Jpn. J. Protozool. Vol. 35, No. 2. (2002)

135

Review
ゾウリムシ・ディディニウムのエクストルゾームの放出とカルシウム岩楯好昭

徳島大学総合科学部〒770-8502 徳島市南常三島町1-1

Calcium dynamics in Paramecium-Didinium system
Yoshiaki IWADATE
Department of Life Science, Faculty of Integrated Arts and Sciences,
The University of Tokushima, Tokushima 770-8502, Japan
１．はじめに原生動物細胞では，他の細胞同様に，カルシウムイオンはきわめて重要な細胞内情報伝達物質である。繊毛打方向の逆転やエキソサイトーシス，細胞骨格系の運動などカルシウムイオンによって制御される細胞機能は多岐にわたる。カルシウムイメージング法やケイジド化合物の開発など近年の新しい技術と相まって，繊毛虫を材料とした細胞内カルシウムイオンの研究はおおいに発展してきた。
さ て，肉 食 性 繊 毛 虫 デ ィ デ ィ ニ ウ ム（Didiniumnasutum）はゾウリムシ（Paramecium spp.）を特異的に認識し捕食する。このときディディニウムはゾウリムシを捕らえるためにエクストルゾーム（extrusome）を放出し，かたや，ゾウリムシもこれに応答してエクストルゾームを放出する。本稿では，ゾウリムシやディディニウムのエクストルゾームの放出とカルシウムイオンの関係について述べる。

２．ゾウリムシのトリコシスト（trichocysts）放出とカルシウム
2-1 膜融合とトリコシストの伸張
ゾウリムシのエクストルゾーム，トリコシストの放出は（１）トリコシスト膜と細胞膜の融合（２）トリコシスト本体の伸張という２段階の現象である（図１）。トリコシスト膜と細胞膜の融合は細胞内のシグ

図１ ゾウリムシのトリコシスト放出の過程。トリ
コシスト放出は，トリコシスト膜と細胞膜の融合(1)，トリコシスト本体の伸張(2) という２段階の現象である。t; トリコシスト，tm; トリコシスト膜，pm; 細胞膜。

136

原生動物学雑誌 第35巻 2002年

ナルによって誘発されるが，膜の融合の後トリコシス
ト本体は細胞外液に触れるため，トリコシスト本体の伸張は細胞外の溶液条件に依存する。
2-2 膜融合とカルシウムカルシウムの由来
細胞外液のカルシウムイオンをキレートした状態
でゾウリムシに外部から刺激を与えても，光学顕微鏡下で細胞外へ放出されたトリコシストを観察することはできない。このとき，光学顕微鏡レベルで観察しても，トリコシストの放出の過程が上記のトリコシス
ト膜と細胞膜の融合の段階で止まっているのか，あるいは，膜同士は融合しており，トリコシストの伸張のみが起きていないのかわからない。Knoll（Knoll et al.,1991）ら は ゾ ウ リ ム シ（P. tetraurelia）を AED（aminoethyldextran ポリアミン，トリコシスト放出誘発剤）で刺激し急速凍結することで，トリコシスト放出過程の細胞膜の様子を，ms の時間分解能で電子顕微鏡で観察した。彼らは，外液のカルシウムイオンをキレートした条件でも，細胞膜とトリコシスト膜の融合が起きることを確認した。Knoll et al. (1993) は，electron spectroscopic imaging を用いて，AED 刺激前後の細胞内カルシウムイオンの分布を画像としてとらえた。AED 刺激前にアルベオラサック（alveolar sacs）内に分布していたカルシウムシグナルは，刺激後，アルベオラサック内には見られず，その周辺に見られた。この結果から，細胞内のカルシウムストアとして，細胞表層のアルベオラサックが有力な候補者となっている。
一方，Kerboeuf et al., (1990) と Knoll et al. (1992) は45
Ca2+ を 用 い て，AED 刺 激 後，ゾ ウ リ ム シ（P.
tetraurelia）細胞内へ外液カルシウムイオンの流入があることを測定した。この結果は，膜融合に細胞内ストアからのカルシウム放出だけではなく外液カルシウムイオンも関与していることを示唆している。
Plattner et al. (1997) は，外液カルシウムイオン存在下と外液カルシウムイオンをキレートした時とで，膜融合の起こる頻度を詳細に計測した。外液カルシウムイオンをキレートした場合，融合口ができなくなることは無かったものの融合口のできる割合は減った。
これらの結果から，細胞膜とトリコシスト膜の融合は，細胞内ストアからのカルシウムイオンの放出のみでも起きるが，細胞内ストアからのカルシウムイオンの放出により細胞外からのカルシウムイオンの流入が誘導され，この流入が膜融合を促進させるのだと考えられる。

図２ ゾウリムシとディディニウムの捕食-被食相互作用時の細胞内カルシウムレベルの可視化。上; ゾウリムシ，下; ディディニウム。
表示時刻は双方の細胞の接触時を０ｓとしたときの時刻。ゾウリムシをディディニウムの口吻の先端に接触させると，ディディニウムの口吻の基部のカルシウムレベルが上昇し（白矢印頭），続いて，ゾウリムシのディディニウムに攻撃された箇所のカルシウムレベルが上昇する（白矢印）。スケール
バー; 30 µm。

カルシウムイメージング
さて，膜融合を引き起こすカルシウムイオンの細胞内での振る舞いをより正確に知るためには，細胞内でのカルシウムイオン濃度の時間空間的な変化を生きた細胞を用いて調べることが望ましい。Plattner ら（Erxleben et al., 1997, Klauke and Plattner, 1997, 1998,Klauke et al., 1998, Klauke et al., 2000）と我々（Iwadateet al., 1997）は，それぞれ独立に，生きたゾウリムシを使ってトリコシスト放出時の細胞内カルシウムイメージングを行った。
Plattner らは， AED の刺激によるトリコシスト放出

Jpn. J. Protozool. Vol. 35, No. 2. (2002)時の細胞内カルシウムレベルを記録した。一方，我々は，よりナチュラルに，ディディニウムとゾウリムシの接触により双方のエクストルゾーム放出を誘導したときの，細胞内カルシウムレベルを双方の細胞で同時に記録することを試みた。光学顕微鏡下でゾウリムシ（P. caudatum）とディディニウム（D. nasutum）を固定 し，双 方 に カ ル シ ウ ム 感 受 性 蛍 光 色 素 Calcium
green-1 dextran を顕微注射する。マイクロマニピュレータを使ってディディニウムの口吻先端にゆっくりとゾウリムシを接触させ，このときの蛍光強度の変化を記録した（図２）。ゾウリムシはディディニウムの攻撃により確かに攻撃された箇所で蛍光強度を上昇させた。蛍光強度の上昇はディディニウムに攻撃された箇所から細胞表層に沿って広がり，トリコシスト放出後，細胞深部まで広がりディディニウムに飲み込まれてしまうまで続いた。トリコシスト放出後続く蛍光強度の上昇は，おそらく細胞外からのカルシウムイオンの流入なのであろう。

137

トした状態で， 4-chloro-m-cresol により細胞内ストアのカルシウムイオンを枯渇させ，その後細胞を外液カルシウムイオン存在下に移すと，細胞内カルシウムレベルが上昇することを示した。トリコシスト放出時の外液からのカルシウム流入は，細胞内ストアのカルシウム枯渇による store-operated Ca2+ influx (SOC) なのかもしれない。
膜融合のカルシウムの閾値

ゾウリムシにはトリコシスト放出の他に，繊毛逆転および細胞体の収縮というカルシウムイオンによって引き起こされる細胞機能がある。いずれもカルシウムイオン濃度によって制御される機能であるにもかかわらず，これらは必ずしも同時に起きるわけではない。我々（Iwadate et al., 1999a）はケイジドカルシウムを使って，細胞全体の細胞内カルシウムレベルを人為的に上昇させ，これらの３つの細胞機能を引き起こすカルシウムレベルの閾値の違いを調べた。ゾウリムシ
細胞外からのカルシウムイオンの流入（P. caudatum）にケイジドカルシウム NP-EGTA を顕微注射し，紫外線を段階的に照射することで NPKlauke, et al. (2000) は，外液カルシウムを BAPTA で EGTA からカルシウムイオンを解放させ，段階的に細キレートした条件で，生きたゾウリムシ（P. tetraurelia） 胞内カルシウムレベルを上昇させたときの細胞の応に AED をスプレーしても細胞表層のカルシウムレベ 答を見た（図３）。NP-EGTA と共に Calcium green-1 をルが上昇することを示した。また，Iwadate and Kiku- ゾウリムシに顕微注射し，紫外線を 125 ms ずつ２回
yama (2001) は，顕微画像と蛍光強度を光路の切り替 照射すると，Calcium green-1 の蛍光強度，すなわち細えなく同時に測定できる実験系を用いて，トリコシス 胞内カルシウムレベル，は確かに２段階に上昇した。
ト放出と細胞内カルシウムレベルの関係を調べた。外 ゾウリムシの細胞機能を観察すると，１回目のカルシ
液カルシウムイオン存在下でゾウリムシ（P. cauda- ウムレベルの上昇では繊毛逆転と細胞体の収縮が起tum）にエタノールをスプレーすると，大きなカルシウ き，トリコシストの放出は起きなかった。２回目のカムトランジェントと共にトリコシスト放出が確認さ ルシウムレベルの上昇で初めてトリコシストの放出れた。一方，外液カルシウムイオンを EGTA でキレー が確認できた。この結果はトリコシスト放出の膜融合
トした状態でエタノールをスプレーすると，トリコシ を引き起こす細胞内カルシウムレベルの閾値が繊毛ストの伸張は確認できず，ごく小さなカルシウムトラ 逆転・細胞体収縮の閾値よりも高いことを示していンジェントのみを確認した。さらに，外液カルシウム る。
を薄い EGTA で一時的にキレートした場合，２相のカルシウムトランジェントが生じ，２相目のカルシウム 2-3 トリコシスト伸張とカルシウムトランジェントの最中にトリコシストの伸張が確認できた。外液のカルシウムイオンを完全にキレートし単離したトリコシストはカルシウムイオンを含むた時にゾウリムシの細胞内で観察されたカルシウム 溶液中で伸張する（Lima et al., 1989）ので，トリコシトランジェントは細胞内ストアからのカルシウムイ ストの伸張もカルシウムによって引き起こされる現オンの放出で，外液のカルシウムイオンを薄い EGTA 象である。細胞膜とトリコシスト膜の融合後，トリコで一時的にキレートした時の２相に分かれたカルシ シスト本体は細胞外液に露出されため，細胞外液のカウムトランジェントは細胞内ストアからのカルシウ ルシウムイオンによってトリコシスト本体は伸張すムイオンの放出と細胞外からの流入だと考えられる。 るのだろう。
これらの結果は，トリコシスト放出時のカルシウムトカルシウムがトリコシストを伸張させるメカニズ
ランジェントのカルシウムの由来が細胞内ストアと ムについて，Bilinski et al. (1981) は X-ray microanalysis
細胞外の両方であることを示している。
による測定を元に，トリコシストを構成しているタン
さて，Klauke et al. (2000) は外液カルシウムをキレー パク質の正電荷に結合しているリン酸（PO43-）が正電

138

原生動物学雑誌 第35巻 2002年

荷を持つ外液のカルシウムイオンによって取り除かれることで，トリコシストの急激な伸張が起きると説明した。一方，Garofalo et al. (1983) はカルモジュリンの阻害剤 TFP や W-7 がピクリン酸によるトリコシストの伸張を阻害することを観察しており，カルモジュリンの関与を示唆した。
2-4 ゾウリムシのトリコシスト放出とカルシウムのまとめ
ゾウリムシのトリコシスト放出過程は次のように考えられる。まず外部からの刺激により，細胞内カルシウムストア（アルベオラサック）からカルシウムイオンが放出される。このカルシウムイオンが細胞膜とトリコシスト膜の融合を誘導すると共に，外液からのカルシウムイオンの流入を引き起こす。膜の融合はこの外液から流入するカルシウムイオンによってさらに促進されるのかもしれない。膜の融合後外液にさらされたトリコシスト本体は外液カルシウムイオンによって急激に伸張する。
外部からの刺激がアルベオラサックからのカルシウム放出を引き起こすメカニズム，そのカルシウムチャネルの同定や外液から流入するカルシウムのチャネルの同定，また，カルシウムがトリコシスト本体の伸張を引き起こすメカニズムなど，今後の研究が待たれるところである。

３．ディディニウムのエクストルゾーム放出とカルシウム
3-1 ディディニウムのエクストルゾーム
ディディニウムの口吻の構造は Yagiu and Shigenaka（1965），Wessenberg and Antipa（1970）によって電子顕微鏡によって観察された。Wessenberg and Antipa（1970）は，ディ ディニウムの 口吻には pexicysts,

図３ ゾ ウ リ ム シ の ケ イ ジ ド カ ル シ ウ ム (NPEGTA) 光分解による細胞内カルシウムレベ
ルの変化（グラフ下のバーの黒色部が紫外線照射時）（上）と細胞の様子（下）。a; 紫外線照射前，b; １度目の照射後，c; ２度目の照射後。照射時間は 125 ms。１度目の細胞内カルシウムレベルの上昇で繊毛反転と細胞体収縮が見られ、２度目でさらにトリコシスト放出（矢印）が見られた。スケールバー; 50µm。

Jpn. J. Protozool. Vol. 35, No. 2. (2002)

139

toxicysts という２種類のエクストルゾームが格納さ は，口吻内部のカルシウムレベルの上昇が，確かにエれており，ゾウリムシの捕獲に際して，これらのエク クストルゾーム放出の原因であることを示している。
ストルゾームが２段階に放出すると結論づけた。一方，
Yagiu and Shigenaka（1965）の電子顕微鏡観察からは， カルシウムイオンの由来２種類のエクストルゾームは見られない。我々の光学顕微鏡下で観察したディディニウムのエクストル
ディディニウムは外液のカルシウムイオンをゾームの放出でも２種類のエクストルゾームは確認 EGTA でキレートした条件下でもゾウリムシを補食できなかった。従って，本稿では以下，pexicysts と する（Hara et al. 1985）。これは，ディディニウムのエtoxicysts をまとめてエクストルゾームと呼ぶことと クストルゾーム放出に必要なカルシウムイオンの出する。
所が，細胞内のストアのみであることを示唆している。ゾウリムシのトリコシスト放出に関しては，膜融
3-2 電気生理的研究
合における細胞外からのカルシウムの流入，トリコシスト本体の伸張の外液カルシウムイオン依存性が示
Hara et al.（1985) は，外液にカルシウムイオンを含 されており，ディディニウムのエクストルゾーム放出
む溶液中で，ディディニウムへ強い内向き電流を流す に必要なカルシウムイオンの出所が細胞内のストアとエクストルゾームが放出されることを見いだした。 のみであれば，ディディニウムのエクストルゾーム放一方，外液のカルシウムイオンを EGTA でキレートし 出機構がゾウリムシのトリコシスト放出機構と違った条件で内向き電流を流してもディディニウムはエ ていて興味深い。
クストルゾームを放出しなかった。この結果は，内向き電流に伴って口吻に流入したカルシウムイオンが， 3-4 補食-被食相互作用ディディニウムのエクストルゾームの放出を引き起こすことを示唆している。
ディディニウムとゾウリムシのカルシウムレベルを同時に記録した結果（Iwadate et al., 1997, 図２）から，双方のカルシウムレベルの変化を比較すると，ディ3-3 上昇箇所の検討
ディニウムの口吻基部のカルシウムレベルの上昇が，ゾウリムシのディディニウムに攻撃された箇所のカ
カルシウムイメージング
ルシウムレベルの上昇に比べて，ビデオレートで１コ
Hara ら (Hara et al., 1985) の示唆したとおり，ディ マ先立ってきた。これは，双方の細胞の接触により，ディニウムのエクストルゾームの放出が口吻のカル まずディディニウムがゾウリムシを認識しエクストシウムイオン濃度の上昇によるものであるか，我々は， ルゾームを放出し，その攻撃を受けて始めてゾウリムディディニウムのエクストルゾーム放出時に口吻で シがトリコシストを放出することを示唆している。
カルシウムイオン濃度が上昇するかどうか測定した（図２）。Calcium green-1 dextran を顕微注射したディ 3-5 ディディニウムのエクストルゾーム放出とカルシウムのまとめ
ディニウムの口吻先端にゾウリムシを接触させると，ディディニウムは口吻基部から蛍光強度を上昇させディディニウムはゾウリムシとの接触により，口吻た（Iwadate et al., 1997）。この結果はゾウリムシの口吻先端への接触がディディニウムの口吻内部のカル 基部表層のカルシウムイオン濃度を上昇させる。このシウムレベルの上昇を引き起こすことを示している。 カルシウムイオン濃度の上昇がエクストルゾームの放出を引き起こす。カルシウムイオンの出所は細胞内ストアだと思われる。ディディニウムのエクストル
顕微注射
ゾームの放出とカルシウムについてはカルシウムがディディニウムの口吻内部のカルシウムレベルの 原因であるということがわかったばかりで，ゾウリム上昇がエクストルゾーム放出の結果ではなく原因で シとの接触から口吻表層のカルシウムレベルの上昇あることを確認するため，我々は，カルシウムバッ に至る過程，カルシウムストアやカルシウムチャネルファーを直接ディディニウムの口吻に顕微注射した など，未知の部分が多く，今後の詳細な研究が待たれときディディニウムがエクストルゾームを放出する る。
ディディニウムとゾウリムシのカルシウムレベルかどうか観察した（Iwadate et al., 1999b）。カルシウムバッファーを口吻基部表層に顕微注射したとき，ディ を同時に記録した結果から，これらの補食-被食相互（１）ディニウムはエクストルゾームを放出した。この結果 作用は以下のような過程で起こると考えられる。

140

原生動物学雑誌 第35巻 2002年

ディディニウムの口吻先端とゾウリムシ（おそらく繊毛）の接触により，ディディニウムの口吻基部表層のカルシウムレベルが上昇する。（２）このカルシウムレベルの上昇によりディディニウムがエクストルゾームを放出する。（３）この強い機械的な刺激によりゾウリムシは攻撃を受けた箇所でカルシウムレベルを上昇させる。（４）ゾウリムシはトリコシストを放出する。ディディニウムのエクストルゾームの攻撃が非常に強いのとゾウリムシのトリコシスト放出よりも先立つことから，ゾウリムシはディディニウムから逃れられないのだろう。

４．終わりに繊毛虫細胞はそのサイズが大きく光学顕微鏡下での観察が容易である。また，カルシウム感受性蛍光色素やケイジド化合物など試薬の導入，紫外線の照射などに対して非常に丈夫で，細胞機能が損なわれることが少なく実験操作がやりやすい。繊毛虫細胞はエクストルゾームをはじめとして，繊毛運動など細胞機能と細胞内シグナルの非常に良い研究材料である。
エクストルゾームの放出ではカルシウムが重要な役割を果たしていることはわかったものの，カルシウムイオンのターゲットやカルシウムチャネルなどまだまだ未知のことが多い。今後，多くの研究者に繊毛虫細胞のエクストルゾームや細胞内カルシウムイオン動態の研究に興味を持っていただきたい。

参考文献
Bilinski, M., Plattner, H. and Matt, H. (1981) Secretory
protein decondensation as a distinct, Ca2+-mediatedevent during the final steps of exocytosis in Paramecium cells. J. Cell Biol., 88, 179-188.
Erxleben, C., Klauke, N., Flötenmeyer, M., Blanchard, M.P., Braun, C. and Plattner, H. (1997) Microdomain
Ca2+ activation during exocytosis in Paramecium
cells. Superposition of local subplasmalemmal calcium store activation by local Ca2+ influx. J. CellBiol., 136, 597-607.
Garafolo, R. S., Gilligan, D. M. and Satir, B. H. (1983)
Calmodulin antagonists inhibit secretion in Paramecium. J. Cell Biol., 96, 1072-1081.
Hara, R., Asai, H. and Naitoh, Y. (1985) Electrical responseof the carnivorous ciliate Didinium nasutum in response to discharge of the extrusive organelles. J.
Exp. Biol., 119, 211-224.
Iwadate, Y., Katoh, K., Asai, H. and Kikuyama, M. (1997)

Simultaneous recording of cytosolic Ca2+ levels inDidinium and Paramecium during a Didinium attack
on Paramecium. Protoplasma, 200, 117-127.
Iwadate, Y., Kikuyama, M. and Asai, H. (1999) Photolysisof caged Ca2+ induces trichocyst discharge in Paramecium caudatum. Protoplasma, 206, 11-19.
Iwadate, Y., Katoh, K., Kikuyama, M. and Asai, H. (1999)
Ca2+ triggers toxicyst discharge in Didinium nasutum. Protoplasma, 206, 20-26.
Iwadate, Y. and Kikuyama, M. (2001) Contribution ofcalcium influx on trichocyst discharge in Paramecium caudatum. Zool. Sci., 18, 497-504.
Kerboeuf, D. and Cohen, J. (1990) A Ca2+ influx associatedwith exocytosis is specifically abolished in a Paramecium exocytotic mutant. J. Cell Biol., 111, 25272535.
Klauke, N. and Plattner, M. (1997) Imaging of Ca2+ transients induced in Paramecium cells by a polyamine
secretagogue. J. Cell Sci. 110, 975-983.
Klauke, N. and Plattner, H. (1998) Caffeine-induced Ca2+transients and exocytosis in Paramecium cells. A
correlated Ca2+ imaging and quenched-flow/freezefracture analysis. J. Membr. Biol. 161, 65-81.
Klauke, N., Kissmehl, R., Plattner, H., Haga, N. and Watanabe, T. (1998) An exocytotic mutant of Paramecium
caudatum: membrane fusion without secretory contents release. Cell Calcium, 23, 349-360.
Klauke N, Blanchard M and Plattner H. (2000) Polyamine
triggering of exocytosis in Paramecium involves anextracellular Ca2+/(polyvalent cation)-sensing receptor, subplasmalemmal Ca-store mobilization andstore-operated Ca2+-influx via unspecific cation
channels. J. Membr. Biol., 174, 141-156.
Knoll, G., Braun, C. and Plattner, H. (1991) Quenched flow
analysis of exocytosis in Paramecium cells: timecourse, change in membrane structure, and calcium
requirements revealed after rapid freezing of intact
cells. J. Cell Biol., 113, 1295-1304.
Knoll, G., Kerboeuf, D. and Plattner, H. (1992) A rapid
calcium influx during exocytosis in Paramecium
cells in followed by a rise cyclic GMP within 1 s.
FEBS Letter, 304, 265-268.
Knoll, G., Grassle, A., Braun, C., Probst, W., Hohne-Zell,
B. and Plattner, H. (1993) A calcium influx is neither
strictly associated with nor necessary for exocytotic
membrane fusion in Paramecium cells. Cell Calcium,14, 173-183.
Lima, O., Gulik-Krzywicki, T. and Sperling, L. (1989)
Paramecium trichocysts isolated with their mem-Jpn. J. Protozool. Vol. 35, No. 2. (2002)

branes are stable in the presence of millimolar Ca2+.
J. Cell Sci., 93, 557-564.
Plattner, H., Braun, C. and Hentschel, J. (1997) Facilitationof membrane fusion during exocytosis and exocytosis-coupled endocytosis and acceleration of "ghost"detachment in Paramecium by extracellular calcium.
A quenched-flow/freeze-fracture analysis. J. Membr.
Biol., 158, 197-208.
Wessenberg, H. and Antipa, G. (1970) Capture and ingestion of Paramecium by Didinium nasutum. J. Protozool., 17, 250-270.
Yagiu, R. and Shigenaka, Y. (1965). Electron microscopyof the ectoplasm and the proboscis in Didinium
nasutum. J. Protozool., 12. 363-381.

141