BioResource Now ! Vol.10 No.8

BioResource Now !
Issue Number 10 August 2014

国内外のバイオリソースを巡る様々な問題や取り組みについて、毎月ホットな話題をこのニュースレターで紹介していきます。

リソースセンター
紹介No.52
今月のデータベース

中村幸夫 （理化学研究所 バイオリソースセンター 細胞材料開発室 ）細胞バンク

広義キク属データベース

P1 - 2

Chrysanthemum

P2

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リソースセンター紹介〈NO.52〉

細胞バンク
はじめに
PCR 技術による遺伝子クローニング、ES 細胞と遺伝子相同組換え技術との融合による、遺伝子変異マウスの作成等に代表される遺伝工学技術等の進歩によって、20 世紀終盤の遺伝子機能解析は飛躍的に発展した。また、20 世紀中に開発された核移植技術による細胞の初期化や ES 細胞培養技術は、21 世紀に入って、iPS 細胞技術として花開くこととなった。iPS 細胞技術が明確にした事は、体細胞がいとも簡単に ES細胞類似の多能性幹細胞に変化できることのみではなく、体細胞が様々な工夫によって多能性幹細胞を経由する
こ と な く 他 の 細 胞 へ も 変 化 で き る、という事実であった。「遺伝子を自由自在に操作する時代」を経て、「細胞を自由自在に操作する時代」が到来した感がある。そのような中、細胞材料の種類も爆発的に増加している。

品質管理
上述のとおり、細胞工学技術は飛躍的な発展を遂げており、研究者が取り扱う細胞の種類も急速にその幅を広げている。しかし、培養細胞の種類がどのように多種多様になったとしても、すべての細胞材料に共通の品質管理が存在する。
先ずは微生物汚染の排除である。細胞培養系においては、細菌、真菌、ウイルス、マイコプラズマ等の微生物汚染が発生可能である。細菌汚染に対しては培養液に抗生剤（ペニシリンとストレプトマイシンが汎用されている）を加えることで防止可能であり、真菌汚染に関しても抗真菌剤を培養液に加えることでかなりの防止効果がある。いずれにしても、細菌や真菌の汚染は科学的に大きな問題とはならない。何故なら、もし細胞培養系にそうした汚染が発生した場合には、研究者は実験を続行することを断念し、結果として、そのような実験系の結果を論文等で公表することがないからである。

中村幸夫

理化学研究所 バイオリソースセンター 細胞材料開発室 室長

ウイルスに関しては、少し事情が複雑となる。ウイルス感染は細胞培養中に生じる可能性もあるが、培養細胞の元となった細胞そのものに特定のウイルスが感染している可能性もあり、さらにはそのことが細胞の形質や疾患等に関与している可能性もある。また、ありとあらゆるウイルス感染の可能性を検査することは、費用対効果等から勘案しても妥当とは言い難い。理研 BRC 細胞バンクでは、バイオハザードとなるウイルスに限定し、ウイルスのトロピズム*1を考慮して、肝臓細胞に関しては肝炎
ウ イ ル ス（HBV と HCV）の 検 査 を、血液細胞に関しては HIV と HTLV の検査を実施している。

マイコプラズマ汚染
微生物汚染の中で最も厄介な存在が、
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マイコプラズマ* 汚染である。最も厄介 な 理 由 は、マ イ コ プ ラ ズ マ が 培 養
細 胞 に 感 染 し て も、細 胞 は 死 ぬ 事 なく増え続けるからである。さらには、感染細胞の方が元の細胞よりも増殖速度が速くなったりするケースすらある。そして、研究者が日常的なルーチン作業として位相差顕微鏡で細胞を観察しているのみでは、決してマイコプラズマ汚染に気付くことはできない。
マイコプラズマ汚染された培養細胞を実験に使用しない方法はただ一つ。
定期的にその可能性を検査することである。しかし、多くの研究者にとって、それは煩わしい作業であり、省略されることが多い。そして、現実問題として、マイコプラズマ汚染された培養細胞が実験にたくさん使用されている。この事はつい最近の Nature 誌でも警鐘が鳴らされている（図 1）。
マイコプラズマ汚染の検査には様々なものがあるが、DNA 染色法が最も感度の良い方法であり、理研 BRC 細胞バンクでは DNA 染色法をルーチン検査として実施している（図 2）。

PCR によるマイコプラズマ DNA の検出や、マイコプラズマ特有の酵素を同定する検査
キ ッ ト な ど も、市販されている。一般の研究者 の 皆 様 に は、そうしたより簡便な検査をお奨めする。
図 1. Nature 511, 518 (2014)

陰性細胞陽性細胞図 2. マイコプラズマ汚染検査。
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検査細胞を培養した培養上清液を Vero細胞* の培養系に加えて１週間程度培養してから、DNA染色剤で Vero 細胞を染色した写真。陰性細胞
では細胞核のみが染まるが、陽性細胞では細胞核以外に細胞質も染まり、細胞質に微生物由来の DNA が存在することを示している。そのほとんどはマイコプラズマ感染である。

細胞誤認胃癌由来の細胞株と思って使用していた細胞株が、子宮癌由来の細胞株であった、というような細胞の誤認が未だに研究コミュニティに蔓延している。マイコプラズマ汚染と同様に、研究者が日常的なルーチン作業として位相差顕微鏡で細胞を観察しているのみでは、決して誤認細胞に気付くことはできない。遺伝子レベルでの解析なくして細胞識別は不能である。マイクロサテライト*4（ShortTandem Repeat: STR）多型解析は、犯罪捜査等でも利用されている精度の高い検査法であり、これが培養細胞株にも適用できることが分かり、世界中の主要細胞バンクは STR 多型解析をルーチン検査として実施している（図 3）。
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CRISPR/Cas9 によるゲノム編集細胞疾患特異的 iPS 細胞
HeLa
1112OL allele?

81291012812910HeLa-SC11OL allele?

図 3. 細胞誤認検査としての Short Tandem Repeat（STR）多型解析。HeLa 細胞とその亜株（HeLa-SC）との解析結果。
実際には８ローカスの多型を解析するが、図は４ローカスの結果を示す。各ローカスには父親由来と母親由来の２ピークが検出される。ただし、父親由来と母親由来のSTR が同じ長さの場合には１ピークのみが検出される。
HeLa 細胞と HeLa-SC との間でも 100％合致する訳ではない（長期培養中に生じた変異によるもの）。

誤認細胞検査は個々の研究室内で完結できない特殊性を有している。例えば、
マイコプラズマ汚染検査は、個々の研究室で最も感度の良い DNA 染色法を実施して、汚染のない細胞株であると結論を出して使用することが可能である。一方で、誤認細胞検査は、特定の細胞株が他の細胞株の誤認でないか否かを確認するためには、世界中に存在する他の全ての細胞株と比較する必要がある。何故なら、かつて細胞株は世界中の研究者の間でかなり自由に融通されていたからである。即ち、特定の細胞株が世界中のどこの研究室で使用されているのか、誰も正確には把握していないのである。
従 っ て、こ の解析に必要とな る の は、世界中の細胞株を 網 羅 す る
STR 多 型 解 析
図 4. Nature 492, 186 (2012)の結果に関するデータベースである。世界中の主要
細 胞 バ ン ク は そ の 重 要 性 を 認 識 し、
The International Cell Line
Authentication Committee (ICLAC) を設立し、共同で啓発活動等を開始した。
一番最近では、Nature 誌にも啓発記事を掲載した（図 4）。しかし、まだその緒についたばかりである。

培養細胞は、そもそも正常な細胞や病気の細胞のモデル細胞として利用されている。代表的な癌細胞株は、言うまでもなく主には癌のモデル細胞として研究に利用されている。一方で、がん以外の疾患に関しては、疾患モデル細胞は皆無であったと言っても過言ではない。そこに登場したのが iPS 細胞樹立技術である。iPS 細胞樹立技術は、再生医療への応用も期待されているが、疾患モデル細胞の構築にも大きな期待を集めている。即ち、患者由来の体細胞から iPS 細胞を樹立し（疾患特異的iPS 細胞という）、そこから疾患モデル細胞を作成して実験に使用するという研究法である。
例えば、脳 変性 疾患の患 者の 脳細胞を採取して研究に用いるなどということは不可能であるが、当該患者の皮膚細胞や血液細胞を用いて iPS 細胞を樹立し、樹立した iPS 細胞から脳神経細胞を誘導すれば、疾患モデル細胞として利用できる可能性が大きい。
ま た、臨床では、心臓、肝臓、腎臓などを採取する検査（バイオプシー）が行われているが、出血等の危険性が大きい検査であり、iPS 細胞から目的の組織を分化誘導できれば、バイオプシーに代わる検査となる可能性がある。
「可能性」と表記している理由は、そうした研究はまだ始まったばかりであり、疾患特異的 iPS 細胞をプラットフォー
ムとする研究法が、どういう分野で有効であるのかはまだ確定していないからである。

・野生系統：204系統
・実験系統：36系統
・園芸系統：20系統(2014年8月現在)

おわりに
上記のような新規細胞材料に関しては、従来とは異なる品質管理も必要となる。科学の進歩と社会情勢や経済情勢との調和を勘案しながら、細胞バンク事業を発展させていきたいと考えている。■[ 利用者の皆様へのお願い ]American Association for Cancer Research(AACR) の投稿規程に細胞の品質検証に関する記載がある。他の雑誌でも同様な投稿規程が増え始めているので、参照して頂きたい（詳細は HTML 版でご覧になれます）。
http://www.shigen.nig.ac.jp/shigen/news/n_letter/2014/n8/aacr_contribution_rule.html*1：ウイルスの種類によって増殖可能な細胞の種類が決まること。
*2：真核生物を宿主とする寄生生物。
*3：アフリカミドリザルの腎臓上皮細胞に由来する細胞株である。
*4：細胞核やオルガネラのゲノム上に存在する反復配列で、とくに数塩基の単位配列の繰り返しからなるものである。
*5：新技術のゲノム編集ツール。

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広義キク属データベース

ゲノム編集技術は目覚ましい速さで進歩 し て い る。特 に、最 近 開 発 さ れ た
CRISPR/Cas9*5 は大きな注目を集めており、生命科学の全分野でその活用が研究され始めている。培養細胞分野も例外ではない。例えば、前項で疾患特異的 iPS 細胞の有用性を紹介したが、疾患特異的 iPS 細胞を樹立するには該当疾患の発生を待たねばならない。
ところが、既に原因遺伝子が特定されている疾患に関しては、原因遺伝子が複数であっても、正常な iPS 細胞に CRISPR/Cas9 技術を用いて、原因となっている遺伝子変異を導入すれば、疾患特異的 iPS 細胞を人工的に樹立することが可能である。別々の個人由来の正常な iPS 細胞を多数用いれば、遺伝的背景の異なる多数の疾患特異的 iPS 細胞を樹立することも可能である。

Chrysanthemum
DB名：Chrysanthemum
URL ：http://www.shigen.nig.ac.jp/chrysanthemum/
言 語：日本語 英語
オリジナルのコンテンツ：
・野生系統、実験系統、園芸系統について、産地、表現型、倍数性、写真などの情報を公開
・モデル植物としてのキクタニギクの役割、キクの花の構造、同質倍数性進化、遺伝子汚染による野生ギクの絶滅危機、種を識別するDNA
マーカー開発の話を掲載
特徴：・分かりやすく分類されたリソース一覧
・写真のある系統はカメラアイコンを表示
・エクセルにまとめた系統情報を中核機関側でアップロードし公開できる
連携DB：RRC(成果論文データベース)
DB構築グループ：NBRP広義キク属、NBRP情報
運用機関：国立遺伝学研究所 生物遺伝資源センター
DB公開開始年：2004年
DB最終更新年：2013年

現役開発者のコメント：広義キク属データベースサイトは公開サイトと管理サイトの２つからできており、系統情報や画像ファイルのアップロードから公開まで、すべて中核機関側で運用できる仕組みになっています。また、系統情報をアップロードする過程において、公開サイトのメニューにある「リソース一覧」の部分を動的に作り出す仕組みを組み込んでいるため、系統や下位分類の増減、メニューの並び順を自由にカスタマイズできるようになっています。

連絡先 〒411-8540 静岡県三島市谷田 1111
国立遺伝学研究所 生物遺伝資源センター
TEL 055-981-6885 ( 山崎 )E-mail：brnews@shigen.info
Editor's Note
中 村 先 生 に は 理 研 BRC の 細 胞 バ ン ク に つ い て 過 去 ２ 回（2005/2008）ご執筆いただいておりますが、今回のご説明で疾患特異的 iPS 細胞やゲノム編集細胞への期待など、短期間にこの分野が飛躍的に発展していることがわかりました。また
最も神経を使われている品質管理について世界の最新情報をご紹介くださいましたが、実験科学の再現性を保障するというリソース事業の根幹に関わることでもあり、他のリソースへの波及効果が期待されます。（Y.Y.)

バイオリソース情報(NBRP) www.nbrp.jp/(SHIGEN) www.shigen.nig.ac.jp/indexja.htm(WGR) www.shigen.nig.ac.jp/wgr/(JGR) www.shigen.nig.ac.jp/wgr/jgr/jgrUrlList.jsp

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