嗅球の神経ステロイド
Neurosteroids in the Rat Olfactory Bulb
清蔭恵美ａ，樋田一徳ａ，山本登志子ｂ，石村和敬ｃEmi Kiyokage, Kazunori Toida, Toshiko Yamamoto and Kazunori Ishimuraａ

川崎医科大学解剖学ｂｃ

要旨

岡山県立大学保健福祉学部栄養学科

徳島大学大学院ヘルスバイオサイエンス研究部顕微解剖学分野

副腎・性腺などの末梢器官とは独立して中枢神経系で de novo 合成されるステロイド物質は神経ステロイドと呼ばれ，神経機能の調整と維持に関わっていると考えられているが，その存在意義は未だ十分明らかになっていない．このため我々は神経ステロイドを合成する酵素に着目し，その局在を解析している．本稿ではステロイド合成酵素のうち testosterone や progesterone を還元する酵素である 5α-reductase の嗅球における局在についての解析結果を紹介し，神経ステロイドの存在意義を合成酵素の点から考えてみたい．

キーワード：神経ステロイド，5α-reductase，グリア，嗅球1.

cleavage enzyme（P450scc）によって pregnenolone が生合成はじめにされる．次いで 3β-hydroxysteroid dehydrogenase（3β-HSD）

ステロイドホルモンは主に性腺・副腎皮質などの内分泌器により progesterone になり，ここから二つの代謝経路に分官で産生され，血流を介して標的組織に作用し，生体機能にかれる．ひとつは GABAA 受容体の調節物質である 3α,5α-著明な影響を及ぼす．ところが 20 年程前から末梢器官とはtetrahydroprogesterone（THP） を 生 合 成 す る 経 路 で，独立して神経組織においてもステロイドが de novo 生合成さ5α-reductase によって 5α-dihydroprogesterone（5α-DHP）が1）れることがわかり，“神経ステロイド” と命名された．そ合成され，更に 3α-hydroxysteroid dehydrogenase（3α-HSD）の後の研究で，特に海馬，小脳，大脳皮質などにおけるステにより THP が合成される．もうひとつの経路では andro-2）

ロイド合成酵素の存在が注目されている ．しかし，神経スstenedione から 17β-hydroxysteroid dehydrogenase（17β-HSD）

テロイドの存在と作用機序の詳細は依然として推測の域を出により testosterone へ，さらに aromatase（P450arom）によない．これは（1）神経ステロイドの存在様式が脳領域によっり estradiol へと段階的に生合成される．また testosterone は，て異なること，（2）ステロイドの産生細胞がニューロンかグ

5α-reductase に よ っ て よ り 強 い ア ン ド ロ ゲ ン 作 用 を も つ

リアか確定されていないこと，（3）ステロイドが多種類の酵5α-dihydrotestosterone（5α-DHT）に変換される．

素によって多段階的に合成されること，（4）ステロイドが作
ラット嗅球での 5α-reductase の局在解析

用する受容体の存在様式と局在に十分な確証が得られてない3.

こと，などに起因する．このため，神経ステロイドの理解に上述のように，5α-reductase は，生理活性の高いステロイは，合成酵素と受容体の組織・細胞レベルの局在と発現動態

ド の 合 成 酵 素 と し て 重 要 で あ り， ま た マ ウ ス 脳 で のの探求が不可欠であると考えられる．本稿ではこれまでの筆

5α-reductase と 3α-HSD mRNA は共に嗅球で最も著しい発現

者らの解析例を紹介しながら，ステロイド合成酵素の局在とがみられたことから3），我々は特に神経ステロイドの合成のその役割について考えてみたい．

意義を知るためのモデルとして，5α-reductase の嗅球内での詳細な局在の解析を行った．

2. 神経系におけるステロイド生合成

5α-reductase には type 1 と type 2 の二つのアイソフォーム

現在までにわかっている神経系のステロイド生合成経路をがあるが，主に脳で発現する 5α-reductase type 1 についての

図 1 に 示 す2）． ま ず cholesterol か ら cholesterol side-chain

局在解析を行った4）．RT-PCR 法の結果，異なる週齢，性腺及び下垂体摘出ラットでも性差なく，またマウスでも同様のａ〒 701–0192 倉敷市松島 577
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2009 年 6 月 2 日受付

講座

嗅球の神経ステロイド発現が確認され，5α-reductase は内分泌生殖系の影響を受けず嗅球内で恒常的に発現することが示された．また薄層クロマトグラフィー法において嗅球での 5α-reductase の酵素活性215【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

も確認された5）．

た（図 2b）．外網状層及び顆粒細胞層では全般に分布してお次に，5α-reductase type1 に対する特異的抗体を用いてそのり，近傍の血管周囲に突起を伸ばす細胞（図 2c）と有髄線局在を検討した．5α-reductase 免疫陽性細胞（5α-reductase(+)

維に突起を伸ばす細胞（図 2d）の 2 種類の細胞が見られたが，細胞）は免疫反応の強度の違いはあるものの嗅球全層に見ら投射ニューロン（僧帽細胞）にはほとんど免疫反応性はなかっれた（図 2a，b）．最も強い免疫反応性は嗅神経細胞層に見た（図 2b）．

られ，細長く嗅神経軸索束に沿って見られた（図 2b）．また

次にこれらの細胞を同定するために更に蛍光多重染色を糸球体層では傍糸球体領域に 5α-reductase(+) 細胞が見られ行った．嗅神経細胞に特異的な抗 olfactory marker protein 抗

図 1 神経系におけるステロイドの生合成経路
P450scc; cholesterol side chain cleavage enzyme, 3β-HSD; 3β-hydroxysteroid dehydrogenase, P450c17; 17α-hydroxylase/C17-C20lyase, 17β-HSD; 17β-hydroxysteroid dehydrogenase, P450arom; aromatase, 3α-HSD; 3α-hydroxysteroid dehydrogenase.

図 2 ラット嗅球における 5α-reductase の免疫組織化学
a；嗅球全体像を示す傍矢状断面像．b；嗅球の層構造と 5α-reductase 免疫陽性細胞の分布．様々な免疫反応性を示す
5α-reductase 陽性細胞が全層に見られる．ONL；嗅神経細胞層，GLL；糸球体層，EPL；外網状層，MCL；僧帽細胞層，GRL；顆粒細胞層．c；外網状層の拡大像．d；顆粒細胞層の拡大像．鏃は 5α-reductase 免疫陽性細胞を示す．Scale bars；1 mm（a），100 μm（b），50 μm（c，d）．
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顕微鏡 Vol. 44, No. 3（2009）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

体とニューロンマーカーの抗 protein gene product 9.5 抗体をしないこと（図 3c），抗 NPY 抗体を用いて三重染色を行っ

5）用いて染色したが 5α-reductase との共存関係はなかった ．

た結果，5α-reductase(+)/S-100β(+)/NPY(+) 細胞が多く観察さ次にグリアマーカーである抗 S-100β 抗体（アストロサイト）

れ（図 3d），それらは嗅細胞軸索束に沿って存在していたと抗 2′,3′-cyclic nucleotide 3′-phosphodiesterase（CNPase）抗（図 3e），などの知見から，5α-reductase は嗅神経細胞層に体（オリゴデンドロサイト）を用いて蛍光多重染色を行った

おいてアストロサイトだけではなく OECs にも局在することと こ ろ， ほ と ん ど 全 て の 5α-reductase(+) 細 胞 は S-100β とが明らかになった．

CNPase のどちらかを発現していた（図 3a，b）．

次に嗅球各層での 5α-reductase と S-100β 及び CNPase 陽

5α-reductase 免疫反応性が最も強い嗅神経細胞層には 2 種性 細 胞 間 で の 共 存 関 係 を 検 討 し た． 単 位 体 積 あ た り

類のグリアが存在する．一つはアストロサイト，もう一つは

5α-reductase(+) 細胞が最も多いのは嗅神経細胞層，次いで糸6）olfactory ensheathing cells（OECs）である ．嗅上皮にある球体層，顆粒層，外網状層の順になる．嗅神経細胞層の嗅細胞の軸索は嗅球表層にある特定の糸球体へと集束して5α-reductase(+) 細 胞 の う ち 91.6 ％ が S-100β(+)，8.4 ％ はいる．この嗅細胞は生後もニューロン新生を続け，新生した5α-reductase(+) のみで，CNPase との共存は見られなかった．

嗅細胞軸索は同じ標的糸球体へと投射し，古いニューロン

S-100β との共存率は糸球体層 84.9％，外網状層 89.7％，顆と置き換わるが，OECs はこの軸索の誘導に関わっていると粒層 52.3％で，CNPase との共存率は糸球体層 9.6％，外網いう7）．OECs はアストロサイトのマーカーである S-100β の状層 8.2％，顆粒層 35.6％を示し，各層での 5α-reductase と他に neuropeptide-Y（NPY）の免疫反応性を示すと報告されS-100β と の 共 存 率 は CNPase よ り も 高 い が， 顆 粒 層 で はて い る が8），5α-reductase は 嗅 神 経 細 胞 層 で ほ と ん ど のCNPase と 最 も 高 い 共 存 関 係 を 示 し た5）． こ の よ う に

S-100β と 共 存 関 係 が あ る こ と， 全 て の 5α-reductase(+)/

5α-reductase は嗅球全層のグリアに局在することから，嗅球S-100β(+) 細胞が glial fibrillary acidic protein（GFAP）を発現の基本的神経回路の維持のため，特にニューロンとグリア間

図 3 多重蛍光染色によるラット嗅球における 5α-reductase の局在
a，b；5α-reductase（赤），S-100β（緑），2′,3′-cyclic nucleotide 3′-phosphodiesterase（CNPase，青）との蛍光三重染色．すべての S-100β 陽性細胞（鏃）とすべての CNPase 陽性細胞（白鏃）は 5α-reductase を発現している．c；5α-reductase（赤），S-100β（緑），glial fibrillary acidic protein（GFAP，青）との蛍光三重染色．GFAP を発現していない 5α-reductase も見られる．d；
嗅神経細胞層と糸球体層での 5α-reductase（赤），S-100β（緑），neuropeptide-Y（NPY，青）の蛍光三重染色．NPY 免疫反応
性は S-100β 及び 5α-reductase の両方を発現している（二重鏃）．e；5α-reductase（赤），olfactory marker protein（緑），NPY（青）の蛍光三重染色．二重鏃は 5α-reductase と NPY の両方を発現した olfactory ensheathing cells を示す．Scale bars；50 μm（a–e）．

講座

嗅球の神経ステロイド217【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

の機能的な相互作用の調節に関わっているのかもしれない．

トロサイトであったことから，嗅球を構成するニューロンのまた，これまでの我々の研究では特に顕著な性差は認められ保護や形成維持に関わることが示唆される．

ず，性分化や性差よりも根源的な神経系の機能調節にステロ

神経ステロイドはニューロンとグリア双方で生合成され，イドが関わっており，そのステロイドは神経系各領域に特異ニューロンとグリア間の相互作用によって新たな分子シグナ的に発現していると推測される．

ルとして働き，この複雑な相互作用を介して神経ステロイドは局所神経回路やその神経機能の恒常的な維持に関わってい4.

神経ステロイドの機能ると考えられる2）．今後，分子レベルから組織レベルの解析

神経ステロイドはグリアだけではなく，小脳プルキンエ細のみならず行動レベルでの様々な研究の展開が期待される．

胞や海馬，大脳皮質の錐体細胞においても生合成され，発達，分化及び機能発現，神経組織の損傷反応の調節をしていると

謝

辞考 え ら れ て い る． 主 要 な ス テ ロ イ ド の 働 き と し て，

本 研 究 は 日 本 学 術 振 興 会 科 学 研 究 費（ 基 盤 研 究 C；9）progesterone には外傷性脳障害後の神経再生促進の作用 ，16590145, 18590185, 19500295, 20590192）及び自然科学研究

さらにその代謝産物である THP では神経新生促進作用が考機構生理学研究所超高圧電子顕微鏡共同利用実験（NIPS-えられており，その例として Niemann-Pick 病 type C モデル

H1250M）の援助によって行われたものである．

マウスの延命，小脳プルキンエ細胞・顆粒細胞の保護やコレステロール及びガングリオシドの蓄積を減らす作用などがあげられている10）．また estradiol と testosterone には共にニューロン保護作用があり，なかでも estradiol は黒質のドーパミ
ンニューロンの神経保護因子として知られる11）．
Progesterone，DHP，THP はグリアの発達に関わっていると考えられており，DHP は分化したオリゴデンドロサイ
トで，THP はオリゴデンドロサイトの前駆細胞で主に生合12）

成 さ れ る ． 更 に progesterone と THP は myelin basic protein の発現を促し，髄鞘形成に関わっている13）．これらのことから，嗅球のオリゴデンドロサイトの 5α-reductase は髄鞘形成とその維持に関わることが示唆される．
OECs は無髄の嗅細胞軸索束を取り囲み，その形態は末梢のシュワン細胞と似ている．また OECs は様々な神経成長因
子 を 発 現 し， 機 能 的 に も シ ュ ワ ン 細 胞 に 類 似 し て い る．
OECs は嗅球内では髄鞘を形成しないが，神経細胞再生，脊髄損傷の機能回復を促し，髄鞘形成能も併せ持つ14,15）．主にグリアに局在する S-100β は神経栄養因子としても知られ，アストロサイトもまた軸索伸長やニューロンの保護，損傷ニューロンの再生に関わると考えられている．ほとんど全ての OECs は S-100β を 発 現 す る こ と か ら，OECs の 5αreductase は嗅細胞軸索の成長とその保護に関わっているのかもしれない．
アストロサイトに対しステロイドは GFAP の発現に影響する．特に estradiol とその前駆物質である testosterone は，脳組織損傷後のグリオーシス反応に対する GFAP の発現と細胞骨格タンパクの発現調節を行い，ニューロンの保護に関わるという16）．我々の定量解析の結果，5α-reductase(+) 細胞は嗅文

献1）Baulieu, E.E.: Biol. Cell., 71, 3–10 (1991)
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球の全層に分布し，そのほとんどが S-100β を発現するアス218

顕微鏡 Vol. 44, No. 3（2009）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】