川西　節明千葉工業大学先進工学部体育教室Key words :エクソソーム,  miRNA, 背格筋,運動,筋収縮
箱 富
加齢は骨格筋の萎縮や糖代謝機能の低下など身体機能の変化を生じさせることで、サルコペニア(加齢性筋肉減弱症)や糖尿病などの代謝性疾患の発症リスクを増大させる。一方で、運動は骨格筋の容量の増大や糖代謝機能の向上させることで、サルコペニアや生活習慣病の子防あるいは改善の効果を有することが知られている［1］が、この現象の調節機能の全容は明らかにされていない。したがって、運動による骨格筋の糖代謝機能の向上などの適応現象の分子メカニズムを解明することは、健康寿命の延伸を目指した治療法の技術開発に重要となる。運動に伴い骨格筋からは数多くのホルモンやサイトカインなどの液性因子が分泌されるが、これらの骨格筋由来の液性因子はマイオカインと呼ばれ、骨格筋の错代謝機能の向上や脂肪組織のエネルギー消費の増大、抗炎症作用など様々な生理機能を有することが明らかにされている［2］。しかしながら、マイオカインなどの液性因子のみでは運動適応現象の分子メカニズムの全容を解明することには至らず、マイオカインなどの液性因子以外にも運動適応現象を制御する因子が存在することが示唆されている。近年、エクソソームと呼ばれる顆粒物質が様々な生理機能を有することが明らかにされてきた。エクソソームは様々な細胞から分泌される細胞外小胞の一つで、エクソソームの中には多種多様なタンパク質、遺伝子の発現を調節する作用を有するマイクロRNA（miRNA）などが含まれている。組織に常在する細胞から分泌されたエクソソームはオートクリン（自己分泌）やパラクリン（傍分泌）として分泌臓器内で作用するのみならず、エンドクリン（内分泌）として血液により運搬されて標的組織に作用することで、エネルギー代謝亢進や抗炎症作用など様々な生理応答を生じさせることが知られている[3]。重要なことに、エクソソームは表面に発現する受容体や含有するmiRNAなどの違いにより数多くのサプタイプが存在しており、これらの各種のエクソソームサプタイプは生理応答に異なる影響を及ぼすことが明らかにされてきた。したがって、エクソソームは生体内での量的な変化のみならず、質的な変化が生体機能の調節に重要となる。近年、骨格筋からもエクソソームが分泌されることが報告されてきた。興味深いことに、高強度間欠的運動により、血液中のエクソソームに含まれるmiRNAの発現プロファイルが変化することが示されている[4]。エクソソームは背格筋の容量や魅代謝機能の調節など検々な運動適応現象に重要な役割を担うことが想定されるが、背格筋由来のエクソソームの変動とその生理学的意義についての全容は解明されていない。そこで、本研究では筋収縮により変動する骨格筋由来のエクソソームのmiRNAの探索と、変動するエクソソームが骨格筋の遺伝子発現を制御するのか否かを検討した。
方　炭
本実験は千葉工業大学動物実験委員会の承認を得て実施した。実験には10週齢のC57/BL6J雄マウスを使用した。マウスの下腿腓腹筋の近位と遠位に球竜極を留置して、経皮竜気刺激を負荷した。電気刺激の竜流の強度は足関節の伸展運動時の最大トルクを発揮する条件とした。20 mAの電流で3秒間の電気刺激と7秒間のインターバルの条件で10回1セット、セット間のインターバルを3分間に設定して合計6セットの電気刺激による筋収縮を麻積す下で負荷した。竜気刺激の90分後にマウスから血液を採取した。尚、対照として電気刺激無しのマウスから血液と下肢骨格筋を採取した。血液は30分間静置した後に遠心操作を行い、血清を分離した。血清中のエクソソームはポリマ一沈殿法により回収した。血清中エクソソームの数の測定には、エクソソームに含有されるAcetyl-CoA Acetylcholinesterase (AChE)の活性を酵素反応による比色定量法を使用した。また、血清中エクソソームからRNAを抽出した後にcDNAを作製して、real-time PCR法によりmicroRNAの発現量を定量した。内部標準としてU6 small RNAを用いた。細胞実験には、マウス骨格筋細胞株C2C12細胞を使用した。C2C12細胞はコンフルエンスした段階で分化用培地に交換して6日間培養した後に実験に使用した。筋背細胞に分化したC2C12細胞にエクソソームを1×10個添加した。尚、経皮電気刺激による筋収縮を負荷90分後のマウスおよび電気刺激無しのマウスから回収したエクソソームを使用した。エクソソーム添加6時間後に細胞を回収して、細胞からRNAを抽出した。cDNAを作製して、real-time PCR法によりmRNAの発現量を定量した。内部標準としてβ -Actinを用いた。
結　果
1.電気刺激による筋収縮が血清エクソソームの数およびmiRNA発現量に及ぼす影響
動物実験では骨格筋への経皮電気刺激が血清のエクソソーム教の変化とエクソソームに含有するmiRNA発現に及ぼす影響を検討した。マウス腓腹筋への経皮電気刺激による血清エクソソームの数の変化を図１に示した。電気刺激を行わなかったコントロール群では血清1 μ Lあたり3.1×10個、電気刺險群では2.7×10個であった（図1)。群間に有意な違いは見られなかった。マウス腓腹筋への経皮電気刺激による血清エクソソームのmiRNA発現の変化を図2に示した。miRNA-1発現量は、経皮電気刺激を行わなかったコントロール群と比べて、電気刺激群では約16.6倍に有意に高値であった（図2)。 miRNA-133発現量はコントロール群と比べて電気刺激群では約12.5倍に有意に高値であった（図2)。miRNA-206発現量はコントロール群と比べて電気刺激群では約11.1倍に有意に高値であった（図2)。図1.電気制激によるマウスの血清エクソソームの教の変化マウスの腓腹筋に経皮電気刺腋による筋収縮負荷90分後の血清エクソソームの数の変化。 CON :電気刺激負荷無し条件群、EPS :電気刺激負荷条件群。群間の差の比較にはStudentのt検定を用いた。図2.電気刺激によるマウスの血清エクソソームのmiRNA発現の変化マウスの脚Ь筋に経皮電気刺激による筋収縮負荷90分後の血清エクソソームのmiR-1、 miR-133、 miR-206の発現の変化。CON :電気刺激負荷無し条件群、EPS :電気刺激負荷条件群。群間の差の比較にはStudentのt検定を用いた（*p < 0.05)。
2.筋収縮により分泌されるエクソソームが骨格筋細胞の遺伝子発現に及ぼす影響
細胞培養実験では、筋収縮により分泌される血清エクソソームが骨格筋の糖代謝を制御する因子のmRNA発現に及ぼす影響を検討した。マウスの血清エクソソームの骨格筋細胞株C2C12細胞への添加によるmRNA発現量の変化を図3に示した。 IL-1 βおよびFndc5のmRNA発現は電気刺激を負荷したマウスの血清中エクソソームの添加は、無添加および電気刺激を負荷していないマウスの血清中エクソソームの添加と比較して有意な違いは見られなかった（図3A、D)。 IL-6のmRNA発現は電気刺激を負荷したマウスの血清中エクソソームの添加は、無添加および電気刺激を負荷していないマウスの血清中エクソソームの添加と比較して有意に高値を示した（図3B)。IL-15のmRNA発現は電気刺激を負荷したマウスの血清中エクソソームの添加は、無添加と比較して有意に低値を示したが、電気刺激を負荷していないマウスの血清中エクソソームの添加と比較して有意な違いは見られなかった（図3C)。図3.マウスの血清エクソソーム添加による骨格筋細胞のmRNA発現の変化骨格筋細胞株C2C12細胞へのマウス血清エクソソーム派加によるIL-1b (A)、IL-6 (B)、IL-15 (C)、 Fnde5 (D)のmRNA発現の変化。None :無添加、CON-Exo :電気刺激を負荷していないマウスの血清エクソソームの添加、EPS-Exo：電気刺激を負荷したマウスの血清エクソソームの添加。統計処理は一元配置分散分析を行い、多重比較にはTukey's testを用いた（*p＜0.05)。持久的運動によりエクソソーム中のmiRNAの発現プロファイルが変動することが報告されている。しかしながら、筋収縮で変動するエクソソームについてはほとんど明らかにされていない。本研究により、電気刺激負荷による筋収縮はマウスの血清エクソソームに miRNA 発現量を変化させることが示された。興味深いことに、竜気刺激負荷により血清エクソソ一ムで発現量が増加したmiR-1およびmiR-133、miR-206は骨格筋で発現が強いことが報告されている[5]。したがって、筋収縮により骨格筋からエクソソームが分泌されたことにより、血清中のmiRNA発現の変動が生じた可能性が示唆される。本研究では、骨格筋に特異的に発現するmiRNAのみに着眼して筋収縮による変動を検討したが、エクソソームにはこれら以外の多種多様な分子が含まれることから、筋収縮により分泌されるエクソソームの性質については、シークエンス法や質量分析法などの網羅的な分子解析法を用いて解析することが必要である。また、筋収縮により骨格筋からエクソソームが分泌される分子機序については、本研究は明らかにすることが出来ていないことから、今後はどのような分子機序により筋収縮によりエクソソームが分泌されるのかについての詳細な解明が必要である。また、電気刺險を負荷したマウス血清エクソソームの筋細胞への添加により、糖代謝けに関連するmRNA発現量の影響を検討した。結果として、糖の取り込みを亢進させるIL-6のmRNA発現が筋収縮を負荷したマウス血清エクソソームの添加により減少することが示された。したがって、筋収縮により分泌されるエクソソームが競代謝機能を制御することで、運動時の骨格筋の糖代謝の亢進に関与する可能性が示唆される。今後は、糖代謝に関連する細胞内シグナル伝達経路や糖の取り込み動態を検証することで、筋収縮由来のエクソソームの詳細な生理作用の解明が必要である。
訪　辞
本研究を遂行するにあたり、助成を賜りました公益財団法人上原記念生命科学財団に深く御礼申し上げます。