２０１８年度 傾斜的研究費（全学分） 研究報告書【研究費区分】：国際共同研究支援枠【研究代表者所属】：理学研究科化学専攻【研究代表者氏名】：廣田 耕志【研究代表者氏名フリガナ】：ヒロタコウジ【研究代表者職】：教授【研究分担者（所属,氏名,職）】
・化学専攻, 阿部拓也, 助教【国外研究分担者（所属,氏名,職）】
・Leicester Univ., Andrew Fry, Professor
・Leicester Univ., Kayoko Tanaka, Lector
・ケンブリッジ大学, Julian Sale, Professor
・サセックス大学, Aidan Doherty, Professor
・ボストン大学, Charles S. Hoffman, Professor【研究課題名】：ゲノム編集・１分子イメージング・クライオ電顕の利用による蛋白質機能解析の国際共同研究ネットワーク【研究実績の概要（600～800 字程度で記入。図，グラフ等の使用も可。
）】
DNA 複製は、鋳型鎖上の DNA 損傷部位において頻繁に停止している。この停止を解除する機構として、DNA 損傷乗り越え機構が知られている。この機構は複製ポリメラーゼから、忠実度の低い TLS ポリメラーゼにスイッチすることで損傷部位でのその場しのぎの複製を継続することが知られている、このほか、下流からの複製のリプライミング機構も複製停止解除に寄与することが知られている。申請者は TLSポリメラーゼの Polηとリプライミングに必要の PrimPol の関係を調査し、紫外線などの DNA 損傷に対する応答において、相補的に機能することを示している。さらに、申請者は第３の複製停止トレランス経路として、複製ポリメラーゼδが損傷部位で誤りがちな複製を行い変異を伴いながら複製を継続する「複製ポリメラーゼによる損傷の乗り越え」を発見した。この機構も、TLS ポリメラーゼの Polηの経路と相補的関係にあることを示している。本研究では、TLS ポリメラーゼ群、複製ポリメラーゼδとε、リプライミングに必要の PrimPol プライマーゼがどのように連携し、ゲノム維持に寄与するのか解明する。2018 年度には、下記３点を研究した。(1) TLS ポリメラーゼの中で中心的役割を果たす Polηとその近縁酵素 Polι及び Polκ の２重破壊や、すべてを欠損した三重破壊細胞を系統的に作製しこれら酵素群の関係を調べ、損傷の種類（酸化、アルキル化、紫外線によるチミン二量体）ごとに異なる酵素の要求性があり、酵素の使い分けがあることを見出した（図１）。(2)複製ポリメラーゼδ複合体の相互作用因子を包括的に調査し、転写基本因子複合体の制御に関わる因子との DNA 損傷に応答した複合体形成を見出し、転写制御における損傷応答機構の一端を明らかにした。(3)ポリメラーゼεの複製フォークの安全な停止における機能を明らかにした（図２）
。

UV
100$

wt$
WT##Polη
PolH$(/(##10$

Polι
PolI$

(/(#$(%)#Polκ(/(#PolK$

1$#PolHI$
Polη(/(ι(/(#PolHK$
Polη(/(κ(/(#0.1$#PolKI$
Polι(/(κ(/(##PolHIK$
Polη(/(ι(/(κ(/(0.01$0$

1$

2$

3$
4$
UV$(J/m2)

5$

6$

7$

図１ TLS ポリメラーゼ Polηとその近縁酵素 Polι及び Polκ の遺伝学的関係。紫外線感受性を調査しした研究例を示す。縦軸は細胞生存率(%)、横軸は紫外線量を表す。
CPT -1 μM CPT

DT40 WT
DT40 PolεexoTK6 WT
TK6 Polεexo-

図２ ポリメラーゼεの構成エキソヌクレアーゼ活性を変異で潰した細胞 Polεexo-細胞では、カンプトテシンによる DNA 損傷に応答した複製フォーク停止が不良である。赤で示す部分はカンプトテシン処理前１５分の複製長を示す。緑で示す部分は、カンプトテシン処理後１５分の複製長を示す。
【学会発表（発表題目，発表大会名，年月を記入）】
・

梅村小雪、阿部拓也、廣田耕志

Analysis of the function of topoisomerase 1 with auxin degron based conditional

knock out system バイオコンファレンス２０１８（首都大学東京・２０１８年

１１月１６日）Satoshi Senmatsu, Ryuta Asada, Arisa Oda, Charles S. Hoffman, Kunihiro Ohta and Kouji Hirota The novelcis-acting element for metabolic stress-induced lncRNA (mlonRNA) and meiotic recombination in fission yeast.
3R&3C Symposium (Kanazawa, Japan November, 2018)

・Yuya Suzuki, Takuya Abe, Kouji Hirota
The correction of chromosome 2 trisomy in chicken DT40 cell using negative selection markers バイオコンフ
ァレンス(東京, 2018, 11 月 16 日)

・Takuya Abe, Ryotaro Kawasumi, Michele Giannattasio, Sabrina Dusi, Yui Yoshimoto, Keiji Miyata, Koyuki
Umemura, Kouji Hirota & Dana Branzei、AND-1 fork protection function prevents fork resection and is essential

for proliferation、The 11th 3R+3C Symposium (石川県・Yui Yoshimoto, Takuya Abe, Hirota Kouji, The hunting of synthetic lethal gene with ATR, InternationalSymposium on 3R・and 3C (石川県 2018 年 11 月 12 日〜16 日)

Keiji Miyata, Takuya Abe, Kouji Hirota Functional analysis of TopBP1 using TOPBP1 conditional knock out cells
The 11th 3R+3C Symposium (石川県・2018 年 11 月 15 日)

2018 年 11 月 15 日)

Kouji Hirota, Minami Fukuchi, Koji Kobayashi, Takuya Abe, Masataka Tsuda and Shunichi Takeda Role ofproofreading exonuclease activity of replicative polymerase ε in camptothecin induced safe replication forkslowing 3R&3C Symposium (Kanazawa, Japan November, 2018)

・

廣田耕志、大岡正人、津田雅貴、阿部拓也、浅田隆大、笹沼博之、荻朋男、安井明、武田俊一 ALC1 ク
ロマチンリモデリング因子のゲノム維持における働き 分子生物学会 2018 12 月

神戸

【論文発表又は著書発行（発表題目，著者，発表誌又は出版社，年月を記入）】
・Senmatsu S, Asada R, Abe T, Hoffman CS, Ohta K, *Hirota K lncRNA transcriptional initiation induces chromatin
remodeling within a limited range in the fission yeast fbp1 promoter. Sci Rep 9: 299 (2019)・Abe T, Branzei D, Hirota K DNA Damage Tolerance Mechanisms Revealed from the Analysis of Immunoglobulin
V Gene Diversification in Avian DT40 Cells. Genes (Basel) 9(2018)

・Abe T, Kawasumi R, Giannattasio M, Dusi S, Yoshimoto Y, Miyata K, Umemura K, Hirota K, Branzei D AND-1fork protection function prevents fork resection and is essential for proliferation. Nat Commun 9: 3091 (2018)

・Abe T, Ooka M, Kawasumi R, Miyata K, Takata M, Hirota K, Branzei D Warsaw breakage syndrome DDX11
helicase acts jointly with RAD17 in the repair of bulky lesions and replication through abasic sites. Proc Natl AcadSci U S A 115: 8412-8417 (2018)

・Nakazato A, Kajita K, Ooka M, Akagawa R, Abe T, Takeda S, Branzei D, *Hirota K SPARTAN promotes genetic
diversification of the immunoglobulin-variable gene locus in avian DT40 cells. DNA Repair (Amst) 68: 50-57(2018)

・Saha LK, Kim S, Kang H, Akter S, Choi K, Sakuma T, Yamamoto T, Sasanuma H, Hirota K, Nakamura J, Honma
M, Takeda S, Dertinger S Differential micronucleus frequency in isogenic human cells deficient in DNA repair
pathways is a valuable indicator for evaluating genotoxic agents and their genotoxic mechanisms. Environ Mol
Mutagen 59: 529-538 (2018)

・Taoka M, Nobe Y, Yamaki Y, Sato K, Ishikawa H, Izumikawa K, Yamauchi Y, Hirota K, Nakayama H, Takahashi N,Isobe T Landscape of the complete RNA chemical modifications in the human 80S ribosome. Nucleic Acids Res
46: 9289-9298 (2018)

・Umeda M, Tsunekawa C, Senmatsu S, Asada R, Abe T, Ohta K, Hoffman CS, *Hirota K Histone Chaperone Asf1
Is Required for the Establishment of Repressive Chromatin in Schizosaccharomyces pombe fbp1 Gene Repression.
Mol Cell Biol 38(2018)

・Ooka M, Abe T, Cho K, Koike K, Takeda S, *Hirota K (2018) Chromatin remodeler ALC1 prevents
replication-fork collapse by slowing fork progression. PLoS One 13: e0192421【科学研究費補助金への応募状況，採択状況】
・基盤研究(B)（2018 年度まで受理, 2019 は不採択）、新学術領域（不採択）、挑戦的研究（萌芽）（申請中）、国際共同研究強化(B) （不採択, 2019 は申請中）

【国等の提案公募型研究費，企業からの受託研究費・共同研究費の獲得状況】
・なし
【受賞等】
・なし
【その他（都との連携施策，特許出願など）】
・なし[公的審議会・委員会等の公的貢献，生涯学習支援・普及啓発，国際貢献・国際交流等]
・海外に 2018 年度は 7 名研究室員の留学を斡旋した。
（イタリア５名、米国１名、スウェーデン１名）【研究成果による特許等の工業所有権の出願・取得状況】（工業所有権の名称,発明者,権利者,工業所有権の種類・番号,出願年月日,取得年月日）
・なし【研究分担額】（研究代表者・分担者名,所属,金額（円））・基盤研究(S)(武田俊一, 京都大学, 203 万円)