「揺らぎと生体機能」ニュースレター
No. 2027 July, 2010
業績紹介：機能の無くなる(揺らぎの静まる)速度は？
寺嶋正秀（京都大院理・A01 計画研究代表者）には数マイクロ秒で共有結合が生成する過程が立ち上がりとして観測されるが、逆反応には見られない。これは共有結合解裂がピコ秒の早い時間スケールで完了

論文題目：" When is the helix conformation restored after

していることを示している。ミリ秒領域での構造変化

the reverse reaction of Phototropin? "を表す信号は両過程で似ているが、詳細な解析による

著 者 ： Y.Kawaguchi, Y. Nakasone, K.Zikihara, S.

と屈折率変化の符号が逆であり、順反応ではヘリック

Tokutomi, M.Terazima

スの崩壊が、逆反応ではヘリックス生成が観測されて

雑 誌 巻 号 ： J.Am.Chem.Soc.(Communication),132,いることが分かった。更に、逆反応の信号の時間変化

8838–8839(2010).

を測定し、このヘリックス形成速度を求めたところ、10 ミリ秒ほどと Unfolding 過程よりも遅いものであった。ヘリックス形成速度は種々のポリペプチドで報告

フォトトロピン(Phot)は、多くの植物が持つ代表的なされており、サブマイクロ秒から数マイクロ秒で完了

青色光センサータンパク質である。Phot は、LOV ドメすることがほとんどである。実験前には Phot のヘリッインと呼ばれる光受容を担うドメインを２つ有していクスもこれらの速度で巻き戻るものと予想していたが、る。その光反応は多くの興味を集め、詳細な研究がな

結果は４桁以上遅いものであった。これは LOV ドメされてきた。それによると、発色団 FMN の光励起後、インがヘリックスのテンプレートとして働いており、数マイクロ秒で FMN とタンパク質部分との間で共有

まさに揺らいでいる変性タンパク質が折り畳まれる過結合が作られ、その後約 100 マイクロ秒ほどで、LOV程を再現していると考えられる。

に疎水結合でついているリンカーと呼ばれるヘリック
ス構造をもった部分が LOV から解離する。その解離に続いて、数ミリ秒でそのヘリックス構造が壊れ(図1)、それによって C 末にあるキナーゼドメインが活性化し、生理学的な機能を発揮する。この活性状態は数分続き、その後 FMN とタンパク質の間の共有結合が

図１

解裂して元の不活性状態へ戻る。この一連の機能に関フォトトロピンの反応

する反応の中で、機能を持つ方向への順反応については FMN やタンパク質構造変化も含めて多くの研究がなされて来ているが、不活性になる過程については発色団の吸収変化による戻り反応が分のオーダーの時間分解で調べられているだけであり、構造変化についての知見は全くなかった。タンパク質構造は、共有結合が切れるのと同時に素早く元に戻るのであろうか、
LOV ドメインからリンカーが解離する過程には揺らぎ増大が関与している可能性があるが、その揺らぎはすぐに収まる(静まる)のであろうか。Unfold したリンカー部分が元のヘリックスを巻く過程は、タンパク質の折り畳み過程とも関係して興味深い。この逆反応過程について、構造変化を時間分解で調べることのできる過渡回折格子(TG)法を用いて調べた。TG 法を逆反応に適用するために、筆者が以前に開発していた 2 段
励起 TG 測定法を用いた。
図 2

図 2 に、この手法を用いて測定した逆反応と順反応

フォトトロピンの戻り反応を表す TG 信号(上)の TG 信号を示す。一見するとかなり似た信号であると順反応の場合の TG 信号(下)。下図の挿入図は時間のが、幾つか異なる点が見つかる。まず、順反応の信号早いところの拡大図。

1

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No. 2027 July, 2010
業績紹介： HaloTag タンパク質の 1 分子力学計測への応用：目的タンパク質の基盤への部位特異的共有結合による固定法
川上 勝（北陸先端大・A01 公募研究代表者）

パク質に置き換えた融合タンパク質を調製し、これをHalotag リガンドを化学修飾したマイカ上に共有結合で化学固定する。このタンパク質のＣ末側をカンチレ

論文題目："Application of HaloTag Protein to Covalent

バーの物理吸着によって捕らえ、融合タンパク質の力

Immobilization of Recombinant Proteins for Single

学的アンフォールディングを測定することに成功した。

Molecule Force Spectroscopy"

Halotag タンパク質とタイチンのアンフォールディン

著者：Yukinori Taniguchi and Masaru Kawakami*

グピークは、分子のアミノ酸残基数が異なることから、

雑誌巻号：Langmuir, 26, 13, 10433-10436, 2010

ほどけた長さL を調べることで容易に区別できる（図１右）。また Halotag タンパク質はタイチンよりも弱い

近年、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）技術を用いたタン力でアンフォールディングすることがわかった。さらパク質 1 分子力学測定法が発展し、タンパク質フォーに詳細にピークを調べると、Halotag タンパク質は 2

ルディング、ダイナミクス、メカノケミストリーとい種類の中間体を持つことが分かり、L からその構造のった研究分野へ、「力」をプローブとした新しい切り口

キャラクタリゼーションを行った（図２）。

からの貢献が注目されている。この手法の要は、いか本手法はシステインを含んだ、生物学的に重要な多に対象となるタンパク質分子を基盤とカンチレバー間

くのタンパク質を部位特異的に固定することが可能でに部位特異的に固定するかにある。現在はタンパク質

あり、ＡＦＭを用いた１分子力学測定の適用範囲を大を数珠状に作成し、１）基盤とカンチレバー先端部へきく広げると期待される。

の物理吸着を利用してタンパク質の両端を固定する
２）金基盤を用い、ポリプロテインの一端にのみ存在させたシステインとの金－チオール結合を利用して化
学的に固定し、もう一端を物理的吸着を利用して捕らえる、という 2 つの手法が主流である。しかし前者は分子の物理的吸着が両末端部のみに偶然起こる事象を利用しているため測定効率は非常に悪い。後者の方法

図１.（左）Halotag-Titin(I27)4 融合タンパク質のマイカ上は、金－チオール結合を用いており、測定の効率、部への化学固定の模式図。（右）アンフォールディング力とL

位特異的固定の観点では改善されている。しかしこのをプロットすると、Halotag と Titin のピークが分離される。

方法の欠点は、タンパク質末端部にのみシステインが許されていないため（そうでないと、タンパク質分子中のシステインと金基盤間で共有結合が起こってしまう）、本来システインを有さないタンパク質や、あらか
じめシステインを変異によってセリンなどへ変えたタ
ンパク質でしか測定が出来ない点にある。生物学的に重要な働きをするタンパク質はシステインを有している場合が多く、それらタンパク質に対して計測が困難であることは深刻な問題である。
近年 HaloTag タンパク質とリガンドの共有結合を利用したタンパク質の選択的固定手法が様々な分野において急速に発展している。我々はこの固定法に着目し図 2. Halotag タンパク質の立体構造とアンフォールディン

た。タイチン 5 量体のＮ末端ドメインを Halotag タン

グ中間体(I1,I2)の残存構造（上図、点線で囲った部分）。

2

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No. 2027 July, 2010
業績紹介：1 分子粘弾性測定によるミオシンロッド Coiled-coil 構造のフォールディ
ング／アンフォールディング転移のダイナミクス研究川上 勝（北陸先端大・A01 公募研究代表者）

ミオシンロッドを引っ張ると、最初は Coiled-coil 構
造を保っており、その粘性は単にランダムコイルのペプチド２本分（右図ドットと赤破線）に比べてもはる

論文題目：”Dynamics of the coiled-coil unfolding

かに大きく、これは Coiled-coil 構造をとることで、大transition of myosin rod probed by dissipation force

きな粘性、エネルギーの散逸経路が存在するという事

spectrum”を示唆している。これまで純粋なばね弾性体といわれ

著者：Yukinori Taniguchi, Bhavin S. Khatri, David J.

てきたミオシンロッドが、実は異常に大きな粘性を持

Brockwell, Emanuele Paci and Masaru Kawakami*

つことを初めて示した。さらに力を加えると、ミオシ

雑誌巻号：Biophysical Journal, 99, 1, 257-262, 2010

ンロッドは 50pN 辺りの張 力で coiled-coil 構造のunfolding を起こし、フォースカーブに平坦部が現れる。

ミオシンはアクチン繊維上を動くモータータンパク

このとき、ロッドの弾性、粘性は大きく減少し（右図質であり、筋肉中のミオシンⅡはアクチンフィラメン

0.05nN 付近）、ミオシンが純粋なばね弾性体として働

ト上を動くことで筋収縮を起こしていることが知られくことを 示し た。これ はミ オシンロ ッド の構造がている。ミオシンの尾部である Coiled-coil（ミオシン

un-coiling に関して非常に大きなエネルギー障壁を持ロッドと呼ばれる）は、頭部で発生した力を効率よくち、そのことで予期せぬ大きな力に対しての力伝達の伝える重要な役割を果たしていると考えられている。

調節機構として働くことを示唆している。

これまでミオシンロッドに関する研究は、その弾性に

本研究結果は、これまで弾性測定しか行われていな

ついて、いわば静的(static)な物性についてのみが行わかったために隠されていたタンパク質分子のダイナミれており、これらの研究から、ミオシンロッドは純粋ックな分子構造を、１分子粘弾性スペクトルを測定すな弾性体であると考えられてきた。しかし、ミオシン

ることで高感度で捕らえることが出来ることを示した。

は生体内において、様々な時間（速度）に依存した負荷に対して応答しているはずであり、そういったミオ
シン分子のダイナミックな特性を本当に理解するためには、分子の弾性だけでなく、粘弾性（Viscoelastic）
応答を調べる必要がある。
これまで 1 分子の力学特性を調べるために、原子間力顕微鏡技術を用いて対象となる 1 分子の一端を基盤に固定し、もう一端をカンチレバーで捕らえて分子を引っ張り上げ、フォースカーブを測定する 1 分子力学
測定が用いられてきた。しかしこの手法では分子の粘性情報を得ることが出来ないでいた。我々は強力に磁化された磁石球を付けたカンチレバーで１分子を引っ張り、同時に振動磁場によって引き起こされるカンチ
レバーの振動スペクトルを測定、解析することで、捉えている分子の粘弾性を測定する手法を開発してきた。

図．
（左）ミオシンロッド１分子の力学曲線と弾性、今回本手法を用いて、ミオシンロッドの Coiled-coil 構

粘性スペクトル（黒実線）。
（右）ミオシン１分子粘弾造のアンフォールディング転移前後での 1 分子粘弾性性の張力依存性（ドット）。ランダムコイルペプチド

スペクトルを測定し、ミオシンロッドの粘弾性が張力

１本、２本分の粘弾性を重ねて表示（赤実線、破線はに対して非常に特徴的な変化を示すことを発見した。

理論値、マーカーは１本分の実測値）

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No. 2027 July, 2010
業績紹介：レーザー照射によるアミロイド  線維の増殖と崩壊
八木寿梓（大阪大学蛋白質研究所）
後藤祐児（大阪大学蛋白質研究所・A01 公募研究代表者）

壊した。アミロイド線維の増殖と崩壊をレーザー照射
エネルギーに対してプロットすると、照射エネルギーが強いときはアミロイド線維を崩壊させるが、照射エ
ネルギーが弱いときは線維が増殖する結果が得られた（図 2）。すでに蓄積したアミロイド線維に対するレー
ザーによる分解・除去は、今後のアミロイドーシスの論文題目："Laser-induced propagation and destruction of

治療方法の一つとして期待されるが、これらの結果は、amyloid  fibrils"

徹底したレーザー照射でなければアミロイド線維を増著者：Hisashi Yagi, Daisaku Ozawa, Kazumasa Sakurai,

殖させてしまう危険性も示唆する。

Toru Kawakami, Hiroki Kuyama, Osamu Nishimura,Toshinori Shimanouchi, Ryoichi Kuboi, Hironobu Naiki
and Yuji Goto
雑誌巻号：J. Biol. Chem. 285, 19660-19667 (2010)
図１．レーザー照射による A(1-40) 線維の増殖。一線維上で線維の断片化等が生じ、その後に爆発的に線維が増殖した。
スケールバーは 10m。

アミロイド線維は、部分変性した蛋白質が規則正し(a)

く重合した超分子複合体である。アミロイド線維が原因とされる疾患を総称してアミロイドーシスと呼ばれ、約３０種類の疾患が報告されている。アミロイド線維の増殖機構はさまざまな仮説が提案されているが、可視化した例は少なく、また直接的な証明はされていな
い。アミロイド線維の形成阻害・崩壊機構を調べることはアミロイドーシスの治療の足がかりとなる。以前の研究より、アミロイド線維特異性蛍光色素（チオフ
ラビン T）と、励起レーザーを組み合わせることより、(b)

2 ミクログロブリンの部分ペプチド（K3 ペプチド）が形成するアミロイド線維が分解することを明らかにした[1]。
本研究では、この方法が他のアミロイド線維に対しても同様の効果を与えるかを調べるために、アルツハ
イマー病原因ペプチドの一つである、Amyloid  (1-40)(A(1-40)) を用いた。実験は全反射蛍光顕微鏡を用い、アミロイド線維は自発的に石英スライドガラス上で形成させた。形成途中、形成後のアミロイド線維に対してさまざまな条件でレーザーを照射し、アミロイド線まで伸長すると断片化が生じ、その後に爆発的にアミ

図 2. (a) TIRFM 観察で得られた線維の増殖および崩壊における蛍光強度を算出し、それをレーザー強度と照射時間から得られたエネルギーに対してプロット。(b) (a) をもとに作成したレーザー強度と線維量との関係図。線維増殖には線維が損傷することが必須であるが、その程度の違いが増殖と崩壊のいずれかの経路を決定する。

ロイド線維の増殖することが明らかになった（図 1）。

参考文献

さらに徹底したレーザー照射では A(1-40) 線維は崩

[1] D. Ozawa et al., J. Biol. Chem. 284, 1009-1017 (2009).

維の挙動を調べた。サンプルに対するレーザー照射の回数が少ない場合には、自発重合によってアミロイド線維が形成した。興味深いことに、一線維がある長さ

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No. 2027 July, 2010
業績紹介：超分子集合化を利用した Zn2+イオン濃度の可視化
湯浅順平（奈良先端大物質創成・A02 公募研究代表者）
論文題目："Highly Selective Ratiometric Emission Color
Change by Zinc-Assisted Self-Assembly Processes"
著者：Takuya Ogawa, Junpei Yuasa, Tsuyoshi Kawai
雑誌巻号：Angew. Chem., Int. Ed., 49, 5110-5114 (2010)
蛍光プローブは系中に存在する金属イオンなどのターゲットを検出する簡便かつ高感度な分析法の一つで

図 1 アセトニトリル中、BzIm-An(50 M)に Zn2+イオン(0-14あり、ターゲットと相互作用することでターゲットをmM)を滴下した際の CIE 色度図; A:0 M, B 75 M, C: 66 mM

可視化することができる。[1]一方で、生体内の重要る(図 1)。一方、さらに過剰の Zn2+イオンを存在させる

2+な金属イオンである Zn イオンなどの金属イオンは、と [(BzIm-An)3–Zn2+]2 は シ ン プ ル な 2:1 錯 体 、

その存在量が細胞部位によってナノモル濃度からミリ(BzIm-An)2–Zn2+ へ と 構 造 変 化 を 起 こ す 。 こ の

モル濃度の幅広い分布を持つことが知られている。そ(BzIm-An)2–Zn2+ は錯体内にπ-π相互作用を持たないのため蛍光プローブには従来のイメージングによる位ため、[(BzIm-An)3–Zn2+]2 に由来する白黄発光は再びア

置情報だけでなく、金属イオンの濃度変化を蛍光シグ

ンオラセンモノマー発光に由来する青緑発光へと変化

ナルの変化として情報化することのできる機能が求めする(図 1)。

られるようになってきている。

さらにこの蛍光プローブの Zn2+イオン選択性につい2+

本研究では、段階的な錯形成によって Zn イオンとて調べた。図 2 に示すように BzIm-An は 0.5 mM の各

高次組織化し、Zn2+イオンの濃度変化を蛍光の色調変種金属塩イオンの内、Zn2+イオン存在下でのみアント

化として可視化することのできる新規蛍光プローブ

ラセンダイマー発光に由来する白黄発光が観測された。

(BzIm-An)について報告する。BzIm-An は発光部位であるアントラセンに三重結合を介して金属配位部位であるベンズイミダゾールを連結したプローブであり、シンプルなプロセスによって簡便に合成することができる。この BzIm-An は 6 分子で 2 個の Zn2+イオンを認識

図 2 各種金属塩(0.5 mM)に対する BzIm-An(50M)の発光応答

し[(BzIm-An)3–Zn2+]2 で表される超分子錯体を与える。

以上のことから今回我々が開発した BzIm-An が Zn2+
イオンを選択的に認識し、その濃度変化をプローブの発光色の変化として情報化することのできるユニークなセンサーとして機能することを明らかにした。今後はプローブの水溶化を行い、細胞系への展開を計りた
いと考えている。
この超分子錯形成によって BzIm-An のアントラセン

参考文献

部位にπ-π相互作用が誘起され、アントラセンダイマ[1] A. P. de Silva, H. Q. N. Gunaratne, T. Gunnlaugsson, A.

ー発光に特徴的な白黄発光が観測される。そのため低J. M. Huxley, C. P. McCoy, J. T. Rademacher, T. E. Rice,2+

Chem. Rev. 97, 1515 (1997).

濃度(< 0.1 mM)の Zn イオンを存在下においては、
BzIm-An 本来の青色発光が白黄発光へと劇的に変化す5

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No. 2027 July, 2010
業績紹介：チャネル１分子イメージング法の開発
井出 徹（阪大生命機能・A03 公募研究代表者）

ャネルタンパクは、図のようにビオチン-アビジン系を介してガラス表面に固定される。これによって、タン
パクの膜内拡散は完全に抑えられ（図左下）、タンパク

論文題目：" Simultaneous optical and electrical singleと蛍光性夾雑物とが容易に識別可能となった。図中のchannel recordings on a PEG-glass"(+)はガラスに固定したとき、(-)は固定しないときのチ

著 者 ： Toru Ide, Yuko Takeuchi, Hiroyuki Noji, andャネルタンパク 1 分子の軌跡を表している。このとき、Kazuhito Tabata

膜とガラス表面の間隙を介してイオン性電流が流れ、

雑誌巻号：Lanmuir 26 (11), 8540–8543 (2010)

単一チャネル電流の記録が可能であった（図右下）。
チャネルを固定することが可能となったことにより、
長時間にわたる 1 分子観測が出来るようになり、冒頭

単一チャネル記録法は、生理学、薬理学の重要なツに記した薬剤とチャネルタンパクの相互作用の電気・ールであり、これを用いて多くのチャネルタンパクの光学的同時計測、即ち 1 分子薬理学への道が拓かれた

機能が 1 分子レベルで、かつ高い時間分解能で解析さと言える。

れている。しかし、残念ながらチャネルの機能変化に伴う他分子との相互作用を 1 分子レベルで検出する方法は存在していない。例えば、アセチルコリン受容体
チャネルのような化学受容チャネルの機能は、結合するリガンドの個数やタイミングも含めて詳細に議論されているが、リガンドの結合解離を直視した例はなく
巨視的な測定からの推論によるところが大きい。そこ
で我々は、薬剤 1 分子とチャネル 1 分子の相互作用を
電気的かつ光学的に同時計測可能な実験系の開発に取り組んできた。即ち、単一チャネル電流記録法と 1 分
子蛍光イメージングの融合である。
本論文では、チャネルタンパク 1 分子の電気・光学
同時計測を行うための新しい技術を開発した。1 分子
イメージング法は多くの生体分子に適用され、今や生物物理学の標準的な手法となったと言える。しかし、

図：新規チャネル 1 分子同時計測法（BK チャネルの膜タンパク、特にチャネルタンパクに関する適用例は

拡散阻害）

少なく、1 分子の機能を測る技術が確立しているにも

上：チャネル固定法の概略図. チャネルはベシクル融

関わらず、単一チャネル記録法と 1 分子イメージング合によって人工膜に組み込まれた後、抗体・2 次抗体・との融合は成功していなかった。それは、膜の脆弱性

ビオチン・アビジン・ビオチン PEG を介してガラス表と流動性に起因しており、汎用的な技術開発のために面に固定された．左下：(+)抗体存在下および(-)非存在

は膜の強化とタンパクの拡散阻害が避けて通れない課下で記録されたチャネル 1 分子の軌跡. 右下：左図(+)

題であった。

時に記録された電流ゆらぎ.従来法での測定結果と同様である.

我 々 は 、 ガ ラ ス 表 面 を ポ リ エ チ レ ン グ リコー ル(PEG)で被覆することにより、安定に 1 分子蛍光観察を行い、同時に単一チャネル電流も記録できる実験系の開発に成功した。ここでは平滑筋由来のカルシウム
依存性カリウムチャネル(BK)の同時計測を行った。チ6

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No. 2027 July, 2010
「揺らぎと生体機能」第２回合同班会議報告
芳坂貴弘（北陸先端科学技術大学院大学・A02 計画研
究代表者、第 2 回合同班会議世話人）

域の方針が示された。続いて、各研究者の発表が行なわれた（発表25分間、討論5分間）。それぞれの発表内
容に関しては、次頁以降で神山先生、水口先生、米谷先生に詳細にご報告頂いている。発表は夕方まで続き、「揺らぎと生体機能」平成22年度合同班会議が、平夕食後も夜遅くまで自由討論が繰り広げられた。また、

成22年6月27日(日)から6月30日(水)の日程で、石川県加2日目の夕食時には懇親会が行なわれ、研究者や学生間

賀市片山津温泉の加賀観光ホテルにおいて開催された。

の親睦を大いに深める機会となった。

本会議には、A01～A03班の計画・公募研究の研究代表
者41名（A03班 黒田玲子先生は欠席）、評価委員の北川禎三先生、榊茂好先生に出席頂き、また、各研究室に所属する研究員・大学院生37名の参加もあり、合計で参加者は80名に達した。片山津温泉は、大阪・京都・名古屋からJR特急で2時間ほど(加賀温泉駅下車)、空路
でも羽田・福岡・札幌・仙台から小松空港への便があり、全国の研究者が集う上で比較的アクセスの良い地点にある。また、会場となった加賀観光ホテルは、100人以上規模のコンベンション施設を備え、駅・空港か懇親会の一コマらバスで15分程度と近く、本会議の会場として十分な

また、3日目の昼休みには、近くの中谷宇吉郎雪の科施設であった。
当日はあいにくの梅雨空が広がっていたものの、雨学館の見学会を行なった。中谷博士の業績に触れるとには至らず、穏やかな湖面の柴山潟を望む会場で、４ともに、よく工夫された雪や氷に関わる実験への参加

日間の研究発表・討論が開始された。

を通じて、研究成果の社会への発信という点でも大いに参考になったのではないかと思われる。

雪の科学館での実験風景
今回の班会議は、各研究者の研究内容を改めて相互に理解するとともに、最新の成果について討論する機会となり、本領域全体の進展に大きく寄与するもので寺嶋先生（領域代表）挨拶あった。今後、それぞれの研究のさらなる進展と、新研究発表に先立ち、領域代表の寺嶋先生より、本領

たな共同研究等につながることが大いに期待される。

域の目標と各班の発表内容について紹介があり、また、

最後に、遠路ご参加頂いた先生方、お手伝い頂いた事

領域内の共同研究の状況とさらなる活性化に向けた領務局の皆様、会場スタッフの皆様に感謝申し上げます。

7

「揺らぎと生体機能」ニュースレター
No. 2027 July, 2010
神山 匡
（近畿大学・A01 公募研究代表者）

分子量や、濃度、超音波照射の効果について報告し、アミロイド形成と結晶化の関係について議論が行われた。高橋 聡 氏（東北大・多元物質科学研）は、蛍光

2010 年6 月27 日～30 日の4 日間にわたり、本特定

ラベルを用いた一分子観測による、蛍光強度変動と拡領域研究の平成22年度合同班会議が石川県片山津の加散定数による揺らぎの決定を装置改良と併せて報告し、

賀観光ホテルで行われた。今回の合同班会議は昨年9

溶媒粘性と揺らぎの関係について質疑が交わされた。

月の阿蘇に続く二回目であり、昨年末に名古屋で行わ川上 勝 氏（北陸先端大）は、AFMを用いて蛋白質分れた第3回公開シンポジウム以来の研究報告となる。こ子のばね定数から揺らぎの決定と温度の影響について、

こでは、私が所属するA01班を中心に簡単に報告させモデルの問題点と併せて報告した。質疑ではRefoldingていただく。

過程の観測や、両端固定の影響、エントロピー効果にA01班では、構造やエネルギーなどのさまざまな揺ついて意見が交わされた。山村泰久 氏（筑波大）は、

らぎ検出手法の開発と、生体分子の機能と揺らぎの相

絶対熱容量を指標にし、シス体とトランス体を有する

関解明を目指し、熱力学や分光学、一分子計測、NMR、

脂質二分子膜のラメラ相と等方相のエネルギー揺らぎ

シミュレーションなど、さまざまな角度から“揺らぎ”

について報告した。膜サイズや曲率の影響、二本鎖へという多彩な側面を持つ概念の実像化を目指しており、の展開などについて議論が行われた。

これまでの成果や共同研究の進展状況について、計画

2日目は2件の報告が行われた。石森浩一郎 氏（北研究班と公募班をあわせた16件の報告がなされた。今大・院理）は、FRET効率の圧力依存性から求まる線圧回の合同班会議は、これまでよりも長めに各30分の講

縮率を指標にした揺らぎの決定について報告した。質演時間が設定されていたが、時間を超過して議論が続疑では、蛋白質の特定部位間の揺らぎの定量化や経時くこともしばしばであった。質疑では、同じA01班か変化について議論が行われた。山口真理子氏（奈良先らだけでなく、他班からもそれぞれの視点に立った質端大）は蛋白質分子内・分子間の蛍光・燐光寿命をク

疑が積極的に行われ、“揺らぎ”という目標のもとにエンチャー濃度を変えて計測することで、構造のダイ

多種多様な研究者が集まる本特定領域の特徴が有効にナミクスを計測する手法について報告し、クエンチャ機能している様子がうかがえた。以下に、A01班の各ーの種類について議論が行われた。
3日目前半はシミュレーションを用いた揺らぎ検出

研究報告を簡単にまとめさせていただくが、内容に関について、3件の報告があった。佐藤啓文 氏（京都大）

する齟齬は平にご容赦いただきたい。
1日目は8件の報告が行われた。寺嶋正秀 A01 班班

は、3D-RISMとMC-MOZ法を統合することにより、蛋長（京都大院）は、パルスレーザー励起の過渡回析格

白質の水和状態について、内部水の位置と特定の方向

子法に新規の高圧システムを加え、揺らぎへの圧力効

への揺らぎがあることを報告した。質疑では、決定さ果や、光応答が熱応答にも対応していることを報告しれる水分子の位置と第一水和層との関係について意見た。石井邦彦 氏（理研・基幹研）は、無標識蛍光相関が交わされた。高田彰二 氏（京大院理）は、原子レベ分光を用いた広い時間領域での揺らぎ検出について装ルの分子力場と粗視化モデルにより天然構造まわりの置の改良を含めて報告し、多段階反応の緩和過程の解析について質疑が交わされた。筆者（神山 匡・近畿大）
は、高圧下密度測定により求まる等温圧縮率を指標にした揺らぎ検出について報告し、高圧下での内部空隙や水和が構造揺らぎに及ぼす影響について質疑が交わされた。木寺詔紀 氏（横浜市立大）は、MDによる炭素鎖の揺らぎや二面角を指標にしたダイナミクスについて報告し、質疑においてホモ多量体の分子対称性が揺らぎに及ぼす素数則について議論が行われた。後藤
討論風景

祐児 氏（阪大蛋白研）はアミロイド繊維形成における8

「揺らぎと生体機能」ニュースレター
No. 2027 July, 2010
常時揺らぎを予測し、クラッキング探索を通してClose

意されており、まさに、24 時間、刺激を受ける合同班

状態が稀にOpen状態になることについて報告した。質会議であった。このようなすばらしい会場とホスピタ

疑では、CloseとOpenの存在率、活性部位と揺らぎの関

リティをご準備下さった芳坂貴弘先生ならびに北陸先係、大きな揺らぎの原因について議論が行われた。岡

端大の皆さんに御礼申し上げます。

本祐幸 氏（名大院理／計画班）は、拡張アンサンブル法を用い、エネルギー上、温度上のランダムウォーク

水口峰之（富山大学・A02 公募研究代表者）に加え、圧力によるランダムウォークも行い、高圧NMRの結果との比較について報告した。3日目後半は
NMRを用いた揺らぎ検出について、3件の報告があった。加藤晃一 氏（自然科学研／計画班）は、タンパク2010 年 6 月 27 日～6 月 30 日に新学術領域研究「揺質の異常な会合形成における揺らぎの影響を明らかにらぎが機能を決める生命分子の科学」の平成 22 年度するため、モデル系としてGM1およびlyso-GM1の高磁合同班会議が加賀観光ホテルで開催された。加賀観光

場NMR計測について報告した。質疑では、不溶ダイマ

ホテルは美しい湖（柴山潟）の隣に位置し、討論会場

ーの要因やスピンラベルの減少について意見が交わさからは素晴らしい風景を楽しむことができた。本稿でれた。北原 亮 氏（立命館大・薬）は、高圧NMRを用は、班会議 2 日目の午前と午後に行われた A02 班の発いて直鎖状および環状のジユビキチンの構造揺らぎを

表を中心に報告したい。

測定し、単体と同様に加圧により各サブユニットに準安定構造が誘起されることを報告した。質疑では、各状態の安定性や水和水の圧力によるダイナミクス変化について議論が交わされた。菅瀬謙治 氏（サントリー
生有研）は、R2 dispersion法によりDNA結合蛋白質や
heme Oxidase Iのマイナー状態の構造情報を検出し、揺らぎとアミノ酸配列の関係について報告した。質疑では検出可能なマイナー状態の数や速い状態について議論が交わされた。3日目の昼食時には個別班会議が行われ、互いの研究について意見を交換するとともに、今片岡先生（A02 班班長）

後、“揺らぎ”の検出手法を発展させていくためには、

片岡幹雄 A02 班班長（奈良先端科学技術大学院大どのような分野の研究が必要か、などが話し合われた。

学）は、天然変性タンパク質の性質を有する SNase

講演以外でも、夕食後の自由討論や、温泉、各宿泊

変異体を発見され、そのフォールディングについて研部屋において、普段あまり話す機会のない研究者の方究されている。興味深いことに、リガンド結合によっと研究や研究環境のことなど話し合う機会が十分に用てフォールディングが誘起される変異体（Induced-fit
model）と、フォールディングしてからリガンドが結合する変異体（pre-existing model）を作り分けることに成功された。また、N 末端領域と C 末端領域を結びつける相互作用がフォールディング初期にできていること、N 末端領域と C 末端領域を結びつけるにはW140 が特に重要であることを明らかにされた。
SNase のアミノ酸配列をわずかに変えるだけで天然
変性タンパク質の性質をもつことは非常に興味深いと感じた。天然変性タンパク質は揺らぎが大きいタンパ
ク質と考えられるが、その理解にとって重要な研究に神山先生なると期待される。

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No. 2027 July, 2010
芳坂貴弘氏（北陸先端科学技術大学院大学）は、非BPTI 変異体の結晶構造を決定する際に、ヘテロシー

天然アミノ酸を部位特異的に導入する技術を用いてタディングの手法が有効であると報告された。変異体にンパク質の揺らぎを研究している。非天然アミノ酸のよってヘテロシーディングが有効な場合とそうでない

導入は４塩基コドンに非天然アミノ酸を割り当てるこ

場合があることについて興味深く聞かせていただいた。

とによって達成されている。会議では、マルトース結

楯真一氏（広島大学）は、ジヒドロ葉酸還元酵素

合タンパク質に蛍光標識アミノ酸を導入し、タンパク（DHFR）の揺らぎと機能について研究されている。

質の変性に伴う FRET を蛍光相関分光法で調べた結この研究は、構造を乱さないアミノ酸置換で揺らぎを果について報告された。芳坂氏の４塩基コドンを用い制御し機能を制御する試みである。DHFR の変異体は、た非天然アミノ酸導入技術はオリジナリティーが高く、活性ループから離れた遠隔位ループにアミノ酸変異を

この領域内で多数の共同研究が行われている。共同研

導入することによって得ている。DHFR に系統的なア究を含めた今後の研究の発展が楽しみである。

ミノ酸変異を導入し、NMR のスピン緩和分散法によ新井宗仁氏（東京大学）は、配列摂動解析法を利用

る揺らぎ解析を行った結果から、酵素活性に重要な揺して DHFR の揺らぎ制御について研究されている。今らぎは 500 Hz 程度の揺らぎであるかもしれないと報回の班会議では、DHFR の Arg44 に 20 種類全てのア告された。タンパク質にはいろいろな時間スケールのミノ酸変異を導入し、酵素活性や熱安定性について解揺らぎがあるが、比較的ゆっくりとした大きな動きが析した結果を報告された。新井氏は Arg44 の位置は酵素活性に重要であるのかもしれないということであ

20 種類全てのアミノ酸を許容するが、変異によって酵った。今後の研究の発展によって、DHFR の遠隔位ル素活性と補酵素結合能は低下することを示された。さープ変異と揺らぎの関係が明らかになると期待される。

らに網羅的な相関解析を行い、DHFR の Arg44 の位

この他に、天然変性タンパク質である FACT の NMR

置は、タンパク質の安定性を犠牲にしながら、静電的解析についても報告された。

相互作用を通して補酵素 NADPH との強い親和性を湯浅順平氏（奈良先端科学技術大学院大学）は、こ

維持し、これにより高い酵素活性を保持する

れまでにない新しい希土類プローブの開発に取り組ん

stability-activity trade-off で あ る と 提 案 さ れ た 。

でいる。そのプローブを使うことで、タンパク質の揺

DHFR の研究に加えて、天然変性タンパク質 p53 転写

らぎ変化を円偏光や発光スペクトル形状の変化として活性化ドメインと転写コアクチベーターCBP TAZ2 ド

検出できるという。会議では SNase-Biot-Eu3+に 370

メインとの相互作用解析についても報告された。

nm の紫外光を照射すると、594 nm および 614 nm に

今西未来氏（京都大学）は、代表的な DNA 結合モ

それぞれ磁気双極子遷移および電気双極子遷移が観測チーフであるジンクフィンガーにアミノ酸変異を導入されることを示された。さらに、CD で調べた SNase

し、新しいジンクフィンガーを創出することに挑戦さの熱変性曲線との比較から、湯浅氏の希土類プローブ

れている。そのために、あえて保存されている Zn 配を使うことでタンパク質の構造変化を検出できること

位子に変異を導入することで安定性を低下させ、Znを示された。
著者は、天然変性タンパク質 PQBP-1 がターゲット濃度に依存して DNA に結合するジンクフィンガーを作ることに成功された。また、ルシフェラーゼを用い分子である U5-15kD をどのように認識しているのかた系で細胞内での機能評価を行い、人工のジンクフィ

について報告した。また、PQBP-1 の変異は精神遅滞

ンガーが細胞内で Zn 濃度に応答して転写を活性化すに深く関与していることがわかっているが、本発表でることを示された。

は PQBP-1 変異体の構造と精神遅滞の関係についても

黒田裕氏（東京農工大学）は、タンパク質の主鎖構報告した。PQBP-1 がターゲット分子に結合しても構造の局所的な揺らぎと変形が熱安定性に及ぼす影響を造が変わらないこと、PQBP-1 は C 末端ドメインにあ解明するために、BPTI の 14 番目および 38 番目の残る 23 残基を使って U5-15kD に結合していること、基をそれぞれグリシン、アラニン、バリンに置換し、U5-15kD への結合に必須のセグメントが精神遅滞の合計 9 種類の変異体について熱安定性と置換残基周辺

PQBP-1 変異体では失われていることを示した 。

の局所的揺らぎとの関係を調べて報告した。また、10

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リポソームの流動性が高いほど制がん効果は大きいということが分かってきたが、そのメカニズムは検証中ということで、共振の可能性など、活発な議論が行われた。また、臨床実験においても患者の延命など、ハイブリッドリポソームによる効果が確認できていることなどお話された。
松下氏（崇城大学）は、テロメア 4 重らせんの構造と金属導入の影響について報告された。FRET により、
Na+、K+、Rb+、Ca2+が 4 重らせんの形成を促進することがわかってきた。実験結果に加えて、3D-RISM によ
水口先生

るエネルギー成分の結果を示し、テロメア 4 重らせん

以上、A02 班 8 名の研究報告について簡単に紹介しがバスケット型構造をとり、その安定性に脱水和が大きく寄与していることなどをお話された。

た。他の班の発表についても多数の興味深い発表があり、活発な議論が行われた。共同研究の進行状況につ岡田氏（熊本大学）は、細胞膜の揺らぎが人の正常いての報告も多く、領域内での共同研究が活発になっ

造血、造血器腫瘍に及ぼす影響を報告された。ハイブてきていると感じた。最後に、今回の合同班会議をおリッドリポソーム、セファラチンにより膜の流動性を世話してくださった芳坂先生と研究室の皆様に感謝い変化させ、アポトーシスを選択的に誘導できることをたします。

示された。新たに作成した無毛高度免疫不全マウスの応用研究についても紹介された。
黒田氏（東京大学、原田氏が代理発表）は、蛋白質

米谷佳晃（日本原子力研究開発機構・A03 公募研究代
表者）の凝集に伴う構造転移を観測するために、非溶液状態の光学異方性存在下でキラリティを測定する分光装置を開発されており、LB 膜、キャスト膜を用いた測定結果などを示された。現在、第 2 世代のマルチチャン

A03 班の発表は、班会議 2 日目の午後から始まり、

ネル CD、吸収同時測定装置を開発中ということであ

最終日の 4 日目まで、全部で 17 件あった。最初に班長る。

の上岡先生から A03 班全体の紹介があり、引き続き各

桑島氏（岡崎統合バイオ）は、αラクトアルブミン

講演者の発表が行われた。以下発表順に講演内容を記のフォールディング中間状態の構造について報告されします。

た。ヒトとヤギのαラクトアルブミンは、いずれも不飽和脂肪酸の結合により細胞死誘導活性を示すが、そ
れぞれ、結合部位が全く異なっていることが NMR により明らかになったとお話された。
飯野氏（大阪大学）は、回転モータータンパク質 F1の 1 分子測定を報告された。開発したレーザー暗視野
顕微鏡による測定でわかってきた F1 の回転メカニズ
ムについて紹介された。また、プローブの揺らぎから
F1 のトルクを求める理論など、新しい方法も導入されているということであった。
上岡先生（A03 班班長）

井出氏（理化学研究所）は、チャネルタンパク質 KcsA

上岡氏（崇城大学）は、ハイブリッドリポソームのの構造変化と機能の同時観測について報告された。チ

制がん機能について報告された。テレビでも紹介され

ャネル電流により 1 分子の活性を測定しながら、AFMたアポトーシスのムービーが示された。ハイブリッドの指針により KcsA の開閉構造を操作する実験系を開11

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発し、開閉構造の変化がチャネル電流の変化と直接関る」という結果になったことを示し、3D-RISM が優位係していることを実証された。

である点を述べられた。他に、KcsA 中の Na イオンの矢野氏（京都大学）は、膜貫通タンパク質の構造形

透過、M2 チャネル中の水の透過について紹介された。

成について報告された。POPC、POPC コレステロール

吉田氏（分子科学研究所）は QM/MM と RISM 理論

膜内で２種類のモデル膜貫通へリックスの蛍光強度をを組み合わせた新規手法の開発について報告された。

測定し、その時間変化の様子から、へリックスの相互

溶媒の配置についてサンプリングが不要なことなど

作用の揺らぎを実験的に捉えることに成功した。

QM/MM/RISM の長所を述べ、適用例として DNA とプ

老木氏（福井大学）は、KcsA カリウムチャネルのロフラビンの結合を示された。結合に対する配列の違開閉の構造変化を報告された。バックグラウンドノイいの影響や溶媒の寄与が明らかになってきたというこ

ズを下げるなど改良を重ね、回折 X 線追跡法で時間分とであった。

解能を従来の毎秒 30 フレームから 5000 フレームへ上筆者米谷（日本原子力研究開発機構）は、DNA マイ

げたことにより、１分子の構造変化の過程を詳細に追ナーグルーブの水和水の振舞いについて分子動力学計

跡することができるようになってきたということであ算から得られた結果を報告した。特に水和パターンとる。大量データの解析など、今後の課題についてもおDNA 構造揺らぎの配列依存性、水和水の水素結合ダイ話された。

ナミクスについて紹介した。また、DNA とタンパク質の結合に伴う自由エネルギー変化の計算など進行中の岡村氏（姫路獨協大学）は生体膜中の薬物の輸送機構について報告された。高分解能 NMR とパルス磁場

課題について紹介した。

勾配スピンエコー法の組み合わせにより、ベシクル結合状態と非結合状態の薬物分子の運動性を測定し、結合・解離速度、膜透過速度を in situ で決定することに成功した。膜の中での薬物分子の位置がまだわかっておらず、今後調査しなければならないということである。
戸谷氏（成蹊大学）は、糖タンパク質のプロセシン
グに対する分子クラウディング環境の影響について報告された。分子クラウディングは、グルコースの切断を加速するのに対して、マンノースの切断を減速するという結果を紹介された。他に、微小空間、網目環境
米谷先生の影響についてもお話された。
鈴木氏（名古屋大学）は、遺伝子の複製エラーが発

手老氏（分子科学研究所）は、脂質膜の過渡的相分

がんにどのように関与しているかについて報告された。

離過程の構造、物性について報告された。蛍光標識脂細胞 DNA 複製酵素をノックアウトすると、細胞レベ質を用いた一分子追跡法により、サブミクロン、50ms

ルでも複製エラーが増大することを示し、DNA ポリメのスケールで分子拡散を追跡することができるように

ラーゼ内の複製エラー抑制機構が重要であることなどなってきた。基板表面のナノ構造を反映した階層的分お話された。他に、ハイブリッドリポソームと細胞死

子拡散の可能性など、測定から導かれた見解についてについての進行中の課題について紹介された。

述べられた。

平田氏（分子科学研究所）は、3D-RISM により明ら

出羽氏（名古屋工業大学）は、ポリアミン脂質と DNA

かになってきた膜透過現象について報告された。アクの複合体形成について報告された。、リポソーム化した

アポリン中のグリセリンの透過については、実験結果

ポリアミン脂質と DNA が複合体を形成すると、ラメに反して「透過しない」という結果が海外のシミュレ

ラ構造をとるが、酸性条件下では、構造変化し、DNAーショングループにより示されていたが、3D-RISM でが放出されることが明らかになってきた。これらの構

計算すると、実験結果にも矛盾することなく「透過す

造変化と遺伝子送達活性の関係についてお話された。

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以上 A03 班の発表は、タンパク質、脂質、核酸など

りは、昨年度の合同班会議、公開シンポジウムに続い様々な対象を扱いつつも、いくつか共通するトピックて 3 回目であり、研究の進展や共同研究などについてを含み、それらが接点となり全体的につながりができ

繰り返し情報交換することは刺激になった。これからていくように編成されていた。そのため、全ての発表の研究活動の活力にしたいと思う。また、研究発表のを聞いたあとで各テーマを振り返ると、これまで直接ほかに、懇親会、討論会も多く、貴重な機会となった。

体験したことがなかったことも身近な問題に感じられ今回の合同班会議でお世話になりました芳坂先生と研るようになってきた。
「揺らぎと生体機能」全体の集ま究室の皆さまに感謝いたします。

平成 22 年度合同班会議（片山津）集合写真（会議３日目）

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