イルミナ
Sequencing By Synthesis (SBS)
ケミストリーのご紹介小林 孝史
イルミナ株式会社
テクニカルアプリケーション
サイエンティスト

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本日のウェビナーの概要
キャピラリーシーケンサー

合成→分離→読み取り• 鋳型DNAから1塩基違いの相補鎖DNAを合成• キャピラリー内でゲル電気泳動で分離しながら読み取り（サンガー法）• 一度に少数（96）のDNA断片しか同時に解析できない

次世代シーケンサー（イルミナ）

合成→読み取り• 相補鎖DNAを合成しながら読み取りを行う（SBS法）• 分離は行わない• 一度に多数（30億）のDNA断片を同時に解析できる2

サンガー法イルミナシーケンサーワークフロー

改良
イルミナシーケンサーSBS法

サンプル調製3

ライブラリー作製

DNA増幅
クラスター形成

シーケンス

データ解析

はじめに
Sequencing By Synthesis (SBS)法

MiSeq

4

GAIIx

HiScanSQ

HiSeq
1000/1500

HiSeq
2000/2500

イルミナシーケンサーのワークフロー

1. サンプル調製：
シーケンサー解析用のDNAサンプルを作る
2. クラスター形成：
DNAを増幅する
3. シーケンシング：
塩基配列（蛍光）を読み取る
4. データ解析：
データを綜合して塩基配列を得る

51. サンプル調製：
シーケンサー解析用のDNAサンプルを作る
DNAライブラリー（イルミナシーケンサー解析用DNAサンプル）の構造

イルミナシーケンサー専用オリゴヌクレオチドアダプターDNA Insert
 P5, P7
 SP Index

6

数百bpに断片化したDNA（解析する配列）
フローセルへの結合部位→DNA増幅
シーケンスプライマー結合部位→シーケンス
複数サンプル解析用のバーコード

1. サンプル調製：
シーケンサー解析用のDNAサンプルを作る
DNAライブラリーの調製方法例（TruSeq DNA prepの場合）
アプリケーションごとに最適化された試薬キットの提供

ゲノムDNA (1 ugから)

7

DNAの断片化
数百bp2種類のアダプター添加→DNAライブラリー

1. サンプル調製：
シーケンサー解析用のDNAサンプルを作る
主なサンプル調製キット（2013年7月現在）
Kit

Details

Nextera
Nextera XT

DNA、トランスポゾームを使用
最多96種類のindex
少量のDNAから適応

TruSeq DNA
TruSeq nano
TruSeq PCR-Free

DNA、超音波破砕
24(LT), 96(HT)種類のインデックス
低コスト

TruSeq RNA (v2)
TruSeq Stranded RNA

mRNA、最多24種類のインデックス
ストランド情報（Stranded）が得られる

TruSeq Small RNA

Small RNA,
最多48種類のインデックス

Nextera Rapid Capture(Exome/Custom)

ターゲット領域を濃縮

Nextera Mate Pair

メイトペアシーケンス、長断片に対応

TruSeq Amplicon(Custom/Cancer)

アンプリコンを作製しライブラリー作製

8

2. クラスター形成：
DNAを増幅する

１つのDNAライブラリーから増幅したクラスター

クラスター形成は、調製したDNAライブラリーをシーケンスの際に検出可能な充分量に増やす目的で行う増幅工程
9

2. クラスター形成：
DNAを増幅する
イルミナシーケンサーでは、クラスター作製は「フローセル」と呼ばれるガラス基板上で行われる
1~8レーンの試薬が流れる穴が開いている。
フローセルのレーンの上下面にはオリゴヌクレオチド(P5/P7)が林立している
クラスター形成時やシーケンス解析時には試薬が流れる試薬が流れて反応起こる
レーンの両端に穴が開いている

図はHiSeqシリーズのHighOutputフローセル（１枚につき８レーン）
102. クラスター形成：
DNAを増幅する
１つのフローセルで８レーン

フローセルの流路の表面にはオリゴヌクレオチドが林立

11

2. クラスター形成：
DNAを増幅する
1. 変性された一本鎖DNAライブラリーが、フローセル内部のオリゴヌクレオチドと結合2. 近傍の別なオリゴヌクレオチドとブリッジPCRすることにより一本鎖DNAが増幅
3. クラスター形成のために～1000分子形成される
4. P7を根元に含む鎖のみ切断すること
により、１方向の鎖のみ得られる

図はMiSeqのフローセル（１枚につき１レーン）
12

変性した１本鎖DNAライブラリー

3. シーケンシング：
塩基配列（蛍光）を読み取る
Sequencing By Synthesis (SBS) 法（サンガー法の改良法）
可逆的ターミネーターを用いて一塩基ずつシーケンスする
3’末端に保護基があるためDNA合成が一塩基ずつストップしながら行われる
1反応に蛍光ラベルされた 4ヌクレオチドを加える（蛍光の種類で塩基を特定）高精度で信頼があり、ホモポリマー領域も正確に解析可能
蛍光色素

O

O
切断部位

HN
O

N
O

PPP
3’

保護基

135’
DNA
O

1サイクル
①ヌクレオチド取り込み②蛍光検出③保護基を除去④蛍光色素を除去

HN
O

N
O

3’OH

X

次のサイクルへ3. シーケンシング：
塩基配列（蛍光）を読み取る
3’ 5’

A
C

T

GC

G
A

T

C
T

C
A

C
T

C

GA
A

G
T

14

G
C
T
A
C
GG
GC
A
T
T
GC
A
A
C
A

C
GA
T
GC
C
C
GT
A
A
C
GT
T
GT

Cycle 1シーケンス試薬の添加
1塩基伸長反応
未反応試薬の除去
蛍光シグナルの取り込み
保護基と蛍光の除去
Cycle 2
上記反応の繰り返し
Cycle 3, 4, 5…..
上記反応の繰り返し

4. データ解析：
データを綜合して塩基配列を得る
1回のサイクル終了後のイメージ

MiSeqだと1フローセルあたり1500万個のクラスター

20um

100um
15

4. データ解析：
データを綜合して塩基配列を得る
それぞれのサイクルにおけるFC上の画像から塩基情報が抽出される
まずクラスターの認識、位置づけ、そしてカウントが行われる
サイクル 1-4= 28 clusters

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4. データ解析：
データを綜合して塩基配列を得る
Quality scores (Q Scores) がすべての塩基に割り当てられるサイクル 1-4= TG C T

Q scores はそれぞれの塩基が不正確にBaseCallされる可能性を示す

17Q Score

Probability of error

Q30

1 in 1000

Q20

1 in 100

4. データ解析：
データを綜合して塩基配列を得る
T G CA

テキストファイルの視覚化

Sequence

ASCII Character Q-score

PF (0,1)

Read #

Index #

Y-coordX-coord

Tile

Lane

Run ID

Instrument

座標

T

配列

最終的にクラスター位置を座標で表し、そのクラスターに含まれているDNAの塩基配列を示したものが出力される
18

イルミナシーケンサーでアウトプット量を大きくするための工夫

19その１：PE(ペアエンド)シーケンス
Read1 シーケンス

3’ 5’T
G
C
A
G
T
A
C
T
G
T
A
C

Read 1
シーケンス(100bp)5’フローセル表面上のクラスター20

1分子での例Read1が終わった後、クラスターの再形成を行う

Single molecule array
クラスターを再合成する

21

逆側からのシーケンス＝Read2
R2 プライマーをハイブ
リダイズ

3’ 5’T
GCA
GT
A
CT
G
T
A
C

5’

フローセル上のクラスター

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1分子での例

ペアエンドリードの利点：両端からユニークリードが得られるということはアウトプット量が２倍に！

100bp
single read

100bp
paired-end read
100bp

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その２：多サンプル解析（マルチプレックス解析）
Indexシーケンシングとはなにか？
DNAライブラリーの端に、識別のためのインデックスが付加されてある→それぞれのDNA断片がどのサンプル由来か同定が可能・簡単ということは？
→サンプルを混ぜて（pooling)解析して、後でクラスターをそれぞれのサンプルに振り分ければいい（de-multiplex）→多サンプル解析(multiplex analysis)が可能

インデックスを持つDNAライブラリーの例
イルミナでは矢印の部分がインデックス配列を指します24Indexシーケンシングとはなにか？
最多24サンプルか96サンプルの多サンプルの同時解析が可能です！ということは？
→１サンプル当たり、より経済的に安価に解析が可能です！
より具体的には、１サンプルにつきデータ量がたくさん要らないサンプルについてまとめて多くのサンプルを解析できる

別なサンプル
必要なデータ量: 1Gbases
別なサンプル必要なデータ量: 1Gbases
必要なデータ量: 1Gbases

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MiSeq Output: max 8Gbases
残った部分のデータは実質捨ててしまうマルチプレックス解析がどのように行われるか

Read 126

マルチプレックス解析がどのように行われるか

Read 1Index Read27

マルチプレックス解析がどのように行われるか

Read 1Index Read

Read 228

多サンプル解析に関してもっと知りたい場合にはサポートウェビナー：Dual Indexを持つLibraryのシーケンサーセットアップ（pdfのダウンロードのみも可能です）

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本日のまとめ：イルミナシーケンサーのワークフロー
3’ 5’

解析したい
サンプル

DNAライブラリー

GA(DNA/RNA)

C

T
G
C
T
A
A
C
A
GT
C
T
G
T
G
C
T
A
A

A

T
CGA
T
GC
T

サンプル調製クラスター形成（フローセルの中で）
5’

シーケンシング（SBS法による）123456789T G C T A C G A T …

シーケンシングにおけるサイクル
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ベースコール

参考文献
細胞工学別冊：「次世代シークエンサー目的アドバンストメソッド」

菅野純夫/鈴木穣 監修
イルミナのホームページから得られる情報– http://www.illuminakk.co.jp/applications/sequencing.ilmnからシーケンスサンプル調製キットセレクター （目的のアプリケーションに沿ったキット）– http://www.illuminakk.co.jp/support/training.ilmn （ウェブ上でトレーニング、英語）– MyIllumina（弊社サイト内）からユーザーガイドのダウンロード– サポートメールニュース、イルミナからのお知らせメール（登録が必要）

イルミナシーケンサーの原理について:– Bentley et al. (2008) Accurate whole human genome sequencing using reversible
terminator chemistry. Nature 456: 53-59

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