バイオ実験キット  Dr.ジーンシリーズDr.ジーン7荷物多型解析PCRキッ取扱説明書第4版2024年５月改訂株式会社ニッポンジーン富士フイルム和光純薬株式会社

本キットについて
本キットは、「サンプルからDNAを抽出」、「Polymerase chain reaction ( PCR ) 法により植物の特定の遺伝子領域を増幅」、「増幅したDNA断片をアガロースゲル電気泳動により確認」といった実際に大学や企業・研究所のラボで行われている操作を実習しながら、植物の種類の違いと遺伝子の関係を遺伝子レベルで調べることを目的としています。植物は，進化の過程や人為的改良のため多様性を持っています。同一種内の個体間にある形質や形態について多様性の存在する状態を多形現象といいます。多型現象が遺伝的差によって生じる場合を遺伝的多型（genetic polymorphism）といいます。遺伝的多型には、いろいろな種類が知られていますが、本キットでは植物の葉緑体DNA内に存在する特定遺伝子領域（trnH遺伝子、psbA遺伝子間のスペーサー領域）の多型を知ることができます。増幅される塩基配列に欠失や挿入などがある場合、PCRで増幅されるDNA断片の長さ（塩基数）が異なります。本キットでは、この違いを電気泳動で確認することができます。 PCR反応は、一般的にサーマルサイクラーと呼ばれる装置を使って行います。本キットは装置を使ってのPCRはもちろんですが、手動でPCRを行うこともできます。
本キットにはアガロースゲル電気泳動を行うための試薬は付いておりません。
電気泳動を行うためには、別売の「Dr.ジーン9　アガロースゲル電気泳動セット」をご購入ください。「Dr.ジーン9　アガロースゲル電気泳動セット」は、発がん物質を含まない「CLEAR STAIN Blue」という染色試薬を用いています。核酸は青色に染まり、安全に目視での観察ができます。(UVイルミネーター等特別な装置は必要ありません。)
本キットで増幅する領域
一般的に真核生物には核が存在し、核の内部に染色体DNAがあります。真核生物である植物も同様に核内に染色体DNAを持っています。しかし、染色体DNAとは別に、植物がもつ葉緑体の内部には「葉緑体DNA（chloroplast DNA）」と呼ばれるDNAが存在しています。この葉緑体DNAは、葉緑体の維持や機能発現に必要な遺伝子がコードされています。本キットでは、この葉緑体DNA内に存在するtrnH遺伝子とpsbA遺伝子の間のスペーサ一領域（発現する遺伝子間に存在する、発現しない領域）をPCR反応により増幅し検出します。trnH遺伝子はヒスチジンtRNA遺伝子、psbA遺伝子は光合成に関する遺伝子を表しています。
※　本キットは保存温度の異なる試薬で構成されています。必ずそれぞれ指定の温度で保管してください。 ※　サンプルマッシャーは右図のようなものです。
2）キット以外に必要なもの

※　本キットにはPCR反応後の電気泳動を行うための試薬は付いておりません。別売りの、「Dr.ジーン9　アガロースゲル電気泳動セット」（1 Kit）で本キット(1 Kit)には必要な電気泳動試薬がそろっています。 3.
◆　本品は試験研究用試薬ですので、医薬品、その他の目的にはご使用できません。また、試薬についての基本的な知識を十分に理解した上で使用してください。 ◆　本品の取り扱いは、マニュアルの記載通りに行ってください。マニュアルの記載内容と異なった取り扱いによるトラブル、事故につきましては、弊社では責任を負いかねます。 ◆　本品の仕様は、ご使用になったお客様のご意見等を参考に予告なく変更されることがあります。 ◆　お湯を使用します。火傷には充分注意してください。以下の操作はあらかじめ実験を指導する方々が行ってください。時間に余裕がある場合は学生が行ってもかまいません。
1)氷の造信
可能であれば各班の分を準備します。氷が大きい場合は氷中にチューブを差し込むことができるサイズに砕いてください。氷水を作ります。水が少量しか用意できない場合は、水を多くし、フロートでチューブを浮かべて使用してください。実験中に氷が溶けないように注意してください。
2)ウォーターバスの準備
ウォーターバス、または、ポットに94～98℃、 52℃、72℃のお湯を準備します。 94～98℃は電気ポットを使用すると簡単です。 (94～98℃に設定ができない場合があります。沸騰させ蓋を開けておくだけで反応に必要な温度は充分保たれます。この場合、実験中に再沸騰が必要です。）実験中、お湯の温度は必ず一定に保ってください。温度が変化すると実験はうまくいきません。火傷には充分注意してください。手動PCRを行わない場合、サーマルサイクラーをご利用ください。機器によっては本マニュアルのPCR条件では増幅しにくい場合があります。事前に予備実験を行うことをお勧めします。
3)フロートの準備
付属のフロートに点線のようにカッターで切り込みを入れ、下の図の状態にします。手動 PCRを行う際、８連のPCRチューブを差し込み使用します。切り込みが入っていても1.5 mlチューブは使用できます。
4)電気泳動の準備
必要な試験
電気泳動に必要な試薬・装置は以下の通りです。 1班あたり6レーン（6ウェル）使用します。6班で1.5%アガロースゲル（12ウェル）
入になれます。弊しくは、ニッポンジーンのホームページより、Dr.ジーン9取扱い説明書をご参照ください。
#45の動物
詳しくは、「Dr.ジーン9アガロースゲル電気泳動セット」の取扱説明書をご参照ください。詳細な準備方法が記載されています。
植物は、進化の過程や人為的改良のため多様性を持っています。同一種内の個体間にも多様性（多型現象）が存在します。多型現象が遺伝的差によって生じる場合を遺伝的多型（genetic polymorphism）といいます。本実験では、サンプリングした植物より植物のDNAを抽出します。この抽出したDNAをPCR反応の鋳型DNAとし、植物のDNAの特定の領域をPCR法によって増幅します。植物の種類によりPCRで増幅されるDNA断片の長さ（塩基数）が異なります。これをアガロースゲル電気泳動で分離すると、バンドの有無、あるいはバンドのパターンなどに差が生じます。この差を利用してDNA多型を検出します。コントロールDNAとして、ホウレン草のDNAを使用しています。ホウレン草の結果と採集した植物の結果などを比較してみましょう。

1）実験をはじめる前に
実験を行う際は、実験室の窓及び扉は閉めてください。 ①石鹸で手を洗います。 ②ティッシュペーパーやペーパータオル等に滅菌用70%エタノールを含ませ、実験台を拭きます。 ③以下の試薬が実験台にあるか確認してください。 (一つの班に必要な試薬です。)一つの班で、2種類の植物サンプルを使用します。

実験操作における注意点—
チップは使い捨てです。一度チュープ内へ入れたチップは捨て、毎回新しいチップを使用してください。コンタミネーションを防止します。コンタミネーションとは、不必要なものが混入することを意味します。 PCR反応は微量な脾型DNAでも反応がすすみます。二種類のサンプルのDNAが混ざると二種類の植物のDNAが同時に増幅します。
2) 奥戦機作

「NC」（ネガティプコントロール）、「C」（コントロール）、「S1」、「S2」、と記入します。
以降、本マニュアル中では「S」「C」と表します。試薬の分注
(*1) 「NC」（ネガティプコントロール）では、DNAが混入していない水をPCR反応に用いることで、調製する反応液中に他のDNAが混入していないか確認するためにおこないます。 「C」（ポジティプコントロール）では、PCR反応が成立することが分っているDNAを鋳型にPCR反応を行い、実験が成立していることを確認するためにおこないます。 PCR反応の美型となります。
各班役割分担すると操作が楽です。
(B)サーマルサイクラー使用の場合
13.マーカーDNAを5 μl、PCRチュープからサンプルを10 μlずつウェルにアプライします。
3.電気泳動の結果を他の人と比較してみましょう。植物による違い、共通点はありますか？ Dr.ジーン9を用いた場合、付属のマーカーDNAはGene Ladder Wide 1です。 (*1)下の例）を参考にバンドのサイズを確認してください。 M(マーカーDNA) : Gene Ladder Wide 1 NC :水 (DNA添加なし) C：ホウレンソウS1：カリフラワ:ダイコン(菜) S6：ブロッコリー S7：ネギS8：シュンギクM(マーカーDNA) : Gene Ladder Wide 1 NC :水（DNA添加なし） C：ホウレンソウS1：カリフラワー S2：レタスS3：コマツナS4：ギャベツS5：ダイコン(寒) S6 :プロッコリー S7 :ネギ
で増幅した塩基数も同じであり、同じアプラナ科に属します。同様に、ホウレンソウとコマツナも見た目が似ています。しかし、両社はアカザ科およびアプラナ科と異なり、PCRで増幅したサイズも異なる結果となりました。また、コマツナとキャベツ、カリフラワー、プロッコリーは見た目からは類縁関係は想像できませんが、同じアプラナ科に属しPCRで増幅するサイズも同じになりました。同じアプラナ科ですが、ダイコンはダイコン属に属するため、他のアプラナ科より少し増幅サイズが小さくなりました。また、キャベツとレタスは見た目が似ていますが、レタスはシュンギクと同じキク科に属します。このように、見た目だけでは類縁関係は判断できない結果が、PCRにより確認することができました。系統樹等を作成し、共通点をみつけてもおもしろいかもしれません。 1）実験後の培地、器具等の廃棄について電気氷動バッファー(TAE廃液)は産業廃棄物として処理してください。染色液(CLEAR STAIN Blueの10倍希釈液)は、活性炭に色素を吸着させろ過します。活性炭は可燃物、ろ液(TAE廃液)は産業廃棄物として処理してください。アガロースゲルは可燃物として廃棄してください。製品についてのお問い合わせ先富士フイルム和光純薬株式会社フリータﾟｲﾔﾙ: 0120-052-099フリーファックス: 0120-052-806株式会社ニッポンジーンTEL: 076-451-6548 FAX: 076-451-6547ホームページ: http://www.nippongene.com/siyaku/