●■■

王

第27巻第3号平成1！年9月
内総説
抗デングワクチン：歴史と展望

堀田
原

容

進……

・・397−415

著

新しい迅速検査法であるDetemineTM

Malaria

Pfと，標準顕微鏡法，∫CT躍吻吻P∫TM，

PαrαSightTMFとの比較評価（英文）Dorina G Bustos，Remigio M．01veda，根岸 昌功，栗村 敬…・一…………・………………417−425

パラグアイ国から分離されたTη勿％oso窺α6鰯2づ株のDNA多形性に関する比較研究（英文）馬場さゆみ，松本 珠美，神原 廣二，坂本信，Marisel Maldonado，Antonieta

Rojas

de

Ariasン佐谷秀行，三森龍之…一…………・………………一・…一……427−431

インドネシア，スラバヤ地区における小児下痢症からの腸管病原菌分離頻度：
病院における5年間の推移（英文）Eddy Bagus Wasito，Pitono Soeparto，Subijanto Marto Soed6rmo，Liek Sunami Djupri，Lindawati AlimSardjono，Dadik Rahardjo，片岡 陳正，
仲宗根

昇…・……………・・一………………・…・……………・・…………・……・・…・…

一433−436

1999年度日本熱帯医学会会員名簿

一437−459

会報・記録
理事会記録…一……………・………

・・461一弱2

1999年度日本熱帯医学会役員名簿・・・・螂

雑誌編集委員名簿…一……………・

一464−465

投稿規定…………・…・…・…………

−466−468

著作権複写に関する注意一…………

・・469

1■

397

日熱医会誌，第27巻，第3号，397−415頁，1999年

総説

抗デングワクチン：歴史と展望堀田進

1999年5月10日受付／1999年5月17日受理

あえて古い年代の研究実例をも紹介し，一・っの大きな流れを辿ることを試みた。

言ロ

序デング熱（以下DENと略記）は，すでに数世紀以前から存在していたと推定されるが，20世紀に入ってその発生が世界的規模で拡大した。特に，第二次世界大戦中，その主戦場の一つであった東南アジア，西太平洋地区で猛威を振い，日本内地もその余波を受けて，史上稀にみる大流行を来したことは，今なお記憶に新しい。戦後，本病は一時減少の傾向を示したが，その後1960−1970年代以降再び爆発の兆しを見せはじめた。数万，数十万，時には百万以上の患者を出す流行（公的記録による）が決して稀ではない。調査から洩れた患者などを考えれば，年問の全世界の患者数は1億に達する場合すらあり得ると推定されている（Ha1−

ちなみに，第二次大戦中にデングウイルス（以下DENVと略記）のマウス伝達が成功し，ついで組織培養によるウイルス培養も可能となり，ワクチン研究も新しい段階に入った。さらに分子生物学や分子遺伝学の進歩が加わって，今日に至っている。よって以下ワクチン研究の経緯を，（A）「大戦前」と（B）「大戦中および大戦後」の二時期に大別して論じることにする。また，ワクチンには，（1）有毒ウイ
ルス株を不活化した「死ワクチン」と，（II）無毒化ないし弱毒化したウイルス株による「生ワクチン」との2種類があることは周知の通りであり，本論文でもこの区分に従って考察を進める。

stead，1988；Monath，1994）。

DENの病原体がウイルスであることはAshbum

and

（A）

「第二次世界大戦前」の研究

Craig（1907）により証明され，また，、484θsに属する蚊によって媒介されることは，多くの研究者によって確定された（Hotta，1969；Schlesinger，1977）。従って，本病制圧の要点が媒介蚊の駆除とワクチンの開発にあることは，ほとんど常識と言ってよい。前者はかつて最も直接的かつ確実な手段と見なされたが，現在のところ実施上大きな困難に直面している。その理由は，殺虫剤の広範囲の使用は，必然的に薬剤耐性蚊の出現をもたらすと共に，環境汚染をひき起こす恐れがあるからである。殺虫剤の撒布のみによって媒介蚊の撲滅を企図することには，疑問を呈する研究者が少なくない（Gubler，1993）。ただし，殺虫剤を浸み込ませたmesh netを住居の戸口や窓に張る方法が，防蚊上有効であると主張されている（lgarashi，1997）。

一方，抗DENワクチン開発の研究は，ウイルス病因説の確定の後，比較的早い時期から開始され，既に長い歴史を経ている。ワクチンが，本病制圧に必要不可欠の手段の一つであることには，理論上も異論がない。それにもかかわらず，種々の試みは概ね実験室内の段階に止まっており，人体に確実に有効無害と見なされるワクチンの実用化は，未だ達成されていない。しかし，研究の努力は絶えることなく続けられてきたし，現在も続けられている。本論文では，その経過をふりかえって，これを将来の希望につなげたいと思う。記述に当たっては，最近の研究成果の他に，
Review：Antidengue Vaccine二Retrospect and Prospect
Susumu HOTTA，M．D．，Vice President，Japan WHO Assosiation；
Emeritus Professor，Kobe University
567−0891茨木市水尾1−7
1

A．1．「死ワクチン」の研究供試されたウイルス素材は，有熱期の患者血液，感染サ
ルの臓器（サルがDENVに感染することは，比較的早くから知られていた；Blanc6齢1．，1929a），および感染蚊体等であった。いずれも，活性ウイルスを含有すると考えられるものである。

A．1．a．「胆汁ワクチン」

DENワクチンの人体適用に関する世界最初の学術論文
は，おそらくBlanc an（1Caminopetros（1929b，1930）のそれであろう。彼らは，有熱期患者血清をウシの胆汁で処理したものを，ワクチンとして用いた。予備実験において，胆汁と血液との混合比率を1：15（胆汁濃度7％）とすると，ウイルス活性（人体感染性）は完全に失われたが，混合比率を1：20（胆汁濃度5％）とすると，ウイルス活性が少し残存し，被検者の一部がワクチン注射自体によって軽度に発症した。この成績に基づいて，人体にまず「1：15ワクチン」を与え，適当な時期を置いて「1：20ワクチン」を与えると，被検者に異常な症状を起さしめないで，

398

しかも強い免疫（有毒ウイルスに対する感染防御能）を生ぜしめたと唱えた。

えてウイルスを不活化した。しかし，これも人体において全く感染防御能を示さないという結果になり，その後の検討は放棄されている。

A．1．b．「乾燥血ワクチン」および「蚊体ワクチン」
A．II．「生ワクチン」の研究

Simmons6∫α」．（1931）は，フィリピンにおいて「乾燥血ワクチン」（desiccatedbloodvaccine）と「蚊体ワクチン」（mosquito

vaccine）を試みた。

乾燥血ワクチンは，有熱期患者血清をガラス管内に封じ，18℃に静置，乾固させ，一定期間後に生理食塩水で溶解したものである。完全に人体感染性を失った材料0．5mlない
し1．O mlを被検者に注射し，8ないし18日後に有毒蚊をもって攻撃した。しかし，全員定型的に発症し，本ワクチ

古来，微生物の変異株を得る目的のために，（1）特定宿主での継代通過，あるいは（2）放射線の照射という手段がとられている。この方法によって，抗DEN生ワクチンを作製しようとする試みがなされた。

A．II．a．

ンは無効と判定された。

充分増殖したと思われる蚊体を集め，食塩水を加え磨潰，フェノールとホルマリンを加えて48時問静置の後，遠沈して上清をとる。食塩水をもって適宜に希釈，フェノールとC

蚊体ワクチンは，下記のごとく作製された。蚊（、弛46s
σ聯めに患者を刺咬させ，一定潜伏期の後，ウイルスがleland6！α1．（1919）は，患者血液を健常人に注射し，発症した場合の血液をさらに次の健常人に注射するという「ヒト→ヒト通過」を行った。しかし，ウイルスの毒力に変化は見られず，ワクチン株樹立は成功しなかった。その後，第二次世界大戦中に，緒方，吉井（1943）は同様の試みをホルマリンの最終濃度をそれぞれ0．4％および0．1％とし，したが，その成績はClelandのそれに異なるところはな

ワクチン1ml当たり約50蚊体の成分を含むように調整された。ワクチンの1回注射，2回注射（8ないし10日間かった。

隔），3回注射（9ないし12日間隔）のグループ，また，蚊
体ワクチン・乾燥血ワクチン併用（両者の間隔は10日）のグループを置いた（各回，ワクチン1ml，皮下注射）。しかし，供試の全例において，有毒ウイルスの攻撃に対する防御能は全く認められず，無効と判定された。
ちなみに，発疹チフスに対して「血液ワクチン」と，「シラミ・ワクチン」が試みられたことがある。前者は，患者
血液を58℃，30分加熱したもの。後者は，リケッチア感染
シラミの腸内容を磨潰して乳剤とし，ホルマリン不活化したものである。いずれも，人体に感染防御能を与えることを実験的に確かめた後，実際に野外で使用して有効であったと主張されている。同様に，ロッキー山紅斑熱に対して「ダニ・ワクチン」（感染ダニの乳剤に，ホルマリンを加えて不活化したもの）も有効であったという報告がある（Weigl，1920；Manson−Bahr，1935，1964）。

現在リケッチア疾患に対しては，艀化鶏卵卵黄嚢内で発育したリケッチアから作製した不活化ワクチンが実用化されており，シラミあるいはダニ・ワクチンは，全く過去のものとなった。しかし，患者血液あるいは媒介節足動物を素材とするワクチンという共通の発想があったことは，歴史的に興味ある事実と思われる。

A．II．b．

Siler6砲1，（1926）は，上記の方法をやや改変して，「ヒト→蚊→ヒト→蚊通過」を行ったが，これによってもウイ
ルスの毒力に変化は認められなかった。

A．II．c．

Simmons8砲1．（1931）は，「蚊→蚊通過」の実験を行った。患者血液を吸引後7日以上を経過させて，完全に感染力を帯びた。48．α鰹卿を磨潰，健常人血を加えて乳剤とし，これを次の蚊に吸引させて帯毒させる。かようにして，
順次蚊通過のウイルス株を得た。しかし，このウイルスも
その感染力に変化がなかった。ただし，彼らの記載によれば，蚊通過ウイルスで感染した患者の症状は，通常の感染の症状よりも軽症の例があった。換言すれば，一見ウイル
ス毒力の減弱とみなし得る傾向が認められた。しかしその後この種の実験を続行して，ワクチン株の獲得を目指した
ことは報告されていない。

A．1．c．「サル肝ワクチン」

A．II．d．

St．John and Holt（1931）は，「サル肝ワクチン」の効果を調べた。患者血液を接種されて感染したサル（〃αogO郷Holtとその共同研究者（1931a，b）は，帯毒した蚊にX線あるいは紫外線を照射した後にヒトを刺咬させたが，その感染力に全く変化は認められなかったと報告した。

ρhJl吻劾8％諮）の肝を採集し，その乳剤にホルマリンを加

399

表1

「第二次世界大戦前」になされた抗デング・ワクチン研究のまとめ（1）各種素材を用いた「死ワクチン」の効果判定実験
素材と作製法

評価方法

感染防御成

文

献

Blanc

and

立の有無

有熱期患者血清ウシ胆汁処理

ヒト接種

有熱期患者血清乾燥処理

ヒト接種

Simmonsα認（1931）

感染蚊乳剤
フェノール・ホルマリン処理

ヒト接種

Simmonsαα乙（1931）

感染サル肝乳剤
ホルマリン処理ヒト接種

St．John十Caminopetros（1929b，1930）

and

Holt

（1931）（II）無毒（ないし弱毒）変異株獲得の試み
方法

評価方法

ヒト→ヒト通過ヒト接種

無毒化の可否文

献

Clelandαα乙（1919）

緒方，吉井（1943）

ヒト→蚊→ヒト→蚊通過

ヒト接種

Silerα召乙

蚊→蚊通過

ヒト接種

Simmonsθ渉α乙（1931）

感染蚊のX線または紫外線照射

ヒト接種

Holtαα乙（1931a，b）

ここに紹介した研究は，すべて人体接種実験に基づいたものである。また，供試材料中に含まれるウイルスの性状や，濃度も明確にされていない。現代のウイルス学から見れば，不完全な実験といわざるを得ないかも知れない。しかし，全く無意味であったかと言えば，必ずしもそうとは断定出来ないであろう。「死ワクチン」にしろ，「生ワクチン」にしろ，何か有効なものを見出そうとして苦闘した先人の努力は，歴史上一つの意義ある段階を形づくったと考（1926）の基礎的構造の一端を解明することにつながったもので，
いささか興味あることと思われた。
「第二次大戦前」のDENワクチン研究成果をまとめてみると，表1のごとくになる。

（B）「第二次世界大戦中および大戦後」の研究

第二次大戦中にDENVのマウスヘの感染が成功し，つえるべきである。

唯一「胆汁ワクチン」が，若干の陽性成績を収めている。
これは，後にマウス伝達ウイルスを用いた実験においても，ある程度の有効性が認められた（後述）。
ちなみに，この研究は偶然に意外な方向に進展した。胆いで組織培養によるウイルス培養が達成されたので，ワクチンの研究も新しい段階に入った。

汁は脂質溶解作用を有するので，脂質溶解物質のDENV

B．1．「死ワクチン」の研究に及ぼす作用を検討しようという発想が生まれたのである。
その結果，エチルエーテル（Hotta and Evans，1956c），
deoxycholate（Theiler，1957），リパーゼ（TakeharaandB．1．a．「ホルマリン・ワクチン」

Hotta，1961）が，いずれもDENVの感染性を失わせることが明らかになった。同様のことが，日本脳炎（JE），黄熱

DENVがマウス接種によって分離されてから（木村，堀田，1943，1944a），直ちにワクチンの研究が開始され，ま（YF）などのFlα∂伽7％s，ならびにウマ脳炎ウイルス（、41一ず，ホルマリン・ワクチンが試みられた（木村，堀田，1944b，

ヵ伽∂枷s）にっいても認められた（Takehara and Hotta
1961）。さらに，32PでラベルされたDENVを分画すること
により，ウイルス粒子に脂質の存在することが確実に証明

c；堀田，1947a；Hotta，1954）。

された（Stevens

および0．2％の割に加えてウイルスを不活化した。マウスに
まず「0．4％ワクチン」，その5日後に「0．2％ワクチン」をそれぞれ0．1ml宛皮下注射し，第2回注射の10日後に，強毒ウイルスの脳内注射により攻撃を行った。かような条件において，ワクチン接種群マウスは，対照マウス群に比べ，有意の死亡率の低下，死期（生存期間）の延長を示し，こandSchlesinger，1965）。この場合，脂質分画にとり込まれる32P量はウイルスの赤血球凝集価に対し，コンスタントであることが示されている。またJEVがリパーゼ処理されると，その抗原性（抗体産生能）が減弱することも知られた（徳地，1961）。これらの成績は，ワク
チン開発という当初の研究目的からは外れたが，ウイルス

ウイルス浮遊液（感染マウス脳のTyrode液添加10％乳剤を，3，000rpm，10分遠心の上清）に，ホルマリンを0．4％

400のワクチンは感染防御上有効であると判定された。
この方式が人体に適用された（0．4％ワクチン，0．2％ワ
クチン共に0．5mlを皮内注射）。しかし，被検者の抗体産生は極めて微弱で，有効な感染防御能が与えられたとは到底考えられなかった。すなわち，上記の条件による限り，このワクチンはマウスでは有効であったが，ヒトでは有効でなかったと判定された。

これとは全く独立に，アメリカのSabinらは，マウス接種によりDENVを分離し，そのハワイ株ウイルスによるホルマリン・ワクチンを人体に試みたが，感染防御効果は得られなかったと報告した（Sabin

andSchlesinger，1945；

Sabin，1948，1950，1952，1955）。

クチン」の効果が検討された（木村，堀田，1944b，c；堀田，1947a；Hotta，1954）。Blanc

andCaminopetros（1929b，

1930）の記載に準じて，マウス継代ウイルスをウシ胆汁で処理した「1：15ワクチン」と「1：20ワクチン」が作製され，ヒトに第1回に「1：15ワクチン」，第2回（10日後）に「1：20ワクチン」をそれぞれ0．5ml宛皮内注射した。
第2回注射の3−6週後に，被検者の血中にウイルス中和抗体が出現した。この時期に有毒ウイルス（有熱期患者血清）を皮内注射すると，感染防御効果が認められた。すなわち，「胆汁ワクチン」は人体に一定度の予防効果を与えると判定された。ただし，被検者の一人が「ワクチン」そのものの注射後に，軽度ながらDEN様症状を発したので，これはおそらく，ウイルスの不活化が不充分で，残存した活性ウイ
ルスによって，感染がひき起こされたためではなかろうか

かようなマウス・ヒト間の成績の不一致の理由は，明らかでない。考え得られる可能性として，異種動物間の免疫反応の差異があるかも知れない。しかし，むしろ単純に，投与ワクチンの量的差異によると考えるのが妥当ではなかろうか。ヒトに与えられた抗原の相対的な量（対体重比）
が，マウスに与えられたそれよりも格段に少なかったため，誘発された免疫の程度が弱かったと説明することが可能である。言い換えれば，充分高濃度の抗原が与えられれば，ヒトにおいても充分な免疫が成立するであろうと推定された。よって，濃縮された抗原材料を用いた実験が，新たにこの成績に関し，次のような説明が可能であるかも知れない。胆汁の作用によって完全に不活化されず，なにがしかの程度の活性（人体感染性）を保有しているようなウイ
ルスが，ワクチンとして有効であったのではないか。言い換えれば，生死の中間の微妙な状態にあるウイルスが，有効性を発揮したのではないかという考察が可能であった。
「胆汁ワクチン」に関して，以後追試や再試はなされていな試みられた。

いo

Fujita6砲1．（1976）は，感染マウス脳乳剤を硫酸プロタ
ミン処理後，蕉糖密度勾配遠心（100，000g／90min）によっは，表2にまとめられる。

と推定された。

マウス伝達ウイルスを用いた「死ワクチン」研究の成績て得られた高力価の赤血球凝集能を有するcomponentが不活化されても，なおウサギおよびサルにおいて（静脈内注射による），抗体産生（中和および赤血球凝集抑制）をも

B．II．「生ワクチン」の研究たらすことを示した。

Mori8砲1．（1986）は，感染マウス脳乳剤を硫酸プロタ

B．II．a．

ミン処理，，ホルマリン不活化，活性炭処理，59，000g／6hr

遠心の操作によって精製されたウイルスが，マウスに良好な抗体産生を促すことを示した（ワクチン作製の方法および効果判定の基準等は，すべて現行のJEワクチンのそれに従っている）。彼らは，DENVの4種の血清型の代表株をり，おのおのについて各型ウイルスに対する反応を定量的

DENVをマウス脳内接種により連続継代している間に，一種の変異株が得られた。このウイルスを活性のまま健常人に接種（皮内または皮下注射）すると，異常な症状を全く呈しないで，その後に強い免疫が成立した。この免疫は，明瞭な抗体産生（中和，赤血球凝集抑制，補体結合），および強毒ウイルスの攻撃に対する感染防御として示される。
すなわち，「生ワクチン」として用いられる可能性が提供さに比較検討している。

れたのである。

これらのグループのいずれにおいても，ヒトにおける感染防御効果は調べられていないが，上記動物における抗体産生の程度，あるいは感染防御能の発現，並びにJEワクチ
ンの実際的効果から類推して，おのおのの「ワクチン」はヒトにおいても，相当程度の効果を発揮するであろうことが示唆された。抗DEN「死ワクチン」も，あながち悲観的な結諦のみを下すべきではなかろうと考えられる。

第二次世界大戦中に，日本とアメリカで殆ど同じ研究成績が独立的に得られた（木村，堀田，1944d；堀田，1947b，

用いて，1価（monovalent），2価（bivalent），3価（trivalent），および，4価（tetravalent）のワクチンを作

c，Hotta，1952，1969；Sabin

andSchlesinger，1945；Sabin，

1948，1950，1952，1955；Schlesinger，1977）。最も典型的かつ異論のない成績をもたらしたウイルス株は，日本の長崎で分離された望月株（Mochizukistrain）と，ハワイで採取されたハワイ株（Hawaiianstrain）である。現在の知見によれば，いずれも1型に属する。その後Schlesingerα召1．（1956）は，ニューギニアで分離された2型ウイルス・

B．1．b．「胆汁ワクチン」

ニューギニア株のマウス通過によって，同様な弱毒変異株を樹立した。

ホルマリン・ワクチンの初期の実際に併行して，「胆汁ワ

これらの研究は，当初もっぱら実験室内で限られた人数

401「第二次世界大戦中および大戦後」になされた抗デング・ワクチン研究のまとめ（1）：死ワクチンの研究

表2マウス脳通過ウイルスを用いた「死ワクチン」の効果判定実験
素材と処理法

評価方法（1）

効果感染マウス脳乳剤
ホルマリン不活化マウス（C）＋ 木村，堀田（1944b）
一 木村，堀田（1944c）1
堀田（1947a）；Hotta（1954）

感染マウス脳乳剤
ウシ胆汁不活化

マウス（C）

感染マウス脳乳剤
ホルマリン不活化

ヒト（C）

ヒト（S）

ヒト（C）

一
＋（2）

感染マウス脳乳剤
サル（S）
薦糖密度勾配遠心分画

感染マウス脳乳剤
ホルマリン不活化
活性炭処理
超遠心沈渣

マウス（S）

文献

木村，堀田（1944b）

木村，堀田（1944c）；
堀田（1947a）；Hotta（1954）
Sabin

and

z乙

Schlesinger（1945）

十Fujita6渉（1976）

十Mori8地乙（1986）（註）（1）C（Challenge）：強毒ウイルスの攻撃に対する感染防御。

S（Serology）：抗デング抗体の産生。
（2）被検者のうち，ワクチン接種後に軽度の発熱をきたした例があった。胆汁によるウ
イルスの不活化が，不完全なためではなかったかと推定された。

の特志者を求めて行われたが，その後，野外での応用も試みられた。Wissemanと共同研究者はSabin−Schlesingerのハワイ株から出発して新しい亜株（MD−1と命名された）を分離し，これをPuerto

RicoでのDEN流行（1963）に際し住民に接種したところ，流行を頓挫的に終息させる効果があったと報告した（Wissemanαα1．，1963；Wisseman，
1966；Bellanti6齢1．，1966）。興味あることは，このPuerto

Ricoの流行では3型ウイルスが主役を演じたのだが（別になされた疫学調査から判明），そうであるならば，1型ハワイ株由来のワクチンが3型の流行にも有効であったと考えられるわけである。この点は，DENVの血清型間の交差反
応や二次感染・三次感染の問題ともからめて，さらに追求検討する必要があろう。

Fujita6厩1．，1969，1972）。結論として，培養されたウイルスもよく免疫原性を保持しており，マウス，サル，ヒトなどにおいて良好な抗体産生をもたらし，あるいは，感染防御効果を与えた。この場合，黄熱ワクチン（17D株）とのcombined immunizationも可能であった。また，ワクチンを接種されたサルの組織を採って培養し，その培養液中に出現する抗体を調べると，肺，肝，脾，リンパ腺などの組織が良好な抗体産生を行っていることが認められた。これ
らの組織は，リンパ球・マクロファージ系の細胞を豊富に持っていることが知られており，恐らくそれらの細胞が抗体産生に主として関与したのであろうと推定された。無毒株ウイルスが，培養細胞通過によって毒力を回復するか否かについては，一定期間の観察に関する限り，その恐れは認められなかった。よって組織培養された無毒化DENVを生ワクチン材料として使用することは，原則的に充分合理的であると判定された。

B．II．b．

この段階までの「生ワクチン」研究の成績は，表3にまDENVが初∂飾oの培養細胞で増殖可能ということが判明したので（Hottaand

とめられる。

Evans，1956a，b；Hotta，1959），

組織培養されたウイルスを用いての「生ワクチン」の実験が開始された。組織培養液はマウス脳乳剤にくらべて，不純物混入度が格段に低いこと，またDENVに関する限り，感染培養液と感染脳乳剤の，それぞれの単位体積当たりウ
イルス濃度に大きな差異がないことなどから，組織培養ワ
クチンがより優れていることは明らかである。
既にマウス通過によってヒト無毒化した望月株ウイルスを素材とし，サル腎，ハムスター腎，イヌ腎などの培養の感染培養液が供試された（Hotta，1957；Hottaε厩1．，1966；（C〉細胞培養通過による変異株ウイルス獲得の試み
C．a．

上述の研究は，マウス通過によってヒトに完全に無毒化した変異株ウイルスを用いたものであった。これに対し，マウスに一且伝達されたが，その継代数が比較的少なく，ヒトに感染性をなお保有するウイルスから，細胞培養通過

402

によってより好適なワクチン株を得ようとする試みがなされた。その目的は，マウス脳通過によって発現し得る神経毒性（neurovimlence）の危険性，および既知，あるいは未知のウイルスの迷入の恐れを，可及的除去しようとするこ

susmonkey（〃．窺κ伽伽），チンパンジーなどが用いられた。

C．a．3．

とにある。．

TarrandLubiniecki（1975，1976）は，2型TH−36株
C．a．1．

ウイルスから出発して，初代ハムスター腎細胞培養により，温度感受性（temperature−sensitivity；ts）を指標として変Beasley6！召1．（1960，1964）は，2型Trinidad1751株
ウイルスをKB細胞培養に継代培養することによって，培養細胞での増殖能は不変であるにかかわらず，マウスに対する病原性が著明に低下したことを観察した。しかし，こ異株を選択した。この株は親株ウイルスに比べて，マウス
あるいはハムスターでの脳内致死率の低下，rhesus mon−keyでのウイルス血症（viremia）の消失を来し，しかもサ
ルに極めて良好な抗体産生を促した。ちなみに，この研究においては，使用細胞培養の培養液に5−azacytidineが添加され，変異効率の促進が企図されている。

れをワクチンとして用いる実験は報告されていない。
C．a．2．

C．b．

Price6厩1．（1973a，b；1974）は，2型ニューギニアC株
ウイルスを，アフリカミドリザル腎細胞を通過させて無毒化変異株を得た。この株と，近縁フラビウイルスの無毒株（17D黄熱ワクチン株あるいはLangatE5株）とを組み合

上記の研究では，その出発材料はいずれもマウス脳通過を経たウイルスであった。従って，マウス通過世代数の多少にかかわらず，神経毒性の発現や他種ウイルス迷入の可

わせて1連続免疫処理（sequential

proce−

能性は，、不可避ではないかという異論が起り得た。よって，

dure）を施すと，はなはだ優秀な免疫効果が得られると報告した。実験動物としては，各種のサル，すなわちspider

患者血液から出発して細胞培養に直接伝達して，変異株ウイルスを得ようとする研究が行われた。

monkey（ノ46」6s8

s6勿zo％s），cynomolgus

immunization

8ゆo亜），squirrel

monkey（S召枷加monkey（〃．ρh乞1吻初8πs歪s），rhe一「第二次世界大戦中および大戦後」になされた抗デング・ワクチン研究のまとめ

表3（II）：生ワクチンの研究

マウス脳通過無毒化ウイルスおよびその組織培養伝達ウイルスを用いた「生ワクチン」の効果判定
実験

材料

感染マウス脳乳剤

ウイルスの型評価方法と効果（1）1

ヒトC（十），S（十）文献木村，堀田（1944d）
堀田（1947b，c）

感染マウス脳乳剤1

ヒトC（十），S（十）Hotta（1952，1969）

Sabin

and

Schlesinger（1945）

Sabin（1950，1952，1955）

感染マウス脳乳剤21

ヒトS（＋）

Schlesinger6渉o乙

ヒトF（＋）

Wissemanαα乙（1963）
Wisseman（1966）（1956）（2）

Bellantiαα乙（1966）

細胞培養液

1

マウスC（＋）

Hotta（1957）

サル（〃iα侃o鰐吻認α枷サルS（＋）

Hottaα認（1966）または〃．血soα劾s）

ヒトS（＋）

腎初代培養

細胞培養液

1

ヒトS（＋）

Fujita4σ乙

サル（〃1．吻鰯α枷）腎またはイヌ腎初代培養（1）

C（Challengeγ：強毒ウイルスの攻撃に対する感染防御。
S（Serology）：抗デング抗体の産生（中和抗体，赤血球凝集抑制抗体）。
F（Field）：野外において流行を抑制。

（2）

17D黄熱ワクチンとの混合免疫例を含む。

（1969，1972）（2）

403

C．b．1．

消失などを参考条件としている。DENVの4種の血清型のWalterReed陸軍医学研究所，CDC，ハワイ大学，メリーランド大学，コロラド州立大学などを含めたアメリカ・グ
ループは，上記の線に沿った広範な研究を進めた（Eckels（tetravalentvaccine）の作製を目指している（Yoksan6！

すべてについて変異株を追求し，4価ワクチン

α81．，1976，1980，19841Scott6！o：1．，1980，1983；Bancroft

α1．，1986；Bhamarapravati6！召1．，1987；Bhamarapravati
and Yoksan，1989，1990；Yoksan and Bhamarapravati，
1990；Bhamarapravati and Yoksan，1993；Vaughn6齢1．，αα1．，1982a，b，1984；Miller6緬1．，1982；Halstead6∫α1，，1996）。

1981，1984a−d；Imis6印1．，1988；Marchette6厩1．，1990；

この場合にも，変異株を接種された被検者に，軽度ながら発熱，白血球減少症などのDEN症状が観察された。しかHokeαα1．，1990；Schoepp6孟α1．，1991；Edelman6渉α1，，1994）。

培養細胞としては，アフリカミドリザル腎，ビーグル犬腎の初代培養，rhesus monkey胎児肺細胞（diploid株）などが用いられた。これに患者血液が接種され，継代実験が行われた。変異株ウイルス選択に当たってはts，小型プラク形成（smallplaquefomation）（lmis6∫α1．，1988）を主要なマーカーとし，その他に，ヒト単核球培養における増殖の可否（Halstead6砲1．，1981），被接種サルにおける50％感染価（ID5。）の減少，及びそのviremia出現の有無（lmis6！α1．，1988），媒介蚊（・46．α6脚劾体内での増殖の有無（Millerθ！α1．，1982），などが参考にされた。

最終的にはヒトに接種されて，DEN症状発現の有無，抗体産生の状況が調べられた。また，黄熱17Dワクチンとの混合免疫（combined immmization）も併せ試みられた。
被検者は，陸軍兵士を含め全員健康成人であった。すべての実験において，プラセボ接種対照群を置き，二重盲検方式を採用している。

上記マーカーに適合したと見なされる変異株ウイルスが，いくつか得られた。これを被検者に接種（多くの場合，皮下注射）してみると，いずれも良好な抗体産生をひき起こした。この場合，DEN・黄熱併用免疫群の抗体産生度が，DEN単独免疫群のそれよりも優れていることが証明された。これは，前述のPrice8∫α1．の成績（C．a2．の項参照）と軌を一にするものであろう。

しかし，被検者において「ワクチン」接種後に軽度ではあるが，DEN症状（発熱，発疹，白血球減少等）を発する
ものが観察された。変異株ウイルス自体は，これをマウスに「戻し接種」すると，比較的容易に親株への復帰（rever−sion）を来した例があった。

このように，なお解決の困難な問題点が横たわっているが，研究の着眼点そのものは，現在のウイルス学からみて決して誤っていないので，さらに検討を進めて，成功に到し彼らは，この程度の副作用は臨床上許容し得るもの（to1−erable）と見なし，「ワクチン」使用に対し致命的な欠陥にはならないと主張している。この立場に立って，タイ政府の認可の下にこれをタイの小児に与え，現在Phase IIない
しPhase IIIの実験が進められつつある由である。野外でも充分に有効，かつ無害であるか否かの最終的結論には，しばらく時日を仮す必要があるであろう。
上に述べた細胞培養通過による変異株ウイルス獲得の試みは，表4にまとめられる。

DENワクチン研究の歴史の小括
以上DENワクチン研究の流れを，かなり古くに湖って概観した。このように，DENワクチンはかなり長い研究の歴史を有するにかかわらず，現在なお実用化の段階には至っていない。ウイルス疾患のワクチンについては，種痘や狂犬病ワクチンのごとき歴史的な成果に引き続いて，既にいくつかの成功例が示されている。特に第二次世界大戦後において，ポリオ，麻疹，風疹などの生ワクチンが世界的な規模で実用化されており，死ワクチンとしても，B型
肝炎，日本脳炎に対するそれが国際的な評価を得て適用範囲が広まりつつある。このように見てくると，DENの流行が世界的に拡大しつつある現状にもかかわらず，ワクチンが今なお完成の域に達しないことは，誠に残念と言うほかない。タイ国での試みが希望を持たしめられるが，その完成には，なおしばらくの時を要すると予想されるg

このように，DENワクチンの開発には大きな困難が立
ちはだかっているが，しかしそれにはそれなりの理由があるのであって，以下にその問題点のいくつかを列挙して見たいと思う。

DENワクチン開発の問題点達することを望みたい。

（1）まず，本質的な問題点として，DENVには4種のC．b．2．

タイ国のNatthBhamarapravatiのグループは，アメリ
カ・グループの一部の協力を得て、上記と同様の発想に基づいて変異株ウイルスの獲得を試みた。培養細胞にはアフ
リカミドリザル腎，あるいはイヌ腎の初代培養が用いられ，変異株選択の主要マーカーとしてtsとsmall plaqueを採用し，その他に，マウス神経毒性の低下，サルviremiaの異った型（1−4型）が存在する事実がある。これらの型は相互にcross−seroreactiveであるが，non−cross−im−
mmogenicであると言われる。すなわち，各型のウイルス
は血清反応の上では交差するけれども，感染防御の上では無関係である。従って，ある型のDENに感染して回復しても，感染防御はその型に対してのみ成立し，他の型には及ばない。実際臨床的に，同一個体がDENの複数回感染を被ることは古くから観察されており，そのために，DENには

404

表4

細胞培養通過によるデング・ウイルス変異株獲得の試みとその効果判定実験

出発材料

使用細胞

文

感染マウス脳乳剤

KB細胞

Beasley召渉

z乙献（1960，1964）（未変異ウイルス）

感染マウス脳乳剤（未変異ウイルス）

アフリカミドリザル腎
初代培養

Priceαα乙（1973a，b，1974）（1）

感染マウス脳乳剤（未変異ウイルス）

ハ4スター腎初代培養

Tarr

Lubiniecki（1975，1976）（2）

患者血清

アフリカミドリザル腎ま Eckels6渉磁（1976，1980，1984）
たはビーグル犬腎の初代、Scott6∫磁（1980，1983）

and培養，またはrhesus Bancroftα砿（1982a，b，1984）
monkey胎児肺細胞（di−Halsteadα磁（1984a−d）
ploid株）その他本文中に引用の文献参照
患者血清

アフリカミドリザル腎またはイヌ腎の初代培養

Bhamarapravati6砲乙（1987）
Yoksan and Bhamarapravati（1990）
Bhamarapravati and Yoksan（1993）

その他本文中に引用の文献参照（註）（1）黄熱ワクチン，その他数種のフラビウイルス変異株との組合せ免疫。
（2）変異の促進を企図するため，細胞培養液に5−azacytidineが添加された。

感染後免疫が成立しないのではないかとの説が，一時信じられたほどであった。要するに，DENワクチンには4種類を揃えねばならないが，これは実際上は必ずしも容易なこ実用化されているDEN以外のウイルスワクチンには，この恐れは実際上無いようであるが，DENの4価ワクチンとではない。

められる。ちなみに，DENに近縁のYFについては既に17Dワクチンがあるが，その効果は少なくとも6年間持続すると言われている（Dick andSmithbum，1949）。YFVが単一血清型であることと併せて，YFの予防接種は比較的困難度が少ないと考えられ，また事実そうであったわけで（2）次に，DENにはimmmeenhancementという特異な事象が著明に認められる。例えば，1型DENに感染回復
した後に2型の感染を受けると，その症状が初感染のそれよりも重くなるという例が少なからず起こる。DENの重症型である「デング出血熱・ショック症候群」（DHF／DSS）
は，初感染例よりも二次感染例に多く見られるという臨床疫学的事実が，その裏付けの一つとなっている。1981年のキューバでの流行で，この現象が顕著に観察されたと言われている。

このことは，実験的にも証明される。例えば，2型DENVを感染させた細胞培養に抗1型血清，あるいは，中和反応を示さない程度の濃度にまで希釈された（subneutraliz−ing）抗2型血清を加えると，2型ウイルスの産生が増大するという事実が認められる。この点から推理すると，一つの型のワクチンのみを与えて，それに対する抗体が産生された後に，他の型のウイルスの感染を被ると，かえって重篤な症状を発する恐れがあるということになる。従って，

DENワクチンは必ず4種の型の全部を包含する4価ワク
チン，しかもどの型に対しても，充分強力な防御能を与え得るものでなければならないと言うことになる。
この問題に関連して，いわゆるbooster injectionについても，考慮されねばならない。仮に優秀なワクチンが作られたとしても，多分何年か後には免疫の低下が避けられず，
従ってboosterが必要となるであろう。その場合，前回注射
によってなお残存する抗体が（たとえ少量であっても），第2回目に与えられたウイルスと反応して，一種のショック症状をひき起こす可能性は充分あり得ることである。現在については果してどうであろうか，真剣な考慮と対応が求ある。

（3）更に，有効無害な変異株DENVの獲得が困難な根本的原因の一つに，DENVには確実な「毒力マーカー」（virulencemarker）が知られていないという事実がある。

例えば，tsマーカーはポリオウイルスについてはSabin
and Lwoff（1959）以来確認されているが，DENVについては，必ずしも確定されたとは称し難いようである。その他，small plaqueマーカーやヒトリンパ球培養における増殖の有無，サルにおけるviremiaなども提唱されているが，それらの確実性に対しては，若干の疑問を呈する研究者もある（McKee召地1．，1987；Schoepp6！α1．，1991）。また，これらのマーカーに基づいて変異したと見なされた
DENVも，比較的容易に逆変異を起こして親株に復帰することなども知られている。DENVの基礎的性状や複製過程には，ポリオウイルスなどとは異なった，特有の事象が存在するのかも知れない。DENVの毒力マーカーについて
は，更に基礎的な諸問題に立ち帰って，根本的に究明することが必要と考えられる。
（4）もう一一っ重要な点は，DEN感染，特にその重症型であるDHF／DSSに関して厳密な意味での「動物実験モデル」が存在しないことがある。マウスが脳内注射によりDENVに感染するが，その病理学的本態はヒトのDENな
いしDHF／DSSのモデルにはなり難い。いくつかの新しい405

試みがなされているが（例えば，ヒトの遣伝子を組み込んだtransgenic miceの利用），現在のところ完全なものとは考え難い。以上のことが，DENワクチンの開発，DENのpathogenesisの解明などに，大きなネックとなっているのである。

今後の方策の若干
上記の問題点をふまえて，今後取るべき，ないし取る可能性のある方策のいくつかを考察してみたい。
（1）上に述べた問題点は，常に念頭に置くべき案件であろう。ただし，それらはウイルス学的に極めて基本的な事項であるから，早急には解決に向い得ないものかも知れない。従って，次善策とでも言うべきか，ベストでな．くても，ベターな方策を探るのも一つの道であろうと思われる。それには，次のような事項が考えられるかも知れない。
（2）ウイルスの細胞培養を継続して，変異株を獲得しようとする場合，屡々経験されることは，継代数の少ない世代ではなおヒト感染性が保持され，継代数を重ねるにつれて次第に弱毒化が進む。しかし，ある程度以上に継代されると，ヒト病原性は消失するが，同時に免疫原性（「生ワクチン」の場合は，ごく軽度のヒト感染性）も無くなるという事実がある。言い換えれば，ワクチン材料として，最適の継代数が定まっているように思える。Edelman6！α1．

起こすことによって免疫効果を得ようとするものであるから，ウイルスの感染性と免疫原性との微妙な兼ね合いを，細菌菌体成分，その他特殊な生物活性物質によって刺激促進させて，免疫効果の増大を図るという可能性は，一考に価するのではないかと考えられる。
（5）筆者の独断を許していただけるならば，少なくともDENに関する限り，細胞培養によるよりも，マウス脳通過によって比較的容易かつ確実に弱毒変異株が得られるような印象を受ける。ただし，これに対しては，前述したごと
くウイルスの神経毒性（neurovirulence）の発現について根本的な抵抗感がある。しかし，何らかの手段によって，特に最近の遺伝子工学的方法によって，神経毒性だけを除去することが出来ないであろうか。
Despres6！α1．（1993）は。46．ρs6偏oso漉伽魏AP61株

細胞に培養されたDENV−1にっいて，lowpH処理によって2種のmutants（BR／90とFGA／89）を作り，薗者を比較して下記の差異を認めた。（i）BP／goはAP61に強い
CPEを来たすが，FGA／89はほとんどCPEを示さない。しかし細胞当たりのウイルス産生量は，FGA／89がBR／90よりも多量である。（ii）mouse−neurovirulenceは，BR／90は極めて強いが，FGA／89は弱い。（iii）Esequenceにおいて，E96（hydrophobic domain）がBR／90はPhe，FGA／
89はVa1，E379（conserved

region）力書BR／90はVal，FGA／

89は11eとなっている。

（1994）は，イヌ腎初代培養において1型DENVのある株

Guirakhoo窃α1．（1993）は，DENV−2とノ16．α1ゐoφJo劾sでは，約20代前後が最適ではないかと述べている。むろん，
これは細胞の種類，ウイルスの株の如何によって異なるであろうが，着眼すべき一つの点であろうと考えられる。
（3）現在，多くの研究者の目は，もっぱら「生ワクチン」の作製に向けられている。しかし，「死ワクチン」についても，全く考慮の余地はないのであろうか。日本脳炎の「死ワクチン」の有効性が認められている以上，それに倣った方式を試みるのも，一つの方策ではなかろうか。「死ワクチン」ならば，4価ワクチンも比較的無理なく作製出来るように思われる。むろん，その技術と費用は，日脳ワクチンに比べて格段に複雑・高価となるであろう。従って，広く一般向きではないかも知れない。しかし特殊な必要に迫られた人たち（例えば，侵淫地での長期滞在者）への適用などは，考慮されてよいのではなかろうか。もっとも，このC6／36株細胞の組合せについて，酸性pH処理による
mutant（AM）と塩化アンモニウム処理によるmutant

1168（G→A），E390（Asp→Asn）でmouse−neurovirulen−
ceが弱く，これに対し1arge plaque株は1168（G→C），
E390（Asp→His）でmouse−neurovirulenceが強いことが場合にもimmune

示された。

enhancementの問題は，避けて通れないであろう。

（4）免疫原性の比較的弱い変異株については，adjuvantの利用を考慮することも一方法であろうと考えられる。

DENではないが，黄熱にっいては，Ambrosch

6孟α1．

（1994）は，17D株ワクチンとSα1窺on召磁あψ雇のVi−
polysaccharideとのcombined vaccinationが，良好な黄熱抗体の産生をもたらすと述べている。DENVにも，試みられる価値があるように思われる。

（FM）を選択し，両者と親ウイルスとの差異を比較したところ，（i）AMではE153（Asn→Asp），（ii）FMではE6（11e→Met），E134（Asn→Ser），E153（Asn→Tyr）の変異を認めた。ただし，neurovirulenceとの関係は述べられていない。

SanchezandRuiz（1996）は，DENV−2メキシコ株に関して，次の所見を得ている。Nucleotide1168の変化がE390のアミノ酸の変化をもたらし，さような株からplaquesize

でvariantを分けると，small

plaque株はnucleotide

ちなみに，現行の黄熱ワクチン17D株は脳内接種によりマウスを艶し得るので，その意味でneurovirulentである

が，Rymanαgl．（1997）は，17D親株よりいくつかの
variantを作ってそのneurovirulenceを解析した。それによると，（i）variant17D（一wt）はマウス脳内感染値が著明に低下しているが，それはE240（Ala→Va1）の変異を来していること，（ii）一方，17D（＋wt）は親株と変わらな

ちなみに，ある種の細菌菌体成分によってmonocyte／
macrophage系の細胞の活性が，著明に増進することが既いneurovirulenceをもち，E173（Thr→11e）の変異を示し，同時に，wild−typeのAsibi株ウイルスにspecificな
nucleotide（17Dワクチン株はこれを有していない）を回復に知られている。元来生ワクチンは，「軽度の感染」をひきしていること，などが示された。

406

これらの事象が，一般的なものであるか否かは今後の検討にまたねばならないが，比較的簡単な処理によってEの変化を来し，それがウイルスの毒力の変異につらなるという可能性は，さらに追求すべき課題と考えられる（Neur・
ovirulenceの問題は，後述の「新世代ワクチン」に関連して再論する）。

（6）ここにおいて，最近の分子生物学，遺伝子工学の技術を用いて，いわゆる「新世代ワクチン」（newgeneration

一方，DNAのplasmidを直接利用することも試みられている。これは，免疫誘導機構の点からは，組換えウイル
スのそれと同じである。また，synthetic peptideを作り，これによって，抗体を産生せしめ免疫を成立させようとす
る試みもなされている。これは，原理的には，遺伝子工学的技術によるものではないが，一つの新しい研究方向と言えるであろう。これらをも併せて，以下に記述することとする。

vaccine），ないし「第二世代ワクチン」（secondgeneration

vaccine）を作製しようとする試みがなされてきた。この種の研究は未だ発展途上の段階で，ワクチンとしての有用性に関し，確定的な結論を下すには至らないが，有望な将来性をもつことは否定出来ないであろう。よって次章以下において，今日までに挙げられた成果を紹介することとする。
（D）新世代ワクチン（new generation vaccine）ないし第二世代ワクチン（second generation vaccine）「新世代ワクチン」ないし「第二世代ワクチン」とは，広義には，従来と異なる新しい発想と手法によって作製されD．1．E．collを用いる方法

DENVのE

proteingeneとE601」の適当なgeneとを

fuseさせて，E oolづにウイルス特異的免疫原性物質を発現させることが出来る。

Fonsecaα81．（1991）は，1−4の各型DENVについて，

E proteinをcodeするgenomeの特定部位からcDNAを作り，適当なprimerを定め，これらとE6011の麺E

immunizationやmucosalimmunization）なども含まれる

fusionproteingeneを合わせることによって，型特異的抗原を産生させた。これらは，DENの各型抗体（たとえばマウス免疫腹水）と特異的に反応するので，診断用reagentsとして極めて有用であると主張した。しかし，動物に感染防御能を与える作用があるか否かについては，述べられてかも知れない。

いない。

たワクチンを意味する。これには，新しいadjuvantの開発，あるいは新しい投与方法の考案（たとえば，combined

一方，狭義には，最近の分子生物学，あるいは分子遺伝学の技術を応用して作られたワクチンを総称する。ここでは，狭義のものについて紹介する。そのようなワクチンは既に多種類の微生物について（ウイルスのみならず，細菌，
原虫なども含め）試みられている。しかし，そのすべてを網羅することは本論文の目的ではないので，DENVに関す

Tan6砲1、（1996）は，1型DENVの非構造蛋白NS5をE601」に発現させたと報告したが，その免疫学的活性についての検討はなされていない。

この点に関し，JEVについてであるが，Mason6渉α1．
（1987，1989）は，E60〃で発現させたfusionproteinはウ
イルスと結合する抗体を作るが，感染防御的な機能は有しる成果のみに限って記述することとする。（脚註）＊ないと述べている。一方，Srivastava召∫α1．（1991）は，

狭義の「新ワクチン」の要点を一言に言えば，DENV−
RNAのnucleotide sequenceの内の免疫機能をcodeする
部分を操作して，免疫原性物質を新しく作ろうとするものである。その目的のために，いくつかの具体的な技術があ同じくJEVに関して，E

geneとを併せ用いることによって，感染防御能を動物に与えることが可能であると主張している。これらの事項につる。

必要であろう。

proteingeneとNSI

protein

いては，JEVおよびDENVにっいて今後さらなる検討が誘導される免疫機構の相異によって2つのカテゴリーに大別される。（i）組換え蛋白を作り，それによって特異的抗体を産生させる手法と，（ii）組換えウイルス自体を作って，これをワクチンとして用いる手法である。前者は，Eoolづ，baculovirusを利用することが多く，後者は現在のところ，vaccinia virus（一部avipoxvirus）を利用する方法

binant proteinは，マウスにおいてIgG抗体を産生せしめ，
100×LD5。親ウイルスの脳内攻撃に対し，約80％の防御率を示したと報告した。これは，優秀な効果であると評価出が取られている。

来る。

Simmons6齢1．（1998）は，DENV−2envelopeのB

proteindomainアミノ酸298−400の部位と，E601歪のmaltosebindingprotein（MBP）とをfuseさせたrecom−（脚註）＊これらの問題について単行本が刊行されており，また，ニューヨーク科学アカデミーが，一連のシンポジウムを開催している。筆
者の手許にある若干の文献を以下に挙げるが，急速に進展する領域の記載として，いささか旧聞に属するものであるかも知れない。雑誌
Vaccineには，本問題に関する新しい成績が掲載されつつある。
Isaacson，R．E（ed．）（1992）：Recombinant DNA Vaccines，Rationale and Strategy，New York，Marcel Dekker．
Prokop，A、and Bajpai，RK（eds．）（1991）：Recombinant DNA Technology I．Ann．NY Acad．Sci．，646，1−386
Williams，」．C．，Goldenthal，K．L，Bums，D．L．and Lewis，B．P．Jr．（eds．）（1995）：Combined Vaccines and Simultaneous
Administration：Current Issues and Perspectives．Am．NY Acad．Sci．，754，1−404
AsenjoJA and Andrews，BA（eds．）（1996）：Recombinant DNA Biotechnology IIL The Integration of Biological andEngineering Sciences．Ann．NY Acad．Sci．，782，1−569

407

D．II．Baculovirusを用いる方法

おいて，chimeraを形成したことである。
以下論文の一々についての紹介を省き，筆者なりに理解

Baculovirus（Family励6％lo∂魏磁召）は節足動物由来のウイルスで，成熟粒子は12−30の異なったpeptideを有し，した要点を列記することとする。

核酸は90−160kbのdsDNAである。かような性状のため，遺伝子操作が比較的容易であるとされている。特に，蛋白をcodeするcDNAを作り，これをもってvaccinia

Species／1zπ09名の）hzozl〃わηz廊α

7z鋸6160ゆo砂h64zo∂〃z6s（AcMNPV，134kbp）が好んで供試され，昆虫細胞（1）DENV（主として4型）の構造蛋白，および非構造
virusrecombinantを得た。これを細胞に感染させると，構造蛋白および非構造蛋白（主としてNS1）が産生された。
（2）C，prM，E，NS1，NS2aをcodeするDNA sequenceを含むvacciniarecombinantは，マウスに親株DENVの助040φ齢π〃％g卿7磁（Sf9）で増殖させられる。

上述のE601づの場合と同じく，DENVの構造蛋白ある

脳内攻撃に対する感染防御能を与えた。

いは非構造蛋白をcodeするcDNAとAcMNPVの特定非構造蛋白NS1／NS2aを含むrecombinantは，マウスのgenomeを合わせ，これをSf9細胞で増殖させることにzl．（1993）；Feighny6渉α1．（1994）；Eckelsαα1．

において抗NS1抗体を産生しめた。
（3）解析を進めた結果，C−termimsを欠いた部位を発現するrecombinantが免疫学的に，より有効であることが判明した。すなわち，E sequenceの最初の392のアミノ酸が重要であり，79％まで短縮されたもの（79％E）が，抗体産生およびマウス感染防御の上で，より良好な成績をもたらすと述べている。ちなみに，彼ら（Jan召砲1．，1993）は（1994）；Bielefeldt−Ohmann6孟α1．（1997）；Staropoli

JEVについても，C−terminusを欠いたrecombinantの免αα1．（1997）．

疫的効果が，よりすぐれていることを示した。
（4）彼らの研究で興味ある点は，異なった種類のウイル

よって，特異的免疫原性物質の産生を目指すのである。
かような原理に基づいてなされた研究の代表的なものを，ほぼ発表年代順に挙げて見ると次のごとくとなる。
Zhangαzl．（1988）；Lai6孟

zl．（1989）；Lai6孟zl。

（1990）；Deubel召渉α1．（1991）；Putnak6渉α1．（1991）；

Quα

また，Despres6！α1．（1991）は，黄熱ウイルス（YFV）
について同様な研究を報告している。

いずれの成績においても，培養Sf9細胞よりDENV特
異的蛋白が分泌され，これを動物に与えると特異的抗体が産生され，あるいは親ウイルス（強毒）の攻撃に対する感染防御能をひき起こすことが示された。この場合も，構造蛋白（E）と非構造蛋白（NS1）を同時に用いた成績が，よ
り有効のように考えられる。また，Bielefeldt−Ohmann（1997）は，DENV−2とDENV−3のhybrid envelope pro−teinの産生が可能であると述べている。これは，後述する

chimeravirus作製の試みと同じく，究極的にはスの間でchimeraを作製したことであろう。すなわち，（Dl／D4，D2／D4の間），およびDENVとtick−bome encephalitis virus（TBEV）との問のchimeraなどを作り，その免疫学的性

intratypic（D4の間），intertypic状，並びにneurovirulenceを調べた。
（i）まずD4にっいて，neurovirulent（nv）株とnon−neurovirulent（non−nv）株との問でchimeraを作ると，Ser（156）→Proはnon−nv，Thr（155）→Ileはnv，Phe（401）→Leuは両者の中問であることなどが示された。つ
まり，Eのこれらの部分がneurovirulenceを支配するのでpolyvalentなワクチンの製造を目指すもので，今後の進展あろうと述べている。

が望まれるところである。

（ii）D4の非構造蛋白と，D1（C−prM−E）あるいはD2（prM−E）のおのおのとのchimeraを作り，これらをrhe−
susサルに皮下注射してみると，D1／D4chimeraを与えら

D．III．Vaccinia

れたサルは抗D1抗体を，D2／D4chimeraを与えられたサ
ルは抗D4抗体をそれぞれ産生した。D1／D4とD2／D4の混合物を与えると，抗D1，抗D2の両方の抗体が産生されVaccinia

virusを用いる方法

virusも大型であって，遺伝子操作が比較的容易である。しかも元来生ワクチンの素材であるから，
recombinant virusをそのまま生体に与えることが可能という利点がある。Recombinant作製の技術的原理は，上述のbaculovirusの場合と同様である。
アメリカのLai一派は，recombinant vaccinia vims／
DENVに関して一連の広範な研究を展開した。Zhao6厩1．
（1987a，b）；Bray6孟α1．（1989a，b）；Falgout6渉α1．（1990）；

Men6齢1．（1991）；Bray（1992）；Pletnev

αandLai（1991a，b）；BrayandLai

α1．（1992）；Pletnev

αzl．（1993）；

Kawano8∫α1．（1993）；Chenαα1．（1995）；Brayαα1．
（1996）；Pletnev

andMen（1998）。

彼らの研究の特色の一つは，DENVの異なったウイルス
間，または，DENVと異なった種類のアルボウイルス間にた。いずれの場合も，おのおのの親株ウイルスの攻撃に対し，サルは一定度の感染防御（viremiaの抑制）を示した。

（iii）DENV−4とTBEVのM／Eをcodeする部位とのchimeraを作製したが，それは下記のごとき性状を示した。

（a）TBE／D4chimeraは，サル腎細胞培養においてTBE
親ウイルスよりもより高値の増殖を示し，大きなplaqueを作る。しかし蚊細胞培養での増殖は，制限されている。
（b）Chimeraウイルスは，wild−typeTBEと異なり，マウスのperiphera1感染（皮内または腹腔内注射による）で脳炎をひき起こさないが（ただし脳内注射によってはマウスを驚し得る），その後の強毒TBEVの攻撃に対して防御を与える。このことは，弱毒TBEワクチンの可能性を示唆する

408

ものである。（c）同様の成績が，Langat（LGT）ウイルスにと，マウスにおいて一層良好な免疫効果がもたらされた（後ついても得られた。すなわち，LGT（prM−E）／DEN4
chimeraはLGT親株ウイルスに比べてmouse−neurovir−

述ulenceは低下しているが，これを腹腔内注射されたマウス

は抗LGT中和抗体を産生し，親株ウイルスの攻撃に対し抵抗を示した。

同様な研究が，他のグループによってもなされている。

DNA

vaccine［plasmid

vaccine］の部を参照のこと）。

（5）これらrecombinantまたは粒子成分は，マウスおよびヒトに接種されると，cytotoxic T lymphocyte（CTL）
を誘導し，それはCD8＋CD4−typeであることが示された乙細胞性免疫の誘発は，ワクチンの効果を考える上で極めて重要な点であり，今後この種の知見はDENVにおいても早くHahn6！召1．（1990）は，DENV−2のprM／Mを含む蓄積される必要がある。

vacciniavirus recombinantを作り，これを与えられたマ
ウスは抗体（中和）を産生したこと，また，同じ実験を黄熱ウイルス（YFV）17D株について行ったところ，その場

なお，彼らは黄熱ウイルスについてもvaccinia recom−
binantを作製し，その免疫的効果を検討している（Pincus
6！41．，1992）。

合の抗体産生効率はDENVのそれよりも低かったなどと

また，Sato6！α1．（1993）もvaccinia／JEのrecombinant

報告した。Fonseca6∫α1．（1994）も，DENV−1のprM／について研究し，JEVのprM／Eを発現するrecombinant
は，感染組織培養細胞にJEV−E蛋白を作らしめてこれを細胞外に放出すること，この場合培養細胞にDENV−2を

Mを含むvaccinia vims recombinantがマウスに抗DEN抗体産生をひき起こすこと，およびこれにっいてDENVのC−geneは不要であることなどを示した。

このように，vaccinia virus／DENV recombinantを作
り，あるいは異なったウイルス間のchimeraを作って，その免疫原性やneurovimlenceなどを追求解析することが

予め感染させておくと，JEV−E蛋白の細胞外放出が増大すること，および，そのようなE蛋白放出の増大は，NS2bおよびNS3を併せ発現するrecombinantによってももたらされること，などを報告している。

可能となったわけである。

この種の研究は，DENVと同じくF伽魏7％sに属する

以上の要約

日本脳炎ウイルス（JEV）についても盛んに行われている。

それらのデータはDENVに対しても有用であると考えられるので，ここに併せ紹介することとする。

エール大学と神戸大学との共同研究において，Mason
and Konishiおよび共同研究者は，vaccinia／JE recom・
binantにっいて一連の広範な研究を遂行した。その成績の要点を，再び筆者の理解に基づいて列挙してみると，下記のごとくになる。まず，発表論文は次の通りである。Masonασ1。（1991）；Konishiαα1．（1991）；Konishi6渉α1．（1992）；

Konishiθα1．（1994）；Konishi6！81．（1997a）；Konishi6孟

σ1．（1997b）；Konishi6！θ1．（1998a）。なお，彼ら（Pincus

8厩1．，1992）は黄熱ウイルス（YFV）についても，同様の検討成績を発表している。

（1）JEV／vacciniarecombinantは，prM−E−NS1を発現してM−Eを含む粒子成分（hemagglutinin作用をもっ）
を細胞外に放出し，これはマウスに特異抗体（中和並びに赤血球凝集抑制）を産生せしめると共に，親株ウイルスに対する感染防御効果をもたらした。非構造蛋白NSlを発現するrecombinantも免疫的効果をもたらすが，その程度

上に述べた研究の基本的発想を改めて要約すると，次のごとくなるであろう。DENV（またはJEV）の核酸（RNA）の，免疫に関与する特定部位を含むcDNAを作り，（i）これをE oolづやbaculovirusの核酸に組み込んで，組換え蛋
白としての特異的抗体を誘導せしめて免疫を成立させたり，（ii）あるいは，vaccinia vimsを用いて組換えウイルスを作り，これによって抗体産生の他に，cytotoxic
lymphocyteの誘導を図ったり，または（iii）異なったウイ
ルス問のchimeraを作って，より毒性の低いウイルス株を産出し，究極的にはpolyvalentなワクチンの創製をも，企図しようとするものである。
免疫に関する特定部位としては，prM，E，NSlが重要であることに見解が一致している。この点に関し，早くKauf−man6渉召1．（1987，1989）がmonoclona1抗体によって，

DENVのprMおよびEが感染防御に必要な因子であることを明らかにし，また，Hencha16！α1．（1988）は同じく
NS1が不可欠であることを示した。それ以後の多くの研究は，いずれもこの点に関しては一致した成績を得ている。

はprM／Eのrecombinantよりも弱度であった。
（2）prM／E，NS1を発現するrecombinantは，JEV感
染ブタのviremiaを阻止した。その意味で，JEの流行に対する抑止効果を期待することが出来る。
（3）vaccinia

virusと平行して，avipox

virusに属する

canarypox vimsを用いた実験が行われた。JEVのprM−
E−NS1，あるいはprM−Eを発現するavipoxrecombinant

D．W．その他の方法
上記の他にも，新しい試みがなされつつある。
（a）

DNA

vaccine（plasmid

vaccine）

は，いずれもマウスに抗体産生能と感染防御能を賦与した。

（4）上記のごときJE／poxvirus recombinantをHeLa細胞に感染せしめると，免疫原性を有する粒子成分が産生分泌される。これと，prM／E recombinantとを併用する

前述したように，これによる免疫誘導機構は，原理的には組換えウイルス（たとえばvaccinia／DEN recombinantvirUS）によるそれと類似であるが，いわばより直接的に免409

疫効果を得ようとするものであると言える。
KochelとPorterおよびその共同研究者（Koche16厩1．，
1997；Porter召齢1．，1998）はDENV−2を用いて，そのprMとEの92％をcodeするcDNAをベクターに組み込み，
plasmidを作った。これをマウスに皮内注射すると，被投与マウスの全例において抗DEN抗体（中和）の産生を見た。
しかし，これだけではマウスに感染防御を与えることが出来なかったが，これにCpGmotifを含むpUCl9を加えてマウスに与えると，抗体産生をより増強させると共に，親株ウイルスの攻撃に対する感染防御をも，成立せしめたと述べている。

JEVにっいてKonishi6！α1．（1998b）は，prM／Eを含
むplasmidを作製，それがマウスに抗JE抗体（中和）の産生と感染防御をもたらすことを示した。また，免疫マウスの脾組織から，JE特異的のcytotoxicTlymphocyte（CTL／CD8＋）が検出され，その持続は約6カ月に及んだと述べている。彼らは，既にvaccinia／JErecombinantによるCTL（CD8＋CD4一）の産生を報告している（Konishi6孟

おわりにDENワクチンについて，ほぼ80年に亙る研究の歴史の流れを辿ってみた。初期の，専ら人体材料のみに依存していた，いわば揺藍期の研究から，ウイルスのマウスあるいは培養細胞への伝達，それによる人体無毒化ないし弱毒化
ウイルス株の選択，それを材料としたワクチン開発の研究を経て，現在の分子遺伝学的解析に至るまでの道筋である。
おのおのの研究は，それぞれの段階において必然的な意義を持つものである。さような意味において，それらは，ウ
イルス学自体の発展の姿を，そのまま映し出していると言えるであろう。来世紀は，DENワクチンにとっても，文字通り新しい世紀になるであろうと思われる。本論文が，今後DENワクチンの研究に携わられる方々，特に若い研究者諸氏に何らかの参考になり得るならば，筆者の喜びこれに過ぎるものはない。

謝

辞α1．，1997a，b）。ワクチン接種による細胞免疫増強効果は，

ちなみにDEN感染に伴うリンパ球の動態については，

五十嵐章教授（長崎大学熱帯医学研究所），小西英二博士（神戸大学医学部保健学科）は草稿をお目通しの上，貴重な倉根（一郎）及び共同研究者による一連の広範な研究があるが，本論文ではそれへの言及は割愛することとする。

御助言を賜った。原稿の整理には児島利香さん，小澤牧人
君（神戸大学医学部学生）の援助を頂いた。これらの方々

今後さらに検討を進めるべき重要課題である。

に対し，深甚の謝意を表します。
（b）

Synthetic

Peptide

参考Markoff6！π1．（1988）はDENV−4を用いて，そのenvelope glycoproteinをcodeするsequenceに基づき，38箇のpeptide（おのおのは15箇のアミノ酸より成る）を作った。その内，9箇のpeptideは抗DEN抗体（マウス免疫腹水）に結合し，さらにその内の8箇のpeptideは，DEN
回復患者血清の少なくとも50％に反応したと報告している。
しかし，感染防御効果については述べられていない。

「新世代ワクチン」研究の小括
以上，「新世代ワクチン」に関する最近の研究を，概観した。新しい考え方と技術に基づいて進められるこの種の研究は，魅力的であり，新しい希望をもたらすものであろう。

特に現時点でなお確実有効なワクチンを有しないDENについては，一層その感が強い。ただし，希望を現実とする
ことは，必ずしも容易な道程ではない。前章に述べたいく

文献1）Ambrosch，F．，Fritzell，B．，Gregor，J．，Jonas，S．，Kollarits−ch，H．，Teulieres，L．and

Wiedermam，G．（1994）：Com−
bined vaccination against yellow fever and typhoid
fever：a comparative triaL Vaccine，12，625−6282）Ashbum，P．M．and Craig，C．F．（1907）：Experimental
investigations

regardingthe

etiologyofdenguefever．J．

Infect．Dis．，4，440−475

3）Bancroft，W．H．，Top，EH，Jr．，Eckels，K．H、，A阜derson，」．H．，Jr．，McCown，」．M．and Russell P．K．（1982a）：

Dengue−2vaccine：virologica1，immunological，andclini−calresponsesofsixyellow

fever−immune

recipients．

Infect．Immun．，31，698−703
4）Bancroft，W．H．，Scott，R．McN．，Brandt，W．E．，McCown，J．M．，Eckels，K．H．，Hayes，D．E．，Gould，D．」．and

Russell，P．K．（1982b）： Dengue−2vaccine：infection of∠L648s
αθgゆあmosquitoes by feeding on vifemic recipients．

Am．」．Trop．Med．Hyg．，31，1229−1231

つかの問題点，例えば，immuneenhancementの解決，毒5）Bancroft，W．H．，Scott，R．McN．，Eckels，K．H．，Hoke，C．

力マーカーの確立，動物実験モデルの作製などは，そのま
ま新ワクチンにも当てはまることである。
ただ，neurovirulenceなど副作用の若干点については，
遺伝子工学的手法による解決の曙光が，かすかながら見えてきたように思われる。最終的には，人体に適用して無害性・有効性を確める必要のあることは，言うまでもない。

H．，Jr．，Simms，T．E．，Jesrani，K．D．T．，Summers，P．L，Dubois，D．R．，Tsoulos，D．and

Denguevims

munogenicity

Russe11，P．K．（1984）：

type2vaccine：reactogenicity

in6）Beasley，A．R．，Lichter，W．and
Studiesgue

onlatentandim−soldiers．」．Infect．Dis．，149，1005−1010

Sige1，M．M（1960）：

infectionsoftissuevims．1．Characteristics

of

the

Virusforsch．，10，672−683

cultures

with

den−

system．Arch．f．ges．

4107 ) Beasley, A.R., Wellings. F.M., Sigel, M.M. and Williams,
J.A. (1964): Studies on latent infections of tissue cul‑tures with dengue virus. II. Alterations in the virus.
Arch. f. ges. Virusforsch., 14, 411‑421
8 ) Bellanti, J.A., Bourke, A.T.C.. Buescher, E.L., Cadigan,
F.C., Cole, G.A., Banawi, Y.E.L., Hatgi, J.N., McCown, J.
M., Negron, H., Ordonez, J.V., Scheider, F.G.. Smith, T.,
Warram, J.H. and Wisseman, C.L., Jr. (1966): Report ofdengue vaccine field trial in the Caribbean, 1963: acollaborative study. Bull. WHO., 35, 93
9 ) Bharnarapravati, N., Yoksan, S., Chayaniyayothin, T.,

Angsubphakorn. S. and Btmyaratvej, A. (1987): Immu‑

brane and membrane proteins elicit a protective irnmune
response. Virology, 185, 505‑508
21) Bray, M. and Lai. C.‑J. (1992): Construction and charac‑terization of chimeric dengue viruses. Vaccine 92, Cold

Spring Harbor Laboratory, pp. 271‑276

22) Bray, M., Men, R. and Lai, C.‑J. (1996) : Monkeys
immunized with intertypic chirneric dengue viruses areprotected against wild‑type virus challenge. J. Virol.,70, 4162‑41662･3) Chen, W., Kawano, H., Men, R., Clark, D. and Lai. C.‑J.

(1995): Construction of intertypic chimeric dengue

nization with a live attenuated dengue‑2 virus candidate

viruses exhibiting type 3 antigenicity and neurovirulence
for mice. J. Virol, 69, 5186‑5190

vaccine (16681‑PDK53): clinical, immunological and24) Cleland, J.B.. Bradley, B. and McDonald, W. (1919):

biological responses in adult volunteers. Bull. WHO., 65,

Further experiments in the aetiology of dengue fever. J.
Hyg., 18, 217‑254

189‑195

10) Bhamarapravati, N. and Yoksan. S. (1989): Study ofbivalent dengue vaccine in volunteers. Lancet (i), 1077
11) Bhamarapravati, N. and Yoksan, S. (1990): The clinical
trial of trivalent dengue vaccine. Southeast Asian J.
Trop. Med. Publ. Health, 21, 709

25) Despr s, P., Dietrich, J., Girard. M. and Bouloy, M.
(1991): Recombinant baculoviruses expressing yellow
fever virus E and NSI proteins elicit protective immu‑
nity in mice. J. Gen. Virol., 72, 2811‑2816

26) Despr s, P., Frenkiel, M.‑P. and Deubel, V. (1993):

12) Bharnarapravati, N. and Yoksan, S. (1993): Immuniza‑tion in hurnans with live attenuated trivalent dengue
vaccine. Southeast Asian J. Trop. Med, Publ. Health

Differences between cell membrane fusion activities of
two dengue type‑1 isolates reflect modification of viralstructure. Virology, 196, 209‑219(Suppl. 1), pp. 246‑249
13) Bielefeldt‑Ohmann, H., Beasley, W.C., Fitzpatrick, D.R.

27) Deubel, V., Bordier, M., Megret, F.. Gentry, M.K.,
Schlesinger. J.J. and Girard, M. (1991): Processing,and Aaskov, J.G. (1997) : Analysis of a recombinantdengue‑2 virus‑dengue‑3 virus hybrid envelope protein
expressed in a secretory baculovirus system. J. Gen.

secretion, and immunoreactivity of carboxy terminallytruncated dengue‑2 virus envelope proteins expressed in
insect cells by recombinant baculoviruses. Virology,

Virol., 78, 2723‑2733

180, 442‑447

14) Blanc, G., Caminopetros, J., Dumas, J. and Saenz, A.
(1929a): Recherches exp rimentales sur la sensibilit28) Dick, G.W.A. and Smithburn, K.C. (1949): Immunity toyellow fever six years after vaccination. Am. J. Trop.

des singes inferieur au virus de la dengue. Compt. Rend.
Acad. Sci., 188, 468‑470
15) Blanc, G. and Caminopetros, J. (1929b) : Contribution
1' 6tude de la vaccination contre da dengue. Bull. Acad.
Nat. Med. (Paris) , 102, 37‑40

Med., 29, 57‑6129) Eckels, K.H., Brandt, W.E., Harrison, V.R., McCown, J.

16) Blanc, G. and Caminopetros, J. (1930): Recherches
exp6rimentales sur la dengue. Ann. l'Inst. Pasteur, 44,
367‑436
17) Bray, M., Zhao, B., Markoff, L., Eckels, K.H., Chanock,

R.M. and Lai, C.‑J. (1989a): Mice immunized withrecombinant vaccinia virus expressing dengue 4 virus
structural proteins with or without nonstructural protein
NSI are protected against fatal dengue virus encephali‑tis. J. Virol., 63, 2853‑2856
18) Bray, M., Falgout, B., Zhao, B., Markoff, L., Moss, B.,

Chanock, R.M. and Lai, C.‑J. (1989b) : Mice immunizedwith recornbinant vaccinia virus expressing dengue‑4
structural proteins and/or nonstructural protein NS1
are protected against fatal dengue encephalitis. Vac‑cine, 89, Cold Spring Harbor Laboratory, pp. 357‑362
19) Bray, M. and Lai, C.‑J. (199la): Construction of inter‑typic chimeric dengue viruses by substitution of struc‑tural protein genes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88,
10342‑ 10346
20) Bray, M. and Laj, C.‑J. (199lb) : Dengue virus premem‑

M. and Russell. P.K. (1976) : Isolation of a temperature‑sensitive dengue‑2 virus under conditions suitable for
vaccine development. Infect. Irnmun., 14, 1221‑1227
30) Eckels, K.H., Harrison, V.R., Summers, P.L. and Russell,

P.K. (1980): Dengue‑2 vaccine: preparation from asmall‑plaque virus clone. Infect. Immun., 27, 175‑18031) Eckels, K.H., Scott, R. McN., Bancroft, W.H., Brown, J.,
Dubois, D.R., Summers, P.L., Russell, P.K. and Halstead,
S.B. (1984): Selection of attenuated dengue 4 viruses byserial passage in primary kidney cells. V. Human
response to immunization with a candidate vaccine
prepared in fetal rhesus lung cells. Am. J. Trop. Med.
Hyg., 33, 684‑689
32) Eckels, K.H., Dubois, D.R., Summers, P.L., Schlesinger,
J.J., Shelly, M. Cohen, S., Zhang, Y.‑M., Lai, C.‑J.,

Kurane, I., Rothman, A., Hasty, S. and Howard. B.
(1994): Immunization of monkeys with baculovirus‑
dengue type‑4 recombinant containing envelope andnonstructural proteins: evidence of priming and partial
protection. Am. J. Trop. Med. Hyg., 50, 472‑47833) Edelman, R., Tacket, C.O., Wasserman, S.S., Vaughn, D.
W., Eckels, K.H., Dubois, D.R., Summers, P.L. and Hoke,
C.H. (1994): A Iive attenuated dengue‑1 vaccine candi‑

411

N.E. and Putvatana R. (1984b): Selection of attenuateddengue 4 viruses by serial passage in primary kidneycells. II. Attributes of virus cloned at different dog

date (45AZ5) passaged in primary dog kidney cell cul‑

ture is attenuated and immunogenic for humans. J.
Infect. Dis., 170, 1448‑1455

34) Falgout, B., Bray, M., Schlesinger, J.J. and Lai, C.‑J.

(1990): Immunization of mice with recombinant vac‑cinia virus expressing authentic dengue virus non‑structural protein NSI protects against lethal dengue

kidney passage levels. Am. J. Trop. Med. Hyg., 33, 666‑
67147) Halstead. S.B., Marchette, N.J., Diwan, A.R., Palumbo,
N.E.. Putvatana, R. and Larsen. L.K. (1984c) : Selectionof attenuated dengue 4 viruses by serial passage inprimary kidney cells. 111. Reversion to virulence byvirus encephalitis. J. Virol., 64, 4356‑4363

35) Feighny, R., Burrous, J. and Putnak, R. (1994): Dengue
type‑2 virus envelope protein made using recombinantbaculovirus protects mice against virus challenge. Am.
J. Trop. Med. Hyg., 50, 322‑32836) Fonseca, B.A.L., Khoshnood K., Shope, R.E. and Mason,
P.W. (1991) : Flavivirus type‑specific antigens produced
from fusion of a portion of the E protein gene with the
Escherichia coli type E gene. Am. J. Trop. Med. Hyg.,44, 500‑508

passage of cloned virus in fetal rhesus lung cells. Am. J.

Trop. Med. Hyg., 33, 672‑67848) Halstead. S.B., Eckels, K.H., Putvatana, R.. Larsen, L.K.

and Marchette, N.J. (1984d) : Selection of attenuateddengue 4 viruses by serial passage in primary kidneycells. IV. Characterization of a vaccine candidate infetal rhesus lung cells. Am. J. Trop. Med. Hyg., 33, 679‑

37) Fonseca, B.A.L., Pincus, S., Shope, R.E., Paoletti, E. and

68349) Halstead, S.B., Tom, M.C. and Elm, J.L., Jr. (1981): In

Mason, P.W. (1994): Recombinant vaccinia viruses co‑expressing dengue‑1 glycoproteins prM and E induce

vitro virulence marker: growth of dengue‑2 virus inhuman leukocyte suspension cultures. Infect. Immun.,neutralizing antibodies in mice. Vaccine, 12, 279‑28538) Fujita, N., Oda, K., Yasui, Y. and Hotta, S. (1969):
Research on dengue in tissue culture. IV. Serologic
responses of human beings to combined inoculations ofattenuated, tissue‑cultured type I dengue virus andyellow fever vaccine. Kobe J. Med. Sci., 15, 163‑18039) Fujita, N., Izaki, S., Oda, K.. Kimura, E. and Hotta, S.
(1972) : Research on dengue in tissue culture. V. Produc‑tion of anti‑dengue antibodies in tissue cultures from31, 102‑10650) Henchal, E.A., Henchal. L.S. and Schlesinger, J.J.
(1988): Synergistic interactions of anti‑NSI mono‑clonal antibodies protect passively immunized micefrom lethal challenge with dengue 2 virus. J. Gen. Viol.,69, 2101‑2107
51) Hoke, C.H., Jr., Malinoski. F.J., Eckels, K.H., Scott, R.
M., Dubois, D.R., Summers, P.L., Simms. T.. Burrous, J.,

Hasty, S.E. and Bancroft. W.H. (1990): Preparation ofmonkeys inoculated with an attenuated type I dengue

an attenuated dengue 4 (341750 Carib) virus vaccine. II.

virus strain. Kobe J. Med. Sci., 18, 143‑152

Safety and immunogenicity in humans. Am. J. Trop.

40) Fujita, N.. Tamura, M. and Hotta, S. (1976): Immuno‑
biological studies on dengue. I. Immunogenic effects ofpartially purified dengue‑1 virus and some of its compo‑
nents. Kobe J. Med. Sci., 22, 211‑228
41) Gubler, D.J. (1993) : Epidemiology of dengue and dengue

hemorrhagic fever. (2) Dengue and dengue hemorrhagicMed. Hyg., 43, 219‑226
52) Holt, R.L. and Kintner, J.H. (193la) : Notes on dengue.
Philippine J. Sci., 46, 593‑599

53) Holt, R.L., Fleming, W.D. and Kintner, J.H. (193lb) :54)

Resistance of dengue virus. Philippine J. Sci., 46, 601‑609
iBEI(1947a) :T')/7) f‑i 5fil: : ) c : c } )fever in the Americas. In: Monograph on Dengue/(1). 7 ; )1/ :7 7 )/ ()Dengue Haemorrhagic Fever, (cornpil.) Prasert Thong‑charoen, 1993, pp. 9‑22, New Delhi, WHO Regional; F1 c : : 3413
55)

Office for South‑East Asia
42) Guirakhoo, F., Hunt., A.R., Lewis, J.G. and Roehrig, J.T.
(1993) : Selection and partial characterization of dengue

2 virus mutants that induce fusion at elevated pH.
Virology, 194, 219‑223

43) Hahn, Y.S., Lenches, E.M., Galler, R., Rice, C.M.,
Dalrymple, J. and Strauss, J.H. (1990): Expression of
structural proteins of dengue 2 and yellow fever virus byrecombinant vaccinia viruses. Arch. Virol, 115, 251‑26544) Halstead, S.B. (1988): Pathogenesis of dengue: chal‑lenge to molecular biology. Science, 239, 476‑48145) Halstead. S.B., Diwan, A.R., Marchette, N.J., Palumbo,
N.E. and Srisukonth, L. (1984a) : Selection of attenuateddengue 4 viruses by serial passage in primary kidneycells. I. Attributes of uncloned virus at different passage

levels. Am. J. Trop. Med. Hyg., 33, 654‑665
46) Halstead, S.B., Marchette, N.J., Diwan, A.R., Palumbo,

EEI(1947b) : ' 'f')/: +7 7 )/ ) f: *?

. 87‑89
L.,,, ) fi

f : :

'.

"[

j

f: ec v

EEI J

(1947c) T:/ 7 L(Z) ft 5ti: : )

c

1

..

. H2 clC F1 c : : 3413 ", 89‑90
56)

(2).

"[

fi J

f 1)It61);‑

34141 =, 105‑10657) Hotta. S. (1952): Experimental studies on dengue. I.
Isolation, identification and modification of the virus. J.
Infect. Dis., 90, 1‑958) Hotta, S. (1954) : Experiments of active immunization
against dengue with mouse‑passaged unmodified virus.
Acta Tropica, 11, 97‑10459) Hotta, S. (1957): Some irnmunological properties ofdengue virus cultivated in tissue culture. Ann. Trop.
Med. P, arasitol., 51, 249‑255

60) Hotta, S. (1959): Propagation of dengue virus in tissue
culture. Acta Tropica, 16, 108‑150

61) Hotta. S. (1969): Dengue and Related Hemorrhagic
Diseases. Warren H. Green, Inc., St. Louis41262) Hotta, S. and Evans, C.A. (1956a) : Cultivation ofmouse‑adapted dengue virus (type 1) in rhesus monkey
tissue culture. J. Infect. Dis., 98, 88‑97

protective immunity elicited by recombinant vaccinia
viruses that synthesize E or NSI of Japanese encephali‑
tis virus. Virology, 185, 401‑410

63) Hotta, S. and Evans. C.A.. (1956b) : Cultivation of type2 dengue virus in rhesus kidney tissue culture. Proc. Soc.
Exp. Biol. Med., 93, 153‑155
64) Hotta, S. and Evans, C.A. (1956c) : Ether‑sensitivity of79) Konishi, E., Pincus, S., Paoletti, E., Laegreid, W.W.,
Shope, R.E. and Mason, P.W. (1992): A highly attenuat‑
ed host range‑restricted vaccinia virus strain, NYVAC,
encoding the prM, E, and NSI genes of Japanese enceph‑

dengue virus. Virology, 2, 704‑706
65) Hotta, S., Fujita, N. Shimazu. Y., Yasui, Y., Okubo, Y.
and Maruyama, T. (1966) : Research on dengue in tissue
culture. 111. Immunogenic effect of a tissue‑cultured(human‑attenuated) type I virus strain. Kobe J. Med.

alitis virus prevent JEV viremia in swine. Virology, 190,

Sci., 12, 199‑205

454‑45880) Konishi, E,, Pincus, S., Pao,letti, E., Shope, R.E. and

Mason, P.W. (1994): Avipox virus‑vectored Japanese
encephalitis virus vaccines: use as vaccine candidates incombination with purified subunit immunogens. Vac‑

66) Igarashi, A. (1997): Impact of dengue virus infection
and its control. FEMS Immunol. Med. Microbiol., 18,
291‑30067) Innis, B.L.. Eckels, K.H., Kraiselburd. E., Dubois, D.R.,

Meadors, G.F., Gubler, D.J., Burke, D.S. and Bancroft W.

H. (1988): Virulence of a live dengue virus vaccine

cine, 12, 633‑638

81) Konishi, E,, Kurane, I.. Mason, P.W., Shope, R.E. andEnnis, F.A. (1997a) : Poxvirus‑based Japanese encepha‑litis vaccine candidates induce JE virus‑specific CD8+cytotoxic T Iymphocytes in mice. Virology, 227 353‑360
82) Konishi, E,, Khin, S.W. Kurane, I., Mason, P.W., Shope,candidate: a possible new marker of dengue virus

R.E. and Eunis, F.A. (1997b) : Particulate vaccine candidate

attenuation. J. Infect. Dis., 158, 876‑880

for Japanese encephalitis induces long‑1asting virus‑
specific memory T Iyrnphocytes in mice. Vaccine, 15,281‑28668) Jan, L.‑R., Yang, C.‑S., Henchal, L.S., Sumiyoshi, H.,

Summers, P.L.. Dubois, D.R. and Lai, C.‑J. (1993):
Increased immunogenicity and protective efficacy inoutbred and inbred mice by strategic carboxyl‑terminal

83) Konishi, E,, Kurane, I., Mason, P.W., Shope, R.E.,
Kanesa‑Thasan, N., Smucny, J.J., Hoke, C.H., Jr. andtruncation of Japanese encephalitis virus envelope

Ennis, F.A. (1998a): Induction of Japanese encephalitis

glycoprotein. Am. J. Trop. Med. Hyg., 48, 412‑423
69) Kaufman, B.M., Summers, P.L.. Dubois, D.R. and Eckels,
K.H. (1987): Monoclonal antibodies against dengue 2
virus E‑glycoprotein protect mice against lethal dengue
infection. Am. J. Trop. Med. Hyg., 36, 427‑434
70) Kaufman. B.M., Summers, P.L., Dubois, D.R., Cohen, W.

virus‑specific cytotoxic T Iymphocytes in humans bypoxvirus‑based JE vaccine candidates. Vaccine, 16,

H., Gentry, M.K., Timchak, R.L., Burke, D.S. andEckels, K.H. (1989): Monoclonal antibodies for dengue
virus prM glycoprotein protect mice against lethal den‑gue infection. Am. J. Trop. Med. Hyg., 41, 576‑580
71) Kawano. H., Rostapshov, V.. Rosen, L. and Lai, C.‑J.
(1993) : Genetic determinants of dengue 4 virus neurovir‑
ulence for mice. J, Virol., 67, 6567‑6575
72) 7fcI73) 7f f r: l74) ; c

l .

EI

!

. El cI ,(1943) : ' 7')/7 L.,,. ) f , "!EEI

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T')/7 L.,,,!

(1944d) :fiT')/7 L.,,. )f O

f F :" t * : 2

f

6 )

2i

premembrane and envelope genes. J. Virol., 72, 4925‑
493085) Lai, C.‑J., Zhang, Y.‑M., Bray, M., Chanock, R. andEckels, K.H. (1989): Use of dengue virus structuralproteins and nonstructural protein NSI produded byrecombinant baculovirus for immunization against den‑gue virus infection. Vaccine 89, Cold Spring Harbor
Laboratory, pp. 351‑356
86) Lai. C.‑J., Zhang, Y.‑M., Men, R., Bray, M., Chanock, R.
M., Dubois, D.R. and Eckels, K.H. (1990) : Immunizationof monkeys with baculovirus recombinant‑expressed7; ) E:!;. C

dengue envelope and NS1 glycoproteins induces partial
resistance to challenge with homotypic dengue virus.
Vaccine 90, Cold Spring Harbor Laboratory, pp. 119‑12487) Manson‑Bahr, P.H. (1935): Manson's Tropical Disease,i , 1, 96*99() ; Tt J

and Mason, P.W. (1998b) : Induction of protective immu‑
nity against Japanese encephalitis in mice by immuniza‑tion with a plasmid encoding Japanese encephalitis virus

f 1 L i* :75) 7f f r {I , !FEI I(1944c) T/ 7 L6:) f i
7 7 L)/ fzj;
h7 7 L)/6 )) l c)

842‑ 849

84) Konishi, E,, Yamaoka. M., Khin‑Sane‑Win, Kurane, I.

.. "I Uf

;.

l : ‑

77) Kochel, T. Wu, S.J., Raviprakash, K., Hobart, P.. Hoff‑man, S. Porter, K. and Hayes, C. (1997): Inoculation ofplasmids expressing the dengue‑2 envelope gene elicit
neutralizing antibodies in mice. Vaccine, 15, 547‑552
78) Konishi, E., Pincus, S., Fonseca, B.A.L., Shope. R.E.,

Paoletti, E. and Mason, P.W. (1991): Comparison of

10th Ed., Cassell, London, p. 225

88) Manson‑Bahr, P. (1964): Tropical Diseases, 15th Ed.,
Cassell, London, pp. 247‑24889) Marchette, N.J., Dubois, D.R., Larsen, L.K., Summers, P.
L., Kraiselburd, E., Gubler, D.J. and Eckels, K.H. (1990) :Preparation of an attenuated dengue 4 (341750 Carib)
virus vaccine. I. Preclinical studies. Am. J. Trop. Med.
Hyg., 43, 212‑21890) Markoff, L.J., Bray. M., Lai, C.‑J., Chanock, R.M.,

413

Eckels. K., Summers, P., Gentry, M.K., Houghten, R.A.
and Lerner. R.A. (1988) : Antigenic analysis of thedengue virus envelope glycoprotein using synthetic pe‑
ptides. Vaccine 88. Cold Spring Harbor Laboratory, pp.
161‑16591) Mason, P.W., McAda, P.C., Dalrymple, J.M., Fournier,
M.J. and Mason, T.L. (1987): Expression of Japanese
encephalitis virus antigens in Escherichia coli. Virology,

Langat tick‑borne flavivirus by chimerization withmosquito‑borne flavivirus dengue type 4. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 95, 1746‑1751
104) Porter, K.R., Kochel, T.J., Wu, S.‑J., Raviprakash, K.,
Phillips, I. and Hayes, C.G. (1998): Protective efficacy
of a dengue 2 DNA vaccine in mice and the effect of CpG

immuno‑stimulatory motifs on antibody responses.

158, 361‑372

92) Mason, P.W., Dalrymple, J.M., Gentry, M.K., McCown,
J.M., Hoke C.H., Burke, D.S., Fournier, M.J. and Mason,
T.L. (1989): Molecular characterization of a neutraliz‑ing domain of the Japanese encephalitis virus structural
glycoprotein. J. Gen. Virol., 70, 2037‑2049
93) Mason, P.W., Pincus, S., Fournier, M.J., Mason, T.L.,
Shope, R.E. and Paoletti, E. (1991): Japanese encephali‑Arch. Virol., 143, 997‑1003

105) Price, W.H., Thind, I.S. and O'Leary, W. (1973a): The

attenuation of the 26th mouse brain passage of New
Guinea C strain of dengue 2 virus for use in the sequen‑

tis virus‑vaccinia recombinants produce particulate
forms of the structural membrane proteins and inducetial immunization procedure against group B arbovir‑
uses. Am. J. Trop. Med. Hyg., 22, 92‑99
106) Price, W.H., Casals, J., Thind, I. and O'Leary, W.
(1973b) : Sequential immunization procedure againstgroup B arboviruses using living attenuated 17D yellow

high levels of protection against lethal JEV infection.

fever virus, Iiving attenuated Langat E5 virus, and living

attenuated dengue 2 virus (New Guinea C isolate) . Am.

Virology, 180, 294‑305

94) McKee, K.T., Jr., Bancroft, W.H., Eckels, K.H., Red‑
field, R.R., Summers, P.L. and Russell, P.K. (1987):
Lack of attenuation of a candidate dengue I vaccine(45AZ5) in human volunteers. Am. J. Trop. Med. Hyg.,36, 435‑442
95) Men, R., Bray, M. and Lai, C.‑J. (1991): Carboxy‑termi‑

nally truncated dengue virus envelope glycoproteins
expressed on the cell surface and secreted extracellular‑ly exhibit increased immunogenicity in mice. J. Virol.,65, 1400‑1407
96) Miller, B.R.. Beaty, B.J., Aitken, T.H.G., Eckels, K.H.
and Russell, P.K. (1982): Dengue‑2 vaccine: oral infec‑
tion, transmission, and lack of evidence for reversion in
the mosquito Aedes aegypti. Am. J. Trop. Med. Hyg., 31,

1232‑1237
97) Monath. T.P. (1994) : Dengue: the risk to devoloped anddeveloping countries. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91,

J. Trop. Med. Hyg., 22, 509‑523
107) Price, W.H.. Casals, J. and O'Leary, W. (1974): Studies
on the sequential immunization against group B arbovir‑
uses in squirrel monkeys, cynomolgus monkeys, rhesus
monkeys and chirnpanzees. Am. J. Trop. Med. Hyg., 23,

118‑130
108) Putnak, R., Feighny, R., Burrous, J.. Cochran. M., Hack‑ett, C., Smith, G. and Hoke, C. (1991): Dengue‑1 virus

envelope glycoprotein gene expressed in recombinantbaculovirus elicits virus‑neutralizing antibody in miceand protects them from virus challenge. Am. J. Trop.
Med. Hyg., 45, 159‑167
109) Qu, X., Chen, W., Maguire, T. and Austin, F. (1993):
Immunoreactivity and protective effects in mice of arecombinant dengue 2 Tonga virus NSI protein
produced in a baculovirus expression system. J. Gen.
Virol., 74, 89‑97

Yoshida, I., Fukai K. and Okuno, Y. (1986):

110) Ryman, K.D., Xie, H., Ledger, T.N., Campbell, G.A. andBarrett, A.D.T. (1997) : Antigenic variants of yellow
fever virus with an altered neurovirulence phenotype in

Antigenicities and immunogenicities of mouse brain‑grown and formalin‑inactivated dengue viruses. Trop.

mice. Virology, 230, 376‑380
11D Sabin, A.B. (1948) : Recent advances in phlebotomus and2395‑2400
98) Mori, C.. Bundo, K., Matsuo, S., Igarashi, A., Takagi, M.,

99)

67, 4956‑4963l03) Pletnev, A.G. and Men, R. (1998): Attenuation of theMed., 28, 87‑99f
1 d # ‑
) 'l

}C l(1943) ' 'T"n]*. HlT')/7 L

:i

)

: :

. 3338ff :* . 1124‑1128

100) Pincus, S., Mason, P.W., Konishi, E., Fonseca, B.A.L.,
Shope, R.E., Rice, C.M. and Paoletti, E. (1992) : Recom‑
binant vaccinia virus producing the prM and E proteinsof yellow fever virus protects mice frorn lethal yellow
fever encephalitis. Virology, 187 290‑297

10D Pletnev, A.G., Bray, M., Huggins, J. and Lai, C.‑J.
(1992): Construction and characterizaton of chimerictick‑borne encephalitis/dengue type 4 viruses. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10532‑10536
102) Pletnev, A.G., Bray, M. and Lai, C.‑J. (1993): Chimericdengue fevers. Proc. 4th Internat. Congr. Trop. Med.
Malaria, Washington, D.C., pp. 520‑525112) Sabin, A.B. (1950): The dengue group of viruses and its
family relationships. Bacteriol. Rev., 14, 225‑232

113) Sabin, A.B. (1952): Research on dengue during WorldWar II. Am. J. Trop. Med. Hyg., 1, 30‑50
114) Sabin, A.B. (1955): Recent advances in our knowledgeof dengue and sandfly fever. Am. J. Trop. Med. Hyg., 4,

198‑207115) Sabin, A.B. and Lwoff, A. (1959): Relation between
reproductive capacity of polio viruses at different tem‑
peratures in tissue culture and neurovirulence. Science,tick‑borne encephalitis and dengue type 4 viruses:

129, 1287‑1288116) Sabin, A.B. and Schlesinger, R.W. (1945): Production ofeffects of mutations on neurovirulence in mice. J. Virol.,immunity to dengue with virus modified by propagation

414
in mice. Science, 101, 640‑642
117) S nchez, I. and Ruiz, B.H. (1996): A single nucleotidechange in the E protein gene of dengue virus 2 Mexican
strain affects neurovirulence in mice. J. Gen. Virol., 77,

2541‑2545ll8) Sato, T., Takamura, C., Yasuda, A., Miyamoto, M.,
Kamogawa, K. and Yasui K. (1993): High‑Ievel expres‑sion of the Japanese encephalitis virus E protein byrecombinant vaccinia virus and enhancement of its
extracellular release by the NS3 gene product. Vir‑immunity in mice. Vaccine, 15, 1946‑1954
130) Stevens, T.M. and Schlesinger, R.W. (1965): Studies on
the nature of dengue viruses: I. Correlation of particle
density, infectivity, and RNA content of type 2 virus.
Virology, 27, 103‑112
13D St. John, J.H. and Holt, R.L. (1931): A dengue vaccine

prepared from Macacus philippinensis. Am. J. Trop.
Med., 11, 325‑336
132) Takehara, M. and Hotta, S. (1961): Effect of enzymes
on partially purfied Japanese. B encephalitis and related
arboviruses. Science, 134, 1878‑1880

ology, 192, 483‑490

119) Schlesinger. R.W. (1977): Dengue Viruses. Virology
Monographs 16, Springer‑Verlag, Wien

133) Tan. B.H., Fu, J., Sugrue. R.J., Yap, E.H.. Chan, Y.C. and120) Schlesinger, R.W. and Frankel, J.W. (1952): Adaptationof the "New Guinea B" strain of dengue virus to suck‑ling and to adult Swiss mice. Am. J. Trop. Med. Hyg.,

NS5 protein expressed in Escherichia coli exhibits RNA‑
dependent RNA polyrnerase activity. Virology, 216, 317‑325134) Tarr, G.C. and Lubiniecki. A.S. (1975) : Chemicallyinduced temperature‑sensitive mutants of dengue virus
type 2: I. Isolation and partial characterization. Arch.

1, 66‑76

12D Schlesinger, R.W., Gordon, I., Frankel, J.W.. Winter. J.
W., Patterson, P.R. and Dorrance, W.R. (1956): Clinicaland serologic response of man to irnmunization withattenuated dengue and yellow fever vaccines. J. Im‑
munol., 77, 352‑364

122) Schoepp, R.J., Beaty. B.J. and Eckels, K.H. (1991):
Infection of Aedes albopictus and Aedes aegypti mos‑quitoes with dengue parent and progeny candidate vac‑cine viruses: a possible marker of human attenuation.
Arn. J. Trop. Med. Hyg., 45, 202‑210123) Scott, R. McD., Nisalak, A., Eckels, K.H., Tingpalapong,M., Harrison. V.R., Gould, D.J., Chapple. F.E. and Rus‑sell, P.K. (1980): Dengue‑2 vaccine: viremia andimmune response in rhesus monkeys. Infect. Immun., 27,
181‑186124) Scott. R. McD., Eckels, K.H., Bancroft, W.H., Summers,
P.L., McCown, J.M.. Anderson, J.H. and Russell, P.K.
(1983): Dengue‑2 vaccine: dose response in volunteers
in relation to yellow fever immune status. J. Infect. Dis.,

148, 1055‑1060
125) Siler, J.F., Hall, M.W. and Hitchens, A.P. (1926) : Den‑gue: its history, epidemiology, mechanism of transmis‑
sion, etiology, clinical manifestations, immunity, andprevention. Philippine J. Sci., 29, 1‑304

126) Simmons, J.S., St. John, J.H. and Reynolds, F.H.K.
(1931): Experimental studies of dengue. Philippine J.
Sci., 44, 1‑251

127) Simmons, M., Nelson, W.M., Wu, S.J.L. and Hayes, C.G.
(1998) : Evaluation of the protective efficacy of a recom‑

Tan, Y.H. (1996): Recombinant dengue type I virus

Virol., 48, 279‑287

135) Tarr, G.C. and Lubiniecki, A.S. (1976) : Chemicallyinduced temperature‑sensitive mutants of dengue virus
type 2: comparison of temperature sensitivity in vitro
with infectivity in suckling mice, hamsters, and rhesus
monkeys. Infect. Immun., 13, 688‑695
136) Theiler, M. (1957) : Action of sodium deoxycholate on
arthropod‑borne viruses. Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 96,
380‑382137)i(1961) :l5L

L7*･ EI･bK"

7 4 )V;) : tf e･ I ) f 5t
F' : 4 ‑ E l, 23, 822‑835
138) Vaughn, D.W., Hoke, C.H., Jr., Yoksan, S., LaChance, R.,

Innis, B.L., Rice, R.M. and Bhamarapravati, N. (1996):

Testing of dengue‑2 Iive attenuated vaccine (strain
16681 PDK‑53) in ten American volunteers. Vaccine, 14,
329‑336139) Weigl, R. (1920): Untersuchungen und Experimente an
Fleckfieberl usen: Die Technik der Rickettsia‑Fors‑chung. Beitr. Klin. Infektionskr. Irnmun. Forsch., 8, 353‑

376140) Wisseman, C.L., Jr., Sweet, B.H., Rosenzweig, E.C. andEylar, O.R. (1963): Attenuated living type I dengue
vaccines. Am. J. Trop. Med. Hyg., 12, 620‑623
14D Wisseman, C.L., Jr. (1966): Prophylaxis of dengue, withspecial reference to live virus vaccine,L.,,. ; : F‑

, 7,

51‑56

binant dengue envelope B dornain fusion protein against

142) Yoksan, S.. Bhamarapravati, N. and Halstead, S.B.
(1986): Dengue virus vaccine development: study on

dengue 2 virus infection in mice. Am. J. Trop. Med.

biological markers of uncloned dengue 1‑4 viruses, seri‑Hyg., 58, 655‑662

128) Srivastava, A.K., Morita, K., Matsuo, S., Tanaka, M.
and lgarashi, A. (1991): Japanese encephalitis virus
fusion protein with protein A expressed in Escherichia
coli confers protective immunity in mice. Microbiol.

ally passaged in primary kidney cells. Ipz: Arbovirus
Research in Australia: Proceedins of 4th Symposiurn,(eds.) St. George TD, Kay BH, Blok J. pp. 35‑38
143) Yoksan, S. and Bhamarapravati, N. (1990): Evaluationof biological markers for live attenuated dengue vac‑cines. Southeast Asian J. Trop. Med. Publ. Health, 21,708‑709

lrnmunol., 35, 863‑870
129) Staropoli, I., Frenkiel, M.‑P., M gret, F. and Deubel, V.
(1997) : Affinity‑purified dengue‑2 virus envelope glyco‑144) Zhang. Y.‑M., Hayes, E.P., McCarty, T.C., Dubois, D.R.,

protein induces neutralizing antibodies and protective

Summers, P.L., Eckels, K.H., Chanock. R.M. and Lai,

415

C.‑J. (1988) : Immunization of mice with dengue struc‑tural proteins and nonstructural protein NSI expressedby bacu,10virus recornbinant induces resistance to den‑4019‑4022
146) Zhao. B., Mackow, E., Guiler, M., Kruger, S., Markoff,gue virus encephalitis. J. Virol., 62, 3027‑3031
145) Zhao. B., Prince, G., Horswood, R., Eckels, K., Summers,

K. and Surnmers, P. (1987b) : Expression of dengue virus
structural proteins and nonstructural protein NSI by aP., Chanock, R. and Lai, C.‑J. (1987a): Expression of
dengue virus structural proteins and nonstructural pro‑tein NSI by a recombinant vaccinia virus. J. Virol., 61,

recombinant vaccinia virus. Vaccine 87, Cold Spring
Harbor Laboratory, pp. 397‑402

L., Prince, G., Chanock. R., Moss, B., Lai, C.‑J., Eckels,

417

J pn. J. Tro p. Med. Hyg., Vol. 27, No. 3, 1999, pp. 417 425

EVALUATION OF A NEW RAPID DIAGNOSTICTEST "DETERMINE+ MALARIA PF" AGAlNSTSTANDARD BLOOD FILM, ICT MALARIA P.F+
AND PARASIGHT+ F
DORlNA G. BUSTOS1, REMIGIO M. OLVEDAl, MASAYOSHI NEGISH12
and TAKASHI KURIMURA3.*
Received March 26, 1999/Accepted May 21, 1999

Abstract: A new rapid immunochromatographic test for malaria diagnosis, DetermineTM Malaria Pf, wasevaluated. This diagnostic kit is an antigen capture assay based on the detection of histidine‑rich protein
2 (HRP‑2) of Plasmodium falciparum. Positive test results are read visually, with the formation of red bands

within 30 min. 438 patient samples were tested from malaria endemic areas in Palawan, Philippines and non‑endemic areas, the Research Institute for Tropical Medicine in Metro Manila and the Komagome Hospitaland Keio University Hospital in Tokyo. Of 136 malaria samples, 101 was P. falciparum, 33 P. vivax and 2
mixed infection. There were 302 other diseases, 26 of infectious nature, 201 non‑infectious, and 75 working

normals. Using microscopy as the gold standard,. sensitivity for DetermineTM Malaria Pf, ICT Malaria P.fTM

and ParaSightTM F was 100%, 99% and 100%, respectively, and specificity was 96.7%, 99.1%, and 93.4%,
respectively. The positive predictive value for DetermineTM Malaria Pf was 90.4%, 97.1% for ICT Malaria

p.fTM and 82.4% for ParaSightTM F. The negative predictive value was 100% for DetermineTM Malaria Pf,

99.7% for ICT Malaria P.fTM and 100% for ParaSightTM F. DetermmeTM Malana Pf had an analyticalsensitivity for parasite detection as low as 30‑50 parasites//ll. Antigenemia was seen to persist until about

9 days in patients treated with the second line drug sulfadoxine‑pyrimethamine (Fansidar R) despite anegative blood film. It was longer in chloroquine‑treated patients, 14‑21 days, only to give a strong positive

signal on the day some patients recrudesce, also with a positive blood film. Following of HRP‑2 antigen
clearance might be used to predict early treatment failures or drug resistance. DetermineTM Malaria Pf isa very simple 2‑step rapid and convenient procedure with excellent sensitivity and specificity. Its marked
simplicity and reliability makes it ideal for field use where remote health centers are minimally equipped andstaffed, and malaria diagnosis urgently needed.

Keywords: Plasmodium falciparum, diagnosis, histidine rich protein 2 (HRP‑2), immunochromatography

INTRODUCTION
The development of rapid and specific diagnostic
tests to identify individuals infected with malaria is ofparamount importance in efforts to control the publichealth impact of this disease. Despite the simple tech‑
nology and relatively low direct costs, microscopic
diagnosis is still expensive requiring an adequate infras‑

tructure to purchase and maintain supplies and equip‑
ment, to train microscopists and to ensure proper qual‑
ity assurance of the service. Rural clinics do not havethe ability to diagnose malaria on‑site due to lack of
microscopes and trained technicians to evaluate blood
films. Since access; to a microscopic diagnosis in case ofillness in the Rural Health Units (RHU) of endemicareas is not only difficult but time‑constrained, a simple

1

Research Institute for Tropical Medicine, Department of Health, Alabang. Muntinlupa City, Philippines

2

Department of Infectious Diseases. Komagome Hospital, 18‑22 3 Chome, Honkomagome, Bunkyo‑ku, Tokyo 113‑8677, Ja pan

3

Department of Viral Infections, Research Institute for Microbial Diseases, Osaka University, 3‑1 Yamada‑Oka, Suita,

Osaka 565‑0871 Japan*

Correspondence: Dr. TAKASHI KURIMURA (565‑0781 D

EEl

VJEEIJ E3‑ I ;

i) :

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f

418

and rapid diagnostic test is most useful for early casedetection and prompt treatment. If such a simple test is
made available to trained village health workers, thiswill save the patient time to treatment and the cost ofclinical diagnostic utility of the kit DetermineTM Malaria

Pf in actual field conditions in endemic areas in thePhilippines, comparing its performance with the stan‑

dard malaria blood smear, ICT Malaria P.fTM andtravel.

ParaSightTM F among P. falciparum and P. vivax infec‑

The urgent need for new simple and cost‑effective
diagnostic tests to overcome the deficiencies of lighttions. The secondary purpose was to test in a non‑endemic area in Japan against imported malaria andmicroscopy have been recognized for a long time
(WHO, 1996).
Recent advances have now made it possible tonon‑malaria specimen. A third purpose was to test theconsider the feasibility of supplementing light micros‑
copy with a standard antigen detection test using highantigen clearance and assess if the test results could be
used to predict drug resistance if antigens do not clear,or they are detectable earlier in the blood before a blood

film becomes positive.

technology production methods and low technology
applications. In the last 5 years, rapid diagnostic tests
have been developed and tested in the field. These tests
are based on the detection of the parasite‑specific his‑

tidine‑rich protein 2 (HRP‑2), commercially available

ParaSightTM F and Immunochromatographic Test; ICTMalaria P.fTM, and lactate dehydrogenase enzyme
known as OptiMALR Test (FIOW Inc., Portland, Oreg.
USA) . All tests use a dipstick technique, a methodologythat has been successfully ernployed in clinical biochem‑

istry. This dipstick has been evaluated extensively andfound to have a level of diagnostic sensitivity equal to,

MATERIALS AND METHODS
2.1. Study area and study population

The study was conducted in endemic areas in Pal‑awan, Philippines, where suspected malaria patientswere screened at the Palawan Provincial Hospital in

Puerto Princesa City, and in Quezon and E1 Nido,
Palawan. Non‑malarious cases, suspected malaria
patients and working normals were tested in non‑endemic areas at the Research Institute for Tropicalor better than conventional microscopy. The first 2

Medicine in Metro Manila, Philippines, and the
Komagome Hospital and Keio University in Tokyo,

procedures ma.ke use of a dipstick to which are attachedJapan.

antibodies directed against the P. falciparum HRP‑2
antigen. This water‑soluble protein is secreted by theparasite and is present in both blood and plasma(Howard et al.. 1986; Parra et al.. 1991; Desakorn et al.,1997). OptiMALR utilizes a dipstick coated withmonoclonal antibodies against the intracellular meta‑

bolic enzyme parasite lactate dehydrogenase (LDH)(Palmer et al., 1998). Comparative studies of these

2.2. Collection and microscopic analysis of specimen
Following a signed informed consent, a fingerprick

was done and approximately 200 pl blood taken for a
thick and thin blood film, ParaSightTM F, ICT Malaria
p.fTM and DetermineTM Malaria Pf tests. The thick andthin blood films were examined blindly on site, without

different diagnostic tests with Giemsa‑stained bloodreference to the results of the rapid tests. Malaria
microscopy was considered as the gold standard. Bloodfilms showed good sensitivities (84%‑98.5%) andfilms were considered negative if no parasites were seen

specificities (86% to 99.5%) (Schiff et al., 1993; Beadle

in 200 WBC counts on thick film. Parasitemia waset al.. 1994; Garcia et al.. 1996; WHO, 1996; Valecha etal., 1998). The availability of the commercially avail‑determined on thick film, counting the number of para‑sites per pl of blood against 200 WBCs, and 800 WBCS
if parasites are very scarce. If parasitemia was tooable rapid tests is however constrained by its cost.
There will always be a compelling reason to try thehigh, ･this was counted in the thin film, counting theleast expensive, simplest and rapid quality test proce‑dures available to health providers.

thin film was used to differentiate P. falciparum from P.

asexual forms against 1,000 RBCS per pl blood. The

More recently, another rapid immunochrotnatogra‑
phic test known as DetermineTM Malaria Pf had been

2 ml of venous blood was extracted and set aside fordeveloped. It is also an antigen capture assay, based oncold storage (2‑8'C for I week) and retested. The

the detection of the circulating HRP‑2 antigen of P.
falciparum. If this simple rapid test is made available atresults of the retest were used as final results. All
positive malaria patients were given the appropriate

low cost in the field, the current flow of work in malaria

treatment and hospitalized if necessary.

diagnosis shall be changed and improved considerably.

The primary purpose of this study was to test thevivax. If found positive by any of the above procedures,419

30'C. It is a 2‑step procedure, shTlpler, more rapid andeasier to use and stare than the other available kits.

{i;Comparison of assay feature between Determh･leTM

iControl Bar
Patient Bar

;

;

{

{

Malaria Pf and other HRP2 tests is shown in Table l.

{

H

=

{

s

i
i
i

2.4. Compari.son of microscopy with other HRP‑2

j

i

=

.

Malaria tests

A11 smear positive and negative specimen were

;

s ; s

evaluated against the Determine'rM Malaria Pf al,Id twoother commercially available tests ParaSightTM F(Becton Dickinson, Sparks, MD, USA) and ICT

Positive Negative Positive
Figure I Description of Determine* IVl:alana Pf assay

Malaria IJ.fTM (ICT Diagnostics, Sydney, Australia) .
These were used as previously described (Schiff et al..
1993; Garcia et al.. 1996), to determin, e the level ofagreement with the Determinel'NI Maiaria Pf and bloodsmears.

2.3. DetermipeeTM Malaria Pf test

2.5. Antigen clearance determipzation in chloroqui e‑

A11 blood sarnples were tested with Determine'r 4
Malaria Pf (Abbott Laboratories, Japan) , an immuno‑
chromatographic rapid test. This is an antigen capture

trealed i.90lates

To confirm the antigen clearance period (antigen‑emia) of whole blood in Determinel'M Malaria Pf, finger

assay, based on the detection of the circulating histidine

prick and venous blood were further collected from lOrich protein‑‑2 (HRP‑2} antigen of P, falciparum in

P. f‑alciparum cases on days O, l, 2, 4, 7, 9, 21 and 28. The

blood (Figure l). The test uses a nitrocellulose strip
with a conjugate site containing anti HRP‑2 IgG coatedselenium conjugate, and a capture site containing anti
HRP‑2 lgG. If a sample contains HRP‑2 antigen, it firstreacts with the an, ti‑HRP‑2 selenium conjngate. As thesame whole blood specimen were also examined on

antigenantibody selenium colloid complex flows past

2.6. Threshold of parasite detectiov2:

blood filrn and compared with ICT Malaria P.fTM and
ParaSightlrM F. Results were reassessed for the antigen
clearance especially in recrudescing cases.

the capture site, a visible red line forms within 2‑5 min.

To determine the lowest end point sensitivity, serial

About 2 ,tll of whole blood is deposited on the sample
pad using a caiibrated sampling device, followed by theaddition of 2 drops o, f a chaser buffer. The test strip
also contains a control site which confirms the validity

intensity af the signal of DetermineTM Malaria Pf kit asagainst standard microscopy count (parasites/,eil) . Theof th, e assay by the formation of a second visible red line.

According to manufacturing instructions, standard read‑ing time is 30 min. The test device can be stored at 2‑

dilution was performed in I Pf isolate, comparing the

Pf specimen was diluted up to l:8C to achieve low ievel
detection limit, a parasite count of less than 50 asexualf orms/ f I I .

Table I Comparison of 3 rapid HRP2 tests

Product Name

DetermmeTM IVl:alaria Pf

ICT Malaria P,fl'M;

Pa raSight*M F

No. of Assay Step

2 steps

5 steps

6 steps

Sample Volurne

2 pi

10

50

Storage Condition

2‑30'c

2‑8*c

230'c

Time to Result

30 min5‑lO min20‑30 minCcurlponents

Reagent card
Chase Buffer
Sample collection device

Reagent card
Chase Buffer

Reagent card
Chase Buffer

Capillary tube

Capillary tubellSample lysing reagent
Liquid conjugate

Sample treatment tube

420

2. 7. Interference and Rheumatoid Factor test parameters; 5% Ievel of significance and power of 80%,
To confirm the effect of interference substance, one‑sided test, assuming that the gold standard (bloodhigh concentrations of triglyceride (1,000 mg/dl) and film) will achieve 95% sensitivity and 85% for the test
bilirubin (20 mg/dl) was added to 5 P. falciparum kit. This gives us n=111 positive specimen (Pf and Pv) .
specimen and 5 negative specimen, and tested by Deter‑ The statistical analysis included descriptive statistics,

mineTM Malaria Pf. sensitivity and specificity, the positive and negative
Patient samples from Tokyo were also subjected to predictive values, accuracy of the test, and McNemar's
rheumatoid factor (RF) tests to determine any cross test is to evaluate significant change in positivity ofreactions with the HRP‑2 kits as reported in previous each HRP‑2 rapid test as compared to the gold
literatures (Bartoloni et al. 1998; Grobusch et al., 1999) .,standard.

This was done by latex agglutination (Iatron Labora‑
tories, Inc. LPIA Ace RF) on automated instrumenta‑
RESULTStion. Subjects in Keio Univ. were I P. vivax and 150
in‑outpatients, 147 of those specimens could be tested Comparison of microscopy with HRP‑2 tests
for RF. Subjects in Komagome Hospital were 16 out‑
A total of 438 samples were collected from various
patients for Clinic of Infectious Diseases, 15 of those patients, examined by microscopy and compared withspecimens could be tested for RF. ' ParaSightTM F, ICT Malaria P.fTM and DetermineTM
Malaria Pf. Of 438 samples tested microscopically

2.8. Statistical design and analysis (Tables 2, 3), 101 were P. falciparum. 33 P. vivax, 2 were
The sample size was calculated based on positive mixed infection P. vivax and P. falciparum, 26 tropical
blood specimen as the study population rather than diseases those were collected in Research Institute fordisease prevalence. This was estimated using hypothe‑ Tropical Medicine (a breakdown of those were 12
sis tests for 2 population proportions, with the following dengue fe er, 3 urinary tract infection, 3 hepatitis, 2
Table 2 Sensitivity results of the 3 rapid HRP‑2 tests vs. microscopy gold standard

SampleMicroscopy

Pf malaria

P. falciparum

Mixed Infection

Total
*

**

***

P. falciparumand P. vivax

Determine*

ICT * *ParaSight F* * *

100%

99%

100%

(101/101)(100/101)(101/101)

100%

100%

100%

(2/2)

(2/2)

(2/2)

Pf +mixed

100%

99%

100%

inf ection(103/103)(102/103)(103/103)

Determine* Malaria Pf
ICT Malaria P.f'
ParaSight+ F

Table 3 Specificity results of the 3 rapid HRP‑2 tests Vs . microscopy gold standard

SampleMicroscopy

Pv malaria

P. vivax

Tropical diseases

Negative

Other diseases

Negative

Working Normal

Negative

Total
*

**

***

P. vivax andnegatives
DetermineTM Malaria Pf
ICT Malaria P,fTM
ParaSightTM F

Determine*

ICT* *

100%

100%

100%

(33/33)(33/33)(33/33)

ParaSight F* * *

100%

100%

100%

(26/26)(26/26)(26/26)

94.5%

98.5%

89 . 1%(190/201)(198/201)(179/201)

100%

100%

100%

(75/75)(75/75)(75/75)96 . 7%99 . 1%93 . 4%(324/335)(332/335)(313/335)

421

Table4Comparative

Test

resultsofthe3rapid

McNemar P value
X2value

NPV††

Accuracy

90．4％

100％

97．5％

99．1％

97．1％

99．7％

99．1％

0．250

93．4％

82．4％

100％

95．0％

20．045

Sensitivity

Specificity

Determine＊

100％

96．7％

ICT＊＊

99．0％

PFT＊＊＊

100％＊：DetermineTM Malaria＊＊：∫CT〃i認α万αP∫TM

HRP−2tests
PPV†

9．091

0．0026†††

0．61710．0001†††

Pf＊＊＊：PαrαSightTMF†：Positive Predictive Value††：Negative Predictive Value†††：statisticallysignificant

at5％level（p＜0．05）

leprosy，2pulmonary TB，2typhiod fever，1chronic
obstructual pulmonary disease，1erythematous patch

100％，99％and100％，respectively．
positive

for

and

each

PαrαSightTM

multiple

papules，1sytemic

malarious（otherviralinfection），201non−diseases）and75working

normalsbymineTMP．吻砿byMalaria

werepositive

F，∫CT〃iα伽7宛P．

copy，280，299and291were

∫TM

and

a

PαrαSightTM

Table5Pt

byLengthof

PαrαSightTM

Malaria

antigenemia

Tx

No

CO9

Pf，givingaccording

to

DO

Test

CQ

sensitivity

ThBF

Pf40

（一）

十

十

（一）

︵︵

十十十

十十
（一）

十十
（一）

十

一一

ω

（一）

（一）

（一）

十十十十
（一）

十十十十
（一）

十十十十

十十十

Pf32

十十十十
ND

十十十十

ND

十十十十

十十

十

Pf32

ND

（一）

（一）

（一）

十十十十

fg80

ND
ND

十十十十
（一）

ND

Pf800

Pf20
十十十十

ND

ND

十十十十

ThBF

Pf2238

ND

fg16

DetPf

十十十十

ND

十十

十十十十

Pf2298

ND

（一）

十十十十

ND

十十十十

Pf8472

ND

fg687

十十十十

ND

十十

ThBF
DetPf

Pf60，160
十十十十

ND
ND

十

ND＝Nottreatment

at

a

total

dose

of25mg十十十十二consideredthepositive

DetemineTM

signalofmaximum

intensity

MalariaofPfabase／kgBWsignal

fg800

fg32

（一）

（一）

（一）

（一）

（一）

十十十十

十十十

over3days

with十as

the

ω

fg320

dose

positive

十

十

Done

SP＝Sulfadoxine−Pyrimethamdse（Fansidar）single
Pf＝P血lo吻剛吻asexual forms／μl
fg＝Pカ1吻α鰯彫gametocytes／μ」

fg312

十十十十

fg754

＊＝only Patients C9，10，12and H12had Day2and5blood samples tested
ThBF＝Thick Blood Film
DetPfニDetemine Malaria Pf
CQ＝Chloroquine

十十十十Pf2325faintest

︶十
︵十

ThBF
DetPf

fg32

十十
（一）

O

十十十十

ND
ND
ND

一一

DetPf

ND

一一

Pf43，520
十十十十
Pf31，904

（一）

︵︵

十十十十

ThBF
DetPf
ThBF

一一

DetPf

︵︵

Pf15，000

DN
D
DN
D
N
N

ThBF

︵︵

十十十十

の

Pf1920
十十十十

︶十
︵十

十十十

（一）

O甘

十十十十

（一）

ThBF

CQ

D28

（一）

十十十十

十十十

EN48

D21

（一）

（一）

十十十十

SP

D14

（一）

D5＊

十十十十

DetPf

EN36

D7

（一）

十十

Pf80

SP

D3
Pf40

（一）

十十十十

EN31

each

（一）

Pf160

all

by

DetermineTM

十十十

十十十

CQ

and

（一）

DetPf
ThBF

EN27

negative

十十十

CQ

CQ

be

十十十

C12

EN24

to

Pf100

ThBF

CQ

found

F，κT〃iα1α吻PゾTM

Pf1080

CQ

EN23

of

十十十十

DetPf

Deter−

lOO％for

十十十十

Pf800

CQ

of

DetPf

C10

H21

specificity

treatment

D2＊

Pf8080anegativeandtests．Of302samples of tropical diseases，non−malar−diseases）and working normals by micros−ious（other

each

F，∫CT〃iα如7宛PゾTM

Pf，giving（negative）．Of103samples positive for Pヵlo吻鰯卿
and mixed infections microscopically，103，102and103
DetermineTM

Of33samples

microscopy，all33were422

from the gold standard, as implied by the relatively highMalaria Pf, giving a specificity each of 92.7%, 99.0% and96.4%, respectively. One patient positive on blood filmwith a parasitemia of 32 parasites/pl was negative by
ICT Malaria P.fTM and positive on the 2 other tests, andAs Determine*" Malaria Pf was designed for 30 min
reading time, there was no difference between 20 and 30

had been previously treated. Another patient negative

min to get results in all tests.

false positive rate in each test.

by blood film (verified by 3 well‑trained microscopists)

was strongly positive in all 3 HRP‑2 tests, with noLength of antigenemia of the DetermineTM Malaria Pf
Of 10 cases followed‑up until day 28, 5 cases showedhistory of treatment. Patient samples with gametocytes
only were excluded in the final analysis as the HRP‑2
antigen is not secreted by mature gametocytes. There
was one patient that remained gametocyte positive until
Day 14 of the follow‑up but was HRP‑2 test negative.
Overall, the sensitivity, specificity, positive andslower antigen clearance period in whole blood up to thelast day of follow‑up (Table 5). In one particularpatient treated with chloroquine, the signal remained
positive up to day 14 despite a negative blood film. But

by day 21, the patient returned with fever of 2 days

negative predictive values and accuracy of the Para
SlghtTM F ICT Malarza PfTM and DetermineTM Malaria

duration, was blood film positive for P. falciparum. and

Pf as against the gold standard are summarized in Table
4. The McNemar's Test shows significance of deviation

clearance could therefore be an indication of drug resis‑

all HRP‑2 tests strongly positive. The delayed antigen
tance, as the blood film subsequently became positive on

Table 6 Endpoint sensitivity of DetermineTM Malaria Pf as against
parasitemia
Dilution

Parasites/ pl

Intensity of signal

Initial parasitemia

11 , 862

1:4

2 , 705

1 : 10

1 , 095

1 : 20
1 : 40

256
48

++++
++++
+++

1 : 8032++++

Table 7 Interference test results

Malana Positrve Samples Bilirubin (mg/dl)

H12
H11

Triglyceride (mg/dl )Determine * Results

o

O

20

1 OOO

o

o

20

1, oooPositive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive

Bilirubin (mg/dl)

Triglyceride (mg/dl )Determine * Results

o

O

20

1 OOO

Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative

o

20
S O1

o

20
S 02
S 03

Negative Samples

H06
H07

o
1

ooo
o

1

ooo

o

o

20

1, ooo

o

20

o
1

ooo

H 08

o

o
1, ooo

CO1

20
o
20

1

M02

o

20

* DetermmeTM Malaria Pf

o

ooo
o

1

ooo

423

Table 8 Specificity data from Japanese patients and RF test results

DetermineTM Malaria Pf

Test Site

Komagome Hospi‑

93.8% (15/16)
1/1 RF(+) **talParasitology Dept.,

ICT Malaria P.fTM

ParaSightTM F

75% (12/16)

100% (16/16)

1/4 RF(+) **100% (1/1)*

100% (1/1)*

100% (1/1) *Keio University
Hospital

94% (141/150)

98.7% (148/150)
0/1 RF(+)***

90% (135/150)

6/9 RF(+) **Total

94% (157/167)

98.8% (165/167)

88 . 6%

Keio University

*

**

***

7/14 RF(+) ***(148/167)

Malaria P. vivax infection
False positivity associated with positive rheumatoid factor (RF)
Inadequate blood sample in one patient, hence could not be tested for RF

the faintest positive signal until day 7, and had a defini‑before slide results are available (WHO, 1996). Hencethe delay in the diagnosis and treatment of cases con‑tribute to the continuing transmission in these areas.
Because of the scarcity of microscopes and well=trained

tive negative signal by day 14 and until the end of the

microscopitst to read the slides, there is a need for more

f ollow‑u p.

rapid and simple diagnostic tests that can be carried out

further follow‑up. Two other patients treated with
Sulfadoxine‑Pyrimethamine (Fansidar R) f ollowing
recrudescence after chloroquine treatment failure gaveples, parasite counts of 32, 40, 40 and 80 asexual forms/

with ease in remote areas by a village health worker
with minimum training.
This study compared the diagnosis of malaria by a
new rapid test, Determine' Malaria Pf, with standard
microscopy and 2 other commercially available HRP‑2
antigen tests, and found that the 3 methods yieldedcomparable results. Blood films identified positive by
the gold standard microscopical diagnosis were mostly

pl by microscopy were all positive on DetermineTM

positive by ICT Malaria P.f*M, paraSightTM F andMalaria Pf.

Determine* Malaria Pf . That one suspect Pf sample
was strongly positive by the 3 HRP‑2 tests and not

Analytical sensitivity

Comparison of end‑point sensitivity (detection
limit) by serial dilution as against parasitemia per pl ofblood by microscopy showed that the minimum sensitiv‑
ity of DetermineTM Malaria Pf could be at least 30‑50
asexual forms per pl (Table 6). And from field sam‑Interference and rheumatoid factor tests
A11 5 P. falcipurum positive specimen and 5 negative
specimen were not affected by triglyceride and bilirubin
up to 1,000 mg/dl and 20 mg/dl respectively (Table 7) .

Table 8 shows the specificity data of patient samples
from Japan, where false positivity in the 3 rapid HRP‑
2 tests are associated with positive RF test results inmore than 50% of false positive patients.

detected on blood film may be explained by the fact thatthe kits detect circulating antigen which may still be in
the blood 6‑14 days post‑treatment (Shiff et al., 1993;

Singh et al.. 1997). Another possible explanation forthis discrepancy is subpatent parasitemia not detected in

the peripheral circulation with or without treatment.
The study of length of antigenemia was done in E1 Nido,

northern area of Palawan island, being famous asendemic area of P. falciparum and people in this area

DISCUSSION
Malaria is of major public health importance andranks among the top ten leading causes of morbidity in
the Philippines, especially in rural areas. It remains

endemic in 63 out of 76 provinces in the country.
Detection of the malaria parasite by microscopy
remains as the standard operational diagnostic proce‑dure. Unfortunately, especially in the remote areas

where malaria is highly endemic, microscopy is notreadily accessible and it can take as long as 2‑3 weeks

had been infected by P. falciparum repeatedly since theirinfancy. As we had appropriately observed in I re‑
crudescing case, the DetermineTM Malaria Pf remained
positive even after the blood films were negative for 2
weeks, only to give a stronger signal (again) when the
blood films became positive by the 3rd week (day 21) .
In 2 other patients who received sulfadoxine‑pyrimeth‑amine following treatment failure with chloroquine, theHRP‑2 test was negative by the second week even jf
gametocytes were still present in the blood films. A
highly efficaceous drug will eliminate parasites in a

424

shorter time hence antigenemia will also be shorter.
These observations indicate the potential of Deter‑
mineTM Malaria Pf as a diagnostic tool to predict early
treatment failures in areas where resistance to currently

positives associated with positive RF tests accounts forthe significant change between the gold standard andeach HRP‑2 kit (by McNemar's test) . Relatively highfalse positive rates of HRP‑2 tests in RF positive speci‑

used antimalarials is an emerging problem. It can be

men was considered a general issue for HRP‑2 detecting

used to monitor in vivo response to antimalarial treat‑ment (Di Perri et al.. 1997), but more field tests may

kits (Grobusch et al.. 1999). This may need to be

have to be done.
The present study shows that DetermineTM Malaria
Pf is highly sensitive and specific, comparable withother HRP‑2 tests (Scb.iff et al.. 1993; Beadle et al..

investigated further in malaria endemic areas acrosspopulation age groups.
Technical difficulties and discrepancies in micro‑
scopic readings are a common problem in the field. In
one field survey in Quezon, Palawan, 6 P. falciparum

1994; Valecha et al., 1998). In the analytical sensitivity

false positive slides were read by an inexperienced field‑

tests, the lower detection of 30‑50 parasites/pl indicatedbased microscopist, which were all negative on the 3

by a faint positive signal on DetermineTM Malaria Pf
makes it superior to microscopy, since a longer exami‑
nation time and expertise is needed with the latter.

HRP‑2 tests. Some ICT Malaria P.fTM tests werepositive control of the test card. This technical variabil‑

From field samples, parasite counts of 32, 40, 40 and 80

ity may be due to lot variation of the kits. In a fieldasexual forms/pl by microscopy were all positive on

situation, the reliability of each test, the ease with which

Determine. The lowest parasite count of 32 ring forms/

tive by ICT Malaria P.fTM. A similar finding was

it is performed operationally, the rapidity of yielding
results in a large number of sick patients and the eco‑nomic costs are all very irnportant factors to consider.
Since the HRP‑2 tests are specific for P. falciparum, it

observed with the serial dilution of one positive sample

still has its lirnitations in areas where the prevalence of

wherein the corresponding intensity of the signal was
graded (Table 6) . Craig and Sharp (1997) reported thatan expert microscopist can detect 80 parasites//ll withother species such as P. vivax are just as high, andrelapsing infections contribute significantly to thepl in one patient was positive by ParaSightTM F and
DetermineTM Malaria Pf with a weak signal, but nega‑

good reproducibility, and that sensitivity of microscopic
detection diminishes with counts less than 50lpl. Deter‑

mineTM Malaria Pf would therefore have the same detec‑tion sensitivity as an expert microscopist, but at ashorter time and with less training or expertise andequipment needed.
A relatively high false positive rate with all 3

invalidated as there was no band formation on themalaria morbidity in these regions.

DetermineTM Malaria Pf is a very simple, rapid,
easy‑to‑read and convenient diagnostic test with excel‑
lent sentitivity and specificity for field use. Further‑more, comparing with other HRP‑2 tests, DetermineTM
Malaria Pf has some advanced features. Though final
reading time is designed as 30 min, it is easy for every
technician to see a clear red line in patient bar within

HRP‑2 tests was observed in patients from Tokyo,

2‑5 min in case of strong positive specimens. Assay

associated with the findings of high rheumatoid factor(RF) . 82% of this Japanese study population was overprocedure needs only 2 steps while ParaSightTM F needs
6 steps and card type device is easy to handle and keep
it. Storage condition is 2‑30'C so that device could be
stored in room temperature. Required sample volume is

40 years old. Tohge et al. (1991) reported that the
average RF value in a population of 20‑29 year old was
3.5 IU/ml, significantly lower than in the 40‑49 year old

only 2 pl and unique sample col･1ecting device is attached

age group which had 6.3 IU/ml, and 5.6 IU/ml in the 50‑
59 year old age group. 19.8% (32/162 excluding untested

for easy to apply sample to card. As ParaSightTM F

inadequate samples) of the Tokyo study population was
RF positive, coming mainly from an elderly age group.
Grobusch et al. (1999) reported that ICT Malaria P.f TM
and ParaSightTM F showed high false positives in RF
positive specimen, 6.6% and 16.5%, respectively. Bar‑
toloni et al. (1998) also showed 68.4% (13/19) false
positives with ParaSightTM F in RF positive specimen,

patient to collect large volume. Though some ICT

and mentioned a prevalence rate of 5% in healthy
persons and 10‑20% in over 65 years old. We cannot
discount the possibility that the relatively high false

needs 50 pl sample, it is difficult for infant malaria

Malaria P.fTM tests were invalidated showing no bandformation on the positive control of the test card, invalid

result was not occurred in DetermineTM Malaria Pf
during this study. Its marked simplicity and reliability
puts it at a greater advantage than other rapid tests,
with the provision that its price can be as competitiveand economically affordable in developing countries
where its ultimate usefuness will be put to test.

425

ACKNOWLEDGEMENTS
We gratefully acknowledge the laboratory person‑
nel of the Palawan Provincial Hospital, the Diagnostic
Parasitology Section of the Research Institute for Trop‑ical Medicine in Metro Manila, the staff of the Malaria
Control Service, Palawan, the Rural Health Unit staff ofand Rieckrnann, K.H. (1996) : Immunochrornatographic
test for malaria diagnosis. Lancet, 347, 1549

7 ) Grobusch, M.P.. Alpermann, U., Schwenke, S., Jelinek,
T. and Warhurst, D.C. (1999) : False‑positive rapid tests

for malaria in patients with rheumatoid factor. Lancet,
353, 297,

8 ) Howard, R.J., Uni, S., Aikawa, M., Aley, S.B., Leech, J.

E1 Nido and Quezon, Palawan, and the staff of

H., Lew, A.M., Wellems, T.E., Rener, J. and Taylor, D.

Komagome Hospital and Keio University Hospital inW. (1986) : Secretion of a malarial histidine‑rich pro‑Tokyo, Japan. We also wish to thank Dainabot Labora‑tein (Pf HRP ID from Plasmodium falciparum‑infected

tories, Japan, for this technical collaborative research.

erythrocytes. J. Cell Biol., 103, 1269‑1277
9 ) Palmer, C.J., Lindo, J.F., Klaskala, W.1., Quesada, J.A.,

REFEREN CES
1 ) Bartoloni. A.. Strohmeyer, M., Sabatinelli, G.. Benucci,

M., Serni, U. and Paradisi, F. (1998): False positive
Parasight F test for malaria in patients with rheumatoid

Kamisnky, R., Baum, M.K. and Ager, A.L. (1998) :Evaluation of the OptiMAL test rapid diagnosis of
Plasmodium vivax and Plasmodium falciparum malaria.
J. Clin. Microbiol., 36(1), 203‑206

10) Parra. M.E., Evans, C.V. and Taylor D.W. (1991):

factor. Trans. R. Soc. trop. Med. Hyg., 92, 33‑34

ldentification of Plasmodium falciparum histidine‑rich

2 ) Beadle, C., Long, G.W., Weiss, W.R., McElroy, P.D.,

protein 2 in the plasrna of humans with malaria. J. Clin.
Microbiol., 29(8), 1629‑i634

Maret, S.M., Oloo. A.J. and Hoffman, S.L. (1994):
Diagnosis of malaria by detection of Plasmodium fal‑ciparum HRP‑2 antigen with a rapid dipstick antigen‑capture assay. Lancet, 343 (8897) , 564‑568

3 ) Craig, M.H. and Sharp, B.L. (1997): Comparative evalu‑
ation of four techniques for the diagnosis of Plasmodium11) Schiff, C.1., Premji, Z. and Minjas, J.N. (1993): The

rapid manual Parasight F test. A new diagnostic toolfor Plasmodium falciparum infection. Trans. R. Soc.
trop. Med. Hyg., 87, 647‑648
12) Singh, N., Valecha, N. and Sharma, V.P. (1997) : Malaria

falciparum infections. Trans. R. Soc. trop. Med. Hyg, 91,

diagnosis by field workers using an immunochromato‑279‑2824 ) Desakorn, V., Silamut, K., Angus, B., Sahassananda. D.,graphic test. Trans. R. Soc. trop. Med. Hyg., 91, 396‑397

13) Tohge, H., Ichimura, M., Sakiyama, J., Ohi, H. andChotivanich, K., Suntharasamai, P., Simpson. J. andWhite, N.J. (1997): Semi‑quantitative measurement of

Kawanami, H. (1991) : RA (Rheumatoid Athritis) test' ‑Plasmodium falciparum antigen PfHRP‑2 in blood andJapanese)
14) Valecha, N., Sharma, V.P. and Usha Devi, C. (1998): A

plasma. Trans. R. Soc. trop. Med. Hyg., 91, 479‑483
5 ) Di Perri, G., Olliaro, P., Nardi, S., A1legranzi, B.,

RF (Rheumatoid Factor) . Sogo Rinsho, 40, 368‑376 (inrapid immunochromatographic test (ICT) for diagnosis

Deganello, R., Vento, S., Lanzafame, M., Cazzadori, A.,of Plasmodium falciparum. Diagn. Microbiol. Infect.

Bobora, S. and Concia, E. (1977): The Parasight‑F
rapid dipstick antigen capture assay for monitoring

Dis., 30, 257‑260

15) WHO (1996) : Informal Consultation of Recent Advances

parasite clearance after drug treatment of Plasmodiumin Diagnostic Techniques and Vaccines for Malaria: A

falciparum malaria. Trans. R. Soc. trop. Med. Hyg., 91,

rapid dipstick403‑405

falciparum malaria. WHO Bulletin OMS., 74 (1), 47‑54

6 ) Garcia, M., Kirimoama, S.. Marlborough, D., Leafasia, J.

mtigen capture assay for the diagnosis of

Jpn. J. Tro p. Med. Hyg., Vol. 27, No. 3, 1999, pp. 427‑431

427

COMPARATIVE STUDY OF RANDOMAMPLIFIED POLYMORPHIC DNA OF
TR YPANOSOMA CRUZI ISOLATESFROM PARAGUAYSAYUMI BABA , TAMAMI MATSUMOT02, HIROJI KANBARA3,
MAKOTO SAKAMOT04, MARISEL MALDONAD05,
ANTONIETA ROJAS DE ARIAS5, HIDEYUKI SAYAI AND TATSUYUKI MIMORll*
Received April 26, 1999/Accepted June 2, 1999

Abstract: The variation of Paraguayan Trypanosoma cruzi isolates was examined using the unweighted pairgroup method analysis (UPGMA) based on the resulting matrix of the Dice sirnilarity coefficients of random

amplified polymorphic DNA (RAPD) profiles. These isolates were also compared with the establishedstrains isolated from Brazil, Chile and Colombia in South America. Of 9 Paraguayan isolates, 3 isolates weresimilar to the Berenice, Y and Sao Felipe strains (zymodeme type; Brazilian Z2) , respectively, isolated frorn

Brazil, and 4 strains were sirnilar to the Tulahuen strain from Chile. There was no isolate similar to the

Colombiana I strain (Z1) from Colombia.
Key words: Trypanosoma cruzi, Chagas' disease, Paraguay, random amplified polymorphic DNA (RAPD) ,unweighted pair group method analysis (UPGMA)

strains has mainly depended on by zymodeme analysis(Ebert, 1982; Miles and Cibulskis, 1986; Higo et al.,INTRODUCTION
Chagas' disease caused by Trypanosoma cruzi, iswidely distributed in South and Central America and1997). Schizodeme analyses have been adopted forclassification of T. cruzi strains using kinetoplast DNA

represents a considerable health problem. In Paraguay,
20‑30% of the population is infected in endemic areas(Rojas de Arias et al., 1984), where Triatoma infestans
is a responsible vector for the domestic transmission of
T. cruzi (Canese, 1978). In Paraguay, about 30% of therestriction fragment length polymorphism (Carreno etal., 1987; Mimori et al., 1992) and polymerase chain
reaction (PCR) methods (Avila et al., 1990). Recently,

random amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis
using arbitrarily‑primed polymerase chain reaction(AP‑ PCR) have been also adopted for classification ofpatients infected with T. cruzi have cardiac symptoms,
but digestive symptoms are rare (Canese et al., 1972).

T. cruzi strains because of its sentitivity and besides the

The multiform symptoms of Chagas' disease might bepoint that it does not require sequence information forcaused by genetic differences in T. cruzi strains (Miles

primer design, and recommended the RAPD analysis

et al., 1981).

method as a useful tool for the study of parasite popula‑tions (Steindel et al., 1993; Brisse et al., 1998; Gomes et

The classification and identification of T. cruzi
1

Department of Tumor Genetics and Biology, Kumamoto University School of Medicine, Honjo 2‑2‑1, Kumamoto 860‑0811,
Ja an

2
3

Ginkyo College of Medical Science, Okubo 1‑6‑2, Kumamoto 860‑0038, Japan
Department of Protozoology, Institute of Tropical Medicine, Nagasaki University, Sakamoto 1‑12‑4, Nagasaki 852‑8523,
Ja pan4

Sanwa Hospital, Sanwa‑machi, Nagasaki 851‑0403, Japan

Instituto de Investigaciones en Ciencias de la Salud, Universidad Nacional de Asuncion, P.O. Box 2511, Asuncion, Paraguay*Corres pondence: Dr. TATSUYUKI MIMORI
Department of Tumor Genetics and Biology, Kumamoto University School of Medicine, Honjo 2‑2‑1, Kumamoto 860‑0811, Japan
5

Tel.+81‑96‑373‑5117 Fax.+81‑96‑373‑5120 E‑mail: tmimori@kaiju.medic.kumamoto‑u.ac.jp(860‑0811;:

2 ‑ 2 ‑ I

;)

f ' ,

H

1

‑ C i

;

{

)

428

medium with 15% fetal bovine serum at 26'C andal., 1998).

In the present study, we conducted an RAPD analy‑

washed with physiological saline, then the parasite

sis on T. cruzi isolates from different endemic areas ofpellets were suspended in SE buffer (0.15 M NaCl, 0.1 M

Paraguay and compared them with established strains

EDTA, pH 8.0), Iysed with sarkosyl and digested withproteinase K at 60'C. The kinetoplast DNA‑enrichedmaterials were collected by centrifugation (16,000 rpm
for 90 min at 4'O , extracted by phenol/chloroform andprecipitated by ethanol (Mimori et al., 1992). These
DNAs were used as the templates for AP‑PCR.

from Brazil, Chile and Colombia using the Dice similar‑
ity coefficient.

MATERIALS AND METHODSParasites:

Seven T. cruzi isolates were from Chagas' disease
patients, 3 males and 4 females, and two isolates werefrom vector insects in endemic areas of Paraguay, SouthAmerica. Three strains were isolated from patients of

PCR amplification and polyacrylamide gel electrophor‑esis:

The protocol of AP‑PCR was based on our methodfor Leishmania parasites (Mimori et al., 1998). Eachthe acute Chagas' disease with Romana's sign oramplification reaction was done in a final volume of 15

oedema; JAG strain from Ita Moroti in Department of
Paraguari, MG from Ygatimi in Canindeyu and RF from
Altos in Cordillera. Two were from seropositive (IgG)
patients without the symptoms of the disease; DG from
Paraguari in Paraguari and LO from Tobati in Cordi‑
llera. The other patients have chronic chagasic car‑pl reaction solution containing 200 pM each dNTP, 10
mM Tris‑HCI (pH 8.3) , 50 mM KCl, 1.5 mM MgC12, and30 ng template DNA, 150 ng primer, 0.3 Units rTaq DNA

polymerase (Takara), and was performed on a
GeneAmp PCR System 2400 (Perkin Elmer). The fol‑
10wing 6 primers were tested for the amplification of

diopathy; CIR from Quiindy in Paraguari and ARM

Trypanosoma DNA: FL‑S (5'‑GCCATGCAGCAGCC‑

from Villeta in Central. Two strains were isolated from
Triatoma infestans, 201 and 204, captured in two housesof Ypahu in Paraguari, which is a highly endemic areaof Chagas' disease (Table 1). Five established T. cruzi
strains, i.e., Col,ombiana I (ZI by zyrnodeme classifica‑

CTTCAATTAC‑3'), M‑13 (5'‑GTAAAACGACGGC‑
CAGT‑3'), LS‑3 (5'‑AAGTGTTGATACCCACTTT‑
GT‑3') FL‑AS (5'‑GTGCTTCTCTTAGAGCTTATAT‑tion) from Colombia, Y, Berenice (Brazilian Z2) and
Sao Felipe (Brazilian Z2) from Brazil, and Tulahuen
from Chile, were used for comparison with the Par‑aguayan strains. The T. rangeli. Leishmania amazonen‑sis. L. guyanensis and L. mexicana were also examinedfor comparison.

CATGCCTG‑3'). The reaction mixture was subjected

DNA preparation:
T. cruzi epimastigotes were cultured in a Schneider's

AAGCC‑3') , PDR2‑S (5'‑CTGGTAAGTTTAGTCTT‑
TTTGTC‑3') and PDR2‑AS (5'‑GTGCCAAGCTTG‑
at 94'C for 5 min for the initial denaturation, and was
subjected to the initial 10 cycles though the following
profiles: 94'C for 30 sec for denaturation, 37'C for 30 sec

for annealing and 72"C for 30 sec for extension, followed

by 30 cycles where the annealing step was altered to60"C. Finally, the mixture was subjected to 72'C for 7
min, and stored at 4'C. Each 7 /d of PCR product wereanalyzed by electrophoresis in 6% polyacrylamide gels

Table I Paraguayan Trypanosoma cruzi isolates used in this study

Isolate Host (Age and sex)

RF
JAG

MG
DG
LO

ARM
CIR

Man (7, M)
Man (12, M)
Man (41, M)
Man (45, F)
Man (15, F)
Man (59, F)
Man (65, F)

Phase

Locality

Acute
Acute
Acute

Ita Moroti (Paraguari)

Indeterminate
Indeterminate

Chronic cardiopathy
Chronic cardiopathy

Altos (Cordillera)

Ygatimi (Canindeyu)
Paraguari (Paraguari)
Tobati (Cordillera)

Villeta (CentraD
Quiindy (Paraguari)

Vector201

Triatoma infestans

Y pahu (Paraguari)

204

Triatoma infestansYpahu (Paraguari)

429

the following formula. The similarity coefficient S=2a/

at 100 V far I hr. The gels were stained by the silver

2a+, b+c; a=the number of bands present in both iso‑nitrate staining.

lates, b =the number af bands present in an isolate I andabsent an isolate 2, and c = the nun‑iber of bands present

Data analysis:
Phenetic trees based on the Dice similarity coeffi‑
cient (Dice, 1945) between all possible pairs in an analy‑
sis group vere constructed. The similarity coefflcientin an isolate 2 and absent in an isolate 1. These data

were compared by means of an UPGM:A. The phenon
line, which was marked on the phenetic tree of UPGMA.
is the average of the similarities among all possible

between an isolate I and an isolate 2 was calculated in(A)(M) C Y T B{ ' S' 1

4 5 6 78 932+=>**,*+*=='*=++*******+****'+ ***.

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Figure l RAPD products of established and Paraguayan l ypanosoma cruzi strains using arbitrary

primers FLS(A) , lvl‑13(B} and LS‑3(O separated on 6% polyacrylamide gels stainedwith silver. (M) ; I kb ladder. C; Colombiana I, Y; Y strain, T; Tulahuen, B; Berenice, S;
Sao Felipe, l; CrR, 2; JAG, 3; RF, 4; MG, 5; DG, 6; LO, 7; ARIVl:, 8; 201 and 9; 204.

430
0.5

0,6

0.7

0.8

0.9

C
Y
S
B
7
5

6
9

4

T
8

3

Phenon nne

Figure 2 UPGMA dendrogram of the established and Par‑aguayan T. cruzi strains based on the Dice similar‑
ity coefficients of RAPD profiles (average data ofthe matrix with the primers FL‑S, M‑13 and LS‑
3). The vertical bar indicates the phenon line. C;

Colombiana I, Y; Y strain, T; Tulahuen, B; Ber‑enice, S; Sao Felipe, 1; CIR, 2; JAG, 3; RF, 4; MG,
5; DG, 6; LO, 7; ARM, 8; 201 and 9; 204.
pairs, and indicates separation among groups (Steindel
et al.,

1993; Vidigal et al., 1994).

RESULTS AND DISCUSSION
The random amplified polymorphic DNA (RAPD)
patterns of AP‑PCR were compared among Paraguayan

ent from those of previous research, however, we werealso able to construct the appropriate grouping of T.
cruzi. This method is an useful technique for the classi‑

fication of T. cruzi strains without requiring muchamount of DNA.
Dice similarity coefficients between two strains
were calculated according to the method described inmaterials and methods. The construction of the
UPGMA dendrogram of Paraguayan and establishedstrains was based on the average data of the matrix ofDice similarity coefficients in the RAPD profiles with 3
primers. These strains of T. cruzi were divided into 5
distinct groups as indicated by the position of the phenonline. Of 9 Paraguayan isolates, 3 isolates (CIR, JAG andARM) were similar to the Berenice, Y and Sao Felipestrains isolated from Brazil (zyrnodeme type; Brazilian
Z2), respectively, and 4 strains (DG, 204, LO and MG)

were similar to the Tulahuen strain from Chile. There
was no Paraguayan isolate similar to Colombiana I (Z1)from Colombia in this study. The classification bypresent RAPD profiles were also paralleled to analysesof our restriction enzyme analysis previously reported(Mimori et al., 1992) and those of zymodeme analyses(Ebert, 1982; Higo et al., 1997). We were able toconstruct the appropriate grouping of T. cruzi. The
RAPD profiles were easy and convenient as a classifica‑tion of T. cruzi organisms.
It is interesting that the strains in the same groups;

isolates and established strains of T. cruzi. T. rangeli

3 strains (CIR, JAG and ARM) and 3 strains (DG, 204

and Leishmania strains. Six arbitrary primers wereand LO) were isolated from near endemic areas, respec‑tively. The ubiquity observed in the strains studied in
the work, as well as in other investigations has beentested for the amplification of parasite DNA, and three

primers (FL‑S, M‑13 and LS‑3) were found to give theclear consistent DNA fingerprinting patterns for thestrain‑comparison as shown in Figure 1. The Colom‑
biana I strain had a DNA profile very different fromthose of the others. The Y, Be enice and Sao Felipestrains were similar to each other. The DNA profile of
the Tulahuen were slightly different from the others.
There was a similar tendency of the division of Par‑aguayan and established strains among RAPD profiles

with each primer. The DNA profiles patterns of T.
rangeli and 3 Leishmania strains were completely differ‑ent from those of T. cruzi strains (data not shown) . As

well as the zymodeme analysis, RAPD was successfully

explained by the clonality criteria used mainly in studies

ernploying zymodeme techniques (Tibayrenc et al.,1984) . The fixed heterozygosity observed in several lociover time and in distant geographical areas is due to theabsence of meiotic segregation in T. cruzi populations(Tibayrenc and Ayala, 1988; Lewicka et al., 1995). In
this study, we found no correlation between the path‑ogenicity and the DNA profiles of T. cruzi strains. A
further detailed analysis for more different strains
might clarify this correlation in this country.

used for classification of T. cruzi variants (Steindel et

ACKNOWLEDGEMENTS

al., 1993; Brisse et al., 1998; Gornes et al., 1998).
Moreover, it was indicated that RAPD analyses might

the Institute of Tropical Medicine, Nagasaki University.

make a major contribution to the study of the genetics

We thank Takako Arino for her editorial assistance.

of the snail, Biomphalaria glabrata, an intermediate hostfor Schistosomiasis (Vidigal et al., 1994). Our condi‑
tions of PCR method and arbitrary primers were differ‑This work was supported in part by a grant frorn

431

REFERENCES
1 ) Avila, H., Goncalves, A.M., Nehme, N.S., Morel, C.M.

and Simpson, L. (1990) : Schizodeme analysis of
Tmpanosoma cruzi stocks from South and Central
America by analysis of PCR‑amplified minicircle vari‑able region sequences. Mol. Biochem. Parasitol., 42,
175‑ 1882 ) Brisse, S., Barnabe, C., Banuls, A.L., Sidibe, I., Noel. S.

and Tibayrenc, T. (1998) : A phylogenetic analysis of the

Trypanosoma cruzi genome project CL Brener reference
strain by multilocus enzyme electrophoresis and multi‑
primer random amplified polymorphic DNA fingerprint‑
ing. Mol. Biochem. Parasitol., 92, 253‑2563 ) Canese, A. (1978): Datos actualizados soble
conocimientos epidemiologicos de la enfermedad deChagas en el Paraguay. Revista Paraguaya de Mi‑
crobiol., 13, 3‑64 ) Canese, A., Adorno, A., Cattoni, A., De Vargas, H.,

Galeano, A. and Sanchez. A. (1972): Alteraciones
electrocardiogrficas en pacientes con immunofluores‑
cencia positiva para la enfermedad le Chages. Rev.
Paraguaya de Microbiol., 7, 15‑165 ) Carreno, H., Rojas, C., Aguilera, X., Apt, W., Miles, M.

and Solari, A. (1987): Schizodeme analysis of
Trypanosoma cruzi zymodemes from Chile. Exp. Par‑
asitol., 64, 252‑260

6 ) Dice, L.R. (1945): Measures of the amount of ecologicalassociation between species. Ecology, 26, 853‑860
7 ) Ebert, F. (1982): The identification of two main‑groupsof Trypanosoma cruzi stocks from Brazil by their isoen‑

zyme patterns of isoelectrofocusing. Tropenmed. Par‑
asitol., 33, 140‑1468 ) Gomes, M.L., Macedo, A.M., Pena, S.D. and Chiari, E.
(1998) : Genetic relationships between Trypanosoma
cruzi strains isolated from chronic chagasic patients insouthern Brazil as revealed by RAPD and SSR‑PCR
analysis. Acta Trop., 69, 99‑109
9 ) Higo, H., Yanagi, T., Matta, V., Agatsuma, T., Kanbara,
H., Tada, I., De Leon, M.P., Monroy, C. and Tabaru, Y.
(1997) : Genetic Structure of Trypanosoma cruzi in Cen‑

tral America and its comparison with South America
strains. Inter. J. Parasitol., 27, 1369‑1374

10) Lewicka, K., Breniere, S., Barnabe, C.. D det, J.P. andTibayrenc, M. (1995): An isoenzyme survey of
Tmpanosoma cruzi genetic variability in sylvatic cycles
from french guiana. Exp. Parasitol., 81, 20‑2811) Miles, M.A., Povoa, M., Prata, A., Cedillos, R., DeSouza,

A.A. and Macedo, V. (1981): Do radically dissimilar

Trypanosoma cruzi strains (zymodemes) cause Ven‑ezuelan and Brazilian forms of Chagas' disease? Lancet,
8234, 1338‑1340

12) Miles, M.A. and Cibulskis, R.E. (1986): The heter‑
ogeneity of Trypanosoma cruzi zymodeme characteriza‑tion of Trypanosoma cruzi. Parasitol. Today, 2, 94‑97

13) Mimori, T., Maldonado, M., Samudio. M., Rojas deArias, A., Moreno, R. and Sakamoto, M. (1992) : Charac‑terization of Trypanosoma cruzi isolates from Paraguay,using restriction enzyme analysis of kinetoplast DNA.
Annal. Trop. Med. Parasitol., 86, 231‑237
14) Mimori, T., Sasaki, J., Nakata, M., Gornez, E.A., Uezato,
H., Nonaka, S., Hashiguchi, Y., Furuya, M. and Saya, H.
(1998) : Rapid identification of Leishmania species fromformalin‑fixed biopsy samples by polymorphism‑spe‑
cific polymerase chain reaction. Gene, 210, 179‑186
15) Rojas de Arias, A.. Monzon, M.1., Velazques, G., Guillen,

E. and Torreani, T.N. (1984): A seroepidemiologic sur‑vey of Chagas' disease in two Paraguayan villages. Bull.

Pan Am. Heal. Org., 18, 164‑171
16) Steindel, M., Neto, E.D., De Menezes, C.L.P.. Romanha,

A.J. and Simpson, A.J.G. (1993): Random amplified

polymorphic DNA analysis of Trypanosoma cruzi
strains. Mol. Biochem. Parasitol., 60, 71‑80
17) Tibayrenc, M., Echalar, L.. Dujardin, J.P., Poch, O. and
Desjeux, P. (1984) : The microdistribucion of isoenzymic

strains of Trypanosoma cruzi in southern Bolivia; newisoenzyme profile and further arguments against Men‑delian sexuality. Trans. R. Soc. trop. Med. Hyg., 78, 519‑52518) Tibayrenc, M. and Ayala, F.J. (1988) : Isozyrne variabil‑
ity in T. cruzi, the agent of Chagas disease: Genetical,

toxonomical and epidemiological significance. Evolu‑tion, 42, 277‑292

19) Vidigal, T.H.D.A., Neto, E.D., Carvalho, O.D.S.C. andSimpson, A.J.G. (1994): Biomphalaria glabrata: Exten‑
sive genetic variation in Brazillian isolates revealed byrandom amplified polymorphic DNA analysis. Exp.
Parasitol., 79, 187‑194

J pn. J

433

Trop. Med. H yg ., Vol. 27, No. 3, 1999, pp. 433 436

ISOLATION FREQUENCY OF ENTEROPATHOGENSFROM PEDIATRIC DIARRHEAL STOOL IN
SURABAYA, INDONESIA= A FIVE YEARHOSPITAL BASED STUDYEDDY BAGUS WASITO*, PITONO SOEPART02, SUBIJANTO MARTO SOEDARMO LIEK SUNARNl D JUPR12,
LlNDAWATI ALIMSARDJONO*'3, DADIK RAHARDJ03, NOBUMASA KATAOKA4,*

AND NOBORU NAKASONE5
Received April 16, 1999/Accepted June 8, 1999

Abstract: In order to increase our knowledge of the epidemiology for our patient population, we retrospec‑tively analyzed the data obtained from stool samples received at Tropical Disease Research Center,
Airlangga University during a five year period. Isolation frequency of enteropathogens from diarrheal stools
from 1993 to 1997 were examined in Surabaya, Indonesia. A total of 1,477 hospitalized pediatric patients
under 2 years of age with acute diarrhea were enrolled. Bacterial enteropathogens other than Campylobacter
jejuni and Clostridium dlfficile were positive cumulatively in 1,086 cases out of 1,477 (73.5%) , and the annual

isolation frequency ranged from 61.1% to 82.4%. Rotavirus was detected cumulatively in 408 cases out of
1,184 examined (34.5%) , and 210 cases of 408 (51.5%) were co‑infected with diarrheagenic Escherichia coli.
Generally, diarrheagenic E. coli were dominant isolates (53.8%) while Vibrio cholerae Ol, Aeromonas
hydrophila. Salmonella spp. and Shigella spp. were also isolated from the patients with lower frequencies.
Key words: isolation frequency, enteropathogens, diarrheal stool, Surabaya, Indonesia

1981; Serichantalergs et al.. 1997). From these view‑

INTRODUCTION

points, diarrheal disease should be regarded as a global

Diarrhea remains a frequent disease worldwide,with attack rates estimated to be from 2 to 12 or morediarrheal episodes per person annually (Bern et al..
1992). It was the first leading cause of death among

young children in developing countries until 1980s.
Although the mortality of diarrheal disease in the past

health problem. In order to increase our knowledge ofthe epidemiology for our patient population and monitor
the situation of diarrheal diseases in Surabaya, weretrospectively analyzed the data obtained from stool
samples received at Tropical Disease Research Center,
Airlangga University during a five year period.

decade appears to be decreasing because of intensive

world wide promotion of Primary Health Care (PHO

MATERIALS AND METHODS

activities including the enhancement of oral rehydration

therapy (ORT) , it still remains as a major cause ofdeath among young children in these areas. About 3.3
million children younger than 5 years die each year fromdiarrhea (Bern et al., 1992).

Moreover, about 10%‑50% of tourists to the Third
World develop traveler's diarrhea (Echeverria et al.,

2
3
4

5

*

Patients: A total of 1,477 patients with acute diarrhea at

Dr. Soetomo Hospital in Surabaya during the period
from January 1993 to December 1997 were examined.
They were children under 2 years of age and wereadmitted to the hospital.

Specimens: Stool samples were taken before giving

Department of Microbiology, Faculty of Medicine, Airlangga University
Department of Child Health School of Medicine Airlangga University
Tropical Disease Center, Airlangga University
Faculty of Health Science, Kobe University School of Medicine
Department of Bacteriology, Faculty of Medicine, University of the Ryukyus

Correspondence: Dr. NOBUMASA KATAOKA, Faculty of Health Science, Kobe University School of Medicine, 7‑10‑2
Tomogaoka, Suma‑ku, Kobe 654‑0142, Japan
(654‑0142

i f

j

J E 7‑10‑2

i;

‑

‑ 1

;{

‑ *

;t l

l IE:)

434

Table I Isolation frequency of enteropathogens
1993

1994

1995

1996

1997

No. (%)

No. (%)

No. (%)

No. (%)

No. (%)

No.

examined
No. pathogen
positiveNo. pathogen
negative

Diarrheagenic
E. coli

Total ( % )

461

303

250

144

319

1 , 477351 (76 . 1)

234 (77 . 2)

206 (82 . 4)

88 (61 . 1)

207 (64 . 8)

1 , 086 (73 . 5)

110 (23 . 9)

69 (22 . 8)

44 (17 . 6)

56 (38 . 9)112 (35 . 2)

391 (26 . 5)292 (63 . 3)

185 (61 . 1)

164 (65. 6)

60 (41 . 7)

93 (29. 2)

794 (53 . 8)

Shigel la

32 (6.9)

20 (6.6)

21 (8. 4)

5 (3.5)4 (1. 3)82 (5. 6)

Sal monel la

35 (7.6)

13 (4.3)

4 (1. 6)64 (4. 3)

Aeromonas

13 (2.8)

5 (1.7)

O

(o)

O (O)
O (O)

12 (3. 8)(o)

18 (1. 2)

V. cholerae O1

32 (6.9)

19 (6.3)

. 8)

27(10

4 (2.8)

. 9)

6 (1

88 (6. O)

K. oxytoca

10 (2.2)

5 (1.7)6 (2. 4)5 (3.5)5 (1. 6)31 (2. 1)

antibiotics. Self medication prior to visiting the hospital

could not be completely excluded. An appropriate
amount of stool was collected in a plastic container.

Microbiological examinations: The target bacteria for
isolation from all patients were Vibrio. Aeromonas.

O(73.5%) , and the annual isolation frequency are shownin Table 1. Diarrheagenic E. coli (DEO were isolated
from more than half of specimens examined (53.8%).
The isolation rate of DEC among pathogens was 73.0%.
Shigella spp., Salmonella spp., Aeromonas spp. andSalmonella. Shigella. E. coli and Klebsiella oxytoca. Ten

V. cholerae O1 were also isolated with lower frequencies

fold dilution of stool samples were made in sterileof 7.6%, 5.8%, 1.7% and 8.1%, respectively. Rotavirus
was detected cumulatively in 408 pediatric diarrhea
cases out of 1,184 examined (34.5%), however, diarr‑
heagenic E. coli were also isolated cumulatively from210 cases of the 408 (51.5%) with rotavirus‑positive
diarrhea. The annual detection rates of rotavirus areshown in Table 2.

normal saline solution, and one loopful of the dilution
was 'streaked on to Thiosulphate Citrate Bile salt Su‑

crose agar (TCBS agar, Eiken) , Salmonella‑Shigellaagar (SS agar, Eiken) and modified Drigalsky medium(BTB agar, Eiken) . The colonies grown on agar plates
were identified by routine laboratory tests. For thedetection of Rotavirus; the stools were diluted ten times

in buffer solution and were centrifuged and a drop of
supernatant was mixed with a drop of anti‑rotavirus
antibody sensitized latex (Biomerieux) on a slide glass.

RESULTSDISCUSSION
The isolation rate of enteropathogens from diarr‑
heal stools is largely dependent on the effort of theperson conducting the examination. In well conductedstudies, the isolation rates of bacterial enteropathogens

Enteropathogenic bacteria wereisolated
cumulatively from 1,086 cases out of 1,477 exarninedfrom diarrheal stools in developing countries have beenreported as about 40 to 60% (Adkins et al., 1987;

Table 2 Detection rate of rotavirus

Total
(%)

1993

1994

1995

1996

1997

(%)

(%)

(%)

(%)

(%)

No. examined

168

308

250

144

319

1 , 184

No. ratavirus

56 (33 . 3)

95 (31 . 4)

71 (28 . 4)

52 (36 . 1)

134 (42. o)

408 (34 . 5)

43 (76 . 8*)

61 (64 . 2*)

43 (60 . 6*)

22 (42 . 3*)

41 (30 . 6*)

210 (51 . 5*)

positiverotavirus and DEC
both positive

DEC: diarrheagenic E. coli.
The percentages of DEC positive cases among rotavirus positive cases.

435

lwanaga et al.. 1993; Kain et al.. 1991; Rohner et al.,uous monitoring f or etiologic agents of diarrheal dis‑

1997; Siddique et al.. 1992).

eases (Albert et al.. 1993; Ramamurthy et al.. 1993).

The present study revealed the isolation rate of
73.5%. And it may be possible to increase the isolation
rate by using enrichment media such as Selenite‑F brothfor Salmonella, alkaline peptone water for Vibrios, andampicillin blood agar for Aeromonas. Adkins et al.
(1987) reported that approximately 60% of Salmonella

ACKNOWLEDGEMENT
And also to Sugeng Harijono, Wahyu Hidayatining‑
sih and Sarah Wuryani who helped in conducting labora‑
tory work and administration.

isolates were obtained only after enrichment (Adkins etal.. 1987).

REFERENCES

Three to four colonies of E. coli isolated from eachsample were examined only for their serogroup based1 ) Adkins, H.J., Escamilla, J., Santiago, L.T., Ranoa, C.,enteropathogenicities in the present study. Therefore, if

Echeverria. P. and Cross, J.H. (1987) : Two year survey

enterotoxin production was examined, the isolationof etiologic agents of diarrheal diasease at San Lazaro

frequency of pathogens would be higher than the present

Hospital, Manila, Republic of the Philippines. J. Clin.

report. However, it should be noted that serogroup

Microbiol., 25, 1143‑1147

based enteropathogenicities are not necessarily compat‑
ible with the real pathogenicities. Therefore, if gene
analysis such as detection of eaeA, bfp, and lpaH for
enteropathogenic E. coli and enteroinvasive E. coli werecarried out, the isolation frequency of pathogens would2 ) Albert, M.J., Siddique, A.K., Islam, M.S., Faruque, A.S.

G., Ansaruzaman, M., Faruque, S.M. and Sack. R.B.
(1993): Large outbreak of clinical cholera due to Vibrio

cholerae non‑OI in Bangladesh. Lancet, 341, 704
3 ) Barbut, F., Leluan. P., Antoniotti, G., Collignon, A.,

go dows. Recently, Rohner et al. (1997) reported an

Sedallian, A. and Petit, J.C. (1995): Value of routine

isolation rate of 8.8% for total of 3 genera (Salmonellastool cultures in hospitalized patiens with diarrhea. Eur.

spp., Shigella spp. and Campylobacter spp.) from 3,837

stool samples originating from pediatric patients in
Switzerland. Although the pediatric cases were not

J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 14, 346‑349
4 ) Bern, C., Martines, J., de Zoysa, I. and Glass, R.1. (1992):

separately analysed, Campylobacter revealed the highest

The magnitude of the global problem of diarrheal dis‑ease: A ten‑year update. Bull. W.H.O., 70, 705‑714

isolation rate in total of 13,965 samples from 7,124

5 ) Echeverria, P., Blacklow, N.R., Sanford, L.B. and Cukor,

patients including adult cases (Rohner et al.. 1997).

G. (1981): Traveller's diarrhea among American peace

In the present study, DEC was predominant isolates
whereas the isolation rate for Shigella spp., Salmonella
spp. were 5.6% and 4.3% respectively, yielding a cumula‑

corps volunteers in rural Thailand. J. Infect. Dis., 143,

767‑771
6 ) Fujita, Y. (1990): Rotavirus infection ‑Clinical symp‑

tive isolation rate of 9.9%. Shigella spp., Salmonella spp.

toms and influence of climate. J. Jpn. Assoc. Infect. Dis.,

and Campylobacter spp. are known to cause mainly
community‑acquired diarrhea (Barbut et al.. 1995).
And rotavirus may cause both community‑acquired and7 ) Iwanaga, M., Nakasone, N., Nakamura, S., Wasito, E.B.,

nosocomial diarrhea, with the latter being a particularcause of diarrhea in children (Iwanaga et al.. 1993).

64, 1255‑1263

Soeparto, P., Sudarmo, S.M., Soewandojo, E. and Ranuh,
I.G.N.G. (1993) : Etiologic agents of diarrheal diseases in

Surabaya, Indonesia. Jpn. J. Trop. Med. Hyg., 21, 143‑

Rotavirus was detected cumulatively in 34.5% of infan‑
tile diarrhea during 5 years study with no definite sea‑

8 ) Haffejee, I.E. (1995): The epidemiology of rotavirus

sonal variation. This epidemiological feature is ininfections: a global perspective. J. Pediatr. Gastroenter‑

contrast to that in Japan where the epidemic of rotavir‑
us infection is concentrated in the first 3 months of theyear (Fujita, 1990) . The reason for this epidemiological9 ) Kain. K.C., Barteluk, R.L., Kelly, M.T., Xin, H., Hua, G.

147

ol. Nutr., 20, 275‑286

D., Yuan, G., Proctor, E.M., Byrne, S. and Stiver, H.G.

(1991): Etiology of childhood diarrhea in Beijing,

contrast is of great interest in the field of tropical
medicine and public health. More than one half of thecases with rotavirus infection were also infected withanother enteropathogens. The pathogenic role of micro‑organisms in the dual infection is obscure.

10) Ramamurthy, T., Garg, S., Sharma, R., Bhattacharya, S.

The recent emergence of a new serovar of non‑Ol

gence of novel strain of Vibrio cholerae with epidemic

Vibrio cholerae in India suggests the necessity of contin‑

potential in southern and eastern India. Lancet, 341,

China,. J. Clin. Microbiol., 29, 90‑95

K., Nair, G.B., Shimada, T., Takeda, T., Karasawa, T.,

Kurazono, H., Pal, A. and Takeda, Y. (1993): Emer‑

436

703‑704
11) Rohner, P., Pittet, D., Pepey, B., Nije‑Kinge, T. and

Auckenthaler, R. (1997): Etiological agents of infec‑
tious diarrhea: implications for requests for microbial
culture. J. Clin. Microbiol., 35, 1427‑1432
12) Serichantalergs, O., Nirdnoy, W., Cravioto A.. LeBron,

C., Wolf, M., Svennerholm, A.M., Shlim, D., Hoge, C.W.

and Echeverria, P. (1997): Coli surface antigens as‑sociated with enterotoxigenic Escherichia coli strains
isolated from persons with traveler's diarrhea in Asia. J.

Clin. Microbiol., 35, 1639‑1641

13) Siddique, A.K., Zaman, K., Baqui, A.H., Akram, K.,
Mutsuddy, P., Eusof, A., Haider, K., Islam, S. and Sack,

R.B. (1992): Cholera epidemic in Bangladesh: 1985‑
1991. J. Diarroeal Dis., 10, 79‑86

VOl、27NO．3 SEPTEMBER1999
CONTENTS

Review
Hotta，S．

Antidengue

Original

Vaccine＝Retrospect

andProspect（inJapanese）

一397−415

articleBustos，D．G．，Olveda，R．M．，Negishi，M．and

Evaluation

againstofaStandard

New

Rapid

Blood

Diagnostic

Kurimura，T．

Test

DetermineTM

Film∫（〕T〃iα伽吻P∫TM

andMalariaPf

PαrαSightTM

F一・・417−425Baba，S．，Matsumoto，T．，Kanbara，H．，Sakamoto，M．，Maldonado，M．，
Rojas

de

Arias，A．，Saya，H．and

Comparative

Study

of

Mimori，T．

Random

Tゆ伽oso㎜on廊Isolates

AmplifiedfromPolymorphic

DNA

of

Paraguay一一

一427−431

Wasito，E．B．，Soeparto，P．，Soedarmo，S．M．，Djupri，L．S．，Aimsardjono，L，Rahardjo，D．，Kataoka，N．and
Isolation

Frequency

Stool

Surabaya，Indonesia：ainofNakasone，N．

Enteropathogens
Five

from

Year

Pediatric

Hospital

Diarrheal

Based

Study

・……・

・・433−436