東京衛研年報 Ann. Rep. Tokyo Metr. Res. Lab. P.H., 51, 279-285,2000

マウスを用いた混餌法及び混水法による食用赤色２号の２世代毒性試験
田中豊人＊，高橋省＊，大石眞之＊＊

Reproductive and Neurobehavioural Toxicity Studies of Amaranth Administered to Mice in theDiet or in Drinking Water.
TOYOHITO TANAKA＊, OSAMU TAKAHASHI＊, SHINSHI OISHI＊
The colour additive amaranth was given in the diet at levels of 0 (control), 0.03, 0.09, and 0.27 %, or indrinking water at levels of 0 (control), 0.025, 0.075, and 0.225 % from 5 weeks of age in the F0 generation until
weaning of the F1 generation to mice, and selected reproductive and neurobehavioural parameters weremeasured. Amaranth produced few adverse effects on either litter size or litter weight and sex ratio at birth.
There were no significant adverse effects of amaranth on the average offspring weight during the lactation
period. In neurobehavioural parameters, swimming direction on postnatal day (PND) 4 and olfactory
orientation on PND 14 were significantly affected in male and female offspring in a dose-related manner in thediet study. In drinking water study, swimming head angle on PND 4 and olfactory orientation on PND 14 weresignificantly affected in both male and female offspring in a dose-related manner. The dose levels of amaranthin these studies produced some adverse effects on neurobehavioural parameters in mice.

Keywords：食用赤色２号 Food Red No.2, アマランス amaranth, 生殖毒性 reproductive toxicity, 行動発達
behavioural development, マウス mice
緒言いる．さらに，食用赤色２号は３世代試験においてラッ合成色素trisodium salt of 3-hydroxy-4 [4(sulfo-1-トの繁殖 5)及び発生 6)に影響がないことが報告されていnaphtalenyl)azo]- 2,7- naphthalenedisulfonic acid は一般る．また，食用赤色２号の発生毒性に関しては，マウス7)

名をアマランスamaranthといい，日本では食用赤色２及びラットとウサギ8)について催奇形性が認められない号の名で食品添加物の食用色素として広く用いられていことが報告されている．

る．また，食用赤色２号は赤褐色の水溶性の粒または粉

しかしながら，マウスを用いた混餌法9)及び混水法10)に末で，食品以外にも医薬品や化粧品の着色料としても使よる２世代試験で，食用赤色２号が行動の発達に影響を用が認められている．食用赤色２号の日本における標準及ぼすことが認められている．そこで，今回はこれらの的な使用レベルは，食品に対して５〜100ppmであり，２つの試験の詳細について報告する．

WHOが定める１日当たりの許容摂取量（ADI）は体重
1)

材料と方法
試料：食用赤色２号は食品添加物用の製品を東京化成

１o当たり0〜0.5mgになっている ．
食用赤色２号の毒性に関しては、ラットの子宮内での工業1より購入し，その純度は85％以上であった．また，投与が出産後の長期飼育において癌原性を喚起しないこ

ロット番号は混餌法で使用したものはAY01，混水法で2)とが報告されている ．また，食用赤色２号はマウスに3)使用したものはAX01であった．

おいて優性致死的変異を引き起こさず ，ラットにおい動物と飼育条件：マウスは，日本チャールス・リバーて胚仔毒性及び胎仔毒性を示さないこと4)が報告されて1のCrj：CD-1（ICR）の雌雄を４週齢で購入し，一般＊ ＊ 東京都立衛生研究所毒性部薬理研究科

169-0073

東京都新宿区百人町３−24−１＊ ＊ The Tokyo Metropolitan Research Laboratory of Public Health＊ ＊ ３−24−１, Hyakunincho, Shinjuku-ku, Tokyo, 169-0073 Japan280

Ann. Rep. Tokyo Metr. Res. Lab. P.H., 51, 2000

状態の良好なマウスを実験に供した．マウスは温度24±４．遊泳試験

仔マウスを水を張った水槽に置き，水１℃・相対湿度55±５％に調節された飼育室でプラスチ泳能力を観察した．方向：直進d，回転s，浮遊a．頭ックケージで１匹ずつ飼育した．混餌法においては，給水

角度：耳が全部水面上f，耳が半分水面上d，鼻と頭頂瓶によってフィルターを通した水道水と標準飼料（日本部が水面上s，頭部を水面上に維持不能a．四肢の動クレアCE-2）に食用赤色２号を混入した実験飼料を，混水

き：四肢全てを使うa，後肢のみs．

法においては，フィルターを通した水道水に食用赤色２５．嗅覚性指向反応

仔マウスを２つの部屋を通路で号を溶解させた実験飲料水と標準飼料を自由摂取させた．

つないだ装置の通路部分に置き，行動を観察した．一方

実験計画：混餌法試験においては，食用赤色２号を１の部屋には仔マウスのいたケージの床敷を入れ，もう一群雌雄各10匹ずつ0.03，0.09，0.27％の濃度で５週齢よ方には新しい床敷を入れた．仔マウスのいた床敷のあるり投与を開始した．混水法においては，食用赤色２号を部屋に入るまでの時間を測定した．90秒以上;，90秒未

１群雌雄各10匹ずつ0.025，0.075，0.225％の濃度で５週満で新しい床敷の部屋経由a，90秒未満で直行s．

齢より投与を開始した．各実験とも対照群として，雌雄各10匹ずつ実験期間中に標準飼料とフィルターを通した統計解析：出生時の性比・授乳期間中の生存率及び行動発達のデータは χ 2検定により解析し，その他のデー水道水を供した．各マウスについて混餌法では摂餌量を，タは一元配置分散分析またはKruskal-Wallisの順位の分混水法では摂水量を，交配前期（30日間，５週齢から交散分析を行った後に，Bonferroniの多重比較検定により配まで），交配期（５日間），妊娠期（14日間），授乳期解析した．用量反応効果の検定には，Jonckheereの順位の傾向検定または頻度の傾向検定である累積 χ 2検定を（28日間，出産から離乳まで）の４期に分けて測定した．
繁殖試験：マウスは交配前に実験開始日（５週齢）を用いた．
結０日として，０，２，４，７，14，21，28，30日目に体重を測定した．９週齢時に同じ処置群の雌雄を各１匹ず

果

１．混餌法試験つ５日間同居交配させ，５日後に雌雄を分離した．交配

飼料及び薬物摂取量：Table 1に実験期間中の飼料摂後，妊娠した雌は自然分娩させ，その仔を授乳させた．

取量を示した．雌の交配前期を除いて食用赤色２号によ新生仔については，その出生時に産仔数・１腹仔の重ると思われる影響は見られなかった．交配前期に雌の平さ・性比を測定した．仔マウスは出生時を0日齢として，均摂餌量が低濃度投与群で有意に増加した．したがって，０，４，７，14，21日齢時に仔体重を１匹ずつ測定した．

食用赤色２号の摂取量は各時期において用量依存的に増４週齢時に仔マウスを母マウスから離乳させた．

加し，摂取量の逆転は見られなかった．

行動試験：仔マウスの機能と行動発達に関するテスト

親マウスへの影響：交配前期における雌雄マウスの平を授乳期間中に行った．測定項目は，正向反射（４，７均体重の推移には，食用赤色２号の投与による影響は見11-12)

日齢時）

11-13)，断崖回避られなかった．また，妊娠期及び授乳期における母マウ（７日齢時） ，遊泳テスト［方向・頭角度・四肢の動スの平均体重の推移にも，投与によると思われる影響は，背地走性（４，７日齢時）
11-13)

11-12)

13-15)

き］（４，14日齢時） ，嗅覚性指向反応（14日齢時）認められなかった．出産時に対照群の母マウス１匹が，であり，各パラメーターは下記に示すカテゴリー分類に新生仔マウスをすべて食殺した．また，対照群１匹，中よる得点法［（濃度投与群２匹，低・高濃度投与群各３匹の計９匹の母）内がスコア］により，その発現頻度16)マウスが，授乳期の第１週に乳腺の発達不良を示した．

を分析した ．
仔マウスの背部をなめらかな平面につ仔マウスへの影響：Table 2に出生時の産仔数・一腹け，起きあがるまでの時間を測定した．１秒未満s，１仔の重さ及び性比を示した．いずれも食用赤色２号の投秒以上２秒未満a，２秒以上;．

与によると思われる影響は見られなかった．また，Fig.

１．正向反射２．背地走性仔マウスを30°の傾斜面に頭部を下に１に示すように授乳期間中の平均仔体重の推移にも投与して置き，頭部を上に向けるまでの時間を測定した．30によると思われる影響は認められなかった．授乳期の第秒未満s，30秒以上60秒未満a，60秒以上;．

１週に，対照群及び中濃度投与群各１腹仔・低濃度投与

３．断崖回避仔マウスをプラットホームの縁に前肢群２腹仔・高濃度投与群３腹仔の計７腹仔が母マウスのと鼻を外に出すように置き，断崖を回避するまでの時間乳腺の発達不良が原因で全滅した．Table 3に示したよを測定した．20秒以上;，20秒未満で後退により回避a，うに死亡した腹仔を除いて計算した生存率は，低濃度投20秒未満で回転により回避s．

与群の雌で有意に低下した．

東Table 1.

京衛

研

年報51,281

2000

Average Daily Food and Chemical Intake of Mice Administered Amaranth in the Diet in Two-generation
Toxicity Study.
Dose Level (%)

Food intake (n/o/day)pre-conception
malefemalematinggestationlactation
Chemical intake (m/o/day)pre-conception
malefemalematinggestationlactation

00.03

0.09

0.27

167.0±06.71
196.7±13.52
141.9±17.72
149.7±11.27
619.3±59.16

167.9±10.450
232.4±33.00*
154.0±07.160
164.9±18.020
614.4±82.390

168.6±09.56
217.6±24.56
150.6±22.82
157.7±18.29
654.2±86.19

0168.5±008.81
0220.8±030.70
0152.9±017.41
0163.6±031.24
0581.6±145.06

−
−−
−
−

050.4±03.130069.7±09.900
046.2±02.150
049.5±05.410
184.3±24.720

151.7±08.61
195.9±22.11
135.6±20.53
142.0±16.46
588.8±77.57

0455.0±023.79
0596.1±082.90
0412.8±046.99
0441.8±084.35
1570.3±391.56

Each value represents daily intake during each period (mean±SD). Significantly different from controls: *P<0.05.

Table 2. Summary of Data of Litters at Birth in Two-generation Toxicity Study of Amaranth Administered toMice in the Diet.

No. of females examined
No. of pregnant females
No. of litters
No. of offspring
Average litter size
Average litter weight (n)Sex ratio (male/female)

0010
010
009
109
12.10±0.93
18.96±1.23
0.91 (52/57)

Dose Level (%)
0.03
0.09010
010
010
009
010
009
124
109
12.40±2.8012.10±2.67
19.12±3.79
18.68±3.50
0.88 (58/66)
0.98 (54/55)

0.27
1010109709.70±2.1214.95±6.33
0.76 (42/55)

Each value represents the mean±SD.

Fig.1 Average body weight of offspring during the lactation period in two-generation toxicity study of amaranthadministered to mice in the diet. Each value represents the mean±SD.

仔マウスの行動発達のテストの結果をFig. 2に示した．
7日齢の正向反射が雌雄ともに投与群で有意に抑制され，なかった．
２．混水法試験

その影響は用量依存的であった（雌雄ともP<0.01）．４

飲料水及び薬物摂取量：Table 4に実験期間中の飲料

日齢の遊泳試験では，方向が雌雄ともに投与群で有意に水摂取量を示した．全期間を通じて食用赤色２号の投与抑制され，その影響は用量依存的であった（雄P<0.001，によると思われる影響は見られなかった．したがって，雌P<0.01）．14日齢の嗅覚性指向反応は，雌雄ともに各食用赤色２号の摂取量は各時期において用量依存的に増投与群で有意に抑制され，これらの影響は用量依存的で加した．

あった（雄P<0.001，雌P<0.05）．その他の測定項目に親マウスへの影響：交配前期における雌雄マウスの平は，食用赤色２号の投与によると思われる影響は見られ

均体重の推移には，食用赤色２号の投与による影響は見282

Ann. Rep. Tokyo Metr. Res. Lab. P.H., 51, 2000

Table 3. Summary of Number of Offspring and Survival Index (%) during the Lactation Period in Two-generation
Toxicity Study of Amaranth Administered to Mice in the Diet.
Dose Level (%)
Male offspring
PND000
PND004
PND007
PND014
PND021
Female offspring
PND000
PND004
PND007
PND014
PND021

00.03

0.09

0.2752（100.0）45（100.0）45（100.0）45（100.0）45（100.0）58（100.0）*49（092.5）*48（090.6）*47（095.9）*47（095.9）*54（100.0）44（097.8）44（097.8）44（097.8）44（097.8）42（100.0）32（100.0）32（100.0）32（100.0）32（100.0）57（100.0）53（100.0）53（100.0）53（100.0）53（100.0）66（100.0）*48（092.3）*
48（092.3）*
48（092.3）*
48（092.3）*55（100.0）49（100.0）49（100.0）49（100.0）49（100.0）55（100.0）39（097.5）39（097.5）39（097.5）39（097.5）

Each value represents number of offspring; survival index in parentheses. Significantly different from controls: *P<0.05.
Survival index is calculated with exception of litters that died.

Fig.2 Score frequencies of behavioural development in the lactation period in two-generation toxicity study of amaranthadministered to mice in the diet. Significantly different from controls: *P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001.

られなかった．また，妊娠期及び授乳期における母マウ期間中に，対照群１匹，低・高濃度投与群各２匹の計５スの平均体重の推移にも，投与によると思われる影響は匹の母マウスが乳腺の発達不良を示した．

認められなかった．対照群１匹，低濃度投与群２匹の計

仔マウスへの影響：Table 5に出生時の産仔数・一腹３匹の母マウスが授乳期の第１週に死亡した．また，授仔の重さ及び性比を示した．いずれも食用赤色２号の投乳期の第２週に対照群の母マウス１匹が死亡した．授乳与によると思われる影響は見られなかった．また，Fig.

東Table 4.

京衛

研

年報51,

283

2000

Average Daily Fluid and Chemical Intake of Mice Administered Amaranth in Drinking Water in
Two-generation Toxicity Study.
Dose Level (%)

Fluid intake (n/o/day)pre-conception
malefemalematinggestationlactation
Chemical intake (m/o/day)pre-conception
malefemalematinggestationlactation

00.025

0.075

0.225

245.6± 17.86
297.0 ± 21.48
225.4 ± 21.18
207.0 ± 19.83
878.0 ± 123.52

236.3±041.19
311.2±040.01
230.7±030.92
217.5±019.55
721.5±232.35

234.6±017.09
293.2±030.65
215.7±023.87
198.0±021.61
961.2±137.37

0241.7±027.35
0299.6±032.06
0216.7±033.62
0220.2±027.42
0759.6±162.52

−
−
−
−
−

059.1±10.30
077.8±10.00
057.7±07.73
054.4±04.89
180.4±58.09

175.0±012.82
219.9±022.99
161.7±017.90
148.5±016.20
720.9±103.03

0543.7±061.54
0674.0±072.14
0487.7±075.65
0495.4±061.70
1709.1±365.67

Each value represents daily intake during each period (mean±SD).

３に示したように授乳期間中の平均仔体重の推移は，低濃度投与群で雌雄ともに有意に増加したが，他の投与群では対照群との差は見られなかった．授乳期間中に母マウスが死亡した4腹仔は，餓死を避けるために安楽死させた．また，授乳期の第２週に，高濃度投与群の１腹仔が，母マウスの乳腺の発達不良が原因で全滅した．
Table 6に示したように死亡した腹仔を除いて計算した生存率は低濃度投与群の雌で有意に低下した．
仔マウスの行動発達のテストの結果をFig. 4 に示した．４日齢の正向反射が雌の中濃度投与群で有意に抑制され，その影響は用量依存的であった（P<0.05）．４日齢の遊泳試験では，頭角度が中・高濃度投与群で雌雄ともに有意に抑制され，その影響は用量依存的であった（雌雄ともP<0.01）．また，14日齢の遊泳試験の四肢の動きが，中・高濃度投与群の雄で有意に抑制され，その影響は用量依存的であった（P<0.05）．14日齢の嗅覚性指向反応は，雌雄ともに各投与群で有意に抑制され，これらの影響は用量依存的であった（雄P<0.05，雌P<0.001）．その他の測定項目には，食用赤色２号の投与によると思われる影響は見られなかった．また，４日齢時に高濃度投与群で不自然な動きをし，姿勢を維持できない雄の仔マウスが１匹見つかった．
考察

これらの試験において，食用赤色２号の投与によりマウスの行動発達のいくつかの項目が有意に抑制的な影響を示した．混餌法試験において仔マウスの体重は全群でほぼ同様であり，母マウスの摂餌量が各群ほぼ同量なことから，仔マウスの栄養状態は各群で差が見られなかっ

Fig.3

Average body weight of offspring during thelactation period in two-generation toxicity studyof amaranth administered to mice in drinking
water. Each valus represents the mean±SD.
Significantly different from controls: **P＜0.01.

284

Ann. Rep. Tokyo Metr. Res. Lab. P.H., 51, 2000

Table 5.

Summary of Data of Litters at Birth in Two-generation Toxicity Study of Amaranth Administered toMice in Drinking Water.

0
No. of females examined010
No. of pregnant females010
No. of litters010
No. of offspring
126
Average litter size
12.60±1.78
Average litter weight (n)20.09±3.33
Sex ratio (male/female)
1.17（68/58）
Each value represents the mean±SD.

Dose Level (%)
0.025
0.075
10010
09010
09010
91
134
10.10±3.82
13.40±2.32
16.20±5.44
20.83±3.031.12（48/43）
1.16（72/62）

0.225
010
010010105
10.05±3.63
17.22±4.971.56（64/41）

Table 6. Summary of Number of Offspring and Survival Index (%) during the Lactation Period in Two-generation
Toxicity Study of Amaranth Administered to Mice in Drinking Water.
Dose Level (%)
Male offspring
PND000
PND004
PND007
PND014
PND021
Female offspring
PND000
PND004
PND007
PND014
PND021

0

0.025

0.075

0.225

68（100.0）66（097.1）
66（097.1）
60（096.8）
53（096.4）48（100.0）**45（093.8）**42（093.3）**
31（091.2）**30（088.2）**

72（100.0）70（097.2）
70（097.2）
70（097.2）
61（093.8）42（100.0）32（100.0）32（100.0）32（100.0）32（100.0）58（100.0）57（098.3）
57（098.3）
49（098.0）41（091.1）43（100.0）**37（086.0）**37（086.0）**22（075.9）**21（072.4）**

62（100.0）60（096.8）
60（096.8）
59（095.2）
53（094.6）41（100.0）41（100.0）36（100.0）36（100.0）31（086.1）

Each value represents number of offspring ; survival index in parentheses. Significantly different from controls : ＊P<0.05,＊＊

P<0.01.

Survival index is calculated with exception of litters that died.

Fig.4

Score frequencies of behavioural development in the lactation period in two-generation toxicity study ofamaranth administered to mice in drinking water. Significantly different from controls: ＊P＜0.05, ＊＊P＜0.01,***P＜0.001

東京衛研たものと思われる．混水法試験ではむしろ投与群で体重が増加する傾向が見られたが，授乳期間中の仔マウスの生存率が低濃度投与群で低下していることから，仔体重が増加しているのは一腹仔数の減少による栄養状態の差

年報51,2000285２）Clode, S. A., Hooson, J., Grant, D., et al. : Food Chem.
Toxicol., 25, 937-946, 1987.
３）Arnold, D. W., Kennedy, G. L. Jr., Keplinger, M. L.,
et al.:Food Cosmet. Toxicol., 14, 163-165, 1976.
４）Khera, K. S., Przybylski, W., McKinley, W. P. : Foodによるものと思われる．
しかしながら両試験において，食用赤色２号の投与群の行動発達のいくつかの項目が抑制される傾向を示した．運動協調性の発達を表す正向反射と遊泳試験の方向，さらに平衡感覚の発達を表す遊泳試験の頭角度が投与群で有意に抑制された．また，嗅覚性指向反応が投与群でCosmet. Toxocol., 12, 507-510, 1974.
５）Collins, T. F. X., Keeler, H. V., Black, T. N., et al. :Toxicology, 3, 115-128, 1975.
６）Collins, T. F. X., Black, T. N., Ruggles, D. I. :Toxicology, 3, 129-140, 1975.

用量依存的に抑制されたことから，食用赤色２号は嗅覚

７）Larsson, K. S. : Toxicology, 4, 75-82, 1975.の発達に影響を与えることが示唆された．投与群の仔マ８）Keplinger, M. L., Wright, P. L., Plank, J. B., et al. :ウスの栄養状態に大きな差がないことから，これらの行Toxicol. Appl. Pharmacol., 28, 209-215, 1974.

動発達に対する抑制的な影響は食用赤色２号の投与によ９）Tanaka, T. : Toxicol. Lett., 60, 315-324, 1992.

るものと思われる．

10）Tanaka, T. : Toxicol. Ind. Health, 9, 1027-1035, 1993.

以上の結果から，上記の試験に用いられた用量の食用赤色２号は，仔マウスの行動発達に対しては抑制的に影響することが確認された．しかし，日本における食用赤色２号の推定摂取量は，大人１人当たり23μgと報告さ17)れており ，食用赤色２号のADI値に較べてもはるかに少ない．したがって，食用赤色２号の実際の摂取量ではほとんど人体に影響を及ぼさないことが推察された．
文献11）Fox, W. M. : Anim. Behav., 13, 234-241, 1965.
12）Pantaleoni, G., Fanini, D., Sponta, A. M., et al. :Fundam. Appl. Toxicol., 11, 440-449, 1988.
13）Altman, J., Sudarshan, K. : Anim. Behav., 23, 896920, 1975.
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