Ⓒ2017 The Japanese Society for AIDS Research

The Journal of AIDS Research

第 17 回日本エイズ学会 ECC 山口メモリアルエイズ研究奨励賞受賞研究

HIV-1 プロテアーゼの二量体化の機序の解析とその阻止，およびHIV-1 プロテアーゼ阻害剤のデザインと開発
Elucidation of the Mechanism of HIV-1 Protease Dimerization and
Its Inhibition by HIV-1 Protease Inhibitors
林宏典

Hironori HAYASHI

国立国際医療研究センター難治性ウイルス感染症研究部

Department of Refractory Viral Infection, National Center for Global Health and Medicine
日本エイズ学会誌 19 : 128⊖136，2017

研究背景

DRV 耐性誘導実験は 2010 年に Koh らによってすでに報告されており，DRV 耐性に重要な 4 つの変異（V32I/L33F/

HIV-1 に対する抗ウイルス療法（ART : antiretroviral therapy）

I54M/V84I）が明らかとなっている3, 4）。本稿では，PR がこれの導入は，HIV-1 感染者の quality of life（QOL）を劇的に

ら 4 つの変異を獲得することによってどのような変化が起改善するだけでなく二次感染の予防に繋がること（TasP :こり薬剤耐性を獲得しているのかを結晶構造解析，質量分

treatment as prevention）が示され，ART および ART に使用

析，分子動力学計算および熱力学的解析を用いて検討したされる抗 HIV 剤の重要性がますます高まっている。他方，

結果と，われわれが設計・合成・開発し，HIVDRVRs に対して高現在の ART では，感染患者内から HIV-1 の排除は不可能

い阻害効果を発揮する新規 PR 阻害剤（protease inhibitors ;で，いったん感染すると複数の抗 HIV-1 剤を一生涯にわたPIs）の分子機序について解説するとともに，DRV およびり毎日服用しなくてはならない。しかも HIV-1 は容易に薬

tipranavir（TPV）に代表される PR の二量体化阻害剤の作剤耐性を獲得するため，薬剤の長期服用による多剤耐性

用機序と新規二量体化阻害剤の開発について述べる。

HIV-1 変異株（HIV-1MDRs）の出現がいぜん大きな課題である。
2006 年に米国 FDA に認可を受けた darunavir（DRV）は，

薬剤耐性変異が PR の構造に及ぼす影響と薬剤耐性獲得のメカニズム

HIV-1 野生株（HIV-1WT）だけでなく HIV-1MDRs に対しても

PR は単量体（monomer）が 99 アミノ酸から成る比較的高い抗 HIV-1 活性を示し，さらに HIV-1 の薬剤耐性獲得に

小さなタンパク質でその酵素活性の発揮には二量体化が必対して高い抵抗性を示す（高いジェネティックバリアを有須である。PR が二量体（dimer）を形成することは 1980する）ことがしられている1, 2）（図 1，表 1）。DRV に関して

年代後半に結晶構造解析等を用いて確認され，活性中心近は，過去に結晶構造や ﬂuorescent resonance energy transfer

傍部位（active site interface）と末端領域（termini interface）（FRET）と呼ばれる方法を用いて詳細な解析が行われておと呼ばれる部分で相互作用することで dimer を形成していり，DRV は HIV-1 由来のプロテアーゼ（PR）の主鎖と強ることが明らかにされた5, 6）（図 2）。特に末端領域は，逆平力な水素結合を形成するだけでなく，PR の二量体形成を衡に並んだ 4 つの β シート構造間で水素結合ネットワーク

阻害することで強力な抗 HIV-1 作用と高いジェネティックが形成されることによって PR dimer の安定化に大きく貢バリアを発揮していると考えられている1, 2）（図 2）。しか献すると考えられており，末端領域の相互作用だけで PRし，近年この DRV に対する耐性を有する HIV-1 変異株

dimer の安定化に必要なエネルギーの約 75% を占めると報（HIV-1DRVRs）の出現が in vivo および in vitro の両方で確認

告されている7）。また，アミノ酸番号 50 番付近の構造はされ，将来問題となることが予想される。In vitro における

ﬂap 領域と呼ばれており，PR が基質と結合することで“開著者連絡先：林 宏典（〒162⊖8655 東京都新宿区戸山 1⊖21⊖1
国立国際医療研究センター難治性ウイルス感染症研究部）
2017 年 5 月 30 日受付

128 （ 12 ）いた状態”から“閉じた状態”へと大きく構造が変化する部
分として知られている8, 9）（図 3）。
過去にさまざまな研究グループが結晶構造解析を用いて薬剤耐性に関連する変異が PR の構造および DRV との相The Journal of AIDS ResearchVol. 19

No. 3

2017

互作用様式に及ぼす影響を検討してきた。これらの解析の造から得られる情報は，DRV と PR の結合・解離における結果，DRV と複合体を形成していない PR（apo-PR）の構

一側面，すなわち結合解離平衡における DRV と PR の複造には変化が確認されており，HIV-1WT 由来の PR（PRWT）

合体がとり得る構造中で最も結晶化しやすい状態のみを反に比べて HIV-1s）は ﬂap 領域

映するといったことが考えられる。実際，double electron-

10）が大きく開いた構造を形成することが明らかとなった 。

electron resonance（DEER）法を用いて動的な状態での ﬂap

一方，PRMDRs と DRV の複合体を結晶化し構造解析を用い領域の動きに関して解析を行った研究では，PRMDRs が薬剤て，耐性変異が DRV の結合様式に与える影響を解析して存在下において ﬂap 領域の構造が“開いた状態”から“閉きたが，PRWT と PRMDRs に対する DRV の結合様式に明確なじた状態”へと移行しにくくなっていることを示唆する結差異は確認できていない。われわれの研究グループに果が得られている12, 13）。また，予備的な実験ではあるが，お い て も，HIV-1DRV s 由 来 の PR 変 異 体（PRDRV s） の apo

最新の GPU（graphics processing unit）を搭載したスーパー体および DRV 結合体の構造解析を行い上記と同じ結果をコンピュータを用いて，われわれが NIH の研究者と共同得ている。

して行った分子動力学計算の結果では，DRV と結合した

MDRs 由来の PR 変異体（PRMDR

10, 11）RR

s に対する DRV との結PRDRVRs の ﬂap 領域は PRWT に比べ“閉じた状態”から“開合様式の違いが確認できなかった理由に関しては，結晶構いた状態”へ移行しやすくなっていることを示唆する結果

結晶構造において PR と PR
WT

MDRが得られている（未発表）。すでに，2007 年に報告された
surface plasmon resonance（SPR）法を用いた研究の結果から，薬剤耐性を獲得した種々の PR に対して，DRV を含む
各 PIs の結合速度は低下し解離速度が上昇するという結果が得られている14）。これらの結果から，HIV-1 がアミノ酸変異を獲得することで，PR の ﬂap 領域が閉じにくく開きやすい構造，すなわち DRV およびその他の PIs が結合しにくくまた解離しやすくなる構造へと変化することで，結果的に薬剤耐性が獲得されると考えられる。

HIVDRVRs に対して阻害効果を発揮する化合物の開発とその作用機序の解析
われわれは，DRV の開発以降，in vitro における DRV 耐性の誘導を行い，耐性度の異なる種々の DRV 耐性 HIV-1 変
図 1

異株（HIVDRVRP20, HIVDRVRP30 および HIVDRVRP51）の同定を行っ

DRV および新規化合物の化学構造
GRL-015, -085 および GRL-097 は Tp-THF の C5 の位置にてきた。これらの変異株を用いて HIV-1DRVRs に高い阻害効

存在する水酸基によって PR の ﬂap 領域にある Gly48 と水果を発揮する新規化合物群（GRL-015, -085, -097 etc.）の同素結合を形成する 。

定に成功（図 1，表 2），結晶構造解析を用いて各化合物の

15）

表 1

DRV は種々の HIV-1MDRs に対して高い阻害効果を発揮する2）

Virus
HIV-1ERS104pre (wild-type X4)
HIV-1MOKW (wild-type R5)
HIV-1TM (MDR X4)
HIV-1MM (MDR X4)
HIV-1JSL (MDR R5)
HIV-1A (MDR R5)
HIV-1B (MDR X4)
HIV-1C (MDR X4)
HIV-1D (MDR X4)

IC50 (mM)
SQV

APV

IDV

NFV

DRV

0.01
0.004
0.23 (23)0.30 (30)0.35 (35)0.14 (14)0.31 (31)0.037 (4)0.029 (3)

0.023
0.011
0.39 (17)0.34 (15)0.75 (33)
0.16 (7)0.34 (15)0.28 (12)0.25 (11)

0.018
0.018
＞1 (＞56)＞1 (＞56)＞1 (＞56)＞1 (＞56)＞1 (＞56)＞1 (＞56)
0.39 (22)

0.019
0.033
0.54 (28)＞1 (＞53)＞1 (＞53)
0.36 (19)＞1 (＞53)
0.44 (23)0.32 (17)

0.003
0.003
0.004 (1)0.02 (7)0.029 (10)0.004 (1)0.013 (4)0.003 (1)0.004 (1)129 （ 13 ）

H Hayashi : HIV-1 Protease Dimerization and Its Inhibition

図 2

Fluorescent resonance energy transfer（FRET）を用いた HIV-1 プロテアーゼ（PR）の二量体化阻害の検出：A）HIVNL4-3 をコードしたプラスミド上の PR 領域と逆転写酵素（RT）領域の間にアラ
ニンリンカーを介して cyan ﬂuorescent protein（CFP）または yellow ﬂuorescent protein（YFP）を導入したプラスミドを作成した。この 2 種類のプラスミドを細胞にトランスフェクションして，CFP-tagged PR および YFP-tagged PR を発現させる。これらの PR が dimer を形成することで CFP と YFP が近接し，FRET が起こる。すなわち，PR が dimerを形成した場合は FRET が起こるが，dimer を形成しなければ FRET は起こらない。実際に FRET が起こったかどう
かは，CFP A/B ratio という値を基に判断している。CFP A/B ratio が 1.0 より大きな値を示した場合，FRET が起こっている（dimer を形成している）ことを，1.0 より小さな値を示した場合は，FRET が起こっていない（dimer を形成していない）ことを示す1）。B）FRET を用いた実験系で DRV, TPV および KU-241 の PR 二量体化阻害活性を測定した結果を示す。DRV は 100 nM 存在下で，TPV は 1,000 nM 存在下で PR の二量体形成を阻害していることが示された1）。

PR との相互作用様式を検討，GRL-015, -085 および -097 がの ﬂap 領域と相互作用を形成するという結果は，この ﬂap

15）s を効果的に阻害するメカニズムの解明を行った 。

の不安定化による耐性獲得という機構を支持する結果であ解析の結果，新たに開発した GRL-015, -085 および -097

り，GRL-015, -085 および -097 が PRDRVRs の不安定化したは ﬂap 領域に存在する Gly48 と強力な水素結合を形成する

ﬂap 領域と相互作用を形成することで，ﬂap 領域を安定化ことが明らかとなった（図 4）。上述のように，HIV-1DRVRs

することで PRDRVRs に対する高い親和性を維持しているこは PR の ﬂap 領域が閉じにくく開きやすい構造（不安定化とを示唆する結果と考えられる。

HIV-1

R
DRV

した構造），すなわち DRV およびその他の PIs が結合しにくくまた解離しやすくなる構造へと変化することで，結果的に薬剤耐性が獲得されると考えられる。HIV-1DRVRs を効
果的に阻害する化合物，GRL-015, -085 および -097 が PR

130 （ 14 ）新規プロテアーゼ阻害剤（PIs）の開発における今後の課題
現在，ART で使用されている投薬方法は，1 日 1 回の経The Journal of AIDS ResearchVol. 19

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口投与（QD）となっているが，過去にわれわれが同定・開 発 し， メ ル ク 社 に 導 出 さ れ た 4′-ethynyl-2-ﬂuoro-2′deoxyadenosine（EFdA/MK-8591） は16）， 第 I 相 臨 床 試 験（Phase I）の結果から 1 週間に 1 回の投与（QW）または
1 カ月に 1 回の投与（QM）で十分な抗 HIV 効果を発揮することが示唆されている。今後，EFdA/MK-8591 が米国
FDA の認可を受けた場合，ART の投与法は 1 日 1 回（QD）
から QW または QM へ大きく方向転換し，患者の負担を大きく軽減できると期待される。一方，現在 ART で使用されているすべての PIs は，薬剤耐性変異に対して非常に高い抵抗性を示すという利点はあるものの，CYP 酵素による代謝を受けやすく booster と呼ばれる CYP 阻害剤との併
図 3

Darunavir（DRV）の HIV-1 プロテアーゼ（PR）に対する結合と解離の過程

用によってようやく QD による服薬方法を維持できている状態である。また，比較的副作用が生じやすいなど患者に

PR は DRV と結合することで ﬂap が開いた状態から閉じとって負担の大きな薬剤となりつつある。通常，致死的なた状態へと移行することがしられている。PR は薬剤変異疾患を除く慢性疾患などの治療に関しては，CYP 阻害効を獲得することで ﬂap 領域が不安定化し閉じた状態へと果のある化合物は，その他に服薬する薬剤への影響（drug-

移行しづらくなると考えられる。

drug interactions ; DDI）や副作用の観点から好ましくない，
あるいは禁忌薬とされている。ART の導入により HIV-1 感

表 2

DRV および新規化合物の HIV-1WT および HIV-1DRVRs に対する抗 HIV-1 活性15）IC50 in nM (fold change)

Virus

DRV

GRL-0476

GRL-015

GRL-085

GRL-097

HIVNL4-3
HIVDRVRP20
HIVDRVRP30
HIVDRVRP51

2.8
36 (13)222 (80)
2,800 (1,022)

2.8
270 (64)420 (98)
ND*

3.3
3.3 (1.0)
16 (4.7)
220 (68)

3.2
1.6 (0.5)
2.8 (0.9)42 (13)46ND*
28 (0.6)
310 (6.8)* Not determined.

図 4HIV-1WT 由来の PR（PRWT）と新規化合物の複合体の結晶構造解析
HIV-1DRVRs に対して高い阻害効果を発揮する化合物，GRL-015, -085, -097 は PRWT の ﬂap 領域に存在する Gly48 と水素結合を形成しているが，HIV-1DRVRs に対して阻害効果を発揮しない化合物，DRV と GRL-0476 には Gly48 との水素結合の形成は確認できなかった15）。

131 （ 15 ）

H Hayashi : HIV-1 Protease Dimerization and Its Inhibition

染症は，「死の病」から「治療可能な慢性感染症」へと再結合阻害といった効果を持つ小分子化合物27, 28）が報告され定義されるほどとなっており，booster を使用しないことている。既存の化合物の新たな作用機序として報告されたを念頭に置いた PIs の開発が望まれる。実際，2017 年の 2

例としては，抗 HIV-1 活性との関連は不明であるが efavirenz

月に開催された conference on retroviruses and opportunistic（EFV）などの非核酸系逆転写阻害剤（non-nucleoside reverse

infections（CROI）で Gilead 社が CYP による代謝をほとんtranscriptase inhibitors ; NNRTIs）による逆転写酵素の二量

ど受けず生体内で長期間血中濃度を維持できる PIs の報告

体化促進効果等があげられる29, 30）。

を行っている。このようなことからも，今後は booster に依存せずに QD または QW での投与が可能となる PIs の開発が主流となることが予測される。新規 PIs に関する現在

新規 PR 二量体化阻害剤の開発を志向した PR 二量体化過程の詳細な解析の薬剤耐性を生じにくいという利点を保持したまま，CYP

上述のように，PR が酵素活性を発揮するためには dimer

酵素による代謝の影響を減らし生体内での血中濃度をよりの形成が不可欠であることから，PR の二量体化阻害は創薬

長期間維持できるような PIs をどのようにして開発していのターゲットとなり得ると考えられており，これまで複数

くかが今後の大きな課題である。

の研究者が PR の二量体化阻害剤の開発を試みてきた31～34）。

タンパク質間相互作用に着目した新規抗 HIV 剤の開発

しかし，それらの研究者が開発した化合物は臨床応用されることはなく，現在 ART で使用されている PIs の中で二細胞内外で起こる生命現象のほとんどは，酵素やレセプ量体化阻害効果を有する化合物は DRV と TPV のみであターといったタンパク質と基質の結合，または複合体形成る。より効果的かつ効率的に PR 二量体化阻害剤の開発をなどのタンパク質間相互作用（protein-protein interactions ;行うためには，PR がどのように二量体を形成し，その二PPIs）によってコントロールされている。複合体を形成す

量体形成過程で重要な役割を果たすアミノ酸すなわち“hotるタンパク質は 1,000～2,000 Å2 という広い範囲にわたっspots”を同定する必要がある。そこで，われわれは新たて相互作用しており，その作用は面と面が接して結合するに electrospray ionization mass spectrometry（ESI-MS） と 呼構造をとることが多い。一方，タンパク質と化合物との結ばれる質量分析法を用いて PR の二量体化過程の詳細な解合では，結合面に cavity と呼ばれる“ポケット”が必要で析を行った35）。上述のとおり PR の二量体形成に重要な相あり，かつ 300～500 Å2 と狭い範囲での相互作用しか形成

互作用部位は，活性中心近傍部位（active site interface）としないためタンパク質間で起こる相互作用（PPIs）を完全末端領域（termini interface）の 2 カ所存在しており，特にに阻害することはむずかしく，1990 年代前半頃までタン

termini interface は，PR dimer の安定化に必要なエネルギー

パク質間の相互作用面は創薬の標的には不向きであると考の約 75% を占めると報告されている7）。過去に NMR や

えられていた17）。1995 年から 2005 年にかけて行われた

FRET 等を用いた研究（図 2A）が行われ，PR の active site

種々の変異導入実験により，PPIs が相互作用面に存在す

interface のアミノ酸（Thr26, Asp29 および Arg87）に変異るすべてのアミノ酸ではなく“hot spots”と呼ばれる一部のを加える，または，C 末端領域に存在する 96 番目から 99

アミノ酸が相互作用またはその開始に重要であり，“hot

番目までのアミノ酸を削除することで PR の二量体形成がspots”を標的とすることで化合物による PPIs の制御が可著しく阻害されることが明らかとなっていることから，こ能になるという事実が示唆されるようになってようやくれらのアミノ酸を“hot spots”の候補として解析を行った。

PPIs の阻害剤の開発は活発になったPR の二量体化に重要とされる各相互作用部に存在するア。

18～23）

DRV および TPV が PR の酵素活性だけでなく二量体化

ミノ酸に変異や欠損を導入，ESI-MS を用いて PR の dimerを阻害することが明らかになったのは 2007 年のことであの検出を行った結果，active site interface に位置するアミ

り，それ以前は ART で使用されているすべての PIs は，ノ酸，Thr26 を Ala に，Arg87 を Lys にそれぞれ置換した

PR の dimer に結合することにより酵素活性を阻害していPR 変異体（PRT26A and PRR87K）では，dimer の形成が確認さると考えられていた。現在では，DRV および TPV 以外にれなかった35）（図 5）。一方で，同じく二量体形成に重要ともタンパク質間相互作用を阻害または促進する効果を持っされ，dimer の安定化に最も貢献するとされている termini

た抗 HIV-1 剤がいくつか報告されている。これらの化合物

interface に存在するアミノ酸（Thr96～Phe99）を削除したの中には，現在開発段階にある化合物だけでなく，すでに変異体（PR1-C95A）は，わずかではあるが dimer の形成が確ART で使用されている小分子化合物の新たな作用機序と認された35）（図 5）。この結果は，active site interface に存在して報告されているものもある。開発中の化合物に関してする Thr26 および Arg87 が PR の二量体化における“hotは，integrase と宿主因子である LEDGF/p75 などとの結合

spots”であることを示している。また，active site interface

阻害24, 25），capsid 間の相互作用の阻害26），envelope と CD4 のに 1 カ所変異を導入するだけで，dimer の安定化に最も貢132 （ 16 ）The Journal of AIDS Research

図 5Vol. 19

No. 3

2017

Electrospray ionization mass spectrometry（ESI-MS）を用いた HIV-1 プロテアーゼ（PR）の二量体化の検出
A）ESI-MS にアプライしたサンプルはキャピラリーから水滴が霧状に噴出される。噴出口で高電圧を付与することで，噴出された水滴に電荷が付与される。その水滴の溶媒を蒸発させると，PR は水滴に含まれる電荷の影響を受けイオン化される。
このとき PR に付与される電荷の価数はランダムであり，さまざまな電荷をもったイオンが生成される。イオン化された PR
monomer および dimer は，質量分析器によって検出されるが，検出されるイオンの位置はイオンの質量（m）と，それぞれのイオンに付与された電荷の価数（z）の比（m/z）によって検出される。このため，実際の測定データには，monomer 由来のピー
クまたは dimer 由来のピークが複数検出されることになる。B）ESI-MS によって種々の PR 変異体の二量体形成を確認した結果，変異を含まない PRWT は dimer を形成しているのに対して，活性中心近傍のアミノ酸に変異を加えた変異体（PRT26A and PRR87K）
は monomer のみしか存在していないことが明らかとなった。一方，PR の C 末端のアミノ酸を削除した変異体（PR1-C95A）はdimer を形成していることが明らかとなった35）。

献するとされる termini interface の相互作用までもが失われ，PR が dimer を形成しなくなるという結果は，PR のDRV および TPV の二量体化阻害機構の解明

dimer が，2 段階で形成されることを示唆している。すな

さらにわれわれは，新たに明らかとなった二量体化過程

わち，PR は，（1）まず，active site interface で相互作用すのどのステップを DRV が阻害しているかを明らかにするることで，不安定な dimer を形成し，ついで（2）termini

ために，DRV が PR monomer の active site interface またはinterface の相互作用を形成することにより不安定な dimer

termini interface のどちらに結合しているかを検討することを安定化し，完全な dimer を形成する （図 6）。

にした。Active site interface に位置し，かつ DRV 耐性に関

35）

与する変異（V32I/L33F/I543M/I84V）を導入した PR 変異体（PRV32I/L33F/I54M/I84V）および termini interface に変異を加えた

133 （ 17 ）

H Hayashi : HIV-1 Protease Dimerization and Its Inhibition

図 6

PR の二量体化のダイナミックスと DRV の二量体化阻害機構
PR は，まず活性中心近傍で相互作用することによって不安定な dimer を形成し，ついで末端領域で相互作用することで不安定な dimer を安定化し，完全な dimer を形成する。DRV は，PR monomer の活性中心近傍に結合して，PR monomer が不安定な dimer を形成することを阻害する。PR が DRV の二量体化阻害を逃れて dimer を形成しても DRV は PR dimer に結合し，その酵素活性を阻害する35）。

PR 変異体（PRL97A/F99A）を作成し，DRV と monomer の結合

site interface に結合して二量体化過程の第一段階である不を ESI-MS を用い て 検討 し た3, 4, 35）。 解 析 の結 果，DRV は

安定な dimer の形成を阻害しているのではないかと考えら

PR

V32I/L33F/I54M/I84Vの monomer に対する結合を失ったが，PR

L97A/F99Aの monomer に対する結合は維持していた。すなわち，DRV
は二量体形成に重要な“hot spots”が存在する PR monomerの active site interface に結合することで，PR 二量体化過程の第一段階である不安定な dimer の形成を阻害していることが示唆された35）（図 6）。

れる。

PR の二量体化阻害剤の開発におけるこれまでの問
題点と展望
上述のように，PPIs を阻害するためには“hot spots”を標的とすることが効果的であると考えられる。ESI-MS を用

PR が termini interface での相互作用の形成を完了し安定いた研究の結果，PR の二量体形成における“hot spots”は的な dimer がいったん形成されると，DRV は PR dimer を

活性中心近傍に位置していると考えられる。しかし，過去

monomer へと解離することはない 。しかし，dimer が形に設計された DRV および TPV 以外の PR 二量体化阻害剤成されたとしても，DRV は dimer の基質結合部位に強力（protease dimerization inhibitors ; PDIs）は，PR の活性中心に結合し，その酵素活性を阻害して HIV-1 の複製を阻害す

近傍ではなく termini interface を標的としていた31～34）。上述る（図 6）。すなわち，DRV は二量体化阻害，酵素活性阻したように termini interface は，強固な水素結合ネットワー

害という 2 つの機能を有しているために高いジェネティッ

クを形成することで PR dimer の安定化に非常に重要な働

クバリアと強力な抗 HIV 効果を発揮すると考えられる。

きをすることが結晶構造から明らかとなっている。一方

1）

TPV に関しては，ESI-MS ではなく FRET を用いた詳細

で，PR monomer の状態では末端領域は不安定な構造をな解析が過去に行われており，活性中心近傍のアミノ酸にとっていると考えられている37）。Termini interface を標的と変異を加えた変異体（PRL24M, PRL33I, PRL33F and PRE34D）に対した場合，不安定な monomer の構造に結合し，二量体化のする二量体化阻害能が著しく低下することが明らかとなっ際に形成される強固な水素結合ネットワークの形成を阻害ている36）。これらの結果から，TPV も DRV と同様に active

し得るほど強力な結合能を持った化合物の開発が必要とな

134 （ 18 ）The Journal of AIDS ResearchVol. 19

No. 3

2017

る。このような化合物の開発は非常に困難であると考えら

highly darunavir-resistant and replication-competent HIV-1

れる。特記すべきは，われわれの報告した DRV などのvariants by using a mixture of clinical HIV-1 isolates

PDIs 以外の PDIs は termini interface を標的としたペプチド

resistant to multiple conventional protease inhibitors. J

のみであり，経口投与は不可能で，血中半減期はきわめて

Virol 84 : 11961⊖11969, 2010.

短いと考えられ，治療薬とはならないことである。DRV が4 ）Koh Y, Aoki M, Danish ML, et al : Loss of protease

二量体化阻害に成功した要因の 1 つは，非ペプチド性の小dimerization inhibition activity of darunavir is associated

分子化合物であって，しかも末端領域ではなく“hot spots”

with the acquisition of resistance to darunavir by HIV-1. Jの存在する active site interface の相互作用を標的としたこ

Virol 85 : 10079⊖10089, 2011.

とであると考えられる。
現在までに PR monomer と PDIs との複合体の結晶構造は得られておらず，詳細な相互作用様式はいぜん不明であ5 ）McKeever BM, Navia MA, Fitzgerald PM : Crystallizationof the aspartylprotease from the human immunodeﬁciency
virus, HIV-1. J Biol Chem 264 : 1919⊖1921, 1989.

る。一方で，DRV と PR monomer の相互作用様式に関する6 ）Wlodawer A, Miller M, Jaskólski M, et al : Conserved

分子動力学的な解析手法を用いた研究が行われている38）。

folding in retroviral proteases : crystal structure of a synthetic

また，最新の研究では，PDIs を開発する上で創薬の標的

HIV-1 protease. Science 245 : 616⊖621, 1989.

となり得る部位（druggable sites）が PR monomer の表面，
特に active site interface に複数存在している可能性が示唆

7 ）Todd MJ, Semo N, Freire E : The structural stability of theHIV-1 protease. J Mol Biol 283 : 475⊖488, 1998.

されている 。これらの結果は，同じ active site interface へ

8 ）Ishima R, Freedberg D, Wang YX, et al : Flap opening andの結合であったとしても DRV および TPV とはまったく異dimer-interface flexibility in the free and inhibitor-boundなる結合部位（または相互作用様式）を有し，これらの化

HIV protease, and their implications for function. Structure

合物と交叉耐性を示さない PDIs が開発される可能性を示

7 : 1047⊖1055, 1999.

39）

唆しており，興味深い。DRV と TPV の PR monomer に対9 ）Cai Y, Yilmaz NK, Myint W, et al : Differential flap

する結合部位に違いがあるかどうかに関しては，現在

dynamics in wild-type and a drug resistant variant of HIV-1

ESI-MS を用いたより詳細な検討が行われている。今後，protease revealed by molecular dynamics and NMR

PR monomer と PDIs の結晶構造が解明され，その相互作

relaxation. J Chem Theory Comput 8 : 3452⊖3462, 2012.

用様式が明らかとなれば，これまで以上に強力な PDIs の10）Agniswarmy J, Shen CH, Aniana A, et al : HIV-1 protease

設計・開発が可能となると強く期待できる。

with 20 mutations exhibits extreme resistance to clinicalinhibitors through coordinated structural rearrangements.

謝辞

Biochemistry 51 : 2819⊖2828, 2012.

本研究に際してさまざまなご指導をいただきました満屋

11）Wang Y, Liu Z, Brunzelle JS, et al : The higher barrier of

裕明先生に深く感謝いたします。また実験および研究の遂

darunavir and tipranavir resistance for HIV-1 protease.

行に当たり，さまざまな面でご助力やご指摘をいただいた

Biochem Biophys Res Commun 412 : 737⊖742, 2011.

青木学先生，閌康博先生に感謝いたします。

12）Galiano L, Ding F, Veloro AM, et al : Drug pressure selected
mutations in HIV-1 protease alter ﬂap conformations. J Am

利益相反：この研究における利益相反に相当する事項はない。

文

献1 ）Koh Y, Matsumi S, Das D, et al : Potent inhibition of HIV-1
replication by novel non-peptidyl small molecule inhibitorsof protease dimerization. J Biol Chem 282 : 28709⊖28720,
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2 ）Koh Y, Nakata H, Maeda K, et al : Novel bis-tetrahydrofuranylurethane-containing nonpeptidic protease inhibitor

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13）Vera IMS, Blackburn ME, Fanucci GE : Correlating
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potency in a multidrug resistant HIV-1 protease variant.
Biochemistry 51 : 7813⊖7815, 2012.
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(PI) UIC-94017 (TMC114) with potent activity against

15）Aoki M, Hayashi H, Yedidi RS, et al : C-5-modified

multi-PI-resistant human immunodeﬁciency virus in vitro.

tetrahydropyrano-tetrahydofuran-derived protease inhibitors

AAC 47 : 3123⊖3129, 2003.

(PIs) exert potent inhibition of the replication of HIV-1

3 ）Koh Y, Amano M, Towata T, et al : In vitro selection ofvariants highly resistant to various PIs, including Darunavir.

135 （ 19 ）

H Hayashi : HIV-1 Protease Dimerization and Its Inhibition

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