操作説明書ー第2版一2021年3月改訂2019年11月作成薄肌(製菓株式式会社目 次1.測定原理. 2.製品内容(キットの構成)
4.使用上又は取扱い上の注意................................................................................9
別紙紙フローシート: WAKFlow  HLA抗体サブクラス同定試薬-原理と操作概要-
1.測定原理
WAKFlow HLA抗体サプクラス同定試薬は、ヒト血清中のHLAに対する抗体(抗HLA抗体)のIgGサプクラスを同定するための研究用試薬です。本製品はLuminex社(http://www.luminexcorp.com)の xMAP®テクノロジーを用いて検出を行うものです。本製品は必ず対応したLot.番号の「WAKFlow HLA抗体クラスI抗体/クラスI抗体_特長性同定誌寒山(以下、特異性同定試薬)と組み合わせて使用して下さい。操作は以下の2つのステップから成ります。
I ）ビーズと検体血清との反応
検体血清を、あらかじめ精製 HLA が固定された蛍光ビーズと反応させます。特異性同定試薬は、1つの蛍光ビーズに1種類のHLAが固定されており、検体血清中に抗HLA抗体が存在する場合は、その抗体が反応性を持つ(CREG (Cross REactivity Group)を含む) HLAが固定されたビーズに結合します。
II ）標識抗体による標識および特異性の検出
血清との反応が終了した蛍光ビーズと標識抗体反応させると、抗HLA抗体のサプクラスに応じてサプクラス特異的な標識抗体が結合します。各蛍光ビーズは異なった蛍光色素で色分けされていますので、抗HLA抗体が結合した蛍光ビーズからはビーズ由来の蛍光シグナル以外に標識抗体による蛍光シグナルが得られます。すなわち、蛍光ビーズの種類(色分け)と標識抗体からの蛍光シグナルを識別して同時に検出し、さらに、蛍光シグナルのパターンから、抗HLA抗体の特異性を決定します。
2.製品内容(キットの構成)
本製品は、以下の試薬から構成されています。これらの構成試薬は必ず対応したロットの特異性同定試薬と組み合わせて使用してください。
注1）　すべての試薬は遮光して2〜8℃で保存して下さい。
3.使用手順
3. 1操作上の注意事項
1.すべての操作は、できるだけ光が当たらないように注意して行って下さい。 2.検体血清中にはウイルス、細菌等の感染性のものが含まれている恐れがありますので、感染防止のため、操作の際はご留意下さい。(後述) 3.検体ごとにチップを交換して下さい。
3. 2必要な装置・器具
本製品は必ず「 WAKFlow  HLA抗体特典性同定試薬」と併用してください。
(1)ビーズミックスと検体血清反応及び標識抗体による標識反応•96穴V底プレート■■以下のプレートを推奨いたします。 96穴V底マイクロウエルプレート(Thermo Fischer Scientific、商品番号#249944) •マイクロピペット(可変式:1〜20 μ L, 10〜200 μ L, 100〜1000 μ L  ) ・マルチチャンネルピペット(あると便利) •ボルテックスミキサー •プレートミキサー •マイクロプレート遠心分離機(1,300×gで使用可能なもの) (2)検出と解析•Luminexシステム・パーソナルコンピュータ
3. 3操作方法
3.3.1準備(1)検体血清の処理検体血清を10,000×gで2分間遠心分離を行い、不溶物を沈降させます。注)不溶物の混入があると、抗原抗体反応を阻害して正しい結果が得られなくなる恐れがあります。 (2)ビーズの処理1検体あたり特異性同定試薬のビーズミックス125μＬに①ポジティブコントロールピーズ10μＬを落加し、ボルテックスでしっかりと攪拌しておきます。 (3)プレートの準備本試薬では、1検体あたり5ウエル使用します。なお、下記の様にレイアウトすることで、解析が容易になります。 (3) Luminex装置ウオームアップを行います。 ■ Luminexを4時間以上放置すると、レーザーが消え、ウオームアップに30分かかりますのでご注意ください。
3.3.2 操作手順
(1)検体血清の処理1）特異性同定試薬の検体処理液を十分にボルテックスして撹拌します。 2） 検体血清125  μ Lと特異性同定試薬の検体処理液25  μ Lを混和します。 ■検体血清採取時は、チュープの壁や底に固着した沈殿物を持ち込まないように注意して上清を取り、ウエルに入れて下さい。 3） 25℃、10分間以上撹拌します。 *検体の処理後、壁面などに検体が多く付着している場合、状況に応じて遠心分離(フラッシュもしくは1,300×gで1分間)を行ってください。 ※ 以下の1)～11)の操作は、感染防止のため手袋を着用して行って下さい。 ※　操作は、96穴V底プレートを用いて行います。 1） ①ビーズミックス:25 μを96穴V底プレートに1検体あたり5ウエルに分注します。 2）これに(1)検体血清の処理で調製した検体血清:25μ Lずつ添加します。 3）反応ウエルに隣のウエルの検体が混入しないように隙間なくしっかりシールをした後、遮光(遮光可能なインキュベーター内、あるいはアルミホイル等で覆う)して25℃、30分間プレートミキサーを用いて攬拌し続けます。 ■■反応を行っている間に、Luminexシステムの測定準備をしておきます。 4）反応後、反応液が隣のウエルに混入しないよう注意しながら、慎重にシールをはがします。 5） 洗浄液:150μ Lを各ウエルに加え、プレート遠心分離機で1,300×g、2分間遠心分離を行います。遠心分離の後、上清をスナッピングまたはアスピレーションで除きます。 6）各ウエルに选準液:150μLを添加し、しっかりとシールをし、ボルテックスによりよく攪拌した後、 1,300×g、2分間遠心分離を行います。遠心分離の後、上清をスナッピング又はアスピレーションにより除きます。
7)  6)の操作を2度繰り返します。
■　この速心分離の間に、PE標識抗ヒトIgG(Fo Y)抗体は100倍、PE標識IgG1抗体、PE標識IgG2 抗体、PE標識IgG3抗体およびPE標識IgG4抗体は10倍に洗浄液で希釈しておきます。各サプクラス用のPE標識抗体は沈殿することがあります。使用前に10秒程度ボルテックスにより護担してください。
8）希釈した5種類の標識抗体:50 μ Lを1ウエルずつ添加します。
なお、3.3.1(3)の様にレイアウトした場合は、1行目にPE標識抗ヒトIgG(Fc y )抗体、2行目にPE標識抗ヒトIgG1抗体、3行目にPE標識抗ヒトIgG2抗体、4行目にPE標識抗ヒトIgG3抗体、5行目にPE標識抗ヒトIgG4抗体をそれぞれ添加します。 PE標識抗ヒトIgG(Fcy)抗体- PE標識抗ヒトIgG1抗体一PE標識抗ヒトIgG2抗体一PE標識抗ヒトIgG3抗体→ PE標識抗ヒトIgG4抗体→ 9）しっかりシールした後、遮光（遮光可能なインキュベーター内、あるいはアルミホイル等で覆う）して25℃、30分間プレートミキサーを用いて攪拌し続けます。 10)反応後、慎重にシールをはがし、各ウエルに洗浄液:150 μ Lを加え、1,300×g、2分間遠心分離を行います。遠心分離の後、上清をスナッピング又はアスピレーションにより除きます。 11)各ウエルに洗浄液:75  μ L を添加します。ビーズの塊が見えるようならシールして軽くボルテックスにより分散させて下さい。
(3)測定
Luminexシステムを用いて、ビーズミックスのLot番号に対応したプロトコールファイル或いはテンプレートファイルを使用して測定を行います。なお、3.3.1(3)の様にレイアウトした場合は、縦方向に測定してください。またその際、Luminex XYPの温度設定がOFFになっていることを確認して下さい。
3. 4測定結果の解析法
測定結果のCSVファイルを「WAKFlow HLA抗体サプクラス同定試薬解析ファイル」で解析します。ビーズミックスのLot番号に対応していない解析ファイルでは正しく解析できませんので、ご注意ください。
・「 WAKFlow HLA抗体解析ソフトウェア」
測定結果を専用の「WAKFlow HLA抗体サプクラス同定試薬保析ファイル」で解析します。検体血清の反応性は各HLA結合ビーズの蛍光値をプランクビーズ(BB)および標準陰性血清の測定値で補正したCalmed値を用いて解析します。それぞれのビーズはCalmed値に応じて4つの領域(スコア)に分類されます。抗HLA抗体の特異性が既知である複数のアロ血清を用いて陽性カットオフとするスコアをご確認ください。なお、ビーズミックスのLot番号に対応していないテンプレートファイルで測定した場合は正しく解析できませんのでご注意ください。
4.使用上又は取扱い上の注意
1.一般的注意事項•本品は研究用試薬です。疾病の治療や診断を目的として使用しないで下さい。 •使用期限を過ぎた試薬は使用しないで下さい。 •試薬類を飲んだりなめたりしないで下さい。試薬が皮膚に付着したり、目や口に入ったりしないよう十分に注意して下さい。また誤って皮膚に付着したり、目や口に入ったりした場合は、直ちに水で十分に洗い流すなどの応急処置を行い、異常があれば医師に相談して下さい。 2.使用者の危険防止に関する注意事項(1)ウイルス、細菌•検体血清中にはウイルス、細菌等の感染性のものが含まれている恐れがあるものとして取り扱い、専用エリアで操作して下さい。 •使用するピペットおよびチップはエリア専用として下さい。 •エリア専用の作業者を着用し、使い捨てのプラスチック手袋をご使用下さい。 •作業終了後は実験台を0.5％次亜塩素酸ナトリウム溶液(家庭用の塩素系漂白剤を10倍に希釈したもの)で拭いて下さい。 ・実験台等に血清が付着した場合は、0.5％次亜塩素酸ナトリウム溶液で拭いて下さい。 (2)廃棄物に関する注意事項血清を使用したものは、オートクレープ後廃棄して下さい。あるいは医療用廃棄物として廃棄して下さい。医療用廃棄物としての廃棄方法は、各実験施設の廃棄方法に従って下さい。 3.その他の注意事項本製品は、改良のため予告なく仕様を変更することもありますのでご了承下さい。
≪包装単位≫
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