（LBHI）形成3） が神経細胞に対して毒性をもつのか，逆に，凝集体形成は神経細胞保護のためなのかは不明であり，また，凝集体形成のメカニズムも依然として不明である．従って，この凝集体の形成されるメカニズムの解明は，ALS の筋萎縮性側索硬化症（ALS）と小胞体ストレス発症機構解明に非常に重要であると考えられる．ヒト変異
SOD1 を発現するマウス（SOD1 マウス）は筋力低下と筋萎

Amyotrophic Lateral Screlosis (ALS) andEndoplasmic Reticulum Stress片山泰とが問題であった．そこで，我々は，この LBHI 様凝集体をPD に見られる神経細胞死が小胞体（ER）を起源とする細胞死であることが報告されている4 ～ 6） 点に着目し，研究を開ａ

大阪大学大学院・大阪大学，金沢大学，浜松医科大学

連合小児発達学研究科こころの発達神経科学講座・分子細胞遺伝学研究領域
旨

究されているが，これに対して in vitro でのモデルが無いこ形成する in vitro のモデル系の確立をめざし，近年，AD や一ａ

Taiichi Katayama

要縮を示して死亡することから，ALS のモデル動物として研始した．
2. L84V 変異 SOD1 発現細胞は ER ストレスによってユビキチン化された凝集体を形成する

家族性筋萎縮性側索硬化症（FALS）の早期発症型変異

まず我々は FALS の中でも早期発症の原因として知られてSOD1（L84V）を発現する細胞を作製し小胞体（ER）ストレス誘導剤ツニカマイシンを負荷した．その結果，同細胞に SOD1 陽性凝集体が多数観察され，この凝集体はER に局在することが示された．更に Lewy 小体様硝子様封入体（LBHI）等 FALS 患者様病理像が観察された事から FALS 発症機構に ER ストレスが関与し L84V 発現細胞は LBHI 形成モデルとなり得る．

いる L84V 変異 SOD1 を恒常的に発現するヒト由来神経芽細胞腫 SK-N-SH 細胞と野生型 SOD1 を高発現する細胞を作製し，これら細胞に ER ストレスとして糖鎖修飾阻害剤ツニカマイシン（TM）を 24 時間負荷し，両細胞の形態学的変化を比較した7）．すると，L84V 変異 SOD1 発現細胞の一部に凝集体が観察された．なお，この凝集体は野生型 SOD1 を発現する細胞ではほとんど観察されなかった．更にこの細胞にキーワード：筋萎縮性側索硬化症，SOD1，小胞体，Lewy 小体様
硝子様封入体プロテアソーム―ユビキチン経路阻害剤である Ac-LLNlealdehyde（ALLN）を負荷するとこの凝集体を持つ細胞が多く観察された（図 1）．この凝集体は，エオジン好性で SOD1抗体，ユビキチン抗体による免疫反応陽性であることから，1.

ALS 患者に見られる病理像に近いとの期待から，この凝集はじめに体は本当に SOD1 がユビキチン化されて形成されているか否

筋萎縮性側索硬化症（ALS）は，重篤な上肢，下肢筋肉のかについて検討した．すなわち，ユビキチンを強制発現させ，萎縮と筋力低下をきたす遅発性，進行性かつ特定の細胞（運抗 SOD1 抗体で免疫沈降し，ユビキチン抗体でブロットする動神経）が変性を受ける神経変性疾患で，発症すると患者のこ と に よ り， ユ ビ キ チ ン ア ッ セ イ を 試 み た． そ の 結 果，半数ほどが発症後 3 年から 5 年で呼吸筋麻痺により死に到る

L84VSOD1 を発現する細胞のみでポリユビキチンによるラことが知られている1）．しかしながら，現在のところ根本的ダーを検出した．このことは，凝集した SOD1 がユビキチンに有効な治療法はない．その原因は ALS における運動神経化されていることを示唆している．

細胞死の分子メカニズムが解明されていないことに寄るところが大きい．ALS 患者の一部は家族性であるが大部分が3. L84V 細胞 /ER ストレスは LBHI 様封入体が観察される孤発性である点は，アルツハイマー病（AD）やパーキンソ

さて，上記 ER ストレス負荷した L84VSOD1 発現細胞をン病（PD）など他の神経変性疾患と類似性を有する．家族

詳細に観察すると，ALS 患者に見られるような LBHI 様封入性 ALS（FALS）の 20％以上が Super Oxide Dismutase 1（SOD1）体が見つかった．この封入体は，L84VSOD1 発現トランスジェ2）の変異によって起きることが解っている ．これまでの研究

ニックマウス脊髄前角に見られるアストロサイト内硝子様封から，SOD1 変異による FALS 発症の原因は SOD1 変異によ入体（Ast-HI）と形態学的に酷似していた．すなわち，このる“Toxic gain of function” で あ る 可 能 性 が 高 い が， 変 異封入体は，エオジン好性であること，電子顕微鏡観察によっ

SOD1 患者で見られる特徴的な Lewy 小体様硝子様封入体て，この封入体内に約 15 ～ 25 nm 径の granule-coated fibrilが存在することが明らかとなった（図 2）．

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最近の研究と技術

筋萎縮性側索硬化症（ALS）と小胞体ストレス233【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

図 1 Flag タグ付き野生型 SOD1 ならびに L84VSOD1 変異体細胞のウェスタンブロットと L84VSOD1/ER ストレス細胞に見られる凝集体（A）Flag タグ付き野生型 SOD1 ならびに L84VSOD1 変異体を定常的に発現する神経芽細胞腫 SK-N-SH 細胞のウェスタンブロット．矢頭は Flag タグした SOD1，矢印は内因性の SOD1の位置を示す．（B–D）蛍光免疫染色による SOD1 抗体陽性凝集体．SOD1 発現細胞（B，C），L84V SOD1 発現細胞（D，E）．
細胞は溶媒刺激のみ（B，D），1 μg/ml tunicamycinTM 刺激（C，E）．TM 刺激した L84VSOD1 発現細胞では SOD1 陽性凝集体が観察される（矢頭），しかし同凝集体は野生型 SOD 発現細胞には見られない．Scale bar = 20 μm．

図 2 granule-coated fibrils を含む硝子様封入体（A–C）： 小 胞 体 ス ト レ ス 刺 激 後 の L84V SOD1 発 現 SK-N-SH細胞における Lewy 小体様硝子様封入体（LBHI）と（D–F）：
L84V SOD1 トランスジェニックマウスの脊髄前角細胞におけるアストロサイト内硝子様封入体（Ast-HI）．（A）：TM 刺激後の細胞におけるエオジン好性 LHI（scale bar = 20 μm）．（B）：（A）を拡大した電子顕微鏡による硝子様封入体（矢印），N，核；
scale bar = 1 μm．（C）：さらに強拡大した電子顕微鏡像 granule-coated fibrils（矢印）直径約 15–25 nm（scale bar = 1 μm）．
（D）
：エオジン好性 Ast-HI．（E）：（D）を拡大した電子顕微鏡によるAst-HI．N，核；scale bar = 1 μm．（F）：（E）の強拡大像．（scalebar = 1 μm）．（C）と（F）に見られる fibrils は超微構造的に一致する．

かどうかについて検討した．その結果，四肢麻痺などの症状が見られる前の Presymptomatic stage の L84VSOD1 発現 Tg
マウスでは粗面小胞体に多数の遊離リボソームの異常な凝集が観察される事が解った（図 3）．
5.

今後の展開

それではこの L84VSOD1 発現細胞は野生型 SOD1 発現細胞
4. L84V 細胞 /ER ストレスに見られる封入体は ER 由来であるに比べて ER ストレスに対して脆弱になっているのだろう
か？実際，予備検討ながら，L84VSOD1 発現細胞は，野生型SOD1 発現細胞に比べて，TM，サプシガルギンといった ER

それでは L84VSOD1 発現細胞を ER ストレス刺激して観察ストレス誘導剤に対して脆弱になっていることを確認していされるこのユビキチン化された SOD1 陽性凝集物はどのオルる．また，この時，L84VSOD1 発現細胞は，ER ストレス特ガネラで形成されているのだろうか？そこで，Mito-tracker

異的に活性化される細胞死実行分子カスパーゼ 4 8） の cleav-（ミトコンドリアマーカー），Lyso-tracker（リソソームマー

age 断片が野生型 SOD1 発現細胞に比べて刺激後早期に出現カ ー），GM130（ ゴ ル ジ 体 マ ー カ ー），ER 保 持 シ グ ナ ル

することが解っている．今後，どのようにして細胞質に存在KDEL（ER マーカー）など各種オルガネラマーカーを用いしている SOD1 変異体が ER 機能に影響を及ぼすのかについて免疫染色を行うと，この凝集体上で SOD1 と ER マーカーて明らかにするとともに，この現象が L84VSOD1 変異体のみの KDEL のシグナルが共局在することが解った．また，免の現象ではないことを確認する必要がある．すなわち，FALS

疫電顕による観察では TM 刺激した L84VSOD1 発現細胞の患者で見られる他の変異，例えば G93A，H46R 等の代表的細胞質の辺縁部に SOD1 シグナル陽性の粗面小胞体が多く観な SOD1 変異体でも確認する予定である．以上のことから変察された．そこで，この in vitro での現象が in vivo モデルで異 SOD1 を原因とする FALS の発症機構に小胞体ストレスがも見られるかどうかを確かめた．すなわち L84VSOD1 発現関与する可能性が示され，今回作製した L84V SOD1 発現細Tg マウス脊髄前角細胞で見られる凝集体が ER 由来である胞は LBHI 様封入体形成のモデルとなりうることが示された．

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顕微鏡 Vol. 44, No. 3（2009）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

謝

辞

本研究は，現在ミュンヘン MaxPlanck 研究所に所属する
山岸覚先生，大阪大学，小山佳久先生，遠山正彌先生，鳥取大学加藤信介先生，東北大学糸山泰人先生ら多くの共同研究者によってなされたものであり，ここに感謝の意を表します．
文献1）Bruijn, L.I., Miller, T.M. and Cleveland, D.W.: Annu. Rev. Neurosci.,
27, 723–749 (2004)
2）Rosen, D.R., Siddique, T., Patterson, D., Figlewicz, D.A., Sapp, P. etal.: Nature, 362, 59–62 (1993)
3）Kato, S., Takikawa, M., Nakashima, K., Hirano, A., Cleveland, D.W.
et al.: Amyotroph. Lateral Scler. Other Motor Neuron Disord., 1, 163–184 (2000)
4）Katayama, T., Imaizumi, K., Sato, N., Miyoshi, K., Kudo, T. et al.:Nat. Cell Biol., 1, 479–485 (1999)
5）Nishitoh, H., Matsuzawa, A., Tobiume, K., Saegusa, K., Takeda, K.
et al.: Genes Dev., 16, 1345–1355 (2002)
6）Takahashi, R. and Imai. Y.: J. Neurol., 250 Suppl 3, III25–29 (2003)
7）Yamagishi, S. et al.: PLos One, 2(10), e1030 (2007)8）Hitomi, J., Katayama, T., Eguchi, Y., Kudo, T., Taniguchi, M. et al.: J.
Cell Biol., 165, 347–356 (2004)

図 3 Presymptomatic stage の L84VSOD1-Tg マ ウ ス に 見 られる粗面小胞体における多数の遊離リボソームの異常な凝集（A–C）（A）のインセットはトルイジンブルー染色による細胞質内封入（A）：× 3500（scale bars = 20 μm）．
（B）
体様構造物（矢頭）を示す．
× 8000（scale bar = 1 μm）．（C）× 15000（scale bar = 1 μm）．矢頭は異常な遊離リボソームの凝集物を示す．

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筋萎縮性側索硬化症（ALS）と小胞体ストレス235【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】