「揺らぎと生体機能」ニュースレター
No. Z426 November, 2010
業績紹介：天然ＳＳ結合を形成する組換えガウシア由来ルシフェラーゼの大量発現系の構築及びその生物物理学的解析
黒田 裕（東京農工大学・A02 公募研究代表者）
論文題目：Biophysical characterization ofhighly active recombinant Gaussia luciferase
expressed in Escherichia coli.
著 者 ： Tharagani Rathnayaka, Minako Tawa,
Shihori Sohya, Masafumi Yohda, Yutaka Kuroda
雑誌巻号：Biochim Biophys Acta. Proteins andProteomics (2010)
最近発見されたガウシア(海洋カイアシ類
Gaussia princeps;海洋性プランクトンの一種)由来のルシフェラーゼ(以下、GLuc；169 残基)は、生物発光を触媒する最も小さな酵素である(文献１)。GLuc は、蛍ルシフェラーゼ(550 残基)より安定性・活性・汎用性の面で優れたレポータータンパク質となる可能性を秘めている。しかし、10個のシステインが SS 結合を形成する組換え GLucの巻き戻しは難しく、動物細胞からしか精製できない GLuc の応用範囲は限られている(図 1A)。
本研究では、大腸菌を宿主とした組換え GLuc の発現・精製法を確立し、その活性や熱安定性を初めて生物物理学的な手法で測定した。まず、非天然型 SS 結合の問題に対して、発現温度を 25℃及び 16℃に下げ、上清画分で発現された GLuc のみを回収する工夫を施すことで、培養液 1L 当たり2mg の組換え GLuc を得ることが可能となった(図1B）。この手法で得た組換え GLuc の発光活性は今まで考えられていたよりはるかに強く、蛍ルシフ
ェラーゼの 10 倍（同酵素濃度比較）以上であることを示した(図 1C)。さらに、円偏光二色分光法から測定した GLuc の変性温度が 60℃であり、GLuc が広い温度範囲で利用可能であることを示した。今後は、本手法で発現した組換え GLuc を用いて、GLuc の２つの推定ドメイン間の揺らぎを解析し、GLuc をさらに改変する予定である。

図１：大腸菌で発現した組換え GLuc における SS 結合形成の問題。 (Ａ)配列中に 10 個のシステインを有する GLuc を、従来の手法で発現すると非天然型 SS 結合を形成する不活性 GLuc が多く混合する。本計画では
天然 GLuc のみを大腸菌から精製する方法を開発した。
(Ｂ) 大腸菌で発現した GLuc の逆相 HPLC。
（左）本手法で発現した GLuc では一本の HPLC ピークが観測される。
（右）従来の発現方法では、非天然 SS 結合を有する GLuc が混合しているため、多数のブロードなピークが HPLC で観測される（Ｃ）組換え GLuc の発光スペクトル。今回開発した手法で発現した GLuc の発光活性が強いことから、天然型 SS 結合を形成する天然 GLuc の精製に成功したことが、強く示唆される。

参 考 文 献 ： １ ） O. Shimomura, Bioluminescence:chemical principles and methods, World Scientific,
Hackensack, N.J.; London, 2006.

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No. 2426 November, 2010
業績紹介：インフルエンザ A-M2 チャネルのプロトン透過機構
平田文男（分子科学研究所・A03 計画研究代表者）
吉田紀生（分子科学研究所・A03 公募研究代表者）

ン間の静電反発により起こるため、0H,1H,2H,3H,4Hとプロトン化状態が進むほどゲートは大きく開くが、一方でプロトン化したヒスチジンにより、正の静電ポテンシャルが作られるため、ヒドロニウムイオンには反発力が働くことになる。したがって、M2 チャネル

論文題目："Proton Transport through the Influenza A M2のプロトン透過性はゲート開閉による立体障害とプロ

Channel: 3D-RISM Study"

トン化による静電反発のトレードオフによって決まる

著者：Saree Phongphanphanee, Thanyada Rungromongkol,ことになる。

Norio Yoshida, Spot Hannongbua, and Fumio Hirata
雑誌巻号：J. Am. Chem. Soc., 2010, 132, pp 9782–9788.
M2 チャネルはインフルエンザ A の細胞膜に存在するプロトンチャネルであり、細胞膜内外の pH を調整する機能を持つ。よく知られたインフルエンザ薬であるアマンタジンはこのチャネルの阻害剤である。しかし、アマンタジンの作動機構は未だによく分かっていない。また、アマンタジン耐性ウイルスの出現が報告されている。したがって、M2 チャネルのプロトン透過機構自体の理解を深めることは今後のドラッグデザインにおいて重要である。
M2 チャネルは pH に応じてゲートを開閉することで細胞内の pH を調整している。M2 チャネルは 4 量体からなり、ゲート部には 4 つのヒスチジン残基が存在する。これまでの、実験およびシミュレーションなどから、細胞外の pH に応じてヒスチジンのプロトン

図１化状態が変わることでゲートが開閉していることが知以上の分布関数およびそれから求めたヒスチジン残られている。そこで、0H(全てのヒスチジンがプロト基の周りの水およびヒドロニウムイオンの動径分布関ン化していない状態)から 4H(全てのヒスチジンがプ数から、プロトンの透過機構に関して図２に示す新しロトン化している状態)の 5 つの状態について、MD シいモデルを提案した。

ミュレーションから抽出した構造を用いて、3D-RISMでチャネル内のプロトン（ヒドロニウムイオン）および水分子の分布および平均力ポテンシャルを計算した。
図に 3D-RISM 理論で求めたチャネル内の平均力ポテンシャルを示す。0H~2H では大きな障壁が存在しており、水もプロトンも透過の可能性は無いことが分かる。3H では 5kJ/mol 程度の障壁が見られるが、これは熱運動で超えることができる程度の障壁である。
4H ではゲートは 3H よりも開いているものの、障壁が高くなり、プロトン透過性はむしろ下がっているこ
図２とが分かる。ゲートの開閉はプロトン化したヒスチジ2

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No. 2426 November, 2010
大阪大学蛋白質研究所セミナー「蛋白質の多様な相互作用 ―動的機構の解明から医学的応用まで―」報告
石森浩一郎（北大院理・A01 公募研究代表者）
鎌形 清人（東北大多元研・A01 公募研究連携研究者）
櫻井 一正（阪大蛋白研・A01 公募研究連携研究者）
渕上壮太郎（横浜市大生命ナノシステム）

質結合による蛋白質の構造変化について、線形応答理論によるデータベース解析を行い、多くの蛋白質における基質結合による構造変化が数種の構造変化に分類可能であることを示した。この研究は、基質結合による構造変化の基本原理を解き明かすものであり、先の箱嶋博士の実験的な結果からも、生物は蛋白質の基質結合における相互作用を共通性のある一定の原理に基づいて設計してきたことを強く示唆しているように感じた。このセッション最後の講演は原田英里砂博士（サ本セミナーは、蛋白質の相互作用を多面的にかつ動ントリー生有研）で、ヘムオキシゲナーゼの NMR 解的に捉え、その新たな実験、理論的手法によるアプロ

析から、「見えない構造」の存在とその機能的意義がーチから、現在注目されている蛋白質相互作用の研究明確に示された。このような蛋白質の動的構造の重要状況とその課題、さらに発展して生体内での蛋白質相性からは、先の発表の 2 件とは対象的に、蛋白質構造互作用を利用した医学的な応用まで、各分野での最新には表面的にはわからない「奥深さ」のようなものを動向を概観するとともに、今後の展開について種々の感じることができた。（座長：石森）観点から討議することを目的として、東北大・多元研の鎌形、大阪大・蛋白研の櫻井、横浜市大・生命ナノシステムの渕上、北大・院理の石森が企画し、大阪大学蛋白質研究所セミナーの一環として平成 22 年 10 月
21 日、22 日の両日にわたって開催された。講演内容
は「蛋白質―基質結合」（座長：石森）、「蛋白質―蛋白質結合」（座長：渕上）、「蛋白質―生体高分子結合」（座長：鎌形）、「相互作用の医療への応用」（座長：櫻井）の 4 つのセッションに分かれ、それぞれ 3～5 名の研究者が発表を行った。いずれも蛋白質の「揺らぎ」と深く関連した内容であるので、以下に多数の参加者を集めてセッション 1 の開始

その概要は紹介する。
セッション 1 では蛋白質と基質の間の相互作用につ2 番目のセッションでは、蛋白質－蛋白質結合に焦いて 3 件の発表があり、最初の箱嶋敏雄博士（奈良先点をあて、3 名の方々に講演していただいた。まず、

端大・情報科学）が植物ホルモンの受容体における相野本直子博士（北大・院理）の代理として石森浩一郎互作用について、その詳細な結晶解析の結果から、植博士（北大・院理）によって、電子伝達系におけるシ物ホルモンの受容体に共通な蛋白質―基質（植物ホルトクロム c とシトクロム c 酸化酵素との間の相互作用モン）相互作用様式を提案した。一見、その構造に類について NMR を用いて解明された結果が紹介された。

似性のない植物ホルモンであるが、その疎水性、親水従来から認識されていた静電相互作用だけでなく、多性官能基の配置には一定の規則性があり、その受容体様な相互作用が関与していることが明らかにされ、まとの相互作用にも共通性があるということは、蛋白質た、それらの相互作用が蛋白質間の安定な結合に最適の分子進化の点でも非常に興味深い。一方、二番目の化されているわけではないことが指摘された。続いて、発表者である雨宮崇之博士（名大・院情報科学）は基肥後順一博士（阪大・蛋白研）から天然変性蛋白質で3

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No. 2426 November, 2010
一本鎖 DNA に蛍光色素と消光子を付加し、それらの接触速度を測定することにより、DNA の分子内運動の時間スケールを明らかにした。原田慶恵博士（京大・iCeMS）は、DNA－タンパク質相互作用の１分子イメージングについて発表された。RNA ポリメラーゼのプロモーターを探す運動や DNA 相同性組み換え運動などの一分子測定の結果を示された。以上 3 名の発表は、生体高分子の物性と蛋白質―生体高分子結合の理解を促進するものであった。
セッション 2 での質疑ある NRSF とそのパートナー蛋白質 Sin3 との複合体形成について計算機シミュレーションを駆使して得られた成果が発表された。蛋白質間の相互作用と NRSFのフォールディングが複雑に絡み合った様相がシミュレーションによって再現され、自由エネルギー地形を用いて複合体形成のシナリオが端的に提示された。最後に、佐甲靖志博士（理研・細胞情報）から細胞内 1分子イメージングによって明らかにされた情報伝達系における蛋白質間相互作用について 2 つの話題が紹介

セッション 3 での質疑された。前半では、低分子量 GTPase である Ras とセッション 3 終了後にはセミナー会場の隣室で懇親

リン酸化酵素 Raf との間の tight な分子間相互作用に会が開催され、若い研究者から熟年の研究者まで幅広おいて、Ras が Raf のコンフォメーションを巧妙に制い年齢層の方々にご参加いただいた。懇親会は、箱嶋御していることが示された。後半では、EGF 受容体の先生の乾杯の挨拶で始まり、和やかな雰囲気の中、参動的会合形成における loose な分子間相互作用の実態加者間で「多様な」交流が行われた。（座長：鎌形）が紹介された。本セッションの 3 つの講演により、蛋2 日目のセッション 4 では相互作用の医療への応用

白質－蛋白質間相互作用といってもその形態は個々のというテーマで 5 人の方に講演していただいた。小澤

機能に即して多種多彩であり、簡単に一般化できるも大作博士（福井大・医）はアミロイド原因蛋白質の2のではないことが改めて浮き彫りにされた。一方で、ミクログロブリン(2m)と細胞外シャペロンの α2 マいずれにおいても蛋白質ならではの柔軟さ・曖昧さがクログロブリン(2M)の相互作用研究について発表さ決定的な役割を担っているように感じられる。今後、れた。2m の変性に伴い2M との会合が促進される

多様な研究の展開により、その共通メカニズムが解ことを示し、変性条件と結合増強の関係性を考察され明・理解されることが期待される。（座長：渕上）ていた。山本典史博士（名大・院情報科学）はファーセッション 3 は蛋白質―生体高分子結合というテーマコロジカルシャペロンと呼ばれる蛋白質の変性を抑マで 3 人の方に講演していただいた。五十嵐圭日子博

制する合成分子とヒトプリオン蛋白質との相互作用を士（東大・院農学生命）は、糖質加水分解酵素の結晶シミュレーションした結果を述べられた。博士の研究

性多糖への吸着と反応について発表された。高速ＡＦ室で発見された GN8 という分子とプリオンの複合体Ｍを使用し、糖質加水分解酵素一分子が結晶性のセルのシミュレーションを行ったところ、正常型プリオンロースの上を動きながら、加水分解する様子を明らかの構造を安定化し、異常型プリオンへの構造転移を抑にした。鵜澤尊規博士（理研）は、一本鎖 DNA のダえるという結果が得られた。富山貴美博士（大阪市大・イナミクスの観測から明らかとなった生体高分子の分院医）はアミロイド(A)がアルツハイマー病を引き起子内運動の普遍的時間スケールについて発表された。

こす機構について発表された。現在広く受け入れられ4

「揺らぎと生体機能」ニュースレター
No. 2426 November, 2010ているアミロイド仮説を否定し、博士の提唱するオリ象であることが再認識された。しかし、その光はまだゴマー仮説を裏付ける実験結果を数多く示された。以十分に掴み切れるものではなく、大きく揺らぐ曖昧な上 3 名の発表は、コンフォメーション病と呼ばれる病もののようにも感じられた。今後、「蛋白質の相互作用」

気の原因解明と対処法の可能性を示すものであったとの意義をさらに明確にしていくためには、各分野のさ思う。

らなる研究発展はもちろんのこと、分野をまたいだ研究者間の「多様な」相互作用が必須であることは間違いない。本セミナーがその一助となれば、世話人として望外の喜びである。（まとめ：渕上）セッション 4 の開始
本セッション 4 人目の乾隆博士（大阪府大・院生命環境）は L-PGDS という輸送蛋白質のドラッグデリバリーシステムへの利用について話された。難溶性の薬剤分子と L-PGDS が複合体を形成することを物理化学的な実験から示し、マウスを使った実験から薬剤の効果が L-PGDS を用いた時に増強する結果を示された。最後の朴三用博士（横浜市大・生命ナノシステム）
はインフルエンザ RNA ポリメラーゼの結晶構造をもとにした阻害剤の開発について発表された。RNA ポリメラーゼは 3 サブユニットの複合体であり、博士の解いたサブユニット間の会合部位の構造を元に、複合体形成を阻害する候補分子が得られたという結果を示された。後半 2 名の発表は、構造という蛋白質の基礎的な情報が、薬剤開発の応用につながるというとても明快な例を示されたものだと感じた。（座長：櫻井）
本セミナーでは「蛋白質の相互作用」をキーワードとし、分野や手法については敢えて特定のものに限定せず、幅広い内容の講演をお願いした。そのため、全体的なまとまりがない散漫な会になってしまうことも危惧されたが、わずか 2 日間で「多様な」分野を概観することができただけでなく、個々の講演それぞれには講演者の分野ならではの「多様な」個性が感じられたと同時に、その根底に共通する「蛋白質の相互作用」を実感することができた。本セミナーの講演を通して、「蛋白質の相互作用」は「多様な」アプローチによって「多様な」意味づけをされ、多彩な光を放つ研究対5

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No. 2424 November, 2010
シンポジウム報告
膜シンポジウム 2010 セッション「膜の揺らぎと機能への展開：研究の最前線」
岡村恵美子（姫路獨協大薬・A03 公募研究代表者）

生体膜はソフトな空間であり、膜の揺らぎが機能に果たす役割は大きいと考えられます。本セッションでは、「膜のなかの揺らぎ」に焦点をあて、揺らぎをいか2010年11月19～20日に京都大学薬学部記念講堂ににして捉え、膜の動的な機能の理解に結び付けるかにおいて「膜シンポジウム2010」が開催され、その初日ついて、本領域からの成果を含む最新の研究例を紹介に本領域の共催のもと標記のセッション講演が行われし、膜学研究の場において揺らぎの概念と重要性をさました。膜シンポジウムは日本膜学会が毎年秋に開催らに定着させることを目的としました。

するシンポジウムで、膜をキーワードとする医学・生オーガナイザーの趣旨説明の後、松本先生には抗が物学・化学・物理・工学に至る幅広い分野の研究者がん剤としてのハイブリッドリポソームの基礎から臨床一堂に会して十分な討論を行うというユニークなもの応用までを、筆者らのグループから高分解能溶液NMRです。22回目となる本年、運営委員長である筆者の提を用いた薬物輸送を、手老先生には蛍光一分子追跡法案で初めてセッション講演を企画しました。本領域かによる膜のなかの分子拡散を、中野先生には中性子散らの3名の先生を含む以下の講演に対して、100名を超乱によるリポソーム間の脂質分子移動とフリップフロえる参加者全員で白熱した討論が展開されました。

ップについて、篠田先生には分子シミュレーション＋

１．「趣旨説明」（姫路獨協大学）岡村恵美子

粗子化モデリングによるリポソーム形成過程について

２．「人工膜および細胞膜の揺らぎとがん治療」

それぞれ講演をいただきました。

（崇城大学）松本陽子

いずれのトピックスも膜の揺らぎが密接に関係し３．
「ソフトな脂質膜の揺らぎと薬物透過についてのＮたものであり、「揺らぎ」が膜において非常に重要な役ＭＲ研究」割を演じていることが分かります。また、方法論も、（姫路獨協大学）吉井範行・岡村恵美子

NMR 、蛍光、中性子散乱、分子シミュレーションな

４．
「酸化物基板表面上の平面支持脂質二重膜内での分ど多彩です。今後、これらの方法や関連のアプローチ

子拡散挙動のその場観察」

によって、生体機能に結びつく膜の様々な揺らぎが捉（豊橋技術科学大学）手老龍吾えられ、理解されていくものと期待されます。

５．
「中性子散乱と蛍光法を用いた脂質膜の構造とダイ最後になりましたが、本セッションの共催をご快諾

ナミクスの評価」（京都大学大学院薬学研究科）中野いただくとともに、当日もセッション講演から懇親会
実まで長時間にわたってご参加いただきました領域代表

６．
「リポソーム形成のメカニズム：分子シミュレーシの寺嶋先生に厚く御礼申し上げます。

ョンによるアプローチ」（産業技術総合研究所ナノシステム）篠田渉

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