となるようにして下さい。 * 4）遠心終了後、慎重にチューブを取り出し、中間層を入れないように注意しながら水層を新しいチューブに移します。 *5)水層の容量が650 μlよりも少ない場合、水層の容量と等量のPrecipitation Solution Rを添加します。 * 6）ご使用の遠心機の最大遠心力が20,000×ｇよりも小さい場合は、遠心機の最大遠心力(だたし12,000×g以上)で遠心して下さい。 * 7）できるだけ上清を取り除いて下さい。上清に含まれる着色物質（腐植物質)はPCRを阻害することが知られています。 * 8）このときの沈殿ははがれやすくなっています。Ethachinmateの添加で、沈殿を可視化しRNAを安定して回収できるようになります。 Ethachinmateを添加しない場合は、ボルテックスを避け、転倒混和によって穏やかに沈殿を洗浄して下さい。 * 9）チューブの蓋を開けたまま、ほこりが入らないようキムワイブなどで覆って、室温で15分間程放置して風乾します。 * 10)沈殿を溶解した状態ですぐに次の操作に進まれる場合はRNaseフリー水で溶解し、中断して一時保管する場合は、RNaseフリー水ではなくTE溶液で溶解することをお勧めします。
2. ＜DNase処理プロトコール＞ * ¹²)
|核酸溶液  155 μl ●— 5 μl  Deoxyribonuclease (RT Grade) ↑水層水層◄—  20 µl   10 × DNase (RT Grade) Buffer ●—  20 μl   2 mg/ml BSA Solutionピペッティングで軽く混合インキュベート(37°C, 15分間) * ¹³ ) 200 μl フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール、ホﾞルテックスで混合† A遠心(12,000×g, 5分間,室温) ～200 μl を新しい1.5 ml容チューブに移す* * ◄— 200 μl フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール、ホﾞルテックスで混合* ¹⁴ )遠心(12,000×g, 5分間,室温) ～200 μl を新しい1.5 ml容チューブに移す* 4 ↓— 200 μl クロロホルム、ボルテックスで混合遠心(12,000×g, 5分間,室温)タ～200 µlを新しい1.5 ml容チューブに移す◄—  6.6 μl   3M Sodium Acetate (pH5.2) ◄— 500 μl エタノール、ボルテックスで混合* ¹5)遠心(15,000×g, 5分間,室温)タ上清を除去し、沈殿を残す— 1 ml  70%エタノール、軽く転倒混和* 161 clo遠心(15,000×g, 5分間,室温)上清を除去したあと、沈殿を風乾* 91 ◄— 10 μl〜30 μl  TE(pH8.0)で溶解* 10) * 11)RNA抽出プロトコール終了後の核酸溶液には、RNAの他に多くのDNA が含まれていますが、DNA 落液としての利用はお勧めできません。DNA抽出専用キット(ISOIL, Code No.316-06211など)で回収したDNA落液をご利用下さい。 *12)DNase処理プロトコールの代わりに、RNA抽出・精製用キット(ISOGEN II, 311-07361など)を用いた精製も可能です。実験例はニッポンジーンWEBページをご参照下さい。 *13)最終的に得られたRNA溶液にDNAが残留している場合は、 DNase処理条件(反応時間をのばす、酵素量を増やす、反応系を大きくする、等）を検討して下さい。 * 14)RNAの純度を上げるため、フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール抽出は２回行います。 * 15)水層の量に対して2.5倍量のエタノールを添加します。エタノールの代わりにイソプロパノールも使用できますが、その場合は、水層の量に対して等量(水層の量が200 μlの場合は、イソプロパノールの量を200 μl)添加して下さい。 * 16)RNA 溶液は、70%エタノール溶液中で－70℃で安定して保管できます。 * 17)RT-PCRなどの鋳型に使用できる純度のRNAが得られます。土壌は極めて多様なサンブルです。土壌の種類によってはプロトコールを一部変更することでRNA収量が改善する場合があります。詳細についてはニッポンジーンのホームページをご覧下さい。株式会社ニッポンジーン 遺伝子工学研究用試薬www.nippongene.com/siyaku/