技術資料

TR09A

LC-MS用有機酸分析カラム

有機酸を誘導体化することなくLC-MS分析ができます
カルボン酸以外の有機酸も分析できます※)
一般的な有機酸は10分以内に測定ができます
1分以下のハイスループット分析用カラムも用意されています
高純度球状3μｍシリカ / 有機酸分析専用固定相（イオン交換モード， 順相モード）

クエン酸回路の 非誘導体化LC-M S分析

oxaloacetic acidaconitic acidfumaric acidpyruvic acidcitric acidisocitric acidmalic acidsuccinic acid123456 min

クエン酸回路を構成するトリカルボン酸やジカルボン酸は，以下の理由によりHPLC分析が困難でした。
極性が極めて高く，逆相カラムでは保持しにくい
複数の解離基を制御することが困難な多価酸は，シャープなピーク形状が得にくい
UV吸収が小さいために，直接検出が難しい
電気電導度検出はイオン交換モード（グラジエント溶出）に適さない
プレカラム/ポストカラム誘導体化法はHPLCシステム構成が煩雑になる
近年普及しつつある汎用LC-MSを用いることで，簡便かつ選択的な有機酸分析を可能にする画期的な分析カラムを開発しました。 シリカ系カラムとしては世界初の有機酸分析専用カラムです。
煩雑な誘導体化を不要とし，10分でほとんどの有機酸をLC-MS分析することができます。
※) 異性体を含むすべての有機酸の分析を保証するものではありません。アミノ酸やペプチドなどの双性イオンは対象外です。

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TR09AJ-SG24一般的有機酸が10分以内で分析できます
Intrada Organic Acid は，多様な構造からなる有機酸に適用するための固定相表面設計の工夫がなされたLC-MS用カラムです。 弱酸から強酸まで広範囲な有機酸に対応します。 しかもほとんどの有機酸を10分以内に溶出させることができます。

基本的有機酸のLC-MS分析（イオン交換モード）[M-H]- m/z = 253.0[M-H]- m/z = 165.0[M-H]- m/z = 115.0

pyromellitic acido-phthalic acidlevulinic acidtrimesic acid

[M-H]- m/z = 209.0[M+HCOO]- m/z = 133.0

n-butyric acid (2mg/mL)
cis-aconitic acidglutaric acidfumaric acidlactic acidtrans-aconitic acidacetic acid (5mg/mL)
gluconic acidbutane-1,2,3,4-tetracarboxylic acidphosphoenolpyruvic acid
2-hydroxyisobutyric acidketoglutaric acid
2-keto-D-gluconic acid
2-hydroxy-3-methylbutyric acid

[M-H]- m/z = 173.0[M-H]- m/z = 131.0[M-H]- m/z = 115.0[M-H]- m/z = 89.0
[M-H]- m/z = 173.0[M+HCOO]- m/z = 105.0[M-H]- m/z = 195.0[M-H]- m/z = 233.0[M-H]- m/z = 167.0[M-H]- m/z = 103.0[M-H]- m/z = 145.0[M-H]- m/z = 193.0[M-H]- m/z = 117.0[M+HCOO]- m/z = 119.0

propionic acid (1mg/mL)
glycolic acidmaleic acidglucose-6-phosphate
pyroglutamic acid
oxaloacetic acid

[M-H]- m/z = 75.0
[M-H]- m/z = 115.0[M-H]- m/z = 259.0[M-H]- m/z = 128.0[M-H]- m/z = 131.03-hydroxy-3-methylglutaric acidN-glycolylneuraminic acidadipic acidglucose-1-phosphaten-valeric acid (1mg/mL)
benzoic acidN-acetylneuraminic acidpyruvic acid

[M-H]- m/z = 161.0[M-H]- m/z = 324.1[M-H]- m/z = 145.0[M-H]- m/z = 259.0[M+HCOO]- m/z = 147.0[M-H]- m/z = 121.0[M-H]- m/z = 308.1[M-H]- m/z = 133.0[M+HCOO]- m/z = 133.0

isobutyric acid (1mg/mL)
glyoxylic acidmesaconic aciditaconic acidL-tartaric acid
3-hydroxypropionic acidcitric acid

[M-H]- m/z = 73.0
[M-H]- m/z = 129.0[M-H]- m/z = 129.0[M-H]- m/z = 149.0[M-H]- m/z = 89.0
[M-H]- m/z = 191.0[M-H]- m/z = 145.0

3-methylglutaric acidisocitric acid
isovaleric acid (1mg/mL)
malic acidsuccinic acid

[M-H]- m/z = 191.0[M+HCOO]- m/z = 147.0[M-H]- m/z = 133.0[M-H]- m/z = 117.00

12345678910 minA07

基本的分析条件（イオン交換モード）

Intrada Organic Acid, 150 x 2 mm
A: acetonitrile / water / formic acid = 10 / 90 / 0.1
B: acetonitrile / 100mM ammonium formate = 10 / 90
0%B (0-1min), 0-100%B (1-7min), 100%B (7-10min)
0.2mL/min, 37°C, MS (ESI, SIM, Negative)
5µL (100µg/mL in 0.1% HCOOH)

有機酸構造は多岐にわたっています。 モノ，ジ，トリカルボン酸の他，ヒドロキシカルボン酸，ケト酸，芳香族カルボン酸，さらにはスルホン酸や硫酸，リン酸化合物など多くの種類があり，これらすべてを分離分析することはかなり困難です。
Intrada Organic Acid カラムの設計では，各種有機酸のアニオン性と極性に注目し，LC-MSに適応する揮発性移動相を用いた吸脱着の最適化を念頭に置きました。 その結果，多様な有機酸構造にほぼ対応できる固定相の開発に成功しました。
Intrada Organic Acidは，有機酸を誘導体化することなく直接LC-MS分析できる，シリカ系としては世界初のLC-MS用カラムです。

2多様な有機酸構造に対応しています
多価酸やポリカルボン酸のLC-MS分析（順相モード）
HOOC

COOH

HOOC

COOH

Intrada Organic Acid カラムは，弱酸に最適な固定相表面として基本設計がなされています。 このため，多価酸やポリカルボン酸などのイオン性の強い酸は，イオン交換モードによる分析条件では溶出が困難な場合があります。
この課題を解決するために，中性pH条件における順相モードを用いて，ほとんどの有機酸を溶出できるような工夫をおこないました。
従来のポリマー系イオン交換カラムとは異なり，Intrada Organic Acid カラムは，有機溶媒濃度変化に対して強度の高いシリカ系カラムです。
Intrada Organic Acid カラムは多様な有機酸の分析に対応します。

pyromellitic acid
(0.94µg/mL)[M-H]- m/z = 253.0

COOH
HOOC

COOH

HOOC

COOH
COOH[M-H]- m/z = 341.0

mellitic acid (25µg/mL)

基本的分析条件（順相モード）

OO
HOP

HOPOHOOOHOPOHO[M-H]- m/z = 658.9

12OHO POHOOH

0OH
OHOPOOPphytic acidOH
OH(250µg/mL)

O

3

4

5

678910 min

Intrada Organic Acid, 150 x 2 mm
A: acetonitrile / 100mM ammonium acetate = 95 / 5
B: acetonitrile / 100mM ammonium acetate = 10 / 90
0%B (0-1min), 0-100%B (1-4min), 100%B (4-10min)
0.2 mL/min, 37 °C, MS (ESI, SIM, Negative)
5 µL (50mM AcONH4 solution)

A01

基本的分析条件（イオン交換モード）によるカルボン酸以外の有機酸のLC-MS分析
スルホン酸，硫酸類

H3Cリン酸，ヌクレオチド

SO3H

Intrada Organic Acidカラム
O
phosphoric acid
HO P OHは ，カルボン 酸のような代OH[M-H]- m/z=171.0
p-toluenesulfonic acid 表 的な有 機 酸だけ でな く，
硫酸やスルホン酸などの強[2M-H] m/z = 195.0
SO3H
酸や多価酸も，イオン交換
NH2[M-H]- m/z=157.0
benzenesulfonic acidNN
モ ー ド と M S 検 出 に よ っ て，
OOONATPN
HOCH2SO3
CH2O P O P O P OH
簡単に分析することを可能O[M-H]- m/z=111.0
sodium hydroxymethanesulfonate
OHOHOHにします。
CH3SO3SO42[M-H] m/z = 506.0
さらにライフサイエンスで重NH2要なリン酸化合物も同様に
N
NOO
分析できます。 リン酸の数NN
ADP
CH2O P O P OH
[M-H]- m/z=95.0
Osodium methanesulfonateが異なるヌクレ オチ ドは 逆OH
OH[M-H] m/z = 426.0[M-H]- m/z=97.0
sodium sulfate 相保持が困難な対象物でNH2
すが，本カラムを用 いれ ば
S2O32NN
O
いずれも短時間分析が可N
AMP
N
CH2O P OH
O[M-H]- m/z = 113.0
ammonium thiosulfate 能です。 しかもイオンクロマOH
トグラフィーが主流であるリ
2SO3[M-H]- m/z=81.0
sodium sulfite[M-H] m/z = 346.0(100µg//mL in 5mM tris(2-carboxyethyl)phosphine), 0.1%HCOOH) ン酸そのものも分析することができます。
12345678910 min012345 min 67891005µL (50-100µg/mL in 0.1% HCOOH)

5µL (100µg/mL in 0.1% HCOOH)

A09

A03

基本的分析条件（イオン交換モード）による糖質有機酸のLC-MS分析（分析温度変更）
50°C
糖酸HOOC
OHOH

CH2OH
CHOH
O CHOH

60°C

N-glycolylneuraminic acid
[M-H]- m/z = 324.1

NHCOCH2OH

HOOC
OHOH

CH2OH
CHOH
O CHOHN-acetylneuraminic acid
[M-H]- m/z = 308.1

NHCOCH3

2-keto-D-gluconic acid(hemicalcium salt)

CH2OHOHOHCOOHHOOHOOCOHOH[M-H]- m/z = 193.0

CH2OHO CHOH

2-keto-3-deoxyoctulosonic acid(ammonium salt)

OH01

2

[M-H]- m/z = 237.0

345 min 6

75µL (100µg/mL in 0.1% HCOOH)

89

Intrada Organic Acidカラム
は，イオン交換モードにより酸性糖を簡単に分析することができます。
ただし還元末端のアルデヒド構造に起因 するアノマ ー互変異性により，通常の分析温度では2ピークになりがちです。 このため本カラムによる還元糖の分析においては基本的分析条件（イオン 交換 モー ド）に加 えて，分析温度を50-60℃に高めることが望まれます。
これによりグルクロン酸とガラクチ ュロ ン酸のような構造異性 体（エ ピマ ー ） も分離が可能となります。

10ウロン酸異性体
HOCOOHOOH

galacturonic acidOH

glucuronic acid
COOHOOHOH[M-H] m/z=193.00

1234565µL (40-60µg/mL in 0.1% HCOOH)

3OHHO0A10OH7 min
A08試料溶媒と前処理の重要性
有機酸の解離基の数やpKaによっては，試料溶解溶媒（特にpH）の検討が必要となります。 また実試料の場合，タンパク質などの極性高分子と有機酸を分離する前処理が重要となります。

試料前処理例（限外ろ過）

試料溶解溶媒pHの影響
基本的分析条件（イオン交換モード）
5µL (500µg/mL)[M-H] m/z = 89.0

シュウ酸(pKa1.2, 4.2)やメチルマロン酸(pKa 3.1, 5.7)のようなpKaの大きく異なるようなジカルボン酸は，通常のギ酸溶液では解離制御が困難なため，良好なピーク形状が得られないことが懸念されます。 この場合，溶解溶媒をより低pH（過塩素酸）や高pH（アンモニア）にすることにより，解離を安定化できる可能性があります。 対象物の解離基の数とpKaに応じた溶解溶媒の検討が重要です。

HOOC COOH

oxalic acid
0.02% NH4OH

50mM HCOONH41% HCOOH

有機酸を含む実試料の前処理はかなり難しい課題です。 一例としては以下のように，試料を適切なpH溶媒で希釈 し，遠 心限外ろ過（ 排除限界
MW 3000Da）により，高分子を除去する方法が考えら れま す 。 ま た ，除 蛋 白を 兼ね た 終濃 度
0.2N 過塩素酸溶液を遠心(13,000rpm, 5min）して，上清を注入試料溶液とすることも一案です。

Japanese Sake
20-fold dilution with 0.1% HCOOH
Centrifugal Ultrafiltration(Amicon, 3000 NMWL)

日本酒中の有機酸

Filtrate (Injection Sample)

基本的分析条件（イオン交換モード）
fumaric acid

[M-H]- m/z = 115.0

0.2N HClO40123456789citric acidlactic acid

10 min[M-H]- m/z = 191.0

A06

5µL (100µg/mL)[M-H] m/z = 117.0

malic acid

CH3
HOOC CH COOH

[M-H] m/z = 117.0

methylmalonic acidphosphoric acid
[M-H]- m/z = 133.0[M-H] m/z = 97.0

pyroglutamic acidsuccinic acid

[M-H] m/z = 128.0[M-H]- m/z = 89.0

pyruvic acid01234567[M-H] m/z = 87.08910 minA11ご注意
本製品は，LC-MS専用の有機酸分析用カラムです。 グラジエント溶出が必須であるため，UV検出器や電気電導度検出器は使用することができません。 またELSDも物質同定が困難であることからおすすめできません。
本製品は，異性体などを含むすべての有機酸の分離を保証するものではありません。
分析感度は化合物構造や質量分析装置性能に依存します。 特に脱溶媒温度はMS感度に影響します。
ピーク形状は試料マトリクスの影響を受ける場合があります。 試料前処理や試料溶解溶媒，移動相条件を工夫する必要があります。
ガードカラムはメタルフリーではありません。 イオン抑制や配位性を示す化合物にはガードカラムはおすすめできません。

製品情報

主な仕様： 粒子径3μｍ球状シリカゲル， 固定相：有機酸分析用（イオン交換），耐圧：30MPa, メタルフリーカラム

カラム名カラムサイズ30x2mm, 50x2mm,75x2mm, 100x2mm,150x2mm, 250x2mm

ガードカラム

ガードホルダー / カートリッジカラム
ご注意： ガードカラムはメタルフリーではありません
金属イオンと相互作用しやすい有機酸には適用できません。

A04