「揺らぎと生体機能」ニュースレター
No. 2626 January, 2011
業績紹介：遠隔ループ変異がおよぼす構造安定性および活性変調に対する干渉効果
楯 真一（広島大学理学研究科・A02 公募研究代表者）(DHFR)を対象とし４つのループに対して欠失変異（∆52, ∆67, ∆121, ∆145）を導入した時の構造安定正・酵素活性パラメーターに対する影響を調べた（図１）。

論文題目："Coupling effects of distal loops on structural

また、二重欠失変異の影響

stability and enzymatic activity of Escherichia coliも解析した。

dihydrofolate reductase by deletion mutants"

尿素による変性自由エネ

著者 ： Yuji Horiuchi, Eiji Ohmae, Shin-ichi Tate, andルギー変化を１つの欠失変

Kunihiko Gekko

異の場合と二重欠失変異の雑誌巻号：Biochim. Biophys. Acta, 1804, 846-855 (2010)場合とで比較した結果の一部を示す（図２）。特に興味

図１：DHFR の立体構造と変異点深いのは Arg52 に対する欠タンパク質の構造揺らぎと機能との関係を解析するには、タンパク質の構造を大きく変化させずにその揺失変異体である。尿素変性に対する自由エネルギー変らぎのみを変化させる試料上の工夫が必要である。私化の大きさから、∆52 変異体は野生体よりも立体構造たちの研究グループでは、タンパク質の立体構造形成が安定になる性質があることが分かる。∆67 変異が立には大きな寄与をしないと考えられる構造柔軟性を持

体構造を不安定化するのに対して、∆52/∆67 二重変異つループへの変異が、構造安定性・機能変調に影響を体では∆52 の構造安定化効果が作用するようで∆67 単与えるという現象を様々な変異体を使って解析してき独変異体よりも逆に立体構造が安定化するという効果ている。また、異なるループ部に同時に変異を導入しが観測された。

た二重変異体を用いた実験では、２つの変異の影響が、活性に関しては、∆52 は Km が２桁ほど野生体よりも多くの場合は加算的ではなく相互に干渉して非加算的悪くなるために酵素活性として野生体よりも低下する効果をおよぼすことを見いだしている。

が、興味深いことに kcat は、野生型の約３倍に向上しループ変異間での干渉は、遠隔位置にあるアミノ酸ている。∆67 変異体では Km の低下は顕著ではないが、残基が機能上や構造安定化の上で、相互に依存し合っkcat は野生体の約半分になる。∆52/∆67 2 重欠損変異体ていることを示す。ループ部の二重変異が立体構造にの酵素活性は、∆67 変異体より低下するが、その低下大きな摂動を与えないことは、変異によりわずかなの程度は非加算的である。特に興味深いことに、二重CD スペクトル変化しか観測されないことから示され変異体の kcat は∆67 変異体よりも向上するが、∆52 変異る。したがって、遠隔位置にある変異の影響が相互に体の 1/3 程度の値にしかならない。２つの変異が酵素干渉するには、立体構造の変化ではなく、タンパク質反応過程で相互干渉していることが分かる。

構造に内在する揺らぎの変化が主に関与していると考この一連のデータからも異なるループ変異の様々なえられる。この事実から私たちは、ループ変異が、タ相互干渉が観測されるが、それがどのように揺らぎのンパク質構造の揺らぎをかなり選択的に変化させる試

変調と関連するかが興味深い。
今後順次解析を進める。

料を提供すると考え、揺らぎと機能の関係を解明する対象として利用している。研究プロジェクトではループ変異が実際のどのような揺らぎの変調を誘導するかを NMR による定量的な解析を進めている。同時に、様々なパターンのループ変異体の特性解明も進めており、揺らぎと機能の相関を解析する新たな対象の探索
図２：欠失変異体の変性自由エネルギー変化の比較も進めている。今回紹介する論文は、新たなタイプのループ変異体に関する特性についての報告である。
この研究では、E.coli 由来のジヒドロ葉酸還元酵素

1

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No. 2626 January, 2011
業績紹介：ハイブリッドリポソームのアポトーシス誘導による胃がん治療上岡龍一（崇城大学応用生命科学・A03 計画研究代表者）

投与群（Dose 136 mg/kg および 203 mg/kg）では、未治療群と比べ、腫瘍結節数および腹水量に顕著な減少がみられ、高い治療効果を示した（図 1）。また、未治療

論文題目："Therapeutic effects of hybrid liposomes on群に対する HL 投与群の延命率は、Dose 136 mg/kg で

gastric carcinoma involve apoptosis "は 135％以上（p<0.05）、Dose 203 mg/kg では 145％以上（p<0.01）であり、高い延命効果が得られた。次に、

著者：Hideaki Ichihara, Yusuke Matsuoka, Yoko

アポトーシス誘導について検証するため、腫瘍採取後、

Matsumoto, and Ryuichi Ueoka

TUNEL 染色した腫瘍組織切片を観察した。
その結果、雑誌巻号：Anticancer Res., 30, 2011–2016 (2010)

HL 投与群（Dose 136 mg/kg および 203 mg/kg）において、アポトーシス誘導に伴う DNA 断片化が明らかに筆者らが創製したハイブリッドリポソーム（HL）はなった。すなわち、HL が、胃がん腹膜播種モデルマ[1]、従来の制がん剤なしに HL のみで種々のヒトがんウスに対して、アポトーシス誘導による顕著な治療効細胞に対し増殖抑制効果を示し、アポトーシスを誘導果および延命効果を示すことを明確にした。

することが明らかになっている[2]。in vivo において、

以上のように、胃がんの腹膜播種に関して、HL の担がんマウスを用いた治療実験から延命効果が得られみによる副作用のない顕著な治療効果が動物レベルで[3]、正常動物を用いた安全性試験で副作用が無いこと確認されたことから、臨床応用が期待できる。

が確認されている[4]。生命倫理委員会承認後の悪性リンパ腫患者に対する臨床試験において、高い安全性および延命効果が得られている[5]。
本研究では、in vitro におけるコトンラット胃がん（CoRa 622 G6）細胞に対するアポトーシス誘導メカニ
ズムと in vivo における胃がんの腹膜播種マウスモデルに対する HL の治療効果を検討した。以下に結果を示す。
①HL は、直径約 100 nm の均一なベシクルであることが観察された。動的光散乱法からは、1 ヶ月以上安定であることが明らかとなった。すなわち、HL は細網内皮系への取り込みが回避可能な膜直径であり、長期間安定で、臨床応用における保存に有用であることが明確となった。
②in vitro における胃がん細胞に対するアポトーシス誘導メカニズムの解析から、アポトーシスシグナルとして最も重要なカスペース-3, -8, -9 を活性化していることが明らかとなった。また、ミトコンドリアの関与

図 1．胃がん腹膜播種モデルマウスに対する HL の治療効果
A：腹腔内写真、B：腫瘍数、C：腹水量
HL 治療群は未治療のコントロール群と比較して、腫瘍数および腹水が、顕著に減少した。

を検討した結果、HL 処理した CoRa 622 G6 細胞でミトコンドリアの膜電位の低下が観察されたことから、アポトーシス誘導にミトコンドリアが関与していることも明らかにした。HL の制がんメカニズムは、HL がCoRa 622 G6 細胞膜に融合・蓄積後、ミトコンドリア参考文献[1] R. Ueoka et al., J. Am. Chem. Soc., 110, 1588-1595(1988). [2] Y. Matsumoto et al., Int. J. Cancer, 115,377-382 (2005). [3] R. Ueoka et al., Biol. Pharm. Bull., 23,1262-1263 (2000). [4] H. Nagami et. al., Int. J. Pharm.,
315, 167-172 (2006). [5] H. Ichihara et al., Anticancer Res.,28, 1187-1196 (2008).

およびカスペース-3, -8, -9 を経由するアポトーシス誘導である可能性を明らかにした。
③ヌードマウスに CoRa 622 G6 細胞を腹膜移植し、胃がん腹膜播種モデルマウスを作成後、HL の制がん効果およびアポトーシス誘導について検討した。HL2

「揺らぎと生体機能」ニュースレター
No. ２６26 Ｊａｎｕａｒｙ, 201１
業績紹介：ハイブリッドリポソームの白血病細胞に対するアポトーシス誘導メカニズムへの脂質ラフトの関与
上岡龍一（崇城大生物生命・A03 計画研究代表者）

脂質ラフトに多く存在する GM1 を蛍光標識コレラ
トキシン B (赤)で染色し、共焦点レーザ顕微鏡で観察したところ、未処理の白血病細胞は、均一な膜構造を示した（図 3, Control）。一方、HL-23 を処理した白血論文題目："Clustering of lipid rafts in plasma membranes
by hybrid liposomes for leukemia cells along with

病細胞では、膜構造が大きく偏り、脂質ドメイン(GM1)apoptosis"のクラスター形成が観察された（図 3, Treatment）。
以上の結果より、ハイブリッドリポソームは、白血

著者：Yuji Komizu, Sayuri Nakata, Koichi Goto, Yoko
Matsumoto, and Ryuichi Ueoka

病細胞に対して、細胞膜上で脂質ラフトのクラスター

雑誌巻号：Chem. Lett., 39, 1291–1293 (2010).

を形成し、アポトーシスシグナル伝達を活性化させることが初めて明らかになった。現在、詳細な脂質ラフトのシグナル伝達機構について検討している。

ハイブリッドリポソーム (HL) は、種々の培養がん細胞に対して、細胞レベルおよび動物レベルでがん細Apoptotic D NA Rate (%)

100胞増殖を抑制し、アポトーシスを誘導することを示した。患者様へのインフォームド・コンセントを経て、生命倫理委員会承認後の臨床応用では、副作用が無く、リンパ腫の縮小効果を得ている。
ヒト白血病 (HL-60) 細胞に対するアポトーシス誘75***50250

導メカニズムに関し、Fas (デスレセプター) およびミ**0246Time (h)トコンドリアを経由して、核にアポトーシスシグナル

図1 HL-23の白血病 (HL-60) 細胞に対するアポトーシス誘導が伝わり細胞死を誘導することが分かっている。しかし、細胞膜構造変化についての影響は分かっていな

150

Fluorescence Intensity (-)

かった。
一方、脂質ラフトは、コレステロール、スフィンゴ脂質、ガングリオシド (GM1) を多く含み、細胞膜上で脂質ドメインを形成している。近年、ラフトは、細胞膜上でシグナル伝達のプラットホームとして働き、膜の構築そのものが機能をもつことが示唆されている。

1005000特に、アポトーシス誘導シグナル分子とラフトとの関51015202530

Time (min)

わり合いが注目を集めている。

図2 蛍光脂質含有HL-23の白血病 (HL-60) 細胞に対する短時間での融合・蓄積

本研究では、リン脂質 (DMPC) および PEG 系界面活性剤 C12(EO)23 からなるハイブリッドリポソーム(HL-23) を用い、ハイブリッドリポソームのヒト白血Treatment

Control

HL-23

病 (HL-60) 細胞に対するアポトーシス誘導メカニズ

90 mol % DMPC/10mol% C1 2 (EO) 2 3

ムへのラフトの関与について in vitro で検討した。
ハイブリッドリポソームは、HL-60 細胞に対して、DMPC
C1 2 (EO) 2 3

アポトーシスを誘導することが明らかになった（図 1）。

HL-60 cell

10 µm

10 µm

次に、ハイブリッドリポソーム細胞膜への融合・蓄積を蛍光脂質含有ハイブリッドリポソーム

図3 HL-23の白血病 (HL-60) 細胞膜における脂質ラフトのクラスター形成
処理時間：10 min(HL/NBDPC) を用い検討した。HL/NBDPC は、短時間で HL-60 細胞膜に集積することが分かった（図 2）。

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No. 2626 January, 2011
業績紹介：蛍光脂質含有ハイブリッドリポソームのヒト肺がん細胞に対する特異的蓄積と制がん効果
上岡龍一（崇城大学応用生命科学・A03 計画研究代表者）
松下 琢（崇城大学応用生命科学・A03 公募研究代表者）

HL-23/NBDPC の肺がん細胞への蓄積は、細胞膜の流動性が関与している可能性が高いと考えられる。
正常肺細胞(HMVEC- L)

肺がん細胞(H520)

論文題目："ハイブリッドリポソームの肺がん細胞への特異的蓄積と制がん効果"

0 min

著者：行原真美子, 古水雄志, 田上修, 松下琢, 松本陽子, 上岡龍一
雑誌巻号：薬学雑誌, 130, 1581–1587 (2010)
ハイブリッドリポソーム (HL) は、リン脂質と界面

180 minScale bar: 20 μm

活性剤を緩衝水溶液中で超音波照射するだけで容易に得られる生体適合性の医用素材であり[1]、これまでに、in vitro において種々の培養がん細胞に対する制がん効図．HL-23/NBDPCの肺がん細胞への特異的融合・蓄積

果および制がんメカニズムが明らかになっている[2]。

（3）HL-23 の種々の肺がん細胞に対する IC50 値をまた、in vivo において、担がんモデル動物に対する治WST-1 assay により検討した結果、DMPC 単一リポソ療効果および正常動物に対する安全性が確認されておームの IC50 値の約 1/2 であった。種類の異なる肺がんり、さらに、生命倫理委員会の承認後、臨床応用にお細胞に対し、HL-23 が DMPC 単一リポソームより顕著いて副作用がなく、固形リンパ腫瘍の顕著な縮小効果に高い増殖抑制効果を示すことを明らかにした。

が得られている[3]。

（4）HL-23 が各種肺がん細胞に対して誘導する細胞

本研究では、肺がんの約 85%を占め、抗がん剤が効死について、Annexin-V binding assay を用いて検討した

き難いと言われている非小細胞がん（NSCLC）に焦点結果、7～11 時間後に Annexin-V-Fluorescein の緑色蛍を合わせ、リン脂質 (DMPC) と PEG 系界面活性剤光のみが観察され、初期のアポトーシス誘導が明らか[C12(EO)23] からなる HL-23 および HL に蛍光脂質となった。また、TUNEL assay の結果、HL-23 処理 48(NBDPC) を 組 み 込 ん だ 蛍 光 脂 質 含 有 HL

時間後に、すべての細胞において TUNEL 陽性を示す（HL-23/NBDPC）の肺がん細胞に対する融合・蓄積、緑色蛍光が観察され、DNA の断片化が確認された。以

増殖抑制効果およびアポトーシス誘導について検討し上の結果より、HL-23 は肺がん細胞に対しアポトーシた。以下に結果を示す。

スを誘導することが初めて明らかとなった（ 1） HL-23/NBDPC を 種々の 肺がん 細胞 (A549,

以上のように、HL-23 は非小細胞がんに対し選択的

H460, H23, H520) および正常肺細胞 (WI-38, NHLF,に融合・蓄積し、アポトーシスを誘導することによりHMVEC-L)に添加し、共焦点レーザー顕微鏡を用いて顕著に大きな増殖抑制効果を示すことが明らかになっ

3 時間観察した。肺がん細胞には HL-23/NBDPC の強た。今後、肺がんの新しい治療薬として期待される。

い蛍光が観察されたが、正常肺細胞には極めて弱い蛍光しか観察されず（図）、HL-23/NBDPC が肺がん細胞参考文献に選択的に融合・蓄積することが明らかとなった。

[1] R. Ueoka et al., J. Am. Chem. Soc., 110, 1588-1595（2）肺がん細胞および正常肺細胞の膜流動性を蛍光(1988). [2] Y. Matsumoto et al., Int. J. Cancer, 115,

偏光解消法により測定した結果、肺がん細胞の膜流動377-382 (2005). [3] H. Ichihara et al., Anticancer Res., 28性は正常肺 細胞よりも高いことが明ら かになり、

1187-1196 (2008).

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No. 2626 January, 2011
業績紹介：22-oxa-dihydroxyvitamin D3 の胆管細胞癌に対する有効性についての検討
岡田誠治（熊本大学エイズ研・A03 公募研究代表者）

増加と Cycline D1, PNCAの減少が認められた。
そこで、CCA の初代組織培養系を樹立し、22-Oxa-D3 を添加したところ、TUNEL 法によりアポトーシス細胞の増加

論文題目："22-oxa-1,25-dihydroxyvitamin D3 efficientlyが認められた。

inhibits tumor growth in inoculated mice and primary

以上の結果より、22-Oxa-D3 が胆管細胞癌の有効なhistoculutre of Cholangiocarcinoma"治療薬となり得ることが示唆された。この結果を受け

著者：Wunchana Seubwai, Chaisiri Wongkham, Anuchaて、コンケン大学において 22-Oxa-D3 の臨床試験が開Puapairoj, Seiji Okada, and Sopit Wongkham

始されている.

雑誌巻号：Cancer 116 (23), 5535-5543 (2010)
胆管細胞癌（Cholangiocarcinoma；CCA）は、胆管上皮から生じる悪性腫瘍である。CCA は初期診断が困難であり、発見時には多くは進行癌で手術不能であり、化学療法も有効なものはないことから、予後不良の疾患である。タイ東北部は、肝吸虫の持続感染を起因とする CCA の好発地域であり、大きな社会問題となっている。
Vitamin D3 は、カルシウムのホメオスタシスに必須のビタミンであるが、活性化型 Vitamin D3 は、乳癌や大腸癌などにおいてその細胞増殖を制御していることが知られている。Vitamin D3 は、高カルシウム血症を起こすため、臨床応用は限られていたが、最近、高カル シ ウ ム 血 症 が 生 じ に く い 誘 導 体
22-oxa-dihydroxyvitamin D3 (22-Oxa-D3) が市販された。

図 １ ． CCA 細 胞 株 移 植 マ ウ ス モ デ ル に お け る

本研究では、CCA 細胞株をマウスに移植したマウスモ22-Oxa-D3 の有効性．
A.B. 22-Oxa-D3 投与により M213,デル系と CCA の初代培養系を用いて 22-Oxa-D3 のM214 いずれにおいても腫瘍増殖抑制が認められた。

CCA に対する有効性を検討した。

また、体重減少(C)や血清中カルシウムの増加(D)など

MTT 法 に よ り CCA 細 胞 株 (M213, M214) がの副作用は認められなかった。

22-Oxa-D3 添加により細胞増殖が抑制されることが判明した。FACS を用いた解析では、細胞周期の停止が参考文献認められ、Western blot 法により p21 の増加と Cyclin D1[1] S. Okada et al., Int. J. Hematol. 88, 476-482 (2008).の減少が認められた。そこで、高度免疫不全マウス（NOJ マウス）[1]に CCA 細胞株を移植した CCA マウ

本研究は、タイ国 Royal Golden Jubilee Ph.D. Program

スモデルに 22-Oxa-D3 (15 µg/kg/day) を 17 日間腹腔内(RGJ) と 日本 学 生 支 援機 構 (JASSO) の 支 援 に よ り、投与し、その in vivo における有効性を検討した。そのWunchana Seubwai 氏（コンケン大学医学部医学博士課

結果、M213, M214 いずれを移植したマウスにおいて程学生）が、熊本大学に一年間滞在して行った研究をも腫瘍の縮小が認められた。また、血清中カルシウムまとめたものである。の増加などの副作用は認められなかった。移植した腫瘍の免疫組織 染色及 び Western blot 法 解析では、
22-Oxa-D3 投与群において Vitamin D 受容体増加、p215