CiCLE: クライオ電顕単粒⼦解析 情報処理講習会
2021年1⽉19⽇

Cootによる原子モデリング
平均分解能：4.0Å↓⼤阪⼤学蛋⽩質研究所
⽥中 秀明←最高分解能：1.1Å

EMDB statistics

モデル構築の流れ
Map analysis(Phenix.mtriage)

Map improvement(Phenix.auto_sharpen)
Novel structure

de novo modeling(Phenix.map_to_model)←単粒子解析の際に出てくるFSCの結果を使えば良いので特に必要はない。

←側鎖の電子密度が確認できるようであれば不要（今回は、単粒子解析のマップをそのまま使用）

Known structure（相同性、サブユニットの違い等）

Rigid body fitting（Chimera, gmfit等）

Validation(Phenix.molprobity)

１．α-helixやβ-sheetなどの二次構造の主鎖は正しく配置する事ができるので、まずはポリアラニンでモデルを構築する。

２．マップから全てのアミノ酸側鎖をアサインすることは難しいが、かさ高い側鎖の電子密度を目印にしてモデルを構築する。

３．分解能にもよるがreal space refinementをする際に二次構造が崩れてしまう場合がある。その際は、制限を掛けながら精密化を進める。
・二次構造、Ramachandran plotのrestraint
・高分解能で決定された構造をreference modelとして使用したrestraint

Manual model building(Coot)
Refinement(Phenix.real_space_refine)

低分解能（3-5Å）でのモデル構築

Deposition

４．モデル構築、精密化の際には、常にRamachandran plotを確認しながら進める。

Ramachandran Plot
平面

Ramachandran Plot

ペプチド結合は電子が非局在化した 共鳴構造を取る
ことにより、窒素とカルボニル炭素との間の結合が 二重結合性を持つので自由回転が制限され、ペプチド結合を形成している炭素、酸素、窒素、水素の各原子とペプチド結合をはさむ二つのα炭素は同一平面上に並ぶ。

Φとψの角度を二次元プロットしたのがRamachandran Plotで、ほとんどの領域では近接した原子間の衝突が起こる。衝突しない領域のほとんどは、二次構造が取る領域とよく一致している。

平面

ペプチド結合は電子が非局在化した 共鳴構造を取る
ことにより、窒素とカルボニル炭素との間の結合が 二重結合性を持つので自由回転が制限され、ペプチド結合を形成している炭素、酸素、窒素、水素の各原子とペプチド結合をはさむ二つのα炭素は同一平面上に並ぶ。

Φとψの角度を二次元プロットしたのがRamachandran Plotで、ほどんとの領域では近接した原子間の衝突が起こる。衝突しない領域のほとんどは、二次構造とよく対応している。
β-sheetPreferred regionorAllowed region↓
この2つの領域に100% の 残 基 が 収 まるように精密化を進める。

α-helix

Disallowed region

モデル構築の流れ

Phenix

Map analysis(Phenix.mtriage)←単粒子解析の際に出てくるFSCの結果を使えば良いので特に必要はない。

Map improvement(Phenix.auto_sharpen)←側鎖の電子密度が確認できるようであれば不要（今回は、単粒子解析のマップをそのまま使用）

Novel structure

de novo modeling(Phenix.map_to_model)

プロジェクトを作る（計算結果の保存先などの指定）① Click New Project

Known structure（相同性、サブユニットの違い等）

Rigid body fitting（Chimera, gmfit等）
INX-6② Input project ID③Input Project directotry

EM_koushuukai/PHENIX

Manual model building(Coot)
Refinement(Phenix.real_space_refine)

Valida>on(Phenix.molprobity)

EM_koushuukai/SEQ/6KFH.fasta④Input sequence file (FASTA format)
Deposi>on⑤ Click OK

Phenix

Phenixプログラム“Map Symmetry”を⽤いた対称マトリックスの計算プログラム“Map Symmetry”を⽤いた対称マトリックスの計算④Click Run
Mapから対称マトリックスが計算される。

② Input Map file
EM_koushuukai/EM_map/emd_9973.map

Phenix “Map Symmetry ” は
このmapに8回回転対称があることを認識した。

3.6③ Input high resolution
limit determined by FSC① Select Map Symmetry

計算結果で得られた対称マトリックスを”map to model”を用いた自動モデル構築に用いる。

PhenixPhenixプログラム “Map to model”を用いた自動モデル構築

プログラム “Map to model”を用いた自動モデル構築⑥Click Run⑥click Run② Input a mapfile② Input a mapfile

EM_koushuukai/EM_map/emd_9973.map
3.6
EM_koushuukai/SEQ/6KFH.fasta

EM_koushuukai/EM_map/emd_9973.map
3.6
EM_koushuukai/SEQ/6KFH.fasta③Input high resolution limit
determined by FSC④Input sequence file (FASTA format)① Select Map to Model④Input sequence file (FASTA format)① Select Map to Model⑤Click find symmetry⑤Input symmetry file

③Input high resolution limit
determined by FSC

Phenix

モデル構築の流れ

プログラム “Map to model”を用いた自動モデル構築

Map analysis(Phenix.mtriage)←単粒子解析の際に出てくるFSCの結果を使えば良いので特に必要はない。

Map improvement(Phenix.auto_sharpen)←側鎖の電子密度が確認できるようであれば不要（今回は、単粒子解析のマップをそのまま使用）

Novel structure

Known structure（相同性、サブユニットの違い等）

de novo modeling(Phenix.map_to_model)

Rigid body fitting（Chimera, gmfit等）

Manual model building(Coot)
計算就労後に”Open in Coot”をクリックすると、 “Coot” が起動してマップとモデルが表示される。

Refinement(Phenix.real_space_refine)

Coot・Paul Emsley氏によって開発されたモデル構築ソフトでX線結晶構造解析でのモデル構築では最もよく使われています。
・ダウンロードやインストールについては下記URLを参照して下さい。
・Linux版の他にWindows版、OSX版もあります。

Validation(Phenix.molprobity)

Coot
PHENIXで自動構築したモデルやマップの表示方法
１）Coot を起動します。（ターミナルで”coot”と打つ）とメインウィンドウが表示されます。
２）メインウィンドウの”File”→”Open Coordinates”→をクリックすると選択ウィンドウが開くので、目的のpdbファイル（EM_koushuukai/MapToModeal/map_to_model.pdb）を選択してOKOpen Coordinatesを選択

map_to_model.pdb

https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/

Deposition   Coot

Coot

PHENIXで自動構築したモデルやマップの表示方法
４）メインウィンドウの”Edit”→”Open Map”→をクリックすると選択ウィンドウが開くので、目的のmapファイル（EM_koushuukai/EM_MAP/emd_9973.map）を選択してOKをクリックします。

Mapの表示範囲を広げてみる３）メインウィンドウの”File”→”Map Parameters”→をクリックすると選択ウィンドウが開くので、目的のmapファイルを選択してOKをクリックします。
Map Parametersを選択

Open Mapを選択

マウスの真ん中にあるホイールを回転して、⻘⾊でMapが表⽰されるマップの表示レベルを調整する。

⻘⾊でMapが表⽰される

emd_9973.map
Map Radiusを100.0Åくらいにすると分子全体のマップを確認する事ができる。
ただし、重たくなるのでモデル構築の際は30-50Å程度にしておくのが良い。

Coot

Coot

PDBをCαで表示してみる

マウスの操作方法

３）メインウィンドウの”File”→”Map Parameters”→をクリックすると選択ウィンドウが開くので、目的のmapファイルを選択してOKをクリックします。
Display Managerを選択

１）左クリックを押しながらマウスを動かすと分子が回転する。
２）中クリックで原子を選択すると、その原子が画面の中心になる。
３）右クリックを押しながらマウスを動かすと分子が拡大、縮小される。

マウスの左クリックを押しながらマウスを上に動かし、分子を90度回転させてみる。

emd_9973.map

４）Ctrl + 左クリックでマウスを動かすと分子が並進移動する。
５）Ctrl + 右クリックでマウスを動かすと画面の奥行きが変わる。
６）ホイールを回転させると電子密度のレベルが変わる。

←Moleculesの表示方法を”Bonds(Color by Atom)”から”C-alphas/Backbone”に変更する。

７）原子をダブルクリックすると、残基番号、残基の種類が表示される。
例えば、Chain Aの残基番号１番のアラニンのCα原子だと→ CA/1 ALA/A二次構造（α-helix）が確認できる。

Coot

Coot

Cootによるモデル構築の流れ

アミノ酸残基の置換

１）INX-6のモデルを見て、今見ている電子密度がINX-6分子のどの部分に相当するのかを電子密度を元に考えて正しいアミノ酸残基に置換する。

１）まずは、電子密度の形状から、電子密度がINX-6分子のどの部分に相当するのかを判断する。
２）判断が難しい場合で、他の似た分子がPDBに登録されている場合は、それを重ね合わせて表示させてみる（Chimeraやgmfitでフィットさせたモデルを使用する）。

２）正しいアミノ酸残基番号に置換する。
＊低分解能で自動構築したモデルでは側鎖のアサインが難しく、アミノ酸残基番号も正しくない場合が多い。

Open Coordinates
を選択

３）ループなど、主鎖が途中で切れている場合は、アミノ酸残基を挿入して繋げていく。
４）α-helixやβ-シートと思われる電子密度にモデルがない場合は、Cootの自動で二次構造を配置する機能を利用する（Place Helix Here等）。
５）モデルを配置したら、Real Space Refineの機能を使って精密化する。
＊マップの分解能が低く、Refinementをすると二次構造が崩れてしまう場合は、Ramachandran Restraintsで制限を掛けながら行う方が良い。また、モデル構築の際は常にCootのRamachandran Plotを確認しながら作業を進める。

6kfh.pdb

EM_koushuukai/PDB/6kfh.pdb
を選択

Coot

Coot

アミノ酸残基の置換

アミノ酸残基の置換
1TYR/U = 105TYR/D

105TYR/D①Draw -> Go To Atom…

② map_to_model.pdbを選択
map_to_model.pdb③ map_to_model.pdbのU分子のN末端（1番）CAを選択

104TYR/D
106GLN/D

1TYR/U

2GLN/U
map_to_model.pdb

map_to_model.pdbのU分子のN末端を画面のセンターに表示

Real space refinementで1TYR/Uを選択して摘んで修正する。
以降27番目の残基までは配列も合っているのでreal
space refinementを使って修正していく。

←ここから選んでも良い

緑：6kfh.pdb
橙：map_to_model.pdb④Applyをクリック

側鎖が合いにくい場合はRotamersで側鎖の位置を合わせる（高分解能のMapではAuto fit rotamerが便モデル構築された分⼦は6kfh 利）。のD分⼦と重なっている。

Realspace refinmentで修正できない場合は削除してモデル構築し直す。

①Real Space Refine Zoneをクリック

Coot

Coot

Real Space Refinement

Chain IDの変更①Change Chain IDs をクリック②Chain IDを変更したいPDBファイルを選択
map_to_model.pdb②カーソルが十字になるのでRefineしたい領域 （ 10 残 基 程 度 ） を選択するとフィッティングされる。

③IDを変更したいChainを選択
1
27④IDを変更したい領域を指定⑤変更後のIDを記入⑥Apply New Chain ID
をクリック

上手く精密化されると全て緑表示になる。
↓Acceptをクリック

chain Uの1番から27番まではchain IDがAに変更される。

大抵はこれでフィッティングされるが、されない場合はアクティブになった残基（白色）をマウスで電子密度にドラッグすればフィッティングされる。
まずはchain Uの1番から27番までを修正してみる。

Coot①Renumber Residuesをクリック

Coot①Add residueをクリック

残基番号の変更②残基番号を変更したいPDBファイルとChain IDを選択
map_to_model.pdb③残基番号を変更したい領域を記入
104

127

アミノ酸残基の追加②カーソルが十字になるので末端の残基を選択するとアミノ酸（Ala）が足される。
アクティブな状態（白色）ではマウスを使ってモデルを移動できる。

④Offsetの数値を入力⑤Applyをクリック

1TYR/U = 105TYR/Dだったので、+104すれば正しい残基番号になる。
これで修正したモデルはchain IDがAで残基番号が105〜131となった。

ChainA Ala131よりC末側はモデルが構築されたいないので、アミノ酸残基を3残基足してReal Spacerefineしてみましょう。
配置後にReal Space refine
すると電子密度にフィットするまずはポリアラニンモデルを作って、その後アミノ酸残基を置換します。

Coot

Coot

アミノ酸残基の置換

アミノ酸残基の置換

Chain A 132-134: AAA → YAY
134TYR/A③残基を左クリック②置換したい残基を左クリックで選択するとsub windowが開く

Chain U 138 – 158： 主鎖は合っているが側鎖が合っていない。

Map_to_model.pdb: Chain U 138 – 158
6kfh.pdb: Chain D 29 - 49

133Ala/A①Simple mutate

132TYR/A
このようにかさ高いアミノ酸残基を目印にしてどの領域にどの残基が当てはまるのかを考えます。

Coot

Coot

アミノ酸残基の置換

Ramachandran Plotの確認

領域を指定してまとめて置換する機能もある①Ramachandran Plotをクリック②修正中のモデルを選択
map_to_model.pdb①Mutate Residue Rangeを選択

map_to_model.pdb②置換したいResidue numberを入力
158
138
RLNSRVTVVILAVSSALLLSS③指定した領域のアミノ酸配列を入力↑Autofit …
をチェックしておくと置換後に側鎖を電子密度に合わせてくれる（今回くらいの分解能では不向きかも）→置換後にReal space refinement④Mutateをクリック

Real Space Refinementの際にこの数値が悪くならないように注意する→
Preferred Region + Allowed Region = 100%になることが望ましい。

CootCootReal Space Refinement

モデル構築（その他の機能）

分解能が低くてreal space refinementの際に二次構造が崩れてしまう場合、
Edit-> Settings-> Set Refinement Options-> Use Ramachandran Restraints
をチェックしてOKしておく*mapの質が良い場合は使わない方が良い

Place helix here

Go to atomでChain ID: B
Residue number: 228に移動します。

この周辺は短いα-helixがありますがmap_to_modelでは上手く構築できていません。
もし、mapの分解能が低く、ここにhelixが置かれていない場合、
Calculate -> Other modeling tool -> Place helix here を使えば容易にα-helixを置くことができます。

Reverse-Helix-X

Helix-X

Helix-X①Other Modelling Tools
をクリック

Reverse-Helix-X②Place Helix Hereをクリック①Other Modelling Tools
をクリック②Place Helix Hereをクリック
逆向き逆向き逆向きのhelixも表示される場合があるが、不要な方はDisplay manager から削除しておく。正しい方はReal
画面の中心にある電子密度に合うように
space refinement ->アミノ酸残基を置換-> 再度Real
α-helixを置いてくれます
space refinement

逆向きのhelixも表示される場合があるが、不要な方はDisplay manager から削除しておく。正しい方はReal
space refinement ->アミノ酸残基を置換-> 再度Real
space refinement

Coot

不要な残基を削除する

モデルのマージ
重複していば領域やマップからはみ出した領域を削除
map_to_model.pdb②Merge したいPDBファイルを選択①Merge Moleculesを選択

一残基ずつ削除

領域を指定して座駆除

削除したい残基を左クリック

Delet Item

map_to_model.pdb③どのPDBファイルにMergeするか選択④Mergeをクリック

Coot

Coot

モデルの保存Place helix hereで加えたhelixモデルのchain ID等を修正③Saveするファイル名を書き換える

1．HelixのChain IDをAに変える
2. 残基番号を変える（6kfh.pdbを参考にする）
3. 2つのhelix間の空いているマップに残基を追加する。
4. Chain Uの重複する部分は削除する。

①Save Coordinates
を選択④Saveする場所を確認してSaveをクリック

map_to_model.pdb

加えたhelixが1本に繋がる②Save したいPDBを選択してSelect Filenameをクリック

これらの作業を繰り返して“chain A”を完成させる。

Phenix

Phenix対称操作でモノマーを8個発生させる。

Apply NCS operators

Apply NCS operators④Runをクリック”Project name_apply_ncs_job_number.pdb”というPDB が出来る
②モデル構築したPDBファイルをBrowseから選択↓Cootをクリック↑③
MapSymmetry/symmetry_from_map.ncs_specを使用① Apply NCS operatorsを選択

このモデルを使ってReal Space Refinement を行う。
Cootが開いてFerritinの全体構造が確認できる。

モデル構築の流れ
Map analysis(Phenix.mtriage)

Phenix←単粒子解析の際に出てくるFSCの結果を使えば良いので特に必要はない。

Real-space reﬁnement②Apply NCS operatorsで発生したPDBファイルとMapファイルを選択

Map improvement(Phenix.auto_sharpen)
Novel structure

de novo modeling(Phenix.map_to_model)

Known structure（相同性、サブユニットの違い等）③分解能を入力① Real-space refinementを選択

Rigid body fitting（Chimera, gmfit等）

Manual model building(Coot)
Refinement(Phenix.real_space_refine)

3.1←側鎖の電子密度が確認できるようであれば不要（今回は、単粒子解析のマップをそのまま使用）

Validation(Phenix.molprobity)④二次構造が崩れやすい場合はチェック（今回はしなくても良い）
Deposi@onPhenix

PhenixReal-space refinement

Real-space reﬁnement

計算終了後にValidationをクリックす
るとRamachandran plotなどの結果を見ることができる。

Export Table1をクリックすると以下の内容がテキストファイルに保存される。

これらの値が収束するまでモデル修正とreal space refinementを繰り返す

計算終了後にResultsをクリックするとOutput fileを見ることができる。
↓Cootをクリックすると精密化されたPDBを表示することができる。
↓
Cootを使ってモデル修正を行う。

＊この作業を繰り返して収束してきたらValidationを行う

PhenixPhenixReal-space refinement後のPDB を修正する。

Real-space refinement後のPDB を修正する。

Cootを起動してPDBとMAPを表示する。

Cootを起動してPDBとMAPを表示する。

↓CaBLAMのところをクリックすると修正すべき残基のリストが表示される。

↓CaBLAMのところをクリックすると修正すべき残基のリストが表示される。

Phenix

その他
Rotamer Outliresを修正するには便利な機能（Coot）

Real-space refinement後のPDB を修正する。

Coot←ClashCootを起動してPDBとMAPを表示する。
↓CaBLAMのところをクリックすると修正すべき残基のリストが表示される。

Pro86
Lys87

他、ClashやRamachandran等についても同様

Pro86とLys87が上⼿く繋がっていない

Regularize Zone と Real Space Refine Zoneを使って修正する。

その他

PhenixComprehensive validation (Cryo EM)

Runをクリック

精密化したpdbとmapファイルを追加

分解能を入力Validationを行うだけならこれも使えます。

PDBを選択修正すべき残基が赤、紫、オレンジ、黄色で表示される。
↓
修正したい残基をクリックするとcoot画面上にセンター表示される。
↓Real Space Refine Zone や Regularize Zoneで修正する。