〇上野　亮　（地方独立行政法人　大阪健康安全基盤研究所）
【研究目的】
殺菌剤として用いられる農薬クロロタロニルは広く使用されているものの、現在主流の残留農薬一斉分析法では分析が困難であり、残留実態の調査が一部の機関でしか行われていない。そこで、当研究所において一斉分析法に準じた手法でクロロタロニル分析を可能にするため本研究を実施した。
【研究の必要性】
農薬は食糧生産において、その省力化や収量の増加に大きくCN寄与しており、現代の農業において必要不可欠のものである。 Cl Cl農薬の中で広く使用されているもののひとつに殺菌剤クロCl CCNロタロニル(2,4,5,6–テトラクロロイソフタロニトリル)がある。クロロタロニルは多くの作物に使用され、2019年の生産図1.クロロタタロニル量は2003.7 tと国内での生産量の上位に位置しているり。一方でEUでは、クロロタロニルは安全性を証明する根拠が十分でないという理由のため、 2020年より使用禁止となっている21。わが国では食品中の残留農薬について多数の機関が実施している。しかし、国内でクロロタロニルの残留検査を行っている機関は少なく、分析件数も少ない9)。その理由としては、現在広く行われている残留農薬の一斉分析法では分析が難しいことが挙げられる。同法の工程の一つに固相抽出による精製があり、グラファイトカーボンブラック(GCB)や一級・二級アミン(PSA)修飾シリカゲルが汎用される。しかし、クロロタタロニルはGCBに吸着されやすいため、他の農薬と同様の条件ではクロロタロニルが除去されてしまう。また、塩基性条件下でユリ科やアブラナ科作物の酵素や硫黄化合物により分解されることが報告されていることから、塩基性を示すPSAによる精製もまた適さない場合がある4)。報告されているクロロタロニル分析法では処理途中でのクロロタタロニルの分解を抑制するため、試料破砕時に酸の添加や試料の凍結が行われている¶。しかし、凍結試料の粉砕には相応の設備が必要であり、酸の添加では多量の酸を含む廃棄物が生じる。そのため、クロロタロニルの検査体制を構築する上で、特別な設備を必要としない簡便な分析法の確立が求められる。
【研究計画】
アセトニトリルによる抽出を行うクロロタロニル分析法が報告されているため抽出法の検討は行わず、精製処理に使用する固相抽出法の検討を実施し、精製法の最適化を行う。そして、その手法を用いて複数の作物に対して添加回収試験を実施し分析法の評価を行う。試料からの抽出操作及び分析は既報にに準じた手法で実施する。すなわち、アセトニトリルを用いたホモジナイズ抽出にて行い(図 2)、抽出液を固相抽出にて精製を行った後、 GC-MS/MSにて分析する(表1)。

【実施内容・結果】
固相抽出カラム検討
クロロタロニルを添加した野菜果実ジュースに対して既報にと同様の精製操作、すなわちGCB/PSAカラム(Supelclean ENVI-Carb II/PSA、 Merck社製)による精製を行ったところ回収率は23%であった。この試料にリン酸を添加することで回収率が78%に大幅に向上したため、塩基性条件でクロロタロニルが不安定であることが示唆された。しかし、酸を加える場合PSAによる精製効果が減少すると考えられるため、他の精製カラムを検討した。 C18カラム(Supelclean ENVI-18、Merck社製)、HLBカラム(Oasis PRiME HLB、 1958年5月2 plix st(x )カラムGCB Waters 社製)、GCB カラム(Supelclean C18 ENVI-Carb 、 Merck 社製)、 FL カラムHLB (InertSep FL、GLサイエンス(株)製)およびFL SIシリカゲル(SI)カラム(InertSep SI、GLサイエンス(株)製)について、負荷したクロロタロニルの回収を検討した。その結果GCB、 FL、SI、C18では78%以上回収できたが、HLBは回収率が低く実験毎の再現性も低かった(表2)。 FL、SI、C18について検討を進めた際に、試料抽出液をFL、SIカラムで精製する段階で、作物によってはカラムが詰まり作業効率が著しく低下する場合があった。また、夾雑成分が多く残ることによる測定結果や分析機器への悪影響が懸念されたため、GCBによる精製を加えて野菜果実ジュースを用いた添加回収試験を行った。その結果、GCB+FLで78%、GCB+SIで80%、GCB+C18で90%の回収率となった。ただし、GCB+C18については、きゅうり、ピーマンで検討した際に試料マトリックスが分析に与える影響が大きく、 C18では精製が不十分である可能性があるため侯補から除外した。 FLとSIを比較するため、野菜果実ジュースをGCB+FLまたはGCB+SIを用いて精製した溶液をScanモードで測定したところ、FLカラムのほうが観測されたピークが少なく、より精製されていることを示唆する結果が得られた(図3)。このため、以降の添加回収試験はGCBとFLによる精製法(図4)を用いて実施した。
添加回収試験
本手法を用いて9作物と野菜果実ジュースに対してクロロタロニルの添加回収試験を実施した(表3)。また、野菜果実ジュース、ほうれん草、大根については試料に酸を添加する方法も検討した。その結果、きゅうり、ピーマンについてはクロロタロニルの回収率が70%を超え、本法の適用可能性が示された。また、大根については、報告されている通り試料中での分解が示唆される結果となった。酸の添加について、大根ではリン酸を添加することにより回収率が向上したものの、未だ不十分な回収率であった。また、野菜ジュースでは酸の添加により回収率が低下した。

【考察と今後の課題】
今回検討した結果では回収率が50%~75%程度となる作物が多く、また併行精度が低くなる傾向が見られたため、精製が不十分もしくは不適切である可能性がある。検討した固相抽出カラムの多くで回収率が約80%~90%となったため、精製を行わない方法の検討も必要だと思われる。その場合、分析機器として汚染に強いLCが適すると思われるものの、 LC-MS/MS(イオン化: ESI)にて測定を試みたところクロロタタロニルを観測できなかった。今後、測定例が報告 §されている大気圧化学イオン化法(APCI)を用いた分析を検討する。大根ではリン酸の添加により回収率が向上したものの、クロロタタロニルの分解を完全には抑制できなかった。野菜果実ジュースについても酸によって回収率が大きく異なる結果が得られているため、添加する酸やその量の検討が必要と思われる。しかし、酸による試料粉砕時の分解抑制は、試料に対して一律に酸を加えるため多量の酸廃棄物が生じる。使用する酸の量を削減するため、試料を凍結し粉砕する方法により粉砕時の分解を抑制し、分取した試料に酸を加えることで精製時の分解を抑制する手法も今後検討したい。
【参考文献】
1）日本植物防疫協会『農薬要覧2019』(2019) 2)  European Commission, Final Renewal report for the active substance chlorothalonil. SANTE/10186/2018 Rev 1 (2019) 3)厚生労働省『平成30年度食品中の残留農薬等検査結果』(2020) 4)永井雄太郎, QuEChERSを見直してみよう.日本農薬学会誌, 37(4), 362–371 (2012) 5) EU Reference Laboratories for Single Residue Methods, Modified QuEChERS- Method for the Analysis of Chlorothalonil in Fruits and Vegetables. https://www. eurl-pesticides.eu/library/docs/srm/meth_QuEChERSforChlorothalonil_2010.pdf 6)福井直樹,高取聡,山口聡子,北川陽子,吉光真人,小阪田正和,梶村計志,尾花裕孝.汎用マトリックス添加標準溶液を活用した野菜類および果実類中の残留農薬一斉分析法の妥当性評価.食品衛生学雑誌, 56(4), 178-184 (2015)