バイアル抽出法(独）産業技術総合研究所
計測標準研究部門
有機分析科 バイオメディカル標準研究室
川口 研
2014年5月30日GC研究懇談会
薬業健保会館

スターバー抽出の問題点
スターバー抽出(SBSE)法

PDMS

ガラス製撹拌子

● PDMSをスターラーの撹拌子にコーティング● 撹拌するだけという極めて簡便な操作● 液々抽出の原理● 抽出･濃縮･精製<SBSEの欠点>
・撹拌子にコーティングできるPDMS量に制限がある

・撹拌子のサイズ制限により、微量な試料に適用する場合、試料を希釈する必要がある
・高疎水性化合物はバイアル内面に吸着される⇒ 回収率の低下

Vial・自動化が困難バイアル抽出法(VWSE)の開発• バイアル内面への分析対象物質の吸着→ バイアル内面に効率的に分析対象物質を抽出させてみては？
<期待できるメリット>
・大量のPDMSをコーティング可能・微量な試料に適用可能
・疎水性化合物の回収率低下を防ぐ
・自動化が容易<特許第5142276号>“試料採取容器および容器抽出・分析方法”

バイアル抽出法の操作概要

・抽出バイアルに試料を添加し、振とうするだけで、目的化合物を効率良く抽出・濃縮・少量の脱着溶媒(アセトニトリルまたはメタノール)を添加し、目的成分を脱着・各種機器分析(大量注入-GC/MS、 LC-MS/MSなど)で測定

M. Kawaguchi, et al, J. Chromatogr. A, 1216 (2009) 7553-7556.

デバイスの形状による抽出効率の変化
333

分析対象物質
O211
L22
1arr

Absolute recovery (%)

Device 1

Orr’

Device 2

プロゲステロン

Device 3

10090

Device 3が最も効率的

807060Device 1: Contact area = 0.785 cm2
Device 2: Contact area = 0.899 cm2
Device 3: Contact area = 5.20 cm25040

Device 130

Device 220Device 310001020304050

Extraction time (min)607080試料とPDMSの接触面積が影響？

バイアル抽出法 vs. スターバー抽出法①• 試料量
バイアル抽出法
バイアルサイズを変更することで、様々な試料量に容易に対応
スターバー抽出法
撹拌子のサイズ制限により、微量な試料の場合、希釈させる必要がある。

バイアル抽出法 vs. スターバー抽出法②• 抽出時間と抽出効率
10090

Absolute recovery (%)

Absolute recovery (%)

1008070605040

Device 130

Device 220

Device 390807060504030201010000102030405060

Extraction time (min)7080

010203040506070

Extraction time (min)バイアル抽出法

スターバー抽出法

抽出時間：30 min

抽出時間：60 min抽出効率：94 %抽出効率：70 %

8090100

バイアル抽出法 vs. スターバー抽出法③• 溶媒脱着脱着溶媒の種類 → 差はない
脱着方法 →
バイアル抽出法：ボルテックス
スターバー抽出法：超音波
脱着溶媒 →
バイアル抽出法：微量(50 μL以下)
スターバー抽出法：サイズ制限を受ける(150 μL)• 脱着時間120

Relative peak response (%)

Relative peak response (%)

120

100

80

60

4020010080

60

40

20005101520

Liquid desorption time (min)バイアル抽出法：10 min

2505101520

Liquid desorption time (min)スターバー抽出法：15 min25

バイアル抽出法 vs. スターバー抽出法④• 感度
ヒト血清中プロゲステロンに関して
方法

検出下限

定量下限

ng/mLng/mL

バイアル抽出法

0.10.5スターバー抽出法

0.52.0

バイアル抽出法がスターバー抽出法より、4-5倍高感度

認証標準物質の測定• European Reference Material (ERM)-DA 347
LC-MS/MS測定
15.78

100

SRM: m/z 315 → 97

Relative Abundance

90
80

Progesterone

70(3.2 ng ml-1)

60
50
40
30
20
10010015.80

SRM: m/z 317 → 99

90

Relative Abundance

80

Progesterone-13C2

70
60
50
40
30
20
1000246810Time (min)121416

バイアル抽出法

3.2 ± 0.1 ng/mL

認証値

3.19 ± 0.07 ng/mL

1820

小括• バイアル抽出法の開発
バイアル内面での積極的な抽出(逆転の発想)
簡便で、自動化も容易• バイアル抽出法とスターバー抽出法との比較
スターバー抽出法よりも優れた利点
メリット

・大量のPDMSをコーティング可能・微量な試料に適用可能
・疎水性化合物の回収率低下を防ぐ

その他の前処理法

液相マイクロ抽出(LPME)法
極少量の有機溶媒を用いた液-液抽出法<概要>
液相マイクロ抽出(LPME)法は、マイクロシリンジを用いて極少量の抽出溶媒により、分析対象物質を抽出・濃縮する方法
<利点>
簡便
高感度
低コスト

SampleHexaneStir bar

Y. He, H.K. Lee, Anal. Chem. 69 (1997) 4634.

In situ 誘導体化を伴うLPME法による
河川水中BPAの測定
河川水 10 ml
1M NaOH 1 ml
無水酢酸 100 μl
テフロン製撹拌子

抽出溶媒：Toluene 4 μｌ

注入量：2 μl

GC/MS

20 ml vial撹拌 (30 min, 500 rpm)
M. Kawaguchi et al. J. Chromatogr. A, 1110 (2006) 1-5誘導体化の比較
Abundance1000000

LPME法

800000m/z 213

10 ng/ml standard solution

600000400000

BPA

200000

12.00

13.00

14.00

15.00

16.00

17.00

18.00

19.00

Abundance

1000000

In situ 誘導体化を伴うLPME法

800000m/z 213600000

LOD: 2 pg/ml

400000Acyl derivativeof BPA

LOQ: 10 pg/ml

200000

12.00

13.00

14.00

15.00

16.00

17.00

18.00

19.00

In situ 誘導体化により100 倍程度の感度上昇

多孔性中空糸保護膜
200 µm
600 µmNeedlePore size: 0.2 µm

Porous hollow fiber (多孔性中空糸)

安定性
簡便性
経済性

1.1 cm

Q3/2 Accurel polypropylene

LPME法を用いたヒト尿中BPAの測定
脱抱合体化済み尿試料 (1 ml)

SGE 10F-HP-0.63

Surrogate standard
1M NaOH (100 µl)
無水酢酸 (20 µl)

注入量：2 µl
抽出溶媒：

Toluene 7 µl

撹拌子 (0.8 cm)

GC/MS
LOD: 0.02ng/ml
2 ml vial

多孔性中空糸撹拌 (500 rpm, 15 min)小型化 → 抽出時間の短縮

LOQ: 0.1ng/ml

簡便且つ高感度な測定法

分子インプリントポリマー(MIP)の開発
分子インプリント法の原理
架橋剤
洗浄
相補的結合部位(選択性)
鋳型分子

機能性モノマー複合体形成

MIP

ラジカル重合従来法

MIP自身からのAnalyteの溶出

微量分析への応用は困難
Analyte

改良法

Analyte-dMIP

実用化に至っていない
安定同位体ラベル化物質をインプリントし、質量分析計(MS)で検出
MSでIMIPとを識別

分子インプリント固相抽出法の性能評価<分子インプリントポリマーの種類><実験の概要>No.

Name

Print molecule

①NIP

None

精製水 100 ml (BPA +BPA-13C12)②

MIP

Bisphenol A (BPA)

③

DMIP

4-tert-Butylphenol④IMIP

Bisphenol A-d16

ポリマー合成分子インプリント固相抽出法

従来法

LC-MSで測定
改良法

固相抽出用カートリッジ<分子インプリント固相抽出法の回収率>
回収率 (%)

NIP

MIP

DMIP

BPA

74.6

507.9

83.8

BPA-13C12

75.3

99.3

85.2

補正後

99.1

511.5

98.4

<結果>

・従来法では、コンタミネーション
・選択性
IMIP
MIP = IMIP > DMIP > NIP
97.2
・河川水中BPAの分析に適用
98.9
LOD: 1 pptの超高感度分析
98.3

M. Kawaguchi, et al. Anal. Chim. Acta, 539 (2005) 83-89

総括• マイクロ抽出法• スターバー抽出法• バイアル抽出法• 液相マイクロ抽出法

様々な誘導体化法や試料導入法を組み合わせることで、簡便かつ高感度な測定が可能