LC-MS法による肥料中のスルファミン酸の測定 －共同試験成績－769

液体クロマトグラフ質量分析計（LC-MS）法による肥料中のスルファミン酸の測定－共同試験成績－
野崎友春１

キーワード

スルファミン酸，高速液体クロマトグラフ質量分析法，共同試験

1． はじめに
肥料中の有害成分であるスルファミン酸（別名，アミド硫酸（Fig.1））の定量については，肥料分析法において亜硝酸ナトリウム法が定められている１），２）が，外部指示薬による滴定操作において終点の判定に高度な修練が必要である．また，肥料の種類によっては，共存物質の影響により終点の判定が困難となり精確な測定が行えないという問題がある．このことから，平成 26 年に肥料中のスルファミン酸の分析法として，高速液体クロマトグラフ質量分析（LC-MS）法が伊藤らによって検討され，真度，併行精度，定量下限等の検討を行った結果，単一試
験室内における試験方法の妥当性が確認された３）．
今回，LC-MS 法による肥料中のスルファミン酸の測定の性能評価のため，共通試料を用いて，試験室間の再現精度を調査したので，その概要を報告する．

スルファミン酸[HOSO2NH2]
Fig.1 Chemical structural formula of sulfamic acid
2． 材料及び方法
1） 共同試験用添加溶液
JIS K 8005 に規定する容量分析用標準物質アミド硫酸を用いてスルファミン酸の添加溶液を調製した．
2） 共同試験用試料
共同試験用試料を作成し，均質性の確認を実施したところ，試料中のスルファミン酸の均一な混合が難しいことが確認された．そのため，共同試験参加試験室においてスルファミン酸溶液を添加して共同試験を実施することとした．
1 独立行政法人農林水産消費安全技術センター肥飼料安全検査部

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肥料研究報告 Vol. 9 （2016）

ブランク試料はスルファミン酸を含まないことを確認した流通している化成肥料，副産複合肥料，副産窒素肥料，硫酸アンモニア及び液状の家庭園芸用複合肥料とした．家庭園芸用複合肥料以外は目開き 500 µm のふるいを通過するまで粉砕した．共同試験用試料は約 1.5 g の化成肥料をポリエチレン袋に，約 1.5 g の家庭園芸用複合肥料を 2 mL バイアルに入れ密封してそれぞれ 20 個を調製した．ブラインド試料を提供するため，共同試験用試料及スルファミン酸を一定量混合した添加溶液に乱数を付し，参加試験室に配付した．
3） 装置及び器具各試験室に設置している高速液体クロマトグラフ質量分析計及び高速遠心分離機を使用した．
4） スルファミン酸の測定（1） 固形肥料（化成肥料，副産複合肥料，副産窒素肥料及び硫酸アンモニア）の抽出
分析試料 1.00 g をはかりとり，共栓三角フラスコ 200 mL に入れ，添加溶液を加え 16 時間室温で放置し，水100 mL を加え，マグネチックスターラーを用いて約 10 分間かき混ぜ，共栓遠心沈殿管 50 mL にとり，2000×gで約 5 分間遠心分離し，上澄み液を抽出液とした．
（2） 液状肥料（家庭園芸用複合肥料）の抽出
分析試料 1.00 g をはかりとり，全量フラスコ 100 mL に入れ，水約 50 mL を加え，全量フラスコの蓋をして，振り混ぜて溶かし，標線まで水を加えて抽出液とした．
（3） 測定各抽出液 5 mL を全量フラスコ 100 mL に入れ，水約 50 mL を加え，振り混ぜた後，標線まで水を加えて希釈抽出液とした．副産窒素肥料及び硫酸アンモニアは各希釈抽出液 10 mL を全量フラスコに入れ，水約 20 mL を加え，振り混ぜた後，標線まで水を加えて 1/5 希釈抽出液とした．各希釈抽出液及び 1/5 希釈抽出液を 1.5 mLの共栓遠心沈殿管にとり，8000×g で約 5 分間遠心分離した上澄み液を LC-MS 測定用試料溶液とした（Scheme
1 及び Scheme 2）． その試料溶液を高速液体クロマトグラフ質量分析計に供し，Table 1 の測定条件で測定し，ピーク面積から試料溶液中のスルファミン酸の量を求め，分析試料中の濃度を算出した．測定に当たっては，各試験室の高速液体クロマトグラフ質量分析計の操作方法に従った．

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LC-MS法による肥料中のスルファミン酸の測定 －共同試験成績－

1 g analytical sample

Weigh to the order of 10 mg to a 200-mL Erlenmeyer flask← Add 100 mL water
Extraction
Centrifugation
Dilutionstir 10 minutes
1800×g , 5 minutes
Diluting extract 20 times with water

Centrifugation

8000×g , 5 minutes

Measurement

LC-MS

Scheme 1

Flow sheet for sulfamic acid in solid fertilizers

1 g analytical sample

Weigh to the order of 10 mg to a 100-mL volumetric flask← About 50 mL water
Shaking to mix← Water (up to the marked line)
Dilution

Diluting extract 20 times with waterCentrifugation

8000×g , 5 minutes

Measurement

LC-MS

Scheme 2

Flow sheet for sulfamic acid in liquid fertilizers

Table 1 Analytical conditions for LC-MS
HPLC conditions
Column

Silica surface is covered with vross-linked diolgroups or polyhydroxymethacrylate

Guard column

Same type as analytical column

Temperature

40 °C±1 °C

Mobile phase

Ammonium formate buffer - Acetonitrile (1+9)

Flow rate

0.2 mL/min

Injection volume

1 µL

MS conditons
Ionization

Electrospray ionization (ESI)

Ion monitoringm /z 95.9

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肥料研究報告 Vol. 9 （2016）5） 共同試験用試料の均質性試験
今回の試験では，試料はスルファミン酸の混入がないこと及びスルファミン酸を液体で添加することから，均質性試験を行わなかった．
6） 共同試験
試験に参加した 7 試験室と使用した高速液体クロマトグラフ質量分析計及び使用カラムは以下のとおりであり，それぞれの試験室において送付した 12 試料について 4）に従って分析した．
・ 株式会社島津製作所（島津製作所 LCMS-2020 システム，Phenomenex Luna 5u HILIC 200A (100mm×2.0 mm，5.0 µm)）
・ 昭和電工株式会社（島津製作所 Nexera/LCMS-8030 Plus，昭和電工 Shodex ODP2 HP-2D (150 mm×2.0 mm)）
・ 一般社団法人日本海事検定協会（島津製作所 LC/MS-2010C HT，MS-2020，Phenomenex Luna 5u
HILIC 200A (100 mm×2.0 mm，5.0 µm)，Phenomenex SecurityGuard Cartridge HILIC (4.0 mm×2.0 mm)）・ 一般財団法人日本食品分析センター（Agilent Technologies 1100 Series，Phenomenex Luna 5u HILIC
200A (100 mm×2.0 mm，5.0 µm)，Phenomenex SecurityGuard Cartridge HILIC (4.0 mm×2.0 mm)）・ 一般財団法人日本冷凍食品検査協会（Waters Alliance 2695，Waters Quattro micro，Phenomenex Luna
5u HILIC 200A (100 mm×2.0 mm，5.0 µm)，Phenomenex SecurityGuard Cartridge HILIC (4.0 mm×2.0 mm)）・ 独立行政法人農林水産消費安全技術センター福岡センター（島津製作所 LC/MS-2020 システム，
Phenomenex Luna 5u HILIC 200A (100 mm×2.0 mm，5.0 µm)，Phenomenex SecurityGuard Cartridge HILIC(4.0 mm×2.0 mm)）・ 独立行政法人農林水産消費安全技術センター本部（島津製作所 LC/MS-2020 システム，Phenomenex
Luna 5u HILIC 200A (100 mm×2.0 mm，5.0 µm)，Phenomenex SecurityGuard Cartridge HILIC (4.0 mm×2.0mm)）（50 音順）
3． 結果及び考察
1） 共同試験成績及び外れ値検定
各試験室から報告された共同試験成績を Table 2 に示した．各系列の分析試料の結果を IUPAC の共同試験プロトコル４，５）に従って統計処理した．この結果，Cochran の検定で 3 種類の試料について 1 試験室の分析値が棄却．また，Grubbs の検定で 2 種類の試料について 1 試験室の分析値が棄却された．さらに，2 種類の試料では、外れ値検定の結果棄却された試験室が 2/9 を超えたため，それらの試料の試験成績の統計処理は全ての試験室の結果を用いた．

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LC-MS法による肥料中のスルファミン酸の測定 －共同試験成績－

Table 273

Indivisual result of sulfamic acid in fertilizer
By-product Compound By-product nitrogen
Compound fetilizer
fertilizer
fertilizer(mass %)
By-product nitrogen
fertilizer (dilution)

A

0.0566

0.05250.03270.02450.08900.08450.09700.101

B0.04180.04410.02340.02270.05290.0532

0.0616

0.0632

C

0.0466

0.04660.02440.02430.06720.06440.0606

0.0629D

0.04990.06620.06750.09140.0927

0.124

0.176

0.140

0.122

0.108

0.03640.06740.0629Lab IDa)EF

0.08430.0419

G

0.0499Lab IDa)

0.0507c)

0.08030.04000.0271c)

0.0606Ammonium sulphate

0.03950.02150.0236c)

0.04470.0220c)

0.02150.0232Ammonium sulphate(dilution)

0.07240.0686Compound fertilizer
for home gardening 1

0.06980.0790Compound fertilizer
for home gardening 2

A

0.215

0.210

0.252

0.254

0.01000.00937

0.03730.0342

B

0.205

0.203

0.215

0.219

0.009630.009640.03950.0389

C

0.196

0.189

0.188

0.216

0.00768

0.00769

0.03710.0343D

0.197

0.186

0.257

0.00937

0.00930

0.04570.0289b)0.429
0.0114b)0.499
0.0104b)2.34
0.03473.19
0.03870.01050.01080.03860.0443

E

0.325

0.413

F

0.0850

0.270

0.411
0.206

G

0.252

0.242

0.2080.220b)0.306
0.217b)0.229b)a) Laboratory identificationb) Outliers of Cochran's testc) Outliers of Grubbs' test3） 併行精度及び室間再現精度
外れ値を除外した試験成績より算出４，５）した平均値，併行標準偏差（sr）及び併行相対標準偏差（RSDr），並びに室間再現標準偏差（sR）及び室間再現相対標準偏差（RSDR）を Table 3 に示した．
外れ値を実施した各試料の平均回収率は 94.2 %～112 %であり，その sr は 0.00035 %（質量分率）～0.055 %（質量分率），RSDr は 3.7 %～29.4 %，sR は 0.00117 %（質量分率）～0.077 %（質量分率），RSDR は 9.7 %～44.9 %であった．なお，RSDR が RSDr より小さかった試料が 1 種類あった．
これらの試料について，平均回収率は肥料等試験法６）に基づく真度の目標の範囲内（80 %～115 %）であった．併行相対標準偏差は併行精度の目安の 1.5 倍に入った試料が 1 点，室間再現相対標準偏差は室間再現精度の目安の 1.5 倍に入った試料が 1 点であった．また，副産窒素肥料及び硫酸アンモニアの試料溶液を希釈して分析した結果と希釈しないで分析した結果を比較すると，併行相対標準偏差及び室間相対標準偏差ともに希釈して分析した方が希釈しないで分析したより小さい値となった．

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肥料研究報告 Vol. 9 （2016）

Table 3SampleCompound fetilizer

Labs

Statistical analysis of collaborative study resultsa)

Conc.

b)

Meana)c)c)p (q )

(%)

(%)

d)

Recovery

(%)

sre)

(%)

c)

RSD r(%)

f)

CRSD rg)

h)

sR

(%)

(%)

c)

i)

RSD R
(%)

CRSD Rj)

(%)

6 (1)

0.05

0.048496.9 0.0034

7.1

40.0064

13.3

86 (1)

0.025 0.0242

97.0 0.0026

10.940.0031

12.987 (0)0.075 0.0807

107.7 0.0237

29.44

0.0362

44.9

8

7 (0)

0.075 0.0837

111.6 0.0057

6.840.0258

30.98

Ammonium sulphatel) 7 (0)

0.21

0.228

108.4 0.055

24.1

40.0767

33.7

8

Ammonium sulphate(dilution)

6 (1)

0.21

0.223

106.4 0.015

6.8

40.0216

9.78

Compound fertilizer
for home gardening 1

6 (1)

0.01

0.00965

96.5 0.00035

3.7

40.001212.1

8

By-productCompound fertilizer
By-product nitrogenfertilizerk)
By-product nitrogen
fertilizer (dilution)

Compound fertilizer
6 (1)0.04 0.0377
94.2 0.0054
14.3
40.0044 14.311)
for home gardening 2a) Number of laboratories, where p = number of laboratories retained after outlier removed and(q ) = number of outlier8b) Sulfamic acid concentration contributed by spikec) Mass fractiond) Grand mean value of the results of duplicate sample which were reported from laboratories retained afteroutlier removed (n = The number of laboratories (p ) × The number of repetition (2))e) Standard deviation of repeatabilityf) Relative standard deviation of repeatabilityg) Rough standard of relative standard deviation of repeatability in Testing Methods for Fertilizers 2015h) Standard deviation of reproducibilityi) Relative standard deviation of reproducibilityj) Rough standard of rerative deviation of reproducibility in Testing Methods for Fertilizers 2015k) Sample of number of outlier / number of laboratories exceed 2/9l) Value was RSD r because RSD R<RSD r4． まとめ
7 試験室において化成肥料，副産複合肥料，副産窒素肥料，硫酸アンモニア及び液状の家庭園芸用複合肥料（計 12 点）にスルファミン酸を添加して LC-MS 法によるスルファミン酸分析法の共同試験を実施し，試験法の評価を行った．その結果，平均回収率は 94.2 %～112 %，併行精度（相対標準偏差）は 3.7 %～29.4 %，室間再現精度（相対標準偏差）は 9.7 %～44.9 %であり，平均回収率は肥料等試験法に基づく真度の目標の範囲内であったものの，併行精度及び室間再現精度は肥料等試験法の併行精度及び室間再現精度の目安の範囲内には入らなかった．
このことから，今回の共同試験結果からは本試験法が肥料中のスルファミン酸の測定に用いることができる十<80>

LC-MS法による肥料中のスルファミン酸の測定 －共同試験成績－

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分な性能を有しているとは言えないが，昨年度の単一試験室の結果では，問題がなかったことから，今後，試験方法も含めて検討をおこなう必要があると考える．
謝辞共同試験にご協力頂きました，株式会社島津製作所，昭和電工株式会社，一般社団法人日本海事検定協会，一般財団法人日本食品分析センター及び一般財団法人日本冷凍食品検査協会の各位に謝意を表します．
文献1） 農林水産省告示：肥料取締法に基づき普通肥料の公定規格を定める等の件，昭和 61 年 2 月 22 日，農林水産省告示第 284 号，最終改正平成 27 年 1 月 9 日，農林水産省告示第 52 号 (2015)2） 農林水産省農業環境技術研究所：肥料分析法（1992 年版），日本肥糧検定協会，東京 (1992)
3） LC-MS 法による肥料中のスルファミン酸の測定，平成 27 年肥料等技術検討会資料
4） Horwitz W. : Protocol for the Design, Conduct and Interpretation of Method-Performance Studies, Pure &Appl. Chem., 67 (2), 331~343 (1995)
5） AOAC OFFICIAL METHODS OF ANALYSIS Appendix D：Guidelines for Collaborative Study Procedures
To Validate Characteristics of a Method of Analysis, AOAC INTERNATIONAL (2005)
6） 独立行政法人農林水産消費安全技術センター（FAMIC）：肥料等試験法（2015）< http://www.famic.go.jp/ffis/fert/obj/shikenho_2015.pdf >

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肥料研究報告 Vol. 9 （2016）

Determination of Sulfamic Acid in Fertilizers using Liquid Chromatography-Mass
Spectrometer (LC-MS): A Collaborative Study
Tomoharu NOZAKI1
1

Food and Agricultural Materials Inspection Center, Fertilizer and Feed Inspection Department
A collaborative study was conducted to evaluate the applicability of liquid chromatography-mass spectrometry(LC-MS) for determination of sulfamic acid in fertilizers. Sulfamic acid in fertilizer was extracted and dilutedwith water. The sulfamic acid in the mixture was determined by LC-MS. Six samples of fertilizers, respectively,were sent to 7 collaborators. These samples were analyzed as blind duplicates. Recovery values reported from94.2 % to 112 %, the relative standard deviation (RSDr) for repeatability ranged from 3.7 % to 29.4 %, the relative
standard deviation (RSDR) for reproducibility ranged from 9.7 % to 44.9 %. These results indicated that thismethod has an unacceptable precision for determination of sulfamic acid in fertilizers.
Key words

sulfamic acid, LC-MS, collaborative study(Research Report of Fertilizer, 9, 69-76, 2016)<82>