超高圧電子顕微鏡の医生物科学への応用

超高圧電子顕微鏡を用いた細胞小器官の観察
Observation of Cell Organelles with HVEM
野田亨

Toru Nodaａ要旨

藍野大学

医療保健学部

理学療法学科

超高圧電子顕微鏡を用いた厚切り切片の観察からは細胞内小器官の真実に近い立体構造を捉えることができる．しかし，そのためには選択的に細胞小器官を染め出す組織化学的な方法が必須となる．本稿では超高圧電子顕微鏡で厚切り切片を観察する場合に使われる種々の染色法，細胞小器官の立体構造の具体例などを紹介する．

キーワード：超高圧電子顕微鏡，組織化学，細胞小器官

試料に含まれる基本的構造である膜，基質，線維構造などを1.

はじめに高電子密度に修飾する方法は主に超薄切片像のコントラスト

細胞，細胞小器官，組織が本来，どのような形をなしておを高める方法として，いくつか知られている．それらには後り，その周囲の構造とどのような位置関係にあるかという基固定に用いられる四酸化オスミウムの他に，電子染色として本的な問題は判っているようでいて，不明な点が少なくない．

酢酸ウラニル，クエン酸鉛を代表とする各種鉛溶液，また後電子顕微鏡を使って観察すれば判りそうなものであるが，固定時に電子密度を上げるためにオスミウムを一部，還元さ個々の構造の断面は見えるが，全体の広がりはどうなっていせる作用を持つフェロシアン化カリウムを含むもの，あるいるのかは想像するしかない．その想像が正しいかどうかはわ

はタンニン酸処理されたものなどが含まれる．しかし，注意からない．そうした基本的な疑問に対して答える一つの手段

しなければならないのはこれらの染色によって明瞭になる構として超高圧電子顕微鏡を用いた観察方法がある．

造は主として細胞骨格や膜系のアウトラインであるという点である．一般的に膜からなる立体を含む厚切り切片を透過型

2.

超高圧電子顕微鏡で細胞を見ることの電子顕微鏡で観察した場合，三次元空間に広がった膜系を細胞や細胞小器官の細部の構造は電子顕微鏡で観察しない

二次元平面に投影した像となり，超薄切片像とはかなり異とわからない．細胞を人体構造の基本的な単位と考えると，なった像となる．つまり像はその膜のアウトラインが電子線多くの場合，10 μm でほぼ 1 個の細胞の厚みをカバーしていの光軸に沿って重なれば，濃い線状の影となり，それ以外でると考えられる．それに比べて通常の電子顕微鏡用の超薄切は淡い平面状の影となるだけである．要するに超薄切片の像片の厚さは 30 nm 前後であり，超薄切片像は立体の一断面の輪郭やコントラストを高めるためのこれまでの染色方法はという表現をせざるを得ない．この限られた情報から細胞全超高圧電子顕微鏡では複雑なアウトラインの重なり合いとし体の構造を推測するには無理がある．筆者らが主として用いてしか表現できないことになる．ている 1000 kV 程度の超高圧電子顕微鏡では 1 μm から数μm までが観察に適した切片の厚さであると思われる．この厚さでも 1 つの細胞全体を 1 枚の厚切り切片内に収めること

3. 細胞小器官の形状を見るためには組織化学的染色はかかせないはできないが，比較的小型の細胞小器官か細胞小器官の一部

それではどのように染めれば意味のある立体像を得ることを切片内に収めることはでき，その立体観察は可能である．

ができるか．筆者の経験では最も明瞭な構造を描き出すこと

超高圧電子顕微鏡といっても，切片を観察する透過型電子のできる染色法はオスミウムや銀などを用いた古典的特殊染顕微鏡であるので，観察する切片内に高電子密度の対象物が色法である．これらの染色法にはその染色機構が不明で，細存在すれば，何らかの像を作り出すことはできることになる．

胞小器官のどのような物質と反応しているかが判らないものが多い．しかしながら一度染まると，他のどのような染色法ａ〒 567–0012 大阪府茨木市東太田 4–5–4
TEL: 072–627–1711; FAX: 072–627–1753
E-mail: t-noda@pt-u.aino.ac.jp
2008 年 8 月 30 日受付
246

で見るより鮮明にある構造を描出することができるという，捨てがたい方法である．これには Friend のオスミウム法 1），
Zinc-Iodide-Osmium（ZIO）法 2），硝酸銀を用いるゴルジ法 3）
顕微鏡 Vol. 43, No. 4（2008）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

図1

図2

図 1 ラット小腸吸収上皮細胞，抗 Calreticulin 抗体を用いた酵素抗体法で染色された小胞体，および核膜．核膜や小胞体の立体的広がりや小胞体にある大小不同の孔が確認できる．1 μm 厚切片，1000 kV．
図 2 ラット精巣上体細胞，Zinc-Iodide-Osmium（ZIO）染色で染色された小胞体，および核膜．細胞質全体に広がった網状の小胞体と核膜の曲面が明瞭に示されている．核膜には染色されない無数の核膜孔の分布を認めることができる．1 μm 厚切片，1000 kV．などが知られている．

用いる方法か，最終的に DAB 反応産物の局在から見る酵素

次には重金属を用いた酵素組織化学による染色法が挙げら抗体法になる．電顕レベルで標識感度が良いとされる凍結超れる．上記の古典的特殊染色法に比べると酵素組織化学は酵薄切片や樹脂包埋した試料の超薄切片上にコロイド金粒子で素と基質というある程度の特異性があり，再現性が高い．ま標識する免疫金標識法では点状に示された箇所で蛋白の標識た免疫組織化学は抗原が存在する限り標識するのに対して，があることが理解できるが，それらの分布が全体としてどの酵素組織化学は酵素が活性を表していると考えられ，免疫組ような形を成すかという推測は一般的に困難である．今のと織化学では表現できない生理的状態をもある程度反映させる

ころ光顕所見と電顕所見との間の形態的，免疫組織化学的なことも可能な標識法である．ただ，一つの酵素が化学構造上特徴を直接つなぐパイプは酵素抗体法である．しかし，この似たような基質を分解しうること，あるいは組織中で一つの方法も通常の加速電圧を持つ電子顕微鏡では観察可能であっ基質を複数の異なる酵素が分解しうる可能性も考えておかねても，超高圧電子顕微鏡下では細胞小器官の三次元構造の描ばならない．AcPase や TPPase などのフォスファターゼ類で出にはまだ困難があり，さらなる電子密度の増加が求められは生じたリン酸を鉛等の重金属で結合させ，酵素の局在するる．

部位に定着させる．サイトクロームオキシダーゼ，ペルオキシダーゼなどの酸化還元酵素類では，最終的にオスミウムを4.

還元，不溶化することによりその酵素の存在部位を高電子密上記の細胞化学的染色法で高電子密度に染め出された試度に染め出す．この後者の例は次に述べる酵素抗体法の最終料，そこから切り出された厚切り切片，そして厚切り切片を反応産物と原理的に同じである．超高圧電子顕微鏡で観察すも観察可能とする強力な透過力を持つ超高圧電子顕微鏡といることを前提とする場合は，対象とする構造体をくまなく描う三者の組み合わせにより，細胞内の構造を標識し，その立出するほどの酵素と組織との組み合わせを選ぶ必要がある 4）．

体的広がりを観察することができる．最終的に高電子密度の超高圧電子顕微鏡を用いた細胞小器官の観察

細胞小器官の大まかな分布であれば，細胞小器官を形づく反応産物を細胞小器官に残すことにより，その標識を立体的る構造蛋白を標識するか，袋状の構造なら内部に均等に存在に捉えることができるというわけである．次に各細胞小器官する可溶性蛋白を標識することにより，その局在を把握するの超高圧電子顕微鏡で観察されたいくつかの例を簡単に説明ことが可能である．すなわち蛍光抗体法などの免疫組織化学してみたい．

である構造にのみ認められる蛋白を特異抗体で標識すれば，4.1

切片に含まれる蛋白の分布を把握できるのであるが，あくま細胞の核には細胞質との間に核膜孔という核膜に特有の穴でそれは光顕レベルの所見である．電子顕微鏡レベルで免疫がある．核膜は外膜，内膜の 2 枚の膜でできており，核膜内組織化学を行おうとすると，蛋白の標識はコロイド金粒子を腔は小胞体の内腔と連絡を持つ部分もあるので，calreticulin

特集

超高圧電子顕微鏡を用いた細胞小器官の観察

核，核膜，核膜孔，有窓層板

247【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

図4

図3

図5

図 3 ラット小腸吸収上皮細胞，ZIO 染色で染色されたゴルジ装置．ここには規則正しく積み重なったゴルジスタック，網状のゴルジ層板，ゴルジ装置に連続する小管構造を認めることができる．1 μm 厚切片，1000 kV．
図 4 ラット胃壁細胞，Cytochrome Oxidase の酵素組織化学で染色されたミトコンドリア．槽状のクリステに酵素活性をもつ球状のミトコンドリアが細胞内分泌細管をよけて分布する様子を認めることができる．1 μm 厚切片，1000 kV．
図 5 ラット精子，ZIO 染色で染色されたミトコンドリア．クリステ構造は明瞭ではないが，中間部の複数の小型ミトコンドリアが軸糸に螺旋状に巻き付いている様子を認めることができる．1 μm 厚切片，1000 kV．のように小胞体内腔に存在する可溶性蛋白の多くは核膜内腔ゴルジ装置全体が染色されることはまれである．にも同様に分布する（図 1）．このような染色では核膜の凹トランス側凸や曲面の状態，小胞体との連絡などが認められ，核膜孔は反応産物のぬけた部分として認められる．
4.2

小胞体，小管構造

上に述べたように，小胞体内腔と核膜内腔とは連続していゴルジ装置のトランス面の形状は細胞の種類や分泌活動状態によってかなり変化する様に思われる．酵素組織化学による AcPase の反応産物がこの部分の内腔に分布することを利用して，その形状を観察すると，小管からなる網状な構造をると考えられるので小胞体の前述の calreticulin などの可溶性していることがある 5）．

蛋白に対する抗体を用いて酵素抗体法で染色すれば小胞体のシス側広がりは把握できる．またゴルジ装置やシナプス小胞を染めシス側でもゴルジスタックの層板は穴の少ない層板の積みることのできる ZIO 染色でも小胞体内腔を核膜内腔と共に染重ねであるのに対して，シス側最外層の層板はスタックに色できる場合がある（図 2）．ステロイド分泌細胞では網状ぴったり寄り添いながらも，多数の穴を持った，網状の層板滑面小胞体が脂肪滴を取り囲んでいる．筋小胞体も ZIO 染色である．オスミウムによる染色 1） や ZIO 染色 2） では全体とや硝酸銀を用いた古典的な染色法により明瞭に描出される．

してシス側を中心に染色され，特に最外層の層板が高電子密4.3

ゴルジ装置

ゴルジ装置は袋状の層板が一定間隔で積み重なっている部

度に染色される傾向があるが，理由は不明である．この網状構造はゴルジ周辺の小管がシス側最外層に移行しながら，編分をゴルジスタックとよび，周囲の網状構造や小胞までを含み込まれて形成されると考えられている 6）（図 3）．

める．この細胞小器官はその複雑な三次元構造を超高圧電子全体像顕微鏡で追求するのに恰好の対象である．このゴルジスタッ

ゴルジ装置の全体像は細胞の種類によってかなりの違いがクを形成する層板には極性があり，分泌面と形成面，あるいある．小腸の円柱上皮細胞では核上部に上下に開いた円筒形，はトランス（trans）側，シス（cis）側と区別する．その両その他の分泌細胞では 10 μm を超えるかなり巨大な球状，者は形態像では同じような層板でありながら，含まれる蛋白，或いは楕円体様空間を取り囲んでいる 1,7,8）．通常，ゴルジ装糖，脂質などの分布が異なっているため，1 つの染色方法で置として超薄切片像で認識されるゴルジ装置は連続したゴル248

顕微鏡 Vol. 43, No. 4（2008）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

ジスタックが形成する巨大な網状構造の一部にすぎない．同様所見は超高圧電子顕微鏡による厚切り連続切片による観察1,9）

察10）や，高分解能走査電子顕微鏡によるゴルジ装置の観によっても同様の所見が得られている．

4.4

6.

あとがき

医学，生物学に携わる研究者のみならず，多くの細胞に興味を持つ人々は細胞内の三次元構造をそのまま実感してみたいという願望を潜在的に持っていると思う．この願望の表れ

ミトコンドリア

ミトコンドリアは cytochrome oxidase の酵素組織化学には多くの教科書，科学雑誌等のメディアに登場する「細胞のよって特にクリステの外区画部分に高電子密度の反応産物が立体像」であるが，それらは不完全であったり，正確でない集中する．ZIO 法では内区画に高電子密度の反応産物が観察ことが多い．このことは細胞小器官の三次元構造に関する研される．ミトコンドリア全体の大きさ，形状，クリステの形究が医学，生物学の研究者の間にも充分知られていないため状も細胞の種類によってさまざまである．小腸上皮では超薄かと思われる．真実に近い細胞や細胞小器官の三次元構造，切片像では数 μm 程度に観察されたものが，厚切り切片内で立体的細胞内分布等は医学，生物学において最も基本的な情は立体的な連続性が保たれ，10 数 μm にまで連続したミトコ

報の 1 つであり，これまで，そのような研究成果は超高圧電ンドリアが観察されることもある．胃壁細胞やステロイドホ子顕微鏡や高分解能走査電子顕微鏡 14）によって得られてきルモン分泌細胞では球形の（図 4），そして神経細胞や精子たものである．このような形態学的研究がさらに進歩し，そなどでは比較的小型のミトコンドリアが観察される．特に精の成果が多くの細胞の構造と機能に興味を抱く人々に受け入子の中間部に集中するミトコンドリアは小型で全体に螺旋状れられることを望む．

（図 5）．に巻き付いている様子が立体的に捉えることができる
4.5

謝

ライソゾーム

酵素組織化学的 AcPase の反応産物の分布をもとに食作用辞

本稿に掲載した超高圧電子顕微鏡写真はすべて，自然科学の盛んなマクロファージのライソゾームの分布を見た研究で機構，生理学研究所，脳形態計測室の H1250M を使用し，は様々な刺激でヒモ状に伸びたネマトライソゾーム撮影されたものである．御指導いただいた有井達夫准教授に（nematolysosome）が生ずる様子が超高圧電子顕微鏡で捉え感謝致します．

られている 11）．しかし，このネマトライソゾームは食作用文のある細胞にのみ認められるわけではなく，分泌細胞では細胞の中心体から放射状にネマトライソゾームのネットワークが微小管に沿って広がっていることも観察されている
4.612）．

ペロキシゾーム

ペロキシゾームは特に肝，腎の組織に多く分布し，通常，球形の形状をしている．ペロキシゾームにはカタラーゼが含まれるため，この酵素を酵素組織化学的に検出することにより，高電子密度に染め出すことができる．特に，肝ではDi(2-ethylhexyl)phthalate（DEHP）の投与でペロキシゾームの増加とそれに伴う立体構造の変化が観察されている 13）．
5.

超高圧電子顕微鏡像を机の上でじっくり観察する

通常，超高圧電子顕微鏡の場合，厚切り切片観察が多いので，特に理由がなければ，ステレオ写真を撮影しておくべきである．切片のステレオ像はゴニオメーターを用いて切片を傾斜させて撮影された 2 枚の写真を並べて，裸眼あるいはステレオスコピーで観察するものなので，実際の観察時にはそのステレオ観察はできない．ステレオ写真を観察することにより，切片に含まれる構造の立体感が強調され，得られる情報も多い．ステレオ写真の他に，より広い範囲を高分解能で観察するための組み写真，より巨大な構造を捉えるための厚切り連続切片観察，ゴニオメーターの機能をフル活用して作献1）Friend, D.S. and Murray, M.J.: Am. J. Anat., 117，135–150（1965）
2）Noda, T. and Ogawa, K.: Acta Histochem. Cytochem., 17，435–451（1984）
3）Chan-Palay, V. and Palay, S.L.: Z. Anat. Entwickl-Gesch., 137，125–152（1972），組織細胞化学 1996，学
4）野田 亨：日本組織細胞化学会（編）際企画，東京，1996，p. 65–72
5）Mayahara, H. and Chang, J.P.: Acta Histochem. Cytochem., 11，239–251（1978）
6）Noda, T. and Ogawa, K.: Acta Histochem. Cytochem., 21，343–364（1988）
7）Rambourg, A. and Clermont, Y.: Eur. J. Cell Biol., 51，189–200（1990）
8）野田 亨，小川和朗：細胞，20，376–381（1988）
9）野田 亨，小川和朗：細胞，17，542–547（1985）
10）Tanaka, K., Mitsushima, A., Fukudome, H. and Kashima, Y.: J.
Submicrosc., 18，1–9（1986）11）Sakai, M., Araki, N. and Ogawa, K.: J. Electron Microscl. Tech., 12，101–131（1989）
12）Araki, N., Ohno, J., Lee, T., Takashima, Y. and Ogawa, K.: Exp. CellRes., 204，181–191（1993）
13）Nagata, T.: Micron, 32，387–404（2001）
14）田中敬一：超ミクロ世界への挑戦，岩波書店，東京，1989，p.
109–145

成するトモグラフィー像など，超高圧電子顕微鏡を用いた細胞や組織の観察は事後になされることが多い．

特集

超高圧電子顕微鏡を用いた細胞小器官の観察249【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】