35 jPOSTdb: COVID-19データベースの構築

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トーゴーの日シンポジウム2021○吉沢明康1)、守屋勇樹2)、小林大樹3)、張智翔4)、奥田修二郎5)、田畑剛1)6)、河野信2)7)、幡野敦3)、高見知代3)、
松本雅記3)、山ノ内祥訓8)、荒木令江4)、岩崎未央6)、杉山直幸1)、福島敦史9)、田中聡10)、五斗進2)、石濱泰1)
1)京都大学大学院薬学研究科 2)情報・システム研究機構 データサイエンス共同利用基盤施設 ライフサイエンス統合データベースセンター
3)新潟大学大学院医歯学総合研究科 4)熊本大学大学院生命科学研究部 5)新潟大学医学部メディカルAIセンター 6)京都大学iPS細胞研究所
7)富山国際大学現代社会学部 8)熊本大学医学部附属病院 9)理化学研究所環境資源科学研究センター 10)Trans-IT

COVID-19とプロテオーム解析
COVID-19への対策には、ウイルス・宿主間相互作用などタンパク質レベルでの理解が必須である。
このためには、プロテオーム解析の有用性・重要性

jPOSTと再解析によるデータベース化
jPOSTはこのような問題に対応することを当初から念頭に置いて開発が行われてきたプロジェクトであり、リポジトリ部分 (jPOSTrepo) で収集した生デーが高いが、質量分析を用いたプロテオーム解析にはタを、独自の統一的な基準に基づいて再解析し、そ• 実験系によってデータの意味が変化し得るの結果をデータベース (jPOSTdb) に収録している。

• 他のオミクス解析と異なった手続き（p-valueを用い今回我々はそのリソース（再解析・jPOSTdb）を利ない、target-decoy法という独自の方法）でFalse用して、複数のCOVID-19研究の公開データを再解析

Discovery Rate (q-value)を計算するした。得られた結果は、特徴を閲覧しやすい形でのなどの特徴があり、また実験系によってq-valueの基準データベース化を進めている。

が異なることもあるため、結果の単純な比較や他オミクスデータとの統一的な解釈が難しい。

https://jpostdb.org/

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トーゴーの日シンポジウム2021

jPOSTの構成

今までに寄託されたデータ（2021年9月1日現在）：• 約79,400ファイル（34.6TB）・170生物種• 1,044プロジェクト中633プロジェクトが公開•［利用方法解説文献］Watanabe, Y., Yoshizawa, A.C., Ishihama, Y.
and Okuda, S. The jPOST Repository as a Public Data Repository for
Shotgun Proteomics. Methods in Molecular Biology, 2259, Chapter
20: 309-322 (2021) [PubMed: 33687724] [doi: 10.1007/978-1-0716-1178-4_20]

https://jpostdb.org/

すべてのデータを統一的な方法で解析• ピーク検出：MaxQuant• データベース検索：MaxQuant, X!Tandem, Comet• UniScore（旧名 jPOST score、論文執筆中）を用いて、3エンジンからの結果を統合• q-value≦1%を満たすペプチドのみを用いる

生データのプロジェクトごとに結果を管理• 各プロジェクトごとの結果 (Slice)• それらの全体集合 (Globe)• Sliceは自由にGlobeから抽出し、組み合わせて結果表示ができる• メタデータを使ってSliceを検索

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トーゴーの日シンポジウム2021• メタデータの整備（例）COVID-19のプロテオーム解析データ( https://www.ebi.ac.uk/pride/archive/projects/PXD017710 )COVID-19の解析データは（現時点では）jPOSTにはRaw files were analyzed using Proteome Discoverer (PD) 2.4 software (ThermoFisher Scientific).
Spectra were selected using default settings and database searches performed using SequestHT
node in PD. Database searches were performed against trypsin digested Homo Sapiens
SwissProt database, SARS-CoV-2 database (Uniprot pre-release) and FASTA files of common
contaminants (`contaminants.fasta` provided with MaxQuant) for quality control. Fixed
modifications were set as TMT6 at the N-terminus and carbamidomethyl at cysteine residues.
One search node was set up to search with TMT6 (K) and methionine oxidation as static
modifications to search for light peptides and one search node was set up with TMT6+K8 (K,+237.177), Arg10 (R, +10.008) and methionine oxidation as static modifications to identify heavypeptides. Searches were performed using Sequest HT. After search, posterior error probabilities
were calculated and PSMs filtered using Percolator using default settings. Consensus Workflow
for reporter ion quantification was performed with default settings, except the minimal signalto-noise ratio was set to 5.

寄託されていないため、ProteomeXchange加盟リポジトリに寄託されたデータを用いた。
• 〔方針〕各プロジェクトのメタデータをjPOST形式にjPOST形式メタデータリポジトリで公開されていた研究プロジェクト：20件• うち、再解析プロトコルで対応できる（解析可能な）

この変換作業はマニュアルでプロジェクト：10件

https://jpostdb.org/

多いが、COVID-19の場合は論文↓〔変換〕• 2020年7月時点で、生データがProteomeXchange加盟

国際標準のプロテオームデータリポジトリの連携組織（加盟6件、オブザーバー1件）（jPOSTは2016年7月加盟）

Methodのコピーであることが未発表であるケースも多い）

変換し、jPOST再解析プロトコルに流し込む• COVID-19のプロテオーム解析・生データが公開されている（主に英PRIDE。一部は米MassIVE、中IProXにも）• ただしメタデータは文章記述形式

文章形式のメタデータ（論文の（人手で）進める•

検索パラメータ設定
原則としてオリジナルと同一であるが、• データベース検索のための配列データベース
SARS-CoV-2 :Nextstrain (https://nextstrain.org/) 収録変異

以下の2点は（jPOST再解析プロトコルに（2020年7月20日時点）をすべて反映（13,555配列）

したがって）変更している：

human :• mass tolerance: プレサーチして決定

Chlorocebus sabaeus（ミドリザル）:

Swiss-Prot + isoform (release2020_06)（42,383配列）
UniProt reference• missed cleavage number: 1 or 2（リン酸化の場合） proteome (release2021_01) （19,229配列）

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35 jPOSTdb: COVID-19データベースの構築得られた結果とデータベース（開発中画面）

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トーゴーの日シンポジウム2021

データセット（プロジェクト）のリスト

Click
そのデータセットで同定された
SARS-CoV-2のタンパク質のリスト

そのタンパク質中の同定されたペプチドの個数

Click

•

q-value≦1%である配列として、5,018,134個のPSM (Peptide –Spectrum

タンパク質配列に同定ペプチドをマッピング
変異 (SAAV)
マッピング-Match) が得られた。
•この結果を基に、重複のないペプチドのリストを取得した。

https://jpostdb.org/

同定ペプチド情報••

jPOSTdbの既存の機能を用いてウイルスタンパク質の視点から情報を要約した。
宿主タンパク質との相互作用情報などの表示機能を追加中。

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35 jPOSTdb: COVID-19データベースの構築
収録データの内容の例（再解析の効果）(A) 両解析結果のペプチド総数比較

データベース検索条件（オリジナル論文）：• 酵素条件 … Trypsin• Missed cleavage number (mc) <=2• PSMの結果に対してq-value<=1%

1000

1,839
8.6%

オリジナル結果

データベース検索条件（jPOST再解析）：• 酵素条件 … Trypsin/P• mc <=2• PSM (q-value<=1%)からUniqueなペプチドのリストを作成、再度q-value<=1%（次ページ）同定ペプチド上のリン酸化サイトの存在をPhosPep Analyzer [2] で検証し、その結果をオリジナルと比較した。

n=16,384

4,935
23.1%
jPOST
n=19,480(A) 同定されたペプチドのアミノ酸配列と修飾の種類・個数ごとにカウント。
なおjPOSTでは「修飾同一種類個数・サイト違い」の結果も得ている（n=27,171）。

（オリジナルの結果は、公開データを基に再描画したもの）

https://jpostdb.org/

14,54568.2%

Unique peptide count

解析条件
実験条件：
• 試料 … ヒト培養細胞 (Caco-2) ・SARS-CoV-2• 酵素消化 … Trypsin+Lys-C

Uniquein original study
オリジナル結果のみに存在
両結果共通
Common800

Uniquein jPOSTjPOST再解析結果のみに存在
600

4002000

再解析によって、長い（＝信頼性の高い）ペプチドが、より多数同定された。
文献：[1] Klann et al., Molecular Cell 80, 164 (2020)[2] Nakagami et al. Plant Physiol. 153, 1161 (2010)

トーゴーの日シンポジウム2021(B) 両解析結果のペプチド長ごとの比較

1200

PXD018357（ウイルス感染ヒト細胞のリン酸化プロテオーム）の再解析結果を、オリジナル
論文[1]の解析結果と比較した。

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6

8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50

Peptide length(B) (A)と同じ条件で、アミノ酸配列の長さごとにカウント。UniScoreは短いペプチドには不利に働くので、結果の個数が減る。特に配列長≦6の結果はすべて除外されている。

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35 jPOSTdb: COVID-19データベースの構築(C) 発現量に変化のあったリン酸化ペプチドと同定されたリン酸化サイトの個数比較(D) リン酸化サイトの比較

オリジナル (Mol Cell) の結果

jPOST再解析の結果

n = 858n = 2,323
FC < -1, p < 0.05 FC > 1, p < 0.05

n = 1,490
n = 3,476
FC < -1, p < 0.05 FC > 1, p < 0.05

Fold Change

修正p値

P0DTC3 (ORF 3a)
TMM

1TMM

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トーゴーの日シンポジウム2021

Y264
T248 T268
S252 S272

P0DTC5 (M) (ORF 5)

P P P

P P

TMM

T172 S212
S173 S213
S177

TMM

1275

TMM

P P

P P

16,714 phosphopeptides

127,171 phosphopeptides
PPPPP

27

オリジナル
結果のみ

PhosPep Analyzerによって確認されたペプチド27,171本から同定

https://jpostdb.org/

P

P P P

180

251

364

419

S201
S186 ?
S202
S187
S180
T205
S188 S197
S183
S206
T198
S190
S184
PPP

P P

P

PP

P

P P

P P

両結果共通

jPOSTのみ180? … オリジナル論文には記載なし、同補足データには記載あり「確率≧75%」のペプチド
15,186本から同定

P

222

S412
S413
T417

T141 T176
T166

P P P

P P

TMM

P0DTC9 (N) (ORF 9)

S23
T76
S26
S78
S33
S79

P

再解析による同定結果は、より高精度と考えられる。

本研究・開発は科学技術振興機構(JST)・バイオサイエンスデータベースセンター(NBDC)による統合化推進プログラム予算によって実施した。

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