高解像度の遺伝子解析手法を用いた
琵琶湖・淀川水系における病原細菌の一斉検出
京都大学大学院 工学研究科 中西智宏
１. はじめに
近年の温暖化や気象の極端化を鑑みれば、水道水源における微生物リスク管理の重要性が増している。飲料水の微生物リスクを評価するためには、定量的微生物リスク評価(Quantitative Microbial Risk Assessment; QMRA)手法が用いられる。QMRA ではまず対象とする病原体を決定し、水源等での濃度を測定/推定したあとに感染確率の推定を行う。しかし、水源には多種多様な病原体が存在しており、始めに対象微生物を絞ることで本当に重要な病原体を見逃してしまう可能性がある。
一方、これまで琵琶湖・淀川水系においては Campylobacter 1）や Legionella 2)といった細菌類、薬剤耐性菌 3)、ウイルス 4,5）、原虫類 6)が測定され、個々の病原体の分布調査や QMRA が行われてきた。しかし、「琵琶湖・淀川水系には潜在的にどれだけの種類の病原微生物が存在するのか？」ということは未だ明らかになっておらず、重要な病原体についての情報も乏しい。合理的な微生物リスク管理のためには、制御すべき病原微生物の多様性を正しく捉え、流域での分布特性を把握しておくことが望ましい。
上記を踏まえ、本研究では琵琶湖・淀川水系において病原細菌を網羅的に検出し、病原細菌の多様性や分布特性を把握することを目的とした。ここで、微生物の一斉検出には次世代シーケンサーを用いた網羅的な遺伝子解析が有用だが、細菌の病原性の有無を判断するには種レベルまでの高い分類解像度を備えた分析技術が必要である。そこで、本研究では 16S
rRNA 遺伝子(16S rDNA)全長を解読対象としたメタバーコーディング手法に着目し、まずは適切な分析条件を決定した。その後、決定した分析条件を桂川〜淀川水系の環境水に適用し、病原細菌の一斉検出を試みた。
２. 研究方法
2.1 標準試料に対する PCR 反応条件の決定
2.1.1 標準試料
PCR 条件の決定にあたっては、15 種の既知の細菌種が既知濃度で混合された標準試料を用いた。具体的には、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 (NBRC）から標準 DNA（DNA-Mock001）を購入した。その細菌種の組成と混合割合を表 1 に示す。この標準試料を鋳型として、2.1.2 に示す様々な反応条件で PCR 増幅を行った。
2.1.2 PCR 増幅とライブラリ調製、シーケンシング
上記試料を適宜希釈した後、LongAmp Hot Start Taq DNA Polymerase (New England BioLab)と16S Barcoding Kit 1-24（SQK-16S024; Oxford Nanopore Technologies 社, 以下 ONT 社）を用いて、真正細菌由来の 16S rDNA 全長を PCR 増幅した。増幅には Thermal Cycler Dice Gradient(タカラバイオ社)を使用した。アニーリング温度と伸長時間は増幅産物の細菌組成に影響しうる重要なパラメータであると判断し、アニーリング温度を 50, 55, 60 度、伸長時間を 1, 2, 3 分に設定し、25 サイクルの増幅を行った。反応液組成やその他の反応条件は原則 Barcoding kit 付

表 1 標準試料に含まれる細菌種の学名と 16S rDNA コピー数の存在割合
学名NBRC 番号Bacillus subtilis subsp. subtilis

13719T

Bifidobacterium pseudocatenulatum
Clostridium butyricum

Corynebacterium striatum

Cutibacterium acnes subsp. acnes

Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii
Staphylococcus epidermidis
Streptococcus mutans

Acinetobacter radioresistens
Bacteroides uniformisEnterocloster clostridioformis
Comamonas terrigena

Escherichia coli (K-12株)

Parabacteroides distasonis
Pseudomonas putida

16S rDNAの存在割合（理論値） (%)
10.5

113353

5.313949T

11.6

15291T

4.2

107605T

3.2

3202T

8.4100911T

6.3

13955T

5.3

102413T

6.3

1133504.21133525.313299T

7.4

3301

7.4

1138067.414164T

7.4

属のプロトコルに従った。増幅産物をビーズ精製し、2 本鎖 DNA 濃度を適宜調整した後全サンプルをプーリングしたものを Flow Cell R9.4.1(ONT 社）にロードし、MinION Mk1B(ONT 社）を用いて配列データを取得した。取得リード数はサンプル当たり 45 万〜60 万リードであった。
2.1.3 配列データの解析
ONT 社の配布する解析ソフト Guppy ver. 5.0.16 の guppy_basecaller でベースコールした後、guppy_barcoder を用いてバーコード配列に応じて検体ごとに配列データを仕分け、プライマー配列を除去した。その後、NanoCLUST7)という解析ソフトを用いてリードの品質フィルタリ
ング、リードの 5mer 頻度データの次元削減 (UMAP 法)、HDBSCAN によるリードのクラスタリング、各クラスターにおけるリードのエラー補正を経て、主たる細菌種由来の代表配列を推定した。得られた代表配列を NCBI の Refseq デー
タベースに対して BLAST 検索し、配列類似性が最上位保津峡地点にヒットした細菌種の分類群情報を取得し、種レベル下⽔までの微生物名を割り当てた。なお、NanoCLUST の解⾄処理場
析パラメータはデフォルトの値を用いた。
琵琶湖
桂川
以上のデータ解析を PCR 条件ごとに行い、標準試料に含まれる細菌種の検出精度や感度、細菌組成の妥当下⽔処理場性を評価し、最も適切な PCR 条件を選定した。
放流⼝
2.2 琵琶湖・淀川水系への手法の適用
調査対象地点を図 1 に示す。桂川の保津峡地点と宮前橋地点、さらに三川合流後の枚方大橋を対象地点とし、河川水を約 5 L 程度採水した。また、宮前橋地点よりも上流に位置する鳥羽水環境保全センター放流口で下水処理後の放流水も採水した。採水時期は 2021 年 8月〜12 月とし、計 22 サンプルを採取した。

宮前橋地点

淀川

宇治川
⽊津川

枚⽅⼤橋地点

図 1 採水地点

採水した試料は実験室に持ち帰り、孔径 0.2 µm のメンブレンフィルターを用いてろ過濃縮後、PowerSoil kit (Qiagen 社)でろ紙から核酸を抽出した。この核酸抽出液を鋳型として、2.1 で決定した PCR 条件を用いながら同様の方法でメタバーコーディング解析を行った。最後に、NanoCLUST によって同定された全細菌種の中から病原種のみを抽出した。具体的には、既報
8,9)や日本細菌学会による病原細菌リスト、BacDive データベース 10)を参考に全 1409 種からなる病原種リストを作成し、同定結果を照合することで病原種を抽出した。

３. 結果と考察
3.1 標準試料に対する PCR 反応条件の決定
アニーリング温度 50, 55, 60 度、伸長時間 1, 2, 3 分のもとで PCR 増幅し、標準試料中の細菌種を属レベルで検出した結果を表 2 に、種レベルで検出した結果を表 3 にまとめる。例えばアニーリング温度 50 度、伸長時間 2 分の条件では、標準試料に含まれる 15 種のうち 14 種が属レベルまで正しく検出でき、偽陰性となった種は 1 種、誤検出（偽陽性）された種は 1 種であった(表 2)。また同じ PCR 条件での種レベルでの同定結果(表 3)を見れば、15 種のうち 13種を種レベルまで正しく検出でき、2 種が偽陰性、6 種が偽陽性となった。適合率（検出された種のうち本当に標準試料に存在するものの割合）と再現率（標準試料に含まれる細菌種のうち実際に検出できたものの割合）、F 値（適合率と再現率の調和平均）に着目すれば、「50 度-2 分」の条件で属レベルの検出は最も良好であり、また種レベルにおいても F 値が 0.76 と最も良好（＝適合率と再現率のバランスをうまくとっている）であった。

表 2 属レベルでの同定精度と感度
アニーリング 伸長時間温度(℃)(min)
551552553502602

検出された/されなかった属の数
真陽性数
偽陽性数
偽陰性数
13221223132214111213

適合率(-)
0.87
0.86
0.87
0.93
0.92

再現率(-)
0.87
0.80
0.87
0.93
0.80

F値
(-)
0.87
0.83
0.87
0.93
0.86

再現率(-)
0.80
0.73
0.87
0.87
0.73

F値
(-)
0.75
0.71
0.76
0.760.73

表 3 種レベルでの同定精度と感度
アニーリング 伸長時間
温度(℃)
(min)
55
1552553502602

検出された/されなかった種の数
真陽性数
偽陽性数
偽陰性数
12531154136213621144適合率(-)
0.710.690.680.680.73続いて、図 2 に各条件での細菌種の相対存在割合（属レベルで表示）を示す。図中左側の「理論値」は標準試料のメーカー公表値であり、積み上げグラフがこれに近いほど真の群集構造を正しく推定できていることを意味する。Bray-Curtis 非類似度によって標準試料の組成との違いを評価すると、「50 度-2 分」の条件で 0.28 と最も小さく、他の条件よりも正しく組成を推定できていることが確認された。
以上より、検出精度と感度のみならず細菌組成の正確さという点でもアニーリング温度 50度、伸長時間 2 分という条件が最も良好な検出結果であったため、この条件を環境試料に適用することとした。
次に、表 4 に「50 度-2 分」の条件で検出された細菌種と真の細菌種の対応関係を表３に示す。大半の種は正しく検出・同定できており、真の 16S rDNA 配列に対して 99%以上の類似性で配列を推定できているものの、Bifidobacterium 由来の 16S rDNA 配列は全く検出されなかった。また、大腸菌(Escherichia coli)や Staphylococcus、Lactobacillus 由来の 16S rDNA 配列は、検出はされたものの実際とは異なる分類群情報が割り当てられ、誤検出を招いていた。特に大腸菌は属内での 16S rRNA 遺伝子の相同性が高く、たとえ 16S rDNA 全長を解読しても種の違いを正しく判別できない可能性が考えられた。このように一部の細菌種に関しては本分析手法の検出精度・感度に限界があるものの、大半の細菌種については当初の目的通り「種レベル」までの検出・同定が可能であることが確認でき、なおかつ適切な PCR 条件を決定することができた。

1.00
Genus
Acinetobacter
Bacillus
Bacteroides
Bifidobacterium
Clostridium
Comamonas
Corynebacterium
CutibacteriumEnterocloster
Escherichia+Shigella
Lactobacillus
Other
Parabacteroides
PseudomonasStaphylococcus
Streptococcus

相対存在割合value0.75

0.50

0.250.00

理論値

Mock55℃
1 min

X55.1

55℃
55℃
variable
2 min
3 min

X55.2

X55.350℃
2 min

X50.260℃
2 min

X60.2

Bray-Curtis非類似度

0.37

0.38

0.39

0.280.41

図 2 各 PCR 条件で得られた細菌組成と標準試料との非類似度

表 4 真の細菌種に対する同定結果と配列類似性（PCR 条件：アニーリング温度 50 度、伸長時間 2 分）
真の細菌種検出された細菌種

Acinetobacter radioresistens

Acinetobacter radioresistens

Bacillus subtilis subsp. subtilis

Bacillus subtilis

Bacteroides uniformis

Bifidobacterium pseudocatenulatum
Clostridium butyricumComamonas terrigena

Corynebacterium striatum

Cutibacterium acnes subsp. acnes

Bacteroides uniformis
不検出

真の配列に対する類似性 (%)
99.8
100
99.8〜99.9-Clostridium butyricum

100

Corynebacterium striatum

99.5

Comamonas terrigena
Cutibacterium acnes

100
100

Enterocloster clostridioformisEnterocloster
clostridioformis

Escherichia coli (K-12株)

Escherichia fergusonii
Escherichia marmotae
Shigella boydii
Shigella flexneri

Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii

Lactobacillus acidophilus
Lactobacillus delbrueckii

99.9

Parabacteroides distasonis

Parabacteroides distasonis

97.9〜99.4

Pseudomonas putidaPseudomonas putida

99.9

Staphylococcus epidermidis

Staphylococcus caprae
Staphylococcus epidermidis

99.9

Streptococcus mutans

Streptococcus mutans

10099.0-

3.2 琵琶湖・淀川水系への手法の適用
3.2.1 検出された病源種と同定結果の妥当性
図 3 に環境サンプルから抽出された病原種と、データベース上でヒットした参照配列との配列類似性をまとめる。下水処理場放流水を含む桂川〜淀川流域 4 地点で採取された全 22 試料から、合計 47 属 78 種が病原種として抽出された。ただし、図 3 に示すように、これらの半分程度は参照配列との配列類似性が 99%を下回っており、抽出された病源種の多くが誤検出である可能性が考えられた。環境サンプルでは標準試料に比べてはるかに細菌の多様性が高いため、シーケンシングのエラー補正やクラスターの判別が困難となったことがその原因として考えられ、データ解析方法等の改善が望ましい。以上のように検出精度には課題が残るものの、16S rDNA 全長が病源種と「ある程度」類似した配列を多く検出できている、とも考えることができる。これより、水中の病原細菌を（多少の誤検出も許容しながら）スクリーニングする上では、本分析手法は依然として有用であると考えられる。

mean_per_indentity
配列類似性(%)

0255075100species

図 3 病原種として同定された代表配列と同定先の参照配列との配列類似性(平均値)

類似性99%のライン

Ac
Ac idamine intob oco
A ac ccc
ine ter h us in
tob ae tesmo tin
A actilA cin er j ytic
Ae Ac cine etob ohns usrom ine tob act oniteaona obac cter r jun is a ter parv iillsocus
Ae Aero acch hindl s
rom mo aro eripo n
Ae nas as c hila
rhoy av
Ae mona drop iaeros ja hila
A mer on nd
Ae omo as m aei
rom na edo s s ia
Ba nas obriav
c
Ba Ba illus eroniiccc
Ba illus illus ereu
cte thu su s
C Ba ro rin btila
mp ctero ides gien issyid eloba es u gger is
cn th
Ce ter m iform iidu
C Citro ecea cosa islobClo stridi acte lapa lisum r fr gesd eu i
C tridC om ium isp ndoma amo per oricu ii
mmn friona as te ngensrs
Co test rigenoxaEh iella sterorlic bu nirnh
En Ehter rlic Ehrl ia ew etii
iob
ac hia r chia ingii
ut
En er ca min murisat
En erob ncer ntiumoategcr
En ococ ter lu enus
tedwcig
E roc usEs nter occu dura ii
ch oco s g nserich ccus ilvus
Helico H ia fer hiraba afni gus ecte a p onrii
aKle Helic cana ralve
Kle Kle bsie oba dens i
bs bsi lla cter isiel ell aelaaro sui
Le Klu qua pneu gen sgio yv sip m es
ne era neu oni
llacry m ae
Le birm ocr onia
Le gion ingh esce e
gio ell am nsen aella brun nsis
bLe Legio usa ensisng
L ion nel enLe egio ella la fe sis
gio ne ha elenell lla im ckel ii
alo pl iae
Legio Leg ngb etisoeln
L el ion acha ieelg la
Le ione pneu la lyt egio lla m ica
opnt
Mo ella waurin hila
Ne raxe ads ensi
isw slser la os orthloii
O Ne iar
ien orick dum ensistie as
Ps Pan a tsu ttsia ianateu
do oea tsug risti
P m ag am cii
Ps seud onas glom usheu
e iaodom mon erug rans
Ps ona as m inosseo a
Ps Pse udo oleo ssee
ud udo mona vora lii
Ra omo mon s pu nsanlt
R sto as s s idaaou nia m taiwa tutzeltella ann nen ri
or ito sis
Ric R nithi lilyticke icke nol ayticttstt
si
Ric a can ia be ake ad llii
tte
R Ri sia ns
Ric icke ckett con iske tts sia orii
tts iam honia
S Ri mo ass ei
Str trept ckett ntan iliae
ep oc si en
Str toco occu a sib sis
ep cc s e irictuoqu aco sli
Str ccus utetie nus
ep
to sal nsi
coc ivari scu usssuis

枚方大橋地点

宮前橋地点

下水放流口

保津峡地点

図 4 検出された病原細菌種のヒートマップ

相対存在割合3.2.2 流域における病源細菌の分布
図 4 に、検出された病原種を地点別にヒートマップで表示したものを示す。なお、横軸の細菌名の表示は属レベルでまとめている。土壌・水環境中に常在する日和見感染菌として、
Achromobacter, Acinetobacter, Aeromonas, Bacillus, Legionella, Pseudomonas などが検出された。

これらは桂川上流〜下流や下水処理放流水において高頻度で検出されており、流域内の位置関係による明確な分布の違いは見られなかった。また、動物の糞便等を由来とする病原細菌としては、Campylobacter, Clostridium, Enterobacter, Enterococcus, Klebsiella, Streptococcus などが挙げられた。これらは下水処理放流水で比較的、高頻度かつ高い相対割合で検出されていた。さらに図 5 に検出された病原種の数を地点別に示す。検出種数の中央値は、最上流の保津峡地点で 4 種、下水処理放流水で 14.5 種、宮前橋地点で 7.5 種、枚方大橋地点で 7 種となり、下水処理放流水で病原細菌の多様性が高いことがわかった。また、下水処理水の流入前後（保津峡と宮前橋/枚方大橋）で比較すれば、流入前の地点（宮前橋）で病原種数が小さかった。これより、桂川の流下過程で下水処理水が流入することによって病原細菌の汚染を受け、病原種の多様性が増している可能性が示された。
20

棒グラフ：中央値検出された病原種の数
num_of_pathogens
num_of_pathogens

20
15

sample_place

15
10
105

保津峡地点

下水放流口

宮前橋地点

枚方大橋地点






 


















50


sample_place

sample_month
08
0910
sample_month
11088月12099月
1010月
11月
1112月
12





0
図 5 検出された病原細菌の種数に関する地点別比較



４. おわりに本研究では琵琶湖・淀川水系における病原細菌を一斉検出可能とするために、まず種レベ
sample_place
ルまでの分類解像度を備えた細菌のメタバーコーディング手法を整備した。標準試料を用いた検討の結果、PCR におけるアニーリング温度 50 度、伸長時間 2 分の条件が種レベルでの検
sample_place
出精度と感度、細菌組成の正確さの観点から最適であった。さらにこの手法を桂川〜淀川水系における河川水や下水処理放流水に適用した結果 47 属 78 種の病原種が検出され、下水処
理放流水において病原細菌の多様性が特に高いこと、放流水の流入により河川水中の病原細菌の種数が増加していることが明らかとなった。
なお、環境水からの検出結果には偽陽性の可能性が高い病原種も見られたため、分析手法を今後改善することが望ましい。また、今回の河川水の採水回数には限界があり、病原細菌の詳細な分布特性（例えば地点ごとに特有の病原細菌種など）を明らかにするには至らなかったことは今後の課題である。

参考文献
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