「揺らぎと生体機能」ニュースレター
No. 3
26 February, 2009
業績紹介：1 分子検出 FRET の新しい解析法
寺嶋正秀（京都大院理・A01 計画研究代表者）

布数を正確に出すことができた。

論文題目："Distribution analysis for single molecule FRET行い、本手法を適用した。片方の端にエネルギードナ

measurement"

ー分子、もう片方にエネルギーアクセプター分子を結著者：K.Okamoto, M. Terazima

合したサンプルについて、1 分子蛍光測定を行い、雑誌巻号：J.Phys.Chem.B, 112, 7308-7314(2008).

FRET 効率を求めた結果を図 2 に示す。これを解析しいでも、積分表示にして、残差解析を行うことで、分次に、実際の DNA oligonucleotides の 1 分子検出をたところ、DNA 構造から予想される妥当な分布数を揺らぎを検出する上で、1 分子検出法は有用となる。

求めることができた。
本手法は、今後 FRET 解析に大きな威力を発揮する

特に、FRET と呼ばれる共鳴エネルギー移動による蛍光検出手法は、現在では多くの研究者に用いられる標ものと思われる。

準的な手法となっている。この FRET 法では、エネルギードナー分子からアクセプター分子へのエネルギー移動効率を測定し、その分布数を知ることによって、不均一性や揺らぎについての情報を得る。このために、各分子あるいは種々の時間で測定したエネルギー移動効率を横軸にとり、その頻度を縦軸にプロットし、たとえばガウス関数でフィットする。しかしその際に、ランダムなノイズが含まれるために、ビンとよばれるある範囲を決めて平均する必要がある。ビンサイズを大きく取りすぎると 2 つの分布が重なってしまい間違

図１った分布を解析で出してしまうことになるし、逆にビ上図の四角の幅がビンサイズである。

従来の解析法(a)と、新しい解析法(b)の概念図。

ンサイズを小さく取りすぎると、ノイズが大きくなりフィットができなくなる。このように、FRET 解析にはビンサイズを適切に選ぶ必要があり、それは経験で選ばれていた。
我々は、ビンサイズを用いない FRET 解析法をここで提案した。それは、横軸に FRET 効率を取り、FRET効率の順番に均一な幅で縦軸にプロットしていくものである。これは FRET 効率の積分型分布を与える。よって、もし FRET 分布がガウス型関数で与えられるものならば、その積分型であるエラー関数でこの分布がフィットされるはずとなる。もしいくつかのガウス型分布が存在するならば、積分分布曲線はエラー関数の和で表わされるはずである。この方法では、ビンサイズという任意性のあるものを使用しないで解析できる

図 2 (a)実際に測定された FRET 効率の積分表示、(b)ことが特徴である(図 1)。

エラー関数の和でフィットした時の残差(緑、赤、青はまずはじめに、このアイデアに基づく解析の妥当性使用した関数の数(2,3,4)を示す)、(c)使用した関数の数を、ノイズを加えて数値計算したデータをこの手法でと残差との相関。エラー関数を 3 個以上用いてもフィ解析することで確認した。その結果、ビン化を行わなットがよくなってないことを示す。

1「揺らぎと生体機能」ニュースレター
No. 3
26 February, 2009
業績紹介：イェロープロテインにおける低障壁水素結合の存在の証明
片岡幹雄（奈良先端大物質創成・A02 計画研究代表者）

E46

pCA

E46

論文題目：" Low barrier hydrogen bond in photoactive

Y42

yellow protein "Y42

著者：Shigeo Yamaguchi, Hironari Kamikubo, Kazuo

Y42

CApCA

Kurihara, Ryota Kuroki, Nobuo Niimura, Nobutaka
Shimizu, Yoichi Yamazaki and Mikio Kataoka
雑誌巻号：Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 440-444(2009).

angle: 167 9°

angle: 148 2°

図 1．PYP の二つの短距離水素結合と水素（重水素）1990 年代初頭より、低障壁水素結合(LBHB)が酵素活性の発現に寄与しているという主張がなされてきた。

原子の位置。赤は水素原子、青は重水素原子を表す。

一方で、LBHB 形成の直接的証拠がないため、その主張に対する疑義も投げかけられている。LBHB の存在めてのことである。また、対イオンと考えられていたを証明するためには、水素原子の位置を同定し、ドナ

R52 は電荷を持っていないことも明らかにした。

ー原子、アクセプター原子の両者とも共有結合をしてこれまでは、発色団が脱プロトン化しているのに対いないことを示す必要がある。イェロープロテイン

し E46 がプロトン化しており、R52 の正電荷が発色団(PYP)には、発色団の周囲に二つの短距離水素結合があの負電荷を安定化していると信じられていた。しかし、り、LBHB の存在が議論されている。
本研究では、PYP の高分解能中性子結晶構造解析により、PYP の水素原子の位置を同定し、発色団周りの水素結合ネットワークや二つの短距離水素結合の実体を明らかにすることを目的にした。中性子回折実験のために調整した結晶は、室温でＸ線および中性子線に対しそれぞれ 1.25Å、1.5Åまで回折像を与えた。1.25Å分解能のＸ線構造解析により、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓの各図 2．提唱された電荷の安定化機構。

原子を精密化し、それに基づき 1.5Å分解能中性子構造解析によりＨ（Ｄ）を精密化するという中性子／Ｘ線

今回の結果は、これまで信じられていた機構は誤りで併用解析法を開発し、1.5Å分解能中性子構造を得た。

あることを明瞭に示した。LBHB の強い結合エネルギ

全 942 個の水素原子のうち 819 個の水素原子の位置をーが静電エネルギーの不利を補い、LBHB 形成により決定することに成功した。発色団と E46 の間の短距離π電子系が発色団から E46 まで広がることで電荷密水素結合においては、水素原子と E46 のカルボキシル度を薄めているというタンパク質内部での疎水的環境

酸素との距離は 1.21Å、水素原子と発色団のフェノー下での孤立した負電荷の安定化機構が提唱された。まル酸素との距離は 1.37Åであり、LBHB を形成していた、励起状態では発色団の電荷はアリル基側に局在することが明らかとなった。一方、発色団と Y42 の間のる。これにより、プロトン親和性が低下し、E46 がプ短距離水素結合では、水素原子は Y42 のフェノール酸ロトン化した通常の水素結合に緩和すると考えられる。

素に共有結合しており（距離 0.96Å）、短距離イオン性

つまり、発色団からタンパク質部分に情報が伝わるこ水素結合と同定された。LBHB がタンパク質のしかもとになり、これまでに知られていなかった情報伝達機基底状態に存在することが証明されたのは、世界で初構が提唱されたものである。

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No. 3
26 February, 2009
業績紹介：タンパク質のＮ末端特異的標識のための新規手法を開発
芳坂貴弘（北陸先端大マテリアルサイエンス・A02 計画研究代表者）

質蛍光標識法を開発した。タンパク質に導入された蛍光標識ヒドロキシ酸とその直前のアミノ酸の間のエステル結合は、翻訳反応が行われる弱塩基性条件では自発的に加水分解が起こり、その結果、N 末端に蛍光標

論文題目：" N-Terminal specific fluorescence labeling of

識分子のみが付加されたタンパク質が得られると予想

proteins through incorporation of fluorescent hydroxy acid

される（図 1）。
今回、蛍光標識ヒドロキシ酸として、BODIPYFL-and subsequent ester cleavage"
著者：Takayoshi Watanabe, Yoichi Miyata, Ryoji Abe,

アミノフェニル乳酸 (BFLAFL)を設計・合成した。発Norihito Muranaka, Takahiro Hohsaka

現遺伝子として、様々なタグペプチドをストレプトア

雑誌巻号：ChemBioChem 9, 1235-1242 (2008)

ビジンの N 末端に付加し、タグとストレプトアビジンの間に４塩基コドン CGGG を挿入した。これらタグ付

タンパク質を蛍光標識することは、タンパク質の構加ストレプトアビジンの mRNA と、BFLAFL を結合さ造機能解析において有用である。しかし、化学修飾法

せた４塩基アンチコドンを持つ tRNA を、大腸菌無細によるタンパク質の蛍光標識では、特定部位のみを定胞翻訳系に加えることで、タンパク質合成を行なった。

量的に蛍光標識することは困難な場合がある。また、翻訳生成物を SDS-PAGE で分離し、蛍光イメージ測定

GFP などの蛍光タンパク質融合法では、分子量の大きとウェスタンブロットにより解析した結果、BFLAFLな蛍光タンパク質が標識するタンパク質の構造や機能を導入することで、タグペプチドが除去されて N 末端に影響を与える可能性が考えられる。に蛍光標識分子が付加されたタンパク質が生成するこ

一方、これまでに我々は、４塩基コドン法を用いてとを確認できた。

蛍光分子を結合させた非天然アミノ酸をタンパク質のまた、直前アミノ酸の最適化を行なった結果、Asn特定部位に定量的に導入できることを報告している。にすることで効率良くエステル結合の分解が起こるこ

この際、タンパク質の構造や機能への影響を最小限にとを見いだした。さらに、直前アミノ酸に Asn を挿入するためには、多くの場合、タンパク質の N 末端領域したタグ配列を用いて、様々なタンパク質について Nへ蛍光標識することが望ましいと考えられる。しかし、末端特異的蛍光標識が可能であることも確認した。今N 末端にはタンパク質発現を効率化させるタグペプチ後、本手法はタンパク質内部への別の蛍光標識アミノドが付加されることが多く、その場合は蛍光分子を残酸の導入と組み合わせて、タンパク質の構造揺らぎをしてタグペプチドが除去されることが望ましい。

蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）等により解析する上そこで我々は、蛍光標識アミノ酸の代わりに蛍光標で、有用な手法になると期待される。

識ヒドロキシ酸を用いた、新規 N 末端特異的タンパク

図 1 蛍光標識ヒドロキシ酸の導入によるタンパク質の N 末端特異的蛍光標識3

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No. 3
26 February, 2009
業績紹介：乳がんに対するハイブリッドリポソームの制がん効果
上岡龍一（崇城大応用生命科学・A03 計画研究代表者）

んモデルマウスを作成後、HL の in vivo における抗腫瘍効果について検証した。HL は、担がんモデルマウ
スに対して顕著な腫瘍抑制効果を示した。一方、DMPC

論文題目：“Nanoparticles of Hybrid Liposomes for the

リポソーム治療群においては、腫瘍抑制効果が見られInhibition of Breast Tumor Growth along with Apoptosis”なかった(図)。2 週間連続投与終了後、腫瘍切片を作成

著者：Shinya Shimoda, Hideaki Ichihara, Yoko Matsumoto,

し、TUNEL 法により検証したところ、HL 治療群におand Ryuichi Ueoka

いてアポトーシス細胞が多く観察された。以上のよう

雑誌巻号：Chem. Lett., 38, 134-135 (2009)に、in vivo において、HL は担がんモデルマウスに対して、アポトーシス誘導による抗腫瘍効果を示すこと

ハイブリッドリポソームは、リン脂質と界面活性剤を今回初めて明らかにした。

を緩衝水溶液中で超音波照射するだけで容易に得られる生体適合性の医用素材である[1, 2]。これまでに、invitro において、種々の培養がん細胞に対する制がん効果および制がんメカニズムが明らかになっている。ハイブリッドリポソームは、正常細胞には作用せず、膜の揺らぎ(流動性)の大きながん細胞膜へ特異的に融合・蓄積し、アポトーシスを誘導することを報告している[3]。in vivo においては、担がんモデル動物に対する治療効果および正常動物に対する安全性が確認されている。さらに、生命倫理委員会の承認後の臨床応用において、副作用がなく、固形リンパ腫瘍の顕著な縮小効果が得られている[4]。
本研究では、副作用がなく患者にやさしい制がん剤の開発を目指し、リン脂質(DMPC)および PEG 系界面活 性 剤 (C12(EO)25) を 構 成 成 分 と し た 95mol%DMPC/
図：担がんモデルマウスに対するハイブリッドリポソームの腫瘍抑制効果.
(a)：腫瘍容積, (b)：腫瘍写真.
今回得られた知見に加え、HL の高い安全性がこれ5mol%C12(EO)25 ハイブリッドリポソーム(HL)を用い、
in vivo における担がんモデルマウスに対する抗腫瘍効果について検討した。
OOOOCHPO - OO

までに報告されており、乳がんに対し、副作用のない+N「膜の揺らぎをターゲットとする」新しい制がん剤とOしての期待が高まった。今後、さらに多くの知見を蓄DMPC (L-α-dimyristoylphosphatidylcholine)
O積し、患者にやさしい制がん剤としての臨床応用を目(CH2CH2O)25H

C12(EO)25 (Polyoxyethylene(25)dodecyl ether)指す予定である。

まず、HL の膜物性について検討した。HL は、調製直後から粒形分布幅が狭く、均一な約 100 nm の膜直参考文献

径で、1 ヶ月以上安定であることを確認した。この膜[1] R. Ueoka et al., J. Am.Chem. Soc. 107, 2185-2186

直径は、細網内皮系への取り込みを回避可能である。

(1985). [2] R. Ueoka et al., J. Am.Chem. Soc. 110,

さらに、長期間安定であることから、臨床応用に適し1588-1595 (1988). [3] Y. Komizu et al., Bioorg. Med Chem.

た医用素材であることが明らかになった。

Lett. 16, 6131-6134 (2006). [4] H. Ichihara et al.,

次に、ヒト乳がん細胞をマウスに皮下移植し、担がAnticancer Res. 29, 1187 (2008).

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No. 3
26 February, 2009
シンポジウム報告
2nd International Symposium on Nanomedicine (ISNM2009)
Asian Core Symposium –Nano and Biomedical Molecular ScienceFebruary 4-7, 2009 at Okazaki Conference Center
上岡龍一（崇城大応用生命科学・A03 計画研究代表者）

生まれています。がん、神経変性疾患、循環器病など
難治性疾患の克服に向けて、新規治療開発研究におけるナノメディシンの役割は重要になりつつあります。

表記のシンポジウムが 2009 年 2 月 4 日から 4 日間、自上岡教授の講演には質問時間をはるかに超過して多く

然科学研究機構岡崎コンファレンスセンターにおいての質問がなされ、ハイブリッドリポソームの制がん効開催された。

果に大きな反響がありました。本会議は、米国、欧州、本シンポジウムの企画者は、分子科学研究所の宇理アジア各国から研究者が集い、ナノメディシンの現状須恒雄教授、京都大学再生医学研究所の岩田博夫教授と将来について熱い討論が交わされました。ポスター

および東北大学医学系研究科の大内憲明教授である。

発表では、上岡研究室の古水雄志博士研究員が基調講演および特別講演に招待された研究者のリスト｢Inhibitory Effects of Ca2+ on the Growth of Tumor Cells｣

は以下の通りである。のタイトルで英語で発表し、The Best Poster Award に選ばれました(写真 2)。

Plenary Talk and Special Lecture
Hirro IWATA (Kyoto Univ., Japan)
Kazunori KATAOKA (The Univ. of Tokyo, Japan)
Chung-Hsuan Winston CHEN (Academia Sinica,Taiwan)
Li-Jun WAN (Chinese Acad. Sci., China)
Ryuichi UEOKA (Sojo Univ., Japan)
Shinae KONDOH (Kyoto Univ., Japan)
Steven G. BOXER (Stanford Univ., USA)
Takaomi SAIDO (RIKEN, Japan)
Yoon-Sik LEE (Seoul Nat'l. Univ., Korea)
Yoshiki SAWA (Osaka Univ., Japan)
Yuji KASHIWAKURA (Okayama Univ., Japan)

写真１

上岡教授の基調講演

第 2 回ナノメディシン国際会議では、新学術領域研究｢揺らぎと生体機能｣の計画班員のなかから、崇城大学の上岡龍一教授が｢Membrane Targeted Nanotherapywith Hybrid Liposomes for Tumor Cells Leading toApoptosis｣のタイトルで基調講演しました(写真１)。
ナノメディシンは、分子科学を基盤とした医学や医療という新しい概念であり、ナノサイズレベルのテクノロジーを医療応用する学問領域です。ワトソン、クリックの DNA 二重らせん発見を契機として、生命を生写真 2 The Best Poster Award の古水研究員(左)と宇理須教授(右)物物理学など物質科学の観点から研究する学際領域が5

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No. 3
26 February, 2009
片岡班員らの研究成果が新聞に掲載される。
A02 班、計画研究代表者の片岡幹雄博士と同グループの上久保裕生博士（連携研究者）、山口繁生氏（研究協力者）及び日本原子力研究開発機構の黒木良太博士のグループの共同研究の成果が科学新聞（1月 16 日）に掲載されました。

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