「揺らぎと生体機能」ニュースレター
No. 4126 April, 2012
業績紹介：G 蛋白質αサブユニットの C 末端部はヌクレオチド交換反応を制御する
今元 泰（京都大学理学・A01 公募研究代表者）
論文題目："The C-terminus of the G protein α subunit
controls the affinity of nucleotides"
著者：Naoki Kimata, Takahiro Yamashita, Take Matsuyama,
Yasushi Imamoto, and Yoshinori Shichida
雑誌巻号：Biochemistry 51, 2768-2774 (2012)
G 蛋白質共役型受容体（GPCR）は細胞表面に存在

図１：作成した Gα変異体の C 末端アミノ酸配列。

する受容体蛋白質の中で最大のファミリーを形成しており、創薬のターゲットとして重要な蛋白質群である。

これらの変異体を用いて GDP/GTP 交換速度の速度

GPCR はそれぞれ固有の刺激に応答するため、哺乳類を解析したところ、Gαの C 末端部は Gαのヌクレオで約 1,000 種類が報告されている。一方、G 蛋白質はチド結合部位から約 30Å離れているにもかかわらず、

数 10 種類程度しか報告されておらず、GPCR による G
蛋白質活性化効率は G 蛋白質の種類に大きく依存する。
そのため GPCR は、それぞれが相互作用するべき G 蛋

GDP/GTP 交換速度に大きく影響することがわかった。
速度論的な解析から、GDP の結合速度（k-1）と GTPの結合速度（k+2）を求めたところ、いずれも C 末端部

白質を認識することができると考えられる。

の変異による影響をうけていた。

刺激を受けた GPCR は、膜貫通ヘリックスの配置が大きく変化してオープンな構造をもつ。GPCR と G 蛋
白質の複合体の結晶構造解析では、G 蛋白質αサブユ
ニット（Gα）の C 末端部のαヘリックスが GPCR と相互作用していることが示されており、GPCR と G 蛋
白質の選択性には、この領域が関与していると考えられる。しかし、GPCR と結合していない G 蛋白質の結図 2：刺激を受容した GPCR（R*）が G 蛋白質を活性化する４つのステップ。
赤線で囲んだ GDP/GTP 交換反応が Gαの C 末端部の影響をうけることがわかった。

晶構造解析では、Gαの C 末端部の構造は得られていない。このように、高い選択性を持つ蛋白質間相互作用において、選択性に関わると考えられる部位の構造が揺らいでいることは、揺らぎが蛋白質間の選択性や光刺激したロドプシンは、G 蛋白質と複合体を形成

相互作用に関与することを示唆する知見である。本研することで活性状態が安定化するが、活性状態の生成究では Gαの C 末端部に変異を加え、G 蛋白質活性化

量と Gi の活性化効率には相関がみられなかった。これにおける C 末端部の役割を検討した。

は、G 蛋白質 C 末端部が単に GPCR との相互作用を担実験には、光刺激で活性化することができる GPCR

うだけでなく、ヌクレオチド結合部位にも影響を及ぼであるウシロドプシンを用いた。ロドプシンと相互作していることを示唆している。このことを確認するた

用する G 蛋白質は視細胞内ではトランスデューシン

め、GPCR と結合していない状態の Gαの自己活性（自（Gt）であるが、Gt は大腸菌を用いた変異体の調製が発的 GDP/GTP 交換反応）を測定したところ、自己活困難であるため、同じグループに属する Gi を用いた。

性も C 末端部の影響を受けることがわかった。

Gi の C 末端部のアミノ酸配列を、ロドプシンによる活本研究は、結晶構造解析で構造が得られない揺らい性化効率が低い Go のものと比較し、配列を入れ替えだ領域のアミノ酸残基が、相互作用する蛋白質の認識た変異体を作成した。

や活性化に深く関与していることを示している。

1

「揺らぎと生体機能」ニュースレター
No. 4126 April, 2012
業績紹介：揺らぎの定理による回転分子モーターのトルク測定
林久美子（東北大学工学研究科・A01 公募研究代表者）

る。ビーズの重心から回転角度θ(t)を計算する。ATP
の濃度が高い場合、タイムコースθ(t)は連続的になるが(図 2 左)、ATP の濃度が低い場合、ATP の待ち時間が論 文 題 目 ： "Measurements of the driving forces of

長いため、θ(t)はステップ状になる(図 2 右)。後者の場

bio-motors using the fluctuation theorem"

合、実際に F1 がトルクを発生している赤い四角中の著者：Kumiko Hayashi, Mizue Tanigawara and Jun-ichi

θ(t)から P(∆θ)を計算する(図 2 右上)。P(∆θ) から、(2)Kishikawa

式の左辺 ln[P(∆θ)/P(-∆θ)]を計算し、∆θ/kBT に対してプ

雑誌巻号：BIOPHYSICS 8, 67-72 (2012)

ロットすると、グラフの傾きがトルク N である。

本研究では、揺らぎの定理を生体モーターの駆動力測定に応用した [1]。生体モーターの運動の揺らぎを利用して非破壊に力を測定する。本論文は(1)コロイド
粒子のシミュレーションを用いた揺らぎの定理の検証(2)揺らぎの定理の導出 (3)生体分子モーターの駆動力測定法 (4) 回転分子モーターF1-ATPase の一分子実験への応用から成り、実験分野でも広く読まれるよう工
図 2

夫してレビューした。

揺らぎの定理を F1 の回転トルク測定へ応用す

る：ATP 高濃度(a)と ATP 低濃度(b)の場合

揺らぎの定理による駆動力測定：熱揺らぎを受けて駆動力 F で一方向に進むリニアモーターに対して（図1 左）、ln[P(∆Χ)/P(-∆Χ)] = F ∆Χ/kBT(1)(2)式は従来の回転トルク測定法と比較して、トルク

ここで、X はカルゴの位置、∆Χ=X(t+∆t)-X(t)、kB はボ

値が回転ビーズの揺らぎから直接求まることが利点でルツマン定数、T は温度、P(∆Χ)は∆Χの分布である。

ある。F1 のトルク発生メカニズムを調べる際、変異型

一方、熱揺らぎを受けてトルク N で一方向に回転すると野生型のトルク比較のために、(2)式が利用された回転モーターに対して（図 1 右）、ln[P(∆θ)/P(-∆θ)] = N ∆θ/kBT[2-3]。また、F1 と類似した回転モーターV1 の研究にお(2)いても、(2)式からトルク値が測定された。近年、揺ら

ここで、θはビーズの回転角度、∆θ=θ (t+∆t)- θ (t)、P(∆θ)

ぎの定理による駆動力測定が回転モーターの一分子計

は∆θの分布である。X(t)やθ(t)のタイムコースを一分子測で定着しつつあるので、他の生体モーターへの応用

実験で測定し、P(∆Χ)と P(∆θ)から F や N を得る。

が期待される。今後、私自身は揺らぎの定理を生細胞

回転モーターF1-ATPase のトルク測定：F1-ATPase (F1)

内のミトコンドリア輸送へ応用する研究を進めたい。

は ATP を加水分解して得たエネルギーで動く回転
モ ー タ ー で あ る 。 F1 が 約 10nm と 小 さ い た め

参考文献

200nm-500nm のビーズを付けて、光学顕微鏡で観察す[1] 林久美子, 生物物理 51 188-189 (2011).
[2] E. Usukura, T. Suzuki, S. Furuike, N. Soga, E. Saita, T.
Hisabori, K. Kinosita Jr and M. Yoshida, J. Biol. Chem.
287, 1885-1891 (2012).
[3] M. Tanigawara, J. Ito, Y. Ito, R. Watanabe, K. Koyasu,
M. Ikeguchi, K. V. Tabata and H. Noji, submitted.

図 1 リニアモーター(左)と回転モーター(右)の模式図

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「揺らぎと生体機能」ニュースレター
No. ４１26 April, 2012
業績紹介：がん細胞膜の揺らぎを標的とするハイブリッドリポソームのがん抑制機構
上岡龍一（崇城大応用生命科学・A03 計画研究代表者）

らかにした。
(Ⅲ) がん細胞膜の流動性と HL の制がん効果との関連性に関し、正常肝臓(Hc)細胞を含む 7 種類の細胞株

論文題目："Selective accumulation and growth inhibition

について、膜流動性(1/P)と HL の制がん効果(1/IC50)とof hybrid liposomes to human hepatocellular carcinomaの間で、良好な相関性が得られた(図 B)。すなわち、“揺cells in relation to fluidity of plasma membranes"

らぎ（流動性）の大きながん細胞ほど、HL のがん抑著者：Yuji Komizu, Hidetsugu Ueoka, Ryuichi Ueoka

制効果が高くなること”が分かった。さらに、HL の雑誌巻号：Biochem. Biophys. Res. Commun., 418, 81-86

融合・蓄積の度合いと膜流動性や制がん効果との間に(2012)

も良好な相関性が得られた。これらの結果より、「膜の揺らぎの大きながん細胞は、流動性の小さな正常細胞

ハイブリッドリポソーム (HL) は、リン脂質とミセルと比べ、HL が融合・蓄積し易く、顕著ながん抑制を

系界面活性剤を緩衝水溶液中で超音波処理することに示した」と考える。今後、in vivo での揺らぎと HL のより調製でき、HL 自身がアポトーシス誘導型の制ががん抑制について検討する予定である。

ん効果を示すこと、その制がん機構として“HL 自身の揺らぎ(流動性)”や“がん細胞膜の揺らぎ”が重要であることを報告している[1]。また、HL がヒト肝臓がん(HepG2)細胞に対して、選択的に融合・蓄積し、アポトーシスを誘導することは明らかとなっていたものの[2]、細胞膜の流動性とがん抑制効果との関連性については不明であった。本論文では、がん細胞膜の揺らぎを標的とした HL のがん抑制機構の一般化を目指し、7 種類の細胞株（正常肝臓、肝臓がん、白血病、
膵臓がん、脳腫瘍、星細胞腫）を用い、細胞膜の流動

B性と HL のがん抑制との関連性について in vitro で検討し、以下に示す新しい知見が得られた。
(Ⅰ) In vitro での細胞増殖抑制試験から、HL (DMPC/
C12(EO)23) は、ヒト肝臓がん(HepG2, HuH-7) 細胞に対して、濃度依存的に細胞増殖を抑制した(図 A)。一方、
正常肝臓細胞 (Hc) に対しては、0-400 µM の濃度範囲において、細胞増殖にほとんど影響を及ぼさなかった。
すなわち、HL の HepG2 および HuH-7 細胞に対する50％細胞増殖抑制濃度 (IC50) は、
Hc 細胞に対する IC50の約 1/4～1/7 であり、HL は、肝臓がん細胞の増殖を

図 がん細胞膜の揺らぎを標的とする HL のがん抑制効果
A: HL の肝臓がん細胞に対する選択的な増殖抑制効果
B: 種々の細胞膜の揺らぎ (流動性) と制がん効果の相関性
肝臓がん HuH-7(●), 肝臓がん HepG-2(▲), 正常肝臓 Hc( ◆ ), 脳 腫 瘍 U251( ○ ), 膵 臓 が ん KP-4( △ ), 白 血 病
MOLT-4(□), 星細胞腫 Marcus(◇) 細胞.
r = 0.85, p < 0.01

選択的に抑制することが分かった。さらに、細胞内カスペース-3 活性の蛍光イメージングにより、HL は、
肝臓がん細胞に対して、
カスペース-3 の活性化を経て、アポトーシスを誘導することを明らかにした。

参考文献[1] R. Ueoka et al., Curr. Pharm. Des. 17, 1709-1719 (2011).
[2] K. Nakano et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 12, 3251-3254(2002).

(Ⅱ) 蛍光脂質含有 HL を用いた全反射顕微鏡による細胞膜への融合・蓄積の蛍光イメージングにより、HL
は、肝臓がん細胞膜選択的に融合・蓄積することを明3

「揺らぎと生体機能」ニュースレター
No. 4126 April, 2012
業績紹介：べん毛のⅢ型分泌装置内の基質認識切り替えタンパク質
FliKのNMR構造解析
楯 真一（広島大理学研究科・A02 公募研究代表者）

FliKC core domainの構造安定性または基質認識切り替
え時に重要な役割を持っていると考えられる。
我々は、Ⅲ型分泌装置内のFlhBのホモログである

論文題目："The NMR Structure of FliK, the Trigger for the

YscUの結晶構造[1]を用いてFliKとの相互作用に重要

Switch of Substrate Specificity in the Flagellar Type Ⅲ

なNPTHループのcleaved, uncleavedモデル構造を作成

Secretion Apparatus"

した。この二つの構造の差異はループが切断されるこ

著者：Shino Mizuno, Hirokazu Amida, Naohiro Kobayashi,とによって、表面に隠れていた塩基性残基が露出されShin-ichi Aizawa and Shin-ichi Tate

る点にある。FliKCと上記のFlhBモデル構造を用いて、

雑誌巻号：J. Mol. Biol. 409, 558-573 (2011)

ドッキングシミュレーションプログラムHADDOCKにより、変異体による活性情報を基にしてFliK:FlhB複合体

多くの細菌は、溶液中でべん毛を動かすことで移動のモデルを構築した（図B）。この結果、FliKCのルーしている。べん毛は基部体、フック、フィラメントのプ2は、FlhBのNPTHループが切断されることでできた

３つの基礎部分から構成されており、細胞内から細胞"basic cleft"に割り込むように立体相補的な相互作外へと伸長していく。基部体とフィラメントをつなぐ用を行っており、NPTHループの切断が基質認識切り替

フックは、長さがFliKタンパク質により約55 nmと制御えに必要であることが示された。
本研究の成果は、べん毛形成において二機能性を示されており、その情報がFlhBに伝わりフックタンパク質からフィラメントタンパク質へと輸送基質が変化す

すタンパク質であるFliKの構造から，その基質認識切る。FliKは、フック長制御と基質認識切り替えの二機り替え機構に関する新たな知見を与えた。

能性タンパク質である。本研究では、NMRを用いてFliK

参考文献の構造決定を行い、基質認識切り替え機構を調べた。

[1] Lountos GT et. al., Protein Sci. 18. 467-74 (2009)

本研究では、S.Typhimurium由来のFliKを用い、タン
パク質限定分解と構造予測ソフトPONDRの情報から
FliKfull、GST-FliKN(1-147)、FliKC(204-370)の３通りの試料を作成した。1H-15N HSQCスペクトルは、FliKfull
では、約70％のアミドプロトンの信号が8.4ppm付近に集中しており、FliKNでも同様に信号の大きな分散が見られなかった。これは、安定な構造を保っていないためと考えられる。一方、FliKCは，よく分散した信号を示した。構造情報を得るために、15N{1H}hetNOE測定を行い、Pro253-Ser355の領域に安定な構造（FliKC core図domain）が存在することを確認し、NMR立体構造決定を

A FliKC core domain の構行った。得られたFliKC core domainの構造は、2本の造

α-へリックスと平行、逆平行それぞれ1組ずつで構成

B HADDOCK による FliKC

されたβ-シートを有している(図A)。その中のβ1-β2間

core domain（黄）と FlhBのループ2は、FliKと同様の機能を持つタンパク質の相の cleaved 構造（ピンク：N

同性検索により、LxPx1x2LGと高く保存されていること

末端ドメイン、緑；C 末端を我々は発見した。このモチーフのx1とx2には酸性アドメイン）の複合体

ミノ酸が入り、FliKCではLHPEELGとなる。また、ループ2内のcis-Pro296も配列解析より保存されており、

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「揺らぎと生体機能」ニュースレター
No. 4126 April, 2012
班友の今西氏が日本薬学会奨励賞を受賞
とって DNA 結合能を発揮するジンクフィンガーを鋳

中野 実（富山大学大学院医学薬学研究部・
A03 公募研究代表者）

型として、新しい DNA 結合特性を有する人工タンパ
ク質をデザインしました。DNA 結合には直接関与し平成 24 年 3 月 28 日（水）から 31 日（土）まで、ないと考えられていたリンカー部分の重要性を示唆し、北海道大学で開催された日本薬学会第１３２年会におまた、亜鉛イオン濃度に応答して構造形成と DNA 結

いて、本新学術領域研究の班友である今西未来氏（京合能をオン・オフできるスイッチ型タンパク質を創製

都大学化学研究所）が、平成２４年度日本薬学会奨励しました。さらに、応用例として、特定のゲノム領域

賞を受賞されました。

を標的とする人工転写因子をデザインし、概日リズム

今西さんの受賞タイトルは「人工 DNA 結合タンパを司る時計遺伝子を制御することに成功しました。構ク質のデザインと細胞機能制御への展開」です。今西造揺らぎを利用した機能制御など、本新学術領域研究

さんは「金属イオン配位能」および「DNA 認識能」の目的に合致した内容も含まれており、今後のさらなの２つの精密な分子認識能を有し、モジュール構造をる研究の展開が期待されます。

平成 24 年度行事のご案内
今年度は下記の会議を予定しております。班員の皆様はご出席下さい。
詳細は別途お知らせいたします。

◆ 平成 24 年度合同班会議
日時：平成 24 年 7 月 29 日（日）午後～8 月 1 日（水）午前
会場：作並温泉 ゆづくし Salon 一の坊◆ 新学術「水を主役とした ATP エネルギー変換」との合同シンポジウム
日時：平成 24 年 9 月 14 日（金）、15 日（土）
会場：大阪ガーデンパレス(予定)◆ 第 6 回公開シンポジウム
日時：平成 24 年 12 月 5 日（水）、6 日（木）
会場：京都テルサ

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