改訂細胞培養
入門ノート

● 改訂版
● 初版

序
序・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・

井出利憲，田原栄俊

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井出利憲

事前講義

細胞培養の基礎知識を学ぼう！
講義１● 細胞培養とは・・・・・・・・・・・・・・・・・・

講義２● 培養細胞の種類と特徴

・・・・・・・

14

14
講義４● 培養室の見学

15

細胞の一般的な性質 ＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ 15
代表的な培養細胞 ＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ 17

講義３● 細胞培養でよく使う試薬や器具・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・

22

培養室の意義 ＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ 23
培養室へ入る前の注意 ＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ 24
まず前室へ入る ＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ 25
無菌室へ入る ＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ 28

19

解説■ 継代と PDL …………………………………………………………………………………………… 16■ 線維芽細胞と細胞増殖因子 ………………………………………………………… 19■ 癌細胞とトランスフォーム細胞………………………………………………… 18■ 空気（ホコリ）以外のコンタミのルート …………………………… 23■ 初代培養と株細胞 ……………………………………………………………………………… 19■ クレゾール石けん液の廃液について ……………………………………… 26

1
無菌操作の基本を身につけよう！
実習 1 ● 培地替え・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・

34

34

Step1

前室での準備＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ 37

Step6

ディッシュの観察＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ 45

Step2

無菌室へ入る

38

Step7

培地替えのために培地を吸い取る＿＿＿ 49

Step3

クリーンベンチの用意＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ 40

Step8

新しい培地を加える＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ 53

Step4

必要なものをクリーンベンチへ

Step9

ディッシュをインキュベーターに＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿

41

しまう＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ 57

インキュベーターから細胞を出す＿＿＿ 43

Step10 あとしまつ＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ 58

入れる＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿

Step5

contents

解説■ ピペッター使用の必要性 ……………………………………………………………… 35■ コンタミを見つける ………………………………………………………………………… 48■ はじめから自分で工夫することの利点と欠点 ………………… 36■ ピペット捨てについて …………………………………………………………………… 52■ 殺菌灯についての Q&A ………………………………………………………………… 41■ クリーンベンチ内での操作について ……………………………………… 52■ ビンのあぶり方 …………………………………………………………………………………… 43■ 一度使用したピペットは再び培地ビンに■ トレイでディッシュを運ぶときの注意 ………………………………… 44

戻さないこと！ …………………………………………………………………………………… 57■ 培地をこぼしたら ……………………………………………………………………………… 57■ 培地の色は重要（pH 指示薬としてのフェノールレッド）…………………………………………………………………………… 47■ ゴミの始末 ……………………………………………………………………………………………… 59■ 色のついていない培地もある …………………………………………………… 48

2
継代の方法と細胞数の計測法を身につけよう！
実習 1 ● 細胞の継代・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・

62

継代を行う前に知っておくべきこと ＿＿＿＿＿＿ 62
無菌室へ入る前に準備しておくこと＿＿＿＿＿＿63

Step1

前準備＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ 64

Step2

無菌室へ入る＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ 66

Step3細胞の確認と培地の準備

Step4細胞を剥がす＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ 68

Step5培地を加え，トリプシンの作用を＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿

67

止める＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ 72

Step6細胞の観察とあとしまつ＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ 75

実習２● 細胞を数える
実習 2-162・・・・・・・・・・・・・・・・・・・

裸核にして細胞を数える

77＿＿＿＿＿＿＿77

Step1

核浮遊液の調製＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ 79

Step2細胞の数え方＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ 81

実習 2-2

裸核にしないで数える ＿＿＿＿＿＿＿＿＿ 84

生きた浮遊細胞をそのまま数える（細胞を染色しない）＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ 84
生細胞のみを数える（トリパンブルー液を用いた計測法）＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ 85

実習 2-3

ディッシュに付着したままの細胞を数える＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ 87

解説■ トリプシン /EDTA の溶かし方 ………………………………………………… 65■ トリプシン /EDTA の持ち込みについて ……………………………… 75■ 研究室でまとめて作って管理する！ ……………………………………… 65■ 継代は最低２枚のディッシュにまく ……………………………………… 76■ なぜロット番号まで記録しておくのか ………………………………… 66■ ラバーポリスマンの使い方 ………………………………………………………… 80■ 新しいディッシュの取り出し方………………………………………………… 66■ アスピレートのやり方 …………………………………………………………………… 80■ 前もって観察しておいてから実験を■ クリスタルバイオレット液による核浮遊液の開始すべきである ……………………………………………………………………………… 68

調製ついて ……………………………………………………………………………………………… 81■ 細胞の剥がれ方を観察してみよう …………………………………………… 70■ 細胞の数え方 ………………………………………………………………………………………… 82■ 剥がれたところと剥がれていないところの■ 酔う人が少なくない ………………………………………………………………………… 83

見分け方 …………………………………………………………………………………………………… 73■ 混ぜた後どのくらい時間をおけば染色されるか，■ ピペッティングによる細胞の損傷 …………………………………………… 73

どのくらいの時間保てるか ………………………………………………………… 87■ 希釈について ………………………………………………………………………………………… 74■ 生細胞，死細胞の見分け方 ………………………………………………………… 87■ ディッシュに均一に分散させるには ……………………………………… 74

3
正確な細胞数をまく技術を身につけよう！
実習 1 ● 細胞浮遊液の正確な分注

90

実験前に考えておくべきこと ＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ 90

実習 2 ● 少数細胞のまき込みによるコロニー形成

95

正確な分注のしかた ＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ 91

実習 3 ● コロニーのギムザ染色

99・・・・・

90・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・

Step1

細胞浮遊液をつくり，分注する＿＿＿＿＿ 93

Step1

細胞を固定する＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿100

Step2

細胞を数える＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ 94

Step2染色する＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿101

Step3

観察 / コロニーを数える ＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿102

解説■ 一般的な懸濁のやり方 …………………………………………………………………… 94■ 顕微鏡での観察について ……………………………………………………………103■ コロニーを数える ……………………………………………………………………………102

4
マルチウェルプレートの扱いとクローニングの方法を学ぼう！
実習１● マルチウェルプレートにまく107
実習２● 細胞のクローニング・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・

107

Step1 カバーグラスを・・・・・・・・・

112

Step1 コロニーを選択する＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿115
Step2 コロニーを回収する＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿117

マルチウェルプレートに入れる＿＿＿＿110

Step2 細胞をまき込む＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿110

解説■ カバーグラスへまき込むときのポイント …………………………111■ どのコロニーを選ぶか …………………………………………………………………115■ ディッシュにカバーグラスを入れて■ 必要なコロニーに印をつける …………………………………………………116

細胞をまく場合 …………………………………………………………………………………112■ クローニングの目的と方法 ………………………………………………………113■ 細胞は乾かさないように ……………………………………………………………118■ いくつぐらいのコロニーを拾うか …………………………………………1205増殖曲線の作成と応用実習にチャレンジしよう！
実習１● 増殖曲線を描く

・・・・・・・・・・・・・・・

122

122

実験操作で注意すべきこと ＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿125

増殖曲線の描き方 ＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿127

contents
実習２● 応用実習

・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・

130

実習 2-0

実験材料となる細胞の準備

実習 2-1免疫染色 ＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿131

＿＿＿＿

130

実習 2-2細胞への遺伝子導入（トランスフェクション）＿＿＿＿＿＿135

実習 2-3放射性同位元素で標識する＿＿＿＿138

解説■ 増殖曲線についての解説 ……………………………………………………………126■ チミジンをチップで加えるときのコツ ………………………………139■ カバーグラス上の細胞の洗い方………………………………………………130■ 取り込まれたチミジンの算出法………………………………………………140■ カバーグラスを培養器から出して固定する場合 …………131

特別実習

細胞培養に必要な準備を学ぼう！
実習１● 培養室のメンテナンス・・・・・・

141

141
実習３● 共通試薬の調製・・・・・・・・・・・・・・・

152

実習 1-1

培養室の掃除 ＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿141

実習 3-1培地を作る ＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿152

実習 1-2

インキュベーターの掃除 ＿＿＿＿＿＿142

実習 3-2

血清を非動化する ＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿155

実習 1-3

炭酸ガスボンベの交換 ＿＿＿＿＿＿＿＿143

実習 3-3トリプシン /EDTA を作る ＿＿＿＿157

炭酸ガスゲージの見かた ＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿143

実習 3-4

血清のロットチェック ＿＿＿＿＿＿＿＿158

炭酸ガスボンベの交換 ＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿143

実習２● 器具・試薬の滅菌
実習 2-1

オートクレーブ

実習 2-2
実習 2-3・・・・・・・・・・・・

145＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿

145

乾熱滅菌

＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿

147

濾過滅菌

＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿

147

数十 mL までの濾過 ＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿148

実習 4 ● 細胞の管理

・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・

160

実習 4-1細胞を凍結保存する＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿160

実習 4-2細胞を解凍する ＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿164

実習 4-3

マイコプラズマの検出 ＿＿＿＿＿＿＿＿166● 特別実習を通じて・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・

168

数十 mL から数百 mL 程度の濾過 ＿＿＿＿＿＿＿＿＿149
大量の溶液（数 L から 10 L まで）の濾過 ＿＿150

実習 2-4ガラスピペットの洗浄と滅菌 ＿150

Step1

ピペットの洗浄＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿150

Step2

ピペットの準備＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿151

Step3

乾熱滅菌＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿151

解説■ なぜ綿を詰めるのか ………………………………………………………………………151■ 爆発に対する注意 ……………………………………………………………………………165■ 血清の非動化処理のしかた ………………………………………………………156■ 温め方：液体窒素が消えたらなるべく急速に■ 凍傷に対する注意 ……………………………………………………………………………165● 索引

解凍する …………………………………………………………………………………………………166・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・

169