大豆たん白質に豊富なアミノ酸の摂取は運動後に筋力の低下が継続することを防止するか？
神崎圭太＊1・渡邊大輝2・川上祐生1・高橋吉孝1・和田正信21

岡山県立大学保健福祉学部栄養学科2
広島大学大学院総合科学研究科

The Eﬀect of L-arginine Administration on Exercise-induced Calpain Activation
and Force Depression
Keita KANZAKI＊1, Daiki WATANABE2, Yuki KAWAKAMI1,
Yoshitaka TAKAHASHI1 and Masanobu WADA2
1

Faculty of Health and Welfare Science, Okayama Prefectural University, Soja 719-1197
2
Graduate School of Integrated Arts and Sciences, Hiroshima University,
Higashihiroshima 739-8521

ABSTRACTIn this study, we examined the effects of L-arginine (ARG) administration oncalpain activation and force output in rat skeletal muscle exposed to eccentric
contractions (EC). Male Wistar rats were allowed ad libitum to drink 0.3% L-ARG
solution (221 ± 7 mg/day of L-ARG) 3 days prior to the EC. Age-matched controls(CON) were provided water without L-ARG. After 3 days, the left anterior cruralmuscles were exposed to 200-repeated EC. The contralateral muscles were used
as controls. Three days following EC, isometric torque produced by the anterior
crural muscles was measured and then tibialis anterior muscles were removed andused for biochemical analyses. In CON muscles, the increase in total calpain activity
and calpain-1 autolysis was observed. L-ARG treatment alleviate increase in calpain
activity and abrogate increase in calpain-1 autolysis. In all stimulation frequency,
isometric torque in ARG muscles was greater than that in CON muscles, although
the decrease in torque evoked by low-frequency (1〜20 Hz) stimulation wasalso observed in ARG muscles. In addition, L-ARG administration induced thesuppressed degradation of dihydropyridine receptor and ryanodine receptor andthe attenuated degradation of junctophilin-1. These results suggest that dietary
L-ARG supplementation may facilitate force recovery following EC by preventing
the calpain-mediated proteolysis of Ca2+- regulatory proteins. Soy Protein Research,
Japan 19, 136-142, 2016.
＊〒719-1197136

総社市窪木111
大豆たん白質研究

Vol. 19（2016）

Key words : L-arginine, eccentric contraction, muscle damage, calpain, proteolysis
筋が引き伸ばされながら力を発揮する収縮様式は，収縮を誘起した．その後，1秒で元の位置に戻し，2秒伸張性収縮と呼ばれる．身体活動の多くには，この様間安静を保った．これを1サイクルとし，200回繰り返式の収縮が含まれており，激しい運動や筋力トレーニした．反対脚は安静脚とした．収縮3日後に，アキレングでは，高強度の伸張性収縮が主動筋に負荷される

ス腱を切除した状態で腓骨神経からの電気刺激を行いことになる．他の収縮様式（短縮性収縮や等尺性収縮）（1 〜 80 Hz），足背屈力を測定した後，前脛骨筋を摘とは異なり，伸張性収縮には，収縮終了後，数日間に出し，下記の分析に供した．なお，L-ARGの自由飲水

1）

わたって筋力低下が継続するという特徴がある ．

は，解剖直前まで継続した．

カルパインは，Ca2+濃度の上昇により活性化するたん白質分解酵素である．伸張性収縮後には，筋細胞内筋中亜硝酸/硝酸 （NO2/NO3）濃度の測定の遊離Ca2+濃度が上昇する2）．そのため，活性化され一 酸 化 窒 素 の 代 謝 産 物 で あ るNO2/NO3濃 度 は，たカルパインが，筋力発揮に関わるたん白質を分解す

Griess法を用いて測定した．なお，NO3− の還元には，ることが，筋力低下が継続する原因の1つであると考

塩化バナジウムを用いた．

えられる3）．これを支持する知見として，我々はカルパイン阻害剤の投与により，伸張性収縮後に低下した
4）

筋力が早期に回復することを確認している ．

総カルパイン活性の測定
総カルパイン活性は，蛍光基質であるN-succinyl-昨年度の本助成研究において我々は，カゼインに比Leu-Tyr-7-amido-4-methylcoumarinを用い，還元剤でべ分離大豆たん白質を摂取させたラットの骨格筋であるジチオトレイトールの存在下または非存在下で測は，カルパイン活性の増加や筋たん白質分解が抑制定した．なお，活性値はたん白質濃度あたりの値で算され，伸張性収縮後に低下した筋力が早期に回復する出した．

ことを確認した．カゼインに比べ大豆たん白質には一酸化窒素ドナーであるL-アルギニンが豊富に含まれるウエスタンブロット

こと5），一酸化窒素はS-ニトロシル化を介してカルパ

筋 ホ モ ジ ネ ー ト に 含 ま れ る10μgの た ん 白 質 を，インの活性や自己分解を抑制することが報告されてい

7%SDS-PAGEで分画した後，セミドライブロッティ

る6, 7）．

ング装置を用いて，polyvinylidene diﬂuoride（PVDF）

そこで本研究では，昨年度の研究での大豆たん白質

膜 に 転 写 し た（2 mA/cm2，75分 ）． そ の 後，0.05%摂取時と同程度の量のL-アルギニンの摂取により，伸Tween-20を 含 むPBSに3%ス キ ム ミ ル ク を 溶 解 し た

張性収縮後のカルパインの活性化や筋力の低下が軽減

バッファーを用いて，PVDF膜を室温で1時間ブロッされるかどうかを検討することを目的とした．

キ ン グ し た． 洗 浄 し たPVDF膜 を 抗 リ ア ノ ジ ン 受容 体 抗 体（2,500倍 希 釈，Thermo Scientiﬁc，MA3-方法925），抗ジヒドロピリジン受容体抗体（1,000倍希釈;Thermo Scientiﬁc, MA3-920），抗ジャンクトフィリ

被験動物およびL-アルギニンの投与
8週 齢 のWistar系 雄 性 ラ ッ ト を， ア ル ギ ニ ンン1抗体（500倍希釈; Thermo Scientiﬁc, 40-5100），抗カ ル セ ク エ ス ト リ ン1抗 体（500倍 希 釈; Santa Cruz,（arginine: ARG）群とコントロール（control: CON）

sc-53012），抗カルパイン-1抗体（1,000倍希釈; Sigma,群に分類した（各n=7）．ARG群には収縮負荷3日前よC0355）と一晩反応させた後（4℃），再度洗浄を行り，0.3%L-ARG溶液を自由飲水投与した．

い，5,000倍に希釈した二次抗体と室温で1時間反応させた．検出は化学発光試薬を用いて，ルミノ・イメー

伸張性収縮の負荷および足背屈力の測定ジアナライザー（LAS-4000）で行った．検出が終わっ麻酔下において，ラットを仰臥位に置き，左脚をたPVDF膜はクーマシー染色を行った後，スキャナーフットホルダーに足関節が約90°になるように固定しで画像をコンピューターに取り込み，Image Jを用いた．フットホルダーと連結したモーターによって，約て，各レーンの総たん白質量を定量した．なお，カル90°/secの速度で足関節を1秒間で伸展させると同時

パイン-1の自己分解の割合は，総カルパイン-1量に対に，坐骨神経より電気刺激（5 V，50 Hz）を与えて，する自己分解型カルパイン-1の量で，その他の各たん方脚の下腿前部の筋（長趾伸筋と前脛骨筋）に伸張性白質の発現量は，総たん白質量で除した値で表した．

大豆たん白質研究

Vol. 19（2016）

137統計処理20RestEC

統計量は平均値±標準誤差で表した．伸張性収縮およびL-Arg摂取の影響を検討するために，二元配置のNO2/NO3 content(nmol/g muscle)れた場合は，Holm-sidakの検定にしたがって，統計学的有意性を検討した．なお，有意水準は p <0.05とした．

結果aa

15

分散分析を行った．分散分析において有意性が認めら

105

L-Arg摂取量
飲水量から算出したARG群の平均L-Arg摂取量は221±7 mg/dayであった．この摂取量は，昨年度の本0助成研究における分離大豆たん白質摂取に伴う平均CON

ARG

L-Arg摂取量（254 ± 8 mg/day）に比べ13%の低値であった．
筋中NO2/NO3濃度
NO2−とNO3−は一酸化窒素由来の比較的安定な酸化代謝産物であるため，NO2/NO3濃度は一酸化窒素の産生量を間接的に表す指標として用いられている．安静脚の筋中NO2/NO3濃度は，CON群に比べARG群がFig. 1. L-arginine administration and eccentriccontractions increase nitrite/nitrate (NO 2/NO3) concentrations. NO2/NO3 concentration intibialis anterior muscles was spectrometricallydetermined by using the Griess reaction.
Values are means ± SE (n = 6-7). ap <0.05 vs.
CON-Rest. CON, control; ARG, arginine; EC,
eccentric contractions.

83%の高値を示した（Fig. 1）．CON群においては，安静脚に比べ収縮脚の濃度が有意な高値を示したが，ARG群では安静脚と収縮脚との間に差異は認められなかった．

A:+DTT

SLY-AMC cleavage(μmol AMC/min/g protein)60

EC100aab50
403020SLY-AMC cleavage(μmol AMC/min/g protein)

70B:-DTTRest80bc60

40

20100CON

ARG0CON

ARG

Fig. 2. L-arginine administration attenuates increase in calpain activity following eccentric contractions. Total
calpain activity was ﬂuorometrically measured in the presence (A) or the absence (B) of dithiothreitol(DTT) using N-Succinyl-Leu-Tyr-7-amido-4-methylcoumarin (SLY-AMC) as a substrate. Values are means± SE (n = 6-7). ap <0.05 vs. CON-Rest, bp <0.05 vs. ARG-Rest, cp <0.05 vs. CON-EC. CON, control; ARG,arginine; EC, eccentric contractions.
138

大豆たん白質研究Vol. 19（2016）

A

CONkDa75

REC

ARG
REC

BRest

25Ca2+ECaProportion of autolyzedcalpain-1 (%)

20
Autolyzed
100

CBBstaining

75

15

105

membrane
0CON

ARG

Fig. 3. L-arginine administration suppresses increase in calpain-1 autolysis following eccentric contractions. A,Representative western blot of calpain-1. B, Quantiﬁcation of the amount of autolyzed calpain-1. Values
are means ± SE (n = 6-7). ap <0.05 vs. CON-Rest. CON, control; ARG, arginine; R, rest; EC, eccentric
contractions; CBB, coomassie brilliant blue.
カルパインの活性と自己分解
CON群およびARG群の両群において，総カルパイン活性は，ジチオトレイトールの有無にかかわらず，安静脚に比べ収縮脚が有意な高値を示した（Fig. 2A& B）．しかしながら，ジチオトレイトール非存在下においては，CON群に比べARG群の収縮脚の活性が型カルパイン-1の増加は，活性化を表す指標として用いられている．CON群では，安静脚に比べ収縮脚の自己分解型の割合が57%の高値を示したが，ARG群では安静脚と収縮脚との間に差異はみられなかった（Fig.
3A & B）．

Isometric torque (mNm)

骨格筋に発現するカルパインアイソフォームの1つめに必要なCa2+濃度が低下する．そのため，自己分解

CON-ECARG-Rest

ARG-EC120

有意な低値を示した（Fig. 2B）．
であるカルパイン-1は，自己分解すると活性を示すた

CON-Rest

10080604020abc

足背屈力CON群では，全ての刺激頻度において，安静脚に比べ収縮脚の足背屈力が低値を示した（Fig. 4）．一方，
ARG群では，低頻度領域（1 〜 20 Hz）において，安静脚に比べ収縮脚の筋力が低値を示したが，高頻度領域（50 〜 80 Hz）においては，安静脚と収縮脚との間に差異はみられなかった．また，収縮脚の筋力は，全ての刺激頻度において，CON群に比べARG群が高値を示した．

大豆たん白質研究

ac0Vol. 19（2016）

020406080

Stimulation frequency (Hz)Fig. 4. L-arginine administration attenuate decline
in dorsiflex torque following eccentriccontractions. Isometric torque of anterior
crural muscles were measured by peroneal
nerve electrical stimulations (1-80 Hz). Values
are means ± SE (n = 7). ap <0.05 CON-Restvs. CON-EC, bP <0.05 ARG-Rest vs. ARG-EC,cp <0.05 CON-EC vs. ARG-EC. CON, control;
ARG, arginine; EC, eccentric contractions.
139kDa

EC R

Rest

EC

EC

0.5

Dc
RyR

245
180
135
1000.3

B

DHPR
JP1

75
630.2

CBB

100

membranestaining

75
63

DHPR/total protein

135

CON

0.3

bc0.2
aa0.3
0.2
0.1

CONCON

ARG

CON

ARG

0.6

E

0.4

0.00.0ARG

0.5

C0.40.1
0.0

180

a0.1

CSQ1245

JP1/total protein

R

ARG

CSQ1/total protein

CONRyR/total protein

A

0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0

ARG

Fig. 5. L-arginine administration attenuate degradation of Ca 2+-regulatory proteins following eccentric
contractions. A, Representative western blot of ryanodine receptor (RyR), dihydropyridine receptor(DHPR), junctophilin-1 (JP1), calsequestrin-1 (CSQ1). B-E, Quantiﬁcation of the amount of RyR (B), DHPR(C), JP1 (D) and CSQ1 (E). Values are means ± SE (n = 6-7). ap <0.05 vs. CON-Rest, bp <0.05 vs. ARG-Rest,cp <0.05 vs. CON-EC. CON, control; ARG, arginine; R, rest; EC, eccentric contractions; CBB, coomassie
brilliant blue.
Ca2+制御たん白質の発現量
CON群では，安静脚に比べ収縮脚のリアノジン受容考察体およびジヒドロピリジン受容体の発現量が低値を示したが，ARG群では，安静脚と収縮脚との間に差異は昨年度の本助成研究において我々は，分離大豆たんみられなかった（Fig. 5A-C）．また，ジャンクトフィ白質を20%含む食餌を4週間摂取させたラットの骨格リン1の発現量は，CON群とARG群の両群において，筋では，カゼインを摂取させた場合に比べて，伸張性安静脚に比べ収縮脚の発現量が低値を示したが，収縮収縮後に低下した筋力がより早く回復することを確認

脚の発現量は，CON群に比べARG群が有意な高値をしている．本研究では，筋力が早期に回復する原因が，示した（Fig. 5A & D）
．カルセクエストリン1の発現

大豆たん白質に豊富に含まれるL-Argの作用にあると量は，CON群およびARG群の両群において，安静脚考え，分離大豆たん白質摂取時と同程度の量のL-Argと収縮脚との間に差異はみられなかった（Fig. 5A &の摂取が伸張性収縮後の筋力低下に及ぼす影響を検討E）．

した．その結果，L-Argの摂取により，伸張性収縮後に低下した筋力が早期に回復することを示唆する結果が得られた（Fig. 4）．

140

大豆たん白質研究

Vol. 19（2016）

骨格筋の発揮張力が低下する原因の1つは，筋小胞パイン阻害剤の投与により，伸張性収縮後の筋たん白体からのCa2+放出が減少することにより，収縮時に筋質分解が抑制されることを確認している4）．本研究で2+

8）は，L-Argの摂取により，非還元条件下におけるカル細胞内Ca 濃度が十分に高まらなくなることにある ．
2+筋小胞体のCa 放出には，横行小管に位置し，ボルテー

パイン活性の増加が軽減されること（Fig. 2B），およジセンサーとして機能するジヒドロピリジン受容体やびカルパイン-1の自己分解の増加が抑制されることが筋小胞体のCa2+放出チャネルを構成するリアノジン受観察された（Fig. 3）．L-Argから産生される一酸化窒容体が主要な役割を果たしている．また，三つ組み構

素はS-ニトロシル化という可逆的修飾により，カルパ造の形成や維持に関わるジャンクトフィリンは，ジヒインの活性や自己分解を阻害することが報告されていドロピリジン受容体からリアノジン受容体へのシグナ

る6, 7）．これらの知見と，L-Argの摂取により，安静時ル伝達に必須の役割を果たしている8）．これらの機能において，筋中の一酸化窒素濃度が上昇することを示

たん白質の発現量の低下が抑制あるいは軽減されるこ唆する本研究結果は（Fig. 1），S-ニトロシル化を介しとが（Fig. 5），L-Argの摂取により筋力が早期に回復たカルパインの阻害が，L-Argの摂取により筋たん白する原因の1つであると考えられる．

質分解が軽減される原因の1つであることを示唆する

骨格筋において，カルパイン系はアポトーシス系，ものである．

オートファジー系およびユビキチン-プロテアソーム

以上のように，本研究では，L-Argの摂取が運動後系とならぶ主要なたん白質分解経路である．伸張性収に低下した筋力の回復に有効であること，およびその縮後の筋たん白質分解にはカルパインが関与すること

原因の1つは，筋小胞体のCa2+放出に関わるたん白質が提唱されており3），我々も伸張性収縮後にカルパイの分解が軽減されることにあることが示唆された．

ンの活性や自己分解が増加すること1, 9），およびカル要約本研究では，L-アルギニン（L-Arg）の摂取が，伸張性収縮後のカルパイン活性化および筋力低下に及ぼす影響を検討することを目的とした．Wistar系雄性ラットをARG群とコントロール（CON）群に分類し，ARG群には300 mg/100 mLのL-Arg溶液を収縮負荷3日前より自由飲水投与した．投与3日後に，坐骨神経からの電気刺激と伸展装置を用いて，200回の伸張性収縮を負荷した．収縮終了3日後に，足背屈力を測定した後，収縮脚および安静脚から前脛骨筋を摘出した．これらを分析に用い，以下の結果を得た．
1. CON群では，カルパイン-1の自己分解が安静脚に比べ収縮脚で高値を示した．ARG群では，この差異はみられなかった．
2. CON群では，足背屈力が安静脚に比べ収縮脚で低値を示した．ARG群では，低頻度領域においてのみ，足背屈力が安静脚に比べ収縮脚で低値を示したが，全ての刺激頻度において，収縮脚の足背屈力はCON群に比べARG群で高値を示した．
3. CON群では，ジヒドロピリジン受容体，リアノジン受容体の発現量が，安静脚に比べ収縮脚で低値を示した．ARG群ではこれらの差異はみられなかった．
以上の結果から，L-Argの摂取により伸張性収縮後に低下した筋力が早期に回復すること，およびその原因の1つは，筋小胞体からのCa2+放出を制御するたん白質の分解が軽減されることにあることが示唆された．

大豆たん白質研究

Vol. 19（2016）141文献1）Kanzaki K, Kuratani M, Mishima T, Matsunaga

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142

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