鈴木　拓札幌医科大学医学部分子生物学講座Key words :長鎖非コードRNA,  lncRNA, 胃がん、エピゲノム、免疫応答
箱 富
近年、長鎖非コードRNA（IncRNA）と疾患とのつながりが注目されているが、多くのlncRNAはいまだ機能が不明である。慢性炎症からの発がんは胃・食道・肝臓など様々な臓器に見られ、その対策はがん罹患率・死亡率の低下につながる。本研究は、我々が同定した胃炎・胃がん関連lncRNAを解析することで炎症からの発がんメカニズムを解明し、診断・治療法の開発につなげることを目的とした。これまで我々は、主に消化器がんにおけるエピゲノムおよびnon-coding RNAの異常を解析することで、疾患メカニズム解明とその臨床応用に関する研究を行ってきた［1］。近年では胃がんにおけるDNAメチル化およびmicroRNAに巻目し、腫瘍抑制的なmiR·34b/c遺伝子がDNAメチル化異常により不活性化されること、DNAメチル化異常は胃炎の段階で発生し、胃がんリスクと相関することを明らかにした［2, 3］。また大腸がんにおいてエピジェネティックな不活性化を受けるlncRNA遺伝子を網羅的に探索し、新規大腸がん関連lncRNAを報告している［4］。今回我々は、健常者の胃粘膜と胃がん患者の非がん部胃粘膜におけるエピゲノムおよびlncRNA発現の違いに着目して解析を行った。胃粘膜におけるエピゲノムを網羅的に解析し、数万のlncRNA遺伝子プロモーターのヒストン修飾パターンを比較することで、胃がん高リスク群の胃粘膜で転写活性化するlncRNAを複数同定した。その一つであるLUGGC1 （LncRNA Upregulated in Gastritis and Gastric Cancer 1）は胃がん細胞で高発現し、増殖・遊走・浸潤能を促進することが実験的に確認されたことから、発がんにおいて重要な役割を担うと考えられた。LUGGC1と相互作用する分子および下流標的を明らかにすることで、発がんメカニズムを解明すると共に、新たな診断法や分子標的治療法の開発につなげられると着想した。
方　株
1. RNAプルダウンおよび質量分析
BrUラベルしたLUGGC1 RNAあるいはLUGGC1のアンチセンスRNAをin vitro転写により生成し、胃がん細胞株の抽出液と混合してインキュベートした。その後、抗BrdU抗体によりRNAとタンパクの複合体をプルダウンし、SDS-PAGEで分離したのち、LUGGC1と特異的に結合するタンパクをゲルから切り出して質量分析した。同定したタンパクの相互作用を、共免疫沈降とウエスタンプロッティングにより検証した。
2.マイクロアレイ解析
LUGGC1に対するsiRNAを、Lipofectamine RNAi MAX（(Thermo Fisher Scientific）を用いて胃がん細胞にトランスフェクトし、48時間後にRNAを抽出した。遺伝子発現をSurePrint G3 Human GEアレイ（Agilent）によって解析した。 アレイデータをGene Spring GX（(Agilent)により解析した。
3. インターフェロン応答遺伝子の発現解析
LUGGC1に対するsiRNAをLipofectamine RNAi MAXを用いて胃がん細胞にトランスフェクトし、免疫応答遺伝子の発現に与える影響を定量RTPCRにより解析した。またLUGGC1を安定的に過剰発現する胃がん細胞を作製し、同様の定量RT-PCR解析を行った。さらにLUGGC1のノックダウンおよび過剰発現がSTAT1に与える影響をウエスタンプロッティングにより解析した。
4. in vitroおよびin vivoの増殖アッセイ
LUGGC1およびLUGGC1と相互作用するタンパクに対するsiRNAをLipofectamine RNAi MAXを用いて胃がん細胞にトランスフェクトし、細胞増殖に与える影響をCell Counting Kit·8（Dojindo）により解析した。また胃がん細胞をヌードマウスの皮下に移植し、LUGGC1に対するsiRNAを経時的に局所注射することでin vivoにおけるxenograft形成能を評価した。さらにLUGGC1を安定発現する胃がん細胞をヌードマウスの皮下に移植してxenograft形成能を評価した。
植果
1.  LUGGC1と相互作用するタンパクの同定
宵がん細胞においてLUGGC1と相互作用するタンパクを探索するため、BrUラベルしたLUGGC1あるいはLUGGC1のアンチセンスRNAと胃がん細胞株HSC45の抽出液を混合し、RNAプルダウンを行った。沈降したタンパクをSDS-PAGEで分離し、LUGGC1のみに観察されるバンドを切り出して質量分析した結果、PUR-α  (purine- rich element binding protein A) 、 PUR  β （purine rich element binding protein B) 、 YB1 （Y box binding protein 1)を同定した（図1a）。共免疫沈降とウエスタンプロッティングによりPUR-αとYB1が胃がん細胞において相互作用すること、そしてその相互作用はRNaseによるRNA分解処理後に消失することが確認され、これらのタンパクがLUGGC1を介して複合体を形成している可能性が示唆された（図1b）。またPUR-αおよびYB1をそれぞれsiRNAによりノックダウンし、胃がん細胞株HSC45の増殖能に与える影響を解析した結果、PUR-α、YB1いずれのノックダウンも増殖を抑制することが明らかとなった（図1c)。このことからLUGGC1の機能はPUR- α 、YB1を介している可能性が示された。図1.  LUGGC1と相互作用するタンパクの同定a) RNAプルダウン後にSDS-PAGEを行い、LUGGC1と相互作用するタンパクを質量分析した。 b) PUR-αとYB1の相互作用を免疫沈降とウエスタンプロッティングで検証した。 c)  PUR-αのノックダウンが胃がん細胞株HSC45の増殖に与える影響を解析した。
2.  LUGGC1の下洗標的の探索
LUGGC1の下流標的を明らかにするため、胃がん細胞株HSC45のLUGGC1をノックダウンし、遺伝子発現プロファイルに与える影響をマイクロアレイで解析した。その結果、LUGGC1ノックダウンにより発現低下する遺伝子を649個同定した（図2a）。Gene Ontology解析の結果、これらの遺伝子にはAntiviral defense（P = 1.0× 10− 1 9 )、Type II  interferon signaling pathway  ( P = 1.64 × 10 − 1 5 )、Defense response to virus  ( P = 1.47 × 10 − 1 4 )、Innate immunity (P = 3.55×10−1°) など免疫応答に関与するものが多く含まれることが示された。特にIFIT1、IFITM1など複数の免疫応答遺伝子が影響を受けることに着目し、定量RTPCRによる検証を進めた結果、多くの免疫応答遺伝子の発現がLUGGC1のノックダウンによって低下することを見いだした（図2b）。さらにLUGGC1を安定的に過剰発現する胃がん細胞株SNU638を作製し、免疫応答遺伝子群の発現が上昇することを確認した。またこれらの免疫応答遺伝子はPUR-αのノックダウンにより低下したことから、LUGGC1とPUR-αの複合体が免疫応答遺伝子の発現制御に関2わる可能性が示唆された。さらにLUGGC1のノックダウンがSTAT1のタンパク量を低下させ、逆にLUGGC1の過剰発現はSTAT1のタンパク量とリン酸化を上昇させたことから、LUGGC1がSTAT1を活性化させることで免疫応答遺伝子の発現を誘導する可能性が示された。図2.  LUGGC1の下流標的の探索a）HSC45を用いてLUGGC1ノックダウン後の遺伝子発現をマイクロアレイで解析した。 b) LUGGC1ノックダウンによる免疫応答遺伝子の発現抑制を定量RTPCRで検証した。
3. in vivo腫瘍形成能の解析
これまで我々はLUGGC1のノックダウンが胃がん細胞株の増殖、遊走、浸潤能を抑制することを明らかにした。次に我々はin vivoの腫瘍形成能に対するLUGGC1の影響を検証した。胃がん細胞株HSC45をヌードマウスの皮下に移植し、LUGGC1に対するsiRNAを経時的に局所投与した結果、LUGGC1 siRNAはcontrol siRNAと比較してxenograftの成長を抑制する効果を示した。さらにLUGGC1を安定的に過剰発現する胃がん細胞株SNU638をヌードマウスの皮下に移植した結果、コントロールのGFP発現細胞と比較してxenograft形成の促進が認められた（(図3)。これらの結果から、LUGGC1はin vivoの腫瘍形成能を促進することが示された。図3.  in vivo腫瘍形成能の解析LUGGC1あるいはGFPを安定発現するSNU638細胞を作製し、ヌードマウスに移植してxenograft形成能を評価した。 a）摘出したxenograft。 b) xenograftの腫瘍容積を経時的に計測した結果（n = 4)。
4.他がん種におけるLUGGC1の解析
LUGGC1の他がん種における役割を明らかにするため、乳がん細胞株（n = 9)、肝がん細胞株（n = 10)、大腸がん細胞株（n =12）と、それぞれの正常組織におけるLUGGC1の発現を定量RT-PCRで解析した。その結果、乳がん細胞８株、肝がん細胞５株、大腸がん９株において、正常組織と比較してLUGGC1の発現亢進が認められた（図4a、b）。次に特にLUGGC1発現が高レベルであった乳がん細胞3株、肝がん細胞5株、大腸がん細胞５株を対象に、LUGGC1に対するsiRNAをトランスフェクションして増殖能を検討した。その結果、乳がん細胞２株、肝がん細胞３株において、LUGGC1のノックダウンが細胞増殖を抑制した（(図4c)。図4. 胃がん以外のがん種におけるLUGGC1の解析a）乳がん細胞株におけるLUGGC1の定量RTPCR解析結果。 b）肝がん細胞株におけるLUGGC1の定量RT-PCR解析結果。 c) LUGGC1ノックダウンが乳がん細胞株SK-BR-3の増殖に与える影響の解析結果。
有東
本研究において我々は、がんにおけるLUGGC1の機能を明らかにすべく解析を行った。LUGGC1と相互作用するタンパクとして同定したPUR-α、PUR-βは、RNAやDNAと結合して転写、翻訳、細胞周期、細胞増殖などの制御に関わることが知られている[5]。また近年では、PUR αがOct4-antisense、PUR βガ² linc-HOXA1などのlncRNAと結合することが報告されている［6,  7］。YB1はRNA結合タンパクであり、転写制御、RNAスプライシング、翻訳制御、DNA修復、ストレス応答など多彩な機能を持つことが知られる。さらに近年では、がん細胞においてYB1がTP53TG1やHULCなどのlncRNAと結合し、がん化に関わることが報告された［8, 9］。またPUR-αとYB1が複合体を形成し、p53標的遺伝子であるBaxの転写を抑制するという研究報告もある[10]。これらのことから、LUGGC1はPUR-α、PUR-β、YB1と複合体を形成し、転写制御やその他の細胞内機能に関わっている可能性が推測された。我々はLUGGC1の下流標的を探索するため、胃がん細胞においてLUGGC1のノックダウンが遺伝子発現プロファイルに与える影響を解析し、多くの免疫応答遺伝子の発現が抑制されることを見いだした。これらの結果がsiRNAによるアーチファクトではないことを検証するため、LUGGC1を安定的に過剰発現する胃がん細胞株を作製し、免疫応答遺伝子群の発現上昇を確認した。さらにLUGGC1がSTATのタンパク量およびリン酸化を上昇させ、これら免疫応答遺伝子の発現を誘導する可能性を見いだした。LUGGC1は、胃がんの背景胃粘膜において転写活性化する領域から同定されたことから、LUGGC1が何らかの免疫応答に関わっている可能性が推測された。慢性胃炎および胃がん発生におけるLUGGC1の役割を解明するため、今後さらなる研究を推進したい。また我々は、LUGGC1が胃がん以外の複数のがん種において発現上昇していること、そしてLUGGC1の阻害ががん細胞の増殖を抑制することを明らかにした。このことから、LUGGC1が様々な臓器のがんにおいて治療標的となりうることが示唆された。
本研究の共同研究者は、札幌医科大学医学部分子生物学講座の北鳩洋志、新沼猛、山本英一郎、甲斐正広、がん研究会がん研究所がんエピゲノムプロジェクトの丸山玲緒である。
文歌
Suzuki H, Takatsuka S, Akashi H, Yamamoto E, Nojima M, Maruyama R, Kai M, Yamano HO, Sasaki Y, 1) Tokino T, Shinomura Y, Imai K, Toyota M. Genome-wide profiling of chromatin signatures reveals epigenetic regulation of MicroRNA genes in colorectal cancer. Cancer Res. 2011 Sep 1;71(17):5646·58. doi: 10.1158/0008· 5472.CAN-11-1076.Epub 2011 Jul 6. PMID: 21734013 Suzuki H, Yamamoto E, Nojima M, Kai M, Yamano HO, Yoshikawa K, Kimura T, Kudo T, Harada E, Sugai T, 2) Takamaru H, Niinuma T, Maruyama R, Yamamoto H, Tokino T, Imai K, Toyota M, Shinomura Y. Methylation- associated silencing of microRNA-34b/c in gastric cancer and its involvement in an epigenetic field defect. Carcinogenesis. 2010 Dec:31(12):2066-73. doi: 10.1093/carcin/bgq203. Epub 2010 Oct 5. PMID: 20924086 Suzuki R, Yamamoto E, Nojima M, Maruyama R, Yamano HO, Yoshikawa K, Kimura T, Harada T, Ashida M, 3) Niinuma T, Sato A, Nosho K, Yamamoto H, Kai M, Sugai T, Imai K, Suzuki H, Shinomura Y. Aberrant methylation of microRNA-34b/c is a predictive marker of metachronous gastric cancer risk. J Gastroenterol. 2014 Jul;49(7):1135-44. doi: 10.1007/s00535-013-0861-7. Epub 2013 Aug 13. PMID: 23942619 4) Kumegawa K, Maruyama R, Yamamoto E, Ashida M, Kitajima H, Tsuyada A, Niinuma T, Kai M, Yamano HO, Sugai T, Tokino T, Shinomura Y, Imai K, Suzuki H. A genomic screen for long noncoding RNA genes epigenetically silenced by aberrant DNA methylation in colorectal cancer. Sci Rep. 2016 May 24;6:26699. doi: 10.1038/srep26699. PMID: 27215978 5) White MK, Johnson EM, Khalili K. Multiple roles for Puralpha in cellular and viral regulation. Cell Cycle. 2009 Feb 1;8(3):1-7. Epub 2009 Feb 10. PMID: 19182532 Hawkins PG, Morris KV. Transcriptional regulation of Oct4 by a long non-coding RNA antisense to Oct4- 6) pseudogene 5. Transcription. 2010 Nov;1(3):165-175. Epub 2010 Aug 16. PMID: 21151833 77) Maamar H, Cabili MN, Rinn J, Raj A. linc HOXA1 is a noncoding RNA that represses Hoxa1 transcription in cis. Genes Dev. 2013 Jun 1;27(11):1260-71. doi: 10.1101/gad.217018.113. Epub 2013 May 30. 8) Diaz Lagares A, Crujeiras AB, Lopez Serra P, Soler M, Setien F, Goyal A, Sandoval J, Hashimoto Y, Martinez- Cardús A, Gomez A, Heyn H, Moutinho C, Espada J, Vidal A, Paúles M, Galán M, Sala N, Akiyama Y, Martínez-Iniesta M, Farré L, Villanueva A, Gross M, Diederichs S, Guil S, Esteller M. Epigenetic inactivation of the p53-induced long noncoding RNA TP53 target 1 in human cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016 Nov 22;113(47):E7535-E7544. Epub 2016 Nov 7. PMID: 28027578 9) Li D1, Liu X, Zhou J, Hu J, Zhang D, Liu J, Qiao Y, Zhan Q. Long noncoding RNA HULC modulates the phosphorylation of YB-1 through serving as a scaffold of extracellular signal-regulated kinase and YB-1 to enhance hepatocarcinogenesis. Hepatology. 2017 May:65(5):1612-1627. doi: 10.1002/hep.29010. Epub 2017 Mar 22. 10) Kim K, Choi J, Heo K, Kim H, Levens D, Kohno K, Johnson EM, Brock HW, An W. Isolation and characterization of a novel H1.2 complex that acts as a repressor of p53-mediated transcription. J Biol Chem. 2008 Apr 4;283(14):9113-26. doi: 10.1074/jbc.M708205200. Epub 2008 Feb 7.