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60 巻 4 号 2014［新しい検査法］153

新規に保険収載された検査法
ELISA による抗アクアポリン 4 抗体測定
Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay for Anti-aquaporin4 antibody

たか高はし橋とし利ゆきふじ幸 1, 2）：藤Toshiyuki TAKAHASHI

はら原かず一お男 2）

Kazuo FUJIHARAが保険収載された（陽性例の経過観察目的での検査はじめには認められていない）。本稿では、この抗体が陽性になり得る疾患である NMOSD について概説し、アクアポリン（aquaporin : AQP）は、生物の細胞国内における従来法である CBA による抗 AQP4 抗膜に発現している膜タンパクで、主に水分子が通過体測定と、今回保険適用になった ELISA による抗するチャネルとして機能している。ヒトでは 13 種

AQP4 抗体測定について、順に述べる。

類（AQP0 ～ AQP12）の AQP が知られており、そⅠ. 視 神経脊髄炎関連疾患（Neuromyelitisoptica spectrum disorders : NMOSD）
概説の一つがアクアポリン 4（aquaporin - 4 : AQP4）である。AQP4 は、中枢神経系・気管・腸管・腎臓・骨格筋などに発現しているが、特に中枢神経系に豊富に発現しており、神経系と血液間での水分子の出し入れや、脳脊髄液循環などに深く関係していると考えられている 。一方、視神経炎と脊髄炎を主徴と1）

1. 視神経脊髄炎の歴史的背景

する炎症性中枢神経疾患、視神経脊髄炎（Neuromy-視神経脊髄炎（Neuromyelitis optica : NMO）の疾

elitis optica : NMO）の患者血清から、極めて特異性患概念は、1894 年に Devic が「視神経炎を伴ったの高い自己抗体が検出され、この対応抗原が AQP4亜急性脊髄炎」と題する 1 例を報告したことに端をであることが判明した。その後の知見により、現在、発する。同年、彼の弟子 Gault がこの 1 例を含む欧

抗 AQP4 抗体は、単なる疾患マーカーではなく、米の 17 症例をまとめて解析し、視神経と脊髄を侵すNMO 発症の病原性を持った自己抗体だと考えられ特異な疾患として Neuromyelitis optica という名称ている。また、抗 AQP4 抗体は、NMO の部分症と考を提唱した。1907 年に、Acchiote によって、Devic 病えられる疾患群でも陽性となることが分かり、最近という名前も提唱され、以後、Neuromyelitis optica

では、NMO とその部分症を併せて、NMO 関連疾あるいは Devic 病として記載されていくことになっ患（NMO spectrum disorders : NMOSD）と呼ぶ。

2, 3）

4）
視神経炎・脊髄炎の特徴、た 。その後約 100 年の間、NMOSD は、 特 に 病 初 期 に お い て 多 発 性 硬 化 症

発症間隔、再発の有無等に基づき、各研究者によって（multiple sclerosis : MS）と類似し、治療選択上の異なる定義が用いられてきたが、1999 年に、Wing-問題となるが、これらの鑑別のために、抗 AQP4 抗erchuk らが自験例をもとに、単相性・再発性を問体測定が広く用いられることとなった。国内では主わない診断基準案を提案し、これが近年の研究発展に、AQP4 発現細胞を用いた間接蛍光抗体法（cell-5）「視神経と脊髄」との基盤となった 。この基準は、based assay : CBA）によって幾つかの研究施設が測いう病変分布以外の、NMO の特徴である、重篤な定を行ってきたが、今回、Enzyme-Linked Immuno-視力障害や運動障害、MRI における長大な（しばしSorbent Assay（ELISA）による、診断目的での測定ば 3 椎体長を超える）脊髄病変、などを明確にし、

1）国立病院機構米沢病院神経内科〠992 - 1202 山形県米沢市大字三沢26100 - 12）東北大学大学院医学系研究科 多発性硬化症治療学講座〠980 - 8574 仙台市青葉区星陵町1 - 1

1)Department of Neurology, Yonezawa National Hospital(26100-1 Misawa, Yonezawa)2)Department of Multiple Sclerosis Therapeutics,
Tohoku University Graduate School of Medicine(1-1 Seiryo-cho, Aoba-ku, Sendai)（ 17 ）

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典型的な NMO の疾患概念はここで完成したと考え議論するには明らかに不十分であった。また、病理られる。

学的な検討や、動物モデルによる検討により、抗AQP4 抗体が単なる疾患マーカーではなく、中枢神

2. NMO-IgG（抗 AQP4 抗体）の発見

経系への病原性を持つことも確定的となった。抗その後、病理学的に、液性免疫の関与が強く示唆

AQP4 抗体が直接関与する NMO の発症機序は、1）されることも分かり、解析が進む中、2004 年に極血中に何らかの理由で抗 AQP4 抗体が出現する。2）

めて特異性の高い自己抗体として、NMO-IgG が報

抗 AQP4 抗体が何らかの理由で血液脳関門（Blood-告された 。これは、マウスの中枢神経組織を患者Brain Barrier : BBB）を越える。3）BBB を裏打ち血清で免疫染色すると、特異なパターンが検出されしているアストロサイトの足突起には、AQP4 が高るというもので、NMO に対する感度は 73％、特異発現しており、complement-dependent cytotoxicity度は 91％と報告された。翌年に、その対応抗原がや antibody-dependent cellular cytotoxicity によりこ

アクアポリン 4（aquaporin - 4 : AQP4）であることがれが傷害され、引き続く細胞浸潤・脱髄・壊死等に分かり、抗 AQP4 抗体測定系の確立が相次ぐこととより病変形成に至るなった。東北大学で確立した、AQP4 発現細胞を用学的検討では、これとは別に補体沈着を伴わず、アいた間接蛍光抗体法（cell-based assay : CBA）では、ストロサイトの細胞質の腫大、空胞化、突起の念血清抗 AQP4 抗体の NMO に対する感度は 91％、珠状変化や崩壊、アポトーシス様の核の変化がみ

High-risk syndrome（NMO の部分症と考えられるられる clasmatodendrosis など多彩な病理像が同一症例群。現在では NMOSD の範疇に入る。）に対す症例においてもみられることがわかっている6）

る感度は 85％で、特異度は 100％であった。

。なお剖検例の詳細な病理11, 12）。抗13）

AQP4 抗体陽性例のうち典型的な表現型が NMO で7, 8）あるが、その部分症や NMO に特徴的な脳病変を呈3. 現行の NMO 診断基準する症例も抗 AQP4 抗体が陽性であれば同一の疾抗 AQP4 抗体陽性例の解析が進むと、抗体陽性例患概念に含まれると考えられるようになった。そこでは大脳病変も稀ではなく、しばしば AQP4 の高発で、2007 年に NMO 関連疾患（Neuromyelitis optica

現部位（視床下部・脳室周囲・脳幹の水道周囲など）

spectrum disorders : NMOSD）という疾患概念が提に病変が出現することも分かってきた 。1999 年の示され（表 2）、以後、 NMO とその部分症は主に診断基準は、脳病変がないことを前提にしていたた

2）
NMOSD として記載されることとなった 。ただし、め、Wingerchuk らは 2006 年に診断基準案を改訂し、この記載は「こういった例で抗 AQP4 抗体が陽性にここに NMO-IgG（抗 AQP4 抗体）も取り入れられたなり得る」というものであり、診断基準ではないた（表 1） 。現時点では、これが NMO の診断基準とめ、その後の NMOSD の定義は研究者によって異して一般に用いられている。

なることに注意が必要である。実臨床上は、①何ら

9）

10）

かの中枢神経病変があり、②抗 AQP4 抗体が陽性で、4. NMO から NMOSD への発展

③その中枢神経病変が NMO あるいはその部分症としかし、NMO の部分症と考えられる、視神経炎やして矛盾のない場合、NMOSD と診断され得る。な脊髄炎単独例、あるいは、単独の脳病変例での抗体

お、臨床型が NMOSD を示唆するにもかかわらず、陽性例も多く、2006 年の基準だけで抗体陽性例を

抗 AQP4 抗体が陰性である症例群が存在し、sero-

表1 視神経脊髄炎の2006 年Wingerchuk らの診断基準案
以下の（1）～（3）を満たす
（1）
視神経炎
（2）
急性脊髄炎
（2）
以下の補助基準のうち少なくとも2 つを満たす
補助基準1：3椎体以上に連続する脊髄MRI 病変を認める
1）
補助基準 2：発症時の頭部 MRI がPaty らの多発性硬化症の診断基準 を満たさない
2）
補助基準 3：血清 NMO-IgG陽性
1）4 個以上の大脳白質病変、または、1 つが側脳室に接する場合は 3個以上の大脳白質病変を認める。
2）現在、この項目は「血清抗AQP4 抗体陽性」
で代用されることが一般的である。

（ 18 ）

155

表2 Neuromyelitis optica spectrum disorders
Neuromyelitis optica
Limited forms of neuromyelitis optica
・Idiopathic single or recurrent events of longitudinally extensive myelitis（≥3 vertebral segment
spinal cord lesion seen on MRI）
・Optic neuritis: recurrent or simultaneous bilateral
Asian optic-spinal multiple sclerosis
Optic neuritis or longitudinally extensive myelitis associated with systemic autoimmune disease
Optic neuritis or myelitis associated with brain lesions typical of neuromyelitis optica（hypothalamic, corpus callosal, periventricular, or brainstem）

図 1 ELISA 測定原理

negative NMOSD と呼ばれる。この seronegative

たが、その後の知見で、M23-AQP4 を用いた方が、NMOSD の一部で、血清抗 MOG 抗体が陽性になるより精度が高くなることが確定的となり、2012 年ことが分かっており、今後さらに検討を要する。

14, 15）16）からは M23-AQP4 を抗原として用いている 。なお、

現在、国際委員会により新たな NMOSD の診断基

M1-AQP4 は 1 番目のアミノ酸から、M23-AQP4 は準が検討されている。

23 番目のアミノ酸から翻訳されている、splicingvaliant である。M23-AQP4 は M1-AQP4 と異なり、Ⅱ . 抗アクアポリン 4 抗体測定

細 胞 膜 上 で 集 簇 し た Orthogonal arrays particles（OAPs）と呼ばれる構造を作るが、この OAPs の有前述の通り、今回、ELISA による抗 AQP4 抗体測定が保険収載されたが、国内ではこれまで主に
CBA による検査が行われてきた。実臨床上、CBAと ELISA の感度・特異度の違いも問題になると想無が抗 AQP4 抗体の親和性の差異に寄与していると考えられている。

12）

2. Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay（ELISA）
今回保険適用となったのは、イギリスの RSR 社

定され、まず、CBA および ELISA の概要についてによって開発され、コスミック社が輸入販売、ある述べ、各感度・特異度について述べる。

いは受託測定していた ELISA キットである（今後

1. Cell-based assay（CBA）の実際の測定は SRL 社、および、三菱化学メディエ

AQP4 発現細胞を用いた間接蛍光抗体法による測ンス社で行われる）。AQP4 抗原と患者血清の反応定法である。抗 AQP4 抗体検査系としては、2006

後、ビオチン化 AQP4 を添加し、Streptavidin-Per-

年に筆者らが最初に報告しており、生きた細胞のまoxidase（SA-POD）と基質を反応させることで発色ま抗原抗体反応を行うことで、高い精度の検査とさせ、その吸光度を測定する（図 1）。患者血清の。当初は抗原として M1-AQP4 を用いてい抗体を AQP4 抗原で挟み込む形で検出する、ブリッなった

7, 8）（ 19 ）

156

表3 保険収載されたELISAによる抗アクアポリン4 抗体測定
保険適用日

平成 25年11月 1日

測定項目

抗アクアポリン 4抗体

測定方法

酵素免疫測定法（ELISA 法）

主な測定目的

血清中の抗アクアポリン4 抗体の測定（視神経脊髄炎の診断の補助）

保険点数

1,000点

区分「D014」
自己抗体検査の26

判断料

免疫学的検査判断料

留意事項

抗アクアポリン 4抗体は、ELISA法により、視神経脊髄炎の診断（治療効果判定を除く。）を目的として測定した場合に算定できる。

144点

ジ型の ELISA である 17 ～ 19）。現時点では、用いられ劣る可能性があるものの、依頼者としては、検査提ている抗原は M1-AQP4 である。保険診療としては、出がより容易になり、測定者としても、多くの検体視神経脊髄炎の診断目的で測定した場合に算定でを一度に定量的に測定することができるという利点

き、保険点数は 1,000 点である（表 3）。

がある。また、ELISA 施行後に希望がある場合、有償ではあるが、コスミック社において、東北大学か3. CBA と ELISA の感度・特異度

ら技術提供された CBA を行う態勢も取られている。

CBA および ELISA の感度・特異度については、さまざまな報告があるが、名称として同じ CBA あ

今後、これらの検査が、NMOSD や他の炎症性中枢神経病変の診療向上に寄与することが期待される

るいは ELISA であっても、各施設で検査や臨床診断の精度が異なる可能性があり、単純な比較は困文献難である。今のところ、最も信頼性が高いと考えられるのは、2012 年に報告された Waters らの検討で、同一検体群が複数の方法で測定され、各測定法の感度・特異度が比較されている。これによると、
NMOSD に対する各検査の感度は、通常の CBA が73％、EUROIMMUN 社の CBA キットが 68％、RSR社の ELISA が 60％で、特異度はそれぞれ 100％で20）
16）あった 。自験例も併せて考えると 、東北大学で行保険適用となっわれてきた CBA を基準とした場合、た RSR 社 ELISA の感度は 20％程度低くなることが予想され、特異度もやや低くなることが予想される。

おわりにかつて病変分布によって規定された NMO という疾患概念は、近年の目覚ましい研究発展により、抗AQP4 抗 体 に よ っ て 惹 起 さ れ る 中 枢 神 経 病 変、NMOSD へ と 大 き く 変 貌 し た。 こ れ に よ り、 抗AQP4 抗体測定は、日常臨床で必須のものとなり、広範に検査が行われることとなった。今回、ELISAによる NMO 診断目的での抗 AQP4 抗体測定が保険収載され、検査提出が容易になった。ELISA は国内の従来法である CBA と比較して、感度・特異度は（ 20 ）1 ）Papadopoulos MC, Verkman AS. Aquaporin water channels in the nervous system. Nat Rev Neurosci. 2013 ; 14（4）: 265-277.
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