GC研究懇談会
2016年12月

固相誘導体化によるメタボローム分析
株式会社 アイスティサイエンス
佐々野僚一
Metabolomics 2015（国際学会）「Development of in-SPE derivatization for GC-MS metabolome analysis」○Ryoichi SASANO1, Yoko KOJIMA1, Shusuke OSAKI2, Yoshie TANAKA2, Akihiro MATSUMOTO2, Toshiyuki
YAMASHITA3, Takeshi BAMBA3, Eiichiro FUKUSAKI3 1;AiSTI, 2;Wakayama prefecture, 3;Osaka University
第９回メタボロームシンポジウム「GC/MS基盤メタボローム分析に資する固相誘導体化法の応用」○佐々野僚一 1* 大﨑秀介 2 松本明弘 2 馬場健史 3 山下俊幸 4 福﨑英一郎 4
1. アイスティ 2.和歌山県工技セ 3.九大・生医研 4.阪大・工1 / 11メタボロミクスの現状と課題従来の前処理法の課題
現在のメタボローム分析法▲ 脱水に一晩(16時間) !!

▲ 誘導体化に2時間 !!

アミノ酸のCX固相を用いた誘導体化
Step1

Step２

Step３

Step４

負荷・保持脱水

誘導体化

溶出

試料抽出液
R- C – COO⊖
–

⊕NH
3洗浄液
アセトニトリル

誘導体化試薬 [含浸]
MSTFA

溶出液
ヘキサン

アミノ酸

CX R-C–COO⊖––SO3⊖ ⊕NH3

アミノ酸をイオン交換相互作用により固相に保持。

アセトニトリルで水分を除去

固相誘導体化R-C-COO-TMS
TMS-NH–

SO3⊖ ⊕NH3

CX R-C-COO-TMS CX
TMS-NH
SO3⊖
SO3⊖–

CX R-C–COO⊖有機酸・糖類のAX固相を用いた誘導体化
Step1

Step２

Step３

Step４

Step5

負荷・保持脱水

メトキシム化

TMS化

溶出試料抽出液

洗浄液アセトニトリル

誘導体化試薬[含浸]メトキシアミン

有機酸 糖類－COO⊖ －OH

AX－OH
Ｎ⊕ －COO⊖(CH3)3
有機酸をイオン交換相互作用により固相に保持。
糖類を極性相互作用により固相に保持。

AX －OHＮ⊕ －COO⊖(CH3)3
アセトニトリルで水分を除去

AX －OHＮ⊕ －COO⊖(CH3)3固相誘導体化

誘導体化試薬 [含浸]MSTFA

AX －O-TMS

溶出液
ヘキサン

AX

Ｎ⊕ －COO-TMS Ｎ⊕(CH3)3(CH3)3固相誘導体化－O-TMS－COO-TMS

試料負荷時の水濃度と固相への保持について【アミノ酸とCX固相】【糖とAX固相】

02.5%

5%

10%

20%

50%

Ala-2TMS

Water concentration
Gly-2TMS
Val-2TMS

Ile-2TMS

Pro-2TMS

Ser-3TMS

75% 97.5%Leu-2TMS
Thr-3TMS【有機酸とAX固相】
Relative peak area

1005001%

2%

5%

10%

50%

75%

90%

Water concentration
Pyruvate-2TMS Oxalic-2TMS
Maleic-2TMS
Succinic-2TMS
Fumaric-2TMS
Malic-3TMS

Relative peak area

Relative peak Area

100

00.5%

1%

2%

5%

10%

20%

50%

Water concentration

Xylose-4TMS
Rhamnose-4TMS
Fructose1-5TMS

Arabinose-4TMS
Fucose-4TMS
Fructose2-5TMSCX固相誘導体化前処理法（アミノ酸）の評価
直線性（R2）と再現性（RSD, n=6）
No. Amino acid

SCANトータルイオンクロマトグラム
3.E+06

アミノ酸量とピーク面積値の関係

Peak area

2.E+06目的成分量0.2, 0.5, 1.0, 2.0 nmol

2.E+06
1.E+06
5.E+050.E+00
0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Quantity of amino acid (nmol)
Val-2TMS Ile-2TMS Tyr-3TMS

R2RSD
n=6, %

1

Ala-2TMS

0.9996

7.4

2

Gly-2TMS

0.995813.1

3Val-2TMS

0.9993

7.54

Leu-2TMS

0.9992

6.75Ile-2TMS

0.9995

6.2

6Pro-2TMS

0.9982

12.5

7Ser-3TMS

0.9988

5.58

Thr-3TMS

0.9990

4.79

Asp-3TMS

0.99894.9

10 Met-2TMS

0.9991

7.5

11

Glt-3TMS

0.99118.812 Phe-2TMS

0.9996

5.6

13

Lys-3TMS

0.9927

32.2

14

Tyr-3TMS

0.9977

4.8

15

Cys-4TMS

0.995029.2

AX固相誘導体化前処理法（有機酸）の評価
直線性（R2）と再現性（RSD, n=6）No.

SCANトータルイオンクロマトグラム
1.E+07

Peak area

8.E+06

有機酸量とピーク面積値の関係

6.E+06
4.E+06
2.E+06
0.E+00

0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Quantity of orano acid (nmol)
Fumaric-2TMS Tartaric-4TMS Citric-4TMS

目的成分量0.2, 0.5, 1.0, 2.0 nmol

Organic acidR2RSD
n=6, %

1 Pyruvate-2TMS

0.999815.1

2 Oxalic-2TMS

0.9946

6.23 Maleic-2TMS

0.9991

1.8

4 Succinic-2TMS

0.958822.0

5 Fumaric-2TMS

0.9991

2.2

6 Malic-3TMS

0.99972.1

7 Tartaric-4TMS

0.99981.9

8 Citric-4TMS

0.99982.5

AX固相誘導体化前処理法（糖類）の評価

直線性（R2）と再現性（RSD, n=6）No.

SCANトータルイオンクロマトグラム

Peak area

3.E+06

2.E+06

1.E+06

0.E+000.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
Quantity of saccharides (nmol)
Fructose1-5TMS
Mannose-5TMS

糖類量とピーク面積値の関係
目的成分量0.1, 0.2, 0.5, 1.0 nmol

Saccharides

R2RSD
n=6, %

1 Xylose-4TMS0.9998

5.4

2 Arabinose-4TMS

0.9996

7.5

3 Rhamnose-4TMS

0.997410.8

4 Fucose-4TMS

0.99889.8

5 Fructose1-5TMS

1.0000

3.3

6 Fructose2-5TMS

0.99983.2

7 Mannose-5TMS

0.99822.5

8 Galactose-5TMS

0.9995

1.8

9 Glucose-5TMS

0.9778

2.3

10 Sucrose-8TMS

0.9993

2.9

11 Lactose-8TMS

0.99977.2

12 Maltose-8TMS

0.99996.5

従来法と本法の前処理時間の比較
現在のメタボローム分析法

19時間

固相誘導体化法（新技術）10分
メタボローム分析
用固相誘導体化法
キット

特許登録

まとめ
固相カートリッジを用いた新規GC/MSメタボローム解析用試料調製法を開発した。
当該固相誘導体化法を用いることで１．固相に対象物質を保持させて、洗浄することで、脱水操作を簡易かつ迅速に行うことが可能となった。
２．対象物質を保持した強イオン交換系固相に誘導体化試薬メトキシアミン溶液およびMSTFA誘導体化試薬を直接添加して含浸させることにより、固相上で速やかに誘導体化反応が進んだ。
３．水分除去及び誘導体化の操作時間は10分と従来法(19時間)に比べて大きく短縮された。

はじめに
【経緯】
これまでに、従来のメタボローム分析における長時間にわたる操作を必要としない迅速な前処理法を目的として、固相に目的成分を濃縮・保持した状態で誘導体化する固相誘導体化法を開発した。

【本研究の課題】
一般的なGC-MS基盤メタボローム分析において、試料によっては高濃度の糖類が測定および解析時にアミノ酸や有機酸の分析を困難にすることがある。
【目的】
先の固相抽出の技術を応用し、糖類は固相に保持させず、アミノ酸と有機酸を固相に保持させた状態で誘導体化するアミノ酸と有機酸の迅速分析法の開発

試料負荷時の水濃度と固相への保持について【アミノ酸とCX固相】【糖とAX固相】

02.5%

5%

10%

20%

50%

Ala-2TMS

Water concentration
Gly-2TMS
Val-2TMS

Ile-2TMS

Pro-2TMS

Ser-3TMS

75% 97.5%
Leu-2TMS
Thr-3TMS

Relative peak area

Relative peak Area

100

00.5%

1%

2%

5%

10%

20%

50%

Water concentration

Xylose-4TMS
Rhamnose-4TMS
Fructose1-5TMS

Arabinose-4TMS
Fucose-4TMS
Fructose2-5TMS【有機酸とAX固相】
Relative peak area

100

20%水-アセトニトリル溶液では糖類を除去して、アミノ酸と有機酸を保持することが可能。

50
01%

2%

5%

10%50%75%

90%

Water concentration
Pyruvate-2TMS Oxalic-2TMS
Maleic-2TMS
Succinic-2TMS
Fumaric-2TMS
Malic-3TMS

糖類を除去する固相誘導体化前処理法の工程
Step1

Step2

Step3

Step4

Step5

試料負荷

保持脱水誘導体化

溶出

試料抽出液
20%水-ACN

洗浄液
20%水-ACN

洗浄液
アセトニトリル

アミノ酸
CX- –NH3+

CX-

AX+ 有機酸

AX+ 有機酸

AX+ 有機酸

糖類 -OH

残存糖類 -OH

残存水–COO-

アミノ酸
–NH3+

–COO-

アミノ酸をと有機酸を固相に保持。
糖類はスルーさせ、除去。

CX-

アミノ酸
–NH3+

–COO-

アセトニトリル
で水分を除去誘導体化試薬 [含浸]
MSTFA

CX-

アミノ酸–NH-TMS

AX+ 有機酸–COO-TMS

固相誘導体化

溶出液
ヘキサン

CXAX+アミノ酸–NH-TMS
有機酸–COO-TMS

洗浄液量と糖類の除去効果
糖類

糖類
洗浄無洗浄液量：25µL

洗浄液量：50µL

SCANトータルイオンクロマトグラム比較

20%水-アセトニトリル50µLで洗浄することで固相に残存している糖類を除去できることが分かった。

20%水-アセトニトリル洗浄液量について【有機酸】

相対ピーク面積比

相対ピーク面積比【アミノ酸】

20%水-アセトニトリル洗浄液量（µL）

20%水-アセトニトリル洗浄液量（µL）

固相抽出技術による糖類の除去効果

糖類

試料抽出液量：10uL
2%水-アセトニトリル
測定機器を安定に保ち、メンテナンス頻度を下げられ、短時間分析が可能となる。

アミノ酸、有機酸

試料抽出液量：50uL
20%水-アセトニトリル

解析の時間短縮が図れ、精度の高い解析が可能となる。

低濃度のアミノ酸や有機酸が測定できるようになり、アミノ酸や有機酸の網羅的な分析枠が広がる可能性がある。

SCANトータルイオンクロマトグラム比較

フルーツジュースによる固相誘導体化法の再現性
No.

CompoundPeak Area
123456Ave.

101 Alanine-2TMS

922,366

896,338

900,613924,316

893,251

907,292

907,363

102 Valine-2TMS

2,280,757

2,199,247

2,175,089

2,249,300

2,179,606

2,188,250

2,212,042

103 Leucine-2TMS

8,238,086

7,993,113

7,807,302

8,156,037

7,842,769

8,070,694

8,018,000

104 Isoleucine-2TMS

3,152,605

2,931,310

2,878,507

3,061,404

2,924,058

3,027,144

2,995,838

105 Proline-2TMS

7,153,058

6,916,459

7,114,867

7,343,125

6,908,4787,208,605

7,107,432

106 Serine-3TMS

1,630,455

1,578,066

1,539,055

1,604,529

1,547,032

1,574,444

1,578,930

107 Threonine-3TMS

223,434

214,033

204,897

206,024

204,772

212,917

211,013108 Aspartic acid-3TMS

1,440,509

1,416,698

1,390,517

1,410,988

1,407,988

1,403,984

1,411,781

109 Methione-2TMS

72,91973,207

67,574

72,11871,73773,063

71,770110 Glutamic acid-3TMS

379,603359,315366,787352,375

366,416353,280

362,963

111 Phenylalanine-2TMS

1,623,907

1,607,477

1,546,167

1,633,851

1,590,592

1,625,657

1,604,609

180,343

168,369

154,763

172,856

165,834

169,786

168,658

393,542355,299

303,190396,236

369,866

377,538

365,945

31,836,205

31,114,777

27,480,877

33,665,359

31,651,902

32,598,864

31,391,331

203 Ketoglutaric acid-3TMS

485,776545,080

445,816

477,290461,074

479,614482,441

204 Tartaric acid-4TMS

202,387

196,159

178,516

202,680

194,985

204,069

196,466

118,149,126

116,573,721

109,788,429

119,169,130

117,325,701

RSD
(%)

Amino group

112 Tyrosine-2TMS1.51.92.13.4
2.42.2
3.5
1.23.02.8
2.05.0Organo acid group
201 Fumaric acid-2TMS
202 Malic acid-3TMS

205 Citric acid-4TMS

117,454,095 116,410,034

9.4
6.7
7.0
4.92.9高濃度の糖類が分析に及ぼす影響【測定機器について】
・注入口が汚れる・フィラメントが切れやすくなる
・感度低下
・メンテナンス頻度が高い
・GCへの注入量を増やせない。
【解析について】
・定量イオンが限定される。
・ピーク形状が崩れる。
・低濃度の目的成分が分析できない。
・解析に時間が掛かる。
・リテンションタイムが重なると解析できなくなる。
・リテンションタイムが重なる物質は測定対象から除外する。
・リテンションタイムがずれる。

糖類を除いた「アミノ酸」と「有機酸」の分析測定機器を安定に保ち、メンテナンス頻度を下げられ、短時間分析が可能となる。
解析の時間短縮が図れ、精度の高い分析が可能となる。
低濃度のアミノ酸や有機酸が測定できるようになり、アミノ酸や有機酸の網羅的な分析枠が広がる可能性がある。

まとめ
 アミノ酸を保持させる陽イオン交換樹脂（CXi）と有機酸を保持させる陰イオン交換樹脂（AXi）を積層にした固相カートリッジを開発した。
 糖類は固相に保持せずアミノ酸と有機酸を固相に保持させるための通液時の水-アセトニトリル比率の最適化を行い、アミノ酸と有機酸の迅速な分析法を開発した。
 糖類を多く含む検体においてもその影響を受けずアミノ酸と有機酸のトリメチルシリル(TMS)化されたピークが再現性良く検出された。
 固相誘導体化法を用いることで誘導体化前処理に要する時間の大幅な短縮が可能となった。

研究開発の概要および背景
 社会環境の変化
健康社会の構築
 予防医学の確立、疾病の早期発見、機能性食品／飲料の創出
 代謝物の分析・解析を通して疾病の発見、食品の機能性把握、創薬・治療の発展 メタボローム分析技術が必須技術に！
分析手段：GC-MS LC-MS
解析手段：データの多変量解析

 分析現場のニーズ

新技術

現在のメタボローム分析法（現行技術）

固相抽出＋オンライン化

試料を採取

手作業
・オフ
ライン

試料を極少量採取

抽出
精製
凍結乾燥誘導体化

前処
理
：
約2日

GC-MSで測定

完
全自動化
・
オン
ライン

抽出
精製
固相保持誘導体化溶出

前処
理：
約
１０分

全自動注入

メタボローム分析の課題

ごく少量での血液等の試料の分析
・患者の身体的負担を低減

分析精度、再現性の向上
・測定者によるバラツキ低減

 分析の迅速化
・前処理の時間を短くしたい
・多検体対応課題
 前処理時間が長い
 手作業のため、再現性に問題
 測定者による分析バラツキ
 誘導体化条件のコントロールが困難

GC-MSで測定

新技術の効果・特徴
 前処理時間が極めて短時間
 自動化で分析精度・再現性の向上
 オンラインでハイスループット
 誘導体化条件が一定

オンラインSPE-GCシステムの展開
洗浄-脱水

誘導体化

含浸