防衛医科大学校皮膚科&島新百Tropoelastin polypeptide and mRNA were detected in cultured normal human kerastinocytes(NHKs) by RNase protection and Western blot assays.  The expression of elastin by NHKs was found to reach a maximum level at t the quiescent phase of keratinocyte growth.  When NHKs were cultured on tropoelastin-coated dishes, their growth potential was greatly suppressed compared with other matrix protein-coated dishes.  These results suggest that cultured NHKs can actively synthesize elastin and that keratinocyte tropoelastin may act as a growth -regulator for keratinocyte.
緒
1
(10)
エラスチンは血管、報帯、皮膚、肺など、ほほ全身の臓器、組織に分布されている。心臓、消化器、眼球、生殖器、泌尿器、耳鼻咽喉、乳腺、胸腺、リンパ節などの臓器の基本的機能である弾性の保持に関与していると思われる。皮膚は表皮、真皮の２層から構成される。皮膚真皮では弾力線維を認め主に皮膚線維芽細胞において産生されていることが知られていることが分かっている。表皮は外胚葉に由来する重層扁平上皮で、この上皮細胞は角化するのを特徴とする。表皮角化細胞はtype IV、 type V、 type Wコラーゲン、ラミニン、フィプロネクチン等の様々なマトリックスタンパクを産生していることが既に報告されている。そこで、表皮角化細胞においてエラスチンの前駆体のトロポエラスチンの発現と表皮角化細胞の増殖との関連について研究した。 Relation between epidermal elastin and skin aging Shingo Tajima Department of Dermatology, National Defense Medical College
2
実　験
2. 1 細胞培養法ヒト表皮角化細胞(NHKs)は無血清、低カルシウム(0.03mM)、表皮成長因子(EGF)、インスリン、腐下垂体抽出液、ハイドロコルチゾンを含む塔地(K110type II)で、37℃、 5 % CO 2、95 airの条件下で培養した。プレコンフレント(80% of confluent)になったら1 ：３の割合で継体し、 ３代目、４代目の細胞を本実験で使用した。ヒト皮膚殺維茅細胞は10％子牛血清を含むDMEMで培養した。静止期を得るための浮遊培養はDikeとFarmerの方法に準じて行った( 1 。プレコンフルエント(80 % of confluent)になったヒト表皮角化細胞を0.02 % EDTAを含む0.25%トリプシンで37℃、 5分間インキュベートし、細胞を剥離し1 mL当たり1.5 × 10 5cellsの密度で1.3%メチルセルロースを含むK110type II塔地中に浮遊させ37℃で2時間培養した(suspension-arrested)。また、ヒト表皮角化細胞を2 × 10 5cellsの密度で35mmシャーレに播き37℃で６時間、24時間、72時間K110type艦塔地中で塔養した。６時間後に細胞はpetri dishの底にほとんど接着し(接着期) (²)、24時間後には細胞は増殖していた(増殖期)。また、72時間後には細胞はコンフレントになり分化(角化)が始まっていた（density - arrested）（3）。細胞増殖に対する固相トロポエラスチンの影響を見るためにヒト表皮角化細胞を4.0 × 10 cellsの密度で、予めtype  Iコラーゲン、type IVコラーゲン、ラミニン、フィプロメクチン、トロポエラスチンをそれぞれコートしておいた35mmシャーレに播き(4)、37℃、 5 % CO 2、 95% airの条件下でK110type II中で培養した。そして、３日目、 5日目に細胞数を測定した。細胞数の測定は次のようにして行った。シャーレ内の培地を除去し、 PBSで２回洗浄した。シャーレ内に0.02% EDTAを含む0.25%トリプシンを加え37℃、５分間インキュベートし、位相差倒立顕微鏡で細胞が剥離しているのを確認した後、コールターカウンターで細胞数を測定した。
2. 2  Northen blot assay
2. 1の方法で培養したNHKsから全RNAをChomoczynskiとSacchiの方法(5)に準じてグアニジンチオシアネートを用いて抽出し2μg/μLの濃度に調製して使用するまで−80℃で保存した。 10µgのRNAを1 Mグリオキサールを含む10mMリン酸級衝液(pH6.5)で50℃、 1時間処理して変性させた後、１％アガロースゲルで電気泳動し、ナイロンメンプレンに転写した。このフィルターを50％ホルムアミド、0.1％ filcol1400, 0.1% polyvinylpyrrolidone、 0.1%  bovine serum albumin、 0.1% SDS、 100μg/mL tRNA、 5 × SSCを含む溶液で42℃、24時間プレハイプリダイズした後、32pで標識したプロープで42℃、24時間ハイプリダイズした。フィルターを2 × SSC/0.1% SDSを含む溶液で15分間室温で洗浄した後、0.1 × SSC/0.1% SDSを含む溶液で15分間室温で洗浄した。mRNAの変動は、オートラジオグラフィーにより観察し、オートラジオグラムをデンシトメーターにより定量化した。尚プローブはGAPDH (glyceraldehyde - 3 - phosphate dehydrogenase)  (6)合成オリゴンクレオチドを5*末端ラベル法を用いて[ γ - 32 P] dATPで標識したものを用いた。
2. 3   Ribonuclease protection assay (RNase
protection assay)
2. 1の方法で培養したNHKsから全RNAをChomoczynskiとSacchiの方法に準じてグアニジンチオシアネートを用いて抽出し2μg/μLの濃度になるように調製して使用するまで– 80℃で保存した。エラスチンのN端末領域を含むヒトのエラスチンcDNA (EcoR I /Sac I 424 bp)  (7)をpGEM32Zf (-) vectorに組み込み、T7 RNA polymeraseを用いて鋳型の配列からanti- senseRNAプロープを転写し、このプロープを[ a - 23P] UTP(16TBq/mmol)で標識した。そして、50μgのRNAとこのプロープを80%ホルムアミド、40mM Piperrazinediethanesulphonic acid (pH6.4)、400mM酢酸ナトリウム(pH6.4)、 1 mM EDTAを含む溶液で42℃、24時間ハイプリダイズした後、RNase A (10units/mL)、RNaseA (10units/mL)、 RNaseT1 (200units/mL)を用いて37℃、30分間酵素消化した。そして酵素消化されなかったRNAは８M尿茶を含む６％アクリルアミドゲルで電気泳動した後、X線フィルムに転写後24時間から48時間、 – 80℃に放置8し、オートラジオグラフィーにより観察し、デシトメーターにより定量化した。
2. 4  Western blot assay
ヒト表皮角化細胞がコンフレントになったときの培地を200mLブールした。この培地をタンパク分解酵素阻害剤( 1 mM EDTA、 1 mM NEM、 1 mM PMSF)存在下、硫酸アンモニウム(176mg/ mL)を加え４℃で撹拌しながら、１晩放置し、タンバクを塩析した(9)。その後、４℃、10,000r.p.m 20分間遠心し上清を除去し、沈殿物を２Mグアミジン塩酸を含む、50mM Tris-HCl (pH7.4)溶液に溶解し、4 ℃、10,000r.pm 20分間遠心し上消を、 2 Mグアニジン塩酸を含む50mM Tris-HCl (pH7.4)溶液で子め平衡化しておいた４％アガロースカラムを用いてゲルろ過を行った(10)。そして各フラクションを３本１組にしてまとめ、上記のタンバク分解酵茶阻害剤を含む0.1%酢酸で℃、 3日間透析した透析内液を凍結乾燥後、sample buffer (10mM Tris-HCl pH7.4、 1 % SDS、 5 % Glycerol、 0.01% BPB、 1 mMDTT)に溶解し、各試料を100℃、２分間煮沸した後、SDS-PAGEグラデイエントゲル(2 ～ 15%)で電気泳動し、ニトロセルロースフィルターに転写した(11)。抗エラスチン抗体による発色は、ECL™-ウエスタンプロッティング検出システムを用いて以下のように行った。フィルターをT-TBS (50mM Tris-HCl pH8.0、0.9% NaCl、0.05% Tween20)中で5分間洗浄後、５％スキムミルクを含むT-TBSで１時間プロッキングした。T- TBS中で30分間洗浄後、 5,000倍希釈のモノクローナル抗エラスチン抗体(12)で1時間反応させた。T-TBS中で30分間洗浄後、 5.000倍希釈の抗マウスIgG抗体で1時間反応させた。 T - TBS中で1時間洗浄後、ECL発光試薬と反応させ、X線フィルムにて観察した。
2.5免疫染色
ヒト表皮角化細胞と皮膚線維芽細胞をガラスチャンバースライドを用いて培養し、コンフルエントの状態になった後、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、T - TBSで洗浄後、0.01％サポニンを含むT - TBSで５分間反応させた。 1 %ウシ血清アルプミンでプロッキング後、500倍希釈のモノクローナル抗エラスチン抗体で４℃で24時間反応させた。T - TBSで60分間洗浄後、500倍希釈のビオチン標識された抗マウスIgG抗体で30分間反応させた。T - TBSで洗浄後、ABC/AP kitを用いて反応させた後、倒立顕微鏡下で観察した。
3 結結果
3. 1 培養ヒト表皮角化細胞におけるトロポエラスチン遺伝子の発現培養ヒト表皮角化細胞においてトロポエラスチンmRNAはノーザンプロット法では、含有量が少ないためか検出できなかった。しかし、RNase protection assayでは、プロープに特異的なフラグメント(424bp)を、培養ヒト皮膚線維芽細胞に限らず、培養ヒト表皮角化細胞においても確認することができた(Fig. 1 )。424bpのバンドをデシンTotal RNA was isolated from cultured human keratinocytes of dermal fibroblasts. (a) RNase protection assays were per- formed without (lane 1 ) or with (lanes 2-4 ) RNase digestion, using dermal fibroblast RNA( 1 μg per lane) (lane 2 ), keratinocyte RNA(50 μg per lane) (lane1 and 3), or no sample RNA(lane 4). Molecular markers were Hinf I  fragments of pBR322 DNA(b) For quantitative assays, RNase protection assays were performed with a range of keratinocytes RNA(0 -100 μg). Values are mean ± range from duplicate assays.トメーターによって測定したところ培養ヒト表皮角化細胞のトロポエラスチンmRNAレベルは培養ヒト皮膚縁維芽細胞のトロポエラスチンmRNAレベルの約1/20の量であった。また、予備実験としてヒト表皮角化細胞RNAの量を0 ～ 100μgの範囲で変化させたときプロープに特異的なフラゲメントのデンシティーはRNAの最に比例して増加した。よってこれからの実験で使用するRNAの量を50μgと決定した。
3.2 培養ヒト表皮角化細胞におけるエラスチ
ンポリベプチドの発現
培養ヒト表皮角化細胞培養中のタンバクをゲルマトグラフィーで分画した。 No.45 ～ 47のフラクションに68kDaの位置に抗エラスチン抗体に特異Figure 2  Tropoelastin polypeptide is detected in the me- dium of cultured keratinocytes. (a) Conditioning media of curtured keratinocytes were pooled and the proteins were fractionated by gel chro- matography equilibrated with 50mM Tris-HCl (pH7.5) contaning 4M guanidine-HCl. (b) Every three fractions were mixed and subjected to SDS-PAGE. Tropoelastin polypeptide was detected by western blot analysis using antibody. The right lane indicates tropoelastin secreted in the medium by cultured smooth muscle cells.的なバンドを検出した。また他のフラクションではなにも検出されなかった(Fig. 2)。また免疫染色において、ヒト皮膚線維芽細胞と同様にヒト表皮角化細胞において抗エラスチン抗体に対する陽性所見が得られた(Fig. 3)。
3.３ヒト表皮角化細胞の細胞増殖とトロポエ
ラスチンとの関連
50μgのRNAを使用した結果、プロープに特異的なフラグメントの発現は接着期、増殖期に比べて、細胞の分化誘導期のほうが発現量は多かった(Fig. 4)。ヒト表皮角化細胞の増殖に対する固相エラスチFigure 3   Cultured keratinocytes are immunostained with anti-elastin antibody. Cultured skin fibroblasts (a) and NHKs (b and c) were fixed and stained with (a and b) or without (c) anti-elastin antibody at a 1 : 500 dilution. Scale bars, 40 μm. Figufe 4  Tropoelastin expression is modulated during different phases of keratinocyte growth.ンの影響において、type Iコラーゲン、type IIコラーゲン、ラミニン、ファイプロネクチンをそれぞれコートしたシャーレにおいては３日目、５日目ともに、以前の報告通りコントロールのシャーレより細胞増殖を促進した。トロポエラスチンをコートしたシャーレにおいては前者のコートしたシャーレ及びコントロールのシャーレと比較して３日目、５日目ともに細胞増殖は抑えられていた(Fig.5 )。
4
考
察
今回の実験の結果で培養ヒト表皮角化細胞においてトロポエラスチンがmRNA、タンバク両レベルで発現されていることが分かった。表皮角化細胞ではコラーゲン、ラミニン、プロテオグリカン、フィプロネクチンといった多くのマトリックスタンパクを発現していることが既に報告されているので、このことはそれほど不自然なことではない。培養ヒト表皮角化細胞のトロポエラスチンmRNAレベルは培養ヒト皮膚線維芽細胞のトロポエラスチンmRNAレベルの1 ⁄ 20の量であった。今まで培養ヒト表皮角化細胞においてエラスチンが同定されなかったのは発現量があまりにも少なかったためだと考える。また、トロポエラスチンの発現は細胞増殖の状態に依存していて、固相トロポエラスチンが、ヒト表皮角化細胞の細胞増殖を調節していることが分かった。以上のことよりヒト表皮角化細胞のトロポエラスチンは細胞増殖に関連したいくつかの機能を持っていることが分かった。また、ヒト表皮角化細胞におけるトロポエラスチン発現は、静止期(分化期)において最も多くなった。このことは血管平滑筋細胞においてエラスチンはG 0期で発現されている(13という報告に一致しているように思える。よってヒト表皮角化細胞のトロポエラスチンの発現はヒト表皮角化細胞の分化(角化)に関係していることが推測された。