【はじめにお読みください】
　このたびは、高温性ピシウム属菌プライマーセット1 -ピシウムヘリコイデス−をお買い上げ頂き、
誠にありがとうございます。このマニュアルをよくお読みの上、正しい方法で試薬を使用してください。
使用上の注意
1.本品は、LAMP 法を用いて高温性ピシウム属菌を検出するための試験研究用試薬です。医療行為および臨床診断等の目的では使用できません。 2.試薬は−20˚Cの冷凍庫内に遮光して保存し、納品後6カ月以内に使用してください。また、試薬の凍結、融解の繰り返しは避けてください。 wi本品を使用する際は、このマニュアルの記載内容に従ってください。記載内容と異なる使用方法および使用目的により発生するトラブルに関しましては、株式会社ニッポンジーンでは一切の責任を負いかねますので、あらかじめご了承ください。 4.本品はLAMP法用DNA増幅試薬セット−動物種・植物病検査専用B−(製品コード: NE6031)と組み合わせて使用します。Loopamp® DNA増幅試薬キットとは組み合わせて使用することはできません。 5.本品による判定結果を二次利用する場合は、必ず使用者の責任の下で行ってください。製品性能の異常によって発生するトラブルの場合を除き、株式会社ニッポンジーンでは一切の責任を負いかねますので、あらかじめご了承ください。 6.検査環境の汚染を防ぐため、LAMP 法反応後の増幅産物の電気泳動等の操作およびオートクレーブ高圧滅菌処理は行わないでください。 7. LAMP 法は栄研化学株式会社が特許を保有しています。株式会社ニッポンジーンは、本品の製造および販売を許諾されています。本製品を用いた測定にはLAMP法専用濁度測定装置を使用します。エンドポイント濁度測定装置 LT-16 (製品コード:  NE4011)の測定用パラメ一タの設定に関しては、株式会社ニッポンジ一ンまでお電話もしくはWEBフォームよりお問い合わせください。株式会社ニッポンジーンTEL  076-451-6548 URL  http://nippongene-analysis.com/
【高温性ピシウム属菌プライマ一セットの概要】
本製品はLAMP法用DNA増幅試薬セット−動物種･植物病検査専用B−と組み合わせて使用する、高温性ピシウム属菌 Pythium  helicoides (ピシウムヘリコイデス) 検出用のプライマーセットです。 LAMP法はインフルエンザウィルス感染の診断及びノロウィルス、レジオネラ属菌、サルモネラ属菌、腸管出血性大腸菌等の検査にも用いられている迅速、簡便なDNA増幅技術であり、その優れた特異性と高い感度を最大の特長としています。本製品に含まれるLAMP法用プライマーは、高温性ピシウム属菌DNAの特異的な遺伝子領域内に設計されているため、LAMP法によるDNAの増幅の有無から検体中に標的の高温性ピシウム属菌が存在するかを判定します。本製品では、DNA増幅法としてLAMP法を用いているため、DNA増幅に必要な時間が短時間であり、サンプル由来の阻害物等の影響も受け難いです。また、エンドポイント濁度測定装置  LT−16などのLAMP法専用の濁度測定装置やLAMP法用DNA増幅試薬セット−動物種･植物病検査専用B−に付属する検出液を用いることにより検出に電気泳動を必要とせず、DNA増幅から検出までを閉鎖系（同一反応チューブ内）で行うため、検査のコンタミネーションのリスクがなく、短時間で高温性ピシウム属菌の検出を行うことが可能です。
【高温性ピシウム属菌とその検出について】
近年、ピシウム属菌は土壌栽培や養液栽培において植物の苗立枯れや根腐れを引き起こす病原菌として防除の対象となっています。ピシウム属菌の中でも38°C程度の高温条件下で生育できるピシウム属菌は高温性ピシウム属菌と呼ばれ、養液栽培において水媒伝染病害の原因として大きな問題となっています。従来の高温性ピシウム属菌が原因となる病害の診断には検査対象からの高温性ピシウム属菌の分離・培養を行った後、形態による同定が必要であり、判定に専門知識や4～5日間の期間を必要とします。 【LAMP (Loop – mediated Isothermal Amplification）法】 LAMP法は、一定温度でDNA増幅反応が進行する画期的な技術です。従来の方法と比較して特異性に優れ、またその高いDNA増幅効率から、短時間反応および簡易検出が可能である等の利点を有しています。 LAMP法の原理の詳細については、栄研化学株式会社ホームページをご参照ください。栄研化学株式会社Eiken GENOME SITE; http://loopamp.eiken.co.jp/
【本品に含まれる合成オリゴヌクレオチドについて】
本品に含まれるプライマーは全て「リライアブル&トレーサブルオリゴ」を使用しています。「リライアブル&トレーサブルオリゴ」は、株式会社ニッポンジーンマテリアルが製造する高信頼性オリゴヌクレオチド「リライアブルオリゴ」の一つです。ISO 13485:2003に準拠した品質マネジメントシステム、専用陽圧ルームでの製造、チェックリストによる工程管理、トレーサビリティ一完備を特長としています。詳細に関しましては、株式会社ニッポンジーンマテリアルホームページをご参照ください。株式会社ニッポンジーンマテリアル; http://www.nippongenematerial.com/本キットに含まれるLAMPプライマーセットおよびこのLAMPプライマーセットを用いたLAMP法による高温性ピシウム属菌の検出技術は農林水産業・食品産業科学技術研究推進事業「養液栽培における高温性水媒伝染病害の安全性診断マニュアルの策定｣により開発されました。

【製品内容】
高温性ピシウム属菌プライマ一セット1 −ピシウムヘリコイデス− 48テスト用

.取り扱い上の注意
試薬は−20°Cで暗所に保存し、納品後6カ月以内に使用してください。 ◆陽性コントロールDNAには高温性ピシウム属菌 DNAに特徴的な配列が含まれています。検査環境への汚染を防ぐため、使用の際には溶液を飛散させたり、溶液に触れたフィルター付きマイクロチップが他の器具や試薬に接触しないようにご注意ください。連続分注を行うと試薬への汚染が発生する可能性がありますので、フィルター付きマイクロチップは１回分注するごとに使い捨てとして使用してくだ◆さい。
III必要な器具、
機群、
● LAMP法用DNA増幅試薬セット−動物種･植物病検査専用B− (製品コード: NE6031) ● Loopamp反応チューブ（栄研化学株式会社） ● マイクロピペット(0.5-10 μL、10-100 μL、100-1,000 μL) ●フィルター付マイクロチップ（滅菌済み） ● マスターミックス調製用チューブ(1.5 mLあるいは2.0 mL) ●ヒートブロック● LAMP法専用濁度測定装置エンドポイント濁度測定装置 LT-16 (製品コード: NE4011)など● 氷 (クラッシュアイス) ● ピンセット（核酸の汚染がないもの） ●チューブラック●アルミラック(あるいはプレートラック) ●ボルテックスミキサー ● 簡易遠心機（1.5 mLチューブ用及びLoopamp反応チューブ用）
ロントロールの準備■コントロール本品には、陽性コントロールDNAが添付されています。検査の成否を確認するためには、陽性コントロールおよび陰性コントロールの作製が重要となりま陽性コントロールDNA 5.0 μLを鋳型として25.0 μL(1 テスト分)の容量でLAMP法を行い、65 C、60分間で反応が起動することを確認しています。
見え、無意の年間
■  LAMP法事用湯皮潤定装置
操作の詳細は各装置の取扱説明書をご参照ください。
■ 各人

教育事事
LAMP法は高感度なDNA増幅技術であるため、検査環境にLAMP反応後の増幅産物等、鋳型となる核酸の汚染が発生すると、以降正確な検査を行うことが困難になります。サンブルの取り扱いにおいては、作業用の着衣および器具への付着に十分注意し、着衣の交換を徹底してください。以後の検査における誤判定を防止するため、使用済みのチップ、チューブ、検査後サンブルは二重にしたビニール袋にまとめて廃棄してください。また、LAMP反応後の増幅産物の電気泳動等による操作およびオートクレーブ高圧減菌処理は行わないでください。
作業区域
核酸抽出および核酸増幅を実施していない（核酸による汚染が存在しない）クリーンベンチあるいは作業台を試薬調製作業区域とし、マスターミックスは試薬調製作業区域にて作製してください。試薬調製作業区域ではLAMP法において鋳型となる核酸を含む溶液、試薬類の取り扱いは行わないでください。マスターミックスへのサンプル添加を行うスペースは試薬調製作業区域と区分し、専用の核酸取扱区域を設けてください。
以重険去臭作
器具は常に清潔に保ってください。洗浄が可能である器具は大量の水道水でよく濯ぐことにより、付着した核酸を希釈、除去できます。高濃度の核酸を取り扱った場合など、核酸による汚染が疑われるような場合には、0.5%次亜塩素酸ナトリウム水溶液を用いて検査環境中に存在する核酸の除去操作を行います。次亜塩素酸ナトリウム水溶液は塩素ガスを発生するので、使用の際には換気に十分注意してください。また、金属に対する腐食性があるため、金属に対して使用する際は、迅速に塩素成分を拭き取る等の対応が必要です。高温環境下における劣化が寄しいため、0.5%水溶液調製後の経過日数や保存温度に注意してください。非金属の磐具は次亜塩素酸ナトリウム水溶液に1時間以上浸し、よく湿いで乾燥します。作業台、器具は常に清潔に保ち、定期的に次亜塩素酸ナトリウム水溶液による拭き取り清掃を行います。
〈胖氣な技酸除去方法〉
(）使い捨て手袋を装着します。 ill》有効塩素濃度5,000 ppm (0.5%)の次亜塩素酸ナトリウム水溶液を準備します。 Ⅲ》次亜塩素酸ナトリウム水溶液を含ませたベーパータオルで作業台、磐具を丁寧に拭き、5分間そのまま放置します。 hs）5分間の処理が終了したら塩素成分をベーパータオルで拭き取り、その後、蒸留水等核酸の混入がない水を含ませたベーパータオルで確実に塩素成分を除去します。
【プロトコル】
1. DNAサンプルの開製
あらかじめ、市販のDNA抽出キット、又は、国立大学法人岐阜大学流域圏科学研究センターより発行されている「養液栽培における高温性水媒伝染病害の安全性診断マニュアル」に従い、ピシウム属菌の検査を行う検体からDNAを調製してください。しかし、1 mMを超えるEDTA（エチレンジアミン四酢酸）等のキレ一ト化合物を含むと、誤判定の原因となりますので、抽出を行った際のDNAを溶解させる最適な溶媒としては核酸フリー水、あるいは10 mM Tri-HCl (pH 8.0)を推奨しています。 「養液栽培における高温性水媒伝染病害の安全性診断マニュアル」 http://www.green.gifu-u.ac.jp/~kageyamalab/pdf/diagnosis.pdf
2.検査反応
2–1.試薬の融解
本品（プライマー液、陽性コントロールDNA）とLAMP法用DNA増幅試薬セット−動物種･植物病検査専用B-の10x 反応バッファーB、5x 反応添加液、dNTPs Mixture、ddWaterを室温で完全に融解します。判定方法が濁度測定ではなく目視検出の場合は、検出液も同様に室温で完全に融解させてください。ただし、増幅酵素は−20℃では凍結しないため、使用する直前にキットから取り出してください。
2–2.混合とスピンダウン
各試薬をポルテックスミキサーにて1秒間×3回混合して均一にした後、スピンダウンを行い、試薬を氷上に静置します。
2–3.マスターミックスの作製
マスターミックス調製用チューブ（1.5 mLあるいは2.0 mL)に下記の試薬を必要テスト数分ずつ分注し、ポルテックスミキサーにて1秒間×3回混合した後、スピンダウンを行います。これをマスターミックスとし、氷上に静置します。標準反応スケールは25 μLです。

2–4.マスターミックスの分注
Loopamp 反応用チューブを袋から取り出し、アルミブロックあるいはプレートラックに立て、マスターミックスを20 μμLずつ分注します（Loopamp反応用チューブを袋から取り出す際には、核酸の汚染がないピンセットを準備し、使用してください）。
2–5.サンプルの蒸加
まず、陰性コントロール用のチューブ!こddWaterを5.0 μL添加してキャップを閉じます。次にサンプル反応チューブに1で調製したDNAサンプルを5.0 μL添加してキャップを閉じます。最後に、陽性コントロール用のチューブに陽性コントロールDNAを5.0 μL添加してキャップを閉じます。 2–6.検査反応検査反応の前にサンプルとマスターミックスを混合します。Loopamp 反応チューブの全てのキャップを閉じた状態でタッピング（チューブの腹を指で数回叩く）により混合した後、スピンダウンを行い、濁度測定装置あるいはインキュベーターにセットして65°Cで60分間の測定を開始します。ピペッティングによる混合をする場合は、2-5.のサンプル添加ごとに行ってください。
If ( 1 )
混合の際は気泡が発生しないように注意してください。ボルテックスミキサーによる撹拌は行わないでください。
2–7.増幅酵素の失活
測定終了後には、80°Cで5分間の熱処理により反応を停止し、判定を行います。
3.判定
■ 温度測定の場合
3–1.検査の成否の判定最初に、陽性コントロールで濁度が上昇し、陰性コントロールで濁度が上昇していないことを確認してください。これを満たしていない場合は検査結果を無効とし、原因を追究してください。
3–2.サンプルの判定
コントロールの判定においてその検査が有効と判断された場合、次にサンプルの判定を行います。判定ははコントロールと同様に濁度上昇の有無を確認してください。陽性のサンプルに関してはTt値を確認してください。濁度上昇が認められる場合、サンプル中に標的の高温性ピシウム属菌が存在する可能性があります。
■ 目視検出の場合
3–3.検査の成否の判定
最初に、陽性コントロール検査溶液が空色に変化し、陰性コントロール検査溶液は青紫色のまま変色していないことを確認してください。これを満たしていない場合は検査結果を無効とし、原因を追究してください。
3–4.サンプルの判定
コントロールの判定においてその検査が有効とされた場合、次に、サンプルの判定を行います。判定はコントロール検査溶液と同様に色の変化の有無を確認してください。色の変化が認められる場合、サンプe start of 人民生活療と同人誌に出来てきた作作紙を確認していた。
ル中に標的の高温性ピシウム属菌が存在する可能性があります。
本品の使用において何らかの問題が発生した場合は、以下の項目に従って対処してください。その他のご不明な点については株式会社ニッポンジーンまでお問い合わせください。

参考文献・資料
VI
1. Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K, Amino N, Hase T. (2000) Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28 (12): e63 2. Prince AM, Andrus L. (1992) PCR: how to kill unwanted DNA. Biotechniques. 12 (3): 358 •記載内容や製品仕様、価格に関しては予告無しに変更する場合があります。 •本マニュアルの記載内容は2018年5月現在のものです｡最新のマニュアルは株式会社ニッポンジーンホームページからダウンロードしてください。 • [ Loopamp ]は、栄研化学株式会社の登録商標です。 ・「ニッポンジーン」および「NIPPON GENE 」はは、株式会社ニッポンジーンの日本における登録商標です。 •その他、製品名等の固有名詞は各社の商標あるいは登録商標です。 ・記載内容の複製、転載を禁止します。
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