BioResource Now ! Vol.7 No.4

BioResource Now !
Issue Number 7

April 2011

国内外のバイオリソースを巡る様々な問題や取り組みについて、毎月ホットな話題をこのニュースレターで紹介していきます。
研究とバイオリソース
No.10
じょうほう通信No.56

堀江 健生・笹倉 靖徳 ( 筑波大学・下田臨海実験センター )Kaede 蛍光タンパク質を利用した
カタユウレイボヤ (Ciona intestinalis ) の神経系の研究
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P1 - 2
P2

ニュースレターのダウンロード先
www.shigen.nig.ac.jp/shigen/news/

研究とバイオリソース〈NO.10〉

Kaede 蛍光タンパク質を利用した
カタユウレイボヤ (Ciona intestinalis )の神経系の研究
モデル生物としてのカタユウレイボヤ

カタユウレイボヤ・トランスジェニック系統の作製

カタユウレイボヤ（写真１）を含むホヤのグループは脊索動物門に属する動物で、その幼生は典型的なオタマジャクシ型の体制を取り（写真１Ａ）、脊索や背側中枢神経系といった脊椎動物と共通のボディプラン *1を備えています。多くのホヤの発生は単純で、例えば初期胚や幼生は数えられる程度の細胞から構成されており、細胞系譜 *2 が明らかとされています。さらにホヤは、卵のそれぞれの領域が将来の体のどの部分になるかが発生初期に決められている「モザイク卵」であるため、発生の研究においても注目されている動物です。

カタユウレイボヤのもう一つの特徴は、世代時間が 2−3 ヶ月と比較的短いことです。
この短さに着目し、我々の研究グループではこのホヤの遺伝学的技術基盤を整備することを進めてきました。まず、室内閉鎖飼育系を構築しました。これにより、カタユウレイボヤを研究室内で飼育し子孫を得ることや、遺伝子組換え体を封じ込めて飼育すること、つまり遺伝学的な実験を行うことが可能になりました。続いてトランスジェニック
系統 *4の作製を進めることにしました。我々は、Tc1/mariner ス ー パ ー フ ァ ミ リ ー のトランスポゾン*5の１つ Minos がこのホヤで転移活性を有していることを明らかにし 2)、
Minos をカタユウレイボヤゲノムへと挿入させたトランスジェニック系統を作製する
ことに成功しました ( 図 1)。

Ｂ(A) カタユウレイボヤの幼生。幼生の時期はオタＡ マジャクシ型の体制を取り活発に遊泳する。
(B) 変態直後のカタユウレイボヤ。変態後は尾部を失い固着生活を送る。
(C) カタユウレイボヤ
Ｃ 成体

写真１：ホヤの一種

Minos転移酵素 mRNA

卵に導入

カタユウレイボヤ

カタユウレイボヤは、ホヤの中でも遺伝子機能解明に適した研究材料です。ゲノ
ム配列は 2002 年に決定され 1)、ゲノムサ
イズは半数体辺り約 160Mbp で、遺伝子をおよそ 15,852 個含んでいると推定されました。この数値から、カタユウレイボヤが非常にコンパクトなゲノムを有していることが分かります。また、カタユウレイボヤ
においては卵への顕微注入による外来 DNAや RNA の導入による遺伝子機能解析法が盛んに進められています。特に遺伝子の機能阻害法としてはモルフォリノオリゴ *3 の顕
微 注 入 に よ る 翻 訳 阻 害 が 利 用 可 能 で す。
さらに、外来 DNA を何百もの卵や初期胚にエレクトロポレーション法（電気穿孔法）により一度に導入ことも可能です。このように、遺伝子の配列情報を入手でき、遺伝子機能解析の各種実験技術が確立しているという特徴から、カタユウレイボヤは脊索動物のモデル生物とも言われています。

terPromoter Kaede カタユウレイボヤ

飼育
野生型個体

ファウンダー個体
掛け合わせて次世代個体を得る

蛍光タンパク質を発現させる個体を選別し系統を樹立する。

図 1：Minosトランス
ポゾンによるカタユウレイボヤの形質転換
レポーター遺伝子 *6を組み込んだ Minos
ベクターを転移酵素
mRNA と共にホヤ卵に導入する。導入された個体の一部はMinos 挿 入 を 次 世 代に伝える。

Minos トランスポゾンベクターと転移酵素 *7mRNA を初期発生の時期に導入した個体を飼育し、その子孫を得ますと、およそ 30%程度の個体が Minos 挿入を子孫に伝えます。
つ ま り、 Minos が ホ ヤ ゲ ノ ム に 挿 入 さ れ、それが遺伝することを意味しています。最近
では転移酵素を生殖細胞で発現させる系統が作製され、この系統と Minos の挿入を持つ系統を掛け合わせることにより、生殖細胞のゲノム中で Minos が転移酵素の働きで別の領域へと転移し、新しい挿入を持つ系統を作製できる系も構築されました 3)。

1

堀江 健生 ・笹倉 靖徳

1, 2
1

筑波大学 下田臨海実験センター 准教授

2

さらに、 Minos を用いてゲノム中の転写制御領域であるエンハンサー活性を検出する
エンハンサートラップ法 *8 や 4)、Minos の挿入により遺伝子を破壊する挿入突然変異体の作製にも成功しています 5)。 Minos を用いて作製されたトランスジェニック系統の多くは、ナショナルバイオリソースプロジェクト（NBRP）に寄託されており、提供体制が整えられています。

Kaede を発現する
カタユウレイボヤ系統
Kaede はサンゴから単離された蛍光タンパク質 6) で、紫外光によって色が緑から赤に変換する特性（光変換活性）を有しています。オワンクラゲ由来の緑色蛍光タン
パク質も細胞を光らせることができますが、Kaede 蛍光タンパク質の場合、光交換活性を利用して細胞の位置や時期をより細かく指定してマーキングし、細胞のその後の変化を追跡することができるのです。
こ の Kaede を 神 経 系 全 体 や 特 定 のニューロン、特にコリン作動性ニューロン、GABA / グリシン作動性ニューロン、グルタミン酸作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロンで発現させたカタユウレイボヤ系統（写真 2）が作製され、ナショナルバイオリソースに寄託されています。ホヤの幼生は 100 個程度のニューロンから構成される単純な神経系を有していますので、これらの Kaede 系統は、全神経ネットワークを徹底的に研究する上で強力なマーカーとして期待されています。
AB

写真 2：Kaede を幼生の神経系で発現させるトランスジェニック系統(A) 神経系全体で Kaede を発現させる系統の幼生(B) コリン作動性ニューロンで特異的にKaede を発現させる系統の幼生
次ページへ続く

1 生物の体をつくる設計図
2 受精卵から成体ができるまでの各細胞の分化の道筋
3 モルフォリノオリゴヌクレオチド。人工的な核酸類似物質。遺伝子の研究では主に*** mRNA の翻訳開始点付近に相補的な塩基配列を持つモルフォリノオリゴが作製され、そのオリゴを細胞に注入すると mRNA に結合して翻訳を阻害することができる。

*4 その生物が本来は有しない、外来性の DNA をもつ系統

5 生物のゲノム DNA 中を転移する性質を持つ DNA のこと。末端に繰り返し配列を持つ* などの特徴がある*67 特定の生命現象を簡便に検出するために用いられる遺伝子の総称*8 トランスポゾンの転移に必須の働きをする酵素
レポーター遺伝子がエンハンサー活性のあるゲノム DNA の近傍に挿入された時、* レポーター遺伝子の発現がそのエンハンサーにより制御されて変化することを利用して、ゲノム中のエンハンサーを検出する方法

BioResource Now ! Vol.7 No.4

Kaede の光変換を利用した神経細胞の変態過程での追跡
前述の Kaede 系統を利用した研究を一つ紹介します。ホヤは、幼生の時期にはオタマジャクシ型の体制をとり活発に泳ぎますが、変態後は固着生活を送るようになります（写真１参照）。このように、生活スタイルまでが大きく変化するホヤの変態過程
では、中枢神経系が大規模な改変を受けると考えられてきました。これまでは、ホヤ幼生の中枢神経系は一度完全に失われ、成体の神経系は変態過程で新たに形成されるというのが通説になっていました。しかしながら、ホヤ幼生の神経系の細胞を、変態過程で正確にトレースした実験はこれまでなく、幼生の神経系の細胞が消失するのか残るのかについては、議論になっていました。

さらに、上衣細胞の一部は変態中にニューロンに分化し成体ニューロンを補っていること、つまり、カタユウレイボヤの変態過程では、幼生のグリア細胞が神経幹細胞的に働き、成体ニューロンのソースとなっているということが分かりました 7)。このようにKaede 系統は細胞のトレース実験に強力なツールとなります。Kaede に限らず、蛍光タンパク質で組織を特異的にラベルしたトランスジェニック系統も、発生メカニズムの解明の強力なツールになります。世界でもこのようなホヤ系統が整備されているのは、日本の NBRP リソースだけになります。
その日本独自のリソースを利用して、ホヤの発生メカニズムを独創的な視点から解明したいと考えています。
■

このことに対して、上記の Kaede 系統を利用してアプローチしました。具体的には、Kaede の光変換を利用して幼生の中枢神経系の細胞を Kaede の赤色蛍光でラベルし（写真３Ａ）、その赤色蛍光を発する細胞が、変態後に残っているのか消失するのかを解析しました。その結果、幼生の中枢神経系由来の細胞の多くは変態後も残っており、成体の中枢神経系を構築していることが分かりました（写真３Ｂ，Ｃ）。
続いて中枢神経系のどの細胞タイプが残るのかを追跡したところ、幼生のニューロンの大多数は消失すること、変態後にメインに残っているのは、幼生のグリア細胞である上衣細胞であることが分かりました（上衣細胞はホヤの中枢神経系から報告されている唯一のグリア細胞です）。

文献
1) Dehal et al., 2002. Science 298:2157-2167.
2) Sasakura et al., 2003. PNAS 100:7726-7730.
3) Sasakura et al., 2008. Dev. Dyn. 237:39-50.
4) Awazu et al., 2004. Dev. Biol. 275:459-472.
5) Sasakura et al., 2005. PNAS 102:15134-15139.
6) Ando et al., 2002. PNAS 99:12651-12656.
7) Horie et al., 2011. Nature 469:525-528.

A

写真 3：Kaede を用いた幼生神経系の細胞の変態過程でのトレース実験(A) 幼生の神経系の細胞を Kaede の光変換を利用して赤色蛍光でラベルした状態。
(B) (A) の幼生を変態後まで飼育し、赤色蛍光でラベルされた神経系の細胞が変態後の中枢神経系に残っていることを示した写真。
(C) (Ｂ) の四角い枠の部分を拡大したもの

C

B

画像の一括操作をしてみよう

じょうほう通信上記 URL にアクセスしダウンロードを行います。
Linux 版、Windows 版、MacOS 版がありますが、今回は Windows バイナリパッケージ版を利用しています ( 図 1)。
ダウンロードした exe ファイルを実行するとインストールが始まります。インストーラの指示に従って進めてください。

2

文字を描く場合のフォントサイズ

サイズ変更

処理する画像名（今回はワイルドカード (*) で指定）

mogrify△-resize△320x240△-pointsize△18△-annotate△+50+50△"National△BioResource△Project"△-format△png△*.jpg「ImageMagick」(http://www.imagemagick.org/) は、豊富な機能 ( サイズ変更・フォーマット変換・文字描画・合成など ) を持った画像処理ツールです。
コマンドラインからの使用を基本としていますが、大量画像の効率的な処理に適しています。

インストールしてみよう

10 分

今回は、
『全 jpeg 画像（*.jpg）
に対し、サイズを、高さ 320px 幅 240px に変更、“ National BioResource Project ” という文字の書き込み ( 書 き 込 み 座 標50px, 50px、フォントサイズ 18px)、png 画像として出力』という処理を行ってみます。

画像を処理するツールには、MS ペイント、フォトショップなど様々なものがあります。例えばサイズやフォーマットの変更、文字の記載を行う場合、少量の画像であれば問題ないのですが、大量の画像を処理する場合には大変手間が掛かります。今回はその様な場面で有用な「ImageMagick」をご紹介します。

1[ 第 56 回 ]出力する画像のフォーマット指定

書き込む文字とその座標※ページの都合で複数行となっていますが、1 行のコマンドです。
△は半角空白を意味します。
処理前

Binary Release で使用している環境に合わせて選択コマンドで処理してみよう

1024px

処理後

240px
National BioResource Project

768px

National BioResource Project

320px

National BioResource Project

図：コマンドの実行処理前後の画像
図1

上図のように、コマンド 1 つで画像の一括処理が行うことができます。
さらに ImageMagick には画像操作画面も付属しています。デスクトッ
プに imdisplay アイコン ( 又はスタートメニュー内の “ImageMagickDisplay”）から起動して下さい。但し、コマンド版ほど多機能ではありません。また、
ImageMagick は様々な言語から呼び出すことができます。
（Perl の場合、Image : : Magick の実装で利用可能となります。
）

インストールが完了しましたら、コマンドプロンプトを起動します。
（スタートメニュー → アクセサリ → コマンドプロンプト）「処理する画像のディレクトリ」に移動し、コマンドを実行します。
コ マ ン ド に は convert( 単 一 画 像 変 換 )、mogrify( 複 数 画 像 変 換 )、combine( 合成 ) などがあり、オプションには resize( サイズ変更 )、annotate( 文字描画 )、format( フォーマット変更 ) など豊富なコマンドが用意されています。
※参考ページ：http://www.imagemagick.org/Usage

皆さんも多くの画像を 1 回のスクリプトで処理したい場合、使ってみてはいかがでしょうか？
最後に一言：magick, mogrify はスペルミスではありません・・。
（生物遺伝資源情報総合センター 系統情報研究室 服部 学）

Contact Address
連絡先 〒411-8540 静岡県三島市谷田 1111
国立遺伝学研究所 生物遺伝資源情報総合センター
TEL055-981-6885 ( 山崎 )E-mail brnews@chanko.lab.nig.ac.jp

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バ イ オリソ ー ス 情 報

Editor's Note(NBRP) www.nbrp.jp/(SHIGEN) www.shigen.nig.ac.jp/indexja.htm(WGR) www.shigen.nig.ac.jp/wgr/(JGR) www.shigen.nig.ac.jp/wgr/jgr/jgrUrlList.jsp

微細な生命現象を位置特異的、時間特異的に追跡することができる出来立て
ホヤホヤのホヤリソースを紹介していただきました。昨年 12 月のメダカに続く日本の研究グループの快挙です。NBRP を通して世界中の研究者がこれらのリソースを利用できるということは、誇らしいことですね。
（Y.Y.)

BioResource Now !

Issue Number 7 April 20112