「揺らぎと生体機能」ニュースレター
No. 4225 May, 2012
業績紹介：分子動力学計算と常磁性 NMR 法による糖鎖立体構造の揺らぎの検証
合成し、これを GM3 糖鎖の還元末端へ連結した後、加藤晃一（自然科学研究機構・A01 計画研究代表者）

Tm3+ イオンを添加することで常磁性プローブを特定の位置へ導入した。調製した試料につい て 1H-13C

論 文題 目： "Lanthanide-assisted NMR evaluation of a

HSQC 測定を行い、糖鎖の各水素および炭素原子の化

dynamic ensemble of oligosaccharide conformations"

学シフト変化から PCS 値を求めた。一方、MD 計算に

著者：Sayoko Yamamoto, Ying Zhang, Takumi Yamaguchi,

よって得られた複数のコンフォマーを考慮した立体構

Tomoshi Kameda, and Koichi Kato造モデルを作成し、PCS の理論値を算出した。このよ雑誌巻号：Chem. Commun. 48, 4752–4754 (2012)

うにして得られた PCS の実験値と理論値の比較を行った。その結果、主要なコンフォメーションのみな糖鎖の機能を詳細に理解するためには、その立体構らず、存在割合の低い安定構造を考慮することで両者造を溶液中での揺らぎを含めて明らかにする必要があがよりよく一致することが判明し、これにより溶液中る。そこで、私たちは、溶液 NMR による糖鎖の立体での糖鎖の立体構造の揺らぎを正しく記述することに構造およびダイナミクス解析のための新規手法の開発成功した。以上のように、PCS と MD 計算を組み合わに取り組んでいる。生体分子の立体構造の揺らぎを記せることで、糖鎖の動的な立体構造解析のための体系述する有力な方法の１つに分子動力学（MD）計算が的な方法論を構築することができた。

あげられるが、その計算結果の検証には NMR 法が広く用いられている。糖鎖の MD 計算においても、得られた結果が実際の系の振る舞いを再現しているか否かを検証するために、NMR による核オーバーハウザー効果（NOE）やスピン結合定数などの観測に基づく立体構造情報が利用されている。しかしながら、NOE は近傍の原子間でのみ観測されるため、プロトン密度が低い糖鎖においては十分な量の構造情報を得ることは困難である。
また内部運動の自由度が大きい糖鎖では、結合の二面角を反映するスピン結合定数を定量的に解釈することは容易ではない。一方、私たちは、新たな立体構造情報として常磁性効果に着目し、ランタニドイオンの導入によって観測される擬コンタクトシフト（PCS）を利用した糖鎖の NMR 立体構造解析法を報告している[1]。本研究では、PCS を活用した糖鎖のMD 計算結果の新規評価法の確立を行った。
具体的には、神経細胞膜上に存在する糖脂質ガング
リオシド GM3 の糖鎖構造（NeuAcα1-3Galβ1-4Glc）について、MD 計算と常磁性 NMR 計測を実施し、PCS

図 1．MD 計算によって得られた GM3 糖鎖のグリコシの理論値と実験値を比較することで MD 計算により得ド結合の二面角の分布図（上）および立体構造の重ねられた構造サンプリングの適切さを評価した。GM3 糖合わせ（下）。

鎖の MD 計算を行ったところ、エネルギー差の小さな複数の安定構造が存在し、その立体構造は水溶液中で参考文献揺らいでいることが示唆された。そこで剛直な金属キ[1] S. Yamamoto et al., Chem. Euro. J. 17, 9280–9282

レートタグとしてフェニレンジアミン四酢酸誘導体を(2011).

1

「揺らぎと生体機能」ニュースレター
No. 4225 May, 2012
業績紹介：糖タンパク質の分解に関わるタンパク質間相互作用の構造基盤加藤晃一（自然科学研究機構・A01 計画研究代表者）

辺に分布する塩基性アミノ酸と静電的に相互作用することが明らかとなった (図 1)。さらに、フロンタルア
フィニティークロマトグラフィ実験により PUB と論 文 題 目 ： "NMR characterization of the interaction

HR23-UBL および Ub 鎖との親和性を定量的に評価しbetween the PUB domain of peptide:N-glycanase andた。

ubiquitin-like domain of HR23"

以上の結果を総合して私たちが提唱する ERAD マ

著者：Yukiko Kamiya, Yoshinori Uekusa, Akira Sumiyoshi,

シーナリーにおける HR23 と PUB の複合体形成モデル

Hiroaki Sasakawa, Takeshi Hirao, Tadashi Suzuki, andを図 2 に示す。すなわち、HR23 は UBL と UBA が分

Koichi Kato

子内で互いに相互作用することで不活化状態にあるが、雑誌巻号：FEBS Lett. 586, 1141–1146 (2012)

ERAD システムにリクルートされると、UBL が PNGaseの PUB と優先的に相互作用し、その結果、UBA は Ub

私たちは NMR を用いてユビキチン (Ub)−プロテア鎖と結合可能な活性型となる。ERAD の基質である Ubソーム系で機能する分子の構造揺らぎを探査している。

化糖タンパク質は、HR23-UBA と PNGase の C 末領域

Ub はその疎水表面を用いて Ub 結合ドメイン (UBA)に存在するレクチンドメインによって協同的に認識さ等を含む様々なパートナー分子と相互作用しているが、れ、糖鎖の脱離が起こることが考えられる。このよう

Ub 2 量体ではこの疎水性表面を露出した開構造と閉に、HR23 の UBL は同一分子表面を介した分子内相互構造の動的平衡にあることを私たちは明らかにしてい作用と分子 間相互作用を切り替えるこ とにより、る [1]。ところで、Ub−プロテアソーム系で働くタンパ

PNGase と協同して糖タンパク質の細胞内分解を制御

ク質の中には Ub と相同性の高いドメイン (UBL) をしていることが明らかとなった。

持つものがいくつか存在する。本研究で着目している
プロテアソーム基質運搬因子 HR23 は UBL と UBA を併せ持っており、これらは分子内で相互作用していることが報告されている。また HR23 は立体構造不全の糖 タ ン パ ク 質 か ら 糖 鎖 を 切 り 離 す 酵素
peptide:N-glycanase (PNGase) と結合することが知られている。PNGase の N 末端には、PUB ドメインとよば

図 1. ３者複合体の立体構造モデルれるドメインが存在しており、このドメインは小胞体関連分解 (ERAD) マシーナリーを構成する p97 の C末端部と結合することが知られている。Ub−プロテア
ソーム系のタンパク質の中には PUB と相同なドメインが同定されているがそれらの機能は明らかではない。
私たちは PNGase の PUB が、p97 に加えて HR23 の UBLとも結合し得るという可能性を検証するとともに、そうした相互作用の構造基盤を明確にするために NMR解析を実施した。
PUB と HR23-UBL を用いた化学シフト摂動実験を

図 2. ERAD システムにおける HR23 と PNGase の相互行い、得られた結合部位の情報に基づいてドッキング作用モデルシミュレーションを実施することで複合体の 3 次元構造モデルを構築した。その結果、PUB は、HR23 の UBL

参考文献

上で UBA との相互作用に関わる疎水性表面パッチ周[1] T. Hirano et al., J. Biol. Chem. 286, 37496–37502 (2011).

2

「揺らぎと生体機能」ニュースレター
No. 4225 May, 2012
業績紹介：超並列マルチスケール自由エネルギー計算 MSFEL による Villin Headpiece
サブドメインのフォールディングメカニズム北尾彰朗（東京大学分生研・A01 公募研究代表者）
論文題目："The fast-folding mechanism of villin headpiece
subdomain studied by multi-scale distributed computing"
著者：Ryuhei Harada and Akio Kitao
雑誌巻号：J. Chem. Theory Comput. 8 (1), 290-299 (2012).
これまでにも報告してきたように、我々は大規模計算が必要な全原子シミュレーションにおいてプロセス間の通信や同期を排除し、完全に並列なシミュレーションを実行し、最終的に結果を統合して自由エネルギー
地 形 を 計 算 す る こ と が で き る MMMM （ Multiple
Markov transition Matrix Method, [1] ） や MSFEL（Multi-Scale Free Energy Landscape analysis, [2,3]）を開発してきた。後者の MSFEL ではまず粗視化モデルなどを用いて広い構造空間をサンプリングする。次にサンプリングされた多数の構造から全原子構造(溶媒含む)を構築し、精度の高いシミュレーションを完全に独立 に 実 行 す る 。 そ し て 最 後 に WHAM （ Weighted
Histogram Analysis Method）などを用いて自由エネル
ギ ー 地 形 を 計 算 す る 。 こ れ ま で に Met-enkephalin,Trpzip2, Chignolin において、MSFEL によって従来の分子動力学シミュレーションやレプリカ交換法よりも効率的に自由エネルギー計算が可能であることを示してきた。
今回紹介する研究で、我々は MSFEL を用いて 35 残Villin Headpiece サブドメインの代表的なフォー基からなる villin headpiece サブドメイン（HP35）の図

フォールディング自由エネルギー地形を計算し、ルディング経路（上）とフォールディング自由エネルフォールディングのメカニズムを研究した。
本研究でギー地形（下）は、これまで知られていたメジャーなフォールディング経路に加えて、マイナーなフォールディング経路も参考文献存在しうることを示した。
フォールディング経路の解[1] Shun Sakuraba and Akio Kitao, J. Comp. Chem., 30,

析と変異体の計算結果から、前者では PLWK モチー

1850-1858 (2009).

フと呼ばれる部位の構造形成がフォールディングの[2] Ryuhei Harada and Akio Kitao, Chem. Phys. Lett.,

トリガーと考えられるのに対し、後者では Phe6,503(1-3), 145-152 (2011).

Phe10, Phe17 などで形成される疎水性コアの形成が[3] Ryuhei Harada and Akio Kitao, J. Phys. Chem. B.,

フォールディングのドライビングフォースになって115(27), 8806-8812 (2011).

いることが明らかになった。

3

「揺らぎと生体機能」ニュースレター
No. 4225 May, 2012
業績紹介：蛋白質中の全チロシン残基の pKa を決定する
片岡幹雄（奈良先端大物質創成・A02 計画研究代表者）
論 文 題 目 ： "Comprehensive determination of protein
tyrosine pKa values for photoactive yellow protein using
indirect 13C NMR spectroscopy"
著者：N. A. Oktaviani, T. J. Pool, H. Kamikubo, J. Slager,
R. M. Sceek, M. Kataoka and F. A. Mulder
雑誌巻号：Biophys. J. 102, 579-586 (2012).
蛋白質内の解離性残基の pKa は、蛋白質機能の分子機構を理解する上で重要な情報である。NMR は、解離性残基のプロトン化状態を精度良く検出することができるが、チロシンの pKa の決定例は少ない。
我々は、
Cγ-Hβ２次元 NMR に基づき、Tyr の pKa を残基特異的に決定する方法を開発し、13C、15N 標識イェロープロテイン（PYP）に適用した。この方法は、変異体を用いる必要がなく、蛋白質中の Tyr を含む静電相互作用を正確に、包括的に記述することが可能である。
PYP には、５個の Tyr 残基が含まれている。このうち、Tyr42 は、発色団 p-クマル酸（pCA）と短距離水素結合を形成し、光反応に重要な役割を担っている。
PYP の５個の Tyr のうち、２つ（Tyr76、Tyr98）は、溶媒に露出している。脱プロトン化により、Cγのケミカルシフトは約 4ppm 低振動数側にシフトし、転移の中点、すなわち pKa はほぼ 10 であった。Tyr118 は、蛋白質内部にほぼ埋まっているが（図）、OH 基は、どの残基とも水素結合していない。この残基の Cγのケミカルシフトの pH 依存性から pKa は 11.6 と決定された。
Tyr42 と Tyr94 は、蛋白質内部で水素結合に関与している（図）。これらの Cγケミカルシフトは、pH11.24 まで、0.1ppm 未満の変化しか観測されない。この結果から、この２つの Tyr の pKa は 13 以上であると求められた。Tyr42 と pCA の間の短距離水素結合は、pH3 から pH11.2 の間で、安定に形成されており、PYP は、図。PYP における Tyr の位置(A)とそれぞれの Cγケミ熱力学的にも化学的にも安定であることを示している。

カルシフトの pH 依存性(B)。

これまで知られている光反応の pH 依存性は、Tyr42 の（上）ほぼ内部に埋まっている Tyr118。

プロトン化状態の変化によるものではないことが明ら（下）水素結合に関与している Tyr42 と Tyr94。関係すかであり、pCA のプロトン化状態は基底状態において、る水素結合の相手も示されている。

pH 依存的に変化しないと結論できる。

4

「揺らぎと生体機能」ニュースレター
No. 4225 May, 2012
業績紹介：抗凝集作用と自身の凝集という二面性を示すミニシャペロン
桑島邦博（岡崎統合バイオサイエンスセンター・A03計画研究代表者）
論文題目："Fibrillogenic propensity of the GroEL apicaldomain: A Janus-faced minichaperone"
著者：Jin Chen, Hisashi Yagi, Pietro Sormanni, Michele
Vendruscolo, Koki Makabe, Takashi Nakamura, Yuji Goto,
Kunihiro Kuwajima
雑誌巻号：FEBS Lett. 586, 1120-1127 (2012)
シャペロニン GroEL は蛋白質のフォールディングを促進したり、ミスフォールディングや凝集を防ぐ働きがある。GroEL 頂上ドメインはミニシャペロンと呼ばれ、それ自身が折れ畳まり、不完全ながらも分子シャペロンとしての機能を有している。GroEL の一次配列を PASTA や TANGO、Zyggregator で解析すると、凝集能が高いと予想される領域（残基番号 260-280）が頂上ドメインに存在した（図上）。そこで我々は GroEL及び GroEL 頂上ドメインのアミロイド線維形成をチオフラビン T を用いた蛍光分光法や透過型電子顕微鏡観察で調べた。その結果、GroEL 及び GroEL 頂上ドメインが生理的条件下でアミロイド状線維を形成し、頂上ドメインのアミロイド線維形成は酸性条件下で加速されることを見いだした。しかしながら酸性条件下の反応初期では、頂上ドメインはβ2 ミクログロブリンのアミロイド線維成長を阻害する働きがあることもわかった（図中及び図下）。このような頂上ドメインの振る舞いは、自身の凝集とシャペロニンとしての抗凝集作用という、相反する２つの性質の間に密接な関係があることを示している。さらに、1003 種類の GroEL の相同配列の凝集能を Zyggregator で解析したところ、他のシャペロニンファミリーにも GroEL と同様に基質結合部位に凝集能が高い配列が存在した。このことは図. PASTA による GroEL の解析結果(上)と生理的条シャペロニンが、一般的に、自身の凝集とシャペロニ件下（pH 7.0, 37°C で、0.1 M NaCl と 0.5 mM SDS を含ンとしての凝集を抑える作用という２面性を有していむ）での GroEL 頂上ドメインのアミロイド線維形成のる可能性を示している。

様子（中及び下）。
（中）： 攪拌しなかった場合。
（下）：
攪拌により線維形成を促進させた場合。

5

「揺らぎと生体機能」ニュースレター
No. 4225 May, 2012
業績紹介：酵素反応に相関する大きなタンパク質揺らぎを考慮することができる新規分子シミュレーション手法の開発
QM 法によって取り扱われる活性部位分子の最適自林 重彦（京都大学理学研究科・A03 公募研究代表者）

由エネルギー構造が決定される。我々は、平均場近似と統計的 reweighting の手法を組み合わせ、さらに論文題目："QM/MM reweighting free energy SCF for

QM-MM 間の長距離クーロン相互作用を Ewald 法を

geometry optimization on extensive free energy surface of

用いて適切に考慮することにより、非常に精度の高い

enzymatic reaction"

効率的な手法を開発した。特に、本手法のスキームで

著者：Takahiro Kosugi, Shigehiko Hayashi

は、QM/MM 法部分の計算と MM 構造サンプリング

雑誌巻号：J. Chem. Theory Comput. 8, 322-334 (2012)のための MD シミュレーション部分が完全に分離される。従って、MD シミュレーションに既存の洗練された MD プログラムを使用することが可能になり、酵素活性の分子機構を分子シミュレーションにより探るために、近年、広く用いられ成功を収めている手計算遂行上の大きな柔軟性を達成している。

法が、QM/MM 法である。この方法は、分子軌道法や

図 1 に自由エネルギー構造最適化により観測され密度汎関数法などの量子化学的（QM）手法と、生体たタンパク質構造変化を示す。反応始及び終状態とも分子の分子シミュレーションで通常用いられている分に、基質近傍のループが、構造最適化の初期構造から子力場に基づく分子力学的（MM）手法をハイブリッ大きく構造変化をしていることがわかる。この構造変ドするものであり、化学反応に関わる領域を QM 法

化は、サブマイクロ秒程度の MD シミュレーションで取り扱う際に、そのまわりのタンパク質環境の影響から得られており、直接的な QM/MM MD 法よりもを MM 法に基づき記述することにより、酵素反応活10,000 倍以上、また従来行われている QM 電子状態性に関わる触媒場を非常に効率良く考慮することを可計算の近似の粗い QM/MM MD 法によるシミュレー能にする。

ションよりも、100～1,000 倍もの長時間の現象の記述

しかしながら、QM/MM 法の有用性の一方で、そのに成功した。また、L2 ループが、反応の始状態と終限界も明らかになってきた。最も大きな困難は、生体状態において異なる構造を取っており、化学反応の進分子の熱揺らぎを考慮するための十分な統計サンプル行に近傍ループの大きな構造変化が相関していることが取れないことである。多くの場合、タンパク質酵素が示唆された。

活性や機能の発現には生体分子の大きな構造変化が伴う。このような構造変化は、通常 MM 法に基づく分子動力学（MD）シミュレーションにより解析されるが、その構造変化に共役する酵素化学反応の計算にはQM/MM 法に基づく記述が必要となる。しかしながら、
QM/MM 法では、局所的な活性部位のみの適用に制限
した QM 計算であっても MM 計算に比べて圧倒的に計算コストが高く、生体分子系の遅い緩和を適切に考慮できるだけの MD サンプリング時間を得ることができない。

図 1：QM/MM-RWFE-SCF 自由エネルギー構造最この問題を解決するために、我々は、新規な適化により得られたタンパク質構造。
（a）反応始QM/MM 自由エネルギー法（QM/MM-RWFE-SCF 法）

状態、（b）反応終状態。青及び赤はそれぞれ構造を開発した。QM/MM 自由エネルギー法では、MD シ

最適化前及び後の構造。緑は基質分子でサブサイミュレーションによりサンプルされた MM 部分の構

ト+1 及び -1 周辺が QM 領域。

造分布により定義される自由エネルギー曲面上で、6