電顕画像からの自動 3 次元再構成法の開発と TRP チャネルの構造
小椋俊彦ａ，ｂ，三尾和弘ａ，佐藤主税ａ＊ａ

産業技術総合研究所脳神経情報研究部門，ｂ科学技術振興機構さきがけ研究員

キーワード：単粒子構造解析，TRP チャネル，画像分類，画像認識，オイラー角推定

こうしたことから，電子顕微鏡を用いた単粒子構造解析法
1.

はじめにと呼ばれる解析方法が脚光を集めつつある．この方法では，電子顕微鏡画像から蛋白質の 3 次元構造を決定する単粒子

薄い氷の層に閉じ込めた蛋白質粒子を極低温電子顕微鏡で撮構造解析法は，結晶サンプルを必要としない極めて汎用性の影し，この画像だけから 3 次元構造を求めていく．具体的に高い方法である．しかし，多くの処理が手作業であるため解は，まず電顕画像内に点在する蛋白質粒子部分の画像を選択

析期間が 2 年以上必要であり，その分解能も X 線結晶解析的に拾い上げる．こうして拾い上げた数千から数万の粒子画や NMR と比較すると低い．そのため，解析速度と分解能の像の位置や回転角度を推定し，それぞれに適合した角度や位向上が極めて重要な課題となっている．これまで我々の研究置で加算平均を計算し，バックグランドノイズを減少させて室 で は，Neural Network や Simulated Annealing（SA） 等 のS/N 比を向上させる．この平均画像を基にそれぞれの 3 次元

柔軟な情報処理の方法論を単粒子構造解析に取り入れ，様々角度を推定し 3 次元構造を再構築する 1）．そのため結晶サンな処理の自動化と分解能の向上を達成してきた．本稿では，プルが必要なく，伝達物質や薬物などによる構造変化も，サ粒子像の 3 次元角度推定法の歴史を述べ，さらに我々が最近ンプル作成時に付加するだけで解析が可能である．また，蛋開発した自動決定法を概説する．さらに，この手法を用い白質が細胞内で機能する時には，様々な種類の蛋白質と結合て，神経可塑性や細胞死に関与する TRPC3 チャネルの構造し複合体を形成することが必要であるが，こうした蛋白質複解析を行い，その 3 次元構造を 10 Å の分解能で解析した．

合体に関しても，解析が可能になる．

こうして解析された結果は，生理学や薬理学など多くの生物学分野で活用されるものと予想される．

3.

粒子平均画像の角度推定法の概要

単粒子構造解析では，分類された後のクラスごとの平均画
2. 単粒子構造解析の概要像から 3 次元構造を構築する．こうした平均画像は，蛋白質

生物の多種多様な機能の多くは，重要な基本コンポーネンをさまざまな角度から投射したプロジェクションと捉えるこトである蛋白質の働きによって実現されている．個々の蛋白とができるが，そのオイラー角や回転角は未知である（図 1）．

質は，精緻で特異的な 3 次元構造を形成することで極めて複そのため，各平均画像のオイラー角と回転角を画像情報のみ雑な機能を実現している．そのため，生体内の生理機能や生から推定する必要がある．こうした画像情報のみから角度を化学反応，さらに病理の解明や薬理特性の解析において，推定する方法として，中央断面定理に基づくシノグラム法が個々の蛋白質の 3 次元構造を解明することが極めて重要とな用いられてきた 2）．しかし，この方法では，2 次元画像を回る．こうした理由から，現在多くの蛋白質の 3 次元構造解析転させながら投射して 1 次元データへと変換するため情報がが X 線結晶構造解析により進行中である．しかし，蛋白質大幅に減少し極めて精度が悪かった．そのため，この方法での結晶化が必要であるため，結晶化が困難な膜蛋白質は解析は，対称性が高く角度推定範囲を大幅に絞り込める粒子に対が難しい．細胞膜に存在する膜蛋白質は，細胞間の情報伝達しては有効であるが，対称性の極めて低い粒子では角度推定や外部環境に対する細胞応答を担っており，生理学的にも薬が困難であった．一度，初期の 3 次元モデル構造ができてし理学的にも極めて重要である．しかし先の理由より，そのほまえば，そこから様々の角度へのプロジェクションを作成し，とんどが手付かずのままである．

これとのマッチングにより角度を推定する方法も提案されてToshihiko Ogura, Kazuhiro Mio and Chikara Sato: Development ofaccurate automatic 3D reconstruction method and the structure of
TPRC3 channelａ〒 305―8568 つくば市梅園 1―1―4
FAX: 029―861―6478＊E-mail: ti-sato@aist.go.jp
2007 年 11 月 6 日受付40いる 3）．しかしこの方法では，高精度な初期の 3 次元モデルをいかに作るかが重要な問題となる．もし初期 3 次元モデルが実際の構造と大きく異なる場合は，その推定された角度も真値からかけ離れたものとなり，形成される 3 次元構造も実際の構造とは大きく異なる．当然のことながら，対称性を持たない一般的な蛋白質の場合には，その複雑さから人間が手顕微鏡 Vol. 43, No. 1（2008）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

作業で 3 次元モデルを作ることは不可能に近い．

る．すなわち全ての画像の推定角度が実際の角度と一致した

こうした，2 次元画像から 3 次元構造を求める問題は，2場合には，相関値の総和が最高となる．

次元画像の 3 次元オイラー角への最適配置問題と捉えることSA 法を用いた 3 次元モデルの再構成方法の概要を図 2 にができる．通常こうした問題には，多くのローカルミニマム示す．単粒子構造解析の初期に得られるプロジェクションのが存在する．そのため最急勾配法やニュートン法などのようクラス平均画像中の粒子は，それぞれ様々な回転角を有し，に最適な方向にのみ移動するだけではすぐにローカルミニマ

さらに中心位置からのずれがあり，それらの値は未知であムにはまり，極めて悪い結果しか得られない．こうした問題

る．こうした各画像の回転角度や位置，オイラー角を推定を解くためには，ローカルミニマムから抜け出す方法を備えし，3 次元モデルを再構成する必要がある．本論文で提案することが本質的に必要となる．

る方法では，まず各平均画像のオイラー角をランダムに設定

4.

し Back-projection（BP） に よ り 3 次 元 モ デ ル を 作 成 す る
新規角度推定法（図 2 左中）．各構成画像のオイラー角は真値とまったく異

最近我々は，SA を用いた 3 次元角度推定法を開発した 4）．

なっているため，実際の構造から大きくかけ離れている．次

一般的に 3 次元角度推定問題では，極めて多くのローカルミに，画像を一枚ランダムに選択し，オイラー角と画像の回転ニマムが存在しており，それらの多くは真の構造からかけ離角，中心位置をランダムに変化させる（図 2 右上）．そしれたものと想定される．SA 法は，極めてローカルミニマムて，この位置で再度 BP を行い 3 次元モデルの再構成を行の多い最適配置問題や最短経路問題を現実的な精度で解くこう．この再構成画像から全ての平均画像の対応するオイラーとが可能な最適化法の一つである．本方法を応用して，3 次角へと再プロジェクションを行い，それぞれの平均画像との元角度推定問題においてもローカルミニマムから抜け出し相関スコアを計算する（図 2 右下）．この全体のスコアが，て，真の構造に近い形状まで近づけることが期待される．

画像の移動によって向上する場合は「移動」が確定する．も我々は，スコア関数として，各画像と再プロジェクションのし，低下する場合は，遷移確率 P（ΔL）を計算し，これが 0相関関数を計算し，これが高くなるようなアルゴリズムを開から 1 の乱数値より大きい場合に「移動」を確定させ，これ発した．この理由としては，もし全ての平均画像の推定角度以下では移動を取り消して以前の位置に戻す．こうした一連が最適ならば，再構成される 3 次元構造も極めて真の形状にのサイクルを繰り返しながら，徐々に温度係数を指数関数的近く，これから再投射される画像も元の平均画像と極めて類に低下させることで，平均画像と再プロジェクションが徐々似するため，相関値が高くなる．これに対して，推定角度がに類似するよう，回転角と位置が変化していき，それと同時実際の角度と異なる場合は，形成される 3 次元構造も真実かに 3 次元構造も最適な形へと成長する（図 2 左下）．

らかけ離れるため，その再投射画像も異なり相関値は低くな

図1

講座

単粒子構造解析法の概要．

電顕画像からの自動 3 次元再構成法の開発と TRP チャネルの構造

41【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

図2

Simulated-Annealing 法を用いた新規角度推定方法の概要 4）．

角，回転角，位置が最適化され極めて妥当な位置に全ての画5.

IP3 受容体のクライオ電顕画像を用いた 3 次元再構築像が配置される．この時の 3 次元構造の変化とスコア変化を本方法の妥当性を検証するため，IP3 受容体のクライオ電示したものが図 3C である．温度の低下と供にスコアが上昇顕像のクラス平均画像を用いて確認を行った．IP3 受容体し，3 次元構造が徐々に形成されていく（図 3B，C）．最終は，細胞内の小胞膜に存在するレセプターで，IP3 や Ca イ的に形成される 3 次元構造はモデルデータに極めて近く，オンを受容することでチャネルが開きカルシウムイオンを放IP3 結合部位の L 形状の部分も再現されている（図 3D）．

5）

出する ．我々は，クライオ電顕を用いて IP3 受容体の粒子

この方法では数十枚のクラス平均画像に，いくつかのパラ画像を撮影し，15 Å の分解能で単粒子構造解析を行っていメータを設定するだけで，自動的に高精度な 3 次元モデルをる 6）．ここでは，テストデータとして IP3 受容体のクライオ作りだすことができる．計算の初期には温度パラメータが高電顕による粒子のクラス平均画像を用いて 3 次元再構築をいため，画像はほぼランダムにオイラー角や位置を変化させ行った．使用した平均画像は任意に選択した 40 枚であり，る．温度が徐々に減少するに従い，スコアが高くなる方向にその角度や回転角・位置は図 3a のようにバラバラの状態で移動が制限される．これは自然の分子が結晶化する状態を模ある．この画像をオイラーマップ上にランダムに配置し，本倣したものであり，低エネルギー状態（本方法では High方法による再構築を行った．IP3 受容体は 4 回対称性があるScore）を達成するための必須条件である 4）．自然における分ため，γ の角度は 0 ～ 90° に限定される．そして 3 次元再構

子の結晶化では，温度低下がゆっくりであればあるほど良質

築の FBP（Filtered-BP）では，各画像の α とさらに α+90°，な結晶が得られる．このことは，本方法にもあてはまり，急−90°，−180° の 4 角 度 か ら も 同 じ 画 像 を 投 射 さ せ た．SA

激に温度が低下した場合はノイズの多い不完全な 3 次元構造

process を所定回数繰り返した後には，各画像のオイラーが構築される．一方，温度低下をスローにした場合は，極め

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顕微鏡 Vol. 43, No. 1（2008）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

図3

IP3 受容体の平均画像による本方法の精度検証．て真の構造に近い形状となる 4）．こうした結果からも，3 次マッチングを用いた方法がいくつか提案されているが，これ

元角度推定問題には極めて多くのローカルミニマムが存在しらはあらかじめ基となる 3 次元構造が必要で，さらにスコアており，急激な温度低下では真の形状とかけ離れたローカルを最適な方向のみに変更させるため，容易にローカルミニマミニマムにトラップされることが確認できる．そのため，温ムにトラップされる．そのため妥当な構造を得ることが極め度をゆっくりと低下させ，その間に計算回数を増やせば増やて困難であった．こうした方法は，イメージ的には結晶化にすほど，より最適な角度を推定することが可能となる．

おける急速冷凍的な方法のため，そこで形成される構造はア

さ ら に 本 方 法 で は， 非 対 称 粒 子 で あ る リ ボ ゾ ー ム RF

モルファス構造となり良質の結晶を得ることは困難であるこ（Release factor）2 のオイラー角・回転角・位置がバラバラとと似ている．我々の方法では，初期構造も不用で，ローカなプロジェクション群から，オリジナルの構造を自動的にほルミニマムをエスケープし妥当な構造を自動的に形成するこ4）ぼ形成することができた （図 4）．従来の方法では非対称粒とが可能である．ここでの 2 次元画像の BP と再プロジェク子に対する角度決定は極めて困難であり，いくつかの方法をションは，比較的負荷の高い計算であるため，現実的な計算試行錯誤的に組合せながら角度を決定していた．そのため角回数は限定される．今回の RF2 や IP3 受容体の計算では，度の精度は悪く，不完全な構造しか形成できなかった．これ

700 cycle で通常のパソコンで 3 日ほど費やした．しかしながに比べて本方法では，2 次元平均画像と再構成された 3 次元ら，画像処理の計算は繰り返し部分が多く，数十台のコン構造からの再プロジェクションとの相関をスコアとすることピュータによる並列化が容易である．これにより，計算速度で，数学的な最適化問題として定義し，これを SA アルゴリを 10 倍以上高めることが可能であると思われる．今後は，ズムで解決している．これまでにも，こうした 2 次元画像の本アルゴリズムの並列・分散化により計算速度を向上させ，講座

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43【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

図4

非対称粒子 RF2 のモデル画像による本方法の精度検証．

計算回数を増やすことで精度を向上させると共に，1 日で計持つタンパク質と推定されたため 8），13 万 6 千枚ものクラ算を終了させるシステムの開発を行う予定である．

イオ粒子画像を用いて 3 次元構造の構築を行った．今回分解

6.

能 10 Å（6σ ノ イ ズ カ ー ブ と の 交 点．Fourier shell correla-

TRPC3 チャネルの構造解析

tion：FSC > 0.5 の定義では 15.3 Å）で決定された構造から，

TRP（transient receptor potential）channel はショウジョウ

TRPC3 は高さ 240 Å 幅 200 Å の隙間だらけの膨れあがった構

バエの光受容体異常を引き起こす trp 遺伝子のホモログとし造を持つことが分かった．外側はワイヤー状の構造で中心にて見つかってきた遺伝子群で，ヒトでは 30 近くの異なるチャはイオンが入り込むと思われる小部屋状になっていた．外側

ネル種からなる Superfamily として報告されている．細胞膜のワイヤーが 3 次元的な結合スペースをつくり出し，そのアに存在し，温度感受や酸化ストレス，浸透圧，味覚等々，ンテナの様な張り出しが様々な制御タンパク質との同時結合様々なセンサー的役割を担っている．それぞれの刺激特異的を可能にしていると思われる．これはマルチセンサーである2+にイオン通路チャネルが開口し，分子内への Ca 等のイオンTRP チャネルとしては極めて理にかなった構造であると言流入が行われる．しかし，その構造は全くの未知であった．

える．本報告は TRP superfamily の中で初めての構造解明で

我々は単粒子解析法を用い，このファミリーの中で最も生あると共に，そこから得られた表面構造からは，IP3 受容体

理学的な研究の積み重ねの多い TRPC3 の構造解析を，クラ7）と 1：1 の比率で結合する可能性が示唆された（図 5）．

イオ電子顕微鏡で撮影した画像を用いて行った ．TRPC3

このように単粒子構造解析法は，結晶化の難しいタンパクは ホ ス ホ リ パ ー ゼ Cγ の 直 接 的 結 合， お よ び 産 生 さ れ る質の構造解析に利点がある．我々は最近，TRP superfamily

Diacylglycerol により活性化する．また Ca2+ 放出に働く小胞の中でも酸化センサーとして働くと考えられている TRPM2

膜 IP3 受容体チャネルも TRPC3 と直接結合して活性を制御

チャネルの 3 次元構造も，負染色電子顕微鏡画像を用いて解す る た め，TRPC3 は 長 年 想 定 さ れ て き た SOC（Store析した 9）．また，TRP ファミリー以外のイオンチャネルでOperated Channel：細胞内小胞での Ca イオン枯渇を感知しは，細胞内膜からの Ca2+ 放出を助ける TRIC channel が近年，て開口するチャネル）そのものと考えられている．

京大の竹島浩教授等によって発見された．そのサイズはわず

負染色電子顕微鏡を用いた検討から，「軟らかい」構造を
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か 90 kDa と小さい．本システム開発によって，この様なサ顕微鏡 Vol. 43, No. 1（2008）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

図 5 TRPC3 チャネルの 3 次元構造．
左：13 万 6 千枚のクライオ電子顕微鏡画像から再構築された TRPC3 チャネルの 3次元構造．赤で示した図は分子量 388 kDa,
緑は分子量 610 kDa で構築されたイメージである．細胞膜の位置を青の二重線で示した．バーは 100 オングストロームを示す．右：2004 年に 3 次元構造が決定された IP3 受容体との結合イメージ．構築
された TRPC3 の立体構造は IP3 受容体と似た大きさであることがわかり，それぞれが 1：1 の比率で結合する可能性が示された．

イズの膜蛋白質の単粒子解析も可能になった 10）．

類法を用いればタンパク精製も完全である必要はない．今後は，結晶化が困難な超分子複合体や構造変化の解析に用いら7. まとめれることが期待される．

2 次元画像から 3 次元構造を推定する問題は，単粒子構造
謝解析のみならず画像処理全般に関わる極めて重要な問題で辞ある．医学・生物学関連の分野においても，実験により得クライオ電子顕微鏡像を京大生物物理，藤吉好則教授とグられるデータは顕微鏡画像のように 2 次元画像であることがループの方々に感謝いたします．また，TRPC3 チャネルに多く，ここから 3 次元構造を推定できれば，より生物機能に関して京大工，森泰生教授とグループの方々に感謝いたしま対する理解を深めることができる．こうした視点は，蛋白す．さらに，IP3 受容体精製を東大医科研，御子柴克彦教授

質の機能解析において特に顕著であり，蛋白質の機能を探とそのグループの方々に感謝いたします．本研究の画像処理るためには，それぞれの蛋白質の 3 次元構造を高精度に調べの一部は阿部幸絵，柳原真佐子が，生化学の一部は三尾宗代ることが重要となる．単粒子構造解析は，結晶化が困難でが行った．本成果は，NEDO，科研費，科学技術振興機構・質量の大きな膜蛋白質の構造を決定することが可能な方法

さきがけ研究の支援による．

であり，最近では幾つかのチャネルやレセプターの構造が文解析されている 1）．
単粒子構造解析は，コンピュータ上における 2 次元画像を用いた結晶化と捉えることができる．そのため，自然の結晶化のメカニズムを模倣した SA 法と極めて相性が良い．我々は，SA 法を用いた粒子の拾い上げ法も報告しており，いくつかのパラメータを設定するだけで自動的に粒子を拾い上げることができる 11）．こうした戦略は，単粒子解析のアライメントを含めた数々の処理にも応用が可能と考えられる．さらに，この拾い上げ法と今回提案した 3 次元角度推定法，さらに高精度な GNG による画像分類法 12）を組合せることで，ほぼ完全な自動蛋白質構造解析システムを構築することが可能と思われる．さらに本方法は，単粒子構造解析だけでなく，2 次元画像から 3 次元構造を構築するための極めて汎用な方法である．その適用範囲は画像処理全般に及ぶため，さまざまな応用分野に用いられる可能性がある．
8.

おわりに単粒子解析は，タンパク質の結晶サンプルを必要としない．そのため，結晶化の困難なタンパク質の構造解析に必須の手法となりつつある．本手法では必要とされるタンパク質

献1）Frank, J.: Three-Dimensional Electron Microscopy of Macromolecular Assemblies, Academic Press, 20062）van Heel, M.: Ultramicroscopy, 21，111―123（1987）
3）Penczek, P.A., Grassucci, R.A. and Frank, J.: Ultramicroscopy, 53，251―270（1994）
4）Ogura, T. and Sato, C.: J. Struct. Biol., 156，371―386（2006）
5）Furuichi, T. et al.: Nature, 342，32―38（1989）
6）Sato, C., Hamada, K., Ogura, T., Miyazawa, A., Iwasaki, K., Hiroaki,Y., Tani, K., Terauchi, A., Fujiyoshi, Y. and Mikoshiba, K.: J. Mol.
Biol., 336，155―164（2004）
7）Mio, K., Ogura, T., Kiyonaka, S., Hiroaki, Y., Tanimura, Y., Fujiyoshi,Y., Mori, Y. and Sato, C.: J. Mol. Biol., 367，373―383（2007）8）Mio, K., Ogura, T., Hara, Y., Mori, Y. and Sato, C.: Biochem. Biophys. Res. Commun., 333，768―777（2005）9）Maruyama, Y., Ogura, T., Mio, K., Kiyonaka, S., Kato, K., Mori, Y.
and Sato, C.: J. Biol. Chem., 282(51)，36961―36970（2007）10）Yazawa, M., Ferrante, C., Feng, J., Mio, K., Ogura, T., Zhang, M.,
Lin, P.H., Pan, Z., Komazaki, S., Kato, K., Nishi, M., Zhao, X.,
Weisleder, N., Sato, C., Ma, J. and Takeshima, H.: Nature, 448，78―82（2007）11）Ogura, T. and Sato, C.: J. Struct. Biol., 146，344―358（2004）
12）Ogura, T., Iwasaki, K. and Sato, C.: J. Struct. Biol., 143，185―200（2003）

量は数 μg であり，これまで開発されてきた画像処理法や分講座

電顕画像からの自動 3 次元再構成法の開発と TRP チャネルの構造45【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】