STEM の生物応用

STEM トモグラフィーにおける電子線損傷の定量
Quantitative Determination of Beam Irradiation Damages to Biological Specimens Caused
by STEM Tomography
平瀬愛ａ，ｂ，ｃ，宮澤淳

夫ａ，ｂ，ｃAi Hirase and Atsuo Miyazawaａ

独立行政法人理化学研究所放射光科学総合研究センターｂ

兵庫県立大学大学院生命理学研究科
ｃ

JST·CREST

要旨

生物試料の電子線トモグラフィーにおいて，走査透過型電子顕微鏡法（STEM: Scanning Transmission Electron Microscopy）は，馴染みの薄いものであった．その理由の 1 つとして，STEM では収束電子を用いるため，生物試料に利用する場合には電子線損傷が最も深刻な問題になると危惧されたからである．一方，STEM を電子線トモグラフィーに応用する（STEM トモグラフィー）ことで，超高圧電子顕微鏡法を用いることなく 1 μm という電子顕微鏡用試料としては非常に厚い試料の像取得が可能となり，試料の三次元構造を解明できるという利点がある．そこで，実際に STEM トモグラフィー測定により生物試料が受ける電子線損傷を，撮影視野の中でミトコンドリアなどの分かりやすい形状のものの大きさを測定し，試料の収縮率として定量した．その結果，厚い試料を用いた場合には STEM トモグラフィーの方が，通常の透過型電子顕微鏡法（TEM: Transmission Electron Microscopy）を用いた電子線トモグラフィーよりも，電子線損傷が少ない事がわかった．

キーワード：STEM，TEM，電子線トモグラフィー，電子線ダメージ，樹脂包埋試みた．電子顕微鏡観察のために一般的な方法で樹脂包埋さ
1.

はじめにれた生物試料は電子線照射によって樹脂が収縮してしまう．

生 物 試 料 の 観 察 に， 走 査 透 過 型 電 子 顕 微 鏡 法（STEM:

この事は電子線トモグラフィーで三次元再構築を行う際に重Scanning Transmission Electron Microscopy） を 用 い る 場 合，大な問題となる．TEM，STEM それぞれの手法により連続一点に集中した電子線をあてて試料をスキャンするために，傾斜像を撮影し，三次元再構築した像を比べるのが直接の比連続傾斜像を撮影する電子線トモグラフィーでは試料の電子較になるが，連続傾斜像を撮影する過程で徐々に収縮した連線損傷がもっとも深刻な問題になると危惧されてきた．しか続傾斜像から再構築した像を比較する事は困難であった．そし，電子線が当たる時間は非常に短いので，逆にダメージがこで今回は，TEM，STEM それぞれの連続傾斜像撮影を行軽減されることも予測できる．また，透過型電子顕微鏡法

う前と後に撮影した写真の収縮率を比較することで，試料が（TEM: Transmission Electron Microscopy） よ り も STEM の受ける照射ダメージを定量することにした．

方が厚い試料の電子線トモグラフィーに有効であることが報
告されており 1,2），STEM による電子線トモグラフィー（STEM

2.

実験方法

トモグラフィー）を行う事で，より多くの厚み方向の情報を2.1

試料作製（図 1 フローチャート参照）含んだ立体構造を観察することができると考えられる．そこ

定量実験には HEK293 細胞を用いた．培養 3 日目の細胞で，STEM トモグラフィーでの電子線が与える試料ダメージを回収し，遠心してペレット状にしたものを試料キャリアーが，TEM に よ る 電 子 線 ト モ グ ラ フ ィ ー（TEM ト モ グ ラに載せ，EM PACT 2（Leica Microsystems）を用いて加圧凍フィー）のときよりも，実際に大きいのかを確認するために，結固定を行った．その後，2.5％オスミウム／アセトン中でTEM トモグラフィー，STEM トモグラフィー，それぞれにAFS 2（Leica Microsystems）を用いて凍結置換【−85°C（50 hr）

よって生物試料が受ける照射ダメージを比較定量することを⇒ −85°C → −20°C（13°C/hr） ⇒ −20°C（7 hr） ⇒ −20°C →ａ〒 679–5148 兵庫県佐用郡佐用町光都 1–1–1
TEL: 0791–58–1823; FAX: 0791–58–1826
E-mail: atsuo@spring8.or.jp
2009 年 8 月 31 日受付
248−4°C（5.3°C/hr）】を行った．凍結置換後アセトンで洗浄し，プロピレンオキシドに置換した後に，EPON812 樹脂を 1 晩浸透させ，60°C で 24 時間重合した樹脂ブロックをウルトラ
ミクロトーム EM UC 6（Leica Microsystems）を用いて 1 μm
顕微鏡 Vol. 44, No. 4（2009）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

に切削した．プラスチック・カーボン膜を張ったグリッドに当 た り 233 electrons/pixel/sec で 15 秒 ） は STEM ト モ グ ラ

切片を回収し，切片をグリッド上で酢酸ウラニルとクエン酸フィーで一般的に用いられる条件である．露光条件 2 の露光

鉛で電子染色し，さらに上からカーボン蒸着を行った．

量（233 electrons/pixel/sec）は TEM トモグラフィーを行う

2.2には非常に暗く，露光時間 15 秒もドリフトが起きてしまう

測定方法

連続傾斜像の撮影は TEM と STEM の自動トモグラフィーなどの問題があるので，一般的ではないが，STEM トモグラシステムを搭載した加速電圧 300 kV の TECNAI F30（FEI

フィーの露光条件を再現するために用いた．全傾斜像を取得Company）で行った．TEM トモグラフィーにはエネルギーするのに露光条件 1 では 20 分，露光条件 2 と 3 では 45 分か

幅 15 eV のエナジーフィルター（GATAN）を使用し，ゼロかった．連続傾斜像を撮り始める前に，電子線によるダメーロス像を取得した．STEM トモグラフィーは高角度散乱暗視ジがないように，なるべく素早く撮影した写真と取得し終野法（HAADF-STEM）で行った．TEM トモグラフィーとわってから撮影した視野の中で，ミトコンドリアなどの分かSTEM トモグラフィーを行った時の電子線による生物試料へりやすい形状のものの大きさを比較した．3 つの条件での測のダメージを傾斜像取得前後での試料の収縮率を比べること

定はそれぞれ照射ダメージを受けていない別の領域で行っで定量した．条件を一定にするために，イメージサイズた．

= 1024 × 1024，ピクセルサイズ = 2.6 nm，一枚の像に照射され る 全 電 子 線 量 = 3.5 × 109 electrons と し た． 傾 斜 角 度 は

3.

結果・考察

−65° から +65° までで，87 枚の傾斜像を取得した．表 1 に3.1

厚い試料の電子線トモグラフィー

示したように，3 つの露光条件で傾斜シリーズの取得を行

TEM では試料の厚さが増すと，像のボケの原因となる非い， 収 縮 率 を 比 較 し た． 露 光 条 件 1（1 イ メ ー ジ 当 た り

弾性散乱した電子が増えてしまう．そこで，エネルギーフィ

3,500 electrons/pixel/sec で 1 秒）は TEM トモグラフィーでルターで非弾性散乱した電子をカットすることにより，全体一般的に使われている条件であり，露光条件 3（1 イメージ的には暗くなるが，比較的コントラストの高い像を得ることができる．しかし，図 2 に示したように，今回のような非常に厚い試料（厚さ 1 μm）では，傾斜角度が 0° でもゼロロス像のピークは非常に小さく，大半の電子をカットしてしまう事になり，実際，わずか 1 ～ 1.5％の入射電子しか像形成に使う事ができなかった．つまり，像形成の主役である弾性散乱した電子が極端に少ないために，像形成のために照射しなければならない電子線量が増大することになり，その結果として電子線によるダメージが大きくなってしまうと考えられる．また，このスペクトルから TEM ではほとんどが非弾性散乱電子であり，エネルギーフィルターを用いないと焦点の異なる像が重なるような事になり，最終的に像を劣化させてしまう事も分かる．一方，高角度散乱電子（熱散漫散乱電子）を取得する STEM では，得られる像は原子番号の二乗でコントラスを与えるため，試料が厚くなることによる色収差の影響を受けないので，像形成に十分な電子を使う事ができる．
よって，通常の TEM トモグラフィーでの傾斜像の撮影時と比較して，STEM トモグラフィーでは少ない電子線量で高いコントラストの像が得られると考えられる．この性質は，
表13 つの露光条件での傾斜像取得前後での試料の収縮率
A/B rate
Exp. 1露光条件 1（TEM, 1 s）

Exp. 2Exp. 3

Exp. 4

0.913
0.920
0.920
0.921
（−8.7％） （−8.0％） （−8.0％） （−7.9％）露光条件 2
0.940
0.947
0.935
（TEM, 15 s） （−6.0％） （−5.3％） （−6.5％）

図1

特集

試料作製方法のフローチャート

STEM トモグラフィーにおける電子線損傷の定量

露光条件 3
1.000（STEM, 15 s） （0％）

0.993
0.994
0.991
（−0.7％） （−0.6％） （−0.9％）249【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】特に試料の高傾斜時，試料の電子線通過距離が長くなった際（60 度傾斜時に 0 度の 2 倍になる）の像撮影に，非常に有効である．なお，STEM トモグラフィーによる実際の三次元再構成像とそのコントラストについては，本特集の他稿で詳しく述べられているので，本稿では割愛させていただく．
3.2

トモグラフィー前後の収縮率

よって，楕円形になってしまったという例がある 1）．
この場合は，三次元再構成後のトモグラムでの楕円の形状から，約 50％の収縮が起きていると考えられる．
試料の厚みは三次元再構成した結果を得て始めて計測できるので，連続傾斜像を撮影する前の厚さの実測値を得ることはできない．したがって，電子線トモグラフィー計測時の電表 1 で示した結果のように，STEM トモグラフィーによ

子線照射による試料の厚さ方向の収縮について，電子線照射る収縮率（0 ～ 0.7％）は，TEM トモグラフィー（5 ～ 9％）前後で比較することは不可能である．ただし，試料切片の作に比べて，明らかに少ない結果となった．露光条件 1 での試製時における，ウルトラミクロトームでの切削厚の設定値，料の収縮率は，電子線照射による試料へのダメージを測定しまた実際に切削された際の超薄切片の干渉色から，電子顕微た Luther らの報告ともほぼ一致していた 3）．STEM では電鏡観察前の切片厚を推測することはできる．一般的に超薄切子線がスキャンする一点に集中するが，その照射時間は非常片の作製では，ウルトラミクロトームでの切削厚を 80 nmに短い．断続的で短い照射によって，撮影視野全体に一定時に設定しており，切片の干渉色もグレー（80 nm 前後）を示

間，電子線が照射される TEM よりもダメージが軽減される

す．この場合の切片の三次元再構成後の厚さは 50 nm 程度可能性が考えられる．更に，STEM のプローブサイズは約 0.6となる場合が多い．本稿で用いた厚い切片は，切削厚を～ 1.0 nm で，ピクセルサイズよりも小さい事もダメージが1 μm に設定して作製した．この切片の三次元再構成後に試軽減された要因であると考えられる．また，露光条件 1 と 2料の厚さを計測したところ，約 750 nm となり，切削時に設の結果を比べると TEM における電子線照射による試料の収定した切片の厚さから約 75％の収縮が起きたと思われる．

縮は総電子線量を同じにした場合，強い露光で短時間照射す

前述の酵母のトモグラムから想定された収縮率（50％）と異る（3,500 electrons/pixel/sec で 1 秒）よりも弱い露光で長時なっているが，これは包埋に用いた樹脂の種類違いや，樹脂間照射した（233 electrons/pixel/sec で 15 秒）方が軽減されの硬化度や乾燥度の違い，また試料ごとのトモグラフィー計ていることが分かる．おそらく像取得時の温度が試料へのダ測時における電子線照射量の違い（撮影された像数の違い）メージに関与していると思われる．などに依存して収縮率が変動したと考えられる．いずれにし

3.3

電子線照射による樹脂収縮問題ても，電子線照射により試料の厚さ方向の収縮は発生する．

電子線照射による試料の収縮でもうひとつ問題になるのが，厚み方向（Z 軸）と表面方向（X 軸，Y 軸）で収縮率が異なる点である．厚み方向の収縮率の方が大きいために図 4の左写真のように円形のはずの酵母の断面像が樹脂の圧縮に

図 3 露光条件 1 のときの傾斜像取得前（左）と後（右）の電子顕微鏡写真．
傾斜像取得後のミトコンドリアは取得前に比べて小さくなっている．

図 2 厚 み 1 μm の 生 物 試 料 切 片 の EELS spectrum（GATANimaging filter）．
上が傾斜角度 0°，下が傾斜角度 70° のときのスペクトラム．白いバーはゼロロスのスリットを示している．傾斜角度 0° でのゼロロスのピークは非常に小さく，70° では完全にない．

250

図 4 三次元再構築した酵母菌切片の断面像 1）．
左：丸いはずの断面像が収縮のために楕円形になっている．右：三次元再構築後に像の厚みを 2 倍にすることで，断面像が本来の円形になったことから，おそらく厚み方向（Z 軸）には 50％程度の収縮が起きている．

顕微鏡 Vol. 44, No. 4（2009）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

傾斜像取得途中で試料が収縮してしまう事は三次元再構築を行う上で重要な問題になるので，実際に傾斜像を取得する
ときは，直径約 30 ～ 40 μm の領域に 600 ～ 1000（electrons/nm2·sec）で 5 分間の予備照射を行っている．TEM でも電子線ダメージを試料の収縮率を測定した実験で，厚み方向の収縮の方が大きい事が報告されており 2），収縮の仕方も電子線を照射してから 3 分で大きく収縮することが分かっているので，予備照射することで，傾斜像取得途中で厚みが変化してしまうのをある程度防ぐ事ができると考えられる．しかし，収縮の影響は試料が厚いほど大きく，電子線トモグラフィーにおいて正しい立体構造を観察する妨げになってしまうとも考えられる．
今後，収縮を回避するため試料作製段階での手法の検討・

図 5 EPON812 樹脂の混合比と硬さの関係
EPON812 樹脂の硬化剤である DDSA と MNA の混合比によって重合後の樹脂の固さを調節することができる．

選択が，非常に重要になると考えられる．なぜなら，樹脂の重合が不完全であること事や，不均一になっている事も，試料の収縮の原因となりうるからである．樹脂の調整や重合後に，超薄切片を作製するときの実験室の湿度を 60％以下にすること（40％以下が望ましいという人もいる），樹脂重合に使用する容器は使う直前までオーブンに入れておくこと，なども不完全重合を防ぐ手段である．また，吸湿性の高い樹脂にはビームカプセルよりもゼラチンカプセルの方がよいな

図6

厚切り切片トモグラフィーに用いる樹脂の候補と配合ど，容器の工夫も必要だと考えられる．さらに，切片を電子染色する際に使用する水によっても樹脂が柔らかくなってしも検討する必要がある．厚い試料の電子線トモグラフィーにまう可能性があるが，これについては，電子染色後に 60°C有利である STEM トモグラフィーを行う上でも，このようのオーブンに一晩，入れておくことで回避できる．

な様々な検討を行っていくことにより，生体内でのより正し

3.4

包埋樹脂の選択

最近になり，通常の生物試料の電子顕微鏡観察には包埋剤い，より生きた状態に近い立体構造が観察に，使用できるようになると期待している．

としては，電子線への安定性があり，電子線によって昇華することが少ない事から，エポキシ系の樹脂が広く使用される謝

辞ようになった．その中でもよく用いられている樹脂の一つで加圧凍結・凍結置換法については，日本電子株式会社の会

ある EPON812 も，配合を少し変えるだけでも樹脂の固さは田嵯武朗様に，詳しくご指導をいただきました．切片の作製違ってくる（図 5）．また，EPON812 よりも硬いエポキシ系にあたっては，ライカマイクロシステムズ株式会社の伊藤喜樹脂である EPON815 や，電子線の透過性がよく，厚切り切子様に，丁寧なご指導をいただきました．ここに記して深謝片作製に最適であるとされている Qetol651-ERL4206 包埋の意を表します．また，特集号への執筆の機会を与えていた

法 4），電子線に強いとされている EPON-Araldid 包埋法などだきました日本エフイー・アイ株式会社の青山一弘博士に，も，検討の価値があると思われる（図 6 参照）．さらに，切心より御礼申し上げます．

削の仕方も切片の仕上がりに影響を与える．切削の速度が速すぎると厚みが不均一になったり，切削するときのナイフの圧力によって切片が圧縮されてしまうことが報告されてお5）

り ，それによって電子線による収縮の影響も大きくなってしまうと考えられる．通常のダイアモンドナイフを用いて，エポキシ系の樹脂を切削した場合，切片は一般に切削方向に10 ～ 20％圧縮されてしまうので，ナイフの種類や角度など

特集

STEM トモグラフィーにおける電子線損傷の定量

文献1）Aoyama, A. et al.: Ultramicroscopy, 109, 70–80 (2008)
2）Yakushevska, A.E. et al.: J. Struct. Biol., 159, 381–391 (2007)3）Luther, P. et al.: Ultramicroscopy, 24, 7–18 (1988)
4）Kushida, H. et al.: J. Electron Microsc., 36, 133–135 (1987)
5）Studer, D. and Gnaegi, H.: J. Microsc., 197, 94–100 (2000)

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