2023/01/26 Literature seminar 質問回答
B4 寺⽥周平「RaPID システムで⼊れられる⾮天然アミノ酸の個数は？」組み込む⾮天然アミノ酸の個数を制限する要因については分かりませんでした。
発表中ではペプチドの構成要素として天然アミノ酸と⾮天然アミノ酸に注⽬していました
Chemistry & Biology
が、FIT システムはヒドロキシ酸なども構成要素にすることができ、これを組み込んだポリ
PolyesterSynthesis via Reprogrammed Genetic Code
エステル合成では 7 つのヒドロキシ酸に対応するコドンができるよう reprogramming を⾏なった例が報告されていました。

Figure 2. Genetic Code Reprogramming for mRNA-Directed Polyester Synthesis(A) Chemical structure and abbreviation of a-hydroxy acids used in this study. Flac, phenyllactic acid; mFlac, p-methoxyphenyllactic acid; pFlac, p-isopropylphenyllactic acid; cFlac, p-cyanophenyllactic acid; Glac, glycolic acid; Alac, lactic acid; Llac, isopropyllactic acid. The abbreviations used are
based on structurally similar amino acids. The stereochemistry of pFlac, mFlac, and cFlac is racemic, whereas that of other a-hydroxy acids is S configuration. All phenyllactic acid derivatives bear a cyanomethyl ester group (LG1) and are charged onto tRNAs shown in Figure 3 using eFlexiresin,
while others bear a 3,5-dinitrobenzyl ester group (LG2) and are charged onto the tRNAs using dFlexiresin.
(B) The reprogrammed genetic code used in this study. a-hydroxy acids assigned to the respective triplets are color-coded as shown.

polyester-reading
frame.
Presumably,
these ,tRNAs
were1315-1322.
Tricine-SDS-PAGE
analysis
revealed that expression of
2007(Ohta,A., et al.
. Chem. Biol.
14(12),
より引⽤)
susceptible to Lys misacylation by LysRS included in the
E1 was observed only when all ha-tRNAs were present in
wPURE system, so that the resulting Lys-tRNAAsn-E1/E2CUG
the wPURE system and its expression level was comparacompeted with the Alac-tRNAAsn-E1/E2CUG for incorporation
ble to that of the control peptide, P1 (Figure 4B, lanes 1–5).
into the polypeptide chain (data not shown). To circumThe molecular mass (ms) of E1 determined by MALDI-TOF
ventthis problem, we developed an orthogonal tRNA
analysis was consistent with the calculated ms of
the full開始コドンのクロロアセチルは主鎖から出ているのか（側鎖から出ているのなら
graft
し
「
derived from a Mycobacteriophage L5 tRNAAsnCUG
length E1 (Figure 5A, E1). Likewise, the respective T2–T4(tRNAMLAsn in Figure 3C). We found that tRNAMLAsnCUG
templates expressed
た時も擬似環状構造ではなく、完全な環構造にできるのか）？
」 the E2–E4 polyesters with thewas not aminoacylated with Lys by LysRS, and thus the
expected ms (Figure 4B, lanes 6–11; Figure 5A, E2–E4).
クロロアセチル基は主鎖のN 末端に組み込んでいます。またこの官能基はCys
misincorporation of Lys was not observed.
To this end,
The expression levels of P1, E1, E2, E3,
andとの反応にE4 were estiwe engineered each of the seven anticodons, each asmated by the incorporation of [14C]Asp by tricineよりを形成するために必要(下図)となります初期検討では
2-ブロモアセチル基もSDS-PAGE autoradiography
analysis considering thatsignedthioether
to a different
a-hydroxy acid, into three different
five aspartic acids were included in the polymers, givingtRNA body sequences to explore the mRNA-directed
試されていたようですが、速い分⼦間反応に起因した望ましくない thioether が⽣成してしapproximately 6 pmol/5 ml, 9.5 pmol/5 ml, 15 pmol/5 ml,
expression of polyesters (Figures 2B and 3A–3C).
まったようです。(Molecules. 2013, 18, 3510.) 12 pmol/5 ml, and 5.3 pmol/5 ml, respectively (data notshown). These results provide solid evidence that themRNA-Directed Synthesis of Polyesters
length and sequence of the tetrapolyesters are strictly
Containing Four Consecutive Ester Linkages
controlled by the mRNA template sequence.
We designed four nucleotide templates (hereafter referred
to as T1–T4) to express polyesters (E1–E4) consisting ofmRNA-Directed Synthesis of Longer Polyesters
four consecutive ester bonds in the wPURE system
We next explored the capability of ribosomes for the syn(Figure 4A). As a control, these templates were also transthesis of various lengths of polyesters. In addition to T1
lated in the conventional PURE system, and thereby theexpressing tetrapolyester E1, five templates T5–T9 wereexpression level of polyesters could be compared withdesigned to express tri-, penta-, hexa-, octa-, and dodecthat of polypeptides (P1–P4). To detect the expressed
apolyesters E5–E9 (Figure 4A). We were able to detectproducts containing polyester, [14C]Asp was included inまた graft 後については⾮天然アミノ酸を構成要素とできないため、クロロアセチルを持つようなタンパク質を⽣成することはできません。しかし環構造に近づける取り組みとして、論⽂中では環状ペプチドのファーマコフォア配列の両端(タンパク側)を Cys にして、⽣成後にジスルフィド結合で環構造にするという取り組みがなされていました。
（これにより、Molecules
2013, 183511
標的タンパク質との親和性の向上が⾒られたものもありました。
）

Figure 4. Macrocyclization by post-translational thioether-ring closure [36,45]. A
chloroacetyl-amino acid incorporated at the N-terminus using the FIT system spontaneously
reacts with a downstream Cys to generate a macrocyclic thioether bond.

(Molecules. 2013, 18, 3511. より引⽤)
Through extensive studies, we have found that this particular thioether macrocyclization chemistry
designed into the FIT system occurs regardless of peptide sequence composition and length. There is,however, one exception; a Cys incorporated at the second position (note that the first position is the
した後の活性は事前に予測できるのか。計算科学的なアプローチはできるのか。
「graft」initiating
aminoacid residue that attached to the ClAc group) will not react with the chloroacetyl
moiety,leaving
this Cys residue intact [45].今回紹介した論⽂(Sakai,This observation turns out
for thedesign of2022, Nat.
Graft
後のタンパクの活性については、
K.,to
et be
al. useful
Biomed.
bicyclic
which the first Cys is incorporated at the second position and the second and third
Engpeptides. 1-13.) in
を⾒る限りでは事前の予測は⾏っていませんでした。実際今回の実験ではCys residues
are incorporated in downstream positions. In such a construct, the second Cys residue候補となる位置にペプチドを graft したタンパクを実際に発現させてから活性評価を⾏なっ
selectively reacts with the N-terminal ClAc group and the intact first and third Cys residues form aており、それらの結晶構造を撮ってから構造的考察をするという流れで書かれています。活disulfide linkage, yielding an overlapping bicyclic peptide scaffold. In this manner, various compact
性は組み込むペプチドと⾜場タンパク質の組み合わせに依存するようです。
structures of overlapping bicyclic peptides closed by a thioether bond and a disulfide bond can be
また構造の予測についても本分中に⾔及はありませんでした。(今回の話とは直接関係があ
expressed
as designed (Figure 5a).
りませんが、環状ペプチド⾃体も溶媒中では⼀定の構造をとるわけではないようです。
Another strategy generating an overlapping bicyclic scaffold has been devised based on the[Takeuchi, K.,
et al. 2021. cycloaddition
Angew. Chem.reaction,
Int. Ed., 133(12),Cu(I)-catalyzed
alkyne–azide
known as6641-6646.])“click” chemistry (Figure 5b) in
combination with the thioether macrocyclization method [46]. In this case, the FIT system was used toincorporate azidohomoalanine (Aha) and propargylglycine (Pgl) into peptides and the posttranslational
treatmentof the peptides
with Cu(I) as（完全に菅研が開発した技術なのか、
a catalyst resulted in a triazole formation.
の originality
はどこにあるのか。
共同研 The「Lasso-Graft
orthogonality of the click macrocyclization to the thioether macrocyclization enables us to selectively
form thioether bonds spontaneously upon translation and then form the triazole bond through treatment
with the catalyst. The advantage of this methodology over the aforementioned thioether-disulfide bondformation methodology is that any positions can be chosen for bicycliczation, so that diverse bicyclic
structures can be generated. Moreover, both macrocyclic linkages in the latter methodology are nonreducible and therefore physiologically more robust, whereas the former contains a reducible disulfide

究先の独⾃技術を組み合わせて開発されているのか）」

Lasso-graft は菅研究室とぺプチドリームの RaPID システムをもとにしており、環状ペプチ
ドのファーマコフォアを組み込むという戦略⾃体は⼤阪⼤学蛋⽩質研究所の⾼⽊教授のグループで考案されたもののようです（以下参照）。
“RaPID 法で得られる環状ペプチドは、10 の 12〜13 乗という膨⼤な多様性をもつライブラ
リーのなかから選択されるために、その⼗数残基のひと続きの領域に標的結合を達成するのに⼗分な三次元的構造がすべて内包されているため、⾼⽊教授らの研究グループはこれを単純にタンパク質表⾯のループに挿⼊して提⽰するという⽅法を考案しました。
（http://www.protein.osaka-u.ac.jp/achievements/pr20210309/ より引⽤）。
また⾼⽊教授らの研究グループでは構造⽣物学やタンパク質⼯学を中⼼とした研究がされており、セミナー中で紹介した標的タンパク質である PlexnB1 や MET については以前か
ら研究がなされていたようです。Lasso-graft でグラフトされる cyclic peptide についても共同研究が⾏われていたようであり、RaPID 法を元にした共同研究の延⻑で Lasso-Graft 法が開発されたと考えられます。

「Genetic Code Expansion との違いは何か。
」
RaPID 法の中で Flexizyme を⽤いて遺伝暗号に⾮天然アミノ酸を組み込めること(FIT システム)について、これは Genetic Code Expansion の⼀つの⽅法として考えられているようです。Genetic Code Expansion は、⾮天然アミノ酸を tRNA に組み込んでリボソームにより翻訳させる技術のことであり、tRNA への組み込み⼿段がいくつかある中で FIT システム
ではリボザイムの⼀種である Flexizyme を⽤いているという説明の review がありました。
(Shandell,60(46), 3455-3469.)
Biochemistry M. A., et al. 2021. Biochemistry,
pubs.acs.org/biochemistry

Perspective

Figure 4. General methods for misacylating tRNA. P.G., protecting group.

polypeptide.20 They prepared a semisynthetic, non-hypermodiﬁed E. coli glycyl tRNACUA nonsense suppressor tRNAacylated with L-3-[125I]tyrosine and incubated with the message
containing UAG at position 9 in rabbit reticulocyte lysate. The
translation product was puriﬁed and sequenced to unambiguously determine the site speciﬁcity of incorporation. Nonsense
suppression was due entirely to the added synthetic suppressor
because they could not detect read-through by endogenous
aminoacyl-tRNAs (aa-tRNA).21
General Methods for UAA-tRNA Synthesis. A key issue

isolated from the pool by selection with N-biotinyl-L-glutaminylCME and subsequent pull-down with streptavidin.25
The Suga lab generalized the ribozyme de novo catalyst for
tRNA acylation using aaRS-like RNA molecules called
Flexizymes (Fx) and mutants thereof.26 They noticed that Fx
recognizes neither the leaving nor the amino group of thesubstrate, but rather the aromatic functionality of the amino acidside chain and the carbonyl group of the ester. To improvebinding, they redesigned substrates incorporating an aromaticring in the leaving group. They used dinitrobenzyl ester (DBE)「ピューロマイシンの役割、構造について詳しく。
」
mRNA display 法におけるピューロマイシンの役割はセミナー中に述べたように、ライブラ
リ構築において mRNA とその翻訳産物であるタンパク質を⼀対⼀に対応させるためのもの
60
D. Lipovsek, A. Plückthun / Journal of Immunological Methods 290 (2004) 51–67です。⼀般のライブラリ構築⽅法においても遺伝⼦型と表現型の対応付けが必要でとなりますが、ｍRNARNAthroughが分解を受けやすいという問題がAR protein with its を⽤いる⽅法では遺伝⼦型である
target was recently determinedmoleculesa small adaptor molecule, typically(Binz et al., 2004), proving that the use of repeat-based

puromycin (Fig. 5).

あります。この解決策としていくつかの試みがなされており、mRNA
ディスプレイ法では
consensus design for the generation of repeat protein
A typical mRNA-display selection cycle is shown
R. Aviner / Computational and Structural Biotechnology Journal 18 (2020) 1074–1083

1. Introduction

1075

starting from adenosine triphosphate (ATP) [1]. Structurally, puromycin resembles the 30 end of aminoacylated tRNA (aa-tRNA), witha modified adenosine base covalently linked to a tyrosine aminoacid [2]. The major difference lies in the nature of the bondlibraries was successful.
in Fig. 1 (right panel), side-by-side with the ribosomemRNA(またはより安定な
cDNA)をタンパク質とピューロマイシンにより共有結合で連結
Puromycin is produced by Streptomyces alboniger, a grampositive actinomycete, through a series of enzymatic reactions

Amino acid

Nucleoside

Since the designed libraries contain no cysteines,
display selection cycle (left panel). The steps involved
させています。またピューロマイシンは以下に⽰すような構造をしており、アミノアシル
these molecules may be especially suitable for intra– protein fusion
A in the synthesis
Tyrosyl-tRNAof covalent mRNA
Puromycin
cellular or proteomics applications. Additionally, themolecules and in the selection of target-binding polytRNA の 3ʼ末端に類似した構造をしていることからリボソームへ取り込まれ、ペプチド伸⻑
repeat protein libraries are highly valuable sources for
peptides are summarized below:
novel binding molecules, which may be suitable for a
反応が進⾏しますが、続くエステルの加⽔分解によるtRNA の脱離において Puromycin で
whole range biotechnological, biomedical, and poten(1) A large DNA library, which encodes the poはアミド結合のため加⽔分解が進⾏せずペプチドと共有結合で繋がれることになります。
Ester
tially therapeutic applications.
lypeptide of interest andPeptide
is free of stop codons, is
bond
bond
transcribed
into
mRNA.
mRNA display ではこの翻訳阻害の性質を活かしており、mRNAの 3ʼ末端にNHpuromycin を(2) The 3VO-end of each encoding mRNA
is ligated to
組み込むことで3. mRNA display mRNA とその転写産物であるペプチドが連結された融合体が⽣成します。
a short, synthetic linker, which contains theadaptor molecule at its 3V- end.
2014. Drug Discov. Today, 19(4),(Josephson,
K.,ofettheal.method
Free amino
Freeasamino
3.1. Description(3) The 388-399.)
resultingmodified mRNA is used
template
group
group
starting from adenosine triphosphate (ATP) [1]. Structurally, puro1. Introduction
mycin resembles the 3 end of aminoacylated tRNA (aa-tRNA), forwith in-vitro translation. After translating the entire
a modified adenosine base covalently linked to a tyrosine amino
Puromycin is produced by Streptomyces alboniger, a gramdisplay,(Nemotocoding sequence, the ribosome proceeds to form aacid [2]. display
The major difference
lies in et
the nature of the bondpositive actinomycete, Like
through ribosome
a series of enzymatic
reactionsmRNA
B
al., 1997; Roberts and Szostak, 1997; Roberts, 1999;
peptidebond between the adaptor molecule andTranslation
elongation
Pe
A
Takahashi Tyrosyl-tRNA
et al., 2003) uses a complex
betweenthe C-terminal amino acidresidue in the nascentPuromycin
PemRNA and the polypeptide encoded by that mRNA
polypeptide chain (Fig. 1) The resulting mRNA –as the basic unit of selection. Since the mRNA –protein fusion is purified away from ribosomes
Translocation
protein complex is generated entirely in vitro, withand other components.
(The in-vitro translationout transforming bacteria with the genetic material,canbe used to introduce
Estep
P
A
E
P
A unnatural amino
large Ester
libraries can be constructedwith ease. Typicalacids into the protein (Li et al., 2002).)
Peptide
bond
bond
mRNA
– protein libraries used inselection contain(4) For most applications, a DNA chain complemenPuromycylation
O
NH
1012 – 1013 uniquetary to the protein-bonded mRNA is introduced,
sequences (Roberts, 1999;
Cho etPeusing reverse transcription, in orderPeptidyl-puro
to stabilize theal., 2000; Keefe and Szostak, 2001; Xu et al., 2002;
tRNA
nucleic acid component and to facilitate the recoTakahashi et al., 2003).
Translocation
very of genetic
information after the selection.
What distinguishes mRNA display from ribosome
Free amino
Free amino
Typically,thetemperature and the buffer condidisplay is the covalentnatureofthelinkage
between
E
P
A
group
group
E
P
A
tions that can be used during affinity selection are
the mRNA and the protein in the mRNA – protein
limited only by the stability of the protein target.
complex. This is achieved by bonding the two macroB
R. Aviner / Computational and Structural Biotechnology Journal 18 (2020) 1074–1083

1075

Puro

Amino acidaa - tRNAdyl - tRNApti

dyl - aa - tRNA
pti
A
tRN

dyl - tRNA
pti

Nucleoside

0

Fig. 1. Puromycin structure and mechanism of action. (A) Chemical structures of the 30 end of an aminoacylated tyrosyl-tRNA (left) and puromycin (right). The different
bonds between the nucleoside and amino acid moieties are shown in pink. (B) Basic mechanism of puromycin action. During translation elongation, aa-tRNA enters the A-siteand accepts the nascent polypeptide chain from the peptidyl-tRNA in the P-site. Following translocation, the A-site becomes available to accommodate the next aa-tRNA(top). Like aa-tRNA, puromycin can enter the A-site and accept the nascent chain. This results in translation termination, ribosome disassembly and release of the nascent
chain bearing a 30 puromycin (bottom). (For interpretation of the references to colour in this figure legend, the reader is referred to the web version of this article.)(Aviner, R. 2020. Comput. Struct. Biotechnol., 18, 1074-1083.より引⽤)
Translation elongationPedyl - tRNApti

aa - tRNAP

A

E

Translocation

dyl - aa - tRNA
pti
A
tRN

Pe

E

P

A

Puromycylation
Pe

tRNA

Puro

dyl - tRNA
pti

Peptidyl-puro

Fig. 5. Model of mRNATranslocation– peptide fusion, the unit of selection in mRNA display. Both a molecule of mRNA (gray) and the encoded peptide orprotein (teal and red) form covalent bonds to an adaptor molecule, e.g., puromycin (purple). A strand of complementary DNA (green) is reverseE
PA
transcribed from the mRNA and hybridizes
E toPthisAtemplate. The figure is drawn to scale for Ecballium elaterium trypsin inhibitor, EETI-II, adisulfide-constrained, 28-residue (3 kDa) peptide and for its encoding nucleic acid.
Fig. 1. Puromycin structure and mechanism of action. (A) Chemical structures of the 30 end of an aminoacylated tyrosyl-tRNA (left) and puromycin (right). The different
bonds between the nucleoside and amino acid moieties are shown in pink. (B) Basic mechanism of puromycin action. During translation elongation, aa-tRNA enters the A-siteand accepts the nascent polypeptide chain from the peptidyl-tRNA in the P-site. Following translocation, the A-site becomes available to accommodate the next aa-tRNA(top). Like aa-tRNA, puromycin can enter the A-site and accept the nascent chain. This results in translation termination, ribosome disassembly and release of the nascent
chain bearing a 30 puromycin (bottom). (For interpretation of the references to colour in this figure legend, the reader is referred to the web version of this article.)(Lipovsek, D., et al. 2004. J. Immunol. Methods, 290(1-2), 51-67.より引⽤)「OBOC ディスプレイのライブラリサイズの制限になる要因はなにか。
」
2015 年時点で OBOC ディスプレイによる環状ペプチド合成の化合物ライブラリサイズについて 107 程度であるとの記述がありました(Qian, Z., et al. 2015. Peptide Libraries:

Methods and Protocols, 39-53.)。また、ライブラリサイズの事実的な制約になるのはライブ
ラリ作成後にターゲットとの親和性を調べる段階にあるようです。ライブラリとなる化合物が担持されたビーズ上でスクリーニングを⾏う際に、ビーズ上の化合物密度が⾼く(~100mM)、そのためターゲットはビーズ表⾯上の複数のリガンドと同時に相互作⽤(弱い相互作⽤や⾮特異的な相互作⽤も含む)します。その結果、最初にヒットしたビーズ（通常、数⼗から数百）を個別に再合成し、溶液中でその活性を測定しなければならず、これが⾮常に律速となる段階であるとともに、環状ペプチドの構造を同定することも困難であるようです。
また OBOC 法は combinatorial chemistry の⼀種であるようですが、
combinatorial chemistryについての総説をみたところ、「スプリット合成法では必ずしも全ての組み合わせのペプチドが得られるわけではなく、全ての組み合わせのペプチドがライブラリ中に存在するようにするためには、組み合わせ数より過剰量のビーズを使う必要がある。これは統計学的に計算されており、10 種類のアミノ酸で構成されるテトラペプチドのライブラリ（104 通り）を99%の信頼度で全ての組み合わせが存在するようにするには最低 5 万個のビーズが必要になる。
」との記述がありました。
（⼯藤⼀秋. (1997). コンビナトリアル化学. ⽣産研究: 東京
⼤学⽣産技術研究所所報= Journal of Institute of Industrial Science, The University of Tokyo,
49(3), 131-138.）この記述からも、ライブラリサイズの拡⼤には相当量のビーズ量が必要となり、事実上の制限となることが類推できます。

「Lasso-Graft では RaPID 法と異なり⾮天然アミノ酸が組み込まれていないが、⾮天然ア
ミノ酸を組み込まないことについて。
」

調べた限りでは該当する内容の記述を⾒つけられなかったため、わかりませんでした。

「MET 活性化が脳において神経保護作⽤を果たすと述べられていたが、具体的に神経保護
作⽤とは何か。
」

元論⽂を当たったところ、HGF-MET シグナルの下流で神経細胞のアポトーシス抑制があるようです。より詳しくは、HGF-MET シグナル→Erk (または PI3K/Akt)→アポトーシスという経路が⽰されていました。(Desole, C. et al. 2021, Front. Cell Dev. Biol. 9, 683609.)

「⼀般的な Grafting approach と⽐較した Lasso-Graft の⻑所、また LieD と Lasso-Graft を
⽐べてまとめて」⼀般的な Grafting approach の⽬的としては「⾜場としてのタンパク質にペプチドを埋め込
むことにより、ペプチドの安定性の向上」にあると⾔われています。
（Wang, C. K., et al. 2018.

Nat. Chem. Biol., 14(5), 417-427. ）Lasso-Graft もこの特徴が当てはまりますが、LassoGraft では特に de novo で⾒つけてきた特異性の⾼い環状ペプチドを殆ど構造を失わずに
⾜場タンパク質と融合させることができるという点が⻑所であると考えられます。
また Lasso-Graft のコンセプトとしては「環状ペプチドをタンパク質に(擬似的に)埋め込んだ構造で発現させ、ペプチドリガンドによりタンパク質を機能付加する」ということも⾔えると思います。この点で LieD の「LANA ペプチドを eDHFR の⾮構造領域に埋め込んだよ
うな融合タンパクを発現させ、LANA により eDHFR がヒストン選択的に集積するという機能が付加される」という特徴は類似していると思います。しかしながら、Lasso-graft が「細胞外タンパク質をターゲットとする」ことや「ペプチドとタンパク質の組み合わせに終始した戦略である」のに対し、LieD では「細胞内タンパク（ヒストン）をターゲットとする」ことや「化学触媒の機能付加(ligand-directed でターゲティング)をする」という点で⽬的が異なっているのではないかと思います。