「揺らぎと生体機能」ニュースレター
No. 4426 July, 2012
業績紹介：長時間一分子観測による変性タンパク質のエネルギー地形解析高橋 聡（東北大多元研・A01 公募研究代表者）
鎌形清人（東北大多元研・A01 公募研究連携研究者）いることで、一分子時系列信号から変性タンパク質の特性を再現する自由エネルギー空間を構成することが可能になった。
本研究では、試料タンパク質として緑膿菌由来のシ
トクロム c を用いた。C 末端付近に色素をラベルした

論文題目："Long-term observation of fluorescence of free

試料を用意し、蛍光強度の変動を一分子レベルで観察

single molecules

したところ、タンパク質の構造変化を現す蛍光強度のto explore

protein-folding energy

landscapes"

変動が多数観測された。得られた時系列データを、LES

著者：Kiyoto Kamagata, Toshifumi Kawaguchi, Yoshitomo

解析で定量的に解析した結果、複数の局所平衡状態とIwahashi, Akinori

Tamiki

その間の遷移を特定することができた。さらに、遷移Komatsuzaki, Yoshihiro Sambongi, Yuji Goto, and Satoshi

回数や各状態の滞在時間を調べることで、試料の自由

Takahashi

エネルギー地形を作製できた（図１）。

Baba, Kazuya

Fujimoto,

雑誌巻号：J. Am. Chem. Soc. 134, 11525-11532 (2012)

開発した一分子蛍光測定と自由エネルギー地形解析
方法は、多くの系への応用が可能である。開発した手変性したタンパク質は無数の構造の集合体であり、法により他のタンパク質のフォールディング特性や機たえずゆらぎ運動を行うと考えられる。そのため、あ能特性を解明する研究が期待される。一方で、図 1 にる一分子の変性タンパク質を継続して観察するならば、示された変性タンパク質の状態数は、我々が期待してこの分子がさまざまな構造を経巡る様子が追跡できる

いた数よりも驚くほど少ない。時系列データの時間分はずである。これは、タンパク質のフォールディング

解能や、タンパク質ラベル方法の工夫による構造情報

過程の解明に必須の情報となるに違いない。

量の向上など、研究手法のさらなる深化が必要である。

私達は、このような期待に基づいて、変性したタン
パク質を一分子レベルで観察する研究プロジェクトを継続している。我々は、第一に蛍光信号を観測する方法について、第二に得られた時系列データの解析方法について、新しい手法を開発することを志した。
第一のデータ観察方法の開発では、色素をラベルしたタンパク質が、自由拡散しながら蛍光を発する様子の継続観察を目指した。2007 年に報告した手法[1]に根本的な改良を加え、低倍率でありながら集光効率の大きい球面鏡を使った光学系を開発した。これにより、
比較的大きい観察体積の中を、セルの壁面との相互作
用の影響無しに運動する分子の観察がはじめて可能に

図 1：緑膿菌由来シトクロム c の変性状態におけるなった。さらに、一分子を長時間観察できるように、エネルギー地形（紹介論文の Fig. 4 を改変した）

圧力制御方式のポンプを使ってセル中の試料溶液の流れを止める技術を確立した。そのほか、試料の調整方
法、試料セルの作成技術、時系列データの抽出方法な

参考文献

どについて、さまざまな課題を克服する必要があった。

[1] M. Kinoshita et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104,
10453-10458 (2007).

第二の時系列データ解析方法の開発では、局所平衡
状態解析（LES 解析）と名付けられた新しい解析技術[2] A. Baba and T. Komatsuzaki , Proc. Natl. Acad. Sci.

を共著者である小松崎らが開発した[2]。この手法を用USA 104, 19297-19302 (2007).

1

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No. 4426 July, 2012
業績紹介：酸化 LDL 受容体の２量体を安定化するインターロック構造
楯 真一（広島大学理学研究科・A02 公募研究代表者）

近接残基への構造変化の影響はきわめて少なかった。
このことは，NMR スペクトル上のわずかな変化としても確認された。W150A 変位によりどのようなホモ 2

論文題目："Structural implication for the impaired binding

量体形成能の変化が生じるかをドッキングシミュレー

of W150A mutant LOX-1 to low density lipoprotein,

ションを併用して検討した。

OxLDL"

野生型では W150 の W 側鎖がもう 1 つのサブユニッ

著者：Shogo Nakano, Mamoru Sugihara, Risato Yamada,

トの疎水性残基からなるキャビティーに対して立体相

Katsuo Katayanagi, Shin-ichi Tate

補的に挿入して強固なインターロック構造を形成して

雑誌巻号：Biochim. Biophys. Acta 1824, 739-749 (2012)いる。これに対して，W150A 変異体では相互作用エネ
ルギーの似通った多様な相互作用が可能となり，安定酸化 LDL(OxLDL)は動脈硬化発症を誘導する主たるに野生型と同様な 2 量体構造を形成し得ないことが示原因物質である。
OxLDL は血管内皮細胞上の酸化 LDL

唆された。

受容体(scavenger receptor)に結合することで，内皮細胞

上記のシミュレーションとすでに得ている相互作用に機能不全を誘導し，動脈硬化病巣（プラーク）形成

データ・2 量対形成能のデータ[2]から，LOX-1 は分子に至る反応カスケードを促進する。つまり，OxLDL のW150 による強固なインターロック構造により安定な

酸化 LDL 受容体への結合は動脈硬化発症のスイッチ

ホモ 2 量体を形成することが OxLDL 認識に必要であとなる過程であり，その分子認識機構に興味が持たれるということが分かった。

ている。
私達は，酸化 LDL 受容体の 1 つである LOX-1 の立体構造を報告した。これは，酸化 LDL 受容体の初めての構造の例であり，現時点では唯一の構造例となっている[1]。立体構造と同時に，その認識機構の詳細も解析してきており，LOX-1 が細胞膜状でクラスターを形成することが重要であることも明らかにしてきている。
LOX-1 は，ホモ 2 量体を基本単位として細胞膜状で複数の（最低 3 つのホモ 2 量体からなる）受容体からなるクラスターを形成することで初めて特異的な
OxLDL 認識が可能である [2]。
これまでの一連の研究で，基質認識部位とは分子構

図：LOX-1 の 2 量体構造を安定化する W150 を介した造上反対側に位置する W150 が A に置換された変異体

インターロック構造。(A) 野生型 (B) W150A 変異体でが劇的な活性の低下を示すことを見いだしていた。今可能となるホモ 2 量体構造の１つ。

回の研究では，W150A 変異によりどのような受容体構
参考文献

造変化が生じているかを結晶構造解析により明らかにした。

[1] I. Ohki, T. Ishigaki, T. Oyama, S. Matsunaga, Q. Xie,
M. Ohnishi-Kameyama, T. Murata, D. Tsuchiya, S.
Machida, K. Morikawa, S. Tate, Structure (Camb.) 13(2005) 905–917.
[2] I. Ohki, H. Amida, R. Yamada, M. Sugihara, T. Ishigaki,
S. Tate, Biochim. Biophys. Acta 1814 (2011) 345–354.

解析の結果，W150 がホモ 2 量体構造を安定化するために非常に緊密な分子間相互作用を実現していること，また，その特異な相互作用により，LOX-1 の基質
結合部のホモ 2 量体構造が OxLDL に最適になるように保たれていることが明らかになった。
W150 は疎水性部の中心に位置するが，変異による2

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No. 4426 July, 2012
業績紹介：焼酎蒸留粕の肝臓がんモデルマウスに対する治療効果
上岡龍一(崇城大学応用生命科学・A03 計画研究代表者）

肝臓がんの増殖によるさまざまな異常所見が見られた
が、barley- PSDR 治療群では、がん細胞を移植していないノーマルマウスの肝臓とほぼ変わらず、顕著な治療効果が確認された（図 1）。

論文題目："Anticancer effects of residual powder from

② HCC モデルマウスに対して barley-PSDR を経口

barley-Shochu distillation remnants against the orthotopic

投与し、肝臓組織切片を作成し TUNEL 法により検討

xenograft mouse models of hepatocellular carcinoma in

したところ、barley-PSDR 治療群では、多くのアポト

vivo"ーシス細胞が確認された。

著者：Masahiro Ohgidani, Hideaki Ichihara, Koichi Goto,③ HCC モデルマウスに対して barley-PSDR を経口

Yoko Matsumoto, Ryuichi Ueoka

投与し、延命効果を検討したところ、barley-PSDR 治

雑誌巻号：Biol. Pharm. Bull. 35, 984–987 (2012).

療群では、170% (p < 0.01)の顕著な延命効果が確認された。また、投与期間中に体重減少などの副作用は全

本格焼酎は、麹に水と酵母を加えて発酵させたもろ

くなく、barley-PSDR の安全性が確認された。

みに主原料 (蒸した米、麦、芋など) を仕込み、発酵

以上のように、HCC に関して、天然物質である成熟させたもろみを単式蒸留機で蒸留して作られる。

barley-PSDR による副作用のない顕著な治療効果が動

焼酎もろみを蒸留した後に残る焼酎蒸留粕 (焼酎粕)物レベルでの組織学的分析により確認されたことは、は、年間十数万トン排出されており、主な処理方法と非常に興味深い。

して、海洋投棄、堆肥化、飼料化、焼却といった処理がなされてきた。2007 年以降、焼酎粕の海洋投棄が原則禁止された。
そのため、海洋投棄に代わる処理方法、
または有効利用法の開発が求められている。
焼酎粕に含まれる成分は、原料である米、麦、芋や
酵母菌体、麹菌体などに由来したタンパク質、脂質、糖分、有機酸、繊維質、ミネラル、ビタミン類など有効成分を多く含んでおり、バイオマス有効利用の観点

未治療群から、焼酎粕の医薬分野での基礎研究がおこなわれている。本研究室では、焼酎粕の種々の培養がん細胞に対するがん抑制効果[1]、正常ラットに対する免疫賦活

barley-PSDR
治療群

健常
マウス

図 1. 肝臓がん(HCC)モデルマウスに対する麦焼
酎粕パウダー（barley-PSDR）の治療効果

効果[2]を明らかにした。さらに、特有の発酵臭を減らし、吸湿性を抑えるため、独自に開発した各焼酎粕パ

未治療群では肝臓がんの増殖が見られたが、barley-PSDR 治療群では、がん細胞を移植していな
いノーマルマウスの肝臓とほぼ変わらなかった。

ウダー(PSDR: powders from Shochu distillation remnants)のがん細胞の増殖抑制効果[3]および美白効果[4]などを報告している。
本研究では、肝臓がん(HCC: hepatocellular carcinoma)
原発モデルマウスに対する麦焼酎粕パウダー

参考文献[1] Y. Kadota et al., J. Chem. Eng. Japan, 38, 154-157(2005).
[2] K. Funamoto et al., J. Health. Sci., 54, 287-293 (2008).
[3] M. Ohgidani et al., J. Biosci. Bioeng., 114, 104-109(2012).
[4] M. Ohgidani et al., Food Chem., 132, 2140-2143(2012).

（barley-PSDR）の治療効果を検討した。以下に得られた興味深い知見を示す。
① 免疫不全 (SCID: Severe Combined Immuno
Deficiency) マウスの肝臓に、ヒト HCC(HepG2)細胞を同所移植して、HCC モデルマウスを作成し、barley-PSDR の 21 日間の経口反復投与後に肝臓を取り出し、肝臓重量、ヘマトキシリン－エオシン染色により治療効果を検討した。未治療群の肝臓においては、

3

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No. ４426 July, 2012
業績紹介：焼酎蒸留粕パウダーのヒト肝臓がん細胞に対する増殖抑制機構

上岡龍一（崇城大応用生命科学・A03 計画研究代表者）

ダーを処理した肝臓がん細胞におけるミトコンドリアの膜電位の低下、シトクローム C の放出、およびアポトーシス誘導因子(AIF)の核への移行（図）が観察され

論文題目："Residual powders from Shochu distillation

た。これらの結果から、麦焼酎粕パウダーは、ヒト肝remnants induce apoptosis in human hepatoma cells via the

臓がん細胞に対して、カスペース非依存のミトコンド

caspase-indipendent patway"

リア経路でアポトーシスを誘導することが強く示唆さ

著者：Masahiro Ohgidani, Yuji Komizu, Koichi Goto,れた。これらの結果より、麦焼酎粕パウダーのヒト肝

Ryuichi Ueoka

臓がん細胞に対する増殖抑制効果およびアポトーシス

雑誌巻号：J. Biosci. Bioeng., 114, 104–109 (2012)

誘導機構が細胞レベルで明らかとなった。最近、麦焼
酎粕パウダーの肝臓がん細胞移植モデルへの治療効果

焼酎もろみを蒸留した後に残る焼酎蒸留粕 (焼酎を報告している[4]。以上のことより、焼酎粕の医薬分粕) は、年間十数万トン排出されており、主な処理方

野への応用へ向けた基礎的な知見が得られた。

法として、海洋投棄、堆肥化、飼料化、焼却といった処理がなされてきた。2007 年以降、焼酎粕の海洋投棄AIFが原則禁止された。そのため、海洋投棄に代わる処理方法、または有効利用法の開発が求められている。

(核)

TO-PRO-3
TO-PRO3

Overlay

Control

焼酎粕に含まれる成分は、原料である米、麦、芋や
HepG2

酵母菌体、麹菌体などに由来したタンパク質、脂質、糖分、有機酸、繊維質、ミネラル、ビタミン類など有Barley-PSDR

効成分を多く含んでおり、バイオマス有効利用の観点から、焼酎粕の医薬分野での基礎研究がおこなわれている。本研究室では、特有の発酵臭を減らし、吸湿性
Controlを抑えるため、独自に開発した焼酎粕パウダーのがん抑制効果[1]、免疫賦活効果[2]、および美白効果[3]など

HuH-7を報告している。
本論文では、各 (麦、芋、米) 焼酎粕パウダーのヒBarley-PSDR

ト肝臓がん細胞に対する増殖抑制機構について検討し、以下に示す新しい知見が得られた。
(Ⅰ) in vitro での増殖抑制試験から、麦焼酎粕パウダー

図 麦焼酎粕パウダー処理したヒト肝臓がん細胞内でのアポトーシス誘導因子(AIF)*の核への移行がヒト肝臓がん細胞株（HepG2、HuH-7）に対して、Control(未処理)、麦焼酎粕パウダー (Barley-PSDR)、重ね合わせ

最も顕著な細胞増殖抑制効果を示した。

（Overlay）*AIF(アポトーシス誘導因子)は、ミトコンドリア膜より放出され、(Ⅱ) 細胞死の解析より、各焼酎粕パウダーは、ヒト

カスペース非依存的に核へ移行し、アポトーシスを誘導することが肝臓がん細胞に対して、アポトーシスを誘導すること分かっている。

を明らかにした。
さらに、麦焼酎粕パウダーのアポトー
参考文献

シス誘導率は、最も顕著な効果を示した。

[1] Y. Kadota et al., J. Chem. Eng. Japan, 38, 154-157 (2005).

(Ⅲ) アポトーシス誘導メカニズムを検討するため、[2] K. Funamoto et al., J. Health. Sci., 54, 287-293 (2008).

カスペースの関与について調べた。その結果、麦焼酎[3] M. Ohgidani et al., Food Chem., 132, 2140–2143 (2012).

粕パウダーは、肝臓がん細胞に対して、カスペース非[4] M. Ohgidani et al., Biol Pharm. Bull.., 35, 984–987 (2012).

依存的にアポトーシスを誘導することが分かった。さらに、ミトコンドリアの関与について、麦焼酎粕パウ4

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No. 4426 July, 2012
業績紹介：Berberine の悪性リンパ腫に対する抗腫瘍効果
岡田誠治（熊本大学エイズ学研究センター・
A03 公募研究代表者）
論文題目："Antitumor effect of berberine against primaryeffusion lymphoma via inhibition of NF-κB pathway"
著者：Hiroki Goto, Ryusho Kariya, Masako Shimamoto,
Eriko Kudo, Manabu Taura, Harutaka Katano and Seiji
Okada
雑誌巻号：Cancer Sci. 103, 775-781 (2012)
原発性滲出液リンパ腫(Primary Effusion Lymphoma:
PEL)は、リンパ節や節外臓器に明らかな腫瘤を形成せず、体腔内(胸腔・腹腔・心膜腔)に腫瘍細胞が浮遊した状態で発症する非ホジキン悪性リンパ腫である。
HIV-1 感染者や臓器移植後の免疫不全患者に特異的に認め、HHV-8 によるウイルス発がんが原因とされる。
従来の化学療法に抵抗性で、生存期間中央値は 6 ヶ月

図１．PEL マウスモデルでの Berberine の抗腫瘍効果。

未満と予後は極めて不良であり、新たな治療法の開発(a), (b), (c). Berberine 投与により腹水量が減少している。(d). Berberine 投与群で生存率の改善を認めた。

が望まれている。
Berberine は、キハダやオウレンなどの植物に含まれるベンジルイソキノリンアルカロイドの一種で、古来

さらに、Berberine の PEL モデルマウスにおける抗腫より Chinese herb として使用され、抗菌・抗炎症・中瘍効果の検討を行った。当研究室で樹立した高度免疫枢抑制・血圧降下などの薬理作用があるとされる。近不全マウス(NOD/Rag-2/Jak3 二重欠損マウス)の腹腔

年、Berberine の様々な腫瘍に対する抗腫瘍効果の報告

内に PEL 細胞株 BCBL-1 を移植し、無治療群、Berberine

があり、Berberine の PEL に対する治療効果について検

投与群にわけて 28 日間観察したところ、無治療群では、討した。

マウスへの腫瘍細胞の生着と腹水の貯留を認めた。

Berberine は 3 種類の PEL 細胞株(BCBL-1、BC-1、Berbeirne 投与群では、腹水量の減少、遠隔臓器への浸BC-3) に対して MTT アッセイで濃度依存的な細胞増潤抑制及び生存率の改善を認めた。

殖抑制効果を認めた。フローサイトメトリーを用いた

以上の結果から、Berberine は PEL 細胞に対して、in解析からカスパーゼを介したアポトーシスの誘導が明vitro、in vivo における抗腫瘍効果を認め、その作用機らかとなり、DNA ラダー法でアポトーシスに伴う腫瘍序として NF-κB 経路の抑制を介していることが判明

細胞の断片化を認めた。ウエスタンブロッテイングでした。

NF-κB 経路上流の IKK(IκBkinase)リン酸化の阻害及びBerberine のその他の薬理作用として、HIV-1 に対す

それに引き続く IκB の蓄積・IκB のリン酸化の阻害、る抗ウィルス効果及び小胞体ストレス抑制を介した核内での p65 の減少を確認した。EMSA(Electrophoretic

HIV プロテアーゼ阻害薬の毒性緩和効果の報告があり、

Mobility Shift Assay)で NF-κB と DNA の結合抑制を認PEL だけでなく HIV に対する抗ウイルス療法にも寄与めた。PEL では腫瘍細胞の生存に NF-κB 経路の恒常的する可能性があるな活性化が関わっているとされ、Berberine は IKK を含

今回の研究から、PEL に対して IKK を含めた NF-kB

めた NF-κB 経路の抑制を介して PEL に対する抗腫瘍経路を標的とした治療は有効であり、Berberine は有望効果を認めることが明らかとなった。

な治療薬剤の一つと考えられる

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No. 4426 July, 2012
業績紹介：ハイブリッドリポソームは細胞の脂質組成とカベオラ構造を変化させる
鈴木 元（名大院医・A03 公募研究代表者）

されなかった非典型的なカベオラと推定される構造体の出現が観察された（図 C 参照）。

論 文 題 目 ： "Hybrid liposomes affect cellular lipid
constituents and caveolae structures"

以上の結果はハイブリッドリポソームが細胞膜の組

著者：Cao K, Tanaka K, Komizu Y, Tamiya-Koizumi K,

成を変化させ、その結果細胞膜上のシグナル伝達機能

Murate T, Ueoka R, Kyogashima M, Usukura J, Takahashi

体カベオラ構造も変化させていることを示している。

T, Suzuki M.

細胞死のシグナルはこうした非典型的カベオラより発雑誌巻号：Bioorg. Med. Chem. Lett. 22, 1731-1733 (2012)

生している可能性がある。今後さらにアポトーシスの
詳細なメカニズムを解明することにより、より抗がん

ハイブリッドリポソームはリン脂質とポリエチレ効果の高いリポソームの開発やハイブリッドリポソー

ングリコールよりなり、様々ながん細胞に対してアポムの臨床応用への道が開けるのではないか。

トーシス作用を有する。我々は、このアポトーシス発
現メカニズムを解明するため、ハイブリッドリポソー
ム投与の細胞脂質組成に与える影響を調べた。まず、
種々カスパーゼ群の切断活性を調べたところ、アポト
ーシスは投与後 2 時間程度から活性化されると推測された。一方で、MALDI-TOF MS 解析により、投与したハイブリッドリポソームの主要構成成分 DMPC が速やかに細胞に取り込まれることを明らかとした。さらに、ハイブリッドリポソーム投与後 1 時間の時点ですでに細胞内のスフィンゴミエリンとエーテル型リン脂質の総量の減少およびセラミドの増加を観察した（図 A,B 参照）。これら脂質は全て death signal を含む様々な情報を細胞内へと伝達する機能を有する構造体「カベオラ」の構成成分である。さらに、脂質組成
変化が、アポトーシスシグナル発生時間より早期に観察されるため、我々はハイブリッドリポソーム投与が細胞内脂質組成の変化を誘導し、カベオラ構造に何らかの変化を与ることを通じて細胞死を誘発したと推測した。
この仮説を検証するため、我々は、電子顕微鏡観察
によりカベオラの構造変化を調べた。観察に際しては

図：A および B、SHSY5Y および LS174T 細胞にお細胞固定によるアーティファクトを排除するため、従けるハイブリッドリポソーム投与後の細胞内スフィン

来の切片作成する方法ではなく、細胞を液体ヘリウム

ゴミエリン（SM）、エーテル型 PC(Ether-PC)、セラ

で急速凍結し、形質膜裏打ち構造を観察する新世代電ミド（Cer）量の変化。横軸は時間。C、ハイブリッド子顕微鏡技術を用いた。すると我々の予測通り、ハイ

リポソーム投与前（左）、投与後（右）の細胞膜カベオ

ブリッドリポソーム投与により、典型的なカベオラ構

ラ構造の変化。投与後においてはカベオラの数が減少

造の消失が明らかとなった。さらに、投与前には観察し、その形も非典型的なものとなっていた。

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No. 4426 July, 2012
業績紹介：酵素反応の触媒活性におけるタンパク質の柔軟さの役割
林 重彦（京都大学理学研究科・A03 公募研究代表者）の顕著なシフトが見える。この動きは線形応答揺らぎ
より大きく、タンパク質の特徴的な遅い（>10 ns）非線形構造緩和による。図 1b に示されるように、反応

論文題目："Crucial role of protein flexibility in formation

遷移状態生成（Glu220 と glucose 間のプロトン移動）

of a stable reaction transition state in an α-amylaseの際の基質部分の小さな構造変化が伝播・増幅し、ルー

catalysis"

プ部分の大きな構造変化と相関している。

著者：Takahiro Kosugi and Shigehiko Hayashi

図 1c にこの反応の活性化自由エネルギーを示す。

雑誌巻号：J. Am. Chem. Soc. 134, 7045-7055 (2012)

ここで、図 1a に見られた L2 ループの再配向を考慮できる長い MD シミュレーションと、その構造緩和がタンパク質の構造の柔軟さは、その顕著な分子機能含まれない短い MD シミュレーションの結果を比較を可能にする重要な特徴の一つである。
しかしながら、したところ、L2 ループの再配向により活性化自由エ酵素の化学反応ステップの触媒活性へのタンパク質ダ

ネルギーが大きく減少することを見出した。詳細な解

イナミクスの影響は、依然、論争が続いている。一般

析により、L2 ループの遅い大きな再配向が、反応遷的な触媒活性のモデルは、酵素に限らず、基質の化学

移状態生成に伴う基質周辺の速い線形応答的な再配向

反応遷移状態を安定化するように配置された構造を持を安定化し、活性化自由エネルギーの減少を与えていつ触媒への結合によるものである（事前配向）。一方、ることを見出した。
このように、
新規な分子シミュレータンパク質の基質結合部位の構造は不変のまま、遅いションの手法により、タンパク質の柔軟さがもたらす構造揺らぎダイナミクスの振る舞いを変える変異体に酵素活性への重要な寄与の分子機構が明らかになった。

より、化学反応ステップの時定数が変化する例が観測されており[1]、タンパク質ダイナミクスの触媒活性への関与が示唆されている。しかしながら、化学反応遷移状態の寿命（< ピコ秒）とタンパク質に特徴的なダイナミクス（ナノ～ミリ秒）の時定数は大きく異なり、それらの相関の分子機構は明らかではない。
本研究では、そのようなタンパク質の特徴的なダイ
ナミクスとして捉えられる構造緩和により、化学反応のエナジェティクスが変化し（再配向）、大きな触媒活性が得られることを、分子シミュレーションを用いて明らかにした。このとき問題となるのは、反応基質の電子状態が陽に変化する化学反応遷移状態の同定を、
タンパク質の遅い構造緩和を考慮して行う必要がある

図 1:（a）化学反応ステップに相関する近傍ループの構ことであり、従来の分子シミュレーションの技術では造変化（赤）。参照に X 線結晶構造も示す（青）。
（b）

困難であった。一方、最近、我々が開発した QM/MM

反応活性部位（Glu200 と glucose）と L2 ループの構

RWFE-SCF 法は、この困難を解決し、タンパク質の大造変化の相関。反応遷移状態（青）と始状態（オレン

きな構造変化を含む自由エネルギー曲面上で、酵素反ジ）。
（c）反応自由エネルギープロファイル。

応の遷移状態を決定することを可能にしている[2]。
本研究で対象とする酵素反応は、好冷性 α アミラー

参考文献

ゼのグリコシル結合加水分解である。図 1a に、基質

[1] G. Bhabha et al., Science 332, 234-238 (2011).

の化学反応ステップに相関する近傍ループの構造変化[2] T. Kosugi and S. Hayashi, J. Chem. Theory. Comput. 8,を示す。反応遷移状態（TS）生成により、L2 ループ

322-334 (2012).

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「揺らぎと生体機能」ニュースレター
No. 4426 July, 2012
業績紹介：分子シミュレーションと一分子観測実験による
F1-ATPase の ATP 加水分解反応の分子機構の解明
F1-ATPase の高い触媒活性を与えている。

林 重彦（京都大学理学研究科・A03 公募研究代表者）
飯野亮太（東京大学工学研究科・A03 公募研究代表者）

計算によって予測された反応機構は、一分子観測実験により検証された（図 2）。反応時定数は D2O 溶媒中で顕著に遅くなり、PT 反応が律速段階であることを示している。また、ATPγS アナログ分子の時定数の論文題目："Molecular mechanism of ATP hydrolysis in

変化は、POD→PT の順序を示している。更に、αR373K

F1-ATPase revealed by molecular simulations and single

変異体における同位体効果（KIE）の消失は、POD と

molecule observations"

PT 過程が強く相関していることを表しており、それ

著者：Shigehiko Hayashi, Hiroshi Ueno, Abdul Rajjak

らの過程の連鎖的活性化機構を支持する。

Shaikh, Myco Umemura, Motoshi Kamiya, Yuko Ito,
Mitsunori Ikeguchi, Yoshihito Komoriya, Ryota Iino, andHiroyuki Noji
雑誌巻号：J. Am. Chem. Soc. 134, 8447-8454 (2012)
ヌクレオチド三リン酸の加水分解は、多くの生体分子の機能において鍵となる化学反応である。しかしながら、その重要性にも関わらず、化学反応機構及び触媒活性の分子機構は明らかではない。本研究では、分子シミュレーションと一分子観測実験の共同研究により、分子モータータンパク質である F1-ATPase のアデ
ノシン三リン酸（ATP）加水分解反応の反応機構を解明した。F1-ATPase は、一分子観測実験により、酵素
化学反応ステップなどの素過程が直接観測可能であり、計算と実験の対応を非常に明確に行うことができる。
図 1 に、MD シミュレーション及び QM/MM 計算
により得られた、ATP 加水分解反応のポテンシャルエ
ネルギープロファイルと反応機構を示す。三リン酸の加水分解のためには、求核攻撃をする水分子（Wat1）

図 1: ATP 加水分解反応の分子機構。
（a）ポテンからプロトン移動（PT）によりプロトンを一つ取り除

シャルエネルギープロファイル。
（b）反応機構。

かなければならない。本研究で明らかになった反応経路では、従来の単純な SN2 型反応モデルとは異なり、PT 反応が反応の律速段階となり、また、それに先立ってリン酸の Pγ-Oβ 結合の解離（POD）及びメタγリン酸の生成が起こる。メタリン酸の生成は、アルギニン
フィンガー（αR373）及び P-loop のアミノ酸との相互作用により活性化され、生成した反応性の高いメタリン酸は、求核攻撃水との結合形成の安定化を用いて、

図 2: 反応時定数の変化（native/ATP/H2O との比）。

最も困難な過程である求核攻撃水分子からのプロトンの放出を促進する。このような連鎖的な活性化が、8

「揺らぎと生体機能」ニュースレター
No. 4426 July, 2012
シンポジウム報告
大阪大学蛋白質研究所セミナー 蛋白質と過飽和～ Impacts of Supersaturation on Protein Science ～濵田大三（神戸大医・A03 公募研究代表者）
櫻井一正（阪大蛋白研・A01 公募研究代表者）

セミナー全体を通して「蛋白質・水の結晶化」「蛋白質のアミロイド凝集形成と可溶性」「アクチン線維形成
機構と生命現象」
が話題の中心であり、様々なアプローチがとられていることが印象的でした。特に、「レー
ザー共焦点微分干渉顕微鏡を用いた氷結晶の表面液体

2012 年 6 月 18 日から 19 日にかけて、後藤祐児（阪相形成に関する直接観察（佐崎）」、「蛋白質可溶性予測大蛋白研）、桑田一夫（岐阜大医）と濵田大三（神戸大（原野、Ham）」「温度接動を伴うアミド重水素交換法医）の三名をオーガナイザーとする標記のセミナーが、による、蛋白質の揺らぎの研究（Esposito）」「異なる生

大阪大学蛋白質研究所において開催されました。当日

物種のアクチン線維形成のメカニズムと機能の比較

は台風 4 号が接近しており開催自体も危ぶまれました（Robinson）」など、非常にユニークな講演が行われ活が、７０名近い来聴者があり、関連する学会直前（続発な議論がなされました。

く 6 月 20 日～22 日に名古屋で日本蛋白質科学会年会

生命科学において「過飽和現象」が関与しているとが開かれた）に開かれる英語でのセミナーとしては、いう概念は未だに定着しておらず、未開の領域ですが、中々な盛況でありました。

その理解には「分子内及び分子間の揺らぎ」を意識し

本セミナーは、蛋白質のアミロイド凝集反応や水のなければならない点で、本新学術領域研究とも深く関

結晶化といった、生命科学・生命現象に関連する様々

連しています。今後も同様な活動を進め、生命現象のな「過飽和現象」
について議論することを目的として、本質に迫る研究を推進することが重要であると感じま

国内外の関連する研究を進めている 13 名の研究者にした。

よる講演が行われました。
講演の内容は 5 部に分かれており、それぞれの演者
は以下の通りです。
Session 1: Crystalization and solubility
佐崎元（北大）、杉山成（阪大）、李映昊（阪大）
Session 2: Theories and models
原野雄一（阪大）、Sihyun Ham（Sookmyung Women's
University, Korea）、石川岳志（東北大）

講演の一風景（左：講演中の原野先生、右：質問中のSession 3: Amyloids

後藤先生）

Riccardo Porcari (Univ. Pavia, Italy)、山口圭一（岐阜大）Session 4: Folding and Unfolding
濵田大三（神戸大）、Rino Esposito (Univ. Udine, Italy)、
Rita Chen, (Academica Sinica, Taiwan)
Session 5: Structure and Function
Kardos József (Eötvös Loránd University, Hungary)、
Robert Robinson (Institute of Molecular and Cell Biology,

懇親会の様子（歓談中の Ham 先生と後藤先生（左）とSingapore)

一仕事終え、リラックスした様子の桑田先生（右））9