GC,GC/MSによる代謝産物の一斉分析～定量に向けた情報共有～

ジーエルサイエンス株式会社
宮川 浩美

第341回 ガスクロマトグラフィー研究会特別講演会

2015/12/11

はじめに見積もれる系統誤差は同じ組成のサンプル（QC）を一定間隔で測定することで補正されるが，何が起こっているのかを知っておくことが重要である
抽出・誘導体化

測定

blank

QC

・・・

QC

・・・

ESI友の会，メタボロームデータの標準化方法より

多変量解析
差異のありなし

見積もれる系統誤差はQCによる補正が可能• 誘導体化による変動• GCMSによる感度変動 など

結果2

本日の内容• 誘導体化の問題～官能基によりTMS化のされやすさは異なる～• イオン化室におけるマトリックス効果～酵母と血清サンプルを例に～• 代謝物質の容器と保管の問題

3

GC，GC/MS代謝物分析のための誘導体化～誘導体化の準備と誘導体化方法～
メトキシム化とTMS化後の化合物は，ライブラリが充実している

メトキシム化とTMS化をうけた代謝物の保持指標とマススペクトルが収録されたラ
イブラリと，そのライブラリを使用してピーク同定を自動で行うことができ多変量解
析までをサポートしているソフトウェアAIoutputがフリーで公開された（http://prime.psc.riken.jp/Metabolomics_Software/AIoutput/index.）
NISTの質量スペクトルデータベースにおいてメトキシ化とTMS化された成分の収録数が増加、研究者がマススペクトルを共有することを目的としたデータベース
MassBank（http://www.massbank.jp/）に基礎代謝、二次代謝物質の登録数が増
えている
4

GC，GC/MS代謝物分析のための誘導体化～誘導体化の準備と誘導体化方法～
しっかり乾燥させる
濃縮遠心（2時間）と凍結乾燥（一晩）※後ほど行うTMS化反応は水の影響を大きく受けるためメトキシム化
Methoxylamine・HCl 20mg/mLピリジン溶液を100µL入れ，振とうする(30⁰C，90min)※ピリジンは脱水したものを使用する，またピリジンは吸湿性が高いので注意

TMS化
MSTFAを50µL入れ，振とうする(37⁰C，30min)

GC，GC/MSでの測定

5誘導体化の問題～官能基によりTMS化のされやすさは異なる～官能基によるTMS 化のされやすさは，
アルコール＞フェノール＞カルボン酸＞アミン＞アミドの順であり，さらに立体障害の影響をうけるため，
そのなかで一級＞二級＞三級の順番になる
Handbook of Derivatives for Chromatography 2nd edition, Advances in Silylation• Alanineは2TMS体と3TMS体が検出される
O
TMS

H3C
O
NH

System: GC-MS
Column: InertCap 5MS/NP 0.25mm x 30m, df=0.25µm
Column Temp.: 80ºC(2 min) - 15ºC/min - 330ºC(9 min)Inj.: 230ºC, Split 25:1
Carrier Gas: He 39cm/s
Septum Purge: 5.0 mL/min
Inj. Vol.: 1 µL
Ion Source Temp.: 200ºC
Interface Temp.: 250ºC
Scan Range: m/z = 85 - 500
Scan Speed: 5000 u/s

Alanine_2TMS(RI: 1106)

TMS

O
Structures are created using Chemistry 4-D Draw
which is provided by ChemInnovation Software, Inc.

TMS

H3C
O

Alanine_3TMS(RI: 1372)

N
TMS

TMS
6

誘導体化の問題～官能基によりTMS化のされやすさは異なる～
誘導体化後測定までの時間が，個々のサンプルによって異なるため，値は変化する• Alanineは2TMS体と3TMS体が検出される

誘導体化後測定までの時間により値が変化する
化合物は限定的である

O

O

TMS

H3C

TMS

H3C

O

O
N

NH

TMS

TMS

TMS

誘導体化後測定までの時間によるAlanineの2TMS体と3TMS体の変化
180000誘導体化後サンプルを集め均一化
160000
し，分注して得たデータ
140000

Alanine_2TMS
Alanine_3TMS

120000100000
80000
60000
40000
20000

• メトキシム化 個々のサンプル間で• TMS化TMS化後測定までの• バイアルへ 時間差が生じる
凍結乾燥 の移し替え

0

0:00

夕方

4:48

9:36

14:24

19:12

0:00

4:48

測定

9:36

14:24

19:12
7

誘導体化の問題～官能基によりTMS化のされやすさは異なる～
誘導体化後測定までの時間を一定にすることにより，値は一定になる• Alanineは2TMS体と3TMS体が検出される
O

O
TMS

H3C

TMS

H3C
O

O
N

NH
TMS

TMS

TMS

TMS化後測定までの時間を一定にした場合のAlanineの2TMS体と3TMS体の変化
160000メトキシム化後サンプルを集め均一化
140000
し分注，TMS化から測定までの時間を120000一定にしたデータ
100000
80000
60000
40000

Alanine_2TMS 5.343
Alanine_3TMS 8.037• メトキシム化 TMS化を• バイアルへ 行ったら
すぐ測定
の移し替え

20000

凍結乾燥
0

夕方

0:00

4:48

9:36

14:24

19:12

測定

0:00

4:48
8

検討した内容は共有をしていくことを考えている
http://www.gls.co.jp/technique/metabolomics/index.html

9ライブラリの中には• 保持指標• マススペクトル•誘導体化後の構造（メトキシム基の数，TMS基の数，SMILES）• 構造推定の有力なイオン• 分解や変性の情報• 化合物名とPubChem CID• Excel形式で収録，ESI友の会よりダウンロード可能になってる10イオン化室におけるマトリックス効果
GC/FIDとGC/MSの比較
Pyridine

Pyridine

処理後のサンプルを3つに分け，GC-MS2台とGC-FIDで同時にデータを取得した

n-alkane

STD

12

blank

STD

13

Pyridine

Pyridine

1

STD

S(serum)

14

2

STD

S+STD

15

内標準物質

Pyridine

S+STD

16

抽出溶媒1 mL（MeOH/H2O/CHCl3, 2.5/1/1,v/v/v）

3

Y(yeast)Pyridine

4

Y+STD

S(serun)

17

5

Y+STD

S+STD

18

Pyridine

S+STD

19

6

Y(yeast)Pyridine

7

Y+STD

S(serum)

20

8

Y+STD

S+STD

21

上清 200 µL

Pyridine

S+STD

22

STD

9

Y(yeast)Pyridine

10

Y+STD

STD

誘導体化

11

23

Y+STD

STD

24

GC/MS，GC/FID測定

酵母菌体 10mg
ボールミルで粉砕（20 Hz, 5 min）

振とう（37ºC, 30 min, 1200 rpm）
遠心分離（4ºC, 3 min, 16000 rcf）
上清 900 µL
H2O 400 µL
振とう（10 s）
遠心分離（4ºC, 10 min, 9500 xg）

遠心濃縮，凍結乾燥

System: GC-MS
Column: InertCap 5MS/NP 0.25mm x 30m, df=0.25µm
Column Temp.: 80ºC(2 min) - 15ºC/min - 330ºC(9 min)Inj.: 230ºC, Split 25:1
Carrier Gas: He 39cm/s
Septum Purge: 5.0 mL/min
Inj. Vol.: 1 µL
Ion Source Temp.: 200ºC
Interface Temp.: 250ºC
Scan Range: m/z = 85 - 500
Scan Speed: 5000 u/s
System: GC-FID
Column: InertCap 5MS/NP 0.25mm x 30m, df=0.25µm
Column Temp.: 80ºC(2 min) - 15ºC/min - 330ºC(20 min)Inj.: 230ºC, Split
Split flow 25 mL/min
Carrier Gas: He 100 kPa
Septum Purge: 5.0 mL/min
Inj. Vol.: 1 µL
FIDTemp.: 300ºC
Data acquisition: 50 msec

Pyridine
11イオン化室におけるマトリックス効果
イオン源ボックスとリペラーの洗浄後，GC/FIDとGC/MSの比較
Adipic acid(I.S.)
200000Adipicacid・FID
GC/FID

15000010000050000
0
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23

200000Adipic acid・Plus

GC/MS_1

60000

20000

20000

200000

50000

100000Adipicacid・Ultra
GC/MS_2

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23

400000Thymine_3TMS・Plus
GC/MS_1

150000

GC/MS_1
Proline_2TMS・Plus

10000050000
00

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23

400000

Proline_2TMS・FID
GC/FID0

0

100000150000

60000
40000

3000001 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23

Thymine_3TMS・FID
GC/FID

40000

1500000ProlineThymine

GC/MS_2
Thymine_3TMS・Ultra

100000

GC/MS_2
Proline_2TMS・Ultra

30000010000050000

200000

50000

1000000
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23

00
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 2312イオン化室におけるマトリックス効果
GC/FIDとGC/MSの比較，繰り返し実験

200000

GC/FIDacid・FID
2-Isopropylmalic

150000100000
50000
0

60000

GC/MS_12-Isopropylmalic
acid・Plus

50000
02-Isopropylmalic
acid・Ultra
GC/MS_2

20000

20000

0

0

30000060000

200000

40000

100000

20000

0

0

400000100000200000

50000

100000Thymine_3TMS・Ultra
GC/MS_2

Proline_2TMS・Plus
GC/MS_1

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23

3000001 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23

Thymine_3TMS・Plus
GC/MS_1

GC/FID
Proline_2TMS・FID

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23

150000

0

60000
40000

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23
200000Thymine_3TMS・FID
GC/FID40000

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23
100000

ProlineThymine2-Isopropylmalic acid(I.S.)

150000

Proline_2TMS・Ultra
GC/MS_2

10000050000
00
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 2313

代謝産物の容器の選択について
代謝産物の容器に求められること• 少容量（～2mL）• 吸着，溶け込みがおきない• 濃縮遠心，凍結乾燥に適応できる
• 利便性
• 安価
素材
• PE
• PP
• COP
• 透明のガラス• 褐色のガラス
など

メーカー
•A
•B
•C
•D
•E
•F
•G
など

抽出・精製時は・・・
保管時は・・・

形状• マイクロチューブ• バイアル• インサート入りバイアル
•アンプル

容量
• ～0.3mL• ～1.5mL• ～2.0mL

14代謝産物の容器の選択について～樹脂製の容器の溶媒影響～
メーカーの違いにより，容器からの溶出物の影響の大きさは異なる
1.0(x1,000,000)

System: GC-MS
Column: InertCap 5MS/NP 0.25mm x 30m, df=0.25µm
Column Temp.: 40ºC(2 min) - 15ºC/min - 330ºC(20 min)Inj.: 230ºC, SPL
Carrier Gas: He 39cm/s
Septum Purge: 5.0 mL/min
Inj. Vol.: 1 µL
Ion Source Temp.: 200ºC
Interface Temp.: 250ºC
Scan Range: m/z = 85 - 500
Scan Speed: 5000 u/s

1mL of Chloroform

0.9
0.8
0.7
0.6

10min

0.5
0.4
0.3
0.2
0.1

A

0.0

E
7.5

10.0

12.5

15.0

17.5

20.0

22.5

25.0

27.5

30.0

32.5

35.0

37.5

15

代謝産物の容器の選択について～樹脂製の容器，顕微鏡での観察～メーカーにより溶出物が多かったり，キズが多いものがある

析出物

キズ

16

代謝産物の容器の選択について～樹脂製の容器のブランク～
樹脂製の容器は脂肪酸系の離型剤が使用されていることが多く，ブランクとして検出される場合がある

System: GC-MS
Column: InertCap 5MS/NP 0.25mm x 30m, df=0.25µm
Column Temp.: 80ºC(2 min) - 15ºC/min - 330ºC(9 min)Inj.: 230ºC, Split 25:1
Carrier Gas: He 39cm/s
Septum Purge: 5.0 mL/min
Inj. Vol.: 1 µL
Ion Source Temp.: 200ºC
Interface Temp.: 250ºC
Scan Range: m/z = 85 - 500
Scan Speed: 5000 u/s

ポリプロピレンの容器でブランク測定をしたTICC
Palmitic acid_1TMS

Stearic acid_1TMS

%
117

100

313
50

129
145

95

0

100

150

201 229 258 285
200
250
300

328

362
350

399 421
466
400
450

498
500

Palmitic acid_1TMS(RI: 2048)

O

O

TMS

%
117

100

O

132

341

50
0

91

145

100

150

164

213
200

243

264

250

299 321300

367 388 411 434 456 479497
350

400

450

500

http://www.gls.co.jp/technique/metabolomics/index.html

Stearic acid_1TMS(RI: 2244)O

TMS

Structures are created using Chemistry 4-D Draw
which is provided by ChemInnovation Software, Inc.

17

代謝産物の容器の選択について～容器の金属～EDX（エネルギー分散型蛍光X線）による元素分析の結果
透明のガラス，N社
Si 99.8%
Zr 0.11%
Fe 0.11%

Si 75.0%
Al 7.8%Ba 5.3%K 4.2%
Ti 4.0%Fe 2.6%
Ca 0.7%
Zr 0.2%

僅かなCa，Feが認められるが，ほとんど金属はない

褐色のガラス，N社

PP製マイクロチューブ，E社

18混合試料の保管試験（保管温度-30⁰C，5⁰C ）～樹脂製容器への溶け込み～
成分数：52種
解糖系（グルコース，ピルビン酸）
TCA回路の有機酸
アミノ酸
核酸塩基
調製溶媒：メタノール（酢酸，クロロホルム，塩酸，硝酸，アンモニアを若干含む）
容器：0.5mL容PP製マイクロチューブ
濃度：0.2mmol/L
容量：200µL
保管温度：-30⁰C，5⁰C

19混合試料の保管試験から得られた結果（保管温度）-30⁰Cと5⁰Cで，12ヶ月間混合試料を保管したところ，5⁰Cでは一部のアミノ酸，有機酸のピーク面積値が減少した．
41,42

36,37
11,12 16,17

38

49,50

25,26,27,28-30 ⁰C 保管

55

48 52
29
18
13,14
2

8
67
4

3

5

19
22
20,21

910
15

1

23

65,66

62
54

24

63

34
46
44
47

33 35

53

56
58

59

40
31
30 32

64

43
39

45

69
61

51

67

68

57 60

5⁰C保管

20

混合試料の保管試験から得られた結果（保管温度）-30⁰Cと5⁰Cで，12ヶ月間混合試料を保管したところ，5⁰Cでは一部のアミノ酸，有機酸のピーク面積値が減少した．
Peak
No.

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35

Compounds

R.T.

-30℃_15℃_1-30℃_25℃_2

Pyruvic acid _1TMS
Glycolic acid_2TMS
Valine_1TMS
Alanine_2TMS
Glycine_2TMS
Leucine_1TMS
Isoleucine_1TMS
Valine_2TMS
Serine_2TMS
Leucine_2TMS
Phosphoric acid_3TMS
Glycerol_3TMS
Threonine_2TMS
Isoleucine_2TMS
Proline_2TMS
Succinic acid_2TMS
Glycine_3TMS
Uracil_2TMS
Fumaric acid_2TMS
Serine_3TMS
Alanine_3TMS
Threonine_3TMS
Thymine_2TMS
Malic acid_3TMS
Methionine_2TMS
Aspartic acid_3TMS
Pyroglutamicacid_2TMS
Cytosine
4-Aminobutyric acid_3TMS
Phenylalanine_1TMS
Cysteine_3TMS
α-Ketoglutaric acid_2TMS
Glutamic acid_3TMS
Phenylalanine_2TMS
Asparagine_3TMS

4.711 51248
2080 55244
2667
5.017 132421 124441 139523 128467
5.135 21622 21661 19856 19414
5.343 412573 347073 274887 271208
5.512
4198
4920
2856
2629
5.895 332332 286007 327491 321330
6.129 386020 328176 351122 383519
6.59 600114 538225 563080 556471
6.987 232707 177076 175177 213484
7.157 468925 586115 481539 436838
7.179 799757 831581 853043 863204
7.19 367978 368942 385723 372075
7.37 205475 134816 147724 180552
7.378 84097 109740 91151 84816
7.416 365766 403227 363792 322870
7.512 96622 114976 108993 120194
7.52 911263 892127 883654 821280
7.793 351637 348071 372689 367875
7.815 489615 525681 536104 554321
8.023 188266 300856 256072 181123
8.033
7474 17844 22125 26609
8.284 128207 193001 167141 123384
8.387 570367 604785 630925 595457
9.158 148095 135131 166932 148531
9.423 398239 390675 419087 352287
9.432 476166 329827 463493 369190
9.443 1440328 1722066 1415539 1754430
9.45 252063 239459 278965 217277
9.517 897898 785823 898377 741080
9.637 134340 130189 116074 123213
9.738 145996 19272 158516 15546
9.858 42172 28319 50861 31856
10.228 438525 336250 364398 300813
10.32 614381 576925 592042 569838
10.645 252811 163537 147794 115195

Peak
No.

36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69

Compounds

R.T.

-30℃_1

5℃_1

Ribitol_5TMS
Aconitic acid_3TMS
Putrescine_4TMS
Ornithine_3TMS
Glutamine_3TMS
Ornithine_4TMS
Isocitric acid_4TMS&Citiric acid_4TMS
Caffein
Adenine_2TMS
Asparagine_4TMS
Fructose_1
Fructose_2
Glucose_1
Lysine_4TMS
Histidine_3TMS
Glucose_2
Tyrosine_3TMS
Xanthine
Palmitic acid_1TMS
Inositol_6TMS
Guanine_3TMS
Tryptophan
Tryptophan_2TMS
Stearic acid_1TMS
Tryptophan_3TMS
Inosine_4TMS
Sucroseβ-Lactose_1
β-Lactose_2
Trehalose
Maltose_1
Maltose_2
Ergosterol_1TMS
Raffinose

11.165 828155 809801 797910 755644
11.186 97215 44950 106455 45509
11.201 1939870 2000767 1888360 1828180
11.273 15285 21947 16502 27538
11.405 287383
0 168563
011.77 914298 856829 853438 768516
11.79 773434 762449 837198 768537
11.951 277274 287797 311645 293162
12.09 647305 646135 725660 681210
12.137 10380 23666 30924 34296
12.245 265673 306820 303660 319628
12.314 176405 203434 174322 192705
12.434 420976 471365 456546 486353
12.478 555258 542346 542400 518379
12.481 378809 222328 242020 163047
12.57 84167 86250 99013 98464
12.595 1466872 631973 1356100 664379
13.124 403979 310600 435147 334955
13.177 451201 424183 473598 418712
13.723 533957 475505 559533 506324
13.79 610277 634730 718254 641886
14.021 42362 89941 78518 119553
14.215 509499 401260 493613 341464
14.386 353439 398796 427764 383041
14.407 28594 40670 55153 51565
16.358 134593 100594 148453 98370
16.871 984147 1004944 1066922 961526
17.16 368345 350173 406743 328354
17.248 149014 120654 169305 130644
17.401 1322561 1341769 1398785 1350702
17.401 1322561 1341769 1398785 1350702
17.559 155163 154919 184767 146360
19.627 115635 104053 144602 108355
20.801 880869 932458 1104386 994328

保管温度（-30⁰Cと5⁰C ）の違いで面積値に変化があった化合物• Pyruvic acid
• α-Ketoglutaric acid
• Aconitic acid
• Glutamic acid
• Glutamine• Tyrosine• Cysteine-30℃_25℃_2

混合試料の保管試験から得られた結果（樹脂製容器，保管温度
Room Temp.）
保管温度からRoom Temp.にし，再度保管温度に戻す操作を7回行った．
-30⁰C 保管で差が出た化合物• Pyruvic acid
• Cysteine• Glutamine
5⁰C保管で差が出た化合物• Glutamic acid
• Aconitic acid
樹脂製の容器で保管する場合，室温に戻したら使い切る-30℃・大38011
10549811707
264138442801483891562684
175018330115794813629103107522391118150057134784735728363567558154235103286718217067584473
197908497115714501164050732249688723846169
15199133255
27691365946298727
957051130674
186289338904
17531
840989-30℃・小
44960
95116
13075
25386643430448716857658515334535437974279858938693875
429950173299117408800020370142544655307483311606251009592991
187726543211806092
166427130746494055134413
20137128638
30430770222599045
965422127906
1956239
30952
34927
908870

5℃・大
39899
97836
13308
187779482701567937625190231911322045770790629295
1851623830171262931218205431163681084973191356714890411525015740631805473128705409212551144273199649253
88852
14482
29789
66286
61682366964
93456396022
149907446963
0752121

5℃・小
21154
90910
13687
2085764850645382175645661807983161416423225279961150903954821359051064287607783406044720252409844205482242645555701603095235386634132191176283744
908186
29656
72145
25002
18896070636562801
93592981310
195160124238
0948240room・大
238
98260
14613
162650503922576483519441
19314526522477490367817913078433440495326
165951671250344863566586
180934424037
1929705864481641407233
5605442349058
29560084818532074
1610
011599965732358960
925530
19586
180931224159
0877335-30℃・大37694
10582813821
148611474014538401551831169605304724789646630337110720384452119809131659745889389761571676238698517612227336614174202182514150765795
197861332128589539836947
15767334967
12287868082140223
944575131105189876229582
2547
899564-30℃・小53972
10191616459
171068522524584065595494
188585329405795730638518121808423809128724125311807752382051579081274039534645250937600505200343549479743680206017930123597068436675
22271231444
14889773811144813
9631071339302053696
21214
5808
982996

5℃・大
39722
97045
13180
124328504276593399619350216591
312687712588586700185625373481
98578
119285570712339988484966125540610430157550558465
1823843599786144012702382282003699446
72834
18358
29022
23970
62454342489
91963897164
161510349195
0784023

5℃・小
24344
97138
14655
134780475522529801542034
1648552966856669835657341044723748231184841095457273233146004955752484405280252279435385431675585310416653322313631267991885190
24064
82959
26446
10654067489331227
89917689129
191051717883
0929058Isocitric acid_4TMS&Citiric acid_4TMS

117184511532271035817

9466279167201126304

1106524

1001172

980665936964

Caffein
Adenine_2TMS
Asparagine_4TMS
Fructose_1
Fructose_2
Glucose_1
Lysine_4TMS
Histidine_3TMS
Glucose_2
Tyrosine_3TMS
Xanthine
Palmitic acid_1TMS
Inositol_6TMS
Guanine_3TMS
Tryptophan
Tryptophan_2TMS
Stearic acid_1TMS
Tryptophan_3TMS
Inosine_4TMS
Sucroseb-Lactose_1b-Lactose_2
Trehalose&Maltose_1
Maltose_2
Ergosterol_1TMS
Raffinose

30196572556562749
13074975743
49998849975914419891233
1410023426078705945854864724359241679456739673148155783335584219542965767919228730831632855592703072606233

30063872567865458
14591483811
501110536006
20063594023
1538906
4750046517488365067502012083065145765989451678153177172143368676795
19147231501242962892592452528989

32092877463013033826699315694551588443763110928994686
135372642832865442381113677292119104945026463974521909033495221658757080302254943112537
327900230080261902928671870044181458
21843912462248789854793818394889552
1284032405625593260766063703456110228556970565646217362293257
1951513647712
1921962812145274883213983234191031343176679384867
14702385935
52013651051514471099206
130169245456869240181165671874465195
32709865525019673569236
20057157317352205372995358289478110717238883531346875977491728
13041075899
46700851918017824287860
149321745312769752579885475043984113
5296456792302603523770922046885658236
1936432946714262463267290253835530438673582093833
228269134521531348585363
18933297090
152531246636470723384789676202777162
585630619138285207348231
201817470854220259630976303062182498742551757300929722455150396221615131137484716461763137976
89667
140910844966563920681402373365510957546474762879432414334364121939307015262220093152035
332545225955266047627891966171685275
25171714496850048753525715435493602
126898538961263451679091167240259186
523110593150276794287672
1995298
683053
1991182870747278272219020241459131796275074210512010441361000
51085452128315880296264
133419050019570907788092577730949538
33388466995326919275740
220834569948920751431680413043001118252598649

Pyruvic acid _1TMS
Glycolic acid_2TMS
Valine_1TMS
Alanine_2TMS
Leucine_1TMS
Isoleucine_1TMS
Valine_2TMS
Serine_2TMS
Leucine_2TMS
Phosphoric acid_3TMS
Glycerol_3TMS
Threonine_2TMS
Isoleucine_2TMS
Proline_2TMS
Succinic acid_2TMS
Glycine_3TMS
Uracil_2TMS
Fumaric acid_2TMS
Serine_3TMS
Alanine_3TMS
Threonine_3TMS
Thymine_2TMS
Malic acid_3TMS
Methionine_2TMS
Aspartic acid_3TMS
Pyroglutamicacid_2TMS
Cytosine
4-Aminobutyric acid_3TMS
Phenylalanine_1TMS
Cysteine_3TMS
a-Ketoglutaric acid_2TMS
Glutamic acid_3TMS
Phenylalanine_2TMS
Asparagine_3TMS
Ribitol_5TMS
Aconitic acid_3TMS
Putrescine_4TMS
Ornithine_3TMS
Glutamine_3TMS
Ornithine_4TMS

room・大
0
97715
15602
115835523734600344557554
19796826408180474368383914066934765789159
162345690644352507576441
18288757733020341759915116540812330
5838222578775
314652889255
34418
2236
0
62076
68773338198
97495620513
188034019206
0931391

22

GC・GC/MSメタボロミクス用代謝物質混合試料仕様からの抜粋
成分数：52種
調製溶媒：メタノール（安定性確保のため，5グループに分けています．
グループにより，酢酸，クロロホルム，塩酸，硝酸，アンモニアを若干含みます．）
容器：0.5mL容PP製マイクロチューブ
濃度：0.2mmol/L（濃度調製法は重量法を採用しています．）
容量：200µL
保管温度：-30⁰C
入数：40セット合計200本（40個x5グループ）
その他：秤量実績表，プロトコール，分解・変性しやすい化合物についての注意書きを同封します．
混合試料には，分解変性し易い成分も含まれています．代謝物質の混合において，分解変性の起きにくい条件で調製し保管温度と保管容器を決めました．濃度調製法
は重量法を採用し，調製後の濃度の値付けは行っておりません．

23

まとめ
• 見積もれる系統誤差は同じ組成のサンプル（QC）を一定間隔で測定することで補正されるが，誘導体化や装置による変動など何が起こっているかを知っておくことが重要である．
• 誘導体化
官能基によりTMS化のされやすさは異なる，加水分解が起こる．
• イオン化室におけるマトリックス効果
マトリックス効果は，見積もれない系統誤差なので，要因や対策を検討していく必要がある．
• 代謝物質の容器と保管
容器の材質や不純物などの情報を知っておくことが重要で，用途に応じて選択する必要がある．

25

謝辞
大阪大学大学院工学研究科 生命先端工学専攻
福崎 英一郎 教授
松尾 晃子 様九州大学 生体防御医学研究所
附属トランスオミクス医学研究センター メタボロミクス分野
馬場 健史 教授（独）理化学研究所 CSRS
津川 裕司 先生
ジーエルサイエンス（株） 技術開発部
古野 正浩 様本川 正規 様26