「揺らぎと生体機能」ニュースレター
No. 51
7 March, 2013
新学術領域研究「揺らぎと生体機能」終了にあたって
膜、DNA などバラエティーのある生体系に対して、実寺嶋正秀（京都大院理・領域代表）

験・理論の面からより機能に直結した研究が発展し、特に癌治療への進展が見られたのは大きな発展であっはやいもので、2008 年末に始まった新学術領域研究たと思います。こうした点は領域代表としてかなりひ「揺らぎが機能を決める生命分子の科学」が 5 年目をいき目に見ているかもしれませんが、客観的に見ても迎え、領域研究として一つの区切りを迎えようとして「揺らぎ」の言葉を学会に根付かせ、「揺らぎ」の言葉います。このニュースレターに最初のあいさつを書いで反応・機能を理解できるようになったのは大きいこたのがついこの前のような気もしますが、F&F ニューとだと思います。

スレターもこれが最後になるでしょうので、最後のあ期限が決まっているとはいえ、この領域研究が盛ん

いさつを書かせていただきます。

になってきたこの時点で終了するのは、非常にもった

思い出すと、この領域を立ち上げる時には、片岡先いないことでもありますが、この領域研究の目的が領生と何度も議論して、「揺らぎ」をキーワードにまとめ域の形成の立ち上げにあると思えば、一応の立ち上げていくことにしました。
「揺らぎ」と言うのは学会でもを終えて、次のステージに入るための役目を終えたと時々聞く言葉だし、これから重要になってくるに違い見ることもできます。この領域研究は、分野形成のたない。自信を持って領域提案しました。しかし内容をめの助走と Take off の初期段階であり、これからこの説明した時、多くの人から「揺らぎって何？」と聞か

領域メンバーによって研究はますます活発になり安定れ、その説明を何度もすることになるとは思いもしま

飛行に移ることを願っています。

せんでした。実際、公募研究が始まって最初の合同班

このニュースレター発行はおそらく最後でしょうが、会議の時にも、メンバー間で「揺らぎ」がいろいろに

この新学術領域研究自体は実はまだ完全には終わってとらえられており、そうかそういう風に見ることもでいません。来年度はとりまとめの年として、これまできるのかとびっくりしたことが思い出されます。

の成果を世に出してまとめる年となっています。このしかし合同班会議を繰り返し、公開シンポジウムをため、いくつかの出版とシンポジウムを計画している

行い、各種学会でのシンポジウムを行っているうちに、

ので、またご協力をお願いすることになると思います。

だんだんと統一した理解がなされてきたように感じま

よろしくお願いいたします。

した。これがまさに「領域」形成ではないでしょうか。

更に、こうしたとりまとめと言う意味だけでなく、

特に、最後の合同班会議では、まさに「揺らぎ」が私研究自体もこれで終わりということではありません。

の思いもしないいろいろな場面で重要な働きをしてい既存の分野を離れ、真に融合した新しい分野を形成しることが解き明かされている過程を見ることができ、なくてはいけませんが、サイエンスの分野を作るには、改めて「揺らぎ」の重要性と多くの異なった現象が「揺長い年月がかかることは当然であり、5 年間で完結す

らぎ」という共通の言葉で理解できるという驚きを感るわけがありません。是非とも、皆さんのご協力を得じました。

て、この「揺らぎと生体機能」と言う分野の確立と更A01 班(検出班)では、最初はどうやって揺らぎといなる発展をめざしたいと思っております。

うある意味「あいまい」なものをとらえればいいのだ

最後になりますが、このような活発な領域研究が遂

ろう、本当にできるのかとも思うときもありましたが、行できたのは、多くの方のご協力のおかげです。事務理論開発も含めて多くの方の協力の下で、種々の手法

的には、領域事務局の片岡先生をはじめとして先の事が可能となってきました。A02 班(制御班)では、変異務局秘書の日笠(旧姓)さん、現事務局秘書・藤澤さん、

体作成をキーとして、揺らぎと機能との相関が解き明

寺嶋研究室秘書の清水さんのご努力がなければ運営はかされ、改めて生体分子は安定性を犠牲にしてでも揺できなかったでしょう。また研究面では、計画研究班

らぎを大きくするように進化したのだなと認識を新た

員、前期・後期の公募研究班員、班友をはじめとして、にしました。A03 班(応用班)においては、タンパク質、共同研究や議論のための多くの先生方のお世話になり1

「揺らぎと生体機能」ニュースレター
No. 51
7 March, 2013
ました。また、お忙しい中でシンポジウムなどの活動

また来年度も(そして将来長くに渡って)お会いできに参加していただき、多くの有用なご助言をいただいることを願いながら、最後のあいさつとさせていただ

た評価班の先生方、特に海外からこの領域のために毎きます。ありがとうございました。

年駆けつけていただいた、Miller 教授にはいくら感謝しても、し足りないぐらいです。本当にお世話になりました。

2012 年 12 月の最終公開シンポジウムで片岡先生と2012 年 12 月の最終公開シンポジウム

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「揺らぎと生体機能」ニュースレター
No. 51
7 March, 2013
領域終了に寄せて～評価委員より～
北川禎三（兵庫県立大生命理学・評価委員）

は、重要な具体的問題に対して解明していかれ、成功された事に高い敬意を表する次第である。
多様性の中には、静的なものと動的のものがあり、

化学では、
「反応」
、
「構造」
、
「物性」が基本と云われ後者がダイナミクスとして注目された。
静的のものは、てきたが、それと並んで「揺らぎ」という概念が同程

遺伝子工学で蛋白質にアミノ酸置換を起こし多様性を度に重要である事を、領域代表の寺嶋先生が言い出さ作るという実験と、測定の精度を上げて構造の少しのれた。そして本領域の概要には、「確率入出力でありな違いを検出するという実験から生まれてくる。動的ながら、確定的な生命現象を創出する基礎は何か？」と研究は、時間分解測定という新しい手法の開発を伴っいう質問を設定しておられる。これは、非常に大事なて初めて生まれる。どちらも専門家しか出来ない面が問題提起であり、新しい学術領域の創成に相応しい提ある。新しい手法を開発するには、装置に関する知識案であると思った。

や技術が必要であり、その人が、細胞中に新しい分子「揺らぎが生体機能を作る」という言葉を聞くと、を見つける実験をする事は難しい。一方、新しい生体

以下に書くような「ノイズが機能を生み出す系」を頭

分子を見つけ、機能を決める人達は、ダイナミクスをに浮かべられる人もあると思う。細胞中で動きまわり調べる装置を開発する事も不可能に近い。その両者が反応する分子それぞれは、弱い相互作用をし合ってい共同研究をすると、一つの研究グループでは達成できるが、見た目は互いに無関係に行動しているように見ない、新しい成果が得られるはずであり、国際的なブえる。つまり揺らいでいる。しかし、それが細胞内でレークスルーとなる事が期待される。それは、新学術集まって、ある種の集合体として行動すると、機能が領域のようなグループ研究によって生まれやすくなり、生まれる。これは、要素と階層の問題であり、要素間

そこに存在意義があると思う。本グループは沢山の異にある関係が整えば、自発的に揺らぎが規則的な構造分野間の共同研究でその目的を見事に達成され、国際や物性を生み出す。これは「自己組織化」として、錯的にトップレベルの成果をあげたと思う。班長の片岡

体化学では最近非常に注目された言葉である。エント

先生、上岡先生のそのための陰の努力を評価したい。

ロピー減少に向かう系である。

領域会議に於ける多くの発表は、ハイレベルの生体化学では BZ 反応として知られる系があり、要素分

分子科学の研究であり、優れた理論家がメンバーにい子の濃度がある閾値を超えると反応が進むという非線た事が、討論を深め、非常に良かったと思う。しかし、形性のために、シャーレでそれをやるとパターンが出

それらの基礎研究と A03 班の「ハイブリッドリポソー

来る。そういう系にノイズを入れるとパターンが時間

ムが選択的にがん細胞を殺す」という興味深い結果と軸で変化する。空に雲が出来る過程も、対流の階層構がどう繋がるか？は評価委員としては心配であった。

造によるとされる。要素それぞれがあるリズムでラン

実際には、最終年度の発表で、桑島グループと上岡グダムに動いている時に、ノイズが入るとそれが同期す

ループの共同研究で、解決の糸口が見えた気がして、る現象も、揺らぎが機能を生み出す系であり、確率共非常に良かったと思う。学理が確立されれば、この方鳴といわれている。脳における神経伝達も、同じ原理

法が現実に使われていくだろう。

が働いているかもしれない。

また本領域の全体会議には、いつも多くの若い人た

しかしながら、寺嶋先生が提案された新学術領域研

ちがポスター発表をかねて、活発に討論に参加された。

究「揺らぎと生体機能」は、物理の人が抱く揺らぎで結果として、この新学術領域研究は、生体分子科学のはなくて、生体分子の構造の多様性と機能の相関で分野に多くの若い優秀な人材を育てる事が出来た。そあった。これは生体分子科学としては基本的問題であの事が、何より大事な功績であったと、高く評価してり、マクロに現れる生体機能をミクロに調べ、それらいる。私は領域会議で多くの新しい事を学ぶと共に、を結びつけるとい云う点で、上記の物理的な見方と共サイエンスを楽しませてもらった。５年間、会議に招通性をもつ。この抽象的な考えを、本学術領域研究で待して下さった事に深く感謝している。

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「揺らぎと生体機能」ニュースレター
No. 51
7 March, 2013榊 茂好
(京都大福井謙一記念研究センター・評価委員)の新学術領域は大成功であったと言えよう。癌の治療を化学の観点から、これまでの制癌剤とは全く異なる
方向からアプローチすると言う研究は基礎化学、理論

この新学術領域は、化学およびその周辺領域に、ま化学の研究者にとっても興味深かったと考える。

た、私個人にとっても、多くの点で新しい概念や視点

このように、新しい化学事象を、新しい手法で測定を提供してくれたと考えている。その意味で、「新学術

し、新しい結果を得て、解釈するには、物理化学、分領域」と言う範疇に最も適した研究領域であったと

子科学、理論化学との共同研究、共同作業が必要不可

言っても良いだろう。
「揺らぎと生体機能」と言う言葉欠である。構造揺らぎにアプローチすると言うことかからは、タンパクが生体の中で、様々な構造を取るこら、分子動力学法や積分方程式理論の研究者の参加がとが出来て、しかも、その構造の間を容易に変化する多かったが、構造変化により電子状態が変化し、あることが可能であり、ある構造をとる時に特有の機能をいは、逆に電子状態の変化が構造変化を誘起し、物性発揮する、と言うように、直感的に理解できる。しか値の変化や新しい機能が表れると言う場合には、電子し、これを学術的に研究しようとすると、とたんに難状態理論の参加が不可欠であろう。次のステージではしくなる。第一に「揺らぎ」をどのように定義出来る

電子状態との関連を考えると、研究の新しい側面が表だろう。
私の専門は電子状態理論とその応用であるが、れるのでは無いだろうか。

電子状態計算で「揺らぎ」
をどう取り扱えば良いのか、

この新学術では揺らぎを構造に限定し、生体機能とこれまで考えたこともないし、考えて見ても簡単では関連付ける、と言う方向性も持っていたが、しかし、ない。
分子動力学計算では、多少容易になるとしても、生体機能だけでなく、多くの場合に、揺らぎは重要な

やはり簡単ではない。
「揺らぎ」は構造の広がりではな役割を果たしているのでは無いだろうか。分子素子はく、振動でもないはずである。
「揺らぎ」に関する私な

複数の構造、電子状態の間の相互変換を利用しているりの理解は、「多数の(準)安定構造が、近いエネルギー場合が多い。

準位で存在し、構造はそれらの間を、容易に（熱的に）そのように考えると、「揺らぎとＸＸ」と言うように、行き来出来る」と言うものであろう。それをどのようもっと広い領域で揺らぎを考慮した研究があっても良に、物理化学的・分子科学的に明らかにすることが出いように感じられる。この研究領域が終了し、次の研来るだろうか？このような視点は、研究者の心の奥に、究領域が始まるとしても、｢揺らぎ｣と言う考え方、化

無意識的に、あるいは、深層心理的に存在していたで学事象の見方は、終わることなく、一層深化して欲し

あろうが、これまで、正面から考えられたことは無い

いと感じている。

のでは無いか。そう考えると、この新学術領域は、新
しい視点で、新しい研究領域を提案し、そのために、

中原 勝（京都大学名誉教授・評価委員）

新しい実験的測定法、理論的手法の開発を要請し、その結果の理解と解釈にも新しい考察を必要としたと言える。

「生体機能に開かれた揺らぎの扉」

この新学術領域の、もう一つの特徴は、化学から医学までの領域をカバーしたことであろう。多くの場合、あっという間であった。新学術領域研究「揺らぎが化学およびその周辺領域と言うと、生物物理、化学物

機能を決める生命分子の科学」【略称、「揺らぎと生体理などが想起されるが、医学までをカバーした領域は機能」】（寺嶋先生代表）が採択されたのは 2008 年晩秋

ほとんど無かったであろう。特定領域や新学術領域でであったが、「揺らぎと生体機能」は多くの成果論文やは、異なる専門の研究者が多少の強制力を感じながら、情報発信のドキュメントを世に残して、やがて幕を降一堂に会し、お互いの研究成果を発表し、視野と研究ろす。評価委員・アドバイザーの一人として「揺らぎ」

者間の交流を広げ、各々の研究を一層深め、発展させと戦った研究者集団の傍にいた筆者。日本語の評価委ると言う側面があり、それが、実のところ、直接的な員というより、英語のアドバイザーを意識しながら、成果よりも重要とさえ考えられる。その意味でも、こ好かれるためでも嫌われるためでもなく、枯れた研究4

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No. 51
7 March, 2013者として。日本の学術研究発展のために資金と時間があった。揺らぎの要素を発見し、要素のメカニズムを有効に使われるようにとの気配りで。研究の進歩を希解明して制御し、揺らぎの基礎研究を応用研究に活用

求し、未来への懸け橋が誕生することを願いながら。

する、一連の流れが構想されているプロジェクトで「揺らぎと生体機能」とのプロジェクト名には求心あった。これまで機能と静的構造との相関関係が注目

力とインパクトがあった。
「揺らぎ」はやや難解で、物されてきたが、その枠組みを超えて、機能と動的揺ら理学（微分が絡む、光散乱、液体論の世界、久保亮五、ぎの相関関係に着目して、検出・制御・機能を総合化

山本常信の線形応答理論業績を思い出して）に埋もれする試みであった。プロジェクト進行中に突如としてた自然科学用語と心配されたが、「機能と生命分子」と日本を襲った東日本大震災の影響を乗り越えて、良いいう単語との（ちょっと思いつかない、やわらかい）

中間評価を経て、プロジェクトは閉めの時期を迎えた。

結合で現代風の力を生み出した。新しい学問の扉を開

評価委員の一人として寺嶋プロジェクトに参加し、く「テコ」としての「揺らぎ」への期待感をアピール

さまざまな事業・活動を楽しませてもらった。超臨界

した。
「揺らぎ」の新領域は、熱力学、統計力学、量子

水・脂質・糖質・電解質を主たる対象とした揺らぎ研

力学などの歴史的発展に登場した、微分を伴う基礎方

究の自己体験を参考にしながら、「揺らぎと生体機能」

程式に端を発するもの（揺らぎの古典論と量子論）で研究者の揺らぎ研究を学ばせてもらった。国内のみなあるが、それを定性的な概念の下で「生体機能」へとらず世界を視野に入れる国家プロジェクトであると理扉を開こうとした野心に新領域「揺らぎと生体機能」

解し、国際的な波にもまれる科学者集団の活躍を観察の真骨頂がある。
「スナップショット」などの一点時間

し、プロジェクトの全体構想と個々の成果の分散状態

描写では尽くせない、自然の多体系についての真理描

を国際基準で評価しながら見守ってきた。評価の良心像の発展への心意気であった。動的に揺らぐ自然を静的基準値には客観性が求められるが、論文数や発表数

止画に投影すると、濃い一点スポットの周りには薄いというもの以外の評価は、研究の進行中の真っただ中

影がつきまとう。揺らぎの研究はいわば自然界の影武で行うしかない。自己の経験に照らして価値判断の評者探しである。無束縛自由運動の気体には均一に塗り価軸を設定するしかない。もちろん、評価の一般的基

潰された影描写が想定され、格子モデルの結晶性固体

準は、論文の数×掲載誌の国際的知名度×論文引用回にはスポット描写が近似的に妥当する。束縛下で分数。論文の引用回数が最も客観性に優れており、その子・原子が運動する液体・溶液・ゲル・界面にこそ「揺信頼度は群を抜いて高い。プロジェクトの期間内にプらぎの描像」が相応しい。一方、溶液には生命現象のロジェクトの成果として発表された論文の引用回数のゆりかごがある。そこには、様々な時間スケール、空統計量は不十分である。よって、論文誌の知名度が過間スケールの揺らぎがある。基底状態だけでなく、励度に偏重される。結局、著者ではなく歴史が研究の成起状態や中間体・遷移状態でも揺らぎの概念は重要で果を評価するといえる。

ある。揺らぎの数学・物理学・化学・生化学・生物学の序列で、“左翼”の数学から“右翼”の生物学を視野に入れて、化学・生化学の分野に境界領域を開拓する
ことが代表者寺嶋先生の大目標であった（「揺らぎと生体機能」ニュースレターNo.1, 26 December 2008 を参照）。
大目標を達成するために用意された 3 つの計画班は、
A01「揺らぎ検出」（寺嶋先生班長）、A02「揺らぎ制御」（片岡先生班長）、A03「揺らぎと機能」（上岡先生班長）であった。野心的な方法論で、生命現象の多様性を支える「揺らぎを検出」し、生命現象を支える分子―タンパク質・DNA/RNA・糖質・脂質・水―の「揺らぎを制御」し、生命にかかわる分子の「機能における揺らぎの役割」を解明しようとするプロジェクトで5

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7 March, 2013
業績紹介：プロテアソーム活性化因子 PA28 の柔軟なループの役割
加藤晃一（自然科学研究機構・A01 計画研究代表者）

ルはシャープなピークとして観測された。
これは、ルー
プ領域のコンフォメーションが顕著に揺らいでいることを意味している。SANS によって明らかとなった 4

論文題目：“Spatial arrangement and functional role of the

次構造を考慮すると、これらの柔軟なループは、プロα subunits of the proteasome activator PA28 in the

テアソーム内への基質の出入り口を取り囲むように配

heterooligomeric form”

置しているものと考えられる。

著者：Massaki Sugiyama, Hiroki Sahashi, Eiji Kurimoto,

次に、野生型 PA28 と α サブユニットのループを欠Shin-ichi Takata, Hirokazu Yagi, Keita Kanai, Eri Sakata,

損した PA28 変異体を用いて、それぞれによって活性Yasufumi Minami, Keiji Tanaka, and Koichi Kato化された 20S プロテアソームの基質分解の効率を鎖長

雑誌巻号：Biochem. Biophys. Res. Commun. 432, 141-145の異なる一連の基質ペプチドについて比較した。その(2013)

結果、野生型 PA28 は 9 残基を越えるペプチドについては分解が抑えられているのに対して、ループ欠失体

プロテアソームはタンパク質分解活性を介して細胞では、こうしたペプチド鎖長に対する選択性が失われの生存と恒常性の維持に重要な役割を果たしている。

ていることが明らかとなった。このことは、α サブユ

プロテアソームの分解活性は、その活性中心である

ニットのループが、鎖長が長い基質のプロテアソーム

20S プロテアソームの両端に結合した、プロテアソーへ出入りを抑制するゲートキーパーの役割を演じていム活性化因子（PA）により厳密に制御されている。本ることを示唆している（図 2）。このことは PA28 が抗研究の対象である PA28 は α および β サブユニットか

原提示に用いられる 9 残基程度のペプチドを効率よくらなるヘテロ 7 量体を形成し、MHC クラス I 分子が提生成することと深く関わっている可能性がある。

示する 9 残基程の抗原ペプチドの生成に関与することが知られている。両サブユニットは 50%の相同性を有するが、それぞれ独特の挿入ループを有している。α
サブユニットのホモ 7 量体については結晶構造が報告されているが、このループ部分の電子密度像は得られ
図 1. SANS により明らかになった水溶液中におけるていない。本研究では、PA28 ヘテロ 7 量体中の α およPA28 のサブユニット配置

び β サブユニットの空間配置を中性子小角散乱（SANS）法により決定するとともに、α サブユニットのループ領域の存在がプロテアソームによる基質ペプ
チドの分解に及ぼす影響を解析した。
α サブユニットを選択的に重水素で標識した PA28
について実測した SANS プロファイルと α サブユニッ
トホモ 7 量体の結晶構造に基づいて構築した立体構造
モデルを比較照合した結果、PA28 のヘテロ 7 量体中で図 2. PA28α サブユニットのループ領域はプロテアソー

は 3 つの α サブユニットと 4 つの β サブユニットがムへの基質の出入りを制御している

βαβαβαβ とほぼ互い違いに配置されたリング構造をしていることを見出した（図 1）。一方、15N で標識を施

参考文献

した α サブユニットを用いて再構成した PA28 の[1] M.Sugiyama, E.Kurimoto, Y.Morimoto, H.Sahashi,

1

H-15N HSQC スペクトルにおいては、大部分の残基に

E.Sakata, K.Hamada, K.Itoh, K.Mori, T.Fukunaga,

由来する信号はピークが観測困難なほど広幅化していY.Minami, and K.Kato, J. Phys. Soc. Jpn. 78, 124802

る中で、ループ領域に位置する残基に由来するシグナ(2009)

6

「揺らぎと生体機能」ニュースレター
No. 51
７ March, 2013
業績紹介：安定同位体標識を活用した高マンノース型糖鎖の NMR 解析
子間距離を評価した。その結果、M8B は M9 に比べ立加藤晃一
（自然科学研究機構・A01 計画研究代表者）

体構造の変動範囲が大きいことが示唆された（図）。以上の研究により、糖タンパク質の品質管理に関わる一論 文 題 目 ： “Application of metabolic

13

C labeling in

連の高マンノース型糖鎖のプロセシングによる、ダイ

conjunction with high-field NMR spectroscopy for

ナミックなコンフォメーション変化を明らかにするこ

comparative conformational analysis of high mannose-typeとができた。

oligosaccharides”
著者：Yukiko Kamiya, Kotaro Yanagi, Toshihiko Kitajima,
Takumi Yamaguchi, Yasunori Chiba, and Koichi Kato
雑誌巻号：Biomolecules 3, 108-123 (2013)
タンパク質上に提示された高マンノース型糖鎖は、そのプロセシング過程と共役して分泌経路におけるタ
ンパク質の品質を表示するタグとしての役割を担っている。これらの高マンノース型糖鎖は、タンパク質のフォールディング・輸送・分解といった運命の決定に関わっており、プロセシングの各段階における糖鎖が示す揺らぎを含めた 3 次元構造の差異が、糖鎖と様々なレクチンとの相互作用を通じてタンパク質品質管理機構に密接に関与していると考えられる。私たちはこれまでに、溶液 NMR による糖鎖構造の精密解析を行
うための技術基盤として、酵母変異体を用いて安定同位体標識を施した高マンノース型糖鎖を、均一かつ大量に調製する方法を確立してきた[1]。これにより、マンノース 8 残基、アセチルグルコサミン 2 残基からなるオリゴ糖鎖 M8B の NMR 解析例を報告している。本
研究ではこの手法を拡張し、小胞体内の糖鎖プロセシ
ングの過程で生じる 2 種の高マンノース型糖鎖 M8B
および M9（図）を対象に、それらの動的 3 次元構造を明らかにすることを試みた。
糖鎖プロセシングに関わる遺伝子 OCH1、MNN1、
MNN4 および MNS1 を破壊した酵母変異体を用いて、新たに高マンノース型 11 糖である M9 の安定同位体標
識体を大量調製することに成功した。得られた試料を図．細胞内における高マンノース型糖鎖のプロセシン

用いて超高磁場 NMR 解析を実施した結果、両糖鎖のグパスウェイ（上）と、安定同位体標識を利用して観違いは非還元末端のマンノース 1 残基の有無だけであ測された M8B と M9 の NOE ネットワーク（下）。

るにもかかわらず、コンフォメーションの差異が、共参考文献

通のコア部分にまで及んでいることが示された。そこ
13

で、M9 および M8B について C-edited NOESY 法によ[1] Y. Kamiya, S. Yamamoto, Y. Chiba, Y. Jigami, and K.

る核オーバーハウザー効果（NOE）の計測を行い、原Kato, J. Biomol. NMR 50, 397–401 (2011).

7

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No. 51
7 March, 2013
業績紹介：常磁性プローブ導入による高マンノース型糖鎖の動的構造解析
（図 2）
。

加藤晃一
（自然科学研究機構・A01 計画研究代表者）

このように NMR 解析を通じて複雑な分岐構造を有する高マンノース型糖鎖のコンフォメーションのダイ

論文題目：“Terminal spin labeling of a high-mannose-type

ナミクスを定量的に捉える道筋を確立することができ

oligosaccharide for quantitative NMR analysis of its

た。更に私たちが確立した糖鎖の安定同位体標識技術

dynamic conformation”と組み合わせることにより、一連の高マンノース型糖

著者：Takumi Yamaguchi, Yukiko Kamiya, Yeun-Mun

鎖のコンフォメーションの揺らぎの評価を系統的に実Choo, Sayoko Yamamoto, and Koichi Kato

施することが可能となる。

雑誌巻号：Chem. Lett. (2013) in press
糖鎖は、内部運動の自由度に富むことに加え、複雑な分岐構造を持ち、水溶液中では一定のコンフォメー
ションをとっていない。私たちは、このような糖鎖の立体構造の揺らぎを通じて発揮される生物機能の理解を深めるために、溶液 NMR を用いた糖鎖の動的構造解析手法の開発に取組んできた。
例えば、常磁性プローブを用いた NMR 法と分子動力学計算とを組み合わせ
図 1．常磁性プローブを導入した M9 糖鎖。

ることで、糖鎖の動的 3 次元構造を定量的に描象する手法の開発に成功している[1]。一方、遺伝子改変酵母を用いて、複雑な高マンノース型糖鎖を大量に調製することを可能としてきた。タンパク質の品質を提示する高マンノース型糖鎖 M9 は、マンノース 9 残基を含む 11 糖であり、その非還元末端に 3 本の分岐鎖を有している。これらの分岐鎖にはいずれも共通する糖鎖構造(Manα1-2Man)が含まれているにも関わらず、M9 に結合するタンパク質が特定の枝を選択的に識別していることを私たちは見出している[2]。そこで今回、これまでに培ってきたこれらの技術を組み合わせて、高マンノース型糖鎖の精密 NMR 解析を行うことを試みた。
酵母糖タンパク質上に均一に発現させた M9 に関して、その分離・精製条件、および化学修飾のための反図 2．常磁性 NMR 解析による各マンノース残基の横応条件を最適化し、高効率に常磁性プローブを付与す

緩和速度（R2）変化。

る手法を確立した。これにより、M9 糖鎖の還元末端にニトロキシルラジカルを選択的に導入することに成功した（図 1）
。こうして得られた M9 について 1H の参考文献

緩和時間測定を実施し、各マンノース残基の空間配置[1] Y. Zhang, S. Yamamoto, T. Yamaguchi, K. Kato,

に関する情報を反映した常磁性緩和促進効果を観測しMolecules 17, 6658–6671 (2012).

た。解析の結果、3 本の分岐鎖のコンフォメーション[2] Y. Kamiya, T. Satoh, and K. Kato, Biochim. Biophys.

は有意に異なっており、一部の枝を還元末端側に向け

Acta. 1820, 1327-1337 (2012).

たフォールドバック構造を取り得ることが示された

8

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7 March, 2013
業績紹介：NMR 法を用いた GroEL と変性タンパク質との相互作用解析
し、αSN のスペクトル変化を指標に GroEL と αSN の加藤晃一（自然科学研究機構・A01 計画研究代表者）
元島史尋（京都産業大・A03 公募研究代表者）

相互作用解析を実施した。GroEL の添加に伴い、αSNの N 末端の２つの領域（Val3-Ala17、Val37-Val40）に由来するシグナルにおいて、特異的に強度減弱が観測された。このことから、αSN はこれら N 末端の 2 つの論 文 題 目 ： “NMR approaches for characterizing

領域を介して GroEL に結合しており、その他の領域はinteractions between the bacterial chaperonin GroEL and

高い運動性を保持していることが判明した
（図 1）
。
αSN

unstructured proteins”の N 末端はアニオン性の膜に結合して α ヘリックス構

著 者： Noritaka Nishida, Maho Yagi-Utsumi, Fumihiro

造を形成することが知られているが、GroEL に結合しMotojima, Masasuke Yoshida, Ichio Shimada and Koichi

た状態では特定の二次構造を形成していないことも明

Kato

らかとなった。

雑誌巻号：J. Biosci. Bioeng. (2013) in press

このように本研究を通じて、基質タンパク質は高い

doi: 10.1016/j.jbiosc.2013.02.012

運動性を保持したままアンフォールド状態で GroELと結合することが示された。さらに、NMR を用いて変性状態にあるタンパク質の中の“GroEL-philic”な領

分子シャペロンは、生体条件下もしくはストレス条域を捉えることを可能とした。

件下においてタンパク質のフォールディングを補助することを通じて、細胞内の様々な生物現象に関わっている。大腸菌の分子シャペロンである GroEL の反応サイクルに関しては、はじめに GroEL に基質となるタン
パク質が結合し、さらに ATP および補助シャペロンである GroES が結合することでタンパク質の折り畳みを促進することが既に明らかにされている。しかしながら GroEL と基質タンパク質との詳細な相互作用様式
についてはこれまで必ずしも十分には明らかにされていない。本研究では GroEL と基質タンパク質との相互作用の構造的基盤を明らかにすることを目的とし、安定同位体標識技術と NMR 手法を組み合わせることにより、両者の結合様式の詳細を解明することを試みた。

図 1 GroEL 添加前後における αSN 由来の NMR シグナル

モデル基質タンパク質としては、GroEL の機能解析に

強度比のプロット（上）および αSN の一次構造（下）。NMR

広く用いられているロダネーゼ（Rho）、および天然変シグナルの強度減弱が有意に観測された残基を赤色で性タンパク質である α シヌクレイン（αSN）を用いた。

示した。

まずはじめに、大腸菌発現系を用いてアミノ酸残基
13
C NMR
選択的に α 炭素を 13C 標識した Rho を調製し、計測を実施した。 13Cα の化学シフト値に基づいて

参考文献

GroEL に結合した際の Rho の二次構造を評価し、尿素

Nishida, N., Motojima, F., Idota, M., Fujikawa, H., Yoshida,を用いて Rho を変性させた際のスペクトルと比較した

M., Shimada, I. and Kato, K., J. Biochem. (Tokyo) 140,

結果、Rho は GroEL に結合した状態でも分子の大部分

591-598 (2006)

は特定の二次構造をとっておらず、そのコンフォメー

Yamaguchi, Y., Masuda, M., Sasakawa, H., Nonaka, T.,

ションは揺らいだ状態にあることが明らかとなった。

Hanashima, S., Hasegawa, S.-I., Kato, K. and Hasegawa,

15

M., J. Mol. Biol. 395, 445-456 (2010)

次に、 N 標識を施したリコンビナント αSN を調製

9

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No. 51
7 March, 2013
業績紹介：圧力によるフォールディングエネルギーランドスケープの探索
北原 亮（立命大薬・A01 公募研究代表者）

まっているとともに，まだ十分な理解に及んでいない
問題点についても指摘している．例えば，蛋白質内部に存在するキャビティー周辺では，特徴的な圧力応答

論文題目："Exploring the folding energy landscape withが得られる場合が多いが，その常圧下における水和状

pressure"

態を X 線結晶構造解析や溶液 NMR 法によってもまだ

著者：Kazuyuki Akasaka, Ryo Kitahara, Yuji O. Kamatari

十分に確立されていないため，圧力による応答につい

雑誌巻号：Arch. Biochem. Biophys. (2013) in pressてもまだ理解が不十分である．大きなキャビティーのhttp://dx.doi.org/10.1016/j.abb.2012.11.016

周辺では圧力による局所変性がみられるなど，局所的な安定性や揺らぎと密接に関わっている事が推測され

高圧力 NMR 研究によりこれまでに報告してきた研る．

究結果に基づいて，蛋白質の圧力変性機構を平衡論と速度論の立場から紹介した総説である．特に，圧力軸における蛋白質の変性過程をフォールディングファネ
ルを用いて説明している．フォールディングファネルの横軸はコンフォメーションエントロピーであり，縦軸は内部エネルギーと水和エントロピーの和となっているが，縦軸に含まれる内部エネルギー項は，蛋白質の構造形成と強く相関している．一般に蛋白質の構造が壊れるほど部分モル体積が小さくなる事から，ファネルの最下部には構造形成したいわゆる天然状態が，最上部には変性状態が位置し，その中間域には中間体が位置する事となる．つまり加圧により部分モル体積の大きな天然状態から部分モル体積が小さな変性状態までの一連の構造を順に安定化させ NMR による高分
解能構造解析が可能になる．本総説では，ユビキチンとリゾチームを例に圧力下で変性中間体がどのように
NMR 観測されるかを解説し，構造的特徴を明らかにしている．また圧力下では，水の凝固点が降下する事から（2000 気圧の場合，約-20℃），蛋白質の低温変性
状態についても解説している．
さらに圧力下で安定化された変性中間体の特徴と速度論的に観測されているフォールディング中間体の構
造的類似性も指摘している．また天然状態における水素/重水素交換 NMR 法による構造揺らぎの特徴との類似性についても指摘している．
これらの比較解析から，圧力下で安定化される高いギブスエネルギーを持った状態は，生理条件において蛋白質が持つ構造揺らぎの一部である事を強く示している．
本総説により，高圧力 NMR 研究から得られた蛋白
質の圧力変性のメカニズムや構造的特徴がよくまと10

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７ March, 2013
業績紹介：圧力化学シフト変化を用いた蛋白質の構造揺らぎの解明する事により，1H と 15N の線形性或は非線形性は互い

北原 亮（立命大薬・A01 公募研究代表者）に良い相関を示した事から，本質的には線形性が状態内の圧縮率を反映し，非線形性が高エネルギー状態へ

論文題目："Pressure-induced chemical shifts as probes forの状態転移を反映しているとする我々の考えは裏付け

conformational fluctuations in proteins "られた．

著者： Ryo Kitahara, Kazumi Hata, Hua Li, Mike P.

また２状態転移を仮定した化学シフトからの熱力学

Williamson, Kazuyuki Akasaka

解析の方法についても紹介した．NMR の場合，状態

雑誌巻号：Prog. Nucl. Mag. Res. Sp. (2013) in press

間の化学シフト差が交換速度より十分に小さい場合，

http://dx.doi.org/10.1016/j.pnmrs.2012.12.001

分布率に応じ平均化された信号が観測される．すなわ
ち化学シフト値は，速く交換するすべてのコンフォ

高圧力 NMR 法は，耐圧 NMR セルの汎用化もありメーションの分布率を加味した平均値として得られる．

(Daedalus Innovation, USA)，世界で１０以上のグループ

圧力により分布率の変化が生じると，化学シフトが非が研究を開始している．高圧力 NMR 法の背景や方法

線形的に変化するため，解析的にΔG(分布率差)やΔ論，理論などを包括的に紹介するとともに，これまで

V(部分モル体積差)が算出できる．

に行った研究のうち 16 の蛋白質のデータを統計的に

このような 16 蛋白質の構造揺らぎの程度を立体構解析し，新しい発見や解釈を紹介している．

造上にカラーマップで示しており，揺らぎの大きな部

これまでに我々が報告した 20 以上の蛋白質の研究

位がわかりやすくプレゼンテーションされている．

例の中から，50-250 アミノ酸残基の範囲の 16 蛋白質のデータとその実験条件を紹介した．加圧による pH
変化や化学シフト基準物質を使用する際の注意事項についてもまとめた．
次に化学シフトの圧力依存性の線形応答と非線形応答について解説し，テトラペプチド内のアミノ酸に対して，立体構造を有する蛋白質中でのアミノ酸では，
1

H や 15N 化学シフトの圧力依存性に非線形性が増大する事を示した．線形応答が１つの状態内での原子間距離等の変化（圧縮・膨張）を示すのに対し，蛋白質中でみられるアミド 1H や 15N の非線形応答は，異なる圧縮率を有する状態への転移と解釈できる．
次に，Williamson らにより開発された化学シフト変化量から立体構造を計算する手法により，リゾチーム
や BPTI について加圧により水素結合の短縮や膨張が生じる事を示した．化学シフトから計算された立体構
造変化は，高圧力下の X 線結晶構造解析の結果と良い一致を示した．
また 16 の蛋白質の圧力に対する化学シフト変化を２次式によりフィットし，線形性と非線形性を定量的に評価した．非線形性が高い部位は立体構造上近接する場合が多く構造変化部位に相当すると考えられる．
さらに蛋白質ごとの線形性，非線形性の平均値を解析

11

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業績紹介：ユビキチンの高エネルギー構造 N2 の精密立体構造解析に成功
北原 亮（立命大薬・A01 公募研究代表者）
加藤晃一（自然科学研究機構・A01 計画研究代表者）

距離情報(NOE)と角度情報(RDC, TALOS+)から Q41N の精
密な立体構造に成功した。Q41N は、8-44-70 からなる
疎水性パッチの構造は保持しつつも、高圧下で決定さ
α-helix, loop, β3-strand,
れた WT の N2 構造と同様に、
β5-strand の配向が変化していた。

論文題目："Solution structure of the Q41N variant of

Q41N のスピン緩和 NMR 解析から、α-helix, loop,

ubiquitin as a model for the alternatively folded state N2 of

β3-strand, β5-strand の領域で us-ms 域の構造揺らぎ

ubiquitin"が観測されたことからも、変異により N1-N2 構造転移

著 者 ： Soichiro Kitazawa, Maho Yagi-Utsumi, Kenjiが増幅されたことが分かった。Cleanex-PM NMR 解析か

Sugase, Nicola Baxter, Koichi Kato, Mike P. Williamson,

らは、これらの部分で変異により安定性が低下し水和

Ryo Kitahara

が進んでいることが示された。α-helix と loop 部分は雑誌巻号：Biochemistry (2013) in press

酵素 E2 との相互作用部位であり、N2 構造が E2 認識に

doi: 10.1021/bi301420m

関与している可能性が示唆される。Q41N 変異体は N2構造の良いモデル変異体であり、機能的意義の解明に

蛋白質構造において、天然状態を逸脱した高エネル

必須な変異体となるだろう。

ギー状態の存在が溶液 NMR 法で確認されているが、構造やダイナミクス、安定性の解析、機能的意義の解明

参考文献

は天然状態ほど進んでいない。蛋白質の高エネルギー

1. R. Kitahara et al., J. Mol. Biol. 347, 277-285 (2005).

状態を圧力下で安定化させ、NMR による立体構造を行

2. R. Kitahara et al., Progress in NMR spectroscopy, in

い、最安定状態から変性状態までの一連の構造変化を

press (2013).

可視化する事ができる。これまでに高圧力 NMR 法によりユビキチンには、最安定状態 N1 の他に準安定状態 N2や局所変性状態 I、完全変性状態 D が存在することを明らかにしてきた(1,2)。
また野生型ユビキチンについて 3000 気圧下で N2 構造を 78%まで分布させ、立体構造解析に成功している(1)。N2 構造の精密構造解析や、機能的意義の研究のために１気圧下で N2 構造が安定化された変異体を合理的に設計することを試みた。
1 気圧下での N1 構造と 3000 気圧下での N2 構造の立体構造比較から、I36-Q41 間の水素結合長と K11-E34間の塩橋が大きく変化していることが明らかになった。
そこで、水素結合と塩橋の相互作用を減弱させるために Q41A, Q41N, K11A, E34A 変異体を作成し、高圧力
NMR 測定を含む各種 NMR 測定に基づいて、立体構造、ダイナミクス、熱力学的安定性の解析を行った。
圧力(3000-30 bar)による化学シフト変化と変異による化学シフト変化に相関がみられたことから、加圧時と同様に変異によっても N2 構造の安定化が示唆された。
最も化学シフト変化量が大きい Q41N について、
高圧力
NMR 法により N2 構造の分布率が 70％程度と分かった。

12

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業績紹介：化学シフトデータから複数の基質結合部位を同時に同定
櫻井一正（大阪大学蛋白質研究所・A01 公募研究代表者）

その結果 2 つの結合部位、ひとつは β バレル内部、も

論文題目："Principal component analysis of chemical shiftのパラメータから、後者は ANS が単純にβLG 分子表

perturbation data of a multiple-ligand-binding system for

面に結合するのに対し、前者は基質結合と構造変化がelucidation of respective binding mechanism"

同時に起こる協同性の高い結合様式であることが示唆

著者：Tsuyoshi Konuma, Young-Ho Lee, Yuji Goto, andされた。これまでの蛍光や CD、ITC などによる測定でKazumasa Sakurai.

は、各部位への結合を分離して観測できなかったため、

雑誌巻号：Proteins 81, 107-118 (2013)

詳細な結合機構を説明できなかったと考えられる。

うひとつは β バレル―α ヘリックス間の溝、に ANS が結合した構造を得ることができた（図参照）。また、
CS-PCA で得られた結合定数や各部位への ANS 結合数

タンパク質の 2 次元 NMR スペクトルのひとつである HSQC スペクトルから各残基の主鎖アミド窒素と水素の化学シフト値が得られる。化学シフトは対応する残基の周辺環境を敏感に反映するため、基質の滴定に伴う各残基の化学シフト変化（化学シフト摂動）の情報は、リガンド結合部位の同定によく用いられている。
しかし、対象タンパク質が複数のリガンド結合部位を持つ場合、化学シフト摂動データだけではそれぞれの結合サイトを分離して同定することは難しい。そこで
我々は、滴定実験から得られる一連の化学シフト(CS)
データを主成分分析（PCA）することで各リガンド結合部位を分離して同定する方法（CS-PCA）
を提案した。
PCA は、膨大なデータの中からある傾向を見つけ出し、限られた数のパラメータでそれらを説明する方法

今回我々はこの CS-PCA 法を基質結合部位の同定にである[1]。今回提案する手法では、全ての残基の化学用いた。しかし尿素変性や温度、圧力変化によるタン

シフトデータの主成分解析から共通の挙動を示す残基

パク質の構造変化は化学シフト摂動を伴うことが多く、をグルーピングし、それぞれを基質の各結合部位に帰このようなデータにも本解析法が適用できる。この場合、条件変化の途中に生じる変性中間体の構造やダイ属するという手順で行った。
我々はこの CS-PCA 法をウシ β ラクトグロブリン

ナミクス変化に関する情報が得られると期待される。

（βLG）の基質結合の解析に適用した。これまでの研今後本解析法を様々なタンパク質、そして様々な変性

究から、βLG は基質のひとつであるアニリノナフタレ

実験における構造変化や揺らぎの解析に応用し、本解ンスルホン酸（ANS）の結合サイトを複数持つと考え析法を改良していきたい。もし他の班員の方に本解析られていたが、結合部位、会合定数、各部位の結合数に適すると思われるデータをお持ちの方は、是非ご紹などは明確に分かっていなかった。そこで我々は ANS

介いただけると幸いである。

滴定に伴う HSQC スペクトル変化を測定し、得られた
化学シフトデータを主成分解析した。得られた主成分

参考文献

データを加重平均距離( d )という値を参考にグルーピ[1] K. Sakurai and Y. Goto. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.

ングし、それぞれのグループに対し HADDOCK という

104, 15346-51 (2007).

プログラムで βLG-ANS 複合体の構造計算を行った。

13

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業績紹介：癌抑制転写因子 p53 は DNA 上をどのように探索するか？

（図 C）。このメカニズムは、近年の一分子実験の結果

高田彰二（京都大学大学院理学研究科・A01 公募研究代表者）を説明するために提唱されたモデルと一致する。
また、
C 末端ドメインによるスライディングが、DNA 上の溝に沿った拡散ではないことを明らかにした。これは、論文題目："p53 searches on DNA by rotation-uncoupled

他のタンパク質が DNA に結合している状況でも、p53

sliding at C-terminal tails and restricted hopping of coreがそれらを避けて DNA 上を拡散することができるこ

domains"とを示唆している。さらに、拡散定数の塩濃度依存性

著 者 ： Tsuyoshi Terakawa, Hiroo Kenzaki, and Shojiを解析した結果から、天然変性領域である C 末端ドメ

Takadaインが DNA 上を素早くスライディングすることに適

雑誌巻号：J. Am. Chem. Soc. 134, 14555-14562 (2012)

したドメインであることが示唆された。また、コアド
メインと C 末端ドメインを繋ぐリンカーの、特異的結

p53 は癌抑制性の多機能転写因子であり、細胞周期に合部位の探索における重要性が示唆された。

関わる多数のタンパク質の転写を制御する。転写因子
は一般に長いゲノム DNA 上の特異的結合部位を効率

参考文献

よく探索する必要がある。転写因子が、いかにして速[1] Terakawa & Takada (2011) Biophys J 101:1450

やかにターゲットを探索できるのか、という問題は細[2] Li, Wolynes, & Takada (2011) PNAS 108:3504

胞生物学における重要な基礎問題である。
p53 はホモ４量体を形成してその機能を果たす。それぞれの単量体は、2 つの構造ドメイン（右図上のコ
アと TET）と３つの変性領域（NTD、Linker と、C末端ドメイン）よりなっており、このうちコアドメイ
ンと C 末端ドメインがともに DNA 結合ドメインであることが興味深い。二つの DNA 結合ドメインが、どのように協調して特異的結合部位を探索するかはよく知られていない。
本研究では、まず、p53-DNA 複合体の粗視化モデルを構築した。特に、p53 のアミノ酸配列の 40％を構成する天然変性領域のモデルのために、PDB に登録されているループ領域の構造から統計ポテンシャルを構築した [1]。また、3 次元立体構造を形成する領域には、
天然構造の情報をベースにしたモデルを用いたが、全原子シミュレーションで求めたタンパク質の揺らぎと粗視化シミュレーションの揺らぎが一致するように決定したパラメータ（AICG [2]）を用いた。
それらのモデルを用いて、p53-DNA 複合体の粗視化シミュレーションを行うことにより、生理的な塩濃度下で（構造は図 B）、C 末端ドメインが DNA 上をス
ライディングする一方で、コアドメインは探索中に
DNA との結合、解離を繰り返すことを明らかにした14

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No.51
7 March, 2013
業績紹介：ハイブリッドリポソームを用いたヒト成人Ｔ細胞白血病細胞移植
モデルマウスに対する in vivo での治療効果
上岡龍一（崇城大応用生命科学・A03 計画研究代表者）
松本陽子（崇城大応用生命科学・A03 公募研究代表者）
岡田誠治（熊本大エイズ研・A03 公募研究代表者）

脈投与後の肝臓重量は、未処理のコントロールおよびDMPC 単一リポソーム投与群と比べ、有意に抑制された (p < 0.01, 図 1A)。さらに、肝臓の組織切片作成後の HE 染色 (図 1B) および免疫染色 (CD4, CD25) においても、HL-25 処理により、肝臓での MT-4 細胞増殖を顕著に抑制することが明確となった。
次に、HL-25 による ATLL 移植マウスの延命効果について検討した。HL-25 を 14 日間の連続投与した

論文題目：“Therapeutic effects of hybrid liposomes for

ATLL 移植モデルマウスにおいて、平均生存日数が 72

mouse models of adult T-cell leukemia/lymphoma in vivo”

日であった。一方、コントロールおよび DMPC 単一リ

著者：Yuji Komizu, Mamiko Yukihara, Toshiko Ueoka,

ポソーム群では、それぞれ、57 日および 56 日であっ

Hideaki Ichihara, Yoko Matsumoto, Seiji Okada, Ryuichi

た。さらに、HL-25 投与群の延命率は、125％であり (pUeoka< 0.01)、顕著な延命効果が明らかとなった。

雑誌巻号：Nano Bull., 1, 120105 (2012).

以上の結果から、HL-25 の ATLL モデルマウスに対する in vivo での治療効果を初めて明らかとした。
今後、成人Ｔ細胞白血病/リンパ腫 (Adult T-cell Leukemia/

さらに前臨床試験を積み重ね、副作用のない ATLL 治

Lymphoma : ATLL) は、HTLV-Ⅰ(ヒト T 細胞白血病ウ

療薬を目指して、
ステップアップできるものと考える。

イルスⅠ型) の感染が原因となる T 細胞の悪性腫瘍疾

Relative liver weight (g/100g B.W.)

A

患であり、日本において九州地方で多発している。
HTLV-Ⅰ感染者の大多数は無症候であるが、ごく一部が ATLL を発症する。そのため、ATLL に対する安全で効果的な新しい治療薬の開発が急務となっている。
ハイブリッドリポソーム (HL) [1] は、リン脂質とミセル系界面活性剤を緩衝水溶液中で超音波処理することにより調製でき、HL 自身がアポトーシス誘導型のの揺らぎ(流動性)”や“がん細胞膜の揺らぎ”が重要

15
10

*

5
0

NormalB

制がん効果を示すこと、その制がんメカニズムに“HL

20

NormalControl

Control

DMPC

DMPC

HL-25

HL

HE

であることを報告している［2］。最近、ATLL (MT-2,
MT-4) 細胞に対して、HL が選択的に融合・蓄積後、

図1. HL-25のATLL移植モデルマウスに対するin vivoでの肝転移抑制効果。A,マウスの肝臓の重量。B, 肝臓の組織切片のHE染色画像。Normal：MT-4細胞を移植していないマウス, Control : 5%-ブドウ糖水溶液,
DMPC : 136 mg/kg, HL-25:136 mg/kg。* : p < 0.01

アポトーシスを誘導するがん抑制効果を報告した[3]。
しかし、ATLL マウスに対する in vivo での効果については不明であった。そこで、本研究では、リン脂質(DMPC) および PEG 系界面活性剤 C12(EO)25 からなる
HL-25 を用い、ATLL モデルマウスに対する in vivo で参考文献のがん抑制効果について検討した。

[1] R. Ueoka et al., J. Am. Chem. Soc., 110, 1588-1595 (1988).
[2] Y. Komizu et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 418,

まず、ATLL モデルの作成として、T 細胞、B 細胞お

81-86 (2012).

よび NK 細胞の免疫機能を欠損した高度免疫不全マウ[3] Y. Komizu et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 21, 3962-3965

ス (Balb/c Rag-2/Jak3) [4] を用い、ATLL (MT-4) 細胞(2011).

をマウスの脾臓に移植し、ATLL の肝転移モデルを作[4] A. Ono et al., J. Biomed. Biotechnol., 2011, 539748 (2011).

成した。HL-25 の MT-4 細胞の肝転移モデルマウスへの治療効果を検討したところ、HL-25 の 14 日間の静15

「揺らぎと生体機能」ニュースレター
No. 51
７ March, 2013
業績紹介：スピンカラムを用いた DMSO 反応停止水素/重水素交換 NMR 法
条件で我々は6 Μグアニジン存在下でのユビキチンの桑島邦博（岡崎統合バイオサイエンスセンター・A03
計画研究代表者）
加藤晃一（自然科学研究機構・A01 計画研究代表者）

DMSO 反応停止水素/重水素交換 NMR 法を行った。その結果、図中の A、B、C の NMR 信号が交換反応時間に応じて減衰している様子を観測する、つまり6 Μグ
アニジン存在下でのユビキチンの水素/重水素交換反応を追跡することに成功した。

論 文 題 目 ： "The use of spin desalting columns in

この方法を用いることにより、高濃度の塩存在下でDMSO-quenched H/D-exchange NMR experiments"

DMSO 反応停止水素/重水素交換 NMR 法を行うことが

著者：Mahesh S. Chandak, Takashi Nakamura, Toshio

可能となる。例えば 6 M のグアニジンで変性させた蛋

Takenaka, Tapan K. Chaudhuri, Maho Yagi-Utsumi, Jin

白質の水素/重水素交換反応速度を調べることにより、Chen, Koichi Kato and Kunihiro Kuwajima

その蛋白質が 6 M のグアニジン存在下で完全に変性し雑誌巻号：Protein Sci. (2013) in pressているのか、それとも何らかの残存構造があるのかと

doi: 10.1002/pro.2221

いった情報を得ることができるだろう。

水素/重水素交換 NMR 法は蛋白質の構造揺らぎを調べるために有用な実験法である。その中でも Zhang らによって発表された DMSO 反応停止水素/重水素交換
NMR 法は、①DMSO は強力な変性剤であるため、会合体や不溶性の凝集体を単量体として溶解することができる、②DMSO 中では水素/重水素交換速度は水溶液中と比較して非常に遅いため、DMSO で水素/重水素交換を停止することにより水溶液中では観測困難な速い
水素/重水素交換反応を追跡できる、という点において蛋白質又は蛋白質集合体の構造揺らぎを調べることに適している。従来の DMSO 反応停止水素/重水素交換
NMR 法は、まず水溶液中で水素/重水素交換させた蛋
白質試料を液体窒素等で凍結させ、凍結乾燥した蛋白
質試料を DMSO に溶解することにより NMR 測定用の図

試料を調製する。しかしながら、この方法では NMR

素交換反応

測定用の試料に水素/重水素交換反応時に用いた塩が水素/重水素交換反応条件は、6M グアニジン、pH 2.6、

残ってしまうため、水素/重水素交換反応時の溶媒条件20℃。それぞれの NMR スペクトルは、(a)水素/重水素に制限が生じる。この問題を克服するために我々はス

交換反応前(b)水素/重水素交換反応後、10 分(c)水素/重ピンカラムを用いた DMSO 反応停止水素/重水素交換

水素交換反応後、60 分(d)55℃、30 分で完全に水素/重NMR 用の試料調製方法を開発したので、ここで紹介

水素交換反応させた試料、である。

する。
まず、我々はスピンカラムにのせる試料体積を決めた。Bed Volume 5 ml、MWCO7000 の ZebaTM spin
desalting columns を用いた場合、1.0 ml 以下の蛋白質試
料溶液をスピンカラムにのせると蛋白質試料溶液由来の水のコンタミが少ないことがわかった。次に、この

16

6Μグアニジン存在下でのユビキチンの水素/重水「揺らぎと生体機能」ニュースレター
No. 51
7 March, 2013
業績紹介：Vγ9Vδ2T 細胞の悪性リンパ腫に対する抗腫瘍効果
岡田誠治（熊本大学エイズ学研究センター・
A03 公募研究代表者）
A

論文題目："Potent antitumor activity of zoledronic
acid-induced Vγ9Vδ2 T cells against primary effusion
lymphoma"
著者：Hiroki Goto, Kouki Matsuda, Pattaravadee Srikoon,
Ryusho Kariya,

Shinichiro Hattori, Manabu Taura,

Harutaka Katano and Seiji Okada

B

雑誌巻号：Cancer Lett. (2013) in pressC

doi: 10.1016/j.canlet.2012.12.021
原発性滲出液リンパ腫(Primary Effusion Lymphoma:
PEL)は、リンパ節や節外臓器に明らかな腫瘤を形成せず、体腔内(胸腔・腹腔・心膜腔)に腫瘍細胞が浮遊した状態で発症する非ホジキン悪性リンパ腫である。
HIV/AIDS 患者や臓器移植後の免疫不全患者に特異的に認め、HHV-8 によるウイルス発がんが原因とされる。

図１．Vγ9Vδ2T 細胞の抗腫瘍効果。A, PEL 細胞株に

従来の化学療法に抵抗性で、生存期間中央値は 6 ヶ月

細胞傷害活性を認めた。B, C, PEL マウスモデルで腹水未満と予後は極めて不良であり、新たな治療法の開発

量が減少した。

が望まれている。
Vγ9Vδ2T 細胞は、
主に末梢血に存在する γδT 細胞で、さらに、Vγ9Vδ2T 細胞の PEL モデルマウスにおける末梢血リンパ球の 1-10%を占める。がん細胞やウイル

抗腫瘍効果の検討を行った。当研究室で樹立した高度ス感染細胞に対して、MHC 非拘束性の細胞傷害活性免 疫 不 全 マ ウ ス (NOD/Rag-2/Jak3 二 重 欠 損 マ ウ ス :を有する。近年、第 3 世代ビスフォスホネート製剤でNRJ マウス)の腹腔内に PEL細胞株 BCBL-1 を移植し、あるゾレドロン酸により Vγ9Vδ2T 細胞を特異的に誘無治療群、Vγ9Vδ2T 細胞投与群にわけて 31 日間観察導する方法が見出された。そこで、Vγ9Vδ2T 細胞のしたところ、無治療群では、マウスへの腫瘍細胞の生

PEL に対する治療効果について検討した。

着と腹水の貯留を認めた。Vγ9Vδ2T 細胞投与群では、

末 梢 血 単 核 球 (PBMCs) を ゾ レ ド ロ ン 酸 1µM 、腹水量の減少、遠隔臓器への浸潤抑制を認めた。
また、

IL-2(100U/ml)存在下で 14 日間培養し、Vγ9Vδ2T 細胞

治療群のマウス脾臓・末梢血中には、Vγ9Vδ2T 細胞をの特異的な増幅を in vitro で行った。

認めており、NRJ マウスは Vγ9Vδ2T 細胞の解析モデル

Vγ9Vδ2T 細胞は 3 種類の PEL 細部株(BCBL-1、BC-1、としても有用であることが示唆された。

BC-3)に対して、
フローサイトメトリーを用いた実験に以上の結果から、ゾレドロン酸により誘導された

おいて、細胞傷害活性を認めた。阻害剤や阻害抗体を

Vγ9Vδ2T 細胞は、PEL 細胞に対して、腫瘍表面の用いた実験から、腫瘍細胞の MICA/B やメバロチン代

MICA/B・メバロチン代謝産物を認識し perforin 経路・

謝産物を認識し、perforin 経路・TRAIL 経路を介した

TRAIL 経路を介して、in vitro、in vivo で抗腫瘍効果を

細胞傷害活性を認めることが明らかとなった。

認めることが明らかとなった。
今回の研究から、Vγ9Vδ2T 細胞による免疫療法は

フローサイトメトリーで脱顆粒のマーカーとして知PEL に対する有効な治療法の一つと考えられる。

られる CD107a の発現を評価したところ、PEL 細胞との共培養下で、CD107a の発現上昇を認めた。

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「揺らぎと生体機能」ニュースレター
No. 51
7 March, 2013
業績紹介：生体内糖鎖プロセシングに対する多様な分子クラウディング効果
戸谷希一郎（成蹊大理工・A03 公募研究代表者）

進行した生成物が減少した。分子クラウディングによるグルコース切断の加速とマンノース切断の減速は、それぞれを個別に評価する実験系でも同様に確認され論文題目："Diverse effects of macromolecular crowding

た。これらの結果は分子クラウディングが、ひとつのon the sequential glycan processing pathway involved in

生命プロセスの上流と下流に対して異なる影響を及ぼ

glycoprotein quality control"

す場合があることを示した初めての例である。また、

著者：Hikaru Matsushima, Makoto Hirano, Yukishige Ito

これらの分子クラウディング効果は、生体内糖鎖構造

and Kiichiro Totaniをもつ高マンノース型糖鎖基質を用いた場合にのみ観

雑誌巻号：ChemBioChem (2013) in press

測され、市販の p-ニトロフェニルグリコシドを基質とした場合には、顕著な分子クラウディング効果は認め

細胞内環境は一般的な in vitro 実験環境と比べて多られなかった。さらに本研究では糖鎖プロセシング中

様な生命分子によって混み合った状態にある。この分間体と結合するレクチン様分子シャペロン「カルレ子クラウディングは酵素やタンパク質の性状に様々な

ティキュリン」のレクチン活性に対する分子クラウ

影響を及ぼすことが知られている。これまでタンパク

ディングについても併せて検討した。その結果、分子質のフォールディングや相互作用、酵素反応に対するクラウディング下で当該レクチン活性は有意に向上す

分子クラウディング効果は個々に評価されてきたが、ることが分かった。

連続的な分子変換や相互作用が関わる生命プロセス全

本研究では in vitro 実験において、分子クラウディン

体に対して分子クラウディングを検討した例はない。

グによって疑似細胞内環境を作り出すことや、真のリ本研究では小胞体内の糖タンパク質糖鎖プロセシング

ガンド構造をもつ基質を用いることの重要性を実証しを連続的な代謝経路のモデルとして、分子クラウディた。とくに連続的な代謝過程を正しく理解するためにングが生命プロセス全体に及ぼす影響を検証した。

は、分子クラウディング効果を考慮することが肝要である。

糖加水分解酵素やレクチンが関わる糖タンパク質プ
ロセシングは、タンパク質の品質管理を制御する因子として重要である。我々は化学合成した均一構造のGlc2Man9GlcNAc2(G2M9)誘導体（上図）をラット肝臓から抽出した小胞体画分中に添加し、その糖鎖プロセ
シング状況を高速液体クロマトグラフィーによって定量的に評価した（下図）。その際、通常の in vitro 実験
環境とウシ血清アルブミンをクラウディング剤として共存させた分子クラウディング環境の双方で糖鎖プロ
セシング状況を経時的に比較したところ、反応 1 時間
後ではグルコース切断のみが観測され、それらの反応
は分子クラウディング下で促進することが分かった。
反応 5 時間後では、グルコース切断に加えマンノース
切断も観測されたが、分子クラウディング下のクロマ
トグラムは通常の希釈条件下とほぼ同一であった。このことはグルコース切断に引き続き起こるマンノース
切断が、分子クラウディング下で減速することを示唆している。実際、反応 8 時間後のクロマトグラムを比図：連続糖鎖プロセシングに対する分子クラウディング効果

較すると、分子クラウディング下でマンノース切断が本研究の概要 (上図) と典型的な結果 (下図) を示す

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「揺らぎと生体機能」ニュースレター
No. 51
7 March, 2013
業績紹介：Katanin p60 のカルシウム結合による機能制御機構
p60-katanin のマイクロチューブル切断活性が、抑制さ濵田大三（神戸大学大学院医学研究科・A03 公募研究代表者）れた。同様に、p80 の存在下によるマイクロチューブ
ル切断活性も、Ca2+ によって抑制された。しかし、
p60-katanin のマイクロチューブル結合に対して、Ca2+

論文題目："Effect of Ca2+

on the microtubule-severingの有無は影響を与えない。溶液 NMR を用いて、enzyme p60-katanin"

p60-vMIT の Ca2+結合部位を解析したところ、マイクロ

著 者 ： Naoko Iwaya, Kohei Akiyama, Natsuko Goda,

チューブル結合部位とは異なるへリックス 2 の末端部

Takeshi Tenno, Yoshie Fujiwara, Daizo Hamada, Teikichi

分に Ca2+が結合することが、明らかになった（図１）。

Ikura, Masahiro Shirakawa, Hidekazu Hiroaki
雑誌巻号：FEBS J. 279, 1339-1352 (2012).
Katanin は、spastin や fidgetin と同様にマイクロチューブルの切断活性を持つ酵素であり、ATP 加水分
解活性を持つ p60 サブユニット(p60-katanin)と、そのアダプターである p80 サブユニットのヘテロ二量体構造を形成している。P60-katanin は、ATP 依存的なマイク
ロ チ ュ ー ブ ル 切 断 活 性 を 有 し 、 N 末 端 の variant
microtubule interacting and trafficking（vMIT）ドメインとその下流の AAA ATPase ドメイン、ならびに二つのドメインを連結する 200 アミノ酸程度のリンカー領域から構成される。遺伝的に関連する他の AAA ATPase
である Vps4 と p60-katanin は良く似た基質認識機構を保持しており、katanin の vMIT ドメインは、アミノ酸

図１．p60-vMIT の Ca2+結合部位. (A) Ca2+の常磁性プローブである Ce3+添加による 1H-15N HSQC スペクト
ルの変化．(B) Ca2+結合に関与するアミノ酸の側鎖．

配列の相動性は低いものの、Vps4 の N 末端にある
microtubule interacting and trafficking（MIT）ドメインと良く似た立体構造を形成している[1,2]。また、これまでの研究から、マイクロチューブルあるいは、マイク

す な わ ち 、 マ イ ク ロ チ ュ ー ブ ル お よ び p80 は

ロチューブルと p80 共存下において、p60-katanin のp60-vMIT に結合して、200 残基離れた AAA ドメイン

ATPase 活性が促進されることが報告されている。

の ATPase を活性化し、一方 Ca2+は p60-vMIT に結合し本研究では、
p60-katanin の vMIT ドメイン(p60-vMIT)て ATPase を不活性化する。このことは、200 アミノ酸のマイクロチューブルや p80 による ATPase 活性促進のドメイン連結リンカー領域に、大きな構造揺らぎがのメカニズムを明らかにするために、溶液 NMR やそあり、p60-vMIT と AAA の二つのドメインが過渡的にの他の生化学的アッセイ系を用いて、p60-vMIT とこれ接触することで、ATPase が活性化状態になるのに対し、らの因子の相互作用について解析を行った。
その結果、p60-vMIT に Ca2+が結合し、リンカー領域の揺らぎが抑

p80 の C 末端ドメインが、p60-vMIT のへリックス 1 を制されると ATPase が不活性化されることを示唆する。

とりまくような広範囲の領域に結合することが明らかになった。この p80 結合サイトはマイクロチューブル

参考文献の結合サイト（へリックス 2 と 3 で構成される面）と[1] N. Iwaya et al., J. Biomol. NMR 37, 53-63 (2007).

は異なっていた。

[2] N. Iwaya et al., J. Biol. Chem. 285, 16822-16829

このような研究を進める中で、Ca2+の添加によって、(2010).

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「揺らぎと生体機能」ニュースレター
No. 515 March, 2013
業績紹介：並進・回転運動するベシクル上の脂質の側方拡散を NMR で分離
岡村恵美子（姫路獨協大薬・班友）

ることを利用すれば、DL、DROT、DT を分離できる。
脂質分子のベシクル上での側方拡散を球面上でのランダムウォークとみなし、ベシクル自体の並進、回転

論文題目："Lateral Diffusion of Lipids Separated from

運動もランダムウォークとして取り扱えば、実測されRotational and Translational Diffusion of a Fluid Large

る拡散係数 Deff はUnilamellar Vesicle"eff
D eff =DT + DLeff + DROT

(1)
eff
L

著 者 ： Noriyuki Yoshii, Tomomi Emoto, and Emikoのように表される。 D は側方拡散に伴う見かけの拡

Okamura

散係数で、拡散時間を Δdiff、ベシクルの半径を R とす

雑誌巻号：Colloid Surf. B-Biointerfaces 106, 22-27 (2013)

るとDLeff=

脂質膜ベシクル中で、脂質分子はベシクル表面上のR2 
 2D D 
1 − exp  − L 2 diff  R
3D diff 



(2)

eff

制限された空間を移動する。膜の流動性や構造揺らぎ

で与えられる。DROT についても式(2)の DL を DROT に置と関連して重要なのは脂質の側方拡散であるが、実験

き換えることにより同様の式で与えられる。
DT や DROT

によって観測される（見かけの）拡散係数には、ベシは水の粘性係数を η として、それぞれ Einstein-Stokes

クル表面上の側方拡散のほかに、ベシクル自体の並進、の関係式 DT = kBT / 6πη R および球の粘性流体中の回回転運動に伴う拡散が合わさっており、観測される拡転拡散の式 DROT = kBT 8πη R を用いて求められる。

散係数はこれらが足し合わされたものとなっている。

Dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC)を成分とする

本研究では、パルス磁場勾配 NMR 測定を利用して、直径 800 nm のベシクルについて、脂質が液晶相にあ実測の拡散係数からベシクル自体の並進拡散係数 DT、る 45 ˚C で磁場勾配 NMR 計測を行い、実測された拡および回転拡散係数 DROT を分離し、脂質分子の側方拡

散係数 Deff の Δdiff 依存性を求めた。図 2 のように、Δdiff

散係数 DL を求める方法を考案した。

の大きな領域では実測の Deff（●）がベシクル自体の

図 1 のように、脂質分子は球状ベシクル上を DL で並進拡散係数 DT=8.2×10-13 m2/s と同程度の値となって拡散する。同時に、ベシクル自体も DT および DROT でいるのに対し、Δdiff が小さくなるに従い次第に Deff が拡散運動している。拡散時間が短い場合、ベシクル自増加する。得られた Deff に式(1)をフィッティングする

体の並進、回転による変位に比べ、脂質分子の側方拡ことにより DL を求めると、1.5(±0.6)×10-11 m2/s となる

散による変位が支配的になる。一方、時間が十分に長（図 2）。ベシクル自体の並進や回転の拡散係数の 10ければベシクル自体の並進拡散による変位が支配的に倍以上に相当し、脂質分子がベシクル表面上で非常にeffなる。見かけの拡散係数 D が時間に依存して変化す

速く拡散していることがわかる。

Diffusion motion in a fluid lipid vesicle
Diffusion motions:short time

DL: lateral
DROT: rotational
DT: translational

long time

図 1：並進・回転運動するベシクル表面の脂質分子の

図 2：ベシクル中の DPPC の拡散係数の時間依存性.

側方拡散.

●は実測値、各線は側方拡散係数 DL が図中の数値で与えられるときの式(1)のフィッティング結果.

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「揺らぎと生体機能」ニュースレター
No. 51
7 March, 2013
上岡班員の研究成果がテレビに放映される
A03 班、班長の上岡龍一教授 (崇城大学) の研究成果が、KKT くまもと県民テレビ「テレビタミン」
カラダ ココロ研究所のニュース特集として「副作用のないがん治療を目指して」とのタイトルで、2013
年 2 月 6 日に放映されました。注目されている『がん細胞膜の揺らぎをターゲットとするハイブリッ
ドリポソームの制がん効果』についてであり、約 7 分間の中で、上岡教授のインタビューとわかりや
すいアナウンサーの解説が好評でした。報道後には、多くの視聴者から問い合わせがありました。

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