epigenome という．そもそもエピジェネティクスは発生学的な細胞分化を記載する安定な静的な調節機構と考えられていたが，最近では発ガンを含む様々な病態への関与が示されて

HELMET 法―DNA メチル化部位局在のための新しい組織化学

おり，これらのエピジェネティックな因子の変異は基本的にA New Histochemical Approach to Localize
Methylation Sites of DNA: HELMETDNA メチル化は，直接遺伝子を発現抑制させることから可逆的であることから，人為制御による治療可能性も視野に大いに注目されている 1）．
エピゲノムの中でも基本的なもので，例えば X 染色体の不活性化やゲノムインプリンティング，更にはゲノム内のレトロトランスポゾンの不活性化等に於いて主役である．また，

小

路

武

彦

Takehiko Koji
長崎大学大学院医歯薬学総合研究科生命医科学講座
組織細胞生物学分野

ガン細胞では，特定の遺伝子プロモーターは hypermethylation されているが，ゲノムワイドには hypomethylation となっており，遺伝子の不安定化が引き起こされる要因となっている 2）．
このような背景を基に，細胞単位での DNA のメチル化状

要

旨

真 核 生 物 で は， 細 胞 分 化 の 誘 導 や そ の 固 定 化 に DNAのメチル化が重要な役割を果たしており，エピジェネ

態の検索と，更にはメチル化部位の塩基配列との関連の検討

ティック制御機構として注目されている．これまで，塩基配列特異的な DNA メチル化部位を細胞単位で検出することは不可能であった．我々は，メチル化の有無で同一塩基配列の切断能力が異なるイソシゾマー性制限酵素を用いた新しい組織化学的手法（HELMET 法）を開発し，マウス精巣に応用したのでご紹介する．

法はこれまで存在していなかった．そこで，今回我々はイソが必要と思われるが，これらの必要性を全て満たす有効な方
シゾマー性の制限酵素の組み合わせを利用することによる
4-6 塩基と短いながら塩基配列特異性を基本にした組織化学
的 な メ チ ル 化 同 定 法 histo-endonuclease-linked detection of
methylation sites of DNA（HELMET）法 3）を開発したのでご紹介したい．

キーワード：DNA メチル化，エピジェネティクス，イソシゾマー
性制限酵素，組織化学，ヘルメット

2.

HELMET 法とは何か？

真核生物の DNA では，CG メチラーゼによる CpG 配列のシトシンのメチル化が起こり，それによってその下流域の遺1. 緒言伝子の不活性化が引き起こされ，細胞分化の誘導や分化の固生命現象を理解するうえで，生命の最小単位である細胞定化が生じることが知られ，エピジェネティック制御機構と個々についてその活動状態を正確に把握することが必要と思して注目されている．そこで我々は，イソシゾマー性の制限われる．細胞の活動状態，つまり生理的或いは病理的状態を酵素が同一の CG を含む塩基配列を認識するが，そのメチルより正確に捉えるためには，遺伝子の発現状態はもとよりそ化の有無により切断能力が異なることに着目し，制限酵素がの調節機構を理解する必要がある．遺伝子の発現調節には，認識する塩基配列に特異的なメチル化レベルを細胞単位で検大別すると転写調節因子による短期的な機構とクロマチン構

出し定量する方法を開発し，HELMET と名付けた．

造の変化による長期的な機構が関与する．後者のクロマチン
構造の変化が，特定の遺伝子の発現可能性を規定しており，

3.

HELMET 法の必要性

それが細胞の分化状態の固定化につながる．結果として，肝DNA の特定的部位のメチル化は，細胞分化のエピジェネ

細胞からは肝細胞が生じることになる．このような調節機構

ティック制御機構の根幹をなすものであり，また最近では

は，細胞の世代を越えて維持されるが，本来の遺伝情報であ種々のがんでメチル化の昂進や，また脱メチル化剤の抗癌作

る DNA の塩基配列とは独立した調節系であり，その研究領用などから DNA の異常メチル化の発がんへの関与が強く示

域を遺伝学に対してエピジェネティクス epigenetics（後成的唆されている．しかしながら，これまで組織内で細胞分化段

修飾）と呼ぶ．エピジェネティクスに於ける主要な役者は，

階特異的な DNA のメチル化レベルに関する知見は殆ど皆無

DNA のメチル化であり，またヒストン蛋白のメチル化，アであった．5- メチルシトシンに対する免疫組織化学は可能

セチル化，リン酸化といった修飾であるが，更にヌクレオソー

であるが，CpG 配列のメチル化は，全ゲノム 3 × 109 塩基中，ムの位置決めと miRNA 発現制御を含め総称してエピゲノム

3 × 107 箇所で生じるため，シグナル強度が飽和レベルに達し細胞間での差異を議論するのは困難であった．一方，メチ〒 852–8523 長崎市坂本 1–12–4
TEL: 095–819–7025
E-mail: tkoji@nagasaki-u.ac.jp
2011 年 11 月 4 日受付

最近の研究と技術

ル化 CpG で CCGG 配列を取る頻度は 5％に過ぎず，その結果，本法によればメチル化レベルの差異を視覚化可能となるものと考えられる．また，ここでは CCGG 配列に関するイソシ

HELMET 法―DNA メチル化部位局在のための新しい組織化学

55【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

ゾマーである Hpa II と Msp I の組み合わせを用いて解析してるが，メチル化により Hpa II では切断不可能となる．一方，

いるが，Sau 3A I と Mbo I 等の他の組み合わせを用いること

Msp I では切断可能である．切断部位の 3'-OH に，ターミナも可能である．

ルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TdT）を作4.

用させると DNA 鎖の伸長反応が起こるので，そこにハプテ

HELMET 法の原理と具体的方法論 4）

ン化ヌクレオチドを取り込ませ，そのハプテンに対する抗体

ここでは，基本的な CCGG 配列のメチル化部位局在化法を用いた免疫組織化学を行うことにより染色し切断箇所を検について述べる．この配列は左から 2 番目の C がメチル化出する．従って，両制限酵素を連続的に作用させ，切断部位される．メチル化されていない場合は Hpa II でも Msp I でもを異なる核酸アナログで標識し分別的な染色を行うことで，同様に 1 番目の C の 3'-OH が自由端となるように切断されこの配列のメチル化された部位とメチル化されていない部位

図1

HELMET 法の原理
内容は本文参照．

図 2 HELMET 法によるマウス精子形成細胞に於けるメチル化 CCGG 配列の局在解析 3）
マウス精巣パラフィン包埋切片上で，HELMET 法を施行した．左図が非メチル化 CCGG 部位の蛍光染色．中央がメチル化
CCGG 部位の染色である．右図が二重染色像で，多くの生殖細胞核内で両者は混在しているのが判る．一方で，伸長精子細胞
核の一部にメチル化が優勢な箇所がり，更にアポトーシス細胞（矢印）では CCGG 配列の非メチル化が見い出された．
バー；50 μm56

顕微鏡 Vol. 47, No. 1（2012）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

を定性的或いは定量的に解析可能となる．これらの原理をなっていると思われるので，その箇所を予め TdT が反応で

図 1 にまとめて示した（図 1）．

きないようブロックする必要がある．また，TdT 作用後に具体的には，切片上でまず標本作製時などに生じた既存のも同様に反応を停止させるために同様のブロックが必要で，DNA 切断部位の 3'-OH を dideoxyATP（ddATP）と dideoxyTTP

この目的の為に 20 μM ddATP と 20 μM ddTTP を TdT で取（ddTTP）を基質として TdT で取り込ませ，その更なる伸長

り込ませている．また，DNA の組織中に隠れている切断部

反応をブロックした後，非メチル化 CCGG のみ切断できる

位が TdT 反応中に出現すると制限酵素活性に関係ない非特

Hpa II で切断し，その後切断により出来た 3'-OH 部位を TdT

異的な染色を呈するので，4％ PFA/PBS で操作毎に再固定をによりビオチン -16-dUTP で標識する．ジデオキシヌクレオ

行う．

チドでブロック後，今度はメチル化 CCGG も切断できる
Msp I で切断し，ジゴキシゲニン -11-dUTP で標識する．本5. 特異性の検定法等

稿では最終的に，FITC 標識抗ビオチン及び rhodamine 標識

本方法論での特異性の検討では，制限酵素を作用させない

抗ジゴキシゲニン抗体を用いてシグナルを分別的に検出し（或いは失活させた）場合にはシグナルが出ないこと，ジデた．操作の実際に関しては表 1 に示した（表 1）．

オキシヌクレオチドを取り込ませた後には TdT で標識が出

特に重要なことは，アポトーシス細胞では DNA 二本鎖切来ないこと，また TdT 反応の際にハプテン化ヌクレオチド断が生じており，既に多くの DNA 部位で 3'-OH が自由端とを TTP に置き換えたり TdT を添加しない場合にはシグナル

表 1 パラフィン切片を用いての HELMET 法（蛍光二重染色法）
1）パラフィン切片をシラン処理スライドグラスに拾い，トルエンに浸漬（5 min，3 回）し脱パラフィ
ン後，100％ –70％エタノール処理しミリ Q 水（DDW）に浸漬
2）PBS で洗浄（5 min，3 回）3）プロテイナーゼ K/PBS 処理（10 μg/ml, 37°C, 15 min）
4）PBS で洗浄（5 min，3 回）後，DDW に浸漬
5）1 × TdT buffer ※ 1）を添加（25–30 μl）し，湿室中に静置（RT, 30 min）
6）3'-OH のブロッキング：ブロッキング溶液 ※2）を添加し，湿室中に静置（37°C, 2 hr）
7）DDW でリンス後，4％ PFA/PBS で固定（RT, 5 min）し，PBS で洗浄（15 min，2 回）8）DDW で リ ン ス 後，Hpa II 処 理（100 U/ml Hpa II/10 mM Tris/HCl (pH 7.5)/10 mM MgCl2/1 mM DTT,
37°C, 2 hr）
9）ステップ 4）–5）を繰り返す
10）TdT 反応溶液※ 3）を添加（25–30 μl）し，3'-OH を biotin 標識（37°C, 90 min）
11）DDW でリンス後，ステップ 4）–7）を繰り返す
12）DDW で リ ン ス 後，Msp I 処 理（100 U/ml Msp I/33 mM Tris/HCl (pH 7.9)/66 mM potassium acetate/
10 mM MgCl2 /0.5 mM DTT, 37°C, 2 hr）
13）ステップ 4）–5）を繰り返す
14）TdT 反応溶液※ 3）を添加（25–30 μl）し，3'-OH を digoxigenin 標識（37°C, 90 min）
15）DDW でリンス後，PBS で洗浄（5 min，3 回）
16）500 μg/ml 正常ヤギ IgG/500 μg/ml 正常ヒツジ IgG/5％ 牛血清アルブミン (BSA)/PBS を切片に添加（25–30 μl）し，湿室内に静置（1 hr）
17）FITC-anti-biotin/rhodamine-anti-digoxigenin/5％ BSA/PBS 溶液を添加（25–30 μl）し，湿室内に静置（1 hr）
18）0.075％ Brij35/PBS で洗浄する（10 min，3 回）19）PBS で洗浄（5 min）
20）90％（v/v）glycerol/PBS で封入し，観察※1
1 × TdT buffer: 25 mM Tris/HCl (pH 6.6), 200 mM potassium cacodylate, 0.25 mg/ml BSA.
※2
ブロッキング溶液：800 units/ml TdT, 1 × TdT buffer, 20 μM ddATP, 20 μM ddTTP, 0.1 mM dithiothreitol(DTT), 1.5 mM CoCl2※3
TdT 反応溶液

最近の研究と技術

添加物

添加量

最終濃度

5 × TdT buffer
10 mM DTT
25 mM CoCl2
1 mM dATP
0.1 mM Biotin-16-dUTP(or digoxigenin-11-dUTP)
40 U/μl TdT
DDW

40 μl
2 μl
12 μl
4 μl
1 μl

1 × TdT buffer
0.1 mM
1.5 mM20 μM
0.5 μM

4 μl
137 μl800 U/ml

Total

200 μlHELMET 法―DNA メチル化部位局在のための新しい組織化学

57【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

が出ない事などを示すべきである．具体例は，参考文献を参3）での行程についての解析法が必要である 6）．本稿ではそのう

照頂きたい ．
6.

質内分布，更には翻訳調節と最終生産物としての蛋白産生まちの DNA のメチル化状態解析法に焦点をあてて解説した．

実際例

こういった方法論は日進月歩で開発が試みられており，多く

具 体 例 と し て， マ ウ ス 精 巣 パ ラ フ ィ ン 切 片 に 於 い て，
HELMET 法によりメチル化 CCGG と非メチル化 CCGG をの方々の本領域への参入により我々の理解が飛躍的に深まることを望んで止まない．

検出した例を示した（図 2）．
文

7. おわりに
本稿で扱った方法論は，分子組織細胞化学

5）の一端をなすものとして位置付けられる．これらの学問が目指すものは，個々の細胞レベルでの遺伝子発現状態並びにその制御機構を明らかにすることであり，新たな細胞の理解への挑戦でもある．組織内において，一見同一に見える細胞も決して同調的に活動している訳ではなく個性（固有分化）をもって生きており，その多様性を知ることによって生命現象の一様性へ近づけるものと考える．方法論として，遺伝子のそのものの存在状態からエピジェネティックな調節機構の関与，その遺伝

献1）Sharma, S., Kelly, T.K. and Jones, P.A.: Carcinogenesis, 31, 27–36(2010)
2）Wilson, A.S., Power, B.E. and Molloy, P.L.: Biochim. Biophys. Acta,
1775, 138–163 (2007)3）Koji, T., Kondo, S., Hishikawa, Y., An, S. and Sato, Y.: Histochem.
Cell Biol., 130, 917–925 (2008)
4）小路武彦：組織細胞化学 2010（日本組織細胞化学会編），中西
印刷，京都，61–70（2010）5）Koji, T. (Ed.): Molecular Histochemical Techniques (Springer Lab
Manuals), Springer-Verlag, Heidelberg (2000)
6）小路武彦，菱川善隆：日本臨床，68，219–226（2010）子の転写状態，次いでそれら転写産物の核内での挙動と細胞58

顕微鏡 Vol. 47, No. 1（2012）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】