商品コード 53150

ATAC-Seq Kit

日本語簡易プロトコル

英語版 version B4（最新の英文プロトコルも必ず確認してください）

細胞サンプル（Cell Sample Preparation）＊実験を始める前に、SPRI beads を 4℃の冷蔵庫から取り出して室温に戻してください。

1. 1.5 ml の遠心チューブに 50,000-100,000 細胞を用意します。
2. チューブを遠心します。500 x g, 5 min, 4℃。ペレットを確認しやすいように、ペレットが集まる向きがわかるようにしてから遠心してください。ペレットが観察されない場合には、さらに 1,000 x g, 5 min, 4℃を行います。
3. 上清を除き、100 μl の氷冷した PBS を加え、500 x g, 5 min, 4℃で遠心して細胞を回収します。
4. ペレットが崩れないように上清を丁寧に除き、 100 μl の ATAC Lysis Bufferを加えて、細胞を懸濁します。
5. 懸濁したサンプルを氷上の PCR チューブに移し、素早く遠心します。500 x g,10 min, 4℃。この間に Tagmentation Master Mix を用意します。
6. ペレットを崩さないように上清を丁寧に除き、速やかに Tagmentation 反応と精製ステップへ進みます。
（ポイント！ペレットを崩さずに余分な ATAC Lysis
buffer を除くことは非常に重要な作業です）

組織サンプル（Tissue Sample Preparation）*このプロトコルは、20-30 mg の組織の処理を想定しています。
実験を始める前に、SPRI beads を 4℃の冷蔵庫から取り出して室温に戻してください。

1. 15 ml のチューブに 5 ml の氷冷した PBS を入れたものと、氷上に 5 cm のペトリディッシュを用意してください。
2. サンプルをペトリディッシュに取り出し、カミソリ刃を用いて、細かく裁断し、先端を切ったピペットを用意して、1 ml の PBS を使って PBS の入った 15ml チューブに移してください。
3. 15 ml チューブを遠心します。500 x g, 5 min, 4℃
4. 上清の PBS を除き、1 ml ATAC Lysis Buffer を加えます。
5. 先端を切るなどして穴を大きくしたチップを使って、サンプルを 1 ml のdounce homogenizer (例: #40401 Dounce Homogenizer, 1 ml)に移し、氷冷しながら、ゆっくりと 30 ストロークします。このとき、small-clearance, type B をお使いください。
6. ホモジナイズしたサンプルは、40 μm の mesh strainer (例：Falcon #352340)
を使って夾雑物を除き、1.5 ml のエッペンドルフチューブに回収します。回
収したらすぐに 10 μl を取り出し、細胞数を計測します。
7. トリパンブルー(0.4%)を加えて細胞数を計測します。核が染色されているものだけを計測します。
8. 回収したチューブを混和後、50,000-100,000 細胞を別の 1.5 ml チューブに移します。
9. 遠心して 細胞を 回収しま す。500 x g, 5 min, 4℃。遠心している間に、Tagmentation Master Mix を用意します。
10. 上清を除き、速やかに Tagmentation 反応と精製ステップへ進みます。

Tagmentation Reaction and Purification

このプロトコルは、50,000-100,000 細胞、20-30 mg の組織の処理を想定しています。

1. 50 μl の Tagmentation Master Mix を各チューブに加えます。細胞を懸濁します。氷冷せずに室温で良いです。
2. 800 rpm で撹拌しながら 37℃、30 分間反応します。
3. 1.5 ml のチューブに移し替えます。
4. 250 μl の DNA Purification Binding Buffer と 5 μl の 3 M Sodium Acetate をそれぞれのサンプルに加えて混合します。このときの溶液の色を確認します。
5. DNA Purification Binding Buffer には、pH 指示薬が含まれます。図１の左のチ
ューブのように黄色であれば次のステップに進みます。紫色やオレンジ色の場合は pH が高い状態を示していますので、一度に 5 μl ずつ 3M Sodium
Acetate を色が黄色くなるまで加えて、混合します。
※このステップをしっかりとおこなわないと DNA の精製がうまくいかなくなるので注意すること。手順に従って、適切な pH に溶液を調整すること。

図 1: pH に対応する溶液の色。
6. ピペッティングしてよく撹拌します。
7. DNA purification column を、サンプル名を記載した付属の遠心チューブに取り付けます。
8. サンプル DNA purification column に加え、蓋を閉めて 17,000 x g (14,000 rpm)

で 1 分間遠心します。
9. Flow-through した溶液を除き、カラムを再びチューブにセットします。
10. 2.4 ml の Wash Buffer に 9.6 ml 100% EtOH を加えて調製した Wash Buffer（最終エタノール濃度 80%）を用意し、750 μl を DNA purification column に加えて蓋を閉めます。
11. 17,000 x g (14,000 rpm)で 1 分間遠心します。
12. Flow-through した溶液を除き、カラムを再びチューブにセットします。
13. その後、DNA purification column のキャップを開けたままで、17,000 x g (14,000rpm)で 2 分間遠心します。
14. カラムを新しい遠心チューブにセットします。
15. 35 μl の DNA Purification Elution Buffer をカラムの真ん中のフィルターに滴下して、キャップをして１分間室温で放置します。
16. 17,000 x g (14,000 rpm)で 1 分間遠心します。
17. チューブに DNA が精製されます。DNA purification column は捨ててください。
18. 精 製 さ れ た DNA は 、 -20 ℃ で 保 管 可 能 で す 。 も し く は こ の ま ま PCR
Amplification of Tagmented DNA のステップに進むこともできます。

PCR Amplification of Tagmented DNA

注）KAPA Real-Time Library Amplification Kit などを使用する場合、最初の 72℃の伸長反応ステップは不要です。

1. PCR 反応液を用意します。マルチプレックスシーケンスを実施する場合には、適切なプライマーの組み合わせを利用してください。各サンプルは、一つの i7 Indexed Primer と一つの i5 Indexed Primer の組み合わせが必要です。キットには 4 種類ずつ Primer が用意されているので、4ｘ4＝16 種類の組み合わせが可能で、16 サンプルのマルチプレックスが可能です。このIndexed Prime は、illumina 社の Nextera adapters を元にしています。
Use one i7 Indexed Primeri7 Indexed Primer 1 = i7 N701
i7 Indexed Primer 2 = i7 N702
i7 Indexed Primer 3 = i7 N703
i7 Indexed Primer 4 = i7 N704

And use one i5 Indexed Primer
i5 Indexed Primer 1 = i5 N501
i5 Indexed Primer 2 = i5 N502
i5 Indexed Primer 3 = i5 N503
i5 Indexed Primer 4 = i5 N504

2. ヒートリッドのある PCR 機器を用いて、次のようなプログラムで行います。

3. SPRI ビーズを使ったライブラリーDNA の精製を行います。
(ア) PCR 反応液に、室温に戻した SPRI beads solution を、よく混ぜてから、60 μl（1.2X Sample Volume）を加えます。
(イ) ボルテックスで撹拌し、5 分間室温で放置します。
(ウ) マグネットを使ってビーズを集めます。
(エ) 溶液を除きます。
(オ) （ビーズはマグネットに集められたまま）80%エタノール溶液を 180μl 加えます。
(カ) 室温で 30 秒放置します。
(キ) 上清を除きます。
(ク) 再び 80%エタノール溶液を 180 μl 加え、同様の操作をします（オキ）。
(ケ) チューブの蓋を開けて、残存するエタノールを蒸発させます（約 2-5 分間）。ビーズの色がつやつやした感じからつや消しになったら、次のステップにいきます。
(コ) チューブをマグネットから離して、20 μl DNA Purification Elution Bufferを加えます。
(サ) 蓋をしてボルテックスします。
(シ) 室温で 5 分間静置します。
(ス) マグネットでビーズを集めます。
(セ) ビーズが回収し上清が透明になったら、上清を新しいチューブに移し替えます。
4. ライブラリーDNA が回収できました。ライブラリーは、Bioanalyzer,TapeStation などを使ってサイズの確認をするか、NGS 用の定量キット（例：KAPA Biosystems, Catalog No. KR0405）を使って定量してください。

Index Primers and Sample Sheet information
Index 1 (i7) Primers
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[i7]GTCTCGTGGGCTCGG
Index 2 (i5) Primers
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[i5]TCGTCGGCAGCGTC

Sequence for Read 1 and Read 2 adapter trimming: CTGTCTCTTATACACATCT.

References
1. Buenrostro, J. D., et al. (2013) Nat. Methods 10: 1213-1218.
2. Adley, A., et al. (2010) Genome Biol. 11.
3. Corces, M. R. et al. (2017) Nat. Methods 14: 959-962.

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