Potential role of protein phosphatases in exocytosis
着盛久　人
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追充Effects of okadaic acid (OA) and calyculin-A (CL-A), specific inhibitors of protein phosphatases 1 (PP1) and 2A (PP2A) on the release of serotonin from rat basophilic leukemia cell line (RBL-2H3) were investigated.  Both OA and CL-A induced the long-lasting release of serotonin in an extracellular Ca2*-independent manner.  CL-A did not increase intracellular Ca 2* concentration in the fura-2-loaded cells. CL-A was 100-fold more potent than OA in inducing the release, suggesting that PP1 is a dominant protein phosphatase in regulating RBL-2H3 cells. The CL-A-induced release of serotonin was completely inhibited by the nonselective protein kinase inhibitors, staurosporine and K-252a.  CL-A induced phosphorylation of several cellular proteins in RBL-2H3 cells, which could be inhibited by staurosporine. These findings suggest that the release of serotonin is subjected to tonic, Ca2*-independent, inhibition by PP1 in RBL-2H3 cells.
研究目的
神経伝達物質やホルモンなどの分泌過程はシナプス小胞（あるいは分泌小胞）と細胞膜との結合(docking)と融合(fusion)により行なわれ、この現象は同口分泌（exocytosis）と呼ばれる。この現糸は細胞膜の脱分框に続いて起こる細胞内Ca²濃度の上昇が引き金となり、これに伴う蛋白質リン酸化反応を介して遂行されると考えられている。この過程にはプロテインキナーゼＣをはじめ、穆々のプロテインキナーゼとリン蛋白質が関与している。例えばシナプス小胞のリン蛋白質であるシナプシンIはカルモデュリンキナーゼIIによりリン酸化を受けることで伝達物質遊織を惹起することが示唆されているなど、その他にも多くの知見が得られている。しかし、細胞内で燐酸化反応とcoupleしていると考えられる脱燐酸化反応の機能については未だ不明な点が多い。 2B型プロテインホスファターゼ（PP2Bまたはカルシニューリン）の特興的阻害薬である免疫抑制薬のFK506およびシクロスポリンが、肥満細胞のモデルであるラット好塩基球性白血病(RBL-2H3)細胞からのセロトニン滋養を抑制することが報告されている。このことから分泌反応が脱リン酸化反応を介して行なわれる、あるいは調節されていることが示唆される。プロテインホスファターゼはその梢造および機能上多様化が見られ、1型、2A、2B、2C型（PP1, PP2A, PP2B, PP2C）およびプロテインチロシンホスファターゼに分類される。本研究ではプロテインホスファターゼの機能を細胞工学的および分子生物学的手法を用いて解析し、プロテインホスファターゼによるエクソサイトーシスの調節の分子機構を明らかにすることを目的としている。
研究経過
（1）細胞塔發:ラット好塩基球性白血病(RBL-2H3)細胞は10%牛胎児血消を含むDMEM増地で、5% COz存在下、37度で培養した。 ( 2 )セロトニン遊獣実験：4 x 105／mlのRBL-2H3細胞を3H-セロトニンを含むDMEM培養液中にて18時間増築した後、洗浄し、HEPESバッファーにて縣潟した。0.2 mlずつ24穴プレートに分注し、種々の濃度の1型および2A型プロテインホスファターゼの特異的阻害薬（okadaic acid (OA)およびcalyculin-A (CL-A)）を適用した後、バッファー中および細胞内に残存する放射活性を測定し、セロトニン遊継級を算定した。 （３）細胞内カルシウム過度測定実験：HEPESパッファーにて10°／mlの細胞浮遊液を作成し、カルシウム蛍光指示薬fura-2 (5 x 10 ° M)を取り込ませ、細胞内カルシウム邊度測定装置(CAF-100)を用いて細胞内カルシウム濃度の変化を測定した。 ( 4 )細胞内蛋白質リン酸化実験：4 x 10 5 /mlの濃度の細胞内浮遊液を作成し、³²P-orthophate (0.1 mCi/ml)を30分間取り込ませた。種々の薬物を処置した後、細胞抽出液を調製し、SDS-PAGEおよびオートラジオグラフィによりリン酸化蛋白質を解析した。
研究成果
（1）セロトニン遊撃実験: OAあるいはCL-Aを処遊により、時間依存的に増加する持続性のセロトニン遊獣が窓起された。また、OAあるいはCL-Aにより誘発される遊嫌反応は濃度依存性であり、 ED50値はそれぞれ、1.2 μMおよび15 nMであった(Fig.1および2) 。EGTAを含むカルシウム除去HEPESパッファー中でも同様のセロトニン遊館を認めた。従って、この反応はカルシウム非依存性であることが示唆された。孫白質リン酸化酵素阻部薬であるスタウロスポリン(1 μM)およびK-252a (1 μM)を15分間前処設した細胞ではCL-Aによるセロトニン巡糖は完全に抑制された(Fig. 4) 。 ( 2 )細胞内カルシウム濃度測定実験：イオノマイシン(0.1 μM)により細胞内カルシウム濃度の急激な上昇を認めた。一方、CL-Aを45分間処置によっても有意の細胞内カルシウム濃度の上昇は認められなかった（Fig. 3）。このことからもセロトニン遊艇反応がカルシウム非依存性であることが示された。 (3)細胞内蛋白質リン酸化英酸：CL-A (30 nM)を処置した細胞で、25、20、18、15、13および12 KDaの蛋白質のリン酸化の亢進が認められた。スタウロスポリン(1 μM)前処控によりこのリン酸化の亢兆は完全に抑制された（Fig.5）。以上の結果よりPP1/2AはCa*非依存性の構成性分あに関与していると考えられる。即ち、RBL-2H3細胞からのセロトニン遊維に対してPP1/2Aはtonicに抑制をかけている。それが解除されると、数種類の蛋白質のリン酸化の亢進と共に遊雛反応が蒸起される。この反応は外液Ca*非依存性であること、高親和性IgEレセプター刺激を介したCa²*依存性セロトニン遊獣反応の際に見られるmyosin light chainのリン酸化の亢進は認められないことから、Ca²依存性の國節性分泌とは異なるメカニズムが存在すると考えられる。
今後の課題と発展
寝近、分泌反応は酵母のような下等動物から両等哺乳動物に至るまで、さらには免疫系および内分泌系細胞から伸経系細胞に至るまで、SNAPsとSNAP receptor (SNARE)との組み合わせにより遂行されるという極めて普遍的な機構が存在することが解かった。即ち、シナプス小胞（分泌小胞）膜にはsynaptobrevin/VAMPが、シナプス前酸にはsyntaxinとSNAP-25か局在し、これらがcomplexを作ることにより、fusionが起こりexocytosisにより伝達物質が放出される。脱リン酸化酵素系はシナプス小胞に局在する種々のリン蛋白質に作用して、分泌反応を獨節しているものと考えられる。さらに、開口分泌が起こった直後にはendocytosisと呼ばれる現象により分泌小胞のrecyclingが始まる。 endocytosisにはカルシニューリンがその標的蛋白質のdynaminと呼ばれるlarge molecular weight GTP-binding proteinを脱リン酸化することで盗起されると考えられている。さらに、clathrin-coated pitと結合するadaptor peptide(AP-2)もこの過程で機能すると考えられ、これらの分子間相互反応とプロテインホスファターゼの機能については今後の発展が期待される。
発表論文リスト
1) Sakamoto, N., Shuntoh, H., Tanaka, C. (1994): Protein phosphatase inhibitors induce the release of serotonin from rat basophilic leukemia cells (RBL-2H3). Biochim. Biophys. Acta 1221, 291-296. 2) Katayama, S., Shuntoh, H., Matsuyama, S., Tanaka, C. (1994): Effect of heat shock on intracellular calcium mobilization in neuroblastoma x glioma hybrid cells. J. Neurochem. 62, 2292-2299. 3) Mukai, H., Shuntoh, H., Chang, C.-D., Asami, M., Ueno, M., Suzuki, K., Kuno., T. (1994): Isolation and characterization of CAJ1, a novel yeast homolog of dnaJ. Gene 145, 125-127. 4) Chang, C.-D., Mukai, H., Kuno, T., Tanaka, C. (1994). cDNA cloning of an alternatively spliced isoform of the regulatory subunit of Ca2+/calmodulin-dependent protein phosphatase (calcincurin Ba2). Biochim. Biophys. Acta 1217, 174-180. 5) Tamura, K., Fujimura, T., Iwasaki, K., Sakuma, S., Fujitsu, T., Nakamura, K., Shimomura, K., Kuno, T., Tanaka, C., Kobayashi, M. (1994).  Interaction of tacrolimus (FK506) and its metabolites with FKBP and calcineurin. Biochem. Biophys. Res. Commun. 202, 437-443. 6) Yokoyama, N., Kuno, T., Furuyama, S., Wang, J. H. (1994).  Immunological approach to identify calmodulin-stimulated phosphatase isozymes from bovine brain. Mol. Cell. Biochem. 132, 101-108. 7) Nishikawa, M., Toyoda, H., Saito, M., Morita, K., Tawara, I., Deguchi, K., Kuno, T., Shima, H., Nagao, M., Shirakawa, S. (1994). Calyculin A and okadaic acid inhibit human platelet aggregation by blocking protein phosphatases type 1 and 2A. Cell. Signal. 6, 59-72. 8) Ikegaki, N., Saito, N., Hashima, M, Tanaka, C. (1994).  Production of specific antibodies against GABA transporter subtypes (GAT1, GAT2, GAT3) and their application to immunocytochemistry.  Brain Res. Mol. Brain Res. 26, 47-54. 9) Murakami, N., Sakai, N., Nei, K., Matsuyama, S., Saito, N., Tanaka, C. (1994). Potassium and calcium channel involvement in induction of long-lasting synaptic enhancement by calyculin A, a protein phosphatase inhibitor, in rat hippocampal CA1 region. Neurosci. Leit. 176, 181-184. 10) Osawa, I., Saito, N., Koga, T., Tanaka, C. (1994). Phorbol ester-induced inhibition of GABA uptake by synaptosomes and Xenopus oocytes expressing GABA transporter (GAT1). Neurosci. Res. 19, 287-293.