龍馬準横浜市立大学大学院医学研究科免疫学Key words :転写因子, IRF5 ,樹状細胞,全身性エリテマト一デス
精 官
全身性エリテマト一デス（systemic lupus erythematosus：SLE）は難治性自己免疫疾患であり、様々な自己抗体が産生されることで皮膚や腎臓など全身の臓器で炎症が起こる。SLEでは副腎皮質ステロイドや免疫抑制剤を中心とした療法により生存率は高くなったものの、易感染症をはじめとする様々な副作用があるため、生活の質や長期予後を改善できる新たな治療法の開発が望まれている。SLEの病態は多様でありその発症機構は未だ不明な点が多いが、正常な免疫応答において抗原提示やサイトカイン産生などにより司令塔の役割を果たす樹状細胞（dendritic cell : DC）がSLEの病態形成に重要であることが知られている［1，2］。Interferon regulatory factor 5（IRF5）はDCなどの自然免疫細胞で働く転写因子であり、Toll様受容体（Toll-like receptor : TLR）などを介した自然免疫応答において重要な役割を果たすが、SLEなどの自己免疫疾患の病態発症と密接に関連していることが多数のヒトのゲノムワイド関連解析（genome-wide association study：GWAS）ならびにモデルマウスを用いた研究により示されている［3～5］。著者らはSLEモデルマウスを用いて、IRF5の過剰な活性化はDCによるI型インターフェロン(interferon ; IFN)などのサイトカイン産生を亢進させSLE検病態を引き起こすこと、そしてIRF5遺伝子の片アリル欠損のみでその発症が顕著に抑制されることを示した[6]。これらの結果はIRF5がSLEの強力な治療標的である可能性を示している。一方で、DCにおけるI型IFNをはじめとするサイトカイン以外のIRF5の標的遺伝子とそのSLEにおける役割や、 IRF5が転写を活性化する詳細な分子機構についての解析は遅れている。そこで本研究では、ヒトおよびマウスのDCの網羅的解析により、DCにおけるIRF5による新たな遺伝子発現制御機構を見出し、そのSLEの病態形成への関与を解明することを目的とする。
方　姓
1.細胞とマウス
TLR刺激実験には形質細胞様樹状細胞（plasmacytoid DC : pDC）細胞株であるCAL-1細胞を用いた [7]。CAL-1細胞のTLR刺激は3 μ MのR-848（Enzo Life Science）を用いた。 Lyn遺伝子欠損（ Lyn二）マウス［8］はIfnar1ナマウス［9］あるいはInf5ナマウス［10］と掛け合わせた。 2. mRNAsequencing (mRNA-Seq)ならび4こchromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) CAL-1細胞のRNAはNucleoSpin RNA（タカラバイオ）、マウス末梢血RNAはRNeasy Protect Animal Blood Kit (キアゲン)を用いて精製した。mRNA seq用ライプラリーはSureSelect Strand Specific RNAライプラリー調製キット（アジレント）を用いて作製した。CAL-1細胞のChIPはRichard Youngらの手法を基本に行った。抗体はウサギ抗IRF5抗体(アプカム: ab21689)ならびにウサギ抗アセチル化ヒストン抗体(ミリポア: 06-599)を用いた。ChIP- seq用ライプラリーはTruSeq ChIPサンプル調製キット（イルミナ）を用いて作製した。シークエンシングはTG NextSeq 500/550 High Output Kit v2（75 cycles）（イルミナ）ならびにNextSeq 500システム（イルミナ）により行った。
3.バイオインフォマティクス解析
過去のマイクロアレイデータの解析はGeneSpringソフトウェア(アジレント)により行った。Gene ontology (GO)解析はDAVIDソフトウェアを使用した。RNA seqデータはSTARプログラムでマッピングを行った後、featureCountsプログラムならびにedgeRバッケージを用いて正規化された遺伝子発現量を求めた。ChIP-seqデータはHOMERバッケージを用いてマッピングし、UCSC Genome Browserにより可視化した。SLE患者のRNA seqデータは公共データベースから取得した（アクセッション番号：GSE72420）。
結果および考察
1.  TLR刺激したBMDCではion transport関連遺伝子群の発現がIRF6依存的に変動する
マウス骨髄由来樹状細胞（bone marrow-derived DC : BMDC）におけるマイクロアレイデータ［7］を用い、野生型(WT)  BMDCでTLR刺激時に誘導される転写産物のうちIRF5依存的であるものを348個抽出した（図1a、b)。この転写産物に含まれる遺伝子のGO解析を行った結果、予想通り”inflammatory response”のようにサイトカイン遺伝子を含む複数のGO termが上位になったが、一方で”proteolysis”や”ion transport”のようなサイトカイン遺伝子を含まないGO termも濃縮されることが判明した（図1c）。Ion transportは濃縮されたGO termの中でカウント数が最も多かった。
2. SLEモデルマウスの解析
SLEモデルマウスの一つであるLyn →マウスの末梢血（peripheral blood : PB）における遺伝子発現プロファイルをRNA seqにより解析した。Lynナマウスでは、IRF5の発現が半分になるだけでそのSLE接病態が顕著に抑制される［6］。野生型（wild-type : WT）PBと比較してLyn一PBで発現が亢進しており、かつLyn一におけるI型IFN受容体ヘテロ欠損（Lyn → Ifnar1 +γ）あさよりもIRF5ヘテロ欠損（Lyn → Irf +γ）によって有意に減弱するものとしてtransportならびにion transport関連遺伝子群が抽出された（図2a、b）。その中でもSlc22a4は両方のGO termに含まれており、Lyn → Ifnar1 +→ PBとLyn → I rfs +→ PBの差が特に顕著であった（図2c）。これらの結果から、SLEモデルマウスにおいてIRF5はI型IFNの遺伝子誘導だけではなく、ion transport関車遺伝子の誘導にも関与する可能性が示唆された。また、ヒトSLE患者においてもSLC22A4は健常者と比較して発現が亢進してい
た（図2d）。
3.  DCにおけるIRF5によるSLC22A4の発現制御
Lyn + Ifnar1 ++ PBとLyn + Irf5 ++ PBの差が特に顕著であったSlc22a4についてさらに解析を行った。この解析ではプライマリーDCを用いる予定であったが、解析に十分な細胞数を得るのが困難であったため、ヒト形質細胞様樹状細胞（plasmacytoid DC：pDC）株であるCAL-1細胞を用いた。CAL-1細胞においてIRF5がSLC22A4の発現制御に関与するかどうかについてChIP-seqにより検討した。その結果、TLR刺激においてIRF5依存的に発現誘導されることが知られているIFNB1についてはそのプロモーター領域において刺激依存的にIRF5が結合し、かつアセチル化ヒストンが生じていた (図3、左パネル)。一方で、意外なことに、SLC22A4のプロモーター領域においてはTLR刺激依存的なIRF5の結合ならびにアセチル化ヒストンは生じなかった（図3、右パネル）。なお、RNA-seqの結果から、CAL-1細胞においてIFNB1はTLR刺激依存的に発現誘導されるが、SLC22A4はそうではなかった。以上の結果から、IRF5はマウスBMDCにおけるTLR刺激依存的なion transport関連遺伝子群の発現制御に関与しているが、SLEモデルマウスPBにおいてIRF5依存的に変動するion transport遺伝子Slc22a4の場合はTLR刺激依存的ではない経路によりその発現制御に関与することが示唆された。Slc22a4は炎症部位に多く発現することが知られており、SLEモデルマウスのPBではIRF5依存的な炎症性サイトカイン産生を介して間接的にその発現が変動した可能性が考えられる。今後はマウスPBの細胞種を分けた解析やヒトプライマリーDCの解析により、I型IFNや炎症性サイトカイン以外でIRF5が直接的に制御するSLE病態関車遺伝子を同定することが重要であると考えられる。 a絞り込みの条件: 1. WT BMDCにおいてTLR刺激により誘導される(FC > 2, FDR < 0.05) 2. TLR刺激においてWTBMDCと比較してInf5 ⁄ BMDCで誘導が減弱する(FC > 2, FDR < 0.05) 3. 1と2で得られた348転写産物についてGO解析b
図1.  TLR刺激したBMDCにおいてIRF5依存的に発現誘導される遺伝子群のプロファイルTLR刺激したBMDCにおいてIRF5依存的に誘導される転写産物348個の絞り込み条件（a）、 MAプロット（b）ならびに濃縮されたGO termのうち上位５個（c）を示す。 FC : fold change、FDR : false discovery rate。
a
絞り込みの条件: 1. WT (正常) PBと比較してLyn ➪ (SLE) PBで発現が亢進する(FC > 2, FDR < 0.05) 2. Lyn- l-lfnar1+l-PBと比較してLyn-l-lri5+l- PBで発現が減弱する(FC > 2, FDR < 0.05) 3. 1と2で得られた24遺伝子についてGO解析b健常者SLE患者図2.マウスPBならびにSLE患者 PBにおける遺伝子発現プロファイル(a, b) WT PBと比較してLyn →マウスのPBで発現が亢進しておりLyn → Ifnar1ｷｬｰ PBと比較してLyn → Iff5 *广PBで減弱する24個の遺伝子の絞り込み条件（a）、濃縮されたGO term 2個（b）を示す。（c）マウスPBにおけるSlc22a4遺伝子発現（mean ± s.e.m., n = 4）。 (d)  SLE患者PBにおけるSLC22A4遺伝子発現のポックスプロット(?常者n = 18、SLE患者n = 99、P = 0.012 [Wilcoxon rank-sum test])。 RPKM  ; reads per kilo base per million。未刺激あるいはTLR刺激（R-848刺激）したCAL-1細胞における、IFNB1あるいはSLC22A4遺伝子とそれらの近傍のIRF5のゲノムDNA結合 (ChIP : IRF5) とアセチル化ヒストン (ChIP : H3K27ac) をUCSC Genome Browserで表示した。本研究の共同研究者は、横浜市立大学大学院医学研究科免疫学教室の田村智彦教授ならびに西山晃准教授である。 Lynデマウスは沖縄科学技術大学院大学細胞シゲナルユニットの山本雅教授、Ifnar1デマウスならびにIntデマウススは東京大学生産技術研究所炎症・免疫制御学社会連携研究部門の谷口雑紹教授より分与いただいた。最後に、本研究に多大なご支援を賜りました上原記念生命科学財団に深く感謝申し上げます。 1) Baccala R, Hoebe K, Kono DH, Beutler B, Theofilopoulos AN. TLR-dependent and TLR-independent pathways of type I interferon induction in systemic autoimmunity. Nat Med. 2007;13(5):543-51. Epub 2007/05/05. doi: 10.1038/nm1590. PubMed PMID: 17479100. 2) Ganguly D, Haak S, Sisirak V, Reizis B. The role of dendritic œlls in autoimmunity. Nat Rev Immunol. 2013;13(8):566-77. Epub 2013/07/06. doi: 10.1038/nri3477. PubMed PMID: 23827956; PubMed Central PMCID: PMCPMC4160805. 3) Ban T, Sato GR, Tamura T. Regulation and role of the transcription factor IRF5 in innate immune responses erythematosus. Int Immunol. 2018;30(11):529-36. and systemic lupus Epub 2018/06/04. doi 10.1093/intimm/dxy032. PubMed PMID: 29860420. 4) Eames HL, Corbin AL, Udalova IA. Interferon regulatory factor 5 in human autoimmunity and murine models of autoimmune disease. Transl Res. 2016;167(1):167-82. Epub 2015/07/25. doi: 10.1016/j.trsl.2015.06.018. PubMed PMID: 26207886. 5) 6) Harley IT, Kaufman KM, Langefeld CD, Harley JB, Kelly JA. Genetic susceptibility to SLE: new insights from fine mapping and genome-wide association studies. Nat Rev Genet. 2009;10(5):285-90. doi:10.1038/ nrg2571. PubMed PMID: 19337289; PubMed Central PMCID: PMC2737697. Ban T, Sato GR, Nishiyama A, Akiyama A, Takasuna M, Umehara M, et al. Lyn Kinase Suppresses the Transcriptional Activity of IRF5 in the TLR-MyD88 Pathway to Restrain the Development of Autoimmunity. Immunity. 2016;45(2):319-32. Epub 2016/08/16. doi: 10.1016/j.immuni.2016.07.015. PubMed PMID: 27521268. 7) Maeda T, Murata K, Fukushima T, Sugahara K, Tsuruda K, Anami M, et al. A novel plasmacytoid dendritic cell line, CAL-1, established from a patient with blastic natural killer cell lymphoma. Int J Hematol. 2005;81(2):148-54. Epub 2005/03/16. PubMed PMID: 15765784. 8) Nishizumi H, Taniuchi I, Yamanashi Y, Kitamura D, Ilic D, Mori S, et al. Impaired proliferation of peripheral B cells and indication of autoimmune disease in lynrdeficient mice. Immunity. 1995;3(5):549-60. PubMed PMID: 7584145. 9) Takaoka A, Hayakawa S, Yanai H, Stoiber D, Negishi H, Kikuchi H, et al. Integration of interferon alpha/beta signalling to p53 responses in tumour suppression and antiviral defence. Nature. 2003;424(6948):516·23. Epub 2003/07/23. doi: 10.1038/nature01850. PubMed PMID: 12872134. 10)  Takaoka A, Yanai H, Kondo S, Duncan G, Negishi H, Mizutani T, et al. Integral role of IRF-5 in the gene induction programme activated by Toll-like receptors. Nature. 2005;434(7030):243-9. doi: 10.1038/nature03308. PubMed PMID: 15665823.