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肥料研究報告 Vol. 2 （2009）5-2

石灰窒素等中のジシアンジアミド性窒素測定－共同試験成績－齊木雅一 1，義本将之 1

キーワード

ジシアンジアミド，石灰窒素，高速液体クロマトグラフ法，共同試験

1. はじめに
現在、肥料分析法（1992 年） １）は石灰窒素中のジシアンジアミド性窒素の試験法としてニッケルグアニル尿素法を採用している．しかし，この方法は使用する試薬が入手困難であり，また定量に長時間を必要とす
る．筆者らは，硝酸化成抑制材のジシアンジアミドの試験法である高速液体クロマトグラフ法を用いることにより，迅速に精度よく定量することを報告した２）．さらに ISO/IEC 17025 の要求事項である試験所間の比較試
験について，IUPAC の共同試験プロトコル ３）を参考に高速液体クロマトグラフによるジシアンジアミド性窒素の試験法の共同試験を実施し，機種間も含む試験室間の再現精度を調査したので，その概要を報告する．
2. 材料及び方法
1) 共同試験用試料の調製
石灰窒素 3 点及び石灰窒素入り配合肥料 2 点（計 5 点）各 2～3 kg を試験品として採取し，ビニール袋に入れて密封した．超遠心粉砕機（Retsch ZM100）で目開き 500 µm のふるいを全通するまで粉砕し，よく混合して共同試験用試料を調製した．
各共同試験用試料約 2 g をビニール袋に入れ密封した．一対のブラインド試料を提供するため，それぞれの肥料の共同試験用試料の袋に 2 系列の番号のラベルを付けた．共同試験用試料（10 点）を参加試験室に送付した．
2) 装置
各試験室に設置している振とう機及び高速液体クロマトグラフ装置を使用した．
3) ジシアンジアミドの測定
分析試料 1.00 g を 200 mL 共栓付き三角フラスコに量りとり，メタノール 100 mL を加え 10 分間振り混ぜ，その上澄み液を PTFE メンブランフィルターでろ過したろ液，又は遠心力 8×103 g（10,000 rpm）で 5 分間遠心分離した上澄み液を試料溶液とした．その試料溶液を高速液体クロマトグラフに供し，ピーク面積又は高さから試料溶液中のジシアンジアミド量を求め，分析試料中のジシアンジアミド濃度を算出した（図 1）．
測定にあたっては，各試験室の高速液体クロマトグラフの操作方法に従った．

1（独）農林水産消費安全技術センター札幌センター

石灰窒素中のジシアンジアミド性窒素測定 －共同試験成績－334) 共同試験用試料の均質性確認
IUPAC/ISO/AOAC の技能試験プロトコル４）の均質性試験に従い，各系列の共同試験用試料からそれぞれ 10 試料を抜き取り,各試料につき 2 点併行で 3）に従って分析した．

分析試料 1 g

共栓三角フラスコ 200 mL←

メタノール 100 mL

抽出

10分間振り混ぜろ過

メンブランフィルター(孔径0.45 μm)
または高速遠心分離(10,000 rpm，5分)

測定

高速液体クロマトグラフ

図 1 ジシアンジアミドの試験法フローシート
5) 共同試験
試験に参加した 11 試験室と使用した高速液体クロマトグラフ及びカラムは以下のとおりであり，それぞれの試験室において送付した 10 試料について 3)に従って試験を実施した．

・ ジーエルサイエンス株式会社

カスタマーサポートセンター（ GL-7400 Series, Inertsil NH2（内径 4.6 mm，長さ 250 mm，粒径 5 µm））
・ 株式会社島津総合分析試験センター

京都事業所（ 島津製作所 LC-10A Series, Unison UK-Amino （内径 4.6 mm，長さ 150 mm，粒径 3 µm））
・ 電気化学工業株式会社

青海工場（TOSOH-8020 Series, Unisil Q NH2 （内径 4.6 mm，長さ 250 mm，粒径 5 µm））・ 財団法人日本食品分析センター

多摩研究所（島津製作所 LC-20AD Series, Mightysil NH2 （内径 4.6 mm，長さ 250 mm，粒径 5 µm））・ 財団法人日本肥糧検定協会（島津製作所 LC-6A Series, Shim-pack CLC-NH2 （内径 6 mm，長さ 150 mm，粒径 5 µm））

・ 独立行政法人農林水産消費安全技術センター神戸センター大阪事務所（Agilent 1100 Series, Mightysil NH2 （内径 4.6 mm，長さ 250 mm，粒径 5 µm））

・ 独立行政法人農林水産消費安全技術センター札幌センター（Agilent 1100 Series, Hibar LiChrosorb NH2 （内径 4.6 mm，長さ 250 mm，粒径 5 µm））

・ 独立行政法人農林水産消費安全技術センター仙台センター（HEWLETT PACKARD SERIES 1100, Unisil Q NH2 （内径 4.6 mm，長さ 250 mm，粒径 5 µm））

・ 独立行政法人農林水産消費安全技術センター名古屋センター（Agilent 1100 Series, Mightysil NH2 （内径 4.6 mm，長さ 250 mm，粒径 5 µm））

・ 独立行政法人農林水産消費安全技術センター福岡センター（Agilent 1100 Series, Unisil Q NH2 （内径 4.6 mm，長さ 250 mm，粒径 5 µm））

・ 独立行政法人農林水産消費安全技術センター肥飼料安全検査部（島津製作所 LC-10A Series, Shodex NH-5A （内径 4.6 mm，長さ 250 mm，粒径 5 µm））

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肥料研究報告 Vol. 2 （2009）（50 音順）
3. 結果及び考察
1) 共同試験用試料の均質性確認
均質性試験の成績から IUPAC/ISO/AOAC の技能試験プロトコル４）の新たな統計手法に記述されている判定基準（次式）に用いる統計量 ５）を表 1 に示した．算出した各共同試験用試料の統計量がこの判断基準を満たし，更に，試料間の相対標準偏差は 0.9～7.7 %であることから，全ての共同試験用試料が共同試験に用いるための均質性を有することを確認した．
s2sam ≦ F1σ2all + F2s2an
s2sam：試料間の純分散（負の値の場合は，0 とする）
s2an：繰返しの分散
σ2all：許容可能な試料間の分散 （σ2all=(0.3×σp)2 ；σp は Horwitz の式 ９）により算出）
F1，F2：10 試料を 2 点併行で測定した場合のファクター（F1=1.88，F2 = 1.01；critical values for homogeneity testing(Appendix 1)）
表１ ジシアンジアミドの均質性確認試験の結果
標準偏差2) 相対標準偏差2平均定量値1)222s samF1σ all+F2s an
(%)
(%)
(%)
0.02460.0006
2.4
2.54E-07
6.06E-07
石灰窒素1
0.164
0.002
1.3
3.01E-06
1.39E-05
石灰窒素2
0.266
0.003
1.1
2.08E-06
3.53E-05
石灰窒素34)0.133
0.010
7.701.23E-04
配合肥料14)0.418
0.004
0.907.64E-05
配合肥料21) 10試料2点併行分析の総平均定量値2) 試料間の標準偏差
3) 試料間の相対標準偏差
4) s 2samの算出値が負の値であったので0とした
試料の種類

2) 共同試験成績及び外れ値検定
各試験室から報告された共同試験成績を表 2 に示した．各系列の分析試料の試験結果を IUPAC の共同試験プロトコル ３ ， ６ ） に従って統計処理した．試験成績の外れ値を検出するために Cochran の検定及びGrubbs の検定を実施したところ，11 試験室の試験成績のうち石灰窒素 1 で 2 試験室，石灰窒素 2 で 1 試
験室の試験成績が外れ値と判別された．
3) 併行精度及び室間再現精度
外 れ値 を除 外 した試 験 成 績 より算 出 した平 均 値 ，併 行 標 準 偏 差 （SDr ），相 対 標 準 偏 差 （RSDr ）及 び
HorRat 値（Hor）並びに室間再現標準偏差（SDR），相対標準偏差（RSDR）及び HorRat 値（HoR）を表 3 に示した．HorRat 値は分析方法の精度の評価をするために用いられており，Hor は RSDr/RSDr（P）及び HoR はRSDR/RSDR（P）により求められる７）．なお，RSDR（P）は平均定量値から Horwitz 式 ５）により求め，RSDr（P）はHorwitz 式に係数（1/2）を乗じて求めた８，９）．外れ値を除外した試験成績の平均値は 0.0321～0.410 %であ35

石灰窒素中のジシアンジアミド性窒素測定 －共同試験成績－

り，その SDr 及び SDR は 0.001～0.007 %及び 0.001～0.008 %であり，RSDr 及び RSDR は 0.7～3.2 %及び1.9～3.8 %であった．また，RSDr 及び RSDR の評価に用いる Hor 及び HoR は 0.24～0.94 及び 0.37～0.72であり，いずれも 2 以下であった１０）．

1)

試験室ABCDEFG
HI
JK
試験室
AB

表2 ジシアンジアミドの共同試験成績 （%）
石灰窒素1
石灰窒素2
0.03100.03140.165
0.165
0.03230.03070.149
0.151
0.03190.03350.159
0.164
0.03290.03540.155
0.152
0.03190.03100.153
0.1503)
3)0.03900.164
0.166
0.03750.03310.03140.164
0.164
0.03200.03310.155
0.156
0.03170.03310.165
0.163
0.03070.03120.172 2) 0.159 2)
0.156
0.162
0.0354 3) 0.0374 3)
配合肥料1
配合肥料2
0.126
0.128
0.418
0.417
0.121

0.122

0.418

0.421

C

0.125

0.123

0.406

0.400

D

0.128

0.129

0.406

0.402

E

0.123

0.124

0.402

0.403

F

0.120

0.121

0.409

0.420

G

0.123

0.124

0.415

0.408

HI

0.122
0.121

0.122
0.122

0.406
0.414

0.400
0.402

J

0.124

0.124

0.418

0.407

K
0.122
0.123
0.422
1) 共同試験に参加した試験室の記号（順不同）
2) Cochranテストによる外れ値
3) Grubbs テストによる外れ値

0.401

表3 共同試験成績の解析結果
3)
4)
5)
SDr
RSDr
Hor
平均値
試料の種類
（%）
（%）
（%）
室数1)
石灰窒素1
90.03210.00103.2
0.94
石灰窒素2100.159
0.002
1.3
0.51
石灰窒素3
110.245
0.002
0.70.30
配合肥料1110.124
0.001
0.70.24配合肥料2110.4100.007
1.60.711） 解析に用いた試験室数2） 平均値（n =試験室数×試料数（2））3） 併行標準偏差4） 併行相対標準偏差5） 併行HorRat値6） 室間再現標準偏差7） 室間再現相対標準偏差
8） 室間再現HorRat値
試験2)

石灰窒素3
0.264
0.265
0.251
0.254
0.243
0.243
0.245
0.246
0.249
0.250
0.236
0.235
0.243
0.246
0.241
0.241
0.242
0.242
0.248
0.243
0.239
0.2346)SDR（%）
0.0012
0.006
0.008
0.002
0.008

RSDR
（%）
3.8
3.83.32.01.97)

HoR8)

0.570.720.67
0.370.4136

肥料研究報告 Vol. 2 （2009）

4. まとめ11 試験室において 5 銘柄（10 点）の石灰窒素及び石灰窒素入り配合肥料を用いてジシアンジアミドの共同試験を実施し，高速液体クロマトグラフによるジシアンジアミド性窒素試験法の評価を行った．その結果，室間再現相対標準偏差は 1.9～3.8 %であった．また，その評価に用いる HorRat 値は 0.37～0.72 であり，2を下回っていたことから，試験所間の比較による本試験法の室間再現精度は満足する成績であった．
既報により測定範囲，公定法との整合性等が検討されており，本試験法は石灰窒素及び石灰窒素入り配合肥料中のジシアンジアミド性窒素測定に用いることができる充分な性能を有することが確認された．このことから，2008 年度肥料等技術検討会の審議を受け，本試験法は肥料等試験法（2009）に収載された１１）．
謝辞

この試験の実施においてコープケミカル株式会社にはサンプルをご提供頂いたことを感謝いたします．また，共同試験にご協力頂いたジーエルサイエンス株式会社，株式会社島津総合分析試験センター，電気化学工業株式会社，財団法人日本食品分析センター及び財団法人日本肥糧検定協会の各位に謝意を表します．
文献1） 農林水産省農業環境技術研究所：肥料分析法（1992 年版），日本肥糧検定協会，東京(1992)
2） 内山丈，白井裕治：汚泥肥料中の水分測定 －共同試験成績－，肥料研究報告，2，25~31 (2009)3） Horwitz, W.: Protocol for the Design, Conduct and Interpretation of Method-Performance Studies, Pure& Appl. Chem., 67 (2), 331~343 (1995)
4） Thompson, M., R.Ellison, S.,Wood, R.: The International Harmonized Protocol for the Proficiency
Testing of Analytical Chemical Laboratories, Pure & Appl. Chem., 78 (1), 145~196 (2006)
5） Fearn, T., Thompson, M., A new test for ‘sufficient homogeneity’, Analyst, 126, 1414~1417 (2001)
6） Thompson, M.: Recent trends in inter-laboratory precision at ppb and sub-ppb concentrations in relation
to fitness for purpose criteria in proficiency testing, Analyst, 125, 385~386 (2000)
7 ） AOAC OFFICIAL METHODS OF ANALYSIS Appendix D: Guideline for Collaborative Study
Procedures To Validate Characteristics of a Method of Analysis, AOAC INTERNATIONAL, Gaithersburg(2000)
8） AOAC OFFICIAL METHODS OF ANALYSIS Appendix E: Laboratory Quality Assurance, AOAC
INTERNATIONAL, Gaithersburg (2000)
9） Horwitz, W., Kamps, L.R., Boyer, K.W.: Quality control. Quality assurance in the analysis of foods fortrace constituents, J. AOAC Int., 63 (6), 1344~1354 (1980)
10） Codex Alimentarius: “Recommendation for a checklist of information required to evaluate method ofanalysis and submitted to the Codex Committee on Method of Analysis and Sampling for endorsement”,
Vol.13, p.129 (1994)
11） 農林水産消費安全技術センター（FAMIC）：肥料等試験法(2009)＜http://www.famic.go.jp/ffis/fert/bunnseki/sub9.html＞

石灰窒素中のジシアンジアミド性窒素測定 －共同試験成績－

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Determination of Dicyandiamide in Nitrolime by High Performance Liquid
Chromatography: A Collaborative Study

Masakazu SAIKI1 and Masayuki YOSHIMOTO1
1Food and Agricultural Materials Inspection Center, Sapporo Regional Center
A collaborative study was conducted to evaluate high performance liquid chromatography (HPLC) for

determination of dicyandiamide in nitrolime and compound fertilizer with nitrolime. Dicyandiamide in these
fertilizers was extracted with methanol. The extract was injected into a high performance liquid
chromatograph connecting aminopropyl silica gel column Dicyandiamide was detected with UV detector.
The samples of 3 kinds of nitrolimes and 2 kinds of compound fertilizers with nitrolime were sent to 11collaborators. The samples were analyzed as blind duplicates. After removing the outlying data using
Cochran and Grubbs outlier test, mean values were from 0.0321 to 0.410 % for each kind of samples. The
relative standard deviation (RSDr) for repeatability ranged from 0.7 to 3.2 %. The relative standard deviation(RSDR) for reproducibility ranged from 1.9 to 3.8 %. The HorRat values (RSDR/predicted RSDR) rangedfrom 0.37 to 0.72. These HorRat values indicated that this method has an acceptable precision for
determination of dicyandiamide in nitrolime and compound fertilizer with nitrolime.
Key words

dicyandiamide, nitrolime, high performance liquid chromatography, collaborative study(Research Report of Fertilizer, 2, 32~37, 2009)