九州シンクロトロン光研究センター
県有ビームライン利用報告書
課 題 番 号 ： 1304026P

Ｂ Ｌ 番 号 ： 07

（様式第 5 号）

実施課題名※マイクロ流体デバイスを用いたタンパク質結晶のin-situ X 線 結 晶 構 造 解 析In-situ X-ray crystal structure analysis of protein crystal by using Microfluidic
device著 者 ･共 著 者 氏 名English

山下健一

YAMASHITA, Kenichi

著 者 ･共 著 者 所 属 独 立 行 政 法 人 産 業 技 術 総 合 研 究 所
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST)※１※２

先 端 創 生 利 用（ 長 期 タ イ プ 、長 期 ト ラ イ ア ル ユ ー ス 、長 期 産 学 連 携 ユ ー ス ）課 題 は 、実 施 課 題
名 の 末 尾 に 期 を 表 す （ Ⅰ ）、（ Ⅱ ）、（ Ⅲ ） を 追 記 し て く だ さ い 。
利 用 情 報 の 開 示 が 必 要 な 課 題 は 、本 利 用 報 告 書 と は 別 に 利 用 年 度 終 了 後 二 年 以 内 に 研 究 成 果 公
開 ｛ 論 文 （ 査 読 付 ） の 発 表 又 は 研 究 セ ン タ ー の 研 究 成 果 公 報 で 公 表 ｝ が 必 要 で す 。 (ト ラ イ アルユース、及び産学連携ユースを除く)

１．概要（注：結論を含めて下さい）
様々な結晶化条件をひとつのチップ内で試験することができるマイクロ流体デバイスを用いて、2 種類のタンパク質の結晶化を行った。ここでは、これら 2 種類のタン
パ ク 質 結 晶 を 、そ の チ ッ プ か ら 取 り 出 す こ と な く X 線 回 折 像 を 得 る こ と が で き る か ど う
か の 試 験 を 行 っ た 。 そ の 結 果 、 室 温 や 4℃ に お い て 、 良 好 な 回 折 像 を 得 る こ と が で き た
も の の 、極 低 温 窒 素 ガ ス 吹 き 付 け 下 で は 霜 付 き に よ り 長 時 間 の 測 定 に は 適 合 せ ず 、全 体形状の再検討を要する結果となった。
（ English ）The crystallization of two kinds of proteins was carried out using the microfluidic chip
which enables the easy screening of crystallization conditions. We herein examined to obtaindiffraction patterns from crystal grown in the microfluidic chip without any manipulation. At
room temperature or 4 ℃ , the obtained several diffraction patterns were of sufficiently finequality for the crystal structure factors to be generated. However at freezing condition, longtime measurement was not able to be carried out because of frosting.

２．背景と目的
マイクロ流体デバイスを用いたタンパク質の結晶化は、効率的な結晶化条件の探索が可能であり、様々なデバイスが開発されてきた。さらに、タンパク質の結晶は脆く壊れやすいことから、デバイスのままX線結晶構造解析が可能であり、熟練した結晶のハンドリングが不要である本手法は、結晶構造解析において大きな利点であると考えられる。このin-situのX線回折実験のためには、大きな単結晶を得ることよりも、液滴やデバイス中で良質な単結晶を１個だけ作製することが重要である。以前、我々はキャピラリー中の微小液滴内に１個だけタンパク質結晶を析出させる技術について報告し、キャピラリーのままX線回折実験を行い、クリアな回折像を得ることに成功した。しかしながら、微小液滴出の結晶化では、従来法よりも結晶化の頻度が低下するという課題があった。そこで本研究では新たに、このような問題点を改善したマイクロ流体デバイス（図1）を用いたタンパク質結晶化技術を検討した。今回、モデルタンパク質として、リゾチームとPseudoalteromonas sp. AS-13由来のグルコキナーゼ（PsGK）を用い、その中に生じた結晶を取り出すことなく、そのままX線回折測定を行うことについての実験を行った。

３．実験内容（試料、実験方法、解析方法の説明）

回転写真法によるリゾチーム結晶、および、Pseudoalteromonas sp. AS-13由来のグルコキナーゼ（PsGK）結晶（図2）の X 線回折データを収集した。当該単結晶をマイクロ流体デバイスから取り出すことなく、試料台（ゴニオメーター）に設置し（図 3）、室温、もしくはフラッシュクーラーにて冷却した。
その後、X 線回折のデータを収集した。
１フレーム当たりの回転角は１度で、デバイスの片面から 90 度分で１データセットとした。使用した X 線波長は

図 1

本研究で使用したマイクロ流体デバイスの写真と、その動作の概略図。

1.5Å、露光時間は１フレーム 20 秒程度であった。

図 2 バッチ中で得られる PsGK 結晶（左）と、前記デ

図 3 実験の様子を示した写真

バイスで結晶化した場合（右）の比較写真

４．実験結果と考察
リゾチームと PsGK の結晶より得られた X 線回折像の一例を図 4 に示す。また、後日行った解析の結果、リゾチーム結晶の単位格子は、a=b=79.40 Å、c=37.91 Å、α=β=γ=90º であり、P43212 の対称性であった。回折点から、分解能は 1.66 Å と計算された。一方、PsGK 結晶では、a=b=100.01 Å、c=59.84Å、α=β=90º、γ=120º であり、P3121 の対称性であった。回折点から、分解能はおよそ 2.0 Å であった。
（A）

（B）

図 4 得られた X 線回折像の一例。（A）がリゾチーム、（B）が PsGK である。

５．今後の課題
前述のとおり、マイクロ流体チップから結晶を取り出すことなく X 線回折像を得ることができ、さらに単位格子の情報を得るのに十分なデータの質であることも確認できた。さらに、これらはプロテインデータバンク登録値とよく一致するものであった。一方で、これらのデータは、4℃や室温という、凍結させない状態でのみ得られることができた。フラッシュクーラーにより、極低温下における測定を試みたところ、窒素が吹き付けられている反対側の面での霜付きが生じ、さらにそれが時間とともに大きくなってしまうという問題が生じた。この理由は、今回用いたマイクロ流体チップの形状の問題であることははっきりしており、この問題を回避するための形状の再検討が必要という結論に至った。本マイクロ流体チップによる結晶化と X 線回折測定の今後の展開を考える上で、タンパクを対象とする以上、凍結状態における測定は実現しておくことが不可欠である。
６．参考文献該当なし

７．論文発表・特許（注：本課題に関連するこれまでの代表的な成果）
1)

Masatoshi Maeki, Hiroshi Yamaguchi, Kenichi Yamashita, Hiroyuki Nakamura, Masaya Miyazaki,Hideaki Maeda, “A method for generating single crystals that rely on internal fluid dynamics ofmicrodroplets”, Chemical Communications, Vol. 48, 5037-5039 (2012)

2)

Masatoshi Maeki, Saori Yoshizuka, Hiroshi Yamaguchi, Masahide Kawamoto, Kenichi Yamashita,
Hiroyuki Nakamura, Masaya Miyazaki, Hideaki Maeda “X-ray diffraction of protein crystal grown in
nano-liter scale droplet in microchannel and evaluation of itsapplicability”, Analytical Sciences, Vol. 28,65-68 (2012)

3)

Masatoshi Maeki, Hiroshi Yamaguchi, Kenichi Yamashita, Hiroyuki Nakamura, Masaya Miyazaki,Hideaki Maeda, “Analysis of Kinetic Behavior of Protein Crystallization in Nanodroplets”, Chemistry
Letters, Vol. 40, 825-827 (2011)4)

特願 2011-258194「結晶成長用容器、液滴調製器具および結晶取得方法」

８．キーワード（注：試料及び実験方法を特定する用語を２～３）
タンパク結晶化、結晶構造解析、X 線回折
９．研究成果公開について（注：※２に記載した研究成果の公開について①と②のうち該当しない方を消してください。また、論文（査読付）発表と研究センターへの報告、または研究成果公報への原稿提出時期を記入してください（2013 年度実施課題は 2015 年度末が期限となります。）
長期タイプ課題は、ご利用の最終期の利用報告書にご記入ください。

① 論文（査読付）発表の報告
論文（査読付）発表の報告（報告時期：平成25 年12 月）