6.3.2 低線量率γ線連続照射マウスにおける悪性リンパ腫等腫瘍の早期発生の確認 -血清中のタンパク質を指標とした解析Latency Period of Malignant Lymphoma and Potential Biomarkers in Mice Exposed toContinuous Low-Dose-Rate Gamma-Rays-Analysis of Serum Proteins杉原 崇, 田中 聡, 田中 イグナシャ, 田中 公夫
生物影響研究部

Takashi SUGIHARA, Satoshi TANAKA, Ignacia TANAKA, Kimio TANAKA
Department of Radiobiology
Abstract
Previously, a life span study revealed that low-dose-rate (LDR: 21 mGy/ 22 h/ day) gamma-rays
induced a shortening of the life span by approximately 120 days due to premature death from variousneoplasms, mainly due to malignant lymphomas (ML). We analyzed serum proteins from LDR gamma-ray
irradiated mice using cell-based assays, a newly developed method for measuring the physiological activityof substances in sera, combined with gene expression analyses of mouse embryonic fibroblasts (MEFs).
Gene expressions using a microarray were performed to identify candidate bio-active molecules in sera from
non-irradiated or irradiated mice with ML. When the gene expressions from the LDR irradiated groups werecompared to those of the non-irradiated groups, 291 genes were found to be changed significantly by LDRirradiation. Moreover, Pparγ, Nr3c1, Thrb and Myc were considered as bio-active candidate molecules basedon prediction of transcriptional analysis using IPA software that stimulates MEFs with serum proteins. Theseresults suggest that irradiated mice or mice that developed ML may have bio-active molecules in theirserum.
1. 目的とに経時的な解剖を行い、病理診断の結果、悪性リ

平成 7 年度から 15 年度にかけて行った環境研でのンパ腫と診断されたマウスの血清中の生理活性物質

寿命試験では、低線量率（21 mGy/ 22 時間/ 日）γの変化量を調べ、それを指標とすることにより、低線の 8Gy までの長期連続γ線照射で早期腫瘍死によ

線量率放射線照射により悪性リンパ腫が早期に発生る寿命短縮が認められ、腫瘍の早期発生による早期することを確認する事を目的とした。昨年度まで、の腫瘍死が引き起こされることが示唆された

中線量率（400 mGy/ 22 時間/ 日）γ線連続照射を行（Tanaka et al. 2003, Tanaka et al. 2007）。人の健康診ったマウス血清をマウス線維芽細胞（MEFs）の培養

断では採取の簡便さと得られる情報量が多いことか液中に添加し、マイクロアレイ法で解析し、特徴的ら血液検査が用いられている。そのため、我々は放な遺伝子発現から血清中の生理活性物質を予測する

射線照射マウス血清中のタンパク質を用いることで、新規の方法（Cell-based assay ：CBA 法）の開発を行寿命試験で得られたマウスの低線量率放射線影響をった。この方法により、放射線の連続照射によって調べることが可能ではないかと考えた。本調査では生体内に生じた生理活性物質の量的な変化を検出でマウスへの低線量率 γ 線の照射開始後から 100 日ごきること、さらに、その変化を引き起こす原因となった物質の一つを同定した。今年度は、低線量率γ倍以上影響を受ける遺伝子の数は 1 個であった。次線を長期連続照射し、悪性リンパ腫を生じたマウスに、悪性リンパ腫であることで特徴的に発現変化をの血清中に分泌された生理活性物質を、CBA 法によ示す遺伝子 1969 個を抽出した。そのうち、非照射群り解析し、悪性リンパ腫を発生したマウス血清中の由来の悪性リンパ腫で 2 倍以上変化する遺伝子の数生理活性物質による培養細胞への影響を明らかにすは 24 個、照射群由来の悪性リンパ腫で 2 倍以上変化ることを目指す。

する遺伝子の数は 72 個であった。次に、有意差が検出されたこれらの遺伝子群を一つにまとめ、IPA解2. 方法
B6C3F1 メスマウスに低線量率（20 mGy/ 22 時間/137

析ソフトにより発現量差が 1.3 倍以上のものを抽出して、非照射群由来の非悪性リンパ腫と悪性リンパ日） Cs-γ線を 400 日間照射し、その後、非照射条腫間で差のある遺伝子、照射群由来の非悪性リンパ件下で 100，200，300 日間飼育したマウス（すなわ腫と悪性リンパ腫間で差のある遺伝子、非悪性リンち、照射開始から 500、600、700 日後のマウス）のパ腫群であり照射と非照射間で差のある遺伝子、悪中から病理診断の結果、悪性リンパ腫と同定された性リンパ腫群であり照射と非照射間で差のある遺伝8 匹（照射群：4 匹、非照射群 4 匹）と、悪性リンパ子の 4 群について、それぞれパスウェイ解析を行っ腫を持たない 11 匹（照射群：5 匹、非照射群：6 匹）た（Table 1）。発現アレイ法で分類された遺伝子群ののマウスから心採血により血液を採取し、CBA法に中から上流の因子を推測するために、遺伝子群の発よる解析を行った（Fig. 1）。24wellプレート中でICR現変化を引き起こすことを予測する転写因子スコア系マウスの胎仔線維芽細胞（ICR-MEFs）をFBS10％（ IPA 解 析 ソ フ ト 中 の 一 つ の プ ロ グ ラ ム で あ る入の基礎培地(A-DMEM)に加え 37℃、5％CO2下で一Transcription Factors解析によって得られるRegulation

日培養した。次に、各well中の細胞の培養液を各マ

Zscoreの絶対値が 2 以上となる指標）を用いて解析

ウス個体から採取した血清 15μlを含有した 1 mlのを行った。この結果、血清を培養液中に添加した刺基礎培地にそれぞれ交換し、さらに、37℃、5％CO2激によってICR-MEFsの遺伝子発現変化に影響を及下で一日培養した。培養後、各マウス血清を添加培

ぼすと予測されるPPARγやMyc等の細胞内転写因養したICR-MEFsの遺伝子発現を調べるために、トリ子を検出した（Table 1）。

ゾ ール 液を加 え、 RNA抽 出後 、マイ クロ アレイ

本調査で行った経時的解剖実験の病理学的解析で（Agilent社）解析、リアルタイムPCR解析を行った。

は、低線量率γ線長期連続照射による悪性リンパ腫の早期発生は見られないことから、悪性リンパ腫の3. 成果の概要

腫瘍細胞が速く増殖している可能性がある。この血低線量率（20 mGy/ 22 時間/ 日）γ線を 400 日間連

清解析の結果も早期発生よりもむしろMyc等による続照射したマウス及び同日齢の非照射群のそれぞれ悪性リンパ腫細胞の増殖促進が早期腫瘍死に関与しのマウスの血清をICR-MEFs細胞に添加して 1 日培ていることを示唆する。その他に、PPARγ、NR3C1、養後RNAを細胞から抽出し、網羅的な遺伝子発現変THRB等の核内受容体であるホルモンリセプターが化の結果を得た。このデータに 2 Way Anova法と活性化している可能性が示された。これら転写因子

Benjamini Hochberg法による統計解析を適用して有のリガンドである 5-デオキシ-Δ12, 14-プロスタグ意差（p < 0.05）のある遺伝子を抽出した。その結果、ランジンJ2、ニトロリノール酸、酸化LDL（oxLDL）

低線量率連続照射により発現変化が見られた遺伝子等のホルモン量が、低線量率γ線長期連続照射によ291 個を抽出した。そのうち、照射と非照射群由来ってマウス血清中に分泌されているのかもしれない。の悪性リンパ腫陽性群間の比較で、照射によって 2

今後、低線量率γ線長期連続照射マウスの経時的解倍以上影響を受ける遺伝子の数は 4 個、同様な群由剖実験の病理学的解析により、低線量率γ線長期連来の悪性リンパ腫陰性群間の比較で照射によって 2続照射により早期発生が見られた肝細胞腺腫等のCBA法を用いた血清解析も行う計画である。

Tanaka, S. et al. (2003) Radiat. Res.,160,376-379.
Tanaka, I.B. III et al. (2007) Radiat. Res.,167,417-437.

引用文献

Fig. 1 Cell-based assay (CBA) using sera from irradiated mice. Legend: LDR, Low-dose-rate; ML, Malignant
Lymphoma; A-DMEM, Advanced DME medium.

Table 1 Candidate bio-active molecules detected by addition of sera from 4 different groups in the transcription factor
analysis of IPA. Legend: LDR, Low-dose-rate; ML, Malignant Lymphoma.

ML(-) vs ML(+)

LDR(-) vs LDR(+)

LDR(-)LDR(+)

ML(-)

ML(+)

Pparg

Cebpb
Spi1
Notch1
Nr3c1

Myc
Nr3c1
Thrb
Cebpb

Pparg
Stat3