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64 巻 4 号 2018［食水系感染症病原体の検査法］

食水系感染症病原体の検査法－16

ウエルシュ菌うえ上だ田しげ成Shigeko UEDA

こ子つでもあり、本菌の糞便中の菌数は、日本人の場合、Ⅰ. 病原体発展途上国の人に比し低く、欧米人に比し高いことが報告されている。このことは食生活の相違や公衆衛生に関わる要因が関与しているかも知れない。欧1. 病原体1-1 病原菌の存在

米では本菌食中毒はカンピロバクター／ジェジュ
ニー／コリー食中毒やノロウイルス食中毒と並んで1）

ウエルシュ菌（Clostridium perfringens）はヒトお患者数が多く発生している。わが国では欧米に比較よび動物の腸内や土壌および下水などに広く分布しして発生件数は少ないが、“集団食中毒菌”ともいている。本菌はセレウス菌（Bacillus cereus）やボツわれ、集団給食を原因とする大規模発生例がみられリヌス菌（Clostridium botulinum）と同様に本来土壌ている。本菌は環境細菌の一つであるとともに、ヒ細菌である。また、医学的には C.novyi や C.septicum

ト・動物の腸管常在菌であり、偏性嫌気性の芽胞形とともにガス壊疸菌として知られている。この菌は成菌であることを認識しておく必要がある。

1940 年代以降に食中毒を起こすことが知られるよ1 - 2. 細菌学的特徴

2 ～ 4）

うになった。特に、1953 年にイギリスの Hobbs ら

本菌は Genus Clostridium に分類され、大型のグがロンドンで発生した本菌による集団事例を調査・

ラム陽性の偏性嫌気性桿菌であり（写真 1）、鞭毛を報告し、世界的に注目されるようになった。本菌はもたず、芽胞を菌体の中央部からやや偏在して形成

多種の毒素や酵素を菌体外に産生し、これらの毒素し、ボツリヌス菌の様に絶対嫌気性でない（表 1）。の協調作用により、その特徴ある病害作用を示すとその酸化還元電位は培養条件等によって多少異なるされている。ウエルシュ菌は腸管内の常在細菌の一が、－200mV である。従って大量調理中のスープ類

電子顕微鏡写真

CW 培地上コロニー

写真 1 Cl.perfringens の電子顕微鏡写真、
CW 培地上のコロニー（上田成子作製）
神奈川工科大学 応用バイオ科学部 栄養生命科学科
元 女子栄養大学・衛生学教室（ Kagawa Nutrition University）〠243 - 0292 神奈川県厚木市下荻野1030

Kanagawa Institute of Technology Faculty of Applied Bioscience
Department of Nutrition and Life Science(1030 Shimo-ogino, Atsugi, Kanagawa)（ 14 ）

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表 1 C.perfringens の確認のための生化学性状試験
生化学性状
嫌気培養
運動性
芽胞形成
糖発酵
乳糖
ブドウ糖
ラフィノースインドール産生
牛乳培地
凝固
ガス産生
ゼラチン（Hobbs 型菌）に分類している。また、易熱性の芽胞形成菌や Hobbs 型に該当しない菌も食中毒の原結果＋－＋因になることが報告されている。しかしながら、
Hobbs らの報告から、耐熱性芽胞形成菌は食品の加熱調理によってもそれらの生残性が高く、食中毒＋＋（ガス＋）＋－発生原因菌としての確率も高いとされていることか＋＋＋（液化）本菌はセレウス菌やボツリヌス菌と同様に栄養細ら、Hobbs らの分類法は食中毒事例の疫学的追跡調査に利用されている。
胞と芽胞細胞とに形態変化する。栄養細胞は D59℃
値が 7.2 分であるが、芽胞細胞は 82℃で加熱ショッやカレー類は加熱・調理により食品中心部は微嫌気クを受け 54℃以下の保存条件で発芽し、増殖する。

状態になり、調理後の取扱い・保管が衛生的でない

通常のウエルシュ菌芽胞は 100℃、5 分あるいはと汚染を受けていた場合、本菌の増殖を助長する結80℃、30 分で死滅し耐熱性は比較的弱い。しかし果となる。

ながら、食中毒の原因となるウエルシュ菌芽胞は本菌は産生毒素が A ～ E 型の 5 種に分類され、100℃で 1 ～ 4 時間の加熱に耐える。このことから、ヒトの食中毒を起こすのは A 型である（表 2）。A 型

一般の調理温度では芽胞は死滅しないので、食品の菌はヒト、動物の腸管内、土壌、下水および塵埃など加熱・調理後の保存は急速冷却するとともに 5℃以広く自然環境中に分布している。さらに、エンテロト下の保存により本菌の増殖を極力制御することが重キシン非産生株が食中毒をおこすことが明らかとな要である。そのためには FDA では 6 時間以内に 5℃り、その遺伝子も同定され BEC（binary enterotoxin以下に冷却することを推奨している。即ち、60℃かof Clostridium perfringens）と命名された。Hobbs らら 21℃までの冷却時間を 2 時間以内に、21℃から 5℃

はウエルシュ菌食中毒の疫学的調査から耐熱性芽胞までの冷却時間を 4 時間以内にすることとしてい形成菌が食中毒発生に関与するとし、1 型～ 17 型

る。また、本菌の発育温度は 15 ～ 50℃と広範囲であ表 2 C.perfringens の型別毒素・生物活性・感染症およびエンテロトキシンの性状菌
A

生物活性++
++
++
－++
++
－－++
－++
－++
－－++

致死、壊死、溶血致死、壊死致死、壊死致死、壊死++－+++++++－+++++++

溶血
コラーゲン分解
蛋白分解
下痢性エンテロトキシン＊

1）

3）

感
染 症

4）

5）

6）

腸性中毒症

++
2）
－－－

腸性中毒症

E

壊疽性腸炎

D

子ヒツジ赤痢・腸性中毒症

C

食中毒・ガス壊疽

主要毒素
αβεｉ
従属毒素
θκλEnt型

B7）＊エンテロトキシンの性状・分子量：35,317
・等電点：4.3
・熱安定性：易熱性（55 ℃､ 1時間）
・タンパク質分解酵素感受性
トリプシン、キモトリプシン、パパイン→ 安定プロナーゼ、サブチリシン→ 失活
・生物活性：下痢原性、細胞毒性、血管透過性亢進

1）: 大半の菌株が産性 2）:大半の菌株が非産性 3）: 一部の菌株が産性 4）:ヒツジ、ヤギ5）: Pig-bel.Darmbrand 6）:ヒツジ、ヤギ 7）:ウシ､ウサギ（ 15 ）

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り、至適増殖温度は 43 ～ 45℃である。この温度は取扱いの欠陥、厨房内の衛生管理の欠陥、調理従業一般の食中毒菌および腐敗細菌に比し高温であり、員の衛生・教育管理の欠陥があげられる。そのなかまた分裂速度は 10 ～ 12 分とかなり速い。発育可能

でも、調理食品の長時間室温放置や加熱不十分の使

pH は 5.5 ～ 9.0 であり、至適増殖 pH は 7.2 である。

用等によるものが、発生要因数のうちほぼ 70％と一般の食中毒菌と同様、胃などの酸性環境下では強圧倒的に多く、厨房内の衛生管理の欠陥によるものくない。水分活性値の至適増殖域は 0.93 ～ 0.96 でが 7％とされ、主に調理場の汚染・二次汚染が原因ある。最高食塩濃度の発育濃度は 5％であり、ブドとされている。調理従業員については保菌者の存在

ウ球菌のように耐塩性ではない。

が問題である。

2. 疫学

ヒトに食中毒を起こす A 型ウエルシュ菌はヒト、

5 ～ 6）

動物の腸管内、土壌、下水および塵埃など広く自然

ウエルシュ菌食中毒は北欧・米諸国では比較的高環境中に分布し、動物ではウシ、ブタ、ヒツジ、ニ頻度に発生している。わが国においては、これらのワトリ、イヌおよびネコなどの腸管や糞便から検出国と比較して本菌食中毒発生事例は必ずしも多くはされている。その他、魚介類の腸管や糞便からも検なく、1978 ～ 2016 年の 39 年間の発生事例は 848出されている。市販食品では冷凍食品、さつまあげ件みられ、患者数は 83,037 人であった。また、1 事等は本菌の汚染が高いとされている。また、煮豆や件当たりの平均患者数は 108 人であり、他の食中毒弁当類のおかずからも本菌が検出されている。

細菌と比し 1 件当たりの患者数が多いのが特徴で、概して大規模事件をもたらしている。また、月別発

3. 臨床症状4）

生状況をみると、他の細菌性食中毒と同様に本菌食本菌食中毒の潜伏期は通常 6 ～ 18 時間、平均 12中毒は夏季に多発する傾向があるが、ウエルシュ菌時間であり、爆発的な発生を起こすことが多い。主の発育性状や原因食品から冬季でもかなり発生がみな症状は腹痛と下痢であるが、他の食中毒に比してられ、季節的な偏りは小さい。原因施設は全発生事症状は軽い。下痢の発現は、本菌が 1 g 当たり 10例のうち飲食店がほぼ 45％と最も多く、次いで仕個以上に増殖した食品を喫食すると、小腸内でさら出し屋、旅館、学校、病院の順になっている。原因に増殖し、芽胞を形成する際にエンテロトキシンが食品をみると、複合調理食品（弁当類、セット食お遊出される。本毒素の標的は腸管粘膜の上皮細胞微よび複合その他）がほぼ 44％と半数近くを占め、次絨毛とされ、腸粘膜上皮に作用し、腸管内への水分いで肉類・卵類・乳類およびその加工品、穀類およの分泌を亢進させることによって下痢をもたらす。

びその加工品の順になっており特に、複合調理食品

この種のエンテロトキシンは生体内毒素と呼ばれてに使用される豚肉や鶏肉の調理食品（煮物、肉ダンいる。

6ゴ、シュウマイ、コロッケなど）、魚介類の調理食

この毒素は pH4 以下では短時間で破壊されて胃品（煮物、フライ、練製品など）が重要である。本を通過できないので、腸管内で形成される必要があ

菌は動物や魚介類の腸管に広く存在していることかる。エンテロトキシンは分子量 35,000 の単純タンパ

ら、これらの食品素材に注意することにより本菌食ク質であり、その生物活性は下痢作用（サルへの経中毒発生を減少させうると思われる。

口投与等）、液体貯留活性（ウサギ、ヤギの腸管ルー

上述したように原因食品は自家給食や仕出し弁当プテスト）、細胞毒性（Vero 細胞、腸管粘膜細胞）、によるものが多く、大部分が獣肉、鶏肉、魚介類等

血管透過性亢進（皮下、皮内）、流涙および呼吸困のタンパク食品であり、獣肉や魚介類は本菌の汚染

難（静脈内投与）、Mitogen 作用（末稍リンパ球）、率が高い。これは動物性食品にはグルタチオンなど神経・筋接合部の伝達阻害、大量投与による致死作の還元物質も多く含まれており嫌気性菌が発育しや用や脳幹部の呼吸中枢の障害等が知られている。エ

すく、また加熱調理後に同一容器内に大量に詰め込

ンテロトキシンに対する感受性は回腸が最も高く、んで数時間以上放置されていたことが食中毒発生に次に空腸、十二指腸であり、小腸後部ほど感受性が関与している。

高くなる。なお、FDA によるとヒトの本菌感染菌

また、ウエルシュ菌食中毒の発生要因は、食品の量は 10 / ヒト以上とされている。

（ 16 ）

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では SC 寒天（混釈培養、（要重層））：37 ± 1℃、20 ±Ⅱ. 検査法2 時間、嫌気培養、③ BAM では TSC 基礎寒天（混釈培養）または卵黄加 TSC 寒天（塗抹培養、要重層）：
35 ± 1℃、20 ± 2 時間、嫌気培養、④の FSIS では

1. 検査法の流れ

卵黄加 TSC 寒天（塗抹培養（要重層））：35℃、24 時

食品のウエルシュ菌の検査方法は、①食品衛生検査指針・微生物編（2015）、② ISO7937、③ U.S.FDA
BAM、④ USDA PSIS MLG に記載されている。こ間の嫌気培養が記載されている。
3. 嫌気培養方法

こでは食品衛生検査指針・微生物編（2015）の手法
を中心に述べる。

ウエルシュ菌は偏性嫌気性桿菌である。このことから嫌気培養が必要となる。

本菌の検査方法は図 1 に示したように、検査試料

1）嫌気培養法はグローブボックスを用いる方法（平は熱処理後チオグリコール培地に接種し、増菌培養

沢製作所など）：混合ガス（炭酸ガス 10％＋水素し、選択分離培地に塗抹し、嫌気培養を行う。単離10％＋窒素ガス 80％または炭酸ガス 10％ ＋窒したコロニーは再度単一のコロニーとする。

素ガス 90％）純窒素ガスがある。

単離コロニーは増菌後、ウエルシュ菌抗血清含有2）ガス発生袋を用いる方法：嫌気ジャーまたはガスろ紙を埋め込んだ卵黄寒天培地に、そのろ紙と直角発生袋用パウチ袋になるように菌を画線塗抹し嫌気培養を行う。形成ガス発生袋（OXOID、三菱ガス化学）、嫌気性された集落の周辺に真珠色の不透明帯が観察され、インジケーター。使用方法はガス発生袋を嫌気

ウエルシュ菌抗血清含有ろ紙の周辺で阻止されれジャーに入れ、ふ卵器の中に入れて培養する（嫌ば、ほとんどの場合ウエルシュ菌と同定できる。こ気ジャーの大きさとガス発生袋は嫌気ジャーのれらの菌をヒツジ血液寒天培地に塗抹し、嫌気培養大きさにあわせる。）。

を行うと溶血環が認められる。この溶血環は本菌の確認に役立つ。本菌の完全な同定のためには表 2 の性状を調べる必要がある。A 型ウエルシュ菌のさら

3）混合ガスと嫌気ジャーを用いる方法
4. 遺伝子診断法

7）に厳密な試験は型別抗毒素血清（Wellcome 社製）のPCR 法と Real time PCR 法：PCR 法はウエルシュ中和能を利用して、マウス致死試験かモルモット皮菌毒素遺伝子の検出のキットが市販されている（タ内試験で毒素型別を行う必要がある。また、Hobbsカラバイオ株式会社）。また、エンテロトキシン非型別には、1 ～ 17 の 17 型の型別血清が市販されて産生の菌株が食中毒をおこすことが明らかとなり、いる耐熱性 A 型ウエルシュ菌型別キットである『耐その遺伝子も同定され BEC（binary enterotoxin of

熱性 A 型ウエルシュ菌免疫血清「生研」』を利用でClostridium perfringens）と命名されたが、この遺伝きる。ウエルシュ菌のエンテロトキシンの検出には

8）
子 は becAB、becA、および becB 遺伝子でありこれ細菌毒素検出キットである『PET-RPLA「生研」』をらについても PCR 法による遺伝子の存在を試験す

使用して逆受身ラテック凝集反応により検査できることは重要である。さらに Real time PCR 法はいる。このほかに酵素抗体法でも実施できる。

くつかの研究論文が存在しているので調査研究後、利用すると良い。

2. 分離用培地
選択分離培地は、①の食品衛生検査指針ではハン5. 簡易・迅速診断法としてのイムノクロマト法

ドフォード改良培地（46℃）
、パウチ法（図 2）、卵黄

イムノクロマト法は、検体中の抗原が金コロイド

加 CW 寒天培地：37℃、塗抹培養、TSC 寒天培地

標識特異抗体と結合してシート上を移動し、シート（Oxoid Merck）：35℃、塗抹／混釈、なおカナマイ上部に固相化された抗体に捕捉されて、金コロイドシン低耐性ウエルシュ菌による食中毒菌が出現して由来の赤色の線が現れることにより抗原の検出がでいることから、カナマイシンに変わってシクロセリきる。また、青色のラテックスで標識した抗体を利ンを使用した培地も検討する必要がある。②の ISO用したイムノクロマト法のキットもある。これらの（ 17 ）

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検査試料

直接または加熱処理、あるいは両方増菌培養（37℃, 16時間）

C.perfringens菌数測定
（推定）

グラム染色

C.perfringensの分離

生化学性状試験

血清型別試験

エンテロトキシン産生試験・毒素型別

図 1 C.perfringens の一般的分離・同定手順
食品

10倍希釈試料 10ml

ハンドフォード改良培地 15ml
パウチ袋の中で混和

混和後パウチホルダーに入れ薄く固化
開口部を完全にシール

ハンドフォード改良培地

組成（L）
酵母エキス
8.0g
ペプトン
25.0g
大豆ペプトン8.0g
クエン酸鉄アンモニウム 1.5g
メタ重亜硫酸ナトリウム 1.5g

46℃ 24時間嫌好気培養
1～3mmの黒色集落を推定ウエルシュ菌と判定（必要に応じ同定試験を実施）

図 2 パウチ法による C.perfringens 定量試験

方法は操作が簡便で、個人により結果・判定が異な間は 1 時間以内であり、インターナルコントロールることが少なく、特別な機器も必要としないので、（IC）を共増幅することにより増幅阻害による偽陰熟練した技術者のいない規模の小さい検査室にも適性を防止している。

している。通常、選択増菌培養を行ってから使用するので、そのキットに最適な選択増菌培養培地を使用して適切な培養条件で培養し、検出に必要な菌数レベルまで増菌させることが重要である。そのためには、イムノクロマトのキットと最適化された選択増菌培地がセットで開発、販売されているものを使用することが勧められる。
ウエルシュ菌については、核酸クロマトのスイフ
トジーン CPE 産生ウエルシュ菌「カイノス」（株式会社カイノス）が市販されている。本クロマトはエンテロトキシン産生ウエルシュ菌の生菌を検出する。培養は不要で食品試料から直接標的となる核酸を抽出する。核酸抽出、増幅、検出までに要する時（ 18 ）

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