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64 巻 3 号 2018［食水系感染症病原体の検査法］

食水系感染症病原体の検査法－15

セレウス菌

うえ上だしげ田成Shigeko UEDAこ子

Manual of Systematic Bacteriology（2009 年）では

Ⅰ. 病原体B.pseudomycoides、B.weihenstephanensis が B.cereusと遺伝学的に近縁関係にあるとして追加されている。
2. 疫学

1. 病原体B.cereus 食中毒は臨床症状により嘔吐型と下痢型

Bacillus cereus は、食中毒細菌として知られておりに分けられる。本菌食中毒の最初の食中毒事例は、、Bacillaceae 科の Bacillus 属に属するグラム

1, 2）

陽性の大型（栄養細胞：1.0 ～ 1.2 × 3.5μm）の芽胞4）1955 年に Hauge によって報告されたバニラソー形成桿菌（写真 1）であり、周毛性の鞭毛を有し、芽スを原因食品とする下痢型食中毒である。その後胞は菌体の中央あるいはやや中央に存在している。

1971 年に、イギリスにおいて中華料理店で米飯ま本菌は B.thuringiensis、B.mycoides および B.anthra-

たは焼飯を原因食品とする嘔吐型食中毒

cis と遺伝学的に近縁関係にある。これらのうち、B.

れた。わが国では岡山県の小学校で学童 354 名がカ

thuringiensis は、B.cereus と類似しており、B.cereus

ナダ産の脱脂粉乳によって下痢、腹痛等を主徴とす食中毒と関係のある下痢毒を産生し 、B.cereus とる食中毒発生事例が 1960 年に初めて報告され、そ生化学性状および寒天平板上での成育状況は全くの後本菌食中毒事例が多々報告されるようになり、同一であり、これらの区別は顕微鏡的に殺虫性のわが国では 1982 年より行政的に B.cereus が食中毒

結晶タンパク（crystal toxin : parasporal body）を形細菌として扱われるようになった。

3）

成するか否かによって判定される。また、Bergey’s5）が報告さ

B.cereus による食中毒は、しばしば世界各国で発②①

電子顕微鏡写真NGKG 培地上コロニー

NGKG 培地上の①下痢型菌株（でんぷん分解＋）と②嘔吐型菌株（でんぷん分解－）

写真 1 B.cereus の電子顕微鏡写真，
NGKG 培地上コロニー（上田成子作製）
神奈川工科大学 応用バイオ科学部 栄養生命科学科
元 女子栄養大学・衛生学教室（ Kagawa Nutrition University）〠243 - 0292 神奈川県厚木市下荻野1030（8）Kanagawa Institute of Technology Faculty of Applied Bioscience
Department of Nutrition and Life Science(1030 Shimo-ogino, Atsugi, Kanagawa)

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生する食中毒細菌である。わが国においては、欧米腹部の痙攣や下痢がみられ、症状の持続時間は一般諸国と比較して本菌食中毒発生事例は必ずしも多くに 24 時間以内である。

ない。1978 ～ 2016 年の 39 年間の本菌による食中一方、下痢型食中毒の発症に関与している毒素は毒事例は 453 件みられ、1 件あたりの患者数は平均

下痢原性毒素（下痢毒）、ウサギ腸管ループ液体貯24 人で、その発生頻度は 0.2 ～ 2.3％となっている。

留因子、血管透過性亢進因子、腸管壊死毒、皮膚壊

また、月別発生状況は他の細菌性食中毒と同様に、死毒、マウス致死因子等とされている。

ほぼ 86％が 6 月～ 10 月の間に発生している。原因

Ⅱ. 検査法施設は全発生事例のうち飲食店がほぼ 58％と最も多く、次いで家庭、事業所、仕出し屋の順になっている。

1. 検査法の流れ

原因食品をみると、主なものは穀類およびその加

B.cereus の生化学性状については表 2 に示してあ工品（焼飯類、米飯類、麺類等）であり、次いで複合調理食品（弁当類等、その他）である。わが国では、り、その検査法については図１に示した。

特に焼飯類（チャーハン、焼き飯）が重要視されるが、本菌は普通寒天培地上で好気的に培養すると、通欧米、その他の国では、野菜サラダ、肉料理、魚料常、ワックス状の粗慥で湿潤な灰色から暗灰色の集理、土鍋料理、あるいはスパゲティや米飯の調理・落を形成する。本菌がマンニットを醗酵せず、強い加工食品のような澱粉食品、チーズや粉乳を加えたレシチナーゼ活性（卵黄反応）を示すことを利用しバニラ・スライス等が原因食品としてあげられ、日て、分離にさいしては卵黄を加えた NGKG 寒天や本とは様相が異なっている。 B.cereus 食中毒の発生

MYP 寒天平板が使用されている（写真 1）。これら要因は、全国食中毒事件録（1982 ～ 2012 年）からの培地上ではレシチナーゼ反応を示し、マンニットみると、調理食品の長時間室温放置や前日調理食品を分解しない大型集落を示す。B. cereus はブドウ糖の使用、食品の取り扱いの不衛生等によるものが、加普通寒天培地に培養すると対数増殖期の菌体内に記載された発生要因のうちほぼ 40％と最も多い。

空胞（非染顆粒）を形成する。また、本菌は周毛性のまた、厨房内の衛生管理の欠陥によるものが 21％鞭毛を有し、この鞭毛（H）抗原によりいくつかの血あり、主に調理場の汚染が原因とされている。

清型に分類されている。Taylor & Gilbert は食中毒

そ ぞう6）由来株を中心として H 抗原の解析を行ない、26 の3. 臨床症状血清型を分類している。これまでの諸報告を整理す

B.cereus 食中毒は臨床症状によって下痢型と嘔吐ると、食中毒由来株のほとんどは Taylor & Gilbert型食中毒がある（表 1）。わが国に頻繁にみられる嘔の 1 ～ 26 型に該当することが明らかにされている。

吐型食中毒の発症には嘔吐毒（セレウリド（Cere-

本菌が産生する毒素のうち下痢毒については、現ulide））が関与し、食物内毒素と考えられている。

在、主に免疫学的方法が使用されており、このほか嘔吐型食中毒の臨床症状は 30 分～ 6 時間の潜伏期に結紮腸管ループ試験、血管透過性亢進試験などの後に悪心と嘔吐がおこるのが特徴であり、また時々、生物学的試験法も利用できる。免疫学的手法としては逆受身ラテックス凝集反応に基づくセレウス菌エ

表 1 B.cereus 食中毒の疾病特徴
感染菌量
毒素産生場所
毒素物質
潜伏期間

嘔吐型
5810 ～ 10 /g
食品（食物内毒素）
環状ペプチド0.5 ～ 5 時間

疾病期間

6 ～ 24 時間

症状

吐気，嘔吐，不快（たまに下痢）
いため料理米飯
パスタ，ペーストリヌードル

原因食品

ンテロトキシン検出キット（デンカ生研）が使用さ

下痢型
5810 ～ 10 /g
小腸（生体内毒素）
たんぱく質
8 ～16 時間
（たまに 24 時間以上）
12～ 24 時間（たまに数日）腹痛，水溶性下痢
吐気
食肉製品，スープ野菜，プディング，ミルク・ミルク製品

れている。嘔吐毒に関しては HEp -2 細胞（ヒト喉頭癌由来）の空胞化変性の有無による形態変化によっ
7）て測定されている 。また、LC/MS（Liquid chroma-tography/mass spectrometry : 液体クロマトグラフィー／質量）分析法

8）による検出も可能である。

さらに、嘔吐毒合成酵素を対象としたイムノクロマ
ト法９）により定性的な嘔吐毒産生菌の検出も可能であり、LC/MS による定量実験の前提実験に利用す

（9）

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表 2 B.cereus および遺伝学的近縁関係菌の生化学性状
生化学的性状

B.cereus

B.thuringiensis

B.mycoides

B.anthraciｓ

卵黄反応
根様状集落
莢膜
非染顆粒の形成
クリスタル・トキシン
カタラーゼ反応
嫌気条件下での発育pH5.7 での発育
溶血能：ヒトインドール反応
ゼラチンの液化能
カゼインの分解能
チロシンの分解能フェニールアラニンの脱アミノ作用
リゾチーム中での発育7％ NaClでの発育能リトマスミルクの還元
でんぷんの加水分解能
クエン酸塩利用能
硝酸塩還元能
VP反応
尿素分解能
運動性
糖分解能
グルコース
アラビノース，キシロース，
マンニット＋－－＋－＋＋＋＋－＋＋＋－＋a＋a
a＋＋＋aa－－＋＋＋＋＋＋－＋＋＋－＋＋＋＋＋＋a＋a

a＋－＋－＋＋＋＋－＋＋a－＋a＋＋a＋＋＋－＋－＋－－＋＋＋－－＋＋－－＋＋＋＋b＋＋＋－＋－＋－＋－＋－

栄養細胞（μm）
・長さ
幅
芽胞細胞（μm）
・形
位置
病原性

3～ 51.0～ 1.2楕円形
中央
鱗翅目，双翅目，鞘翅目の昆虫に殺虫作用・日和見感染

食中毒・日和見感染

B.cereus 各種性状
●栄養細胞
発育温度域 ：10 ～ 48℃ 至適発育温度 32℃
発育 pH 域 ：4.9 ～ 9.3 至適発育 pH 域 7.0
Aw 域：0.912～ 0.95
熱抵抗性 D100 ℃値 1.2～ 8.0 分●毒素の熱抵抗性
嘔吐毒：121℃，90 分
下痢毒：56℃，5 分＋：85～ 100％の菌株が陽性

a : 50～ 84％

ヒト，動物に対する感染症●芽胞細胞の発芽
発芽温度域：1～ 59℃
発芽pH 域 ：4.35 ～ 9.30
Aw 域：0.993 以上●芽胞細胞の熱抵抗性 D95 ℃値
でんぷん分解菌 ：4.1～ 7.0 分
でんぷん非分解菌：6.3～ 25 分－ : 0～ 14％b : 15～ 49％

ると労力や経済性などを低減させることができ、迅MYP 培地（MERCK）、MYP培地（OXOID）、BACIL-速性からも有効な手法と考えられる。さらに、嘔吐

LUSCEREUS AGAR BASE（PEMBA）（OXOID）、

毒測定のための LC/MS 機器はタンデム四重極型質

CHROMagar B.cereus base（KANTOU）等があり、量分析計で実施すると従来の LC/MS 機器と比較すいずれも遜色なかったが、著者の経験によると特にると、その感度は ng から pg/μI と鋭敏に検出でき

CHROM agar B.cereus base（KANTOU）上での培る。さらに、嘔吐毒合成酵素を対象としたイムノク

養所見は明確な色彩と集落を示し B.cereus の判定がロマト法（メルク）、下痢毒合成酵素を対象とした容易であった。

イムノクロマトにより、定性的測定ができ、また、
核酸クロマト（カイノス）により定性的な嘔吐毒の3. 遺伝子検出法i ）嘔吐毒遺伝子検査の方法検出が可能となった。
2. 分離用培地

11）

嘔吐毒を産生する B.cereus 検出のための遺伝子検

10）

査法は PCR 法や Real time PCR 法で行うことがで

B.cereus の選択培地として NGKG 培地（日水）、きる。なお、Fricker 等の Primer は嘔吐毒合成酵素（ 10 ）

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検査試料
増菌培養32℃、16時間・嘔吐毒：PCR法Real time PCR法（SYBR Green法）（TaqMan Probe法）

NGKG平板培地、MYP培地、CHROMagar B.cereus base培地
32℃、24～48時間培養
B.cereusの菌数測定
グラム染色

生化学性状試験

培養細胞試験
・嘔吐毒：
HEp-2細胞・下痢毒：
Vero細胞

B.cereusの分離
H-血清型別試験

免疫学的試験

毒素産生試験
機器分析

生物学的試験毒素遺伝子試験

・嘔吐毒：・嘔吐毒：・嘔吐毒：・嘔吐毒：
イムノクロマト
PCR法
液体クロマトグラフィー/質量試験
スンクス・下痢毒：Real time PCR法
経口/腹腔内投与
逆受身ラテックス
サル凝集反応
経口投与試験
イムノクロマト・下痢毒：
酵素免疫法（EIA） ウサギ/マウス血管透過性試験
ウサギ/マウス結紮腸管ループ試験
マウス致死毒サイトトキシン活性

図 1 B. cereus の分離・同定

遺伝子を標的とし、各種腸管病原菌や Bacillus 属間光を検出する。Primer セットは次のようである：

でも特異性が高く、また、食品、水、糞便中からの

ces-SYBR-FCACGCCGAAAGTGATTATACC

直接検出に対しても特異性の高い有効な Primer で

ces-SYBR-RCACGATAAAACCACTGAGATAGTGある。

増幅条件は 95℃、10 分（amplitaq gold activation① PCR 法hot start）と 95℃、15 秒，60℃、1 分を 40 回繰り返

Primer セ ッ ト に は CACGCCGAAAGTGATTATす。 さ ら に 95 ℃、15 秒，60 ℃、60 秒，95 ℃、15 秒

ACCAA と CACGATAAAACCATG - AGATAGT を用（Melting curve）操作する。

い、増幅産物の分子量は 176 bp である。増幅条件

ii. TaqMan プローブ法

は Denaturation : 94℃、1 分/Annealing : 55℃、12 つの PCR Primer に囲まれた増幅配列とハイブ分/Polymerization : 72℃、1 分の 35 回繰り返すとリダイズできる第 3 のオリゴヌクレオチドプローブ

良い。

を準備する。この第 3 のプローブの 5’、3’両末端にまた、PCR 法キット（Bacillus cereus PCR Kit : タ

各々別の蛍光色素を結合させておく。PCR 反応にカラバイオ）も市販されているが、菌株によって嘔伴い、TaqDNA ポリメラーゼが持つ 5’、3’エキソヌ吐毒合成遺伝子を保有していても嘔吐毒を産生しなクレアーゼ活性により第 3 のプローブは分解し、い株もみられることから注意が必要であり、さらにFluorescence resonance energy transfer 効果がなくB.cereus による食中毒を、直接明らかにするものでなり出てきた蛍光を検出する。

ない。

TaqMan プローブ法の Primer セットは次のよう② Real time PCR 法である：

主な方法として、インターカレート法と TaqMan

ces_TaqMan_for CGCCGAAAGTGATTATACCAA

プローブ法があるが、これ以外にモレキュラービー

ces_ TaqMan_rev TATGCCCCG-TTCTCAAA-CTG

コン法、ハイブリプローブ法などある。

ces_TaqMan_probe FAM-GGGAAAATA-ACGAGA

i. インターカレート法

AATGCA-MGB

PCR 反応の際に合成された二本鎖 DNA に結合し蛍光を発する SYBR GreenⅠなどの蛍光色素を取り増幅条件は 50℃、2 分（UNG activation）と 95℃、10 分（amplitaq gold activation hot start）

込ませ（インターカレート）、PCR 反応に応じた蛍（ 11 ）さらに 95℃、15 秒，60℃、60 秒を 40 回繰り返す。

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Real time PCR 法の機器は Applied Biosystems Stepあるので、この点においても注意を要する。また、

one system を用いると良い。

嘔吐毒産生キットは核酸クロマトであるスイフトii ）下痢毒遺伝子の検査

ジーン・セレウリド産生セレウス・カイノス（カイ下痢毒を産生する遺伝子による PCR 法のプライノス）がある。

マー（Primer）については多くの報告があるが、特文

異的 Primer は明らかでない。また、多種由来の菌株のうち下痢毒産生 B. cereus は 90％以上の菌株にみられ、下痢毒を産生するからといって、食中毒原因菌と決定づけることは出来ない。食中毒発症に関与する菌株は、その毒素産生活性が 2μg/ml 以上の菌株が対象となる。
4. 簡易・迅速診断法としてのイムノクロマト法12）

イムノクロマト法は、検体中の抗原が金コロイド標識特異抗体と結合してシート上を移動し、シート上部に固相化された抗体に捕捉されて、金コロイド由来の赤色の線が現れることにより抗原の検出ができる。また、青色のラテックスで標識した抗体を利用したイムノクロマト法のキットもある。これらの方法は操作が簡便で、個人により結果・判定が異なることが少なく、特別な機器も必要としないので、熟練した技術者のいない規模の小さい検査室にも適している。通常、選択増菌培養を行ってから使用するので、そのキットに最適な選択増菌培養培地を使用して適切な培養条件で培養し、検出に必要な菌数レベルまで増菌させることが重要である。そのためには、イムノクロマトのキットと最適化された選択増菌培地がセットで開発、販売されているものを使用することが勧められる。
B.cereus の嘔吐毒産生能のイムノクロマトキットは®
シングルパス エメテイックトキシンマーカー（メルク）、下痢毒産生能はデュオパス・セレウス・エンテロトキシン（メルク）で毒素産生能の定性試験ができる。この手法は労力、経済性には良い手法と考えられる。なお、下痢毒は 90％の菌株が下痢毒を産生することから、本菌のリスクの有無は定量的手法である逆受身ラテックス凝集反応に依存すればよい。また、イムノクロマトキットは食品からの直接

献1 ）Jean l, Schoeni and Amy C. Lee Wong. Bacillus cereus
food poisoning and its toxins. J. Food Prot., 2005 ; 68 :636 -648.
2 ）上田成子：セレウス菌、（熊谷進編代表）HACCP 衛生管理計画の作成と実践 改定データー編、中央法規出版；
2003. 122.
3 ）上田成子 . 微生物農薬としての Bacillus thuringiensisと
食 料 及 び 土 壌 に お け る そ の 存 在. 食 衛 誌 , 1996 ; 37 :J145 - J154.
4 ）Hauge S. Food poisoning caused by aerobic spore forming bacilli. J.Appl.Bacteriol. 1995 ; 18 : 591 - 595．
5 ）Mossel DAA.MJ kooprman.E Jongerius Enumeration ofBacillus cereus in foods. Appl.Microbiol. 1967 ; 15 : 650653.
6 ）Fernado Jose Meira De vasconcellos and Leon Rabinovitch. A new formula for an alternative culture medium,
without antbiotics, for isolation and preoumptive quantification of Bacillus cereus in food. J. Food Protection. 1995 ;
58 : 235 -238.
7 ）Hughes, S,. Bartholomew. B., Hardy, J.C and Kramer.
J.M. Potential application of a HEp－2 cell assay in the investigation of Bacillus cereus emetic syndrome food poisoning. FEMS Microbiol.Lett., 1988 ; 52 : 7-11.
8 ）Shigeko Ueda, Hajime Nakajima, Miki Iwase, Kunihiro
Shinagawa, and Yoshihiro Kuwabara.: LC-MS analysis of
the emetic toxin cereulide produced by Bacillus cereus.
Biocontrol Science, 2012 ; 17（4）: 191 - 195.
9 ）Shigeko Ueda and Yoshihiro Kuwabara.: Rapid Identification of emetic Bacillus cereus by Immunochromatography. Biocontrol Science. 2011 ; 16（1）: 41- 45.
10）上田成子：Bacillus cereus 食中毒と検査、THE CHEMICAL TIMES 2013 No.2
（通巻 228号）; 2013. 11- 18.
11）Shigeko Ueda, Manami Yamaguchi and Miki Iwase: detection of emetic Bacillus cereus by Real -Time PCR infoods. Biocontrol Science, 2013 ; 18（4）: 227- 232.
12）Shigeko Ueda, Manami Yamaguti, Kayako Eguchi andMmiki Iwase:.Identification of cereulide-producing Bacillus cereus by nucleic acid chromatography and reverse
transcription Real-time PCR. Biocontrol Science, 2016 ; 21（1）: 45 - 50.

検出は食品によって偽造のバンドが出現することが（ 12 ）