技術紹介

株式会社アイスティサイエンス

固相抽出の可能性とその自動化技術
─シリーズ 3/5：固相誘導体化法：メタボロミクス─

佐々野

僚 一

的として，固相抽出を用いた誘導体化を行い前処理の劇

1 は じ め に

1）2）と，それを組的な時短を実現した「固相誘導体化法」

メタボロミクスでは，あらゆる物質の代謝を把握するみ込こんだ抽出後の前処理から測定までを全自動化した

ために，網羅的に多くの物質を一度に測定することが望

3）4）を「オンライン固相誘導体化 SPE-GC/MS システム」

まれている．代謝物の主格でもあるアミノ酸や有機酸，糖類などは極性が高い不揮発性物質であるため，通常はLC の測定対象物質である．しかし，それらはそれぞれ紹介する．

2 固相誘導体化法の原理異なる物性を持っているため，LC において一斉に分析固相誘導体化法（特許取得）の原理を図 2 に示す．

することは難しい．そこで，これらを誘導体化（メトキ

固相はスルホン酸の陽イオン交換樹脂（CX）と 4 級アシム化，トリメチルシリル（TMS）化：図 1）するこンモニウムの陰イオン交換樹脂（AX）の 2 層になってとで，揮発性物質に化学的に変化させ，GC による一斉おり，それぞれの樹脂が持つ官能基はマイナスとプラス分析を可能としている．このように，アミノ酸・有機に強く帯電している．

酸・糖類の「誘導体化」による GC/MS の一斉分析は代Step 1：アミノ酸と有機酸を含む試料を固相に負荷し謝物を網羅的に分析できるという点から極めて有効であて，プラスに帯電しているアミノ基を持つアミノ酸はマり，さらに高分離能で，スペクトルライブラリを用いたイナスに帯電している固相 CX に，マイナスに帯電して検出成分の検索による定性が可能になる．

いるカルボキシル基を持つ有機酸はプラスに帯電していしかしながら，従来の「誘導体化」の前処理は，凍結る固相 AX に，イオン交換の相互作用により，固相に保乾燥（脱水）や誘導体化反応の工程に時間がかかり，抽持される．この時，試料に含まれる脂質（グリセリド）出など手作業に頼る工程も多く，煩雑で長時間を要し，や糖類などの非イオン性物質は固相に保持されず，その分析者の技量によってはデータがばらつくことがあるのまま除去される．

が現状である．また，前処理に問題があった場合は，再度，最初から時間のかかる前処理をやり直して分析することになることになり，その労力や時間的損失が大き

イオン性物質を洗い流し，除去する．
Step 3：アセトニトリルで固相に残存している水を洗い流し，固相から水を除去する．

い．
本シリーズでは，メタボロミクスの分析の効率化を目

図1
ぶんせき 2022 12

Step 2：アセトニトリル─水で固相に残存している非Step 4：誘導体化試薬（メトキシアミン／ピリジン溶

アミノ酸と有機酸の TMS 化

515

図2

固相誘導体化法の原理

浸させて，固相中で誘導体化反応を行う．アミノ基とカルボキシル基が MSTFA により誘導体化（TMS 化）され，イオン性を失ったアミノ酸と有機酸が固相から脱離する．
Step 6：TMS 化したアミノ酸と有機酸をヘキサンで固相から溶出する．その溶出液を GC/MS で測定する．

特に注目すべきところは Step 3 の脱水と Step 4 と 5の誘導体化である．従来法では凍結乾燥（水除去）に一晩（16 時間）かかっている作業を本法では固相にアセトニトリルを通液するだけで水除去を成し遂げている．
そのアセトニトリルの通液は 1 分未満で完了する．また，従来法ではメトキシム化に 90 分，TMS 化に 30 分かけて誘導体化しているが，本法ではメトキシム化に 3分，TMS 化に 1 分と大幅に反応時間を短縮している．
次にアミノ酸・有機酸・糖類の固相への保持について述べる．試料負荷時のアセトニトリル─水の濃度比と固相への保持についてそれぞれの成分と固相について調べた結果を図 3 に示す．アミノ酸と CX，有機酸と AX については水の濃度にかかわらず，保持することが分かった．一方，糖類と AX については 20 ％ アセトニトリル─水では固相に保持されず，1 ％ アセトニトリル─水で固相に保持されることが分かった．液相の水の濃度が低くなったために液相よりも固相の親水性相互作用（順相）により保持していると考えられる．この結果を基に糖類を除去したい時は 20 ％ 以上の水濃度で洗浄し，逆に固相に保持したい時は 1 ％ の水濃度で負荷する．

3 オンライン固相誘導体化 SPE-GC/MS シス
図 3 試料負荷時の水濃度と固相への保持についてテム
前処理に固相抽出法（SPE）を用いることのメリットの一つに前処理操作を自動化しやすいことが挙げられ液）を固相に 3 分間含浸させて，固相中で誘導体化反る．さらにシリーズ第 2 弾5）で紹介した固相からの溶出応を行い，ケトン基をメトキシム化する．

液を全量注入できるオンライン SPE-GC システムを用

Step 5：誘導体化試薬（MSTFA）を固相に 1 分間含516

いることで，抽出／除タンパク後の精製・誘導体化からぶんせき 2022 12

図4オンライン固相誘導体化 SPE-GC/MS システム

測定まで全自動で分析することが可能となった．本シスかけて凍結乾燥して脱水乾固する．その試験管にメトキテムにより，従来の分析法で課題となっていた個人が持シアミン／ピリジン溶液を添加して 90 分間誘導体化反つ技量やラボ間で生じる差を最小限に留め，かつサンプ応（メトキシム化）させ，その後，MSTFA を添加してルごとに誘導体化時間を一定に保てることにより，分析30 分間誘導体化反応（TMS 化）させ，バイアルに移しの精度および再現性が向上した．ここではそのオンライ替えて，GCMS にセットして GC/MS に 1 μL 注入（スン固相誘導体化 SPE-GC/MS システム（図 4）を紹介する．

プリット 25：1）で測定している．

これに対して，オンライン固相誘導体化 SPE-GC/MS法は，試料を水─アセトニトリルで抽出／除タンパクし，3･1 従来法と本法の比較

その上清をバイアルに移し替えて，本システムにセット

6）

従来法 と本法の比較を図 5 に示す．従来法は，試料する．その後は固相誘導体化を含む前処理から測定までをメタノール─水─クロロホルムで抽出／除タンパクし，全自動で行う．自動前処理の動作は，固相をアセトニト

次に水を追加しメタノール─水とクロロホルムを分離す

リル水でコンディショニングし，試料を 40 μL 吸引後，ることによる液液分配で親水性物質（メタノール─水相）固相に負荷させて，そのままアセトニトリル─水で洗浄と疎水性物質（クロロホルム相）に分けて脱脂する．そし，続けてアセトニトリルを通液させて固相内を脱水すして，その親水性物質を含むメタノール─水を試験管る．そして，メトキシアミン／ピリジン溶液（誘導体化（遠沈チューブ）に分注し，減圧濃縮遠心分離後，一晩試薬）を固相に含浸させて，測定対象物質がアミノ酸・

図5
ぶんせき 2022 12

従来法と本法の比較517

有機酸であれば 3 分間，糖類を含む場合は 15 分間，誘で測定するまでの時間が検体の測定順ごとに長くなり，導体化を行いメトキシム化する．次に MSTFA を固相その間，バイアル中での誘導体化が進行したり，逆に誘に 1 分間含浸させて，固相中で誘導体化を行い，目的導体化したものが分解したりと，測定対象物質の変動に物質を TMS 化する．そして，その固相カートリッジに問題があった．本システムでは誘導体化から GC に注ニードルを接続し，そのままニードルを GC 注入口に入するまでの時間が検体ごとに一定であるため，誘導体挿入して，ヘキサンで誘導体化物質を溶出させながら化時間の差による偏りを抑えられる．

GC/MS へその溶出液を全量注入し，スプリット 1：50

7）分析所要時間の効率化で測定する．

3･2 オンライン固相誘導体化システムのメリット
1）前処理時間の大幅な短縮

GC で測定している間に次の検体の前処理をオーバーラップして処理することで，GC の測定サイクル時間で，効率的に連続分析を行うことができる．

8）抽出液を保管することでき，再分析が容易

従来法は抽出後の処理工程に 20 時間を要するのに対本法ではバイアル中の処理した抽出液の一部（20～し，本法では固相誘導体化法により 15～30 分と大幅な50 μL）しか使用しないため，残りの抽出液をそのまま短縮を実現した．

バイアルで保管することができる．そのため，容易に再2）抽出後の前処理から測定までを全自動化分析ができる．

従来法では遠心分離や凍結乾燥などの各工程を連結させて自動化するのは難しく，検体の取り間違えなどのリ

4 分 析 例

スクもある．前処理に固相誘導体化法を採用することに4･1 アミノ酸・有機酸より，煩雑な作業を自動化することができた．これによ本システムを用いて，ホウレンソウ・トマト・ウメのり，人によるバラツキを低減し，分析精度を向上するこアミノ酸・有機酸の一斉分析を行い，成分比較を行っとができた．また，オペレータの操作も簡便で，事前にた．前処理フローを図 6 に示す．

溶媒瓶や固相カートリッジをセットしておけば，試料バ抽出操作：それぞれの農作物の可食部 100～200 g にイアル（抽出液）を本システムにセットし測定シーケン

ドライアイスを加えて凍結粉砕し試料とした．その試料スをスタートさせるだけなので，検体の取り間違えなど10 g を採取し，水 10 mL とアセトニトリル 20 mL をのリスクも低減しつつ，省力化の効果も得られる．

加え振とう抽出後，遠心分離し，除タンパクを行った．

3）手作業を必要とする抽出の簡易化

その上清を 500 μL 分取し，アセトニトリル 500 μL を

従来法はグリセリドなどの脂溶性物質を取り除くため加え，振とう遠心分離し，さらに除タンパクを行った．に抽出／除タンパク後にメタノール─水とクロロホルムで水酸化ナトリウム溶液で pH 調製し，バイアルに移し，液液分配による精製（脱脂）を行っているが，本法は自本システムにセットした．

動前処理による固相抽出の洗浄工程でグリセリドを除去

本法で得られたホウレンソウの連続測定によるピークしている．そのため，手作業を必要とする抽出操作は抽面積値の再現性を表 1 に示す．アミノ酸・有機酸とも出／除タンパクのみで抽出工程においても省力化となる．

良好な結果を得られた．本法による各試料の SCAN トー

4）精製効果タルイオンクロマトグラムを図 7 に示す．各試料から本法は GC-MS の汚染物質であるグリセリドや糖など得られた成分のピーク形状および分離も良好であった．の非イオン性の物質は固相に保持せず除去できるため，各試料から検出された成分のピーク面積比を図 8 に示

従来法に比べ，装置の汚染を軽減し，メンテナンス頻度す．ホウレンソウにはシュウ酸，トマトにはグルタミンきょうざつを抑えられる．また，精製効果により夾雑ピークが減少

酸，うめにはクエン酸が多く含むことが一般的に知られし解析もしやすくなる．ており，今回の結果からも各試料の成分の違いが明確に

5）従来法と比較して高感度判定できた．

本システムでは溶出する前に固相にニードルを装着し，溶出させながら GC に全量注入する．これにより，GC に注入される試料相対量を増やすことができ，従来4･2 糖類抽出液を固相上でアセトニトリルと混合して水濃度を法に比べ 6 倍程度の高感度分析が可能となる．なお，下げてから固相に負荷して，糖類を固相に保持させた．

注入絶対量が多くなるが，固相抽出で精製しているのそして，アセトニトリルで脱水し，その後誘導体化試

で，GC-MS への汚れの影響は少ない．

薬（メトキシアミン／ピリジン溶液）を固相に含浸して，6）誘導体化してから GC 注入までの時間が一定

固相中で誘導体化反応させてメトキシム化（図 9）した．

従来法は効率よく多検体を前処理するために一斉に誘導体化してから，GC にセットする．しかしながら，1本ずつ測定することになるので，誘導体化してから GC518

その後，誘導体化試薬 MSTFA を固相に含浸して，固相中で誘導体化反応させて TMS 化した．

糖類は環状構造や直鎖構造の構造異性体やそれらの立ぶんせき 2022 12

図6表1No.

成分名

2Alanine-2TMS

3Oxalic acid-2TMS

5

Malonic acid-2TMS6Valine-2TMS

8

Leucine-2TMS

9Isoleucine-2TMS

前処理フロー（アミノ酸／有機酸）

本法で得られたホウレンソウの連続測定によるピーク面積値の再現性
U1U2U3U4U5U6

2.5

532,192

3.5

548,802

512,489

526,249

519,043526,234

560,334

4,606,428 4,497,232 4,519,964 4,488,579 4,370,621 4,330,268 4,468,849
3,949,838 3,823,120 3,869,338 3,815,906 3,775,518 3,506,105 3,789,971
3,815,850 3,746,055 3,773,535 3,748,879 3,647,235 3,642,443 3,729,000
722,955

701,361

703,837

693,309677,892

656,913

11 Glycine-3TMS

311,795

300,133

304,260

291,269

293,179

271,290

13 Succinic acid-2TMS

686,713683,285

686,428

692,873

682,757

675,948

14 Fumaric acid-2TMS

142,760

142,743

148,768

147,353

140,625

139,958

16 Threonine-3TMS
17 Malic acid-3TMS
19 Aspartic acid-3TMS

602,931560,277

568,682558,021542,283

550,970

53,84457,581

57,174

46,74055,391

50,128435,615443,665

423,246

417,886

397,142

24 Threonic acid-4TMS

111,636

103,963

109,708

112,379

106,450

117,600

4,372

4,620

5,300

5,080

4,4894,590

29 Asparagine-3TMS
30 Putrescine-4TMS

100,127

90,21892,87994,574

87,116

79,29023,913

20,94622,90922,98821,733

20,749471,479

470,472

476,376

461,721453,838

32,88828,552

26,642

27,28325,23937 Tyrosine-3TMS

1,086,746 1,036,401 1,065,106 1,021,094 1,015,699

110,289
4,742

309,715305,531314,436

317,818

296,923

24,36490,701
22,206469,103

287,021

138,662

133,594

136,100

134,166

131,844

134,22854,50452,592

57,39854,37052,77451,431

2.3
4.0
1.9
3.3
4.7
0.8
2.5
3.4
3.7
1.2
1.9
8.0
4.2
4.3
7.7
1.4
2.8
4.6
7.8
5.7
2.1

11.0

305,2413.8

3,660,407 3,522,793 3,549,047 3,567,762 3,463,739 3,332,989 3,516,123

43 Adenosine-4TMS

2.0

27,495926,104 1,025,192

40 Tryptophan-3TMS

ぶんせき 2022 12

53,476426,698

1,993,942 1,800,771 1,838,868 1,826,318 1,806,007 1,968,777 1,872,447

480,734

36 Histidine-3TMS

563,861

1,525,816 1,487,573 1,505,821 1,508,921 1,441,017 1,419,540 1,481,448

32 Citric acid-4TMS
35 Lysine-4TMS

143,701

4,609,844 4,600,117 4,559,014 4,622,500 4,452,911 4,616,932 4,576,886

31 Shikimic acid-4TMS
34 Adenine-2TMS

684,667

4,528,602 4,434,587 4,423,349 4,546,915 4,327,986 4,393,956 4,442,566
442,63127 Phenylalanine-2TMS

295,321

1,584,318 1,575,211 1,591,829 1,609,113 1,555,666 1,566,658 1,580,466

22 GABA-3TMS

26 Glutamic acid-3TMS

692,711

3,965,989 3,691,721 3,774,761 3,724,560 3,590,127 3,663,876 3,735,172

20 Methionine-2TMS

25 Ketoglutaric acid-MO-2TMS

RSD., %

2,705,765 2,625,243 2,661,635 2,613,090 2,563,111 2,522,121 2,615,161

21,958,314 21,851,090 21,894,348 22,511,436 21,642,163 21,152,779 21,835,022

10 Proline-2TMS

15 Serine-3TMS

Ave.

134,76653,845

5.4
3.1
1.7
3.9519体異性体で化学平衡しており，そのまま GC で測定すると複数のピークが出現し，解析が困難である．そこ
で，GC で測定する時は直鎖構造の時にメトキシム化することで環状構造への変化を防ぎ，直鎖構造のメトキシム化へ反応させていくことにより，出現するピーク数を抑えられる．従来法ではこのメトキシム化の反応に 90分を要するが，本システムでは 15 分で行った．

4･3 アミノ酸・有機酸・糖類（2 段階試料負荷法）
食品試料では多成分が様々な濃度範囲で含有している．特に高濃度の糖類が存在する試料においては，その糖類のピークのリテンションタイムに近接する低濃度のアミノ酸や有機酸の測定が困難になるという問題がある．また，高濃度の糖類が大量に GC に導入されると，分離カラムの液相の保持可能な量を超え，目的成分も含めてリテンションタイムが大きくずれることがあり，解析が困難になる．さらに，高濃度の糖類が MS に導入されることにより，MS の汚染や感度低下につながる．
そこで，低濃度のアミノ酸および有機酸と高濃度の糖類の一斉分析を目的とし，2 段階試料負荷法7）を開発した．前処理フローを図 10 に示す．1 回目の試料負荷では，溶媒アセトニトリル─水（4/1）の試料 40 μL を固相に負荷して，糖類は固相に保持させずアミノ酸と有機酸を固相に保持する．2 回目のサンプル負荷では，固相
図7

本法による各農作物の SCAN トータルイオンクロマト
グラム

上で試料 2 μL をアセトニトリルと混合して水濃度比率

図 8 ホウレンソウ , トマト , ウメにおける各成分のピーク面積値の比較
HOU：ホウレンソウ，TOM：トマト，UME：ウメ

520

ぶんせき 2022 12図9糖類の異性体とメトキシム化

図 10 前処理フロー（アミノ酸／有機酸／糖類）を下げた状態で同じ固相に負荷し糖類を保持する．よっ

結乾燥／遠心乾固の工程における気化損失が懸念されるたて，アミノ酸と有機酸は第 1 回目の試料負荷 40 µL とめ，前処理が難しく，塩酸酸性下でのジエチルエーテル

2 回目の 2 μL を合わせて 42 μL 分が固相に保持してい抽出などの手法が取られることが多い．また，分子量のることになる．一方，糖類は 1 回目は保持されず，2 回小さい短鎖脂肪酸であるギ酸，酢酸，プロピオン酸は目の 2 μL が固相に保持されていることになる．つまり，MSTFA で TMS 化しても沸点が低く，残存誘導体化試2 段階に分けて試料量および溶媒比率を変更して固相に負荷することで，低濃度のアミノ酸および有機酸を多く固相に保持させ，高濃度の糖類を同じ固相に少なく保持させることができる．

薬由来のピークとリテンションタイムが重なり測定が難しい．一方，短鎖脂肪酸には誘導体化試薬に MTBSTFAを用いて TMS 化よりも質量が重くなる t-BDMS（t-butyldimethyl silyl）化をすることで残存誘導体化試薬由来の低濃度のアミノ酸・有機酸と高濃度の糖類が含まれて妨害ピークとの重なりを回避する手法が報告されていいる野菜ジュースを用いて本法により得られた SCANる．そこで，凍結乾燥工程を必要としないオンライン固果，得られたクロマトグラムは同じダイナミックレンジ

誘導体化試薬による短鎖脂肪酸の一斉分析8）のメソッド内でそれぞれのピーク強度を得ることができた．これに開発を行い，有効であることが分かった．

トータルイオンクロマトグラムを図 11 に示す．その結相誘導体化 SPE/GC/MS システムを用いて，MTBSTFAより，GC-MS に負荷を与えることなく，低濃度のアミただし，ギ酸，酢酸，乳酸はブランクとして高濃度でノ酸および有機酸と高濃度の糖類を含む試料の一斉分析検出される．特にプラスチック製品からの溶出が疑わが可能であることが示された．

れ，遠沈チューブやピペットのチップ，固相カートリッ
ジ，溶媒，誘導体化試薬などが疑われる．微量ながらそ4･4 短鎖脂肪酸のほかの成分も多く検出されるので，ブランク操作の測

従来のメタボローム分析において，短鎖脂肪酸は，凍定は必ず行うことをお勧めする．

ぶんせき 2022 12521

図 11 本法による野菜ジュースの SCAN トータルイオンクロマトグラム

5 ま と め従来，アミノ酸や有機酸を GC/MS で測定するには凍結乾燥や誘導体化が必要であり，その工程に多くの労力と時間を費やしていた．しかし固相誘導体化法によりそれらを劇的に改善することができた．さらにその固相誘導体化法とオンライン SPE-GC/MS システムとの融合により前処理から測定までを完全に自動化することでメタボローム分析の更なる効率化と分析精度の向上を図ることができた．
医学や食品，バイオなどの様々な分野のメタボローム
分析においてこのオンライン固相誘導体化 SPE-GC/MSシステムを用いることで，正確な評価や多くの情報の獲得による研究開発のスピードアップが期待できる．

Biosci. Bioeng., 124, 700（2017）.
3） 佐々野僚一，古野正浩，大森一生，山本祐一，片上直人，
下村伊一郎，福崎英一郎：第 11 回メタボロームシンポジ
ウム要旨集，p.100（2017）.
4） K. Yamamoto, M. Taniguchi, T. Nakahara, Y. Ito, R. Sasano,
E. Fukusaki : J. Biosci. Bioeng., 132, 599（2021）.
5） 島三記絵，松尾俊介，佐々野僚一：ぶんせき（Bunseki），2022, 286.
6） O. Fiehn, J. Kopka, R. N. Trethewey, L. Willmitzer : Anal.
Chem., 72, 3573（2000）.
7） 佐々野僚一，大崎秀介，古野正浩，福崎英一郎：第 65 回
質量分析総合討論会講演要旨集，p.63（2017）.
8） 佐々野僚一，杉立久仁代，野原健太，古野正浩，福崎英
一郎：第 12 回メタボロームシンポジウム要旨集，p.115（2018）.
●●佐々野僚一（Ryoichi Sasano）
株式会社アイスティサイエンス（〒640─8390 和歌山市有本 18─3）．《現在の研究文献

1） 佐々野僚一，大崎秀介，松本明弘，馬場健史，山下俊幸，福崎英一郎：第 9 回メタボロームシンポジウム要旨集，p.54（2015）.
2） E. Takeo, R. Sasano, S. Shimma, T. Bamba, E. Fukusaki : J.

テーマ》理化学分析における前処理の自動化．《趣味》テニス．
E─mail : sasano@aisti.co.jp

会社ホームページ URL：
http://www.aisti.co.jp/

関連製品ページ URL：

http://www.aisti.co.jp/product/sgi-m100/

522

ぶんせき 2022 12