奈良県立医科大学産婦人科小林浩Background: Cytokines are produced as a consequence of photo-damaged DNA and oxidative stress in ultraviolet (UV)-exposed keratinocytes. A soybean Kunitz trypsin inhibitor (KTI) down-regulates the expression of proinflammatory cytokines such as TNF-alpha in tumor cells and inflammatory cells. Purpose: We analyze the effect of KTI on TNF-alpha production in UV-exposed primary human keratinocytes. Results: Here, we show 1) UV induced up-regulation of TNF-alpha mRNA and protein expression in keratinocytes; 2) cells treated with KTI before UV irradiation showed a significantly lower accumulation of TNF-alpha protein in a dose-dependent manner and reduces UV-induced up-regulation of TNF-alpha mRNA expression; 3) KTI inhibits the induction of TNF-alpha target molecules interleukin-1beta (IL-1beta) and IL-6 proteins; 4) UV irradiation transiently activates JNK and Akt signaling but only weakly activates ERK and p38; 5) KTI specifically inhibits UV-induced activation of ERK, JNK and p38, but not Akt; 5) treatment of cells with SP600125, a pharmacological inhibitor of JNK, predominantly suppresses UV-induced up-regulation of TNF- alpha expression; 6) KTI does not enhance suppression of UV-induced JNK phosphorylation by SP600125. Conclusions: KTI specifically inhibits UV-induced up-regulation of cytokine expression predominantly through suppression of JNK signaling pathway.
緒言
紫外線照射による発赤や皮膚の炎症は身近に経験するが、抗ヒスタミン剤やステロイド等により治療されることが多い。しかし、ステロイドによる反応性皮膚障害の報告もあり、多用・長期使用することは困難である。最近、我々は、大豆蛋白中に炎症を抑制する成分があることを発見し、精製した結果、この物質はKunitz trypsin inhibitor（KTI）と呼ばれている分子量20kDaの蛋白質であった。Kunitz inhibitorは大豆のみならず、羊水・尿にも存在し、国際的にはビクニンと命名されている。ヒトのビクニンの分子量は40kDaである。ビクニン及びKTIには抗炎症作用があることが報告されている。その作用機序はTNF-alphaやIL-lbeta等のサイトカイン産生抑制であえ。紫外線照射によってDNAが損傷したり、酸化ストレスが起こった結果皮膚からサイトカインが産生されるので、もし、紫外線照射による皮膚の炎症をビクニンやKTIが抑制することができるのであれば、日焼け止めクリームとして利用可能であると考えた。そこで、今回、皮膚のkeratinocytesの初代培養系を使用し、KTIが紫外線照射に伴うサイトカイン産生抑制をInhibition of ultraviolet-induced sunburn by a soybean Kunitz trypsin inhibitor Hiroshi Kobayashi Department of Obstetrics and Gynecology, Nara Medical Universityおこすかどうか実験した。
実験
1）培養細胞ヒトkeratinocytesの初代培養は手術時に採取した組織より調整したり。塔養液はMCDB153を用い、 3－5代目の培養細胞を今回の実験に用いた。
2）紫外線照射
培養液を除去後にUV 0−800J/ ㎡のエネルギーで培養細胞に照射した。Westinghouse broad-band sunlampを使用して培養皿の後面から照射した。290nmのUVCを除去する為にKodacel TA 401/407を使用した。細胞に直接照射されたエネルギーはUVB60 – 70%、UVA30 – 40%の構成であった。照射エネルギーのモニタリングは常にUV-340 photometer/photodetector systemにより監視した。培養細胞には照射前にKTIやpharmacological inhibitorを添加しておいてから１時間後に紫外線照射した。培養細胞に紫外線照射したときのTNF-alpha産生に対するKTIの抑制効果をみるために、KTIの濃度を0.1,   1 , 5，10 microMに設定して事前に添加した。その２時間後に紫外線照射を行ない、TNF-alpha濃度を測定した。このKTIの抑制がどのようなシグナル伝達に関与しているかを見るために、MEK, JNK, p38, EGFRに対するインヒビターを0.5–1時間前に投与することにより比較検討した。塔養液を採取し、サイトカイン測定まで凍結保存した。 TNF-alpha, IL-1beta, IL-6はそれぞれの特異的ELISAにて測定した。実験の一部では、KTIを照射前、照射中、照射後に添加して、その効果を確認した。細胞障害性はMTTアッセイと培養液中のLDH測定、ならびにトリパンプルー法により評価した。また、アポトーシスはHoechst 33342の取り込みにより蛍光顕微鏡で評価した。Western blotやRT-PCRは既報のごとくである。
結果
1）紫外線照射後における細胞内シグナル伝達図１は紫外線照射後、５, 15, 30, 60分後におけるMAPキナーゼとAktのリン酸化と総蛋白量との関係をWestern blotにより示したものである。この実験では400J/ ㎡のエネルギーを照射した場合の結果を示す。紫外線により最も活性化されるのは、JNKとAktであり、いずれも15分後にピークを認めた。ERKとp38のリン酸化は非常に僅かではあるが、これらも活性化されていた。紫外線照射は200–400J/ ㎡のエネルギーでリン酸化が最大を示した。
2）紫外線依存性のAktのリン酸化はEGFRとPI3K
を介している
図2は紫外線によるAktのリン酸化はEGFRとPI3Kを介していることを示したものである。400J/ ㎡のエネルギー照射によるAktのリン酸化はAG1478（EGFR inhibitor）とLY294002 (PI3K inhibitor) およぴWortmannin (PI3K inhibitor）により抑制されたが、SP600125（JNK inhibitor）の影響を受けなかった。 3）KTIはMAPキナーゼのリン酸化は抑制するが、 Aktのリン酸化は抑制しなかった図３には紫外線400J/㎡で刺激する前に、KTI, LY294002, SP600125を事前投与することにより、JNKとAktのリン酸化を検討した結果を示したものである。KTIは紫外線400J/ ㎡によるJNKのリン酸化は抑制するが、Aktのリン酸化は抑制しなかった。コントロール実験ではJNKのリン酸化はSP600125により抑制されるが、LY294002では無効であった。KTIとSP600125の同時添加によってもSP600125の効果を促進することはなかった。
4）KTIは紫外線照射によるkeratinocytesからの
TNF-alpha産生を濃度依存性に抑制する
図４aに示したように紫外線照射によるTNF-alpha産生はSP600125事前添加により著明に減少した。一方、図4 bに示したように紫外線照射によるTNF-alpha産生はKTI事前添加により濃度依存性に減少した。50％抑制はKTI約5 microMであった。これはJNKのリン酸化抑制する濃度と類似していた。
5）KTIは紫外線照射によるkeratinocytesからの
TNF-alpha mRNA産生を抑制する
図５に示したように紫外線照射によるTNF-alpha mRNA産生はSP600125事前添加により著明に減少した。一方、紫外線照射によるTNF-alpha mRNA産生はSP600125あるいはKTI事前添加により減少した。このデータはTNF- alpha蛋白産生と一致した。 AG1478
LY294002図２　Keratinocytesを培養し400J/㎡ UV照射後のAktのリン酸化の状態をWestern blotで示す。それぞれのレーいはAG1478, LY294002,しWortmannin, SP600125を前添加してある。上段はリン酸化蛋白で、下段は総蛋白を示す。a, b, c, dのラベルは５％の有意差があることを示す。ことを示す。 B UV KTI LY294002 SP600125
Keratinocytesを培養し400J/㎡ UV照図5射後の培養細胞中のTNF-alphaのmRNAを示す。それぞれのレーンには各種インヒビターを前添加してある。下段はコントロールとしてのbeta-actinを示す。a, b, c, dのラベルは５％の有意差があることを示す。
6）KTIは紫外線照射によるkeratinocytesからのIL-
1betaおよびIL-6産生を抑制する
TNF-alphaのターゲットサイトカインであるIL-1betaおよびIL-6産生についても検討した。予想されたとおり、 KTIによりIL-1betaおよびIL-6産生も抑制された（図6 )。
考案
我々はヒト羊水・尿中より抗炎症作用を有する糖蛋自質としてビクニン(bikunin, urinary trypsin inhibitor [UTI]）を発見し、①切迫早産治療薬、および、②癌転移抑制薬として開発してきた。切迫早産治療薬はすでにウリナスタチン膽座薬として臨床で使用されている。また、猫転移抑制薬としては現在、特許申請も終了した段階である。我々はクニッツ型構造に着目し、類似構造を有する物質を探索してきた。その結果、大豆蛋白中に存在するクニッツ型構造であるKTIが、ビクニン同様に、抗炎症作用を有していることが判明した². 3 )。今回、ヒトkeratinocytesの初代培養を利用して、KTIの持つ抗炎症作用として紫外線照射によるサイトカイン産生抑制が可能であるかどうかを検討した。その結果、KTIの濃度依存性に紫外線照射によるTNF-alpha, IL-1beta, IL-6産生がmRNAレベルで産生抑制されており、日焼け止めクリームとしての効果を有しているものと推定された。 50％抑制濃度は5 microMであり、十分臨床応用可能な濃度である。このKTIは主に細胞内シグナル伝達のJNKを介する系を制御することにより得られた結果であった。今後は実際にヒトの皮膚で紫外線照射前にKTI入りクリームを塗布することにより、日焼けや炎症反応がどの程度抑制されるのかを検討する必要がある。今回の実験にかかった経費は全て「コスメトロジー研究振興財団」から頂いたものであることを報告する。
総括
現在の日焼け止めクリームはあくまで対症療法が主体であったが、大豆やヒト尿から精製した蛋白は抗ヒスタミン剤やステロイド剤とは異なり、全く副作用がなく、紫外線照射によるサイトカイン産生を抑制することを始めて確認できた。今後は、臨床研究を通して市場への拡大を計っていきたいと考えている。
(文献)
1 ) Fisher G, Tavakkol A, Leach K, et al. Differential expression of protein kinase C isoenzymes in normal and psoriatic adult human skin: reduced expression of protein kinase C-beta II in psoriasis. J Investig Dermatol 1993; 101, 553-559. 2) Kobayashi H, Suzuki M, Kanayama N, Terao T. A soybean Kunitz trypsin inhibitor suppresses ovarian cancer cell invasion by blocking urokinase upregulation. Clin Exp Metastasis 2004; 21: 159-166. 3 ) Kobayashi H, Yoshida R, Kanada Y, Fukuda Y, Yagyu T, Inagaki K, Kondo T, Kurita N, Suzuki M, Kanayama N, and Terao T. Dietary Supplementation of Soybean Kunitz Trypsin Inhibitor (KTI) Reduces Lipopolysaccharide- induced Lethality in Mouse Model. Shock 2005, 23: 441-447.