ATAC-Seq Kit Manual!B6 "#$
货号：53150

Active Motif 中国
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本手册中的信息如有更改，恕不另行通知，也不构成 Active Motif, Inc.的承诺。本手册按“原样”提供，无任何明示或暗示的担保。本手册中的信息可随时更改或更新。
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本文件的制造商为 Active Motif, Inc。
© 2020 Active Motif, Inc.，地址：1914 Palomar Oaks Way，Suite 150；Carlsbad, CA 92008。版权
所有。
此处引用的所有商标、商号、服务标志或徽标均属于其各自的公司。
仅供科研实验使用，不可用于医学诊断。
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!"!" ............................................................................................................................................................. 1#$%&'()*+ .................................................................................................................................... 2

ATAC-Seq Kit #$,- ........................................................................................................................ 2./0123 ....................................................................................................................................... 3
ATAC-Seq 4567.................................................................................................................................... 4%89:;<= .................................................................................................................................... 4>?9:;<= .................................................................................................................................... 5@ABCDEF .................................................................................................................................... 5@AG DNA ; PCR HI..................................................................................................................... 7
Index JKD Sample sheet LM .............................................................................................................. 9
NOPQ ...................................................................................................................................................... 9
RSTUVW ............................................................................................................................................ 10

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#$2013 年首次报道染色质转座酶可及性测序（Transposase-Accessible Chromatin via
Sequencing, ATAC-Seq）技术[1]，该技术能够通过识别染色质开放区域快速有效的反映表观遗传状态。在这个过程中，经突变改造过的 Tn5 转座酶作用于完整的细胞核，Tn5 在转座（tagmentation）
的过程中，能够片段化 DNA 的同时将测序接头连接在靶 DNA 的两头。
因为 ATAC-Seq 检测的快速性，简单性，敏锐性，以及样品的广泛适用性，现已是表观遗传学研
究的重要实验技术，进一步，可为深入详细分析表观遗传学提供支持。ATAC-Seq Kit 试剂盒提供的试剂足够生产出 16 个独一无二的，适用于 illumina® 测序平台的文库。每一个 ATAC-Seq 文库的起始
样本量可以是 20-30mg 组织或者 50,000-100,000 细胞。
ATAC-Seq 的优点：l评估染色质开放区域的表观特征l

数小时内便能完成 NGS 的样本准备工作l简单且快速的三步法
产品名称

规格货号

ATAC-Seq Kit

16rxn53150

注意：此试剂仅限适用于科研实验，不可用于医学检测。

illumina ® 是 illumina, Inc. 注册商标www.activemotif.com

1

%&'()*+,此试剂所含试剂足够完成 16 个样本的 ATAC-Seq 实验对应的 NGS 文库构建。这些试剂涉及多种保存条件。ATAC-Seq 试剂盒分两个盒子两种温度运输，其中一个-20℃保存的盒子由干冰运输，另一个 4℃保存的盒子常温运输。请依据本试剂盒推荐温度保存各试剂（详见下表），请妥善保管所有试剂，自收货之日起六个月稳定。

ATAC-Seq Kit !"#$!"%&'()*+,ATAC Lysis Buffer

17 ml

RT

Assembled Transposomes

170 μl-20℃

2 × Tagmentation Buffer

425 μl-20℃

1 × PBS

2 × 1 ml

-20℃ or RT

10 × PBS

500 μl

RT

10% Tween 2010 μl

RT

1 % Digitonin

10 μl-20℃

DNA Purification Columns

16 !

RTDNA Purification Binding Buffer

4.5 ml

RTDNA Purification Wash Buffer

10 ml

RT

DNA Purification Elution Buffer

5 ml

RT

3 M Sodium Acetate

450 μlRT

10 mM dNTPs

40 μl-20℃

5 × Q5 Buffer

2 × 130 μl-20℃

Q5 High-Fidelity DNA Polymerase (2U/μl)

10 μl

-20℃

i7 Indexed Primer1

10 μl

-20℃

i7 Indexed Primer2

10 μl

-20℃

i7 Indexed Primer3

10 μl-20℃

i7 Indexed Primer4

10 μl

-20℃

i5 Indexed Primer1

10 μl

-20℃

i5 Indexed Primer2

10 μl

-20℃

i5 Indexed Primer3

10 μl

-20℃

i5 Indexed Primer4

10 μl

-20℃

SPRI Beads

1 ml4℃

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2-./012lllllllllllllll

100% 乙醇去离子水台盼蓝
移液器及其相应的枪头离心机
水平台式离心机
1.5 ml 离心管
300 μl PCR 管磁力架（或磁力条）
40 μl 细胞筛（用于组织样本）无菌手术刀片（用于组织样本）
5 cm 培养皿（用于组织样本）
15 ml 锥形管（用于组织样本）
预冷的 PBS（用于组织样本）
Dounce 组织匀浆研磨器（用于组织样本）www.activemotif.com

3

ATAC-Seq ./01
注意：此实验方法适用于 20-30 mg 组织，或 50,000-100,000 个细胞。

3456789

此方法适用于单次 20-30 mg 组织样本。
SPRI 磁珠在使用前，请从 4℃中取出，平衡至室温后使用。
1. 对于每个样品，将标记好的 5 cm 培养皿放置在冰上，同时准备 5 ml 预冷的 PBS 在
15 ml 离心管中。
2. 将样品转移至对应的培养皿中，用干净无菌的刀片将组织切碎后，用 1 ml 移液器转移切碎后的组织至含有 5 ml 预冷 PBS 的 15 ml 离心管中（枪头可用宽口枪头，或剪掉枪头前端 2 mm 左右，以防止堵塞）。
3. 4℃下 500 × g 离心 5 min。
4. 吸出 PBS，加入 1 ml ATAC Lysis Buffer。
5. 用宽口枪头（或修剪过的枪头）转移匀浆样本至 1 ml Dounce 匀浆研磨器中，使用
紧密配合的杵（B 型）缓慢均质化样品 30 次
6. 利用 40 μm 细胞筛过滤上一步的匀浆至 1.5 ml 离心管中，并立即取出 10 μl 过滤后的液体检测细胞数量。
7. 利用台盼蓝染液（细胞体积∶0.4%台盼蓝 = 1∶1）在光学显微镜下检测细胞核数量
和状态，只有细胞核能被台盼蓝着色。
8. 轻柔颠倒混匀细胞核悬液，吸取 50,000-100,000 的细胞核至新 1.5 ml 管中。
9. 4℃下 500 × g 离心 5 min。在离心的过程中，请依据下表配制 Tagmentation
Master Mix。
Tagmentation Master Mix(一个样品的用量)
试剂名称用量2 × Tagmentation Buffer

25 μl

10 × PBS2 μl1 % Digitonin

0.5 μl

10% Tween 20

0.5 μl

H2 O

12 μl

Assembled Transposomes

10 μl

10. 吸除上层液体，并立即开始转座反应（Tagmentation Reaction）和纯化步骤。

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4:;56789

SPRI 磁珠在使用前，请从 4℃中取出，平衡至室温后使用。
1. 经计数后的细胞悬液，每个样品吸取 50,000-100,000 个细胞分别转移至新的 1.5 ml
离心管中。
2. 4℃下 500 × g 离心 5 min。通常离心后能够看到细胞聚集在管底，若未见细胞聚集物，可再在 4℃下 1000 × g 离心 5 min。
3. 轻柔的移除上层液体后，加入 100 μl 预冷的 PBS。不要重悬或扰动底层细胞团聚物。4℃下 500 × g 离心 5 min。
4. 小心的移除上层液体，确保不要扰动底层细胞团聚物。加入 100 μl 预冷的 Lysis
Buffer，并用移液枪完全吹打重悬细胞。
5. 转移重悬后的细胞至提前放在冰上的 PCR 管中。在 4℃下 500 × g 离心 10 min。在离心的过程中，请依据下表配制 Tagmentation Master Mix。
Tagmentation Master Mix(一个样品的用量)
试剂名称用量2 × Tagmentation Buffer

25 μl

10 × PBS

2 μl

1 % Digitonin

0.5 μl

10% Tween 20

0.5 μl

H2 O

12 μl

Assembled Transposomes

10 μl

6. 离心后，小心的移除上清，确认细胞核团聚物未被扰动（这步是关键步骤，需格外小心的去除 ATAC Lysis Buffer 但不造成细胞核的损失）。立即开始转座反应（Tagmentation Reaction）和纯化步骤。
<=>?（Tagmentation Reaction）@AB

1. 每个样品中加入 50 μl Tagmentation Master Mix（不需要放置在冰上）。轻柔的吹打重悬细胞核在 Tagmentation Master Mix 中（样本多的情况下，可用排枪）。
2. 设置恒温混匀仪（或类似仪器）温度 37℃，转速 800 rpm，将样品放置在恒温混匀仪上孵育反应 30 min。
3. 反应结束后，立即将样品转移至干净的 1.5 ml 离心管中。
4. 每个样品各加入 250 μl DNA Purification Bind Buffer 和 5 μl 3 M 乙酸钠（sodiumacetate）。
5. 若样品的颜色是亮黄色以外的颜色，请再加入 5 μl 3 M 乙酸钠直至样品变为亮黄色。请看下图（图一）。
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CD EF pH GHI7JKLMDNA Purification Binding Buffer 含有 pH 指示染料，所以样品溶液的 pH 很容易被分辨出来.只有当液体颜色是亮黄色时(图示左边管)，才说明 pH 在 7.5 以下。当 pH
高于 7.5 时，DNA 不能与纯化柱结合。注意：全彩图片可从 Active Motif 官网获得。
6.
7.
8.
9.

吹打混匀各样品。
对于每个样品，在收集管中放置一个 DNA 纯化柱。
转移样品至对应的纯化柱中，关闭管盖，17,000 × g（14,000 rpm）离心 1 min。
从收集管上取下纯化柱，弃废液后，将纯化柱放回收集管中。
注意：Wash Buffer 第一次使用时需要加入 100%乙醇，终浓度为 80%（DNAPurification Buffer 瓶中加入 40 ml 100%乙醇）。
10. 每管加入 750 μl Wash Buffer，并盖好管盖。
11. 17,000 × g 离心 1 min。
12. 从收集管上取下纯化柱，弃废液后，将纯化柱放回收集管中。
13. 打开纯化柱的盖子，17,000×g 离心 2 min 去除残留的 Wash Buffer。
14. 转移纯化柱至新的离心管中。
15. 在纯化柱的中心位置加入 35 μl DNA Purification Elution Buffer，关闭管盖，室温放置 1 min。
16. 17,000 × g 离心 1 min。
17. 丢弃纯化柱，DNA 纯化步骤完成。
18. 纯化后的 DNA 可保存在-20℃，或直接进行下一步，转座后 DNA 的 PCR 扩增。

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6转座后 DNA 的 PCR 扩增
注意：若需使用类似 KAPA Real-Time Library Amplification Kit 的试剂，下面步骤中最开始的72℃延伸是必不可少的。
1. 按下表组分配制 PCR 反应体系。若建库后的文库测序在同一 flow cell 上，需要确认每一个样本都链接了独一无二的 i5 和 i7 index 序列。
每一个样本均需要通过 PCR 反应链接 i7 index 和 i5 index 各一个。这里我们提供 4× 4 =16 种组合方式的 i7/i5 index 引物， 供 16 个样本使用。这些 index 引物基于
Illumina’s Nextera adapters 设计。
每个反应：使用一个 i7 indexed 引物
i7 Indexed Primer1 = i7 N701
i7 Indexed Primer2 = i7 N702
i7 Indexed Primer3 = i7 N703
i7 Indexed Primer4 = i7 N704

和一个 i5 indexed 引物
i5 Indexed Primer1 = i5 N501
i5 Indexed Primer2 = i5 N502
i5 Indexed Primer3 = i5 N503
i5 Indexed Primer4 = i5 N504

试剂名称

用量

Tagmented DNA

33.5 μl

i7 Indexed Primer (25 μM)

2.5 μl

i5 Indexed Primer (25 μM)

2.5 μl

10% Tween 20

0.5 μldNTPs (10 mM)

1 μl

5 × Q5 Reaction Buffer

10 μl

Q5 Polymerase(2 U/μl)

0.5 μl2. 使用下方程序运行 PCR（需要热盖）：
72℃
5 min
98℃
30 s
10 个循环：98℃ 10 s, 63℃ 30 s, 72℃
保持 10℃。

1 min

3. 操作 SPRI Clean-up 过程时，每个样本需要 60 μl SPRI 磁珠溶液（1.2 × 样品体积），20 μl DNA Purification Elution Buffer，400 μl 新鲜配制的 80%乙醇溶液。
a. 室温下，每个样本加入 60 μl 完全混匀的 SPRI 磁珠。
b. 短暂涡旋混匀后室温孵育 5 min 使 beads 能充分绑定。
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7

c.
d.
e.
f.
g.
h.
i.

使用磁力架吸附 beads 于管壁上。
当溶液清亮后，吸除上清。
保持磁力吸附状态，每个样本加入 180 μl 80%乙醇，不可吹打混匀。
室温保持 30 s。
吸除酒精。
重复 e 到 g 的步骤。
室温放置使残余酒精液体挥发，当磁珠由光滑明亮转变为哑光粗糙时（25 min），开始执行下一步。
j. 从磁力架上取下样品管，加入 20 μl DNA Purification Elution Buffer。
k. 关上管盖，并涡旋混匀。
l. 室温保持 5 min。
m. 用磁力架再次吸附磁珠。
n. 当溶液澄清后，转移含有 DNA 的上清至新管。
4. 到了这一步，文库已经可以用于定量和测序了。用 NGS 文库定量试剂（如：KapaBiosystems， Catalog No.KR0405）检测文库质量。文库也可用 Bioanalyzer，
TapeStation，或类似仪器分析文库大小分布情况。

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Index 234 Sample sheet 56
Index1 (i7) Primers
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[i7]GTCTCGTGGGCTCGG
Index2 (i5) Primers
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[i5]TCGTCGGCAGCGTC
i7 Index

i7 NOPQ

sample sheet PQ

N701

TCGCCTTATAAGGCGA

N702

CTAGTACGCGTACTAG

N703

TTCTGCCTAGGCAGAA

N704

GCTCAGGA

TCCTGAGC

i5 Index

i5 NOPQ

sample sheet PQ(NovaSeq v1.0 Reagent
Kits, MiSeq,HiSeq2000/2500)

N501

TAGATCGCTAGATCGC

N502

CTCTCTATCTCTCTAT

N503

TATCCTCTTATCCTCT

N504

AGAGTAGAAGAGTAGA

i5 Index

i5 NOPQ

sample sheet PQ(NovaSeq v1.5 Reagent
Kits, iSeq, MiniSeq,NextSeq,HiSeq3000/4000)

N501

TAGATCGCGCGATCTA

N502

CTCTCTATATAGAGAG

N503

TATCCTCTAGAGGATA

N504

AGAGTAGATCTACTCT为 Read1 和 Read2 adapter 剪切的序列为：CTGTCTCTTATACACATCT.

789:
1. Buenrostro, J. D., et al. (2013) Nat. Methods 10: 1213-1218.
2. Adley, A., et al. (2010) Genome Biol. 11.
3. Corces, M. R. et al. (2017) Nat. Methods 14:959-962.
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9

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问题

可能原因

建议

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7 DNAblm DNA nop
Tn5 qr<=b/stuWvwV[xyz:;{|}~•DNase I tSTp€B•l#{|‚ƒ]„…Y:;†‡\ˆp‰Š•‹Œ•Ž••z‘’“”U56••b–r]z{|—˜™(:;}bš›œ7:;•žŸ
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U-®•¯7°±bŠ²³
lysis buffer }[´µ¶JKs.bz²³·¸JK}bz•ž…¹²³•Eº'7»¼”NATAC-Seq ŽŒ½ 72¾7¿ÀÁÂ]ÃÄÁÂbÅÆ
5‘Ç adapter NOÈÉ•DNA 7ÊËÌE]ÍÎÏ
‡•¿ÀÁÂ[ÐÑ indexprimers 7ÒÓ•EÔ7]blÌE\ÕÖ7×Ø`a•

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