2014年 5月30日

誘導体化試薬と誘導体化反応の基礎
東京化成工業株式会社
深谷工場 製造部 金子 広之

1©2014 Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.

2014年 5月30日

なぜ誘導体化するの？
分離の改善
 難揮発性化合物を揮発性に変える。
 熱安定性を増し熱分解を防止する。
 光学異性体をジアステレオマーにすることで、光学活性カラムを使わずに分離できる。
 カラム充填剤への吸着を防ぐ。
検出感度の向上 検出器への感度を上げる(ECD, MS, NPD)。

化学構造に対する知見
 官能基の数や特定の成分を見分けられる。

2©2014 Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.

2014年 5月30日

誘導体化による沸点降下
メチルエステル化

CH3COOCH3（沸点:56℃, 分子量:74.08）

CH3COOH（沸点:118℃, 分子量:60.05）

CH3COOSi(CH3)3TMS化

アセチル化（沸点:108℃, 分子量:132.23）

CH3CH2OCOCH3（沸点:77℃, 分子量:88.11）

CH3CH2OH（沸点:78℃, 分子量:46.07）

CH3CH2OCOCF3TFA化（沸点:62℃, 分子量:142.08）
3©2014 Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.

2014年 5月30日

糖の誘導体化砂糖

加熱

炭化TMS-砂糖TMS化

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2014年 5月30日

分析例 TMS Sugars
ColumnTemperature: 007-1(Dimethylpolysiloxane)
25m x 0.25mmI.D. x 0.25mm: 150℃(5℃/min)～220℃(10℃/min)～270℃
25 78966 663101412 13141105101520 Time(min)Sample :1. b-Arabinose
2. a-Ribose
3. b-Ribose
4. a-Xylose
5. a-Mannose
6. b-Fructose
7. a-Galactose
8. a-Sorbose
9. a-Glucose
10. b-Mannose
11. b-Glucose
12. Lactose
13. Sucrose
14. Maltose
5©2014 Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.

2014年 5月30日

官能基による誘導体化
官能基

水酸基
(OH)

対象物

アルコール
ステロイド
糖

カルボキシル基（COOH)

脂肪酸

アミノ基
(NH2)

アミン
アミノ酸

メルカプト基(SH)

チオール

カルボニル基
(CO)

ステロイド

誘導体化

試薬

シリル化

トリメチルシリル化剤
酸-アルコール

N,N-ジメチルホルムアミド

エステル化

ジメチルアセタール
ジアゾメタンオンカラムメチル化剤

アシル化

無水酢酸
トリフルオロ酢酸無水物

シリル化

トリメチルシリル化剤

エステル化

酸-アルコール
N,N-ジメチルホルムアミド
ジメチルアセタール
ジアゾメタンオンカラムメチル化剤

シリル化

トリメチルシリル化剤

アシル化

無水酢酸
トリフルオロ酢酸無水物

シリル化

トリメチルシリル化剤

アシル化

無水酢酸
トリフルオロ酢酸無水物

オキシム化

ペンタフルオロベンジル
ヒドロキシアミン塩酸塩

6©2014 Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.

2014年 5月30日

誘導体化の種類
1.エステル化
2.シリル化
3.アシル化

4.その他
7©2014 Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.

2014年 5月30日

エステル化とは？

カルボン酸

8©2014 Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.

2014年 5月30日

エステル化剤
メチルエステル化剤
酸-メタノール
ジアゾメタン
TMS-ジアゾメタン
N,N-ジメチルホルムアミドジメチルアセタール

オンカラムメチル化剤

9©2014 Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.

2014年 5月30日

ジアゾメタン発生装置【操作方法】① エーテル約10mL入れる。（Ⅰ）② 水酸化カリウム 5～6粒を水 1mLに溶解しカルビトール又エタノール10mLを加える。（Ⅱ）③ 脂肪酸のエーテル溶液を入れ、窒素ガスを少量流しておく。（Ⅲ）④ （Ⅱ）にp-トルエンスルホニル-N-メチルN-ニトロソアミド加える。
⑤ （Ⅲ）が微黄色になったらエステル化完了。

N2（Ⅰ）

（Ⅱ）

（Ⅲ）

＊カルビトール ： ジエチレングリコールモノエチルエーテル
10©2014 Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.

2014年 5月30日

誘導体化方法（メチルエステル化)
脂肪酸2mgトルエン(25%メタノール含有) 0.5mL

バイアルビン使用

TMS-ジアゾメタン(10%ヘキサン溶液） 0.1mL
放置(20℃ x 15min)(窒素ガス発生終了後密栓する）
脂肪酸メチルエステル

11©2014 Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.

2014年 5月30日

オンカラムメチル化剤とは？
カルボン酸

 脂肪酸などと試薬を混合しGCに注入すると、試料気化室内で反応しメチルエステル化する。

 トリグリセリドとは、エステル交換反応によって構成脂肪酸のメチルエステルを生成する。

12©2014 Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.

2014年 5月30日

オンカラムメチル化剤
テトラメチルアンモニウムヒドロキシド(TMAH)（メタノール溶液）

フェニルトリメチルアンモニウムヒドロキシド (PTAH) （メタノール溶液）

m-トリフルオロメチルフェニルトリメチルアンモニウムヒドロキシド(TFPTAH) （メタノール溶液）

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2014年 5月30日

反応例 トリグリセリド

14©2014 Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.

2014年 5月30日

分析例 Butter TriglycerideColumn: 007-65HT（15m x 0.25mmI.D., 0.1mm)
Temperature : 250℃(5℃/min)-365℃

Sample:1. Cholesterol
2. PPP
3. PPS
4. PPO
5. PSS
6. PSO
7. POO
8. SSO
9. SOO10. OOO

15©2014 Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.

2014年 5月30日

反応例 トリグリセリド

16©2014 Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.

2014年 5月30日

脂肪酸・亜麻仁油分析例: 007-23(Cyanopropylphenyldimethylpolysiloxane)(30m x 0.25mmI.D., 0.25mm)
Temperature : 180℃
Column脂肪酸

亜麻仁油

Sample: 1.パルミチン酸(C16:0)メチル
2.ステアリン酸(C18:0)メチル
3.オレイン酸(C18:1)メチル
4.リノール酸(C18:2)メチル
5.リノレン酸(C18:3)メチル17©2014 Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.

2014年 5月30日

シリル化とは？

アルコールアミノ酸18©2014 Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.

2014年 5月30日

シリル化剤
1. トリメチルシリル化剤
2. ジメチルシリル化剤
3. ジメチルアルキルシリル化剤

4. ハロメチルシリル化剤
5. 環状シリレン化剤
19©2014 Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.

2014年 5月30日

誘導体化方法（TMS化)
アルコ－ル

5mg

脱水ピリジン

0.5mL

バイアルビン使用

TMS-HT(HMDS+TMCSピリジン混合液) 0.5mL
室温放置(25℃ x 15min)

TMS誘導体上澄み液をGCに注入する

20©2014 Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.

2014年 5月30日

フェニルフェノールのTMS化: 007-1(Dimethylpolysiloxane)（30m x 0.25mmI.D., 0.25mm)
Temperature : 180℃
Column

誘導体化前

誘導体化後

Sample: 1. 2-フェニルフェノール
2. 3-フェニルフェノール
3. 4-フェニルフェノール

21©2014 Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.

2014年 5月30日シリル化のしやすさ

アルコール＞フェノール＞カルボン酸＞
アミン＞アミドアルコール 1級＞2級＞3級
アミン
1級＞2級22©2014 Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.

2014年 5月30日

TMS化剤の強さ
TMSI >BSTFA >BSA >MSTFA >TMSDMA>TMSDEA >MSTA >TMCS >HMDSTMSI = N-Trimetylsilylimidazole
BSTFA = N,O-Bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide
BSA = N,O-Bis(trimethylsilyl)acetamide
MSTFA = N-Methyl-N-trimethylsilyltrifluoroacetamide
TMSDMA = Trimethylsildimethylamine
TMSDEA = Trimethylsildiethylamine
MSTA = N-Trimethylsilyl-N-methylacetamide
TMCS = Trimethylchlorosilane
HMDS = Hexamethyldisilazane
23©2014 Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.

2014年 5月30日

ジメチルアルキルシリルイミダゾール(DMASI)種類
1. ジメチルエチルシリルイミダゾール(DMESI)
2. ジメチルイソプロピルシリルイミダゾール(DMIPSI)
3. ジメチル-tert-ブチルシリルイミダゾール(DMTBSI)

24©2014 Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.

2014年 5月30日

DMASIの特長
1. GCでの分離が良くなる。
2. MSによる分子量の推定が容易になり、SIMでの検出感度が増す。

3. 構造未知な水酸化ステロイドの水酸基の数が、GC分析だけでわかる。
4. フェノール性水酸基と、アルコール性水酸基の弁別が容易にわかる。
25©2014 Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.

2014年 5月30日

b-エストラジオールのTMS-DMES

サンドイッチ注入法
DMESI

DMESI
0.2mL
b-エストラジオール TMS体 0.1mLDMESI
0.2mL
26©2014 Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.

2014年 5月30日

分析例 b-エストラジオール
ColumnTemperatureSample
123: 007-1(Dimethylpolysiloxane)
25m x 0.25mmI.D. x 0.25mm: 250℃: 1. Bis TMS Ether
2. 3-O-DMES-17-O-TMS
3. 3-O-TMS-17-O-DMES
4. Bis DMES Ether

401020 Time(min)TMS→DMES

0102030 Time(min)DMES→TMS27©2014 Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.

2014年 5月30日

TMS試薬の注意事項
1．湿気を避けて、密栓し乾燥冷暗所に保管する。
2．皮膚、目、口粘膜との接触を避け、蒸気を吸わない。
3．火気厳禁。
4．バイアルビンから試薬を取り出す場合は、乾燥した注射器等でとる。

5．バイアルビンのパッキンにはテフロン張りのゴムを使用しているので、一度注射器を突き刺した場合は、なるべく早く使い切る。

28©2014 Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.

2014年 5月30日

アシル化とは？
アミンアルコール29©2014 Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.

2014年 5月30日

トリフルオロアセチル化反応30©2014 Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.

2014年 5月30日

誘導体化方法（TFA化)
アミン5mg
脱水塩化メチレン 0.5mL

バイアルビン使用

トリフルオロ酢酸無水物(TFAA) 0.2mL
加温(40℃ x 30min)
溶媒除去(N2ガスパージ)
脱水アセトン添加 0.2mL
TFA誘導体31©2014 Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.

2014年 5月30日

アミルアミンのTFA化: 007-1(Dimethylpolysiloxane)（30m x 0.25mmI.D., 0.25mm)
Temperature : 60℃
Column誘導体化前誘導体化後

Sample: 1. 2-メチルブチルアミン
2. 3-メチルブチルアミン
3. n-アミルアミン

32©2014 Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.

2014年 5月30日

光学異性体分離ジアステレオマー法
R体 ＋ R体(試薬） → R-R体
S体 ＋ R体(試薬） → S-R体

直接分離法(光学活性固定相使用）
水素結合型
キラル金属錯体型
シクロデキストリン誘導体型
33©2014 Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.

2014年 5月30日

検出感度の向上
MS用試薬
ジメチルアルキルシリルイミダゾール
標識化合物
d9-TMCS, d18-BSA, d18-BSTFA, d9-TMSIMECD用試薬含フッ素化合物
TFAA, PFPA, HFBA

34
©2014 Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.

2014年 5月30日

新水道法（平成16年4月より施行）

フェノール類

ホルムアルデヒド

ハロ酢酸類

固相抽出誘導体化-GC/MS

誘導体化溶媒抽出-GC/MS

溶媒抽出誘導体化-GC/MS

ﾎﾙﾑｱﾙﾃﾞﾋﾄﾞ

ｸﾛﾛ酢酸
ｼﾞｸﾛﾛ酢酸
ﾄﾘｸﾛﾛ酢酸

基準値

0.005mg/L(ﾌｪﾉｰﾙに換算して)0.08mg/L

ｸﾛﾛ酢酸 0.02mg/L
ｼﾞｸﾛﾛ酢酸 0.04mg/L
ﾄﾘｸﾛﾛ酢酸 0.20mg/L

使用試薬

N,O-ﾋﾞｽ(ﾄﾘﾒﾁﾙｼﾘﾙ)ﾄﾘﾌﾙｵﾛ
ｱｾﾄｱﾐﾄﾞ(BSTFA)

ﾍﾟﾝﾀﾌﾙｵﾛﾍﾞﾝｼﾞﾙﾋﾄﾞﾛｷｼ
ｱﾐﾝ塩酸塩(PFBOA)

ｼﾞｱｿﾞﾒﾀﾝ(CH2N2)

分析方法

ﾌｪﾉｰﾙ
2-ｸﾛﾛﾌｪﾉｰﾙ
種類

4-ｸﾛﾛﾌｪﾉﾙ
2,4-ｼﾞｸﾛﾛﾌｪﾉﾙ
2,6-ｼﾞｸﾛﾛﾌｪﾉﾙ
2,4,6-ﾄﾘｸﾛﾛﾌｪﾉﾙ

35©2014 Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.

2014年 5月30日

フェノール類の分析法
検水500mL

固相ｶﾗﾑ

ｼﾞﾋﾞﾆﾙﾍﾞﾝｾﾞﾝ-N-ﾋﾞﾆﾙﾋﾄﾞﾘﾝ共重合体

ｼﾞｸﾛﾛﾒﾀﾝ（HClでpH=2に調製）

ﾒﾀﾉｰﾙ精製水固相抽出
精製水洗浄
窒素乾燥
ｼﾞｸﾛﾛﾒﾀﾝ 5mLでﾊﾞｯｸﾌﾗｯｼｭ溶出

溶出液脱水（無水硫酸ﾅﾄﾘｳﾑ）
1mL正確に分取

誘導体化

N,O-ﾋﾞｽ(ﾄﾘﾒﾁﾙｼﾘﾙ)ﾄﾘﾌﾙｵﾛｱｾﾄｱﾐﾄﾞ(BSTFA) 0.1mL (室温1時間放置）←ｱｾﾅﾌﾃﾝ-d10 100μg

GC/MS測定36©2014 Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.

2014年 5月30日

ホルムアルデヒドの分析法
分液ロート(100mL)←検水 50mL

誘導体化

ﾍﾟﾝﾀﾌﾙｵﾛﾍﾞﾝｼﾞﾙﾋﾄﾞﾛｷｼｱﾐﾝ塩酸塩(PFBOA)(1mg/mL 水溶液） 3mL（室温2時間放置）←硫酸（1+1） 0.8mL←塩化ナトリウム 20g←ヘキサン 5mL

5分間振とう分液
ヘキサン相

水 相脱水（無水硫酸ナトリウム）
1mL正確に分取←1-クロロデカン(100mg/L) 1mL

廃 棄

GC/MS測定37©2014 Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.

2014年 5月30日ハロ酢酸の分析法
分液ロート(100mL)←検水 50mL(硫酸（1+1）でpH 0.5以下に調製）←塩化ナトリウム 20g←tert-ブチルエーテル(MTBE) 4mL

2分間振とう分液
MTBE相

水 相脱水（無水硫酸ナトリウム）
2mL正確に分取

誘導体化

廃 棄
ジアゾメタン(MTBE溶液) 200mL(室温30分放置）←1,2,3-トリクロロプロパン(10mg/L) 20mL

GC/MS測定38©2014 Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.

2014年 5月30日

官能基による誘導体化
官能基

対象物

誘導体化

水酸基

アルコール

TMS化

アルコール
ステロイド

TMS化

アルコール, 糖

TMS化

ステロイド

TMS化

糖水溶液
アルコール

TMS化
アシル化

脂肪酸

TMS化

脂肪酸

TMS化

脂肪酸
脂肪酸

エステル化
エステル化

A5601
B0511
A5603
B0830
A5604
T0274
A5605
T0585
T0623
T0433
A5603
B0830
A5605
T0585
X0041
T0323

脂肪酸

エステル化

アミン, アミノ酸

TMS化

アミン, アミノ酸
アミン, アミノ酸

アシル化
シリル化
シリル化

カルボキシル基

アミノ基

メルカプト基品 名特 長記載ﾍﾟｰｼﾞ*BSA

非常によく使用される

BSTFA

BSAより強力TMS-HT

非常によく使用される

SIM

シリル化剤の中で最も強力

TMS-PZ
TFAA

水溶液に有効
無水酢酸よりECD感度高い

BSTFA

BSAより強力SIM

シリル化剤の中で最も強力

HCl-Methanol
Diazomethane

非常によく使用される非常によく使用される

41251351051617951351625
35

T1146 TMS-Diazomethane

爆発性や毒性無し

34

A5601
B0511
T0433
B1150
B1150

BSA

非常によく使用される

TFAA
MTBSTFAMTBSTFA

無水酢酸よりECD感度高い
GC-MS感度高い
GC-MS感度高い

41292020＊弊社発行「GC前処理試薬｣中の掲載ページです。
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39

2014年 5月30日

TCI試薬前処理分類
試薬使用割合特徴

25% BSA(アセトニトリル溶液）
TMS-BA60%

もっとも多用されている
TMS-HTより反応性弱い
カルボン酸・ジカルボン酸には良い(沸点の高いもの）

HMDS+TMCS（ピリジン溶液）
TMS-HT

27%

TMS-BAより反応性強くカルボン酸との反応物を加水分解する場合がある
アルコール性水酸基・フェノール性水酸基

TMS-PZ

3%

BSTFA

2%

ｼﾞｱｿﾞﾒﾀﾝ

7%

TFAA

1%

糖類（特に含水）に良い

BSAに比べて、反応性強く副生成物の揮発性が高い
アミノ酸は難しい
直鎖カルボン酸のメチルエステル化に良い(沸点の低いもの）
前処理剤がGCに現れない
無水酢酸に比べて、副生成物の揮発性が高い
キラル分離に特に有効40©2014 Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.