第348回 ガスクロマトグラフィー研究会 特別講演会

ドーピング検査の現状
カタールアンチドーピングラボラトリー
植 ⽊ 眞 琴

ガスクロマトグラフィー研究懇談会編
1997年、朝倉書店

Endogenous Chol

蛋⽩同化ステロイド薬トゥリナボール®
投与尿の分析例*) Dehydrochloromethyltestosterone

NPD検出時の保持指標校正
N,N-Diisopropylaminoalkane

メトキシフェナミン服⽤尿の分析例とDIPAによる代謝物保持指標の校正

WADA (世界アンチ・ドーピング機構)

2017年禁⽌表

競技会・競技会外で、常時禁⽌される物質 (S: Substance)• S0. 無承認医薬品・物質 (動物専⽤薬を含む)• S1. 蛋⽩同化薬(天然型/化学合成型ステロイド, ⾮ステロイド)

••
•
•
•

S2. ペプチドホルモン・成⻑因⼦
関連物質と模倣物質
S3. β2-作⽤薬（気管⽀拡張薬）
S4. ホルモン調節薬および代謝調節薬
S5. 利尿薬とその他の隠蔽薬

S1-S5群に追加して競技時に禁⽌される物質・⾏為• S6. 興奮薬
• S7. ⿇薬• S8. カンナビノイド• S9. 糖質コルチコイド

常時禁⽌されるドーピング⼿法(M: Method)• M1. ⾎液および⾎液成分の操作• M2. 科学的および物理的操作• M3. 遺伝⼦ドーピング特定の競技で禁⽌される物質(P: Particular Sports)• P1. アルコール• P2. β－遮断薬

特定物質• 状況により、不正の意図がないことが⽴証できる場合に処罰の減免措置が適⽤される。
（禁⽌表に例⽰のない興奮剤、気管⽀拡張剤、⼤⿇など）

監視物質
現時点で禁⽌されていないが、将来の乱⽤防⽌や判定基準整備の調査⽬的で検査される物質。
「事例」
メルドニウムはバルト海沿岸諸国での複数の使⽤例が報告され、2015
年の監視物質として調査した結果、8,300⼈中182⼈の選⼿から検出され、2016年1⽉から禁⽌物質に移⾏した。⼼臓治療薬としてのほかス
タミナ増強薬として使⽤されている。 マリア・シャラポワ選⼿などの陽性報告有。
「注意」
許容濃度が設定されている場合であっても、隠蔽薬や利尿薬が同時に検出されれば濃度に関わらず違反を⽰す証拠と⾒なされる。

ロシアのドーピング⼿法-a

開発中⽌となり、ロシア陸上界で流通していた覚せい剤排泄薬メソカルブ (’90半ば）

ロシアのドーピング⼿法-b

ステロイドと共存すると包摂化合物となって保持時間に影響を与える未発売興奮剤(ʻ90後半)ロシアのドーピング⼿法-c
未発売のドーピング専⽤薬

⻄欧には流通せず、それまで知られていなかった興奮剤（ʻ90後半）

ロシアのドーピング⼿法-dキセノン吸引による酸素供給能⼒活性化

ソチ五輪でロシア五輪委員会が実施。
⼤会後 2014年禁⽌物質に指定。

TUE:禁⽌薬の治療使⽤特例
Therapeutic Use Exemption

以下の条件のもと、禁⽌物質の治療⽬的使⽤を許容する制度•

治療上必須（使⽤しないと健康に重⼤な影響を及ぼす•

他に合理的な代換え治療⽅法がない•

使⽤後健康状態に復しても、競技⼒を増強しない。

• ドーピングの副作⽤に対する治療ではない

TUE 運⽤の問題化• 今年のツール・ド・フランスで連覇を果したクリス・フルーム選⼿が、落⾞傷害後遺症の治療として国際⾃転⾞連盟からコルチコステロイドの経⼝使⽤を許可されていることが発覚。ロー
ドでの全⾝投与は持久⼒増強の効果ありとして問題化。
• ハッキングされたTUE情報から、運⽤の不透明さが指摘される。

TUE申告書例

Fancy Bears’ hack Page より

検査⼿法
質量分析法

GC-MS, LC-MS-MS, HR-MS
GC-C-IRMS
LC-TOF-MS(-MS)

低分⼦物質の構造解析・⾼感度検出
同位体⽐測定によるホルモンの由来識別Non-Target Analysis (新物質を含む網羅的分析)

電気泳動⼆重免疫転写化学発光法

尿中、遺伝⼦組み換え医薬品検出

⾃動免疫測定法
フローサイトメトリー法
⾎算検査（⼆種類のキットで偽陽性を排除）
ペプチドホルモンのスクリーニング
同種⾎（ヒト）輸⾎の検出
増⾎薬、輸⾎使⽤痕跡検知

選⼿⽣体パスポート検査 （個⼈内検査値履歴管理）

天然型ドーピング薬,⾃⼰⾎輸⾎の検知

薬物検索法の推移-a
マスクロマトグラム

サイクリックスキャンデータをマスクロマトグラムに展開
未知物質、代謝物に対応
感度に限界
親化合物対象の興奮薬向き

薬物検索法の推移-bターゲット検索SIM/SRMスライスデータから、3つ以上のDiagnostic Ionsを選んで予測保持領域を検索するターゲット検索。
処理能⼒⼤。多成分⾃動検索向き。標的外未知物質を⾒逃す。

薬物検索法の推移-c
⾼分解能SIM検出

m/z: 560
R=1,000m/z: 560.3650
R=10,000

超⾼感度、同定精度⾼い
相互汚染の影響に要注意薬物検索⼿法の推移-d
ノンターゲット検索

薬物粗抽出物中物質のノンターゲット検索
未知物質、代謝物も網羅可能

LC-TOFMSによる検索
全イオンスライスを保存、分析後網羅的に検索
Kolmonen M. et al., Drug Test. Anal. 2009, 1, 250–266

検索対象物質の選択による⾼感度化
例：スタノゾロールのGC/MS検出

Stanozolol

3’-Hydroxystanozolol

1984 ロス五輪

1988 ソウル五輪

3’-Hydroxystanozolol-bis-O-TMS-N-HFB誘導体

トゥリナボール®の主代謝物による検出(ロンドン五輪以前）

Epistanozolol-N-glucuronide

後期代謝物のLC-MSによる
スタノゾロールの⾼感度検出
2014~ 北京、ロンドン五輪

再分析

35.5Cl

37.5ClDHCMT

6β-Hydroxy DHCMT

トゥリナボール®の後期代謝物による⻑期間検出 4-Chloro-17-methyl-5β-Androstan-3,16,17-triol

最適な検索指標の選択による検出率の向上- まとめ -

１）

未変化体から主代謝物へ

２）

より半減期の⻑い後期代謝物へ新検査法による過去検体の再分析が五輪の記録を塗り替える

Olympics History Rewritten:
New Doping Tests Topple the Podium

北京五輪重量挙げ検体の再検査事例
国際重量挙げ連盟(IWF) 2016年8⽉25⽇公⽰

AKKAEV, Khadzhimurat(RUS) –LAPIKOV, Dmitry(RUS) –DAVYDOVA, Natalya(UKR) –KOROBKA, Olha(UKR) –KULESHA, Iryna(BLR) –MANEZA, Maya(KAZ) –NEKRASSOVA, Irina(KAZ) –SEDOV, Vladimir(KAZ) –NOVIKAVA, Nastassia(BLR) –RYBAKOU, Andrei(BLR) –GRABOVETSKAYA, Mariya (KAZ) –PASHAYEV, Nizami(AZE) –CAO, Lei(CHN) –CHEN, Xiexia(CHN) –LIU, Chun Hong(CHN) –DHCMT
DHCMT
DHCMT
DHCMT
DHCMT
STZSTZSTZDHCMT, STZ
DHCMT, STZ
DHCMT, STZ, Oxandrolone
DHCMT, STZ, Oxandrolone
GHRP-2
GHRP-2
GHRP-2, Sibutramine (S6)DHCMT: Dehydrochloromethyltestosterone, STZ: Stanozolol

⾃転⾞ロードレースにみる

最近のドーピング事情(タイラーハミルトン選⼿の聴聞より)1995年

USPとプロ契約・移籍。2001年まで在籍。
同種⾎液輸⾎開始、テストステロン、EPO (⽪下注射)
ヘマトクリット値を常時測定。常に規程以下(< 50%)に調節

1998年

Tour de FranceでEPO検査開始、EPOスキャンダル発⽣。
US 2000$でEPOを個⼈購⼊。ツール中個⼈バイク便で輸送し使⽤

1999年

アンドリオール(ステロイド）２tab/day,hGH (すぐに中⽌)EPO 2,000U/ 2から３⽇間隔で注射。
抜き打ち検査時間帯（７AM-１０PM）を避け、午後10時過ぎにドーピング。

最近のドーピング事情 - 続き (タイラーハミルトン選⼿の聴聞より)2000年 ⾎液ドーピングを同種血輸血から⾃⼰⾎輸⾎に変更（当時99%検出回避可）
EPOマイクロドーズ法に変更
2,000IU/3-4⽇(⽪下注射)から、4-500IU x 毎⽇(低⽤量頻回静脈注射)
テストステロンを経⼝薬からパッチ２時間貼付に変更
2002年 CSCチームに移籍。 ⾃⼰⾎輸⾎はレース前から計画的に継続。
10週前；１回採⾎--- ⾃⼰⾎液1回分を確保
6週前； ２回採⾎+１回輸⾎--- ⾃⼰⾎液２回分を確保
2週前； ３回採⾎, ２回輸⾎--- ⾃⼰⾎液３回分を確保
ジロ・ド・イタリア２位。レース中、週１回、計３回新鮮⾃⼰⾎輸⾎。
2003年 世界ランク１位
2004年 ⾎液ドーピング陽性（主治医が⾎液バッグを取り違えて輸⾎し違反発覚)
2009年 処分開けの検査でステロイド(DHEA)陽性。再度失格。永久追放・リタイア。

選⼿の証⾔から判明したドーピング⼿法の進歩

EPO

テストステロン

⾎液ドーピング

筋注→

同種⾎輸⾎→

2000IU ⽪下注/経⼝→⾃⼰⾎輸⾎→2-3⽇

パッチ貼付2hrs

採⾎・輸⾎同時→ 4-500IU静注/⽇(マイクロドーズ）最近のドーピング⼿法の傾向
ドーピング物質の⽤法・⽤量• ステロイド薬は体内に残留し易い筋⾁注射から、半減期の短かい経⼝投与、パッチ貼付に変更。
• ペプチド糖蛋⽩ホルモンは、隔⽇⽪下注ではなく、1/4量を毎⽇静脈内注射、常時最低限の濃度を維持。
• 薬理作⽤ごとに薬剤を固定せず、類似薬を変更しながら体内蓄積を避ける。
• ⾎液ドーピングは同種⾎ではなく、⾃⼰⾎を使⽤。
複数の判定指標で間接・直接に検知
例: EPO濃度と⾎液検査値
検査履歴管理の徹底（選⼿⽣体パスポート）
由来識別の重要性

スポーツ競技における 造⾎薬・⾎液ドーピングの検知へモグロビン異常高値の頻度
世界選手権９レースで、上位１０位に異常値が集中
陸上とスキーのクロスカントリー種⽬に異常値が集中

Gunderson et.alUeki M.

選⼿⽣体パスポート検査（⾎液検査値:Hb, Ret, Hct の個⼈内検歴管理）

AFP: Adverse Passport Findingステロイド炭素の由来識別
ヒト内因性ステロイド

⽜⾁、豚⾁、⽺⾁、鶏⾁、サカナ等
医薬品外因性ステロイド

主にC3-植物（ヤマイモ、豆など）のフィトステロールから合成

内因性ステロイドの代謝
メバロン酸、イソプレノイド、コレステロール

食物由来動物性脂質

O

HOO

O

O

OH

O

O
O H

OH

HO

H
5 α -Androstan-3α,17β-diol

H

Androsterone

OH

Epitestosterone

O

H

DHTHO

OH

H

Testosterone

5 α -Androstan-3β,17β-diolO

HOO

Androstenedione

DHEA

6OH-Adione

OHOH

HO

H
5 β -Androstan-3α,17β-diolO

HOH

Epiandrosterone

O

HOH

Etiocholanoloneステロイド医薬品の合成（植物原料より合成）
YamBeans

安定同位体⽐による元素の由来識別
富重炭素ステロイド動物性脂質

13C-含量

Andro

Etio

内因性ステロイド
軽炭素

重炭素
C3-plant

テルペン類,メバロン酸類など

Synth.
Steroids

富軽炭素フィトステロール

炭酸同化作⽤

合成ステロイド薬

CCCCC

Eto

H2O

GC燃焼安定同位体⽐質量分析計
ステロイドの由来識別

GC燃焼安定同位体⽐質量分析計
⽔分除去⽅法による差異

窒素浴トラップ

中空ナフィオン膜

中空ナフィオン膜では燃焼残渣がイオン源に到達し夾雑シグナルを与える。

GC燃焼安定同位体⽐質量分析計
燃焼⽅法による差異

46 (nA)
0.020
0.015

10.0100.005
0.000
12001250

ワイヤー触媒式

13001350

1400

酸化銅ペレット充填カラム式

燃焼管の死容量がピーク形状に影響を与える

1

各種由来有機物の13C-含有量 (δ13C-値分布）
藻類
C4-植物
C3-植物

フィトステロール

外因性

医薬品ステロイド

呼気中 CO2

内因性ヒト尿ステロイド
δ13C-値Naturally elevated DHEA in Japanese (/East Asian) athletes

Total DHEA concentration(n=1,850)

DHEA conc (GC/MS)

δ-value of DHEA (IRMS)

テストステロン投与の濃度⽐判定と同位体⽐判定
同位体⽐による判定はステロイド代謝酵素の遺伝⼦多型に影響されない

UGT2B17遺伝⼦型とステロイド異性体⽐

UGT2B17遺伝⼦型と濃度
Basal Values

del/del(0)Conc.(ng/ml)
100

ins/del or ins/ins(1)(2)

Testosterone propionate 50mg (M.S)

Ratio
1.090

Conc.(ng/ml)
7,000

a. テストステロン濃度*) Aoki K, Shinahara H, Tanaka H, Ueki M, Forensic Toxicol. (2014) 32: 194-200

Testosterone propionate 51mg (M.U)

0.9800.8

70

0.7

60

0.6

50

0.5

40

0.4

30

0.3

200.2

100.1

00.0

Ratio
160

P3-G

140

6,000
5,000

T

120

4,000

ET

100

T/ET

80

3,000b. 異性体T/ET⽐率

A-T
-15

Case MS

-20

E-T

P3-G

Case MU

-20

E-T

-25

-25
-30

P2-G

A-T
-15

A-S

-30

P2-G

A-S

-35

-35

60

2,000

40

1,000

DHEA-SE-S

DHEA-S

E-S

20

00

pre 7'00"12'00"19'50"25'00"29'00"34'30"43'00"48'30"57'30"63'00"71'15"

pre 3'10" 11'00"19'30"25'30"39'10"47'20"54'10"63'00"69'20"

Poor responderResponder

GC-MS: 投与後濃度推移

5bA2-G

5aA2-G

Poor responder

5bA2-G

5aA2-G

Responder

GC-C-IRMS 投与後13Ｃ-含量推移リオ五輪を前に発覚した組織的ドーピング分析だけで解決できないドーピング問題

ロシアの検査所⻑
ドーピングに中⼼的役割
ロシアの検査機関を登録取り消し
所⻑は永久追放ロシアの組織的ドーピングと⼿法

WADA独⽴監査団

ロシアの不正に関する報告抜粋
所長が積極的に不正に関与再検証を困難にするため、1417検体を検査所内で廃棄所長が,選手に興奮剤を提供していた者から結果の隠蔽を依頼され賄賂を受領

ドーピングを駆逐できない現状
選⼿の状況• 新規物質は即時使⽤ → 検査法開発前の使⽤はリスク低• デザイナーステロイドの登場 → ⼊⼿が容易• 天然型ホルモンの増加 → 検出されただけでは違反不成⽴
検査当局の状況• 次期新規物質の予測困難 → 検査対象の的が絞れない• 無承認物質では投与実験出来ない → 代謝物の検証が困難これからの反ドーピング戦略
検査当局の状況• 事前の取り締まりが不可ならば事後に→ 検体の⼗年保管と検査対象の的が絞れない• 陽性者への罰則適⽤は遡って適⽤→ 選⼿にとって、現時点での陰性は検査の完了を意味せず• 内部告発制度の実施と、内部告発者の保護プログラムの充実