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64 巻 12 号 2018［臨床検査アップデート］

臨床検査アップデート 25

Up date

結核菌群遺伝子検査に関する最近のトピックス

うわ上みの蓑

よし義ふみは せ がわ典 1, 2）：長谷川

Yoshifumi UWAMINO

なお直き樹 2）

Naoki HASEGAWAして定着している。この点では、結核菌群遺伝子検

はじめに査は“常識”の領域まで普及した唯一無二の微生物遺伝子検査ともいえる。

微生物検査の領域において、現在最も成長を遂げこの結核菌群検出遺伝子検査の市場はロシュ・ダつつある分野が遺伝子検査である。各社が競って、イアグノスティクスよりリアルタイム遺伝子解析装置

全自動遺伝子検査や迅速遺伝子検査法の開発およびコバス Taqman48 用試薬として、2006 年に販売開始

臨床応用を進めており、保険収載される項目も徐々されたリアルタイム PCR 試薬であるコバス Taqmanに増えてきている。

MTB が圧倒的なシェアを占める状況が続いてきた。

結核菌の検出は、診療上および感染管理上も迅速

本製品は、最大 48 検体の同時処理が可能であるこ性が要求されるが、結核菌群の発育は緩徐であることや、大量処理時の 1 テストあたりの価格が比較とから、通常の培養・同定法を用いてもある程度の的安価であるという特徴を持つ。さらに、診断薬早期診断が可能な一般細菌感染症に比べ、遺伝子検として承認を得ている検体種が非常に幅広いこと、

査を用いて少しでも早く菌の存在や薬剤耐性を検知

Mycobacterium avium complex に対する核酸検出もすることが重要になってくる。その意味で、結核菌同一装置で結核菌群と並行して検査可能である等の群の遺伝子検査は、臨床現場からの要求も高く、市優位性がある。しかしながら、Hands on time が 3

場規模も大きい領域と言え、諸外国に比ベるとやや時間を要すること、核酸抽出、前処理の過程でいく遅まきながら着実に変化を遂げつつある。

つかの用手的過程を要することから、検査技師の多今回、抗酸菌検査ガイド 2016 の出版以降に新たい施設においてはバッチ処理にて検査を行う場合がに結核菌群検出遺伝子検査のラインナップに加わっ多く迅速検査となりにくい状況にある。

た試薬について紹介するとともに、結核菌群の薬剤そこに、検査過程を自動化迅速化することにより耐性遺伝子検査として保険収載され利用可能となっ検査室の負担を軽減し、検査の随時性迅速性を向上た試薬について紹介する。

させたのが TRC（transcription reverse transcription
concerted reaction）
法を用いる TRC Ready M.TB
（東Ⅰ. 全自動遺伝子検査の発展ソー）や PCR 法の増幅、検出を自動で行う GENECUBE（東洋紡）である。これらの登場により結核菌喀痰や気管支肺胞洗浄液検体に対する結核菌群遺群遺伝子検査は所要時間 1 時間前後にまで短縮され伝子検査は、現在、結核の診断に必須である。多くた。また、NALC（N-acetyl-L-cystein）-NaOH 処理済の医療施設において、抗酸菌塗抹染色検査陽性の際み検体から比較的容易に結核菌群核酸遺伝子検査をに、結核菌群遺伝子検査を実施し、陽性であれば活行うことが可能となった。

動性結核と診断する、というプラクティスは常識と1）
慶應義塾大学医学部臨床検査医学2）慶應義塾大学医学部感染制御センター〠160 - 8582 東京都新宿区信濃町35

さらに、栄研化学の開発した LAMP（Loop-Mediat-Department of Laboratory Medicine,Center for infectious diseases and infection control,
Keio University School of Medicine(Shinanomachi 35, Shinjuku-ku, Tokyo)

（6）

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ed Isothermal Amplification）法は迅速性、簡便性と本製品は M. avium, M. intracellulare 検出試薬で装置の小型化により、結核菌群遺伝子検査を小規模あるミュータスワコー MAC も発売されており、抗医療機関でも迅速に行える検査にまで変貌させた。

酸菌全般の遺伝子検査を全自動化・迅速化するにはLAMP 法は等温増幅および濁度測定を行うことによ利便性の高い製品であるが、NALC-NaOH 処理を必り検出するため検出装置が非常にシンプルで小型で要とすることと検体種が喀痰と培養液に限られるたあり、また検出時間も短時間となっている。さらにめ、胃液や気管支肺胞洗浄液検体に対して使用しづPURE（Procedure for Ultra Rapid Extraction）法にらいという点に留意が必要である。

よる簡易な核酸抽出法を組み合わせることで、全自2. Xpert MTB/RIF

動遺伝子検査装置に匹敵する用手過程の省略および簡略化を実現した。また導入コストも低く、専門外

Xpert MTB/RIF は 2016 年 11 月 1 日に販売開始の技師であっても短時間で遺伝子検査を行うことがされた。本製品はすでに 2011 年に WHO が recom-可能となった。実際に、多くの中規模医療機関で外mendation を出し、途上国の結核診断を中心に幅広来における結核のスクリーニング検査として LAMPく活用されてきた。米国でも 2013 年に FDA の承認法が行われるようになった。

を得ており、さらに 2015 年には喀痰の Xpert MTB/

さらに、2016 年秋に 2 種類の結核菌群核酸遺伝

RIF 検査 2 回陰性をもって隔離解除の判断にしてよ子試薬が販売開始された。富士フイルム和光純薬のいとの適応拡大まで取得している。そのような国際

ミュータスワコー MTB とセフィエドの Xpert MTB/的な状況の中でようやく日本でも認可販売された。

RIF である。いずれも全自動遺伝子検査の名のとおり

全自動遺伝子検査装置 Gene Xpert システム用リ

極めて少ない用手操作で検査可能という特色を持つ。

アルタイム PCR 検査試薬は、カートリッジ型の試薬となっており、カートリッジ内で核酸抽出からリ

1. ミュータスワコー MTB

アルタイム PCR 反応および検出まで完結する形となっている。

ミュータスワコー MTB は 2016 年 12 月 8 日に販売開始された。全自動遺伝子検査装置ミュータスワ

適応検体種は喀痰であり、NALC-NaOH 処理前検コー g1 用 PCR 検査試薬である。分析に必要な混合・体であっても分析可能という点は特筆すべき点であ撹拌・洗浄・分離・検出等の操作を数センチほどのる。喀痰に検体前処理液を添加し、ボルテックス後チップ上で行うμTAS（micro Total Analysis System）

15 分間反応させる。その後、試薬カートリッジ内に技術を使用しており、マイクロチップ内で PCR 法ピペットを用いて検体を添加し、あとは Gene Xpert

により増幅した産物をキャピラリーゲル電気泳動をシステムに架設すれば測定まで全自動で完了する。

行い測定する。
適応検体種は喀痰および培養液であり、喀痰を用いる場合 NALC-NaOH 処理済み喀痰を使用する必要がある。しかし、NALC-NaOH 処理後は、サンプルを抗酸菌前処理液に添加し転倒混和、静置を行った後、機械に試薬カートリッジとチップ核酸精製キットとともに架設すれば、PCR 反応から測定まで全自動で完了する。測定時間は約 45 分であり、4 検体同時測定が可能である。
臨床検体を用いた評価ではメーカーによる 147 検体を用いた臨床性能評価試験でコバス Taqman48 との一致率 98.6％と報告がある 。また、亀田総合病1）院での臨床検体を用いた評価ではコバス Taqman48（セフィエド社資料より）との一致率 98.9％、液体培養法との一致率 94.5％と

図 1 Gene Xpert system

2）報告されている 。

（7）

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測定時間は約 120 分である。Gene Xpert システムは、

Ⅱ. 薬剤耐性遺伝子検査に関する話題

カートリッジを収容する分析モジュール数に応じてさまざまなサイズの測定装置が用意されており、2検体～ 16 検体を同時に測定可能である。また本装結核の治療において、標準治療が可能かどうかと置はモジュール毎に完結した制御であるため、検査いうことは、治療期間や予後も含めて非常に重要で開始のタイミングが異なる複数の検体や異なる検査ある。国内での薬剤感受性検査実施結核患者におけ対象のカートリッジ試薬を合わせて測定できること

る多剤耐性結核患者の割合は 2012 年以降 0.6％程度から非常にオンデマンド性が高い。

で推移している。しかし 2016 年の新規多剤耐性結日本の 5 施設からの 427 検体を解析した研究では核患者 49 例のうち 15 例が外国出身者というデータ培養法との比較で感度 86.8％、特異度 96.8％であり、が示すように、外国出身者の薬剤耐性結核罹患率はコバス TaqMan MTB および TRC Rapid M.TB と比高いとされ、今後より多くの外国出身者が国内に流較し検出性能に有意な差はなかったと報告されてい入してくることが想定されることから、わが国にお3）る 。

いても薬剤耐性検査の重要性はより一層増してくる

Gene Xpert 用試薬としては M. avium, M. intra-と考えられる。

4）

cellulare 検出試薬のラインナップはなく、また検体種

これまでの薬剤耐性検査は概ね培養法をベースとが喀痰に限られるため、これまでコバス Taqman48していることから、現在では結核の診断から耐性判等で抗酸菌遺伝子検査を実施してきた施設などで完明までに数週間を要している。この現状を乗り越え

全に Gene Xpert に切り替える場合には、MAC のるべく、薬剤耐性遺伝子検査が承認販売開始された。

検査や適応外検体種の扱いなどについて予め十分に1. イソニアジド、ピラジナミド耐性遺伝子検査検討する必要がある。われわれの施設でも 2017 年
9 月より Gene Xpert を導入したが、上記の問題からニプロのジェノスカラー PZA-TBⅡ、ジェノスカ

コバス Taqman48 と併用している状況にある。われラー INH-TBⅡは、ピラジナミド耐性変異、イソニ

われの施設では簡便性と迅速性から、隔離の判断がアジド耐性変異をラインプローブアッセイにて検出必要な際の迅速遺伝子検査として 24 時間体制でする試薬である。ラインプローブアッセイは結核菌

Gene Xpert を運用し、MAC 遺伝子検査や肺外検体の DNA を PCR 反応により増幅させたものを、テの結核菌群遺伝子検査には、コバス Taqman48 を使ストストリップ上のプローブとハイブリダイズさ用している。Gene Xpert の大きな利点は、NALC-せ、ハイブリダイズしたものを発色させる方法であNaOH 処理が不要で、モジュール毎に制御が可能でる。プローブ配列と配列の異なる DNA はハイブリあるという点である。このため、微生物検査技師等ダイズしないため、変異遺伝子を含む場合、該当プが不在の時間、不在の施設でも誰でもいつでも簡単

ローブ箇所の発色がなくなることから変異を検出でに結核菌群遺伝子検査が可能になるというメリットがきる。

ある。なお、この点では、LAMP 法も NALC-NaOH

もともと、ジェノスカラー PZA-TB、ジェノスカ処理不要で、非常に簡便であり、GenesXpert、LAMP

ラー INH-TB としてそれぞれ 2012 年 2013 年より保の 2 法が Point of care（POC）検査として WHO の険収載されていたものだが、増幅行程が 2 回必要でrecommendation を得ている点には納得がいく。

あったものが 1 回になり作業手順が簡易化され使い

なお、 Xpert MTB/RIF は LAMP 法、 TRC 法、やすい形で 2018 年 3 月より販売開始となっている。

μTAS 法などに比し、所要測定時間が長いという欠培養菌株だけでなく、喀痰から直接検査すること点を持つ。これについては感度を向上させ測定時間も可能であり、結核の初回診断時に直ちに検査を行を 80 分以下に短縮した Xpert MTB/RIF ultra 試薬

うことで、薬剤治療開始前に耐性を確認できるメが国際的にはすでに使用されており、現在 WHO もリットは大きい。
ピラジナミド耐性変異としては、pyrazinamidase/こちらを推奨しており、日本でも早期に利用可能とnicotinamidase 遺伝子である pncA 遺伝子の変異がなることが望まれる。

知られている。この遺伝子変異によりピラジナミド（8）361（ニプロ社資料より）

図 2 ジェノスカラー INH-TBⅡの測定原理（セフィエド社資料より）

図 3 rpoB 遺伝子と Xpert MTB/RIF の検出プローブ（図 2, 3 は巻末にカラーで掲載しています）

耐性の 70 -97％が説明可能とされ、ジェノスカラー多く、調査によっては 98％でこの変異が認められPZA-TBⅡのターゲットとなっている。またイソニ6）
た 。

アジド耐性変異としては catalase-peroxidase 遺伝子

このリファンピシン耐性遺伝子検査としては 2 試（katG），enoyl-ACP-reductase 遺伝子（inhA），alkyl-薬があり、1 つめはニプロのジェノスカラー RFP-

hydroperoxidase reductase 遺伝子（ahpC）などの複TBⅡである。測定原理はイソニアジド、ピラジナ数の遺伝子変異が問題となる 。ジェノスカラー

ミド耐性遺伝子検出試薬と同様、ラインプローブ

INH-TBⅡは KatG 変異、inhA 変異および、inhA 領アッセイであり、すでに 2016 年より市販されている。

域の upregulation を起こす変異として報告 された

もう 1 つは全自動遺伝子検査試薬である Xpert

mabA 遺伝子の 3 つをターゲットとしている。これ

MTB/RIF である。この試薬は rpoB をターゲットとによりイソニアジド耐性のおよそ 90％程度が検出して結核菌群の遺伝子検査を行っており、その全領可能とされている。

域を probeA-E でカバーしている。これにより、5 つ6）7）の probe 全てで増幅を認めた場合には、リファンピ

2. リファンピシン耐性遺伝子検査

シン感受性結核といえ、4 つの probe で増幅を認め

リファンピシンは、結核菌の RNA polymerase のた場合は、増幅が認められなかった probe 領域に変β subunit に結合し、RNA 鎖形成の開始を阻害し異があるリファンピシン耐性結核と判定することが抗菌活性を発揮する。リファンピシン耐性菌では、βできる。

subunit 上の 23 個のアミノ酸をコードする rpoB 遺実際に、リファンピシン耐性を強く疑っていない伝子のホットスポット領域の変異が見られる場合が症例においても、副次的にリファンピシン耐性が検

（9）

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査されるため、われわれの施設でも、特に海外在住歴など耐性結核の検出リスクが高くない症例から、偶発的に超多剤耐性結核に相当する遺伝子変異を持
つ多剤耐性結核菌を検出しており、結核菌群核酸検出検査と同時に薬剤耐性検査を行うメリットの大きさを実感した 。
8）

なお診療報酬上、リファンピシン耐性、イソニアジド耐性、ピラジナミド耐性遺伝子検査はいずれも820 点とされている。結核菌群核酸検出検査（410 点）と同時に実施した場合は、いずれかの算定となる。

おわりに
微生物遺伝子検査は続々と診断薬として承認され、各社の競争が激しい分野となっている。しかし、全自動遺伝子検査装置などは初期投資費用も高く、それぞれの機器試薬の特性を理解した上で、自施設の抗酸菌診療において実際に臨床側から求められている検査を基軸に、それは自施設内で実施する必要があるものか、あるいは外注検査機関に任せるべきものか、任せてもよいものか、などを検査室側でも十分に検討した上で、賢く遺伝子検査を導入あるいは利用していく姿勢が重要である。

（ 10 ）

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