「揺らぎと生体機能」ニュースレター
No. 21
26 August, 2010
業績紹介：電子伝達活性中心の酸化還元による蛋白質の構造揺らぎの変化
石森浩一郎（北大院理・A01 公募研究代表者）

運動性が制限された構造であることが明らかになった。
このような主鎖 NH 基の運動性は、ヘム鉄が酸化されて酸化型 Cyt c になることでより制限を受け、酸化論 文 題 目 ： "Redox-controlled backbone dynamics of型での主鎖 NH 基の平均の order parameter は 0.921 を15N NMR relaxation示し、さらに 1 に近くなった。特に，この運動性のさmeasurements"

らなる制限は 2 つの軸配位子アミノ酸残基近傍のルー

著 者 ： Koichi Sakamoto, Masakatsu Kamiya, Takeshi

プ部分（L3、L6、L7）において、より顕著に（S2 = +Uchida, Keiichi Kawano, Koichiro Ishimori0.055 ～ 0.072）現れていることから、ヘム鉄の酸化に

雑誌巻号：Biochem. Biophys. Res. Commun. 398, 231-236

よるヘム鉄と軸配位子間の結合の変化が、軸配位子ア(2010)

ミノ酸残基近傍の主鎖の構造的揺らぎをさらに小さく

human cytochrome c revealed byすることを示唆している。
c

生体内で重要な役割を果たしている蛋白質間の電子以上の結果は、ヘム鉄の酸化状態によって、Cyt伝達反応の制御機構を明らかにするため、代表的な電の主鎖の運動性が影響を受けることを示しており、ヘ子伝達蛋白質であるシトクロム c（Cyt c）の構造的揺

ム鉄の酸化状態の変化、つまり、電子伝達反応の前後らぎを NMR の緩和測定で検討し、その揺らぎの大きにおいて Cytさが電子伝達の活性中心であるヘムの酸化状態に依存意味している。さらに、Cyt c は、そのヘム鉄の酸化することを見出したので、以下にその概要を報告する。

により運動性が大きく変化する領域である軸配位子

Cytc の構造的揺らぎは異なっていること

c は、呼吸鎖の電子伝達系において、シトクロMet 80 付近のアミノ酸残基を介してその電子受容体でム bc1 複合体からシトクロム c 酸化酵素（CcO）への電ある CcO と相互することを考えると、このような運動子伝達を担う分子量 12 kDa のヘム蛋白質である。これ

性の変化、つまり構造的な揺らぎの変化によって、Cytc はアミノ酸が両側から配位しc と CcO の相互作用が変化し、その相互作用の変化にまでの研究から、Cyt

た 6 配位のヘムを有するため、その構造的揺らぎは小よる電子伝達反応の制御の可能性を示している。

さいとされてきたが、各アミノ酸残基の構造的揺らぎの定量的検討は行われていなかった。さらに、電子伝

Table. Average order parameter values (S2) for structural elementsof reduced and oxidized Cyt c達反応においては構造的揺らぎが大きな役割を果たしResiduesていると推定されているものの、実際に電子伝達反応13と構造的揺らぎの相関についても明らかではない。
本論文では NMR の緩和測定から主鎖 NH 基につい14ての order parameter（S2）を算出することで、主鎖 NH15

 2
 13

 1617基の運動性からその構造的揺らぎを検討し、さらに、その電子伝達反応との相関を議論するため、ヘム鉄が182 価の状態（還元型）と 3 価の状態（酸化型）での order19505661707175

parameter を比較した（Table）。その結果、還元型では主鎖 NH 基の平均の order parameter は 0.883 となり、運動が完全に束縛された 1 に近く、予想通り Cyt c は構造的揺らぎの小さい蛋白質であることが示された。

 49
 55
 60
 69
 74
 7980

また、比較的構造上の自由度が高いと考えられるルー81  8788 101
102 104
average

プ部分（L1～L8）においても、その order parameter は他の蛋白質におけるヘリックス構造に相当するほど運動性は制限されており、Cyt c は構造全体にわたって

1

Oxidized Cyt cS2(S2ox)(S2ox S2red)

StructuralElements

Reduced Cyt c(S2red)

L1
H1Cys(thioether)
L2Cys(thioether)His(axial ligand)
L3
H2L4H3L5H4
L6Met(axial ligand)
L7
H5
L8

0.862
0.905

0.810
0.917

0.052+ 0.012

0.854

0.990

+ 0.145

0.867

0.860

0.007

0.902

0.870

0.032

0.850

0.857
0.9160.823
0.933
0.776
0.896
0.887

0.929
0.925
0.873
0.952
0.890
0.903
0.942

+ 0.072+ 0.009+ 0.050+ 0.019+ 0.114+ 0.007+ 0.055

0.921

0.920

0.001

0.874
0.912
0.829

0.943
0.931
0.863

+ 0.069+ 0.017+ 0.034

0.883

0.921

+ 0.038

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No. 21
26 August, 2010
業績紹介：アミロイド線維伸長における反応中間体の捕捉と観察
茶谷絵理（立命館大学薬学部）
後藤祐児（大阪大学蛋白質研究所・A01 公募研究代表者）
論文題目："Pre-steady-state kinetic analysis of theelongation of amyloid fibrils of  2-microglobulin withtryptophan mutagenesis"
著 者 ： Eri Chatani, Reina Ohnishi, Tsuyoshi Konuma,Kazumasa Sakurai, Hironobu Naiki and Yuji Goto
雑誌巻号：J. Mol. Biol. 400, 1057-1066 (2010)
アミロイド線維は、タンパク質の誤った折りたたみによって形成される立体構造である。アミロイド線維が原因とされる疾患はアミロイドーシスと総称され、現在では約３０種類報告されている。これらの疾病の伝播は、アミロイド線維の核依存的な伸長による線維の複製が関わると考えられているが、モノマー分子がどのように線維末端を認識し、自己の構造を複製してゆくのかの分子機構は明らかにされていない。そこで
我々は、アミロイド線維の伸長過程で経由する速度論的中間体を捉えて観察することでアミロイド形成機構の理解につながる具体的な構造イメージを明らにしようと考えた。
本研究では、透析アミロイドーシスの原因タンパク質である β2 ミクログロブリンのアミロイド線維を解析した。核依存的伸長反応は、シード（アミロイド線維断片）とモノマーの 2 分子反応であることを考えると、核線維の末端にモノマー分子が結合した中間体を経由することが予想されるが、実際の捕捉例は存在していない。しかし、従来のモノマー溶液にごく少量のシードを添加するのとは逆に、過剰量のシードに少量のモノマーに添加することで、添加したモノマータンパク質が全てシード末端に結合し、シード・モノマー複合中間体を過渡的に蓄積できる可能性がある。まず、60 と 95 位のトリプトファン残基をすべてフェニルアラニンに置換した無蛍光性の変異体でシードを作製し、これに少量の野生型タンパク質を添加する反応系を構築した。これにより、反応開始時点にモノマーとして添加したタンパク質由来の蛍光のみを観測することが可能になり、高シード濃度条件でのトリプトファン蛍光スペクトル変化の追跡が可能となった（図 1A-C）。
様々なシード濃度での伸長反応を解析した結果、低シード濃度での見かけの伸長速度定数はシード濃度に2比例して中間体は見出されなかったが、高シード濃度
では伸長速度が飽和する現象が見られた（図１D）。これ は 、酵素反応の前定常状態のように、中間体が過渡的に蓄積したことを意味する。興味深いことに、速度定数が一定になるのはシード末端数 1 に対してモノマー数がおおよそ 10 程度であることが示された。すなわ
ち、線維の末端にはモノマーが 1 分子ではなく側面付近にも不活性型として複数同時に結合しているようであり、アミロイド線維形成に関わる新たなイメージを捉えたと考えられる（図２）。
さらに中間体の構造特徴を解析するために、トリプトファンを一残基のみもつ変異体を解析したところ、中間体構造の構造形成レベルは低いことが示唆された。
現在、重水素交換-NMR 法による中間体構造の解析を進めており、中間体における構造形成の程度および領域がより詳細に明らかになることを期待している。

図１．(A,B)アミロイド線維伸長反応にともなうトリプトファン蛍光スペクトル変化例（モノマー濃度は常に 0.03 mg/ml）と蛍光強度をもちいて作製した各シード濃度での伸長反応プロット(C)。得られた
速度定数をシード濃度に対してプロットすると、高シード濃度領域において速度定数の飽和が観察された(D)。さらに、超音波破砕レベルを変えることでシード線維末端の濃度を変えてゆくと、伸長速度が飽和する点が変化することも確認した(D)。

図２．本研究から提案されたアミロイド線維の伸長スキーム。中間体において、複数のモノマー分子がアミロイド線維の先端および側面に結合していることが考えられる。

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26 August, 2010
業績紹介：水和水のパーコレーションがタンパク質ダイナミクスを制御する
片岡幹雄（奈良先端大物質創成・A02 計画研究代表者）あったが、パーコレーション転移後かつ動力学転移後の MSD は、水和水のものがタンパク質のものよりもはるかに大きかった。すなわち、タンパク質の動力学

論文題目："Percolation of hydration water as a control ofは水和水に支配されていることになる。以上の結果か

protein dynamics"

ら、水和水のパーコレーションがタンパク質動力学を

著者：Hiroshi Nakagawa and Mikio Kataoka制御していると結論した。

雑誌巻号：J. Phys. Soc. Jpn. 79, 083801 (2010)

これらの成果は、タンパク質の働きに必要な水和水の本質的な性質を明確に示した最初の研究であり、耐タンパク質機能発現に必須な非調和な運動は、水和乾燥性を示す生物の細胞等の保護機構の理解等基礎生水によって活性化される。したがって、水和水のどの物学のみならず、食品工学等の他の分野への貢献も期ような性質がタンパク質動力学を制御するのかという待される。

問題は、タンパク質機能発現の分子機構を理解する上で、最も本質的な課題である。我々は、中性子非干渉性散乱と MD シミュレーションにより、この問題に取り組んでいる。
タンパク質は、200K 近傍で非調和な運動が活性化し構造変化が可能になって機能を発現する。中性子非干渉性散乱により、タンパク質の内部運動による平均二乗変位（MSD）を評価することができる。動力学転移は、MSD の温度依存性の傾きの不連続な増加として観測される。200K 以上の傾きを様々な水和率で測定することにより、200K 転移は、水和率 0.37g D2O/g
protein 以上で起きることを示した（図 1、赤）。この水和率は、第一水和層の占有率 0.59 に対応する。理想

図 1． 200K 転移（赤丸）と水和水クラスターサイズ的な格子モデルでは、この占有率でパーコレーション（青三角）の水和率依存性。

転移が起きる。様々な水和率に対して、MD シミュレーションを行い、水和水構造を解析した（図 2）。低水和では、水和水は孤立している（図 2 の青）。水和率が上がるにつれ、水和水はクラスターを形成し、パッチ状に存在するようになる（図 2Ｃ、赤、緑、黄）。同色のクラスター内の水分子は水素結合により連結できるが、異なる色のクラスターとの間では水素結合による連結はできない。さらに、水和率が上がるとこのクラスターが成長してタンパク質表面を覆い、水素結合によってタンパク質を取り囲むことができるようになる（パーコレーション）。クラスターサイズの水和率依存性を見ると、200K 転移開始の水和率依存性とまったく一致する（図 1）。水和水だけの MSD を測定した
ところ、パーコレーション転移前の水和率では、水和水の MSD は、タンパク質の MSD とまったく同一で

図 2．水和水構造の水和率依存性。

3

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業績紹介：スイッチ型人工ジンクフィンガータンパク質の創製
今西未来（京大化研・A02 公募研究代表者）

ギン酸に置換した、CDH2 型ジンクフィンガーを作製した。その結果、CDH2 型の Zn(II)結合親和性は野生型（C2H2 型）と比較し約 500 倍低下することが明ら

論文題目："Metal-Stimulated Regulation of Transcriptionかとなった。また、３つの連続する C2H2 型ジンクフ

by an Artificial Zinc Finger Protein"ィンガーを有する Zif268 ジンクフィンガードメインに

著者：Miki Imanishi, Tomohiro Nakaya, Tatsuya Morisaki,

おいて、２番目のフィンガーを CDH2 型に置き換えた

Daisuke Noshiro, Shiroh Futaki, Yukio Sugiura

CDH2-ZF3 を作製した。野生型では亜鉛濃度を低下さ

雑誌巻号：ChemBioChem 11, 1653-1655 (2010)
刺激への応答性を有する人工 DNA 結合タンパク質
は、転写調節のためのツールや環境変化のセンシングツールとしての有用性が期待されている。本研究では、転写因子に見られる代表的な DNA 結合モチーフの一つである C2H2 型ジンクフィンガーの「構造形成能」と機能発現、すなわち「DNA 結合能」に着目し、Zn(II)濃度応答性の人工 DNA 結合タンパク質を創製した。
転写因子の代表的な DNA 結合モチーフの一つである C2H2 型ジンクフィンガーモチーフは、約 30 アミノ

図 2. ゲルシフトアッセイ A) wtZF3, B) CDH2-ZF3。
（上）Zn(II)存在下、（下）キレータ存在下。

酸から成り、２つのシステインとヒスチジン残基へのせても、その DNA 結合能に変化は認められなかった

Zn(II)の結合および、保存された疎水性アミノ酸によるのに対し、CDH2-ZF3 は、亜鉛濃度依存性の DNA 結疎水性コアの形成によってββα構造をとり、配列特合能を発揮することが明らかとなった（図２）。

異的に DNA へ結合する。通常、システインとヒスチさらに、細胞内環境において、CDH2-ZF3 を有するジンへの Zn(II)の結合は極めて安定であり、Zn(II)濃度人工転写因子は、亜鉛濃度依存的に機能発現すること依存的な DNA 結合能の制御は困難である。

を示すことができた（図３）。意図的な構造形成能の不本研究では、保存された配位子に着目し、「配位子に安定化、すなわち、揺らぎをコントロールすることに変異を加え、あえて Zn(II)との結合を不安定化させる」

よって、逆に、天然には無い新しいスイッチ機能の獲ことによって、金属濃度依存的な機能発現（DNA 結合）得に成功した興味深い例であると考えられる。

能を有する人工 DNA 結合タンパク質および転写因子の作製を試みた（図１）。DNA 配列特異性は維持しておくために、DNA 認識に関与するヘリックスではなく、シート上に存在する保存されたシステインをアスパラ

図３. CDH2-ZF3 を DNA 結合ドメインとする転写因子は、細胞内で亜鉛濃度依存的な転写活性化能を示す。

図１. 配位子置換型人工ジンクフィンガータン
パク質の Zn(II)依存的機能発現4

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26 August, 2010
片岡氏の論文が JPSJ Papers of Editor's Choice Award を受賞
片岡幹雄（奈良先端大物質創成・A02 研究計画代表者）
片岡幹雄氏らが、Journal of the Physical Society of委員の選ぶ注目すべき論文に選ばれ、賞状を授与されJapan に公表した論文"Effect of conformational states onました。同論文の内容は、今月号のニュースレターで

protein dynamical transition"が、同誌 1804 巻 8 号の編集紹介されています。

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26 August, 2010
片岡グループの芝るみさんが The 4th Shanghai International Conference onBiophysics and Molecular Biology において優秀ポスター賞を受賞
片岡幹雄（奈良先端大物質創成・A02 計画研究代表者）

構造と酵素活性を測定することにより、構造形成と酵素活性発現のために必須な一次構造上の領域を明らかにしたものです。配列をアラニン挿入で分断すること

片岡グループ（Ａ02 班計画研究）の芝るみさん（博により、構造形成能を失う領域、酵素活性を失う領域

士後期課程 3 年）が、8 月 4 日から 12 日まで、上海が明確に決定できます。機能発現に必須な領域は、さ郊 外 の 嘉 善 市 で 開 か れ て い た The 4th Shanghai

らに補酵素(NADPH)結合に関与する領域、基質（ジヒInternationalandドロ葉酸）の結合に関与する領域および触媒活性に関

Molecular Biology (2010SICBM)において、優秀ポス与する領域に分類することができました。触媒活性にタ ー 賞 を 受 賞 し ま し た 。 Shanghai International

関与する領域には、活性部位を含んでいない領域もあConference on Biohysics and Molecular Biology は、り、揺らぎとの関係が注目されます。A02 班公募研究

上海の生物物理学会が主催する国際会議で、5 年に 1代表者の新井宗仁さんが、円順列変換により DHFR度開催されています。会議には、中国のほか、日欧米の folding element を同定していますが、今回の結果の第一線の生物物理学研究者や脳研究者が参加しましは、この結果を支持するとともに、folding elementた。のうちのいくつかは、機能発現に必須で必ずしも構造

ConferenceonBiophysics

芝 さ ん は 、 ”Extraction of the regions encoded

形成に必須な領域ではないことも示されました。8 月foldability and/or functionability from dihydrofolate

11 日に行われた Farewell Banquet で、会議の議長でreductase by the systematic alanine insertion“の演ある Ruan 教授から、賞状と副賞を授与され、大勢の題で発表しました。ジヒドロ葉酸還元酵素に対し、網参加者から、祝福の拍手を受けました。

羅的アラニン挿入変異を行い、各変異体を精製した後、表彰式で Ruan 教授とともに。

領域代表の寺嶋先生とともに記念撮影。

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26 August, 2010
片岡班員らの研究成果が新聞に掲載される。
A02 班、計画研究代表者の片岡幹雄博士と日本原子力研究開発機構の中川洋博士のグループの共同研究の成果が科学新聞（8 月 6 日）
、日経産業新聞(8 月 16 日)、日刊工業新聞（8 月 23 日）に掲載されました。

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26 August, 20108