細胞骨格イメージング

蛍光単分子可視化と他の分子動態解析法の融合による細胞内アクチン重合機構の解明
Combination Analysis of Fluorescence Single-Molecule Imaging with Other MicroscopicTechniques Elucidates Actin Turnover Mechanisms in Living Cells
渡邊 直樹，木内泰Naoki Watanabe and Tai Kiuchi
東北大学・大学院生命科学研究科・単分子動態生物学分野
要旨

細胞骨格関連分子の細胞内ダイナミクスを捕捉するうえで，蛍光単分子イメージングは有用な情報を提供する．しかし，直接可視化による高精細な分子動態データが得られても，集団として分子がどのように振る舞うのか直観的に捉えにくいことがある．一方，蛍光消光後回復（FRAP：fluorescence recovery after photobleaching）など分子全体の分布変化を可視化する方法では，時空間分解能の制約が大きいため，分子の細かい動態や異なる動きをする分子種の存在を捉えることが難しく，ときに誤った解釈を与えてしまう．最近，われわれの研究において，FRAP やアクチン単量体濃度を連続的に定量する s-FDAP（sequential-fluorescence decay afterphotoactivation）法のデータと，蛍光単分子イメージングのデータを同じ条件下で比較することで，アクチン重合・脱重合サイクルのより深い理解につながった経験が得られたので，学術的背景とあわせて紹介する．

キーワード：単分子スペックル顕微鏡法，アクチンターンオーバー，蛍光消光後回復，s-FDAP 法，フォルミンファミリーる．当時，低濃度の蛍光標識チュブリンを細胞内に導入し微1.

はじめに小管をまだらに標識することで，その軸方向への移動や運搬

アクチン細胞骨格は，細胞表層の主要な構成成分である．

を可視化できることが報告された 4）．これをアクチンに応用

アクチンは真核生物における最も豊富なタンパク質であし，さらに蛍光標識体の密度を下げ，1 分子ごとに可視化し1）

る ．アクチンは，単量体アクチン（G アクチン）と線維状たのが SiMS 顕微鏡である．1 ～ 2 秒といった比較的長い露アクチン（F-アクチン）の 2 つの状態の間を行き来しながら，光時間を用いることで，蛍光標識アクチンのうち細胞内のア細胞表層を支持する足場として機能する．同時に，ミオシンクチン線維と共重合したもののみ点状のシグナルとして可視による収縮力とアクチン線維が伸長する際に発生する，押し化できる．この原理によって，アクチンが細胞内のいつどこ出す力を細胞に提供する．アクチン細胞骨格は，その骨格とで重合するか，線維の寿命がどのように分布するかについていう言葉が示すような静的な構造ではなく，その構成分子は高い精度と分解能で捕捉できるようになった．本法は，アク絶え間なく入れ替わり続ける．G-アクチン，もしくは F-アチン調節分子を中心とした他のタンパク質にも応用され，細クチンに結合する数多くの分子が存在し，必要に応じて様々胞構造への分子の結合・解離動態の解析に用いられている．

な形態の線維ネットワーク構造を構築する．横紋筋細胞の筋この手法が威力を発揮したのは，細胞の先導端に形成され原線維や神経の樹状突起，内耳有毛細胞の不動毛などでは，る薄いベール状の仮足であるラメリポディア（葉状仮足）特有の巨大なアクチン高次構造が形成される．

（図 1）において，「アクチン重合が先導端でのみ起きる」とこの制御機構を解明するうえで，アクチン細胞骨格系分子いうトレッドミリング仮説 5）の検証においてであった．アクの細胞内分子挙動を捕捉することは有効である．通常の 2 次チン線維には極性があり，ATP 存在下で重合させたアクチ

元培養条件下では，蛍光単分子スペックル（single-molecule

ンは，定常状態に至ると，一方の端（barbed end，B 端）がspeckle：SiMS）顕微鏡によって，アクチンネットワークの伸長し，反対側（pointed end，P 端）が短縮するトレッドミ構築や崩壊，移動の高解像解析が可能である 2,3）．

リングという現象を引き起こす．一方，ラメリポディア内の元 来， こ の 手 法 は 1990 年 代 後 半，Waterman-Storer とアクチン線維は，B 端を外向きに向け 6,7），線維が伸長する

Salmon によって報告された蛍光スペックル顕微鏡に由来す

力によって細胞の先導端を外へ押し出している 8）．また，蛍〒 980–8578 仙台市青葉区荒巻字青葉 6–3
E-mail: nwatanabe@m.tohoku.ac.jp
2013 年 6 月 28 日受付
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理学部生物棟 505 号

光アクチンを用いた FRAP により，アクチンネットワークが細胞中心に向かって恒常的に流動するレトログレードフ
ローという現象が観察されてきた 9）．これらの所見から，ア
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クチン線維が先導端でのみ重合し，葉状仮足後端で脱重合す全域で多くのアクチン線維が短時間で脱重合すること 10）がるというトレッドミリング仮説が支持されていた．ところが，確認された．つまり，アクチン線維の多くはラメポディア全長

蛍光アクチンを用いた SiMS 解析の結果では，ラメリポディアにわたる距離をトレッドミリングしないことが判明した 2,11）．
このように，SiMS 顕微鏡を用いることで，アクチンやアクチン結合タンパク質の細胞骨格への結合や解離の分子動態を直接解明できるが，奇妙なことに，SiMS 解析による結果と FRAP のような従来のイメージング法による結果が一致しないという主張が近年でも存在する 12）．この主張は，われわ
れが SiMS 顕微鏡によるデータを再考するきっかけとなった．
本 稿 で は，SiMS 顕 微 鏡 に よ る デ ー タ と，2 色 FRAP やs-FDAP（sequential-fluorescence decay after photoactivation）13）といった分子分布動態変動を測定する他のイメージング手法によるデータを比較することにより，細胞内のアクチン線維のターンオーバーのメカニズムをより明確に示した最近のわ
れわれの研究について紹介する．また，近年汎用されるようになった FRAP における潜在的な問題点についても触れる．
2. アクチン線維ターンオーバーにおける SiMS と FRAPによるデータの見かけ上の相違
上述したように，Rottner らのグループは，彼らのアクチン FRAP のデータと我々のラメリポディアにおける F アクチンの速い脱重合成分を明らかにした SiMS 解析のデータ 2）には矛盾があると指摘している 12）．確かに彼らの画像を一見したところ，細胞先導端に限局的にアクチンが重合するように観える．一方，我々の SiMS 解析のデータによれば，新たに重合したアクチンフィラメントのおおよそ 1/3 が 10 秒の間に脱重合するので 2），それを補う分新規のアクチン重合がラメリポディア全域で起きるはずである．
この 2 つの異なる実験手法によるデータの解釈には，いくつか留意すべきことがある 14）．1 つは，線維寿命に関して，何を対象に分布を集計するかが SiMS と FRAP では異なることである．SiMS 解析では，一定期間内に出現したスペックルを全て捉え，それらの寿命を集計するため，重合のイベントあたりの線維寿命の分布が表示される．一方，FRAP では，ある瞬間に存在するアクチン線維を総体としてそれらの崩壊

図 1 ラメリポディアのアクチンネットワーク（文献 20 より改変して転載）．先導端の細胞膜直下やその近傍で Arp2/3 複合体が頻回に活性化され，既存の線維の側方に結合しつつアクチン重合核を形成することで，枝分かれしたアクチンネットワークが形成される．
ラメリポディアのアクチン線維は B 端を細胞の外向きに配向しており，細胞先導端を外向きに押し出す力を発生する．線維ネットワー
クは，レトログレードフローと呼ばれる内向きの流動に乗って移動するが，その速度はほぼ一定であり，線維は互いにクロスリンクされていると考えられている．キャッピングプロテインはアクチン線維が無秩序に伸びないように B 端の伸長を制限する．レトログレー
ドフローで移動するアクチン線維は，いずれ脱重合し，拡散によって再度重合する線維へと供給される．この脱重合のステップでは，コフィリンが重要な役割を担っている．コフィリンは，AIP1 など他の分子と協調してアクチン脱重合を触媒するが，図に示すように，個々のアクチン線維は P 端で脱重合されるのか，或いは線維が切断されその部分が崩壊するかなどについては諸説があり，迅速な脱重合を実現するための分子・構造レベルのメカニズムに関するさまざまな仮説が提唱されている．

特集速度を観察する．もし，アクチン線維に寿命の長短が著しく異なるものが混在する場合，FRAP による解析では，寿命が短く重合・脱重合を繰り返すアクチン線維の割合が，SiMS解析による結果より過小評価される可能性がある．
2 つ目は，FRAP の範囲が大きいとアクチンの再取り込みの影響を受けることである．線維の脱重合が非常に速いときや F ア ク チ ン が G ア ク チ ン よ り 高 濃 度 で 存 在 す る と き，
FRAP の回復速度は脱重合速度より遅れることが数学モデル
によって示されている 15）．これは，脱重合によって離脱したプローブが再度，FRAP で標識された領域に取り込まれるためである．ラメリポディアでは，1000 μM もの F アクチンが存在し 16），G アクチンより相当多いと考えられる．上述した数理モデルを用い FRAP の実験をシミュレートすると，
FRAP の減衰速度は脱重合速度より 2 倍近くまで遅くなるこ

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とがわかる 14）．の移り変わりも合わせて経時的に把握することができ，GFP

3 点目として，SiMS 解析の問題点について述べる．多様と mCherry アクチンの比率から，FRAP の回復の程度をよな寿命をもつ線維が混在するラメリポディアの場合，長寿命り明確に捉え，FRAP による蛍光回復をより正確に解析できの線維がどれくらい含まれるかに関しては，SiMS 解析ではるようになった 17）．

観察数が不足しがちであり，また，フォトブリーチングの補SiMS 解析によるアクチン線維の脱重合解析のデータから正は可能であるが 2,3），計測のばらつきによって誤差が大き得られたパラメーターを用いて，二色 FRAP の実験のシミュくなることで，長寿命の線維の割合を見誤る可能性がある．

レーションを行い，実際のデータと比較した．すると，わず近年，EM-CCD など高感度低ノイズのカメラや高効率の蛍かではあるが，実際の FRAP によるデータほうが SiMS 解析

光フィルターの導入によって，長い時間の観察が容易になり，で得られたパラメーターから予測される回復より遅れること

これらの問題点は随分改善された．さらに，われわれの研究が判明した．その差は何で生まれるのだろうか．1 つの可能室では，EGFP アクチンに代えて，DyLight 550 などの安定性としてわれわれは，アクチンは脱重合する際に拡散の遅い，な蛍光化合物で標識したアクチンを用いることで，ほとんど短く切断されたアクチンオリゴマーを経て次の重合へ向けてフォトブリーチングの影響を受けずにアクチンターンオーリサイクルする仮説を提唱している 17）．

バーを測定できることも見出している（投稿中）．加えて，この仮説は，以前のわれわれの研究 19）で見出された，
キャッラメリポディアでは，細胞中心に向かってアクチン線維の濃ピングプロテインが細胞内のアクチンネットワークから非常度が減少する勾配が存在するため，線維は長いものでも先導に速く離脱する所見に由来する．キャッピングプロテインは，端からラメリポディア後端までを橋渡ししているわけではな

試験管内ではアクチン線維の B 端に強く結合し，その離脱

い．先導端から出現したアクチンがどれくらいの割合でラメは半減期が 30 分と非常に遅い．ところが，細胞内での離脱リポディアを横断するかという問題の解決に SiMS 顕微鏡を速度は 0.57 s−1 と速い．アクチン脱重合阻害薬である jasplak-用いた場合，これらの点に留意し，注意深い実験のコントロー

inolide を投与すると，この細胞内での速い離脱が速やかにルとデータの解釈が必要である．

消失する．これらの所見をもとに，キャッピングプロテインは，コフィリンなどアクチン脱重合因子によって切断された

3. SiMS と FRAP データのずれが暗示するオリゴマーを介したアクチンリサイクル

短いアクチンオリコマーとともに，アクチンネットワークから離脱することを提唱した 19）．他にも，コフィリンが切断し上述した批判論文 12） では，限られた前提条件のみではあたアクチン線維の B 端に特異的に結合するタンパク質 AIP1

るが，FRAP データのシミュレーション解析も取りいれ，上においても，脱重合阻害薬の投与によってその離脱が遅延す記の問題点を回避した形で議論が展開されていた．そこで，ることが観察された 20）．

われわれは SiMS と FRAP を同じ条件下，同じ細胞系におい上述した FRAP と SiMS のデータ比較で見いだされたわず

17）．

かな差も，このオリゴマー仮説を支持すると考えている．F

まず，われわれの細胞（XTC 細胞）を用いて，ラメリポディアクチンが崩壊する際，部分的にアクチンオリゴマーとしてアにおける F アクチン動態を通常の FRAP 法で調べた．ラ

線維ネットワークから離脱するのであれば，FRAP においてメリポディアでは F アクチンの密度はレトログレードフロー離脱したアクチンの拡散が部分的に遅くなり，FRAP 標識にに沿って徐々に減少する場合が多い．よって，細胞先導端で再び取り込まれる確率が増して，FRAP の回復が見かけ上遅フォトブリーチによってつくられた FRAP の領域では，ラくなることが考えられるためである．このオリゴマー仮説はて直接比較することを試みた

メリポディアの後端に達するとき，ときに元の蛍光強度の半更なる検証が必要であるが，このような精密な SiMS のデー分程度にしか回復しない（図 2）．このような状況では，フォタとの比較検討は，二色 FRAP なくしては十分成し遂げなトブリーチングによるダメージによって局所のアクチンネッかったと思われる．アクチンネットワーク以外の解析においトワークが部分的に傷つき，回復しないことが起きていてもても，構造全体の形状や観察する分子の分布や濃度が大きく認識しづらい．さらに，FRAP の回復率に関して実験ごとにゆらぐような状態で分子動態を検討するときは，単純な大きな差があることに気付いた．また，ラメリポディアの後FRAP ではなく，二色 FRAP など全体の挙動も同時にモニター

端近傍には，ストレス線維などの F アクチン構造がときにできる解析法を用いることが望ましいだろう．

集積しており，FRAP の回復の後半部分を測定しづらいといった問題もあった．
そこで，我々は FLAP（fluorescence localization after phptobleaching）18）と呼ばれる手法に順じた二色 FRAP 法を採用した．この方法では，フォトブリーチさせる GFP アクチン

4. SiMS 解析のコインのうら側を可視化する s-FDAPplus（sequential-fluorescence decay after photoactivationplus）法
われわれは，最近 SiMS 顕微鏡を用いて mDia1 を始めとしの回復と対比させるためにフォトブリーチングしない RFPたフォルミン相同タンパク質が，物理刺激にさらされた細胞アクチンを細胞に共発現し，アクチンネットワーク全体像をにおいて，盛んにアクチン重合核を形成することを見出し可視化する．その結果，局所のアクチンネットワークの濃淡た 21）．フォルミンファミリーは，多くの真核生物において細86

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図 2 二色 FRAP によるアクチンターンオーバー解析．（a）EGFP アクチンと mCherry アクチンを共発現させた XTC 細胞のラメリポディア先端部で EGFP のみの FRAP を施行した．フォトブリーチされた EGFP アクチン（上段）の蛍光回復はレト
ログレードフローに沿って徐々に起きる．その移動や蛍光回復の程度は下段に示すように GFP と mCherry の蛍光強度の比率でみるとより明確である．
（b）フォトブリーチされた領域（a の点線）における EGFP-actin の蛍光強度．異なる 7 細胞のデータを示す．
（c）同じ部位の mCherry-actin の蛍光強度変化．細胞ごとに異なるアクチン濃度の勾配や不均質さが観察できる．
（d）
GFP と mCherry の蛍光強度比をグラフにしたもの．b に比べると，蛍光回復する成分が捉えやすい．文献 29 より改変して転載．

胞質分裂や初期胚の極性形成に重要な役割をもつアクチン重合核形成因子である

22）．フォルミンファミリーは，重合中のアクチンの B 端に結合したままプロセッシブに線維を伸長

多くのフォルミンファミリーのメンバーが刺激に対して同様の反応を示すことから，普遍的な新規の機械受容アクチン重合機構の存在が予想された．

するユニークな性質をもつ．この性質により長距離にわたっさらにいくつかの実験によって，物理刺激下でのフォルミてアクチン線維を伸長するフォルミンファミリーの分子の像

ンファミリーによるアクチン重合核形成の亢進は，G- アクを，細胞内で可視化することに，われわれは成功してきチンの濃度上昇が引き金となることの証拠を得た．1 つは，た 23）．さらに，その性質がいつ，どこで，どのようなアクチ物理刺激が誘発するアクチンストレス線維の崩壊の程度とアン重合を担うのかを検討してきたのだが，マイクロニードルクチン重合核形成頻度の増加がよく相関すること，2 つめは，を用いて細胞表面を 3 秒ほどの短時間変形させると，フォルSiMS 顕微鏡で観察したアクチンに結合する AIP1 が約 20％ミンファミリーが盛んにプロセッシブにアクチンを重合し始増加すること，3 つめは，LIM キナーゼを過剰発現しコフィめることを見出したのである．この活性化はニードル刺激後リンを不活性化 24） させると，物理刺激によるアクチン重合10 秒以内に起こり，100 秒未満で消失する．この細胞の機械核形成の亢進が阻害されることである．AIP1 はコフィリン刺激に応答したアクチン重合機構は，カルシウムイオンの上によって切断されたアクチン線維の B 端に結合する分子で昇もタンパク質リン酸化のシグナルも必要としない．また，あり 20,25），そのアクチン線維への結合の増加は，コフィリン

特集

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図 3 s-FDAPplus 法による細胞内 G アクチン濃度変動の計測方法．
（a）まず細胞の厚さをみるための mPlum 蛍光像，つぎに細胞全体のアクチン分布をモニターするための消光のための照射中の Dp アクチン画像，最後に円で囲った領域のみ 390 nmのレーザー光で Dp アクチンを光活性化し，その後速いタイムラプスで Dp アクチンの減衰を測定する．約 4.3 秒で 1 回の計測サイクルを行う．これを 5 回測定した後，細胞をマイクロニードルで物理刺激し，刺激しなかった細胞と比較を行った．（b）
各計測サイクルにおける G アクチン分画測定の例．11 点のタイムラプスから Dp アクチンの局所強度の減衰を測定し（点で示す），モデルにフィッティングさせることで G アクチンの分画を正確に測定できる．文献 21 より改変して転載．

によるアクチン脱重合頻度の増加を反映すると考えられる．

で，その部位における G アクチンの割合を計算する．単一

これらの証拠から，物理刺激によるフォルミンファミリーの細胞において，繰り返し Dp アクチンの光活性化と消光をの活性化には，アクチンの脱重合が重要であることがわかっ

繰り返すことで，数秒おきに G アクチン濃度を捉えることた．しかしながら，実際に G-アクチンが増加しているかどが可能である．

うかは未確認であった．そこで，われわれは G-アクチンのその s-FDAP 法について，G アクチン濃度の微細な変化も細胞内濃度を s-FDAP 法によって計測することを試みた．

捉えられるようにいくつかの点で改良した（図 3）．まず，s-FDAP 法は，アクチンの自由拡散成分，すなわち G アクチ

光活性化された Dp アクチンの拡散成分を推定するうえで，ンの濃度変動を連続的に計測するための手法として開発され以前は 2 枚の画像間の蛍光強度の差分を用いたが 13），改良版

た13,26）．s-FDAP 法は，光によってスイッチオン・オフが可である s-FDAPplus 法では，100 ms のインターバルで 11 フレー27）

能な緑色蛍光タンパク質 Dronpaで標識したアクチン（Dpム撮影した画像の Dp アクチンの減衰を測定し数理モデルにアクチン）を用いる．細胞局所で光活性化した Dp アクチンフィッティングすることで，G アクチンの割合を正確に求めが速く拡散することによる蛍光強度の減衰を測定することた．2 つ目は，消光ステップで得られた Dp アクチンの蛍光88

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文

分布を用い，測定部位にあるアクチン総量を推定した．3 つ目は，共発現した赤色蛍光タンパク質 mPlum の蛍光を用い，物理刺激を加えた細胞の厚さの変動をモニターし，補正に加えた．これらの改良によって，測定間のばらつきを 2 ～ 3％の範囲に収めることに成功した．
これらの改良により，細胞の物理刺激に反応して，G- アクチンが即座に増加することが明らかになった．物理刺激を加えた 12 細胞のうち，3 細胞で 20％以上，4 細胞で 10 ～20％ G- アクチンの増加が計測された．これらの G- アクチンの増加は大幅なものではない．しかしながら，細胞内にはプロフィリンやサイモシン β4 といった G- アクチンを隔離するタンパク質が相当量存在しており，それらと G- アクチンとの結合を平衡状態として計算すると，総 G- アクチンが20％程度増加しただけでも，約 0.5 μM 程度存在する遊離 Gアクチン濃度を 2 ～ 3 倍近くまで上昇させることが予想できる 21）．さらに，フォルミンファミリーでもっともよく解析されている mDia1 の場合，そのアクチン重合核形成効率は，遊離 G-アクチン濃度の 3 乗に比例することが報告されている 28）．これらの知見をあわせると，s-FDAPplus で測定されたわずかな G-アクチン濃度の上昇でも，十分フォルミンによるアクチン重合核形成反応を顕著に亢進させることが予想される．
このように，細胞構造に結合した分子の動態を直接明らかにする SiMS 顕微鏡と，アクチンの速く拡散する成分を捕捉する s-FDAPplus 法は，アクチンのターンオーバーサイクルにおけるコインの裏表の現象を照らしだすことで，互いに相補的なデータをもたらした．これら両面からのアプローチによって，細胞の物理刺激に応答したフォルミンによるアクチン重合核形成の誘発は，これまで知られていなかった F ア
クチンと G アクチンのホメオスターシスの崩れから G アクチンが上昇する機構が引き金となって惹起されることが強力に裏付けられたのである．
5.

おわりにSiMS 顕微鏡は，生細胞内のタンパク質の結合と解離を直接可視化するが，FRAP や s-FDAP など全体の分子分布変動を可視化するその他の手法とデータを比較することによって，SiMS データだけではできなかったより深い洞察ができたことを本稿では紹介した．重要なことは，モデル化を通じた定量的な考察が問題の解決に必要不可欠な役割を果たしたことである．FRAP 法は，共焦点顕微鏡に装備されるなど利用の機会が増え，多くの論文で用いられるようになった．多くの事例において，FRAP 等の手法によってもたらされた結果を単に記述するだけでなく，分子動態をモデル化するなど定量的な考察を加えることで，背後のメカニズムのいっそうの理解につながるのではないだろうか．

特集

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