令和２年９月２４日判決言渡

同日原本領収平成２８年（ワ）第２５４３６号
口頭弁論終結日

裁判所書記官

特許権侵害差止等請求事件

令和２年３月１９日
判当事者の表示5

決別紙１当事者目録記載のとおり

主１

文

被告は，別紙１７差止対象製品目録記載１及び２の各製品を譲渡し，輸入し，又はその譲渡の申出（譲渡のための展示を含む。）をしてはならない。

10２

被告は，前項記載の各製品を廃棄せよ。

３

被告は，原告に対し，９億９０００万円及びこれに対する平成２８年８月１０日から支払済みまで年５分の割合による金員を支払え。

15

４

原告のその余の請求をいずれも棄却する。

５

訴訟費用は，これを２０分し，その１を原告の負担とし，その余を被告の負担とする。

６

この判決は，第１項及び第３項に限り，仮に執行することができる。
事実及び理由

20

【目次】
第１

請求 ............................................................. 13

第２事案の概要 ....................................................... 13

１

事案の要旨 ....................................................... 13

25

２

(1)

原告の請求の概要 .............................................. 13(2)

被告の主張の概要 .............................................. 15

前提事実等 ....................................................... 15

1

5

10

(1)

当事者等 ...................................................... 15(2)

発酵法によるグルタミン酸ナトリウムの製造 ...................... 16(3)

本件各特許権 .................................................. 17(4)

本件特許１に係る発明の特許請求の範囲等 ........................ 17(5)

本件特許２に係る発明の特許請求の範囲等 ........................ 19(6)

本件各特許に係る明細書等 ...................................... 20(7)

被告各製品及び被告各製法 ...................................... 21(8)

先行文献 ...................................................... 21

３

争点 ............................................................. 23

第３

争点に対する当事者の主張 ......................................... 24

１

争点１（被告各製法の使用の有無，使用時期等）について............. 24【原告の主張】 ..................................................... 24

15

(1)

主位的な主張 ................................................ 24(2)

予備的な主張 ................................................ 24(3)

各時期の使用菌株についての補充主張 .......................... 25【被告の主張】 ..................................................... 26

20

２

(1)

原告の主位的主張について .................................... 26(2)

製造時期ごとの使用菌株について .............................. 26(3)

各時期の使用菌株についての補充主張 .......................... 27

争点２－１（被告製法１及び３は，文言上，本件発明１の技術的範囲に属す

るか）について ....................................................... 28【原告の主張】 ..................................................... 28【被告の主張】 ..................................................... 28
３
25

争点２－２（被告製法１ないし３は，文言上，本件発明２の技術的範囲に属するか）について ..................................................... 28【原告の主張】 ..................................................... 282

【被告の主張】 ..................................................... 29
４

争点２－３（被告製法４は，本件発明２と均等なものとして，その技術的範囲に属するか）について ............................................... 29【原告の主張】 ..................................................... 29
5

10

(1)

被告製法４と１９型変異使用構成との相違点 .................... 29(2)

第１要件について（非本質的部分） ............................ 31(3)

第２要件について（置換可能性） .............................. 34(4)

第３要件について（置換容易性） .............................. 34(5)

第４要件について（対象方法の容易推考性） .................... 36(6)

第５要件について（特段の事情） .............................. 36【被告の主張】 ..................................................... 37

15

５

(1)

被告製法４と１９型変異使用構成との相違点 .................... 37(2)

第１要件について（非本質的部分） ............................ 37(3)

第２要件について（置換可能性） .............................. 39(4)

第３要件について（置換容易性） .............................. 39(5)

第５要件について（特段の事情） .............................. 40

争点３－１（本件発明１についての乙６発明を主引例とする進歩性欠如の有無）について ......................................................... 41【被告の主張】 ..................................................... 41
20

25

(1)

乙６発明について ............................................ 41(2)

本件発明１－１の進歩性について .............................. 41(3)

本件発明１－２の進歩性について .............................. 46(4)

本件発明１－３の進歩性について .............................. 47(5)本件発明１－４の進歩性について .............................. 47【原告の主張】 ..................................................... 48(1)

乙６発明について ............................................ 48

3

６

(2)

本件発明１－１の進歩性について .............................. 48(3)

本件発明１－２，１－３，１－４の進歩性について .............. 50

争点３－２（本件発明１についての乙９発明を主引例とする進歩性欠如の有無）について ......................................................... 51【被告の主張】 ..................................................... 51

5

10

(1)

乙９発明について ............................................ 51(2)

本件発明１－１の進歩性について .............................. 51(3)

本件発明１－２の進歩性について .............................. 53(4)

本件発明１－３の進歩性について .............................. 54(5)

本件発明１－４の進歩性について .............................. 55【原告の主張】 ..................................................... 55

15

７

(1)

乙９発明について ............................................ 55(2)

本件発明１－１の進歩性について .............................. 56(3)

本件発明１－２，１－３，１－４の進歩性について .............. 57

争点３－３（本件発明１についての実施可能要件違反・サポート要件違反の有無）について ....................................................... 57【被告の主張】 ..................................................... 57

20

(1)

ＧＤＨ遺伝子のプロモーターへの変異導入について .............. 57(2)ＣＳ遺伝子のプロモーターへの変異導入について ................ 58(3)

ＩＣＤＨ遺伝子，ＰＤＨ遺伝子のプロモーターへの変異導入について................................................................. 59(4)

アルギニノコハク酸シンターゼ遺伝子のプロモーターへの変異導入について ........................................................... 60(5)25

コリネバクテリウム・グルタミカム野生株ＡＴＣＣ１３８６９のプロモーター配列について ............................................... 61(6)

プロモーターの－３５領域及び－１０領域の周辺領域について.... 614【原告の主張】 ..................................................... 62(1)

各種の遺伝子のプロモーターへの変異導入について .............. 62(2)

コリネバクテリウム・グルタミカム野生株ＡＴＣＣ１３８６９のプロモーター配列について ............................................... 62
(3)

5

８

プロモーターの－３５領域及び－１０領域の周辺領域について.... 63

争点４－１（本件発明２についての乙４２発明による新規性欠如の有無）について ............................................................... 63【被告の主張】 ..................................................... 63

10

(1)

乙４２発明について .......................................... 63(2)

原告の主張について .......................................... 63【原告の主張】 ..................................................... 64

15

９

(1)

対象外のアミノ酸の欠失について .............................. 64(2)グルタミン酸生産能の向上について ............................ 64(3)

翻訳開始点の誤認について .................................... 64

争点４－２（本件発明２についての乙２４発明を主引例とする進歩性欠如の有無）について ....................................................... 65【被告の主張】 ..................................................... 65

20

(1)

乙２４発明について .......................................... 65(2)

請求項１を引用する本件発明２－５の進歩性について ............ 65(3)

請求項４を引用する本件発明２－５の進歩性について ............ 67(4)

請求項６を引用する本件発明２－５の進歩性について ............ 68(5)

請求項１０を引用する本件発明２－５の進歩性について .......... 69(6)

本件発明２－５の効果について ................................ 70【原告の主張】 ..................................................... 7025(1)

乙２４発明について .......................................... 70(2)

請求項１を引用する本件発明２－５の進歩性について ............ 70

5

１０
5

(3)

請求項４又は６を引用する本件発明２－５の進歩性について...... 71(4)

請求項１０を引用する本件発明２－５の進歩性について .......... 71(5)

本件発明２－５の効果について ................................ 71

争点４－３（本件発明２についての実施可能要件違反・サポート要件違反の有無）について ..................................................... 71【被告の主張】 ..................................................... 72

10

15

(1)

培養条件について ............................................ 72(2)

請求項１の(i)，(i')の変異について ........................... 73(3)

請求項１の(i'')の変異について ............................... 74(4)

請求項１の(ii)の変異（膜貫通領域の変異）について ............ 75(5)

配列番号８５について ........................................ 76(6)

請求項４の変異について ...................................... 77(7)

請求項６の変異について ...................................... 78(8)

請求項１０の変異について .................................... 79(9)グルタミン酸の生成及び回収の方法（請求項１１）について...... 79【原告の主張】 ..................................................... 79

20

25

１１

(1)

培養条件について ............................................ 79(2)

請求項１の(i)，(i')の変異について ........................... 81(3)

請求項１の(i'')の変異について ............................... 81(4)

請求項１の(ii)の変異（膜貫通領域の変異）について ............ 82(5)

配列番号８５について ........................................ 82(6)

請求項４の変異について ...................................... 83(7)

請求項６の変異について ...................................... 83(8)

請求項１０の変異について .................................... 84(9)グルタミン酸の生成及び回収の方法（請求項１１）について...... 84

争点４－４（本件発明２についての明確性要件違反の有無）について

684

【被告の主張】 ..................................................... 84【原告の主張】 ..................................................... 85
１２

争点５（本件特許１の訂正の再抗弁の成否）について............... 85【原告の主張】 ..................................................... 85(1)

5

被告製法１及び３が本件訂正発明１の技術的範囲に属することについて ............................................................... 85(2)

本件訂正発明１についての乙６発明を主引例とする進歩性欠如について ............................................................... 85(3)

本件訂正発明１についての乙９発明を主引例とする進歩性欠如について ............................................................... 86

10

(4)

本件訂正発明１についての実施可能要件違反・サポート要件違反について ............................................................... 86【被告の主張】 ..................................................... 87(1)

被告製法１及び３が本件訂正発明１の技術的範囲に属することについて ............................................................... 87

15

(2)

本件訂正発明１についての乙６発明を主引例とする進歩性欠如について ............................................................... 87(3)

本件訂正発明１についての乙９発明を主引例とする進歩性欠如について ............................................................... 89(4)20

本件訂正発明１についての実施可能要件・サポート要件違反について................................................................. 90
１３

争点６（本件特許２の訂正（本件訂正２）の再抗弁の成否）について

92【原告の主張】 ..................................................... 92

25

(1)

本件訂正２が訂正の要件を満たすことについて .................. 92(2)被告各製法が本件訂正発明２の技術的範囲に属することについて.. 94(3)

本件訂正発明２についての乙４２発明による新規性欠如について.. 94

7

(4)

本件訂正発明２についての乙２４発明を主引例とする進歩性欠如について ............................................................. 95(5)

本件訂正発明２についての実施可能要件違反・サポート要件違反について ............................................................... 95(6)5

本件訂正発明２についての明確性要件違反について .............. 95【被告の主張】 ..................................................... 95

10

(1)

本件訂正２が訂正の要件を満たすことについて .................. 95(2)被告各製法が本件訂正発明２の技術的範囲に属することについて.. 96(3)

本件訂正発明２についての乙４２発明による新規性欠如について.. 96(4)

本件訂正発明２についての乙２４発明を主引例とする進歩性欠如について ............................................................. 97(5)

本件訂正発明２についての実施可能要件・サポート要件違反について................................................................. 97
(6)
15

１４

本件訂正発明２についての明確性要件違反について .............. 97

争点７（本件特許２の再訂正の再抗弁の成否（争点６の再抗弁の予備的な主張））について ..................................................... 98【原告の主張】 ..................................................... 98

20

(1)

本件特許２の再訂正が訂正の要件を満たすことについて .......... 98(2)

被告各製法が本件再訂正発明２の技術的範囲に属することについて 98(3)

本件特許２の再訂正によって無効理由が解消されることについて.. 99【被告の主張】 ..................................................... 99

25

１５

(1)

本件特許２の再訂正が訂正の要件を満たすことについて .......... 99(2)被告各製法が本件再訂正発明２の技術的範囲に属することについて 99(3)

本件特許２の再訂正によって無効理由が解消されることについて. 100

争点８（損害の発生の有無及び額）について ...................... 100【原告の主張】 .................................................... 100

8

5

(1)

被告が不法行為責任を負う実施の範囲 ......................... 100(2)

被告各製品の販売額及び販売数量について ..................... 102(3)

特許法１０２条２項ないし３項によって算定される損害額について103(4)

弁護士費用・弁理士費用について ............................. 103(5)

まとめ ..................................................... 103【被告の主張】 .................................................... 103

10

(1)

被告が不法行為責任を負う実施の範囲 ......................... 103(2)

被告各製品の販売額及び販売数量について ..................... 105(3)

特許法１０２条２項ないし３項によって算定される損害額について106(4)

弁護士費用・弁理士費用について ............................. 106

１６

争点９（差止請求及び廃棄請求の当否）について.................. 106【原告の主張】 .................................................... 106(1)被告各製法の使用時期についての主位的主張を前提とした場合... 106(2)

被告各製品の製造時期についての予備的主張を前提とした場合... 106【被告の主張】 .................................................... 107

15

第４

当裁判所の判断 .................................................. 107

１

争点１（被告各製法の使用の有無，使用時期等）について............ 107

20

２

(1)

平成２３年１月から平成２６年５月までの期間について ........... 107(2)

平成２７年８月から平成２８年６月の期間について ............... 108(3)

それ以外の期間について ....................................... 110(4)被告各製法の使用時期についての小括 ........................... 112

争点２－１（被告製法１及び３は，文言上，本件発明１の技術的範囲に属す

るか）について ...................................................... 112
３
25

争点２－２（被告製法１ないし３は，文言上，本件発明２の技術的範囲に属するか）について .................................................... 112(1)

被告製法１について ........................................... 112

9

(2)
４

被告製法２及び３について ..................................... 113

争点２－３（被告製法４は，本件発明２と均等なものとして，その技術的範囲に属するか）について .............................................. 114

5

10

15

５

(1)

均等侵害の判断基準について ................................... 114(2)

本件発明２の内容 ............................................. 115(3)１９型変異使用構成について ................................... 122(4)

被告製法４で使用される菌株について ........................... 125(5)

被告製法４と本件発明２との対比 ............................... 129(6)

第１要件について（非本質的部分） ............................. 131(7)

第２要件について（置換可能性） ............................... 136(8)

第３要件について（置換容易性） ............................... 136(9)第４要件について（対象方法の容易推考性） ..................... 143(10)

第５要件について（特段の事情） .............................. 143(11)

均等侵害の有無についての小括 ................................ 145

争点３－３（本件発明１についての実施可能要件・サポート要件違反の有無）について ............................................................ 145(1)

本件明細書１におけるアルギニンの製造方法に関する記載 ......... 145(2)

アルギニンの製造方法についての実施可能要件違反及びサポート要件違反について ........................................................ 151
(3)

20

６

25

本件発明１についての無効理由についての小括 ................... 153

争点５（本件特許１の訂正の再抗弁の成否）について................ 153(1)

本件訂正発明１の内容 ......................................... 153(2)

被告製法１及び３が本件訂正発明１の技術的範囲に属するかについて157(3)

乙６発明について ............................................. 157(4)乙９発明について ............................................. 162(5)

乙６文献，乙９文献以外の公知文献の記載事項について ........... 170

10

5

(6)

本件訂正発明１についての乙６発明を主引例とする進歩性欠如の有無178(7)

本件訂正発明１についての乙９発明を主引例とする進歩性欠如の有無188(8)

本件訂正発明１についての実施可能要件・サポート要件違反の有無. 192(9)

本件特許権１に関する無効の抗弁についての小括 ................. 201

７

争点６（本件特許２の訂正（本件訂正２）の再抗弁の成否）について . 202(1)

本件訂正２が訂正の要件を満たすかについて ..................... 202(2)被告各製法は，本件訂正発明２の技術的範囲に属するかについて... 205(3)

本件訂正発明２についての乙４２発明による新規性欠如の有無..... 206(4)

本件訂正発明２についての乙２４発明を主引例とする進歩性欠如の有無.................................................................. 208

10

(5)

本件訂正発明２についての実施可能要件・サポート要件違反の有無. 210(6)

本件訂正発明２についての明確性要件違反の有無 ................. 220(7)

本件特許権２に関する無効の抗弁についての小括 ................. 221

８
15

争点８（損害の発生の有無及び額）について ........................ 221(1)

被告各製法の使用時期と本件各特許権との対応関係の整理 ......... 221(2)

被告が不法行為責任を負う実施の範囲 ........................... 222(3)

被告ら販売分全体に対する特許法１０２条２項による損害額（別紙１１－１損害額の主張１）について ...................................... 231

20

(4)

弁護士費用・弁理士費用について ............................... 240(5)

損害賠償請求についてのまとめ ................................. 241

９25

争点９（差止請求及び廃棄請求の当否）について.................... 241(1)

本件特許権１に基づく請求について ............................. 241(2)

本件特許権２に基づく請求について ............................. 241

１０

結論 .......................................................... 242

別紙一覧 .............................................................. 244
別紙１

当事者目録 .................................................... 246

11

5

10

15

20

別紙２

被告製品目録 .................................................. 247

別紙３

被告製法目録 .................................................. 248

別紙４－１

特許請求の範囲（本件特許１） .............................. 249

別紙４－２

訂正後の特許請求の範囲（本件特許１）...................... 250

別紙４－３

構成要件の分説（本件発明１） .............................. 251

別紙４－４

構成要件の分説（本件訂正発明１） .......................... 253

別紙５－１

特許請求の範囲（本件特許２） .............................. 254

別紙５－２

訂正後の特許請求の範囲（本件特許２）...................... 257

別紙５－３

再訂正後の特許請求の範囲（本件特許２）.................... 260

別紙５－４

構成要件の分説（本件発明２） .............................. 262

別紙５－５

構成要件の分説（本件訂正発明２） .......................... 266

別紙５－６

構成要件の分説（本件再訂正発明２） ........................ 270

別紙６－１

被告製法１及び３と本件発明１との対比...................... 272

別紙６－２

被告製法１及び３と本件訂正発明１との対比.................. 276

別紙７－１

被告製法１ないし３と本件発明２との対比.................... 279

別紙７－２

被告製法１ないし３と本件訂正発明２との対比................ 283

別紙７－３

被告製法１ないし３と本件再訂正発明２との対比.............. 287

別紙８－１

被告製法４と本件発明２との対比 ............................ 289

別紙８－２

被告製法４と本件訂正発明２との対比 ........................ 292

別紙８－３

被告製法４と本件再訂正発明２との対比...................... 294

別紙９

本件ＭＳＧの製法についての主張対比表 .......................... 296

別紙１０

販売金額・数量一覧表 ........................................ 298

別紙１１－１

損害額の主張１（被告ら販売分全体に対する特許法１０２条２項による損害額） .......................................................... 299
25

別紙１１－２

損害額の主張２（被告ら販売分全体に対する特許法１０２条３項による損害額） .......................................................... 308

12

別紙１１－３

損害額の主張３（被告販売分につき特許法１０２条３項，ＣＪイン

ドネシア販売分につき同条２項による損害額） ............................ 311
別紙１１－４

損害額の主張４（被告販売分につき特許法１０２条３項，ＣＪイン

ドネシア販売分についての被告のコミッションについて同条２項による損害額）
510...................................................................... 315
別紙１２

本件明細書１の記載 .......................................... 318

別紙１３

本件明細書２の記載 .......................................... 337

別紙１４

引用文献の図面 .............................................. 389

別紙１５

被告ら販売分の特許法１０２条２項による損害額計算表 ......... 395

別紙１６

被告各製法使用期間中のグルタミン酸ナトリウムの輸入状況 ..... 396

別紙１７

差止対象製品目録 ............................................ 397

第１
１
15

請求
被告は，別紙２被告製品目録記載１ないし４のグルタミン酸ナトリウムを譲渡し，輸入し，又はその譲渡の申出（譲渡のための展示を含む。）をしてはならない。
２

被告は，その占有に係る別紙２被告製品目録記載１ないし４のグルタミン酸

ナトリウムを廃棄せよ。
３20

主文第３項同旨。

第２

事案の概要

１

事案の要旨

(1)

原告の請求の概要

本件は，発明の名称を「アミノ酸生産菌の構築方法及び構築されたアミノ酸生産菌を用いる醗酵法によるアミノ酸の製造法」とする特許第３６５１００２号の特許25権（以下「本件特許権１」といい，この特許を「本件特許１」という。）及び発明の名称を「Ｌ－グルタミン酸生産菌及びＬ－グルタミン酸の製造方法」とする特許

13

第５３４３３０３号の特許権（以下「本件特許権２」といい，この特許を「本件特許２」という。また，本件特許権１と本件特許権２を併せて「本件各特許権」，本件特許１と本件特許２を併せて「本件各特許」という。）の特許権者である原告が，別紙２被告製品目録記載１ないし４のグルタミン酸ナトリウム（以下，同目録の番5号に対応して「被告製品１」などといい，これらを併せて「被告各製品」という。）
をそれぞれ対応する別紙３被告製法目録記載の方法で生産する製法（以下，同目録の番号に対応して「被告製法１」などといい，これらを併せて「被告各製法」という。）は，本件特許１ないし２に係る発明の技術的範囲に属するものであり，被告が，自ら又は関連会社と共同して，被告各製法によって生産された被告各製品につ10いて，輸入，譲渡及び譲渡の申出をすることは，被告製品１及び３について本件特許権１の，被告製品１から４までについて本件特許権２の侵害に当たると主張して，以下の請求をする事案である。
ア

特許法１００条１項に基づく，被告各製品の譲渡，輸入及び譲渡の申出（譲渡のための展示を含む。）の差止請求（請求の趣旨第１項）。
15

イ

特許法１００条２項に基づく，被告が占有する被告各製品の廃棄請求(請求の趣旨第２項)。
ウ

特許権侵害の不法行為による損害賠償請求権に基づく，損害金９億９０００万円（特許法１０２条２項又は３項による損害金のうち，一部請求として９億円及び弁護士費用９０００万円の合計）及びこれに対する不法行為後の日である平成２20

８年８月１０日（訴状送達の日の翌日）から支払済みまでの民法（平成２９年法律第４４号による改正前のもの。以下同じ。）所定年５分の割合による遅延損害金の支払請求（請求の趣旨第３項）。
損害賠償請求の対象期間は，本件特許権１の侵害につき平成１９年１月１日から
平成２９年１２月３１日までの期間（以下「対象期間」という。）であり，本件特25

許権２の侵害については本件特許権２の登録日である平成２５年８月２３日から平成２９年１２月３１日までの期間（以下「本件特許権２についての対象期間」とい14

うことがある。）であり，これらの期間における各特許権侵害による損害賠償請求の各一部請求として，選択的に上記の額を請求している。
(2)

被告の主張の概要

被告は，対象期間の一部において被告製法１が使用されていたことは認めた上で，
5

被告各製法の使用の有無，使用時期等について原告の主張を争うほか，被告各製法が本件各特許に係る発明の技術的範囲に含まれるかについて，主に被告製品４について本件特許権２の均等侵害の有無を争い，また，本件特許１及び本件特許２には，いずれも訂正の前後を通じて無効事由があるとして，被告各製法による本件各特許権の侵害の事実はない旨主張する。

10

また，被告は，現在は被告各製品が製造されていないとして差止めの必要性を争うほか，対象期間中の行為に対する損害賠償請求に関して，自らが損害賠償責任を負うべき実施の有無，範囲につき，被告各製品はインドネシア共和国（以下「インドネシア」という。）で生産されたものであるところ，日本に輸出された被告各製
品には，それを製造したインドネシア法人が直接日本の顧客に販売した部分がある

15

として，当該部分については，販売行為が国外で行われているから日本国内での実施に当たらず，被告が損害賠償責任を負うべきものではない旨を主張した上で，原告の損害額の算定方法を争っている。
２

前提事実等（当事者間に争いがない事実又は後掲の証拠（以下，書証番号は特記しない限り枝番の記載を省略する。）及び弁論の全趣旨により容易に認められ
20

る事実等）
(1)

当事者等

ア

原告

原告は，調味料，甘味料，各種アミノ酸類等の各製品，その原材料，副産物及び関連商品の製造，加工，売買，輸出入及び研究開発等を業とする会社であり，「味25の素」と称するグルタミン酸ナトリウム（ＭＳＧ）製品を製造している（弁論の全
趣旨）。

15

イ

被告及び被告が属する企業グループ(ｱ)

被告は，グルタミン酸ナトリウム，核酸など調味香辛料加工販売業，飼料及び飼料添加物の加工，販売業並びに発酵化学，有機化学及び無機化学を応用した調
味料及び食品添加物の販売等を業とする日本法人である（弁論の全趣旨）。
5(ｲ)

被告は，韓国法人である「シージェー

チェイルジェダン

コーポレーション」（以下「ＣＪＣＪ」という。）を中心とする企業グループ（以下「ＣＪグループ」という。）に属しており，ＣＪグループにおいては所属企業が，世界各国で，ＣＪブランド等の製品の製造や販売を分担している。
被告は，持株会社である韓国法人の「ＣＪ
10

ＣＯＲＰ．」（以下「ＣＪカンパニー」という。）の１００％子会社であり，ＣＪカンパニーはＣＪＣＪの株式の４４％を保有している(乙１０８，弁論の全趣旨)。
(ｳ) 「ＰＴ

ＣＨＥＩＬ

ＪＥＤＡＮＧＩＮＤＯＮＥＳＩＡ」（以下「ＣＪインドネシア」という。）はＣＪグループに属するインドネシア法人であり，ＣＪＣ
Ｊの１００％子会社である（乙１０８，弁論の全趣旨。以下，被告とＣＪインドネ
15

シアを併せて「被告ら」ということがある。）。
(2)

発酵法によるグルタミン酸ナトリウムの製造

グルタミン酸を始めとするアミノ酸の製造方法の１つとして，微生物を培養する
培地に糖蜜などの原料を入れ，微生物の増殖とともにアミノ酸を生産させるアミノ酸発酵法（以下「発酵法」という。）がある。
20

発酵法に用いられるグルタミン酸生産菌としては，コリネ型細菌であるコリネバ
クテリウム属などが知られている。
発酵法によるグルタミン酸ナトリウムの一般的な製法としては，グルタミン酸生産菌を，糖蜜に代表される炭素源などの主原料が入った発酵槽（発酵タンク）に入れて増殖させ，菌体内の代謝反応により炭素源（糖分）をグルタミン酸へと変換さ25せることによりＬ－グルタミン酸（以下，特記しない限り，「Ｌ－グルタミン酸」
を単に「グルタミン酸」という。）を製造し，この発酵工程の終了後，発酵液から，

16

結晶を析出させ，分離操作によりグルタミン酸の結晶を回収し，回収されたグルタ
ミン酸は，苛性ソーダにより中和し，その後，活性炭により脱色して，グルタミン
酸ナトリウムの結晶を得る方法がある（甲８，９，乙２）。
本件各特許権は発酵法によるグルタミン酸の製造方法に関係するものである。
5(3)

本件各特許権

原告は，本件各特許権の特許権者であり，それらの出願日等は次のとおりである（甲１～４）。本件特許権１は，令和元年９月２２日，存続期間が満了した。
ア

10

15

本件特許権１

特許番号

第３６５１００２号

出願日

平成１６年７月８日

出願番号

特願２００４－２０２１２１

登録日

平成１７年３月４日

原出願日

平成１１年９月２２日

優先日

平成１０年９月２５日（以下「本件優先日１」という。）

優先権主張国

日本国

発明の名称

アミノ酸生産菌の構築方法及び構築されたアミノ酸生産菌を用いる醗酵法によるアミノ酸の製造法
イ

20

25

本件特許権２

特許番号

第５３４３３０３号

出願日

平成１７年１２月２８日

出願番号

特願２００５－３７９２５９

登録日

平成２５年８月２３日

優先日

平成１６年１２月２８日（以下「本件優先日２」という。）

優先権主張国

日本国

発明の名称

Ｌ－グルタミン酸生産菌及びＬ－グルタミン酸の製造方法(4)

本件特許１に係る発明の特許請求の範囲等

17

ア

訂正前の特許請求の範囲

本件特許１の特許請求の範囲請求項１ないし４は別紙４－１特許請求の範囲（本件特許１）のとおりである。
これらの請求項１ないし４に係る発明（以下，順に，「本件発明１－１」，「本5

件発明１－２」，「本件発明１－３」，「本件発明１－４」といい，これらを総称して「本件発明１」という。）を構成要件に分説すると，別紙４－３構成要件の分説（本件発明１）のとおりである（以下，分説に係る各構成要件については頭書の符号に対応させて「構成要件１－Ａ－１」などという。別紙４－４，５－４，５－
５，５－６における分説についても同じ。）。

10

イ

訂正請求

原告は，本件特許１につき，被告が申し立てた特許無効審判の手続（無効２０１
７－８０００２１号）において，平成２９年７月７日付けで訂正請求（以下「本件訂正１」という。）をした（甲９３，乙６９）。
本件訂正１に係る訂正後の特許請求の範囲請求項１，２及び４（請求項３は削除）
15

は別紙４－２訂正後の特許請求の範囲（本件特許１）のとおりである。
訂正後の請求項１，２及び４に係る発明（以下，順に，「本件訂正発明１－１」（請求項１），「本件訂正発明１－２」（請求項２），「本件訂正発明１－３」（請求項４））といい，これらを総称して「本件訂正発明１」という。）を構成要件に分説すると，別紙４－４構成要件の分説（本件訂正発明１）のとおりである。

20

本件訂正１は，いずれも，特許請求の範囲の減縮ないし明瞭でない記載の釈明（特許法１３４条の２第１項ただし書１号，３号）を目的として，願書に添付した明細書，特許請求の範囲又は図面に記載した事項の範囲内においてするものであり，実質上特許請求の範囲を拡張し，又は変更するものではないから，訂正の要件（特許法１３４条の２第９項，１２６条５項，６項）を満たすものである（甲５０の１，

25

９３，弁論の全趣旨）。
ウ

審決等

18

前記イの特許無効審判請求について，平成３１年１月８日付けで本件訂正１を認め，訂正によって削除された部分以外についての無効審判の請求は成り立たない旨の審決（甲９３）がなされた。これに対して，被告は審決取消訴訟を提起しており，
本件口頭弁論終結時において，上記審決は確定していない（弁論の全趣旨）。
5(5)

本件特許２に係る発明の特許請求の範囲等

ア

訂正前の特許請求の範囲

本件特許２の特許請求の範囲請求項１，４，６，１０及び１１は別紙５－１特許請求の範囲（本件特許２）のとおりである。
これらの請求項１，４，６，１０及び１１に係る発明（以下，順に，「本件発明10２－１」（請求項１），「本件発明２－２」（請求項４），「本件発明２－３」（請求項６），「本件発明２－４」（請求項１０），「本件発明２－５」（請求項１１）といい，これらを総称して「本件発明２」という。）を構成要件に分説すると，別紙５－４構成要件の分説（本件発明２）のとおりである。
イ

15

訂正請求

原告は，本件特許２につき，被告が申し立てた特許無効審判の手続（無効２０１
７－８０００２２号）において，平成２９年７月７日付けで訂正請求（以下「本件訂正２」という。）をした（甲９４，乙７０）。
本件訂正２に係る訂正後の特許請求の範囲請求項１，４，６，１０及び１１は別紙５－２訂正後の特許請求の範囲（本件特許２）のとおりである。

20

訂正後の請求項１，４，６，１０及び１１に係る発明（以下，順に，「本件訂正発明２－１」（請求項１），「本件訂正発明２－２」（請求項４），「本件訂正発明２－３」（請求項６），「本件訂正発明２－４」（請求項１０），「本件訂正発明２－５」（請求項１１）といい，これらを総称して「本件訂正発明２」という。）
を構成要件に分説すると，別紙５－５構成要件の分説（本件訂正発明２）のとおり

25

である。
ウ

審決等

19

前記イの特許無効審判請求について，平成３１年１月８日付けで本件訂正２を認め，訂正によって削除された部分以外についての無効審判の請求は成り立たない旨の審決（甲９４）がなされた。これに対して，被告は審決取消訴訟を提起しており，
本件口頭弁論終結時において，上記審決は確定していない（弁論の全趣旨）。
5

エ

更なる訂正の予定

原告は，本件特許２につき，本件訂正２に基づく主張の予備的主張として，手続上可能となった時点で，本件訂正２とは異なる更なる訂正（以下「本件特許２の再訂正」ということがある。）を予定していると主張するが，本件口頭弁論終結時において，この訂正請求はなされていない（弁論の全趣旨）。
10

本件特許２の再訂正に係る訂正後の特許請求の範囲請求項４，１３及び１４は別
紙５－３再訂正後の特許請求の範囲（本件特許２）のとおりである（甲５３）。
本件特許２の再訂正後の請求項４，１３及び１４に係る発明（以下，順に，「本件再訂正発明２－２」（請求項４），「本件再訂正発明２－３」（請求項１３），「本件再訂正発明２－６」（請求項１４）といい，これらを総称して「本件再訂正

15

発明２」という。）を構成要件に分説すると，別紙５－６構成要件の分説（本件再訂正発明２）のとおりである。
(6)

本件各特許に係る明細書等

本件特許１に係る明細書及び図面（甲３）を「本件明細書１」といい，本件特許２に係る明細書及び図面（甲４）を「本件明細書２」という。
20

また，特記しない限り，本件各特許に係る発明の内容に関して，明細書の発明の詳細な説明に記載された実施例，段落番号（【０００１】などと記載する）及び図面ないし表の番号（【表１】，【図１】などと記載する。）を記載するときは，それぞれ，本件特許１に係る発明については本件明細書１の対応箇所を，本件特許２に係る発明については本件明細書２の対応箇所を指すものとする。なお，本件明細25

書２の【００３３】は本件訂正２により訂正されているので，当該箇所を引用する
場合は訂正の前後を明記する。

20

(7)

被告各製品及び被告各製法

ア

被告によるグルタミン酸ナトリウム製品の輸入販売

被告は，平成１９年以降，少なくとも平成２９年末まで，製品名「ＭＩ－ＰＯＯ
ＮＧ」のグルタミン酸ナトリウム（以下「本件ＭＳＧ」という。）を，インドネシ
5アから日本国内に輸入し，譲渡の申出及び譲渡を行っている。
本件ＭＳＧは，ＣＪインドネシアにより，インドネシア国内の工場で，発酵法によって製造されたものである（乙２，弁論の全趣旨）。
被告は，対象期間中にインドネシアから日本に輸出され，日本において流通している本件ＭＳＧの中には，被告が輸入して販売したもの（以下「被告販売分」とい10う。）のほか，ＣＪインドネシアが直接日本の顧客に販売したもの（以下「ＣＪインドネシア販売分」といい，被告販売分と併せて「被告ら販売分」という。）があると主張しており，後記のとおり，ＣＪインドネシア販売分について，被告が本件各特許権侵害の不法行為責任を負うかは当事者間に争いがある。
イ15

原告が請求の対象とする製品の範囲等

本件ＭＳＧのうち，原告が，本件請求の対象として特定した製品は，別紙３被告
製法目録記載の被告各製法によって製造された別紙２被告製品目録記載の被告各製品である。
原告は，被告各製法と本件各特許に係る発明との関係について，それぞれ訂正の前後を通じて，被告製法１は本件特許１及び２に係る発明の技術的範囲に属し，被20

告製法２は本件特許２に係る発明の技術的範囲に属し，被告製法３は本件特許１及び本件特許２に係る発明の技術的範囲に属し，被告製法４は，本件特許２に係る発明と均等なものとして，その技術的範囲に属すると主張する。

25

(8)

先行文献

ア

本件特許１関係

本件優先日１である平成１０年９月２５日より前に，次の文献等が存在してい
た。

21

(ｱ)

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９９６）１４２，ｐ．１２９７－１３０９（乙６，以下「乙６文献」といい，乙６文献に記載された発明を「乙６発明」という。同様に，以下の各文献についても，特記しない限り，それぞれ対応する乙号証の番号で「乙６文献」などといい，各文献に記載された発明を表記する場合は「乙5６発明」などと表記する。）(ｲ)

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）１４０，ｐ．１８１７－１８２８（乙８，甲２５）

10(ｳ)

国際公開第９５／３４６７２号（乙９）

(ｴ)

ＥＭＢＯ

(ｵ)

Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８５）２６０（６），ｐ．３５３９－３

Ｊ．（１９８２）１（７），ｐ．８７５－８８１（乙１０）５４１（乙１１）15(ｶ)

特開平３－１４７７９２号公報（乙１２）(ｷ)

特開昭６３－２１４１８９号公報（乙３５）イ

本件特許２関係

本件優先日２である平成１６年１２月２８日より前に，次の文献等が存在していた。
(ｱ)Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９７）２４７，ｐ．５７２－５８０

(乙２４)
(ｲ)
20

ＦＥＭＳ

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．（２００３），２１８，ｐ．

３０５－３０９（乙２６）(ｳ)Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００２）２９８（２２），ｐ．１５８２－１５８７

（乙２９）

25

(ｴ)

ＥＭＢＯ

Ｊ．（２００３）２２（１），ｐ．３６－４６（乙３０）(ｵ)ＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＪ．（２００４．Ｎｏｖ．）８７，ｐ．３０５

０－３０６５（乙３１）

22

(ｶ)

国際公開第２００３／０４６１２３号（乙４１の１），米国特許出願公開

第２００５／０００３４９４号明細書（乙４１の２。乙４１の１の国際出願に対応する米国特許出願公開公報であり，乙４１の１と併せて「乙４１文献」という。）

5(ｷ)

欧州特許出願公開第１１０８７９０号明細書（乙４２）

３

争点

(1)

被告各製法の使用の有無，使用時期等（争点１）(2)

被告各製法が本件各特許に係る発明の技術的範囲に属するか（争点２）

ア

被告製法１及び３は，文言上，本件発明１の技術的範囲に属するか（争点２

－１）
10

イ

被告製法１ないし３は，文言上，本件発明２の技術的範囲に属するか（争点

２－２）ウ

被告製法４は，本件発明２と均等なものとして，その技術的範囲に属するか（争点２－３）15(3)

本件特許１は特許無効審判により無効にされるべきものか（争点３）ア

本件発明１についての乙６発明を主引例とする進歩性欠如の有無（争点３－１）イ

本件発明１についての乙９発明を主引例とする進歩性欠如の有無（争点３－

２）
ウ
20

本件発明１についての実施可能要件違反・サポート要件違反の有無（争点３

－３）
(4)

本件特許２は特許無効審判により無効にされるべきものか（争点４）ア

本件発明２についての乙４２発明による新規性欠如の有無（争点４－１）

イ

本件発明２についての乙２４発明を主引例とする進歩性欠如の有無（争点４

－２）
25

ウ

本件発明２についての実施可能要件違反・サポート要件違反の有無（争点４

－３）

23

5

エ

本件発明２についての明確性要件違反の有無（争点４－４）(5)

本件特許１の訂正の再抗弁の成否（争点５）(6)

本件特許２の訂正（本件訂正２）の再抗弁の成否（争点６）(7)

本件特許２の再訂正の再抗弁の成否（争点６の再抗弁の予備的な主張）（争

点７）
(8)

損害の発生の有無及び額（争点８）(9)

差止請求及び廃棄請求の当否（争点９）

第３
１
10

争点に対する当事者の主張
争点１（被告各製法の使用の有無，使用時期等）について

以下のとおり，原告は，主位的な主張としては，平成１９年から現在まで，本件
ＭＳＧは，被告製法１で製造されていると主張する。これに対して，被告は，平成２３年１月頃から平成２６年５月頃までに生産された本件ＭＳＧが被告製法１により製造されたものであったことは認めるが，それ以外の時期においては被告製法１は使用されていないと主張している。原告は，上記の被告の主張を受けて，予備的15に，本件ＭＳＧは，被告製法１以外にも被告製法２ないし４によって製造されていると主張している。
【原告の主張】(1)

主位的な主張平成１９年以降の被告ら販売分に係る本件ＭＳＧは，全期間を通じて，いずれも
20

被告製法１によって製造された被告製品１であった。
(2)

予備的な主張被告は，平成１９年以降に本件ＭＳＧの製造に用いられていた菌株について，後記【被告の主張】(2)のとおりであったと主張するところ，被告の主張を前提とすれ
ば，その主張する菌株（以下，別紙９本件ＭＳＧの製法についての主張対比表に記25載された被告が主張する菌株については，同別紙の番号欄の番号を使用して「③の菌株」などということがある。また，被告が資料がないとする①と記載された平成

24

１９年から平成２２年までの期間について「①の菌株不明期間」ということもある。）
が使用されていた期間については，それぞれ対応する別紙９の「原告の予備的主張」欄に記載の各製法が使用されていたものである。

5(3)

各時期の使用菌株についての補充主張

ア

平成１９年から平成２２年まで（①の菌株不明期間）

被告は，調査しても資料が発見されなかったと主張するが，ＣＪグループのような規模の企業で，わずか６年ほど前に使用した菌株の記録を全く保有していないことは，製造する製品の性質及びその品質管理の観点からは考えられない。
被告製法１を使用していたことを認める平成２３年以降（②の菌株）と異なる菌10を使用していたことを立証できない以上，当然に同じ菌を使用していたと推認されるべきであるから，①の菌株不明期間も被告製法１を使用していたというべきである。
イ

平成２６年４月以降について被告が行った解析結果（乙７４）は，黒塗り部分が多く，被告の主張の裏付けと15はならない。
ウ

ＰＲＯＭＡＴＥ２０１５について

本件ＭＳＧを製造する際の使用済みの菌体は回収され，「ＣＪ

ＰＲＯＭＡＴＥ」との名称の家畜用飼料（以下「ＰＲＯＭＡＴＥ」という。）として販売されている。
原告が，平成２７年（２０１５年）１２月３０日製造のＰＲＯＭＡＴＥ（以下「Ｐ20ＲＯＭＡＴＥ２０１５」という。）を入手して分析したところ，被告製法１で使用される菌株の特徴（②の菌株の特徴）を有することが確認できた（甲４９）。
原告が行ったＰＲＯＭＡＴＥ２０１５の解析結果においては，グルタミン酸デヒ
ドロゲナーゼ遺伝子（以下「ＧＤＨ遺伝子」という。）の②の菌株と同じ変異型の成分が，野生型と比較して多量に含まれており，被告が主張するようなＳｅｅｄと25

しての利用等による過去の菌株の混入では説明がつかない。
ＰＲＯＭＡＴＥ２０１５と同時期に製造されたＰＲＯＭＡＴＥについて被告が行25

ったとする実験（乙７５）は，実験条件，解析が適切でなく，信用できない。
エ平成２８年７月以降について

被告は，平成２８年７月以降，使用する菌株のｙｇｇＢ遺伝子の配列が変更され，
平成２９年１２月にも更にｙｇｇＢ遺伝子の配列が変更された旨主張する。
5

しかしながら，変異型ｙｇｇＢ遺伝子を使用して製造された本件ＭＳＧについて
は，食品衛生法上，組換えＤＮＡ技術を応用した食品又は添加物について求められる安全性審査を経てその旨が公表がなされるべきものと考えられるところ，平成２
８年７月以降に被告が本件ＭＳＧについての安全性審査の申請を行ったことは認められない。したがって，本件ＭＳＧの製造には，平成２８年７月以降も，それ以前

10と同様の変異型ｙｇｇＢ遺伝子を有する菌株が使用されていたはずであり，菌株が変更されたとの被告の主張は信用できない。
【被告の主張】(1)

原告の主位的主張について

平成２３年１月から平成２６年５月頃までの期間について，本件ＭＳＧが被告製
15

法１によって製造されていたことは認める。ただし，平成２６年４月及び５月頃に生産された本件ＭＳＧの一部は，被告製法１とは異なる菌株（③，④の菌株）によって製造されていた。
それ以外の期間において，被告製法１が使用されていたとの事実は否認する。
(2)

20

製造時期ごとの使用菌株について

本件ＭＳＧの製造には，単一の菌株が使用されていた訳ではなく，複数の種類のコリネバクテリウム・グルタミカムの菌株が使用され，菌株によっては，２つの期間にまたがって使用されたものもある。
各期間において，使用されていた菌株の遺伝子の塩基配列等は，別紙９本件ＭＳ
Ｇの製法についての主張対比表の「被告の主張」欄のとおりであり，ＧＤＨ遺伝子

25のプロモーターの－３５領域及び－１０領域の配列は「ＧＤＨ」の「－３５」「－１０」の各欄，クエン酸合成酵素遺伝子（ｇｌｔＡ遺伝子ともいう。以下「ＣＳ遺26

伝子」という。）のプロモーターの－１０領域の配列は「ＣＳ」の「－１０」の各欄のとおりであった。
また，別紙９の「ｙｇｇＢ」欄に「Ａ１００Ｔ」とある菌株（②～⑪）は，ｙｇ
ｇＢ遺伝子に，それによってコードされるアミノ酸配列の１００位のアラニンがス
5レオニンに置換されている変異（以下，アミノ酸配列の１００番目のアラニン（Ａ）をスレオニン（Ｔ）に置換する変異を単に「Ａ１００Ｔ変異」ということがある。）があるものであった。
また，別紙９の「ｙｇｇＢ」欄に「＊＊」とある菌株（⑫，⑬）は，ｙｇｇＢ遺伝子に，コリネバクテリウム・グルタミカムのｙｇｇＢ遺伝子がコードするアミノ10酸配列のうち２６１個のアミノ酸が欠失し，コリネバクテリウム・カルナエ由来のｙｇｇＢ遺伝子がコードするアミノ酸のうち，９８位のアラニンがスレオニンに，
２４１位のバリン（Ｖ）がイソロイシン（Ｉ）に置換されているという変異があるものである（以下，アミノ酸配列の９８番目のアラニン（Ａ）をスレオニン（Ｔ）に置換する変異を単に「Ａ９８Ｔ変異」，アミノ酸配列の２４１番目のバリン（Ｖ）

15をイソロイシン（Ｉ）に置換する変異を単に「Ｖ２４１Ｉ変異」ということがある。）。
平成２９年１２月以降に使用されている⑭の菌株においては，ｙｇｇＢ遺伝子に，そのアミノ酸配列の１００位のアミノ酸に変異は加わっておらず，別菌種由来のｙｇｇＢ遺伝子も含まれていない。

20

(3)

各時期の使用菌株についての補充主張

ア

平成１９年から平成２２年まで（①の菌株不明期間）

本件ＭＳＧの製造に用いた菌株の遺伝子配列については，被告及びＣＪＣＪ，Ｃ
Ｊインドネシアにおいて調査したものの，文書の保存期間が５年であり，資料が発見できなかったことから不知。
イ25

平成２６年４月頃から平成２９年１２月頃まで③，④及び⑧から⑬までの菌株についての被告の主張は，被告が行った解析結果（乙４，７４）により裏付けられている。

27

ウ

ＰＲＯＭＡＴＥ２０１５の分析結果について

原告は，⑩の菌株について，ＰＲＯＭＡＴＥ２０１５を分析した結果，②の菌株と同じ遺伝子配列を有すると主張するが，原告が行った実験（甲４９）を被告が検証しても（乙７５），その結果は再現できなかった。
5

ＰＲＯＭＡＴＥには，製造の際に，過去に製造したＰＲＯＭＡＴＥを粉砕した粉体がＳｅｅｄとして投入されており（混入割合は変動するが，代表的には３０％である。），また，製造設備内に残留物があることも原因となって，過去の菌株由来の成分が直近に使用された菌株由来の固形成分と混在している。したがって，ＰＲＯＭＡＴＥ２０１５を分析してもその製造日頃の菌株を正確に特定できるものでは

10

ない。
２

争点２－１（被告製法１及び３は，文言上，本件発明１の技術的範囲に属す

るか）について【原告の主張】被告製法１及び３と本件発明１とを対比すると，別紙６－１被告製法１及び３と15

本件発明１との対比のとおりとなり，被告製法１は，文言上，本件発明１－１から
１－４までの技術的範囲に属し，被告製法３は，文言上，本件発明１－１及び１－４の技術的範囲に属する。
【被告の主張】原告の主張は争う。

20

３

争点２－２（被告製法１ないし３は，文言上，本件発明２の技術的範囲に属するか）について【原告の主張】被告製法１ないし３と本件発明２とを対比すると，別紙７－１被告製法１ないし３と本件発明２の対比のとおりとなり，被告製法１ないし３で用いられる細菌は，
25

いずれも，文言上，本件発明２－１，２－２，２－３及び２－４の技術的範囲に属するものであり，それを使用する被告製法１ないし３は，本件発明２－５の技術的28

範囲に属する。
【被告の主張】原告の主張は争う。
４
5

争点２－３（被告製法４は，本件発明２と均等なものとして，その技術的範囲に属するか）について【原告の主張】被告製法４は，被告が平成２８年７月頃から平成２９年１２月頃まで使用していたと主張する⑫及び⑬の菌株を使用する製法である。
そして，当該菌株を用いてグルタミン酸を製造する行為は，本件特許２の請求項

10

１又は４を引用する請求項６（本件発明２－３）のうち（ｅ）の変異型ｙｇｇＢ遺伝子（以下，当該ｙｇｇＢ遺伝子の変異を本件明細書２の段落【０１１９】の定義を使用して「１９型変異」という。）が導入されたコリネ型細菌を用いた，本件発明２－５の製造方法の構成（以下「１９型変異使用構成」という。）と均等なものとして，本件発明２－５の技術的範囲に属する。

15

(1)

被告製法４と１９型変異使用構成との相違点

ア

被告製法４と本件発明２との対比

被告製法４と本件発明２との対比は，別紙８－１被告製法４と本件発明２との対比のとおりである。
被告製法４で使用される菌株は，文言上，本件発明２－１の構成要件２－Ａ，２
20－Ｂを充足するが２－Ｃを充足せず，本件発明２－２及び２－３の構成要件をいずれも充足しない。また，被告製法４は，文言上，本件発明２－５の構成要件２－Ｈについて，請求項１から１０を引用する部分を除いて充足し，構成要件２－Ｉ及び２－Ｊを充足する。
イ

25

被告製法４と１９型変異使用構成との相違点

被告製法４と１９型変異使用構成との相違点は，構成要件２－Ｃ，２－Ｄ，２－
Ｅ，２－Ｆ－１，２－Ｆ－２，２－Ｆ－３，２－Ｈに係る部分であり，具体的には，

29

使用されている菌株に係る，後記(ｳ)の相違点である。
(ｱ)

１９型変異使用構成で用いられる菌株

１９型変異使用構成で用いられる菌株に導入される変異型ｙｇｇＢ遺伝子がコードするアミノ酸配列は，本件明細書２の配列番号２２（以下，特記しない限り，本5件各特許に関して「配列番号」というときは，本件特許１については本件明細書１に添付された配列表の配列番号を，本件特許２については本件明細書２に添付された配列表の配列番号を指す。）として示されるものである。この変異後の配列番号
２２は，配列番号６のコリネバクテリウム・グルタミカム由来の５３３個のアミノ酸からなるｙｇｇＢ遺伝子のアミノ酸配列に，アミノ酸番号１００番目のアラニン

10をスレオニンに置換する変異（Ａ１００Ｔ変異）が導入されたアミノ酸配列である。
(ｲ)

被告製法４で使用される菌株

被告製法４で用いられるコリネ型細菌は⑫・⑬の菌株であり，コリネバクテリウ
ム・カルナエ由来のＹｇｇＢのアミノ酸配列において９８番目のアラニンがスレオ
ニン（Ａ９８Ｔ変異）に，２４１番目のバリンがイソロイシンに置換されている変15

異（Ｖ２４１Ｉ変異）を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡが導入されているものである。
(ｳ)

相違点

１９型変異使用構成で用いられるコリネ型細菌と比較した，被告製法４で用いられるコリネ型細菌の相違点は，以下の相違点１ないし３である。
20

相違点１

コリネバクテリウム・カルナエ由来のｙｇｇＢ遺伝子に変異が導入された遺伝子が導入されていること。
相違点２

導入された変異が，コリネバクテリウム・カルナエ由来のｙｇｇＢ遺伝子のアミノ酸配列の９８番目のアラニンをスレオニンに置換する（Ａ９８Ｔ変異）ものであること（アミノ酸番号の違い）。
25

相違点３

さらに，相違点２のアミノ酸配列の２４１番目のバリンをイソロイシンに置換する変異（Ｖ２４１Ｉ変異）も導入されていること。

30なお，相違点１に起因するアミノ酸配列の相違点としては，相違点１’として，
コリネバクテリウム・カルナエ由来の５３７個のアミノ酸により構成されるアミノ酸配列のうち，本件明細書２の配列番号２２のアミノ酸の１から２８６番目までのアミノ酸との比較では４６個のアミノ酸が異なっており（同一性８４％），アミノ5酸の全配列での比較では１９４個のアミノ酸が異なっている（同一性６４％）こと
がある。
(2)

第１要件について（非本質的部分）

ア

１９型変異使用構成に係る発明の本質的部分について

本件発明２の発明者らは，コリネ型細菌の保有するＹｇｇＢタンパク質（ｙｇｇ10Ｂ遺伝子がコードするアミノ酸配列によって作られるタンパク質であり，以下，単に「ＹｇｇＢ」ということがある。）。が，同細菌の細胞膜に存在し，グルタミン
酸排出において重要な役割を果たしていることを明らかにし，その上，ｙｇｇＢ遺伝子の特定の変異によりＹｇｇＢによるグルタミン酸排出機能が高まり，結果として，そのような変異型ｙｇｇＢ遺伝子を有するコリネ型細菌がグルタミン酸の高い15生産能力を有することを見出した。
本件発明２は，そのようにして，コリネ型細菌を用いたグルタミン酸の製造において，グルタミン酸生産能力を向上させる新規な技術として，変異型ｙｇｇＢ遺伝子を用いてコリネ型細菌を改変することにより，グルタミン酸の生産能を大幅に向上させたものであり，本件発明２は，産業上極めて重要かつ画期的な発明である。

20

したがって，本件発明２の特許請求の範囲に含まれる１９型変異使用構成に係る発明の本質的部分は，「コリネ型細菌由来のｙｇｇＢ遺伝子に，コリネバクテリウ
ム・グルタミカム由来のＹｇｇＢのＡ１００Ｔ変異（１００番目のアラニン（Ａ）
をスレオニン（Ｔ）に変換する変異）に相当する変異を導入し，当該変異遺伝子を用いてコリネ型細菌を改変し，グルタミン酸生産能を向上させる点」にある。

25

なお，被告は，１９型変異使用構成の効果がわずかであったと主張するが，本件明細書２に記載された実施例８の結果は当業者により認識できるレベルの生産能の31

向上を示すものである（実施例８の評価については，後記１０【原告の主張】(1)イのとおり。）。
イ

相違点１について１９型変異使用構成において，コリネ型細菌に導入される変異型ｙｇｇＢ遺伝子
5がグルタミン酸生産能を有するいずれのコリネ型細菌由来のものであるか（相違点１）は，１９型変異使用構成の本質的部分ではない。
ウ

相違点１’について

コリネバクテリウム・グルタミカム由来のＹｇｇＢ（配列番号２２）とコリネバ
クテリウム・カルナエ由来のＹｇｇＢのアミノ酸配列を比較すると，１から２８６
10

番目までのアミノ酸との比較では同一性８４％，全アミノ酸配列同士の比較では同一性６４％となる。
そして，アミノ酸同士の類似関係及び同一の関係にあるアミノ酸を考慮して，ア
ミノ酸配列間の相同性を比率として算出すると，両ＹｇｇＢの相同性は全アミノ酸配列同士で比較した場合には相同性は９１％となり，コリネバクテリウム・グルタ

15

ミカムのＹｇｇＢの機能に重要であることが知られている１から２８６番目までのアミノ酸（コリネバクテリウム・カルナエでは１～２８４番目まで）での比較では，相同性は９８％（２８６個のアミノ酸中２７９個のアミノ酸が同一又は類似の関係にある）にも達している。
一般的に，アミノ酸同士の類似の関係までも考慮し，相同性が８０～９０％以上

20であれば，それらのタンパク質の有する機能は同一又は極めて類似したものであると考えられている。
したがって，相違点１’にかかるコリネバクテリウム・グルタミカム由来とコリ
ネバクテリウム・カルナエ由来によるｙｇｇＢ遺伝子間の違いは，１９型変異使用
構成の本質的部分ではない。

25

エ相違点２についてコリネバクテリウム・グルタミカム由来のｙｇｇＢ遺伝子とコリネバクテリウム．

32

カルナエ由来のｙｇｇＢ遺伝子がコードする各ＹｇｇＢのアミノ酸配列を一般的なアミノ酸配列の比較方法により比較をすると，コリネバクテリウム・グルタミカムの１００番目のアラニンが，コリネバクテリウム・カルナエの９８番目のアラニンに対応していることがわかる。したがって，コリネバクテリウム・カルナエ由来の
5

ＹｇｇＢの９８番目のアラニンをスレオニンに変換する変異（Ａ９８Ｔ変異）は，
コリネバクテリウム・グルタミカムのＡ１００Ｔ変異に相当するものであることが理解される。
したがって，相違点２は１９型変異使用構成の本質的部分ではない。
オ10

相違点３についてコリネバクテリウム・グルタミカム由来の２４３番目のバリン（Ｖ）については，
ＹｇｇＢの機能に直接影響を与えていないことが示唆されており，このバリンには
コリネバクテリウム・カルナエ由来のＹｇｇＢでは２４１番目のバリンが対応している。バリン（Ｖ）とイソロイシン（Ｉ）はアミノ酸として極めて類似の性質を有しているため，アミノ酸を変換した場合の影響の比較結果においても一般的に，バ15

リンとイソロイシンの変換は，他のアミノ酸の変換の場合と比較し最も安定的な変換であることが示されている。バリンからイソロイシンへの保存的置換は本件明細書２の段落【００７８】にも記載されている。
コリネバクテリウム・カルナエ由来のＹｇｇＢの２４１番目のバリンをイソロイシンに置換する変異（Ｖ２４１Ｉ変異）は，当該ＹｇｇＢの機能には影響を与えな20いことが容易に理解され，実際に原告の試験結果（甲５４）により裏付けられている。
したがって，相違点３は１９型変異使用構成の本質的部分ではない。
カ

立体構成モデリングによる裏付け

前記の相違点２及び３が非本質的部分にあたることは，ＹｇｇＢの立体構造モデ
25

リングからも裏付けられている。
キ

以上のとおり，被告製法４との相違点はいずれも１９型変異使用構成の非本33

質的部分である。
(3)

第２要件について（置換可能性）

ア

被告製法４のグルタミン酸の生産量が，１９型変異使用構成と同様に，非改変株と比較してグルタミン酸生産量が向上しており，両者の結果に差異がないこと
5

は，原告による試験結果（甲５４）から明らかである。
したがって，１９型変異使用構成を上記の各相違点に係る構成と置き換えても，
１９型変異使用構成の目的を達することができ，同一の作用効果を奏していることは明らかである。
イ10

被告は，被告が行った実験（乙９７）では，コリネバクテリウム・カルナエ

由来のＹｇｇＢにＡ９８Ｔ変異のみを導入してもグルタミン酸生産能が向上しなかったと主張するが，原告がこの変異のみを導入した実験（甲９２）においては，グルタミン酸生産能の向上が認められた。被告の実験は，導入したプラスミド自体の安定性についての解析・検討がなされておらず，誤った結果が導かれたものである。

15

(4)

第３要件について（置換容易性）

ア

本件特許権２のコリネ型細菌の例として，本件明細書２の段落【００１２】には，「コリネバクテリウム・グルタミカム」と並んで「コリネバクテリウム・カ
ルナエ」が記載されている。
本件優先日２においては，グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌のうち，ｙｇｇＢ遺伝子の配列が解読されていたのは，コリネバクテリウム・グルタミカムと20

コリネバクテリウム・メラセコーラのみであり，コリネバクテリウム・カルナエの配列は未解読であったが，その後，２０１３年３月頃にコリネバクテリウム・カル
ナエの全ゲノム配列が解読された。
被告製法４の実施時点においては，コリネバクテリウム・カルナエについての当業者の技術常識として，コリネバクテリウム・カルナエはコリネバクテリウム・グ

25

ルタミカムと分類上近縁関係にある菌株同士であり，グルタミン酸生産菌としての性質も類似していること，コリネバクテリウム・グルタミカムと同様にｙｇｇＢ遺34

伝子が存在することが知られていた。
そして，被告製法４の実施時点においては，①コリネバクテリウム・グルタミカ
ム由来のｙｇｇＢ遺伝子とコリネバクテリウム・カルナエ由来のｙｇｇＢ遺伝子の間ではそれぞれがコードするアミノ配列の相同性が非常に高いことが知られていた。
5

また，被告製法４の実施時点においては，コリネバクテリウム・グルタミカム由
来のＹｇｇＢとコリネバクテリウム・カルナエ由来のＹｇｇＢのアミノ酸配列の比
較では，②コリネバクテリウム・グルタミカムの１００番目のアラニンが，コリネ
バクテリウム・カルナエの９８番目のアラニンの位置に対応していること，③コリ
ネバクテリウム・グルタミカムの１００番目のアラニンをスレオニンに変換した変10

異体ではＬ－グルタミン酸生産能が向上していたことから，１００番目のアラニンが菌体のグルタミン酸の排出に関与している可能性が高いことが知られていた。
以上に加えて，④コリネバクテリウム・カルナエの２４１番目のバリンはコリネ
バクテリウム・グルタミカムの２４３番目のバリンに対応しており，コリネバクテ
リウム・グルタミカムの２４３番目のアミノ酸の存在する領域については，Ｙｇｇ

15

Ｂのグルタミン酸排出能に影響を与えないこと，さらに，⑤バリンとイソロイシン
はアミノ酸として極めて類似の性質を有しているため，一般的には，バリンからイ
ソロイシンへのアミノ酸の変換は，タンパク質の立体構造や機能に影響を与えないものであることが知られている。
したがって，上記のコリネバクテリウム・カルナエに関する技術常識と，①ない

20

し⑤を踏まえると，当業者にとって，被告製法４が実施された平成２８年７月時点
で，コリネ型細菌のグルタミン酸生産能を向上させる目的で，コリネ型細菌に導入する変異型ｙｇｇＢ遺伝子を，１９型変異使用構成に係る本件明細書２の配列番号
２２をコードするコリネバクテリウム・グルタミカム由来のものから，コリネバク
テリウム・カルナエ由来の変異型ｙｇｇＢ遺伝子を使用する被告製法４に係る構成25に変換することに思い至ることは極めて容易であった。
イ

被告は，原告の提出資料（甲５４，５６）が，平成２８年７月頃の公知文献

35

でないと主張するが，これら自体が同月当時の公知文献でなくても，同月頃の公知
技術の立証に用いることは可能である。また，甲第５４号証の実験は，同月当時に当業者であれば誰でも容易に入手し得る情報，技術常識に基づいて実施したもので
あるし，そこで示されている立体構造モデリングは，同月以前から当業者が利用可
5

能なソフトウェアの標準機能によって作成可能であった。
被告は，アミノ酸配列のデータベース検索の結果としては，本件明細書２の配列
番号６のアミノ酸配列との同一性から，コリネバクテリウム・カルナエ由来のＹｇ
ｇＢを選択する優先順位は低いと主張するが，配列番号６のアミノ酸配列と高い相同性を示すアミノ酸配列のうち，コリネバクテリウム・グルタミカム由来のＹｇｇ

10

Ｂを除けば，コリネバクテリウム・カルナエ由来のものが選択される優先度は高く，その相同性も高い。
また，被告は，グルタミン酸生産能の向上にはＡ９８Ｔ変異とＶ２４１Ｉ変異の組み合わせが必要であったとも主張するが，前記(3)イのとおり，被告が引用する実験結果（乙９７）は相当でない。

15

(5)

第４要件について（対象方法の容易推考性）

本件優先日２において，被告製法４に相当する公知技術は存在しない。また，１９型変異使用構成との相違点にかかる構成が，本件優先日２当時の公知技術に基づいて容易に推考できたとされる事情もない。
(6)20

第５要件について（特段の事情）

本件特許権２の出願過程において，被告製法４に係る構成が，特許請求の範囲か
ら意識的に除外された等の特段の事情はない。
本件特許権２の出願当時，コリネ型細菌の中にコリネバクテリウム・カルナエが存在することは知られていたものの，コリネバクテリウム・カルナエ由来のｙｇｇ
Ｂ遺伝子は解読されておらず，公知ではなかった。したがって，出願人である原告

25

は，コリネバクテリウム・カルナエ由来の変異型ｙｇｇＢ遺伝子を含む具体的な構成を容易に想到できる状況にはなく，これらの構成を特許請求の範囲や明細書の記36

載において開示することはできなかった。したがって，補正の経緯等を踏まえても，
被告製法４が特許請求の範囲から意識的に除外されたものには該当しない。
【被告の主張】原告の主張は争う。被告製法４は，１９型変異使用構成と均等なものとはいえず，
5

本件発明２－５の技術的範囲に含まれない。
(1)

被告製法４と１９型変異使用構成との相違点

被告製法４と１９型変異使用構成とが，原告が主張する相違点において異なることは認める。ただし，相違点をより正確に記載すると，それぞれ，以下のとおりで
ある。
10

相違点１

１９型変異使用構成の菌株のｙｇｇＢ遺伝子では，本件明細書２の配

列番号５の塩基配列（コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株の遺伝子であり，配列番号６のアミノ酸配列に対応する。）に変異が導入されている
ところ，被告製法４の菌株のｙｇｇＢ遺伝子では，コリネバクテリウム・カルナエ
由来の塩基配列に変異が導入されていること。
15

相違点２

導入された変異が，１９型変異使用構成の菌株では，ｙｇｇＢ遺伝子にＡ１００Ｔ変異が導入されているのに対し，被告製法４では，ｙｇｇＢ遺伝子に
Ａ９８Ｔ変異が導入されている。
相違点３

１９型変異使用構成では，Ａ１００Ｔ変異のみが導入されているのに対し，被告製法４の菌株のｙｇｇＢ遺伝子では，Ｖ２４１Ｉ変異も導入されている
20

こと。
(2)

第１要件について（非本質的部分）

ア

１９型変異使用構成に係る発明の本質的部分について

以下に述べる，本件明細書２の記載，出願経過，優先日当時の技術水準等に照らし，１９型変異使用構成に係る発明の本質的部分は，「本件明細書２の配列番号２25２という特定のアミノ酸配列におけるＡ１００Ｔ変異」に限定されるべきである。
(ｱ)

出願経過等

37

出願当初の本件特許２の請求項１では，変異型ｙｇｇＢ遺伝子の塩基配列，アミノ酸配列はコリネ型細菌という限度でのみ特定されていたが，補正の結果，本件特許２に係る発明において，変異前のアミノ酸配列は数種に特定され，変異後の配列も数種に特定された。また，本件特許２の再訂正後の請求項１４では更に変異後の5

アミノ酸配列が限定されている。
訂正によって特許請求の範囲に含まれるものとして特定された本件明細書２の配列番号６，６２，６８，８４及び８５のコリネバクテリウム・グルタミカム由来のアミノ酸配列は相互に高度に類似し，それらの同一性は９７％を超えるものである。
(ｲ)

10

本件優先日２の技術水準

本件優先日２においても，コリネ型細菌によるアミノ酸の生成において，生成したアミノ酸の菌体外への排出がボトルネックであることは周知であった。また，乙２４文献のとおり，コリネバクテリウム・グルタミカムの浸透圧調節チャネル（ＹｇｇＢ）がグルタミン酸の排出に寄与することは知られており，コリネ型細菌のＹ
ｇｇＢについては様々なアミノ酸配列が知られていた。このような，本件優先日２

15

当時の技術水準に照らしても，本質的部分を本件明細書２の配列番号２２のアミノ酸配列から上位概念化すべきではない。
(ｳ)

１９型変異使用構成の効果

原告は，本件発明２は，産業上の極めて重要かつ画期的な発明であったと主張するが，本件明細書２に開示された各種の変異の中でも，１９型変異使用構成につい20ては，グルタミン酸生成量に与える影響は，あるとしてもごくわずかであり，１９型変異使用構成に係る発明について，本質的部分の上位概念化をすべきではない（１９型変異の効果については，後記１０【被告の主張】(1)イのとおり。）。
イ

前記の相違点１ないし３は，いずれも，配列番号２２のアミノ酸配列をコードするものではなく，別菌種由来の塩基配列に変異が導入されている上，アミノ酸25

配列における置換の場所も異なるものであるから，前記アの発明の本質的部分に関する相違点である。したがって，均等の第１要件は満たされない。

38

(3)

第２要件について（置換可能性）

１９型変異使用構成の本質的部分は，本件明細書２の配列番号２２という特定の変異であるから，その作用効果も配列番号２２という特定のアミノ酸配列の作用効
果に限定される。したがって，被告製法４は，１９型変異使用構成と同一の作用効
5果を有しないから，均等の第２要件も否定される。
また，コリネバクテリウム・カルナエ由来のＹｇｇＢのアミノ酸配列に関し，相違点２に係るＡ９８Ｔ変異のみを導入し，相違点３に係るＶ２４１Ｉ変異を導入しなかった場合，被告が行った実験（乙９７）ではグルタミン酸産生は検出されなかったから，相違点２に係るＡ９８Ｔ変異はＡ１００Ｔ変異と機能的に同等のもので

10

はない。
(4)

第３要件について（置換容易性）

ア

第３要件での「容易に想到することができた」の範囲は，特許法２９条２項の容易想到の範囲よりも狭く，当業者であれば，誰もが特許請求の範囲に明記されているのと同じように認識できる程度の容易さと解すべきである。
15

イ

被告製法４が使用開始された平成２８年７月時点では，コリネバクテリウム

・カルナエの全ゲノム配列の解読が完了したばかりであり，ｙｇｇＢ遺伝子の特定，コリネバクテリウム・グルタミカムとのＹｇｇＢの相同性，同一性は公知情報ではなかった。原告が置換容易性について依拠する資料（甲５４，５６）は，被告製法
４の開始後のものである。
20

ウ

アミノ酸配列のデータベース検索の結果としては，本件明細書２の配列番号６のアミノ酸配列との同一性から，コリネバクテリウム・カルナエ由来のＹｇｇＢを選択する優先順位は低く，配列番号６のアミノ酸配列とコリネバクテリウム・カ
ルナエのアミノ酸配列との相同性も低い。
前記(2)ア(ｱ)のとおり，訂正によって特許請求の範囲に含まれるものとして特定25された本件明細書２の配列番号のアミノ酸配列は相互に高度に類似するが，別菌種のＹｇｇＢのアミノ酸配列とこれらの配列とを対比した同一性は著しく低下してい39

る。
したがって，相違点１について，前記配列番号６に代わる候補として，あえてコ
リネバクテリウム・カルナエ由来の配列を選択する合理的な理由はない。
この点について，原告は，ＹｇｇＢの機能に重要なアミノ酸であるとして１から
5

２８６番目までのアミノ酸配列の比較をするが，本件明細書２には４２４番目のア
ミノ酸の置換によるＣ末端側の変異も開示されているから，２８７番目以降のアミノ酸も含めた全配列で比較をすべきである。
エ相違点２及び３についても，コリネバクテリウム・カルナエのｙｇｇＢ遺伝

子は公知情報として特定されておらず，原告が根拠とする立体構造モデリングの結10

果（甲５４）は平成２８年７月当時の公知情報ではなかった。また，相違点３について，膜貫通領域の外にあるアミノ酸の置換であっても，グルタミン酸の排出に影響を及ぼすことがあるから，相違点３のＶ２４１Ｉ変異がグルタミン酸の排出に影響を与えていないことが明らかとはいえない。
オ

15

前記(3)のとおり，コリネバクテリウム・カルナエ由来のＹｇｇＢのアミノ酸配列に関し，相違点２に係るＡ９８Ｔ変異のみを導入し，相違点３に係るＶ２４１
Ｉ変異を導入しなかった場合にはグルタミン酸産生は検出されなかったものであり，相違点３に係るＶ２４１Ｉ変異が加わって初めてグルタミン酸生産能が増加する。
被告製法４にはこれらの２つの変異の組み合わせが必要であるが，原告が置換容
易性の根拠とする証拠には，このような組み合わせは示されていない。

20

カ

したがって，均等の第３要件も満たされていない。

(5)

第５要件について（特段の事情）

前記(2)で第１要件について述べたとおり，本件明細書２の記載や出願経過等によれば，別菌種由来のｙｇｇＢ遺伝子を用いた被告製法４は，１９型変異使用構成の技術的範囲から意識的に除外された。したがって，第５要件も満たされていない。
25

原告は，特許出願の際には，明細書に，コリネバクテリウム・グルタミカム以外のコリネバクテリウム・カルナエ等の別菌種を明示していたにも関わらず，出願経40過においてコリネバクテリウム・グルタミカムに菌種を限定し，さらに変異を導入する配列をコリネバクテリウム・グルタミカムの中でも同一性の極めて高い範囲に限定した。このような外形の作出に対する第三者の信頼は保護されるべきである。
５
5

争点３－１（本件発明１についての乙６発明を主引例とする進歩性欠如の有無）について【被告の主張】本件発明１は，いずれも乙６発明を主引例とし，乙８文献，乙９文献，乙１０文献，乙１１文献，乙１２文献及び乙３５文献等に記載の発明に基づいて当業者が容易に発明することができたものであり，従来予測し得なかった顕著な効果を有する

10

ものではないから，進歩性を欠き，無効とされるべきものである（特許法１２３条
１項２号，２９条２項）。
(1)

乙６発明について

乙６文献には以下の発明（乙６発明）が記載されている。
「コリネ型細菌の染色体上のＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列の－３５領域にＴ
15

ＧＧＴＣＡのＤＮＡ配列，ＣＳ遺伝子のプロモーター配列の－３５領域にＴＧＧＣ
ＴＡのＤＮＡ配列を有し，ＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列の－１０領域にＣＡＴ
ＡＡＴのＤＮＡ配列，ＣＳ遺伝子のプロモーター配列の－１０領域にＴＡＧＣＧＴのＤＮＡ配列を有するコリネ型細菌」の発明

20

(2)

本件発明１－１の進歩性についてア

本件発明１－１と乙６発明との対比

本件発明１－１と乙６発明とを対比すると，両者は，相違点１又は相違点２と相
違点３で相違する。
相違点１

本件発明１－１のコリネ型細菌では，ＧＤＨ遺伝子又はＣＳ遺伝子のプロモーター配列の－３５領域に，ＴＴＧＴＣＡ，ＴＴＧＡＣＡ，ＴＴＧＣＴＡ及25

びＴＴＧＣＣＡからなる群から選ばれる少なくとも一種のＤＮＡ配列が導入されているのに対し（１－Ａ－１），乙６発明のコリネ型細菌は，ＧＤＨ遺伝子のプロモ

41

ーター配列の－３５領域にＴＧＧＴＣＡのＤＮＡ配列，ＣＳ遺伝子のプロモーター
配列の－３５領域にＴＧＧＣＴＡのＤＮＡ配列を有する。
相違点２

本件発明１－１のコリネ型細菌では，ＧＤＨ遺伝子又はＣＳ遺伝子のプロモーター配列の－１０領域にＴＡＴＡＡＴ配列又はＴＡＴＡＡＣ配列が導入さ5れているのに対し（１－Ａ－２），乙６発明のコリネ型細菌は，ＧＤＨ遺伝子のプ
ロモータ配列の－１０領域にＣＡＴＡＡＴのＤＮＡ配列，ＣＳ遺伝子のプロモータ
ー配列の－１０領域にＴＡＧＣＧＴのＤＮＡ配列を有する。
相違点３

本件発明１－１は，コリネ型細菌を培養し，培地中にグルタミン酸を蓄積させ，これを培地から採取することを特徴とする発酵法によりグルタミン酸を10製造する発明であるのに対し（１－Ａ－３，１－Ｂ），乙６発明は，コリネ型細菌の発明である。
イ

相違点に係る構成の容易想到性(ｱ)

相違点１について（－３５領域について）

コリネ型細菌によるＬ－グルタミン酸の生産性を高めるために，グルタミン酸生15

合成系遺伝子を増強することが有利であり，特にＧＤＨ活性ないしＣＳ活性を増強
することが知られていた。したがって，コリネバクテリウム・グルタミカムの培養によりＬ－グルタミン酸を生産する方法において，Ｌ－グルタミン酸の生産性を改善する目的で，コリネバクテリウム・グルタミカムのＧＤＨ及び／又はＣＳのプロ
モーター配列の－３５領域に変異を加えることは，当業者が当然に試みる事項であ20る。
そして，その際，乙６発明のＧＤＨ及び／又はＣＳのプロモーター配列の－３５領域の配列を，本件発明１－１に記載された配列に変更することは，以下に説明するとおり当業者が容易に想到できた事項である。
ａ25

コリネバクテリウム・グルタミカムのコンセンサス配列（ＴＴＧＣＣＡ）への変更
Ｅ．ｃｏｌｉ及びコリネバクテリウム・グルタミカムにおいて，目的とする遺伝42

子のプロモーターの－３５領域をコンセンサス配列に近づけることにより，発現が促進されることが知られていた。また，乙６文献には，コリネバクテリウム・グル
タミカムのプロモーター－３５領域のコンセンサス配列がＴＴＧＣＣＡであることが記載されていた。
5

したがって，乙６発明に基づいて，ＧＤＨ遺伝子又はＣＳ遺伝子のプロモーターの－３５領域を，コリネ型細菌のプロモーター－３５領域のコンセンサス配列（ＴＴＧＣＣＡ）に変異させることは，当業者が容易に想到し得た事項である。
ｂ

コンセンサス配列（ＴＴＧＣＣＡ）の４番目，５番目の塩基を変異させた配列（ＴＴＧＴＣＡ，ＴＴＧＡＣＡ，ＴＴＧＣＴＡ）への変更
10

野生型コリネバクテリウム・グルカミカムのプロモーター－３５領域のコンセン
サス配列は，ＴＴＧＣＣＡであり，１番目ないし３番目の塩基は「ＴＴＧ」である。
コリネバクテリウム・グルカミカムに限らず，Ｅ．ｃｏｌｉ等各種の細菌でも，プロモーター－３５領域のコンセンサス配列の１番目ないし３番目の塩基は，「ＴＴＧ」であり，Ｅ．ｃｏｌｉのプロモーターの－３５領域の配列において，最初の15

３塩基「ＴＴＧ」の保存性は高い（乙１０）。
したがって，Ｅ．ｃｏｌｉの知見を持つ当業者が野生型コリネバクテリウム・グ
ルタミカムのプロモーター－３５領域の変異を試みる場合，１ないし３番目の塩基については保存性の高い「ＴＴＧ」を維持するはずであり，変異の対象は，４番目
ないし６番目の塩基となる。

20

ＴＴＧＣＣＡの４番目の塩基（Ｃ）をＴ又はＡに変異させた配列は，相違点１の
ＴＴＧＴＣＡ，ＴＴＧＡＣＡであり，ＴＴＧＣＣＡの５番目の塩基（Ｃ）をＴに変異させた配列は，相違点１のＴＴＧＣＴＡである。
したがって，乙６文献に基づいて，乙６発明のコリネ型細菌におけるＧＤＨ遺伝
子及び／又はＣＳ遺伝子のプロモーター－３５領域を，コリネ型細菌のプロモータ

25

ー－３５領域のコンセンサス配列に近づけて，ＴＴＧＴＣＡないしＴＴＧＣＴＡとすることは，当業者が容易に想到し得た事項である。

43

ｃ

乙６発明の２番目の塩基を変異させた配列（ＴＴＧＴＣＡ，ＴＴＧＣＴＡ）

への変更
野生型コリネバクテリウム・グルカミカムに関する乙６発明では，プロモーター－３５領域の配列は，ＧＤＨに関しＴＧＧＴＣＡであり，ＣＳに関してＴＧＧＣＴ5Ａである。これらの配列における２番目の塩基「Ｇ」を「Ｔ」に変更すると「ＴＴ
ＧＴＣＡ」及び「ＴＴＧＣＴＡ」となる。
コリネバクテリウム・グルカミカムのプロモーター－３５領域のコンセンサス配列は，ＴＴＧＣＣＡであり，２番目の塩基は「Ｔ」である。Ｅ．ｃｏｌｉのプロモ
ーター－３５領域のコンセンサス配列でも，最初の３塩基は「ＴＴＧ」であり，そ10の保存性は高い（乙１０）。したがって，当業者が野生型コリネバクテリウム・グ
ルタミカムのプロモーター－３５領域の変異を試みる場合，１ないし３番目の塩基については保存性の高い「ＴＴＧ」を採用するはずである。つまり，２番目の「Ｇ」を「Ｔ」に変更することを動機付けられる。
したがって，乙６発明に基づいて，コリネ型細菌におけるＧＤＨ遺伝子及び／又15はＣＳ遺伝子のプロモーター－３５領域をＴＴＧＴＣＡないしＴＴＧＣＴＡとする
ことは，当業者が容易に想到し得た事項である。
ｄＥ．ｃｏｌｉのコンセンサス配列（ＴＴＧＡＣＡ）への変更

コリネ型細菌において，Ｅ．ｃｏｌｉ等その他の細菌のプロモーターを適用する
ことは，適宜行われている。
20

乙１０文献には，Ｅ．ｃｏｌｉでは，プロモーター－３５領域をＴＴＧＴＣＡからコンセンサス配列であるＴＴＧＡＣＡに変更することにより，活性が２１倍上昇
したことが示されており，乙１１文献には，Ｅ．ｃｏｌｉにおけるプロモータ－３５領域のコンセンサス配列の例として，ｔａｃプロモーターが記載されている。
したがって，乙６発明のコリネ型細菌においても，当業者は，Ｅ．ｃｏｌｉの知25見に基づき，ＧＤＨ又はＣＳ遺伝子のプロモーター－３５領域をＴＴＧＡＣＡに変更するよう動機付けられていた。

44

したがって，乙６発明に乙１０発明又は乙１１発明を適用し，プロモーター－３
５領域をＴＴＧＡＣＡとすることにより，相違点１の構成を採用することは，当業者が容易に想到し得た事項である。
(ｲ)5

相違点２について（－１０領域について）

コリネバクテリウム・グルタミカムの培養によりＬ－グルタミン酸を生産する方法において，Ｌ－グルタミン酸の生産性を改善する目的で，コリネバクテリウム・
グルタミカムのＧＤＨ及びＣＳ遺伝子の配列のプロモーター－１０領域に変異を加えることは，当業者が当然に試みる事項である。
そして，乙６発明のＧＤＨ及びＣＳ遺伝子のプロモーター配列の－１０領域の配10列を，本件発明１－１に記載された配列（ＴＡＴＡＡＴ）に変更することは，以下のとおり，当業者が容易に想到できた事項である。
ａ

コリネバクテリウム・グルタミカムのコンセンサス配列（ＴＡＴＡＡＴ）への変更
Ｅ．ｃｏｌｉ及びコリネバクテリウム・グルタミカムにおいて，目的とする遺伝
15子のプロモーターにコンセンサス配列を導入することにより，発現が促進されることが知られていた。そして，コリネバクテリウム・グルタミカムのプロモーターの－１０領域のコンセンサス配列が，ＴＡＴＡＡＴであることが乙６文献には記載されていた。しかも，乙１２文献では，コリネ型細菌では，プロモーター－１０領域
をＴＡＴＡＡＴにすることにより，目的遺伝子の発現が１４倍にも上昇したことが20知られていた。
したがって，乙６発明に基づいて，又は，乙６発明に乙１２発明を適用し，コリ
ネ型細菌のＧＤＨ及び／又はＣＳ遺伝子の野生型プロモーターの－１０領域をＴＡ
ＴＡＡＴに変異させ，相違点２の構成を採用することは，当業者が容易に想到し得た事項である。

25

原告は，乙６発明に開示されているコンセンサス配列は「ＴＡ．ａａＴ」であったと主張するが，三番目の塩基「．」はＴである確率が最も高いとされており，当45

業者であればＴＡＴＡＡＴの配列を第一に認識するものであった。
ｂＥ．ｃｏｌｉのコンセンサス配列（ＴＡＴＡＡＴ）への変更

Ｅ．ｃｏｌｉのプロモーター－１０領域がＴＡＴＡＡＴであることは周知であった（乙１０，１１，１３）。さらに，Ｅ．ｃｏｌｉのプロモーターにはコリネ型細5菌で利用可能なものが多いこと，Ｅ．ｃｏｌｉでは目的遺伝子のプロモーターをコ
ンセンサス配列にすることにより発現が促進されることも技術常識であった。
したがって，乙６発明に基づいて，Ｅ．ｃｏｌｉのプロモーター－１０領域の周知技術を適用し，相違点２の構成を採用することは，当業者が容易に想到し得た事
項である。

10

(ｳ)

相違点３についてコリネ型細菌を培地中に培養し，培地中にＬ－グルタミン酸を生成蓄積させ，これを採取することは周知の事項に過ぎないから（乙９），相違点３の構成に到達す
ることに困難な事情はない。
(ｴ)15

本件発明１－１の効果について－３５領域への変異の導入に係る本件発明１－１の効果は，いずれも，グルタミ
ン酸生産性に実質的な影響を及ぼさないか，本件明細書１において開示されていな
い。また，－１０領域への変異の導入に係る本件発明１－１の効果は，いずれも当業者の予想の範囲内にとどまるものである。
したがって，本件発明１－１は，予測し得ないような優れた効果を有するもので

20

はない。
(3)

本件発明１－２の進歩性についてア

本件発明１－２と乙６発明との対比

本件発明１－２と乙６発明とを対比すると，両者は，前記相違点３に加え，以下の相違点４又は相違点５で相違する。
25

相違点４

本件発明１－２のコリネ型細菌では，ＧＤＨ遺伝子のプロモーターが，－３５領域にＴＴＧＴＣＡ，ＴＴＧＡＣＡ及びＴＴＧＣＣＡからなる群から選ばれ46

る少なくとも一種のＤＮＡ配列を有するのに対し（１－Ｃ－１），乙６発明のコリネ型細菌では，ＧＤＨ遺伝子のプロモーターが，－３５領域にＴＧＧＴＣＡのＤＮ
Ａ配列を有する。
相違点５5

本件発明１－２のコリネ型細菌では，ＧＤＨ遺伝子のプロモーターが，－１０領域にＴＡＴＡＡＴ配列を有するのに対し（１－Ｃ－２），乙６発明のコリネ型細菌では，ＧＤＨ遺伝子のプロモーターが，－１０領域にＣＡＴＡＡＴのＤＮ
Ａ配列を有する。
イ

相違点に係る構成の容易想到性

本件発明１－１の相違点１及び２と同様の理由により，相違点４及び５の構成を10採用することは当業者が容易に想到し得た事項である。
(4)

本件発明１－３の進歩性についてア

本件発明１－３と乙６発明との対比

本件発明１－３と乙６発明とを対比すると，両者は，前記相違点３に加え，以下の相違点６又は相違点７で相違する。
15

相違点６

本件発明１－３のコリネ型細菌では，ＧＤＨ遺伝子のプロモーターが，－３５領域にＴＴＧＡＣＡ又はＴＴＧＣＣＡ配列を有するのに対し（１－Ｅ－１），
乙６発明のコリネ型細菌では，ＧＤＨ遺伝子のプロモーターが，－３５領域にＴＧ
ＧＴＣＡ配列を有する。
相違点７（相違点４と同内容）
20

本件発明１－３のコリネ型細菌では，ＧＤＨ遺伝子のプロモーターが，－１０領域にＴＡＴＡＡＴ配列を有するのに対し（１－Ｅ－２），乙６発明のコリネ型細菌では，ＧＤＨ遺伝子のプロモーターが，－１０領域にＣＡＴＡＡＴ配列を有する。
イ

相違点に係る構成の容易想到性

本件発明１－１との相違点１及び２と同様の理由により，相違点６及び７の構成25を採用することは当業者が容易に想到し得た事項である。
(5)

本件発明１－４の進歩性について

47

ア

本件発明１－４と乙６発明との対比

本件発明１－４と乙６発明とを対比すると，両者は，前記相違点３に加え，以下の相違点８又は相違点９で相違する。
相違点８5

本件発明１－４のコリネ型細菌では，ＣＳ遺伝子のプロモーターが，－３５領域にＴＴＧＡＣＡを有するのに対し（１－Ｇ－１），乙６発明のコリネ型細菌では，ＣＳ遺伝子のプロモーターが，ＴＧＧＣＴＡ配列を有する。
相違点９

本件発明１－４のコリネ型細菌では，ＣＳ遺伝子のプロモーターが，－１０領域にＴＡＴＡＡＴ配列を有するのに対し（１－Ｇ－２），乙６発明のコリネ型細菌では，ＣＳ遺伝子のプロモーターが，ＴＡＧＣＧＴ配列を有する。
10

イ

相違点に係る構成の容易想到性

本件発明１－１との相違点１及び２と同様の理由により，相違点８及び９の構成を採用することは当業者が容易に想到し得た事項である。
【原告の主張】本件発明１は，いずれも乙６発明等に基づいて当業者が容易に想到し得るもので15はなく，その効果も従来予測し得なかった顕著なものであるから，乙６発明を主引例とする進歩性欠如の主張は理由がない。
(1)

乙６発明について

乙６文献に，被告が主張する内容の乙６発明が開示されていることは認める。

20

(2)

本件発明１－１の進歩性について

ア

被告主張の相違点１（－３５領域）について

以下のとおり，－３５領域の配列の変更に関する相違点は，いずれも当業者が容易に想到し得たものではない。
乙６文献には，コリネ型細菌において，プロモーターの活性と，各プロモーターの－３５領域及び－１０領域とコンセンサス配列との類似性との間に相関が確認で25きなかったと記載されており，コリネ型細菌の遺伝子のプロモーターの－３５領域
及び－１０領域をコンセンサス配列に近づける動機付けはなかったし，それにより48

当該遺伝子の活性が高まるとは予測し得なかった。
また，乙６文献には，そこで開示された多数の遺伝子のうち，特にＧＤＨ遺伝子及びＣＳ遺伝子に着目する動機付けはなく，これらのプロモーターの－３５領域及び－１０領域に特定の変異を導入することは，当業者が容易になし得るものではな
5

かった。
(ｱ)

ＴＴＧＣＣＡへの変更について

前記のとおり，乙６文献の記載から，当業者がＧＤＨ遺伝子及びＣＳ遺伝子のプ
ロモーター配列を改変しようとする動機付けはない。
(ｲ)
10

ＴＴＧＴＣＡへの変更について

前記のとおり，乙６文献の記載から，当業者がＧＤＨ遺伝子及びＣＳ遺伝子のプ
ロモーター配列を改変しようとする動機付けはなく，－３５領域をコンセンサス配列に近づける動機付けもない。
仮に，コンセンサス配列を意識した改変を試みたとしても，乙６文献には，Ｅ．
ｃｏｌｉのコンセンサス配列とは異なり，コリネバクテリウム・グルタミカムのコ

15

ンセンサス配列では１番目から３番目までの「ＴＴＧ」のうち，１番目と２番目の保存性は高くないとされているから，ＴＴＧＴＣＡの配列は選択されないはずである。
(ｳ)

ＴＴＧＣＴＡへの変更について

前記(ｲ)と同様に，このような変更をする動機付けはない。
20

なお，被告は，コンセンサス配列の５番目の塩基を変異させるとＴＴＧＣＴＡとなると主張するが，コンセンサス配列から遠ざけるように変異させる動機付けは全
くない。
(ｴ)

ＴＴＧＡＣＡへの変更について

Ｅ．ｃｏｌｉとコリネバクテリウム・グルタミカムとでは，コンセンサス配列が25異なり，コリネ型細菌にＥ．ｃｏｌｉのコンセンサス配列と一致させる変異を導入することは容易ではない。微生物間で相互にプロモーターが機能することと，コン

49

センサス配列とは無関係である。
また，コンセンサス配列に変異を加えて，ＴＴＧＡＣＡとすることが容易との主張についても理由がない。
イ
5

被告主張の相違点２（－１０領域の配列のＴＡＴＡＡＴへの変更）について

前記のとおり，乙６文献の記載から，当業者がＧＤＨ遺伝子及びＣＳ遺伝子のプ
ロモーター配列を改変しようとする動機付けはなく，－１０領域をコンセンサス配列に近づける動機付けもない。
また，乙６文献に記載されているコリネバクテリウム・グルタミカムのプロモー
ターの－１０領域のコンセンサス配列は「ＴＡ．ａａＴ」であり，ＴＡＴＡＡＴで10あったとの被告の主張は誤っている。さらに，Ｅ．ｃｏｌｉのコンセンサス配列とコリネ型細菌のコンセンサス配列は同一ではなく，Ｅ．ｃｏｌｉに関する知見をそのままコリネ型細菌に適用できるとは考えられていなかった。
ウ

被告主張の相違点３について

乙６発明のコリネ型細菌を，グルタミン酸の製造方法に用いることを容易に想到15し得たとしても，それ以外の点から，本件発明１－１は進歩性を有する。
エ本件発明１－１の効果について

本件発明１については，アミノ酸生成菌の染色体上の遺伝子のプロモーターの特異的領域である－３５領域又は－１０領域に特定の配列を導入することで，目的遺伝子の発現が適度に強化され，グルタミン酸の収率が上がり，目的以外のアミノ酸20の副生を抑制することができる，グルタミン酸の生産に好ましいコリネ型細菌が得られるという，当業者が全く予測し得なかった顕著な効果がある。
(3)

本件発明１－２，１－３，１－４の進歩性について

被告主張の相違点４ないし９についても，前記(2)ア及びイと同様の理由により，当業者が容易に想到し得た事項ではない。また，本件発明１－２，１－３及び１－
25

４は，前記(2)エのとおり，当業者が全く予測し得なかった顕著な効果を有するもの
である。

50

６

争点３－２（本件発明１についての乙９発明を主引例とする進歩性欠如の有無）について【被告の主張】本件発明１は，いずれも乙９発明を主引例とし，乙６文献，乙８文献，乙１０文
5

献，乙１１文献，乙１２文献及び乙３５文献等に記載の発明に基づいて当業者が容易に発明することができたものであり，前記５【被告の主張】(2)イ(ｴ)のとおり，
従来予測し得なかった顕著な効果を有するものではないから，進歩性を欠き，無効とされるべきものである（特許法１２３条１項２号，２９条２項）。
(1)10乙９発明について

乙９文献には以下の発明（乙９発明）が記載されている。
「コリネ型細菌の染色体上のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）又はクエン酸合成酵素（ＣＳ）遺伝子のプロモーター配列に変異を導入したコリネ型細菌を培地で培養し，培地中にＬ－グルタミン酸を生成蓄積させ，これを該培地から採取することを特徴とする発酵法によるＬ－グルタミン酸の製造方法。」

15

(2)

本件発明１－１の進歩性についてア

本件発明１－１と乙９発明との対比

本件発明１－１と乙９発明とを対比すると，両者は，相違点１又は相違点２で相
違する。
相違点１
20

本件発明１－１のコリネ型細菌では，ＧＤＨ又はＣＳ遺伝子のプロモーター配列の－３５領域に，ＴＴＧＴＣＡ，ＴＴＧＡＣＡ，ＴＴＧＣＴＡ及びＴＴ
ＧＣＣＡからなる群から選ばれる少なくとも一種のＤＮＡ配列が導入されているのに対し（１－Ａ－１），乙９発明のコリネ型細菌では，ＧＤＨ遺伝子又はＣＳ遺伝
子のプロモーター配列に変異が導入されているものの，－３５領域の配列が特定されていない。

25

相違点２

本件発明１－１のコリネ型細菌では，ＧＤＨ又はＣＳ遺伝子のプロモーター配列の－１０領域にＴＡＴＡＡＴ配列又はＴＡＴＡＡＣ配列が導入されてい51

るのに対し（１－Ａ－２），乙９発明のコリネ型細菌では，ＧＤＨ遺伝子又はＣＳ
遺伝子のプロモーター配列に変異が導入されているものの，－１０領域の配列が特定されていない。

5イ

相違点に係る構成の容易想到性(ｱ)

相違点１（－３５領域）について

ａ

乙９文献中のＴＴＧＡＣＡの示唆

乙９文献は，プロモーターの－３５領域をＴＴＧＡＣＡに，プロモーターの－１０領域をＴＡＴＡＡＴにするよう示唆している。
乙９文献には，コリネ型細菌の細胞内で機能するプロモーターのうち強力なもの
10として，大腸菌のｔａｃプロモーター（その配列は，乙１１文献に記載されており，－３５領域は「ＴＴＧＡＣＡ」，－１０領域は「ＴＡＴＡＡＴ」である。）がある
ことが記載されている。
ｂ

コリネバクテリウム・グルタミカムのコンセンサス配列（ＴＴＧＣＣＡ）への変更
15

乙６発明との相違点１で検討したところからすれば，乙９発明に乙６発明を適用し，乙９発明のコリネ型細菌におけるＧＤＨ遺伝子又はＣＳ遺伝子のプロモーター－３５領域を，コリネ型細菌のプロモーター－３５領域のコンセンサス配列（ＴＴ
ＧＣＣＡ）に変異することは，当業者が容易に想到し得た事項である。
ｃ20

コンセンサス配列を修飾した配列（ＴＴＧＴＣＡ，ＴＴＧＡＣＡ及びＴＴＧ

ＣＴＡ）への変更
乙６発明との相違点１で検討したところからすれば，コリネ型細菌のプロモータ
ー－３５領域の配列を，コンセンサス配列を修飾したＴＴＧＴＣＡ，ＴＴＧＡＣＡ
又はＴＴＧＣＴＡの配列に変異させることは，当業者が容易に想到し得た事項であ
る。

25

ｄ

Ｅ．ｃｏｌｉのコンセンサス配列（ＴＴＧＡＣＡ）への変更

乙６発明との相違点１で検討したところからすれば，乙９発明に乙１０発明又は52

乙１１発明を適用し，プロモーターの－３５領域をＴＴＧＡＣＡとすることにより，相違点１の構成を採用することは，当業者が容易に想到し得た事項である。

5(ｲ)

相違点２（－１０領域）について

ａ

乙９文献中のＴＡＴＡＡＴの示唆

相違点１で検討したとおり，乙９文献は，ｔａｃプロモーターの配列を導入し，プロモーターの－１０領域をＴＡＴＡＡＴにするよう示唆している。
ｂ

コリネバクテリウム・グルタミカムのコンセンサス配列（ＴＡＴＡＡＴ）への変更
乙６発明との相違点２で検討したところからすれば，乙９発明に乙６発明又は乙10１２発明を適用し，コリネ型細菌のＧＤＨ及び／又はＣＳ遺伝子の野生型プロモー
ターの－１０領域をＴＡＴＡＡＴに変異させ，相違点２の構成を採用することは，当業者が容易に想到し得た事項である。
ｃＥ．ｃｏｌｉのコンセンサス配列（ＴＡＴＡＡＴ）への変更

乙６発明との相違点２で検討したところからすれば，乙９発明に対し，周知技術15であるＥ．ｃｏｌｉのプロモーター－１０領域の配列（ＴＡＴＡＡＴ）適用し，相違点２の構成を採用することは，当業者が容易に想到し得た事項である。
(ｳ)

原告が主張する相違点について

乙９発明には，目的遺伝子を相同組換えによって染色体上に固定することが記載されており，本件優先日１当時，このような技術はプラスミドを使用する技術の課
20

題を解決するための手段として，既に知られていた。ベクターの使用により生じる課題を解決するために，ＧＤＨ遺伝子ないしＣＳ遺伝子の発現増強を，ベクター上ではなく，特定の配列を有するプロモーターを用いて染色体上で行うことは，当業者が容易に想到し得た事項にすぎない。

25

(3)

本件発明１－２の進歩性についてア

本件発明１－２と乙９発明との対比

本件発明１－２と乙９発明とを対比すると，両者は，相違点３又は相違点４で相

53

違する。
相違点３

本件発明１－２では，ＧＤＨ遺伝子のプロモーターが，－３５領域にＴＴＧＴＣＡ，ＴＴＧＡＣＡ及びＴＴＧＣＣＡからなる群から選ばれる少なくとも一種のＤＮＡ配列を有するのに対し（１－Ｃ－１），乙９発明のコリネ型細菌では，
5ＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列に変異が導入されているものの，－３５領域の配列が特定されていない。
相違点４

本件発明１－２では，ＧＤＨ遺伝子のプロモーターが，－１０領域にＴＡＴＡＡＴ配列を有するのに対し（１－Ｃ－２），乙９発明のコリネ型細菌では，ＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列に変異が導入されているものの，－１０領域の配10

列が特定されていない。
イ

相違点に係る構成の容易想到性

本件発明１－１との相違点１及び２と同様の理由により，相違点３及び４の構成を採用することは当業者が容易に想到し得た事項である。

15

(4)

本件発明１－３の進歩性についてア

本件発明１－３と乙９発明との対比

本件発明１－３と乙９発明とを対比すると，両者は，相違点５又は相違点６で相
違する。
相違点５

本件発明１－３では，ＧＤＨ遺伝子のプロモーターが，－３５領域にＴＴＧＡＣＡ又はＴＴＧＣＣＡ配列を有するのに対し（１－Ｅ－１），乙９発明の20

コリネ型細菌では，ＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列に変異が導入されているものの，－３５領域の配列が特定されていない。
相違点６（相違点４と同内容）

本件発明１－３では，ＧＤＨ遺伝子のプロモー

ターが，－１０領域にＴＡＴＡＡＴ配列を有するのに対し（１－Ｅ－２），乙９発
明のコリネ型細菌では，ＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列に変異が導入されている
25

ものの，－１０領域の配列が特定されていない。
イ

相違点に係る構成の容易想到性

54

本件発明１－１との相違点１及び２と同様の理由により，相違点５及び６の構成を採用することは当業者が容易に想到し得た事項である。

5(5)本件発明１－４の進歩性についてア

本件発明１－４と乙９発明との対比

本件発明１－４と乙９発明とを対比すると，両者は，相違点７又は相違点８で相
違する。
相違点７

本件発明１－４では，ＣＳ遺伝子のプロモーターが，－３５領域にＴＴＧＡＣＡ配列を有するのに対し（１－Ｇ－１），乙９発明のコリネ型細菌では，ＣＳの遺伝子のプロモーター配列に変異が導入されているものの，－３５領域の配10列が特定されていない。
相違点８

本件発明１－４では，ＣＳ遺伝子のプロモーターが，－１０領域にＴ

ＡＴＡＡＴ配列又はＴＡＴＡＡＣ配列を有するのに対し（１－Ｇ－２），乙９発明のコリネ型細菌では，ＣＳ遺伝子のプロモーター配列に変異が導入されているものの，－１０領域の配列が特定されていない。
15

イ

相違点に係る構成の容易想到性

本件発明１－１との相違点１及び２と同様の理由により，相違点７及び８の構成を採用することは当業者が容易に想到し得た事項である。
【原告の主張】本件発明１は，いずれも乙９発明等に基づいて当業者が容易に想到し得るもので20はなく，前記５【原告の主張】(2)エのとおり，その効果も従来予測し得なかった顕著なものであるから，乙９発明を主引例とする進歩性欠如の主張は理由がない。
(1)

乙９発明について

乙９文献に開示されている乙９発明は，被告の主張とは異なり，以下のとおり認定されるべきである。
25「α－ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ（以下「α－ＫＧＤＨ」ということがある。）活性が欠失したコリネ型細菌であって，ＧＤＨ，ＣＳ遺伝子等のグルタミン

55

酸生合成系遺伝子を強力なプロモーターの下流に連結したベクターを導入したコリ
ネ型細菌を培地中で培養し，Ｌ－グルタミン酸を生成蓄積させ，採取する発酵法によるＬ－グルタミン酸の製造方法。」

5(2)

本件発明１－１の進歩性についてア

本件発明１－１と乙９発明との対比

本件発明１－１と乙９発明とを対比すると，プロモーター部分の配列が特定されているかどうかに加えて，①本件発明１－１のコリネ型細菌は，染色体上のプロモ
ーター配列に変異を導入したコリネ型細菌であるのに対して，乙９発明におけるコリネ型細菌はＧＤＨ遺伝子等のグルタミン酸生合成系遺伝子を強力なプロモーター
10の下流に連結したベクターを導入したコリネ型細菌であること，②本件発明１－１のコリネ型細菌はα－ＫＧＤＨ活性が欠失したコリネ型細菌に限られないところ，
乙９発明のコリネ型細菌はα－ＫＧＤＨ活性が欠失したコリネ型細菌に限られるという点でも相違する。
イ15

相違点に係る構成の容易想到性

乙９文献には，目的遺伝子を染色体から取得して，プラスミドに代表されるベク
ターに搭載した上で，その目的遺伝子の発現を強化する場合には，強力なプロモー
ターの下流に連結することのみが開示されており，染色体上の遺伝子を取得せずに染色体上の遺伝子のプロモーター部分のみを改変することは，全く開示も示唆もされておらず，そのような構成とする動機付けはないから，前記ア①の相違点に想到20することは容易ではない。
さらには，仮に染色体上の遺伝子のプロモーターのみを改変することに思い至り，かかる遺伝子としてＧＤＨを選択したとしても，コリネ型細菌の染色体上のＧＤＨ又はＣＳ遺伝子のプロモーター配列の特定の箇所に特定の変異を加えたコリネ型細菌に想到することは容易ではない。乙９文献には，多数存在する強力なプロモータ

25

ーのうち，特にＥ．ｃｏｌｉのｔａｃプロモーターを連結させることを示唆する記
載はない。

56

(3)

本件発明１－２，１－３，１－４の進歩性について

本件発明１－２，１－３及び１－４にも，前記(2)アの乙９発明と本件発明１－１との相違点と同様の相違点があり，同イと同様の理由により，相違点に想到することは容易ではない。
5

７

争点３－３（本件発明１についての実施可能要件違反・サポート要件違反の有無）について【被告の主張】本件明細書１の発明の詳細な説明の記載は，以下の点で，特許法３６条４項１号に規定された要件（実施可能要件）を満たしていないものであり，本件発明１は，
10

いずれも同法１２３条１項４号の規定により無効とされるべきである。
また，本件発明１は，以下の点で，いずれも同法３６条６項１号に規定された要件（サポート要件）を満たしていないものであり，同法１２３条１項４号の規定により無効とされるべきである。

15

(1)

ＧＤＨ遺伝子のプロモーターへの変異導入について

アグルタミン酸の製造方法について

本件特許１の請求項１ないし３には，様々な配列の組み合わせの変異が包含されるが，本件明細書１中に，ＧＤＨ遺伝子のプロモーターの変異についての具体例は，
僅か２つ（実施例２及び７）が示されているのみであり，染色体上のＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列に変異を導入したコリネ型細菌を用いるグルタミン酸の製造方20法に関し，発明の詳細な説明は，その収率が向上できる程度に十分かつ明確に記載されていない。また，当業者は，当該具体例，本件明細書１のその他の記載及び技術常識を参照しても，本件特許１の請求項１ないし３に記載された様々な変異の組
み合わせをコリネ型細菌の染色体上のＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列の－３５及び／又は－１０領域に導入することによって，本件発明１の課題を解決することが25

できることを認識できない。
イ

Ｌ－アルギニンの製造方法について57

染色体上のＧＤＨ遺伝子のプロモーターへの変異導入によって，Ｌ－アルギニン（以下，単に「アルギニン」ということがある。）の生産性がどのように変化するのかについては，本件明細書１には何ら具体的に記載されていない。
したがって，請求項１ないし３について，染色体上のＧＤＨ遺伝子のプロモータ
5ーに変異を導入したコリネ型細菌を用いるアルギニンの製造方法に関し，発明の詳細な説明は，その収率が向上できる程度に十分かつ明確に記載されておらず，当業者は，請求項１ないし３に記載された様々な変異の組み合わせをコリネ型細菌の染
色体上のＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列の－３５及び／又は－１０領域に導入することによって，Ｌ－アルギニンの収率が向上するとは認識できない。

10

(2)

ＣＳ遺伝子のプロモーターへの変異導入について

アグルタミン酸の製造方法について

本件明細書１には，ＣＳ遺伝子のプロモーターのみに変異を加えた実施例がない。
実施例では，ＣＳ遺伝子のプロモーター配列の変異に加えて，ＧＤＨ遺伝子のプロ
モーター配列にも変異が加えられている。そのため，ＣＳ遺伝子のプロモーター配15

列への影響を独立に検討することができない。しかも，ＣＳ遺伝子のプロモーター
配列に変異を加えた例は，僅か３つの菌株のみである（実施例３のＧＢ０１，ＧＢ
０２及びＧＢ０３）。
したがって，本件特許１の請求項１及び４について，染色体上のＣＳ遺伝子のプ
ロモーター配列に変異を導入したコリネ型細菌を用いるグルタミン酸の製造方法に20関し，発明の詳細な説明は，その収率が向上できる程度に十分かつ明確に記載されていない。また，当業者は，実施例３，本件明細書１のその他の記載及び技術常識を参照しても，本件特許１の請求項１及び４に記載された様々な変異の組み合わせをコリネ型細菌の染色体上のＣＳ遺伝子のプロモーター配列の－３５及び／又は－１０領域に導入することによって，発明の課題を解決できることを認識できない。

25

イ

アルギニンの製造方法について

前記(1)イのＧＤＨ遺伝子のプロモーターと同様に，染色体上のＣＳ遺伝子のプ58

ロモーターへの変異導入によって，Ｌ－アルギニンの生産性がどのように変化するのかについては，本件明細書１には何ら具体的に記載されていないから，本件特許
１の請求項１及び４につき，染色体上のＣＳ遺伝子のプロモーターに変異を導入したアルギニンの製造方法に関して，実施可能要件及びサポート要件は満たされてい
5

ない。
(3)

ＩＣＤＨ遺伝子，ＰＤＨ遺伝子のプロモーターへの変異導入について

アグルタミン酸の製造方法について

本件明細書１には，ＩＣＤＨ遺伝子又はＰＤＨ遺伝子のプロモーターの－３５領域及び／又は－１０領域のみが変異された実施例がない。実施例４ではＩＣＤＨ遺10

伝子のプロモーター配列に，実施例５ではＰＤＨ遺伝子のプロモーター配列に，それぞれ変異が加えられているものの，いずれも他の遺伝子のプロモーターにも変異が加えられている。そのため，ＩＣＤＨ遺伝子又はＰＤＨ遺伝子のプロモーターのみが変異された場合に，グルタミン酸の生産性が上昇することを当業者は理解できない。

15

したがって，本件特許１の請求項１について，染色体上のＩＣＤＨ遺伝子又はＰ
ＤＨ遺伝子のプロモーターに変異を導入したコリネ型細菌を用いるグルタミン酸の製造方法に関し，発明の詳細な説明は，その収率が向上できる程度に十分かつ明確に記載されていない。また，当業者は，上記実施例，本件明細書１のその他の記載
及び技術常識を参照しても，請求項１に記載された様々な変異の組合せをコリネ型

20

細菌の染色体上のＩＣＤＨ遺伝子又はＰＤＨ遺伝子のプロモーター配列の－３５領域及び／又は－１０領域に導入することによって，発明の課題を解決できることを認識できない。
イ

アルギニンの製造方法について

前記(1)イのＧＤＨ遺伝子のプロモーターと同様に，染色体上のＩＣＤＨ遺伝子25

又はＰＤＨ遺伝子のプロモーターへの変異導入によってアルギニンの生産性がどのように変化するのかについては，本件明細書１には何ら具体的に記載されていない

59

から，本件特許１の請求項１につき，染色体上のＩＣＤＨ遺伝子又はＰＤＨ遺伝子のプロモーター配列に変異を導入したコリネ型細菌を用いるアルギニンの製造方法に関して，実施可能要件及びサポート要件は満たされていない。

5(4)

アルギニノコハク酸シンターゼ遺伝子のプロモーターへの変異導入についアグルタミン酸の製造方法についてて本件明細書１には，アルギニノコハク酸シンターゼ遺伝子のプロモーターの－３５領域及び／又は－１０領域へ変異を導入することによって，グルタミン酸の生産性がどのように変化するのかについて，何ら具体的に記載されていない。
10

したがって，本件特許１の請求項１について，染色体上のアルギニノコハク酸シンターゼ遺伝子のプロモーター配列に変異を導入したコリネ型細菌を用いるグルタ
ミン酸の製造方法に関し，発明の詳細な説明は，その収率が向上できる程度に十分かつ明確に記載されていない。また，当業者は，本件明細書１の記載及び技術常識を参照しても，請求項１に記載された様々な変異を染色体上のアルギニノコハク酸

15

シンターゼ遺伝子のプロモーター配列に導入することによって，発明の課題を解決できることを認識できない。
イ

アルギニンの製造方法について

本件明細書１には，アルギニノコハク酸シンターゼ遺伝子のプロモーターの変異がアルギニンの生産性に及ぼす影響について，わずか２つの具体例が示されている
20のみであるし，その実施例には，アルギニノコハク酸シンターゼ遺伝子のプロモー
ターの変異によりアルギニンの生産性が上昇しないものも含まれている。
したがって，本件特許１の請求項１について，染色体上のアルギニノコハク酸シンターゼ遺伝子のプロモーター配列に変異を導入したコリネ型細菌を用いるアルギ
ニンの製造方法に関し，発明の詳細な説明は，その収率が向上できる程度に十分か

25

つ明確に記載されていない。また，本件明細書１のその他の記載及び技術常識を併せて参酌しても，請求項１に記載されたいずれかの変異の組み合わせをコリネ型細60

菌の染色体上のアルギニノコハク酸シンターゼ遺伝子のプロモーターに導入することによって，発明の課題を解決できることを認識できない。
(5)

コリネバクテリウム・グルタミカム野生株ＡＴＣＣ１３８６９のプロモー

ター配列について
5

本件明細書１の段落【００２５】には，配列番号１ないし６のプロモーター配列が開示されており，これらの配列はコリネバクテリウム・グルタミカムの野生株Ａ
ＴＣＣ１３８６９に由来するとの記載がある。
しかし，上記配列番号１と，原告が提出する甲第２２号証に記載された野生株Ａ
ＴＣＣ１３８６９の配列は，－３５領域と－１０領域の間，－１０領域よりも３’

10

末端側の２か所で異なっており，本件明細書１の実験は，野生株ＡＴＣＣ１３８６
９ではなく，別の菌株に基づいて行われたものといわざるを得ない。したがって，
本件明細書１は，少なくともＧＤＨ遺伝子に関し，野生株のプロモーター配列を変異させたことによる活性の変化を実証したものとはいえない。
この点からも，本件発明１について，実施可能要件及びサポート要件は満たされ

15

ていない。
(6)

プロモーターの－３５領域及び－１０領域の周辺領域について

本件発明１においては，遺伝子のプロモーターの－３５領域及び／又は－１０領
域に，特定の変異を導入することが規定されているが，当該－３５領域と－１０領
域の間の領域，－３５領域の上流領域及び－１０領域の下流領域（以下，併せて「－
20

３５領域及び－１０領域の周辺領域」という。）の配列は，いずれも特定されていない。
－３５領域及び－１０領域の周辺領域の配列や長さはプロモーター活性に大きく影響することが知られているが，本件明細書１では，これらの領域の配列についての具体例は配列番号１における記載しかされていない。

25

したがって，本件発明１について，本件明細書１における発明の詳細な説明は，グルタミン酸又はアルギニンの収率が向上できる程度に十分かつ明確に記載されて61

いない。また，本件明細書１の実施例及びその他の記載，並びに技術常識を参照しても，－３５領域及び－１０領域の周辺領域を任意の配列や長さにした場合に，グルタミン酸又はアルギニンの生産性が上昇することを当業者は認識できない。
【原告の主張】5

本件発明１について，実施可能要件及びサポート要件の違反はない。
(1)

各種の遺伝子のプロモーターへの変異導入について

本件発明１の各種の遺伝子のプロモーターへの変異導入について，本件明細書１には，ＧＤＨ遺伝子については実施例１，２及び７に，ＣＳ遺伝子については実施
例３に，ＩＣＤＨ遺伝子については実施例４に，ＰＤＨ遺伝子については実施例５
10に，アルギニノコハク酸シンターゼについては実施例６に，それぞれ当業者が実施可能な程度に十分かつ明確に記載されており，この点の実施可能要件違反及びサポート要件違反はない。
(2)

コリネバクテリウム・グルタミカム野生株ＡＴＣＣ１３８６９のプロモー

ター配列について
15

被告は，本件明細書１の段落【００２５】に記載された配列と，甲第２２号証に記載されたＡＴＣＣ１３８６９の配列が異なると指摘するが，段落【００２５】に記載の配列はプロモーターに変異を導入したプラスミドが有する配列であり，これらの変異が及ぼす影響を予測するために行った予備的実験にすぎない。
実施例２で用いた菌株の配列は表６に記載されており，そこでは被告が指摘する

20－３５領域と－１０領域の間の配列の違いはない。
また，段落【００２５】に記載された配列のうち，－１０領域よりも３’末端側の配列の違いについては，本件明細書１には本件優先日１当時知られていたＡＴＣＣ１３８６９の配列を記載していたところ，甲第２２号証では，その後に判明した
ＡＴＣＣ１３８６９の配列を記載していることによるものである。

25

被告の指摘する点から，本件明細書１の実施例がＡＴＣＣ１３８６９とは別の菌株に基づいて行われたものとはいえない。

62

(3)

プロモーターの－３５領域及び－１０領域の周辺領域について

本件発明１は，－３５領域及び－１０領域の周辺領域の配列や長さを発明特定事項とするものではなく，これらの領域の配列や長さについては，当業者であれば，技術常識に基づき容易に理解できるから，これらの領域について本件明細書１にい5かなる記載がされているかは，本件発明１の実施可能要件，サポート要件に関わるものではない。
８

争点４－１（本件発明２についての乙４２発明による新規性欠如の有無）について【被告の主張】10

乙４２文献には，本件特許２の請求項１及び１０のコリネ型細菌の発明が開示されている。したがって，本件特許２の請求項１及び１０を引用する本件発明２－５についても，新規性を欠き，無効とされるべきものである（特許法第１２３条１項
２号，２９条１第３号）。
(1)15乙４２発明について

乙４２文献には，本件明細書２の配列番号８４から，その１ないし４２番目のア
ミノ酸が欠失したコリネバクテリウム属に属するコリネバクテリウム・グルタミカ
ム（乙４２発明）が開示されている。
したがって，乙４２文献には，本件特許２の請求項１の（ｉｉ）に記載された配列番号８４の１ないし２３番目のアミノ酸が欠失されたアミノ酸配列を有するＬ－

20

グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌であり，請求項１０に記載されたコリネ型細菌が開示されているといえる。
(2)

原告の主張についてア

対象外のアミノ酸の欠失について

本件発明２－１においては，変異対象とされた領域以外の領域について何ら言及
25

されていないから，乙４２発明において，配列番号８４について，２４ないし４２番目のアミノ酸が欠失していることは，本件発明２－１との同一性を否定するもの

63

ではない。
イ

グルタミン酸生産能の向上について

本件発明２－１には「変異型ｙｇｇＢ遺伝子が導入されたことにより非改変株と比較してＬ－グルタミン酸生産能が向上した」との特定（構成要件２－Ｂ）がある
5が，当該事項は構成要件２－Ｃのコリネ型細菌の特性・機能を説明しているにすぎず，構成要件２－Ｃを満たすコリネ型細菌を更に限定するものではない。したがって，構成要件２－Ｂは，乙４２発明と本件発明２－１の相違点の根拠とはならない。
ウ

翻訳開始点の誤認について

乙４２発明における，配列番号８４のアミノ酸配列からアミノ酸が欠失している
10のは翻訳開始点の誤認が原因であるとの原告の主張は根拠がない。
【原告の主張】本件発明２－１，２－５は，乙４２発明と同一ではなく，新規性欠如の主張は理
由がない。
(1)

15

対象外のアミノ酸の欠失について

被告は，乙４２発明において，配列番号８４の配列から１ないし４２番目のアミノ酸が欠失していると主張するところ，これは，本件発明２－１が変異対象の領域として限定している範囲外の２４ないし４２番目のアミノ酸も欠失しているものであり，本件発明２－１のコリネ型細菌には当たらない。
しかも，構成要件２－Ｃの(ii)は，変異対象の領域における「１若しくは数個」

20のアミノ酸の欠失とされているから，１ないし２３番目のアミノ酸の全てが欠失している点でも，乙４２発明は本件発明２－１とは異なる。
(2)グルタミン酸生産能の向上について

乙４２発明のコリネ型細菌は，その有するグルタミン酸生産能の評価が全くされておらず，グルタミン酸生産能が向上した（構成要件２－Ｂ）を満たすものではな
25

い。
(3)

翻訳開始点の誤認について

64

乙４２文献に記載されたアミノ酸配列は野生型の菌株由来のものであり，配列番
号８４のアミノ酸配列から１ないし４２番目のアミノ酸が欠失しているのは，配列の推定の際に翻訳開始点の位置を誤認したことが原因と考えられる。したがって，
そもそも，乙４２文献は，変異型ｙｇｇＢ遺伝子が導入されたコリネ型細菌を開示5するものではない。
９

争点４－２（本件発明２についての乙２４発明を主引例とする進歩性欠如の有無）について【被告の主張】本件発明２－５は，乙２４発明等に基づいて当業者が容易に発明することができ10たものであり，従来予測し得なかった顕著な効果を有するものではないから，進歩性を欠き，無効とされるべきものである（特許法１２３条１項２号，２９条２項）。
(1)乙２４発明について

乙２４文献には以下の発明（乙２４発明）が記載されている。
「グルタミン酸の排出に関わる，Ｅ．ｃｏｌｉのＭｓｃＳとの類似性が示唆され
15

る浸透圧調節チャネルを有する，コリネバクテリウム・グルタミカム」の発明
なお，乙２４文献に記載された，ＭｓｃＳとは，Ｅ．ｃｏｌｉの機械受容チャネル（メカノセンシティブチャネルとも呼ばれる。）の一つである。
原告は，乙２４文献には，グルタミン酸排出は浸透圧に依存するのではない旨が記載されていると主張するが，乙２４文献は，グルタミン酸の浸透圧変化による排20出を否定しているわけではなく，他の溶質との比較において，グルタミン酸の浸透圧変化による排出が制限されていると記載しているにすぎない。
(2)

請求項１を引用する本件発明２－５の進歩性について

ア

請求項１を引用する本件発明２－５と乙２４発明との対比

本件特許２の請求項１を引用する本件発明２－５と乙２４発明とを対比すると，
25

両者は，相違点１及び２で相違する。
相違点１

本件発明２－５は，コリネ型細菌を培地で培養し，グルタミン酸を該

65

培地中又は菌体内に生成蓄積させ，該培地又は菌体からグルタミン酸を回収することを特徴とするグルタミン酸の製造方法の発明であるのに対し，乙２４発明はコリ
ネ型細菌の発明である。
相違点２
5

本件発明２－５では，コリネ型細菌に変異型ｙｇｇＢ遺伝子が導入されており，その変異型ｙｇｇＢ遺伝子には，請求項１の（ｉ），（ｉ’），（ｉ’’），又は（ｉｉ）の変異が導入され，非改変株と比較してグルタミン酸の生産能力が向上したのに対し，乙２４発明のコリネ型細菌では，ｙｇｇＢ遺伝子が特定されておらずグルタミン酸の生産能力が特定されていない。

10

イ

相違点に係る構成の容易想到性(ｱ)

相違点１についてコリネ型細菌を用いてグルタミン酸を製造するために。コリネ型細菌を培地中で培養し，培地中にグルタミン酸を蓄積させ，これを回収することは技術常識から当然に行われることである（乙９）。相違点１の構成を採用することは，当業者が容易に想到し得た事項である。
15(ｲ)

相違点２についてコリネ型細菌を用いてグルタミン酸を生産するに際し，生成したアミノ酸の菌体
内での過剰蓄積や菌体外への排出がボトルネックとなっていることは広く知られており，アミノ酸生産能を高めるため，アミノ酸を菌体外に効率的に排出することは周知の課題であった。
20

グルタミン酸生産能を有することが周知であったコリネ型細菌について，グルタミン酸の生産性を高めるという周知の課題を解決するために，重要な問題として認識されていた菌体内のグルタミン酸の菌体外への排出に着目し，コリネ型細菌のグ
ルタミン酸の排出能を増強することは，当業者が容易に試みる事項である。その際，グルタミン酸の排出能を有する浸透圧調節チャネルを標的として選択し，それによ25るグルタミン酸の排出効率を高めることは当然である。
乙２６文献及び乙４１文献には，コリネバクテリウム・グルタミカムが，Ｅ．ｃ

66

ｏｌｉのＹｇｇＢ（ＭｓｃＳと同義である。）のホモログを有していること，本件明細書２の配列番号８４及び８５と一致するｙｇｇＢ遺伝子のアミノ酸配列（Ｃｇｌ１２７０のアミノ酸配列）が開示されていた。
また，乙２９文献，乙３０発明及び乙３１発明には，Ｅ．ｃｏｌｉにおいて，Ｙ
5ｇｇＢの膜貫通領域のアミノ酸に変異を加えるとチャネルが開いた状態（ＧＯＦ）
が実現し，細胞内の溶質が外部に容易に排出されること，排出効率を高める手段としてＹｇｇＢの第三膜貫通領域（ＴＭ３。おおよそ９６－１２７番目のアミノ酸）に変異を導入することが開示されていた。
したがって，グルタミン酸の排出効率を高めることを目的として，乙２４発明に

10

上記の各文献及び技術常識を適用して，乙２４発明のコリネバクテリウム・グルタ
ミカムのｙｇｇＢ遺伝子のアミノ酸配列をＣｇｌ１２７０に特定し（乙２６文献），
その際，ＴＭ３のアミノ酸を変異させ（乙３０発明，乙３１発明），相違点２の構成を採用することは，当業者が容易に想到し得た事項である。

15

(3)

請求項４を引用する本件発明２－５の進歩性について

ア

請求項４を引用する本件発明２－５と乙２４発明との対比

本件特許２の請求項４を引用する本件発明２－５と乙２４発明とを対比すると，両者は，前記の相違点１及び２に加え，次の相違点３で相違する。
相違点３

請求項４を引用する本件発明２－５では，相違点２のうち（ｉｉ）の変異は，配列番号６，６２，６８，８４もしくは８５のアミノ酸配列において，１20００位のアラニン及び／または１１１位のアラニンを他のアミノ酸に置換する変異であるのに対し，乙２４発明ではこの特定がされていない。
イ

相違点に係る構成の容易想到性(ｱ)

相違点１，２について

前記(2)イのとおりである。
25(ｲ)

相違点３について前記(2)イ(ｲ)と同様の理由のほか，以下の理由からも，相違点３の構成を採用す

67

ることは，当業者が容易に想到し得た事項である。
ａ

ＹｇｇＢにおいて，以下のアミノ酸の置換を行うことにより，ＹｇｇＢのチャネルが開いた状態（ＧＯＦ）になることが知られている。
９３番目のスレオニン
5

１０１番目のグリシン
１０２番目のアラニン
１０５番目のロイシン
１０６番目のアラニン
乙３１文献によれば，これらのアミノ酸は，ＹｇｇＢのチャネルの疎水性ポア形

10成に関わり，細胞内の溶質の排出に寄与する部分である，第三膜貫通領域（ＴＭ３）のうちＡ部分を構成する９６－１１３番目のアミノ酸領域に存在し，１０２番目のアラニン，１０５番目のロイシン，及び１０６番目のアラニンは，チャネルの遮へい等に関与している。
ｂ

15

そうすると，チャネルの開閉に関わり，ＹｇｇＢによるグルタミン酸などの溶質の排出に直接影響するＴＭ３のうちＡ部分を構成するアミノ酸（９６－１１３番目）に着目し，このうち，チャネルの遮へい等に関わるアラニン（１０２番目，
１０６番目）に着目してアミノ酸置換を行うことは，当業者が当然に試みる事項である。Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＹｇｇＢの１０２番目及び１０６番目のアラニンは，コリネ型細菌由来のＹｇｇＢ（Ｃｇｌ１２７０にコードされるアミノ酸，本件明細書

20２の配列番号８４に相当）における１００番目，１０３番目，１０５番目，１０６
番目，及び１１１番目のいずれかのアラニンに対応する（乙６８）から，相違点３の構成のように，１００番目又は１１１番目のアラニンについてアミノ酸置換を行うことは容易なことである。

25

(4)

請求項６を引用する本件発明２－５の進歩性について

ア

請求項６を引用する本件発明２－５と乙２４発明との対比

本件特許２の請求項６を引用する本件発明２－５と乙２４発明とを対比すると，

68

両者は，前記の相違点１及び２に加え，次の相違点４で相違する。
相違点４

請求項６を引用する本件発明２－５では，変異型ｙｇｇＢ遺伝子が，請求項６の（ａ）～（ｎ）より選ばれる変異型ｙｇｇＢ遺伝子であるのに対し，乙２４発明では，ｙｇｇＢ遺伝子が特定されていない。
5

イ

相違点に係る構成の容易想到性

相違点１，２については前記(2)イのとおりである。
配列番号８４のアミノ酸配列と配列番号６のアミノ酸配列は９９．０６％と高い相同性を有するところ，前記(2)イ(ｲ)と同様の理由で，配列番号６のアミノ酸配列を修飾して配列番号２２又は２４のアミノ酸配列（請求項６の(e)又は(g)）を採用
10することも容易である。
また，配列番号８４のアミノ酸配列に，１００番目のアラニンをスレオニンに置換する変異（Ａ１００Ｔ変異）を加えた配列は請求項６の(f)に含まれ，１１１番目のアラニンをバリンに置換する変異（以下「Ａ１１１Ｖ変異」という。）を加えた
配列は請求項６の(h)に含まれるところ，前記(3)イのとおり，配列番号８４のアミ15ノ酸配列にＡ１００Ｔ変異又はＡ１１１Ｖ変異を導入する構成を採用することは容易である。
したがって，相違点４の構成を採用することは，当業者が容易に想到し得た事項
である。
(5)

20

請求項１０を引用する本件発明２－５の進歩性について

本件特許２の請求項１０を引用する本件発明２－５のコリネ型細菌は，コリネバ
クテリウム属又はブレビバクテリウム属に属する。乙２４発明のコリネ型細菌（コリネバクテリウム・グルタミカムである。）も，コリネバクテリウム属に属する。
そのため，請求項１０で追加された構成要件は，乙２４発明との新たな相違点を生じさせるものではない。

25

したがって，前記(2)ないし(4)と同様に，請求項１０を引用する場合の本件発明
２－５も，当業者が容易に発明できたものである。

69

(6)

本件発明２－５の効果について

本件特許２の請求項１の変異は広い範囲に及ぶ。しかし，本件明細書２に開示されたコリネ型細菌の変異株のうち，実施例においてグルタミン酸の生産性が具体的に確認されたのは限られている。なお，実施例８については，グルタミン酸生産能5の向上を裏付けるものとはいえない。
したがって，本件発明２－５の効果は，その全範囲において格別顕著なものとはいえないから，進歩性の判断において考慮することはできない【原告の主張】本件発明２－５は，乙２４発明等に基づいて当業者が容易に想到し得るものでは

10

なく，乙２４発明を主引例とする進歩性欠如の主張は理由がない(1)

乙２４発明について

乙２４文献には，コリネバクテリウム・グルタミカムについて，研究の対象とされた浸透圧調節チャネルは，グルタミン酸の排出チャネルとは異なるものであり，グルタミン酸排出は浸透圧に依存するのではなく，エネルギー依存性の特定のキャ
15

リアシステムによりなされていることが開示されている。
したがって，乙２４発明は，「グルタミン酸の排出とは無関係であることが明らかな，Ｅ．ｃｏｌｉのＭｓｃＳとの類似性が示唆させる浸透圧調節チャネルを有す
る，コリネバクテリウム・グルタミカム」の発明であるというべきである。

20

(2)

請求項１を引用する本件発明２－５の進歩性について

ア

相違点１について

被告主張の相違点１について，当業者が容易に想到し得たことは認める。
イ

相違点２について(ｱ)

乙２４発明として開示されている事項は，グルタミン酸排出とは関係のないことが明らかなコリネ型細菌中の浸透圧調節チャネルであり，乙２４発明におい25ては，本件特許２の請求項１に記載されたグルタミン酸チャネルであるｙｇｇＢ遺伝子及びその変異体を導入するという構成を当業者が採用する動機付け及びその示

70

唆等は全くない。
(ｲ)

被告が副引例として引用する乙２６文献，乙４１文献，乙２９文献，乙３０

文献及び乙３１文献には，コリネバクテリウム・グルタミカムのＹｇｇＢがメカノ
センシティブチャネルとしてグルタミン酸を溶質として排出する機能を有すること
5を示唆する記載はなく，また，Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）とコリネバクテリウム・グ
ルタミカムのメカノセンシティブチャネルの構成及びＹｇｇＢタンパク質の大きさがいずれも異なっていることが明確に示されている。
(ｳ)

仮に，グルタミン酸生産能を有することが周知であったコリネ型細菌について，グルタミン酸の生産性を高めるという周知の課題が存在していたとしても，
10

前記(ｱ)及び(ｲ)からすれば，その解決手段として，前記の乙２４発明に被告が主張する副引例を適用して，相違点２の構成に想到することは容易ではない。
(3)

請求項４又は６を引用する本件発明２－５の進歩性について

前記(2)イと同様の理由で，被告主張の相違点２ないし４の構成に想到することは容易ではない。
15(4)

請求項１０を引用する本件発明２－５の進歩性について

前記(2)イ及び(3)のとおり，被告主張の相違点２ないし４に係る構成に想到するのは容易ではないから,請求項１０を引用する本件発明２－５についても，乙２４発明から容易に発明できたものではない。
(5)20

本件発明２－５の効果について

本件発明２－５については，被告がその主張の根拠として引用する主引例及び副引例から容易想到であったと認められる余地はないことから，そもそも効果の点を
本件発明２－５の進歩性判断において考慮する必要はない。
なお，本件発明２－５は本件明細書２記載の各実施例により裏付けがなされており，実施例８についても，グルタミン酸生産能の向上を示しており，かつ，追試可

25

能なものであるから，この点の被告の主張も理由がない。
１０

争点４－３（本件発明２についての実施可能要件違反・サポート要件違反

71

の有無）について【被告の主張】本件明細書２の発明の詳細な説明の記載は，以下の点で，特許法３６条４項１号に規定された要件（実施可能要件）を満たしていないものであり，本件発明２－５5は同法第１２３条１項４号の規定により無効とされるべきである。
また，本件発明２－５は，以下の点で，同法３６条６項１号に規定された要件（サポート要件）を満たしていないものであり，同法第１２３条１項４号の規定により無効とされるべきである。

10

(1)

培養条件について

ア

実施例８によれば，請求項１，４，６及び１０のコリネ型細菌を通常の条件で培養してもグルタミン酸の生産能力は向上しないといえる。本件明細書２の実施
例１０によれば，請求項１，４，６及び１０のコリネ型細菌は，Ｔｗｅｅｎ４０を添加した条件又はＢｉｏｔｉｎ制限条件という特定の条件（以下，これらの条件を「誘導条件」といい，これらの条件をいずれも満たさないという条件を「非誘導条15件」という。）の下でのみ，グルタミン酸生産能が向上するものである。この点は第三者が行った実験（乙４４）によっても証明された。
したがって，グルタミン酸生産能力を向上させるという本件発明２－５の課題は，誘導条件下でのみ解決できるが，請求項１１には，これらの条件が加えられておらず，通常の培養による製造法が記載されているにすぎないから，請求項１１に記載20された本件発明２－５は課題を解決できない範囲に及ぶものであり，サポート要件を満たさない。さらに，本件明細書２の発明の詳細な説明は，当業者が非誘導条件
下でグルタミン酸の生産能力を向上させて発明を実施できるよう記載されていないから，実施可能要件も満たされていない。

25

イ

実施例８について(ｱ)

実施例８では，非誘導条件下で，野生株と１９型変異を導入した菌株（請求項１の(ii)，請求項４，請求項６の(e)の菌株に当たる）とのグルタミン酸生産量が72

比較されているが，段落【０１２１】の【表７】のとおり，グルタミン酸の生産量
は前者が０．５ｇ／Ｌ，後者が０．７ｇ／Ｌであった。実施例２，実施例３の結果に照らせば，１９型変異を導入した株の生産量の絶対値はブランクの値と一致する
ような極めて低いものであり，野生型との上記０．２ｇ／Ｌの差も誤差の範囲内に5過ぎず，非誘導条件下で，１９型変異を導入することによってグルタミン酸の生産能力が向上したとはいえない。
(ｲ)

乙第４４号証の実験について，原告は，乙第４４号証の培養実験では，当業者が技術常識として通常用いる培養条件と大きく異なる条件，特に坂口フラスコではなく三角フラスコを用いて低速で10の撹拌培養を行うとの条件を採用し，培養を行った結果，実施例８に記載の結果を再現できなかったと主張する。
しかし，実施例８の培養は，実施例２の条件に沿って行われており（本件明細書
２の段落【０１２０】），実施例２ではフラスコの種類を特定していない。原告は，実施例１５で坂口フラスコを用いたと主張するが，実施例１５は実施例８の培養条

15

件とは関係がない。実施例２や実施例８では「フラスコ培地」との記載しかなされておらず，「坂口フラスコ」の明示はなく，「坂口フラスコ」を用いることが周知であるといえる証拠の提出もない。
また，本件明細書２の実施例８は振とう速度の指定もされておらず，三角フラス
コを用いるのであれば２８０ｒｐｍ以上の振とう速度を用いるべきとの技術常識は20立証されていない。
(2)

請求項１の(i)，(i')の変異について

ア

請求項１の(i)について

請求項１の(i)の変異が導入されたコリネ型細菌及びそのグルタミン酸の生産性は，本件明細書２の発明の詳細な説明には記載されていない。
25

イ

請求項１の(i')の変異について

本件明細書２において，請求項１の(i')の変異が導入され，グルタミン酸の生産

73

性向上が実際に確認されたコリネ型細菌は，実施例５及び６に使用されたコリネ型細菌のみである。これは，配列番号６のアミノ酸配列の４１９番目から下流のアミノ酸が欠失され，そのＣ末端側に５つのアミノ酸よりなるインサーションシークエ
ンスが挿入された変異型ｙｇｇＢ遺伝子が導入されたコリネ型細菌であり，変異後5のアミノ酸配列番号が配列番号８となるものである（以下，この変異型ｙｇｇＢ遺伝子に導入された変異を「２Ａ－１型変異」という。）。
しかしながら，それ以外の４１９番目から５２９番目のアミノ酸の任意の位置に任意の長さ及び配列のインサーションシークエンス又はトランスポゾンが挿入された変異型ｙｇｇＢ遺伝子を有するコリネ型細菌，及びそのグルタミン酸の生産能は

10

具体的に示されていない。このような変異型ｙｇｇＢ遺伝子を有するコリネ型細菌が，実施例に示された２Ａ－１型変異が導入されたコリネ型細菌と同等のグルタミン酸の生産性を有すると理解することはできない。
ウ

前記ア及びイによれば，本件明細書２の発明の詳細な説明は，請求項１の（ｉ）及び（ｉ’）の変異により，グルタミン酸の生産性が向上することが理解できる程15

度に明確かつ十分に記載されておらず，また，本件明細書２の記載から，請求項１の（ｉ）及び(i')の変異により，グルタミン酸の生産能力向上という発明の課題が解決できることを認識できない。したがって，請求項１を引用する本件発明２－５は，この点で実施可能要件及びサポート要件を満たさない。
原告は，２Ａ－１型変異が開示されていることによって，請求項１の（ⅰ）及び20（ⅰ’）のいずれについてもサポート要件違反はないと主張するが，２Ａ－１型変
異は，４１９－５３３番目のアミノ酸をインサーションシークエンス配列に置き換えた「置換」であり，「欠失」や「挿入」の態様はサポートされていない。

25

(3)

請求項１の(i'')の変異について

ア

請求項１の(i'')の変異において，置換の対象となり得るプロリンは多数存在している。しかし，本件明細書２の発明の詳細な説明において変異株として取得
され，グルタミン酸の生産性が実際に確認されているのは，実施例１３の４３７番

74

目のプロリンがセリンに置換された変異ｙｇｇＢ遺伝子（変異後のアミノ酸配列は
配列番号７４。以下，この変異型ｙｇｇＢ遺伝子に導入された変異を「２２型変異」という。）が導入されたコリネ型細菌のみである。
なお，実施例１２の配列番号６８のアミノ酸配列の４２４番目のプロリンがロイ5シンに置換された変異型ｙｇｇＢ遺伝子（変異後のアミノ酸配列は配列番号７０。
以下，この変異型ｙｇｇＢ遺伝子に導入された変異を「６６型変異」という。）が導入されたコリネ型細菌については，グルタミン酸の生産性は確認されていない。
タンパク質に変異を導入する場合，同じ変異であっても，導入する位置が異なれば結果が異なるものである。

10イ

このように本件明細書２の発明の詳細な説明は，請求項１の(i'')の変異により，グルタミン酸の生産性が向上することが理解できる程度に明確かつ十分に記載されておらず，また，本件明細書２の記載から，請求項１の(i'')の変異により，
グルタミン酸の生産能力向上という発明の課題が解決できることを認識できない。
したがって，請求項１を引用する本件発明２－５は，この点で実施可能要件及びサ
15

ポート要件を満たさない。
(4)

請求項１の(ii)の変異（膜貫通領域の変異）について

ア

請求項１の(ii)の変異（膜貫通領域の変異）について，本件明細書２の発明の詳細な説明に具体的に記載されているのは，以下の４つのみであり，それ以外の態様については具体的に示されていない。そして，このうちグルタミン酸の生産性
20が具体的に確認された変異は，実施例７と実施例９に係るもののみである。前記(1)イのとおり，実施例８については，グルタミン酸生産性の向上を示すものではない。
また，請求項１の(ii)の変異で特定されている領域の任意の位置にある１から数個のアミノ酸をその他の任意のアミノ酸に置換等した場合に共通して起こるメカニ
ズム等については説明されていない。

25

実施例７

配列番号６のアミノ酸配列の１４番目のロイシンと１５番目のトリプ

トファンの間に３アミノ酸からなるインサーションシークエンスが挿入された変異75

（変異後のアミノ酸配列番号は２０。以下，この変異を「Ａ１型変異」という。）
実施例８

配列番号６のアミノ酸配列の１００番目のアラニンがスレオニンに置換された変異（変異後のアミノ酸配列番号は２２。１９型変異）
実施例９5

配列番号６のアミノ酸配列の１１１番目のアラニンがバリンに置換された変異（変異後のアミノ酸配列番号は２４。以下，この変異を「Ｌ３０型変異」
という。）
実施例１１

配列番号６２のアミノ酸配列の１１１番目のアラニンがスレオニンに置換された変異（変異後のアミノ酸配列番号は６４。以下，この変異を「８型変異」という。）
10イ

このように本件明細書２の発明の詳細な説明は，請求項１の(ii)の変異により，グルタミン酸の生産性が向上することが理解できる程度に明確かつ十分に記載されておらず，また，本件明細書２の記載から，請求項１の(ii) の変異により，グルタミン酸の生産能力向上という発明の課題が解決できることを認識できない。したがって，請求項１を引用する本件発明２－５は，この点で実施可能要件及びサポ
15

ート要件を満たさない。
(5)

配列番号８５について

ア

請求項１の(i)，(i’)，(i’’)及び(ii)に記載された配列番号８５は，配列番号６の複数箇所でアミノ酸の置換又は欠失（Ｘａａ）が起こったものである（本件明細書２の【００３５】）。
20発明の詳細な説明において，野生型ＹｇｇＢタンパク質として具体的に示されているのは，配列番号６，６８，８４及び６２のみであり，配列番号６の上記の箇所のアミノ酸に対して，任意のアミノ酸への置換又は欠失を行ったことは，具体的に示されていない。そして，このような置換又は欠失の場合に共通して起こるメカニ
ズム等については，本件明細書２には説明されていない。

25

タンパク質に変異を導入する場合，同じ変異であっても，導入する位置が異なれば結果が異なるものであり，配列番号６の複数箇所において，任意のアミノ酸で置

76

換した場合や欠失させた場合に，そもそもｙｇｇＢタンパク質として機能するのか
当業者は認識することができない。ましてや，そのような置換や欠失が導入された
アミノ酸配列に対して，請求項１の(i)，(i’)，(i’’)，又は(ii)で規定されるような変異をさらに導入した場合に，グルタミン酸の生産性が向上することを当業者
5は認識することができない。
イ

したがって，本件明細書２の発明の詳細な説明は，配列番号８５に対して請求項１の(i)，(i')，(i'')又は（ii）で規定されるような変異を行うことにより，グルタミン酸の生産性が向上することが理解できる程度に明確かつ十分に記載されておらず，また，本件明細書２の記載から，配列番号８５にこれらの変異を加える
10

ことにより，グルタミン酸の生産能力向上という発明の課題が解決できることを認識できない。したがって，請求項１を引用する本件発明２－５は，この点で実施可能要件及びサポート要件を満たさない。

15

(6)

請求項４の変異について

ア

請求項４の変異について，本件明細書２の発明の詳細な説明に具体的に記載されているのは，実施例８の１９型変異，実施例９のＬ３０型変異及び実施例１１の８型変異のみであり，それ以外の態様については具体的に示されていない。前記(1)イのとおり，実施例８については，グルタミン酸生産性の向上を示すものではない。
また，本件明細書２には，１００番目及び／又は１１１番目のアラニンを任意の20アミノ酸に置換した場合に共通して起こるメカニズム等については説明されていない。
イ

このように本件明細書２の発明の詳細な説明は，請求項４に記載された，配列番号６等の１００番目及び／又は１１１番目のアラニンの任意のアミノ酸への置換により，Ｌ－グルタミン酸の生産性が向上することが理解できる程度に明確かつ25十分に記載されておらず，また，本件明細書２の記載から，請求項４の変異により，
グルタミン酸の生産能力向上という発明の課題が解決できることを認識できない。

77したがって，請求項４を引用する本件発明２－５は，この点で実施可能要件及びサポート要件を満たさない。

5(7)

請求項６の変異について

ア

請求項６の(b)には，配列番号８の変異型ＹｇｇＢタンパク質を基礎として，

１ないし５個のアミノ酸の範囲で置換，欠失，挿入，又は付加により更なる変異が導入されたＹｇｇＢタンパク質をコードする遺伝子が含まれる。しかし，配列番号８のアミノ酸にこのような更なる変異が導入されたアミノ酸配列，それをコードする遺伝子，及び当該変異によるグルタミン酸の生産性に関して，本件明細書２は実質的に記載していない。

10

配列番号８のアミノ酸において，１～５個の任意のアミノ酸について置換又は欠失を行った場合，或いは任意の部位に１～５個の任意のアミノ酸を挿入又は付加した場合に，どのような変異タンパク質が，過剰量のビオチンを含む培地中でグルタミン酸の生産性向上をもたらすのか理解することはできない。
この点は，請求項６の（d），（f），（h），（j），（l）及び（n）についても

15同様である。
原告は，請求項６の(b)等に導入すべき変異に関し，保存度の低い（機能的に重要でない）アミノ酸に変異を導入すればＹｇｇＢは活性を維持する旨主張しているが，請求項６の(b)等は，変異を導入するアミノ酸の位置をそのようなアミノ酸に限定していない。

20イ

このように本件明細書２の発明の詳細な説明は，請求項６の(b)，(d)，（f），（h），（j），（l）及び（n）のＤＮＡを有する変異型ｙｇｇＢ遺伝子の導入により，グルタミン酸の生産性が向上することが理解できる程度に明確かつ十分に記載されておらず，また，本件明細書２の記載から，これらの変異型ｙｇｇＢ遺伝子の導入により，グルタミン酸の生産能力向上という発明の課題が解決できることを認
25

識できない。したがって，請求項６を引用する本件発明２－５は，この点で実施可能要件及びサポート要件を満たさない。

78

(8)

請求項１０の変異について

請求項１０を引用する場合の本件発明２－５の実施可能要件違反及びサポート要件違反については，請求項１，４及び６について述べた理由が当てはまる。

5(9)グルタミン酸の生成及び回収の方法（請求項１１）について

ア

請求項１１には「Ｌ－グルタミン酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ，該培地又は菌体からＬ－グルタミン酸を回収する」と記載されているが，グルタミン酸の生成は菌体内で行われ，培地中では行われず，培地中では，Ｌ－グルタミン酸の蓄積が行われるのみである。そして，グルタミン酸の回収について，本件明細書２の発明の詳細な説明の記載からは，グルタミン酸は培地のみから回収されてお10り，菌体からは回収されていないことが明らかである。
イ

このように，本件発明２－５のうち，グルタミン酸を培地中に生成させること，及び菌体からＬ－グルタミン酸を回収することについては，いずれも本件明細書２には記載されておらず，この点で，本件発明２－５は，実施可能要件及びサポート要件を満たさない。
15【原告の主張】本件発明２－５について，実施可能要件及びサポート要件の違反はない。
(1)

培養条件についてア

そもそも本件発明２の本質は，コリネ型細菌のｙｇｇＢ遺伝子の変異体の導入により，コリネ型細菌を改変し，それによりグルタミン酸の生産能を大幅に向上
20させることにより本件発明２の課題を解決するところにある。したがって，被告が主張するようなコリネ型細菌の培養条件といった好適条件は発明特定事項として課
題解決に必要な事項ではない。
また，下記イのとおり，実施例８の結果は，再現可能な非誘導条件下の１９型変異を導入した株によるコリネ型細菌のグルタミン酸生産能の向上を如実に示したも25のである。また，被告提出の乙第４４号証の実験についても，被告による培養条件の選択の誤りに基づき実施された結果，誤った結果を得たものであり，その主張の79

根拠とはならない。
したがって，本件発明２－５について，培養条件の記載に関し，サポート要件違反及び実施可能性要件違反はない。

5

イ

実施例８について(ｱ)

本件明細書２の実施例８の試験結果（段落【０１２１】表７）は，培養後のグルタミン酸濃度は野生型が０．５ｇ／Ｌであるのに対し，１９型変異を導入した
株は０．７ｇ／Ｌを示しており，１９型変異の導入によりグルタミン酸生産能が野生型の１．４倍になったことが明示されている。実施例８の結果は，１９型変異の導入によるグルタミン酸生産能の向上を如実に示すものであり，この結果は原告が10実施した非誘導条件下での再現実験（甲３７）でも再現されている。
被告は，１９型変異を導入した株の示したグルタミン酸濃度の値は，実施例２及び３でのブランク値（菌体を添加しない培地のみの測定結果）の数値と同程度であることから，１９型変異を導入した株のグルタミン酸生産能が極めて低いものと主張しているが，異なる培養条件下での実験間のブランク値，菌体量，生産されたグ15

ルタミン酸濃度やその誤差範囲等を絶対値により比較し，議論すること自体には何ら意味はなく，このことは，当業者にとっては周知の内容である。なお，実施例２
及び３のブランク値が示しているのは，菌体の培養のために栄養分として培地に添加した大豆加水分解物由来のグルタミン酸の値である。
(ｲ)20

乙第４４号証の実験について被告が実施例８の再現試験と主張する乙第４４号証の培養実験では，当業者がコリネ型細菌を用いてグルタミン酸の製造を行う際に技術常識として通常用いる培養条件と大きく異なる条件，特に，坂口フラスコではなく三角フラスコを用いて低速での撹拌培養を行うとの条件を採用し，培養を行った上で，ＹｇｇＢ変異体の評価を行った結果，実施例８に記載の結果を再現できなかったものと考えられる。

25

仮に，実施例８にフラスコの特定がなかったとしても，三角フラスコを用いて培養を行うのであれば，２８０ｒｐｍ以上の振とう速度を用いるべきことは，当業者

80

の技術常識（甲４１～４４）である。よって，三角フラスコを用いて１１５ｒｐｍという低速の振とう速度で培養を行った乙第４４号証の実験は当業者による実験とは評価し得ないものである。

5(2)

請求項１の(i)，(i')の変異について

ア

請求項１の(i)について

実施例５及び６の２Ａ－１型変異は，配列番号６のアミノ酸配列のアミノ酸番号
４１９―５３３のＹｇｇＢタンパク質のＣ末端側領域が，５個のアミノ酸に変換されたものであり，その変異の態様からすれば，実質的にはＹｇｇＢタンパク質のア
ミノ酸番号４１９以降のＣ末端領域が欠損した変異であると考えられる。
10

イ

請求項１の(i')について

実施例５及び６として，配列番号６のアミノ酸配列のアミノ酸番号４１９から下流部分のＣ末端側に，トランスポゾンによりインサーションシークエンスが挿入された２Ａ－１型変異を導入したコリネ型細菌のグルタミン酸生産能の向上を確認し
ている。
15

ウ

前記のとおり，２Ａ－１型変異は，その変異の態様からすれば，実質的にはＹｇｇＢタンパク質のアミノ酸番号４１９以降のＣ末端領域が「欠損」した変異であると考えられ，また，これは,Ｃ末端領域において５個のアミノ酸が「挿入」されたものであり，また，Ｃ末端領域が５個のアミノ酸に「置換」されたものでもある。
そして，当業者であれば，実施例５及び６の記載から，ＹｇｇＢタンパク質のア20ミノ酸番号４１９以降のＣ末端領域が欠損した変異について同様の効果が得られることを認識できるものであるから，請求項１の(i)及び(i')の変異に関して，本件発明２－５は実施可能要件及びサポート要件を満たしている。
(3)

請求項１の(i'')の変異について

本件明細書２には実施例１２及び１３として，アミノ酸番号４２４のプロリンを25置換した６６型変異，及びアミノ酸番号４３７のプロリンを置換した２２型変異が開示され，グルタミン酸生産能の向上の効果が確認されている。

81

プロリンについては，その側鎖分子内で環状構造をとるため，他のアミノ酸との間で水素結合ができないという他のアミノ酸とは異なる構造上の特徴があり，タン
パク質の立体構造形成に関与するといった特異な性質を有するアミノ酸であること
は，従前から周知の事項である（甲４４～４６）。
5

したがって，これらの点や，前記(2)の２Ａ－１型変異に係る記載から，当業者であれば，ＹｇｇＢタンパク質のアミノ酸番号４１９以降のＣ末端領域に存在するプ
ロリンを他のアミノ酸に置換することにより，当該領域のアミノ酸構造が改変され，これらの実施例と同様の効果が得られることを認識できるものであり，請求項１の(i'')の変異に関して，本件発明２－５は実施可能要件及びサポート要件を満たし

10

ている。
(4)

請求項１の(ii)の変異（膜貫通領域の変異）について

膜貫通領域に対する変異の導入によるアミノ酸生産能向上の効果については，本件明細書２の実施例７（Ａ１型変異），実施例８（１９型変異），実施例９（Ｌ３０型変異）及び実施例１１（８型変異）として開示されており，また，変異株の作
15

製方法，グルタミン酸生産能を向上させる変異株の評価方法等も詳細に記載がなされている。実施例８に関する被告の主張への反論は前記(1)イのとおりである。
当業者であれば，これらの実施例の記載に基づき，ＹｇｇＢの膜貫通領域への変異導入により，グルタミン酸生産能を向上させるような変異体の取得が可能である
ことを理解できる。また，実施例中の評価方法等の詳細な説明により，当業者が過20度の試行錯誤を経ずに容易にそのような変異体を取得することは可能である。
したがって，請求項１の(ii)の変異に関して，本件発明２－５は実施可能要件及びサポート要件を満たしている。
(5)

配列番号８５について

配列番号８５については，コリネ型細菌に保存されるＹｇｇＢタンパク質のアミ25ノ酸配列を示したものであり，配列番号６等で示すＹｇｇＢタンパク質のアミノ酸配列のうち，アミノ酸置換・欠失が起こっていてもよい箇所をＸａａで示したもの

82

である（段落【００３５】，【００３６】，【００７８】，【００７９】等）。
一般的に，一定の機能を有するタンパク質について，異なる種間において高度に保存されているアミノ酸は，タンパク質の機能に重要なものであると考えられている（甲４８）。配列番号８５として示されるこれらの情報は複数のｙｇｇＢ遺伝子
5の解析に基づき得られたものである（段落【００３４】等）。
当業者であれば，本件明細書２の各実施例の記載を踏まえ，配列番号８５についても，他の配列番号のｙｇｇＢ遺伝子と同様に，本件特許権２の請求項１の（ｉ），（ｉ’），（ｉ’’）又は（ii）を導入した場合に，グルタミン酸の生産性が向上することを認識できる。

10

したがって，配列番号８５に関し，本件発明２－５に，実施可能要件違反及びサ
ポート要件違反はない。
(6)

請求項４の変異について

請求項４に記載された，配列番号６等のアミノ酸配列において，１００位及び／又は１１１位のアラニンを他のアミノ酸に置換する変異については，特にスレオニ
15ン又はバリンに置換する変異に関し，それぞれ，実施例８の１９型変異，実施例９のＬ３０型変異及び実施例１１の８型変異として開示されている。実施例８に関する被告の主張への反論は前記(1)イのとおりである。
当業者であれば，本件明細書２の上記の各実施例の記載を踏まえ，配列番号６等のアミノ酸配列において，１００位及び／又は１１１位のアラニンを他のアミノ酸20に置換するような変異を導入した場合に，グルタミン酸の生産性が向上することを認識できる。
したがって，請求項４の変異に関し，本件発明２－５に，実施可能要件違反及びサポート要件違反はない。
(7)

25

請求項６の変異について

本件特許権２の請求項６の(b)の変異につき，ｙｇｇＢ遺伝子のアミノ酸配列のうち１～５個の任意のアミノ酸の置換，欠失，挿入又は付加について，当業者であ83

れば，本件明細書２記載の各実施例，配列番号８５等のアミノ酸配列情報や公知のコリネ型細菌のｙｇｇＢ遺伝子のアミノ酸配列の比較等の結果から得られる高度に保存されたアミノ酸配列等の情報から，変異を導入するとＹｇｇＢの活性が失われてしまうようなアミノ酸の位置等については理解することが可能である。前記(5)5のとおり，一般的に異なる種間のｙｇｇＢ遺伝子で共通し，高度に保存されているアミノ酸は，ＹｇｇＢタンパク質の機能に重要なものであり（甲４８），他方，共通性が低く，保存度の低いアミノ酸については，機能発現に関与している可能性が低く，そのようなアミノ酸については変異を導入しても活性自体は維持される可能性が高いことは，当業者にとって周知の事項である。

10

このことは請求項６の(d)，(f)，(h)，(j)，(l)及び(n)の変異についても同様である。
したがって，請求項６の変異に関し，本件発明２－５に，実施可能要件違反及びサポート要件違反はない。
(8)15

請求項１０の変異について

請求項１０を引用する場合の本件発明２－５についても，実施可能要件違反及びサポート要件違反がないことは，請求項１，４及び６について述べたとおりである。
(9)グルタミン酸の生成及び回収の方法（請求項１１）について

コリネ型細菌が培地中で培養され，菌体内でグルタミン酸を生産，蓄積し，培地中へ放出すること自体は，コリネ型細菌を用いたグルタミン酸の工業的生産が開始
20

された当時から，当業者にとり周知の事項であり（甲５，８，９等），また，コリ
ネ型細菌自体からもグルタミン酸を回収することについては，当業者であれば，容易に理解できるものである。
したがって，本件発明２－５に，この点の被告が主張する実施可能要件違反及びサポート要件違反はない。

25

１１

争点４－４（本件発明２についての明確性要件違反の有無）について【被告の主張】84

本件特許２の請求項６（本件発明２－３）には「過剰量のビオチン」と記載されているが，この「過剰量」とはいかなる量をいうのか不明である。
したがって，請求項６を引用する本件発明２－５は，不明確であるから，無効とされるべきものである（特許法第１２３条１項４号，３６条６項２号）。
5【原告の主張】本件明細書２の段落【００３２】には「過剰量のビオチン」に関する記載があり，この記載を踏まえれば，本件発明２－３の「過剰量のビオチン」の内容は明確であるから，明確性要件違反の主張は理由がない。
１２

10

争点５（本件特許１の訂正の再抗弁の成否）について【原告の主張】以下のとおり，被告製法１及び３は，本件訂正発明１の技術的範囲に属し，本件訂正１によって無効理由は解消されるから，本件発明１について訂正の再抗弁が成
立する。
(1)

15

被告製法１及び３が本件訂正発明１の技術的範囲に属することについて

被告製法１及び３と本件訂正発明１とを対比すると，別紙６－２被告製法１及び３と本件訂正発明１との対比のとおりとなり，被告製法１は，文言上，本件訂正発明１－１から１－３までの技術的範囲に属し，被告製法３は，文言上，本件訂正発明１－１の技術的範囲に属する。
(2)20

本件訂正発明１についての乙６発明を主引例とする進歩性欠如について

以下のとおり，本件訂正発明１について，乙６発明を主引例として進歩性がないとの無効理由は存在しない。
ＧＤＨ遺伝子のプロモーターの－３５領域をＴＴＧＴＣＡにすることを容易に想到し得なかったことは前記５【原告の主張】(2)ア(ｲ)のとおり，ＧＤＨ遺伝子又はＣＳ遺伝子のプロモーターの－１０領域をＴＡＴＡＡＴにすることを容易に想到し25得なかったことは前記５【原告の主張】(2)イのとおり，ＣＳ遺伝子のプロモーターの－３５領域をＴＴＧＡＣＡとすることを容易に想到し得なかったことは前記５85

【原告の主張】(2)ア(ｴ)のとおりである。
また，本件訂正発明１は，前記５【原告の主張】(2)エのとおり，従来予測し得なかった顕著な効果があるものである。
(3)
5

本件訂正発明１についての乙９発明を主引例とする進歩性欠如について

本件訂正発明１について，乙９発明を主引例として進歩性がないとの無効理由は存在しない。この点についての主張は，前記６【原告の主張】と同様である。
(4)

本件訂正発明１についての実施可能要件違反・サポート要件違反について

本件訂正発明１はアルギニンの製造方法並びにＩＣＤＨ遺伝子，ＰＤＨ遺伝子及びアルギニノコハク酸シンターゼ遺伝子に関する記載を含まないから，本件発明１10についての実施可能要件違反・サポート要件違反のうち，これらの記載に関するものは本件訂正発明１については理由がない。
また，本件訂正発明１のコリネ型細菌は，本件明細書１の実施例２，３及び７においてグルタミン酸生産能の向上を確認したコリネ型細菌変異株に限定されているから，ＧＤＨ遺伝子及びＣＳ遺伝子への変異の導入についても，実施可能要件違反

15・サポート要件違反はない。
ア

ＣＳ遺伝子のプロモーターに変異を導入したコリネ型細菌を用いるグルタミン酸の製造方法について
ＣＳ遺伝子のプロモーターの－１０領域にＴＡＴＡＡＴ配列を導入したコリネ型細菌を用いてグルタミン酸を製造する方法については，本件明細書１に実施例３が20記載されている。実施例３では，ＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列が同一の菌株において，ＣＳ遺伝子のプロモーター配列の－１０領域にＴＡＴＡＡＴ配列を導入すした菌株の方が，当該配列を導入していない菌株よりもグルタミン酸生産性が向上している。
被告は，ＣＳ遺伝子のみの活性を増強させてもグルタミン酸の生産性が向上しな

25

いことが知られていたと主張するが，被告が主張の根拠とする文献（乙８，３５）
は，いずれもプラスミドを用いたＣＳ遺伝子の増強を示しているものであり，染色86

体上のプロモーターの改変による本件訂正発明１－１の効果とは関係がない。
イ

プロモーターの－３５領域及び－１０領域の周辺領域について

この点についての実施可能要件違反及びサポート要件違反がないことは，前記７【原告の主張】(3)のとおりである。
5【被告の主張】本件訂正発明１には，依然として無効理由が存在し，訂正の再抗弁は成立しない。
(1)

被告製法１及び３が本件訂正発明１の技術的範囲に属することについて

原告の主張は争う。
(2)10

本件訂正発明１についての乙６発明を主引例とする進歩性欠如について

本件訂正発明１は，いずれも乙６発明を主引例とし，乙８文献，乙９文献，乙１０文献，乙１１文献，乙１２文献及び乙３５文献等に記載の発明に基づいて当業者が容易に発明することができたものであり，前記５【被告の主張】(2)イ(ｴ)のとおり，従来予測し得なかった顕著な効果を有するものではないから，進歩性を欠き，無効とされるべきものである。

15

ア

本件訂正発明１－１について(ｱ)

本件訂正発明１－１と乙６発明との対比

本件訂正発明１－１と乙６発明とを対比すると，両者は，相違点１’又は相違点
２’と相違点３で相違する。
相違点１’
20

本件訂正発明１－１のコリネ型細菌では，ＧＤＨ遺伝子のプロモー

ター配列の－３５領域にＴＴＧＴＣＡ配列，－１０領域にＴＡＴＡＡＴ配列が導入されているのに対し（１－Ａ’－１），乙６発明のコリネ型細菌は，ＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列の－３５領域にＴＧＧＴＣＡ配列，－１０領域にＣＡＴＡＡＴ
配列を有する。
相違点２’25

本件訂正発明１－１のコリネ型細菌では，ＣＳ遺伝子のプロモータ

ー配列の－１０領域にＴＡＴＡＡＴ配列が導入されているのに対し（１－Ａ’－２），
乙６発明のコリネ型細菌は，ＣＳ遺伝子のプロモーター配列の－１０領域にＴＡＧ

87

ＣＧＴ配列を有する。
相違点３

5

本件発明１－１との相違点３と同じ。

(ｲ)

相違点に係る構成の容易想到性

ａ

ＧＤＨ遺伝子のプロモーターの－３５領域をＴＴＧＴＣＡにすること（相違点１’）について
ＧＤＨ遺伝子のプロモーターの－３５領域をＴＴＧＴＣＡにすることを，当業者が容易に想到しうることは，前記５【被告の主張】(2)イ(ｱ)ｂ及びｃのとおりであ
る。
ｂ

10

ＧＤＨ遺伝子又はＣＳ遺伝子のプロモーターの－１０領域をＴＡＴＡＡＴにすること（相違点１’，２’）について
ＧＤＨ遺伝子又はＣＳ遺伝子のプロモーターの－１０領域をＴＡＴＡＡＴにすることを，当業者が容易に想到しうることは，前記５【被告の主張】(2)イ(ｲ)のとおりである。すなわち，乙６発明に記載されたコリネバクテリウム・グルタミカムのコンセンサス配列である「ＴＡＴ．ＡＴ」からＴＡＴＡＡＴを採用すること，Ｅ．

15

ｃｏｌｉのコンセンサス配列からＴＡＴＡＡＴを採用することは容易である。
さらには，乙６文献に記載された野生型のＧＤＨ遺伝子のプロモーターの－１０領域であるＣＡＴＡＡＴについて，コンセンサス配列に近づくように一文字目の「Ｃ」
を「Ｔ」に変異させることは容易であり，乙６文献に記載された野生型のＣＳ遺伝
子のプロモーターの－１０領域であるＴＡＧＣＧＴについて，コンセンサス配列に20

従い，３番目から５番目の「ＧＣＧ」を「ＴＡＡ」に変更することも容易であった。
また，乙６文献に記載された野生型のＣＳ遺伝子のプロモーターの－１０領域は，別の文献（乙８文献）の記載を参考とすれば「ＴＡＴＡＧＣ」と特定でき，コンセ
ンサス配列に従い，この５番目と６番目の「ＧＣ」を「ＡＴ」に変更することも容易であった。

25ｃ

相違点３についてこの点を当業者が容易に想到しうることは，前記５【被告の主張】(2)イ(ｳ)のと88

おりである。
イ

本件訂正発明１－２，１－３について

本件訂正発明１－２と乙６発明とは前記相違点１’と相違点３で相違し，本件訂正発明１－３と乙６発明とは前記相違点１’，相違点２’及び相違点３で相違し，
5

これらの相違点に係る構成を採用することが容易であることは前記アのとおりである。また，本件訂正発明１－３について，ＣＳ遺伝子のプロモーターの－３５領域をＴＴＧＡＣＡとすることが容易であることについては，前記５【被告の主張】(2)イ(ｱ)ｂ及びｄのとおりである。
(3)10

本件訂正発明１についての乙９発明を主引例とする進歩性欠如について

本件訂正発明１は，本件発明１は，いずれも乙９発明を主引例とし，乙６文献，
乙８文献，乙１０文献，乙１１文献，乙１２文献及び乙３５文献等に記載の発明に基づいて当業者が容易に発明することができたものであり，前記５【被告の主張】(2)イ(ｴ)のとおり，従来予測し得なかった顕著な効果を有するものではないから，進歩性を欠く。

15ア

本件訂正発明１－１について(ｱ)

本件訂正発明１－１と乙９発明との対比

本件訂正発明１－１と乙９発明とを対比すると，両者は，相違点１’又は相違点
２’で相違する。
相違点１’
20

本件訂正発明１－１のコリネ型細菌では，ＧＤＨ遺伝子のプロモー

ター配列の－３５領域にＴＴＧＴＣＡ配列，－１０領域にＴＡＴＡＡＴ配列が導入されているのに対し（１－Ａ’－１），乙９発明のコリネ型細菌では，ＧＤＨ遺伝
子のプロモーター配列に変異が導入されているものの，－３５領域及び－１０領域の配列が特定されていない。
相違点２’

25

本件訂正発明１－１のコリネ型細菌では，ＣＳ遺伝子のプロモータ

ー配列の－１０領域にＴＡＴＡＡＴ配列が導入されているのに対し（１－Ａ’－２），
乙９発明のコリネ型細菌では，ＣＳ遺伝子のプロモーター配列に変異が導入されて89

いるものの，－１０領域の配列が特定されていない。
(ｲ)

相違点に係る構成の容易想到性

ａ

ＧＤＨ遺伝子のプロモーターの－３５領域をＴＴＧＴＣＡにすること（相違点１’）について
5

ＧＤＨ遺伝子のプロモーターの－３５領域をＴＴＧＴＣＡにすることを，当業者が容易に想到しうることは，前記６【被告の主張】(2)イ(ｱ)ｃ及び前記(2)ア(ｲ)ａのとおりである。
ｂ

ＧＤＨ遺伝子又はＣＳ遺伝子のプロモーターの－１０領域をＴＡＴＡＡＴにすること（相違点１’，２’）について
10

ＧＤＨ遺伝子又はＣＳ遺伝子のプロモーターの－１０領域をＴＡＴＡＡＴにすることを，当業者が容易に想到しうることは，前記６【被告の主張】(2)イ(ｲ)及び前記(2)ア(ｲ)ｂのとおりであるｃ

原告が主張する相違点について

前記６【被告の主張】(2)イ(ｳ)のとおり，ベクターの使用により生じる課題を解15決するために，ＧＤＨ遺伝子ないしＣＳ遺伝子の発現増強を，ベクター上ではなく，特定の配列を有するプロモーターを用いて染色体上で行うことは，当業者が容易に想到し得た事項にすぎない。
イ

本件訂正発明１－２，１－３について

本件訂正発明１－２と乙９発明とは前記相違点１’で相違し，本件訂正発明１－20３と乙９発明とは前記相違点１’及び相違点２’で相違し，これらの相違点に係る構成を採用することが容易であることは前記アのとおりである。
また，本件訂正発明１－３について，ＣＳ遺伝子のプロモーターの－３５領域を
ＴＴＧＡＣＡとすることが容易であることについては，前記６【被告の主張】(2)イ(ｱ)ａ，ｃ及びｄのとおりである。

25

(4)

本件訂正発明１についての実施可能要件・サポート要件違反について

本件訂正発明１についても，以下の点についての実施可能要件違反及びサポート90要件違反は当てはまり，解消されていない。
ア

ＣＳ遺伝子のプロモーターに変異を導入したコリネ型細菌を用いるグルタミン酸の製造方法について
本件訂正発明１－１には，ＧＤＨ遺伝子のプロモーターには変異を導入せず，Ｃ
5Ｓ遺伝子のプロモーターの－１０領域にＴＡＴＡＡＴ配列を導入したコリネ型細菌を用いてグルタミン酸を製造する方法が包含される。
しかし，前記７【被告の主張】(2)アのとおり，本件明細書１では，ＣＳ遺伝子のプロモーターのみに変異を導入した実施例はない。
実施例３では，ＣＳ遺伝子のプロモーター配列の変異に加えて，ＧＤＨ遺伝子の10プロモーター配列にも変異を導入しており，ＣＳ活性を単独で強化するものではない。本件特許１の出願以前の文献（乙８，３５）によっても，コリネ型細菌において，ＧＤＨ活性を増強せず，ＣＳ活性を増強させてもグルタミン酸の生産性は向上
しないことが知られていた。なお，遺伝子変異がプラスミド上で行われるか，染色体上に導入されるかの違いは，グルタミン酸の生産向上に直接的に関係しないから，

15

上記の文献についての原告の反論には理由がない。
したがって，訂正後の本件特許１の請求項１については，染色体上のＣＳ遺伝子のプロモーター配列に変異を導入したコリネ型細菌を用いるグルタミン酸の製造方法に関し，本件明細書１の発明の詳細な説明は十分かつ明確に記載されていない。
また，当業者は，本件明細書１の記載及び出願時の技術常識を考慮しても，ＧＤＨ

20

遺伝子のプロモーターには変異を導入せず，染色体上のＣＳ遺伝子のプロモーターの－１０領域にＴＡＴＡＡＴ配列を導入することのみによって，グルタミン酸の生産性が向上することを認識できない。
イ

プロモーターの－３５領域及び－１０領域の周辺領域について－３５領域及び－１０領域の周辺領域の配列や長さが特定されていないことによ25

る，実施可能要件違反及びサポート要件違反は，前記７【被告の主張】(6)のとおり
である。

91

１３

争点６（本件特許２の訂正（本件訂正２）の再抗弁の成否）について【原告の主張】5(1)

本件訂正２が訂正の要件を満たすことについて

ア

本件訂正２は，いずれも，特許請求の範囲の減縮（特許法１３４条の２第１項ただし書１号），誤記又は誤訳の訂正（同２号）又は他の請求項の記載を引用す
る請求項の記載を当該他の請求項の記載を引用しないものとすること（同４号）を目的として，願書に添付した明細書，特許請求の範囲又は図面に記載した事項の範
囲内においてするものであり，実質上特許請求の範囲を拡張し，又は変更するものではないから，訂正の要件（特許法１３４条の２第９項，１２６条５項，６項）を10満たすものである。
イ

被告の主張への反論(ｱ)

アミノ酸の個数に関する訂正（請求項１関係）について

本件訂正２では，請求項１の（ⅱ）において，置換等するアミノ酸の個数が「１若しくは数個」とあるのを「１～５個」に訂正しているところ，これは訂正前の請15

求項１の記載を減縮するものであり（特許法１３４条の２第１項ただし書１号），
上記の訂正の要件（同法１３４条の２第９項，１２６条５項，６項）を満たすものである。
被告は，本件明細書２には置換等するアミノ酸の個数を「１～５個」とする数値
範囲の記載はないとして訂正要件違反を主張するが，本件明細書２の段落【００３20４】には「yggB遺伝子は，コリネ型細菌のL-グルタミン酸生産能を向上させるもの
である限り，配列番号６，６２，６８または８４に示すアミノ酸配列において，１
若しくは数個のアミノ酸の置換，欠失，挿入，または付加を含むアミノ酸配列を有するものであってもよい。ここで，数個とは，例えば，２～２０個，好ましくは２～１０個，より好ましくは２～５個を意味する。」との記載があり，アミノ酸の個25数を「１～５個」とする数値範囲の記載は存在する。
(ｲ)

菌株名に関する訂正（本件明細書２の段落【００３３】関係）について

92

ａ

本件訂正２では，本件明細書２の段落【００３３】の３文目の「配列番号５の塩基配列1437-3035番目の配列を有する遺伝子は，コリネバクテリウム・グルタミ
カムATCC13032株のyggB遺伝子であり，」との部分に，「ＡＴＣＣ１３０３２株」とあるのを「ＡＴＣＣ１３８６９株」に訂正しているところ，これは誤記又は誤訳の5

訂正（特許法１３４条の２第１項ただし書２号）であり，上記の訂正の要件（同法
１３４条の２第９項，１２６条５項，６項）を満たすものである。
ｂ

被告は，この点の修正について誤記であると断定できないとして訂正要件違反を主張するが，以下のとおり，段落【００３３】中の配列番号５の由来菌株を説明する記載中の「ＡＴＣＣ１３０３２株」の記載は誤記であり，正しくは「ＡＴＣ10

Ｃ１３８６９株」であることは当業者には当然に理解できるものである。
訂正前の本件明細書２の段落【００３３】では，配列番号５の塩基配列と，配列
番号８３の塩基配列が，いずれもＡＴＣＣ１３０３２株の配列とされているが，両記載の配列が重なる１４３７番目乃至２０９９番目を比較すると配列番号５と配列
番号８３とで一致しないので，いずれかが誤記であることは明らかである。さらに，

15

出願時にデータベース上で公開されていた配列情報，その他の公表されている論文
情報を踏まえて，配列番号８３の配列として記載されているＮＣｇｌ

１２２１と比較すれば，配列番号８３がＡＴＣＣ１３０３２株の配列であることは明らかであるから，配列番号５がＡＴＣＣ１３０３２株である旨の記載が誤記であることは明らかである。
20

そして，訂正前の本件明細書２の段落【０１０３】には，配列番号５のｙｇｇＢ遺伝子を保有するコリネバクテリウム・グルタミカムの菌株名の説明として「ＡＴＣＣ１３８６９株」との記載があることから，段落【００３３】に記載された配列
番号５が「ＡＴＣＣ１３０３２株」である旨の記載が誤記であり，正しくは，「ＡＴＣＣ１３８６９株」であることは明らかである。なお，本件明細書２の段落【０25１０３】及び【０１０４】には，ＡＴＣＣ１３８６９株由来の配列番号５の遺伝子配列を含むｐＬ５ＫとＡＴＣＣ１３０３２株の配列とを比較する旨が記載されてい93

ることから，この点からも，配列番号５はＡＴＣＣ１３０３２株由来の遺伝子配列ではないことがわかる。

5(2)被告各製法が本件訂正発明２の技術的範囲に属することについてア

被告製法１ないし３について

被告製法１ないし３と本件訂正発明２とを対比すると，別紙７－２被告製法１ないし３と本件訂正発明２の対比のとおりとなり，被告製法１ないし３で用いられる
細菌は，いずれも，文言上，本件訂正発明２－１，２－２，２－３及び２－４の技
術的範囲に属するものであり，それを使用する被告製法１ないし３は，本件訂正発明２－５の技術的範囲に属する。

10

イ

被告製法４について(ｱ)

被告製法４と本件訂正発明２との対比は，別紙８－２被告製法４と本件訂正発明２との対比のとおりである。
被告製法４で使用される菌株は，文言上，本件訂正発明２－２の構成要件２－Ｅ’－１，２－Ｅ’－２を充足するが２－Ｄ’を充足せず，本件訂正発明２－３の構成
15

要件をいずれも充足しない。また，被告製法４は，文言上，本件訂正発明２－５の構成要件２－Ｈ’について，請求項１，２及び４～１０を引用する部分を除いて充足し，構成要件２－Ｉ’及び２－Ｊを充足する。
(ｲ)

前記４【原告の主張】で検討した１９型変異使用構成は,本件訂正２後の請

求項４を引用する請求項６の（ｅ）の変異型ｙｇｇＢ遺伝子が導入されたコリネ型
20細菌を用いた本件訂正発明２－５と同じである。
したがって，前記４【原告の主張】のとおり，被告製法４（⑫及び⑬の菌株を使用する製法）は，本件訂正２後の特許請求の範囲に含まれる１９型変異使用構成と均等なものとして，本件訂正発明２－５の技術的範囲に属する。
(3)25

本件訂正発明２についての乙４２発明による新規性欠如について

乙４２発明が，本件訂正発明２－１，２－５と同一でないことは，前記８【原告の主張】と同様である。

94

なお，本件訂正２後の構成要件２－Ｃ’の(ii)は，変異対象の領域における「１～５個」のアミノ酸の欠失とされているから，乙４２発明が本件訂正発明２－１とは異なることはより明らかである。
(4)5

本件訂正発明２についての乙２４発明を主引例とする進歩性欠如について

本件訂正２後の請求項１，４，６及び１０を引用する本件訂正発明２－５と乙２４発明との相違点は，訂正前の請求項１，４，６及び１０を引用する本件発明２－５と乙２４発明との相違点と，実質的には同じである。
したがって,訂正後の本件特許２の請求項１，４，６及び１０を引用する本件訂正
発明２－５についても，前記９【原告の主張】と同様に，進歩性欠如の無効理由は

10

ない。
(5)

本件訂正発明２についての実施可能要件違反・サポート要件違反について

本件訂正発明２－５についても，前記１０【原告の主張】と同様の理由で，実施可能要件違反及びサポート要件違反はない。
さらに，本件訂正２によって，請求項１の(ii)の変異について置換等されるアミ15ノ酸の個数が１ないし５個に限定されたこと，請求項４の変異について実施例に記載された３つの変異に限定されたこと，請求項１１のグルタミン酸の生成及び回収の方法についてグルタミン酸の生成蓄積，回収が培地からに限定されたことからも，
これらについての実施可能要件違反及びサポート要件違反は解消されている。
(6)20

本件訂正発明２についての明確性要件違反について

本件訂正２後の請求項６を引用する本件訂正発明２－５について，明確性要件違反がないことは，前記１１【原告の主張】のとおりである。
【被告の主張】(1)

本件訂正２が訂正の要件を満たすことについて

本件訂正２は，少なくとも以下の点で訂正要件を満たしていない。
25

ア

アミノ酸の個数に関する訂正（請求項１関係）について

本件訂正２では，請求項１の（ⅱ）において，置換等するアミノ酸の個数が「１95若しくは数個」とあるのを「１～５個」に訂正するものであるが，本件明細書２には，アミノ酸の個数を「１～５個」とする数値範囲の記載はなく，この訂正事項は本件特許権２の設定登録時の願書に添付した明細書，特許請求の範囲又は図面に記載した事項の範囲内の訂正ではなく，特許法１３４条の２第９項が準用する同法１5２６条５項に違反する。
イ

菌株名に関する訂正（本件明細書２の段落【００３３】関係）について

本件訂正２では，本件明細書２の段落【００３３】の３文目の「配列番号５の塩基配列1437-3035番目の配列を有する遺伝子は，コリネバクテリウム・グルタミカム
ATCC13032株のyggB遺伝子であり，」との部分に，「ＡＴＣＣ１３０３２株」とある
10のを「ＡＴＣＣ１３８６９株」に訂正するものであるが，この訂正事項は，誤記による訂正ではなく，特許法１３４条の２第１項ただし書２号に該当しない。
原告の指摘する訂正前の本件明細書２の段落【００３３】及び【０１０３】の記載からは，「ＡＴＣＣ１３０３２株」が「ＡＴＣＣ１３８６９株」の誤記であると断定することはできず，段落【０１０４】の記載も参酌すれば，「ＡＴＣＣ１３０15３２株」との記載は正しく，「ＡＴＣＣ１３８６９株」の方が誤記である可能性も否定できない。
(2)

被告各製法が本件訂正発明２の技術的範囲に属することについてア

被告製法１ないし３について

原告の主張は争う。
20

イ

被告製法４について

原告の主張は争う。
前記４【被告の主張】のとおり，被告製法４は，１９型変異使用構成と均等なものとはいえず，本件訂正発明２－５の技術的範囲に含まれない。
(3)25

本件訂正発明２についての乙４２発明による新規性欠如について

乙４２発明は，訂正後の本件特許２の請求項１の(ii)及び請求項１０に記載されたコリネ型細菌と同一であり，本件訂正発明２－５は，前記８【被告の主張】と同96

様の理由で，乙４２発明によって新規性を欠くものであり，この点の無効理由は解消されていない。
(4)

本件訂正発明２についての乙２４発明を主引例とする進歩性欠如について

本件訂正発明２－５は，乙２４発明等に基づいて当業者が容易に発明することが5できたものであり，前記９【被告の主張】(6)のとおり，従来予測し得なかった顕著な効果を有するものではないから，進歩性を欠き，無効とされるべきものであり，この点の無効理由は解消されていない。
ア

本件訂正発明２－５と乙２４発明との対比

本件訂正２後の請求項１，４及び６を引用する本件訂正発明２－５と乙２４発明
10とを対比すると，訂正前の本件発明２－５との相違点１（前記９【被告の主張】(2)ア）のほか，本件訂正２後の請求項１及び４では変異の内容が一部限定されている点を除けば，訂正前の本件発明２－５との相違点２（前記９【被告の主張】(2)ア），
相違点３（同(3)ア）及び相違点４（同(4)ア）と同様の相違点が存在する。
また，本件訂正２後の請求項１０を引用する本件訂正発明２－５と乙２４との対15比において，相違点１ないし４以外の相違点が生じないことは，前記９【被告の主張】(5)と同様である。
イ

相違点に係る構成の容易想到性

相違点に係る構成が容易に想到し得る事項であることについては，前記９【被告の主張】(2)ないし(5)のとおりである。
20(5)

本件訂正発明２についての実施可能要件・サポート要件違反について

本件訂正発明２－５についても，前記１０【被告の主張】(1)の培養条件についての主張，同(2)，(3)，(4)及び(5)の請求項１の(i)，(i')，(i'')及び(ii)の変異並
びに配列番号８５についての主張，並びに同(7)及び(8)の請求項６及び１０の変異についての主張は当てはまり，実施可能要件違反及びサポート要件違反は解消され
25

ていない。
(6)

本件訂正発明２についての明確性要件違反について

97

訂正後の請求項６を引用する本件訂正発明２－５についても，「過剰量のビオチン」の記載についての，前記１１【被告の主張】の明確性要件違反は解消されてい
ない。
１４
5

争点７（本件特許２の再訂正の再抗弁の成否（争点６の再抗弁の予備的な主張））について【原告の主張】(1)

本件特許２の再訂正が訂正の要件を満たすことについて

本件特許２の再訂正は，いずれも，特許請求の範囲の減縮（特許法１３４条の２
第１項ただし書１号），誤記又は誤訳の訂正（同２号）又は他の請求項の記載を引10用する請求項の記載を当該他の請求項の記載を引用しないものとすること（同４号）を目的として，願書に添付した明細書，特許請求の範囲又は図面に記載した事項の範囲内においてするものであり，実質上特許請求の範囲を拡張し，又は変更するものではないから，訂正の要件（特許法１３４条の２第９項，１２６条５項，６項）
を満たすものである。

15

(2)

被告各製法が本件再訂正発明２の技術的範囲に属することについてア

被告製法１ないし３について

被告製法１ないし３と本件再訂正発明２とを対比すると，別紙７－３被告製法１
ないし３と本件再訂正発明２の対比のとおりとなり，被告製法１ないし３で用いられる細菌は，いずれも，文言上，本件再訂正発明２－２及び２－３の技術的範囲に20属するものであり，それを使用する被告製法１ないし３は，本件再訂正発明２－６の技術的範囲に属する。
イ

被告製法４について(ｱ)

被告製法４と本件再訂正発明２との対比は，別紙８－３被告製法４と本件再訂正発明２との対比のとおりである。
25

被告製法４で使用される菌株は，文言上，本件再訂正発明２－２の構成要件２－
Ｅ’－１，２－Ｅ’－２を充足するが２－Ｄ’を充足せず，本件再訂正発明２－３

98

の構成要件をいずれも充足しない。また，被告製法４は，文言上，本件再訂正発明
２－６の構成要件２－Ｋについて，請求項１３を引用する部分を除いて充足し，構
成要件２－Ｌ及び２－Ｍを充足する。
(ｲ)5

前記４【原告の主張】で検討した１９型変異使用構成は,本件特許２の再訂

正後の請求項４を引用する請求項１３の（ｅ）の変異型ｙｇｇＢ遺伝子が導入されたコリネ型細菌を用いた本件再訂正発明２－６と同じである。
したがって，前記４【原告の主張】のとおり，被告製法４（⑫及び⑬の菌株を使用する製法）は，本件特許２の再訂正後の特許請求の範囲に含まれる１９型変異使
用構成と均等なものとして，本件再訂正発明２－６の技術的範囲に属する。

10

(3)

本件特許２の再訂正によって無効理由が解消されることについて

前記１３【原告の主張】(3)ないし(6)と同様に，本件特許２の再訂正後の再訂正
発明２－６についても，無効理由は存在しない。
また，訂正前の請求項１の(i)，(i')及び(i'')の変異についての実施可能要件違反及びサポート要件違反の主張（前記１０【被告の主張】(2)，(3)）については，
15

本件特許２の再訂正後の請求項４及び１３を引用する本件再訂正発明２－６については，これらの変異が引用されていないから解消されている。
【被告の主張】(1)

本件特許２の再訂正が訂正の要件を満たすことについて

原告の主張は争う。
20(2)被告各製法が本件再訂正発明２の技術的範囲に属することについてア

被告製法１ないし３について

原告の主張は争う。
イ

被告製法４について

原告の主張は争う。
25

前記４【被告の主張】のとおり，被告製法４は，１９型変異使用構成と均等なものとはいえず，本件再訂正発明２－６の技術的範囲に含まれない。

99

(3)

本件特許２の再訂正によって無効理由が解消されることについて

原告の主張は争う。
前記８ないし１１の各【被告の主張】並びに前記１３【被告の主張】(3)ないし(6)からすれば，本件特許２の再訂正後の本件再訂正発明２－６についても，無効理由
5は解消されていない。
１５

争点８（損害の発生の有無及び額）について【原告の主張】(1)

被告が不法行為責任を負う実施の範囲

以下のとおり，被告製品１ないし４については，被告販売分に加え，被告がＣＪ
10

インドネシア販売分と主張するものについても，被告ないしＣＪインドネシアによる，輸入，譲渡及び譲渡の申出という，日本国内での実施が認められる。また，被告ら販売分の全体について，被告とＣＪインドネシアとの間には共同不法行為の成立が認められるから，被告は，被告製品１ないし４に係る被告ら販売分全体について，対応する本件各特許権侵害の不法行為責任を負う。

15

ア
（ｱ）

ＣＪインドネシア販売分についての日本国内での実施について
輸入・譲渡について

被告販売分とＣＪインドネシア販売分については，いずれも，被告，ＣＪインド
ネシア及びＣＪＣＪが一体となって製造・販売しているものであり，被告販売分とＣＪインドネシア販売分というのは，ＣＪインドネシアが製造した本件ＭＳＧを日20

本国内で販売するにあたり，ＣＪグループ内部での利益の分配方法が異なるというものにすぎず，それぞれの取引における被告の関与の方法は異ならない。
被告がＣＪインドネシア販売分と主張する販売は，契約書上はＣＪインドネシアの名義でなされていても，実際には，被告が日本国内の取引先と契約書作成の手続等をし，被告各製品は，被告の倉庫又は被告が手配した倉庫に輸入され，被告が取25

引先に配送又は配送手配するというものと考えられ，被告らによる日本国内への輸入・日本国内での譲渡と評価されるべきものであり，国内での実施に当たる。

100

被告が主張するように，ＣＪインドネシア取引分において，ＣＪインドネシアと日本の取引先が契約を締結し，日本の取引先がコンテナヤードから貨物で本件ＭＳＧを直接引き取っているとしても，特許権侵害物品に関しては，保税地域への搬入も輸入行為に該当すると解すべきであるから，ＣＪインドネシアの行為は輸入に該5当する。また，ＣＪインドネシアから運搬を委託され，その手足とみなされる船会
社から日本の取引先への譲渡行為も日本国内で行われているから，この点でも，被告らによる日本国内での譲渡も存在している。

10

(ｲ)

譲渡の申出について

ａ

被告は，ＣＪインドネシア販売分について，日本国内において日本国内の取引先からの注文を受けており，少なくとも，被告らによる譲渡の申出が日本国内でなされている。被告は，ＣＪインドネシア販売分については，注文書をＣＪインド
ネシアに転送していただけであり，被告は売主ではないと主張するが，被告に注文書が送付されることがあるとの事実からは，少なくとも，被告が譲渡の申出をしていたことが推認される。

15

なお，特許法は「譲渡の申出」を売主によるものと限定しておらず，売主と異なる者が行った場合でも，譲渡の申出があれば譲渡を可能にできる者による申出は，譲渡の申出に含まれる。
ｂ

譲渡の申出の主張をすることが，時機に後れた攻撃防御方法に当たるとの被告の主張は争う。
20

イ

被告とＣＪインドネシアの共同不法行為について

前記ア(ｱ)のとおり，被告販売分とＣＪインドネシア販売分については，いずれも，
被告，ＣＪインドネシア及びＣＪＣＪが一体となって製造・販売しているものである。
被告は，ＣＪインドネシア販売分について，コミッションという名目での利益分25配を得ているが，これは，被告がＣＪインドネシア販売分について相当の役割を果たしていることを示すものである。また，被告は，被告販売分とＣＪインドネシア

101

販売分に係る経費についても，ＣＪＣＪの指示でその配分を変更する等しており，
この点も，被告，ＣＪインドネシア及びＣＪＣＪの一体性を示すものである。

5(2)

被告各製品の販売額及び販売数量についてア

平成２３年分から平成２９年分まで

平成２３年分から平成２９年分までの被告ら販売分に係る被告各製品の販売額は，別紙１０販売金額・数量一覧表記載１のとおりであり，その販売数量は同別紙記載
２のとおりである。
イ

平成１９年分から平成２２年分まで

前記１【原告の主張】(3)アのとおり，平成１９年分から平成２２年分までについ10ても，本件ＭＳＧの製造には被告製法１が使用されていたところ，被告ら販売分の売上額が平成２３年以降概ね増加傾向にあることに鑑み，平成１９年分から平成２２年分の被告製品１の販売金額，販売数量については，平成２３年分以降の平均ではなく，平成２３年分の販売金額及び販売数量を用いて，それと同じであったとして算定するのが相当である。

15

したがって，被告ら販売分に係る，この期間の被告製品１の販売総額及び販売数
量は以下のとおり算定される。
(ｱ)

20

販売総額

●（省略）●円×４年＝●（省略）●円

販売数量●（省略）●トン×４年＝●（省略）●トン

(ｲ)

被告販売分

販売総額

●（省略）●円×４年＝●（省略）●円

販売数量●（省略）●トン×４年＝●（省略）●トン

(ｳ)

25

被告ら販売分全体

ＣＪインドネシア販売分

販売総額●（省略）●円×４年＝●（省略）●円

販売数量●（省略）●トン×４年＝●（省略）●トン

ウ

合計

102

被告ら販売分に係る，平成１９年分から平成２９年分までの被告各製品の販売金額は合計●（省略）●円，同期間の販売数量は合計●（省略）●トンである。
(3)5

特許法１０２条２項ないし３項によって算定される損害額について

対象期間中の上記の被告ら販売分の輸入販売について，本件各特許権の侵害についての，特許法１０２条２項ないし３項による原告の損害額は，別紙１１－１損害額の主張１から別紙１１－４損害額の主張４までの各【原告の主張】欄に記載された，４つのいずれかの方法によって算定され，原告は，このようにして算定された損害額の一部請求として９億円を請求する。

10

(4)

弁護士費用・弁理士費用について

被告の不法行為と相当因果関係のある弁護士費用及び弁理士費用は，前記(3)の１割に相当する９０００万円を下らない。
(5)

まとめ

本件各特許権の侵害行為によって原告が受けた損害の額は少なくとも９億９００
15０万円を下らない。
【被告の主張】(1)

被告が不法行為責任を負う実施の範囲

以下のとおり，ＣＪインドネシア販売分については，「輸入」，「譲渡」及び「譲渡の申出」のいずれの点でも，被告らによる日本国内での実施はない。したがって，
20

ＣＪインドネシア販売分について本件各特許権侵害についての不法行為は成立せず，
被告がこれについて共同不法行為責任を負うこともない。
ア（ｱ）

ＣＪインドネシア販売分についての被告らの日本国内での実施について
輸入・譲渡について

被告販売分とＣＪインドネシア販売分は，実態として異なる取引である。ＣＪイ
25

ンドネシア販売分では，ＣＪインドネシアと日本の取引先が契約を締結し，日本の取引先が日本のコンテナヤードから貨物で本件ＭＳＧを直接引き取っているもので103

あり，被告はその保管や運送に関与していないから，実質的に被告による輸入・譲渡行為と評価されるようなものではない。なお，日本の取引先によっては，被告がＣＪグループの日本法人であることから，ＣＪインドネシア販売分の注文書を被告宛に送付することがあり，その場合には，被告はこれをＣＪインドネシアに転送し5ていたが，当該注文書には売主はＣＪインドネシアと記載されており，被告はＣＪ
インドネシア販売分の売主ではなかった。
ＣＪインドネシア販売分について，ＣＪインドネシアと日本の顧客との取引はＣ
ＩＦ又はＣＦＲの条件で行われており，販売された本件ＭＳＧの危険負担は船積地であるインドネシアにおいて買主に移転し，その際，不特定物である売買の目的物10も特定される。また，ＣＪインドネシアは，出荷時に船荷証券も買主に送付済みであり，それによって本件ＭＳＧの所有権も買主に移転している。このように，ＣＪ
インドネシア販売分の売買は船積地で行われており，被告らによる日本国内への輸入，日本国内での販売はない。

15

(ｲ)

譲渡の申出についてａ

時機に後れた攻撃防御方法

原告は，令和元年１０月１１日付けの原告第１８準備書面において，ＣＪインド
ネシア販売分について被告らによる譲渡の申出の主張を追加したが，新たな主張を追加するものであり，時機に後れた攻撃防御方法として却下されるべきである。
ｂ20

譲渡の申出の有無について「譲渡の申出」は，譲渡を行う者が自ら予備行為として行うことが想定されている。すなわち，譲渡の申出は，将来の譲渡人である売主によって行われる行為であり，予備行為として広告宣伝等の申出行為を行う者が譲渡をする者と異なっている
場合は，譲渡の申出は成立しない。ＣＪインドネシア販売分について，売主はＣＪ
インドネシアであるから，売主ではない被告が何らかの関与をしたとしても，当該25行為は譲渡の申出には当たらない。
また，特許法上の「譲渡」（同法２条３項１号）は日本国内での譲渡を意味し，

104

その準備行為である「譲渡の申出」も日本国内での譲渡のための申出を意味する。
ＣＪインドネシア販売分においては，インドネシアでの売買が目的とされているか
ら，被告の行為は譲渡の申出には当たらない。
ｃ5

譲渡の申出による損害の範囲

仮に，被告による「譲渡の申出」が認められるとしても，それによる損害額はＣ
Ｊインドネシア販売分の売上げに基づいて算出されるべきものではなく，「譲渡の申出」に固有の範囲に留まるべきである。
イ

被告とＣＪインドネシアの共同不法行為について

ＣＪインドネシアによる本件ＭＳＧの製造及び販売は，インドネシアで行われて
10

おり，ＣＪインドネシアの行為について，日本の特許権侵害の不法行為が成立しない。したがって，被告，ＣＪインドネシア及びＣＪＣＪによる共同不法行為は成立しない。
また，グループ企業であるという以上に，被告，ＣＪインドネシア及びＣＪＣＪとの間の客観的関連共同性や主観的関連共同性について具体的な主張立証はされて15いないから，この点でも共同不法行為は成立しない。
(2)

被告各製品の販売額及び販売数量についてア

平成２３年分から平成２９年分まで

被告ら販売分の本件ＭＳＧの販売金額，販売数量につき，別紙１０販売金額・数量一覧表の金額，数量は認める。
20イ

平成１９年分から平成２２年分まで

原告の主張は否認する。
仮に，平成１９年分から平成２２年分までの間の被告ら販売分の中に，被告製法
１ないし４で製造された本件ＭＳＧがあったとしても，原告の推定は過剰である。
被告販売分及びＣＪインドネシア販売分のいずれについても，平成１９年分以降
25の各年の売上は，毎年，等比級数的に増加したとみるべきである。したがって，平成２３年分から平成２４年分への増加割合に基づいて，平成１９年分から平成２２105

年分の売上合計を推定すると，被告販売分については合計●（省略）●円，ＣＪイ
ンドネシア販売分については合計●（省略）●円となる。
(3)

特許法１０２条２項ないし３項によって算定される損害額について

特許法１０２条２項ないし３項による損害額の算定についての被告の主張は，別5

紙１１－１損害額の主張１から別紙１１－４損害額の主張４までの各【被告の主張】のとおりである。
(4)

弁護士費用・弁理士費用について

原告の主張は争う。
１６
10

争点９（差止請求及び廃棄請求の当否）について【原告の主張】(1)

被告各製法の使用時期についての主位的主張を前提とした場合

被告各製法の使用時期についての原告の主位的な主張（前記１【原告の主張】(1)）
を前提とした場合，平成１９年から現在まで，被告が輸入販売する本件ＭＳＧは一貫して被告製法１によって製造された被告製品１である。したがって，特許法１０15０条２項に基づく廃棄請求（請求の趣旨第２項）については，被告製品１の廃棄の必要があり，これを求めるものである。
ただし，同条１項に基づく差止請求（請求の趣旨第１項）については，被告が，本件ＭＳＧが被告製法１ないし４によって製造されていたと主張していること，かつ，後記(2)のとおり，被告の主張からすれば，その製造に用いる菌株の変更が頻繁

20になされ，その変更は容易であることが明らかであることから，被告製品１ないし４の全てについての差止めの必要性があり，これを求めるものである。
(2)

被告各製品の製造時期についての予備的主張を前提とした場合

被告各製法の使用時期についての原告の予備的な主張（前記１【原告の主張】(2)）
を前提とした場合，差止請求及び廃棄請求のいずれについても，被告製品１ないし25４の全てについて，差止め及び廃棄の必要性があり，これを求めるものである。
被告は，平成２９年１２月頃より本件ＭＳＧの生産に用いる菌株を変更しており，

106

それ以降，被告製法１ないし４を使用していない旨主張している。しかしながら，被告の主張によれば，本件ＭＳＧの製造のために使用する菌株は頻繁に変更されて
おり，このような変更が可能であれば，今後も，被告製法１ないし４の使用が再開
されて，これらを用いて製造された本件ＭＳＧを被告が輸入販売する蓋然性が高い
5

ことから，上記のような平成２９年１２月以降の使用菌株の変更という主張を踏まえても，依然として被告製品１ないし４の差止めの必要性が認められる。
【被告の主張】差止め及び廃棄の必要性については争う。
前記１【被告の主張】(2)のとおり，平成２９年１２月以降については本件ＭＳＧ10の製造に使用されている菌株は⑭の菌株に変更されており，その後は，被告製法１
ないし４によって製造された被告製品１ないし４を被告は輸入販売していない。
第４15

当裁判所の判断１

争点１（被告各製法の使用の有無，使用時期等）について(1)

平成２３年１月から平成２６年５月までの期間について

ア

被告が②の菌株を使用したと主張する平成２３年１月から平成２６年５月までの期間において，本件ＭＳＧが被告製法１によって製造されていたことは当事者間に争いがない。
したがって，この期間に本件ＭＳＧの製造に使用されていた菌株は，染色体上の遺伝子に別紙２被告製品目録記載１の特徴（別紙９本件ＭＳＧの製法についての主20

張対比表の「被告の主張」欄の②の菌株に記載された特徴と同じ。）を有するコリ
ネバクテリウム・グルタミカムであった。
イ

ＰＲＯＭＡＴＥ２０１２の分析結果について証拠（甲１５，２２）及び弁論の全趣旨によれば，当該期間に含まれる平成２４
年１１月３０日付けでＣＪインドネシアの工場で製造されたＰＲＯＭＡＴＥ（本件25

ＭＳＧを製造する際の使用済みの菌体を使用した家畜用飼料であり，以下，この原告が入手したＰＲＯＭＡＴＥを「ＰＲＯＭＡＴＥ２０１２」という。）を原告が入107

手して分析をすると，ＰＲＯＭＡＴＥ２０１２に含まれていた菌株について，前記
アの特徴が確認できた。

5(2)

平成２７年８月から平成２８年６月の期間について

ア

被告が⑩の菌株を使用していたと主張するこの期間について，原告は，入手したＰＲＯＭＡＴＥ２０１５の分析結果（甲４９）から，前記(1)の時期と同じ菌株が使用されていた旨主張し，被告は，前記(1)とは異なる特徴を有する菌株が使用されていた旨主張する。

10

イ

原告の分析結果とその信用性について(ｱ)

証拠（甲４９，６６，６７）及び弁論の全趣旨によれば，平成２７年１２月

３０日付けでＣＪインドネシアが製造したＰＲＯＭＡＴＥ２０１５を原告が入手して分析したこと，その分析結果（甲４９）によれば，ＰＲＯＭＡＴＥ２０１５から抽出したＤＮＡからは，ＰＲＯＭＡＴＥ２０１２で検出されたものと同様に，ＧＤ
Ｈ遺伝子のプロモーター配列の－３５領域がＴＴＧＴＣＡ配列，－１０領域がＴＡ
ＴＡＡＴ配列となる変異，ＣＳ遺伝子のプロモーター配列の－１０領域がＴＡＴＡ

15ＡＴ配列となる変異，及びｙｇｇＢ遺伝子がコードするアミノ酸配列における１０
０番目のアミノ酸がアラニンからスレオニンに置換されている変異が検出されたことが認められる。
(ｲ)

被告は，ＰＲＯＭＡＴＥ２０１５と同日に製造されたＰＲＯＭＡＴＥをＣ

ＪＣＪにおいて分析した結果（乙７５）では，原告による分析結果（甲４９）は確20

認できなかったとして，原告による分析結果の信用性を争うが，ＣＪＣＪによる分析は，ＧＤＨ遺伝子のプロモーター領域の分析の一部や，ＣＳ遺伝子のプロモータ
ー領域及びｙｇｇＢ遺伝子の分析について，いずれもシグナルが弱い等として配列分析ができなかったとするものであり，また，そのような結果を得ながら，条件を変えた再度の分析等を行ったような形跡もないから，本件ＭＳＧの製法についての

25

知見を有する当業者（乙２）が行う分析としては，信頼性に欠けるものというべきであり，原告の分析結果の信用性を覆すに足りるものとはいえない。

108

したがって，ＰＲＯＭＡＴＥ２０１５に由来するＤＮＡから，ＰＲＯＭＡＴＥ２
０１２の分析と同様の前記(ｱ)の変異が検出されたとの原告の分析結果は信用できるというべきである。
ウ
5

過去に使用された菌株が混入しているとの点について

原告の分析結果（甲４９）によれば，ＰＲＯＭＡＴＥ２０１５からは，ＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列について，①ＰＲＯＭＡＴＥ２０１２と同様の変異を含む
配列のほか，②野生型の配列及び③前２者のいずれとも異なる配列が検出されたこと，これらの割合は前記①が最も多く，②が最も少なく，シグナル強度の比は番号順に５：１：２であったことが認められる。

10

被告は，ＰＲＯＭＡＴＥには，製造の際に，過去に使用したＰＲＯＭＡＴＥを粉砕した粉体がＳｅｅｄとして投入されており，また，製造設備内に残留物があることも原因となって，過去の菌株由来の成分が直近に使用された菌株由来の固形成分と混在していると主張する。
証拠（乙８８）及び弁論の全趣旨によれば，ＰＲＯＭＡＴＥの製造段階において

15は，原料として，その当時に本件ＭＳＧ製造に使用されていた菌株に加え，顆粒化を進行させるためのＳｅｅｄとして，それ以前に製造されていた従来のＰＲＯＭＡ
ＴＥが投入されることが認められる。しかしながら，被告は，Ｓｅｅｄの投入割合
として代表的なものは３０％であったと説明するところ，上記のとおり，ＰＲＯＭ
ＡＴＥ２０１５からは，ＰＲＯＭＡＴＥ２０１２と同様の変異を含む配列が最も多20

く，被告の主張する当時の菌株の配列である野生型が最も少なく検出されているから，上記の変異を含む配列はＳｅｅｄとして混入したものとは考えにくい。
被告は，製造設備内の残留物による影響についても指摘するが，上記のとおり，
ＰＲＯＭＡＴＥ２０１２と同様の変異を含む配列が最も多く検出されていることは，残留物による影響からは説明しにくい。

25

その他，被告はＰＲＯＭＡＴＥは家畜用飼料であり，菌体が各粒子に均一になるよう製造されているわけではないとも指摘するが，ＰＲＯＭＡＴＥ２０１２と同様

109

の変異を含む配列の割合について，原告の分析結果と異なる結果を示す分析結果は示されておらず，現在の菌株よりも過去の菌株の方が強く検出される理由を十分説明するものとはいえない。
このように，被告が指摘する点を考慮しても，ＰＲＯＭＡＴＥ２０１５から検出5された前記イ(ｱ)の変異は，平成２７年１２月３０日頃において本件ＭＳＧの製造に使用されていた菌株に由来するものであったと認めるのが相当であり，これを覆すに足りる証拠はない。
エ

したがって，ＰＲＯＭＡＴＥ２０１５が製造された平成２７年１２月３０日頃に使用されていた菌株は，②の菌株と同一の特徴を有する，被告製法１で用いら10れる菌株であり，少なくとも被告が⑩の菌株を使用していたと主張する平成２７年
８月頃から平成２８年６月頃までの期間については，この菌株が使用されていたと推認するのが相当である。
被告は，本件ＭＳＧが発酵法によって製造されたことは認めており，当該期間中の被告製法１の使用の有無について，菌株の種類以外の点については具体的に争っ15ていないから，当該期間中に製造された本件ＭＳＧは被告製法１によって製造された被告製品１であったと認められる。
(3)

それ以外の期間について

ア

原告は，前記(1)及び(2)の期間のほか，①の菌株不明期間並びに被告が③から⑨までの菌株及び⑪から⑭の菌株を使用したと主張している期間についても，い20

ずれも被告製法１が使用されていたと主張するが，これらの期間に被告製法１が使用されていたことを直接的に裏付ける資料はない。
また，前記(2)ウのとおり，ＰＲＯＭＡＴＥの製造に当たっては，それ以前に本件
ＭＳＧの製造に用いられた菌株由来の成分が混入することがあり得るところ，原告が行ったＰＲＯＭＡＴＥ２０１５の分析結果によれば，ＧＤＨ遺伝子のプロモータ

25

ー配列において，ＰＲＯＭＡＴＥ２０１２と同様の変異を含む配列以外の配列も検出されており，これは，本件ＭＳＧの製造において，常に同一の菌株が使用されて110

いたわけではなく，時期によって異なる菌株が使用されていたとの被告の主張と整合するものといえる。
被告が，①の菌株不明期間を除いて，使用されていた菌株の遺伝子の特徴について別紙９本件ＭＳＧの製法についての主張対比表のとおり主張し，一部の期間の菌5株については，それと整合する分析結果を開示していること（乙７４）も考慮すれば，前記(1)及び(2)で検討したＰＲＯＭＡＴＥ２０１２とＰＲＯＭＡＴＥ２０１５の分析結果から，前記(1)及び(2)以外の期間についても同様に被告製法１が使用されていたと推認することはできず，その他，この点の原告の主張を認めるに足りる証拠はない。

10

そうすると，①の菌株不明期間並びに被告が③から⑨までの菌株及び⑪から⑭の菌株を使用したと主張している期間については，それぞれ，別紙９本件ＭＳＧの製法についての主張対比表の「被告の主張」欄記載の特徴を有するコリネバクテリウ
ム・グルタミカムが使用されていたと認めるのが相当である。
イ

15

被告は，本件ＭＳＧが発酵法によって製造されたことは認めており，被告各製法の使用の有無について，菌株の種類以外の点については具体的に争っていないから，前記アで検討した各菌株の使用期間における，本件ＭＳＧの製造への被告各
製法の使用状況については，それぞれ，別紙９の「原告の予備的主張」欄記載の原
告の予備的主張のとおりであったと認めるのが相当であり，①の菌株不明期間及び⑭の菌株の使用期間については被告各製法が使用されていたとは認められない。

20

ウ

原告は，①の菌株不明期間についてわずか６年ほど前の菌株の記録を保有していないことは考えられず，②の菌株と異なる菌を使用していたことを立証できない以上，当然に同じ菌を使用していたと推認されるべきであると主張するが，前記
アのとおり，ＰＲＯＭＡＴＥ２０１５の分析結果からも，本件ＭＳＧの製造には時期によって異なる菌株が使用されていたことがうかがわれることを考慮すれば，被25

告が具体的な菌株の特徴について主張立証をしていないことをもって，当然に①の菌株不明期間に②の菌株と同じ菌株が使用されていたとは推認できない。

111

また，原告は，⑫及び⑬の菌株について，被告が主張するように，それ以前の菌株とｙｇｇＢ遺伝子の配列が変更されているのであれば，食品衛生法上求められる安全性審査の申請が行われるべきところ，それが行われていないから被告の主張は信用できない旨も主張する。しかしながら，原告の主張によれば，被告においては，
5

Ａ１００Ｔ型変異が導入された変異型ｙｇｇＢ遺伝子を有する菌株（②から⑪までの菌株）を使用して製造されたＭＳＧについても，上記の安全性審査の申請をすべきであるのに，それをしていなかったというものであるから，⑫及び⑬の菌株の使用の前後の時期において上記安全性審査の申請が行われていなかったとしても，これをもって，⑫及び⑬の菌株にそれ以前と同じ変異型ｙｇｇＢ遺伝子が使用されて10いたとはいえず，この点も前記イの判断を覆すに足りるものではない。
(4)

被告各製法の使用時期についての小括

前記(1)から(3)までによれば，各時期における被告各製法の使用の有無について
は，別紙９本件ＭＳＧの製法についての主張対比表に記載された②及び⑩の菌株の使用期間については被告製法１が使用されており，それ以外の期間については，同
15

別紙の「原告の予備的主張」欄記載のとおりであったと認められる。
２

争点２－１（被告製法１及び３は，文言上，本件発明１の技術的範囲に属す

るか）について弁論の全趣旨によれば，被告製法１及び３と本件発明１を対比すると，別紙６－
１被告製法１及び３と本件発明１との対比のとおりとなると認められるから，被告
20

製法１は，文言上，本件発明１－１から１－４までの技術的範囲に属し，被告製法
３は，文言上，本件発明１－１及び１－４の技術的範囲に属する。
３

争点２－２（被告製法１ないし３は，文言上，本件発明２の技術的範囲に属するか）について(1)
25

被告製法１について

ＰＲＯＭＡＴＥ２０１２の分析結果（甲２２）によれば，②の菌株については，
ｙｇｇＢ遺伝子の配列番号６のアミノ酸配列にＡ１００Ｔ変異が導入され，変異後112

のｙｇｇＢ遺伝子のアミノ酸配列が配列番号２２のアミノ酸配列と一致するものであったことが認められる。また，本件明細書２の実施例８及び証拠（甲３７）によれば，当該変異型ｙｇｇＢ遺伝子を導入することによって，非改変株と比較して，グルタミン酸生産能が向上することが認められる（実施例８及び甲３７号証により，
5

配列番号２２のアミノ酸配列を有する変異型ｙｇｇＢ遺伝子を使用する１９型変異
使用構成において，グルタミン酸生産能の向上が確認できることについては，後記
４(3)イのとおり。）。
以上の点及び弁論の全趣旨によれば，被告製法１と本件発明２を対比すると，別紙７－１被告製法１ないし３と本件発明２との対比のとおりとなると認められ，被10

告製法１で用いられる細菌（②の菌株及びそれと同一の特徴を有する⑩の菌株）は，
本件発明２－１，２－２，２－３及び２－４の技術的範囲に属するものであり，それを使用する被告製法１は，本件発明２－５の技術的範囲に属する。
(2)

被告製法２及び３について

被告製法２及び３において使用された菌株（③～⑨，⑪の菌株）の変異型ｙｇｇ
15

Ｂ遺伝子は，被告製法１で使用された菌株（②，⑩の菌株）のｙｇｇＢ遺伝子と同様にＡ１００Ｔ変異が導入されたものである。そして，被告は，ｙｇｇＢ遺伝子のそれ以外の部分のアミノ酸配列において，両者に違いがあったとの主張をしていな
いから，被告製法２及び３において使用された菌株（③～⑨，⑪の菌株）の変異型
ｙｇｇＢ遺伝子についても，被告製法１で使用された菌株のｙｇｇＢ遺伝子と同様

20に，変異前のアミノ酸配列が配列番号６のアミノ酸配列であり，変異後のアミノ酸配列が配列番号２２のアミノ酸配列と一致するものであったと認められる。
そうすると，被告製法２及び３で用いられる細菌と本件発明２との対比について
は，前記(1)の被告製法１と本件発明２との対比と同様となり，被告製法２及び３で用いられた細菌（③～⑨，⑪の菌株）は，いずれも，本件発明２－１，２－２，２

25－３及び２－４の技術的範囲に属するものであり，それを使用する被告製法２及び３は，いずれも本件発明２－５の技術的範囲に属する。

113

４

争点２－３（被告製法４は，本件発明２と均等なものとして，その技術的範囲に属するか）について(1)

均等侵害の判断基準について

特許請求の範囲に記載された構成中に相手方が製造等をする製品又は用いる方法
5（以下「対象製品等」という。）と異なる部分が存する場合であっても，①同部分が特許発明の本質的部分ではなく，②同部分を対象製品等におけるものと置き換えても，特許発明の目的を達することができ，同一の作用効果を奏するものであって，③上記のように置き換えることに，当該発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者（当業者）が，対象製品等の製造等の時点において容易に想到するこ10とができたものであり，④対象製品等が，特許発明の特許出願時における公知技術と同一又は当業者がこれから右出願時に容易に推考できたものではなく，かつ，⑤対象製品等が特許発明の特許出願手続において特許請求の範囲から意識的に除外されたものに当たるなどの特段の事情もないときは，同対象製品等は，特許請求の範囲に記載された構成と均等なものとして，特許発明の技術的範囲に属するものと解

15するのが相当である（最高裁平成６年（オ）第１０８３号同１０年２月２４日第三小法廷判決・民集５２巻１号１１３頁（以下「平成１０年最高裁判決」という。），
最高裁平成２８年（受）第１２４２号同２９年３月２４日第二小法廷判決・民集７
１巻３号３５９頁（以下「平成２９年最高裁判決」という。）参照。以下，上記①
ないし⑤の要件を，順次「第１要件」ないし「第５要件」という。）。

20

そして，第１要件ないし第５要件の主張立証責任については，第１要件ないし第３要件については，対象製品等が特許発明と均等であると主張する者が主張立証責任を負うと解すべきであり，他方，これらの要件により対象製品等が均等の範囲内にあっても，均等の法理の適用が除外されるべき場合である第４要件及び第５要件については，対象製品等について均等の法理の適用を否定する者が主張立証責任を25負うと解するのが相当である（知財高裁平成２７年（ネ）第１００１４号同２８年３月２５日特別部判決・判時２３０６号８７頁参照）。

114

以下，被告製法４が本件発明２と均等なものとしてその技術的範囲に属するかについて，まず，本件発明２及びそこに含まれる１９型変異使用構成の内容と被告製法４の内容とをそれぞれ検討して，これを対比した上で，均等の法理の第１要件ないし第５要件について順に検討する。
5(2)

本件発明２の内容

ア

本件明細書２の記載内容

本件発明２に関する，本件明細書２の発明の詳細な説明の記載は，概要，別紙１
３本件明細書２の記載のとおりである。
なお，本件明細書２の【００３３】は本件訂正２により訂正されているところ，
10

後記７(1)イのとおり，当該箇所の訂正は誤記によるものと認められるから，以下，
特記しない限り，訂正後の記載による。
イ

本件発明２の概要

本件発明２に係る特許請求の範囲（別紙５－１），前記アの本件明細書２の記載
及び弁論の全趣旨によれば，本件発明２の概要は，以下のとおりであると認められ
15

る。
(ｱ)

技術分野・背景技術

本件発明２は，発酵工業に関し，調味料原料等として広く用いられるＬ－グルタ
ミン酸の製造法及びそれに用いる細菌に関するものである（【０００１】）。
従来から，Ｌ－グルタミン酸は，Ｌ－グルタミン酸生産能を有するブレビバクテ
20

リウム属やコリネバクテリウム属に属するコリネ型細菌を用いて発酵法により工業生産されていた（【０００２】）。
コリネ型細菌の野生株は，一般的にビオチンが存在している条件ではグルタミン酸を生成しないため，コリネ型細菌によるＬ－グルタミン酸生産は，ビオチン制限，界面活性剤添加，ペニシリン添加等によってグルタミン酸生成を誘導した状態で行25われており，これらの方法を適用しなくてもビオチンが十分存在している条件下でＬ－グルタミン酸を生成できる株として，界面活性剤温度感受性株，ペニシリン感

115

受性株，セルレニン感受性株，リゾチーム感受性株等が開発されていたものの，これらの株は，Ｌ－グルタミン酸生産と引き換えに環境変化への適応力の低下を引き起こしている可能性が高く，Ｌ－グルタミン酸を著量蓄積できる菌株を開発するには相当の労力を要していた（【０００３】，【０００４】）。
5

そのほか，ビオチン十分条件でＬ－グルタミン酸を生成する株は，α－ケトグル
タル酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を欠損させることによっても達成されるが，ＴＣＡサイクルを途中で遮断するα－ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ欠損
株は生育が遅いことから菌体量の確保が困難などの課題があった（【０００５】）。
コリネ型細菌のｙｇｇＢ遺伝子は，エシェリヒア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ，大腸菌）

10のｙｇｇＢ遺伝子のホモログであり，メカノセンシティブチャンネルの一種として解析されているが，Ｌ－グルタミン酸に及ぼす影響については知られていなかった（【０００６】）。
(ｲ)

本件発明２の課題

本件発明２は，コリネ型細菌を用いたＬ－グルタミン酸の製造において，Ｌ－グ
15ルタミン酸生産能力を向上させる新規な技術を提供することを課題とする（【００
０７】）。
(ｳ)

課題を解決するための手段等

ａｙｇｇＢ遺伝子を用いた改変

本件発明２は，ｙｇｇＢ遺伝子がコリネ型細菌のＬ－グルタミン酸生産に関与し20ていることを明らかにし，ｙｇｇＢ遺伝子を用いてコリネ型細菌を改変することにより，Ｌ－グルタミン酸の生産能が大幅に向上することを見いだしたものである（【０００８】）。
本件発明２のコリネ型細菌は，Ｌ－グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌であって，ｙｇｇＢ遺伝子を用いて改変されたことにより，非改変株と比較してＬ－

25

グルタミン酸生産能が向上したコリネ型細菌である（【００１１】）。
yggB遺伝子を用いた改変としては，yggB遺伝子の発現量を増加させる方法，及び116

変異型yggB遺伝子を導入する方法が含まれるが，本件発明２は後者の方法である（【００２９】）。
ｂ

変異型ｙｇｇＢ遺伝子の導入

変異型ｙｇｇＢ遺伝子の具体例としては，以下のものがあるが，コリネ型細菌に
5おいてビオチンが過剰量存在する条件で，Ｌ－グルタミン酸生産能を向上させ得る
変異であれば特に制限されない（【００６９】）。
(a)Ｃ末端側変異本件発明２でｙｇｇＢ遺伝子に導入される変異の一形態は，ｙｇｇＢ遺伝子のＣ末端領域に変異を導入するＣ末端側変異であり，この変異は，配列番号６，６８，
10

８４，８５のアミノ酸番号４１９－５３３の配列，又は配列番号６２のアミノ酸番号４１９－５２９の配列をコードする領域の塩基配列の一部に導入された変異である（段落【００７０】）。Ｃ末端側変異の一例としては，①転移因子の挿入による変異（２Ａ－１型変異）と②プロリン残基を他のアミノ酸に置換する変異（６６型
変異，２２型変異）がある（請求項１，【００７０】～【００７２】，実施例２～

15

実施例６，実施例１２，実施例１３，実施例１７）。
(b)膜貫通領域の変異

本件発明２でｙｇｇＢ遺伝子に導入される変異のもう一つの形態は，ｙｇｇＢ遺伝子がコードするＹｇｇＢタンパク質が有すると推測される５個の膜貫通領域（配列番号６，６２，６８，８４，８５の野生型のＹｇｇＢタンパク質のアミノ酸配列20において，膜貫通領域はそれぞれ，アミノ酸番号１～２３（第１膜貫通領域），２５～４７（第２膜貫通領域），６２～８４（第３膜貫通領域），８６～１０８（第４膜貫通領域），１１０～１３２（第５膜貫通領域））をコードする部分に変異を導入するものであり，その例として，①第１膜貫通領域の変異（Ａ１型変異），②
第４膜貫通領域の変異（１９型変異），③第５膜貫通領域の変異（Ｌ３０型変異，

25８型変異）が挙げられる（請求項１，【００７３】～【００７６】，実施例７～実
施例１１，実施例１５，実施例１６）。

117

(ｴ)

本件発明２の効果

本件発明２のｙｇｇＢ遺伝子を用いて改変したコリネ型細菌を用いることにより，Ｌ－グルタミン酸を効率よく生産することができる（【００１０】）。
ウ5

本件発明２の意義（課題解決原理）

以上に照らせば，本件明細書２記載の従来技術と比較して，本件発明２における従来技術に見られない特有の技術的思想（課題解決原理）とは，従来，グルタミン
酸生産に及ぼす影響について知られていなかったコリネ型細菌のｙｇｇＢ遺伝子に着目し，Ｃ末端側変異や膜貫通領域の変異といった変異型ｙｇｇＢ遺伝子を用いてメカノセンシティブチャネルの一種であるＹｇｇＢタンパク質を改変することによ

10って，グルタミン酸の生産能力を上げるための，新規な技術を提供することにあったというべきである。
エ

本件優先日２当時の従来技術について

被告は，本件優先日２当時の従来技術につき，乙２４文献によれば，コリネバク
テリウム・グルタミカムの浸透圧調節チャネル（ＹｇｇＢ）がグルタミン酸の排出15に寄与することはその当時から知られていた等と主張する。
(ｱ)

乙２４文献の記載内容

乙２４文献には以下の記載がある（乙２４，弁論の全趣旨。表１は，別紙１４引
用文献の図面参照）。

20ａａｂｓｔｒａｃｔ(a)５７２頁１行～６行「細菌は，低浸透圧ストレスに対して，低分子量の溶質を遊離し，一定の膨脹圧を維持することによって応答する。我々は，コリネバクテリウム・グルタミカムにおいて，浸透圧の突然の低下による様々な溶質の排出に関わる，浸透圧調節チャネ
ルの機能を研究している。当該チャネルは，グリシンベタイン及びプロリンのよう25な相溶性の溶質の排出を優先的に媒介する。同じような大きさの分子，例えば，グルタミン酸又はリジンの遊離は，制限され，ＡＴＰは，厳しい浸透圧ショックの後118

であっても，完全に維持された。」(b)

５７２頁１３行～１４行「これらの結果は，大腸菌のメカノセンシティブチャネルに類似の浸透圧調節チャネルが，Ｃ．グルタミカムに存在することを示唆する。」
5ｂ

ＲＥＳＵＬＴＳ(a)

表１（５７５頁）「表１．Ｃ．グルタミカムでの低浸透圧ショック後の溶質排出の特異性。標識又は非標識の相溶性の溶質（グリシンベタイン，プロリン，エクトイン）の蓄積により，あるいはジペプチド（リジン，アラニン）の添加により，高浸透圧条件下（そ10

れぞれ１８６０ｍＯｓｍ及び２１００ｍＯｓｍ）で細胞を溶質に負荷した。細胞は，表に示したように希釈した。シリコンオイルの上清及びペレットにおける低浸透圧ショックの１分後，シンチレーションカウンティング（ｓｃ．ｃｏｕｎｔ．），Ｈ
ＰＬＣ，酵素アッセイ，ＮＭＲ，ルシフェリン／ルシフェラーゼアッセイ，又はフレームフォトメトリー（ｆｌａｍｅ

15ｐｈ．）を用いて排出を測定した。値はμｍ

ｏｌ・ｍｇｄｍ－１で示す，なぜなら，変化した細胞質体積に基づく真の内部濃度への補正は，総変化の結果のミスリーディングを起こすためである。全ての値は，少なくとも３回の実験の平均である。等モル希釈及び５４０ｍＯｓｍに対する低浸透圧ショックのそれぞれに関し，残存した溶質の相対値を示す。」(b)20

５７５頁右欄末行～５７６頁左欄１行「グルタミン酸とリジンの流出は顕著に制限されていた」
ｃＤｉｓｃｕｓｓｉｏｎ(a)５７８頁左欄３８～４９行「土壌細菌として，Ｃ．グルタミカムは，頻繁に起こる緊急事態，即ち，低浸透圧ショックに対して応答する効率的なメカニズムを装備している。浸透圧変化に由25来する膜に作用する機械的ストレスは，細胞サイズの有意な変化を定量することにより明らかにされた。我々が研究してきた排出システムは，大腸菌及びＬ．プラン

119

タルムにおいて以前記載したメカノセンシティブチャネル（Ｂｅｒｒｉｅｒら，１９９２；Ｓｃｈｌｅｖｅｒら，１９９３；Ｇｌａａｓｋｅｒら，１９９６）と定性的に類似する方法で低浸透圧ショックに応答する。しかしながら，Ｃ．グルタミカ
ムのチャネルは，運搬の特異性と排出活性の制御に関して，いくつかの特異的性質
5

を示す。」
(b)

５７８頁右欄３０行～３３行「分子は大きさに関係している，例えば，グルタミン酸，又は小さい無機イオン（ナトリウムイオン，カリウムイオン）でさえ，明らかにこのチャネルをグリシン
ベタインやプロリンと同じ程度には使用していない。」
10(c)５７８頁右欄３６行～４０行「コリネバクテリウム・グルタミカムのチャネルの分子識別性は判明していないが，観察されたコリネバクテリウム・グルタミカムのチャネルを介した透過性の順序については，異なる特異性を有するチャネルの多様性により説明可能である。」(d)15

５７８頁右欄４６行～５５行「非特異的チャネル阻害剤Ｇｄ３＋に対するこのチャネルの感受性の欠如は（Ｂｅｒｒｉｅｒら，１９９２；Ｓｃｈｌｅｖｅｒら，１９９３；Ｈａｓｅら，１９９５），
大腸菌において記載されクローン化されたＧｄ ３＋ 感受性ＭｓｃＬチャネルとは異なるものとして，それをさらに定義する（Ｓｕｋｈａｒｅｖら，１９９４）。しかしながら，この非特異的遮蔽剤が作用しないその他の例も存在する（Ｂｅｒｒｉｅ20

ｒら，１９９６）。したがって，Ｃ．グルタミカムのチャネルは，電気生理学的技
術を用いることにより大腸菌において同定されたその他のタイプ，即ち，ＭｓｃＳと類似するかもしれない（Ｍａｒｔｉｎａｃら，１９８７，１９９０；Ｚｏｒａｔ
ｔｉとＰｅｔｒｏｎｉｌｌｉ，１９８８；Ｂｅｒｒｉｅｒら，１９９６）。」(e)25

５７９頁左欄３９～４６行「最後に，ここで強調されるべきは，ここで述べた排出チャネルは，よく知られた特定の代謝条件下で観察されるＣ．グルタミカムのグルタミン酸排出とは関係が

120

ないことである。継続的なグルタミン酸生産の条件下でのグルタミン酸排出は，その活性に関し浸透圧変化に応答しているようにも見えるが（ランバートら，１９９５年），その排出は，以前から示されているエネルギーに依存する特定の担体系によりなされるものである（グートマンら，１９９２年，クラマー，１９９４年）。
5

(ｲ)

検討

上記のとおり，乙２４文献の表１には，コリネバクテリウム・グルタミカムについて低浸透圧ショックを与えた際の溶質の排出を測定した結果，低浸透圧の状態でグルタミン酸が排出されていることが記載されているが，５４０ｍＯｓｍの条件下においても２０％が排出されているにすぎず，グリシンベタイン（同条件下で７０％10排出）やプロリン（同条件下で７１％排出）などの物質の排出割合とは大きく異なるものであった。グルタミン酸の上記排出割合は，全部で１１種類検討されている溶質の中で，ほとんど排出が見られなかったＡＴＰに次いで小さいものであり，「グ
ルタミン酸とリジンの流出は顕著に制限されていた」と評価されている。
そして，このような結果を受けて，乙２４文献においては，コリネバクテリウム

15

・グルタミカムにおける浸透圧調節チャンネルの働きについて，グリシンベタイン
やプロリンの排出を優先的に媒介しているとする一方で，グルタミン酸の排出とは関係がないとし，グルタミン酸の排出については，浸透圧調節チャネルではなく，それ以前から指摘されていた担体による排出であるとの結論を導いている。
そうすると，乙２４文献は，コリネバクテリウム・グルタミカムにＥ．ｃｏｌｉ

20のメカノセンシティブチャンネルと類似する性質を持つ浸透圧調節チャンネルが存在することを示唆するものではあっても，その浸透圧調節チャネルがグルタミン酸の排出に寄与することを示す内容ではない。
その他，被告が本件優先日２当時の技術常識として引用する文献（乙２８，３７～４０）についても，その中に，コリネ型細菌を用いたアミノ酸の生産においてア

25

ミノ酸菌体外への排出量を増やす必要性についての言及は一部見られるものの，コリネ型細菌の浸透圧調節チャンネル（ＹｇｇＢ）のグルタミン酸排出との関連性に121

ついての言及は認められない。
したがって，コリネ型細菌のｙｇｇＢ遺伝子について，Ｅ．ｃｏｌｉのｙｇｇＢ遺伝子のホモログであり，メカノセンシティブチャンネルの一種として解析されているが，Ｌ－グルタミン酸に及ぼす影響については知られていなかったこと等を記
5載する，本件明細書２における従来技術の記載（【０００２】～【０００６】）が，客観的に見て不十分であるとは認められない。
(3)１９型変異使用構成について

ア

１９型変異使用構成の内容

１９型変異使用構成は，本件発明２－５に含まれる構成であり，本件特許２の請10

求項１又は４を引用する請求項６のうち（ｅ）の変異型ｙｇｇＢ遺伝子が導入されたコリネ型細菌を使用する，請求項１１のグルタミン酸の製造法である。
１９型変異は，本件発明２でｙｇｇＢ遺伝子に導入される変異のうち，ＹｇｇＢ
タンパク質の第４膜貫通領域をコードする部分に変異を導入するものであり（【００７５】），具体的には，配列番号６のコリネバクテリウム・グルタミカム由来の

15

ｙｇｇＢ遺伝子がコードするアミノ酸配列の１００番目のアラニンがスレオニンに置換された変異（Ａ１００Ｔ変異）であり，変異後のｙｇｇＢ遺伝子がコードする
アミノ酸配列は配列番号２２である（【００３３】，【００７５】，【０１１９】）。
イ

１９型変異使用構成の効果

被告は，本件発明２に含まれる構成の中でも，１９型変異使用構成については，
20

グルタミン酸生成量に与える影響はあるとしてもごくわずかであると主張しており，
以下，１９型変異使用構成の効果について検討する。
(ｱ)

実施例１０について

実施例１０においては，界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ４０）を添加した条件又はビオ
チン制限条件という，グルタミン酸生成を誘導する条件下においては，いずれの場
25

合も，１９型変異使用構成によって，野生株（非改変株）と比較してグルタミン酸の生産量の増大が確認された（【表９】，【表１０】）。

122

(ｲ)

実施例８についてａ

本件明細書２の記載について

実施例８は，実施例２と同様に，「過剰量のビオチンを含む条件」（【００３２】）に該当する３００μｇ／ｌのビオチンが存在した上で，界面活性剤等は添加されて5いない非誘導条件下での実験である（【０１２０】，【００９７】）。
そして，実施例８の【表７】には，野生株（非改変株）のグルタミン酸生産量が０．５ｇ／Ｌであったのに対して１９型変異を導入した菌株のグルタミン酸生産量が０．７ｇ／Ｌであったことが示されており，この結果について段落【０１２０】では，１９型変異を導入した菌株において野生株と比べて培養液中のグルタミン酸

10

蓄積が大幅に向上していたと記載されている。
ｂ

被告は，上記の１９型変異を導入した菌株のグルタミン酸生産量は，実施例

２，実施例３のブランクの値と一致するような低いものであり，野生型との差も誤差の範囲内に過ぎない旨主張する。
段落【００９７】及び甲第３７号証によれば，ブランク値が示しているのは，培15

養開始時点の培地において含まれている，菌体の培養のために栄養分として培地に添加した大豆加水分解物由来のグルタミン酸の値であると認められるところ，いずれも実施例２の方法で培養したとされる，実施例２，３，６の【表１】，【表２】，【表４】，【表５】において，ブランク値には０．４ｇ／Ｌから０．７ｇ／Ｌまでの異なる値が示されている。そうすると，同じく実施例２の方法によって培養をし20ても，ブランク値は各実験によって異なり得るものであり，異なる実験におけるブランク値と比較して，実施例８における１９型変異導入株によるグルタミン酸生産量の向上がないとはいえず，また，異なる実験におけるブランク値や，異なる実験における同一の菌株の培養結果を根拠として，実施例８における１９型変異導入株と野生株とのグルタミン酸生産量の差が誤差によるものであったともいえない。

25ｃ

乙第４４号証の実験について

被告は，被告ないしＣＪＣＪが依頼して行った乙第４４号証の実験においては，

123

１９型変異によるグルタミン酸生産能の向上は見られなかったと主張する。
乙第４４号証には，実施例８と同じ培地の条件で，実施例８での菌株と同じく，
ＡＴＣＣ１３８６９株の野生型と，ＡＴＣＣ１３８６９株に１９型変異が導入されたｙｇｇＢ遺伝子を導入した菌株を用いて培養実験を行った結果，いずれの菌株に5おいてもグルタミン酸は生成されないことが確認されたとの記載がある。
実施例８は，実施例２と同様の方法で培養を行うものであるが（【０１２０】），
実施例２では，「フラスコ培地」で「振とう培養」する旨の記載はあるものの，フラスコの種類と振とう速度についての特定はされておらず（【００９７】），実施
例８にもこれらを特定する記載はない。

10

証拠（甲３７～４３）及び弁論の全趣旨によれば，本件優先日２当時の技術常識として，酸素供給量が十分でないと発酵によるグルタミン酸生産が阻害されること，好気性菌の振とう培養によく用いられるフラスコとしては，三角フラスコ，バッフ
ル付き三角フラスコ及び坂口フラスコがあるが，十分な酸素供給をするためには，
三角フラスコでは坂口フラスコと比較して高速での振とうが必要となることが認め

15

られる。
乙第４４号証の実験では，三角フラスコを用いて１１５ｒｐｍの速度で振とう培養したものと認められるところ（乙４４，弁論の全趣旨），本件明細書２においては，実施例１５の段落【０１４６】において，１１５ｒｐｍの速度で振とう培養を行った実験の記載があるが，当該実験は坂口フラスコを用いたものであると記載さ20れており，段落【０１４６】の記載から，上記の乙第４４号証の振とう速度が適切なものであったとはいえない。
原告が行った甲第３７号証の１の実験において，実施例８と同様の培地を使用し，
坂口フラスコを用いて１１５ｒｐｍの速度で振とう培養した結果，１９型変異を導入したＡＴＣＣ１３８６９株が野生型のＡＴＣＣ１３８６９株よりもグルタミン酸

25

生産能が増えるとの結果が確認され，さらに，同様の実験を，三角フラスコで１１５ｒｐｍの振とう速度という乙第４４号証と同様の条件に変更して行った場合には，

124坂口フラスコを用いた上記実験結果と比較して，１９型変異を導入したＡＴＣＣ１
３８６９株のグルタミン酸生産量が大きく低下したとの結果が確認されていることも考慮すれば，乙第４４号証の実験においては，振とう速度が低かったためにグルタミン酸生産が阻害されたことが考えられ，その実験結果は，前記ａの実施例８の5

記載内容を左右するものとはいえない。
ｄ

したがって，実施例８に記載されたとおり，過剰量のビオチンを含む条件において，１９型変異使用構成によって，野生株（非改変株）と比較してグルタミン酸生産が増大すると認められる。
(ｳ)
10

前記(ｱ)及び(ｲ)によれば，１９型変異使用構成は，本件発明２の課題を解決する効果を有すると認められ，その影響がごくわずかであるとの被告の主張は採用
できない。
(4)

被告製法４で使用される菌株について

ア

コリネバクテリウム・カルナエ由来のｙｇｇＢ遺伝子へのＡ９８Ｔ変異及びＶ２４１Ｉ変異の導入について
15

証拠（甲５４，乙４）及び弁論の全趣旨によれば，⑬の菌株には野生型コリネバ
クテリウム・カルナエ由来の変異型ｙｇｇＢ遺伝子が導入されており，当該変異型
ｙｇｇＢ遺伝子は野生型コリネバクテリウム・カルナエのｙｇｇＢ遺伝子がコードするアミノ酸配列（野生型コリネバクテリウム・カルナエであるＤＳＭ２０１４７
株のＹｇｇＢのアミノ酸配列）において９８番目のアラニンがスレオニン（Ａ９８20Ｔ変異）に２４１番目のバリンがイソロイシンに置換されている変異（Ｖ２４１Ｉ
変異）が導入されたものであったことが認められる。
被告は，⑫の菌株については，導入されたコリネバクテリウム・カルナエ由来のｙｇｇＢ遺伝子の解析結果を提出していないが，同様にＡ９８Ｔ変異及びＶ２４１
Ｉ変異を有するものであったと主張しており，それ以外の点で⑬の菌株に導入され25た上記変異型ｙｇｇＢ遺伝子と異なる点があったとは主張していないから，⑫の菌株についても，同じ変異型ｙｇｇＢ遺伝子が導入されていたものと認めるのが相当

125

である。
イ
5

コリネバクテリウム・グルタミカム由来のｙｇｇＢ遺伝子への変異の導入について証拠（甲５４，乙２，４）及び弁論の全趣旨によれば，⑫，⑬の菌株には，上記
アの変異型ｙｇｇＢ遺伝子とは異なるコリネバクテリウム・グルタミカム由来のｙｇｇＢ遺伝子の配列も存在していたところ，そのコードするアミノ酸配列には，●（省略）●との特徴があったことも認められる。

10

ウ

各変異の導入によるグルタミン酸生産能への影響⑫及び⑬の菌株はいずれもコリネバクテリウム・グルタミカムであるが（弁論の全趣旨），そのｙｇｇＢ遺伝子に前記ア及びイの変異が導入されたことによるグルタミン酸生産能への影響について，以下検討する。

15

(ｱ)

Ａ９８Ｔ変異及びＶ２４１Ｉ変異について

ａ

原告による甲第９２号証の実験結果

原告による実験においては，コリネバクテリウム・カルナエ（ＤＳＭ２０１４７株）由来のｙｇｇＢ遺伝子に，①Ａ９８Ｔ変異のみを導入した変異型ｙｇｇＢ遺伝
子をコリネバクテリウム・グルタミカムの染色体上に導入し，実施例８と同様の培地（過剰量のビオチンを含む条件）を使用して，バッフル付き三角フラスコを用い
20て２００ｒｐｍの速度（後記ｃの被告の実験と同じ速度）で振とう培養したところ，
当該菌株では，コリネバクテリウム・カルナエ由来の野生型のｙｇｇＢ遺伝子が導入されたコリネバクテリウム・グルタミカムと比較して，グルタミン酸生産量が増大していることが確認された（甲９２の実験１）。
また，上記①の菌株を使用して，実施例１０と同様の培地（界面活性剤であるＴ

25

ｗｅｅｎ４０が添加された条件）を使用して，振とう培養した結果，コリネバクテ
リウム・カルナエ由来の野生型のｙｇｇＢ遺伝子が導入されたコリネバクテリウム

126

・グルタミカムと比較して，上記①の菌株ではグルタミン酸の生産量が増大していることが確認された（甲９２の実験２）。
ｂ

原告による甲第５４号証の実験結果

原告による実験においては，コリネバクテリウム・カルナエ（ＤＳＭ２０１４７5株）由来のｙｇｇＢ遺伝子に，②Ａ９８Ｔ変異及びＶ２４１Ｉ変異を導入した変異
型ｙｇｇＢ遺伝子，並びに③Ｖ２４１Ｉ変異のみを導入した変異型ｙｇｇＢ遺伝子
を，それぞれコリネバクテリウム・グルタミカムにプラスミドとして導入し，実施
例８と同様の培地（過剰量のビオチンを含む条件）を使用して，坂口フラスコを用いて１１５ｒｐｍの速度で振とう培養したところ，コリネバクテリウム・カルナエ

10

由来の野生型のｙｇｇＢ遺伝子をプラスミドとして導入したコリネバクテリウム・
グルタミカムと比較した場合，上記③の菌株ではグルタミン酸生産量は同様であり，
いずれもほとんどグルタミン酸を生産しないが，上記②の菌株では大幅にグルタミ
ン酸生産量が増大することが確認された（甲５４の実験２）。
ｃ

15

乙第９７号証における実験結果

被告の関連研究機関の実験においては，コリネバクテリウム・カルナエ由来のｙｇｇＢ遺伝子に，Ａ９８Ｔ変異のみを導入した変異型ｙｇｇＢ遺伝子をコリネバク
テリウム・グルタミカムにプラスミドとして導入し，過剰量のビオチン（３００μｇ／ｌ）を含む培地を使用して，バッフル付き三角フラスコを用いて２００ｒｐｍの速度で振とう培養したところ，当該菌株からはグルタミン酸の産生は確認されな20かった（乙９７）。
ｄ

検討

(a)

原告の実験と被告側の実験の比較

前記ａ及びｃのとおり，コリネバクテリウム・カルナエ由来のｙｇｇＢ遺伝子に
Ａ９８Ｔ変異のみを導入した変異型ｙｇｇＢ遺伝子が，過剰量のビオチンが存在す
25る条件下でのグルタミン酸生産能を向上させる効果を持つかどうかについて，原告の実験（甲９２）と被告側の実験（乙９７）では異なる結果が示されている。

127

この点の違いについて，上記の原告の実験の報告書では，その考察部分の中で，被告側の実験では変異型ｙｇｇＢ遺伝子がプラスミドとして導入されているが，導入されたプラスミドが菌体内で安定に保持されているかどうかの確認がされておらず，プラスミドが不安定化した結果，変異型ｙｇｇＢ遺伝子の効果が確認されなか5ったことが考えられる旨の記載がある（甲９２）。
本件発明２における変異型ｙｇｇＢ遺伝子の導入方法は，細菌の染色体上のｙｇｇＢ遺伝子に変異を導入する方法と，変異型ｙｇｇＢ遺伝子を含むプラスミドを菌体内に導入する方法があるが（【００５０】），一般的にプラスミドによる遺伝子
変異の導入の際には，プラスミド自体が脱落する等の問題があることが指摘されて10おり（本件明細書１の段落【０００２】，【０００３】），被告が，被告側の上記実験においてプラスミドとして導入された変異型ｙｇｇＢ遺伝子の安定性について，
具体的な主張立証をしていないことも考慮すれば，コリネバクテリウム・カルナエ
由来のｙｇｇＢ遺伝子にＡ９８Ｔ変異のみを導入した場合の効果について，被告側の実験結果（乙９７）は採用できない。

15

(b)

Ａ９８Ｔ変異とＶ２４１Ｉ変異の導入の効果

そうすると，前記ａ及びｂの実験結果によれば，コリネバクテリウム・カルナエ（ＤＳＭ２０１４７株）由来のｙｇｇＢ遺伝子にＡ９８Ｔ変異を導入した変異型ｙｇｇＢ遺伝子を導入することによって，過剰量のビオチンを含む条件下でのコリネ
バクテリウム・グルタミカムのグルタミン酸生産能が向上することが認められ，他
20

方で，コリネバクテリウム・カルナエ（ＤＳＭ２０１４７株）由来のｙｇｇＢ遺伝
子にＶ２４１Ｉ変異を導入することは，過剰量のビオチンを含む条件下でのコリネ
バクテリウム・グルタミカムのグルタミン酸生産能の向上には寄与しないことが認められる。
被告は，コリネバクテリウム・カルナエ由来のｙｇｇＢ遺伝子にＡ９８Ｔ変異の25みを導入しても，グルタミン酸生産能は向上せず，Ａ９８Ｔ変異にＶ２４１Ｉ変異が加わって初めてグルタミン酸生産能が増加する旨主張するが，前記のａ及びｂの128

実験結果に照らして採用できない。
(ｲ)

コリネバクテリウム・グルタミカム由来のｙｇｇＢ遺伝子への変異の導入について証拠（甲５４）によれば，コリネバクテリウム由来のｙｇｇＢ遺伝子に前記イの5変異を導入した上で，コリネバクテリウム・グルタミカムに当該変異型ｙｇｇＢ遺伝子を導入し，実施例８と同様の培地（過剰量のビオチンを含む条件）を使用して，
坂口フラスコを用いて１１５ｒｐｍの速度で振とう培養したところ，当該菌株では，グルタミン酸生産能は確認できず，ｙｇｇＢ遺伝子を有しないようにした菌株と同様の結果となったことが認められ，その実験結果については，上記変異型ｙｇｇＢ10

遺伝子のコードするアミノ酸配列はＹｇｇＢとしての機能を有しないとの考察がされている。
したがって，この変異の導入は，ビオチンが過剰量存在する条件下でのグルタミン酸生産能の向上には寄与しないものといえる。

15

(5)

被告製法４と本件発明２との対比

ア

前記(4)で検討したところからすれば，被告製法４で使用される⑫及び⑬の菌株は，いずれも，コリネバクテリウム・カルナエ（ＤＳＭ２０１４７株）由来のｙｇｇＢ遺伝子にＡ９８Ｔ変異及びＶ２４１Ｉ変異が導入された変異型ｙｇｇＢ遺伝子が導入されたコリネバクテリウム・グルタミカムであり，非改変株と比較して，ビオチンが過剰量存在する条件下でのグルタミン酸生産能が向上しているものとい20える。
したがって，被告製法４で使用される⑫及び⑬の菌株は，文言上，本件発明２－１の構成要件２－Ａ及び２－Ｂを充足するが，２－Ｃを充足せず，本件発明２－２
及び２－３の構成要件（構成要件２－Ｄ，２－Ｅ，２－Ｆ－１，２－Ｆ－２，２－Ｆ－３）をいずれも充足しない。また，弁論の全趣旨によれば，被告製法４は，被25

告製法１ないし３と同様に，文言上，本件発明２－５の構成要件２－Ｈについて，
請求項１から１０を引用する部分を除いて充足し，構成要件２－Ｉ及び２－Ｊを充129

足するものと認められる。
イ

被告製法４と１９型変異使用構成との相違点

前記(3)及び(4)の検討からすれば，被告製法４と，被告発明２－５に含まれる１９型変異使用構成（本件特許２の請求項１又は４を引用する請求項６のうち（ｅ）
5の変異型ｙｇｇＢ遺伝子が導入されたコリネ型細菌を使用する，請求項１１のグルタミン酸の製造法）との相違点は，構成要件２－Ｃ，２－Ｄ，２－Ｅ，２－Ｆ－１，
２－Ｆ－２，２－Ｆ－３，２―Ｈに係る部分（前記アの文言非充足部分）であり，具体的には，使用されている菌株に係る，以下の相違点があるものと認められる。
相違点１

10

導入されている変異型ｙｇｇＢ遺伝子が，１９型変異使用構成の菌株ではコリネバクテリウム・グルタミカム由来のもの（変異前のアミノ酸配列は配列
番号６）であるのに対して，被告製法４で使用される菌株（⑫，⑬の菌株）では，コリネバクテリウム・カルナエ（ＤＳＭ２０１４７株）由来のものである点。
相違点２

ｙｇｇＢ遺伝子に導入された変異が，１９型変異使用構成の菌株ではｙｇｇＢ遺伝子がコードするアミノ酸配列の１００番目のアラニンをスレオニンに15置換するもの（Ａ１００Ｔ変異）であるのに対して，被告製法４で使用される菌株
では，ｙｇｇＢ遺伝子がコードするアミノ酸配列の９８番目のアラニンをスレオニンに置換するもの（Ａ９８Ｔ変異）である点。
相違点３

１９型変異使用構成では，ｙｇｇＢ遺伝子にはＡ１００Ｔ変異のみが導入されているのに対して，被告製法４で使用される菌株では，Ａ１００Ｔ変異に20

加えてｙｇｇＢ遺伝子がコードするアミノ酸配列の２４１番目のバリンをイソロイシンに置換する変異（Ｖ２４１Ｉ変異）も導入されている点。
前記(4)イのとおり，⑫及び⑬の菌株には，前記のコリネバクテリウム・カルナエ
由来の変異型ｙｇｇＢ遺伝子とは別に，コリネバクテリウム・グルタミカム由来の
ｙｇｇＢ遺伝子の配列も存在しており，そのコードするアミノ酸配列は，●（省略）25●

しかしながら，

130

前記(4)ウ(ｲ)のとおり，このｙｇｇＢ遺伝子の配列は，ビオチンが過剰量存在する条件下でのグルタミン酸生産能の向上には寄与せず，そのコードするアミノ酸配列がＹｇｇＢとしての機能を有しないと考えられるものであり，その配列の存在について，当事者双方とも均等侵害の成否に当たって考慮すべき相違点であるとは主張
5

していないものであるから，上記の相違点１ないし３に加えて考慮すべき相違点であるとはいえない。
(6)

第１要件について（非本質的部分）

ア

本件発明２（１９型変異使用構成）の本質的部分

上記のとおり，本件において，被告製法４が本件発明２と均等なものとしてその10

技術的範囲に属するかについては，被告製法４と本件発明２に含まれる１９型変異
使用構成とを対比するのが相当であるから，第１要件の充足に関して，本件発明２の本質的部分を検討するに当たっても，以下のとおり，具体的には１９型変異使用
構成の本質的部分を検討することとする。
(ｱ)15

特許法が保護しようとする発明の実質的価値は，従来技術では達成し得なかった技術的課題の解決を実現するための，従来技術に見られない特有の技術的思想に基づく解決手段を，具体的な構成をもって社会に開示した点にある。特許発明における本質的部分とは，当該特許発明の特許請求の範囲の記載のうち，従来技術に見られない特有の技術的思想を構成する特徴的部分であると解すべきである（前記知財高裁平成２８年３月２５日判決参照）。

20

(ｲ)

前記(2)ウのとおり，本件明細書２記載の従来技術と比較して，本件発明２における従来技術に見られない特有の技術的思想（課題解決原理）とは，従来，グルタミン酸生産に及ぼす影響について知られていなかったコリネ型細菌のｙｇｇＢ遺伝子に着目し，Ｃ末端側変異や膜貫通領域の変異といった変異型ｙｇｇＢ遺伝子を用いてメカノセンシティブチャネルの一種であるＹｇｇＢタンパク質を改変する
25

ことによって，グルタミン酸の生産能力を上げるための，新規な技術を提供することにあったというべきである。また，前記(2)エで検討したとおり，本件明細書２に131

おける従来技術の記載が客観的に見て不十分であるとは認められない。
(ｳ)

前記(3)アのとおり，１９型変異使用構成は，本件発明２－５に含まれる，

本件特許２の請求項１又は４を引用する請求項６のうち（ｅ）の変異型ｙｇｇＢ遺伝子が導入されたコリネ型細菌を使用する構成であり，前記(ｲ)の本件発明２にお5ける特有の技術的思想ないし課題解決原理に照らせば，１９型変異使用構成の本質的部分は，「コリネ型細菌由来のｙｇｇＢ遺伝子に，コリネバクテリウム・グルタ
ミカム由来のｙｇｇＢ遺伝子におけるＡ１００Ｔ変異に相当する変異を導入し，当該変異型ｙｇｇＢ遺伝子を用いてコリネ型細菌を改変し，ビオチンが過剰量存在する条件下においてもグルタミン酸の生産能力を上げる点」にあると認められる。

10

(ｴ)

被告は，出願経過，本件優先日２当時の技術水準，１９型変異使用構成の効果から，１９型変異使用構成の本質的部分の認定に当たっては，特許請求の範囲の記載の上位概念化をすべきでなく，特許請求の範囲に記載された「変異後のｙｇｇ
Ｂ遺伝子の配列である配列番号２２という特定のアミノ酸配列におけるＡ１００Ｔ
変異」に限定して認定されるべきであると主張する。
15

しかしながら，前記(2)ア及びイの本件明細書２の記載内容によれば，本件発明２は，特定の配列のｙｇｇＢ遺伝子を有するコリネ型細菌にのみ存在する課題を対象とするものではなく，また，その解決原理としても，グルタミン酸生産能力を上げるために，Ｃ末端側変異や膜貫通領域の変異といった変異型ｙｇｇＢ遺伝子を用いてメカノセンシティブチャネルの一種であるＹｇｇＢタンパク質を改変するという

20

新規な技術を導入するというものであったから，本件発明２の請求項１や請求項４において変異を導入する前のｙｇｇＢ遺伝子のアミノ酸配列が列挙され，請求項６において変異後のｙｇｇＢ遺伝子のアミノ酸配列が列挙されていることを考慮しても，本件発明２及びそれに含まれる１９型変異使用構成の本質的部分を認定するに当たっては，ｙｇｇＢ遺伝子が由来するコリネ型細菌の菌種，ｙｇｇＢ遺伝子全体

25の変異前の具体的配列，あるいは，Ａ１００Ｔ変異に相当する変異を導入した後のｙｇｇＢ遺伝子の具体的配列は，その本質的部分ではないものと認めるのが相当で132ある。これは，被告が指摘するように，本件特許２の出願当初の請求項１にはｙｇｇＢ遺伝子が由来するコリネ型細菌の菌種や変異前後のｙｇｇＢ遺伝子のアミノ酸配列が特定されていなかったところ，補正によって，現在の請求項１のようにｙｇｇＢ遺伝子のアミノ酸配列の配列番号が，コリネバクテリウム・グルタミカム（ブ5

レビバクテリウム・フラバムを含む。）又はコリネバクテリウム・メラセコーラに由来する配列番号６，６２，６８，８４及び８５に特定されるようになったこと（【００３３】，乙８０～８４），請求項１に記載された配列番号６，６２，６８，８４
及び８５のアミノ酸配列が相互に相同性が高いこと（乙８５）を考慮しても同様である。また，被告は，出願経過に関連して，本件特許２の再訂正後の請求項の記載

10も考慮すべきとも主張するが，当該訂正の内容は，少なくとも訂正前の本件発明２の本質的部分の認定には影響しないというべきである。
そのほか，本件優先日２当時の技術水準や１９型変異使用構成の効果についての
被告の主張が採用できないことは，前記(2)エ及び(3)イのとおりであり，これらを理由として，１９型変異使用構成の本質的部分を特許請求の範囲に記載された変異

15前後のｙｇｇＢ遺伝子の具体的配列に限定すべきともいえないから，この点の被告の主張も，前記(ｳ)の判断を左右するものではない。
イ

相違点１について前記ア(ｴ)のとおり，１９型変異使用構成の本質的部分については，ｙｇｇＢ遺伝子が由来するコリネ型細菌の菌種，ｙｇｇＢ遺伝子全体の変異前の具体的配列，あ20

るいは，Ａ１００Ｔ変異に相当する変異を導入した後のｙｇｇＢ遺伝子の具体的配列は，その本質的部分ではないものと認めるのが相当であることに加え，以下の(ｱ)及び(ｲ)の点を考慮すれば，相違点１に係る違い，すなわち，導入されている変異型
ｙｇｇＢ遺伝子が由来する細菌の種類の違い及びそれによるｙｇｇＢ遺伝子の具体的な配列の違いは，１９型変異使用構成の本質的部分とはいえない。

25

(ｱ)

コリネバクテリウム・カルナエの有する性質

証拠（甲５４～５６，７８，乙８６）及び弁論の全趣旨によれば，コリネバクテ

133リウム・カルナエは，コリネバクテリウム・グルタミカムと比較すると，同じコリ
ネバクテリウム属に属し，その中の分類上でも近縁の細菌であり，コリネバクテリ
ウム・グルタミカムと同様にグルタミン酸を工業的に生産する際に利用される微生物として知られているものと認められ，本件明細書２においても，本件発明２のコ
5リネ型細菌として例示されている（【００１２】）。乙第９６号証には，同じコリ
ネバクテリウム属に属する細菌であっても，その性質には多様性がある旨の記載があるが，グルタミン酸生産に関し，コリネバクテリウム・カルナエとコリネバクテ
リウム・グルタミカムの性質に具体的な差があることを示すものではなく，上記認定を左右するものではない。

10

(ｲ)

変異型ｙｇｇＢ遺伝子の具体的な配列の同一性，相同性の程度

証拠（甲５４，５６，７１，乙８５）及び弁論の全趣旨によれば，１９型変異使
用構成で用いられるコリネバクテリウム・グルタミカム由来の変異型ｙｇｇＢ遺伝
子のアミノ酸配列全体(Ａ１００Ｔ変異導入後の配列番号２２の配列)と，⑫及び⑬の菌株のｙｇｇＢ遺伝子のアミノ酸配列全体を比較すると，両者はアミノ酸配列間15の同一性が６４％程度であり，類似性のあるアミノ酸による保存的置換も考慮して比較した相同性は９１％程度になることが認められる。
ウ

相違点２について証拠（甲５４，乙８５）及び弁論の全趣旨によれば，１９型変異使用構成の菌株に導入されたコリネバクテリウム・グルタミカム由来のｙｇｇＢ遺伝子（変異前の20

アミノ酸配列の配列番号６）とコリネバクテリウム・カルナエ（ＤＳＭ２０１４７株）由来のｙｇｇＢ遺伝子のアミノ酸配列を一般的なアミノ酸配列の比較方法で比較すると前者の１００番目のアラニンは後者の９８番目のアラニンに相当するものであり，また，これらのアラニンは，タンパク質の立体構造モデルを比較してもい
ずれもＹｇｇＢの膜貫通領域の同等の位置に存在していることが認められる。

25

そうすると，相違点２に係る，ｙｇｇＢ遺伝子のコードするアミノ酸配列のうちスレオニンに置換するアラニンの位置が，１９型変異使用構成の菌株では１００番

134

目のアラニンであるのに対して，被告製法４の⑫及び⑬の菌株では９８番目のアラニンであることは，１９型変異使用構成の本質的な部分における相違点ではない。

5エ

相違点３について(ｱ)

証拠（甲５４，５６，乙８５）及び弁論の全趣旨によれば，前記ウ同様に一般的なアミノ酸配列の比較方法で比較するとコリネバクテリウム・カルナエ（ＤＳＭ２０１４７株）由来のｙｇｇＢ遺伝子の２４１番目のバリンは，１９型変異使用構成の菌株のｙｇｇＢ遺伝子（変異前のアミノ酸配列の配列番号６）の２４３番目のバリンに相当するものであること，これらのバリンは，本件明細書２に開示された膜貫通領域（【００７３】）及びＣ末端側領域（【００７０】）のアミノ酸に相10当しないものであり，タンパク質の立体構造モデルを検討しても膜貫通領域及びその周辺には存在していないこと，バリンとイソロイシンは性質が近く，バリンからイソロイシンへの置換はタンパク質構造への影響が少ないことが認められる。
(ｲ)

また，本件明細書２においては，ビオチンが過剰量存在する条件においてＬ－グルタミン酸生産能を向上させる機能を有する限り，Ｃ末端側変異ないし膜貫通15領域の「変異点のアミノ酸以外にさらに，１若しくは数個のアミノ酸の置換，欠失，
挿入，または付加を含むアミノ酸配列を有するものであってもよい。」，その置換は「保存的置換（中性変異）が好ましく」，その例としてバリン（ｖａｌ）からイ
ソロイシン（ｉｌｅ）への置換が挙げられるとの記載がされ（【００７８】），請求項６の(f)では，１９型変異使用構成の菌株の変異型ｙｇｇＢ遺伝子のアミノ酸20

配列（配列番号２２）から「１～５個のアミノ酸が置換，欠失，挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし，コリネ型細菌に導入することにより，過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ－グルタミン酸生産能を向上させるDNA」についても本件発明２－３に含まれることが示されている。

25(ｳ)

そして，前記(4)ウのとおり，Ａ９８Ｔ変異とＶ２４１Ｉ変異が導入された⑫及び⑬の菌株には，本件発明２の課題である，過剰量のビオチンを含む条件下で135

のグルタミン酸生産能の向上が見られるが，それに寄与しているのはＡ９８Ｔ変異であって，Ｖ２４１Ｉ変異はこれに寄与していないことが認められる。
(ｴ)

これらの点からすれば，相違点３に係る違い，すなわち相違点２に係るＡ９８Ｔ変異に加えて，被告製法４の菌株ではＶ２４１Ｉ変異が導入されているという
5点は，本件明細書２で開示された本件発明２の課題解決原理である膜貫通領域の変異ないしＣ末端側変異と関連しない部位の１つのアミノ酸に保存的置換を加えるものであり，Ａ９８Ｔ変異に加えることで課題解決に影響するものではないから，１９型変異使用構成の本質的な部分における相違点ではない。
オ

10

したがって，１９型変異使用構成と被告製法４との相違点１ないし３は，いずれも，特許発明の本質的部分ではないから，⑫及び⑬の菌株を使用する被告製法
４は均等の第１要件を充足すると認められる。
(7)

第２要件について（置換可能性）

前記(3)イ及び前記(4)ウによれば，被告製法４で使用される⑫及び⑬の菌株には，本件発明２の課題であるグルタミン酸生産能の向上が見られ，過剰量のビオチンを15含む条件下でのグルタミン酸生産能の向上という１９型変異使用構成と同一の作用効果を奏するものと認められる。
被告は，１９型変異使用構成の本質的部分は，配列番号２２という特定の変異であり，その作用効果も配列番号２２という特定のアミノ酸配列の作用効果に限定されるから，被告製法４と１９型変異使用構成の作用効果は同一でないと主張する。

20

しかしながら，前記(6)ア(ｴ)のとおり，本件発明２の課題とその解決原理に照らして，１９型変異使用構成の本質的部分を変異前後のｙｇｇＢ遺伝子の具体的配列に限定すべきとはいえず，１９型変異使用構成の作用効果が配列番号２２のアミノ酸配列の作用効果に限定されるともいえないから，被告の主張は採用できない。
したがって，⑫及び⑬の菌株を使用する被告製法４は均等の第２要件を充足する25と認められる。
(8)

第３要件について（置換容易性）

136

ア

相違点１及び相違点２について(ｱ)

本件明細書２におけるコリネバクテリウム・カルナエの記載

コリネバクテリウム・カルナエは，本件明細書２において，請求項１に記載されたｙｇｇＢ遺伝子の配列番号６，６２，６８，８４及び８５が由来する，コリネバ
5

クテリウム・グルタミカム（ブレビバクテリウム・フラバムを含む。）又はコリネ
バクテリウム・メラセコーラと同様に，本件発明２のコリネ型細菌として例示されている（【００１２】，【００３３】）。
(ｲ)

コリネバクテリウム・カルナエの性質についての技術常識

証拠（甲５４～５６，７８，乙８６）及び弁論の全趣旨によれば，コリネバクテ
10

リウム・カルナエは，１９６３年にそれを用いたグルタミン酸の生産方法について
米国特許が登録されるなど，当業者には，古くからグルタミン酸を工業的に生産する際に利用される微生物として知られていたことが認められ，また，コリネバクテ
リウム・カルナエとコリネバクテリウム・グルタミカムとの関係については，本件優先日２の時点においても，同じコリネバクテリウム属に属し，その中の分類上で15も近縁の細菌であることが知られていたものであり，その後に新たなコリネ型細菌が発見されるなどして分類が見直された後も，この点は同様であったことが認められ，これらのコリネバクテリウム・カルナエの性質は，被告製法４による製造が開始された平成２８年７月の時点では，技術常識となっていたものと認められる。
(ｳ)

20

コリネバクテリウム・カルナエのゲノム解析の状況

証拠（甲５６，７４，８４，乙８６）及び弁論の全趣旨によれば，本件優先日２において，コリネバクテリウム・カルナエＤＳＭ２０１４７株の全ゲノム及びｙｇ
ｇＢ遺伝子のアミノ酸配列は解析がされていなかったが，平成２５年３月までにこれらの解析が終了し，同月にいずれもデータベース上に登録されたこと，平成２７
年１月に公表された論文（Ｓｔａｎｄａｒｄｓ

25

ｉｎＧｅｎｏｍｉｃ

Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（２０１５）１０：５，乙８６）において，上記ＤＳＭ２０１４７株のゲノム解析の結果が報告され，そこでは，コリネバクテリウム・グルタミカムとの関137

係について以下の記載がされ，相互のゲノム配列の近さから，コリネバクテリウム
・グルタミカムにおける知見をコリネバクテリウム・カルナエに応用できる可能性が示唆されていたことが認められる。
ａ5５頁目左欄末行～右欄６行「コリネバクテリウム・カルナエはコリネバクテリウム・グルタミカムに匹敵する量のＬ－グルタミン酸を生産することが示されてきたため，そしてクロモソーム
がコリネバクテリウム・グルタミカム及びコリネバクテリウム・エフィシェンスよりも既に相当に小さいことから（２．８４Ｍｂｐ対それぞれ３．２１Ｍｂｐ及び３．
１５Ｍｂｐ），コリネバクテリウム・カルナエは，将来のゲノム・リダクションの10

努力にとって潜在的な候補として考慮されるかもしれない。」
ｂ

６頁目左欄１０行～１４行「それゆえ，この細菌（コリネバクテリウム・カルナエ）は，十分に研究されているコリネバクテリウム・グルタミカムに対するそのゲノム配列における高度の類似性により，新しい宿主への知見の移転を容易にするため，将来のプラットフォー
15

ム株の開発のための理想的な選択であり得る。」(ｴ)

ゲノム解析後のコリネバクテリウム・カルナエのｙｇｇＢ遺伝子の一般的なソフトウェア等を利用した分析結果
証拠（甲５４，乙８５，９８）及び弁論の全趣旨によれば，前記(ｳ)のとおり，コ
リネバクテリウム・カルナエのｙｇｇＢ遺伝子がデータベースに登録された平成２20

５年の時点では，インターネットを通じて利用可能な一般的な検索ソフトウェア（Ｂｌａｓｔ）を利用して，データベース上に登録されたｙｇｇＢ遺伝子の中で，１９型変異使用構成の菌株のｙｇｇＢ遺伝子の変異前のアミノ酸配列（配列番号６）と同一性の高いアミノ酸配列を検索することが可能であり，前記(ｳ)のように登録されたコリネバクテリウム・カルナエ（ＤＳＭ２０１４７株）のｙｇｇＢ遺伝子のア25

ミノ酸配列は，コリネバクテリウム・グルタミカム（現在の分類上コリネバクテリ
ウム・グルタミカムに分類されるブレビバクテリウム・フラバムを含む。）由来の138

ＹｇｇＢ遺伝子に次いで，同一性が上位の配列の一つとして表示される（カバー率９０％での同一性が７０％）ことが認められ，さらには，配列番号６のアミノ酸配列とコリネバクテリウム・カルナエ（ＤＳＭ２０１４７株）のｙｇｇＢ遺伝子のアミノ酸配列とを，上記ソフトウェアやその他インターネットを通じて入手可能な一5

般的なソフトウェア（ＣｌｕｓｔａｌＷ）などを用いて比較すると，配列番号６の１００番目のアラニンはＤＳＭ２０１４７株の９８番目のアラニンに相当するものであることが確認できたものと認められる。
(ｵ)

コリネバクテリウム・カルナエ由来の変異型ｙｇｇＢ遺伝子を導入することの困難性等の有無
10

証拠（甲５４，９２）及び弁論の全趣旨によれば，コリネバクテリウム・カルナ
エ（ＤＳＭ２０１４７株）のｙｇｇＢ遺伝子のアミノ酸配列と変異を導入するアミノ酸の位置が分かれば，被告製法４による製造が開始された平成２８年７月当時，当業者は，本件明細書２に記載された方法を用いるなどして，そのアミノ酸配列に
Ａ９８Ｔ変異を導入した上で，コリネバクテリウム・グルタミカムに導入すること15をなし得たものと認められ，その点に技術的な困難性があったとは認められない。
また，証拠（甲７５～７７）及び弁論の全趣旨によれば，ある菌に由来する遺伝子を同様の遺伝子を持つ別種の菌に導入しても同様に機能する例が，本件優先日２の以前から知られていたことが認められるから，当業者において，菌種が異なることのみをもって，コリネバクテリウム・カルナエ由来の変異型ｙｇｇＢ遺伝子をコ

20

リネバクテリウム・グルタミカムに導入しても効果を奏しないと考えるとはいえず，
その他，このような構成を回避すべきとする知見があったともいえない。
(ｶ)

検討

前記(ｱ)ないし(ｵ)で検討したとおり，本件明細書２に本件発明２のコリネ型細菌の例としてコリネバクテリウム・カルナエが言及されていたこと（前記(ｱ)），コリ
25

ネバクテリウム・カルナエがグルタミン酸生産菌であり，コリネバクテリウム・グ
ルタミカムと近縁の細菌であることが技術常識であったこと（前記(ｲ)），コリネバ

139クテリウム・カルナエのゲノム解析が平成２５年３月までに終了してそのｙｇｇＢ遺伝子のアミノ酸配列の検索ないし分析が一般的なソフトウェアを使用して可能になり，それによって，配列番号６のｙｇｇＢ遺伝子とコリネバクテリウム・カルナ
エ（ＤＳＭ２０１４７株）のｙｇｇＢ遺伝子のアミノ酸配列の同一性が高く，配列5

番号６の１００番目のアラニンがＤＳＭ２０１４７株の９８番目のアラニンに相当
することが確認可能となっていたこと（前記(ｳ)，(ｴ)），変異を導入するアミノ酸の位置が特定されれば，ＤＳＭ２０１４７株のアミノ酸配列にＡ９８Ｔ変異を導入した上で，コリネバクテリウム・グルタミカムに導入することに当業者に技術的な困難性は認められず，異なる菌種に由来する変異型ｙｇｇＢ遺伝子を使用すること

10を回避すべきとの知見があったともいえないこと（前記(ｵ)）からすれば，１９型変異使用構成について，相違点１及び２に係る構成に置換すること，すなわち変異型
ｙｇｇＢ遺伝子が由来する菌株をコリネバクテリウム・グルタミカムからコリネバ
クテリウム・カルナエに置き換え，それに伴って，ｙｇｇＢ遺伝子のアミノ酸配列のうちアラニンをスレオニンに変更する位置を１００番目から９８番目に変更する

15

ことは，当業者が，被告製法４による製造が開始された平成２８年７月の時点で，容易に想到することができたと認めるのが相当である。
被告は，第３要件にいう容易想到とは，当業者であれば，誰もが特許請求の範囲に明記されているのと同じように認識できる程度の容易さと解すべきであり，そのような容易さはなかった旨主張するが，上記の事情からすれば，当業者である，本20

件発明２の属する細菌を用いたグルタミン酸発酵工業における平均的技術者を基準として，相違点１及び２についての容易想到性は認められるというべきであり，この点の被告の主張は採用できない。また，被告は，コリネバクテリウム・グルタミ
カム由来のｙｇｇＢ遺伝子に代えて，あえてコリネバクテリウム・カルナエ由来のｙｇｇＢ遺伝子を選択する優先順位は低かった旨も主張するが，前記(ｱ)及び(ｲ)の25

本件明細書２での言及やコリネバクテリウム・カルナエについての技術常識，並びに前記(ｴ)の利用可能な分析結果に照らして，上記の結論を覆すものとはいえない。

140

イ

相違点３について(ｱ)

前記(6)エ(ｲ)のとおり，本件明細書２（【００７８】）及び本件発明２の請

求項６の(f)においては，１９型変異使用構成の菌株のｙｇｇＢ遺伝子のアミノ酸配列（配列番号２２）にバリンからイソロイシンへの置換等の保存的置換を加えて5も，同様に課題を解決し得ることが示されていた。
(ｲ)

そして，前記(6)エ(ｱ)のとおり，コリネバクテリウム・カルナエ（ＤＳＭ２

０１４７株）由来のｙｇｇＢ遺伝子の２４１番目のバリンは１９型変異使用構成の菌株に導入されたｙｇｇＢ遺伝子（変異前のアミノ酸配列の配列番号６）の２４３番目のバリンに相当するものであるところ，証拠（甲５４，乙８５，９８）及び弁10

論の全趣旨によれば，前記ア(ｴ)と同様に，当業者は，コリネバクテリウム・カルナ
エのｙｇｇＢ遺伝子がデータベースに登録された平成２５年の時点では，一般的なソフトウェアを用いて上記のバリン相互の対応関係について確認することができ，
これらのバリンの位置が，本件明細書２に開示された膜貫通領域（配列番号６のア
ミノ酸番号１～２３，２５～４７，６２～８４，８６～１０８及び１１０～１３２。

15【００７３】）及びＣ末端側領域（配列番号６のアミノ酸番号４１９～５３３。【００７０】）のアミノ酸に相当しないものであることも認識できたと認められる。
(ｳ)

また，証拠（甲５４）及び弁論の全趣旨によれば，前記ア(ｵ)同様，コリネ

バクテリウム・カルナエ（ＤＳＭ２０１４７株）のｙｇｇＢ遺伝子のアミノ酸配列と変異を導入するアミノ酸の位置が分かれば，被告製法４による製造が開始された
20

平成２８年７月当時において，当業者が，本件明細書２に記載された方法を用いるなどして，そのアミノ酸配列にＡ９８Ｔ変異と共にＶ２４１Ｉ変異を導入することは可能であり，その点に技術的な困難性があったとは認められない。
(ｴ)

そうすると，１９型変異使用構成について，相違点１及び２に係る構成に加えて，相違点３に係る構成を取ること，すなわちコリネバクテリウム・カルナエ（Ｄ25ＳＭ２０１４７株）由来のｙｇｇＢ遺伝子にＡ９８Ｔ変異のほかに，Ｖ２４１Ｉ変異を加えることは，本件明細書２及び請求項６の(f)において，１９型変異使用構成141

の菌株のｙｇｇＢ遺伝子に加えても同様に課題を解決し得ることが示されていた保存的置換に相当する変異を加えるものといえるから，コリネバクテリウム・カルナ
エのｙｇｇＢ遺伝子がデータベースに登録された後である，被告製法４による製造が開始された平成２８年７月の時点で，当業者が容易に想到することができたと認
5めるのが相当である。
(ｵ)

被告は，被告製法４においては，Ａ９８Ｔ変異にＶ２４１Ｉ変異が加わって初めてグルタミン酸生産能が増加するものであり，被告製法４にはこれらの２つの変異の組み合わせが必要であるところ，そのような組み合わせを示唆するものはな
かったとして，当業者が相違点１及び２に加えて，相違点３に係る構成を取ること10は容易ではなかったと主張するが，前記(4)ウのとおり，Ａ９８Ｔ変異にＶ２４１Ｉ
変異が加わって初めてグルタミン酸生産能が増加するとはいえず，Ｖ２４１Ｉ変異は過剰量のビオチンを含む条件下でのグルタミン酸生産能の向上には寄与していな
いと認められるから，被告の主張は採用できない。
また，被告は，膜貫通領域の外にあるアミノ酸の置換であっても，グルタミン酸

15の排出に影響を及ぼし得るから，Ｖ２４１Ｉ変異がグルタミンの排出に影響を与えていないことが明らかとはいえなかったとも主張する。この点につき，被告が指摘する，本件優先日２より後の平成２５年に発表された論文（Ｂｉｏｓｃｉ．
ｏｔｅｃｈｎｏｌ．

Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２０１３）７７（５）Ｂｉ

１００８－１０

１３。甲３１，乙８７）には，コリネバクテリウム・グルタミカムのｙｇｇＢ遺伝
20子について，アミノ酸配列のアミノ酸番号２２１－２３２の領域を欠失させることや，本件明細書２のＣ末端側領域に含まれる，アミノ酸番号４２０－５３３の領域を欠失させることでグルタミン酸の生産に影響があることが記載されているものの，
このような知見が平成２８年７月当時にあったとしても，これらの部位の欠失は，
Ｖ２４１Ｉ変異とは位置や変異の内容が異なるものであるから，当該知見を考慮し25ても，当業者において，Ｖ２４１Ｉ変異を加えることで，本件明細書２に示された
保存的置換とは異なる効果が生じると考えるとはいえず，この点も前記(ｴ)の結論

142

を覆すに足りるものではない。
ウ

したがって，１９型変異使用構成について，相違点１ないし３に係る構成に置き換えることは，当業者が，被告製法４による製造が開始された平成２８年７月の時点で，容易に想到することができたと認められるから，⑫及び⑬の菌株を使用5する被告製法４は均等の第３要件を充足する。
(9)

第４要件について（対象方法の容易推考性）

被告製法４について，均等の法理の適用が除外されるべき，第４要件に該当する事情が存在することの主張立証はない。

10

(10)

第５要件について（特段の事情）

ア

出願当初の請求項等の記載と補正の状況

証拠（甲７９～８２，乙８０～８４）及び弁論の全趣旨によれば，本件発明２の出願当初の請求項１は「Ｌ－グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌であって，ｙｇｇＢ遺伝子を用いて改変されたことにより，非改変株と比較してＬ－グルタミン酸生産生産能が向上したコリネ型細菌」（乙８０）と記載されており，本件発明
15２は変異型ｙｇｇＢ遺伝子の由来する菌株や変異前後の具体的なアミノ酸配列を特定しない請求項を含んでいたが，その後，拒絶理由通知を受けて，２度の補正をした結果，登録時の請求項１の記載は，別紙５－１特許請求の範囲（本件特許２）の【請求項１】のとおりとなり，変異型ｙｇｇＢ遺伝子の変異前のアミノ酸配列の番号が，コリネバクテリウム・グルタミカム（ブレビバクテリウム・フラバムを含む。）

20

又はコリネバクテリウム・メラセコーラに由来する配列番号６，６２，６８，８４
及び８５に特定され，そこに導入される変異の内容も特定され，これによって，本件発明２には，被告製法４のように，コリネバクテリウム・カルナエ由来の変異型
ｙｇｇＢ遺伝子を使用する構成が，文言上，本件発明２の技術的範囲に含まれなくなったことが認められる。

25

また，証拠（甲８１，８２，乙８２～８４）によれば，出願時の本件明細書２において，コリネバクテリウム・カルナエについての言及は，段落【００１２】及び

143

【００１３】にのみ存在しており，この部分は上記の補正の際にも補正の対象とされなかったことが認められる。

5

イ

特段の事情の有無の判断(ｱ)

第５要件において，対象製品等が特許発明の特許出願手続において特許請求の範囲から意識的に除外されたものに当たるなどの特段の事情が存するときは，均等の主張は許されないものとしている理由は，特許権者の側においていったん特許発明の技術的範囲に属しないことを承認するか，または外形的にそのように解されるような行動をとったものについて，特許権者が後にこれと反する主張をすることは，禁反言の法理に照らし許されないというところにある（平成１０年最高裁判10決，平成２９年最高裁判決参照）。
(ｲ)

前記アの出願及び補正の経過のとおり，出願時の請求項１は，被告製法４のような，コリネバクテリウム・カルナエ由来の変異型ｙｇｇＢ遺伝子を使用する構成を含み得るものであったところ，補正によって，そのような構成は文言上本件発明２に含まれなくなったものである。
15(ｳ)

しかしながら，前記(8)ア(ｳ)のとおり，コリネバクテリウム・カルナエＤＳ

Ｍ２０１４７株の全ゲノム及びｙｇｇＢ遺伝子のアミノ酸配列の解析がされて利用可能となったのは平成２５年３月頃以降であり，本件優先日２である平成１６年１２月２８日の時点，あるいは，本件特許２の出願日である平成１７年１２月２８日の時点において，コリネバクテリウム・カルナエのｙｇｇＢ遺伝子のアミノ酸配列20を特定することはできなかったものである。そうすると，前記(8)ア(ｲ)のとおり，
本件優先日２より前から，コリネバクテリウム・カルナエがグルタミン酸生産菌であり，コリネバクテリウム・グルタミカムと近縁の細菌であることが知られていたことを考慮しても，本件発明２の出願時において，出願人である原告が，本件発明
２の課題を解決し得るような，コリネバクテリウム・カルナエ由来の変異型ｙｇｇ

25

Ｂ遺伝子を用いた具体的な構成を特定し，サポート要件その他の記載要件を満たす形で特許請求の範囲に記載することが容易に可能であったとは認められない。

144

(ｴ)

また，前記アのとおり，出願時の請求項１は，概括的に「Ｌ－グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌」という以上に菌種を特定しない記載をしたものであり，特に，コリネバクテリウム・カルナエ由来の変異型ｙｇｇＢ遺伝子を使用する
構成を記載したものではなく，本件明細書２におけるコリネバクテリウム・カルナ
5エへの言及も，本件発明２のコリネ型細菌として利用可能な細菌の例（【００１２】，【００１３】）として挙げられているものに留まり，コリネバクテリウム・カルナ
エ由来のｙｇｇＢ遺伝子を使用した構成についての言及は補正の前後を通じて本件明細書２ではされていない。
(ｵ)10

前記(ｳ)及び(ｴ)の事情に照らせば，前記(ｲ)の出願及び補正の経過をもって，客観的，外形的に見て，コリネバクテリウム・カルナエ由来の変異型ｙｇｇＢ遺伝子を使用する構成を特許請求の範囲からあえて除外する旨が表示されていたとはいえず，その他，本件全証拠によっても，被告製法４について，第５要件に係る，特許発明の特許出願手続において特許請求の範囲から意識的に除外されたものに当たるなどの特段の事情が存するとは認められない。

15

(11)

均等侵害の有無についての小括以上によれば，⑫及び⑬の菌株を使用する被告製法４については，均等の第１要件から第３要件がいずれも認められ，第４要件及び第５要件に該当する事情は認められないから，特許請求の範囲に記載された１９型変異使用構成と均等なものとして，本件発明２－５の技術的範囲に属するものと解するのが相当である。
20

５

争点３－３（本件発明１についての実施可能要件・サポート要件違反の有無）について事案に鑑み，本件発明１についての無効理由のうち，実施可能要件違反・サポー
ト要件違反の有無について判断する。
(1)25

本件明細書１におけるアルギニンの製造方法に関する記載

本件明細書１には，アルギニンの製造方法に関して，別紙１２本件明細書１の記載のほか，以下の記載がある。

145

ア

課題を解決するための手段【００１２】
目的物質としてのアミノ酸としては，生合成に関与する遺伝子およびそのプロモーターが明らかになっているものであれば何でもよい。生合成に関与する酵素の例
5として具体的には，…
アルギニン発酵では，Ｎ－アセチルグルタミン酸シンターゼ，Ｎ－アセチルグル
タミン酸キナーゼ，Ｎ－アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ，アセチルオルニ
チンアミノトランスフェラーゼ，Ｎ－アセチルオルニチナーゼ，オルニチンカルバ
ミルトランスフェラーゼ，アルギニノコハク酸シンターゼ及びアルギニノサクシナ

10ーゼによって触媒される反応で生成する。そして，これらの酵素が有効である。また，これらの酵素は，順にargA，argB，argC，argD，argE，argF，argG，argHの各遺伝子によってコードされている。
【００１９】
アルギニノコハク酸シンターゼ用プロモーターとしては，－３５領域にTTGCCA，

15

TTGCTA及び TTGTCA からなる群から選ばれる少なくとも一種のＤＮＡ配列及び／又は－１０領域にTATAAT配列若しくは該配列のATAAT の塩基が別の塩基で置換されて
おり，プロモーター機能を阻害しない配列を有するがあげられる。又，上記プロモーターを有するアルギニノコハク酸シンターゼ遺伝子を提供する。
本発明は，又，上記遺伝子を有するコリネ型アルギニン生産菌を提供する。

20

本発明のコリネ型アミノ酸，好ましくはＬ－グルタミン酸生産菌を，液体培地に培養し，培地中に所望のアミノ酸，好ましくはＬ－グルタミン酸を生成蓄積させ，これを該培地から採取することによりアミノ酸を得ることができる。
本発明において上記菌株の培養に用いられる液体培地としては，炭素源，窒素源，
無機塩類，生育因子等を含有する通常の栄養培地が用いられる。

25

炭素源としては，グルコース，フラクトース，シュクロース，廃糖蜜，澱粉加水分解物等の炭水化物，エタノール，グリセロール等のアルコール類，酢酸等の有機

146

酸類が使用される。窒素源としては，硫酸アンモニウム，硝酸アンモニウム，塩化アンモニウム，リン酸アンモニウム，酢酸アンモニウム，アンモニア，ペプトン，
肉エキス，酵母エキス，コーン・スティープ・リカー等が使用される。栄養要求性を有する変異株を用いる場合には，それらの要求物質を標品もしくはそれを含有す
5る天然物として添加するのがよい。
イ

実施例６

コリネ型アルギニン生産菌へのアルギノコハク酸シンターゼ遺伝

子のプロモーター領域への変異の導入【００７７】…1) argG遺伝子の上流域の塩基配列決定
10ブレビバクテリウム・フラバムのargG遺伝子をPCR により増幅するために，同ORFの上流及び下流の領域の塩基配列を決定した。…
【００７８】
2)promoter部位の予測
上記配列より，市販のソフト（GENETYX）を用いて，argG遺伝子のORFの上流にあ15るpromoter様配列を検索した。最もスコアの高かった部位(最初のATGから約120bp上流)に変異を導入し，次いでプロモーターの活性を評価した。
3)promoter配列への変異導入と変異型promoterの活性測定
最もスコアの高かった部位に，変異導入用プライマー…を用いてAJ12092株の染色体DNAを鋳型として1回目のPCRを行い，このPCR産物を3'側のprimerとし，…を5'側

20の primer と し て 再 度 同 染 色 体 DNA を 鋳 型 と し て PCR を 行 う こ と に よ り ， 目 的 のpromoter部分に変異が導入されたDNA断片を得た。次にこの変異型promoterの活性を測定する為に，これらのDNA断片を

promoter probe vector pNEOLのSmaIサイトにリポーター遺伝子のlacZと順向きになるように挿入したplasmid pNEOL-1,pNEOL-2,
pNEOL-3, pNEOL-４，pNEOL-7 を得た。また活性の対照として…を用いてAJ12092株
25の染色体DNAを鋳型としてPCRを行って得たDNA断片を同様にpNEOLのlacZ遺伝子の上流に挿入したplasmid

pNEOL-0を構築した。

147

【００７９】pNEOL-0，pNEOL-1，pNEOL-2， pNEOL-3， pNEOL-４，pNEOL-7 をAJ12092株に導入した。プラスミドの導入は電気パルス法（特開平２－２０７７９１）を用いた。…
これらの菌株を…β-ガラクトシダーゼ活性を測定した。
5

表２０に示す様にAJ12092/pNEOL-0でβ-ガラクトシダーゼ活性が検出されたことから，lacZ構造遺伝子の上流に挿入したDNA断片がpromtoerとして機能していることがわかった。また，AJ12092/pNEOL-0に比して各plasmid導入株ではβ-ガラクトシダーゼ活性が高くなっており，このpromoter様配列への変異導入により，転写活性が表２０の様に上昇することが判った。

10【００８０】【表２０】
相対活性（AJ12092/pNEOL-0=1）

15

20

AJ12092

nd

AJ12092/pNEOL-0

1.0

AJ12092/pNEOL-1

2.8

AJ12092/pNEOL-2

2.7

AJ12092/pNEOL-3

1.8

AJ12092/pNEOL-4

0.8

AJ12092/pNEOL-7

3.0【００８１】
4)変異導入用plasmidの構築
primer14，15（配列番号５５と５６）を用いてAJ12092株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行って得たDNA断片をクローニングベクターpHSG398(TaKaRa製のマルチクローニングサイトのSmalI部位に挿入しplasmid p0を構築した。次にp0を制限酵素

25

EcoRV及びBspHIで消化し，同様にpNEOL-3及びpNEOL-7を制限酵素EcoRV及びBspHIで消化することによってえられるＤＮＡ断片をライゲーションすることにより変異導148

入用plasmid p3(…)及びp7(…)を得た。
5)変異導入用plasmidのArg生産菌への導入
上記plasmidをArg生産菌 Bevribacterium lactofermentum AJ12092株に導入した。
プラスミドの導入は電気パルス法（特開平２－２０７７９１）を用いた。
5

Bevribacterium 中でこれらのプラスミドの自律複製不可能な為，本plasmidが相同組換えによって染色体に組み込まれた株のみがCm耐性株として選択できる。変異導入用plasmidが染色体に組み込まれた株は5μg/mlのクロラムフェニコールを含むＣ
Ｍ２Ｇプレート培地（ポリペプトン１０ｇ，酵母エキス１０ｇ，グルコース５ｇ，
ＮａＣｌ５ｇ，寒天１５ｇを純水１ｌに含む。ｐＨ７．２）にてクロラムフェニコ

10ール耐性株として選択した。
次に再度相同組換えをおこしてCm感受性になった株の中から ，argG遺伝子のpromoter部分が目的の変異配列に置換された株を選択した。
その結果，P3の配列に置換されたもの(AJ12092-P3)及びP7の配列に置換されたもの(AJ12092-P7)を得た。

15【００８２】
6) argG遺伝子のクローニング
１）のようにして決定した塩基配列をもとに，配列番号46及び47に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（プライマー５，６）を合成し，ブレビバクテリウム
・フラバム2247の染色体ＤＮＡを鋳型としてPCR を行った。…得られたDNA 断片を

20

クローニングベクターpSTV29（宝酒造（株）製）のマルチクローニングサイト内のSmaI部位にクローニングし，pSTVarG を作製した。さらに，pSTVargGのSalI部位に，実施例１(1) 記載のpSAK4 をSalI処理して得られた複製起点を含む断片を挿入した
pargG を作製した。
７）pargGのBrev.への導入

25

pargGを Bevribacterium lactofermentum AJ12092株に導入した。プラスミドの導入は電気パルス法（特開平２－２０７７９１）を用いた。…

149

【００８３】８) promoter変異株のArgG活性
上 記 2 種 類 の ArgG

promoter 変 異 株 及 び plasmid に て argG を 増 幅 し た 株(AJ12092/pargG)のArgG活性を測定した。…上記2種類のArgG promoter変異株及び
5

plasmidにてargGを増幅した株(AJ12092/pargG)のArgG活性を表２１に示す．表２１に示すように，promoterに変異を導入することにより，AJ１２０９２-P3では親株の約2倍に，AJ12092-P7では約3倍にArgG活性が上がっていた。また，AJ12092/pargGではArgG活性は親株の約4.5倍であった。
【００８４】10【表２１】
相対活性（AJ12092=1）

15

AJ12092

1.0

AJ12092-P3

2.1

AJ12092-P7

2.9

AJ12092/pargG

4.4【００８５】
９)promoter変異株によるArg生産
ArgG promoter変異株のフラスコ培養を行った。対照として親株 AJ12092及びAJ12092/pargGも同様に培養した。…表２２に示す様に，argG promoter変異株では20

Arg収率が向上し，plasmidでのargG増幅株と同等の収率であった。また，plasmid増幅株では培養時間が遅延したのに対し，promoter変異株ではAJ12092-P3,AJ12092-P7
ともに培養時間は親株と同等であり，Arg生産性がplasmid増幅株よりも向上することが判った。
【００８６】

25

【表２２】
OD

Arg(g/dl)

150

培養時間(h)

生産性(g/dl/h)

5

AJ12092

0.502

1.25

48

0.026

AJ12092-P3

0.510

1.47

48

0.031

AJ12092-P7

0.514

1.43

48

0.030

AJ12092/pargG

0.520

1.47

52

0.028

(2)

アルギニンの製造方法についての実施可能要件違反及びサポート要件違反について
ア

本件発明１－１について(ｱ)

本件発明１－１の特許請求の範囲は別紙４－１特許請求の範囲(本件特許

１)【請求項１】記載のとおりであり，本件発明１－１は，ＧＤＨ遺伝子，ＣＳ遺伝
10子，ＩＣＤＨ遺伝子，ＰＤＨ遺伝子及びアルギニノコハク酸シンターゼ遺伝子のいずれかのプロモーター配列の－３５領域及び／又は－１０領域に特定の塩基配列を導入したコリネ型細菌を用いたグルタミン酸又はアルギニンの製造方法の発明であ
る。
(ｲ)

15

本件明細書１には，本件発明１の課題について，プラスミドを用いることな

く，目的遺伝子の発現量の適度な強化および調節を行うことができ，アミノ酸を高収率で生産する能力を有する変異株を遺伝子組換え又は変異により構築する方法を提供すること（【０００１】，【０００６】）にある旨の記載がある。
しかしながら，本件明細書１において，アミノ酸のうち，本件発明１－１に含まれるアルギニンの製造方法に関する記載は，前記(1)のとおりであり，アルギニンの20

発酵に関係する酵素とそれをコードする遺伝子の種類及びアルギニノコハク酸シンターゼがアルギニンの発酵に関係する酵素の一つであること（【００１２】，【００１９】），実施例６として，アルギニノコハク酸シンターゼ遺伝子のプロモーター領域に変異を導入したコリネ型アルギニン生産菌によるアルギニンの生産（【００７７】～【００８６】）の記載があるものの，ＧＤＨ遺伝子，ＣＳ遺伝子，ＩＣ25

ＤＨ遺伝子及びＰＤＨ遺伝子は，いずれもグルタミン酸発酵に関与する酵素をコードする遺伝子であるとされ（【００１２】），アルギニン発酵に関与する酵素をコ151

ードするものとしては記載されておらず（【００１２】），その他，これらの遺伝子がアルギニンの製造に関連することを示す記載や，これらの遺伝子のプロモーター領域に変異を導入した菌によるアルギニン生産の実施例の記載はない。
(ｳ)5

そうすると，本件発明１－１に記載された発明のうち，少なくともＧＤＨ遺伝子，ＣＳ遺伝子，ＩＣＤＨ遺伝子及びＰＤＨ遺伝子に変異を導入したコリネ型細菌によるアルギニンの製造方法については，本件明細書１の発明の詳細な記載により，当業者が，アミノ酸を高収率で生産する能力を有する変異株を遺伝子組換え又は変異により構築するとの前記の課題を解決できると認識できる範囲を超えるものであるといえる。また，これらの遺伝子の変異を用いたアルギニンの製造方法につ10いて，本件明細書１の記載のほかに，当業者が前記の課題を解決できるような出願時の技術常識があったとも認められない。
したがって，本件発明１－１に係る特許は，特許法３６条６項１号に規定する要件（サポート要件）に反してなされたものというべきであり，特許法１２３条１項４号に基づき特許無効審判により無効にされるべきものである。

15イ

本件発明１－２，１－３，１－４について

別紙４－１特許請求の範囲(本件特許１)【請求項２】ないし【請求項４】記載のとおり，本件発明１－２及び１－３は，いずれもＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列の－３５領域及び／又は－１０領域に特定の塩基配列を導入したコリネ型細菌を用いたグルタミン酸又はアルギニンの製造方法の発明であり，本件発明１－４は，Ｃ20Ｓ遺伝子のプロモーター配列の－３５領域及び／又は－１０領域に特定の塩基配列を導入したコリネ型細菌を用いたグルタミン酸又はアルギニンの製造方法の発明である。
そうすると，本件発明１－１と同様の理由により，これらの発明のうち少なくともアルギニンの製造方法については，本件明細書１ないし当時の技術常識から，当25業者が，アミノ酸を高収率で生産する能力を有する変異株を遺伝子組換え又は変異

152

により構築するとの課題を解決できると認識できる範囲を超えるものであったといえる。
したがって，本件発明１－２，１－３及び１－４に係る特許は，いずれも，特許法３６条６項１号に規定する要件（サポート要件）に反してなされたものというべ5きであり，特許法１２３条１項４号に基づき特許無効審判により無効にされるべきものである。
(3)

本件発明１についての無効理由についての小括以上によれば，本件発明１に係る特許は，その余の無効理由の有無について判断するまでもなく，いずれも特許無効審判において無効とされるべきものであるから，
10

特許法１０４条の３第１項の抗弁が成立する。
そして，原告は，本件訂正１において，請求項３については削除しており，本件発明１－３については訂正の再抗弁の主張をしていないから，本件発明１－３に基づいては，被告に対して権利行使することができない。
他方で，原告は，本件発明１－１，１－２及び１－４については，それぞれ訂正

15の再抗弁の主張をしているから，本件発明１－１，１－２及び１－４について主張されたその余の無効理由については，後記６で訂正の再抗弁の成否を判断するに当たり，上記サポート要件違反の無効理由が解消されたかどうかと併せて，訂正後の本件訂正発明１を基準としてその無効理由の存否を判断することとする。

20

６

争点５（本件特許１の訂正の再抗弁の成否）について(1)

本件訂正発明１の内容

ア

本件明細書１の記載内容

本件訂正発明１に関する，本件明細書１の発明の詳細な説明の記載は，概要，別紙１２本件明細書１の記載のとおりである。
イ25

本件訂正発明１の概要

本件訂正発明１に係る特許請求の範囲（別紙４－２），前記アの本件明細書１の記載及び弁論の全趣旨によれば，本件訂正発明１の概要は，以下のとおりであると

153

認められる。
(ｱ)

技術分野・背景技術

発酵法によるアミノ酸の生産に用いられる変異株の構築方法として遺伝子組換えを用いる場合，目的遺伝子を強化するために，細胞内で染色体とは独立して自律複5製が可能なプラスミドが主に用いられてきたが，目的遺伝子の強化の程度はプラス
ミド自体のコピー数によって決まるため，目的遺伝子の種類によっては，コピー数が高過ぎて発現量が高くなり過ぎることにより，生育が著しく抑制されたり，目的物質の生産能が低下したりする例が多くある。また，プラスミドの複製は，しばしば不安定であり，プラスミドが脱落してしまうという問題がある（【０００２】【０10００３】）。
(ｲ)

本件訂正発明１の課題

本件訂正発明１は，目的遺伝子の発現量の適度な強化及び調節を行うことができ，アミノ酸を高収率で生産する能力を有する変異株を，プラスミドを用いることなく，
遺伝子組換え又は変異によって構築する方法を提供し，コリネ型グルタミン酸生産
15

菌を用いる，グルタミン酸の収率を向上させ，より安価にグルタミン酸を製造する
グルタミン酸発酵法を提供することを目的とする（【０００６】）。
(ｳ)

課題を解決するための手段等

本件訂正発明１は，上記課題を解決するために，コリネ型細菌の染色体上のアミノ酸生合成系遺伝子のプロモーター配列に，コンセンサス配列に近づくような変異20を起こさせるか，又は遺伝子組換えにより変異を導入して，コリネ型細菌の変異体を調製し，該変異体を培養して，目的とするアミノ酸の産生量の多い変異体を採取するという構成を採用した（【０００７】）。
アミノ酸の生合成に関与する酵素の例として，グルタミン酸発酵の場合には，グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ），クエン酸合成酵素（ＣＳ）等が有効であ25

る（【００１２】）。また，上記のプロモーター配列への変異は，１つの遺伝子のプロモーター配列のみに起こさせてもよいし，２つ以上の遺伝子のプロモーター配154

列に起こさせてもよい（【００１５】）。
本件訂正発明１では，ＧＤＨ遺伝子のプロモーターの－３５領域のＤＮＡ配列が，ＴＴＧＴＣＡ等からなる群から選ばれる少なくとも一種のＤＮＡ配列となっている
か，及び／又は該プロモーターの－１０領域のＤＮＡ配列がＴＡＴＡＡＴ等となっ5ているものが好ましい（【００１７】）。
また，本件訂正発明１では，ＣＳ遺伝子のプロモーターについては，－３５領域にＴＴＧＡＣＡ配列及び／又は－１０領域にＴＡＴＡＡＴ配列を有するものが挙げられる（【００１８】）。
本件訂正発明１は，コリネ型アミノ酸生産菌のアミノ酸生合成遺伝子のプロモー10ター領域に変異を導入し，目的遺伝子の発現量を調節することにより，目的アミノ酸を高収率で得ることができ，又プラスミドのように脱落がなく，安定して目的ア
ミノ酸を高収率で得ることができるので，工業的に大きな利点がある（【００２０】）。
また，本件訂正発明１によれば，副生アスパラギン酸及びアラニンの増加を引き起こすことなく，コリネバクテリア菌株にアミノ酸，特にグルタミン酸を高収率で生15産する能力を付与できる（【００２１】）。
(ｴ)

開示された実施例の概要

ａ

実施例１

「ＡＴＣＣ１３８６９／ｐ６－８」は，コリネ型細菌野生株（ブレビバクテリウ
ム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９株）に，プロモーター配列の－３５20領域（ＡＴＣＣ１３８６９株ではＴＧＧＴＣＡ配列）がＴＴＧＴＣＡ配列に改変され，かつ，同－１０領域（ＡＴＣＣ１３８６９株ではＣＡＴＡＡＴ配列）がＴＡＴ
ＡＡＴ配列に改変されたＧＤＨ遺伝子のプラスミドを導入したものである。
「ＡＴＣＣ１３８６９／ｐ６－８」のＧＤＨ比活性（４０１．３）は，親株（ＡＴＣＣ１３８６９株）と同じプロモーター配列を有するＧＤＨ遺伝子のプラスミド

25を導入した菌株である「ＡＴＣＣ１３８６９／ｐＧＤＨ」の約４．９倍であることが示されている。（【００２２】～【００２５】，【表１】）。

155

ｂ

実施例２

「ＦＧＲ２」は，ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（ＡＪ１３０２９株）に変異が加わったものであって，ＡＪ１３０２９株のＧＤＨ遺伝子のプロモー
ター配列の－３５領域（ＴＧＧＴＣＡ配列）にＴＴＧＴＣＡ配列への変異を有し，
5

かつ，同－１０領域（ＣＡＴＡＡＴ配列）にＴＡＴＡＡＴ配列への変異を有するものである。
ＦＧＲ２のＧＤＨ比活性は，ＡＪ１３０２９株の約３．４倍であり，Ｌ－グルタ
ミン酸生成（３．０ｇ／ｄｌ）は，ＡＪ１３０２９株（２．６ｇ／ｄｌ）より増大したことが示されている（【００２６】，【００２９】，【００３１】，【００３10２】，【表５】，【表６】）。
ｃ

実施例３「ＧＢ０２」は，前記ｂのＦＧＲ２の染色体上のＣＳ遺伝子につき，プロモータ
ー配列の－１０領域を改変してＴＡＴＡＡＴ配列（変異前の配列ＴＡＴＡＧＣ）としたＣＳ遺伝子に置換する変異を導入したものである。「ＧＢ０３」は，ＦＧＲ２15の染色体上のＣＳ遺伝子につき，プロモーターの－１０領域を改変してＴＡＴＡＡ
Ｔ配列とするのに加えて，同－３５領域を改変してＴＴＧＡＣＡ配列（変異前の配列ＡＴＧＧＣＴ）としたＣＳ遺伝子に置換する変異を導入したものである。ＧＢ０２及びＧＢ０３のＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列の－３５領域及び－１０領域は，ＦＧＲ２と同一である。

20①ＧＢ０２のクエン酸合成酵素の比活性はＦＧＲ２の約１．９倍であり，ＧＢ０３のクエン酸合成酵素の比活性は同約４．０倍であること，②ＧＢ０２及びＧＢ０
３のＬ－グルタミン酸生成（各９．４ｇ／ｌ）は，ＦＧＲ２（８．９ｇ／ｌ）より増大したことが示されている。
（以上につき，【００３３】～【００３６】，【００４１】～【００４６】，【０25０４８】，【表７】，【表１０】，【表１２】）。
ｄ

実施例７

156

「ＧＡ０２」は，前記ｂのＦＧＲ２が持つＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列を用いて，前記ｂのＡＪ１３０２９株の染色体上に変異を導入したものであって，導入されたＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列の－３５領域及び－１０領域は，ＦＧＲ２と同一である。
5

ＧＡ０２のＧＤＨ比活性は，親株（ＡＪ１３０２９）の約３．５倍であること，
ＧＡ０２のＬ－グルタミン酸生成（２．９ｇ／ｄｌ）は，ＡＪ１３０２９（２．６ｇ／ｄｌ）より増大したことが示されている。（【００８７】～【００８９】，【表
２３】）。
(2)

10

被告製法１及び３が本件訂正発明１の技術的範囲に属するかについて弁論の全趣旨によれば，被告製法１及び３と本件訂正発明１を対比すると，別紙
６－２被告製法１及び３と本件訂正発明１との対比のとおりとなると認められるか
ら，被告製法１は，文言上，本件訂正発明１－１（本件発明１－１に対応），本件訂正発明１－２（本件発明１－２に対応）及び本件訂正発明１－３（本件発明１－
４に対応）の技術的範囲に属し，被告製法３は，文言上，本件訂正発明１－１の技

15

術的範囲に属するが，本件訂正発明１－３の技術的範囲に属しない。
(3)

乙６発明についてア

乙６文献の記載内容

乙６文献には，以下の記載がある（乙６，弁論の全趣旨。図１，図５及び表２は，別紙１４引用文献の図面参照）。
20(ｱ)ａｂｓｔｒａｃｔ（１２９７頁１行～１８行）「これまでのところ，コリネバクテリウム・グルタミカムのプロモーターの構造に関しては限られた情報しか入手可能ではなかった。…Ｃ．グルタミカム由来の新たに特徴づけられたプロモーター配列と共に公開されたプロモーターを比較分析することにより，保存された配列は，ＴＳ（転写開始）サイト上流のおよそ３５ｂｐ25（ｔｔＧｃｃａ）及び１０ｂｐ（ＴＡ．ａａＴ）であることが明らかになった。これらモチーフの位置及びモチーフ自体は，他のグラム陽性及びグラム陰性細菌の－157

３５及び－１０プロモーターコンセンサス配列と同等であり，それらはＣ．グルタ
ミカムでの転写開始シグナルを表すことを示唆している。」(ｲ)

図１（１３０１頁）「図１．ＴＳサイトに従って並べられたＣ．グルタミカムプロモーターの核酸配5列。プロムスキャンプログラムにより同定された推定－３５及び－１０領域に下線を引いた。ｈｏｍ，ｔｈｒＣ，ｆｄａ，ｌｙｓＡ，ａｓｋ，ｇｄｈ，ｇｌｔ，ｇａｐ，ｐｇｋ，及びｔｒｐのプロモーター配列は，本文で参照したレファレンスより取得した。」

10(ｳ)

Ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎａ１３０５頁右欄１１行～１３０６頁左欄２行「試験した全１８フラグメントは，Ｅ．ｃｏｌｉにおいてｃａｔの転写を作動させ，単離されたプロモーターがこの生物においても活性であったことが示唆される。
この結果は予想できないものではなかった。なぜなら，Ｃ．グルタミカムからクローン化された遺伝子の多くは，適切な栄養要求体の異種相補性により示唆されるよ15

うに…，Ｅ．ｃｏｌｉで発現したからである。反対に，いくつかのＥ．ｃｏｌｉ遺伝子は，コリネバクテリウム・グルタミカムで効率的に発現し…，そしてＥ．ｃｏｌｉｔａｃ，ｌａｃＵＶ５，及びｔｒｐプロモーターはコリネバクテリアで機能的であることが示されている…。これら全ての結果は，Ｃ．グルタミカムのプロモーターの一般的構造は，Ｅ．ｃｏｌｉのプロモーターのものと類似していることを20示唆する。しかしながら，コリネ型細菌特有のプロモーターがＥ．ｃｏｌｉでは明らかに機能しなかったという複数の報告もある…。」
ｂ

１３０６頁左欄３行～３８行「コリネバクテリウム・グルタミカム由来のプロモーターと他の細菌由来のプロモーターの一次構造の類似性は，比較コンピュータ分析により立証された。本研究
25で適用した両プログラムは，コリネバクテリウム・グルタミカムプロモーターの我々のセットにおいて，最も関連する領域が，ＴＳ部位の上流１０ｂｐ周辺に位置し，

158

ヘキサマーＴＡ．ＡＡＴを含むことを示した。当該または類似のモチーフをすべてのプロモーターで見つけることができる。別の保存領域はＴＳ部位の上流およそ３５ｐｂで検出された。この領域で見いだされたコンセンサスヘキサマーＴＴＧＣＣ
Ａは，Ｅ．ｃｏｌｉのコンセンサスＴＴＧＡＣＡと，４番目の位置でのみ異なる。
5

このＴＴＧＣＣＡモチーフはプロモーター３３種のうち１４種にしか明確に（３塩基対より大きいマッチングで）は見出されず，その機能が明確ではない。他のいく
つかのプロモーターにおいては，このモチーフは容易に識別できず，Ｃ．グルタミ
カムのプロモーターにおける，より低い保存性を示唆する。
しかしながら，ＴＳ部位に関連する位置から，スペーシング（１７・３５ｂｐの10平均）から，及び２つの保存されたヘキサマーモチーフの配列から，コリネバクテ
リウム・グルタミカムにおけるこれらのシグナルは，Ｅ．ｃｏｌｉ…及びその他の真正細菌，ｅ．ｇ．バシラス…，ラクトバチルス…，及びストレプトコッカス…の－１０及び－３５プロモーターコンセンサス配列に相当することが明らかである。
我々の分析により明らかになったコリネバクテリウム・グルタミカムのコンセンサ

15

スモチーフの優位性は，ｔａｃプロモーター（１２個の位置中１１がコンセンサスと同一）がＣ．グルタミカムで非常に効率的であることが判明し…，並びにＥ．ｃｏｌｉｌａｃプロモーターにおいて－１０ヘキサマーをＴＡＴＧＴＴからＴＡＴ

ＡＴＴへ変更し，コンセンサス配列との類似性を高めることは，Ｃ．グルタミカム
でのプロモーターのより高い効率を導く…という事実により裏付けられる。」
20ｃ１３０６頁右欄１８行～４２行「例えばバチルス及びストレプトコッカスのようないくつかのグラム陽性細菌では，殆どの－１０及び－３５プロモーター領域は，それらのコンセンサス配列であるＴＡＴＡＡＴ及びＴＴＧＡＣＡのそれぞれと，ほぼ完全に一致する…。一方，本論文で研究したＣ．グルタミカムのプロモーターのセットにおいて，これは当ては25

まらなかった。Ｃ．グルタミカムのプロモーターのコンセンサスモチーフにおけるいくつかの塩基は，中程度にしか保存されておらず（図５参照），全体として，比159

較的中程度にしかモチーフが保存されていないことを示唆する。プロモーターのコ
ンセンサス配列の保存レベルは，所与の細菌における主要ＲＮＡポリメラーゼのσ因子の要求を反映している可能性があることから…，我々の研究におけるポジショ
ンごとのコンセンサスの保存の程度を，他の細菌からのプロモーターの編集物にお5けるものと比較することは興味深い。表２に示すとおり，－３５及び－１０コンセ
ンサスヘキサマーにおけるほぼすべての塩基は，Ｃ．グルタミカムのプロモーターのセットと比較して，バチルス，ラクトバチルス及びストレプトコッカスのプロモーターでは非常に高く，Ｅ．ｃｏｌｉプロモーターではかなり高く，保存されていた。これらのデータは，リストした微生物における主要ＲＮＡポリメラーゼの認識10特異性が，バチルス／ラクトバチルス／ストレプトコッカス＞Ｅ．ｃｏｌｉ＞Ｃ．
グルタミカムの順で低下することを示唆する。」
ｄ

表２（１３０７頁）「表２．異なる生物に由来するプロモーターのコンパイルでの，－３５及び－１
０モチーフにおけるコンセンサス保存の程度
15

異なる生物のプロモーターコンパイルを以下のレファレンスより取得した：Ｃ．
グルタミカム，３３プロモーター（本研究）；Ｅ．ｃｏｌｉ，２６３プロモーター…；バチルス・サブチリス，２３７プロモーター…；ラクトバチルス，３０プロモ
ーター…；ストレプトコッカス，１７プロモーター…」ｅ20

１３０６頁右欄下から２行～１３０７頁左欄６行「Ｅ．ｃｏｌｉにおけるプロモーターの活性は，－３５及び－１０コンセンサス
ヘキサマーとの類似性と大部分は相関し得るため…，我々は，観察されたＣＡＴ活
性は，所定のプロモーターと，予測コンセンサスプロモーター配列との類似性スコ
アとおおよそ相関すると推測した。しかしながら，そのような相関は確認できなか
った。」

25

ｆ

１３０７頁右欄４行～１０行「本論文において提供したデータから明らかなとおり，Ｃ．グルタミカムにおけ160

るプロモーター（又はプロモータークラス）の構造－機能相関について詳細な情報を得て，それによりこの産業上重要な微生物における遺伝子発現をより良く理解するためには，例えば，選択プロモーターの厳密な変異分析及び生化学的分析のようなさらなる研究が必要であることが明らかである。」
5

イ

乙６発明の概要

前記ア(ｲ)のとおり，乙６文献の図１には，ＧＤＨ遺伝子及びＣＳ遺伝子を含むコ
リネバクテリウム・グルタミカムの遺伝子のプロモーターの核酸配列が記載されており，そこでは，ＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列（「ｐ－ｇｄｈ」）の－３５領域に「ＴＧＧＴＣＡ」配列及び－１０領域に「ＣＡＴＡＡＴ」配列，ＣＳ遺伝子の10

プロモーター配列（「ｐ－ｇｌｔ」）の－３５領域に「ＴＧＧＣＴＡ」配列及び－１０領域に「ＴＡＧＣＧＴ」配列を有する，コリネバクテリウム・グルタミカムの遺伝子のプロモーターの核酸配列が記載されている。
したがって，乙６文献には，本件訂正発明１と対比される構成として，以下の構成を有する乙６発明が開示されていると認められる。

15「コリネ型細菌の染色体上の，ＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列の－３５領域に
ＴＧＧＴＣＡ配列及び－１０領域にＣＡＴＡＡＴ配列を有し，ＣＳ遺伝子のプロモーター配列の－３５領域にＴＧＧＣＴＡ配列及び－１０領域にＴＡＧＣＧＴのＤＮ
Ａ配列を有する，コリネ型細菌」
ウ20

乙６文献のその他の開示事項

前記アの記載事項によれば，乙６文献には，前記イの乙６発明のほか，以下の開示があると認められる。
(ｱ)

コリネバクテリウム・グルタミカムの遺伝子のプロモーターを分析すると，保存されている配列は－３５領域のｔｔＧｃｃａ．ａ及び－１０領域のｇｇＴＡ．
ａａＴであること，これらのモチーフの位置及びモチーフ自体は，他のグラム陽性
25

及びグラム陰性細菌のプロモーターの－３５領域及び－１０領域のコンセンサス配列に相当すること（前記ア(ｱ)，図５）。

161

(ｲ)

コリネバクテリウム・グルタミカムとＥ．Ｃｏｌｉの間では，一方のプロモーター配列が他方で機能する例があり，コリネバクテリウム・グルタミカムの遺伝
子のプロモーター領域とＥ．Ｃｏｌｉのプロモーター領域の一般的構造等の類似性が示唆される一方で，コリネ型細菌特有のプロモーターがＥ．ｃｏｌｉでは明らか
5に機能しなかったという複数の報告もあること（前記ア(ｳ)ａ，ｂ）。
(ｳ)

コリネバクテリウム・グルタミカムのコンセンサスモチーフにおけるいく

つかの塩基は中程度にしか保存されておらず，ほとんどの塩基において，バチルス
及びストレプトコッカスのようなグラム陽性細菌やＥ．ｃｏｌｉよりも保存される程度が低かったこと（前記ア(ｳ)ｃ，ｄ，図５，表２）。
10(ｴ)Ｅ．ｃｏｌｉにおけるプロモーターの活性は，－３５領域及び－１０領域のコンセンサス配列との類似性と大部分は相関し得るのに対して，コリネバクテリウ
ム・グルタミカムのプロモーターの活性については，予測されたコンセンサス配列との類似性との相関は確認できなかったこと（前記ア(ｳ)ｅ）。

15

(4)

乙９発明についてア

乙９文献の記載内容

乙９文献には，以下の記載がある（乙９。表９は，別紙１４引用文献の図面参照。）(ｱ)

特許請求の範囲（５５頁２行～８行）「１．染色体上に存在するα－ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵
素をコードする遺伝子又はそのプロモーターの塩基配列中に１又は２以上の塩基の20置換，欠失，挿入，付加又は逆位が生じたことにより，α－ケトグルタル酸デヒド
口ゲナーゼ活性が欠損したコリネ型Ｌ－グルタミン酸生産菌。
２．請求項１記載のコリネ型Ｌ－グルタミン酸生産菌を液体培地中に培養し，培養液中にＬ－グルタミン酸を生成蓄積させ，これを採取することを特徴とするＬ－
グルタミン酸の製造法。」

25

(ｲ)

明細書

ａ

技術分野（１頁４行～１１行）

162

「本発明は，Ｌ－グルタミン酸…の発酵生産に用いられるコリネ型細菌の育種と利用に関する。更に詳しくは，本発明は，α－ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ（α－ＫＧＤＨ）活性が欠失したコリネ型Ｌ－グルタミン酸生産菌，該菌を用いたＬ－
グルタミン酸の製造法…に関する。」
5ｂ

背景技術（１頁１３行～２頁５行）「従来よりＬ－グルタミン酸はブレビバクテリウム属又はコリネバクテリウム属に属するコリネ型細菌を用いた発酵法により工業的に生産されている。
近年，α－ＫＧＤＨ活性が欠損もしくは低下し，かつＬ－グルタミン酸分解活性が低下した大腸菌変異株が，高いＬ－グルタミン酸生産能を持つことが明らかとな10った…。
これに対し，ブレビバクテリウム属の細菌においては，α－ＫＧＤＨ活性の低下した変異株のＬ－グルタミン酸生産能は親株とほぼ同じであったとの報告があり…，
コリネ型細菌では，α－ＫＧＤＨ活性のレベルはＬ－グルタミン酸の生産に重要ではないものと考えられていた。

15

一方，α－ＫＧＤＨ活性が低下し，かつＬ－グルタミン酸生産能を有する変異株
をビオチン過剰原料を炭素源とする培地中で培養すると，ぺニシリン類や界面活性剤等のビオチン作用抑制物質を培地に添加することなく，高収率でＬ－グルタミン酸が生産されることが見い出されている…。しかしながら，上述したようにコリネ型細菌では，α－ＫＧＤＨ活性のレベルはＬ－グルタミン酸の生産に重要ではない

20ものと考えられていたため，コリネ型Ｌ－グルタミン酸生産菌のα－ＫＧＤＨ遺伝
子をクローニングし解析した例はなかった。また，α－ＫＧＤＨを欠失したコリネホルム細菌の変異株も知られていなかった。」
ｃ

発明の開示

(a) 「本発明の目的は，コリネ型Ｌ－グルタミン酸生産菌由来のα－ＫＧＤＨ遺25伝子を取得し，該遺伝子を含む組換えＤＮＡを作製し，該組換えＤＮＡで形質転換した微生物を用いてα－ＫＧＤＨ活性のレベルがＬ－グルタミン酸の発酵生産に及163

ぼす影響を明らかにし，もってコリネ型Ｌ－グルタミン酸生産菌の育種において新たな方法論を提供することにある。より具体的には，本発明の目的は，染色体上に存在するα－ＫＧＤＨ遺伝子を破壊することによりα－ＫＧＤＨ活性を欠失させた
コリネ型Ｌ－グルタミン酸生産菌を取得し，該菌を用いたＬ－グルタミン酸の製造5法を提供することにある。…
本発明者らは，コリネ型Ｌ－グルタミン酸生産菌由来のα－ＫＧＤＨ遺伝子を取得しその構造を明らかにするとともに，該遺伝子を組み込んだ組換え体プラスミド
でコリネ型Ｌ－グルタミン酸生産菌を形質転換し，得られた形質転換体のα－ＫＧ
ＤＨ活性のレベルとＬ－グルタミン酸の生産能を調べた結果，α－ＫＧＤＨ活性が10

Ｌ－グルタミン酸の生産に顕著な影響を及ぼすことを見いだした。また，本発明者
らは，コリネ型Ｌ－グルタミン酸生産菌において染色体上に存在するα－ＫＧＤＨ
遺伝子を破壊することによりα－ＫＧＤＨ活性を欠失させた株が，過剰量のビオチンを含有する培地に培養する際，界面活性剤やぺニシリンのようなビオチン作用抑制物質を培地に添加することなく著量のＬ－グルタミン酸を生成蓄積することを見15いだした。」（２頁７行～２７行）(b)「すなわち，本発明は，（１）染色体上に存在するα－ＫＧＤＨ活性を有する酵素をコードする遺伝子又はそのプロモーターの塩基配列中に１又は２以上の塩基の置換，欠失，挿入，付加又は逆位が生じたことにより，α－ＫＧＤＨ活性が欠損したコリネ型Ｌ－グルタミ
20

ン酸生産菌，（２）上記（１）記載のコリネ型Ｌ－グルタミン酸生産菌を液体培地中に培養し，培養液中にＬ－グルタミン酸を生成蓄積させ，これを採取することを特徴とするＬ－グルタミン酸の製造法，…を提供するものである。」（３頁３行～１８行）

25(c) 「本遺伝子の利用としては，薬剤遺伝子の挿入等によるα－ＫＧＤＨ活性欠失株の取得，in vitro変異による活性弱化株の取得，プロモーターの改変による発164

現低下株の取得等により，従来のコリネ型Ｌ－グルタミン酸生産菌と比較してさらにＬ－グルタミン酸生産能が向上した菌株を効率よく育種することが可能となる。
α－ＫＧＤＨ活性が欠失した株の取得は，化学薬剤を用いて変異を誘導する方法
でも，遺伝子組換えによる方法でも取得可能である。しかし，化学薬剤による変異
5誘導法ではα－ＫＧＤＨ活性が低下した株を得ることは比較的容易であるが該活性が完全に欠失した株の取得は困難であり，このような株を取得するには上記のようにして明らかとなったα－ＫＧＤＨ遺伝子の構造を基に，遺伝子相同組換え法により染色体上に存在するα－ＫＧＤＨ遺伝子を改変又は破壊する方法が有利である。
…

10

具体的には，部位特異的変異法…や次亜硫酸ナトリウム，ヒドロキシルアミン等の化学薬剤による処理…によって，α－ＫＧＤＨ遺伝子のコーディング領域又はプロモーター領域の塩基配列の中に１つ又は複数個の塩基の置換，欠失，挿入，付加
又は逆位を起こさせ，このようにして改変又は破壊した遺伝子を染色体上の正常な遺伝子と置換することにより遺伝子産物であるα－ＫＧＤＨの活性を欠失させるか

15

α－ＫＧＤＨ遺伝子の転写を消失させることができる。」（８頁２０行～９頁１０行）「このようにして取得した変異が導入されて改変又は破壊された遺伝子をコリネ
型Ｌ－グルタミン酸生産菌の染色体上の正常な遺伝子と置換する方法としては，相同性組換えを利用した方法…がある。…このような菌株を選択することにより，塩20基の置換，欠失，挿入，付加又は逆位を持つ変異が導入されて改変又は破壊された遺伝子が染色体上の正常な遺伝子と置換された菌株を取得することができる。」（９頁２９行～１０頁１３行）「かくして得られるα－ＫＧＤＨ活性が欠失したコリネ型Ｌ－グルタミン酸生産
菌は，α－ＫＧＤＨ活性が部分的に低下した株に比ベて特に過剰量のビオチンを含25有する培地においてＬ－グルタミン酸生産能が顕著に優れている。」（１０頁１４行～１６行）

165

(d) 「なお，Ｌ－グルタミン酸生産性を向上させるには，グルタミン酸生合成系
遺伝子を強化することが有利である。グルタミン酸生合成系遺伝子を強化した例としては，解糖系のホスフォフルクトキナーゼ（ＰＦＫ…），アナプレロティック経路のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＥＰＣ…），ＴＣＡ回路のク5エン酸合成酵素（ＣＳ…），アコニット酸ヒドラターゼ（ＡＣＯ…），イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＣＤＨ…），アミノ化反応としてはグルタミン酸デヒドロ
ゲナーゼ（ＧＤＨ…）等がある。」（１１頁１１行～２０行）「上記の遺伝子を取得するためには以下に示す様な方法が考えられる。
（１）目的遺伝子に変異が起こり特徴的な形質を示す変異株で，目的遺伝子を導10入することによりその形質が消失するような変異株を取得し，その変異株の形質を相補するような遺伝子をコリネ型細菌の染色体から取得する方法。
（２）目的遺伝子が他の生物において既に取得され塩基配列が明らかになっている場合，相同性の高い領域のＤＮＡをプローブとしてハイブリダイゼーションの手法により目的の遺伝子を取得する方法。
（３）目的遺伝子の塩基配列がかなり詳細に判明している場合は目的遺伝子を含15

む遺伝子断片をコリネ型細菌の染色体を鋳型としＰＣＲ法…により取得する方法。
…
また，上記（２）及び（３）の方法で遺伝子を取得する場合，目的遺伝子が独自のプロモーターを持たない時にはコリネ型細菌でプロモーター活性を持つＤＮＡ断20

片を目的遺伝子の上流に挿入することにより目的遺伝子を発現させることができる。
目的遺伝子の発現を強化するには，強力なプロモーターの下流に目的遺伝子を連結することが考えられる。コリネ型細菌の細胞内で機能するプロモーターのうち強力なものとしては，大腸菌のｌａｃプロモーター，ｔａｃプロモーター，ｔｒｐプロ
モーター等がある…。また，コリネバクテリウム属細菌のｔｒｐプロモーターも好25

適なプロモーターである…。本発明の実施例においては，ＰＥＰＣ遺伝子の発現にコリネ型細菌のｔｒｐプロモーターを用いた。」（１１頁２１行～１２頁１６行）

166

ｄ

発明を実施するための最良の形態

(a)

「実施例３

α－ＫＧＤＨ遺伝子欠損株の作製

α－ＫＧＤＨ遺伝子増幅によりＬ－グルタミン酸生成が抑制されたことから，逆にα－ＫＧＤＨ遺伝子を破壊する事によりグルタミン酸収率を向上させることが期5待された。遺伝子破壊株は，特開平５－７４９１号に示される温度感受性プラスミ
ドを用いた相同組換え法により取得した。」（２３頁１８行～２２行）「この感受性株から染色体上のα－ＫＧＤＨ遺伝子の塩基配列を調べ，α－ＫＧ
ＤＨ遺伝子が欠失型に置換されていることを確認し，これをΔＳ株と命名した。」（２４頁２１行～２３行）

10

(b)

「実施例４

ｇｄｈ，ｇｌｔＡ及びｉｃｄ遺伝子増幅用プラスミドの作製」（２４頁２６行）「次に，ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムで機能するプロモーターとして知られているトリプトファンオペロンのプロモーター（…）をｐＨＳＧ－ｐｐ
ｃ’上のｐｐｃ遺伝子の上流に挿入した。…これにより，ｐｐｃ遺伝子の上流にト
15

リプトファンオペロンのプロモーターが１コピー挿入されたプラスミドｐＨＳＧ－
ｐｐｃを得た」（２６頁２行～１５行）(c) 「実施例７

ｐＧＤＨ，ｐＧＬＴＡ，ｐＰＰＣ，ｐＩＣＤ，ｐＧＤＨ＋ＧＬ

ＴＡ＋ＩＣＤ及びｐＧＤＨ＋ＧＬＴＡ＋ＰＰＣ上の各遺伝子の発現の確認
ｐＧＤＨ，ｐＧＬＴＡ，ｐＰＰＣ，ｐＩＣＤ，ｐＧＤＨ＋ＧＬＴＡ＋ＩＣＤ及び20

ｐＧＤＨ＋ＧＬＴＡ＋ＰＰＣ上の各遺伝子がブレビバクテリウム・ラクトファーメ
ンタムの細胞内で発現し，これらのプラスミドが遺伝子増幅の機能を果たしていることの確認を行った。具体的には，ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム

Ａ

ＴＣＣ１３８６９に，電気パルス法（…）によりそれぞれのプラスミドを導入した。」（２８頁３行～８行）
25(d) 「実施例８

ΔＳ株と，ｇｄｈ，ｇｌｔＡ，ｐｐｃ及びｉｃｄ遺伝子を増幅したΔＳ株のＬ－グルタミン酸生産」（３０頁１３行～１４行）

167

「(1)…過剰量のビオチンを含有する培地で培養したにもかかわらず，ΔＳ株は高い収率でＬ－グルタミン酸を生成蓄積することが確認された。」（３１頁１０行，
１１行）「(2)…ΔＳ株に上記の様にして作製したｐＧＤＨ，ｐＧＬＴＡ，ｐＰＰＣ，ｐＩ
5

ＣＤ，ｐＧＤＨ＋ＧＬＴＡ＋ＩＣＤ又はｐＧＤＨ＋ＧＬＴＡ＋ＰＰＣを導入し，それぞれのプラスミドが導入された形質転換体のＬ－グルタミン酸生産性を評価した。
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム細胞へのプラスミドの導入は電気パルス法（…）により行った。」（３１頁１２行～１８行）「ΔＳ株と，得られた形質転換体のＬ－グルタミン酸の生産性の評価は，上記(1)10と同様にして行った。…結果を表９に記す。」（３１頁２２行～２４行）
ｅ

産業上の利用性「コリネ型Ｌ－グルタミン酸生産菌のα－ＫＧＤＨ活性のレベルがＬ－グルタミ
ン酸の発酵生産に影響を及ぼすことが明らかとなった。従って，薬剤遺伝子の挿入等によるα－ＫＧＤＨ遺伝子活性欠失株の取得，ｉｎ
15

ｖｉｔｒｏ

変異による活性弱化株の取得，プロモーターの改変による発現低下株の取得等により，従来のコ
リネ型Ｌ－グルタミン酸生産菌と比較してさらにＬ－グルタミン酸生産能が向上した菌株を効率よく育種することが可能となる。」（３３頁１３行～１８行）

20

イ

乙９発明の概要(ｱ)

前記アによれば，乙９文献には，以下の開示があると認められる。

ａ

コリネ型Ｌ－グルタミン酸生産菌において，α－ＫＧＤＨ遺伝子の活性がＬ－グルタミン酸の生産に顕著な影響を及ぼすものであり，α－ＫＧＤＨ活性を欠失させたコリネ型Ｌ－グルタミン酸生産菌が著量のＬ－グルタミン酸を生成蓄積すること（前記ア(ｲ)ｃ(a)），α－ＫＧＤＨ遺伝子の活性を欠失させる方法としては，染色体上に存在するα－ＫＧＤＨ活性を有する酵素をコードする遺伝子又はそのプ
25

ロモーターの塩基配列中に１又は２以上の塩基の置換，欠失，挿入，付加又は逆位が生じさせることによって，α－ＫＧＤＨ遺伝子を改変又は破壊する方法があるこ

168

と（前記ア(ｲ)ｃ(b)，(c)）。
ｂα－ＫＧＤＨ遺伝子の活性の欠失の他に，グルタミン酸生産性を向上させる

方法としてグルタミン酸生合成系の遺伝子を強化する方法があること，遺伝子を強化する方法の一つとして，目的遺伝子の発現を強化するために目的遺伝子を連結す5ることが考えられ，コリネ型細菌の細胞内で機能するプロモーターのうち強力なものとしては，大腸菌のｌａｃプロモーター，ｔａｃプロモーター，ｔｒｐプロモー
ター，コリネバクテリウム属細菌のｔｒｐプロモーターがあること（前記ア(ｲ)ｃ
(d)）。
ｃ

10

コリネ型細菌の染色体上のα－ＫＧＤＨ遺伝子の活性を欠失させた上で，Ｇ

ＤＨ遺伝子やＣＳ遺伝子（ｇｌｔＡ）などのグルタミン酸生合成系の遺伝子を，当該遺伝子を含むプラスミド（ベクター）を導入することによって強化した実施例（前記ア(ｲ)ｄ）。
(ｲ)

乙９発明

前記(ｱ)によれば，乙９文献には，本件訂正発明１と対比される構成として，次の15とおりの構成を有する乙９発明が開示されていると認められる。
「染色体上に存在するα－ＫＧＤＨ活性を有する酵素をコードする遺伝子又はそのプロモーターの塩基配列中に１又は２以上の塩基の置換，欠失，挿入，付加又は逆位が生じたことにより，α－ＫＧＤＨ活性が欠損したコリネ型細菌であって，Ｇ
ＤＨ，ＣＳ遺伝子等のグルタミン酸生合成系遺伝子を強力なプロモーターの下流に20連結したベクターを導入したコリネ型細菌を培地中で培養し，培地中にＬ－グルタ
ミン酸を生成蓄積させ，これを該培地から採取することを特徴とする発酵法によるＬ－グルタミン酸の製造方法」(ｳ)

被告の主張について

被告は，乙９文献には「コリネ型細菌の染色体上のグルタミン酸デヒドロゲナー
25

ゼ（ＧＤＨ）又はクエン酸合成酵素（ＣＳ）遺伝子のプロモーター配列に変異を導入したコリネ型細菌を培地で培養し，培地中にＬ－グルタミン酸を生成蓄積させ，169

これを該培地から採取することを特徴とする発酵法によるＬ－グルタミン酸の製造方法」の発明が開示されていると主張する。
前記ア(ｲ)ｃ(c)のとおり，乙９文献には，相同性組み換えを利用して染色体上の遺伝子又はそのプロモーター配列に変異を導入する方法の記載があるが，当該記載
5はα－ＫＧＤＨ遺伝子の活性を欠損させる手段として記載されているものであり，染色体上のＧＤＨ遺伝子等を強化する手段として記載されているものではない。また，前記(ｱ)ｂのとおり，乙９文献には，グルタミン酸生合成系の遺伝子を強化する方法の一つとして，目的遺伝子の発現を強化するために強力なプロモーターの下流に目的遺伝子を連結する方法が開示されているが，ＧＤＨ，ＣＳ遺伝子の強化をす

10

る具体的な方法として記載されているのは，前記ア(ｲ)ｄの当該遺伝子のベクター（プラスミド）を導入する方法のみであり，染色体上のＧＤＨ，ＣＳ遺伝子のプロ
モーター配列を改変する方法についての記載はない。
このように，乙９文献において，コリネ型細菌の染色体上のＧＤＨ遺伝子又はＣＳ遺伝子のプロモーター配列に変異を導入することが開示されているとはいえない

15から，被告の上記主張は採用できず，乙９発明については，前記(ｲ)のとおり認定するのが相当である。

20(5)

乙６文献，乙９文献以外の公知文献の記載事項について

ア

乙８文献について(ｱ)

乙８文献の記載事項

乙８文献には，以下の記載がある（乙８，甲２５）。
ａｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ「クエン酸合成酵素（ＥＣ４．１．３．７）はクエン酸回路のエントリーでの重要なステップ，即ち，アセチルＣｏＡとオキサロ酢酸を縮合してクエン酸とＣｏＡを生成するステップを触媒する。中心的な代謝におけるこの酵素の重要な位置は，
25

その構造的，動力学的，制御的及び分子的特性において大いに興味をかきたて，それゆえに，様々な生物で詳細に研究されている（…）。」（１８１８頁左欄１行～

170

９行。）
「同じ著者は，低下したクエン酸合成酵素活性を有する，Ｃ．グルタミカムｓｓｐ．フラバムの古典的に得られた変異体は，著量のアスパラギン酸及びリジンを生成できたことを報告した（…）。このことと，炭水化物からクエン酸経路，そして
5

それに由来するアミノ酸への炭素フローにおける当該酵素の重要な位置づけは，クエン酸合成酵素が定義されたアミノ酸生産Ｃ．グルタミカム種の遺伝的構築における重要な標的かもしれないことを示唆する。
我々は，制御，クエン酸合成酵素遺伝子（ｇｌｔＡ）の単離，その核酸配列，同種及び異種発現，並びにその転写機構との関連で，Ｃ．グルタミカムのクエン酸合10

成酵素を記載する。」（１８１８頁左欄２７行～４０行。）
ｂｒｅｓｕｌｔｓａｎｄｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ(a) 「ｇｌｔＡを過剰発現するＣ．グルタミカム株が試験した全ての培地において，より遅い生育を示したこと（例えば，ＬＢ培地において，８０分ではなく１２０分の倍増時間）から，クエン酸合成酵素の増加した濃度による細胞の軽度の障害
15が示唆されることは，特筆すべきである。」（１８２０頁右欄第３２行～第３６行）(b)「増強されたクエン酸合成酵素活性のグルタミン酸分泌への効果を試験するために，標準的なグルタミン酸醗酵（Ｈｏｉｓｃｈｅｎ＆Ｋｒａｍｅｒ，１９８９）をＣ．グルタミカムＷＴ及びＷＴ（ｐＪＣ－ｇｌｔＡ３Ａ）で実施した。これ
らの実験で，約１７μｍｏｌ
20ｍｉｎ －１（ｇ乾燥重量）－１ の同一グルタミン酸分泌速度が両株に関して見いだされた。したがって，クエン酸合成酵素の濃度を単に増強することによっては，Ｃ．グルタミカムのグルタミン酸を分泌する能力を増強することはできない。」（１８２１頁左欄１７行～２６行）(c) 「Ｃ．グルタミカムのクエン酸合成酵素の得られた核酸配列及び推定アミノ酸配列は図２に示す。」（１８２１頁右欄１０行～１２行）

25

「図２

３００７塩基対のＳａｌＩ－ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントの核酸配列及び推定のクエン酸合成酵素のアミノ酸配列。転写開始部位（→），推定－１０領域

171

（―）…を示す。」（１８２２頁～第１８２３頁，図２。図２の推定－１０領域には「ＴＡＴＡＧＣ」配列が記載されている。）(ｲ)

前記(ｱ)の記載事項及び弁論の全趣旨によれば，乙８文献には，クエン酸合成酵素（ＣＳ）がクエン酸回路の重要な反応を触媒していること，ＣＳ活性が低下
5したコリネバクテリウム・グルタミカムにおいて，アスパラギン酸及びリジンの生産が増加したこと，ＣＳを過剰に発現させることでコリネバクテリウム・グルタミ
カムの生育が遅くなること，プラスミドを導入することによってＣＳの活性を増大させたコリネバクテリウム・グルタミカムにおいて変異を加えなかった菌株と比較してグルタミン酸生産能が増強されなかったことの開示があり，また，野生型のコ

10

リネバクテリウム・グルタミカムのＣＳ遺伝子のプロモーターの－１０領域の配列がＴＡＴＡＧＣと推定されたことが開示されている。
イ

乙１０文献について(ｱ)乙１０文献の記載事項

乙１０文献には，Ｅ．ｃｏｌｉのプロモーター配列に関して以下の記載がある（乙15１０）。
「野生型と比較してプロモーター強度が２１倍に増強した６つの変異体は，－３５プロモーター領域において，ＴＴＧＴＣＡからコンセンサス配列ＴＴＧＡＣＡに変異されていた。野生型より７倍強いａｍｐＣプロモーターを示す３つの変異体において，－１０領域配列ＴＡＣＡＡＴは，コンセンサス配列ＴＡＴＡＡＴに変異さ20れていた。」（８７５頁左欄，ａｂｓｔｒａｃｔ４行～１０行）「－３５領域の非常に保存されたＴＴＧ配列の下流には，３つのより厳密でない保存されたヌクレオチドが続く。」（８７５頁左欄，ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ１
８行～２０行）(ｲ)

25

前記(ｱ)の記載事項によれば，乙１０文献には，Ｅ．ｃｏｌｉにおいて，－

３５領域のＴＴＧＴＣＡ配列がコンセンサス配列ＴＴＧＡＣＡに変異した変異体では，プロモーター強度が２１倍に増強したこと，－１０領域のＴＡＣＡＡＴ配列が172

コンセンサス配列ＴＡＴＡＡＴに変異した変異体では，プロモーター強度が７倍に増強したこと，－３５領域にＴＴＧ配列が保存されていることの開示がある。
ウ

乙１１文献について

乙１１文献には，Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｔａｃプロモーターの配列について，－
5３５領域がＴＴＧＡＣＡ，－１０領域がＴＡＴＡＡＴであること，ｌａｃＵＶ５プ
ロモーターの配列について，－３５領域がＴＴＴＡＣＡ，－１０領域がＴＡＴＡＡ
Ｔであることが開示されている（３５４０頁図１ｂ）（乙１１，弁論の全趣旨）。

10

エ

乙１２文献について(ｱ)

乙１２文献の記載事項

乙１２文献には，以下の記載がある（乙１２，弁論の全趣旨）。
ａ

特許請求の範囲「１．ＴＡＧＡＣＡで示される塩基配列（ａ）と，該塩基配列（ａ）の１５～２０塩基対下流のＴＡＴＡＡＴで示される塩基配列（ｂ）とを有することを特徴とす
るコリネ型細菌細胞内でプロモーターとして機能するＤＮＡ断片（ｃ）。」（１頁
15

左欄５行～９行）
ｂ

発明の詳細な説明

(a)

実施例２

「合成プロモーターのｐＰＲ３への導入：
プロモーターはＤＮＡ合成装置…を用いて合成した（その両末端がＢａｍＨＩ断20

片になるようにした）。そのＤＮＡ断片の塩基配列を下記に示す。」（６頁右上欄
１３行～１８行。引用された塩基配列は，別紙１４引用文献の図面参照）「実施例１で調製したプラスミドｐＰＲ３

０．５μｇに制限酵素ＢａｍＨＩ（５ｕｎｉｔｓ）を３７℃で１時間反応させ，プラスミドＤＮＡを完全に分解した。
上記合成プロモーターＤＮＡとプラスミドＤＮＡ解物を混合し，…この溶液を用25いてエシェリヒア・コリＨＢ１０１コンピテントセル（宝酒造製）を形質転換した。
形質転換株は…培養し，生育株として得られた。これら生育株のプラスミドをア173

ルカリ－ＳＤＳ法…により抽出した。
得られたプラスミドは実施例１の（Ｅ）項に記載の方法に従い，ブレビバクテリ
ウム・フラバムＭＪ－２３３株（ＦＥＲＭ

ＢＰ－１４９７）プラスミド除去株へ形質転換し，実施例１の（Ａ）項に記載の方法を用いてプラスミドを抽出した。
5

このプラスミドの制限酵素ＢａｍＨＩ，ＫｐｎＩ，ＳａｃＩ等の制限酵素による切断パターンによってｐＰＲ３に合成ＤＮＡが組み込まれていることを確認し，このプラスミドを“ｐＰＲ３ＢＴ２”と命名した。」（６頁左下欄１行～右下欄１１
行。）
(b)

10

実施例３

「合成プロモーター強度の測定：
実施例２でｐＰＲ３に挿入したプロモーターの強度を，クロラムフェニコールア
セチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）の活性を測定することによって調べた。
ｐＰＲ３を保有するブレビバクテリウム

フラバムＭＪ－２３３株とｐＰＲ３Ｂ

Ｔ２を保有するブレビバクテリウム・フラバムＭＪ－２３３株をそれぞれ，実施例
15

１の（Ａ）項に記載の半合成培地Ａにカナマイシンを５０μｇ／ｍｌ加えた培地１
０ｍ１の入った試験管で一晩前培養し，その培養液を上記の培地１００ｍｌの入った三角フラスコで約６時間培養後集菌し，活性測定に用いた。ＣＡＴの活性はＷ．
Ｖ．Ｓｈａｗらの方法…により測定した。その結果，ｐＰＲ３ＢＴ２を有するＭＪ－２３３株は，プロモーターの挿入されていないｐＰＲ３を有するＭＪ－２３３株

20の約１４倍のＣＡＴ活性をもっていた。」（６頁右下欄１２行～７頁左上欄１１行）(ｲ)

前記(ｱ)の記載事項によれば，乙１２文献には，－３５領域にＴＡＧＡＣＡ

及び－１０領域にＴＡＴＡＡＴ配列を有するプロモーターがコリネ型細菌で機能し，目的遺伝子（ＣＡＴ遺伝子）の発現を，プロモーターが挿入されていない菌株と比較して１４倍に高めたことの開示がある。
25

オ

乙３５文献について(ｱ)

乙３５文献の記載事項

174乙３５文献には，以下の記載がある（第２表，第１０表，第１１表及び第１３表
は，別紙１４引用文献の図面参照）。
ａ

従来の技術

「Ｌ－グルタミン酸は調味料として幅広い用途があり，グルタミン酸生産性コリ
5

ネ型細菌を培養して該細菌にＬ－グルタミン酸を生産せしめ，生成するＬ－グルタ
ミン酸を該細菌の培養物から分離する発酵法により工業的に生産されている。」（２
頁左下欄１０行～１４行）「…グルタミン酸生合成に関与する酵素の活性を強化することによりＬ－グルタ
ミン酸の生産速度を高めるとともに効率良くＬ－グルタミン酸を生成させる試みも10

近年行われるようになり，この目的を達成するためにグルタミン酸の生合成経路に関与する各種酵素遺伝子のクローニングが行われつつある。」（２頁右下欄１３行～１９行）
ｂ

本発明が解決しようとする問題点「しかしながら，Ｌ－グルタミン酸発酵においてその生産性を十分向上すること
15のできる菌株については，これまでに報告された例がなかった。」（３頁右上欄５行～７行）
ｃ

問題点を解決するための手段および作用「本発明者らは上記問題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果，グルタミン酸生合
成経路に関与する酵素遺伝子のうち，少なくとも２種以上の酵素遺伝子を組換えＤ
20ＮＡ技術を用いることにより同時に強化した種々の菌株を作製することに成功し，これらの菌株を用いてグルタミン酸発酵を行ったところ，少なくともグルタミン酸
デヒドロゲナーゼ（…ＧＤＨ）遺伝子とイソクエン酸デヒドロゲナーゼ（…ＩＣＤ
Ｈ）遺伝子を含む少なくとも２種以上のグルタミン酸生合成経路に関与するグルタ
ミン酸生産性コリネ型細菌由来の酵素遺伝子を含む組換え体ＤＮＡで形質転換され25た菌株を用いてグルタミン酸発酵を行なった場合には親株を使用した場合に比較して培地中へのＬ－グルタミン酸の蓄積レベルのみならず対糖収率も著しく向上して175

いることを見出し，本発明を完成するに到った。」（３頁右上欄９行～左下欄６行）「多重強化株を作製する際の材料となる組換えプラスミドとして，ＧＤＨ遺伝子を含むｐＡＧ１００１，ＩＣＤＨ遺伝子を含むｐＡＧ３００１，ＡＨ遺伝子を含む
ｐＡＧ５００１，およびＣＳ遺伝子を含むｐＡＧ４００３等が挙げられる。…グル5タミン酸生産性コリネ型細菌のベクタープラスミドｐＡＧ５０の中にそれぞれＧＤ
Ｈ遺伝子を含む断片，ＩＣＤＨ遺伝子を含む断片，ＡＨ遺伝子を含む断片，またはＣＳ遺伝子を含む断片が組込まれたものである。」（６頁右下欄８行～１８行）「本発明のグルタミン酸生産性コリネ型細菌が保有する組換え体ＤＮＡの例としては，後述のプラスミドｐＩＧ１０１，ｐＡＩＧ３２１，ｐＣＩＧ２３１，ｐＣＡ

10ＩＧ４等が挙げられる。ｐＩＧｌ０１はｐＡＧ５０にグルタミン酸生産性コリネ型
細菌由来のＧＤＨ遺伝子とＩＣＤＨ遺伝子が同時に組込まれたものである。ｐＡＩ
Ｇ３２１は同時にＡＨ遺伝子，ＩＣＤＨ遺伝子およびＧＤＨ遺伝子が同時に組込まれたものである。また，ｐＣＩＧ２３１は同時にＣＳ，ＩＣＤＨ，ＧＤＨの３種の酵素の遺伝子がｐＡＧ５０に同時に組込まれたものである。さらにｐＣＡＩＧ４は15

ｐＡＧ５０にＣＳ，ＡＨ，ＩＣＤＨ，およびＧＤＨの４種の酵素の遺伝子が同時に組込まれたものである。」（７頁左上欄７行～１９行）
ｄ

実施例１「本実施例では，グルタミン酸生産性コリネ型細菌で，ＧＤＨとＩＣＤＨの活性が同時に強化された２重強化株を作製した例を示す。
20

ＧＤＨ遺伝子およびＩＣＤＨ遺伝子を含む組換えプラスミドとしてそれぞれｐＡ
Ｇ１００１およびｐＡＧ３００１を使用した。」（８頁右上欄３行～８行）「プラスミドｐＡＧ１００１を保有するコリネバクテリウム・メラセコラ（…）
を…培養した。…
ＧＤＨ活性は，…で測定することにより求めた。…結果を第２表に示す。」（１25

６頁左上欄１９行～１８行）
ｅ

実施例３

176

「実施例では，ＣＳ＋ＩＣＤＨ＋ＧＤＨの３重強化株を作成した例を示す。また
ＣＳ＋ＩＣＤＨの２重強化株およびＣＳ＋ＧＤＨの２重強化株を作成した例についても同時に示す。
組換えプラスミドを作製する際の材料としては前述のｐＡＧ１００１，ｐＡＧ３
5００１の他にＣＳ遺伝子を含む組換えプラスミドｐＡＧ４００３を用いた。」（３５頁左下欄１行～８行）「（６）プラスミドｐＡＧ４００１保有菌株のＣＳ活性の測定
プラスミドｐＡＧ４００１の保有のコリネバクテリウム・メラセコラ（…）８０
１を，…培養した。……ＣＳ活性を測定した。その結果，第１０表に示した様に，

10

プラスミドｐＡＧ４００１保持菌株は，ベクターｐＡＧ５０保持菌株やプラスミド
非保持菌に比べて，高いＣＳ比活性を示した。」（４１頁左上欄７行～右上欄４行）「ｐＣＩ３１およびｐＣＧ５はそれぞれＣＳとＩＣＤＨを同時に含む組換えプラ
スミドおよびＣＳとＧＤＨを同時に含む組換えプラスミドである。ＣＳ＋ＩＣＤＨ＋ＧＤＨの組換えプラスミドはｐＣＩ３１のＥｃｏＲＩ切断点にＧＤＨ断片を組み15込むことにより得られ，本発明のプラスミドｐＣＩＧ２３１についてさらに詳細な解析を行った。」（４２頁右下欄１２行～１８行）「ｐＣＩ３１，ｐＣＧ５，およびｐＣＩＧ２３１の各プラスミドを保持する宿主菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ

ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ８０１）よりそ

れぞれ細胞抽出液を調製し，ＣＳ，ＩＣＤＨ，ＧＤＨの酵素活性をプラスミドを保20持しない宿主菌の細胞抽出液を用いた場合と比較した。…
第１１表の結果によりｐＣＩ３１保持株，ｐＣＧ５保持株，ｐＣＩＧ２３１保持
株はそれぞれ目的の酵素活性が全て強化されていることが確認された。」（４３頁
左上欄９行～右上欄１５行）
ｆ

25

実施例５

「本実施例では，実施例１～４で得られた多重強化株を用いたグルタミン酸発酵の例を示す。…

177

…得られた結果を第１３表に示す。…
第１３表から明らかなように，少なくともＧＤＨとＩＣＤＨの両酵素が同時に強化された菌株では，他の菌株に比較してグルタミン酸蓄積量，対糖収率ともに高い成績を示した。」（４４頁左上欄１７行～４５頁左上欄５行）
5(ｲ)

前記(ｱ)の記載事項によれば，乙３５文献には，グルタミン酸生合成経路に関与する酵素遺伝子のうち，ＧＤＨ遺伝子，ＣＳ遺伝子及びＩＣＤＨ遺伝子等を，当該遺伝子を有するプラスミドを導入することによって強化したグルタミン酸生産性コリネ型細菌が開示され，そのうち，少なくともＧＤＨ遺伝子とＩＣＤＨ遺伝子を同時に強化したグルタミン酸生産性コリネ型細菌において，グルタミン酸生産能10が向上したこと，他方で，ＧＤＨ遺伝子及びＣＳ遺伝子を単独で強化した菌株においては，第１３表において，いずれもグルタミン酸の生産性（９．２ｇ／ｄｌ）は親株の生産性（９．１ｇ／ｄｌ）と比較して実質的に変わらなかったことが開示さ
れている。

15

(6)

本件訂正発明１についての乙６発明を主引例とする進歩性欠如の有無

ア

本件訂正発明１－１の進歩性について(ｱ)

乙６発明と本件訂正発明１－１との対比

前記(3)イの乙６発明と本件訂正発明１－１とを対比すると以下のとおりであると認められる。
ａ20

一致点

コリネ型細菌の染色体上の，ＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列の－３５領域及び－１０領域に特定の塩基配列を有し，並びに／又は，ＣＳ遺伝子のプロモーター配列の－１０領域に特定の塩基配列を有する，コリネ型細菌に係る発明である点。
ｂ

相違点

相違点１
25

本件訂正発明１－１のコリネ型細菌では，ＧＤＨ遺伝子のプロモータ

ー配列の－３５領域にＴＴＧＴＣＡ配列，－１０領域にＴＡＴＡＡＴ配列が導入されているのに対し（１－Ａ’－１），乙６発明のコリネ型細菌は，ＧＤＨ遺伝子の178プロモーター配列の－３５領域にＴＧＧＴＣＡ配列，－１０領域にＣＡＴＡＡＴ配列を有する点。
相違点２

本件訂正発明１－１のコリネ型細菌では，ＣＳ遺伝子のプロモーター

配列の－１０領域にＴＡＴＡＡＴ配列が導入されているのに対し（１－Ａ’－２），5

乙６発明のコリネ型細菌は，ＣＳ遺伝子のプロモーター配列の－１０領域にＴＡＧ
ＣＧＴ配列を有する点。
相違点３

本件訂正発明１－１は，コリネ型細菌を培養し，培地中にグルタミン酸を蓄積させ，これを該培地から採取することを特徴とする発酵法によるグルタミン酸の製造方法の発明であるのに対し（１－Ａ－３，１－Ｂ’），乙６発明は，コ10リネ型細菌の発明である点。
なお，本件訂正発明１－１の構成要件のうち，構成要件１－Ａ’－１と１－Ａ’－２については，いずれか１つが充足されれば足りる。したがって，相違点１と相違点２については，これらに係る構成のいずれかが容易想到であれば，本件訂正発明１－１は乙６発明に基づいて容易に想到することができた構成を含むものと言い

15

得る。
(ｲ)

相違点１（ＧＤＨ遺伝子の－３５領域をＴＴＧＴＣＡ配列，－１０領域をＴ

ＡＴＡＡＴ配列とすること）の容易想到性について

20

ａ乙６文献の示唆について(a)

前記(3)イのとおり，乙６文献の図１においては，ある野生型のコリネバク

テリウム・グルタミカムの各種の遺伝子のプロモーターの核酸配列が開示され，その中で，乙６発明に係る野生型のＧＤＨ遺伝子及びＣＳ遺伝子の各プロモーター配列（ＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列の－３５領域に「ＴＧＧＴＣＡ」配列，－１０領域に「ＣＡＴＡＡＴ」配列，ＣＳ遺伝子のプロモーター配列の－３５領域に「ＴＧＧＣＴＡ」配列及び－１０領域に「ＴＡＧＣＧＴ」配列）が開示されている。

25

また，乙６文献においては，コリネバクテリウム・グルタミカムの遺伝子のプロ
モーターのコンセンサス配列に関する記載として，コリネバクテリウム・グルタミ

179

カムの遺伝子のプロモーター配列において，保存されている配列は－３５領域のｔｔＧｃｃａ．ａ及び－１０領域のｇｇＴＡ．ａａＴであること，これらの位置等が，他のグラム陽性及びグラム陰性細菌のプロモーターの－３５領域及び－１０領域のコンセンサス配列に相当することが記載されている（前記(3)ウ(ｱ)）。
5

他方で，乙６文献には，コリネ型細菌を用いた発酵法によるグルタミン酸の製造方法において，グルタミン酸生産能を向上させるために，グルタミン酸生合成系遺伝子であり，コリネ型細菌の染色体上の特定の遺伝子であるＧＤＨ遺伝子及びＣＳ遺伝子の発現を強化することや，その具体的な方法として，これらの遺伝子のプロ
モーター配列の－３５領域及び－１０領域をコリネ型細菌のコンセンサス配列に近10づけるように改変することを示唆するような記載はない。
したがって，当業者において，乙６文献の示唆に基づき，乙６発明におけるコリ
ネ型細菌について，その染色体上のＧＤＨ遺伝子のプロモーターの－３５領域をＴ
ＴＧＴＣＡ配列，－１０領域をＴＡＴＡＡＴ配列と変更する動機付けはないから，当業者において相違点１に係る構成を容易に想到できたものとは認められない。

15

(b)

被告の主張について

被告は，本件優先日１当時の技術常識として，①コリネ型細菌によるＬ－グルタ
ミン酸の生産性を高めるために，グルタミン酸生合成系遺伝子を増強することが有利であり，特にＧＤＨ活性ないしＣＳ活性を増強することは知られていた，また，②Ｅ．ｃｏｌｉ及びコリネバクテリウム・グルタミカムにおいて，目的とする遺伝
20子のプロモーターの－３５領域及び－１０領域をコンセンサス配列に近づけること
により，発現が促進されることが知られていた等として，乙６文献に接した当業者
は，グルタミン酸生産能を向上させるため，乙６発明におけるコリネ型細菌の染色体上のＧＤＨ遺伝子のプロモーターの－３５領域及び－１０領域の配列を，乙６文
献に記載されたコリネバクテリウム・グルタミカムのコンセンサス配列（－３５領

25

域について「ＴＴＧＣＣＡ」，－１０領域について「ＴＡＴ．ＡＴ」の配列）ない
しそれに近い配列に変更することは，当業者が容易に想到し得たとして，ＧＤＨ遺180

伝子の－３５領域をＴＴＧＴＣＡ配列，－１０領域をＴＡＴＡＡＴ配列とすることは容易想到であった旨主張する。
しかしながら，本件優先日１当時において，後記(8)エ(ｲ)のグルタミン酸の生合成に関与する酵素としてのＧＤＨ及びＣＳの一般的な働きのほか，乙９文献（前記
5(4)イ(ｱ)）に記載されているように，コリネ型細菌によるグルタミン酸生産能を向上させるためにＧＤＨ遺伝子やＣＳ遺伝子などのグルタミン酸の生合成に関与する遺伝子の発現を強化することが望ましいことが知られていたとしても，その具体的な強化の方法として染色体上のこれらの遺伝子のプロモーターの特定の領域に特定の変異を導入する方法が知られていたことを認めるに足りる証拠はない。

10

また，本件優先日１当時において，乙１０文献（前記(5)イ(ｲ)）のように，Ｅ．
ｃｏｌｉにおいて目的とする遺伝子のプロモーターの－３５領域及び－１０領域をそのコンセンサス配列に近づけることにより発現が促進される例が知られていたとしても，コリネ型細菌についてこれと同様の知見が存在していたことを認めるに足りる証拠はない。この点について，乙６文献には，Ｅ．ｃｏｌｉの遺伝子のプロモ

15

ーターがコリネ型細菌で機能した例があることや，コリネバクテリウム・グルタミ
カムの遺伝子のプロモーター領域とＥ．Ｃｏｌｉの遺伝子のプロモーター領域の類似性を示唆する記載（前記(3)ウ(ｲ)）があるものの，他方で，コリネ型細菌特有のプロモーターがＥ．ｃｏｌｉでは明らかに機能しなかったという複数の報告があること（前記(3)ウ(ｲ)）や，コリネバクテリウム・グルタミカムの上記コンセンサス

20

モチーフはＥ．ｃｏｌｉよりも保存される程度が低かったこと（前記(3)ウ(ｳ)）といった，コリネバクテリウム・グルタミカムとＥ．ｃｏｌｉとの間で遺伝子のプロ
モーター領域の配列の特徴に違いがある旨の記載もされている。さらには，乙６文献においては，前記(3)ウ(ｴ)のとおり，遺伝子のプロモーターの活性と，その－３５領域及び－１０領域をコンセンサス配列と類似させることとの関係について，Ｅ．

25

ｃｏｌｉの遺伝子のプロモーターの活性については大部分は相関し得るのに対して，
コリネバクテリウム・グルタミカムの遺伝子のプロモーターの活性についてはコン

181

センサス配列との類似性との相関は確認できなかったとの記載もされているから，
乙６文献におけるコリネバクテリウム・グルタミカムのコンセンサス配列に関する記載やＥ．ｃｏｌｉのプロモーター等に関する記載は，コリネ型細菌の目的遺伝子を強化するために，コリネ型細菌の染色体上の遺伝子のプロモーターの－３５領域
5及び－１０領域の塩基配列をコリネ型細菌のコンセンサス配列ないしはそれに近い配列に改変することを示唆するものとはいえない。
なお，前記(3)ア(ｳ)ａのとおり，乙６文献においては，コリネ型細菌で機能する
Ｅ．ｃｏｌｉのプロモーターとして，ｔａｃプロモーター及びｌａｃＵＶ５プロモ
ーターが挙げられており，前記(5)ウのとおり，乙１１文献の記載からは，これらの10

プロモーターの－１０領域の配列は「ＴＡＴＡＡＴ」配列であると認められ，前記(5)イの乙１０文献の記載からは当該配列はＥ．ｃｏｌｉにおけるコンセンサス配列であることが認められる。しかしながら，乙６文献においては，ｔａｃプロモー
ター等がコリネ型細菌のＧＤＨ遺伝子又はＣＳ遺伝子の活性に与える影響についての言及はなく，これらのプロモーターを用いてコリネ型細菌のＧＤＨ遺伝子又はＣ

15Ｓ遺伝子を強化できるとの技術常識があったことを認めるに足りる証拠もない（これらのプロモーターのコリネ型細菌における機能について被告が指摘する乙６４文
献はＣＡＴ遺伝子の活性についてのものである。）。Ｅ．ｃｏｌｉとコリネバクテ
リウム・グルタミカムにおいてコンセンサス配列の性質に違いがある旨の上記の乙６文献の記載も考慮すれば，乙６文献において，ｔａｃプロモーター等の－１０領

20

域の配列あるいはＥ．ｃｏｌｉのコンセンサス配列に従って，ＧＤＨ遺伝子又はＣＳ遺伝子のプロモーターの－１０領域に「ＴＡＴＡＡＴ」配列を導入することの示唆があったとはいえない。
したがって，被告の上記主張は採用できない。
ｂ25

乙６文献以外の公知文献の記載事項との組み合わせについて

前記ａで検討した乙６文献における示唆を踏まえた上で，他の公知文献の記載との組み合わせによって相違点１の構成に想到することが容易かを検討する。

182

(a)

乙９文献の記載事項について

前記(4)イ(ｱ)のとおり，乙９文献には，Ｌ－グルタミン酸生産性を向上させるにはグルタミン酸生合成系遺伝子を強化することが有利である旨が記載され，グルタ
ミン酸生合成系遺伝子を強化した例として，ＧＤＨ遺伝子及びＣＳ遺伝子を強化し5た例が記載されている。
他方で，乙９文献において，目的遺伝子を増強する方法として具体的な開示があるのは，これらの遺伝子を強力なプロモーターの下流に連結した上でベクターとして導入することにとどまり，染色体上の目的遺伝子のプロモーター配列に変異を加える例についての開示はされていない（前記(4)イ(ｱ)，(ｲ)）。

10

この点，染色体上の遺伝子のプロモーター配列への変異の導入について，乙９文
献には，α－ＫＧＤＨ活性が欠失したコリネ型細菌を得る方法として，相同性組み換えを利用して染色体上のプロモーター配列に変異を導入する方法の記載があるが（前記(4)ア(ｲ)ｃ(c)），これは，α－ＫＧＤＨ活性を欠損させる手段として記載されているに過ぎず，コリネ型細菌の染色体上のＧＤＨ遺伝子等のグルタミン酸生合

15

成系の酵素活性を増強する手段として記載されているわけではない。
その他，乙９文献において，コリネ型細菌で機能する強力なプロモーターについての記載（前記(4)ア(ｲ)ｃ(d)）はあるが，これらのプロモーターの配列と，コリネ型細菌の遺伝子のプロモーターのコンセンサス配列との関連に関する記載はない。
したがって，乙６発明に接した当業者が，乙９文献の記載内容を認識していたと20しても，乙６発明のコリネ型細菌の染色体上のＧＤＨ遺伝子のプロモーター領域に
本件訂正発明１－１の配列を導入する動機付けは認められないというべきである。
なお，乙９発明でコリネ型細菌で機能する強力なプロモーターとして記載されているものにはその－１０領域が「ＴＡＴＡＡＴ」配列であるものが含まれるが（前記(4)ア(ｲ)ｃ(d)のうち，前記(5)ウの乙１１文献に記載があるｔａｃプロモーター

25の配列），上記のとおり，乙９文献では目的遺伝子の強化の方法として，染色体上の目的遺伝子のプロモーター配列に変異を導入することは記載されていないことを183

考慮すれば，この点は上記の結論を覆すものではない。
(b)

乙１０文献の記載事項について

乙１０文献に開示されている事項は，前記(5)イ(ｲ)のとおりであり，Ｅ．ｃｏｌｉにおいて，プロモーターの－３５領域ないし－１０領域の配列をコンセンサス配5列に変異した変異体ではプロモーター強度が増強したこと，－３５領域にＴＴＧ配列が保存されていることの開示があるが，コリネ型細菌のプロモーターの配列に関する記載はない。
前記ａ(b)で検討したところからすれば，乙６文献に接した当業者が，Ｅ．ｃｏｌｉのプロモーター領域についての乙１０文献の記載内容を認識していたとしても，

10

コリネ型細菌の目的遺伝子を強化するために，乙６発明のコリネ型細菌の染色体上のＧＤＨ遺伝子のプロモーター領域に本件訂正発明１－１の配列を導入する動機付
けは認められない。
(c)

乙１１文献の記載事項について

乙１１文献に開示されている事項は，前記(5)ウのとおりであり，Ｅ．ｃｏｌｉに
15

おけるｔａｃプロモーターの配列が－３５領域がＴＴＧＡＣＡ，－１０領域がＴＡ
ＴＡＡＴであること，ｌａｃＵＶ５プロモーターの配列が－３５領域がＴＴＴＡＣ
Ａ，－１０領域がＴＡＴＡＡＴであることが開示されているが，コリネ型細菌のプロモーターの配列に関する記載ではなく，コリネ型細菌の遺伝子のプロモーターのコンセンサス配列に関する記載がされたものでもない。

20

前記(3)ア(ｳ)ａのとおり，乙６文献においてｔａｃプロモーター及びｌａｃＵＶ
５プロモーターの言及があることを考慮しても，前記ａ(b)で検討したところからすれば，当業者が，乙６文献と乙１１文献の記載内容に基づいて，コリネ型細菌の目的遺伝子を強化するために，乙６発明のコリネ型細菌の染色体上のＧＤＨ遺伝子のプロモーター領域に本件訂正発明１－１の配列を導入する動機付けは認められな

25

い。
(d)

乙１２文献の記載事項について184

乙１２文献に開示されている事項は，前記(5)エ(ｲ)のとおりであり，－３５領域にＴＡＧＡＣＡ及び－１０領域にＴＡＴＡＡＴ配列を有するプロモーターがコリネ型細菌で機能し，目的遺伝子（ＣＡＴ遺伝子）の発現を，プロモーターが挿入されていない菌株と比較して１４倍に高めたことの開示がある。
5

他方で，乙１２文献には，特定の配列を有するプロモーターと，特定の遺伝子（ＣＡＴ遺伝子）の活性の関係を調べた結果が記載されているのにとどまり，コリネ型細菌のプロモーターの－３５領域及び－１０領域のコンセンサス配列について開示
ないし示唆する記載はなく，また，コリネ型細菌の染色体上の遺伝子のプロモータ
ー配列に変異を導入した菌株を開示するものでもない。

10

したがって，乙６文献に接した当業者が，乙１２文献の記載内容を認識していたとしても，コリネ型細菌の目的遺伝子を強化するために，乙６発明のコリネ型細菌の染色体上のＧＤＨ遺伝子のプロモーター領域に本件訂正発明１－１の配列を導入する動機付けは認められない。
(e)15

乙３５文献の記載事項について

前記(5)オ(ｱ)のとおり，乙３５文献には，グルタミン酸生産性を向上させる方法
として，ＧＤＨ遺伝子，ＣＳ遺伝子，ＩＣＤＨ遺伝子等のグルタミン酸生合成系遺伝子を強化した例が記載されている。
他方で，乙３５文献において，これらの目的遺伝子を増強する方法として，具的手的に開示があるのは，当該遺伝子を有するプラスミド（ベクター）を導入する方20法であり，染色体上の遺伝子のプロモーター配列に変異を加えることについての記載はない（前記(5)オ(ｱ)，(ｲ)）。
また，乙３５文献においては，グルタミン酸生産能が向上したのは，少なくともＧＤＨ遺伝子とＩＣＤＨ遺伝子を同時に強化した菌株であり，ＧＤＨ遺伝子及びＣＳ遺伝子を単独で強化した菌株においては，親株と比較してグルタミン酸生産能が25

実質的に変わらなかったことも開示されているから，乙３５文献は，グルタミン酸
生産能を向上させる方法として，ＧＤＨ遺伝子及びＣＳ遺伝子を単独又は同時に強185

化する方法を示唆する内容とはいえない。
したがって，乙６文献に接した当業者が，乙３５文献の記載内容を認識していたとしても，コリネ型細菌の目的遺伝子を強化するために，乙６発明のコリネ型細菌の染色体上のＧＤＨ遺伝子のプロモーター領域に本件訂正発明１－１の配列を導入
5

する動機付けは認められない。
ｃ

前記ａ及びｂで検討したところからすれば，当業者において，本件優先日１

当時において，乙６文献に基づき，これに前記ｂの公知文献の記載内容及びその他
技術常識を組み合わせることによって，相違点１に係る構成を容易に想到できたものとは認められない。
10(ｳ)

相違点２（ＣＳ遺伝子の－１０領域をＴＡＴＡＡＴ配列とすること）の容易

想到性について前記(ｲ)ａと同様に，当業者において，乙６文献の示唆に基づき，乙６発明におけるコリネバクテリウム・グルタミカムについて，その染色体上のＣＳ遺伝子のプロ
モーターの－１０領域をＴＡＴＡＡＴ配列と変更する動機付けはない。そして，前15

記(ｲ)ｂの各文献の記載内容からすれば，これらの記載内容を乙６文献に接した当業者が認識していたとしても，乙６発明のコリネ型細菌に上記の変異を導入する動機付けもない。
また，乙８文献には，前記(5)ア(ｲ)のとおり，野生型のコリネバクテリウム・グ
ルタミカムのＣＳ遺伝子のプロモーターの－１０領域の配列について，乙６発明と20は異なり，ＴＡＴＡＧＣと推定されたことが開示されているが，当該記載を乙６文献に接した当業者が認識していたとしても，乙６発明のコリネ型細菌について，染色体上のＣＳ遺伝子のプロモーターの－１０領域をＴＡＴＡＡＴ配列と変更する動機付けがない点は上記と同様である。
したがって，当業者において，本件優先日１当時において，乙６文献に基づき，

25

これに前記(5)の公知文献の記載内容及びその他技術常識を組み合わせることによって，相違点２に係る構成を容易に想到できたものとは認められない。

186

(ｴ)

前記(ｲ)及び(ｳ)のとおり，相違点１及び相違点２に係る構成はいずれも乙６発明から容易に想到できたものとはいえない。したがって，その余の点について判断するまでもなく，本件訂正発明１－１は，乙６発明を主引例として当業者が容易に想到することができたものとはいえないから，本件訂正発明１－１について，
5

乙６発明を主引例とする進歩性欠如の無効理由（特許法１２３条１項２号，２９条
２項）は認められない。
イ

本件訂正発明１－２の進歩性について

本件訂正発明１－２の構成は，本件訂正発明１－１の構成に含まれるものであり，前記(3)イの乙６発明と本件訂正発明１－２とを対比すると，前記ア(ｱ)ｂの相違点
10１及び相違点３で相違している。
そして，前記ア(ｲ)と同様に，当業者において，本件優先日１当時において，乙６
文献に基づき，これに前記ア(ｲ)ｂの公知文献の記載内容及びその他技術常識を組み合わせることによって，相違点１に係る構成を容易に想到できたものとは認めら
れない。

15

したがって，その余の点について判断するまでもなく，本件訂正発明１－２は，乙６発明を主引例として当業者が容易に想到することができたものとはいえないか
ら，本件訂正発明１－２について，乙６発明を主引例とする進歩性欠如の無効理由（特許法１２３条１項２号，２９条２項）は認められない。
ウ20

本件訂正発明１－３の進歩性について

本件訂正発明１－３の構成は，本件訂正発明１－１の構成に含まれるものであり，前記(3)イの乙６発明と本件訂正発明１－２とを対比すると，少なくとも，前記ア(ｱ)ｂの相違点１，相違点２及び相違点３で相違している。
そして，前記ア(ｲ)及び(ｳ)と同様に，相違点１及び相違点２に係る構成について
は，いずれも，当業者において，本件優先日１当時において，乙６文献に基づき，

25

これに前記ア(ｲ)ｂ及びア(ｳ)の公知文献の記載内容及びその他技術常識を組み合わせることによって容易に想到できたものとは認められない。

187

したがって，その余の点について判断するまでもなく，本件訂正発明１－３は，乙６発明を主引例として当業者が容易に想到することができたものとはいえないか
ら，本件訂正発明１－３について，乙６発明を主引例とする進歩性欠如の無効理由（特許法１２３条１項２号，２９条２項）は認められない。
5(7)

本件訂正発明１についての乙９発明を主引例とする進歩性欠如の有無

ア

本件訂正発明１－１の進歩性について(ｱ)

乙９発明と本件訂正発明１－１との対比

前記(4)イ(ｲ)の乙９発明と本件訂正発明１－１とを対比すると以下のとおりであると認められる。
10

ａ

一致点

染色体上の遺伝子のプロモーターの塩基配列中に変異を導入したコリネ型細菌を，培地で培養し，培地中にＬ－グルタミン酸を生成蓄積させ，これを該培地から採取することを特徴とする発酵法によるＬ－グルタミン酸の製造方法である点。
ｂ
15

相違点

相違点１

本件訂正発明１－１のコリネ型細菌では，染色体上のＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列の－３５領域にＴＴＧＴＣＡ配列，－１０領域にＴＡＴＡＡＴ配列が導入されているのに対し（１－Ａ’－１），乙９発明のコリネ型細菌では，そのような特定はされておらず，ＧＤＨ遺伝子を強力なプロモーターの下流に連結したベクターが導入されていること。
20

相違点２

本件訂正発明１－１のコリネ型細菌では，染色体上のＣＳ遺伝子のプ

ロモーター配列の－１０領域にＴＡＴＡＡＴ配列が導入されているのに対し（１－Ａ’－２），乙９発明のコリネ型細菌ではそのような特定はされておらず，ＣＳ遺伝子を強力なプロモーターの下流に連結したベクターが導入されていること。
なお，本件訂正発明１－１の構成要件のうち，構成要件１－Ａ’－１と１－Ａ’
25－２については，いずれか１つが充足されれば足りる。したがって，相違点１と相違点２については，これらに係る構成のいずれかが容易想到であれば，本件訂正発188明１－１は乙９発明に基づいて容易に想到することができた構成を含むものと言い得る。
(ｲ)

相違点１（染色体上のＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列の－３５領域にＴＴＧＴＣＡ配列，－１０領域にＴＡＴＡＡＴ配列を導入すること）の容易想到性に
5

ついて
ａ

前記(6)ア(ｲ)ｂ(a)で検討したところからすれば，乙９文献には，Ｌ－グルタ

ミン酸生産性を向上させるにはグルタミン酸生合成系遺伝子を強化することが有利であり，グルタミン酸生合成系遺伝子を強化した例として，ＧＤＨ遺伝子及びＣＳ遺伝子を強化した例があることが記載されているものの，ＧＤＨ遺伝子及びＣＳ遺10

伝子等を増強する方法として具体的な開示があるのは，これらの遺伝子を強力なプ
ロモーターの下流に連結した上でベクターとして導入することすることにとどまり，染色体上の目的遺伝子のプロモーター配列に変異を加える例についての開示はされていないのであって，そのほかに，グルタミン酸生合成系遺伝子であり，コリネ型細菌の染色体上の特定の遺伝子であるＧＤＨ遺伝子及びＣＳ遺伝子のプロモーター

15

配列について，その－３５領域及び－１０領域の塩基配列をコリネ型細菌のコンセ
ンサス配列に近づけるように改変することの動機付けとなるような記載はない。
したがって，乙９発明に接した当業者が，前記(3)，(5)及び(6)ア(ｲ)で検討した，
乙６文献，乙１０文献，乙１１文献，乙１２文献又は乙３５文献の記載内容を認識していたとしても，乙９発明において，ＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列の－３５20

領域及び－１０領域の配列と目的遺伝子の発現量の強化の程度及びそれによるグルタミン酸生産能の向上との関係に着目し，グルタミン酸を高収率で生産する能力を有する変異株を得るために，コリネ型細菌の染色体上のＧＤＨ遺伝子のプロモータ
ー配列の－３５領域及び－１０領域に本件訂正発明１－１の配列を導入する動機付
けはないから，当業者は相違点１に係る構成を容易に想到できたものとは認められ

25

ない。
ｂ

被告は，ベクターの使用により生じる課題を解決するために，ＧＤＨ遺伝子

189

ないしＣＳ遺伝子の発現増強を，ベクター上ではなく，特定の配列を有するプロモーターを用いて染色体上で行うことは当業者が容易に想到し得た事項にすぎないと主張する。しかしながら，本件優先日１当時の技術常識として，ベクターの使用によって目的遺伝子を強化する方法に，本件明細書１の段落【０００２】及び【００5０３】に記載された，目的遺伝子の発現量が高くなり過ぎることにより，生育が著しく抑制されたり，逆に目的物質の生産能が低下したりする例が多くあることや，
プラスミド自体が脱落してしまうといった課題があることが知られており，相同性
組み換えを利用して染色体上に変異遺伝子を導入する方法が知られていた（ただし，前記(4)ア(ｲ)ｃ(c)のとおり，乙９文献では，これは，α－ＫＧＤＨ活性を欠損させ10る手段として記載されたものであり，遺伝子を強化する手段として記載されたものではなかった。）としても，前記の乙９文献や被告が指摘する公知文献の記載内容に照らせば，乙９発明に接した当業者が，コリネ型細菌のＧＤＨ遺伝子及びＣＳ遺伝子のプロモータ－の特定の位置の配列をコリネ型細菌のコンセンサス配列に近づけるように改変する動機付けはないというべきであるから，上記ａの結論を覆すも15のではない。
(ｳ)

相違点２（染色体上のＣＳ遺伝子のプロモーター配列の－１０領域にＴＡ

ＴＡＡＴ配列を導入すること）の容易想到性について
前記(ｲ)と同様の理由により，乙９発明に接した当業者が，前記(3)，(5)並びに(6)ア(ｲ)及び(ｳ)で検討した，乙６文献，乙８文献，乙１０文献，乙１１文献，乙１２20

文献又は乙３５文献の記載内容を認識していたとしても，乙９発明において，ＣＳ
遺伝子のプロモーターの－１０領域の配列と目的遺伝子の発現量の強化の程度及びそれによるグルタミン酸生産能の向上との関係に着目し，グルタミン酸を高収率で生産する能力を有する変異株を得るために，染色体上のＣＳ遺伝子のプロモーターの－１０領域に本件訂正発明１－１の配列を導入する動機付けはないから，当業者

25は相違点２に係る構成を容易に想到できたものとは認められない。
(ｴ)

前記(ｲ)及び(ｳ)のとおり，相違点１及び相違点２に係る構成はいずれも乙190

９発明から容易に想到できたものとはいえない。したがって，その余の点について判断するまでもなく，本件訂正発明１－１は，乙９発明を主引例として当業者が容易に想到することができたものとはいえないから，本件訂正発明１－１について，
乙９発明を主引例とする進歩性欠如の無効理由（特許法１２３条１項２号，２９条
5２項）は認められない。
イ

本件訂正発明１－２の進歩性について

本件訂正発明１－２の構成は，本件訂正発明１－１の構成に含まれるものであり，前記(4)イ(ｲ)の乙９発明と本件訂正発明１－２とを対比すると，前記ア(ｱ)ｂの相
違点１で相違している。
10

そして，前記ア(ｲ)と同様に，当業者において，本件優先日１当時において，乙９
文献に基づき，これに前記(3)，(5)及び(6)ア(ｲ)の公知文献の記載内容及びその他
技術常識を組み合わせることによって，相違点１に係る構成を容易に想到できたものとは認められない。
したがって，その余の点について判断するまでもなく，本件訂正発明１－２は，15

乙９発明を主引例として当業者が容易に想到することができたものとはいえないか
ら，本件訂正発明１－２について，乙９発明を主引例とする進歩性欠如の無効理由（特許法１２３条１項２号，２９条２項）は認められない。
ウ

本件訂正発明１－３の進歩性について

本件訂正発明１－３の構成は，本件訂正発明１－１の構成に含まれるものであり，
20

前記(4)イ(ｲ)の乙９発明と本件訂正発明１－３とを対比すると，少なくとも，前記
ア(ｱ)ｂの相違点１及び相違点２で相違している。
そして，前記ア(ｲ)及び(ｳ)と同様に，相違点１及び相違点２に係る構成について
は，いずれも，当業者において，本件優先日１当時において，乙９文献に基づき，これに前記(3)，(5)並びに(6)ア(ｲ)及び(ｳ)の公知文献の記載内容及びその他技術

25

常識を組み合わせることによって容易に想到できたものとは認められない。
したがって，その余の点について判断するまでもなく，本件訂正発明１－３は，191

乙９発明を主引例として当業者が容易に想到することができたものとはいえないか
ら，本件訂正発明１－３について，乙９発明を主引例とする進歩性欠如の無効理由（特許法１２３条１項２号，２９条２項）は認められない。

5(8)

本件訂正発明１についての実施可能要件・サポート要件違反の有無

ア

本件訂正発明１の課題

本件訂正発明１の課題は，前記(1)イ(ｲ)のとおり，目的遺伝子の発現量の適度な強化及び調節を行うことができ，アミノ酸を高収率で生産する能力を有する変異株
を，プラスミドを用いることなく，遺伝子組換え又は変異によって構築する方法を提供し，コリネ型グルタミン酸生産菌を用いる，グルタミン酸の収率を向上させ，10より安価にグルタミン酸を製造するグルタミン酸発酵法を提供することである（【０００６】）。
イ

Ｌ－アルギニンの製造方法について

本件訂正１により，本件訂正発明１－１，１－２及び１－３は，いずれもアルギ
ニンの製造方法の発明を含まないものになっているから，これらの発明について，
15

前記５(2)のアルギニンの製造方法についてのサポート要件違反は，本件訂正１によって解消されているものと認められる。
また，同様に，本件訂正発明１－１，１－２及び１－３について，アルギニンの製造方法についての実施可能要件違反も認められない。
ウ

20

ＩＣＤＨ遺伝子，ＰＤＨ遺伝子及びアルギニノコハク酸シンターゼ遺伝子のプロモーターへの変異導入について
訂正前の本件発明１－１は，ＩＣＤＨ遺伝子，ＰＤＨ遺伝子又はアルギニノコハ
ク酸シンターゼ遺伝子のプロモーター配列に特定の塩基配列を導入したコリネ型細菌を用いた発明を含むものであったが，本件訂正１により，本件訂正発明１－１には，これらの発明が含まれなくなった。

25

したがって，本件訂正発明１－１について，ＩＣＤＨ遺伝子，ＰＤＨ遺伝子及びアルギニノコハク酸シンターゼ遺伝子のプロモーターへの変異の導入についてのサ

192

ポート要件違反及び実施可能要件違反は，いずれも認められない。
エ

ＧＤＨ遺伝子のプロモーターへの変異導入について(ｱ)

本件明細書１の記載

前記(1)イのとおり，本件明細書１の発明の詳細な説明には，①前記アの課題を解5決するために，コリネ型細菌の染色体上のアミノ酸生合成系遺伝子のプロモーター
配列に，コンセンサス配列に近づくような変異を起こさせるか，又は遺伝子組換え
により変異を導入して，コリネ型細菌の変異体を調製し，該変異体を培養して，目的とするアミノ酸の産生量の多い変異体を採取するという構成を採用することができること（【０００７】），アミノ酸の生合成に関与する酵素の例として，グルタ

10

ミン酸発酵の場合には，ＧＤＨ，ＣＳ等が有効であって（【００１２】），上記の変異は，１つの遺伝子のプロモーター配列のみに起こさせても，２つ以上の遺伝子のプロモーター配列に起こさせてもよいこと（【００１５】），②このような変異の構成の例として，ＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列の－３５領域がＴＴＧＴＣＡ
であるか，－１０領域がＴＡＴＡＡＴとなっているものが好ましいこと（【００１15７】）が記載されている。
前記(1)イのとおり，本件明細書１には，③実施例２において，「ＦＧＲ２」として，親株（ＡＪ１３０２９）のＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列について，その－３５領域がＴＴＧＴＣＡ配列，－１０領域がＴＡＴＡＡＴ配列となる変異を有する菌株の作成方法と，そのＧＤＨ比活性は親株の約３．４倍であり，Ｌ－グルタミン

20

酸生産能も親株より増大した旨が記載され（【００２６】，【００２９】，【００３１】，【００３２】，【表５】，【表６】），④実施例７においても，染色体上のＧＤＨ遺伝子に「ＦＧＲ２」と同じ変異が導入された菌株（「ＧＡ０２」）について，その作成方法と，そのＧＤＨ比活性が親株の約３．５倍であり，Ｌ－グルタ
ミン酸生産能が親株より増大した旨が記載されている（【００８７】～【００８９】，25【表２３】）。
(ｲ)グルタミン酸の生成過程におけるＧＤＨ及びＣＳの働きに関する技術常識

193

乙第１７号証（岩波生物学辞典第４版

平成８年７月１２日発行）及び弁論の全趣旨によれば，本件特許権１の出願当時において，グルタミン酸の生合成におけるＧＤＨ及びＣＳの関与について，以下のような技術常識が存在したものと認められる。
5ａグルタミン酸の生合成には，クエン酸回路（ＴＣＡ回路）が，グルタミン酸の合成の原料を供給するという形で関与している。
ｂ

ＴＣＡ回路は，解糖及びその他の異化作用によって生じたアセチルＣｏＡを

完全に水と二酸化炭素に分解する酸化的過程であるが，８段階からなり，アセチル
ＣｏＡが，オキサロ酢酸と縮合してクエン酸になり，この後，イソクエン酸，α－10ケトグルタル酸，スクシニルＣｏＡ，コハク酸，フマル酸，Ｌ－リンゴ酸，オキサ
ロ酢酸に順次変換され，再びクエン酸が生成するサイクルが繰り返される。
ｃ

クエン酸生成酵素（ＣＳ）は，ＴＣＡ回路において，オキサロ酢酸とアセチ

ルＣｏＡとを縮合して，クエン酸を合成する反応を触媒する酵素である。
ｄ15Ｌ－グルタミン酸は，ＴＣＡ回路の中間生成物であるα－ケトグルタル酸から生成される。そして，ＧＤＨは，アンモニアをα－ケトグルタル酸に還元的に固定し，Ｌ－グルタミン酸を生成する反応を触媒する酵素である。
(ｳ)

前記（ｱ）の本件明細書１の記載及び前記(ｲ)の技術常識からすれば，本件明細書１に接した当業者は，本件訂正発明１のＧＤＨ遺伝子のプロモーターに変異を導入したＬ－グルタミン酸の製造方法，すなわち，グルタミン酸の製造に使用され20るコリネ型細菌の染色体上のＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列の－３５領域にＴＴ
ＧＴＣＡ配列を導入し，かつ，同－１０領域にＴＡＴＡＡＴ配列を導入する方法によって，プラスミドを用いることなく，目的遺伝子の発現量の適度な強化及び調節を行うことができ，グルタミン酸を高収率で生産する能力を有する変異株を構築する方法を提供するという前記アの課題を解決できると認識できるものと認められる。

25

また，上記の本件明細書１の記載によれば，当業者は，これに基づいて，過度の試行錯誤をすることがなく，コリネ型細菌の染色体上のＧＤＨ遺伝子のプロモータ

194

ー配列の－３５領域及び－１０領域に上記の各配列が導入された菌株を取得し，本件訂正発明１を実施することができると認められる。
したがって，本件訂正発明１につき，上記のＧＤＨ遺伝子のプロモーターへの変
異導入についてのサポート要件違反及び実施可能性要件違反は認められない。
5

オ

ＣＳ遺伝子のプロモーターへの変異導入について(ｱ)

本件明細書１の記載

前記(1)イ及び前記エのとおり，本件明細書１の発明の詳細な説明には，前記エの①の記載に加え，前記アの課題を解決するために採用し得る変異の構成の例として，
ＣＳ遺伝子のプロモーター配列の－３５領域がＴＴＧＡＣＡ配列，及び／又は－１
10０領域にＴＡＴＡＡＴ配列を有するものが挙げられること（【００１８】）が記載されている。そして，前記エの③のＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列に変異を導入することでグルタミン酸生産能が向上した「ＦＧＲ２」についての実施例２が記載された上で，実施例３においては，上記実施例２の「ＦＧＲ２」の染色体上の遺伝子につき，ＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列について実施例２のままとした上で，15ＣＳ遺伝子について，プロモーター配列の－１０領域をＴＡＴＡＡＴ配列とする変異を導入した「ＧＢ０２」及びプロモーター配列の－３５領域をＴＴＧＡＣＡ配列，－１０領域をＴＡＴＡＡＴ配列とする変異を導入した「ＧＢ０３」の作成方法と，それらのＣＳ比活性が，ＧＢ０２がＦＧＲ２の約１．９倍，ＧＢ０３が同約４．０倍であり，いずれも，Ｌ－グルタミン酸生産能がＦＧＲ２よりもさらに増大した旨20が記載されている。
(ｲ)

本件訂正発明１－１についてａ

前記(ｱ)の本件明細書１の記載及び前記エ(ｲ)の技術常識を総合すると，本件明細書１に接した当業者は，本件訂正発明１－１のＣＳ遺伝子のプロモーターに変異を導入したＬ－グルタミン酸の製造方法，すなわち，グルタミン酸の製造に使用25されるコリネ型細菌の染色体上のＣＳ遺伝子のプロモーター配列の－１０領域にＴ
ＡＴＡＡＴ配列を導入する方法によって，プラスミドを用いることなく，目的遺伝

195

子の発現量の適度な強化及び調節を行うことができ，グルタミン酸を高収率で生産する能力を有する変異株を構築する方法を提供するという前記アの課題を解決できると認識できるものと認められる。また，前記(ｱ)の本件明細書１の記載によれば，当業者は，これに基づいて，過度の試行錯誤をすることがなく，コリネ型細菌の染5

色体上のＣＳ遺伝子のプロモーター配列の－１０領域に上記の配列が導入された菌株を取得し，本件訂正発明１－１を実施することができると認められる。
ｂ

被告の主張について(a)

被告は，本件訂正発明１－１に含まれる構成のうち，ＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列に変異を導入せず，ＣＳ遺伝子のプロモーター配列にのみ変異を導入し10た菌株を使用する構成（構成要件１－Ａ’－２を充足するが，構成要件１－Ａ’－
１を充足しない構成）について，本件明細書１では，ＣＳ遺伝子のプロモーターのみに変異を導入した実施例はなく，出願以前の文献（乙８文献，乙３５文献）において，コリネ型細菌において，ＧＤＨ活性を増強せず，ＣＳ活性を増強させてもグルタミン酸の生産性は向上しないことが知られていたとして，当業者は，本件明細

15

書１の記載及び出願当時の技術常識からは，グルタミン酸の生産性が向上することを認識できない旨主張する。
(b)

確かに，前記(ｱ)のとおり，実施例３における染色体上のＣＳ遺伝子のプロ

モーターに変異が導入されたＧＢ０２及びＧＢ０３は，実施例２のＦＧＲ２にさらに変異を導入して作成された菌株であったため，ＣＳ遺伝子のプロモーターのほか
20に，ＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列についても実施例２の変異が導入されているものであり，本件明細書１には，ＣＳ遺伝子のプロモーター配列のみに変異が導入された菌株による実施例の記載はない。しかしながら，前記(ｱ)のとおり，実施例３
においては，ＦＧＲ２のＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列については実施例２と同じ配列としたままで，さらに，ＣＳ遺伝子について，プロモーター配列の－１０領

25

域をＴＡＴＡＡＴ配列とする変異を導入したＧＢ０２及びＧＢ０３をＦＧＲ２と比較した結果が示されているから，実施例３には，染色体上のＣＳ遺伝子のプロモー196

ター配列に上記配列を導入する方法がグルタミン酸生産能に与える影響についての開示があるものといえる。
(c)

また，被告は，出願以前から，コリネ型細菌において，ＧＤＨ活性を増強せず，ＣＳ活性を増強させてもグルタミン酸の生産性は向上しないことが知られてい5たと主張する。
被告が指摘する乙８文献の記載内容は，前記(5)アのとおりであるが，ＣＳ遺伝子を過剰に発現させることでコリネバクテリウム・グルタミカムの生育が遅くなることのほか，プラスミドを導入することによってＣＳの活性を増大させたコリネバク
テリウム・グルタミカムにおいて変異を加えなかった菌株と比較してグルタミン酸

10

生産能が増強されなかったことの開示がある。また，乙３５文献には，前記(5)オのとおり，ＧＤＨ遺伝子，ＣＳ遺伝子及びＩＣＤＨ遺伝子等を，当該遺伝子を有する
プラスミドを導入することによって強化したグルタミン酸生産性コリネ型細菌について，ＧＤＨ遺伝子及びＣＳ遺伝子を単独で強化した菌株においては親株と比較してグルタミン酸生産能が実質的に変わらなかったことが開示されている。

15

しかしながら，上記の乙８文献及び乙３５文献においてＣＳ遺伝子を単独で強化した場合にグルタミン酸の生産能が向上しなかった例は，いずれもプラスミドの導入によってＣＳ遺伝子を強化した例であり，染色体上の目的遺伝子のプロモーター
配列を変更するという本件訂正発明１－１における強化の方法とは異なるものである。そして，乙３５文献においては，プラスミドの導入による遺伝子強化について

20

は，ＧＤＨ遺伝子を単独で強化した場合についても親株と比較してグルタミン酸の生産能が実質的に変わらないとの結果が示されているところ，これは本件明細書１の実施例２における，染色体上の目的遺伝子のプロモーターの配列を変更することによってＧＤＨ遺伝子を単独で強化したＦＧＲ２の実験結果とは異なるものである。
本件明細書１の段落【０００２】及び【０００３】の記載及び弁論の全趣旨によれ

25

ば，プラスミドによる目的遺伝子の強化については，目的遺伝子の発現量が高くな
り過ぎることにより，生育が著しく抑制されたり，目的物質の生産能が低下したり197

する例があることなどが出願以前から知られていたと認められ，この点も考慮すれば，コリネ型細菌において，同じ目的遺伝子を強化する場合でも，強化の方法によってグルタミン酸生産能の向上に与える影響は異なり得るものと考えられるから，乙８文献及び乙３５文献の記載をもって，プラスミドを導入するという方法を採ら
5ない場合に，ＣＳ遺伝子を単独で強化することによってはグルタミン酸生産能は向上しないということはできず，その他，出願当時にこのような技術常識があったことを認めるに足りる証拠はない。
(d)

前記(a)ないし(c)によれば，被告の主張を考慮しても，前記ａの結論を覆すに足りない。
10(ｳ)

本件訂正発明１－３について

前記(ｲ)と同様に，前記(ｱ)の本件明細書１の記載及び前記エ(ｲ)の技術常識からは，本件明細書１に接した当業者は，本件訂正発明１－３のＣＳ遺伝子のプロモー
ターに変異を導入したＬ－グルタミン酸の製造方法，すなわち，グルタミン酸の製造に使用されるコリネ型細菌の染色体上のＣＳ遺伝子のプロモーター配列の－１０15領域にＴＡＴＡＡＴ配列を導入する方法，あるいは，プロモーター配列の－３５領域をＴＴＧＡＣＡ配列，－１０領域をＴＡＴＡＡＴ配列を導入する方法によって，プラスミドを用いることなく，目的遺伝子の発現量の適度な強化及び調節を行うことができ，グルタミン酸を高収率で生産する能力を有する変異株を構築する方法を提供するという前記アの課題を解決できると認識できるものと認められる。また，

20

前記(ｱ)の本件明細書１の記載によれば，当業者は，これに基づいて，過度の試行錯
誤をすることがなく，コリネ型細菌の染色体上のＣＳ遺伝子のプロモーター配列に
上記の各配列が導入された菌株を取得し，本件訂正発明１－３を実施することができると認められる。
カ25

コリネバクテリウム・グルタミカム野生株ＡＴＣＣ１３８６９のプロモータ

ー配列について被告は，実施例１における本件明細書１の段落【００２５】の配列番号１のプロ

198

モーター配列における－３５領域及び－１０領域の周辺領域の配列が，甲第２２号
証に記載された野生株ＡＴＣＣ１３８６９の配列と２か所で異なっていることを指摘し，本件明細書１の実験は，野生株ＡＴＣＣ１３８６９ではなく，別の菌株に基づいて行われたものであるとして，そのために，本件明細書１は，少なくともＧＤ
5Ｈ遺伝子に関し，野生株のプロモーター配列を変異させたことによる活性の変化を実証したものとは言えない旨主張する。
しかしながら，前記(1)イ(ｴ)ａのとおり，実施例１においてはＧＤＨ遺伝子のプ
ロモーター配列に変異を導入したプラスミドは作成されているが，コリネ型細菌の染色体上のＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列への変異の導入まではされておらず，

10前記エ(ｱ)のとおり，染色体上のＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列に本件訂正発明
１に規定する配列を導入した菌株においてグルタミン酸生産能が向上することについては，実施例２及び実施例７において確認されているものである。
実施例２で用いられたＡＪ１３０２９株とそれに変異を導入したＦＧＲ１，ＦＧ
Ｒ２のＧＤＨ遺伝子のプロモーター領域の塩基配列は，本件明細書１の【表６】に15記載されているが，これらの配列については被告は特段の指摘はしておらず，同様に，実施例７で変異が導入された菌株についても被告からの特段の指摘はない。
そうすると，実施例１におけるプロモーター配列の記載についての被告の上記指摘は，本件訂正発明１が，ＧＤＨ遺伝子のプロモーターへの変異導入についてサポート要件及び実施可能要件を充足するとの前記エの結論を左右するものとはいえな20い。
被告は，実施例１におけるＡＴＣＣ１３８６９のプロモーター配列の記載について，ＧＤＨ遺伝子への変異導入との関係で上記の主張をするほかには，サポート要件違反及び実施可能要件違反の具体的な主張をしておらず，したがって，本件訂正
発明１について，上記の配列の記載を理由とする，サポート要件違反及び実施可能25

要件違反は認められない。
キプロモーターの－３５領域及び－１０領域の周辺領域について199

被告は，本件訂正発明１においてはＧＤＨ遺伝子及びＣＳ遺伝子についての－３５領域及び－１０領域の周辺領域の配列の特定がされていないところ，本件明細書
１の実施例及びその他の記載，並びに技術常識を参照しても，－３５領域及び－１０領域の周辺領域を任意の配列や長さにした場合にグルタミン酸の生産性が上昇す5ることを当業者は認識できないからサポート要件は満たされておらず，同様の理由で本件明細書１における発明の詳細な説明の記載は実施可能要件を満たすものではないと主張する。
前記(1)イ(ｴ)ｂのとおり，実施例２の「ＦＧＲ２」は，親株であるＡＪ１３０２
９のＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列の－３５領域及び－１０領域に本件訂正発明

10１の配列への変異を導入するものである。そして，本件明細書１の【表６】には，「ＦＧＲ２」のＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列の－３５領域と－１０領域の間の領域の配列について，１塩基の欠失があるほかは，親株であるＡＪ１３０２９と同一であることが示されており，その他，本件明細書１において，ＦＧＲ２のＧＤＨのプロモーターの－３５領域及び－１０領域の周辺領域の配列について，親株の配15列に変異を加えた旨の記載はない。
また，前記エ及びオで検討した，実施例３の「ＧＢ０２」及び「ＧＢ０３」の菌株，実施例７の「ＧＡ０２」の菌株についても，本件明細書１には，それぞれ，その作成に当たってＣＳ遺伝子又はＧＤＨ遺伝子のプロモーターの－３５領域及び－１０領域の周辺領域の配列に変更を加えた旨の記載はない。

20以上によれば，被告が主張するように，－３５領域及び－１０領域の周辺領域の配列や長さがプロモーター活性に影響することが公知であったとしても，本件明細書１に接した当業者は，ＧＤＨ遺伝子ないしＣＳ遺伝子のプロモーター配列の－３５領域ないし－１０領域を特定の配列とする変異を染色体上に導入することを解決手段とする本件訂正発明１において，発明の特定事項とされていないプロモーター

25

配列の－３５領域と－１０領域の周辺領域については，非改変株と同様でよいことを理解できるというべきである。

200

したがって，－３５領域と－１０領域の周辺領域の配列が特定されていないことをもって，本件訂正発明１が，発明の詳細な説明の記載及び出願時の技術常識に照らして，当業者が当該発明の課題を解決できると認識できる範囲を超えるとはいえないから，この点のサポート要件違反の主張は理由がない。また，同様の理由で，
5

当業者は，本件明細書１の記載から，プロモーター配列の－３５領域及び－１０領
域の周辺領域の配列の特定がなくても，過度の試行錯誤を要することなく，本件訂正発明１を実施をすることができるといえるから，この点の実施可能要件違反の主張も理由がない。

10(9)

本件特許権１に関する無効の抗弁についての小括

ア

訂正の再抗弁に係る各要件の充足の有無について

前記第２の２(4)のとおり本件訂正１は訂正要件を満たすものであるところ，前記(2)のとおり，被告製法１は，文言上，本件訂正発明１－１（本件発明１－１に対応），本件訂正発明１－２（本件発明１－２に対応）及び本件訂正発明１－３（本件発明１－４に対応）の技術的範囲に属し，被告製法３は，文言上，本件訂正発明
15

１－１の技術的範囲に属するが，本件訂正発明１－３の技術的範囲に属しない。
そして，本件発明１の無効理由のうち，前記５のサポート要件違反については，
前記(8)イのとおり，本件訂正発明１についてはいずれも解消されている。また，被告が本件発明１及び本件訂正発明１について主張するその他の無効理由については，
少なくとも，訂正後の本件訂正発明１について無効理由が存在しているとは認めら

20

れない。
イ

被告製法１に関する請求について

前記アによれば，被告製法１に関する本件特許権１に基づく請求については，その余の点について判断するまでもなく，本件訂正発明１－１（本件発明１－１に対応），本件訂正発明１－２（本件発明１－２に対応），本件訂正発明１－３（本件25

発明１－４に対応）について，いずれも訂正の再抗弁の要件が充たされるから，当該訂正の再抗弁が認められる部分については，被告の特許法１０４条の３第１項に201

基づく無効の抗弁はいずれも理由がない。
他方で，前記５(3)のとおり，本件発明１－３に基づく請求については，原告は訂正の再抗弁の主張をしていないから，上記無効の抗弁により，被告に対して権利行使することができない。
5以上によれば，被告製法１について，原告が，被告に対して，無効の抗弁によって制限されずに本件特許権１に基づく権利行使をし得るのは，本件発明１－１（本件訂正発明１－１に対応），本件発明１－２（本件訂正発明１－２に対応）及び本件発明１－４（本件訂正発明１－３に対応）に基づく請求となる。
ウ

10

被告製法３に関する請求について

前記アによれば，被告製法３に関する本件特許権１に基づく請求については，その余の点について判断するまでもなく，本件訂正発明１－１について，訂正の再抗弁の要件が充たされるから，当該訂正の再抗弁が認められる部分については，被告の特許法１０４条の３第１項に基づく無効の抗弁は理由がない。
他方で，前記アのとおり，被告製法３は，本件訂正発明１－３（本件発明１－４15に対応）の技術的範囲に属しないから，本件発明１－４に基づく請求については訂
正の再抗弁が成立するとは認められない。よって，本件発明１－４（本件訂正発明
１－３に対応）に基づく請求については，上記無効の抗弁により，被告に対して権利行使することができない。
以上によれば，被告製法３について，原告が，被告に対して，無効の抗弁によっ20て制限されずに本件特許権１に基づく権利行使をし得るのは，本件発明１－１（本件訂正発明１－１に対応）に基づく請求となる。
７

争点６（本件特許２の訂正（本件訂正２）の再抗弁の成否）について事案に鑑み，本件特許２に係る発明の無効理由に関しては，争点６から判断する。

25

(1)

本件訂正２が訂正の要件を満たすかについて

ア

アミノ酸の個数に関する訂正（請求項１関係）について

本件訂正２では，請求項１の（ⅱ）において，置換等するアミノ酸の個数を訂正

202

前の「１若しくは数個」から「１～５個」に訂正しているが，この訂正事項は，特許請求の範囲の減縮（特許法１３４条の２第１項ただし書１号）を目的とするものといえる。
被告は，本件明細書２には置換等するアミノ酸の個数を「１～５個」とする数値
5範囲の記載はないとして訂正要件違反（特許法１２６条５項の違反）を主張するが，願書に添付した本件明細書２の段落【００３４】には「yggB遺伝子は，コリネ型細菌のL-グルタミン酸生産能を向上させるものである限り，配列番号６，６２，６８
または８４に示すアミノ酸配列において，１若しくは数個のアミノ酸の置換，欠失，
挿入，または付加を含むアミノ酸配列を有するものであってもよい。ここで，数個10とは，例えば，２～２０個，好ましくは２～１０個，より好ましくは２～５個を意味する。」との数値範囲の記載があるから，上記の訂正事項は，願書に添付した明細書，特許請求の範囲又は図面に記載した事項の範囲内での訂正であり，特許法１３４条の２第９項で準用する同法１２６条５項の要件に適合するものである。
さらに，この訂正事項は，置換等されるアミノ酸の個数を限定するもので，実質15

上，訂正前の請求項１の発明の対象の範囲を拡張したり，変更するものではないか
ら，特許法１３４条の２第９項で準用する同法１２６条６項の要件にも適合するか
ら，訂正の要件をいずれも満たすものである。
イ

菌株名に関する訂正（本件明細書２の段落【００３３】関係）について

本件訂正２では，願書に添付した本件明細書２の段落【００３３】の３文目の「配20

列番号５の塩基配列1437-3035番目の配列を有する遺伝子は，コリネバクテリウム・
グルタミカムATCC13032株のyggB遺伝子であり，」との部分に，「ＡＴＣＣ１３０３２株」とあるのを「ＡＴＣＣ１３８６９株」に訂正しているところ（甲５１，９４），
被告は，当該訂正事項は誤記の訂正ではなく許されないと主張する。
まず，訂正前の本件明細書２の段落【００３３】では，配列番号５の塩基配列と，

25

配列番号８３の塩基配列が，いずれもＡＴＣＣ１３０３２株に由来する配列とされており，これらの塩基配列のｙｇｇＢ遺伝子に相当するとされる部分の配列には一203致しない部分があるので（甲４の２），いずれかが誤記であることは明らかである。
そして，訂正前の段落【００３３】には，「配列番号８３の塩基配列501-2099番
目の配列を有する遺伝子は，コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032のGenbank
Accession No. NC_003450として登録されているゲノム配列中の塩基番号13360925

1337693にコードされており，NCgl 1221として登録されている（NP_600492. Reports
small-conductance...[gi:19552490]）。」との記載があるところ，証拠（甲９４）
及び弁論の全趣旨によれば，出願時に公開されていたＮＣｇｌ１２２１の配列情報と配列番号８３を比較すると，配列番号８３がＡＴＣＣ１３０３２株の配列である
ことが確認できるものと認められる。

10

さらに，訂正前の段落【０１０３】に配列番号５のｙｇｇＢ遺伝子が「ＡＴＣＣ
１３８６９株」に由来することを示す記載があることも考慮すれば，段落【００３３】に記載された配列番号５が「ＡＴＣＣ１３０３２株」である旨の記載は誤記であり，これを「ＡＴＣＣ１３８６９株」と訂正することは，誤記又は誤訳の訂正（特許法１３４条の２第１項ただし書２号）に該当すると認められる。

15

また，これらの訂正の内容に照らして，当該訂正事項については，同法１３４条の２第９項で準用される同様１２６条５項及び６項の要件にも適合し，訂正の要件をいずれも満たすものである。
ウ

前記ア及びイの各訂正事項の他に，被告は，本件訂正２について，訂正要件違反の具体的な指摘をしておらず，証拠（甲５１の１，９４）及び弁論の全趣旨に20よれば，本件訂正２は，いずれも，特許請求の範囲の減縮（特許法１３４条の２第１項ただし書１号），誤記又は誤訳の訂正（同２号）又は他の請求項の記載を引用する請求項の記載を当該他の請求項の記載を引用しないものとすること（同４号）を目的として，願書に添付した明細書，特許請求の範囲又は図面に記載した事項の範囲内においてするものであり，実質上特許請求の範囲を拡張し，又は変更するも25のではないから，訂正の要件（特許法１３４条の２第９項，１２６条５項，６項）
を満たすものである。

204

(2)

被告各製法は，本件訂正発明２の技術的範囲に属するかについてア

被告製法１ないし３について

前記３で検討したとおり，被告製法１ないし３で用いられる細菌は，いずれも，
配列番号６のアミノ酸配列を持つｙｇｇＢ遺伝子にＡ１００Ｔ変異が加えられ，変5

異後のアミノ酸配列が配列番号２２である変異型ｙｇｇＢ遺伝子が導入されたコリ
ネバクテリウム・グルタミカムであり，非改変株と比較して，グルタミン酸生産能が向上したものであった。
したがって，被告製法１ないし３と本件訂正発明２を対比すると，別紙７－２被告製法１ないし３と本件訂正発明２との対比のとおりとなると認められ，被告製法

10１ないし３で用いられる細菌は，いずれも本件訂正発明２－１，２－２，２－３及
び２－４の技術的範囲に属するものであり，それを使用する被告製法１ないし３は，本件訂正発明２－５の技術的範囲に属する。

15

イ

被告製法４について(ｱ)

前記４(5)アのとおり，被告製法４で使用される⑫及び⑬の菌株は，いずれも，コリネバクテリウム・カルナエ（ＤＳＭ２０１４７株）由来のｙｇｇＢ遺伝子にＡ９８Ｔ変異及びＶ２４１Ｉ変異が導入された変異型ｙｇｇＢ遺伝子が導入されたコリネバクテリウム・グルタミカムであり，非改変株と比較して，ビオチンが過剰量存在する条件下でのグルタミン酸生産能が向上しているものといえる。
したがって，被告製法４で使用される⑫及び⑬の菌株は，本件訂正発明２－２の20

構成要件２－Ｅ’－１，２－Ｅ’－２を充足するが２－Ｄ’を充足せず，本件訂正
発明２－３の構成要件をいずれも充足しない。また，被告製法４は，文言上，本件訂正発明２－５の構成要件２－Ｈ’について，請求項１，２及び請求項４ないし１
０を引用する部分を除いて充足し，構成要件２－Ｉ’及び２－Ｊを充足する。
(ｲ)25１９型変異使用構成は，本件訂正２後も本件訂正発明２－５に含まれる構成であり，本件訂正２後の請求項４を引用する請求項６の（ｅ）の変異型ｙｇｇＢ遺伝子が導入されたコリネ型細菌を使用する，請求項１１のグルタミン酸の製造法

205

である。
(ｳ)

被告製法４と，被告発明２－５に含まれる１９型変異使用構成との相違点

は，構成要件２－Ｄ’，２－Ｆ－１，２－Ｆ’－２，２－Ｆ－３，２―Ｈ’に係る部分（前記(ｱ)の文言非充足部分）であり，その具体的な内容は，前記４(5)イの相
5

違点１ないし３と同一である。
そして，⑫及び⑬の菌株を使用する被告製法４と本件訂正発明２－５に含まれる
１９型変異使用構成について，均等の第１要件ないし第５要件に係る事情は前記４(6)ないし(10)と同様であり，本件証拠上，各要件についての結論を覆すような事情は認められない。

10

したがって，⑫及び⑬の菌株を使用する被告製法４は特許請求の範囲に記載された１９型変異使用構成と均等なものとして，本件訂正発明２－５の技術的範囲に属するものと解するのが相当である。

15

(3)

本件訂正発明２についての乙４２発明による新規性欠如の有無

ア

乙４２文献の記載

乙４２文献には以下の記載がある（乙４２，弁論の全趣旨）(ｱ)

段落【０００３】「例えば，コリネバクテリウム・グルタミカムはグルタミン酸生産菌として同定されたグラム陽性バクテリアであり，その変異株により多くのアミノ酸が生産されている。例えば，旨味調味料として有名なＬ－グルタミン酸は全世界で年間１，０20

００，０００トン，家畜飼料の添加物等に重要なＬ－リジンは年間２５０，０００
トン，それ以外にもＬ－アルギニン，Ｌ－プロリン，Ｌ－グルタミン，Ｌ－トリプ
トファン等のアミノ酸がこの菌により各々年間数百トン以上のスケールで生産されている（日経バイオ年間９９，日経ＢＰ社製，１９９８）。」(ｲ)

25

段落【０００９】「本発明の目的は，産業上有用なコリネ型細菌由来のポリヌクレオチド及びポリペプチド，該ポリヌクレオチド及びポリペプチドの配列情報，該微生物の解析方法，

206

該解析に用いる装置及びシステム，並びに該微生物の育種法を提供することにある。」(ｳ)

段落【００１０】「この発明は，コリネ型細菌に属する微生物由来のポリヌクレオチド及びオリゴ
ヌクレオチド，…当該ポリヌクレオチドにコードされたポリペプチド，…を提供す5

るものである。」
(ｴ)

Ｔａｂｌｅ

１（１１０頁１～２行）

配列番号（ＤＮＡ）「１４０１」，配列番号(ａａ)「４９０１」，開始（ｎｔ）「１３３７５６７」，終始（ｎｔ）「１３３６０９５」，ＯＲＦ長（ｂｐ）「１４７３」，ｄｂマッチ「ｓｐ：ＹＩＬＶ＿ＣＯＲＧＬ」，相同遺伝子名「コリネバク
10

テリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２ｙｉｌＶ」，同一性（％）「１００．
０」，類似性（％）「１００，０」，一致長（ａａ）「６２」，機能「推定膜タンパク質」との配列
イ

証拠（甲４の２，乙４２，４３）及び弁論の全趣旨によれば，乙４２文献に記載された，前記ア(ｴ)の配列は，配列番号１４０１の遺伝子にコードされる配列番
15

号４９０１のポリペプチドの配列であり，このポリペプチドの配列は，コリネバク
テリウム・グルタミカム由来のｙｇｇＢ遺伝子の配列である本件明細書２の配列番
号８４の５３３個のアミノ酸からなるアミノ酸配列から，１番目から４２番目までのアミノ酸を除いた配列に当たるものと認められる。
ウ

20

被告は，乙４２文献の配列番号４９０１の配列には，本件特許２の請求項１の（ii）に記載されたアミノ酸配列（本件訂正２後の記載は「（ｉｉ）配列番号６，６２，６８，８４もしくは８５のアミノ酸配列のアミノ酸番号１－２３，８６－１
０８，及び１１０－１３２からなる群から選ばれる領域における１～５個のアミノ酸の置換，欠失，又は挿入」）が開示されていると主張する。
しかしながら，前記イのとおり，乙４２文献の配列番号４９０１の配列は，本件25

明細書２の配列番号８４のアミノ酸配列から１番目から４２番目までのアミノ酸を全て除いたものであり，上記の本件訂正２後の請求項１の(ii)のアミノ酸配列には

207

該当しないものである。
したがって，その余の点について判断するまでもなく，請求項１又は請求項１０を引用する本件訂正発明２－５が，乙４２発明と同一の発明を含むとはいえないか
ら，本件訂正発明２－５について乙４２発明による新規性欠如の無効理由（特許法5第１２３条１項２号，２９条１項３号）は存在しない。
(4)

本件訂正発明２についての乙２４発明を主引例とする進歩性欠如の有無

ア

乙２４発明について

乙２４文献の記載内容は前記４(2)エ(ｱ)のとおりであり，同(ｲ)で検討したとおり，乙２４文献は，コリネバクテリウム・グルタミカムにＥ．ｃｏｌｉのメカノセ
10

ンシティブチャンネルと類似する性質を持つ浸透圧調節チャネルが存在することが示唆するものではあっても，その浸透圧調節チャネルがグルタミン酸の排出に寄与することを示す内容ではなく，かえって，当該浸透圧調節チャネルは，グルタミン酸の排出とは関係がないとし，グルタミン酸の排出については，浸透圧調節チャネ
ルではなく，それ以前から指摘されていた担体による排出であると結論づけるもの

15

であった。
したがって，乙２４文献には「大腸菌のメカノセンシティブチャンネルとの類似性が示唆される浸透圧調節チャネルを有するコリネバクテリウム・グルタミカム」の発明（乙２４発明）が開示されていると認めるのが相当であり，乙２４発明に「グルタミン酸の排出に関わる，浸透圧調節チャネルを有するコリネバクテリウム・グ

20

ルタミカム」が開示されているとの被告の主張は採用できない。
イ

請求項１を引用する本件訂正発明２－５の進歩性について(ｱ)

乙２４発明と請求項１を引用する本件訂正発明２－５の対比

乙２４発明と請求項１を引用する本件訂正発明２－５を対比すると以下のようになると認められる。
25

ａ

一致点

乙２４発明と請求項１の細菌は，浸透圧調節チャネルを有するコリネ型細菌であ208

る点で一致するｂ

相違点

乙２４発明と請求項１を引用する本件訂正発明２－５は以下の点で相違する。
相違点１
5

本件訂正発明２－５は，コリネ型細菌を培地で培養し，グルタミン酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ，該培地又は菌体からグルタミン酸を回収することを特徴とするグルタミン酸の製造方法の発明であるのに対し，乙２４発明はコリネ型細菌の発明である点。
相違点２

本件訂正発明２－５では，コリネ型細菌に変異型ｙｇｇＢ遺伝子が導入されており，その変異型ｙｇｇＢ遺伝子には，請求項１の（ｉ），（ｉ’），（ｉ’’），
10

又は（ｉｉ）の変異が導入され，非改変株と比較してグルタミン酸の生産能力が向上したのに対し，乙２４発明のコリネ型細菌では，ｙｇｇＢ遺伝子が特定されておらずグルタミン酸の生産能力が特定されていない点(ｲ)

相違点１の容易想到性

相違点１について，本件優先日２当時，当業者が容易に想到し得たことは当事者15間に争いがない。
(ｳ)

相違点２の容易想到性

前記４(2)エで検討したところからすれば，本件優先日２当時に，コリネバクテリ
ウム・グルタミカムをはじめとするコリネ型細菌において，浸透圧調節チャネルがグルタミン酸の排出に寄与しているということが当業者において周知になっていた
20とは認められず，乙２４文献にも浸透圧調節チャネルがグルタミン酸の排出に寄与しているとの記載はなく，グルタミン酸の排出については，浸透圧調節チャネルではなく，担体による排出であると結論づけられていた。
被告は，乙２４発明に，乙２６文献，乙２９文献，乙３０発明，乙３１発明及び乙４１文献並びに技術常識を適用すれば，相違点２の構成を採用することは，当業25

者が容易に想到し得たと主張するが，上記の各文献ないし発明に，コリネ型細菌において，浸透圧調節チャネルからグルタミン酸が排出されることを示唆する記載は

209

なく（乙２６，２９～３１，４１），上記のとおり，本件優先日２において，そのような周知技術・技術常識が存したとは認められない。
そうすると，当業者が，乙２４発明に上記の各文献ないし発明並びに技術常識を適用して，コリネ型細菌において浸透圧調節チャネルをコードするｙｇｇＢ遺伝子5に着目し，それにグルタミン酸の排出を促すような変異を導入することを動機付られることはないというべきであるから，相違点２に係る構成は，本件優先日２当時，当業者が容易に想到し得たものではない。
(ｳ)

そうすると，請求項１を引用する本件訂正発明２－５は，乙２４発明を主引例として当業者が容易に想到することができたものとはいえない。
10

ウ

請求項４，請求項６又は請求項１０を引用する本件訂正発明２－５の進歩性について
本件訂正２後の請求項４は，請求項１の(ii)の変異に包含される変異を有する変異型ｙｇｇＢ遺伝子が導入されたコリネ型細菌の発明であり，本件訂正２後の請求
項６及び請求項１０は，請求項１をさらに限定したコリネ型細菌の発明である。し15

たがって，前記アで検討したところからすれば，請求項１を引用する本件訂正発明
２と同様に，請求項４，請求項６又は請求項１０を引用する本件訂正発明２－５についても，いずれも，乙２４発明を主引例として当業者が容易に想到することができたものとはいえない。
エ

20

したがって，請求項１，請求項４，請求項６又は請求項１０を引用する本件訂正発明２－５について，乙２４発明を主引例とする進歩性欠如の無効理由（特許法１２３条１項２号，２９条２項）は認められない。

25

(5)

本件訂正発明２についての実施可能要件・サポート要件違反の有無

ア

培養条件について(ｱ)

実施例８及び実施例１０について

前記４(3)イ(ｲ)のとおり，実施例８は，過剰量のビオチンを含む条件（非誘導条件）において，本件訂正発明２－５に含まれる１９型変異使用構成によって，非改210

変株と比較してグルタミン酸生産が増大することを示すものであり，被告が行った
乙第４４号証の実験も，実施例８の実験結果の信用性を覆すものではない。
また，前記４(3)イ(ｱ)のとおり，実施例１０は，１９型変異使用構成によって，誘導条件下でのグルタミン酸生産が増大することを示すものであるが，そのような5効果が誘導条件下でのみ見られることを示すものではない（【０１２５】～【０１
２８】）。
(ｲ)

サポート要件違反について

本件訂正発明２－５の課題は，「コリネ型細菌を用いたＬ－グルタミン酸の製造において，Ｌ－グルタミン酸生産能力を向上させる新規な技術を提供すること」(【０10００７】)である。
前記(ｱ)のとおり，実施例８及び１０には，本件訂正発明２－５に含まれる１９型
変異使用構成が，誘導条件下のみならず非誘導条件下でもグルタミン酸生産能力を向上させることが開示されているといえ，その他，上記の課題が誘導条件下のみで解決できることを認めるに足りる証拠はない。

15

したがって，培養条件として誘導条件を用いることが要件とされていないことをもって，本件訂正発明２－５が，発明の詳細な説明の記載及び出願時の技術常識に照らして，当業者が当該発明の課題を解決できると認識できる範囲を超えるとはいえないから，この点のサポート要件違反の主張は理由がない。
(ｳ)

20

実施可能要件違反について

前記４(3)イで検討したところからすれば，当業者は，本件明細書２における培養条件に関する記載及び出願当時の技術常識に基づいて，誘導条件下のみならず，非誘導条件下においても，過度の試行錯誤を要することなく，１９型変異使用構成に係る発明を実施することができるといえる。
また，本件訂正発明２－５に含まれるその他の構成についても，培養条件に関し25て，本件明細書２の記載及び出願当時の技術常識に基づいて非誘導条件下で当業者が実施できないことをうかがわせる事情は認められないから，この点の実施可能要211

件違反の主張は理由がない。
イ

請求項１の(i)，(i')の変異について(ｱ)

前記４(2)で検討したところからすれば，本件訂正発明２の技術的思想は，

コリネ型細菌のｙｇｇＢ遺伝子がコードする浸透圧調節チャネルであるＹｇｇＢタ
5

ンパク質がグルタミン酸の排出に関与していることに着目し，Ｃ末端側変異や膜貫通領域の変異といった変異型ｙｇｇＢ遺伝子を用いてＹｇｇＢタンパク質を改変することによって，グルタミン酸の排出を促進してグルタミン酸の生産能力を上げることにあると認められる。そして，請求項１の(i)及び(i')の変異は，変異型ｙｇｇ
Ｂ遺伝子のうち，Ｃ末端側領域をコードする部分に変異を導入するものである（【０10０７０】）。
(ｲ)

本件明細書２には，段落【００７０】にＣ末端側変異一般についての説明があるほか，その一例として，段落【００７１】には，アミノ酸配列のＣ末端側の４１９位より下流の領域（配列番号６のアミノ酸配列の４１９位から５３３位）のア
ミノ酸配列が短いインサーションシークエンスに由来する５個のアミノ酸からなる
15配列に置換された２Ａ－１型変異が記載され，当該変異には，配列番号６，６２，
６８，８４及び８５のＣ末端側の４１９位より下流の領域を欠失又は置換する変異が含まれるとも記載されている。さらに，本件明細書２の実施例５，６には，Ｃ末端側の４１９位より下流の領域が５個のアミノ酸からなる配列に置換された２Ａ－
１型変異において，グルタミン酸の生産能力が向上したことが確認されたことが記20載されている（【０１０７】～【０１１３】）。
(ｳ)

前記(ｱ)の基本となる技術思想を踏まえつつ，前記(ｲ)の本件明細書２の記載に接した当業者は，請求項１の（ｉ）及び（ｉ’）の変異においては，Ｃ末端側の４１９位より下流の領域に欠失や置換等の変異が導入されることで，ＹｇｇＢタ
ンパク質の立体構造が改変されて，グルタミン酸の生産能力の向上が図られるもの
25と認識すると認められる。
被告は，請求項１の(i)の変異が導入されたコリネ型細菌については本件明細書

212

２に記載されていないと主張するが，実施例５及び６で導入された２Ａ－１型変異は，上記のとおり，Ｃ末端側領域において４１９位から５３３位までの１１５個のアミノ酸が５個のアミノ酸に置換されたものであり，その変異の態様からすると，
Ｃ末端側領域の４１９位より下流の領域が欠失した場合でも，同様にＣ末端側領域
5のアミノ酸がコードする部分のＹｇｇＢタンパク質の立体構造が改変され，グルタ
ミン酸生産能力が向上すると認識することができるといえる。
また，被告は，請求項１の（ｉ’）の変異のうち，実施例５及び６の２Ａ－１型
変異以外において，これと同様の効果があると理解することはできない旨主張するが，上記のとおり，当業者は，本件明細書２の記載から，Ｃ末端側の４１９位より10下流の領域へのインサーションシークエンスの挿入等によるＹｇｇＢタンパク質の立体構造の変化によって，グルタミン酸生産能力の向上が図られるという，その基本的な原理を認識できるといえる。
したがって，請求項１の（ｉ）及び（ｉ’）の変異を導入することによってグルタミン酸生産能が向上したコリネ型細菌に関し，請求項１を引用する本件訂正発明

15２－５は，発明の詳細な説明の記載に照らして，当業者が当該発明の課題を解決できると認識できる範囲を超えるとはいえないから，この点のサポート要件違反の主張は理由がない。また，当業者は，上記の本件明細書２の記載に基づいて，過度の試行錯誤を要することなく， 上記のグルタミン酸生産能が向上したコリネ型細菌を取得し，本件訂正発明２－５を実施することができるといえるから，実施可能要20

件が欠けるともいえない。
ウ

請求項１の(i'')の変異について(ｱ)

本件明細書２の段落【００７２】には，ｙｇｇＢ遺伝子のＣ末端側の４１９位より下流の領域にある，置換可能なプロリンが１２個開示されるとともに，これらのプロリンがＹｇｇＢタンパク質の立体構造維持のために重要な役割を果たして25いると考えられることが記載されている。また，本件明細書２の実施例１２，１３
では，配列番号６８のアミノ酸配列の４２４番目のプロリンをロイシンに（６６型213変異），配列番号６のアミノ酸配列の４３７番目のプロリンをセリンに（２２型変異）それぞれ置換した変異株を作成したことが記載され，実施例１３の２２型変異株については，実際にグルタミン酸の生産能力が向上したことが記載されている（段落【０１３０】～【０１３８】）。
5

また，証拠（甲４４～４６）及び弁論の全趣旨によれば，一般にプロリンがタン
パク質の立体構造形成に関与する特異な性質を有するアミノ酸であることは出願以前から当業者に周知であったものと認められる。
(ｲ)

前記(ｱ)の本件明細書２の記載及びプロリンの性質についての技術常識に，

前記イ(ｱ)の本件訂正発明２の基本的な技術思想を踏まえれば，当業者は，Ｃ末端側10の４１９位より下流の領域にあるプロリンを他のアミノ酸に置換することで当該領域のアミノ酸がコードする部分のＹｇｇＢタンパク質の立体構造が改変され，グルタミン酸生産能力が向上すると認識することができるといえる。
したがって，請求項１の(i'')の変異を導入することによってグルタミン酸生産能が向上したコリネ型細菌に関し，請求項１を引用する本件訂正発明２－５は，発15

明の詳細な説明の記載に照らして，当業者が当該発明の課題を解決できると認識できる範囲を超えるとはいえず，また，当業者は，上記の本件明細書２の記載に基づいて，過度の試行錯誤を要することなく， 上記のグルタミン酸生産能が向上したコリネ型細菌を取得し，本件訂正発明２－５を実施することができるといえるから，
この点のサポート要件違反及び実施可能要件違反は認められない。

20

被告は，請求項１の(i'')の変異において，置換の対象となり得るプロリンは多数存在しているが，グルタミン酸の生産性が実際に確認されているのは実施例１３の２２型変異のみであり，上記のプロリンのうち異なる位置のプロリンを置換した場
合には結果が異なり得る等と指摘するが，上記のとおり，基本的な原理は明らかにされている上，置換可能なプロリンが具体的に本件明細書２に開示されていること

25

からすると，被告の主張を考慮しても，上記のとおり，サポート要件違反及び実施可能要件違反は認められない。

214

エ

請求項１の(ii)の変異（膜貫通領域の変異）について(ｱ)

請求項１(ii)の変異は，ｙｇｇＢ遺伝子に導入すべき変異のうち膜貫通領域において１～５個のアミノ酸を置換，欠失又は挿入するというものである。
本件明細書２の段落【００７３】では，膜貫通領域の変異に関する一般論として，
5

ＹｇｇＢタンパク質が５個の膜貫通領域を有していると推測されること，これらの膜貫通領域が，請求項１の(ii)において変異を導入すべき領域として記載された，
配列番号６，６２，６８，８４及び８５のアミノ酸配列の１－２３（第１膜貫通領域），８６－１０８（第４膜貫通領域），１１０－１３２（第５膜貫通領域）の各領域に相当すること，及び膜貫通領域に導入すべき変異の内容が記載されている。

10

本件明細書２においては，変異の具体例として，第１膜貫通領域の変異としてＡ
１型変異，第４膜貫通領域の変異として１９型変異，第５膜貫通領域の変異の例としてＬ３０型変異及び８型変異がそれぞれ記載されている（段落【００７４】～【００７６】）。そして，本件明細書２では，実施例７として，Ａ１型変異を導入した菌株の作成方法及び同菌株でグルタミン酸の生産能力が向上していること（段落【０15１１４】～【０１１８】），実施例８及び１０として，１９型変異を導入した菌株の作成方法及び同菌株でグルタミン酸の生産能力が向上していること（段落【０１１９】～【０１２１】，【０１２５】～【０１２８】），実施例９として，Ｌ３０型変異を導入した菌株の作成方法及び同菌株でグルタミン酸の生産能力が向上していること（段落【０１２２】～【０１２４】），並びに実施例１１として，８型変20異を導入した菌株の作成方法（段落【０１２９】）が，それぞれ記載されている。
(ｲ)

前記(ｱ)の本件明細書２の記載及び前記イ(ｱ)の本件訂正発明２の基本的な技術思想を踏まえれば，当業者は，グルタミン酸の排出に関係する浸透圧調節チャネルを形成するＹｇｇＢタンパク質の膜貫通領域に改変を加えることで，グルタミン酸の排出が促進され，グルタミン酸生産能力が向上するという，課題を解決する
25

ための基本的な原理を認識できるといえる。
本件明細書２には，グルタミン酸の生産能力の向上がみられた実施例が三つの膜

215

貫通領域について記載されていること，請求項１の(ii)では変異を導入する領域が限定され，置換，欠失又は挿入するアミノ酸の数も１～５個と限定されていることも考慮すれば，請求項１の(ii)の変異を導入することによってグルタミン酸生産能が向上したコリネ型細菌に関し，請求項１を引用する本件訂正発明２－５は，発明
5の詳細な説明の記載に照らして，当業者が当該発明の課題を解決できると認識できる範囲を超えるとはいえず，また，当業者は，上記の本件明細書２の記載に基づいて，過度の試行錯誤を要することなく， 上記のグルタミン酸生産能が向上したコリネ型細菌を取得し，本件訂正発明２－５を実施することができるといえるから，この点のサポート要件違反及び実施可能要件違反は認められない。

10

オ

配列番号８５について(ｱ)

請求項１の(i)，(i')，(i'')又は（ii）の変異には，変異前のｙｇｇＢ遺伝

子のアミノ酸配列について，配列番号６，６２，６８及び８４のほか，配列番号８５のアミノ酸配列を用いるものも含まれている。
本件明細書２の段落【００３４】には，変異を導入するｙｇｇＢ遺伝子のアミノ15酸配列は，配列番号６，６２，６８又は８４のアミノ酸配列において，１若しくは数個のアミノ酸の置換，欠失等を含むアミノ酸配列を有するものであってもよく，置換をする場合には保存的置換が好ましいとの記載があり，各種のアミノ酸の保存的置換の具体例が示されている。その上で，配列番号８５は，段落【００３５】において，配列番号６のアミノ酸配列について，特に置換又は欠失していてもよい１20

４箇所のアミノ酸をＸａａで示した配列として開示されている。また，本件明細書
２では，段落【００７８】及び【００７９】においても保存的置換についての記載がある。
さらには，証拠（甲４８）によれば，タンパク質の性質として，活性中心や機能上重要な部位以外の部位で，大きさや極性といった性質のよく似たアミノ酸同士に25よる置換（保存的置換）があってもタンパク質の機能が保存されることは，出願当時の当業者にとって周知であったと認められる。

216

(ｲ)

前記(ｱ)の本件明細書２の記載や出願当時の技術常識からすれば，当業者は，

配列番号８５のＸａａで示された箇所は，上記のようなタンパク質にとって機能上重要ではなく，置換・欠失が許容されている部位であり，どのような置換をすることが許容されるかについても，上記の保存的置換の意義を踏まえ，一定の範囲のも5のを認識することができる。そうすると，配列番号８５のアミノ酸配列に変異を加えた実施例の記載が本件明細書２になくても，前記イないしエで検討した点を踏まえれば，当業者は，請求項１に列挙された他の配列番号のアミノ酸配列と同様に，
配列番号８５のアミノ酸配列に請求項１記載の各変異を導入することによってもグ
ルタミン酸生産能を向上させられると認識できるといえる。

10

前記(ｱ)のとおり，配列番号８５については，配列番号６から置換等してもよいア
ミノ酸（Ｘａａ）が具体的に特定され，望ましい置換の内容についても本件明細書
２に記載があることも考慮すれば，配列番号８５のアミノ酸配列に対して，請求項
１記載の各変異を導入することによってグルタミン酸生産能が向上したコリネ型細菌に関しても，請求項１を引用する本件訂正発明２－５は，発明の詳細な説明の記15載及び本件優先日２当時の技術常識に照らして，当業者が当該発明の課題を解決できると認識できる範囲を超えるとはいえず，また，当業者は，上記の本件明細書２の記載及び出願当時の技術常識に基づいて，過度の試行錯誤を要することなく， 上記のグルタミン酸生産能が向上したコリネ型細菌を取得し，本件訂正発明２－５を実施することができるといえるから，この点のサポート要件違反及び実施可能要件

20

違反は認められない。
カ

請求項４の変異について

本件訂正２後の請求項４で導入される変異は，請求項１の(ii)の変異に包含されるものである。
前記エで検討した点に加え，さらに，本件訂正２によって請求項４については，
25

１００位又は１１１位のアラニンから置換されるアミノ酸が限定されており，請求項４に含まれる変異である，１００位のアラニンをスレオニンに置換する変異につ217

いては実施例８及び１０の１９型変異が，１１１位のアラニンをスレオニンに置換する変異については実施例１１の８型変異が，１１１位のアラニンをバリンに置換する変異については実施例９のＬ３０型変異が，それぞれ開示されていることからすれば，請求項４を引用する本件訂正発明２－５についても，サポート要件違反及5び実施可能要件違反は認められない。前記オで検討したところからすれば，請求項４の変異のうち，配列番号８５のアミノ酸配列に変異を導入する部分に関しても同
様である。

10

キ

請求項６の変異について(ｱ)

請求項６の(a)，（c），（e），（g），（i），（k）及び（m）に記載された配列番号８，２０，２２，２４，６４，７０及び７４のアミノ酸配列は，それぞれ順に，実施例６の２Ａ－１型変異，実施例７のＡ１型変異，実施例８及び１０の１９型変異，実施例９のＬ３０型変異，実施例１１の８型変異，実施例１２の６６型変異並びに実施例１３の２２型変異について，各変異導入後のｙｇｇＢ遺伝子がコードするアミノ酸配列に対応するものである。

15

被告は，これらの変異後の各アミノ酸配列に，更に１ないし５個のアミノ酸の欠失等が加わった請求項６の(b)，（d），（f），（h），（j），（l）及び（n）の変異型ｙｇｇＢ遺伝子について，任意の位置の１～５個のアミノ酸に置換等が付加されることによって，どのような変異タンパク質が，過剰量のビオチンを含む培地中でグルタミン酸の生産性向上をもたらすのか理解することはできないと主張する。

20

しかしながら，前記オ(ｱ)のとおり，タンパク質の性質として，活性中心や機能上重要な部位以外の部位で，大きさや極性といった性質のよく似たアミノ酸同士による置換（保存的置換）があってもタンパク質の機能が保存されることは，出願当時の当業者にとって周知であったと認められ，本件明細書２の段落【００７８】及び【００７９】には，配列番号８，２０，２２，２４，６４，７０又は７４のアミノ

25

酸配列に加えることが許容される変異は保存的置換が好ましい旨の記載がされた上で，これらのアミノ酸配列に加えることが許容される置換の具体例が記載されてい

218

る。
(ｲ)

前記(ｱ)の本件明細書２の記載及び技術常識に，前記イからエまでで検討した点並びに請求項６の(b)，（d），（f），（h），（j），（l）及び（n）の変異型
ｙｇｇＢ遺伝子について，配列番号８，２０，２２，２４，６４，７０又は７４の5

アミノ酸配列からの置換等が許されるアミノ酸の数が１～５個に限定されていることを併せ考慮すれば，上記の各変異型ｙｇｇＢ遺伝子を導入することによって，過剰量のビオチンを含む培地で培養したときのグルタミン酸生産能が向上したコリネ型細菌に関して，請求項６を引用する本件訂正発明２－５は，発明の詳細な説明の記載及び出願当時の技術常識に照らして，当業者が当該発明の課題を解決できると10認識できる範囲を超えるとはいえず，また，当業者は，上記の本件明細書２の記載
及び本件優先日２当時の技術常識に基づいて，過度の試行錯誤を要することなく，
上記の過剰量のビオチンを含む培地で培養したときのグルタミン酸生産能が向上したコリネ型細菌を取得し，本件訂正発明２－５を実施することができるといえるか
ら，この点のサポート要件違反及び実施可能要件違反は認められない。

15ク

請求項１０の変異について

請求項１０は，請求項１，４及び６の変異型ｙｇｇＢ遺伝子を導入するコリネ型
細菌に，コリネバクテリウム属又はブレビバクテリウム属に属する細菌との限定を加えたものである。
本件明細書２の段落【００１２】及び【００１３】には，発明の対象となるコリ
20

ネ型細菌には，コリネバクテリウム属の細菌のほか，従来ブレビバクテリウム族に分類されていたが現在コリネバクテリウム属に分類された細菌，あるいはコリネバ
クテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム族の細菌が含まれることが記載され，これらの細菌の具体例が記載されている。また，実施例としても，いずれも現
在はコリネバクテリウム属に分類される，コリネバクテリウム・グルタミカム及び

25

ブレビバクテリウム・フラバムに変異型ｙｇｇＢ遺伝子を導入したものの記載がされている（実施例８の【０１１９】，実施例１１の【０１２９】等）。

219

これらの本件明細書２の記載及び前記イからキで検討したところからすれば，請求項１０を引用する本件訂正発明２－５についても，サポート要件違反及び実施可能要件違反は認められない。
ケ5グルタミン酸の生成及び回収の方法（請求項１１）について
被告は，訂正前の本件発明２－５につき，グルタミン酸を培地中に生成させること，及び菌体からグルタミン酸を回収することについては，いずれも本件明細書２には記載されていないから，その点で実施可能要件違反及びサポート要件違反があると主張するが，本件訂正発明２－５についてはこの点の無効理由を主張していない。
10

本件訂正２後の請求項１１では，菌体からのグルタミン酸の回収についての記載が削除されており，この点の実施可能要件違反及びサポート要件違反は，本件訂正
発明２－５については問題とならない。また，コリネ型細菌を培地で培養して「Ｌ－グルタミン酸を該培地中に生成備蓄させ」る（本件訂正２後の請求項１１）との点については，本件明細書２の段落【００８５】から【００９０】の記載や証拠（甲15８，９，乙２）及び弁論の全趣旨によれば，本件優先日２の時点で当業者に周知の事項であったと認められる。
したがって，本件訂正発明２－５には，グルタミン酸の生成及び回収の方法について，実施可能要件違反及びサポート要件違反は認められない。
(6)20

本件訂正発明２についての明確性要件違反の有無

被告は，本件特許２の請求項６の「過剰量のビオチン」との記載について，「過剰量」とはいかなる量をいうのか不明であると主張する。
しかしながら，本件明細書２の段落【００３２】には，「「過剰量のビオチンを含む条件」とは，例えば，培地中にビオチンを30μg/L以上，好ましくは40μg/L，
さらに好ましくは50μg/L含む条件をいう。」と記載されており，本件明細書２の記25載から「過剰量のビオチン」という記載の意味内容を理解することができるから，
この点の記載に明確性要件（特許法３６条６項２号）違反はない。

220

したがって，請求項６を引用する本件訂正発明２－５についても，明確性要件違反の無効理由はない。
(7)

本件特許権２に関する無効の抗弁についての小括以上のとおり，本件訂正２は訂正要件を満たすものであり，被告各製法は，いず
5

れも本件訂正発明２－５の技術的範囲に含まれるものである。
そして，本件発明２－５及び本件訂正発明２－５について被告が主張する各無効理由につき，少なくとも，訂正後の本件訂正発明２－５について無効理由が存在しているとは認められないから，訂正の再抗弁の要件はいずれも満たされ，これにより，その余の点について判断するまでもなく，本件特許権２に基づく請求に対する，

10

被告の特許法１０４条の３第１項に基づく無効の抗弁はいずれも理由がない。
８

争点８（損害の発生の有無及び額）について(1)

被告各製法の使用時期と本件各特許権との対応関係の整理

ア

前記１(4)のとおり，対象期間中の各時期における被告各製法の使用の有無については，別紙９本件ＭＳＧの製法についての主張対比表に記載された②及び⑩15の菌株の使用期間については被告製法１が使用されており，それ以外の期間については，同別紙の「原告の予備的主張」欄記載のとおりである。
したがって，被告各製法の使用時期は以下のとおり整理される。
(ｱ)

被告製法１

平成２３年１月から平成２６年５月まで
20

平成２７年８月から平成２８年６月まで
(ｲ)

被告製法２

平成２６年４月から６月まで，同年１１月及び１２月
平成２７年６月
平成２８年５月から８月まで
25

(ｳ)

被告製法３

平成２６年６月から平成２７年１１月まで

221

(ｴ)

被告製法４

平成２８年７月から平成２９年１２月まで
イ

そして，前記２，５(3)及び６(9)によれば，被告各製法のうち本件特許権１に基づく請求が可能であるのは，被告製法１及び被告製法３であり，前記３，４(11)5

及び７(7)によれば，本件特許権２に基づく請求は，被告各製法について可能である。
そうすると，本件各特許権とこれに基づいて権利行使し得る被告各製法，及びそれによって製造された被告各製品の関係について，製造時期の順に整理すると，以下のようになり，平成２３年から平成２９年までの期間（以下「被告各製法使用期間」という。）に製造された本件ＭＳＧは被告各製法のいずれかによって製造され10たもの（被告各製品）であって，本件特許権１又は本件特許権２に基づく権利行使が可能である。
(ｱ)

平成２３年１月から平成２５年８月２２日まで

被告製法１が使用されている期間であるが，本件特許権２の設定登録前の期間であるため，被告製品１について本件特許権１に基づく権利行使が可能である。
(ｲ)

15

平成２５年８月２３日（本件特許権２の設定登録日）から平成２８年６月まで当該期間を通じて，被告製法１又は被告製法３が使用されており，これらによって製造された被告製品１又は被告製品３について本件特許権１及び２に基づく権利行使が可能である。
20

この期間中の一部には，併せて被告製法２も使用されており，これによって製造された被告製品２については，本件特許権２に基づく権利行使が可能である。
(ｳ)

平成２８年７月から平成２９年１２月まで

当該期間を通じて，被告製法２又は被告製法４が使用されており，これらによって製造された被告製品２又は被告製品４について本件特許権２に基づく権利行使が25可能である。
(2)

被告が不法行為責任を負う実施の範囲

222

ア

事実認定

前記第２の２の前提事実等，後掲各証拠及び弁論の全趣旨によれば，被告各製法
使用期間中の本件ＭＳＧの製造及び日本の顧客に対する販売について，以下の事実が認められる。
5(ｱ)

ＣＪグループの関係

被告及びＣＪインドネシアは，ＣＪグループに属しており，ＣＪインドネシアはＣＪグループの中心企業であるＣＪＣＪの１００％子会社であり，被告は，ＣＪＣ
Ｊの株式の４４％を保有する持株会社であるＣＪカンパニーの１００％子会社である（前記第２の２(1)イ）。
10

ＣＪグループにおいては所属企業が，世界各国で，ＣＪブランド等の製品の製造や販売を分担しているところ，ＣＪグループのバイオ部門のウェブサイトにおいては，同部門の製造拠点は，アジア，北米及び南米にあり，インドネシアにあるＣＪ
インドネシアの工場が同部門の製造拠点の一つとして紹介されているが，日本には同部門の製造拠点はないものとされている。また，同ウェブサイトでは，同部門の15

販売拠点はアジア，ヨーロッパ，北米，南米，中東北アフリカにあり，そのうち，
韓国のＣＪＣＪが本部であり，ジャカルタに存するＣＪインドネシア及び東京に存する被告がそれぞれアジアの販売拠点の一つとして紹介されている（甲９７）。
ＣＪＣＪは研究開発部門を有しており，被告各製法使用期間中，ＣＪインドネシ
アのインドネシアの工場において本件ＭＳＧの製造に使用された菌株は，ＣＪＣＪ

20によって開発され，ＣＪインドネシアに送付されたものであった（乙１，２，５）。
(ｲ)

被告販売分

被告は，被告各製法使用期間中において，ＣＪインドネシアがインドネシア国内
において製造した本件ＭＳＧをＣＪインドネシアから購入して，インドネシアから日本国内に輸入し，日本国内において譲渡の申出及び譲渡をしている（前記第２の25２(7)アの被告販売分。乙１０１，１０４，１１１，１１３）。
(ｳ)

ＣＪインドネシア販売分

223

ＣＪインドネシアは，被告各製法使用期間中において，被告販売分とは別に，自らがインドネシアで製造した本件ＭＳＧを，日本の顧客に対して，自らが売主となって販売しており（前記第２の２(7)アのＣＪインドネシア販売分。乙１０１），この取引の具体的態様は次のとおりであった。
5ａ

ＣＪインドネシア販売分に係る売買契約の締結に当たって，日本の顧客からの注文書においては，本件ＭＳＧの売主はＣＪインドネシアである旨が記載されていた（乙１０２の１，１０３の１）
ただし，ＣＪインドネシアに対する注文書が，日本の顧客から被告宛に送られてくることがあり，その場合，被告は，その注文書をＣＪインドネシアに送付してい10た（乙１０３の１）。
ｂ

ＣＪインドネシア販売分においては，本件ＭＳＧはインドネシアで船積みされ，ＣＪインドネシアを荷送人として日本に輸送されており，その輸送に係るインボイスや船荷証券等においても，荷送人はＣＪインドネシアである旨が記載されていた
15

本件ＭＳＧの日本への輸送に当たり，輸送に係るインボイスにはＣＪインドネシ
アと日本の顧客との取引条件としてはＣＩＦ又はＣＦＲの貿易条件によることが記載されていた。一般的に，ＣＩＦの取引条件は陸揚港までの運賃及び保険料を売主が負担するもの，ＣＦＲの取引条件は陸揚港までの運賃を売主が負担するものであるが，いずれも売主が輸出・通関手続をして輸出港での船積みをすることによって20

買主に目的物の引渡しがされ，その際に危険負担も売主から買主に移転するものとされている（甲１０４，１０５，乙４５，４６，１０２，１０３，１０６）。
ｃ

被告とＣＪインドネシアとの間には，被告各製法使用期間中，ＣＪインドネ

シアが被告に対して，ＣＪインドネシア販売分の売上高の●（省略）●％又は●（省略）●％に相当する額をコミッションとして支払うことを内容とするコミッション25

契約（以下「本件コミッション契約」といい，これに基づくコミッションを「本件コミッション」という。）が存在していた。被告各製法使用期間である平成２３年

224

から平成２９年までに支払われた本件コミッションの合計は●（省略）●円である（乙１０１）。
ｄ

ＣＪインドネシア販売分の取引に関する作業として，被告は，日本国内において，前記ａの注文書の転送のほか，少なくとも，本件ＭＳＧのサンプルの配送や5不良品の回収を行うことがあった（乙１０１）。
(ｴ)

被告における被告ら販売分についての販管費の会計処理

ａ

被告は，被告各製法使用期間中において，会計処理上，本件ＭＳＧの販売に関係する販管費として，「運送費」，「倉庫費」，「人件費」，「サービス費用」，「その他」の費目において，被告販売分のほか，ＣＪインドネシア販売分に係る費10用を計上していた。被告各製法使用期間中に計上された上記の販管費の合計額を比較すると，被告販売分に係る販管費とＣＪインドネシア販売分に係る販管費は概ね４対３の割合であった（乙１０１）。
ｂ「運送費」及び「倉庫費」

被告の会計処理において，本件ＭＳＧの販売に関する「運送費」及び「倉庫費」
15を，被告販売分とＣＪインドネシア販売分にどのように配分するかの基準はＣＪＣ
Ｊが指示していた。
具体的には，「運送費」については，平成２５年の半ばまで，本件ＭＳＧに関する全輸送費が，被告販売分の売上高と本件コミッションの総額に応じて按分され，その後は，原則として輸送費は被告販売分の経費とし，サンプルの配送や不良品の20回収等のための間接費に相当する費用のみ，被告販売分の売上高と本件コミッショ
ンの総額とに応じて按分されていた。また，倉庫費については，平成２８年までは，
本件ＭＳＧに関する全倉庫費が被告販売分の売上高と本件コミッションの総額に応じて按分され，平成２９年は全倉庫費が被告販売分の取扱高とＣＪインドネシア販
売分の取扱高に応じて按分されていた（乙９９，１０１）。

25ｃ「人件費」，「サービス費用」，「その他」

被告は，会計処理上，本件ＭＳＧの販売に関する販管費のうち「人件費」，「サ225

ービス費用」及び「その他」の費目を，以下のような手順で計上していた。
まず，被告全体で生じた「人件費」等の経費が各事業部署の取扱高等の規模に応じて各事業部署に配分され，そのようにして本件ＭＳＧを扱う「バイオ」事業部署に配分された経費のうち，同事業部署の売上に占める本件ＭＳＧの売上の割合に応5じて本件ＭＳＧに関する費用が算出され，さらに，この本件ＭＳＧに関する費用を，それぞれの取扱高を基準として，被告販売分とＣＪインドネシア販売分に配分していた。このような費用の配分の基準は，被告とＣＪＣＪとの合意によって定められたものであった（乙９９，１０１）。
(ｵ)

10被告各製法使用期間中の被告各製品の販売額及び販売数量について

被告各製法使用期間中（平成２３年から平成２９年まで）の被告販売分及びＣＪ
インドネシア販売分に係る被告各製品の販売額は，別紙１０販売金額・数量一覧表
記載１のとおりであり，その販売数量は同別紙記載２のとおりである（争いのない
事実）。
(ｶ)

15

平成３０年以降の日本の顧客に対する本件ＭＳＧの販売状況

平成３０年以降，ＣＪインドネシアが製造した本件ＭＳＧを日本向けに販売する
際には，ＣＪＣＪがＣＪインドネシアに代わって売主となり，ＣＪＣＪが日本の買主に直接販売するか，被告に販売した上で，被告が日本の買主に販売するようになった（乙９９，１０１，１１２）。
イ20

被告販売分についての日本国内での実施について

前記(1)のとおり，被告各製法使用期間中に製造された本件ＭＳＧは被告各製法のいずれかによって製造されたもの（被告各製品）であるところ，前記ア(ｲ)のとおり，当該期間中の被告販売分については，被告によって，本件ＭＳＧの輸入，譲渡
及び譲渡の申出がなされているから，被告による本件発明１又は本件発明２の実施（特許法２条３項３号）が認められる。

25

ウ

ＣＪインドネシア販売分についての日本国内での実施について(ｱ)

時機に後れた攻撃防御方法の主張について

226

被告は，ＣＪインドネシア販売分について被告らによる譲渡の申出の主張をすることについて，時機に後れた攻撃防御方法として却下されるべきであると主張する。
しかしながら，本件ＭＳＧの譲渡の申出については，被告による実施行為の一つとして訴状の段階から主張されていたものであり，また，被告販売分とは別にＣＪ
5インドネシア販売分があるとの被告の主張は，平成３１年２月２０日付け被告第１７準備書面及び同年４月１８日付け被告第１８準備書面までは明示的になされていなかったことも考慮すれば，原告が，令和元年１０月１１日付け原告第１８準備書
面において，ＣＪインドネシア販売分に係る実施行為として譲渡の申出の主張をす
ることは時機に後れた主張を追加するものとはいえない。

10

したがって，当該主張について時機に後れた攻撃防御方法として却下することを求める被告の上記申立ては却下する。
(ｲ)

輸入・譲渡についてａ

前記ア(ｳ)で認定した事実からすれば，ＣＪインドネシア販売分については，

その売買契約はＣＪインドネシアと日本の顧客との間で行われているところ，本件
15

ＭＳＧの日本への輸送に当たってインボイスに記載されていたＣＩＦないしＣＦＲの貿易条件（前記ア(ｳ)ｂ）からは，本件ＭＳＧの買主への引渡しは，インドネシアでの船積みの時点で行われていたものと認めるのが相当であり，これに反して，本件ＭＳＧの買主への引渡しが陸揚港での陸揚後に行われていたことや，日本への輸入手続を売主であるＣＪインドネシアが行っていたことを認めるに足りる証拠はな

20

い。
そうすると，ＣＪインドネシア販売分に係る本件ＭＳＧについては，その譲渡は日本国外において行われているものと認めるのが相当であり，被告らによる日本への輸入の事実も認められない。ＣＪインドネシア販売分に係る本件ＭＳＧの日本国
内への輸入については，本件ＭＳＧの引渡しを受けた買主側によって行われていた

25

ものというべきである。
ｂ

原告の主張について

227

原告は，ＣＪインドネシア販売分は，実際には被告らによる日本国内への輸入・日本国内での譲渡と評価されるべきものと主張するが，前記ア(ｱ)のＣＪグループ
における被告とＣＪインドネシアとの関係や，前記ア(ｳ)ａのとおり，ＣＪインドネ
シア宛の注文書が被告宛に送付されることがあったこと，前記ア(ｳ)ｃ及びｄのＣ
5Ｊインドネシア販売分への被告の関与や，前記ア(ｴ)の被告における会計上の処理を考慮しても，ＣＪインドネシア販売分に係る売買契約及び本件ＭＳＧの引渡しが日本国内で行われていたとは認められないとの前記ａの判断を覆すに足りず，原告の上記主張は採用できない。
また，原告は，①ＣＪインドネシアと日本の取引先が契約を締結し，日本の取引10先がコンテナヤードから貨物で本件ＭＳＧを直接引き取っているとしても，特許権侵害物品に関しては，保税地域への搬入も輸入行為に該当すると解すべきであるから，ＣＪインドネシアの行為は輸入に該当する，②ＣＪインドネシアから運搬を委託され，その手足とみなされる船会社から日本の取引先への譲渡行為も日本国内で行われているから，被告らによる日本国内での譲渡も存在していると主張する。し15

かしながら，前記ａのとおり，本件ＭＳＧの買主への引渡しについては，インドネ
シアの船積みの時点で行われていると認められ，陸揚港での陸揚後に引渡しが行われていたとは認められないことからすれば，上記①について，保税地域への搬入が特許法２条３項３号の輸入に当たりうるかどうかにかかわらず，被告又はＣＪイン
ドネシアによる輸入行為があったということはできず，同様の理由で，②について20も採用できない。
(ｳ)

譲渡の申出についてａ

前記(ｲ)のとおり，ＣＪインドネシア販売分について，本件ＭＳＧの譲渡自体が日本国内で行われているとは認められないものの，前記ア(ｱ)のＣＪグループにおける被告とＣＪインドネシアとの関係，前記ア(ｳ)ａのとおり，ＣＪインドネシア
25

販売分の注文書が被告宛に提出され，被告を経由してＣＪインドネシアに送付されることがあったこと，同ｃのとおり，被告とＣＪインドネシアとの間でＣＪインド

228

ネシア販売分の売上高の一部を被告に支払う旨の本件コミッション契約が締結されていたこと，同ｄのとおり，ＣＪインドネシア販売分について，被告が日本国内での本件ＭＳＧのサンプル配送や不良品の回収を行っていたこと，前記ア(ｴ)のとおり，被告の会計処理において，ＣＪＣＪの指示ないしＣＪＣＪとの合意に基づいて，
5

ＣＪインドネシア販売分に係る経費が計上されていたことからすれば，被告各製法
使用期間中のＣＪインドネシア販売分について，被告は，日本国内において，ＣＪ
インドネシアと共同して，ＣＪインドネシア販売分に係る営業活動を行っていたものと認めるのが相当であり，被告による譲渡の申出があったと認められる。
そして，前記イのとおり，被告各製法使用期間中に製造された本件ＭＳＧは被告

10

各製法のいずれかによって製造されたもの（被告各製品）であるから，当該期間中の被告による本件ＭＳＧの譲渡の申出は，被告による本件発明１又は本件発明２の実施（特許法２条３項３号）に当たる。

15ｂ

被告の主張について(a)

被告は，「譲渡の申出」は，将来の譲渡人である売主によって行われる行為であり，広告宣伝等の申出行為を行う者が譲渡をする者と異なっている場合は譲渡の申出は成立しないとして，ＣＪインドネシア販売分について，売主ではない被告
が何らかの関与をしたとしても，当該行為は譲渡の申出には当たらないと主張する。
しかしながら，譲渡の申出が譲渡とは別個に実施行為とされている趣旨からすれば，譲渡の申出をする行為が譲渡人である売主によるものではないとしても，当該20売主と一定の関係を有する者による行為であるなどの事情があれば，当該申出行為を譲渡の申出と解し得ると考えるべきである。そして，前記ａで検討したところからすれば，ＣＪインドネシアと被告とは，同じ企業グループに属している上，ＣＪ
インドネシア販売分について，本件コミッション契約を締結して利益の分配を行うなどの密接な関係にあったといえるから，ＣＪインドネシア販売分の売買契約の主

25

体がＣＪインドネシアであって被告ではないことは，被告の上記ａの関与が本件ＭＳＧの譲渡の申出に当たるとの認定を妨げるものではない。

229

(b)

被告は，特許法上の「譲渡」は日本国内での譲渡を意味し，その準備行為である「譲渡の申出」も日本国内での譲渡のための申出を意味するから，ＣＪインド
ネシア販売分についての被告の行為は譲渡の申出には当たらないとも主張する。
確かに，前記(ｲ)ａのとおり，ＣＪインドネシア販売分に係る本件ＭＳＧの買主へ
5の譲渡は日本国外において行われているものと認められるものの，ＣＪインドネシ
ア販売分はいずれも日本の買主に対する販売であり，本件ＭＳＧの引渡し自体は船積みの際になされるとしても，その後に本件ＭＳＧが買主側によって日本国内に輸入されることが予定されているものであった。譲渡の申出が譲渡とは別個に実施行為とされている趣旨からすれば，ＣＪインドネシア販売分に係る本件ＭＳＧのよう

10に，日本国内での営業活動の結果，日本の買主に販売され，日本国内に輸入される商品について，その買主への譲渡が日本国外で行われるか，日本国内で行われているか否かの違いのみで，当該営業活動が，日本における譲渡の申出に当たるかどうかの結論を異にするのは相当ではなく，上記ａのとおり，日本国内において被告とＣＪインドネシアが共同してＣＪインドネシア販売分に係る営業活動を行うことは，

15

被告による「譲渡の申出」に当たると解するのが相当であり，この点の被告の主張は採用できない。
エ被告とＣＪインドネシアの共同不法行為について(ｱ)

前記イ及びウのとおり，被告各製法使用期間中，被告によって，被告販売分については本件ＭＳＧの輸入，譲渡及び譲渡の申出，ＣＪインドネシア販売分につ20

いては本件ＭＳＧの譲渡の申出という本件特許権１又は本件特許権２の実施がなさ
れている。
(ｲ)

前記ア(ｱ)のとおり，被告及びＣＪインドネシアは，ＣＪインドネシアの１００％親会社であるＣＪＣＪを中心とするＣＪグループに属しており，当該グルー
プ内では，所属企業が，世界各国でＣＪブランド等の製品の製造や販売を分担して25いたものである。
そして，被告各製法使用期間中の本件ＭＳＧの販売については，被告販売分とＣ

230

Ｊインドネシア販売分という２つの契約形態が併存しており，日本の顧客に販売する際の商流に被告が入るかどうかという違いはあるものの，いずれも，ＣＪインド
ネシアによって製造された本件ＭＳＧという同一の製品を日本の市場に向けて販売するものであり，前記ウ(ｳ)で検討したとおり，ＣＪインドネシア販売分についても，
5

売買契約の当事者ではない被告がその利益の分配を受けて営業活動を行い，被告販売分と同様に不良品の回収作業等も行っていたことが認められる，また，前記ア(ｴ)のとおり，被告の会計処理においては，本件ＭＳＧの販売に関する輸送費，倉庫費
用等について，全体の費用をＣＪインドネシアの親会社であるＣＪＣＪの指示によって，被告販売分とＣＪインドネシア販売分とに配分していたことが認められる。

10

これらの事実に照らせば，被告とＣＪインドネシアは，単に，被告取引分についての本件ＭＳＧの仕入先・販売先という関係に留まらず，ＣＪインドネシアが製造した本件ＭＳＧを日本市場に向けて販売するに当たって，被告販売分及びＣＪイン
ドネシア販売分という販売形態を問わず，それぞれ一体的な関係にあり，被告販売
分及びＣＪインドネシア販売分についての前記(ｱ)の各実施行為を共同して行って15いると認めるのが相当であり，これらについて，被告らには共同不法行為が成立すると解するのが相当である。
(3)

被告ら販売分全体に対する特許法１０２条２項による損害額（別紙１１－

１損害額の主張１）について
原告は，前記第３の１５【原告の主張】(3)のとおり，原告の損害額として，別紙
20

１１－１損害額の主張１から別紙１１－４損害額の主張４までの各【原告の主張】欄に記載された４つの算定方法による主張をしているところ，まず，別紙１１－１
損害額の主張１に係る，被告ら販売分全体に対する特許法１０２条２項による損害額の主張について検討する。
ア25

特許法１０２条２項の利益の意義

特許法１０２条２項所定の侵害行為により侵害者が受けた利益の額は，侵害者の侵害品の売上高から，侵害者において侵害品を販売することによりその販売に直接231

関連して追加的に必要となった経費を控除した限界利益の額である。
イ

被告らの共同不法行為による特許法１０２条２項の利益の算定方法(ｱ)

前記(2)のとおり，被告販売分については本件ＭＳＧの輸入，譲渡及び譲渡の申出，ＣＪインドネシア販売分については本件ＭＳＧの譲渡の申出について，本5

件特許権１又は本件特許権２の実施がなされており，これらについて，被告とＣＪ
インドネシアとの共同不法行為が成立すると認められるから，特許法１０２条２項に基づく損害額の推定の場面でも，上記の被告ら販売分に係る各侵害行為について，
前記アの算定方法による被告らの限界利益の合計額が原告が受けた損害の額と推定されるというべきである。

10

そして，前記(2)のとおり，被告とＣＪインドネシアが，ＣＪインドネシアが製造した本件ＭＳＧを日本市場に向けて販売するに当たって，被告販売分及びＣＪイン
ドネシア販売分という販売形態を問わず，それぞれ一体的な関係にあったことも考慮すれば，被告ら販売分に係る各侵害行為による被告らの限界利益の合計額は，被告ら販売分の全体の売上高から，その販売に直接関連して被告らにおいて追加的に15必要となった全体の経費を控除することによって算定するのが相当である。
(ｲ)

この点について，被告は，ＣＪインドネシア販売分に係る実施行為である「譲渡の申出」による損害額はＣＪインドネシア販売分の売上高に基づいて算出されるべきではなく，「譲渡の申出」に固有の範囲に留まるべきであると主張する。
しかしながら，前記(2)エのとおり，ＣＪインドネシア販売分について，被告とＣ
20

Ｊインドネシアには共同不法行為が成立するため，損害額の算定に当たっては，被告のみならず被告ＣＪインドネシアの利益も考慮されること，前記(2)ウ(ｳ)ｂ(b)で検討したとおり，ＣＪインドネシア販売分はいずれも日本の買主に対する販売であり，買主への引渡し後に日本国内に輸入されることが予定されているものであったことからすれば，「譲渡」自体が日本国外で行われているとしても，ＣＪインド

25

ネシア販売分の売上高に基づいて算出される被告らの利益は，特許法１０２条２項の適用において，日本国内での「譲渡の申出」によって被告らが受けた利益と認め232

るのが相当であり，被告の上記主張は採用できない。
ウ

被告ら販売分の売上高

前記(2)ア(ｵ)のとおり，被告各製法使用期間中（平成２３年から平成２９年）の被告ら販売分に係る被告各製品の販売額は，別紙１０販売金額・数量一覧表記載１5のとおりである。
エ

売上高から控除すべき被告らの経費

(ｱ)

販売数量

前記(2)ア(ｵ)のとおり，被告各製法使用期間中の被告ら販売分に係る被告各製品の販売数量は，別紙１０販売金額・数量一覧表記載２のとおりである。
10(ｲ)

本件ＭＳＧの製造費用について

ａ

経費該当性

被告ら販売分に係る本件ＭＳＧは，いずれもＣＪインドネシアによって製造されたものであったから，その製造費用については，被告ら販売分の販売に直接関連して追加的に必要となった経費として，被告らの限界利益の算定に当たって控除すべ
15

き経費に該当するというべきである。
ｂ

本件ＭＳＧの１トン当たりの製造費用

証拠（乙１０７）及び弁論の全趣旨によれば，被告各製法使用期間中における本件ＭＳＧの製造費用として，各年の本件ＭＳＧ１トン当たりの発酵原料費，精製原料費，水道光熱費，梱包費の合計額は，別紙１１－１損害額の主張１（被告ら販売
20

分全体に対する特許法１０２条２項による損害額）【原告の主張】２(2)イ(ｱ)記載の額（米ドル建てであり，平成２７年から平成２９年までについては平成２６年と同額）であったと認めるのが相当である。
なお，被告が開示した上記証拠（乙１０７）には，本件ＭＳＧの製造に関する費用として「固定費（労働，減価償却，その他）」との名目の費用も記載されている

25が，その性質上，本件ＭＳＧの販売に直接関連する経費とはいえないから，限界利益の算定に当たって考慮すべきものではない。

233

ｃ

為替レート

証拠（甲１０６）によれば，被告各製法使用期間中の，米ドルの円への為替レー
トは，別紙１１－１損害額の主張１（被告ら販売分全体に対する特許法１０２条２項による損害額）【原告の主張】２(2)イ(ｲ)記載のとおりであったと認められる。
5ｄ

控除すべき経費の額

そうすると，前記(ｱ)の被告ら販売分の販売数量に，前記ｂの１トン当たりの製造費用及び前記ｃの為替レートを乗じて計算すると，限界利益の算定に当たって控除すべき，被告ら販売分に係る被告各製法使用期間中の本件ＭＳＧの製造費用は，別紙１５被告ら販売分の特許法１０２条２項による損害額計算表記載３の①－３のと10おりとなる。
(ｳ)

本件ＭＳＧの日本までの輸送費について

ａ

経費該当性

被告ら販売分に係る本件ＭＳＧは，いずれもＣＪインドネシアのインドネシアの工場で製造されて日本に送られたものであったこと，前記(2)ア(ｳ)ｂのインボイス
15の記載からは，ＣＪインドネシア販売分では陸揚港までの運賃を売主であるＣＪイ
ンドネシアが負担するとのＣＩＦ又はＣＦＲの貿易条件が取られていたと考えられることからすれば，被告ら販売分に係る本件ＭＳＧの日本までの輸送費については，
被告ら販売分の販売に直接関連して追加的に必要となった経費として，被告らの限界利益の算定に当たって控除すべき経費に該当するというべきである。

20ｂ

本件ＭＳＧの１トン当たりの日本までの輸送費証拠（乙１１３）及び弁論の全趣旨によれば，被告各製法使用期間中において，被告ら販売分に係る本件ＭＳＧ１トン当たりの日本までの輸送費用を平均すると，別紙１１－１損害額の主張１（被告ら販売分全体に対する特許法１０２条２項による損害額）【原告の主張】２(2)ウ(ｱ)記載の額（米ドル建て）であったと認めるの25が相当である。
ｃ

控除すべき経費の額234

前記(ｱ)の被告ら販売分の販売数量に，前記ｂの１トン当たりの輸送費及び前記(ｲ)ｃの為替レートを乗じて計算すると，限界利益の算定に当たって控除すべき，被告ら販売分に係る被告各製法使用期間中の本件ＭＳＧの日本までの輸送費は，別紙
１５被告ら販売分の特許法１０２条２項による損害額計算表記載３の②のとおりと
5

なる。
(ｴ)

国内運送費その他の販管費について

前記(2)ア(ｴ)のとおり，被告は，被告ら販売分に係る販管費として「運送費」，「倉庫費」，「人件費」，「サービス費用」及び「その他」の各費目での費用を計上していたところ，これらの費目についての経費該当性及び控除すべき経費の額を
10

検討する。
ａ

「運送費」及び「倉庫費」について証拠（乙９９，１０１）及び弁論の全趣旨によれば，被告各製法使用期間中において，被告ら販売分に係る本件ＭＳＧの「運送費」及び「倉庫費」として計上された費用の額は，被告販売分及びＣＪインドネシア販売分につき，それぞれ，別紙１
15

５被告ら販売分の特許法１０２条２項による損害額計算表記載３の③の額であったと認められる（被告販売分については，別紙１１－１損害額の主張１（被告ら販売分全体に対する特許法１０２条２項による損害額）【原告の主張】２(2)エ記載の額と同じ。）。なお，上記認定した平成２９年分の各倉庫費については，乙第１０１号証の添付資料３に記載された各費用について，被告第１９準備書面における主張20に沿って，被告販売分とＣＪインドネシア販売分の合計額は変えずに，それらへの配分を修正した後のものである。
そして，証拠（乙９９，１０１）及び弁論の全趣旨によれば，これらの「運送費」
及び「倉庫費」として計上された費用は，被告において，実際に被告ら販売分に係る本件ＭＳＧの国内での輸送及び保管に要した費用の合計額を，会計処理上，前記

25(2)ア(ｴ)ｂのとおり，被告販売分とＣＪインドネシア販売分へと配分したものと認められるから，原告が経費として認める被告販売分に配分された費用の額に，ＣＪ

235

インドネシア販売分に配分された費用の額を合算した金額が，被告ら販売分の販売に直接関連して追加的に必要となった経費として，被告らの限界利益の算定に当たって控除すべき経費に該当するというべきである。
ｂ5

その他の販管費について被告が，本件ＭＳＧの販売に関する販管費として計上していた「人件費」，「サービス費用」及び「その他」の費目については，前記(2)ア(ｴ)ｃのとおり，被告全体で生じた「人件費」等の経費を，会計処理上，被告の「バイオ」事業部署に配分し，その一部をさらに被告販売分とＣＪインドネシア販売分に配分したというものであり，その性質上，被告ら販売分の販売に直接関連して追加的に必要となった経10費とはいえないから，被告らの限界利益の算定に当たって控除すべき経費に該当しない。
被告は「人件費」には，事業部の人件費と間接部門の人件費が含まれるところ，
少なくとも事業部の人件費は営業の業務量に依存するから，本件ＭＳＧの販売に直接関連して追加的に必要となった経費として控除されるべきと主張するが，被告ら

15販売分に計上された「人件費」の額の定め方からすれば，その一部である事業部の人件費についても，その性質上，被告ら販売分の販売に直接関連して追加的に必要となった経費とはいえず，被告の主張は採用できない。
(ｵ)

仕入費用について

被告は，被告販売分の利益を考慮するに当たっては，その仕入れに要した費用を20考慮すべきと主張する。
前記イ(ｲ)のとおり，被告ら販売分について被告らは一体的な関係にあり，被告ら販売分については，被告らの共同不法行為が成立するものであるから，被告販売分についての利益を考慮する際にも，被告とＣＪインドネシアの利益の合計額を算定すべきこととなる。したがって，被告販売分において，被告がＣＪインドネシアか25

ら本件ＭＳＧを購入した際の仕入費用については，被告販売分についての被告らの利益の合計額を算定するに当たっては，被告販売分の売上高から控除すべき経費に236

該当しないというべきである。
(ｶ)

小括

以上によれば，被告らの限界利益の合計額の算定に当たり，被告ら販売分の売上高から控除すべき経費は，前記(ｲ)の本件ＭＳＧの製造費用，前記(ｳ)の本件ＭＳＧ
5の日本までの輸送費，前記(ｴ)ａの国内での運送費および倉庫費である（控除すべき各経費の合計額は，別紙１５被告ら販売分の特許法１０２条２項による損害額計算
表記載４のとおり）。
オ

被告らの限界利益の合計額

以上によれば，被告各製法使用期間中における，被告ら販売分に係る各侵害行為
10による被告らの限界利益の合計額は，前記ウの被告ら販売分の売上高から，前記エ(ｶ)の控除すべき経費を控除したものとなり，別紙１５被告ら販売分の特許法１０２条２項による損害額計算表記載４のとおり，期間を通じた合計額は３８億５７３
１万３０６５円となる。

15

カ

推定覆滅事由について(ｱ)

競合品の販売（シェアに応じた減額）についてａ

証拠（乙１０１，１１７）及び弁論の全趣旨によれば，被告各製法使用期間

中のグルタミン酸ナトリウムの各国から日本への輸入量は，別紙１６被告各製法使
用期間中のグルタミン酸ナトリウムの輸入状況の①欄から⑩欄までに記載のとおりであり，そのうち，①タイと②ブラジルからの輸入については，その全量が原告が20

輸入して日本国内で販売したものであり，③インドネシアからの輸入については，
被告ら販売分（③Ａ）のほか，原告が輸入したものがあったことが認められる。なお，平成２９年分の算定に当たっては，平成２３年から平成２８年までの資料（乙１１７）と同様の資料として，乙第１０１号証の添付資料６ではなく，添付資料７に記載の数量を採用した。

25ｂ

本件ＭＳＧはグルタミン酸ナトリウムであり，前記ａのとおり，被告各製法

使用期間中に輸入されていた前記ａのグルタミン酸ナトリウムは，いずれも被告ら

237

販売分に係る本件ＭＳＧと同等なものとして日本の市場において競合関係にある製品に当たると認められる。
このように，被告ら販売分と原告による輸入販売分以外に，上記の競合品が存在していたことは，前記オの被告らの限界利益の合計額の一部について，特許法１０5２条２項の推定を覆滅すべき事情として考慮すべきである。
ｃ

上記事情による覆滅割合を以下検討する。

前記ａの③インドネシアからの輸入分のうち，被告ら販売分（③Ａ）以外の数量（③Ｂ）について，被告はその半分は原告以外によるものと推定されると主張するが，原告以外の業者によるインドネシアからの輸入量を裏付ける証拠はない。
10

原告が，当該数量（③Ｂ）のほとんどは原告によるものであったと主張していることを考慮して，これについて原告による輸入であったと仮定した上で，原告による輸入販売分（⑪）を算定し，全体の輸入量（⑩）から被告ら販売分を控除した数
量（③Ａ）に占める，原告による輸入販売分（⑪）の割合を算定すると，被告各製法使用期間中の各年における当該割合は，同別紙記載のとおり，それぞれ●（省略）15●％から●（省略）●％までとなり，各年の平均は４４．７％と算定される。
原告は，被告が提出する財務省の貿易統計の資料（乙１１７の資料３～１０）について，当該資料に含まれていない輸入量として，グルタミン酸として輸入されて，国内でグルタミン酸ナトリウムに加工されるものがあり，それはほとんどが原告による輸入であったとも主張するが，それを裏付ける具体的な資料を提出しておらず，

20

証拠（乙１０１の添付資料７）によれば，このようなグルタミン酸の輸入量は，グルタミン酸ナトリウムの輸入量に比較して少ないものであったことがうかがわれる。
そうすると，原告の主張を考慮しても，被告各製法使用期間中に，被告ら販売分が販売されていなかったとしても，被告ら販売分に係る本件ＭＳＧに向けられた需要の少なくとも５０％程度は，原告以外によって輸入販売されたグルタミン酸ナト

25

リウムに向かった可能性があると認めるのが相当であり，これによる５０％の推定
覆滅を認めるのが相当である。

238

(ｲ)

本件各特許権の損害に対する寄与の程度について

被告は，本件各特許に係る発明は，複雑かつ多様な工程を備えたグルタミン酸の製造方法のうちごく一部に寄与しているにすぎず，それぞれの本件ＭＳＧの製造への寄与の程度は低いとして，特許法１０２条２項による損害の算定に当たっ
5ては，本件各特許の寄与率を考慮すべきであり，あるいは，寄与率に応じた推定の覆滅が認められるべきであると主張する。
しかしながら，被告各製法使用期間において実施が認められる，本件発明１－１（本件訂正発明１－１），本件発明１－２（本件訂正発明１－２）及び本件発明１－４（本件訂正発明１－３）並びに本件発明２－５（本件訂正発明２－５）は，い10

ずれも，特定の特徴を有する菌株を使用することによるグルタミン酸（アミノ酸）の製造方法の発明であるから，当該菌株を使用して製造された本件ＭＳＧの販売等
によって上記の各特許発明の実施が認められる場合には，当該各特許発明は，いずれも販売された本件ＭＳＧの全体について実施されているものというべきである。
そして，発酵法によるグルタミン酸の製造に当たり，発酵段階と精製段階があり，

15

さらに発酵段階において菌株内で複数の反応があって，上記の各特許発明がそのうちの特定の段階ないし反応に係るものであるとしても，それをもって本件ＭＳＧの製造への上記各特許発明の寄与の程度が低いとは認められず，その他，本件証拠上，上記各特許発明の寄与度を理由として，本件各特許権に基づく請求について特許法
１０２条２項の推定を覆滅すべき事情があるとは認められないから，被告の上記主20張は採用できない。
キ

被告ら販売分全体に対する特許法１０２条２項による損害額についての小括(ｱ)

前記オの被告らの限界利益の合計額に，前記カの推定覆滅事由を考慮すれば，特許法１０２条２項に基づく原告の損害額は合計１９億２８６５万６５３２円となる。
25

これは，原告が，特許法１０２条２項ないし３項によって算定される損害額の一部請求として求める損害額９億円を超えるから，前記カの覆滅部分についての特許239

法１０２条３項の重畳適用の可否，あるいは，別紙１１－２損害額の主張２から別紙１１－４損害額の主張４までの各【原告の主張】欄に記載された主張については判断することを要しない。
(ｲ)5

上記(ｱ)の損害額について，前記(1)の本件各特許権に基づく権利行使が可能な期間を考慮して，各期間に発生した損害と本件各特許権の対応を検討すると，以下のとおりとなる(各計算結果は，別紙１５被告ら販売分の特許法１０２条２項による損害額計算表記載５のとおり)。
ａ

平成２３年１月から平成２５年８月２２日まで

本件特許権１の実施がされている期間であり，合計４億６６１８万４４６３円
ｂ10

平成２５年８月２３日（本件特許権２の設定登録日）から平成２８年６月まで本件特許権１及び２の実施がされている期間であり，合計８億９７６２万８７６７円
ｃ15

平成２８年７月から平成２９年１２月まで

本件特許権２の実施がされている期間であり，合計５億６４８４万３３０２円(ｳ)

原告は，本件特許権１と本件特許権２に基づく請求相互の関係について，いずれも一部請求額である９億円の範囲で選択的に請求しているところ，上記(ｲ)によれば，本件特許権１と本件特許権２の実施による損害額は，それぞれ９億円の半額の４億５０００万円を超えると認められるから，前記(ｱ)の損害額については，一20

部請求額の割合である１対１で按分し，本件特許権１に基づく請求について４億５０００万円，本件特許権２に基づく請求について４億５０００万円を認容するのが相当である。
(4)

弁護士費用・弁理士費用について

本件事案の難易，本件の損害賠償請求における一部請求額，前記(3)の認容額等の25

事情を考慮すると，被告らの本件各特許権侵害の共同不法行為と相当因果関係のある弁護士費用・弁理士費用は９０００万円（本件特許権１の侵害について４５００240

万円，本件特許権２の侵害について４５００万円）と認めるのが相当である。
(5)

損害賠償請求についてのまとめ

以上によれば，その余の点について判断するまでもなく，原告の被告に対する本
件各特許権侵害の不法行為に基づく損害賠償請求（損害額合計９億９０００万円の5

一部請求と同額に対する訴状送達の日の翌日である平成２８年８月１０日以後の民法所定の年５分の割合による遅延損害金請求）は，全て理由があると認められる。
９

争点９（差止請求及び廃棄請求の当否）について(1)

本件特許権１に基づく請求について

前記第２の２(3)のとおり，本件特許権１は，令和元年９月２２日に存続期間が満10了しているから，本件特許権１に基づく差止請求及び廃棄請求はいずれも理由がない。
(2)

本件特許権２に基づく請求について

ア

被告各製法の使用時期については，前記１(4)で検討したとおり，別紙９本件

ＭＳＧの製法についての主張対比表に記載された②及び⑩の菌株の使用期間につい15ては被告製法１が使用されており，それ以外の期間については，同別紙の「原告の予備的主張」欄記載のとおりであったと認められ，平成２９年１２月に⑬の菌株の使用が終了した後には，本件ＭＳＧの製造に当たって，本件発明２－５（本件訂正
発明２－５）の技術的範囲に含まれる被告各製法が使用されたとは認められない。
しかしながら，上記のとおり，被告各製法使用期間において本件ＭＳＧの製造に20用いられる菌株が頻繁に変更されていたことからすれば，ＣＪインドネシアにおいて，再び菌株を変更し，被告各製法によって本件ＭＳＧを製造することは容易であると考えられる。したがって，現時点においても，被告各製法によって製造された
本件ＭＳＧについて，被告が，本件特許権２に基づいて，特許法１００条１項，２項により，譲渡，輸入，又はその譲渡の申出（譲渡のための展示を含む。）を差し

25

止め，その廃棄を求める必要性が認められる。
イ

差止め等の対象製品

241前記３のとおり，被告製法１ないし３で使用されていた菌株は，いずれも，本件明細書２の配列番号６のアミノ酸配列における１００番目のアミノ酸がアラニンからスレオニンに置換されているｙｇｇＢ遺伝子が導入されたコリネバクテリウム・
グルタミカムとして，本件発明２－５の技術的範囲に属するものであったことが認5められる。
また，前記４のとおり，被告製法４で使用された菌株（⑫及び⑬の菌株）は，いずれも，野生型コリネバクテリウム・カルナエであるＤＳＭ２０１４７株由来のｙｇｇＢ遺伝子がコードするアミノ酸配列における９８番目のアラニンがスレオニンに置換され，２４１番目のバリンがイソロイシンに置換されているｙｇｇＢ遺伝子10が導入されたコリネバクテリウム・グルタミカムとして，本件発明２－５の技術的範囲に属するものであったことが認められる。
そうすると，本件特許権２に基づいて，前記アの差止め及び廃棄を求めるべき対象製品は，別紙１７差止対象製品目録記載１及び２のとおり特定されるものというべきである（なお，同別紙添付の配列表に示されるアミノ酸配列は，本件明細書２

15の配列番号６のアミノ酸配列である。）。
１０

結論

以上によれば，原告の被告に対する，本件各特許権に基づく差止め及び廃棄請求は，本件特許権２に基づく別紙１７差止対象製品目録記載１及び２のグルタミン酸
ナトリウムの譲渡，輸入，譲渡の申出行為の差止め及び廃棄を求める限度で理由が20あり，また，本件各特許権侵害による損害賠償請求については，原告が本件において一部請求する限度では全部理由があり，原告のその余の請求はいずれも理由がな
いから，主文のとおり判決する。なお，主文第２項については，仮執行宣言を付すのは相当でないから，これを付さないこととする。
東京地方裁判所民事第２９部

25

242

裁判官

矢

5

野

紀

夫

裁判長裁判官山田真紀及び裁判官西山芳樹は，転補につき ，署名押印することが
できない。

裁判官

矢

10

243

野

紀

夫

別紙一覧

5

10

15

20

別紙１

当事者目録

別紙２

被告製品目録別紙３

被告製法目録別紙４－１

特許請求の範囲（本件特許１）

別紙４－２

訂正後の特許請求の範囲（本件特許１）

別紙４－３

構成要件の分説（本件発明１）

別紙４－４

構成要件の分説（本件訂正発明１）

別紙５－１

特許請求の範囲（本件特許２）

別紙５－２

訂正後の特許請求の範囲（本件特許２）

別紙５－３

再訂正後の特許請求の範囲（本件特許２）

別紙５－４

構成要件の分説（本件発明２）

別紙５－５

構成要件の分説（本件訂正発明２）

別紙５－６

構成要件の分説（本件再訂正発明２）

別紙６－１

被告製法１及び３と本件発明１との対比

別紙６－２

被告製法１及び３と本件訂正発明１との対比

別紙７－１

被告製法１ないし３と本件発明２との対比

別紙７－２

被告製法１ないし３と本件訂正発明２との対比

別紙７－３

被告製法１ないし３と本件再訂正発明２との対比

別紙８－１

被告製法４と本件発明２との対比

別紙８－２

被告製法４と本件訂正発明２との対比

別紙８－３

被告製法４と本件再訂正発明２との対比

別紙９

本件ＭＳＧの製法についての主張対比表

別紙１０
25

別紙１１－１

販売金額・数量一覧表
損害額の主張１（被告ら販売分全体に対する特許法１０２条２項による損害額）244

別紙１１－２

損害額の主張２（被告ら販売分全体に対する特許法１０２条３項による損害額）
別紙１１－３

損害額の主張３（被告販売分につき特許法１０２条３項，ＣＪイ

ンドネシア販売分につき同条２項による損害額）
5

別紙１１－４

損害額の主張４（被告販売分につき特許法１０２条３項，ＣＪイ

ンドネシア販売分についての被告のコミッションについて同条２項による損害額）

10

別紙１２

本件明細書１の記載

別紙１３

本件明細書２の記載

別紙１４

引用文献の図面

別紙１５

被告ら販売分の特許法１０２条２項による損害額計算表

別紙１６

被告各製法使用期間中のグルタミン酸ナトリウムの輸入状況

別紙１７

差止対象製品目録

15

245

別紙１

当事者目録

原
5

告

味

の

素

株

式

会

社

同訴訟代理人弁護士

森

﨑

博

之

同訴訟復代理人弁護士

津

城

尚

子

同 補 佐 人 弁 理 士

白

石

真

琴

北

谷

賢

次

10

被

告

同訴訟代理人弁護士

同訴訟代理人弁理士
15

同訴訟復代理人弁護士

シージェイジャパン株式会社
飯

村

末

吉

剛

山

本

修

鶴

喰

寿

孝

髙

橋

聖

史

246

敏

明

別紙２

被告製品目録製品名「ＭＩ－ＰＯＯＮＧ」のグルタミン酸ナトリウム
ただし，
5

１

被告製品１
グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）遺伝子（ＧＤＨ遺伝子）のプロモータ

ー配列の－３５領域にＴＴＧＴＣＡ配列，－１０領域にＴＡＴＡＡＴ配列を導入し，クエン酸合成酵素（ＣＳ）遺伝子（ｇｌｔＡ遺伝子）のプロモーター配列の－１０
領域に，ＴＡＴＡＡＴ配列を導入し，ｙｇｇＢ遺伝子がコードするアミノ酸配列に10おける１００番目のアミノ酸がアラニンからスレオニンに置換されているコリネバ
クテリウム・グルタミカムを用いて生産されたもの
２

被告製品２
ｙｇｇＢ遺伝子がコードするアミノ酸配列における１００番目のアミノ酸がアラニンからスレオニンに置換されているコリネバクテリウム・グルタミカムを用いて15生産されたもの３

被告製品３
クエン酸合成酵素（ＣＳ）遺伝子（ｇｌｔＡ遺伝子）のプロモーター配列の－１０領域に，ＴＡＴＡＡＴ配列を導入し，ｙｇｇＢ遺伝子がコードするアミノ酸配列における１００番目のアミノ酸がアラニンからスレオニンに置換されているコリネ
20

バクテリウム・グルタミカムを用いて生産されたもの
４

被告製品４
ｙｇｇＢ遺伝子がコードするアミノ酸配列における９８番目のアミノ酸がアラニンからスレオニンに置換されているコリネバクテリウム・カルナエのｙｇｇＢ遺伝子が導入されたコリネバクテリウム・グルタミカムを用いて生産されたもの
以上

25

247

別紙３

１

被告製法目録

炭素源をはじめとする原料を含んだ培地，及び，染色体上の遺伝子に別紙２被告製品目録記載１の特徴を有するコリネ型細菌であるコリネバクテリウム・グルタ
5

ミカムを発酵槽に入れ，コリネバクテリウム・グルタミカムを増殖させ，菌体内の代謝反応により炭素源をＬ－グルタミン酸へと変換させる発酵法により，Ｌ－グルタミン酸を生成し，発酵工程の終了後，発酵菌（菌体）が含まれる上清液とＬ－グルタミン酸とを分離し回収し，回収されたＬ－グルタミン酸を，苛性ソーダにより中和し，別紙２被10

告製品目録記載１の製品であるグルタミン酸ナトリウムを生産する方法
２

染色体上の遺伝子に別紙２被告製品目録記載２の特徴を有するコリネ型細菌であるコリネバクテリウム・グルタミカムを使用するほかは，前記１と同じ方法を用いて，別紙２被告製品目録記載２の製品であるグルタミン酸ナトリウムを生産す
る方法
15

３

染色体上の遺伝子に別紙２被告製品目録記載３の特徴を有するコリネ型細菌であるコリネバクテリウム・グルタミカムを使用するほかは，前記１と同じ方法を用いて，別紙２被告製品目録記載３の製品であるグルタミン酸ナトリウムを生産す
る方法
４
20

染色体上の遺伝子に別紙２被告製品目録記載４の特徴を有するコリネ型細菌であるコリネバクテリウム・グルタミカムを使用するほかは，前記１と同じ方法を用いて，別紙２被告製品目録記載４の製品であるグルタミン酸ナトリウムを生産す
る方法
以上

248

別紙４－１

特許請求の範囲（本件特許１）【請求項１】（本件発明１－１）
コリネ型細菌の染色体上のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ），クエン酸合成酵素（ＣＳ），イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＣＤＨ），ピルビン酸デヒ
5

ドロゲナーセ（ＰＤＨ）及びアルギニノコハク酸シンターゼからなる群から選ばれる遺伝子のプロモーター配列の－３５領域に，TTGTCA，TTGACA，TTGCTA及びTTGCCAからなる群から選ばれる少なくとも一種のＤＮＡ配列及び／又は－１０領域にTATAAT配列若しくはTATAAC配列を導入したコリネ型細菌を，培地で培養し，培地中にＬ－グルタミン酸又はＬ－アルギニンを生成蓄積させ，これを該培地から採取す

10

ることを特徴とする発酵法によるＬ－グルタミン酸又はＬ－アルギニンの製造方法。
【請求項２】（本件発明１－２）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）産生遺伝子のプロモーターが，－３５領域に，TTGTCA，TTGACA及びTTGCCA からなる群から選ばれる少なくとも一種のＤＮ
Ａ配列及び／又は－１０領域にTATAAT配列を有するものである請求項１記載の方法。

15【請求項３】（本件発明１－３）
ＧＤＨのプロモーターが，－３５領域にTTGACA配列又はTTGCCA配列を有し，及び／又は－１０領域としてTATAATを有するものである請求項２記載の方法。
【請求項４】（本件発明１－４）
ＣＳのプロモーターが，－３５領域にTTGACA配列及び／又は－１０領域にTATAAT

20

配列又はTATAAC配列を有するものである請求項１記載の方法。
以上

249

別紙４－２

訂正後の特許請求の範囲（本件特許１）【請求項１】（本件訂正発明１－１）
コリネ型細菌の染色体上の，グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）遺伝子のプ
5ロモーター配列の－３５領域にＴＴＧＴＣＡ配列及び－１０領域にＴＡＴＡＡＴ配列，並びに／或いはクエン酸合成酵素（ＣＳ）遺伝子のプロモーター配列の－１０
領域にＴＡＴＡＡＴ配列を導入したコリネ型細菌を，培地で培養し，培地中にＬ－
グルタミン酸を生成蓄積させ，これを該培地から採取することを特徴とする発酵法
によるＬ－グルタミン酸の製造方法。

10【請求項２】（本件訂正発明１－２）
ＧＤＨ遺伝子のプロモーターが，－３５領域にＴＴＧＴＣＡ配列及び－１０領域にＴＡＴＡＡＴ配列を有するものである請求項１記載の方法。
【請求項３】（削除）【請求項４】（本件訂正発明１－３）15ＣＳ遺伝子のプロモーターが，－１０領域にＴＡＴＡＡＴ配列を有するもの，又は－３５領域にＴＴＧＡＣＡ配列及び－１０領域にＴＡＴＡＡＴ配列を有するものであり，ＧＤＨ遺伝子のプロモーターが，－３５領域にＴＴＧＴＣＡ配列及び－１０
領域にＴＡＴＡＡＴ配列を有するものである請求項１記載の方法。
以上

20

250

別紙４－３

構成要件の分説（本件発明１）

本件発明１－１（請求項１）１－Ａ－１

コリネ型細菌の染色体上のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ），クエン酸合成酵素（ＣＳ），イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＣＤＨ），ピルビン酸デヒドロゲナーセ（ＰＤＨ）及びアルギニノコハ

5

ク酸シンターゼからなる群から選ばれる遺伝子のプロモーター配列の－３５領域に，ＴＴＧＴＣＡ，ＴＴＧＡＣＡ，ＴＴＧＣＴＡ及びＴＴＧＣ
ＣＡからなる群から選ばれる少なくとも一種のＤＮＡ配列及び／又は

10

１－Ａ－２

－１０領域にＴＡＴＡＡＴ配列若しくはＴＡＴＡＡＣ配列

１－Ａ－３を導入したコリネ型細菌を，１－Ｂ培地で培養し，培地中にＬ－グルタミン酸又はＬ－アルギニンを生成蓄積させ，これを該培地から採取することを特徴とする発酵法によるＬ－グルタミン酸又はＬ－アルギニンの製造方法。

15

本件発明１－２（請求項２）１－Ｃ－１グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）産生遺伝子のプロモーター
が，－３５領域に，ＴＴＧＴＣＡ，ＴＴＧＡＣＡ及びＴＴＧＣＣＡ

からなる群から選ばれる少なくとも一種のＤＮＡ配列及び／又は

20

１－Ｃ－２

－１０領域にＴＡＴＡＡＴ配列を有するものである

１－Ｄ

請求項１記載の方法。

本件発明１－３（請求項３）
１－Ｅ－１

ＧＤＨのプロモーターが，－３５領域にＴＴＧＡＣＡ配列又はＴＴＧ
ＣＣＡ配列を有し，及び／又は

25

１－Ｅ－２

－１０領域としてＴＡＴＡＡＴを有するものである

１－Ｆ

請求項２記載の方法。

251

本件発明１－４（請求項４）
１－Ｇ－１

ＣＳのプロモーターが，－３５領域にＴＴＧＡＣＡ配列及び／又は

１－Ｇ－２－１０領域にＴＡＴＡＡＴ配列又はＴＡＴＡＡＣ配列を有するもので
ある

5

１－Ｈ

請求項１記載の方法。
以上

252

別紙４－４

構成要件の分説（本件訂正発明１）

本件訂正発明１－１（請求項１）
１－Ａ’－１

コリネ型細菌の染色体上の，グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）遺伝子のプロモーター配列の－３５領域にＴＴＧＴＣＡ配列及び5－１０領域にＴＡＴＡＡＴ配列，並びに／或いは
１－Ａ’－２クエン酸合成酵素（ＣＳ）遺伝子のプロモーター配列の－１０領域にＴＡＴＡＡＴ配列

10

１－Ａ－３

を導入したコリネ型細菌を，１－Ｂ’培地で培養し，培地中にＬ－グルタミン酸を生成蓄積させ，これを該培地から採取することを特徴とする発酵法によるＬ－グルタミン酸の製造方法。

本件訂正発明１－２（請求項２）
15

１－Ｃ’－１ＧＤＨ遺伝子のプロモーターが，－３５領域にＴＴＧＴＣＡ配列及び

20

１－Ｃ’－２－１０領域にＴＡＴＡＡＴ配列を有するもの

１－Ｄ

である請求項１記載の方法。

本件訂正発明１－３（請求項４）
１－Ｇ’

ＣＳ遺伝子のプロモーターが，－１０領域にＴＡＴＡＡＴ配列を有するもの，又は－３５領域にＴＴＧＡＣＡ配列及び－１０領域にＴＡＴＡＡＴ配列を有するものであり，

１－Ｇ’’

ＧＤＨ遺伝子のプロモーターが，－３５領域にＴＴＧＴＣＡ配列及び－１０領域にＴＡＴＡＡＴ配列を有するもの

25

１－Ｈ

である請求項１記載の方法。

253

別紙５－１

特許請求の範囲（本件特許２）【請求項１】（本件発明２－１）
Ｌ－グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌であって，変異型yggB遺伝子が導入されたことにより非改変株と比較してＬ－グルタミン酸生
5産能が向上したコリネ型細菌であって前記変異型yggB遺伝子は，（ｉ），（ｉ’），（ｉ’’）または（ii）の変異が導入された，コリネ型細菌：（ｉ）配列番号６，６８，８４もしくは８５のアミノ酸配列のアミノ酸番号４１９－５３３の領域もしくは配列番号６２のアミノ酸番号４１９－５２９の領域の10欠失，（ｉ’）配列番号６，６８，８４もしくは８５のアミノ酸配列のアミノ酸番号
４１９－５３３の領域もしくは配列番号６２のアミノ酸番号４１９－５２９の領域へのインサーションシーケンス又はトランスポゾンの挿入，（ｉ’’）配列番号６，６８，８４もしくは８５のアミノ酸配列のアミノ酸番

15号４１９－５３３の領域もしくは配列番号６２のアミノ酸番号４１９－５２９の領域に存在するプロリンを他のアミノ酸に置換する変異，
または（ii）配列番号６，６２，６８，８４もしくは８５のアミノ酸配列のアミノ酸
番号１－２３，８６－１０８，及び１１０－１３２からなる群から選ばれる領域に20おける１若しくは数個のアミノ酸の置換，欠失，又は挿入。
【請求項４】（本件発明２－２）
前記（ii）の変異は，配列番号６，６２，６８，８４もしくは８５のアミノ酸配列
において，100位のアラニン及び/または111位のアラニンを他のアミノ酸に置換する変異である，請求項１に記載のコリネ型細菌。

25【請求項６】（本件発明２－３）前記変異型yggB遺伝子が，下記(a)～（n）より選ばれる変異型yggB遺伝子である請254

求項１～５のいずれか一項に記載のコリネ型細菌：(a) 配列番号８のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ，(b) 配列番号８のアミノ酸配列において，１～５個のアミノ酸が置換，欠失，
挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし，コリネ型細5菌に導入することにより，過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ－グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(c) 配列番号２０のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ，(d) 配列番号２０のアミノ酸配列において，１～５個のアミノ酸が置換，欠失，
挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし，コリネ型細10菌に導入することにより，過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ－グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(e) 配列番号２２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ，(f) 配列番号２２のアミノ酸配列において，１～５個のアミノ酸が置換，欠失，
挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし，コリネ型細15菌に導入することにより，過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ－グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(g) 配列番号２４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ，(h) 配列番号２４のアミノ酸配列において，１～５個のアミノ酸が置換，欠失，
挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし，コリネ型細20

菌に導入することにより，過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ－グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(i) 配列番号６４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ，(j) 配列番号６４のアミノ酸配列において，１～５個のアミノ酸が置換，欠失，
挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし，コリネ型細25

菌に導入することにより，過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ－グルタミン酸生産能を向上させるDNA。

255

(k) 配列番号７０のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ，(l) 配列番号７０のアミノ酸配列において，１～５個のアミノ酸が置換，欠失，
挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし，コリネ型細菌に導入することにより，過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ
5型細菌のＬ－グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(m) 配列番号７４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ，(n) 配列番号７４のアミノ酸配列において，１～５個のアミノ酸が置換，欠失，
挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし，コリネ型細菌に導入することにより，過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ

10型細菌のＬ－グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
【請求項１０】（本件発明２－４）
コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属する，請求項１～９のいず
れか一項に記載のコリネ型細菌。
【請求項１１】（本件発明２－５）15

請求項１～１０のいずれか一項に記載のコリネ型細菌を培地で培養し，Ｌ－グルタ
ミン酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ，該培地又は菌体からＬ－グルタミン酸を回収することを特徴とするL-グルタミン酸の製造法。
以上

256

別紙５－２

訂正後の特許請求の範囲（本件特許２）【請求項１】（本件訂正発明２－１）
Ｌ－グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌であって，変異型ｙｇｇＢ遺伝子が導入されたことにより非改変株と比較してＬ－グルタミン
5酸生産能が向上したコリネ型細菌であって，
前記変異型ｙｇｇＢ遺伝子は，（ｉ），（ｉ’），（ｉ’’）または（ｉｉ）の変異が導入された，コリネ型細菌：（ｉ）配列番号６，６８，８４もしくは８５のアミノ酸配列のアミノ酸番号４１９－５３３の領域もしくは配列番号６２のアミノ酸番号４１９－５２９の領域の10欠失，（ｉ’）配列番号６，６８，８４もしくは８５のアミノ酸配列のアミノ酸番号
４１９－５３３の領域もしくは配列番号６２のアミノ酸番号４１９－５２９の領域へのインサーションシーケンス又はトランスポゾンの挿入，（ｉ’’）配列番号６，６８，８４もしくは８５のアミノ酸配列のアミノ酸番

15号４１９－５３３の領域もしくは配列番号６２のアミノ酸番号４１９－５２９の領域に存在するプロリンを他のアミノ酸に置換する変異，
または（ｉｉ）配列番号６，６２，６８，８４もしくは８５のアミノ酸配列のアミノ
酸番号１－２３，８６－１０８，及び１１０－１３２からなる群から選ばれる領域

20における１～５個のアミノ酸の置換，欠失，又は挿入。
【請求項４】（本件訂正発明２－２）
Ｌ－グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌であって，変異型ｙｇｇＢ遺伝子が導入されたことにより非改変株と比較してＬ－グルタミン
酸生産能が向上したコリネ型細菌であって，

25

前記変異型ｙｇｇＢ遺伝子の変異は，配列番号６，６２，６８，８４もしくは８５のアミノ酸配列において，１００位のアラニンをスレオニンに，及び／または１１257

１位のアラニンをスレオニンもしくはバリンに置換する変異である，コリネ型細菌。
【請求項６】（本件訂正発明２－３）前記変異型ｙｇｇＢ遺伝子が，下記（ａ）～（ｎ）より選ばれる変異型ｙｇｇＢ遺伝子である請求項１，２，４及び５のいずれか一項に記載のコリネ型細菌：
5（ａ）

配列番号８のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ，（ｂ）

配列番号８のアミノ酸配列において，１～５個のアミノ酸が置換，欠失，挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし，コリネ型細菌に導入することにより，過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コ
リネ型細菌のＬ－グルタミン酸生産能を向上させるＤＮＡ。
10（ｃ）

配列番号２０のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ，（ｄ）

配列番号２０のアミノ酸配列において，１～５個のアミノ酸が置換，欠失，挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし，コリ
ネ型細菌に導入することにより，過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該
コリネ型細菌のＬ－グルタミン酸生産能を向上させるＤＮＡ。
15（ｅ）

配列番号２２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ，（ｆ）

配列番号２２のアミノ酸配列において，１～５個のアミノ酸が置換，欠失，挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし，コリ
ネ型細菌に導入することにより，過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該
コリネ型細菌のＬ－グルタミン酸生産能を向上させるＤＮＡ。
20（ｇ）

配列番号２４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ，（ｈ）

配列番号２４のアミノ酸配列において，１～５個のアミノ酸が置換，欠失，挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし，コリ
ネ型細菌に導入することにより，過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該
コリネ型細菌のＬ－グルタミン酸生産能を向上させるＤＮＡ。
25（ｉ）

配列番号６４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ，（ｊ）

配列番号６４のアミノ酸配列において，１～５個のアミノ酸が置換，

258

欠失，挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし，コリ
ネ型細菌に導入することにより，過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該
コリネ型細菌のＬ－グルタミン酸生産能を向上させるＤＮＡ。

5（ｋ）

配列番号７０のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ，（ｌ）

配列番号７０のアミノ酸配列において，１～５個のアミノ酸が置換，欠失，挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし，コリ
ネ型細菌に導入することにより，過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該
コリネ型細菌のＬ－グルタミン酸生産能を向上させるＤＮＡ。

10

（ｍ）

配列番号７４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ，（ｎ）

配列番号７４のアミノ酸配列において，１～５個のアミノ酸が置換，欠失，挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし，コリ
ネ型細菌に導入することにより，過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該
コリネ型細菌のＬ－グルタミン酸生産能を向上させるＤＮＡ。
【請求項１０】（本件訂正発明２－４）
15

コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属する，請求項１，２及び４～９のいずれか一項に記載のコリネ型細菌。
【請求項１１】（本件訂正発明２－５）
請求項１，２及び４～１０のいずれか一項に記載のコリネ型細菌を培地で培養し，Ｌ－グルタミン酸を該培地中に生成蓄積させ，該培地からＬ－グルタミン酸を回収20することを特徴とするＬ－グルタミン酸の製造法。

259

別紙５－３

再訂正後の特許請求の範囲（本件特許２）【請求項４】（本件再訂正発明２－２）（本件訂正発明２－２と同内容）
Ｌ－グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌であって，
5

変異型ｙｇｇＢ遺伝子が導入されたことにより非改変株と比較してＬ－グルタミン
酸生産能が向上したコリネ型細菌であって，
前記変異型ｙｇｇＢ遺伝子の変異は，配列番号６，６２，６８，８４若しくは８５のアミノ酸配列において，100位のアラニンをスレオニンに，及び/または111位のア
ラニンをスレオニンもしくはバリンに置換する変異である，コリネ型細菌。

10【請求項１３】（本件再訂正発明２－３）前記変異型ｙｇｇＢ遺伝子が，下記(e)～(j)より選ばれる変異型yggB遺伝子である
請求項４に記載のコリネ型細菌：

15

(e)

配列番号２２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ，(f)

配列番号２２のアミノ酸配列において，１～５個のアミノ酸が置換，欠失，

挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし，コリネ型細菌に導入することにより，過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ－グルタミン酸生産能を向上させるDNA。

20

(g)

配列番号２４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ，(h)

配列番号２４のアミノ酸配列において，１～５個のアミノ酸が置換，欠失，

挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし，コリネ型細菌に導入することにより，過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ－グルタミン酸生産能を向上させるDNA。

25

(i)

配列番号６４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ，(j)

配列番号６４のアミノ酸配列において，１～５個のアミノ酸が置換，欠失，

挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし，コリネ型細菌に導入することにより，過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ

260

型細菌のＬ－グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
【請求項１４】（本件再訂正発明２－６）
請求項１３に記載のコリネ型細菌を培地で培養し，Ｌ－グルタミン酸を該培地中に生成蓄積させ，該培地からＬ－グルタミン酸を回収することを特徴とするL-グルタ
5ミン酸の製造法。
以上261

別紙５－４

構成要件の分説（本件発明２）

本件発明２－１（請求項１）
２－Ａ

Ｌ－グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌であって，２－Ｂ

変異型ｙｇｇＢ遺伝子が導入されたことにより非改変株と比較してＬ－グ
ルタミン酸生産能が向上したコリネ型細菌であって5２－Ｃ

前記変異型ｙｇｇＢ遺伝子は，（ｉ），（ｉ’），（ｉ’’）または（ii）の変異が導入された，コリネ型細菌：（ｉ）配列番号６，６８，８４もしくは８５のアミノ酸配列のアミノ酸番号
４１９－５３３の領域もしくは配列番号６２のアミノ酸番号４１９－５10２９の領域の欠失，（ｉ’）配列番号６，６８，８４もしくは８５のアミノ酸配列のアミノ酸番号４１９－５３３の領域もしくは配列番号６２のアミノ酸番号４１９－
５２９の領域へのインサーションシーケンス又はトランスポゾンの挿入，15（ｉ’’）配列番号６，６８，８４もしくは８５のアミノ酸配列のアミノ酸
番号４１９－５３３の領域もしくは配列番号６２のアミノ酸番号４１９－５２９の領域に存在するプロリンを他のアミノ酸に置換する変異，
または（ii）配列番号６，６２，６８，８４もしくは８５のアミノ酸配列のアミノ

20

酸番号１－２３，８６－１０８，及び１１０－１３２からなる群から選ばれる領域における１若しくは数個のアミノ酸の置換，欠失，又は挿入。

本件発明２－２（請求項４）

262

２－Ｄ

前記（ii）の変異は，配列番号６，６２，６８，８４もしくは８５のアミノ酸配列において，１００位のアラニン及び/または１１１位のアラニンを
他のアミノ酸に置換する変異である，

２－Ｅ

請求項１に記載のコリネ型細菌。

5

本件発明２－３（請求項６）２－Ｆ－１

前記変異型ｙｇｇＢ遺伝子が，下記(a)～（n）より選ばれる変異型ｙｇｇＢ遺伝子である

10

２－Ｆ－２

請求項１～５のいずれか一項に記載のコリネ型細菌：

２－Ｆ－３(a) 配列番号８のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ，(b) 配列番号８のアミノ酸配列において，１～５個のアミノ酸が置換，欠失，挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし，コリネ型細菌に導入することにより，過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ－グルタミン酸生

15

産能を向上させるDNA。
(c) 配列番号２０のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ，(d) 配列番号２０のアミノ酸配列において，１～５個のアミノ酸が置
換，欠失，挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし，コリネ型細菌に導入することにより，過剰量のビオ20チンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ－グルタミン
酸生産能を向上させるDNA。
(e) 配列番号２２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ，(f) 配列番号２２のアミノ酸配列において，１～５個のアミノ酸が置
換，欠失，挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク25

質をコードし，コリネ型細菌に導入することにより，過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ－グルタミン263

酸生産能を向上させるDNA。
(g) 配列番号２４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ，(h) 配列番号２４のアミノ酸配列において，１～５個のアミノ酸が置
換，欠失，挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク
5

質をコードし，コリネ型細菌に導入することにより，過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ－グルタミン
酸生産能を向上させるDNA。
(i) 配列番号６４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ，(j) 配列番号６４のアミノ酸配列において，１～５個のアミノ酸が置

10換，欠失，挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし，コリネ型細菌に導入することにより，過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ－グルタミン
酸生産能を向上させるDNA。
(k) 配列番号７０のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ，

15(l) 配列番号７０のアミノ酸配列において，１～５個のアミノ酸が置
換，欠失，挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし，コリネ型細菌に導入することにより，過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ－グルタミン
酸生産能を向上させるDNA。

20(m) 配列番号７４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ，(n) 配列番号７４のアミノ酸配列において，１～５個のアミノ酸が置
換，欠失，挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし，コリネ型細菌に導入することにより，過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ－グルタミン

25

酸生産能を向上させる DNA。

264

本件発明２－４（請求項１０）
２－Ｇ

コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属する，請求項１～９のいずれか一項に記載のコリネ型細菌。

5

本件発明２－５（請求項１１）
２－Ｈ

請求項１～１０のいずれか一項に記載のコリネ型細菌を培地で培養し，２－ＩＬ－グルタミン酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ，該培地又は菌体からＬ－グルタミン酸を回収することを特徴とする

２－Ｊ

Ｌ-グルタミン酸の製造法。
以上

10

265

別紙５－５

構成要件の分説（本件訂正発明２）

本件訂正発明２－１（請求項１）

5

２－Ａ

Ｌ－グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌であって，２－Ｂ

変異型ｙｇｇＢ遺伝子が導入されたことにより非改変株と比較してＬ－
グルタミン酸生産能が向上したコリネ型細菌であって２－Ｃ’ 前記変異型ｙｇｇＢ遺伝子は，（ｉ），（ｉ’），（ｉ’’）または（ii）の変異が導入された，コリネ型細菌：（ｉ）配列番号６，６８，８４もしくは８５のアミノ酸配列のアミノ酸番
10号４１９－５３３の領域もしくは配列番号６２のアミノ酸番号４１９－５２９の領域の欠失，（ｉ’）配列番号６，６８，８４もしくは８５のアミノ酸配列のアミノ酸
番号４１９－５３３の領域もしくは配列番号６２のアミノ酸番号４１９－５２９の領域へのインサーションシーケンス又はト
ランスポゾンの挿入，

15（ｉ’’）配列番号６，６８，８４もしくは８５のアミノ酸配列のアミノ酸番号４１９－５３３の領域もしくは配列番号６２のアミノ酸
番号４１９－５２９の領域に存在するプロリンを他のアミノ酸に置換する変異，
20または（ii）配列番号６，６２，６８，８４もしくは８５のアミノ酸配列のアミノ酸番号１－２３，８６－１０８，及び１１０－１３２からなる群から選ばれる領域における１～５個のアミノ酸の置換，欠失，又は挿入。

25

本件訂正発明２－２（請求項４）266

２－Ｅ’－１

Ｌ－グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌であって，

２－Ｅ’－２変異型ｙｇｇＢ遺伝子が導入されたことにより非改変株と比較してＬ－グルタミン酸生産能が向上したコリネ型細菌であって２－Ｄ’

前記変異型ｙｇｇＢ遺伝子の変異は，配列番号６，６２，６８，８
４もしくは８５のアミノ酸配列において，１００位のアラニンをスレ

5

オニンに，及び/または１１１位のアラニンをスレオニンもしくはバリンに置換する変異である，コリネ型細菌。

本件訂正発明２－３（請求項６）
10

２－Ｆ－１

前記変異型ｙｇｇＢ遺伝子が，下記(a)～（n）より選ばれる変異型
ｙｇｇＢ遺伝子である

２－Ｆ’－２２－Ｆ－３

請求項１，２，４及び５のいずれか一項に記載のコリネ型細菌：(a) 配列番号８のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ，(b) 配列番号８のアミノ酸配列において，１～５個のアミノ酸が置換，

15

欠失，挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし，コリネ型細菌に導入することにより，過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ－グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(c) 配列番号２０のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ，

20(d) 配列番号２０のアミノ酸配列において，１～５個のアミノ酸が置
換，欠失，挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし，コリネ型細菌に導入することにより，過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ－グルタミン
酸生産能を向上させるDNA。

25(e) 配列番号２２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ，(f) 配列番号２２のアミノ酸配列において，１～５個のアミノ酸が置

267

換，欠失，挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし，コリネ型細菌に導入することにより，過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ－グルタミン
酸生産能を向上させるDNA。
5(g) 配列番号２４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ，(h) 配列番号２４のアミノ酸配列において，１～５個のアミノ酸が置
換，欠失，挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし，コリネ型細菌に導入することにより，過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ－グルタミン

10

酸生産能を向上させるDNA。
(i) 配列番号６４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ，(j) 配列番号６４のアミノ酸配列において，１～５個のアミノ酸が置
換，欠失，挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし，コリネ型細菌に導入することにより，過剰量のビオ

15チンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ－グルタミン
酸生産能を向上させるDNA。
(k) 配列番号７０のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ，(l) 配列番号７０のアミノ酸配列において，１～５個のアミノ酸が置
換，欠失，挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク20

質をコードし，コリネ型細菌に導入することにより，過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ－グルタミン
酸生産能を向上させるDNA。
(m) 配列番号７４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ，(n) 配列番号７４のアミノ酸配列において，１～５個のアミノ酸が置

25

換，欠失，挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし，コリネ型細菌に導入することにより，過剰量のビオ

268

チンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ－グルタミン
酸生産能を向上させるDNA。

本件訂正発明２－４（請求項１０）
5２－Ｇ’

コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属する，請求
項１，２及び４～９のいずれか一項に記載のコリネ型細菌。

本件訂正発明２－５（請求項１１）
２－Ｈ’

請求項１，２及び４～１０のいずれか一項に記載のコリネ型細菌を培地で培養し，

10

２－Ｉ’

Ｌ－グルタミン酸を該培地中に生成蓄積させ，該培地からＬ－グルタミン酸を回収することを特徴とする

２－Ｊ

Ｌ-グルタミン酸の製造法。
以上

15

269

別紙５－６

構成要件の分説（本件再訂正発明２）

本件再訂正発明２－２（請求項４）（本件訂正発明２－２と同内容）

5

２－Ｅ’－１

Ｌ－グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌であって，

２－Ｅ’－２変異型ｙｇｇＢ遺伝子が導入されたことにより非改変株と比較してＬ－グルタミン酸生産能が向上したコリネ型細菌であって，２－Ｄ’

前記変異型ｙｇｇＢ遺伝子の変異は，配列番号６，６２，６８，８
４もしくは８５のアミノ酸配列において，１００位のアラニンをスレオニンに，及び/または１１１位のアラニンをスレオニンもしくはバリンに置換する変異である，コリネ型細菌。

10

本件再訂正発明２－３（請求項１３）２－Ｆ’－１

前記変異型ｙｇｇＢ遺伝子が，下記(e)～(j)より選ばれる変異型yggB

遺伝子である
15

２－Ｆ’’－２
２－Ｆ’－３

請求項４に記載のコリネ型細菌：(e)

配列番号２２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ，(f)

配列番号２２のアミノ酸配列において，１～５個のアミノ酸が置換，欠失，挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし，コリネ型細菌に導入することにより，過剰量のビオチ
20ンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ－グルタミン酸生産能を向上させるDNA。
(g)

配列番号２４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ，(h)

配列番号２４のアミノ酸配列において，１～５個のアミノ酸が置換，欠失，挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク25

質をコードし，コリネ型細菌に導入することにより，過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ－グルタミン酸生

270

産能を向上させるDNA。
(i)

配列番号６４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ，(j)

配列番号６４のアミノ酸配列において，１～５個のアミノ酸が置換，欠失，挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし，コリネ型細菌に導入することにより，過剰量のビオチ

5ンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ－グルタミン酸生産能を向上させるDNA。

本件再訂正発明２－６（請求項１４）
10２－Ｋ

請求項１３に記載のコリネ型細菌を培地で培養し，２－ＬＬ－グルタミン酸を該培地中に生成蓄積させ，該培地からＬ－グルタミン酸を回収することを特徴とする

２－Ｍ

Ｌ-グルタミン酸の製造法。
以上

15

271

別紙６－１

１

被告製法１及び３と本件発明１との対比

被告製法１について
以下のとおり，被告製法１は，本件発明１－１から１－４までの，いずれの技

5

術的範囲にも属する。
(1)

本件発明１－１との対比

ア

構成要件１－Ａ－１について

被告製法１は，染色体上の遺伝子であるＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列の－３５領域に，ＴＴＧＴＣＡ配列を導入したコリネ型細菌である「コリネバクテリ
10

ウム・グルタミカム」を用いており，構成要件１－Ａ－１を充足する。
イ

構成要件１－Ａ－２について

被告製法１は，染色体上の遺伝子であるＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列の－１０領域に，ＴＡＴＡＡＴ配列を導入し，さらに，染色体上の遺伝子であるＣＳ
遺伝子のプロモーター配列の－１０領域にＴＡＴＡＡＴ配列を導入したコリネ型
15細菌である「コリネバクテリウム・グルタミカム」を用いている。
したがって，被告製法１は構成要件１－Ａ－２を充足する。
ウ

構成要件１－Ａ－３について

被告製法１においては，前記ア及びイのとおり，コリネ型細菌である「コリネバクテリウム・グルタミカム」を用いているから，被告製法１は構成要件１－Ａ20－３を充足する。
エ構成要件１－Ｂについて

被告製法１においては，コリネ型細菌である「コリネバクテリウム・グルタミ
カム」を，炭素源等を含んだ液体培地で培養し，グルタミン酸を生成蓄積させ，これを分離操作により，該培地から採取することを特徴とする発酵法を用いてい25る。
したがって，被告製法１は，構成要件１－Ｂを充足する。

272

オ

まとめ

前記アないしエに記載のとおり，被告製法１は，構成要件１－Ａ－１ないし３
及び１－Ｂを充足するから，本件発明１－１の技術的範囲に属する。

5(2)

本件発明１－２との対比

ア

構成要件１－Ｃ－１，１－Ｃ－２について

被告製法１においては，前記(1)ア及びイのとおり，コリネ型細菌の染色体上の遺伝子であるＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列の－３５領域にＴＴＧＴＣＡ配列を導入し，－１０領域に，ＴＡＴＡＡＴ配列を導入したコリネ型細菌である
10「コリネバクテリウム・グルタミカム」を用いている。
したがって，被告製法１は，構成要件１－Ｃ－１及び１－Ｃ－２を充足する。
イ

構成要件１－Ｄについて

被告製法１は，前記１(1)で述べたとおり，本件特許１の請求項１記載の方法を用いているから，構成要件１－Ｄを充足する。
15

ウ

まとめ

前記ア及びイのとおり，被告製法１は構成要件１－Ｃ－１，１－Ｃ－２及び１－Ｄを充足するから，本件発明１－２の技術的範囲に属する。

20

(3)

本件発明１－３との対比

ア

構成要件１－Ｅ－１，１－Ｅ－２について

被告製法１においては，前記(1)イのとおり，コリネ型細菌である「コリネバクテリウム・グルタミカム」の染色体上の遺伝子であるＧＤＨ遺伝子のプロモー
ターが，－１０領域にＴＡＴＡＡＴ配列を有しているから，構成要件１－Ｅ－２を充足する。
25

イ

構成要件１－Ｆについて

被告製法１においては，前記(1)及び(2)のとおり，本件特許１の請求項２記載

273

の方法を用いているから，構成要件１－Ｆを充足する。
ウ

まとめ

前記ア及びイに記載のとおり，被告製法１は構成要件１－Ｅ－２及び１－Ｆを充足するから，本件発明１－３の技術的範囲に属する。
5(4)

本件発明１－４との対比

ア

構成要件１－Ｇ－１，１－Ｇ－２について

被告製法１においては，前記(1)イのとおり，コリネ型細菌の染色体上の遺伝子であるＣＳ遺伝子のプロモーター配列が，－１０領域にＴＡＴＡＡＴ配列を有10するものであるから，構成要件１－Ｇ－２を充足する。
イ

構成要件１－Ｈについて

被告製法１は，前記(1)のとおり，本件特許１の請求項１記載の方法を用いているから，構成要件１－Ｈを充足する。
ウ

まとめ

前記ア及びイに記載のとおり，被告製法１は構成要件１－Ｇ－２及び１－Ｈを15充足するから，本件発明１－４の技術的範囲に属する。

２

被告製法３について
被告製法３は，本件発明１との関係においては，使用するコリネバクテリウム

20

・グルタミカムが，ＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列の点で，被告製法１と異なり，その他の点では被告製法１と共通している。
以下のとおり，被告製法３は，本件発明１－１及び１－４の技術的範囲に属す
る。

25

(1)

本件発明１－１との対比

ア

構成要件１－Ａ－１，１－Ａ－２について

被告製法３は，コリネ型細菌の染色体上の遺伝子であるＣＳ遺伝子のプロモー274

ター配列の－１０領域にＴＡＴＡＡＴ配列を導入したコリネ型細菌である「コリネバクテリウム・グルタミカム」を用いている。
したがって，被告製法３は構成要件１－Ａ－２を充足する。
イ5

構成要件１－Ａ－３，構成要件１－Ｂについて

被告製法３は，被告製法１同様，構成要件１－Ａ－３，１－Ｂを充足する。
ウ

まとめ

前記ア及びイのとおり，被告製法３は，構成要件１－Ａ－２，１－Ａ－３及び
１－Ｂを充足するから，本件発明１－１の技術的範囲に属する。

10

(2)

本件発明１－４との対比

ア

構成要件１－Ｇ－１，１－Ｇ－２について

被告製法３においては，被告製法１と同様に，コリネ型細菌の染色体上の遺伝子であるＣＳ遺伝子のプロモーター配列が，－１０領域にＴＡＴＡＡＴ配列を有するものであるから，構成要件１－Ｇ－２を充足する。
15

イ

構成要件１－Ｈについて

被告製法３は，被告製法１と同様に構成要件１－Ｈを充足する。
ウ

まとめ

前記ア及びイに記載のとおり，被告製法３は構成要件１－Ｇ－２及び１－Ｈを充足するから，本件発明１－４の技術的範囲に属する。
20275

別紙６－２

１

被告製法１及び３と本件訂正発明１との対比

被告製法１について
以下のとおり，被告製法１は，本件訂正発明１－１から１－３までの，いずれ5の技術的範囲にも属する。
(1)

本件訂正発明１－１との対比

ア

構成要件１－Ａ’－１について

被告製法１は，染色体上の遺伝子であるＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列の－３５領域にＴＴＧＴＣＡ配列を，－１０領域にＴＡＴＡＡＴ配列を導入したコリ10

ネ型細菌である「コリネバクテリウム・グルタミカム」を用いており，構成要件
１－Ａ’－１を充足する。
イ

構成要件１－Ａ’－２について

被告製法１は，染色体上の遺伝子であるＣＳ遺伝子のプロモーター配列の－１０領域にＴＡＴＡＡＴ配列を導入したコリネ型細菌である「コリネバクテリウム
15

・グルタミカム」を用いており，したがって，被告製法１は構成要件１－Ａ’－
２を充足する。
ウ

構成要件１－Ａ－３について

被告製法１においては，前記ア及びイのとおり，コリネ型細菌である「コリネバクテリウム・グルタミカム」を用いているから，被告製法１は構成要件１－Ａ20３を充足する。
エ構成要件１－Ｂ’について

被告製法１においては，コリネ型細菌である「コリネバクテリウム・グルタミ
カム」を，炭素源等を含んだ液体培地で培養し，グルタミン酸を生成蓄積させ，これを分離操作により，該培地から採取することを特徴とする発酵法を用いてい25るから，被告製法１は，構成要件１－Ｂ’を充足する。
オ

まとめ

276

前記アないしエに記載のとおり，被告製法１は，構成要件１－Ａ’－１，１－
Ａ’－２，１－Ａ－３及び１－Ｂ’を充足するから，本件訂正発明１－１の技術的範囲に属する。

5(2)

本件訂正発明１－２との対比

ア

構成要件１－Ｃ’－１，１－Ｃ’－２について

被告製法１においては，染色体上の遺伝子であるＧＤＨ遺伝子のプロモーター
配列に前記(1)アの配列を導入したコリネバクテリウム・グルタミカムを用いているから，被告製法１は，構成要件１－Ｃ’－１及び１－Ｃ’－２を充足する。
10

イ

構成要件１－Ｄについて

被告製法１は，前記(1)で述べたとおり，本件訂正１後の本件特許１の請求項
１記載の方法を用いているから，構成要件１－Ｄを充足する。
ウ

まとめ

前記ア及びイのとおり，被告製法１は構成要件１－Ｃ’－１，１－Ｃ’－２及
15

び１－Ｄを充足するから，本件訂正発明１－２の技術的範囲に属する。

(3)

本件訂正発明１－３との対比

ア

構成要件１－Ｇ’について

被告製法１においては，前記(1)イのとおり，コリネ型細菌の染色体上の遺伝20子であるＣＳ遺伝子のプロモーター配列が－１０領域にＴＡＴＡＡＴ配列を有するものであるから，構成要件１－Ｇ’を充足する。
イ

構成要件１－Ｇ’’について

被告製法１においては，染色体上の遺伝子であるＧＤＨ遺伝子のプロモーター
配列に前記(1)アの配列を導入したコリネバクテリウム・グルタミカムを用いて25いるから，構成要件１－Ｇ’’を充足する。
ウ

構成要件１－Ｈについて

277

被告製法１は，前記(1)のとおり，本件訂正１後の本件特許１の請求項１記載の方法を用いているから，構成要件１－Ｈを充足する。
エまとめ

前記アないしウに記載のとおり，被告製法１は構成要件１－Ｇ’，１－Ｇ’’
5

及び１－Ｈを充足するから，本件訂正発明１－３の技術的範囲に属する。

２

被告製法３について
被告製法３は，本件訂正発明１との関係においては，使用するコリネバクテリ

ウム・グルタミカムが，ＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列の点で被告製法１と異10なり，その他の点では被告製法１と共通している。
以下のとおり，被告製法３は，本件訂正発明１－１の技術的範囲に属する。
(1)

本件訂正発明１－１との対比

ア

構成要件１－Ａ’－１，構成要件１－Ａ’－２について

被告製法３は，染色体上の遺伝子であるＣＳ遺伝子のプロモーター配列の－１15０領域にＴＡＴＡＡＴ配列を導入したコリネ型細菌である「コリネバクテリウム
・グルタミカム」を用いており，したがって，被告製法３は構成要件１－Ａ’－
２を充足する。
イ

構成要件１－Ａ－３，１－Ｂ’について

被告製法３は，被告製法１同様，構成要件１－Ａ－３，１－Ｂ’を充足する。
20

ウ

まとめ

前記ア及びイのとおり，被告製法３は，構成要件１－Ａ’－２，１－Ａ－３及び１－Ｂ’を充足するから，本件訂正発明１－１の技術的範囲に属する。

(2)25

本件訂正発明１－３との対比

被告製法３は，構成要件１－Ｇ’’を充足しないから，本件訂正発明１－３の技術的範囲に属しない。

278

別紙７－１

１

被告製法１ないし３と本件発明２との対比

被告製法１について
以下のとおり，被告製法１で用いられる細菌は，本件発明２－１（請求項１），

5２－２（請求項４），２－３（請求項６）及び２－４（請求項１０）の技術的範囲に属するものであり，それを使用する被告製法１は，本件発明２－５（請求項１１）の技術的範囲に属する。

10

(1)

被告製法１で用いられる細菌と本件発明２－１との対比

ア

構成要件２－Ａについて

被告製法１においては，グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌である「コリネバクテリウム・グルタミカム」を用いており，被告製法１で用いられる細菌は，構成要件２－Ａを充足する。
イ

構成要件２－Ｂについて

被告製法１においては，ｙｇｇＢ遺伝子のアミノ酸配列における１００番目のア
15

ミノ酸がスレオニンに置換されている変異型ｙｇｇＢ遺伝子が導入されたコリネバ
クテリウム・グルタミカムを用いており，非改変株と比較してＬ－グルタミン酸生産能が向上しているものであって，被告製法１で用いられる細菌は，構成要件２－
Ｂを充足する。
ウ20

構成要件２－Ｃについて

被告製法１において用いられているコリネ型細菌であるコリネバクテリウム・グ
ルタミカムに導入された変異型ｙｇｇＢ遺伝子は，本件明細書２の配列番号６として記載されているアミノ酸配列の１００番目のアラニンをスレオニンに置換する変異が導入されている（構成要件２－Ｃの(ii)の変異）。
したがって，被告製法１で用いられるコリネ型細菌は構成要件２－Ｃを充足する。

25

エ

まとめ

前記アないしウ記載のとおり，被告製法１で用いられるコリネ型細菌は，構成要279

件２－Ａないし２－Ｃを充足するから，本件特許２の請求項１記載のコリネ型細菌
である。

5

(2)

被告製法１で用いられる細菌と本件発明２－２との対比

ア

構成要件２－Ｄについて

被告製法１において用いられているコリネバクテリウム・グルタミカムに導入された変異型ｙｇｇＢ遺伝子は，前記(1)ウのとおり，本件明細書２の配列番号６として記載されているアミノ酸配列の１００番目のアラニンをスレオニンに置換する変異が導入されているから，構成要件２－Ｄを充足する。
10

イ

構成要件２－Ｅについて

被告製法１で用いられる細菌は，前記(1)のとおり，本件特許２の請求項１に記載のコリネ型細菌であるコリネバクテリウム・グルタミカムであるから，構成要件２－Ｅを充足する。
ウ
15

前記ア及びイのとおり，被告製法１で用いられるコリネ型細菌は本件発明２－２の構成要件２－Ｄ及び２－Ｅを充足するから，本件特許２の請求項４記載のコリネ型細菌である。

20(3)

被告製法１で用いられる細菌と本件発明２－３との対比

ア

構成要件２－Ｆ－１，２－Ｆ－３について

被告製法１において用いられるコリネ型細菌であるコリネバクテリウム・グルタ
ミカムに導入された変異型ｙｇｇＢ遺伝子は，前記(1)ウのとおり，本件明細書２の配列番号６として記載されているアミノ酸配列の１００番目のアラニンをスレオニンに置換する変異が導入されているものであり，本件明細書２に配列番号２２として記載されたアミノ酸配列（２－Ｆ－３の(e)のアミノ酸配列）をコードするもので25ある。
したがって，この細菌は構成要件２－Ｆ－１及び２－Ｆ－３を充足する。

280

イ

構成要件２－Ｆ－２について

被告製法１において用いられるコリネ型細菌は，前記(1)及び(2)のとおり，本件特許２の請求項１及び４に記載のコリネ型細菌であるから，構成要件２－Ｆ－２を
充足する。
5

ウ

まとめ

前記のとおり，被告製法１で用いられるコリネ型細菌は本件発明２－３の構成要件２－Ｆ－１，２－Ｆ－２，２－Ｆ－３を充足するから，本件特許２の請求項６記載のコリネ型細菌である。

10

(4)

被告製法１で用いられる細菌と本件発明２－４との対比

ア

構成要件２－Ｇについて

被告製法１において用いられているコリネ型細菌は，前記(1)ないし(3)のとおり，
本件特許２の請求項１，４及び６に記載のコリネ型細菌である「コリネバクテリウ
ム・グルタミカム」であり，当該細菌はコリネバクテリウム属に属するコリネ型細15菌であるから，構成要件２－Ｇを充足する。
イ

まとめ

前記のとおり，被告製法１で用いられるコリネ型細菌は本件発明２－４の構成要件２－Ｇを充足するから，本件特許２の請求項１０記載のコリネ型細菌である。

20

(5)

被告製法１と本件発明２－５との対比

ア

構成要件２－Ｈについて

被告製法１においては，前記(1)ないし(4)のとおり本件特許２の請求項１，４，
６及び１０に記載のコリネ型細菌である「コリネバクテリウム・グルタミカム」が用いられており，当該細菌は炭素源をはじめとする各種原料を含んだ培地で培養さ25れる。
したがって，被告製法１は構成要件２－Ｈを充足する。

281

イ

構成要件２－Ｉについて

被告製法１は，コリネ型細菌であるコリネバクテリウム・グルタミカムを培養した培地である発酵液からグルタミン酸を回収するものであり，構成要件２－Ｉを充
足する。
ウ

5

構成要件２－Ｊについて

被告製法１は，グルタミン酸の製造方法であるから，構成要件２－Ｊを充足する。
エ前記アないしウ記載のとおり，被告製法１は構成要件２－Ｈないし２－Ｊを充足するから，本件発明２－５の技術的範囲に属する。

10２

被告製法２及び３について
被告製法２及び３においては，被告製法１と同じ変異型ｙｇｇＢ遺伝子が導入されたコリネバクテリウム・グルタミカムが使用されており，本件発明２との関係において，各構成要件の充足関係は被告製法１と同様である。
したがって，被告製法２及び３はいずれも，本件発明２－５の技術的範囲に属す
15

る。

282

別紙７－２

１

被告製法１ないし３と本件訂正発明２との対比

被告製法１について
以下のとおり，被告製法１で用いられる細菌は，本件訂正発明２－１（請求項１），

5２－２（請求項４），２－３（請求項６）及び２－４（請求項１０）の技術的範囲に属するものであり，それを使用する被告製法１は，本件訂正発明２－５（請求項１１）の技術的範囲に属する。

10

(1)

被告製法１で用いられる細菌と本件発明２－１との対比

ア

構成要件２－Ａについて

被告製法１においては，グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌である「コリネバクテリウム・グルタミカム」を用いており，被告製法１で用いられる細菌は，構成要件２－Ａを充足する。
イ

構成要件２－Ｂについて

被告製法１においては，ｙｇｇＢ遺伝子のアミノ酸配列における１００番目のア
15

ミノ酸がスレオニンに置換されている変異型ｙｇｇＢ遺伝子が導入されたコリネバ
クテリウム・グルタミカムを用いており，非改変株と比較してＬ－グルタミン酸生産能が向上しているものであって，被告製法１で用いられる細菌は，構成要件２－
Ｂを充足する。
ウ20

構成要件２－Ｃ’について

被告製法１において用いられているコリネ型細菌であるコリネバクテリウム・グ
ルタミカムに導入された変異型ｙｇｇＢ遺伝子は，本件明細書２の配列番号６として記載されているアミノ酸配列の１００番目のアラニンをスレオニンに置換する変異が導入されている（構成要件２－Ｃ’の(ii)の変異）。
したがって，被告製法１で用いられるコリネ型細菌は構成要件２－Ｃ’を充足す

25

る。
エ

まとめ

283

前記アないしウ記載のとおり，被告製法１で用いられるコリネ型細菌は，構成要件２－Ａ，２－Ｂ，２－Ｃ’を充足するから，本件特許２の本件訂正２後の請求項
１記載のコリネ型細菌である。

5(2)

被告製法１で用いられる細菌と本件訂正発明２－２との対比

ア

構成要件２－Ｅ’－１，２－Ｅ’－２について

被告製法１においては，前記(1)ア，イのとおり，変異型ｙｇｇＢ遺伝子が導入されたコリネバクテリウム・グルタミカムを用いており，被告製法１で用いられる細菌は構成要件２－Ｅ’－１及び２－Ｅ’－２を充足する。
10

イ

構成要件２－Ｄ’について

被告製法１で用いられているコリネ型細菌であるコリネバクテリウム・グルタミ
カムに導入された変異型ｙｇｇＢ遺伝子は，前記(1)ウのとおり，本件明細書２の配列番号６として記載されているアミノ酸配列の１００番目のアラニンをスレオニンに置換する変異が導入されているから，被告製法１で用いられるコリネ型細菌は構15

成要件２－Ｄ’を充足する。
ウ

前記ア及びイのとおり，被告製法１で用いられるコリネ型細菌は本件訂正発明２－２の構成要件２－Ｅ’－１，２－Ｅ’－２及び２－Ｄ’を充足するから，本件特許２の本件訂正２後の請求項４記載のコリネ型細菌である。

20

(3)

被告製法１で用いられる細菌と本件訂正発明２－３との対比

ア

構成要件２－Ｆ－１，２－Ｆ－３について

被告製法１において用いられるコリネ型細菌であるコリネバクテリウム・グルタ
ミカムに導入された変異型ｙｇｇＢ遺伝子は，前記(1)ウのとおり，本件明細書２の配列番号６として記載されているアミノ酸配列の１００番目のアラニンをスレオニ
25ンに置換する変異が導入されているものであり，本件明細書２に配列番号２２として記載されたアミノ酸配列（２－Ｆ－３の(e)のアミノ酸配列）をコードするもので

284

ある。
したがって，この細菌は構成要件２－Ｆ－１及び２－Ｆ－３を充足する。
イ

構成要件２－Ｆ’－２について

被告製法１において用いられるコリネ型細菌は，前記(1)及び(2)のとおり，本件
5

特許２の本件訂正２後の請求項１及び４に記載のコリネ型細菌であるから，構成要件２－Ｆ’－２を充足する。
ウ

まとめ

前記のとおり，被告製法１で用いられるコリネ型細菌は本件訂正発明２－３の構
成要件２－Ｆ－１，２－Ｆ’－２，２－Ｆ－３を充足するから，本件訂正２後の請10

求項６記載のコリネ型細菌である。

(4)

被告製法１で用いられる細菌と本件訂正発明２－４との対比

ア

構成要件２－Ｇ’について

被告製法１において用いられているコリネ型細菌は，前記(1)ないし(3)のとおり，
15

本件特許２の本件訂正２後の請求項１，４及び６に記載のコリネ型細菌である「コ
リネバクテリウム・グルタミカム」であり，当該細菌はコリネバクテリウム属に属するコリネ型細菌であるから，構成要件２－Ｇ’を充足する。
イ

まとめ

前記のとおり，被告製法１で用いられるコリネ型細菌は本件訂正発明２－４の構
20

成要件２－Ｇ’を充足するから，本件特許２の請求項１０記載のコリネ型細菌であ
る。

25

(5)

被告製法１と本件訂正発明２－５との対比

ア

構成要件２－Ｈ’について

被告製法１においては，前記(1)ないし(4)のとおり本件特許２の本件訂正２後の請求項１，４，６及び１０に記載のコリネ型細菌である「コリネバクテリウム・グ

285ルタミカム」が用いられており，当該細菌は炭素源をはじめとする各種原料を含んだ培地で培養される。
したがって，被告製法１は構成要件２－Ｈ’を充足する。
イ

構成要件２－Ｉ’について

被告製法１は，コリネ型細菌であるコリネバクテリウム・グルタミカムを培養し5た培地である発酵液からグルタミン酸を回収するものであり，構成要件２－Ｉ’を充足する。
ウ

構成要件２－Ｊについて

被告製法１は，グルタミン酸の製造方法であるから，構成要件２－Ｊを充足する。
エ10

前記アないしウ記載のとおり，被告製法１は構成要件２－Ｈ’，２－Ｉ’及び２－Ｊを充足するから，本件訂正発明２－５の技術的範囲に属する。

２

被告製法２及び３について
被告製法２及び３においては，被告製法１と同じ変異型ｙｇｇＢ遺伝子が導入さ15れたコリネバクテリウム・グルタミカムが使用されており，本件訂正発明２との関係において，各構成要件の充足関係は被告製法１と同様である。
したがって，被告製法２及び３はいずれも，本件訂正発明２－５の技術的範囲に
属する。

286

別紙７－３

１

被告製法１ないし３と本件再訂正発明２との対比

被告製法１について
以下のとおり，被告製法１で用いられる細菌は，本件再訂正発明２－２（請求項5４），２－３（請求項１３）の技術的範囲に属するものであり，それを使用する被告製法１は，本件再訂正発明２－６（請求項１４）の技術的範囲に属する。
(1)

被告製法１で用いられる細菌と本件再訂正発明２－２との対比

本件再訂正発明２－２は，本件訂正発明２－２と同内容であり，別紙７－２被告
製法１ないし３と本件訂正発明２との対比の１(2)記載のとおり，被告製法１で用10いられるコリネ型細菌は本件訂正２－２の構成要件２－Ｅ’－１，２－Ｅ’－２及び２－Ｄ’を充足するから，本件特許２の本件訂正２後の請求項４記載のコリネ型細菌である。

15(2)

被告製法１で用いられる細菌と本件再訂正発明２－３との対比

ア

構成要件２－Ｆ’－１，２－Ｆ’－３について

被告製法１において用いられるコリネ型細菌であるコリネバクテリウム・グルタ
ミカムに導入された変異型ｙｇｇＢ遺伝子は，本件明細書２の配列番号６として記載されているアミノ酸配列の１００番目のアラニンをスレオニンに置換する変異が導入されているものであり，本件明細書２に配列番号２２として記載されたアミノ20

酸配列（２－Ｆ’－３の(e)のアミノ酸配列）をコードするものである。
したがって，この細菌は構成要件２－Ｆ’－１及び２－Ｆ’－３を充足する。
イ

構成要件２－Ｆ’’－２について

被告製法１において用いられるコリネ型細菌は，前記(1)のとおり，本件特許２の再訂正後の請求項４に記載のコリネ型細菌であるから，構成要件２－Ｆ’’－２を
25

充足する。
ウ

まとめ

287

前記ア及びイのとおり，被告製法１で用いられるコリネ型細菌は本件再訂正発明
２－３の構成要件２－Ｆ’－１，２－Ｆ’’－２，２－Ｆ’－３を充足するから，
本件特許２の再訂正後の請求項１３記載のコリネ型細菌である。

5(3)

被告製法１と本件再訂正発明２－６との対比

ア

構成要件２－Ｋについて

被告製法１においては，前記(2)のとおり本件特許２の再訂正後の請求項１３記載のコリネ型細菌であるコリネバクテリウム・グルタミカムが用いられており，当
該細菌は炭素源をはじめとする各種原料を含んだ培地で培養される。
したがって，被告製法１は構成要件２－Ｋを充足する。

10

イ

構成要件２－Ｌについて

被告製法１は，コリネ型細菌であるコリネバクテリウム・グルタミカムを培養した培地である発酵液からグルタミン酸を回収するものであり，構成要件２－Ｌを充
足する。
ウ

15

構成要件２－Ｍについて

被告製法１は，グルタミン酸の製造方法であるから，構成要件２－Ｍを充足する。
エ前記アないしウ記載のとおり，被告製法１は構成要件２－Ｋ，２－Ｌ及び２－Ｍを充足するから，本件再訂正発明２－６の技術的範囲に属する。

20２

被告製法２及び３について
被告製法２及び３においては，被告製法１と同じ変異型ｙｇｇＢ遺伝子が導入されたコリネバクテリウム・グルタミカムが使用されており，本件再訂正発明２との関係において，各構成要件の充足関係は被告製法１と同様である。
したがって，被告製法２及び３はいずれも，本件再訂正発明２－６の技術的範囲
25

に属する。

288

別紙８－１

１

5

被告製法４と本件発明２との対比

被告製法４で用いられる菌株と本件発明２－１，２－２，２－３の対比(1)

被告製法４で用いられる菌株と本件発明２－１との対比

ア

構成要件２－Ａについて

被告製法４においては，グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌である「コリネバクテリウム・グルタミカム」を用いており，被告製法４で用いられる菌株は，構成要件２－Ａを充足する。
イ10

構成要件２－Ｂについて

被告製法４で用いられる菌株には，野生型のコリネバクテリウム・カルナエのＹ
ｇｇＢの９８位のアラニンがスレオニンに（Ａ９８Ｔ変異），２４１位のバリンがイソロイシンに（Ｖ２４１Ｉ変異）置換された変異型ｙｇｇB遺伝子が導入されている。また，グルタミン酸の生産量は，非改変株と比較して増加しているから，構成
要件２－Ｂを充足する。

15

ウ

構成要件２－Ｃについて

被告製法４で用いられる菌株は，前記イのとおりの変異型ｙｇｇＢ遺伝子が導入されたコリネ型細菌であるコリネバクテリウム・グルタミカムである。この変異型
ｙｇｇＢ遺伝子は，本件明細書２の配列番号６として記載されているアミノ酸配列のアミノ酸番号１００番のアラニンがスレオニンに置換されたアミノ酸配列（（ii）
20の変異）をコードするＤＮＡと一致せず，その他の構成要件２－Ｃに規定する変異が導入されたものではない。
したがって，被告製法４で用いられる菌株は，構成要件２－Ｃを充足しない。

25

(2)

被告製法４で用いられる菌株と本件発明２－２との対比

ア

構成要件２－Ｄについて

被告製法４で用いられる菌株は，前記(1)イのとおりであるから，その変異は，本289

件明細書２の配列番号６として記載されているアミノ酸配列のアミノ酸番号１００番のアラニンがスレオニンに置換されたものとは一致せず，その他の構成要件２－
Ｄに規定する変異が導入されたものではない。
イ

構成要件２－Ｅについて

被告製法４で用いられる菌株は，構成要件２－Ｅのうち，前記(1)のとおり，本件

5

発明２－１の構成要件２－Ｃに係る部分を充足しない。

(3)

被告製法４で用いられる菌株と本件発明２－３との対比

被告製法４で用いられる菌株は，前記(1)イのとおりであり，その変異型ｙｇｇＢ10遺伝子は本件明細書２の配列番号６として記載されているアミノ酸配列のアミノ酸
番号１００番のアラニンがスレオニンに置換されたアミノ酸配列（２－Ｆ－３の(e)の配列番号２２として記載されているアミノ酸配列）をコードするＤＮＡとは一致せず，その他，構成要件２－Ｆ－３に規定する変異が導入されたものではない。
また，前記(1)，(2)によれば，構成要件２－Ｆ－２も充足しない。
したがって，被告製法４で用いられる菌株は，構成要件２－Ｆ－１，２－Ｆ－２，

15

２－Ｆ－３を充足しない。

２

被告製法４と本件発明２－５との対比(1)

20

構成要件２－Ｈについて

被告製法４においては，使用されるコリネ型細菌は炭素源をはじめとする各種原料を含んだ培地で培養される。
したがって，使用される菌株が請求項６（本件発明２－３）に記載のコリネ型細菌と均等であれば，構成要件２－Ｈを充足する。

25

(2)

構成要件２－Ｉについて

被告製法４は，コリネ型細菌を培養した培地である発酵液からグルタミン酸を回290収するものであり，構成要件２－Ｉを充足する。

(3)

構成要件２－Ｊについて

被告製法４は，グルタミン酸の製造方法であるから，構成要件２－Ｊを充足する。
5291

別紙８－２１5被告製法４と本件訂正発明２との対比

被告製法４で用いられる菌株と本件訂正発明２－２，２－３の対比(1)

被告製法４で用いられる菌株と本件訂正発明２－２との対比

ア

構成要件２－Ｅ’－１について

被告製法４においては，グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌である「コリネバクテリウム・グルタミカム」を用いており，被告製法４で用いられる菌株は，構成要件２－Ｅ’－１を充足する。
イ10

構成要件２－Ｅ’－２について

被告製法４で用いられる菌株には，野生型のコリネバクテリウム・カルナエのＹ
ｇｇＢの９８位のアラニンがスレオニンに（Ａ９８Ｔ変異），２４１位のバリンがイソロイシンに（Ｖ２４１Ｉ変異）置換された変異型ｙｇｇB遺伝子が導入されている。また，グルタミン酸の生産量は，非改変株と比較して増加しているから，構成
要件２－Ｅ’－２を充足する。

15

ウ

構成要件２－Ｄ’について

被告製法４で用いられる菌株は，前記イのとおりであり，その変異は，本件明細書２の配列番号６として記載されているアミノ酸配列のアミノ酸番号１００番のア
ラニンがスレオニンに置換されたものとは一致せず，その他の構成要件２－Ｄ’に規定する変異が導入されたものではないから，構成要件２－Ｄ’を充足しない。
20(2)

被告製法４で用いられる菌株と本件訂正発明２－３との対比

被告製法４で用いられる菌株は，前記(1)イのとおりであり，その変異型ｙｇｇＢ遺伝子は本件明細書２の配列番号６として記載されているアミノ酸配列のアミノ酸
番号１００番のアラニンがスレオニンに置換されたアミノ酸配列（２－Ｆ－３の(e)25の配列番号２２として記載されているアミノ酸配列）をコードするＤＮＡとは一致せず，その他，２－Ｆ－３に規定する変異が導入されたものではない。

292

また，前記(1)によれば，構成要件２－Ｆ’－２も充足しない。
したがって，被告製法４で用いられる菌株は，構成要件２－Ｆ－１，２－Ｆ’－
２，２－Ｆ－３を充足しない。

5２

被告製法４と本件訂正発明２－５との対比(1)

構成要件２－Ｈ’について

被告製法４においては，使用されるコリネ型細菌は炭素源をはじめとする各種原料を含んだ培地で培養される。
したがって，使用される菌株が訂正後の請求項６（本件訂正発明２－３）に記載
10のコリネ型細菌と均等であれば，構成要件２－Ｈ’を充足する。

(2)

構成要件２－Ｉ’について

被告製法４は，コリネ型細菌を培養した培地である発酵液からグルタミン酸を回収するものであり，構成要件２－Ｉ’を充足する。
15(3)

構成要件２－Ｊについて

被告製法４は，グルタミン酸の製造方法であるから，構成要件２－Ｊを充足する。

293

別紙８－３

１

被告製法４と本件再訂正発明２との対比

被告製法４で用いられる菌株と本件再訂正発明２－２，２－３の対比(1)

被告製法４で用いられる菌株と本件再訂正発明２－２の対比

本件再訂正発明２－２は，本件訂正発明２－２と同一である。したがって，別紙

5８－２被告製法４と本件訂正発明２との対比の１(1)のとおり，被告製法４で用いられる菌株は，構成要件２－Ｅ’－１及び２－Ｅ’－２を充足し，構成要件２－Ｄ’を充足しない。

(2)

10

被告製法４で用いられる菌株と本件再訂正発明２－３の対比

被告製法４で用いられる菌株は，野生型のコリネバクテリウム・カルナエのＹｇ
ｇＢの９８位のアラニンがスレオニンに（Ａ９８Ｔ変異），２４１位のバリンがイ
ソロイシンに（Ｖ２４１Ｉ変異）置換された変異型ｙｇｇＢ遺伝子が導入されたコリネ型細菌であるコリネバクテリウム・グルタミカムであり，その変異型ｙｇｇＢ15遺伝子は本件明細書２の配列番号６として記載されているアミノ酸配列のアミノ酸
番号１００番のアラニンがスレオニンに置換されたアミノ酸配列（２－Ｆ’－３の(e)の配列番号２２として記載されているアミノ酸配列）をコードするＤＮＡとは一致せず，その他，構成要件２－Ｆ’－３に規定する変異が導入されたものではない。
また，前記(1)によれば，構成要件２－Ｆ’’－２も充足しない。

20

したがって，被告製法４で用いられる菌株は，構成要件２－Ｆ’－１，２－Ｆ’’－２，２－Ｆ’－３を充足しない。

２
25

被告製法４と本件再訂正発明２－６との対比(1)

構成要件２－Ｋについて

被告製法４においては，使用されるコリネ型細菌は炭素源をはじめとする各種原294

料を含んだ培地で培養される。
したがって，使用される菌株が本件特許２の再訂正後の請求項１３（本件再訂正
発明２－３）に記載のコリネ型細菌と均等であれば，構成要件２－Ｋを充足する。

5(2)

構成要件２－Ｌについて

被告製法４は，コリネ型細菌を培養した培地である発酵液からグルタミン酸を回収するものであり，構成要件２－Ｌを充足する。

(3)
10

構成要件２－Ｍについて

被告製法４は，グルタミン酸の製造方法であるから，構成要件２－Ｍを充足する。

295

別紙９

本件ＭＳＧの製法についての主張対比表
被告の主張
期間

●(省略)●

番 菌株

CS

号 番号

-10

①

GDH
-35

-10

原告の

的主張

主位的

ｙｇｇ

主張

Ｂ

資料がなく，不知A100●(省略)●

原告の予備②

TATAAT

TTGTCATATAAT

T

被告製法
１

＊
③ ●（省 ● （ 省 ● （ 省 ● （ 省

A100

被告製法

●(省略)●
略)●

略)●

略)●

略)●

④ ●（省 ● （ 省 ● （ 省 ● （ 省

T
A100

２
被告製法

●(省略)●略)●略)●⑤ ●（省 TATAAT

略)●

略)●

T

●（省

●（省

A100

略)●

略)●

T

●（省

●（省

A100

略)●

略)●

T

●（省

●（省

A100

略)●

略)●

T

２
被告製法

●(省略)●略)●３
被告⑥ ●（省 TATAAT

被告製法●(省略)●

製法
略)●

３
１

⑦ ●（省 TATAAT

被告製法●(省略)●略)●⑧ ●（省 ● （ 省 ● （ 省 ● （ 省

A100

３
被告製法

●(省略)●
略)●

略)●

略)●

略)●

⑨ ●（省 ● （ 省 ● （ 省 ● （ 省

T
A100

２
被告製法

●(省略)●●(省略)●

略)●

略)●

略)●

略)●

T

●（省

●（省

●（省

●（省

A100

略)●

略)●

略)●

略)●

T

２
被告製法

⑩
⑪ ●（省 ● （ 省 ● （ 省 ● （ 省

A100

２
被告製法

●(省略)●
略)●

略)●

略)●

296

略)●

T

２

⑫ ●（省 ● （ 省 ● （ 省 ● （ 省●(省略)●

被告製法
**

略)●

略)●

略)●

４

略)●

⑬ ●（省 ● （ 省 ● （ 省 ● （ 省●(省略)●
略)●●(省略)●

＊＊

略)●

略)●

略)●

略)●

４

略)●

⑭ ●（省 ● （ 省 ● （ 省 ● （ 省
略)●

＊

被告製法
**

略)●

変異
なし

１００位のアラニンがスレオニンに置換されている。
コリネバクテリウム・グルタミカムのｙｇｇＢのうち●（省略）●コリネバ

クテリウム・カルナエ由来のｙｇｇＢのうち，９８位のアラニンがスレオニンに，
２４１位のバリンがイソロイシンに置換されている。
5

297

別紙１０
１

販売金額・数量一覧表

販売金額（平成２３年分から平成２９年分まで）

被告販
売分
CJイン
ドネシ
ア販売
分
合計販
売金額

平成23年

平成24年

平成25年

平成26年

平成27年

平成28年

平成29年

計

●(省略)●●(省略)●●(省略)●●(省略)●●(省略)●●(省略)●●(省略)●●(省略)●●(省略)●●(省略)●●(省略)●●(省略)●●(省略)●●(省略)●●(省略)●●(省略)●●(省略)●●(省略)●●(省略)●●(省略)●●(省略)●●(省略)●●(省略)●●(省略)●（単位は千円）
5２

販売数量（平成２３年分から平成２９年分まで）

被告販売分

平成23年

平成24年

平成25年

平成26年

平成27年

平成28年

平成29年

計

●省略●

●省略●

●省略●

●省略●

●省略●

●省略●

●省略●

●省略●

●省略●

●省略●

●省略●

●省略●

●省略●

●省略●

●省略●

●省略●

●省略●

●省略●

●省略●

●省略●

●省略●

●省略●

●省略●

●省略●

CJ イ ン ド ネ
シア販売分
合計
販売量

（単位はＭＴ）

298

別紙１１－１

損害額の主張１（被告ら販売分全体に対する特許法１０２条２項による損害額）【原告の主張】１
5

主張の概要

本文第３の１５【原告の主張】(1)のとおり，被告ら販売分の全体について，被告とＣＪインドネシアとの間には共同不法行為の成立が認められ，被告は，被告ら販売分全体について対応する本件各特許権侵害の不法行為責任を負う。
したがって，対象期間（後記２のとおり，本件特許権２との関係では，そのうち
平成２５年８月２３日以降の期間）中の，被告ら販売分全体に対する被告らの利益

10

全体が，特許法１０２条２項により被告が賠償すべき損害額となる。
２

対象期間における被告らの利益

(1)

売上高

対象期間中の被告ら販売分に係る売上高は，合計●（省略）●円である（本文
第３の１５【原告の主張】(2)）。
15(2)

被告らの経費について

ア

被告らの販売数量

対象期間中の被告らの販売数量は，本文第３の１５【原告の主張】(2)のとお
りである。

20

イ

本件ＭＳＧの製造コスト(ｱ)

１トン当たりの製造コスト

平成２１年から平成２６年の本件ＭＳＧの１トン当たりの製造コスト（単位は米ドル）は，以下の表のとおりである。
これは，被告開示資料（乙１０７）のうち，発酵原料費，精製原料費，水道光
熱費，梱包費の合計である。なお，同資料に，固定費（労働，減価償却，その25他）として記載されている費用は，特許法１０２条２項の利益の算定に当たり，経費として算入されるべきものではない。

299

同資料には，その他の年のコストについて記載されていないので，平成１９年
及び平成２０年については平成２１年と，平成２７年から平成２９年までについては平成２６年と，それぞれ同額であるとして計算する。
平成21年

平成22年

平成23年

平成24年

平成25年

平成26年

●（省略）●●（省略）●●（省略）●●（省略）●●（省略）●●（省略）●(ｲ)
5円ドル為替レート

対象期間中の米ドルの円への為替レートは以下の表のとおりである。
平成19年

平成20年

平成21年

117.8

103.4

93.6

平成25年

平成26年

平成27年

97.6

105.9

121.0

(ｳ)

平成22年

平成23年

87.8

79.8

平成28年

平成29年

108.8

112.2

平成24年
79.8

円建ての製造コスト

前記アの販売数量に，前記(ｱ)の１トン当たりの製造コスト及び前記(ｲ)の為替レートを乗じて計算すると，対象期間中の被告ら販売分に係る製造コストは，合計●（省略）●円となる。
10

ウ

国際輸送費

対象期間中の本件ＭＳＧ１トン当たりの国際輸送費（インドネシアの工場から日本までの輸送費をいう。以下同じ。）は，以下のとおり算出される。
(ｱ)

米ドル建ての１トン当たりの国際輸送費は以下の表のとおりである（単位は米ドル。）。

15

平成23

平成24

平成25

平成26

平成27

平成28

平成29

年

年

年

年

年

年

年

●省略●

●省略●

●省略●

●省略●

●省略●

●省略●

●省略●

(ｲ)

前記(ｱ)の米ドル建ての費用額を，前記イ(ｲ)の為替レートを用いて換算すると，１トン当たり平均●（省略）●円となり，同額を対象期間中の国際輸送費の算定に用いるのが相当である。
300

したがって，前記アの対象期間中の被告ら販売数量についての国際輸送費は合計●（省略）●円となる。
エ

国内運送費その他の販管費

被告が開示した資料（乙９９）に記載された被告の販管費のうち，特許法１０5２条２項の利益の計算において経費として認められるべきものは，以下の表の運送費及び倉庫費のみである。また，平成１９年から平成２２年のこれらの経費の額は不明であるので，平成２３年と同額として算定する。
そうすると，対象期間中の被告ら販売分に係る販管費として経費と認められるべき額は，合計●（省略）●円となる。
平成

平成

平成

平成

平成

平成

平成

23年

24年

25年

26年

27年

28年

29年

運送

●（省

●（省

●（省

●（省

●（省

●（省

●（省

費

略）●

略）●

略）●

略）●

略）●

略）●

略）●

倉庫

●（省

●（省

●（省

●（省

●（省

●（省

●（省

費

略）●

略）●

略）●

略）●

略）●

略）●

略）●

（単位はいずれも千円）

10

オ

経費合計

対象期間中の被告ら販売分について，考慮すべき経費の合計は前記イないしエの合計の●（省略）●円となる。
(3)
15

被告らの利益前記(1)の売上高から前記(2)オの経費合計を控除すると，対象期間中の被告ら販売分に係る被告らの利益は４９億９４８８万５９７０円となる。
３

本件特許権２についての対象期間（平成２５年８月２３日から平成２９年１２月３１日まで）における損害額
(1)
20

売上高

被告ら販売分に係る平成２５年分の売上高●（省略）●円のうち，平成２５年

301

８月２３日から同年末日までの分は，日数で按分して，●（省略）●円と推定される。
平成２６年分から平成２９年分の売上高は，別紙１０販売金額・数量一覧表記
載１のとおりであるから，被告ら販売分に係る，本件特許権２についての対象期5間における売上高は●（省略）●円となる。
(2)

被告らの経費について

平成２５年分の費用について，同年８月２３日以降の分を日数で按分して計算
し，平成２６年分から平成２９年分については，前記２(2)に記載した方法で計算すると，本件特許権２についての対象期間中の被告ら販売分について，経費と1015して認められるべき額は，おおよそ以下のとおりとなる。
ア

製造コスト

●（省略）●円

イ

国際輸送費●（省略）●円

ウ

国内運送費，倉庫費，その他の販管費(3)

被告らの利益●（省略）●円

前記(1)の売上高から前記(2)の経費を控除すると，本件特許権２についての対象
期間中の被告ら販売分に係る被告らの利益はおおよそ２９億１７４５万５０００円となる。
４本件各特許権侵害による損害賠償請求相互の関係

対象期間のうち，平成１９年１月１日から平成２５年８月２２日までの期間は20

本件特許権１のみが侵害され，同月２３日以後の本件特許権２についての対象期間については，本件各特許権の双方が侵害されている。
特許法１０２条２項による損害額の推定においては，本件特許権１のみを侵害した期間については，当該期間の被告らの利益全額が本件特許権１の侵害による損害と認められる。そして，本件各特許権の双方を侵害した期間については，そ25

れぞれの特許権の侵害について，当該期間の被告らの利益全額がその損害と推定されるものの，同法１０２条の趣旨に鑑み，被告の支払義務は当該期間の被告ら

302

の利益全額の範囲に留まる。
原告は，本件特許権１の侵害について，その侵害された期間である対象期間全体の被告らの利益４９億９４８８万５９７０円（前記２）の損害を被ったと推定される。そして，本件特許権２の侵害については，その侵害された期間である本
5

件特許権２についての対象期間中の被告らの利益２９億１７４５万５０００円（前記３）の損害を被ったと推定されるが，これは，当該期間中の本件特許権１の侵害による損害と重複するので，当該期間中の本件各特許権の侵害について
は，２９億１７４５万５０００円の範囲で，本件各特許権に基づく請求を選択的
に行う。

10

また，対象期間を通じた損害としては，前記２の４９億９４８８万５９７０円となる範囲内で，本件各特許権に基づく請求を選択的に行う。そして，原告が本件訴訟で一部請求するのは，そのうち９億円である。

15

５

覆滅事由について(1)

競合品の販売による覆滅（シェアに応じた減額）について

被告は，グルタミン酸ナトリウムのシェアに応じた減額がなされるべきであると主張するが，特許法１０２条２項の推定の覆滅させるためには，原告が被告ら
販売分の全てを販売できない理由について具体的な立証を行う必要があり，シェアに基づく覆滅は相当でない。
被告は，被告ら販売分を除いたインドネシアから日本へのグルタミン酸ナトリ

20

ウムの輸入量のうち，原告による輸入量は半分であったと主張するが，実際はそのほとんどは原告によるものであり，輸入量に占めるシェアについての被告の計算は相当でない。また，乙第１１７号証の分析においては，グルタミン酸として輸入されて，国内でグルタミン酸ナトリウムに加工されるもの（そのほとんどが原告によるものである。）を考慮していない点でも相当でない。

25

(2)

本件各特許権の損害に対する寄与の程度による覆滅について

被告は，グルタミン酸の生産工程等を峻別して，本件各特許の寄与度を主張す303

るが，本件各特許は，特定の菌を用いたグルタミン酸の製造方法であり，被告らは当該特定の菌を用いて製造されたグルタミン酸を販売しているのであるから，本件各特許の寄与度は１００％というべきであり，寄与度による覆滅は理由がない。
5６

覆滅部分についての特許法１０２条３項の重畳適用について

仮に，競合品の存在による損害推定の覆滅を認める場合，覆滅された部分については，別紙１１－２の特許法１０２条３項による実施料相当額の損害額が認定されるべきである。
【被告の主張】
10

１

主張の概要

原告の損害主張は争う。
本文第３の１５【被告の主張】(1)のとおり，ＣＪインドネシア販売分について，
被告は損害賠償責任を負わないから，特許法１０２条２項の損害額の算定に当たって，ＣＪインドネシア販売分を考慮すべきではない。
15

また，本文第３の１５【被告の主張】(2)のとおり，平成１９年分から平成２２年分の販売金額・販売数量についての原告の主張は相当でない。
２

控除すべき経費について控除すべき経費額についての原告の主張は争う。
(1)
20

販管費について販管費（乙１０１）としては，運送費及び倉庫費のほか，人件費，サービス費
用，その他の諸費用を考慮すべきである。販管費の額は，平成２３年分から平成
２９年分の合計は，被告販売分につき●（省略）●円，ＣＪインドネシア販売分につき●（省略）●円である。乙第１０１号証には平成２３年分以降の販管費のみ記載しているが，平成１９年分から平成２２年分についての利益を仮に考慮す25

る場合には，当該期間の販管費についても，本文第３の１５【被告の主張】(2)イと同様の計算式によって，売上同様の推計をすべきであり，被告販売分につき304

合計●（省略）●円，ＣＪインドネシア販売分につき合計●（省略）●円である。
被告においては，会計処理上，本件ＭＳＧに関する運送費及び倉庫費全体を，被告販売分とＣＪインドネシア販売分に関する費用（実際には発生していないも5の）に配分して計上していた。
また，被告においては，人件費等の各事業に共通の経費については，被告全体の経費額を社内の基準に基づいて各事業部署に比例配分しており，本件ＭＳＧの販売に関わる事業部署に配分された費用のうち，売上げに占める割合に応じて，本件ＭＳＧに関する費用が算出される。さらには，会計上，本件ＭＳＧに関し

10て，被告販売分とＣＪインドネシア販売分に関する費用の間でも経費の配分を行っている。このうち，人件費については事業部の人件費と間接部門の人件費が含まれるが，少なくとも，以下の表に示す事業部の人件費は，営業の業務量に依存するから，本件ＭＳＧの販売に直接関連して追加的に必要となった経費として控除されるべきである。
平成23

平成24

平成25

平成26

平成27

平成28

平成29

年

年

年

年

年

年

年

●省略●

●省略●

●省略●

●省略●

●省略●

●省略●

●省略●

（単位は千円）

15(2)

仕入費用について被告販売分の利益を考慮するに当たっては，その仕入れに要した費用を考慮すべきである。
平成２３年分から平成２９年分までの仕入費用の合計は●（省略）●円である
20（乙９９，１０１）。また，乙第１０１号証には平成２３年分以降の販管費のみ記載しているが，平成１９年分から平成２２年分についての利益を仮に考慮する
場合には，当該期間の仕入費用についても，本文第３の１５【被告の主張】(2)イと同様の計算式によって，売上同様の推計をすべきであり，その合計は●（省305略）●円である。
３

本件各特許権侵害による損害賠償請求相互の関係

原告は，特許法１０２条２項によって推定される損害額について，１つの特許権が侵害された場合と２つの特許権が侵害された場合の損害額は，いずれも侵害
5

者の利益全額であって同じであると主張している。しかしながら，侵害された特許権の個数が少ない方が損害額は小さくなるべきであり，原告の主張は不合理である。
複数の特許権が侵害された場合には，１つの特許権侵害について特許法１０２条２項の侵害行為により侵害者が受けた利益とは，侵害者の利益全額ではないと10解すべきである。このように解さないとしても，少なくとも後記４(2)のとおり，侵害された特許権の数及び各特許権の貢献の程度に応じて推定の覆滅が認められるべきである。
４

覆滅事由について

特許法１０２条２項による損害額の推定は以下の事情によって覆滅されるべきで
15

ある。
(1)

競合品の販売（シェアに応じた減額）

被告販売分の利益及びＣＪインドネシア販売分の利益のいずれについても，シ
ェアに応じた損害額の減額がなされるべきである。
本件ＭＳＧはグルタミン酸ナトリウムという化学物質であり，製造方法によっ
20て製品の違いは生じず，顧客は製造方法に関心を有していない。被告ないしＣＪ
インドネシアが本件ＭＳＧを販売できなかったとしても，その分全てを原告が販売できたわけではなく，原告は自らのシェアに応じた分のみ販売できたにすぎない。
財務省の貿易統計に基づいて分析すると（乙１０１添付資料７，乙１１７），25

インドネシアから日本に輸入されたグルタミン酸ナトリウムのうち，被告ら販売分を控除した場合，原告が製造販売しているものはその半分である。また，その306

他の国からの輸入も考慮すると，被告ら販売分を控除した場合，グルタミン酸ナトリウムの輸入量のうち，原告が製造販売しているものが占める割合は約●（省略）●％である。
(2)5

本件各特許権の損害に対する寄与の程度

本件各特許は，複雑かつ多様な工程を備えたグルタミン酸の製造方法のうちごく一部に寄与しているにすぎない。
グルタミン酸の製造は，発酵段階と精製段階の２つに大別され，発酵段階には少なくとも６つの項目が存在する。
本件特許１は,発酵段階の６つの項目のうち１つの生合成に関するものであ

10り，さらに生合成の４つの反応のうち１つに関わるものであるから，グルタミン酸の製造方法に対する寄与は最大でも約２％である（１／２×１／６×１／４＝
１／４８）。
本件特許２は,発酵段階の６つの項目のうち１つのグルタミン酸の体外への排出の技術開発に関するものであるから，グルタミン酸の製造方法に対する寄与は

15

最大でも約８．３％である（１／２×１／６＝１／１２）。
したがって，特許法１０２条２項による損害の算定に当たっては，本件各特許の寄与率として上記の各割合が考慮されるべきであり，あるいは，上記の割合まで推定の覆滅が認められるべきである。
５20

覆滅部分についての特許法１０２条３項の重畳適用について競合品によって特許法１０２条２項の推定が覆滅される場合，覆滅される部分に同条３項の規定を重畳適用することは許されないと解すべきである。
以上

307

別紙１１－２

損害額の主張２（被告ら販売分全体に対する特許法１０２条３項による損害額）【原告の主張】
5

１

主張の概要

本文第３の１５【原告の主張】(1)のとおり，被告ら販売分の全体について，被告とＣＪインドネシアとの間には共同不法行為の成立が認められ，被告は，被告ら販売分全体について対応する本件各特許権侵害の不法行為責任を負う。
したがって，平成１９年１月１日から平成２９年１２月３１日までの対象期間（後10

記２のとおり，本件特許権２との関係では，そのうち平成２５年８月２３日以降の期間）中の，被告ら販売分全体についての実施料相当額が，特許法１０２条３項により被告が賠償すべき損害額となる。
２

本件各特許権に係る実施料率

本件各特許権に係る実施料率は，それぞれ販売数量１ｋｇ当たり３０円が相当で15ある。
１ｋｇ当たり３０円というのは，被告販売分の売上金額に対する料率で示すと
約●（省略）●％となる。
「ロイヤルティ料率データハンドブック」によればバイオテクノロジーのロイ
ヤルティ料率の平均値は６．２％とされているが，特許侵害訴訟において認定さ20れる料率は通常の実施料率よりも高く認定されるべきであるし，本件各特許に係る発明の価値が高く，利益への貢献が大きいことからしても，高い実施料率が認定されるべきである。特に，本件においては，●（省略）●このような事情も実施料率の算定に当たって考慮されるべきである。
３25

本件特許権１についての実施料相当額

対象期間中の被告ら販売分に係る販売数量は，本文第３の１５【原告の主張】

308

(2)のとおり，●（省略）●トンであり，これに１ｋｇあたり３０円を乗じた●（省略）●円が，本件特許権１についての実施料相当額となる。

5４

本件特許権２についての実施料相当額(1)

本件特許権２についての対象期間における販売数量

被告ら販売分に係る平成２５年分の販売数量●（省略）●トンのうち，平成２
５年８月２３日から同年末日までの分は，日数で按分して，●（省略）●トンと推定される。
平成２６年分から平成２９年分の販売数量は，別紙１０販売金額・数量一覧表
記載２のとおりであるから，被告ら販売分に係る，本件特許権２についての対象

10

期間における販売数量は●（省略）●トンとなる。
(2)

本件特許権２についての対象期間における実施料相当額

本件特許権２の実施料相当額は，前記(1)の販売数量●（省略）●トンに，１ｋｇあたり３０円を乗じた●（省略）●円となる。
５15本件各特許権侵害による損害賠償請求相互の関係

本件特許権２についての対象期間については，本件特許権１と本件特許権２の双方が侵害されており，本件特許権１の侵害についての実施料相当額も前記４(2)と同額であるが，当該期間中の本件各特許権の侵害については，合計●（省略）●円の範囲内で本件各特許権に基づく請求を選択的に行う。
また，対象期間を通じた損害としては，前記３の合計●（省略）●円となる範20

囲内で，本件各特許権に基づく請求を選択的にするものである。そして，原告が本件訴訟で一部請求するのは，そのうち９億円である。
【被告の主張】１

主張の概要

本文第３の１５【被告の主張】(1)のとおり，ＣＪインドネシア販売分について，
25

被告は損害賠償責任を負わないから，特許法１０２条３項の損害額の算定に当たって，ＣＪインドネシア販売分を考慮すべきではない。

309

また，本文第３の１５【被告の主張】(2)のとおり，実施料相当額算定の基礎となるべき，平成１９年分から平成２２年分の販売数量についての原告の主張は相当でない。
２5

本件各特許権に係る実施料率

原告は特許権ごとに売上金額の約１８．６％もの実施料率を主張するが，これは相場から著しく乖離しており，実施料率についての原告の主張は争う。
①当該技術分野での一般的な実施料率，②本件各特許に係る発明は，いずれも汎用品の製造方法に関するものであり，代替技術が存在すること，③本件各特許に係る発明は，いずれもグルタミン酸の製造プロセスのうち，発酵工程中の一部

10にのみ使用されており，利益への寄与，効果が小さいことに照らせば，本件各特許権に係る実施料率は低く，１％以下が相当である。
以上

310

別紙１１－３

損害額の主張３（被告販売分につき特許法１０２条３項，ＣＪイン

ドネシア販売分につき同条２項による損害額）【原告の主張】１
5

主張の概要

本文第３の１５【原告の主張】(1)によれば，少なくとも，ＣＪインドネシア販売
分について，被告とＣＪインドネシアとの間には共同不法行為の成立が認められる。
したがって，対象期間（本件特許権２との関係では，そのうち平成２５年８月２３日以降の期間）中の被告ら販売分のうち，被告販売分については特許法１０２条
３項に基づく実施料相当額（実施料率は別紙１１－２【原告の主張】２のとおり）

10が，ＣＪインドネシア販売分については特許法１０２条２項による被告らの利益相
当額の損害が，被告が賠償すべき損害額となる。
２

被告販売分についての実施料相当額(1)

本件特許権１についての実施料相当額

対象期間中の被告販売分に係る販売数量は，本文第３の１５【原告の主張】
15(2)ア，同イ(ｲ)によれば，合計●（省略）●トンであり，これに１ｋｇあたり３０円を乗じた●（省略）●円が，本件特許権１についての実施料相当額となる。
(2)

本件特許権２についての実施料相当額

被告販売分に係る平成２５年分の販売数量●（省略）●トンのうち，平成２５
年８月２３日から同年末日までの分は，日数で按分して，●（省略）●トンと推20定される。また，平成２６年分から平成２９年分の販売数量は，別紙１０販売金
額・数量一覧表記載２のとおりであるから，被告販売分に係る，本件特許権２についての対象期間における販売数量は●（省略）●トンとなる。
本件特許権２についての実施料相当額は，この●（省略）●トンに１ｋｇあたり３０円を乗じた●（省略）●円となる。

25

３

ＣＪインドネシア販売分につき，対象期間における被告らの利益

311

(1)

売上高

本文第３の１５【原告の主張】(2)ア及び同イ(ｳ)によれば，対象期間中のＣＪ
インドネシア販売分に係る売上高は合計●（省略）●円である。
(2)
5

被告らの経費について控除すべき経費については，別紙１１－１損害額の主張１【原告の主張】２(2)の本件ＭＳＧの製造コスト，国際輸送費及び国内輸送費その他の販管費の額に，対象期間中の被告ら販売分の販売数量に占めるＣＪインドネシア販売分の販
売数量の割合を乗じて算出される。
そうすると，本件ＭＳＧの製造コストと国内輸送費その他の販管費について

10

は，合計●（省略）●円，国際輸送費については合計●（省略）●円となる。
(3)

被告らの利益前記(1)の売上高から前記(2)の控除すべき経費を控除すると，対象期間中のＣ
Ｊインドネシア販売分に係る被告らの利益は３１億１０３４万３０００円とな
る。
15

４

ＣＪインドネシア販売分につき，本件特許権２についての対象期間（平成２５年８月２３日から平成２９年１２月３１日まで）における被告らの利益
(1)

売上高

ＣＪインドネシア販売分に係る平成２５年分の売上高●（省略）●円のうち，
平成２５年８月２３日から同年末日までの分は，日数で按分して，●（省略）●
20円と推定される。また，平成２６年分から平成２９年分の販売数量は，別紙１０
販売金額・数量一覧表記載１のとおりであるから，ＣＪインドネシア販売分に係る，本件特許権２についての対象期間における売上高は●（省略）●円となる。
(2)

被告らの経費について

ＣＪインドネシア販売分に係る控除すべき経費について，別紙１１－１損害額
25

312

の主張１【原告の主張】３(2)と同様に計算すると，それぞれ以下のようになる。
本件ＭＳＧの製造コスト
国際輸送費5●（省略）●円

国内輸送費その他の販管費(3)●（省略）●円●（省略）●円

被告らの利益前記(1)の売上高から前記(2)の控除すべき経費を控除すると，本件特許権２についての対象期間中のＣＪインドネシア販売分に係る被告らの利益は１７億４５
８７万６０００円となる。
10５本件各特許権侵害による損害賠償請求相互の関係

本件特許権１の侵害について推定される損害額は，前記２(1)の被告販売分についての実施料相当額と前記３(3)のＣＪインドネシア販売分についての被告らの利益額の合計●（省略）●円である。
本件特許権２の侵害について推定される損害額は，前記２(2)の被告販売分に15ついての実施料相当額と前記４(3)のＣＪインドネシア販売分についての被告らの利益額の合計●（省略）●円である。
原告は，本件各特許権双方が侵害されている，本件特許権２についての対象期間に係る損害については，上記損害額合計●（省略）●円の範囲内で，本件各特許権に基づく請求を選択的に行う。

20

また，対象期間を通じた損害としては，前記の合計●（省略）●円となる範囲内で，本件各特許権に基づく請求を選択的に行う。そして，原告が本件訴訟で一部請求するのは，そのうち９億円である。
６

ＣＪインドネシア販売分についての覆滅事由について

ＣＪインドネシア販売分について，特許法１０２条２項による損害推定を覆滅
25

すべき事由が存在しないことは，別紙１１－１損害額の主張１【原告の主張】５のとおりであり，仮に競合品の存在による推定の覆滅を認める場合に，覆滅され313

た部分に特許法１０２条３項による実施料相当額の損害額を認定すべきことは，
同別紙【原告の主張】６のとおりである。
【被告の主張】本文第３の１５【被告の主張】(1)のとおり，ＣＪインドネシア販売分について，
5

被告は損害賠償責任を負わないから，特許法１０２条２項の損害額の算定に当たって，ＣＪインドネシア販売分を考慮すべきではない。
その他,被告販売分についての特許法１０２条３項による損害額についての主張
は別紙１１－２損害額の主張２【被告の主張】のとおりであり，ＣＪインドネシア
販売分についての同条２項による損害額についての主張は別紙１１－１損害額の主10

張１【被告の主張】のとおりである。
以上

314

別紙１１－４

損害額の主張４（被告販売分につき特許法１０２条３項，ＣＪイン

ドネシア販売分についての被告のコミッションについて同条２項による損害額）【原告の主張】１
5

主張の概要

ＣＪインドネシア販売分について，被告とＣＪインドネシアとの間に共同不法行為が成立するかどうかにかかわらず，対象期間（特許権２との関係では，そのうち
平成２５年８月２３日以降の期間）中の被告ら販売分のうち，被告販売分について
は特許法１０２条３項に基づく実施料相当額の損害賠償に加え,ＣＪインドネシア
販売分については，特許法１０２条２項による損害額として，これによる被告の利10益であるコミッション相当額の損害賠償請求が可能である。
２

被告販売分についての実施料相当額

別紙１１－３【原告の主張】２と同じ。

15

３

ＣＪインドネシア販売分についての，コミッション相当額の被告の利益(1)

対象期間における被告の利益（コミッションの額）

被告の資料（乙１０１添付資料３）によると，ＣＪインドネシア販売分について，
被告はＣＪインドネシアからコミッション（手数料）の支払を受けており，これは，ＣＪインドネシア販売分について，被告による譲渡の申出という侵害行為によって被告が受けた利益（特許法１０２条２項）である。
平成２３年から平成２９年のコミッションの合計は●（省略）●円であり，平成

20

１９年から平成２２年についても，それぞれ，少なくとも平成２３年と同額の●（省略）●円のコミッションの支払を受けていることが推測されるから，対象期間中に支払われたコミッションの合計額は●（省略）●円であり，同額について特許法１０２条２項により原告の損害と推定される。
(2)25

本件特許権２についての対象期間（平成２５年８月２３日から平成２９年

１２月３１日まで）における被告の利益（コミッションの額）
平成２５年分のコミッション●（省略）●円のうち，平成２５年８月２３日か315

ら同年末日までの分は，日数で按分して，●（省略）●円と推定される。
そして，平成２６年分から平成２９年分のコミッションと合算すると，本件特許権２についての対象期間に被告に支払われたコミッションの合計は●（省略）5●円となる。
４

本件各特許権侵害による損害賠償請求相互の関係

本件特許権１の侵害について推定される損害額は，対象期間に係る，被告販売分についての実施料相当額（別紙１１－３損額額の主張３【原告の主張】２(1)）と前記３(1)のコミッションの額の合計●（省略）●円である。
10

本件特許権２の侵害について推定される損害額は，本件特許権２についての対象期間に係る，被告販売分についての実施料相当額（別紙１１－３損額額の主張
３【原告の主張】２(2)）と前記３(2)のコミッションの額の合計●（省略）●円である。
原告は，本件各特許権双方が侵害されている，本件特許権２についての対象期15間に係る損害については，上記損害額合計●（省略）●円の範囲内で，本件各特許権に基づく請求を選択的に行う。
また，対象期間を通じた損害としては，前記の合計●（省略）●円となる範囲内で，本件各特許権に基づく請求を選択的に行う。そして，原告が本件訴訟で一部請求するのは，そのうち９億円である。

20

５ＣＪインドネシア販売分についての覆滅事由について

ＣＪインドネシア販売分について，特許法１０２条２項による損害推定を覆滅すべき事由が存在しないことは，別紙１１－１損害額の主張１【原告の主張】５のとおりであり，仮に競合品の存在による推定の覆滅を認める場合に，覆滅された部分に特許法１０２条３項による実施料相当額の損害額を認定すべきことは，
25

同別紙【原告の主張】６のとおりである。

316

【被告の主張】
１

被告販売分についての特許法１０２条３項による損害額について

別紙１１－２損害額の主張２【被告の主張】のとおりである。
２
5

ＣＪインドネシア販売分に係る，コミッションを被告の利益とする特許法１０２条２項に基づく主張について
コミッションは，被告がＣＪインドネシアとのコミッション契約に基づいて独自に得られる利益である。他方で，原告は，コミッションに関する事業を行っている
わけではない。したがって，コミッションに関する事業において原告と被告とが競合しているわけではなく，被告がコミッションを得ることで原告がコミッションを10得られなかったという関係にはないから，特許法１０２条２項の被告の利益として
コミッションは考慮されるべきではない。
仮に，コミッションを被告の利益として考慮するとしても，平成１９年から平成２２年までの各年のコミッションの額は，平成２３年と同額ではない。平成１９年
分から平成２２年分までのコミッションについても，本文第３の１５【被告の主張】

15(2)イと同様の計算式によって売上同様の推計をすべきであり，当該期間のコミッ
ションの合計は●（省略）●円である。また，コミッションについても，それに関する経費（別紙１１－１損害額の主張１【被告の主張】２(1)のうち，ＣＪインドネ
シア販売分の販管費）が考慮されるべきである。
さらに，別紙１１－１損害額の主張１【被告の主張】４(1)同様に，コミッション

20による被告の利益についても，原告のシェアに基づく減額（覆滅）をすべきであり，同別紙【被告の主張】５同様に覆滅部分について特許法１０２条３項の重畳適用は許されない。
以上

317

別紙１２

本件明細書１の記載

本件訂正発明１に関し，本件明細書１の発明の詳細な説明には，以下の記載があ
る。
5

１

技術分野

【０００１】
本発明は，アミノ酸を高収率で生産する能力を有する変異株を構築する方法及びその変異株を用いる発酵法によるＬ－アミノ酸の製造方法に関するものである。
10

２

背景技術

【０００２】
発酵法によるアミノ酸の生産に用いられる変異株の構築方法は，大別すると２通りあり，１つは化学変異剤をもちいて DNA にランダムに変異を導入する方法であり，もう１つは遺伝子組換えを用いる方法である。遺伝子組換えを用いる方法では，目15的物質の生合成に関与する代謝経路上の遺伝子を強化したり，分解に関与する酵素の遺伝子を弱化したりすることにより，目的物質の生産性が向上した菌株を開発出来る。また，その際に，目的遺伝子を強化する方法として，細胞内で，染色体とは独立して自立複製可能なプラスミドが主に用いられてきた。
しかし，プラスミドを用いた目的遺伝子の強化方法には問題点がある。具体的に20は目的遺伝子の強化の程度はプラスミド自体のコピー数によって決まるため，目的遺伝子の種類によってはコピー数が高過ぎて，発現量が高くなり過ぎることにより，生育が著しく抑制されたり，逆に目的物質の生産能が低下したりする例が多くある。
この様な場合，コピー数が低い種類のプラスミドを用いることにより，目的遺伝子の強化の程度を下げることが可能であるが，プラスミドの種類は多くの場合限定的

25であり，目的遺伝子の発現レベルを自由に調節することは不可能である。
【０００３】

318

もう一つの問題点は，プラスミドの複製が不安定であることがしばしばであり，プラスミドが脱落してしまうことである。…
３

発明が解決しようとする課題【０００６】
5

本発明は，プラスミドを用いることなく目的遺伝子の発現量の適度な強化および調節を行うことができ，アミノ酸を高収率で生産する能力を有する変異株を遺伝子組換え又は変異により構築する方法を提供することを目的とする。
本発明は，副生アスパラギン酸およびアラニンの著しい増加を引き起こすことなく，コリネバクテリア菌株にグルタミン酸を高収率で生産する能力を付与すること10ができるＧＤＨ用プロモーターを提供することを目的とする。
本発明は，又，上記ＧＤＨ用プロモーター配列を持つＧＤＨ遺伝子を提供することを目的とする。
本発明は，又，上記遺伝子を有するＬ－グルタミン酸生産性コリネバクテリア菌株を提供することを目的とする。

15

本発明は，構築されたアミノ酸生産菌を用いる醗酵法によるアミノ酸の製造法を提供することを目的とする。
本発明は，コリネ型グルタミン酸生産菌を用いる，グルタミン酸の収率を向上させ，より安価にグルタミン酸を製造するグルタミン酸発酵法を提供することを目的
とする。

20

４

課題を解決するための手段【０００７】
本発明は，染色体上のアミノ酸生合成系遺伝子のプロモーターを様々に改変し，目的とする遺伝子の発現量を調節することにより上記課題を効率的に解決できるとの知見に基づいてなされたものである。特に，プロモーターの特異的領域である－
25

３５領域および／または－１０領域に特定の変異を導入することにより上記課題を効率的に解決できるとの知見に基づいてなされたものである。

319すなわち，本発明は，コリネ型細菌の染色体上のアミノ酸又は核酸生合成系遺伝
子のプロモーター配列に，コンセンサス配列に近づくような変異を起こさせるか又は遺伝子組換えにより導入して，コリネ型細菌の変異体を調製し，該変異体を培養して目的とするアミノ酸又は核酸の産生量の多い変異体を採取することを特徴とす
5るアミノ酸又は核酸産生能が向上したコリネ型細菌の調製方法を提供する。
【０００８】
本発明は，又，－３５領域に CGGTCA ，TTGTCA，TTGACA 及び TTGCCA からなる群から選ばれる少なくとも一種のＤＮＡ配列及び／又は－１０領域に TATAAT 配列若
しくは該配列の ATAAT の塩基が別の塩基で置換されており，プロモーター機能を阻

10

害しない配列を有することを特徴とするグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）
産生遺伝子用プロモーターを提供する。
本発明は，又，上記プロモーターを有するグルタミン酸デヒドロゲナーゼ産生遺伝子を提供する。
本発明は，又，上記遺伝子を有するコリネ型Ｌ－グルタミン酸生産菌を提供する。

15【０００９】
本発明は，また，上記の方法で構築したアミノ酸又は核酸産生能が向上したコリネ型細菌を，培地で培養し，培地中に目的のアミノ酸又は核酸を生成蓄積させ，これを該培地から採取することを特徴とする発酵法による該アミノ酸又は核酸の製造方法を提供する。

20

本発明は，また，４－フルオログルタミン酸に対して耐性を有するコリネ型Ｌ－グルタミン酸生産菌を，液体培地で培養し，培地中にＬ－グルタミン酸を生成蓄積させ，これを該培地から採取することを特徴とする発酵法によるＬ－グルタミン酸の製造方法を提供する。
５25

発明を実施するための最良の形態【００１０】

320

本発明でいうコリネ型グルタミン酸生産菌とは，従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属細菌として統合された細菌を含み(Int.
J. Syst. Bacteriol., 41, 255(1981)) ，またコリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌を含む。したがって，本発明で使用する変異株は，ブ5

レビバクテリウム属またはコリネバクテリウム属に属する下記のようなコリネ型グ
ルタミン酸生産菌から誘導することができる。尚，本明細書において，グルタミン
酸生産性に言及しない場合は，コリネバクテリウム属細菌及びブレビバクテリウム
属細菌を単にコリネ型細菌ということがある。
【００１１】

10…コリネバクテリウム・グルタミクム

ATCC13032…ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム

ATCC13869…

【００１２】
目的物質としてのアミノ酸としては，生合成に関与する遺伝子およびそのプロモーターが明らかになっているものであれば何でもよい。生合成に関与する酵素の例
15として具体的には，グルタミン酸発酵の場合には，ＧＤＨ，クエン酸合成酵素（ＣＳ），イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＣＤＨ），ピルビン酸デヒドロゲナーセ（ＰＤＨ），アコニターゼ（ＡＣＯ）等が有効である。…
【００１５】
本発明では，コリネ型アミノ酸生産菌の染色体上の所望のアミノ酸生合成系遺伝20

子のプロモーター配列，例えば，上記ＧＤＨ用プロモーターなどのプロモーター配列に，コンセンサス配列に近づくような変異を，化学薬品などを用いる変異により起こさせるか又は該変異を遺伝子組換えにより導入して，コリネ型アミノ酸生産菌の変異体を調製する。
ここで，コンセンサス配列は，多くのプロモーター配列を比較して最も高頻度で25出現する塩基を並べた配列である。このようなコンセンサス配列としては，大腸菌，
バチルス

サブチリスなどのコンセンサス配列があげられる。大腸菌のコンセンサ

321

ス配列は，Diane K. Hawley and William R. McClure Nuc. Acid. Res. 11:22372255(1983)に記載されており，バチルス

サブチリスのコンセンサス配列は，Charles et al. Mol. Gen. Genet 186:339-346(1982)に記載されている。
上記変異は，１つのプロモーター配列，例えば，ＧＤＨ用プロモーターのみに起
5

こさせてもよいが，２つ以上のプロモーター配列，例えば，ＧＤＨ用プロモーター，
クエン酸合成酵素（ＣＳ）やイソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＣＤＨ）に起こさせてもよい。
本発明では，このようにして得られた該変異体を培養して目的とするアミノ酸の産生量の多い変異体を採取する。

10【００１６】
グルタミン酸発酵の場合に，コリネ型グルタミン酸生産菌のＧＤＨはそれ自身のプロモーター配列をその上流域に持つことが明らかになっている（Sahm et al.
Molecular Microbiology(1992), 6, 317-326)。
例えば，本発明のＧＤＨ用プロモーター，該ＧＤＨ用プロモーター配列を持つＧ

15

ＤＨ遺伝子及び該遺伝子を有するＬ－グルタミン酸生産性コリネバクテリア菌株は，例えば次のようにして得ることができる。
つまり，上記のような菌株に紫外線照射，Ｘ線照射，放射線照射，変異誘起剤処
理等の変異処理を施し，４－フルオログルタミン酸を含有する寒天平板培地上で，４－フルオログルタミン酸に対して耐性を有する菌株を得る。すなわち，親株の生20

育を抑制する濃度の４－フルオログルタミン酸を含有する寒天平板培地上に変異処理を施した菌株を塗布し，生育してきた変異株を分離すればよい。
又，ＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列を，部位特異的変異法を用いて各種変異を導入した配列に置換したものを多数作製し，それぞれの配列とＧＤＨ活性との関係を調べて，Ｌ－グルタミン酸生産性の高いものを選択することができる。

25【００１７】

322

本発明では，特に，ＧＤＨ遺伝子のプロモーターの－３５領域のＤＮＡ配列がCGGTCA，TTGTCA，TTGACA 及び TTGCCA からなる群から選ばれる少なくとも一種のＤ
ＮＡ配列となっているか，及び／又は該プロモーターの－１０領域のＤＮＡ配列がTATAAT となっているか，若しくは－１０領域に TATAAT 配列の ATAAT の塩基が別の5塩基で置換されており，プロモーター機能を阻害しない配列となっているものが好ましい。-10 配列の TATAAT 配列の ATAAT の塩基が別の塩基で置換されており，プ
ロモーター機能を阻害しない配列となっているものを選択できるのは，野生型の10 配列である CATAAT の最初の「C 」を「T 」に代えただけで劇的にＧＤＨ比活性の上昇が観察されたので（表１，p6-4 参照），他の塩基にかえてもかまわないと考10えられるからである。
ＧＤＨ遺伝子のプロモーター配列は，例えば，前出の Sahm et al. Molecular
Microbiology(1992), 6, 317-326 に記載されており，又，配列番号１に記載されている。又，ＧＤＨ遺伝子自体の配列は，例えば，同じく Sahm et al. Molecular
Microbiology(1992), 6, 317-326 に記載されており，又，配列番号１に記載されて15いる。
同様にして，クエン酸合成酵素（ＣＳ）やイソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＣＤＨ）のプロモーターについても変異を起こさせることができる。
このようにして，ＧＤＨ用プロモーターとしては，－３５領域に CGGTCA ，TTGTCA，
TTGACA 及び TTGCCA からなる群から選ばれる少なくとも一種のＤＮＡ配列及び／

20

又は－１０領域に TATAAT 配列若しくは該配列の ATAAT の塩基が別の塩基で置換されており，プロモーター機能を阻害しない配列を有するものがあげられる。又，上記プロモーターを有するグルタミン酸デヒドロゲナーゼ産生遺伝子を提供する。
【００１８】
ＣＳ用プロモーターとしては，－３５領域に TTGACA 配列及び／又は－１０領域

25に TATAAT 配列を有しており，プロモーター機能を阻害しない配列を有するものがあげられる。又，上記プロモーターを有するＣＳ遺伝子を提供する。…

323

本発明は，又，上記遺伝子を有するコリネ型Ｌ－グルタミン酸生産菌を提供する。
【００２０】
コリネ型細菌は一般に，ビオチン制限下でＬ－グルタミン酸を生産する。従って，培地中のビオチン量を制限するか，界面活性剤やペニシリンなどのビオチン作用抑5制物質を添加する。
発酵は，振とう培養や通気攪拌培養等による好気条件下にて，培養液のｐＨを５～９の間に保持しつつ２～７日間行うのがよい。ｐＨの調節には，尿素，炭酸カルシウム，アンモニアガス，アンモニア水等を用いるのがよい。培養温度は２４～３７℃であるのが好ましい。

10

培養液中に生成蓄積したＬ－グルタミン酸の採取は常法によって行えばよく，例
えばイオン交換樹脂法，晶析法等によることができる。具体的には，Ｌ－グルタミ
ン酸を陰イオン交換樹脂により吸着，分離させるか，または中和晶析させればよい。
本発明によれば，コリネ型アミノ酸生産菌のアミノ酸生合成遺伝子のプロモーター領域に変異を導入し，目的遺伝子の発現量を調節することにより，目的アミノ酸15を高収率で得ることができ，又プラスミドのように脱落がなく，安定して目的アミノ酸を高収率で得ることができるので，工業的に大きな利点がある。
【００２１】
また，本発明によれば，副生アスパラギン酸およびアラニンの増加を引き起こす
ことなく，コリネバクテリア菌株にアミノ酸，特にグルタミン酸を高収率で生産す20る能力を付与することができる各種プロモーター，特にＧＤＨ用プロモーターを提供することができる。
また，本発明によれば，コリネ型Ｌ－グルタミン酸生産菌に変異処理を施し，変異がＧＤＨ遺伝子のプロモーター領域に起こった，４－フルオログルタミン酸に対して耐性を有する菌株を採取し，この菌株を培養することによりグルタミン酸を高25収率で得ることができるので，工業的に大きな利点がある。
６

実施例

324

(1)

実施例１

変異型ＧＤＨプロモーターの作製【００２２】…部位特異変異法を用い：次の方法で変異型ＧＤＨプロモーターを調製した。
(1) 各種変異型のプロモーターを持つＧＤＨ遺伝子の作製
5

コリネ型細菌のＧＤＨ遺伝子のプロモーターの－３５領域および－１０領域の野生型配列を配列１に示す。但し，野生型のプロモーター配列は既に報告されている（Molecular Microbiolgy (1992), 6, 317-326) 。
変異型プロモーターを持つＧＤＨ遺伝子を運ぶプラスミドの作製方法は，以下の通りである。図１に示すように，“Bacterial Genome DNA purification kit”

10

(Advanced Genetic Technologies Corp.)に基づいて調製したコリネ型細菌野生株
ATCC13869 株の染色体遺伝子を鋳型とし，ＧＤＨ遺伝子の上流と下流とでＰＣＲにより遺伝子を増幅し，両端を平滑末端化した後に，それをプラスミド pHSG399 （宝酒造社製）の SmaI 部位に挿入した。次にこのプラスミドの SalＩ部位に，コリネ型細菌で複製可能な複製基点をもつプラスミド pSAK4 から取得した複製起点を導15入することによりプラスミドｐＧＤＨを作製した。この方法において，ＧＤＨ遺伝
子の上流側のプライマーとして配列表１から６に示す配列を持つプライマーを用いることにより，上記のおのおのプロモーター配列を持つＧＤＨ遺伝子を作製することが出来る。なお，ここで用いたＰＣＲ増幅断片中には導入したプロモーター配列
内の変異以外は変異は導入されていないことを塩基配列の決定により確認した。ｐ20

SAK4 を構築するためには，既に取得されているコリネバクテリウム属細菌で自律複製可能なプラスミド pHM1519(Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984))由来の複製起点を持つプラスミド pHK4（特開平 5-7491 号) を制限酵素 BamHI 及び KpnI で消化して，複製起点を含むＤＮＡ断片を取得し，得られた断片をＤＮＡ平滑末端化キット（宝酒造社製，Bluntingkit)を用いて平滑末端化した後 SalＩリンカー（宝25

酒造社製）を結合し，これを pHSG299 の SalＩサイトに挿入した。得られたプラス
ミドが pSAK4 である。

325

【００２３】(2) 各プロモーター配列を有するＧＤＨの発現量の比較
上記の様にして作製したプラスミドをコリネ型細菌野生株 ATCC13869 株にそれぞれ導入した。導入の方法はエレクトロポレーション法を用いた（特開平２－２０5

７７９１号公報参照）。作製したこれらの菌株のＧＤＨの発現量を比較するために，
ＧＤＨの比活性を調べた。活性測定方法は上記の Sahm 等の方法に従った。その結果を表１に示す。
【００２４】
表１

10【００２５】
上記 ATCC 13869／p6-2～ATCC 13869／p6-8 は配列番号２～６に対応するものであり，これらの配列は配列番号１記載の配列（野生型）を基に下線部を下記の通り
変更したものである。
15

20

配列番号１

5'-TTAATTCTTTGTGGTCATATCTGCGACACTGC CATAATTTGAACGT- 3'

配列番号２

CGGTCACATAAT

配列番号３

TGGTCATATAAT

配列番号４

TTGACATATAAT

配列番号５

TTGCCATATAAT

配列番号６

TTGTCATATAAT326

尚，これらの配列は，直鎖状，２本鎖の合成ＤＮＡである。
(2)

実施例２

変異株の取得

【００２６】…(1) ４－フルオログルタミン酸に対する耐性を有する変異株の誘導
5AJ13029 株は WO96/06180 に記載されるグルタミン酸生産株で，培養温度が３1.
５℃ではグルタミン酸を生産しないが，培養温度を３７℃にシフトするとビオチン作用抑制物質の非存在下でもグルタミン酸を生産する変異株である。本実施例では，
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ13029 株を変異株誘導の親株として用いた。もちろん，AJ13029 株以外のグルタミン酸生産株であっても４－フルオロ

10グルタミン酸に対する耐性を有する変異株誘導の親株となりうる。
AJ13029 株を CM2B 寒天培地（…）上にて３1.５℃で２４時間培養して菌体を得た。得られた菌体を２５０μg/ml のＮ－メチル－Ｎ′－ニトロ－Ｎ－ニトロソグア
ニジンの水溶液で３０℃で３０分間処理した後，生存率１％の当該菌体の懸濁液を
４－フルオログルタミン酸（４ＦＧ）を含む寒天平板培地（…）に播種し，３1.５℃

15で２０～３０時間培養しコロニーを形成させた。この際，初めに１mg/ml の４ＦＧを含む培地を傾斜をつけて作製し，その上に４ＦＧを含まない同培地を水平に重層した。これにより，寒天培地表面は４ＦＧの濃度勾配が作製される。このプレート上に上記変異処理菌体を播種すると，菌株の生育限界の領域を境に境界線が出来る。
この境界よりも高濃度の４ＦＧが存在する領域でコロニーを形成した株を採種した。

20

かくして約１0,０００個の変異処理菌株から約５０株の４ＦＧ耐性株を取得した。
【００２９】(2) ４ＦＧに対して耐性を示す変異株によるＬ－グルタミン酸の生産能の確認
上記(1) において得られた約５０株の変異株及びその親株である AJ13029 株について，グルタミン酸の生産能を以下のようにして確認した。

25

AJ13029 及び各変異株をそれぞれ…培養終了後，旭化成社製バイオテックアナラ
イザーを用いてＬ－グルタミン酸の生成の有無を調べた。その結果，この約５０株

327

を培養しグルタミン酸収率が親株より高く，ＧＤＨ活性も高い株を２株分離した（Ａ株およびＢ株）。それぞれのＧＤＨ活性を測定したところ両株ともＧＤＨの比活性が上昇していた（表５）。ＧＤＨ活性の測定は E. R. Bormann 等の方法（Molecular
Microbiol., 6, 317-326(1996)) に従った。そこでＧＤＨ遺伝子の塩基配列を解析5したところＧＤＨのプロモーター領域内にのみ変異点が存在していた（表６）。
【００３１】
表５変異株のグルタミン酸生成とＧＤＨ活性【００３２】
10

表６

変異株のＧＤＨプロモーター領域の塩基配列

(3)

実施例３

コリネ型グルタミン酸生産菌のＣＳ遺伝子プロモーター領域への変異の導入【００３３】
15…本実施例ではグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）およびクエン酸合成酵
素（ＣＳ）をコードする遺伝子のプロモーター強化株を作成した例を示す。
（１）gltA 遺伝子のクローニング
コリネ型細菌のクエン酸合成酵素をコードする遺伝子 gltA の塩基配列は既に明らかにされている（Microbiol. 140 1817-1828 (1994)）。この配列をもとに配列番

20号７および配列番号８に示すプライマーを合成した。一方，Bacterial Genome DNA
Purification Kit(Advanced Genetic Technologies Corp.)を用いて，ブレビバク

328

テリウム・ラクトファーメンタム ATCC13869 の染色体 DNA を調製した。この染色体
DNA を 0.5μg，前記オリゴヌクレオチドをそれぞれ 10pmol，dNTP mixture(各2.5mM)8μl，10× LA Taq Buffer（宝酒造）5μl，LA Taq（宝酒造）2U に滅菌水を加えて全量 50μl の PCR 反応液を調製した。この反応液をサーマルサイクラーTP2405（宝酒造）を用いて，変性 94℃ 30 秒，会合 55℃ 15 秒，伸長反応 72℃ 3 分の条件
で 30 サイクルの PCR を行ない，gltA 遺伝子およびそのプロモーターを含む約３Kbpの DNA 断片を増幅した。得られた増幅断片は宝酒造社製の SUPREC02 にて精製した
後平滑末端化した。平滑末端化は宝酒造社製の Blunting Kit により行なった。これと pHSG399（宝酒造）を SmaI で完全分解したものを混合し連結した。連結反応は宝10

酒造社製 DNA ligation kit ver2 にて行なった。連結した後，エシェリヒア・コリ
JM109 のコンピテントセル（宝酒造社製）を用いて形質転換を行い，IPTG（イソプ
ロピル-β-D-チオガラクトピラノシド）１０μg/ml，X-Gal（5-ブロモ-4-クロロ-3インドリル-β-D－ガラクトシド）４０μg/ml 及びクロラムフェニコール 40μg/ml
を含む L 培地（バクトトリプトン 10g/l，バクトイーストエキストラクト 5g/l，

15

NaCl5g/l，寒天 15g/l，pH7.2）に塗布し，一晩培養後，出現した白色のコロニーを釣り上げ，単コロニー分離し，形質転換株を得た。
形質転換株からアルカリ法（生物工学実験書，日本生物工学会編，105 頁，培風館，1992 年）を用いてプラスミドを調製し，制限酵素地図を作成し，図２に示す制限酵素地図と同等であるものを pHSG399CS と名付けた。

20【００３４】（2）gltA プロモーターへの変異導入
gltA プロモーター領域への変異導入には宝酒造社製の Mutan-Super Express Kmを用いた。…
【００３５】

25…gltA プ ロ モ ー ター 領 域 が 表７ に 示 す配 列 に 置 換さ れ た もの を ， そ れぞ れ
pKF19CS1,pKF19CS2,pKF19CS4 と名づけた。

329

【００３６】
表７【００４１】
5（５）変異型 gltA 遺伝子の温度感受性プラスミドへの導入
変異型 gltA プロモーター配列の染色体への遺伝子組み込み方法としては，コリ
ネ型細菌内で複製が温度感受性であるプラスミドを用いる方法が知られている（特開平 5-7491）。…形質転換株からプラスミドを調製し，gltA 遺伝子を含む温度感受性シャトルベクターをそれぞれ pSFKTC1, pSFKTC2, pSFKTC4 と名づけた。

10【００４２】（６）変異型 gltA プロモーターの染色体への導入
pSFKTC1, pSFKTC2, pSFKTC4 をそれぞれブレビバクテリウム・ラクトファーメン
タム FGR2 株に電気パルス法で導入した。…したがってこの株は相同的な組換えにより，宿主染色体の gltA 遺伝子の近傍に，温度感受性プラスミド由来の変異型 gltA15遺伝子が組み込まれていることが示された。pSFKTC1,2,4 より誘導された株をそれぞれ BLCS11，BLCS12,BLCS14 と名づけた。
【００４３】（７）gltA プロモーター置換株の取得
相同組換えにより，変異型 gltA 遺伝子を組み込んだ BLCS11，BLCS12,BLCS14 株よ20

り，まず，カナマイシン感受性株を取得した。…
カナマイシン感受性になった株から，染色体を抽出し，配列番号７および配列番号８に示すプライマーを用いて PCR を行ない gltA 遺伝子断片を調製した。得られた増幅断片は宝酒造社製の SUPREC02 にて精製した後，配列番号１３に示すプライ

330

マーを用いてシーケンス反応を行ない，そのプロモーター領域の配列を決定した。
その結果，表７中の pKF19CS1 と同じプロモーター配列をもつ株を GB01，pKF19CS2と同じプロモーター配列をもつ株を GB02，pKF19CS4 と同じプロモーター配列をもつ株を GB03 と名づけた。これらの株では，染色体からプラスミドおよび重複する
5

gltA 遺伝子が脱落する際，プラスミドにより導入した変異型の gltA 遺伝子は染色体上に残り，元来染色体上にあった野生型の gltA 遺伝子が，ベクタープラスミドと共に脱落し，遺伝子置換が起こったことを意味する。
【００４４】（８）gltA プロモーター変異株のクエン酸合成酵素活性測定10（７）で得られた FGR2, GB01, GB02, GB03 株及び FGR2/pSFKC 株を…クエン酸合
成酵素の活性を測定した。測定結果を表１０に示す。gltA プロモーター置換株はその親株に比しクエン酸合成酵素活性が上昇していることが確認された。
【００４５】
表１０15【００４６】（９）gltA プロモーター置換株の培養成績
上記(７)で取得した各株を…培養を終了し，培溶液中に生成蓄積された L-グルタ
ミン酸の量を測定した。
20

その結果，表１２に示すように GB01 や FGR2/pSFKC 株よりは，むしろ GB02 や GB02
株では L-グルタミン酸の大幅な収率向上が認められた。以上のことより，これらの331

株のグルタミン酸収率向上において，プロモーターに変異を導入し CS 活性を２～４倍に強めることで好成績となりうることが示された。
【００４８】
表１２

5

(4)

実施例７

コリネ型グルタミン酸生産菌のGDH遺伝子プロモーター領域への変異の導入【００８７】…（１）変異型 gdh プラスミドの構築
10

上記実施例２に示した FGR1 株および FGR2 株がもつ GDH プロモーター配列を有す
るプラスミドを部位特異的変異手法により構築した。FGR1 株の GDH プロモーター配列を得るためには，…をプライマーに用い ATCC13869 の染色体 DNA を鋳型として PCRを行ない，…さらにこの PCR 産物を混合したものを鋳型として…をプライマーに用い PCR を行なった。こうして得られた PCR 産物を pSFKT2（特願平 11－69896）の Smal15

部位に挿入した pSFKTG11 を構築した。FGR2 株の GDH プロモーター配列を得るためには，…をプライマーに用い ATCC13869 の染色体 DNA を鋳型として PCR を行ない，一方で…をプライマーとして用い ATCC13869 の染色体 DNA を鋳型として PCR を行なった。さらにこの PCR 産物を混合したものを鋳型として…をプライマーに用い PCRを行なった。こうして得られた PCR 産物を pSFKT2（特願平 11－69896）の Smal 部位

20に挿入した pSFKTG07 を構築した。なお，pSFKTG11 および pSFKTG07 の Smal 部位に挿入した DNA 断片の塩基配列決定を行ない，GDH のプロモーター領域以外に変異が導入されていないことを確認している。

332

【００８８】（２）gdh プロモーター変異株の構築
次に pSFKTG11 および pSFKTG07 を電気パルス法により AJ13029 株に導入し，25℃
で 25μg/ml のカナマイシンを含む CM2B プレート上に生育する形質転換体を選択し5た。この形質転換体を 34℃で培養し，34℃でカナマイシン耐性を示す株を選択した。
34℃でカナマイシン耐性を示すことは pSFKTG11 あるいは pSFKTG07 が AJ13029 株の染色体上に組み込まれたことを意味する。このような染色体上にプラスミドが組み込まれた株よりカナマイシン感受性株を取得した。これらの株の GDH プロモーター
配列を決定し，pSFKTG11 および pSFKTG07 と同じ gdh プロモーター配列を持つ株を10

それぞれ GA01,GA02 とした。
（３）gdh プロモーター変異株の L－グルタミン酸生産能の確認
GA01 株，GA02 株およびその親株 AJ13029 株についてグルタミン酸の生産能を上記実施例２（２）と同じ方法で確認した。その結果，GA01 および GA02 では顕著なグルタミン酸の蓄積向上が認められた（表２３）。

15【００８９】
表２３【００９０】（４）セルフクローニング型 gdh プラスミドの構築
20

まず，セルフクローニングベクターpAJ220 を構築した。…本プラスミドはコリネ型菌類内で自律複製可能であり，宿主にトリメトプリム耐性を付与する。
コリネ型細菌野生型の ATCC13869 株の染色体 DNA を鋳型として…をプライマーとして PCR 反応を行ない gdh 遺伝子断片を調製し，これを pAJ220 の Ball 部位に挿入した pAJ220G を構築した。…pAJ220G および pGDH を ATCC13869 株に電気パルス法で333導入した株を構築し，上記（１）記載の方法で GDH 活性を測定した。その結果，pAJ220G
導入株では pGDH 導入株に比しおよそ 1.5 倍の GDH 活性が認められた。（表２４）【００９１】
表２４

5【００９２】(5)

gdh 活性が収率および副生 Asp に与える影響の検討

pGDH および pAJ220G を AJ13029 に電気パルス法にて導入した。これらの株と上記（２）で取得した各株を…培養を終了し，培溶液中に生成蓄積された L-グルタミ
10ン酸の量を測定した（表 26）。収率を最高にする GDH 活性は３倍程度であり，それよりも GDH 活性が上昇すると収率向上幅は減少し，およそ 16 倍に強化したところではむしろ収率は低下していた。副生アミノ酸を日立のアミノ酸アナライザーL8500 にて分析したところ，GDH 活性の上昇に伴いアスパラギン酸およびアラニンの蓄積が上昇していることが明らかとなった。これらの結果から，グルタミン酸収率15を向上させるためにはアスパラギン酸およびアラニンの著しい増加を引き起こさな
いように GDH 活性を適度に強化する必要があり，その方法の一つして gdh プロモーターに各種の変異を導入することで GDH 活性を親株の３倍前後に調節することが有効な手段であることが示された。
【００９４】

20

表２６

334

７

図面

【図１】変異プロモーターを有するＧＤＨ遺伝子の構築フローを示す。

【図２】変異プロモーターを有するＣＳ遺伝子の構築フローを示す。

5335

【図３】レポーター遺伝子として lacZ を有するシャトルベクターの構築フローを
示す。

以上
5

336

別紙１３

本件明細書２の記載

本件明細書２の発明の詳細な説明には，以下の記載がある。

5

１

技術分野

【０００１】
本発明は，発酵工業に関し，詳しくは，Ｌ－グルタミン酸の製造法及びそれに用いる細菌に関する。Ｌ－グルタミン酸は調味料原料等として広く用いられる。
２
10

背景技術

【０００２】
従来，Ｌ－グルタミン酸は，Ｌ－グルタミン酸生産能を有するブレビバクテリウ
ム属やコリネバクテリウム属に属するコリネ型細菌を用いて発酵法により工業生産
されている。これらのコリネ型細菌は，生産性を向上させるために，自然界から分離した菌株または該菌株の人工変異株が用いられている。

15【０００３】
コリネ型細菌の野生株は，一般的にビオチンが存在している条件ではグルタミン酸を生成しない。したがって，コリネ型細菌によるグルタミン酸生産は，ビオチン
制限，界面活性剤添加，ペニシリン添加等によってグルタミン酸生成を誘導した状態で行われる（非特許文献１）。また，これらの方法を適用しなくてもビオチンが20

十分存在している条件でＬ－グルタミン酸を生成できる株として，界面活性剤温度感受性株（特許文献1），ペニシリン感受性株（特許文献２），セルレニン感受性株（特許文献３）リゾチーム感受性株（特許文献４）等が開発されている。
【０００４】
しかし，これらの手法により開発されたL-グルタミン酸生産菌は，脂肪酸合成能

25の低下や細胞壁合成能の低下を伴っている場合が多く，L-グルタミン酸生産と引き換えに環境変化への適応力の低下を引き起こしている可能性が高い。したがって，

337

これらの手法を用いてL-グルタミン酸を著量蓄積できる菌株を開発するには相当の労力を要していた。
【０００５】
一方，ビオチン十分条件でＬ－グルタミン酸を生成する株は，α－ケトグルタル
5酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を欠損させることによっても達成される（特許文献５）。しかし，TCAサイクルを途中で遮断するα－ケトグルタル酸デヒド
ロゲナーゼ欠損株は生育が遅いことから菌体量の確保が困難などの課題があった。
【０００６】
コリネ型細菌のyggB遺伝子は，エシェリヒア・コリのyggB遺伝子のホモログであ10り（非特許文献２，３），メカノセンシティブチャンネル(mechanosensitive channel)の一種として解析されているが，（非特許文献４），Ｌ－グルタミン酸に及ぼす影響については知られていなかった。
３

発明が解決しようとする課題【０００７】
15

本発明は，コリネ型細菌を用いたＬ－グルタミン酸の製造において，Ｌ－グルタ
ミン酸生産能力を向上させる新規な技術を提供することを課題とする。
４

課題を解決するための手段【０００８】
本研究者らは，上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果，yggB遺20

伝子がコリネ型細菌のL-グルタミン生産に関与していることを明らかにし，yggB遺伝子を用いてコリネ型細菌を改変することにより，L-グルタミン酸の生産能が大幅に向上することを見出し，本発明を完成するに至った。
５

発明の効果

【００１０】
25

本発明のyggB遺伝子を用いて改変したコリネ型細菌を用いることにより，Ｌ－グ
ルタミン酸を効率よく生産することが出来る。

338

６

発明を実施するための最良の形態(1)

本発明のコリネ型細菌【００１１】…本発明のコリネ型細菌は，Ｌ－グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌であ
5って，yggB遺伝子を用いて改変されたことにより，非改変株と比較してＬ－グルタ
ミン酸生産能が向上したコリネ型細菌である。
【００１２】
本発明において，「コリネ型細菌」とは，従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが，現在コリネバクテリウム属に分類された細菌も含み（Int. J. Syst.

10

Bacteriol., 41, 255(1991)），またコリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバ
クテリウム属細菌を含む。このようなコリネ型細菌の例として以下のものが挙げられる。
…コリネバクテリウム・カルナエ
コリネバクテリウム・グルタミカム…

15…コリネバクテリウム・メラセコーラ…
…ブレビバクテリウム・フラバム…
【００１３】
具体的には，下記のような菌株を例示することができる。
…コリネバクテリウム・カルナエ ATCC15991

20

コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC13020, ATCC13032, ATCC13060…
…コリネバクテリウム・メラセコーラ ATCC17965…
…ブレビバクテリウム・フラバム ATCC13826, ATCC14067…
【００１５】
本発明において，「Ｌ－グルタミン酸生産能」とは，本発明のコリネ型細菌を培25養したときに，培地中または菌体内にＬ－グルタミン酸を蓄積する能力をいう。コリネ型細菌の多くは後述する「L-グルタミン酸生産条件」でL-グルタミン酸を生産

339

することができるため，「Ｌ－グルタミン酸生産能」は，コリネ型細菌の野生株の性質として有するものであってもよい。ただし，育種によって付与または増強された性質であってもよく，さらに後述するようにして，yggB遺伝子を用いた改変によって，Ｌ－グルタミン酸の生産能が付与されたものでもよい。
5「Ｌ－グルタミン酸生産能が向上した」とは，野生株などの非改変株と比較して，
Ｌ－グルタミン酸生産能が上昇したことを意味する。ここで，コリネ型細菌の野生株としては，コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032株，13869株，14067株，
コリネバクテリウム・メラセコーラATCC17965株などが挙げられる。なお，「非改変株」としては，上記のような野生株と同程度のyggB遺伝子の発現量を示すような株，

10yggB遺伝子のコード領域内に変異が導入されていない株も含む。
【００２９】
本発明のコリネ型細菌は，上記のようなＬ－グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌を，yggB遺伝子を用いてＬ－グルタミン酸生産能がさらに向上するように改変することによって得ることができる。あるいは，yggB遺伝子を用いて改変した後

15に，さらに，上述したようなＬ－グルタミン酸生産能を付与または向上させる操作を付加的に行ってもよい。
yggB遺伝子を用いた改変としては，後述のようなyggB遺伝子の発現量を増加させること，および変異型yggB遺伝子を導入することを含む。
(2)20

yggB遺伝子の発現量の増強【００３０】…yggB遺伝子は，メカノセンシティブチャンネル(mechanosensitive channel)の一種として知られ，mscSとも呼ばれるタンパク質をコードする（FEMS Microbiol
Lett. 2003 Jan 28;218(2):305-9.）。
yggB遺伝子の発現量を増加させることにより，コリネ型細菌のL-グルタミン酸生

25

産能が非改変株に比べて向上する。すなわち，yggB遺伝子の発現量が増加するように改変されたコリネ型細菌を培養することにより，非改変株に比べて多くの量のL-

340

グルタミン酸を培地中に蓄積するか，あるいは，非改変株に比べて速い速度でL-グ
ルタミン酸を生産する。例えば，yggB遺伝子発現増強株は，親株あるいは非改変株と比べて，対糖収率でL-グルタミン酸の収率が2%以上上昇していることが好ましく，
4%以上上昇していることがより好ましく，6%以上向上していることが特に好ましい。
5

yggB遺伝子発現増強株は，非改変株と比べて，除菌体収率が向上していてもよい。
除菌体収率とは，対糖収率から菌体生成に用いられた炭素収率を除いたものを意味する。
【００３２】
yggB遺伝子の発現量が上昇するように改変されたコリネ型細菌は，L-グルタミン

10酸生産条件と過剰量のビオチンを含む条件の少なくとも1つの条件で，非改変株と比べてL-グルタミン酸生産能が向上していればよい。
ここで，「L-グルタミン酸生産条件」とは炭素源，窒素源，無機塩類，その他必要に応じてアミノ酸，ビタミン等の有機微量栄養素を含有する培地に，Ｌ－グルタ
ミン酸生産を誘導する物質を添加したり，あるいはＬ－グルタミン酸生産を阻害す

15

る物質の培地中の量を制限した条件を意味し，Ｌ－グルタミン酸生産を誘導するために添加する物質には，ペニシリンGやTween40等の飽和脂肪酸を含む界面活性剤が挙げられ，Ｌ－グルタミン生産を阻害するために制限する物質とはビオチンが挙げられる（アミノ酸発酵

学会出版センター

1986年）。Ｌ－グルタミン酸生産条件

でのこれらの物質の培地中の添加濃度は，ビオチンは，15μg/L未満，好ましくは，
20

10μg/L未満，さらに好ましくは，5μg/L未満であり，培地中にビオチンを全く含まなくてもよい。ペニシリンの培地中の添加濃度は，0.1U/ml以上，好ましくは，0.2U/ml
以上，さらに好ましくは，0.4U/ml以上であり，界面活性剤の添加濃度は，0.5g/L以上，好ましくは，1g/L以上，さらに好ましくは，2g/L以上である。
一方，「過剰量のビオチンを含む条件」とは，例えば，培地中にビオチンを30μg/L

25以上，好ましくは40μg/L，さらに好ましくは50μg/L含む条件をいう。
【００３３】（本件訂正２による訂正あり）

341

コリネ型細菌のyggB遺伝子としては，例えば，配列番号６，６２，６８，または８４のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。より具体的には，配列番号５の塩基配列1437-3035番目の配列を有する遺伝子，配列番号６１の塩基配列507-2093番目の配列を有する遺伝子，配列番号６７の塩基配列4035

2001番目の配列を有する遺伝子，配列番号８３の塩基配列501-2099番目の配列を有する遺伝子などが挙げられる。配列番号５の塩基配列1437-3035番目の配列を有する遺伝子は，コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032株〔判決注本件訂正２により「ATCC13869株」に訂正〕のyggB遺伝子であり，配列番号６１の塩基配列507-2093
番目の配列を有する遺伝子は，コリネバクテリウム・グルタミカム（ブレビバクテ
10

リウム・フラバム）ATCC14967株のyggB遺伝子であり，配列番号６７の塩基配列4032001番目の配列を有する遺伝子は，コリネバクテリウム・メラセコーラATCC17965株のyggB遺伝子である。配列番号８３の塩基配列501-2099番目の配列を有する遺伝子
は ， コ リ ネ バ ク テ リ ウ ム ・ グ ル タ ミ カ ム ATCC13032 の Genbank Accession No.
NC_003450として登録されているゲノム配列中の塩基番号1336092-1337693にコード15されており， NCgl 1221として登録されている（ NP_600492. Reports

small-

conductance...[gi:19552490]）。
また，コリネ型細菌の種や菌株によってyggB遺伝子の塩基配列に差異が存在することがあるため，yggB遺伝子は配列番号５の塩基番号1437-3035番目からなる塩基配列のバリアントであってもよい。yggB遺伝子のバリアントは，配列番号５の塩基番
20

号1437-3035番目からなる塩基配列の配列を参考にして，BLAST等によって検索出来る（http://blast.genome.jp/）。また，yggB遺伝子のバリアントは，yggB遺伝子ホモログ，例えばコリネ型細菌の染色体を鋳型にして例えば配列番号７５，７６の合
成オリゴヌクレオチドを用いてPCRで増幅可能な遺伝子を含む。また，本発明の遺伝
子は，コリネ型細菌のyggB遺伝子が望ましいがコリネ型細菌で機能を有する限り，

25

他の微生物由来の遺伝子を用いてもよい。また，後述する変異型yggB遺伝子を用い
てもよい。

342

【００３４】
yggB遺伝子は，コリネ型細菌のL-グルタミン酸生産能を向上させるものである限
り，配列番号６，６２，６８または８４に示すアミノ酸配列において，１若しくは数個のアミノ酸の置換，欠失，挿入，または付加を含むアミノ酸配列を有するもの
5であってもよい。ここで，数個とは，例えば，２～２０個，好ましくは２～１０個，より好ましくは２～５個を意味する。
上記置換は保存的置換が好ましく，保存的置換としては，alaからser又はthrへの置換，argからgln，his又はlysへの置換，asnからglu，gln，lys，his又はaspへの置換，aspからasn，glu又はglnへの置換，cysからser又はalaへの置換，glnからasn，

10

glu，lys，his，asp又はargへの置換，gluからgly，asn，gln，lys又はaspへの置換，glyからproへの置換，hisからasn，lys，gln，arg又はtyrへの置換，ileからleu，
met，val又はpheへの置換，leuからile，met，val又はpheへの置換，lysからasn，
glu，gln，his又はargへの置換，metからile，leu，val又はpheへの置換，pheから
trp，tyr，met，ile又はleuへの置換，serからthr又はalaへの置換，thrからser又

15

はalaへの置換，trpからphe又はtyrへの置換，tyrからhis，phe又はtrpへの置換，
及び，valからmet，ile又はleuへの置換が挙げられる。
さらに，本発明のyggB遺伝子は，配列番号6，６２，６８，または８４のアミノ酸配列全体に対して，８０％以上，好ましくは９０％以上，より好ましくは９５％以上，特に好ましくは９７％以上の相同性を有するタンパク質をコードし，コリネ型

20

細菌のL-グルタミン酸生産能を向上させる遺伝子も含む。ここで，ホモロジーは，Karlin とAltschulによるBLAST (Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993))や PearsonによるFASTA (Methods Enzymol., 183, 63 (1990))などによって計算することができる。これらのアルゴリズムによるホモロジー検索プログラム（BLASTN ，
BLASTP など）が，NCBIなどより入手できる(//www.ncbi.nlm.nih.gov)。

25

なお，上記のようなアミノ酸の置換，欠失，挿入，付加，または逆位等には，yggB
遺伝子を保持する微生物の個体差，種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異343

（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。
【００３５】
特に配列番号６の以下の位置のアミノ酸は置換・欠失していてもよい。コリネ型
細菌に保存されるYggBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号８５に示し，アミノ酸5

置換・欠失が起こっていてもよい箇所をXaaで示す。
４８番目のグルタミン残基（望ましくはアルギニン残基への置換）
２７５番目のアスパラギン残基（望ましくはセリン残基への置換）
２９８番目のグルタミン酸残基（望ましくはアラニン残基への置換）
３４３番目のアラニン残基（望ましくはバリン残基への置換）

10

３９６番目のフェニルアラニン残基（望ましくはイソロイシン残基への置換）
４３８番目のセリン残基（望ましくはグリシン残基への置換）
４４５番目のバリン残基（望ましくはアラニン残基への置換）
４５４番目のアラニン残基（望ましくはバリン残基への置換）
４５７番目のプロリン残基（望ましくはセリン残基への置換）

15

４７４番目のセリン残基（望ましくはアスパラギン残基への置換）
５１７番目のバリン残基（望ましくは欠失）
５１８番目のグルタミン酸残基（望ましくは欠失）
５１９番目のアラニン残基（望ましくは欠失）
５２０番目のプロリン残基（望ましくは欠失）

20【００３６】
上記のようなyggB遺伝子ホモログは，例えば，部位特異的変異法によって，コードされるタンパク質の特定の部位のアミノ酸残基が置換，欠失，挿入または付加を含むように配列番号５の塩基配列の1437-3035番目の配列を有する遺伝子，配列番号６１の塩基配列の507-2093番目の配列を有する遺伝子，配列番号６７の塩基配列の25403-2001番目の配列を有する遺伝子，または配列番号８３の塩基配列の501-2099番
目の配列を有する遺伝子を改変することによって取得することができる。

344

また，以下のような従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては，配列番号５の塩基配列の1437-3035番目の配列を有する遺伝子，配列番
号６１の塩基配列の507-2093番目の配列を有する遺伝子，配列番号６７の塩基配列の403-2001番目の配列を有する遺伝子，または配列番号８３の塩基配列の501-2099
5番目の配列を有する遺伝子を有する遺伝子をヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法，および該遺伝子を保持する微生物，例えばエシェリヒア属細菌を，紫外線またはN-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(NTG)もしくはエチルメタ
ンスルフォネート（EMS）等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。また，上記のようなアミノ酸の置換，欠失，挿入，付加，ま10

たは逆位等には，yggB遺伝子を保持する微生物の個体差，種の違いに基づく場合な
どの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。これ
らの遺伝子がコリネ型細菌に導入したときにＬ－グルタミン酸生産能を向上させるか否かは，例えば，これらの遺伝子をコリネ型細菌の野生株に導入し，上述の条件
でＬ－グルタミン酸の生産能が向上するかどうかを調べることにより，確かめるこ

15とができる。
【００３９】
yggB遺伝子の発現を増強するための方法としては，yggB遺伝子のコピー数を増加させる方法や，yggB遺伝子の発現調節領域を改変する方法や，yggB遺伝子の転写活性因子を増幅する方法や，yggB遺伝子の転写抑制因子の活性を低下する方法などが20挙げられる。…
(3)

変異型ｙｇｇＢ遺伝子の導入【００５０】…yggB遺伝子を用いた改変として，コリネ型細菌への変異型yggB遺伝子の導入も挙げられる。ここで，「変異型yggB遺伝子の導入」とは，コリネ型細菌の染色体上25のyggB遺伝子への変異の導入であってもよいし，変異型yggB遺伝子を含むプラスミ
ドのコリネ型細菌への導入であってもよいし，染色体上のyggB遺伝子の変異型yggB

345

遺伝子への置換であってもよい。
本発明において，「変異型yggB遺伝子」とは，yggB遺伝子のコード領域内の変異であって，コリネ型細菌のビオチンを過剰量含む条件下でのL-グルタミン酸生産能を向上させる機能をyggB遺伝子に付与する変異，を含むyggB遺伝子を意味する。な5

お，変異型yggB遺伝子は，コリネ型細菌に導入したときに，ビオチンを過剰量含む
条件下だけでなく，上述したようなL-グルタミン酸生産条件でもL-グルタミン酸生産能を向上させる遺伝子であってもよい。
「過剰量のビオチンを含む条件下でのＬ－グルタミン酸生産能が向上した」とは，本発明のコリネ型細菌を，非改変株がL-グルタミン酸を蓄積できないような濃度の10

ビオチンを含む条件，例えば，30μg/L以上の濃度のビオチンを含む培地で培養した
ときに，本発明のコリネ型細菌が，非改変株に比べて多くの量のL-グルタミン酸を培地中に蓄積するか，あるいは，非改変株に比べて速い速度でL-グルタミン酸を生産することを意味する。
【００５１】

15

以下，本発明の変異型yggB遺伝子の取得方法，yggB遺伝子に変異を導入する方法について記載する。しかしながら，変異型yggB遺伝子の取得方法，yggB遺伝子に変異を導入する方法は以下の方法には限定されない。
（II-１）odhA遺伝子欠損株を利用する方法
変異型yggB遺伝子を取得する方法として，α-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ

20のE1oサブユニットをコードしているodhA遺伝子(sucA遺伝子)を欠損した株（以下odhA破壊株という）が利用出来ることを本発明者は発見した。odhA破壊株の構築は，上述したようなsacB遺伝子などを用いる方法によって行うことが可能である。
【００５８】（II-２）転移因子を利用する方法

25

また，変異型yggB遺伝子を有するコリネ型細菌はコリネ型細菌で機能する転移因子を用いてスクリーニングしてもよい。転移因子とはインサーションシーケンス（IS346因子），トランスポゾンを含む。変異型yggB遺伝子は，野生型のyggB遺伝子にインサーションシーケンス（IS因子），トランスポゾンが偶然挿入されることによって取得できるものでもよいし，人工トランスポゾンを用いて，人為的に構築したものでもよい。転移因子が挿入された株は，例えばL-グルタミン酸アナログに対する感5

受性の低下を指標として選択することができる。L-グルタミン酸のアナログとしては，4－フルオログルタミン酸が利用できる。また，薬剤耐性遺伝子含む人工トラン
スポゾンを用いて薬剤耐性株をランダムに選択し，耐性株のyggB遺伝子長をPCRで確認することによっても転移因子挿入株を選択できる。
【００６４】

10（II-３）in vitroでyggB遺伝子にランダムに変異を導入する方法
また，変異型yggB遺伝子は，in vitroでランダムに変異を導入し，その中から界面活性剤等の添加なしにＬ－グルタミン酸生産が可能となるクローンから選択することも出来る。スクリーニングに用いる親株としては，ビオチンが過剰量含まれた条件でＬ－グルタミン酸を蓄積することが出来ない株，例えば，C.glutamicum 野生15

株 で あ るATCC13869 株 ，ATCC13032株， ATCC14067株， C.melasecola 野生株であ る
ATCC17965が望ましい。
【００６８】（II-4）L-グルタミン酸アナログ耐性株を取得する方法
変異型yggB遺伝子は，野生型のyggB遺伝子を有するコリネ型細菌をL－グルタミ

20ン酸アナログを含む培地で培養し，同培地で生育可能なL-グルタミン酸アナログ耐性株を取得することによっても取得することができる。スクリーニングに用いる親株としては，上述のコリネ型細菌野生株が好ましいが，野生型のyggB遺伝子を有するものであれば，いずれでもよい。また野生型のyggB遺伝子を搭載したプラスミドを有するコリネ型細菌でもよい。…

25

(4)

本発明の変異型ｙｇｇＢ遺伝子【００６９】

347

…以下，変異型yggB遺伝子の具体例を挙げる。ただし，変異型yggB遺伝子は，コリネ型細菌においてビオチンが過剰量存在する条件で，L-グルタミン酸生産能を向上させうる変異であれば特に制限されない。
ア5

Ｃ末端側変異【００７０】…この変異は，配列番号６，６８，８４もしくは８５のアミノ酸番号４１９－５
３３の配列，または配列番号６２のアミノ酸番号４１９－５２９の配列をコードする領域の塩基配列の一部に導入された変異である。例えば，この領域は，配列番号５の塩基配列においては，塩基番号2692-3035番目に相当する。上記領域の塩基配列

10中の少なくとも一部に変異が導入されていればいずれでもよいが，インサーション
シーケンス（以下ISという）や，トランスポゾンが挿入されたものが好ましい。変異は，アミノ酸置換を伴うもの（ミスセンス変異）や，上記ISの挿入によってフレームシフト変異が導入されたもの，ナンセンス変異が導入されたものの何れでもよ
い。

15

(ｱ)

転移因子の挿入による変異（2A-1型変異）【００７１】…C末端側変異の一例として，配列番号５の２６９１番目のGの次にISが挿入された変異が挙げられる。この変異が導入された変異型yggB遺伝子の塩基配列を配列番
号７に，該遺伝子にコードされる変異型YggBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号20８に示す。配列番号８においては，配列番号６の419位のバリンから下流の領域が短いISに由来する配列に置換されている。なお，配列番号７にて挿入されたISは，
IS1207(Genbank accession No. X96962) ，IS719: (Genbank accession No E12759)と相同性の高い配列である。
上記変異型yggB遺伝子を２Ａ－１型変異と呼ぶ。２Ａ－１型変異には，配列番号

25

６，６２，６８，８４および８５のC末端側の該領域を欠失または置換する変異が含
まれる。

348

また，上記領域に他のISが挿入されたもの，例えば上述したようなtransposaseをコードするISが挿入されたものも，本発明の範囲に含まれる。transposaseが導入される位置は上記領域のいずれの位置でもよいが，それぞれのtransposaseが認識しやすい箇所やISが挿入しやすいホットスポットの位置が好ましい。
5(ｲ)

プロリン残基を他のアミノ酸に置換する変異（６６型変異，２２型変異）【００７２】…またC末端側変異の一例として，配列番号６，６８，８４もしくは８５のアミノ
酸番号４１９－５３３の配列，または配列番号６２のアミノ酸番号４１９－５２９の領域内に存在するプロリンを他のアミノ酸に置換する変異が挙げられる。置換し10てもよいプロリンは，配列番号６の以下の位置に存在する。
４２４番目のプロリン残基（配列番号６２，６８，８４，８５の４２４番目）
４３７番目のプロリン残基（配列番号６２，６８，８４，８５の４３７番目）
４５３番目のプロリン残基（配列番号６２，６８，８４，８５の４５３番目）
４５７番目のプロリン残基（配列番号６２，６８，８４，８５の４５７番目）

15

４６２番目のプロリン残基（配列番号６２，６８，８４，８５の４６２番目）
４６９番目のプロリン残基（配列番号６２，６８，８４，８５の４６９番目）
４８４番目のプロリン残基（配列番号６２，６８，８４，８５の４８４番目）
４８９番目のプロリン残基（配列番号６２，６８，８４，８５の４８９番目）
４９７番目のプロリン残基（配列番号６２，６８，８４，８５の４９７番目）

20

５１５番目のプロリン残基（配列番号６２，６８，８４，８５の５１５番目）
５２９番目のプロリン残基（配列番号６８，８４，８５の５２９番目，配列番号
６２番目の５２５番目）
５３３番目のプロリン残基（配列番号６８，８４，８５の５３３番目，配列番号
６２番目の５２９番目）

25

yggB遺伝子のC末端側のプロリン残基は，YggBタンパク質の立体構造維持の為に重要な役割を果たしていると考えられる。（Protein Eng. 2002 Jan;15(1):29-33，

349

J Biol Chem. 1991 Dec 25;266(36):24287-94.）
中でも４２４番目と４３７番目のプロリンが他のアミノ酸に置換することが望ましい。
ここで他のアミノ酸とは，プロリン以外のアミノ酸で天然型アミノ酸であればい
5ずれのアミノ酸でもよく，Lys,Glu,Thr,Val,Leu,Ile,Ser,Asp,Asn,Gln,Arg,Cys,Met,Phe,Trp,Tyr,Gly,Ala,Hisから選択される残基に置換すればよい。特に，424番目のプロリンは，疎水性アミノ酸であるAla，Gly，Val，Leu，Ileに置換されることが望ましく，中でも分岐鎖アミノ酸であるLeu，Val，Ileが望ましい。（６６型変異）
424番目のプロリンをロイシンに置換する変異として，例えば，配列番号６７の167

10

3位の“C”を“T”に置換する変異が挙げられる。この変異型yggB遺伝子を配列番号６９に，該遺伝子にコードされる変異型YggBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号７０に示す。
ま た ， 437 番 目 の プ ロ リ ン は ， 側 鎖 に ヒ ド ロ キ シ ル 基 を 有 す る ア ミ ノ 酸（Thr,Ser,Tyr）に置換することが望ましく，中でもSerへの置換が望ましい。（２15２型変異）437番目のプロリンをセリンに置換する変異としては，例えば配列番号５の2745位のCをTに置換する変異が挙げられる。また，本変異は，3060位のCをTに置換する変異を伴っていてもよい。この変異型yggB遺伝子を配列番号７３に，該遺伝
子にコードされる変異型YggBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号７４に示す。
イ20

膜貫通領域の変異【００７３】…yggB遺伝子がコードするYggBタンパク質は，5個の膜貫通領域を有していると推測される。配列番号６，６２，６８，８４，８５の野生型のYggBタンパク質のアミノ酸配列において，膜貫通領域はそれぞれ，アミノ酸番号１～２３（第１膜貫通領域），２５～４７（第２膜貫通領域），６２～８４（第３膜貫通領域），８６～１

25

０８（第４膜貫通領域），１１０～１３２（第５膜貫通領域）の領域に相当する。
これらをコードするDNAは配列番号５の1437-1505，1509-1577，1620-1688，1692-1760，

350

1764-1832番目の塩基に該当する。本発明の変異は，この膜貫通領域をコードするDNA
内に変異を有していることが望ましく，変異導入は１若しくは数個のアミノ酸の置
換，欠失，付加，挿入又は逆位を含む変異で，フレームシフト変異，ナンセンス変異を伴わないものが望ましい。従って，ここでアミノ酸配列の置換の場合は，アミ5ノ酸置換を伴うミスセンス変異が好ましく，上記数個の置換，欠失，付加，挿入又は逆位とは，２～２０個，好ましくは２～１０個，より好ましくは２～５個，さらに好ましくは２～3個を意味する。またアミノ酸の挿入，欠失変異は，１～数塩基のポイントミューテーションの導入や，フレームシフト変異を伴わない塩基配列導入，
例えば，３，６，９，１２，１５，１８，または２１塩基の挿入または欠失，好ま10

しくは，３，６，または９塩基の欠失または挿入，より好ましくは３塩基の塩基配列の欠失または挿入が望ましい。
(ｱ)

第１膜貫通領域の変異（Ａ１型変異）【００７４】
例えば，以下のような変異が例として挙げられる。
15…この変異は，配列番号６，６２，６８，８４，８５に示されるアミノ酸配列において，14番目のロイシン残基，15番目のトリプトファン残基間に１又は数アミノ酸挿入された変異である。
具体例としては，14番目のロイシン残基，15番目のトリプトファン残基間に，３アミノ酸導入されたもの，例えばCys-Ser-Leuが挿入されたものが挙げられ，この変20異の例として，配列番号５の１４８０番目のGの次にＴＴＣＡＴＴＧＴＧが挿入された変異が挙げられる。この変異が導入された変異型yggB遺伝子の塩基配列を配列
番号１９に，該遺伝子にコードされる変異型YggBタンパク質のアミノ酸配列を配列
番号２０に示す。
(ｲ)25

第４膜貫通領域の変異（１９型変異）【００７５】…この変異は，配列番号６，６２，６８，８４，８５に示されるアミノ酸配列に351

おいて，１００番目のアラニン残基が，他のアミノ酸残基へ置換した変異である。
他のアミノ酸とは，アラニン以外のアミノ酸残基であればいずれでもよく，他のア
ミノ酸とはアルギニン，アスパラギン酸，アスパラギン，システイン，グルタミン
酸，グルタミン，グリシン，ヒスチジン，イソロイシン，メチオニン，ロイシン，
5

リジン，フェニルアラニン，プロリン，セリン，トリプトファン，チロシン，バリン，スレオニンを意味するが，中でも側鎖にヒドロキシル基を有するアミノ酸（スレオニン，セリン，チロシン）に置換されていることが望ましく，特にスレオニン
残基に置換されていることが望ましい。一例として配列番号５の１７３４番目のＧがＡに置換された変異が挙げられる。

10

この変異が導入された変異型yggB遺伝子の塩基配列を配列番号２１に，該遺伝子にコードされる変異型YggBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２２に示す。
(ｳ)

第５膜貫通領域の変異（Ｌ３０型変異，8型変異）【００７６】…この変異は，配列番号６，６２，６８，８４，８５に示されるアミノ酸配列に
15

おいて，１１１番目のアラニン残基が，他のアミノ酸残基へ置換した変異である。
他のアミノ酸とは，アラニン以外のアミノ酸残基であれば，いずれでもよく，他のアミノ酸とはアルギニン，アスパラギン酸，アスパラギン，システイン，グルタミ
ン酸，グルタミン，グリシン，ヒスチジン，イソロイシン，メチオニン，ロイシン，
リジン，フェニルアラニン，プロリン，セリン，トリプトファン，チロシン，バリ

20

ン，スレオニンを意味するが，中でも分岐鎖アミノ酸（バリン，イソロイシン，ロイシン），特にバリン残基や，側鎖にヒドロキシル基を有するアミノ酸（スレオニン，セリン，チロシン），特にスレオニン残基に置換されていることが望ましい。
この変異の例として，配列番号５の１７６８番目のＣがＴに置換された変異（L30型
変異）や，配列番号６１の８３７番目のGがAに置換された変異（8型変異）が挙げら25れる。L30型変異が導入された変異型yggB遺伝子の塩基配列を配列番号２３に，該遺伝子にコードされる変異型YggBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２４に示す。

352

8型変異が導入された変異型yggB遺伝子の塩基配列を配列番号６３に，該遺伝子にコードされる変異型YggBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号６４に示す。
ウ【００７７】
5

上記の「変異型 yggB 遺伝子」は，ビオチンが過剰量存在する条件におけるＬ－グ
ルタミン酸生産能を向上させる機能を有する限り，上述の変異を含む機能的に均等な遺伝子，例えば，配列番号 7 の塩基番号 1437～2705 の塩基配列を含むＤＮＡ，
配列番号 19 の塩基番号 1437～3044 の塩基配列を含む DNA，配列番号 21 の塩基番
号 1437～3035 の塩基配列を含む DNA，配列番号 23 の塩基番号 1437-3035 の塩基配10列を含む DNA，配列番号 63 の塩基番号 507-2093 の塩基配列を含む DNA，配列番号69 の塩基番号 403-2001 の塩基配列を含む DNA，配列番号７３の塩基番号 548－
2146 の塩基配列を含む DNA のような変異型遺伝子と実質的に相同な遺伝子で，これらと相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該塩基配列の一部を有するプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子であってもよ15い。ここでストリンジェントな条件とは，いわゆる特異的なハイブリッドが形成され，非特異的なハイブリッドが形成されない条件のことをいう。例えば，通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件が挙げられ，具体的には，６０℃，０．
１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ，さらに好ましくは，６８℃，０．１×ＳＳＣ，０．
１％ＳＤＳに相当する塩濃度，温度で，１回より好ましくは２～３回洗浄する条件20が挙げられる。
【００７８】
変異型 yggB 遺伝子がコードするタンパク質としては，同タンパク質の活性がビ
オチンが過剰量存在する条件においてＬ－グルタミン酸生産能を向上させる機能を有する限り，機能的に均等なタンパク質例えば，配列番号８，２０，２２，２４，

25

６４，７０，７４から選択されるアミノ酸配列において，上記変異点のアミノ酸以
外にさらに，１若しくは数個のアミノ酸の置換，欠失，挿入，または付加を含むア353

ミノ酸配列を有するものであってもよい。ここで，数個とは，例えば，２～２０
個，好ましくは２～１０個，より好ましくは２～５個を意味する。上記置換は保存的置換（中性変異）が好ましく，保存的置換としては，ala から ser 又は thr への置換，arg から gln，his 又は lys への置換，asn から glu，gln，lys，his 又は5

asp への置換，asp から asn，glu 又は gln への置換，cys から ser 又は ala への置換，gln から asn，glu，lys，his，asp 又は arg への置換，glu から gly，asn，
gln，lys 又は asp への置換，gly から pro への置換，his から asn，lys，gln，arg
又は tyr への置換，ile から leu，met，val 又は phe への置換，leu から ile，
met，val 又は phe への置換，lys から asn，glu，gln，his 又は arg への置換，met

10から ile，leu，val 又は phe への置換，phe から trp，tyr，met，ile 又は leu への置換，ser から thr 又は ala への置換，thr から ser 又は ala への置換，trp から phe 又は tyr への置換，tyr から his，phe 又は trp への置換，及び，val から
met，ile 又は leu への置換が挙げられる。また，上述したように，配列番号８５の Xaa のアミノ酸が置換されてもよい。さらに，本発明の yggB 遺伝子は，配列番

15

号８，２０，２２，２４，６４，７０，７４のアミノ酸配列全体に対して，８０％
以上，好ましくは９０％以上，より好ましくは９５％以上，特に好ましくは９７％以上の相同性を有するタンパク質をコードし，コリネ型細菌で変異型 yggB がコー
ドするタンパク質と同等の活性を有するタンパク質をコードするホモログも含む。
【００７９】

20

特に，以下のアミノ酸は配列番号８，２０，２２，２４，６４，７０，７４のア
ミノ酸配列において置換されていてもよい。
48 位の Glu（好ましくは Arg による置換）
275 位の Asp（好ましくは Ser による置換）
298 位の Glu（好ましくは Ala による置換）

25

343 位の Ala（好ましくは Val による置換）
396 位の Phe（好ましくは Ile による置換）354

438 位の Ser（好ましくは Gly による置換）
445 位の Val（好ましくは Ala による置換）
454 位の Ala（好ましくは Val による置換）
457 位の Pro（好ましくは Ser による置換）
5474 位の Ser（好ましくは Asp による置換）
517 位の Val（好ましくは欠失）
518 位の Glu（好ましくは欠失）
519 位の Ala（好ましくは欠失）
520 位の Pro（好ましくは欠失）

10

(5)

変異型yggB遺伝子のコリネ型細菌への導入方法【００８０】…上記のような変異を有する変異型 yggB 遺伝子は，例えば，部位特異的変異導入法などによって得ることができる。より具体的には，yggB 遺伝子の該当領域に変異を含む配列を有する PCR プライマーを用いて，該当箇所を増幅するオーバーラップ
15

エクステンション PCR 法などを用いて，変異を含む yggB 遺伝子を増幅してクローニングすることができる (Urban,A., Neukirchen, S. and Jaeger, K. E., A rapid
and efficient method for site-directed mutagenesis using one-step overlap
extension PCR. Nucleic Acids Res, 25, 2227-8. (1997).)。
得られた変異型 yggB 遺伝子をコリネ型細菌に導入することにより本発明のコリ

20

ネ型細菌を得ることができる。導入の方法としては，変異型 yggB 遺伝子で染色体上の野生型の yggB 遺伝子を置換する方法が挙げられる。染色体上の野生型の yggB 遺伝子を破壊した株に変異型 yggB 遺伝子を導入してもよい。なお，一回組換え株のよ
うに，野生型の yggB 遺伝子を染色体上に残したまま，変異型 yggB 遺伝子を導入してもよく，野生型遺伝子と，変異型遺伝子が組み込まれる１コピーずつ染色体上に25存在してもよい。染色体上の yggB 遺伝子の置換は，例えば，上述したレバンシュー355

クラーゼをコードする sacB 遺伝子を含む温度感受性プラスミドを用いて行うこと
ができる。
(6)

本発明のＬ－グルタミン酸の製造方法【００８５】
5…上記のようにして得られるコリネ型細菌をを培地に培養し，培地中にＬ－グルタミン酸を生成蓄積せしめ，Ｌ－グルタミン酸を該培地から採取することにより，Ｌ－グルタミン酸を製造することが出来る。
【００８６】
培養に用いる培地は，炭素源，窒素源，無機塩類，その他必要に応じてアミノ酸，

10

ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常の培地を用いることができる。合成培地または天然培地のいずれも使用可能である。培地に使用される炭素源および窒素源は培養する菌株が利用可能であるものならばいずれの種類を用いてもよい。
【００８７】
炭素源としては，グルコース，グリセロール，フラクトース，スクロース，マル15

トース，マンノース，ガラクトース，澱粉加水分解物，糖蜜等の糖類が使用でき，その他，酢酸，クエン酸等の有機酸，エタノール等のアルコール類も単独あるいは他の炭素源と併用して用いることができる。窒素源としては，アンモニア，硫酸ア
ンモニウム，炭酸アンモニウム，塩化アンモニウム，りん酸アンモニウム，酢酸ア
ンモニウム等のアンモニウム塩または硝酸塩等が使用することができる。有機微量

20

栄養素としては，アミノ酸，ビタミン，脂肪酸，核酸，更にこれらのものを含有するペプトン，カザミノ酸，酵母エキス，大豆たん白分解物等が使用でき，生育にア
ミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添することが好ましい。無機塩類としてはりん酸塩，マグネシウム塩，カルシウム
塩，鉄塩，マンガン塩等が使用できる。

356

また，用いる yggB 遺伝子改変株の性質にあわせて適当な濃度の界面活性剤，ペニシリンを加えてもよいし，用いる yggB 遺伝子改変株の性質にあわせてビオチン濃度も調節すればよい。
【００８８】
5

培養は，好ましくは，発酵温度２０～４５℃，ｐＨを３～９に制御し，通気培養を行う。培養中にｐＨが下がる場合には，例えば，炭酸カルシウムを加えるか，アンモニアガス等のアルカリで中和する。このような条件下で，好ましくは１０時間～１２０時間程度培養することにより，培養液中に著量のＬ－グルタミン酸が蓄積
される。

10

【００８９】
また，Ｌ－グルタミン酸が析出するような条件に調整された液体培地を用いて，培地中にＬ－グルタミン酸を析出させながら培養を行うことも出来る。Ｌ－グルタ
ミン酸が析出する条件としては，例えば，ｐＨ５．０～４．０，好ましくはｐＨ４．
５～４．０，さらに好ましくはｐＨ４．３～４．０，特に好ましくはｐＨ４．０を15挙げることができる。（欧州特許出願公開第 1078989 号明細書）【００９０】
培養終了後の培養液からＬ－グルタミン酸を採取する方法は，公知の回収方法に従って行えばよい。例えば，培養液から菌体を除去した後に濃縮晶析する方法ある
いはイオン交換クロマトグラフィー等によって採取される。Ｌ－グルタミン酸が析

20

出するような条件下で培養した場合，培養液中に析出したＬ－グルタミン酸は，遠心分離又は濾過等により採取することができる。この場合，培地中に溶解している
Ｌ－グルタミン酸を晶析した後に，併せて単離してもよい。

25

７

実施例

(1)

実施例１

【００９２】＜sacB 搭載遺伝子破壊用ベクターの構築＞

357

（A）pBS3 の構築
sacB 搭 載 遺 伝 子 破 壊 用 ベ ク タ ー の 構 築 は ， 国 際 公 開 WO2005113745 号 ，WO2005113744 号の方法を参照にして行った。sacB 遺伝子（配列番号１１）をバチ
ルス・ズブチリスの染色体 DNA を鋳型として配列番号 13 と 14 をプライマーとして5用いて，PCR により取得した。PCR 反応は，LA taq(TaKaRa)を用い，94 ℃で 5 分保温を 1 サイクル行った後，変性 94℃ 30 秒，会合 49℃ 30 秒，伸長 72℃ 2 分からなるサイクルを 25 回繰り返した。生成した PCR 産物を常法により精製後 BglII と
BamHI で消化し，平滑化した。この断片を pHSG299 の AvaII で消化後，平滑化した部位に挿入した。この DNA を用いて，エシェリヒア・コリ JM109 のコンピテントセ

10ル（宝バイオ社製）を用いて形質転換を行い，カナマイシン（以下，Km と略す）
25μg/ml を含む LB 培地に塗布し，一晩培養した。その後，出現したコロニーを釣り上げ，単コロニーを分離し形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミ
ドを抽出し，目的の PCR 産物が挿入されていたものを pBS3 と命名した。pBS3 の構築過程を図 1 に示す。

15

【００９３】（B）pBS4S の構築
pBS3 上に存在するカナマイシン耐性遺伝子配列中の SmaI 部位をアミノ基置換を伴わない塩基置換(SmaI により切断されない変異)によりカナマイシン耐性遺伝子を破壊したプラスミドをクロスオーバーPCR で取得した。まず，pBS3 を鋳型として

20

配列番号 15，16 の合成 DNA をプライマーとして PCR を行い，カナマイシン耐性遺伝子の N 末端側の増幅産物を得る。一方 Km 耐性遺伝子の C 末端側の増幅産物を得るために pBS3 を鋳型として配列番号 17，18 の合成 DNA を鋳型として PCR を行った。
PCR 反応は Pyrobest DNA Polymerase(宝バイオ社製)を用い，98 ℃で 5 分保温を 1
サイクル行った後，変性 98℃ 10 秒，会合 57℃ 30 秒，伸長 72℃ 1 分からなるサイ25

クルを 25 回繰り返すことにより目的の PCR 産物を得ることができる。配列番号１６と１７は部分的に相補的であり，またこの配列内に存在する SmaI 部位はアミノ

358

酸置換を伴わない塩基置換を施すことにより破壊されている。次に SmaI 部位が破壊された変異型カナマイシン耐性遺伝子断片を得るために，上記カナマイシン耐性
遺伝子 N 末端側及び C 末端側の遺伝子産物を，それぞれほぼ等モルとなるように混合し，これを鋳型として配列番号 15，18 の合成 DNA をプライマーとして PCR を行5

い 変 異 導 入 さ れ た Km 耐 性 遺 伝 子 増 幅 産 物 を 得 た 。 PCR 反 応 は Pyrobest DNA
Polymerase(宝バイオ社)を用い，98 ℃で 5 分保温を 1 サイクル行った後，変性 98℃
10 秒，会合 57℃ 30 秒，伸長 72℃ 1.5 分からなるサイクルを 25 回繰り返すことに
より目的の PCR 産物を得ることができる。
【００９４】

10

PCR 産物を常法により精製後 BanII で消化し，上記の pBS3 の BanII 部位に挿入した。この DNA を用いて，エシェリヒア・コリ JM109 のコンピテントセル（宝バイオ社製宝バイオ社製）を用いて形質転換を行い，カナマイシン 25μg/ml を含む LB 培
地に塗布し，一晩培養した。その後，出現したコロニーを釣り上げ，単コロニー分
離し，形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し，目的の PCR

15

産物が挿入されていたものを pBS4S と命名した。pBS4S の構築過程を図 2 に示す。
(2)

実施例２

【００９５】＜C. glutamicum ATCC13869 由来 odhA 変異株の構築＞
コリネ型細菌の α－ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼをコードしている odhA 遺20

伝子の配列は既に明らかにされている（Microbiology 142, 3347-3354, (1996)，
GenBank accession No.D84102）。公開されている odhA 遺伝子の配列を基に，配列
番号１，２に記載のプライマーを設計し ATCC13869 株の染色体 DNA を鋳型として PCRを行い，odhA 遺伝子の内部配列のみを増幅した。増幅した PCR 断片を BamHI で完全分 解 し ， 実 施 例 １ で 構 築 し た pBS4S の BamHI 部 位 に 挿 入 し た プ ラ ス ミ ド

25

pBS4SΔsucAint を構築した（構築図は図３に記載）。
【００９６】

359

電気パルス法（特開平 2-207791）にて C.glutamicum

ATCC13869 へ pBS4SΔsucAintを導入し，カナマイシン 25μg/ml を含む CM-Dex 寒天培地（グルコース 5g/l，ポリペプトン 10g/l，酵母エキス 10g/l，KH2PO4 1g/l，MgSO4・7H2O 0.4g/l，FeSO4・7H2O
0.01g/l，MnSO4・4-5H2O 0.01g/l，尿素 3g/l，大豆蛋白加水分解液 1.2g/l，寒天
520g/l，NaOH を用いて pH7.5 に調整：オートクレーブ 120℃20 分）上に塗布した。
31.5℃ に て 培 養 後 ， 生 育 し て き た 株 を ， 相 同 組 換 え に よ っ て 染 色 体 上 に
pBS4SΔsucAint が組み込まれた 1 回組換え株であることを PCR にて確認した。なお
1 回組換え株であることの確認は，候補株の染色体を鋳型にし，pBS4S 上の特異的配列（配列番号 3）と染色体上の配列（配列番号 4）をプライマーにした PCR を行うこ

10とによって，容易に確認することが出来る（非組み換え株の染色体上には pBS4S の配列が存在していないため，PCR によって増幅される断片が出現しないことから判別可能となる）。
【００９７】
こうして取得した 1 回組換え株を 2A-1 株と名付けた。野生株 ATCC13869 および

15

2A-1 株を 20ml のフラスコ培地（グルコース 30g/l,

硫酸アンモニウム

15g/l,

KH2PO4 1g/l, MgSO4・7H2O 0.4g/l, FeSO 4・7H2O 0.01g/l, MnSO 4・4～5H2O 0.01g/l,
VB1 200μg/l, Biotin 300μg/l, 大豆加水分解物（T-N）0.48g/l, KOH を用いて
pH8.0 に調整：オートクレーブ 115℃10 分）に接種した後，予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウムを 1g 加え，31.5℃で振とう培養した。完全に糖を消費したのち，
20培地中のＬ－グルタミン酸濃度を測定した。結果を表１に示す（OD620 は 101 倍希釈の濁度で菌体量の指標であり，Glu(g/L)はＬ－グルタミン酸の蓄積量を示す）。
親株の ATCC13869 ではＬ－グルタミン酸を全く生成しない条件においても 2A-1 株
ではＬ－グルタミン酸生産能を有することが確認された。
【００９８】

25

【表１】

360

(3)

実施例３

【００９９】＜２A-1 由来 odhA 復帰株の構築＞5取得した 2A-1 株は，染色体上の odhA 遺伝子が pBS4SΔＴ￥sucAint によって破壊されている。この株から染色体上のプラスミドを脱落させれば odhA は野生型に復帰する。一方，odhA が欠損した株では，糖を含まない培地での生育が著しく遅い
が，odhA が野生型に復帰すれば糖を含まない CM2B(ポリペプトン 10g/l，酵母エキ
ス 10g/l，NaCl 5g/l，Biotin 10μg/L，寒天 20g/l，KOH を用いて pH7.0 に調整)

10のような培地でも良好に生育すると推測される。そこで，2A-1 株を CM2B プレートに塗布し，生育改善株を誘導した。こうして出現した生育改善株 2A-1R 株を CM2B プ
レートで純化し，そのカナマイシン感受性を調べたところ，すべてカナマイシン感受性であり，スクロース耐性であることが明らかとなった。
【０１００】

15

pBS4SΔsucAint にはカナマイシン耐性遺伝子とレバンシュークラーゼをコードする sacB 遺伝子が含まれているため，pBS4SΔsucAint を有する株ではカナマイシ
ン耐性とスクロース感受性を示し，脱落した株ではカナマイシン感受性を示し，またスクロース耐性を示すこととなる。これらの結果から 2A-1R 株では odhA が野生型に復帰していることが示唆された。さらに odhA 遺伝子の配列を確認した結果，

20

odhA 遺伝子には変異がないことが確認されたことから，2A-1R 株では odhA は野生型に復帰していると結論した。2A-1R 株のグルタミン酸生産能を実施例２と同様の

361

方法で確認した。結果を表２に示す。（OD620 は 101 倍希釈の菌体量，Glu(g/L)はＬ－グルタミン酸の蓄積量を示す）2A-1R 株のグルタミン酸蓄積は 2A-1 株には劣る
ものの野生株 ATCC13869 よりも遥かに高いことが示された（表２）。また，糖を完全に消費した後も振とうを続けたところ，2A-1R ではグルタミン酸の分解が認めら
5

れ，odhA が野生型に復帰していることが裏付けられた（図４）。
【０１０１】
【表２】

(4)
10

実施例４

【０１０２】＜2A-1R 株のグルタミン酸生成に関与する遺伝子の単離＞
2A-1R 株は，CM2B プレート培地上においては，野生株 ATCC13869 とほぼ変わらない速度でコロニーを形成できる。しかし，最少培地（グルコース 20g/l,硫酸アンモ
ニウム

152.64g/L, KH2PO4 0.5g/L, K2HPO4 0.5g/L, MgSO4・7H2O 0.25g/L, FeSO4・

7H2O 0.01g/L, MnSO4・7H2O 0.01g/L,

CaCl2 0.01g/L, CuSO4 0.02mg/L, MOPS 40g/L,

プロトカテク酸 30mg/L, VB1・HCl200μg/L, Biotin 300μg/L, 寒天 20g/L, NaOH
を用いて pH6.7 に調整）プレート上では野生株 ATCC13869 に比し著しくコロニー形
成速度が低下していることが明らかとなった。そこで，最少培地で 2A-1R 株の生育を回復できる遺伝子の探索をおこなった。
20【０１０３】

362

ATCC13869 株の染色体 DNA を Sau3AI で部分分解し，シャトルベクターpVK9 を
BamHI で処理したものとライゲーションし，ライゲーション反応液をエタノール沈殿した後，E.coli DH5α(タカラバイオ)のエレクトロコンピテントセルを電気パルス法で形質転換した。pVK9 は，pHSG299（タカラバイオ）の AvaII 部位を平滑末端5化し，pHK4(特開平 05-007491)に含まれるコリネ型細菌内で自律複製可能な領域をBamHI および KpnI で切り出し平滑末端化した断片を挿入したシャトルベクターである。形質転換後の菌体はカナマイシン 25μg/ml を含む LB プレート培地（ポリペプトン 10g/l，酵母エキス 5g/l，NaCl 5g/l，寒天 20g/l，NaOH を用いて pH7.0 に調整）に塗布し，37℃で一晩培養した。翌日出現したコロニーを全てエーゼでかき

10

とり，プラスミドを抽出し ATCC13869 のライブラリーとした。このライブラリーを実施 例３ で得 られ た 2A-1R 株に 電気 パル ス法 にて 形質 転 換し ， カ ナマ イシン
25μg/ml を含む最少培地プレートに塗布し，コロニー形成速度が向上した株をスクリーニングした。コロニー形成速度が向上した株よりプラスミドを抽出した結果，
配列番号５に記す断片が pVK9 の BamHI 部位に挿入されていたことが明らかとなっ15た。このプラスミドを pL5k と命名した。
【０１０４】
pL5k の挿入配列と，既に公開されているコリネバクテリウム・グルタミカム
ATCC13032 のゲノム配列（Acc.No.

NC_003450）を比較した結果，pL5k には完全長の ORF として，配列番号６に示すアミノ酸配列をもつ ORF のみが含まれていること
20が明らかとなった。ORF が膜タンパク質か否かは，インターネット上で利用可能な
プ ロ グ ラ ム 「 SOSUI 」 に よ っ て 予 測 可 能 で あ る （ 2004/10/07

現在

http://sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp/sosuiframe0E.html にリンクされている）。
「SOSUI」でこの ORF を解析した結果，５回の膜貫通領域が存在していることが示唆された。配列番号６のアミノ酸配列において，膜貫通領域はそれぞれ，アミノ酸番
25

号１～２３，２５～４７，６２～８４，８６～１０８，１１０～１３２の領域に相当する。これらをコードするＤＮＡ配列は，配列番号５の 1437-1505，1509-1577，

363

1620-1688，1692-1760，1764-1832 番目の塩基配列に，膜貫通領域のアミノ酸配列
は配列番号２５－２９，表３に示した【０１０５】
【表３】

5

(5)

実施例５

【０１０７】＜2A-1R 株の YggB 遺伝子の変異点同定＞
2A-1R 株の最少培地における生育を pL5K が相補したことから，2A-1R 株の yggB 遺10

伝子には何らかの変異がある可能性が示唆された。そこで，2A-1R 株の yggB 遺伝子の塩基配列を決定した。その結果 2A-1R 株では YggB 遺伝子の C 末端側の領域に ISが挿入されていることが明らかとなった（図 5）。2A-1R 株の変異型 yggB 遺伝子の塩基配列を配列番号７に，アミノ酸配列を配列番号８に記した。このことから，2A1R 株のグルタミン酸生産能は，yggB 遺伝子の変異によって維持されていた可能性

15が示唆された。なお，この変異は 2A-1R 株のみならず 2A-1 株にも存在していた。
odhA 遺伝子に変異を導入した際に，安定してグルタミン酸を細胞外に放出するためのサプレッサー変異として起こった変異であると推測される。ここで，ＩＳが挿入されたこの変異を，2A-1 型変異とした。
(6)

20

実施例６

【０１０８】364

＜2A-1 型 yggB 変異株構築と L-グルタミン酸生産能評価＞（６－１）

2A-1 型変異の野生株への導入と評価（１回組換え株）

2A-1 株の染色体 DNA を鋳型として，配列番号９と配列番号１０に示す合成 DNA を
プライマーとして PCR を行い，2A-1 型変異を有する yggB 遺伝子断片を増幅した。
5

増幅産物は SacI で処理し，実施例１の pBS3 の SacI 部位に挿入した。2A-1 型変異を有する yggB 断片がクローニングされたプラスミドを pBS3yggB2A と名付けた。
電気パルス法にて C.glutamicum

ATCC13869 に pBS3yggB2A を導入し，カナマイ

シン 25μg/ml を含む CM-Dex 寒天培地上に塗布した。31.5℃にて培養後生育してきた株を，相同組換えによって染色体上に pBS3yggB2A が組み込まれた 1 回組換え株
10であることを PCR で確認した。
得られた一回組換え株を 13869-2A とした。この株では，野生型の yggB 遺伝子と変異型の yggB 遺伝子の両方が発現していることとなる。
【０１０９】
取得した yggB 変異導入株 13869-2A のグルタミン酸生産能を，実施例 2 記載の方

15

法にて確認した。その結果を表４に示す（OD620 は 101 倍希釈の菌体量，Glu(g/L)
はＬ－グルタミン酸の蓄積量を示す）。13869-2A 株では，ATCC13869 株がＬ－グルタミン酸を生成しない条件でも，明確なグルタミン酸生産能が確認できた。このことから，YggB 遺伝子の変異により，グルタミン酸生産が誘導できることが示された。
【０１１０】

20

【表４】

365

【０１１１】（６－２）2A-1 型変異の野生株への導入と評価（２回組換え株）
変異型遺伝子のみを有する株を構築する為，13869-2A 株を CM-Dex 液体培地で一夜培養した懸濁液を S10 寒天培地（スクロース 100g/l，ポリペプトン 10g/l，酵母
5

エキス 10g/l，KH2PO4 1g/l，MgSO4・7H2O 0.4g/l，FeSO4・7H2O 0.01g/l，MnSO4・45H2O 0.01g/l，尿素 3g/l，大豆蛋白加水分解液 1.2g/l，寒天 20g/l，NaOH を用いて pH7.5 に調整：オートクレーブ 120℃20 分）上に塗布し 31.5℃で培養した。出現したコロニーのうち，カナマイシン感受性を示す株をｓ2B 寒天培地上で純化した。
これらの株より染色体ＤＮＡを調整し，配列番号９と配列番号１０に示す合成 DNA

10をプライマーとして PCR を行い変異を確認し，yggB 遺伝子にＩＳ様配列が挿入されていた株を 13869-2A-7 とした。
【０１１２】
取得した 13869-2A-7 株のグルタミン酸生産能を，実施例 2 記載の方法にて確認した。その結果を表５に示す。（OD620 は 101 倍希釈の菌体量，Glu(g/L)はＬ－グ

15ルタミン酸の蓄積量を示す）。13869-2A-7 株では，2A-1R 株と同等以上のグルタミン酸生産能を示したことから，ビオチン過剰量存在下でのＬ－グルタミン酸生産は，
yggB 遺伝子の変異によって引き起こされることが確認できた。
【０１１３】
【表５】

20

(7)

実施例７

366

【０１１４】＜A1 型 YggB 変異株の構築と評価＞

上述のＬ－グルタミン酸生産性の odhA 変異株を解析した結果，上述の 2A-1 変異の他に yggB 遺伝子上に５種類の変異を見出した。以下，それぞれＡ１型変異，１９5型変異，L30 型変異，８型変異，６６型変異とし，前者３つについては ATCC13869 の染色体に変異を導入して効果を確認した。８型変異については ATCC14067 の染色体に 変 異 を 導 入 し て 効 果 を 確 認 し た 。 ６ ６ 型 変 異 に 関 し て は ， C.melassecola
ATCC17965 の染色体に変異を導入して効果を確認した。
【０１１５】

10

A1 型変異は，配列番号５の１４８０番目の G の次にＴＴＣＡＴＴＧＴＧが挿入された変異であり，配列番号６のアミノ酸配列の 14 番目のロイシン残基，15 番目のトリプトファン残基間にシステイン，セリン，ロイシン残基が挿入された変異である。この変異が導入された変異型 yggB 遺伝子の塩基配列を配列番号１９に，該遺伝
子にコードされる変異型 YggB タンパク質のアミノ酸配列を配列番号２０に示す。

15【０１１６】
A1 型変異遺伝子の取得は次のようにすれば行うことが出来る。配列番号 30 に示す合成 DNA と配列番号 31 に示す合成 DNA をプライマーとして，ATCC１３８６９株の染色体 DNA を鋳型として PCR を行い，N 末端側断片を調製する。同様に配列番号
32 と配列番号 33 の合成 DNA をプライマーとして，C 末端側断片を調製する。続い20て N 末端側断片と C 末端側断片を等量混合したものを鋳型として，配列番号９と配
列番号 34 の合成 DNA をプライマーとして PCR を行えば A1 型 YggB 遺伝子の部分断片を取得できる。得られた YggB 断片は SacI で処理して pBS4S の SacI 部位に挿入することにより，変異導入用のプラスミドが構築可能である。このようにして得られた pBS4 YggBA1 を実施例６記載の方法と同様に ATCC13869 株の染色体に挿入した

25

後，脱落させる。得られたカナマイシン感受性株の yggB 遺伝子の配列を決定し，A1367

型に置換されていた株を選択すれば，A1 型変異を有する株を構築することができる。
このような変異を持つ A1 型変異株を ATCC13869-A1 株とした。
【０１１７】
ATCC13869-A1 株と親株の ATCC13869 株を実施例２と同様の方法で培養を行った。
5

培養終了後，培養液中に含まれるＬ－グルタミン酸の量を公知の方法で測定した。
A1 変異を染色体上に導入した，ATCC13869-A1 株は親株の ATCC13869 株と比べてＬ－グルタミン酸蓄積が大幅に向上していた。
【０１１８】
【表６】

10

(8)

実施例８

【０１１９】＜19 型 YggB 変異株の構築と評価＞
１９型変異は，配列番号５の１７３４番目のＧがＡに置換された変異であり，配15

列番号６のアミノ酸配列の 100 番目のアラニンがスレオニンに置換された変異である。この変異が導入された変異型 YggB 遺伝子の塩基配列を配列番号２１に，該遺伝
子にコードされる変異型 YggB タンパク質のアミノ酸配列を配列番号２２に示す。
実施例７と同様の方法にて，１９型変異が導入された yggB 変異株を構築した。具体的には，配列番号 30 に示す合成 DNA と配列番号 35 に示す合成 DNA をプライマーと20

して，ATCC１３８６９株の染色体 DNA を鋳型として PCR を行い，N 末端側断片を調製する。同様に配列番号 33 と配列番号 36 の合成 DNA をプライマーとして，C 末端
側断片を調製する。続いて N 末端側断片と C 末端側断片を等量混合したものを鋳型として，配列番号 9 と配列番号 34 の合成 DNA をプライマーとして PCR を行えば 19368

型 YggB 遺伝子の部分断片を取得できる。得られた YggB 断片は SacI で処理してpBS4S の SacI 部位に挿入することにより，変異導入用のプラスミドが構築可能である。このようにして得られた pBS4 YggB19 を実施例６記載の方法と同様に ATCC13869
株の染色体に挿入した後，脱落させる。得られたカナマイシン感受性株の yggB 遺伝
5子の配列を決定し，19 型に置換されていた株を選択すれば，19 型変異を有する株を構築することができる。このような変異を持つ 19 型変異株を ATCC13869-19 株とした。
【０１２０】
ATCC13869-19 株と親株の ATCC13869 株を実施例２と同様の方法で培養を行った。

10

培養終了後，培養液中に含まれるＬ－グルタミン酸の量を公知の方法で測定した。
19 変異を染色体上に導入した，ATCC13869-19 株は親株の ATCC13869 株と比べてＬ－グルタミン酸蓄積が大幅に向上していた。
【０１２１】
【表７】

15

(9)

実施例９

【０１２２】＜Ｌ３０型 YggB 変異株の構築＞
Ｌ３０型変異は，配列番号５の１７６８番目のＣがＴに置換された変異であり，
20

配列番号６の１１１番目のアラニンがバリンに置換された変異である。この変異が導入された変異型 YggB 遺伝子の塩基配列を配列番号２３に，該遺伝子にコードされる変異型 YggB タンパク質のアミノ酸配列を配列番号２４に示す。

369

実施例７と同様の方法にて，Ｌ３０型変異が導入された yggB 変異株を構築した。
具体的には，配列番号 30 に示す合成 DNA と配列番号 37 に示す合成 DNA をプライマーとして，ATCC１３８６９株の染色体 DNA を鋳型として PCR を行い，N 末端側断片を調製する。同様に配列番号 34 と配列番号 38 の合成 DNA をプライマーとして，C5末端側断片を調製する。続いて N 末端側断片と C 末端側断片を等量混合したものを鋳型として，配列番号 9 と配列番号 34 の合成 DNA をプライマーとして PCR を行な
いＬ３０型 YggB 遺伝子の部分断片を取得する。得られた変異型 YggB 断片は SacI で処理して pBS4S の SacI 部位に挿入することにより，変異導入用のプラスミドを構築した。このようにして得られた pBS4 YggB-L を実施例６記載の方法と同様に

10

ATCC13869 株の染色体に挿入した後，脱落させる。得られたカナマイシン感受性株の yggB 遺伝子の配列を決定し，L30 型に置換されていた株を選択し，L30 型変異を有する株を構築した。このような変異を持つ L30 型変異株を ATCC13869-L 株とした。
【０１２３】
ATCC13869 株と，ATCC13869-L 株を実施例２と同様の方法で培養を行い，培養終了

15後，培養液中に含まれるＬ－グルタミン酸の量を公知の方法で測定した。結果を表８に示す。（OD620 は 101 倍希釈の菌体量，Glu(g/L)はＬ－グルタミン酸の蓄積量を示す）。Ｌ－３０変異を導入した ATCC13869-L30 株は親株の ATCC13869 株と比べてＬ－グルタミン酸蓄積が大幅に向上していた。
【０１２４】

20

【表８】

(10)

実施例１０

【０１２５】

370

＜変異型 yggB 遺伝子導入株の L-グルタミン酸生成条件における培養評価＞
コリネ型細菌は Tween40 等の脂肪酸系界面活性剤の添加や，ビオチン制限によりグルタミン酸生成を誘導できる。そこで，ATCC13869 株と ATCC13869-19 株について，Tween40 添加条件およびビオチン制限条件での培養も行った。シード培養は，20ml
5のフラスコ培地（グルコース 80g/l,

硫酸アンモニウム

30g/l, KH2PO4 1g/l,

MgSO4・7H2O 0.4g/l, FeSO4・7H2O 0.01g/l, MnSO4・4～5H2O 0.01g/l, VB1 200μg/l,
Biotin 60μg/l, 大豆加水分解物（T-N）0.48g/l, KOH を用いて pH8.0 に調整：オートクレーブ 115℃10 分）に接種した後，予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウムを 1g 加え，31.5℃で振とう培養した。完全に糖を消費した培養液を種培養液とし10た。Tween40 添加培養においては，種培養液 2ml を 20ml のフラスコ培地（グルコー
ス 80g/l,

硫酸アンモニウム

30g/l, KH2PO4 1g/l, MgSO 4・7H2O 0.4g/l, FeSO4・

7H2O 0.01g/l, MnSO 4・4～5H2O 0.01g/l, VB1 200μg/l, Biotin 60μg/l, 大豆加水分解物（T-N）0.48g/l, KOH を用いて pH8.0 に調整：オートクレーブ 115℃10 分）に接種した後，予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウムを 1g 加え，31.5℃で振とう15培養した。培養開始後，OD620(x101)=0.2 に到達した時点で，最終濃度 5g/L となる
ように Tween40 を添加し培養を継続した。ビオチン制限培養においては，種培養液
1ml を 20ml のフラスコ培地（グルコース 80g/l,

硫酸アンモニウム

30g/l, KH2PO4

1g/l, MgSO4・7H2O 0.4g/l, FeSO4・7H2O 0.01g/l, MnSO4・4～5H2O 0.01g/l, VB1
200μg/l, 大豆加水分解物（T-N）0.48g/l, KOH を用いて pH8.0 に調整：オートク
20

レーブ 115℃10 分）に接種した後，予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウムを 1g 加え，31.5℃で振とう培養した。この条件ではビオチンの終濃度が約 2.9μg/L となる。
Tween40 添加培養およびビオチン制限培養ともに，培養開始後 40 時間後の培地中のＬ－グルタミン酸濃度を測定した。結果を表９に示す（OD620 は 101 倍希釈の菌

25

体量，Glu(g/L)はＬ－グルタミン酸の蓄積量を示す）。ATCC13869-19 株では，L-グルタミン酸生産条件でも L-グルタミン酸の蓄積の増大が認められた。

371

【０１２６】【表９】【０１２７】
5

ATCC13869 株，ATCC13869-L30，ATCC13869-A1 株，ATCC13869-19 株，プラスミド
による yggB 増幅株についても，Tween40 添加培養を行なった。CM-Dex プレートに一夜培養した菌体を 1/6 プレート分かきとり，20ml のフラスコ培地（グルコース 80g/l,
硫酸アンモニウム 30g/l, KH2PO4 1g/l, MgSO4・7H2O 0.4g/l, FeSO4・7H2O 0.01g/l,
MnSO4・4～5H2O 0.01g/l, VB1 200μg/l, Biotin 60μg/l, 大豆加水分解物（T-N）

10

0.48g/l, KOH を用いて pH8.0 に調整：オートクレーブ 115℃10 分）に接種した後，予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウムを 1g 加え，31.5℃で振とう培養した。培養
開始５時間後に Tween40 を終濃度 1g/L となるように添加し，培養開始から 24 時間
後の菌体量と L-グルタミン酸の収量を分析した。その結果，表１０に示すように，
ATCC13869-19, ATCC13869-L30, ATCC13869-A1 株，野生型の yggB 遺伝子増幅株

15（ATCC13869/pL5k-1）ともに L-グルタミン酸生産条件での L-グルタミン酸の収量が向上していることが示された。
【０１２８】
【表１０】

372

(11)

実施例１１

【０１２９】＜８型 YggB 変異株の構築＞
5８型変異は，配列番号６１の 837 位の G が A に置換された変異であり，配列番号
６２の１１１位のアラニンがスレオニンに置換されている。この変異が導入された変異型 YggB 遺伝子の塩基配列を配列番号６３に，該遺伝子にコードされる変異型
YggB タンパク質のアミノ酸配列を配列番号６４に示す。
実施例７と同様の方法にて，8 型変異が導入された yggB 変異株を構築する。具体10

的には，配列番号 30 に示す合成 DNA と配列番号６５に示す合成 DNA をプライマー
として，Brevibacterium flavumATCC14067 株の染色体 DNA を鋳型として PCR を行い，N 末端側断片を調製する。同様に配列番号 34 と配列番号６６の合成 DNA をプライマーとして，C 末端側断片を調製する。続いて N 末端側断片と C 末端側断片を等量混合したものを鋳型として，配列番号 9 と配列番号 34 の合成 DNA をプライマー

15として PCR を行い，８型 YggB 遺伝子の部分断片を取得する。得られた変異型 YggB
断片は SacI で処理して pBS4S の SacI 部位に挿入することにより，変異導入用のプラスミドを構築する。このようにして得られた pBS4 YggB８を実施例６記載の方法と同様に ATCC14067 株の染色体に挿入した後，脱落させる。得られたカナマイシン
感受性株の yggB 遺伝子の配列を決定し，８型に置換されていた株を選択し，８型変20異を有する株を構築する。このような変異を持つ８型変異株を ATCC14067yggB8 株
とする。

373

(12)

実施例１２

【０１３０】＜６６型 YggB 変異株の構築＞
６６型変異は，配列番号６７の 1673 番目の C が T に置換された変異であり，配5

列番号６８の４２４番目のプロリンがロイシンに置換されている。この変異が導入された変異型 YggB 遺伝子の塩基配列を配列番号６９に，該遺伝子にコードされる
変異型 YggB タンパク質のアミノ酸配列を配列番号７０に示す。
実施例７と同様の方法にて，66 型変異が導入された yggB 変異株を構築する。具
体的には，配列番号 30 に示す合成 DNA と配列番号７１に示す合成 DNA をプライマ

10ーとして，C.melassecolaATCC17965 株の染色体 DNA を鋳型として PCR を行い，N 末
端側断片を調製した。同様に配列番号３４と配列番号７２の合成 DNA をプライマー
として，C 末端側断片を調製する。続いて N 末端側断片と C 末端側断片を等量混合したものを鋳型として，配列番号 9 と配列番号 10 の合成 DNA をプライマーとして
PCR を行えば６６型 yggB 遺伝子の部分断片を取得できる。得られた変異型 YggB 断

15

片を SacI で処理して pBS4S の SacI 部位に挿入することにより，変異導入用のプラ
スミドを構築する。このようにして得られた pBS4 YggB６６を実施例６記載の方法と同様に ATCC17965 株の染色体に挿入した後，脱落させる。得られたカナマイシン
感受性株の yggB 遺伝子の配列を決定し，６６型に置換されていた株を選択することで，６６型変異を有する株を構築できる。このような変異を持つ６６型変異株を

20

yggB66 株とする。
(13)

実施例１３

【０１３１】＜in vitro 変異による変異型 yggB 遺伝子のスクリーニング＞（１３－１）yggB 欠損株の構築
25

変異型の yggB 遺伝子を in vitro で yggB に変異をランダムに導入し，その中から界面活性剤等の添加なしにグルタミン酸生産が可能となるクローンを選択するこ

374

とも出来る。変異型遺伝子のスクリーニングを行うため，まず yggB 欠損株を構築した。配列番号 39 に示す合成 DNA と配列番号 40 に示す合成 DNA をプライマーとして，
ATCC１３８６９株の染色体 DNA を鋳型として PCR を行い，N 末端側断片を調製した。
同様に配列番号 41 と配列番号 42 の合成 DNA をプライマーとして，C 末端側断片を5調製した。配列番号 40 と 41 は互いに相補的である。続いて N 末端側断片と C 末端
側断片を等量混合したものを鋳型として，配列番号 39 と配列番号 42 の合成 DNA を
プライマーとして PCR を行ない yggB 遺伝子の ORF を欠失した断片を取得した。
【０１３２】
得られた PCR 断片は SacI で処理して pBS4S の SacI 部位に挿入することにより，10欠損変異導入用のプラスミドを構築した。このようにして得られた pBS4ΔYggB を
実施例６記載の方法で ATCC13869 株の染色体に挿入した後，脱落させた。得られたカナマイシン感受性株の染色体 DNA を鋳型として，配列番号 39 と配列番号 42 の合成 DNA をプライマーとして PCR を行い，yggB 遺伝子が欠損していることを確認した。得られた yggB 遺伝子欠損株を ATCC13869ΔyggB 株とした。

15【０１３３】（1３－2）変異型 yggB 遺伝子の in vitro スクリーニング
一方，yggB 遺伝子の変異処理は以下のようにして行った。まず，プラスミド pL5k
は yggB 遺伝子以外の領域を若干含んでいるため，pL5k を XhoI と SalI で処理し，セルフライゲーションすることにより，プラスミド pL5kXS を得た。なお SalI 認識20

部位は，配列番号 5 の塩基配列上には存在しないが，pBS3 のマルチクローニングサ
イトに存在している。得られた pL5kXS 約 10μg を 500mM リン酸緩衝液，400mM ヒド
ロキシルアミン，1mM EDTA (pH6.0)に溶解し，75℃で３０分から９０分処理することにより変異を導入した。変異導入後のプラスミドは，SUPREC-02（タカラバイオ）で脱塩した後，実施例６記載の方法で ATCC13869ΔyggB 株に導入し，Km25μg/ml を

25

含む CM2B 培地で形質転換体を選択した。また，対照として変異処理前の pL5kXS についても ATCC13869ΔyggB 株に導入した。出現した形質転換体を，CM2BGU2 培地（実375

施例３記載の CM2B 培地にグルコース 10g/L と 15g/L の Urea を含む）2ml の液体培地に接種し，31.5℃で５時間しんとう培養したのち，グルタミン酸濃度を定量した。
表１１に，ATCC13869ΔyggB を変異処理した pL5kXS で形質転換した株を CM2BGU2培地にて試験管培養評価した結果を示す。変異処理時間６０分と９０分のプラスミ
5ド混合物から得られた形質転換体の中には，1g/L 以上の L-グルタミン酸を蓄積するクローンが３クローンが存在していた。なお，培地中にもともと含まれていたグ
ルタミン酸は 0.16g/L であり，ATCC13869ΔyggB/pL5kXS(変異処理なし)のグルタミ
ン酸蓄積量は 0.31g/L であった。
表１２に，ATCC13869ΔyggB を変異処理した pL5kXS で形質転換した株を CM2BGU

10培地（Urea が 1.5g/L である以外は CM2BGU2 培地と同組成）にて試験管培養評価した結果を示す。変異処理時間９０分のプラスミド混合物から得られた形質転換体の中に，1g/L 以上の L-グルタミン酸を蓄積するクローンが１クローン存在していた。
【０１３４】【表１１】

15【０１３５】【表１２】376

【０１３６】
表１１において，６０分の変異処理時間を行うことで 1g/L 以上の L-グルタミン酸を蓄積する生産能を獲得したプラスミドを pL5kXSm-22, 表１２において，９０分
5の変異処理時間を行うことで 0.9g/L 以上の L-グルタミン酸生産能を獲得したプラ
ス ミ ド を

pL5kXSm-27と し た 。 ATCC13869ΔyggB/pL5kXS

株 ，

ATCC13869ΔyggB/pL5kXSm-27 株，ATCC13869ΔyggB/pL5kXSm-22 株を，実施例２記載の条件で培養し，４時間後の菌体量と L-グルタミン酸蓄積を分析した。表１３に，独立した３回の実験による平均値を示した。 ATCC13869ΔyggB/pL5kXSm-27 株，
10

ATCC13869ΔyggB/pL5kXSm-22 株では有意に L-グルタミン酸蓄積が上昇していることが確認でき，in vitro でのランダムな変異導入によっても L-グルタミン酸に有利な変異型遺伝子が構築可能であることが示された。なお，pL5kXSm-22 が含む yggB
遺伝子の配列は，配列番号７３に示した。（２２型変異）
22 型変異は，437 番目のプロリンをセリンに置換する変異であり，例えば配列番

15

号５の 2745 位の C を T に置換する変異である。また，本変異は，3060 位の C を Tに置換する変異を伴っている。この変異型 yggB 遺伝子を配列番号７３に，該遺伝子にコードされる変異型 YggB タンパク質のアミノ酸配列を配列番号７４に示す。
【０１３７】【表１３】377

【０１３８】（１３－３）変異型遺伝子のコリネ型細菌への導入とＬ－グルタミン酸生産確認（１３－２）で得られた新規変異型 yggB 遺伝子をコリネ型細菌に導入する。導入5

方法は，実施例 6 に記載された方法で pBS4S に変異型遺伝子を導入し，ATCC13869の染色体上の野生型の yggB 遺伝子と置換した。この新規変異型遺伝子を導入した
株と親株の ATCC13869 株を実施例２と同様の方法で培養を行う。培養終了後，培養液中に含まれるＬ－グルタミン酸の量を公知の方法で測定し，変異導入株がＬ-グ
ルタミン酸の蓄積が向上していることを確認する。このような方法でＬ－グルタミ

10ン酸生産能の向上した yggB 変異株を取得することが出来る。
(14)

実施例１４

【０１３９】＜変異型 yggB 遺伝子保持株のグルタミン酸アナログ感受性＞(１４－１)固体培地における４-フルオログルタミン酸感受性
15yggB 変異によって L-グルタミン酸の生産能が向上している株では，L-グルタミ
ン酸アナログ感受性が低下していることが予測された。そこで，yggB 変異による Lグルタミン酸のアナログとして，4-フルオログルタミン酸に対する感受性の変化を検討した。実施例４記載の最少培地に，NaOH で pH6.7 に調整しフィルター滅菌した
４－フルオログルタミン酸を終濃度 7.5mM となるように添加した。ATCC13869 株，

20

ATCC13869-L30 株，ATCC13869-A1 株を CM-Dex 培地に塗布して一夜培養した後集菌し，滅菌した 0.85%の NaCl 溶液で洗浄し，図６上部に記載の菌濃度となるように希釈してプレートにスポットした。プレートは 31.5℃で培養し，その経時変化を図６378

に示した。4-フルオログルタミン酸を無添加の条件では，ATCC13869 株が最も生育が速いのに対し，4-フルオログルタミン酸添加条件では ATCC13869 株の生育が抑えられ，ATCC13869-L 株および ATCC13869-A1 株の方が生育が良好であることが示された。
5【０１４０】（１４－２）液体培地における４-フルオログルタミン酸感受性
実施例４記載の最少培地（ただし寒天を含まない）に，NaOH で pH6.7 に調整しフィルター滅菌した４－フルオログルタミン酸を終濃度 1.25mM, 2.5mM, 5mM, 10mM,
20mM となるように添加した。ATCC13869 株，ATCC13869ΔyggB 株，ATCC13869-L30 株，

10

ATCC13869-A1 株を CM-Dex 培地に塗布して 31.5℃で一夜培養した後集菌し，滅菌した 0.85%の NaCl 溶液で洗浄し，液体培地に接種し 31.5℃にて振とう培養した。各菌株において，４-フルオログルタミン酸を無添加の培地での OD660 の値が１に到達した時点で培養を終了し，培養液を適当に希釈して CM-Dex プレートに塗布した。翌日出現したコロニー数を計測し，液体培養終了時の生菌数とした。４－フルオログ

15ルタミン酸無添加区の生菌数を１として，４－フルオログルタミン酸添加による相対生菌数の変化を図７に示した。ATCC13869-A1 株および ATCC13869-L30 株では，４－フルオログルタミン酸に対する感受性が低下（４フルオログルタミン酸耐性が向上）していることが明らかとなった。
これらの結果から，４-フルオログルタミン酸等，グルタミン酸の構造類縁体の感20

受性を指標としたスクリーニングによっても本発明の yggB 変異株が取得できることが示された。
(15)

実施例１５

【０１４１】＜odhA 弱化株での変異型 yggB 遺伝子導入株の作成と評価＞
25【０１４２】

379

上記実施例 9 で構築した ATCC13869-L30 株を用いて yggB odhA 二重変異株を構築し，変異型 odhA 遺伝子の評価を行った。
まず，ATCC13869-L 株の odhA 遺伝子に表１４に示す変異を導入した株を構築した。なお，表１４では，配列番号４３の塩基番号２５２８～２５６２に相当する領5

域の配列を示した。また，表１５では配列番号４４のアミノ酸番号６９６～７０７に相当する領域の配列を示した。
配列番号４５の塩基配列を有する変異型 odhA 遺伝子が導入された L30sucA8 株を構築するには以下のようにすればよい。まず配列番号５３と配列番号５４に示す合成 DNA をプライマーとして PCR を行い，odhA 断片を調整する。得られた odhA 断片

10を BamHI 処理して，タカラバイオ製 Mutan-Super Express Km に付属のプラスミド
pKF19m の BamHI 部位にクローニングした後，5'末端がリン酸化された配列番号５５の合成 DNA と Mutan-Super Express Km に添付されているセレクションプライマーを用いて PCR を行い，得られた PCR 産物で sup0 の E.coli 例えば MV1184 株を形質転換することで変異型 odhA 断片を含むプラスミドを構築する。次にこの断片を

15

BamHI で切り出し，pBS4S の BamHI 部位に挿入することで変異導入用プラスミドが構築できる。このプラスミドを用いて実施例１記載の方法と同様にして ATCC13869L 株を形質転換し，染色体に変異導入用プラスミドが挿入された株を取得する。次に，これらの染色体にプラスミドが挿入された株から，スクロースに耐性を示し，かつカナマイシンに感受性を示す株を分離する。さらに odhA 遺伝子の配列を確認

20

し，目的フレームシフトが導入された株を選択することにより odhA 遺伝子が欠損した L30sucA8(odhA8)株が構築できる。
【０１４３】
また，以下の方法で yggB 変異株を用いて，他の odhA 変異株を得ることができる。
配列番号４７の塩基配列を有する変異型 odhA 遺伝子が導入された L30sucA801 株

25の取得には，5'末端がリン酸化された配列番号５５の合成 DNA の代わりに 5'末端がリン酸化された配列番号５６の合成 DNA を用いて上記方法を適用すればよい。

380

配列番号４９の塩基配列を有する変異型 odhA 遺伝子が導入された L30sucA805 株の取得には，5'末端がリン酸化された配列番号５５の合成 DNA の代わりに 5'末端がリン酸化された配列番号５７の合成 DNA を用いて上記方法を適用すればよい。
配列番号５１の塩基配列を有する変異型 odhA 遺伝子が導入された L30sucA77 株
5の取得には，5'末端がリン酸化された配列番号５５の合成 DNA の代わりに 5'末端がリン酸化された配列番号５８の合成 DNA を用いて上記方法を適用すればよい。
L30sucA8 株の odhA 遺伝子はフレームシフト変異であるために，αKGDH 活性を有さない。しかし，L30sucA801 株，L30sucA805 株，L30sucA77 株は odhA 遺伝子に欠失があるものの，フレームシフトが起こらない変異となっており，αKGDH 活性を有10しているが活性は非改変株より低下している。（データは示さず）【０１４４】【表１４】【０１４５】15【表１５】【０１４６】＜odhA 改変株のグルタミン酸生産培養＞381

これらの odhA 改変株のＬ－グルタミン酸生産能を，坂口フラスコを用いた培養を行うことにより検証した。表１４に示した株を CM-Dex 寒天培地で 31.5℃で一昼夜培養を行い，フラスコ培地（グルコース 60g/l，硫安 22.5g/l，KH2PO4
・7H2O
5

0.4g/l，FeSO4・7H2O

0.01g/l，MnSO4・4-5H2O

1g/l，MgSO4

0.01g/l，ビタミン B1

200μg/l，大豆蛋白加水分解液 0.48g/l，ビオチン 300μg/l，KOH を用いて pH8.0 に調整）20ml に 1/6 プレート分の菌体を接種し，予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシ
ウム 1g を添加した後，31.5℃，速度 115rpm で振とう培養を行った。培養開始 19 時
間目のＬ－グルタミン酸蓄積を表１６に示した。odhA 改変株の中には，ATCC13869L 株 と ほ ぼ 同 等 の Ｌ － グ ル タ ミ ン 酸 蓄 積 の も の も 含 ま れ て い た が ， sucA801,

10

sucA805,sucA77 株は sucA8 株よりも高いグルタミン酸蓄積を示した。これらの結果
から，yggB 遺伝子の変異と共に odhA 遺伝子に変異を導入することによって，さらにＬ－グルタミン酸収率が向上することを見出した。
【０１４７】
【表１６】

15

(16)

実施例１６

【０１４８】＜ATCC14067 株および ATCC14067yggB8 からの odhA 弱化株の構築＞
８型変異を有する yggB 変異株より odhA 欠損株を構築し，odhA 欠損のみを有する
20株と比較培養を行なった。まず，odhA を完全欠損するためのプラスミドを構築した。

382

ATCC14067 株の染色体 DNA を鋳型として，配列番号７７と配列番号７８の合成 DNA
を用いて PCR を行い，sucA 遺伝子の上流側断片を調製した。続けて，ATCC14067 株の染色体 DNA を鋳型として，配列番号７９と配列番号８０の合成 DNA を用いて PCRを行い，sucA 遺伝子の下流側断片を調製した。次に，上流側断片と下流側断片を等5モルとなるように混合し，これを鋳型として配列番号８１と配列番号８２の合成
DNA を用いて PCR を行い，odhA を欠失した遺伝子断片を調製した。得られた PCR 断
片を BamHI で処理した後，実施例１で構築した pBS4S にクローニングした。こうして得られるプラスミドを pBSΔsucA47 とした。
pBSΔsucA47 を実施例６記載の方法と同様に ATCC14067 株または ATCC14067yggB810株の染色体に挿入した後，脱落させた。得られたカナマイシン感受性株より染色体DNA を調製し，これを鋳型として配列番号７７および配列番号８０の合成 DNA を用いて PCR を行い，odhA 領域が欠損している株を選択した。こうして構築した odhA
欠損株をそれぞれ ATCC14067ΔodhA 株および ATCC14067ΔodhA yggB８株とした。
構築した ATCC14067ΔodhA 株および ATCC14067ΔodhA yggB８株を実施例３記載の15

方法で培養した結果を表１７に示した。yggB8 変異によって odhA 変異株の L-グル
タミン酸収量を向上できることが明らかとなった。
【０１４９】
【表１７】

20

(17)

実施例１７

【０１５０】＜2A-1R 株からの symA 欠損株の構築＞383

実施例３で構築した，yggB に IS 挿入変異を有する２A-1R 株より，symA(suppressor of ygg mutation A)遺伝子を欠損した株を構築し，2A-1R 株と比較培養を行なった。ATCC13869 株の NCgl1867 遺伝子の核酸配列およびアミノ酸配列はそれぞれ配列番号８６および８７に記した。まず，symA 遺伝子を完全欠損す
5るためのプラスミドを構築した。ATCC13869 株の染色体 DNA を鋳型として，配列番
号８８と配列番号８９の合成 DNA を用いて PCR を行い，symA 遺伝子の上流側断片を調製した。続けて，ATCC13869 株の染色体 DNA を鋳型として，配列番号９０と配
列番号９１の合成 DNA を用いて PCR を行い，symA 遺伝子の下流側断片を調製した。次に，上流側断片と下流側断片を等モルとなるように混合し，これを鋳型とし

10て配列番号８８と配列番号９１の合成 DNA を用いて PCR を行い，symA 遺伝子を欠失した遺伝子断片を調製した。得られた PCR 断片を BglII で処理した後，実施例１で構築した pBS4S にクローニングした。こうして得られるプラスミドを pBSΔsymAとした。
pBSΔsymA を実施例６記載の方法と同様に 2A-1R 株の染色体に挿入した後，脱落15させた。得られたカナマイシン感受性株より染色体 DNA を調製し，これを鋳型として配列番号８８および配列番号９１の合成 DNA を用いて PCR を行い，symA 領域が欠損している株を選択した。こうして構築した symA 欠損株を 2A-1RΔsymA 株とした。
構築した 2A-1RΔsymA 株および親株の 2A-1R 株を実施例３記載の方法で培養した

20

結果を表１８に示した。symA 遺伝子の欠損によって，変異型 yggB 遺伝子を有する
株のグルタミン酸生産能を向上できることが明らかとなった。
【０１５１】
【表１８】

384

８

図面

【図１】プラスミド pBS3 の構築手順を示す図。

5385

【図２】プラスミド pBS4S の構築手順を示す図。

386

【図３】プラスミド pBS4sucAint の構築手順を示す図。

【図４】yggB 変異導入株の L-グルタミン酸蓄積を示す図。

5【図５】2A-1 型変異 yggB 遺伝子の変異導入箇所を示す図。

387

【図６】変異型 yggB 遺伝子導入株の４-フルオログルタミン酸含有 CM-Dex プレート培地における生育を示す図（写真）。

【図７】変異型 yggB 遺伝子導入株の４-フルオログルタミン酸(4-FG)含有液体培地
5における生育を示す図。

以上

388

別紙１４

１

引用文献の図面

乙６文献
図１

5

389

図５

表２

5

＊Ｃ．グルタミカム－３５コンセンサス配列において，４番目のヌクレオチドはＡではなくＣである。この位置でのＡは，３３プロモーターのうち７のみで見られた（２１％保存）。

390

２

乙９文献
表９

5

３

乙１２文献
６頁右上欄のＤＮＡ断片の塩基配列

391

４

乙２４文献
表１

5

注ａ

グリシンベタイン（３ｍＭ）及びエクトイン（３ｍＭ）を同時に負荷。

注ｂ

ＡＴＰの排出は，細胞質のＡＴＰ総量の２％を超えなかった。

注ｃ

Ｎａ＋及びＫ＋の場合，浸透圧のステップは２１００，１１４０，８２０，

４２０ｍＯｓｍとした。
注ｄ

10

５

２ｍＭグリシンベタインの存在下で負荷し，競合状態を作出（本文を参照）。

乙３５文献
第２表

392

第１０表

第１１表

5

393

第１３表

394

別紙１５

被告ら販売分の特許法１０２条２項による損害額計算表
省略

395

別紙１６

被告各製法使用期間中のグルタミン酸ナトリウムの輸入状況
省略

396

別紙１７

差止対象製品目録

製品名「ＭＩ－ＰＯＯＮＧ」のグルタミン酸ナトリウム
ただし，
5

１

本目録添付の配列表に示されるアミノ酸配列における１００番目のアミノ酸がアラニンからスレオニンに置換されているｙｇｇＢ遺伝子が導入されたコリネバク
テリウム・グルタミカムを用いて生産されたもの。
２

コリネバクテリウム・カルナエ（ＤＳＭ２０１４７株）由来のｙｇｇＢ遺伝子がコードするアミノ酸配列における９８番目のアミノ酸がアラニンからスレオニン10に置換され，２４１番目のアミノ酸がバリンからイソロイシンに置換されているｙｇｇＢ遺伝子が導入されたコリネバクテリウム・グルタミカムを用いて生産された
もの。
以

397

上

別紙１７添付の配列表

Met Ile Leu Gly Val Pro Ile Gln Tyr Leu Leu Tyr Ser Leu Trp Asn
1
5

5

10

15

Trp Ile Val Asp Thr Gly Phe Asp Val Ala Ile Ile Leu Val Leu Ala
20

25

30

Phe Leu Ile Pro Arg Ile Gly Arg Leu Ala Met Arg Ile Ile Lys Gln
35

40

45

Arg Val Glu Ser Ala Ala Asp Ala Asp Thr Thr Lys Asn Gln Leu Ala
50

10

55

60

Phe Ala Gly Val Gly Val Tyr Ile Ala Gln Ile Val Ala Phe Phe Met
65

70

75

80

Leu Ala Val Ser Ala Met Gln Ala Phe Gly Phe Ser Leu Ala Gly Ala
85
15

90

95

Ala Ile Pro Ala Thr Ile Ala Ser Ala Ala Ile Gly Leu Gly Ala Gln
100

105

110

Ser Ile Val Ala Asp Phe Leu Ala Gly Phe Phe Ile Leu Thr Glu Lys
115

120

125

Gln Phe Gly Val Gly Asp Trp Val Arg Phe Glu Gly Asn Gly Ile Val
130

20

135

140

Val Glu Gly Thr Val Ile Glu Ile Thr Met Arg Ala Thr Lys Ile Arg
145

150

155

160

Thr Ile Ala Gln Glu Thr Val Ile Ile Pro Asn Ser Thr Ala Lys Val
165
25

170

175

Cys Ile Asn Asn Ser Asn Asn Trp Ser Arg Ala Val Val Val Ile Pro
180

185

190

398

Ile Pro Met Leu Gly Ser Glu Asn Ile Thr Asp Val Ile Ala Arg Ser
195

200

205

Glu Ala Ala Thr Arg Arg Ala Leu Gly Gln Glu Lys Ile Ala Pro Glu
210
5

215

220

Ile Leu Gly Glu Leu Asp Val His Pro Ala Thr Glu Val Thr Pro Pro
225

230

235

240

Thr Val Val Gly Met Pro Trp Met Val Thr Met Arg Phe Leu Val Gln
245

250

255

Val Thr Ala Gly Asn Gln Trp Leu Val Glu Arg Ala Ile Arg Thr Glu
260

10

265

270

Ile Ile Asn Glu Phe Trp Glu Glu Tyr Gly Ser Ala Thr Thr Thr Ser
275

280

285

Gly Thr Leu Ile Asp Ser Leu His Val Glu His Glu Glu Pro Lys Thr
290
15

295

300

Ser Leu Ile Asp Ala Ser Pro Gln Ala Leu Lys Glu Pro Lys Pro Glu
305

310

315

320

Ala Ala Ala Thr Val Ala Ser Leu Ala Ala Ser Ser Asn Asp Asp Ala
325

330

335

Asp Asn Ala Asp Ala Ser Ala Ile Asn Ala Gly Asn Pro Glu Lys Glu
340

20

345

350

Leu Asp Ser Asp Val Leu Glu Gln Glu Leu Ser Ser Glu Glu Pro Glu
355

360

365

Glu Thr Ala Lys Pro Asp His Ser Leu Arg Gly Phe Phe Arg Thr Asp
370
25

375

380

Tyr Tyr Pro Asn Arg Trp Gln Lys Ile Leu Ser Phe Gly Gly Arg Val
385

390

395

399

400

Arg Met Ser Thr Ser Leu Leu Leu Gly Ala Leu Leu Leu Leu Ser Leu
405

410

415

Phe Lys Val Met Thr Val Glu Pro Ser Glu Asn Trp Gln Asn Ser Ser
420
5

425

430

Gly Trp Leu Ser Pro Ser Thr Ala Thr Ser Thr Ala Val Thr Thr Ser
435

440

445

Glu Thr Ser Ala Pro Ala Ser Thr Pro Ser Met Thr Val Pro Thr Thr
450

455

460

Val Glu Glu Thr Pro Thr Met Glu Ser Ser Val Glu Thr Gln Gln Glu
10

465

470

475

480

Thr Ser Thr Pro Ala Thr Ala Thr Pro Gln Arg Ala Asp Thr Ile Glu
485

490

495

Pro Thr Glu Glu Ala Thr Ser Gln Glu Glu Thr Thr Ala Ser Gln Thr
500
15

505

510

Gln Ser Pro Ala Val Glu Ala Pro Thr Ala Val Gln Glu Thr Val Ala
515

520

525

Pro Thr Ser Thr Pro
530

以上

20

400