Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)7

核内共生細菌 Holospora obtusa は宿主 Paramecium caudatum が発現する
表層蛋白質の抗原型を可逆的に変化させる
中村欽光，堀 学，藤島政博（山口大・理・生物）

Endonuclear symbiotic bacterium Holospora obtusa reversibly changes types of surface antigens expressed in the host Paramecium caudatum
Yoshimitsu NAKAMURA, Manabu HORI and Masahiro FUJISHIMA(Biological Institute, Faculty of Science, Yamaguchi University)
SUMMARY
The Gram-negative bacterium Holospora obtusa is an endonuclear symbiont of the ciliate Paramecium caudatum.
The surface protein with a molecular mass of about 266 kDa was extracted only from the aposymbiotic cells by salt/ethanol treatment, but not from the symbiotic cells. Instead, two surface proteins of 188 kDa and 149 kDa were extracted
from the symbiotic cells by the same method. Indirect immunofluorescence microscopy and immunoblot with a monoclonal antibody raised for the 266-kDa protein showed that the antigen was present only on the surface of the aposymbiotic cell but not on the symbiotic cell. When H. obtusa were removed from the symbiotic cells by treatment with penicillin-G-potassium, resulting aposymbiotic cells recovered the 266-kDa surface protein but lost both 188- and 149-kDa
proteins from the cell surface. These results show that the P. caudatum cell changes the surface antigen depending on thepresence or the absence of H. obtusa in the macronucleus. Although Paramecium changes types of the cell surface antigen by various stresses such as temperature-shifts, ionic strength and starvation, the188 kDa and 149 kDa only by theinfection of H. obtusa.

[目的] グラム陰性細菌Holospora obtusaは繊毛虫

caudatum のSAgを抽出し、SDS-PAGEゲルをCBB染Paramecium caudatumの核内に共生する。これまでの色で検出した。さらにその局在性を確認するため、研究で我々は、H. obtusaを維持している状態のP.

モノクローナル抗体の作製を行った。抗原はWholecaudatum (symbiotic cell) は細胞表層蛋白質、surface

cellを用い、繊毛を含む細胞表面全体を認識する抗体

antigen (SAg)の遺伝子発現が消失することを明らかにを 得 た。A-cell、S-cell そ れ ぞ れ に 抗 体 を 混 合 しし た (1)。Paramecium の SAg は 次 ぎ の 特 徴 を 持 つ ：(Immobilization test) 細胞の遊泳行動を観察した。こ（１）１０数種の型を持つファミリータンパク質、の抗体を用いてウエスタンブロット解析、間接蛍光（２）Glycosyl-phosphatidylinositol (GPI)-anchored抗体法を行った。同様にしてペニシリン処理によprotein、（３）250-300 kDa の 高 分 子 量、（４）温る、ホロ スポラ 除 去後 の宿主 の SAg発 現を 確 認し度、pHや飢餓などの細胞外環境のストレスに依存した。環境ストレス条件下（低温、高温、飢餓）に置て型を変化、（５）抗体による細胞の遊泳行動の阻かれた細胞から抽出されるSAgの分子量を比較し害。しかし、Parameciumの細胞表層抗原の機能につた。

いてはまだ明らかにされていない(2)。本研究ではP.
caudatumのSAgの抗原型の変化がH. obtusaの感染で誘[結果と考察] P. aureliaのSAgの抽出に用いられた導されるかどうかを調べた。

salt/ethanol法で細胞を処理すると、A-cellからは分子量約266 kDaのタンパク質が抽出されたが、S-cellか[材料と方法] 細胞はP. caudatum Rb-1株 (syngen 4, E

らはこのタンパク質を抽出できなかった。その代わ型) を用いた。Aposymbiotic cell (A-cell)、Symbiotic

りに、S-cellからは、分子量188と149 kDaのタンパク

cell (S-cell) そ れ ぞ れ か ら salt/ethanol 抽 出 法 (3) で P.

質が同じ方法で抽出された。得られた抗体を用い間8

原生動物学雑誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年

接蛍光抗体法とイムノブロットを行ったところ、抗ろ、188と149 kDaの細胞表層タンパク質はH. obtusa

原はA-cellの細胞表層には存在するがS-cellには存在を大核に持つS-cellからのみ抽出されることが明らかしないことが明らかになった。A-cellはこの抗体で処になった。この結果は、188と149 kDaのタンパク質

理されると、遊泳行動を停止したが、S-cellの遊泳行

がH. obtusaの感染によって出現が誘導される表層タ動に変化はなかった。S-cellのH. obtusaを250 units/ml

ンパク質であることを示している。

のペニシリンで処理して得られたA-cellは、分子量約266 kDaのタンパク質の細胞表層への出現を回復し、[文献]

分子量約188と149 kDaのタンパク質を消失すること

1) Nakamura, Y., Hori, M. and Fujishima, M. (2004) Jpn.

が確認された。これらの結果は、宿主細胞が細胞表

J. Protozool., 37, No1.: 46-47.

層タンパク質の型をH. obtusaの有無で可逆的に変化

2) Schmidt, H.-J. (1988) Immobilization Antigen. In: Para-

さ せ る こ と を 示 し て い る。Paramecium は、温 度 変

mecium (ed. Gortz, H.-D.), pp. 155-163. Springer-

化、イオン強度、飢餓等の環境ストレスに依存して細胞表層抗原の型を変化させることが知られている(2)。環境ストレス条件下に置かれた細胞から抽出さ

Verlag.
3) Preer, J. R., Preer, L. B. and Rudman, B. M. (1981)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 11: 6776-6778.

れる細胞表層タンパク質の分子量を比較したとこ

熱帯熱マラリア原虫表面抗原における単塩基多型の安定性
田辺和裄，先濱直子，＊金子明（大阪工大・工・生物，＊東京女子医大）

Stable single nucleotide polymorphism in antigen genes of Plasmodium falciparum
Kazuyuki TANABE, Naoko SAKIHAMA and Akira KANEKO(Lab. Biol, Osaka Inst. Technol. and Tokyo Women’s Med. Univ.)
SUMMARY
Since surface antigen genes of the human malaria parasite, Plasmodium falciparum, show extensive polymorphism,
a rapid evolution of their polymorphism is presumed. However, little is known about frequency of the generation ofnovel polymorphisms. We are interested in P. falciparum populations in Vanuatu, in the southwestern Pacific, where themalaria epidemiological settings are suitable to test whether novel antigen polymorphism evolves rapidly because limited
human movement limits the parasite diversity in isolated populations. We analyzed single nucleotide polymorphisms(SNPs) and repeat-length polymorphisms in three major surface antigens, msp1, msp2 and csp, in populations from 7
islands of Vanuatu in 1996 to 2002. We also sequenced simple repeat-length polymorphisms at three microsatellite loci,serca second intron, TA40 and TA101. Analysis of more than one million bases revealed no de novo SNPs in the three
antigen genes in Vanuatu. In contrast, repeat length polymorphism evolved rapidly. Analysis of ‘linkage disequilibrium’
between pairs of loci revealed a spectrum of population genetic structure, suggesting that some of old antigen alleles
have persisted through meiotic recombination events after the appearance of chloroquine resistance in Vanuatu. We argue that SNPs in P. falciparum antigen genes are substantially stable in isolated populations.

[目的] マラリア原虫では宿主免疫系の標的となる原機構の解明、またワクチン耐性株の出現といった問

虫表面抗原において遺伝子多型が激しい(1)。この激題と密接に関わる重要な研究課題であるが、抗原多しい多型は抗原遺伝子における急速な進化を示唆す型の進化に関する研究はほとんどなされていない。

る。抗原多型はマラリア原虫の免疫回避、寄生適応

その最大の理由は、マラリア感染では異なる遺伝子

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)

9型原虫の重複感染が普通に見られ、新しく出現したが見られた。３つの抗原遺伝子座位の対立遺伝子の多型を新たな感染による外部由来の多型と明確に区多くは異なる複数の島嶼に分布していた。一方、別することが容易でないからである。この点におい

msp2, csp 遺伝子では反復配列の反復数の違いが特定て私達は南西太平洋バヌアツの熱帯熱マラリア原虫の島嶼だけに見られた。以上の観察は、バヌアツで集団に関心を持っている。バヌアツでは島嶼間の人認められた抗原遺伝子における SNPs はバヌアツでの移動が限られ、また異なる遺伝子型の重複感染も発生したものでなく、外来性であること、一方、反まれである(2)。こうしたマラリア疫学的状況は新規

復数の多型はバヌアツにおいて発生したことを示に発生した抗原多型の検出に適している。本研究です。

はバヌアツ７島の原虫集団について、３つの主要表

バヌアツのクロロキン耐性はすでに 1967 年には広面抗原遺伝子とクロロキン耐性遺伝子の多型を調べまっていたので、pfcrt 遺伝子多型を調べたところ、た。結果は抗原遺伝子におけるSNPs（単塩基多型）

すべての株がパプアニューギニア型のクロロキン耐が安定であることを示した。

性 SNPs を示した。３つのマイロサテライト座位で[材料と方法] 1996年から2002年にかけ、バヌアツのを確認した。抗原遺伝子とマイクロサテライト座位

７島（Gaua, Santo, Malakula, Ambae, Pentecost,Ngua,を合わせた計６座位による多座位遺伝子型の解析、はバヌアツにおいてそれぞれ３個の‘対立遺伝子’

Tanna）から熱帯熱マラリア原虫234株を採取し、そ及び、連鎖不平衡解析の結果は、島嶼によりマラリのDNAを抽出した。塩基配列決定は直接シーケンス

ア原虫集団の遺伝的構成の度合いが変化し、減数分法によった。解析対象遺伝子は msp1（メロゾイト表

裂期における染色体交雑をほとんど行わないものか

面タンパク１）, msp2（同２）, csp（スポロゾイト表

ら頻繁に行うものに分かれた。

面タンパク）, pfcrt（クロロキン耐性トランスポー

以上の結果から次のことが結論できる。(i) 調べた３2+

つの表面抗原遺伝子では少なくとも過去３５年間はター遺伝子）、及び、マイクロサテライ トのCa ATPase第２イントロン、TA40, TA101で、それらのバヌアツにおいて新規の SNPs が発生しておらず、座位における単塩基多型及び反復配列多型を調べ

抗原遺伝子の SNPs が安定である。(ii) バヌアツにクた。遺伝子座位間における対立遺伝子どうしの組合

ロロキン耐性が現れる以前に存在していた表面抗原

わせ（non-random association）はχ 検定によった。

の対立遺伝子のあるものは減数分裂期における染色２体交雑によって、現在まで存続している。(iii) 表面[結果及び考察] 1996年-1998年に４島（Gaua, Santo,

抗原における反復配列の多型は数年という比較的短Malakula, Pentecost）から採取した原虫株の解析結果

時間で生じる。

は既発表である(3)が、同一の島々から2000年-2002年

本研究は、バヌアツにおけるように他のマラリアにもサンプリングできたので、結果を合わせて報告

流行地域から隔離され、遺伝子プールの限られた原する。

虫集団ではマラリアワクチンがより効果的であるこ

msp1 遺伝子 (n=178) について 4.9 kb でアラインメとを示唆する。

ント可能で、６個の対立遺伝子を認めた。それらの間での SNPs の違いは 4-33 個であった。msp2 遺伝子[文献](n=228) では 291-321 bp のアライメントで５個の対立

1) Tanabe K, et al. (1987) J. Mol. Biol. 195: 273-287.

遺伝子を認め、それらの間では 3-6 個の置換が存在

2) Sakihama N, et al. (2001) Gene 279: 41-48.

した。csp 遺伝子 (n=218) では 687 bp のアライメント

3) Tanabe K, et al. (2004) Science 303: 493.

で２個の対立遺伝子があり、それらには２個の置換

10

原生動物学雑誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年

葉緑体を持たない渦鞭毛虫ヤコウチュウの遊走子形成
福田康弘（金沢大・院自然科学・生物）

Gametogenesis in the nonphotosynthetic dinoflagellate Noctiluca scintillans
Yasuhiro FUKUDA (Div. of Biol. Sci., Grad. Sch. of Natural Sci., Kanazawa Univ.)
SUMMARY
Noctiluca scintillans is one of the organisms responsible for harmful red tides and usually reproduces by binary fission. A small fraction of cells sporadically differentiate into a form for sexual reproduction and produce zoospores. Here,I describe the processes in zoospore formation, which is followed by gamete fusion. Initial signs of differentiation were achange of the cell shape (from eggplant-like to spherical), accompanied by loss of the tentacle, rod organ and cytosome.
After this differentiation, the nucleus migrated towards the the cell surface, where it divided twice. Each of the resultant
four nuclei, together with some cytoplasm, protruded from the cell surface. Zoospores (gametes) were produced throughsuccessive divisions in the protrusions (nucleus–cytoplasm complex). During the divisions of zoospore formation, thenuclei seem to be connected to one another with a thin network of cytoplasm. Mature zoospores were biflagellate andhad a semi-spindle shape when they were released from the parental cell ghost. The released biflagellated zoospores
fused in pairs, but their subsequent fate is unknown. In the vegetative phase the cells are highly specialized, so they do
not have the typical morphology of dinoflagellates, but the zoospores maintain dinoflagellate-like characteristics. Further
study of the zoospores will shed new light on the evolution of dinoflagellates.

[目的] 葉緑体を持たない渦鞭毛虫ヤコウチュウは、細胞口が消失した。また、核が細胞外殻の直下へ移

大量に増殖し赤潮の原因生物となる海産の渦鞭毛虫動した。その後、核は二回の分裂後、細胞質を伴っである。ヤコウチュウは２分裂によって増 殖する無て細胞外殻表面へ移動し、突出した。この四個の突性生殖過程のほかに、遊走子を形成し遊走子が融合

出は多数回の分裂後、将来遊走子を形成するので、する有性生殖過程が存在することが報告されていここでは原遊走子と呼ぶ。４つの原遊走子はクラスる。しかし、遊走子形成に関する報 告は少なく、生ターを形成しながら分裂を続けた。細胞数は最小で活環についての記述は十分とは言えない。そこで、

256、最大で1024にまで達し、その分裂は完全に同調

ヤコウチュウの全生活環を解明するため、ヤコウしていた。また、原遊走子の核の分裂はほぼ全てのチュウの遊走子形成とその後 の過程を観察した。

原遊走子間で同調して行われていた。原遊走子の分裂が進むほど、核の形はより明瞭になり、核の染色[材料と方法] 石川県能登島須曽で採取し、単離、株性は強くなった。この染色性の変化はおそらく、遊化 した ヤコ ウチ ュウ（Noctiluca scintillans）（strain

走子への分化前の核凝縮を反映していると考えられname JSO 1）を用いた。 遊走子形成細胞は、培養中る。分裂の完了した原遊走子は遊走子へ変化した。

に低頻度で出現した。この遊走子形成細胞を光学顕

原遊走子の分裂時に見られたクラスター構造が失わ微鏡で観察、記録した。また、同時にカルノア固定

れ、原遊走子は半紡錘形になり、二本の鞭毛を持っ（ethanol : chloroform : acetic acid = 6 : 3 : 1）・オルセ

た遊走子へと分化した。この段階ですでに活発な鞭イン染色を行い、核の状態を観察した。

毛運動が見られた。この後、全ての遊走子は親個体から放出され、自由遊泳を開始した。ヤコウチュウ[結果と考察] 遊走子形成期に入ったヤコウチュウのの遊走子は半紡錘形をしており、頭部に複数の顆粒細胞には大きな形態変化が見られた。通常、二分裂と細胞後部に核を持つ。遊走子は明らかに長さの異期の細胞はナス型をしており、触手、桿状体、細胞なる二本の鞭毛を持っており、これはこれまでの報口等の構造が見られる。ヤコウチュウが遊走子形成

告とは異なっていた。親個体と同様に、遊走子には期に入ると、細胞は球形に変化し、触手、桿状体、渦鞭毛虫の特徴である縦溝や横溝は確認できなかっJpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)

11

た。遊走子の中に２個体が向かい合って融合していヤコウチュウの遊走子のような細胞だったと考えらるように見える像が観察された。融合したと思われれる。渦鞭毛虫の祖先は未分化な二本の鞭毛を持っる細胞は四本の鞭毛と二個の核を持っていた。また細胞で、その細胞には明確な縦溝や横溝が無かった、細胞が融合前よりも少し大きくなっていた。遊た。ヤコウチュウの成熟個体は捕食者から逃れるた

走子形成後、遊走子同士の融合が起こり、二倍体世

め、液胞の発達によって巨大化し、鞭毛を失うこと代へと移行すると考えられる。このことは、遊走子

によって遊泳能力はほとんど失われてしまった。し形成のある段階で減数分裂が起こるということを意

かし、代わりに潮流に乗って拡散し分布域を広げ、味している。減数分裂が何回目の分裂時に起こってまた、捕食のために触手を発達させるという戦略をいるのかを特定することが今後の課題である。ヤコとったものと考えられる。成熟個体の形態は、拡散

ウチュウの遊走子は二本の鞭毛を持ち、親個体よりによる分布域の拡大と、遊走子（配偶子）形成のた

渦鞭毛虫的であると言える。しかし、二本の鞭毛にめに特殊化したもの、とみなすことができるだろは、やや長さが異なることを除けば、明確な分化がう。

見られないことから、典型的渦鞭毛虫の形態をもってはいないようである。このことに加え、rDNA分子[文献]

系統樹解析によると、ヤコウチュウが渦鞭毛虫の中

1) Soyer M-O (1972) Chromosoma 39: 419-441.

で最も祖先的な種とされることから、以下のような

2) Zingmark R.G (1970) J. Phycol. 6: 122-126.

進化のシナリオが考えられる。渦鞭毛虫の祖先は、

日本産ミドリゾウリムシは共生藻の光合成に影響を及ぼす
鎌戸伸一郎，今村信孝（立命大・理工・化生工）

Effect of Japanese Paramecium bursaria on symbiotic algae
Shin-ichiro KAMAKO, Nobutaka IMAMURA(Sci. and Eng., Dept. Biosci. and Bioeng., Ritsumeikan Univ.)
SUMMARY
Cells of green paramecium, Paramecium bursaria, have several hundred endosymbiotic algae. To investigate interactions between Paramecium bursaria and its symbiont, we attempted to measure the effect of a cell-free extract of Japanese P. bursaria on the photosynthetic carbon fixation of the symbiont. A cell-free extract of P. bursaria was preparedby filtration of P. bursaria cells on a membrane filter. Carbon fixation by the symbiotic algae and by free-living Chlorella spp. in solutions of various concentrations of the extract were measured using NaH[14C]O3. The amount of carbon
fixed by all algae increased about 3-fold with increasing extract concentration. Since this phenomenon was not affectedby elimination of carbon dioxide from the extract, the existence of a host factor that stimulates algal carbon fixation(without species specificity) is suggested. In addition, the host factor would be a heat-stable low molecular weight substance. From a comparison with pH effects on carbon fixation by the symbiotic alga and a free-living Chlorella sp., thestimulation of algal carbon fixation seemed not to be caused by a change of intracellular pH. It appears that paramecium
regulates photosynthesis of the symbiotic alga via a specific host factor.

てきた。これまでに共生藻単離株についての形態、[目的] ミドリゾウリムシは数百の共生藻を細胞内共生理などの研究が行われており、また光合成産物の生させており、宿主と共生藻を分離できることか

マルトースを放出している １）ことが報告されていら、細胞内共生関係の良い研究材料として用いられる。著者らは日本産ミドリゾウリムシから共生藻を

12

原生動物学雑誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年

無菌株として単離、維持することに成功し２）、その験条件下では殆どなく、極めて稀な現象と思われ生理的な特徴３）や18S rDNAの解析からの解析を進めた。今回の実験系では光条件は一定であるので無視て来た ４）。これまでに共生藻への宿主側からの働きできるが、抽出液中の炭酸により光合成が上昇してかけについて検討した研究例は殆どなく、細胞内共いる可能性は残された。そこで抽出液中の炭酸を除生関係での相互の制御機構について知見を得る目的

去して共生藻への影響を検討したが、やはり光合成

で、今回、宿主無細胞抽出液の共生藻光合成活性へ活性が上昇したことから、抽出液中に炭酸とは異なの影響を検討した。

る光合成活性上昇させる因子が存在することが明らかになった。さらに、この因子について知見を得る[材料と方法] ミドリゾウリムシF36株培養液から、べく、熱処理、分子量分画を行ったところ、いずれ細胞をろ紙上に濃縮、培地を蒸留水に置換し、細胞の処理後でもほぼ100%の活性を保持していたことか数を計測した後に、メンブランフィルター(0.45 µm)

ら、この宿主因子は熱安定性な分子量5000以下の低で吸引ろ過することで、ミドリゾウリムシ無細胞抽分子である。

出液(以後、抽出液)を得た。抽出液中の炭酸の影響

また、抽出液によって共生藻、非共生藻Chlorellaを検討する際には、抽出液に0.1N HClを添加し、炭sp.に関わらず、F36-ZK同様に抽出液濃度に依存して酸を減圧下で留去しリン酸バッファーでpH調製した

光合成活性が3倍程度上昇した。このことから、抽出も の を 試 料 と し て 用 い た。ま た、熱 処 理 (60° C,

液中の光合成活性を上昇させる宿主側の因子には、30min)およびメンブランフィルターで分子量分画

種特異性がないと考えられる。一方、共生藻および(MW 5,000)を行った抽出液試料についても共生藻へ

非共生藻Chlorella sp.の光合成活性へのpHの影響を検の影響を検討した。 日本産共生藻F36-ZK株を、濃度討したところ、共生藻F36-ZK株の炭素同化はpHに依調製した抽出液溶液中に懸濁してNaH[14C]O3 を添加

存性を示したのに対し、非共生藻Chlorella sp.ではpH

2

後、イ ンキ ュベ ー ト (120 µmol photons/m s, 25° C,の影響を受けなかった。抽出液の藻類への光合成上

2hours)した。藻体と外液をメンブランフィルターで昇作用には種特異性がなく、一方でpHでは共生藻のろ別(15,000rpm, 5min)し、藻体の放射線量を測定してみ依存性を示すことから、抽出液の影響は単なる藻

藻体内炭素同化量とした。また、外液中の遊離炭酸

体内のpHの上昇によるものではないと考えている。

イオンを酸性条件(pH1.0, 90°C)下で留去した後、放以上の結果より、宿主ミドリゾウリムシは、低分射線量を測定し放出した光合成産物中の炭素同化量

子物質を介して共生藻の光合成活性を調製しているとした。抽出液の他の共生藻(OK1-ZK, So13-ZK)およと考えられ、今後、この宿主因子の解明とメカニズ

びfree-living Chlorella sp. (C. vulgaris NIES-227, C.

ムの解析を行う予定である。

kessleri IAM C-143) への影響も同様にして検討を行った。また、光合成活性へのpHの影響も比較のために

[文献]

検討した。

1. Brown A. J. and Nielsen J. P. (1974) J. Protozool. 21,[結果と考察] 共生藻F36-ZKの光合成活性は、抽出2. Kamako S., Hoshina R. and Imamura N. (2004) Jpn. J.

液の濃度に依存して最大3倍程度上昇した。また、光Protzool. 37, 39-40
3. Kato Y., Ueno S. and Imamura N. (2004) 原生動物学

569-570

合成産物の放出量に関しては、抽出液の影響はみられなかった。光合成活性を上昇させる既知の因子としては、光強度とCO2 濃度が知られているが、その他の要因で光合成活性が上昇することは一般的な実会
4. Hoshina R., Kamako S. and Imamura N. (2004) Plant
Biol. 6, 447-453

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)13

ミドリゾウリムシ共生藻の窒素源に関する研究加藤 豊，上野聖子，今村信孝（立命大・理工・化生工）

Nitrogen utilization by endosymbiotic algae isolated from Paramecium bursaria
Yutaka KATO, Seiko UENO and Nobutaka IMAMURA(Sci. and Eng., Dept. Biosci. and Bioeng., Ritsumeikan Univ.)
SUMMARY
The green ciliate, Paramecium bursaria, has several hundred endosymbiotic algae. Symbiont F36-ZK isolated fromJapanese P. bursaria F36 required some amino acids as a nitrogen source for its remarkable growth, rather than nitrate,
which is used by endosymbionts of American and European P. bursaria and most of free-living Chlorella spp. To elucidate this novel nitrogen utilization by F36-ZK, we studied enzymatic activity related to nitrogen assimilation and aminoacid transport. Nitrate reductase (NR) activity was not detectable in F36-ZK, indicating why F36-ZK could not utilize
nitrate. Activities of the key enzymes of ammonium assimilation, glutamine synthetase (GS) and glutamate dehydrogenase (GDH), were also assayed. As no GS activity was detectable, it seemed likely that GDH assimilated ammonium
to yield Glu and this was utilized for algal growth. However, our previous results showed that Glu could be taken up, but
not utilized, by F36-ZK. This suggests the presence of an unknown ammonium assimilative pathway in F36-ZK. Symbiont F36-ZK possesses three active amino acid uptake systems, a basic amino acid transport system (Arg and Lys), a
general amino acid transport system (Lys, His, Glu and neutral amino acids) and an alanine transport system (only Ala).
The novel character of F36-ZK may have evolved during symbiosis over a long period.
びNiRの酵素活性を経時変化ごとに追った。粗酵素[目的] ミドリゾウリムシ細胞内には数百の緑色藻類を抽出後、基質とNADHを加え、亜硝酸の量の変化

が細胞内共生している。この共生藻は宿主から単離を測定した。グルタミン酸脱水素酵素（GDH）及び可能であることから、細胞内共生に関する研究材料

グルタミンシンテターゼ（GS）の酵素活性測定でとして古くから用いられてきた。しかしながら、日は、アンモニアを唯一の窒素源とし生育させた藻体

本産のミドリゾウリムシ共生藻に関しては無菌的にを用い、前述と同様に粗酵素を抽出後、基質を加単離、維持することが困難とされ、無菌株の生理学

え、活性を測定した。

的研究はほとんどなされていなかった。当研究室で1

日本産共生藻の無菌的単離に成功 し、その単離の過1, 2

アミノ酸輸送系の解析は、14C標識アミノ酸を用いて行った。藻体に 14C アミノ酸を添加し、各時間におによって、無機窒素である硝酸ける藻体をろ取後、液体シンチレーションカウン

塩を利用できず、顕著な増殖にいくつかのアミノ酸

ターを用いて藻体内放射線量を測定した。アミノ酸を要求することがわかった。本研究では、日本産共

輸送系の種類の数を予測するためにキネティクス

生藻の特異な窒素利用性を解明すべく、窒素代謝関を、また他のアミノ酸と取り込みを競合させること程やその後の検討

連酵素およびアミノ酸輸送に着目し検討を行った。

により、同一の輸送系で輸送されるアミノ酸の同定を行い、F36-ZKのアミノ酸輸送系の解析を行った。

[ 材料と方 法] 硝酸 での誘導によ る硝酸還元酵 素（NR）及び亜硝酸還元酵素（NiR）の活性を測定す[結果と考察] 硝酸を生育に利用できるC. kessleri, C.

るため、まず、free-livingのC. kessleri, C. vulgarisではvulgaris及びNC64Aでは、硝酸誘導によってNR、NiR

アンモニアを、アメリカ産共生藻NC64A及び日本産

ともに活性が確認できたが、F36-ZKではNR活性が認

共生藻F36-ZKではアミノ酸（それぞれArgとSer）をめられなかった。従って、F36-ZK はNRの酵素活性窒素源として培養した。対数増殖期の藻体を洗浄が欠失しているため、硝酸の利用は不可能である。

後、硝酸を唯一の窒素源とするC培地へ移し、NR及F36-ZKはアンモニアの利用はできる。通常、アンモ14

原生動物学雑誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年

ニアは主経路としてのGS及び補助経路としてのGDH

ことがわかった。

により同化される。検討した4株ともにGDHの活性

特異な窒素利用性を示すF36-ZKは、NR、GSの欠は確認できたが、F36-ZKのみがGS活性が認められな落など無機窒素同化経路に異常が生じ、またアミノ

かった。これらの結果からは、F36-ZKの主なアンモ酸輸送系が常に発現した状態にあった。このようなニア同化経路として、GDHによるグルタミン酸の生

特異な窒素利用性は、宿主との窒素化合物の永いや成が考えられる。しかし、既にグルタミン酸は取り

り取りの結果とも考えられ、共生関係で共生藻が受込まれるものの生育には利用できないこと3を確認しけ取る窒素化合物としてアミノ酸が重要な位置を占ており、F36-ZKのアンモニア同化代謝経路に、GSとめていることが示された。

GDH以外の経路の存在が示唆された。
F36-ZKはアンモニアを窒素源とした場合、非常に生育速度が遅いが、アミノ酸を窒素源とすると顕著な増殖をみせる。アミノ酸の取り込みを測定したと[文献]
1. Shin-ichiro K., Ryo H. and Nobutaka I., (2004) Jpn. J.
Protozool. 37(1), 39-40.

ころ、Asp以外の19種のアミノ酸を顕著に取り込ん

2. Seiko U., Yutaka K. and Nobutaka I., (2004) Jpn. J.

だ。一般の藻類は、硝酸を窒素源として利用しておProtozool. 37(1), 42-43.
3. 加藤 豊・今村信孝 (2004) 日本農芸化学会

り、アミノ酸輸送系は発達していない4, 5。発達しているF36-ZKのアミノ酸輸送系を調べた結果、basic
amino acid transport system(Arg, Lysを輸送する系)、
general amino acid transport system (Lys, His, Glu, 中性
アミノ酸を輸送する系)、alanine transport systemの3つのアミノ酸輸送系が常に発現されている状態である

大会

講演要旨集p.166
4. Cho H., Sauer N., Komor E. and Tanner W., (1981)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78(6) 3591-3594
5. David L. K. and Marilyn M. K. (1978) Plant Physiol. 61
556-560

ヤマトシロアリの個体数が共生原生生物群集に及ぼす影響
権田まり子，北出理 （茨城大・理）Effects of host termite colony size on the symbiotic protist fauna.
Mariko GONDA and Osamu KITADE, (Faculty of Science, Ibaraki University)
SUMMARY
The symbiotic flagellate community of a termite is characterized by host-specific species composition, definite
boundary, and clear community structure created by social system of host termite. To investigate the effects of metacommunity size on the symbiotic flagellate community, we set up experimental termite colonies of Reticulitermes speratus composed of five, 25, 100 and 300 workers with seven replicates. The colonies were kept in an incubator at 22°C,
and on the day 60 and 90 we picked up five termite individuals from each experimental colony and investigated the numbers of each flagellate species. We also investigated the flagellate numbers of the original field colony. Fifteen flagellate
species were found from the field colony with nearly 100% infection rates. The total numbers of flagellates were significantly smaller in five-termites colonies than in the field colony, but slightly larger in 25- and 100-termites colonies. In
the three Trichomonad species with small individual numbers in the community, infection rates and population sizes ofthe flagellates clearly decreased as the meta-community size decreased. However, some flagellate species of large population sizes did not follow these trends. The diversity of the flagellate community, measured by species number andShannon-Wiener index, tended to decrease as the size of meta-community decreased.

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)

15[目的] 下等シロアリとよばれるシロアリ類は後腸内ニーから35個体について同様に鞭毛虫組成を調査しに共生鞭毛虫の群集を保有し、共生鞭毛虫のもつセた。

ルラーゼがシロアリの摂食した材の分解に重要な役割を果たしていることが知られる。鞭毛虫は超鞭毛[結果と考察] 野外コロニーでは計15種の原生生物が虫目、トリコモナス目、オキシモナス目に属し、そ見 出 さ れ た。Pyrsonympha grandis と Pyrsonymphaの種組成はシロアリの種に特異的である。シロアリ

modestaは生体の観察では判別が困難な場合があるたのもつ鞭毛虫群集は、その境界が明確であり、かつめ、まとめて扱った。感染率はトリコモナス目の３シロアリの個体・コロニーの別によって構造化され種を除けばすべて100％であった。平均個体数はオキた群集である点に特徴がある。また、コロニーを構

シモナス目の種が多く（32536-3442）、次いで超鞭成するシロアリの個体間では、時折鞭毛虫の受け渡

毛 虫 目（752-167）、ト リ コ モ ナ ス 目（97-69）でしが行われることから、シロアリ１個体の鞭毛虫群あった。平均の総個体数は86373個体であった。

集にとってコロニー全体はメタ群集であると考える

実験期間終了後の個体数は５個体区で野外コロことができる。このためシロアリの共生鞭毛虫群集

ニーより有意に低くなる傾向がみられた（Tukey-test,

系を使えば、宿主の個体数を操作してやることで、

P<0.05）が、25・100個体区ではあまり変化しない

メタ群集のサイズの違いが群集に及ぼす影響を調べか、むしろ多くなった。感染率は、とくに消化管内ることが可能である。本研究ではヤマトシロアリ

で個体数が少ないトリコモナス目の３種で、宿主個Reticulitermes speratusとその共生鞭毛虫群集を用いて体数の減少とともに顕著に減少した。また5個体区でこれを調べた。

は全ての種で共通して低くなる傾向がみられた。個[材料と方法] 茨城県ひたちなか市において、ヤマト

なって直線的に減少するものから、25・100個体区でシロアリを営巣している枯死木ごと採集した。このはっきり増加するものまで、異なるパターンを示し

コロニーの中から職蟻を選別し、5個体、25個体、た。

体数は鞭毛虫の種により、宿主個体数の減少にとも100個体、300個体のワーカーからなる実験コロニー

種数は、飼育期間に拘わらず、宿主個体数の減少をそれぞれ14ずつ作成した。うち7コロニーは60日にともなって減少し、5個体区と野外コロニーの間に間、残りの7コロニーは90日間の飼育を行った。シロは有意な差がみられた（Tukey-type nonparametric test,

アリの飼育は蒸留水で湿らせた濾紙を敷いたスチ

P<0.05）。またShannon-Wienerの多様度指数H’も、

ロールケース（5×6×2.5cm3）内で22℃、全暗の条件

60日飼育の場合には同様に宿主個体数の減少にともで行った。餌として市販の昆虫飼育用マット（クヌない低下した。90日飼育の場合にはH’は300個体区でギ材）を与えた。

最大になったが、総じてメタ群集のサイズの減少に

飼育期間終了時に各実験コロニーから5個体の職蟻ともなって、群集の多様度は減少するといえる。

を選び、鞭毛虫の種ごとに個体数を調査した。消化管を抜き取った後に40μlの0.4％食塩水中で切開し[文献]て、内容物を縣濁し、血球計算板を用いて微分干渉

1) Koidzumi, M. (1921) Parasitology. 13, 235-309.

顕微鏡下で個体数の算定、総個体数の推定を行っ

2) Kitade, O. and Matsumoto, T. (1993) Sociobiology. 23,

た。鞭毛虫の同定はKoidzumi (1921)、Kitade (1993)にもとづいて行った。また、実験に用いた野外コロ

135-153.

16

原生動物学雑誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年

SS rDNA 塩基配列に基づくカバの前胃に生息するParentodinium 属繊毛虫の系統学的検討
宮崎 裕1，池 和憲1，森田 達志1，伊藤 章2，今井 壮一1，Wouter van Hoven3（1日獣大・寄生虫，2おおくさ動物病院，3プレトリア大学・野生生物管理センター）

Phylogenetic analysis, based on the SS rDNA gene, of Parentodinium
living in the fore-stomach of Hippopotamus
Yutaka MIYAZAKI1, Kazunori IKE1, Tatsushi MORITA1, Akira ITO2 Soichi IMAI1 and Wouter van
HOVEN3 (1Dept. Parasitol., Nippon Vet. and Ani. Sci. Univ., 2Ookusa Ani. Hosp., 3Centre Wildl.
Manage., Univ. Pretoria)
SUMMARY
It is well known that numbers of ciliate species belonging to the Subclass Trichostomatia live in the digestive tract oflarge herbivores. Phylogenic relationships of rumen ciliates, including the families Ophryoscoleciidae and Isotrichidae,
have been inferred by comparison of DNA sequences of small subunit ribosomal RNA region (SSrDNA). But a comparative study on molecular phylogenetic relationships of the ciliates living in the fore-stomach of hippopotamus, Hippopotamus amphibius, has never been done. Furthermore, our previous morphological studies suggested that these Parentodinium ciliates do not belong in the family Cycloposthiidae in which the genus has been included. To determine the phylogenetic position of the genus Parentodinium more clearly, we examined, for the first time, the SSrDNA of Parentodinium and Cycloposthium ciliates and compared these sequences with those of the other Trichostomatia ciliates. Using
Distance Matrix, Maximum Parsimony and Maximum Likelihood methods, all the results indicated that Parentodinium
did not belong in any described families of the Subclass Trichostomatia, although the Cycloposthiidae had a close relationship to the Ophryoscoleciidae as a monophyletic clade. This result indicates the need to establish a new family, Parentodiniidae, in the Subclass Trichostomatia.

[目的] 草食動物であるカバの前胃内に生息する 5 科

および日本国内で飼養されていたウマより得られた6 属の繊毛虫の中で、Parentodinium 属繊毛虫は、鍍

Cycloposthium 属繊毛虫 約 1,500 個体を回収し、使用

銀染色標本を用いた比較形態学的調査によって、初した．DNA の抽出後、 PCR 法には Small subunit

記載1 時より提唱されてきた Cycloposthiidae 科には属

ribosomal RNA をコードする領域の配列 (SSrDNA) をさず、本属繊毛虫をタイプ属とする新科を設立すべ増幅させるため Universal SSrRNA primer2 の一部を取き可能性が示唆された．しかしながら、形態学的情り出したものをプライマーとして使用し、シーケン

報のみからの分類学的位置に関する考察は、研究者

ス後、配列を決定した．その後、今回得られた 2 種によって重視する形質に偏りがあることが多いと考の系統学的位置について、反芻動物の消化管内繊毛えられる．そこで、比較的重視する形質の偏りが少虫 12 種および、外群として Didinium nasutum を使用ない遺伝子配列を用いた系統学的解析を、 Parento-

して、系統学的解析を行った．解析における塩基配

dinium 属と既知の消化管内繊毛虫との間で行い、本列のアライメントには Clustal W3 を、系統推定アル属繊毛虫の系統分類学的位置について検討した．

ゴリズムには距離行列法、最大節約法、最尤法を使用し、分岐点に対する信頼性指数値はブートスト[材料と方法] 材料として、 90-100% (v/v) のエタ

ラップ法4 を 1,000 回繰り返すことで検出した．

ノールで固定された、南アフリカ共和国の野生カバより得られた Parentodinium 属繊毛虫 約 3,000 個体、[結果と考察] SSrDNA を用いた系統解析の結果、全Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)

17ての系統推定アルゴリズムにおいて、Parentodinium

考えられた．今後、Parentodinium 属繊毛虫の系統学

属は、Isotrichidae 科である Dasytricha ruminantium と的位置を明らかにするためには、前述の Buetchelii-

姉妹関係を有していた．形態学的特徴に関して、

dae 科や Blepharocorythidae 科繊毛虫の SSrDNA 配列

Parentodinium 属は Dasytricha 属と核装置の位置が不を明らかにし、系統推定分岐図の作成を行う必要が定である点や Ophryoscoleciidae 科が有するような分あるものと考えられる．

厚い外質を有さない点4 の２点を共通点として有して本調査結果はParentodinium 属の Trichostomatia 亜

い る．し か し な が ら こ れ ら の 形 態 学 的 特 徴 は、綱内における明確な系統分類学的位置を示すもので

SSrDNA 配列が未解明の Buetscheliidae 科や Blepharo-はなかったが、少なくとも Parentodinium 属がこれま

corythidae 科と、前者に関しては核装置の位置が不定でに言われていたような Cycloposthiidae 科には属さな点および分厚い外質を有さない点で、後者とは分ず、さらに形態的に類似している Ophryoscoleciidae

厚い外質を有さない点 (Strelkow 1939) で共通してい科に属することをも否定するものであり、本属をタる．また、Parentodinium 属と Dasytricha 属の分岐点

イプ属とする新科設立の必要性を裏付けるものでにおける信頼性指数値は、距離行列法では 58―62%

あった．

と 50% 以上の値を得たが、最大節約法や最尤法ではそれぞれ 43%、32% と低い値であり、この分岐点が[文献]成立する可能性が低いことを示唆していた．また、

1) Thurston, J. P. and Noirot-Timothée, C. (1973) J. Proto-

Parentodinium 属と Dasytricha 属からなるクレイドの分岐点の信頼性指数値は、全ての方法で 50% 以下と低値を示した．これも、本分岐点が成立する可能性が低いことを示すものであった．従って、本調査にzool., 20: 562-565.
2) Medlin L., Elwood H.J., Stickel S., and Sogin M.L.
(1988) Gene, 71: 491-499.
3) Thompson, J. D., Higgins, D. G., and Gibson, T. J.

よる分岐図 は、Parentodinium 属、Dasytricha 属、(1994) Nucleic Acids Res., 22: 4673-4680.

Isotricha 属および Cycloposthiidae 科と Ophryoscolecii-

4) Felsenstein, J. (1985) Evolution, 39: 783-789.

dae 科からなる Entodiniomorpha 目が 1 つの分岐点か

5) Ogimoto, K. and Imai, S. (1981) Japan Sci. Soc. Press,

ら 分 岐 す る ポ リ ト ミ ー を 形 成 す る も の で あ り、
SSrDNA 配列がすでに明らかにされている消化管内
繊毛虫との間において Parentodinium 属が Dasytricha
属と最も近縁であることを示唆するものではないとTokyo, p.p. 231.
6) Strelkow, A. (1939) Uchen. Zap. Leningrad Pedagog.
Inst. Gert., 17: 1-262.

原生動物学雑誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年

18

Entamoebaの脱嚢および脱嚢後アメーバの発育に対する
DNAポリメラーゼ阻害剤アフィディコリンの効果
牧岡朝夫1，熊谷正広1，小林正規2, 竹内 勤2（1慈恵医大・熱帯医学，2慶大・医・熱帯医学 ・寄生虫学）

Effect of aphidicolin on the excystation and metacystic developmentof Entamoeba invadens
Asao MAKIOKA1, Masahiro KUMAGAI1, Seiki KOBAYASHI2 and Tsutomu TAKEUCHI2(1Department of Tropical Medicine, Jikei University School of Medicine, 2Department of Tropical
Medicine and Parasitology, Keio University School of Medicine)
SUMMARY
The effect of aphidicolin, a specific inhibitor of the replicative DNA polymerases, on the excystation and metacystic
development of Entamoeba invadens was examined. The protein profile of metacystic amoebae and their immunogenicity in the presence and absence of aphidicolin were also examined by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis and immunoblotting. Excystation, which was assessed by counting the number of metacystic amoebae after the
induction of excystation, was inhibited by aphidicolin in a concentration-dependent manner during incubation comparedto the controls. Metacystic development, when determined by the number of nuclei in amoeba, was also inhibited byaphidicolin, because the percentage of 4-nucleate amoebae in cultures with aphidicolin during incubation was higher thanthat in cultures without the drug. The addition of aphidicolin to cultures at day 1 of incubation reduced the number ofmetacystic amoebae thereafter compared to cultures without the drug. The inhibitory effect of aphidicolin on excystationand metacystic development was reversed by removal of the drug. Cellular proteins of metacystic amoebae with 4 nuclei,
which were predominant even at day 3 in the cultures with aphidicolin, reacted strongly with rabbit anticyst serum absorbed with trophozoite proteins. In contrast, those of metacystic amoebae with 1 nucleus, which were predominant at
day 3 in cultures without aphidicolin, no longer reacted with the absorbed anticyst serum, suggesting change in the expression of proteins during metacystic development.

[目的] Entamoebaの脱嚢および脱嚢したアメ－バのえ、３日間培養後metacystic amoebaeの数をカウント

発育は感染の成立に とって必須の過程であり、そのし、また虫体当りの核数を求めた。metacystic amoe-

機構の解明は感染予防、新規薬剤開発の標的を探求

baeは 0.05% sarkosyl処理でlysateを調製し、これをするうえで重要である。我々はこれまでこの機構のSDS-PAGEに用いた。イムノブロッティ ングは抗栄解明のため種々の阻害剤を用いて検 討してきた。今養型血清、抗嚢子血清および栄養型抗原で吸収した

回はDNAポリメラーゼ阻害剤アフィディコリンの効

抗嚢子血清を用い常法 により行った。

果を調べるとともに、この過程の発育型の虫体構成蛋白の変化およびそれに対するアフィディコリンの[結果と考察] 種々の濃度のアフィディコリン存在下影響についてもSDS-PAGE/イムノブロッティングにで脱嚢後アメーバ虫体数を比較した結果、濃度に依より調べた。

存した虫体数の減少が認められた。脱嚢後アメーバの発育に伴い、その核数は４核から最後に１核にな[材料と方法] E. invadens栄養型を嚢子形成液に移しる。そこでアメーバの核数により発育に対する効果

３日間培養すること により嚢子を得、この嚢子を栄を調べた結果、アフィディコリン存在下では培養3日

養型培養液に戻すことにより脱嚢を誘導した。その目でも４核のアメーバの割合が対照に比しはるかに際、種々の濃度のアフィディコリンを培養液に加高く、発育の阻害が認められた。アフィディコリン

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)

19を培養 １日目に加えた場合もアメーバ虫体数の減少の培養3日目で大部分を占める１核のアメーバにはが認められた。アフィディコリンを培養 1日目に除存在せず、この過程で遺伝子発現の変化が起こって去することにより虫体数が回復したことから、そのいることが明らかになった。以上の結果から、ア効果は可逆的であった。栄養型、嚢子に対するウサ

フィディコリンがEntamoebaの脱嚢および発育を阻害

ギ抗血清ならびに栄養型抗原で吸収した嚢子抗血清し、それにより遺伝子発現の変化も阻害することがを 用いたイムノブロッティングにより虫体タンパク示唆された。

質の変化を調べた結果、アフィディ コリン存在下で高い割合を占める４核のアメーバには88 kDaおよび[文献]

66 kDaの嚢子特異的タンパク質が存在するが、対照

Makioka, A. et al. (2002). Parasitol. Res., 88: 873-843

爬虫類におけるCryptosporidiumの保有状況
黒木俊郎1，泉山信司2，八木田健司2，宇根有美3，鳥羽道久4，遠藤卓郎2（1神奈川衛研・微生物，2感染研・寄生動物，3麻布大・獣医・病理，4日本蛇族学術研究所）

Occurrence of Cryptosporidium spp. among reptile hosts
Toshiro KUROKI1, Shinji IZUMIYAMA2, Kenji YAGITA2, Yumi UNE3, Michihisa TORIBA4, andTakuro ENDO2 (1Dept. of Microbiol., Kanagawa Inst. of Public Health, 2Dept. of Parasitol., Natl. Inst.
of Infect. Dis., 3Lab. of Vet. Pathol., School of Vet. Med., Azabu Univ., 4The Japan Snake Inst.)
SUMMARY
Waterborne transmission of Cryptosporidium is one of the most prominent public health concerns in drinking-watersafety, since the oocysts are highly resistant to chlorine disinfection. In 2001, high levels of cryptosporidial oocysts weredetected in a community water treatment plant in western part of Japan, where well water was supplied to the consumers
without filtration. Studies by PCR and sequencing revealed that the isolate is identified as the W11 genotype, suggesting
the wild reptile(s) to be the source of contamination. This study aimed at obtaining the prevalence of cryptosporidial
infection among reptiles in Japan, which might again be microbial contaminants of drinking-water. A total of 598 stool
samples from wild reptiles, including snakes, lizards and tortoises, and 524 samples from captive bred reptiles, mostly
exotics, were examined occurrence of Cryptosporidium by means of sedimentation method followed by fluorescent antibody staining. Only one domestic wild lizard was positive for Cryptosporidium, whereas 45 bred reptiles were positive.
Until now 14 isolates were genotyped and obtained 4 distinct species/genotypes; C. serpentis (1), C. saurophilum (9), C.
parvum bovine genotype (3) and C. andersoni (1), though the latter 2 might have originated from the food fed that had
transiently been shed into feces.

[目的] Cryptosporidiumは塩素耐性を有し、大きさが水源として利用し、ろ過処理なしの塩素消毒のみで5 µm 程度と小さく浄水処理では完全に除けないこと

給水していたことから、オーシストによる井戸水のから、水道を介した集団感染が生じる恐れがあり問

汚染は上水の汚染に直結した。汚染源の把握を目的

題となっている。平成13年に、ある簡易水道においとしてオーシストの遺伝子型別を実施した結果、爬てCryptosporidiumによる汚染事例が発生し、給水停

虫類由来と推定される配列W11型と100％一致した。

止に至った (1)。問題となった簡易水道では井戸水をこれに呼応して、地域住民に患者は認められなかっ原生動物学雑誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年

20た。井戸の汚染は周辺に棲息する爬虫類動物に由来た。トカゲ類とヘビ類を扱う8施設中7施設でオーシするものと考えられたが、汚染原因は未だ不明であストが検出された。国内で飼養されている爬虫類にる。爬虫類に寄生するCryptosporidiumに関する情報

Cryptosporidiumが蔓延しており、環境汚染が憂慮さは国内外共に限られており(2,3)

、本研究では野外および飼養されている爬虫類における保有状況の調査を
行った。

れる。
これまでに国内の爬虫類より得たオーシストの遺伝子型別を行った結果、C. serpentisの配列が1試料か
ら、C. saurophilumの配列が9試料から得られた。そ[材料と方法] 野外に生息する爬虫類の試料としてカの他にC. parvumの配列が3試料から、C. andersoniが1

メ類8種345検体、トカゲ類3種76検体、ヘビ類4種177

試料から得られたが、これらについては餌由来であ検体の計15種598検体を得た。トカゲ類とカメ類は関る可能性を含め、再検討する必要があるものと考え

東地方での採取が多く、ヘビ類は青森から宮崎までている。ちなみに、井戸水のオーシストより取得さの広い地域より採取した。動物飼養施設で飼育されれたCryptosporidium sp. W11型の配列は得られなかっている爬虫類の試料は9施設の協力の下、カメ類51種

た。

151検体、トカゲ類47種181検体、ヘビ類64種185検体、ワニ類6種7検体の計168種524検体を得た。本調[文献]

査では糞便を検査対象とし、FEA法による固定と濃1) 辻英高、押部智宏、小野一男、近平雅嗣、増田邦縮を行なった。沈渣をCryptosporidiumのオーシスト

義、山本昇五、八木田健司、遠藤卓郎 簡易水道

壁に特異的な蛍光抗体（Aqua-Glo G/C Direct FL、から検出された爬虫類由来のクリプトスポリジウ

Waterborne）で染色した。同時にDAPIを用いた核酸

ム染色を行なった。微分干渉蛍光顕微鏡を用いて染色
試 料 を 観 察 し、特 異 蛍 光、細 胞 核、形 態 を 根 拠 にオーシストの同定を行った。
PCRは18S rDNAの一部領域を標的としたJohnson
らの方法を用いた（4）。得られたPCR産物の塩基配列を決定し、既存の配列との相同性を確認した。

2002年感染症学会講演要旨集

2002 76:680-681
2) 黒木俊郎、宇根有美、遠藤卓郎
トスポリジウム感染

感染症学雑誌

爬虫類のクリプ野生動物医学会誌 2003

8:27-34.
3) Xiao L, Ryan UM, Graczyk TK, Limor J, Li L, Kombert M, Junge R, Sulaiman IM, Zhou L, Arrowood
MJ, Koudela B, Modry D, Lal AA. Genetic diversity[結果と考察] 野外の爬虫類15種598検体の中で、唯一ニホンヤモリの1個体からオーシストが検出されof Cryptosporidium spp. in captive reptiles.

Appl

Environ Microbiol. 2004 Feb;70(2):891-9.

た。野外の爬虫類全体から見た感染率は0.2％であ4) Johnson DW, Pieniazek NJ, Griffin DW, Misener L,

り、Cryptosporidiumの感染は極めて稀であった。飼Rose JB. Development of a PCR protocol for sensi-

養 さ れ て い る 爬 虫 類 で は 複 数 の 個 体 でtive detection of Cryptosporidium oocysts in water

Cryptosporidiumの感染が確認され、ワニ類、トカゲ

samples.

類、並びにヘビ類ではいずれも10％程度の感染率を(11):3849-55.

示した。一方、カメ類での陽性率は2％と少なかっAppl Environ Microbiol. 1995 Nov;61

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)21

赤痢アメーバのゲラニルゲラニル転移酵素I型の解析
熊谷正広1, 牧岡朝夫1, 竹内 勤2, 野崎智義3,4 （1慈恵医大・熱帯医学, 2慶大・熱帯医学・寄生虫学, 3感染研・寄生動物, 4 PRESTO・科技団）

Molecular cloning and characterization of a protein geranylgeranyltransferase
type I from Entamoeba histolytica
Masahiro KUMAGAI1, Asao MAKIOKA1, Tsutomu TAKEUCHI2 and Tomoyoshi NOZAKI3,4( Dept. Trop. Med., Jikei Univ. Sch. Med., 2Dept. Trop. Med. Parasitol., Keio Univ. Sch. Med., 3Natl.
Inst. Infect. Dis. 4PRESTO, JST)
1

SUMMARY
Protein prenylation is essential for the Ras superfamily small G proteins to function. Protein prenylation includes
protein farnesylation and protein geranylgeranylation, which are catalyzed by protein farnesyltransferase (FT), protein
geranylgeranyltransferases type I (GGT-I) and type II. FT and GGT-I have attracted attention as an anti-cancer agent,
and attempts have been made to use the enzymes as a target of anti-protozoan chemotherapy. Following the study on FTof Entamoeba histolytica (Eh), we characterized EhGGT-I. The α subunit of EhGGT-I was shared with FT. The β subunit of EhGGT-I had 337 amino acids, and showed 22 to 28% identities to those of other organisms. The recombinant
EhGGT-I, expressed by Escherichia coli, was a complex of 38 kD and 35 kD proteins. The rabbit anti-EhGGT-I serum
did not reacted with rat GGT-I, showing difference in antigenicity. Rat GGT-I geranylgeranylates human mutant H-RasCVLL, but does not H-Ras-CVLS. EhGGT-I, however, geranylgeranylated both substrates. In mammals, Ras proteinsare farnesylated by FT, and Rac proteins are geranylgeranylated by GGT-I. In contrast, EhGGT-I geranylgeranylated
Ras proteins as well as Rac proteins. To inhibitors for mammalian GGT-I, EhGGT-I was much more resistant than rat
GGT-I. In conclusion, EhGGT-I was significantly different from mammalian GGT-I in substrate specificity and sensitivity to the inhibitors, and thus EhGGT-I would become a possible chemotherapeutic target of amoebiasis.

[目的] Ras スーパーファミリーの低分子量 G タンパてファルネシル化され、Rho/Rac ファミリーでは X

ク質は細胞内の分子スイッチとして、細胞の増殖、は L、F で GGT-I によってゲラニルゲラニル化され分化、細胞内小胞輸送等の制御に関与している。こる。一方、GGT-II は Rab (CC または CXC モチーフ)

れらのタンパク質の細胞内膜構造への結合および機に特異的に作用する。我々は赤痢アメーバ (Eh) の増能発現には、プレニル化とよばれる翻訳後脂質修飾

殖と分化における制御因子として、また、化学療法が必須である。プレニル化にはファルネシル基が転の標的分子として、プレニル化酵素の解析を行って移されるファルネシル化とゲラニルゲラニル基が転おり、先に、FT の 1 次構造および組換え酵素の性状移されるゲラニルゲラニル化があり、それぞれファについて報告した。今回は Eh の GGT-I について解

ルネシル転移酵素 (FT)、ゲラニルゲラニル転移酵素

析した。

I 型および II 型 (GGT-I, GGT-II) により触媒される。
これらの酵素はαおよびβサブユニットからなる２量[材料と方法] Eh の ゲノム・データベースから相同体で、FT と GGT-I のαサブユニットは同一である。

検索により EhGGT-I の N 末端と C 末端の配列を見つ

Ras および Rho/Rac ファミリーの低分子量 G タンパ

け、PCR プライマーを設計し、cDNA ライブラリー

ク質はその C 末に CaaX モチーフ (C はシステイン、をテンプレイトとしてクローニングを行なった。

a は脂肪族アミノ酸、X は何らかのアミノ酸) をも

EhGGT-I は、発現プラスミドを作成して大腸菌に発ち、このシステインにプレニル基が結合する。Ras

現させ、付加したヒスチジン・タグを用いて精製しファミリーでは X は主として S、M、Q で FT によった。酵素活性は低分子量 G タンパク質への [3H] ゲラ

原生動物学雑誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年

22

ニルゲラニル・ピロリン酸の取り込みによって測定

ルネシル化され、GGT-I によってゲラニルゲラニル

した。阻害効果については、種々の濃度の阻害剤存化されるのに対し、EhGGT-I は, EhRacA-CLLF や在下での酵素活性の低下率から IC50 を求めた。近隣

EhRacG-CSLF の よ う な Rac の み な ら ず、EhRas1-

結合法による系統樹は ClustalW と TreeView を用い

CIMF や EhRas2-CELL のような Ras をもゲラニルゲて作成した。

ラニル化した。哺乳類の GGT-I 阻害剤に対して、[結果と考察] GGT-I のαサブユニットは FT と共通で性であった。

EhGGT-I はラット GGT-I に比べて 8 から 500 倍抵抗ある。EhGGT-I のβサブユニットは、337 アミノ酸か以上のことから、Eh の GGT-I は、基質特異性も阻らなり、他種生物と 22 から 28％の相同性があっ

害剤に対する感受性も哺乳類の GGT-I と著しく異た。系統解析を行なったところ、EhGGT-I のβサブユなっていることが明らかとなり、生物の多様性といニットは他種生物のものとは離れており、独自の進う点から興味深いのみならず、抗アメーバ薬の標的化をしたものと考えられた。大腸菌に発現させた組としての可能性が示唆された。

換えタンパク質は、38 kD と 35 kD の複合体として精製された。ウサギを免疫して得た抗 EhGGT-I 血清は[文献]

EhGGT-I と反応したが、ラット GGT-I とは反応せ

1) Zhang F.L. and Casey P.J.(1996) Annu. Rev. Biochem.,

ず、抗原性に違いが認められた。ラット GGT-I がヒトの変異型 H-Ras-CVLL を基質とし、H-Ras-CVLS を
基質としないのに対し、EhGGT-I は両方を基質とし

65: 241-269.
2) Kumagai, M., Makioka, A., Takeuchi T. and Nozaki T.
(2004) J. Biol. Chem., 279: 2316-2323.

た。哺乳類では、Ras タンパク質は FT によってファ18S rDNAに基づく放散虫類の分子系統関係
湯浅智子1，高橋 修2，真山茂樹3，本多大輔4，松岡 篤5，Kjell R. Bjørklund6（1東学大・院教・自然系教育，2東学大・教・地学，3東学大・教・生物，4甲南大・理工・生物，5新潟大・理・地質科学，6Oslo Univ.）

Phylogenetic position of Radiolaria based on 18S rDNAs sequences
Tomoko YUASA1, Osamu TAKAHASHI2, Shigeki MAYAMA3, Daisuke HONDA4,
Atsushi MAYSUOKA5 and Kjell R. BJØRKLUND6
1( Div. Math.Natural Sci. Edu., Grad. Sch. of Edu., Tokyo Gakugei Univ., 2Dept. Astro. and Earth
Sci.,Tokyo Gakugei Univ., 3Dept. Biology,Tokyo Gakugei Univ.,4Dept. Biology, Fac. Sci. and Engineering, Konan Univ.,5Dept. Geology , Fac. Sci., Niigata Univ.,6Paleont. Musium, Oslo Univ.)
SUMMARY‘Radiolaria’ (classes Acantharea, Polycystinea, and Phaeodarea) are planktonic protists widely distributed in tropical,
subtropical, and even polar marine environments. Some recent studies based on 18S rDNA sequences have reported that
the Polycystinea and the Acantharea form a monophyletic group, but the Phaeodarea branch with the phylum Cercozoa,
separately from the Polycystinea and the Acantharea (Polet et al., 2004). Here we show the phylogenetic relationships of‘Radiolaria’, using the 18S rDNA regions of the solitary shell-bearing polycystines and phaeodarians. Their molecularanalyses have never been reported. Phylogenetic analyses of our sequences indicate that the Polycystinea and the Acantharea are monophyletic, and the Phaeodarea diverge with the phylum Cercozoa as already suggested by Polet et al.

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)

23(2004). Furthermore, the Polycystinea were shown to be a paraphyletic group in the ‘Radiolaria’. These conclusions are
not consistent with the current taxonomy of ‘Radiolaria’, and lead us to consider that the collosphaerid, sphaerozoid, andthalassicollid spumellarians and the pterocorycid nassellarians may have evolved from an ancestor with triradiatebranched spicules.

[ 目 的 ] “ 放 散 虫 ”（Acantharea 綱，Polycystinea 綱，

et al. (2004)の結果と同様に，Cercozoaに属する種ととPhaeodarea綱）は，海洋に生息する浮遊性原生生物でもに単系統を形成した． Phaeodarea綱については，ある．それらの系統関係は，これまで主に現世堆積

遊 走 子 の 鞭 毛 の 数 や 殻 の 形 態 的 な 特 徴 な ど，

物中の，あるいは生層序学的に解析された微化石のCercozoa に 属 す る 種 と の 類 似 性 が 見 ら れ る こ と形態に基づいて議論されてきたが（e.g., Anderson,（Polet et al., 2004），また，Polycystinea綱について

1983），近年，18S rDNA領域を用いた系統解析が進は，Acantharea綱の殻と同成分のSrSO4 を含む遊走子

められ，最近の報告ではAcantharea綱とPolycystinea綱をつくることや共生藻を持つことなど，Acantharea綱が姉妹群を形成し，Phaeodarea綱はCercozoa内で単系との類似性が指摘されている（Anderson, 1983）．

統になることが示されている（Polet et al., 2004）．

一方、Polycystinea綱とAcantharea綱の系統関係を調

しかし，Polycystinea綱とPhaeodarea綱の大部分を占べ た 29 種 デ ー タ セ ッ ト で は、Polycystinea 綱

める有殻単体性の種は未だ解析されておらず，本研

Spumellarida 目 の 群 体 性 と 無 殻 単 体 性 種 は 同 じ く

究では，この有殻単体性種の18S rDNA領域を用い系

Polycystinea綱のNassellarida目と、Spumellarida目のう統解析を試みた．

ちの有殻単体性種はAcantharea綱とそれぞれ単系統を形成した．KH testおよびSH testを用いてこの結果を[材料と方法] 今回用いたDictyocoryne truncatum，D.

検定し、合意系統樹を構築してみると、(1) Spumel-

profunda，Spongasterelegans，

larida目の群体性と無殻単体性およびNassellarida目、

furcartum の 6 種(2) Spumellarida目の有殻単体性、(3) Acantharea綱のTriastrum

tetras，Euchitonia

aurivillii，Dicranastrum（Polycystinea

目），Eucyrtidium

少なくとも3つのクレードに分けられることが指示さ

hexagonatum，Pterocorys zancleusの2種（Polycystinea

綱，Spumellarida

れた．この結果についても、殻骨格構造において共綱，Nassellarida 目），お よ び Protocystis

xiphodon

通する形態的特徴を見ることができる．群体性およ（Phaeodarea 綱）は 沖 縄 県 瀬 底 島 沖 合 で，び無殻単体性種のSpumellarida目は三叉状の骨針を細Conchellium capsula（Phaeodarea綱）は新潟県佐渡島

胞 質 内 に 持 っ て い る が、こ の 三 叉 状 の 骨 針 は沖合で，Challengeron diodon（Phaeodarea綱）はノル

Nassellarida 目 の 内 部 基 本 骨 格 に 類 似 し て い る．まウェーのソグンダルフィヨルドで採集されたものでた、Spumellarida 目 の 有 殻 単 体 性 の 骨 格 は、ある．それぞれ1個体のみを単離し，共生している藻

Acantharea綱の放射状の骨格と類似している．これら類を取り除き，PCR，クローニング，そして塩基配の形態的特徴の類似性は、18S rDNAによって示され

列解析を行った．その後，2つのデータセット（57種

るPolycystinea綱（Spumellarida目）の側系統の関係を

および29種）を用い，NJ法，MP法，ML法によって支持しているものと考える．

系統樹を構築し，さらに，29種データセットについてはKH testとSH testによって検定を行った．

[文献]1) Anderson, O. R. (1983) Radiolaria, Springer-Verlag,[結果と考察] 真核生物内での放散虫の系統関係を調べ た 57 種 デ ー タ セ ッ ト で は，Polycystinea 綱 はAcantharea綱と単系統を形成し，Phaeodarea綱はPoletNew York.
2) Polet, S., Berney, C., Fahrni, J., and Pawlowski, J.
(2004) Protist, 155, 53-63.

24

原生動物学雑誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年

Naegleria fowleri 総タンパク質のアミノ酸配列解析— 2D-PAGEデータベースの拡充を目指して —小村麻子，八木田健司，泉山信司，下河原理江子，遠藤卓郎（国立感染症研究所・寄生動物）

Amino acid sequence analysis on Naegleria fowleri proteins separated by 2D-PAGE
Mako OMURA, Kenji YAGITA, Shinji IZUMIYAMA, Rieko SHIMOGAWARA and Takuro ENDO
(Dept Parasitol., NIID, Japan)
SUMMARY
We have established and released partially on a website as database of 2D-PAGE map of Naegleria fowleri total
proteins obtained by a combination of 2D-PAGE image analysis with direct N-terminal amino acid analysis. Until now,
N-terminal sequences of 38 proteins out of 59 major proteins spots examined have been successfully determined. Further, internal sequences of 11 and 24 proteins have, then, been analyzed along either with Cleveland peptide mapping orwith EST-IT tandem MS followed by similarity search for known proteins against NCBInr database using Mascot searchengine, and 3 and 4 proteins were identified with high confidence as cyclophilin, nucleoside diphosphate kinase andisocitrate dehydrogenase [NADP], and MP2CL5, N.fowleri HSP70, albumin and actin , respectively. In addition, MS/MS
spectra have been de novo sequenced by means of PEAKS Studio v2.4 and revealed many peptide candidates from eachof 24 spots. The methods reported in the present experiments showed an ultimate advantage for the identification of theproteins from the internal sequences of protein spots especially of which N-terminal are blocked like many of those ofN.fowleri. The 2D-PAGE database will be updated spot by spot without delay for public access.

[目的] 本研究では強い病原性を持つNaegleria fowleri

出し、1次元目はｐH3-10、18cmイモビリンストリッと非 病原性のN. lovaniensisの総 タンパク質に ついプ（Amersham biosciences社）、2次元目は12.5％ゲルて、2D-PAGEによる比較を行ってきた(1,2,3)。2種そを用いて2D-PAGEを行った。2D-PAGE後CBB染色しれぞれのスポットパターンの特徴が判明したこと

たゲルを乾燥させた後、クリーブランド法によるペで、N. fowleriの1株の2D-PAGEゲルから、種特異的

プチドマッピングを行った。目的のスポットを切り

あるいは2種間共通な特徴を持つタンパク質を選択で出し、濃縮ゲルの高さを5cmとしたSDS-PAGEゲル

きるようになった。この情報をもとにスポットの解(20％ ) の ウ ェ ル に 入 れ、Tris-SDS 緩 衝 液（125mM

析を進め、得られた情報を統合するため、N. fowleri2D-PAGEデータベースを構築した。プロテオミク

Tris-HCl (pH6.8), 0.1% SDS, 10% Glycerol, 5% 2ME）を加えてゲル片を膨潤した。S. aureus V8 prote-

スの主流であるMALDI-TOF MSを用いたPeptide massase を溶解したTris-SDS緩衝液（125 mM Tris-HCl(pHfingerprinting（PMF）法はデータベースの充実してい6.8), 0.1% SDS, 5% Glycerol) を各ウェルに重層して電ないNaegleria 属アメーバの解析には不向きであるた

気泳動を開始した。試料のバンドが濃縮ゲルの下端

め、これまではN末端アミノ酸配列解析を中心としに濃縮されたところで１時間泳動を停止してタンパ

たスポット解析を行ってきたが、中間配列について

ク質の部分酵素分解を行った。その後泳動を再開も解析する必要があった。今回はデータベース情報

し、終了後にPVDF膜にブロットし、得られたペプチの拡充を目的に、より簡便な中間アミノ酸配列解析

ド のバン ドを気 相シー クエン サー (Procise cLC494

法として、クリーブランド法によるペプチドマッピ(Applied Biosystems社))で解析した。LC-MS/MS解析

ングを中間配列解析に応用した(4)。さらにより迅速

では2D-PAGE後スポットを切り出し、Trypsinによるな解析法としてLC-MS/MS解析を行い、MS/MSデー

ゲル内消化の後、抽出液を試料とした。HPLC部にタのde novo Sequencing を試みた。

MAGIC2002（Michrom BioResources 社）、質量 分 析
部 に は LCQ-Deca XP（ESI-IT MS (Thermo Electron[材料と方法] N. fowleriNf66株から総タンパク質を抽社)）を用いた。得られたMS/MSデータはMascotプロ

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)

25

グラムを用いてNCBInrデータベースと照合した。

novo Sequencingを行い、得られた配列がMascotサー

MS/MSデータの de novo Sequencing にはPEAKS Stu-

チの結果とよく一致したことを確認した。さらに未dio v2.4 (infocom 社）を用いた。

知のスポットからもそれぞれ複数の中間配列情報を得た。MS/MS解析による de novo Sequencing では質[結果と考察] N末端ブロックあるいはN末端アミノ量で区別できないアミノ酸やジペプチドが一部含ま

酸配列では未知のスポットについて、中間アミノ酸れるため、候補となる配列が複数生ずる不都合もあ

配列解析を試みた結果、シークエンシング可能なペるが、Naegleriaのように未知のタンパク質が多い試

プチド11個を得、その内3個のスポットは相同性検索料について質量分析を行う場合は、部分配列情報をにより同定できた。クリーブランド法による解析で得ることができるMS/MS解析を中心に進めるのが妥

は1サンプル当たり100 pmol 以上を要し、したがって

当だと考えられた。

複数枚の2D-PAGEゲルが必要となるが、培養が容易なNaegleriaは比較的タンパク量を確保しやすいこと[文献]から、中間アミノ酸配列解析を効率的に行う上でク

1) Omura, M. et al. (2002) Jpn. J.Protozool., 35: 33-33.

リーブランド法は有効であると考えた。MS/MS解析

2) Omura, M. et al. (2003) Jpn. J.Protozool., 36: 22-23.

を行った24個のスポットの内4個がMascotサーチによ3) Omura, M. et al. (2004) Jpn. J.Protozool., 37: 91-93.

り同定できた。また同定できたMS/MSデータで de4) Woo, SH. et al. (2002) Electrophoresis, 23: 647-654.

テトラヒメナで得られた分子量 60 kDa の微小管結合蛋白質の解析松井孝憲1，徳楽清孝2，島崎由佳1，小谷 享3（1九工大・情報工・生物，2都城高専・物質，3神奈川大・理・生物）

Characterization of the 60 kDa microtubule-associated proteinfrom Tetrahymena pyriformis
Takanori MATUI1, Kiyotaka TOKURAKU2, Yuka SHIMAZAKI1, Susumu KOTANI3(1Dep. of Biochim. Engineering and Sci., Fac. of Comp. Sci. and Sys. Engineering, Kyushu Inst. of
Tech., 2Dep. of Chemical Sci. and Engineering, Miyakonojo Natl. College of Tech., 3Dep. of Biol.
Sci., Fac. of Sci., Kanagawa Univ.)
SUMMARYIn preparing the microtubule-associated proteins (MAPs) of Tetrahymena pyriformis, we identified three polypeptides, with apparent molecular masses of 90 kDa, 60 kDa, and 37 kDa, that co-sedimented with taxol-stabilized mammalian microtubules. The 60 kDa MAP was heat-stable. Using this characteristic, the protein was purified to homogeneity,
and was further characterized biochemically. Partial amino acid sequences of the 60 kDa MAP were homologous tothose of Xenopus XMAP215. The 60 kDa MAP enhanced both the initial rate and the plateau level of mammalian tubulin
polymerization, in a concentration-dependent manner. Electron microscope observations showed that the assembled
structures were normal microtubules. The 60 kDa MAP existed abundantly in the soluble fraction, rather than the membranous one, as revealed by a partial cell fractionation. Immunofluorescence microscope observations using anti-60 kDa
MAP antibody also revealed that the 60 kDa MAP existed in the cytoplasm. The 60 kDa MAP appeared as particles,
suggesting that the 60 kDa MAP was associated with granules or vesicles. The cellular 60 kDa MAPs were mostly co-

原生動物学雑誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年

26

図1 60 kDa MAPとXMAP215ファミリーのアミノ酸配列比較
60 kDaMAPから得られたアミノ酸配列とアフリカツメガエル（XMAP215）、ヒト（ch-TOG）、ショウ
ジョウバエ（Msps）、線虫（Zyg-9）、シロイヌナズナ（Mor1）、細胞性粘菌（DdCP224）の配列の一部。
XMAP215ファミリーの各メンバーはXMAP215と相同性を比較して、最も一致するように並べた際の前後10残基を含めて示した。XMAP215と相同なアミノ酸残基は白字で示し、残基数はかっこ内に示した。

localized with cytoplasmic microtubules, while some of the 60 kDa MAPs were situated near microtubules, but without
clear associations. Nocodazole treatment resulted in a change in the 60 kDa MAP localization, which probably accompanied the disruption of microtubule networks.

[目的] 微小管には微小管結合蛋白質（MAPs）と呼フィー、Taxol安定化微小管との共沈などを経て精製ばれる多種多様な蛋白質が結合しており、細胞内のした1。

微小管の機能に深く関わっている。我々はテトラヒ

チューブリンの重合は350nmの波長で測定し（濁メナをモデル細胞として用いMAPsの生理機能を明ら度法）、微小管のサンプルを逆染色しJEOL社のJEM-

かにしたいと考えている。そのためにはin vitroとin100Sで電子顕微鏡観察をおこなった。間接蛍光抗体

vivoの両面からMAPsの解析をおこなう必要があっ

法は抗チューブリン抗体と抗60kDaMAP抗体を用いた。そこで我々は、まずテトラヒメナからMAPsを得て藤生らの方法2に従いおこなった。

て生化学的な解析をおこない、そのMAPsの細胞内の挙動を調べようと考えた。得られたMAPs画分には三[結果] テトラヒメナの粗抽出液からTaxol安定化微種類のMAPsが含まれた。そのうち、新規に得られた小管との共沈でMAPs画分を得た。そのMAPs画分にみかけの分子量が60kDaのMAPについて、そのアミは再現的に90kDa、60kDa、37kDaの三つのMAPsが得ノ酸配列やチューブリン重合促進活性と細胞内の局られ、60kDaMAPの詳しい解析をおこなった。37kDa

在を調べた。

のMAPはグリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素であり、既知の蛋白質であった。60kDaMAPは熱安定[方法] テトラヒメナ(T. pyriformis W株)は筑波大学のな蛋白質であった。哺乳類の熱安定なMAPの一つで沼田先生に頂いた。PYD培地中26℃で二日培養し、

あ る Tau と 分 子 量 が 似 て い た が、哺 乳 類 の MAPs

破砕後に超遠心分離で得た上清を粗抽出液とした1。

（MAP2、MAP4、Tau）と は 免 疫 交 叉 性 を 示 さ な

粗抽出液からTaxol安定化微小管との共沈でMAPs画

か っ た。ま た 60kDaMAP か ら 得 ら れ た 8 残 基分を得た。60kDaMAPはテトラヒメナの粗抽出液か(QRIERLEE)と9残基(APTKEVEEK)のアミノ酸配列は

ら熱処理、DEAE-セルロースカラムクロマトグラ

アフリカツメガエルのMAPであるXMAP215と高い相Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)

同性を示した。精製した60kDaMAPを用いてチュー27

わ た っ て 相 同 性 な メ ン バ ー で あ る XMAP215 と ch-

ブリン重合促進活性を調べた。すると濁度法の結TOGにしか保存されていなかった（図1）。二つの配果、60kDaMAPは濃度依存的にチューブリンの重合

列 を 得 た 限 定 分 解 後 の 断 片 の 分 子 量 か ら、を促進し、電子顕微鏡観察では典型的な微小管が観60kDaMAPはXMAP215のC端側に相当する分子では察された。間接蛍光抗体法の結果、60kDaMAPのほ

ないかと考えている。

とんどは粒状に光って細胞質に存在していた。ま分裂中のテトラヒメナは細胞質に発達した微小管

た、細胞質の60kDaMAPの多くは微小管上に局在し網を持つ2。今回60kDaMAPは主に可溶性画分に回収ていたが、いくつかは微小管上にはおらず微小管のされ、間接蛍光抗体法の結果でも60kDaMAPは主に近くに局在していた。ノコダゾール処理した細胞で細胞質の微小管と結合していた。60kDaMAPは粒状

は微小管の崩壊に伴う60kDaMAPの局在の変化が見に光って見えたことから、細胞質の顆粒や小胞体とられた。

結合している可能性がある。また、チューブリン重合促進活性を持っていたことから、60kDaMAPは細[考察] 今回、テトラヒメナから得た60kDaMAPは胞質微小管の調節に関わっている可能性がある。

チューブリン重合促進活性を持つテトラヒメナの新規のMAPであった。60kDaMAPから得られた8残基と[文献]9残基のアミノ酸配列はXMAP215と高い相同性を示

1) Matui,T., Tokuraku,K., Shimazaki,Y. and Kotani,S.

した。XMAP215は広範囲の種にわたって保存された
MAPのファミリーに属しており、各メンバーは微小管のダイナミクスを調節することで知られている3。
二つの配列のうち、QRIERLEEはファミリーの各メンバーに保存されているが、APTKEVEEKは全長に(2004) Jpn. J. Protozool. 37,11-18.
2) Fujiu,K. and Numata,O.(2000) Cell Motil. Cytoskeleton
46,17-27.
3) Ohkura,H., Garcia,M.A. and Toda,T.(2001) J. Cell
Sci.114,3805-3812.

テトラヒメナの細胞分裂における細胞質オルガネラの分配
菅井俊郎（茨城大・理・自然機能）

Division inheritance of free cytoplasmic organelles in Tetrahymena thermophila
Toshiro SUGAI(Department of Materials and Biological Sciences, Faculty of Science, Ibaraki University)
SUMMARY
Cells of Tetrahymena thermophila are full of membrane-bound cytoplasmic organelles such as food vacuoles orlysosomes that are free in the cytoplasm, while all mitochondria are attached to the cell cortex. There is no protoplasmic
streaming. When cells were slightly starved, cytoplasmic organelles were found in the posterior half of a cell. Whenthese cells divided, cytoplasmic organelles moved from this posterior position to the surface of the macronucleus (MAC)
just after completion of micronuclear division and covered the whole surface of the MAC. During division, cytoplasmic
organelles were partitioned almost equally to the daughter cells by hitchhiking on the dividing MAC, and they dispersed
into the cytoplasm just after MAC division and before separation of the daughter cells. The MAC is the partition apparatus for cytoplasmic organelles. Similar partition was also observed in T. pyriformis W. During the first division of exconjugants after conjugation, there is no MAC division. Organelles located in the posterior part of exconjutants also moved
to the central part of the cell and partitioned almost equally to daughter cells. This shows that Tetrahymena cells haveprecise mechanisms for organelle partitioning.

28

原生動物学雑誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年[目的] 細胞分裂の際、染色体は正確に娘細胞に分配

ヒッチハイクする形で娘細胞にほぼ均等に配分されされるが、細胞質のオルガネラに関しては一般にはた。細胞質分裂が完了する前に、オルガネラは大核

ランダムに分配されると考えられている。テトラヒから離れて細胞質に分散し、娘細胞の分離後、またメナ細胞ではミトコンドリアは細胞皮層に付着して細胞後部に移動した。この現象は、対数増殖期でもいるが、細胞質には食胞やリソゾームなどの遊離の観察され、またT. pyriformis Wでも同様に見られるこ

オルガネラが充満している。これらの遊離オルガネとがわかった。微小管阻害剤のBenomylで細胞を処

ラが細胞分裂の際にランダムに分配されるのかにつ理すると、大核の位置が細胞中心より動くが、オル

いて、オルガネラの数を減少させて生細胞で調べ

ガネラはやはり位置のずれた大核表面にあり、分裂た。

溝が入る細胞の中心に位置することはなかった。

[材料と方法] Tetrahymena thermophila inbred strain

細胞分裂では大核は分裂せずに娘細胞に１個ずつ配B、およびT. pyriformis Wを使用した。最近開発した分される。この時のオルガネラの配分を観察した結細胞を透明にする培地（T培地）で培養し、対数増殖

果、細胞後部にあったオルガネラは細胞の中心, 特に期の細胞分裂と、T. thermophila については10mM

新大核の間に移動し、やはり均等に配分されること

Tris中で軽い飢餓状態にして、異なる交配型の細胞とがわかった。 テトラヒメナ細胞には、細胞質内の多接触させて誘導される細胞分裂について主に調べ数の遊離のオルガネラを均等に配分する機構が存在た。観察は全て生細胞について行い、主に位相差をすることがわかった。大核が分裂する通常の細胞分接合後、新大核を２つ持つ接合完了体は、最初の使用した。蛍光観察では、DNAはHoechst 33342で,裂では、大核が分配装置であり、接合完了体では細リソゾームはアクリジンオレンジで染色した。

胞の中心にオルガネラが集まり、そこで分裂溝が入って均等分配されることがわかった。この場合、[結果と考察] ペプトン培地のような栄養豊富な培地

細胞の中心は新大核の間であり、やはり核に集まる

中では、テトラヒメナ細胞は、通常食胞が充満してという可能性がある。大核と細胞の皮層の間には微いて内部が観察できない。飢餓状態にすると、遊離小管が存在し、分裂期には核から前後方向と分裂溝のオルガネラの数が減少し、小さい少数のものは、ができる部分との間によく発達する（Fujiu and Nu-

細胞前端と口部装置付近にあるが、大部分は細胞のmata, 1999）。オルガネラの移動のパターンは、この後部に局在する。本種では原形質流動は認められな微小間の分布のパターンとほぼ同じであり、微小管かった。細胞内の小さいオルガネラは、通常の跳躍阻害剤によっても影響をうけたので、微小管上を移運動を行い、方向はランダムであった。飢餓状態で動している可能性が高い。

あっても異なる交配型の細胞を混合すると、細胞分このような劇的な現象が、モデル生物の一つであ裂が誘導される。こ細胞分裂では、最初に小核が分るテトラヒメナで発見されたことは、単細胞生物で裂し長いspindleを形成した。小核の分裂が完了したは生細胞の観察方法が未開拓であり、これから有望直後に大核が不規則な形になるが、後部にあったオな方向であることを意味すると思われる。

ルガネラはこの時期に、大核表面に移動した。オル
ガネラは大核に直接付着してはおらず表面付近で細[文献]

かい運動を繰り返し、大核表面全体に分布するようFujiu, K. and Numata, O. (1999) Cell Struct. Funct.,になった。オルガネラは、その後分裂する大核に

24:401-404

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)29

繊毛虫ブレファリズマにおけるガモン１遺伝子のゲノム配列とその上流配列の決定
高見梨沙1，杉浦真由美2，春本晃江2（1奈良女大院・人間文化・生物科学，2奈良女大・人間文化・共生自然科学）

Determination of the genomic sequence and the upstream sequence of thegamone 1 gene in the ciliate Blepharisma japonicum
Risa TAKAMI1, Mayumi SUGIURA2 and Terue HARUMOTO2(1Div. of Biol. Sci., Grad. Sch. of Human Culture, Nara Women’s Univ., 2Dept. Biol. Sci. and Environ., Grad. Sch. of Human Culture, Nara Women’s Univ.)
SUMMARY
In the conjugation of Blepharisma japonicum, cells of complementary mating types I and II participate in the interaction which leads to mating pair formation. Pair formation is induced by conjugation-inducing substances, called gamones, which are secreted by cells of each mating type. Gamone 1 is not constitutively secreted, but is secreted exclusively by moderately starved, sexually mature type I cells. Moreover, synthesis of gamone 1 is further promoted by gamone 2 which is secreted by cells of mating type II. It was clearly shown in our laboratory that the expression of gamone 1 was regulated by its transcription level in various conditions. In this study, we aimed to find the transcription
regulatory region of the gamone 1 gene. First, we determined the genomic sequence of the gamone 1 gene, and foundthat an intron was not included in the gene. Second, we amplified the 5'-flanking region of the gamone 1 gene using
inverse PCR, and an upstream sequence of 868 bp was determined. The sequence contained a proximal sequence element(PSE)-like sequence, which is considered to be the transcriptional regulatory sequence for RNA polymerase III, a TATAbox sequence, CCAAT box sequence, and several recognition sequences of various transcription factors.

[目的] Blepharisma japonicumには相補的な接合型で[材料と方法] ブレファリズマのI型細胞（B. japoni-

あるI型とII型がある。性的に成熟し、かつ適度な飢

cum, R1072株）からゲノムDNAを抽出し、ガモン１

餓状態にある両者が出会うと、接合対が形成され、のcDNA配列のほぼ端と端からORFを全て含むように一連の有性生殖過程が引き起こされる。この接合対設計したプライマーを用いてPCRを行い、増幅され形成は、それぞれの細胞が放出するガモンという物

たPCR産物のクローニング及びシークエンスを行っ

質により誘導される。これまでに、I型細胞が合成た。さらに、決定した配列から新たにプライマーをし、分泌する接合誘導物質であるガモン１のcDNAの設計し、Sau3 AI, Hind IIIによってそれぞれ制限酵素

塩基配列が決定され、またガモン１の発現は接合処理したゲノムDNAを用いてインバースPCRを行型、性成熟度、栄養条件、ガモン２などの条件によい、増幅されたインバースPCR産物のクローニング

り転写レベルで制御されていることが本研究室によ及びシークエンスを行った。アライメントの解析にり明らかにされている１）。しかしガモン１遺伝子のはClustalWを、上流配列における転写調節因子の結ゲノム遺伝子の配列はまだ明らかにされておらず、合領域予測にはTF SEARCHを用いた。

転写調節機構についての研究も進められていない。
そこで本研究では、ガモン１遺伝子の転写調節機[結果と考察] まずPCRによってガモン１遺伝子を構を解明するための第一段階として、接合型Iの細胞コードしている領域を増幅させたところ、約1000 bp

におけるガモン１遺伝子のゲノム配列と５´側上流配のPCR産物が得られ、この産物のクローニング及び列を決定することを目的とした。

シークエンスを行い、ゲノム配列933 塩基を決定した。この配列とcDNAの配列をアライメントさせると

30

原生動物学雑誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年

完全に一致し、イントロンを含んでいないことが明性もある。

らかになった。B. japonicumにおいてはα-tubulin２）や今後は、I型とII型それぞれの細胞におけるガモン

HSP-90３）のゲノム遺伝子がすでに単離されており、１遺伝子の上流領域を比較することや、上流配列の

これらもイントロンを含んでいないことが分かってさまざまな領域を欠失させることによって、実際にいる。次に、Sau3 AIによって制限酵素処理したゲノ

どの転写制御因子や領域がガモン１遺伝子発現の制ムDNAを用いてインバースPCRを行うと、約150 bp

御に関わっているのかについて実験的に調べる必要のPCR産物が得られ、この産物のクローニング及びがある。また、ガモン１遺伝子の転写制御に関わる

シークエンスを行い、ガモン１遺伝子の５´側上流配領域は、より５´上流または３´下流に存在すること列を112塩基決定した。そして決定した配列から新たも考えられるのでより広い範囲での塩基配列の決定にプライマーを設計し、Hind IIIによって制限酵素処を試みるつもりである。

理したゲノムDNAを用いて再度インバースPCRを行ったところ、より大きな断片を増幅することがで[文献]

き、最終的にガモン１遺伝子の５´側上流配列を868

1) Harumoto, T. and Sugiura, M. (2003) Jpn. J. Protozool.,

塩基決定した。決定したガモン１遺伝子の上流配列

36(2), 147-172 (in Japanese).

をTF SEARCHを用いて解析したところ、TATAボッ2) Tourancheau, A.B., Villalobo, E., Tsao, N., Torres, A.

クスが２箇所、また繊毛虫のRNAポリメラーゼIIIで

and Pearlman, R.E. (1998) Mol. Phylogenet. Evol. 10

転写される遺伝子のプロモーター構造で共通して見られるPSE配列４）、そしてCCAATボックスなどのプ
ロモーター構造が見られ、また様々な転写因子の認(3), 299-309.
3) Leander, B.S. and Keeling, P.J. (2004) J. Phycol. 40(2),341-350.

識配列が見られた。例えば飢餓ストレスなどで働く

4) Hargrove, B.W., Bhattacharyya, A., Domitrovich,

転写因子として知られるCREBや HSFの認識配列がA.M., Kapler, G.M., Kirk, K., Shippen, D.E. and見られ、これらはガモン１遺伝子の転写開始必須条

Kunkel, G.R. (1999) Nucleic Acids Res. 27(21), 4269-

件でもある飢餓刺激と何らかのかかわりがある可能

4275.

ブレファリスマにおける光刺激応答性
グルタチオンS-トランスフェラーゼ遺伝子の解析
高田雄一，松岡達臣（高知大・理・生物）

Analysis of glutathione S-transferase gene inducedby light stimulation in Blepharisma japonicum
Yuichi TAKADA and Tatsuomi MATSUOKA (Dept. Biol., Fac. Sci., Kochi Univ.)
SUMMARY
The ciliated protozoan Blepharisma japonicum possesses a photosensitive pigment called blepharismin that causes
the generation of reactive oxygen species (ROS) such as hydroxyl radicals and singlet oxygen. In order to elucidate themechanism of resistance to photooxidative stress caused by ROS, cDNA clones induced by light stimulation were isolated from a cDNA library of B. japonicum by a differential screening method, and their light-dependent expression wasJpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)31

checked by semi-quantitative RT-PCR analysis. Sequence analysis showed that one of these clones encodes glutathione
S-transferase (GST), which is known as an antioxidative enzyme. Further cDNA library screening with a B. japonicum
GST (BjGST1) cDNA probe revealed the presence of another GST cDNA (BjGST2), and the two BjGST (BjGST1 and
BjGST2) clones showed 86% sequence identity at the amino acid level. Both BjGST sequences were overexpressed in
Eschericia coli, and the quaternary structure was investigated using gel filtration chromatography and Native-PAGE. It
was found that BjGST could form homodimers and heterodimers. Furthermore, Southern blot analysis showed that the
two BjGST genes were tandemly arranged in the Blepharisma genome. These results indicate that Blepharisma GSTs
could act cooperatively in response to photooxidative stress.

[目的] 繊毛虫Blepharisma japonicumはブレファリス

た。

ミンと呼ばれる光感受性色素を有している。この色
素はこれまでの研究において２つの機能、１）光回
1[結果と考察] スクリーニングおよび半定量的RT-

避行動の起点となる 、２）外敵からの防御物質としPCRの結果から、４種類の遺伝子が光刺激に応答してはたらく2ということが知られている一方で、光条て発現することを確認した。決定した部分塩基配列

件下においてヒドロキシルラジカルや一重項酸素とについてBlastXプログラムにより相同性検索をおこいった活性酸素種を発生させることが分かっているなった結果、その中の１種類については他生物種の3,4。活性酸素は生体内において細胞傷害性の反応をGlutathione S-transferase（GST）と相同性を示した6。

引き起こし、老化や細胞死といった現象と密接に関B. japonicumのGSTについてさらに検討するために、わっている5。本研究では、Blepharismaが活性酸素に

今 回 ス ク リ ー ニ ン グ さ れ た GST ホ モ ロ グ 遺 伝 子

起因する光酸化ストレスに対してなんらかの耐性機（BjGST1）をプローブとしてcDNAライブラリーを構を備えているはずであるという仮説を立てた。そスクリーニングしたところ、新たにBjGST2を得た。

して、それを実証するために、光刺激に応答して発２つの遺伝子の推定アミノ酸配列は86％一致し、さ現する遺伝子の探索、ならびにその機能・構造解析

らにBjGST2の発現もまた光刺激によって誘導されるをおこなった。

ことを確認した。次に、BjGST分子のサブユニット
構造を検討するためにリコンビナントタンパク質の[材料と方法] Differential screening 法：24時間光条件

発 現 を お こ な っ た。rBjGST1（pET で 発 現、25下（5 W/m-2）に置いたB. japonicumからmRNAを抽出kD）、rBjGST2（pET で 発 現、25 kD）、rBjGST2-

し、cDNAライブラリーを作製した。次に、光条件

MBP（MBP融合タンパク質としてpMALで発現、65下、暗条件下に置いた細胞からそれぞれcDNAプロー

kD）の３種類のタンパク質を発現させ、ゲルろ過ク

ブを調整し、プラークハイブリダイゼーションをおロマトグラフィーとNative-PAGEで解析したところホ

こない、光条件下で特異的に発現する遺伝子をスク

モダイマーを形成することが明らかになった。まリーニングした。発現の最終的な確認は半定量的た、rBjGST1とrBjGST2-MBPを同時に発現させた場

RT-PCR法でおこなった。

合、Native-PAGE上で３つのバンドが確認できたこと

リコンビナントタンパク質の発現と精製：発現ベからBjGST1とBjGST2のヘテロダイマーが形成され

ク タ ー（pET も し く は pMAL）を 構 築 後、大 腸 菌ることも強く示唆された。また、サザンブロッティ

BL21株を形質転換した。タンパク質の精製はGSTrap

ングの結果から２つのGST遺伝子はゲノム上にタンFF（Amersham Biosciences）を用いておこなった。

デムに配置していることが明らかになった。以上の多量体形成の検討：ゲル濾過カラムSuperdex 75

結果から、BjGST1とBjGST2が光刺激（おそらくは（Pharmacia Biotech）を用いたクロマトグラフィーと

光酸化ストレス）に対して協調的に働いていること

Native-PAGEによって多量体形成の可能性を検討しが示唆された。

た。
サザンブロッティング：5 µgの大核DNAを制限酵
素（Hind III, Sac I, Xba I）を用いてそれぞれ消化し、電気泳動により分離した。ナイロンメンブレンにトランスファーした後、cDNAプローブを用いて検出し[文献]
1) Matsuoka, T. et al. (1995) Photochem. Photobiol. 62,
190-193.
2) Noda Terazima, M. et al. (1999) Photochem. Photobiol.

原生動物学雑誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年

32
69, 47-54.

49-55.

3) Kato, Y. et al. (1996) J. Photochem. Photobiol. 34, 2933.

5) Cabiscol, E. et al. (2000) Int. Microbiol. 3, 3-8.
6) Takada, Y. et al (2004) FEMS Microbiol. Lett. 231,

4) Checcucci, G. et al. (1991) J. Photochem. Photobiol. 11,

185-189.

ミドリムシEuglena gracilis の膜内在性タンパク質IP39の分子生物学的解析
末友靖隆，洲崎敏伸（神戸大・理・生物）

Molecular biological analyses of IP39, the intramembrane protein of Euglena gracilis
Yasutaka SUETOMO and Toshinobu SUZAKI(Department of Biology, Faculty of Science, Kobe University)
SUMMARY
The euglenoid flagellates perform a characteristic movement called euglenoid movement. Intramembrane proteins
called IP39, which are regularly and densely arranged in the plasma membrane, have been implicated in this movement.
We carried out PCR-based cDNA cloning of IP39 from Euglena gracilis in our previous studies, and found two types ofIP39-encoding cDNAs (α- and β-types). The α- and β-type cDNAs consisted of 792 and 795 base pairs, respectively.
Between α- and β-type cDNAs, differences were found over the whole sequence. However, between the deduced aminoacid sequences, differences were restricted to the C-terminal region, except for two residues in the middle part. To examine the expression of these two types of IP39 mRNA, we carried out northern blot analyses of mRNA extracted from
cells in the logarithmic growth phase. The specific DNA probes were designed from the 3' untranslated region of theIP39 mRNA. Results of northern blotting showed that both mRNAs are expressed in the cell and suggested that expression levels of the two types of IP39 mRNA were similar.

[目的] ユーグレナ類は、古くからユーグレナ運動と設計し、それを用いてcDNAのPCRクローニングを呼ばれる活発な細胞変形運動を行うことが知られて

行 っ た。ア ミ ノ 酸 配 列 解 析 に は ALL-IN-ONE-SEQ-いる(1)。この運動の仕組みとして、ユーグレナ類の

ANALYZERを、相同性検索にはBLASTを用いた。

一種であるEuglena gracilis では、細胞体表面全体をNorthern blot解析に用いたIP39の二種類の型それぞれ覆う膜状外被ペリクルの細胞膜中に密に規則正しくに特異的に結合するDNAプローブは、ともにIP39存在する膜内在性タンパク質IP39の構造変化が細胞mRNAの3’ 非翻訳領域の一部を用い、α型では176

表層部の湾曲を引き起こすことで細胞の変形が生じ

bp、β型では150 bpの全長となるように設計し、DIGるという仮説が提唱されている(2)。そこで本研究で（Digoxigenin）をラベリングした。また、解析に用は、IP39のユーグレナ運動に対する関与を明らかにいたEuglena のmRNAには、対数増殖期にある細胞をするために、IP39タンパク質のcDNAのPCRクローニ

液体窒素で瞬間凍結したうえで、抽出、精製したもングを行い、その結果を基に、種々の分子生物学的のを用いた。

解析を行った。
[結果と考察] IP39のcDNAの塩基配列を解析した結[材料と方法] Euglena gracilis の膜内在性タンパク質

果、2種類のcDNAが見つかった。そこで我々は、一IP39のN末端アミノ酸配列データを基にプライマーを方をα型、もう一方をβ型と名付けた。α型は792塩

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)

33

基、β型は795塩基から構成されていた。α型とβ型の析の結果から、瓢箪型ユニットは、α型とβ型が一組塩基配列の間には、全体に渡って違いが見られ、相となって形成されているのかもしれない。現在は本同性は約88%であった。また、α型とβ型のアミノ酸研究結果を基に、RNAi技術を用いたIP39タンパク質配列の間には、C末端付近とその他一部のアミノ酸の発現抑制を試み、IP39とユーグレナ運動の間の関残基に違いが見られ、相同性は94%であった。さら連性を探っている。今後は、α型とβ型の細胞内でのに、α型、β型は共に、全ての構造予測において、ほ局 在 性 に つ い て 調 べ、さ ら に、IP39 が ど の よ う にぼ同じ結果が得られた。相同性検索の結果、既存のユーグレナ運動に関与しているのかを解明していく

どのタンパク質とも高い相同性が見られなかったこ

予定である。

とから、IP39は新しいタンパク質であることが示された。膜貫通領域予測、及びタンパク質局在部位予[文献]

測、2次構造予測の結果と過去のIP39に関する研究論

1) Suzaki, T. and Williamson, R. E. (1985) Protoplasma

文の結果(3-6)を総合すると、IP39は2回膜貫通型タン

124, 137-146.

パク質である可能性が最も高いことが示唆された。

2) Murata, K. et al. (2000) Protoplasma 214, 73-79.

Northern blot解析により、IP39の2種類の型のmRNA

3) Dubreuil, R. R. and Bouck, G. B. (1985) J. Cell Biol.,

レベルでの発現量を調べたところ、α型、β型ともに

101, 1884-1896.

同程度であることが確認できた。過去の研究(2)で、

4) Dubreuil, R. R. et al. (1988) J. Cell Biol., 107, 191-200.

Euglena の細胞膜中におけるIP39の配列は、2つの形

5) Fazio, M. J. et al. (1995) J. Euk. Microbiol., 42, 570-の異なるタンパク顆粒から構成される瓢箪型ユニッ
トの規則的なパターンから構成されており、そのパターンがユーグレナ運動時の細胞形態変化に応じて

579.
6) Murata, K. and Suzaki, T. (1998) Protoplasma 203,
125-129.

変化していることが確認されている。Northern blot解

繊毛虫 Sterkiella cavicola のシスト形成・脱シスト時における140 kDタンパク質の消長と小核クロマチンの微細構造変化
小田明日香1，松坂理夫2 （1熊本大・自然科学・自然システム，2熊本大・理・理）

Appearance and disappearance of the 140 kD protein of the ciliate,
Sterkiella cavicola, and the ultrastructural changes of micronuclear
chromatins during encystment and excystment
Asuka ODA1 and Tadao MATSUSAKA2( Syst.Nat.Env.,Grad.Sch.Sci.Technol.,Kumamoto Univ., 2Dept.Sci.,Fac.Sci.,Kumamoto Univ.)
1

SUMMARY
Hongo (1984) has discovered a cyst specific 140 kD protein in the ciliate, Sterkiella cavicola, assuming its localization in the outermost layer of the cyst wall. Himura (1993) has made clear that this protein localizes in the cystic micronuclear chromatins by immunoelectron microscopy. Kikukawa (1996) has shown that the cysts contain 2 types of micronuclei, with thin compact chromatins and with thick rough chromatins, and that the 140 kD protein is recognized only inthe micronuclei with thin compact chromatins. In order to elucidate the function of the 140 kD protein, we compared theappearance and disappearance of the protein by Western blotting technique and the ultrastructural changes of micronu-

34

原生動物学雑誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年

clear chromatins during encystment and excystment. The results of the Western blots indicated that the 140 kD protein
appeared at the stage 4-5 of the encystment, and remained in the ciliates immediately after excystment but disappeared
during a few hours after excystment. Ultrastructurally the thin compact chromatins were first found at the stage 5 of theencystment, and remained immediately after excystment but was not found in the cells a few hours after excystment. We
supposed that the 140 kD protein condensed micronuclear chromatins and the condensation of chromatins might protect
genetic information of the cyst against adverse environmental conditions.

[目的] 本研究で用いた繊毛虫Sterkiella cavicolaは環た。包埋した試料をガラスナイフを用いて超薄切片境が悪化するとシストを形成して休眠し、環境が改を作成し、抗体染色後あるいは直接電子染色を施し善すると脱シストして栄養増殖活動を再開する。当て観察した。

研究室ではこれまで、この繊毛虫のシスト形成に関する様々な研究を行ってきた。本郷 (1984) はシスト

[結果と考察] ウェスタンブロッティングの結果、特有の140kDタンパク質を発見し、このタンパク質

140kDタンパク質はシスト形成のステージ4～5の段は シ ス ト 壁 最 外 層 に 存 在 す る と 推 論 し た。樋 村

階で出現し、脱シスト直後まで保持されており、最(1993) はこのタンパク質に対する抗体を作成し、終的な消失には脱シスト後数時間かかることが明ら

140kDタンパク質がシスト壁最外層ではなく、シスかになった。シスト形成及び脱シストの過程を電子トの小核に存在することを明らかにした。更に、菊顕微鏡で観察した結果、i）栄養体とシストでは細胞

川 (1996)は樋村 (1993) が作成した抗体を用いて、シ内部の様子（細胞質やミトコンドリア）が異なるこ

ストには栄養体に存在するクロマチンが太く（径約と、ii）栄養体ではシスト型小核が発見できないこ

50nm）粗い小核(栄養体型小核)とクロマチンが細くと、iii）シスト形成末期のシスト壁ができ始めた細（径約25nm）密に凝縮した小核(シスト型小核)の２胞にはシスト型小核が存在すること、iv）脱シスト

種類が存在することを明らかにし、140kDタンパク

直後の栄養体と同じように遊泳している個体でもシ質はシスト型小核クロマチンにのみ存在することを

スト型小核から栄養体型小核へ移行中と思われる小示した。本研究ではシスト形成および脱シストの過核が存在していることなどが明らかになった。この

程における140kDタンパク質の消長と、透過型電顕

ように、ウェスタンブロッティングによる140 kDタによるシスト小核のクロマチンの形態変化を観察

ンパク質の消長と電顕観察によるシスト型小核の出し、140kDタンパク質とクロマチン凝縮との関わり

現・消失のステージがほぼ一致した。

を明らかにし、クロマチン凝縮の持つ意義を推定することを目的とした。

免疫電顕法によって、140 kDタンパク質はシスト型小核の凝縮したクロマチンに存在することが明らかになっており、140 kDタンパク質はシスト形成の[材料と方法] 繊毛虫をChrologonium elongatumを餌

ほとんど最終段階で形成され、徐々にクロマチンをとして培養し、シスト形成過程の研究にはMatsusaka

凝縮させているのではないかと推定される。その(1979)の方法で同調的なシスト形成を誘導した。多後、脱シストが始まると140kDタンパク質は徐々に数のシストを必要とする場合には、餌を消費し尽く消失していき、それまで凝縮されていたクロマチンした繊毛虫をそのまま放置し自然にシストを形成さがほどかれて栄養体型小核へと戻り、再び分裂を始せた。脱シストの誘導はシストを0.1％野菜マッシュ

めるのではないかと推定される。シストには栄養体溶液に移すことで行った。
シスト形成及び脱シストの誘導後、適当な時間間型小核とシスト型小核の2種類が存在する。元々栄養体に存在する1種類の小核がどのような基準でシスト

隔でSDS-PAGE用サンプルと電顕用サンプルの作成

型小核として選ばれクロマチンが凝縮されるのかはを行った。SDS-PAGE用サンプルは7.5％アクリルア

わかっていない。しかし、休眠状態から活動を再開

ミドゲルで電気泳動し、ウェスタンブロッティング

するまで、シスト型小核はクロマチンを凝縮させるを行った。形態観察のための電顕用サンプルはグルことで自身の遺伝情報を保護しているのではないだ

タルアルデヒド・オスミウム混合液で固定し、エポろうか。今後、シスト小核の役割についてさらに研キシ樹脂で包埋した。免疫電顕用のシストは急速凍究を進める必要がある。

結後アセトンで置換し、L-Rホワイト樹脂で包埋しJpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)[文献]

菊川雅子（1996）熊本大学卒業論文

Himura, M.（1993）Master’s thesis, Kumamoto Univ.

Matsusaka, T.（1979）J. Protozool., 26, pp. 619-62535

本郷文和（1984）熊本大学修士論文

Colpoda sp. におけるシスト形成抑制因子の研究
木田明美，松岡達臣（高知大・理・生物科学）

Suppressing factors for encystment in Colpoda sp.
Akemi KIDA and Tatsuomi MATSUOKA (Inst. Biol, Fac. Sci., Kochi Univ.)
SUMMARY
Ca2+-induced encystment of Colpoda sp. is cancelled by bacterial products such as proteins and peptides in the surrounding medium. In the presence of bovine serum albumin (BSA), suppression of Ca2+-induced encystment occurredconcomitantly with uptake of BSA into endocytic vesicles. Such suppression of encystment was not affected when endocytosis was inhibited by chlorpromazine. The result suggests that the suppression of encystment is not correlated withendocytosis and/or nutrient supply via endocytosis. In order to elucidate whether the Colpoda cells detect the specificconformation of the proteins or peptides, we examined the suppression effects of BSA, peptides obtained by digestion of
BSA, or a mixture of the total amino acids constituting BSA, on Ca2+-induced encystment. All of them had a marked
encystment-suppression effect, implying that the receptors involved in suppression of encystment might recognize side
chains of amino acids or certain structures common between amino acid residues and free amino acids.

[目的] 繊毛虫コルポーダ（Colpoda sp.）のシスト形[材料と方法] Colpoda sp.はバクテリア（Enterobacter

成は外液塩濃度の上昇（主としてCa2+）によって誘

aerogenes）を植え付けた0.1％麦葉浸出液で培養し導される 1）が、外液中に放出されたバクテリア由来た。シスト形成は、脱シスト後培養２日目の細胞を成分（タンパク質やペプチドなどの低分子）によっ

時計皿（直径5 cm）に満たしたシスト誘導用塩類溶て抑制される2)。外液に存在するタンパク質などはエ

液（1mM CaCl2, 1mM KCl, 5mM Tris-HCl, pH 7.2）でンドサイトーシスを介して細胞内に取り込まれるの数回洗った後、同液に50~100細胞/mlの密度で懸濁す

で、シスト化の抑制機構がエンドサイトーシスのプ

ることによって誘導した。BSAをトリプシン消化す

ロセスやエンドサイトーシスを介した栄養供給と関る場合は、BSA量1に対して1/10量のトリプシンを反係があるかもしれない。本研究では、シスト化の抑応液（2% 2-メルカプトエタノール, 10 mM NH4HCO3制は、エンドサイトーシスのプロセスやこれによっを含む）に加え、37℃で48時間処理した。処理後、てもたらされる栄養供給と関連があるかどうかにつ

遠 心 し て（8,000g, 10 分）沈 殿 を 取 り 除 き、透 析

いて検討し、これらの間に関連性がないことを示唆

チューブ（分画分子量：100）を用いて塩類溶液中でした。シスト化の抑制は、コルポーダ栄養細胞の受72時間透析(氷上)した。BSAの消化産物の濃度は280

容体が外液に存在するタンパク質やペプチドの立体nmにおける吸光度から推定した。

構造を認識することによってもたらされると推察される。そこで、ウシ血清アルブミン（BSA）とその[結果と考察] コルポーダをシスト誘導用塩類溶液

消化産物および遊離のアミノ酸を用いてCa2+ 依存的（1mM CaCl2, 1mM KCl, 5mM Tris-HCl, pH 7.2）に移

シスト誘導に対する抑制効果を調べた。

すと、数時間以内にシスト形成が誘導される。このようなCa2+依存的に誘導されるシスト形成はBSA（2原生動物学雑誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年

36

mg/ml, 0.03 mM）を含む塩類溶液中で著しく抑制さ体を活性化することが考えられるため、BSAを構成れた。BSAはエンドサイトーシスによって細胞内にするアミノ酸組成を求め、2 mg/ml BSAの酸加水分解

取り込まれる。したがって、BSAによるシスト化のによって得られる組成に相当する遊離アミノ酸混合抑制がエンドサイトーシスを介した栄養供給と関係液を作成した（水に難溶なアミノ酸は除いた）。こがあるかも知れない。そこで、クロルプロマジンのアミノ酸混合液も顕著なシスト化抑制作用を示し（0.5μg／ml）によりエンドサイトーシスを阻害したことから、BSAやペプチドによるシスト化抑制作

た条件下でシスト化の抑制がおきるかどうかを調べ

用はそれを構成するアミノ酸残基の側鎖に起因するた結果（エンドサイトーシスが抑制されていることことが示唆される。特別な側鎖が認識されるのかど

はBSA-FITCにより確認）、シスト化抑制には全く影うかを知るために、複数の水溶性アミノ酸（1 mM）

響がみられなかった。このことから、シスト形成のの効果を調べた結果、どのアミノ酸もシスト化を抑抑制は、受容体によるBSA分子の認識を含む一連の制する傾向がみられた（アラニン、グルタミン、トエンドサイトーシスおよび栄養供給のプロセスとはレオニン、ヒスチジン、フェニルアラニンは有意に独立したシグナリング機構によってもたらされるこ

抑制; p ≦ 0.05, Mann-Whitney test）。この結果から、とが示唆される。

シスト化抑制に関わる受容体が存在する場合、次のCa2+ 依存的に誘導されるシスト形成の抑制は、コような可能性が推察される。（1）それぞれのアミノ

ルポーダ栄養細胞がBSAの高次構造を認識すること

酸側鎖に対応した受容体が存在する；（2）単一またによってもたらされる可能性がある。そこでBSAのは少数の受容体がアミノ酸側鎖中の共通構造を認識

トリプシン消化産物（ペプチド断片）の効果を調べする：（3）単一の受容体がアミノ酸残基と遊離アミた。この場合もBSAと同様に顕著なシスト化抑制効

ノ酸に共通する基本骨格を認識する。

果が認められた。この結果は、コルポーダ細胞表層に存在すると推定される受容体がBSAの高次構造を[文献]認識するのではないことを示している。さらに、短

1) Yamaoka M. et al. (2004) Acta Protozool. 43: 93 - 98

いペプチド鎖が形成するコンフォメーションが受容

2) Yamasaki C. et al. (2004) Jpn. J. ProtoZool. 37:111-117

ゾウリムシの Clonal Aging におけるテロメアの伸張太田 聡，芳賀信幸（石巻専修大・理工）

Evidences for the increase of telomere length with clonal aging
in Paramecium caudatum
Satoshi OHTA and Nobuyuki HAGA (Dept. of Biotech. Ishinomaki Senshu Univ.)
SUMMARY
Telomere shortening is associated with proliferative senescence in cultured human cells. However, stable maintenance of telomere length is found in proliferative senescence in Paramecium tetraurelia. In previous studies of P. caudatum, we found that the length of telomeres increased for about 700 fissions after conjugation. In this study we altered theconditions of Southern hybridization by changing both the non-RI detection system and the length of telomere probes.
The biotin-labeled telomere probes (TTGGGG: 4 repeats) enabled us to increase the hybridization temperature from
42.5°C to 68°C. Under these conditions, we have reconfirmed that the signals obtained in the previous experiments werefrom the terminal restriction fragments. Furthermore, under the new experimental conditions, we could estimate the telomere elongation ratio as about 2.5 bp per cell division in KNZ52 strain and about 1.0 bp per division in SOS2. How-

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)

37

ever, there was no statistically significant difference between the two strains. Paramecia have detectable telomerase reverse transcriptase (TERT) activity during sexual maturation and until about 170 fissions after conjugation. Although
there is no information about TERT activity in senescent cells, this enzyme is one of the candidates for telomere elongation. In some cell lines, homologous recombination is thought to be an alternative mechanism. Our results suggest that
telomere length may be useful as a molecular indicator of the clonal age in P. caudatum. For an understanding of thebiological meaning of telomere elongation, it would be necessary to establish methods of artificial manipulation of telomere length in future.

[目的] ゾウリムシ ( Paramecium caudatum ) は細胞分スファターゼから安定なビオチンに変更し、ハイブ

裂齢およそ700回で死を迎えるまでに、細胞増殖速度

リダイゼーションの温度を42.5℃から68℃の高温にの低下や子孫の生存率の低下などの細胞分裂齢に依設定した。

存した細胞機能の低下を起こす。しかしながら、ヒ・プ ロ ー ブ の テ ロ メ ア 配 列 の 繰 り 返 し を 3 回

ト培養細胞に見られるような細胞分裂齢に依存した(TTGGGG)3 か ら 4 回 (TTGGGG)4 に 増 や す こ と で プ

テロメアの短縮は確認されていない。ヨツヒメゾウ

ローブの非特異的なハイブリダイズの可能性を低く

リムシ( P. tetraurelia ) では生涯を通して細胞分裂齢した。

に依存したテロメア長の著しい変化は起こらないこ・ハイブリダイゼーションバッファーはSDS濃度のとが報告されている1)。また、ゾウリムシでは分裂齢高い0.5M NaPO4 (pH7.1), 2mM EDTA, 7% SDS, 0.1%

170回まではテロメアが伸張することが報告されていSodium Pyrophosphateに変更し、プローブの非特異的る2)。

なハイブリダイズの可能性を低くした。

本研究では分裂齢およそ600回の老化の兆候が見られ・シグナルの検出にはBioLabsのPhototope-Star Detec-

る細胞においてもテロメアが伸張しているというこtion Kitを用いた。

とを第35回大会で報告した。しかし、本研究で用いた測定法にはテロメアを検出する特異性の点でまだ[結果] 細胞増殖速度はKNZ52, SOS2のどちらの株に改善しうる可能性が残されていた。そこで今回、おいても細胞分裂齢に依存した低下が確認された。

我々はテロメア長を測定するサザンブロットの系にそれぞれの増殖速度は、KNZ52では分裂齢50回でおいて、プローブや標識法などの条件を検討し、よ4.0±0.26 fission/day (mean±S.D, n=10)、1000 回 でり特異的にテロメアを検出できる系を再構築した。

1.9±0.66 fission/day (mean±S.D, n=10)、SOS2では分裂
齢50回で 3.7±0.41 fission/day (mean±S.D, n=10) 、850

[材料と方法] 遺伝的背景の異なる２つの株 ( KNZ52,

回で 1.5±1.08 fission/day (mean±S.D, n=10)であった。

SOS2 ) について細胞分裂齢の異なる細胞 ( KNZ52 :一方、テロメアは2つの株において分裂齢50回から

f=50, 100, 500, 750, 850, 1000. SOS2 : f=50, 350, 500,
600, 750, 850)を準備した。細胞分裂齢は全ての細胞

750回まで伸張していた。このときのテロメア長は、KNZ52では約0.5kbpから3.0kbpに,が同じ速度で分裂すると仮定して、試験管に植え継から1.3kbpに伸張していた。しかし、分裂齢750回以

いだ細胞数と次の試験管に植え継ぐ前の全細胞数か降の細胞では伸張は確認されなかった。テロメアのら計測した。

伸張率は1回の細胞分裂でKNZ52では約2.5bp, SOS2で

SOS2では0.5kbp

細胞老化の指標として２つの株の各分裂齢の細胞は約1.0bpずつ伸張していると算出されたが、2つのについて細胞増殖速度を計測し、さらにテロメア長株の間では統計的に有意な差は確認されなかった。

を測定した。増殖速度の計測には、毎日新しい培養液の入ったデプレッションスライドに1細胞ずつ植え[考察] 本研究においてテロメアの測定に用いた方法

継いでいくDaily Isolation Cultureを用いた。テロメア

は、non-RIでのハイブリダイゼーションの系では最の測定法にはTRFs (Terminal Restriction Fragments) 法

もストリンジェンシーの高い系であり、今回得られを用いた。制限酵素はこれまでと同様にSsp Ⅰを用いたシグナルには非特異的な配列はほとんど含まれてたが、プローブがテロメアにハイブリダイズする特いないと考えられる。一方、細胞分裂齢に伴ってテ異性を高くするために以下の点を改良した。

ロ メ ア が 伸 張 す る こ と か ら、ゾ ウ リ ム シ の Clonal・プローブの標識法を高温に不安定なアルカリフォ

Agingではテロメアが伸張することで細胞増殖速度の原生動物学雑誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年

38低下などの老化形質が発現する可能性が示唆され[文献]た。このことを確かめるためには今後テロメア長を

1) D. Gilley., E. H. Blackburn. (1994) Proc. Natl. Acad.

実験的に操作する方法を確立することが重要であると考える。

Sci. USA. 91, 1955-1958.
2) Y. Takenaka., T. Matsuura., N. Haga., Y. Mitsui. (2001)
Gene. 264, 153-161.

Paramecium tetraureliaにおける子孫のagingに対する親のageの影響
荻野友義，三輪五十二（茨城大・理・自然機能）

The effects of parental age on the aging of offspring in Paramecium tetraurelia
Tomoyoshi OGINO and Isoji MIWA (Dept. Biol., Fac. Sci., Ibaraki Univ.)
SUMMARY
It is known that the germinal age of the parent affects the initial mortality of offspring after fertilization in Paramecium tetraurelia. In this experiment, we examined the length of autogamy immaturity, life span and the fission rate, ofoffspring induced by autogamy for various parental ages and generations. When we examined the initial mortality ofoffspring induced at each parental age, we found, as did the previous study, that the initial mortality of offspring induced
from aged parents increased rapidly. Furthermore, the offspring induced from cells after 30 fissions in the second generation showed a lower initial mortality than that of the parent. The length of autogamy immaturity, life span and aging
speed of offspring, however, were not affected by parental age, and they maintained a constant value in all offspring
induced from every generation. These results indicate that parental age may be reset in a viable offspring induced by
autogamy.

[目的] 親のageが子孫のagingに与える影響として、期に行った。また、加齢速度を調べるためには5日間老齢細胞による有性生殖誘導直後の死亡率の増加が毎の分裂回数の平均を指標とした。autogamy誘導後

知 ら れ て い る。今 回 は そ の 確 認 の 他、子 孫 の初期に死亡したcloneは、誘導直後から分裂速度が遅autogamy未熟期の期間、寿命、加齢速度に対して親く、20回分裂齢程度までに死亡したものとした。このageがどのように影響を与えるのか調べることを目のような方法でautogamy未熟期の期間、加齢速度、的とした。

寿命、autogamy誘導後の子孫の初期死亡率に対する親のageの影響を調べた。

[材料と方法] Paramecium tetraurelia stock 51を使った。毎回のisolationを行う間隔は、autogamyを間に含[結果と考察] 今回の実験で以下のような結果が得ら

むと細胞分裂の周期はおよそ18時間になることが予れた。①autogamy誘導後の子孫の初期死亡率は親の備実験から分かったので、12時間毎に行った。このageが90回分裂齢以前ではおよそ6.8～16.8％という低方法で行うと培養中のautogamyを正確に把握できい値を示したのに対し、それ以降急増した。しかる。次世代を得るために、autogamyの誘導は30回分し、親が老齢で高い初期死亡率を示した世代でも、裂齢から150回分裂齢までの間を30回分裂齢ごとに3その世代が30回分裂齢時に誘導した子孫では死亡率世代まで、計30回行った。世代誘導後のautogamy未が低下し、その後90回分裂齢時以降に誘導された子熟期の長さはautogamy率50％までの期間とした。そ孫で高い死亡率を示した。②autogamy未熟期の測定

れぞれのautogamyの誘導はculture agingが進まない時はなるべくculture agingの影響が小さくなるように注Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)39

意した。その結果、どの世代においても親のageによのageによらずほぼ一定であった。このことから、

らずおよそ25回分裂齢でautogamy率50％に達し、ほautogamy誘導後初期に生存を許された子孫のagingにぼ一定であった。③加齢速度は世代誘導後およそ10は親のageは影響しないことがわかった。ただし、今日目以降から直線的に減少した。その減少速度にお回はautogamyを誘導する際にculture agingの影響が少いても親のageによらずほぼ一定であった。④寿命にない条件下で、親のageのみが子孫のagingに対する因関しては、各世代の平均寿命を検討した結果、子孫子となるように考慮して行った。以前の実験で、誘導後初期の死亡を免れたそれぞれ世代内のcloneはautogamy未熟期の期間を調べる際にculture ageを進ま

親のageの影響を受けず、同程度の分裂寿命を示し

せ る と 子 孫 を 誘 導 す る 際 の 親 の age の 加 算 に 伴 いた。以上の結果をもとにして考察すると、もし親のautogamy未熟期の期間が同じ世代のclone間で大きくageが子孫のagingに影響があるなら、子孫を誘導した変動する傾向があった。そのため、子孫誘導時の親

ときの親の分裂齢の加算に伴いその影響が見られるのageは単独では影響しないが、culture ageなどの第2はずである。親のageとその子孫の初期死亡率の関係の因子の存在でその影響が現れる可能性がある。

については、以前の報告の結果と同じように90回分
裂齢以降で初期死亡率が急増した。今回、初期死亡[文献]を免れたcloneの3世代目の子孫の初期死亡率の変化

Ishikawa, Y., Suzuki, A., Takagi, Y. (1998) Zool. Sci., 15:を調べると、autogamy誘導後初期の死亡率に関して
親のageの影響がリセットされていることが示唆された。ま た、初 期 死 亡 を 免 れ た clone の autogamy 未 熟707-712Rodermel, S., R., Smith-Sonneborn, J. (1977) Genetics 87:
259-274

期、加齢速度、寿命を調べた結果、これらの値は親セントリンのCa2+感受性は電位依存性Ca2+チャンネルの活性に重要である
権田幸祐，高橋三保子（筑波大学、生命環境科学研究科）

Ca2+-sensitivity of centrin is important for the activity of the voltage-gated
Ca2+ channels in Paramecium caudatum.
Kohsuke GONDA and Mihoko TAKAHASHI(Inst. Biol. Scis., Univ. Tsukuba)
SUMMARY
Internal Ca2+ concentration regulates the waveform or beat direction of flagella/cilia of various eukaryotes. Ciliary
reversal in Paramecium depends on a Ca2+ influx through voltage-gated Ca2+ channels on the ciliary membrane. However, little is known about the molecular mechanisms of the Ca2+ channels that control ciliary reversal. One of the voltage-gated Ca2+ channel mutants in P. caudatum, cnrC, neither produces Ca2+ action potentials nor responds to any depolarizing stimuli. Previously, we reported that the cnrC+ gene product is P. caudatum centrin (Pccentrin1p), a member ofthe calmodulin superfamily. Like calmodulin, centrin possesses four Ca2+-binding sites called EF-hand. To examine
whether Pccentrin1p controls the voltage-gated Ca2+ channels in a Ca2+-dependent manner in vivo, the curing effect ofPccentrin1p genomic DNA that had mutations in the EF-hand was examined. The DNA was microinjected into cnrC
cells, and then the responses of the cells to depolarizing current were investigated. The results showed that the Ca2+ sensitivity of Pccentrin1p is important to the regulatory mechanisms of the voltage-gated Ca2+ channels. In particular, it wassuggested that the cooperative work of EF-hand 3 and 4 in the presence of Ca2+ is indispensable to the Ca2+ channel activity.

原生動物学雑誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年

40[目的] 繊毛は波打ち運動を行う細胞小器官であり、の効果と同様に約30秒前後の後退遊泳を行った。まこの運動の調節にはCa2+ が重要な役割を果たしていた、EF-hand 3変異型をMicroinjectionした細胞では、る。ゾウリムシでは、繊毛膜に存在する電位依存性

定電流刺激に反応して野生株と同様のCa2+ 活動電位

Ca2+チャンネルの活性化によって繊毛内Ca2+濃度が上が観察された。以上の結果はEF-hand 1、2、3のCa2+

昇すると、繊毛打の方向が逆転し(繊毛逆転)、後退

感受性がCa2+ チャンネルの機能に必須ではないこと

2+

遊泳を行う。しかし、このCa チャンネルの実体やを示している。次に、EF-hand 4変異型では、高K+刺制御機構はよく分かっていない。ゾウリムシでは、激溶液中において後退遊泳の時間が短くなっており

Ca2+ チャンネルの制御機構に欠陥があるため後退遊(約7秒)、定電流刺激に対するCa2+ 活動電位も野生株

泳を行うことができない突然変異株cnrCが単離されに比べ非常に小さくなっていた。この結果はEF-handている(1, 2)。これまでに、我々はcnrC+遺伝子産物の4のCa2+感受性がCa2+チャンネルの機能に重要である

実体がCa2+結合蛋白質セントリン(Pccentrin1p)である

ことを示している。またEF-hand 1 & 2変異型では、

こ と を 明 ら か に し て き た (3)。セ ン ト リ ン は

高K+刺激溶液中において後退遊泳の時間が短くなっ2+

Calmodulinファミリーに属し、Ca 結合部位であるており(約12秒)、定電流刺激に対するCa2+活動電位もEF-handを４つ持つ(EF-hand1～4)。そこで、本研究でEF-hand 4変異型ほどではないが野生株に比べ小さく

はPccentrin1pのCa2+感受性が電位依存性Ca2+チャンネ

なっていた。この結果とEF-hand 1や2の単独の変異

ルの活性にどの様に関わるのかを検討した。

の結果を合わせて考えると、EF-hand 1もしくは2のどちらか一方にCa2+感受性があることがCa2+チャンネ[方法] 野生型の1213bpのPccentrin1pゲノムDNA断片

ルの機能に重要であることを示している。さらに驚を cnrC に Microinjection す る と、cnrC の 電 位 依 存 性

くべきことに、EF-hand 3 & 4変異型をMicroinjection

Ca2+ チャンネルの機能が回復し、cnrCは脱分極性のした細胞では、98%以上の細胞が高K+ 刺激溶液に反刺激に反応して後退遊泳を行う。セントリンを含む

応せず、定電流刺激に対するCa2+ 活動電位もほとん

Calmodulinファミリーでは、EF-hand内の酸性アミノ

ど見られなかった。この結果とEF-hand 3や4の単独

酸 (D、E)が Ca2+ 感 受性に 重要な 役割を 果たし ておの変異の結果を合わせて考えると、EF-hand 3と4がり、これらのアミノ酸を非極性のアミノ酸に置換す

Ca2+ 存在下で協調的に立体構造を変化させること

2+

ると(D→A、E→V)、Ca 結合能が失われることが報が、電位依 存性 Ca2+ チャンネ ルの活 性に必 須で あ

告 さ れ て い る。ま た、セ ン ト リ ン や Calmodulin でり、その際EF-hand 4はEF-hand 3に比べより機能的では、EF-hand 1と2およびEF-hand 3と4それぞれがペアあることを示している。cnrCのPccentrin1pは、突然になって機能していると考えられている。そこで、変異によりEF-hand 4を含むC末側の28アミノ酸を1213bpのPccentrin1pゲノムDNAのEF-handをコードす失っている。この結果からもEF-hand 3と4の協調的る領域に塩基置換を与え、各EF-hand (EF-hand1～4)

なCa2+感受性が電位依存性Ca2+チャンネルの活性に重の酸性アミノ酸を全て非極性のアミノ酸に置換した要であることが示唆された。

コンストラクトを調製した。そしてこれらのコンス
トラクトをcnrCにMicroinjectionした後、脱分極性の[文献]

刺激(高K+刺激、定電流刺激)を与え、電位依存性Ca2+

1) Takahashi, M. & Naitoh, Y. (1978) Nature 271, 656-

チャンネルの機能回復効果を検討した。

659.
2) Takahashi, M. (1979) Genetics 91, 393-408.

[結果と考察] EF-hand 1変異型、EF-hand 2変異型、EF-hand 3変異型をMicroinjectionした細胞では、高K+刺激溶液中において、野生型Pccentrin1pゲノムDNA3) Gonda, K. et al. (2004) Biochem. Biophys. Res. Commun. 323, 891-897

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)41

繊毛虫ブレファリズマの性成熟過程におけるガモン1遺伝子の発現
杉浦真由美1,2，川原聖子1，春本晃江1,2（1奈良女子大・理・生物科学，2奈良女子大・院・共生自然科学）

Expression of gamone 1 gene during sexual maturation in the progeny clones of theciliate Blepharisma japonicum
Mayumi SUGIURA1,2, Seiko KAWAHARA1 and Terue HARUMOTO1,2(1Department of Biological Science, Faculty of Science, Nara Women’s University, 2Department of
Biological Science and Environment, Graduate School of Human Culture, Nara Women’s University)
SUMMARY
The ciliate Blepharisma japonicum switches the reproductive process from asexual (binary fission) to sexual(conjugation) when cells are deprived of food . This switching mechanism has not been elucidated yet. Conjugation in B.
japonicum is induced by interaction between cells of complementary mating types I and II. Substances that act as signaling molecules for conjugation are called gamones. The glycoprotein gamone 1, produced by mating type I cells, is a key
factor that triggers interaction. In this study, we examined the influence of nutritional conditions on the expression ofgamone 1. We found that mature mating type I cells do not transcribe gamone 1 in the logarithmic phase, but start transcribing it when they are starved, and that the level of transcription increases as starvation progresses. We isolated progeny clones and examined their level of maturation and the expression of gamone 1 at different clonal ages. We showedthat most progeny clones differentiated into mating type I, becoming mature at about age 25 and continuing maturation
gradually. The expression of gamone 1 was examined at the clonal ages of 10, 18, 25 and 39 by northern blot analysis.
Gamone 1 mRNA was not detected in immature cells (clonal age of 10 and 18), first faintly detected at age 25, and became distinct at age 39. Gamone 1 activity in cell-free fluid prepared from each sample corresponded to the level ofgamone 1 mRNA. These results suggest that the transcription of gamone 1 is strictly linked to the process of sexual
maturation and clonal age.

[目的] 繊毛虫類異毛綱に属するブレファリズマは、明らかにした1)。本研究では、接合に関わる様々な内

富栄養条件下では二分裂で増殖し、貧栄養条件下に的要因・外的要因によるガモン１の発現制御を分子おかれると相補的な接合型細胞（I型、II型）間で有レベルで明らかにするために、栄養条件と性成熟過性生殖（接合）を行う。接合は、両接合型細胞が分程のガモン１遺伝子の転写に及ぼす影響を調べた。

泌する接合誘導物質、ガモン１、ガモン２を介した細胞間相互作用の結果引き起こされる。ブレファリ[材料と方法] 栄養条件のガモン１遺伝子発現へ及ぼ

ズマのガモンはすでに単離同定されており、ガモン

す影響を調べるために、増殖期、定常期１日目、定１は、272アミノ酸と７つの糖からなる糖タンパク質

常期５日目のI型細胞を用意し、total RNAの抽出をであることが報告されている1)。また、ガモン２は、行った。また、分裂齢の進行（性成熟過程）におけ

3-(2’-formylamino-5’-hydroxybenzoyl) lactate と し て 同るガモン１遺伝子の発現を調べるために、I型細胞と定されている1)。しかし、これらの物質を介した接合

II型細胞を交配させて接合完了体を単離し、一回分誘導機構の分子メカニズムは解明されていない。

裂させることによってcaryonidal cloneを単離した。単我々は、ブレファリズマにおける接合誘導の第一イ

離した子孫株をWGP（Wheat-grass-powder）培養液でベントであるI型細胞によるガモン１の合成・分泌に培養して分裂を繰り返させ、各分裂齢時に接合型の注目し、これまでにガモン１の発現が接合型特異的

判別、成熟度の測定およびサンプリング（total RNA

な機構により転写レベルで制御されていること、ガの抽出と細胞外液の回収）を行った。接合型の判別

モン２によってその転写が著しく促進されることをおよび成熟度の測定は、各分裂齢時の細胞とテス

42

原生動物学雑誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年

ター細胞（I型、II型）を混合し、接合するかどうか

齢を境に未熟期から成熟期への移行を開始し、分裂で成熟度の測定を、どちらの型のテスター細胞と接を繰り返すことによってさらに成熟度を増すと考え合するかで接合型の判別を行った。また、各細胞かられた。また、II型のテスター細胞とのみ接合したら 抽 出 し た total RNA を 用 い、ガ モ ン １ cDNA を プことから、接合型I型に分化したと考えられた。各分

ローブとしてノーザンハイブリダイゼーションを行

裂齢時（10、18、25、39）の細胞を飢餓状態においい、ガモン１遺伝子の転写レベルを検出した。さらた時のガモン1の発現を調べた結果、ガモン1mRNAに、ガモン１の翻訳および分泌を確認するために細は未熟期の細胞では検出されず、成熟期への移行が胞外液のガモン1活性を測定した。

見られ始めた25分裂齢の細胞でわずかに検出され、39分裂齢ではっきりと検出された。このことから、[結果と考察] 栄養条件の異なるI型細胞におけるガガモン1遺伝子の転写レベルは性成熟度合と対応して

モン1遺伝子の転写レベルをノーザンハイブリダイ

おり、分裂回数をカウントする機構の下流で制御さゼーションによって調べた結果、ガモン1mRNAは、れていると考えられた。また、細胞外液の活性テス

増殖期の細胞では検出されず、定常期1日目に入ってトを行った結果、ノーザンハイブリダイゼーション

飢餓状態におかれた細胞で初めて検出され始め、さの結果と一致し、ガモン1の発現は転写レベルで制御らに飢餓が進行した定常期5日目の細胞で、その量がされていることを確認した。

増加していることが分かった。このことより、ガモ

これまでの報告と本研究によって、ブレファリズ

ン1遺伝子の転写は、成熟期にあるI型細胞が栄養のマの接合誘導の第一イベントであるガモン1の発現は欠乏という刺激を感知することが引き金となって開転写レベルで制御されていることが遺伝子レベルで始され、その程度によって促進される可能性が考え明らかになった。また、「接合後約25回以上分裂すられた。

ること」、「接合型がI型に分化すること」、「栄養単離した子孫株を用いて分裂齢の進行に伴う性成の欠乏」が、ガモン1遺伝子の転写開始必須条件であ熟度の測定を行った結果、約25分裂齢時まではどちり、ガモン2は転写促進にはたらくことを示した。

らのテスター細胞とも接合を行わず、これらのクローンは性的に未熟期にあると考えられた。約25分[文献]

裂齢を境にII型のテスター細胞と接合を行う細胞が1) 春本晃江、杉浦真由美（2003）原生動物学雑誌, 36

現れ始め、その割合は分裂齢が進行するにつれて増(2), 147-172. 総説加した。したがって、これらの子孫株は、約25分裂

太陽虫 Actinophrys sol の捕食機構の解析
角田宗一郎、洲崎敏伸（神戸大・理・生物）

Analysis of the feeding system in the heliozoon Actinophrys sol
Soichiro KAKUTA and Toshinobu SUZAKI (Dept. Biol., Fac. Sci., Kobe Univ.)
SUMMARY
Actinophrys sol is a predatory protozoan which captures prey organisms with its axopodia. When capturing preyorganisms, A. sol discharges the contents of extrusomes, which are secretory granules located beneath the cell membrane.
It has been reported that extrusomes contain concanavalin A (Con A)-binding materials. At least two proteins are known
to be involved in feeding of A. sol. The first is a 40-kDa glycoprotein (gp40) that binds Con A, and gp40-adsorbed agarose beads induce phagocytosis by A. sol. This suggests that gp40 functions in prey recognition. Another protein involved in feeding is TPPI , which is deduced to be a peptidase involved in lysosomal digestion. By immuno-microscopicJpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)

43

observation, it was found that TPPI was localized in lysosomes and discharged into late phagosomes. From the results ofa homology search, it is conceivable that TPPI is a peptidase belonging to the sedolisin family. Immuno-electron microscopy confirmed that gp40 was localized in extrusomes. After gp40 was purified with Con A-agarose, and then digested
with N-glycosidase, SDS-PAGE and western blotting showed that its molecular mass, without the Con A- binding sugar
chain, was 37.5 kDa.

[目的] 太陽虫 Actinophrys sol は捕食性の原生動物た。包埋、超薄切片化した試料を電子顕微鏡で観察

で、軸足と呼ばれる仮足を用いてエサを捕らえる。

した。またCon Aアガロースを用いてgp40を精製した

その際、細胞表層にあるエクストルソームという細後、N-glycosidaseにより糖鎖を分解しSDS-PAGE及び胞小器官から内容物が放出されることが分かっておWestern blottingにより糖鎖を除いたタンパク質の分り、その中には Concanavalin A (Con A) に結合する物

子量を推定した。

質が含まれている。これまでにCon A に結合する糖タンパク質としてgp40が見つかっており、gp40 はA.

[結果と考察] 抗体を用いた顕微鏡観察によりTPPIが

sol がエサを認識して細胞内に取り込むという機構にライソソーム内に存在し、かつ捕食開始後およそ90

関与していると考えられている。今回この gp40 の抗分以降という比較的遅い時期に食胞内に放出される体を用いた顕微鏡観察により細胞内での局在を観察

タンパク質であることが分かった。クローニングさした。またCon Aによりgp40の精製を行ったうえでグれたcDNAと相同性の高かったタンパク質においてのリコシダーゼによる糖鎖分解を行い糖鎖の種類と分

過去の研究結果 3) と合わせて、このタンパク質が子量を推定した。また A. sol ではこれまでに、ライ

sedolisinと呼ばれるペプチダーゼファミリーに属する

ソソーム酵素の一種ではないかと思われるタンパク

ライソソーム酵素であることが強く示唆された。一

質TPPIのクローニングがされている。TPPIがライソ

方gp40は顕微鏡観察の結果からエクストルソーム内

ソームに関するタンパク質であれば、gp40とともにに存在するタンパク質であることが確認できた。同用いることで捕食の経路に関してより詳細に解析でじ抗体を用いての免疫沈降ではgp40を集めることがきると考え、TPPI についても gp40 同様に抗体を作できなかったが、Con Aを用いてgp40を精製すること製し、局在性を調べるため顕微鏡による観察を行っができた。この精製gp40をN-glycosidaseによって処た。

理したところ分子量が約37.5 kDaに減少した。ウェスタンブロッティングの結果からこれがgp40である
A. solはSakaguchi and Suzaki (1) にことは確認でき、Con A結合型の糖鎖を除いたタンパ

従って無菌培養したものを用いた。抗体はgp40はNク質の分子量を推定することができた。今後は精製[材料と方法]2)末端のアミノ酸配列 に対するペプチド抗体、TPPIはしたgp40をもちいて内部アミノ酸配列を読み、cDNA

大腸菌に発現させ精製したタンパク質からウサギポのクローニングを行っていきたい。

リクローナル抗体を作製して使用した。免疫蛍光法
では、細胞を4% ホルムアルデヒドで固定後エタノー[文献]

ルで透過処理をし、一次抗体及びAlexa488二次抗体

1) Sakaguchi, M. and Suzaki, T. (1999) Europ. J. Pro-を反応させて共焦点レーザー顕微鏡で観察した。またTPPIでは飢餓状態の細胞に餌を与えてから30分ごとに固定染色し、局在性の経時変化を観察した。免
疫電子顕微鏡法では4% ホルムアルデヒドと0.4% グルタルアルデヒドで固定後0.5% のTritonX-100で脱膜処理をした細胞を、一次抗体および金粒子で標識しtistol., 35, 411-415.
2) Sakaguchi, M., Suzaki, T. and Murakami, H. (2001)
Protist, 152, 33-41.
3) Yoo, S. Y., Choi, J. Y., Kim, H. and Ahn. T.I. (1996)
Molecules and Cells, 6, 316-324.

44

原生動物学雑誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年

Toxic effect of heavy metal ions on the axopodia of heliozoon
Raphidiophrys contractilis
S. M. Mostafa Kamal KHAN1, Mikihiko ARIKAWA1, 2, and Toshinobu SUZAKI1(1Dept. Biol., Fac. Sci., Kobe Univ., 2Dept. Biol. Sci. Environ., Nara Women's Univ.)
SUMMARY
In this study we have observed the effect of zinc, lead, copper, mercury and cadmium ions on the heliozoon Raphidiophrys contractilis. The effects of heavy metal ions on the axopodial length, food uptake mechanism and axopodial
contraction were examined, and we found that the axopodial length decreased significantly, the food uptake mechanism
and axopodial contraction prolonged. The half strength effects of these heavy metals are around 1 µM, i.e., in 1 µM
heavy metal ions axopodial length became almost half. In the same concentration of these heavy metal ions, the affect of
mercury is higher than those of zinc, lead, copper and cadmium. In high concentration of these heavy metals, it wasobserved that axopodia were disappeared and cells were disrupted very quickly.

[INTRODUCTION] Heavy metal pollution is a worldwide
problem, due to the industrial discharge. Considerable
efforts have therefore been made to identify polluted areas
and to develop efficient methods for their quantitative
assessment (1, 2). In natural and polluted environments,
the uptake and handling of essential toxic metals by different cells constitute critical steps in the cell survival (3).
Heavy metal pollutants, found in the environment, areserious toxicants in the aquatic environment. Heavy metal
ions form unspecific complex compounds in the cell thatlead to toxic effects. Even highly reputable trace elements
like Zn2+ or Ni2+ and especially Cu2+ are toxic at higher
concentrations. Thus, the intracellular concentration ofheavy metal ions has to be tightly controlled, and heavy
metal resistance is just a specific case of the general demand of every living cell for some heavy metal homeostasis system. However, heliozoa are primarily freshwaterand sub-benthic species from brackish or marine water inthe euphotic zone. The heliozoon Raphidiophrys contractilis possesses lot of axopodia radiating from the cell bodyand food organisms are captured by axopodial contraction(4). In the present study we have observed the physiological effect of zinc, lead, mercury, copper and cadmium on
R. contractilis.
[MATERIALS AND METHODS]
Organism and Culture: The heliozoon Raphidiophrys
contractilis was originally collected from a brackish pondin Shukkei-en Garden, Hiroshima City, Japan. Organisms
were cultured monoxenically at 20 ± 1°C in a culture medium based on 10% artificial sea water and food flagellate

Chlorogonium elongatum (5). C. elongatum was added tothe culture medium as food source sub-culturing was carried out at intervals of about 7 to 10 days.
Methods: Floating heliozoans were placed on a glass slide,surrounded with rectangular mounting ridges of petroleum
jelly. The cells were allowed to settle for 5-10 minutes sothat they might recover from axopodial disturbance causedby pipetting. Then metal ions were added and cells werecovered with a cover slip, observed under microscope(Nomarski differential interference optics, BX50, Olympus, Tokyo, Japan) and recorded on S-VHS video tapeusing a video recorder (Mitsubishi HV-S77 and BR-S822,
Victor, Tokyo, Japan).
[RESULTS AND DISCUSSION] Heavy metal pollution
resulting from human, industrial and agricultural activities
affect biological systems. This pollution affects thegrowth, development, morphology, metabolism and manyother cellular and molecular biological activities of all
eukaryotic organisms from higher to lower, including, ofcourse, unicellular microorganisms. In the present study
we have observed the physiological effect of zinc, lead,
mercury, copper and cadmium on the heliozoon R. contractilis. The cells displayed different sensitivities to these
metals, such as, axopodial degradation, number of kinetocyst decreased, movement of kinetocyst become slower,
food uptake mechanism and axopodial contraction by
external stimuli prolonged. The effect of Zn2+, Pb2+, Cu2+
and Cd2+ observed less severe and it took little more timethan Hg2+ to disappear all axopodia. The effect of mercury
severely damaged the axopodia. Mercury produced aJpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)
high-pronounced effect on the axopodia. We have observed that in the presence of these heavy metal ions theaxopodia of R. contractilis become shorter than its normal
length and in the Hg2+ all axopodia disappear with in the
shortest period of time. The axopodial length of the heliozoon was observed, recorded and calculated up to 20 min
after the addition of metal ions. These observations indicate the toxic affect of heavy metal ions for the survival of
the heliozoon and affect on aquatic ecosystem, and alsosignify that R. contractilis is an effective biological modelfor the study of metal poisoning of eukaryotic cell.

45[References]
1) Anton A. et al. (2000): The Sci. of the Total Environ.,
247 (2-3), 239-251
2) Carvan M. J. et al. (2000): N.Y., Acad. Sci., 919, 133147
3) Lamas M. E. et al. (2002): Environ. Pollu., 120, 779786
4) Kinoshita E. et al., (1995): J. Euk. Microbiol. 42(3):283-2885) Sakaguchi M. and Suzaki T. (1999): Eur. J. Protistol.
35, 411- 415

テトラヒメナの細胞質分裂におけるADF/cofilinの研究
汐崎七海，中野賢太郎，沼田 治 （筑波大・生物科学）

Isolation of a gene encoding ADF/cofilin in Tetrahymena thermophila
Nanami SHIOZAKI, Kentaro NAKANO and Osamu NUMATA (Inst. of Biol. Sci., Univ. of Tsukuba)
SUMMARY
Cytokinesis is one of the most important events for cell growth and is accomplished by contraction of the contractile
ring. Although the contractile ring is mainly composed of actin filaments and myosin, it is not well understood how these
proteins are assembled in the ring. Therefore, we decided to study the function of actin-regulating proteins in Tetrahymena thermophila, and identified an ADF/cofilin-homologous gene, ADF73, from its genome project. ADF/cofilin is a
protein that severs and depolymerizes actin filaments and plays an important role in establishing cytokinesis in many
eukaryotic cells. First, we cloned ADF73 and deduced its encoded amino acid sequence. It was revealed that Adf73p is a
136-amino acid protein and is most similar to starfish and Schistosoma ADF/cofilin. Next, we determined that the molecular weight of Adf73p is about 14.5 kDa, by subjecting its recombinant protein, expressed in E. coli, to SDS-PAGE.
In addition, we confirmed the intercellular interaction of Adf73p with actin from the fission yeast, Schizosaccharomyces
pombe. In future, we will study the biochemical reactivity of Adf73p to actin in vitro, and the function of Adf73p incytokinesis in Tetrahymena, by knocking out its gene and by immunofluorescence microscopy.

[目的] 細胞質分裂は、細胞の増殖に不可欠な生命現た。すでに、アクチン重合調節タンパク質であるプ象の1つである。動物細胞では、細胞質分裂はアクチ

ロフィリンやEF1αが収縮環形成に関わることを示

ン繊維とミオシンからなる収縮環の収縮により起こしている。しかし、これらのタンパク質のみの働きる。しかし、収縮環形成のメカニズムの詳細はよく

では、収縮環におけるアクチン繊維の制御を説明す

分かっていない。テトラヒメナTetrahymena thermo-

るには不十分である。一方、テトラヒメナのゲノム

philaは動物細胞と同様に収縮環による細胞質分裂をプロジェクトが進行し、最近その全貌が明らかにな行う。これまでに本研究室では、テトラヒメナを用りつつある。そこで私たちは、この情報をもとにアいて収縮環形成のメカニズムについて解析してきクチン調節タンパク質の遺伝子の網羅的な探索にの原生動物学雑誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年

46

りだした。ここではADF/cofilin様のアクチン調節タ

イブラリーからADF73をクローニングすることに成ンパク質をコードする遺伝子ADF73の同定と機能に功した。cDNAが単離できたため、この遺伝子はテト

ついて報告する。

ラヒメナで発現していることが確認された。ADF73

ADF/cofilinはアクチン繊維を脱重合・切断する活のDNA配列から推定される遺伝子産物のアミノ酸配性をもつ。テトラヒメナにおいては、この他にアク列は全長が136a.a.で、分子量は約15 kDaである。推チン繊維の切断や脱重合に関わるタンパク質は見つ定遺伝子産物であるAdf73と他の生物のADF/cofilinとかっていないため、Adf73pの収縮環形成における働の ア ミ ノ 酸 配 列 の 相 同 性 を 調 べ た 結 果、ヒ ト デきは大変に興味深いと考えた。

A.amurensis やジュウケツキュウチュウS. japonicumと相同性が高いことが判明した。

[方法] テトラヒメナのゲノムDNAとcDNAライブラ

大腸菌の発現システムを利用して精製したAdf73p

リーを鋳型とし、ADF73をPCR法により増幅し、クをSDS-PAGEで調べたところ、約14.5 kDaの位置にバ

ローニングした。得られたそれぞれのDNA断片につンドが検出された。これはADF73のcDNAのアミノ酸

いてはシークエンスを明らかにし、目的の遺伝子で配列から推定される分子量の大きさと一致する。

あることを確認した。

また、分裂酵母におけるAdf73pの局在を調べたと

次に、ADF73のcDNAを大腸菌を用いて発現させる

ころ、Adf73pが分裂酵母のアクチン構造体に局在しため、テトラヒメナではGlnをコードするTAAコドンている様子が観察された。さらに、アクチンを破壊を大腸菌では終止コドンとなるためMutagenesis Sys-

するとAdf73pが細胞内に分散したことから、Adf73p

temとPCR法を用いてCAAコドンへ置換した。これをは分裂酵母のアクチンと結合していることが示され大腸菌発現用ベクターpGEX4T-1に組み込み、発現･た。

精製した。精製産物についてはSDS-ポリアクリルア

現在、Adf73pのアクチンに対する生化学的活性を

ミドゲル電気泳動法(SDS-PAGE)でチェックした。さ検討している。また、Adf73pの抗体を作製し、免疫らに、Adf73pとYellow fluorescence protein (YFP)の融抗体法により細胞質分裂時のテトラヒメナ細胞内の合タンパク質を分裂酵母細胞内で発現させ、蛍光顕

Adf73p の 局 在性 を 解 析 す る。ま た、ア ンチ セ ン ス

微鏡を用いてその局在を観察した。

rRNA法を用いてテトラヒメナのADF73遺伝子ノック
ダウン株を作製し、Adf73pの収縮環形成における働[結果と考察] テトラヒメナのゲノムDNAとcDNAラきについて検討を行う。

アメーバ細胞運動におけるイノシトールリン脂質の役割
新木良子，前田佳祥子，鎌田英明，平田 肇，新免輝男，園部誠司，八木澤 仁（兵庫県立大学大学院 生命理学研究科）

Role of phospholipase C in the motility of Amoeba proteus
Ryoko SHINKI, Kayoko MAEDA, Hideaki KAMATA, Hajime HIRATA, Teruo SHIMMEN, Seiji
SONOBE, Hitoshi YAGISAWA (Graduate School of Life Science, University of Hyogo)
SUMMARY
We have examined the role of phospholipase C (PLC) in the cell movement of Amoeba proteus. Although mechanisms of regulation of actin-based cell motility by phosphoinositide in mammalian cells have been well explored, thoseof Amoeba proteus still remain poorly understood. The Amoeba movement was examined as a model system to dissectJpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)

47

locomotion of mammalian cells, such as macrophages, neutrophils as well as some cancer cells, exhibiting a rapid amoeboid movement. Amoeba cell lysates showed the PtdIns(4,5)P2 hydrolyzing activity. Microinjection of Ins(1,4,5)P3, oneof the products of PtdIns(4,5)P2 hydrolysis, into the cytoplasm of resting Amoeba caused pseudopod extension and cell
movement. We have isolated cDNA clone encoding a functional PLC from Amoeba by RT-PCR cloning method. The
deduced amino acid sequence and the domain structure show a marked similarity to the eukaryotic PLCs, especiallythose of mammalian delta type isoforms except that the structure includes an additional C2 domain at the N-terminus
instead of the pleckstrin homology (PH) domain. We designate the gene as Applc (Amoeba proteus phospholipase C).

[目的] Amoeba proteus の細胞運動におけるイノシ

パク質 GST-ApPLC の発現を誘導した。発現タンパ

トールリン脂質とその加水分解酵素であるホスホリ

ク質はグルタチオン-セファロース 4B（アマシャム

パーゼ C(PLC) の役割について解析した。

バイオサイエンス社）を用いて精製した。

[材料と方法][結果と考察]Amoeba proteus 培養

アメーバにおける PLC の存在とその意味

Amoeba proteus は KCM 溶液 (KCl 94 µM, CaCl2 72

アメーバ粗抽出液は用量依存的に PtdIns(4,5)P2 をµM, MgSO4-7H2O 32 µM) で培養し、餌として Tetra-

加水分解することから、PLC の存在が推定された。

hymena pyriformis を与えた。

また、注入した Ins(1,4,5)P3 濃度依存的にアメーバのPtdIns(4,5)P2 加水分解活性の測定

運動性が更新することより、PtdIns(4,5)P2 の加水分解

アメーバに溶解液（10% Sucrose, 50 mM PIPES/がアメーバの細胞運動に関与していることが示唆さ

KOH(pH7.0), 1 mM DTT, プロテアーゼ阻害剤）をれた。

加え、シリンジで破砕した。超遠心（100,000 rpm 20

遺伝子クローニング

分 4°C）を行い、その上清を測定試料とした。[3H]

哺乳類 PLC β、γ、δの X ドメインで保存されていPtdIns(4,5)P2 を含むリポソームを基質として 10-4 M

るアミノ酸配列から設計した縮重プライマーを用い

Ca2+存在下で 37°C、10 分間測定試料と反応させた。

て、cDNA を鋳型として PCR を行ったところ、1183遊離した [ H] Ins(1,4,5)P3 を液体シンチレーションカ

bp の DNA 断片が得られた。この塩基配列をもとにウンターで測定した。

3’RACE 法および 5’RACE 法を行い、遺伝子全長を含Ins(1,4,5)P3 インジェクションの影響むと推定される配列を得た。ノザンブロッティング

静止状態のアメーバ（貪食後 1 ～ 2 日）に Ins

による mRNA 発現解析を行ったところ、アメーバ(1,4,5)P3 を顕微注入し、その後の仮足の形成およびRNA のレーンにのみ約 2.5 kb に相当する位置にシグ運動速度を画像解析によって定量化した。

ナルが検出された。これは単離した cDNA のサイズ

cDNA クローニング

2544 bp とほぼ一致し、得られた遺伝子がアメーバ由飢餓状態に 1 週間以上おいたアメーバから総 RNA

来の転写産物であることが示唆された。得られた遺を抽出し、RT-PCR 法により cDNA を合成した。哺伝子を Applc (Amoeba proteus phospholipase C) と命名

乳類 PLC β、γ、δの X ドメインで保存されているアした。大腸菌で発現させ、精製した GST-ApPLC に

ミノ酸配列から設計した縮重プライマーを用いて、は PtdIns(4,5)P2 加水分解活性が存在した。

cDNA を鋳型として PCR を行った。

ApPLCは新規のPLCである

ノーザンブロットによる発現解析
アメーバと餌であるテトラヒメナのそれぞれの総ApPLC のアミノ酸配列について DDBJ の FASTA
で検索したところ、種々の PLC と相同性があった。

RNA 5 µg に対して、[32P]dCTP で標識した Applc 3’末

また、ApPLC のアミノ酸配列について Pfam のドメ

端の 1 kb に対応する DNA 断片を用いてノーザンブ

インサーチを行ったところ、N 末端側から C2 ドメイ

ロット解析を行った。

ン、EF ハンドモチーフ、XY ドメイン、C2 ドメイン

大腸菌によるタンパク質発現と精製を持つことが示された。すなわち、哺乳動物の PLC

pGEX-4T ベクター（アマシャム バイオサイエンス

アイソフォームに存在する PH ドメインの代わりに社）に Applc の全長をサブクローニングし、大腸菌

C2 ドメインが存在していた。C2 ドメインは Ca2+依BL21(DE3) 株に形質転換させ、IPTG により融合タン

存的にリン脂質膜に結合することが知られるドメイ

48

原生動物学雑誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年

ンであるが、現在までに、N 末端側に C2 ドメインが強く示唆された。細胞運動との関係はまだ不明であ存 在 す る PLC は 報 告 さ れ て い な い。す な わ ち、るが、我々は Amoeba proteus からユニークなドメイ

ApPLC は新規の PLC である。また、ApPLC の C 末ン構造をもつ PLC をコードする遺伝子をクローニン

端側の C2 ドメインは PLC ファミリーの C 末端に存グした。今後、ApPLC とアメーバの細胞運動との関在する C2 ドメインと相同性があったが、Ｎ末端側与について解析していきたい。

の C2 ドメインは PLC の C2 ドメインよりも、エキソ
サイトーシスに関与する Doc2 やシナプトタグミン[文献]の C2 ドメインと相同性が高いことがわかった。

1) Kawakatsu, T. et al. (2000) Cell Struct. Funct., 25,

PtdIns(4,5)P2 の加水分解産物である Ins(1,4,5)P3 の注入により運動が引き起こされたことから、アメーバの細胞運動には PLC の活性化が関与していることが269-277.
2) Rebecchi, M. J. et al. (2000) Physiol. Rev., 80, 12911335.

Paramecium caudatum における低温条件での細胞増殖に関する
遺伝学的研究佐々木 大，芳賀信幸（石巻専修大学・理工）

Genetical research on cell proliferation at low temperature in Paramecium caudatum
Hajime SASAKI and Nobuyuki HAGA (Dept. of Biotech., Ishinomaki Senshu Univ.)
SUMMARY
The question of how paramecia survive the winter season involves many interesting problems in the fields of ecology, physiology and genetics. Using growth experiments under low temperature, we have examined the importance of
heritable characters for both proliferation and survival. To elucidate genetic effects on cell proliferation and survival in
low temperature cultivation, we have examined the acclimation effect, a short-term physiological adaptation, by changing the cooling rate leading to low temperature cultivation. Two proliferative lines (KNZ2S1 #24, #26) showed growth
curves after acclimation treatment (20 days incubation with a cooling rate of 1°C per day from 25°C) similar to thegrowth curves obtained in rapid-cooling conditions; and two non-proliferative lines (#11, #22) still showed no proliferation after acclimation treatment. These results indicate that neither proliferation nor survival under low temperature depend on the cooling rate. Average survival ratio and average proliferative activity in the progeny of a selfing conjugationof KNZ2, the original low-temperature proliferative stock, showed positive correlation. However, we could not obtainclear segregation ratios in either proliferative ability or survival in these experiments. We must therefore consider the
possibility of genetic complexity underlying the mechanisms of low-temperature acclimation, and hence the wintering
mechanisms.

[目的] P. caudatumの越冬に関する研究を行う上で、よって推測するとともに、P. caudatumの低温増殖能

低温条件での細胞増殖能力に関わる遺伝的要因を調力が遺伝学的特性を調べることを目的とした。本実

べる実験の基礎として、急激な温度の低下と緩やか

験では4系統のP. caudatumをそれぞれ低温条件下で培な温度の低下が細胞増殖能に与える影響を低温条件養し、増殖曲線を比較解析し、自系接合の子孫が低下（5°C）における20日間の細胞増殖を調べる事に温条件下でどのような増殖曲線を示すかを調べるこJpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)とで、培養の温度条件を検討した。

49

よりも早い、など幾つかの相違点も見られた。以上の結果より、実験結果が出るまでの時間が短く手間[材料と方法] 今回使用した株は、KNZ2という低温がかからないという点から、Bの実験系を用いて以条件下でも高い細胞増殖能力を持つ株の自系接合に後の実験を行うことにした。

よって作り出した子孫、KNZ2S1＃11・＃22・＃24・＃26である。

次に、KNZ2の自系接合によって得られた子孫40系
列について低温条件下での細胞増殖能力を調べた。

実験A：緩やかな温度の低下が細胞増殖に与える

低温条件下での細胞増殖には少なくとも低温でも生影響を調べる実験系で、①培養温度が25℃から24時存できる能力と分裂する能力が必要だと考え、20日

間毎に1°Cずつ低下していくインキュベータのなかで間における平均生存率に対する平均分裂回数をプ

1細胞単離培養法を用いて20日間培養した後、②5℃ロットしたグラフを作成した。その結果、5℃におけで20日間培養し、その細胞増殖能力と生存率を調べ

る20日間の平均生存率と平均分裂回数との間には弱た。（②では培養液は3日に1度交換した。）

い正の相関があることが明らかになった。しかし、

実験B：急激な温度の低下を伴う実験系で、培養
温度25℃から前述行程②に入れた。

遺伝学的な分離比に分けることが出来なかったので、低温条件での生存・分裂の能力にはそれぞれ複各株ともに25℃で最低8日間培養した後、上述の実数の遺伝子が関与ているのではないかと考えられ

験系を用いて、低温培養20日間における平均生存細る。そこで、＃22の自系接合による子孫を7系列獲得

胞数を調べ、細胞増殖の様子をグラフに表した。

し、その低温条件下における細胞増殖能力について調べたところ、親である＃22とは異なる増殖曲線を[ 結 果 と 考 察 ] 実 験 A お よ び B 共 に、低 温 条 件 下で＃24・＃26は増殖可能であり、＃11・＃22はほと示す子孫も出現した。
以上の結果は、これまで低温条件下での生存能力

んど増殖することができなかった。このことより、について不明な点が多かったP. caudatumの増殖能に低温条件下での細胞増殖能力を調べる際の実験系と関して個々の細胞が持つ遺伝的要因の重要性という

してはどちらの実験系も有効であることが示唆され新たな視点を提供するものであり、今後、生物の越たが、(ⅰ)20日間における死亡細胞数や、(ⅱ)実験A

冬メカニズムを理解する上でもこの点は検討されるでは細胞増殖は実験開始直後から始まるのに対し、べき課題であると思われる。

Bでは実験開始5日後から増殖を始め、増殖速度はA

高温下でオートガミー未熟期が延長するヨツヒメゾウリムシの新規突然変異体の分離
高木由臣，小森理絵（奈良女大・理・生物科学）

A new type of temperature sensitive mutant of Paramecium tetraurelia that has longautogamy immaturity and short clonal life span
Yoshiomi TAKAGI and Rie KOMORI(Department of Biological Science, Faculty of Science, Nara Women’s University)
SUMMARY
We have isolated a new type of Paramecium tetraurelia mutant, named d4-312, that has a long immaturity period
until autogamy. As such a mutant, we previously isolated the stock d4-RK (Komori, R., et al., 2004). These two mutants

50

原生動物学雑誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年

had some additional common features such as dependence of the occurrence of autogamy on the temperature, involvement of a single recessive gene, lower fission rate and shorter clonal life span. However, d4-312 was considered a new
type mutant distinguishable from d4-RK because of their different natures of temperature sensitivity. First, the temperature at which they resembled the wild-type phenotype was low (19°C) in d4-312, although it was high (32°C) in d4-RK.
Second, the clonal life span of d4-312 at 25°C was similar to that of the wild-type, but it was extremely shorter at 32°C
than at 25°C, although it was similarly shorter at both temperatures in d4-RK. Third, the difference of the fission rate
between the mutant and wild-type was greater at 32°C than at 25°C in d4-312, although it was similar at both temperatures in d4-RK. The age at sexual maturation did not correlate, within species, to the maximum clonal life span as proposed among species.

[目 的] 「生 物 の 時 間 は 体 重 の 1/4 乗 に 比 例 す る

ローンでそのクローンを代表させた。

（T=aW1/4）」というアロメトリー式がある。この式
は、寿命 TL、性成熟までの時間 TM、心臓の拍動周[結果と考察] 突然変異剤処理をした 478 クローンの期 TP など様々な時間に適用できるので、例えば TL/

うち、選別基準を充たした 1 株（d4-312）を得た。

TM=一定、すなわち「生物の寿命は性成熟までの時

一旦ストックとして保存した後、改めて 100%オート間に比例する」という関係が導かれる。実際この関ガミーカルチャーをつくり、この株の様々な特徴に係は、哺乳類１）や繊毛虫類２）で大まかに成立するこ

ついて調べた。その結果以下の 5 点について、先にとが報告されている。我々が先に分離したヨツヒメ

分離した d4-RK 株と共通の特徴を示した。(1) 野生株

ゾウリムシの短寿命突然変異株 d4-SL4（jumyo ホに比べオートガミー誘導開始分裂齢が遅く、その後モ）ではオートガミー未熟期も短縮していた３）が、も変異幅の大きな誘導率を示した。(2) オートガミー

オートガミー未熟期延長突然変異株 d4-RK（rie ホ

誘導率が培養温度によって大きく変動した。(3) 単一モ）ではクローン寿命が短縮していた ４）。しかしの劣性遺伝子の関与が示唆された（rie-2 と命名し、rie 遺伝子が寿命の延長にも関わっている可能性を否

先の rie を rie-1 と改めた）。(4) 短いクローン寿命

定し切れなかったため、再度オートガミー未熟期延と、(5) 遅い分裂速度を示した。

長型の突然変異株を分離し、クローン寿命との関係を調べることを目的とした。

以上のような共通性にもかかわらず、rie-2 と rie-1とは別な遺伝子であると結論したのは、d4-312 株がd4-RK 株とは全く対照的な温度感受性を示したこと[材料と方法] 材料はヨツヒメゾウリムシの 51 株による。第一に、d4-RK 株のオートガミー誘導は 32°（野 生 株）と、遺 伝 解 析 の た め に マ ー カ ー と し てC で促進されたのに対し、d4-312 株では 32°C で抑制

nd169 をホモにもつ d4N-527 株（トリコシスト放出

され 19°C で促進された。第二に、d4-RK 株のクロー不能）を用いた。突然変異剤処理、オートガミー誘ン寿命は 25°C でも 32°C でも野生株に比べ同程度に導、ク ロ ー ニ ン グ と 続 く 常 法 処 置 の 後、9 回・18

短縮したのに対し、d4-312 株では 25°C で野生株並み

回・27 回分裂齢のオートガミー率が 25°C で 0%・のクローン寿命を示しながら 32°C では著しく短縮し0%・30%以下という条件を充たしたクローンを選別た。第三に、d4-RK 株の分裂速度は 25°C で 32°C よした。その後、d4N-527 株との接合と、それに続くり低下したのに対し、d4-312 株では 32°C で 25°C よオートガミーで得た子孫について、マーカー遺伝子り低下した。

で 1:1 分離を示したものについて遺伝解析を行っ我々はこれまで、クローン寿命とオートガミー未た。培養はバクテリア接種の WGP 浸出液をエサと熟期の長さに関係する突然変異株の分離を行ってきし、異なる培養温度下で、各 10-15 クローンについたが、今回 3 つ目の突然変異株をこの分野の共有資て 単 離 培 養 法 で 分 裂 齢 を 進 め、単 離 後 の 各 カ ル

産として提供することが出来た。これら 3 株のうち

チャーが定常期になったときにオートガミー率（大2 株で、オートガミー未熟期の延長とクローン寿命

核崩壊像を示す細胞の割合）を調べた。クローン寿の短縮という共通の特徴を示したことから、よく知命と分裂速度を調べる実験には、それぞれ 2 つのサられている「生物の寿命は性成熟までの時間に比例

ブクローンからなる 30 クローンを用い、サブクロー

する」という法則は、種間の関係として理解すべき

ン間での置き換えを許しながら、長く生きたサブク

であって、種内でのクローンでは両者は必ずしもカJpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)

51

プリングしないことが明らかになった。

2) Smith-Sonneborn, J., (1981), Int. Rev. Cytol. 73, 319-

[文献]3) Takagi, Y., Izumi, K., Kinoshita, H., Yamada, T., Kaji,354.
1) Cutler, R.G., (1978), In: Behnke, J.A., Finch, C.E., andMoment, G.B. (Eds.). The Biology of Aging. Plenum
Press, New York, pp. 311-360.

K., and Tanabe, H., (1989), Genetics 123, 749-754.
4) Komori, R., Harumoto, T., Fujisawa, H. and Takagi, Y.,(2004), Mech. Ageing Dev. 125, 603-613.

ボウフラから発見された繊毛虫テトラヒメナの無菌培養について
久富裕子，岩見涼子，松田涼子，赤川裕美，内田眞砂子，高橋忠夫（西九州大・生物）

On the axenic culture of the ciliate Tetrahymena sp. found in a dead mosquito larva
Yuko HISATOMI, Ryoko IWAMI, Ryoko MATSUDA, Yumi AKAGAWA, Masako UCHIDA andTadao TAKAHASHI (Biol. Lab., Nishikyushu Univ.)
SUMMARY
We succeeded in axenically culturing the ciliate Tetrahymena sp., which was found in a dead mosquito larva, using
PY medium (1% proteose peptone, 0.5% yeast extract containing antibiotics) at 23°C (Hisatomi et al., 2003). Under theculture conditions, the cells grew logarithmically and reached the stationary phase at day 9. At that time, the cell densities reached 174,000 cells/ml. However, from day 11, some of the cells gradually assumed a round shape and subsequently underwent cytolysis. Therefore, the purpose of this work was to modify the culture method to prevent cytolysis.
As a first step, the population growth was examined in the following four culture media: 1% proteose peptone (1%P),
0.5% yeast extract (0.5%Y), 1% proteose peptone with 0.1% yeast extract (P with 0.1%Y), and 1% proteose peptonewith 0.01% yeast extract (P with 0.01%Y). In 1%P, P with 0.1%Y, and P with 0.01%Y, the cells grew logarithmically
until day 7, and their cell densities reached 8,900 cells/ml, 28,000 cells/ml, and 18,000 cells/ml, respectively. In 0.5%Y
the cells grew continuously until day 21, but the cell density reached only 7,000 cells/ml. It is clear that further modification of the culture method is required, because cytolysis occurred gradually from day 22 to day 24 in the first three media.

[目的] Tetrahymena pyriformisやT. thermophilaなどテだボウフラからテトラヒメナ属の1種を発見した。こトラヒメナ属の多くの種が無菌的に培養できることの繊毛虫はバクテリアを与えただけでは培養できなが知られており、プロテオースペプトン（P）や酵母

いが、鶏肉などの生肉を与えることで培養できるこエキス（Y）を用いた簡便な培地から完全合成培地とが当研究室で明らかになった 5,8,9）。さらに、培養まで、様々な培地が提案されている

1,2,4 4,6,7,10）。これ

液中の定常期にはシストを形成した。現在、シスト

らの繊毛虫は、無菌培養できることで細胞モデルと形成要因を無菌的に培養できる系は知られていない

して極めて有用な生物となっている。しかし、一ので、本種を無菌培養しようと考えた。昨年、本種方、これまで無菌化されていなかった繊毛虫を無菌をPY培地（1％P＋0.5％Y）で無菌的に培養すること

化することで新しい問題にアプローチできる糸口をに成功したが、定常期に達した11日目には細胞がダ見出すことも可能と考えられる。我々は1999年に佐メージを受けて崩壊してしまった。そこでこの細胞

賀市近郊の竹薮で採取されたヒトスジシマカの死ん崩壊を防ぐための培養法について様々な検討を行っ52

原生動物学雑誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年

た。

れ ら で も 7 日 目 ま で 対 数 的 に 増 殖 し、そ れ ぞ れ[材料と方法] ヒトスジシマカのボウフラの死体からとなった。そして細胞崩壊は22日目以降になるまで発見されたテトラヒメナの保存株はレタス浸出液

起こらなかった。さらに1％Pのみで培養した場合、

28,000cells/ml、18,000cells/ml に 達 し、そ の後定 常期（0.5g/1000 ｍ l）に 鶏 肉（2g/1000ml）を 加 え、

同じく7日目まで対数的に増殖したが、8,900cells/ml

20±1℃ に 保 っ た。ま た、無 菌 化 し た 保 存 株 は 1％と前者に比べて増殖が低下した。しかし、細胞崩壊

P+0.5％ Y 培 地 に 抗 生 物 質 を 加 え た も の に 植 え、は同様に24日目以降と遅らせることができた。一23±1℃に保ち、10日ごとに培養を更新した。実験で方、0.5％Yのみでは21日まで増殖しつづけたが、は、100mlの三角フラスコに30mlの培養液を入れ、テ7000cells/mlに しかならなかった。これらのことか

トラヒメナは初期細胞密度が2cells/mlになるようにら、さらにより長期間細胞崩壊を起こさない安定し無 菌 化 保 存 株 か ら 接 種 し、23±1℃ に 保 っ た。そ のた培地について現在も検討している。そのように安後、毎日、一定量の細胞懸濁液を細胞計算板に移定した培養条件を確立した上で、シスト形成機構にし、ブアン氏液で固定したのち、ズーム式実体顕微ついて調べる予定である。

鏡の下で数取器を用いて細胞数を計数した。
[文献][結果と考察] 本種はバクテリア、または肉エキスを

1) Bruns, P. J. et al. （1983） Genetics, 104, 257-270

加えたレタス浸出液では増殖しないが、鶏肉片を加2) Cameron, I.L.（1973）Biology of Tetrahymena, Dow-

えたレタス浸出液で増殖し、定常期には約2,000cells/den, Hutchinson＆Ross, Inc., Pensylvania, 199-226.

mlに達する5,8,9）。この繊毛虫を、1% P＋0.5%Y 培地

3) Corliss, J. O. and Esser, S. C．(1974) Trans. Amer.

に移すと無菌的に培養できることはすでに報告した。しかし、この培地では定常期には174,000cells/ml

Micros. Soc., 93, 578-593.
4) Frankel, J. et al. （1976） Genetics, 83, 489-506.

に達するが、培養11日目には細胞崩壊が生じ、細胞

5) Hisatomi, Y. et al.（2004）Jpn. J. Protozool., 37, 62-

密度は減少に転じた。そこでこの細胞崩壊をできる

63.
6) Martindale, D.W. et al. （1982）Exp Cell Res., 140,5)だけ遅らせる、または防ぐことを目的としてPとYの濃度や比率を変えたときのテトラヒメナの増殖について調べた。第一段階としてPとYの濃度を低下させた0.5％P＋0.25％Y培地では、培養7日目まで、1％
P ＋ 0.5％ Y 培 地 と 同 様 に 対 数 的 に 増 殖 し、約227-236.
7) Nanney, D. L. and McCoy, J. W. （1976） Trans.
Amer. Micros. Soc., 95, 664-682.

20,000cells/mlに達した。この場合、細胞崩壊は17日

8) Takahashi, T. et al. (2002) Jpn. J. Protozool., 35, 35.
9) Takahashi, T. et al. （2004） JEOLnews, 39， 16-19.

まで遅らせることができた。次にPとYの比を変え、

10) 渡辺良雄,斉藤実（1968） 生物学的技術Ⅰ, 吉岡書

1％P+0.1％Yおよび1％P+0.01％Yで培養すると、こ店.

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)

53

コルポーダにおけるシスト形成誘導因子について：
細胞間相互作用および古い培養液中に含まれる成分の検討
明松隆彦，松岡達臣（高知大・理・生物科学）

Encystment-inducing factors in Colpoda sp.: Cell-to-cell interaction and effect ofcomponents contained in exhausted medium
Takahiko AKEMATSU and Tatsuomi MATSUOKA (Inst. Biol, Fac. Sci., Kochi Univ.)
SUMMARY
Cells of the ciliated protozoan Colpoda sp. gradually encyst in stationary phase culture. Candidates for encystmentinducing factors could be as follows: (1) an increase in cell density; (2) molecules accumulated in exhausted medium; or(3) a decrease in encystment-suppressing elements contained in fresh culture medium (cereal infusion). We found that anincrease in cell density up to 3,000 cells/ml strongly induced encystment, and replacement of the living cells with polystyrene latex particles (PLP) or glass particles also induced encystment. Cell-free exhausted medium also showed strong
encystment-inducing activity, and boiling destroyed this activity. These results indicate that factors inducing encystmentof the cells during the stationary phase include cell-to-cell contact due to an increase in cell density, and molecules thatare unstable to heat which accumulate in exhausted medium.

[序論] 繊毛虫コルポーダのシスト化は、Ca2+などのたExhausted mediumは、脱シスト誘導から３日間経塩濃度の上昇（乾燥シグナル）によって誘導され過した培養液（ほぼ100％のシスト化がおきたもの）

1,2)、外液に存在するバクテリア由来の分子や培養液を濾紙で濾過することによって得た（4℃で保存）。

（麦葉浸出液）に含まれるポルフィリン化合物によ

個体群成長およびシスト形成の観察は、脱シスト誘り抑制される 3,4) ことが分かっている。一方、個体群

導から8時間以内に脱シストした細胞を、20mlの各テ成長の定常期に達したコルポーダはCa2+ によるシスス ト 溶 液 を 入 れ た ガ ラ ス シ ャ ー レ（底 面 の 直 径ト化誘導を行わなくてもシスト形成が起きる。この4.5cm、高さ４cm）に懸濁し、12時間毎の細胞数を場合、シスト形成を誘導する因子として、１）細胞計測した。

密 度の 上昇、２）培養 液中へ の誘 導因子の 蓄積、
３）培養液に存在したシスト化抑制因子の消失が考[結果と考察] （１）細胞密度の効果：Tris緩衝液えられる。本研究では、上述した３つの因子の可能（0.1mM Tris-HCl, pH 7.2）中 に、遠 心（1,000 g,

性を検討し、個体群成長後に起きるシスト化誘導因

1min）により集めた細胞を異なる密度で懸濁した場

子が細胞密度上昇による物理的な接触頻度の上昇お合、低密度（30 cells/ml）では、8時間までにほとん

よび古い培養液（Exhausted medium）中に含まれる

どシスト形成は誘導されなかったが、高密度（3,000

熱不安定な成分であることを明らかにした。

cells/ml）では約80％のシスト形成が誘導された。このようなシスト誘導効果が外液に放出された細胞由[材料と方法] コルポーダ（Colpoda sp.）は、バクテ来の分子に起因するか否かを知るために、高密度懸リア（Enterobacter aerogenes）を植え付けた麦葉浸出

濁液（一晩懸濁）から得た上清に細胞を低密度で懸液（0.1％）で培養した。各実験には原則として休眠濁したシスト誘導効果を調べた。しかし、この上清シストから脱シスト誘導した細胞を用いた。細胞密はシスト誘導効果を示さなかった。生きた細胞の代度のシスト形成に及ぼす影響やポリスチレンラテッ

わりにPLP（直径25μｍ）やガラスビーズ（直径45ク ス 粒 子（PLP）等 の 各 粒 子 の 影 響 を 調 べ る 場 合μｍ）の高密度懸濁液中でも顕著なシスト形成が誘は、定 常 期 の細 胞 を 含 む 懸濁 液（１ ml）を 時 計 皿

導されたことから、高密度細胞懸濁液中では細胞同（直径５cm）に入れて観察を行った。実験に使用し士の物理的接触がシスト形成の誘導に関与している

原生動物学雑誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年

54と考えられる。

て、定常期以降の培養液中ではこのような抑制因子（２）Exhausted medium 中 に 存 在 す る 成 分 ：の濃度（密度）が低下しているかも知れない。そこ

Exhausted medium中に脱シストさせたコルポーダをで、すでにシスト形成抑制因子として知られている

懸濁すると、速やかにシスト形成が誘導され36時間

銅クロロフィリンナトリウムを定常期の細胞に添加以内にほぼ100％の細胞はシスト化し、細胞増殖はほしてシスト形成が抑制されるかどうかを調べたが、とんど起こらなかった。（新鮮な麦葉浸出液に懸濁抑制効果はみられなかった。また、培養開始から3日し た 場 合 は 100％ の シ ス ト 化 に 要 す る 時 間 は 72 時

目まで、培養液中のバクテリア密度はむしろ上昇傾間）。一方、数分間煮沸したExhausted mediumは個向にあった。これらの結果は、このような2つのシス体数の増加は同様に抑制されたが、シスト形成誘導

ト化抑制因子の消失がシスト形成を誘導したのでは効果は著しく抑制された（72時間で約50％のシストないことを示唆している。

化）。この結果は、Exhausted medium中に存在する
熱不安定な分子がシスト形成の誘導因子として働い[文献]ていることを示している。

1) Watoh, T. et al. (2003) Jpn.J.Protozool., 36, 105-111.

（３）培養液に存在したシスト化抑制因子の消2) Yamaoka, M. et al. (2004) Acta Protozool., 43, 93-98.

失：新鮮な麦葉浸出液（培養液）中の成分（おそら

3) Yamasaki, C. et al. (2004) Jpn. J.Protozool., 37, 111-

くポルフィリン化合物）や外液に放出されたバクテ
リア由来の成分はシスト化を抑制する 3,4)。したがっ117.
4) Tsutsumi, S. et al. (2004) Jpn. J.Protozool., in press.

ゾウリムシ（Paramecium caudatum）の接合型決定遺伝子の探索
佐藤千尋，権田幸祐，高橋三保子（筑波大・生命環境科学研究科）

Screening of the gene controlling mating type in Paramecium caudatum
Chihiro SATOH, Kohsuke GONDA and Mihoko TAKAHASHI(Graduate School of Life and Environmental Sciences, Univ. of Tsukuba)
SUMMARY
In Paramecium caudatum, when the Odd (O) mating-type and Even (E) mating-type cells are mixed together underappropriate condition, they make mating clumps that called mating reaction leading to conjugation. The genes controlling mating types were investigated by cross breeding analyses and proposed three gene hypotheses (Tsukii & Hiwatashi,1983). According to this hypothesis, co-dominant allele Mt at the Mt locus determines E mating type, and MA and MB at
the MA and MB loci determine O type. However, little is known about the substances controlled by three genes. Here, wereport two attempts for molecular identification of genes involved in mating types. One attempt is the cloning by complementation cloning method. First, we tried to find the proper restriction enzyme for preparation of sub-genomic library.
When E1 DNA digested with DraI was microinjected to E3 macronucleus, only a few recipient cell lines expressed very
weak E1 type. We are searching the better restriction enzyme to prepare the library. The other attempt is differential display method for screening the genes involved in controlling mating types. Comparing the band patterns between mating
reactive and non-reactive cells, several bands that expressed only in mating reactive cells were detected.

[目的] ゾウリムシ（Paramecium caudatum）の接合（以下O型）とEven type（以下E型）から成る。接合型グループ（syngen）は相補的な接合型、Odd type

活性を現すこれらの細胞が出会うと凝集し（交配反Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)

55応）、接合が誘導される。各々の接合型はsyngen特

切断した野生型DNAによるrecipientの形質転換を利用

異的な3つの遺伝子、Mt,MA,MBにより決められ、Mt

した方法である。形質転換に有効な画分を特定し、が接合型をE型に決定していることが交雑実験により

sub-genomic（1）

libraryを作製し、目的遺伝子をクロー。しかし、これらの遺伝子のニングする。そこでまず、Mtを切断しない制限酵素

実体はまだ明らかにされていない。今回、2つの方法の選択を行った。制限酵素で切断したE1(Mt1/-, +cnrB/でこれら接合型決定に関わる遺伝子をクローニング+cnrB, +tnd2/+tnd2)DNAをE3(Mt3/-, cnrB/cnrB, tnd2/tnd2)のすることを目指した。①ゾウリムシでは野生型の細大核に注入した場合（例えばBamHI）、マーカー形胞の核からDNAを抽出し変異体の核にmicroinjection

質であるCNRとTNDが完全に治癒されたcell lineを多明らかにされている(2)

するとその変異体の形質が野生型に戻ること 、異く得ることができた。しかし、13種類の制限酵素のなるsyngenに属するE型細胞間で大核の核質移植を行うち、極めて弱いがE1活性を示すrecipientが得られた

うとrecipientのcell lineで２つのsyngen特異性を現すもものはBamHIとDraIのみであり、それぞれ51 cell lineの（dual E type）が高率で出現すること(3)が示されて

中1例、27 cell line中5例であった。DNA注入から接合いる。これらの事実を利用し、syngenの異なるE型細型の判定までの分裂回数を約15回と約6回で比較した胞間でのDNAの移植を行い、Mtのクローニングを試が、形質転換の強さに差は確認されなかった。明確

み た。② 接 合 活 性 の 強 さ に 差 の あ る 細 胞 間 で のな形質転換が確認されない原因として、接合型の発Differential Displayを行い、接合活性のある細胞に特

現にはCNRやTNDよりも多くの遺伝子量を必要とす

異的に発現する遺伝子の探索を試みた。

ることが示唆されており (3)、注入DNA中の遺伝子コ
ピー数の不足が考えられる。また、O型物質はE型物[材料と方法] ①相補性クローニングによるMtのク質の前駆物質であると考えられており(4)、E型を発現

ローニングの試み： E1（株N93-079,野生型）を大量する為には、syngen特異性を有するO1 型物質の存在

培養し、DNAを抽出した。これを13種類の制限酵素が必要であるか、O型物質とMt遺伝子産物とのバラ（BamHI、DraI、ScaI、HinfI、KpnI、HincII、XbaI、ンスが重要であることを示唆していると考えられ

EcoRI、PstI、SacII、NotI、SmaI、ApaI）で そ れ ぞ れる。

切 断 し た も の を recipient で あ る E3( 株②逆転写に用いたanchorプライマーとrandomプラ

16BKZs2,cnrB;tnd2)の大核にmicroinjectionし、接合型イマーでcDNA poolをtemplateとするPCRを行ったとの転換が起こるかどうかを検討した。接合型の判定

ころ、1レーンあたり約20本のバンドが検出された。

は injection後 のrecipient 細 胞 を試 験管 又は キャ ピラ

同じプライマーの組み合わせでPCRした接合活性のリー中で15回分裂又は6回分裂させた後、cell lineの無い時期である未熟期と対数増殖期、強い接合活性細胞群をおよそ４等分し、強い接合活性を現すテス

を現す初期定常期のバンドパターンを比較した。3種

ター細胞４種類（E1,O1,E3,O3）と混ぜ合わせ交配反類のanchorプライマーと10種類のrandomプライマー応の有無により行った。

を用い、合計30通りのPCRの結果、接合活性のある②Differential Display法による接合型決定遺伝子ス
3

時期のみで発現している再現性のあるバンドを7個得

クリーニングの試み：株G3(O ）の未熟期（接合活性ることができた。今後、これらのバンドからDNAを無し）、対数増殖期（接合活性無し）、初期定常期

回収、クローニングし、接合型の発現との関係を明（接合活性あり）にある細胞からpoly(A)+ RNAを抽らかにする。

出した。これをそれぞれ３種類のanchorプライマー
aagct(11)vで逆転写しcDNA poolを調製した。これを[文献]

逆 転 写 に 用 い た anchor プ ラ イ マ ー と random プ ラ イ

1) Tsukii, Y. and Hiwatashi, K. (1983) Genetics, 104: 41-

マー（10mer）でPCRし、5%アクリルアミドゲル電
気 泳 動 を 行 っ た。SYBR GOLD に よ る 染 色 後、
Molecular Imager FX(Bio Rad)でバンドの検出を行い、接合活性の有無によるバンドパターンの比較を行った。

622) Haynes, W. Vaillant , B., Preston, R. Saimi, Y. andKung, C. (1998) Genetics, 149:947-957
3) Hori, M. and Takahashi, M. (1994) Genet. Res., Camb.,
63: 101-107
4) Xu, X., Kumakura, M., Kaku, E. and Takahashi, M.

[結果と考察] ①相補性クローニングは、制限酵素で(2001) J.Eukaryot. Microbiol., 48: 683-689

原生動物学雑誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年

56

接合中のプログラム核死過程におけるミトコンドリアの役割小林

孝1,2，遠藤

浩1（1金沢大・院・自然科学，2愛知医大・分医研）

A role of mitochondria in programmed nuclear death during conjugationof Tetrahymena thermophila
Takashi KOBAYASHI1,2, Hiroshi ENDOH1 (1Div. of Life Sci., Grad. Sch. of Natural Sci. & Technol.,Kanazawa Univ.,2 Inst . Mol. Sci. Med., Aichi Med. Univ.)
SUMMARY
Protozoan ciliates, represented by Tetrahymena thermophila, have two morphologically and functionally different
nuclei in a single cytoplasm. One is a germinal micronucleus and the other is a somatic macronucleus. During conjugation, new macro- and micronuclei for the next generation are differentiated from a synkaryon (fertilized nucleus). Oncethe new macronucleus is differentiated, old parental macronucleus begins to degenerate. The nuclear degradation is sosimilar to that of the nucleus in apoptosis or programmed cell death (PCD) that this is called “programmed nuclear death(PND)”. The death process is divided into three stages, depending upon the degraded DNA sizes: 1) Initial generation ofhigh-molecular-weight DNA fragments (>30 kb), 2) oligonucleosome-sized ladder formation, 3) Eventual complete
degradation of the DNA. Previously we identified caspase-like activities in PND. Here, we show association of mitochondria with PND using two mitochondria specific dyes, DePsipher and MitoTracker. Mitochondria are incorporated
into autophagosome together with the parental macronucleus prior to an entire resorption. In addition, we demonstratethat mitochondria retain a DNase activity similar to mammalian endonuclease G. Taking the mitochondrial DNase activity and the timing of the autophagosome formation into consideration, we presently conclude that the DNase activity
might play a role for the oligonucleosomal fragmentation during PND.

[目的] 繊毛虫の有性生殖（接合）過程中の核退化過ション中のミトコンドリアの量をPCRで、またリソ

程は、アポトーシス様の特徴を示すことが知られてソームの量をAcid Phosphataseの活性で定量した。

いる（プログラム核死）。これまでに（第34, 35回大会）、テトラヒメナの旧大核退化中にカスパーゼ様[結果と考察] ミトコンドリアの DNase活性を計るたの活性があること、核消化前にミトコンドリアが退めTetrahymena細胞破砕液を遠心により分画し、以下

化核と共に自食胞に取り込まれること、そのミトコの ５ つ の 分 画 を 用 意 し た。分 画 1:post-nuclear frac-

ンドリアが膜電位を失っていることを示した。しかtion、分 画 2:mitochondria

fraction、分 画 3:

post-

しながら、ミトコンドリアの核退化過程での機能にmitochondria fraction 1、分画4: post-mitochondria frac-

ついては不明であった。ミトコンドリアが関与する

tion 2、分画5,cytosol fraction。これらの分画中に含ま時期は、核DNAの分解時期と一致することから、今れる、ミトコンドリアはPCR法によって定量した結回ミトコンドリアの細胞死因子の一つである果、2 > 1, 3 > 4, 5の順で多く、リソソームはAcid

Endonuclease G (EndoG)のようなDNaseが退化過程に

Phosphatase活性を指標に定量した結果、3 > 4 > 1 > 2

関与している可能性を検証した。

>5の順で多かった。 以上の結果から、分画2をミト[材料と方法] 栄養増殖期のTetrahymena thermophila

含む分画、4をリソソームの分画として実験に用い(CU428)を細胞分画したミトコンドリアとそのポストた。

コンドリア分画、3をミトコンドリアとリソソームを

フラクション中のDNase活性を見た。活性はplasmid

まず各分画中のDNase活性をpH6.5とpH5.0の2つのDNAを基質に50 mM MOPS (pH 6.5), 10 mM KClの反条件下で検討した結果、pH5.0の条件下では、各分画

応液中で30°Cで1～2時間の条件で行った。各フラク

ともにほとんどDNAの分解活性を示さなかった。一Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)

57

方、 pH6.5では全ての分画で DNAの分解が認められ2

反応液中でインキュベートすると、クロマチンDNA> 1, 3 > 4 > 5の順で強かった。この結果から、ミトコ

は約150-400 bp程度の大きさに分解された。この大きンドリアにはEndoGのような中性付近でのDNase活性

さはmono-、di-nucleosomeの大きさの範囲に相当すがあることがわかった。

る。以上のことから、中性から弱酸性の条件下では次に、このミトコンドリア由来のDNase活性の特ミトコンドリア由来のDNaseは核DNAの分解に関与徴を調べた結果。EndoGは2価イオンを要求性するのできる。退化核を含む自食胞の酸性化は、ミトコン

で、EDTA、EGTAを反応液加えた結果、濃度依存的

ドリアの取り込みが観察される時期よりも後なのな阻害が見られ、25 mMでは完全に阻害した。しかで、核DNAの分解、特にladderの形成時に関与して

2+

2+

2+

しながら、Mg 、Ca 、Mn でもまた濃度依存的にいる可能性が示された。

活性を阻害した。これらの結果から、2価イオンは不

これまでの研究結果から繊毛虫のプログラム核死

要のように思われるが、DNaseを単離精製するなど

は、アポトーシスの系を使った、細胞死とは異なる

して再度検証する必要があると考えられる。また、進化を遂げた発生現象であると考えられる。

2+

EndoGを含む種々のDNaseを阻害するZn は、低濃度で効果的に活性を阻害した。次に至適pHをpH5.0 -[文献]

8.0の間で検討したところ、pH 6.0 - 7.0の間で非常にDavis MC et al. (1992) Dev. Biol. 154: 419-432.

活性が強く、これよりもアルカリ側では活性が弱Mpoke S and Wolfe J (1996) Exp. Cell. Res. 225: 357-

く、酸性側ではあまり活性がなかった。
最後に、クロマチンDNAを基質とし、in vitroでの核退化を再現した、単離した核とミトコンドリアを

365.
Kobayashi T and Endoh H (2003) Cell Death Differ.
10:634-640.

ゾウリムシの小核DNAにおける非コード領域解析の試み
神居志寿香1，多賀郁乃2，見上一幸1（1宮城教育大学 EEC ，2仙台白百合学園高等学校）

Analysis of non-coding regions in the micronuclear DNA of Paramecium caudatum
Shizuka KAMII1,Ikuno TAGA2 and Kazuyuki MIKAMI1( EEC Miyagi Univ. of Educ.,2Sendai Shirayuri Gakuen high-school)
1

SUMMARY
Paramecium caudatum exhibits nuclear dimorphism. Each cell contains a germ micronucleus and a somatic macronucleus. During the conjugation, micronuclei underwent meiosis, followed by reciprocal exchange of gametic nuclei andfertilization. The zygotic nucleus divided three times. Four of the division products differentiated into macronuclei. It is
known that chromosomal rearrangement occurs during the development by the caryonides, that is, the third cell cycle
after conjugation. We analyzed the upstream region of the pap gene to elucidate the structure of micronuclear chromosome. When the micronuclear DNA amplified by inverse-PCR with two primers, which was designed according to themacronuclear sequence of the pap gene, a 6.5-kbp fragment was obtained. This fragment contains two ORFs (0.7-kbp
and 0.6-kbp), and non-coding regions (6.5-kbp in total). Consequently ORFs were not clustered close in the 6.5-kbp
fragment, through six ORFs were concentrated in the 6.5-kbp downstream of the pap gene. In the non-coding regions
other than ORF like region CAAT boxes, GC boxes and TATA-like sequences were found.

58

原生動物学雑誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年[目的] ゾウリムシ（Paramecium caudatum）は、細MAC 遺伝情報処理ソフトウェア Ver.10 を用いた。

胞内に有性生殖に関わる小核と、細胞の維持や分裂の調整に関わる大核の 2 核を持っている。この小核[結果と考察] 小核 DNA における PH 染色体未知領と大核は、同一細胞内に存在しながら全く異なる染域を、pap 遺伝子より上流に 6.5 kbp の塩基配列を決色体構造をしている。有性生殖である接合におい定することができた。この塩基配列を決定した領域て、小核は減数分裂の後、受精核を形成し、その受では、ORF を 2 箇所確認できたが、下流域で見られ精核から次世代の小核と大核が分化する。このとたような ORF の密集は見られなかった。さらに、き、大核になる核にのみ染色体の編集が起こり、ポGAPDH（Obara, Iwataki and Mikami, 2000）に関してリゲノミックな状態となる（Mikami, 1988）。このも、その近傍に ORF 密集域が見られないことを考え

編集過程を経ることで、大核遺伝子は活発な転写をると、小核 DNA における ORF の密集はゾウリムシ

行うようになる。この編集は、我々が PH 染色体と染色体において必ずしも一般的な現象とはいえない

名付けた染色体のコード領域において、接合過程のことが示唆される。

核分化後からキャリオナイドクローンまでの内に起

今回塩基配列を決定した 6.5 kbp（図 1）の非コー

こることが分かっている。また、編集における DNA

ド領域について解析を行ったところ、プロモ－ター

部分除去は、それぞれの編集部位で完全に除かれる

領域内で見られる CAAT box や GC box に似た塩基配

わけではないため、結果として大核 DNA の多様性の列を持つ領域が確認できた。さらに、遺伝子の転写原因となっている。現在、多くの繊毛虫で行われてに関わるとされる TATA 配列も存在した。これらのいるゲノムプロジェクトは、大核を中心に行われ、ことから、pap の ORF 密集域の上流には、それらの小核に関してはあまり進んでいない。本研究では、

遺伝子転写に関わる調整領域が存在していることが小核の PH 染色体の一部について、塩基配列の決定示唆される。しかし、小核 DNA でこのような CAATを行い、非コード領域に注目した小核染色体の解析

box や GC box、TATA 配列の間に ORF が確認できてを目的とした。

いないことから、核分化後、大核 DNA となる際に編集され、その領域に遺伝子コード領域が挿入される[方法] 株は、P. caudatum の Syngen3 に属する野生のではないかと考えられる。

型株 KK0007（E type）を使用した。小核の単離にはフィルターと遠心分離を用い（Takahashi and Mikami,[文献]

2002 第 73 回日本動物学会）、精製した小核 DNA を

1) Mikami. K. (1988) Nuclear Dimorphism and Function.

制限酵素で処理し、pap 遺伝子上流域を inverse-PCR

in Paramecium (ed Gortz, H.-D.) pp. 120-130,で増幅した。得られた断片を pGEM-T easy vector でSpringer-Verlag, Berlin

クローニングし、塩基配列の決定を行った。シーク2) Obara. S., Iwataki. Y., and Mikami. K. (2000) Identifi-

エンシングには ABI PRISM 310 Genetics Analyzer を

cation of a possible stem-cell-maintenance gene

使用し、得られた塩基配列の解析には GENETYX-

homologue in the unicellular eukaryote ParameciumJpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)

caudatum. Proc. Japan Acad., 76, Ser. B
3) Austerberry, C. F., Allis, C. D., and Yao, M. C. (1984)

59

oping nuclei of Tettrahymena. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 81: 7383-7387.

Specific DNA rearrangements in synchronously devel-

Amoeba proteusの収縮胞における水集積機構の解析
西原絵里，新免輝男，園部誠司（兵庫県立大・院・生命理学・生命）

Studies on water accumulation by contractile vacuole in Amoeba proteus
Eri NISHIHARA, Teruo SHIMMEN, and Seiji SONOBE (Grad. Sch. Life Sci., Univ. Hyogo)
SUMMARY
In fresh water, the osmolality of the cytoplasm is higher than that of the extracellular medium, and water always
enters the cell along the osmotic gradient across the plasma membrane. The cell volume of protozoa is controlled bycontractile vacuoles (CV). However, the mechanism of collecting water into the CV is poorly understood. The present
study is aimed at elucidation of the mechanism of water accumulation by the CV in Amoeba proteus. CVs released from
cells were analyzed in vitro. When CVs were treated with a hypertonic medium, their volume quickly decreased. This
result suggests that the CV membrane is semi-permeable and that fluid is collected along the osmotic gradient in vivo.
The water permeability of the CV membrane was calculated from the rate of osmotic volume change. The value washigh, suggesting that the CV membrane is equipped with water channels. To observe CV dynamics in vivo, living cells
were vitally stained with FM4-64. It strongly stained the plasma membrane and CV. Just after systole, the membrane of
the CV was flattened. During diastole, a part of the flattened membrane expanded to a few vesicles and they fused witheach other before reformation of CV.

[目的] 収縮胞は淡水産原生動物に特有の細胞小器官(pH7.0)）を灌流し、続いて、等張液を灌流した。そで、細胞内へ流入した水を集積し、周期的に細胞外の際の収縮胞の体積変化を測定した。さらに、このへ排出することで細胞内の浸透圧を調節していると結果より、収縮胞膜の水透過係数を求めた。

考えられている。この収縮胞内への水の集積機構を

細胞内での収縮胞の動態を観察するため、FM4-64

調べるために、Amoeba proteusから取り出した収縮胞で生体染色を行い、観察した(3)。10 μM FM4-64をを用いて解析を行った。また、エンドサイトーシス

含む培地中で20分間細胞を処理し、共焦点顕微鏡でのトレーサーであるFM4-64により細胞を生体染色観察した。さらに、上記の方法で単離した収縮胞をし、in vivoにおける収縮胞の動態を観察した。

用いて、in vitroにおける収縮胞の再形成の過程を観察した。

[材料と方法] 材料にはAmoeba proteusを用いた。
Tetrahymenaを餌として培養した。実験には2日以上[結果と考察] 収縮胞内への水集積機構を調べるため飢餓状態にした細胞を用いた。

に、単離した収縮胞周辺の外液の浸透圧を変化さ

等 張 液（5 mM EGTA、6 mM MgCl2、30 mM

せ、その時の体積変化を調べた。高張液を灌流する

PIPES、67 mM KOH、100 mM sorbitol (pH7.0)）(1)でと、その体積は急速に減少した。続いて、等張液を20分間処理した細胞をスライドガラスとカバーガラ

灌流すると、膨張したが、もとの体積には戻らず破スの間に挟み、押しつぶして収縮胞を単離した(2)。

裂した。このことから、収縮胞膜が半透性であるこ

こ の 収 縮 胞 周 辺 に 高 張 液（5 mM EGTA、6 mMとが考えられた。Parameciumにおいて収縮胞内の無MgCl2、30 mM PIPES、67 mM KOH、500 mM sorbitol

機イオン活性が高いことが報告されている(4)。これ

60

原生動物学雑誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年

らのことより、浸透圧差を利用した収縮胞内への水つまり、1つの膜が形状を変えて水を集積し、細胞外の集積が示唆される。さらに、前述した結果より、へ排出することがわかった。また、等張液中に単離

収縮胞膜の水透過係数を求めると、1.06 (μm/sec・した収縮胞において、融合に似た現象が観察されOsM)であった。これは赤血球やカエル卵における細た。このことから、収縮胞が収縮した直後に出現す

胞膜の水透過係数に近い値であった(5)。これらの細る小胞は、膜の塊が何らかの要因により区切られ、胞膜には水チャネルであるアクアポリンが存在する

そこへ水が集積し、形成された可能性が考えられことが知られており、A. proteusの収縮胞の膜にもアる。さらに、その区切りがはずれることで、小胞どクアポリンが存在する可能性が示唆される。

うしが融合し、収縮胞が再形成されることが考えら

エンドサイトーシスのトレーサーとして知られるれる。

FM4-64でAmoeba細胞を生体染色した。その結果、細胞膜と収縮胞に強い蛍光が確認できた。これを利用[文献]し、細胞内における収縮胞の動態を観察した。明視

1) Shimmen, T. and MacRobbie, E. A. C. (1987) Plant

野による観察では、収縮直後の収縮胞は消失し、確認できない。また、電子顕微鏡を用いた観察から、収縮胞収縮直後の細胞内では多数のベシクルの存在が観察されている(6)。そのため、収縮胞の収縮直後
では、収縮胞膜が破れることで多数のベシクルが形成され、それらが融合し、収縮胞が再形成されると考えられていた。しかし、FM4-64による観察では、Cell Physiol., 28: 1023-1037
2) Nishihara, E., Shimmen, T., and Sonobe, S. (2004) Cell
Struct. Funct., 29(4): 85-90.
3) Heuser, J., Zhu, Q., and Clarke, M. (1993) J. Cell Biol.,1311-1327
4) Stock, C., Gronlien, H.K., Allen, R.D., and Naitoh, Y.
(2001) J. Cell Sci., 2339-2348

収縮胞が収縮した直後、膜が凝縮して1つの塊となっ

5) Tazawa, M., and Shimmen, T. (1981) Regulation ofて存在していた。続いて、その凝縮した膜から小胞

water and ions. Kumazawa, K. Asakusashoten, Tokyoが形成された。これらの小胞は常に連結しており、顆粒質が流動している場合でも離れなかった。まJapan. p.p. 18-77.
6) Mackanna, J.A. (1973) Science, 88-90

た、その形態変化は約1分という短時間で起こった。

ゾウリムシにおける過剰収縮胞の形成
岩本政明，Allen, Richard D.，内藤 豊（ハワイ大・パシフィックバイオメディカルリサーチセンター）

Generation of extra contractile vacuole complex in Paramecium
Masaaki IWAMOTO, Richard D. ALLEN and Yutaka NAITOH (Pacific Biomedical Research Center,
University of Hawaii at Manoa)
SUMMARY
Paramecium species normally have two contractile vacuole complexes (CVC) in a single cell. However, the numberof CVC per cell (NCVC) increased when a hypoosmotic and/or a Ca2+-rich external condition. The CVCs of third and after
were generated more remarkably in starved cells than in growing cells. The generation of extra CVCs was independentof a cell cycle progression, while the replication of CVCs occurs only when just before cell division. In the cytoplasm of
growing cells, there are two clear regions that are prohibited to generate extra CVC, and the replications occur in theseJpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)

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two regions at the same time prior to cell division. In the cytoplasm of starved cells, on the other hand, these regions
might be canceled, and then extra CVCs could spread along the dorsal axis. The NCVC is larger in the bigger individuals
and in the bigger species.

[目的] 収縮胞複合体（contractile vacuole complexes;

ことでより広い細胞表層をカバーでき、水とCa2+ のCVC）は、原生生物に見られる膜系オルガネラで、速やかな集積、排出が可能になると考えられる。

細 胞 内 浸 透 圧 調 節 器 官 と 考 え ら れ て い る。

通常、細胞分裂直前のCVC複製は、既存の２個のParamecium属の繊毛虫は、一般に１細胞中に２個のCVCの前方に１個ずつ２個同時に行われるのに対CVCを持つが、大型種のP. multimicronucleatumではし、過剰CVCは多くの場合１個ずつ形成され、その３個以上の過剰なCVCを持つ細胞の存在が知られて場所は既存CVCの前方に限定していなかった。まいる１。このような細胞は、細胞分裂時におけるCVC

た、過剰CVCの形成は細胞分裂に依存せず、飢餓化の複製や分配のエラーによって出現する単なるイレやDNA合成阻害剤によって分裂停止したG1細胞でもギュラーな存在なのか、または、細胞当たりのCVC見られた。これらの結果は、細胞分列前の娘CVCの数（NCVC）を積極的に変化させるしくみがあるのだ

複製と過剰CVCの形成が異なる機構で調節されていろうか。これらを明らかにするため、NCVC の増加がることを示唆している。

見られる条件と、過剰なCVC形成の規則性について調べた。

分裂間期に行われる過剰CVCの形成は増殖細胞でも見られたが、分裂停止した飢餓細胞においてより顕著であった。増殖細胞集団における過剰CVC保有[ 材 料 と 方 法 ] Paramecium multimicronucleatum、P.

細 胞の 割合 は約 10% で、その 多く は３ 個の CVC を

caudatumおよびP. tetraureliaは無菌合成培地で培養し持っていた。一方、低浸透圧下の飢餓細胞集団でたものを用いた。飢餓誘導するため、対数増殖期のは、過剰CVC保有細胞は50%を超え、３-５個のCVC細胞を緩衝溶液（2 mmol l-1 KCl, 0.25 mmol l-1 CaCl2, 1を持つものが多く見られた。細胞内におけるCVの位

mmol l-1 MOPS-KOH, pH7.0）で２回洗浄後、同組成

置は、増殖細胞では細胞前半（細胞相対長の35%）溶液に再懸濁して室温で12-18時間放置した。緩衝溶と後半（81%）に分布のピークが存在し、細胞前端

液の浸透圧は、ソルビトールを添加することで4-144（19%付近より前方）と細胞中央（62%付近）にCV-1mosmol l に調節した。CVC特異的抗体による免疫染の存在しない領域のあることが分かった。CVが分布

色は、細胞を3.5% (w/v) ホルムアルデヒドで３０分しないこれらの領域は、細胞分裂前に複製される娘間固定後、-20°Cのアセトンで２０分間抽出し、SS-1

CVCの新CVが発生する箇所と一致した。したがっmAb (anti-smooth spongiomes, IgM)で１次抗体処理して、増殖細胞の間期には、娘CVC複製予定部位に過た。SS-1はP. multimicronucleatumに特異的であるた

剰CVCの形成を阻止する機構が存在すると予想されめ、他種のゾウリムシにはDS-1 mAb (anti-decorated

る。一方、飢餓細胞では増殖細胞に見られたCVの形

spongiomes, IgG) を１次抗体として使用した。それぞ成されない領域に新たに分布のピークが出現し、CVれの１次抗体に対するFITC標識２次抗体で処理し、は細胞長軸に沿って広く存在した。この結果は、増PBSで洗浄後、落射式蛍光顕微鏡で観察した。

殖細胞の過剰CVC形成を抑制する機構が飢餓化によって無効になったことを示している。飢餓細胞に[結果と考察] 4 mosmol l-1 の緩衝溶液に順応したP.

形成された過剰CVCは、細胞分裂によって娘細胞に

multimicronucleatumの集団中には、NCVCが１から７の分配されることなく細胞内に蓄積する。これらのこ細胞が存在した。３個以上の過剰なCVCを持つ細胞とがNCVCの増加が飢餓細胞においてより顕著であっが集団中に占める割合は、外液の浸透圧が低い、おた原因と考えられる。

よびCa2+ 濃度が高い場合に有意に増加した。また、

次に、NCVC と細胞長の関係を調べた。分裂停止し

収 縮 胞（CV）当 た り の 平 均 ラ ジ ア ル ア ー ム 数

たP. multimicronucleatumではNCVC の大きい細胞ほど（NRA）は、増殖細胞における9.0±1.5から11.2±2.2へ大型であった。この傾向は種間のサイズ差において増加した。CVCは水と共に細胞内Ca2+ の排出を行っも見られ、過剰CVC保有細胞の出現率およびNCVC はていることが知られており２、NCVCとNRAが増加する

最大種のP. multimicronucleatumで最も大きく、次い原生動物学雑誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年

62

でP. caudutum、P. tetraureliaの順であった。この結果[文献]

は、NCVC の増加が大型細胞の広い細胞表面積をカ

1) Wichterman, R. (1986) The Biology of Paramecium

バーし、Ca2+ など細胞内老廃物の速やかな排出を可能にするという考えを支持している。

(2nd ed.): 1-59
2) Stock, C. et al. (2002) J. Cell Sci. 115: 2339-2348.

Phytophthoraにおけるマスティゴネマタンパク質の免疫細胞化学的解析
有川幹彦1, 2, 3, エイドリアン・ハーダム2, 春本晃江1, 洲崎敏伸3（1奈良女子大・院・共生自然科学, 2オーストラリア国立大・生物科学研究所・植物細胞生物学グループ, 3神戸大・理・生物）

Immunocytochemical analysis of the mastigonemal protein in zoosporicplant pathogen Phytophthora
Mikihiko ARIKAWA1, 2, 3, Adrienne HARDHAM2, Terue HARUMOTO1, Toshinobu SUZAKI3(1Dept. Biol. Sci. Environ., Nara Women’s Univ., 2Plant Cell Biol. Group, Res. Sch. Biol. Sci., Australian Natl. Univ., 3Dept. Biol., Fac. Sci., Kobe Univ.)
SUMMARY
The stramenopiles are one of the main groups of eukaryotes and characterized as having hair-like appendages calledmastigonemes on the surface of their flagella. It has long been thought that the mastigonemes play an important role incell motility, especially in flagellar function. There is, however, currently almost no information on the proteins thatform the mastigonemes. Phytophthora and other Oomycetes which belong to the stramenopiles are known as notorious
plant pathogens which cause the worldwide devastation of plant diseases. For most species of Phytophthora, the motile
biflagellate zoospore is the main infective agent, which is responsible for rapid dissemination and initiation of infectionof potential host plants. In this study, as a first attempt to elucidate the function of mastigonemes in zoospore motility at
the molecular level, we have tried to produce monoclonal antibodies by immunization of isolated and purified flagella ofPhytophthora. Consequently, we successfully obtained antibodies against various kinds of zoosporic surface components. Immunofluorescent and immunoelectron microscopy using the mastigoneme-specific antibody showed that the
antigenic protein scattered throughout the mastigonemes, not on the plasma membrane or inside the flagellum. Furthermore, the antigen was also found to be localized in a certain granular organelle in the cytoplasm.

[目的]

ストラメノパイル生物群に属する持っており、鞭毛の機能と遊走子の運動性において

Phytophthoraは、幅広い種類の植物に寄生して壊滅的

重要な働きをしていると考えられている。しかしなな 病 気 を 引 き 起 こ す こ と で 知 ら れ て い る 1)。

がら、遊走子の運動性が病気感染の確立と拡散に特

Phytophthoraの感染手段は遊走子である。遊走子は2に重要であるにも関わらず、マスティゴネマの構成

本の鞭毛を持っているため長い距離を泳ぐことが可タンパク質やその合成・輸送の機構、細胞運動にお能であり、この遊走子の運動性こそがPhytophthoraのける役割等はほとんど明らかにされていない。そこ

宿主間の素早い拡散を可能にしている。Phytophthora

で本研究では、遊走子の鞭毛機能、特に細胞の推進やその他のOomycetesなどの植物病原菌の遊走子は、力発生におけるマスティゴネマの働きを分子レベル

管状マスティゴネマと呼ばれる小毛を鞭毛表面にで明らかにすることを目的とし、その基礎研究としJpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)

63て、マスティゴネマに対するモノクローナル抗体のた結果、グルタルアルデヒドとホルムアルデヒドを作製を行った。

含む固定液で固定した細胞においては、遊走子が持つ２本の鞭毛のうち、前鞭毛の表面に存在するマス[方法] 遊走子嚢を形成したPhytophthora nicotianae

ティゴネマにのみ抗体が結合し、ホルムアルデヒド

を冷たい蒸留水で処理することにより、遊走子の形

単独で固定した細胞においては、細胞質内に斑点状成・放出を誘導した。LiCl存在下で遠心操作によっの蛍光が数多く観察され、抗原タンパク質は細胞質て集めた遊走子に微小管安定化溶液を加えて懸濁内にも存在することが分かった。遊走子嚢を抗体染し、voltexによる機械的刺激で遊走子のシスト化を誘色した場合も同様に、細胞質内に斑点状の蛍光が観導して鞭毛の自切を促した。軽い遠心によって細胞察されたことから、この時期には既にマスティゴネ

体およびシストを除去した後、強い遠心によって単マタンパク質が合成されていることが明らかになっ離鞭毛を得た。これらをマウスに複数回免疫し、血た。抗原タンパク質の局在性をより詳細に調べるた

清の抗体価の確認を経て、脾臓細胞とミエローマ細め、ネガティブ染色法と免疫電顕法を組み合わせた胞の融合を行った。ハイブリドーマを増殖させて得手法を用いて観察を行った。その結果、二次抗体られた培養上清を使用抗体とし、必要に応じて硫安（protein A）に結合した金粒子は前鞭毛表面に存在沈殿により濃縮した。

するマスティゴネマ上に認められ、抗原タンパク質はマスティゴネマの基部から先端部にかけて一様に[結果と考察] 本研究では、Phytophthoraの遊走子を散在していることが分かった。同様の結果は、免疫シスト化させることなく集め、これらの遊走子から電顕法の包埋前染色法によっても得られた。さら鞭毛を単離することにより、高密度で、且つ他の細に、包埋後染色法による観察の結果、抗原は細胞膜

胞小器官をほとんど含まない純粋な単離鞭毛分画を上や鞭毛内部には存在せず、細胞質中のある顆粒状得た。遊走子そのものを免疫する場合よりも高確率構造の内部に局在していた。この観察結果は、ホルでマスティゴネマ抗体を得ることを狙いとして、こムアルデヒド単独で固定した細胞における蛍光抗体の精製した鞭毛を抗原として免疫を行った。その結法による観察結果と一致した。これらの観察結果に果、細胞膜構成タンパク質や収縮胞構成タンパク

よって、今回得られた抗体は分子量約50 kDaのマス質、鞭毛軸糸構成タンパク質に対する抗体に加えティゴネマ構成タンパク質に特異的に結合する抗体て、マスティゴネマに特異的に結合する抗体を複数であり、今後、マスティゴネマの構造と機能を分子種得ることに成功した。これらの抗マスティゴネマ

レベルで追及するうえで非常に有用であることが示

抗体のうち最も結合性の高い抗体を用いて、細胞生された。

化学的および細胞免疫学的解析を行った。ウェスタ
ンブロット解析の結果、このマスティゴネマ抗体は[文献]

単一のタンパク質と結合し、その分子量は約50 kDa

1) Erwin, D. C. and Ribeiro, O. K. (1996) Phytophthoraであった。蛍光抗体法を用いて抗原の局在性を調べ

diseases worldwide. APS Press, St. Paul, Minn.

64

原生動物学雑誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年

テトラヒメナ繊毛運動のエネルギー供給機構の解明
1．ATP再生産系における軸糸アデニル酸キナーゼの局在
増山悦子1，中村健一1，石田秀樹2（1県立広島女子大・生活・健康科学，2島根大・生資・生物科学）

Elucidation of the energy-supplying mechanism for ciliary motility in Tetrahymena
I. Localization of axonemal adenylate kinase in the ATP-regenerating system
Etsuko MASUYAMA1, Ken-ichi NAKAMURA1 and Hideki ISHIDA2(1Dept. of Health Sci., Hiroshima Pref. Women’s Univ., 2Dept. Biol. Sci., Fac. Life and Environmental
Sci., Shimane Univ.)
SUMMARY
The function of adenylate kinase, which has been detected in Tetrahymena pyriformis cilia, is to potentiate the utilization of ATP for motility. This study has shown, by low ionic strength dialysis (1 mM Tris and 0.1 mM EDTA buffer,
pH 8.0), that adenylate kinases associated with ciliary axonemes differ in solubility. Adenylate kinases were solubilized
together with other axonemal components such as outer- and inner-arm dyneins, radial spokes and the two central-pairmicrotubules, and were further separated into 16 S and 4 S fractions by sucrose density gradient centrifugation. By native-gel electrophoresis, followed by SDS-PAGE analysis, the active band of the 16 S fraction was found to consist of six
polypeptides and that of the 4 S fraction of a few bands above 21 kDa. Insoluble axoneme components also possessed
adenylate kinase activity. Furthermore, affinity-purified polyclonal antibody against adenylate kinase from chicken muscle (MW 21) was cross-reacted with the 21-kDa band from the insoluble axonemal proteins on immunoblots. Immunoelectron microscopy of the insoluble axoneme component suggested that immunogold-labelled adenylate kinase islocated at the inner side of the outer doublet microtubules. These data suggest that the three types of adenylate kinases
are located beside the axonemal proteins that require ATP.

[目的] 真核細胞の繊毛や鞭毛の運動はATPを加水分

205 kDa）はアデニル酸キナーゼをコードしているこ解して得たエネルギーを機械的な滑りに変換すること３）などが報告され、 ATP供給の必要な場所に、そとにより引き起こされる。ATPは繊毛や鞭毛の根元れぞれに適した複雑な構造を形作っていることが推に位置するミトコンドリアで産生されるが、ミトコ察される。
本研究では、Tetrahymena繊毛軸糸に結合している
アデニル酸キナーゼの特徴や軸糸上の局在を明らかにする目的で、ショ糖密度勾配遠心による分離精製や筋肉アデニル酸キナーゼの抗体を用いた免疫電子
顕微鏡による解析を試みることにした。

ンドリアよりかけ離れた長い軸糸に沿って存在する
ダイニン腕にATP濃度を常に供給するためには、分解産物の ADPをATPに転換する酵素であるアデニル酸キナーゼ（AK）などを利用した供給システムがダ
イニン腕近傍に必須であると考えられる。筋肉アデ
ニル酸キナーゼが可溶化した三量体で存在すること[方法] Tetrahymena pyriformis strain GLを大量培養しとは異なり、Tetrahymena繊毛アデニル酸キナーゼはて集め、10 mM dibucaineで繊毛を単離した。繊毛を軸糸に強く結合した状態で複合体として存在するこ

0.25% NP-40を含むHEPES緩衝液( HMEDK溶液、pHとを報告した １）。その局在について不明であった

7.4 )で除膜して得た軸糸を0.6 M NaCl緩衝液で30分間が、2004年 Chlamydomonas変異株を用いた研究によ抽出し、さらにその沈殿を低イオン強度のTE緩衝液

り、アデニル酸キナーゼは外腕ダイニンと、軸糸上（1ｍM Tris/HCl, 0.1mM EDTA, 0.1mM PMSF, pHに結合しているOda5pタンパク質と会合している ２）8.0）に対して一晩透析した。その上清を5-25％ショ

こと、中心小管鞘を構成するタンパク質Cpc1（Mｒ;

糖密度勾配遠心（45,000rpm,16hr）し分取した。透析Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)

65

後の軸糸は電子顕微鏡試料に供した。電子顕微鏡試

複雑な高分子構成ポリペプチド鎖からなることか料作成は、抗原性をできるだけ保持するため１％パ

ら、Chlamydomonas鞭毛軸糸の中心小管鞘を構成す

ラホルムアルデヒドを含むＴＥ緩衝液で軸糸を固る6本のペプチド鎖のうち205kDa のcpc1（AK活性は定、包埋した。超薄切片を作成後、ブロッキング、

未測定）3）に類似していると考えられる。 Tetrahy-

一次抗体(精製ＡＫ抗体)反応、金コロイド二次抗体

mena繊毛においても、複雑な構成ポリペプチドを有の順で反応させ、電子染色を行った。筋肉AKに対すする16S AKは中心小管鞘である可能性がもたれる。

る抗体はウサギに免疫感作して作成し、アフィニ

9対の周辺小管のどの部位にAKを持つタンパク質

ティー精製した。 Native-gel電気泳動、SDS-PAGE、が局在しているのかを検討するために、ニワトリ筋

イムノブロットは通常の方法で行った。

肉由来のAKのポリクロナル抗体を作成し、アフィニ
ティー精製の後、周辺小管のみの軸糸に反応させ[結果および考察] Tetrahymena繊毛のＡＫ活性の９た。SDS‐PAGE、ウェスタンブロットによる解析に５％は軸糸に存在し、0.6M NaClを含むHMEDK緩衝

より、筋肉由来のAKバンド（21 kDa）を認識する21液での抽出操作で外腕ダイニン等の除去された軸糸

kDaのバンドが透析後の軸糸にあることが確かめらは、高いＡＫ活性を保持されたままであることかれた。免疫電子顕微鏡による観察では、周辺小管のら、AKは外腕ダイニンと強く結合していないと考え

主に内腕付近にAK抗体に結合させた金コロイドの粒られる。さらに低イオン強度のTE緩衝液で一晩透析子がいくつか反応している像が得られた。軸糸に強した上清、沈殿共にＡＫ活性を保持していた。透析固に結合しているAKは内腕ダイニンATPaseへのATP

した後の軸糸（沈殿）を電子顕微鏡で観察すると、供給に働いているとも推察される。現在、モーター

外腕、内腕、スポーク、中心小管、中心小管鞘などタンパク質ダイニンへのATP供給経路を明らかにすの構造体タンパク質が溶出されて、9対の周辺微小管るため16S、4Sを構成する AKや周辺小管結合ＡＫのが 残 っ て い る の が 観 察 さ れ た。さ ら に、上 清 を精製を試みている。

5－20％のショ糖密度勾配遠心分離法で分画すると、4Sと16SにＡＫ活性が検出され、Native-gel 電気泳動

[文献]

でともに1本の活性バンドを検出した。さらにNative-

1) Nakamura, K. et.al. (1999) Comp. Biochem. Physiol.

gel 電気泳動を一次元目にし、二次元目に12.5％ゲル
濃度のSDS-PAGEを行ったところ、１６S由来の ＡＫ
バンドからは、6本以上のペプチドバンドが検出された。４S 由来のＡＫバンドは、２１ｋDaを含んだペプチドから構成されていた。16S由来 AKバンドは、

124, 195-199
2) Wirschell M. et.al. (2004) Mol. Biol. Cell, 15, 27292741
3) Zhang H. and Mitchell D. R. (2004) J. Cell Sci. 117,4179-4188

テトラヒメナの大核における分裂特異的球状クロマチン
遠藤政城，菅井俊郎（茨城大・理・自然機能）

A macronuclear division specific globular chromatin in Tetrahymena
Masaki ENDO and Toshiro SUGAI (Dept. Mate. Biol. Sci., Fac. Sci., Ibaraki Univ.)
SUMMARYIn Tetrahymena cell, there are two kinds of nuclei, the macronucleus (MAC) and the micronucleus (MIC). MAC
divides amitotically and MIC divides mitotically. In the interphase MAC, there are diffused chromatin and numerous

66

原生動物学雑誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年

condensed heterochromatin called chromatin body while loosely condensed chromatin aggregate of various size appears
in the dividing MAC. We observed large globular chromatin of similar size in the dividing MAC in living cell and studied conditions for inducing clear globular chromatin; culturing cells in a medium containing EDTA and inducing cell
division in Tris buffer containing benomyl, a microtubular drug, were effective. The globular chromatin appeared at MIC
division and disappeared just after moving of the MIC from cell surface to the MAC in separated daughter cell. We compared T. thermophila and T. pyriformis and found the MAC of the former had clear globular chromatin. At first cell division of exconjugant when no MAC division occur, globular chromatin appeared in the MACs, indicating appearance ofthe globular chromatin is related to cell division, not to MAC division itself. It seemed that the globular chromatin is theunit of DNA distribution during division as it's numer seemed to be halved before and after division.

[目的] T.thermophilaの細胞は、大核と小核という２培 地 で 培 養 後、0.1% EDTA と benomy を ふ く む

種類の核を持つ。細胞分裂の際、小核は有糸分裂を10mMTris中で分裂させるた場合が最適であった。

行い大核は無糸分裂を行う。大核内には、ほどけた

Seyfertは細胞を固定し広げてクロマチンの大きさをクロマチンと無数のchromatin bodyと呼ばれるヘテロ

測定し、様々なサイズがあると報告しているが２）、

ク ロ マ チ ン が 存 在 す る。分 裂 中 の 大 核 内 に は

これは球状クロマチンを破壊した可能性がある。

chromatin bodyより大きなクロマチンの塊が出現する（２）T.pyriformisとT.thermophilaの比較。T.pyriformis

ことが知られている。このクロマチンの塊の大きさ

ではクロマチンが塊状となるだけで球状クロマチン

は 均一 では無く、数種 類ある １）。大核の 染色 体は出現しない。T.thermophilaでは明確な球状クロマ（DNA分子）は４５×（２００～３００）本ある。

チンが出現したので、実験にはT.thermophilaを使っ

しかしchromatin body やこの塊との関係は不明であた。

る。

（３）球状クロマチンの出現と消失時期：スピンド

我々は生細胞で、分裂中の大核内に均一な大きさ

ル状の小核が大核から離れるときに球状クロマチンの球状のクロマチンを観察した。現在では否定されが徐々に現れ、小核が分裂後期（anaphase B）の時にているが、大核内にはsubnucleiが存在するという仮明確になる。また消失するのは、細胞分裂完了後細説があり、ここで推定されたsubnucleiの数と今回観胞表層に付着していた小核が大核に戻る時期より少察された球状クロマチンの数に大差はない。球状クし後である。

ロマチンの数が大核染色体数よりも少ないことか（４）接合完了体の新大核分配時に出現する球状ク

ら、球状クロマチンは多数の大核染色体を含むはずロマチン。細胞分裂はするが大核分裂をしないときであり、分裂の際の分配単位である可能性が考えらでも球状クロマチンは出現した。この場合、球状クれる。今まで染色体よりも高次の分配単位は知られロマチンの数は少なくほぼ一定であった。球状クロていない。そこで球状クロマチンを明確に観察でき

マチンは核分裂で誘導されるのではなく、細胞分裂る条件を検討し、出現時期等について調べた。

と関連している可能性がある。
（５）固定細胞での観察方法の検討、核当たりの球[材料と方法] Tetrahymena thermophila

B株および状クロマチンの数とDNAの測定のために、球状クロT. pyriformis W. を使用した。T培地で培養した対数増マチンの構造を壊さず、かつ数えられる程度に広げ殖期の細胞をTris＋Benomylに移し、後者はそのまる為に、低調処理や細胞の広げ方、spermidine, Mg なま、前者では接合型の異なる細胞を混合して分裂をどの効果３）を検討中である。

誘導した。また接合では、細胞を軽い飢餓状態にし大核分裂前後で球状クロマチンの数は半減していてから異なる交配型の細胞を混合し接合を誘導しるように見える。また各々の球状クロマチンが分裂た。観察には主に位相差を用い、DNAは １）Hoechst

することはなく、単に娘大核へと分配されている。

33342で染色し蛍光顕微鏡で観察した。

DNAの分配単位は染色体であり、染色体よりも高次の分配単位は知られていない。球状クロマチンは[結果と考察] （１） 明確な球状クロマチンの出現

DNA分配の単位なのかもしれない。またその分配の条件の検討：種々の条件を検討した結果、培地の種機構には微小管と相互作用する４）転写伸長因子 138k

類、EDTAやbenomyl の添加などが有効であった。T

蛋白が関与しているのかもしれない。

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)[文献]2) Seyfert, H. M. (1979) J. Protozool., 26.：66-74

1) Mpoke, S. S. and Wolfe, J. (1997) J. Histochem. Cytochem ., 45：675－683

4) Fujiu, K.and Numata, O. (2004) BBRC, 315:196-203

673) Sone, T. et al. (2002) Arch. Histol. Cytol., 65:445-455

ゾウリムシにおける接合後の生殖核の決定と退化について
高 法子，見上一幸（宮城教育大学 ・ EEC）

Determination and degeneration of a germinal micronucleus
in exconjugants of Paramecium caudatum
Noriko TAKA and Kazuyuki MIKAMI (EEC, Miyagi University of Education)
SUMMARY
In Paramecium caudatum each cell has a germinal micronucleus. Artificially produced bi-micronucleate cells did
not reduce to a uni-micronucleate state, at least for some fissions. However, there are four presumptive micronuclei in an
exconjugant and only one of them divides at the first post-conjugational fission. There must be an exconjugant-specificreduction mechanism for the nuclear division. It is generally accepted that four of the eight postzygotic micronuclei
derived from a synkaryon appear as micronuclei, and then three of them degenerate by the first post-conjugational fission. However, we obtained contradictory evidence by immunofluorescence using an anti-α-tubulin antibody and DAPI
staining. Most of the four micronuclei remained even after the first post-conjugational fission, regardless of nutritional
condition or stock difference. Artificial removal of the dividing micronucleus at anaphase of the first post-conjugational
fission showed that the remaining micronuclei had the ability to divide at the following fissions, because each cell of theresulting clones had a micronucleus. In some clones, however, the micronuclei sometimes seemed to be degenerative
because the clones produced some amicronucleate cells and were composed of both micronucleate and amicronucleate
cells. To determine at what time the micronucleus is committed to divide, a micronucleus was transplanted from a vegetative G1 cell into an exconjugant. It was shown that the selective decision for nuclear division occurs between about 10
h and 24 h after the critical stage of macro- and micronuclear differentiation.

[目的] ゾウリムシ（Paramecium caudatum）は、同

1998，日本動物学会）。それでは、これら 4 小核の一細胞内に栄養核（大核）の他に 1 つの生殖核（小中から生殖核として残るための核の決定と退化は、核）を持つ。小核は、有性生殖（接合）時には大核

どのように起こっているのだろうか。栄養期の細胞の支配の下に新大核と新小核を形成する。生殖核のを顕微手術により 2 小核体にしたとき、少なくとも決定が起こり、1 小核が分裂している接合後第 1 回目

数分裂の間、2 小核はともに分裂し 2 小核状態が維持の細胞分裂時には、従来の考えでは、すでに他の 3されることが分かっている（Araki and Mikami, 未発

小核は退化・消失してしまっていると考えられてき表）。本研究では、顕微手術と形態観察により、生た（Maupas,1889;

Klitzke,1914）。し か し、抗 α-

殖核の決定と退化について解析を行った。

tubulin 抗体を用いた染色により従来の考え方を覆し、退化すべき 3 核は第 1 回細胞分裂以後も細胞内[方法] 株は、P. caudatum の Syngen3 の 16B001sⅡB5に残っていることが明らかになった（Kurokawa et al.,(O) と KC1A01(E) を使用した。接合完了細胞に残る

原生動物学雑誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年

68

小核の観察には、DAPI 染色（1 µg/ml）と抗α-tubulin[考察] 接合完了細胞内の 4 つの新しい小核は、等価抗体による間接蛍光抗体法を用いた（Ishida et al.,

であると考えられている（Mikami, 1982）。しかし1999）。さらに、顕微技術により、小核の除去と移その後の接合後第 1 回目の細胞分裂時には、この 4小核の中から 1 核が分裂し小核として生き残る。栄

植を行った。

養期の細胞には、このように厳密な 1 小核選択機構[結果] 抗α-tubulin 抗体による間接蛍光抗体法で調べはない。一方で、接合完了細胞で分裂しない残りのる限り、分裂しない残りの小核は接合後第 2 分裂時

3 小核はいずれ退化する。このように、接合完了細まで残っていることが分かった。その後の小核の退胞には小核に対する決定と退化という独立した 2 つ化消失は、しばらく飢餓状態においた細胞よりも富の機構が存在すると考えられる。それらの機構は、栄養条件下の方が、やや早くなる傾向が認められ細胞内でいつ、どのように起こっているのだろう

た。また、接合後の第 1 回細胞分裂時に、分裂中のか。接合完了細胞に栄養期の小核を移植すると、移1 小核を除去すると、飢餓状態においた細胞では他植された核は接合完了細胞にある 4 小核と同様に、の小核は退化せずに残り、子孫は有小核クローンと選択を受けていることが分かった。さらに、核分化なることが明らかになった。ただし、そのクローン決定期から 24 時間後に核移植を行った細胞を培養す

は増殖が途中で止まるものも多く、一旦退化の方向

ると、もとあった小核と移植した小核をもつ細胞がに向かった核には、その何らかの影響が残っている

含まれていた。これは、生殖核として残る 1 小核の可能性が示唆された。

決定が、栄養期の核を移植した時期（核分化決定期

つぎに、接合完了細胞（核分化決定期後約 10 時
間）に移植された栄養期（G1）の小核は、小核とし後 24 時間）より前に、すでに起こっていた結果であると考えている。

て細胞内に残りにくいことが分かった。また、核分化決定期から 24 時間後に核移植を行った場合、移植[文献]

小核は残っており、細胞を caryonide clones に分ける

Ishida, M., Nakajima, Y., Kurokawa, K. and Mikami, K.

と、移植された小核をもつ細胞と、もとあった小核

1999 Zool. Sci., 16: 915-926.

をもつ細胞が共に残っていた。このことから、生殖Klitzke, M. 1914 Arch. Protistenk., 33: 1-20.

核として残る 1 小核の決定は接合後 24 時間ではすで

Maupas, E. 1889 Archs. Zool. Exp. Gen., (2) 7: 149-517.

に起こっていたということが示唆される。

Mikami, K. 1982 J. Cell Sci., 56: 453-460.

ゾウリムシの栄養期における小核の役割について
武田さと子，見上一幸（宮城教育大学・EEC）

Function of the micronucleus at vegetative phase of Paramecium caudatum
Satoko TAKEDA and Kazuyuki MIKAMI (EEC, Miyagi Univ. of Edu.)
SUMMARY
In Paramecium caudatum, removal of the micronucleus causes some abnormal symptoms: structural changes of oral
apparatus, decline in food vacuole formation and increase of inter-fission time, so it appears likely that the micronucleus
has a specific function in stomatogenesis. To investigate whether the micronucleus is involved in forming the new oral
apparatus at cell division, the length of cell cycle was compared between “proter” and “opisthe” after elimination of the
micronucleus. At cell division, the new oral apparatus is formed at the opisthe and the existent one stays with the proter.
Delay in the occurrence of fission appeared about three cell cycles after micronucleus removal. But the length of the twoJpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)

69

to three cell cycles after micronucleus removal was no different between proters and opisthes. This means that the micronucleus was not directly involved in stomatogenesis. In the next experiment, the cells were starved after micronucleus removal so that the time of fission was postponed. The starvation treatment delayed the fissions of both micronucleate and amicronucleate cells, but the delay was more conspicuous in amicronucleates and appeared one to two cell
cycles after micronucleus removal. Appearance of the amicronucleate-specific abnormality depends not on the times ofcell division but on the elapsed time after micronucleus removal.

[目的と背景] これまでの研究では、ゾウリムシの小のため、細胞前方の娘細胞（proter）は既存の口部を核を除去すると口部形態の異常、食胞形成能の低維持し、後方の娘細胞（opisthe）は新しく形成され下、分裂速度の低下といった異常が現れることが明た口部装置を持つことになる。もし、小核が細胞分らかになっている。また、別な細胞から小核を移植

裂時の新しい口部の形成に直接的に関わっているな

することによって、異常から回復することもわかっ

らば、無小核細胞では形成の際に何らかの異常が生て い る（Mikami, 1979; Fujishima and Watanabe,

じ ると 仮定 でき、それ は opisthe に 現れ ること に な

1981）。これらのことより、小核は口部形成に対しる。また、その口部形態の異常は結果として分裂速て何らかの機能をはたしているとされてきた。

度の低下として示されると考えられる。つまり、手本研究は、もし小核が口部形態形成に直接的に関術後に単離した無小核細胞のうち、もともとの口部わっているとすれば、その異常は分裂時の新しい口を維持していく細胞に比べて、手術後に新口部形成部の形成過程で現れると仮定し、実験を行なった。

を１回もしくは２回行なった細胞で分裂速度がより

小核は栄養期の細胞分裂時の口部形成やその形成回低下すると仮定し、手術後の２回の細胞分裂に関し

数と関わりがあるのか。また、小核除去手術後に現て細胞周期の測定を行なった。この際、有小核細胞

れる口部の形態異常の進行は分裂回数に依存するには何も手術を施さず、コントロールとした。

か、それとも絶対時間に依存するのか。これらを検証する目的で本研究を行なった。

実験の結果、口部形成回数を重ねた細胞ほど分裂速度が遅くなるという傾向は見られなかった。それとは逆に古い口部を維持してきた細胞の分裂速度の[材料と方法] 株は16BK2 08（cnrB /cnrB,tnd2 /tnd2）

ほうがより遅くなっていたものもあった。これらのを使用した。培養は25℃の恒温室で、新鮮なレタス

ことから新しい口部の形成と分裂速度の低下とは直ジュースとバクテリア（Klebsiella pneumoniae）によ接的な関連がないといえる。すなわち、分裂速度のる二員培養（Hiwatashi,1967）を行なった。

低下の進行は既存の口部を持つものにも等しく現れ

はじめに、通常の栄養条件で無小核細胞の分裂速ることが実証できた。結局、小核は新旧に関係な度を測定した。顕微鏡下手術によって小核を除去しく、口部装置の維持に関係していると考えられる。

た細胞と、何も手術をしていない細胞を用意し、エ

小核除去後、細胞に変化が現れるのは通常２～３

サを入れたデプレッションスライドで単離して培養分裂後である。つまり異常が現れるまでに時間がかした。一定時間ごとに継続観察し、分裂の度に細胞かり、一定の遅延期間がある。そこで、この異常がを単離することによって手術後から２回分の分裂速現れるまでの時間は分裂回数に依存するのか、それ度の測定を行なった。

とも絶対時間に依存するのかを検証するために、有次に、飢餓処理により分裂を抑制した細胞の分裂

小核細胞と無小核細胞を一定時間飢餓状態において速度を測定した。与えるエサの量を二日間制限して分裂を抑制してから、通常の栄養培養液に移し分裂できるだけ分裂を抑制した細胞を用意し、有小核細速度を測定した。有小核細胞の分裂率は通常の回数

胞と無小核細胞とで処理後に通常の培養条件に戻しまでにすぐ回復したが、無小核細胞では分裂しないてから分裂速度の比較を行なった。飢餓処理は、一細胞や、分裂速度が低下した細胞があった。この分

日に一回、15分だけエサの入った培養液に移し、残裂速度の低下は除去手術後の第一回細胞分裂後、すりの時間はDryl氏液に移すことにより行なった。

なわち第二細胞周期に現れた。通常、飢餓に置かな[結果と考察] ゾウリムシでは細胞分裂に際し、新しれることを考えると、細胞分裂に依存していないこ

い口部の原基は既存の口部装置の下方にできる。そとが分かった。言い換えると、分裂速度の低下の進い場合では、二分裂後、すなわち第三細胞周期に現原生動物学雑誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年

70

行は分裂の回数ではなく、手術後の絶対時間に依存の絶対時間に依存するのではないかと考えられる。

することが示された。
以上の実験から、小核は細胞分裂時の口部新形成には直接は関わっていないといえる。そして、小核除去後、貧栄養条件下に置くことによって分裂を遅[文献]
Fujishima, M. and Watanabe, T. (1981) Exp. Cell Res.
132, 47-56.

らせた場合も、一定時間後には無小核細胞では有小Hiwatashi, K. (1967) Genetics 58: 373-386

核細胞と比べるとより早い時期に分裂の遅れが現れ

Mikami, K. (1979) Exp. Zool. 208, 121-128.

たことから、分裂速度の低下の進行は分裂回数（口Wichterman, R. (1986) The Biology of Paramecium.,部形成の回数）に依存するのではなく、除去手術後

原生生物繊毛虫類の分類体系

Second Edition, Plenum Press—近年における分類体系の変遷と現状—

三好孝和1，島野智之1，高橋忠夫2（1東北農研，2西九州大・生物）

Classification systems of phylum Ciliophora– Review of changing systems in recent years –Norikazu MIYOSHI1, Satoshi SHIMANO1, Tadao TAKAHASHI2(1Natl. Agr. Res. Cent. Tohoku Reg., 2Biol. Lab., Nishikyushu Univ.)
SUMMARY
The ciliated protozoa are widely distributed in nature. To classify these ciliates, various classification systems havebeen proposed so far. Of these, three main systems were compared between each other in this work. 1) A classification
system based on the oral morphological criteria was systematically constructed by Corliss (1979). In present time, thissystem is often used for identification of ciliates. However, this concept becomes to be hardly adopted in classification.
2) The system based on the ultrastructural morphology on the somatic kinetids was established by Small and Lynn (1981,1985). This system, however, contained some questionable taxa, because the classification criteria more biased toward
the characters of somatic kinetids. The system, thereafter, has been modified by some additional ultrastructural and molecular information. As a result, in this system the phylum Ciliophora consisted of two subphyla; Postciliodesmatophoraand Intramacronucleata. 3) Lynn (2003) established a new classification system based on the molecular information,
especially SSrRNA gene sequences. This system includes two “riboclasses”, which is a new concept taxon based on themolecular information. However, this system includes severe problems, that is, it is a chimeric system without reasonable
explanations. From these analyses, we concluded that Lynn and Small’s system (2000), which seems to be more accomplished system than others, should be adopted for a practical use at the present time.

[目的] 繊毛虫類は、地球上の至る所に広く分布し、もっとも妥当なのかを検討した。

現在までに約8,000種が記載されているが8）、その種数は潜在的な現存種の2割に満たないと推測されてい[結果と考察] 1）口部構造（oral structure）を基準形

る 2）。一方、繊毛虫類の高次分類体系は現在までに質とした分類体系：繊毛虫類の口部構造の共通的な様々なものが提唱されているが、それらのうち、主形質に着目した高次分類体系は1887年にBütschliに

要な3つの体系について、それぞれの概念と欠点につよって創設された。その後、新たな形態形質情報のいて比較検証し、現時点ではどの体系に従うのが蓄積により、1門3綱7目から構成される体系が提唱さJpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)

71れた１）。現時点においても、このシステムは繊毛虫

11綱のうち6綱に関しては形態分類と分子分類が強くを同定する際によく用いられているが、体系学的価支持しているものの、3綱は形態分類のみで、2綱は値としては、その役割をすでに終えたと考えて良い

分子分類のみでしか支持されていなかった。

だろう。

以上のことから、Lynn（2003）の報告は、体系学

2）繊毛基部構造（somatic kinetid structure）を基準形質とした分類体系：

繊毛虫の繊毛基部の微細構造的な視点から見れば、尊重すべきであるものの、分子分類と形質分類の双方を適切な理由が不明であるが明確になったことにより「口部構造は淘汰圧によるままに結合させているため、今後、体系が大きく変

変異が大きく、共通的な分類形質の指標としては信頼化する危険性が高い。したがって、現時点での実用性に欠けるので、繊毛基部構造を基準形質とすべきで的な分類には、完成度の高いLynn and Small（2000）

ある 10）」という考えが台頭し、それによって3亜門に基づくのが良いと考えられる。今後は情報の蓄積（Postciliodesmatophora 亜 門，Rhabdophora 亜 門，を見守った上で、Riboclass等の分子分類体系を分類

Cyrtophora亜門）からなる新しい体系が提唱された 5,の実用面に生かしていくのが良いのではないかと思

11）

われる。

。しかし、この体系では繊毛基部構造という新しい分類形質を重視しすぎたために、口部構造や大核の類似性が軽視され、その結果、それらに類似性を持つも[文献]のが別の分類群に属する一方、外見上全く違ったもの

1) Corliss, J. O. (1979) The Ciliated Protozoa (2nd ed.),が同一分類群に属してしまうという矛盾が生じ、このPergamon, New York.
体系の整合性について再検討が行われた。その結果、 2) Foissner, W. (1997) 10th International Congress of
Postciliodesmatophora亜門はSpirotrichea綱の一部を除Protozoology (ICOP-X), pp. 86.
けば、形態分類と分子分類がほぼ一致する単系統的な分類群であることが明らかにされた3, 4）。
一方、その他の繊毛虫類は分裂中の大核内に微小3) Hattenlauchmidt, B., et al. (1996) J. Euk. Microbiol.,
43: 225-230.
4) Hirt, R. P. et al. (1995) Mol. Phylogen. Evol., 4: 77-87.

管が生じるという共通する特徴をもつことが発見さ

5) Lynn, D. H. (1981) Biol. Rev., 56: 243-292.

れ、それらはIntramacronucreata亜門としてまとめら

6) Lynn, D. H. (1996) J. Euk. Microbiol. 43: 253-260.

れた。すなわちここに、2亜門から構成される新しい

7) Lynn, D. H. (2003) Europ. J. Protistol., 39: 356-364.

体系が構築された6, 9）。

8) Lynn, D. H. and Corliss, J. O. (1991) Ciliophora., In:3）分子生物学的情報を基準形質とした分類体系：
上記の分類体系において、Intramacronucreata亜門内に置かれている所属不明の4つの目やPlagiopylea綱にMicroscopic anatomy of invertebrates. Vol. 1. Protozoa., Wiley-Liss, New York, pp. 333-467.
9) Lynn, D. H. and Small, E. B. (2000) Ciliophora., In: An属する繊毛虫は、繊毛基部構造に関して、他の分類

Illustrated Guide to the Protozoa (2nd ed.), Society of

群との明確な共通点がないが、嫌気的環境下に生息

Protozoologists, Lawrence, Kansas, pp. 371-656.

しているという生態学的な共通点やSSrRNA遺伝子に

10) Small, E. B. and Lynn, D. H. (1981) Biosystems, 14:

共通点を持つことから、Lynn（2003）は繊毛基部構387-401.

造 の 形 態 学 的 な 特 徴 に 関 す る 違 い を 無 視 し、

11) Small, E. B. and Lynn, D. H. (1985) Ciliophora., In:

Riboclassという新しい概念の綱を創設し、体系も1門

An Illustrated Guide to the Protozoa, Society of Proto-

2亜門11綱への再編が提案された7）。しかし、それら

zoologists, Lawrence, Kansas, pp. 393-575.

72

原生動物学雑誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年

オパリナ類の分子系統解析 II：オパリナはクロムアルベオラータ大分類群の早期に出現した祖先的生物かもしれない
西あかね（金沢大・院自然・生命科学）

Opalinids as an ancestral chromalveolate inferred from alpha-, beta-tubulin genes
and 18S rDNA sequence
Akane NISHI (Div. of Life Sci., Grad. Sch. of Natural Sci. and Technol.，Kanazawa Univ.)
SUMMARY
Opalinids are enigmatic endosymbionts principally found in the large intestine of anuran amphibians. They are multinucleate and uniformly covered with numerous flagella (or cilia). Their appearance is somewhat similar to that of ciliates, so that opalinids were initially classified in ciliates. However, based on their monomorphic nuclei, absence of aciliate-like life cycle characterized by conjugation, and an interkinetal fission mode, opalinids were subsequently transferred into the zooflagellates. Currently, opalinids are favored to be placed in the Class Opalinea, within the heterokontof the Kingdom Chromista, based on the ultrastructural characteristics of the flagellar base called transitional helix
shared with the proteromonads. However, the question of their classification has not been fully resolved, because of thepossession of a double-stranded ciliary necklace shared with ciliates, and lack of molecular information. Here, we show
their phylogenetic position inferred from 18S rDNA and alpha-, beta-tubulin gene sequences. The 18S rDNA analysis
gave the opalinids an ancestral position in heterokonts, together with the proteromonad flagellates, as suggested by theprevious morphological studies. In contrast, alpha-, beta-tubulin gene analyses suggest an affiliation of opalinids to alveolates, not to heterokonts. Taking account of a few characters dispersed in the large taxon “Chromalveolata”, the present results may reflect an early branching of opalinids from ancestral chromalveolates.

[目的] オパリナ類は、主に無尾両生類の直腸に寄生の構造においても、繊毛ネックレスと呼ばれる構造

する多核性の原生動物であり、核の個数と細胞の横が 繊 毛 虫 と 共 通 し て い る こ と か ら (C. F. Bardele

断面の形状によって１科４属に分類される。オパリ

1981)、その分子系統的位置が確定したとは言えなナ類の体表は、一様に多数の繊毛で覆われており、い。オパリナ類はヘテロコントとアルベオラータ両

外見上は繊毛虫のように見えることから、発見当初

方の特徴を持っており、形態的特徴からのみではそ

は細胞口を持たない原始的な繊毛虫として分類されの系統的位置の判断が難しいため、分子系統的研究ていた。しかしオパリナ類は、一般的な繊毛虫のよが急務である。

うに核が分化しておらず、有性生殖過程においても接合ではなく異形配偶子の融合を行うなどといった[材料と方法] オパリナ類はカエルの直腸内という環

理由から、その後動物性鞭毛虫の一種として分類さ境にいるため、その分子系統を調べようとした際、れたり、独立した１つの門として扱われるなどし、DNAを抽出するときの他の生物のコンタミが一番の

その系統的位置については発見以来様々な議論がな問題となってくる。そこで、他の生物のコンタミがされてきた (Corliss, J. O. 1955)。現在ではオパリナ類

ないようにマイクロピペットで単離・洗浄したオパ

は、鞭毛基部のtransitional helixと呼ばれる超微細構

リナ類の細胞10個体より抽出したDNAを用いてPCR

造等によって、クロミスタ界のヘテロコントにプロを行い、18S rDNAとalpha-tubulin、beta-tubulinについテロモナス類と最も近縁な種である１つの綱としてて分子系統樹を作成した。

分 類 す る の が 主 流 な 見 解 と な っ て い る (CavalierSmith, T. 1993)。しかし、オパリナ類はヘテロコント[結果と考察] 解析の結果、18S rDNAでは、オパリの共有形質であるマスチゴネマを持たず、鞭毛基部

ナ類はヘテロコントのクレードにおいてプロテロモ

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)73

ナスと最も近い位置に分岐し、形態的特徴による現いう現在の分類が支持される結果が得られた一方、在の分類と一致した結果になった。ただし、この系

alpha-tubulin、beta-tubulinの解析においては、オパリ

統樹においてプロトオパリナとプロテロモナスの枝ナ類がアルベオラータである可能性が示唆された。

が他の生物より長くなっており、long-branch attrac-

18S rDNAの系統樹において、オパリナ類とプロテロ

tionによって引き寄せられた可能性も考えられる。まモナスがヘテロコントの祖先的な位置に分岐したこ

た、プロトオパリナ、プロテロモナスを含むクレーとと、rDNAとtubulin遺伝子解析による系統的位置のドがヘテロコントのクレードの中で最も祖先的な位違いに加え、オパリナ類がヘテロコント、アルベオ

置で分岐していた。一方、alpha-tubulin、beta-tubulin

ラータ両方の特徴を持つことをあわせて考慮するの解析においては、両方の系統樹で、オパリナ類はと、オパリナ類はクロムアルベオラータ大分類群の現在分類されているヘテロコントではなくアルベオ

中で早期に分岐し、寄生による特殊化が著しく進ん

ラータ内に分岐した。アルベオラータ内での分岐だ生物であるのかもしれない。

は、alpha-tubulin で は 繊 毛 虫 の ク レ ー ド に、betatubulinでは繊毛虫かアピコンプレクサのクレードに[文献]分岐した。しかし、alpha-tubulinの系統樹ではヘテロ

Bardele, C. F. (1981) Functional and phylogenetic aspects

コントの配列があまりに少なく、beta-tubulinの系統

of the ciliary membrane: a comparative freeze-fracture

樹では繊毛虫が単系統にならないため、これらの系
統樹におけるアルベオラータ内でのオパリナ類の分岐は、はっきりとはわからなかった。
今回の解析の結果、18S rDNAではオパリナ類がヘテロコントであり、プロテロモナスと近縁であるとstudy. BioSystems 14:403-421
Cavalier-Smith, T. (1993) Kingdom protozoa and its 18
phyla. Microbiol. Rev., 57: 953-994 Corliss, J. O.
(1955) The opalinid infusorians: Flagellates or ciliates? J. Protozool., 2: 107-114

異なる環境下に生息する土壌有殻アメーバ（II）—有殻アメーバの畑土壌からの分離法の検討とバイオマスの推定—
島野智之1, 三好孝和1, 橋本知義2, 高橋忠夫3 （1東北農研, 2九州沖縄農研, 3西九州大・生物）

Comparison of soil testate amoeba communities under the various environments (II).
– Improvement of treatment condition to estimate soil testate amoeba fauna –Satoshi SHIMANO1, Norikazu MIYOSHI1, Tomoyoshi HASHIMOTO2, Tadao TAKAHASHI3(1Natl. Agr. Res. Cent. Tohoku Reg., 2Natl. Agr. Res. Cent. Kyushu Okinawa Reg.,
3
Biol. Lab., Nishikyusyu Univ.)
SUMMARY
This study was aimed to improve direct or viable counting methods to evaluate testate amoebae communities inupland soils with slurry application (the 0, 60, 150 or 300 t/ha). The direct counting method: Soil samples were dispersed by stirring to isolate testate amoebae. Then samples on membrane filters were stained by the EQPS method andexamined with a microscope or a confocal laser scanning microscope. The viable counting method: Three gram of soil
samples were inoculated on 1.5% agar plates poured by water, MNAS (Modified Neff’s Amoeba Saline) 6）or KCMt 5）
with or without Enterobacter aerogenes. Viable counts of testate amoebae were determined after 50 days incubation at
20°C. Although the active forms of testate amoebae were not detected in the 0 and 60 t/ha plots by the direct counting
method, they existed 43 and 69 active cells/g wet soil in the 150 and 300 t/ha plots, respectively. The shapes of stained
cells were enough clear to identify testate amoebae communities. Viable counts increased with slurry application levels.

原生動物学雑誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年

74

The identified species number and viable counts with KCMt media were significantly higher than those with other media. These results suggest that these counting methods would be valuable tools to examine dynamics of testate amoebae
in soil.

[目的] 土壌環境中には、数多くの原生動物が生息し炭、KCMt 5）の計6種類の平面培地上に接種し、50日ている。その中でも、土壌有殻アメーバは、土壌繊間培養後、同様に計数・同定を行った。

毛虫とともに、生物学的指標として最も有効な分類群であることが示唆されている4)。本研究では、土壌[結果および考察]

有殻アメーバ相の比較検討手法を開発するために、

I. 直接計数法

単純な土壌環境として畑土壌を材料として計数法の検討を行った。

ス ラ リ ー 投 入 量 の 異 な る 試 験 区 の う ち、150t 区（43個体：細胞質を含む生細胞/1g湿土）と300t区（69個体）でしか、有殻アメーバの出現頻度が低い[材料と方法] 九州沖縄農業研究センター内に設置さため、計数出来なかった。また、メンブレンフィル

れた家畜スラリー長期連用畑圃場（1985年開始：ス

ターに回収、EQPS法を用いることにより、有殻アラリー投入量0 t, 60 t, 150 t, 300 t/haの4試験区）、表

メーバの殻の構造が染色され、光学顕微鏡やレー層クロボク層、0～20 cmから採取した土壌を撹拌

ザー共焦点顕微鏡（励起光：633nm/HeNe）での明瞭し、5 mmメッシュを通過させ土壌試料とした。

な観察像が得られた。この方法で同時にメンブレン

直接計数法

上に採取される繊毛虫も、本来のEQPS法の目的通土壌より最も抽出効率が高かったスターラー法7), 著者

り、染色・同定が可能になることから、この2つの原ら、未発表)

生動物分類群による生物学的指標、および生態学研

ン ブ レ ン・フ ィ ル タ ー 上 に 回 収 し た 後、EQPS究に有用であることが明らかとなった。

（Edaphic Quantitative Protargol Stain）法に従い染色培養法を行った 2)。その後、電子顕微鏡用包埋剤Spurrにて(1)培養法による計数では、スラリー投入量と有殻ア

透徹化を行い、プレパラートを作成し、光学顕微鏡

メーバの種数、および個体数は平行して有意に増加下で計数した。

した。直接検鏡法では計数できなかった出現頻度でを用いて分離抽出1), 3)を行い、セルロース・メ

II. 培養法

も、培養による個体数の増加のためバイオマス測定(1)各試験区の土壌試料3ｇを1.5％素寒天（9cmシャーが可能であった。

レ）の上に静置し、蒸留水5mlを加え、湿度をほぼ(2)成長率はチューブでの培養よりも平面培地で有意100％に保ったタッパウエアに入れ、20±1℃で平面培に高くなった。これはアメーバの高酸素要求性によ養した。50日間培養したシャーレ内の土壌懸濁液をるものだと考察される 5）。また、好気、嫌気環境区

十分に攪拌した後、100µl を5回、ランダムに試料を間の比較では、好気環境区の種数および個体数は若採 取 し、蒸 着 ス ラ イ ド（（株）東 新 理 興）を 用 い

干多いものの、双方に有意な差は見られなかった。

て、合計500µlを全て検鏡後、100µlあたりの平均個(3)種数および個体数はKCMt培地が他の5処理区に比体数を算出した。

べ、有意に高い値を示した（図）。

(2) 好 気・嫌 気 環 境 条 件 の 検 討 ： 50ml フ ァ ル コ ン

本研究では単純系としての有機管理畑圃場を用いチューブ内に各試験区の土壌試料5gと蒸留水10mlをたが。今後は、多様な環境の土壌調査への応用およ

加え、好気環境は同チューブの蓋に穴を開け、通気び計数条件の検討が必要であり、総合的な手法とし性のあるメンブレンでシールした。嫌気環境は同ての確立が重要である。

チューブ内を窒素ガスに置換した。これらはタッパ
ウエアにて、20±1℃で培養し、培養50日後、同様に[文献］

計数・同定を行った。

1) Aoki, S. (2003) J. Microbiol. Methods., 55: 791-795.

(3)300t区の土壌試料を(1)と同様の方法で、バクテリ

2) Acosta-Mercado, D. and Lynn, D. H (2003) J. Micro-

ア（Ea: Enterobacter aerogenes）添 加 区 ： 素 寒 天、
MNAS（Modified Neff’s Amoeba Saline）6）培地、およ び バ ク テ リ ア 未 添 加 区 ： 素 寒 天、MNAS、活 性

biol. Methods., 53: 365-375.
3) Coûteaux, M-M. (1967) Rev. Ecol. Biol. Sol., 4: 593596.

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)

754) Foissner, W. (1999) Agric. Ecosyst. Environ., 74: 95-

Gymnamoebae, with instructions for culture. CCAP112.
5) 石井圭一 (1999) アメーバ図鑑, 堀上英紀・木原章

and FBA, Cumbria, Ambleside, 122pp.
7) 島野智之・盛下勇 (2004) 原生動物学雑誌, 37: 68-

編, 金原出版, 東京, 253pp.

69.

6) Page, F. C (1989) A new key to freshwater and soil

家畜スラリーを投与した畑における繊毛虫の種組成と個体数について
Ⅱ．年次間差と季節間差
河知圭介1，久富裕子1，橋本知義2，島野智之3，三好孝和3，高橋忠夫1（1西九州大・生物、2九州沖縄農業研究センター、3東北農業研究センター）

Species Composition of Soil Ciliates and their Population Size in the Upland Soils
with Slurry Application. II. Seasonal and Yearly Change.
Keisuke KAWACHI1, Yuko HISATOMI1, Tomoyoshi HASHIMOTO2, Satoshi SHIMANO3, Norikazu MIYOSHI3 and Tadao TAKAHASHI1
1( Bio. Lab. Nishikyushu Univ., 2 NARC Kyushu-Okinawa Reg., 3 NARC Tohoku Reg.)SUMMARY
We have already reported that the biomass of soil ciliates can be estimated by using the modified MPN method(MPN-SIPSE: Most Probable Number with Species Identification and their Population Size Estimation) (Takahashi etal., 2003). In this work, we attempted to examine the ciliate fauna and their biomass relative to seasonal and yearlychanges by using the MPN-SIPSE method. From analyzing the soil samples, which were collected from the upland field

76

原生動物学雑誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年

with slurry application of NARC Kyushu-Okinawa Reg. Miyakonojo Branch in August 2003 and 2004, it was found thatthe population size of soil ciliates significantly increased with increase of the applied slurry volume in both soil samples.
Further, the water content of soil samples also indicated significant positive correlation with the applied slurry volume.
In May and August in 2004, the population size of soil ciliates and their biomass in soil obtained from a 60t/ha slurryapplied field were greater than those of other soils collected from 0, 150, and 300t/ha slurry-applied fields. These results
indicate that the MPN-SIPSE method might be more suitable than the MPN method to estimate the population size ofsoil ciliates and their biomass.
１．年次間差：2003年８月の調査ではバイオマスを[目的] 土壌繊毛虫による環境評価基準は今日まで確調べていないので種組成と個体数で比較する。2003

立していない。そこで、そのような基準の作成を目

年８月では0t区で18種、総個体数は乾燥土壌1g当り

的として土壌微生物のバイオマス推定によく利用さ

5.3×104個体、60t区で24種、6.0×104個体、150t区で31れているMPN法を改良した改良MPN法（MPN-SIPE

種、13.2×104 個 体、300t 区 で 39 種、12.2×104 個 体 で法）によって、土壌繊毛虫相とそのバイオマスにつあった。これに対して2004年8月では60t区で6種、いて調べている 6)。我々は2003年8月に都城市九州沖

10.3×104 個体、150t区で9種、3.2×104 個体、300t区で

縄農業研究センターにある家畜スラリーが長期間連

12種、10.2×104 個体であった。0t区では検出されな用されている畑の土壌繊毛虫相とそれらの個体数にかった。このように2004年の出現種数は前年に比べつ いて MPN-SIPSE 法を 用いて 調査し たが、今回 はて非常に少なかったが総個体数には大きな違いは見2004年の5月と8月に同じ畑から得られた土壌サンプられなかった。

ルについて同じ方法で調べることによって、それらの年次間差と季節間差を検討した。

2003 年 の 土 壌 含 水 率 は 0t 区 で 31.8%、60t 区 で35.1%、150t区で35.1%、300t区で36.8%であった。一方、2004 年 の も の で は そ れ ぞ れ 23.6%、24.0%、[材料と方法] 土壌サンプルを採取した畑における家

25.5%、27.0%とやや少ない傾向があり、これが種数

畜スラリー投与量は年間1ha当り60t、150t、300tの3の減少と関連している可能性も考えられた。

区画であった。採取した土壌は5mmのふるいにかけ

２．季節間差：2004年5月のサンプルでは0t区で7て室温（23℃）で保存した。土壌試料1gを50mlディ

種、2.0×104 個体、60t区で12種、12.9×104 個体、50t区

スポ遠心管に移し、これらにバクテリアを含むレタ

で10種、5.6×104 個体、300t区で12種、6.3×104 個体でス浸出液9mlを加えたものを10倍希釈液とし、土壌分あった。総バイオマスで見ると2004年5月では0t区で散装置を用いて分散処理行った。その後、10倍希釈

3.1×107U、60t 区 で 17.6×107U、150t 区 で 3.9×107U、系列で105倍希釈液まで作製した。それらの土壌懸濁

300t 区 で 4.2×107U。一 方、2004 年 8 月 で は そ れ ぞ れ液を3穴凹スライドの各ウェルに6反復で0.7mlずつ分

0U、8.5×107U、2.5×107U、7.9×107U で あ っ た。こ の注して23±1℃に保った。その後、毎日2週間、繊毛虫

ように0t区を除けば季節間での総個体数とバイオマの出現を記録するとともに出現した繊毛虫は全て1個

スの差はほとんど無く、総個体数と総バイオマスも体ずつ1％メチルセルロースに移して運動を抑制し、ほぼ並行関係にあるように見えた。しかし、個々の光学顕微鏡に取り付けた３CCDカメラにてパソコン

繊毛虫の個体数とバイオマスの比較では、比較的大にそれらの動画を取り込み、外部形態、遊泳方法な型の繊毛虫が個体数は少なくても、大きなバイオマ

どの特徴に基づいて種の同定を行った。土壌繊毛虫

スを示すケースがしばしば見られた。

の個体数は繊毛虫が発見されたウェル数に基づく

このようにMPN-SIPSE法は従来のMPN法では得ら

データセットから統計的手法で推定した。バイオマれなかった種組成や総個体数だけでなく総バイオマ

スは個々の繊毛虫の体長、体幅を測定し、その平均

スや個々の種のバイオマス推定にも有効であること

値を乗じたものをその種の１個体当りのバイオマスが示され、年次間差や季節間差を鋭敏に検出できる

任意単位（U）と定義し、出現した各種のバイオマことが分った。

スはそれらの１個体当りバイオマスに個体数を乗じることで求めた。

[文献]1) 土壌微生物学会編（1981）新編土壌微生物実験[結果・考察]法、養賢堂、東京

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)

2) Fenchel, T. (1987) Ecology of protozoa, SpringerVerlag, New York.
3) Fiossner, W. (1987) Soil protozoa, Prog. Protistol., 2,77

illustrated guide to the protozoa, 2nd ed., Allen Press,
Lawrence.
5) 高橋忠夫（2000）土の原生動物.,第1章, pp.5-54,博友社．

69-2124) Lee, J. J., Leedale, G. F. and Bradbery, P. (2000) An

6) 高橋忠夫他（2003）Jpn. J. Protozool., 36, 18-19

中海における原生動物の分布
石田秀樹1，石橋将行1，中原広和1，増山悦子2（1島根大･生物･生物，2広島女子大学・健康科学）

Investigation of the protozoan distribution in the Nakaumi Lake
Hideki ISHIDA1, Masayuki ISHIBASHI1, Hirokazu NAKAHARA1 and Etsuko MASUYAMA2(1Department of Biological Science, Faculty of Life and Environmental Science, Shimane University,2
Department of Health Science, Hiroshima Prefectural Women's University)
SUMMARY
Protozoa were observed from 2002 to 2003 in relation to salinity, water temperature, pH, COD etc. in Nakaumi
Lake. This lake, a typical brackish water lake, is known to have a large change in salt concentration through the year.
It has become clear from our research in recent years that various protozoans exist in Nakaumi Lake. However, hardly
anything is known about composition or density of species in this habitat. Therefore, 12 stations were set up to checkfactors which influence protozoan species composition. Inflow of seawater from the Sea of Japan into Nakaumi Lakechanges sharply according to season. It is also known that the amount of inflow from the upstream Shinji Lake depends
on rainfall etc. It was found that distributions of Cinetochilum sp., Helicostoma sp., and Mesodinium sp. positively correlated to salt concentration, and those of Euplotes eurystomus and Halteria grandinella negatively correlated to salt concentration. Moreover, Chlamydomonas reinhardtii and Cinetochilum sp. negatively correlated with water temperature,
while Gymnodinium paradoxum, Mastigina sp., and Ochromonas sp. showed positive correlation to water temperature.

[目的] 汽水に生息する自由遊泳型の微小動物は，汽とんどない。この原因として，微小動物特に原生動

水環境に適応した様々な種が生息している事が知ら物の生息分布調査がほとんど行われていないことがれている。これらの微小動物は微小動物以外の多様あげられる。したがって，原生動物の分布調査は生な生物とともに汽水域特有の生態系構造を形成して態系ピラミッドの最底辺を明らかにする鍵となるといると考えられている。汽水域における特徴的な生考えられる。

態系構造や食物連鎖について，植物プランクトン－

中海は代表的汽水湖であるが，年間を通じて塩分

二枚貝－鳥類（または人間による漁獲）の関係につ濃度が大きく変化し，生物相の季節的な変動が大きいては詳しい研究が行われている。しかし，低次消いこと知られている。近年の我々の研究から，中海費者同士である，原生動物・動物プランクトン・二には多様な原生動物が生息することが明らかになっ枚貝やその他のベントスの関係についての知見はほてきた。しかし，原生動物に関する調査は過去には

78

原生動物学雑誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年

ほとんどおこなわれておらず，種組成やその生息密水温に有意に負の相関を示す種として Chlamy-

度などについての知見はほとんど無い。そこで，中

domonas reinhardtii，Cinetochilum sp.，水温に正の相海に生息し生態ピラミッドの底辺の一角を支える原関を示す種として Gymnodinium paradoxum，Masti-

生動物の，種組成，生息環境を左右する要因についgina sp.，Ochromonas sp.，水温に関係なく出現するて明らかにすることを目的として，定点を設定して種として Amphisiella sp.，Euplotes eurystomus，Heli-

継続的な調査を行った。

costoma sp.が認められた。また，塩分濃度に正の相関を示す種として Cinetochilum sp.，Helicostoma sp.，

[材料と方法] まず，中海に 12 箇所の調査地点を設

Mesodinium sp.があげられ，塩分濃度に負の相関を示定した。調査地点は，流入河川の状況，調査地点間す種として Euplotes eurystomus，Halteria grandinellaの距離，湖岸の構造や形状，周囲からの人為的な影があげられた。中海は季節によって日本海からの海響などを考慮しながら，おおよそ付近の環境を代表

水の流入量が大幅に変わること，上流の宍道湖からすると思われる場所を選定した。最も上流側に位置の流入量が降雨などで大きく変化することが知られする地点を St.1 とし，本庄工区と呼ばれる本流からており，水温 (季節) と塩分濃度の間にも関連性があ

外れる水域についても調査地点に加えた。調査は，ることを考えると，水温や塩分濃度などの単一の環

すべての調査地点で，毎月一回行い（データ欠損あ

境要因のみを取り上げて生息環境を特定する環境因り），原生動物の個体数・種数に影響をおよぼす可子とすることは難しいと考えられる。

能性が考えられる水温･塩分濃度，ｐＨ，濁度，DO

水温と個体数の関係についてみると，水温が低下

について現地で測定を行った。また，同時に採水をする冬季のみならず，水温の上昇する夏季にも原生行い，採取した湖水は直ちに実験室に持ち帰り，原動物の種数･個体数が減少することがあった。また，生動物の同定を行った。採水した湖水の一部を用い繊毛虫と鞭毛虫の間で種数･個体数に負の相関が見らてＣＯＤ，窒素塩，リン酸塩の測定をおこなった。

れる場合があり，捕食･非捕食の関係を予測させた。
また，夏季の種数･個体数の減少については，原生動[結果と考察] 今回の調査では，鞭毛虫 43 種，肉質

物以外の捕食者からの捕食による可能性が考えられ

虫 17 種，繊毛虫 101 種の合計 161 種が確認され，以た。捕食者としては二枚貝を含むベントスがその候下のことが明らかになった。 水質の変化に明確に呼補として考えられるため，現在研究を行っている。

応する種は非常に少なく，多くの種では水質データ

2 年間にわたる調査の結果，原生動物の生息場所との有意な相関は見られなかった。その中で，水温･を左右する環境因子を決定するためには，さらに複塩分濃度についてはそれぞれの値と正または負の相数年にわたる調査が必要と考えられる。また，調査

関の見られる種が数種確認された。一方，ｐＨ・Ｃ

頻度についても月一回ではなく，調査頻度を上げる

ＯＤ・窒素塩・リン酸塩については，有意な相関をことも必要と考えられる。このためには，今後は多示す種は無かった。ｐＨ・ＣＯＤ・窒素塩・リン酸

人数による調査が必要になると考えられるため，多塩は比較的変動の幅が小さいため，変動幅が個体数数の調査者の参加を可能とするような，水質や種同等に影響を及ぼすことのない範囲内に収まっている定のための画像を含めたデータベースなどを整備しものと思われる。

ていく必要がある。

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)79

ミドリゾウリムシにおける共生藻の形態変化
山口 純，高橋利幸，細谷浩史，小阪敏和（広島大・院理・生物科学）

Morphological variation of the symbiotic algae in Paramecium bursaria
Jun YAMAGUCHI, Toshiyuki TAKAHASHI, Hiroshi HOSOYA and Toshikazu KOSAKA(Department of Biological Science, Graduate School of Science, Hiroshima University)
SUMMARY
Paramecium bursaria has hundreds of symbiotic algae in its cytoplasm, and is often used for the study of symbiosis.
In the light, P. bursaria exchanges metabolic products with its symbiotic algae (mutualism). However, in the dark, thesymbiotic algae come to depend completely on the paramecium for their nutrition. To see how the morphology of thesymbiotic algae is affected by light, P. bursaria was cultivated in continuous darkness (DD), continuous light (LL) or
alternating light/dark (LD)conditions. In this study, four stocks of P. bursaria syngen 1, KN-1(mating type I), BWK16 (II), KN-21 (III) and BWK-4 (IV) were used. After cultivating the four stocks for one week under DD conditions, thestocks were transfered to LL conditions. Morphological variations of symbiotic algae were observed using a microscopeand compared in LD, DD and LL conditions over time. The size and fluorescence intensity of the symbiotic algae ofstock BWK-4 were measured using a flow cytometer. In DD conditions, the size and fluorescence intensity of the symbiotic algae decreased markedly when compared with those of the symbiotic algae in LD conditions. When the paramecia
cultured in DD conditions were transferred to LL conditions, the symbiotic algae recovered their fluorescence intensity
and size again within one week.

[目的] 繊毛虫ミドリゾウリムシは、細胞質内に数百[結果と考察] ミドリゾウリムシは通常LDサイクルの共生藻をもっており、共生のモデル生物として研で培養しているが、光を遮断したDDだと共生藻のサ究されている。ミドリゾウリムシと共生藻は光があ

イズ、色調、密度に著しい変化がみられた。一週間る条件下では相互に代謝産物のやり取りをして両者DDで培養した共生藻数は、暗闇に置く前のLDで培が利益を得る相利共生を行っている。しかし、全暗養した共生藻と比較して、約半数まで減少している

条件下で培養を行うと、共生藻は宿主のミドリゾウ

ことがわかった。色彩は濃緑色から薄緑色になり、リムシに栄養を依存して生活するようになる。本研LD時では細胞の長径が6.2～12.3 µmであったのに対究では全暗条件（DD）でミドリゾウリムシを培養し、光を遮断したDDでは3.1～9.2 µmとサイズに著しし、明暗条件（LD）の時と共生藻の形態を比較しい減少傾向がみられた。全暗条件では上述のようなて、共生関係の変化による違いを調べた。

形態変化が生じるが、共生藻は栄養を完全に宿主に依存することで分裂を維持し、低い割合ながら増殖[材料と方法] ミドリゾウリムシParamecium bursaria

していることが光学顕微鏡による観察からわかっsyngen １、KN-1(I)、BWK-16(II)、KN-21(III)、BWK-た。サイズが減少し薄緑色になった共生藻は、再び4(IV)の4株を使った。温度は25°C、光条件は明暗サ

LLにすると約一週間でＬＤ時の状態に回復した。さイクル(LD12)で培養している。培養液は、0.1%液体

らに、定量的な結果を得るためにLD、DD、LL時のカロリーメイトにバクテリアKlebsiella pneumoniaeを共生藻20,000細胞を、フローサイトメーターを用い接種して使用した。4株の初期密度を50cells/100mlとてサイズと蛍光強度を測定した。その結果、共生藻

し、DDで一週間培養後、全明条件(LL)にしてその間はDDにおいて、サイズと蛍光強度の両方が著しく減の共生藻の形態変化を、一日置きに光学顕微鏡で観少する事がわかった。また、LLにして約一週間でサ察し、比較を行った。さらに、BWK-4株をフローサ

イズと蛍光強度は、LD時とほぼ同程度に回復した。

イトメーターで共生藻20,000細胞を実験に供し、細胞当たりのサイズとクロロフィルの蛍光強度を定量的に測定した。

80

原生動物学雑誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年

ミドリゾウリムシを用いたアクリルアミド毒性の評価とその毒性メカニズムに関する研究高橋利幸1,2，吉井昌信2 ，小阪敏和1，細谷浩史1（1広島大・院理・生物科学，2（株）タイムアソシエイツ）

Biotoxicity of acrylamide on the ciliate Paramecium bursaria
Toshiyuki TAKAHASHI1,2,Masanobu YOSHII2,Toshikazu KOSOKA1and Hiroshi HOSOYA1(1Department of Biological Science, Graduate School of Science, Hiroshima University,
2
Time Associates Inc.)SUMMARY
Monomeric but not polymeric form of acrylamide induces toxicity like carcinogenic or neurotoxic effects. Recent
studies revealed that high acrylamide concentrations were found in starch-containing foods cooked at high temperatures(Press Release, WHO, 2002). However, the mechanisms of acrylamide toxicity to living organisms including humanhave not been well elucidated. We have introduced a convenient bioassay system using a green paramecium, Paramecium bursaria, possessing several hundreds of endosymbiotic algae to evaluate acrylamide toxicity of various kind ofenvironmental chemicals. Using this system, acrylamide toxicity has been evaluated on the P. bursaria (Takahashi et al.,2004 (Toxicol. in Vitro 19, 99-105)). It has been also reported that a herbicide paraquat, which is known as a generatorof reactive oxygen species (ROS), can produce alga-free paramecia. In this study, a production of ROS was investigatedto elucidate mechanisms of the toxicity of acrylamide on the ciliate P. bursaria.

[目的] 糖質の豊富な食品を高温で加熱処理すると食1250 mg/L）に対数増殖期のミドリゾウリムシを加え品中に発ガン性物質アクリルアミド（AA）が生成さ

細胞密度20 cells/mlで培養した。ミドリゾウリムシをれ る こ と が 報 告 さ れ た（WHO, 2002）。こ の こ とAA存在下で23±1℃、全明条件（照度1500 lux）または、我々が日常の食生活を通してAAを取り込む危険は全暗条件下で5日間培養し増殖を比較した。AAに性が高いことを示しており大きな社会問題となってよる活性酸素の生成の有無を明らかにするために、いる。従って、AAの毒性の作用機序の解明とその毒AAと同時に活性酸素捕捉剤（ニトロブルーテトラゾ

性を抑制する物質の探索は緊急の課題である。既リ ウム ；NBT）を 10 時間 処理 し、活 性酸素 によ るに、我々の研究室では、ミドリゾウリムシ（ Para-

NBTの還元を分光光度計を用いて定量化した。

mecium bursaria ）に対するAAの効果を調べており、AA処理したミドリゾウリムシでは、ミドリゾウリム[結果と考察] 活性酸素発生剤であるパラコートやメシの致死や増殖阻害さらに細胞内共生藻数の減少がチレンブルーは光依存的な毒性の助長（光増感作

観 察 さ れ る こ と を 報 告 し た（Takahashi et al.,用）を示すことが知られている。AAにおける光増感2005）。ミドリゾウリムシの細胞内共生藻数の減少

作用の有無を調べるために、AA処理を全明または全は、除 草 剤 パ ラ コ ー ト で も 起 こ り（Hosoya et al.,

暗条件下で行い効果の差を観察した。その結果、AA

1995）、パラコートは活性酸素発生剤としても知らによるミドリゾウリムシの増殖阻害や細胞内共生藻れている。本研究では、AAの毒性がパラコートの毒数の減少の割合は全暗条件下に比べ全明条件下で処性と類似していることに着目し、AAによる活性酸素

理したときの方が効果が大きいことから、AAはパラ生成の有無を検討したのでその結果を報告する。

コートと同様に光増感作用を示すことが明らかと[材料と方法] 実験にはP. bursaria、MB-1株およびために、AA処理後のNBTの還元を調べたところ、

BWK-4 株を用い た。AA を 含む 培養 液（濃度 ：0 ～AA処理したものでは未処理のものと比べNBT還元産なった。また、AAによる活性酸素の生成を証明する

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)

物の顕著な増加が示された。これらの実験結果か

81

変動は種々の疾病の要因となり得ると考えられる。

ら、AA は生体内で代謝される過程で活性酸素を産生することが示唆された。

[文献]

活性酸素は、細胞内の酸化還元調節を通しタンパ

1) Press Release WHO / 32, 26 April 2002.

ク質の翻訳後修飾に関与する。AA により生じる神2) Hosoya et al. (1995) Zool. Sci 12, 807-10.

経疾患や発ガンと活性酸素との関連は不明である

3) Takahashi et al. (2005) Toxicol. in Vitro 19, 99-105.

が、AA由来の活性酸素による細胞内酸化還元状態のミドリゾウリムシと共生藻の共生に関与する遺伝子の探索
金子裕代，前田奈津子，小坂敏和，細谷浩史（広島大・院理・生物科学）

Search for symbiosis-related genes of symbiotic algae from Paramecium bursaria
Hiroyo KANEKO, Nachuko MAEDA, Toshikazu KOSAKA and Hiroshi HOSOYA(Department of Biological Science, Faculty of Science, Hiroshima University)
SUMMARY
Paramecium bursaria harbors several hundreds endosymbiotic algae in its cytoplasm. To investigate the symbiotic
association of P.bursaria with its symbiotic algae, we made both aposymbiotic cell strains of P.bursaria and the cloned
strains of symbiotic algae isolated from P.bursaria. We have revealed that some of the cloned strains of symbiotic algae
have infective activities into aposymbiotic P.bursaria, but the others are non-infective for aposymbiotic P.bursaria. In
this study, we tried to search for possible symbiosis-related genes of symbiotic algae from P.bursaria by comparing thegenetic differences between the infective and the non-infective algal strains. We have obtained three genes expressing
more highly in an infective algal strain (SA-4b) and one gene expressing more highly in a non-infective algal strain (SA4a).

[目的]ミドリゾウリムシの細胞質には数百のクロレを試みた。

ラ 様 の 緑 藻（共 生 藻）が 共 生 し て い る。現 在 ま でに、この共生メカニズムの解明のため、共生藻を除[材料と方法] 本研究には、ミドリゾウリムシのBS-4

去したミドリゾウリムシの作製１，２、ミドリゾウ株（syngen 1, mating type II，1994年に愛媛県別子山

リムシ由来の共生藻の単離．クローン化、さらに、村で採集）から単離・クローン化された共生藻、SA-

これらを用いた再共生の実験系を確立している３。

4a株とSA-4b株の2株を用いた。これら2株のミドリゾ

また、クローン化共生藻と自由生活性のクロレラのウリムシ由来の共生藻株を実験的に作製した共生藻

それぞれ複数株について共生藻除去ミドリゾウリム

除去ミドリゾウリムシ（KSKw-103株）に経口摂取さシへの再共生を試みたところ、クローン化共生藻とせたところ、SA-4b株はミドリゾウリムシと再共生す

自由生活性のクロレラの両者で再共生可能な株と不るが、SA-4a株は再共生しないことがすでに分かって可能な株が存在することが分かっている。本研究でいる。

は、ミドリゾウリムシと共生藻の共生メカニズムのSA-4a株とSA-4b株からフェノール/SDS法により全解明を目的とし、ディファレンシャル・ディスプレ

RNAを抽出した。アンカープライマーを用いて全イ法により再共生可能な株（SA-4b株）と不可能な株RNAからpoly(A)-mRNAを選択的に逆転写し、合成さ（SA-4a株）の両者で発現量に差のある遺伝子の同定れたcDNAと60種類の任意プライマーを用い、ディ原生動物学雑誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年

82

ファレンシャル・ディスプレイ法（D. D法）４によした。OPC12-4b-3については、さらに5'RACEを行いり両株の発現遺伝子を比較した。

全 長 配 列（2441 bp）を 決 定 し た。DDBJ/EMBL/

D. D法により得られた両株で発現量に差のあった

GenBankデータベースのFASTAプログラムでホモロ

cDNA断片をもとに作製したプローブでノザンブロッ

ジー検索を行ったがこれまでのところ相同性の高い

トにより両株で発現量に差のある遺伝子であるのか

配列は存在しなかった。

の確認を行った。

今後、OPC12-4b-3以外のノザン解析で再共生可能

発現量に差があることが確認されたcDNA断片の塩株と再共生不可能株で発現量に差の生じた遺伝子に基配列を明らかにし、さらに5'RACEにより全長配列

ついても全長配列を決定し、再度ホモロジー検索をを決定した。ホモロジー検索はDDBJ/EMBL/GenBank

行う予定である。また、ノザン解析を行っていない

データベースのFASTAプログラムで行った。

残りの20個のcDNA断片について同様の解析を行う予[結果と考察] D. D法により60種類の任意プライマーれた5個の遺伝子については、他の共生可能な株と不を用いて再共生可能株（SA-4b株）と再共生不可能株

可能な株でも発現量の比較を行う予定である。

定である。さらに、ノザン解析により再現性の得ら（SA-4a株）の発現遺伝子を比較したところ、SA-4a株で特異的に検出されたは15個、SA-4b株で特異的に[文献]検出されたものは21個であった。

1) Hosoya H, Kimura K, Matsuda S, Kitamura M, Takaha-

D. D法で得られたcDNA断片をプローブとして用shi T, Kosaka T (1995) Zool Sci 12: 807-810.

い、ノザン解析による発現量の再確認を行った。現

2) Tanaka M, Murata-Hori M, Kadono T, Yamada T,

在までに36個のうち16個のcDNA断片について解析を

Kawano T, Kosaka T, Hosoya H (2002) Acta Proto-

行い、そのうちの5個で再現性のある結果が得られた。今回はそれら5個のうち、SA-4b株でSA-4a株よzool 41: 255-261.
3) Nishihara N, Horiike S, Takahashi T, Kosaka T, Shi-

りも発現量が多いcDNA断片、OPC12-4b-3とOPD14-

genaka Y, Hosoya H (1998) Protoplasma 203: 91-99.

4b-1について示した。 2個のcDNA断片、OPC12-4b-3

4) Liang P and Pardee A.B (1992) Science 257: 967-971.

(325 bp)とOPD14-4b-1（471 bp）、の塩基配列を決定

ミドリゾウリムシと細胞内共生藻間における共生関与遺伝子の探索
前田奈津子，金子裕代，小阪敏和，細谷浩史（広島大・院理・生物科学）

Symbiosis-related genes of endosymbiotic algae of Paramecium bursaria syngen 1
N. MAEDA, H. KANEKO, T. KOSAKA, H. HOSOYA(Biol. Inst., Grad. Sch. of Sci., Hiroshima Univ.)
SUMMARY
The green paramecium Paramecium bursaria has several hundreds of endosymbiotic algae in its cytoplasm. But it is
not clarified how this symbiotic association can be established and maintained. To elucidate the mechanism of symbiosis,
we had removed these endosymbiotic algae from paramecium using the herbicide paraquat and symbiotic algae-freestrains were prepared (Hosoya et al. 1995, Tanaka et al. 2002). Using several clones of symbiotic algae isolated fromgreen paramecia, we have already established the conditions to let them re-infect into symbiotic algae-free paramecia(Nishihara et al. 1998). Interestingly, these cloned symbiotic algae contained two kinds of strains, infective or noninfective for algae-free paramecia, respectively. Here we compared DNA patterns developed in the infective and non-Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)

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infective strains of cloned algae using a differential display and northern blot method. As a result, four cDNA fragments,
which show different patterns of expression in the infective and the non-infective clones, were obtained.

[目的] 繊毛虫ミドリゾウリムシ（Paramecium bur-

FASTA 検索 を行 っ た。さ らに、そ の う ちの 一 つ、

saria）は、その細胞質中に多数の共生藻が共生してcDNA断片OPC-12 4b-1については、5’RACEを行っている。当研究室では、ミドリゾウリムシにおける共遺伝子の全長を得た。

生メカニズムの解明を目的として、これまでに共生藻除去ミドリゾウリムシの作製 1,2 や、共生藻の単[結果と考察] D・D法を用いてSA-4a株とSA-4b株で離・クローン化、共生藻除去ミドリゾウリムシへク

cDNA断片のバンドの有無を比較した結果、差のあるローン化藻類を再感染させる系の確立等3を行ってきcDNA断片が計36個得られた。36個のうち、20個の断た。自由生活性のクロレラがミドリゾウリムシに共片のサブクローニングに成功した。このうち、16個生するという過去の報告があるので、共生藻除去ミのcDNA断片についてはノザンブロット解析が終了

ドリゾウリムシにクローン化した共生藻及び自由生

し、５個の断片（OPC-12 4b-1, OPC-12 4b-2, OPC-12

活性のクロレラの複数株を経口接種させると、それ

4b-3, OPC-17 4a-8, OPD-14 4b-1）でSA-4a株とSA-4b

らの中に再感染可能な株と不可能な株の２種類ある株での発現量に差が見られることが分かった。再感ことが分かった。そこでこの成果をもとに、共生藻

染不可能なSA-4a株で発現量が多かった断片はOPC-とクロレラの発現遺伝子をディファレンシャル・

17 4a-8で、その他が再感染可能なSA-4b株で発現量のディスプレイ法（D・D法）により比較した。その結多かった断片である。その後、シークエンスを行っ

果、感染能の有無に関係なく、発現遺伝子のバンドて断片の塩基配列を決定し、FASTAプログラムで相パターンによりA~Fまでの12グループに分かれるこ

同性検索を行ったが、どの断片も相同性の高い遺伝とが分かった。そこで本研究では、このグループ分

子が見つからなかった。しかし、OPC-12 4b-1とOPC-

けにおいて感染能を持つ株と持たない株の両方を含

12 4b-2は、その配列が一致したため、その後OPC-12

むグループＤに焦点を絞り、D・D法及びノザン解析

4b-1 の み 解 析 を 進 め た。ノザ ン ブ ロ ッ ト の 結 果、法を用いて両株の発現遺伝子を比較、解析する・ ｱ

OPC-12 4b-1の全長は、約3kbであることが分かったとにより共生に関与する因子の探索を行った。

が、得られている断片は約700bpであったので、引き[材料と方法] 共生藻は、グループＤに含まれるSA-

OPC-12 4b-1が得られた。シークエンスを行い、3kb

4a株とSA-4b株の2株を用いた。これらを大量培養しのうち約2.5kbの塩基配列を決定した。再びFASTA検た後、フェノール/SDS法を用いてトータルRNAを抽索にかけたが、有意に相同性のある遺伝子は見つか

続いて5’RACEを行った。その結果、完全長の遺伝子出した。トータルRNAはDNase I処理してからアンらなかった。今後、塩基配列の解析を進めて全塩基

カープライマーでpoly(A)-mRNAを選択的に逆転写配列を決定し、SA-4a株・SA-4b株以外の共生藻株にし、その後60個の任意プライマーをそれぞれ用いておいても再感染可能、不可能な株の間でこの遺伝子

PCRで増幅した。得られたPCR産物をアクリルアミの発現量に差があるのか、検討を行いたいと考えてドゲルで電気泳動し、SA-4a株とSA-4b株で差の見らいる。

れたバンドをゲルから切り出した。D・D法はその過程にPCRを用いるため、本来の遺伝子の発現量を定[文献]

量的に反映していない可能性があるので、そこから

1. Hosoya H. et al., (1995) Zool. Sci. 12, 807-810.

抽出したcDNA断片からプローブを作製し、ノザンブ

2. Tanaka M. et al., (2002) Acta Protozool. 41, 255-261.

ロッティングを行った。ノザンブロッティングで発

3. Nishihara N. et al., (1998) Protoplasma 203, 91-99.

現量に差の見られたcDNAはシークエンスを行い、原生動物学雑誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年

84

ミドリゾウリムシ細胞内共生藻の系統
保科 亮，鎌戸伸一郎，今村信孝 （立命大・理工・化生工）

Phylogeny of symbiotic algae of Paramecium bursaria
Ryo HOSHINA, Shin-ichiro KAMAKO and Nobutaka IMAMURA(Sci. and Eng., Dept. Biosci. and Bioeng., Ritsumeikan Univ.)
SUMMARY
We have made progress on the study of phylogeny of paramecian symbionts based on the 5’ half ribosomal DNA
operon. All symbiotic algae we used (6 Japanese, 1 Chinese, 2 American and 1 German samples) belong to Chlorella
sensu stricto (Huss et al. 1999 [3]) based on the 18S rDNA phylogeny. An analysis based on internal transcribed spacer 2
unveiled two phylogenetic groups J-C-A (Japanese, Chinese and American) and German, which suggests the event ofalgal symbiosis have occurred more than one time.

[目的] ミドリゾウリムシの共生藻は, それがホスト数の報告がある。一方ミドリゾウリムシから得られであるミドリゾウリムシのオルガネラではないこと

た共生藻DNAは日本産, ドイツ産とも単一であり, 日が古くから認知され, その形態や生理特性, 成分分析

本産のものは単離した共生藻での報告[1] [2]と一致しな ど か ら ク ロ レ ラ Chlorella (Trebouxiophyceae,

た。これらの結果は1ミドリゾウリムシ細胞内に共生Chlorophyta)に近縁であることが示唆されてきたが,している藻類はクローンであることを強く示唆してクロレラ自体の形態が単純で分類体系もあやふやでいる。中国産ではITS1領域内にわずかな多型が見らあることから, DNA, 特にリボゾームRNA遺伝子に基れたが, これもSyngen 2-3のケース同様, 1共生藻のゲづく分子系統解析が待たれていた。本研究では, 日

ノム内多型である可能性が高く, ミドリゾウリムシ細本, 中国, アメリカ, ドイツ産の共生藻について, リボ

胞内における共生藻のクローン化を否定するものでゾ ー ム RNA の ス モ ー ル サ ブ ユ ニ ッ ト 遺 伝 子 (18Sはない。

rDNA), および真のクロレラにおける系統解析に最適

全ての共生藻の18S rDNA中にはイントロンの挿入な 分 子 種 と して 提 示 さ れ てい る Internal transcribedが確認された。中国産とアメリカ産は, すでに報告しspacer 2 (ITS 2; [1])を用いて分析をおこなう。

ている日本産共生藻のもの[2]と同じ3ヶ所にほぼ同様の配列がみられた。一方ドイツ産のものではイン[材料と方法] 系統解析にはミドリゾウリムシ株[日トロンは1つしか認められず, 挿入位置, 配列とも大き本産; Ok1, So13, F36, KM2, Dd1, Bnd1, 中国産; Cs2, ド

く異なった。18S rDNAのエクソン領域は日本－中イツ産; PB-SW1] およびアメリカ産共生藻単離株

国－アメリカ産のもので完全に一致し, ドイツ産のも(NC64Aのではいくらか異なる。

Syngen 2-3)を用いた。ユニバーサルプライ

マー, または緑色藻にspecificなプライマーを用いて

18S rDNAに基づく系統樹では, 日本－中国－アメPCRをおこない, 18S rDNAおよびITS領域を得た。近リカ産, ドイツ産ともに真のクロレラ属[3]のC. vul-

隣結合 (NJ)法を用い, 18S rDNA, ITS2それぞれに基づ

garisグループのクレードに入った(ブーツストラップ

く系統樹を構築した。

100%)。このクレード内における遺伝的距離はわず
かで, グルーピングや分岐順などを推測するのが困難[結果と考察] 共生藻株からDNA増幅をおこなったであるため, 真のクロレラ属の系統解析に最適な分子

アメリカ産Syngen 2-3ではITS2領域内にわずかな多型種として提示された[1] ITS2を用いた系統樹を構築しが見られた。これはゲノム中にリボゾーマルオペロ

た結果, 日本－中国－アメリカ産とドイツ産共生藻のンが複数存在するためと考えられ, 変化しやすいITS

系統が異なることをはっきり示すことができた。こ領域におけるこのような細胞内多型はこれまでも多

れはミドリゾウリムシの形成, すなわち藻類を細胞内Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)

85に共生させるといった進化上のイベントが複数回[文献]あったことを示すものと考えられる。ITS2では 他[1] Hoshina, R., Kamako, S-i. and Imamura, N. (2004)

Chlorella属藻類との関係や分岐順を示すには至っていない。これはITS2の変異が大きすぎるためで, すな
わち, 18S rDNAよりも変異が早くITS2よりも遅い分

Plant Biol., 6: 447-453.
[2] Hoshina, R., Kamako, S-i. and Imamura, N. (2004)
AIP Conf. Proc., 716: 203-206.

子種の選択, およびより多くの共生藻やChlorella属藻[3] Huss, V. A. R., Frank, C., Hartmann, E. C., Hirmer,

類を加えて解析をおこなうことが今後の課題であM., Kloboucek, A., Seidel, B. M., Wenzeler, P., andる。

Kessler, E. (1999) J. Phycol., 35: 587-598.

ミドリゾウリムシの共生クロレラ再感染にクロレラの培養期間が及ぼす影響について
後藤宗範，渡辺 彊（東北大・生命科学・生命機能）

Influence of cultivation period of symbiotic Chlorella on reinfection in
Paramecium bursaria
Munenori GOTO and Tsuyoshi WATANABE(Dept. Dev. Biol&Neuro. Sci., Biol. Inst. Tohoku Univ.)
SUMMARY
Symbiotic algae-free Paramecium bursaria can be re-infected with isolated algae through ingestion via cytopharynx.
It is believed that cell cycle of algae play some roles in the host-algae recognition. In the present work, we re-examined
whether cell cycle and culture age of algae affect on the re-infection phenomena of P. bursaria. We cultivated algae for 2
weeks under 16h light (L)-8h dark (D) condition and obtained semi-synchronized algae (CA1). In 6 weeks culture under
the same condition, however, growth of algae was asynchronous (CA2). When CA1 and CA2 algae were ingested byaposymbiotic paramecia, rate of algae-retaining paramecia and number of retaining algae per paramecia was significantly
much when determined at 12 and 24 hours after infection. This suggests that the culture age influence on the reestablishment of paramecia-algae relationship. When algae of CA1 and CA2 were prepared at the start and the end of Lperiod and ingested in paramecia, infection rate was not significantly different, indicating that reassociation of algae toparamecia was not influenced by cell cycle of algae.

[目的] ミドリゾウリムシParamecium bursariaは通殖し、やがてもとの共生関係を構築する（共生藻の常、細胞内に数百個の共生藻（クロレラの一種）を再感染）。

持って生活している（緑色細胞）。この共生藻は実再感染の際、共生藻はまず通常のエサと同じよう

験室内で種々の手法で取り除くことができ、共生藻にゾウリムシの食胞に数個取り込まれた後、取り込を取り除かれた細胞（白色細胞）は通常時と同じよまれた共生藻の一部が宿主の消化過程を免れて一つうに培養することができる。白色細胞に外部から共一 つ 宿 主 由 来 の 単 層 膜（perialgal vacuole）に 包 ま生藻を加えるとこれを細胞口経由で取り込み、取りれ、やがて増殖し元の共生関係を構築されると考え込まれた共生藻の一部は宿主の消化過程を免れて増られているが、このときにゾウリムシが食胞内の共86

原生動物学雑誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年

生藻を餌と区別する機構や、共生藻の一部のみが生

加、細胞の体積の変動に周期性が認められ、細胞周き残ることができる理由などはほとんど明らかに期が同調していることが確認された。しかし6週間後なっていない。クロレラの種によって再感染能力を

では細胞数の増加、細胞の体積の変動とも2週間後の持つものと持たないものがおり、そこには細胞壁のものほどはっきりした周期性は認められなかった。

構成成分の違いが存在することがわかっている(1,2)

また6週間後の共生藻の方が2週間後のものより全体が決定的な要因とは結論付けられていない。

的に細胞が大きかった。そこで培養後2週間の共生藻

緑色細胞内の共生藻は宿主から取り出し培養する（CA1）と6週間の共生藻（CA2）を用い再感染実験

ことができる。また単離培養した共生藻を白色細胞を行ったところ、CA1の方がとり込み後消化されずに再感染させることもできる。共生藻はクロレラのに残る数、最終的に感染が成立するゾウリムシの割一種と考えられているが、クロレラを明暗サイクル

合がともに多かった。この結果から、培養期間の短条件下で培養するとその細胞周期が同調すること、い共生藻の方が白色細胞への感染能力が高いことがまたクロレラの細胞周期において細胞壁の構成成分示された。またCA1を用いた再感染実験では、明期が量的に変化することが知られている(3)。そこで開始直後の共生藻、明期終了直前の共生藻共に白色

我々は緑色細胞から取り出した共生藻を明暗サイク細胞に対して高い感染率を示した。明期開始直後にル下で培養し細胞周期を同調させ、それぞれの時期

行った実験で再感染実験後12時間から24時間の間にの共生藻を再感染させた際の違いを見ることを目的

ゾウリムシ1細胞あたりの共生藻数が増加したのに対として実験を行った。

し、明期終了直前に行った実験では12時間から24時間のあいだで共生藻数の増加は見られなかった。両[材料と方法] Paramecium bursariaのGr3を共生藻供実験で24時間後にゾウリムシ1細胞あたりに含まれる

与株、Miw2-1wを共生藻受容株とした。Gr3の細胞を共生藻数の数に統計的有意差は見られなかった。以SDSで溶解し共生藻を単離後、まずCA培地を含む

前、クロレラは分裂直後の娘細胞の方が感染しやす2％（w/v）寒 天 培 地 上 で 培 養 し た。数 週 間 後 コ ロ

いという結果が報告されているが(4)、今回の結果はニーを拾って別の培地に蒔き、これを4回繰り返し共生藻の細胞周期が感染率に直接的な影響を与えなた。得られた共生藻を液体CA培地に移し、16h/8hのいことを示唆している。

明暗サイクル下で培養した。2～3週間ごとに一部を別の液体培地に移し培養を行った。
培養を開始してから2週間後と6週間後における共生藻の1日の細胞数、細胞の大きさの変化を調べた。
さらにそれぞれの時期の共生藻をMiw2-1w株に与え、取り込んだ共生藻の生き残りの様子、再感染率の違いを調べた。

[文献]
1. Takeda,H. (1995) Phytochemistry 40:457-459
2. Takeda,H., Sekiguchi,T., Nunokawa,S. and Usuki,I.
(1998) Europ. J. Protistol. 34:133-137
3. Takeda,H. and Hirokawa,T. (1978) Plant & Cell
Physiol. 19:591-598
4. Reisser,W.,[結果と考察] 液体CA培地を用いて培養した共生藻
は、培地に移してから2週間後の段階では細胞数の増Radunz,A.

Cytobios. 33: 39-50

andWiessner,W.

(1982)

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)87

ミドリゾウリムシの共生クロレラが宿主食胞から脱出するしくみについて
児玉有紀，藤島政博 （山口大・院理工・生物科学）

The mechanism of escape of symbiotic Chlorella sp. from the hostParamecium digestive vacuoles
Yuuki KODAMA and Masahiro FUJISHIMA(Biol. Inst., Grad. Sch. of Sci. and Engeneering, Yamaguchi Univ.)
SUMMARY
In Paramecium bursaria, each symbiotic alga is enclosed in a perialgal vacuole derived from the host digestive vacuole (DV), which protects the alga from lysosomal fusion. Algae-free cells can be easily reinfected with algae isolated
from algae-bearing cells by ingestion into DVs. By pulse label for 1.5 min and chase, we showed that an alga can successfully escape from the host's DV after acidosomal and lysosomal fusion with the vacuole has occurred, in order toproduce endosymbiosis. When symbiotic Chlorella sp. isolated from P. bursaria were ingested into the DVs, each algal
cell was pinched off into the cytoplasm and enclosed within the DV membrane, irrespective of whether the ingested cells
were living or had been killed by boiling. However, this phenomenon was not observed when labeled yeast S. cerevisiae,
India ink or latex spheres were ingested into the DVs. This suggests that a contact between the DV membrane of P. bursaria and the cell walls of the algae may participate in this phenomenon. Effects of various temperatures, pHs, and enzymes on abilities for escaping from the DV and for maintenance in the alga-free cell was examined.

[目的] ミドリゾウリムシはParamecium属の中では唯一クロレラ (Chlorella sp.) を細胞内共生させる能力を持っている。シンビオティック細胞から共生藻を単調べた。
さらに、共生藻が持つこの能力に対する糖分解酵
素、蛋白質分解酵素、熱、pHの影響を調べた。

離し、予め共生藻を除去したアポシンビオティック細胞と混合すると、クロレラは食胞を経由して宿主[材料と方法] 共生藻を持たないアポシンビオティッ

ライソソームが融合しないPV膜に包まれて再感染す

ク細胞 (OS1w) に、墨汁やSaccharomyces cerevisiaeやることができる。このようにミドリゾウリムシとク

ラテックスビーズ、共生藻を一定条件で与え、1.5分

ロレラは動物細胞と藻類との細胞内共生の感染初期間のパルスラベル後に手回し遠心機または直径15mm

過程で何が行われるのかを解明するのに適した材料のナイロンメッシュで洗浄し、外液に残ったこれらであるが、どのようにしてクロレラが消化を免れてを除去した。その後、細胞を数時間毎に4% (w/v) パ

細胞内共生を開始するのかについてはほとんど分

ラホルムアルデヒドで固定し、宿主食胞から細胞質

かっていない。そこで、我々は宿主食胞に取り込まへの脱出が起きるかを観察した。また、ゾウリムシ

れるクロレラの数と時間を制限し、その運命を追跡(P. caudatum) においても、パルスラベルを3分間行するパルスラベルとチェイスの方法によって、細胞い、その後同様の方法で食胞の観察を行った。

内共生に成功した共生藻の大部分が、ライソソーム

さらに、シンビオティック細胞 (OS1g株) から共生

融合後の食胞から食胞膜の細胞質側へのくびれに藻を単離し、各種酵素 (α-マンノシダーゼ [220 µg/ml,

よって細胞質に脱出した緑色のクロレラであること

30°C]、β-ガラクトシダーゼ [220 µg/ml, 30°C]、 β-グを明らかにした (Kodama and Fujishima, Protoplasma,

ルコシダーゼ [230 µg/ml, 30°C]、プロテナーゼK [32005, in press)。

mg/ml, 30°C]、リティケース [1.5 mg/ml, 25°C]、リ

この研究では、どのようにして共生藻が宿主細胞パーゼPN [3 mg/ml, 30°C]で1または6 h処理)、各種

質に脱出するかを調べるために、ボイルした共生

熱、各種pHで処理した後、ドリル氏液で洗浄し、上藻、墨汁、ラテックスビーズ、S. cerevisiaeを与えた記の方法と同様にアポシンビオティック細胞に与時の食胞でもこのような現象が見られるかについて

え、これらの処理が宿主食胞からの脱出及び感染率

原生動物学雑誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年

88に与える影響を調べた。

らないものを識別する能力があると考えられた。

[結果と考察] ミドリゾウリムシに墨汁、ラテックスの探索のため、シンビオティック細胞 (OS1g株) からさらに共生藻が持つ食胞からの脱出に関わる物質
ビーズ、ボイルした酵母菌を与えた場合には宿主食単離した共生藻を各種酵素、熱、pHで処理したとき胞からの脱出は見られなかったが、10分間ボイルしの影響を調べた。その結果、コントロールの無処理た共生藻や生きた酵母菌には食胞脱出能力が存在しと比較してα-マンノシダーゼで6時間処理した場合約た。Suzaki et al. (2003) は、酵母菌をアポシンビオ

15%、β-グルコシダーゼで6時間処理した場合約30%

ティック細胞に与えると１週間から10日程度宿主細感染率が低下することが明らかになった。プロテ胞質に維持されたと報告している。このことは、10ナーゼKやリパーゼPNで処理した場合は感染率の低分間熱処理した共生藻や生きた酵母菌に存在する物

下が見られなかったので、Reisser et al. (1982)と同様質が、食胞からの脱出と細胞内共生の成立に必要でに細胞壁表面の糖が細胞内共生成立のために必要であることを示している。

ある可能性が示唆された。

また、ミドリゾウリムシに墨汁やラテックスビー
ズを与えた場合は24時間以内に全てが排泄されるの[文献]に対して、ボイルした共生藻や酵母菌を与えた場合

1) Kodama, Y. and Fujishima, M. Protoplasma (in press).

は72時間後までは宿主細胞質に残っており、96時間

2) Reisser, W., Radunz, A. and Wiessner, W. (1982)

後に全てが消化または排出された。また、同様の現象がゾウリムシにおいても観察されたことから、ミドリゾウリムシとゾウリムシには餌になるものとな

Cytobios 33, 39-50.
3) Suzaki, T., Omura, G. and Görtz, H-D. (2003) Jpn. J.
Protozool. 36(1), 17-18.

クロレラ、大腸菌、テトラヒメナから成るマイクロコズムにおける
クロレラ-テトラヒメナの細胞内共生関係の形成過程
佐野明子1，松岡秀哲2，中島敏幸2 （1愛媛大・院理工，2愛媛大・理）

Ecological process of producing endosymbiotic relation between Chlorella vulgaris
and Tetrahymena thermophila in microcosm composed of C. vulgaris, E. coli, andT. thermophila
Akiko SANO1, Hideaki MATSUOKA2, Toshiyuki NAKAJIMA2(1Grad. Sch. Sci.and Eng. Ehime Univ., 2Fac. Sci., Ehime Univ.)
SUMMARY
A microcosm composed of three species, including algae (Chlorella vulgaris), bacteria (Escherichia coli), and protozoa (Tetrahymena thermophila, containing two different mating type), was fabricated to investigate an ecological process
producing the evolution of endosymbiotic relation between algal and protozoan cells. The microcosm, containing 250 ml
culture medium in a glass-bottle, was cultured over 1,200 days under 12h-light/12h-dark condition at 30°C. T. thermophila cells containing algal cells within the vacuoles (TC cells, hereafter) were observed from the beginning of microcosm culture, whose frequency was maintained around 50% in the T. thermophila population until about 100th day.
However, the TC cells increased in the frequency in the population, which reached about 90% until about 260th day, andmaintained the frequency during the experimental period. Measurements of dynamical changes in other components ofJpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)89

the microcosm revealed that photosynthetic activity of the algal population began to decline after 60th day, and bacterial
activity of decomposing the detritus of dead cells began to increase after that. These indicate that the concentration ofDO (dissolved oxygen) in the microcosm decreased at the late phase of the microcosm culture. These results and otherdata suggest the possibility that TC cells increased in frequency due to an adaptive advantage of obtaining oxygen fromintracellular algae in a low DO environment.

[目的] 細胞内共生は生物が環境に適応し進化してい1)日以降は死細胞数が生細胞数を上回った状態で安定くための有力な手段であると考えられている 。しかした。大腸菌の生菌数は培養開始後約100日目まではし、異種の生物同士が出会い、細胞内共生という密低密度だった が、その後大幅に増加し約200日目以

接な関係を築き上げるまでの生態学的な過程は未だ

降は高密度で安定した。以上の結果から、約200 日

解明されていない。自然生態系において、生物が長目以降は、クロレラの生細胞数が減少し死細胞数がい世代をかけて進化する過程を追跡することは現実増加したことによって、クロレラの光合成量が減少的に不可能だが、世代時間の短い微生物が構成する

し酸素の供給量が低下したと考えられる。また大腸

実験群集を用いることにより有効な実験モデルを構菌の増殖活性が増大したことによって、大腸菌の呼築することができる2)。本研究では、クロレラ、大腸

吸量が増加し酸素の消費量が増加したと考えられ菌、テトラヒメナから成るCETマイクロコズムを作る。このことから、約200日目以降のマイクロコズム

成し約1200日以上にわたって培養したところ、細胞内の溶存酸素濃度は低濃度であったと考えられる。

内にクロレラを取り込みこれを生きたまま保持した約200日目以降にC-テトラの割合が増加したことにつテトラヒメナ（以下、C-テトラ）の出現が確認されいて、C-テトラが細胞内のクロレラから酸素の供給た。このマイクロコズムを細胞内共生関係の成立すを得ることができ、貧酸素下においてN-テトラよりる初期過程を解析するための実験モデルとして用も適応的に有利であったため増加した可能性が考え

い、細胞内共生の成立に影響を及ぼす生態学的要因られる。そこで、クロレラの光合成活性がC-テトラの解明を試みた。

の割合に及ぼす影響を調べるために、培養開始後449[材料と方法] クロレラ(Chlorella vulgaris), 大腸菌

た。その結果、C-テトラの割合は約20%減少した。

日目のCETマイクロコズムを24時間光照射下に移し(F-)), テ ト ラ ヒ メ ナ

クロレラの生細胞数は約3倍に増加したことから、ク(Tetrahymena thermophila CU427 (mating type Ⅶ)、

ロレラの光合成量が増加しマイクロコズム内の溶存

CU438 (mating type Ⅳ))の3種を無機塩培地に接種し、酸素濃度が上昇したと考えられる。これによって、

温度30°C、照度3000 lux（明12 h、暗12 h）の条件で貧酸素条件におけるN-テトラ対するC-テトラの有利(Escherichia

coli

ME7767静置培養した。この系（CETマイクロコズム）にお性がなくなりC-テトラの割合が減少した可能性が考いて、特にクロレラフリーの正常テトラヒメナ （以えられる。また、溶存酸素濃度が充分（もしくは高下、N-テトラ）とC-テトラの挙動及びその他の構成濃度）である時に細胞内にクロレラをもつことがテ

個体群の動態との関係を解析 した。

トラヒメナにとってコストになっている可能性も考えられる。また、培養開始後462日目のCETマイクロ[結果と考察] CETマイクロコズムの培養開始後1日

コズムを新たな無機塩培地に植え継ぐと、C-テトラ目にはすでにC-テトラの出現が確認された。テトラは培養初期から約80%の割合で出現した。このこと

ヒメナ個体群中のC-テトラの割合は、培養日数が約は、長期間培養したことによってテトラヒメナがク

100日目までは50％を中心に変動した。その後C-テト

ロレラをより保持しやすい形質を獲得した可能性 をラの割合は増加し、約200日目以降は約85%の高い割示唆している。以上の結果から、細胞内共生体の初合で安定した。また、テトラヒメナの全個体数は培期の出現に関しては摂食時にエサと共に共生者を取養開始後約100日目まで増加したが、その後やや減少

りこんだことがきっかけであると考えられるが、共し約200日以降は定常状態を保った。一方、他の構成

生体の割合が増加するメカニズムについては生態系

種は以下の挙動を示した。培養液中のクロレラの生の生物群集動態や物質循環と密接な関係があること

細胞数は培養開始後約60日目まで増加したが、そのが示唆された。また、共生者保持率の増大や共生体

後死細胞数の増加に伴って生細胞数が減少し、約200の適応度の増大などの進化的な要因が深く関係して

原生動物学雑誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年

90いる可能性が示唆された。

University of California Press
2) 中島敏幸、稲森悠平、遠藤銀朗、川端善一郎、栗[文献]

原康. (1998) Microbes and Environments. Vol. 13,

1) Lynn Margulis & Dorion Sagan. (1997) MICROCSMS.

No.4 : 217-233

核内共生細菌ホロスポラオブツサの先端領域特異的モノクローナル抗体とゾウリムシアクチン特異的モノクローナル抗体によるホロスポラオブツサ感染過程の解析
岩谷綱一1，仲 慶晃1，中村欽光1，道羅英夫2，堀 学1，B. Franz LANG3，Gertraud
BURGER3，藤島政博1 （1山口大・理・生物，2静岡大・遺伝子実験施設，3Universitéde Montréal, Départment de Biochimie, Canadian Institute for Advanced Research）

Investigation of Infection Process of Holospora obtusa with Monoclonal Antibodies
Specific for Special Tip of the Bacterium and for Actin of the Host
Paramecium caudatum
Koichi IWATANI1, Yoshiaki NAKA1, Yoshimitsu NAKAMURA1, Hideo DOHRA2, Manabu HORI1,
B. Franz LANG3, Gertraud BURGER3, Masahiro FUJISHIMA1(1Biol. Inst., Fac. Sci., Yamaguchi Univ. 2Insti. Genet. Res. & Biotech., Shizuoka Univ. 3Université deMontréal, Départment de Biochimie, Canadian Institute for Advanced Research)
SUMMARY
The endosymbiotic bacterium Holospora obtusa infects the macronucleus of the ciliate Paramacium caudatum. This
bacterium enters into the target nucleus with a tip of the periplasmic region first, but never with the other tip, suggestingthat this special tip may have an important function for infection. In order to clarify the substances in the special tip, amonoclonal antibody against the tip was developed, and the antigen of 89k was purified from 2D-SDS-PAGE gel of thebacteria. After determination of the partial amino acid sequence of the 89k protein, a gene coding the protein was cloned
from the bacterial genome using oligonucleotides against the amino acid sequence of 89k protein as proves. The ORF of
the protein encoded 750 amino acids and possessed two actin-binding motifs at the N-terminal. Indirect immunofluorescence microscopy with an anti-P. caudatum actin antibody and anti-89 k antibody labeled the bacteria escaped from thehost digestive vacuoles into the cytoplasm. The anti-89k antibody also labeled several dots on the macronuclear envelope
if the nuclei were infected with the bacteria. Transmission electron microscopy showed fibrous materials around the tip
in infection. Correlation between the 89k protein and the host actin was discussed.

[目的] ゾウリムシの大核内共生細菌ホロスポラオブ

特殊な末端領域(Tip)が観察される。感染型はTipを先ツサ(オブツサ)の感染型は細胞質領域とペリプラズ

頭にして大核に感染するため、Tipが感染で重要な役

ム領域で二分された細胞であり、透過型電子顕微鏡

割を演じていると予測される。一方、リステリア等(TEM)でペリプラズム領域の先端に電子密度の低いの細胞内寄生細菌はアクチンテールを誘導して宿主

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)91

細胞質内を移動する。宿主細胞質のオブツサ周囲に在する可能性が示され、相同性検索では細胞骨格関も同様な構造が報告されているが、アクチンの存在

連蛋白質が20%前後の相同性を示し、N末端に2箇所は証明されていない。我々は、感染過程でのTipと宿のアクチン結合モチーフの可能性が示唆された。ゾ

主アクチンの関与を明らかにするため、特殊な末端ウリムシに感染した全オブツサの89k反応部位は間接特異的モノクローナル抗体(抗89k)とゾウリムシアク

蛍光抗体法で次ぎの4つに分類できた。：(A)Tip、(B)

チン特異的モノクローナル抗体(抗PA)を作成し、間Tipとペリプラズム領域、(C)ペリプラズム領域のTip

接蛍光抗体法とTEMで感染過程を調べ、特殊な末端に近い部分、および(D)ペリプラズム領域中央部から物質の遺伝子をクローニングし機能を推測した。

細胞質領域に近い部分。A、B、CおよびDは、感染
15 分 に は 7.5、8.4、1.4 お よ び 0.1%、感 染 30 分 に は[材料と方法] Tipには60-90kDaの物質の存在が明ら

4.3、8.0、2.0および1.0%、感染60分には3.5、5.2、4.7

かにされていた為(福井ら、未発表)、感染型のSDS-

お よ び 1.7%、感 染 24 時 間 に は 0.1、0.2、0.0 お よ び

PAGEの60-90kDaのゲル抽出物を抗89kの抗原とし0.1%であった。89kは感染中に一部の菌体でTipに表て、抗PAはマウスアクチンと相同性の低い部分の11

出され、感染後の時間と共に細胞質領域側に移動す

アミノ酸にBSAを結合させた合成ペプチドを抗原とると考えられた。大核侵入中のオブツサでは、感染して、それぞれモノクローナル抗体産生ハイブリ

15、30および60分でそれぞれ71、65および46%が89k

ドーマを作成した。Tip抗原(89k)は、抗89kで、特定の蛍光を大核膜との接点付近に現わした。従って、した感染型の二次元電気泳動ゲル上の抗原スポット

89kは大核侵入中の菌体と大核膜との接点付近に表出をゲル抽出して部分アミノ酸配列を決定して塩基配し、菌体の大核内侵入に従い菌体の後方に移動する列を推定した。この塩基配列から設計したプライと考えられた。TEMでは、食胞脱出時のオブツサにマーで89k遺伝子の一部をゲノムDNAからPCRで増幅

は、食胞周囲に一部ゾウリムシアクチン陽性の雲状し、89kの全アミノ酸配列を推定し、相同性検索し構造が見られ、Tipでは菌体から直接、繊維状構造がた。感染過程の89kの動態は、オブツサを感染させた形成されていた。大核侵入時にもTipに繊維状構造がゾウリムシを一定時間後にNP-40で処理し、固定して見られたが、雲状構造は見られなかった。繊維状構一次抗体の抗89k、二次抗体の蛍光標識抗マウスIgG

造は直径約10nmであったことから、アクチン繊維かで処理後、観察した。大核侵入時の89kの動態は、感中間径繊維と考えられた。以上の結果から、89kは、染後のゾウリムシを、一定時間後に固定し、ホモジオブツサが宿主に取り込まれてから菌体表面に表出

ナイズして大核を露出させ、同様に処理して観察しし、アクチン結合モチーフでアクチン繊維の形成にた。また、感染後のゾウリムシを、抗PAでpre-stain

関与し、菌体が大核内に侵入する際には大核膜とのする場合はメタノール固定後、金コロイド標識抗マ

接点に位置して菌体を核内に移動させるのではない

ウスIgAIgMIgGを二次抗体として使用し、一般染色かと考えられた。

の場合はアルデヒド混液と1%オスミウム酸で二重固
定し、いずれもスパー樹脂に包埋し、薄切後、TEM[文献]で観察した。

1) Fujishima, M. & Fujita, M. (1985) J. Cell Sci., 76: 179-

[結果と考察] 89k遺伝子は2253 bp、GT含量は32.5%

2) Görtz, H. D. & Wiemann, M. (1989) Europ. J. Pro-187.
であり、細胞内共生細菌や寄生細菌に共通するAT
richであった。89kは、動物と植物細胞中では核に存

tistol., 24:101-109.
3) Gouin, G., et al., (1999) J. Cell Sci., 112:1697-1708.

原生動物学雑誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年

92

小核特異的共生細菌 Holospora elegans は、宿主 Paramecium caudatum のストレス応答遺伝子の発現を不可逆的に促進する
堀 学，藤井貴美子，藤島政博（山口大・理・生物科学）

Micronucleus-specific bacterium Holospora elegans enhances stress gene
expressions of the host Paramecium caudatum ireversively
Manabu HORI, Kimiko FUJII and Masahiro FUJISHIMA(Dept. of Biosci., Fac. of Sci., Yamaguchi Univ.)
SUMMARY
The bacterium Holospora elegans is a micronuclear-specific symbiont of the ciliate Paramecium caudatum. H.
elegans-bearing paramecia could survive well compared with Holospora-free paramecia under the heat shock condition.
And symbiont-bearing paramecia expressed high levels of hsp60 and hsp70 mRNA even at 25°C. To determine whether
infection with H. elegans confers heat shock resistance on its host, we had prepared aposymbiotic paramecia that removed the symbiont with penicillin. However, aposymbiotic paramecia could survive at 37°C and also express highlevels of hsp60 and hsp70 mRNA at 25°C. Furthermore, in order to determine whether unknown substance originatedfrom H. elegans is in a micronucleus, we had established amicronucleate cell that removed a micronucleus from aposymbiotic cell by microsurgery. Surprisingly, amicronucleate cells still expressed high levels of hsp60 and hsp70 mRNA as
same as aposymbiotic cells. These results suggest that the host Paramecium was made to transform the heat-tolerance
ireversivly by H. elegans.

[背景] 大核特異的共生細菌Holospora obtusaを維持[結果と考察] 大核特異的共生細菌H. obtusa、及び、しているゾウリムシは、維持していないゾウリムシ

小核特異的共生細菌H. elagansとH. undulataを用いに比べて、様々なストレスに対して耐性を示すことて、共生細菌を維持したゾウリムシと維持しないゾがわかっている。又、共生細菌を維持しているゾウ

ウリムシ、共生細菌をペニシリンによって除去した

リムシでは、ストレス応答タンパク質であるhsp60やゾウリムシの熱抵抗性を比較した。その結果、小核

hsp70遺伝子が、過剰に発現していることから、スト

特異的共生細菌のどちらを維持していたゾウリムシ

レス耐性との因果関係が示唆される。更に、人為的も、薬剤で共生細菌を除去した後でも、共生細菌を感染実験から、hsp60, 70遺伝子の過剰発現は、共生維持しているゾウリムシと維持していないゾウリム

細菌の感染直後から起こり、共生細菌の除去によっ

シの中間くらいの熱抵抗性を示すことがわかった。

て、正常のレベルに戻る可逆的な変化であることもわかっている。

更に、前述の3つの状態にあるゾウリムシのストレス 応 答 遺 伝 子 (hsp60, hsp70) の 発 現 量 に つ い て、

ところが最近、我々は、小核特異的な共生細菌でCompetitive PCRによって調べたところ、熱抵抗性のあるH. elegansをペニシリンによって除去したゾウリ

結果を裏付けるように、小核特異的共生細菌を薬剤ムシにも、共生細菌を維持しているゾウリムシと同で除去したゾウリムシでも、宿主のhsp60, 70遺伝子様の熱抵抗性が維持されていることを見つけた。こが、高発現していた。この結果は、小核特異的共生のことは、H. elegansが、小核内で宿主ゾウリムシの細菌由来、或いは、細菌が小核に感染したことに形質を変化させるだけでなく、共生細菌が存在しな

よって、何らかの因子が宿主のストレス応答遺伝子

くなっても、その影響が維持され続けること（形質の発現に不可逆的な変化を引き起こしたことを示唆

転換）を意味している。

している。

そこで、我々は、この形質転換の仕組みを調べることを目的に本研究を行っている。

そこで、宿主の遺伝子発現を促進している因子
が、小核に存在しているのかどうかを確かめるために、薬剤でH. elegansを除去したゾウリムシの小核をJpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)

93

一部の大核核質とともに除去した。その結果、得ら以上の結果から、小核特異的共生細菌にのみ見られた無小核の細胞は、熱抵抗性も、hsp60, 70遺伝子

れる、一度、共生細菌が感染したゾウリムシでは、の過剰発現も、小核を除去する前のゾウリムシと差不可逆的にストレス応答遺伝子の過剰発現し続ける異が認められなかった。このことは、小核特異的共という現象は、以下のような仮説が考えられる。小生細菌が感染すると、宿主大核に作用し、大核の遺核から共生細菌のゲノム DNA、或いは、その断片

伝子発現調節系を改変してしまうということを示唆が、何らかの経路で大核に移行し、テロメアが付加している。

されて維持されている。しかし、この DNA は、ゾウ

では、何が、宿主の遺伝子発現を不可逆的に促進

リムシにとっては、異物であるため、ストレス応答

しているのかを調べるために、H. elegans の感染してが誘導され続けている。そして、その結果、過剰ないる小核核質と H. elegans のゲノム DNA を共生細菌

ストレス応答遺伝子群が、様々なストレスに対しを維持していないゾウリムシの大核に注射して、そて、素早く対応できたために、ストレス耐性としての影響を調べた。その結果、小核核質を注射したゾ検出されたのではないかと考えられる。

ウリムシでは、hsp60, 70遺伝子の発現に大きな変化はなかったが、H. elegans のゲノム DNA を注射した[文献]

ゾウリムシでは、hsp60, 70の遺伝子発現量に増加がHori, M. and Fujishima, M. (2003) J. Eukaryot. Micro-見られた。

biol., Vol. 50, No. 4, pp. 293–298.

繊毛虫ブレファリズマの II 型細胞で接合誘導時に発現する遺伝子の単離田中悠里1，杉浦真由美2，春本晃江2（1奈良女子大・院・生物科学，2奈良女子大・院・共生自然科学）

Cloning of the genes specifically expressed during the induction of conjugation inmating type II cells of Blepharisma japonicum
Yuri TANAKA1, Mayumi SUGIURA2 and Terue HARUMOTO2 (1Division of Biological Science,
Guraduate School of Human Culture, Nara Women's University, 2Department of Biological Scienceand Enviroment, Graduate School of Human Culture, Nara Women's University)
SUMMARY
Conjugation of Blepharisma japonicum is induced by interaction between complementary mating-type cells I and II.
Both mating-type cells which received complementary gamones undergo morphological changes and start to unite. It wasreported that protein synthesis drastically increased during this time, and this protein synthesis was indispensable for theformation of conjugating pairs. However, it is still unknown the genes expressed specifically in the induction of conjugation. To identify genes involved in these processes, we isolated genes expressed specifically in conjugation-induced type
II cells by a cDNA subtraction method. To induce mating-pairs, we treated type II cells for 4 hours with cell-free fluid oftype I cells containing gamone 1, then purified polyA+RNA. PolyA+RNA was subjected to cDNA synthesis, and thecDNA was subtracted between such treated cells and untreated cells.We have done subtraction twice and obtained 8
products. We sequenced some of them. Homology search revealed that the two of these fragments showed significant
homology to CDK family (Cdc2 and Cdk2). Northern hybridization demonstrated that the transcription occurred specifically during the induction of conjugation. We also found that the transcript already appeared 2 hours after gamone 1
treatment.

94

原生動物学雑誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年[目的] 繊毛虫ブレファリズマの接合は、適度な飢餓

Driverの両細胞からtotal RNAを抽出してノーザンハ

状態におかれたI型細胞が分泌するガモン１によってイブリダイゼーションを行った。また、ガモン1を含開始される。このガモン１を受け取ったII型細胞でむ細胞外液で未処理、2時間処理、4時間処理を行っは、ガモン2の合成と分泌、細胞形態の変化、細胞間た各細胞のtotal RNAを抽出してノーザンハイブリダの接着といった現象が引き起こされる。この時新たイゼーションを行い、遺伝子の発現パターンの検出なタンパク質の合成が開始され、このタンパク質合を試みた。

成が接合対の形成に不可欠であることがすでに報告されている 1),2)。しかし、どのような遺伝子が発現[結果と考察] 2回のサブトラクションの結果、8つのし、接合誘導機構とどのように関連しているのかに

遺伝子断片を得た（Product A, B, C, D, E, F, G, H）。

ついてはまだ情報が得られていない。
接合の引き金因子であるガモン１の刺激により、II型細胞内で活性化され細胞を接合に導く遺伝子の同

それらの断片のうち5つ（A, B, C, F, H）のシークエンスを行い、以下の結果が得られた。
Product A（432 bp）は、様々な生物のCDKファミ

定が、接合誘導機構を解明する上で重要であると考リー（Cdc2, Cdk2）との相同性が示された。Product

え、本研究ではcDNAサブトラクション法を用いて、B（249 bp）は、Product Aの配列の一部と完全に一致

ブレファリズマのII型細胞がガモン1による接合誘導した。Product C （140 bp）は、大部分に3塩基の繰り時に特異的に発現する遺伝子の単離を行った。ま

返し配列が存在し、相同性のある遺伝子は見つからた、ノーザンハイブリダイゼーション法を用いて候なかった。Product F （564 bp）は、169アミノ酸残基

補遺伝子の発現の確認を行った。

のORFをもっていたが、相同性の高い遺伝子はみられ ず、新 規 の タ ン パ ク 質 で あ る と 示 唆 さ れ た。

[材料と方法] 細胞はBlepharisma japonicumのR48株

Product H のバンドには、芳香族アミノ酸の合成経路（接合型II型）を用いた。初期定常期の細胞を生理に関わる酵素として知られている４-hydroxyphenyl-

的塩類溶液であるSMB中に一晩置いて飢餓状態に

pyruvate dioxygenase (4-HPPD)と相同性のある配列

し、その後二つに分けた。一方にのみ、ガモン１の（258 bp）、そして部分的にCyclin dependent kinase

含まれるI型細胞の細胞外液（103 U/ml）を加えて接regulatory subunit (Cks) と 相 同 性 の あ る 配 列（227合を誘導させ、Testerとした。もう一方をDriverとしbp）の二つのPCR 産物が含まれていた。

て、SMB中でそのまま置き、4時間後それぞれの細胞を回収してpolyA+RNAを精製した。
PCR select cDNA subtraction kit（Clontech）を用い

ノーザンハイブリダイゼーションを用いた解析により、Product Aの転写産物が接合誘導時に特異的に発現していることが確認された。また、ガモン１処て サ ブ ト ラ ク シ ョ ン を 行 っ た。精 製 し た Tester と理をしてから2時間後にすでにこの遺伝子が転写されDriverそれぞれのpolyA+RNAから合成したcDNAを制ていることが示された。

限酵素（Rsa I）処理した後、TesterのcDNAを二つに今後、この遺伝子が接合誘導時にどのように関分け、それぞれに異なるアダプター配列をライゲーわっているのか、その機能を調べるとともに、他のションした。二段階のハイブリダイゼーション操作

候補遺伝子についてもノーザンハイブリダイゼー

により、Testerに特異的な配列同士が別々のアダプ

ションを行い発現を調べる必要がある。

ターを1つずつもつ2本鎖を形成すると期待されるので、この分子の末端を2本鎖に伸長し、PCRで両端に[文献]

別々のアダプターをもった分子だけを選択的に増幅

1) 春本晃江, 杉浦真由美（2003）ブレファリズマのした。得られたバンドを切り出してクローニング
し、シークエンスを行った。
サブトラクションによって得られた候補遺伝子の発現を確認するために、サブトラクションから得られ た 各 配 列 で 作 製 し た プ ロ ー ブ を 用 い、Tester と接合. 原生動物学雑誌, 36(2), 147-172.
2) Miyake, A. (1981) Cell Interaction by Gamones in
Blepharisma. Sexual Interactions in Eukaryotic Microbes, pp. 95-129.

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)95

ミトコンドリアプラスミドを使ったゾウリムシ形質転換系の開発
天野太郎1，矢崎和盛2，西川義尚1，月井雄二2 （1東海大・工，2法政大・自然科学センター）

Development of a transformation system with mitochondrial plasmids
for Paramecium caudatum
Taro AMANO1, Kazumori YAZAKI2, Yoshihisa NISHIKAWA1 and Yuuji TSUKII2(1Sch. of Eng., Tokai Univ., 2Sci. Res. Ctr., Hosei Univ.）
SUMMARY
Mitochondrial plasmids found in Paramecium caudatum in 1994 have been so far studied for their structure, but their
physiological functions are still unknown. To clarify this, we attempted to introduce isolated plasmid DNA into plasmidfree recipient cells. Cells were treated with ice-cold calcium chloride and the plasmid DNA. After the treatment, cells
were cultured for about three weeks, and then DNA was isolated from the cells to conduct PCR using primers constructed from known sequences of the plasmid (type Ia). As a result, plasmid-specific sequences were amplified from theisolated DNAs in 7/61 samples, indicating that plasmid DNA was introduced into the recipients. Furthermore, plasmidspecific sequences were detected in cells which were cultured for three months after the treatment, suggesting that imported plasmids can multiply within the recipient cells. Fractionation of the cells suggests that the imported plasmids arepresent in the cytoplasm (outside of mitochondria).

[目 的] 従 来 ミ ト コ ン ド リ ア プ ラ ス ミ ド（mt-p）

し、mt-p を検出するための分子マーカーとして利用

は、植物、菌類では報告されていたが、動物細胞とした。プラスミド導入後（1 ヶ月以内）、ミトコン

しては初めて繊毛虫ゾウリムシ（P. caudatum）で発ドリアから DNA を回収し、上記のプライマーでプラ見された。ゾウリムシの mt-p は、ミトコンドリア

スミドの有無を確認した。さらに PCR で陽性となっ

DNA と相同性が無く、プラスミドを持つ株と持たなた細胞群を 2 ～ 3 ヶ月培養した後、クローンを単離い株がいる。また、電子顕微鏡による解析やプラスした。

ミド type Ia での全塩基配列の決定などの様々な構造 （３）導入プラスミドの所在の確認：陽性のクローン解析が行われてきたが、これまでに生理学的機能はを、大量培養し、ミトコンドリア内とその他（ミト明らかにされていない。今回生理学的機能を明らか

コンドリア以外）の DNA に分け、DNA の確認、にすることを目的として、プラスミドを持たない株

PCR を行った。さらに単離した細胞を、月井の方法にプラスミドを導入する系の開発を試みた。

により、核（大、小核）の沈澱と混合物（核以外の細胞質）の各々から DNA を抽出し、PCR を行っ[材料と方法] （１）プラスミドの導入： donor にた。

は、ゾウリムシ mt-p の type Ia を持つ野生株 Sh42、
recipient には、プラスミドを持たない野生株 Cy 2 を[結果及び考察] （１）導入プラスミドの検出：塩化使用した。定常期の recipient の細胞を遠心し、集め

カルシウムと mt-p で処理し、細胞群を 2 ～ 3 週間培た細胞(0.5 ml) に、30 mM CaCl2 を約 2 ml 加えて 30養した後、細胞全体から抽出した DNA を鋳型とし

分 0℃で懸濁させた。再度遠心し、上澄みを捨て、て PCR を行ったところ 7/61 サンプルにおいて増幅がSh42 株から抽出した mt-p（1.0 ml、 約 0.16 ～ 0.21

確認できた。

µg）を加え、30 分 0℃で懸濁し、その後培養液を加 （２）導入プラスミドの増幅：（１）で PCR 陽性のえ、室温で 2 ～ 3 週間培養した。

細胞群から細胞を 3 ヶ月以上培養した後の細胞群か（２）導入プラスミドの検出：高橋ら（2001）が決定

ら 576 クローンを作成し、PCR を行った結果、4/576

したプラスミドの全塩基配列からプライマーを作成

陽性クローンを得た。

原生動物学雑誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年

96（３）プラスミドの所在：この導入体の何処に mt-p

また、mt-p の複製については、ミトコンドリアをが存在しているのかを確かめるため、ミトコンドリ

構成しているタンパク質はリボソ−ムで作られてから

アとその他（ミトコンドリア以外）の分画から DNA

ミトコンドリアに輸送される。この輸送過程においを抽出し、アガロース電気泳動したが、いずれの分て mt-p が、複製に必要なタンパク質を使っている可画からもプラスミドのバンドは確認できなかった。

能性が考えられる。今後は mt-p の複製過程および細しかし、PCR を行ったところ、その他（ミトコンド

胞内での動態を明らかにするとともに、mt-p 導入体

リア以外）の分画から抽出した DNA においてのみ増をスクリーニングする手法を開発して、mt-p をベク

幅が確認できた。次に、同じ細胞を核（大、小核）

ターとして利用する形質転換系を目指す。

とその他（核以外の細胞質）の各々から抽出した
DNA を鋳型として PCR を行ったところ、核分画か[文献]

らは増幅は起きず、その他（核以外の細胞質）の方

矢崎和盛 研究報告集 京都臨床医学総合研究所, p1-

からのみ増幅が確認された。これらのことから、導8 (2001)

入されたプラスミドは、核およびミトコンドリアいTsukii. Y. Eup. J. Protistol., 32, 165-169 (1996)

ずれでも無く、細胞質内で維持、複製されているこTsukii, Y., Endoh, H. and Yazaki, K. Jpn. J. Genet., 69,とが示唆される。

685-696 (1994)

繊毛虫 Tetrahymena thermophila における非ミトコンドリア
citrate synthase 遺伝子とその偽遺伝子の構造解析＜大核から小核への RNA を介した遺伝情報の逆流＞
向 敦史（金沢大学・院自然・生命科学）

A reverse flow of genetic information from the somatic Mac to germinal mic suggested by the presence of a processed pseudogene of a glyoxysomal citrate synthasegene in Tetrahymena thermophila
Atsushi MUKAI (Div. Life Sci., Grad. Sch. Natural Sci. and Technol., Kanazawa Univ.)
SUMMARY
Two glyoxysomal citrate synthase genes, a functional gene and a pseudogene, were identified in Tetrahymena thermophila. Phylogenetic analysis revealed that this gene was directly derived from bacteria such as green sulfur bacteria orproteobacteria via lateral gene transfer (LGT). On the other hand, the pseudogene was characterized by the loss of introns. The absence of the introns indicates a duplication from the functional counterpart via mRNA intermediate. The
discovery of a processed pseudogene suggests that genetic information reversely moves from the macronucleus to micronucleus mediated by reverse transcription. Because of the low fidelity of reverse transcriptase, this direction of geneflow may facilitate acceleration of the evolutionary rate of protein-coding genes in ciliates by accumulating mutations
into the micronuclear gene via homologous recombination.

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)

97[目的] クエン酸合成酵素(CS) はミトコンドリアのbootstrap 値で単系統であることが示された。しかTCA cycle において、acetyl-CoA とオキサロ酢酸からし、tgCS は、このクレードには含まれず、少数の真クエン酸を合成する酵素として働いている。一方、核生物のものとともに proteobacteria や green sulfur

菌類ではペルオキシソーム、植物ではグリオキシ

bacteria と高い bootstrap 値で単一クレードを形成しソームに存在する glyoxylate cycle においても、CS がた。さらに、Southern blot の結果から、近縁の繊毛虫働いていることも知られている。前回 Tetrahymenaには T. malaccensis を除き、この配列に相同性のある

thermophila から得られた CS 遺伝子(tgCS) の配列

ものが存在しないことが示唆された。これらのことは、すでに報告のあるミトコンドリアのものとは低から、tgCS 配列はバクテリアの遺伝子が遺伝子水平い相同性しか示さず、バクテリアの CS と高い相同伝播(LGT) によって移行してきたものと考えられ性を示した。このことから、この遺伝子はバクテリる。こ の LGT の 過 程 に つ い て(Recent LGT) とアから遺伝子水平伝播(LGT) によって獲得したもの(Ancient LGT and multiple loss) の２つのモデルをたてだと考えられる。今回、この tgCS 遺伝子や、その偽た。

遺伝子の解析を進め、T. thermophila の進化の過程を探ることを目的とした。

一方、inverse PCR によって、genomic の tgCS 配列
とともに、この遺伝子の pseudogene の部分配列が得ら れ た。配 列 解 析 を お こ な っ た 結 果、こ の[材料と方法] T. thermophila (CU813 and CU428) を用

pseudogene の配列から intron が除かれていることがいた。この株は P. J. Brouns (Cornell Univ.) から頂い判明した。このことから、この配列が processed pseu-

た。Sepasol-RNA super (Nakarai Tesque) により total

dogene であると考えられた。processed pseudogene は

RNA を 抽 出 し、3', 5' R'ACE RT-PCR を SMART

mRNA を介した逆転写によってできる cDNA が生殖

cDNA synthesis kit (Clonetch) を用い、遺伝子の cDNA

系列のゲノムに入り込むことで形成される。逆転写

全長を得た。また、inverse PCR によって、genomic

酵素の活性は、T. thermophila やスタイロニキア、ゾの配列と pseudo gene の部分配列を得た。系統樹の作

ウリムシにおいて、すでに報告がなされている。さ成は PHYLIP package の PROTPARS program (MP),らに、この processed pseudogene の存在により、T.

PROML program (ML) を 用い た。Bootstrap の 計 算

thermophila における大核から小核への遺伝情報の逆は、同 package の SEQBOOT program により計算し流が示唆される。

た。Southern blot analysis は EcoRI- 完 全 分 解 total

以前から、繊毛虫の遺伝子を用い系統樹を作成す

DNA を 10 mg 用 い、tgCS の 部 分 配 列 を[a-(32)P]ると系統関係を反映しない結果となることが度々報dTTP でラベルし Probe とし、low-stringency condition

告されており、繊毛虫の遺伝子の進化速度が大きい

で Hybridization を行った。Northern blot analysis におということが指摘されてきた。この進化速度が加速いても同 probe を用いた。

されるメカニズムの説明として、逆転写酵素と遺伝情報の逆流が関与しているというモデルが提唱され[結果と考察] 今回得られた cDNA 配列の全長から推ている。つまり processed pseudogene の存在は、この定されるアミノ酸配列を解析したところ、N 末端にモデルを支持する証拠と考えることができる。

peroxisome targeting signal (PTS-2) の配列がみつかった。このことから、この配列が glyoxylate cycle で働[文献]

くクエン酸合成酵素をコードしている遺伝子であると考えられ、tgCS と名付けた。また、この配列の系

Mukai, A. and Endoh, H. (2004) J Mol Evol., 58: 540-49.
Nugent, JM. and Palmer, JD. (1991) Cell., 66: 473-81.

統解析の結果、大多数の真核生物由来の配列は高い

Endoh, H. (1994) Jpn. J. Protozool., 27: 55.

原生動物学雑誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年

98

ゾウリムシのミニミニゲノムプロジェクト：
高度にパッケージされた大核 DNA 構造
木村直美（金沢大・院自然・生命科学）

Highly clustered gene organization in the Paramecium caudatum somatic
macronuclear genome
Naomi KIMURA (Department of Biology, Faculty of Science, Kanazawa University)
SUMMARY
Each cell of Paramecium caudatum has a somatic macronucleus and a germinal micronucleus. Ploidy of the macronucleus is approximately 3,400n (Soldo et al., 1981) and assure all gene expression. So far, only 25 genes in P. caudatum
have been registered in database (NCBI). To expect the overall structure of the P. caudatum somatic genome, I randomly cloned 6 fragments of the macronuclear DNA ranging from 6 to 10 kb, and sequenced totally ~50 kb. Sequence
analysis revealed at least 24 known and potential protein-coding genes, suggesting highly cluster gene organization.
Most of the the genes were arranged in the same direction beside one gene, and intergenic regions are short (42-1212 bp).
All of introns identified in this study are also short, as expected previously. This pilot genome analysis suggests that P.
caudatum retains the highest coding density (78%) on chromosomes among eukaryotes including P. tetraurelia (74%)
and budding yeast (70%). This clustered organization must be the result of adaptation for achieving an extremely highcopy number (3,400 copies) in the macronucleus.

[目的] 繊毛虫ゾウリムシは形態・機能共にことなる （AluI）で切断した約 300 bp の断片②トータル

2種類の核（大核と小核）を持っている。大核は、細DNA を制限酵素（BamHI, PstI）で切断した約 6-10胞の増殖や維持のための転写をおこなう特化した高kb の領域、この２つの DNA を回収し、ランダムに度倍数性の核で、各遺伝子が平均 3400 コピーあるとクローニングした。それぞれ（① 32 クローン1)

報告されている 。一方、小核は接合開始後まもなく②

6 クローン）の塩基配列を決定し、解析を行った。

減数分裂を行い、受精核形成を経て次の世代の新大核と新小核を形成する。古くから様々な研究に用い[結果と考察] ゾウリムシの大核ゲノム構造を明らかられているゾウリムシであるが、小核と大核のゲノにするために、DNA 塩基配列の解析を試みた。はじム構造は、ほとんど明らかになっていない。一方、めに、制限酵素（AluI）処理をおこなったトータル

ゾウリムシの近縁種であるヒメゾウリムシでは、大DNA をランダムにクローニングした。相同性検索

核ゲノムの74％ がコードされた領域（遺伝子領域）(GenomeNet, Blast) を行った結果から、クローン化しで、少なくとも30,000 遺伝子あることが報告されてた32のうち24クローンで、予想遺伝子コード領域が2）いる 。本研究の目的は、大核 DNA 断片のクローニみつかった。これは非常に高い確率で、単純に考え

ング・塩基配列の決定・解析から得られた情報をもると大核 DNA の75％がコード領域である可能性が示とに、ゾウリムシの大核ゲノム構造を明らかにする唆された。このことは、遺伝子が高密度でコードさことである。

れていることを示唆している。そこで、この可能性を検証するため、より長い DNA 配列を解析し、複数[材 料 と 方 法] ゾ ウ リ ム シ(Paramecium caudatum)の遺伝子が密にコードされているのかを検証した。

syngen3 に属する野生型株 KNZ 2（接合型 E）を使

約6-10kb の DNA をランダムにクローニングし、この用し、培養は、25±1°C でおこなった。ゾウリムシのうち6クローン（合計

大核ゲノム構造を明らかにするため、細胞からトーした。すると、それぞれの DNA 断片には、平均約４

タル DNA を抽出し、①トータル DNA を制限酵素個の予想遺伝子コード領域があり、各遺伝子間の領約50 Kb）の塩基配列を決定

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)

99

域は、42bp ～1212bp だった。このことから、ゾウリ遺伝子が密にコードされていることが知られている

ムシの大核 DNA には、高密度に遺伝子が並んでいる

yeast（遺伝子密度：2.09）と同じくらいであった。

ことが明らかになった。通常、真核生物では、遺伝

また、近年 Zagulski らによって解析された近縁種で子がゲノム中に散在し、原核生物では、密であるとあるヒメゾウリムシとは、非常に似たゲノム構造をいう特徴から考えると、ゾウリムシは、どちらかとしていることが明らかになった2)。

いうと原核生物に近い遺伝子の配置をしているといゾウリムシの大核 DNA に遺伝子が高密度にパッうことがわかった。今回明らかにした DNA 配列は、ケージされているということは、おそらく小核 DNA

約50 K でこの DNA 配列中に予想遺伝子コード領域

から大核 DNA へ再配列した結果であると考えられ、と考えられる箇所は少なくとも24箇所だった。さら小核ゲノム中には遺伝子が散在しているか、密なに、この予想遺伝子コード領域は、今回明らかにし

コード領域と長い非コード領域があるという可能性

た DNA 配列（約50 Kb）の78.2％であった。これが推測できる。さらに、ゾウリムシは、進化の過程

は、遺伝子密度が高いと報告されている真核生物

で、単純に DNA 量を増加させたのではなく、大核当（ヒメゾウリムシや yeast）よりも高い結果であったりの遺伝子コピー数を増加させるために遺伝子領た。また、約50 K の DNA 配列の G + C content は域が高密度になるという適応進化があったのではな

30.6％で、コード領域では34.4%、非コード領域ではいかと推察できる。

26.8%をいう解析結果も得られた。加えて、24の予想
遺伝子領域のうち3つの遺伝子についてイントロンで[文献]ある箇所が明らかになり、それらの平均値は、24.3

1) Soldo, A. T., Brichson, S.A., Larin, F. (1981)

nt だった。ゲノムサイズ／遺伝子数で計算する遺伝
子密度（遺伝子が高密度にコードされているほど小J.Protozool. 28: 377-383.
2) Zagulski et al. (2004) Current Biol. 14: 1397-1404.

さい値）は、2.08と言う結果になった。この値は、ゾウリムシ大核ゲノムへの改造 Tc1 トランスポゾンの転移
中山早苗（金沢大・院自然・生命科学）

Transposition of artificial Tc1 transposon into macronuclear genome in Paramecium
Sanae NAKAYAMA (Div. of Life Sci., Grad. Sch. of Natural Sci. and Technol., Kanazawa Univ.)
SUMMARY
In the ciliate, Paramecium tetraurelia, thousands of internal eliminated sequences (TA-IESs) are excised from thegerm-line micronuclear DNA during macronuclear differentiation. Based on the resemblance of TA-IES end sequences
to Tc1 transposon termini, it has been proposed that TA-IESs might have degenerately evolved from Tc1 family transposons. To know the mechanism of the transposon invasion into macronuclear genome and evolutionally into the micronuclear genome, using a Tetrahymena metallothionein gene (MTT1) UTR as a promoter, I constructed an artificial Tc1
transposon which can move within the genome of Paramecium. After plasmids carrying the artificial Tc1 transposon
was microinjected into the macronucleus of P. caudatum, the injected cell were treated with CdCl2, expression of the
Tc1A transposase was confirmed by RT-PCR, indicating that the MTT1 promoter is functional in P. caudatum. Although not so efficient, successful amplification of the introduced transposon suggests that transposition into the macronucler genome did occur. The ultimate aim of this study is to make a reproduction of an evolutionary process in labora-

原生動物学雑誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年

100

tory from invasion and fixation of transposons. The first step of this study has been cleared by the success of the artificial transposon.

[目的] 繊毛虫は一つの細胞質中に 2 種類の核、小核(生殖核) と大核 (栄養核) をもつ。有性生殖である[結果と考察] ゾウリムシの大核内での Tc1A gene の接合では、次世代の大核は小核から分化 (核分化)発現が、RT-PCR 法によって確認された。このことする。大核分化では大規模な DNA の再編成が行わから、テトラヒメナのメタロチオネインプロモー

れ、機能的な大核ゲノムが再構成される。このときターがゾウリムシでも有効であることが確認されに除去されてしまう小核特異的配列を、総称して内た。また、PCR 法とゲノミックサザンハイブリダイ(IES: Internal eliminated sequences) とよゼーションによって、改造 Tc1 トランスポゾンのゲ部除去配列

ぶ。ヒメゾウリムシの IES (TA-IES) はその構造的特ノムへの転移が示唆された。しかし、直接的な証拠

徴から、かつて小核ゲノムに侵入した Tc1 ファミは得られなかった。トランスポゾンの転移は、ほぼ

リーのトランスポゾンが退化した DNA 配列である

ランダムに行われるため、ゲノムへの転移を確認すと考えられている (1)。私は、トランスポゾンの侵るには、増幅した上で検出する方法が必要である。

入は小核よりも大核の方が起こりやすいのではない

その一つの方法として、現在はインバース PCR 法にかと考えた。トランスポゾンは先ず大核に侵入してよる挿入サイトの検出を検討している。

コピーを増やした後、やがて小核に転移したのでは一方で、細胞分裂が進むうちにプラスミドの検出ないだろうか。そこで、私は線虫由来の Tc1 トランが困難になった。このことから、ゾウリムシの大核

スポゾン (2) をゾウリムシ大核内で強制的に転移さ内で、インジェクションしたプラスミドが維持されせ、IES の進化の再現を図ることを試みた。

ていないことが明らかになった。この結果は他の繊毛虫の報告と異なっている。強制的に高効率な改造[材料と方法] 重金属イオンの存在下で発現するテト

トランスポゾンの転移を行うには、高コピーのトラ

ラヒメナのメタロチオネイン遺伝子のプロモーター

ンスポゾンの存在と、高効率な転移酵素の発現が必(2) を 用 い て、ゾ ウ リ ム シ の 大 核 内 で 転 移 酵 素須である。今後は大核内でのプラスミドの高コピー(Tc1A transposase) を発現する改造 Tc1 トランスポゾの維持と、Tc1A 転移酵素の高い発現量の条件についンを構築した。メタロチオネイン遺伝子の 5’ 領域ての改善が必要である。

2.5 kb (プロモーターを含む) と 3’ 領域 0.3 kb (ポリ現在考えられている IES の除去システムの Scan

A 付加シグナルを含む) をそれぞれ Tc1A gene の上

RNA theory (4) と IES のトランスポゾン起源説には矛

下流に挿入し、ストップコドン TAA を繊毛虫のス盾がある。改造トランスポゾンの動向を追うこと

トップコドン TGA に置き換えた。さらに、インジェ

で、この矛盾を解く糸口がみつかるのではないかとクションしたプラスミドがゾウリムシの大核内で維期待している。

持されるように、ベクターにテロメア配列を挿入した。制限酵素処理によって両末端にテロメア配列を[文献]持つ線状プラスミドとし、ゾウリムシの大核にマイ

1) Klobutcher, LA. and Herrick, G. (1997) Nucleic Acids

クロインジェクションした。プラスミドの存在は 3細胞を鋳型とした PCR によって確認した。Tc1A
gene の発現は、細胞を 0.5 µg/ml 塩化カドミウムで処理して誘導し、発現の確認は RT-PCR 法を用いて行った。改造 Tc1 トランスポゾンの転移の確認は、PCR 法とゲノミックサザンハイブリダイゼーション
を用いて行った。

Res. and Mol. Biol. 56: 1-62.
2) Vos, JC., Van Luenen, HGAM. and Plasterk, RHA.
(1993) Genes & Dev. 7: 1244-1253.
3) Shang, Y. et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(6): 3734-3739.
4) Mochizuki, K. et al. (2002) Cell 110 (6): 689-699.

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)

101

SH 基修飾試薬によるカルケシウムスパズモネーム収縮阻害とその阻害 200 kDa タンパク質
Fang, Jie，中島 淳, 板橋岳志，浅井 博 (早稲田大・院理工)Contraction deficiency of Carchesium polypinum by SH-modifying reagent
and its 200 kDa protein
Jie FANG, Jyun NAKAYAMA, Takeshi ITABASHI and Hiroshi ASAI
(Dept. Life Sci. Grad. Sch. Sci. Eng. Waseda Univ.)
SUMMARY
It has been thought for a long time that the chemical modification of cysteine amino acid residues in Vorticellidae
spasmonemes does not cause any loss in Ca2+-driven contractility. One of the reasons is that spasmin, which belongs to
one of the calmodulin superfamilies, and is the most important protein in contractile spasmonemes, does not contain any
cysteine residues. Another reason is that nobody, including us, has used glycerinated Carchesium sp. for contractility
experiments. It is well known that an old stalk of Carchesium sp. is easily and naturally deteriorated and loses its contractility. We have recently succeeded in collecting many young colonies of C. polypinum and cultivating them in thepresence of Chlamydomonas reinhardtii and bacteria as food. We have tried to modify the young stalks of glycerinatedC. polypinum using DAM (N-7-dimethyl-amino-4-methyl-coumarinyl-maleimide) as a fluorescent cysteine-group modifying reagent.

We discovered that the contractility was significantly reduced even in young stalks of C. polypinum.

The spasmoneme in a stalk of C. polypinum was fluorescently labeled. On the other hand, the spasmoneme in a stalk of
Vorticella sp. was not fluorescently labeled.

A 200 kDa protein extracted from Carchesium spasmonemes was also

fluorescently labeled. These results mean that both the novel 200 kDa protein and spasmin, as a Ca2+-binding protein,play important roles for spasmoneme contraction. In another experiment, a novel 50 kDa protein in the spasmoneme of
Vorticella sp. was found to be important for its contraction. It is thus suggested that the 200 kDa protein in Carchesium
spasmonemes is evolutionarily a tetrameric form of the 50 kDa protein in Vorticella spasmonemes.

[目的] ツリガネムシの柄（ストーク）の内部には、2+ある。最近、クラミドモナスの共存下で Carchesium

スパズモネームと呼ばれるカルシウムイオ（Ca ）polypinum を安定長期的の培養する方法を確立した

励起収縮性繊維の束が存在する。ツリガネムシに(1)。そこで、若い数個の枝分かれストークのみから

は、一本の柄のみを持つ孤立形（Vorticella sp.）と、成るグリセリンモデルを多量に採集することに成功

枝分かれ形（Carchesium sp. と Zoothamnium sp.）のした。念のために、若いカルケシウムのグリセリン

三種ある。ところで、1958 年の Hoffmann-Berling にモデルを用いてスパズモネームの SH アミノ酸残基よる研究以来、スパズモネームの Ca2+ 励起収縮にの化学修飾を試みたところ、Ca2+ 励起収縮性の喪失

は、Ｓ Ｈ（シ ス テ イ ン）ア ミ ノ 酸 残 基 は 重 要 で なが起きた。本論文は、偶然のこの研究成果をまとめい、と考えられていた。我々や Amos らも孤立形ツたものである。

リガネムシ（Vorticella sp.）や枝分かれツリガネムシの一種である Zoothamnium sp. のグリセリンモデル[材料と方法] 蛍光性のＳＨ残基修飾試薬として、和を用いて同様の結果を得ている。しかし、他の種の

光 純 薬 製 の N-7-dimethyl-amino-4-methyl-coumarinyl-

枝分かれツリガネムシの Carchesium sp. についてのmaleimide (DACM) を用いた。Carchesium polypinum

結果の確認は誰もされてこなかった。その理由は、の培養は、餌としてのバクテリアとクラミドモナス

枝分かれの多い古いカルケシウムは、自然に変性しの共存下で行われた。Vorticella sp. の培養は、餌としやすくグリセリンモデルは不適と考えられたからでてのバクテリアの存在下で行われた。比較的虫体の102

原生動物学雑誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年

数が数個の比較的若いカルケシウムのみを採集し、側鎖と反応するが、pH 6.0 で、特にヒスチジン側鎖50%のグリセリンで処理し、-20°C の温度で保存しを特異的に修飾する。ヒスチジン残基がスパズモた。タンパク質を抽出するときには、虫体部分を取ネームの収縮に必須であるかどうか調べるために、

り除いて、スパズモネームを含むストーク部分を集DEPC のグリセリン処理ストークに及ぼす影響につめた。収縮度は、化学修飾をしない試料と化学修飾

い て 調 べ ら れ た。そ の 結 果、ス パ ズ モ ネ ー ム のを施した試料とのストークの Ca2+ 存在下でのコイリ

DEPC 修飾はその収縮を阻害することが分かった。

ングの度合いの比を顕微鏡写真の測定によって、求同時に DEPC によるスパズモネーム抽出タンパク質めた。

の修飾は、吸光度が 244 nm で、DEPC の濃度上昇に[結果と考察] スパズモネーム収縮に対するシステイ

修 飾 さ れ た ヒ ス チ ジ ン の 特 徴 と 一 致 す る。

ン残基の影響をヴォルチセラとカルケシウムで比較

Hydoroxilamine 処理によって、DEPC 処理スパズモ

している。システイン残基は、多くの酵素活性部位

ネーム収縮の損失は、一部回復した。次に、Ca2+ 存

伴って増加することを示しているが、これは DEPCに直接関係することが多い。DACM によるシステイ

在下での DEPC による阻害が調べられた。その結

ン残基化学修飾は ヴォルチセラのスパズモネームの果、 2 mM Ca2+ 存在下では、スパズモネームの収縮

収縮性に影響を与えない事を確かめた。しかしなが性 が 再 現 さ れ た。一 方、DEPC 修 飾 ス パ ズ ミ ン のら、カルケシウムの場合には、システイン残基がス

Native-PAGE 結果は、Ca2+前処理に関係なく、Ca2+ 結

パズモネーム収縮にとっては重要な役割を果たして合能力が変化しないことを示し、このことは必須のいることを発見した。1958 年の Hoffmann-Berling にヒスチジン残基がスパズミンの Ca2+ 結合部位に存よる研究以来、誰もカルケシウムのスパズモネーム

在しないことを示唆している。これらの結果から、のシステイン残基化学修飾を試みなかったためであ

スパズモネームの収縮における DEPC の影響はスパる。喩えれば、瓢箪から独楽が出たような実験結果

ズミンに対する修飾ではなく、スパズミン受体タンである。DACM はシステイン残基用の非常に特異的パク質として考えられている他のタンパク質を修飾な蛍光性試薬である。そこで、カルケシウムのスパしたかもしれないと結論づけられた(2)。必須のヒス

ズモネームから抽出したタンパク質を DACM によっ

チジン残基を含むタンパク質を同定するために、て修飾し、どのタンパク質が蛍光標識されたかを

GST-spasmin を DEPC 存在下／非存在下のおのおの

Native PAGE 法によって調べられた。DACM ラベル

でスパズモネーム全抽出タンパク質とともにインされたタンパク質は分子量 200 kDa であった。一キュベートした。GST‐spasmin と全抽出タンパク質方、ヴォルチセラのスパズモネームから抽出されたの沈殿物は SDS‐PAGE ゲルに電気泳動された。

タンパク質は、DACM によって蛍光標識されなかっ我々は DEPC に修飾を受けた二種類のタンパク質をた。

発見した。二種類のタンパク質の分子量は各々、約上の結果は、ツリガネムシ類のストークの収縮に40 kDa と約 50k Da であった。我々は必須のヒスチジＳＨ残基が重要でないという早飲み込みを訂正する

ン残基を含むタンパク質が 50k Da のタンパク質であ決定的な証拠となったと信じる。誤った早飲み込み

る こ と を 免 疫 沈 降 法、SDS-PAGE お よ び West-の遠い原因は、スパズモネームの Ca2+ 結合タンパク

western Blotting により同定した。

であるスパズミンにＳＨ残基をもたないことにもよ

この必須ヒスチジン残基を含む 50k Da タンパク質る。より知られたカルモヂュリンもＳＨ残基をもたは、前に述べているカルケシウムの必須システインない。さらに、スパズモネームの Ca2+ 励起収縮に残基を含む 200 kDa タンパク質と生物進化の上で同は、単独のスパズミンだけで充分という Amos らに等である可能性が出てきた。

よる更なる早飲み込みも訂正する決定的な証拠も得ることが出来た。そして、スパズミンの相補的な役[文献]割をになうタンパク質の候補として、200 kDa を得

1) 中 島 淳、浅 井 博．(2004)原 生 動 物 学 雑 誌 37

た。
ヴォルチセを用いた別の実験も行った。化学修飾剤としての Diethyl-pyrocarbonate (DEPC) はヒスチジ
ン、リシン、チロシンといったいくつかのアミノ酸(No.1): 61-62.
2) Jie Fang, Bei Zhang, Ning Chen and Hiroshi Asai.
(2004) Zool. Sci., 21: 527-532.

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)

103

繊毛虫 Spirostomum ambiguum のセントリン様タンパク質の分布高橋暢朗1，石田秀樹1，増山悦子2（1島根大・生物資源科・生物科学，2広島女子大学・健康科学科）

Distribution of centrin-like proteins in the ciliate Spirostomum ambiguum
Noburo TAKAHASHI1, Hideki ISHIDA1 and Etsuko MASUYAMA2 (1Dep. Biol. Sci., Fac. Life andEnviron. Sci., Shimane Univ., 2Dep. Health Sci., Hiroshima Pref. Women's Univ.)
SUMMARY
The large heterotrichous ciliate Spirostomum is known for its remarkable rapid cell contraction that is triggered byexternal stimuli, and the cytoskeleton-based motile systems of contraction and subsequent re-elongation have been studied in order to understand its underlying molecular machineries. The myoneme in the cortex is thought to generate theforce for the Ca2+-dependent contraction, and may be similar to the spasmoneme in the stalk of Vorticella. In Vorticella,
an antibody to centrin 1 has been reported to recognize the spasmoneme. In view of these facts, we have examined thepossible existence of centrin in Spirostomum using immunohistological and immunobiochemical techniques. The specimens of Spirostomum were electrophoresed and blotted, and the antibody to centrin 1 specifically stained a single bandof 18 kDa in an extract of Spirostomum. When frozen thin sections of Spirostomum were stained with anti-centrin 1,
fluorescent signal or deposits of tetramethylbenzidine (TMB) substrate were detected at the cell cortex. These results
suggest that a centrin 1-like protein may exist in the cortex of Spirostomum. Further studies with electron microscopy areneeded to understand the precise localization of the centrin 1-like protein in Spirostomum.

[目的] 繊毛虫 Spirostomum は外部からの様々な刺激[材料と方法] 実験動物には多膜綱、異毛目に属すに対して非常に速い収縮を示す。この収縮運動は細る Spirostomum ambiguum を用いた。細胞の凍結切片

胞皮層に存在する myoneme によるものであると考えを作製し、抗体染色を行った。酵素抗体染色は内因られている。Myoneme による Spirostomum の収縮は性ペルオキシダーゼ失活処理を行い、次に正常ヤギ

アクチン-ミオシン系とは異なる運動系で、収縮に血清でブロッキングを行い、1 次抗体を反応させ

2+

ATP を必要とせず収縮には細胞内の Ca 濃度が関係た。次にビオチン化２次抗体を反応させ、アビジしていると考えられている。この収縮はツリガネム

ン－ビオチン複合体を反応させた。テトラメチルベ

シの柄の収縮と類似のものであると考えられていンジジンで発色させ、封入後観察した。蛍光抗体染る。ツリガネムシの柄にはスパスミンと呼ばれる色は抗ウサギ IgG ヤギ抗体でブロッキングを行い、Ca2+ 結 合 タ ン パ ク 質 が 存 在 し て お り、Carchesium

1 次抗体を反応させた。次に 2 次抗体(FITC 標識抗ウ

polypinum のスパスミンから精製した抗体と Spiro-

サ ギ IgG) を反 応させ、封入 し観察を した。SDS-

stomum は交差反応を示す(Ochiai et al., 1988)。近PAGE は Laemmli 法に従って行った。分離ゲルは 8%

年、スパスミンと同様に Ca2+結合能を持ち、種々のまたは 10 ～ 20%グラディエントゲルを用いた。イム

真核生物に広く存在するセントリンの一次構造が、

ノブロッティングは泳動の終わったゲルを PVDF 膜

スパスミンの一次構造と類似していることが明らかにトランスファーした後、ブロッキングを行い、1になった（Itabashi et al., 2003）。以上より myoneme

次抗体、2 次抗体(HRP 標識抗ウサギ IgG) 反応を

はセントリンやスパスミンに類似したタンパク質で行った。DAB で発色させた後、反応を停止させた。

ある可能性が高いと考えられる。そこで抗セントリ

1 次抗体としてヒト centrin1 の C 末端合成ペプチドにン抗体を用いて、イムノブロット法、免疫組織染色

対するポリクローナルウサギ IgG と脊椎動物骨格筋法により Spirostomum における Ca2+結合タンパク質

アクチンの C 末端 11 残基合成ペプチドに対するポリの検出を試みた。

クローナルウサギ IgG を使用した。

原生動物学雑誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年

104[結果と考察] 抗アクチン抗体に対するイムノブロッ

20 k であり、Spirostomum のセントリン様タンパク質

トでは抗アクチン抗体と交差したタンパク質は分子はこれよりも分子量が低い。抗セントリン抗体によ

量約 40.5 k のバンドのみであった。これは骨格筋アる細胞染色では抗アクチン抗体で染色される膜表層

クチンの平均的な分子量 42 k よりも低い分子量であ直下より内部、つまり myoneme が存在している部位る。Tetrahymena など一部の原生動物のアクチンは高である細胞皮層部に染色が見られた。セントリンが等動物の骨格筋アクチンとは異なる性質を示し、アCa2+ 結合性タンパク質であり、セントリン、スパス

ミノ酸配列の相同性も低いことが知られている。まミン、myoneme の類似性を考えると抗セントリン抗た Spirostomum のアクチン様タンパク質はテトラヒ

体は myoneme を検出している可能性が考えられる。

メナアクチン抗体とも反応性が異なっており

しかし、凍結切片では myoneme 束が明確な構造としSpirostomum は Tetrahymena とも異なった独自のアクて確認できないため myoneme が染色されているかはチンを持つと考えられる。抗アクチン抗体による細不明であり、免疫電子顕微鏡法を用いてより高分解

胞染色では繊毛列部分を含む細胞皮層部、波動膜、能でのセントリン抗体結合タンパク質の局在を調べ

大核の周囲に染色が見られた。特に繊毛列部分におる必要がある。

ける点在する分布パターンから Spirostomum のアク
チン様タンパク質は繊毛基部とその周囲に分布して[文献]いると考えられる。

1) T. Ochiai, M. Kato, T. Ogawa and H. Asai Expericntia

抗セントリン抗体に対するイムノブロットでは、
抗セントリン抗体と交差するバンドは約 18 k のバン
ドのみであった。一般的なセントリンの分子量は約44 (1988).
2) T. Itabashi, K. Mikami and H. Asai Research in Microbiology 154 (2003), 361-367.

国内温水環境における病原性 Naegleria 属アメーバの実態
八木田健司1，下河原理江子1，朝倉登喜子1，泉山信司1，黒木俊郎2，遠藤卓郎1（1国立感染症研究所寄生動物部，2神奈川県衛生研究所微生物部）

The occurrence of pathogenic Naegleria amoebae in thermal waters in Japan
Kenji YAGITA1, Rieko SHIMOGAWARA1, Tokiko ASAKURA1, Shinji IZUMIYAMA1, Toshiro
KUROKO2 and Takuro ENDO1 (1Dept. of Parasitol., Natl. Inst. of Infect. Dis., 2Dept. of Microbiol.,
Kanagawa Inst. of Public Health)A survey to document the presence of pathogenic Naegleria species was conducted for the thermal waters of 25
prefectural areas in Japan. A tota1 of 1,173 samples were collected from hot springs, public spas and thermal discharge
from those sources or industry. Test plates were incubated at 42°C for up to 3 days to isolate thermophilic Naegleria
species. Amoeba isolates were morphologically identified to genus level. Naegleria isolates were further characterized
genetically by means of PCR/RFLP and DNA sequence analysis of Internal Transcribed Spacer (ITS) regions of ribosomal DNA. Amoebae were isolated from 357 (30.4%) of the total samples. Naegleria positive samples represented
14.7% of the total samples. N. lovaniensis, a non-pathogenic species, was recovered from 20 out of 25 areas. Although
N. fowleri, a human pathogen, was not isolated from any samples tested, N. australiensis, experimentally fatal pathogen
to mice, was recovered from 10 areas, mostly isolated from thermal discharge samples with high level of bacteria. The

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)

105

prevalence of these amoeba was correlated with a concentration of residual chlorine of the samples. As the results ofpathogenicity test on N. australiensis strains, six of 16 strains killed the intracerebrally infected mice. Other 3 strains
limited to cause some types of abnormal behavior of the intracerebrally infected mice.

[目的] 高温耐性の Naegleria 属アメーバにはヒト感がっていることが示唆された。また N. australiensis

染性の知られる N. fowleri の他、実験的に動物感染のと同様の病原性を示す N. italica および N. philippin-成立する N. ausutlariensis、N. italica および N. phili-

ensis（その近縁種も含む）が各々 2 地域 3 試料より

pinensis がある。前年度に引続き、国内温水環境（温分離された。浴槽の種類によるアメーバの検出率

泉・公衆浴場等）におけるこれらのアメーバ類の実

は、薬湯等で最も高く（52.4%）、その他内湯等が態調査を行い、N. ausutlariensis が全国的に分布生息

25 ～ 37%であった。また塩素管理が一般的ではないすること等の新たな疫学的知見を得た。動物感染実

かけ流し浴槽の方が、塩素管理の普及している循環験の結果を合わせて、実態調査の結果を報告する。

式浴槽よりもアメーバ検出率が高いという実態が明らかとなった。Naegleria 属に限定しても薬湯の検出[材料および方法] 調査地域は全国 25 地域（都道府率は 26.2%と最も高く、N. australiensis は 4.8%であっ県単位）とし、温泉原水、浴槽水、温排水等を試料た。N. australiensis は薬湯や温排水といった特に細菌として採取した。試料採取時に残留塩素濃度等浴槽

汚染度の高い試料より高率に検出される傾向が見ら

水の衛星管理に関する聞き取りを行った。アメーバれた。今回の調査では、レジオネラ汚染防止を目的

分離には大腸菌塗布寒天培地を用い、42°C 培養で高に多数の循環式浴槽において 0.2 mg/L の残留塩素管

温耐性アメーバを選択分離した。Naegleria 属アメー理が行われていたが、残留塩素 0.2 mg/L 以上の試料

バは形態学的に同定、単離した後、18S rRNA の ITS

ではアメーバ検出率は大きく低下することが明らか

領域のシークエンスで詳細に同定を行った。また分となった。Naegleria 属の病原性試験の結果は、N.

離株の病原性の試験では、ddy マウスへの実験的感

australiensis に関しては 16 株（10 地域より）中 6 株

染（脳内接種、経鼻接種）を行い、致死性、行動異 （6 地域）が脳注マウスに対する致死的病原性を示し常等の所見から病原性を評価した。

たが、経鼻感染および皮内感染では異常は認められなかった。また他の 3 株は持続的な行動異常のみを[結 果 お よ び 考 察] 施 設 総 数 の べ 631、試 料 総 数

呈 す る 病 原 性 が 脳 注 感 染 マ ウ ス で み ら れ た。

1,173 を検査し 3,167 株のアメーバを分離、同定しN.philippinensis は 1 株を試験し、脳注感染のマウスた。何らかのアメーバが検出された試料数は 357

において致死的病原性が見られたものの、N. aus-

（30.4%）、ネグレリア陽性試料数は 173（14.7%）でtraliensis と同様、経鼻感染では異常は認められなあった。得られた Naegleria 属の種類別検出結果をみかった。N. ausutlariensis では 2 つの株を試験した

ると、これまでと同様、非病原性種の代表である N.

が、何ら病原性は認められなかった。

lovaniensis が 20 地域 146 試料より検出され、優占種

温泉や公衆浴場等の温水環境は、N. australiensis をとして国内に広範に分布していた。一方、ヒト病原

はじめとする病原性アメーバ類に汚染される可能性

性の明らかな N. fowleri は、本年度も検出されなかっがあり、その防止には残留塩素濃度管理が大きく関たが、実験的病原性が知られる N. australiensis に関与しているものと考えられた。

しては、10 地域 26 試料より検出され、全国的に広原生動物学雑誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年

106

繊毛虫の放出体（エクストルソーム）の初期進化
三宅 章雄

Early evolution of extrusomes in ciliates
Akio MIYAKE
SUMMARY
Pigment granules (pigmentocysts) are spherical, morphologically-simple extrusomes. They are widely distributed
among the two groups of primitive ciliates, heterotrichs and karyorelictids and carry out chemical defense against predators by means of the toxic pigments which they contain. Cortical granules are morphologically similar to pigment granules and are widely present in heterotrichs. Some of them were found to carry out the chemical defense by means ofcolorless toxins. Based on these recent findings (Miyake, A., Jpn. J. Protozool., 35: 97-11, 2002) and previously known
studies (Rosati, G. & Modeo, L., J. Eukaryot. Microbiol., 50: 383-402, 2003) on extrusomes, it was assumed that extrusomes in ciliates started as toxin-containing cortical granules and evolved as organelles of predator-prey interaction.

[目的と方法] 各種の放出体の繊毛虫における分布や、放出体の機能についての新しい知見に基づき、繊毛虫の放出体の初期進化について考察した。

毒性物質により化学的防御を行う（２）。
これら二つの機能、すなわち、１）捕食者の獲物に対する攻撃、２）捕食者に対する防御、のほか色素顆粒が繊毛虫の光に対する反応における光受容の[考察] ムコシストタイプの放出体は、典型的なムコ機能をもつことが実証されている（２）が、光受容シストのほか、表層顆粒 (cortical granules) や色素顆機能をもつ色素顆粒は同時にまた捕食者に対する化粒（色素を持った表層顆粒）などを含み、構造は比学的防御の機能ももっている（２）。これらの結果

較的簡単で、繊毛虫に広く分布する。一方、もっとを一般化し、繊毛虫の放出体は攻撃か防御あるいは複雑な構造をもつ特殊な放出体は繊毛虫の特定のグ

その両方の機能をもった細胞小器官であるという作

ループに限って見られる傾向がある（１）。また、

業仮説を立てると、繊毛虫の放出体は捕食者と被食

原始的な繊毛虫とみなされる原始大核類と異毛類で者の間の相互作用を行うための細胞小器官として進最も普通な放出体は表層顆粒と色素顆粒で、ムコシ化して来たという統一的な見解が得られる。

ストタイプのものである。そこで、繊毛虫の放出体

上述のように、異毛類の表層顆粒は、色素の有無

で最も原始的なものはムコシストタイプのもの、特に関わらず捕食者に対する化学的防御の機能をもに表層顆粒ではないかと考えられる。
以上は放出体の形態のみを考慮した考察である

ち、最も原始的な繊毛虫とされる原始大核類と異毛類において広く見られ、捕食者に対する化学的防御が、さらに放出体の機能を考慮すればどうなるであの細胞小器官として機能している。これを繊毛虫のろうか。トキシシスト（毒胞）やハプトシストが捕エクストロルソームの原始的な状態とみなせば、繊食のための攻撃の機能をもつことは古くから知られ毛虫の放出体は、最初は表層顆粒のようなもので、ていたが、最近、トリコシスト、表層顆粒および色

その中に含まれる毒性物質によって捕食者に対する素顆粒が捕食者に対する防御の機能をもつことが明

化学的防御を行っていたもので、この機能を維持しらかになった（２）。色素顆粒は異毛類にしばしばたまま各種の放出体を作り出して来たのではないか

見られ、原始大核類には一層広く見られ、その中にと考えられる。

含まれる色素に強い毒性があり、これにより化学的その一例として、光受容の機能をもった色素顆粒防御を行う（２）。異毛類ではクリマコストマムやができた過程について考察する。ここでは、現在知スピロストマムなど色のないものも多いが、これらられている色素顆粒の毒性色素はすべて光動力学的は無色の表層顆粒をもち、その中に含まれる無色の作用（photodynamic action) をもっていることに着目Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)する。このような色素を含む系に光があたると光酸107う。たとえば、原始大核類は殆ど全て海底の砂粒間化が起こり、色素顆粒をもった繊毛虫はしばしば強に住むから、光を避ける反応は適応的なはずであい光によって殺される。これは、光があたると何かる。すなわち、表層顆粒が毒性の光動力学的色素を障害が起こることを示しているが、これが刺激ともつことによって、化学的防御と光受容機能をもっなって細胞に繊毛運動の逆転が起こると、細胞はス

た色素顆粒ができたのであろうと考えられる。

テップアップの光驚動反応を行うこととなり、キネ
シスによって細胞は暗所へ移動することになるであ[文献]ろう。もしこれがその繊毛虫の生活にとって適応的

1) Rosati, G. and Modeo, L. (2003) J. Eukaryot. Micro-であれば、たまたまこのような色素が表層顆粒に含まれるようになると、その状態は維持されたであろbiol., 50: 383-402.
2) Miyake, A. (2002) Jpn. J. Protozool., 35: 97-117.

Teranympha 属の共生鞭毛虫と宿主シロアリ数種の系統比較
近藤武司，北出理（茨城大・理）Comparison of phylogenies between symbiotic flagellate genus
Teranympha and host termites
Takeshi KONDO and Osamu KITADE (Faculty of Science, Ibaraki University)
We examined SSUrRNA gene sequences of symbiotic flagellates of the genus Teranympha derived from four Reticulitermes termite species distributed in and around the Japan Archipelago. The inferred phylogenetic tree usingneighbor-joining method was comprised of three monophyletic groups supported with more than 80% bootstrap probabilities. For the most parts, the tree topology was consistent with both the phylogeny of host termites inferred from mitochondrial genes and a paleogeological hypothesis of the formation process of the Japan Archipelago, suggesting the cospeciation between host termites and Teranympha symbionts. However, clones of Teranympha obtained from R. speratus of the Aichi population and those from R. kanmonensis were separately included in different clusters. If such clones
were not artifacts, possible causes of the results might be lateral transfers of flagellates or lineage sorting among allelesof the SSUrRNA gene.

[目的] 下等シロアリと原生生物の共生関係はよく知

水平感染は生じにくいと考えられるため、両者は一られる共生の例である。シロアリは捕食した木材の致した系統の分化を起こしている可能性がある。本

分解を原生生物に依存し、原生生物は木材の供給と研究では日本周辺に生息する Reticulitermes 属 (ヤマ

生息環境をシロアリに依存している。シロアリ腸内トシロアリ属) とその共生原生生物で超鞭毛虫目に属

原生生物はトリコモナス目・超鞭毛虫目・オキシモ

する Teranympha 属の系統樹を比較する事により共種

ナス目に分類される鞭毛虫であり、前２目は副基体分化の可能性を検討した。

類と呼ばれる。超鞭毛虫目とオキシモナス目のほとんどはシロアリ腸内のみに生息する。シロアリと共[材料と方法] ヤマトシロアリ属のシロアリは茨城

生原生生物は非常に強い共生関係にあり、宿主間の県・愛知県・山口県・ソウル（ヤマトシロアリ R.

108

原生動物学雑誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年

speratus）、石垣島・西表島（ヤエヤマシロアリ R.

た。また、台湾のキアシシロアリ、ラオスの R. sp.、yaeyamanus）、台 湾（キ ア シ シ ロ ア リ R. flavi-

山口＋韓国のヤマトシロアリの各個体群に由来する

ceps）、ラオス（R. sp.）で採集した。東アジアに分クローンはそれぞれ単系統群を形成した。愛知のヤ布する本属の種は Teranympha 属を 1 種消化管に保有

マトシロアリ由来のクローンと山口のカンモンシロ

する。シロアリの腸内容物を 0.45% 生理食塩中で切アリ由来のクローンでは同じ宿主個体に由来するに開し、内容物中から Teranympha 属の鞭毛虫のみを 7-もかかわらず系統的に大きく離れた群に含まれるも15 個体釣り出し DNA 抽出を行った。抽出した DNAのがあった。

を鋳型として SSU rRNA 遺伝子領域を PCR 法で増幅今回推定された系統樹の分岐パターンはいくつかし、クローニング・塩基配列の決定を行った。得らのクローンを除けば宿主シロアリの系統樹の樹形とれた配列は ClustalW を用いてアラインメントの後、一 致 し た。こ の こ と は ヤ マ ト シ ロ ア リ 属 とPAUP*ver.4.0 により HKY85 モデルで置換率を補正

Teranympha 属の共生鞭毛虫が共種分化をしている可

し、近隣接合法で系統樹を推定した。シロアリのミ能性を支持する。系統樹は宿主・鞭毛虫系統ともに

トコンドリア遺伝子 (16SrRNA 遺伝子と COⅡ遺伝

分布域が旧北区と東洋区の境界線であるトカラ海峡子) の配列に基づく系統解析の結果は北出の未発表で大きく 2 つに分かれる。ただし、山口県に生息すデータを使用した。

るカンモンシロアリは中国大陸南部からの移入種で[結果と考察] Teranympha 属の SSUrRNA 遺伝子の配海峡以南の群に含まれた。カンモンシロアリや愛知

列 は 同 じ 超 鞭 毛 虫 目 Eucomonymphidae 科 で あ るのヤマトシロアリに由来する Teranympha 属のクローあると考えられており、宿主・鞭毛虫ともにトカラ

Eucomonympha 属と 90% 以上の相同性を示した。系

ンは系統的に離れた複数の群に含まれ、とくに愛知

統解析の結果、本属のクローンは大きく 3 つの単系のものはトカラ海峡以北・以南両方の群に見られ

統群に分かれた。１つ目は茨城・愛知・韓国で採集た。このような結果に対する説明としては、シロアされたヤマトシロアリに由来するクローンの群、２リ間で原生生物の水平感染が行われた可能性が考えつ目は石垣島・西表島のヤエヤマシロアリ、愛知のられる。あるいは Teranympha 属が単為生殖のみを行

ヤマトシロアリ、山口のカンモンシロアリ、台湾霧うため、祖先的な多型を引き継ぐ lineage sorting の影社のキアシシロアリ由来のクローンで形成される

響を強く受けているのかもしれない。

群、３つ目はラオスの種と山口のカンモンシロアリ
由来のクローンで形成される群である。2、3 番目の[文献]

群は１つの大きな単系統群を形成する。これらの群

1) Yamin, M. A. (1979) Sociobiology. 4, 1-119.

は 80%以上の高いブートストラップ値で支持され