大脳皮質介在ニューロン移動と成熟のライブイメージング
Live Imaging of Migration and Maturation of Corical Interneurons
村上

富 士 夫

Fujio Murakami
大阪大学大学院生命機能研究科脳神経工学講座
要旨

大脳皮質はヒトの様々な高次機能の担い手である．大脳皮質は興奮性投射ニューロンと抑制性介在ニューロンから成るが，後者の占める割合は 2 割程度と低いものの極めて多様性に富んでおり，高次機能発現における役割の認識が高まっている．したがって，大脳皮質の成り立ちの理解にとって如何にして抑制性介在ニューロンが大脳皮質に組み込まれていくかを明らかにすることは極めて重要である．我々は抑制性ニューロン特異的に緑色蛍光蛋白（GFP）を発現するマウス及び電気穿孔法で抑制性介在ニューロン特異的に遺伝子を導入することで皮質の抑制性ニューロンを標識し，その動態を追った．大脳基底核隆起で発生した抑制性ニューロンは脳の深部の中間帯・脳室下帯を接線方向に移動して皮質の背側部に辿り着いた後，辺縁帯で長期間に亙り酔歩用の動きを示した．これを乱すと抑制性ニューロンの脳内最終分布が変化することなどから，この動きは抑制性ニューロンが皮質に万遍なく広がるのに重要な役割を果たすものと考えられる．

キーワード：大脳皮質，細胞移動，子宮内電気穿孔，GFP

1.

（GABA）を発現していることを利用して GABA の合成酵素
はじめにであるグルタミン酸脱炭酸酵素の遺伝子座に緑色の蛍光を発

大脳皮質はヒトの様々な高次機能の担い手である．大脳皮生する分子 GFP の遺伝子を組み込んだマウスを利用してま質によって担われる高次機能はそれを構成する興奮性投射ずその発生様式を観察するとともに動態の可視化を行った．

ニューロンと抑制性の GABA 作動性介在ニューロン（以下冠状断切片での観察の結果，GFP 陽性細胞が次第に新皮質GABA 作動性介在ニューロンと記す）によって形成される神に進入し，拡がっていくことを確認することができた（図 1）．

経回路の働きに大きく依存する．これら 2 種のニューロンのその次に，共焦点顕微鏡を用いてタイムラプス解析を行った．

うち特に後者についてはその占める割合は 2 割程度であるも2–3 時間に亙る解析の結果，GFP によって標識された GABAのの，形態的にも，電気生理学的にも，分子発現，そして脳作動性ニューロンが皮質の中間帯並びに脳室下帯において背内分布パターンにおいても極めて複雑で多様である

1,2）．介内側に向かって勢いよく移動している様子をとらえることが在ニューロンの多様性やそれによって形成される回路の複雑できた 6）．また，その移動速度と運動方向を定量した．そのさは大脳皮質の多様な機能の発現にとって極めて重要と考え結果，中間帯と脳室下帯では接線方向への顕著な移動が観察られるものの，GABA 作動性ニューロンによって形成されるされた一方，辺縁帯や皮質板，サブプレートに分布する局所回路は極めて複雑であるため，現在でもその機能の全容

GABA 作動性ニューロンの多くはわずかな運動性しか示さなの解明には至っていない．GABA 作動性ニューロン大脳基底かった．さらにその移動の運動性や方向性は細胞によって実核原基（GE）に由来するが，その後接線方向への移動によっに多様であり，脳表面に対し垂直方向に移動する細胞や，接て新皮質に到達する 3 ～ 5）．このような移動は大脳の成り立ち線方向ではあるが大部分の細胞とは逆に大脳基底核原基の方にとって極めて重要な現象である．我々はそのような移動の向へ戻るように移動する細胞もわずかながら観察された．ま詳細やそれがいかなるメカニズムで起こるのかについて研究た多くの細胞は，跳躍的な動態を示していた．これらの結果を進めている．

より，発生中の大脳皮質において GABA 作動性ニューロンはそれぞれの層で特異的な動態を示すことが明らかになっ

2.

GABA 作動性ニューロンの可視化

我々はこの細胞が抑制性神経伝達物質のガンマアミノ酪酸た．これら特徴的な動態の大部分はこれまでに提唱されている移動制御メカニズムだけでは十分に説明できず，このことはそれぞれの層での特異的な運動を可能にする，新たな移動〒 565–0871 吹田市山田丘 1–3
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2012 年 5 月 9 日受付

解説大脳皮質介在ニューロン移動と成熟のライブイメージング制御メカニズムが存在することを示唆している．
一方，我々の予想に反して表面近くの辺縁帯には多数のGFP 標識細胞が観察されたものの深部で見られたような動149【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

きは観察されなかった．この結果から，この部分では細胞のえられる．また，細胞が全方向に移動しているのは細胞が発動きが実際に起こっていない可能性も考えられるが，脳を薄生部位から特定の部位に位置を変えるという移動の基本的概い切片として観察したために，動きを捉えることができな念に反するものであり，予想外の結果であった．

かった可能性も考えられた．そこで，切片の作成を行うことなく細胞の動きを観察する方法を開発した．その方法とはフ3.

全方向への移動ラットマウント標本の作製である 6）．胎仔期の皮質はその厚GABA 作動性ニューロンは接線方向に移動した後，辺縁帯みがあまりないことに着目し，全体を切り取り，平面上に伸に向かい，辺縁帯に到達した後は多方向に移動することが明展させた．そして脳室帯側を下に，辺縁帯側を上になるようらかになった 6）．さらに live imaging によって辺縁帯を移動に置き，表面から共焦点顕微鏡を用いて観察を行った．そのする GABA 作動性ニューロンの方向性の定量的解析を行っ結果，GFP 標識細胞が全方向に移動していることを確認すたところ，これらのニューロンは全ての方向に向かう移動をることができた（図 2）．すなわち，冠状切片の辺縁帯で動示すものの，その多くは吻側または，尾側に向かって移動すきを観察することができなかったのは，切片に垂直な方向にる傾向があることが明らかになった 7）．辺縁帯での全方向へ細胞が動くことができなかったのが大きな理由であったと考の GABA ニューロンの移動は切片標本では観察することが図 1 GAD67-GFP マウスの大脳皮質における GABA 作動性介在ニューロンの分布．A は胎生 12 日目，B は 13.5 日目，C は15.5 日目の冠状断切片．13.5 日目には中間帯（IZ）と辺縁帯（MZ）に細胞が分布しており，15.5 日目にはサブプレート（SP）や脳室下帯（SVZ）にも分布が広がる様子がわかる．スケールバー：
100 μm（Tanaka et al., 2003 より）

図 2 GABA 作 動 性 介 在 ニ ュ ー ロ ン の 全 方 向 へ の 移 動．A，
GAD67-GFP マウスの大脳皮質辺縁帯において GABA 作動性介在ニューロンが全方向への移動する様子を示す図．大脳皮質を展開し表面（辺縁帯側）から観察している．B，ニューロンの移動方向を示す図．黒丸についた矢印が移動方向を示す．灰色は 2 時間の観察時間中に動かなかった細胞を示す．スケール
バー：50 μm（Tanaka et al., 2003 より）

150

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出来なかったが，皮質全体を展開して表面から観察を行うこeminence（MGE）由来の GABA ニューロンを特異的に標識し，とにより，明らかにすることが出来た．このことは全方向へその移動の様子を辺縁帯で観察した．そのため，DsRed 遺の GABA ニューロンの移動は辺縁帯以外の層においても起伝子を子宮内電気穿孔法で胎仔の MGE に導入し，標識されこっている可能性を示唆している．技術的制約のため，表面た細胞が皮質辺縁帯到達するまで数日間待った後，皮質を展から離れた部位の GABA ニューロンの（脳表面に平行な面開して live imaging を行った．その結果，GAD67-GFP マウでの）移動の可視化は困難である．しかしながら，脳室帯のスを用いた時と同様に全方向に向かう GABA 作動性ニューニ ュ ー ロ ン に 関 し て は 観 察 可 能 で あ る と 考 え， 我 々 はロンの（脳表面に平行な面での）移動が観察された（図 4）．

GAD67-GFP マウスを用い，上と同様に皮質を展開して，しこのことは，起源を限局した場合でも GABA 作動性ニューかし上面と下面を反転させて脳室帯が上側になるように置いた標本を作製することによって脳室帯のニューロンの動態を可視化した．その結果，興味深いことに脳室帯のニューロンも脳室に平行な面において全方向へ向かって移動していることが明らかになった 7）．また固定標本の観察結果から，サブプレートや皮質板でもそのような動きがあることが示唆された．これらの結果は新皮質の広い範囲で，多方向性の移動が起こっていることを示している．さらに興味深いことに，辺縁帯を接線方向に移動した GABA 作動性ニューロンは皮質版に向かって移動していくことが，明らかになった．元来細胞移動は特定の部位から別の特定の部位へと細胞がその位置を変えることを意味しており，我々の研究結果はこれまでの細胞移動の概念を変える必要のある新奇な発見である．その意義については明らかではないが，一つの可能性としては，皮質内での拡散である．
4.

長時間に亙る接線方向への移動による皮質内分散GAD67-GFP マウスを用いた研究の限界は，細胞密度が高過ぎるために，長距離に亙る移動を追うことが困難であることである．そこで，母胎内のマウス胎仔の大脳皮質に脂溶性のトレーサーである DiD をガラス電極で注入し，必要な生存期間の後に標識された細胞の分布の解析を試みた．その際
GABA 作動性ニューロンの同定のために GAD67-GFP マウスを用い，皮質において GFP の緑色の蛍光と DiD の赤色の蛍光によって 2 重標識された細胞のみを解析の対象とした．
DiD の注入は胎生 15.5 日目に行い，1.5 日または 3 日後に胎仔の脳を固定して観察した．また注入部位は前頭葉，頭頂葉，後頭葉についてそれぞれ行ったが，その何れの場合も，注入後 3 日目には注入部位から 2 ミリ以上離れた脳表面の部位に標識ニューロンが観察された（図 3）7）．このことは辺縁帯に到達した GABA ニューロンは脳の表面で長距離に亙って移動することを意味している．また，GABA ニューロンが辺縁帯において数日間という極めて長期に亙って滞留する可能性が示唆される．
次にそのような移動方向の多様性がどのような要素によって規定されているかを明らかにするため，特定の部位に由来する GABA ニューロンの辺縁帯での動きの観察を試みた．
皮質 GABA ニューロンの起源は一ヶ所ではなく，複数箇所であることが知られており，異なる起源のニューロンが異なる方向へ向かって移動する可能性が考えられた．そこで
GABA ニ ュ ー ロ ン の 起 源 の 一 つ で あ る medial ganglionic
解説

大脳皮質介在ニューロン移動と成熟のライブイメージング

図 3 辺縁層における GABA ニューロンの長距離に亙る移動．
脂溶性色素 DiD を皮質に注入し，1.5 または 3 日後に脳を固定し，標識細胞の分布を観察した．B，C はそれぞれ 1.5 および3 日後の細胞の分布を示す．B2–B3 の挿入図と C3，C4 は標識細胞の拡大図．D は標識細胞の注入部位からの距離の測定結果を示す．スケールバー：B1, C1, 200 μm; B2, B3, 10 μm; C2–C4,10 μm.（Tanaka et al., 2006 より）151【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

図 4 MGE 由来の GABA ニューロン辺縁層での移動．DsRed 遺伝子を電気穿孔法で胎仔の MGE に導入した，標識された細胞が皮質辺縁層到達するまで数日間待った後，皮質を 2 次元に展開して（A）real-time imaging を行った．B の各パネルの右上の数字は観察を計測開始後の時間を示す．あらゆる方向に細胞が動いていることがわかる．B’は移動方向の例を示す．スケー
ルバー：20 μm（Tanaka et al., 2006）

ロンは多方向への移動をすることを意味している 7）．

期に亙って滞留するのは SDF-1 の誘引作用によるのではな

我々は更にその振る舞いを詳細に観察するために長時間にいかと考え，その検証を行った．そのため，まず SDF-1 の亙る観察を試みた結果，数日間に及ぶ GABA 作動性ニュー受容体である CXCR4 が辺縁帯の GABA 作動性ニューロンにロンの移動の様子を捉えることに成功した．辺縁帯の GABA

発 現 し て い る こ と を 確 認 し た 8）． 次 に 生 体 内 で SDF-1 が作動性ニューロンは特定の方向に移動をし続けることはな

GABA 作動性ニューロンを誘引することが出来ることを確認

く，屡々その方向性を変化させ，特定の規則にしたがって移するため，電気穿孔法を用いて興奮性細胞に SDF-1 を強制動している様子は観察されなかった（図 5）．また移動細胞の発現させ，GABA 作動性ニューロンの分布への影響を調べた．

多くは辺縁帯に 2 日以上に亙って滞留し続けた．規則性の認

その結果，GABA 作動性ニューロンが SDF-1 を発現する興

められない GABA 作動性ニューロンの動きはその特徴から奮性細胞を好むかのようにその近傍に高密度に分布すること

我々はこれがランダムウォークではないかと考えて理論的解が明らかになった．次に辺縁帯への GABA 作動性ニューロ

7）析を行った結果，それを支持する結果が得られた ．GABAンへの滞留に CXCR4 を介するシグナリングが関与している作動性ニューロンが辺縁帯に長時間に亙って滞在すること相かどうかを明らかにするために，CXCR4 を loxp 配列で挟ん俟って，このことは辺縁帯において GABA 作動性ニューロンだ遺伝子改変マウス（Cxcr4F/F）を用い，その MGE に cre re-の拡散が起こっているのではないかとの考えを支持している．

combinase 遺伝子を電気穿孔法により導入することで GABA

5.

作動性ニューロン特異的に CXCR4 の発現を抑制した．する
ケモカインの役割と，元来辺縁帯に多くが分布するはずである GABA 作動性

次に我々はこれに加えて，GABA 作動性ニューロンが 2 日ニューロンがより皮質の深部に分布するようになった 8）以上という長期に亙って辺縁帯に留まる機構の解明に取り組（図 6）．この結果は，生体内で GABA 作動性ニューロンが髄んだ．辺縁帯は髄膜の直下にあるが，髄膜にはケモカインの膜から放出される SDF-1 によって誘引されているとの考え一種である SDF-1 が発現していることが知られている．また，を支持するものである．

SDF-1 は神経細胞に対して誘引作用を持っていることも知ら

次に以上の知見を利用して GABA 作動性ニューロンが辺れていた．そこで GABA 作動性ニューロンが髄膜直下に長延帯に滞留することの意義を探った．もし辺縁帯におけるラ152

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図 5 MGE 由来の GABA ニューロン辺縁層での長時間に亘る酔歩様の移動．A は方法を示す．説明は図 4 に準拠．B，C，特定の細胞を選んで長時間に亙る挙動を解析した．C’は C に示す細胞の軌跡を，D は他の 4 つの細胞の軌跡を示す．何れも頻繁に移動方向を変えていることがわかる．A–D は胎生 12 日目で電気穿孔を行い，15.5 日目で観察したもの（E12Ge/E15.5）．
E は D と同様だが，胎生 15 日目で電気穿孔を行い，生後 1 日目で観察を行った細胞の例を示す．スケールバー：B, 30 μm;
C–E, 50 μm; C（挿入図），25 μm（Tanaka et al., 2009, http://www.jneurosci.org/ より）

ンダムウォーク様の移動が GABA 作動性ニューロンの拡散察した．GABA 作動性ニューロンは発現する分子の種類にに寄与しているとすれば，これを乱せば GABA 作動性ニューよって複数のサブタイプに分類することができるが，そのうロンの最終分布に異常が生ずる筈である．そこで我々はタモ

ち Neuropeptide Y 陽性細胞，Calretinin 陽性細胞の皮質内分キシフェン投与により GABA 作動性ニューロンにおける布に大きな違いが見いだされた．このことは辺縁帯におけるCXCR4 の発現が抑えられると同時に GFP が発現するように長期間に亙る移動の継続は GABA 作動性ニューロンのサブTg//+

な る ト ラ ン ス ジ ェ ニ ッ ク マ ウ ス，Dlx1/2-CreER
R; CAG-

CAT-EGFPTg/+/ ; Cxcr4F/F を作製し，GFP 陽性細胞の分布を観解説

大脳皮質介在ニューロン移動と成熟のライブイメージング

タイプが皮質内に正しく分布するのに必要であることを示している 9）．
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図 6 MGE 由来の GABA ニューロン辺縁層での移動にケモカインである SDF-1 とその受容体 CXCR4 を介するシグナリングが必要である．A，Cxcr4 を loxP 配列で挟んだ遺伝子改変マウスを用い，そのホモ接合体マウス（Cxcr4LoxP/LoxP）またはヘテロマウス（Cxcr4LoxP/+/ ）の MGE に電気穿孔法を用いて Gfp 遺伝子と Cre recombinase 遺伝子の両方を導入した．B，ヘテロマウス（Cxcr4LoxP/+/ ）では Cre を発現する細胞（2 列目）に CXCR（3 列目）の発現が認められるが，ホモマウス（Cxcr4LoxP/LoxP）（C）
では消失している．D と E はそれぞれ B，C と同様な条件で実験を行い，胎生 18.5 日目で GFP によって標識される細胞を観察したもの．それぞれの，下部（F）に分布を定量化した結果を示してある．コントロール（Cxcr4LoxP/+/ ）では多くの細胞が辺縁帯（MZ）に分布していたものが，ホモマウスではより深層である皮質板（CP）に分布するようになっている．スケールバー：
B, C, 10 μm; D, E, 300 μm.（Tanaka et al., 2009, http://www.jneurosci.org/ より）を受容するアンテナの役割を果たし，軸索突起は神経細胞で6.

神経細胞移動と極性形成処理された信号の出力を次の神経細胞に伝える役割を果たし脳を構成する神経細胞は極性を有する細胞であり，一本のている．つまりこのような神経細胞の形態は神経細胞の行う軸索突起と数本の樹状突起をのばしている．樹状突起は信号情報処理にとって欠かせない重要なものである．しかし，脳154

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図 7 皮質の GABA ニューロンは過渡的にウニのような無極性の形態示す．電気穿孔法で標識され，生後 0.5 日目に皮質で観察された細胞．右上は観察を始めてからの時間．激しく突起を伸縮させていることがわかる．
（Yamasaki et al., 2010, http://www.jneurosci.org/ より）スケールバー：30 μm

図 8 GABA ニューロンは一無極性の形態を経て軸索の伸長を開始する．A，ウニのような無極性の形態をした神経細胞から軸索突起が伸び出す様子を示す図．右下は観察を始めてからの時間．B–E の挿入図はそれぞれのフレームにおいて四角で囲んだ部分を拡大したもの．B は細胞体，D–E は成長円錐を示す（Yamasaki et al., 2010, http://www.jneurosci.org/ より）の発生の過程で未熟な細胞からどのようにしてこのような形ば先導突起が軸索になると考えれば，成熟神経細胞の極性の態が生まれるのか，またどのようにして一本の軸索突起が伸成り立ちは容易に説明することができる．これを確かめるにび出し，残りが樹状突起になるのかは謎に包まれていた．

は軸索伸展の過程を観察すれば良いが，これまでにそのよう発生期の脳では神経細胞は神経上皮細胞と呼ばれる細胞かな神経細胞の成熟の過程を実際に観察した報告はなかった．

ら生み出されているが，この神経上皮細胞は極性を有していそこで我々は大脳皮質の GABA 作動性ニューロンに着目る．また新しく生まれた細胞は移動を始め，別の場所に移動して，このニューロンが成熟していく過程を長時間に亙ってしてから成熟するが，この移動の際には神経細胞は移動方向観察することで，これまでの考えとは異なる結果を得た．大に先導突起と呼ばれる運動性の高い突起を伸ばしている．つ脳皮質の GABA 作動性ニューロンはマウスではちょうど胎まり移動中の神経細胞も極性を有している．したがって，未仔が生まれる頃に移動を終える．そこでこの時期に焦点を当成熟な細胞が有している極性が受け継がれる，すなわち例えてて観察したところ，ウニのように多くの棘状の突起を持ち，解説大脳皮質介在ニューロン移動と成熟のライブイメージング

155【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

それを伸縮させながらゆっくりと動いている細胞がいることを実現することが明らかになった 12）．これらの観察結果は大を見いだした（図 7）．さらに興味深いことに，その後突然筋において，これまでの in vitro の観察結果を支持するものにその中の一本が急激に伸び出して，軸索のような長い突起であった．になることが確認された（図 8）．このことは移動細胞が一旦その極性を失い，何らかの新たな機構により，成熟神経細胞の極性が獲得されることを意味している 10）．

8.

おわりにスライス標本の利用からはじまった GABA 作動性ニュー次に疑問となるのはこのような現象の一般性である．筆者

ロンのライブイメージングは展開標本，半切標本そして全動の研究室の研究員の山内と生理学研究所の畠中は共同で，大物標本へと新たな標本を開発することにより，また細胞の標脳皮質の興奮性ニューロンの極性形成の過程の解明に取り組識方法をトランスジェニックマウスの利用から子宮内電気穿んだ．そのため胎生 12.5 日目のマウスの皮質の脳室帯を孔法の利用により様々な限界の克服が行われ，新たな展開に電気穿孔法で標識し，数日後に皮質で観察される細胞の動態繋がってきた．筆者らが現在用いている摘出胎仔標本の二光の観察を行った．その結果，皮質の興奮性細胞も抑制性細胞

子顕微鏡による観察は現時点では生体内で起こっている現象と同様に一過性にウニのような形状を示した後，その突起のを理解するのにもっとも適している．しかしながら，胎児の一本が勢いよく伸び出して軸索様の突起となることが確認さ母体からの摘出という操作は胎仔に大きな負荷を与えてしまれた 11）．

う可能性もあり，さらなる改善が求められる．具体的には胎以上のことからウニのような形状を経て，すなわち一時的仔を母体から取り出すことなく観察することが望ましい．まに極性を失ったような形態を示した後に軸索が伸び出すのはた子宮内電気穿孔法による遺伝子の導入は単なる細胞の標識一般的な現象である可能性が高い．に留まらず，遺伝子の発現の抑制や過剰発現などにも用いることができるため，今後さらに応用が広まると思われる極め7.

生体脳における移動

細胞移動はこれまで様々な in vitro 標本を用いて研究が進て有効な手段である．今後は可視化技術と標本の改善により更なる研究の進展があることを期待したい．

められてきた．しかしながら，細胞や脳の一部を取り出す invitro 標本で観察される現象は実際に脳に中で起こっている事とは異なる可能性が考えられる．そこで我々は生きた動物の中の細胞の移動を直接観察することのできる実験系の開発を進めている．皮質の展開標本は切片標本とは異なり皮質全体を保全しているために，基本構造が維持され，細胞はその中を自由に動き回ることが可能である．したがって，展開標本で観察される細胞の動きは生体内での動きをかなり忠実に反映したものと考えられる．しかしながら，皮質に向かう，あるいは皮質から皮質下に投射する線維は切断されているはずであるし，展開標本の外に細胞は移動することもできない．
血液の循環も止まっている．すなわち生体内の条件とは異なっており，細胞移動も何らかの影響を受けている可能性も考えられる．この可能性を評価するためには，全動物標本を用いて細胞移動を観察するしかない．そこで我々は母マウスから取り出した胎仔からの記録を試みた．胎仔は臍帯で母マウスとつながった状態を維持しつつプラスチックのボックスにいれて固定した．そして頭部の皮膚を除去し，頭蓋骨の上から二光子顕微鏡を用いて観察を行った．幸い胎仔の頭蓋骨は透明度が高く，観察の障害にはならない．観察の結果，展開標本で見られたとおり，細胞の移動は全ての方向を向いていた．また先導突起の多くは分枝を形成しており，方向転換

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