令和４年度 公益財団法人 琵琶湖・淀川水質保全機構 水質保全研究助成

河川に広く分布する下痢症起因ウエルシュ菌の拡散機構の解明と水質保全への提言
地方独立行政法人
大阪健康安全基盤研究所
微生物部細菌課
余野木伸哉
1. はじめに
下水道及び下水道システムは現代の都市にとって必要不可欠な機能であり、日本下水道協会によるとその役割として、(1)街を清潔にする、(２)街を浸水から守る、（３）身近な環境を守る、（４）エネルギー・資源を創るという 4 つの役割が挙げられている（図 1.） 1)。このうち(1)街を清潔にする役割は、これま
図 1. 下水道システムの役割 1)
でそして現在も感染症の制御に重要な貢献を果たしており、さらに近年には、下水はコロナウイルスなどの感染症のモニタリングに利用され、感染症の制御において活用や役割が拡がっている。
一方で、下水は処理の最終工程で主に塩素消毒されたのちに放流されるが、この放流水には大腸菌、芽胞菌やウイルスが一部残存していることが知られている 2, 3)。近年には、このような下水処理場に由来する芽胞菌や耐性菌が地域での感染症の発生に関与することが示されている 4)。しかしながら、国内の下水を介した芽胞菌などによる健康被害に関する情報は乏しく、その詳細は不明である。
ウエルシュ菌はグラム陽性の芽胞形成菌であり、ヒトや動物の常在腸内細菌であるほかに、下水、河川水、海水や土壌、食品など広く環境中にも存在している。ウエルシュ菌
はこれまでに 20 種類以上の外毒素を産生することが報告されており、このうち CPE とBEC がヒトの下痢症に関与して食中毒などの原因毒素となることが知られている 5)。CPE遺伝子は染色体上に存在するもの（染色体型）とプラスミド上に存在するもの（プラスミド型）があり、プラスミド型の多くは CPE 遺伝子の近傍に存在する挿入配列の種類によって IS1151 型と IS1470-like 型の 2 種類の遺伝子型に分類される 6, 7)。欧米からの報
告では食中毒事件のうちおよそ 7 割が染色体型の菌が、およそ 3 割がプラスミド型の菌が原因と報告されており、国内も同様の比率で発生していると考えられている 8)。プラ
スミド型の菌は食中毒の原因菌となるほかに抗生物質関連性の下痢症、散発性の下痢症
や高齢者施設などで集団下痢症を起こすことが知られているが、その発生と周辺環境との関連性は不明なことが多い 5)。
本研究では大阪府の環境水における嫌気性芽胞菌の汚染実態を調査した。さらに、これ
ら嫌気性芽胞菌のうちウエルシュ菌について健康被害との関連について調査した。
2. 方法
2.1 環境水の採水
大阪府の 20 ヶ所(A〜t)の河川や湖沼（淀川を含む 7 流域の河川）から 51 サンプルの表

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流水をそれぞれ 200mL 以上を採水した（図 2.:地理武庫川水系G系
院地図 Vector で作製）。採水は 2019 年 6 月から猪名川水
京都市
H
2021 年 3 月の間に行った。
I
2.2 嫌気性芽胞菌数の測定
F淀川E採取した環境水はそれぞれ 200mL を減圧濾過によ
DAって膜濃縮した。検体を濃縮した膜は上水試験方法
BCのハンドフォード改良寒天培地法に供試して、嫌気神戸市
大阪市
性芽胞菌数を計測した。
川 水系
2.3 菌種の同定
大和川-石奈良市分離した嫌気性芽胞菌は１サンプルあたり 30 株を系
3水の上限として菌種を同定した。菌種の同定は MALDI他
SPのM
J
そTOF/MS のバイオタイパー（スメア法およびギ酸抽出るLNOれK流を法）を用いて実施した。バイオタイパーでスコアがR
州Q
泉
2 未満の場合は、およそ 1,500bp の 16S rRNA 遺伝子
Tの塩基配列を解読して、この配列とデータベースに和歌山市登録された配列の相同性を確認して決定した。
図 2. 採水場所
2.4 ウエルシュ菌数の計測
各サンプル 200mL あたりのウエルシュ菌数は以下の計算式を用いて算出した。（ウエルシュ菌数）＝（検出された芽胞菌数）×（ウエルシュ菌と同定された菌数）／（同定作業を実施した菌数）
2.5 CPE 遺伝子の検出と CPE 遺伝子型の決定
CPE 遺伝子の検出と CPE 遺伝子型の決定はそれぞれ Yonogi S らの方法と Miyamoto Kらの方法を用いて実施した 9, 10)。
2.6 データと上流域での大規模下水処理施設の有無による採水場所の分類
本調査の採水場所それぞれについて、採水場所から半径 1km 内の人口を政府統計の総合窓口(e-Stat) 地図で見る統計(統計 GIS)を用いて集計した 11)。また、それぞれの採水場所について、上流域での大規模下水処理施設（lsWWTPs:本研究では処理人口 1 万人以上とした）の放流口の有無を確認した。
2.7 CPE 遺伝子を保有する食中毒原因菌の CPE 遺伝子型
2008 年から 2022 年の 15 年間に大阪健康安全基盤研究所旧森ノ宮センターで検査を実施したウエルシュによる食中毒事件に由来する菌株について、CPE 遺伝子の存在を確認し、その遺伝子型を決定した。方法は 2.5 と同じ方法を用いた。
2.8 Multi locus sequencing typing (MLST)による分子疫学的解析
本研究において環境水から分離した CPE 遺伝子陽性菌と大阪府の食中毒事例由来菌はDeguchi A らの方法に従って MLST 解析に必要な配列を取得した 12, 13)。これらの配列は公共のでデータベースから収集した主に国内分離株の MLST 配列データと比較した。
5,274bp の結合配列を MAFFT でアライメントして、RAxML による最尤推定法を使用して系統樹を作成した。系統のクラスタリングは RhierBAPS ソフトウェアを使用した hierarchical
Bayesian analysis of populations structure (hierBAPS)に基づいて実施し、RStudio 環境内でggtree を用いて視覚化した 15)。
2.9 全ゲノムによる分子疫学的解析とプラスミド配列の決定
環境水から分離した CPE 遺伝子陽性菌と大阪府の食中毒事例由来菌のいくつかの株を選抜してゲノム DNA を抽出した。DNA は MiSeq platform (Illumina)または MinION (OxfordNanopore Technologies)を用いて塩基配列を解読した。得られた配列情報をアセンブルして菌株の全ゲノム配列及び完全プラスミド配列を決定した。

3. 結果と考察
3.1 採水場所の平均嫌気性芽胞菌数と菌種の同定

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各採水場所の平均嫌気性芽胞菌数は表 1.のように 0-178.7 CFU/200mL であった。淀川を除く 17 の採水場所(D-t)では平均検出数の最大値は 21.0 CFU/200mL であった。淀川 3箇所(A-C)の検出数はいずれも 100 CFU/200mL を超えており、その他の採水場所に比べて検出数が著しく多かった。
嫌気性芽胞菌は 51 サンプルから合計 1597 の集落が計測された。このうち 520 株について菌種を同定し、これらのほとんど（498 株、95.8%）はウエルシュ菌であることが分かった。
3.2 CPE 遺伝子保有株数とその遺伝子型
各採水場所についてウエルシュ菌と同定された菌数とその CPE 遺伝子の保有数を集計した（表 1.）。ウエルシュ菌と同定された 498 株のうち 68 株（13.7%）が CPE 遺伝子を保有しており、河川水には高い割合で CPE 遺伝子保有ウエルシュ菌が存在することが分かった。これら CPE 遺伝子保有ウエルシュ菌の CPE 遺伝子型は 94.1％（64 株）が IS1151型であり、染色体型の菌は全く検出されなかった。IS1470-like 型の菌や 3 つの遺伝子型では分類できない菌がそれぞれ 2 株（各 3.1%）分離されたが、その割合は小さかった。IS1151 型の菌が環境水における CPE 遺伝子陽性菌のなかで優勢な菌であることが明らかになった。
3.3 採水場所の分類
採水場所の半径 1km 内の人口と上流域での大規模下水処理施設の有無によって、採水地を表 2.のように 3 つの地域に分類した。地域ごとに大阪府の環境水に関する調査の結果を集計・整理すると、CPE 遺伝子陽性菌は全て都市・郊外地域から分離されていることが明らかになった（図 3.）。また、CPE 遺伝子陽性菌のうち大阪府の環境水に最も優勢に分布していた IS1151 型の菌は農村・山間地域に比べて都市・郊外地域で有意に多く分離され、ウエルシュ菌に占める割合も有意に多いことが確認された。今回の調査に
平均芽胞数 ウエル CPE陽性 IS1151型の菌数/200mL シュ菌数
菌数
(それ以外)
A140.3881010B
178.7
901211 (IS1470-like)C
128.7
901311 (3つ以外の型)
D
9.2
4354 (3つ以外の型)
E18.0
1711F12.0822G2.010H
11.090I1.000J21.0391413 (IS1470-like)K
0.000L
3.5
722M
2.020N
9.0
150O
1.5
10P
3.71033Q
0.000R
2.350- 染色体型の菌は
S
7.3
72
66 分離されなかった
T
0.5
10
合計表 1. 大阪府の環境水に関する調査の結果
498
68 (13.7%) 64 (94.1%)

採水地

武庫川水系g

猪 名川水系
京都市

hls-WWTPの放流水

i

＊E

F

淀川
D

AC

神戸市

大阪市

石
大和川-

CPE遺伝子陽性菌を検出した場所

泉

州を流れる

Bのその他

3水

奈良市

系
SPkr

川水系

JL

mnoqt
和歌山市
図 3.
CPE 陽性菌が検出された採水場所

地域分類

周辺人口 lsWWTPs(半径1km内) の有無

lsWWTPs
9,000人以上あり
lsWWTPs
9,000人以上
なし
lsWWTPs
農村・山間地域
2,000人以下なし

都市・郊外地域+＊--

表 2. 採水場所の分類

地図での表示

3ヶ所
(淀川)
7ヶ所
(地図赤色)
10ヶ所(地図黄色)

サンプル
合計数

92418

*採水地 E は上流に小規模な下水処理施設あり（計画処理人口 3160 人）

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おいて上流域に lsWWTPs が存在する
発生年月
No.
ET
ET遺伝子の所在
採水場所は淀川の 3 地点のみであっ1
2008年6月
CPE
プラスミド (IS1151型-cpe)
たが、ウエルシュ菌に占める2
2008年6月
CPE
プラスミド (IS1151型-cpe)
3
2008年10月
CPE
プラスミド (IS1151型-cpe)
IS1151 型の菌の割合は上流域での4
2009年8月
BEC
pCP13-like プラスミド
lsWWTPs の有無によって有意な差は
5
2010年1月
BEC
pCP13-like プラスミド
確認されなかった。一方で、上流域
6
2010年6月
CPE
染色体での lsWWTPs の存在によって平均芽7
2010年12月
CPE
染色体8
2012年12月
CPE
染色体
胞菌数、ウエルシュ菌数は著しく増
92013年7月
CPE
プラスミド(IS1151型-cpe)
加し、IS1151 型の総菌数も増加す
10
2014年5月
CPE
染色体ることが考えられた。
11
2014年5月
CPE
染色体以上のことから、IS1151 型の菌は
12
2016年6月
CPE
染色体
都市・郊外地域に偏在していること
13
2016年10月
CPE
プラスミド (IS1151型-cpe)
14
2017年5月
CPE
プラスミド (IS1151型-cpe)が明らかになった。lsWWTPs は15
2017年5月
CPE
染色体IS1151 型の菌の環境水における分
16
2018年5月
CPE
染色体布に関わる重要な要因であるが、都
17
2019年8月
CPE
染色体
市・郊外地域に lsWWTPs 以外の要
18
2020年1月
CPE
染色体因が存在することが示された。
192021年5月
CPE
染色体
20
2021年5月
CPE
染色体3.4 食中毒原因菌の CPE 遺伝子型
21
2021年10月
CPE
プラスミド (IS1151型-cpe)
当所で検査した過去 15 年間の食中
22
2022年4月
CPE
染色体
毒事例について原因エンテロトキ
表 3. 過去 15 年間の食中毒事例の概要
シンと CPE 遺伝子型を整理した（表 3.）。22 事例のうち 7 事例（31.8%）では IS1151 型の菌が原因であり、染色体型の菌との比率は欧米の報告とほぼ一致していた。IS1470-like 型の菌が原因となった事例はなかった。
3.5 MLST 解析による国内分離株の分子疫学的解析
66 株の環境水由来株と 37 株の食中毒事例由来の MLST 配列は公共のデータベースに登録されている 188 株の CPE 遺伝子陽性菌の MLST 配列と比較した。188 株のデータベースの配列のうち 177 株は国内分離株の配列であり、主に国内分離株と比較した 12, 15-17)。
19−519−432
19 −17
6
19 −1419 −141 4
19 −1
19 −1240
18 −35−3
717 0017 −101
16 −1
20_999
W20_777
W
W20_0_60
W2 0_54
W2_429W20 0_412
W2 20_39347
W 20_3 25
W 20_3 15 6
W 20_3_26 42
W 20 _2W 20W

RCP21_283
4 −113854cp−22_401cp549−2020_41
cp714−2017_41
T16
W20_154
W20_119
W20_3411
cp668 −29
cp7926 −2
W20_8 −2017_143
9017_143
HCHCP17_2_1
W P17_1
W 20_17 _1
W 20_2 2
W 20_3 29
W 20_3 6
W 20_4 61
W2 20_7 1
W 0_ 1W2 20_ 78
0_ 84
90

プ

グ

W
W 20
W 20 _2
W 20 _23 37
W 20 _19 1
W 20 _16 5
W 20_ _14 5
W 20_ 1309
W 20 12
RC 20__1279
RC P21 10
RC P21_3_807
57
RC P21_3
P21_ 37117
HCP1 T1 T1
HCP1 6_15902
HCP1 6_180
HCP166_167
HCP16__161
144
HCP13_6_5_1 HCP16_150

も大最18−353

きなール

Clade5− 1 29
14 7 − −101 001_1
1 8 34
1 8 − _6 20191 19 −W 37 16
cp9 −
1 80
_2
W20
14−
14 _351
69 WW20
20_200 _221−16
19 −1W20_109
19W20
217 −8170
19−18− 229
F5603

F4013

14−12W19_4
W19_50cp300 −2020_120
W20_366
020_186
cp534−2 150_4
W225−2017_ 25
cp281
0_4 −202 −171
cp13
19W20_65
W19_5 017_155
cp322−2

OSAKA1OSAKA3
W6205

VW A30
0HCP1
4_ps1
4_1

RCP2
0_9

7109_01 17− 2 0_1 17
41 −202 9_1
cp
10 −20 _8451
cp 55 2017
2 −
cp150
cp

IS1151型

23IS1151型 /IS1470-like型

4IS1470-like型

VWA03
15染色体型

6IS1470-like型/
3つの型以外の型

RCP20_64
RCP2
0_39
RCP2
0_8

cp36
−2019_98
18 −2−2017_36 89−2020_36−2020_154
F4969DNo .24
No .2
No .10

HCP14_ps1_1

W4232

RC
P19_63

cp457
cp318

RC
P20_51

RCP2
1_146RC
P2
1_75
RCP21_84VW
A019HCP1
4_HCS1P13R
7__1
3_VW1A085

cp285

14 −1320_427
W
18 −268

cp198

T
M
178C
520_82W
219 −6111CT
M−2019_152

13−11

1_1
HCP18_1

121_5
RCP_104
P16
HC_37
P21RC
221_4
RCP

9_10
P16
HC

D98
87
TC
NC
26
A3
VW

NC
TC
82
39
D

62
8 −2
1VW

4
W583

A001

1_33
RCP2081D
NCTC8A009

2_117
HCP1VW

W20_368A

W20_369

cp45
8−201
7
W1 _84W19 9_19
W19 _45
W19 _44W19 _42_40
W19_W19 37_3
W19_ 631
W19_26
W19_20W
19_17
W19_18−155−2 4182−MR −3617191OSAKA2OSAKA411_35 1_326_49
RCP2RCP2 W20 _17W20 _30
W20

2A01_184VW20203−cp53

CPE遺伝子型

最も大きなグループに含まれた株•食中毒事例株
大阪府 (2016, 21), 富山県 (2001)• ヒト糞便由来
北海道 (2017, 20), 山梨県 (2014-19)• 環境水 大阪府の4流域 (2019-20)• 下水流入出水 山梨県 (2016-19)• アサリ（食品） 愛知県, 熊本県 (2019)

図 4. MLST による国内分離株の系統解析

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BAPS に基づいた系統分けによって、これらの菌株は主に 6 つのクレイドに分類された（図 4.）。IS1151 型、IS1470-like 型、染色体型の菌はそれぞれクレイド[1,2,3]、[2,3,4,6]、[5]に分類された。クレイド 2 と 3 には IS1151 型と IS1470-like 型の菌が共に分類されたが、これらの菌はクレイド内で異なるグループを形成していた。クレイド 1 に形成された最も大きなグループには大阪府と富山県で発生した食中毒由来株、北海道と山梨県のヒト糞便由来株、本研究において分離した大阪府の４流域の河川に由来する株、山梨県の下水流入水と下水流出水に由来する株、愛知県と熊本県で採取されたアサリから分離された株が分類された。このことから同系統の IS1151 型の菌は日本国内に広く分布して、食中毒の原因になることが示された。
3.6 全ゲノム解析によるプラスミドの特定15 株を超える IS1151 型の菌について保有しているプラスミドの全長配列を全ゲノム解析によって決定した。pCPF5603 は挿入配列 IS1151 を近傍に持つ CPE 遺伝子をコードする代表的なプラスミドとして知られており、全長配列を決定した多くのプラスミドはpCPF5603 とほとんど同様なプラスミドであることが分かった。以上の結果から
pCPF5603 が IS1151 型の菌の国内での拡散に関与していることが示された。

4. まとめと今後の展望
本研究によって大阪府の環境水に IS1151 型の菌が広く分布しており、この菌は大阪府だけでなく日本国内に広く分布していることが明らかになった。これら国内に広く分布する IS1151 型の菌は、本研究の結果から一定の人口密度を有する都市・郊外地域に広く分布することが示された。都市・郊外地域を汚染する環境要因として下水処理施設の放流水は重要であるが、都市・郊外地域に下水処理施設の他の要因が存在することが示された。菌が持つ要因としては pCPF5603 の影響が考えられた。
今後はこれらの結果に影響する環境要因や菌の要因をより具体的に特定するとともに、ウエルシュ菌以外の嫌気性芽胞菌や薬剤耐性菌について国内の状況を調査する予定である。
5. 謝辞
本研究は、令和 4 年度 公益財団法人琵琶湖・淀川水質保全機構「水質保全研究助成」を受けて実施いたしました。ここに記して御礼を申し上げます。
6. 参考文献
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http://www.nilim.go.jp/lab/bcg/siryou/tnn/tnn1056pdf/ks105609.pdf
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