単粒子解析のための TEM データ収集の自動化
Automated TEM Data Collection for Single Particle Analysis
中村奈津子

Natsuko Nakamura
日本電子株式会社
要旨

透過型電子顕微鏡を用いた構造生物学の研究手法の一つに単粒子解析が挙げられる．単粒子解析には試料の結晶化が不要であるという大きな利点があると同時に，膨大なデータ収集が要求されるという課題がある．一般にこの分野においては，支持膜の孔に試料液の薄膜を形成して凍結し回折（DIFF）モードでのシャドウイメージによって試料探索を行うが，その結果信号ノイズ比が低く，また糸巻きひずみやたる型ひずみを生じるという像の特性を生じ，そのことが自動化を困難にしている．これらの課題を克服して開発に成功した自動データ収集システム JADAS について紹介する．

キーワード：単粒子解析，DIFF シャドウイメージ，ひずみ補正，自動データ収集，画像処理

1.

2. 単粒子解析法

はじめに様々な手法で生体内の分子の構成部品や分子の複合体の構

前述のように，単粒子解析法とは観察対象の粒子を分散さ造を解析する研究分野は構造生物学と呼ばれ，代表的な手法

せたバッファを薄膜化して TEM で観察し，様々な方向の投として X 線結晶解析，核磁気共鳴法（NMR），透過型電子顕影像を三次元空間で重ね合わせることによって立体構造を導微鏡法（TEM）の三つが挙げられる 1）．

き出す手法である 3,5）．通常は炭素やシリコン等の軽元素で特に TEM に注目すると，電子線結晶解析，単粒子解析法，できた薄い支持膜に 1 μm 程度の大きさの孔を多数あけたもトモグラフィの三つの手法が用いられる．電子線結晶解析はのをメッシュに貼り付けて，その孔の中にバッファを埋め込試料の二次元結晶（シート状結晶）に電子線を照射しその透んで急速凍結し低温に保った状態で撮影を行う．後述するよ

過回折パターンの解析から原子モデルを復元する手法であうに多数の粒子を撮影しなければならないため，一つのメッ2）

る ．X 線と同様に高分解能な結果を得ることができる上に，シュにつき 100 回から 200 回程度の撮影が行われる．倍率は，X 線を用いる場合と異なり，回折パターンを得たのと同じ視撮影の手間と分解能のトレードオフで決定され，典型的には野から像を得ることで位相問題を克服できるという特長があ

40,000 倍ないし 60,000 倍程度で行われる．銀塩フィルムにる．単粒子解析法は試料液（バッファ）内の孤立粒子の像を撮影して現像した後，地図用の高精細なスキャナでデジタイ多数撮影し，それらの互いの方向を推定して三次元空間で重ズすることが従来行われてきたが，近年では CCD カメラでね合わせる手法である 3）．結晶化する必要が無いためにどの撮影して最初からデジタルデータとして取得することが盛ん

ような分子についてもすぐに測定を開始でき，また試料粒子に行われるようになってきている．撮影された画像から個々の濃度は極めて低くてよく，50 nM 程度のものを 5 μL 得らの粒子部分を切り出し，切り出された数千から数十万個の粒れれば実験ができる．トモグラフィは単一の試料から複数の子像を同じ方向ごとに分類する．それぞれの方向で像を平均方向の投影像を取得して，逆ラドン変換により立体構造を復化してノイズを減らし，互いにどの方向にあるかを推定して4）元する手法である ．電子線による試料ダメージが深刻なために撮像中に照射できる電子線量に厳しい制限があり，信号ノイズ比（S/N 比）の低い像を用いることになる．

三次元空間で重ね合わせて立体構造を得る．
2.1 単粒子解析法の課題
満足する結果を得る上で生じる困難としては，バッファの本講座ではまず単粒子解析法について手法の概略を俯瞰

薄膜化の困難，撮影に大変な手間がかかること，撮影されたし，実験を行う上で直面する課題を明らかにする．さらに課像から膨大な数の粒子を個別に抽出する困難，そしてこれら題解決に向けて近年筆者が開発した自動データ収集システム

膨大な数の粒子像を適切に分類して相互の関係を見出す困難

JADAS を紹介し，特にその自動試料探索アルゴリズムにつが挙げられる．

いて説明する．
〒 196–8558 東京都昭島市武蔵野 3–1–2
2009 年 10 月 29 日受付42

まず試料作製の主な困難は凍結する試料の厚みの厳密な制御である．厚すぎても薄すぎても解析に適さないため，マニュアル法の他に市販の膜厚制御装置を用いた試料作製が行われ顕微鏡 Vol. 45, No. 1（2010）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

る．これは，水溶液の薄膜が安定する厚みが，水溶液の塩濃データを良い条件で収集したり収集したデータから無数の粒度と周りの湿度及び気温の関数で表されることを利用したも子を抽出する必要があるため，これらの作業を自動化する試のであり 6），理論的には厳密に環境を調整したチャンバー内みは近年欧米を中心に盛んに行なわれはじめた．取得したで望ましい膜厚の試料を作製できるはずであるが，現実にはデータに対する解析処理については各種の技術 8,9）が開発さ必ずしもよい結果が得られるわけでもなく，最適な厚みの試れてきているが，しかしながら，データ収集に関する自動化料が得られるまで作製しては TEM に挿入して像を確認するの試みはあまり成功しているとはいえない．撮影した像から作業を繰り返すことになる．の粒子抽出やそれらの位置合わせといったデータ処理はコン第二の困難は，撮影枚数の多さである．電子線照射によるピュータによる計算だけで可能であるのに対して，データ収ダメージを受けやすい試料特性のために撮影は低線量で行わ

集はコンピュータソフトウェアだけでは如何ともし難いといれ，得られる像の S/N 比は極めて低い．ノイズを減らしてうのがその理由だと考えられる．すなわち，データ処理なら高分解能なデータを得るには，できるだけ多数の投影像を三ばソフトウェアのアルゴリズムを工夫することで性能の向上

次元空間上で重ね合わせる必要があり，近年要求される Åが見込めるが，データ収集は TEM の動作精度によって得らオーダーのデータとするためには数万から数十万個の粒子をれる性能が制限を受けてしまう．そこで，過去にあったいく撮影しなければならない．1 枚の写真に写る粒子は通常数十つかの自動データ収集の試み 10） においては，十分な性能を個から百個程度であり，デフォーカス量などの条件がうまく得るために装置メーカーの TEM 開発者と共同で装置自身の整っていないために使用に適さない写真もある程度の割合で様々な改造や内部仕様の修正を行っている．

含まれることを考えると，数千枚の写真を用意しなければな

もっとも大きな問題は倍率である．TEM には一般的に，らないということになる．実際にはウィルスなどは高い対称

通常の像観察に用いる MAG モード，回折パターンを観測す性を持つことが多く，その場合には 1 枚の射影を対称的なほる DIFF モード，対物レンズ電流をゼロにして低倍を実現すかの方向にも当てはめて平均化することができ撮影する写真

る LOWMAG モードがある．MAG モードや DIFF モードでの枚数を大幅に減らすことも可能であるが，一般には数百枚は高分解能を得るために対物レンズに大きな電流を流して試から 1,000 枚程度を撮影して，合計数万個の粒子を抽出し，料付近に強い磁場を作るが，これ自体が像を拡大するのでさそれらの互いの方向を見極めた上で三次元空間上において平らに像形成レンズを通った結果はかなり高い倍率の像が観測均化する必要がある．

される．MAG モードで設定可能な最低倍率は，加速電圧

三つ目の困難は，ノイズに埋もれた粒子を数千個から数万200 kV の装置で通常 2,000 倍程度，加速電圧 300 kV の装置個抽出しないといけないということである．様々な自動化のでは 5,000 倍程度である．よってより広い視野を確保できる試みはあるが 7），人間が見ても個々の粒子を識別できないほ

LOWMAG モードで撮影したい試料を検索し，MAG モードやどの低い S/N 比の画像から自動的に粒子を抽出することにDIFF モードでデータを収集するというのが一般的な TEM 像

成功するアルゴリズム 8）はまれである．

観察の流れであるが，LOWMAG モードから MAG モードある

四つ目の困難は抽出した個々の粒子の位置合わせとクラス

いは DIFF モードに切り替えるときに，対物レンズの励磁の分け，方向合わせが難しいことである．同じ方向の投影像ごヒステリシスのために光軸の設定が狂ってしまうため光軸のとにクラス分けを行い像内での回転と位置を合わせて重ね合再調整が必要となる．この調整には時間がかかり，面倒であわせ，さらにそれらのクラスごとの積算像のオイラー角を推るだけでなく調整中に試料を電子線にさらしてダメージを与定して三次元空間で重ねる．ほとんど見えるか見えないかわえてしまうので，単粒子解析のような分野では LOWMAG モー

からないような像同士を比べてこの作業を一度行うだけではドは使用せず，DIFF モードで大きくデフォーカスさせてシャエラーが大きすぎて満足な結果は得られない．そのため，得ドウイメージを得ることが多い．これにより対物レンズの励られた三次元構造を元に各方向の投影像を計算し，それを元磁を変更することなく LOWMAG モード並みに広い視野が得にすべての粒子像の位置合わせ，クラス分け，方向合わせをられるが，この状態では投影レンズによる糸巻きひずみやたやり直すという繰り返し作業を，分解能がそれ以上向上しなる型ひずみを生じる．手動操作では大きなひずみがあってもくなるまで何度も行う．

目標物を中心に持ってくるようにステージを操作することは容易である．しかしソフトウェアで自動的にステージを動か3.

自動データ収集システム

すとなると，ひずみを含む像では不都合を生じる．そのため前節で述べたような様々な課題に対してコンピュータを用

Carragher らは TEM 内部のレンズに特殊な値を設定することいた自動化の試みが様々な研究者によってなされてきていで，MAG モードでありながら LOWMAG モード並みの低い倍る．単粒子解析法は電子線結晶解析とは異なり試料の結晶化率を実現する方針を採用した 10）．実際それによって望ましいが不要でありながら，装置や手法の改良，新しいアルゴリズ状態が実現できたかもしれないが，これには装置メーカーのムの開発やコンピュータの計算能力の向上により得られるエンジニアによる特殊な改造や保守作業が必要であり，このデータの分解能が Å レベルに達してきている．しかし十分ようなシステムでは一般のユーザが利用するのは困難である．

な分解能を得るためには複雑な TEM の操作に習熟し大量のまた像のコントラストが低くノイズが多いこともデータ収講座

単粒子解析のための TEM データ収集の自動化

43【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

図 2 DIFF シャドウイメージ（a），および同じ試料の MAG像（b），a を JADAS で補正したもの（c）．

技 術 と 組 み 合 わ せ て 自 動 デ ー タ 収 集 を 実 現 し た（ 図 1）．
JADAS の応用データについては文献 11）を参照されたい．この章の残りでは JADAS において行っている糸巻きひずみの補正と支持膜の孔の自動検出の効果を紹介する．詳細なアルゴリズムについては文献 12）にまとめた．
図 1 JADAS の実行画面（a）とひずみおよび孔の配列のパラメータをキャリブレーションするツール（b）．

3.1

DIFF シャドウイメージのひずみ補正

図 2 は，炭素薄膜に直径 2 μm 程度の孔のあいたものにさらに薄い連続支持膜を重ね，そこにウィルスを負染色で固定集の自動化を困難にしている．前述のように単粒子解析法にした試料を加速電圧 200 kV の TEM（JEM-2100）で撮影しおいては軽元素の薄膜にあいた孔に試料液を埋め込んで凍らた様子である．DIFF シャドウイメージを（a）に，MAG モーせたものを撮影するので，データ収集を自動化するためにはドの像を（b）に示す．MAG モードにおいては，JEM-2100個々の孔の位置を自動的に検出する必要がある．しかし後述の MAG モードにおける最低倍率である 2,000 倍で撮影をするように，通常のパターン認識の手法である正規化相関は行った．図から容易に見て取れるように，DIFF シャドウイ

このようなノイズの多い画像において個々の孔の位置を検出

メージにおいては通常の MAG モードでの観察に比べて広いするには精度が低く実用に耐えない．前述した Carragher ら

視野が得られる上にコントラストも向上するが，大きな糸巻の研究報告においても，このような環境下でいかにして孔をきひずみを生じて正方格子に整列しているはずの円形の孔が検出しているかについては詳細な記述がなく，高い精度で自変形して見え，像の明るさも変化を受けて外周部が暗くなっ動的に軽元素薄膜の孔を検出する手法に関する研究は行われている．自動的に試料を検索するためには，図 2（c）のよていないようである．

うに補正する必要がある．

著者らは近年このような課題を克服して自動的に単粒子像

JADAS においては，ひずみのパラメータはデータ収集をを収集するシステム JADAS を開発した 11）．JADAS において開始する前に図 1（b）に示した GUI ツールを用いて測定しは，DIFF シャドウイメージにおける大きな糸巻きひずみにておく．このツールでは TEM に装着されたデジタルカメラよる像の形状と明るさの変化を定式化し，それを補正してひから取得した DIFF シャドウイメージに人工的な孔の配列がずみの影響のない像を生成することに成功した．また軽元素重ねて表示され，ユーザがその孔の大きさや配列の傾き，ひ薄膜の孔の周期性を利用して正規化相関の精度を向上し，ずみのパラメータを調整して人工的な孔の配列を像の実際のS/N 比の低い画像中においても安定して目的のパターンを検孔にあわせこむことによってソフトウェアにそれらのパラ出できる技術を確立した．さらにこれらの開発した技術を，メータを理解させる．

ユーザが独自の撮影手順を組めるような柔軟性を配した設計

3.2のフレームワークに組み込み，オートフォーカスなどの既存試料の自動検索のためには，個々の孔の位置を自動的に検44孔の自動検出

顕微鏡 Vol. 45, No. 1（2010）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

単位格子に切り分けて積算することで，個々のピークを高精度に自動検出する（図 3d）．
図 4 に示したのは，加速電圧 300 kV の cryo-TEM（JEM3200FSC）を用いて撮影した氷包埋試料の像に対して，単一の孔の模式図による正規化相関のピーク位置から個々の孔の位置を推定した様子（a）および筆者らが開発した上述の方法で推定した様子（b）である．画像から部分的にはみ出す孔は無視したが，それ以外の孔について正確に検出されている様子が伺える．
4. おわりに
本稿では，単粒子解析法をターゲットにデータ収集の自動化について解説し，筆者らが開発した自動データ収集システ
ム JADAS において用いられている像ひずみの補正方法と低S/N 比の氷包埋試料像におけるパターン認識を紹介した．構造生物学において TEM の存在意義が増すにつれ，多くの研究者がより効率のよいデータ収集手段や解析手段を探求する
図 3 孔あき炭素薄膜に固定された試料の像（a）と人工的な単一の孔の模式図と a との正規化相関（b），人工的な孔の配列の模式図と a との正規化相関（c），単位格子を切り出す様子（d）．

ようになってきている．研究者人口が増えるにつれ各種の作業の自動化はますます重要さを増しているが，取得されたデータに対する解析作業の自動化は盛んに試みられている一方で，装置の各種デバイスの動作特性から結像原理まで幅広
い理解を必要とするデータ収集の自動化はまだ多くの課題と十分な開発の余地を残していると思われる．
5. 謝

辞

日本電子株式会社の技術顧問として長年にわたり構造生物学に関する技術指導を賜っている産業技術総合研究所の佐藤主税先生および小椋俊彦先生に厚く感謝を申し上げます．また JADAS の動作確認や仕様決めにご協力いただいた Baylor
図 4 氷包埋の試料の像に対して，単一の孔の模式図によって孔を検出した様子（a）と孔の配列の模式図を用いた場合の様子（b）．

出する必要がある．既知の形状を抽出するパターン認識において一般的な従来の手法は正規化相関を用いる方法である 13）
が，TEM 像のような S/N 比の低い状態の画像においては単純な正規化相関ではうまく機能できない．図 3 に示すのは加速電圧 200 kV の TEM を用いて 2,000 倍で撮影した孔あき炭素薄膜の試料（負染色のもの）の像（a）と人工的な孔の模式図を用いて計算した正規化相関（b）である．正規化相関（b）においては，元の画像（a）の個々の孔の中心に対応する位置にそれぞれ明るい強度のピークが見られるが，元の画像（a）の S/N 比が低いためにピークはいずれもぼやけていて，それらを自動的に検出することは困難である．
そこで JADAS の構築に当たっては孔が等間隔な正方格子になっていることを利用して，正規化相関のピークを強調する方法を開発した．すなわち，正規化相関の計算に単一の孔の模式図を用いる代わりに，正方格子を形成する孔の配列の模式図を用いることで正規化相関のピークを識別しやすくし（図 3c），その位置が周期的であることを利用して相関像を講座

単粒子解析のための TEM データ収集の自動化

College of Medicine の Wah Chiu 教授および Junjie Zhang さんにこの場を借りてお礼申し上げます．
文献1）Sali, A. et al.: Nature, 422, 216–225 (2003)
2）藤吉好則，光岡 薫：細胞工学，16（11），1677–1689（1997）3）Frank, J.: Three-Dimensional Electron Microscopy of MacromolecularAssemblies, Oxford University Press (2006)4）Frank, J. (Ed.), ELECTRON TOMOGRAPHY 2nd Ed., Springer,
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Chapman and Hall (1993)45【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】