「揺らぎと生体機能」ニュースレター
No. 1726 April, 2010
業績紹介：タンパク質の揺らぎに適した新しい基準振動解析
木寺詔紀（横浜市大・A01 公募研究代表者）

本研究では、分子の一部分の外部運動を取り除いた場合（non-Eckart frame）の基準振動解析を実現する方法論を構築した。その中核は、Eckart frame における共論文題目："Normal mode analysis of protein dynamics in a

分散行列を non-Eckart frame における共分散行列へとnon-Eckart frame"変換する 公式 である。 この 公式によ って 得られた

著 者 ： Sotaro Fuchigami, Satoshi Omori, Mitsunori

non-Eckart frame における共分散行列を対角化するこIkeguchi, and Akinori Kideraとにより、望みの振動モードを得ることができる。

雑誌巻号： J. Chem. Phys. 132, 104109 (2010)T4 リゾチームの一方のドメイン（図の右側、青）の外部運動を取り除いた場合の結果を図(d-f) に示す。期タンパク質の平衡揺らぎは幅広い時空間スケールに待通り、3 つの低振動モードはもう一方のドメイン（図わたって生じている。しかし、タンパク質揺らぎの大の左側、赤）の運動として記述されており、いずれも部分は、少数の低振動モードで指定される低次元空間ドメイン運動であることが容易にわかる。

内の運動によって占められていることが知られている。
この低振動モードを求める簡便で有用な手法が基準振動解析である。現在までに、数多くのタンパク質にこの解析が適用され、タンパク質の揺らぎと機能の関係が明らかにされてきた。
ここで、例として、T4 リゾチームの 3 つの最低振動モードを図(a-c) に示す。2 つのドメインからなる T4リゾチームでは、3 つの最低振動モードはいずれもドメイン運動を表していることがわかる。しかし、矢印で示された運動がドメイン運動であることを理解するのには少々の時間を要するかもしれない。ドメイン運動を表示するには一方のドメインの運動方向を示せば十分であるにもかかわらず、振動モードでは 2 つのドメインが両方とも動くような形で運動が記述されているからである。その理由は外部運動の取り扱いにある。
タンパク質の内部運動を考えるときには、あらかじ

図：T4 リゾチームの低振動モード。2 つのドメインをめ外部運動（並進と回転）を取り除いておく必要があ赤と青で色付けしてある。矢印が各振動モードにおける。立体構造の重ね合わせはこの作業に相当する。従る運動の方向を示している。(a-c) 従来の基準振動解析。

来の基準振動解析ではタンパク質全体の外部運動が自(d-f) 右側のドメインの外部運動を取り除いた場合。

動的に取り除かれる。その結果、振動モードは図(a-c)
新しい基準振動解析は運動の表示法を変更したに過に示したような複雑な運動として表わされる。
しかし、タンパク質全体を用いた重ね合わせ（Eckart

ぎず、従来のものと本質的に等価である。しかし、異frame と呼ぶ）が運動の理解に最適であるとは限らななる視点からの解析結果は、複雑なタンパク質の運動い。ドメイン運動が起こっている場合、一方のドメイを理解する上で大きな助けとなるだろう。また、本研ンを用いて重ね合わせを行い、もう一方のドメインの究で得られた変換公式は、池口らによって提案された動きを観察する方がはるかに運動を理解しやすい。基

線形応答理論による構造変化の記述を基準振動解析に準振動解析でも同様のことができれば、振動モードで基づいて行うことを可能とする。今後、タンパク質立記述される運動の把握が容易になることが期待される。

体構造変化の因果関係解明に役立つと期待される。

1

「揺らぎと生体機能」ニュースレター
No. 1726 April, 2010
業績紹介：タンパク質構造揺らぎにおける主鎖二面角の補償的運動
木寺詔紀（横浜市大・A01 公募研究代表者）

H の大きな固有値に対応する固有ベクトル方向（わずかな二面角の変化で大きな座標の変化を生む方向）に二面角が変位した場合、蛋白質の球状構造に歪みが論 文 題 目 ： "Latent dynamics of a protein molecule

生じてポテンシャルエネルギーの急激な増加を与える。

observed in dihedral angle space"

従って、その方向はΣの小さな固有値を持つ固有ベク

著 者 ： Satoshi Omori, Sotaro Fuchigami, Mitsunori

トル方向（ポテンシャル面の曲率が大きい方向）と一Ikeguchi, and Akinori Kidera

致する。そのために逆相関が表れ、結果として二面角

雑誌巻号： J.Chem. Phys. 132, 115103-115109 (2010)

空間での揺らぎによる座標値の変化が小さく抑えられることとなる。これは蛋白質の球状構造がもたらしてタンパク質の構造変化は、主に主鎖二面角()の変いる特徴であると言える。実際、同様な解析を球状で化によってもたらされる。タンパク質の平衡状態でのないほどけた形状のペプチドに適用すると、このよう構造揺らぎでは、主鎖二面角はタンパク質の球状構造な補償的運動は見ることができなかった。

を維持するためには、2 つ以上の二面角が互いの二面この関係は、もうひとつの二面角ダイナミクスの特角変位によってもたらされた動きを補償するように動徴に結びつく。H の固有値が、単位二面角変化によるく必要がある。しかし、これまでにそのようなタンパ座標値変化の自乗であることを考えると、補償的運動

ク質の二面角ダイナミクスの詳細は明らかにされていにおける逆相関は、二面角空間での大振幅の主成分ほない。そこで本研究では、球状タンパク質の立体構造ど座標値に小さな変化を与える。逆に小振幅の主成分を維持する主鎖二面角の補償的運動の仕組みを、二面は座標値を大きく変化させやすい。結果として、二面角の二体相関のレベルで調べた。

角系ではほぼ全ての主成分が均等に構造揺らぎに寄与多くの場合、タンパク質の平衡状態での構造揺らぎすることとなり、少数の主成分のみが支配的なデカルは、分子動力学(MD)シミュレーションの軌跡から得らト系の場合と全く異なった様相を呈していることが明れるデカルト座標系分散共分散行列の固有値問題としらかとなった。て解かれる主成分分析により記述され、大振幅の主成分で張られる低次元空間においてタンパク質の機能に関わる運動が説明されてきた。本研究では、二面角ダイナミクスの解析に、二面角系にあらわに存在する高次相関の影響を避けるために、デカルト座標系分散共分散行列からの線形変換によって得られた二面角系分散共分散行列を用いて二面角の二体相関を定義した。
座標値の平均二乗変位(MSD)は、二面角系分散共分散行列Σとメトリック行列 H （KtK；K = (dx/d)） によって以下のように記述される。
MSD = tr(HΣ)/N
ここで、tr は対角和を表し、N は原子数。これから、MSD は、H とΣの対応する固有ベクトルの固有値が順

図 1. インフルエンザ菌ペリプラズム鉄結合タンパク

相関の時に最大値を、逆相関のときに最小値になるこ

質の二面角系分散共分散行列Σの固有ベクトル(横軸)とが理解できる。そして実際に、MD の結果は逆相関とメトリック行列 H の固有ベクトル(縦軸)の相関係数。の関係を与え、MSD に最小値をもたらすことが示され

縦軸と横軸はそれぞれの固有ベクトルに対応する固有た（図 1）。これから、二面角の補償的運動は、H とΣ値を表す。相関係数の大きさはグレースケールで表しとの間にある固有値の逆相関によることが分かった。

た。

2

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No. 1726 April, 2010
業績紹介：蛋白質折りたたみにおける非局所相互作用の役割
片岡幹雄（奈良先端大物質創成・A02 計画研究代表者）

きないが、ゲルろ過により SS 架橋した方がコンパクトになっていることが示される。酸変性構造からの折り畳み過程の速度論的解析を行った。SS 架橋したもの

論 文 題 目 ： "Nonlocal interactions are responsible for

は、折り畳みの初めから N 端と C 端の間の非局所相互tertiary structure formation in staphylococcal nuclease"

作用ができあがっている。しかし、SS 架橋の有無にか

著者：Shingo Kato, Hironari Kamikubo, Satoshi Hirano,

かわらず、全長蛋白質の折り畳み反応は、野生型と大Yoichi Yamazaki and Mikio Kataoka

きく異なることはなかった。SNase は複数の折り畳み

雑誌巻号：Biophysical Journal 98, 676-686 (2010)

経路を持つが、SS 架橋は、これらの速度定数に影響を与えなかった。この結果は、野生型においても、N 端蛋白質の折り畳み過程では、非局所相互作用によると C 端の間の非局所相互作用は、折り畳みの初期（ス凝集過程が重要な役割を果たすと考えられている。こトップトフロー装置の不感時間以内）に完成し、そのこで、非局所相互作用とは、一次構造上で離れた位置後二次構造の形成が進むこと、二次構造形成に複数のにあるアミノ酸同士が立体構造上では近接して相互作経路があることを示している。また、欠損変異体の SS用することを意味する。天然構造における”contact

架橋体の結果から、W140 を中心とする C 端疎水クラorder”が折り畳み速度と密接に関係するという主張[1]スターの形成が SNase の折り畳みに必須であるというや、折り畳みが少数の残基間の天然用接触で支配され我々の主張(3)が、妥当であることが裏付けられた。

るという主張[2]は、非局所相互作用の重要性を述べていると考えられる。我々は、折り畳みにおける非局所
相 互 作 用 の 役 割 を 調 べ る た め に 、 Staphylococcal
nuclease (SNase)を用い、非局所相互作用を人工的な SS架橋に置換し、その影響を調べた。
SNase は、N 端と C 端の二つのドメインから形成されている。N 端ドメインの Y54 を中心とする疎水面と、C 端ドメインの I139 を中心とする疎水面が、疎水相互作用により接触し、球状構造となる。C 端の疎水面を形成するためには、W140 を核とした疎水相互作用が必須であり、140-149 や W140A のように W140 を欠くと構造形成できなくなる[3]。そこで、野生型および
140-149 に対し Y54C/I139C の二重システイン置換変異体を作製し、折り畳みに対する SS 架橋の影響を調図．SNase 野生型(1)、全長の二重システイン変異体（酸べた。

化型）（SS+）(2)、全長の二重システイン変異体（還元

図に、野生型(1)、全長二重システイン置換体(3)およ型）(SS-)(3)、140-149 欠損変異体（酸化型）(4)、び SS 架橋をしたもの(2)、欠損変異体の二重システイ

140-149 欠損変異体（還元型）(SS-)(5)の CD スペクトン置換体(5)とその SS 架橋体(4)の CD スペクトルを示ル。

す。SS 架橋を導入することで、構造形成できなかった140-149 が天然様構造に折り畳まれていることが分[1] Baker, D., Nature 405, 39-42 (2000).

かる。すなわち、SS 架橋で代用した N 端ドメインと C[2] Dobson, C. M., Nature 426, 884-890 (2003).

端ドメインの間の非局所相互作用が天然構造形成に必[3] Hirano, S., Kamikubo, H., Yamazaki, Y. and Kataoka,M., Proteins: Struct. Funct. Bioinformat. 58, 271-277

須であることが示された。

(2005).

これらの酸変性構造は、CD スペクトルでは識別で3

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No. 1726 April, 2010
業績紹介：スプライス産物の配列に NER を挿入しない効率的なスプライシング反応
黒田裕（東京農工大学・A02 公募研究代表者）
論文題目：Improved protein splicing reaction for

相同性が高いほか、揺らぎが大きいループ領域を選ぶ

low solubility protein fragments without insertion

ことでスプライシング効率が向上すると考えた（図of native extein residues (NERs)

1c）。この設計法を用いる事で、spliced-GFP に 2 残基

著者：Tetsuya Kamioka, Minako Tawa, Shihori Sohya,のアミノ酸置換が起きるが NER は挿入されず、従来のToshio Yamazaki and Yutaka Kuroda

方法でスプライスして 5 残基が挿入された GFP より活雑誌巻号：Biopolymers, 2009, 92(5):465-70.

性が 6 倍向上した。本研究で開発した効率的なスプラ
イシング反応法及び NER が挿入されないスプライシン

本研究では、緑色蛍光タンパク質(GFP)中の揺らぎがグ法は、スプライシング反応を様々なバイオ研究分野大きいループ領域を利用してスプライシング反応を最に応用する際に活用されると期待される。

適化する方法を開発した。タンパク質スプライシング反応とは、ポリペプチドの一部が切除されるという翻(a)訳後修飾の一種である１）。RNA の intron exon に因ん
で、切除される領域を intein、スプライスされて最終産物のタンパク質となる領域を extein と呼ぶ
（図 1）
。

(b)

また、前駆体タンパク質が 2 つのポリペプチドからなる場合もある（trans-splicing；図１a）。スプライシング活性残基は殆ど intein 領域にあるが、スプライス箇所近辺にある extein 領域に活性に必須な残基があ(c)る（NER、Native Extein Residue）。現在、これら数個の NER 残基を保存すれば、あらゆる extein 配列のスプライスが可能であることが明らかにされている（図1a）。しかし、前駆体タンパク質の溶解性やスプライシング産物のタンパク質配列に NER 残基が挿入されるという課題が残されている。
本研究では、extein と intein にそれぞれ GFPuv（切断部位はループ領域の 142・143；図 1)とシアノバクテリア由来の DnaE SssP を用いて、溶解性と NER 挿入の問題を改善する方法を開発した。まず、溶解性の問題に対して、反応液にアルギニン２）を入れ、種々の反応

図１：NER の挿入問題を解決するための配列設計。(a)従来の手法でスプラスした spliced-GFP。黄緑、黄、白はそれぞれ、GFP（=extein 領域）、intein と産物のspliced-GFP に挿入される NER 領域を示す。(ｂ)本研
究で得られる spliced-GFP。置換残基を下線で示す。
（ｃ）スプライシング位置に選んだループ領域をリボンモデルで示す。

条件（温度、塩濃度、pH）を最適化することでスプライス産物である spliced-GFP の収量を 9 倍向上させた。
次に、NER 挿入の問題については、必須なアミノ酸がEYCFN の 5 残基であることを解明し、従来の方法を用いると spliced-GFP の 142 と 143 残基目の間に 5 残基が挿入されることを明らかにした（図 1a）。我々は、GFP の配列中の NER に類似性の高いループ領域を検索

参考文献：
1) Hirata R. et al, JBiol Chem 25;265, 6726-33(1990)
2) Tsumoto K. et al, Biotechnol Prog, 20, 1301-8(2004)

し、アミノ酸が挿入されるのではなく、置換されるように、GFP 配列の 142-146 残基(EYNYN)を NER 配列（EYCFN）に置き換えて、人工 NER 配列を設計した（図1b）。スプライシング位置を選択する際には、NER との4「揺らぎと生体機能」ニュースレター
No. 1726 April, 2010
業績紹介：ハイブリッドリポソームで原発性体腔性リンパ腫(Primary effusionlymphoma)細胞膜の揺らぎが増大する
上岡龍一（崇城大生物生命・A03 計画研究代表者）
岡田誠治（熊本大学エイズ研・A03 公募研究代表者）

本研究では、リン脂質 (DMPC) および PEG 系界面活性剤 C12(EO)21 からなるハイブリッドリポソーム(HL-21)を用い、HL-21 の PEL に対する細胞膜への融合蓄積、膜流動性の変化およびアポトーシス誘導について検討した。

論文題目：“Highly selective fusion and accumulation of

HL の融合蓄積に関し、蛍光脂質含有 HL-21 は、PEL

hybrid liposomes into primary effusion lymphoma cells細胞に対して、正常細胞（末梢血単核球）にはほとん

along with induction of apoptosis”

ど蓄積せず、PEL 細胞選択的に蓄積することを明らかにした。

著者：Tomomi Towata, Yuji Komizu, Shinya Suzu, Ryuichi

次に、HL-21 の PEL 細胞膜への融合前後で、細胞膜Ueoka, and Seiji Okadaの揺らぎがどのように変化するのかを、蛍光プローブ

雑誌巻号：Biochem. Biophys. Res. Commun.393, 445-448(DPH)で細胞膜を染色後、蛍光偏光解消法により検討(2010)した。その結果、HL-21 は、添加直後から 5 分間で、PEL 細胞膜の流動性が急激に増大することを初めて明エイズは、HIV-1 感染により宿主が免疫不全に陥り、らかにした(図 1)。

様々な日和見感染症を発症する疾患である。HIV-1 感

最後に、PEL 細胞の細胞死について、アポトーシス

染者は年々増加傾向にあるが、複数の抗ウイルス薬を関連タンパク質であるカスペース-3 の活性化を指標に組み合わせた HARRT の導入により予後は改善し、現検証した。HL-21 処理後、短時間で、カスペース活性在では HIV-1 感染症はコントロール可能な慢性疾患と化および細胞の縮小を示し、アポトーシスを誘導するなった。一方、エイズ関連リンパ腫の発症率は、年々ことが明らかとなった。

増加傾向にあり、エイズ患者の予後を脅かす要因とな以上の結果より、HL-21 が正常細胞には影響を与えっている。

ず、PEL 細胞にのみ融合蓄積し、細胞膜のゆらぎの変

エイズ関連リンパ腫のひとつである原発性体腔性リ化を経て、アポトーシスを誘導することが判明した。

ンパ腫（Primary Effusion Lymphoma；PEL) は、腫瘤形PEL に対する、副作用の無い新しい治療薬の可能性が成を欠き、体腔内滲出液を初発として発症する稀なリ期待できる。

ンパ腫であり、約 80%がエイズ患者に発症する。PELは、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス (KSHV/HHV-8)
感染に起因する。PEL の治療は、HAART 療法と化学療法で行われるが、抗がん剤に対して耐性であり、50%生存期間 6.2 ヶ月という予後不良の悪性リンパ腫である。そのため、PEL に対する安全で効果的な新しい治療薬の開発が急務となっている。
これまでの研究により、ハイブリッドリポソーム(HL) は、種々の培養がん細胞に対して、細胞レベルおよび動物レベルでがん細胞増殖を抑制し、アポトーシスを誘導することを示した。患者様へのインフォーム
ド・コンセントを経て、生命倫理委員会承認後の臨床

図1 HL-21処理したPEL細胞膜の流動性の時間変化。蛍光プローブとして、脂質膜の疎水部の流動性を反映する1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene (DPH)を用いた。HL-21
添 加 (Addition) 直 後 の 蛍 光 偏 光 度 (FluorescencePoralization)の急激な減少は(赤色)、細胞膜の流動性の増大を意味する。一方、未処理の細胞膜流動性は一定である(青色)。

応用では、副作用が無く、リンパ腫の縮小効果を得ている。さらに、HL は、正常細胞とがん細胞の膜の揺らぎを見分けて、がん細胞のみに融合蓄積し、アポトーシスを誘導する制がんメカニズムを報告した。

5「揺らぎと生体機能」ニュースレター
No. 1726 April, 2010
業績紹介：カチオン性ハイブリッドリポソームの腎臓がんに対する治療効果
上岡龍一(崇城大学応用生命科学・A03 計画研究代表者）

脂質であるフォスファチジルセリン量も多いことが明らかとなり、カチオン性 HL のヒト腎臓がん細胞に対する特異的な融合に細胞膜の物性が関与することが示唆された。

論文題目：" Effects of Cationic Hybrid Liposomes on the④ カチオン性 HL は、担がんモデルマウスに対して

Growth of Human Renal Cell Carcinoma "延命効果を示した。次に、投与終了後の担がんモデル

著者：Masayo Umebayashi, Taku Makizono, Hideaki

マウスの腎組織切片を用い TUNEL 法により細胞死に

Ichihara, Yoko Matsumoto, Ryuichi Ueoka*

ついて検討したところ、アポトーシスを誘導している

雑誌巻号：Anticancer Research, 30, 327–338 (2010)ことが観察された。また、蛍光標識脂質（NBDPC）を含有したカチオン性 HL を投与後、がん組織への集積筆者らが創製したハイブリッドリポソーム(HL)はを腎臓組織切片により観察したところ、長時間集積す[1]、従来の制がん剤なしに HL のみで種々のヒトがんることが明らかとなった。以上の結果から、カチオン細胞に対し増殖抑制効果を示し、アポトーシスを誘導

性 HL は担がんモデルマウスへの投与後に腫瘍組織にすることが明らかになっている[2]。in vivo において、集積後アポトーシスを誘導し、抗腫瘍効果を示したこ

担がんマウスを用いた治療実験から延命効果が得られとを初めて明らかにした。さらに、安全性を、溶血試[3]、正常動物を用いた安全性試験で副作用が無いこと験により検討したところ、カチオン性 HL は血液毒性が確認されている[4]。生命倫理委員会承認後の悪性リを示さず、安全であることが確認された。

ンパ腫患者に対する臨床試験において、高い安全性お以上のように、カチオン性 HL の腎臓がんに対するよび延命効果が得られている[5]。

「副作用のないアポトーシス誘導による治療効果」が本研究では、がん細胞膜へのより多くの融合・蓄積初めて認められた。腎臓がんの新しい治療薬として期を期待して、HL にカチオン性脂質(2C14ECl)を加えた待できる。

カチオン性 HL を用い、in vitro にてヒト腎臓がん(OS-RC-2)細胞に対する制がん効果および制がんメカニズムについて検討した。in vivo では、担がんモデル+マウスに対する治療効果の検討を行った。以下に結果+++を示す。
+①カチオン性 HL は、電子顕微鏡観察から直径約100nm の均一なベシクルの形態であることが観察され+++++++++++静電的相互作用+アポトーシスシグナル+カチオン性ハイブリッドリポソーム

た。動的光散乱法からは、1 ヶ月以上安定であることがん細胞が明らかとなった。以上の結果から、カチオン性 HLは細網内皮系への取り込みが回避可能な膜直径であり、： フォスファチジルセリン

長期間安定で、臨床応用における保存に有用であるこ
腎臓がんに対するカチオン性 HLの治療効果のメカニズムとが明確となった。
② カチオン性 HL の OS-C-2 細胞に対する制がん効果について検討したところ、50%増殖抑制濃度は、DMPC 単一リポソームの約 1/3 と低く、低濃度で同等

参考文献[1] R. Ueoka et al., J. Am. Chem. Soc., 110, 1588-1595(1988). [2] Y. Matsumoto et al., Int. J. Cancer, 115,377-382 (2005). [3] R. Ueoka et al., Biol. Pharm. Bull., 23,1262-1263 (2000). [4] H. Nagami et. al., Int. J. Pharm.,
315, 167-172 (2006). [5] H. Ichihara et al., Anticancer Res.,28 1187-1196 (2008).の制がん効果が得られることが明らかとなった。
③ 制がんメカニズムについて検討したところ、
OS-RC-2（腎がん）細胞膜に融合・蓄積後カスペース-3, -8, -9 を活性化およびミトコンドリアを経由し、アポトーシスを誘導することが明らかとなった。また、
RPTE（正常腎）細胞に対しては、融合・蓄積しないこと が 確 認 さ れ た 。 さ ら に 、 RPTE 細 胞 と 比 較 し てOS-RC-2 細胞膜は、膜流動性が高く、アニオン性リン6