TR-APA-P02【既報】報文：環境化学 Vol.15,No.3,pp.585-596,2005

GC-MS 法及び生物検定法によるダイオキシン類測定法のための簡易精製・濃縮法に関する検討
藤田 寛之 1）、濵田典明 2）、澤田石一之 3）、本田克久 1）
1) 愛媛大学 農学部 環境産業科学研究室 （〒790-8566 愛媛県松山市樽味 3-5-7）2) 三浦工業株式会社 三浦環境科学研究所 （〒799-2430 愛媛県松山市北条辻 864-1）
3) 愛媛大学 農学部 環境分析化学研究室 （〒790-8566 愛媛県松山市樽味 3-5-7）

Investigation of the purification / concentration method for dioxins
analysis by GC-MS and Bioassay
Hiroyuki Fujita1), Noriaki Hamada2), Kazuyuki Sawadaishi3), Katsuhisa Honda1)
1） Environmental Science for Industry, Ehime University (3-5-7 Tarumi, Matsuyama Ehime,
790-8566)2） Miura Institute of Environmental Science, MIURA Co., Ltd. (864-1, Hojo Tsuji, Matsuyama
Ehime, 799-2430)
3） Environmental Bioanalytical Chemistry, Ehime University (3-5-7 Tarumi, Matsuyama Ehime,
790-8566)

Summary
Our previous report showed that the heating (60ºC) multilayer silica gel columns, i.e., AgNO3 silica gel andH2SO4 silica gel, was useful as purification method for dioxins analysis1). In this study, further simplified- andautomated- preparation method for dioxins analysis using HRGC-HRMS and Bioassay was studied on threesuccessive steps of the purification, concentration and solvent substitution.
The results showed the best suitable condition as follow: An alumina column as concentration and solvent
substitution was set under multilayer silica gel column. Dioxins sample in hexane was applied on a top ofmultilayer silica gel column. After heating the column at 60ºC, dioxins were eluted with 60ml of n-Hexane kept
at 60ºC, and then followed by drying the alumina column with N2 gas. Thereafter, dioxins in alumina column―1―TR-APA-P02
環境化学 Vol.15,No.3,pp.585-596,2005
were reversibly eluted with 0.5ml of Toluene or DMSO solution kept at 60ºC, and determined by GC-MS or
Bioassay. This newly developed method for dioxins analysis was considered to be useful for reduction ofanalytical time, amount of solvent, and cost.

Key words:

Dioxins, Automated solvent concentration, Automated solvent substitution, GC-MS, Bioassayの効率的除去が可能である。しかしながら、精製処

1．はじめに
平成 14 年におけるダイオキシン類の排出総量は、理後の濃縮や溶媒の転溶操作が煩雑であること、ま平成 11 年に施行されたダイオキシン類対策特別措た、多層シリカゲルカラムの加熱による精製だけでは、置法に基づいて行なわれた様々な発生源対策の結試料により GC-MS 測定上の妨害成分が存在する場

果、平成 9 年に比べ 9 割以上の削減率に達した。し合があるなど未検討の部分があった。そこで、本研

かしながら、土壌や底質等については、依然として究では、GC-MS 測定及び生物検定法のための加熱

特定箇所の高濃度汚染が存在するため、汚染対策

多層シリカゲルカラム精製から濃縮までの操作が自の徹底を図ると共に、ダイオキシン類の測定やモニ

動かつ連続的にできるカラム濃縮法について検討しタリング、特に簡素化された測定分析法の開発が一たので報告する。

層求められている。しかし、現行の公定法（例えば、
JIS K0311, K03122） ）は、分析に多大な時間と費用

2．試薬等及び実験方法がかかるため、平成 16 年 12 月のダイオキシン類対2．1 試薬と試料調製及びダイオキシン類の測定策特別措置法の改正以来、国レベルでの簡易法の法
本実験で用いた多層シリカゲルカラムの化学修飾導入と開発が進められてきた。現在までに生物検定
3-6)による迅速かつ低コスト化

シリカゲルは，10％(w/w)硝酸銀シリカゲルと 44％を狙った測定分析法が提案され、そのいくつかは市(w/w)硫酸シリカゲルであり、JIS 法に準じて作成した。

販されている。しかし、いずれの測定法においても、

なお、化学修飾シリカゲルの母剤シリカゲルには、球前処理を適切に行うことは案外難しく、測定時の妨状シリカゲル 60（63〜200µm、関東化学社製）を用

害成分の除去が不十分であったり、ダイオキシン類

い、メタノールで洗浄後、130℃、12 時間乾燥させ、の濃縮操作が煩雑であるなど、未解決の部分が多く

さらにダイオキシン類ブランクの低減のために 500℃、残されている。

3 時間焼成し、使用時まで気密瓶に保存した。

法や GC-LRMS/MS 等

我々は、既報 1) において、ダイオキシン類を高精

濃 縮 カ ラ ム の 充 填 剤 に は 、 ア ル ミ ナ （ ICN ：度かつ迅速に分析測定できる手法の開発を目的としAlumina B super-I for dioxin analysis, 60-200mesh）、て、GC-MS 及び生物検定法の両測定に適用でき、グラファイトカーボンの Carbopack B と Carbopack C

しかも精製効率が高く、簡便な前処理法について検(SUPELCO 社製)及び活性炭分散シリカゲル（関東討し、多層シリカゲルカラムの加熱による精製法が有化学社製）の計 4 種類を用いて検討を行った。実験

効であることを報告した。この精製法は、従来の多層に供した充填剤の物理的特性を Table 1 に示した。

シリカゲルカラムを 60ºC に加熱した状態で試料の精濃縮カラムの評価に用いた標準液及び試料は、製処理を行うことにより、イオウや芳香族炭化水素類

ダイオキシン類標準物質、排ガス抽出試料の 2 種類

―2―

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環境化学 Vol.15,No.3,pp.585-596,2005を用いた。なお、ダイオキシン類標準物質2．2 濃縮カラムにおける吸着剤の選定（Wellington Laboratories Inc.製）は、ジベンゾパラジ

2．2．1 多層シリカゲルカラム及び濃縮カラムのオキシン及びジベンゾフランの 4-5 塩素化物、6-7 塩

作製とダイオキシン類の溶出条件検討

素化物、8 塩素化物（以下、PCDD/DFs）、コプラナー

濃縮カラムにおける吸着剤の選定を行うに当たっPCB （ 以 下 、 Co-PCBs ） が そ れ ぞ れ 1000pg/mℓ 、て、Fig. 1 に示すような実験装置を組み立てた。Fig.1

2000pg/mℓ、5000pg/mℓ、2000pg/mℓ となるようにヘキに示した実験装置の基本的操作手順は、まず多層サンで希釈し調製した。排ガス抽出試料は、焼却炉

シリカゲルカラムの最上部に試料を添加し、恒温槽 1からの排出ガス 30 検体について JIS 法に準じて採取、を 60ºC に設定し、ヘキサン 60mℓ （流速 2.5mℓ/min,

抽出したものから一定量分取し、すべてを混合したもPU-2080 型インテリジェント HPLC ポンプ，日本分光のをヘキサン（ヘキサン 300、和光純薬社製）に転溶

社製）を多層シリカゲルカラム最上部から通液させ恒したものを用いた（以下、排ガス標準液。あらかじめ

温槽 2（このとき室温程度：24±2ºC）の濃縮カラムに測定したダイオキシン類濃度は、約 1.3ng-TEQ/mℓ

連続的に通過させ、廃液ボトル(Fig.1-(h))へ排出さであった。）。

せる。その後、恒温槽 2 を 60ºC に保ち、濃縮カラム

ダイオキシン類の測定は、内標準法により行い、13を窒素により乾燥させる。続いて、恒温槽 2 を 60ºC

C12 でラベル化されたダイオキシに保持させた状態で、トルエン（GC-MS 測定用）もしン類クリーンアップスパイク、シリンジスパイク（それぞくは DMSO(和光純薬社製)（生物検定法用）を用い

れ Wellington Laboratories Inc.製）を用いた。クリーンてバックフラッシュ法（流速は 1.25mℓ/min）により濃縮

アップスパイクは、PCDD/DFs の 2,3,7,8-位塩素置換

カラムからダイオキシン類を溶出させ、測定液を調製

体 17 異性体と Co-PCBs の 12 異性体を用いた。シリする。なお、生物検定法においては精製により得ら

内標準物質として

13

13

ンジスパイクは、 C12-1,2,3,4-TeCDF、 C12-1,2,3,4,6,
13

13

れた回収液を、細胞や生体分子の働きを阻害しない

9-HxCDF、 C12-1,2,3,4,6,8,9-HpCDFs、 C12-2,2’,3,ジメチルスルホキシド（以下、DMSO）などの溶媒に4’,5゜-HxCB を用いた。

置き換えて、測定を行うのが一般的であるが、この操免疫測定には、環境試料においてダイオキシン類

作を自動化することも本研究の目的としている。

トータル TEQ 値と高い相関が見られる 2,3,4,7,8-PeC

多 層 シ リ カ ゲ ル カ ラ ム は （ Fig.1-(c) ） 、 空 カ ラ ム

DF に対して特異性を有する抗ダイオキシンモノク（10φ×150mm，ガラス製 LC 用カラム）に下層からガ

7）

ローナル抗体（京都電子工業社製）を使用した 。

ラスウール、無水硫酸ナトリウム、44％(w/w)硫酸シリ
カゲル 5.6g、10%硝酸銀シリカゲル 3.5ｇ、無水硫酸

Table 1

Physical characteristics of adsorbents

Adsorbent

Dencity (m 3 /g)

Mesh

Surface area (m 2 /g)

Carbopack B

2.8

120 − 400

100

Carbopack C

1.4

80 − 100

10

Carbon/SiO2 (dispersed)

NA

NA

300

Alumina0.95

60 − 260130

NA: not analysis―3―

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(f-1)

(b)
(a)
(c)

(g)

(l)

(d)

(i)

(f-2)

(e)

(h)
(k)

Fig. 1

(j)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(i)
(j)
(k)
(l)

Solvent reservoir (Hexane)
Solvent delivery pumpMultilayer silica gel column
2 way valve
Concentration column
Constant temperature chamber
HeaterWaste bottle
Solvent reservoir (Toluene or DMSO)
3 way solenoid valve
Sample collection vial
Nitrogen cylinder

Diagrams of the experimental equipment for sample preparation of dioxins.

―4―

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ナトリウム、ガラスウールを充填し Fig.1 における恒温

べて溶出する画分を確認した。

槽 1（Fig.1-(f-1)）に設置した。なお、60ºC の場合、多層シリカゲルカラムから、ダイオキシン類をすべて溶

2．2．2 濃縮カラムに用いる各吸着剤の精製効出させるのにヘキサン 60mℓ が必要であることが既報

率の評価

1）

各吸着剤を充填した濃縮カラムの精製効果を調より明らかとなっている。
濃縮カラムは、空カラム（7.6φ×50mm，ステンレ

べるために、排ガス標準液 5mℓ を多層シリカゲルカ

ス製 LC 用カラム）に、アルミナ 1.2g、Carbopack C

ラムの最上部に添加し、2．2．1 に記述した実験装置

0.5g、Carbopack B 0.5g、活性炭分散シリカゲル 0.5gの操作手順で前処理を行った。各吸着剤を充填したをそれぞれ充填した濃縮カラムを恒温槽 2

濃縮カラムから回収されたヘキサン通過廃液画分と、（Fig.1-(f-2)）に設置し、以下の実験を行った。

トルエンによるバックフラッシュ法により得られたダイ

濃縮カラムの充填剤の選定には、まず 4 種類の吸オキシン類画分（ここでは、2．2．1 で求めた濃縮カラ

着剤についてダイオキシン類の回収率の確認を以ムからダイオキシン類を完全に溶出させるのに必要下の方法で行った。多層シリカゲルカラムの最上部

なトルエン量で溶出した。）について、それぞれをヘにダイオキシン類標準物質 1mℓ を添加し、実験装置

キサンに転溶し、100µℓ まで濃縮後、HRGC-LRMSの操作手順に従ってトルエンもしくは DMSO のダイ

にてスキャン測定を行った。

オキシン類測定液を採取し、測定液中のダイオキシン類の回収率を求めた。つまり、バックフラッシュ法

2．3 本前処理法における濃縮カラムの妥当性評によるトルエンもしくは DMSO の通液量が 0〜5mℓ と価

6〜10mℓ の 2 画分を採取し、それぞれの画分にク

前項までの実験結果を基に、濃縮カラムの吸着剤

リーンアップスパイクを添加し、トルエンの場合につ及びダイオキシン類の回収条件を決定し、次いでそいては、2 画分とも 30µℓ まで濃縮後、HRGC-HRMS

れを基にして濃縮カラムからダイオキシン類を回収にて測定し、添加量に対するダイオキシン類標準物

する場合の繰り返し精度及び内標準物質の回収率

質の回収率を求めた。一方、DMSO の場合は、一度の確認を行うため、以下の実験を行った。排ガス標

ヘキサンに転溶させエバポレータ及び窒素気流下

準液 5mℓ を用いて 2．2．1 に記述した実験装置の操で濃縮後、シリンジスパイクを添加した。さらに 30µℓ

作手順で行い、ここでは、排ガス標準液 5mℓ にあらまで濃縮し、HRGC-HRMS にて測定し、回収率を求

かじめクリーンアップスパイクを添加した粗抽出液のめた（DMSO 溶液からヘキサン転溶する場合の内標

前処理を行った。得られたトルエン溶液は、シリンジ

準物質の回収率は、94〜109%であることはあらかじ

ス パ イ ク を 添 加 し 、 30µℓ ま で 濃 縮 し た 後 、め確認している。）。

HRGC-HRMS で測定した。一方、DMSO 溶液につ次に、バックフラッシュ法により濃縮カラムからダイ

いては、一度ヘキサン転溶させエバポレータによりオキシン類をすべて溶出させるために必要な溶媒（ト濃 縮 後 、 活 性 炭 カ ラ ム を 用 い て PCDD/DFs とルエンもしくは DMSO）量を各吸着剤の分画試験に

non-orhto-PCBs 画分及び mono-ortho-PCBs 画分により求めた。それぞれの画分のダイオキシン類量は、

分画後、それぞれの画分にシリンジスパイクを添加し、溶出液を濃縮後、先述した測定法により30µℓ まで濃縮した後、HRGC-HRMS で測定した。

HRGC-HRMS にて測定を行い、ダイオキシン類がす―5―さらに、本濃縮法が生物検定法に適用できるかに

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ついて評価するため、排ガス標準液を用いて前項の

都電子工業株式会社製）を用いた。検量線は、要領に従って前処理し、DMSO 測定液を調製した。

2,3,4,7,8-PeCDF 標準品を DMSO にて希釈したもの

測定には、バイオセンサ（DXS-600: 平衡除外免疫を測定し、2,3,4,7,8-PeCDF 濃度に対して自動的に測定法に基づく自動フロー式免疫蛍光測定計 8）、京算出されるセンサ測定値をプロットして作成した。まTable 2

Measurement and SCAN mode conditions of sample solutions by HRGC-HRMS and HRGC-LRMS.

HRGC Conditions
SCAN
DB-5MS (60m × 0.25mm I.D., 0.25µm Film)
Column70ºC, 2min − 5ºC/min → 290ºC, 14min
Oven Temp.
He: 233kPa (35cm/s, 1.5mℓ/min), Constant flow
Carrier Gas
250ºC
Inlet Temp.
Splitless (1min)
Injection Mode
TeCDDs, TeCDFs, PeCDDs, PeCDFs, HxCDDs, HxCDFs
SP-2331 (60m × 0.25mm I.D., 0.20µm Film)
Column150ºC, 1.5min − 20ºC/min → 200ºC − 2ºC/min →260ºC, 26min
Oven Temp.
He: 233kPa (35cm/s, 1.5mℓ/min), Constant flow
Carrier Gas
280ºC
Inlet Temp.
Splitless (1min)
Injection Mode
Co-PCBs, 1,2,3,7,8,9-Hexa-PCDF, HpCDDs, HpCDFs, OCDD, OCDF
RH-12MS (60m × 0.25mm I.D., 0.20µm Film)
Column150ºC, 1min − 15ºC/min → 210ºC − 3ºC/min →300ºC, 20min
Oven Temp.
He: 233kPa (35cm/s, 1.5mℓ/min), Constant flow
Carrier Gas
270ºC
Inlet Temp.
Splitless (1min)
Injection ModeMS Conditions
LRMS (JMS-K9)
Ionization Current 450µA
70eV
Ionization energy
Monitor Ions
250ºC
Source Temp.
HRMS (JMS-700S and JMS-700D)
NativeLabeled319.8965, 321.8937
331.9368, 333.9339
Ionization Current 500µA
355.8547, 353.8576
367.8949, 365.8978
Ionization Voltage 38V
270ºC
389.8157, 391.8128
401.8559, 403.8530
Source Temp.
10kV
423.7767, 4257738
435.8169, 437.8140
Accel. Voltage>10000457.7377, 459.7348
469.7779, 471.7750
Resolution
303.9016, 305.8987
315.9419, 317.9389
339.8597, 341.8568
351.9000, 353.8970
373.8208, 375.8179
385.8610, 387.8581
407.7818, 409.7789
419.8220, 421.8191
441.7428, 443.7399
453.7830, 455.7801
289.9224, 291.9194
301.9626, 303.9597
325.8804, 327.8775
337.9207, 339.9178
359.8415, 361.8385
371.8817, 373.8788
393.8025, 395.7995
405.8428, 407.8398―6―

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た、本測定時の定量下限値は、2,3,4,7,8-PeCDF 濃

クマス方式による SIM 法で行った。キャピラリーカラ度として 0.08ng/ml であった。

ムは、4 塩素化物から 6 塩素化物の PCDD/DFs には

本濃縮法の評価方法は、上記のバイオセンサに

SP-2331(Supelco 社製; 60m × 0.25 I. D., 0.25µmて希釈試験（Parallelism test）及び添加回収試験Film)を、また 7 塩化物から 8 塩化物の PCDD/DFs と（Recovery of added standard）を行った。希釈試験に

Co-PCBs に は RH-12MS(INVENTX; 60m ×

おいては、本前処理法により調製された DMSO 測定

0.25mm I. D., 0.2µm Film)をそれぞれ使用した。また、液を分取し、4 段階の希釈溶液を調製した後、バイ

GC-MS 測定条件の詳細を Table 2 に示す。

オセンサにより測定し、希釈濃度対センサ測定値の直線性の確認を行った。添加回収試験は、まず本前

3．結果と考察

処理法により調製された DMSO 測定液を分取した

3．1 濃縮カラムにおける吸着剤の選定

DMSO 液を 2 種類用意し、2,3,4,7,8-PeCDF 標準液

3．1．1 濃縮カラムからのダイオキシン類の回収を、ひとつは絶対量 0.4ng、もうひとつは 1.6ng となる率と溶出特性ように添加し、センサ測定液を調製した。その後、バ

ここでは、GC-MS 用及び生物検定法用のためのイオセンサにより測定を行い、自動的に算出されるセ

前処理における濃縮カラムに適した吸着剤を選定す

ンサ測定結果からそれぞれ 2 つのセンサ測定液中るため、ダイオキシン類の回収率及び濃縮効果につの 2,3,4,7,8-PeCDF 量を求めた。そして、あらかじめいて検討を行った。Table 3 はダイオキシン類標準物

添加した 2,3,4,7,8-PeCDF 添加量の差である 1.2ng質を用いた各吸着剤からのダイオキシン類の回収率（＝1.6−0.4ng）を 100 とした場合の 2 つのセンサ測を示した。60ºC トルエン 0〜5mℓ 画分については 4

定液の定量値の差の割合を回収率とした。

種類の吸着剤のいずれにおいても PCDD/DFs 及びnon-ortho-PCBs の回収率はほぼ 80%以上の良好な

2．4 測定に用いた分析機器等結果が得られた。一方、60ºC DMSO 0-5mℓ 画分でGC-MS SCAN 測 定 （ 質 量 測 定 範 囲 は 40 〜

は 3 種類の炭素系吸着剤におけるダイオキシン類の600m/z）は HRGC-LRMS(GC 部：Agilent HP6890

回収率は低かったが、アルミナについてはトルエン

series、MS 部：日本電子製 JMS-K9) で行った。

溶出の場合と同様にダイオキシン類の回収率は 78

GC-MS SCAN 測 定 用 キ ャ ピ ラ リ ー カ ラ ム は ，〜106%であった。これは、ダイオキシン類と炭素系

DB-5MS(J&W 社製; 60m×0.25mm I. D., 0.25µm

吸 着 剤 と の 間 の π − π 相 互 作 用 9) と 、 加 え てFilm) を 用 い た 。 ダ イ オ キ シ ン 類 の 測 定 は 、PCDD/DFs 及び non-ortho-PCBs の構造が平板構造

HRGC-HRMS(MS 部：日本電子製 JMS-700S 及びを有し、かつ疎水性であることが、ダイオキシン類とJMS-700D)によりパーフルオロケロセンを用いたロッ炭素系吸着剤の吸着を強くしているため、強い極性

Table 3

Recoveries of native dioxins in eluate from the concentration columns.
Recoveries (%) with Toluene 0-5mℓ at 60ºC

Adsorbent [g]Recoveries (%) with DMSO 0-5mℓ at 60ºC

Mono-ortho-PCBs

Non-ortho-PCBs

PCDD/DFs

Mono-ortho-PCBs

Non-ortho-PCBs

PCDD/DFs

Carbopack B (0.5g)

2 − 1384 − 9985 − 100――

6 − 53

Carbopack C (0.5g)

0−1

95 − 10289 − 970 − 0.8

15 − 33

1 − 10Carbon/SiO2 (0.5g)

24 − 7888 − 95

78 − 98

31 − 80

43 − 86

2 − 41

Alumina (1.2g)

56 − 67

84 − 9487 − 10228 − 7678 − 10086 − 106−: No data.

―7―

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環境化学 Vol.15,No.3,pp.585-596,2005を有する DMSO では炭素系吸着剤からダイオキシン

以後の DMSO による分画試験はアルミナについて類を回収しにくいと考えられる。それに対して、アルミのみ行った。Fig. 2 から分かるようにダイオキシン類

ナは DMSO との親和性が強く、また、DMSO は比較を完全に溶出させるために必要なトルエン量は、的ダイオキシン類を溶解しやすい溶媒であることから、Carbopack B と Carbopack C がそれぞれ 10mℓ、活性アルミナに吸着しているダイオキシン類を容易に脱炭分散シリカゲルが 30mℓ、アルミナが 0.5mℓ であっ

着させることができたと考えられる。さらに、吸着したた。炭素系吸着剤はアルミナと比較して、ダイオキシ

ダイオキシン類をトルエンで溶出した場合、いずれのン類溶出のためのトルエン量が 10〜50 倍必要であり、吸着剤についても mono-ortho-PCBs の回収率が低

結果として濃縮倍率は悪くなった。アルミナは、トル

かったことは、一連の多層シリカゲルカラム−濃縮カエン及び DMSO のいずれにおいても 0.5mℓ でダイラムの処理中において mono-ortho-PCBs の一部がオキシン類を完全に溶出させることが可能であった。

濃縮カラムからヘキサンにより溶出していたためと思

アルミナ、活性炭分散シリカゲル、Carbopack C のPCDD/DFs 及び non-ortho-PCBs の DMSO 溶出によわれる。
次に、Fig.2 に 60ºC トルエンのバックフラッシュ法にる異性体組成を示す Fig. 3 から、2 種の炭素系吸着

よる各吸着剤（Carbopack B、活性炭分散シリカゲル

剤は、アルミナと比較して特異的な溶出をしているこ及びアルミナ）からのダイオキシン類の溶出パターンとが伺える。つまり、炭素系吸着剤は、2,3,7,8 位塩素を示した。ここでは、Carbopack B と Carbopack C とほ

置換体 PCDD/DFs の中で 2,3,7,8-TCDF、2,3,4,7,8-と ん ど 同 じ パ タ ー ン を 示 し た た め 、 Fig. 2 で はPeCDF、2,3,4,6,7,8-HxCDF の 3 つの異性体がアルミ

Carbopack B のみ示した。また、先述した Table 3 のナに比べて溶出しやすい傾向が認められた。これは、回収率の結果から、炭素系吸着剤からのダイオキシ

1 位又は 9 位が塩素置換していない 2,3,7,8 塩素置

ン類の DMSO による完全溶出は困難であったため、

換 PCDD/DFs 異性体は、炭素系吸着剤においてダ

100

Elution rate [%]

80
60
40

Alumina
CarbopackB

0.5mℓ

20

Carbon/SiO2
30mℓ

10mℓ

0
0.1

1

10

100

Elution volume [mℓ]Fig. 2Elution patterns of PCDD/DFs from each adsorbent packed in the concentration column with 60ºC
toluene.

―8―

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イオキシンよりもジベンゾフランの方が溶出しやすく、を破過させない程度の充填量を確保する、もしくは 2

また DMSO 溶媒との親和性が塩素の置換位置の違種の吸着剤を組み合わせて使用することによっていによって異なるためと推定される。

Co-PCBs の寄与率の高い環境試料の精製法として一般に、活性炭分散シリカゲル及びグラファイト

利用が可能かもしれない。一方、アルミナは、比較的カーボンは、ダイオキシン類の吸着性能が比較的室大きい比表面積を有するが、溶出液中の異性体組

内環境（湿度など）によって影響されることが比較的成に大きな差異はなく、濃縮カラムとして優れた吸脱少なく、分離性能及び保持能力に優れている。本実着性能を持つ充填剤といえ、溶出のための溶媒量

験の結果から炭素系吸着剤の比表面積の増加と共の削減も可能である。しかし、アルミナは、室内環境にダイオキシン類の保持力が増加することがトルエン（特に、湿度など）により、吸着性能に差異が現れる

溶出の結果からも明らかであった。このことは、短時ことがあるため、安定性を維持するための管理が必

間かつ少量の溶媒で濃縮カラムからダイオキシン類要である。

を脱着させる場合の妨げとなり、最終測定液の濃縮

3．1．2 各吸着剤による精製効果

倍率を悪くし、結果的に測定感度を低下させる要因となる。また、ダイオキシン類の溶出挙動に異性体に吸着剤の選定項目の 1 つとして濃縮カラムによるよる差異が存在することは、特に生物検定法の特異精製効果を検討した。Fig. 4 は排ガス標準液を用い的反応を利用した測定系では測定値に強く影響すて実験装置にて前処理を行った場合の各種吸着剤

ると思われる。しかし、炭素系吸着剤には PCDD/DFs、における精製効果をトータルイオンクロマトグラムで

non-ortho-PCBs と mono-ortho-PCBs の分離に優れ示したものである。Fig. 4 の(a)は、多層シリカゲルカているという特徴を持つことから、mono-ortho-PCBs

ラム精製だけを行った時のヘキサン精製液のクロマ

100

Elution rate [%]

80

60

40

20

AluminaFig. 3

―9―

B
'-H

-P

eC

xC

B

B
eC

' ,5
,4

3'
,4

3,

3'
,4

,5

' ,5

' -T
,4

Elution pattern of dioxins from alumina and carbon adsorbents with 10mℓ DMSO.

3,

3'
,4

Carbopack C

,4

F

eC
B

D

-T

C
4,

4'
,5

3,

4,
2,

1,

3,

3,

DF

98,
7,

6,
4,

2,
1,

3,

O

pC
H

H
87,

7,
6,
4,

3,
2,

DF

F

pC

xC
H
8-

98,
7,

2,
1,

Carbon/SiO2

D

D

D

xC
H

xC
H
8-

7,

3,

6,
2,

1,

3,

F

F

F
D

F
7,
4,

4,

3,
2,
1,

3,
2,

xC

8-

87,

87,

2,
1,

3,

H

Pe

Pe

CD

C

CD

D

F

F

D
D

Te

C

7,
2,

3,

87,
6,

4,

1,

2,

3,

8-

H

H
98,
7,

O

D

DD
pC

D

D
xC

D

D
D
2,
1,

3,

6,
2,

1,

3,

2,
1,

3,

4,

7,

7,

8-

8-

H

H

xC

xC

CD
Pe
8-

7,
3,
2,

1,

2,

3,

7,

8-

Te
C

D

D

D

0

TR-APA-P02
環境化学 Vol.15,No.3,pp.585-596,2005
トグラムを、また、Fig. 4 の(b)〜(e)は各吸着剤からの炭分散シリカゲル及び Carbopack C においては、こダイオキシン類画分と各吸着剤のヘキサンの通過廃

れらの化合物がダイオキシン類画分からほぼ完全に液のクロマトグラムをそれぞれ示している。(b)〜(e)の除去できていた。一方、Carbopack B については、吸着剤からの通過廃液において、マススペクトル解

n-C30 以上の炭素鎖をもつ飽和炭化水素化合物の除析したところ、一定の保持時間間隔で見られるピーク

去が不十分であった。

は、直鎖状の飽和炭化水素化合物であったことから、

以上の結果から、比表面積が大きいグラファイト

これら化合物は GC-MS 測定においてロックマスへのカーボンは、高分子の飽和炭化水素化合物と平板影響やイオン化室への負荷が大きくなると考えられ構造をもつ化合物を選択的に保持しやすいため、る。また、生物検定法においては高分子の飽和炭化

PCDD/DFs と non-ortho-PCBs を含む画分に高分子

水素化合物ほど測定を妨害する可能性が高いことかの飽和炭化水素化合物が含まれることになり、測定

ら、EPA Method においては、これらの化合物の除去系に及ぼす影響が大きいことが分かった。また、本を行う必要があるとしている 6, 10-12) 。アルミナ、活性実験に用いた数種の吸着剤の中で、ダイオキシン類(a)

Eluate from Multilayer silica gel column
n-C31

Carbopack C (Dioxins fraction-Toluene 10mℓ)

(b)

n-C32

(c)

Carbopack B (Dioxins fraction-Toluene 10mℓ)

n-C32
n-C31

Carbopack C (Waste fluid-Hexane 60mℓ)

Alumina (Dioxins fraction-Toluene 0.5mℓ)

Carbopack B (Waste fluid-Hexane 60mℓ)(d)

Alumina (Waste fluid-Hexane 60mℓ)

Fig. 4

Carbon/SiO2 (Dioxins fraction-Toluene 20mℓ)(e)

Carbon/SiO2 (Waste fluid-Hexane 60mℓ)

GC-LRMS total ion chromatograms(m/z: 40-600) of flue gas sample. (a) in figure shows thechromatogram of eluate from multilayer silica gel column before treatment of concentration column.
(b)-(e) in figure shows the chromatograms of dioxins fraction (upper) and waste fluids (bottom) fromeach adsorbents.

―10―

TR-APA-P02
環境化学 Vol.15,No.3,pp.585-596,2005
画分の精製度が高いのはアルミナ、活性炭分散シリ

定法用）を用いてバックフラッシュ法によりダイオキシ

カゲル及び Carbopack C であり、クロマトグラムのン類を溶出させる。また、ここでアルミナ濃縮カラムをベースラインが最も安定しているのはアルミナである

加熱することは、乾燥時間の短縮になる。

ことが分かった。

3．2 GC-MS 及び生物検定法における本濃縮法
3．1．3 簡易前処理の最適条件とその方法の妥当性評価

3．1．1 と 3．1．2 の結果から、濃縮カラムに適切な3．1 の条件で排ガス標準液を前処理した場合の充填剤としては、回収率、濃縮率及び精製効率の面

内標準物質の回収率を Table 4 に示した。試験は 3から考慮してアルミナを使用することとした（以下、ア回繰り返し、その平均値と変動係数（%）を算出した。

ルミナ濃縮カラム）。簡易測定法のための前処理条

トルエン回収の場合、内標準物質の回収率は、件を Fig. 5 に、GC-MS 用(Fig. 5-(a))と生物検定法用

PCDD/DFs 85〜103%、 non-ortho-PCBs 98〜105%(Fig. 5-(b))に分けてフロー図に示した。前処理の手で、変動係数は 13%未満と安定した結果であった。

順としては、2．2．1 と同様である。多層シリカゲルカ

また、添加したダイオキシン類濃度 1.34ng-TEQ/mℓ

ラムにて精製を行い、続いてアルミナ濃縮カラムに連であるのに対して本前処理法により得られた値は、続的に通過させる。その後、生物検定法で妨害とな

平均 1.30ng-TEQ/mℓ であり、公定法による TEQ 値とるヘキサンの残留を完全に無くすために、アルミナ

してよく一致する結果であった。これは、排ガス試料

濃縮カラムを 60ºC に保ち、窒素により乾燥する。続は 一 般 に PCDD/DFs と non-ortho-PCBs(#126) がい て 60ºC に 保 持 し た 状 態 で 、 ト ル エ ン 0.5mℓ

TEQ 値に大きく寄与しているため 13) 、mono-ortho-（GC-MS 測定用）もしくは DMSO 0.5mℓ （生物検PCBs の回収率変動の影響をほとんど受けなかったab

Step 2. Hexane 60mℓ 2.5mℓ/min

Step 2. Hexane 60mℓ 2.5mℓ/min

Step 1. Loading sample (Hexane solution)

Step 1. Loading sample (Hexane solution)

Purification column 60ºC

Purification column 60ºC

Dioxins fraction

Step 3. Drying by N2

Dioxins fraction

Concentration column

Concentration column
Step 3. Toluene 0.5mℓ
1.25mℓ/min
60ºC

Step 4. DMSO 0.5mℓ
1.25mℓ/min
60ºC

Waste

Fig. 5

Waste

Flow charts of developed method. (a): for GC-MS, (b): for Bioassay.

―11―

TR-APA-P02
環境化学 Vol.15,No.3,pp.585-596,2005と考えられる。DMSO 回収の場合、内標準物質の回について、調製した試料溶液の希釈試験及び添加

収率は、PCDD/DFs 82〜101%、non-ortho-PCBs 71

回収試験をフロー式免疫測定計にて行い、免疫測〜73%、変動係数は 6%未満で、トルエン回収と比較

定系への影響について検討した。なお、あらかじめして non-ortho-PCBs が若干低い回収率を示した。こ

本法により調製されたブランク測定液は、添加回収

れは DMSO がトルエンに比べ極性が高く、ダイオキ試験を行った結果、使用した試薬の DMSO と同等な

シン類に対する親和性が低いためと思われるが、未回収率を示したことから、ここで用いた免疫測定系に回収の部分は比較的少なく、その変動も小さいこと影響を与えないことを確認した。

からダイオキシン類の簡易測定法としては問題ない

排ガス標準液を用いて本処理法によって得られたと考えられる。以上の結果から、本濃縮法は安定し3 種類の DMSO 液の測定を行った。ここで 3 種類のたダイオキシン類の最終測定液を調製することがで

DMSO 測定液とは、多層シリカゲルカラム精製のみきるといえる。

を行ったヘキサン溶液を濃縮乾固させ DMSO 1mℓ

最後に、本濃縮法の生物検定法への適用可能性

Table 4に溶解させたもの（以下、多層カラム液）、アルミナ濃

Recoveries and repeatability of 13C12-labeled PCDD/DFs and Co-PCBs isomers for flue gas stock
solution.

Toluene (n=3 )IsomerDMSO (n=3 )Average of recoveries (%)

RSD (%)

Average of recoveries (%)

RSD (%)

1,3,6,8-TeCDD

101

3

83

3

2,3,7,8-TeCDD

97

11

92

2

1,2,3,7,8-PeCDD

93

6

95

6

1,2,3,4,7,8-HxCDD

101

6

94

2

1,2,3,6,7,8-HxCDD

92

6

96

3

1,2,3,7,8,9-HxCDD

94

9

92

4

1,2,3,4,6,7,8-HpCDD

93

1

88

5

OCDD

99

4

84

4

2,3,7,8-TeCDF

91

8

91

2

1,2,3,7,8-PeCDF

103

6

92

1

2,3,4,7,8-PeCDF

95

8

91

1

1,2,3,4,7,8-HxCDF

92

3

93

2

1,2,3,6,7,8-HxCDF

90

7

85

4

1,2,3,7,8,9-HxCDF

90

13

101

3

2,3,4,6,7,8-HxCDF

85

7

89

4

1,2,3,4,6,7,8-HpCDF

93

5

82

3

1,2,3,4,7,8,9-HpCDF

96

6

86

4

OCDF

98

3

82

3

3,4,4',5-TeCB

#81

98

5

72

8

3,3',4,4'-TeCB

#77

105

4

73

5

3,3',4,4',5-PeCB

#126

103

7

71

6

3,3',4,4',5,5'-HxCB

#169

101

2

72

7

―12―

TR-APA-P02
環境化学 Vol.15,No.3,pp.585-596,2005
縮カラムのヘキサン通過廃液を濃縮乾固させは、DMSO 測定液 100µℓ 分取の場合では 0.91ng

DMSO 1mℓ に溶解させたもの（以下、通過廃液）、及（=1.28−0.36ng）、150µℓ 分取の場合では 0.74ng

び アルミ ナ濃縮 カラ ムからバ ッ ク フラ ッ シ ュに より（=1.11−0.38ng）であった。よって、それぞれの回収

DMSO で溶出させた測定液（以下、ダイオキシン測

率 は 76% （ ＝ 0.91÷1.2×100 ： こ こ で 1.2 は 、定液）である。Fig. 6 は、多層カラム液とダイオキシン

2,3,4,7,8-PeCDF 添加量 0.4ng と 1.6ng の差）、61%

測定液それぞれの希釈試験の結果である。多層カラ（＝0.74÷1.2×100）となる。試料の分取量が 100 から

ム液の場合は、高濃度域になるに従い横ばいになり、

150µℓ と増加すると、回収率が低下することから、ア

濃度依存的な直線性が得られないことから、この測

ルミナ濃縮カラムの通過廃液中に免疫測定系に影

定液中には免疫測定系に影響を及ぼす成分が多く響を及ぼす成分が含まれていることが判明した。この含まれていることが示唆された。

成分は、多層シリカゲルカラムのみの測定液（多層カ

さらに、Table 5 は、通過廃液を用いた添加回収試ラム液）にも含まれていることは明らかであり、アルミ験結果である。測定液に 2,3,4,7,8-PeCDF 絶対量

ナ濃縮カラムによって影響成分は除去されたため、

0.4ng と 1.6ng を添加した場合、測定液の定量値の差

Fig. 6 で示すようにダイオキシン測定液は濃度依存

Concentration measured with Biosensor [ng/mℓ]

0.30

0.25

0.20

0.15

0.10

0.05

0.00
0.00

0.01

0.02

0.03

0.04

TEQ concentration measured with GC-MS [ng/mℓ]
Fig. 6

Results of parallelism test from prepared samples, the eluate from multilayer silica gel column (▲) andDMSO solution from alumina concentration column (●), in flue gas stock solution. Plotting of theassay values against sample dilutions should be straight with zero intercepts.

―13―

TR-APA-P02
環境化学 Vol.15,No.3,pp.585-596,2005
あった。

的な直線性が得られるようになったと考えられる。
以上のことから、一連の加熱多層シリカゲルカラム③ アルミナは、活性炭及びグラファイトカーボンに−アルミナ濃縮カラムによる試料の精製−濃縮法は、比べ、高分子の炭化水素化合物の除去効果がGC-MS 及び生物検定法に適用可能であり、ダイオ高かった。
④ GC-MS 法用及び生物検定法用として、濃縮カ

キシン類の測定精度の高い、しかも簡易かつ迅速な

ラ ム に ア ル ミ ナ を 用 い る こ と で 、 PCDD/DFs 、試料の前処理法として広く利用が期待できる。

non-ortho-PCBs は高い回収率と精度が得られ、要約

また、生物検定法に適用させる場合には、濃縮

本研究は，ダイオキシン類を迅速かつ簡易に分と同時に精製効果も期待できる。

析測定できる手法を開発するため、特徴的な精製カ

アルミナは、測定液の高濃縮と精製効果があるこ

ラムと濃縮カラムの 2 つのカラムからなる前処理法をとからオンカラム濃縮法に適した吸着剤であり、加熱考案した。今回は、既報で報告した加熱多層シリカ

多層シリカゲルカラム精製法とアルミナ濃縮カラム法

ゲルカラム精製法を行った後の煩雑な濃縮操作及を組み合わせることにより、GC-MS 及び生物検定法

び溶媒転溶を自動化するための濃縮カラムの充填用のための迅速かつ簡便な前処理が行えるといえる。

剤について検討を行った。その結果、以下のことが現在までに全自動で最終濃縮/測定液まで調製でき明らかとなった。

る前処理装置は開発されておらず、本研究において① アルミナ、活性炭、グラファイトカーボンの 3 種類

開発した処理方法を装置化することによりダイオキシの吸着剤はいずれも PCDD/DFs、non-ortho-

ン類測定の処理コスト及び人為的誤差の低減も期待

PCBs を定量的にカラム濃縮が可能であった。

できる。

② 活性炭、グラファイトカーボンは DMSO による脱着速度が遅かったが、アルミナではトルエン及参考文献

び DMSO によるダイオキシン類の脱着が容易で

1) 藤田寛之, 濵田典明, 本田克久：「ダイオキシン

Table 5

Recoveries of analyte (2,3,4,7,8-PeCDF) from different volumes (100 and 150µℓ) of sample spiked
with two analyte concentrations

Sample volume [µℓ]
100

150

Quantity measured [ng]Analyte added [ng]0.400.36 ± 0.02

0.38 ± 0.04

1.60

1.28 ± 0.01

1.11 ± 0.06

0.91

0.74

76%

61%

The amount of increase [ng]Recovery(b)(a)(a): The difference in quantity measured between the solution of analyte added 1.6ng and analyte added 0.4ng.
(b): Percentage recovery calculates for each sample as follows: Recovery (%)=The amount of increase [ng] / quantity expected (1.2ng) × 100―14―

TR-APA-P02
環境化学 Vol.15,No.3,pp.585-596,2005
類分析における加熱多層シリカゲル精製法の検本国）
8) Glass, R. T., Saiki, H., Joh, T., Taemi, Y., Ohmura.

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