毛

I.はじめに
2003年のヒトゲノム解読完了の発表が世間に一大センセーションを巻き起こしたことは記憶に新しいが，このことは一般の人々の遺伝子研究およびその応用技術への期待の高さを示していると言える。遺伝子解析研究は医療や法医学，考古学，農学など様々な分野で行われ，実用的な応用技術が次々と開発されている。特に近年よく耳にし一般の人々の期待も高まっているのが遺伝子診断の分野である。遺伝子診断は遺伝子レベルでの遺伝病の確定診断はもとより，薬物代謝関連遺伝子や体質に関わる様々な遺伝子の多型を検出することで患者個々のレベルでの治療指針の策定を可能とする，すなわちオーダーメイド医療の到来をも予期している。遺伝子診断は近い将来，医療現場を根本から変えるかもしれないと言われている技術である。一方，個々人の遺伝子解析は病気の治療や発症の阻止につながるメリットばかりではなく，遺伝子診断により現在の治療技術では直すことのできない難病に罹る可能性が示されたり，体質次第では治療方針が八方ふさがりになることもありうる。また，個々の遺伝子情報が悪用されるおそれがないともいえない。医療の世界ではインフォームドコンセントの重要性が叶ばれて久しいが，遺伝子診断のような両刃の剣ともなりうる新技術に対してこそ十分なされなくてはならない。新しい技術を正しく発達させていくのは，この場合，説明責任を負う医師だけではなく，実際に判断や同意をすることになる患者の側もまたその役割を担う。その正しい選択のために，あるいは新技術の正しい発展のためにも，高等学校教育の場で遺伝子診断を正しく理解させる機会，すなわち実際に遺伝子診断実験を体験することは大変有意義なことだと考える。遺伝子診断実験を教材化する場合，いくつかの問題が生じる。まず第一に，どの遺伝子をターゲットにするかということである。教育の場で行う実験であるから，病気に直結するような遺伝子は望ましくない。また，現時点では機能不明な遺伝子をターゲットとする遺伝子解析は，結果から具体的なことが示されないので興味がそがれる。第二に，遺伝情報は「究極の個人情報」とも言われるように,その取り扱いは慎重を期さねばならないことがある。特に生徒自身が被験者となる場合は細心の注意が必要となる。第三に安全性の問題がある。実験操作自体に危険はないか，DNAの採取は安全に行えるかなどを考慮しなくてはならない。以上のような問題を考慮して，本研究ではアルコール代謝関連遺伝子であるALDH2遺伝子の多型を，自分自身の口腔粘膜細胞から抽出したDNAを用いて調べることを目標とした。飲酒後エタノールが代謝されてできるアセトアルデヒドを酸化し代謝する酵素であるALDH2 (aldehyde dehydrogenase 2)には遺伝的多型がある。ALDH2の対立遺伝子はALDH2*1（活性型）とALDH2*2（不活性型）の2つがあるが，ALDH2活性の欠損はALDH2遺伝子の一塩基多型（SNP： single nucleotide polymorphism）によるもので，不活性型の場合ALDH2遺伝子の第12ェクソンの104番目の塩基がG（グァニン）からA（アデニン）へ変異をおこし，指定される487番目のアミノ酸がグルタミン酸からリジンに変化しているり。遺伝子型によってALDH2は活性のあるタイプ(遺伝子型がALDH2*1/*1）と活性の低いもしくはないタイプ（ALDH2*1/*2およびALDH2*2/*2)に分けられる。遺伝子型が活性型ホモ接合体（ALDH2*1/*1）の人では，飲酒後，血中アルコール濃度が高くなるにつれてアルコール代謝は早くなるが，ヘテロ接合体（ALDH2*1/*2）や不活性型ホモ接合体（ALDH2*2/*2）の人では，アセトアルデヒドの代謝が遅れて，その血中濃度が上昇し，顔面紅潮や不快症状（フラッシング反応）が出現し，代謝速度は活性型ホモ接合体の人より遅くなる。特に不活性型ホモ接合体（ALDH2*2/*2）の人は，アセトアルデヒドの代謝速度がヘテロ接合体の人より明らかに遅く，不快症状も激しくなる傾向があることがわかっているり。したがってALDH2に関してどの遺伝子型を持っているかを調べることで，酒に強いか弱いか，非常に弱いかを判断することができる（活性型ホモ接合体はいわゆるお酒が飲めるタイプ，ヘテロ接合体はすぐに顔に出るが比較的飲めるタイプ，不活性型型ホモ接合体はすぐに顔に出てほとんど飲めないタイプといえる)。自分がどのタイプに属するかはアルコールパッチテスト（エタノールをしみこませたパッチテープを皮膚に貼り，7分後にはがし皮膚の色を見る。直ちに赤くなる場合は，不活性型ホモ接合体，10分後に赤くなってくる場合はヘテロ接合体，変化が見られない場合は活性型ホモ接合体と判定できる検査,正確性は95％を越える）で簡単に知ることができるので，決して特別な診断ではない。また，未成年者である高校生にとって，遺伝子診断の結果がすぐに役に立つものではないが，将来，急性アルコール中毒やアルコールに関連する病気を未然に防ぐために自ら飲酒量を制限するのに役立つと考える。実験は不特定の他人由来のDNA試料を用いることも考えられるが，実験に対する興味関心をより強く喚起できると期待される自分自身のDNAを用いることとした。個人情報の保護という点を重視するなら，不特定他者の検体が望ましいことは言うまでもない。しかしながら，自分自身の検体を扱うが故に，実験の過程においても個人情報保護の重要性をより強く認識することになり，情報の取り扱いの重要性についての教育的効果も期待できる。なおDNA採取は簡便さと安全性に配慮して口腔粘膜細胞から行うこととした。 SNPの検出法としては様々な方法が開発されているが，比較的方法が簡便な3つの方法について教材化の可能性を検討してみることとした。このうち2つは最近の教科書や資料集などでも紹介されることが多くなってきたPCR (polymerase chain reaction：ポリメラーゼ連鎖反応）法を応用したもので，残りの1つは栄研化学株式会社が開発した全く新しい遺伝子増幅法であるLAMP（loop- mediated isothermal amplification）法2を応用したものである。このうち，LAMP法では，増幅の原理こそ難解であるものの，増幅反応が等温条件下で進むことおよび増幅産物が極端に多いのでその検出がピロリン酸マグネシウムによる白濁の視認によって行える®という特徴があることを生かし、高等学校の実験室でも行える実験にすることを目標として検討を行った。
II.アリル特異的プライマーによるPCR法を用いたＳＮＰの検出(方法１)
1.原理
PCR法でプライマーを設計するときの注意事項の1つに，プライマーの3'末端の塩基配列が正確でなくてはならないというものがある。PCR法は遺伝子を増幅するだけでなく変異の導入や制限酵素切断部位の導入に使われることがあることからもわかるように，プライマーの塩基配列は100%鋳型のDNAと一致していなくても，条件次第で増幅反応が起こる可能性がある。しかし，DNA合成の基点となるプライマーの3'末端が1塩基でも異なるとTaqDNAポリメラーゼはDNA合成を開始しない。このことを応用し，PCRで用いられる2つのプライマーのうち，一方のプライマーにおいてその3'末端にSNPの1塩基がくるように設計することで，活性型ァリルと不活性型ァリルを区別することができろ。なお，この方法はALDH2遺伝子型決定方法としては最もポピュラーな方法であり，ニッポンジーンのDNA抽出キット「ISOHAIR」の実験例としてwebベージにも紹介されている。 4
2．材料と方法
( 1 ) DNAの抽出DNAは以下に示す方法で被験者の口腔粘膜細胞より抽出した。まず，清潔な綿棒を用いて口腔粘膜を15秒ほど擦り取り，これをPBS（リン酸緩衝化生理食塩水）を300 μ 1入れた1.5mlマイクロチューブ内に懸濁し，10000rpmで5分間遠心し，マイクロピペッターで上澄みを取り除いた（沈殿は肉眼で確認できる）。次に，この沈殿を試料として，ニッポンジーンのDNA抽出キット「ISOHAIR」を用いてDNAを抽出した。ISOHAIRは，髪の毛からのDNA抽出を目的としたキットであるが，口腔粘膜細胞からでもDNAを抽出することができる。なおISOHAIRによるDNA抽出のプロトコルは以下の通りである。次　殿70%エタノール800 μ1で洗浄後，5分間減圧乾燥する。 ←TE Buffer(pH8.0)20 μ 1を加え，沈殿を溶かす。 DNA溶液得られたDNA溶液は紫外線分光光度計を用いて濃度測定を行い，DNA濃度が20ng/ μ1になるようにTEパッファー（10mM Tris-HCl 1mM EDTA）で希釈しDNA試料とした。
( 2 )  PCR反応
①プライマープライマーはニッポンジーンのwebページにあるISOHAIR実験例「アルデヒドデヒドロゲナーゼ2遺伝子の遺伝子型決定」プロトコルに記載されていた3種類のプライマーを用いた。このプライマーは， SNPsの存在するALDH2遺伝子のェクソン12領域全体を増幅するもので，プライマー  F (Foword)の塩基配列は5'-CAAATTACAGGGTCAACTGCT-3'であり，活性型ァリルを増幅するプライマー RN (Reverce Normal)の塩基配列は5'-CCACACTCACAGTTTTCTCTTC-3'で，不活性型アリルを増幅するプライマー   RM   (Reverce   Mutant)  の塩基配列は5'- CCACACTCACAGTTTCTCTTT-3'である。プライマー RNとプライマー RMはそれぞれの塩基配列の3'末端の一塩基（下線で示した）が，SNPに相当する。 ②PCR反応得られたDNA試料５μ1に10×PCR Buffer (Applied Biosystems)  5μ1, dNTPs mixture (2mM each) 5 μ l,プライマーF (20pmol/ μ l,プライマー RNまたはプライマー RM (20 pmol/ μ l) 1 μ l, AmpliTaq DNA Polymerase (5unit/ μ l) 0.5 μ l,滅菌蒸留水32.5 μ lを加え,反応液全量を50 μ 1とした。反応サイクルは，予備加熱95℃3分の後，変性95℃20秒，アニーリングX°C20秒，伸長反応72℃30秒のサイクルを30～40サイクルの範囲で行い，最後に72℃ 7分で伸長反応を完成させた後，4℃に保った。アニーリング温度（X）に関しては，50℃～62℃の範囲で試してみた。サーマルサイクラーはPERKIN ELMER社のGeneAmpPCR System 2400を用いた。
（3）増幅産物の確認
増幅産物10 μ 1をBPB ３μ 1と混合し，3%アガロースゲルにより100Vで約30分電気泳動を行った。泳動後のゲルはエチジウムブロマイドで染色し，紫外線トランスイルミネーター上で観察した。
3.結果
様々な条件で検討を行ったが，アニーリング温度は62℃以上では増幅効率が低く，58℃以下の場合は不正な増幅（プライマーダイマーの形成など）が多く見られ，反応回数は35サイクルでは増幅効率が低く，40サイクルでは38サイクルの場合と大差なかったのでアニーリング温度は60℃付近が,反応回数は38サイクル前後が適当であると判断した。図1は，アニーリング温度を60℃，反応回数を38サイクルに設定し，3人分のサンプルの増幅を行ったものの電気泳動写真である。被験者Aは活性型ホモ接合体，被験者Bは不活性型ホモ接合体，被験者Cはヘテロ接合体と判定した。レーン③でもわずかにパンドが認められるが，被験者Aはその他の方法（PCR-RFLP法，LAMP法，アルコールパッチテスト）でもすべて活性型ホモ接合体と判定されたので，レーン③程度の極薄いパンドの場合は，増幅なしと判断して良いと考えた。なお，同じ試料を用いても，増幅が全く見られない場合とわずかに見られる場合があり，不正な増幅（電気泳動像がスメアリングするなど）が見られることもあった。また，図1には見られないが，プライマーダイマー由来と考えられるバンドが観察されることもまれにあった。用ブライマーをそれぞれ用いたものである。
4.考察
PCR法を用いて，ALDH2遺伝子のSNPタイピングをすることができた。しかし，プライマーの3'末端がミスマッチであっても増幅が見られたり，不正な増幅が生じるなど，実験の再現性にやや問題が残った。原因として試薬の撹拌が足りなかったりピペッティングによるコンタミネーションなど実験操作の乱雑なことが考えられるが，詳細は不明である。本法はブライマーの3'末端にSNPの一塩基を認識させる方法であることから，実験操作に十分熟練した実験者が操作を行わないと，判定ミスが生じることが危惧された。
Ш.  PCR－RFLP法を用いたSNPの検出（方法2 ）
1.原理
塩基配列に変異が起こっている部位が制限酵素認識部位となる場合，制限酵素により切断したDNA断片の長さが遺伝子型により変わってくることを利用した検出法である。本実験の場合，ALD H2遺伝子のSNPをふくむ部位は活性型テリルの場合は制限酵素Eco57Iにより認識され切断される(Eco57Iの認識配列を図2に示した。矢印が切断部位，下線部がSNPに相当する）が，不活性型の場合は切断され5'...CTGAAG(N) 16 ↓ ...3'ないので，酵素処理後のサンプルを電気泳動すればSNPタイピングを行うことができる。 RFLPはrestriction 3'...GACTTC(N) 14 ↑ ...5' fragment length polymorphism：制限酵素切断片長多型の略である。図2     Eco57Iの認識配列と切断部位
2.材料と方法
( 1 ) DNAの抽出PCR法の場合と同様に，口腔粘膜細胞をニッポンジーンのDNA抽出キット，ISOHAIRを用いて抽出したものを試料とした。DNA濃度は20ng/ μ lに希釈した。
（2）PCR反応
①プライマー Genbank  AF164120を参考にALDH2のェクソン12を含む周辺領域を増幅するプライマーを設計した。プライマー F (Foword)の塩基配列は5'-GAGCCCAGTCACCCTTTG-3'であり，プライマー R（Reverce）の塩基配列は5'-CCCAACAGACCCCAATCC-3'である。なお，プライマーの認識部位および制限酵茶の認識部位と切断部位，予想される増幅断片長を図3に示した。
ORIGIN
1 aaattacagg gtcaactgct atgatgtgtt tggagcccag tcaccctttg gtggctacaa 61 gatgtcgggg agtggccggg agttgggcga gtacgggctg caggcataca ctgaagtgaa 121 aactgtgagt gtgggacctg ctgggggctc agggcctgtt ggggcttgag ggtctgctgg 181 tggctcggag cctgctgggg gattggggtc tgttgggggc tcggggcctg ccagggttca //
図３　ブライマーの認識部位および制限酵素Eco57Iの認識部位
10〜124までがALDH2のエクソン12領域。実線のアンダーラインがブライマーの認識部位。波線のアンダーラインが制限酵素の認識部位。赤色矢印が制限酵素切断部位。ただし、図に示されていない相補鎖では3'末端方向に2塩基ずれる。予想される増幅断片長は活性型アリルの場合、33～130までの98bpと133～217までの85bp、不活性型アリルの場合は33～217までの185bp。
②PCR反応
得られたDNA試料5 μ 1にPCR Buffer (Applied Biosystems)  5 μ 1, dNTPs mixture (2mM each) 5 μ 1,ブライマー Ｆ (20pmol/ μ 1) 1 μ 1,ブライマー Ｒ (20pmol/ μ 1) 1 μ 1, AmpliTaq DNA  Polymerase  (5unit/ μ 1)  0.5 μ 1, 滅菌蒸留水32.5 μ 1を加え，反応液全量を50 μ 1とした。反応サイクルは，予備加熱95℃3分の後，変性95℃30秒，アニーリング50℃30秒，伸長反応72℃45秒のサイクルを40サイクル行い，最後に72℃ 7分で伸長反応を完成させた後，4℃に保った。サーマルサイクラーはPERKIN ELMER社のGeneAmp PCR System 2400を用いた。 ③酵素切断処理PCR反応後の増幅産物18 μ 1に10 × BufferG （Fermentas)2 μ 1,    0.5mM    SAM （S- adenosylmethionine) 0.4 μ 1, Eco571 (5unit/ μ 1, Fermentas) 1 μ 1を加え全量を21.4 μ 1の反応液とし，37℃で2時間インキュベートした。
（3）増幅産物の確認
増幅産物10 μ 1をBPB ３μ 1と混合し3%アガロースゲルにより100Vで約30分間，または6%ポリアクリルアミドゲルにより80Vで約1時間30分間の電気泳動を行った。泳動後のゲルはエチジウムプロマイドで染色し，紫外線トランスイルミネーター上で観察した。
3.結果
6%ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行ったところ，各遺伝子型を明瞭に区別することができた（図4）。被験者A（レーン②）では，100bp以下の部分に2本のパンドが明瞭に見られるが、これは活性型アリルが制限酵素により切断されたものであると考えられる（上段が98bp，下段が85bpに相当すると考えられる)。200bp付近にわずかにパンドが観察されるが，これは制限酵茶により消化しきれなかった増幅断片であろうと考えられる。この結果から被験者Ａは活性型ホモと判定することができた。被験者B（レーン③）では，レーン②でも見られる制限酵茶切断後の断片の他に200bp付近にも明瞭なバンドが観察される。これは，制限酵茶による切断を受けなかった増幅断片，すなわち不活性型アリル(185bpに相当する)であると考えられるので，被験者Bはヘテロ型と判定することができた。被験者C（レーン④）では，被験者Bにも見られる不活性型ァリルの増幅断片のみが観察されたので不活性型ホモと判定することができた。増幅産物の酵素処理後の６％ボリアクリ改4ルアミドゲル電気泳動像。レーン①はサイズマーカー、レーン②は被験者A(活性型ホモ）、レーン③は被験者B（ヘテロ型）、レーン④は被験者C（不活性型ホモ）である。
4.考察
PCR-RFLP法を用いて，ALDH2遺伝子のSNPタイピングをすることができた。この方法で用いたプライマーでは，プライマーダイマーなどの不正な増幅がパンドとして検出されることも極めて少なく，前述の方法（アリル特異的プライマーによるPCR法）と比較して判定ミスはほとんどで起こらないと考えられた。一方，PCRの段階こそ反応液は1種類で簡潔であるが，その後に酵茶切断処理(2時間)，ポリアクリルアミドゲル電気泳動（準備も含めて3時間強）と続くので，実験操作も煩雑となり，時間もかかることが離点であるように思われた。
IV.  LAMP法を応用した方法を用いたSNPの検出（方法3 ）
1.原理
LAMP法では，増幅を目的とする遺伝子の塩基配列（塩基数は300bp前後）に6つの領域を認識する4種のプライマーを設計し，増幅反応を進めるという新しい遺伝子増幅法であり，その反応は等温条件下（65℃付近）で進み反応時間は30分程度で完了し，さらに反応産物が極端に多く増幅の有無をピロリン酸マグネシウムの白濁で検出できるという特徴がある（詳細は，楽研化学のWebページまたはNotomiら(2000)²')。 LAMP法を応用したSNPタイビングについては，Iwasakiら（2003） 5の方法に準じた。Iwasakiらは，薬物代謝関連酵茶であるチトクロームP450の合成を司る遺伝子であるCYP2C遺伝子のSNPタイピングにおいて，LAMP反応の増幅サイクルの起点構造となるダンベル様の構造を作らせるときにアニールする領域（F1およびB1領域）の5'末端側より1塩基内側にSNPの1塩基を設定して，ミスマッチの場合はダンベル様構造をとらせないようにすることで増幅反応を止める（あるいは遅延させる）という方法をとっている。本研究においても，ALDH2遺伝子のSNPの1塩基をF1およびB1領域の5'末端より1塩基内側に設定するという方法で，SNPタイビングを試みた。
2.材料と方法
( 1 ) DNAの抽出PCR法の場合と同様に，口腔粘膜細胞をニッポンジーンのDNA抽出キット，ISOHAIRを用いて抽出したDNA試料をTEパッファーで様々な濃度に希釈したものを試料として用いた。
（２）LAMP反応
①プライマーの設計まず図5に示すように，ALDH2遺伝子の第12ェクソンとその周辺の領域（GenBank AF164120）に，6つの領域（F1，F2，F3，B1，B2，B3）を設定した。領域の設定に当たっては，インターネットに公開されているLAMP法プライマー作成ソフト（Primer explorer Ver.3）を用いて得られたものを，若干変更するとともに，F1領域とB1領域については，その5'末端側から1塩基内側にSNPsの1塩基が来るように設定した。 91 71 81 51 61 1 11 21 31 41 AAATTACAGG GTCAACTGCT ATGATGTGTT TGGAGCCCAG TCACCCTTTG GTGGCTACAA GATGTCGGGG AGTGGCCGGG AGTTGGCCGA GTACGGCTG F 2 F 3 tttaatgtcc cagttgacga tactacacaa acctcgggtc agteggaaac caccgatgtt ctacagcccc tcaccgggcc tcaacccgct catgccgac L o o p F 191 161 - 171 - 131 141 151 181 101 111 121 CAGGCATACA CTGAAGTGAA AACTGTGAGT GTGGGACCTG CTGGGGGCTC AGGGGCCTGTT GGGGCTTGAG GGTCTGCTGG TGGCTCGGAG CCTGCTGGGG * L o o p B B 1 c etccetatet gacitcacit ttgacactca caccctggac gaccccgag ttcccggacaa ccccgaactc ccagacgaccc acggagcctc ggacgacccg B 2 F 1 c 201 211 221 * 113, in ALDH2*2, replace * A' GATTGGGGTC  TGTTGGGGGC  TCGGGGCCTG-3' ctaaccccag acaaccccg agccccggac-5′ B-3図5　ALDH2遺伝子、第12エクソン領域（10～124）とその周辺の塩基配列および、LAMP法におけるプライマー認識部位（6カ所＋ループプライマー認識部位2カ所）の設定位置。 *がSNPの1塩基。そして，この6つの領域を認識する4種類のLAMPプライマー（FIP，BIP，F3，B3）を作成した。このうちFIPとBIPについては，SNP部分の塩基を変えることによって，活性型アリル増幅用のFIP- N，BIP-Nおよび不活性型ァリル増幅用のFIP-M，BIP-Mを作成し，合計で6種類のプライマーを用意した。さらに，LAMP反応の速度を高めるためにF1とF2の間，およびB1とB2の間にそれぞれLoopFおよびLoopBの領域を設定し（図5 )，それぞれの領域を認識するLoopプライマー2種も作成した（図6)。プライマーの精製度については，B3, F3, LoopF, LoopBプライマーの4つについてはOPC (oligonucleotide purification cartridge column：簡易カラム）精製グレードとし，FIP-N，BIP- N, FIP-M, BIP-MブライマーについてはHPLC (high performance liquid chromatography:高速液体クロマトグラフィー)精製グレードとした。 N (Normal)型増幅用プライマーセットEal P 5ベ「Ｆ 1 c 」「Ｆ 2 」 3ベ5ベ「Ｂ１ｃ」「Ｂ２」 ３ベBell P 5ギャ「Ｆ３」 3ギャF 3 5ベードB 3 」 3ベB  3 5ぎ「ＬｏｏｐＦ」 3ぎL o o p — F 5ぎ「ＬｏｏｐＢ」 3ぎL o o p — B  TCAGTGTATGCC-GCTACAAGATGTCGGGGAGTG (33mer) TGAAGTGAAAACTG-CCACCAGCAGACCCTCAAG (33mer) GAGCCCAGTCACCCTTTG (18mer) CCCAACAGACCCCAATCC (18mer) CCCTCAACCCGCTCATG (17mer) GACTCGGGGTCGTCCA (17mer) M (Mutant)型増幅用プライマーセット5ぎ「Ｆ１ｃ」「Ｆ２」 ３ぎFoll P Brile P 5年[ B 1 c ] 「 B 2 」 3年F 3 5ベ「Ｆ３」 3ベB  3 5年「Ｂ３」 ３年L o o p — F - 50年「Lolop F」31 L o o p — B   5年「 L o o p B 」 3年  3 TTAGTGTATGCC-GCTACAAGATGTCGGGGAGTG (33mer) TAAAGTGAAAACTG-CCACCAGCAGACCCTCAAG (33mer) GAGCCCAGTCACCCTTTG (18mer) CCCAACAGACCCCAATCC (18mer) CCCTCAACCCGCTCATG (17mer) GACTCGGGGTCGTCCA (17mer)図6   LAMP法で用いるプライマー  アンダーラインがSNPの1塩基。
②LAMP反応
得られた試料DNAをTEバッファー（10mM Tris-HCl, 1mM EDTA）で様々な濃度に希釈したもの5 μ 1および蛍光目視検出試薬（楽研化学）1 μ 1, F3プライマーおよびB3プライマー 5pmoles, FIP-NプライマーおよびBIP-Nプライマー 40pmolesまたはFIP-MプライマーおよびBIP-Mプライマー 40pmoles, Bst DNA polymerase (New England BioLabs)  8unitを含む2種類の反応液(表1にその組成を示す) 25 μ 1を，反応温度は55℃～70℃の範囲，反応時間は25分から60分の範囲の様々な条件下ででインキュベートした後，反応停止（酵素失活）の為に80℃で2分間インキュベートした。インキュベートにはPERKIN ELMER社のサーマルサイクラーGeneAmp PCR System 2400を用いた。なお，反応液AはIwasakiら（2003）の論文に記載されている反応液組成，反応液Bは栄研化学のDNA増幅試薬キットの反応液組成を参考に若干の改変を行ったものである。 （3）増幅産物の確認
①電気泳動による確認増幅産物3 μ 1をBPB ２μ 1と混合し，3%アガロースゲルにより100V，約30分の電気泳動を行った。泳動後のゲルはエチジウムプロマイドで染色し，トランスイルミネーター上で観察した。 ②白濁による確認LAMP法の特徴である増幅の副産物であるビロリン酸マグネシウムによる反応後の白濁の度合いを肉眼で観察した。 ③蛍光目視検出試薬による確認LAMP反応後の反応チューブをトランスイルミネータ上または携帯式の長波長紫外線ランプ（Bio- Rad社）を用いて観察した。
3.結果
まず，反応液Aを用いた場合の結果について述べる。遺伝子型のわかっている3人の被験者（A：活性型ホモ，B：ヘテロ型，C：不活性型ホモ）の試料を様々な条件で増幅を試みた結果，増幅時の温度については60℃～63℃の範囲で，増幅時間については40分，試料のDNA濃度についてはISOHAIRの標準プロトコルで得られたDNA溶液を100倍に希釈したもの（DNA濃度は個人差もあるが1ng/ μ l前後）を用いたときに，SNPタイピングを正確に行うことができた。図7はその時の反応後の溶液を電気泳動したものである。アリルがプライマー図7　LAMP反応後の電気泳動像。レーン①はサイズマーカー、レーン②、③が被験者A、レーン④、⑤が被験者B、レーン⑥、⑦が被験者C、レーン⑧、⑨がネガティブコントロール（DNAを加えていない）である。また、レーン②④④は活性型アリル増幅用ブライマーを、レーン③⑤⑦⑨は不活性型アリル増幅用ブライマーをそれぞれ用いたものである。の塩基配列とミスマッチとなるレーン③やレーン⑥ではLAMP反応は全く進行していないことがわかる。また増幅の見られた試料での泳動像は，LAMP法による増幅産物に特有のラダーパターン(様々なサイズの増幅産物が含まれるため)が観察され，LAMP反応が正常に進行したことを示した。被験者Aは活性型ァリル増幅用プライマーでのみ，被験者Bでは活性型ァリル増殖用プライマー，不活性型アリル増殖用プライマーの両方で，被験者Cでは不活性型アリル増殖用プライマーでのみ増幅が起こったので，SNPタイピングが正確に行われた判断した。蛍光目視検出試薬による検出では，増幅反応の有無は紫外線トランスイルミネータ上での蛍光観察(携帯式の簡易紫外線ランプでも可能)についてはもちろんのこと，蛍光灯下において特に紫外線を照射しなくても試薬の変色が肉眼で観察され，増幅の有無を判定することができた（図8)。しかし，LAMP法に特有のピロリン酸マグネシウムによる白濁については，増幅の見られた反応チューブでもわずかな白濁しか観察されず増幅の判定に用いることはやや困難ではないかと思われた。なお，試料DNAの濃度については， 5 ng/ 図8 蛍光目視検出試薬による増幅の検出。左：トランスイルミネーター下で観察したもの。 μ1や20ng/ μ1に調整したものについて増幅テ右：蛍光灯下で観察したもの。どちらも左側のチューストを行ったが，結果にやや揺らぎ（ミスマッブが増幅＋、右側が一。チでも増幅が起こる）が見られた。次に反応液Bを用いた場合の結果について述べる。反応液Bを用いること以外の条件は上記反応液Aを用いた場合と同じ条件で実験を行ったが，安定した結果を得ることができなかった。すなわち，増幅が見られる場合は白濁が強く観察され，肉眼でも判定可能かと思われたのだが，結果に揺らぎが多く（ミスマッチでも増幅反応が見られることがたびたび観察された)，SNPタイビングを行うことはできなかった。
4.考察
LAMP法でALDH2遺伝子の活性型および不活性型の各アリルに特異的なプライマー（F1領域およびB1領域の5'末端側より1塩基内側にSNPの1塩基を設定する）を設計することでALDH2遺伝子のSNPタイピングをすることができた。LAMP反応の最適温度は60℃～63℃付近であり，反応時間は40分が適当であることが示唆された。また，増幅の確認は，蛍光目視検出試薬を用いれば煩雑な電気泳動などの操作によらなくても，紫外線を当てるだけであるいは肉眼ででも行うことが可能であると思われた。一方，LAMP反応で正確にSNPを判定するためには，試料DNAの純度や濃度，温度や時間などの反応条件の正確な設定が必要となることも示唆された。また反応溶液中のdNTPs濃度およびMgイオン濃度が高すぎるとSNPがうまく認識できないことが多くなった。一般にDNAポリメラーゼの反応は反応液中のdNTPs濃度やMgイオン濃度が高くなってくると正確性が低下すると言われているので,このこととの関連性が示唆された。白濁による検出を可能とするためには，Mgイオン濃度を高めに設定する必要があるが，SNP検出においては正確性が低下するので，残念ながら白濁の視認による検出は断念せざるを得なかった。 LAMP法は非常に簡易ではあるが，今回の方法でのSNPの認識に関しては反応液の組成，反応条件のわずかな違いにより揺らぎが見られ，判定ミスも起こりうるので，初心者が行うのに適しているとは言い難い。揺らぎの主な原因としては，ミスマッチのアリルでも増幅がまったく起こらないのではなく，遅れて起こることもあることがあげられる。リアルタイムでDNAの増幅をモニターすることにより，より正確にSNPタイピングを行うことは可能になると思われるが，今回の研究の目的(高等学校でも行える実験とすること)からそれるので行わなかった。
V.まとめ
高等学校生物での教材化を前提に，ALDH2遺伝子の遺伝子診断を3種類の方法で行ってみたが，それぞれに利点や困難点があった。以下の表2は，それぞれの実験方法の特徴などをまとめたものである。
PCR法を応用した2法については，必要な器材や実DNA抽出•細胞中のDNA • RNA験にかかる時間などから考えて，実際に生徒が取り組•酵素の性質（最適温度，最適pH）んでみる実験としては考えにくい。しかし，PCR法は→ •疎水性と親水性などDNA研究を根本から変えるきっかけとなった技術でPCR反応もあり，高等学校の生物の教科書や資料集にも紹介さ• DNAの半保存的複製•塩基の相補性れるようになってきたので，設備次第では是非とも行っ•高熱性細菌たどてみたい実験である。また，DNA抽出から電気泳動電気泳動に至るまでの一連の過程の中では，図9に示すように， •ゾルとゲル（コロイド溶液）高校レベルの化学や生物の知識で説明される内容が目•分子量など白押しであるので，それらの総復習的な実習として取図9   PCR法と高等学校の生物・化学り扱うこともできると思われる。2004年7月には，岐阜大学教育学部生物学教室の実験室にて，岐阜県立東遺高等学校の生徒6名の参加により「先端科学体験講座，遺伝子診断に挑戦」と題しての実験講習会を開催し，方法1に示す流れで実際に遺伝子診断実験を行った。診断実験自体は，操作の未熟さもあってか明瞭な結果を得ることができなかった生徒もいたが，事後のレポートや感想では，実験自体の流れが大変勉強になったという声が聞かれた。実験としては1日丸ごとかかる内容になるのだが，生徒は非常に興味をもって取り組めたようであった。今回の研究における最大の目標は，高等学校の実験室でも行うことのできる平易な遺伝子診断実験の開発であり，その可能性をLAMP法に託したわけであるが，現時点では判定に揺らぎの出る可能性が残され，教育現場で初心者が行うのには問題が残された。しかしプライマーの改良や実験条件の最適化次第では，判定がさらに正確になる可能性も残されており，アルコールパッチテストを実験の誤判定を防ぐためのコントロール実験として熟練した教員が主体となって同時に行えば，現時点でも十分有効な遺伝子診断実験になりうるのではないかと考えている。将来的には，高等学校の1時間の授業でも行えるような実験とされ，より多くの生徒が遺伝子診断を体験できるようになるものと期待したい。一方，LAMP法自体の原理は非常に難解なので，実験過程全体が教材となりうるPCR法と比較すると教材としての学習内容は豊富とはいえない。本来の実験目的である遺伝子診断に焦点を絞って授業を進める必要性が生じると思われる。今回の研究を通じて，遺伝子診断実験が高等学校生物において，非常に有益な教材になりうることが感じられた。しかし現時点では，設備や費用そして生徒の実験技能など様々な問題が山積されており，すぐに現場で役立てるには難しい部分も残されている。一方，日本でもSNPsの影響を調べる大規模な疫学調査が始まり，短時間でSNPs検出が可能な機器が開発されたこと等を考えると，遺伝子診断が日常的に医療の現場で用いられるようになる日は意外と近いかもしれない。高等学校でも可能な実験教材の開発は，そのような未来を生きる為に必要な知識や技能を身につけさせていくためにも，より一層の研究が必要になってくるだろうと考えている。実験に際してDNAサンプルの採取に協力して頂きました岐阜大学教育学部の皆様，および岐阜県立東濃高等学校の皆様に深く感謝いたします。 1) 上野易弘(1999)：飲酒に影響を与える遺伝子  遺伝, 53(10), 51-56 2) Notomi,T., Okayama H., Masubuchi, H., Yonekawa, T., Watanabe, K., Amino, N., and Hase, T.,(2000) : Loop-mediated isothermal amplification of DNA  Nucleic Acid Research, 2000,.28,e63 3) Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., and Notomi, T., (2001):  Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by tubidity delived from magnesium pyrophosphate formation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 289,150 4)ニッポンジーン（株） webベージ：ISOHAIR実験例（http://www.nippongene.jp/pages/protocols/ aldh2.html) 5) Iwasaki, M., Yonekawa, T., Otsuka, K., Suzuki, W., Nagamine, K., Hase, T., Tatsumi, K., Horigome, T., Notomi, T., and Kanda, H.(2003) : Validation of the Loop-Mediated Isothermal Amplification Method for Single Nucleotide Polymorphism Genotyping with Whole Blood. GENOME LETTERS 2003,2,119-126