1.はじめに
産業の発展とともに生活や産業活動に必要な様々な有機物質が創造され，多量に生産かつ消費され，最終的に環境中へと放出されてきた。これらの物質の中には毒性が強く，難分解性で長期間環境中に残存するものも数多く含まれており，人体に有害であるだけでなく生態系にも大きな影響を及ぼすことが懸念されている。 1996年に, Colbornらがその著書“Our Stolen Future (奪われし未来)”により，有機物質の中にはヒトや動物の内分泌系をかく乱する作用を有しているものがあり,ヒトの健康だけでなく生態系にも悪影響を与える恐れがあることを世界に警告した》。これを機に,世界各国でこの内分泌かく乱化学物質に対する研究・調査が行われた。日本においても1998年に「環境ホルモン戦略計画SPEED'98」が発表され,環境庁により内分泌かく乱作用を有する疑いがある約67種類の有機物質が示された。その中の主なものの構造を図１に示す。これらの中にはプラスチック可塑剤として使われているphthalate ester類,ボリカーボネイト製品の原料であるbisphenol A (BPA),非イオン性界面活性剤の分解生成物であるnonylphenol (NP)やp-tert-octylphenolなどのalkylphenol類など我々が日常生活に用いている物質も含まれている。平成11年度に旧環境庁が行った内分泌かく乱化学物質の環境実態調査では， phthalate ester類やBPA, NPなどが河川や湖沼の水や底賀から高い頻度で検出されている")。また, dioxin類などの非意図的生成物質も環境中で検出されている129。これら内分泌かく乱化学物質は，魚類で観察されるオスのメス化,貝類におけるインポセックスなどの原因物質として考えられており，我々ヒトの健康に対する悪影響も懸念されている。従って，このような影響を低減するための対策が必要であり，内分泌かく乱化学物質による環境汚染に対する効果的な処理技術の開発・導入は，他の環境汚染対策と同様に非常に重要な課題である。近年，有害有機物質の処理において注目されている微生物を用いた環境浄化技術，いわゆるbioremediation技術を内分泌かく乱化学物質の処理に利用することが検討されている。そこで本総説では，現在，環境汚染が問題となっているNP, BPA, phthalate ester類,  dioxin類などに対する従属栄養徵生物の分解機構や環境浄化への応用の可能性について最近の研究を紹介し，さらに光独立栄養敵生物である微細藻類を用いた内分泌かく乱化学物質の処理に関する我々の研究について述べる。
2.従属栄養微生物による内分泌かく乱化学物質の分解
内分泌かく乱化学物質による環境汚染と，その生態系やヒトへの危険性が世界的に認識されて以来,多くの研究者により,これら内分泌かく乱化学物質に対して分解•資化能を持つ微生物が単離され，その分解能や分解機構について研究が行われてきた。そこで，まずバクテリアなどの従属栄養敬生物による内分泌かく乱化学物質の分解について紹介する。
2.1. Nonylphenol
環境中において検出されるNPは，非イオン性界面活性剤であるnonylphenol ethoxylateが，環境中や排水処理施設で図2に示すような徹生物分解を受けることによPolychlorodibenzofurans [3] 1. Nonylphenol, bisphenol A, phthalate ester類,  polychlorodibenzofuran類とdibenzo-p -dioxin類の化学構造。り生成される物質であることが知られているか。NPは,その親化合物であるnonylphenol ethoxylateに比べて,非常に生物分解を受けにくく，特に嫌気条件下ではほとんど分解されないか。最近の研究でNPに対して分解能を持つ微生物株がいくつか報告されている。Fujiiらは,束京都内の下水処理施設の排水中から，NPを炭茶源として増殖できるグラム除性細菌S株の単離に成功した49。この株は，生理学的，生化学的そして遺伝子的な解析からSphingomonas属であることが分かっており，NPを芳香環の開裂により分解すると推測されている。一方, NPが持つalkyl側鎖は，直鎖状のものから分岐状のものまで存在する。一般に，分岐状のalkyl基は，生物分解を受けにくいことが知られている。Tangheらは,分啟状のnonyl基を持つNPに対し分解能を持つSphin- gomonas sp. TTNP3株を見出し，芳香環を開裂することにより, NPを分解することを明らかにしている¾。また,低温地域での汚染浄化を目指し，10℃で最も良い増殖を示し，14℃でNPを分解できるPseudomonas sp.も発見されており，この株によるNPの分解も芳香環の開裂反応により進むと推測されている28 。
2.2.   Bisphenol A
BPA は,ボリカーボネイトやエボキシ樹脂の合成原材料や紙のコーティング剤など，多くの工業製品の合成材料として幅広く利用されている物質である³¹。一方, BPA分解微生物に関しては多くの報告がある。LobosとSpivakは,プラスチック工場内の排水処理施設の活性汚泥から，BPAを炭茶源として利用できるグラム陰性細菌株MV1を単離し,そのBPA分解機構について研究を行った。その結果, MV1株は, BPAを4- hydroxybenzoic acidと4-hydroxyacetophenoneに分解した後に，同化もしくは二酸化炭茶に無機化する経路と, BPAを2,2-bis(4-hydroxyphenyl)-1-propanolに酸化した後, dead-end productとして2,3-bis (4-hydroxyphenyl)- 1,2-propanediolを生成する２つの分解経路を持つことが明らかになっている（図3 )¹ﾌ.²9。最近，白色腐朽菌など腐敗した木材を分解する担子菌類のbioremediationへの利用が注目されている。これらの菌は，自然界における難分解性有機物質であるligninを細胞外に分泌した分解酵素群により分解することができる。このlignin分解酵茶であるmanganese peroxidase, laccase, lignin peroxidaseによるBPAの分解が報告されている。Hiranoらは, Pleurotus ostreatusが生成するmanganese peroxidaseにより，BPAかphenol, 4-isopropenylphenol, 4-isopropyl- phenolやhexestrolなどに分解されることを報告していろう。 Tsutsumiらは， Phanerochaete chrysosporiumやTrametes versicolorから得られたmanganese peroxidaseやlaccaseを用いた酸化により，BPAが主にoligomerに重合されて培養液から除去され，それに伴い培養液中のエストロゲン様活性も消失することを報告している49。
2.3. Phthalate ester類
Phthalate ester類は,プラスチック製品の可塑剤として工業的に非常に幅広く利用されている物質群である。これらの物質の微生物分解は，図４に示すように嫌気と好気の両条件において起こる³⁰。phthalate ester類の分解は，まずエステル部分の加水分解によるmonoester体とalcoholの生成から始まり，このmonoester体はphthalic acidにまで分解される。その後，好気条件ではproto- chatechuateを経由しsuccinateあろいはpyruvateに分解され，資化される。一方，嫌気条件では，monoester体から生成されたphthalic acidはbenzoyl-CoAを介した経路により分解される。
2.4.   Dioxin類
Polychlorodibenzo- p -dioxin (PCDD)類とpolychlorod- ibenzofuran (PCDF)類は，dioxin類と呼ばれる化合物であり，廃棄物の焼却過程，塩茶系殺虫剤や除草剤の製造過程において副産物として発生する。Dioxin類の分解については,バクテリアを用いた好気条件下での分解,嫌気条件下での還元的脱塩茶反応,白色腐朽菌による分解が研究されている。好気的なdioxin類の分解では,他の芳香族化合物に対する酸化機構と異なる特殊な酸化反応が関与している。この酸化反応では，angular dioxy- genaseによりdibenzo-p -dioxin (DD)やdibenzofuran (DF)分子内において酸素分子に結合している炭素とそれに隣接した芳香環中の炭茶の両方が酸化される(図5 ) 209。 DDとDFの資化性細菌であるSphingomonas sp. RW1株は，PCDDおよびPCDFのうちモノ，ジ置換体をcat- echolとsalicylic acidとの共酸化により, chlorocatechol, chlorosalicylic acidにそれぞれ分解することが報告されている（図6 ) 439。また，本株は2,8-dichlorodibenzofuranや2,4,8-trichlorodibenzofuranを6-chloro-2-methyl-4H- chromen-4-oneや6,8-dichloro-2-methyl-4 H -chromen-4-oneに酸化的に分解することも報告されている（図6 ) 13,43)。 Biphenyl資化性細菌であるBurkholderia JB1株はbi- phenyl存在下,共酸化により2-chlorodibenzo-p-dioxinと2-chlorodibenzofuranをそれぞれ4-chlorocatecholと5-chlorosalicylic acidに分解する?? 。好気性微生物が持つangular dioxygenaseは，主にPCDDやPCDFに対し塩茶置換されていない芳香環部分の酸化を行うと推測されている。従って，分子内の塩素置換基の増加に伴い，この酸化反応は進行しにくくなると考えられる。事実, Schreinerらは，塩茶置換基の数と位置が異なる210種類のPCDD/PCDFに対するSphingomonas sp., Alcaligenes eutrophusとPseudomonas sp.の分解能を調べ,これらの南は塩茶置換基数が１～４のものまでは分解できるが，５以上では分解できないことを報告している場。一方，嫌気条件下ではPCDD/PCDFは，還元的な脱塩茶作用を受けて塩茶置換基数が減少する。Ballerstedtらは，河川の底泥中の微生物群の脱塩茶作用による1,2,3,4-tetrachlorodibenzo-p-dioxinの2-chlorodibenzo-p- dioxinへの変換を報告しているり。しかし，嫌気条件下での反応では,脱塩茶の順番によっては2,3,7,8-tetrachlo- rodibenzo- p -dioxin/tetrachlorodibenzofuranの様に,より高い毒性を持つ物質が発生する可能性が懸念されていやNPやBPAと同様にPCDD/PCDFに関しても白色腐朽菌が細胞外に分泌するlignin分解酵素群による分解が報告されている。 Valli らは，Phanerochaete  chrysospo- riumによる2,7-dichlorodibenzo-p-dioxinの分解にlignin分解酵素系が関与しているとし，図7に示した分解経路を提唱している49。Takadaらは，Phanerochaete sordida YK-624を用いて最も高い毒性を示す2,3,7,8-tetrachlo- rodibenzo- p -dioxin/tetrachlorodibenzofuran を含め，塩茶置換基の多いdioxin類が白色腐朽菌により分解できることを報告しており，2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxinとoctachlorodibenzo-p-dioxinの分解生成物として4,5-di- chlorocatecholとtetrachlorocatecholが検出されている³³。
従属栄養欲生物を用いた環境浄化
2.5.
Bioremediationとは，微生物が持つ多様な物質代謝・資化機能を利用して有害物質を分解もしくは無毒化する技術の総称である。有害物質の浄化において物理・化学的な処理方法は強力な有害物質浄化法ではあるが、汚染土壌等を回収する必要があるため非常にコストがかかる。このことから低濃度かつ広範囲に拡散した汚染の浄化にはあまり適していない。そこで，bioremediation技術，特に汚染環境の浄化を非破壊的に原位置で行う方法であるin situ bioremediationの適用が注目されていろ。 In situ bioremediationに関する研究は,タンカー座礁などによる原油汚染の浄化や，爆薬原料であるtrini- trotolueneによる汚染土壌の浄化, trichloroethaneによる地下水汚染の浄化などにおいて行われてきた。一方,内分泌かく乱化学物質による汚染サイトのin situ biore- mediationに関する研究としては，Hadknessらによるハドソン川庭泥中のPCBの分解処理を行ったbiostimula- tionの報告例がある》。この例では底泥中に酸素,無機塩類, PCB分解菌に対する増殖基質としてbiphenylを注入しPCBの分解試験が行われ、73日間で平均濃度39.4 mg/kg底泥のPCBの37～55％を分解できたことが報告されている。先に紹介したように，環境中には内分泌かく乱化学物質に対して分解もしくは資化能をもつ微生物が多く存在している。従って，汚染環境中に分解菌の増殖に必要な無機塩類,エネルギー源となる有機物質,分解酵素の誘導基質などを供給し，分解菌が持つ浄化能力を十分に発揮させる方法は内分泌かく乱化学物質による環境汚染に対する効果的な浄化法であると考えられる。一方, dioxin類など生物分解を非常に受けにくい物質を浄化する際，汚染環境中に生息する分解菌を利用する方法で十分な浄化が行うことができない場合がある。このような条件では，外部からより強力な分解菌を導入し汚染浄化を行う方法(bioaugmentation)が有効であると考えられる。
3.微細藻類による内分泌かく乱化学物質の分解
環境中に放出された内分泌かく乱化学物質を浄化することは必要であるが、排水や埋め立てられた廃棄物を介した環境中への内分泌かく乱化学物質の放出を抑制する技術の開発も必要である。水系環境中への内分泌かく乱化学物質の主要な排出源として都市下水や工業排水処理施設からの放流水や廃棄物処分場で発生する浸出水などが考えられている9.26.44 46)。従属栄養欲生物は，微生物がその増殖に利用できる有機物質の濃度すなわちBODの高い排水中の内分泌かく乱化学物質の処理に利用できる。しかし，BODの低い排水中の内分泌かく乱化学物質の処理に用いる場合，分解能を維持するために必要なバイオマスレベルを保つため，増殖基質となる物質を添加する必要ある。このことから，従属栄養微生物を排水中の低濃度の内分泌かく乱化学物質の処理に利用する場合，増殖基質の添加など処理システム運用のために要するコストが高くなる（図８）。このためより安価で安定に排水中の低濃度の内分泌かく乱化学物質の処理を行うことができる技術の開発が望まれている。一方，欲細藻類は光独立栄養微生物であり，太陽光と二酸化炭素を利用して光合成を行うことにより増殖することができ，低BOD条件下においても処理に必要な量のバイオマスを形成し維持することが可能である。このことから,微細藻類は,貧栄養条件下における排水中の有害有機物質の処理に威力を発揮すると考えられる(図8 ) 。微細藻類は高い窒素・リンの取り込み能を持つため,これまで食品系排水などに含まれるこれら無機物の処理に積極的に利用されてきた²¹。また，敵細藻類は，重金属類に対する高い吸着能も有しており，この機能を利用した排水中の重金属類の除去についても良く研究されている。19。一方，微細藻類は脂溶性の高い有機物質を細胞内に寄積することが知られており，このような能力を利用したPCBやDDTなどの除去も研究されている26,329。また，微細藻類による有害有機物質の分解に関しても,多環芳香族化合物や農薬に対していくつかの報告があるか。内分泌かく乱化学物質の分解に関しては, DDT ²3.18 ), γ-hexachlorocyclohexane (lindane) 14,15) , pentachlorophe- nol³ 6 , dibenzo- p -dioxinとdibenzofuran³ ⁷ , tributyltin³ 8 )の分解が報告されている。ここでは，我々が行っている代表的な内分泌かく乱化学物質であるBPAの微細藻類による処理に関する研究を紹介する。
3.1.   Bisphenol A分解微細藻類の探索
我々は，はじめに微細藻類による水系環境における代表的な有害有機物質であるphenol類の処理技術を開発することを目的に研究を開始した。有害な phenol 類は脱共役作用を持つものが多く，生物の呼吸鏡の電子伝達を阻害するだけでなく，光合成生物の光電子伝達系も阻害する²²¹³³³。従って,これらのphenol類を処理するためには，この毒性に対して耐性を持ちかつ高い除去能を持つ株が必要である。そこで，phenol類の中でも除草剤や色菜の原材料として使用されており16 ,強い脱共役剤としても知られている³³, 2,4-dinitrophenol (DNP)に対する除去能を指標に，有害な phenol 類に対して高い除去能を有する株の選抜を行い，緑藻Chlorella fusca var. vacuolataとラン藻Anabaena variabilisを得た。DNP以外の有害 phenol 類に対するこの２種の微細藻類株の除去能を調べた結果，C. fuscaが内分泌かく乱化学物質であるBPAや2,4-dichlorophenolに対して除去能を持つことを明らかにした。図9はC. fuscaとA. variabilisによろBPA除去を示している。A. variabilisの場合は, BPAにより増殖が抑制され，BPAはあまり除去されないが，C. fuscaでは良好に除去することができた。微細藻類によるBPAの除去に関してはこれが初めての報告である。次に連続明条件下において BPA 除去を行った場合の細胞内BPA量を調べた。この結果, 24時間と72時間培養を行った細胞から検出されたBPA量は,それぞれ培養液から除去されたBPA量より低かった（図10)。このことからC. fuscaは細胞内に取り込まれたBPA を分解もしくは酸化などにより他の物質に変換することでその除去を行っていると考えられる。一方,内分泌かく乱化学物質の生分解において，その分解生成物が親物質よりも高い内分泌かく乱作用を持つ場合があるため，培養液中からエストロゲン様活性が消失しているか否か確認することは重要である。そこで，次にC. fuscaによるBPA除去を行った場合の培養液中エストロゲン様活性の変化をyeast two-hybrid assayにより調べた。その結果，培養液中のエストロゲン様活性は，BPAの減少に伴い低下し培養120時間で完全に消失した（図11)。以上の結果から, C. fuscaは,微細藻類による内分泌かく乱化学物質BPAの処理において非常に有用な株であるといえる。
3.2.微細藻類による廃棄物処分場浸出水中の内分泌か
く乱化学物質の処理
廃棄物処分場设出水は処分場内に雨水や地下水が侵入することにより発生する排水であり，この没出水を介した有害有機物質による周辺環境の汚染が懸念されている。一般に浸出水の組成は，処分された廃棄物の種類やその廃棄物処分場の使用期間により大きく変動する。処分場の使用期間の経過に伴い難分解性有機物質が浸出水中の炭茶源の多くを占めるようになる。また，没出水に含まれる有害有機物質に関しては，特に廃プラスチックや焼却厌を含む廃棄物処分場から排出される浸出水に多くの内分泌かく乱化学物質が含まれていることが報告されている。その中でも特にBPAの含有濃度が高く，1.3 μg/Lから17 mg/Lの範囲で検出されている。このことから, 没出水は BPA の水系環境への主要な排出源の１つとして注目されている4547)。一方，没出水は従属栄養欲生物の分解能を維持するために必要な濃度のBOD成分を含んでいない場合が多い。しかし，微細藻類は光合成を行うことにより有害有機物質の処理に必要なエネルギーを得ることができるため，役出水中の内分泌かく乱化学物質の処理に適しているといえる。そこで，我々は，録漢C. fuscaによる浸出水中BPAの処理について検討した。まず, BPAを高濃度で含有する浸出水の発生条件について検討した。BPA は種々の工業製品の原料や添加剤,特にプラスチック製品や食品,飲料用の缶の内部コーティングなどに多く使われている。そのため，これらの不然性廃棄物を多く含む最終処分場からの浸出水には,高い濃度のBPAが検出されているが。また，山田らは日本の７つの最終処分場から浸出水を採取し含有される有吉有機物質の種類と濃度を調べ, BPAが埋め立て開始より約10年から20年経過した管理型の処分場由来の浸出水に高い濃度で含まれることを報告している49。この時期においては, 没出水のBODの大部分を占める処分場
Time (h)
訪
結
文
献
4.おわりに
れる。内分泌かく乱化学物質に対して分解能を有している微細藻類は光独立栄養徵生物であり，没出水など従属栄養微生物では処理が難しかったBOD濃度の低い排水の処理に大いに利用できると考えられる。しかし，微細藻類による内分泌かく乱化学物質の処理に関する研究は,バクテリアなどに比べて非常に少なく，その分解機構などに関してさらなる研究が必要である。また，活性汚泥法と同様に，微細藻類は古くから排水中の窒素やリンの処理に用いられており，その大量培養技術は確立しているといえる。東南アジアは高温多湿であり微細藻類の培養に適している。一方，現在，これらの地域では浸出水など内分泌かく乱化学物質を含む排水が十分に処理されずに環境中に放出され，問題となっている。従って，徴細漢類による排水処理技術は，このような地域において，室素やリンだけでなく内分泌かく乱化学物質を含めた排水の高度処理に大いに利用できると考えられる。従属栄養徵生物と微細藻類の内分泌かく乱化学物質分解機構とその環境浄化への応用について解説してきた。今後，これらの物質による環境汚染の悪化を防止するために，bioremediation技術の急速な発展が期待される。図12.バッチ培養におけるモデル浸出水からのbisphenol Aの除H ●；モデル没出水中のbisphenol A残存率（%） ■；緑藻用培養液中のbisphenol A残存率（%） ○；モデル浸出水中の細胞量(g dry wt./L) □；緑藻用培養液中の細胞量(g dry wt./L)内の撰発性有機酸などの易分解性有機物はメタン発酵により急激に渓少し，没出水中のBOD値は低下する。そこで，著者らはいくつかの文献を参考に4641 ,この時期の没出水の平均的な無機塩組成を考え，モデル没出水を作製した。また，このモデル没出水には BPA 以外の内分泌かく乱化学物質として, p-tert-butylphenol, p-methyl- 2,6-di- tert -butylphenol, 3,5-dimethylphenol, 1-naphthol, diethylphthalateおよびdibutylphthalateを添加した。まず，バッチ培養におけるモデル设出水中からのBPAの除去を調べた。その結果，本株は通常の緑藻用の培養液を用いた時と同様に高いBPA除去能を示した(図12)。また，微細藻類の屋外での培養には，連続やセミバッチ培養法がよく用いられる。Chlorellaの大量培糞においては，他の菌によるコンタミを防ぐために後者の方法が用いられている。そこで，セミバッチ培養を用いたモデル没出水中のBPA長期問処理について検討した結果, 4周期の間 BPA を良好に処理することができた。本研究はモデル浸出水を用いて微細藻類が廃棄物処分場
没出水中の内分泌かく乱化学物質の処理に利用できる可能性を初めて示したものであり，今後の実用化へ向けた展開が期待される。本総説をまとめるにあたり多大なるご助言をいただきました，大阪大学大学院薬学研究科宮本和久教授，平田收正助教授に深く感謝致します。 1) Ballerstedt, H., A. Kraus, and U. Lechner. 1997. Reductive dechlorination of 1,2,3,4-tertachlorodibenzo- p -dioxin and its products by anaerobic mixed culture from Saale river sedi- ment. Environ. Sci. Technol. 31: 1749–1753. 2) Barr, R., and F. L. Crane. 1997. Chloroplast electron transport inhibitors, pp. 95–112. In M. Pessarakli (ed.), Handbook of photosynthesis. Marcel Dekker, Inc. New York. U.S.A. 3) Colborn, T., D. Dumanoski, and J.P. Myers. 1996. Our stolen future. Dutton, New York, U.S.A. 4) Fujii, K., N. Urano, H. Ushio, M. Satomi, H. Iida, N. Ushio-sata, and S. Kimura. 2000. Profile of nonylphenol- degrading microflora and its potential for bioremedial applica- tions. J. Biochem. 128: 909–916. 5) Guang-Guo, Y., B. Williams, and R. Kookana. 2002. Environ- mental fate of alkylphenols and alkylphenol ethoxylates — a review. Environ. 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