微⽣物ゲノムアノテーションパイプラインDFAST

08 DDBJの登録システムとの統合による登録査定業務の効率化を⽬指してトーゴーの日シンポジウム2021○谷澤靖洋1, 2、藤澤 貴智1, 2、大城戸 利久2、青野 英雄2、李 慶範2、有田 正規1, 2、中村 保一1, 21) 情報・システム研究機構 国立遺伝学研究所 情報研究系
2) 情報・システム研究機構 国立遺伝学研究所 生命情報・DDBJセンター

Licensed under a Crea-ve Commons 表⽰4.0国際ライセンス©2021⾕澤靖洋（国⽴遺伝学研究所）

1. 概要: 微⽣物ゲノムアノテーションパイプラインDFAST

Deposit nucleotide data

Sequence data

Public sequence databases

Genome annotation / data submission pipelines

原核⽣物ゲノムの⾃動アノテーション
DDBJへのゲノム塩基配列の登録⽀援機能⾼速なアノテーション (5Mbpのバクテリアゲノムで 3 ~ 5分)

2. Web版とStand-alone版が利⽤可能
Web version (Graphical user interface face)https://dfast.ddbj.nig.ac.jp
ファイルのアップロードのみで実行可能

DDBJ への登録用ファイルをオンラインで作成可能

Stand-alone version (command-line user interface, Python3, Mac/Linux)
シンプルなコマンド
パイプラインのカスタマイズ・拡張

Sample usage
dfast --genome your_genome.fna --config sample.cfg
Bioconda からもインストール可能

https://github.com/nigyta/dfast_core

conda install -c bioconda dfast

3. DFASTの処理ワークフロー
Genomic FASTA file

Structural annotation phasede facto standard gene prediction tools
assemblygapCDS

rRNAtRNA

Collect featuresparallel processing

Functional annotation phase
Ultrafast homology search using GHOSTX

Resolve overlap- 10 times faster(Suzuki et al. 2014)

Small, but well-curated references
Functional Annotation- Default database constructedfrom 120 representative genomes- Optional organism-specific database

Output(GenBank, GFF, DDBJ-MSS...)

Pseudogene detection

4. 利⽤実績
2019年にDDBJ公式サービスとして採用
2020年のWeb版での年間ジョブ投入数 22,895 件
Number of jobs processed
25000
20000
15000
10000
50000
2017

2018

2019

2020

DDBJから公開されたアノテーション付きバクテリアゲノムの92% でDFASTが使用されている (1,716件中1,579件, 2020年)

WDCM* による GCM** 10K type strain sequencing projectの基準株ゲノム約600件が DFAST を使ってDDBJに登録された
http://gcm.wdcm.org/* World Data Centre for Microorganisms** Global Catalogue of Microorganisms

5. 遺伝研スパコンへのサーバー移転と今後の計画
2021.2.22

遺伝研スパコンへのサーバー移転

最大同時実行可能ジョブ数の増大 ( 2 → 8 )ジョブあたりのCPU数・メモリの増強 ( 1 CPU → 3 CPU )実行時間の短縮 ( 5Mbp 程度のバクテリアゲノムで 4 min → 2 min )クオリティチェック機能 DFAST̲QC の正式運用開始

今後の拡張計画 (Web版)
DDBJ ユーザーアカウントとの連携→ ユーザーごとのジョブ履歴の管理を容易化
DDBJ 登録システムとの統合→ DFAST の画面上でDDBJへの登録作業が可能に

6. 公共塩基配列DBにおける諸問題
Quality (accuracy)
他の菌株・⽣物種のコンタミネーション
シークエンス・アッセンブリのエラー (indelエラーによるフレームシフト)

CompletenessPar+al / dra. / complete
必須と思われる遺伝⼦が⽋如している

Authenticity
⽣物種の誤同定、⽣物種名の記載の間違い
細分類されて使⽤されなくなった⽣物種名

Traceability
メタデータの不⾜や誤りによる検索性の低下・データ再利⽤の阻害

7. DFAST_QC の概要
参照マーカー遺伝子配列への相同性検索とaverage nucleotide identity (ANI) を組み合わせた高速な種同定

CheckM (Parks, 2014) を用いたcompleteness と
contamination の評価

13,000 件以上の参照基準株ゲノムデータ

バクテリア・アーキアに対応

Web版と stand-alone 版が利用可能

8. ジョブの投⼊
メニューバーから Analysis →Taxonomy/Completeness Check を選択

https://dfast.ddbj.nig.ac.jp

FASTA形式のゲノムをアップロード◀ DFAST のジョブ投入時に、Perform Taxonomy/Completeness Checkを有効にするとアノテーションとともにクオリティチェックも実行される。

9. 結果画⾯
Query genome: Corynebacterium stationis strain ATCC 6872 (GCA_001561975.1)[Result]
Identified as Corynebacterium stationis by DFAST_QC (ANI 98.2%)
Completeness: 99.49%, Contamination: 0.49%

10. DFAST_QC パイプラインの概要１
参照ゲノムデータの取得
NCBI Assembly DB で公開されているゲノム配列 (>700,000 genomes)
NCBI Assembly Report を参照- 最初のデータ取得に約１⽇- ⾃動更新 (1ヶ⽉に1回程度を予定)

基準株ゲノムを抽出
NCBI ANI Report, NCBI Tax Dump を参照して検証

Reference data for Taxonomy check
検証済みの基準株ゲノム配列*10,574種 13,700 件
2020-09-15現在
Prodigal でCDS予測。rpsA, dnaB, recA, gyrA, pheS, ksgA を抽出

参照マーカー遺伝⼦塩基配列

11. DFAST_QC パイプラインの概要２
Taxonomy check
CDS の同定(Prodigal)
マーカー遺伝⼦配列* の抽出(Hmmer, TIGR)*rpsA, dnaB, etc.
参照マーカー遺伝⼦配列DBへの検索による、検索対象ゲノムの絞り込み (BLASTN)
候補ゲノム配列に対してANIを計算 (fastANI)

Primary search
to narrow down
candidates

Secondary searchCompleteness check
Taxnomy checkの結果に基づきCheckMで⽤いるgene-set を決定
CheckM で completeness と contamination を計算

300 :mes faster, 15 :mes memory-eﬃcient12. ベンチマーク⽤データの準備
NCBI Assembly DB で公開されているバクテリアゲノム配列取得 (*742,505 genomes)* as of 2020-09-15

基準株ゲノムを除く種名が同定されていないゲノム**を除外 (*637,824 genomes)** Uncultured bacterium, Clostridiales bacterium,
Spiroplasma endosymbiont, Lactobacillus sp. ... etc,

Dataset A: ランダムに抽出した10,000件のゲノム配列→ 病原菌等の比較的研究事例の多い菌種の結果を反映
Dataset B: 1菌種1ゲノムとなるようにランダムに抽出した 5,445件のゲノム配列→ より多様な菌種の結果を反映

13. ベンチマーク結果 (Dataset A)
classification# of genomes (percentage)
9,669 (96.7%)

記載された⽣物種名と⼀致*1199 (2.0%)

Secondary search でのaccepted hit(ANI>95%) なし*2101 (1.0%)

Primary search で候補ゲノムがみつからなかった

30 (0.3%)

マーカー遺伝⼦がみつからなかった*31 (0.0%)〃不⼀致*1 Shigella sonnei (130 genomes, 参照ゲノムが存在しない)
Yersinia pestis (9 genome , 参照ゲノムが存在しない)
Bacillus cereus (8 genomes, 登録者の誤同定と推測される)*2 93件では同じ属の別の菌種に対してもっとも⾼い ANI を⽰していた。
61件に関しては同じ菌種の参照ゲノムが存在していない。
*3

ゲノムサイズ が⼩さすぎるのが原因と考えられる

14. ベンチマーク結果 (Dataset B)
Reference genome

classification

available

記載された⽣物種名と⼀致

missing

Total (percentage)

3,074 *1

3,074 (56.5%)

121

328

449 (8.2%) *2

Secondary search でのacceptedhit (ANI>95%) なし

246

1,281

1,527 (28.0%)*2

Primary search で候補ゲノムがみつからなかった

77

315

392 (7.2%) *2

Failedマーカー遺伝⼦がみつからなかった

3

〃

不⼀致

Total

3,521

3 (0.1%)
1,924

5,445

*1 同じ菌種の参照ゲノムが存在していれば、 87% のケースで⼀致 (3074/3521).
*2 43.4% のケースで、様々な理由により不⼀致 または 同定の失敗
登録者による誤同定の可能性
ゲノムのクオリティが低い
種分類の結果が反映されていない

参照ゲノムが存在しない
あいまいな種名、タイポ

15. DFAST_QC まとめ
原核生物ゲノムのクオリティチェックツール DFAST̲QC を新規開発した
DFAST Webサービスから利用可能で、FASTAファイルのアップロードをアップロードするだけで実行できる。
ベンチマークの結果、研究事例の多い菌種については96.7%のケースで記載された生物種名と一致した。
DDBJ に登録されるゲノムの Quality, Completeness, Authenticity の向上に役立つと期待される。
[今後の進展] DDBJの登録システムとの統合により、登録・公開処理の自動化実現、メタデータバリデーション機能の強化Traceabilityの向上を目指す