日本防菌防黴学会第50回年次大会シンポジウム6:光殺菌法の標準化の必要性2023年8月30日（水）＠千里ライフサイエンスセンター発外後の停車を考慮した微生物に吸収される微量非同の必要O准教授秋吉優史大阪公立大学工学研究科量子放射線系専攻、放射線研究センター、大阪国際感染症研究センター兼担Special thanks:古田雅一、角野友美、神野八恵美、橘田早苗E-Mail: akiyoshi-masafumi@omu.ac.jp http://anticovid19.starfree.jp/
吸収された放射線のエネルギー (J)吸収線量(Gy) =強透過性放射線Hp(0.07) ≤ 10 Hp(10)ほとんど素通りでほぼ均一にエネルギーを与え、表面から1cmの微小体積に対する吸収線量( 1cm線量当量)が人体全体の実効線量を代表すると見なす。表面近傍にのみ局所的にエネルギーを与え、深さ70 μ mでの点での吸収線量(70 μ m線量当量)が皮膚の等価線量を代表する。人体の皮膚では数10 μ mの範囲で吸収されてしまう。これまで微少体積へのエネルギー付与の評価は行われておらず、単位面積あたりのエネルギーフラックス(J/m²)で評価。対象とする系の質量(kg)ある体系に於いて吸収した放射線の電離エネルギーをその体系の質量で割った量が吸収線量(J/kg)。不均一な照射の場合体系の取り方(分母の大きさ)によって値が異なってくる。吸収線量(Gy)は電離放射線に対して定義された量で、紫外線については相当する量が定義されていないため、質量吸収光量(J/kg)と言う用語を暫定的に提案する。弱透過性放射線紫外線Hp(0.07) > 10 Hp(10)
吸収された紫外線のエネルギー (J)質量吸収光量(J/kg)  =対象とする系の質量(kg)ランベルト・ベールの法則吸光度A = -log 10 ( I 1 / I 0 ) =  ε c l ( ε :吸光係数、c :媒質濃度、l :光路長)から、系に吸収されるエネルギー I o - I 1はIo (1-10-εcl )と表わすことが出来、吸光度が1だと90%、2だと99%吸収されたことになる。系が厚いほど、媒質濃度が高いほど、吸収されるエネルギー自体は大きくなる。しかしながら、あまりに厚かったり、媒質濃度が高くなると、途中でほぼ紫外線の全量が吸収されそれ以上吸収されるエネルギーは増えず、媒質の量が増えるに従い媒質の単位質量あたりに吸収されるエネルギーは小さくなる。
バクテリオファージＱ β のファージストック(原液、 3.0 × 10 9 PFU/ml)を5, 10, 20, 50倍に希釈していき、初期濃度の異なるファージ液を調整した。これを光路長1mm(原液)もしくは2mmの石英セルに入れて紫外可視光分光光度計(アズワンASUV-6300PC,ダブルビーム、石英セル使用）により吸光度スペクトルを測定した。低圧水銀ランプからの紫外線の波長である254nmにおける吸光度をファージ濃度で整理し、ファージ濃度(PFU/ml)あたりの吸光係数(ml/PFU・mm)を求め、 φ 60mmのシャーレに5mlのファージ液を入れて1mJ/cm²を照射した際の|吸収エネルギー|を求めた。吸光係数= 5.23 × 10-9 ml/PFU • mm ( @254nm)
質量吸収光量を求める際の分母として|ファージの質量を求めた。バクテリオファージＱ βを直径28nm、密度1.2g/cm³の球体と簡略化して計算すると、1つあたりの質量は1.38 × 10 -17 gとなった。ファージ1つで1 PFUと仮定すると、1cm²のファージ液(厚さ1.77mm*)中に存在するファージの質量は、ファージ液の濃度c (PFU/ml)を用いて1.38 × 10 -17 × 0.177 cと表わされる。これを分母として、前ページで求めた1cm²あたりの吸収エネルギーを割ると、質量吸収光量(J/kg)が求まる。 * φ 60mmのシャーレに5mlのファージ液を入れて照射したなお、ファージを分散させている生理食塩水による紫外線の吸収は無視可能であり、ここで求めた吸収線量は系全体を平均化した場合の値である点に注意を要する。計算した質量吸収光量は、わずか1mJ/cm²の照射で1G J/kgにも達するという巨大な値となった。ファージ1つで1 PFUという仮定や、実際の構造から質量を求めていない点、さらに散乱による透過光強度の低下など考慮すべき点は有るが、放射線での滅菌は数10 kGy程度の照射で十分であるのとあまりにも大きく乖離している。ただし、傾向として1 × 10 8 PFU/mlを境に吸収線量の低下が見られるという結果が得られた。
実際にバクテリオファージＱ β液に紫外線照射(低圧水銀灯からの254nm)を行った際の生残曲線が、初期濃度によってどのように変化するのかを検証した。照射はφ60mmのシャーレに5 mlのファージ液を入れて行い、0.13mW/cm²程度に調整した照射器によって10分(78mJ/cm²程度)まで照射した。各回の照射前後で波長254 nmの紫外線に対して校正されている放射照度計(ケニスYK-37UVSD )により照度測定を行い平均を求めた。途中0, 2.5, 5, 7.5, 10分で二段シャッタ一装置を使用して紫外線を遮光して照射を中断し、0.1mlずつサンプリングした。サンプリング後はシャーレのファージ液に対して照射を継続した。サンプリングしたファージ液は生残率に応じて10倍希釈をn回行った後に0.01mlを分取して大腸菌(NBRC13965)に加え、寒天培地に播種してプラーク数(P)を確認する事により、P × 10ʱ/0.01 PFU/mlとして感染価を求めた。
バクテリオファージのβ及び大腸菌の取扱いは、JIS R1706（光触媒材料の抗ウイルス性試験方法-バクテリオファージのβを用いる方法)に準拠する。 (1)ファージ専用の宿主菌である大腸菌(NBRC13965)を37℃で20時間前培養する。 ②前培養した大腸菌を本培養(JIS LB 5 ml :前培養E.coli 5 μ L)する。濁度を分光光度計により測定し、おおよその菌濃度を確認する。 ③凍結保存されていたファージストック(NBRC 20012)を解凍する。(4℃で保存し、2週間以内に使用する)解凍したファージストックをペプトン加生理食塩水で希釈して異なる濃度のファージ液を調整する。希釈率は1倍、2倍、5倍、10倍、 20倍、50倍、100倍、200倍とした。 (使用するファージストックの濃度が時期により異なるため、ファージストック及び希釈後照射前の感染価をその都度評価した） ④ 60 mmシャーレに希釈したファージを5 ml入れ、低圧水銀ランプ(NEC GL-6 +ノーベル照明器具FT-6)からの254nm UV-Cで照射する。 (放射照度:約0.13 mW/cm^2、点灯後30分以上経過後に波長254 nmの紫外線に対して校正されている放射照度計(ケニスYK-37UVSD )により照度を確認後照射を開始） ⑤ UV照射2.5分、5分、7.5分、10分経過した時点で一旦照射をシャッター装置により中断し(低圧水銀ランプは点灯したまま)、ファージ液を0.1mlサンプリングする。 ⑥サンプリングしたファージ液を予備実験などで予想されるプラーク数をカウント可能な濃度まで希釈する(10倍希釈をn回行う)。希釈したファージ液0.01mlを本培養した大腸菌液0.1mlを5mlマイクロチューブに入れ、37℃ 15分間加温する。あらかじめ45℃で加温しておいたNBRCトップアガー 2mlを入れ、手で振って撹拌し、カルシウム添加LB寒天培地に重層する。 (7)37°Cで一晩培養し、プラーク数(P)をカウントする事により、P × 10n/0.01 PFU/mlとして感染価を求めた。
サンプリングしたファージによるプラーク数の測定は2枚のJIS LB平板培地で実施し、平均を取った。照射試験は同じ日に3回行い、平均を取っている。初期濃度は、ファージストック（原液）をm倍希釈して変化させているが、ファージストックの感染価は実験を行った日によって異なっており、m倍希釈というのは整理する上での指標に過ぎない。実際の初期感染価は照射前に実測をしている。結果は、初期感染価が高くファージ濃度が高いほど反応速度定数が小さく、不活化されにくくなった。
縦軸に感染価濃度を対数プロットした際の傾きである、反応定数を初期ファージ液濃度に対してプロットした。その結果、吸光度から求めた吸収線量のファージ液濃度依存性と非常に良く似た傾向を示し、1 × 108 PFU/ml程度を境に、ファージ液が濃くなると不活化されにくくなることが明らかとなった。
生残曲線の横軸をエネルギーフルエンスである積算照度ではなく、ファージが吸収したエネルギーとして質量吸収光量を用いて整理した。 1 × 10 8 PFU/mlよりも低濃度の領域では規格化した生残曲線がほぼ完全に一致しており、質量吸収光量で整理することでより信頼性の高いデータを取得できているが、高濃度域では依然として初期濃度により生残曲線の傾きが変化している。
生残曲線の横軸を吸収線量とした場合の生残曲線の反応定数を初期感染価濃度に対してプロットした。積算照度で整理した場合と同様であるが、低濃度域での傾きがほぼ無くなり、2 × 10 8 PFU/ml程度まで信頼できる測定が可能である。
本来吸収線量を用いれば、初期濃度の違いによる系全体へ吸収されるエネルギーの違いを補正できるはずであるが、高濃度域で補正しきれなかったのは、ファージ液の上層部で紫外線が吸収され下層に到達せず、既に不活化されたファージに照射し続けているためであると考えられる。照射中に撹拌するなど均一化を行えば、ある程度改善されると考えられるが既に不活化されたファージがエネルギーを吸収し続けるオーバーキルは避けられず、完全に補正することは困難で有ると考えられる。なお、ファージ1つの投影断面積は￠28nmの球体と考えると6.16 × 10-12 cm²であり、1cm²あたりのファージの数は1 × 108 PFU/mlの場合で1.77 × 107個（1個で1PFUと考えた場合)に過ぎず、全く重なりが無かった場合でも1.09 × 10 -4 cm²とわずか0.01%程度を覆っているに過ぎない。 。不活化されていないファージ不活化されたファージこのあたりでほぼ完全に紫外線が吸収されてしまういくら照射しても撹拌されない限り下層のファージは不活化されない
254 nmの場合と同様に、222 nmの遠紫外線を照射した場合のバクテリオファージＱ βに対する質量吸収光量を計算した。254 nmの場合よりも吸光度が大きい分、同じ積算照度であっても一桁程度質量吸収光量は大きくなった。また、254 nmでの場合よりも低い濃度から質量吸収光量の低下が見られた。 265 nmでは254 nmとほぼ同等であったが、280 nmでは吸光度が下がり、質量吸収光量も低下している。ただしこれらはいずれも厚さが1.77mmの系に対する場合の計算結果である。実際に異なる濃度のファージに222 nm遠紫外光を照射した場合の生残曲線の取得は、今後実施する予定。
質量吸収光量を求めるために、大腸菌の質量を求めた。大腸菌を直径1 μ m、長さ2 μ m、密度1 g/cm³の円柱として計算すると、体積は約1 μ m³で質量は1 × 10-1² gとなった(*)。大腸菌1つで1 CFUと仮定して、ファージの場合と同様に質量吸収光量(J/kg)を求めた。その結果数十kJ/kg程度の値となり、放射線滅菌の際の吸収線量と比較できる程度の値となった。254 nmの場合で108 CFU/ml程度から質量吸収光量は低下し始めているが、それ以降吸光度も低下するため、実際にはより低下は大きくなる。 (*) https://biomedicalhacks.com/2020-11-25/ecoli-size/
SANEI株式会社との受託研究に於いて、水栓中の滞留水に対する紫外線照射による消毒効果について評価を行った。円筒状の水栓の一端に波長265 nmのUV-C LED (スタンレー電気)を装着、大腸菌液及びバクテリオファージＱ β液を入れて照射を行い、一定時間毎にサンプリングし、生残曲線を得た。また、完全に満水(65ml)にして水平照射した場合と、少し液量を減らし(50ml)空間を空けて斜めにして照射した場合との比較を行った。初期濃度は大腸菌で2 × 10 6 CFU/ml程度、ファージで1 × 10 7 PFU/ml程度であった。
このような体系では、どの点での「放射照度」を時間積分して積算照度を求めれば良いか分からないため、単純に照射時間を横軸として生残曲線を作成した。結果はいずれも斜め照射の場合の方が生残曲線の傾きが大きく、照射効果が大きかった。これは満水中では全ての紫外線が当該波長で吸収域を持つ液中を進むのに対して、斜め照射の場合は一部空気中を進むため、より広い範囲に照射を行うことが出来ているためだと考えられるが、正確な質量吸収光量の評価は困難である。シミュレーションによる計算の他、PVA-KI等の化学線量計による評価が求められる。バクテリオファージＱ βに対する水栓装置での照射効果(n=3)
円筒中のバクテリオファージＯ β  ( 1 × 10 7 PFU/ml )に対して265 nmの紫外線を端面から均一に平行入射した場合に、反対の端面での照度を求め、入射照度を1mJ/cm²とした場合のファージに対する質量吸収光量の変化を求めた(左グラフ)。単純な系ではこのような形で質量吸収光量を評価することが可能であるが、平行ビームの入射の場合など特殊な場合に限られ、やはり化学線量計での評価が必要。さらに、実際の系では希薄極限に近く減衰はほとんど起こらないが、例えば200mmの長さの円筒系の場合、1 × 106 PFU/ml程度以下であれば質量吸収光量はほぼ一定であるため、この程度の濃度で生残曲線の取得を行えば良く、化学線量計による評価もε cが同等になるように調整すれば非常に簡単に質量吸収光量を評価可能である。
質量吸収光量が分かれば、十分に濃度が薄く、厚さが薄い場合の理想的な生残曲線を用いて、どれだけ感染価を下げることが出来るか評価が可能となる。もちろん、質量吸収光量が一定となる濃度域で実際に微生物を使った実験を行いバイオドシメーターとして質量吸収光量を求めることも可能だが、熟練した研究員による時間のかかる実験が必要で、コストが高い。 PVA-KI線量計は簡単な調合で作成可能で、紫外可視分光光度計があれば測定可能。安定な測定が可能となるように今後の標準化が必要。