Jpn. J. Protozool. Vol. 34, No. 1. (2001)

1Review

繊毛虫ブレファリスマのキノン光センサーと光シグナリング
松岡達臣

高知大学理学部自然環境科学科〒 780-8520 高知市曙町 2-5-1Quinone photosensor and photosignaling in ciliated protozoan Blepharisma
Tatsuomi MATSUOKA
Department of Natural Environmental Science, Faculty of Science, Kochi University,
Kochi 780-8520
1.
はじめに｢レチナール／タンパク質複合体以外の分子が受容体として機能しているか否か？｣という問題は，単細胞生物の光受容研究の歴史における最も大きな関心事であった．バクテリア（Bogomolni and Spudich 1982）
やクラミドモナス（Foster et al. 1984）の走光性の光受容体としてロドプシン類が機能していることが発見されたこともあって，1980 年〜 1990 年代には，｢すべての生物の光行動に関わるセンサーは共通の古い起源をもつロドプシン類のみである｣とする説が有力になった．しかしその後，有色繊毛虫のブレファリスマのキノン分子／タンパク質複合体（Matsuoka et al.
1993, Matsuoka 1996），紅色光合成細菌のイエロープロテイン（今元・徳永 1997），ミドリムシのフラビン／タンパク質複合体（Iseki et al. 2000）などの新しい光センサー分子の構造や機能が次々に解明されるに至り，現在では｢光受容体は多様である｣と考えられるようになってきた．
我々は，過去 20 年間，複数の外国の研究グループとは独立に，繊毛虫ブレファリスマ（Blepharisma）の光行動発現に関わる分子として，ロドプシンとは全く異なる光センサー複合体（ブレファリスミン／ 200 kD タンパク質複合体）が機能していることを実証すると共に，ブレファリスミン分子の構造決定，光受容オルガネラの内部構造の解明，光シグナリング経路の部分的解明に成功した．
2.

ブレファリスマの光行動と生物学的意義ブレファリスマは細胞膜直下に多数の規則正しく並んだピンク色の色素顆粒（直径 0.5 µm）を有している．この顆粒はブレファリスミン（Giese 1973）と呼ばれる色素を含むが，この色素には毒性があって，捕食者に対する防御物質（Miyake et al. 1990, Harumoto et al.
1998, Noda Terazima et al. 1999）あるいは増殖において競合する単細胞生物に対する増殖抑制物質（未発表）として機能している．ブレファリスマは急激な光強度の上昇に対して，繊毛打の一時的な逆転反応によってもたらされる後退運動である光驚動反応（光回避反応）を示す．主にこの反応によって，ブレファリスマは相対的に暗い場所に集まる（Matsuoka 1983）．光を避ける理由は，おそらくブレファリスミン色素の光増感による活性酸素種の生成と関係があると考えられる．すなわち，暗黒下ではブレファリスマはブレファリスミン色素の毒性に対する自己耐性をもつが，光照射によって生成する活性酸素種に対してはあまり耐性がない．このため，光照射下ではブレファリスマは防御物質である色素の光増感作用によって傷害をうけることになる（Giese 1973）．ブレファリスマは進化の過程で，活性酸素種に対する有効な防御機構を獲得するかわりに 光から逃げる反応 を獲得したものと思われる．
非常に強い光を照射するとブレファリスマはすぐに死んでしまう．しかし，酸素存在下で中程度の光を照射した場合は，細胞が生きた状態でピンク色のブレファリスミンは酸化型の青色に変わる（オキシブレファリスミンの生成）．青色ブレファリスマも光によく反応し，その作用スペクトルは色素の吸収スペクトルと同様に 20 nm 程度長波長側にシフトする．オキシブレファリスミンの光依存的活性酸素の生成量は，ブレファリスミンに比べて小さいので（Kato and Ma-2

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tsuoka 1995）
その毒性も低い（Noda Terazima et al. 1999）． られた白色ブレファリスマは光感受性を消失するとさらに光照射を続けると，徐々に色素量が減っていっ いう事実である（Matsuoka et al. 1995）．また，アルビて白色のブレファリスマになる．このように，光活性 ノ細胞（わずかに色素を含有）の光感受性は野生型に化ブレファリスミンから身を守る３段階の防御機構 比べるとかなり低い．さらに，間接的な証拠ではあるが存在する．
が，ブレファリスミン色素顆粒の内部には，葉緑体や網膜の光受容細胞などに共通する光を効率よく吸収
3. ブレファリスミン光センサーの証拠するための膜の層状構造が見られる．
どんな色素分子が光センサーとして機能しているかを知る方法の１つは，色素分子の吸収スペクトルと 4. ブレファリスミンの分子構造
光行動の作用スペクトルを比較することである．イタアセトン抽出／薄層クロマトグラフィによって，タリアのグループによって測定された作用スペクトル ンパク質をほとんど含まないブレファリスミン標品（Scevoli et al. 1987）は単離したブレファリスミン溶 が得られる．しかし，さらなる HPLC 分析によって，液（タンパク質は含まない）の吸収スペクトル（in vitro この標品が５種の色素を含んでいることがわかった．
吸収スペクトル）に一致する．しかし，我々が測定し ５種のブレファリスミンの吸収スペクトルの可視光た作用スペクトル（Matsuoka et al. 1992）は，ある程度 領域は完全に一致することから，基本骨格（ブレファ類似してはいるものの， in vitro 吸収スペクトルとは リスミンの発色団構造）が共通していることは容易にかなり異なっている．最近になって，我々の作用スペ 推察できる．NMR とマススペクトルから明らかにクトルは，色素顆粒に組み込まれた状態のブレファリ な っ た ブ レ フ ァ リ ス ミ ン の 構 造（Matsuoka 1996,スミンの吸収スペクトル（in vivo 吸収スペクトル）に Maeda et al. 1997, Checcucci et al. 1997）を図１に示す．
ほぼ一致することが明らかになった．したがって，単 オキシブレファリスミン（Spitzner et al. 1998）やステ離・可溶化したブレファリスミン分子の状態は in vivo ントリン（Tao et al. 1993, Spitzner et al. 1998）は，酸素の状態を反映していないのである．単離したブレファ 存在下でブレファリスマ細胞を光照射することにリスミンにタンパク質が結合していてもいなくても， よって生成する．
この反応は in vitro の実験系において可視光領域の吸収スペクトルに大きな違いはない．す も進行する．ただし，この反応において酸素は必要でなわち，ブレファリスミンの in vivo 吸収と in vitro 吸収 ないとする主張もあるが（Spitzner et al. 1998），色素の大きな違いはタンパク質との結合が原因ではない． 溶液や乾燥標品中の酸素濃度を極端に低く保った
第２の証拠は，色素合成を阻害することによって得 我々の実験系では，オキシブレファリスミンやステン

図 1. ブレファリスミン（Matsuoka 1996, Maeda et al. 1997, Checcucci et al. 1997），オキシブレファリスミン（Spitzner et al. 1998），ステントリン（Tao et al. 1993, Spitzner et al. 1998）の構造と光依存的構造変化．それぞれ官能基（R1〜R3）の違いにより５タイプの色素種が存在する．
Kida et al. (in press) より改変．

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トリンへの転換は起きない（図１）．
光受容初期過程における光シグナル変換のしくみは未だ解明されていないが，少なくとも側鎖フェノール基の解離を伴う分子の構造変化が光シグナリング経路を活性化する可能性は考えにくい．なぜならば，光照射によってオキシブレファリスミンから側鎖フェノール基の解離は起きないからである．また，光シグナリングの初期過程において酸素分子を必須とするステップが存在することを考慮すると（Matsuoka
et al. 1995），色素分子のオキシ型への転換が光シグナリングに関与している可能性は否定できない．
5. ブレファリスミン結合タンパク質細胞（オキシ型）の水溶性成分を部分的に取り除き界面活性剤処理によって疎水性成分を可溶化してクロマトグラフィを行うと，オキシ型ブレファリスミンとタンパク質を含む分画が得られる（図２）．この条
件下では，フリーの色素はフラクション I にのみ溶出するので，フラクション II に溶出した色素は分子量が約 200 kD のタンパク質（200 K）と結合していると考えられる．また，この 200 K は色素顆粒に局在することもわかっている（Matsuoka et al. 1994）．200 K の分子量は実際には 250 kD 程度あり，しばしば 43 kD 成分が解離する（Matsuoka et al. 2000）．43 kD 成分がサブユニットなのか，内在性プロテアーゼによって切断さ3れたペプチド断片なのかは不明である．還元剤処理によって 200 kD 成分はサブユニットに解離しない．図２に示すように，フラクション I には多量の色素が溶出する．サンプル処理中に色素がタンパク質から解離した可能性は否定できないが，後述するように本来タンパク質に結合していなかった成分かも知れない．フラクション I には，オキシブレファリスミンとステントリンが含まれるのに対して，フラクション II にはオキシブレファリスミンのみが含まれる（Matsuoka et al.
2000）．この事実は，200 K と複合体をなすために色素分子側鎖のフェノール基あるいはブレファリスミン
発色団部分の立体構造が重要な役割を担っていることが推察される．
200 K が光シグナル変換機能を担っている証拠として，これが色素蛍光のクエンチング機能（蛍光強度の減少）を有することが挙げられる（Matsuoka et al.
2000）．すなわち，分子の蛍光は励起一重項状態から基底状態へ遷移する際の発光であるから，上記の事実は，色素の励起一重項状態からタンパク質活性化のための光エネルギー変換機構が存在することを示している．1,4-ベンゾキノンのような電子受容分子の共存下では，光励起ブレファリスミン分子から受容分子に電子移動が容易に起きることから（Angelini et al.
1998），色素の光励起一重項からタンパク質への電子移動が起きている可能性が考えられる．一方，初期過図 2. ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィによるオキシブレファリスミン結合膜タンパク質の単離．各フラクションは色素の吸収ピーク波長（600 nm）によって検出した．Matsuoka et al.
(4 ページに続く)(2000)より改変．

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程において観測されるブレファリスミン分子からのH+の遊離が光シグナリングの引き金をひく可能性も示唆されているが，この反応は励起一重項状態からは起きない（Cubeddu et al. 1990, Heelis et al. 1994）．
6.

光受容オルガネラの構造
網膜の光受容細胞や葉緑体の内部には光を効率よく吸収するために積み重なった膜構造が存在する．したがって，ブレファリスミン色素顆粒の内部にはこのような構造が存在すると推察される．しかし，顆粒内には色素が多量に含まれるため電子密度が極端に高くなっていて，切片法による電子顕微鏡観察では内部構造を見ることができない．そこで我々は凍結割断法を試みた．この方法では通常，脂質二重層の中間で割断されるので，もし色素顆粒内部に複雑な膜構造が存在するなら複雑な割断像が得られるはずである．顆粒の割断像や色素を含まない顆粒の切片観察から，顆粒膜の陥入によって構築された 蜂の巣状構造 が存在することが明らかになった（図３）．割断された膜面には多数の膜顆粒（膜タンパク質）が観察されるが，これはブレファリスミン／ 200 K 複合体である可能性が高い．
7.

集光アンテナ仮説
界面活性剤や有機溶媒に溶解したブレファリスミン分子（ブレファリスミン／タンパク質複合体も含む）の吸収スペクトル（in vitro 吸収スペクトル）は invivo 吸収スペクトルとは異なる（特にオキシ型色素の場合大きく異なる）．この結果は，色素顆粒内のブレファリスミン分子やブレファリスミン／タンパク質複合体の状態が，それらを単離・可溶化した場合とは異なることを意味している．さらに，in vitro における蛍光強度は in vivo 蛍光に比べて著しく大きくなる．電子顕微鏡観察によると，色素顆粒内ではブレファリスミン分子が結晶的配向をなして密にパックされていることが推察される．色素分子を可溶化した際に蛍光強度が著しく大きくなる理由は，このような構造が破壊されることによって初期光シグナリング経路が遮断され，吸収した光エネルギーを伝達・変換できなくなったためであろう．図４に仮想的な集光アンテナ複合体と反応中心（ブレファリスミン／ 200 K 複合体）
および分子間のエネルギー移動モデルを示した．
Ｈ＋シグナル
光驚動反応に至る光シグナリング経路の最終段階
では，光シグナルは細胞膜の電気的反応（脱分極性光受容電位の発生）に変換され，この段階で他のシグナリング経路と統合される．細胞膜の脱分極を起こす細胞質シグナルは細胞内イオン濃度の変化であるに違図 3. ブ レ フ ァ リ ス ミ ン 色 素 顆 粒 の 模 式 図．

図 4. 集光アンテナ／反応中心およびH+ 移動のモデル．反応中心はブレファリスミン／200 K複合体である可能性が高い．

8.

いない．ブレファリスミンの蛍光が測定の障害になるため，陽イオン感受性の蛍光色素を用いた手法の適用はうまくいかなかった．しかし，この時我々は，単離したブレファリスミン分子の蛍光強度が H+濃度依存的に変化することに気づいた．さらに，ブレファリス

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ミン分子が色素顆粒膜に埋め込まれた状態にあっても H+濃度依存的に蛍光強度が変化することもわかった．都合のよいことに，Ca2+や K+に対してはほとんど感受性を示さなかった．このようなブレファリスミンの性質は，光センサー分子近傍（図４，膜間スペース）の光依存的 H+濃度変化の観測が可能であることを意味する．H+イメージングの結果，光驚動反応（刺激後500 ミリ秒〜数秒後に起こる）に先立って光感受性の細胞前端部においてのみ H+濃度の低下が観測された（Matsuoka and Kotsuki, 2000）．これは色素顆粒と外膜の間（膜間スペース）の H+が他の区画に移動したために H+濃度が低下したと考えられる．マトリックス部は疎水性のブレファリスミン分子が結晶的配向をなしていると思われる区画であるから，この区画に H+が流入することは考えにくい．外膜から細胞質ゾルに向かって H+が移動し，これによって細胞膜が脱分極すると考えるのが妥当と思われる．光感受性の細胞前端部の色素顆粒においてのみ H+反応が起きるという事実は，H+反応が確かに光反応に関わっていることを強く示唆すると共に，色素顆粒が機能的に分化していることを意味している．

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9. 今後の展望と問題点
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ブレファリスミン結合タンパク質がどのようにし 今元泰・徳永史生（1997）イエロープロテインの構造と光反応．蛋白質 核酸 酵素 Vol. 42, 129-135.てシグナリング経路を活性化するのかという問題を解明するためには，そのドメイン構造から推定される Iseki, M., Matsunaga, S., Murakami, A., Takahashi, T.,
機能を知る必要がある．現在までに，我々は遺伝子クSugai, M. and Watanabe, M. (2000) Mechanism of
ローニングに向けて，精製した 200 K の部分アミノ酸
blue-light sensing in algal photomovement. 13th Int配列の決定を試みてきた．
しかし，通常の条件下で 200Congress. Photobiol., Abstract of ICP, p. 237.
K をプロテアーゼ消化して均一なペプチド断片を得 Kato, Y. and Matsuoka, T. (1995) Photodynamic action of
ることは極めて困難で，現在のところわずか７残基決
the pigment in ciliated protozoan Blepharisma, J. Pro定できているにすぎない．この問題を乗り越えない限
tozool. Res., 5, 136-140.
り未知の光シグナリング系の全容解明はあり得ない． Kida, A., Takada, Y., Kotsuki, H., Tokumori, D., Checcucci,
G. and Matsuoka, T. Primary stages in photosignal
本総説は 2000 年日本原生動物学会奨励賞の受賞講演
transduction leading to step-up photophobic responseの内容に加筆したものである．
in the unicellular eukaryote Blepharisma japonicum.
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