生体分子の動的プロセスを直接可視化する高速 AFM
High-speed Atomic Force Microscopy for Directly Visualizing
Dynamic Biomolecular Processes
安

藤

敏

夫

Toshio Ando
金沢大学理工研究域数物科学系
要旨

タンパク質の機能メカニズムの解明に向けて，個々のタンパク質分子の動的プロセスを高い空間時間分解能で直接可視化できる高速 AFM を開発した．AFM に含まれるすべてのデバイスを高速化し，スキャナーの振動抑制技術や探針・試料間接触力の低減化技術を開発した．条件にもよるが，1 画像を 40 ～ 70 ms の時間で撮ることが可能となった．しかも，デリケートなタンパク質間相互作用を乱さずにイメージングできる．この新規顕微鏡によりタンパク質の機能中のダイナミックな振る舞いを直接映像として捉えることに成功し，且つ，その映像データからタンパク質の機能メカニズムを解明できることを実証した．本稿では，高速 AFM 開発の動機をまず述べ，装置開発の概略，得られた映像，今後の展望について解説する．

キーワード：原子間力顕微鏡，イメージング，タンパク質，動的プロセス，可視化

なわち，直接性の程度が未だ不十分ということである．ラベ
1.

はじめに

ルを介さず直接タンパク質分子の構造形態とそのダイナミッ

より直接的な理解はすべての科学に求められる．データとクな振舞いを同時に観察することができれば，この直接性の結論の間に仮定や込み入った解釈ができるだけ入り込まない

程度は飛躍的に高まるはずである．それを可能にする技術はことが理想である．タンパク質の研究でも同様である．ナノ何か？

メータサイズのタンパク質の精緻且つ高度な機能がどのようきる唯一の顕微鏡，原子間力顕微鏡（AFM），を高速化したに実現されているかをめぐる研究において，アボガドロ数に

高速 AFM 以外にはなさそうである．こう考えたのは今から近い分子数の集団を相手に研究が長い間進められてきた．例

15 年以上も前のことであった．意外ではあるが，バイオ用液中にある試料をナノメータの解像度で直接観察でえば，筋収縮のメカニズムを探る研究では，試験管の中で起に限らず高速 AFM の開発に取り組んだ研究室は非常に少な

こる生化学的な反応（ATP 分解反応）を測定する一方，筋ファ

い 1,2）．私の研究室 3）以外に，スタンフォード大の Quate 研 4），

イバーの電子顕微鏡観察による構造解明や，筋ファイバーのUC Santa Barbara の Hansma 研 5），Bristol 大 の Miles 研 6） のX 線回折像から収縮力の発生に関わると推定されるタンパクみであった．現在でも装置開発を継続しているのは我々の研質の動きを探ることが長い間行われてきた．優れた研究者の究室と以前 Hansma 研のポスドクであった Schitter の研究室ひらめきにより分子メカニズムが提唱されたものの，その是（Delft 工科大）だけである．

非はなかなか決着しない．今から 20 数年前に，この状況を打破すべく 1 分子生物学が誕生した．個々の分子の振舞いを，
ラベル分子が発する蛍光の輝点の動的観察から探る手法であ2. AFM によるイメージングの原理と高速化への技術的課
題る．種々の蛍光分子，明るい光学顕微鏡，感度の高いビデオ

図 1 に，Tapping Mode AFM 装置の概略を示す．共振周波カメラ，エバネッセント照明という技術がそれを可能にした．

数で Z 方向に振動しているカンチレバーの探針が試料に接

この手法及び光ピンセットを利用したナノメータ計測によ触すると，振幅・位相が変化する．カンチレバーのたわみ量り，以前とは比較にならない直接さでタンパク質の働きの詳に比例する信号が 2 分割フォトダイオードの出力電圧の差と細が明らかにされた．それでもなお，蛍光輝点の振舞いからして出力され，振幅計測器（或いは，RMS-DC 変換器）によっ

タンパク質の振舞いを推測するしかなく，同じデータであって振幅値（或いは，RMS 値）に変換される．この振幅値とても解釈の違いにより，異なる結論に達することもある．す振幅の目標値（セットポイント振幅）との差信号（エラー信〒 920–1192 金沢市角間町
TEL: 076–264–5663; FAX: 076–264–5739
E-mail: tando@kenroku.kanazawa-u.ac.jp
2009 年 12 月 31 日受付22号）を比例・積分・微分した信号が PID フィードバック回
路から出力される．この出力をピエゾドライバーに入力し，Z スキャナーを，エラー信号を最小化するように動かす．この動作により，XYZ スキャナーは試料表面をなぞるように
顕微鏡 Vol. 45, No. 1（2010）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

図 2 フィードバック帯域とセットポイントとの関係．実線：
通常の PID 制御の場合，破線：ダイナミック PID 制御の場合．
それぞれの 4 組の線は上から下に，2A
2 0/h0=5, 2, 1, 0.5 の場合に対応する．

ングとは，試料の急な降り勾配で探針が試料表面から完全に
図1

Tapping Mode AFM 装置の概略図．

離れ，再着地までに時間がかかることを意味する．通常フィー
ドバック帯域は 45° の位相遅れが生ずるフィードバック周波

動く．従って，PID 回路の出力を XY 各点についてプロット数で定義され，フィードバック帯域 fB は以下のように表さ

すると，基板に載せた試料の形状が再現される．Tappingれる 7）．

Mode では，探針が上下に振動するため，探針・試料の接触時間は短く，探針から試料に横方向の力はほとんど作用しな

2Qc
2Qs fcfc ⎛⎞2fc(τp + τI + δ) .
fB = α―/ 1 + ― + ― + 2f
8 ⎝
⎠
π
πfs
πf

（2）

い．それ故，この Mode は生体分子の観察に最も多く利用さ

ここで，ffc と fs はそれぞれカンチレバー（水中）と Z スキャ

れている．

ナーの最低共振周波数，Qc と Qs はそれぞれカンチレバーと

市販の AFM では 1 画像を撮るのに分のオーダの時間がかZ スキャナーの Q 値，δ は上述したデバイス以外の応答時間

かる．高速バイオ AFM 実現の第一の技術的課題は，フィーの総和，α は PID 回路の（比例 + 微分）による位相遅れ補

ドバックループに含まれるすべてのデバイスの高速化であ

償効果を表す．τI と τp は色々なパラメータの関数で，解析る．他の顕微鏡と比べ AFM のイメージング速度が遅い最大的に表現することは難しいが，実験と理論的考察との照合にの要因は機械走査と力学的検出（カンチレバー）にある．従っより，以下のように求められた 8）．

て，スキャナーとカンチレバーの高速化は特に重要である．
第 2 の課題は，高速走査によって生ずる機械振動のダンピン
グ，第 3 の課題は高速性と低侵襲性の両立である．

/fc,
τp = (tanβ/β − 1)/f

（3）

4 0 sin(ϕ/2)/(A( 0 fc).
τI = 4h（4）

ここで，β は
3.

可能な最高イメージング速度とフィードバック帯域

走査範囲 W × W を走査線数 N 本でイメージングするのに[ 0(1 − r)/{5h0 sin(ϕ/2)}]
β = cos−1[A（5）かかる時間を T とすると，X 方向の走査速度は Vs = 2WN/
NTであり，カンチレバーの自由振動振幅 A0，サイン波形状をで与えられる．試料が周期 λ のサイン波形状をしているとした試料の最大の高さ h0，無次元のセットポイント振幅 r の仮定すると，探針・試料間距離を一定に保つために試料ステー関数である．As を peak-to-peak のセットポイント振幅とす

ジを Z 方向にフィードバック走査する周波数は f = Vs /λ/ で与ると，r = As /(2A2 0) となる．ϕ は試料表面トレーシングの位相えられる．フィードバック帯域 fB は f 以上でなければならな

遅れ（フィードバック帯域の走査周波数では 45°）である．

いので，式（1）が成り立つ．

図 2 に示すように，フィードバック帯域はセットポイント

fB ≥ 2WN/
N/λT.

（1）

を大きくしていくと下がるが，これはパラシューティイング
が r の増大とともに著しくなるからである．また，2A
2 0/h0 のフィードバック制御は後追い処理なので，試料ステージの減少とともに，フィードバック帯域は下がる．フィードバッ

動きは試料表面を遅延なくトレースすることはできない．各

ク帯域は目安であり，45° の位相遅れで生ずる探針・試料間デバイスの遅れ時間の総和，PID 制御回路でエラー信号を積にかかる力が強すぎる試料では，式（2）が与える周波数よ分する時間 τI，そして，パラシューティング時間 τp によっりもフィードバック走査周波数が小さくなるように，イメーてフィードバック帯域は決定される．ここでパラシューティ

ジング速度を下げる必要がある．

解説

生体分子の動的プロセスを直接可視化する高速 AFM

23【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

4. 装置開発の概略
概略だけを述べる．詳細に関しては最近の総説を参照されたい 8）．オリンパスと共同で窒化シリコン製の微小カンチレ
バ ー（ 長 さ 6 μm， 幅 2 μm， 厚 さ 90 nm） を 開 発 し た（ 図 3a）． 大 気 中 で の 共 振 周 波 数 は 3.5 MHz， 水 中 で は1.2 MHz，ばね定数は 0.1 ～ 0.2 N/m，水中での Q 値は 2–3である．探針は十分に先鋭化されていないので，フェノール
結晶を昇華させ，Electron Beam Deposition（EBD）法により針を形成させた．更にプラズマエッチング処理し，約4 nm の先端曲率半径を得た．
Y ピエゾが X ピエゾを Y 方向に変移させ，X ピエゾが Z
ピエゾを X 方向に変移させ，Z ピエゾが試料ステージを Z 方向に変移させる構造のスキャナーを開発した（図 3b）．振動を抑制するために，最も高い走査周波数が要求される Z ス
キャナーに 2 種のカウンターバランス法を採用した：（1）2
つの Z ピエゾを同時に，同じ距離だけ反対向きに変移させる 3），（2）ひとつのピエゾ素子の固定法を工夫して，質量中心が変移しないようにする．小さいピエゾ素子の固定が容易な（1）の方法を採用した場合，片端固定のため共振周波数はピエゾ素子の自由振動の共振周波数（400 kHz）の半分以下に下がる（171 kHz）．小さいピエゾ素子の固定法を種々試みたところ，Z ピエゾの変移方向に平行な 4 辺を固定する方法が最も有効であった 9）．利用できる最大変位は，片面固定

図 3 微小カンチレバーの SEM 像（a）と高速スキャナーの模式図（b）．

の場合の半分になるが，固定による共振周波数の低下はほとんど起こらず，自由振動の共振周波数をほぼ維持できた

振幅値を出力するアナログ・デジタルハイブリッド回路を開（370 kHz）．X ピエゾについては，両端をフレクシャーで挟発した．フーリエ法の方が，カンチレバーの熱揺らぎの影響

むカウンターバランス法を採用した（図 3b）．3 軸間のクロを受けにくいため，ノイズはピークホールド法の 1/4 程度にストークが生じないように，変位方向に柔らかく，変位に直なった 8）．

角な方向に硬いフレクシャー（板ばね）を用い，また，モノ
リシック加工により，60 kHz の共振周波数を得た．

上述のデバイスと次節で述べるダイナミック PID 制御法・
フィードフォワー
ドリフト補償法以外に，
高速位相検出器 11），

X 走査波形は既知且つ周期的であるので，逆伝達補償のド制御法 12），任意伝達関数に対する逆伝達関数自動生成回

フィードフォワード制御によって 60 kHz の共振ピークをダ

路 13），カンチレバーの光駆動法 13） などを開発した．エレク

ンピングした．または，三角波の角を丸めた波形でドライブ

ト ロ ニ ク ス の ほ と ん ど は ア ナ ロ グ 回 路 を 採 用 し て い る．

する方法も有効であった．Z 走査波形は既知でないので，

FPGA や DSP を利用したデジタル回路よりも高速だからでフィードバックによる振動抑制法として知られる Q 値制御ある．しかし，装置の改良の度に回路を新たに製作しなけれ法を採用した．走査対象の速度に比例する信号の位相を 180ばならず，効率が悪い．最近，デジタルの FPGA ボードに度反転させ，それを走査駆動信号に加える方法である．見か対応するアナログの FPAA ボードが製品化され始め，ソフト

け上，摩擦力（粘性抵抗）を増加させることになるため，振ウェアで回路を変更することが可能になってきた．この新し動がダンピングされる．この方法の Z スキャナーへの適用

い手法を組み入れる検討を現在進めている．

では，Z スキャナーの変位もしくは速度を計測しなければならないが，実際には非常に難しい．そこで，実際の Z スキャ

5.

ナーとほぼ同じ伝達関数をもつ擬似スキャナー（LRC 回路）

低侵襲性を図るためには探針が試料を叩く力を小さくするの出力を利用する方法を我々は開発した

10）．

高速性と低侵襲性との両立必要がある．それには，セットポイント r を 1 に近付けなけ

高速振幅計測器として，サイン波振動のピークとボトムのればならないが，パラシューティングが頻繁に起こり，フィー

電圧値をホールドし，その差を振幅値として出力する回路をドバック帯域が著しく下がるため，低侵襲性と高速性は両立

以前開発した 3）．半周期ごとに振幅値を更新できるが，2 点しない．試料の降り勾配でパラシューティングが起こった場の電圧しか利用していないため，ノイズを拾う．そこで，合，カンチレバーは自由振動し，そのときのエラー信号は

1 周期ごとに振動の 1 次フーリエ係数を求め，その係数から

2 0(1−r) で飽和する．r が 1 に近いと，飽和エラー信号は小2A

24

顕微鏡 Vol. 45, No. 1（2010）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

さくフィードバック走査は遅くなり，パラシューティングが手で周辺の 3 量体と結合しているが，境界部では 1，2，あ

長く続く．試料の昇り勾配では，カンチレバーの振幅はセッ

るいは，3 個の結合手で結合する（図 4d）．それぞれの結合

トポイント振幅よりも小さくなるが，振幅がゼロにならない

手の数に応じて，3 量体の結合寿命は異なっていた．結合手

限りエラー信号は飽和することはない．このエラー信号の非が 2 個の場合の平均寿命 τ2 は 0.19 s，3 個の場合の平均寿命

対称性が問題の本質である．この非対称性をみかけ上なくすτ3 は 0.85 s であった．この違いは結合の自由エネルギーの差

7）

ダイナミック PID 制御法を開発した ．カンチレバー振幅に応じて，PID フィードバックのゲインをダイナミックに自動調整する．この効果は劇的であり，セットポイント r を 0.95

E3−E
− 2 による．すなわち，( 3 − E2)/k/ BT
T],τ2/τ3 = exp[(E（6）

程度まで上げてもパラシューティングが起こらない（図 2 の

ここで，kB はボルツマン定数，T は絶対温度である．従っ破線）．これにより，カンチレバー探針が試料に軽く接触すて，結合手一本あたりの結合エネルギーは −1.5 kBT（300 Kる状態で高速走査することが可能になった．しかし，まだ問で −0.9 kcal/mol に対応）と決定された．

題がある．例えば，A0 = 1 nm，r = 0.9 とした場合，2A
2 0(1−r)bR は 7 本の膜貫通型 α へリックス 7 本（A–G）と色素レ

は 0.2 nm しかない．従って，カンチレバーの自由振動振幅

チナールから成る．へリックス G の Lys216 にシッフ塩基ををオングストロームレベルで一定になるように，カンチレ

介して共有結合しているレチナールが緑色の光を吸収するとバーの励振効率を制御する必要がある．しかし，走査中に自all-trans から 13-cis に異性化する．この異性化が引き金となっ由振動振幅を計測できない．そこで，励振効率のドリフトにて，bR は構造変化し，それに伴い細胞質側から細胞外側による探針・試料間の接触の強さの変動をモニターするために，プロトンが運ばれる．分光学的に区別できる中間体（K, L, M,

カンチレバー振動の 2 次共振振幅をモニターし，それが一定

N, O）が存在し，M → N，N → O の遷移は ms の時間で起こになるように励振パワーを調節する制御を試みた．制御の時るのに対し，それ以外の遷移はずっと速く起こる．他方，光定数は高速 AFM の 1 画像取得時間よりも長くし，試料の凹吸収に伴う bR 分子の構造変化については，X 線結晶構造解凸に起因する 2 次共振振幅の変動に影響されず，平均の接触

析や電子顕微鏡観察による研究はあるものの，詳しいことは力を一定に保つようにした．r ～ 1 でも長時間安定なイメー

よく分かっていない．そこで，光照射に伴う bR 分子の変化

ジングが可能になった 7）．

を高速 AFM で観察した．ワイルドタイプ（WT）のフォト以上の技術によりどの程度の力が試料にかかっているか見

サイクルは 10 ms 程度で完了するため，10 ms のイメージン

積もってみよう．開発した微小カンチレバーのばね定数 kc

グ速度でも光照射に伴う bR 分子の形態的な変化を捉えるこは 0.1 ～ 0.2 N/m で，水中での Q 値（Qc）は約 2.5 である．

とはできなかった．そこで，D96N ミュータントを観察しもろい試料では，カンチレバーの自由振動振幅 A0 を 1 ～た 15）．D96 はプロトンの通過経路に位置し，M → N，N → O

2 nm に，セットポイント r を 0.9 程度に設定している．従っの遷移に関係している．従って，D96N のフォトサイクルは––て，探針が試料を叩く力 kc A0√1−r2/Qc は 17 ～ 70 pN 程度である．モータタンパク質が発生する力は数 pN であるから，かなり大きな力で試料を叩いていることになる．しかし，対象に変化を与える物理量は力そのものではなく激力（力 ×
力が作用する時間）である．カンチレバーの水中での共振周
波数 fc は～ 1.2 MHz であり，力が作用する時間は 100 ns 以下である．従って，激力は小さい．
6.

タンパク質の動的イメージング

6.1

Bacteriorhodopsin

高度好塩菌 Halobacterium Salinarum の細胞膜には紫色のパッチ（紫膜）が存在し，この紫膜は bacteriorhodopsin（bR）の 2 次元結晶である．結晶中で bR は 3 量体を形成し，3 量
体は六方格子状に配置されている．円状の 2 次元結晶の外側に bR 分子の密度が低い領域が存在する．この境界部を観察したところ，bR が結合・解離を繰り返す様子が見えた 14）（ 図 4a–c；bR の い く つ か の 高 速 AFM 映 像 は http://www.
s.kanazawa-u.ac.jp/phys/biophys/bR_movies.htm に掲載）．単体，
2 量体の結合・解離も観察されるが，ほとんどが 3 量体で結合・解離していた．すなわち，濃度の低い周辺部で bR はすでに3 量体を形成している．結晶内部では各 3 量体は 6 個の結合
解説

生体分子の動的プロセスを直接可視化する高速 AFM

図 4 結晶領域と非結晶領域の境界部の AFM 像（a, b, c）．赤
い破線で囲った bR 分子は新たに結合した bR3 量体を表す．白の三角形は以前に結合していた 3 量体を表す（2.1 s）．イメー
ジング速度は 3.3 frames/s．Z 方向の輝度の範囲は 3.8 nm．（d）
結晶のエッジ部での bR3 量体の結合（I, II, III）と結晶内部での結合（VI）の模式図．ローマ数字は結合手（破線）の数を表す．

25【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

～ 10 s と極めて長い．しかし，プロトンポンプの機能は持っ

しあう．すなわち，全体としては，フォトサイクルタイムはている．

光強度に依存せずに一定に保たれるが，これは正・負の協同

紫膜の細胞外側の面では，光照射に伴う変化は観察されな性が共存することによって実現されている．

かったが，細胞質側で大きな変化が観察された（図 5a，b）．

6.2

各 bR 分子の重心位置は，3 量体の中心から外側に約 0.7 nm

Myosin V は ATP の加水分解のエネルギーを使って actin

myosin V の歩行運動

移動し，且つ，反時計周りに約 7.5 度回転した．結晶構造とfilament 上を 1 分子で連続的に歩行するモータタンパク質での比較から，E–F へリックスループが大きく移動し，それ以ある 16）．図 6a に示すように，N 端にあるモータドメインに外はほとんど動かず，その結果，bR 表面は 2 つの突起に分長いネックが続く．ネックは 6 個の IQ モチーフをもち，そかれた．また，この大きな移動に伴い，隣り合う 3 量体にそこに Calmodulin が結合している．モータドメインとネック

れぞれ属する最隣接 bR の 3 つ組（3 量体と区別するためにを合わせて頭部（head）と呼ぶことにする．ネックの先には

Trefoil と 名 付 け た ） は 強 く 接 触 す る よ う に 観 察 さ れ た

Coiled-coil の尾部があり，尾部の先（C 端）に輸送すべきカー（図 5c，d の模式図を参照）．この強い接触はフォトサイク

ゴが結合する．1 分子蛍光技術を使って，72 nm の歩幅で，ルに何らかの影響を及ぼしているに違いない．それを調べる

Hand-over-hand 様式（2 つの頭部が交互に前足と後ろ足になために，照射する光強度を変えて励起される bR 分子の数をる）で運動することが明らかにされている 17 ～ 19）．しかし，調節した．光強度が弱い場合，ひとつの Trefoil 中の bR3 分

歩行メカニズムに関して，未解明な重要問題が多く残されて子の内 1 分子だけが励起され構造変化した．光 off 後の基底

いる．
（1）分子を前進させる駆動力（パワーストローク：状態への遷移時間を測定したところ，励起寿命は約 7 s であっPWS）は何か？ （2）PWS 発生は ATPase 反応とどのようた．一方，光強度を強くした場合には，ひとつの Trefoil 内にカップルしているのか？ （3）Hand-over-hand 様式の運動で 2 ないしは 3 分子が励起された．興味深いことに，平均励を実現している分子基盤は何か ?

起寿命は約 2 s と約 13 s に大きく分かれた．励起寿命の短い

上記（1），（2）については従来以下のように考えられてき分子は光照射中に何回かフォトサイクルを行う．更に詳しくた．ATP が分解し ADP-Pi になると，モータドメインとネッ

見てみると，光照射して最初に励起された bR 分子が長い励

ク の 相 対 的 角 度 が 変 化 し（ 図 6c），Pre-PWS 構 造 を 取 る．

起寿命をもち，後で励起された bR 分子が短い励起寿命をもPre-PWS 構造を取ると前足のモータドメインは actin に結合つことが判明した．また，短い励起寿命をもつ分子の励起寿できるようになる（図 6d）．Actin に結合すると Pi が素早く命の分布は単一指数関数に従うのに対し，長い寿命をもつ分

解離し，モータドメインとネックの相対的角度は元に戻り，

子では山型の分布を示した．以上のことから，Trefoil 内でのPost-PWS 構造を取る．その結果，actin に結合したままの前

bR 分子間相互作用により，正・負の協同性が同時に生ずる

足は屈曲し後ろ足を前方に引っ張る（図 6e）．前方に引っ張ことが明らかとなった．重要なことは，この協同性は 3 量体

られた後ろ足から ADP が解離し，新しい ATP が結合する結中での bR 分子間相互作用によるものではないことである．

果，後ろ足は actin から解離し（図 6f），前方に移動した後

正・負の協同性が同時に現れる結果，それらの効果は打ち消

actin に結合する．Pre-PWS と Post-PWS の構造が ATPase 反応の中間体にタイトにカップルしているという考え方である．ADP-Pi を模擬する ATP アナログや ADP を結合した筋
肉 の myosin II や myosin V の 結 晶 構 造 か ら，Pre-PWS と
Post-PWS の構造が実際に存在するという主張が多くなされてきたが，ADP-Pi 結合の構造から ADP 結合の構造への遷移が駆動力になるという証拠は実際にはない．
Actin filament 上 を 歩 く myosin V を 撮 影 す る 場 合，actin
filament を基板に固定し，myosin V は基板から自由にしなけ
ればならない．この試料系に限らず，ダイナミックな分子プ
ロセスの高速 AFM 観察では，基板に特別な工夫を要することが多い．極性基を外側に出した中性リン脂質の 2 重層膜はタンパク質を非特異的に吸着しないことが知られている．そこで，マイカ基板表面に中性リン脂質，biotin-cap リン脂質の他に正電荷をもつリン脂質 5％からなる 2 重層の平面膜を形成させた．正電荷をもつリン脂質を加える理由は，myosin

図 5 細胞質側の bR2 次元結晶面の光照射による構造変化を捉えた AFM 像（a, b）とその模式図（c, d）．（a, c）：光照射前，（b,d）：光照射中．白い円で囲った部分は 3 量体，水色の円で囲った部分は Trefoil を示す．イメージング速度は 1 frame/s．
26

V を平面膜に若干吸着させ，横倒しの myosin V を観察する
た め で あ る． 部 分 的 に biotin 化 し た actin filament を
streptavidin を介して平面膜に固定した．
以下に我々の観察結果を述べるが，未だ原論文として公表
顕微鏡 Vol. 45, No. 1（2010）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

図6

Myosin V の構造の模式図（a）と歩行モデル（b–f）．

していないので，肝心の画像データやグラフをお見せできな

ADP 存在下とヌクレオチドフリーの条件下で，両足でい こ と を お 許 し 願 い た い． 低 濃 度 ATP 存 在 下 で actin

actin に結合した M5-HMM を観察した．ADP 濃度が高い場

filament 上を約 40 nm のステップサイズで連続的に一方向に合は ATP 存在下と同様に前足は直線状をしているのに対し，運動する M5-HMM（myosin V の尾部を一部切除した）分子

ヌクレオチドフリーの場合には，前足は大きく屈曲していた．

を鮮明な映像として撮影することに成功した（1 画像を図 7

このことは，ADP 存在下において前足に ADP が結合していに示す）．両頭部が actin に結合した分子の後ろ足のモータドるかどうかを，前足の形状を見ることで判断できることを示

メインとネックの接合部は V 字を示し，前足のそれは滑らしている．直線状にある前足の寿命を ADP 濃度の関数としかである．また，短い尾部は進行方向の反対側を向く．このて測定し，前足からの ADP の解離速度を見積もったところ，

特 徴 か ら， 運 動 し て い な い 場 合 で も actin filament の 極 性

0.1/s であった．すなわち，平均で 10 秒に 1 回しか ADP は（myosin V はプラス端に向かって運動する）を知ることがで前足から解離しない．1 μM という低濃度 ATP 存在下でさえ，きる．観察された運動速度は，同じバッファー溶液条件下のM5-HMM は 10 秒間に何歩も歩く．従って，ATP 存在下で蛍光顕微鏡観察の結果とほぼ同じであった．すなわち，探針・M5-HMM が歩行しているとき，前足からは ADP は実質的に試料，試料・基板表面の相互作用は無視できる程度である．

解 離 せ ず， 後 ろ 足 か ら の み ADP が 解 離 す る． す な わ ち，

歩行する瞬間は非常に速く，捉えることはできなかった．そADP の解離，それに続く ATP の結合，その結果生ずる actin

こで，歩行を遅くするために基板に streptavidin 分子を過剰からの解離は後ろ足でしか起こらない．すなわち，何故にばら撒いたところ，歩行する瞬間を捉えることができた．

myosin V は Hand-over-hand 様式で歩くことができるかの明

後ろ足が actin から解離すると，前足は actin に対して反やじ快な答が得られた．また，前足からは ADP が解離しないこ

り の 向 き か ら や じ り の 向 き に 回 転 し た（ 図 7 に お い て，とは，前足による PWS 発生はケミカルな遷移によるもので後ろ足の向きをやじりの向き，前足の向きを反やじりの向きないことを示している．PWS の源は，前足が反やじりの向と呼ぶことにする）．前足は常に直線状をしており屈曲しな

きで actin に結合することによる分子内張力にある．実際，い．重要な結論，「PWS とは前足の回転である」，を得るこ

単頭の myosin V は ADP 存在下でも，ヌクレオチドフリーのとができた．

条件でもやじりの向きで actin と結合する．しかし，ADP を結合した前足のモータドメインとネック部の接合部はある程
度柔らかいため，前足は直線の形をほぼ保ったまま反やじりの向きで actin と結合できる．actin との結合による自由エネ
ルギーの低下の方が，反やじりの向きで actin に結合することによって生ずる分子の歪みに伴う自由エネルギーの増加に勝っている．この歪みによる分子内張力が PWS の原動力になっている．
6.3

脂質平面膜の形成過程

上述したように中性リン脂質の平面 2 重層膜はタンパク質
図 7 歩 行 中 の M5-HMM の AFM 像． イ メ ー ジ ン グ 速 度 は
7 frames/s．矢印は歩行する向きを表す．

解説

生体分子の動的プロセスを直接可視化する高速 AFMへの非特異的吸着がなく，タンパク質の機能ダイナミクスを
高速 AFM 観察するときに便利な基板である 20）．リポソーム
27【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

図 8 リポソームから平面膜が形成されるまでのプロセスを捉えた AFM 像．イメージング速度は 1.03 frame/s．やじりはリポ
ソームを，白い矢印は成長中のナノチューブを，水色の矢印は平面膜に先端部で相互作用しているナノチューブを指す．

をマイカ表面に載せたあとにどのようなプロセスを経て平面膜になるのかに興味をもって，このプロセスを観察した

21）．

ここでは，観察結果の意味や解釈に立ち入らず，観察結果のは壊れ平面膜間のギャップを埋める結果，平面膜は急激に広
くなった．
6.4

Streptavidin 2 次元結晶の格子欠陥の運動みを紹介する．脂質 DOPC/DOPS/biotin-cap-DPPE（3:1:1 w/w）

Streptavidin は D2 二面体対称性をもつホモ 4 量体で，それからなるリポソームを，カルシウムを含むバッファー溶液にぞれのサブユニットはひとつの biotin（ビタミン H）を強く懸濁し，マイカ表面に既に載せた同じバッファー溶液中に結合する（図 9a）．他のタンパク質に非特異に吸着しないた

流し入れ，直ぐに観察を行った（図 8：動画は http://www.

め，biotin を含む脂質平面膜上に形成させた streptavidin2 次

s.kanazawa-u.ac.jp/phys/biophys/BBA/lipid.htm に 掲 載）．リ ポ

元結晶はタンパク質の動的プロセス観察の基板として有効でソームを流し入れた直後の観察で，球形のリポソームの他にある．脂質側を向いた面は biotin 脂質と結合するが，反対側

短いチューブ状のものが若干観察された．マイカ表面との強の biotin 結合部位は空いている．従って，この 2 次元結晶面

い親水性相互作用のため，球形のリポソームは基板に接触し上に biotin 化したタンパク質を直接固定できるとともに，た直後に壊れ小さいパッチ状の平面膜になるのに対し，短い

biotin と Ni-NTA を両端にもつ分子を介して His-tag をもつタ

チューブ状のものは壊れずに，均一な直径（約 20 nm）をもっンパク質を選択的に固定できる．イオン強度や pH に応じてた長いナノチューブへと成長していった．2 本のナノチュー

いくつかの異なる格子構造をもつ結晶が形成される．

ブは端同士で結合し，1 本のナノチューブへと融合する様子

Streptavidin 2 次元結晶を観察すると，たまに空隙欠陥がも観察された．ナノチューブは平面膜とも相互作用する．ナ

残り，それがブラウン運動する様子が観察された．この運動

ノチューブ側面がパッチ状の平面膜のエッジ部に接触する場

を系統的に調べるために，欠陥のない 2 次元結晶（C222 結晶：合の他に，ナノチューブの先端が平面膜のエッジ部で接触す

この命名は正しくないがよく使われている；模式図を図 9bる場合も多く観察された．後者の場合，パッチ状の平面膜のに示す）をカンチレバー探針で強く叩き，単一空隙欠陥をい

大きさが小さくなっていく様子が多く観察され，脂質分子がくつか形成させた．単一空隙欠陥のブラウン運動は異方性を平面膜からナノチューブに移動していると推定される．時間示した（図 9c）22）．拡散定数は a 軸方向で Da = 20.5 nm2/s，の経過とともに，平面膜の面積が増大していくとともに，ナb 軸方向で Db = 48.8 nm2/s であった．空隙欠陥が移動するこノチューブの長さ，密度が増大していった．その結果，ナノとは，それに隣接する streptavidin 分子が空隙に移動するこチューブは互いに押し合う状況になり，真っ直ぐなナノとを意味する．移動するためには，streptavidin 間の結合をチューブが曲がる様子も観察された．曲がったナノチューブ切る必要がある．a 軸に沿って分子が移動する場合には，

28

顕微鏡 Vol. 45, No. 1（2010）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

2 つの○結合（biotin を結合していないサブユニット間の結合）とひとつの●結合（biotin を結合しているサブユニッ

7.

ト間の結合）が切れる．他方，b 軸に沿って移動する場合に他の手法ではなかなか解明できないタンパク質の動的分子は，ひとつの○結合と 2 つの●結合が切れる．Da < Db は従っプロセスや機能メカニズムを高速 AFM による観察で容易にて， ○ 結 合 の 方 が ● 結 合 よ り も 強 い こ と を 意 味 す る．

解明できることを上述の研究で実証した．まだ，観察に成功(2○ + ●)−(○ + 2●) = ○ − ●であるので，拡散定数の違い

している系はそれほど多くないが，このレベルの性能をもっは，ひとつの○結合の自由エネルギー（E（ ○）とひとつの●た高速 AFM による観察で解かれる問題は多く存在する．分

結合の自由エネルギー（E（ ●）の差で決まっている．すなわち，子プロセスに速いブラウン運動が含まれる場合には，ブラウ/ a = exp[−(E( ○ − E●)/k
/ BT
Db /D
T].

（7）

今後の展望

ン運動を抑える何らかの工夫が必要である．酵素反応が速過
ぎてその過程で起こる現象を捉えることができない場合にこ の 関 係 か ら，E○−E− ● = −0.88 kBT（300 K で −0.52 kcal/mol

は，反応速度を下げるミューテーションが有効である．或いに対応）と決定された．

は，観察領域を狭めてイメージング速度を上げることも可能

単一空隙欠陥の運動をしばらく観察していると，2 つの欠である（但し，現在のところ 10 ms/frame 程度まで）．装置

陥が融合し 2 空隙欠陥になる様子も見られた（図 9d）．一旦の更なる高速化も必要であるが，現在の装置原理をそのまま融合すると，2 つに分裂することはない．更に大きな欠陥へ使うとすると，せいぜい 2 倍程度の高速化が期待できるだけと成長する様子も観察された．興味深いことに，大きな欠陥である．生体分子の動的プロセスの観察では，検出したい現（4 空隙欠陥程度まで）になるほど拡散定数が大きくなった．

象を捉えるための基板や試料の工夫が重要である．今後その以上の観察結果は，バルク溶液中に streptavidin が存在し基ためのノウハウが色々な試料系の試行観察を通して集積され板表面で結晶成長するときに，欠陥のない 2 次元結晶が形成る必要がある．装置は今のところ世界的にみても数研究室にされるプロセスを示唆している．単一空隙欠陥は小さく，バしか普及していない．今後数年で装置がメーカにより製造さルク溶液中にある分子がその欠陥を埋めることは容易ではれ，世界的に普及するものと期待している．

ない．融合し，空隙欠陥が大きくなりブラウン運動が速くな

現状の高速 AFM では，生きた細胞の表面で起こる分子プると更に融合が加速され，空隙欠陥は更に大きくなり，バルロセスや細胞内で起こるオルガネラや細胞骨格のダイナミク

ク中の分子で容易に埋められるようになる．この仮説は，結スを観察できない．しかし，この点も今後大きく変わるもの

晶形成過程を直接観察することで実証されなければならなと見込まれる．未だ大気中でしか実証されていないが，超音

いが．

波と AFM を組み合わせて，細胞内を観察できることが既に報告されている 23）．試料基板の下から周波数 f1 の超音波を発射し，カンチレバーに周波数 f2 の超音波を伝播させる．
試料表面と探針との距離が近づき或る臨界点を超えると，探針先端で 2 つの超音波は非線形干渉し，|ff1−f−f2| の周波数をもつ音波が発生する．この差周波数をカンチレバーの共振周波数に一致させておくと，カンチレバーは効率よく励振される．
試料ステージ下から伝播してきた超音波はその伝播経路にある試料によって振幅や位相が変調される．従って，その変調はカンチレバーの振動に反映されるので，カンチレバーの振動や位相を計測することで，超音波の経路にある物体を検出できる．この物体が試料表面の下にあっても検出できるので，細胞内部を観察できる．もちろん，Z 方向に分解能をもたな
いが，電子線トモグラフィーなどと同様に，超音波の伝播方向を変えることで Z 方向にも分解能を持たすことが可能である．XY 方向については，探針先端で起こる非線形干渉を利用しているため，空間分解能は超音波の波長に依存しない．

図 9 Streptavidin2 次元結晶中の単一空隙欠陥の異方性ブラウン運動．（a）biotin を含む脂質平面膜に結合する streptavidin
分子の模式図．黒丸は biotin を結合していることを表す．
（b）
C222 結晶中の streptavidin 分子の配置の模式図．黒丸は biotinを結合している部分，白丸は biotin を結合していない部分を現す．（c）単一空隙欠陥のブラウン運動を捉えた AFM 像．2
種のやじりで 2 つの空隙欠陥を指す．イメージング速度は2 frames/s．（d）2 つの空隙欠陥が近づいて融合する様子を捉えた AFM 像．イメージング速度は 2 frames/s．

解説

生体分子の動的プロセスを直接可視化する高速 AFM

但し，超音波の変調の程度は物体の密度によるため，密度の差が小さい場合には弱いコントラスト像しか得られない．超音波の周波数を上げることによりコントラストは増強される．水中ではカンチレバーの Q 値が小さく，超音波の非線形干渉も弱いため，カンチレバーはほとんど励振されない．
Q 値制御にとって Q 値を上げるなどの工夫が必要である．
非線形干渉は，探針と試料が接近しそれらの距離がある臨
29【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

界点を超えたところで起こるため，探針先端が試料表面に接触していなくても非線形干渉は起こる可能性がある．試料表
面近傍に形成される超音波の波面と探針先端に伝わってきた
超音波の波面との相互作用であるので，試料そのものに大きな力は作用しないと考えられる．非接触イメージングが可能になると，極めて柔らかい生きた細胞膜上で起こる分子プロ
セスの動的観察が可能になる．更には，カンチレバーは硬くても試料にダメージはなく，それ故，共振周波数の更に高い
カンチレバーも利用できる．従って，現状の高速 AFM のイ
メージング速度を遥かに超える超高速 AFM も決して夢ではない．夢の実現を目指してもっと多くの研究者がこの新規分
野に参入することを期待したい．
8.

おわりに

本研究の出発点は今から 15 年以上前に遡る．高速 AFMの開発にこれまで関わった多くの学生さんに感謝したい．また，最近の研究では，内橋貴之准教授，博士課程の学生さんであった宮城篤君，山下隼人君，現在ポスドクである古寺哲
幸君，山本大輔君，柴田幹大君，谷口雅昭君の頑張りに感謝
したい．最後に，本研究をこれまで資金面で支援して頂いた
JST，三菱科学財団，日本学術振興会，文部科学省に深く感謝申し上げる．
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