油汚染土壌の原位置バイオレメディエーション
In-Situ Bioremediation Studies of Oil Contaminated Soil田中宏幸*1

藤長

Hiroyuki Tanaka

愛一郎*2Aiichiro Fujinaga

浦上秀男*3

笹本HideoUragami

Yuzuru Sasamoto

清都通生*2Michio Kiyoto

譲*2

要旨
原位置バイオレメディエーションは、微生物分解を促進させる物質を地盤中に供給し、汚染土壌を掘削することなく有害な化学物質を処理する方法である。本研究では、酸素徐放剤を使用した油汚染土壌に対する原位置バイオレメディエーションの室内実験および現場適用を実施して、次のような結論を得た。
① 関東ロームで構成された油汚染土壌を、透水係数が 10-3cm/s となるように充填させた条件で室内実験を行った
結果、微生物分解による油分除去効果が確認された。その分解速度は、酸素供給が限定されているために、スラリー処理の実験結果よりも低い結果となった。
② カラム実験と実施工の結果より、酸素徐放剤による酸素供給の影響距離は 1m 以内であると判断された。また、酸素供給により油分の低減促進が確認できた。

キーワード：油汚染土壌 バイオレメディエーション 原位置 関東ローム カラム 微生物群集解析

１．はじめにすく、浄化期間の予測も困難であることが示されている。
これには、環境中において汚染物質の存在にはばらつきが近年、顕在化している汚染土壌の対策として、企業は、あること、微生物の分解速度について正しい把握がなされ③従業員の健康ていないことがあげられる。そこで、地盤中の環境条件をなどに積極的に取り組む姿勢を強めているう

想定した室内実験で微生物分解量を調査し、実サイトのデえ、ブラウンフィールド（化学物質などで汚染された土地、ータと比較することにより、バイオレメディエーションのまたは汚染は浄化されたが活用されていない土地）の活用有効性を評価した。

①周辺環境への配慮
影響の抑制②資産価値の向上を促進させる社会機運も高まっている。そのような背景に

また、2005 年 3 月に環境省と経済産業省により「微生物おいて原位置浄化のニーズが高まり、分解処理であり経済によるバイオレメディエーション利用指針」が策定された。

性に優れるという観点から微生物処理（バイオレメディエ

これは主に、微生物製剤を注入して浄化する手法であるバーション）が注目されている。

イオオーグメンテーションを対象とした、その安全性の評

原位置でバイオレメディエーションを行うためには、酸価についての取りまとめである。このなかで、バイオステ

素供給源や栄養塩などを注入し地盤中の微生物活性を促進ィミュレーションについても、このガイドラインに準じた化することが必要である。土壌中に生息する様々な微生物手法で評価することが望ましいとされていることから、今は、酸素や栄養塩を得ることで活性化し、油分を複合的な回実施した処理により活性化する微生物の属性を調べ、病反応経路により最終的に二酸化炭素にまで分解していく。

原性微生物の発生の有無を確認した。

このように、現場由来の微生物を促進化させる手法は、バイオスティミュレーションとよばれている。本研究では、

２．施工サイトの概要

その分解効率のかぎを握る促進物質の供給法として、遅効性の酸素供給源を利用して、数年間という比較的長期間で低減化し、低コスト化を目指した。

施工を行ったサイトは、操業中の工場敷地である。燃料タンクから伸びる送油管から漏洩した重油による汚染が、これまでに実施した原位置浄化の知見から、バイオレメ地下水の流れの影響で拡散していた。汚染源付近の 5,000

ディエーションの浄化効率は、環境の条件に影響を受けや～10,000 mg/kg という高濃度の汚染土壌は場外処分し、汚*1

技術研究所 土木環境技術研究部門*2

大阪本店 土木技術部*3

東京本店 土木営業部

染源から地下水下流側 20m の敷地境界までの領域に対して

供 給高
掘濃削度
除油去分

原位置のバイオレメディエーションによる汚染の低減化の適用を行った（図 1、表 1）。
このサイトの地盤は、関東ローム層で構成されていた。

酸素徐放剤

5m

敷地境
界

栄養塩

4m

1m

関東ロームは細粒分が大部分を占める火山灰土であるため、微生物分解促進化低い透水性が物質供給能の制限要因になると懸念されたが、毛管帯

現場透水試験では、10-3cm/sec オーダーの良好な結果が得られた。

注入井戸

さらに、事前調査としてボーリングを行い、深度ごとの地下水流向汚染を調査した。汚染物質は、全石油系炭化水素（TPH）としてガスクロマトグラフ（GC）による分析（TPH-GC）を行

観測井戸
浄化効果を評価

図 1 原位置バイオレメディエーションの装置

い、その分析チャートから軽油または A 重油であると判断した（図 2）。油分は、深度方向において、地下水面付近がC6C10C28C44最も高い分布を示しており概ね 1,000～3,000 mg/kg の TPHが検出され、敷地境界近傍でも油膜と油臭の発生が認められた。また、原位置浄化エリアにおいては、不飽和層の汚染は確認されなかった。

３．実験および施工の方法
3.1 室内実験

図2

3.1.1 試料

油汚染土壌の TPH チャート

試験土は、市販の赤玉土（栃木県産）を粉砕して粒径 150～850μm を分取し、A 重油を混合した模擬汚染土壌を使用

地 50ml に懸濁させ、スラリー試験を行った（図 3）。全量分析をした。

行うため、分析回数分の培養を設置し、室温 20℃、100rpm

土壌をカラム（図 4）に充填した条件を表 2 に示す。こ-3のとき、透水係数は 10 cm/sec オーダーであった。

で好気的に振とう培養し、定期的に TPH-GC を分析した。
(2)カラム試験

3.1.2 実験装置

カラム実験装置を図 4 に示す。内径 3cm のアクリルパイ（1） スラリー試験

プに模擬汚染土壌を約 10cm の長さに充填したものを 4 本直模擬汚染土壌中の A 重油に対する、実サイトの地盤中に生列に連結し合計長さ 40cm の土壌カラムに、空気の曝気によ育する微生物の生分解能を把握するために、容量 200ml の三り 7～8 mg/L にした溶存酸素(DO)と栄養塩からなる培養液

角フラスコ内に 10g の土壌を、無機塩と A 重油を添加した培を上向流で連続通水した。このときの実流速は、実サイト

表1
処理概念

原位置バイオレメディエ－ション施工概要

原位置好気性バイオスティミュレーション

期間2003 / 5 ～ 2006 / 3

浄化対象物質

汚染源は場外処分

軽油あるいはA重油
開始時の油分含有量：TPH 1,000～3,000 mg/kg、油膜・油臭あり（本報文で取り扱う領域）
地盤条件
供給物質
施工結果

関東ローム、現場透水試験値；3.9×10-3 cm/sec、動水勾配；0.01、推定実流速；0.003 cm/min
酸素：酸素徐放剤を孔内に吊り下げ定期的に交換

栄養塩：定期的に注入井戸から投入
敷地境界では排水基準（n- HEX 5 mg/L）を満足
境界手前5m域に油分が残留（本報文で取り扱う領域）

表2

カラムに充填した土壌の性状

土壌性状
土壌の種類

赤玉土（栃木県産）

粒度(μm)

150～850

強熱減量(g/kg) 1)

103

ｱﾛﾌｪﾝ量(g/kg) 1)

243

充填条件
固相率(%) 2)仮比重25.2

注入井戸0.74

透水係数(cm/sec)
混合物質(40cmｶﾗﾑ）

1.1×10A重油 1,000mg/kg（10cmｶﾗﾑ）A重油 300mg/kg

表3

酸素徐放剤

-3

写真 1

酸素徐放剤

回、カラムに実サイトの地下水を浸漬させて行った。

カラム実験の通水条件(3)分析方法

10cmカラム
促進系
ｺﾝﾄﾛｰﾙ系

40cmカラム

DO(mg/L)

207～8

添加物質

無機塩培地
H2O2 4mg/L

NaN3

無機塩培地

流量(ml/min)

0.5

0.5

0.05～0.3

通水中の土壌間隙中を移動する液相の状態を把握するために、各サンプリングポートから採水し、DO と A 重油資化性菌を測定した。
土壌の分析用試料は、実験終了後にカラム内の土壌を取り出し通水方向に分割して採取した。こうして得られた試料に対して、TPH-GC または赤外分光分析法による炭化水素

ｼﾘｺ栓（TPH-IR）と、A 重油資化性菌を測定した。

フラ スコ

3.2 実施工

培地50ml実サイトにおける施工には、図 1 に示す処理システムを土壌10g使用した。注入井戸に布製の袋に充填した酸素徐放剤を設
振とう培養

置（写真 1）し、モニタリング井戸を地下水下流側 1m と 5mに設置した。酸素徐放剤は定期的に交換し、浄化を 3 年間

図 3 スラリー実験装置実施した（表 1）。
注入井戸とモニタリング井戸内の地下水について、ｱｸﾘﾙﾊﾟｲﾌﾟ
内径30mm

TPH-GC、地下水位、DO、酸化還元電位（ORP）、A 重油資化性菌を定期的に分析して、地盤中の環境の変化とバイオレメディエーションの促進状態を把握した。

土壌充填
長さ100mm
ﾃﾌﾛﾝ樹脂ﾊﾞｯｸP
ｻﾝﾌﾟﾘﾝｸﾞ ﾎﾟｰﾄ

飽和DO
無機塩培地

図 4 カラム実験装置

3.3 微生物群集解析
バイオレメディエーションの促進化により出現する微生物を把握し、また病原性微生物の存在を検討するために、実験終了後のカラム内の土壌から 16S ｒRNA 遺伝子を抽出して、ランダムクローニング法により増幅させた DNA 配列を解析した。さらに、それぞれの配列を GenBank で検索し、近縁の微生物種を同定した 4)。の実流速を想定した条件に設定した（表 3）。実流速の算出
では、有効間隙率を 0.1 3) とした。

４．結果と考察

さらに、油分の低減効果における微生物分解の寄与度を把握するため、上記と同様の装置で 10cm のカラム 1 本を用いて、微生物分解促進系と分解活性を抑制させたコントロール系を設置した実験（表 3）を行った。
模擬汚染土への微生物の添加は、生分解実験開始前に 1

4.1 スラリー試験
汚染濃度の異なる 3 系列の土壌をスラリーで培養を行い、
図 5 に示す結果を得た。油分供給量を高めても微生物分解の著しい遅延は生じることなく、同じような分解挙動を示した。これにより、酸素が豊富に供給される条件では、4めに、カラム上流側から流入した相対的に高い DO がみずみ

週間で 1,000 mg/kg 以上の分解能があることがわかった。

ちを通過してしまうことや、大気から透過してくる酸素の影響が考えられる。以上より、7～8 mg/L の DO を供給し4.2 カラム試験た場合、0.07 cm/min よりも低い流速では、その影響距離(1)40cm カラムは 100cm に満たないことが示唆された。

40 cm のカラム装置に 2 ヶ月にわたり培地を連続通水さ

さらに、図 6 中央のグラフに実験開始前と終了後の土壌せたときの、DO、TPH-GC、A 重油資化性菌の変化を図 6 にの油分濃度を示す。開始前に 830 mg/kg であった油汚染土示す。実流速を 0.5 cm/min と 0.07 cm/min の 2 段階に設壌は、2 ヶ月の通水により油分が低減化され、10cm から 40定し、各サンプリングポートにおける DO を測定した。実流cm の距離の変化に伴い TPH は 560 mg/kg から 730 mg/kg に速が 0.5 cm/min のときよりも 0.07 cm/min の場合に酸素消なった。これは、DO の消費量の挙動と一致していることか費量は大きく、さらに 0.07 cm/min の条件では、通過距離

らうかがえる微生物分解と、土粒子からの物理的な脱着作と DO の相関性が低下する結果となった（図 6 左）。

用によるものと考えられる。ただし、これまでの実験で得られた結果から、土壌の油分分析値はばらつきが大きく、さて、地下水流により飽和透水層を移動する DO は、化学距離と油分変化量の相関性は明らかではない。

的または生物的な消費の影響を受け、その消費量は経過時間と距離間での DO 変化量との擬一次反応に従うと仮定で液相の A 重油資化性菌は、104～105 cfu/ml で推移し、まきる 5,6) が、2 つの流速条件における DO 到達の試算結果を、た土壌中の菌数は、液相よりも 1～2 オーダー多いことがう

図 6 左のグラフにおいて点線で示す。これによると、通過かがえ、油を分解する微生物が実験中、十分に維持されて距離に伴い DO は低下していく傾向が確認でき、初期値 7.8いたことがわかった（図 6 右）。

mg/L が 0.5 cm/min のときには 100 cm の移動で 0.3 mg/L(2)10cm カラムに、0.07 cm/min のときには 50 cm でほとんど DO は消費さ40cm のカラム実験で確認された油分の低減効果についれることになり、実測値よりも DO の消費は大きいことになて、微生物分解量と物理的除去量の内訳を把握するために、る。この原因には、実験の採水時には流速を上昇させるた

さらに低濃度の汚染土壌を充填した 10cm のカラムを使用して、8 週にわたり通水する実験を行った。そのときの土壌中の TPH -IR と A 重油資化性菌の変化を図 7 に示す。

TPH残存率(%)

100

TPH は、8 週間で 280 mg/kg から 140 mg/kg まで低下し、80除去効率は、促進系が 52%で、コントロール系より 15%高か60った。また A 重油資化性菌は、促進系では植種直後の 102

40cfu/g オーダーから 8 週後には 106 cfu/g オーダーに増加20していた。コントロール系では増殖が確認されなかった。
したがって、微生物分解は促進されていると判断できる。

002時間(週)4なお、この実験では物理的除去量が大きい結果となったが、通水開始後の短期間に油分が系外に流出している可能

ｽﾗﾘｰ1000
ｽﾗﾘｰ10000
ｽﾗﾘｰ10000(control)

図5

ｽﾗﾘｰ5000
ｽﾗﾘｰ1000(control)性がある。また、自然状態の地下水流を利用した静的な浄化の場合、原位置浄化の作用で土壌から脱離し移行する油分は、この実験の結果ほどは見込めないと推測される。

スラリー試験における TPH
DO

8A重油資化性菌

TPH（土壌）1.0E+08

1,000

1.0E+07
TPH(mg/kg-dry)DO(mg/L)

0.5cm/min
4CDO =CDO0 *e-0.008t

CDO ； DO(mg/L)
t ； 時間(min)2020600
400
2000.07cm/min
CDO =CDO0 *e-0.0135t

0A重油資化性菌(cfu/ml)

800

660

80

100
初距離(cm)1.0E+05
1.0E+04
1.0E+03

1.0E+01

期

m
10c

m20c

m30c

m
40c

2ヶ月後

図610ｃｍ40cm
土壌20cm1.0E+0220cm
土壌10cm
土壌40cm1.0E+00040

1.0E+06

40cm カラムの DO、TPH および A 重油資化性菌

0102030

植菌後の経過時間（日）

40

400

1.0E+08

TPH（地下水）

1.0E+06

油分（ｺﾝﾄﾛｰﾙ）

200

1.0E+04

油分（促進系）（促進系）
菌数（ｺﾝﾄﾛｰﾙ）

100

1.0E+02

注入井戸
1mﾓﾆﾀ井戸5mﾓﾆﾀ井戸

1000

TPH（mg/L)

TPH(mg/kg-dry)

300

A重油資化性菌(cfu/g)

10000

100

100

1.0E+00
0481時間（週）

0

図7

360

10cm カラムの TPH と A 重油資化性菌

日数7201080

水位
0.0

実施工の注入井戸とモニタリング井戸における地下水の

-1.0

深度(m)

4.3 実施工

注入井戸

1m ﾓﾆﾀ井戸

5m ﾓﾆﾀ井戸

control-2.0

分析結果を図 8 に示す。

-3.0

TPH-GC は、注入井戸では開始時に 70 mg/L であったが、-4.0
030 日後には定量下限値以下になった。注入井戸から距離が360

1m のモニタリング井戸では、数百～1,000 mg/L であったが、

720

DO

100.0

2 年目以降には数十 mg/L に低下し、5 m 地点では、100 mg/L

日数1080注入井戸

1m ﾓﾆﾀ井戸

5m ﾓﾆﾀ井戸

control

10.0

DO(mg/L)から 1 年弱で定量下限値以下に抑えられた。
地下水位は、年間を通じて GL-2 m から-3.5 m の間で変化し、一部の期間を除いて注入井戸での水位がモニタリン
グ井戸よりも高く、地下水の流れにより酸素がモニタリン

1.00.10.0

グ井戸側に供給される条件になっていた。注入井戸から下0360

日数

720

1080

720

1080

720

1080

流側 5m に向かう地下水の動水勾配は概ね 0.01 であり、現場透水試験値とカラム充填時の間隙率から導かれる推定流
ORP(mVNHE)
vs NHE)

地点では、0.1 mg/L 以下である場合が多かったが、5m 地点
では 0.1～1.0 mg/L に推移していた。浄化の影響範囲外のORP (mV vs

速は 0.02 cm/min となる。
DO は、注入井戸では 8～10 mg/L に維持されていた。1mORP600

油分汚染が確認されなかった井戸の DO（コントロール）は400
2000-2000

1 mg/L 前後であった。油分濃度の低い 5m 地点の酸素消費360

量が 1m よりも少なかったのは、TPH の減少量と合致する。

A重油資化性菌
1.0E+06

動促進により好気的領域は拡大し、5m 地点においても油分の低減が促進されたと考えられる。
A 重油資化性菌は、103～104 cfu/ml で推移しており、カラム実験における液相の菌数と同程度ないし 1 オーダー低生菌数(cfu/ml）

また、ORP は浄化開始後から徐々に上昇し、5m 地点の井戸まで還元状態を脱している。これは降雨等の一時的な流

1.0E+04

1.0E+02

1.0E+000360
日数い結果であった。また、注入井戸では、酸素徐放剤の作用で地下水の pH が上昇したが、懸念された微生物の増殖への日数

図8

実施工における分析結果

悪影響は確認できなかった。ている微生物群に変化が生じ、それらは近縁のクラスター
4.4 微生物群集解析
図 9 は、土壌中の微生物群集解析により作成した系統樹である。微生物分解を促進化させることによって、優占しに属している様子がうかがえる。表 4 には、検出された微生物の出現率を示しているが、促進条件下では群集を構成している微生物が大きく変化していた。また、これらの微表4出現した微生物群集の構成
微

初期

促
進化

生物

Sphingobium yanoikuyae
uncultured bacterium
uncultured bacterium oxSCC-4
Achromobacter spanius
Sphingopyxis terrae
bacterium Ellin6082
bacterium Ellin505
Bacillus sp. B90
Sphingomonas sp. B26
Xanthobacter autotrophicus
Sphingomonas sp. ZL5
Ralstonia sp. 1999043680
Caulobacter sp.
aquatic bacterium R1-B11
Sphingomonas sp. dsp-2
Aminobacter sp. COX
uncultured bacterium
Pseudoxanthomonas mexicana
beta proteobacterium PII_GH1.2.A10
Burkholderia sp. CCBAU 23014
bacterium QLW23-isolateQ
Burkholderia sp. wp26
Methylobacterium sp. P1
Acidovorax sp. J33
Hydrogenophaga defluvii

出現率
67.9%
12.3%
3.7%
4.9%
2.5%
1.2%
1.2%
1.2%
1.2%
1.2%
1.2%
41.7%
14.3%
9.5%
6.0%
4.8%
7.2%
3.6%
3.6%
2.4%
2.4%
1.2%
1.2%
1.2%
1.2%

地下水中の油分について、酸素供給による低減促進が確認できた。
現在、室内実験は継続中であり、さらに、反応時間、物質供給量等の条件を検討して取り組んでいく予定である。

図 9 土壌 16SｒRNA のクローン解析による系統樹(□;促進化での出現微生物)謝辞
室内実験および微生物群集解析に関して、筑波大学大学院生命環境科学研究科･内山裕夫教授には貴重な助言を戴い生物について、日本細菌学会バイオセイフティ指針におけるレベル 3 および 27)た。記して謝意を表する。に該当する病原性微生物は、確認できなかった。

５．まとめ

参考文献
1)

(社)地盤工学会：土質試験の方法と解説、丸善、2000.3

2)

中野政詩、宮崎毅、塩沢昌：土壌物理環境測定法、東京大学
出版会、1995.3

油汚染土壌の原位置バイオレメディエーションを想定し

3)

安原正也、丸井敦尚、田中正、石井武政：筑波台地浅層部のた室内実験、さらには現場適用を実施して、次のような結土壌物理性と地下水鉛直流動、地質調査所月報、vol.41、No.9、論を得た。

pp.507-516、1990.9①

関東ロームからなる A 重油汚染土壌を対象にして、透4)

水係数 10-3cm/sec の充填条件でカラム実験を行った結果、微生物分解による油分の低減効果が確認された。

元：新版微生物学実験法、講談社、1999.35)

K.R.Reddy 、 P.S.C.Rao and W.H.Patrick Jr. ： Factors

その物理的除去を含んだ低減速度（40cm カラムの 0～Influencing Oxygen Consumption Rates in Flooded Soils、10cm において 8 週間で 830 mg/kg から 270 mg/kg を低Soil Sci.Soc.Am.J.、vol.44、pp.741-744、1980.4減）は酸素供給が律速となっており、スラリー処理（4②

杉山純多、渡辺信、大和田紘一、黒岩常祥、高橋秀夫、徳田6)

宮林哲司、北沢照啓、田中宏幸、笹本譲：原位置バイオレメ

週間で 10,000mg/kg から 7,000 mg/kg を生分解）の場

ディエーションによる重油汚染地下水の浄化、土壌環境セン合よりも低い結果となった。

ター技術ニュース、No.11、pp.15-20、2006.3

カラム実験と実施工の結果より、酸素徐放剤による酸素供給の影響距離は 1m 以内であると判断された。また、

7)

日本細菌学会 WEB サイト