大分大学教育福祉科学部研究紀要（Res. Bull. Fac. Educ.＆Welf. Sci., Oita Univ.）

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スギナの葉緑体核様体に及ぼすシプロフロキサシンの影響

泉

【要旨】

好弘＊・ 富松美樹＊

紅藻類や緑色植物の葉緑体は藍藻類が共生したものであるということは，一般に広く知られている。DNA の構造変化を触媒する DNA ジャイレースは，原核生物の DNA 複製に，重要な役割を果たしている。我々
は，原核生物の DNA ジャイレース活性を阻害する抗生物質がスギナの葉緑体核様体に及ぼす影響を明らかにするため，抗生物質で処理された前葉体の葉緑体核様体の数を測定した。抗生物質で処理されていない前葉体では，小さな葉緑体核様体が葉緑体内に多数分布していた。一方，抗生物質で処理された前葉体の葉緑体には少数の葉緑体核様体が存在した。これらの結果は，スギナの DNA ジャイレースが核様体が葉緑体内で分散する際に重要な役割を果たしていることを示唆している。
【キーワード】類

葉緑体核様体DNA ジャイレース

抗生物質

トクサ

シダ植物

Ⅰ

はじめに

葉 緑 体 の 起 源 は ， 細 胞 内 に 共 生 し た 藍 藻 類 で あ る と 考 え ら れ て い る （ Margulis 1970,
Cavalier-Smith 2000）。藍藻類を含む原核生物の細胞を構成する物質は真核生物のものと一部異なるため，原核生物のみに存在する酵素が多数存在する。これらの酵素の阻害剤は真核生物の成長には影響を及ぼさないと考えられるため，抗生物質として利用されている。
原核生物では細胞質中に環状の DNA が存在するが，通常，その環状 DNA は複雑に絡み合っている。このような状態では，DNA の複製が進行しないため，DNA を複製する際には DNAを弛緩した状態に戻す必要がある。このような DNA の構造変化に関与する酵素は一般に DNA
トポイソメラーゼと呼ばれている。それらの中で DNA ジャイレースは，原核生物に特有の DNAトポイソメラーゼとして広く知られている。DNA ジャイレースの阻害剤を原核生物に作用させると DNA の構造変化が阻害され，DNA が複製できなくなり，最終的にその原核生物は死滅する。DNA ジャイレースは真核生物には存在しないと考えられていたため，DNA ジャイレー
スの阻害剤であるナリジクス酸やシプロフロキサシンは抗生物質として利用されてきた。
このように DNA ジャイレースは真核生物には存在しないと考えられていたが，その後の研平成 19 年 10 月 30 日受理＊いずみ・よしひろ，とみまつ・みき

大分大学教育福祉科学部生物学教室

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泉 ・富松

究で，植物の葉緑体において重要な働きをしていることが明らかになってきた。Itoh et al.
（1997）は，DNA ジャイレースの阻害剤が紅藻類の葉緑体 DNA の複製と分配を阻害し，分裂によって核様体（DNA）を持つ娘葉緑体と核様体を持たない娘葉緑体が生じることを報告した。この結果は，葉緑体の起源であると考えられている藍藻類に存在する DNA ジャイレースが紅藻類にも存在し，葉緑体に対して原核生物と同様の働きをしていることを示唆している。
一方，Cho et al.（2004）は，タバコ属植物の DNA ジャイレース活性を阻害すると，DNA の複製は阻害されないが，本来葉緑体内に散在している核様体が中央部に密集するようになることを報告した。また，我々は，シダ類のノキシノブの DNA ジャイレース活性を阻害すると，タバコ属植物の場合と同様に，本来葉緑体内に散在している核様体が中央部に密集するようになることを報告した（泉ほか 2007）。これらの結果は，被子植物やシダ類の DNA ジャイレー
スは葉緑体内において核様体が分散する際にのみ作用することを示唆しており，進化の過程でDNA ジャイレースの役割が変化したのではないかと考えられる。
シダ植物はシダ類，トクサ類及び小葉類の３つに大別されるため，シダ植物における DNAジャイレースの働きを明らかにするためにはトクサ類や小葉類においても DNA ジャイレース阻害剤の影響を調べる必要がある。そこで今回の研究では，トクサ類のスギナ（ Equisetumarvense）を用いて葉緑体核様体に及ぼす DNA ジャイレース阻害剤の影響を調べた。

Ⅱ材料と方法

１ 実験材料
今回の実験に用いたスギナ（Equisetum arvense）の胞子は，大分大学内で採集した。ジャイレースの活性を阻害する抗生物質として，シプロフロキサシン塩酸塩（和光）を用いた。
２ 培養条件1 / 2 の濃度の Knop 培地（Knop 1865）を基本培地とし，抗生物質を加えたものを培地として用いた。３種類の濃度（0.01, 0.05, 0.1 mM）でシプロフロキサシンを加えた培地と抗生物質を加えていない培地（コントロール）の計４種類の培地を実験に用いた。これらの培地にスギナの胞子を撒き，25℃，連続光下で 6 日間培養した。
３ 前葉体の観察
成長した前葉体を NS 緩衝液（Kuroiwa et al. 1981）に溶かした 2%グルタルアルデヒド溶液で 1 時間以上固定し，光学顕微鏡で観察した。前葉体の成長に及ぼすシプロフロキサシンの影響を調べるために，前葉体の細胞数を測定した。すべての測定には 100 個以上の前葉体を用いた。
４ 葉緑体核様体の観察
固定した前葉体を 2% セルラーゼ“オノヅカ”RS（ヤクルト）及び 0.3% ペクトリアーゼ
Y-23（キッコーマン）を含む酵素液に浸し，35℃で約 2 時間処理した後，再固定した。酵素処理された前葉体を 1 mg /l の濃度の 4',6-Diamidino-2-phenlyindole（DAPI, Sigma）で約 10分間染色し，蛍光顕微鏡で観察した。葉緑体核様体に及ぼすシプロフロキサシンの影響を調べ

スギナの葉緑体核様体に及ぼす抗生物質の影響

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るために，葉緑体内の核様体の数を測定した。すべての測定には 100 個以上の葉緑体を用いた。

Ⅲ

結果と考察

１ 前葉体の成長に及ぼすシプロフロキサシンの影響
シプロフロキサシンを含まない培地で培養されたスギナ前葉体の細胞数の平均値は 4.3（±1.5）であった（図 1, 2）。一方，0.01，0.05 または 0.1 mM のシプロフロキサシンで処理された場合の細胞数の平均値はそれぞれ 4.7（±1.4），4.2（±1.3）及び 4.0（±2.1）であった（図1, 2）。シャーリー・ウィリアムズの検定の結果，これらの値の間に有意な差はなかった（有意水準：0.05）。これらの結果は，6 日間の培養ではシプロフロキサシンによる成長阻害は見られないことを示している。
２ 葉緑体核様体に及ぼすシプロフロキサシンの影響
シプロフロキサシンを含まない培地で培養された前葉体を DAPI で染色し，紫外光下で観察すると，赤色に光るクロロフィルの自家蛍光の中に白色に光る小粒が多数観察された（図３A2）。その小粒は葉緑体核様体と呼ばれ，その小粒内には 1～数コピーの葉緑体 DNA が存在すると考えられている。シプロフロキサシンを含まない培地で培養された前葉体の葉緑体は 15個以上の核様体を持つものが多く，核様体数の平均値は 19.3（±5.6）であった（図４）。一方，
0.05 または 0.1 mM のシプロフロキサシンで処理された前葉体の葉緑体は少数の核様体を持つものが多く，平均値はそれぞれ 5.4（±1.9）及び 3.6（±1.5）であった（図４）。0.01 mM の濃度で処理された前葉体の葉緑体の核様体数はそれらの中間的な値で，平均値は 10.2（±2.2）であった（図４）。これらの結果は，タバコ属植物（Cho 2004）やシダ類のノキシノブ（泉ほか 2007）の場合と同様に，トクサ類のスギナにも DNA ジャイレースが存在し，シプロフロキサシンによって葉緑体内における核様体の分散が阻害されることを示唆している。
Miyamura et al.（1986）は，コムギの発芽初期における葉緑体核様体の変化を調べ，発芽の初期段階では核様体は葉緑体の中央部に密集しているが，その後の葉緑体の発達とともに核様体は小さな顆粒となり，葉緑体全体にランダムに分布するようになることを報告した。スギナにおいても胞子発芽の初期段階ではコムギと同様の現象が起こり，核様体が葉緑体全体に分散する過程がシプロフロキサシンによって阻害されたと考えられる。
紅藻類の葉緑体では，原核生物の細胞分裂の場合と同様に DNA ジャイレースは葉緑体分裂の際の DNA の複製と分配に重要な働きをしている（Itoh et al. 1997）。一方，トクサ類の DNAジャイレースは，被子植物やシダ類の場合と同様に葉緑体内における核様体の分散に重要な働きをしていることが今回の研究において明らかになった。本来，DNA ジャイレースは原核生物の細胞分裂の際の DNA の複製と分配に重要な働きをするものであるため，葉緑体分裂の際の DNA の複製と分配にも関与するはずであるが，シダ植物や被子植物では真核生物由来のDNA トポイソメラーゼが代わりに働いている可能性がある。シダ植物や被子植物では DNA ジャイレースの役割が変化して，葉緑体内で核様体を分散させる際にのみ DNA の構造変化を促進するようになったのではないかと我々は考えている。今後，シダ植物の小葉類，コケ植物及び緑藻類において同様の研究を行うことにより，進化のどの段階で DNA ジャイレースの役割が変化したのかが明らかなると考えられる。

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泉 ・富松

参考文献
Cavalier-Smith, T. (2000) Membrane heredity and early chloroplast evolution. Trends in Plant
Science 5: 174-182.
Cho, H., S., Lee, S., S., Kim, K., D., Hwang, I., Lim, J., S. and Park, Y. (2004) DNA gyrase isinvolved in chloroplast nucleoid partitioning. The Plant Cell 16: 2665-2682.
Itoh, R., Takahashi, H., Toda, K., Kuroiwa, H. and Kuroiwa, T. (1997) DNA gyrase involvementin chloroplast-nucleoid division in Cyanidioschyzon merolae. Eur. J. Cell Biol. 73: 252-258.
泉 好弘，佐藤 衣里， 金田 沙弓，倉富 桃李，酒井 達彦 (2007) シダ植物ノキシノブの葉緑体核様体に及ぼすシプロフロキサシンの影響 大分大学教育福祉科学部研究紀要 第 29 巻 61-67.
Knop, W. (1865) Quantitative Untersuchungen uber die Ernah Rungsprozesse der Pflanze.
Die Landwirtschaftlichen Versuchs-Stationen. 7: 93-107.
Kuroiwa, T., Nishibayashi, S., Kawano, S. and Suzuki, S. (1981) Visualization of DNA in variousphages (T4, χ, T7, f29) by ethidium bromide epi-fluorescent microscopy. Experientia 37:
969-971.
Margulis, L. (1970) Origin of eukaryotic cells. Yale Univ. Press, New Haven.
Miyamura, S., Nagata, T., and Kuroiwa, T. (1986) Quantitative fluorescence microscopy on
dynamic changes of plastid nucleoids during wheat development. Protoplasma 133: 66-72.

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スギナの葉緑体核様体に及ぼす抗生物質の影響抗生物質（シプロフロキサシン）で処理されたスギナの前葉体
A はシプロフロキサシンを含まない培地で，B は 0.01 mM，C は 0.05 mM，D は 0.1 mM のシプロフロキサシンを含む培地で培養された前葉体の写真である。6 日間の培養では，シプロフロキサシンによる成長阻害は見られなかった。

765
前葉体の細胞数

図１432100

図２0.010.05
シプロフロキサシンの濃度 （mM）

0.1

抗生物質（シプロフロキサシン）で処理されたスギナの前葉体の細胞数（平均値）

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富松

抗生物質（シプロフロキサシン）で処理されたスギナ前葉体の葉緑体内の DAPI 染色像
A1, B1, C1 及び D1 は透過光下で，A2, B2, C2 及び D2 は紫外光下で観察した像である。A1 及び A2 はシプロフロキサシンを含まない培地で，B1 及び B2 は 0.01 mM，C1 及び C2 は 0.05 mM，
D1 及び D2 は 0.1 mM のシプロフロキサシンを含む培地で培養された前葉体の葉緑体の写真で，それぞれ同一の視野で観察されたものである。無処理の前葉体では，小さな葉緑体核様体が葉緑体内に多数分布していたが（A2），抗生物質で処理された前葉体の葉緑体には少数の葉緑体核様体が存在した（C2 and D2）。

2520
葉緑体内の核様体の数

図３泉 ・15105000.010.050.1

抗生物質の濃度 （mM）

図４

抗生物質（シプロフロキサシン）で処理されたスギナ前葉体の葉緑体内に存在する核様体の数（平均値）

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スギナの葉緑体核様体に及ぼす抗生物質の影響

Effects of Ciprofloxacin on Chloroplast Nucleoids ofEquisetum arvense.

IZUMI, Yoshihiro and TOMIMATSU, Miki

Abstract
It is well known that the ancestor of the chloroplasts of red algaeand green plants is a cyanobacterium. DNA gyrase, which catalyzes thetopological transformation of DNA, plays an essential role in the DNA
replication of prokaryotes. To determine the effects of the antibiotics that
inhibit the bacterial DNA gyrase activity on the chloroplast nucleoids ofEquisetum arvense, the numbers of the chloroplast nucleoids inantibiotic-treated prothallia were counted. In untreated prothallia, manychloroplast nucleoids were randomly distributed in the chloroplasts. On
the other hand, the chloroplasts of antibiotic-treated prothallia had a few
chloroplast nucleoids. These results suggest that DNA gyrase ofEquisetum arvense

plays a critical role in the chloroplast nucleoid

dispersion.
【 Key words 】
Horsetail,

Chloroplast nucleoid,

Pteridophyte

DNA gyrase,

Antibiotic,