福岡県保健環境研究所年報第 40 号，63-68, 2013

原著
Variable number of tandem repeats (VNTR) 法を用いた結核菌の遺伝子型別―繰り返し回数算出における基礎的検討―
前田詠里子・大石明・江藤良樹・村上光一・世良暢之・堀川和美
結核菌の Variable number of tandem repeats (VNTR) 解析の上で重要となる繰り返し回数の算出方法を確立することを目的として、VNTR 領域の塩基配列の決定・解析により得られた値（真の値）とシークエンサーを用いたフラグメント解析により得られた値（見かけの値）の相関性を明らかにした。その結果、真の値と見かけの値の関係は一定の範囲内の大きさの PCR 産物においては相関することが分かった。この範囲内では、繰り返し回数が既知である PCR 産物を、検量線作成用として使用できることが判明した。また、真の値と見かけの値の直線性が低い、大きい PCR
産物の繰り返し回数の算出には、シークエンサーを用いたフラグメント解析時に見られるスタッターピーク数の計測やパルスフィールド・ゲル電気泳動による測定が有用であることが示された。
さらに、一部の VNTR 領域（QUB11a、QUB11b）の 2000 bp 程度の大きな産物には IS 6110 が挿入されていることが塩基配列の解析によって確認された。これらの結果より、結核菌の VNTR 解析は、
シークエンサーによるフラグメント解析、スタッターピーク数の計測及びパルスフィールド・ゲ
ル電気泳動を組み合わせることによって、繰り返し回数を適切に算出できることが分かった。
［キーワード : 結核、VNTR、フラグメント解析、遺伝子型別］
１50-100 bpを単位として繰り返される「繰り返し配列の数」

はじめに
結核は主に人の肺に病変を起こす病気である。結核患者

を、菌株間で比較することによる遺伝子型別法である。特として 1 年間に新規登録される患者数は全国で約 2 万人、徴として、PCRをベースとした手法であるので、用いる菌死亡者数は約 2 千人と、現在でも公衆衛生上重要な感染症

量が少なくてすみ、比較的迅速に結果が出る利点がある。

となっている。福岡県における結核患者の罹患率は過去

また、結果を数値で表すことができるので、他の検査機関

10 年間全国平均よりも多く、平成 23 年の厚生労働省の調や過去のデータと結果を容易に比較でき、データの保存も査では全国で 16 番目に多い県となっている 1)。福岡県で簡単である。一方で、繰り返し回数算出の基準を明確にしは、平成 24 年度より感染源の究明及び予防対策を支援す

なければ株間での比較が無意味になってしまうという注ることを目的に“結核病原体サーベイランス事業”を開始

意点がある3)。

した。このなかで当所は、主に新たに発生した患者から分繰り返し回数の算出法として、最も正確な方法はVNTR

離された結核菌の遺伝子型別、解析を行い、得られたデー

領域の塩基配列を決定・解析し、繰り返し配列の数を数え

タを行政機関や医療機関に情報提供している。

る方法である。しかしながら、一般的には費用や時間の問

近年、結核菌の遺伝子型別法としてVariable number of

題で、ゲル電気泳動やシークエンサーのフラグメント解析

tandem repeats (VNTR) 法という手法が開発、汎用されて機能を用い、PCR産物の大きさを元に繰り返し配列の数をおり、なかでも日本においては JATA (12) - VNTR 分析法

推定する方法が採用されている。そこで、今回、当所におが日本国内の結核菌を対象とした標準法として提唱され、いて結核菌のVNTR解析法を導入するにあたり、数株のVNTR

全国的な普及が進められている2)。当所においても、結核

領域計24領域の塩基配列を決定・解析し、繰り返し配列の菌の遺伝子型別法として JATA (12) - VNTR 法の領域に数を確認したもの（これを真の値とする）とシークエンサ

QUB18、QUB11a、ETR-Aを加えた領域（以上、JATA (15) - VNTR

ーのフラグメント解析により得た値（これを見かけの値と法の領域）、超多変（hypervariable，HV）領域及び国際する）の相関を明らかにし、より正確な検査系の確立を目

標準領域を加えた計24領域を用い、福岡県内で流行してい的とした（なお、各株の詳細な塩基配列等については福岡る結核菌の分子疫学的解析を試みているところである。

県保健環境研究所のウェブページの所定の場所に掲載予VNTR法の原理は、結核菌のゲノム上に数10ヵ所存在する

定である）。

福岡県保健環境研究所 （〒818-0135 太宰府市大字向佐野 39）

-63-

２

方法

２・１

２・４ PCR 産物の塩基配列解析
供試菌株

臨床株 22 株及び BCG 株の PCR 産物（延べ 259 領域）を

平成 24 年度に当所に搬入された福岡県内在住の結核精製し、ダイレクトシークエンスをおこなった。プライ患者から分離された結核菌株 91 株、また、BCG Tokyo 株

マー両端部位を含め塩基配列を決定・解析することによ（日本ビーシージー製造株式会社）を用いた。なお、本って PCR 産物の大きさを算出する（真の値）とともに、研究は行政依頼検査の一環として行われたものをまとめ繰り返し配列以外の部分の大きさ（オフセット値）、一たものである。

繰り返し配列の大きさ及び繰り返し回数を算出した。また、QUB11a 領域および QUB11b 領域の一部の株 (1800 bpを超える PCR 産物) については、IS6110 の挿入の有無を

２・２ DNA 抽出
小川培地に培養された結核菌株をエーゼで Fast Prep
用破砕用ビーズの入った 2 mL チューブ（MP Biomedicals）

確認するため、IS6110 に特異的なプライマー5)も用いて塩基配列の解析を行った。

に分取し、Fast Prep（MP Biomedicals）を用いて破砕した。その後、5%キレックス（バイオ・ラッド）加 TE buffer

２・５ 電気泳動を加え、適宜ボルテックスしながら 56℃、30 分間および

２・５・１ シークエンサーを用いたフラグメント解析

100℃、10 分間の加熱を行った。10000 rpm で 10 分間遠得られた PCR 産物は適宜希釈し、表 1 の mix1-mix6 に心し、上清を DNA 抽出液として回収した。

従って４領域ごと混合したものを、Hi-Di ホルムアミド（AB）および LIZ 1200 マーカー（AB）の入った 96 ウェ
ルプレートへ混和した。95℃5 分間、氷上 5 分間以上処

２・３ VNTR 領域(24 領域)の PCR
横山栄二先生にご教授いた

理することによって DNA を一本鎖へ変性させ、シークエ

だいたプライマー4)を用いて行い、一部、公益財団法人ンサー （AB3500、AB） にて電気泳動を行った。PCR 産

結核予防会結核研究所の開発した JATA(15)－VNTR キッ

物の大きさは GeneMapper ソフトウェア（AB）を用いて算PCR は千葉県衛生研究所

2)

トのプライマー を使用した。解析に用いた VNTR 領域名出した（見かけの値）。また、Iwamoto らの方法 6)を参は表 1 の通りである。なお、PCR 産物の塩基配列決定用

考にし、VNTR 領域を増幅した際に出現するスタッターピには両側とも非標識のプライマーを、シークエンサーをーク（目的のピークより n 回繰り返し回数が少ないピー

用いたフラグメント解析用には片側に蛍光で標識したプク）の数を計測することにより、繰り返し回数を算出し2)た。カレイダグラフを用いて、各領域の真の値と見かけライマーを用いて PCR を行った。PCR の条件は前田らの方法を一部改変（アニーリング温度を 60℃に変更）しの値の一次回帰式及び相関係数を求めた。

て行い、DNA 量が少ない場合はサイクル数を 40 サイクル
まで延長した。

２・５・２ ゲル電気泳動
LIZ 1200 マーカーの範囲（40-1200 bp）を超える大き表 1 解析に用いた VNTR 領域（24 領域）

さの PCR 産物の繰り返し回数を算出するためにパルスフ（下記の 6 グループに分けて解析）ィールド・ゲル電気泳動を行った。泳動条件は、ゲルと

領域名
miru10
miru16
miru26
J7
J2※
miru31
miru40
ETR-A
ETR-C
J9
J15
Mtub04
Mtub21
Mtub30
Mtub39
J1J3
QUB11b
QUB26
QUB4156
Mtub24
J5
J11
J12
J4
QUB11a
QUB15
QUB18
QUB3232
J14
J8
J13
HV※※
QUB3336 VNTR3820 VNTR4120 VNTR2372
J6
J10
HV※※
HV※※

して 1% Seakem GTG ゲル（0.5% TBE バッファー）、泳動

グループ
mix 1
mix 2
mix 3
mix 4
mix 5
mix 6

miru4

装置として CHEF-DR III（バイオ・ラッド）を用い、3.5V/cm、5-5 s、120°、14ºC 、24 時間の条件で泳動した。サイズマーカーとして、100-4000 bp まで 100 bp 単位でバンドが得られる 100 bp DNA Step Ladder（プロメガ）を用いた。泳動後、エチジウムブロミドにてゲルを染色し、紫外線下でゲルの撮影を行った。ゲル電気泳動
による繰り返し回数の算出は、得られたバンドの大きさ
をサイズマーカーとの移動度の差異を目視で計測し、表2 に記載のオフセット値及び繰り返し単位塩基数を用いて推察した。

※

J1-J15 ：JATA (15) キット内における表示名※※

HV ：超多変領域

３

結果・考察

３・１ VNTR 領域の塩基配列の解析
表 2 に VNTR 領域の塩基配列の解析の結果得られた各領-64-

域のオフセット値、繰り返し単位塩基数を示した。なお、

３・２ 繰り返し回数の算出

今回オフセット値は、すべての領域において、不完全な

３・２・１ VNTR 領域の真の値と見かけの値の相関性

繰り返し領域はオフセット値として組み込んだ。供試し

表 3 に真の値と見かけの値の相関性を表した式を示た株において、オフセット値が一定の株がほとんどであす。比較した大きさの範囲内において、miru10 領域のよったが、miru4 領域においては BCG 株とその他臨床株でうに真の値と見かけの値にほとんど差がない領域（y =比較すると、オフセット値が異なっていた。また、QUB3336

0.85201+1.0092x）がある一方、QUB3232 のように傾きが領域と VNTR3820 領域においては繰り返し単位塩基数が大きく、PCR 産物の大きさが大きくなるほど真の値と差株によって、あるいは一つの株の中でも異なっていた（なが広がる領域（y = -155.64+1.4297x）があった。シークお、表 2 中で、QUB3336 および VNTR3820 のシークエンス

エンサーでの泳動の場合、1 本鎖での泳動となり、さら

確認リピート数が整数値にならないものがあるのは繰りに結核の VNTR 領域の場合 GC 含量が高いため、領域によ返し単位塩基数を数値の大きなものに合わせているためっては立体構造をとることにより真の値とずれが大きくである）。

なる可能性が考えられた。しかしながら、いずれの領域においても比較した大きさの範囲内においては、真の値

領域名

表 2 VNTR24 領域のオフセット値及びと見かけの値の間で良好に線形性を示した（r = 0.999

繰り返し単位塩基数以上）ことから、繰り返し回数が既知の PCR 産物を適切

繰り返し
単位 (bp)

不完全リピート

オフセット値 (bp)

シークエンス確認
リピート数※

miru4

77

41bp の不完全配列が114
繰り返し配列の後に(BCGのオフセット(ただし、BCGには不完
値は61)
全配列なし)

miru1053

51bp の不完全配列が繰り返し配列の後に

273

0,1,2,4

miru1653

7bp の不完全配列が繰り返し配列の後に

369

1,3

miru2651

12bp の不完全配列が繰り返し配列の後に246

1,5,6,7

miru3153

49bp の不完全配列が繰り返し配列の後に

162

2,3,4

1,2,3,4

領域名5416bp の不完全配列が繰り返し配列の後に230

1,2,3,4ETR-A

75

23bp の不完全配列が繰り返し配列の後に

195

3,4

ETR-C

58

37bp の不完全配列が繰り返し配列の後に

102

3,4

Mtub0451

30bp の不完全配列が繰り返し配列の後に

167

0,2,3,434bp の不完全配列が繰り返し配列の後に

149

58

44bp の不完全配列が繰り返し配列の後に261

Mtub3958

52bp の不完全配列が繰り返し配列の後に283

0,1,2,3,4

QUB11b69

9bp の不完全配列が繰り返し配列の後に

67

2,3,4

QUB26

111

24bp の不完全配列が繰り返し配列の後に324

2,3,4,559

51bp の不完全配列が繰り返し配列の後に

106

56

17bp の不完全配列が繰り返し配列の後に

Mtub30

QUB4156
Mtub2457365

真の値と見かけの値の相関式(y : 真の値、x : 見かけの値)r

相関式作成に用いた検体数

miru4

y =1.2388+1.0307x

r =0.99997

12

miru10y =0.85201+1.0092x

r =0.99997

12

miru16y =-7.163+1.0323x

r =0.99972

12

miru26y =-12.137+1.062x

r =0.99995

11

miru31y =3.7058+1.0089x

r =0.99996

12

miru40y =-8.2885+1.0585x

r =0.99999

15

ETR-A

y =3.1236+0.99811x

r =0.99996

12

ETR-C

y =-4.6071+1.0938x

r =0.99889

12

Mtub04y =-5.6432+1.0857x

r =0.99986

11

Mtub21y =-6.3069+1.0628x

r =0.99984

11

Mtub30y =1.3387+1.0082x

r =0.99997

12

2,3,4
1,3,4

Mtub39y =-72.022+1.3402x

r =0.99999

7

QUB11by =2.1196+1.0106x

r =1

12

QUB26

y =20.867+0.99484x

r =0.99995

6

QUB4156

y =0.40108+1.0361x

r =0.99992

11

Mtub24y =-11.667+1.0441x

r =0.99992

12

QUB11ay =6.3427+0.99274x

r =0.99992

10

0,2,3,4

QUB15

y =2.3929+1.0175x

r =0.99995

12

0,1,2

QUB18

y =4.9181+0.99942x

r =0.99998

6

QUB3232

y =-155.64+1.4297x

r =0.99999

7

QUB11a69

20bp の不完全配列が繰り返し配列の後に167

5,6,8,9,10

QUB15

54

45bp の不完全配列が繰り返し配列の後に90

1,2,3,4QUB18

78

21bp の不完全配列が繰り返し配列の後に231

3,7,8,9QUB323256

46bp の不完全配列が繰り返し配列の後に

423

0, 4, 5

QUB333659/58

34bp の不完全配列が繰り返し配列の後に一塩基欠損不完全リ
ピート複数あり171

5.0, 5.9, 7.9, 9.0

VNTR3820

59/57

合計52bp の不完全配列が繰り返し配列の前後に分かれて存在
２塩基欠損不完全リ
ピート多数あり328

1.9, 3.9, 4.9, 6.0, 6.8,

VNTR412057

23bp の不完全配列が繰り返し配列の後に333

2,4,7,8,9,10,12

VNTR237257

10bp の不完全配列が繰り返し配列の後に184

1,2,3,4※用いた菌株のシークエンスにより確認した繰り返し回数できることが分かった。
表 3 真の値とみかけの値の相関性

miru40

Mtub21に組み合わせることによって検量線として用いることがQUB3336y =-22.451+1.1547x

r =0.999

10

VNTR3820

y =-41.557+1.1843xr =0.99982

9

VNTR4120

y =-87.268+1.2753x

r =0.99999

9

VNTR2372

y =-64.966+1.3471x

r =0.99995

9

３・２・２ パルスフィールド・ゲル電気泳動による繰
り返し回数算出
図 1 に LIZ 1200 マーカーの範囲（40-1200 bp）外の大きさの PCR 産物をパルスフィールド・ゲル電気泳動した
結果を示す。前述の条件で、2000 bp 程度の比較的大きな産物も 50 bp 程度の分解能を示した。パルスフィール
ド・ゲル電気泳動は、シークエンサーによるフラグメン-65-

ト解析と異なり、DNA の大きさをデジタルで表示するのの挿入が確認された株においても、IS6110 分の大きさをは難しく、また、泳動にも時間を要するが、DNA を 2 本

差し引かずに繰り返し回数の算出を行うこととした。

鎖のままで泳動するので、特に大きい産物においては見かけの値よりも真の値を反映していると考えられる。ま４

まとめた、QUB11a 領域は 1800-2200 bp の間に 4 通りの大きさ

VNTR 解析の上で重要となる繰り返し回数の算出方法のバンドが（図 1、Lane 13-16）、QUB11b 領域は約 2000を確立することを目的として、VNTR 領域の塩基配列決bp の大きさのバンドが存在することが分かった （図 1、定・解析、シークエンサーによるフラグメント解析、ス

Lane 1） 。しかしながら、これらの PCR 産物の繰り返し

タッターピーク数の計測およびパルスフィールド・ゲル

回数を算出しようと試みたところ、それぞれ数 10 bp 程電気泳動を行った。今回の検討結果を考慮して、今後の度ずつ真の値とずれがでていることが分かった。一方、

VNTR 解析は、①シークエンサーによるフラグメント解析

同時に参考に泳動した 1000 bp 以下の QUB11a 領域の PCRを行い、検量線により繰り返し回数を算出、②シークエ

産物の大きさは、真の値に近い泳動像を示した （図 1、

ンサーによるフラグメント解析の直線性が低くなる大き

Lane 9-12）。

い PCR 産物の場合はスタッターピークの数を計測することにより算出、③QUB11a や QUB11b の 2000 bp 程度の大３・２・３ スタッターピーク数の計測による繰り返し

きい PCR 産物の場合はゲル電気泳動で算出するといった

回数算出

3 つの段階を踏んで行っていく予定である。

岩本らは 6)、LIZ 1200 マーカー（40-1200 bp）の範囲

VNTR 解析の最終的な目標は用いた VNTR 領域 24 領域をを超える大きさの PCR 産物の繰り返し回数を簡易に算出

それぞれ株間で比較し、一致する株はないか、流行株はする方法として、繰り返し回数が既知の PCR 産物を基準

ないか検索し、実地疫学とリンクさせることで新たな集とし、スタッターピークの数を計測する方法を示してい団感染を探知したり、注意喚起を促すことであると考える。そこで、本方法の有用性を確認するため、パルスフられる。今回の検討はあくまで VNTR 解析の基礎となる部ィールド・ゲル電気泳動による結果と比較したところ、分に過ぎないが、今後、分与いただいた株の VNTR 解析を

QUB3232 領域において一致した結果を得ることができた

蓄積することにより、福岡県の結核対策の一役を担うと（図 1、図 2） 。よって、本方法を用いれば比較的大き考えられる。

な産物においても、ゲル電気泳動することなく、より正確な繰り返し回数を算出できることが分かった。一方、

謝辞

QUB11a 領域の大きい産物についてはスタッターピーク

当所で VNTR 解析を開始するにあたって、多大なるご助

がほとんど見られなかったことから比較ができなかっ言をいただきました大分県衛生環境研究センター

た。

喜久代先生、千葉県衛生研究所
崎大学熱帯医学研究所

３・３ QUB11a 領域への IS6110 の挿入

緒方

横山栄二先生並びに長和田崇之先生に深謝いたします。

3・2・2 の結果から、QUB11a 領域への何らかの配列の挿入が疑われた。QUB11a 領域に関して IS6110 の挿入の文献

報告 7)があったため、QUB11a 領域、QUB11b 領域の 1800 bp

1) 厚生労働省

以上の PCR 産物 10 検体について IS6110 の挿入の有無を(http://www.mhlw.go.jp/bunya/kenkou/kekkaku-ka

塩基配列解析したところ、全ての検体において IS6110

nsenshou03/11.html)( 1360 bp ) の挿入が確認された。IS6110 が挿入されて

2) 前田

伸司ら : 結核, 83 (10), 673-678, 2008.

いるものについての繰り返し回数の算出については、仮3) 和田崇之, 長谷に QUB11a の PCR 産物の大きさが 2080 bp であったとする

2010.

と、その大きさのみで繰り返し回数を算出すると 27-28

4)となるが、IS6110 の大きさ 1360 bp を考慮した場合は2080 bp から 1360 bp を減じて繰り返し配列の数は約 85)S.H. Mehdikhani and N. Rokni : World Appl Sci J., 19
(4),

6)

が挿入された繰り返し回数 n の株と IS6110 が挿入されていない繰り返し回数 n の株は異なる物と考えられる。よE. Yokoyama et al. : Infect Genet Evol., 10 (7), 913-918,
2010.

ということになる。しかし、一般的な VNTR 解析条件では、PCR 産物の大きさのみを対象とすべき、つまり、IS6110

篤 : 結核, 85 (12), 845-852,

504-509, 2012.

T. Iwamoto et al. : FEMS Microbiol Lett., 270 (1),67-74, 2007.

7)って、当所においては、塩基配列解析によって IS6110

S. Rodríguez et al.: Emerg Infect Dis., 17 (3), 532-535,
2011.

-66-

Lane
No.

領域名及び繰り返し回数1

QUB11b(26-27)

3

QUB26

(14)

4

QUB26

(14)

5

QUB11a(27-28)

6

QUB3232(24)

7

QUB3232(25)

9

QUB11a(10)

10

QUB11a(9)

11

QUB11a(8)

12

QUB11a(11)

13

QUB11a(27-28)

14

QUB11a(24-25)

15

QUB11a(28-29)

16

QUB11a(26-27)M

100 bp DNA Step Ladder※( )内はパルスフィールド・ゲル電
気泳動により算出した繰り返し回数

図1

2000 bp 付近の PCR 産物のパルスフィールド・ゲル電気泳動像

図 2 スタッターピークを利用した繰り返し回数の算出-67-

Genotyping method by variable number of tandem repeats (VNTR) for Mycobacterium
tuberculosis― Basic study for calculation of repeat number ―Eriko MAEDA, Akira OISHI, Yoshiki ETOH, Koichi MURAKAMI, Nobuyuki SERA and Kazumi HORIKAWA
Fukuoka Institute of Health and Environmental Sciences, 39 Mukaizano, Dazaifu, Fukuoka 818-0135, JapanVNTR analysis is a useful method to evaluate M. tuberculosis isolates molecular epidemiologically. This research
was performed to establish the method for analyzing variable number of tandem repeats (VNTR) of the pathogen in
our laboratory. In the results, it was confirmed that the relation between number of tandem repeats of
Mycobacterium tuberculosis based on DNA sequencing (defined as “true value”) and those based on fragment
analysis with sequence analyzer (defined as “apparent value”) showed a linear correlation during a certain size of
PCR products. Therefore, VNTR can be analyzed by means of calibration curve obtained from PCR products of each
VNTR-region that repeats number had been acquired. For calculation of repeat number for large size of PCR
products showing low linearity between the true value and apparent value, it was useful to use counting the numberof stutter peaks, which are observed in fragment analysis by sequence analyzer, or determining size of PCR products
by pulsed field-gel electrophoresis. Moreover, it was revealed that around 2000 bp PCR products of certain locus(QUB11a and QUB11b) was occasionally inserted with sequence of IS6110 with the base sequence. In conclusion,
repeats number can be accurately calculated by combining fragment analysis by sequence analyzer, counting thenumber of stutter peaks and pulsed field-gel electrophoresis.
[Key words; Mycobacterium tuberculosis, VNTR, fragment analysis, Genotyping］-68-