学位研究紹介

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学 位 研 究 紹 介

ラット臼歯断髄後の歯髄 Myofibroblast の動態解析
Characterization of Dental Pulp
Myofibroblasts in Rat Molars afterPulpotomy
新潟大学医歯学総合研究科イ三金）にて切削し，ケイ酸カルシウム系セメント（ProRoot MTA; Dentsply Tulsa Dental）を用いて断髄処 置 を 行 っ た。 そ の 後， 窩 洞 は コ ン ポ ジ ッ ト レジ ン（ビューティフィルフロー ; 松風）にて封鎖し，１, ３, ５,７, 14 日経過後に以下の実験に用いた。また対象群として，未処置の動物を用いた。
（1）動物を Periodate Lysine Paraformaldehyde 固定う蝕学分野枝並直樹

Division of Cariology, Operative Dentistry and Endodontics,
Niigata University Graduate School of Medical and Dental
Sciences

Naoki Edanami

液を用いて灌流固定し，処置歯を周囲組織と共に摘出した。10% EDTA 溶液により試料の脱灰を行い，厚さ 10μm の凍結切片を作成した。次いで，抗α-SMA 抗体を用いて，酵素抗体法による免疫染色を行うと共に，抗α-SMA 抗体と，抗 NG2 抗体を用いて，蛍光抗体法による二重免疫染色を行った。
（2）動物を安楽死させ，処置歯を抜去した。次いで，抜去歯の歯髄（各期間 n=４）から RNA を抽出し，リ【緒アルタイム PCR を用いて，TGF-β1, EDA-FN, α-SMA

言】の mRNA 発現を解析した。

【結α-smooth muscle actin（α-SMA）を発現する myofi-果】

broblast は，細胞外基質のリモデリングにより創傷治癒や線維化に寄与することが知られている 1）。歯髄の修復

未処置および処置１日後の歯髄において，α-SMA 発象牙質形成過程においても，一過性にα-SMA 陽性細胞現は，血管周囲にのみ認められた（図１A）。しかしなが創傷部に観察されることが報告されている 2） ことかがら，処置３日後では，窩洞直下から歯根側の歯髄までら，myofibroblast の関与が推察される。しかしながら，に及ぶ広範囲に，紡錘形のα-SMA 陽性細胞が観察され修復象牙質形成過程におけるα-SMA 陽性細胞の詳細なた（ 図 １B）。 ま た， 二 重 免 疫 染 色 に お い て， 紡 錘 形動態は明らかにされておらず，また，myofibroblast のα-SMA 陽性細胞は NG2 陰性であった（図２）。処置５

特定には，同じくα-SMA 陽性を示す血管壁細胞との鑑日後には，紡錘形α-SMA 陽性細胞は窩洞直下に集積し別が必要である。そこで我々は，断髄処置後のラット臼た。14 日 後 に な る と 修 復 象 牙 質 の 形 成 が 観 察 さ れ，歯歯髄におけるα-SMA 陽性細胞の局在変化を免疫組織

α-SMA 発現は再び血管壁細胞に限局した。リアルタイ

化学染色により観察するとともに，NG2（血管壁細胞

ム PCR の 結 果 か ら，TGF-β1, EDA-FN, α-SMA のマーカー）の局在と比較することで，修復象牙質形成過mRNA 発現は，未処置歯髄と比較して処置後有意に増程 に myofibroblast が 関 与 す る か を 検 索 し た。 ま た，加 し た（Dunnett’s test p<0.05）。TGF-β1 と EDA-FN

myofibroblast の 分 化 誘 導 因 子 で あ る transforming
growth factor-β1（TGF-β1）および extra domain A fibronectin splice variant（EDA-FN）の修復象牙質形成過程における発現変化を，リアルタイム PCR を用いて解析し，α-SMA 発現と比較した。

【方法】

本研究は，新潟大学動物実験倫理委員会の指針を遵守し，同委員会の認可の下に実施された（承認番号 27 新大研第 79 号１）。８週齢 Wistar 系ラットの上顎第一臼
歯咬合面を直径 0.8mm のカーバイドバー（デンツプラ

図 1 α-SMA に対する免疫染色Ａ：正常歯髄組織において，α-SMA 陽性反応は血管周囲に限局して認められる。
Ｂ： 断 髄 処 置 3 日 後 の 歯 髄 組 織 に お い て， 多 数 の 紡 錘 形
α-SMA 陽性細胞が認められる。

－ 47 －新潟歯学会誌10847（2）：2017

復象牙質が形成されると共に観察されなくなった。これまでに，α-SMA 陽性細胞が骨芽細胞や，象牙芽細胞に分化しうることが報告されている 4） ことから，本研究で観察された myofibroblast の一部は，新生象牙芽細胞に分化することでα-SMA 発現を消失したとも考えられる。
修復象牙質形成過程に特異的に出現する myofibro図 2 α-SMA と NG2 に対する免疫染色
α-SMA 陽性かつ NG2 陰性である myofibroblast を認める
（矢印）

blast は，歯髄創傷部の治癒に重要な役割を果たしていると考えられるため，この細胞を活性化させることで治癒を促進する新たな歯髄保存療法の開発が期待できる。

【結は処置１日後に，α-SMA は処置３日後に発現量が最大論】となり，その後，TGF-β1，EDA-FN，α-SMA ともに，処置 14 日後までに未処置歯髄と同等まで発現量が減少した。

断髄後の歯髄において，修復象牙質形成に先立ち
TGF-β1 と EDA-FN が増加し，α-SMA 陽性かつ NG2【考陰性である myofibroblast が一過性に出現することが示察】された。
【参 考 文 献】

修復象牙質形成過程では，一過性に多数の紡錘形α-SMA 陽性細胞が観察された。これらは未処置歯髄で認められるα-SMA 陽性の血管壁細胞とは異なり，NG2１）T o m a s e k J J , G a b b i a n i G , H i n z B , e t a l :陰性を呈しており，myofibroblast であると考えられる。

Myofibroblasts and mechano-regulation of

myofibroblast は TGF-β1 と EDA-FN の 刺 激 に よ り 分

connective tissue remodelling. Nat Rev Mol Cell

化することが，これまでに多くの臓器で報告されていBiol, 3: 349-363, 2002.

る 1）。本研究においても，myofibroblast の出現に先立っ

２）Yoshiba N, Yoshiba K, Ohkura N, et al:て，TGF-β1 と EDA-FN の有意な増加が確認されたこ

Immunohistochemical analysis of two stem cellとから，修復象牙質形成過程における myofibroblast のmarkers of a-smooth muscle actin and STRO-1

分化にも TGF-β1 と EDA-FN が誘導因子として働いて

during wound healing of human dental pulp.

いることが示唆される。

Histochem Cell Biol, 138: 583–592, 2012.

本研究において myofibroblast は，処置３日後には歯３）Hirata A, Dimitrova-Nakov S, Djole SX, et al:髄の広範囲に出現し，処置５日後では断髄面直下に集積

Plithotaxis, a collective cell migration, regulates

して観察された。このことが，myofibroblast の創傷部

the sliding of proliferating pulp cells located inへの遊走によるものかは不明であるが，これまでの研究

the apical niche. Connect Tissue Res, 55（suppl

では創傷時に歯髄細胞が pulp core から周辺部に，また

1）: 68–72, 2014.

3）は，根尖部から歯冠部に移動することが知られており ，

４）Vidovic I, Banerjee A, Fatahi R, et al: αSMA-

本研究における myofibroblast も，何らかの遊走因子にexpressing perivascular cells represent dental

より創傷部へ移動した可能性がある。

pulp progenitors in vivo. J Dent Res, 96: 323–

断髄面直下に集積した myofibroblast は，その後，修－ 48 －330, 2017.