Data Sheet: Sequencing

TruSeq™ エクソーム濃縮キット
濃縮前のサンプルプールと最も包括的なエクソームカバレッジを可能にした
低コストで拡張性のあるエクソームシーケンス解析
TruSeq エクソーム濃縮キットの特長• シンプルで拡張性のあるワークフロー
自動化対応可能なマスターミックス試薬と最大96サンプル処理可能なプレートベースのプロセス• 低コストエクソームシーケンス

図1：イルミナシーケンサーと組み合わせたエクソームシーケンスの全体のながれ

TruSeq DNAサンプル調製キットを用いてサンプルを調製

濃縮前の6サンプルをプールすることによりハンズオンタイムとコストを大幅に低減

最大6サンプルを濃縮前にプール• 統合的なソリューション
TruSeq DNA サンプル調製キットと最適化され、エンドtoエンドの便利なエクソームシーケンスソリューション

• 最も効率のよいエクソームシーケンス

TruSeqエクソーム濃縮キットを用いてターゲット領域をキャプチャー

最も包括的なエクソームカバレッジ（コーディングエクソン、5 UTR、3 UTR、micro RNA、non-coding RNA領域を含む62Mb）、高い均一性、そして低量DNAでのスタート

イルミナ次世代シーケンサーシステムでシーケンス

はじめに次世代シーケンサーを用いたターゲットリシーケンスにより、ゲノム上のある特定領域にフォーカスし、コスト効率よく疾患の原因となる多型や変異を探索することができます。稀で複雑な疾患の多くはゲノムの1~2%に相当するエクソンあるいはコーディング領域中の多型や変異との関与があることが明らかになりつつあります。ターゲットエクソームシーケンスはこうした領域の詳細な観察を可能にし、様々なヒトの複雑な疾患原因となる多型や変異を同定することができます。
現在のゲノム上のある特定領域をターゲットとする手法にはいくつかの限界があります。PCR とサンガーシーケンスを用いたアプローチは、多数のサンプルや領域を対象にした場合、非常にコスト効率が悪くなります。さらに、PCR では増幅産物間でのカバレッジに差があることが知られています。次世代シーケンサーを用いたターゲットソリューション手法はいくつかありますが、時間やコストがかかるものがほとんどです。
こうした問題を克服し、またより簡単に、より低コストでターゲットエクソームシーケンスを行うために、イルミナはTruSeqエクソーム濃縮キットを提供しています。このキット
は溶液中の反応によりシーケンスをキャプチャーする方法で、ハイブリダイゼーションを用いてヒトゲノムにおけるエクソン領域を抽出します。コモンおよび稀な多型のシステマチックな検出を、イルミナ次世代シーケンサーと組み合わせれば高サンプルスループットを低コストで行うことができます。このTruSeqエクソーム濃縮キットはイルミナの TruSeq DNA サ
ンプル調製キットのサンプルマルチプレックス能力に最適化されており、イルミナのシーケンスサンプル調製溶液と共に用いることにより、シンプルで拡張性のあるワークフローを提供します。

データ解析

イルミナのTruSeqエクソーム濃縮キットを用いることで、ターゲットリシーケンスにおける包括的なソリューションとサポートをイルミナから受けられます。

シンプルで拡張性のあるワークフロー
イルミナのエクソン濃縮法はシンプルで拡張性のあるワークフローにより、最もフレキシブルで効率のよいターゲットリシーケンスを可能にします。マスターミックスされた試薬と最大 96 サンプル処理可能なプレートベースのプロセス、そしてリキッドハンドリング用に最適化された液量により、さらなる高スループットのための自動化にも対応しています。
エクソーム濃縮の前に、サンプルはTruSeq DNAサンプル調製キットを用いてライブラリー調製します。各DNA サンプルにはインデックスを組み込むことができ、最大6 サンプルを 1 回の濃縮反応で処理することができます。複数サンプルをプールすることにより、他の手法と比べてハンズオン時間が大幅に減り、大規模な高スループットプロジェクトも低コストで実施が可能となります。

TruSeq DNA サンプル調製キット
エクソーム濃縮前には、TruSeq DNAサンプル調製キットを用いてライブラリー調製を行います。このキットはマ
スターミックス試薬、最適化されたインデックス付きアダプター配列、シーケンス前に複数のサンプルのプールを可能にするフレキシブルなワークフローを提供し、スループットを向上する一方で、シーケンスのコストを低減します。

Data Sheet: Sequencing

図2：TruSeqエクソーム濃縮ワークフロー
サンプルライブラリーをプール

エクソーム濃縮ワークフロー
エクソーム濃縮ワークフローは、 TruSeq DNA サンプル調製キットでインデックスを使って調製した6つのサンプルをプールすることからはじまります。これらのサンプルライブラ
リーを変性して 1 本鎖 DNA （図 2A ）にし、ターゲット領域に特異的なビオチン標識したプローブとハイブリダイズさせます（図 2B ）。サンプルはビオチン化プローブに結合するストレプトアビジンビーズにより濃縮されます（図2C）。ストレプト
アビジンビーズに結合したビオチン化 DNA 断片は磁気により液中から集められます（図2D）。濃縮したDNA断片をビーズから抽出し、2回目の濃縮反応を行います。

A. 変性した2本鎖のDNAライブラリー

高い効率と包括的なカバレッジ
ビオチンプローブB.ビオチン化プローブをターゲット領域にハイブリダイゼーション

ストレプトアビジンビーズ

TruSeq エクソン濃縮キットは最も包括的なエクソームカバレッジを可能にします。 TruSeq DNA サンプル調製キットで必要なDNAはわずか1µgで、またTruSeq DNAエクソーム濃縮キットでは 95 bp のオリゴを用い、 CCDS （ ConsensusCoding Sequence, hg 19 build）の97.2%、全RefGene（hg19 build）の88.3%、Encode/gencodeコーディングエクソン（hg 19 build）の93.2%をカバーする、約62 Mb のエクソー
ム領域を網羅しています（表1）。ターゲットリシーケンスを行うとき、ターゲットとする領域をシーケンスするため、バイアスなしに精度の高い多型・変異コールを行うため、また効率よくシーケンス深度を得るために濃縮領域を高い率で均一にカバーすることが重要です。 TruSeqエクソーム濃縮キットは高い濃縮率とオンターゲットの特異性を達成するために設計され、最適化されており、高いカバレッジの均一性と優れた再現性を提供しています（図3-5）。

データの評価

C. ストレプトアビジンビーズを用いて濃縮

エクソーム濃縮から得られたシーケンスデータは、アライメン
ト後、そしてCASAVA（Consensus Assessmentof Sequenceand Variation）後の、ふたつの統計結果を出すためのスクリプトを用いて解析されます。アライメント後の解析は、ターゲット領域と重なるリード数をカウントし、リードがターゲット領域内にヒットしたかどうかを定めます。CASAVA 後の解析では、ある領域内の各塩基におけるカバレッジを計算します。オンターゲットとオフターゲットのカバレッジを確認す
るには、GenomeStudio® データ解析ソフトウェアを用いて視覚化させます。
表1：ターゲット領域詳細

D. ビーズからの溶離ターゲット遺伝子数20,794

ターゲットエクソン数201,121

ターゲット領域サイズ

62 Mb

プローブ数340,427

CCDSコーディングエクソン（31.3 Mb; hg19）

97.2%

RefSeq（refGene）コーディングエクソン（33.2 Mb; hg19）96.4%

ゲノム上のターゲット領域を効率よく抽出できます。TruSeqエクソー

RefSeq（refGene）エクソンプラス0（67.8 Mb; hg19）*88.3%

ム濃縮ワークフローには、2つの連続した濃縮ステップがあります。

Encode/Gencod コーディングエクソン†（25.6 Mb; hg 19）

93.2%

TruSeqエクソーム濃縮キットはシンプルで合理化されたワークフローを提供し、TruSeq DNAサンプル調製キットで準備したサンプルから、

予測microRNAターゲット‡（9.0 Mb, hg 19）
推奨ライブラリーサイズ
正規化平均カバレッジ 0.2 xでの塩基の割合

77.6%
300 – 400 bp
80%以上*コーディングエクソン、5 UTR、3 UTR、micro RNA、non-coding RNAを含む。
†Manual V4‡
www.microna.orgで予測されているmirbase 15の ターゲット

Data Sheet: Sequencing

図3：高いカバレッジ均一性

10090

カバレッジ（%）

8070
60

1x50

1 0x402 0x303 0x20100
サンプル1サンプル2サンプル3サンプル4

サンプル5

サンプル66サンプル間で、62Mbのターゲット領域での、各カバレッジの塩基の割合が均一であることが観察できます。これらのサンプルは、TruSeq DNAサン
プル調製キットを用いて調製され、1反応用にプールされた後、TruSeqエクソーム濃縮キットにより6サンプル同時に濃縮されました。濃縮されたサンプルは、HiSeqフローセルの5レーンを使いシーケンスし、平均リードカバレッジ46-70xのデータが得られます。（カバレッジは各サンプルにより変わる。）カバレッジが高い塩基ほど、その塩基の割合は低くなります。サンプル間での微少な値の違いはありますが、このデータより、サンプルプールの工程は、ターゲット領域62Mb全体のカバレッジ均一性にネガティブな影響を及ぼさないということを示しています。通常、80%以上の塩基が0.2xの正規化平均カバレッジを示します。つまり、100xでシーケンスした場合、80%以上の塩基が20xカバレッジとなると予測されます。

図4：高いターゲット特異性
10090

濃縮効率（%）

807060ターゲット領域にマップしたリード（%）

50

ターゲット領域±150 bpにマップした
リード（%）

4030
20100
サンプル1

サンプル2

サンプル3

サンプル4

サンプル5

サンプル6

濃縮効率は、シーケンスで読まれた全リード数のうち、ターゲット領域にマッピングされたリード数の割合として算出されます。6 サンプルのターゲット領域内にマップピングされたリードの濃縮効率（青）は〜70%に達しています。検証リード範囲をターゲット領域の上流と下流150 bpも含めた領域に広げると、濃縮効率（紫）は80-85%へと増加します。これはそれぞれのプローブがターゲット領域よりも大きな範囲をキャプチャーするようにデザインされているためです。

Data Sheet: Sequencing

製品情報

R2 = 0.9475

サンプル数
反応数／（6プレックスの カタログ番号
キット場合）／キット

キット

48

FC-121-1008

144

FC-121-1024

48

288

FC-121-1048

96576

FC-121-1096

192

1152

FC-121-1192

480

2880

FC-121-1480

960

5760

FC-121-1960

TruSeq DNA
Sample Prep Kit, Set A

48

FC-121-1001

TruSeq DNA
Sample Prep Kit, Set B

48

FC-121-1002

1000

824500

TruSeq Exome
Enrichment Kit

0

平均リード深度（6プレックスの場合）

1500

図5：高い再現性

050010001500

平均リード深度（4プレックスの場合）

図3で使用したサンプルを再現性のために解析した結果です。繰り返し実験において、高い整合性がとれていることがわかります。

クオリティコントロール

まとめ

サンプル調製プロセス時には、末端修復、Aテイル付加、ライゲーションの 3 つの酵素反応ステップにおいて人工的な 2 本鎖DNAターゲットをコントロールとして加えます。これらを活用するために、コントロールを特異的にキャプチャーするプローブがCTO（Capture Target Oligo）プールの中に入っています。イルミナは濃縮には300-400 bpのライブラリーサイズを推奨していますが、コントロール試薬は150-850 bpまでのサイズのライブライリーインサートにも使用することができます。シーケンスデータに含まれるコントロールシーケンスは、各酵素反応ステップがうまくいったかどうかを示します。この内在性のコントロールはトラブルシューティングを可能にし、何が原因で失敗したかを同定することができます。内在性コン
トロールは RTA（HiSeq バージョン1.10、Genome Analyzer
バージョン1.9）を用いてシーケンス配列が認識され、サンプ

ヒトゲノムのエクソーム領域をターゲットする TruSeq エク
ソーム濃縮キットは、イルミナ次世代シーケンサーのパワーと組み合わせることで、高い効率で、かつ経済的にエクソームリシーケンス研究を行えます。またサンプル調製から濃縮、シーケンスまで、すべてのワークフローにおける試薬キットをイルミナから提供しているため、一括してすべての試薬をご注文いただける簡便性もあります。エクソーム濃縮の詳細は www.

illumina.com/applications/sequencing/targeted_resequencing.ilmnをご覧ください。

ルデータから抽出されます。
エクソームシーケンス/ランシステム

アウトプット/ラン

2x 100 bp リード

エクソームシーケンス数/レーン、ラン

50 x カバレッジ

75 x カバレッジ

100 x カバレッジ/レーン/ラン/レーン/ラン/レーン/ラン
6.5

Genome Analyzer IIx

60 Gb

216180.8HiSeq 1000

100 Gb3242161.512HiSeq 2000

200 Gb3482321.524

イルミナシークエンサーによる、異なるカバレッジレベルでのエクソーム濃縮数/ランとエクソーム濃縮数/レーンを示しています。エクソーム濃縮に必要とされるアウトプット量は、エクソームサイズ、濃縮効率、そして必要とされるカバレッジにより変わります。例えば、62 Mbのエクソーム濃縮を50xカバレッジで行うときは、3.1 Gbのデータが必要と考えられます。ターゲット濃縮とパスフィルターリードによる濃縮効率を〜70%と想定すると、濃縮後のデータ収量を算出できます。HiSeq 2000では、1ランで約48エクソーム（1レーンで3エクソーム）が得られると考えられます。

イルミナ株式会社

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www.illuminakk.co.jp

本製品の使用目的は研究に限定されます。
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Pub. No. 770-2010-J012 20MAY11