BioResource Now ! Vol.10 No.6

BioResource Now !
Issue Number 10 June 2014

国内外のバイオリソースを巡る様々な問題や取り組みについて、毎月ホットな話題をこのニュースレターで紹介していきます。
研究とバイオリソース
No.16

星野敦（基礎生物学研究所・モデル生物研究センター ）アサガオの新規突然変異を利用した「花の色を濃くするタンパク質」の発見

じょうほう通信：
No.89

PubMed の LinkOut 登録について

今月のデータベース

ミヤコグサ・ダイズデータベース

P1 - 2
P2
P2

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研究とバイオリソース〈NO. 16〉

新たに現れた花の色を薄くする突然変異
今回の研究では、アントシアニンの含有量を少なくして花の色を薄くする性質をもつ、新しい変異が使われました。この変異は人工的に作られたものではなく、「紅ちどり」という市販の系統から自然に現れました。実際には、紅ちどりから直に現れたのではなく、3 度も突然変異が繰り返しておきて現れました（図１）。

3 回目の突然変異

図 1：AK28 の薄いピンク色の花には、濃い赤色の斑点（白い矢の先など）が観察されます。

はじめの変異では、濃い赤色の花の紅ちどりが、白地に赤い斑点模様の花を咲かせるようになりました。この変異は、平成 12年に富山県の一般の方が見つけました。その種子を私たちが入手して栽培していたところ、さらに 2 度の突然変異がおきました。
１つは、富山で現れた突然変異が復帰変異をおこして、もとの赤い花を咲かせるようになるもの。もう 1 つは、この研究に利用された花の色を薄くするという変異でした。このように偶然が重なって得られた薄い赤色の花を咲かせる系
統（AK28）は、新しいリソースとして NBRP アサガオによって収集されました。

EFP タンパク質の発見
AK28 の薄い赤色の花には、紅ちどり本来の濃い赤色の斑点模様が観察されます。また、AK28 の種をまくと、紅ちどりと同じように濃い赤色の花を咲かせる復帰変異体も得られます。このような表現型は、トランスポゾンが関与する変異によく見られるも の で す。そ こ で、ア サ ガ オ のTpn1 ファミリーのトランスポゾンが突然変異をおこしたと仮定して原因遺伝子を探索しました。
探索には「トランスポゾン・ディスプレー法」という、トランスポゾンに接した DNA 配列を PCR で増幅する方法を用いました（図２）。変異体ではトランスポゾンが挿入しているので原因遺伝子に由来する DNA 断片が増幅するが、野生型の植物や復帰変異体では増幅しないという原理にもとづく方法です。この方法で見つかった原因遺伝子は、それまで機能が知られていないタンパク質をコードしていました。花の色素を調べると、アントシアニンだけでなく、無色のフラボノールというフラボノイドの生合成も促進する機能を持つことが分かったので、Enhancer of Flavonoid Production（EFP）と名付けました。EFP は、EFP が働かない場合に比べてアントシアンの生産効率を 3 倍程度に高めています。
次ページへ続く

野生型、復帰変異体
原因遺伝子
PCR プライマー
アダプター

変異体
トランスポゾン
制限酵素処理アダプターのライゲーション
蛍光標識
PCR

変異体 3

2 回目の突然変異

AK28（efp変異体）

変異体 2花の多くは、アントシアニンにより彩られています。アントシアニンは植物の代表的な色素で、フラボノイドと呼ばれるポリフェフェノールの一種です。花の色の濃さは、そこに含まれるアント
シ ア ニ ン の 量 に よ っ て 決 ま り、多く含まれるほど色が濃くなります。これまで、アントシアニンの含有量を調節する因子や仕組みについての知見は限られていました。

1 回目の突然変異

AK27

変異体 1

研究の背景紅ちどり

基礎生物学研究所・モデル生物研究センター 助教

復帰変異体

アサガオには、江戸時代の後期に生じた突然変異が多く現存しています。これらは、「Tpn1 ファ
ミリーのトランスポゾン」と呼ばれる動く遺伝子が、ほかの遺伝子に挿入することで生じたものです。このトランスポゾンは、アサガオのゲノム中に 800 ほどもあるうえに、現在でも動く活性があるので、しばしば新しい突然変異を生みます。そのような新しい突然変異を利用することで、「花の色を濃くするタンパク質」が発見されました。

星野敦

野生型

アサガオの新規突然変異を利用した「花の色を濃くするタンパク質」の発見

電気泳動
蛍光スキャナーによる解析
原因遺伝子に由来する DNA 断片

図２：トランスポゾン・ディスプレー法。
変異体では、原因遺伝子にトランスポゾンが挿入しています。ゲノム DNA を制限酵素で切断し、切断部分にアダプターを結合させたあと、アダプターとトランスポゾンの配列上に設計したプライマーを用いて PCＲを行います。トランスポゾン側のプライマーは蛍光標識してあるため、電気泳動像を蛍光スキャナーで解析すると、このプライマーにより増幅した DNA 断片だけが検出されます（アダプター側のプライマー同士で増幅したDNA 断片は検出されない）。変異体に共通して現れる原因遺伝子に由来する断片を、ゲルから回収して塩基配列を決定するなどして、原因遺伝子を特定します。

BioResource Now ! Vol.10 No.6

さらに私たちは、NBRP アサガオで収集されている薄い色の花の39 系統について、EFP 遺伝子を調べました。その結果、そのうち32 系統は機能欠損した EFP 遺伝
子 を も つ こ と が 分 か り ま し た。
また、ペチュニアやトレニアのEFP も、アサガオの場合とおなじようにフラボノイドの生産効率を高める働きがあることが明らかになりました。

今後の展望
今のところ EFP が、どのような仕組みでフラボノイドの生産効率を高めているのかは謎のままです。これを解き明かすことで、植物が物質生産を効率化する仕組みを理解できると考えています。
ま た、本 研 究 の よ う に、ア サ ガ
オではトランスポゾンを利用して新しい突然変異とその原因遺伝子を見つけることができます。
私たちは、トランスポゾンを利用した新しい突然変異体の選抜（スクリーニング）も進めています。
これまでにない科学的価値や鑑賞価値の高い変異体が得られることを期待しています。■
参考文献
Morita, Y, Takagi, K, Fukuchi-Mizutani,
M, Ishiguro, K, Tanaka, Y, Nitasaka, E,Nakayama, M, Saito, N, Kagami, T,
Hoshino, A, Iida, S. (2014) A chalcone
isomerase-like protein enhances
ﬂavonoid production and ﬂowerpigmentation. The Plant Journal 78,
294-304. Doi:10.1111/tpj.12469

PubMed の LinkOut 登録について
NCBI のデータベースには LinkOut というサービスがあり、関連するサイトへのリンクを登録することができることをご存知でしょうか。よく目にするのは、PubMed からフリーのフルテキストへのリンクで、大学の図書館などが購入している文献かどうか判別し易いようにこのサービスを利用していることもあるようです。
今回 NBRP として LinkOut に登録し、NBRP リソースを使った論文から直接リソースの注文サイトにアクセスできるようになりましたので、その方法について解説したいと思います。
図 1 は PubMed の Abstract の画面です。
赤枠部分が今回紹介する LinkOut の表示です。

じょうほう通信 [ 第 89 回 ] 10 分
■ Resource File※2
リンクに必要な情報を記載します。
リンク先が１カ所の場合はとても簡単です。
RRC の参考例から作成されるリンクは
PubMed ID が 7549 の論文に対して下記のようになります。
http://rrc.nbrp.jp/referenceListAction.do?
pmid=7549

NBRP では利用者からのフィードバックの受 け 皿 と し て、RRC（Resource ResearchCirculation）を公開しております。
RRC は NBRP リソースを使った論文情報の登録サイトで、既に 12000 報以上の論文情報を格納しています。そこで、これらの情報を PubMed の LinkOut に登録しました。

RRC の参考例<?xml version="1.0"?><!DOCTYPE LinkSet PUBLIC "-//NLM//DTD LinkOut 1.0//EN""http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/linkout/doc/LinkOut.dtd"[<!ENTITY base.url"http://rrc.nbrp.jp/referenceListAction.do?">]><LinkSet><Link><LinkId>1</LinkId><ProviderId> プロバイダ番号 </ProviderId><ObjectSelector><Database>PubMed</Database><!-- リンクを張ってもらうデータベース --><ObjectList><ObjId>7549</ObjId><!-- リンクを張ってもらう論文の PubMed ID --><ObjId>15983</ObjId><!-- 複数の場合 2 件目の PubMed ID --><ObjId>22535</ObjId><!-- 複数の場合 3 件目の PubMed ID --><ObjId>35528</ObjId><!-- 複数の場合 4 件目の PubMed ID -->….
<ObjId>24843139</ObjId><!-- 複数の場合 100 件目の PubMed ID --></ObjectList></ObjectSelector><ObjectUrl><Base>&base.url;</Base><!-- 最初に記載されているベースとなる URL --><Rule>pmid=&lo.id;</Rule><!-- リンクのパラメータ --><UrlName>NBRP resources</UrlName><!-- 作成されるリンクの表示 --></ObjectUrl></Link></LinkSet>

パラメータについては、もっと複雑な設 （XML ファイルの詳細は HTML 版でご覧になれます）
定や論文の情報 (ISSN コードや pii・doi http://www.shigen.nig.ac.jp/shigen/news/n_letter/2014/n6/ja/resources.xml_sample.html
コード ) などを使用する事もできます。
図 1. PubMed の Abstract の画面① 最初に NCBI へプロバイダとして登録を希望するというメールを送信します。
以下の内容を記載して NCBI (linkout@ncbi.nlm.nih.gov) 宛にメールを送信。注）英語です
・組織名
RRC の場合は、NBRP・RRC の説明と NBRP・担当者の名前から提供したリソースを使用して発表され・メールアドレスた論文に対してリンクを作成して欲しい旨・電話番号説明しました。
２日後に返事が届き、規模に関する質問な・住所
ど 2,3 回メールのやり取りをした後、サン・リンク先の URL・リンクを行ってほしいデータベース プルファイルの提出を求められました。とリンクの範囲について※1 providerinfo.xml のヘルプページ
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK3807/#ﬁles.Identity̲File※2 Resource File のヘルプページ
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK3807/#ﬁles.Resource̲File
作成したXMLのフォーマットを確認するサイト
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/linkout/doc/validate.shtml

サンプルファイルが適切ならば、後日FTPアカウントが送られてくるので、必要なファイルをアップロードすると、48時間以内に登録したリンクが表示されるようになります。その後の更新も同様に行うことができます。登録したリンクの利用状況についても、１カ月毎にジャーナル名とアクセス数の情報が送られてきてとても<!-- 組織名 --><!-- 略称 -->■ providerinfo.xml※1<!-- カテゴリ -->便利です。
<!-- URL -->こちらは、プロバイダの情報を記載し<!-- 簡単な説明 -->今回は論文情報でしたが、NCBIが公開している様々なデータベースでもLinkOutたファイルです。
（XML ファイルの詳細は HTML 版でご覧になれます） 機能を利用する事ができます。
プロバイダ番号はプロバイダ登録後に http://www.shigen.nig.ac.jp/shigen/news/n_letter/2014/n6/ja/providerinfo.xml_sample.html（渡辺拓貴）
割り振られます。

② サンプルファイルとして次の二つのXML ファイルを提出します。

RRC の参考例<?xml version="1.0"?><!DOCTYPE Provider PUBLIC "-//NLM//DTD LinkOut 1.0//EN""http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/linkout/doc/LinkOut.dtd"><Provider><ProviderId> プロバイダ番号 </ProviderId><Name> National BioResource Project</Name><NameAbbr>jpnbioresp</NameAbbr><SubjectType>culture/stock collections</SubjectType><Url> http://rrc.nbrp.jp/</Url><Brief>The database of papers related to the NBRP resources.</Brief></Provider>

今月のデータベース

Contact Address

ミヤコグサ・ダイズデータベース

連絡先 〒411-8540 静岡県三島市谷田 1111
国立遺伝学研究所 生物遺伝資源センター
TEL 055-981-6885 ( 山崎 )E-mail：brnews@shigen.info

Legume Base (Lotus japonicus、Glycine max/soja)

系統数：9,354系統
DNA：239,164(2014年6月現在)

DB名：Legume BaseURL ：http://www.legumebase.brc.miyazaki-u.ac.jp/
言 語：日本語 英語
Legume Base：
ミヤコグサおよびダイズ共通のリソースの分譲サイト
Lotus japonicus (ミヤコグサリソースデータベース)：
実験系統、国内野生系統、RILs、EMS変異体系統、根粒菌STM株、DNAクローン(BAC,TAC,cDNA)
Glycine max/soja (ダイズリソースデータベース)：
栽培系統、野生系統、RILs、RILs(MxS)、突然変異体系統、エダマメ系統、完全長cDNA
特徴：・採取地、気象情報、表現型等からも検索できる(ミヤコグサ野生系統)。
・採取地を網羅したリサーチセット(ダイズ野生系統)。
・ミヤコグサの実験系統については詳細な特性情報が公開されている。
・すべてのリソースがウェブ上でオーダーできる。
連携DB：Lotus japonicus EST index(かずさDNA研)
Miyakogusa.jp(かずさDNA研)、rsoy(理研PSC)
DB構築グループ：NBRPミヤコグサ・ダイズ、NBRP情報
運用機関：宮崎大学
DB公開開始年：2004年
DB最終更新年：2014年

現役開発者のコメント：ミヤコグサ・ダイズデータベースは分譲機能を担うLegume Base、ミヤコ
グサのリソース情報を提供するLotus japonicus、ダイズのリソース情報を提供するGlycine max/sojaの3サイトから構成され、それぞれを連携して運用しています。歴史的な経緯があってこのようなシステムになっていますが、物理的に機能が分かれていることで機能追加がしやすいため、新しいリソース種が増えても短期間で公開でき、利用者にいち早くリソースを利用してもらうことができます。
Legume Baseは公開してから10年間、変わらない形で運用を続けてきましたが、現在新しいデザインのサイトに向け準備を進めており、今まで以上に使いやすいデータベースにしていきたいと思います。

Editor's Note夏の朝に清々しく開花する朝顔はとても魅力的で、熱烈な愛好家でなくとも毎年数種類は育ててみたくなります。とりわけ多様な花色に目を奪われるものですが、その色の濃度を制御する遺伝子が星野先生達のグループによって発見されました。しかもこの原因遺伝子はこれまで機能が知られていなかったそうで、今回の発見は応用面でもかなり注目されているようです。今後の研究の展開も楽しみですね。
（Y.Y.)

バイオリソース情報(NBRP) www.nbrp.jp/(SHIGEN) www.shigen.nig.ac.jp/indexja.htm(WGR) www.shigen.nig.ac.jp/wgr/(JGR) www.shigen.nig.ac.jp/wgr/jgr/jgrUrlList.jsp

BioResource Now !
Issue Number 10 June 2014