第13回　生命化学シンポジウム・仙台
プログラム

第13回　生命化学研究会

プログラム

1．はじめに
RNA結合タンパク質は、RNAの一本鎖領域の他、ステム・ループやバルジと呼ばれるRNAの二次構造単位に結合することにより、スプライシングなどのRNAプロセシング、RNAの安定性や翻訳など、転写後の遺伝子発現のあらゆる段階の制御に関わっている。また、RNA-タンパク質相互作用は、リボソームやスプライソソームのような高度かつ精密な「分子機械」としてのリボヌクレオタンパク質(RNP)複合体の構築やその機能において重要な役割をはたしている。このため、RNA-タンパク質相互作用のメカニズムに関する一般的なルールの解明は、生命システムの理解ばかりではなく、様々な病気の診断や治療などの医学的な応用のほか、機能性RNPの構築などの工学的な応用にもつながることが期待される[1]。また、RNP複合体の構造一機能相関に関する知見は、生物進化初期においてRNAを主な構成成分とする自己複製体がどのような過程を経て進化し、現在のような DNA/RNA/タンパク質からなる生命システムが生まれたかについて考えるための基盤となる[2]。本稿では、RNA-タンパク質相互作用のメカニズムを理解する上でのモデル•システムとして、アルギニン•リッチ・ペプチドとその結合相手であるRNA構造との相互作用のコンビナトリアル解析、およびこのように得られた知見を用いた機能性RNPの構築原理の解明を目指した研究について紹介する。 2 .  RNA結合モチーフとしてのアルギニン・ペプチドのversatility RNA-タンパク質相互作用のメカニズムを解析する上で、アルギニン・リッチ・モチーフと呼ぼれるアルギニンを豊富に含む10~20残基からなるペプチドはすぐれたモデル•システムとなってきた[3]。筆者がRNA-ペプチド相互作用の解析に取組み始めた1990年代半ばの段階においては、図1に示した三つのRNA-ペプチド相互作用について生化学的な解析、およびその複合体の代表的なアルギニン・リッチ・ペプチドのアミノ酸配列とそのRNAサイトの二次構造、および複合体の立体構造。合アルギニン・リッチ・ペプチド・ライブラリーのデザイン（b）-(d)。 NMRによる立体構造が明らかになっていた。これらのペプチドの注目すべき点として、 1)RNAとの結合に際して、α-ヘリックス、β-ヘアピンなど、様々なコンホメーションを取りうること、2)RNAとの結合に重要なアミノ酸はアルギニンの他、少数の親水性アミノ酸に限られており、配列の「複雑さ」が低いことが挙げられる。このため、疎水性のアミノ酸を除いた少数のアミノ酸を組み合わせることにより、 RNA結合ペプチドを構築できることが示唆された。具体的には、図2(a)の遺伝暗号表の青い太枠で示した12種類のアミノ酸を少数組み合わせることにより、RNA結合ペプチドをデザインできるのではないかと考えた。この考えを実証するため、特定のRNAに結合するペプチドのコンビナトリアル・ライプラリーからの同定を試みることにした。
３.細胞内RNA-ポリペプチド相互作用検出系の開発
RNA結合ペプチドのコンビナトリアル・ライプラリーからの同定は、Franklinが開発したファージλ Nタンパク質による抗転写終結(アンチターミネーション)を利用した図３に示した2つのプラズミドからなる大腸菌レポーター •アッセイを改変することにより行った[4]。 λ Ｎタンパク質は、転写されたRNA上のboxBと呼ばれるRNAステム•ループ構造と結合することにより、RNAポリメラーゼとともにアンチターミネーション複合体を形成し(詳細は７で述べる)、これによってRNAポリメラーゼは転写終結配列(ターミネーター)で解離することなく、下流の遺伝子を発現できるようになる。このため、大腸菌内で一方のプラズミドから発現されたNタンパク質がboxB RNAに結合してアンチターミネーション複合体ができた時にだけLacZ遺伝子からβ ーガラクトシダーゼが発現される。我々は、boxB を他の標的RNA構造と取替え、NタンパクのRNA結合部位を他のRNA結合ドメインあるいはポリペプチド・ライプラリーと取替えることにより、多様なRNAとポリペプチドの相互作用解析に利用できることを示した[5]。レポーター遺伝子としてLacZ遺伝子を用いたアッセイの特徴は、X-galを含む培地上コロニーの青さ(0から8+の評図３　細胞内RNA-ポリペプチド相互作用検出系のための二つのプラズミド価)がRNA-ペプチド相互作用の親和性に対応していることである(図4)。また、類似したRNA-ペプチド複合体を比較した場合、コロニーの青さにおいて、プラス1つ(1+)の違いがKd値で5倍程度の違いに相当することが分かっている。さらに、レポーター遺伝子としてカナマイシン耐性遺伝子(NPT  II)を用いることにより、検索できるライプラリーの配列数が飛躍的に増大する(~10 8程度) [6]。
4． HIV RRE RNA結合ペプチドの配列／コンホーメーションの多様性
我々はアンチターミネーション・システムを用いたHIV RRE結合ペプチドの同定をいくかのライプラリーを用いて行ってきた[7-10]。HIVゲノム上のRREにHIV  Revタンパク質が結合することにより、HIV  RNAが核から細胞質に輸送される。このため、高親和性RRE結合ペプチドは新しいタイプの抗HIV薬の候補になりうる。まず、比較的単純な(配列の複雑性が低い)ライプラリーとして、3-4種類のアミノ酸を用いた“ランダム”ライプラリーをデザインした。RevペプチドがRREと結合する上で重要なアルギニン(R)、セリン(S)、アスパラギン(N)の3つのアミノ酸の他、ヒスチジン(H)をコードするRSNHライプラリー (図2(b))からは、予想通り、本来の結合相手であるRevと類似したペプチドが得られた。また、アルギニン(R)、セリン(S)、グリシン(G)の3つのアミノ酸からなるRSGライプラリー(図2(c))からは、Revとは全く異なる配列を持つペプチド(RSG-1)が得られた[7]。さらに、RSG-1ペプチドをプロトタイプとしたドープ・ライプラリーを作製し、いっそう高いアンチターミネーション活性を示すRSG-1変異体のスクリーニングを行ったところ、RSG-1よりも6-7倍強くRREと結合するRSG-1.2ペプチドを得た[8]。RSG-1.2ペプチドとRREとの複合体のNMR構造が解析され、Revペプチドとは全く異なるRREとRSG-1.2-RRE complex K1-RRE complexの結合様式が見られた(図５)[9]。特定のRNA を認識する方法が複数存在することから、RNA-ペプチド相互作用の多様性を示す結果となった。図５ RSG-1.2-RRE複合体の立体構造、およびK1 (DLA)ペプチドのコンホメーションのモデル。次に、多様なペプチドを含む「複雑な」ライプラリーとして、ポリアルギニン15残基にコドン単位で50%の割合で極性側鎖のアミノ酸( VVKコドン)を導入したArginine-rich peptide library 2 (ARPL2)を作製し(図2(d))、 NPT IIレポーターを用いたセレクションを10 7配列から行ったところ、高いアンチターミネーション活性を持つK1ペプチドが同定できた[10,11]。K1ペプチドとRREとの複合体の構造は、千葉工業大学の坂本泰一博士のグループにより解析中のため詳細については現時点では分かっていないが、上記の細胞内検出系などを用いたペプチドの変異体解析により、Revペプチドと同様にα-ヘリックスとして、Revのアスパラギン残基と類似して、グルタミン残基がループ領域のG-A塩基対を認識していると考えられる(図5、図6)[12]。一方、RREがRevペプチドと結合する際に、そのループ領域においてG-G塩基対が形成され、このG-G塩基対はisostructuralなA-A塩基対に置換することが可能である。興味深いことに、RevおよびRSG-1.2ペプチドは、このRREのG-G塩基対をA-A塩基対に置換したRREaa変異体と強く結合するのに対して、 K1ペプチドは弱くしか結合できない。このことから、K1ペプチドは、RREのG-G塩基対を特異的に認識している可能性が示された。そこで、RREaa変異体に結合するペプチドを上記の ARPL2ライプラリーからのセレクションを行ったところ、K1ペプチドとは異なるアミノ酸要求性を示すLDN1ペプチドを同定した(図6) [12]。このペプチドは、K1ペプチドとは逆に、野生型のRREと結合しない。現在、このG-GからA-A塩基対への置換によるペプチド特異性スイッチングの分子的基盤について、NMRによる構造解析などを行うことにより解析している。 RREによるRev、RSG-1.2、およびK1ペプチドの認識のメカニズムの違いを解析するため、それぞれのペプチドとの結合に重要なヌクレオチドを同定した。これは、上記の細胞内レポーターアッセイを用いて、それぞれのペプチドに結合するRRE変異体をRREドープ・ライプラリーから同定し、それらの配列において保存されているヌクレオチドを決定することにより行った。その結果、それぞれのペプチドを認識する上でのヌクレオチド要求性が異なることが分かった(図7)。また、めに重要なヌクレオチド。得られたRRE変異体のRev、RSG-1.2、K1ペプチドに対する活性を解析したところ、そのペプチド特異性においていくつかのクラスに分類できることが分かった。興味深いことに、RREの一塩基置換により、RevペプチドからRSG-1.2ペプチド(あるいは、その逆も)への段階的な特異性の改変が可能であることを見出した[13]。また、このようなRREのペプチドに対する特異性をスイッチさせるような塩基置換を複数組み合わせた合理的な設計により、新しいペプチド結合特異性を創出できることを明らかにした[14]。これらのことは、RNAのペプチド結合特異性の進化のしやすさ、および、そのモジュール性を示すものであり、RNA-タンパク質相互作用の進化において重要な役割を果たしたと考えられる。
6. RNA結合アルギニン・ペプチドの普遍性
アルギニン・ペプチドは単独では安定な構造を持たず、 RNAとの結合によりその構造(α-ヘリックス、β-ターンなど)が安定化される。同様に、RNAの構造もアルギニン・ペプチドが結合する際に構造が安定化される。代表的な例として、 RREの内部ループにおけるG-G、およびG-A塩基対の形SSFNARONRRRRRAQLRAAAA GLRRRIKYGQWLMGQFGAAA成が挙げられる。このため、RNA-ペプチド複合体は一つの図８　SL2、GRP78B RNAの二次構造とARM折りたたみ単位と見なすことができる。アルギニン・ペプチドライブラリーからの検索により同定したペプがどのようなRNA構造を認識・結合できるか明らかにする意チドのアミノ酸配列。RNA 二次構造のグレーの四角がペプチドとの結合に重要な領域。味で、RREのように本来アルギニン・ペプチドと結合するRNA構造の他、本来、ペプチドやタンパク質との結合サイトではないRNA構造を標的としたスクリーニングを行った。標的RNA構造としては、同定したペプチドによる遺伝子発現の制御への応用を踏まえて、C型肝炎ウイルス(HCV)の5’-および3’-UTRにおける翻訳や複製のために重要な領域などを選び、結合ペプチドのセレクションを行って来た。その結果、図8に示したRNA構造に結合するペプチドを同定できた。これらのRNA構造の共通点は、そのペプチド認識領域がRNAステムに隣接するプリン-プリン塩基対(特にG-A塩基対がよく見られる)を持つ点である。今後もアルギニン・ペプチドにより認識可能なRNA構造のレパートリーを明らかにするとともに、これらのペプチドを用いた遺伝子発現の制御について検討する。
7.機能性リボヌクレオタンパク質複合体（RNP）のエンジニアリング
細胞内には、リボソームやスプライソソームのような複雑な「分子機械」、転写や翻訳制御に関わる分子会合体など、数多くのリボヌクレオタンパク質(RNP)複合体が重要な役割を担っている。我々は、 RNP 複合体の構築原理を理解するため、上述の細胞内検出系で利用しているNタンパク質を中心とするアンチターミネーション複合体に注目した。これは、アンチターミネーション複合体が一つのRNA分子およびファージλ Nタンパク質をはじめとする6種類のタンパク質からなる比較的単純な構造を持つこと(図9)、また、上述の検出系により構造一機能相関を比較的簡単にアッセイできるためである。図9 (A)アンチターミネーション複合体における相互作用ネットワークのモデル。Nタンパク質およびboxA-boxB RNAはファージλ由来、NusA、NusB、S10、NusGおよびRNAポリメラーゼは宿主E. coli由来である。(B) Nタンパク質のドメイン構造。ファージλの最初期の遺伝子であるNタンパク質は、λ nut由来のboxA-boxB RNA、大腸菌宿主因子(NusA, NusB, S10, NusGタンパク質)、およびRNAポリメラーゼとともにアンチターミネーション複合体を形成し、これによりRNAポリメラーゼは下流ターミネーター (tL、tR)をリードスルーし、後期の遺伝子が発現される。 Nタンパク質は図9Bに示したドメイン構造を持ち、λ nut由来のboxB RNA、宿主因子のNusA、およびRNAポリメラーゼともに、アンチターミネーションにおいて最低限必要な「コアcore」複合体を形成する(図9A、"core" complex)。転写開始点から遠く離れたターミネーターのリードスルーには、さらにλ nut由来のboxA RNAおよび宿主因子NusB、S10、およA BびNusGを含む「完全なcomplete」複合体(図boxE RRE 9A、”complete” complex）が必要である。野生型複合体におけるboxB RNAとNタンパク質のpeptide RNA結合ドメインをHIV RRE RNAとRevペプチドにNusA NusA置換することができることは、上述の通り、分かってい3る(図10A,B) [7]。しかしながら、RRE-Rev相互作用のRNA pol RNA pol C親和性はboxB-Nとほぼ同等であるにも関わらず、アRRE/Rev boxB/N RRE/K1ンチターミネーション活性は2％程度まで低下した(図Binding affinity (Kd, nM) 100% 2% Antitermination activity 15% 10C)。その原因として二つのことが考えられる。まず、閩１０　野生型(A)、boxBをRREに置換した(B)、コ野生型複合体におけるNusAタンパク質とboxBとのア・アンチターミネーション複合体における相互作用相互作用(図10A、矢印①)が失われたためと考えらネットワークとそのアンチターミネーション活性(C)。れる。また、RRE-Revの複合体内の空間的配置／配向が最適でないため、複合体全体の安定性が低下したためであるとも考えられる。そこで、我々は、アンチターミネーション複合体における相互作用ネットワーク、および、各ドメインの空間配置のエンジニアリングによる活性の回復について検討している。まず、相互作用ネットワーク改変による複合体の安定性および活性の制御の可能性を示す結果として、RRE-Revを中心とする複合体におけるRevペプチドを高親和性RRE結合アプタマーであるK1ペプチドに置換することにより、活性を15%程度まで回復したことが挙げられる(図10B,C) [11]。また、Nタンパク質のNusAタンパク質間結合領域を改変することにより、活性がさらに回復することが分かっている(図10B、矢印②) (Suzuki  &  Harada,  unpublished) 。現在は、Nタンパク質とRNAポリメラーゼとの相互作用(図10B、矢印③)の最適化について検討している。一方、アンチターミネーション複合体における各モジュールの空間的配置／配向の改変による活性の制御の可能性について解析した[15]。具体的には、boxB RNAのステムの長さ、boxAとboxB間の距離、およびNペプチドとNタンパク質のNusA結合領域との間の距離を改変した。その結果、boxB  RNAのステムの長さ、およびNペプチドとNタンパク質のNusA結合領域との間の距離は非常に重要であることが明らかになった。しかしながら、興味深いことに、boxBとNペプチドを、他の RNA-ペプチド相互作用に置換することにより、RNA のステムの長さ、およびペプチドリンカーの長さに対する厳密性は著しく低下した。実際、 RRE-Rev等の空間的配置／配向を変化させることにより、活性の上昇が見られる場合があった(Takeda & Harada, unpublished)。これらの結果は、機能性RNPとしてのアンチターミネーション複合体のエンジニアリングの可能性を示すものである。今後、機能性RNPの構築原理に関する一般的ルールの解明につながることが期待される。
8.おわりに
今回は、長年取り組んで来た RNA-ペプチド相互作用のメカニズムの解析について、そしてこの数年来、興味を持って進めているリボヌクレオタンパク質複合体(RNP)のエンジニアリングを中心にまとめてさせて頂きました。DNA-タンパク質相互作用の場合と同様に、RNA-タンパク質認識コードの解明やRNA結合タンパク質の合理的なデザイン法の開発を目指し、これまで暗中模索の状態が続いて来ましたが(もちろん、これはこれで十分に楽しいのですが）、これらの問題に取り組むためのツールがようやくそろい始めた気がしています。一方、このような研究を始めた当初から、その成果を医学・工学に応用できればと考えてきました。上記のペプチドなどを用いたウイルスの複製の制御には引き続き挑戦して行きたいと思っています。また、新しいコンセプトにもとづいた実験法の開発にも取り組んで行きたいと思っています。一人でできることには限りがあり、その意味で研究における「指導者」、研究を行う上での「同士」には恵まれて来たと思います。この場を借りて指導してくださった先生方、共同研究者、研究室の学生に深く感謝いたします。 1) 原田和雄,蛋白質核酸酵素, 51, 2489-2495 (2006). 2) 原田和雄,河合剛太･金井昭夫編,「機能性RNAの分子生物学」,クバプロ, pp. 29-40 (2010). 3) A. C. Cheng, V. Calabro, and A. D. Frankel, Curr. Opin. Struct. Biol., 11 , 478 (2001). 4) N. C. Franklin, J. Mol. Biol., 231, 343-360 (1993). 5) a) K. Harada & A. D. Frankel, " RNA-Protein Interactions :A Practical Approach " (C.W.J. Smith ed.), IRL Press, pp. 217-236 (1998); b)原田和雄,蛋白質核酸酵素, 44, 1572 (1999); c)原田和雄,実験医学, 19, 2213-2217 (2001). 6) 原田和雄,中村義一・大内将司監修,「RNA工学」,シーエムシー出版, pp. 259-268 (2005). 7) K. Harada, S. S. Martin & A. D. Frankel, Nature , 380 , 175 (1996). 8) K. Harada, S. S. Martin, R. Tan & A. D. Frankel, Proc. Natl. Acad. Sci., USA , 94 , 11887 (1997). 9) Q. Zhang, K. Harada, H. S. Cho, A. D. Frankel & D. E. Wemmer, Chem. Biol. , 8 , 511-520 (2001). 10) H. Peled-Zehavi, S. Horiya, C. Das, K. Harada & A. D. Frankel, RNA , 9 , 252-261 (2003). 11) M. Sugaya, N. Nishino, A. Katoh & K. Harada, J. Pept. Sci., 14 , 924-935 (2008). 12) S. Aoyama, M. Sugaya, C. Kobayashi, S. Masuda, T. Sakamoto, G. Kawai, A. Katoh & K. Harada, Nucleic Acids Symp. Ser., 53, 271-272 (2009) 13) T. Iwazaki, X. Li & K. Harada   RNA , 11 , 1364-1373 (2005). 14) M. Sugaya, F. Nishimura, A. Katoh & K. Harada,  Nucleos. Nucleot. Nucl., 27 , 534-545 (2008). 15) S. Horiya, M. Inaba, C.-S. Kou, H. Uehara, N. Masui, M. Mizuguchi, M. Ishibashi, S. Matsufuji & K. Harada, Mol. Microbiol., 74, 85-97 (2009).
千葉大学大学院薬学研究院荒井緑(marai@faculty.chiba-u.jp)天然物の医薬への貢献は、近年開発された新薬のほとんどが天然物かその関連化合物であることからも明らかであるがり、欧米を中心として華やかにスタートした多様性志向型合成を基盤とする小分子ライプラリー構築と体系化したハイスループットな生物活性評価を行う大規模なプロジェクトの登場により、天然物やその誘導体は、一時期、窮屈な立場になったようであった。しかし、膨大な数の人工小分子ライプラリーをもってしても、生物活性化合物のヒット率は、自然から見いだされる天然物に一歩譲っている状況から、ここ数年で再び天然物の重要性が再認識されてきているように感じられる。本稿では、我々の研究室(千葉大学大学院薬学研究院 活性構造化学研究室・石橋 正己教授）で行っている、天然物を基盤とした癌細胞、神経幹細胞へのアプローチについて紹介する。1.天然物そのもの(単離・構造決定)と天然物を基盤とした合成化合物ライプラリー、2.タンパク質を用いたアッセイシステム、3.細胞を用いたアッセイシステムの、三軸を中心に研究を行っている(図1)。図1天然物様化合物、タンパク質アッセイ、細胞アッセイの三軸2.タンパク質を基盤としたアプローチ2-1. 敵気ビーズタンパク質を用いた天然物の迅速的探索法生物活性を有する天然物を迅速に探索(単離・構造決定）することは非常に望まれることであろう。この目的を達成するために、我々は興味のあるタンパク質(疾病に関連するもの等)を担持させた磁気ビーズ(図2D)を用いて、天然物のエキス(天然物の混合物)から、そのタンパク質に相互作用する天然物をつりあげる方法を開発した。天然物のエキスとタンパク質担持磁気ビーズを混合し(図2A)、磁石を用いてビーズを回収した後(図2B)、有機溶媒にてタンパク質に結合した天然物を解離、HPLCで解析し(図2C)、ターゲット天然物を保持時間やUV吸収パターンなどの情報を得た後、実際の化合物単離を行うというものである。系の確立のため、ビタミンD受容体（VDR）と、その生体内リガンド1α,25-dihydroxyvitamin   D 3 [1α,25(OH) 2  VD 3 ]  (1)とその代謝前駆体であるvitamin D 3 (VD 3 ) (2)を用い、図3A, Bに示すように化合物1を選択的に検出することができた。この系を用いて、天然物エキス（Limocharis flava ;図3Cはエ図2タンパク質担持磁気ピーズを用いた天然物の迅速的探索法検出(A, B)と、L. flavaからの新規天然物の単雕キスのみのHPLCチャート)から、新規labdane型ジテルペンを迅速に単離・構造決定することに成功した² 。本法は、リバースケミカルゲノミクス的天然物探索とも位置づけることができると考えている。現在、神経幹細胞の分化に重要な転写因子を用いた迅速的天然物探索に取り組んでいる。 2–2.神経幹細胞で働くHes1ダイマー形成阻害剤の探索神経幹細胞が成人脳内で発見³されてから18年が過ぎるが、その分化をモジュレートする化合物の報告は少ない。2ヶ所に局在すると考えられていた神経幹細胞は、大脳新皮質にも存bHLH activators在が確認されか、神経再生医薬の開発は脳神経疾患の患者に大きな希望をもたらすと考える。天然物はもともと自然で創られ、活性、循環、代謝等で医薬としてのアドバンテージを潜在的に有することから、天然物を基盤とした神経幹細胞へのア図4  神経幹細胞におけるbHLH因子の働きプローチは筆者にとって非常に魅力的である。神経幹細胞の分化にはbasic-helix-loop-helix (bHLH)型の転写因子が重要な役割を担っており、分化を促進するもの、抑制し幹細胞を維持するものの、大きく二種類が存在することが知られている(図4)。我々は抑制型のbHLH因子の一つHes1に着目し、その作用を阻害する天然物を探索している。 Hes1は二量体で活性型bHLH因子のDNAプロモーター部に結合し、その転写を阻害することから、Hes1二量体形成を阻害する天然物をハイスループットに探索するべく、蛍光化したHes1と、マイクロプレートに固定化したHes1を用いるアッセイ系を構築し(図5)、当研究室が有する天然物ライプラリーから、初のHes1阻害剤を見いだし、細胞内でもHes1の働きの阻害を示すことを明らかにした')。 3.細胞アッセイを基盤としたアプローチ神経幹細胞の分化モジュレーターや、癌細胞の異図5  プレートアッセイによるHesl 二量体阻害剤常亢進シグナル阻害剤を探索するために、我々は細胞アッセイを用いたアプローチも行っている。神経幹細胞では、ターゲットとしているbHLH因子の転写をルシフェラーゼで定量できる安定発現細胞を構築し研究を行っている。また、癌細胞の異常亢進シグナルでは、そのシグナルの最下流で働く転写因子に制御される遺伝子転写活性をターゲットとしている。本稿では、前立腺癌や基底細胞癌などで異常亢進しているHh (ヘッジホッグ)シグナルの阻害剤探索について述べる。 Hhシグナルは、生物の発生段階などで重要な働きを担う一方で、細胞内での各コンポーネントの変異により異常亢進に傾くと、癌の要因となることが報告されている（図6）。こPTCH . Hh singaling inhibitor GLIDのシグナルの最下流は転写因子GLIによる遺伝子転写でSUFU inhibitあり、プロモーター部のGLI結合配列に結合することで、 expression Hh関連タンパク質の遺伝子転写がおこる。我々はテトラサAllywイクリンによりGLIの発現を制御できる細胞に、プロモータ一部にGLI結合サイトを有するルシフェラーゼ遺伝子を安定発現させた細胞アッセイ系を構築し(図7) 6 、これを用い図6  HhシグナルてGLIによる転写を阻害する天然物を探索している。これまでに単離・構造決定した天然由来Hhシグナル阻害剤を図8に示した。Hhシグナル阻害剤として報告されているものは、天然物のシクロパミンを含め膜タンパク質のSMO阻害剤が多いが、癌細胞にはSMOが変異し、それらの化合物が有効で無いものあるため、SMO以外のコンポーネントを標的とすることが望ましい。そ図7  Hhシグナル阻害剤探索のための細胞アッセイシのような化合物の報告は少なく、ほとんどが合成化合物である。我々は、構築した細胞アッセイを用いて、天然物ライプラリーからzerumbone (4)、staurosporinone (5)を、Physalis minimaからphysalins F (6) and B (7)を、強い阻害剤として単離し。、Zizyphus cambodiana、 Acacia pennataからは中程度の強さの阻害剤colubrinic acid (8)を含むpentacyclic triterpenesを見いだしたﾌｫ,b)。また、Adenium obesumからは3種の新規化合物を含む、17種のcardiac glycosidesをHh阻害剤として単離し70 、digitoxigenin β-D-glucosyl-(1→4)-β-D-thevetoside (12)は0.11 μMのIC 50を示した。 Excoecaria agallochaから単離された新規フラボノイド配替体(13)は、GLIの核内への移行を阻害する新規なHh阻害メカニズムを有していた74 。これらの阻害剤は、Hhシグナルで制御されるタンパク質であり、Hhリガンドの受容体であるPTCHや、抗アポトーシスタンパク質であるBCL-2の発現をmRNAレベルで抑制することを見いだしている。さらに、Hhシグナルが異常亢進しているヒト膵臓癌細胞(PANC1)やヒト前立腺癌細胞(DU145)に著しい細胞毒性を示す一方で、Hhシグナルが亢進している正常細胞として用いられるマウス胚由来線維芽細胞であるC3H10T1/2細胞に毒性を示さないものがほとんどである。 4.天然物を基盤とした活性化合物の合成我々は当研究室で単離・構造決定された天然物の骨格を基盤とし、多様性志向型合成(Diversity-oriented synthesis; DOS)を取り入れた、「天然物基盤DOS化合物」の創製も目指している（図9）。多くの植物から単離され、幅広い生物活性を有するフラボノイド、クロモンの骨格に、ヘテロ環置換基を付与したライプラリー合成に近年成功し、また、変形菌Physarum melleumから単離・構造決定された新規環状デプシペプチドmelleumin  Aや、変形菌Fuligo candidaから単離・構造決定された新規天然物fuligocandins  Bはその全合成を達成し、ライプラリー構築に向かっている。Fuligocandins  Bやその誘導体は、癌細胞を正常細胞と区別図8 天然由来Hhシグナル阻害剤してアポトーシスに導くデスリガンド (TRAIL)に耐性を有する癌細胞を、再びTRAIL感受性細胞に導き、 TRAILと併用することで癌細胞に対し毒性を示すことを見いだしている®。本稿では、melleuminとヘデロ環置換基を有するフラボノイド・クロモンライプラリーについて紹介する。 4-1.変形菌より単離された天然物の骨格を活かした🎵ntシグナル阻害剤の創製Wntシグナルは大腸癌にてその異常亢進が認められるシグナルである。最下流の遺伝子転写はβ-カデニンと転写因子TCFの複合体により引き起こされる。我々は、当研究室で単離・構造決定された天然物の骨格を基盤とした合成化合物でWntシグナル阻害剤を見いだしている。新規環状デプシペプチドmelleumin A (14)とそのセコ酸メチルエステルであるmelleumin B (15)は当研究室にて、変形菌Physarum melleumから単離構造決定された(図10)"。我々は、 melleumin B (15)を全合成し、未決定であった4位の絶対立体配置をSと決定し100 、さらに数種の異性体の合成に成功した。それらのうち、melleumin Bの10R-体(16)、3R-体(17) 、(3R, 10R)-体(18)にWntシグナル阻害活性を見いだしていた10k,b)。Wntシグナル阻害活性は、TCF結合領域を有するルシフェラーゼ遣伝子の転写活性の阻害により評価している。その後我々は、melleumin A (14)と3R-epimer (19)の全合成に成功し、さらに、melleumin  Aの骨格を活かしたmelleumin様化合物20をデザイン、合成した。 melleumin  B誘導体に阻害活性がみられたことから、 melleumin  AとBとの共通部分構造を維持させ、エステOH H L-Thrnnル部を除き、環サイズを大きくしたところ、melleumin  A (14)に比較して阻害活性を20％増強させることに成功した11 )。医薬に発展するような優れたWntシグナル阻害剤は未だ少ないことから、melleuminのようにペプチmelleumin A (14) melleumin B (15) 3-epi-melleumin A (19) 10-epi-melleumin B (16)ドベースの化合物は医薬リードとして有用と考えてい3-epi-melleumin B (17) 3,10-epi-melleumin B (18)タ。 4-2.ヘテロ環置換基を有するクロモン・フラボノド誘導体の効率的合成とライプラリー構築as me eumin A *size change for tlexibility幅広い生物活性を有するクロモン・フラボノイド類は*remove the lactone uni for stability植物の多くから様々な種類が単離される。筆者は、タtrans substituen aryl group e as melleumin YOBnンパク質と相互作用しやすいヘテロ原子の位置を天然R¹ = CH₂CO₂Et   20物の骨格の周りに“ちりばめる”ことで、目的とする生物活性を引き出すのに近道となるケミカルスペースを、天然物の構造の延長として得られるのではないかと考えている。そこでまず、クロモン・フラボノイド類にヘテロ環置換基を効率的に導入する合成法を確立した12 。図11に示すようなヘテロ環を有するクロモン、フラボノイドの合成はそれまで2つの報告例があったが、効率的で様々な置換基に応用する方法は無かった。我々は、ヒドロキシアセトフェノン誘導体とヘテロ環アルデヒドより生じるカCs 2 CO 3 , ElOH, 40iCルコン中間体において、タンデム型マイケルアルドールone-pot reaction 3-pylidyl substituted flavones反応が進行することで、2位3位にヘテロ環を有するクロ図11ヘテロ環置換基を有するクロモン・フラボノイド誘導体の効率的合成法の確立モン誘導体を得ることに成功した。また、芳香族アルデヒド(図11、Aldehyde A)から生じたカルコンの環化が遅いことを利用し、後にヘテロ環アルデヒド（Aldehyde B)を加えることにより、3位にヘテロ環を有するフラボノイド誘導体を合成できる。これらの反応を固相合成にて検討し、種々のヘテロ環アルデヒドを用いて様々な化合物を合成した。さらに図11のR1、R2にあたる部分にPdによるクロスカップリングにて多様性を増加させ、スプリット&プール法によりライプラリーを合成した。これらの化合物に、神経幹細胞の分化を抑制する転写因子Hes1のプロモーター阻害活性を有するものを見いだしている139。現在、神経幹細胞の分化促進作用や、神経幹細胞中の分化に関わるタンパク質のmRNA発現への影響を検討している。我々は、天然物を基盤として、生物活性物質を日々、探索している。まだまだ多くの疾病やその関連シグナルには特異的なモジュレーターが必要であり、それらは未知の生体内機構の解明を助け、医薬のリードにもなり得る。自然が与えた骨格は、そのような有用化合物への近道であると筆者は考えている。謝辞本稿にて紹介した研究は、所属する千葉大学大学院薬学研究院活性構造化学研究室にて行われたものである。研究室主宰者である石橋正己教授をはじめ多くの学生さんの心温かいサポートに対し、心より感謝申し上げる。参考文献1) D. J. Newman, and G. M. Cragg, J. Nat. Prod., 70, 461-477 (2007). 2) M. A. Arai, E. Kobatake, T. Koyano, T. Kowithayakorn, S. Kato, and M. Ishibashi, Chem. Asian J., 4, 1802-1808 (2009). 3) B. A. Reynolds, and S. Weiss, Science, 255 , 1707-1710 (1992). 4) K. Ohira, T. Furuta, H. Hioki, K. C. Nakamura, E. Kuramoto, Y. Tanaka, N. Funatsu, K. Shimizu, T. Oishi, M. Hayashi, T. Miyakawa, T. Kaneko, and S. Nakamura, Nature Neurosci. , 13 , 173-179 (2010). 5) M. A.  Arai, A.  Masada, T.  Ohtsuka, R.  Kageyama, and M.  Ishibashi, Bioorg. Med. Chem. Lett., 19 , 5778-5781 (2009). 6) T. Hosoya, M. A. Arai, T. Koyano, T. Kowithayakorn, and M. Ishibashi, ChemBioChem, 9, 1082-1092 (2008). 7) a) M. A. Arai, C. Tateno, T. Hosoya, T. Koyano, T. Kowithayakorn, and M. Ishibashi, Bioorg. Med. Chem., 16, 9420-9424 (2008). b) Y. Rifai, M. A. Arai, T. Koyano, T. Kowithayakorn, and M. Ishibashi, J. Nat. Prod. 73, 995-997 (2010). c) M. A. Arai, C. Tateno, T. Koyano, T. Kowithayakorn, S. Kawabe, and M. Ishibashi, Org. Biomol. Chem., 9, 1133-1139 (2011). d) Y. Rifai, M. A. Arai, S. K. Sadhu, F. Ahmed, and M. Ishibashi, Bioorganic. Med. Chem. Lett., 21 , 718-722 (2011). 8) M. A. Arai, J. Seto, F. Ahmed, K. Uchiyama, and M. Ishibashi, Synlett, 2010 , 16 , 2498–2502. 9) S. Nakatani, K. Kamata, M. Sato, H. Onuki, H. Hirota, J. Matsumoto, and M. Ishibashi, Tetrahedron Lett., 46 , 267-271 (2005). 10) a) S. Hanazawa, M. A. Arai, X. Li, and M. Ishibashi, Bioorg. Med. Chem. Lett., 18 , 95-98 (2008). b) M. A. Arai, Y. Uchino, S. Hanazawa, X. Li, N. Kimura, and M. Ishibashi, Heterocycles, 76, 1425-1438 (2008). 11) M. A. Arai, S. Hanazawa, Y. Uchino, X. Li, and M. Ishibashi, Org. Biomol. Chem., 8, 5285-5293 (2010). 12) M. A. Arai, M. Sato, K. Sawada, T. Hosoya, and M. Ishibashi, Chem. Asian J., 3, 2056-2064 (2008). 13)特願2010-167577、プラボノイト由来Hes1プロモーター阻害剤、荒井緑・柳瀬なつき・小柳津和音・石橋正己。
東京工業大学院理工学研究科田中浩士(thiroshi@apc.titech.ac.jp)化学を武器に生物学研究を切り開くケミカルバイオロジ一研究は、非常に有効かつ面白い研究分野である。本研究分野において、我々合成化学者は、切れ味のよいメスを生物学者に手渡す役割を担っている。しかしながら、「使いたいもの」と「作りたいもの」が必ずしも一致しないために、使う側と作る側の両者が満足できるメスを設定することは難しい。それは、両専門領域の研究者が共に満足できるケミカルバイオロジー研究における大きな課題である。本稿では、合成化学的にも生物学的にも魅力的であったオリゴシアル酸の合成法の開発と、合成糖鎖誘導体を利用する糖鎖生物学研究への展開について紹介する。シアル酸は、デオキシ酸性9単糖1の総称であり、天然構成単糖の中で最も複雑な構造を有している（図1)。ただし、一般的には、シアル酸とは、5位の置換基がアセトアミド基の誘導体を指すことが多い。多くの場合、シアル酸は、生体内糖鎖の非還元末端、すなわち一番外側に熱力学的に不安定なα結合を介して存在しており、様々な生体分子との相互作用に関わっている。例えば、インフルエンザウイルスが、ガラクトースの3位または6位水酸基に結合したシアル酸含有糖鎖を足がかりに生体内に侵入していくことはよく知られた事実である。また、シアル酸は、シアル酸同士がさらに結合したジ／オリゴシアル酸２を形成することが知られており、近年の生物学的役割が注目されている。 11しかしながら、これらの糖鎖の分析技術が十分開発されていないことが、その研究推進の大きな妨げになっている。例えば、構造分析に重要である糖鎖抗体については、糖タンパク質中のオリゴシアル酸を認識できる抗体は今だ開発されていない。図1シアル酸とオリゴシアル酸一方、ジノオリゴシアル酸の基本構造であるα(2,8)シアル酸７の合成化学は、糖鎖合成化学における長年の課題であった(図2)。 ²まず、天然のシアル酸のグリコシド結合は、熱力学的に不安定なα結合である。しかしながら、シアル酸は、アノマー位の隣の置換基がないために、隣接基効果を用いる速度論的立体化学制御を行なうことができない。さらに、アノマー位にカルボキシル基を置換基として有するために、グリコシル化反応の反応性が低下している。特に、シアル酸糖受容体４の8位水酸基は、アセトアミド基のカルボキシル基との分子内水素結合の影響で非常に反応性が低下しているため、α(2,8)ジシアル酸ユニットの合成において、オキソニウム中間体5からの脱離反応による不飽和エステル6の生成反応を抑制することが難しい。実際に、α(2,8)ジシアル酸の合成法はいくつか報告されているものの、どれも通常のグリコシル化反応に比較して非常に多くのシアル酸糖供与体を必要とする。また、研究開発当時、α(2,8)トリシアル酸の誘導体供給法として有効な化学合成法の報告は無かった。そこで、私は、ジ／オリゴシアル酸の関わる生物学現象とαシアリル化反応の化学に興味を持ち、ジノオリゴシアル酸の合成法の開発を開始した。まず、本研究の課題の解決のためには、高反応性のシアル酸糖供与体が必要であると考えた。本研究を開始した当時、シアル酸の5位アセトアミド基をN,N-ジアセトアミド¶、トリフルオロアセトアミド¶、アジド基¶などに置換したシアル酸糖供与体が、天然型の N-アセチル型の糖供与体と比較して反応性が向上するという知見が見出されていた。しかしながら、その理由は明らかにされていなかった。そこで、5位窒素置換基を種々変えたシアル酸糖供与体 8a-i のグリコシル化反応を検討し、その傾向を明らかにすることとした(図3)。6.77その結果、窒素置換基をグリコシル化反応条件に安定なN -Troc, N -Fmocなどのカルバマート基や、トリクロロアセチルやトリフルオロアセチルなどの電子吸引性置換基を有するアミド基に変えた場合において、シアリル化の効率が向上することを確認した。特に、糖供与体自身の合成とアセトアミド基への変換の容易さの観点より N-Troc 誘導体が有用であると考えた。本結果と同様の結果は、岐阜大の木曽先生、安藤先生のグループが我々より先に報告している8が、本結果は、我々も独自に進めた結果である。5位の室素置換基をアセトアミド基から変更することによるシアリル化の効率向上の理由については、現在のところ、はっきりしたことは分からないが、これまでの実験結果から推定すると、シアル酸糖供与体のグリコシル化反応の反応性は、アセトアミド基のカルボニルのオキソニウムカチオンに対する配位により低下しており、
カルボニルの配位能の低下した窒素置換基への変更により、反応性が向上していると考えている。続いて、N-Troc基を有する糖供与体と糖受容体を用いるα (2,8)オリゴシアル酸17の合成を検討した(図4)。 9チオグリコシド12を用いた際の8位水酸基へのシアリル化は低収率(36％)であった。続いて、Nーフェニルトリフルオロイミダート基を脱離基として有する糖供与体13を用いてグリコシル化の検討を行なった。この脱離基は、低温下活性化できるだけでなく、フェニル基の立体障害により脱離によって生成したアミドの再付加反応が抑えられるため反応性の低い糖受容体とのグリコシル化反応に適している特徴を有する。 10.11)その結果、中程度の収率および、α選択性でα (2,8)ジシアル酸15の合成に成功した。続いて、3量体17の合成を検討した。ジシアル酸15の8位水酸基を脱保護して得られた糖受容体16を用いて、先と同様の反応条件で、シアリル化反応を行なったところ、目的とする3糖成分は、わずかに6％程度得られるのみであった。この結果より、α (2,8)オリゴシアル酸は、糖鎖の長さに応じて、その反応性が著しく低下することが明らかとなり、新しいコンセプトのシアリル化反応が必要であると感じた。新しいα(2,8)シアリル化合成システムを考えるにあたり、α(2,8)シアリル化の問題点を再考した。他のαシアリル化と比較して、α(2,8)シアリル化の最大に問題点は、8位水酸基の反応性の低さにある。その結果、シアル酸糖供与体には、カップリング反応が起こる前に分子内の不活性化反応( β脱離)が引き起こされる。従って、α(2,8)シアリル化では、糖供与体としての反応性の向上だけでなく、8位水酸基の反応性の向上とβ脱離を抑える工夫が必要であると考えた。そこで、これまでの知見と合わせて、環状保護基を有するシアル酸ユニット18,20を用いるα(2,8)シアリル化合成システムを設計した(図5)。配座の規制された環状保護基のカルボニル基は、アノマー位および8位水酸基と相互作用することができない。したがって、糖供与体18としても糖受容体20としても、シアル酸の反応性の低下を抑えられると考えた。また、5、6トランスに縮環した糖供与体では、その環歪みのためオキソニウムカチオン19からのβ脱離が抑えられ、目的とするジシアル酸21が効率的に得られると期待した。α選択性の発現には、アセトニトリル効果を利用することとした。アセトニトリル効果とは、アセトニトリルを溶媒として用いてシアリル化を行なうと、アセトニトリルが、オキソニウムカチオンのβ面に配位し、その中間体19に対するS、2型の反応が進行し、αグリコシドを形成すると考えられているものである。121まず、環状保護基を有したチオシアル酸22のグリコシル化反応を検討した(図6)。192その結果、本糖供与体22では低温下、塩化メチレン溶媒中α選択的なグリコシル化反応が進行することを見出した。本糖供与体が、溶媒効果および、分子内の隣接基効果を用いること無く、アノマー効果に逆らったαグリコンドを構築できたことは特筆すべきことである。本反応の反応メカニズムは非常に興味の持たれるところであるが、現在のところ実験的な証拠を得るに至っていない。続いて、オリゴシアル酸の合成を目指し、糖受容体の検討を行った。その結果、8、9ジオール糖受容体23aを用いた場合に、目的とするα (2,8)二糖24aを高収率高立体選択的に得られることを見出した。5位の窒素をΛ-Troc基で保護した糖受容体23cに対するグリコシル化反応は、低収率低α選択性であった。その結果、環状保護基が8位水酸基の反応性の向上に効果的であることを明らかにした。さらに、α (2,9)シアル酸合成を目指し、環状保護基を有する8、9位水酸基が遊雕な糖受容体23dに対するグリコシル化反応を検討した結果、本糖供与体は、α (2,9)グリコシドの結次に本糖供与体を利用するα (2,8)デトラシアル酸 28 の合成を検討した(図7)。199得られたジシアル酸24aの8、9位クロロアセチル基を選択的に脱保護し、糖受容体25を得た。シアル酸3量化および4量化反応についても、良好な収率とα選択性で進行した。αグリコシド構造については、4量体の ³∑∑∑∑∑∑を測定することによって決定した。最後に、得られたα (2,8)テトラシアル酸保護体を脱保護および、5位窒素の保護基をアセチル基とすることにより、目的とするα (2,8)テトラシアル酸24の化学合成を達成した。本合成は、 α (2,8)テトラシアル酸の世界初の化学合成である。図7 α (2,8)テトラシアル酸の合成さらに、本糖供与体を利用して、α(2,9)テトラシアル酸2914.15)やジおよびトリシアル酸構造を含むc−シリーズガングリオシドGP1c糖鎖3016の合成を達成した(図8)。GP1c糖鎖の合成研究では、ガラクトース32ヘの3位水酸基へのαシアリル化には、アセトナイドで保護した糖供与体31が適していること、また8位水酸基へのαシアリル化には、クロロアセチル基で保護した糖供与体22が良い結果を与えることを明らかにした。本合成は、ガングリオ系列のc−シリーズガンリオシド糖鎖部の最初の化学合成である。本糖供与体によるシアリル化反応については、シアル酸の側鎖の保護基のシアリル化への影響や、糖受容体に対する適合／不適合など不明な点が多い。これらのメカニズムの解明は、今後の検討課題である。糖鎖抗体は、生体内外における糖鎖を分析する有用なツールである。オリゴシアル酸の生物学研究においても抗体の重要性は言うまでもない。これまでに、糖脂質上のオリゴシアル酸を認識できる抗体はいくつか知られている。しかしながら、現在のところ、タンパク質上のオリゴシアル酸を認識できる抗体は開発さ図9 （a)ネオ糖タンパク質を用いる既存抗体の特異性評価（b）A2B5モノクローナル抗体を用いたトリシアル酸含有糖タンパク質の発現解析れていない。その大きな理由として、タンパク質上のオリゴシアル酸の標準品が入手困難であることが挙げられる。そこで、名古屋大学農学部北島健教授、佐藤ちひろ准教授との共同研究として、合成したオリゴシアル酸を利用してオリゴシアル酸を含むネオ糖タンパク質を合成し、それを利用して既存の糖鎖抗体を評価し、タンパク質上のオリゴシアル酸を認識できる抗体の探索を行なうこととした。177ネオ糖タンパク質は、我々の手法を用いて末端にアミノ基を有するシアル酸含有糖鎖を合成し、活性化エステルとマレイミドを有するリンカーを用いてBSAと結合させることにより合成したネオ糖タンパク質を用いて抗体の評価を行った(図9-a)。その結果、糖脂質上のトリシアル酸を認識することが知られているA2B5モノクローナル抗体が、糖タンパク質上のトリシアル酸を認識できること明らかにした。さらに、マウス脳ホモジェネイトを本抗体を用いるウエスタンプロットにて解析したところ、胎児期においてトリシアル酸含有糖タンパク質を発現していることを世界で初めて突き止めた(図9-b)。現在、北島一佐藤グループにおいて、本抗体を用いる新規トリシアル酸含有糖タンパク質の探索、およびその機能解析研究が精力的に進められている。本研究では、従来化学合成によって供給することができなかったオリゴシアル酸の合成法の開発を行なった。その結果、環状保護基を有するシアル酸糖供与体が、従来の糖供与体に見られない高い反応性とα立体選択性を示すことを見出した。また、本糖供与体を用いて、α(2,8)テトラシアル酸およびc-シリーズガングリオシドGP1c糖鎖の合成に成功した。さらに、合成糖鎖誘導体を用いて既存抗体の結合特異性の評価を行なった結果、タンパク質上のトリシアル酸を認識できるA2B5モノクローナル抗体を見出した。さらに、本抗体を用いることにより、マウス脳ホモジェネイト中にトリシアル酸含有糖タンパク質が存在することを明らかにした。今後、本合成技術によって供給できる糖鎖およびそれによって評価した抗体を用いるオリゴシアル酸に関わる生物学的研究が進んで行くと考えている。謝辞:本研究にあたり御指導、御鞭撻をいただきました東京工業大学大学院理工学研究科高橋孝志先生に心から感謝いたします。また、抗体探索研究の共同研究を進めました名古屋大学生物機能開発利用研究センター北島健先生および佐藤ちひろ先生には深謝いたします。また、これらの研究成果は、高橋研究室の学生さんの日々の努力によって成し遂げられた成果であります。この場をかりて深く感謝いたします。 References. 1) Sato C.; Kitajima, K. Trends Glycosci. Glycotechnol. 1999, 11 , 371-390. 2) Boons, G.-J.; Demchenko, A. Chem. Rev. 2000 , 100 , 4539-4565. 3) Demchenko, A. V.; Boons, G.-J. Tetrahedron Lett. 1998, 39 , 3065-3068. 4) Komba, S.; Galustian, C.; Ishida, H.; Feizi, T.; Kannagi, R.; Kiso, M. Angew. Chem., Int. Ed. 1999, 38 , 1131-1133. 5) Yu, C.-S.; Niikura, K.; Lin, C.-C.; Wong, C.-H. Angew. Chem., Int. Ed. 2001 , 40 , 2900-2903. 6) Adachi, M.; Tanaka, H.; Takahashi, T. Synlett 2004, 609-614. 7) Tanaka, H.; Adachi, M.; Takahashi, T. Chem. Eur. J. 2005 11 849-862. 8) Ando, H.; Koike, Y.; Ishida, H.; Kiso, M. Tetrahedron Lett. 2003 , 44 , 6883-6886. 9) Tanaka, H.; Nishiura, Y.; Adachi, M.; Takahashi, T. Heterocycles , 2006 , 67 , 107-112. 10) Yu, B.; Tao, H. Tetrahedron Lett. 2001, 42, 2405-2407. 11) Tanaka, H.; Iwata, Y.; Takahashi, D.; Adachi, M.; Takahashi, T. J. Am. Chem. Soc. 2005 , 127 , 1630 -1631. 12) Murase, T.; Ishida, H.; Kiso, M.; Hasegawa A. Carbohydr. Res. 1988, 184, c1-c4. 13) Tanaka, H.; Nishiura, Y.; Takahashi, T. J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 7124-7125. 14) Tanaka, H.; Tateno, Y.; Nishiura, Y.; Takahashi, T. Org. Lett. , 2008 , 10 , 5597-5600. 15) Tanaka, H.; Nishiura, Y.; Takahashi, T. J. Org. Chem., 2009, 74, 4383-4386. 16) Tanaka, H.; Nishiura, Y.; Takahashi, T. J. Am. Chem. Soc., 2008 , 130 , 17244-17245. 17) Inoko, E.; Nishiura, Y.; Tanaka, H.; Takahashi, T.; Furukawa, K.; Kitajima, K.; Sato, C. Glycobiology, 2010, 20 , 916-928.村田亜沙子(むらたあさこ)大阪大学産業科学研究所精密制御化学分野(中谷研究室) 特任研究員amulata@sanken.osaka-u.ac.jpこの度は、生命化学研究レター「気になった論文」へ執筆の機会を与えていただきまして、誠に有り難うございます。私は現在、大阪大学産業科学研究所、中谷和彦教授のもとで研究を行っています。中谷研究室では、DNAの特異的な構造に結合する低分子リガンドの設計・合成や、その利用について研究してきました。最近は、RNA に結合する低分子化合物の開発なども行っており、それを用いた新しい転写・翻訳制御系の構築を目指しております。私は現在、RNAと化合物の相互作用を細胞内で調べるアッセイ系の開発を目指し、研究を進めております。そこで今回は、RNAを題材にした研究を3つ紹介したいと思います。1報目はRNAと化合物の相互作用を検出するプロープ・方法の開発、2報目はリボスイッチのリエンジニアリング、3報目は4塩基コドンの読み取り効率を上げる改変リボソームの開発についての論文です。 Y. Xie, A. V. Dix, Y. Tor, J. Am. Chem. Soc. 131 , 17605-17614 (2009)アミノグリコシド系抗生物質は、バクテリア16SリボンームRNA (rRNA)のA-siteに結合して翻訳を阻害します。図Aのように、アミノグリコンドはA-siteの小さなループ部分に結合し、A1492とA1493の立体配置を変化させます。アのForster距離は27 Âであり、アミノグリコシドがA-siteに結合した場合にU1406との距離が15 Â未満(X線結晶構造解析により)であることから、ドナーとアクセプターの間に効率よくFRETが起こるものと考えられます。クマリン誘導体２をコンジュゲートしたアミノグリコシドをA-site*に加えると、ドナー１の蛍光(at 395 nm)が減少していくとともに、アクセプター2の蛍光(at 473 nm)が増加しました。FRETにより、RNA-リガンドの結合を検出することができたと言えます。この状態の複合体にラベル化していないアミノグリコシドを加え
筆者らは、A-siteとアミノグリコンドの結合を、FRETを観測することによって検出できないかと考えました。そこで、蛍光性の核酸塩基誘導体(ドナー)をA-siteのアミノグリコンド結合部位の近傍(U1406)に導入しました（A-site*）。さらに、アクセプターをコンジュゲートしたアミノグリコシドを合成しました（図 B）。ドナーには、蛍光性ウラシル誘導体である5-methoxyquinazoline-2,4(1H, 3H)-dione 1、アクセプターには 7-diethylaminocoumarin-3-carboxylic acid  2を用いました(図B)。1の蛍光スペクトルと2の吸収スペクトルは、ほぼ完全にオーバーラップしており、優れたFRETペアと言えます。また、1・2ペると、ドナー1の蛍光が回復し、アクセプター2の蛍光が減少しました。 A-siteとアミノグリコシドの相互作用を調べる方法のひとつとして、2-アミノプリン(2-AP)をRNA配列中に導入する方法があります。2-AP は蛍光性のプリン誘導体であり、A-siteと抗生物質との結合を蛍光強度で検出・解析することができます。しかし、2-APの蛍光応答は抗生物質の種類によって異なり(例えば、2-APを導入したA-siteは、多くのアミノグリコシドの結合に応答するが、ネオマイシンには応答しないケースがあるなど)、それは抗生物質によって RNA への結合様式が異なるからと考えられています。一方、筆者らの方法では、RNAと抗生物質との結合がドナーとアクセプター間の距離情報に変換されるので、抗生物質の結合様式が異なることによる、蛍光応答性の違いを考慮する必要がないという利点があります。さらに、他のリガンドによる競合的な置換反応を検出できるのも優れた点であり、A-site に結合するリガンドの探索に利用できます。論文中で筆者らも述べていますが、FRETペアをつかう方法は、A-siteとアミノグリコシドの結合だけでなく、その他のRNAとリガンドの結合を検出するのにも適用可能であり、今後の応用が期待されます。 N. Dixon, J. N. Duncan, T. Geerlings, M. S. Dunstan, J. E. G. McCarthy, D. Leys, J. Micklefield, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 107, 2830-2835 (2010)リボスイッチは、2002年にR.R  Breakerらがその存在を実験的に証明して以来、生物学的意義が盛んに研究されています。そのような基礎研究とは別に、遺伝子発現をコントロールするツールとして、リボスイッチを使おうという研究も行われてきました。今回紹介する論文もそのひとつで、“ﾘボスイッチのリエンジニアリングにより、生体分子では動作しないが合成分子で動作する直交性リボスイッチを作った”という報告です。アデニンデアミナーゼ(adenine deaminase, add )アデニンリボスイッチ(以下add Aリボスイッチ)は、アデニンの非存在下ではリボソーム結合部位(RBS)と相補鎖を形成し、下流の遺伝子の翻訳が抑制されます。逆に、アデニンがAリボスイッチに結合すると、RBSがadd  Aリボスイッチとの相補鎖形成から開放されて翻訳がオンになります(下図はオン状態)。X線による結晶構造解析から、add Aリボスイッチとアデニンの結合にはU22、U47、U51、U74の4つのヌクレオチドの水素結合が重要であることが分かっていました。そこで筆者らは、U47、U51をランダムに変異させた変異体を作製し、合成分子によってオンになる変異リボスイッチをスクリーニングによって見つけようと考えました。U47、U51部分を変異させた15種類の変異体を作成し、 CAT (chloramphenicol acethyltransferase)遺伝子の上流に導入したプラスミドを作成しました。これを大腸菌に導入し、クロラムフェニコール耐性を指標に約80種類のヘテロ環化合物に対してスクリーニングを行いました。すると、アデニン存在下ではクロラムフェニコール耐性がない（＝翻訳がオンにならない）が、合成ヘテロ環化合物の存在下ではクロラムフェニコール耐性が獲得された、変異リボスイッチ-リガンドペアがいくつか得られました。なかでも“M6”という変異体(U47C, U51C)がammelineという化合物に良好なレスポンスを示すこと分かりました。興味深いことに、ammelineはadd  Aリボスイッチを動かさず、アデニンはM6を動かしませんでした(リボスイッチ-リガンドペアの直交性)。さらに筆者らは、ステム部分の塩基対を変えることにより変異リボスイッチの最適化を行い(G42AあるいはG42C/U28G、図1A参照)、変異リボスイッチとリガンドの結合をITCやX線構造解析などで詳細に調べています。この論文では、リボスイッチをたった2ヶ所変異させるだけで、合成分子では動作するが元々のリガンドである生体分子では動作しないリボスイッチに変えることに成功しました。add  Aリボスイッチとアデニンの複合体の構造がよく分かっていたこと、ライプラリー化合物の構造的な質(？)が成功のカギかもしれません。リボスイッチ-リガンドペアの直交性は、合成分子で動くリボスイッチをツールとして用いる場合に極めて有利な性質であり、他のリボスイッチでもこのようなリエンジニアリングができる可能性を示した興味深い論文だと思いました。 H. Neumann, K. Wang, L. Davis, M. Garcia-Arai, J. W. Chin, Nature , 464 , 441-444 (2010)非天然型アミノ酸を部位特異的にタンパク質に導入する方法のひとつとして、4塩基コドンに非天然型アミノ酸を割り当てる方法があります。しかし、リボソームは4塩基コドンの読み取り効率が悪く、効率を上げるように変異させると本来のmRNAを正確に翻訳することができなくなると考えられています。筆者らは以前に、SD配列やアンチSD配列を改変することにより、天然のリボソーム・mRNAペアと直交して働く、直交性リボソーム・mRNAペア(o-リボソーム・o-mRNA)を作り出すことに成功していました(図A、 Nat. Chem. Biol., 2005 , 1, 159-166)。o-リボソームは天然のmRNAを翻訳しないため、細胞本来の翻訳システムを邪魔することがありません。さらに彼らは、16S  rRNAのA-siteを改変し、o-mRNA上にあるアンバーコドン(UAG)の読み取り効率が向上した、o-リボソーム(ribo-X)を作りました(図B、Nat. Biotechnol. 2007, 25, 770-777)。今回彼らは、ribo-Xをさらに進化させ、4塩基コドンを効率よく読み取る新しいo-リボソーム“ribo-Q“を作りました。ribo-Qを利用して、タンパク質に2種類の非天然型アミノ酸を効率よく導入することにも成功しました。まず筆者らは、ribo-Xの16S  rRNA中のコドン読み取り部分に変異を導入したライプラリーを作りました（図C)。次に、”AAGA”コドンを読み枠に持つCAT遺伝子(o-mRNAとして転写される)をレポーターとして導入したプラスミドを作製しました。同プラスミド上には、AAGAコドンに対応するtRNAとしてtRNA gazz遺伝子も含まれます(図D)。これらo-リボソームライプラリー、レポータープラスミドを大腸菌に発現させ、クロラムフェニコール耐性を強く示した(AAGAコドンがインフレームで読まれた)クローンを単離しました。得られたo-リボソームクローン(ribo-Q1～4)では、天然のリボソームと比べて、4塩基コドンの読み取り効率が大幅に向上しており、翻訳の正確性も保たれていました。また、AAGA以外のコドン、例えばUAGA、AGGA、CCCUといった4塩基コドンの読み取り効率もo-リボソームやribo-Xより向上しました。さらに筆者らは、互いに直交する2つのtRNAシンテターゼ-tRNAペア、およびribo-Q1を用いて、2種類の異なる非天然型アミノ酸をタンパク質に導入することにしました。用いたのは、メタン生成古細菌Methanococcus jannaschiiのチロシルtRNAシンテターゼ-tRNAcua (MjTyrRS-tRNAcua)と、Methanosarcina barkeriのピロリジルtRNAシンテターゼ-tRNAcua(MbPyIRS-tRNAcua)という、2つの互いに直交するtRNAシンテターゼ-tRNAペアです。MbPylRSは、N6-[(2-propynyloxy)carbonyl]-L-lysine(C AK)をtRNAcuaに結合(アミノアシル化)できることが分かっていました。さらに筆者らは、 p-azido-L-phenylalanine (AzPhe)をtRNAuccuに結合できるようMjTyrRSを変異させ、AzPheRS-tRNAuccuペアを作製しました。これら直交するtRNAシンテターゼ-tRNAペアとribo-Q1を用いて、UAG、AGGAコドンがコードされたGST-カルモジュリンo-mRNAを翻訳し、GST-カルモジュリン融合タンパク質に、CAKおよびAzPheを導入することに成功しました。筆者らの方法は、天然のリボソーム・mRNAと直交するシステムであるため、細胞本来の翻訳システムを阻害しません。さらにo-リボソームを進化させ、4塩基コドンを効率よく読めるようしたことで、直交するtRNAシンテターゼ-tRNAペアを使って懐々な非天然型アミノ酸をタンパク質に導入できる可能性が生まれました。気に変っ危論交高山健太郎（たかやまけんたろう）京都大学化学研究所生体機能設計化学研究領域、博士後期課程３年K.Takayama@f06.mbox.media.kyoto-u.ac.jpこの度は、生命化学研究レターの論文紹介への執筆機会を頂き、心より感謝致します。現在、私は京都大学化学研究所の二木史朗教授指導の下、効率的に細胞内へ移行するアルギニンペプチドの開発に取り組んでおります。アルギニンペプチドは細胞膜透過性ペプチド(CPP)の一種で、膜透過性の低い化合物(タンパク質、核酸誘導体、リポソームなど)の細胞内導入ツールとして近年注目を集めており、現在、生理活性ペプチドに CPP を繋げて膜透過型としたペプチドが多く市販されています。今回は、細胞内で特定の分子同士の相互作用を制御するペプチドをアルギニンペプチドにより細胞内へ導入し、機能変化をもたらすこと示した論文を３報紹介させて頂きます。アルギニンペプチドの中でもよく知られているHIV-1 Tatタンパク質由来ペプチド(Tat)を用いた論文2報、アルギニンのみ9残基が連なったR9ペプチドを用いた論文1報で構成させて頂きます。 Disruption of protein kinase A localization using a trans-activator of transcription (TAT)-conjugated A-kinase-anchoring peptide reduces cardiac function. Patel, H.H.; Hamuro, L.L.; Chun, B.J.; Kawaraguchi, Y.; Quick, A.; Rebolledo, B.; Pennypacker, J.; Thurston, J.; Rodriguez-Pinto, N.; Self, C.; Olson, G.; Insel, P.A.; Giles, W.R.; Taylor, S.S.; Roth, D.M. J. Biol. Chem., 285, 27632-27640 (2010).まず、プロテインキナーゼA (PKA)とAキナーゼアンカータンパク質(AKAP)との相互作用を阻害するペプチド(AKAD)の細胞内導入に関する論文を紹介させて頂きます。 cAMP 依存的に活性化した PKA が、多くの下流標的タンパク質をリン酸化することは周知のことですが、近年、AKAPによるPKAアンカリングが、cAMP応答に重要であることが明らかとなってきています。 PKAシグナル研究は数多く行われており、心臓に関しては、細胞レベルでAKAPを介したPKAアンカリングの重要性が確認されています。しかしながら動物レベルでは、環状ヌクレオチドアナログやキナーゼ阻害剤を用いたシグナル研究の報告はあるものの、これらは PKA 局在に関する情報を何も与えません。そこで本文献では、インタクトな心臓や組織レベルで未だ示されていない、シグナル伝達におけるAKAP-PKA相互作用の重要性に関する知見を得ることを目的とした検討を行っています。 PKAは、触媒サプユニット(C) 2つと調節サプユニット(R) 2つで構成されています。Rは、Cの活性部位への結合と共に AKAPとの結合も担っており、type  I、 IIの二種のアイソフォーム(PKA-RI,  -RII) に分けられます。筆者らは、これら両方のア図1． Tat-AKAD 投与時におけるマウス左心室圧トレーシング (論文イソフォームに対して高い結合より一部改変)活性(K α = 3.5 nM, 2.7 nM)を有する19残基のペプチド(AKAD)を創出しました。一方、AKADスクランプル配列ペプチド(AKADscr)はPKA-RI、-RIIに対して結合活性を示しませんでした。膜透過ドメインとしてTatペプチドを繋げたTat-AKADの心筋細胞への投与により、PKAアンカリングが阻害され、下流の標的タンパク質であるトロポニンＩやホスホランバンのリン酸化は抑制されました。また、単離したラット心室筋細胞に対する投与では、細胞の短縮振幅の減少、収縮および拡張最大速度の減少が見られました。さらにマウス灌流心臓に対する１μM Tat-AKAD投与時における左心室圧トレーシング（図 1)により、心拍および左心室最大圧は減少し、これらの効果はイソプロテレノールによるβ刺激時においても有意に観察されました。Tat-AKAD による PKA アンカリング阻害は、心臓に対して陰性変時・変力作用などの効果を示すことから、心臓疾患の研究や治療への貢献が今後ますます期待されます。 Modulation of the protein kinase Cδ interaction with the ''d'' subunit of F 1 F 0 -ATP synthase in neonatal cardiac myocytes: development of cell-permeable, mitochondrially targeted inhibitor and facilitator peptides. Nguyen, T.T.; Ogbi, M.; Yu, Q.; Fishman, J.B.; Thomas, W.; Harvey, B.J.; Fulton, D.; Johnson, J.A. J. Biol. Chem. , 285 , 22164-22173 (2010).次に、プロテインキナーゼCδ (PKCδ)とFıF o-ATP合成酵素dサプユニット(dFıF o)との相互作用を阻害するペプチド、及び促進するペプチドの細胞内導入に関する論文を紹介させて頂きます。 F 1F 0-ATP合成酵素は、ミトコンドリアにおいてATP合成を担う代表的な酵素複合体で16サプユニットで構成されます。心臓は大量の ATP を消費するにもかかわらず、顕著な ATP レベルの変化が見られません。これはF 1 F 0 -ATP合成酵素が、増加したATP消費に対して非常に柔軟な応答を行っているためで、基質が関与した制御だけでなく、キナーゼなども関与した制御機構の存在が考えられました。近年、心筋プレコンディショニング(PC)時や虚血再灌流(IR)障害時におけるPKCアイソザイムの役割が注目を集めています。これまでに筆者らは、PKCδがdF 1F 0との相互作用を介してF 1 F 0 -ATPアーゼ活性を制御し得ることを見出しています(Nguyen et al., J. Biol. Chem. 2008)。本文献では、PKCδとdF₁F⁰との相互作用を阻害もしくは促進するペプチドを細胞内へ導入し、F i F o -ATPアーゼ活性を制御可能か検討しています。 [NH 2 - 3 AGRKLALKTIDWVSF 16 - COOHI H.-'''RVREYEKOLEKIKNMI' 26-COOH1筆者らは、161残基から成るdF 1 F 0全てをカバーする14種のペプチドを合成し、PKCδ-dF 1 F o相互作用に対する影響を評価したところ、濃度依存的に相互作用を阻害するdF₁F₂(2-16)ペプチド、及び促進させるdF₁F⁰(111-126)ペプチドの、逆の効果を発揮する図2. dF 1 F 0由来ペプチドによるPKC δ-dF 1 F 0相互作用の制御（論文より一部改変) 2つのペプチドを発見しました(図2)。dF₁F⁰(2-16)、 dF₁F⁰(111-126)ペプチドにTatおよびミトコンドリア移行配列を繋げたペプチドをそれぞれ Inhibitor、Facilitator とし、活性の維持とミトコンドリア移行性を確認しました。また、dF 1 F o (2-16)スクランプル配列ペプチドには活性がないことも確認されました。新生ラット心筋細胞を用いた検討において、フォルボールエステルの一種である4β-PMA処理はPKCδ–dF₁F⁰相互作用を誘導し、F i F o -ATPアーゼ活性を阻害することが既にわかっています。今回、Inhibitorの投与はPKCδ-dF₁F⁰相互作用を阻害し、4β-PMA処理によるF₁F⁰-ATPアーゼ阻害を有意に減弱させました。一方、Facilitator は単独で PKCδ−dF₁F。相互作用を濃度依存的に誘導し、F₁F⁰−ATP アーゼ活性を阻害しました。PC時やIR障害時におけるFiF。複合体の明確な役割は未だ完全には理解されておらず、これらのペプチドが今後の研究の進捗へ寄与していくことが期待されます。 Grasis, J.A.; Guimond, D.M.; Cam, N.R.; Herman, K.; Magotti, P.; Lambris, J.D.; Tsoukas, C.D. Mol. Cell. Biol., 30, 3596-3609 (2010).最後に、IL-2 誘導型 T 細胞キナーゼ SH3 ドメイン (ITK-SH3) とアダプタータンパク質 SLP-76 のプロリンリッチ領域(SLP-76PR)の相互作用を阻害するペプチド(QQP)の細胞内導入に関する論文を紹介させて頂きます。 ITKは、白血球の成熟や活性化に重要な役割を果たすTecファミリーチロシンキナーゼの1つであり、胸腺細胞の選択やTh2応答制御を行っています。SrcファミリーキナーゼLCKにより活性化されたITK は、ホスホリパーゼ C-γ1 をリン酸化し、サイトカイン産生などの生物応答に関わる下流シグナルを制御しています。 ITK の活性化には、SLP-76 や LAT などのアダプタータンパク質が必要であると言われています。これらは ITK の SH2、 SH3 ドメインを介して相互作用しており、この相互作用が ITK 活性化に重要であると推察されますが、詳細は未だ確認されていません。そこで筆者らは、SLP-76PR (184-195)由来の12残基から成るペプチドQQPと膜透過ペプチドR9を繋げたR9-QQPペプチドを用いて、ITK-SH3とSLP-76PRとの相互作用の生物学的重要性を探りました。筆者らはまず、R9-QQPがJurkat T細胞内へ移行し、 ITK-SH3とSLP-76PRとの相互作用を特異的に阻害することを確認しました。また、QQPスクランプル配列ペプチド(R9-SCR)およびR9ペプチドは相互作用に影響しないことも確認されました。抗CD3ε抗体コートビーズを用いたＴ細胞刺激時に、細胞内に散在している ITKや SLP-76 はビーズGADS接触部位へリクルートされ、ITKの511残基目のチロシンがLCK によるリン酸化を受けます。それと共に、ビーズ接触部位においてアクチン極性化が誘起されます。R9-QQPの前処理により、ITKのリクルートおよびリン酸化、アクチンの極性化が有意に阻害されました。なお、SLP-76のリクルートは影響を受けませんでした。また、マウスの脾臓リンパ初代培養細胞および牌細胞においても、R9-QQPの前処理によりITKのリン酸化図３．R9-QQPマウス腹腔内投与時におけるSLP-76との相互作用阻害(A)が阻害されました。さらにマウス脾細胞において、ITK が制御及びTh2サイトカイン発現阻害(B)しているTh2サイトカイン(IL4、IL-13、IL-2)の発現および分(論文より一部改変)必はR9-QQP処理により有意に抑制されましたが、Th1サイトカイン(IFN-γ)の発現・分泌への影響は見られませんでした。最後に、R9-QQP 20 mg/kgをマウス腹腔内へ２回(脾細胞採取24時間前および30分前)投与後、脾細胞を採取し、ITK活性化に対するR9-QQPの効果を検討しました。細胞レベルでの検討と同様、R9-QQPはITK-SH3とSLP-76PRとの相互作用を特異的に阻害し、ITKのリン酸化、Th2サイトカインの発現・分泌も特異的に阻害しました(図3)。ITK-SH3とSLP-76PRとの相互作用の生物学的重要性が初めて確認されたことから、この相互作用がアレルギー治療戦略の新たなターゲットの1つとなるのではないでしょうか。
名古屋大学大学院工学研究科・名古屋大学革新ナノバイオデバイス研究センター渡辺将生･鏡味幸真･加地範匡･岡本行広･渡慶次学･馬場嘉信名古屋大学医学部湯川博・宮本義孝・林衆治(watanabe.masaki@b.mbox.nagoya-u.ac.jp) 1.はじめにさまざまな優れたプロープの登場により、生命現象をありのまま捉えるin vivoイメージングの発達が目覚ましい。現在では多くのin vivoイメージング手法が存在するが、本稿では蛍光イメージングに焦点を当て、最近の蛍光プロープ研究や検出機器、観察に際しての要点を概観する。また、in vivo蛍光イメージングの例として、我々の行った幹細胞移植治療に関するイメージング実験について紹介する。生体を破嫌することなく、生きたまま生体内での現象を捉える”in vivoイメージング”は、手法・対象ともに大きな広がりを見せている。生命科学分野の基礎研究のみならず、臨床現場における診断においてin vivoイメージングは欠かせないツールとなっている。現在臨床で利用されているものとしては、X線を用いたレントゲンおよびX線CT(X線コンピュータ断層撮影)、磁気を用いたMRI(核磁気共鳴画像)、超音波を用いた超音波検査などが挙げられる。また、最近では陽電子を用いたPET(陽電子放射断層撮影)によるがん診断も行われている。診断・検査を非侵襲に行うことで外科的処置を少なくし、患者の肉体的・精神的な負担を減らすことはQOL(クオリティ･オプ･ライフ)の観点から非常に重要であるため、このような技術は今後も発展を続けることが予想される(表1)。一方で、蛍光や発光といった光を対象とする計測技術は、これまで生命科学の発展に大きく寄与してきた。とりわけ、蛍光イメージングについては2008年のノーベル化学賞に緑色蛍光タンパク質の業績が取り上げられるなどその重要性は記憶に新しい。近年では、蛍光タンパク質にとどまることなく、細胞内の環境を反映してその蛍光波長・蛍光強度などが変化する”Smartな”蛍光色素が作製されている。例えば、周辺環境が一定のpHに達した場合にのみ特定の蛍光波長を持つ蛍光色素を利用してがんを高感度に検出する技術かなど、このような外部環境応答型の蛍光色素がもつ可能性は大きい。さらに後述するように、蛍光プロープとして半導体や金属のナノ粒子である量子ドットを用い、その光学的特徴を活かした蛍光イメージングによる高感度検出などが多数行われている²°)。このような背景の下で、蛍光を用いたin vivoイメージングは急速な発展を遂げている。これまで蛍光in vivoイメージングの障壁となっていたのが、励起光照射した生体からの自家蛍光と、生体組織による散乱・吸収による深部でのイメージングの困難さである。この両方の問題を克服するためには、自家蛍光を少なく、なおかつ生体組織による散乱・吸収と血液・水による吸収が起こりにくい波長領域である近赤外波長(およそ700〜900 nm)でのイメージングが必要であるり。そのため、現在では近赤外領域に蛍光極大をもつ蛍光プロープだけでなく、イメージング装置の開発も飛躍的に進んでいる。CRi社製のMaestro™は、液晶同調フィルターを搭載することにより自家蛍光と目的蛍光波長の確実な識別が可能であり、マルチ測定も達成される。Shimadzu社製のClairvivo  OPTは、近赤外領域の半導体レーザーにより深部観察を可能とし、実験動物の5方向同時測定も可能である。Caliper社製のIVIS® Spectrumは、落射および透過による2種類のイメージングモードをもち、3Dイメージングを可能とする。今回筆者らは、近赤外波長に蛍光極大を持つ量子ドットを利用し、移植した幹細胞の集積部位の検出
量子ドット(Quantum Dots: QDs)は、金属や半導体で出来た直径1～20nm程度のナノ粒子であり、さまざまな光学的特徴を持つことから有用な蛍光材料として注目されている。無機結晶のエネルギー準位は、バルク状態ではバンド構造をとるが、そのサイズを数nmまで小さくすると、結晶体のエネルギー準位は量子サイズ効果によって、原子のように離散的な値をとるようになる。このような状態となった粒子が量子ドットであり、結晶サイズの制御によってエネルギーギャップを変化させることが可能なため、同一材料であっても粒子サイズによって蛍光波長を変化させることが出来る。つまり、半導体材料とサイズの選択により、in  vivo蛍光イメージングに適した近赤外波長に蛍光波長をもつ量子ドットを作製可能なため、in vivo蛍光イメージングにおいては非常に有望視されている。また、量子ドットは広い吸収バンドを持つため、単一の励起波長で多色の蛍光を得ることが可能である。その他、量子ドットには、量子効率が高い、蛍光スペクトルが対称である、光退色しにくい、などの特徴も挙げられる13,14 )。このような特性を活用し、これまでにin vivoの領域では腫瘍19 、リンパ流域16 、センチネルリンパ節17などのイメージングが達成されてきた。また、このようなin vivoイメージングに適した量子ドットは市販もされており、Invitrogen社によって製造・販売されているQdot®はCdSe/ZnSおよびCdSeTe/ZnSのコア/シェル型量子ドットで表面にポリマーコーティングが施されたものである。筆者らは、この製品を用いて後述の実験を行った。今回、モデル系として脂肪組織由来幹細胞(Adipose tissue-derived Stem Cells: ASCs)の幹細胞移植治療を選択した。ASCsは幹細胞の中でも低侵襲かつ容易に獲得できるため、骨髄由来幹細胞などの代替として注目されている189。応用例として、急性肝不全モデルマウスに対して抗血液疑固剤のヘパリンと共にASCsを尾静脈移植すると、症状が改善するといった報告がある199。ただし、この際に移植したASCsの体内分布・挙動は明らかになっておらず、幹細胞移植治療のメカニズム理解のためにASCsの標識・移植後の可視化が望まれている。筆者らはこれまでに、カチオン性リポソームとアニオン性QDsを用い、ASCsを標識する手法を見出してきた201。しかし、カチオン性リポソームによる毒性が比較的低濃度の使用でも見られることが問題であった。本研究では、高い膜透過性を有するペプチドであるオクタアルギニン(R8)²¹をQDsの輸送ベクターとして用い、カルボキシル基修飾QDsをR8により導入したASCsの特性について調査を行った10。更に、マウスの皮下および尾静脈より移植した際のin vivoイメージング実験を行った。 4.1. in vitroでの標識および細胞毒性の検討標識細胞に対し、プロープを毒性なく導入することは必須である。まず、一定濃度のQDs655(2  nM、極大蛍光波長655 nm)に対しR8濃度を変化させて複合させ、それぞれASCsへと導入を行った後に蛍光顕微鏡で観察を行った。R8濃度に対する蛍光強度の依存性を確認した結果、ASCsへの導入に関してQDsとR8の濃度比は1:1×10が適切であると考えられる(図1)。さらに、導入に要する時間を確認するため、標識に際してQDs由来の蛍光を経時的に測定したところ、およそ1時間で標識可能であることが分かった。
次に、QDs-R8複合体の濃度を0から24 nMまで変化させ、48時間導入した際の細胞生存率を測定した。その結果、8 nM以下では細胞生存率に変化は観察されなかった(図2-1)。更に変化が見られなかった濃度域において増殖試験を行ったところ、QDs-R8複合体を導入したASCsにおいても通常のASCsと同様の増殖速度が確認された(図2-2)。これらのことから、8  nM以下においてQDs-R8複合体はASCsの生存・増殖へ悪影響を及ぼさないと言え、イメージングに用いることが可能な標識濃度域が決定された。 2) 毒性の無いQDs濃度域でのQDs標識化ASCsの増殖変化4.2. in vivoイメージングQDs-R8複合体にて標識したASCsをPBS(リン酸緩衝食塩水)に懸濁させ、マウス後背部の皮下へと移植し、in  vivoイメージング装置Maestro™にて蛍光観察を行った。QDsの利点を生かした多重イメージングの基礎検討として、標識には3種類のQDs(QDs655、QDs705、QDs800)を用いた(それぞれ極大蛍光波長655、 705、800 nm)。その結果、どのQDsで標識したASCsもコントラスト良く観察することが可能であり、多重イメージングへの応用が示唆された(図3)。さらに、尾静脈から移植したASCsの集積箇所を検出するため、QDs800標識したASCsをマウス尾静脈より移植し皮下移植の場合と同条件で蛍光観察を行った。 ASCs移植の10分後に開腹観察した結果、QDs800由来の蛍光がマウスの肺より確認された(図4)。更にヘパリン併用の下で同様の移植を行った場合では、肺だけでなく肝臓からもQDs800由来の蛍光が観察され、ヘパリンの併用によるASCsの肝臓への集積向上が示唆された。のイメージング結果(白:自家蛍光、緑: QDs800-ASCs)蛍光によるin vivoイメージングの概略と、量子ドットを用いた応用例として移植幹細胞のイメージング実験について示した。前述したように、in  vivo蛍光イメージングにおいては近赤外領域での観察をはじめ、プロープの生体毒性や機器の選択などを十分に考慮する必要がある。近年ではCCDの感度が向上する中で、安価で短時間に行える蛍光イメージング技術は今後ますます発展するものと思われる。特にナノ粒子を基盤とした蛍光プロープのもつ可能性は大きく、急速に広がりを見せる再生医療研究や、超高感度検出などの分野において重要な役割を果たすと考えられる。参考文献1) Y. Urano et al, Nat. Med. , 15, 104 (2009) 2) R. Bakalova et al., Nanotechnologies for the Life Sciences , Wiley-VCH, 175 (2007) 3) N. Kaji et al., Chemical Record , 7, 295 (2007). 4) R. Bakalova et al., Nature Biotech., 22, 1360 (2004). 5) R. Bakalova et al., J. Am. Chem. Soc. , 127, 11328 (2005). 6) R. Jose et al., J. Am. Chem. Soc. , 128, 629 (2006). 7) R. Weissleder, Nat. Biotechnol. , 19, 316 (2001) 8) J. V. Frangioni, Curr. Opin. Chem. Biol., 7, 626 (2003) 9) S. A. Hilderbrand et al., Curr. Opin. Chem. Biol. , 14, 71 (2010) 10) H. Yukawa et al., Biomaterials , 31, 4094 (2010) 11) Monya Baker, Nature , 463, 977 (2010) 12) M. A. Hahn et al., Anal. Bioanal. Chem. (2010) 13) I.L. Medintz et al., Nat. Mater. , 4, 435 (2005) 14) V. Biju et al., Anal. Bioanal. Chem. , 391, 2469 (2008) 15) X. Gao et al., Nat. Biotech., 22, 969 (2004) 16) H. Kobayashi et al., Nano Lett., 7, 1711 (2007) 17) S. Kim et al., Nat. Biotech., 22, 93 (2003) 18) H. Yukawa et al., Cell Transplant., 17, 43 (2008) 19) H. Yukawa et al., Cell Transplant. , 18, 611 (2009) 20) H. Yukawa et al., Cell Transplant. , 18, 591(2009) 21) S. Futaki et al., J. Biol. Chem., 276, 5836 (2001)
九州大学大学院工学研究院化学工学部門星野友(yhoshino@chem-eng.kyushu-u.ac.jp)私は、2006年に東京工業大学の岡畑恵雄教授の研究室にて博士号を取得してから、2010年の9月に九州大学の三浦佳子先生の研究室の助教に着任するまでの4年半の間、米国のカリフォルニア大学アーバイン校のKenneth  Shea教授の研究室で研究活動を行いました。その間、米国アカデミックの激しい生存競争や産学連携、さらには家族の出産までを体験することが出来ました。これらの経験談が今後世界で活躍される若い方々の参考になればと思い体験記にて報告させていただきます。私は博士3年の時に、日本学術振興会の研究員に採用していただくことが出来ました。学振研究員の契約が一年残るので、卒業後は学振研究員として海外に行くことを希望しました。今考えるとのんきなものですが、当時は、海外に行った後、日本のアカデミックに戻るのか、企業に就職するのか、そのまま海外で生活するのか特に決めていませんでした。しかし、全く新しい環境に身を置けば何か実力がつくような思いを強く持っていました。留学先は岡畑恵雄先生の紹介でカリフォルニア大学アーバイン校のKenneth  Shea研究室に行くことに決めました。岡畑先生からは『ケン(Kenneth Shea)教授は絶対に裏切らない義理深い男だから信用していい』とだけ言われ、研究内容にはこだわらずに留学先を決断しました。父からは電話で『アメリカに行くのだったらしっかりサバイプしてこい』とだけ言われ、ずいぶんとやる気満々で日本を発った記憶があります。最初の1〜2年は無我夢中でとにかく仕事に明け暮れました。当時、米国はイラク戦争の煽りを受けて未會有の研究費削減が行われており大学では皆研究費獲得に苦心していました。隣の研究室のPIも私が渡米してすぐ研究費が枯渇してコンサルタントへの転職を余儀なくされていました。ケン教授の研究室もしばらく大きな研究費を取れず大幅なリストラを行っていました。渡米時3人居たポスドクも毎年減少し、渡米1年半後には私一人になってしまいました。米国アカデミックの厳しい生存競争を目の当たりにし、明日は我が身という緊張感が常にあったように思います。私は最初の一年で学振研究員の契約が終了するので、渡米してすぐに契約交渉を行わなくてはいけなくなりました。ケン教授からは学振と同じ条件で契約更新をするという口約束を貰っていましたが、一向に書面の契約を交わすことは出来ず、滞在期限の一ヶ月前にやっと契約内容を書面にして見るとかなり条件が悪化していました。しかし、当時独身だったこともあり、研究費が足りない中で雇用してもらっているだけでも有り難いと考えて、この条件で6ヶ月毎に契約更新を続けました。6ヶ月で契約更新というのはしんどい話で、契約をして数ヶ月後には次の契約の交渉をしなくてはいけませんでした。しかし、研究室全体として文句を言って条件を改善できる状況ではなかったので、研究室の状況を好転させることだけを考えていました(多くの日本人は行いませんが、米国では契約更新の際貨金や契約期間、保険等の雇用条件を交渉することが可能です)。偶然私は学生の時に、東京大学の菅裕明先生が執筆された『切磋琢磨するアメリカの科学者たち』という本を読み、米国に行ったら是非とも研究費を申請してみたいと考えていました。そこで、研究費を申請してみたいという話をケン教授にしてみたところ、ケン教授は賛成し、NIHのシステムや研究費申請の学内での事務等様々なアドバイスをしてくれるようになりました。しかし、米国内では永住権を持たない私が申請できる研究費の数は非常に限られている上に、慣れない英語で20ページ近くの研究費申請書を作成するのは非常に骨が折れる仕事でした(今思うと米国での研究成果がほとんど出ていない状況で研究費を獲得するのは無謀な挑戦だったのかもしれません)。また、同時に日本の研究費にも申請をしようと考えたのですが、日本の研究費も海外からは応募できない物がほとんどなので応募できる研究費の数は盆々絞られ研究費獲得は困難を極めました。振り返ってみるとこの頃が精神的に最もタフで最も成長できた時期だったと思います。 (研究室の7割以上が中国人を初めとした留学生)私は、恩師の岡畑先生の影響もあって学生時代からバイオベンチャーに憧れており、大学院の時にも友人と企業の立ち上げを行った経験がありました。それが縁で渡米当初からシリコンバレーのバイオベンチャーを訪問し、様々な方と交流していました。そのことを知っていたケン教授はある日、研究費獲得の方法の一つとして、学内のビジネスプランコンペティションに出てみないかと連絡してきました。(アメリカの大学では、サイエンス系の学部とMBAスクールが交流してハイテクイノベーションを起こす事を目的としたビジネスプランコンペティションが多く行われている)。そこで単身コンペティションのキックオフミーティングに参加し、参加者の前で自分の研究テーマを題材にした事業計画を発表してみました。すると、必死さが通じたのか、下手な英語の発表にもかかわらず、MBAの学生を含めた賛同者が集まり、チームを結成することが出来ました。その後このチームで事業計画を立案し投資家の前で発表することになるのですが、チームで事業計画を立案するにも私は英語が下手な上にビジネス用語を全く知らなかったのでメンバーと上手くコミュニケーションを取ることができず非常に苦労しました。それでも何とかチームで事業・研究計画書の作成と計画発表まで漕ぎ着け、セミファイナルまで進むことが出来ました。結果、残念ながらコンペティションでは研究賞金の獲得に至りませんでした。しかしその後、私達の計画を見た日本の企業から研究資金を出資して頂けることになりました。企業との共同研究が決まってからは、大学の知財部との企業の間に入って契約交渉を行う必要に迫られましたが、ここではコンペティションで培ったコミュニケーション力を生かし様々な経験を積むことが出来ました。これらの経験を通じて、米国の公立大学の産学連携の現場(実情・課題)を見ることが出来たのは今後日本で研究活動を行う上で非常に良かったと思います。さらに人の紹介を通じて様々な分野の先生方と知り合う機会に恵まれたので、多くのディスカッションを通じて自分の研究を多角的に見直す良い機会になりました。ビジネスプランコンペティションに参加したのチームメンバーこの出資と前後してケン先生と申請していたNIHの研究費も採択され、落ち着いて研究に集中できる環境が整いました。私の契約条件も大幅に改善し、ずいぶんと余裕を持って生活をする事が出来るようにもなりました。そして何よりも、最後の1〜2年は研究室内で学生数名と新たに雇用したポスドク一名で小グループを作り、チームリーダーとして研究に集中する環境を与えていただくことが出来ました。海外留学に関連して余り語られませんが、案外重要なのは保険や年金、家族の生活等の問題です。私の場合渡米直後は、保険や将来に対する心配を全くしない自由奔放な独身生活を送っていました。しかし2〜3年目に結婚と出産という大きなイベントを続けざまに経験し、これらの問題を無視できない状況になりました。特に、医療保険システムは各国全く異なっているので、甘く見ていると家族の出産や病気の時に取り返しのつかないことになります。ご存じの通り米国では社会保険制度が脆弱で、無保険者は重病人でも医療を受けることは困難です。そこで、便利だったのが下記に挙げた様な現地の日本人コミュニティーを通じた情報収集です。全米の主立った地区には下記に示すような日本人の研究者コミュニティーが存在します。そこで先輩研究者から日本語で保険や生活の問題のアドバイスを頂くことができ、出産時にも大いに助けていただきました。また、同じような境遇の日本人家族との交流を持つことで家族もずいぶんと安心して米国生活を満喫できたようです。さらに、この様なコミュニティーでは大概、参加者が持ち回りで自身の研究発表を行うので様々な分野の研究者と知り合い、議論し、知識の幅を増やすことが出来ます。 Southern California Science Network    http://www.scsn.us/ Southern California Japanese Scholars Forum http://www.scjsf.org/pastevents.html Life Science in Japanese     http://lsjapan.exblog.jp/ Japan Bio Community http://www.j-bio.org/ボストン日本人研究者交流会  http://www.boston-researchers.jp/wp/東工大北米ネットワークhttp://sites.google.com/site/tokyotechus/home以上のように4年半の米国生活を振り返ってみると、留学前に想像できないくらい多くのことを経験し成長することが出来たと思います。言語が通じない中での競争は非常に大きなストレスを伴いますが、フェアなシステムの中での生存競争は貴重な体験でした。また、留学で得た経験や人脈も今後の人生においてかけがえのない財産になりました。今後研究者を目指す若い読者の方々には、一度留学をされることを強く勧めます。また、折角留学されるのであればお客様気分で日本に帰国する事だけを考えるのではなく、一族揚げる心づもりで何年か腰を据えて仕事をしてみることをお勧めします。米国では、世界各国からの留学生が、個々の能力とネットワークをフル活用して勝負をしています。今後日本のアカデミックをより一層盛り上げるためにも、本稿を読んで一人でも多くの若い日本人が留学に興味を持ち、この競争の中に身を置いてグローバルに勝負できる生命力を身につけて頂ければと思います。かけがえのない経験をさせていただいた、Kenneth Shea教授を初め、様々な面からサポートしていただいた岡畑恵雄先生、日本学術振興会や(株)イニシアムの小関博士や(株)資生堂の柳澤様にはこの場を借りて深くお礼申し上げます。 (短い紙面の中では、伝えきれない事が沢山ありますので、留学に関して質問したい方がもしいましたらメール下さい。) (左)豪華なKenneth Shea教授宅(日本で言う職員宿舎！？)でのバーベキューパーティ風景。 (右)近所の海岸で家族との一コマ。座長　築地　真也（長岡技科大産学融合セ） 10:25-10:50「タグ・小分子プロープペアを用いたタンパク貨特異的ラベル化法の新展開」(九大院薬)王子田　彰夫10:50-11:15 「遺伝子の機能発現を光制御するケージド化合物の開発」(東邦大理)古田 寿昭11:15-11:40 「蛍光センサーによる単一細胞内イノシトールポリリン酸代謝動態の解析」(京大エネ研)森井　孝座長　清中　茂樹（京大院工） 11:40-12:05 「トロンボポエチンシグナルの脂質ラフトによる制御」(東大院薬) 船津  高志12:05-12:30 「磁気共鳴による細胞計測手法の開発」(京大院工)白川昌宏(情報提供：浜地　格)会員の皆さんよりお寄せ頂いた会告です。奮ってご参加下さい。会期：2011年3月26日（土）- 29日（火）会場:神奈川大学横浜キャンバス（横浜市神奈川区六角橋3-27-1)繼官近年，生命現象の分子レベルの理解において，過渡的に形成される生体高分子の動的複合体の重要性が強く認識され，我が国でも昨年度より「過渡的複合体」の理解を目指した科研費:新学術領域研究もスタートした。NMRやX 線構造解析などの構造解析や種々の分光学, 蛋白質や核酸の精密合成などの化学技術は,この領域に大きな貢敵をしてきたが，これまでは精製/再構成された系での解析が限界であり,生体分子が真に機能する細胞や組織でのリアルで動的な状態での理解への貢献は不十分であった。本企画では，有機合成，ケミカルバイオロジー，生体機能化学及び構造生物学，一分子計測の第一線研究者に，このような限界を超える新しい手法について紹介いただき,動的な生体分子複合体の理解を加速する化学的アプローチの可能性について，参加者とともに議論する。実施日 3月26日 午前SEN繼官　創薬がバイオ医薬に流れが移りつつある中で,合成低分子による医薬品開発は,様々な分析装置あるいは分注装置の高度化，先端化を受け，新しい挑戦の段階に入っていると言ってよい。一方，最近10年の生命化学領域における著しい成果は,生命科学研究の新しい時代を拓こうとしており，その出口として，次世代創薬の潮流が産まれてきている。そうした背景のもと，創薬領域における化学者の位置づけは今後もますます高まっていくものと考えられる。そこで，本企画では，バイオ医薬時代における低分子創薬とその周辺領域に新しい流れをもたらしている研究者に，最先端研究動向をご紹介いただき，生命化学の新たな挑戦について議論する。実施日 3月26日午後プログラム9:30- 9:35   趣旨説明（京大院工）浜地  格座長　浜地　格（京大院工) 9:35-10:00 [膜蛋白質の構造化学的機能解明」(東大院薬)鳴田一夫13:30-13:35趣旨説明（東大医科研）津本　浩平13:35-14:15低分子化合物の標的タンバク質の同定（産総10:00-10:25「準安定なタンパク質複合体から構造情報を得るための戦略」(九大生体研)神田　大輔
14:15-14:55抗体機能と低分子（化血研）中島敏博15:05-15:45タンパク質−タンパク質相互作用を低分子で制御する（分子設計アドバイザー・インタープロテイン） ○松崎　尹雄・森島　甫・肥塚　靖彦・高島　徹・伊藤学・小松　弘嗣・細田　雅人15:45-16:25フラグメントペースド・ドラッグデザインによるリード化合物創生（アステラス製薬）新美　達也16:25-16:30総括（味の素製薬）辻　尚志(情報提供：津本　浩平) *このほか、公開中の年会サイト*から本会と関連ありそうなプログラムをいくつかピックアップしてみました。詳細は、年会サイト等の更新情報でご確認下さい。 *http://www.chemistry.or.jp/nenkai/91haru/index.htmlセッションオーガナイザー小池康博（慶大理工・教授），山元公寺（東工大資源研・教授，下村政嗣（東北大WPI-AIMR/東北大多元研・教授）趣旨　科学技術が進展する中,より豊かな未来を創造するための新機能材料開発に対する社会の期待はますます高まっています。本セッションでは，こうした中で注目されている以下の三領域を取り上げ，最先端の話題とともに,それぞれの切り口における「未来材料」を議論する機会を提供します。 A.次世代フォトニクス材料：超高速伝送，高画質ディスプレイの急速な発展に伴い,従来のエレクトロニクス材料の延長では対応が難しくなりつつあります。それを超えるイノベーションはフォトニクスであると考えられます。本サプセッションでは,近年注目を浴びる有機フォトニクス材料を中心に，光ファイバー，光導波路，液晶ディスプレイのためのフォトニクス材料,光アクティプ素子などの最前線を探ります。 B.超分子素子を目指したプログラミング:本サプセッションでは，特異機能を連動・増幅した機能階層的な精密超構造体を目指し，思いどおりに自在に物質を組み上げる「超分子プログラミング」に焦点を当てます。この超分子プログラミングを駆使したナノサイズの超構造体から,革新的な機能を連動・増幅して高効率で取り出せる未来型の超分子素子の開発への挑戦について紹介します。 C.バイオミメティック材料の新展開：多様な生物の構造と機能を模倣し,着想を得て新たに設計される材料開発の新しい潮流が世界的に注目されています。欧米では，ナノテクノロジーと生物学・博物学を基盤とする学際的な融合領域に成長しており，さらには，省資源，省エネルギーを可能とする生産技術の革新をもたらすものとして,産業界の関心も高まっています。日本における研究開発の現状と課題について討議します。予定講演者A.次世代フォトニクス材料※講演者調整中B.超分子素子を目指したプログラミング基調講演·配位プログラミングによる化学素子へのアプローチ（東大院理・教授）西原 寛招待講演•超分子ヒドロゲルを基盤としたバイオ素子への展望（京大院工・教授）浜地　格・プロックコポリマーテンプレート工学:ナノ構造とナノ機能のプログラミング（東工大資源研・教授） 第田　智一・応用を指向した有機/金属ハイプリッドポリマーの配位プログラミング（物材機構・グループリーダー）樋口　昌芳•単竜子エレクトロニクスへのナノ粒子科学からのアプローチ（筑波大院数理物質・CREST-JST・教授）寺西利治•分子からマクロへ•マクロから分子へ:超分子階層構造とHand-Operating Nanotechnology（物材機構・主任研究者）有賀　克彦依頼講演•分子デバイスを創る電極からのプログラム•分子からのプログラム（阪大産研・准教授）谷口正輝・竜子・光・磁気機能を発現する超分子集合体の構築（筑波大院数理物質・准教授）山本 洋平•導電性高分子の自己組織化ナノワイヤー・ナノファイバー1 本レベルの電気物性（東農工大院BASE・准教授）下村武史・ヘムタンパク質階層プログラミング:革新的バイオデバイスへの挑戦（阪大院工・助教）○小野田　晃・林　高史C.バイオミメティック材料の新展開基調講演・バイオロジーとナノテクノロジーのマリアージュ:バイオミメティクスから生物規範工学へ（東北大WPIAIMR・東北大多元研・教授）下村　政嗣•自然のすごさを賢く活かすものつくり（東北大院療境・教授）石田　秀輝招待講演・生物規範光学材料（浜松医科大・教授）針山　孝彦・生物規範感覚システム:昆虫の化学センシングを規範にして（神戸大院理・教授）尾崎　まみこ・バイオミメティクスと植物保護（京大院農・森林総研・東大先端研・准教授) ○森　直樹・奥本　裕・三瀬　和之・高梨　琢磨・光野　秀文・神崎　充平・自然に学ぶものづくりと企業活動（積水インテグレーテッドリサーチ・主席研究員）佐野　健三依頼講演・生物規範技術の包括的ガバナンス（産総研ナノシステム・ナノテクノロジ一戦略室長）阿多　誠文・生物規範親水材料（INAX総合技術研究所・室長）井須紀文・ネムリユスリカに学ぶ極限環境システム（農業生物資源研究所・ユニット長） 奥田　隆・数理科学とバイオミメティクス（東北大院情報・教授）久保　英夫•ナノインプリントによるバイオミメティクスデバイス開発への貢献の可能性（日立材料研・主管研究員）宮内　昭提・自己組織化によるモスアイ構造の作製（三菱レイヨン・リサーチフェロー）魚津　吉弘・バイオミメティック・データベースとオントロジー（阪大産研・准教授）古崎　晃司・生物を規範とする接合材料（物材機構・グループリーダー）細田　奈麻絵・バイオTRIZと生物規範創発工学（新潟大工・教授）山内　使・海洋生物に学ぶ防汚材料設計（北大院先端生命科学・教授）室崎　喬之・○鹽　剣萍•バイオミメティック・データベースとしての魚類インベントリー（科博・研究主幹）篠原現人•生体の水潤滑を規範としたポリマープラシの設計と摩擦特性（JST, ERATO）小林　元康・自己組織化マイクロリンクルと応用（産総研ナノシステム・グループ長）大園　拓哉•オパールフォトニック結晶によるチューナプル構造色材科の創成（物材機構・主幹研究員）不動寺浩・生物規範はっ水表面の創製（産総研サステナプルマテリアル・研究グループ長）穂積　篤・メカノタクシス: 生物規範細胞操作材料の設計（九大先導研・教授）木戸秋　悟•自己組織化プロセスの発生遺伝学的検討(北教大・教授)木村 賢一•バイオミメティック・データペースとしての昆虫インベントリー（科博・研究主幹）野村周平・生物規範飛行システム（千葉大院工・教授）劉　浩•生物規範トライボロジーと自動車部品（トヨタ自動車・主幹）鈴木　厚セッションオーガナイザー秋吉一成(京大院工・教授) ,跡見晴幸(京大院工・教授) ,上嶋康秀（帝人ファーマ創薬推進部・技術戦略・プロジェクトマネジメント統括），大橋武久（奈良先端大バイオサイエンス・客員教授），鴻池敏郎（塩野義製薬），須貝　威（慶大薬・教授），高柳輝夫（第一三共・監査役），富ヶ原祥隆（住友化学技術経営企画室・主席部員），深瀬浩一（阪大院理・教授），渡邉英一（東北大NICHes・産学官連携研究員）趣旨　ヒト全ゲノムが解明され,まさにポストゲノム時代のまっただ中，新しいバイオ技術を生かし，あらゆる科学・産業・社会のイノベーションが期待されています。本セッションでは，グリーンバイオ，フロンティアバイオを中心に,今注目を集めているバイオ技術に関する最先端の産官学のシーズとニーズを紹介し,未来産業を築くためのバイオケミカルズの創生につなげようという願いをこめ, 2日間にわたるシンポジウムを企画いたしました。第一線で活躍する講演者と参加者が一堂に会し,未来を志向するバイオ技術の研究開発と産業化への挑戦について，講演（招待・一般口頭）及びパネルディスカッション，ミキサーを通じ，現状と将来を議論する場を提供いたします。以下の2つのカテゴリーをトピックといたしますが,講演は同一会場で行い，広く深いアイディア・知恵と技がぶつかり合うシンポジウムとします。 A. グリーンバイオ：人と自然が共生する世界に不可欠なグリーンケミストリーを実現するバイオ技術として,バイオコンバージョン・バイオマス・バイオポリマー・植物バイオなどを中心に取り上げます。これらの技術はいずれも，環境調和，省エネルギー，廃棄物削減，健康・安全・ QOL向上，創薬などに寄与する一方，産官学一体となった技術構築が強く望まれており,最前線技術の産業化も視野に含んでいます。 B. フロンティアバイオ:我が国の基礎研究の中でも，世界的に非常に高いレベルにあるナノバイオテクノロジー分野において，その技術を応用する領域・範囲を考える場とします。ナノバイオ,バイオ計測,バイオマテリアル・先端医工学を対象として,具体的な産業上の利用と産業化の可能性を議論します。基調講演•ペプチド化学を基盤とした統合創薬科学(京薬大・教授・創薬科学フロンティア研究センター長）木曽　良明・自然に学ぶものづくり一高炭素技術が世界を救う？！ (産総研・所長)田口  隆久・バイオ計測が拓く未来の医療（ソニー先端マテリアル研・ライフサイエンス統括部長）安田　章夫招待講演・微細藻類ユーグレナによる有用物質生産について(ユーグレナ・研究開発部部長・取締役）鈴木　健吾•セルロソーム生産嫌気性菌Clostridium cellulovorans のゲノム解析とバイオマス完全利用への応用（三重大院生物資源・准教授）田丸 浩・清酒醸造技術をバイオ燃料製造に活かす（月桂冠総合研究所・所長）秦 洋二依頼講演・ダイソーのバイオケミカルズ開発（ダイソー株式会社研究センター・研究センター長）雑賀　哲行・セルロース系バイオマス糖化技術開発の現状（三菱重工・主席）西山　理郎・免疫制御を指向したケミカルグリコバイオロジー（阪大院理・教授）深瀬　浩一•進化理論を元に新しい技術と産業を切り開く～ネオ・モルガン研究所の技術と実績〜（ネオ・モルガン研究所・代表取締役社長）藤田　朋宏※バネルディスカッションを実施予定趣旨　生体金属イオンは,それらを取りまく生体高分子が構築する配位環境によって多様な機能を発現する。呼吸,代謝，光合成，神経・生体信号伝達・遺伝情報伝達，窒素固定等の生物界において決定的に重要なプロセスが,金属イオンとタンバク質や核酸との複合体によって初めて可能になることはよく知られている。生物無機化学は，その黎明期にはJ. P. Collmanのヘモグロビンモデルに代表されるような,比較的単純なタンパク機能を模倣する金属錯体小分子の設計や合成研究を主流としてスタートし,金属タンパクや生体金属の構造と反応性の解明を中心課題として，著しい進展を成し遂げた。近年では酸素添加酵素をはじめとする金属酵素が関与する複雑な反応機構が解明され，またそれらの機能モデル錯体の創成が行われ，さらには生体金属の多様な機能発現機構解明さえ可能となり,生物無機化学は「成熟期」を迎えている。最近では，生体信号伝達機構・遺伝情報伝達機構解明などの複雑な生命現象理解に不可欠なツールの創製，光合成・メタンの酸化等を可能にする複合系金属タンバク集合体の解析や,それらのモデル作成などの新展開が見られている。これらの領域で,独創的研究を展開している我が国の研究グループは世界的に注目を集めている。本シンポジウムでは現在,ホットな生物無機化学研究で世界をリードする研究者を招聘し，最新の研究成果，その意義と将来への展望を講演していただく。この講演を契機として，世代を超えた多くの研究者とともに,今後の化学が目指すべき生物無機化学研究の夢と展望を議論したい。実施日  3 月27 日 午後プログラム13:30-14:10人工光合成のシステム開発（阪大院工）福住俊一14:10-14:50生体系に学ぶ酸素活性化二核金属酵素モデルの分子設計（金沢大理工学域）鈴木　正樹14:50-15:30金属酵素機能創成：三つのアプローチ（名大院理）渡辺 芳人15:40-16:20光機能性プロープ開発による先進医療開発（東大院医）浦野　泰照16:20-17:00細胞中の遺伝子制御化学（甲南大FIBER・甲南大FIRST）杉本　直己17:00-17:40生物無機化学からさらなる境界領域へ（京大院工）浜地格趣旨　ケミカルバイオロジーは有機化学の技術・方法論を駆使して生命現象を明らかにする新学問領域である。近年米国では化学を出発点とした生命現象・疾病を理解する,いわゆるケミカルバイオロジーが大きな潮流を生んでいる。しかし，この分野の研究は以前より我が国が先導してきた分野であり,小分子有機化合物を中心に生命科学研究のツール分子や医農薬開発のリード分子を数多く世に送り出してきた。本シンポジウムでは我が国独自の発展が期待される最もホットな小分子生物活性物質を取り上げ,それらに関する研究で世界をリードする研究者を招聘し最新の研究成果とその意義を講演していただく。この講演を契機として世代を超えた多くの研究者とともに今後の目指すべき研究方向と展望を議論したい。実施日 ３月27日午前プログラム09:00-09:10挨拶（阪市大院理）大船　泰史09:10-09:40半田ビーズによるサリドマイド催寄性の原因因子の発見（東工大院生命理工）半田　宏09:40-10:10ムギネ酸類の実践的合成を基盤としたオオムギの鉄取り込み機構に関する研究（北大院理）難波10:10-10:40ケミカルバイオロジー分子基盤としての脂質二重膜（阪大院理）松森　信昭10:50-11:20フシコッカンジテルペノイドをリードとした新規抗がん剤の開発（阪大産研）加藤　修雄11:20-11:50植物の生物現象と天然物ケミカルバイオロジー（東北大院理）上田　実11:50-12:20日本のケミカルバイオロジー（慶大理工）上村大輔趣旨　我が国のアカデミアにおける合成研究は世界的に高く評価されている。これまで，永年にわたり我が国の大学及び公的研究機関において,膨大な数の化合物が創製され，社会の発展に大きく貢献したことは確かである。特に低分子化合物は新薬開発等にとって不可欠なものであり，さらに今後,化合物を合成し所有する化学系研究者と創薬ターゲットとなる蛋白等について研究を行っている生物系研究者が，化合物を介してより密接に連携して，アカデミア化合物ライプラリー及びその化合物データベースを恒常的に構築・活用し，アカデミアにおける創薬研究，特にバーチャルスクリーニングによる新薬候補化合物探索等において，さらに大きな成果を挙げ，社会に貢献することが期待される。実施日 3月26日午前プログラム09:30-09:50有機合成化学者としての社会貢献(星薬科大)井原　正隆09:50-10:05天然物ライプラリーの活用と次世代化（産総研）夏目 欲10:05-10:20標的指向型ライプラリー構築と生命科学への貢献（阪大院理）深瀬　浩一10:20-10:30大学における合成化合物の保管管理（九大名答）森　章10:30-10:40成果有体物の知的財産権（名古屋産業科学研究所中部TLO）大森　茂嘉10:40-10:55生物機能制御化合物ライプラリー機構（東大化合物ライプラリー機構）岡部　隆義10:55-11:10アカデミアにおける化合物ライプラリー（京大iCeMS）上杉　志成11:10-11:25アカデミア化合物の抗がん評価(癒研化療セ)矢守 陸夫11:25-11:40バーチャルスクリーニングによるパーキンソン病治療薬の開発（北大院薬）有賀　寛芳11:40-11:55創薬における合成化学の意義を探る（星薬科大寒）本多　利維11:55-12:05 IT創薬を活用したパーキンソン病治療薬開発(富士通)紙谷希12:05-12:20アカデミア化合物データベースの構築・活用(NPO化合物活用セ) 奥山  彬12:20-12:30アカデミア化合物データベースの構築・活用(NPO化合物活用セ)鈴木　國夫趣旨　自己組織化は,分子から組み上げる材料設計において必須の概念である。これまで，自己組織性分子の設計，自己組織化によるナノ構造体やソフトマテリアルの構楽・構造解析や，電子機能・バイオ機能創発などにおいて多くの研究者が独創的な研究を展開してきた。しかし，限られた学問領域にとどまったままでは,今後新しいプレークスルー，研究の新潮流は生まれにくい。本企画では，他の手法では得難いオリジナルな手法でエキノチック自己組織化分子材料を創製し,それらの物性評価を行っている第一線の研究者による講演を通じて，『ボトムアップ型ものづくり』のハプを形成し，従来の学問領域の枠を超え，未開拓サイエンス創成に向けた情報交換の場を提供する。なお，本特別企画は，日本化学会新領域研究グループ「エキプチック自己組織化材料: ExOM」によるものである。実施日 3月26日午後プログラム13:30-13:35趣旨説明（九大院工）松浦　和則13:35-13:55巧みに構造制御されたエキノチック多形体の機能創発（物材研ナノ有機セ）中西尚志13:55-14:15 企業から見たエキノチック自己組織化材料への期待（富士フイルム　先端コア技術研究所）西見　大成14:15-14:35生体分子モーターの動的自己組織が生むエキプチック機能（北大院先端生命）角五　彰14:35-14:55マイクロ波法による自己組織化材料中の局所的電荷輸送特性（阪大院工・JSTさきがけ）佐伯　昭紀14:55-15:15円偏光発光性キラル超分子の創成と機能創発（奈良先端大物質）内藤　昌信15:15-15:45ヘムタンパク質自己組織化集合体の構築（阪大院工）林　高史15:45-16:05ソフトマターのためのナノ触診技術（東北大WPI-AIMR）中嶋　健16:05-16:35液晶の超分子化・機能化における最前線（東大院工）加藤　隆史趣旨　高分子や生体分子が形成する界面は刺激によって構造や性質が大きく変化する,ソフトな特性を持っており,ソフト界面と定義される。ソフト界面は溶媒や基質などが介在する3 次元的に厚みのある境界領域で,従来の科学領域で議論されてきた2 次元界面ともバルクの状態とも異なる。ソフト界面は,溶媒やゲスト分子などとの相互作用を通じて動的に構造や性質を変化させ,様々な機能を発現する点に特徴がある。ソフト界面の構築,解析,応用によって,次世代に求められるしなやかで高機能な材料の開発が可能と考えられる。本特別企画では，ソフト界面について，特に次世代技術を担う若手研究者の研究について発表の場を設け，活発な議論を行い，本分野の発展と交流に役立てる。実施日 3月26日午前プログラム09:30-09:35趣旨説明（九大院工）三浦　佳子09:35-10:00ソフト界面制御によるポリイオンコンプレックスナノ・マイクロ粒子の構造制御とその機能(東大院工)岸村 顕広10:00-10:25センサー表面における界面設計およびその分析法（日産化学工業）古性 均10:25-10:50トポロジ一変化が駆動するインターロック架橋法の開発（東工大院理工）小山 靖人10:50-11:15超解像光学による界面/薄膜における単一高分子鎖の構造評価（京大先端医工）青木　裕之11:15-11:40超臨界NMR法によるWater-in-CO 2エマルジョンのダイナミクス解析（東工大原子炉研）塚原 剛彦11:40-12:05細胞磁気ラベリングに向けたバイオナノ磁性粒子界面の分子設計（東農工大院工）吉野 知子12:05-12:35細胞界面のナノ接着制御による機能性ハイプリッド組織の創製（阪大院工）松崎　典弥趣旨　分子集積・組織化を利用したナノ及びマイクロメートルサイズの分子配列空間の精密制御は,生体機能や機能性材料の機能を制御する上で極めて重要である。近年，分子間相互作用の基礎的理解を踏まえ,分子構造のみでなく分子の配列空間を精密に制御することで,新たな情報変換デバイスを開発する研究が盛んになっている。本企画では，第一線の研究者による分子配列空間の精密制御と情報変換にかかわる講演を通して,分子を基盤とした情報変換デバイス開発への新たな展望を提案する。実施日 3月26日午前プログラム09:30-09:35趣旨説明（広島大院理）厌野　岳晴09:35-10:05機能因子の空間配列制御による構造・機能変換（筑波大院数理物質）鍋島達弥10:05-10:35超分子相互作用を利用した発光性金属錯体微結晶の創出（奈良先端大物質）河合共10:35-11:05 DNAナノウェルへのゲスト分子の選択的取り込みと精密配列化（東大先端研）葛谷　明紀11:05-11:35設計ペプチド・タンパク質によるアミロイド線維化の制御（東工大院生命理工）三原 久和11:35-12:05可視光駆動による一方向回転分子の開発（名市大院薬）樋口　恒彦12:05-12:35トポロジカル結合が作り出す空間の機能とその制御（東工大院理工）高田十志和Date    PM March 28 Program 13:30-13:40 Opening Remark (Ritsumeikan Univ.) Hitoshi Tamiaki 13:40-14:10 Keynote Lecture: Exploitation of Luminescent Cyclometalated Iridium （III） Polypyridine Complexes as Biomolecular and Cellular Probes  (City Univ. of Hong Kong) Kenneth Kam-Wing Lo Invited Lecture: 14:20-14:50 Hula-Hoop: Molecular Observations of Rotary Movement of a Rotor  (Osaka Univ.) Yoshinori Takashima 14:50-15:20 Keynote Lecture: Nanocatalyst- and Artificial Enzyme-Based Biomolecular Detection (Pusan National Univ.) Haesik Yang 15:30-16:00 Invited Lecture: Optical Enzyme Assay with Cell- Penetrative Polymers  (Ryukoku Univ.)  Tomohiro Miyatake Invited Lecture: Mimicking Multipass 16:00-16:30 Transmembrane Proteins: Folding and Assembly of Alternating Amphiphilic Multiblock Molecules in Liposomal Membranes ( Tohoku Univ.)  Takahiro Muraoka 16:30-17:00 Invited Lecture: Tongue cancer diagnosis using FND-based electrochemical telomerase assay Kyushu Inst. Tech.） Shinobu Sato生命科学分野の解析技術はここ10年で飛躍的な進級官歩を遂げている。これらの先端技術を駆使することによって未知なる細胞機能が明らかになってきた。その中から，細胞個々に特性があることが見いだされ,シングルセルの生物学の必要性が指摘されている。本企画では，シングルセルバイオロジーに必要な，化学，工学，生物学等の幅広い分野の先生方に，シングルセル解析技術の現状と展望，さらにはアウトプットの側面から,シングルセル解析による医学，生物学研究の進展に関して報告していただく。実施日  3月27日 午後プログラム※未定以下、今後の予定も付しておきます。詳細は随時、ニュースレターで掲載、またはメールニュース（担当：石田）でお知らせしてゆきます。変更もあり得えますので、適宜ご確認をお願いします。第14回生命化学シンポジウム（予定）会期：2011年9月12日（月） - 14 日（水）会場：つくぼ（場所未定）会期：2011年12月2日（金）- 3日（土）会場：和歌山県 南紀白浜温泉(世話人：菊地　和也、大神田　淳子、円谷　徳) Asian Conference Chemical Biology (ACB2012) （予定）会期：2012年 7月4日（水）- 6日（金）会場：沖縄県　サザンビーチホテル&リゾートChair: Koichi Fukase (Osaka Univ.) ーション複合体の機能解析について、薬学分野から千葉大・荒井さんに、天然物ライプラリの合成から標的探索、細胞活性評価に至る幅広いご研究について、さらに天然物とコンピナトリアル化学の境界領域でご活躍中の東工大・田中さんには、新規な環状保護基を用いてテトラシアル酸の合成を達成されるまでの経緯とシアル酸認識抗体の探索まで、それぞれご紹介頂きました。「気になる論文」では、阪大村田さんにRNA結合性低分子に関して、京大・高山さんには細胞膜透過性ペプチドに関して、それぞれのご研究分野から最新の論文を取上げて頂きました。一方、名大・渡辺さんには「生命化学研究法」として、近赤外波長蛍光量子ドットによるin vivoイメージングの概要と、R8ペプチドとの複合体による脂肪組織由来幹細胞in vivoイメージングの実際を判り易く解説して頂くとともに、アメリカから帰国されたばかりの九大・星野さんには、グラント申請など様々な挑戦をされたご自身の体験に基づいて、メッセージ溢れるエッセイをご寄稿頂きました。このように、本号も科学的に盛り沢山であるだけでなく、思いの籠められた提言に富む極めて濃い内容となっており、皆様に大いに楽しんで頂けるものと確信しております。ご執筆下さった皆様には改めて御礼を申し上げます。次号（No. 36）は、井原さんのご担当により、2011年6第13回生命化学シンポジウムin仙台において総会が開催され、深瀬浩一氏（阪大院理）が第5代会長として選出されました。任期は3年で、新体制は3月1日から始動い♦佐藤　智典（慶應義塾大学理工学部生命情報学科教授）第10回バイオビジネスコンペJAPANバイオ先端知賞、 「樹鎖プライマー法を用いた細胞に発現する糖鎖マーカーの探索と利用技術の開発」2010年3月11日月頃の発行を予定しております。より充実した内容に向けて、皆様からの建設的なご意見、ご提案、フィードバッグをお待ちしております。下記編集委員までご連絡をいただければ幸いです。 2010環太平洋国際化学会議（Pacifichem 2010）ハイライト諜演、 Hiroshi  AOKI,  Akiko  KITAJIMA,  Masaki TORIMURA, "Label-free, reagent-free, and 'signal-on' DNA detection based on supramolecular electrochemistry" (文真：　大神田) ::: 2011年（平成23年）2月8日美しい雪景色の仙台にて開催された研究会からちょうどひと月、大阪・吹田の地では早くも7部咲きの梅の花が春の訪れを告げています。今号も様々な分野でご活躍されている方々から力作をご寄稿頂きました。 「巻頭言」には、仙台シンポジウム世話人代表の和田さんより、世界化学年にちなんだ熱いメッセージをお寄せ頂きました。「研究紹介」では、生化学分野から学芸大・原田さんに細胞内検出系を用いたRNA結合性ペプチドの探索とアンチターミネ生命化学研究レター編集委員第35号編集担当   ： 大神田  淳子大阪大学産業科学研究所、johkanda@sanken.osaka-u.ac.jp写真:円谷健大阪府立大学、tsumu@b.s.osakafu-u.ac.jp題字・レイアウト熊本大学、toshi@chem.kumamoto-u.ac.jp 【次期会長選出】たします。深瀬新会長、どうぞよろしくお願い致します。三原会長、これまで会の発展にご尽力下さり、誠にありがとうございました。