平成7年度 研究報告 大分県産業科学技術センター

細胞融合によるアルコール耐性酵母の造成
江藤 勧
食品二L楽部

BreedingofHigh1yAlcohoi−TolerantYeastbytheCellFusionMethod
Sust甘nu ETO
FoodScienceandTechnologyDivision

要旨
麦焼酎の醸造に適した大分酵母の造成を目指して，大分酵母として期待される性質の一一つであるアルコールに高い耐性を持つ酵母を，細胞融合法で育種することを試みた．親株としては，県内で最も多く使用されている鹿児島酵母とアルコール耐性の強いワイン酵母（OC−2）を選択した。両細胞をプロトプラスト化し，電気融合法で融合させたところ，鹿児島酵母よりアルコール耐性の強い3株の融合細胞を得た．
1．緒 言

常法十に従いグルコースあるいはα−メチルグルコシ

麦焼酎は大分県の特産品となっているにも関わらず，ドを含む栄養寒天培地上でコロニーを形成させ，トリフ

その醸造には甘藷焼酎用に開発された鹿児島酵母や米焼ェニルテトラゾリウムクロライド（TTC）を含む軟寒天を酎もろみより選抜された協会焼酎酵母が用いられている重層して染色を行った。のが実状である。これに対し鹿児島県や熊本県ではそれ2．2．2酸性ホスファターゼの検出

ぞれの特産焼酎である甘藷焼酎や米焼酎に適した酵杜を栄養寒天培地上に試験株のコロニーを形成させてα−開発しそれが全県的に使用されている．このような状況

ナフチルリン酸とFastb呈uesa旦tBを含む軟寒天を重層しから県内の焼酎業界では大分麦焼酎のための大分酵母のて染色を行い酸性ホスファターゼを検出した．
2．3 パルスフィールドゲル電気泳動（PFG巨〉開発が求められている．

−一方，焼酎製造に伴い生じる蒸留粕は年間4〜5万tに達し，その48％は飼肥料として，残りが海洋投棄等

i65Vで90秒，105秒のパルス時間で各10時間，i20秒のパルス時間で12時間電気泳動を行った。

で処理されているが，ロンドン条約の批准によりこの海2．4 ■アルコ脚ル耐性試験

洋投棄が禁止される方向にある．このため蒸留柏の適正試験棟をYpD液体培地中で前培養した後，各濃度の処理，有効利用は焼酎業界にとって取り組まなければなエタノールを含むYアD液体培地に接種して振返培養装らない緊急の課題である。この間題の解決方法の一つと置（アドバンテック東洋，m−2612）で増殖能を測定して，高準度のアルコール中でも生育できる酵母を用いした。て醸造を行うことにより蒸留和自体を減量することが考2．5 栄養要求変異株の作成えられている。このことから，大分酵母の特性としてアエチルメタンスルホン酸（EMS）により変異を引き起ルコールに高い耐性を持つことも期待される．

本研究では，細胞融合法により麦焼酎の生産に適したアルコール耐性の強い酵母を造成する事を目的として，親細胞株の選定を行った後，電気融合を実施した，こした後，Nystatin処理を行って選択した・
2．6 細胞融合

酵母細胞をZymo吋ase−100Tでプロトプラストとした
後，2種類の細胞を混合し，1MHzの高周波電圧30Vを10秒印加し，2〜：∃偶のプロトプラスト鎖を形成させ

2．実験方法2．1使用菌練た後，直流パルス電圧400V，ハルス幅60〃秒を印加して融合させた．緩衝液等は既報コ1に準じて行った．

（財）日本醸造協会および（財）発酵研究所より醸造
3．実験結果及び考察用酵母を中心に購入した。
2．2 染色試験

3．1染色試験2．2．1TTC寒天重層法

入手した試験探すべてについてグルコースあるいはα−72 −平成7年度 研究報告 大分県産業科学技術センター

Tablel試験酵母抹の染色性
酪母染色試験
分 類

酵 母 名 称記号

TTC−glucose TTC−α MG
R

R

Stl−4
MKAw

R

WP

AmW
SuntoけNo．3．Disd＝eryyeast． SuW

焼酎酵母

K（〕

協会焼酎酵母宮崎酵母
泡盛酵母
ウイスキー酵母

仁l

RP

R

R

P

PR
PR

P

P＋

A．1e
Lager

PR
PR

K−7K−9K∵】i3

RR

PR

PR

清酒酵母
協会9号

協会13号

H−1

アルコール酵母 発研1号＋＋S．postoriaれUSこLager．

ビール酵母

R＋＋WP
PR

OC−2W3

PR協会3号

ワイン酵母

aCp＋◆

P

RRPPR

R：赤，P：ピンク，WP：白っぽいピンク，PR：赤っぽいピンク−メチルグルコシドを炭素漁としたTTC染色及び酸性

3．3 アルコール耐性試験

ホスファターゼの検出を行った．TTC染色の結果は，細胞融合のための親株を選定する目的で試験棟の増殖

ほぼ既報‖に準じたものとなったが，分類による判別がに対するエタノールの影響を検討し，アルコール耐性の出来るほど明確な傾向は認められなかった．これに対し指標とした．YpD培地中で前培養した試験棟を各濃度て酸性ホスファターゼ（acp）の検出結果は宮崎以外の焼のエタノールを含むYPD培地に接種し振盈培養槽で培

酎，ワイン酵母で陽性，ウイスキー，清酒，アルコール養して吸光度を測定することで酵母の増殖を測定した．

酵母で陰性という酵母の分類ではっきりとした差が出た．
（Tablel）

3．2 パルスフィールドゲル電気泳動（PFGE）
試験棟の遺伝子レベルでの分類，解析を行う目的でPFGEによる染色体の分離を試みた．今回検討したほとんどの株がSaccharomycescerevisiaeであるため顕著な差は認められなかったが，いくつかの株で第富i，Ⅸ染色体等に若二子二のシフトが見られた（F皇g旦）。

時間 （h）

0

F主g．iパルスフィールドゲル電気泳軌（pFGE）による酵母試験棟の染色体の解析

︻−JO

時間（h）

F主g2 酵母試験株の増殖に対するエタノールの影響（a）鹿児島酵軋（b）ワイン酵母OC−2…73−平成7年虔 研究報告 大分県産業科学技術センター

鹿児島酵母をはじめほとんどの試験棟がiO％以l二のエTabie2 融介細胞の染色性タノールにより増殖が抑制されたが，ワイン酵母OC−
TTC瑠！ucose TTC−αMG

2では抑制の割合が低かった（Fig．2a，b）．そこで】0％エタノール存在時の増殖抑制率をグラフにするとFig．3のようになった．これよりOC−2以外の酵母が柑％エタノールにより80％以上の抑制を受けているのに対し，

鹿児島酵母

ROCEl（Leu） WP

aCpR＋P＋＋OC−2では60％程度しか抑制されず〜 アルコール耐性

融合細胞F2PPRが比較的強いと考えられた騨

融合細胞F3PP

餉胞F5PPR＋∧U
O

R：赤，P：ピンク，WP‥白っぽいピンク，︵UO

PR：赤っぽいピンク

O
O︵Un︶

この3殊についてPFGEを行った結果，OCEl（Leu「）0ハリ︵ざ︶と鹿児島酵母の染色体パターンの中間的な性質を示し，

9︵‖O掛買象融合細胞であることが確認された坪ig4）．

﹁／ごU
⊂JA﹁
320 6 】2 用 24 30 36 42 48 54 60 66
時間 （h）

Fig．310％エタノールによる酵母試験棟の増殖抑制
3．4 栄養要求性変異株の作成
細胞融合のための親株として，県内で最も多く使用されている鹿児島酵母とアルコール耐性試験の結果有望であったワイン酵経OC−2を選定し，それぞれ変異株の作成を試みた．

当初，紫外線照射による変異誘発を行っていたが目的とする嫌が得られなかったため，EMSを変異源として用いたところOC−2のロイシン要求性変異株OCEi（Leu）を得た。鹿児島酵母については良好な変異株は得られなかったが，TTC染色の結果，OCEl（Leu）と鹿児島酵母の区別は可能であったため，正常な株を使用すること

Fig．4 PFGEによる融合細胞の染色体の解析
3．6 融合細胞のアルコール耐性試験
二王株の融合細胞のアルコール耐性ついて検討した．エタノールが存在しない条件では3株とも親株と同等の増殖を示したが，iO％のエタノール存在下では，F3についてはほぼOCEi（Leu）と同等の，F2，F5についてはOCEl札euⅧ）株と鹿児島酵母との［糾問的な性質を示した（Fig．5）■とした．

3．5 細胞融合
OCEl牲eu▼）と鹿児島酵母をZymoiyase−100Tで処理してプロトプラストとした後，2種類の細胞を混合し，電気融合髄にて融合を行った．最′ト培地上で生育する株のトート一札）ん圧1叫

内，TTC染色で正常の鹿児島酵母とは異なる染色を示

ト・−OC亡1（しeu）Aicl鍋一かF2▲i￠ほ≠したF2，F3，F5の3抹を融合細胞として分離した．この・・・・・中一F3 AIc10引‥

内F2、F5についてはacpは検出されたが，F3については検出されなかった（Table2）．これは，融合したプロトプラストから細胞壁を再生する過程で何らかの変共を起こしたものと思われる．

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72

時間 （h）

Fig．5 融合細胞の増殖に対する10％エタノールの影響
冊74−、トー各伽れtrOi

平成ア年度 研究報告 大分県産業科学技術センタ山

4． まとめ麦焼酎の醸造に適した大分酵母の造成を目的として，（4）アルコールに対する耐性は3株とも鹿児島酵母よりアルコール耐性を指標に親株の選定及び細胞融合を実施

も強く，特にF3株はOC−2に匹敵する耐性を持っていし次の結果を得た．

た．

（り入手した酵母株について増殖に対するエタノールの今後は，得られた：主抹について小仕込み試験等を実施

影響を検討した結果，ワイン酵母OC−2が他の酵母に比し，実際の麦もろみr‡】でのアルコール耐性や産生されるべてアルコール耐性が高いことが明らかとなった．

香気成分の評価を行って大分酵母と成り得るかを判断する。

（2）鹿児島酵母とOC−2の栄養要求性愛巣株を細胞融合させ，融合抹F2，F3，F5を得た．

参考文献
り酉谷尚道：醸協，77（10）648（！9S2）2）野田幸太郎，十川好志：島津評論，舶，i6叩989）（3）ニ主株の細胞は染色体を分析した結果9 融合細胞であることが確認された．

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