大豆を中心とする植物性食品素材のアレルゲン性はストレス負荷に依存するか小川

正*1・森山達哉1・野村紀子2・高橋浩司3

1

京都大学大学院農学研究科 2太陽化学株式会社中央研究所
3
独立行政法人農業技術研究機構豆類育種学研究室

Chemical Treatment of Plants May Activate Defense Mechanisms andIncrease Allergenicity
Tadashi OGAWA1, Tatsuya MORIYAMA1, Noriko NOMURA2
and Koji TAKAHASHI3
1

Graduate School of Agriculture, Kyoto University, Kyoto 611-0011
2
Taiyo Chemical Co., Mie 510-0844
3
National Agriculture Research Center, Ibaraki 305-8517

ABSTRACT
Many plant allergenic proteins have been isolated and identified as pathogenesisrelated proteins. They are produced when biological, chemical, and physical stresses
activate defense mechanisms of plants. These defense proteins are thought to play animportant role in pathogen resistance, and some defense-related proteins are
significant cross-reactive allergens. Accordingly, the allergenicity of plant foods may
depend on the growth conditions of plants or given stress activating defense
mechanisms. Using turnips and soybeans, we measured the allergenicity of thesemodel food plants after treatments activating their defense mechanisms to determine
whether the allergen content of these plants increase. On immunoblotting profiles,IgE-binding protein bands were found to increase in both turnip and soybean treatedchemically, and the allergenicity given as total ELISA values were also increased in
the stress-given plant samples. These results demonstrated that activating defense
mechanism of plants may increase their allergenicity. Soy Protein Research, Japan 6,22-28, 2003.
Key words : plant, soybean, allergen, allergenicity, pathogenesis-related proteins,chemical stress＊〒611-0011 宇治市五ヶ庄

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大豆たん白質研究 Vol. （6 2003）

ここ数年の食物アレルギーに関する厚生労働省の調なる．従って，本研究では，二十日大根と大豆をモデ査の結果を観察すると，国民の食生活習慣の変化を反ル植物として，人為的にストレスを負荷したときのア映して，アレルギー惹起食品の種類が欧米化に向かっレルゲン性に対する影響を検討した．大豆の場合，主ていることが伺えると同時に，事実，ピーナッツ，果要アレルゲンGly m Bd 30Kは，Jiらによって，大豆特物，野菜などの食品によるアレルギー患者の増加が注

異的感染微生物，Pseudomonas syringeの産生するエ目されるようになった 1)．また，医療・食品加工，給リシター，syringolideのレセプターとして機能してい食業務の関係者の間で深刻な職業病として問題となっることが報告されている 4)．また最近では，レセプタている「ラテックス（ゴム手袋）」アレルギー患者がーとして第二メッセンジャー的に植物の光呼吸に関与

アボガドやリンゴやバナナなどの果物に対してアレルするNADH依存性ヒドロキシピルビン酸還元酵素の活ギーを起こす「天然ゴム−果物症候群（Latex-fruits性を制御する働きがあることが見いだされ，本たん白syndrome）」に陥ることや，野菜類のジャガイモ，ト質の発現はストレス依存性PR-Pとの関連の可能性がマト，ニンジンのアレルゲンたん白質とも交差反応す強く示唆されている 5)．本実験では化学物質（微生物ることが明らかにされ関心をよんでいる2)．また，シ感染時のエリシター効果を持つ物質あるいは除草剤なラカバの花粉が原因の花粉症を惹起するアレルゲンたど）の投与による化学ストレスを負荷し，アレルゲンん白質（Bet v 1）も多くの果物アレルゲンたん白質とたん白質の変動を検討した．

高い相同性を有することが立証され，免疫交差性を有方する共通アレルゲンが広く植物界に分布することは明法白な事実となりつつある．また一方では，植物病理学研究者によって，植物界に普遍的に存在あるいは誘導されることが知られるようになった「感染特異的たん実験材料
二十日大根（Brassica rapa）は品種赤丸二十日大根

白質（病原抵抗応答性あるいはストレス応答性たん白を北海道アタリヤ農園より購入したもの，大豆質）：pathogenesis related proteins（PR-P）あるいは（Glycine max）は（独）農業技術研究機構より恵与さ

defence protein (DP)」（Table 1）の仲間にアレルゲンれた５品種タチユタカ，ズズカリ，スズユタカ，タチたん白質分子と相同なたん白質が次々と見いだされ，ナガハ，ユメミノリを実験に供した．

植物由来アレルゲンたん白質間に共通点の存在がうか

患者血清

び上ってきた3)．このようにPR-Pがアレルゲンの有力患者血清は，インフォームドコンセントの実施されな候補になるということは，野菜や果物を傷つけ，腐た成人患者の血清を国際試薬（東京）より購入したもらせたり，化学薬品で処理したり，物理的なストレスのおよび大豆にてアナフラキシーを経験した幼児よりを与えた環境で栽培した後，収穫した場合アレルゲン提供された血清を使用した．成人患者のアレルギー履性，すなわちアレルゲンたん白質成分の含量が増加す

歴は，RAST法による診断で大豆をはじめコムギ，ジることを意味している．最近，蔬菜や果物を自然な環

ャガイモ，トマト，パセリなど多くの植物性食品素材

境で農薬や化学肥料を与えないで栽培する自然有機農に反応することが知られているもののなかから，二十法が推奨されている．この場合，ストレスの少ない従日大根，大豆のたん白質成分を認識するIgE抗体を保来の温室栽培による蔬菜と，ストレスに晒される露地有する血清を実験に供した．

栽培物とではアレルゲン性と言う観点からは，従来の健全性の概念とは異なる複雑な問題を提起することに

Table 1. Pathogenesis-related protein and related allergens
Characteristics/Assignment
Mol. mass (kDa)Class
Anti-fungi/class123β-1, 3-glucanase
25-35
PR-225-35
Anti-fungi/class124 chitinase
PR-3
PR-4
13-19
Anti-fungi/class12 chitinase
PR-5
22-24
Anti-fungi/thaumatin-like protein
PR-828Class 3 chitinase
PR-939-40
Peroxidase isoenzymes
17-18RNase/Bet v 1 homologue
PR-10
10-12
Lipid transfer proteins (nsLTP)
PR-14

大豆たん白質研究 Vol. （6 2003）

PlantsBananaAvocado, banana
Latex
Cherry, pepper
Latex, hevamin
TomatoBirch pollen, celery, apple
Apple, soybean, wheat

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大豆アレルゲンGly m Bd 30K特異的単クローン抗体

ンプルとした．

（F5 mAb）

大豆

抗体は，マウス由来F5 mAb産生ハイブリドーマを一夜水浸漬した大豆種子を５倍量の抽出Buffer

Aでポリトロンホモゲナイザーにてホモゲナイズした用いて前報6)に従って調製した．

のち，二重ガーゼで濾過し，濾液の少量（100〜二十日大根の栽培とストレス負荷

200 mL）を２倍濃度SDS-PAGEサンプルBufferと等量

栽培条件

混合し，加熱（100℃）後，不溶物は遠心除去し，後二十日大根は大学構内温室において，予めオートクレーブ殺菌したバーミキュライト：パーライ

述のSDS-PAGEに用いた．

ト＝１：１の混合土を培地とするプランターを用い，ソディウム・ドデシル硫酸−ポリアクリルアミド電気

オスバン殺菌した種子を直播きし，シロイズナズナの泳動（SDS-PAGE）

室内栽培法 に準じて栽培した．養分として1,000倍希SDS-PAGEはLaemmlliらの改良法8)にしたがって実施

釈ハイポネックスを週一度の割合で施肥した．温室内した．二十日大根試料の場合１レーン20μg，大豆の場

栽培温度：27℃〜８℃（平均18℃）日照：167時間

合は１レーン当たり１μgを泳動後，分離したたん白質（30日間）の染色は，Coomassie Brilliant Blue R-250（CBB）に7)

ストレス負荷は化学物質，サリチより実施した．

ル酸（salicylic acid: SA）の葉面塗布により行った．

イムノブロット

ストレス負荷条件

栽培70日後の成熟結球した二十日大根葉に，それぞれイ ム ノ ブ ロ ッ ト は 既 報 9)に 従 い 実 施 し た ． S D S -1 mMおよび25 mMサリチル酸溶液を，一日一回，一PAGE後のサンプルをニトロセルロース膜上に転写週間にわたり本葉の両面にスプレー塗布し，80日目にし，患者血清を用いた免疫染色では，HRP標識抗ヒト収穫した．

IgE抗体により，F5マウスmAbではHRP標識抗マウス

大豆の栽培条件とストレス負荷

IgG抗体でそれぞれ発色検出を実施し，膜を大豆各種子は，Scheme 1に示す栽培計画に従ってAmersham Pharmacia社製のECL Westernblotting（独）農業技術研究機構実験圃場に直播し，完全登熟まDetection Reagentsで処理し，オートラディオグラフで栽培して収穫した．ストレス負荷はScheme 1に示す

ィー用Ｘ線フィルムに露光感光させ検出した．

登熟過程で化学物質として除草剤，ベンタゾンの葉面ELISAによる総アレルゲンの測定散布法にて実施した．ストレス負荷栽培実験は２区画96穴マイクロタイタープレートの各ウエルに，大豆において同一条件で実施した（Exp. 1およびExp. 2）．の場合総たん白質量2.5μg/well（100μL Buffer A）を，Scheme 1
播種：平成15年７月４日（８月10〜11日開花）
ストレス処理化学物質：ベンタゾン／市販除草剤ザバグラン溶液（ベンタゾン濃度40％）
ストレス処理条件：
・実験１（T-1） ８月21日（開花後１週間）2,000倍希釈液・30リットル/a；９月５日（開花後３週間再散布）
1,000倍希釈液・30リットル/a（２度散布）・実験２（T-2） ９月５日（開花後３週間）500倍希釈液・30リットル/a（１度散布）

二十日大根の場合1μg/wellを４℃１晩放置でコートした．これに患者血清，あるいはF5抗体を処理し，結合した抗体をHRP標識抗ヒトIgE抗体，あるいは抗マウスIgG抗体を用いて免疫染色した後，TMB MicroWell Peroxidase Substrate Systemを用いて一定時間発色した後，マイクロプレートリーダーにて450 nmの吸光度を測定した．
デンシトグラムによるアレルゲンたん白質の定量的測定
イムノブロットによりX線フィルム上に得られた免疫染色されたたん白質バンドの強弱は，それぞれのバンドを画像解析ソフトにより正確に切り出し，積分し分析試料の調製てIDV（integrated density value）として数値化した

二十日大根

収穫した二十日大根は葉部・根部とも水後，バンドの変動を比較した．また，NIH Image 1.61

洗後新鮮重の４倍量の抽出Buffer A (30 mM Tris-によりデンシトグラムを作製し，各ピークの面積を，HCl, pH8.0, 1 mM EDTA)にて，ポリトロンホモゲナ

クロマトグラフィーで汎用される半値幅法S=1/2 hw

イザー（レベル３）により３分間ホモゲナイズした後，により算出し，数値化した（S，面積；h，ピーク高；

２重のコットンガーゼで濾過後，12,000 rpm，４℃，w，ピーク高1/2におけるピーク幅）．

20分遠心分離を行って上澄みを回収し，70％硫安沈殿画分を同上の遠心分離条件で回収した．これを抽出
Buffer Aに溶解し，同bufferで透析後SDS-PAGE用サ

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大豆たん白質研究 Vol. （6 2003）

Fig. 1A. Changes in protein contents by treatment
activating defense mechanism. Experimental
details for SDS-PAGE and the stresstreatment are described in the text.

Fig. 1B. Changes in allergenicity by treatment
activating mechanism. Experimental details
for immunoblot are described in the Materialsand Methods. Allergenicity is defined to beallergen contents as described in the text.

結果と考察二十日大根におけるIgE結合性たん白質とストレス負荷による変動
二十日大根はSAストレス処理前後において見かけ上成育状況における差は観察されなかった．Fig. 1Aに示されるSDS-PAGEの結果より，ストレス処理によるたん白質成分の増減は見かけ上観察されなかった．
しかし，Fig. 1Bが示すように，患者血清は18，22，23，25，37 kDa付近の各たん白質バンドを強く認識し，更に，SA負荷後の免疫染色の各バンドの挙動は，デンシトグラムにより解析した結果，25および37 kDaたん白質において染色強度が増加，即ちアレルゲンたん白質の増加を，一方，18，22および23 kDa各成分に関して減少する傾向が観察された．SA非処理のコントロールのバンド強度を１として，増減をそれとの比で示した結果がTable 2である．25および37 kDaたん白質成分は，25 mMのSA処理で，アレルゲン含量に約２倍の増加が観察された．同様に，ELISAによってIgE結合たん白質量の総量の変化を測定したのがFig. 2である．本患者にとって，コントロール（非ストレス栽培）に比べて１および25 mM SAストレス負荷二十日大根中のたん白質のIgE結合量，すなわち総アレルゲン性は増加したことを意味している．実際は，イムノ
ブロットで示されたように，ストレス負荷によって一部で増加，一部で減少するアレルゲン成分もあり，ELISAでの反応性の強弱は必ずしも真のアレルゲン性を反映しているとは言い難い．患者によって認識する
大豆たん白質研究 Vol. （6 2003）

Fig. 2. Changes in allergenicity of Tachiyutaka bytreatment activating defense mechanism.
Allergenicity measured by ELISA using patient'sserum. Experimental details for ELISA aredescribed in the Materials and Methods A, in thecase of chemical stress with 25 mM SA; B, in thecase of chemical stress with 1 mM SA; C, in thecase of chemical stress without SA as a control.
Table 2. Changes in allergenicity by treatment
activating defense mechanism
Changes in allergenicity
IgE-binding
1 mM SA*
25 mM SA*protein (kDa)
2.09 ↑
37
1.98
25
2.24 ↑
1.11
230.63 ↓0.68
0.39 ↓
220.53180.78 ↓0.62*Stress was given by salicylic acid (SA) administration.
Values are represented by a ratio to control as 1.

25

Exp. 1
3.5
3

3.14

Exp. 12

3.27

2.68
1.5

IDVIDV

2.5
2
1.5
1

1.49

1.61

1.82

10.50.5
00C

T-1

C

T-2

T-2

Exp. 2Exp. 2
3.5

2

1.73

1.66

1.62

3

1.5

2.95

2.84

2.81

CT-1

T-2

2.5

IDV

IDV

T-1

12
1.5
1

0.5

0.5
00C

T-1

T-2

Fig. 3. Immunoblot patterns and densitgrams measured with F5 mAb raised against Gly m Bd 30K. Experimental
details for immunoblot are described in the Materials and Methods. A, Tachiyutaka; B, Yumeminori; Lane
1-6, Experiment 1; lane 7-12, Experiment 2; Lane 1･4･7･10, control; lane 2･5･8･11, T-1; lane 3･6･9･12, T-2.
たん白質が異なることから，それぞれの患者に対するアレルゲン性は，イムノブロットによる免疫染色レーンの認識たん白質の個々のデンシトグラムのプロフィールによって判定されなければならない．同様な結果
はA-R. Haenninenら10)によっても二十日大根について報告されており，ストレス負荷によるアレルゲンたん白質の増加は立証されたといえる．また，ストレス負荷前に既に認識たん白質が存在するのは，これらの多くが一般に構成たん白質として植物体に発現しているからである．予備的に37 kDaたん白質はSDS-PAGE後

Table 3. Changes in allegenicity by treatment withchemical stress
Changes in allegenicity
Allergen(Protein contents)
Exp. 1
Exp. 2
Gly m Bd 30K
T-1
T-2
T-1
T-2
Tachiyutaka
1.17
1.22
1.08
1.21
0.95
0.93Yumeminori
0.96
0.98
Values are represented by a ratio to control as 1.
Experimental conditions of T-1 and T-2 were describedin the Materials and Methods.のイムノブロットのバンドを切り出し，前報11)で示したＮ-末端アミノ酸配列解析法を用いて決定した結果を，コンピューターによるデータベース検索を行った
ところ，37 kDaたん白質は植物において広く分布するグルタチオンS-トランスフェラーゼと相同なたん白質と推定された（未発表データ）．
大豆における主要アレルゲンGly m Bd 30K（Gm30K）
および総アレルゲン量のストレス負荷による変動
F5モノクローナル抗体を用いたGm30Kの変動解析 除草剤散布によるストレス負荷に伴う大豆抽出液中のGm30Kの変動をF5抗体を用いたイムノブロットで追跡した．Fig. 3はタチユタカおよびユメミノリに関す

Table 4. Changes in allergenicity by treatment activating
defense mechanism
Changes in allergenicity
Allergen(Protein contents)
Gly m Bd 30K
T-1 (Exp. 1)
1.11
Tachiyutaka
Suzukari
1.15
Suzuyutaka
2.05
Tachinagaha
1.16
Values are represented by a ratio to control as 1.
Experimental conditions are described in the Materialsand Methods.

るイムノブロットのパターンを示し，Table 3はそれ

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大豆たん白質研究 Vol. （6 2003）

Fig. 4. Changes in allergenicity by treatment activating defense mechanism. Immunoblot was obtained using
patient's serum. A, Tachiyutaka; B, Yumeminori. Lane CBB, protein stained by CBB; lane 2, T-1; lane 3, T-2.
らをIDV数値化した結果を示している．SAによるストレス負荷で，タチユタカの子葉中のGm30Kは少しではあるが増加する傾向を示した．一方でβ-コングリシニンのα-サブユニットを欠失する低アレルゲン品
種ユメミノリにおいてはGm30Kアレルゲンが減少することが観察された．Table 4はユメミノリ以外の大豆品種についてELISAによるアレルゲン性の増加を検討した結果である．イムノブロットの結果を裏付ける様にアレルゲン性の増加する傾向を示した．
患者血清により評価したアレルゲン性の変動

Fig. 4

Table 5. Changes in allegenicity by treatment activating
defense mechanism
Changes in allergenicity
IgE-binding(protein contents)
protein
T-1
T-2(allergen)
β-Conglycinin
1.08
1.16
αsubunit
Gly m Bd 30K
1.19
1.48Values are represented by a ratio to control as 1.
Experimental conditions, T-1 and T-2 are described inMaterials and methods.

は，大豆加工食品の摂取によってアナフィラキシーを経験した患者の血清を用いたイムノブロットの結果で致する．一方，ユメミノリのイムノブロットはβ-コある．多くのたん白質成分が血清中のIgE抗体によりングリシニンのαサブユニットの欠失を示し，患者血認識されている．デンシトグラムにより解析すると，

清によるバンドの免疫染色像は全く観察されない．一Table 5に明らかなごとくタチユタカにおいてβ-コン般に既成概念として，子葉などの貯蔵組織におけるたグリシニンのαサブユニットおよびGm30Kがコント

ん白質成分の含量のストレス依存性は一般的に認めら

ロ ー ル に 比 し て 増 加 し て い る こ と を 示 し た． 特 にれないとされているが，今回の実験において増加が観Gm30Kの変動は，F5抗体によって測定した結果と一察された．

要約

大豆をはじめ植物性食品素材中のアレルゲンたん白質成分が単離・同定され，その多くが植物の防御機構として知られる，感染特異的たん白質に属するたん白質であることが明らかにされている．
従って，植物性食品素材のアレルゲン性は，これら感染特異的たん白質の増減する栽培条件，すなわちストレス負荷の大小に依存する可能性が示唆される．本実験では，モデル植物として二十日大
根と大豆を用い，化学的ストレス負荷によって患者血清中のIgE抗体結合性たん白質の含量が変化するかどうかをELISA法とイムノブロット法を用いて検討した．その結果，二十日大根においては２，３の成分（25kDa，37kDaたん白質成分）が，大豆においては主要アレルゲン，Gly m Bd 30Kが，ストレス負荷によって増加する事実を立証し，ストレス負荷がアレルゲン性の強弱に影響を及ぼすことを明らかにした．

大豆たん白質研究 Vol. （6 2003）27

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