「揺らぎと生体機能」ニュースレター
No. 3426 September, 2011
業績紹介：常磁性プローブを用いた糖鎖立体構造の NMR 解析法の開発
伴って NMR スペクトル変化が確認された。そこで、

加藤晃一（自然科学研究機構・A01 計画研究代表者）

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H-13C HSQC 測定により、糖鎖の各水素および炭素原子の化学シフト変化を求めた。その結果、期待通り、
論文題目："Paramagnetic lanthanide tagging for NMR

常磁性プローブに近接する還元末端側において最も大conformational analyses of N-linked oligosaccharides"

きな PCS 値が観測された（図）。さらに詳細な解析を

著 者 ： Sayoko Yamamoto, Takumi Yamaguchi, Máté

行うために、分子動力学計算により求めたジアセチル

Erdélyi, Christian Griesinger, and Koichi Kato

キトビオースの安定構造をもとに PCS の実験値と計

雑誌巻号：Chem. Euro. J. 17, 9280–9282 (2011)

算値を比較したところ、両者は非常に良い一致を示した。このことから、ランタノイドの導入による糖鎖構糖鎖は内部運動の自由度に富み、水溶液中では一定造への影響はみとめられず、本方法を用いることで、のコンフォメーションをとっていない。そのため糖鎖水溶液中の糖鎖の立体構造情報を新たに取得できるこの生物機能の分子科学的基盤に関する理解を深めるたとが明らかとなった。

めには、その動的な３次元構造について精密な情報を常磁性プローブの導入により、PCS に加え、常磁性収集することが不可欠である。しかしながら、水溶液緩和増強、残余双極子相互作用などを利用した NMR中で揺らいでいる糖鎖に対して分子科学的なアプロー測定が可能となる。これらの各種常磁性効果を系統的チを行うことは、これまで困難であった。私たちはこに解析することで、水溶液中における糖鎖の動的な構の問題の解決に向け、溶液 NMR による糖鎖の立体構造情報が得られるものと期待される。現在、より巨大造およびダイナミクス解析のための新規手法の開発にで複雑な糖鎖について本手法を応用し、その立体構造取り組んでいる。タンパク質の構造学的研究においてと揺らぎを明らかにすることに取り組んでいる。

は、核オーバーハウザー効果（NOE）を利用した NMRによる立体構造解析法が確立されている。一方、糖鎖は一般にプロトン密度が低いため、近距離にあるプロトン間の距離情報を反映する NOE を観測し、これに基づいて構造解析を行うことは容易ではない。そこで本研究では、新たにランタノイドイオンを利用した常磁性プローブを活用し、常磁性 NMR による解析を行った。
ランタノイドイオンの導入により、溶液 NMR において擬コンタクトシフト（PCS）をはじめとする常磁性効果の観測が可能となる。PCS は、固定化した常磁性イオンと各原子の間の距離と角度に依存した化学シフトの変化として観測され、NOE とは異なるロングレンジの構造情報を与えることが知られている。この手法を応用した糖鎖の NMR 解析法を確立するため、タンパク質を修飾する N 型糖鎖に共通なコア構造である
ジアセチルキトビオース（GlcNAcβ1−4GlcNAc）を用

図 常磁性プローブの導入による 1H-13C HSQC スペクい、その還元末端へ新規に合成した EDTA 誘導体を連トルの変化（上）およびジアセチルキトビオースのモ結した。得られた試料に対して 1 当量のランタノイドデル構造（下）。青色は La3+添加時、赤色は常磁性ライオンを添加することで常磁性プローブを所定の位置ンタノイドである Tm3+添加時のスペクトル。アノマーへ導入することに成功し、安定な 1：1 複合体の形成に位のピークの変化を矢印で示した。

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「揺らぎと生体機能」ニュースレター
No. 3426 September, 2011
業績紹介：均一な糖鎖を発現する遺伝子改変酵母を利用した安定同位体標識法
加藤晃一（岡崎統合バイオ・A01 計画研究代表者）を用いた測定を行ったところ、本糖鎖を構成する全ての炭素についてC-H相関ピークを高分解能で観測することができた(図)。さらに糖残基中の特定の部位を選homogeneous

択的に13Cで代謝標識した一連の試料を用いて超高磁

oligosaccharide with C labeling by genetically engineered

場計測を行うことにより、得られたNMR信号の帰属をyeast strain"行うことに成功した(図)。

論 文 題 目 ： "Overexpressionof a13

著者：Yukiko Kamiya, Sayoko Yamamoto, Yasunori Chiba,

本方法の成功により糖鎖の立体構造とそのダイナミ

Toshihiko Kitajima, Yoshifumi Jigami, and Koichi Kato

クスについて精密解析を行う道が拓けた。

雑誌巻号：J. Biomol. NMR 50, 397-401 (2011)
タンパク質を修飾する糖鎖は、分子の安定性を向上させるのみならず、糖鎖を認識するタンパク質との相互作用を通じて、細胞間接着等の生体機能を担っている。
近年、細胞内の糖タンパク質の輸送経路において、高マンノース型糖鎖がそれを担うタンパク質の“品質”を表示するタグとしての役割を果たしていることが明らかとなってきた。
この機構において、糖鎖は分子シャペロン、積荷輸送体としての機能を持つ一連のレクチンによって認識されることにより、糖タンパク質のフォールディング・輸送・分解といった運命の決定に関わっている [1]。糖鎖が担うこうした生物学的メッセージはその3次元構造を通じて表現されているに相違いないが、糖鎖は内部運動が自由度に富んでいるた
め、X線結晶構造解析をはじめとする一般的手法を用いて構造生物学研究を行うことが難しい。こうした状況のもと、我々は糖鎖の立体構造をその動的な性質も含めて解明するために、超高磁場NMRを用いた解析手法を開発することを目指している。本論文では、NMRによる糖鎖構造の精密解析を行うための第一歩として、酵母変異体を用いて安定同位体標識を施した高マン図

酵母の代謝系を利用して調製したピリジルアミノノース型糖鎖を均一かつ大量に調製する方法を発表し化高マンノース型糖鎖 M8B の 1H-13C HSQC スペクトた。

ル。部位選択的に 13C 標識した M8B のスペクトルを重ね合わせた。標識部位は炭素源であるグルコース上に糖転移酵素および糖分解酵素をコードする3つの遺伝子(Och1, Mnn1, Mns1等)を欠損させたSaccharomyces

スペクトルに対応する色で示した。

cerevisiaeの変異株を用いることにより、酵母糖タンパク質上に均一に高マンノース型糖鎖M8Bを発現させることを試みた。さらに、本変異酵母を[13C6]グルコー

参考文献

スを炭素源として含む培地で培養することによって、[1] Y. Kamiya et al., Glycobiology Research Trends, 27,13M8B糖鎖を Cで均一に標識した。得られた酵母糖タン

27-40 (2009)

パク質から調製したM8Bについて920MHzのNMR装置

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「揺らぎと生体機能」ニュースレター
No. 3426 September, 2011
業績紹介：スクリュー運動が T4 ファージタンパク質 gp5 の多種類機能を制御する
北尾彰朗（東京大学分生研・A01 公募研究代表者）

がマルチドメインタンパク質の中で、複数の機能を獲得した興味深いケースだと考えられる。
この論文は、 Virus uses "Swiss Army Knife" protein to

論文題目："Screw motion regulates multiple functions ofcause infection と し て ACS News Service Weekly

T4 phage protein gene product 5 during cell puncturing"

PressPac: August 17, 2011 で も 紹 介 さ れ ま し た 。

著者：Wataru Nishima, Shuji Kanamaru, Fumio Arisaka
and Akio Kitao
雑誌巻号： J. Am. Chem. Soc., 133(34), 13571-13576(2011).
T4 ファージは、大腸菌に感染し増殖するウィルスの1 つである。T4 ファージの感染は、T4 ファージが細胞膜に到達した後に、先端にある蛋白質 gp5（gene product5）が DNA 注入の為の穴を開けるところから開始される。尾鞘と呼ばれる部位が収縮することによって gp5が回転しながら押し出され、細胞膜を貫通する。gp5は、3 量体を形成する蛋白質で、βへリックスドメインと呼ばれる構造ユニットが細胞の外膜に穴を開ける
図 タンパク質 gp5 と結合する gp27 の立体構造ドリルの役割を果たし、リゾチームドメインが内部のペプチドグリカン層を破壊すると考えられている。
この過程を観察するために行った約 90 万原子からなる巨大システムの大規模分子動力学シミュレーションによって、我々は gp5 が一定のスクリュー運動をするにも関わらず、異なる複数の機能を順番に発揮することを示した。βへリックスは細胞膜穴をあけるだけでなく、電荷アミノ酸残基を利用してドリルの溝のように脂質を上に運んでいく役割を果たしていることが見出された。リゾチームドメインはペプチドグリカン層を破壊するだけでなく、穴を更に大きくし、穴が開いた後でβへリックスを解離するように制御している

図 膜貫通途中のスナップショットことが分かった。リゾチームドメインの活性部位は、貫通が終わるまで脂質が結合しないようにタンパク質のリンカー部位によって覆われていることも明らかになった。
タンパク質 gp5 が持つ複数の機能は、分子間相互作用が次第に変化していくことによって生み出される。
これが 1 種類のタンパク質が一定のスクリュー運動によって、順序良く複数の機能を発揮し感染を容易にす
図 βへリックス上での脂質の移動経路るという役割を果たすメカニズムである。リゾチーム
ドメインの機能は、１つの酵素機能をもつタンパク質3

「揺らぎと生体機能」ニュースレター
No. 3４26 September, 2011
業績紹介：回転子のない F1-ATPase が“回転”することを１分子観察で証明
α3β3 固定子リングの N 末端側をマイカ基板表面に共飯野亮太（東大院工・A03 公募研究代表者）有結合で固定し，大きく構造変化する C 末端側を 80
論文題目："High-speed atomic force microscopy reveals

ミリ秒の時間分解能で観察した．ATP 存在下では 3 つrotary catalysis of rotorless F1-ATPase"の β のうち 1 つのみが開いた非対称な構造をみせ，β

著 者 ： Takayuki Uchihashi, Ryota Iino, Toshio Ando,の開閉のダイナミックな構造変化が観察された．特筆

Hiroyuki Noji

すべきは，開いた β が閉じると反時計回り方向にある

雑誌巻号：Science 333, 755-758 (2011)

閉じた β が同時に開くという協同的な構造変化が見られた点で，時間経過とともに β の開閉が反時計回りに遷移していく様子が明確に観察された（図 1B）．

F1-ATPase（F1）は ATP 合成酵素の一部であり ATPを加水分解しながら回転する．F1 が回転モーターとしこれまでの説とは異なり，F1 の一方向性回転を支えて機能する最小単位は α3β3γ 複合体で α，β サブユニッる構造的基盤は α3β3 固定子リングに内蔵されているこトが 3 つずつ交互に並んで作る α3β3 固定子リングに回とが証明された．一方で γ なしの α3β3 リングの一方向転子の γ サブユニットが突き刺さっている．ATP 加水回転の効率や速度は，γ ありに比べ低下していること

分解反応の触媒部位は α-β 界面（図 1A の矢印）に存も確かであった．正確で速い回転触媒反応の実現には在し，ATP 結合に寄与するアミノ酸残基のほとんどはα3β3 リング間の相互作用だけでなく回転子 γ と固定子β サブユニットに存在する．結晶構造中の 3 つの β はの相互作用も“同等に”重要であると考えられた．

結合しているヌクレオチド状態が異なり，ATP またはまた今回の結果は、F1 に似た 6 量体リング構造を持ADP を結合した 2 つの β は“閉じた構造”、ヌクレオチつが回転子を持たない RecA ファミリーおよび AAA+ドを結合していない 1 つの β は“開いた構造”をとってファミリータンパク質もリングを形成するサブユニッいる．このため β は開いた状態と閉じた状態に大きくト同士が協同的に働くことを強く示唆する．今後はこ構造が変化し，この構造変化が γ の回転を駆動するとれらのタンパク質ナノマシンを高速 AFM で観察し F1考えられている．それぞれの β は回転子 γ が反時計回との共通点や相違点を明らかにしたい．

りに 360°回転すると 1 回の ATP 加水分解反応を完了してリセットされる．3 つの β の化学反応と構造変化のタイミングは巧みに制御されており，位相がお互いに120°ずれている．γ が一方向に回転するためには，このタイミングの制御が重要だと考えられる．
F1 の結晶構造をみると，閉じた β は γ を押しているようにみえ，開いた β は γ に押されているようにみえる．この“押し引き”がタイミングの制御に重要である、というのがこれまで最も有力な説であった．このモデルでは一方向への回転の実現には γ と β の相互作用が必須となり，非対称な形をした γ の回転角度が決まれ
ば 3 つの β の状態は自動的に規定される．いわば γ が3 つの β の化学反応と構造変化のタイミングを支配する，“独裁者”としての役割を果たす．しかしながら最近，γ を削って β との接触点を減らしても一方向に回転するという報告がなされた．そこで我々は高速原子間力顕微鏡を用い，回転子のない F1 の α3β3 固定子リン

図 1．F1 の結晶構造（A）と回転子 γ のない α3β3 固定

グが一方向に“回転”できるのかを直接検証した．

子リングの“回転”の高速 AFM 像（B）．

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