Technical News● LC/MS/MS による核酸医薬品の不純物分析

TN523

Impurity Analysis for Oligonucleotides by LC/MS/MS[概要]
核酸医薬品（オリゴ核酸）の製造方法のひとつである固相法では、アミダイトを出発原料とし、固相担体上で合成サイクルを繰り返した後、合成された核酸医薬品の固体担体からの切り出し・脱保護を経て、液体クロマトグラフィー精製を行います。この合成法では、最終生成物に含まれるオリゴヌクレオチド類縁物質の物理的化学的性質が目的成分と類似しているため、さらなる分離精製が困難であることが製造上の課題となっています。このことから、出発物質を含めた原料の品質管理および反応工程の適切な管理が重要です。
当社では、LC/MS/MS で核酸医薬品、その製造工程品（クルード品）、原料などの品質評価を実施しています。本品質評価は、合成法の初期検討時の非規制試験はもとより、製造プロセス評価における承認申請用のGMP に準拠した試験など、開発段階に応じた試験水準で対応します。以下に、LC/MS/MS を用いて CpG オリゴ核酸の製造工程品に含まれる不純物を評価した事例を紹介します。
Keywords：中分子医薬品、特性解析、オリゴヌクレオチド不純物、ニューモダリティ[事例]
CpG D35 オリゴ核酸（FLP 配列：5'-G^GTGCATCGATGCAGGGG^G^G-3'；^：S 化結合；20 塩基長) の製造工程
品を LC/MS/MS 測定し、解析ソフト（BioPharma Finder™ 4.1）を用いた解析を行いました。各成分のインタ
クト質量の算出を行い、成分毎の多価イオン強度の和から各成分の相対含量を算出しました。また、インタ
クト質量および MS/MS の自動解析結果から各成分の分子組成と配列を推定し、さらに MS/MS フラグメントの理論値と測定値とを照合することで配列を確認しました。その際、面積百分率（UV）0.02％の微量不純物の構造も解析することが出来ました(Fig. 1)。
HPLC クロマトグラム（Fig.1）およびイオン強度上位 13 成分の解析結果（Table 1）を以下に示します。目
的成分 FLP 以外に、脱保護不良（No. 7、11）、塩基部分の脱落（No. 2、10)、伸長不良（No. 5、6、9)、硫化不良（No. 12)、主鎖切断由来（No. 8、13)等の不純物が確認されました。配列解析例として、主鎖切断由来不純物（No. 8：G^GTGCATCGATGCA (A14：A loss + NH3）；14 塩基長）の解析結果を Fig. 2、3 および Table
2 に示します。
当社は核酸医薬品の合成工程や精製工程の改善に資する不純物の情報を提供し、品質向上に貢献します。

Fig. 1 HPLC chromatogram of CpG D35

Table 1 13 most abundant components derived from CpG D35 oligonucleotides
No.

RT(min)

15.78

2

5.78

Fractional
Mass
Abundance Different from(%)
FLP

Mono Mass Mono Mass
Exp.
Theo.

Error
(ppm)

Sum IonIntensity

FLP

6323.9970

6324.0035-1.0

1.2E+1066.0

0G1-G20 (G Depurination)

6190.9520

6190.9547-0.4

1.2E+09

6.8-133.0488

6345.9780

6345.9854-1.2

8.5E+08

4.7

21.98196172.9775

6172.9791-0.3

3.1E+081.7-151.0244

Sequence Name

3

5.78

4

5.78

FLP (Na+)FLP (G loss)

5

5.70

G2-G205978.9600

5978.9738-2.3

2.6E+081.5-345.0297

6

5.63

T3-G205649.9120

5649.9213-1.6

2.1E+08

1.2-674.0822

77.66

G1-G20 (+ DMTr)

6626.1260

6626.1341-1.2

1.4E+080.8

302.1306

8

5.14

G1-A14 (A14: A loss + NH3)

4199.7000

4199.7061-1.5

1.3E+08

0.7-2124.2974

9

5.51

G4-G205345.8700

5345.8752-1.0

1.3E+080.7-978.1283

105.70G1-G20 (A Depurination)

6206.9520

6206.9595-1.2

1.3E+08

0.7-117.0440

115.98

G1-G20 (+isobutyryl)

6394.0380

6394.0453-1.1

1.1E+080.6

70.0418

125.67

G1-G20（PS→PO)

6308.0150

6308.0263-1.8

1.0E+08

0.6-15.9772

134.36

G1-A10 (A10: A loss + NH3)

2964.4990

2964.5036-1.6

9.7E+070.5-3359.4999

The MS response of FLP is not linear at high sample concentration. Thus fractional abundances of the other components may
be overestimated.

Fig. 2 LC/MS results of Component No. 8a.HPLC chromatogram of CpG D35 b.Extracted ion chromatogram of Component No. 8d.MS/MS spectrum of Component No. 8

C5 H 4N 5O

HOOPHO SO

C5H 5N 2O2C 5H 4N 5OOHOOPOC 5H4 N 5OOPOHOO

C4H4 N 3OOOOOOOOOPO
HOC 5H4 N5OPOHOOOPOHOC5H 5N 2O2C 4H4N3 OOOOOOOHOPOOOPOHOc.Mass spectrum of Component No. 8

C5H4N 5OOOOPHO OO

C5H 5N2O 2C5H 4N 5OPO
HOOC 4H 4N3O

C 5H4 N5OOOOO

O OPO
HOOPO
HOO
HOO
PO

NH2OH

Chemical Formula: C132H170N51O81P13SExact Mass: 4199.7061

Fig. 3 Putative structure of Component No. 8Table 2 Structure confirmation of Component No. 8#1

c-a-B 3 -a-B 2 -a-B -Sequence1344.0224

31.671748.011197.0295G

2673.0749

146.6815

220.5260

442.0592^Gw4 -w3 -

w2 -

w-x-

#2
14

986.6477

1315.8660 1974.3027 3949.6126 3931.6021

133

977.1210

256.3657

385.0522

771.1117T

900.3903

1200.8561 1801.7878 3604.5829 3586.5724

1241306.1735

357.7144

537.0752

1075.1577

G

824.3788

1099.5075 1649.7648 3300.5369 3282.5263

1151595.2198

467.3986

701.6015

1404.2103

C

742.1156

989.8233

1485.2386 2971.4844 2953.4738

1061908.2775

563.7474

846.1247

1693.2566

A

669.8540

893.4745

1340.7154 2682.4380 2664.4274

972212.3235

668.0999

1002.6535 2006.3142

T

591.5896

789.12201184.1866 2369.3804 2351.3698

882501.3699

769.4486

1154.6765 2310.3603

C515.5781

687.7733

1032.1635 2065.3344 2047.3238

792830.4224

865.7974

1299.1997 2599.4066

G

443.3165

591.4245

887.6404

1776.2880 1758.2774

6103143.4800

975.4815

1463.7259 2928.4592

A361.0534

481.7403

723.11411447.2355 1429.2249

5113447.5260 1079.8341 1620.2547 3241.5168

T282.7890

377.3878

566.5853

1134.1779 1116.1673

4123776.5785 1181.1827 1772.2778 3545.5628

G206.7775

276.0391

414.5623

830.1318

812.1213

3134065.6249 1290.8669 1936.8040 3874.6153

C124.5144

166.3549

250.0360

501.0793

483.0688

2

NH 3

52.252870.0061105.5128

212.0329

194.0224

1

14

The sequence-defining fragments identified from MS/MS results are highlighted in yellow. Error<5 ppm

お問い合わせ先
技術事例：https://www.scas.co.jp/contact/ （株式会社住化分析センター）：https://www.scas.co.jp/technical-informations/technical-news/
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