実験医学別冊

論文だけではわからない

ゲノム編集成功の秘訣 Q&A

目 次

TALEN、CRISPR/Cas9 の極意◆ 序 ……………………………………………………………………………………………………………………………………………… 山本卓◆ 巻頭ガイド

卓第Ⅰ部

ゲノム編集実験の流れ ………………………………………… 佐久間哲史，山本

10

ゲノム編集ツールに関する Q&A

第1章 TALEN に関する Q ＆ A

佐久間哲史

1 TALEN の設計法・作製法について教えてください．
Q2 TALEN の標的配列とスペーサー配列の長さの最適な範囲を教えてください．
Q3 TALEN の標的配列にミスマッチがあった場合の切断効率について教えてください．
Q4 TALEN のオフターゲット変異の調べ方について教えてください．
Q5 TALEN をウイルスベクターで導入することはできますか？
Q6 TALEN を大腸菌組換えタンパク質として精製することはできますか？
Q………………………………………………………………

14………………

17… 20………………………………………

23………………………………………………………

26……………………………… 28

第 2 章 CRISPR/Cas9 に関する Q ＆ A

佐久間哲史

7 CRISPR/Cas9 の設計法・作製法について教えてください．
Q8 標的としたい領域に PAM 配列の 5′-NGG-3′ がみつからない場合にはQ………………………………………………… 30

どうすればよいですか？ …………………………………………………………………………………………………………………… 33

9 sgRNA の標的配列の長さは 20 bpでなければいけないのですか？
Q10 sgRNA の標的配列にミスマッチがあった場合の切断効率について教えてください．
Q11 CRISPR/Cas9 のオフターゲット変異の調べ方について教えてください．
Q12 CRISPR/Cas9 の特異性を上げる方法があれば教えてください．
Q…………………………………… 36…… 38…………………………

41………………………………………

45

CONTENTS

13 Cas9 ニッカーゼを用いた相同組換えは可能ですか？
Q14 Cas9 タンパク質が市販されていますが，それぞれで特徴がありますか？

Q……………………………………………………………… 48

また使用例があれば教えてください． …………………………………………………………………………………………… 50

15 化学合成した sgRNAを使用することはできますか？
Q16 sgRNAをU6 プロモーター以外で発現させたいと思っています．

Q………………………………………………………………

52

組織特異的プロモーターや誘導型プロモーターは使えますか？ ………………………………………… 54

17 CRISPR/Cas9 をウイルスベクターで導入することはできますか？
Q18 sgRNAライブラリーを用いたノックアウトスクリーニングについて教えてください．
Q………………………………………… 56

第 3 章 TALEN，CRISPR/Cas9 に共通の Q ＆ A……… 58佐久間哲史

19 多くのベクターがあり，どれを使えばよいかわかりません．

Q

お勧めのベクターがあれば教えてください． ……………………………………………………………………………… 60

20 短い配列のノックインを行いたいと考えています．

Q

ssODN の設計の仕方について教えてください． ……………………………………………………………………… 64

Q

21 レポーター遺伝子をノックインしたいと考えています．

ターゲティングベクターの設計の仕方について教えてください． …………………………………………… 67

Q

22 複数の遺伝子を同時に破壊したいと考えています．

Q

23 染色体欠失を誘導したいと考えています．どのくらいの長さまでQ

24 転座を誘導したいと考えていますが，可能でしょうか？

どのような戦略が有効でしょうか？ ………………………………………………………………………………………………… 70
欠失させられるでしょうか？ ……………………………………………………………………………………………………………… 73

第Ⅱ部…………………………………………………………

細胞種・生物種ごとの Q&A

第1章 哺乳類培養細胞でのゲノム編集

落合

25 哺乳類培養細胞では，どのようなゲノム編集が可能ですか？
Q26 哺乳類培養細胞でゲノム編集を行う際の注意事項について教えてください．
Q27 哺乳類培養細胞でゲノム編集を行う場合，どのベクターを用いればよいですか？
Q28 哺乳類培養細胞でゲノム編集を行う場合，どのような導入方法が適切ですか？
Q29 哺乳類培養細胞でゲノム編集を行う場合に必要となる材料や施設について
Q75

博………………………………………………

78…………………

81………… 83…………… 85

教えてください．…………………………………………………………………………………………………………………………………… 88

30 哺乳類培養細胞での変異体のスクリーニング方法について教えてください．
Q31 倍数性の高い細胞やプライマリー細胞でゲノム編集は可能でしょうか？

Q………………… 90…………………………… 94

第 2 章 ヒト人工多能性幹細胞（iPS 細胞）でのゲノム編集
李紅梅，堀田秋津

32 ヒトiPS 細胞でゲノム編集を行う際の注意事項を教えてください．
Q33 ヒトiPS 細胞でゲノム編集を行う際，どの発現ベクターを使用すべきでしょうか？
Q34 ヒトiPS 細胞への遺伝子導入方法は何が適していますか？
Q35 ヒトiPS 細胞のサブクローニングの方法を教えてください．
Q……………………………………… 96
…………

98

…………………………………………………… 100…………………………………………………… 102

第 3 章 マウスでのゲノム編集

藤原祥高，伊川正人

36 マウスでは，どのようなゲノム編集が可能ですか？
Q37 マウスでゲノム編集を行う場合，どのベクターを用いればよいですか？
Q38 マウスでゲノム編集を行う場合に必要となる材料や設備について教えてください．
Q39 マウスでゲノム編集を行う場合，どのような導入方法が適切ですか？
Q40 マウスでの変異体のスクリーニング方法について教えてください．
Q41 コンディショナルノックアウトマウスの作製は可能でしょうか？
Q42 マウスでゲノム編集を行う際のその他の注意事項について教えてください．
Q…………………………………………………………………… 106……………………………… 109………… 112………………………………… 114……………………………………… 116……………………………………………… 118…………………… 121

第 4 章 ラットでのゲノム編集

真下知士

43 ラットでは，どのようなゲノム編集が可能ですか？
Q44 ラットでゲノム編集を行う場合，どのようなベクターを用いればよいですか？
Q45 ラットでゲノム編集を行う場合，必要となる材料や設備について教えてください．
Q46 ラットでゲノム編集を行う場合，どのような導入方法が適切ですか？
Q47 ラットでの変異体のスクリーニング方法について教えてください．
Q48 ラットでゲノム編集を行う際の，その他の注意事項について教えてください．
Q…………………………………………………………………… 124…………………… 128………… 131………………………………… 134……………………………………… 137………………… 140

第 5 章 両生類でのゲノム編集
Q49 両生類では，どのようなゲノム編集が可能ですか？

鈴木賢一………………………………………………………………… 143

CONTENTS

50 両生類でゲノム編集を行う場合，どのベクターを用いればよいですか？
Q51 両生類でゲノム編集を行う場合に必要となる，材料や設備について教えてください．
Q52 両生類でゲノム編集を行う場合，どのような導入方法が適切ですか？
Q53 両生類での変異体スクリーニング方法について教えてください．
Q54 両生類でゲノム編集を行う際のその他の注意事項について教えてください．
Q…………………………… 147… 150…………………………… 152………………………………………… 154…………………… 157

第 6 章 小型魚類でのゲノム編集

川原敦雄，木下政人

55 小型魚類では，どのようなゲノム編集が可能ですか？
Q56 小型魚類におけるゲノム編集の手順を教えてください．
Q57 小型魚類での変異体のスクリーニング方法について教えてください．
Q58 小型魚類でゲノム編集を行う際の注意事項を教えてください．
Q59 小型魚類では，効率のよいノックイン法はありますか？
Q60 小型魚類の分野で開発された最新のゲノム編集技術を教えてください．
Q…………………………………………………………… 158………………………………………………………… 161……………………………… 164…………………………………………… 166………………………………………………………… 169

第 7 章 海産無脊椎動物ホヤでのゲノム編集………………………… 172

笹倉靖徳

61 ホヤでは，どのようなゲノム編集が可能ですか？
Q62 ホヤでゲノム編集を行う場合，どのようなベクターを用いればよいですか？
Q63 ホヤでゲノム編集を行う場合，必要となる材料や設備について教えてください．
Q64 ホヤでゲノム編集を行う場合，どのような導入方法が適切ですか？
Q65 本章で紹介されたベクターはカタユウレイボヤ以外の海産動物にも利用できますか？
Q……………………………………………………………………… 175……………………… 178…………… 182…………………………………… 185

第 8 章 ショウジョウバエでのゲノム編集

林

66 ショウジョウバエでのゲノム編集による遺伝子機能解析の概要を教えてください．
Q67 ショウジョウバエではどのようなゲノム編集が可能ですか？
Q68 ショウジョウバエでゲノム編集を行う場合，どのような準備をすればよいですか？
Q69 ショウジョウバエでの変異体のスクリーニング方法について教えてください．
Q70 ショウジョウバエでのゲノム編集についてその他の注意事項を教えてください．

Q… 188茂生……… 190…………………………………………………… 193………… 196………………… 198……………200

第 9 章 カイコでのゲノム編集

大門高明

71 カイコでは，どのようなゲノム編集が可能ですか？
Q72 カイコでゲノム編集を行う場合，どのベクターを用いればよいですか？
Q73 カイコでゲノム編集を行う場合に必要となる材料や設備について教えてください．
Q74 カイコでゲノム編集を行う場合，どのような導入方法が適切ですか？
Q75 カイコでの変異体のスクリーニング方法について教えてください．
Q76 カイコでゲノム編集を行う際のその他の注意事項について教えてください．
Q…………………………………………………………………… 202………………………………205…………208………………………………… 211……………………………………… 213…………………… 216

第10 章 線虫でのゲノム編集

杉拓磨

77 線虫では，どのようなゲノム編集が可能ですか？
Q78 線虫でゲノム編集を行う場合，どのベクターを用いればよいですか？

Q……………………………………………………………………… 218

変異体のスクリーニング法についても教えてください． ……………………………………………………………22079 線虫でゲノム編集を行う場合，どのような導入方法が適切ですか？

Q

必要な設備と手順についても教えてください． ……………………………………………………………………………223

80 線虫でゲノム編集を行う際のその他の注意事項について教えてください.

Q

第11章 植物でのゲノム編集

安本周平，關

………………………… 226光，刑部祐里子，刑部敬史，村中俊哉

81 植物では，どのようなゲノム編集が可能ですか？
Q82 植物でゲノム編集を行う場合，どのベクターを用いればよいですか？
Q83 植物でゲノム編集を行う場合に必要となる材料や設備について教えてください．
Q84 植物でゲノム編集を行う場合，どのような導入方法が適切ですか？
Q85 植物での変異体のスクリーニング方法について教えてください．
Q86 非モデル植物でゲノム編集を行う際のその他の注意事項について教えてください．
Q………………………………………………………………………228………………………………… 232…………… 236……………………………………238………………………………………… 241第12 章 その他の生物でのゲノム編集

87 報告のない生物・細胞種でゲノム編集を行う際に何に気をつけたらよいですか？

Q………244山本

卓…………245

CONTENTS

第Ⅲ部

その他の Q&A

第1章 応用技術について

佐久間哲史

88 ゲノム編集ツールを転写調節に応用できるようですが，Qどのようなことが可能ですか？ …………………………………………………………………………………………………………248

89 ゲノム編集ツールをエピゲノム改変に応用できるようですが，Qどのようなことが可能ですか？ …………………………………………………………………………………………………………250

90 ゲノム編集ツールをクロマチン免疫沈降（ChIP）に応用できるようですが，Qどのようなことが可能ですか？ …………………………………………………………………………………………………………253

91 ゲノム編集ツールを染色体可視化に応用できるようですが，Qどのようなことが可能ですか？ …………………………………………………………………………………………………………255

第 2 章 情報収集について

佐久間哲史

92 ゲノム編集に関する最新情報を入手できるウェブサイトを教えてください．
Q93 ゲノム編集に関するトラブルシューティングを相談できる窓口はありますか？

Q……………………… 257

第 3 章 ゲノム編集生物の取り扱いについて…………………… 259

田中伸和，山本

94 ゲノム編集で作製した生物は，遺伝子組換え生物に該当するのでしょうか？

Q

◆索 引卓

………………… 261…………………………………………………………………………………………………………………………………………………

264