99.酸化ステロイド構造を基盤とする生物活性分子創製平井剛九州大学大学院薬学研究院薬物分子設計学分野Key words :植物ステロイド, NF-к В転写活性化,クリック反応,有機合成,分子設計
箱  高
Physalinは、松浦らによってphysalis alkekengi var. francheti（和名：ホオズキ）から単離されたステロイド天然物である。その後、川井らを中心として、physalin類は30種以上同定されている。Physalin類は、ユニークな13、 14-seco-16、24-cycloergostane骨格が高度に酸素官能基化され、複雑に縮環している。Physalin類のほとんどは、 physalin B  (4)、(図1) のようにC14-O-C27-C25に分子内のアセタール構造を有する。これまでに全合成例は報告されておらず、合成研究も天然物からの誘導によるものであった。Physalin B（4）の生物活性として、研究を開始した当初は抗軍騎活性、抗炎症活性、NF-κB転写活性化阻害［1］などが報告されていたが、ヘッジホッグシゲナル伝達経路の阻害、ユピキチンープロテアソーム経路の阻害などが報告され、幅広い生物活性を有することが示唆されている。しかしながら、その分子レベルでの活性発現機構や活性に重要な部分構造は判明していない。我々は、これら生物活性の中でNF κ B転写活性化阻害に着目した。細胞内のシゲナル伝達の１つであるNF κ B経路は、主にサイトカインやストレスなどで活性化され、炎症やガンなど様々な疾病に関与していることが知られている。このことから、創菓ターゲットしても注目されている。2006年にHeinrichらは、physalin B  (4)とphysalin F  (6)が、TNF・αで誘起されるNF・κ B活性化を阻害することを報告した[1]。また同時に彼らは、B環部が異なるphysalin D（6）は、本阻害活性を示さないことも報告している。一方、我々も独自に取得した天然物ライプラリを評価した結果、似通ったAB環部を有しながらphysalin類とは全く異なる右側構造を有するwithanolide F (7)およびwithanolide E (8)も高い阻害活性を示すことを見出している。これらの結果は、特徴的な右側構造はあまり重要ではなく、5-6位にオレフィン、もしくはエポキシドを有することが阻害活性に重要であることを示している。しかし、これら天然物の構造-作用機序相関を調査した結果、5-6位エポキシト誘導体であるphysalin F（5）とwithanolide E（8）は右側構造の違いに関わらず、IκBαのリン酸化と分解の抑制によって、NF-κ B活性化を阻害することが示唆された。一方、5-6位オレフィン誘導体であるphysalin B（4）は、RelA／p50の核移行とDNAへの結合を抑制したが、withanolide F (6))はこの作用をほとんど示さなかった。同じAB環部を有し、かつ同程度のNF- κ B活性化阻害能を有することから、physalin B（4）の作用機序の決定には、physalin類特有のDEFGH環部が重要な役割を担っていることが示唆された。我々は、physalin特有の分子構造に惹かれ、DEFGH環部の合成を適成した［2, 3］。そのNF κ B活性化阻害能を調べたところ、Bn保護された化合物９において、中程度の阻害活性が確認され、その作用機序は２と同様であることが明らかとなった。 Bn基を持たない化合物10には本阻害活性が見られなかったことから、 AB環部構造はなくともphysalinの右側構造に何らかの疎水性官能基を組み込むことで、RelA／p50の核移行とDNAへの結合を抑制するNF- κ B活性化阻害剤を創製できると考えられた[4]。またこれまで植物由来のステロイド構造の酸化度の高い右側構造は、これまであまり活性に重要であるという認識を持たれていなかった。しかし、我々のこれまでの研究とWaldmannらによるwithanolideの研究[5]から、その右側構造の生物活性への関与が明らかとなって来ており、NF・κ B活性化阻害に関しては上述のように作用機序にも影響があることがわかっている。 Physalin類は、campesterolなどから段階的に酸化され、withanolide類を経て、生合成されると考えられる。これらのことから、「植物ステロイドの生合成的な構造変換は、結合タンパク質・生物活性の変化をもたらす」ということもできる。そこで本仮説を検証すべく、各種ステロイド誘導体の合成も検討した（詳細は、都合により割愛する)。
方法・結果・考察
1. 分子設計
本研究では、DEFGH環部の合成前駆体であるアルキン体12に対し、各種疎水性官能基をクリック反応で導入し13を合成した後、physalin右側背格への環変換によって14に導くことを考えた。化合物14はE環節を持たないが、 physalin特有のDFGH探節を雑持しており、またその疎水性官能基を種々変換可能である。また、以前に合成した9はラセミ体であったが、14は天然型と同じ立体化学を有する光学活性化合物として合成することとした。我々はこれまでに、酵茶を用いる速度論的な光学分割によって、11の不斉合成法を見出している［6］。化合物11からは、既知の手法を利用し16工程で12に導くことが可能であった。本報告書では、12の合成の詳細は割愛する。 by 6 steps
2. 銅 (1) 触媒アジド-アルキン集化付加反応による疎水性官能基の導入
化合物12は安定な分子構造ではあるが、エポキシド、アルキンに加え、アセタール構造を含む7員環ラクトン、さらにそのβ位に脱離基であるモノクロロメシレートを持つ。これら構造を維持したまま、Cu（Ｉ）を用いるアジド-アルキンの環化付加反応（クリック反応）が進行すれば、各種置換基を導入した14の合成が容易となる。そこで、各種アジドとのクリック反応をまず検討した。アジドとしては、先に中程度のNF- κ B活性化阻害活性を示した化合物9との構造類似性を考慮し、ベンジルアジドを用いた。TBTAをリガンドとし、編原としてCuSO 、還元剤としてアスコルピン酸ナトリウムを用いて、含水t-BuOH中80℃で反応させた。その結果、92％の高収率で13aを得ることができた。ベンゼン環の代わりにsp3リッチな疎水性官能基であるアダマンチル基を有するアジドや、ベンゼン環とDFGH環部の間のメチレン基を長くしたアジドを用いても、反応は良好に進行し、それぞれ13b、13cを与えた（図3)。本手法を用いれば、様々な疎水性官能基を12と連結できると考えられる。
3. 化合物13から17 ～の変換とその考察
化合物13から環構造を変換し、DFGH環構造17に導くことを検討した。アルキン体12をTHF水中、LiOHで処理すると、G環部を形成したアセタール18とH環部まで形成した19の混合物を与える(図4B)。本反応は、まずMc基が脱離し、α , β不飽和ラクトンに変換された後、ラクトン環の加水分解と生じたカルボキシレートによるエポキシドの開裂反応によってG環ラクトンが形成され、18を与える。化合物18の14位ヘミアセタールは、18αと18βの混合物として生成するが、これらは平衡問係にあり、18αが27位にマイケル付加することで19を与える。18αと19の間にも平衡関係があり、最終的にそれぞれの安定性によって生成物の収率が決まることになる。アルキン体12の場合、望む19はわずか13%に留まり、18がトータルで75%生成していた。
一方で、疎水性官能基を導入した13の環変換反応では、少々様子が異なっていた（図4A)。先と同様、13をTHF-水中、LiOHで処理すると、同様の反応が進行した。アダマンチル基を持つ13bを基質とした場合、LiOHとの処理時間で脱離体16bの生成量が減少し、G環ラクトン体16bとGH環閉環体17bの生成が徐々に増加した。最終的に８時間処理すると、ほぼ環変換反応は平衡に達し、望む17bを52%、ヘミアセタール体16bを44%で得ることに成功した。他の置換基を持つ13a、13cでも８時間の処理時間でほぼ反応は完結し、13aからは望む17aを29%、ヘミアセタール体16aを33%、18cからは17cを30%、ヘミアセタール体16cを43%で与えた。いずれの場合も、先のアルキン体12と比べ、G環ラクトン体16に対するGH環閉環体17の生成比は向上することがわかった。HPLCで分子した16と17を再度THF-水中、LiOHで処理すると、13からの反応と同様の生成比で16と17の混合物を与えた。このことから、これらの間には平衡関係が存在し、環変換メカニズムは12と同様であることが示唆され、疎水性官能基の導入はDFGH環化合物の安定性に寄与することがわかった。
4. 化合物17から14への変換
合成した各種17のMOM基を塩化アルミニウムとヨウ化ナトリウムで除去し20へと導いた後、生じた水酸基を1-Me·AZADO［7］で酸化し、目的とする14を３種合成することに成功した。環変換反応時に副生したヘミアセタール体に由来する化合物は、HPLCで分離し、14を純度よく得ることができた（図5)。
5. 化合物14のNF- κ B活性化阻害活性の群価と考察
合成した14のNF κ B転写活性化阻害活性を評価した。阻害活性は、プロモーター領域にNF κBの結合サイトを組み込んだルシフェラーゼ遺伝子を安定的に発現するHeLa細胞を用いて、TNF-αによって誘起されるルシフェラーぜの発現をどのくらい抑制するかによって評価した。その結果、子期せぬことにアダマンチル基を持つ化合物14bにおいて、弱い阻害活性が見られたものの(IC o ≒ 85 μ M)、14a、14cには阻害活性は全く見られなかった(最終濃度100 μ M)。化合物14aと中程度の阻害活性が見られた9 (ラセミ体のICzo=43.6 μ M)とを重ね合わせると、当然ながらDFGH環構造ははぼ同じコンホメーションを持ち、疎水性官能基であるBn基も同様のポジションに位置する（図6)。しかしながら、14aが全く阻害活性を示さなかったことから、14aにはないE環部ラクトン構造が9の阻害活性に寄与していたことが考えられる。また、DFGH環情造と疎水性官能基の間にあるトリアゾール環の存在は、疎水性官能基の占める位置に制限を与えることや、そもそもトリアゾール環自体がターゲットタンパク質との相互作用に負に働いている可能性も考えられる。これらの考察を踏まえ、まずは14aのトリアゾール環を炭紫鎖に置換した化合物を合成し、その阻害活性を評価することで、トリアゾール環とE環部ラクトン構造の重要性について検証する予定である。
本研究は、九州大学大学院薬学研究院薬物分子設計学分野の森田友己氏、および理化学研究所袖岡有機合成化学研究室の研修生、Manuel Gemander氏が担当しました。また研究をサポートいただいた、九州大学大学院薬学研究院薬物分子設計学分野特任助教であった森田昌樹博士、および理化学研究所、袖岡幹子主任研究員に深く感謝申し上げます。生物活性評価に際し、九州大学大学院薬学研究院、山下智大助教に多大なるサポートをいただきました。この場をお借りし、深謝いたします。