「揺らぎと生体機能」ニュースレター
No. 4826 November, 2012
業績紹介：フォールディングの初期段階でトラップされた中間体の構造と揺らぎ
水口峰之（富山大学・A02 公募研究代表者）

態におけるαヘリックス構造を調べた。PCP-0SH のプ
ロリン変異体を 16 種類準備し、D1 状態における CD
スペクトルを測定した。プロリンは、天然状態でαヘ

論文題目："Structural characterization of a trapped folding

リックスを形成しているアミノ酸残基に導入した。プintermediate of pyrrolidone carboxyl peptidase from a

ロリン変異によってヘリックス含量が減少したことか

hyperthermophile"

ら、D1 状態でα1, α2, α3, α4, α6 ヘリックスが形成して

著者：Mineyuki Mizuguchi, Makoto Takeuchi, Shinya Ohki,

いることがわかった。

Yuko Nabeshima, Takahide Kouno, Tomoyasu Aizawa,D1 状態の PCP-0SH が存在する条件で、ANS 蛍光を

Makoto Demura, Keiichi Kawano, Katsuhide Yutani

測定すると強い蛍光が観測された。これは D1 状態に

雑誌巻号：Biochemistry 51, 6089-6096 (2012)

おいて、ゆるくパッキングした疎水性コアが存在する
ことを示している。次に、D1 状態のプロリン変異体が一般に球状タンパク質は自発的にフォールディング

存在する条件で測定したところ、Y147P 変異と A199Pするが、一部のタンパク質はフォールディングの途中

変異は ANS 蛍光を大きく減少させたが、これら２つ以で非天然構造にトラップされる。我々は、リフォール

外は ANS 蛍光にほとんど影響を与えなかった。Y147

ディングの初期段階でトラップされた中間体の構造とと A199 はα4 とα6 ヘリックスに位置する。
したがって、

揺らぎについて調べた。

D1 状態のゆるくパッキングした疎水性コアは、α4 と
α6 によって形成されていると思われる（図）。

本研究では、pyrrolidone carboxyl peptidase の Cys フ
リー変異体（PCP-0SH）を用いた。以前の研究により、天然状態の PCP-0SH には７本のβストランドからな

PCP-0SH のリフォールディングは異常に遅いことがるβシートがあり、それはα4 とα6 の間に位置しているわかっている[1]。我々は、PCP-0SH を 6 M のグアニジ（図）。我々は、D1 状態でゆるい疎水性コアを形成す

o

ン塩酸塩で変性し、その後に 4 C, pH 2.3 の条件でリるα4 とα6 は、天然構造にフォールディングする前にフォールディングさせた。この条件では、PCP-0SH は離れると結論づけた。以上の結果は、α4 とα6 の非天

リフォールディングの初期段階で中間状態（D1 状態）

然の相互作用が PCP-0SH の異常に遅いフォールディ

にトラップされる。D1 状態は単量体として存在するのングの原因であることを示唆している。

で、PCP-0SH のトラップはタンパク質凝集が原因ではないと思われる。本研究では、D1 状態の構造と揺らぎについて、NMR、CD、ANS 蛍光を用いて調べた。D1状態の主鎖連鎖帰属は、16 種類のアミノ酸選択標識と3 次元 NMR スペクトルを組み合わせることによって行った。D1 状態の 1H-15N HSQC スペクトルでは、1-113
番目のアミノ酸残基に由来するシグナルが観測された。
一方、114-208 番目に由来するシグナルは観測されなかった。これは、化学交換による広幅化（chemical

図．PCP-0SH の D1 状態の予想図．
比較のために天然構造も示した．

exchange broadening）が原因であり、114-208 残基がµsec～msec のタイムスケールで揺らいでいることを示している。一方、1-113 残基の主鎖アミドプロトンは、1H

参考文献

軸の狭い範囲にシグナルを与えた。これは、D1 状態に[1] J. K. Kaushik et al., The unusually slow relaxation

おける 1-113 残基は disorder 状態であることを示して

kinetics of the folding-unfolding of pyrrolidone carboxyl
peptidase from a hyperthermophile, Pyrococcus furiosus. J.

いる。

Mol. Biol. 316, 991-1003 (2002).

我々は、プロリンスキャン変異導入の手法で D1 状

1

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No. 4826 November, 2012
業績紹介：トラスツズマブで活性化した自己リンパ細胞を用いる新しいがん免疫療法
活性を増強した。一方、HER2 発現レベルの低い MCF-7

上岡龍一(崇城大学応用生命科学・A03 計画研究代表者）

に対する細胞傷害活性は、CD3-LAK 細胞と同レベル

論文題目："New cancer immunotherapy using autologous

CD3-LAK 細胞と同等あるいはそれ以上の増殖を示しであった。また、培養 2 週間後の総細胞数は、従来のたことから、臨床を想定した場合の治療に十分な細胞

lymphocytes activated with Trastuzumab"

数が確保できることが明らかになった。

著者： Shinichirou Nakagawa, Yusuke Matsuoka, Hideaki③ 強い細胞傷害活性を示した TTZ-LAK 細胞のメカ

Ichihara, Hitoji Yoshida, Kenshi Yoshida, Ryuichi Ueoka

ニズムを検討するために、TTZ で刺激したリンパ球を雑誌巻号：Biol. Pharm. Bull., 35, 1213–1215 (2012)

抗体染色してフローサイトメータを用いてリンパ球のポピュレーションを解析した。TTZ で刺激するリンパ乳がん患者の 20～30%が ErbB2(ヒト上皮増殖因子

球培養法により増殖したリンパ球群は、臨床で用いて受容体 2 型：HER2)を過剰発現しているとされる。

いる活性化リンパ球と比較して、細胞傷害活性能の指HER2 陽性患者は抗がん剤が効きにくく、生命予後は標となる NKG2D、TCRγδ（γδ 細胞）の発現率および不良であった。しかし、分子標的薬のトラスツズマブ

CD16＋CD56＋細胞（NK 細胞）集団の割合が上昇する（TTZ, ハーセプチン）が開発され、HER2 陽性乳がんことが確認された。

に対しての有効性が明らかにされた[1]。トラスツズマ

以上のように、in vitro において、TTZ で PBMC を刺ブは、増殖抑制や抗体依存性細胞傷害（ADCC）を引激することにより作成した TTZ-LAK 細胞は、HER2

き起こすことで、HER2 陽性がん細胞への有効性を発を発現している乳がん細胞に対して、現在臨床で用い揮することが明らかになっている[2]。一方で、第 4 のている活性化自己リンパ球 CD3-LAK 細胞よりも高い

がん治療法と言われている活性化自己リンパ球療法

細胞傷害活性を示すことが明らかになり、新しい免疫（LAK）は、患者自身の免疫能力を活用する治療法な療法として期待できる。

ので副作用は少ない。免疫療法を施していないグループと比較して生存率の向上と無再発率が高いという報興味深い結果を示す。
①我々は、TTZ による末梢血単核球（PBMC）へのcytotoxicity [%]して[3-4]、TTZ で活性化したリンパ球を用いて、新し影響を検討した。TTZ 未刺激群の PBMC と比較して刺激群の PBMC が増殖することが確認された。この結果

100

100

75

75

50

*

25
0

により、TTZ により活性化した PBMC を用いる新しい

*

1

2
donor

免疫細胞治療としての有効性が示唆された。

3

cytotoxicity [%]本研究では、筆者らのがんに関する研究をベースとい免疫細胞治療法の開発を目指した。以下に得られた

MBA-MB-453

SK-BR-3

告がある。

**
**
*

CD3-LAKTZZ-LAK

50
25
0

1

2

3

donor

図 HER2 発現乳がん細胞株に対する TTZ-LAK 細胞② TTZ により活性化した自己リンパ球（TTZ-LAK)の細胞傷害活性を用いて、HER2 発現レベルの異なる乳がん細胞株
SK-BR-3(高), MDA-MB-453(中), MCF-7(低)をターゲッ

参考文献[1] G.D. Lewis et al., Cancer Immunol. Immunother., 37,
255-263 (1993). [2] L.M. Weiner et al., Lancet, 373,
1033-1040 (2009). [3] K. Yoshida et al., Nature, 218,
977-78 (1968). [4] R. Ueoka et al., Curr. Pharm. Des., 171709-1719 (2011).

ト細胞とし、細胞傷害活性を検討した。健常ドナー3名の末梢血採血より得られた PBMC を用い、TTZ-LAK
細胞を作製した。WST-8 assay を用いて、TTZ-LAK 細胞と従来法の CD3-LAK 細胞のヒト乳がん細胞株への細胞傷害活性を比較した結果を図に示す。TTZ-LAK 細
胞 は、 CD3-LAK 細 胞 と 比較 して SK-BR-3 お よび
MDA-MB-453 乳がん細胞株に対して有意に細胞傷害2

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業績紹介：ハイブリッドリポソームのヒト大腸がん肝転移モデルマウスに対する治療効果
臓を組織学的に解析した。
HE 染色した切片観察から、

上岡龍一(崇城大学応用生命科学・A03 計画研究代表者）
松本陽子(崇城大学応用生命科学・A03 公募研究代表者）

未治療群および DMPC において、肝臓内で大腸がん細胞の著しい増殖が確認された。一方、HL-25 治療群では、転移巣はほとんど確認されなかった。次に、TUNEL
染色した肝臓組織切片を観察した。HL-25 治療群において、アポトーシス誘導に伴う DNA 断片化が明らか

論文 題目： "Intravenous injection of hybrid liposomesになった。これらの結果からアポトーシス誘導によるsuppresses the liver metastases in xenograft mouse models

治療効果が明らかになった。

of colorectal cancer in vivo"⑤CRC 肝転移モデルマウスに対して、蛍光標識

著者：Hideaki Ichihara, Motoki Hino, Masayo Umebayashi,

HL-25 を投与し、組織切片を用いて体内動態を検討しYoko Matsumoto, Ryuichi Ueoka

た。HL-25 の静注後、CRC 肝転移モデルマウスの肝臓

雑誌巻号：Eur. J. Med. Chem., 57, 143-148 (2012)における腫瘍部位への長時間の選択的蓄積が観察された（図）。

上岡らが開発したハイブリッドリポソーム（HL）はこれらの結果から、ヒト CRC 肝転移モデルマウスに[1]、は、リン脂質とミセル系界面活性剤を緩衝水溶液

対する、薬物を含まない HL のみによる治療効果が、中で超音波処理することにより調製できる。HL 自身

in vivo で初めて明らかとなった。

がアポトーシス誘導型の制がん効果を示すこと[2]、そ1hの制がん機構として“HL 自身の揺らぎ(流動性)”や“が

6h

24h

ん細胞膜の揺らぎ”が重要であることを報告している

HL-25投与
正常マウス[3]。in vivo において、担がんマウスを用いた治療実験
から延命効果が得られている[4]。さらに、生命倫理委
員会承認後の悪性リンパ腫患者に対する臨床試験において、高い安全性および延命効果が得られている[5]。
本研究では、ヒト大腸がん（CRC）肝転移モデルマ

DMPC投与CRCマウス

ウスに対する HL-25 の治療効果を検討し、以下に示す
知見が得られた。
①HL は、直径約 100nm の均一なベシクルであることが観察された。動的光散乱法からは、1 ヶ月以上安HL-25投与
CRCマウス

定であることが明らかとなった。すなわち、HL は細網内皮系への取り込みが回避可能な膜直径であり、長期間安定で、臨床応用における保存に有用であること

HL-25 の CRC 肝転移モデルマウスに対する体内動態
HL-25 は、CRC 肝転移モデルマウスの肝臓において、長時間腫瘍部位へ選択的に蓄積した。
図が明確となった。
②HL-25 の CRC 肝転移モデルマウスに対する延命効果を検討した。未治療群に対する HL 投与群の延命率は、130％ (p<0.05)、であり、高い延命効果が得られ

参考文献[1] R. Ueoka et al., J. Am. Chem. Soc., 110, 1588-1595(1988). [2] Y. Matsumoto et al., Int. J. Cancer, 115,
377-382 (2005). [3] R. Ueoka et al., Curr. Pharm. Des., 171709-1719 (2011). [4] H. Nagami et. al., Int. J. Pharm.,
315, 167-172 (2006). [5] H. Ichihara et al., Anticancer Res.,28, 1187-1196 (2008).

た。一方、DMPC に延命効果は認められなかった。
③HL-25 で治療した CRC 肝転移モデルマウスの肝臓の剖検と重量測定を行った。未治療群および DMPCにおいて、CRC 肝転移による腫瘍の腫大が確認されたが、HL-25 治療群ではノーマルと同等であり、顕著な治療効果が得られた。
④HL-25 で治療した CRC 肝転移モデルマウスの肝3

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No. 4826 November, 2012
業績紹介：カチオン性脂質含有ハイブリッドリポソームの大腸がん細胞に対するアポトーシス誘導
カチオン性脂質含有 HL は、短時間で HCT116 細胞膜

上岡龍一(崇城大学応用生命科学・A03 計画研究代表者）
松本陽子(崇城大学応用生命科学・A03 公募研究代表者）

へ融合・蓄積することが確認された。HCT116 細胞は、アニオン性のフォスファチジルセリンやシアル酸量が多いことが報告されており、カチオン性脂質含有 HLの HCT116 細胞膜に対する特異的な融合に細胞膜の物性が関与することが示唆された。

論文題目："Anti-tumor effects of cationic hybrid liposomes④ カチオン性脂質含有 HL の HCT116 細胞に対するagainst colon carcinoma along with apoptosis in vitro"

増殖抑制メカニズムを検討した。TUNEL 法による観著者： Motoki Hino, Hideaki Ichihara, Yoko Matsumoto,察では、DMPC リポソームでは、アポトーシス細胞がRyuichi Ueoka

観測されないのに対し、カチオン性脂質含有 HL で処

雑誌巻号：Biol. Pharm. Bull., 35, 2097–2101 (2012)

理した HCT116 細胞において、アポトーシス細胞が確認された。また、フローサイトによる断片化 DNA を上岡らが開発したハイブリッドリポソーム（HL）は定量したところ、濃度依存的な断片化 DNA の増大が[1]、従来の制がん剤なしに HL のみで種々のヒトがん確認された。さらに、ミトコンドリア膜電位の低下が細胞に対し増殖抑制効果を示し、アポトーシスを誘導確認され、ミトコンドリアを経由するアポトーシス誘することが明らかになっている[2]。in vivo において、

導メカニズムであることが明らかになった。

担がんマウスを用いた治療実験から延命効果が得られ

以上のように、カチオン性脂質含有 HL の大腸がん[3]、正常動物を用いた安全性試験で副作用が無いことに対する「アポトーシス誘導による増殖抑制効果」がが確認されている[4]。さらに、生命倫理委員会承認後初めて認められ、大腸がんの新しい治療薬として期待の悪性リンパ腫患者に対する臨床試験において、高いできる。

安全性および延命効果が得られている[5]。
アニオン性のがん細胞膜との相互作用を期待し、カ

DMPC

チオン性脂質(2C14ECl)含有 HL を用いて、in vitro およ

カチオン性脂質含有 HL

び in vivo における腎臓がん細胞に対する増殖抑制効果を見出している[6]。本研究では、カチオン性脂質(2C14ECl)含有 HL のヒト大腸がん(HCT116)細胞に対する制がん効果および制がんメカニズムについて検討した。以下に得られた知見を示す。
①カチオン性脂質含有 HL は、電子顕微鏡観察から
直径約 100nm の均一なベシクルの形態であることが観察された。動的光散乱法からは、1 ヶ月以上安定で

図 大腸がん細胞へのカチオン性脂質含有 HL の特異的蓄積あることが明らかとなった。以上の結果から、カチオ
ン性 HL は細網内皮系への取り込みが回避可能な膜直径であり、長期間安定で、臨床応用における保存に有用であることが明確となった。
② カチオン性脂質含有 HL の HCT116 細胞に対する制がん効果について検討したところ、50%増殖抑制濃度は、DMPC 単一リポソームの約 1/3 と低く、低濃度で同等の制がん効果が得られることが明らかとなった。
③ HCT116 細胞膜へのカチオン性脂質含有 HL の融合・蓄積を検討した。結果を図に示す。DMPC 単一リ
ポソームは、HCT116 細胞膜へ融合しないのに対し、

4

参考文献[1] R. Ueoka et al., J. Am. Chem. Soc., 110, 1588-1595(1988). [2] Y. Matsumoto et al., Int. J. Cancer, 115,
377-382 (2005). [3] R. Ueoka et al., Biol. Pharm. Bull., 23,
1262-1263 (2000). [4] H. Nagami et. al., Int. J. Pharm.,
315, 167-172 (2006). [5] H. Ichihara et al., Anticancer Res.,28 1187-1196 (2008). [6] M. Umebayashi et al., Anticancer
Res., 30 327-338 (2010).

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No. 4826 November, 2012
業績紹介：ヒアルロン酸存在下における Jack bean α-mannosidase の性状
おける HA 濃度依存的な反応性の低下は、粘度向上に

戸谷希一郎（成蹊大学理工学部・A03 計画研究代表者）

よるものと思われる。すなわち細胞外マトリクス中では、生体分子の衝突確率を正負の方向に調節する相反

論文題目："Properties of Jack bean α-mannosidase in the

した要因が共存しており、形成される網目構造の大き

presence of hyaluronan"

さと対象となる酵素分子の大きさのバランスによって、

著者：Mayumi Nakamura, Yuka Adachi, and Kiichiro Totani

当該活性への影響が揺らいでいることが示唆される。

雑誌巻号：Biosci. Biotechnol. Biochem. 76, 856-858 (2012)

この現象が網目環境場特異的なものであることを証明するために、我々は次に網目構造を形成しない高分

ヒアルロン酸 (HA) は細胞外マトリクスの構成成子モデルとして架橋していないポリアクリルアミドを、分であり、水溶液中で網目構造を形成することが知ら

酵素反応系内に添加した場合の影響を調べることとしれている。その網目の大きさは HA 濃度に依存し、分た。図 A の検討と同様の反応条件で添加剤を HA か

子量には依存しないことも報告されている。本研究でら分子量 200,000 のポリアクリルアミド (PAA-200K)

は HA 水溶液中の網目環境を、細胞外マトリクス内のに変更して加水分解活性を比較したところ、PAA 添加

反応場モデルとして用い、Jack bean α-mannosidase の濃度依存的な粘度の向上と相関して反応効率は低下し、反応性に与える影響を調べた。

HA のように添加による反応効率の向上は認められなかった (図 C, D)。

網目反応場を形成する HA として平均分子量を300,000 (HA-300K) に調節した合成品を、基質として本研究は HA が形成する網目環境が酵素を捕捉し、p-nitrophenyl α-D-mannopyranoside (pNP-Man) を用い、分子の拡散が制限された微小空間内で酵素と基質の衝Jack bean α-mannosidase の糖加水分解活性を検討した

突頻度が向上する可能性を示したものであり、生体内(図 A)。その結果、HA 非存在下の活性を基準とした場

揺らぎ反応場の存在を示唆するものと解釈できる。

合、0.05% の HA-300K の添加によって相対活性は有意に向上することが分かった。HA の添加濃度を 0.2%まで順次向上させた場合、相対活性は濃度依存的に低下したが、いずれも HA を添加しない場合の活性を超えていた。これらの反応に用いた HA 添加濃度における系内の粘度を測定したところ、粘度は HA 添加濃度依存的に向上し、0.2% 添加時には非添加時の３倍以上の粘度を示した（図 B）。粘度の向上が分子の拡散を低下させることを考慮すると、酵素反応活性も HA 濃
度依存的に低下するはずである。しかしながら図 A の結果は系内粘度に依存しない酵素反応の活性化を示している。
同様の検討を HA-1000K 存在下で行った結果、同じように HA 0.05% 存在下で活性の向上を示し、
HA 添加濃度の向上に伴って、その活性は低下する傾向が認められた。
HA 添加濃度 0.05% における反応性の向上は、酵素が網目内に捕捉されて拡散が制限されることによって、

図：ヒアルロン酸およびポリアクリルアミドの基質との衝突頻度が向上したためと解釈できる。
一方、添加による Jack bean α-mannosidase 活性と本反応場では系内の粘性の向上に伴う反応性の低下も系内粘度の変化

同時に生じており、HA 添加濃度 0.1 および 0.2 %に

5

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業績紹介：好熱性水素細菌由来シトクロム c552 二量体におけるヘムおよび N 末端αへリックスを含む領域のドメインスワッピング
きくずれ、N 末端 α ヘリックスとヘムを含む領域を別

廣田 俊（奈良先端大物質創成・A03 公募研究代表者）

分子の対応する領域とドメインスワッピングしている
ことが明らかになった（図 1）。ヘムに結合するメチオ

論文題目："Domain swapping of the heme and N-terminal

ニン残基のまわりのループで比較的強い水素結合ネッ

α-helix in Hydrogenobacter thermophilus cytochrome c552

トワークが形成されているため、HT cyt c552 二量体で、dimer"C 末端 α ヘリックスは残りのタンパク質部分から解離

著 者 ： Yugo Hayashi, Satoshi Nagao, Hisao Osuka,

しなかったと推測される。二量体では、メチオニンはHirofumi Komori, Yoshiki Higuchi and Shun Hirota

ヘム鉄に配位していたが、ヘムが属しているプロト

雑誌巻号：Biochemistry 51, 8608-8616 (2012)

マーとは別のプロトマーに属していた。HT cyt c552 単量体の熱安定性に重要なアミノ酸残基のパッキングは

好熱性水素細菌（Hydrogenobacter thermophilus, HT）

二量体でも維持され、二量体は高い熱安定性を示した。

由来シトクロム（cyt）c552 は哺乳類の cyt c よりも小さ

HT cyt c552 二量体の酸化還元電位（Em）は単量体のく（9.2 kDa）
、高い熱安定性を示す。我々はこれまで

Em（240 ± 2 mV）より少し低く、213 ± 2 mV であったに、ウマ cyt c が C 末端 α ヘリックス領域を別分子のが、高い Em は維持されていた。二量体から単量体へ対応する領域と交換（ドメインスワッピング）するこの解離反応の活性化エンタルピーおよび活性化エントとにより多量化することを明らかにした[1]。本研究でロピーは、エタノール添加により、それぞれ、140 ± 9

は、HT cyt c552 二量体の構造と機能、熱安定性についから 110 ± 5 kcal/mol、310 ± 30 から 270 ± 20 cal/(mol∙K)て調べた。

に減少した。一方、二量体から単量体への解離反応の酸化型 HT cyt c552 にエタノールを添加すると多量体

エンタルピー変化は正の値を示した (プロトマー当たが得られ、エタノール添加時の温度を 0℃から 50℃にり 14 ± 2 kcal/mol)。これらの結果は、ドメインスワッ

上げるに従って、多量体の形成量は増加した。ウマ cyt

ピングの交換領域および熱力学的性質に対して新しい

c では 40 量体以上の高次多量体が観測されるが、HT知見を与える。

cyt c552 では 5 量体までしか観測されなかった。20℃でHT cyt c552 溶液にエタノールを終濃度 60% (v/v)で加えても吸収スペクトルは変化しなかったが、50℃ではSoret 帯の極大吸収波長が 1 nm 短波長シフトし、メチ
オニン－ヘム鉄結合に由来する 690 nm の吸収帯の吸光度が減少した。この結果は、ヘム鉄に配位するメチ
オニンがエタノール添加により一部解離したことを示している。
HT cyt c552 二量体の Soret 帯の極大吸収波長は単量体と同様、410 nm に観測された。690 nm の吸収強度も単量体と二量体でほとんど変わらなかった。Cyt c552
二量体の CD スペクトルは 208 と 222 nm に負の極大

図：HT cyt c552 単量体（上、PDB: 1YNR）およびを示し、ピーク強度は単量体と類似していた。これら二量体（下、PDB:3VYM）の立体構造。

の分光学的特徴は HT cyt c552 二量体が単量体と類似した活性部位構造と二次構造を有することを示唆してい参考文献

る。X 線結晶構造解析より、HT cyt c552 二量体では、[1] S. Hirota et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 107,

Ala18、Lys19、Lys20 の位置が単量体での位置から大12854–12859 (2010).

6

「揺らぎと生体機能」ニュースレター
No. 4826 November, 2012
業績紹介：シャペロニン空洞内負電荷によるフォールディング促進効果の再検証
元島史尋（京都産業大・A03 公募研究代表者）③ タンパク質のフォールディングに伴う蛍光
anisotropy の減少は、Hartl グループの confinement
model が想定していた空洞内への放出ではなく、

論文題目："Revisiting the contribution of negative charges

空洞外への escape が原因であった（図１B）。シャon the chaperonin cage wall to the acceleration of protein

ペロニンとタンパク質との相互作用により、タン

folding"

パク質の揺らぎは抑制されていることが示された。

著者：F. Motojima, Y. Motojima-Miyazaki, and M.Yoshida④ SRKKK2 の 空 洞 内 に 閉 じ 込 め た DMMBP は

雑誌巻号：Proc. Natl. Acad. Sci. 109(39), 15740-15745

protease で切断できないという結果は再現できず、(2012)

変性状態で escape する DMMBP のほとんどが切断された。

【概要】大腸菌の分子シャペロンの一つ、シャペロニ⑤ TMAO は SRKKK2 が失った負電荷の効果を補っン(GroEL/GroES)は変性タンパク質を空洞に閉じ込めて水分子の構造形成を促すと報告された。しかし、てそのフォールディングを援助する。最近、Hartl グ

上述のように DMMBP は SRKKK2 の空洞内にループは、負電荷を正電荷に置換した single-ring GroEL

入っておらず、この結果は誤りであった。

(SR1)の変異体(SRKKK2)がフォールディング促進活性⑥ SRKKK2 は Rubisco を全くフォールドできないとを失っていることを理由に、シャペロニン空洞内の負報告されたが、彼らの処理条件では活性のある

電荷がフォールディングに必要な水分子の構造形成に

Rubisco dimer が形成できないことが判明し、我々必要であると報告した

1,2の処理条件では dimer が形成しフォールドできた。

。しかし、我々が発見した

3

out-of-cage folding （変性タンパク質がシャペロニン空A

洞外へ遊離した後、自発的フォールディングする）が

B

SRKKK2 で起こっている可能性が考えられ、検証を行った。予想通り、彼らの主張の根拠である DMMBPのフォールディングは out-of-cage folding によるものであった（結果②～⑤）。また SRKKK2 がフォールディ
ングできないとされた藍藻由来 Rubisco はフォール
ディングが可能であることも分かった（結果⑥）。したがって、彼らの主張は誤りであると結論づけた。さらにシャペロニン援助フォールディングは
single-turnover の条件で、tethering model3 を基に解析す

図 1 ． (A) シ ャ ペ ロ ニ ン で フ ォ ー ル デ ィ ン グ 後 のる必要があることがわかった。

DMMBP のゲル濾過解析。グアニジン塩酸の影響で【結果】本研究で分かった彼らの実験の問題点を以下90%以上の DMMBP がシャペロニン複合体から遊離しに列挙する。

ている。(B)蛍光標識 DMMBP のフォールディングに① SR1 に GroES は安定して結合していると報告されおける蛍光 anisotropy 変化。グアニジン塩酸の代わりていたが、実際には GroES は結合・解離を繰り返に尿素を用いた。Free: native DMMBP, SR1 in cage：精していた。
彼らはこれまで single-turnover でフォー製した SR1/DMMBP/GroES 複合体。

ルディング反応を観察していなかったことが判明。
[1] Tang Y.C., et al. Cell 125, 903-914 (2006)② DMMBP は SRKKK2 の空洞内でフォールディン
グされたと考えられていたが、実際にはほとんど[2] Chakraborty K., et al. Cell 142, 112-122 (2010)の変性 DMMBP は SRKKK2 の空洞外に escape し、[3] Motojima, F., et al. EMBO J. 29: 4008-4019 (2010)

自発的にフォールディングしていた（図１A）。

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「揺らぎと生体機能」ニュースレター
No. 4826 November, 2012
北原グループの北沢氏が NMR 討論会若手ポスター賞を受賞
北原 亮（立命館大薬学・A01 公募研究代表者）

析を進めてきた北沢氏の努力の結果であり、指導者としても光栄です。
彼の博士課程における研究テーマは、高圧力下で発平成 23 年 11 月 8 日（木）から 10 日（土）まで、見されたユビキチンの高エネルギー状態をアミノ酸変

愛知県名古屋市のウインクあいちで開催された第 51

異という一般的手法で安定化し、精密な立体構造解析

回 NMR 討論会において、公募研究班員である報告者

や機能解析を進めるというものです。北沢氏は、H23（A01 班、立命館大学・薬学部）グループの北沢創一

年度にはユビキチンの準安定状態 N2 のアミノ酸変異郎氏（博士後期 2 年）が、NMR 討論会若手ポスター

による安定化に成功し蛋白質科学会にて若手ポスター賞を受賞しました。また受賞者には、3 日目に受賞講賞を受賞いたしました。今回は、高圧力 NMR 測定に演の機会が与えられました。受賞演題は、「ユビキチン

より N2 構造が 15％から 70％にまで増幅されているの高エネルギー状態 N2 の立体構造解明」です。今大ことを示し、
さらに N2 状態を模倣した変異体の NMR会の NMR 討論会若手ポスター賞は、大学等アカデミによる精密構造解析に成功しました。ポスター発表でア部門と企業研究者部門の 2 部門よりなり、それぞれは、同 A01 班の川上先生が開発された蛋白質模型を手

6 名と 4 名が受賞されました。北沢氏は、アカデミアに、変異部位や構造転移の様子を分かりやすく解説し部門に応募し受賞となりました。膜たんぱく質の構造たため、審査員の高評価にもつながったものと感じま

揺らぎの研究、MRI や装置開発の研究などレベルの高す。模型を無償提供いただいた川上先生にお礼申し上

い演題が多い中、蛋白質の高エネルギー構造に関するげます。また共同研究者である A01 計画班の加藤晃一

演題で受賞できたのは、蛋白質科学における高エネル

先生、矢木‐内海真穂さんにもお礼申し上げます。今ギー状態の重要性が認められたためかもしれません。

後は高エネルギー状態の機能的意義の解明にも取り組

何より、博士研究のテーマとして一生懸命に実験や解む予定です。

NMR 討論会懇親会にて（左：北沢創一郎、右：北原、左下：分子模型）。
北沢氏は核磁気共鳴学会から、若手研究者渡航費助成も受けたため 2 枚の賞状をいただいた。

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「揺らぎと生体機能」ニュースレター
No. 48
November 26, 20１２
片岡班員らの研究成果が Web で紹介される
A02 班、計画研究代表者の片岡幹雄博士（奈良先端科学技術大学院大学）と同グループの上久保裕生博士（連携研究者）及び米国 NIH の Philip Anfinfud 博士のグループの共同研究により、イェロープロテインの 100 ピコ秒時
間分解能Ｘ線結晶構造解析が行われ、反応に伴う構造変化の詳細が明らかになりました。特に、発色団のトラン
ス型からシス型への異性化の中間状態（90°ねじれた発色団構造）を世界で初めて明らかにしました。この成果が平成 24 年 11 月 9 日付産経新聞の Web ニュース【ベテラン記者のデイリーコラム・坂口至徳の科学の現場を歩く】
で紹介されました。
http://sankei.jp.msn.com/west/west_life/news/121109/wlf12110916300017-n1.htm
この他、11 月 7 日（水）付の日刊工業新聞でも紹介されています。
基となった研究は Proc. Natl. Acad. Sci. USA （early edition）に年 11 月 6 日付でオンライン公表されています。研
究内容の詳細は、後日紹介する予定です。

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