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原生動物学雑誌 第34巻 2001年

β-チューブリン遺伝子系統樹から推測される原生動物としての中生動物
ニハイチュウ○能登 朋子（金沢大・理・生物）［目的］二胚虫類は主に頭足類の腎臓に寄生し，単純な体制をもった多細胞生物である．倍数性の核をもつ長く大きな軸細胞と，それを取り囲む繊毛を備えた体皮細胞から成る．二胚虫類は古くから系統進
化上，原生動物と後生動物をつなぐ生物として，中生動物門に分類されきた．しかし，その系統上の位置については，三胚葉性動物からの寄生退化型であるとする説もある．5SrRNAによる分子系統樹は前者を， 18SrRNAによる分子系統樹は後者を支持しており，現在も論争が続いている．そこで，二胚虫類と他の原生生物，後生生物との系統関係をさらに探る
ため，新たにタンパク質をコードする遺伝子の一つとしてβ-チューブリン遺伝子のクローニングを試みた．
［方法］二胚虫 Dicyema sp. はマダコの腎臓表面から採取した．原生生物から線形動物の間で保存性の高い
共通配列部分をもとに作製したプライマーを用い，Total DNAからPCRによりβ-チューブリン遺伝子を増幅し，塩基配列を決定した．
［結果および考察］ PCRにより，二胚虫のTotal DNA
から約1.2 kbのβチューブリン遺伝子と相同性をもつ
DNA断片が増幅され，このクローンが二胚虫由来であることをSouthern hybridizationと一個体からのPCRを行って確認した．
決定した塩基配列をもとにしたアミノ酸配列から近隣結合法により分子系統樹を作成したところ，系統樹は大きく原生動物，菌類，後生動物の３つの枝に分かれ，二胚虫は原生動物群内に分岐した（Fig.1）．原生 動 物 群 内 に お け る 二 胚 虫 の 位 置 に つ い て は，bootstrap値が低いため明確ではないが，少なくともβチューブリン遺伝子系統樹は，二胚虫類は後生動物ではなく原生動物群に属し，後生動物とは別に，独立して繊毛虫や鞭毛虫等の原生動物が多細胞化した多細胞性原生動物であるという可能性を示唆している．
これまで中生動物二胚虫をより原始的な生物としてとらえ位置付けてきた中には，ミトコンドリアクリス
テの形状，繊毛ネックレス等の原生動物との共通性か
ら，中生動物を原生動物界の中の一つの門であるとする見方や，電子顕微鏡による研究から，二胚虫類は海綿よりも原始的な細胞外マトリックスをもつという報告がある．今後は，二胚虫類の軸細胞に観られる倍数性核のような，核分化機構という観点から二胚虫類の系統関係について更に検討していきたいと考えている．
［文献］
Cavalier-Smith, T. (1993) Amer. Micros. Soc. 57, 953-994.
Czaker R. (2000) Anat. Rec. 1; 259(1): 52-9.
Hori, H. and Osawa, S. (1987) Mol. Biol. Evol. 4, 455-472.
Katayama, T., Wada, H., Furuya, H., Sato, N. and Yamamoto,M. (1995) Biol. Bull. 189, 81-90.
Kobayashi, M. , Furuya, H. and Holland, W. (1999) Nature
401, 762.
Lapan, A. E. and Morowitz, H. (1972) Sci. Am. 227, 94-101.

Fig. 1 近隣結合法によるβ‑チューブリンの分子系統樹

Dicyemid mesozoan as a multicellular protozoan suggested by β-tubulin gene phylogeny.
By Tomoko NOTO (Dept. Biol., Fac. Sci., Kanazawa Univ.)Jpn. J. Protozool. Vol. 34, No. 1. (2001)19

２ 繊毛虫の分類研究○前田 昌調（国際農林水産業研究センター 水産部）

海洋、淡水域に広くまた多く分布する繊毛虫少毛

このような状況において繊毛虫分類学の評価を行類の分類レビューはこれまで詳細には行われていう場合には、文献の網羅、整理作業を基盤とした該当ず、生態研究における問題点の一つとなっていた。

種の所属する分類グループ全体の正確なレビューの今回このグループに属すると考えられる種につい有無が基準となる。対象個体の分類基準となる標本作て、すべての原著論文を検討し日本産海洋プランク

製が困難な状況においては、文献レビュー作業によりトン検索図説（東海大出版）および日本淡水プラン

分類グループの全体像を明らかにした上で当該種のクトン検索図説（同）に記載したので、概要につい分類上の位置を検討しなければならない。

て報告する。また原生動物分類研究の問題点と今後の方向についても考察する。

原生動物分類での新種記載の問題点には、生態研究者による安易な種の記載および、分類レビューの不備

本研究において少毛類は、Order Oligotrichida,
Suborder Oligotrichinaのもと3 Families の構成とにもかかわらず、系統学的知見を基準にして分類ス
キームを改訂する例があげられる。

し、この構成はCorliss (1979) のスキームとほぼ同一

今後の原生動物分類学の方向としては、これまでのとなった。しかしSmall & Lynn (1985) は、あらたに記載種の分類位置の再検討作業を継続して行っていOrder Choreotrichida を新設し、少毛類と有鐘類とをくことが必要と思われる。この中では文献収集、整理、同一グループに配置した。一方Petz (1999) はこのレビューが大半の作業となるため、豊富な文献を収

Small & Lynn (1985)の分類再検討は不必要としてい集、保存するヨーロッパ等の自然史博物館との連携にる。

より研究効率は向上する。また、現在世界的に分類学

記載種（synonymsを含む）の年代別数および関連すの軽視、衰退傾向のあるなかで、博物館の文献保存・

Halteriidae 及 び

収集作業にも混乱が生じてきているので、これに対す

る 記 載 論 文 数 は、Families

Strobilidiidae 2グループ全体では1600年代：それぞる国際的対応も必要と考える。

れ0 %、0.5 %；1700年代：2、1.5；1800年代：28、16；
1900〜1945年：45、23；1946年以降：24、60 であった。またFamily Strombididae グループでは1600年
代：それぞれ0 %、0 %；1700年代：0、1；1800年代：
11、41；1900〜1945年：75、28；1946年以降：14、39 である。このように第２次大戦以前に記載された種が多い。
原生動物の分類には、種数が多い（繊毛虫では8,000
種以上が記載され、その数倍の分類不明種があると言われている）、培養の難しい種が多い、標本の作製が困難である等の問題点ある。これらの解決すべき課題にたいしては映像機器の使用、分子生物学的手法開発
とともに文献による分類整理等の対応が考えられる。
特に、繊毛虫は固定剤の使用によりその大半が原型をとどめないほどに変形あるいは破壊されるため、分類は主として原著論文を基準とすることになる。

Taxonomy of ciliates.
By Masachika MAEDA (International Research Center for Agricultural Sciences)

原生動物学雑誌 第34巻 2001年

20

３

SSrRNA遺伝子塩基配列を基にした繊毛虫ツリガネムシの系統遺伝学的関係○板橋 岳志1、見上 一幸2、浅井 博1（1早大・理工・物理、2宮城教育大・環境研）[目的] 確固たる培養法の確立されていないツリガネ

SSrRNA遺伝子塩基配列及びVorticella convallaria

ムシについての研究は、野外から採取された細胞を（AF070700）として登録されているデータをアライ

直接実験に持ち込む場合が多い。近年、ツリガネム

メントして比較すると、Tetrahymenaの異種間ＳＳｒ

シの収縮器官スパズモネームを構成するＣａ２＋結合ＲＮＡ遺伝子塩基配列のアライメントした結果以上

タンパク質スパズミンの分子レベルからの解析が始に変異が存在した。形態的に同種とされるVorticella

まっているが、形態的に似ているかどうかで種の同convallariaにおいて、形態的変異と同様に、SSｒ

定を行っているため、同種かどうかの判定が難し

RNA遺伝子塩基配列にも変異がある（Table 1）。以く、分子レベルでの違いを同一種内のものとするか

上により、Vorticella属の分類は、考えられていたよ

どうかの判断が困難な状況にある。似ている種におりも複雑であると推測され、形態的に似ている

いても、形態的変異が存在しているため、本研究でVorticella convallaria種内のSSｒRNA遺伝子塩基配列

はその変異を、SSｒRNA遺伝子塩基配列を比較するの変異が激しいことから、スパズミン遺伝子においことによって検討し、今後きちんとした種についてても、同種、異種間で多少の変異があることが示唆のスパズミン研究成果を出していこうとするためのされる。

ものである。
V .c .strain

94%
2%

92%
4%

V .c .
(AF070700)
89%
3%

1047
33

1086
0

94%
3%

89%
2%

USA

1033
49

1049
36

1092
0

88%
3%

V .c .
(AF070700)

992
39

989
24

978
36

1088
0

[方法]本実験には、Vorticella convallaria strain USA、V.
convallaria strain China、V.convallaria strain Japan、Carchesium polypinum strain MiyagiとEpistylis sp. strain
Miyagiを培養して用いた。これらのゲノムDNAを、繊毛虫のSSｒRNA遺伝子塩基配列に特異的なプライマーによりPCR法によって増幅し、ダイレクトシーク
エンシングした。得られた塩基配列を用いて、他繊毛虫の既知のデータとともにDNA Data Bank of Japan

V .c .strain
China

V .c .strain
Japan

V .c .strain

China
1089
0

V .c .strain

V .c .strain

Japan

USA

(DDBJ; Mishima, Japan)のWWWサーバーのCLUSTAL
Wでアライメントを行い、明確にアライメントされた領域のみでPUZZLE ver. 4.0.2 (Maximum likelihood
method: Strimmer and von Haeseler 1999)を用いて系統

Table 1 Similarity values for all pairs of aligned SSrRNA
gene sequences
上段：相同塩基数、相同塩基率(%)
下段：Ｇａｐ数、Ｇａｐ率(%)

樹を作成した。
[結果および考察]野外から採集されたツリガネムシの遺伝子実験は、バクテリアなどの影響が原因で困難とされていた。その上、ツリガネムシは付着細胞のため多くの細胞を効率良く回収することが難しかった。今回、培養法を工夫することによって遊泳形態の状態で以前よりも量、効率共に良く獲得できるようになり、他の原生動物の場合と同様の方法が適用できるようになった。
本実験でVorticella convallariaの部分的に決定した
Phylogenetic relationships of the vorticellid ciliates based on small subunit rRNA gene sequences
By Takeshi ITABASHI1, Kazuyuki MIKAMI2 and Hiroshi ASAI1(1Dept. of Physics, School of Science and Engineering, Waseda Univ., 2EEC, Miyagi Univ. of Edu.)

Jpn. J. Protozool. Vol. 34, No. 1. (2001)

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hsp70 配列から推測されるParamecium 属の系統関係○堀 学, 富川 泉, 藤島 政博（山口大・理・生物）［目的］ Paramecium属は、世界中の淡水〜汽水域に生息する繊毛虫類である。これまでに、1属25種以上が同 定 さ れ て お り、外 部 形 態 の 特 徴 か ら、
bursaria”と“aurelia”の2グループに分類されている。
ところが、個々の種を同定するための指標は、大小核の形態や数など判別し難いものも多く、各々の種の系
統的な位置関係を調べるとともに、種を明確に判別できる指標が必要とされている。
そこで、国内外で保存されていた標準株と採集株を用 い て、cytosol 型 hsp70 遺 伝 子 の 部 分 配 列 か ら
Paramecium属の分子系統樹を作成し、個々の系統関係の解析を試みた。
［材料と方法］ 細胞は、P. aurelia complex 7種を含む、16種23系統とT. thermophilaを用いた。 hsp70遺伝
子の解析は、cytosol型 hsp70遺伝子の5’ 末端側で比較的保存性の高い領域（428bp）を特異的に増幅する
primerを作成し、whole cellsから直接PCRによって増幅した。 得られたPCR産物は、T/A plasmid vectorにク
ローニングし、塩基配列を決定した。 分子系統樹の作成には、最尤法による分子系統樹推定プログラム
MOLPHYを用いた。
［結果及び考察］ 16種のparameciumから、鎖長428bpのcytosol型 hsp70遺伝子断片が増幅できた。得られた塩基配列から系統樹を作成した結果、形態的グループ
であるbursariaとaureliaの2グループに大きく分岐した（下図）。
“aurelia” グループにおいては、更に、形態的特徴が近似したP. aurelia comlexとP. jenningsiのグループ、P.
caudatumとP. multimicronucleatumのグループの2つに分岐した。 P. aurelia complexは、acid phosphataseのisozyme patternを用いてAllenらが作成した系統樹を反映する分岐を示した1)。 又、P. jenningsiは、P. aurelia
comlex の中に含まれる結果となったが、Nannyら2)、Studer-Kypke3) らによって作成された系統樹でも同様の結果が得られており、P. aurelia complexより派生した可能性を示している。 一方、P. multimicronucleatumとP. caudatumは、極めて密接な集団と成り、特に、P.
caudatumのsyngen間の進化距離は、ほとんどない事を示した。
“bursaria” グループにおいては、形態的に識別困難
なP. nephridiatumとP. polycaryumが、1つの集団となったが、その他の種については、各々が互いに独立した系統関係を示した。又、このグループ内では、順番に細胞のサイズが小さな種へと分岐していく傾向がみ
られた。
［文献］
1) Allen, S. et al., (1983) J. Protozool. 30, 143-147.
2) Nanny m D. et al., (1998) J. Euk. Microbiol. 45, 91-100.
3) Struder-Kypke, M. et al., (2000) J. Euk. Microbiol. 47,
419-429.

Analysis of phylogenetic relationships of the genus Paramecium using hsp70 sequences.
By Manabu HORI, Izumi TOMIKAWA and Masahiro FUJISHIMA (Dept. of Biol., Fac. of Sci., Yamaguchi Univ.)

22

原生動物学雑誌 第34巻 2001年

５

ヒトから分離されたブラストシスチス株間の遺伝子多型の解析○北野 祥子，吉川 尚男（奈良女子大・理・生物）［目的］ブラストシスチス（Blastocystis）は動物の消の塩基配列を調べ、コンピューター解析により対象株

化管内に寄生している、嫌気的な原生動物の一種とさの遺伝子型のブラストシスチスに特異的な遺伝子プれており、Brumptにより1912年にヒトの消化管内からライマーを設計した1), 2)。このように設計された７種見いだされて以来、この生物に対する様々な研究がな

類のプライマーは、４種類の遺伝子型のサブタイプ分

されてきている。これまでにホ乳類、鳥類、ハ虫類、 けを可能とし、1999年にヒトから分離した１０株を対両生類、昆虫類の多様な宿主から発見され、分離・株

象に、サブタイプ分けを試みた。

化されてきている。しかし、形態的特徴からこれらの［結果及び考察］４つのサブタイプに分けることがで株を区別・分類することが困難である。これまで血清

きる、７種類の特異的遺伝子プライマーを用いて、大型、抗原性、最適生育温度などの比較によって分離株

阪市内の病院から得られた４９８検体からブラスト

間に相違があることが知られている。また、分子生物

シスチスが分離・株化できた１０株を調べた結果、サ学的手法による、イソ酵素パターン解析や制限酵素切ブ タ イ プ ３ を 分 類 す る 特 異 的 プ ラ イ マ ー SB227,

断断片による解析(RFLP)などで、分離株間に著しい遺SB228, SB229で５株(HJ99-1, -4, -7, -8, -10)が増幅され伝子多型が示されている。そこで、種々のブラストシ

た。同様に、サブタイプ１を分類するSB82, SB83で２

スチス分離株間を簡単に区別・分離する方法が必要と株(HJ99-5, -6)、サブタイプ４のSB332で２株(HJ99-2, -されてきている。我々は、遺伝子的に近い属、種、株3)、サブタイプ２のSB155で１株(HJ99-9)が増幅され、を同定、あるいは区別するために使われている、任意

今回調査した１０株はいずれかのサブタイプに属すのプライマーを用いたPCR法（RAPD-PCR）を応用しることが判明した。１つの株が２つ以上のサブタイプてゲノムの違いを同定し、PCR産物をシークエンスしにまたがって検出された例は見られなかった。今回のて得られた遺伝子情報から、種々の遺伝子型に特異的結果から、ヒトから見いだされるブラストシスチス株

な配列から遺伝子プライマーを設計し、PCR法での増の多くが、我々が設計した特異的プライマーによって幅の有無によるサブタイプ分けを提唱してきた1）,2)。

容易に分類可能であることがわかった。今後、多数の今回、1999年に新たにヒトから分離された１０株を対株を分類し検索していくと、これらのプライマーでは象に、我々が設計した種々のプライマーによる遺伝子

増幅されない新たなサブタイプに属すると思われる

型分類を試みた結果を報告する。

株が出てくる可能性がある。その時には、今回紹介し［方法］ブラストシスチスの既知のシークエンスデー

た方法で新しいサブタイプに対応する特異的プライ

タではGC含量が５０〜６０の間にあるので、RAPD-

マーを設計すれば、分離された株全てをサブタイプに

PCRではGC含量が５０又は６０の１０塩基からなる分類できるプライマーが準備されることになり、新し

任意のプライマーを用いた。ブラストシスチスはバク

くブラストシスチス様の生物が分離された場合、これテリアと共存して培養されており、継代を繰り返してらのプライマーを用いたPCR鑑別法によって簡便に無菌化することが技術的に非常に困難である。それ

同定や分類を行うことが可能となり、ブラストシスチ

故、RAPD-PCRに用いるゲノムDNAを採取する際にスの多様な遺伝子型の解析が容易になると思われる。

は、共存バクテリアをできる限り取り除く処理を行っ[文献]ている。しかし、完全であるとは言い切れないため、 1) Yoshikawa, H. et al., (1998) Mol. Cell Probes 12. 153共存バクテリアのDNAも同時にPCRし比較した。得ら
159.
れた産物が確かにブラストシスチス特有であることを確認してから、遺伝子型が異なる他の株には存在し

2) Yoshikawa, H. et al., (2000) J. Clin. Microbiol. 38.
1324-1330.

ない対象株に特異的なバンドをゲルから切り出し、そAnalysis of Genomic Polymorphism among Blastocystis Strains Isolated from Humans.
By Syoko KITANO & Hisao YOSHIKAWA(Dept. Biol. Sci., Nara Women's University)Jpn. J. Protozool. Vol. 34, No. 1. (2001)

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Are the rumen protozoa incapable of synthesizing threonine?

○Mamun M. Or-Rashid, Shaila Wadud, and Ryoji Onodera(Laboratory of Animal Nutrition and Biochemistry, Faculty of Agriculture, Miyazaki University, Japan)[Introduction] In ruminant animals, a large portion of theamino acids incorporated into milk, meat, and fibre proteins
are synthesized by rumen microorganisms [1]. Threonine(Thr) is thought to be an essential amino acid to ruminants[2] as well as other mammals, which, in absence, retards
normal growth and function of the body. Scientists havedone a lot to define Thr synthesis mechanism in plants andgeneral microorganisms, but they have almost ignored tounderstand how this mechanism works in rumen microorganisms as well as ruminants. In general, plants and microorganisms can synthesize this amino acid by aspartate
pathway in which homoserine (Hser) acts as a key intermediate [3].
In addition to the bacteria in the rumen there are manylarger (5-250 µm long) organisms which at various times
have been designated protozoa. Protozoa can represent as
half of the total rumen microbial biomass and approximately 25% of the microbial protein available to the host is
protozoal in origin [4]. Although rumen protozoa are
known to synthesize some of their amino acids de novo [4,5], but to our knowledge there has been no direct evidence
until now with regard to Thr synthesis from its precursor,
mentioned above, by rumen protozoa.
Considering the scarcity of complete information about
Thr synthesis, this research was conducted to quantitatively
investigate the in vitro synthesis of Thr and production ofother related compounds from Hser by mixed rumen protozoa. In addition, same experiment was also carried out by
mixed rumen bacteria and the mixtures of mixed rumen
bacteria and protozoa.
[Materials and Methods] Suspensions (20 ml) of mixed
protozoa (P), mixed bacteria (B), and B plus P (BP) wereprepared from goat rumen contents [6] and incubated anaerobically with and without substrate (2 mM) in 30 ml
Erlenmeyer flasks at 39°C for 0, 6, and 12 h. After deproteinization and centrifugation samples were analyzed by aconvenient HPLC method established by the authors [7].
[Results and Discussion] Mixed rumen protozoa were notable to synthesize Thr de novo by the main biosynthetic
pathway involving Hser, although Hser disappeared to asignificant extent from the incubation medium (46.0% in 6
h incubation period). Therefore, it seemed that homoserine
kinase [EC 2.7.1.39] and threonine synthetase [EC
4.2.99.2], the enzymes responsible for the conversion of
Hser to Thr via O-phosphohomoserine might not be present
in rumen protozoa. On the contrary, B (329.2 and 272.5µmol/g of microbial nitrogen in 6- and 12- h incubation,

respectively) and BP (371.9 and 297.2 µmol/g of microbial
nitrogen in 6- and 12- h incubation, respectively) possessed
abilities of de novo synthesis of Thr. It was interesting tonote that protozoa alone could not synthesize any Thr from
Hser, but when they were mixed with rumen bacteria, Thr
production (µmol/g of microbial nitrogen) capability of BP
suspensions increased by 13.0 and 9.1% over that of B
alone during 6- and 12-h incubation, respectively. The
reason of the higher value of Thr production in BP in thiscase is not known for certain, but it seems that the association of P with B in the suspension may accelerate the activities of the relevant enzymes [i.e., homoserine kinase andthreonine synthetase] and can be regarded as a positive
interaction between the bacteria and the protozoa. Thus, it isstrongly suggested that co-existence of P in B suspension
may have beneficial effect in Thr production in the natural
rumen microbial ecosystem. Other metabolites produced
from Hser were found to be glycine (Gly) and 2aminobutyric acid (2AB) in B and BP but not in P.
In addition, de novo synthesis of Met from homocysteine,
cystathionine, and Hser plus cysteine was also investigatedin P, B, and BP. P, B, and BP could synthesize Met from thesubstrates. Co-existence of P in B suspension (i.e., in BP)
increased Met production (in terms of per g microbial nitrogen) compared with B.
[References]1] Allison, M.J. (1969) J. Anim. Sci. 29, 797807.
2] Downes, A.M. (1961) Aus. J. Biol. Sci. 14,
254-259.
3] Bender, D.A. (1975) Amino Acid Metabolism,
Wiley, London, p 112.
4] Williams, A.G. and Coleman, G.S. (1992) The
Rumen Protozoa, Springer-Verlag, London.
5] Onodera, R. and Kandatsu, M. (1974) Agric.
Biol. Chem. 38, 913-920.
6] Onodera, R. et al., (1992) Anim. Sci. Technol.
63, 23-31.
7] Or-Rashid, M.M. et al., (2000) J. Chromatogr.
B 741, 279-287.

24

原生動物学雑誌 第34巻 2001年

７

テトラヒメナ細胞のホスホリパーゼＤ活性王 樹林1，坂野 喜子1，中島 茂1，○野澤 義則2（1岐阜大・医・生化、2岐阜県国際バイオ研・応用生化研）[目的] 高等動物細胞はもとより酵母など多くの細胞において、膜リン脂質分解酵素（ホスホリパーゼ、PL）が情報伝達に重要な役割を果たしており、これにはPLA2, PLC, PLDなどが含まれる。しかもそれぞれに多くのアイソザイムがあり、大きなホスホリパーゼ
ファミリーを形成し、細胞刺激によってこれらの酵素が活性化され、固有のセカンドメッセンジャーを産生し、細胞機能を発揮する1)。テトラヒメナにはリソゾー
ム由来の高いホスホリパーゼ活性が存在し、これまでにもいくつかの報告がなされているが、PLDに関する知見は少ない。PLDは情報変換酵素として最近注目されており、PLD1a, 1b, PLD2のクローニングがなされ、活性調節と機能との関連について活発な研究がなされている。テトラヒメナにPLD活性が存在することを初めて見出したが(1996年)2,3)、
その後Rasmussenら4,5)はPLDがテトラヒメナのsurvivalに関与していることを示唆した。本研究ではテトラヒメナのPLDの生化学的性状を明らかにすることを目的とした。
[方法] PLD活性はin vivoおよびin vitroアッセイで行った。前者は予め[3H]パルミチン酸でT. pyriformis W
細胞を３時間標識し、ついで0.3 % 1-ブタノール存在
下で経時的に細胞を収集し、PLDによるホスファチジ
ル基転移反応で生じた[3H]ホスファチジルブタノール(PBut) を測定した。後者のin vitroアッセイでは、T.
pyriformis W細胞のlysateあるいは分離膜画分について、基質（[3H]ジパルミトイルレシチン, DPPC)を用いて[3H]コリン遊離を測定、あるいは、[3H]DPPCを含む
脂質小胞 (PE/PIP2/PC=10/1.5/1,モル比）を用いて [3H]
PBut量を測定した。各膜画分はNozawa＆Thompsonの方法6)に従って分離した。
[結果及び考察] [3H]パルミチン酸標識したテトラヒ
メナ細胞を0.3%１−ブタノール存在下でインキュベー
ションすると、経時的に[3H]PBut産生が増加することが示されたが、プロテインキナーゼＣ(PKC)の活性化
物質のPMAの添加によって活性が変化しないことから、このPLD活性はPKC-independent であることが示された。また、GTP結合タンパク質の関与を検討する
ために、膜画分を用いてGTPγS添加による[3H]PBut産生の変動を調べた結果、コントロール細胞(GTPγS無添加）との差は認められなかった。これらの結果から、
このPLD活性はPKC/GTPγS-dependentなPLD1タイプ
ではなく、これらの因子を必要としないPLD2タイプであることが示唆された。
ついで、PLD1, PLD2ともにコファクターとして必要とするホスファチジルイノシトール (4,5) 二リン酸
(PIP2) の存在、非存在下でのテトラヒメナPLD活性を測定したところ、PIP2添加による著しい活性増大が認められた。
テトラヒメナの多くのホスホリパーゼはリソゾー
ムに存在し、至適pHは酸性であるが、PLD活性は至適pH７を示し、高等動物細胞のPLDと同じである。Ca2+
依存性に関しては、PIP2非存在下ではいずれの濃度によっても活性変化は認められなかった、PIP2存在下では高Ca2+濃度ではむしろPLD活性の低下が示された。
また、基質として他の細胞の場合と同様にレシチン(PC)が最適であり、ホスファチジルエタノールアミン(PE)は分解されない。PLD活性の大部分が膜結合性であり、サイトゾルには少なく（20％）、ミクロソームに最も高活性が存在する。細胞の対数増殖初期にPLD活性が増加するが、Rasmussenら4,5) も細胞増殖に関与していることを最近報告している。
[文献]
1) Nakashima, S. and Nozawa, Y.(1999) Chem. Phys. Lipids (Special Issue: Phosphoinositide Signaling, Y. Nozawa, ed.), 98, 153-164.
2) Kovacs, P., Csaba, G., Ito, Y. and Nozawa, Y.(1996)
Biochem. Bipphys. Res. Commun., 222, 359-361.
3) Kovacs, P., Csaba, G., Nakashima, S. and Nozawa, Y.
(1997) Cell Biochem. Funct., 15, 359-360.
4) Rasmussen, M. and Rasmussen, L.(1999) Comp. Biochem. Pysiol., 124, 467-473.
5) Rasmussen, M. and Rasmussen. L.(2000) Cell Biochem.
Funct., 18, 133-139.
6) Nozawa, Y. and Thompson, G.A.(1997) J. Cell Biol.,49, 722-730.

Phospoholipase D activity in Tetrahymena cells.
By Sulein WANG1, Yoshiko BANNO1, Shigeru NAKSHIMA1 and Yoshinori NOZAWA2 (1Department of Biochemstry, Gifu University School of Medicine, 2Gifu International Institute of Biotechnology & Institute of Appliced Biochemistry)Jpn. J. Protozool. Vol. 34, No. 1. (2001)

８25

チューブリン重合阻害剤オリザリンによる Entamoeba invadens のシスト形成の抑制

○牧岡 朝夫、熊谷 正広、大友 弘士（慈恵医大・熱帯医学)、小林 正規、竹内（慶応大・ 医・ 熱帯医学・寄生虫学 ）勤［目的］ジニトロアニリン系除草剤であるオリザリ

生残に貢献することが示唆された。オリザリン存在下

ン、トリフルラリンにはチューブリンの重合阻害作用

で7日間培養した栄養型では分裂期にある虫体の割合があり、近年、ある種の原虫に対する増殖抑制効果がが約40%に達し、オリザリンによる細胞分裂のM期で明らかになっている。演者らは先にオリザリンが赤痢の停止が確認された。培養1日後に調製したシスト（そアメーバに対してもその栄養型の増殖を抑制するこの50%は1核）をシスト形成液にもどし、これにオリザとを明らかにした。今回はアメーバのヒトへの感染形

リンを加え２日間培養した結果、対照の56%までシスであるシストに注目し、その形成に及ぼすオリザリン

ト数が減少した。以上の結果から、オリザリンによるの効果について検討した。赤痢アメーバにおいては in

シスト形成の抑制は栄養型をシスト形成液に移した

vitro シスト形成系が確立されていないことから、その直後の細胞分裂ならびにシストの成熟過程におけるモデルとして重要なEntamoeba invadens の in vitro シ

核分裂を抑制することにより引き起こされると考え

スト形成系を用いた。

られた。

［方法］無菌培養系で増殖させたE. invadens IP-1株栄［文献］

養型を種々の濃度のオリザリンを含むシスト形成液

Makioka, A. et al. (2000) Parasitol. Res.86, 625-629.

（47%LG）に移し、３日間培養後栄養型とシストの虫体数を求め、シスト形成に対する効果を調べた。また、オリザリン存在下で培養した栄養型をコーン染色しその核を観察した。
［結果及び考察］種々の濃度のオリザリン存在下でのシスト形成率を比較した結果、濃度に依存したシスト形成の抑制がみられた。対照のシスト形成率が93%であったのに対し、オリザリン200 µMでシスト形成率が10%まで低下し、300 µMでは栄養型も消失した。この結果からオリザリンがシスト形成の抑制にも有効であることが明らかになった。培養1日後にオリザリンを加えた場合にもシスト形成は抑制された。栄養型をオリザリンを含むシスト形成液中で１日培養後オリザリンを除去してもシスト形成の回復はみられな
かった。この結果からオリザリンを含むシスト形成液で培養された栄養型はそのシスト形成能を失うことが示唆された。また、オリザリン300 µMを含む培養液中で２日間培養した栄養型は同じ濃度のオリザリンを含むシスト形成液に移したときシスト形成はしないものの、オリザリンで前処理していない栄養型の場合と異なり、多くの栄養型が生残した。この結果からオリザリンの前処理は栄養型のシスト形成液中でのFigure 1. Effect of oryzalin on the encystation of
Entamoeba invadens.

Inhibition of encystation of Entamoeba invadens by antitubulin drug oryzalin.
By Asao Makioka, Masahiro Kumagai, Hiroshi Ohtomo (Dept. Trop. Med., Jikei Univ. Sch. Med.), Seiki Kobayashi &26

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原生動物学雑誌 第34巻 2001年

慢性下痢症AIDS患者からのMicrosporidiaの検出○八木田 健司1)、増田 剛太2)、泉山 信司3)、遠藤 卓郎1)
（国立感染症研究所・寄生動物部1)、都立駒込病院・感染症科2)、㈱池田理化3)）［目的］Microsporidia（微胞子虫類）は近年、AIDSのりMicrosporidiaのsporeを検出した。Trichrome 染色で日和見感染症の病原体として重要視されている。こはsporeおよび酵母類が淡赤色に染色された。しかしれまでにEnterocytozoon やEncephalitozoon属など6属

大きさやvacuoleなどsporeの形態的特徴から、両者は12種類がにヒトに感染することが報告されており、識別された。Spore wallの成分であるキチン質と結合症例数は1000例を超える。典型的にはwasting disease

するCalcofluor whiteによる染色は、Trichrome 染色よ（激しい下痢症）を引き起し、AIDS患者にとっては体りも特異性が高くspore wallが青白色の蛍光を発する

力の消耗が激しく致命的問題を生ずる。細菌とほぼことで酵母、細菌類との識別は良好であった。なお同様の大きさ、形態のため従来検査には困難な部分

MGL処理等の濃縮精製操作はもあったが、染色法の改良と分子生物学的手法の導がるという報告があるが、今回の遠心条件（2,000ｘ

sporeの損失につな入で迅速確定診断が可能となった。その結果、海外でｇ、10分間）はsporeの濃縮に有効であった。このspore

はMicrosporidiaが下痢症の病原体スクリーニングの陽性試料についてＰＣＲを行なったところ、陽性コ

対象となっている。
一方、我が国ではAIDSに関連した

ントロール試料として用いたEncephalitozoon属と同

日和見感染症を含めてMicrosporidiosisに関する調査、

一の1,200bpのDNAが増幅された。さらにHinfⅠおよ研究がこれまでにほとんどないことから、疫学調査

びHindⅢを用いたRFLP解析の結果、検出されたsporeを中心に早急に情報を蓄積する必要がある。
今回、我々は国内におけるMicrosporidia 感染の実

はEncephalitozoon属とは異なり、AIDS患者において消化器疾患と最も関連の強いことが知られている態を明らかにする目的で、慢性下痢症を伴うAIDS患Enterocytozoon bieneusi と同定された。

者を対象にMicrosporidiaのスクリーニングを行ない、［考察］国内においてもMicrosporidia感染症が存在す

国内における感染例を確認したので報告する。

ることが明らかとなった。原虫は極めて小さいが、染［方法］原因不明の下痢症を併発した８名のAIDS患色法によるスクリーニング、さらにはPCRを利用し者の便材料をMGL処理した。方法は便１mlに10％ホ

た迅速診断が可能である。今後、本格的な調査を行な

ルマリンを加えて8 mlとし15分間固定後、2mlの酢酸うとともに、治療面でHIV感染患者への適切な対応がエチルを加えて脱脂処理し、遠心（2,000ｘｇ、10分間）

必要と考えられる。

により精製濃縮した。濃縮沈渣を試料として、その5μｌをスライドグラスに薄く広げ乾燥後、メタノー
ルで3分間固定した。スライド固定標本は赤色色素であるChromotrope 2R を用いたTrichrome 染色、ならびに蛍光色素Calcofluor whiteを用いた染色を行なった。
Calcofluor white染色標本はUV励起フィルターを用いて観察した。染色によりsporeの確認された試料についてはヒト感染例の多いEncephalitozoon ならびに
Enterocytozoon属を検出するプライマーを用いて、Ｐ
ＣＲにより16SｒRNA遺伝子内1,200ｂｐのＤＮＡ増幅を行なった。さらにDNA産物について制限酵素を用いたRFLP解析を行ない種を同定した。
［結果］2種類の染色法で調べた結果、８名中１名よDetection of Microsporidia in fecal samples from HIV-positive patients in Japan.
By Kenji YAGITA1), Gouta MASUDA2), Shinji IZUMIYAMA3) and Takuro ENDO1)(Natl.Inst.Infec.Dis. 1), Tokyo Metropolitan Komagome Hospital2), IKEDA RIKA Co.,Ltd3))

Jpn. J. Protozool. Vol. 34, No. 1. (2001)

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原生動物Trichomonas foetusのマウス腹腔内感染における原虫の排除○高谷 英志1, 酒井 仁美2, 林 弘三2（1徳島大・人間・自然環境研究科, 2徳島大・総合・生命）［目的］ウシに寄生する原虫Trichomonas foetusを用いたマウス腹腔内実験感染における宿主マウスの原虫排除を検討した。この寄生性原虫の感染に対する防御にはマクロファージが主要な働きをしているが、リンパ系細胞が感染原虫の排除に参画する可能性も示唆されている。今回は、腹腔内に投与された原虫の排除過程を、腹腔滲出細胞等を採取して検討した。
［方法］タイロード液で1.0×10 7 cells/ml に調整したT. foetus生虫懸濁液0.5mlを、４週齢のddY雌マウス腹腔内に２回 (１週間隔)投与して免疫した。再感染は1.0×10 7 cells/ml または2.0×10 7 cells/ml のT.
foetus生虫懸濁液0.5ml を腹腔内に注入し、一定時間後に腹腔中の浮遊細胞及びabscessを採取した。腹腔内のリンパ系細胞及び原虫の採取の方法は、タイ
ロード液５mlを腹腔内に注射筒を用いて注入し、マッサージ後その液を回収した。採取した腹腔内原虫の培養は以下の様に行なった。回収した原虫浮遊液 に ２ 倍 容 の 15％ 牛 血 清 添 加 F-bouillon を 加 え、
37℃の孵卵器中で培養した。abscessは、腹腔内をタ
イロード液で洗浄した後開腹して無菌的に採取した。１匹ずつのマウスから得たabscessを３mlのタイ
ロード液中で軽くつぶし、前述の腹腔内原虫浮遊液の培養と同様の方法でabscess中の原虫を培養した。
腹腔滲出リンパ球（PEL）中のリンパ球の分析には、再感染から４時間目のPELをラット抗マウス
CD4抗体-PEとラット抗マウスCD8抗体-FITCを用いて標識し、フローサイトメーターで測定した。
［結果と考察］マウス腹腔内から浮遊原虫を経時的に採取した後 in vitro で培養し、原虫の増殖の有無を調べることにより、腹腔中での原虫排除に要する時間を推定した。その結果、対照の非免疫マウスの腹腔洗浄液中では、感染24時間後でも原虫が存在あ
るいは増殖していることを確認した。一方、免疫マ
ウスでは感染６時間目には腹腔洗浄液中には原虫を検出できなかった。
免疫マウスでは、短時間の内に腹腔中から遊離した状態の原虫が消失することから、投与した原虫の行方の確認を試みた。タイロードで洗浄後のマウスの腹腔内を観察したところ、原虫を投与していない
正常マウスには見られない直径１~３mm程度の白色のabscessが存在した。このabscessを光学顕微鏡下で観察した結果、内部にT. foetus原虫が認められた。
このabscessは、免疫マウスでは再感染直後から出現し、その中に原虫が存在した。さらに致死量以下の感染を施した非免疫マウスにおいても24時間後になって始めてabscessを認め、その中に原虫が存在した。一方、致死量の感染を施した非免疫マウスでは、腹腔中に多数の原虫が増殖したものの、abscess形成は認められなかった。abscess中の原虫を、in vitro で培養した結果、ほとんどの場合増殖能を有していたが、致死量以下の再感染を施した免疫マウスでは、原虫は認められたものの、増殖を確認できない場合もあった。さらに、感染後の時間が経過すると、
abscessを検出できない免疫マウスが見られた。
これらの結果より、腹腔内に注入されたT. foetusの排除の経過は、腹腔に動員された宿主細胞が、原虫を包囲してabscessを形成する方向に進行すると推測した。また、非免疫マウスでも致死量感染でな
いときは、免疫マウスよりも遅れてabscessを形成していることから、免疫感作によりabscessの形成がより活性化されると考えられる。致死量を感染させた
非免疫マウスでは腹腔中に遊離の原虫が多量に増加し、宿主の腹腔滲出細胞も多量に動員されてくるも の の、abscess が 形 成 さ れ な か っ た こ と か ら、
abscess形成が原虫感染マウスの生存に大きな意味を持つと推測される。
次いで、原虫排除の初期過程に関わる宿主細胞の分類を試みた。免疫マウスのCD4 + 細胞は全PELの8.0％及びCD8 +細胞は2.8％であった。対照の非免疫マウスのPELではCD4 + 細胞は、全PELの6.0％及び
CD8 + 細胞は1.5％であった。免疫感作を行なうことにより増加したこれら細胞が、どのように原虫排除過程に関わっているかについては、まだ不明である
が、abscessを構成する細胞を分析して、それらの細胞の関係を現在検討している。

Elimination of the intraperitoneal parasites in mice injected with Trichomonas foetus cells.
By Hideshi TAKATANI1 , Hitomi SAKAI 2 and Hiromi HAYASHI2 , (1 Grad. Sch. of Human and Nat. Environ. Sci., and2Div. of Life Sci., Dept. of Math. and Nat. Sci., Fac. of Integr. Arts and Sci., Univ. of Tokushima)

原生動物学雑誌 第34巻 2001年

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環境汚染物質がドナリエラの鞭毛再生へ及ぼす影響○堀家 直哉，佐藤 忠文，中村 省吾（富山大学・理学部、香川医科大学・分子生物）［目的］ 環境水中の汚染物質が生物へ及ぼす影響［結果及び考察］ まず、ドナリエラの増殖速度を調を、総合的に検出評価する方法としてバイオアッセ

べた。その結果、初期細胞密度を約105 cells/mlとしイが注目されている。そして、河川や池など淡水系て培養を開始すると、倍加時間は約12-18時間で、細のバイオアッセイについては、単細胞藻類やミジン

胞密度が約 1×107 cells/mlで定常期に達することがコ、魚類など様々な生物種が用いられ、評価結果に判っ た。このド ナリエラは、水中を遊泳するた め

関する報告も多い。しかし、海水のバイオアッセイに、1細胞（個体）当たり約10 µmの2本の等長な鞭毛に関しては、そのような報告が少ない。環境中の汚を持つ。そこで、この鞭毛が切断されると再生する

染物質の最終的な集積場所は、主に海洋になると考かどうかを調べた。その結果、切断後約6-8時間で切えられる。したがって、海洋環境のバイオアッセイ

断前の長さ近くにまで鞭毛を再生し、その後ゆっくが重要になると思われる。また、それに使用できる

りと再生を続け、切断後約8-10時間ごろに安定した生物種や方法が、多いほどより正確で広範な影響評

長さに達することが判った。ところで、海水のバイ価ができると考えられる。そこで我々は、海洋性単オアッセイを行う際には、塩分濃度がしばしば問題

細胞緑藻ドナリエラが、海水における急性毒性のバとなる。なぜならば、海水から汽水にかけて、同一

イオアッセイに有用であるかどうかを調べることを実験方法でアッセイできる生物種がほとんどいない試み始めた。ここでは、ドナリエラの鞭毛再生を指からであ る。そ こで、このドナリエラ の鞭毛再生標としたバイオアッセイの有用性について検討したが、海水から汽水にかけての実験に有用であるかど

結果を中心にして報告する。

うかを、人工海水を用いて調べた。その結果、驚い［方法］ 実験材料のドナリエラ（Dunaliella sp.）

たことに10%の海水濃度であっても、コントロール

は、長崎大学水産学部で系統保存されていたもの(100%海水または培養液) と変わらない鞭毛の再生がを、萩原博士より分譲していただいた。そして実験見られた。このことから、海水から汽水にかけてのには、ドナリエラ用のautotrophic mediumを用いて、水質汚染のバイオアッセイに、このドナリエラの鞭

白色蛍光灯下（約4,800 lx）で通気しながら培養した毛再生が、指標として有用であることが判った。さものを使用した。鞭毛再生実験は、まず、対数増殖

ら に、ドナリエ ラの鞭毛 再生 は Cu2+ に高感 受であ

6

期 (1-3×10 cells/ml)まで培養した細胞の懸濁液を、ホり、銅の排水基準値の、約1/4-1/8のEC50値を示すこ

モジナイザー（日本精機、Ace-1）に10,000 rpmで3分とが判った。このことから、汚染物質によっては、

間かけることで鞭毛を切断し、その直後に、各試薬

ドナリエラの鞭毛再生を指標にすることによって、溶液を目的の最終濃度になるように添加した。その海水域から汽水域まで、高感度でそれを検出できる

後、一定時間毎に試料の一部を取って2％グルタルア

ことが示唆された。

ルデヒドで固定し、再生した鞭毛の長さを30個体について、位相差顕微鏡 (Olympus、BH2-NIC）下で接眼マイクロメーターを用いて測定し、その平均値を求めて各時間における再生鞭毛長とした。なお、海水濃度の影響を調べる実験では、培養した細胞を各濃度の人工海水（千寿製薬、マリンアートSF）に再懸濁した後に、鞭毛を切断した。細胞密度は、血球計算盤を用いて測定した。

Effects of some pollutantas on flagellar regeneration in Dunaliella sp.
by Nobuya HORIKE1, Chubun SATO2 & Shogo NAKAMURA1 (1Fac. of Scie., Toyama Univ.; 2Mol. Biol., Kagawa
Medical Univ.)Jpn. J. Protozool. Vol. 34, No. 1. (2001)

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繊毛虫毒の研究

29−方法と実験例−○三宅 章雄，ボナンノ フェデリーコ、サルタラマキア ピエロ（伊、カメリーノ大、分子細胞動物）［目的］Dileptus など多くの捕食性繊毛虫はトキシシスト（毒胞）と呼ばれる放出体を使って捕食する。トキシシストで攻撃された繊毛虫はしばしば瞬時に殺されるので、トキシシストには強い毒が含まれていると考えられている。一方 Blepharisma japonicum, Stentor
coeruleus, Climacostomum virens 等、異毛類の繊毛虫（heterotrichs) はその放出体に毒を持ち、Dileptus に攻撃されると、この毒を放出して防御する（１−５）。
そこで、種々の繊毛虫が攻撃や防御のために持っている毒を単離同定し、その生理作用を明らかにして行くという新しい研究分野が考えられる。しかしそれぞれの毒を繊毛虫から直接に抽出すると、研究に必要な量の毒を得るためにいろいろな繊毛虫を大量に培養しなければならない。この困難を減らすため、毒が放出体に含まれていることに着目し、毒を人工的に放出させ、細胞は殺さずに再利用することを考え、これが実行可能かどうかを Dileptus margaritifer の毒（攻撃用）とSpirostomum teres の毒（防御用）の研究において検討した。
［材 料・方 法］Dileptus margaritifer は 小 型 繊 毛 虫
Sathrophilus sp. を用いて培養した。Sathrophilus とParamecium tetraurelia は Enterobacter aerogenes を植
え た レ タ ス 培 養 液 で 培 養 し、Spirostomum teres(heterotrich) の培養には同レタス培養液に煮沸した酵
母浮遊液を加えたものを用いた。放出体の放出は低温処理によって誘導した。すなわち遠心機で集めた細胞
0.2-0.4 ml を 2 ml の塩類溶液 SMB-III (６)（以下 SMB)に浮遊させ、10 ml の冷却した SMBと混合した。直ちに遠心機で細胞を沈殿させ、細胞と上清に分け、細胞は室温（23 ± 1°C)の SMB に浮遊させ、上清はその毒性をしらべた。
［結果・考察］上の方法でDileptus を 0°CのSMBに加えた場合、上清にParamecium tetraurelia （株 51）を加えると瞬時に大量のトリコシストが発射され、運動が止まり、繊毛が脱落し、細胞は溶解して死亡した。しかし細胞が発射されたトリコシストに完全に取り囲まれた場合は、細胞はこの囲いの中で動き続けた。トリ
コシストを発射できない突然変異体（株 nd7）を加えると、例外なく瞬時に運動が止まり、すぐに繊毛が脱落し、ついで細胞が溶解して死亡した。従って、上清に毒が含まれていることは明らかであり、また、発射されたトリコシストはDileptus の毒に対し防壁と成りうることがわかる。一方、Dileptus はこの低温処理で大きな損傷を受け、再利用できなかった。細胞浮遊液と混合するＳＭＢを4°Cにすると、上清の毒性は減少したが、細胞の損傷は少なく、細胞を培養して再利用することができた。上清の毒性は凍結融解で減少し、90°C、1分の加熱で失われ、ポアサイズ 0.2 µm の膜を通らず、従って毒はタンパク性で, 粒子状のものかある
いは粒子状のものと結合していると考えられる。
Spirostomum teresの場合、上清の毒性は2n 倍に希釈した液 250 µl にDileptus 10 細胞を入れ、一日後すべての細胞が死亡した液のnの値の最大値（毒性指数）で毒性の強さを比較した。例えば64（= 26)倍希釈で生存細胞がなく、128倍希釈で生存細胞があると毒性指数は
VI である。S. teres を0°CのＳＭＢと混合した場合、毒性指数V−VII の上清が得られ、細胞は大きな損傷を受けず、数日間の培養後再使用することができた。
以上の結果から、始めに述べた毒の採取法を用いて種々の繊毛虫の放出体に含まれる毒性物質を研究して行くことができると考えられる。
［文献］
1) Miyake A. et al. (1990) Europ. J. Protistol., 25, 310-315.
2) Harumoto T. et al. (1998) Europ. J. Protistol., 34, 458470.
3) Harumoto T. et al. (1995) Zool. Sci., 12, Suppl. 26.
4) Masaki M.E. et al. (1999) Tetrahedron Lett. 40, 82278229.
5) Miyake A. et al. (1999) Abstr. 3rd Eur. Congr. Protistol.,Helsinger, Denmark 1999, 50.
6) Miyake A. (1981) In: O'Day D. H. and Horgen P. A.
(eds): Sexual Interaction in Eucaryotic Microbes, 95129. Academic Press, New York.

Study on ciliate toxins -- method and practice -By Akio MIYAKE, Federico BUONANNO & Piero SALTALAMACHIA (Dept. Mol. Cell Animal Biol., Univ.
Camerino, Italy)

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原生動物学雑誌 第34巻 2001年

Paramecium multimicronuclearum の接合型変換リズムに関与する遺伝子の探索○小林 寿珠子1・三輪 五十二2・高橋 三保子1（1筑波大学・生物；2茨城大学・理学部・自然機能）[目的] Paramecium multimicronucleatum のシンジェン2の中には、一日のある時間に接合型IIIを、残りの時間に接合型IVを発現する株がある。この現象は接合型変換リズムと呼ばれている。この形質は全ての株が発現するわけではなく、発現する株をcycler、しない株
を acyclerとよぶ。この形質は優性の遺伝子Cycleに支配されており、Cycleをホモまたはヘテロに持つ株はcyclerに、持たない株はacyclerになる。ふしぎなことに、cyclerはどの株もその株独自の位相で接合型変換
リズムを発現する（1）。
概日リズム現象は一般的に、自律振動している概日時計に調節されており、接合型変換リズムもその例外ではないと考えられる。
acyclerにも接合型変換リズム以外の概日リズムは観察されているので、acyclerにも概日時計は存在していると考えられる。
接合型変換リズムの分子メカニズムは、よく分かっていない。そこで本研究では、接合型変換リズムに関係する遺伝子をクローニングすることを目的にした。
[方法]概日リズム現象に関わる遺伝子の多くは、その発現量が日内振動している。そこでまず、cycler株である110B株を用いて、ディファレンシャルディスプレイ
（DD）法を行った。DD法は、mRNA発現量の差を検出できる手法である。
110B株を明暗12時間ずつの同調条件下で培養し、6時間おきに4回細胞を集め、各々mRNAを抽出した。そのmRNAを逆転写して得られたcDNAを鋳型にして、各々PCRを行った。PCR反応条件はできるだけ多くのDNAフラグメントが増幅されるように設定し、PCR反応一回につき10merのランダムプライマーを1種類用いた。このPCR産物の泳動像は、最初の4つの細胞サン
プルのmRNAを反映している。ある時間のPCR産物にだけ、他の時間には見られないバンドがあった場合、そのバンドは、その時間前後に多く発現している
mRNA由来のものと考えられる。
こうして得られたバンドは、概日リズムに関係している可能性が高い遺伝子の一部である。しかし、DD法は疑陽性の遺伝子を検出してしまうことが多い。また、
もし概日リズムに関係している遺伝子だったとしても、接合型変換リズムではなく、他の概日リズムにのみ関係している遺伝子かもしれない。そこで、DD法で得られた概日リズムに関係している可能性が高い
DNAフラグメントを、ノーザン法によって、さらにス
クリーニングすることにした。
ハイブリダイゼーションの基質には、110Ｂ株（cycler）とCH100株 （acycler）のそれぞれ明暗の同調条件下で培養した細胞から、4時間おきにmRNAを調整し、泳動
後、メンブレンにトランスファーしたものを用いた。
プローブには、DD法で得られたDNAフラグメントを使用した。理論的にはcyclerで検出されるシグナルは概日振動しているはずである。その時、もしacycler株
で振動していなければ、検出されたRNAは接合型変換
リズムに関係する遺伝子であると考えられる。逆に、
CH100株で振動していれば、検出された遺伝子は、概日時計、もしくは接合型変換リズム以外の概日リズムに関係する遺伝子と考えられる。
[結果と考察] DD法は、21種類のプライマーを用いて行い、12種類の概日リズム関連遺伝子の一部と思われるフラグメントを得た。このうち、現段階でノーザン法においてシグナルを検出できたのは、3種類である。
この3種類は、みな同じ、約6~7KbのRNAを検出した。
このRNAは、cycler株では明期の始めには発現量が最低で、暗期に入って約8時間目に最高になり、また減少
していくという振動性が認められる。それに対して
acycler株では、明期の始めと、暗期の途中に発現が見られるが、振動性は認められない。
よって、このRNAは接合型変換リズム関連遺伝子由来のものと考えられる。
今後は、この接合型変換リズム関連遺伝子と思われる配列のクローニングをし、その役割についての解析を進める。同時に、DD法で得られたその他のDNAフラグ
メントのスクリーニングを進めていくつもりである。
[文献]（1）A. Barnett,(1966) J. Cell. Physiol. 67, 239-270.

Screening of the genes controlling a circadian rhythm of mating type reversals in Paramecium multimicronucleatum.
By Suzuko KOBAYASHI1, Miwa ISOJI2 & Mihoko TAKAHASHI 1(1Institute of Biological Science, University of Tsukuba; 2Department of Biology, Faculty of science, Ibaraki University)Jpn. J. Protozool. Vol. 34, No. 1. (2001)1431

ミドリゾウリムシ白色細胞の食胞形成過程と共生藻感染の関連について○後藤 宗範・殿岡 裕樹・渡辺 彊（東北大・院理・生物）［目的］ミドリゾウリムシParamecium bursariaは細胞減りはじめ特に形成後３０分あたりのところで著し内に多数の共生藻を持って生活している。この共生藻い面積の減少が見られた。またP.bursariaでは時間のは人為的に取り除くことができ、またこうして得られ経過とともに１細胞あたりの食胞の個数が著しく増た細胞（白色細胞）に外部から単離共生藻を与えるこ

加していき、P.trichiumでもP.bursariaほどではないもとによりもとの共生関係を回復させることができるのの食胞の増加が見られた。このことより、この２種（これを再感染と呼ぶ）。再感染過程においては、共では食胞が形成後、細かく分割していくのではないか

生藻が食胞に包まれるかたちで多数取り込まれたあということが示唆された。

と、ひとつひとつが食胞から単離され、消化を免れて一方共生藻再感染実験では、P.bursariaのみならず安定に存在するようになる。この単離過程ではゾウリ

P.trichiumでも、食胞に取り込まれた共生藻が時間のムシ細胞内で共生藻を識別するなんらかのメカニズ

経過と共に単離されていくというデータが得られた。

ムが働いていると考えられているが、その詳細はほと以上２つの実験より、P.bursariaでみられる共生藻んど明らかになっていない。そこでこの識別メカニズの取込み後の単離という現象は、必ずしもそこに共生ムの解明を目的として再感染実験を行ったところ、そ藻に対する認識が働いておこるものではなく、ただ単の 過 程 に お い て P.bursaria が つ く る 食 胞 が 他 のにP.bursariaの食胞に見られる形成後の分割という現Paramecium とは異なる性質を持つことを示唆する

象に沿って起こっているだけのことではないか、とい

データが得られた。そこで今回はP.bursariaの食胞のうことが示唆された。

形成後の変化を着色したバクテリアを用いて詳細に解析し、食胞形成後の過程と共生藻の識別メカニズムの間にどのような関係があるのかを検討した。
［方法］１．形成後の食胞の経時変化の観察：普段ゾ
ウリムシの培養に用いているバクテリアKlebsiella
Pneumoniaeを生体染色剤であるCongo Redで着色し、これを白色細胞（Sj2w）に２分間与えた。その後細胞をゾウリムシの生理的塩類溶液であるDril's solution（DS）で洗い、細胞外の余分なバクテリアを除いた。
これをDSの中で培養し、形成された食胞の経時変化を追跡した。また、比較対象として細胞の大きさが比較的似ているParamecium trichium（OM4）を用い同じように実験を行った。
２．共生藻再感染実験：P.bursariaの緑色細胞 （Gr3）から共生藻を単離し、Sj2wとOM4にそれぞれ２分間ずつ与えた。その後上記１．の実験と同じように培養し、細胞内での共生藻の経時変化を観察した。
［結果及び考察］着色したバクテリアを与えその後の食胞の経時変化を光学顕微鏡下での食胞の面積を指標にして追跡したところ、食胞形成後からその面積はStudies on the food vacuole-formation in aposymbiotic Paramecium bursaria in relation to the infection of symbiotic
algae.
By Munenori GOTOH , Yuki TONOOKA and Tsuyoshi WATANABE (Biol. Inst., Grad. Sch. of Sci., Tohoku Univ.)

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原生動物学雑誌 第34巻 2001年

ヒメゾウリムシの行動突然変異体における表現型復帰の分子メカニズム○松田 厚志、高橋 三保子（筑波大・生物）［目的］ヒメゾウリムシの行動異常突然変異体pawnB (pwB662) の株d4-662は、有性生殖によって、ミュー
タント形質を示す細胞（P662と呼ぶ）の他に2-8％の復帰細胞（R662と呼ぶ）を生じる 1）。d4-662はpwB
遺伝子の小核特異的配列（IES）を大核発生時に除去することができないことが報告されている 2）。仮にこのIESが突発的に除かれると野生型と同様の遺伝子が生じるため、R662とIES除去の関係を分子遺伝学的方法により検討した。
［方法］野生型の株には51s及びnd6、pwB662のホモ接合体には株d4-662を用いた。培養液にはDrly’s solutionに３％レタス浸出液を加え、Klebsiella pneumoniaeを植菌したものを用い、24-26℃で培養した。行動の表現型は刺激溶液（20mM KCl in Dryl’s solution）にマイクロピペットにより細胞を移し、まった
く反応のない細胞をミュータント（P662）、後退遊
泳や５秒以上の回転を示す細胞をリバータント（R662）と 判 定 し た。PCR及 び、RT-PCRの プ ラ イ
マーは、pwB遺伝子のORF領域と、上流域の配列をもとに設計し、後者はgenomic DNAに特異的である
ためRNAサンプルのゲノムDNAによるコンタミの有無を調べるために用いた。蛍光強度の測定にはヘモ
グロビン遺伝子をreferenceとして、画像解析ソフト（Scion Image）を用いた。
［結果および考察］P662とR662における大核pwB遺伝子をPCRにより増幅しIESの除去を調べたが、IESの除かれた遺伝子は検出されなかった。しかしながら、大核には約1000コピーの遺伝子が存在するた
め、この方法では少量の遺伝子を同定することがで
き な い と 思 わ れる。d4-662は ノ ー ザ ン ブ ロ ッ トによって転写産物が検出されないことが報告されている 2)。d4-662の表現型復帰がpwB以外の遺伝子によらないとすれば、R662においてpwB遺伝子の転写産物を同定することが可能なはずである。P662及びR662
からtotal RNAを抽出し、oligo-d(T) によりcDNAを作成した。これをPCRしたところ、いずれのサンプルからも野生型より弱いシグナルが検出された。遺伝子上流のプライマーによっては増幅が見られなかったので、ゲノムDNAの混入はないと考えられる。野生型を1としたとき、P662、R662のシグナルは、それぞれ約0.5、0.7であった。このRT-PCR産物をHinfIにより切断しイントロン及びIESの除去を調べた。すべてのサンプルにおいてイントロンが除かれた遺伝子が大半であったが、P662にはイントロンの除かれて い な い pre-mature な 遺 伝 子 産 物 が 検 出 さ れ た。
P662、R662のpwB遺伝子転写産物は共にIESを含んだものが大半を占めたが、R662からはIESの除去された遺伝子が検出された。EtBr染色による定量の結果、
R662は大核遺伝子のうち約20%の野生型遺伝子を持っていた。有性生殖により生じるR662は2-8％であることなどを考慮すると、突然変異を含むIESは、遺伝子あたり1%程度の確率で切り出されていることがわかった。今回のR662における野生型遺伝子の定量
結果は、遺伝子が16コピー以下の増幅段階にIESが切り出されるという報告3) により、よく説明することができる。仮に大核遺伝子が16コピーに増幅されたときに1コピーのIESが除かれ、最終的に1000コピーに増幅されるならば、その結果6.25％の野生型遺伝子が生じる。この遺伝子量は大核の無糸分裂による不等分配によって数回の細胞分裂の間に濃縮されると思われ る。ま た、タ イミングがもう少 し早いならば、より多くの 野生型遺伝子が生じ る。オ ートガ
ミーにより生ずるR662の子孫のうち3‐5割の子孫は
R662の細胞のみしか含まないが、これらの子孫ではIESの切り出しが早い時期に起こった事が示唆される。ヒメゾウリムシのIES末端には8塩基のコンセン
サス配列があり、pwB662の変異はその5番目の塩基に存在する。今回の研究により、pwBのIES（IES427）のコンセンサス配列における5番目の塩基置換は、約99％という浸透度で切り出しを阻害するという定量的事実とともに、このような自然発生的なIESの切り出しがd4-662における表現型復帰の分子メカニズム
である事が明らかとなった。
［文献］
1) Matsuda, A. et al. (1997) 原生動物学雑誌 31, 36.
2) Haynes, W. J. et al. (2000) Genetics 155, 1105-1117.
3) Bétermier et al. (2000) Mol. Cell Biol. 20, 1553-1561.

Molecular basis on the reversion of a behavioral mutant, pwB662, in Paramecium tetraurelia
By Atsushi MATSUDA & Mihoko TAKAHASHI (Inst. Biol. Sci., Univ. Tsukuba)Jpn. J. Protozool. Vol. 34, No. 1. (2001)

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クラミドモナスの非保守的アクチン：発現と鞭毛への局在○広野 雅文1・瓜生 さと美1・尾崎 心1・箕浦 高子2・神谷 律1,2
（1東大・院理・生物科学，2基生研・細胞情報）［目的］我々はこれまでに，クラミドモナスには一般とが強く示唆された．

的構造のアクチンと，それとは著しく異なった奇妙なNAP mRNA の一過的な増加は，配偶子が接合する

配列のアクチン（NAP）をコードする遺伝子が，それときにも見られた．この発現誘導はdibutyryl-cAMP処

ぞれ１コピーずつ存在することを明らかにした．NAP

理によって人為的に配偶子細胞内のcAMP 濃度を上は，野生型株での発現はわずかだが，一般的アクチン

げても起こることから，NAPとアクチン遺伝子の発現が欠損した変異株（ida5）では常に多量に発現していは，他の接合特異的な現象と同じように，細胞内cAMP

る．しかし，ida5変異株には接合管が形成できないな

濃度によって制御されていることが明らかとなった．

どの変異形質があることから，NAPはアクチンとは異次に，cAMP処理をした配偶子内のNAPの局在を間なる性質を持つと考えられる．これまでのところ，

接蛍光抗体法で調べたところ，プラス型配偶子では接NAPの野生型における本来の機能は全くわかってい合管にアクチンと共に局在していることがわかった．

ない．我々はこの問題の手がかりを探るため，野生型

NAPがどの程度アクチンと似た性質を持っているか細胞でもNAPが顕著に発現する条件はないか，そのとは全くわかっていないが，この観察結果は，NAPがアき発現したNAPはどこに局在するのか，を検討した． クチンと共重合できることを強く示唆している．ま［方法］野生型およびida5変異株細胞を脱鞭毛し，そた，接合管はアクチンの急激な重合によって形成されの後一定時間ごとの細胞内のアクチン，NAP両mRNAるが，その同じ場にNAPが存在することは，このアク量を定量した．脱鞭毛処理はpHショックにより，またチンの状態変化に何らかの関与をしている可能性を

mRNAの定量はノザン解析により行った．同様に，野示している．

生型とida5の配偶子を作り，接合，dibutyryl-cAMP処理

同様にcAMP処理をしたida5配偶子では，鞭毛になどによるアクチンとNAPのmRNA量を測定した．ア

NAPの強いシグナルが観察された．意外なことに，対クチンおよびNAP蛋白質の検出には，それぞれのＮ末照実験として野生型配偶子を螢光ファロイジンで染端１２残基の配列に特異的に反応する抗体（抗-アク

色すると，特にマイナス型配偶子の鞭毛にFアクチン

チン，抗-NAP抗体）を用いた．これらの抗体と，間接のシグナルが検出されることがわかった．これらのシ蛍光抗体法，ウェスタンブロット法を組み合わせ，ア

グナルは鞭毛を界面活性剤で処理すると消えること

クチンとNAPの局在を検討した．

などから，NAPとアクチンはダイニンとは独立に鞭毛［結果と考察］NAP遺伝子が野生型細胞でも発現誘導に運ばれ，軸糸以外の鞭毛内に存在しうるということされるのかを調べるため，様々な条件に置いたクラミが明らかとなった．このことはダイニンが軸糸に構築

ドモナス細胞のNAP mRNA 量を測定した．その結果， されていく過程に，これら２種のアクチンがどのよう栄養増殖している細胞を脱鞭毛処理した後にNAPに関与しているかという問題に重要な手がかりを与mRNA 量が一過的に増大することがまず明らかとえるものと考えられる．

なった．この増減パターンは，多くの鞭毛構成蛋白質［文献］のmRNA に典型的なものであった．また，再生した直1) Kato-Minoura, T., et al. (1997) J. Cell Biol. 137, 649-

後の鞭毛を単離してウェスタンブロットで解析した
ところ，NAPは新生鞭毛の軸糸に含まれていることがわかった．ida5鞭毛ではもともとNAPはアクチンの代

656.
2) Kato-Minoura, T., et al. (1998) Biochem. Biophys.
Commun., 251, 71-76.

わりとして内腕ダイニンに含まれるが，野生型でも鞭毛が形成される時期に限ってダイニンに含まれるこExpression and flagellar localization of a divergent actin in Chlamydomonas.
Masafumi Hirono1, Satomi Uryu1, Kokoro Ozaki1, Takako Kato-Minoura2, Ritsu Kamiya1,2 (1Department of Biological
Sciences, University of Tokyo; 2Institute for Basic Biology)

原生動物学雑誌 第34巻 2001年

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種間大核置換後の細胞の成長と形態変化：Paramecium caudatum の無大核細胞に P. bursaria の大核を移植した場合○山田 貴之，見上 一幸（宮城教育大・EEC）［目的］繊毛虫類は生殖核としての小核と、栄養核いない細胞から大核を除去して大核を移植したととしての大核を持っており、ＤＮＡを持つ細胞内小ころ、１１例中２細胞で細胞分裂が起こり、３ク器官を除けば、細胞はほぼすべて大核遺伝子の支配

ローン得られた。移植後の最初の分裂は２４~４８のもとにある。しかし、表層パターンの決定は大核時間後に起こった。この３クローンにおいて移植後遺伝子に独立であるとも考えられていることから

２分裂後の４細胞はP. caudatum とP. bursaria の中本研究では既存パターンが大核の支配のもとに細間の形を示した。８分裂後では細胞の形は、大型で胞分裂時に変更されるのか、分裂を経ずに変更が始はあるがP. bursaria の形に近かった。約５０分裂後

まるのか、あるいは分裂後も変更されないのか、とになってから、P. caudatum のミトコンドリアが移いう疑問に対する解決の糸口を探る目的で種間大植された細胞にあるかどうか調べた。P. caudatumに核移植を試みた。

特異的なプラ スミドがＰＣＲにより検出 されな［方法］本実験では、受容細胞としてP. caudatum株

かったことから、ミトコンドリアはP. bursaria型に16BKNs2(CNR、TND)を用い、細胞の表層構造が異な置き換わったと考えられる。このように異種の大核るP. bursaria 株YF1(野生型) を供与細胞として用いを入れ換えた細胞が分裂したことから、現在、再現て大核置換を行なった。

性を確認するとともに、移植後の表層構造変化を追

種間大核移植では、まず受容細胞の大核を除去うことにしている。

し、約１時間後に供与細胞から大核を移植した。種［文献］

間の細胞形比較は、細胞の長軸に対する前部横軸、

1)

中部横軸、後部横軸それぞれの比で行なった。

Mikami, K and Koizumi, S. (1982) Exp. cell Res.
137：379-402

P. caudatumのミトコンドリアの存在を、P. caudatumに特異的なプラスミド（月井ら、私信）を確認することによって知った。
［結 果 と 考 察］こ れ ま で 同 種 間 大 核 移 植 は、P.
tetraureliaで初めて報告1)されて以来、P. caudatumでも成功している。本実験でP. caudatum株ＫＮＺ 2で大核除去後の細胞に大核移植を試みたところ、２７例中８例で成功した。種間大核移植においても供与
細胞、受容細胞ともに定常期２日目の細胞を用いて、１００例以上試みたが、すべて細胞は分裂せずに死んだ。大核を移植しなかった無大核細胞に比べ、生存期が伸びたとはいえない結果であった。また、突然変異株を用いてのコンプリメンテーション
テストにおいても移植大核の遺伝子発現を示す結果は得られなかった。
次にすでに分裂の準備のできた細胞を受容細胞として用いた。すなわち、平均分裂時間の８.５時間を越え約９時間を経過しても、まだ分裂を開始してGrowth and morphological changes of the cells after interspecies macronuclear replacement: Evidence on the clones
derived from amacronucleates of Paramecium caudatum transplanted with the macronucleus of P. bursaria.
By Takayuki Yamada and Kazuyuki Mikami (EEC, Miyagi Univ. of Educ.)

Jpn. J. Protozool. Vol. 34, No. 1. (2001)

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ゾウリムシの接合後における旧大核機能の解析―MRテストは有効か？―○木村 直美，見上 一幸（宮城教育大・環境研）［目的］繊毛虫ゾウリムシ（Paramecium caudatum ）は、 また、接合完了時、第1細胞周期で観察された約40個の大核と小核という機能及び形態の異なる2種類の核を

旧大核（断片）は、第9細胞周期まで減少することも増持ち、有性生殖後、小核から新大核が分化する1)。この加することもなく保存されることが確認された。これ

時、旧大核は断片化し、退化する。しかし、旧大核は、 は、アポトーシス様の現象が起こり退化するといわれ
大核原基が分化しなかったときや、大核原基が不等分るTetrahymenaやP.tetraureliaなどと異なるが、本研究配され、大核原基を持たない細胞が生じたときに再生

では、旧大核の退化像をとらえることが出来ず、積極（MR；Macronuclear Regeneration）2)3)する。大核原基的に消されているという確証は得られなかった。

と共存する旧大核は、４細胞周期まで活発にDNA合成

また、ヘテロカリオンの接合後の表現型を調べるこしているが、その後DNA合成が著しく低下する4)。しとにより、大核原基の遺伝子は、第1細胞周期ですでにかし、その後いつ旧大核が機能を停止し、消失するの発現が始まるが、旧大核の遺伝子発現も第8細胞周期か明らかではない。

まで続くことが明らかになった。

本研究では、接合後のどの周期まで遺伝子発現能

次に旧大核断片の再生能力を調べるために、第6細力を持つのか、また再生能力があるのか、大核原基の胞周期までの時期について大核原基の除去をした。す除去により調べた。

ると、第6細胞周期の細胞でも再生することが確認さ［方法］本研究では、ゾウリムシ（P.caudatum）syngen

れた。しかし、第5,第6細胞周期では、第4細胞周期以3に属す、野生型株KNZ 5（接合型 O）およびKNZ 2（接前の細胞と比較して大核原基を除去してからの最初

合型 E）と行動突然変異株（CNR）であるcnrAの遺伝に起こる分裂までの時間が著しく長くなることが明形質を持ったK16cA6（接合型 E）、K16cA３（接合型

らかになった。新大核（原基）存在下では第4細胞周期O）を使用した。

からDNA合成が抑制されることと何らかの関連があ遺伝子マーカーとなる行動のCNR株を使い、ヘテるものと考えられる。

ロカリオンを作成して、解析した。野生型の無小核の今回の大核原基除去の実験で注目すべき事は第5,受容細胞にCNR株の小核を移植し、小核と大核の遺伝

第6細胞周期の時に大核を除去した場合、そのクロー形質が違う細胞（ヘテロカリオン）を作った。このヘン（MR）は接合活性のないクローンになることが多い

テロカリオンは、野生型の大核を持っているので、テということである。この結果は、大核原基によって旧

スト液に入れたとき逃避行動を起こす。しかし、ヘテ

大核断片が未熟物質の生産を誘導されたということ

ロカリオン同士を接合させた子孫は、新大核の遺伝形を示唆する。この考えが正しいとすれば、従来旧大核質がCNRとなり、テスト液に入れたとき逃避行動を起遺伝子の発現が若返らないと言う考えを根本的に修こさないが、旧大核が機能を示す限り、旧大核の優性正しなければならず、この考えを基本にしている大核形質が表現型として現れる。また、野生型遺伝子の小再生（MR）テストについても再検討する必要が生ず

核とCNRの大核をもつヘテロカリオンも作成し実験る。

に用いた。また、大核原基除去には、マイクロインジェ［文献］

クションを応用した。

1) Mikami, K. (1980) Develop. Biol. 80: 46-55［結果及び考察］接合後8分裂後、すなわち第9細胞周2) Sonneborn, T. M. (1940) Anat. Rec. 78: 53-54

期まで旧大核の存在及びその形態を酢酸オルセイン

3) Mikami, K. and Hiwatashi, K. (1975) J. Protozool, 22:染色により調べたところ、第8細胞周期まで旧大核断536-540片が観察され、第9細胞周期では、観察されなかった。 4) Mikami, K. (1979) Chromosoma (Berl.) 73: 131-142

An analysis of the function of prezygotic macronuclei after conjugation in Paramecium caudatum.
- Is the MR test available? By Naomi KIMURA, Kazuyuki MIKAMI (EEC, Miyagi Univ. of Edu.)

原生動物学雑誌 第34巻 2001年

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Paramecium tetraurelia の増殖に伴う紫外線感受性の変化○山本 奈津子1、小森 理絵2、高木 由臣3（1、2奈良女子大・院・人間文化、3奈良女子大・理・生物）[目的] 繊毛虫Paramecium tetraurelia（ヨツヒメゾウリ
1)、2)ムシ）の紫外線感受性は、分裂加齢

次にこのような変動のパターンが、細胞の分裂回

2)や、細胞周期 、 数と関係しているかどうか調べた。培養開始時の初期

飢餓2) といった細胞の状態によって変動する。ところ

密度を1 cell/ml、10 cells/ml、50〜100 cells/ml、500 cells/で細胞が増殖すると、それに伴って培養液の環境が変

ml、1,000〜1,500 cells/mlと増やし、cultureが飽和密度化すると考えられるが、飢餓の他にもこのような変化に達するまでの集団の倍加数を変えて、それぞれのは紫外線感受性に影響を及ぼさないのだろうか。今回

cultureについて増殖中の細胞の密度と紫外線感受性

我々は、増殖による細胞密度の変化が、その集団のを調べた。その結果、どの場合も同じようなパターン

個々の細胞の紫外線感受性にどのような影響を及ぼ

で、増殖に伴う紫外線抵抗性の上昇と、1,000〜3,500

すか調べた。

cells/mlでのピーク、その後の急激な低下が見られた。

19℃で培養しているcultureから細胞をサンしたがって、この変化は細胞密度に依存しており、培プリングし、細胞密度と紫外線感受性を調べた。分裂

養開始後の細胞の分裂回数によって決まるのではな

中の細胞（divider）をマイクロピペットで集め、同じい。またこのこ とから、高い密度で培 養を始めた

cultureから直前に作成したcell-free mediumの中に入れ

cultureの細胞は、低い密度から始めた場合より少ない[方法]て25℃で1時間おき（大核細胞周期のG1期に当たる）、 分裂回数で紫外線への抵抗性を獲得することが分一定量の紫外線UV-Cを照射した。照射前15分間に、細かった。

胞を400μlのSMB（生理的塩類溶液のひとつ）で一度

これらのことからP. tetraureliaの紫外線応答の機

洗い、さらに100μlのSMBの入ったデプレッションス

構は、細胞密度に由来する未知の要因によって何らか

ライドのwellに1細胞ずつ単離した。この状態で紫外の影響を受けていると考えられる。ゾウリムシでは、線を照射した後、すぐに新しい培養液を300μlずつ加走熱性の行動でも細胞密度の高い方が反応性がよい

え、25℃・暗黒下でインキュベートした。紫外線感受と報告されており3)。単細胞生物において、集団を形成

性は、4日目以降適宜観察して、単離されていた細胞がすることが熱や紫外線へのストレス応答を行う際にそれぞれ数十細胞以上に増殖すれば生存とし、まった

なんらかの利益になっているかもしれないというこ

くいなくなった場合を死亡とした（結果はいずれかでとは、大変興味深い。

あった）。また、cultureは19℃で培養しているが、紫[文献]

外線照射の4時間前までに25℃にして用いた。

1） Smith-Sonneborn J. (1971) Radiat. Res. 46, 64-69[結果] 初期密度１cell/mlから培養を開始し、時間を

2） Yamamoto N., Hayashihara K., Takagi Y. (1997) Zool.

追って細胞密度とLD50の値（50％の細胞が死亡する

Sci. 14, 747-752
3）Tsuchiya Y., Kawakubo T. (1981) J. Protozool. 28, 467-

紫外線量）を調べた。LD50は、細胞密度が増加するとともに上昇し密度2,000〜3,000 cells/mlのときピーク

469になり、その後定常期（密度8,000〜10,000 cells/ml）に達するまでの短い期間に急速に減少した。つまり、P.
tetraureliaは、細胞密度が高くなるにしたがって紫外線に対し次第に高い抵抗性を示すようになり、この抵
抗性は密度2,000〜3,000 cells/mlでピークを迎えた後、急速に失われる。

Change of UV sensitivity with increase of population in Paramecium tetraurelia
By Natsuko YAMAMOTO1, Rie KOMORI2, Yoshiomi TAKAGI3 (1,2Division of Life Science and Human Technology,
Graduate School of Human Culture, 3Department of Biology, Nara Women’s University)Jpn. J. Protozool. Vol. 34, No. 1. (2001)

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ヨツヒメゾウリムシのクローン老化に伴い発現が変化する遺伝子○田辺 寛之, 藤池 昌樹, 吉岡 佐知子（近大・農・生化）［目的］演者らはヨツヒメゾウリムシのクローン寿命

PCR で選択的に増幅しクローン化した。

決定遺伝子の単離を最終目的に，まず短寿命変異株［結果］differential display により得られた４種の遺伝

d4-SL4 (jumyo 変異株) とその野生型親株の 51 株とで子が野生株のクローン老化においていかなる発現様差 次的に 発現し ている ４種の 遺伝子 を differential

式を示すかをノーザン解析で調べたが，若い野生株に

display 法によりクローン化した 1)。これらの遺伝子は特異的な W 遺伝子は老化の全過程で若い時期の発現

いずれもヨツヒメゾウリムシの培養老化の過程で発レベルをほぼ維持しており，一方，jumyo 変異株に特現が変化していた 1)。
この培養老化とクローン老化（通異的な M1 〜 M3 の遺伝子はいずれも老化がどれほど常の概念での老化）との間には何らかの関係が示唆さ

進んでも発現性が上がらず，これらの遺伝子は最初にれているので，これらの遺伝子の発現はクローン老化

期待したような発現の変化を起こさないことがわ

でも変化している可能性がある。そしてクローン寿命

かった。そこで今度はサブトラクション法により目的

決定遺伝子はクローン老化に伴い発現が漸減／漸増の遺伝子の探索をやり直した。同法により得られた遺することが考えられるので，これら４種の遺伝子はそ

伝子の中から野生株のクローン老化の過程で発現がの候補になり得る。そこで今回はこれらの遺伝子のク変化するものを同じくノーザン解析で選抜したとこ

ロ ー ン 老 化 で の 発 現 を 検 討 し た。ま た 今 回 はろ，若い野生株に特異的な遺伝子が２種，jumyo 変異

differential display とは別の差次発現遺伝子単離法であ株に特異的な遺伝子が４種残った。クローン老化の進るサブトラクションによるクローン寿命決定遺伝子

行とともに前者は発現が漸減し，後者は逆に漸増して候補の探索も行った。

おり，これは上で仮定したクローン寿命決定遺伝子の［方法］野生型 51 株のクローン老化の実験はオートクローン老化での発現様式と合致するものである。現

ガミー直後からの６列の単離培養により行い，再現性

在，これらの全長 cDNA の塩基配列の決定を行っていを得るために４回繰り返した。ノーザンブロッティン

るが，その過程で若い野生株に特異的な２種と jumyo

グに供する mRNA はこの単離培養中，適当な間隔で５変異株に特異的な４種のうちの３種はそれぞれ同一回サンプリングして大量培養 (細胞密度：〜 300/ml) し遺伝子の異なった断片であることがわかった。即ち，た細胞から調製した。各 mRNA 抽出時点での細胞の平

今回の探索で若い野生株に特異的な１種と jumyo 変

均分裂齢 (回) と平均分裂速度 (回／日± SD) は次の通異株に特異的な２種が目的遺伝子の候補としてクり：１回目, 21.1 と 3.8 ± 0.32; ２回目, 60.6 と 3.8 ± 0.29;

ローン化されたことになり，今後はこれら３種の遺伝

３回目, 95.3 と 3.2 ± 0.37; ４回目, 139.0 と 2.7 ± 0.77;

子を対象に検討を進めていく予定である。

５回目, 167.6 と 2.1 ± 1.00。この間，細胞がオートガ［文献］

ミーを起こしていないことは分裂速度の低下，200 回

1) Tanabe, H., Yoshioka, S. (2000) Jpn. J. Protoz. 33, 29-34.

弱の分裂齢でのクローン死 (単離培養の終了)，Dippell

2) Diatchenko, L. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA

染色液によるチェック，細胞の形態・挙動の変化から

93, 6025-6030; Gurskaya, N. G. et al. (1996) Anal.

確認した。サブトラクション法 2) では，オートガミー

Biochem. 240, 90-97.

直後の若い野生株のみに発現している遺伝子は同株
由来の cDNA と jumyo 変異株由来の過剰量の cDNA とをハイブリダイズさせ共通種の cDNA を除去し，またjumyo 変異株のみに発現している遺伝子はその逆の操作を行い，その後に残ったいずれか一方の cDNA を

Paramecium tetraurelia genes expressed in an age-dependent manner.
By Hiroyuki TANABE, Masaki FUJIIKE & Sachiko YOSHIOKA (Biochem. Agric. Kinki Univ.)

原生動物学雑誌 第34巻 2001年

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Blepharisma の異種間グラフト〇近藤 雅方・高橋 三保子（筑波大・生物）［目的］繊毛虫Blepharismaはいくつかの種に分けら

２，グラフトから１日後（１回分裂後）

れ、それぞれの種はそれぞれの種独自の形態を持つ。

体長は一方の双体（双頭）の短いほうが、大きめ

例えばBlepharisma japonicumの体長は約250μｍで核はのB. americanumともB. japonicumとも言えるもの

紐状、口部左側の膜板をなす繊毛列数は約100本なのだった。また核の形状は、B. americanumの数珠状のに対して、Blepharisma americanum の体長は約160μｍ

核は見られなかったが、B. japonicumのものとしてはで核は数珠状、口部繊毛列数は約60本である。この種

短い核が1つ観察できた。これは手術の際に切れたB.

独自の形態は安定していてそれぞれの大核と口部を

japonicumの核が残っている、もしくはB. americanum

損傷しても、もとの形態に回復する。

の核が紐状になったとも考えられる。そして口部繊ではB. japonicumとB. americanumを融合させるとそ

毛 列 数 は、一 方 の 双 体（双 頭）の 短 い ほ う で B.

れぞれの種独自の形態は安定で、そのまま維持される

americanum の 特 徴 が 見 ら れ た ほ か は、す べ て B.

のであろうか。前述の通りこの種独特の形態は安定であるが、この形態がどのようにして形成されているかは分かっていない。今までのところTartarによって
1）

japonicumの特徴を示していた。
３，グラフトから6日後（2から3回分裂後）
体長は、2個の細胞で大きめのB. americanumともB.

Stentorの異種間グラフトが報告されているが 、本研

japonicumとも言えるものだったほかは、B. japonicum

究はBlepharismaで異種間グラフトを行い形態的変化の特徴を示していた。また核の形状は、全て紐状でを観察することにより、この疑問に答える研究の一環

B. americanumの数珠状の核は見られなかった。口部としている。

繊毛列数は、全ては確認できなかったが確認できた［方法］グラフトする細胞としてB. japonicumのT121、部分から推定してB. japonicumの特徴を示していた。

B. americanum var americanumのBを使用した。培養液

４，グラフトから2週間後の細胞（20回以上分裂後）

は、Dryl's solutionにレタス浸出液を加え、Klebsiella

観察した細胞で1つのクローンをのぞき、体長、核

pneumoniaeを植菌したものを用い、約25℃で培養しの形状、口部繊毛列数いずれもB. americanumの特徴た。

は失われ、B. japonicumらしい特徴を示した。1つのクグラフトは、まずスライドグラスに1.8％のメチルローンで例外となったのは標本数が少なかったた

セルロースを１滴おき、その中にT121、Bそれぞれの十めであろう。

分大きな細胞を入れる。次に２細胞とも背側を微小針

以上、B. japonicumとB. americanumの異種間グラフト

で切り開き、傷口同士が重なるように20秒から1分間

ではB. japonicumの体長と核の形状、口部繊毛列数の特押さえつける。上手く重なると2細胞は融合するので、 徴は維持されるが、B. americanumのこれらの特徴は
1日1％メチルセルロースで培養し培養液に移した。
グラフトした細胞は、3時間後、1日後、6日後、2週間後の細胞をそれぞれprotargol染色して体長と核の形

徐々に失われていくことが観察された。
［文献］
1）V. Tartar, (1953), J. Exp. Zool., 124, 63-104状、口部繊毛列数を観察した。
［結果と考察］ １，グラフトから3時間後
体長、核の形状ともにそれぞれB. japonicumと B.
americanumの特徴を維持していた。ただ口部繊毛列数はB. japonicumの特徴を示したものと、B. americanumより多いものがあった。

Heteroplastic grafting of Blepharismas
Masanori KONDO , Mihoko TAKAHASHI (Inst. of Biol. Sci., Univ. of Tsukuba)Jpn. J. Protozool. Vol. 34, No. 1. (2001)

22

39

ブレファリスマにおける光シグナリング：色素顆粒内プロトン濃度変化の解析○安田 正治・松岡 達臣（高知大・理・生物）[目的] 繊毛虫ブレファリスマ（Blepharisma japoni-とを意味している。すなわち、生きた細胞の色素小胞cum)は、細胞膜直下に規則的に並ぶ多数のピンク色の内の膜間部（図１）のH+濃度が光刺激依存的に変化し色素小胞をもつ。色素小胞内の内膜（顆粒膜）上には、 たならば、生細胞の蛍光強度が変化するはずである。
キノン分子（通称ブレファリスミン）／200 kD膜タン

我々は、Ca2+（H+）イメージングシステムを使って、パク質複合体が局在する（１）。ブレファリスミン／

光依存的in vivo蛍光強度の変化を分析した。その結果、

200 kD膜タンパク複合体は、光回避反応（２）に関わ

光回避反応に先立って、光感受性をもつ前端部のみにる光センサーとして働いている。ブレファリスミン光

おいて蛍光強度が小さくなる（H+濃度が低くなる）こ

シグナリングは、最終的に細胞膜の脱分極を引き起ことが分かった。以上の結果より、色素小胞膜間スペーす。我々は、脱分極を引き起こす陽イオンの働きを知スのH+濃度が光依存的に減少することが示唆された。

るため、陽イオン感受性蛍光指示薬を用いて膜近傍の色素小胞膜間スペースのH+濃度減少は、H+が別の区画

陽イオン濃度変化解析を試みてきた。しかし、ブレ（色素小胞マトリックスまたは色素小胞外）へ移動す

ファリスミン自家蛍光を完全に排除することや、陽イることによってもたらされると考えられる。

オン感受性蛍光指示薬を細胞内の特定の空間に導入

現在、色素小胞外膜から細胞質ゾルへ光依存的にH+することが極めて困難であるため、確かな結論を得るが輸送されるか否かについて検討している。現在までことができなかった。

の予備実験では、この仮説を支持する結果を得てい最近、我々はブレファリスミン分子の蛍光強度がH+る。以上の結果から、光刺激によって色素小胞から細濃度依存的に著しく変化することを発見した。そこ

胞膜近傍に放出されたH+が、細胞膜を脱分極させるもで、ブレファリスミン分子をH+指示薬として利用するのと推察される。

ことによって、色素小胞膜間部分での光依存的H+濃度[文献]

変化の解析を試みた。

1) Matsuoka,T. et al. (1994) Photochem.Photobiol.,60:[方法] ブレファリスミン分子はアセトン抽出し、エバポレーターを用いて乾燥させた後、10 mMコール酸

598-604.
2) Matsuoka,T (1983) J. Protozool., 30: 409-414.

ナトリウムを含む溶液に溶解した。ブレファリスミン
色素顆粒（内膜部分）は、細胞に低温ショックを与えることによって単離した。単離色素と色素顆粒の蛍光
強度は、日立蛍光分光度計（タイプRF-510)を用いて測定した。生きた細胞の蛍光強度変化およびイメージン
グはイメージ解析システムARGU-50/CA（浜松ホトニクス）を用いて行った。
[結果・考察] 可溶化したブレファリスミン色素の蛍光強度は、外液のH+濃度の上昇に伴って著しく上昇した。一方、色素の蛍光強度はCa2+やK+の影響をほとん
ど受けなかった。さらに、単離した色素顆粒の蛍光強度も外液のH+濃度依存的に上昇した。この結果は、色素顆粒の膜上に存在するブレファリスミン分子が、外図１ 色素小胞膜間スペースからのＨ＋輸送

液のH+濃度変化に反応して蛍光強度を変化させたこ

Photosignaling in Blepharisma: Analysis of proton concentration in pigment granules.
By Masaharu YASUDA, Tatsuomi MATSUOKA (Dept. Biol., Kochi Univ.)

原生動物学雑誌 第34巻 2001年

40

23

ペラネマの滑走運動に対する２価陽イオンの関与○齊藤 育, 洲崎 敏伸（神戸大・理・生物）［目的］前回は、ペラネマの滑走運動の原動力が主にろ、鞭毛の表面構造に変化が認められた。鞭毛の表面

鞭毛表面のサーフィスモティリティーであり、滑走運のマスティゴネマは、コントロールでは鞭毛の長軸に動には細胞外液中にCa2+ イオンが必要であることを対して斜め前方を向いていたのに対し、キレート剤で報告した。今回はCa2+の存在下と非存在下で鞭毛の表処理した細胞では垂直に向いていた。この結果は、マ面構造において変化が生じているのかを調べる目的

スティゴネマの方向性が滑走運動の発現に関係して2+で、透過型電子顕微鏡観察を行った。また、Ca 以外

いる可能性を示唆している。一方、0.001% RR処理によの多価陽イオンの効果についても調べた。さらに、ペりペラネマの滑走運動が阻害されることがわかった。

ラネマをルテニウムレッド (RR) で処理することにこれについても同様に電顕観察を行ったところ、RR

よっても、滑走運動が阻害されることがわかった。そ処理によってもマスティゴネマの構造に変化が生じ

こで、RR処理による鞭毛の表面構造の変化についてていることがわかった。コントロールでは全ての種類

も電顕観察を行った。

のマスティゴネマは湾曲しているが、RR処理のマス［方法］Mg2+、Cd2+、Co2+、La3+、Mn2+などの多価陽イ

ティゴネマではショートタイプのものは直線的とな

オンとルテニウムレッドの滑走運動への影響は、それり、ミディアムタイプやロングタイプのものは量が減ぞれを含む水溶液でスライドグラス上を灌流させる

少し、湾曲の度合いも減少していた。これらの結果よこ と に よっ て 行っ た。Free-Mg2+ の 濃 度 は Ca-EGTA

り、マスティゴネマの構造と、滑走運動との間には密

buffer programによって計算した。また、Free-Mg2+の濃接な関係があることがわかった。

度による滑走速度の測定に用いたもの以外の溶液中にはすべて0.01% Knop 液が含まれている。滑走速度、
ビーズの移動速度の測定と画像の取り込みには、それぞれXL-20 (Olympus)、MR-1500 (Konica)を用いた。鞭毛の表面構造の観察には、10 mMのEGTAあるいはEDTAを含むグルタールアルデヒド前固定液を用いた。一方、RR染色については、固定液を加えたときの濃度が0.1％になるように調整した。観察には透過型
電子顕微鏡JEOL JEM-1010を用いた。
［結果及び考察］これまでの我々の研究から、ペラネ
マの滑走運動は、鞭毛表面におけるサーフィスモティ
リティーによって生じていることが確かめられている。そして、その運動の発現には２価陽イオンが必要
で、特にCa2+ が必要であることをこれまでに報告した。滑走運動には10-6 M以上のCa2+が必要であったが、Mg2+は10-3 M以上が必要であった。２価陽イオンが滑走の運動機構にどのように関与しているのかは不明
であるが、これらのイオンが鞭毛の表面構造の保持に必要とされている可能性が考えられる。そこでEGTA
やEDTAで処理した細胞を固定して電顕観察したとこ

Involvement of extracellular divalent cations in gliding motility of Peranema trichophorum
By Akira SAITO and Toshinobu SUZAKI (Department of Biology, Faculty of Science, Kobe University)Jpn. J. Protozool. Vol. 34, No. 1. (2001)2441

タイヨウチュウの放出体に含まれる糖タンパク質gp40による細胞融合○村上 裕美・畠山 真由子・洲崎 敏伸（神戸大学・理・生物）［目 的］原 生 動 物 の 一 種 で あ る タ イ ヨ ウ チ ュ ウの先端が触れあう程度の距離であることが分かった。

Actinophrys solは、餌を捕食する際に、エクストロソー

それに対し、gp40を与えたモデルでは、タイヨウチュ

ムから、糖タンパク質gp40を含む物質を放出し、軸足

ウは細胞同士が融合する距離（29.2 µm）で最も安定なに餌虫を接着させる。タイヨウチュウの捕食行動に関状態になることが計算された。

するgp40の生理的機能を調べた結果、gp40はタイヨウ

そこで、タイヨウチュウ同士が反発、誘引を及ぼす

チュウの集団化を引き起こすことが明らかとなって仕組みを理解する為、ポリスチレンビーズを用いて軸いる。細胞間の相互作用を数理統計学的手法を用いて足の表面での移動を測定した。その結果、Controlの細解析した結果、gp40はタイヨウチュウ同士の誘引力を

胞では、軸足の先端に向う約1.1 µm/sの速度のサー強め、細胞間距離を縮める作用を示すことが分かっ

フィスモティリティーが観察された。一方、gp40処理た。そこで、このような細胞間の誘引・反発力が形成をすると、移動の方向が逆転し、ビーズは軸足上を約される仕組みを調べる目的で、タイヨウチュウの軸足

0.78 µm/sで細胞体に向かって移動した。また、軸足上表面に付着した物質の移動と、細胞質の流動の速度をを瘤状の細胞質が移動するのも観察さた。Controlで測定した。さらに gp40による細胞体の融合の様子をは、軸足内の細胞質は方向が不規則に移動している

電子顕微鏡により観察した。

が、gp40を与えると、細胞質は軸足上を細胞体側に約［方法］gp40は、冷凍タイヨウチュウをホモジナイズ

1.1 µm/sの速度で移動し、軸足基部が太くなることがした後、Concanavalin Aアガロースによるアフィニ

明らかとなった。Controlに見られる軸足表面での物質

ティークロマトグラフィーにより精製した。gp40をタ

移動は、個体間の反発や自浄作用に役立っていると考イヨウチュウに与えて、配置パターンの変化を光学顕えられる。gp40処理後の軸足表面での物質輸送方向の微鏡を用いて観察した。またgp40を与えた時のタイヨ

逆転は、大形餌虫を捕食する際のコロニー形成や、軸ウチュウの個体配置パターンの変化を、ポテンシャル

足先端に付着した餌が細胞体に運ばれる際の原動力関数を用いて解析した。さらに、ポリスチレンビーズになっていると考えられる。

をタイヨウチュウに与え、細胞表面での物質輸送の速さらに、gp40を与えた後のタイヨウチュウの形態変度を測定した。また、軸足内の細胞質の流動速度も測化を電子顕微鏡で観察した結果、タイヨウチュウの細定した。最後に、タイヨウチュウにgp40を与え、融合胞表面上にエクストロソームが放出され、仮足が多数した細胞を電子顕微鏡で観察した。

見られた。また、軸足を観察すると、軸糸微小管の構［結果及び考察］ 精製gp40を直接タイヨウチュウに造は保たれたまま、軸糸の周囲に存在するContractile

与えると、タイヨウチュウは集団化を起こし、コロ

tubulesが収縮し、粒状化していた。このことから、gp40

ニーをつくった。通常のタイヨウチュウはシャーレなによってContractile tubulesが収縮した結果、軸足上のどの基底面上に定着し生活しているが、この際タイヨ

細胞質の流動が起こるものと考えられる。

ウチュウは隣合う細胞と一定の間隔を保ちつつ規則的な配置パターンを形成する。Controlと、gp40を与えた後の二次元配置図をデータ化し、隣接するタイヨウ
チュウ間の相互作用を、細胞間距離の関数としてポテ
ンシャル解析を行い個体間の誘引・反発の相互作用を
シュミレーションした。その結果、Controlの細胞では、最も安定する個体間距離は131 µmであり、これは軸足Cell fusion of heliozoons by the extrusomal glycoprotein gp40
By Hiromi MURAKAMI, Mayuko HATAKEYAMA and Toshinobu SUZAKI (Department of Biology, Faculty of Science, Kobe University)

原生動物学雑誌 第34巻 2001年

42P1

水質および季節による繊毛虫相の変動○長田 典子1，松坂 理夫2（1熊本大・自然科学研究科・自然システム；2熊本大・
理・環境理学）［目的］ゾウリムシに代表される繊毛虫は、一般に有プが多くいたことは、この地点は有機物量が多いこと

機物汚染の進んだ水域に生息していると思われていを示唆しているのであろう。

る。しかし、実際には湧水域のような有機物汚染のな

個体数は、それぞれのグループに適した餌が豊富にい水域でも発見することができる。また、身近な水域あることによって増加する。そして種数は（Ａ）グルーで発見できる反面、水質に敏感であり種毎に生息できプの増殖により、（Ａ）グループを餌とする（Ｂ）・

る環境が限られているとも考えられている。本研究で（Ｃ）グループが出現し増殖することによって増加すは、今後の研究の基礎段階として、水域環境におけるる。ゆえに、個体数・種数の多少には（Ａ）グループ

繊毛虫の生物指標としての有用性を確かめてみた。

の増殖のもととなる有機物の存在が大きな影響を与［方法］有機物汚染がありそうな水域（坪井川）、逆

えていると考えられる。よって、個体数・種数がともに少なそうな水域（上江津湖）、それらの中間的であに多かった坪井川には有機物量が多く、逆に個体数・

ろう三つの水域（白川・竜田山の池・飼育池の溝）を

種数が少なかった上江津湖には有機物量が少ないと採取地点として選び、1999年4月から2000年3月まで月

言えるであろう。

一度の間隔で採取を行った。プラスチックチューブでBOD値の測定結果は、坪井川が最も高く、上江津湖

採取してきた試料水10mlを実体顕微鏡で観察し、個体が最も低い傾向があった。BOD値と繊毛虫相を比較し数を数え、一個体づつ単離・培養した。個体数が増えてみると、繊毛虫の個体数・種数が多い坪井川ではた後、プロタルゴール染色法、鍍銀染色法を用いて繊BOD値は高く、少ない上江津湖ではBOD値も低いと毛虫を同定した。各採取地点では、水温、pH、溶存酸言う結果になった。水質評価基準の一つであるBOD値

素量を測定し、研究室では持ち帰った試料水をもとにと繊毛虫相による有機物汚染度の判定は一致し、水質

生物化学的酸素消費量（BOD）を測定した。

環境における繊毛虫の生物指標としての有用性を確［結果及び考察］個体数は、飼育池の溝（587個体）がかめることができた。

最も多く、次に坪井川（544個体）、最も少なかったの

今後の研究は、BOD値のほかに全窒素・全リンも測は上江津湖（57個体）だった。種数は、坪井川（33種） 定し、有機物の存在をより確実なものとし、水質とそが最も多く、上江津湖（11種）が最も少なかった。飼こに生息している繊毛虫相の関係を明らかにしてい育池の溝の種数は18種と個体数のわりには多くなきたいと思う。

かった。これは、飼育池の溝が閉鎖的な空間であり、ある一定の種が優占種となり、個体数が増加していたためだと考えられる。
各調査地点で発見できた繊毛虫を食性をもとに、バクテリアを餌とするグループ（Ａ）、主に珪藻や緑藻などの藻類または小型の鞭毛虫・繊毛虫を餌とするグループ（Ｂ）、主に肉食性のグループ（Ｃ）の３グルー
プに分けてみた。すると、上江津湖では（Ｂ）グルー
プしか観察されず、坪井川では他の採取地点よりも（Ａ）グループが多く観察された。（Ａ）グループの存在は、餌となるバクテリアがいるはずなので、有機物の存在が考えられる。よって、坪井川に（Ａ）グルー

Changes in ciliate fauna caused by water qualities and seasons
By Noriko NAGATA1 and Tadao MATUSAKA2 (1Syst. Nat. Env., Grad. Sch. Sci. Technol., and 2Dept. Env. Sci., Fac.
Sci., Kumamoto Univ.)Jpn. J. Protozool. Vol. 34, No. 1. (2001)

P2

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ネパールに生息するスイギュウ (Bubalus bubalis ) ならびにヤギ (Capra
hircus ) のルーメン内繊毛虫相について○宮崎 裕1・島村 麻子1・池 和憲1・森田 達志1・小林 好作2・今井 壯一1（1日本獣医畜産大学・獣医寄生虫学教室、2麻布大学・内科学教室）［目的］反芻動物のルーメン内繊毛虫相は，宿主の種がある。従って，これらの繊毛虫は，スイギュウの起やその生息地域により特徴を持つことが知られてい源であるインド，インドネシアからネパールに至るまる．今回は，ネパール産スイギュウとヤギのルーメン

でに他種反芻動物から伝搬されたものである可能性

内容を入手する機会を得たのでその繊毛虫相を調査が考えられた．家畜，野生のスイギュウ間で検出されし，互いの繊毛虫相および周辺地域のそれとの比較をた繊毛虫種に明瞭な差は認められなかった．ネパール

行った．

では家畜，野生間で食物の種類の差がないこと，頻繁［材料］採材はスイギュウ 6 頭（野生 3 頭，家畜 3 頭）， に接触の機会があることが理由であると考えられた．
ヤギ 10 頭から行い，採取後直ちに，MFS 液 (6) に 懸濁

スイギュウは "river type"と "swamp type" に大別され

し固定，核染色を施した．属別構成比および原虫密度

るが，既報の "river type" で報告されている繊毛虫相にの計数、繊毛虫種の同定は主として Ogimoto & Imai (6)本調査結果を加えると，計 60 種 20 型の繊毛虫が検出を参考とし，高次の分類は Imai (4) に従った．

されたことになり，そのうち 33 種 11 型は "swamp［結果および考察］平均原虫密度はスイギュウ，ヤギ， type" との共通種であった。共通種ではない 27 種 9 型
1.26 (0.6-2.4) ×105 / ml， 1.73 (0.3-6.8) ×105 / ml で、一中 3 型以外は，いずれも検出された地域の近隣に生息

般反芻動物の原虫密度 (2) と大差はなかった．検出さする反芻動物から検出されており、他種反芻動物の影

れた繊毛虫はスイギュウ 12 属 32 種 11 型，ヤギ 9 属

響を強く受けていることが伺えた。

22 種 12 型で，新種ならびに新型は検出されず全てこ［文献］

れまでに報告されているものであった．１宿主あたり

1) Das-Gupta, M. (1935) Arch. Protistenkd. 85. 153-172.

の平均出現種数はスイギュウで 16.8 ± 3.25 (12-22)

2) Dehority, B. A. (1986) Insect Sci. Appl., 7. 279-296.

種，ヤギでは 11.6 ± 1.84（9-15）種であり，差はなかっ

3) Imai, S. (1984) Jpn. J. Vet. Sci. 46. 391-395.

た．ま た 属 別 構 成 比 は，ス イ ギ ュ ウ・ヤ ギ と も に

4) Imai, S. (1998) J. Appl. Anim. Res. 13, 17-36.

Entodinium 属の占める割合が高かったが，ヤギの方で5) Imai,S. and Ogimoto,K. (1984) J. Vet. Med. Sci. 55. 576-より高かった。この差は grazer であるスイギュウとbrowser であるヤギとの食性の違いによって生じたものと考えられた．

583.
6) Ogimoto, K. and Imai, S. (1981) Jpn. Sci. Soc. Press,
Tokyo.

本調査でスイギュウから，熱帯の反芻動物特有の繊毛虫と考えられている， Entodinium chatterjeei, Entodinium longinucleatum forma spinonucleatum, Entodinium
longinucleatum forma spinolobum, Ostracoidinium trivesiculatum が検出され，さらに，Polymorphella bovis,
Entodinium ekendrae, Diplodinium cristagalli の 3 種はス
イギュウから初めて検出されたものであった，P.
bovis, D. cristagalli はタイのコブウシ (3, 5) から，E.
ekendrae, D. cristagalli はインドのヤギ (1) からの報告

Rumen ciliate fauna of water baffalo (Bubalus bubalis) and goat (Capra hircus) in Nepal
By Yutaka MIYAZAKI1, Asako SHIMAMURA1, Kazunori IKE1, Tatsushi MORITA1, Kosaku KOBAYASHI2, Soichi
IMAI1 (1Department of Veterinary Parasitology, Nippon Veterinary and Animal Science University, 2Department of Internal Medicine, Azabu University)

44

原生動物学雑誌 第34巻 2001年

P3培養細胞（HCT-8）系を用いたクリプトスポリジウムの培養と原虫増殖の定量法の検討

Fernando M. HERMIDA1，木俣 勲1，○井関 基弘2（1大阪市大・医・医動物，2金沢
大・医・寄生虫）［目的］クリプトスポリジウム症に有効な治療薬はまし，顕微鏡的に計数が可能であった。原虫の染色にポだ見つかっておらず，そのスクリーニングには簡便でリクローナル抗体を用いたことで，スポロゾイト，ジ

正確なアッセイ系の確立が欠かせない。これまでは感

ゾント，メロゾイト，ミクロガメート，マクロガメー

染マウスの系を用いて薬剤の有効性を評価してきたト，オーシストなど，全ての発育ステージの原虫を観が，高価な免疫不全マウスの使用が必須であること， 察することができた。また，接種オーシストをテキサ
判定までに数週間を要すること，糞便中に排出される

ス赤標識抗体で前染色し，培養後は FITC 標識抗体でオーシスト数の顕微鏡的定量に多大の労力を要する

染色することにより，接種したオーシストと新しく形ことなどから，多種類の薬品を短期間にスクリーニン

成されたオーシストとの鑑別が可能になった。さらグすることは困難であった。今回，ヒトの大腸癌由来に，DAPI 染色により，宿主細胞の核と原虫の核を明瞭上皮細胞（HCT-8）培養系にクリプトスポリジウムをに区別して観察することができ，原虫の発育ステージ

感染させ，原虫の増殖を経時的に定量する方法についの判別も可能であった。また，その鑑別は微分干渉観て検討した。培養系中の原虫数の定量には，蛍光抗体

察を加えることでより容易になった。 以上の結果か染色による顕微鏡的観察，ELISA法，PCR法による原ら，薬剤の抗クリプトスポリジウム効果の判定に培養虫のDNA量やmRNA量の定量などが考えられるが，今細胞系を用いることは，従来のマウス感染系を用いる

回は蛍光抗体染色法による顕微鏡的定量法を試みた

方法よりも，時間・労力・経費を大幅に削減できるこ

結果について報告する。

とが判った。しかし，原虫は培養チャンバー中に均等［方法］接種オーシストはヒト由来のCryptosporidiumに分布して増殖するのではなく，部分的に集塊をな

parvum (HNJ-1株）で，0.5％次亜塩素酸ナトリウムで処す。したがって，各ウェルの原虫数を正確に比較・定理後，ポリクローナル抗クリプトスポリジウム・ウサ

量するには，顕微鏡で多数の視野を観察する必要が

ギ IgG 抗体とテキサス赤標識抗ウサギ IgG ヤギ抗体あった。 今後，この培養法をさらに改良するとともとで前染色した。HCT-8 細胞は８穴チャンバースライに，原虫数の定量には ELISA 法と，定量的 PCR 法にドで培養し，細胞が１層に広がった段階で前記オーシ

ついても比較検討を進めることが必要である。

ストを１×10４個／well 接種した。37℃で24，48，72時
間培養後，冷メタノール・アセトン（1：1）液で10分間固定，抗クリプトスポリジウム・ウサギ IgG 抗体とFITC 標識抗ウサギ IgG ヤギ抗体とで染色，さらに２µg/ml の DAPI 液で５分間染色，DABCO で封入し，落射型蛍光・微分干渉顕微鏡で観察した。テキサス赤の蛍光観察にはＧ-励起フィルター，FITC の観察にはＢ励起フィルター，DAPI 染色の観察にはU-励起フィル
ターを用いた。
［結果と考察］接種したオーシストから，培養細胞系
でスポロゾイトが脱嚢して HCT-8 細胞に侵入・増殖
し，メロゴニーおよびガメトゴニーが進行。24時間，48時間，72時間と，時間の経過とともに原虫数は増加
Cultivation of Cryptosporidium parvum Using HCT-8 Cell Line and Quantification of the Parasite Growth.
By Fernando M. HERMIDA1, Isao KIMATA1, Motohiro ISEKI2 (1Osaka City Univ., 2Kanazawa Univ.)Jpn. J. Protozool. Vol. 34, No. 1. (2001)

P4

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Entamoeba invadensの増殖、シスト形成、多核化に及ぼすサイトカラシンＤの効果○牧岡 朝夫、熊谷 正広、大友 弘士（ 慈恵医大・熱帯医学)、小林 正規、竹内 勤（慶応大・ 医・ 熱帯医学・寄生虫学）［目的］アクチンフィラメントは真核生物においてラシンＤによる栄養型の多核化はそのシスト形成に

種々の細胞運動を担うことが明らかになっている。こ

抑制的に作用することが明らかになった。

れらの機能を解明するうえでアクチン重合の特異的［文献］

阻害剤であるサイトカラシンが広く用いられてきた。 Makioka, A. et al. (2000) Parasitol. Res.86, 599-602.
赤痢アメーバにおいてもサイトカラシンを用いた研究から、アメーバの標的細胞への接着およびその破壊においてアクチンフィラメントが重要な役割を担う
ことが明らかになっている。そこで今回、Entamoeba
invadensを用い、その増殖、シスト形成、多核化に及ぼすサイトカラシンの効果を検討した。
［方法］サイトカラシンとしては最も強力でかつ特異性の高いサイトカラシンＤを用い、E. invadens IP-1株の栄養型を無菌培養系で増殖させ、シスト形成は栄養型をシスト形成液（47% LG）に移すことにより誘導した。
［結果及び考察］種々の濃度のサイトカラシンＤ存在下での増殖ならびにシスト形成を比較した結果、サイ
トカラシンＤは栄養型の増殖を抑制するとともにシスト形成も抑制し、シスト形成に有効なサイトカラシ
ンＤの濃度は増殖に有効な濃度よりも低かった。この結果からシスト形成におけるアクチンフィラメント
の関与が初めて明らかになった。サイトカラシンは核分裂には影響を与えず、細胞質分裂時に出現する収縮

Figure 1. Effect of cytochalasin D on the growth andencystation of Entamoeba invadens.

環の形成を阻害することにより細胞を多核化する作用があることが真核細胞において報告されている。そこで、サイトカラシンＤ存在下で培養した栄養型をコーン染色し虫体当たりの核数を調べた結果、３核以上を持つ栄養型は対照では5%であったのに対し、サ
イトカラシンＤで処理した栄養型では71%に達し、多核になっていることが明らかになった。また、サイト
カラシンＤ処理栄養型はシスト形成液中で多核のシストを形成した。サイトカラシンＤ処理栄養型のサイ
トカラシン存在下でのシスト形成は対照の栄養型に比し、より強く抑制された。また、サイトカラシンＤ
処理栄養型のサイトカラシン非存在下でのシスト形
成は対照に比し低かった。以上の結果から、サイトカ

Effect of cytochalasin D on the growth, encystation and multinucleation of Entamoeba invadens.
By Asao Makioka, Masahiro Kumagai, Hiroshi Ohtomo (Dept. Trop. Med., Jikei Univ. Sch. Med.), Seiki Kobayashi &Tsutomu Takeuchi (Dept. Trop. Med. & Parasitol., Keio Univ. Sch. Med.)

原生動物学雑誌 第34巻 2001年

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P5

RAPD法による裸性アメーバ，マヨレラ属の分子系統調査○月井 雄二（法政大・教養・生物）［目的］裸性アメーバ，マヨレラ属（Mayorella）は， がって，RAPD法はMayorella属全体の系統を調べるに形態が互いに似通っているため種の識別が難しい。そは不適当である可能性が高い。今後は，より進化速度

こで，分子的特徴で種の識別を行なう目的で，核DNAが遅い他の分子マーカー（SSrRNA遺伝子等）を用いてを鋳型としたRAPD-PCRによる属内の分子系統調査

調べる必要がある。

を行なった。
［方法］Mayorella属13株（M. leidyi 6株, M. penardi 1株,
M. lacona 3株, M. godesae 1株, M. oclawaha 1株, M.
viridis 1株），および近縁と考えられるKorotnevella属2株をChlorogniumを餌に培養し，定常期に達した後で細胞を集めてSDS/phenol抽出を行った。得られた核酸分画を鋳型としてRAPD-PCR（0.5 min at 90℃ for
denaturation, 1.0 min at 30 ℃ for annealing, 4.0 min at 50℃ for extension, 30 cycles）を行い，得られたRAPDバンドについて株間の一致率を求め，UPGMA法で系統樹を作成した。
［結果及び考察］SDS/phenol抽出サンプルを電気泳動したところ，Mayorella属およびKorotnevella属いずれにも核酸（DNA, RNA）成分以外に多糖類と思われるバンドがあった。そして，Korotnevella属のバンドはMayorella属のものとは大きく移動度が異なっていた。
この多糖類のバンドはMayorella属の中ではほぼ同じ位置にあった。
さらに，rRNAのサイズもMayorella属とKorotnevella属
は大きく異なっていた。これら多糖類とrRNAの違い
はMayorella属を特徴付ける形質となり得る。
M. viridis, 19-1a株には約8.0-Kbのバンドがあるが，これがプラスミド様の一本鎖RNAであることについて
は本年の日本動物学会で報告した。
作成したRAPD系統樹において，属内の多様性は非常に大きく，種内変異も種間の変異に匹敵するほど大きかった。一方，形態的にM. leiydiと判定される6株の内の5株は，日本各地（東京，栃木，石川）から採集されたものであるにも関わらず，ほぼ一様なゲノム構成だった。これにはMayorella属が有性生殖をしないことが大きく影響していると思われる。
ただし，この系統樹では，株間の違いは最大94％にもなり，違いが飽和に達している可能性が高い。した
Molecular phylogeny of the genus, Mayorella using RAPD-PCR.
By Yuuji Tsukii (Lab. Biol., Hosei University)

Fig. 1. RAPD-PCR法による系統樹

Jpn. J. Protozool. Vol. 34, No. 1. (2001)

P6

47

Acanthamoeba comandoni の38-kDa抗原の性状と特異性○小林 富美恵1，鶴原 喬2，深沢 麻衣子3，福田 稔4，川上 速人5，平野 寛5，辻 守康1(1杏林大・医・感染症，2新潟県環境衛生研・先端技術センター，3東京学芸大・生
物，4杏林大・医・電顕，5杏林大・医・解剖）[目的] Acanthamoeba は、シストの形態的特徴によって Group Ⅰ (astronyxids)、Group II (polyphagids)、GroupⅢ (culbertsonids) の３つに大別されている (Pussard &Pons, 1977)。こ れ ら の う ち Group Ⅰ に 属 す る
Acanthamoeba comandoni は、栄養体やシストが他種に比べて大型であることや、シスト期のアーム数が多い
こと、増殖の最適温度が比較的低く且つシスト化しにくいことなど特異な性状を有する。しかし、それを構成する抗原タンパク分子の性状や特異性などについては報告が極めて少ない。我々は、A. comandoni の特異抗原の解析を目的としてポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体 (mAb) を作製し、それらが認識する抗原のグループ特異性やステージ特異性などについて検討してきた。今回、Immunoblot 法で種特異的・発育ステージ特異的と考えられた mAb を得たので、その標的抗原の特異性や局在性などについて検討した。
[方法] Acanthamoeba comandoniは、東京都小金井市の土壌より分離し、クローン化して用いた(GS89-1012
株)。特異的モノクローナル抗体(mAb)は以下のようにして作製した。A. comandoniの栄養体とシストから調製した可溶性抗原液を過免疫したマウスの脾細胞とP3U1ミエローマ細胞を融合してハイブリドーマを作製し、抗体のスクリーニングをELISA法によって行った。高力価を示した陽性ハイブリドーマに対してク
ローニングを２回行った。Mabは培養上清または腹水型を用い、その標的抗原の解析は、Western blot法、間接蛍光抗体法（IFAT）、共焦点レーザー顕微鏡法及び金コロイドを用いた免疫電子顕微鏡法によって行った。また、過免疫マウス血清 (5回免疫)を抗A. comandoniポリクローナル抗体として用いた。
[結果及び考察] A. comandoni の栄養体とシスト、及び、A. astronyxis (Group I)、 A. castellanii (Group II) 、A.
culbertsoni (Group III) の栄養体を SDS ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動後タンパク染色した。その結果、A.
comandoni の栄養体は A. astronyxis と類似したタンパ

クバンドパターンを示したが、A. castellanii や A.
culbertsoni とは異なるパターンを示した。これらのタ
ンパクをセルロース膜に転写後 Western blot 法を行うと、抗 A. comandoni ポリクローナル抗体は同じグループに属する A. astronyxis の栄養体には反応したが、異なるグループの A. castellanii や A. culbertsoni とは反応性を示さなかった。一方、同様にして転写した抗原に対し、得られた種々の mAb を反応させると、mAb
25G2 は A. comandoni、A. astronyxis、A. castellanii、A.
culbertsoni の栄養体には反応せず、A. comandoni シス
ト中の推定分子量 38kDa の単一のバンドを形成する分子とのみ反応性を示した。この mAb 25G2 が認識する抗原分子の特異性および局在性を蛍光抗体法(IFAT) で調べたところ、蛍光は A. comandoni のシストにのみ認められ、栄養体は蛍光を発しなかった。この結果は Western blot 法の結果と一致し、mAb 25G2 が認識する 38-kDa 抗原分子がシスト特異的であることが示唆された。シストでは、exocyst と endocyst の輪郭に沿って蛍光が認められたほか exocyst では点状の蛍光が観察された。共焦点レーザー顕微鏡を用いた結果においても、標的抗原が exocyst と endocyst あるいはシスト内部に偏在する蛍光が認められた。この局在性をさらに検討するため、金コロイドを用いた免疫電子顕微鏡法により観察すると、mAb 25G2 の標的抗原は特に
endocyst の層内の電子密度が高い部分に多く存在することが明ら かとなった。また、金コロイド 粒子は
endocyst 内の細胞質にも認められた。
以上の結果から、
A. comandoni の 構 成 タ ン パ ク は 他 の グ ル ー プ のAcanthamoeba との共通エピトープが極めて少なくグ
ループ特異的な抗原タンパクを有し、mAb25G2 が認識する 38-kDa 抗原はグループ特異的な抗原の一つであると考えられた。また、38-kDa 抗原はシスト内に広く分布するが特に endocyst 内層に局在することが示
唆された。
[文献]
Pussard, M. & Pons, R. (1977) Protistologica, 13, 557-598.

Characterization and Specificity of a 38-kDa Antigen of Acanthamoeba comandoni.
By Fumie KOBAYASHI1, Takashi TSURUHARA2, Maiko FUKAZAWA3, Minoru FUKUDA4, Hayato KAWAKAMI5,
Hiroshi HIRANO5, Moriyasu TSUJI1 (1Dept. of Infect. Dis., Kyorin Univ. School of Med., 2Advanced Environmental
Tech. Cent., Environ. Sci. Res. Niigata, 3Dept. of Biol., Tokyo Gakugei Univ., 4Lab. for Electron microscopy and 5Dept. of
Anatomy, Kyorin Univ. School of Med.)

48

P7

原生動物学雑誌 第34巻 2001年

有中心粒目太陽虫 Raphidiophrys contractilis の捕食行動とキネトシストの放出○洲崎 敏伸1，坂口 美亜子2（1神戸大・理・生物，2ベルリン自由大・動物学研究所）[目 的] 有 中 心 粒 目 に 属 す る 汽 水 産 太 陽 虫

いる電顕像が観察された。キネトシストは、放出後もRaphidiophrys contractilisの捕食行動と、放出体の一太陽虫の細胞膜に付着したままであった。放出後のキ種であるキネトシストの微細構造を調べ、これまで

ネトシストは、そのコアの部分には変化がなかったに研究されてきたアクティノプリス目と比較した。

が、周辺部の構造が細いフィラメント状に変化し、周[方法] R. contractilis (1) は、Chlorogonium elongatum

囲にもやもやと広がっていた。コアの先端では、エサとの共培養により、Sakaguchi & Suzaki (2)の方法によの細胞表面に結合していた。このようなエサ細胞とのり無菌的に培養した。エサとして用いたChlorogonium

結合は、食胞を形成する仮足が伸展する際の「足場」

elongatum, Tetrahymena thermophila, Paramecium bursariaも、全て無菌的に培養したものを用いた。

を提供していると思われる。
[文献][結果及び考察] 捕食の際、エサはR. contractilisの軸 1) Kinoshita et al. (1994). J. Euk. Microbiol., 42: 283-288.
足表面で捕獲され、次第に細胞体の表面に運ばれた。 2) Sakaguchi & Suzaki (1999). Eur. J. Protistol., 35: 411415.
次いで、細胞体から伸びる仮足によって囲まれて食胞が形成された。このようなプロセスは、これまでに調べられているActinophrys やEchinosphaeriumの場合と同じだった。しかし、R. contractilisに特徴的なこととして、Chlorogoniumが捕獲される際、鞭毛が自切によって高い頻度で切り離された。このような現象は、
Chlorogonium がActinophrys によって捕獲される場合には認められないので、R. contractilisが鞭毛の自切を促す何らかのファクターを出している可能性がある。
Paramecium bursariaなどのような大型のエサが捕獲される場合には、複数の細胞が融合し、コロニーを形成する様子が観察された。細胞のコロニーはゾウリム
シを取り囲み、その細胞質を引きちぎるようにして取り込み、共通の食胞を形成した。R. contractilisが接触したゾウリムシは、繊毛運動を停止した。また、ゾウリ
ムシのトリコシストは全く放出することがなかった。
Actinophrys がゾウリムシを捕食する際にも、多数の太陽虫によるコロニーが形成される。しかしActinophrysにはエサの繊毛を停止させる能力がなく、また、ゾウ
リムシはトリコシストを盛んに放出する。これと比較すると、R. contractilisは捕食の際にゾウリムシに対して、繊毛運動を停止させたりトリコシストの放出を阻害したりする何らかのファクターを放出していると考えられる。捕食に際し、多くのキネトシストがエク
ソサイトーシスを起こし、細胞外に内容物を放出してFood uptake and kinetocyst discharge by the centrohelid heliozoon Raphidiophrys contractilis.
By Toshinobu SUZAKI1 and Miako SAKAGUCHI2 (1Dept. Biol., Fac. Sci., Kobe Univ., 2Inst. Zool., Berlin Free Univ.,
Germany)Jpn. J. Protozool. Vol. 34, No. 1. (2001)

P849

原生生物太陽虫の細胞質内におけるCa2+依存性収縮系の解析○有川 幹彦，洲崎 敏伸（神戸大・理・生物）[目 的] こ れ ま で に、オ オ タ イ ヨ ウ チ ュ ウ

かった。一方、押し潰し法によってスライドグラスにEchinosphaerium akamaeの細胞質内にはCa2+依存性収貼り付いた沈殿物は、EGTAとCa2+を交互に加えるこ縮系が存在することを、セルモデルを用いた系においとにより、ATP非依存的に収縮-弛緩を繰り返した。さて明らかにした。本研究では、Echinosphaerium akamae

らに、沈殿物の収縮度合いはCa2+濃度に依存し、そのに近縁であり、大量培養の可能なタイヨウチュウ

閾値は1.5 × 10-8 Mであり、セルモデルにおける細胞質

2+Actinophrys solを材料として、そのCa 依存性収縮系にのCa2+依存性収縮の閾値とほぼ同じであった。このよ

対し生化学的アプローチを試みた。

うに、A. solの細胞破砕液から得られた沈殿物は、セル[方法] 集めた細胞に1% TritonX-100, 3 mM EGTA, 5

モデルを用いたin vivo系と同様の振る舞いをするこ

mM HEPES (pH 7.0)を加えて細胞破砕液を得た。そのとから、沈殿物の収縮は、細胞質の収縮運動をin vitro

細胞破砕液を7000 × gで遠心することによって得られで再現したものであると考えられる。

2+

た上清をcell homogenate sample (CHS)とし、これにCaを加えて200 × gの遠心で得られた沈殿物をprecipitate
sample (PS)とした。タンパク質の定量は、BSAをスタンダードとし、BCA法によって行った。沈殿物の収縮弛緩を観察する際には、プレパラート内に片側からテスト溶液を流し、ろ紙を用いて他方から吸い取る灌流法を用いた。
[結果及び考察] 細胞破砕液にCa2+を添加して得られる沈殿物はEGTAを加えることによって可溶化され、7000 × gの遠心でも落ちてくることはなかった。しかし、Ca2+の再添加後200 × gの遠心によって再び沈殿が生じた。しかも、そのサイクルは、EGTAとCa2+を交互に加えることによって繰り返すことが可能であった。
この沈殿物を光学顕微鏡および電子顕微鏡によって観察した結果、小さな顆粒や微細な繊維が多数絡まっているように見えた。しかし、contractile tubulesのような中空の繊維構造は観察されなかった。タンパク質定量の結果、CHS中に含まれるタンパク質のうち、約40%のタンパク質がCa2+の添加によって沈殿し、2回目以降のサイクルでは、PSの約80%のタンパク質がCa2+の再添加によって毎回沈殿してくることが分かった。
沈殿物のSDS-PAGEによる解析の結果、多くのタンパ
ク質が検出されたが、沈殿・溶解のサイクルを重ねることによっても、特定のタンパク質の含有率が高まる
ことはなかった。さらに、SDS-PAGEにおいて、CHS
中にはCa2+の有無で移動度が変化する分子量約17 kDaのタンパク質が含まれていることが今回新たに分Calcium-dependent cytoplasmic contraction in Heliozoa.
By Mikihiko ARIKAWA and Toshinobu SUZAKI (Department of Biology, Faculty of Science, Kobe University)

原生動物学雑誌 第34巻 2001年

50

P9

大核内共生細菌 Holospora obtusa は宿主の遺伝子発現に変化を引き起こす○中村 欽光, 堀 学, 藤島 政博 （山口大学理学部生物科学講座）[目 的] Paramecium caudatum は 大 核 内 に 共 生 細 菌

子4種類においてｸﾛｰﾆﾝｸﾞ、ｼｰｹﾝｽが成功し、GenBank

Holospora obtusaを持つ。ﾎﾛｽﾎﾟﾗは主に寒冷地で採集さﾃﾞｰﾀﾍﾞｰｽを利用した相同性検索の結果、CA10-1断片れるﾊﾟﾗﾒｼｳﾑの大核内で発見される。宿主にとって有はParamecium tetraurelia stock 51A i-antigenと高い相同

害にもかかわらず、寒冷地でﾎﾛｽﾎﾟﾗを維持したﾊﾟﾗﾒｼｳ

性 を 示 し た。ま た ﾉ ｰ ｻ ﾞ ﾝ ﾌ ﾞ ﾛ ｯ ﾄ 解 析 に よ っ て

ﾑが見つかるという事実は、低温ではﾎﾛｽﾎﾟﾗの存在がAposymbiotic Cell に特異的な発現であることが確認

宿主の生存に有利な状況をもたらすと考えられる。(1)された。

またﾎﾛｽﾎﾟﾗを維持するためには宿主遺伝子産物が必

i-antigenは温度条件により、変化することが知られて要であることも最近わかってきた。(1)おり(3)、低温ではﾎﾛｽﾎﾟﾗを維持したﾊﾟﾗﾒｼｳﾑの生存がﾎﾛｽﾎﾟﾗの感染の特異性は、比較的寛容でありH.obtusa

有利になる事実と関連があるかもしれない。

は数種のﾊﾟﾗﾒｼｳﾑに感染可能である。しかしその維持[文献]

は宿主株特異的であり、P.caudatumの中でも維持でき(1) 藤島政博（1995）. ｿﾞｳﾘﾑｼの核に共生するﾊﾞｸﾃﾘｱ. In,る株とできない株がある。この宿主株特異的に継代的寄生から共生へ (山村則雄,早川洋一, 藤島政博/編),に維持される現象には宿主遺伝子産物の関与が示唆

pp. 155-222, 平凡社

される。(1)
本研究ではDifferential display法 (2) を用いて宿主の遺伝子発現を解析し、発現量に差を示す遺伝子を発見(2) 3) Peng Liang, Arthur B. Pardee (1992) Science 257:
967-971.
(3) Helmut J. Schmidt(1988) Immobilization Antigens. In :

し、ｸﾛｰﾆﾝｸﾞ、ｼｰｹﾝｽに成功した。

Paramecium (ed. Görtz, H.-D.), pp. 155-163. Springer-[方法] P.caudatum (RB-1株)、H.obtusa (F1株) を用い

Verlag.

て、H.obtusaを持つ場合と持たない場合それぞれの宿主細胞(Symbiotic, Aposymbiotic Cell)から、Total RNAを抽出し、mRNAを精製、3’-anchored oligo-dT primerを用いて逆転写反応によりcDNAを合成した。これをﾃﾝﾌﾟ
ﾚｰﾄに3’-anchored oligo-dT primer、5’-arbitrary primerを用いて次の条件でPCR反応を行った。(95℃, 9 min :95℃, 40 sec, 37℃, 5 min, 72℃, 3 min for 6 cycle : 95℃,
40 sec, 40℃, 2 min, 72℃, 1 min for 55cycle : 72℃, 5 min,4℃)。PCR産物は6% PAGEで分離され、銀染色により検出した。発現量に差を示すﾊﾞﾝﾄﾞをｹﾞﾙから切り出した後、再増幅しｸﾛｰﾆﾝｸﾞ、ｼｰｹﾝｽを行った。ｸﾛｰﾆﾝｸﾞに成功した遺伝子のうちCA10-1断片について、ﾉｰｻﾞﾝﾌﾞﾛｯ
ﾄ解析によりmRNA発現量の比較を行った。
[結果と考察] H.obtusaを持つ場合と持たない場合それぞれの宿主細胞の遺伝子発現を、Differential display
法で比較した結果、Aposymbiotic Cell に特異的な遺伝子を12種類Symbiotic Cellに特異的な遺伝子を3種類発見した。このうちのAposymbiotic Cell に特異的な遺伝

Macronucleus-specific symbiotic bacterium Holospora obtusa induces alterations in gene-expressions of the host cell.
Yoshimitsu NAKAMURA, Manabu HORI, Masahiro FUJISHIMA (Biological Institute, faculty of Science, Yamaguchi
University)Jpn. J. Protozool. Vol. 34, No. 1. (2001)

P10

51

種間接合を利用した接合過程の解析○柳 明1，八島 洋一2（1石巻専修大・理工・生物生産工，2岩手医大・教養・生物）［目的］種間の接合対を誘導し、その接合対を形成している２種の細胞の間で接合過程がどのように影響し合うのかを調べることによって、接合過程を制御する機構が明らかになるのではないかと考えた。そこ
で、メ チ ル セ ル ロ ー ス を 使 っ て ゾ ウ リ ム シ（Paramecium caudatum）とP. multimicronucleatum との種間接合を誘導し、その小核の変化と接合対の接着面の状態を調べた。
［方法］ゾウリムシとP. multimicronucleatum との種間接合対（CMと略記する）は、この２種の細胞を混合し1.25% メチルセルロースで処理して誘導した（１）。
ゾ ウ リム シの 自系 接 合対（CC）と P. multimicronucleatum の自系接合対（MM）もそれぞれの種の細胞を独立に1.25% メチルセルロースで処理することによって誘導した。小核の変化は細胞を約25µg/mlのヘ
キスト33258で染色し蛍光顕微鏡を使って生体で観察した。また、接合対の接着面の状態は電子顕微鏡を使って観察した。実験は、25~26゜Cで行った。
［結果及び考察］まず、小核の変化を観察した。ただし、P. multimicronucleatumの小核は小さく良く観察できなかったので、ここではCMのゾウリムシとCCの小核の変化について報告する。接合誘導後5~6時間では、CMのゾウリムシはstage IIから減数第一分裂前期のstage IVで、コントロールのCCは主にstage IVから三日月期であった。接合誘導後8~9時間では、CMのゾウリ
ムシは減数第一分裂の三日月期から中期で、CCは減数第一分裂中期であった。10~11時間では、CMのゾウ
リムシは減数第一分裂中期が最も多かったが小核の形が異常なものや小核が消失してしまった細胞も現れた。この時、CCは減数第二分裂終了後であった。
12~13時間では、CMのゾウリムシのほとんどで小核が消失していたが、CCは融合核の一回目の分裂まで達した細胞が多かった。このように、CMのゾウリムシでは接合の初期から核の変化が遅れだし、減数第一分裂
中期あたりまで達するとその後小核が消失することがわかった。
接合後10時間にCMのゾウリムシの細胞質を電子顕微鏡で観察すると、リソソーム様の構造を多数含む細胞が１例確認された。この例は、接合後10時間頃からCMのゾウリムシで小核が消失し始めるのは、細胞内消化機構が本来活性化する時期（例えば、減数分裂後に３つの小核が退化する時期）より前に活性化してしまったことによることを示しているのかもしれない。
次に、接合対の接着面の状態を接合後5、10、12時間に電子顕微鏡で観察した。３種類の接合対（CC、CM、
MM）で比較したが、接着面の状態に目立った違いは観察されなかった。そして、接合後5時間には、３種類の接合対で接着面の細胞膜の部分的な融合が起こり、接合対を形成する2つの細胞間に細胞質の連絡口ができていた。また、接合後10、12時間のCMと接合後10時間のMM（接合後12時間では接合対が分離し始めていた）では、細胞質の連絡口の中に電子密度の低い顆粒状の構造が観察された。しかし、この構造は接合後5時間の細胞やCCでは観察されなかった。
また、接合後10、12時間に接合対の接着面の細胞膜が平行に並んでいる部分の細胞質側に、細胞膜を裏打
ちするように電子密度の高い構造が出現した。この構
造は、接合後5時間では、観察されなかった。接合後10時間では、この電子密度の高い構造はMMで最も顕著に現れ、CCやCMでも接着面の全体ではなく一部に現れた。接合後12時間では、MMは接合対が分離し始めていたが、その分離直後と考えられる細胞膜の内側の一部にこの電子密度の高い構造が観察された。CCやCMでも接着面の一部に観察された。今後、この電子密度の高い構造が接合のどの時期に接着面のどこに出現するのかをさらに詳細に検討する必要があるが、この構造が接合対分離の少し前に接着面の細胞膜を裏打ちするように出現することから、この構造が接合対の分離過程で細胞膜を内側から支えて安定化するな
どの機能を持っている可能性が考えられる。また、この構造は、接合後10時間のMMの接着面の細胞質の連
絡口では、その中にある電子密度の低い粒子状構造を取り囲むように現れる。この部分では接合対の分離に先立って細胞膜が再生される必要があるので、この電子密度の高い構造は電子密度の低い粒子状構造と共に細胞質の連絡口に新たに細胞膜を再生させることにも関わっているのかもしれない。
［文献］
1) Yanagi, A. & Haga, N. (1998) J. Euk. Microbiol. 45, 8790.

Analysis of Conjugation Process Using Interspecific Conjugating Pairs
By Akira YANAGI1 and Yoichi YASHIMA2 (1Dept. of Biotechnol., Senshu Univ. of Ishinomaki, 2Sch. Lib. Arts and Sci.,
Iwate Med. Univ.)

原生動物学雑誌 第34巻 2001年

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P11 ゾウリムシParamecium caudatumの大核内に共生するRickettsiaの発見○道羅 英夫（静岡大・遺伝子実験施設）[目的]

原生動物であるゾウリムシはさまざまな細よりもさらにリケッチアに近縁であった。リケッチア

胞内共生体を持っている。その中で、ゾウリムシの核はミトコンドリアと系統的に近い祖先を共有すると内に共生するバクテリアとしては Holospora 属に属す考えられており、ミトコンドリアの起源を探る上で注る核内共生細菌と Caedibacter caryophila が知られて目されている。ゾウリムシの核内にリケッチアが感染いる。今回、P. caudatum の大核内に H. obtusa とは異なしているという発見はこれが世界で最初の例であり、るバクテリアが感染しているのを発見した。そこで、 今後の研究の発展が期待される。
このバクテリアの性質を明らかにするために、まず単今回発見したゾウリムシの大核内共生バクテリア離を試み、さらに単離した共生バクテリアを用いてこの系統解析に関して、現在のところ、16S rRNA 遺伝子のバクテリアを認識する抗血清の作成、16S rRNA 遺の部分的な塩基配列しか決定していないので、16S伝子の部分的な塩基配列に基づく系統解析を行った。 rRNA 遺伝子の全塩基配列を決定し、より正確な系統
共生バクテリアは単離大核を Vortex によっ関係の推定を行う予定である。また、共生バクテリアて破壊し、弱い遠心によって不溶性物質を沈殿させたはゾウリムシの元の株には存在していなかったので、後、上清を強い遠心にかけて共生バクテリアを沈殿さ

H. obtusa の感染実験の過程で感染したと考えられる

せて可溶性物質を除去することによって単離した。単が、その感染経路はまだ不明である。そこで、単離し離した共生バクテリアを２週間おきに３回マウスにた共生バクテリアをゾウリムシに再感染させ、モノク

腹腔注射して、共生バクテリアを認識する抗血清を作

ローナル抗体で検出することによって、その感染経路成した。また、単離した共生バクテリアから DNA を抽を明らかにする。また、共生バクテリアは H. obtusa の[方法]

出し、混入が予想される K. pneumoniae の遺伝子は増存在下で感染したので、その感染には H. obtusa の存在

幅されないように工夫したプライマーを用いて PCRを必要とする可能性がある。そこで、H. obtusa の存在を行い、部分的な 16S rRNA 遺伝子を増幅した。この

下と非存在下で共生バクテリアの感染性の比較を行PCR 産物の塩基配列を決定し、その配列に基づいて系

う予定である。もし、共生バクテリアが H. obtusa の感

統解析を行った。

染経路を利用しているとなれば、まだ未知の部分の多[結果および考察]

P. caudatum の大核内共生細菌 H.

obtusa を宿主ゾウリムシに感染させる実験を行って

い H. obtusa の感染機構の解明にもつながる可能性がある。

いる過程で、H. obtusa とは異なるバクテリアが大核内に感染しているのを発見した。このバクテリアは H.
obtusa に比べてはるかに小さく、H. obtusa は大核内全体に広がって存在するのに対し、このバクテリアは大核内に凝集して局在するという点で異なっていた。まずはこのバクテリアの単離を試み、ある程度の純度で単離することに成功した。単離したバクテリアをマウスに注射して得られた抗血清を用いて間接蛍光抗体法を行うことによって、ゾウリムシに感染したバクテリアの検出が可能になった。また、16S rRNA 遺伝子の塩基配列に基づいて系統解析を行った結果、このバクテリアはリケッチア属に近縁であることが明らかになった（図１）。H. obtusa や C. caryophila もリケッチ
ア属に近縁であることはすでに報告されているが、この共生バクテリアは系統的に H. obtusa や C. caryophila

図１ 16S rRNA遺伝子に基づいた系統樹

Characterization of the Rickettsia newly found in the macronucleus of Paramecium caudatum.
By Hideo DOHRA (Institute for Genetic Research and Biotechnology, Shizuoka University)Jpn. J. Protozool. Vol. 34, No. 1. (2001)

P12

53

パルスフィールド電気泳動によるゾウリムシの染色体ＤＮＡの解析○芳賀 信幸、松島 正和、田中 瑞宝、川島 隆一、保志 稔、小笠原 嘉弘、洞内 安、太田 聡（石巻専修大・理工）[目的] ゾウリムシの染色体は長年の細胞組織学的な研究にも関わらず、大核においても小核においても染色体数は明らかになってはおらず、またサイズ分
布に関してもごく限られた知見しか得られてはいな
い。このような歴史的背景をふまえ、ゲノム時代の研究材料としてゾウリムシの新しい可能性を開くた
めに、本研究においては、パルスフィールド電気泳動法を用いてインタクトな形でゾウリムシの染色体ＤＮＡを分析し、近い将来ゲノムの全容を解明するための染色体ＤＮＡレベルでの基盤を整備することを目的とした。
[方法] パルスフィールド電気泳動はBio-Rad社製のCHEF-DRII を 用 い た (1)。ゾ ウ リ ム シ (Paramecium
caudatum) は長年研究室で保存・維持された株の他に、近年日本各地から採集された新しい株も用いた。また、種間の相違を調べるために、ヒメゾウリ
ムシ (Paramecium tetraurelia) のS51株も用いた。パル
スフィールド電気泳動に用いるためのサンプルゲル
はYeast用に確立された方法をゾウリムシ用に改変した方法で調製した。電気泳動の温度は5℃に保って行った。Yeastの最適条件である14℃で行うとゾウリ
ムシのＤＮＡバンドはすべてスメアになって流れ、各々のＤＮＡバンドを区別することが出来なかった。また、細胞密度はサンプルゲル１ブロック当た
り40,000細胞に調製した。細胞密度がこれ以上に高くなるとＤＮＡの分離が非常に悪くなった。
[結果及び考察] 金沢で採集された２つの株KNZ5及びKNZ2をかけ合わせて子孫 (KNZ52) を作り、接合後80回と180回分裂後の細胞を比較した結果、ＤＮＡのbanding patternに両者の間でまったく相違は認められなかった。これらのクローンからは大きい方から約1100、900、97、48 kbp及びサイズを特定出来なかったsmall bandの５種類が検出された。ところが、親の株であるKNZ5とKNZ2のbanding patternを比較したところいずれの親も大きい２つのバンドが欠失していた。今後、大きい２本のバンドを用いてプローブを作成し、これら２本のバンドを持たない系統ではどのバンドに相同性があるのか検討する必要がある。
次に、大核と小核のＤＮＡを区別するためにKNZ5とKNZ2の２系統について同じクローン由来の有小核
系と無小核系を比較した結果、いずれの系統においても小核特異的なバンドは検出されなかった。この問題に関しては今後、小核特異的な塩基配列である
IESをプローブにしてSouthern hybridizationによる解析を行う予定である。
次に、ＤＮＡのbanding patternの一般性を確かめる目的で近年新たに採集された野外株を用いて比較した結果、５株中２株が５本組のbanding patternを示したのに対し、残りの３株は97kbpから始まる小さい方のＤＮＡ３本から成る３本組のbanding patternを示した。５ 本 組 と ３ 本 組 の 相 違 は Ｄ Ｎ Ａ サ イ ズ のpolymorphismによるものであると思われるが、系統間でサンプルゲル調製の最適条件が異なる可能性も考えられるので今後さらに検討する必要がある。一方、研究室で長期間保存されてきた株を数種調べた
結果、27aG3とKs3において、最も小さいsmall bandがKNZ系とは異なる移動度を持つことが明らかになった。27aG3ではサイズが大型化したものが１本だったのに対し、Ks3ではKNZ系と同程度のものが２本見られた。これらはＤＮＡサイズのpolymorphismであると考えられる。このことを検証するために、現在異なる系統間でのかけ合わせ実験を行いそれぞれのＤ
ＮＡバンドの遺伝様式と分離比を調べているところである。
最 後 に、P. caudatum と P.tetraurelia で Ｄ Ｎ Ａ のbanding patternを比較した。その結果、両者はまった
く異なるpatternを示した。P. tetraureliaでは、約1000kbpから始まって約100 kbpまでの間に10数種のＤＮＡバンドが認められた。この二つの種は細胞体の形
態的な特徴だけではなくイマチュリンによる未熟効
果や行動突然変異体であるCNR４種及びPawn３種において種間での相補性を示すことが報告されており、細胞内での重要な分子種においても機能的保存性が高い関係にある。しかるに、染色体ＤＮＡのサイズ分布やパターンに大きな違いが見られたのは予想外の結果であった。今後、このような相違点を利用して両者に共通のプローブを多数作成することによって、染色体ＤＮＡの組織化に関する分子機構の解明、あるいは染色体ＤＮＡの組織化と種の分化との関連等に関して重要な糸口が見つかるのではないかと期待される。
[文献]
1) Albig,W. and Entian K-D., (1988) Gene, 73, 141-152.

Clamped homogeneous electric field electrophoresis reveals a fascinating world of genomic DNA in Parameicum
By Nobuyuki HAGA, Masakazu MATSUSHIMA, Mizuho TANAKA, Ryuichi KAWASHIMA, Minoru HOSHI, Yoshihiro OGASAWARA, Yasushi HORANAI and Satoshi OHTA (Dept. of Biotech. Senshu Univ. of Ishinomaki)

54

原生動物学雑誌 第34巻 2001年

P13

核内共生細菌ホロスポラはgroELホモログを菌体外に放出する○原山 幸子，藤島 政博（山口大・院理工・自然情報）［目的］グラム陰性細菌Holospora obtusaは繊毛虫なっていた。さらに、菌体外に存在するgroELホモログ

Paramecium caudatumの大核に、また、Holospola un-

をイムノブロットより検出した結果、ホロスポラは

dulataとHolospora elegansは小核に特異的に共生する。 65KDaの完全長のgroELホモログを分泌していること
この細菌の感染型は、宿主核に感染し増殖型に分化す
ると、多量のgroELホモログを合成する。また、ホロスが分かった。
これらの結果は、菌体表面に露出されたり、菌体外

ポラの感染により、宿主はヒートショック耐性に形質に分泌されたgroELホモログが、宿主核内で何らかの転換する。この現象には、ホロスポラのヒートショッ

機能を果たす可能性を示している。予測される機能とク蛋白質のgroELホモログが関与しているのではない

して、宿主のヒートショック耐性の獲得の他に、ホロかという仮説を立てた。そこで、ホロスポラのgroELホ

スポラから宿主側へのシグナル伝達物質としての機

モログに対するモノクローナル抗体を作製し、ホロス

能や増殖型細胞外膜の特徴である宿主クロマチンとポラを維持している宿主細胞内でのgroELホモログのの結合の機能に関与している可能性がある。

局在性について調べた。

［文献］［方法］まず、H. obutusaの増殖型を抗原として、groEL

1) Dohra, H. Fujishima, M. and Ishikawa, H. : J. Euk.

ホモログに対するモノクローナル抗体の作製を行っ

Microbiol., 45(1). 1998 71-79

た結果、IR-6-1抗体が得られた。この抗体は、他のホロ

2) Choi, E. Y. Ahn, G. S. and Jeon, K. W. : BioSystems,

スポラH. undulataやH. elegansのgroELホモログは認識

25 1991 205-212
3) Morioka, M. and Ishikawa, H. : 実験医学 Vol.13

するが、宿主であるP. caudatumや大腸菌、クレブシラのgroELホモログとは交差反応しなかった。そこで、３種のホロスポラをそれぞれ維持している宿主細胞でNo.12 1995
4) Ishikawa, H. : Annual Review 細胞生物学 1993のホロスポラのgroELホモログの局在性について調べるために、この抗体を用いて間接蛍光抗体法を行った。また、宿主核内において、菌体外に存在するgroEL
ホモログをイムノブロットにより検出し、菌体内のgroELホモログと比較した。
［結果および考察］小核内にホロスポラを維持している細胞で間接蛍光抗体法を行うと、小核全体に極めて強いFITC蛍光が観察され、バクテリアの輪郭が確認できないほどであった。本来、ホロスポラには丈夫な細胞壁があり、抗体が菌体内に入ることは不可能である。したがって、ホロスポラは多量のgroELホモログを菌体表面や菌体外に分泌していると考えられる。また、大核内にH. obtusaを持つ細胞にIR-6-1抗体を用いて間接蛍光抗体法を行ったところ、一部の増殖型と中間型にだけ強いFITC蛍光が観察された。大核内全体には、かなり多くの増殖型が存在しているにもかかわらず、蛍光を帯びる増殖型は大核内で縫い目の様に連Endonuclear symbiotic bacteria Holospora excrete their groEL homologues outside the bacteria.
By Yukiko HARAYAMA and Masahiro FUJISHIMA (Biological Institute, Faculty of Science, Yamaguchi Univ.)Jpn. J. Protozool. Vol. 34, No. 1. (2001)

P14

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テトラヒメナにおけるアクチン脱重合因子ADF/コフィリンの探索○松下 真由美1 阿部 洋志2
部・生物学科）沼田 治1（1筑波大学・生物科学系、2千葉大学・理学［目的］
細胞質分裂は主にアクチン繊維とミオシンから成る収縮環の収縮により進行する。収縮環の形成・消失に伴うアクチン繊維の構築と崩壊は、アクチン調節蛋
白質により制御されている。我々は、繊毛虫テトラヒ
メナを用いて、細胞質分裂に関わるアクチン調節蛋白質の探索を行っており、これまでにアクチン繊維重合促進因子としてプロフィリン、束化因子としてEF-1αやフィンブリンを同定し、これらが分裂溝に局在することを明らかにしてきた。以上の結果はこれらの蛋白質が収縮環形成に関わっていることを示唆している。
しかしこれまでに、テトラヒメナでは収縮環の消失過程に関わるアクチン調節タンパク質は得られていな
い。アフリカツメガエルを用いた研究では、アクチン
脱重合因子のひとつであるADF／コフィリンが分裂溝に局在し、収縮環の消失過程に関わると考えられている。そこで本研究では、テトラヒメナの収縮環消失機構の解明を試みるために、遺伝学的手法、生化学的手法を用いてテトラヒメナADF／コフィリンの探索を行なった。
［方法］(１）RT-PCR法
細胞性粘菌、分裂酵母、出芽酵母、アメーバーのADF/コフィリンのアミノ酸配列を比較し、保存性の高い領域を３ケ所決定し、その領域のアミノ酸配列を基にdegeneratedプライマーを１０個作成した。各プラ
イマーを用いて２１通りの組み合わせで、RT-PCR法を行った。約100-400bpの間に増幅されたPCR産物をクローニングし、シークエンス解析を行った。
(２）カラム法① GST-XAC(Xenopus ADF/コフィリン)カラム法
GST-XACビーズにウサギのF-アクチンをカップリングさせ、F-アクチンカラムを作製した。このカラムにテトラヒメナの抽出液を混合し、カラムに吸着した蛋白質を塩濃度依存的に溶出した。コントロールは、
GSTカラム、GST-XACカラムとした。各カラムの溶出
分画は、8%（ A )及び15%（Ｂ）ゲルでSDS-PAGEした
後、銀染色により解析した。
②DNase1カラム法
DNase1ビーズにウサギのG-アクチンをカップリン
グさせた、G-アクチンカラムを作製した。このカラムにテトラヒメナの抽出液を混合し、カラムに吸着した蛋白質を塩濃度依存的に溶出した。コントロールは、
DNase1カラムとした。各カラムからの溶出分画は８％ゲルでSDS-PAGEした後、銀染色により解析した。
［結果］（１）RT-PCR法を行った結果、150種類の遺伝子断片が得られたが、コフィリン遺伝子のクローニングには至らなかった。
（２）
GST-XACカラム法を行った結果、60kDa、
23kDa、
2１kDa、17kDaのF-アクチン結合蛋白質が得られた。
これらの蛋白質はDNase1カラム法では検出されないことから、F-アクチンに特異的な結合蛋白質と推測される。
（３）DNase1カラム法を行った結果、68kDaのG-アクチン結合蛋白質が得られた。この蛋白質はGST-XAC
カラム法では検出されないことから、G-アクチンに特異的な結合蛋白質と推測される。

［文献］
1) Abe H. et al.,(1996) J.Cell Biol .132(5):871-85
2) Okada K. et al.,(1999) J. Cell Sci.112(10):1553-65

Screening of actin depolymerizing factor /cofilin in Tetrahymena
By Mayumi MATSUSHITA1, Hiroshi ABE2, Osamu NUMATA1 (1Institute of Biological Science, Tsukuba Univ., 2Department of Biology, Faculty of Science, Chiba Univ.)

原生動物学雑誌 第34巻 2001年

56

P15

トランスジェニックマウスを用いたトキソプラズマSAG-1の機能解析○長澤 秀行1・セング セイハ1・横山 峯介2・五十嵐 郁男1・藤崎 幸蔵1・見上 彪1・
豊田 裕1・鈴木 直義1（1帯広大・原虫研；2三菱生命研）［目的］SAG-1 は Toxoplasma gondii の主要表面抗原でことから、SAG-1 トランスジェニックマウスにおけるあり、原虫総タンパク量の３〜５％を占める。その機感受性の増強は、SAG-1 に対してマウスがトレラント

能については、原虫の病原性或いは宿主の免疫応答にになっているためであることが明かとなった。

重要な働きを有すると言われているが、詳細は不明で次に、transgenic mouse が SAG-1 に対してトレラントある。今回我々は、SAG-1 トランスジェニックマウスになっていることを利用して、SAG-1 の機能解析を試を用いてトキソプラズマ感染実験を行い、SAG-1 の機みた。致死量の Beverley strain のシスト感染に対して、能について検討した。

予め Toxoplasma homogenate で免疫処置を行うと、マ［方 法］マ ウ ス に 導 入 す る SAG1 の transgene は

ウスは感染に対して抵抗性を獲得する。そこで、SAG-

tachyzoite を精製し、SAG1 gene を RT-

1 トランスジェニックマウスに免疫処置後、致死量のPCR、次に Nested-PCR で増幅した後、pCAG plasmid にBeverley strain のシストを感染した結果、生存率は組み込み、これを大腸菌へ transfect した。この plasmid

Wild type よりも低かったものの、抵抗性を獲得していを精製し、SAG-1 gene は promoter から Poly A 部分を含た。また、Th1-Th2 バランスに対する SAG-1 の影響をむように ristriction enzyme で切り出し micro injection

見る目的で、感染後の IFN-γ 産生量を測定した結果、Toxoplasmaに使用した。Transgenic mouse の作製には、B6C3F1 マ

感染６日目及び９日目において SAG-1 トランスジェ

ウスの受精卵を用い、in vitro fertalization を行なった

ニックマウスの IFN-γ産生量は有意に低い価を示し後、受精卵の前核に cloning した SAG-1 gene を micro

た。一方、IL-4 の産生は、両群で差は認められなかっ

injection method により注入した。SAG-1 transgenic

た。更に、TLA を抗原として ELISA により IgG1 とmouse における SAG-1 の発現は PCR、RT-PCR、サザIgG2a を測定した結果、感染９日目における SAG-1 トンブロッティング、ウェスタンブロッティングの結ランスジェニックマウスの IgG2a 量が極めて低いと果、胸腺、脾臓、脳、肝臓にその発現が観察された。 いう結果が得られた。
［結果及び考察］ Toxoplasma Beverley 株の cyst を 20以上の結果から、SAG-1 トランスジェニックマウス

個感染させた場合、Wild type mouse が感染抵抗性ではトキソプラズマ感染に対する感受性が増強するが、あったのに対し、SAG-1 トランスジェニックマウスは

それは SAG-1 トレラントによるものと考えられた。
ま感受性を示した。この時のマウス脳内のシスト数は、 た、SAG-1 はトキソプラズマ感染防御に重要な分子で対照群より有意に多く、このことからもトキソプラズ

はあるが、他にも防御を誘導する分子の存在が示唆さ

マ感染に対する感受性の増強は明かであった。この原れた。さらに、SAG-1 は Th1 タイプの免疫反応を有意因を調べる目的で、マウスを Toxoplasma homogenateに誘導することが明かとなった。

で 免 疫 し、SAG1 に 対 す る 抗 体 価 を 調 べ た 結 果、

［文献］

transgenic mouse では、SAG-1 に対する抗体産生がほと

Seng, S. et al., (2000) Parasitol. Res. 86. 263-269.

んど見られなかった。次に、Ｔ細胞の反応性について

Seng, S. et al., (1999) Int. J. Parasitol. 29. 1433-1436.

検討した。マウスを Toxoplasma homogenate で免疫後、４週目に脾臓細胞を採取し、 Toxoplasma lysate antigen(TLA) 或いは SAG1 polypeptide で刺激後、48 時間後のＴ細胞の増殖を観察した結果、transgenic mouse では、TLA 及び SAG-1 に対する反応が極めて低かった。このStudies on SAG-1 of Toxoplasma for host immune responses using transgenic mice
By Hideyuki NAGASAWA, Noboru INOUE, Seng SEYHA, Minesuke YOKOYAMA, Ikuko IGARASHI, Kozo FUJISAKI, Takeshi MIKAMI, Yutaka YOYODA, Naoyoshi SUZUKI (National Research Center for Protozoan Diseases,
Obihiro University)Jpn. J. Protozool. Vol. 34, No. 1. (2001)

P16

57

アルカリ性pH領域におけるスパズモネ−ム収縮性に関するマグネシウ
ムイオン効果

○浅井 博1・落合 勉1・長谷川 健司1・陳 寧2（1早大・理工：2天津軽工業学院・食品工程系）
ツリガネムシの茎（ストーク）のコイル状収縮は、 性を種々のpHs（8.5から 9.2 まで）で、Mg2+ の存在下・その茎内にラセン状に存在する微細タンパク繊維の非存在下で測定した。その結果、2 mMのMg2+が存在し束(スパズモネーム)の収縮に基づく。その収縮はカルているときには、pH＝9.2でも収縮性がたもたれていシウムイオン（Ca2+）のスパズモネームへの結合にた。この収縮安定性はKCｌの非存在下でも、90 mM 存

よって引き起こされる。ストークの再伸長は、何らか在下でも同じであった。

2+

2+の方法でCa がCa 結合タンパク質（スパズミン）から

この弱アルカリ性領域における収縮性保持（逆に言え離脱するときに、起きる。生きたツリガネムシでは筋ば、pH 9.2以上における収縮性の喪失）は、スパズミ

小胞体におけるCa2+-ATPアーゼによるポンプ作用にンが原因ではなくて、新発見の疎水性200 kDa タンパ

よって、Ca2+がスパズモネームから除かれると考えら

ク質の性質によるものと推定される。そのことは、pHれる。グリセリン処理ツリガネムシのモデル実験で9.2以上におけるスパズミンのCa2+有無に伴う電気泳

2+

2+は、EGTAなどのCa 特異的キレート剤によって、Ca

動速度変化によって、確かめられた。言い換えれば、濃度が調節される。したがって、スパズモネームの疎水性200 kDa タンパク質は、スパズミンよりもアルCa2+励起による収縮は、生理学的現ながら純物理的現

カリ性に不安定であることが解った。

象である。
最近巨大スパズモネームの伸張度対発生張力の実
験から、スパズモネームはゴム弾性的であること、言い換えれば、収縮の力
はエントロピー力によることが分かった。
そのとき、折れ曲がり（フレキシブル）鎖の分子量は、約 50 kDaと評価された。この値は、スパズミンの分子量（１８〜２３kDa）よりも約２倍大きい。これは、エントロピー力を引き起こすタンパク質は、スパズミン
ではありえないことを示す。
実は、最近分子量約 200 kDaの疎水性の高いタンパ
ク質がその有力候補者であることを、我々は発見した。この疎水性で高分子量である事やフレキシブル鎖構造をとることは、titinやconnectin を想像させる。しかも、高橋ら（J. Biochem. 111, pp782 <1992>）によれ
ば、connectin filaments には二価金属イオンが結合するということである。
我々は、やや古い実験データであるが、弱アルカリ性領域におけるスパズモネームのMg2+ の存在による収縮性安定化の結果を得ているので、新しいデータを含めて発表する。
グリセリン処理ツリガネムシの茎のCa2+ 誘起収縮

Effect of Mg2+ on the contractility of the glycerinated spasmoneme of Vorticella in alkaline PH regions
By Hiroshi ASAI1 Tsutomu OCHIAI1, Kennji HASEGAWA1, and Ning CHEN2 (1Waseda University and 2Tianjin University of Light Industry)

原生動物学雑誌 第34巻 2001年

58

P17

原生生物 Paramecium multimicronucleatum の細胞分裂に対するステロイ
ドの効果

千田 芳裕1・○大畠 慶子2,3・塚原 保夫4（1東北大学大学院情報科学研究科；2東京大学
医科学研究所；3理化学研究所 脳科学総合研究センター；4公立はこだて未来大学）［目的］ ステロイドはシクロペンタノベルヒドロニッケルで痲酔をして数えた。この方法により同時にフェナントレン炭素特有（ステロイド骨格）をもつ比

死亡数もカウントした。細胞分裂間隔測定は96穴プ

校的小さい疎水性分子で、細菌を除くほぼ全ての生物

レートにゾウリムシを１匹ずつ入れ２時間毎に観察が生合成し、天然物として広く存在する物質のひとつし測定した。この一連の実験は女性ホルモンであるといわれている．多細胞動物の場合生殖に必獲の性ホestradiolを培地に添加した状態でも行った。

ルモン，代謝系のコントロールに用いられる副腎皮質［結果および考察］ 始めに通常の無菌培地中には６ホルモン，昆虫の腹皮・変題を制御するエクジソンな

μMのstigmasterol が含まれていることから、この濃度

どはステロイド骨格を持つステロイドホルモンとしが至適濃度であるかどうかを確認するため濃度を振て、極めて微量で作用を現し、代謝の基貿となるのでり増殖曲線を描き、さらに最高細胞密度を濃度毎に対はなく調節物質として働くことが知られている．その数プロットした。結果１）stigmasterol の至適濃度は0.6,受容体は標的細胞の細胞貿または核内に存在し、ホル6.0μM であり、それよりも濃くても薄くても抑制がモンと結合すると直接DNAに結合し転写因子となる． か か る と い う ホ ル モ ン 作 用 に 似 た ベ ル 型 の dose–
全てのステロイド受容体は結合するホルモンの種類

dependency が観察された。さらにこの増殖の違いがに拘わらずほぼ同じ構造をしており、ステロイド受容「死亡率の違い」なのか」「分裂周期の長さの違いな体スーパーファミリーを形成している．このことはスの か」を 検 討 し た と こ ろ、２）分 裂 周 期 の 長 さ がテロイドに対する受容機横は多細胞動物の進化のか

stigmasterol の濃度に依存している事が判明した。さらなり早い時期に獲得されたことを示唆する．一方、単に３）通常培地に同じステロイド骨格を持つ女性ホル細胞動物においてはステロイドがどのように用いら

モンestradiolを添加したところ、濃度依存的に増殖がれているのかほとんど分かっておらず情報伝達系と抑制された。そこで、この２つのステロイドが競合阻の関わりについても全く知られていないが、原生生物

害を起こすかどうか検討するためstigmasterol の濃度

ゾウリムシ等の個体群増殖に植物由来のステロイドを 振 り、estradiol を 添 加 し て い っ た と こ ろ、４）

stigmasterolを要求する事が広く知られている（１）。

stigmasterol濃度0.06μMでは顕著に濃度依存的な増殖

これらの事を背景に本研究では人工培地中のゾウリ抑制効果に乱れが生じた。１）の結果はstigmasterol が、ムシを用いて培地中のstigmasterol、さらには同じステ

単に代謝系の基質として働いているのではない事を

ロール骨格をもつ物質の含量を操作することにより、 示唆してる。ゾウリムシに植物由来のstigmasterol 特有
単細胞動物におけるステロイドは増殖／細胞分裂をレセプターがあると考えるには無理があるが、単細胞制御する細胞内情報伝達系になんらかの影響を与え動物に対するステロイドは増殖／細胞分裂を制御すているのか？それとも単に代謝系の基質として働いる細胞内情報伝達系になんらかの影響を与えているているのかを検討した．

と考えられる。

［方法］ ゾウリムシ株は無菌のP. multimicronuclea-［文献］

tum, YM—８、培地は全てAllen & Fok （２）の人工培

Whitaker. BD and Nelson. DL (1988) J. General Micro-

地を用いた。直径18 mm ×16 cmの試験管内に15 mlの培地を入れ、床より15度の角度を付けて傾け24 ℃で培養した。増殖曲線を描く際は、毎日定時に試験管のbiol.; 134, 1441-1447.
Fok. AK and Allen. RD (1979) J Protozool.; 26 (3): 46370.

培地を均等に混ぜて一部をとり、一定量の培地中のゾ
ウリムシを10分間絵の具の入った培地で泳がせた後、Effect of Steroids on Cell Division in Paramecium multimicronucleatum
By Yoshihiro Chida1, Keiko OHATA2,3, Yasuo Tsukahara4 (1GSIS, Tohoku Univ., 2IMS, Univ. of Tokyo; 3RIKEN, BSI;
4
Future Univ.-Hakodate)Jpn. J. Protozool. Vol. 34, No. 1. (2001)

P18

59

テトラヒメナ細胞質顆粒の運動○武藤 吉徳（岐阜大学・医療短大）［目的］細胞質内に存在するオルガネラは，静止したが 2.5 μm/sec 前後の大きな速度のグループに区別さ状態にあるのではなく，活発な運動性を示すことが古れた。大きい速度のグループは，前述の長距離を移動

くから知られている。こうしたオルガネラの運動や， する顆粒に対応する。こうした細胞質顆粒の運動は，それに伴う配置の変化は，細胞分裂や極性形成など多微小管を脱重合させるcolchicineによって，著しく阻害

様な細胞構築の過程で重要な役割を果たすと考えらされた。阻害は，長距離を移動する顆粒だけでなく，れる。培養細胞などでは，オルガネラが細胞骨格に局所的なランダムな運動にも及んだ。これらの結果

沿って移動することが明らかにされており，細胞質内は，Tetrahymenaの細胞質顆粒が微小管を介した機構に高度に発達した輸送系の存在が想定されている。一

により運動している可能性を示唆している。また，局

般に，原生生物には多様な細胞骨格系が存在すること所的なランダムな運動については純粋なBrown 運動から1)，細胞質のオルガネラの運動についてもユニー

ではないことが予想され，その細胞学的意義は興味深

クな性状が充分に期待される。そこで本研究では，い。

Tetrahymenaの細胞質顆粒の動きを，Time-lapseビデオ［文献］

画像を用いて解析した。

1) Fujiu, K. and Numata, O. (2000) Cell Motil. Cytoskele-［方法］Tetrahymena thermophila BⅡを培養後，無機塩

ton. 46, 17-27.

類溶液あるいはgrowth mediumに懸濁して測定に用いた。Tetrahymenaを生きた状態で静止させるためには，
直径10μmのラテックスビーズを支持物として用い，
カバーグラスで圧迫して細胞を保持した。細胞質顆粒
の観察は微分干渉顕微鏡を用い，CCDカメラで0.1秒
おきにTime -lapse画像を取得した。通常，１回の測定で100枚のTime-lapse画像をコンピュータのRAMに取り込んだ後，画像のコントラスト修正等の処理を行った。そして，この100枚の画像あるいはその一部の画像から顆粒の位置（XY座標）を測定し，これらから顆粒
運動の軌跡を再構成した。画像解析及び画像処理の一部には，NIH Imageを用いた。
［結果及び考察］Tetrahymenaの細胞質を微分干渉顕微鏡で観察すると，大きさの異なる様々な顆粒を識別することができる。これらの顆粒は，そのほとんどが僅かながら動いており，完全に静止している顆粒は少ない。顆粒の運動は，その動きが細胞質の局所に限定されたブラウン運動様のランダムなものと，比較的長距離を方向性を維持して移動するものの二つの型に分けることができる。前者の顆粒は，細胞内での位置があまり変わらないが，後者の場合は運動の結果，細胞内での位置が大きく変化する。方向性のある顆粒の運動軌跡には，直線的なものや，曲線状のもの，あるいは，同一経路を戻っていくようなパターンが認められた（Fig. 1）。また，顆粒の運動速度については，平Fig. 1 Vector diagram plot tracking the motion ofeight representative individual granules.

均速度が1 μm/sec前後の顆粒のグループと平均速度
Movement of cytoplasmic granules in Tetrahymena
By Yoshinori Muto (College of Medical Sciences, Gifu University)

原生動物学雑誌 第34巻 2001年

60

P19

ブレファリズミンおよびクリマコストールのDNA切断活性○寺嶋 昌代1,3・飯尾 英夫2・春本 晃江1（1奈良女子大学・理・生物、2大阪市立大大学
院・理学研究科、3東海女子短大）［目的］繊毛虫ブレファリズマのもつ赤い色素ブレ物のオトギリソウより抽出された色素のヒペリシン

ファリズミンは、色々な繊毛虫に対して、毒性・光毒も、暗条件下ではＤＮＡに作用しないが、強い光を照性があり、捕食性繊毛虫に対して防御機能をもつこと射すると、ＤＮＡを切断した。さらに、暗条件下でも、が明らかとなっている1、2、3）。また、ブレファリズマ

Cu（Ⅱ）イオン存在下ではＤＮＡを切断した。しかし、と同じ異毛目に属するクリマコストマムのエタノー

ブレファリズミンと異なり、NaOH(アルカリ条件下）

ル抽出物から毒性のあるクリマコストールが得られで、反応が促進された。クリマコストール、ブレファている4）。クリマコストールとブレファリズミンは、

リズミン、ヒペリシンのCu（Ⅱ）イオン存在下でのＤ分子構造はかなり異なっているが、その生合成過程はＮＡ切断活性は、OH・ラジカルのスカベンジャーであ

共通で、フェノールやケトンを生じるポリケチド過程

る安息香酸ナトリウムにより、阻害されたので、このを経ると考えられている。クリマコストールはレゾル

ＤＮＡ切断活性はOH・ラジカルの生成によるものとシノール誘導体であり、類似の化合物が植物のHakea

考えられる。

trifurcataより得られており、酸素およびCu(Ⅱ) イオン［文献］

存在下で、DNAを切断する活性が報告されている5）。 (1) A. Miyake, T. Harumoto, B. Salvi and V. Rivola, Eur.
ウルシから抽出されたカテコール誘導体であるウルJ. Protistol.25, 310-315 (1990)
シオールにも同様な活性が報告されている6）。今回、(2) T. Harumoto, A. Miyake, N. Ishikawa, R. Sugibayashi,

ブレファリズミンやクリマコストールについても、

K. Zenfuku and H. Iio, Eur. J. Protistol. 34, 458-470

DNA切断活性を調べた。

(1998)［材料・方法］Blepharisma japonicum (R1072株）より色素を抽出し、薄層クロマトグラフィーにより精製し(3) M. Noda-Terazima, H. Iio and T. Harumoto, Photochem. Photobiol. 69, 47-54（1999）

たブレファリズミンを得た。クリマコストールは合成(4) M. Eiraku-Masaki, T. Harumoto, M. Noda Terazima,

したものを用いた 4）。DNA切断活性はΦX174RFⅠ

A. Miyake, Y. Usuki and H. Iio, Tetrahedron Letters

DNAを用いて調べた。このDNAは超らせん構造（FormⅠ)をとっているが、ニックが入ると、環状構造（Form40, 8227-8229 (1999)(5) R. T. Scannell, J. R. Barr, V. S. Murty, K. S. Reddy andⅡ)になり、二重鎖が切断されると、線状構造（FormⅢ)

S. M. Hecht, J.Am.Chem.Soc. 110, 3650-3651 (1988)になる。この三者は、１％アガロースゲル電気泳動に(6) C. Wasser, F. Silva and E. Rodriguez, Experientia 46,

より区別できる。

500-502 (1990)［結果および考察］クリマコストールはCu(Ⅱ)イオン
存在下で、DNAを切断する活性があることがわかった。この反応はNaOH(アルカリ条件下）で促進された。
ブレファリズミンは暗条件下ではDNAに作用しない
が、強い光を照射すると、DNAを切断した。
さらに、暗条件下でも、Cu(Ⅱ)イオン存在下では、DNAを切断した。この反応は、NaOH(アルカリ条件下）で、抑制された。ブレファリズミンとCu（Ⅱ）イオンを作用させると黒っぽい沈殿物が生成するが、NaOHはこれを阻害した。ブレファリズミンと構造のよく似た植DNA cleavage by blepharismin and climacostol
Masayo Noda-Terazima1,3, Hideo Iio2, Terue Harumoto1(1Dept. Biol. Sci., Nara Women's Univ., 2Graduate School of
Science, Osaka City Univ., 3Tokai Women's Junior College)Jpn. J. Protozool. Vol. 34, No. 1. (2001)

P20

61

分光学的手法によるブレファリスマ光受容系の構造・機能解析○高田 雄一・徳森 大輔・Giovanni Checcucci・松岡 達臣（高知大・理・生物）［目的］
繊毛虫ブレファリスマ（Blepharisma japonicum）は
光刺激に反応して、一時的な繊毛打逆転反応を起こす（光回避反応）（１）。この光反応には、細胞膜直下に存在する色素小胞内に存在するブレファリスミン
（ＢＬ）と呼ばれるピンク色の光受容色素が関与している（２）。また、ＢＬの一部は２００ｋＤ膜タンパ
ク 質（２ ０ ０ Ｋ）と 複 合 体 を な し、色 素 顆 粒 内
honeycombを構成する膜上あるいは膜内に局在すると考えられている（３）。電子顕微鏡観察によると、
honeycombの各々の区画にも色素が沈着していること、クロマトグラフィによって多量２００Ｋと結合していないブレファリスミンが溶出してくることから、ＢＬの大半は単独で準結晶構造をなして存在する可能性がある。本研究では、分光学的手法によって、２００Ｋが確かに光エネルギー変換分子として機能している証拠を得た。さらに、in vivoＢＬ分子群の構造・機能がin vitroのものと大きく異なることを明らかにした。さらに、ＢＬ／２００Ｋ複合体における光エネ
ルギー変換機構についても検討した。
［方法］
ＢＬ／２００Ｋは、コール酸ナトリウムによって可溶化した細胞の疎水成分をヒドロキシアパタイト
クロマトグラフィによって分画することによって得た。ＢＬの光増感によって生じる一重項酸素は、
imidazole ／ Ｒ Ｎ Ｏ（p-nitrosodimethylaniline）反 応 系（４）を用いて検出した。遊離のブレファリスミンは、細胞をアセトン処理することによって抽出した。invivo吸収スペクトルの測定では、光散乱効果を排除するために積分球を用いた。
［結果・考察］１）in vivoＢＬ分子群の機能解析：生きた細胞のＢＬの単位吸光度あたりの蛍光強度は、界面活性剤により可溶化した試料（ＢＬとＢＬ／２００Ｋ複合体の混合試料）に比べて著しく小さいことがわかった。また、それらの吸収スペクトルも異なっていた。この結果は、in vivoＢＬ分子群の構造および機能が、可溶化された状態と大きく異なることを意味している。すなわち、生細胞内における色素分子群においては、光エネルギーを蛍光以外の反応（例えば光シグナル変換）に利用しているが、可溶化された色素分子はうまく光エネルギー変換ができず、蛍光を発して基底状態に遷移すると考えられる。電子顕微鏡観察の結果および非２００Ｋ結合色素の存在を考慮に入れると、生きた細胞のＢ
Ｌ分子は部分的に結晶構造的配向をなして集光アンテナ複合体をなし、一部は２００Ｋと結合して反応中心を構築している可能性が示唆される。集光アンテナＢＬ分子間の光エネルギー伝達機構として、エネルギー移動も想定できる。
２）ＢＬ／２００Ｋ複合体の機能解析：ＢＬ／２００
Ｋ複合体の単位吸光度あたりの蛍光強度（５５０ｎｍ励起）は、遊離のＢＬに比べて著しく小さかった。この結果は、２００Ｋが光エネルギー変換分子であることを意味していると同時に、色素の励起
一重項状態からの遷移によってタンパク質が活性化されることを意味している。
３）ＢＬ光増感による活性酸素種の生成とシグナリン
グ：ＢＬ光増感によって・ＯＨが生成することは既に報告した。また、一重項酸素が発生することも他の研究者によって報告されている。本研究において我々は、ＢＬ／２００Ｋ複合体において生成する一重項酸素生成量が、遊離のＢＬの場合と比べて小さくなることを明らかにした。この結果は、「色素の励起一重項状態からの電子移動等による２００Ｋの活性化」以外に、「ＢＬの励起三重項から酸素分子へのエネルギー移動によって生成した
活性酸素種が２００Ｋの活性化に関与する可能性」も残っていることを示唆している。
［文献］
1) Matsuoka,T. (1983) J.Protozool. 30, 409-414
2) Matsuoka,T. et al. (1994) Photochem.Photobiol. 60,
598-6043) Matsuoka,T. et al. (1993) Photochem.Photobiol. 57,
1042-1047
4) Kraljic,I. et al. (1978) Photochem.Photobiol. 28, 577581

Spectroscopic analysis of structure and function in blepharismin photoreceptor system.
By Yuichi Takada, Daisuke Tokumori, Giovanni Checcucci, Tatsuomi Matsuoka (Dept.Biol., Kochi Univ.)

原生動物学雑誌 第34巻 2001年

62

P21

ゾウリムシNAP-1の遺伝子解析○西山 学即1・石田 正樹2・山内 清志3（1福島県立医科大学・医学部・生物；2三重大学・医学部・生理学第一講座；3静岡大学・理学部・生地環）[目的]

子から発達してきたことを示唆している。以上の結果

我々は、以前にP. caudatumのHb遺伝子近傍で非コーより、ゾウリムシにおいて今回クローン化したDNAはディング領域での遺伝子編集に様々なパターンがあ

高等生物NAP1DNAのホモログであると思われる。まり、同一の遺伝子をコードしながらゲノムサイズの異た、サザンブロット解析、PCR解析の結果からNAP1遺なる断片が複数存在していることを報告した（１）。 伝子の上流域、下流域にもサイズの異なる複数の断片
今回、Hb遺伝子近傍で見らる上記の現象がP. cauda-の存在が認められ、ゾウリムシの大核のゲノムでは一

tumでは一般的に行なわれているかどうかを明らかに

般的に遺伝子は複数のサイズの異なる断片の上にする目的でHb遺伝子下流域に存在するNAP-1遺伝子乗っていることが示唆された。NAP-１は、細胞周期とに注目して解析を行った。また、NAP-1遺伝子は既に共にその動態が大きく変化する分子として非常に興

多くの生物で単離精製されその機能解析が行なわれ味深い。そこで、NAP-1の転写活性が細胞の状態にている。NAP-1は、ヒストンの分子シャペロンとしてよってどう変化するかをノーザンブロット解析によ知られクロマチンの凝集、脱凝集に深く関っている。 り調べた。細胞が盛んに分裂を繰り返すLOG期と、接我々は、P. caudatumからNAP-1遺伝子をクローニング

合活性が高まる飢餓期2日目において、NAP-1の発現しアミノ酸配列から他種の其れと比較し、また、P.

量は一定であった。

caudatumでの細胞の成長状態とNAP-1遺伝子発現量[文献]の変動を明らかにした。

(1) Yamauchi et al., (1992 )BBA 1171, 81-87[方法]
株はParamecium caudatumのYC、G3YC-4株を用いた。
この株から得たDNA、RNAからゲノムライブラリー、
ｃDNAライブラリーを作製し、NAP-1をコードする
DNAをクローニングし塩基配列を決定した。DNAから推定されるアミノ酸配列を他の生物の蛋白と比較
し近接結合法により系統樹を作成した。
[結果と考察]クローニングしたParameciumのNAP-1遺伝子の塩基配列を決定したところ、其れは369アミノ酸の分子量
43kDaの蛋白をコードしていることが解かった。コー
ドされる配列を他種の生物のNAP-1、NAP-1に類する蛋白と比較したところ23-27％のホモロジーが見られた。また、一次構造を詳細に見てみると核移行シグナ
ル、細胞質移行シグナルと似ている領域が存在し、またヒストンと結合すると思われる酸性アミノ酸の領域も確認できた。これらは、他の生物種のNAP-1によく保存されているモチーフである。それらのアミノ酸配列の比較から系統樹を描いたところ動物、植物、菌類、繊毛虫類に分岐し、これらの分子が共通の祖先分Structure and expression of NAP-1 gene in Paramecium caudatum.
Norihito Nishiyama1, Masaki Ishida2 and Kiyoshi Yamauchi3 (1Dept of Biol, School of Medicine, Fukushima Medical
University, 2Dept of Physiology, School of Medicine, Mie University, and 3Dept of Biol and Geos, Faculty of science,
Shizuoka University)Jpn. J. Protozool. Vol. 34, No. 1. (2001)

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P22 Paramecium multimicronucleatumの接合型変換に伴う接合型特異的物質の変化○深作 太郎，三輪 五十二（茨城大学・理・自然）［目的］Paramecium multimicronucleatum, syngen2、１た。ピューロマイシンを最終濃度150μg/mlで2時間処

１０B株の接合型変換リズム発現とそれに伴う接合型

理すると接合活性を消失させることができた。これは特異的物質の変化、Ⅲ型接合型物質とⅣ型接合型物質処理をⅢ型発現時でもⅣ型を発現している時でも差の発現と合成過程について調べた。１１０B株の発現はなかったが薬剤を取り除いたあとの接合活性の回する２つの接合型の接合型特異物質の合成の時期を

復にはⅢ型発現の方が多少早い回復が見られた。LD

特定するためタンパク質合成阻害剤、ピュ―ロマイシ

１２：１２条件下で3時間おきに3時間づつピュ―ロマ

ンとタンパク質分解酵素トリプシンを様々な時期にイシンを処理したところ暗期の特に後半6時間に処理処理した。また、ピュ―ロマイシン処理やトリプシン

した場合その後の接合型Ⅳの発現期間が極端に短縮

処理後の活性の消失した細胞の繊毛とⅣ型とⅢ型をした。暗期の前半部分ではその影響が少ない為１１０

それぞれ発現している細胞の繊毛とを電気泳動によBでは暗期導入後しばらくしてから接合型Ⅳの発現にり物質的な差異が見られるか調べた。

は重要なタンパク合成が行なわれていることが考え［方法］用いた株はParamecum multimicronucleatum、られる。一方、タンパク質分解酵素のトリプシンを用

syngen2に属する110B、53B、49Bである。110B株はいた場合、接合活性の消失する最低濃度であっても接cycler株で、53B、49B株はそれぞれ接合型Ⅲと接合型合活性が再び回復するのに約15時間かかり接合型変Ⅳを常に発現しているacycler株です。これらacycler株換の詳しい解析には利用できなかった。しかし、トリ

は110Bの接合活性を測定する際のテスター株としてプシン処理によって繊毛運動には支障をきたしてな用いた。培養液はK-ドリル氏液にレタスジュースを加いことから接合活性に必要な部分だけが取り除かれえたもの。培養液には一日前にKlebsiella pneumoniae

たと考えられる。トリプシン処理後とピュ―ロマイシを接種し使用した。株の培養は明暗条件下で明期の照ン処理後とで回復の早さにかなりの差があることか

度は約１５００lux、温度は25℃に保った。今回使用しら、接合型の発現や変換の際に合成されている物質はた薬剤、ピュ―ロマイシンはK-DSに溶かし最終濃度

接合型発現に必要な中の一部分のようである。またⅢ

150μｇ/ｍｌで処理した。処理後洗浄する際はK-DSを型とⅣ型を比較してピュ―ロマイシン処理後の回復

使用し外液より薬剤を取り除いた。トリプシンはの速さから接合型物質Ⅲは接合型物質Ⅳより比較的

0.01％で10分間処理した。この際もピュ―ロマイシン

早く合成が終了し発現可能になるようである。しか同様の方法で処理後洗浄した。繊毛はNECS法によっし、cycler株はそれぞれの株によって独自の変換の様て分離した。SDS-PAGEで繊毛試料を電気泳動し銀染式をもつため１１０Bの例が一般的なことかどうかは色で染色した。

わからない。今後は別のcyler株においても同様に調［結果と考察］今回、cycler株（１１０B）の基本的なべ、その点をはっきりさせる必要がある。SDS−PAGE

接合型変換リズム形成とその際の接合型特異物質のにおいての接合型特異的物質の相異については薬剤変化についてを調べた。１１０Bの接合型変換は振動

未処理細胞とピュ―ロマイシン処理後、トリプシン処型と砂時計型の複合計時機構によって支配されてい理後の繊毛上タンパクでいくつかの異なったものをると考えられている。発現する接合型のうち接合型Ⅳ見いだす事ができた。しかし、これらが接合に直接的は一日のうちでも8時間程度で恒明条件下では消失すに関わっている物質かどうか断定はできないが何らる事からこの接合型の発現には暗条件が必要である

かの関与のある物質であることが考えられる。

事がわかる。そこでタンパク質合成阻害剤やタンパク
質分解酵素処理を試み、必要な合成期の特定を試み

Alteration of mating type substances during the mating type reversals rhythm in Paramecium multimicronucleatum.
By Taro Fukasaku and Isoji Miwa (Dept. Biol., Fac. Sci., Ibaraki Univ.)

原生動物学雑誌 第34巻 2001年

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P23

ゾウリムシにおける新規キナーゼ遺伝子の探索○和田 智、小原 真司、渡辺 彊（東北大・院理・生物）［目的］細胞の増殖、分化は様々な外界からのシグナ

化される調節部位の配列は TEY であるのに対し、今回ルによって調節されており、そのシグナルを細胞内に得られた遺伝子のアミノ酸配列は TDY であった。ま伝え、種々の細胞応答に変換する細胞内情報伝達系をた、
典型的な MAP キナーゼのアミノ酸全長が約 300 で研究することは、細胞の増殖、分化だけではなく様々あるのに対し、今回単離した遺伝子はアミノ酸全長はな細胞機能を解明するために重要である。しかしなが573 と長かった。アミノ酸配列のホモロジー検索の結ら 単 細 胞 真 核 生物 で あ る ゾウ リ ム シ (Paramecium

果から Homo sapiens STK-9、Fugu rubripes の STK-9 と

caudatum) における細胞内情報伝達の仕組みについての相同性が認められた。また、代表的なキナーゼファの研究はきわめて限られており、これからの基礎的なミリーとの比較のために系統樹を作成したところ、データの蓄積が必要である。そこで今回、ゾウリムシ

MAP キナーゼファミリー、CDK ファミリーとは異な(P. caudatum) の細胞内でのシグナルトランスダク

り、STK-９に近いことが分かった。しかし、完全にション研究の第一歩として、高等真核生物に高く保存

STK-９ファミリーに属するとはいえず、ゾウリムシ

されて存在する MAP キナーゼの単離を目的として実特有のファミリーを形成する遺伝子かもしれないと験を試みた。

いうことが考えられた。

［方法］MAP キナーゼファミリーにおいて様々な種［文献］

で高度に保存されているアミノ酸配列から予想されMontini, E et al., 1998. GENOMICS 51, 427-433

る塩基配列を縮退プライマーとして作成し、そのプライマーを用い、cDNA を鋳型として PCR を行った。増幅された PCR 断片の配列を決定し、その配列を含む遺伝子の全長の配列をシークエンスし、cDNA における全長の配列を決定した。得られた cDNA 全長から新しくプライマーを作り、ゲノム DNA を鋳型として PCR を行い、この遺伝子のゲノムにおける全長を単離した。遺伝子の塩基配列とそこから予想されるアミノ酸配列の分析を Gapped BLAST search で行い、種々のタンパク質とのアミノ酸配列のアライメントの比較を行った。また、近隣結合法によって系統樹を作成した。
［結果及び考察］今回単離した遺伝子の cDNA、ゲノム DNA の配列を決定した。イントロンは 5 個存在し、そのどれもが 20bp 程と短かった。cDNA から予想されるアミノ酸配列中には他のキナーゼで保存されている ATP 結合部位、キナーゼ活性部位の配列が存在した。MAP キナーゼにおいて最も重要な調節アミノ酸配列である、スレオニンとチロシンの配列が存在していた。しかし、典型的な MAP キナーゼのアミノ酸配列
では、これら MAP キナーゼキナーゼによってリン酸

Screening of new protein kinase gene in Paramecium caudatum.
By Satoru WADA, Shinji OBARA, Tsuyoshi WATANABE (Biological Institute, Tohoku University)Jpn. J. Protozool. Vol. 34, No. 1. (2001)

P24

65

ゾウリムシの磁場感受性応答○竹田 龍太郎1・清水 喜久雄2・中岡 保夫1（1大阪大学・基礎工学研究科・生物工学、2RI総合センター）[目的]

我々は、ゾウリムシが、0,7 T 程度の定常ではないことを示している。

磁場に対して、垂直の方向に泳ぐことを見つけた。

次に、細胞膜直下に多数配列しているトリコシス

その原因は、細胞内器官の反磁性的な性質にあるとトについて検討した。トリコシストを持たない tl-

考え、繊毛、大核、トリコシスト等について磁場にmutant と、ト リ コ シ ス ト の 配 列 が 不 揃 い の tam-

対する感受性を検討した。またゾウリムシの膜を流

mutant では、磁場と垂直方向に泳ぐ細胞の割合が減れる電流が関係するかどうかも検討した。

少した。したがって、トリコシストが細胞内で規則[方 法]

ゾ ウ リ ム シ は、P. multimicronucleatum

的に並んでいることが磁場感受性に影響すると考え(wild)、P. aurelia (pawn-B, nd-3, tl-mutant, tam-mutant)られる。一方、これらのトリコシストに異常のあるを藁汁により培養した。定常期の細胞を、行動観察

mutants は、大核の形態と細胞内での配置にも異常が用液 (CaCl2 1 mM, MgCl2 0.5 mM, Tris-HCl (pH 7.2) 2

見られたので、大核を取り出し、磁場中での配向性mM) で洗い分光器用セルに入れて磁場中の泳ぎを観を調べた。しかし P. multimicronucleatum から取り出察記録した。繊毛の除去は P. multimicronucleatum にした大核について、0.68 T 中での配向性は見られな

ついて Ethanol 法により行った。サポニン・モデルは

かった。

2+

P. multimicronucleatum を saponin 処理後 Mg を含む液さらに細胞表面に多数はえている繊毛について検で洗浄し、Mg･ATP 液で再活性化した。大核は、P.

討するために、繊毛だけを集め磁場中に置いた時のmultimicronucleatum をサポニン処理により細胞を破配向性を調べた。0.68 T の磁場中では配向性が認め

壊して取り出し、大核部分をを sucrose 密度勾配によられなかったが、8 T の超強力磁場ではほとんどの繊

り分画、精製した。

毛が磁場と平行に並んだ。

磁場は、２枚の磁極板を平行に配置しその中央でこれらの結果から、ゾウリムシの細胞膜の内外面に0.68 T の定常磁場が発生するようにした。試料を分多数並んでいる繊毛とトリコシストが反磁性的な性

光器用セルに入れパラフィルムで口を閉じたものを質を持つために、ゾウリムシは磁場と垂直方向に泳磁極内に横向きに入れた。セルの下側から照明光をぐと考えられる。

当て上側から実体顕微鏡、ビデオカメラにより観[文献]

察・記録した。

Nakaoka, Y. et al., (2000) Bioelectromagnetics 21, in press.

[結果及び考察]

K+イオンを加えていない行動観察

用液中で、いずれのゾウリムシ株もほとんど方向変
換せず直進して泳いだ。この条件で磁場の中に置くと、P. multimicronucleatum、と P. aurelia の pawn-B,
nd-3 は、徐々に磁場と垂直に向かうように弧を描きながら泳ぎ高い割合の細胞が磁場と垂直方向に進んだ。そこでこのような磁場に対する応答が細胞のどのような性質、因子によるのかを検討した。
まず、P. multimicronucleatum のサポニン・モデルを作成し ATP を加えて磁場中で泳がせたところ、磁場と垂直方向に泳ぐ傾向が見られた。この結果は、磁場の作用が細胞膜を流れる電流と関係しているもの

Magnetic field sensitive behavior in Paramecium.
By Ryutaro TAKEDA1, Kikuo SHIMIZU2, Yasuo NAKAOKA1 (1Biophysical Engineering, Graduate School of Engineering Science, 2RI Center, Osaka University)

原生動物学雑誌 第34巻 2001年

66

P25 ゾウリムシのトリコシストエキソサイトーシスと細胞内カルシウムレベ
ルの高速同時記録○岩楯 好昭（徳島大・総合科学），菊山 宗弘（放送大・生物）[目的] ゾウリムシのトリコシスト放出は高速なエキえた。しかし残念ながら上記の測定では∆[Ca2+]i は１

ソサイトーシスである。トリコシスト膜と細胞膜の融相だった。そこで次に，エタノールに先立ち EGTA を合は刺激後わずか 30 ms で起こる。過去放出に伴うカスプレーすれば，もし細胞外からのカルシウムの流入

ルシウムトランジェント（∆[Ca2+]i ）が観測された (1,2)

があるのであればこれを遅らせることができるのでが，それらの時間分解能は高々ビデオレート (33 ms)はないかと考えた。エタノールに先立ち 20 mM EGTA

2+であり，また放出とカルシウムレベル ( [Ca ]i )を同時をスプレーするとグラフに示すように∆[Ca2+]i は２相2+計測していないため，放出と∆[Ca ]i の時間的な関係， になり，トリコシストの放出は２相目の中盤になって及び，カルシウムの出所が細胞内ストアのみかあるい

初めて起こった（グラフ中，縦棒：トリコシスト放出

は細胞外からの流入もあるのかは曖昧なままであっ時刻，横棒：エタノールスプレー時間）。
さて，この２相目の∆[Ca2+]i が細胞外からの流入にた。
2+

我々は [Ca ]i と顕微鏡像を，顕微鏡光路の切り替よるものであれば， より高濃度の EGTA をスプレー

えなしに，同時に取得できるシステムを作成し計測しすれば，∆[Ca2+]i はさらに抑えられるはずである。100た。すると∆[Ca2+]i が確かにトリコシスト放出直前で

mM EGTA をエタノールに先立ちスプレーすると，∆

2+あること，∆[Ca ]i には細胞外からのカルシウム流入[Ca2+]i は小さなもの１相になり，かつトリコシストのも関与していることがわかった。

放出は見られなかった。

[方法] 倒立顕微鏡に青色発光ダイオードを取り付
け，明視野観察用の照明と蛍光色素の励起光光源との兼用にした。明視野像はＣＣＤカメラで撮影し，蛍光
色素の蛍光強度は高電子増倍管で測定した。この方法
では蛍光強度の空間的な測定は出来ないが，蛍光強度以上より，（１）∆[Ca2+]i の立ち上がりは確かにトリコシスト放出直前であること（２）∆[Ca2+]i は細胞内ストアからの放出と細胞外からの流入からなることと顕微鏡像を光路の切替えなしに簡単に同時取得でがわかった。

きる。

[文献]

ゾウリムシにカルシウムグリーン（ CaG ）を注射しトリコシスト放出の様子をCCDカメラで， CaG の蛍

1) Iwadate, Y. et al., (1997) Protoplasma 200, 117-127.
2) Erxleben, C. et al., (1997) J. Cell Biol. 136, 597-607.

光強度変化を高電子増倍管で同時に測定した。
[結果] ゾウリムシに飽和ピクリン酸をスプレーすると決してトリコシストを放出しないばかりか時間幅の長い異常な∆[Ca2+]i が見られた。飽和ピクリン酸はトリコシスト放出薬といわれているが，本研究の目的
ではピクリン酸は使えないことがわかり，エタノールを用いることにした。
ゾウリムシにエタノールをスプレーすると過去報告されているのと同じ時間幅の△[Ca2+]i が観測され，かつ正常なトリコシスト放出がみられた。詳しく見てみるとこの [Ca2+]i は確かに放出に先立っていた。
トリコシスト放出を引き起こす△ [Ca2+]i が細胞内ストアからの放出と細胞外からの流入の両方によるものなのであれば，２相の△[Ca2+]i が測定できると考Simultaneous recording of calcium transient and exocytosis in Paramecium caudatum with high time-resolution
by Yoshiaki IWADATE (Faculty of Integrated Arts and Sci., The Univ. Tokushima) and Munehiro KIKUYAMA (Biol.
Lab., The Univ. the Air)Jpn. J. Protozool. Vol. 34, No. 1. (2001)

P26

67

４種のゾウリムシにおける繊毛運動調節の違い○関 誠，野口 宗憲（富山大・理・生物圏）[目的] これまで，ゾウリムシに関してはどの種でも毛逆転を起こすのに約10倍の濃度差があった。また

繊毛運動の調節機構は同じだという前提で研究が進

Ca2+による繊毛逆転に対するcAMPの拮抗作用についめられがちであったが，種の異なるゾウリムシの間でては5 µM Ca2+存在下でP. bursariaの繊毛逆転が解除さ繊毛運動や刺激に対する反応に関与する調節機構やれることはなかったのに対し，他の3種では約 50 µM

調節タンパクが全く同じである保証はない。代表的なのcAMPで繊毛逆転の解除が見られた。P. bursariaに関4種のゾウリムシ（P. caudatum, P. multimicronucleatum,

しては低濃度のCa2+ で繊毛逆転が生じることを考慮

P. tetraurelia, P. bursaria）を用い，繊毛軸糸のcAMP依に入れ，Ca2+ の濃度を0.2 µMに下げてcAMPの拮抗作

存的リン酸化を調べた結果P. bursariaだけが29kDaの用を調べた結果約100 µMのcAMPでほぼ繊毛逆転のタンパクのリン酸化が極端に少ないことが分かった。 解除が起こった。また，P. caudatumの場合cAMPの作用
この結果に基づき，今回はこれら4種のゾウリムシにを消失させる事が分かっているtrypsinの影響 (2) につついて細胞表層シートを調製し繊毛打方向を見やす

いても調べたところいずれの種でもcAMPの作用の消くするためにグリセリン存在下で (1)，繊毛打方向の失を見ることが出来た。P. bursariaにおいて繊毛打方

Ca2+ 濃度依存，Ca2+ とcAMP との拮抗作用，そして向のCa2+濃度依存性やcAMPの作用が他のゾウリムシ

trypsin処理の影響の3つの点について，それぞれの種と異なるのは外腕ダイニンの調節軽鎖と考えられてによる違いを調べた。

いる29kDaタンパクの違いによるものかもしれない。

[方法] ゾウリムシを先端を細く加工した駒込ピペッ

29kDaそのものが少ない，もしくはリン酸化の程度がトでサスペンドすることにより細胞表層シートを調低いという可能性が考えられる。

製した。これをスライドガラス上に滴下したものを， [文献]
ワセリンを両端に塗布したカバーガラスで封入し再活性化溶液をかん流できるチェンバーとした。チェン
バーの片方の開口部から最初に0.05％Triton X-100を含んだ再活性化液を流し除膜した後，グリセリンを含1) Noguchi et al. (1991) Cell Motil. Cytoskeleton 20:3846.
2) Noguchi et al. (2000) Cell Motil. Cytoskeleton 45:263271.

んだ様々な条件の再活性化液を流し繊毛を再活性化
して繊毛打方向の変化の様子を観察，録画した。
[結果と考察] 大型のP. caudatum,やP. multimicronucleatumについては以前から細胞表層シートによる実験は行われてきたが，今回初めて小型のP. tetraureliaとP . bursariaについて細胞表層シートを調製することに成功した。繊毛運動の動きを見やすくするために30％グリセリンを含んだ再活性化液を流した場合，3種のゾウリムシにおいてはこれまでの観察どおり繊
毛打が抑制され繊毛打方向が明瞭になったが，P.
bursariaにおいてはこの傾向はあまり顕著ではなかった。Ca2+ 濃 度 依 存 性 に つ い て 調 べ て み た と こ ろ P.
bursariaが他の3種に比べて低い濃度のCa2+ で繊毛逆転が起こる事が分かった。P. bursariaと他の3種では繊Difference in Ciliary Control by Ca2+ and cAMP between species of Paramecium.
By Makoto SEKI and Munenori NOGUCHI (Dept. of Environ. Biol. and Chem., Fac. of Sci., Toyama University)

原生動物学雑誌 第34巻 2001年

68

P27

核内共生細菌ホロスポラオブツサの宿主外培養○藤島 政博、塚脇 紀和（山口大・理・生物）［目的］グラム陰性細菌ホロスポラオブツサは、リ［結果及び考察］ゾウリムシ 24 リットルの培養からケッチアに近縁の細菌で、ゾウリムシ (Paramecium

2.0 x 106 の大核を単離した。この単離大核を 0.4% (w/caudatum) の大核に侵入し、その中で増殖する核内共v) のトリパンブルーで染色すると大部分の大核クロ生細菌である。この細菌のゲノムサイズは大腸菌の約

マチンは染色されず、核膜が無傷の状態で大核単離が1/3 (1.2 Mbp) しかなく (M. Rautian、私信）、大核内で行われたことが示された。この結果は、大核内のホロは宿主のタンパク質合成存在下で増殖する。これらのスポラが大核単離に用いる NP-40 の影響をあまり受特徴は、ホロスポラの増殖には、宿主の核タンパク質

けていないことを示唆している。この単離大核のホモが必要であることを示している。細胞内共生細菌の宿ジネートを培養し間接蛍光抗体法でホロスポラを観主外培養は、ヒメゾウリムシの細胞質内共生細菌の察すると、細胞数の増加確認された。細菌のタンパク

Caedobacter conjugatus（かつて mu と呼ばれていた）と質合成阻害剤カナマイシン存在下では、ホロスポラの

Lyticum flagellatum（かつて lambda と呼ばれていた）で増加が完全に抑制された。以上の結果は、ホロスポラ

成功の報告があるが通常は困難とされている。ホロスの宿主外培養に成功したことを示している。この培養

ポラオブツサの宿主外培養の試みはこれまでに３つ方法では、雑菌の混入を防ぐことが困難であった。しの研究室で行われたが、市販の細菌用培地や mu やかし、ホロスポラの識別に用いたモノクローナル抗体

lambda の培地では成功しなかった (H.-D. Gortz, 私信；の特異性の強さと細菌の形態の特徴から、増殖した細A. Sold, 私信）。我々はこの研究で、宿主大核のホモジ菌がホロスポラオブツサであることはほぼ確実であ

ネートを用いたホロスポラオブツサの宿主外培養をる。最近、カナマイシン抵抗性のホロスポラオブツサ

試み、増殖型ホロスポラオブツサの培養に初めて成功を単離することに成功したので、今後は、この突然変した。

異体を用いてカナマイシン存在下で宿主外培養を試［方法］ 増殖型ホロスポラオブツサを大核内に持つみる。

ゾウリムシを大量培養し（24 リットル）、大核を単離
1)

筆者らは、この培養に酵母菌を加えるとホロスポラした 。大核を 10 ml の 85 mM sucrose に懸濁し、1,000の増殖が促進されることを偶然発見した。酵母菌によg で 5 分 (4℃) 遠心して洗浄し、5 ml の 85 mM sucrose

る増殖促進の作用機構はまだ明らかではない。

に懸濁し、氷で冷やしながらテフロンホモジナイザー［文献］

でホモジナイズした。ホモジネートを 1 ml ずつ 1.5 ml1) M. Fujishima, K. Nagahara and Y. Kojima. Zool. Sci.,

tube に分注し、25℃で培養した。 その後、培養開始
当日、3 日、5 日、7 日、13 日、15 日、21 日、35 日に
2 μ l 取って間接蛍光抗体法で観察した。間接蛍光抗7, 849-860, 1990.
2) M. Kawai and M. Fujishima. Europ. J. Protistol., 36,
46-52, 2000.

体法の一次抗体には、ホロスポラオブツサの細胞外膜
特異的モノクローナル抗体 (IR-4-1) を使った。この抗体は、他種のホロスポラやゾウリムシの培養液に用いる細菌 Kelebsiella pneumoniae や大腸菌などとは交差反応しない特異性の強い抗体である 2)。
一 方、YPD 培 地 で 25℃ で 培 養 し た 出 芽 酵 母(Saccharomyces cerevisiae) をホロスポラの培養に加えて影響を調べた。

Host-free culture of the endonuclear symbiotic bacterium Holospora obtusa.
By Masahiro FUJISHIMA and Motokazu TSUKAWAKI (Biol. Inst., Fac. Sci., Yamaguchi University)Jpn. J. Protozool. Vol. 34, No. 1. (2001)

P28

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DNA再配列を示唆するニハイチュウの微小DNA群の存在

能登 朋子，○遠藤浩（金沢大・理・生物）［目的］中生動物ニハイチュウは，軸細胞 (Axial

ＤＮＡを電気泳動したパターンによく似ており，微cell) と呼ばれる大きな細胞とそれを取り囲む３０個

小ＤＮＡ群は環状ＤＮＡとして存在している可能性

程度の体皮細胞 (Jacket cell) からなる単純な体制の多が出てきた．そこで，この可能性を検証するため

細胞生物である．中生動物の系統についてはまだ一に，５つのクローンの塩基配列をもとにそれぞれプ

致した見解はなく大別すると，１）名前の通り原生ライマーを設計し，全ＤＮＡを鋳型としてInverse

動物と後生動物をつなぐ中間の生物である，２）三PCR を行った．すべてのプライマーの組み合わせ

胚葉性の後生動物から退化した生物である，３）多で，予測される長さのＰＣＲ産物が増幅した．この細胞の原生動物である，とする説などがある．我々

ことは，これらのＤＮＡが環状の構造をしているこは第３の立場に立つ．

とを示している．

ニハイチュウの軸細胞内には，生殖細胞に相当す

遺伝子をコードしていない環状ＤＮＡ群の存在る軸原細胞 (Axoblast) とそれから発生した幼生，さは，トランスポゾンやレトロウィルスと類似したや

らに繊毛虫の大核のような倍数性の核 (Meganucleus)

り方で，ＤＮＡの再配列がニハイチュウの核でも起がある．また，軸原細胞核と比べると，周りを取りこっていることを示唆している．実際，ニハイチュ

囲む体皮細胞も大きなサイズの核をもつ．これらのウの無性生殖期の発生を見ると，軸原細胞から幼生

核の存在は，ニハイチュウ類と分化した大核をもつが分化してくる．この幼生は成体の単なるミニチュ

繊毛虫類との類似性を連想させる．ニハイチュウか

アで，細胞数は成体と変わらない．その後、個体

らＤＮＡを抽出すると，約 500 bpのサイズの微小Ｄ（細胞）の成長にともない，核はその容積を増す．

ＮＡが検出される．これは染色体とは別個に存在す

現在我々は，個体成長の際にＤＮＡの再配列と増幅

るＤＮＡと考えられる．そこで，が起こると想定している．今後、再配列前の染色体ＤＮＡ再配列の可能性を念頭に置き，この微小ＤＮ

ＤＮＡを得られれば，ニハイチュウの核分化のメカ

Ａの構造を解析した．

ニズム，さらにはかつて Lapan 等が主張したよう［方法］ニハイチュウ Dicyema sp. はマダコの腎嚢表に，繊毛虫との関連を分子レベルで明らかにできる面から採取した．微小ＤＮＡは，全ＤＮＡをアガのではないかと考えている．

ロース電気泳動し，ゲルから抽出して調整した．

［文献］［結果及び考察］このＤＮＡを制限酵素 Dra I で切断

1) Lapan, A. E. and Morowitz, H. (1972) Sci. Am. 227,

してクローニングし，塩基配列を決定した．これま94-101.2) Bardele, C. F., Huttenlauch, I. andでに２０クローン（Dra I siteをもつ１２クローンとSchoppmann, H. (1986) Symposia Biologica Hunga-

もたない８クローン）を解析したところ，これらのrica 33, 115-124.

ＤＮＡは多様な分子種からなり，すべて異なる配列

3) Halanych, M. K. (1991) Mol. Biol. Evol. 8, 249-253.

をもっていることがわかった．また，長いＯＲＦを

4) Cavalier-Smith, T. (1993) Amer. Micros. Soc. 57, 953-

もつクローンは見つかっておらず，遺伝子をコードしていないと考えられる．

994.
5) Czaker, R. (2000) The Anatomical Record 259, 52-59.

クローン化したＤＮＡの一つをプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行ったところ，500
bpのＤＮＡ上に加えて，さらに１ Kb 付近にも２つのシグナルが得られた．これらは環状のプラスミド

Possible DNA rearrangement in polyploid nucleus of dicyemid mesozoa.

By Tomoko NOTO and Hiroshi ENDOH (Dept. Biol., Fac. Sci., Kanazawa Univ.)