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士心

目両
伽

昭和57年12月15日

内
原

雑岬

会㎞
学融
医綱
帯田

熱畑
本鱗

日J

第10巻第3，4号

O304−2146、

容著
トキソプラズマ免疫マウス血清由来加水分解物質（HS・LKs）の異種細胞内トキソプ
ラズマ殺滅効果（英文）・・桜井 治久，佐藤 基佳，一広瀬 恒夫，小俣 吉孝，斉藤 篤志，鈴木 直義

京都鰐勲欄鰍鷺鷺空柵町撫熱照岩城操

183−195

・197−205

蛇毒の酵素化学的研究（第11報），タイワンハブ毒よりアルギニンエステル水解酵素（ME・4）の精製およびその性質

一杉原

久義，鬼頭

玲子，二改

俊章，酒井

恵美

207−217

常時照明および常時暗黒条件飼育におけるフィラリアゑ加∫θ磁の中間宿主アフリカ産

ダニ07勉！ho40m3卿o％加 4の生活環について
・・水野不二男・野上 貞雄・圓橋 正秀・松村 武男
亜熱帯人と温帯人との高温曝露時の生理的反応の比較（英文）・｝………………・………堀清記，飯塚平吉郎，中村

219−227

正229−237

グァテマラのオンコセルカ症流行地における4種のブユの牛に対する吸血活動の日周性について（英文）………一……・一橋口 義久，多田功，Flores C．q高岡 宏行

239−244

ピオチン，アビジン，ペルオキシダーゼ法（免疫酵素抗体法）による狂犬病ウイルス
感染価の迅速演定法とそのウイルス中和抗体測定への応用（英文）…七條明久，三舟求真人，林慧君

245−251

学術記録
日本熱帯医学会九州支部第5回大会講演要旨・…・………一…

日熱医会誌Japan．」．T．M．H．

日

本熱帯医学会253−260

Japan. J. Trop. Med. Hyg., Vol. 10, No. 3, 4, 1982, pp. 183‑195

183

MICROBICIDAL ACTIVITY OF HYDROLYZEDTOXOPLASMA IMMUNE MOUSE SERUM (HS‑LK*) IN
HETEROLOGOUS CELL CULTURES
HARUHISA SAKURAI, MOTOYOSHI SATO*, TSUNEO HIRosE*
YOSHITAKA OMATA**, ATSUSHI SAITO AND NAOYOSHI SuzUKll)
Received for publication March 23 1982

Lymphokines (Spl‑LKS) capable of inhibiting toxoplasma multiplication in ho‑mologous cell monolayers in vitro exist in the supernatant of spleen cells from toxo‑

plasma immune animals incubated either with toxoplasma lysate antigen (TLA),
or with non‑specific mitogens (4, I O, 1 2‑15). Contained in the Spl‑LKs is a toxo‑
plasma growth inhibitory factor, Toxo‑GIF ( 1 5), approximately 30,000 to 40,000
m. w., which inhibits toxoplasma multiplication in homologous but not in hetero‑
10gous cells, thus showing species specificity (IO).

Recently, circulating interferon (IFN) has demonstrated antiviral activity not
only in homologous but also in heterologous cells ( I , 2). In the authors' previous
reports ( 1 1 , 1 2, 1 8), the activity of gamma‑interferon (IFN‑r) in the circulation of

toxoplasma immune animals reached its maximum after 6 h while the Toxo‑GIF
activity peaked 24 to 48 h after TLA injection. The relationship of Toxo‑GIF to
IFN‑r, both of which are found in the same serum, had not yet been clarifled.

Based on the above observations, an attempt was made to determine whether
immune serum, chemically hydrolyzed to its low‑molecular components via enzymes
and acid‑alkaline hydrolysis, would inhibit toxoplasma multiplication not only inhomologous but also in heterologous cells. It also aimed at detecting IFN activity
from the same hydrolyzed samples.

MATERIALS AND METHODS
Mice and Toxoplasma strain used: Inbred Balb/c nu/+ and nu/nu mice were usedin the experiments. They were inoculated intraperitoneally (i.p.) with I OO tachy‑zoites of the S‑273 (swine origin) strain of Toxoplasma gondii. They were challenged
i.p. with I ,OOO tachyzoites of the same strain 4 wks after the I st inoculation. They
were further challenged with I OO tachyzoites of the RH strain 4 wks postinfection inorder to obtain hyperimmune mice which served as donors of immune spleen cells.

The immune mice were injected i,p. with TLA, 100 pg per mouse, 2 wks after the
Departments of Veterinary Physiology and Radiology*, Obihiro University, Obihiro. Hokkaido,
and **School of Basic Medicine, Tsukuba University, Ibaraki, Japanl ) This study was supported in part by Grant No. 5440 1 4 from the Scientific Research Fund of theJapanese Ministry of Education, Science and Culture1 84

last infection. Blood was collected 6 or 24 h after the TLA injection i.p. and theserum separated. The serum was then examined to see if it possessed inhibitory
effects on intracellular toxoplasma multiplication similar to that of Spl‑LKs derived
from immune spleen cells.
Preparation of Toxoplasma lysate antigen (TLA) : TLA was prepared by the methodof lgarashi et al. (4). Cell‑free toxoplasma tachyzoites of the RH strain were ob‑tained from the peritoneal cavities of mice infected 2 days before, and washed with
Hanks' balanced salt solution (HBSS) by centrifugation. After washing, 10 volumesof sterile distilled water were added. The resulting suspension was sonicated with anultrasonic vibrator (100 w Kubota, Model 200, Tokyo) for 3 min and kept at 4'C
for 24 h. The lysate antigen extract was centrifuged at l0,000 rpm for I h. The
supernatant was mixed with an equal volume of I .70/0 NaCl. The total protein con‑tent of TLA was estimated by the Lowry method (8) using bovine serum albumin
fraction V as a standard.
Cell monolayers: Adult mice and guinea pigs were injected i.p. with sterile 0.20/0
glycogen saline solution. Five days later, peritoneal exudate cells containing macro‑phages were harvested by washing the peritoneal cavity with heparinized HBSS.
After washing by centrifugation (1,200 rpm for 5 min), the resulting sediments weresuspended to a concentration of I x 107 nucleated cells/ml in TC‑199 medium con‑taining 100/0 heat‑inactivated calf serum (CS), penicillin (lOO units/ml) and strep‑

tomycin ( I OO pg/ml). This medium is referred to as TC‑199‑CS throughout theexperiment. One ml of the suspension was placed on a multidish tray (FB‑16‑24,
Limbro Chemical Co., Chicago) containing a round coverslip in each dish and in‑cubated at 37'C for 4 h in the air with 50/0 C02' After 4 h of incubation, nonad‑
herent cells were removed by repeated washings and the cultures reincubated over‑night. Thereafter, they were rinsed with TC‑199‑CS and used as macrophagemonolayers for the assay of microbicidal activity. Approximately 980/0 of the cells
remaining on the coverslips could rapidly phagocytize carbon particles. Bovine andcanine monocyte monolayers were prepared in a similar fashion by the method of
Ishimine et al. (6).

Mouse kidney c.ell monolayers were prepared by removal offat and fibrous tissue
from the kidney and placed in HBSS in a petri dish for I h at 4'C. After additionof 40 ml of 0.250/0 trypsin, the homogenized tissue was kept at 37'C for 40 min, withstirring. It. was then filtered through a glass fiber column and centrifuged at 1,500rpm for 10 min. The pellet was washed 3 times with heparinized HBSS and ad‑justed to a final concentration of 5 >< 105 nucleated c̲ells/ml. One ml aliquots of thesuspension were depos ited onto glass coverslips in multidish trays and kept in a C02

incubator at 37'C for 5 days. Likewise, monolayers of human heart cells (Girardi
hea.rt cells, 03‑085 Iine, Flow Lab. Inc. USA) was prepared by the same method as
used for the other cell monolayers.
Interferon assay (IFN) : IFN wa,s assayed by the plaque reduction method using
a continuous cell line ofmouse L cells (clone 929) and vesicu]ar stomatitis virus (VSV)

as challenge̲ virus ( 1 7). To the mouse L cell monolayers formed in 60‑mm petri
dishes, 3 ml of a twofold serial dilution of the sample in minimal essential medium
containing 40/0 CS(MEM‑40/0CS) was added and incubated at 37'C for 18‑24 h in a

185

C02 mcubator. The monolayers then were washed twice with the same medium
and challenged with 100‑200 plaque forming units of VSV for 60 min. Afterwards,
MEM‑20/0CS and I o/o agar were overlaid in each dish. The plates were reincubatedfor 40‑48 h. The second overlay was done with MEM‑40/0CS‑0.80/0 agar andneutral red. Plaques were counted 4 h later. The IFN titer was determined byplotting the percentage of inhibition against different dilutions on a sheet of probit

paper. It was expressed as the reciprocal of the dilution of the sample which had
reduced the plaque count to 500/0 of the control plaque count. A standard reference
IFN sample was included in each assay. It varied in titer within a; twofold range.
One unit of IFN in this assay was equivalent to 6 units of the reference mouse IFN
standard (G 002‑904‑5 1 1 ) provided by the National Institutes of Health, Department
of Health, Education and Welfare, Bethesda, Md., U. S. A. To differentiate regular
IFN (IFN‑a and IFN‑p) from IFN‑r, the sample was diluted to I : 16 with MEM anddialyzed against glycine‑hydrochloric acid buffer, pH 2, at 4'C for 24 h. Since the
IFN activity disappeared from the sample, it was suggested to be that of IFN‑r.
Furthermore, this activity was not influenced by heating in a water bath at 56'C for
60 min. These results lend support to the concept of previous aut,hors (7, 16, 19).
Preparation of hydrolyzed serum (HS‑LKS) and hydrolyzed spleen lymphokines (HSpl‑
LKs) from toxoplasma immune serum (S‑LKS) and cultured spleen cell lymphokines (Spl‑LKs) :To 100 ml of mouse S‑LKs or Spl=LKS, and mouse normal serum or supernatantfrom normal cultured spleen cells, 0.1 g of proteinase (refined' pronase. Sigma Chem‑
ical Co., U. S. A.) was added. The mixture was incubated at 37'C for 12 h in orderto break peptide bonds nonspecifically. It was then mixed with 10 ml of 10 N NaOH
(pH, > 12) by constant stirring and boild at 100'C for I h to inactivate proteinase andantigenicity. After cooling to 4'C, the pH was adjusted to 7.0 0.1 with 10 N HC1.
The hydrolyzed sample was flltered and then centrifuged at I 0,000 rpm for 20 min,and the supernatant collected. That portion of hydrolyzed sample with a m.w. Iessthan 7,000 was fractionated by Sephacryl S‑200 gel chromatography with 0.01 M
PBS, pH 7.2, at a flow rate of 18.6 mljh by using a 5‑AUHIJEOL automatic liquid
chromatograph apparatus (Nihon Denshi Co., lokyo). The eluate (A) was frac‑tionated again by Toyopearl HW‑40 Fractgel chromatography to collect fractions ofapproximately 3,000 to 5,000 m.w. The eluates were pooled, dechlorinized withdouble distilled water by Sephadex G I5 gel filtration, and then freeze‑dried andstored. These products were referred to either as hydrolyzed serum lymphokines(HS‑LKS) or hydrolyzed spleen cell cultured lymphokines (HSpl‑LKS) for conven‑ience. Normal serum and supernatant from normal cultured spleen cells were treatedin a similar fashion and served as a control.
Assessment of cell microbicidal activity : Normal cell monolayers were infected withapproximately I x I 05 tachyzoites of the RH strain per dish I h before the addition ofeither S‑LKs and HS‑LKS, or Spl‑LKs and HSpl‑LKs to each chamber. The fateof the intracellular parasites was monitored by phase contrast microscopy of the in‑fected cell cultures at regular intervals. Toxoplasma could be readily identified byits morphological appearance within cytoplasmic vacuoles. For light microscopy
examination, the cultures were stained with May‑Griinwald‑Giemsa stain. The in‑fection rate of cells was calculated from the number of parasites in vacuoles of I ,OOO

1 86

individual cells on each cover slip. The rate was I to 5 tachyzoites in one group andmore than 6 tachyzoites in the other. To obtain a mean infection rate, experiments
were repeated at least 3 to 5 times.

RESULTSGel filtration of proteinase‑treated and hydrolyzed immune serum and spleen lymphokines

after treatment: The results of fractionation of treated samples were carried out by
Sephacryl S‑200 gel filtration. As shown in Fig. I (top), untreated immune serum

was separated into 3 peaks. Fractionations I, 11 and 111 were collected. Toxo‑
GIF was contained in Fract. I, but not in Fract. 11 and 111. When treated withproteinase and hydrolyzed at 1 2 h, Toxo‑GIF shifted to Fract. II, as marked withblack in the figure. Toxo‑GIF activity in Fract. 11 was of higher level than that at

BEFORE HYDROLYSIS

Immune serum

I II II

Fracti ona ti on

A: 80 mpStartr

Tube No.
(+)

Toxo ‑ G I F activity
AFTER HYDROLYSIS

6 hrs(‑) (‑)

V

12 hrsA

N'bTube No.
Toxo‑ G I Ftacti Vi ty ( +) ( ‑ )Chromatography Pattern on Sephacryl S‑200 gel Filtration of Mouse

Figure 1

Toxoplasma Immune Serum and Its Hydrolysis Samples 6 and 1 2
Hours After Treatment.

Start
P

rude
HS‑LKs2J80 mp

Tube No.
Figure 2‑aFractionation of Crude HS‑LKs Previously Obtained by Sephacryl
S‑200 gel Filtration on Toyo‑pearl Fractgel HW 0.

1 87

start
V

S‑ L Ks

2 p muTube No.
Figure 2‑b Chromatography Pattern of HS‑LKs Obtained by Toyo‑pearl
Fractgel HW LO on Sephadex G I5.

any other time ofincubation and collected as eluate (A) . Eluate (A) was fractionatedagain by Toyo‑pearl HW‑40 (Fig. 2‑a) and by Sephadex G 15 gel chromatography,
and flnally separated into 2 major peaks, as shown in Fig. 2‑b. Toxo‑GIF wascontained in the Ist peak, but not in any other peak. The eluates from the Ist peak,

being called HS‑LKs from immune serum and HSpl‑LKs from spleen cell cultured
lymphokines. The molecular weights of HS‑LKs and HSpl‑LKs were estimated tobe between 3,000 and 5,000 by Sephacryl S‑200 and Sephadex G 15 gel chromato‑graphy after calibration with blue dextran (m.w., 1,000,000), bovine albumin (m.w.,

67,000), egg albumin (m.w., 45,000), alpha chymotrypsinogen (m.w., 24,500), Iy‑
sozyme (m.w., 14,300), insulin (m.w., 6,000) and insulin‑chain B (m.w., 3,400) byusing the same preparative method.
Amino acid composition of HS‑LKs and Hspl‑LKS : As shown in Table I , ana‑lyses were performed with I to 3 pg of HS‑LKs or HSpl‑LKS' Unhydrolyzed
duplicate samples were also analyzed to monitor contaminations by using the aminoacid analyzer (Hitachi 835‑30 type, Tokyo). The quantity of eaph amino aciddetected in the unhydrolyzed samples was less than 50/0 of the amount present afterhydrolysis. Acid and basic amino acids, especially aspartic and glutamic acids andlysine, were abundant in the amino acid composition ofboth HS‑LKs and HSpl‑LKS'

Tryptophan was not detected by using the amino acid analyzer, however, in both

HS‑LKs and HSpl‑LKs tryptophan was ascertained by the method of Neubauer‑
Rhode reaction (5).
Influence of time of bleeding on Toxo‑GIF and IFNproduction in toxoplasma immune mice
after intraperitoneal TLA injection: Two weeks after challenge with the S‑273 strain of

Toxoplasma gondii, groups of hyperimmune or normal mice were injected i.p. withlOO pg of TLA. Blood samples were obtained from the mice by cardiac puncture
at different times after TLA injection. The pooled sera were tested for Toxo‑GIF
and IFN activity by the techniques described above. As shown in Table 2, hyper‑

immune mice showed an enhanced production of IFN which reached a peak 6 hafter TLA ilajection. On the other hand, sera obtained from normal mice showed amaximurn activity of IFN 24 h after TLA injection. The IFN activity in sera ob‑tained from toxoplasma immune mice after TLA injection dropped distinctly after
dialysis at 4'C against pH 2 buffer for 24 h. It remained unchanged, however,after incubation at 56'C for 60 min, suggesting IFN‑r. In contrast, the IFN activityof normal mouse serum peaked 24 h after TLA injection, and dropped drasticallywhen the serum was heated in a water bath at 56'C for 60 min. No significant de‑crease in serum IFN titers was seen wbcn samples were dialyzed against pH 2 buffer

1 88

Table 1

Amino Acid Composition of HS‑LKs and HSpl‑LKs from
Toxoplasma Immune Mouse

HS‑LKsAmino acidHSpl‑LKs

n G,ramsnM

n GramsnM

Asp1275.00

9.586

406 .40

3.055

Th r

160.25l .346203.931.713

Ser240.082.286

l 92 . 76

1 .835

G1 u

1 759.30

l I .968

505.24

3.437

Gly

447 .405.965

l 78.43

2.379

Al a

354.6 13.984

l 50.39l .689Cys
Val

204.780.852

257.09l .070404.833.454

131.77

l.124

Met

43.32

0.290

28.86

O. 1 93

Ile

77.43

0.590

30.73

0.234

Leu
Tyr
Phe

35 1 .36

2.678

l07.51

0.819

127.37

0.702

98.94

0.546

86.34

0.522

67. lO

0.406

Lys

2351.23

16.082907.366.206

NH3760.4444.732220.8312.990His

211.14l .360

38.07

0.245

Arg

101.830.584

7 1 .64

0.41 1Pro

505. I O

4.392

189.87l .65 lThe amino acid residues are Asp. Aspartic acid; Thr, Threonine;
Ser, Serine; Glu, Glutamic acid ; Gly, Glycine; Ala, Alanine;Cys, Cystine; Val, Valine ; Met, Methionine; Ile, Isoleucine;Leu, Leucine; Tyr, Tyrosine; Phe, Phenylalanine; Lys, Lysine;

NH3, Ammoma Hrs Hrstidme; Arg. Arginine; Pro Prol ne
Table 2

Characteristics of Toxo‑GIF and Interferon Present in the Sera of Immune Miceafter Injection of Toxoplasma Lysate Antigen (TLA)Serumcol]ection

Source ofseratime (h)Antigeninjection

Toxoplasma TLA* *immune(lOO krg ip)

mice

Normalmice

after TLA

TLA**

( 100 pg ip)

Mean percentage ofmacrophages with Tp*

Interferon

24 h after inoculation

O Tp 1‑5 Tp

Stable at

6Tp/ Trter
cell

pH 2

o
6
24

90.2 6.0 9.4 5.5 0.4 0.5 <1: 40
l : 160
97.4 2.5 2.2 2.0 0.4 0.5<1: 4099.4 I .2 0.6 1.2 O<1: 40o
6
24

91 .8 I .9 7.4 2.2 0.8 0.4
93.8 3. l 3.4 2.3 3.0 2.0

92.4 4.4 6.6 3.2 1.0 1.2<1: 40<1: 40l : 320l : 320* Mean SD was calculated from the results of 5 independent experiments,** TLA, 100 pg, was injected intraperitoneally in each mQuse,

56'C

l : 160<1: 80

189

for 24 h. These properties were indicative of regular IFN (IFN‑a and IFN‑p) .
In sera collected from toxoplasma immune mice injected with TLA, Toxo‑GIF
activity showed a tendency to increase up to 24 h after injection. Sera collected fromnormal mice after TLA injection, however, showed no inhibitory effect on toxoplasma

multiplication within mouse macrophages.
Determination of the in vitro inhibitory ff;ect of HS‑LKs on toxoplasma multiplication inhomologous cells: Toxoplasma immune mouse serum (S‑LKS) diluted to 100/0 in
TC‑199‑CS inhibited toxoplasma multiplication in normal mouse macropahges
after incubation for 48 h as shown in Table 3. This S‑LKs showed an IFN activity
Table 3Toxoplasmacidal and Cytotoxic Activities of Toxoplasma Immune Mouse

Serum (S‑LKS) and the Hydrolyzed Serum (HS‑LKS) in Normal Mouse
Macrophage Monolayers

(o/o)

city

hydrolyzed

serum

Stable at

48 h after inoculation

O Tp 1 5 Tp

>6 Tpjcell Trter pH 2 56'C

38.6 14.0 33.4 7. 1

28.0 l0.8 <1: 8

lO

33.5

35.3 15.8 <1: 8

0.25
0.50
0.75

34.4 9.2 38.6 3.4 27.0 11.7
40.8 8.9 35.4 5.3 23.8 6.7
34.2 l0.3 43.8 8.4 22.0 5.4
41.4 7.9 41.2 6.6 17.4 4.7

TC‑ 1 99 +100/0 CS alone

Normal mouse
serum
Normal mouse

Interferon

Mean percentage ofmacrophages with Tp*

Concentration of
sam.ple in
Sample addedin TC‑199 + TC‑199+ 100/0 CS
lOo/. CS
Added Cytotoxi‑

l .O

2.0
5.0

+
+

I I .O

3 1 .2

9.5

Destroyed the greater part of macrophages

Immune mouse

10

97.4

HS‑LKs

0.25
0.50
0.75

38.6 8.9 37.4 7.4 24.0 8.6
84.6 l0.0 12.2 7.6 3.2 3.4
96.2 2.8 3.6 2.4 0.2 0.4

serum (S‑LKS)

1 .O

2.0
5.0

+
+

2.5 2.2 2.0 6.4

05 1 160 <1 16 1 : 80

< 1: 8
94.2
4.0
5.8
4.0
O
Destroyed the greater part of macrophages* Mean SD was calculated from the results of 5 independent experiments.
Toxoplasma immune serum was collected at 6 h after intraperitoneal injection of TLA.

titer of I : 160. When it was dialyzed against glycine‑hydrochloric acid buffer, pH
2, at 4'C for 24 h, the IFN activity assay revealed a great drop in activity. No change
in IFN activity was exhibited, however, when the S‑LKs was incubated at 56'C for

60 min. This IFN was therefore regarded as IFN‑r.
HS‑LKs were reconstituted with TC‑199‑CS to concentrations of 0.25, 0.5,
0.75, l, 2, and 50/0 and added to normal mouse macrophage monolayers I h after
toxoplasma inoculation in order to examine parasite multiplication. Cytotoxicity
was observed when HS‑LKs were added in concentration of 2 and 50/0' showing aremarkable destruciton of the macrophage monolayers. When the concentration of1 90

HS‑LKs was less than I o/o' no cytotoxicity was noted, but toxoplasma multiplication
distinctly was inhibited. Only 0.90/0 of the macrophages contained 1‑5 parasites,
and non contained more than 6 toxoplasmas. The inhibitory effect of HS‑LKs was
reduced correspondingly with a decrease in the concentration of HS‑LKs to I olo'
O 750/0' 0.50/0 and 0.250/0 When toxoplasma containing cells were 0.90/0' 3'40/0' 6.00/0
and 9.90/0' respectively. No IFN‑r activity was detected in any of these concentrationof HS‑LKS'
Hydrolyzed normal serum was also reconstituted with culture medium to con‑centrations of0.25, 0.5, l, and 20/0 and added to normal mouse macrophages. Cyto‑
toxicity was observed when the hydrolyzed normal serum was added in a concentra‑of 20/0' resulting in the destruction of most of the macrophages. When the concen‑
tration of the hydrolyzed normal serum was less than I o/o' neither cytotoxicity nor
inhibition of toxoplasma multiplication was noted.
Determination of the in vitro inhibitory effect of HS‑LKs and Hspl‑LKS on toxoplasma
multiplication in heterologous cells : As shown in Table 4 and 5, Spl‑LKs from toxoplas‑

ma immune mouse spleen cells cultured with TLA for 48 h, in 100/0 dilution, in‑hibited toxoplasma multiplication in normal mouse macrophages. Over 950/0 of
the macrophages rernained uninfected, with less than I o/o containing more than 6
toxoplasmas after 48 h. This Spl‑LKs showed a titer of I : 256 of IFN activity, which

seemed to be IFN‑r (Table 4) . When the concentration of HS‑LKs or HSpl‑LKs
was 0.50/0' no cytotoxicity was noted, but toxoplasma multiplication in mouse macro‑phages was inhibited remarkably. At this concentration, no IFN activity was de‑tected (Table 5).
Table 4Microbicidal Activities of Normal Canine Monocytes, Bovine Monocytes andHuman Heart Cells Inoculated with Toxoplasma I Hour Before the Addition of

Toxoplasma Immune Mouse Serum (S‑LKS) or Immune Mouse Spleen Lympho‑
kines (Spl‑LKS)

Source ofCell line

the additionin the medium

Caninemonocytes
Bovinemonocytes

Humanheart cells

Mean percentage ofI nterferon

heterologous cells with Tp*
48 h after Tp inoculation

O Tp 1‑5 Tp

Without S‑LKs 40.2

15.8 18.4

9.4

Without S‑LKs 56.5

13.9 31.1

8.8

Stable at
Titers:

6 Tp/cell

41 .4

pH 2

56'C

<1: 16<1: 16l: 1 60
1: 1 60

8. 1

With 100/ S‑LKs 46.1 11.9 21.3 7.4 32.6 7.4
With 100/0 Spl‑LKs 48.3 9.8 19.9 8.7 31.8 6.6With 100/0 S‑LKs 51.7 9.2 27.2 l0.1
With 100/0 Spl‑LKs 55.8 13.1 25.5 0.6

12.4 5.9
2 l. I

7.9

18.7 8.3

Without S‑LKs 54.6 24.3 20.6

9.3 24.8 9.6VVith 100/0 Spl‑LKs 48.9 22.8 21.3

10.7

Without S‑LKs 45.4

1.7 20.6 8.0

With 100/0 S‑LKs 58.3 13.1 18.4

7.8

23.3

8.3

29.8 9.3

Control

Mouse

9.7 34.0

Macrophages With 100/0 S‑LKs 97.4 2.5 2.2 2.0
With 100/0 Spl‑LKs 95.2 3.6 4.2 2.9

6.4 0.5
0.6 0.9

l: 1 60
l: 256* Mean ̲ SD was calculated frQm the results of 5 independent experiments,

191

Table 5Enhanced Toxoplasmacidal Activity of Heterologous Cells Following the Additionof Toxoplasma Immune Mouse Hydrolyzed Serum (HS*LKS) and Hydrolyzed
Spleen Lymphokines (HSpl‑LKS)
Mean percentage ofSource ofCell line

the additionin the medium

Caninemonocytes

Bovinemonocytes

Humanheart cells

I nterferon

heterologus cells with Tp*
48 h after Tp inoculation

O Tp 1‑5 Tp

Without HS‑LKs 29.6

5.2 51 .3

Stable at:6 Tp/cell
3.2

19. I

56'C

2.0

41 .4 8. 1

With 0.50/* HSpl‑LKs 81.0

3.7 12.6 3.0

6.4 2.5

Without HS‑LKs 2 1.2

4.4 43.6 9.9

35.2

31 . I

8.8

1 2.4

5.9

With 0.5"/o HSpl‑LKs 80.7

4.5 12.8 3.7

6.5

2. 1

Without HS‑LKs 55.7
lO. 1 18. I :k:2.9
With 0.50/0 HS‑LKs 73.2 8.0 2 1 .9 5. 1
Without HSpl‑LKs 54.6 24.3 20.6 9.3

26.2

7.2

6.6 3.2

pH 2

1.8 2.2

With 0.50/* HS‑LKs 94.0 4.l 4.2 2.6
Without HSpl‑LKs 40.2
1 5.8 18.4 9.4With 0.50/* HS‑LKs 92.4 4.4
Without HSpl‑LKs 56.5
1 3.9

Titers

7.2

1 .0 I .2

4.9 2.924.8

9.6

With 0.50/0 HSpl‑LKs 70.2

18.2 19.6 3.9

1 0.2

7.4

Without HS‑LKs 45.4

9.7 34.0 I .7

20.6 8.0

6.4 I .5

2.6 3.7 < I : 16

With 100/0 S‑LKs 97.4

2.5

2.2 2.0
4.2 2.9

6.4

ControlMouse

macrophages With 0.50/0 HS‑LKs 91.0

With 100/0 Spl‑LKs 95.2

5.2

3.6

0.5 1 : 320 <1: 16

0.6 0.9 1 : 1 60 <1: 16

1: l 60
l: l 60* Mean SD was calculated from the results of 5 independent experiments.
100/0 Iymphokines (Spl‑LKs), 100/0 toxoplasma immune serum ( ‑LKs), 0.50/0 hydrolyzed

lymphokines (HSpl‑LKS) or 0.50/0 hydrolyzed immune serum (HS‑LKS) was mixed withthe standard medium containing 100/0 calf serum.

Then I OO/o S‑LKs or Spl‑LKs was also investigated for inhibitory effect on
toxoplasma multiplication in such heterologous cells as canine monocytes, bovine
monocytes and human heart cells. No toxoplasma multiplication was inhibited by

the addition of S‑LKs or Spl‑LKs (Table 4) . However, HS‑LKs or HSpl‑LKs
added to a concentration of 0.50/0 inhibited toxoplasma multiplication in canine
monocytes, of which only 60/0 and 1 90/0 contained toxoplasma, respectively (Table 5) .

Similarly, inhibition of toxoplasma multiplication by the addition of HS‑LKs or
HSpl‑LKs was also observed in bovine monocyte and human heart cell monolayers

as compared with HS‑LKs‑free culture medium. No cytotoxicity was found inhomologous or heterologous, cells upon the addition of 0.50/0 HS‑LKs or HSpl‑LKS.

DISCUSSION

In previous studies, normal mouse macrophages and kidney cells were cultured
with Spl‑LKs from toxoplasma immune spleen cells. When infected with a virulent
toxoplasma strain, the Spl‑LKs‑activated macrophages and kidney cells showed asignificant inhibition of the intracellular multiplication of tachyzoites (4, 9, 1 2‑15).

Thiis inhibitory activity was presumed to be due to a macrophage‑activating factor or1 92

sunilar actrvators released from Immune T Iymphocytes(1 3). Such factors appeared
to have conferred enhanced microbicidal properties to the cultured macrophages andkidney cells. Thus the term toxoplasrna growth inhibitory factor (TOXO‑GIF) was
adopted (15). It had a calculated molecular weight of 30,000 to 40,000 in which

MIF‑1 was also contained (4). The mouse Spl‑LKs inhibited toxoplasma multi‑
plication in mouse macrophages and kidney cells, but not in heterologous cells (9, 10).

In related, earlier studies, separate and distinct mediators from hamster lym‑
phocytes active against Toxoplasma and Besnoitia have been indentified (3). These
mediators were effective not only for macrophages but also for kidney cells andfibroblasts. They had a calculated molecular weight of 4,000 to 5,000. In ourprevious report (lO), MIF‑II and a mediator or cytotoxic factor of 3,000 to 5,000
m.w., which damages macrophage monolayers were found in the mouse Spl‑LKS, but
not in the TOXO‑GIF. In consequence, and attempt was made to determine whether
S‑LKs and Spl‑LKS, chemically hydrolyzed to its low‑molecular components via
hydrolysis, would inhibit toxoplasma multiplication in cell monolayers. These low
molecular weight substances, HS‑LKs and HSpl‑LKS, possessing cytotoxic properties
were similar to that separated by Chinchilla and Frenkel from hamsters (3). How‑ever, inasmuch as we failed to observe TOXO‑GIF, the difference or similarity in themechanism of these mediators is still unknown.
The results obtained in this experiment strongly suggest that a Spl‑LKs‑1ike

substance might have existed in the toxoplasma immune mouse serum, and that
HS‑LKs and HSpl‑LKs might have inhibited toxoplasma multiplication not only inhomologous but also in heterologous cells. A Toxo‑GIF or Toxo‑GIF‑like substance
together with IFN‑r has been detect,ed in the blood of hyperimmune mice after
intraperitoneal injection with TLA.
Lymphokines produced by spleen cells usually show their greatest activity on
cells from the same species ( 10) . This phenomenon of species specificity is undesirable

since it indicates that only homologous preparations can be expected to display ther‑apeutic value. HS‑LKs and HSpl‑LKS, however, showed inhibitory effects on
toxoplasma multiplication in heterologous cells. In addition to anti‑toxoplasrna
activity, cytotoxicity was observed in vitro regarding both heterologous and homol‑
ogous cells after HS‑1.Ks and HSpl‑LKs were added to a high concentration of 20/0 'The components of 3,000 to 5,000 m.w. in a part of the Spl‑LKs and of normal serum
was contained as cytotoxic factor in natural animals (1 1). In consequence, in in vivo
tests, it might be inappropriate to use HS‑LKs or HSpl‑LKs in high concentration

due to cytotoxicity. Furthermore, there is no distinct explanation whether thiscytotoxicity is present naturally, or occurred as a consequence of our preparative

methods for HS‑LKs or HSpl‑LKS.
Therefore ifcytotoxrc components can be idenufied and removed, and if HS‑LKs
and/or HSpl‑LKs can be collected in large volumes by any method, animal prep‑
arations likely may prove useful in enhancing the immunological and microbicidal

properties of human cells as an immunopotentiator. If this phenomenon can be
confirmed in vivo, it will be possible to use animal derived HS‑LKs on a largescale,because this serum is an inexpensive source for the treatment of human diseases.
Since the use of nonhuman HS‑LKs is of significant scientific and clinical value,193

further investigation is both timely and necessary for the development of this source ona large scale.

SUMMARY
Evidence was presented on the production and properties ofTOXO‑GIF and IFN
in the circulating blood of toxoplasma immune mice, following the intraperitoneal
injection of TLA. The IFN elaborated by this method was designated IFN‑r. This
study deals mainly with some biologically active substances derived from hydrolyzed

toxoplasma immune mouse serum (HS‑LKS) or hydrolyzed spleen cell cultured
lymphokines (HSpl‑LKS) and their effects on parasite growth not only in homologous

but also in heterologous cells. The HS‑LKs and HSpl‑LKS, approximately 3,000‑
5,000 m.w., strongly inhibited toxoplasma multiplication in homologous cells, without
cytotoxicity, when administered in concentration of 0.50/0 or less. This substance, or
substances, also inhibited toxoplasma multiplication in heterologous monolayers ofbovine monocytes, canine monocytes and human heart cells. This ability to inhibit
toxoplasma multiplication in homologous and heterologous cells was derived not fromIFN‑r, but from Toxo‑GIF or aToxo‑GIF‑1ike substance.

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1922

195

トキソフ。ラズマ免疫マウス血清由来加水分解物質（HS−LKs）の異種細胞内トキソフ。ラズマ殺滅効果
桜井治久・佐藤基佳＊・広瀬恒夫＊
小俣吉孝＊＊・斉藤篤志・鈴木直義

トキソプラズマ（Tp）免疫マウスに特異抗原（TLA）を腹腔内に注入し，注入前，6および24時間後に血液を採取し，血清を分離した。血清中Toxo−GIF活性は24時間で最高値をJFN−7はTLA注
入後6時間で最大活性を示した。TLA注入24時間後の分離血清は酵素，酸・アルカリ加水分解および熱処理されて，その上清をSephacryl

S−200およびToyo−pearl

Fractogel

HW40でゲル炉過し，

分子量3，000〜5，000の分画を集めて，これをHS−LKsと名づけた。一方，免疫マウス脾臓細胞加TLA
培養上清リンホカイン（Sp1−LKs）が同様に操作され集められた画分がHSpl−LKsと名づけられた。

マウス腹腔マクロファージ（Mp）はTC−199仔牛血清含有培養液で前培養され，Tp接種後1時間
目から免疫血清10彩あるいはHS−LKs（乾燥重量）0．25〜5．0彩含有培養液中における48時間目の細胞内Tp増殖の有無を検討した。その結果，10％Tp免疫血清（S−LKs）あるいは05％以上のHs−LKs
添加では正常マウス血清あるいは，その0．5彩加水分解血清に比較して，細胞内Tp増殖は顕著に抑制された。2彩HS−LKs添加以上では，マウスMpは障害された。イヌ単球，牛単球およびヒト心筋細胞内Tp増殖に関して，HS−LKs添加は，その増殖効果に差があるが異種細胞内Tp増殖を明らかに抑制した。このHS−LKs中にはIFN−7活性は検出されなかった。リンホカイン中Toxo−GIFによる細胞活性は種依存性であることが広く認められている。リンホカイン様物質を含む血清が低分子量化されることによって，種依存性を失い，異種細胞内寄生原虫の増殖を抑制したことの意義は今後，
生物活性物質として攻究されるべきものと考えられる。

（帯広畜産大学家畜生理学教室， ＊家畜臨床放射線学教室，＊＊筑波大学基礎医学系）

日本熱帯医学会雑誌

第10巻

第3，4号

1982

197

197−205頁

京都市内深泥ケ池におけるアシマダラヌマカとキンイロヌマカの生態学的研究
岩城

操

昭和57年6月2日

受付は得られていない。したがって，著者らは1964年

12月より深泥ケ池，池畔においてMonson

緒目の成虫を定期的に採集し，年間消長をくわしく検

日本産熱帯性ヌマカとして知られているルfαル30niα（ハ4n．）μnのr耀∫Theobaldアシマダラヌマ

カ，およびMon50n如（C砿）06hrocεoα蚊Theobald

討し，多発期とみられる8月には，2回の昼夜にわたる24時間採集を行うことにより，時刻的消長をも明らかにすることができた。さらに，アシマ

キンイロヌマカは，分布学上我が国が世界の最北

ダラヌマカとキンイロヌマカの異なった走性を示端に生息するものとして認められている（Yama−

す習性をも知ることができた。そして，アシマダ

guti

Casse1950）。なかでも，京都市内東

ラヌマカの雌成虫の翅長を定期的に計測すること

北部に位置する深泥ケ池には，その両種が池内にによって，季節的に翅長の変動があることが認め混生して池の専任種となっていることは非常に興られたので報告する。

and

La

味あることである。これらのM侃50吻属の蚊は，
東南アジアをはじめ，インド，アフリカ，南アメ

この要旨は，第23回日本衛生動物学会西日本支リカなど各地において，主にマレー糸状虫，特に部大会，および，第21回日本衛生動物学会大会に

βr㎎的脚1のノらおよびデング熱ウィルス等の媒介おいて発表した。

蚊として疫学的に非常に重要な種であることが証明されている（Sasa1976，Wharton1978，Carter
1948）。さらにMon30n∫o蚊についての吸血活動の皿 調査期間および方法
調査は，1964年2月初旬より同年11月までの10

報告はHaddow1954，Laurence1960，そしてSamarawichrema1968らによって，周日時刻的カ月間で，各月平均2回，日没前1時間と日没後消長が調査された。また，アシマダラヌマカが，1時間の計2時間にわたり，ドライアイス採集法

主に夜間吸血性を示すとともに，そのピークが，とライトトラップ採集法を行った。実施ごとに採日没前後と日出前後の二峰性であることなどを集された蚊の中からヌマカ属2種をえらび出し，

報告している。我が国においては，北村・小垣

その個体数とアシマダラヌマカ雌成虫のみの翅長（1962）らによって，前述の深泥ケ池の池畔におを計測した。また，蚊の多発期である8月8日かいてライトトラップ採集を行った成績があり，松ら9日までと，8月21日の昼間，そして8月31日

尾ら（1963）は同池内および池畔において，幼から9月1日までの夜間を合せた通算2回の24時

虫・蝿および成虫の周年消長の調査結果などの報

間昼夜採集を行った。ドライアイス採集法は，昼告をしたが，他の蚊を交えての結果であるところ

夜連続して行ったが，ライトトラップ採集法は，から，未だくわしい生態的調査のみならず，室内

FNKスーパーライトトラップを使用して夜間の飼育実験等に関しては全くといって良いほど知見み施行した。

京都女子大学・生物学教室

198

個体の内，雌個体2138個体，雄個体405個体であった。この周年採集には，2月初旬より5月初

1皿 成績およぴ考察
L

旬までは全く採集されなかったが，5月下旬に周年採集成績

やっと雌個体が数10個体と雄個体が1個体採集でアシマダラヌマカおよびキンイロヌマカのドラきたという成績であった。しかし，8月下旬では，イアイス採集法による周年採集成績は，表1に示採集数はピークに達し雌個体1395個体，雄個体
194個体と全体の約半数に及んでいる結果を得た。

すごとく，アシマダラヌマカの採集総個体数2543

Table1

Number
06hrα

Diary

seasonal

collection

of

0
44
335
98
52
64
1395

194

147

41

3
0

4

2138

405

Tota1

30
25

Max

15
10

Min

FemaleMale

000000000000

Aug．31
Sep． 90ct． 3
Nov．12

Male
0
1

8
ヰ1

36
80

0

20

0000000000

May l

Jun． 7
Jun、20
JuL loAug． 3

庸and瀬砒50痂

ハ4iπ．06hrα060

Femalel

of鉱αn50η宛麗n⑳

ルZη．観⑳77n∫5collection

May23

0C

of

8αby Dry．ice method（1964）

5㎝Hのコ喝剰﹀引喝q引

3Fema］一e

2
］．

旧O

0

．OZ

1

廻a le

2
Jun

Jul

Aug

Sep

Oct：

Monthlycollection
Figure1

Seasonal

HuctuationofMη．観⑳r痂5and

Temperature．

注）Figure1，4，5，6の採集個体数は実数の対数値［log（n＋1）］であらわしてある。

Nov

199

そして，その後次第に減少して10月上旬にはほと

このことがアシマダラヌマカの野外における生態んど飛来しなくなった。一方，キンイロヌマカは，の一要因とは今回の成績だけでは考えられない。

年間を通して薄暮の時間帯にはドライアイス採集

2．翅長の季節的変動には全く飛来することがなく採集されなかった。

蚊の翅長値が，季節的に変動することは，すで次に，アシマダラヌマカのみの周年採集個体数にコガタアカイエカなどによって知られているがを各月毎に実数の対数値であらわし，採集時の気（上本ら1967），ヌマカにもこのような変動がみら温と照らし合わせると図1に示すごとく，6月初

れるかを検討するため，先に周年採集を行った際

旬の月平均気温が20。Cに達した頃から飛来しはに得られたアシマダラヌマカの雌成虫のみを各月

じめ，そして，10月初旬の20。C以下になる頃よごとに約100個体を無作意にえらび出し，その翅り全く飛来しなくなる傾向がみられた。しかし，長を計測し翅長値の巾を図2に示した。さらに平

Jun．

7

仁O引一〇Φ．﹇．﹇OO

Jun．

20

Jul．

10

Auq．

2

唱O
Φ一〇〇

Aug． 31

Sep．17

Oc七．3
3．1

3．2

3．3

Figure23．43．53．63．73．83．94．04．14．24．34．44・54・6
Seasonal

wing⊥eng七h（㎜）variation

ofwing−lengthof瓢η．襯静プ瓶＆

200
4.2

4.l
4.0

:

dJ

Cn

3.9

l::

(D

H
i

3.8

el
F:

̲

3.7
3.6
3.5

Jul Aug

J un

Sep

Oct

Monthly collection
Figure 3

Seasonal variation of Mean wing‑length of Mn. untformis female.
./¥

38
36
34
32

/

/ ¥¥
¥

'c 3 o282624,Sunset¥L

223‑ ¥ l'

l' /

/

/

/

Temp

lOO
80

Humi

60 %

40
20

SunliseFemaleMn uniformis

2
l
O

l
u,

H

,Q
:l

2

B(ale

･O

･H

>

3

･H

I

C:
･H

yd

O
O
2

h̲In .hrac
FemeLlelol

r4a I e2

13 15 17 collection
19 21 time
23 15 73 9 ll
Figure 4

Observation on the durnal change of Mn. umformis and Mn. ochrasea by First
dry‑ice collection method and Temperature, Humidity.

201

均翅長の変動をグラフであらわしたのが図3であmm，平均4．1mmと6月上旬に採集された個体る。

とほぼ同じ翅長になることが認められた。

以上のことから，アシマダラヌマカは，コガタ

結果は，6月上旬の翅長は3．8mm〜4．4mm，平均4．1mmであったが，6月下旬になるとや、

アカイエカなどと同様に，春季と秋季に翅長が長短かい翅長の個体があらわれる。さらに，8月上く，夏季には短かい傾向を示すところから，6月

旬から下旬にかけては，3．3mm〜4．2mm，平均上旬に採集される個体は，池の浮島や近くの民家

3．7mmと短かい翅長の個体が多くあらわれるよの南面などの暖かい場所で前年から成虫越冬した

うになる。そして，9月中旬では3．5mm〜4・4 個体であるため翅長が長く，夏季は幼虫の発生水域の水温も高く幼虫の生育期間が短かいため早く
mm，平均3．8mmと8月の蚊の最盛期と思われる季節よりは少し長い翅の個体があらわれ，10月

成熟するため翅長の短かい個体が多くなるものと上旬には採集個体数も激減するが，4．Omm〜43

考えられる。その後10月上旬になると水温も低く

C

38
36
34
32
30
28
26
24

｝＿＿一嘔＿一一一

／

Temp

＼

1・ノ＼
￥

／

￥

Sunse七

22

＼、．

￥
、

幅』r一一＿、一1

H㎜i

：LO

O

80
60

号

40
20

／
1ノ

Sun工ise3

Mn．uniformis

2Fema le

工

0
1

Male
2
3

一〇⇒つ一＞州喝⊆州

0Q

哨O
．02

2

Mn．ochracea

Female

1
0

Male

1
2

131517192123135791工Collection time
Figure5Observation

dry−iceon thecollection

durnal change

andof班η．麗躍⑳r窺おandルZη．oσhプα56αbyTemperature，Humidity．

Second202

なり幼虫の生育期間が長くなるところから翅長の集を行った。結果は，第1回ドライアイス採集法

長い個体が出現するようになる。そして，これらによる成績を図4に，第2回ドライアイス採集法の個体が気温および短日の環境条件の変化によりによる成績を図5に示すごとく，2回の採集いず

栄養生殖分離をおこして卵巣の発育がおさえられ，れも同じ傾向の消長がみられた。なかでも，特に体内に充分な貯蔵脂肪を貯え，活動力も次第に鈍

アシマダラヌマカの雌成虫は，ドライアイス採集

くなり，・そのまま越冬に入るものと推定される。

法には昼夜間を問わず飛来し，採集者に集まり盛したがって，このような翅長値の変動があるもの

んに吸血活動の態勢をとった。また，雄の出現は，と考えられる。

いづれの回も日没後に一一時的に多く飛来し，その3．時刻的消長

後次第に減少し，明け方には全く飛来しなくなる。

ヌマカの日周活動を知るため，蚊の多発期であ

これに反して，キンイロヌマカは，2回の採集にる8月に2回，前記方法で述べたごとく24時間採はいづれも夜間に雌雄成虫が数個体飛来したにすls七Light 七rap collec七ion

聖．蝉
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22

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5

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betwcenκη．襯静γ罐5andκπ，ooh凹56α，

twice col−

203

ぎなかった。なお，図5の夜中23時頃から明け方

次に2回行った昼夜採集結果を，日中（日出かの5時までは小雨のため採集不可能であったこと

ら日没まで）と夜間（日没から日出まで）とに分を附記しておく。

けて比較して表2に示すと，両種ともに明らかに

一方，ライトトラップ採集法による成績は，図

夜行性を持っているが，ただアシマダラヌマカの6に示すごとく，アシマダラヌマカとキンイロヌ

雌成虫は，ドライアイス採集法に昼間帯においてマカの両種ともに数個体ではあったが採集された。

も数個体の採集をみることは今後検討を要する問なかでも，アシマダラヌマカの雌成虫は，ほとん

題である。さらに，アシマダラヌマカは，ドライ

ど日没から日出まで連続して採集器に入り捕獲さアイス採集法には圧倒的多数の飛来をみるがライれたが，キンィロヌマカは，2回の採集ともに雌

トトラップ採集器にも捕獲された。このことは，

雄成虫が日没後に少数個体捕獲されたのみで，夜蚊の第一次誘引は二酸化炭素であり正の走化性を半には全く飛来しなかった。

示し，次に光に対する走光性も示すものと考えら

Table2Comparative

ofcollection

methodthelst Dry−ice

Speciesandname

Dry−ice掘η．観ψr而5

trap

Total

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840

色male

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malo
ノレ吾π．06hrα08α

琵male

204

れる。一方，キンイロヌマカはアシマダラヌマカ

は成虫越冬によるものと考えられた。さらに，ドとは逆に，ドライアイス採集よりもライトトラッライアイス採集法とライトトラップ採集法（夜間フ。採集に少数ではあるが採集されたことから，第のみ）を併用して，蚊の多発期に二回の昼夜連続・一次誘引は光に対する走光性の結果によるものと採集をこころみ，時刻的消長をみたところ，アシ推定された。これらのことは，両種ヌマカの野外

マダラヌマカの雌成虫は，ドライアイス採集法ににおける生態的な差異として興味ある問題としては昼夜を問わず飛来したが，雄成虫は薄暮から薄今後検討を加えなければならない。

明までに活動することが解った。一方，キンイロ

ヌマカは，ドライアイス採集法には全くといって良いほど飛来することはなかった。次に，二回の

IV 結

目

ライトトラップ採集法には，ドライアイス採集法

京都市東北部の深泥ケ池に発生するヌマカ属二では採集で来なかったキンイロヌマカが採集され種（アシマダラヌマカ及びキンイロヌマカ）の生た。それと同時にアシマダラヌマカも少数個体採態を明らかにするために，ドライアイス採集法及集されているところから，両種のヌマカは，ヌマ

びライトトラップ採集法を用いて成虫の周年採集カとして同様の生態型を持つものといわれているをこころみた結果，アシマダラヌマカの成虫の活が，アシマダラヌマカは光の刺激よりも二酸化炭

動は，5月下旬から始まり8月下旬にピークに達素に対する走性がより強く，キンィロヌマカは二し，10月上旬に終わることが認められた。しかし，酸化炭素よりもより光に強く誘引を受けるものと

キンイロヌマカは，ドライアイス採集法では採集推定される。しかし，これらのことはいづれも野個体が得られず周年消長に関してはくわしいこと

外調査の結果にもとづくもので，さらに室内実験は判らなかった。また，アシマダラヌマカの雌成等を加えて検討せねばならない問題である。

虫が各月あたり翅長値を計測するに足りる個体数であったので，年間翅長値変動をみたところ，コ

本研究に終始ご指導ご協力いただいた名古屋保

ガタアカイエカなどにみられる春季と秋季に翅長

健衛生大学衛生学部医動物，松尾喜久男教授に感が長く，夏期にはそれよりも短かい翅長のものが謝の意を表します。

あらわれることが確かめられたところから，越冬

献

文1）Carter，HE（1948）；Records ofFilariainfection in mosquitoes inCeylon，Ann．Trop．Med．

Parasit42；312
2）

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specialofthe

biting−habbits

referencetotheofAfrican

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hour

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employed

with

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実（1962）：池畔の誘殺灯に捕集された蚊成虫相の周年遷移について

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199

3）

北村

衛生害

虫Vol7No2：11−18
4）Laurence，BR．（1960）；The
obald）and掘onso吻麗n⑳r
Culicidae），

5）

ofTwo

Speciesofn∫s（Theobald）Belongingtothe

Mosquito，、Monso吻ψ
Subgenuscロnα（The−

Mansonioides（Diptera；

Bull，Ent，Res．，51；491−517

松尾喜久男・田村辰夫・北村
消長

biology

茂・石野卯吉（1963）：京都市深泥ケ池周辺における蚊の季節的

18回日衛動西日本支部大会（抄）6）Samarawickrema，W．A．（1968）：Laboratory

culture

and

Life

Cycle

of twospecies

of

Mos一

20 5

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F ･
A c (

it :

‑ (1967) : :::e 7 4 :

1 : :(D :a)

1

22 I

;')

10) Wharton, R. H. (1978) ; The Biology of Mansonia mosquitoes in Relation to the Transmission
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11) Yamaguti, S. and La Casse, W. J. (1950): Mosquito Fauna of Japan and Korea. Ofrice ofthe surgeon Hq 8 th Army Apo. 343 : 65‑79

ECOLOGICAL STUDY OF MANSONIA (MN.) UNIFORMISTHEOBALD AND MANSONIA (CO.) OCHRACEATHEOBALD (DIPTERA, CULICIDAE) IN
KYOTO CITY, MIDOROGA‑IKE PONDMISAO IWAKI
Received for publication 2 June 1982

The specimens of two species of adult mosquitoes, Mansonia (Mansonioides) umformis and Mansonia(Coquillettidea) ochracea were collected by the dry‑ice bollection method and the light‑trap collection

method at the Midoroga‑ike pond which is situated in the northern part of Kyoto City from February
to November in 1964. Seasonal flight activities of Mansonia (Mn.) umformis were seen at this pondfrom the end of May to the beginning of October. Seasonal variation of wing‑length of adult femalesof Mansonia umfon7tis were observed that the wing‑length is longer in spring and autumn than in summer
as well as in the case of Culex tritaeniorhynchus.

Namely it seems to be that Mansonia mosquitoes are hibernated in adult stage in their life cycle.
Mansonia umformis is attractived to C02 strongly, while Mansonia ochracea is aggregated to the light‑trap
collection method. Therefore, it is clarified that there are two different type oftaxis i.e. chemotaxis for

Mansonia umformis and phototaxis for Mansonia ochracea.

Biological Laboratory, Kyoto Women's University

日本熱帯医学会雑誌

第10巻

第3，4号

1982

207−217頁

蛇毒の酵素化学的研究

207（第11報）

タイワンハブ毒よりアルギニンエステル水解酵素（ME−4）の精製およびその性質

杉原久義・鬼頭玲子・二改俊章・酒井恵美
昭和57年7月9日

受付

Sephacel，Polybuffer Exchanger94 （PBE94）ヲ

Polybuffer74，Pharmalyte緒昌

毒蛇咬傷によって生ずる全身性および局所性病

pH3−10はファルマ

シア社製，α一N−tosyl−L−arginine

methyl（TAME），α一N−benzoy1−L−arginine

ethyl

ester
ester

変が蛇毒中のいかなる因子によってひき起こされ（BAEE），α一N−tosyl一レargininamide（TAA），α一N−

るかを知るためには，各因子の単離と動物実験に

benzoy1−L−argininamide（BAA），α一N−tosyl−L−ly−

よる証明が必要である。

sine

methylester（TLME），α一N−acetyl−L−tyro−

sine

ethyl

ester（ATEE），bradykininは株式会

著者らはタイワンハブ毒より各種の生理活性物質を単離し，その本態と作用を明らかにするため

社ペプチド研究所，Soybean

trypsininhibitorの一連の研究を行っている。

（SBTI

type

I−S），Limabeantrypsininhibitor

蛇毒のアルギニンエステル（AE）水解酵素はキ

（LBTl

type

Il−L），卵白trypsin

ニン遊離作用，毛細血管透過性充進作用，血液凝typeIII−0），p−tosyl−L−phenylalanine chlorome−

固作用などの極めて興味ある生理活性をもっていthyl

ketone（TPCK），benzamidine，p−chlorome−

ることが報告されている。各種蛇毒から得られた

rcuribenzoate（PCMB），diisopropyl nuoropho−

精製標品は分子量30，000前後の，熱に安定な，

sphate（DFP）はシグマ社製，trasylolはバイエ

DFPで阻害を受けるセリン酵素であることも共ル株式会社より購入した。その他の試薬は試薬特通した性質である。

級を使用した。

inhibitor（EWTI

タイワンハブ毒は現在知られている蛇毒の中では最も強いAE水解活性をもっているが，著者ら

実 験 方 法はこの毒中のAE水解酵素の分離を試み，これ迄
に3種の酵素を単離し，ME−1，ME−2，ME−3とアルギニンエステル水解活性

Roberts（1958）命名した。今回新たにこれらとは別のAE水解酵の方法に準拠した。基質としてTAMEを用いた。

素を単離したので，その生化学的性質，生理活性

適当濃度の試料0．1m1，0．4Mトリス塩酸緩衝液などについて報告する。

（pH8．5）0．8m1，0．1M基質液0．1m1を混和し，37。C，15分間反応後，2M塩酸ヒドロキシルアミ

実

験

材

ンと3。5M水酸化ナトリウムの等量混液1m1を料加え反応を止め，20分後6彩TCA（4N HCl）0．5

新鮮自然乾燥タイワンハブ毒は台湾の中国血清

m1，0．11MFeCl3（0．04NHCl）2m1で残存して疫苗製造所の蘇卿浮氏より入手したものを用いた。

いるTAMEを発色させ，500nmの吸光度を測Sephadex G−100，CM−Sephadex

定した。活性の単位は1分間に1μmolの基質を

C−50，DEAE一

名城大学薬学部 〒468名古屋市天白区天白町八事裏山15

208
水解する活性を1単位とした。

キニン遊離活性Erspamerら（1962）の方法にの単位は1分間当たり420nmの吸光度1を示す
活性を1単位とした。その他，Phosphomonoes−

準拠した。前日エストラジオールを腹腔内に注

terase，

Phosphodiestemse， 5

一Nucreotidase，

射しておいた処女ラットより子宮を摘出し，DeATPase，Casein水解活性は第1報（1972）で報Jalon液中に28。Cにおいてその収縮を測定した。

告した通りである。

基質としては牛血しょうを60。C，30分処理後，終濃度10−3Mになるようにo−phenanthrolineを結加えたものを用いた。その0．1ml（基質量として果は大過剰），適当濃度の試料液0、1m1を37。C，3

アルギニンエステル水解酵素ME−4の分離

分間反応後，100。Cに加熱して反応を止めそのSeOhadex

G−100ゲルろ過 粗毒2140mgを0．1m1を用いて前記ラット子宮の収縮を測定した。

0．15MNaC1含有0．005Mトリス塩酸緩衝液

活性の単位はあらかじめ合成bradykininを用い（pH8．5）8mJに溶解し，不溶性物質を遠沈除去て作製しておいた標準曲線（05μgから1・5μg

後，同緩衝液で平衡化したSephadex G−100でゲルろ過を行った。溶出後のタンパク量は280nmまでは直線性を示した）より力価（μg）を求めた。

毛細血管透過性克進作用

Miles（1955）の方法の吸収で測定した。その結果，Fig．1に示すように準拠した。2−25kgの家兎を硫化バリウム脱毛

な溶出パターンが得られた。各ピークを溶出順に剤で脱毛後，チンク油をぬり24時間後エバンスブ

P1，P2，P3，P4，P5とするとAE水解活性はP4ルーの20mgを2m1の生理食塩水に溶かしたものを静脈内に注射後，試料液0、1m1を皮内に注にみられたので，この画分について精製を試みた。

射した。1時間後，エーテルにより殺し，皮膚をCM・Sephadex

C−50クロマトグラフィー

Sephadex G−100で得られたP4画分を0・01

はぎとりガラス板に固定し，裏側からその青色斑

M酢酸ナトリウム緩衝液（pH6．0）で透析後，の直径を測定した。10mmを越える青色斑が認め

CM−Sephadex

C−50に吸着させ，素通り画分をられたものを毛細血管透過性充進作用を有するも分取した後，NaCl濃度を05Mまで直線的に上のと判定した。

昇させたところ，Fig．2に示すパターンが得られ

出血活性マウス背部に適当濃度の蛇毒液を皮た。この段階でAE水解酵素はP1とP6の2っ下注射し，24時間後にエーテルにより殺して皮膚に分かれて溶出してくるが，p1からはすでにをはぎとり，裏側から出血の有無を観察した。

ME−1（杉原ら，1980），ME−2（杉原ら，1981）

致死活性適当量の蛇毒液（LD，。の4倍量，が単離されている。またp6からもすでにME−3

約280μ9／mouse）をマウス腹腔に投与し，24時（杉原ら，1982）が単離されているが，こ、こには間の生死を観察した。

ME−4も混在している。今回はME−3のときとProteinase活性Linら（1969）の方法により調製したdimethylcaseinを0．1％濃度になるよ

同様P6画分を集め0．01MNaC1含有0・01Mト
リス塩酸緩衝液（pH7・2）で透析を行った。

う0．01Mホウ酸緩衝液（pH9。0）に溶解しこれ

DEAE・Sephacelクロマトグラフィー 透析しを基質液とする。基質液1m1と蛇毒液（50μg／

た画分をDEAE−Sephacelに吸着させ，素通り画

認）0，1〃！1を37。Cで反応させ，そのうち0．2m1分を分取した後，食塩濃度を0．3Mまで直線的をとり出し，100。C，3分間加熱して反応を止める。

に上昇させたところ，Fig．3に示すパターンが得

水0．3m1，0．2Mホウ酸緩衝液（pH10．15）0．5

られた。AE水解活性はP1，P3，P4に認められた。

溺1，1．1Mトリニトロベンゼンスルホン酸水溶液

今回は試験管番号180−190（p3）を集め25mMイ

0．02m1を加え10分間室温放置する。1．5mM

ミダゾール塩酸緩衝液（pH7．4）で透析を行った。

Na2CO3含有0．2MNaH2PO4（pH6．87）5m1を加え，420nmにおける吸光度を測定した。活性Chromatofocusing

透析した画分をPBE94に吸着させ，Polybuffer74（pH5．0）で溶出した

209

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50

Tube number
Figure I Gel Filtration of the Venom of Trimeresurus mucrosquamatus on a
Column of Sephadex C IOO.
Trimeresurus mucrosquamatus venom (total protein 2 1 40 mg, TAME hydrolytic
activity: 5 1 .7 units/mg) was applied to a column (5.0x 100 cm) of Sephadex( 100 equilibrated with 0.005 M Tris‑HCI buffer containing 0.15 M NaC1,
pH 8.5 and 3‑ml fractions were collected at a flow rate of 12 mljhr.

Oe : absorbance at 280 nm, ‑‑‑‑‑‑ : TAME hydrolytic activity.

oo
Ln
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250

Tube number
Figure 2 CM‑Sephadex C‑50 Column Chromatography
The TAME hydrolase fraction (total protein 1 124.7 mg, TAME hydrolytic activity:
75.5 units/mg) in tubes 90‑1 15 (indicated with black bar in Fig. l) was applied to a column( 1.9x 45 cm) of CM‑Sephadex C‑50 equilibrated with 0.01 M acetate buffer, pH 6.0. The
column was eluted with a linear gradient from 0‑0.5 M NaCl in 800 ml total volume. 3‑ml
fractions were collected. The flow rate was 1 5 mljhr.

ee : absorbance at 280 nm, ‑ ‑ ‑ ‑ ‑ ‑ : TAME hydrolytic activity,‑‑‑: CQnductivity.

210

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H

200

Tube number
Frgure 3 DEAE‑Sephacel Column Chromatography
The TAME hydrolase fraction (total protein 65.0 mg, TAME hydrolytic
activity: 89.9 units/mg) in tubes 196‑208 (indicated with black bar in Fig. 2)

was applied to a column (1.5x48 cm) of DEAE‑Sephacel equilibrated
with 0.01 M Tris‑HCI buffer containing 0.01 M NaCl, pH 7.2. The column
was eluted with a linear gradient from 0.01 M‑0.3 M NaCl in 800 ml total
volume. 3‑ml fractions were collected. The flow rate was 15ml/hr.

OO : absorbance at 280 nm, ‑‑‑‑‑ : TAME hydrolytic activity,‑ ‑ : Conductivity.
C:)

O

Ltl

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Hemorrhagic activity
50

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lOO

l

150

Tube number
Figure 4 Chromatofocusing

The TAME hydrolase fraction (total protein 1 7.8mg, TAME hydrolytic
activity: 92.0 units/mg) in tubes 180*190 (indicated with black bar in Fig. 3)

was applied to a column (1.0x43 cm) of PBE 94 equilibrated with 25 mM
Imidazole buffer, pH 7.4. The column was eluted with polybuffer 74, pH 5.0.
3‑ml fractions were collected. The flow rate was 14 ml/hr.

e

O : absorbance at 280 nm, ‑‑‑‑‑‑ : TAME hydrolytic activity,‑‑: pH.

211

ところFig．4に示すようなパターンが得られた。

AE水解活性を示す試験管番号140−160を集め蒸活性とAE水解活性が分離され，ME−4が精製さ最終標品の均一性

た。Fig．5に示すようにこの精製段階での標品は

／

1

ll

／

』1

6

一

5

0．

Il
：1
ゴii

4

ll
q

2

た。

l

分子量の測定lWeberとOsbome（1969）の方法による，0、1彩

50
Tube

SDSディスク電気泳動法により測定を行った。

Figure6numbeエr

1soelectric●一●：absorbance

持体とし，3％メルカプトエタノール存在下で1

一一一一：TAME

本当たり7mA，約3時間泳動した。標準として

一一一一一：pH，

Isoelectric

ファルマシア社製分子量測定マーカー（α一1actal−

inhibitor20，100，carbo−

8

：1〆
：

これを最終標品ME叫として以下の実験を行っbumin14，400，trypsin

〆

／

ll〆

電気泳動的に単一になっていることがわかった。

5％，6．9％，10彩ポリアクリルアミドゲルを支

1

ゲルディスク電気泳動で，試料は約5μgを用い

lo箆

1
一
0

ポリアクリルアミドゲルを支持体としたpH8・3

12

0

ディスク電気泳動（永井，1967）Fig．5は7．％0

日qO︒D個憾8濤ρ頴o呂くれた。

︒︒m署属唱＞コ︒唱Uコ身︒﹄℃台国臣臼G．4

留水で透析を行った。なおこの段階において出血

covering
ina

Focusing

at280nm，hydrolytic

fbcusingofME−4

withactivity
carricrthepHrange3−10wascolumn ofllOampholyte

conducted

mJ capacity fbr24hr

at

nic anhydrase30，000，0valbumin43，000，albu−

4。CラL2mg of ME−4was put in the center

min67，000，phosphorylase b94，000）を用いて

of

the

column．2−mJfractions

werecollected．

各々の移動度の差から分子量を求めたところ，分子量28，500と算出された。なおこの操作においても最終酵素標品は単一のバンドとして泳動した。

出血活性ME−4（5、0μg）を家兎皮内およびマウス皮下に等電点接種し，24時間後にエーテル麻酔により殺し，皮最終標品を1彩グリシン溶液で透析後，LKBをはいで皮膚の裏側より出血斑の有無を観察した

8100エレクトロフォーカシング蛋白分離装置を用いて，pH3−10のキャリアーアンホライトで4。C，が，出血斑は認められなかった。

粗毒と最終標品の各種酵素活性および生理活性

300V，24時間泳動した後，280nmおよびpHをの検討

測定し等電点を求めた。Fig．6に示したように単Table

一ピークを示し，等電点は5．31であった。

lは粗毒と最終標品における各種酵素活性および生理活性を測定したものである。最終標

毛細血管透過性充進活性品中にはAE水解活性と毛細血管透過性元進活性，Fig．7に示すようにME−4の5．3μ9を家兎皮

キニン遊離活性が存在し粗毒中の他の活性は認め内に接種すると接種部位の毛細血管よりエバンス

ブルーが透過し，著明な青色斑を形成することが観察された。

られなかった。

Table

IIは各精製段階におけるAE水解活性の動向を示したものである。ME−4のAE水解活

キニン遊離活性性は152．5units／mgで，粗毒の5L7units／mg

ラット子宮を用いて活性を測定した結果，ME−に比べ2．9倍と上昇している。しかし収率は1．4彩

4は131μ9／mg／3minのキニン遊離活性を示した。 であった。

212

=' ::

+

Figure 5 Disc Electrophoresis of ME L
Disc electrophoresis was performed 7.50/ polyacrylamide gels (0.5 x 9.0 cm, 2 mA, 4'C) .

The running buffer for ME‑4 was 50 mM Tris‑glycine (pH 8.3).

The gel was stained with

0.050/0 coomassie brilliant blue R 2O'O for protein.

SalineFigure 7

Patterns oi' Capillaly Permeability‑Increasing Activity observed from theInside of the skin

213
Table

I

Various

Enzymatic

Venom

and

EnzymaticandPhysiological

ME−4
Crude

activities

Phosphomonoesterase
Phosphodiesterase．Nucleotidase

ATPasePhysiologicala）Presenceofactivity is

indicated

by十・

b）

Absenceofactivity

indicated

by一。

is

Summary ofthe

Puri且cation

TAME

Units／mg（mg）

Crude venom

Sephadex
G−100

十十LethalProtein＿b）

十十十十Permeability−increasing

Hemorrhagic

Table II十activities

Kinin−releasing

Step

ME−4

十十十十十十Proteinase

Capillaryvenom
ωTAME hydrolase

5

Activities of CrudeofME−4hydrolydc

activity

Total

R．elative

Yield

activity

activity（％）

100

2140．051．71106381．0

1124．7

75．5

84915

1．5

76．8

CM−
Sephadex

65．0

89．9

5844

1．7

5．3

DEAE−

17．8

92．0

1638

1．8

1．5

Chromato−

10．1

1540

2．9

1．4

Sephacel

fbcusing

152．5

基質特異性

熱安定性

各種基質に対するME−4の水解活性を検討し最終標品を0．4Mトリス塩酸緩衝液（pH85）

た結果，TAME（152・5units／mg），BAEE（71．4

中で37。C，45。C，55。C，60。C，70。C，80。C，90。C，units／mg）のような低分子合成アルギニンエステ

95。Cの各温度で20分間保温後，AE水解活性を測

ルを水解した。しかしリジンエステル（TLME），チ

定し，37。Cでの活性と比較した。70。Cで55％，

ロシンエステル（ATEE），アルギニンアミド（BAA，800Cで37％，900Cで7％，95。Cで3％の残TAA）および天然高分子基質であるカゼインある

存活性を示し，本酵素もME−1，ME−2，ME−3といはジメチルカゼインに対する水解活性は認めら同様，熱に対して比較的安定な酵素であることがれなかった。このような点よりME−4はME−1，

認められた。

ME−2，ME−3と同様高い基質特異性を有するζ

pH安定性とが認められた。

最終標品を蒸留水で透析後，Britton−Robinson

214
緩衝液（Britton，Robinson，1931）pH2，3，4，5，6，30

7，8，9，10，11，12，13に加え4。C，24時間保温後，TAME活性の測定条件であるpH8．5としてAEであった。この点でもME−1，ME−2，ME−3との01

類似性が示された。

012で70％以上の活性を示し，幅広いpHで安定

2での活性と比較してその度合を算出した。pH4−HI︵属目．Ho日コ︶＞＼一

水解活性を測定し，最も活性の高かったpH7．0●

糖の定性および定量試験

最終標品についてアンスロン硫酸法（Roe，1955）によりグルコースの検量線から求めた
ME−4の糖含量はグルコースに換算して13．0

1

一1

1／g

Figure9μ9／mgであった。

4

2

l

−2M

o

Lineweaver−Burk Plotsfbr Hydro−

lysis

各種阻害剤による影響

x

8

ofTAMEbyME−4absence ofDFP，
O−O●一● presence ofDFP（10mM）．

最終標品約3μgと各種阻害剤をカッコ内に示した最終濃度になるように混合し，37。C，15分間

保温後AE水解活性を測定した結果，塩酸ベンズ●

30

アミジン（10mM），DFP（10mM），TPCK（50mM）によって阻害され，Trasylol（100unit），SBTIPCMB（0、1mM），Iodo

aceticacid（10mM）にKmおよぴKiの測定●

O
1

よっては何ら影響を受けなかった。

O2（0．2％），Cysteine（10mM），EDTA（10mM），

H ︵q一日．−﹇09ユ︶＞＼−﹇（0．2％），LBTI（0．2勉），EWTI（0．2％），HeparinFig．8，9，10はLineweaver−Burk（1934）のプ

ロット図を作製し図からKm，Kiを求めた結果で

1

一1

2

ある。Kmは基質としてTAME（1．25×10−3M−
20×10−3M）を用いた。その結果，Kmは25．0×

Figure

lO

8

4
1／ε X

−2
M

lO

Lineweaver−Burk

Plots

lysis

by

ofTAME

fbr

Hydro−

ME−4

0−O： absence of TPCK，●＿●：presence ofTPCK（L7mM）．
H−︵目崔．H︒呈＞＼H20

10−3Mと測定された。Kiは塩酸ベンズアミジン（1mM），DFP（10mM），TPCK（1．7mM）を用い最10

終標品約3μ9と37。C，15分間保温したものを酵素液とし，基質としてTAMEを用いて測定した。
その結果，塩酸ベンズアミジンを用いた場合は拮

一1

Figure824

1／s x −2lO M

8抗性阻害でそのKiはo．63×10−3M，DFP，TPcK

Lineweaver−Burk Plots fbr Hydro・を用いた場合は非拮抗性阻害でそのKiは4，44×

Iysis

10−3M，0．57×10−3Mと測定された。

αぴ

〇●

二

1

ofTAMEabsencebyME−4ofbenzamidine，

presence ofbenzamidine（1mM）．

215

Table

III

Comparisons

PropertyofVarious

PropertiesofME−1，2，3and4

ME＿la）

ME−2b）

ME−3c）

29β00
5．62

33，000

Molecular

weight27，000Isoelectric

poiht

5．95

stability

StableStableStablepHstability

Wide

Wide

Wide

range

3．8

Inhibition

by

Benzamidine

十e）Inhibition

by

DFP

＿f）

Inhibition
Substrate

by

range

5．31

Stablerange

Km（TAME）

range

63．9

十

十

十

十

十 ・

十

High

Wide

2．0

TPCK

specificity

28，500

6．93

Heat

Hexoses（μ9／mg）

ME−4

High

High

13．0

十
High

4、0×10暢3M 4．3×10−3M 7．8×10『3M25．0×10』3M
O．29×10−3M O．19×10−3M O．67×10−3M O．63×10−3M
3．66×10−3M4．44×10−3M

Ki（benzamidine）

C．P．1．d）

7
十Z

Ki（DFP）
Ki（TPCK）

十Kinin−releasing（μ9／mg／3min）

O．43×10一3M O．57×10−3M

十

十

131

Clottinga）cited fヒom Yakugaku Zasshi，100，1035（1980）．b）cited岱om Yakugaku Zasshiフ
101，153 （1981）． c）cited from Yakugaku Zasshi，102，560（1982）． d）capillarypermeability−increasing

activity、

of

by一．

activity

考

isindicatecle）Presence

察

ofactivity

is indicatedby十．f）Absence

タンパクである。しかしこの4酵素はDFPで阻害を受けないME−1，ME−2とDFPで阻害をうくの研究者によって報告が行われている。著者らけるME−3，ME−4の2つに分かれた。他の蛇毒に含まれているAE水解酵素はすべてDFPで阻害をうけるセリン酵素であり，その点ME−3，

はなかでもAE水解活性の最も強いタイワンハブ

ME−4の方が一般的であると言えよう。しかし同毒に着目し，その生化学的，生理学的作用を明ら

じ毒中にこのように2つのタイプがみられたこと

かにするため単離精製を行っている。本毒には5は誠に興味深いことであるqこれまでタイワンハ

種類のAE水解酵素が存在しており，そのうちのブ毒から単離されたAE水解酵素はいずれも毛細これまでに蛇毒中のAE水解酵素については多血管透過性充進作用を有していたがME−4も同細血管透過性充進作用を有するME−1と毛細血 様であった。しかしME−4はさらにキニン遊離
管透過性充進作用とキニン遊離作用を併せもつ作用も併せもってお軌この点は単E−2と類似
3種は著者らによってすでに単離精製された。毛ME−2，さらに毛細血管透過性充進作用を有するしている。

ME−3である。今回，4番目のAE水解酵素としこのME−4の精製にあたり，最も困難であってME−4をディスク電気泳動，SDSディスク電

たことは出血因子の分離であった。各種クロマト

気泳動，等電点分画で単一な状態で分離した。

グラフィーで単一ピークとなり，ディスク電気泳

ME−4は毛細血管透過性尤進作用とキニン遊離作

動でもほとんど単一バンドと認められるように用を有していた。ME−4をME−1，ME−2，ME−3

なっても，出血活性が含まれていた。それ故ME−と比較したのがTable IIIである。いずれも分子4は出血作用をも有するAE水解酵素であろうか

量30，000前後の耐熱性，幅広いpH域で安定な糖とも考えたが，クロマトフォーカシングにより完

216
全に出血因子と区別することができた。

液凝固活性を示すし，ヒャッポダ毒ではただ1つ

タイワンハブ毒AE水解酵素で興味のあることの精製された酵素が血液凝固因子であるのに比べ，は，4っの酵素すべてに毛細血管透過性充進作用

タイワンハブ毒では4っともこの活性を示さない。

があること，その中2つはキニン遊離作用をもっ今後は残されたAE水解酵素の精製を行い，こているが，血液凝固作用を示すものが見出されなの毒に多量に含まれているAE水解酵素の役割にいことである。マムシ毒では3種のうち1っが血ついて考察してゆきたい。

引 用
1）

文

献

Britton，LL T．S．and Robinson，R．A．（1931）：The

ElectrodeintheDetermination

Titrations．The

2）

Prideaux−Ward

Erspamer，V．and

lar

Concentration

Universal Buf「er

of

the

ofHydrogen

AntimonyrAntimonous

Ions

and

in

Oxide

PotentiometricMixture．，J．Chem．Soc．，1，458−473

Erspamer，F．（1962）：Pharmacologicalactions

ofeledoisinon extravascu−

smooth muscle．，Brit．J．Pharmacol．，19，337−354

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N・Dimethyl

4）

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Use

E

and

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ActionofProteolytic

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Burk，D．（1934）：The

DeterminationofEnzymeDissociation

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Wilhelm，D．L（1955）：Enzyme−likeofglobulins丘om

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Rate

of

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Synthetic

SpinalFluid

Substrates，

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Blood

and

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AnthroneRe−

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10）杉原久義，二改俊章，二村敦子，田中哲之助（1980）：蛇毒の酵素化学的研究（第8報）タイワ

ンハブ毒より毛細血管透過性充進作用を有するアルギニンエステル水解酵素（ME−1）の精製とその性質，薬学雑誌，100（10），1035−1042
11） 杉原久義，二改俊章，二村敦子，田中哲之助（1981）：蛇毒の酵素化学的研究（第9報）タイワ

ンハブ毒よりアルギニンエステル水解酵素（ME−2）の精製およびその性質，薬学雑誌，101（2）153−160
12）杉原久義，二改俊章，森浦正憲，神谷和人，田中哲之助（1972）：蛇毒の酵素化学的研究1．数種

蛇毒の長期常温保存における各種活性の変化について，日本細菌学雑誌，27（1），47−57
13）杉原久義，二村敦子，加藤智子，二改俊章（1982）：蛇毒の酵素化学的研究（第10報）タイワン

ハブ毒よりアルギニンエステル水解酵素（ME−3）の精製およびその性質，薬学雑誌，102（6）560〜567
14）Trautschold，1．（1970）：Assay

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the

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Sulfate−Polyacrylamide

Gel

Reliability

ofMolecular

WeightDeterminations

Electrophoresis．，J，Bio1．Chem．，244，4406−4412

by

217

ENZYMOCHEMICAL STUDIES ON SNAKE VENOMS. XI.
PURIFICATION AND PROPERTIES OF ARGININEESTER HYDROLASE (ME‑4) IN THE VENOM

OF TRIMERESURUS MUCROS UAMATUS
HISAYOSHI SUGIHARA, REIKO KITO, TOSHIAKI NIKAI AND EMI SAKAI
Received for publication July 9 1 982

One of the arginine ester hydrolases (TAME hydrolases) of Trimeresurus mucrosquamatus venom was
isolated by a combination of gel filtration on Sephadex G 100, ion exchange chromatographies on

CM‑Sephadex C‑50, DEAE‑Sephacel and chromatofocusing on PBE 94. From 2 g of the venom
10.1 mg of purified TAME hydrolase, ME‑4 was obtained. The substrate specificity of ME‑4 wasstrictly directed to the hydrolysis of arginine ester. The esterolytic activity was inhibited by benza‑

midine, p‑tosyl‑L‑phenylalanine chloromethyl keton (TPCK) or diisopropyl fluorophosphate (DFP).
ME‑4 was proved to be homogeneous by electrophoresis on polyacrylamide gel and isoelectric
focusing. The molecular weight was found to be about 28,500. Its isoelectric point was 5.31. This
enzyme was a glycoprotein. The esterolytic activity of the final preparation was 152.5 units/mg (sub‑strate; TAME). This enzyme had capillary permeability‑increasing and kinin‑releasing activities,
but not clotting activity. This protein was stable to heat treatment, and between pH 4 and 12. Its
Michaelis constant (Km) for TAME and inhibition constants (Ki) for benzamidine, DFP and TPCK
were found to be 25.0 x 10‑3 M, 0.63 x 10‑3 M, 4.44>< l0‑3 M and 0.57 x 10‑3 M, respectively.

Faculty of Pharmacy, Meijo University
1 5 Yagotourayama Tenpaku‑cho, Tenpaku‑ku, Nagoya :j: 468

日本熱帯医学会雑誌 第10巻

219

第3，4号 1982 219−227頁

常時照明および常時暗黒条件飼育におけるフィラリア
D・魏8αθの中間宿主アフリカ産ダニOr擁hoδoro3
脚％6伽の生活環について
水野不二男＊・野上貞雄＊＊・圓橋正秀＊・松村武男＊
昭和57年7月27日 受付緒

noめo如（以下0．〃20め郎α）

実験に使用した0．脚oめ躍oは帝京大学医学部

onθs耽8μ加1α硲1こ感染する

寄生虫学教室より，スナネズミは長崎大学熱帯医

ダニOrn∫孟hoの〜os

はスナネズミ漉r

実験材料と実験方法

目フィラリア、0ゆε孟010nθ〃1αv漉α8（以下P．vi

θαθ）の現在知られている唯一の最適中間宿主であるnoめo

ものを使用した。

飼育条件は飼育室を常時暗黒，常時照明そして（Worms，1961）。

この0．

学研究所寄生虫学教室より分与され累系飼育したoの生活についてはHoogstraal 14時間照明，10時間暗黒（以下14L／10D）の3（1956）や他にも種々報告されているが，自然環境条件にし，温度は12。C・27。C・32。C・36。Cの下での生活についてや，生理生態などに関する基4区分にし湿度を60％±5％とした。

礎的な知見は少なく不明な間題が多数ある。α

吸血時間については，すべての0．

noめ郎oはαは雌雄異体で卵生である。卵は卵塊とし実験前6ケ月間は飢餓状態にし，各照明下で温度て産下され適当なる温度および湿度によって1ケを21。Cと27。Cの温度差で第1期と第5期成虫

月以内に艀化し3対の脚を持った幼ダニが現われの2種類に分けた。

noめαる。適当なる吸血によって成長し若ダニ親ダニのスナネズミの腹部を剃毛し，前田式ダニ固定器

各期に成長する不完全変態型である。若ダニは4中に0．脚oめo oを入れ，腹部にかぶせ，0．吻oμ一対の脚を持ち体制も複雑である。若ダニは第1期

δ伽0が宿主皮膚から脱離しなくなった時を吸血から第3期まで区別できる。成虫になると雌雄の開始とし，吸血終了は0．〃10め伽ロが自然に宿主生殖器が判然としてくる。フィラリアP．v漉oθ

皮膚より脱離した時とした。

oの大量繁

吸血後の体重比は吸血時間測定と同じ方法で吸殖，フィラリア寄生のまま長期維持そして吸血時

血中に水分を排出した場合は吸取紙で吸水し天秤間の短縮などが重要な課題である。

にて重量を測定した。

を研究するにあたり，ダニ0．脚oめo

著者等はそれらの課題の為に物理的条件である

照明条件，温度条件の変化がα規oめo厩の成長

産卵数調査については，各照明条件下にて温度21。Cと27。Cにて飼育した雌0．〃！oめα

αをス

率，産卵数，生存率そして吸血時間にどのようにナネズミに吸血させ産卵数を測定した。そして雌影響したか検討したので報告する。

雄差の調査については第5期になった成虫について調べた。

生存率は産卵した卵を各照明条件で21。C・＊神戸大学医学部医動物学教室 〒650兵庫県神戸市中央区楠町7−11−1＊＊束京大学医科学研究所寄生虫部 〒108東京都港区白金台4−6−122027。C・32。C（各湿度60％±5彩）の飼育条件で規oめのoの吸血時間を検討した。白丸は第1期幼第5期になった成虫数を調べた。また同時期に各

虫，黒丸は第5期成虫を示す。常時暗黒条件下で飼育された（λ〃2勧ゐo孟o群では27。Cで飼育され

照明条件27♀Cにて雌雄α

noめ4忽を吸血させ，30・60・150・400・600日目までの体重測定と生た温度下での吸血時間が短かった。

存率を調べた。

常時照明下および14L／10D条件でも27。Cで吸血後の体重変化については，照明条件を常時の吸血時間が短いのが認められた。

暗黒にし，温度は27。C湿度は60彩±5彩とし，実験項目を1）吸血後の雄ダニの体重変化，2）吸各照明条件下では第1期と第5期成虫との有意差は認められなかったが温度においては27。Cで血後の雌ダニの体重変化，3）1）．v飽oθ感染スナ

吸血させると吸血時間が短縮された。

ネズミ吸血後の雄ダニの体重変化，4）1λv舵oθ

図2は明暗条件および温度条件による0．吻oμ一

感染スナネズミ吸血後の雌ダニの体重変化についδ傷0吸血後の体重比を示している。最低は吸血て吸血後30・60・150・400日目の体重を測定した。

後L5倍から最高16倍を示した。第1期成虫およ

卿化率については各照明条件下にて温度21。C・び第5期成虫での吸血率には有意差は認められな27。C・32。C・36。Cの温度差と，60％±5％の湿かったが，やや第1期成虫の方が吸血率が低い傾度について産下直後の卵を8日目より30日目まで

向を示した。

観察した0・吻oめ伽o数を調べた。

また照明条件および温度差による吸血後の体重変化は有意差が認められなかった。

結

図3は明暗条件および温度差にて雌成虫の産卵

果数と卵から卿化した成虫の雌雄の差（性差）を調

図1は明暗条件および温度条件において0．

べた。黒丸は産卵数，Mは産卵後の成虫になった

0

1st

stage

adults

OO

●

5th

stage

adults

OCO

●●●

100

o
o
●

●●●●

●

8

ALL

0

27℃
DAY

of O，脚ψ磁in

●● ●鱒

OOOO

DARK

o

●●●o ●

OO

21℃

O

●
OCO

27℃

bloodミuckin8time

● ●●●

The

●

l

●●

Fl呂ure

DAY

●●●

●●

ALL

O

O

21℃

00 を

3

O

0

10
Minute ofblood sucking

8

o

O●●●

口b§

●

●●

O

GqOQ

3

曽
● ●■

OO

●

O

o

●●●

o

●●

3

50

O

●3

00Q

OO
8

●

LIGHT
each

21℃

27℃

14L／10D
lighting

conditlons，

22 1

lr

e

15

e

o

10

e 5 th stage adults

O
o

o

o
5

8

,

,
e

o

1'

,

O

,

,,

l D

$

O

$e

P

Times ofbody weight

,
,
,

ooo

after blood

o
o
o

,

8

o

,

o

e

S

o

2l

ALL DAY DARKooo so8 :

o

o
o
o
o
o

o

8

e

o

' o
,, 8
e 8

o
o
o
o

,
,

8

ALL DAY LIGHT

,
,
,

27 c

2l ]

27 C

$
e
t

o
o

(

e)

21'C

27 ]

o

o
o

o

sucking

Figure 2o I st stage adults,

14 L /10 D

The ratio of body weight after blood sucking of O. mbubata in each lighting conditions.

400

,
,

,

e

,:
e

,

,,,
e

,
:

300
e
e

,

e
t

,
,,
,
,

,,
(,

200

,
,
e

i

,
e

*.
1 OO

'

e'

e

*

p,
:

,,

'

.
;. .

e
e
,

No, of

eggs

MF

MF

27 C

ALL DAY DARK ALL DAY LIGHT

Figure 3MF

2liC 27'c 27 C
2l C

21

l 4 L /10D

The production of eggs and ratio ofsex of O. moubata in each lighting
conditions .

222︾い﹇U＞網﹇一〇＝↓騨一伊一K8＿δ
闘一翼一創一魯、、電50

ローQ27℃
冒

餌21℃

●

●32℃

＞い﹇O︾イO︾勾国

巳一9−r−gr璽＼珊＿綱＿層＿＿ロ
50

一 い＼一〇∪

葛黛←一ε一〇一唱
賃一昌

轡一一一，嗣50

Percent

ofsurviva1
1st 2ndStage

Figure4Theof

3rd 4th 5th
adult

survival

O ηzo麗ゐα孟o．

ratio

of

雄0． no励鷹o数，Fは産卵後成虫になった雌成虫数を示している。

O。，ηo％ゐ伽in each temperature．

図5は吸血後600日目までの体重変化を追跡した結果である。α溺oめ磁oは温度27。C，湿度60％

産卵数は27。Cの温度条件下で飼育した0．

±5％，照明条件は常時暗黒にて飼育した。黒丸

脚o肋切oに有意に多く認められ，常時暗黒群ではは雄，白丸は雌0．〃10め疏αを示している。吸血常時照明群に飼育されたα〃！側加舵より産卵数

後雌は30日以内に産卵するので，吸血後30日目でが多かった。また産卵の性差は雌0，〃！oめ伽oの雄の体重と比較すると約2倍の体重減になってい方がやや多かったが統計的な有意差は認められなる。

かった。そして照明条件および温度条件が雌雄産150日目になると雄の体重は吸血直後の50％以卵の比率には特に影響を示してなかった。図4は下になり雌では20％前後になり，上背部と下腹部

明暗条件下で21。C・27。C・32。Cの温度条件にてを被っている体表が一枚の紙の様に平担になる。

成長5期までの生存率を追跡調査した。縦軸は生雌雄0．規o麗加

αは400日目前後より体重減少

存率，横軸は第1期から第5期の成虫発育過程をが少くなり，この頃より雄の死亡率が高くなり，示している。図では暗黒群の27。Cと32。Cで高600日目を経過すると動きはほとんど止まり，吸い生存率を示している。

血する体力もなく死亡するαnoμ加如が多くな

223

●Male

ticks

o Female ticks●

Figure5

The survival ratio

ofadult

female andmale

O．規oμゐ磁at27。C．

Female

o一＿r

▲一
．

body

blood

lird（120mf／0．01ml）．Male Om after infectedjird（120mf／0．01ml）

＝＝一〇

歳a

of

weightDays

Figure6Thechangeafterof body

400

150

60

30

blood

weight

suck

a丘er

blood

suck

at27。C．

艀化に対して，どのように影響したかを調べた。

る。

図6は体重減少を400日目まで追跡しているが，
雄，雌0．

after

Male Om after bloodsuck
Female Om after infected

巌ムミ＝一＿＿一
cent

Om

＼3＼．

50

Per

600

400

ム．＿△ suck

100

■

…§，

竃

150

60

30

Days ofsurvival●1●

Per cent ofbody weight

oo80R曹

多㍉●

︒︒︒g窟

e︒尋

50

・⁝︸争

・ψ ・7魅弓

100

noめ躍oを1）．v∫ ε磁感染スナネズミに吸血させ，0．m側6αα体内にミクロフィラリアを取り込んだ0．〃！oμ加αの体重減についても調査した。

温度は21。C・27。C・32。Cそして36。Cの4段階に分けた。

常時照明群において27。Cと32。Cが産卵後8日目より卿化が開始され15日目で約50％の卵が卿化したが，21。Cと36。Cでの艀化率は悪かった。

縦軸は体重変化，横軸は吸血直後からの日数を常時暗黒群にては10日目・27。Cで14％，32。C

示し△は雌，▲は感染スナネズミに吸血させた。

で32％の卿化率であったが，21。Cと36。Cでは18○は雄，●は雄を感染スナネズミに吸血させた。

日目頃から卿化を始めた。14L／10D群では32。C

図では雌雄間とも統計的有意差は認められなかっで10日目に12％の艀化率を示したが，36。Cではた。

産卵17日目で2彩だけが卿化した。

図7は各照明条件と温度条件がO」noμ加 θの温度条件に関しては，21。Cで常時照明群が

224

ゼ
／

N：50

／一！

㎝o︑q
＼

︸︾い一u︾＜﹇Ho＝↓

ロー翼一■一置一■一躍一置一嵐一置一着一醤
一●一●一■一●一←一一◆一一●一■一■一●一●煽4レー←ムィど△一ぺ

8訳＞﹇一U＞イO︾勾囚

／
ロ悔■

N：50

0司一〇一一Q−O−0−O−O−O−O＿O一一〇一〇＿0＿・O△21℃

菖一 彊一■
一〆一一一一霜一■ニニ．／・

■27℃

1昌一煽

／

．一←一■一ピ＿！

＿＿＿．＿墨＿馴一 ノー岩＿．一←・／・一＿．＿．＿／

△述／

圃32℃

036℃

＿ムノ

←認書＿。＿。殉＿。一。一。＿。＿。＿。

N：50 …一一ノー一1一も、み、！
／〆ジ㈱凋4㎝o︑qo︑

一 一＼一〇∪、，］一一ローH一量

■

8＿。

／

／

ムームームー△一4

ノ6→＿〆…一・一通／
一

Days

△一一4

！

of

hatching

『

10

一

15

Figure7Thehatching

20

time

一

一

一

25

一

30

ofeggs丘om O．窺o幼伽．

30日目までに卿化したのが72彩，14L／10Dが58

藤崎（1980）は吸血時間に関してダニ宿主の取％，常時暗黒群が42彩であった。27。Cでは常時り付き行動から始まる複雑な要因があると述べて

照明群が30日目で92％の卿化率，常時暗黒群ではいる。吸血中または吸血後にα〃！o励伽oから排72％，14L／10Dでは62％，32。Cでは常時照明群

出する水分（Coxal quid）も体重増に関与していは84％，常時暗黒群では86彩，14L／10D群ではるが吸血した血液量の半分から2／3を排出する。

82％と艀化率が高く，36。Cでは全照明条件下で2％の低い卿化率であった。

吸血後の体重増に関してLondono（1976）はダ
ニ成虫α云or威0聡窺種をZ》．v舵α召感染スナネ

ズミの血液を吸血した場合，吸血前の体重の2〜考察

6．27倍に増量したと報告している。著者らの場合
各照明条件は吸血後の体重には影響しなかったが吸血時間の短縮は定量的実験を効率化する。照1．5倍から16倍と個体差が大きかった。産卵数に明条件が吸血に要する時間に影響しない。そしてついては宿主側の動物種によって影響されると言また図1で示しているように27。Cで吸血時間がしかしながら吸血部位，0．

われている。Mango（1977）はα短い事が判明した。

noめo∫θを牛血液と豚血液に吸血させた場合，豚血液を吸血し溺oμδ如oの飢餓状態，個体差によっても吸血時間た方が産卵が多かったと述べている。また照明条

のちがうことが分った。吸血部位についても吸血件について，藤崎（1980）はフタトゲスダニやシ場所に太い末梢血管があれば短時間に吸血できる

エルッエマダニは光によって産卵の週期があるとし・また細い血管にあたれば吸血時間が長くなる。

報告している。著者等の実験では温度27。Cの常幼虫と成虫との吸血時間差は幼虫の方が小さいの時暗黒飼育した方が産卵数も多かった。そして各で吸血時間も短いと思ったが，10倍以上も大きい

種照明条件で27。Cが21。Cより最適と判明した。

成虫でも吸血場所，飢餓条件で，時間差が認めら

湿度に関してはHitchcock（1955）は牛に寄生れた。

するダニBo砂h∫1μs吻∫c〜9ρ1μs種では産卵には影225響しないと報告しているので，著者等も60％±に寄生するダニでは照明条件より湿度と温度が重5％の条件で実験した。しかし彼は，この種のダ

要で，湿度が85〜90％・温度27。C〜30。Cで最適

ニは22〜23。Cが最適だと報告している。

の卿化率を示したと報告している。

o襯醒oα88γρ枷彫

以上0．脚oμδ伽oは吸血時の吸血時間・体重変種では20〜35。Cで産卵したが，15。Cの低温や化・産卵数・卿化率・生存率に関しては照明条件が40。Cの高温では産卵しなくなり，30〜35。Cが最有意に影響しないが，温度は27。C〜32。Cが適温

適でまた産卵前の温度も重要であると述べている。

である事が判明した。しかし長期間飼育する場合

Wright（1971）はアメリカの家畜に寄生するダニは21。C位の温度が最適と思われる。この実験で

オ励1アo〃！

は光・温度の影響について調査したが，Dethier

Sweatman（1968）はダニ1かα

nα〃1αcμ10吻脚種は27。C・80彩の湿度（1957），El−Ziady（1958）は，その他に湿度や臭いが最適であるが，4種類の照明条件では産卵数にも吸血ダニは敏感であると述べている。Nevil1

なんら影響はないと報告している。

産卵後の卵の雌雄差についての報告はないが，（1964）やGarcia（1962）そしてSasa（1957）らは，

図3では性差が判別できた。成虫の性差を調べた

吸血ダニ，吸血蚊はCO2に大変敏感であると報が，照明条件による差異は認められなかった。

告しているので，今後は光とか温度とかの物理的条件の他に湿度の変化とCO2の変化をも加えて

照明条件における生存率は暗黒で27。Cと32。Cにおいて比較的に生存率が良好であるが，Mango

いけば，詳細なα（1977）は血液の種類によっても成虫になる比率

き，D．v漉αεのスナネズミ感染実験における貴重noめαoの生態が明らかにでも変わると報告しているので，これらの実験でもな中間宿主として今後さらに活用され得よう。

今後，動物差を変え実験をしてみる必要があると思われる。著者らの実験でも適当な吸血をくり返

要

えさなくても，図5に示すように600日以上も吸血約

常時照明，常時暗黒，そして14時間照明と10時なしに生存できる。吸血後の体重減少については

雌は吸血後30日以内に産卵するので，産卵後は産間暗黒の3条件と温度21。C・27。C・32。C・36。C

卵数にもよるが，体重が1／2から2／3に減少する。

下の飼育が，アフリカ産ダニOrn∫∫ho吻ros〃！oめo αP．v∫∫θoθを感染スナネズミの血液で雌雄0．

no麗一の吸血時間，体重変化，産卵数，卿化率そして産bataに吸血させ，血液と一緒にミクロフィラリア

卵後の雌雄比率にどのように影響したか検討した。

を取り込んだ場合に，0．珈oめ餌oの生存率変化をその結果，照明条件に関しては0 noμ加如

調べたが，0．01m1中120匹前後のミクロフィラの生活になんら影響を示さなかったが，温度ではリアの取り込みではα脚oめo∫αの生存率には何27。Cから32。Cが最適温度であった。また長期

んら影響を示さなかったが，200〜500ミクロフィ

生存には21。Cが適当と思われる。

ラリア／0．01m1の場合であると0．〃20めα∫αの生存に影響を示した。

謝

この実験にて感染幼虫保存0．脚o必α∫oを長期

辞本研究にあたり御助言を賜わりました東京大学

間生存させる至適血中ミクロフィラリア密度も判明した。

医科学研究所寄生虫部の松田肇先生および帝京大

艀化率については各照明条件において27。Cと学医学部寄生虫学教室の前田龍一郎先生に深謝申32。Cが最適であった。Hitchcock（1955）は，牛し上げます。

引
1）

Dethier，V．G，（1957）：The

用

文

sensory physiology

献of

blQod−sucking arthropods．Exp．Parasit．，

226
6 :68‑ 1222) El‑Ziady, S. (1958) : The behaviour ofOrnithodoros erraticus, small form, towards certain en‑

viromental factors. Ann. Ent. Soc. Amer., 51:317‑336

3)(1980) :i ':iiE ( ) 1 r :, ･ : l * A *' 33, '. 109‑112

4) Garcia, R. (1962): Carbon‑dioxide as an attractant for certain ticks (Acarina: Argaside andlxodidae), Ann. Ent. Soc. Amer., 55:605
5) Hitchcock, L. F. (1955) : Studies of the non‑parasitic stages on the cattle tick, Boophilus mi‑
croplus (canesrini) (Acarina: Ixodidae). Aust. J. Zool., 3: 295‑311

6) Hoogstraal, H. (1956): African ixodoidea. I. Ticks of the Sudan Research Report NM 005
050, 29. 07 U. S. Navy Medical Research.

7) Londono, I. M. (1976) : Transmission of microfilariae and infective larvae of Dipetalonema
viteae (Filarioidea) among vector ticks, Ornithodoros tatakowski (Argasidae), and loss of mi‑
crofilariae in coxal fluid. J. Parasit, 62:786‑788

8) Mango, C. K. A. (1977) : Ornithodoros moubata: Breeding in vitro. Exp. Parasit., 42: 282‑288
9) Nevill, E. M. (1964): The role ofcarbon dioxide as stimulant and attractant to the sand tam‑pan, Ornithodoros savignyi (audouin). Onderstepoort J. Vet. Res., 31: 59‑68

10) Sasa, M., Tanaka, H., Ueno,Y and Miura,A. (1957): Notes on the bionomics of unengorgedlarvae of Trombicula scutellaris and Trombicula akamushi, with special reference to thehosts.. Japan. J. Exp. Med., 27:31‑43

1 1) Sweatman, G. K. (1968) : Temperature and humidity effects on the oviposition of Hyalomma
aegyptium ticks of different engorgement weight. J. Med. Ent. 5: 429‑439

12) Worms, M. J and Terry, R. J. (1971): Dipetalonema witei, Filarial parasite of the jird, Me‑riones lybycus. I. Maintenance in the laboratory. 47: 963‑970

13) Wright, J. E, (1971): Response of ovipositing Amblyomma maculatum Koch (Acarina: Ixo‑
didae) to photoperiod. J. Med. Ent., 8: 529‑531

227

LIFE CYCLEOFASVECTORA

AT

AFRICANOFTICKS，0ノ〜亙1丁皿）jDOノ〜03MOUβ、4Tオ

FILARIAE

Z）五PET。4」乙ONEM！望VITE！伍

THE CONDITION

OF CONTINUOUS HGHTANDDARKNESS

FuJIo

CONTINUOUS

MIzuNo＊，SADAo NoGAMI＊＊，MAsAHIDEAND TAKEo MATsuMuRA＊

MARuHAsHI＊

Received長）r publication：July27，1982

Lifセcyclel）bloodbloodofAf｝ican

ticks，Or碗ho顔oro5規o幼α∫αas

sucking time，2）rate ofbody weightsuck

dar㎞ess，andand5）rateof

l4hours

lightavectorofDψ6change，3）production

αJoη餓α〃露昭8were

ofeggs，4）rate

studied

ofsex

on

after

hatching

time

under the conditionof continuous

and

hours

darkness

diHヒrent

temperatures（21。C，27。C，32。C

and

no

upon the

the

lO

at

light and continuous36。C）．

As

suitabletheresult，thetemperaturedif琵rent

condition

ofO，窺o幼伽for

longoflight

li免is

shows

between27。C

ef琵ct

and32。Candlifヒofforthe

O．窺oゆ伽，while

longestone，21。C．

＊Department of Mcdical zoology，Kobe University school ofMedicine，Kobe，Hyogo650・Japan＊＊Department ofParasitology，Institute ofMedical Science，University ofTokyo，Minato−ku，Tokyo

108，Japan

229Japan. J. Trop. Med. Hyg., Vol. lO, No. 3, 4, 1982, pp. 229‑237

COMPARISON OF PHYSIOLOGICAL RESPONSES TO HEATBETWEEN SUBTROPICAL AND TEMPERATE NATIVESSEIKI HORI*, HEIKICHIRO IHZUKA* AND MASASHI NAKAMURA* *Received for publication July 27 1982

Abstract: Anthropometric measurements, measurements of skin temperatures andrectal temperature at 30'C and measurements ofphysiological responses to heat were madeon 30 young male residents of Okinawa who were born and raised in Okinawa (Group O)
and 30 young male residents of Okinawa who were born and raised in main islands ofJapanbut move to Okinawa less than two years (Group M) in summer. Sweating reaction was
examined for 60 min by immersing both legs in stirred water bath of42'C in room of 30'C
and 70 R. H. Group O showed thinner skinfold thickness, slender body shape, higher
skin temperature at 300C, smaller sweat volume with lower Na concentration in sweat,
less rise in core temperature, and less increase in heart rate during heat exposure thangroup M. It is assumed that group O might have superior capacity for nonevaporative
heat dissipation and better efliciency ofsweating for cooling the body that group M. It is
concluded that the acclimatization to heat ofsubjects in group O, subtropical natives, hadadvanced further than those in group M, immigrants of temperate natives to subtropicalzone, and heat tolerance of the former is superior to that of the latter.

INTRODUCTION
Body temperature of men is maintained within a narrow range in spite of a widechange in environmental temperature by regulating both heat dissipation andmetabolic heat production. It is well known that changes in circulatory function
and sweating are the main physiological responses to heat exposure and relative
importance of heat dissipation by evaporation of sweat increases as the ambient
temperature rises (Robinson, 1949 ; Belding and Hertig, 1962). Heat dissipationfrom the skin is in proportion to the body surface area while the metabolic heatproduced in the body is rather in proportion to the body weight when body weight
is displaced as in the case of walking. Therefore, greater ratio of body surface area
to body weight is favorable to regulation of body temperature in heat when the skintemperature is higher than ambient temperature (Coon et al., 1950). The sub‑cutaneous fat prevents heat transfer from the core to the shell and thinner subcutaneous

fat layer is favorable to heat dissipation (Burton and Bazett, 1 936). When unac‑climatized individuals are repeatedly exposed to heat, physiological responses toheat are changed and heat acclimatization occurs (Eichna et al., 1950; Senay, 1972).
In short‑term heat acclimatization, a marked lessening of crdiovascular strain ac‑companied with increase in body fluid, Iess rise in core temperature due to an earlier* Department of Physiology, Hyogo College of Medicine, Nishinomiya, Japan.
of Hygiene, Nagasaki University, School of Medicine, Nagasaki, Japan. **** Department
Deceased.

230

onset of sweating and more profuse sweating with lower salt concentration at a given
sweating rate are observed (Adolph, 1946; Williams et al., 1967). In long‑term heatacclimatization, physical characteristics are changed so as to favor heat dissipation,rise in core temperature, sweat volume and salt concentration decrease when exposedto the sarne heat load (Dill et al., 1938; Christensen, 1946). These adaptive changes
in physiological responses to heat and physical characteristics are favorable to tolerateheat stress (Hori, 1978). Okinawa, subtropical zone, has hot and long summers
and temperate winters, whereas the main islands ofJapan have neither long summer
nor long cold winter. Thus, residents of Okinawa are more acclimatized to heatthan residents in the main islands ofJapan. We then attempted to compare phy‑siological responses to heat and physical characteristics of residents of Okinawa who

were born and raised in Okinawa with those of residents of Okinawa who were borna,nd raised in the main islands of Japan in order to elucidate the different
characteristics of acclimatization of men between short‑term heat acclimatization andlong‑term heat acclimatization.

MATERIALS AND METHODS
Thirty young male residents of Okinawa who were born and raised in Okinawa(Group O) and 30 young male residents of Okinawa who were born and raised in
one of the main islands ofJapan but moved to Okinawa in less than 2 years (Group M)

were selected as subjects. Experiments were performed in summer. The subjects
were instructed to fast and rest for at least 2 hours prior to the experiment in orderto minimize any effects of specific dynamic action and exercise on body temperature.
After staying at rest in a climatic chamber maintained at 30'C of Ta with about 70010
R. H., rectal temperatures and skin temperatures of subjects, dressed in shorts only,
were measured, then the subjects sitting at rest immersed their legs up to the knees

into a stirred water bath of 42'C for 60 min. Cutaneous sites for measurement ofskin temperatures are forehead, chest, back, forearm, hand, calf and foot (Hori et al.,1977). Rectal temperature was recorded continuously by a copper‑constantan
thermocouple throughout the experiment and local skin temperatures were measured

with pyrometer. Body weight was measured before and immediately after heat
exposure, using a platform balance with an accuracy of 5 g and net body weight
was obtained by subtracting the weight of shorts. The local sweat rate of the chest
and back was measured successively at 1 5 min intervals by the filter paper method(Ohara, 1966). Na in sweat was eluted from the filter paper with distilled waterand its concentration was determined by flame photometry. The average value ofmean Na concentration of sweat on the chest and back, and body weight loss without
correction of body weight loss through respiration were used in calculation of thetotal salt loss. The skinfold thickness was measured with a caliper 2 sec after apressure of 10 gjmm2 of the caliper jaw surface was applied to the skin at the following
sites.

Upper arm : halfway between the shoulder and the elbow over the biceps
muscle.
Subscapular : below the tip of the scapula.

231

Chest : at the juxta nipple.

Abdomen : adjacent to the umbilicus and also along the midaxillary line at
the umbilicus level.
Waist: between the ribs and iliac crest at the lateral part of waist.
Thigh : half down, over the rectus femoris muscle.
Body surface area was calculated by the following formula of Takahira :S = 0.007246 x Wo. 425 X Ho. 725

Where : S =Body surface area in sq meters

W=Body weight in kg
H =Height in cm
The numerical heat tolerance indices and their components were calculated asfollows (Hori et al., 1974) :I = JA2 + B2 + C2

S= A2 B+ C2

A ‑0.07AWx W
B ‑ dTre40.6‑TreC ‑0.75
ASx W
Where : W=Body weight before the experiment (kg)
AW=Weight loss at the end of heat exposure (kg)Tre = Rectal temperature before the experiment ('C)
ATre =Rise in rectal temperature at the end of heat exposure ('C)

AS=Salt loss estimated from mean Na concentration in sweat and bodyweight loss (g)RESULTSl . Anthropometrical measurements

Mean values and standard deviations for age, height, body weight and bodysurface area of groups O and M are shown in Table 1 . The mean values of height
Characteristics of subjects (Table 1

Grou pO

M

NumberAge(yr)

Height(cm)

WeightB. S. A.

(m2)

(kg)

30

22.8 2.0 166.2 4･5

30

23. I

I .6 168.7

S. D.)

3.7

57.7 6.0
62.5 5.7

l .65

O. I Ol . 720.09

D. R.
(month)l 3. I

3.9

O: Residents of Okinawa who were born and raised in Okinawa.

M Residents of Okinawa who were born and raised in the main islands of Japan.

B. S. A. : Body surface area.

D. R. : Duration of residence.

2. 32and body weight for group O were smaller than those for group M though thesedifferences were not statistically signiflcant. The ratio of body surface area in m2
to body weight in kg for group O (0.0286) was considerably greater than that forgroup M (0.0275) . Thus it can be said that subjects in group O have more favorable

body shape for heat dissipation when compared with those in group M. The meanvalues and standard deviations of regional skinfold thickness are shown in Table 2.
Table 2 Skinfold thickness (X S. D.)Group Upper arm Subscapular Chest(mm) (mm)
(mm)

O

M

5.9

I .6 7.8

Abdomen

Waist

Thigh

(mm)

(mm)

(mm)

I .4

6.7

I .8

7.5 2.0**

6.6 I .5* *6.6

7.0 2.6 8.4 2.8

7.5

2.3

9.6

8. I

8.4 2.5

3. l

2.4

I .7**

O, M: The same as in Table 1.
** Significant differences between two groups at I o/o level.

A11 the mean values of regional skinfold thickness for group O were smaller thanthose for group M. Among these differences, there were significant differences inmean values of skinfold thickness of abdomen, waist and thigh. The mean value ofskinfold thickness in the extremity in comparison with that in the trunk was smallerin group O than in group M.
2 . Rectal temperature and skin temperatures

The mean values and standard deviation of rectal temperature and skin temper‑
atures at 30'C before sweat test are shown in Table 3. The mean values of rectal
Table 3

Rectal temperature and skin temperatures at 30'C (Group Tre Forehead Chest

Back

Forearm

Hand

O 37.4 0.2 35.6 0.5* 34.4 1.0 34.8 0.9 35.3 0.8 35.4 0.8
M 37.4 0.3 35.3 0.6 34.1 0.8 34.4 0.7 35.0 0.6 35.0 0.8

S. D.)

Calf

Foot

34.9

0.6

34.6

I .O

34. 7

0.6

34.4

0.9

O, M : The same as in Table I .
* Significant difference between two groups at 50/0 Ievel.

temperature in both groups were identical. All the mean values of skin temperaturefor group O were greater than those for group M. Among these differences, themean value of skin temperature on the forehead for group O was significantly greaterthan that for group M.
3 . Physiological responses to heat exposure

The mean values and standard deviations of body weight loss, mean Na con‑centration in sweat, rise in rectal temperature and increase in heart rate were shownin Table 4. The mean values of body weight loss and Na concentration in sweat
for group O were significantly smaller than those for group M. The mean valuesof rise in rectal temperature and increase in heart rate at the end of the experiment

233
Body weight loss, mean Na concentration in sweat, rise in rectal temperature

Table 4and increase in heart rate (X S. D.)

Group

AW
(kg)

O

0.39 O. 1 1 *34,3

1 1 .O*

0.41

O. 1 3

l 3.4

0.46

40.0

I I .80.44

O. 1 415.0 6.6

M

ATC( EqjL)O. 1 3AP('C)( beats/min)
6.4

O, M : The same as in Table I .

AW: Body weight loss.
C : Mean Na concentration in sweat.
AT: Rise in rectal temperature.
AP: Increase in heart rate.
* Significant differences between two groups at 50/0 Ievel.

for group O were considerably smaller than those for group M. These results
indicate that the magnitude of physiological responses induced by heat exposure asa whole was smaller in group O than in group M.
4. Heat tolerance indices and their components

The mean values and their standard deviations of heat tolerance indices and theircomponents calculated using data obtained in the present experiment were shownin Table 5. The mean values of index I and components A, B and C for group O
Table 5

Relative water loss, relative rise in core temperature, relative salt loss and heat

tolerance indices (X S. D.)

A

Group

M

C

B

S

I

0.097

0.024

O. 1 28

0.035

0.0 1 90.004* *O. 1 58

0.03 1 *

l .30

0.56

O. I 05

0.028

O. 1 38

0.029

0.023

0.004

O. 1 75

0.025

l .28

0.40

O, M : The same as in Table I .
A : Relative water loss.

B : Relative rise in core temperature.
C : Relative salt loss.

I : Heat tolerance index.
S'

B' JA2+* Significant differences between two groups at 50/0 Ievel.
** at lo/o level.

were smaller than those for group M while mean value of index S for group O". wasslightly greater than that for group M. There were signiflcant differences in thevalues of index I and component C between two groups. Thus it can be said phy‑siological strain induced by the same heat load for group O was smaller than thatfor group M.

234

DISCUSSION
It is known that heat acclimatization appears not only in physiological function
concerning regulation of body temperature but also in physical characteristics i.e.

body shape and body composition (Coon et al., 1950; Prosser, 1964). As shown in
Table I and 2, the ratio of body surface area to body weight for group O was greaterthan that for group M and the mean value of skinfold thickness for group O was
smaller than that for group M. It is known that a rise in ambient temperature
results in a decrease in the caloric intake and subcutaneous fat might decreaseby lower caloric intake (Johnson and Kark, 1947). Deposit of subcutaneous fat
prevent heat transfer between the body and environment due to its lower thermal
conductance (Burton and Bazett, 1936). Heat dissipation increases as the bodysurface area becomes larger and metabolic heat produced in the body is proportional

to the body weight during movements of the body as in walking. 'rhus, it may
be assumed that physical characteristics of individuals in group O result from
10ng‑term adaptation to hot climate and are favorable to body temperature regula‑tion. As shown in Table 3, all the skin temperatures measured for group O werehigher than those for group M. These results showed subjects in group O had
higher mean skin temperature than those in group M. Body heat is dissipated byradiation, convection and the evaporation of water and heat dissipation by bothradiation and convection is proportional to the temperature gradient between skinsurface and air. Since sweating did not occur or sweating rate was very low at 30'C
before dipping the legs ofsubjects into hot water bath, heat dissipation for group O
was greater than that for group M. These results indicate that the ability of heatdissipation without sweating for group O was superior to that for group M. The
mean values of rectal temperature before sweating in both groups were identical andthe temperature gradient between core and shell was smaller in group O than ingroup M. Since the value of temperature gradient between core and shell at rest isapproximately inversely proportional to the coefficient of heat conductance of the body,subjects in group O had higher heat conductance of the body and superior capacityof heat transfer from the core to the periphery than those in group M. Many inve‑
stigators reported that the blood volume increased as a result of heat acclimatization(Bass and Henschell, 1956; Senay, 1972). Consequently higher skin temperature andhigher heat conductance of the body for group O might be due to an increase in blood
volume with an improvement of the skin circulation as well as thinner subcutaneous

fat layer induced by long‑term heat acclimatization. As shown in Table 4, sweat
volume and salt concentration in sweat for group O were significantly smaller thanthose for group O. As already reported by many investigators, the subjects sweat
more readily and profusely while the salt concentration in sweat at a given sweat
rate decreases after repeated heat exposures (Dill et al., 1938; Adolph, 1946). On theother hand, both sweat volume and salt concentration in sweat decrease duringexposure to a hot environment after long‑term heat acclimatization (Christensen,
1 946) . It may thus be concluded that characteristics of sweating response of subjects

in group O reflect long‑term heat acclimatization of subtropical natives. As shown235

in Table 4, rise in rectal temperature and increase in heart rate during heat exposure

were smaller in group O than in group M. These results are in good agreement withother reports concerning heat acclimatization (Adolph, 1 946 ; Robinson et al., 1 943 ;Bass, 1963). Evaporation of sweat from the skin is dependent on the degree of
wetness of the skin and the difference in vapor pressure between on the skin surface
and that in the surrounding air. The increase of sweat represents only wasted sweat
for heat dissipation after wetness of the overall skin has taken place and a higher
concentration of salt in sweat decreases the difference in vapor pressure between theskin surface and the surrounding air. A smaller volume of sw.eat with a lower salt
concentration in sweat in group O suggests that the efficiency of sweat for coolingthe body in subjects in group O was better than that in group M. Therefore, thebetter efficiency of sweat for cooling the body and superior capacity of nonevaporative
heat dissipation of subjects in group O might be one season for the less rise in coretemperature in spite of smaller sweat volume. Since core temperature is the dominantfactor in determining heart rate at rest, Iess rise in heart rate for group O might bedue to less rise in rectal temperature for group O. Heat tolerance of group O wascompared vyith that of group M by numerical heat tolerance indices. As shown in
Table 5, the mean value of index I for group O was signiflcantly smaller than thatfor group M. Since the value of index I represents the magnitude of strain inducedin the body, smaller value of index I indicates superior heat tolerance. Accordingly,
heat tolerance of subjects in group O was superior to that of subjects in group M

when heat tolerance was assessed by numerical heat tolerance index. The value ofindex S represents the ratio of relative rise in core temperature to relative water loss
and relative salt loss and the parameter "a" represents the magnitude of strain in termsof water‑electrolyte metabolism (Hori et al., 1 974). Figure I represents I versus S

plot for groups O and M. In this figure, iso‑sweating lines are drawn by connectingla=0.115 a=0.tlO

a=0.105

0.18

=alOO

0̲1 7

a=0.095

o,t6

oOOo

tl 1.2 t t.4 t5 s

Figure I Rel ptionship between indices I and S.

O. M: The same as in Table 1.
Isosweating lines were drawn with their values of parameter.
Circles s Drawn a̲rQund the means with radiu es Qf stand rd errQrs

236

the poirits of the same value of parameter "a" A (1 + C2 l‑‑ ‑ ‑ 'A2 )(Hori et al., 1974).

It i . obviolls from the figure the circle drawn around the means with radiuses ofs. anda.rd errors for grbup O is located ip the lower region when compared with thatfor̲ group M, i.e. the value of "a" for grqlrp O was smaller than that for group M.
Tlpe mal; r value of ':a" rith smaller value of index I for group O indicates that14bjects in group O had better efiiciency of sweat for cooling the body than those ingroup M. ̲From these r sults, it̲ may be concluded that subtropical natives, subjects
in grpup O, h d superior heat dissipating capacity without sweating, better efficiencyof sweat for heat dissipation and superior heat tolerance when compared with tem‑erate nativ s, subjects in group M.

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237
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volumeandproteincontent

duringexposures

ofworkingment・vari・ustemperaturesbef・reandafteracclimatizati・nt・heat：Separati・n・fther・les・fcutaneousandskeletalmusclecirculation．J．PhysioL，224，弓1−81

williams，c．G．，wyndham，c．H．and

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insummerand winter，J．ApPL PhysioL，140，168−176

亜熱帯人と温帯人との高温曝露時の生理的反応の比較
堀清記乗・飯塚平吉郎＊・中村正＊＊

沖縄住民から，沖縄生育者の青年30名（0群），本土生育者で沖縄移住後2年以内の青年30名（M群）をえらび，身体計測，室温30。Cのときの安静時皮膚温と直腸温，高温曝露時の生理的反応を夏季に測定した。発汗反応は309C，湿度70％の室内で，下腿に42。Cの温浴を60分させて測定した。

0群はM群と比較して，皮下脂肪厚が薄く，痩身傾向を示し，30。Cにおける皮膚温が高く，発汗量と汗の塩分濃度が低く，暑熱曝露時の中枢温上昇と心拍数の増加が少なかった。

0群はM群と比較して，発汗のない状態での放熱能力が優れており，汗の身体冷却効率がよいことが推定された。亜熱帯人である0群の被検者は温帯生育者の亜熱帯移住者であるM群の被検者より暑熱環境によく馴化し，耐熱性が優れていることが結論された。

＊兵庫医科大学第一生理学教室
学教室（故人）663西宮市武庫川町1−10798−45−6385＊＊長崎大学医学部衛生Japan. J. Trop. Med. Hyg., Vol. lO, No. 3, 4, 1982, pp. 239 244

239

DlURNAL BITING ACTIVITY OF FOUR ZOOPHILICSPECIES OF SIMULIUM IN AN AREA ENDEMIC

FOR HUMAN ONCHOCERCIASIS IN GUATEMALA*l
YOSHIHISA HASHIGUCHI*2, ISAO TADA*3 OTTO FLORES C *4

AND HIROYUKI TAKAOKA*5
R***ived f'* p bh**ti'* J*ly 31 1982

Summary : The biting activity offour zoophilic species ofSimulium was examined in
an area endemic for human onchocerciasis in Guatemala, using bovine baits. The surveys
were performed at three sites within San Vicente Pacaya county (SVP) from daylight untilnightfall of two days in January 1979. A total of 8,203 blackflies were collected from thebaits throughout the collections. Of these flies, 6,531 (79.60/0) were Simulium metallicums. l.; 977 (1 1.90/0)' S. pulverulentum; 654 (8.00/0)' S. callidum; and 41 (0.50/0), S. rubicundulum.

Biting activity of S. metallicum s. l. peaked between 0800 to 0900 hours and a second peak

was noted between 1 500 to 1 600 hours. S. callidum also exhibited two peaks, one in themorning and the other, more pronounced, in the late afternoon, immediately before thenight‑fall. The remaining two species, S. pulverulentum and S. rubicundulum were mainly
mid‑morning attackers of cattle. Thus, the rate of species composition was presumed
to differ within a day.

INTRODUCTION
With regard to human onchocerciasis in Guatemala, amny entomological studies
have been carried out in connection with the transmission of the diseasei The datareported hitherto incriminated Simulium ochraceum as the most important vector,
followed by S. metallicum s. l. and S, callidum (Dalmat, 1 955; De Leon & Duke, 1 966;
Garms, 1 975; Collins, 1 979). The first species is markedly anthropophilic, while thesecond and third are markedly zoophilic in their blood feeding behaviour (Dalmat,
1955; Wilton & Collins, 1978). Recently, Collins et al. (1981) studied on the diurnal
patterns of biting activities of these species including S. downsi, using human baits.
With animal baits, on the other hand, Iittle has been investigated about the biting
activity of Guatemalan blackflies, Simulium spp. Such a study will give an informa‑tion for a better understanding of the vector biology in the transmission of humanonchocerciasis and/or bovine and equine onchocerciasis. Because the animals withonchocerciasis were commonly found in the areas endemic for human onchocerciasis* I This study was supported by the Ministry of Public Health, Republic of Guatemala, and by theJapan International Cooperation Agency (JICA). (ORCOP No. 63) *2 Department of Parasi‑
tology, Kochi Medical School, Nankoku City, Kochi, 781‑51, Japan *3 Department of Parasitic*4 Servicio Nacional
Diseases, Kumamoto University School of Medicine, Kumamoto, 860, Japande Erradicaci6n de la Malaria, Ministerio de Salud Publica A. S., Guatemala, Guatemala. C. A.
*5 DivisiQn Qf Medical Z̲oology, Medical College of Oita, P. O. Box 37, Oita2 870‑91, Japan240

in Guatemala (Hashiguchi et al., 1981). The present paper deals with the resultsof surveys on the diurnal activity and species composition in the cattle‑biting of S.
metallicum s. l., S. callidum, S. pulverulentum and S. rubicundulum.

MATERIALS AND METHODS
Fly collectrons were performed at three srtes Fmca San Jos6 Guachipilin, Finca

Tullio and F:.,inca Terranova, within San Vicente Pacaya (SVP), Department of
Escuintla, C.uatemala. SVP is the pilot area since June 1976, under the Oncho‑
cerciasis Control Project established by the Guatemalan and the Japanese Govern‑ments. The present study sites, about 650 m to 700 m above sea level, stituated on
the Pacific slopes of the Sierra Madre. A11 the blackfly collections were made on
three cows at the respective sites; two collecting men and one animal bait were ar‑ranged in every collection. The two men captured the flies which were biting on the
animal bait, using an aspirator. The collections were carried out from daylight untilnight‑fall of the two consecutive days in January 1 979. The blackflies captured were
kept in sample tubes, separating them with hour‑intervals, respectively; thereafter
they were killed with 100/0 formalin. After taking the samples to the laboratory, thenumbers and species compositions of the flies were assessed in each hour‑interval.

RESULTS
Of 8,203 blackflies collected, 6,531 (79.60/0) were S. metallicum s. l. ; 977 (1 1.9010)'

S. pulverulentum; 654 (8.00/0)' S. callidum; and 41 (0.50/0)' S. rubicundulum in the present

surveys. The result indicates that the first species is the most dominant among theflies engorging on the animal in the area (SVP).
In Fig. I , the numbers of blackflies captured during two consecutive days at thethree sites were summed up, and trfe biting densities were expressed as percentages ofthe flies in hour‑interval, among the total collections of the respective species through‑out the days. Biting activity ofS. metallicum s. l. re̲ached a peak between 0800 to 0900

hours, and the second peak was found between 1 500 to 1 600 hours. S. callidum, on
the other hand, exhibited the first distinct peak of the biting activity in the period froml 700 to l OO hours, followed by the second from 0800 to 0900 hours. In S. pulveru‑
lentum only one remarkable peak of the activity was noted during the hours from 0900
to 1000, while S. rubicundulum indicated two peaks, one, more distinct, in the earlymorning (0800 to 0900 hours), the other in the early afternoon ( 1 300 to 1 400 hours).
In Fig. 2, the species composition was expressed as percentages ofeach fly species,
among the tptal numbers of the four species captured in each hour‑interval throughout
the collections. S. metallicum s. l. was the dominant cattle‑biting species in the survey
area ( VP) from daylight until night‑fall, though there iere two troughs, one in thelate morning and the other in the late afternoon. In connection with these troughs,
S. pulverulentum showed a relatively high rate of the composition in the species during
the hours from I OOO to I I OO, whereas S. callidum composition increased steadily from1500‑1600 and peaked at the hours, 1 700‑1800, immediat.ely before the night‑fall.
The remaining species, S. rubicundulum, was constantly low in the composition through‑241．暑目器8．曵8謡蟹眉＞§の屈§ミ蕊3︒眉8房当畳8N旨εもむ署8b︒損お︒一一蓉礪起0

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13collection
14 15 16 17 18
Figure 2

Diurnal species compositions of cattle biting flies offour zoophilic

species of Simulium in San Vicente Pacaya, Guatemala.

out the day, only 41 individuals being collected during the fly catching.

DISCUSSION
Among the present zoophilic blackfly species, both S. metallicum s. 1. and S. cal‑lidum are known to bite man, and they are considered to be potential vectors ofhuman onchocerciasis. Apparently, these blackflies are markedly zoophilic in theirblood feeding activities. It would be, therefore, necessary to investigate the biting
activity of the flies using animal baits, in terms of an understanding of the vector
biology.
When the present fly collections were made on the bovine baits, S. metallicum s. 1.
and S. callidum, respectively, showed two distinct peaks of biting activities in theday, one in the morning and the other in the afternoon. According to Collins etal. ( 1 980) who worked with human baits, the man biting activity of S. callidum peaked
at 1 500‑1 700 hours, and S. metallicum s. l. was also somewhat more active in the after‑

noon, particularly between 1400 and 1 700 hours at Finca Los Tarrales in Guatemala ;their study area has a similar elevation with the present study sites. These peakbiting activities of the both species are slightly different from those found in thepresent surveys. The discrepancy may be caused by the host difference between
human and bovine baits. Thus, it is assumed that there will be some difference in thehost preference of the flies, according to the time of the day.
Most of S. pulverulentum and S. rubicundulum, were found to have a distinct peak

243

activity mainly in the mid‑morning. This indicates that both of them are morning
attackers of the animals in SVP. On the other hand, these two species were found tobe hardly attracted by men (fly collectors), suggesting that they are solely zoophilic.

The present study area (SVP) being a highly endemic zone of bovine and equine
onchocerciasis with O. gutturosa and O. cervicalis, respectively (Hashiguchi et al.,
1 981), it seems likely that these species including S. metallicum s. l. and S. callidum are

involved in the transmission of non‑human onchocerciasis though the vector of thedisease remains still to be determined in Guatemala. In addition, the area is also
known as the endemic focus of human onchocerciasis with various intensities of theinfections in the residents of villages and plantations within SVP (Tada et al.. 1979).
In such an area, the possible infection of S. metallicum s. 1. and S. callidum with the larvaeof bovine or equine Onchocerca should be taken into consideration, especially in theevaluation of the vector control of the human disease.
In species composition of the flies, there were only four species which landed on thebovine baits for blood feeding. Although S. ochraceum, the principal vector of humanonchocerciasis in Guatemala, was commonly found during the fly catching in thc
study sites, none of this species was attracted by the bovine baits. In SVP, S. metal‑
licum s. l. was the dominant bovine attacker in each hour‑interval throughout the days.
A relatively high composition of S. pulverulentum was noted in the morning, whereas
S. callidum composition increased in the late afternoon.
Further detailed examinations on the biting activity of these zoophilic andjor
anthropophilic species should be made in future, in relation to their ovipositions andhost seeking behaviours, as mentioned by Garms (1975) and Collins et al. (1981) on
the anthropophilic species, S. ochraceum.

ACKNOWLEDGEMENTS
Sincere gratitude is extended to Drs. J.J. Castillo O., H. A. Godoy B., H.

Figueroa M., H. Takahashi, F.J. Aguilar, S. Hayashi for their encouragement
throughout the present study. Thanks are also due to the owners of three Fincas San
Jos6 Guachipilin, Tullio and Terranova for their supports during the field phase ofthis study. The present work was carried out by the helpful assistance of our col‑laborators in Servicio Nacional de Erradicaci6n de la Malaria, Guatemala. We
wish to show our sincere thanks to all of those who participated in the field exam‑
ination.

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グァテマラのオンコセルカ症流行地における4種のブユの牛に対する吸血活動の日周性について
橋口義久＊1・多田功＊2・OttoFloresC．＊3・高岡宏行＊4

グァテマラのオンコセルカ症流行地の一つであるSan

VicentePacaya郡の3地点において牛を囮としてブユの吸血活動について調査した。調査は連続2日間終日行い，4種のブユを含む合計8，203
個体の雌成虫が採集された。最優先種は＆脚ε履」∫cμm s．1．（79．6％）で，以下S．躍Jv8rμ1θ濯μ〃1（11．9％），＆6011蜘

n（8。0％）および＆耀ゐ∫oμ〃24μ1μn（05彩）であった。ぶ〃1θ o〃 cμ〃！s．1．の吸血活動には，午前中の8−9時と午後の3−4時に各々第1および第2の山を示す二峰性の日周期が認められた。また￡co11耐μ溺も同様の二峰性を示したが，大きな山は日没直前にみられた。一方，他の2種の日周活動はいずれも一峰性で，その山は午前中にみられた。このように，各ブユ種別に吸血活動の日周パターンが異なることを反映して相対的種構成比は一日のうちの時刻によって異なる傾向を示した。

＊1高知医科大学環境保健医学講座寄生虫学教室＊2熊本大学医学部寄生虫病学教室
テマラ共和国厚生省マラリア防圧研究所＊4大分医科大学病理学講座医動物学教室＊3グァ

Japan. J. Trop. Med. Hyg., Vol. lO, No. 3, 4, 1982, pp. 245‑251

245

RAPID TITRATION OF RABIES VIRUS INFECTIVITY BY
BIOTIN‑AVIDIN‑PEROXIDASE TECHNIQ]UE AND ITSAPPLICATION TO VIRUS NEUTRALIZATION TESTAKEHISA SHICHIJO1, KUMATO MIFUNEIAND WHEI JUN LlN2
Received for publication September 24 1982

Abstract: The rapid titration method of the infectivity and the neutralizing
antibody of rabies virus was established by the use of immuno‑peroxidase (biotin‑avidin‑

peroxidase) staining technique in microslide culture chambers. This method offers highsensitivity and reproducibility and would provide a new mean for the rapid diagnosis ofrabies and the seroepidemiology of rabies virus.

INTRODUCTION
Many studies have been reported on the quantitation of infectious rabies virus

in vitro (Yoshino et al., 1966; Sedwick and Wiktor, 1967; Matsumoto and Kawai,
1969; Schneider, 1973; Buckley and Tignor, 1975; Strating et al., 1975). However,the plaque titration method can be applied, in general, for only laboratory‑passaged
virus strains and requires a longer incubation period to obtain the results. In con‑trast, in fluorescent antibody (FA) technique, rapid and reproducible titration canbe attained using the culture cells sensitive to rabies virus and even street strains canbe quantitated by counting fluorescent foci on the cells (Smith et al., 1977).

Recent progress of immuno‑peroxidase techniques provides a new mean todetect viral antigens in the infected cells (Benjamin, 1974; Miller et al., 1974; Gernaet al., 1976) and to quantitate the infectivity of virus (Hahon et al., 1975; Okuno

et al., 1977, 1979). This technique has several advantages when compared with FAtechnique. The samples can be examined with a light microscope and stored for
10ng time after fixation according to the stability of the staining. Thus if the tech‑nique is applicable for virus neutralization test, this should be the most suitable

method for determining the neutralizing antibodies against rabies virus of large
number of specimens.
Among the immuno‑peroxidase techniques, the use of biotin‑avidin interaction
system has been proved to be highly sensitive for the detection of cell‑associatedantigens and has been extensively employed for immunohistochemistry (Guesdon
et al., 1979; Warnke et al., 1980; Hsu et al., 1982).

Therefore, 'the present study was begun with an application of biotin‑avidin‑
peroxidase (BAP) technique for the infectivity assay of rabies virus and virus
neutralization test with an ultimate goal of an application for the immunoelectron‑
microscopic studies of the virus.
l Department of Microbiology, Medical College of Oita, P. O. Box 37, Oita 870‑91, Japan
2 Department of Virology, Institute for Tropical Medicine, Nagasaki University

246

MATF*RIALS AND METnODS
Virus : Th,e plaque purified CVS strain (Buckl,ey a;nd Tignor, 1 975) of rabies

virus was grown in murine neuroblastoma cells (N‑18 clone) and stored at = 75'C
until use.

Cells: Murine neuroblastoma cells and CER cells (Smith et al., 1977) weregrown in Eagle minimum essential medium (MEM) supplemented with 5 o/o fetal
calf serum and 50/0 calf serum and antibiotics. CER cells were used for the infec‑

tivity assay of rabies virus throughout the study. Microslide culture chamber(10 chambers Bellco Glass, Inc. NJ, U. S. A.) (Fig. 1) received 0.25 ml/chamber ofc,ell suspensions at a cell density of 8 X 104 cells!ml of medium and the cells wereincubated at 37'C in 50/0 C02 incubator until the monolayers of the cell completed.

Figure I Microslide culture chamber ( 10 chambers per slide). The culture

chamber can be used repeatedly only by changing a bottom slide
glass.

)taining of the cells y BAP technique : CER cell monolayers on microslide culture

chambers were inoculated with 50 pljchamber of serially diluted virus suspensions

and incubated for 90 min at 37 C for virus adsorption. Then the inoculum wasremoved and the cells were incubated for various periods with Eagle MEM supple‑
mented with 5 o/o fetal calf serum and 20//o Seplladex G‑200. At intervals, the cells

were washed with phosphate buff'ered saline (pH 7.4, PBS) and fixed with coldacetone for 20 min. The cells were flrst reacted with anti‑rabies virus mouse ascitic
fluid for 60 min at 37 C. After washing with PBS 3 times, the cells were then stainedwith biotinyl‑anti‑mouse immunoglobulin (Ig) G goat serum (E. Y. Laboratories,
Inc. CA U. S. A.) at an appropriate dilution for 60 min at 37 C and finally stainedwith advidin conjugated with peroxidase (E. Y Laboratories, Inc. CA; U. S. A.)
for 60 min at 37 C. Peroxidase reaction was done with H202 and 3) 3!̲diamino
benzidine tetrahydrochloride (Sigma Chemicals, MO, U. S. A.) as described byGraham and Karnovsky ( 1 966). The slide was sealed with buffered glycerin andthe stained foci were counted under an ordinary light microscope.
Kinetics ofvirus neutralization: Anti‑rabies virus mouse ascitic fluid was pretreated247with 250/0 kaolin suspension as described by Smith et al., (1973). Virus suspension
containing I 06 focus‑forming unit (FFU)/0.1 ml was mixed with an equal volume ofserially diiuted anti=rabies virus mouse ascitic fluid and incubated at 36 C in waterbath. At intervals of incubation, O.2 ml of the mixture were taken and diluted
immediately one hundred fold and kept in ice. The samples were then inoculatcd
onto the cell monolayers in microslide culture chambers and assayed for the in‑fectivity of surviving virus. Control virus suspension with virus diluent only wastreated similarly.

RESULTS
Formation offoci : Development of infected foci on CER cells by rabies virus was

examined. Cell monolayers were infccted with approximately 200 FFU of the virus
and incubated. At intervals, samples of the slides were taken and processed for
BAP staining and the number of foci (Fig. 2) was counted. As shown in Fig. 3,

Figure 2 Stained i'oci of rabies virus‑infected CER cells by biotin‑avidin‑
peroxidase (BAP) techniq.ue.

the foci became countable at 1 6 hr after infe.ction. The number of f'oci increased
threreafter until 32 hr after infection and reached a maximum although the size offocus increased even thereafter and became uncountable at 40 hr because of the
combinations with adjacent foci. From this observation, the number of foci wascounted after 32 hr of incubation in the following experiments.
Relationship between the number of foci and virus dilution was next examined.
Aliquots of serial twofold dilutions of appropriately diluted virus were inoculated on
the cells and the number of foci was counted at 32 hr after infection. Fig. 4 shows alinear relationship between the logarithms of the virus dilution and the number offoci per chamber, indicating that one focus was produced by one infectious particleof virus.

248

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12 Ie 20 24 28 82 3e 40 44 48

Figure 3

Figure 4

Development of foci on CER cells

Linear response of rabies virus focus
formation in CER cells. Serial twofold
dilution of virus was done with virus

infected with rabies virus as mea‑

diluent. Fifty microliters of each dilu‑

sured by the BAP technique.

tion was inoculated onto the CER cells

Hour' Itt'r InfectloRand the number of foci was counted
after 32 hr of incubation. The average
numbers of foci in triplicate chambers
were shown.

Simultaneous experiments with FA staining technique showed an identical dose
response of fluorescent focus formation by rabies virus (Data not shown).
Kinetics of virus neutralization : The optimum incubation period of virus‑antibody
mixtures for measuring neutralizing antibody was determined at 36 C. Fig. 5 shows
the results of the kinetic studies examined with I 06 FFU/ml of virus and different
dilutions of anti‑rabies virus mouse ascitic fluid. Although the virus was neutralizedby more than 900/0 after 1 5 min of incubation, the neutralization progressed gradually

until 90 min of incubation and completed in each dilution of ascitic fluid. Only
280/0 Of the virus was inactivated after 2 hr of incubation.

Thus, the incubation of 90 min at 36 C was selected as the conditions of thefollowing neutralization tests.
Determination of neutralizing antibody titers of anti‑rabies virus mouse asciticfluid: Twolots of mouse ascitic fluid were diluted by twofold dilution starting I : 800. Eachdilution was incubated with an equal volume of virus suspension containing 400 FFU
of virus /O. I ml and incubated at 36 C for 90 min. Fifty pl of the mixtures were theninoculated onto the cells and assayed for surviving virus by BAP technique. The
percent of focus inhibition was obtained by dividing the number of foci in test samples

by the number of foci in control virus sample which was done in parallel only withthe medium. '

249
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Kinetics of neutralization of rabies

eovirus. Rabies vir.us containing 106

FFUjml was mixed with an equalvolume of anti‑rabies virl4s mouse
ascitic fluid diluted I : 250 (0‑0),

A'tib"y du'*"* o'9'ob

Figure 6l : 500 ([1‑[]); or I : 1000 (A‑A)

Neutralization of rabies virus with two
preparations of anti‑rabies virus mouse
ascitic fluid.

and incubated at 360C. Virus
control was incubated with virus
diluent only. At intervals of incu‑

bation, two hundred microliters ofthe mixture were taken and theinfectivity of surviving virus was
assayed.

The percent of focus reduction was transformed into probit and a probit reg* res‑sion line (Y=a+bX) was calculated against the logarithms of antibody dilution(X) . As shown in Fig. 6, probit of the percent of focus reduction fitted to the obtained

probit regression lines at various concentrations of antibodies. The slopes of the
probit regression lines of two preparations of anti‑rabies virus mouse ascitic fluid weresame. Thus the fifty percent focus reduction titer of neutralizing antibody of a given
serum can be estimated from the probit regression line.

DISCUSSION

An immuno‑peroxidase (BAP) technique was applied to the rapid titration ofrabies virus infectivity and virus neutralization test. The results indicated that the

BAP technique can be replaced by FA technique for the titration of rabies virus
infectivity. This application to virus neutralization test would provide a new method
especially for determining neutralizing antibody titers of a large number of specimens

since immuno‑peroxidase staining method has several advantages over the FAtechnique as mentioned previously.

250
anthperoxldase mouse lg

e/' ¥¥ ¥e PAP complex

peroxlda･e8vldl n‑,anthmouse l9 rabbit l9

blotln(2nd antibody) ¥,entFv'ru, mouee l9,‑‑‑ C1･t antlbodV'

'
cell

celt

BAP techntque pAP techntque
Figure 7 The principle ofBAP staining technique and the comparison with
PAP (peroxidase‑anti‑peroxidase) staining technique.

The principle of BAP technique (Fig. 7) is based on extremely high affinity of
avidin (affinity constant, I 015 M‑1) to the biotin which is a vitamin with a molecularweight of 244 and derived from the diet and intestinal bacteria. Ig or proteins can becovalently coupled with many molecules of biotin without loss of biological activitiesof the proteins. Avidin is a basic glycoprotein of approximately 68000 of molecularweight which is present in eggs. Each avidin molecule possesses four binding sites
for biotin while each biotin molecule is capable of binding to only one avidin molecule(MOSS et al., 1 97 1 ) . The binding is extremely resistant to dissociation. One moleculeof avidin can be conjugated with more than two molecules of horseradish peroxidase.

Thus the use of antiviral lg (first antibody), biotinyl anti‑Ig serum (second
antibody) and peroxidase conjugated avidin for the staining of viral antigens in thecells should provide higher sensitivity and specificity than the peroxidase‑labelled
antibody techniques or peroxidase‑anti‑peroxidase (PAP) staining technique as has
been studied and proven by Guesdon et al. (1979). In addition, BAP technique has
one more advantage over the PAP technique, i.e. the ,peroxidase conjugated avidin
can be used to biotinyl anti‑Ig prepared in any species of animals, while in PAP

technique, PAP complex should be prepared each in corresponding animal to whichantiviral serum (first antibody) is prepared (Fig. 7).

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8) Matsumoto, S. & Kawai, A. ( 1969) : Comparative studies on development of rabies virus in di‑fferent host cells, Virology, 39, 449‑459

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14) Sedwick, W. D. & Wiktor, T. J. (1967) : Reproducible plaquing system for rabies, Iymphocytic
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16) Smith, J. S., Yager, P. A. & Baer, G. M. (1973) : A rapid reproducible test for determining
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17) Strating, A., Mitzel, J. R. & Slater, E. A. (1975): Plaque assay of rabies virus on porcine
kidney cell monolayers, J. Clin. Microbiol., 2, 126‑128
18) Warnke, R. & Levy, R. (1980) : Detection ofT and B cell antigens with hybridoma monoclonal
antibodies : A biotin‑avidin‑horseradish peroxidase method, J. Histochem. Cytochem., 28,

771‑776
19) Yoshino. K., Taniguchi, S. & Arai, K. ( 1966) : Plaque assay of rabies virus in chick embryo
cells, Arch. ges. Virusforsch., 18, 370‑373

t ;t :/. Tt S :/, )V; S/i '‑IC J ; Ej : I> 4 )V

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! lCfl ̲f日本熱帯医学会雑誌

第10巻

第3，4号

253

1982 253−260頁

日本熱帯医学会九州支部第5回大会講演要旨

次

特

別 講 演

期場長

会会会

目

昭和56年2月1日（日）熊本大学医学部第2講議室
熊本大学医学部 多田 功

ワークショップIll
熱帯のトピック
1

世界のムカシウサギを追って鈴木

熱帯地を歩いて片峰大助

博士（長大・熱研・所長）

2

博（長大・熱研・ウイルス）オンコセルカ症の皮ふ症状
野中薫雄（長崎中央病院・皮膚）追加発言

ワークショップ 1

3 東アフリカにおける肝疾患とカポジ肉腫の熱帯病を現場で考える

疫学と病理

1 ケニア

2

嶋田

雅暁

（長大・熱研・寄生虫）

鳥山寛（長大・熱研・病理）高岡宏行（大分医大・病理・医動物）吉村健清（産医大・公衛）

正（長大・医・衛生）

3 中国
4

インドネシア高岡

長雄（荒尾・高岡病院）

ワークショップ皿
医学部学生の熱帯医学研究活動

1全国的動向と熊大熱医研
山下
2

耕一

長崎大学熱医研活動

大野

康治，木村

和也

（長大・医・学III）

3九州大学熱医研活動
田中

板倉

英世

耕二

（九大・医・学1）（長大・熱研・病理）4 東南アジア・西アフリカを旅して
福島 英雄

グアテマラ

中村

坂本信（長大・熱研・寄生虫）（鹿大・医・熱研）

254

特

別 講

演

熱帯地を歩いて片峰大助（長崎大・熱研・寄生虫）講演抄録なしワークショップ1．
熱帯病を現場で考える

1−1．現代医学に迫るサパンナの気迫嶋田

雅暁 （長崎大・熱研・寄生虫）学」なのでしょう。

そう考える時，アフリカ人でもなく西欧人でもない私が西欧の武器＝現代医学を持ってアフリカ

OO先生，「熱帯医学」についてフィロソフィーに行くその立場は果たして何なのだろうというこを語れという日本からの手紙，戸惑いながらの返とにしかなりません。まったくやりきれない気持事になります。

ちです。西欧医学＝現代医学を自分の武器としてそれにしても，アフリカの広大な自然の中でそ更に磨き上げるのか，あるいはもっと別の武器をこに生活を営む人々を見るとき，現在の「熱帯医造り出すのか，いずれにしてもや、メランコリッ

学」というものに絶望に近いものを感じるのは私クな気分で筆を置きます。

一人でしょうか。一体，人類が月に立っ時代に，たかが（こんな言い方は誰かに怒られそうです）

1−2．ケニアにおける調査活動を通じて
鳥山寛（長崎大・熱研・病理）

風土病のひとつやふたり何故撲滅とまでは言わな
ヒ ト
くてもコントロールできないのでしょう。他人は今まで3年間ケニアで行ってきた調査は主としそれを経済の間題だと一言で片付けるかもしれまて，B型肝炎の疫学調査であり，具体的に説明すせん。第一こんな疑問は私自身の力不足から出る

ると，ケニア国内の州立病院，地区病院を廻ってものであってそれ以外の理由などないのかもしれ

外来患者の血清を採取し，それを日本に持ち帰り，ません。しかし，それにしてもこの無力感だけは肝炎ウイルスの抗原，抗体を検索するというケニ

間違いのないものです。

ア側から見れば極めて略奪的な仕事，又病理学と元来，「現代医学」というものはアフリカに対しいう立場からはやや逸脱したものであるが，現段て有効性を持てないのではないかと考えてしまう

階の基礎的な調査としてはやむを得ないものだとのはこんな時です。確かに西欧合理主義を基盤に思われる。そういう点で臨床とタイアップし診療した現在の医学は多くの幸せを人類にもたらしまを行いながら調査をするという事が，発展途上国した。にもかかわらずこのアフリカの現実です。

においては，その場しのぎの方法かもしれないが，西欧医学ですら熱帯病を克服できなかったと考えある程度は必要だと思われる。実際に現地で調査

るより，西欧医学だからこそ歯がたたないと考えを行って一番感じるのは，フィールドに入り込める方が事はスッキリするような気がします。アフば入り込むほど，現地の国内問題に関わらざるを

リカにはアフリカの合理性に基く医学が必要なの得なくなるという事である。例えばケニアに於てかもしれません。そしてそれζそ真の「熱帯医は根深い部族間の対立が存在するが，知らず知ら255

ずのうちにその中に組み込まれ，気づいて見ると，る問題は専門家個人の適切な対応によって解決さどちらかの部族の側に立っているという場合があれるものとそうでないものがある。本プロジェクる。リサーチャーとしては，第3者的に物を見，トの対象とした人オンコセルカ症は我国には存在考えるというのが必要であろうが，実際フィール

せずほとんどの専門家が初めて取組むものであり，ドに入り現地の連中と生活しているとそういう醒

従って，自ら流行地で多くを学び，年次計画に決めた立場を貫くのは非常に難しいと思われる。又められた業務を遂行しつつ現地カウンターパート

醒めた態度で現地の連中に対するという事にも疑に技術指導を行うというものであった。演者の属問が残る。日本と全く違った赤道下の高温乾燥のした昆虫部門では現地フィールド作業員をカウン

地で仕事をするというのは実際に非常に辛く，一ターパートとした媒介ブユ駆除方法の開発に関し

日の仕事を終えて宿舎に戻る頃にはフラフラになた野外調査が主体であった。この体験から，1）相り，常に鼻出血に悩まされるという経験もあるが，手国の色々の事情を早く熟知し，2）カウンター

それでもその疲労の中に日本では得られない安らパートの立場に立ち，理解を示し，信頼感をもっぎが見い出せるのは一体どういう事だろうかと自て対等につきあい，プロジェクトの目的計画を十問自答しているが，その結論は未だ出ていない。

分認識させ主体性をもって参照できるよう配慮す自分でも意味のわからない安らぎが結局は自分をること，の重要性を痛感した。

熱帯に送り出すエネルギーであり，それがいわゆるアフリカの毒そのものかもしれない。今年も現地に出るつもりである。そろそろ中毒症状があらわれてきたのかもしれない。

2−2．グァテマラでのオンコセルカ症に対する住民検診の問題点
吉村 健清（産業医科大学・公衆衛生）

グァテマラの保健衛生レベルは他の発展途上国㍗1．グァテマラにおけるオンコセルカ症研究
撲滅対策から
高岡宏行と同様非常に低い。これはグァテマラで死亡率12．7，乳児死亡率27．3という数値や，死因順位の（大分医科大・医動物）

10位以内は，ほとんどが感染性疾患，栄養障害に国際協力事業団による中米・グァテマラ共和国

よるものであることに示されている通りである。

におけるオンコセルカ症研究撲滅対策プロジェク

このような情況の中で，日本とグァテマラ政府のトは1975年から1980年にかけて5年間実施され引共同プロジェクトである「オンコセルカ症研究対続いて3年間の予定で第2次プロジェクトが継続

策プロジェクト」に参加して住民検診を実施した。

中である。演者は1978年8月から1980年1月まで

当プロジェクトではベクターコントロールの効の1年半，派遣専門家としてグァテマラに滞在し果を人間側から評価するために同一人の経年変化

第3・4年次の計画に参加した。プロジェクト前
半期間中の業務実施の結果や経過については第1・を見る必要にせまられたが，オンコセルカ症の治療なしに毎年検査を行えば必ず受診率の低下がお

2次業務報告書及び計画打合せ調査団報告書等にこってくる。この受診率の低下を防ぐためにどの詳述されている。こ、では司会者の申し出に沿いような考え方で，どのような方策をとったかにっ

プロジェクトの実験的・複合的性格，年次計画，

いて述べる。

その実施状況，実際の業務内容などを簡単に紹介

頭初は，受診率の向上を目指して，娯楽映画のし，プロジェクト実施に伴って生じた困難・問題

上映，インスタントカメラによる家族写真の撮影について話題を提供した。上記報告書等に記されをやっていた。しかし住民へのプライマリーヘル

た問題点を整理すると，1）海外医療調査のあり

スケアの重要性に気付いて，現在は次のような方方を問う問題，2）現地カウンターパートと共同策をとっている。

研究を行う上での問題，4）現地住民の検診に関する問題，の3点に分けられる。これらに含まれ

1．住民検診に現地医師（医学生）による健康相談，指導を組み入れる。

256

2・

栄養食品配布一検診受診者に年4回，粉ミ

ルク，小麦粉，食用油等の食品配布。

を偲ぷ。双峰なる部落の生産大隊を訪れ革命がもたらせる生産増大と生活水準向上の程を見せらる。

3．衛生教育一住民一人一人に一般衛生教育，

24日汽車（此国は火車）で上海へ。寄生虫昆虫両指導を行うと同時に当プロジェクトの意義を理解

研究所，上海第一医学院（医大）訪問，学生は臨させる。

床・予防両コースに分かれ教育されあり，予防重4．対象住民との十分な事前の打ち合わせ一住点を三度覚えさせらる。上海近郊青浦の生産大隊

民の検診に対する不満，要望を聞き改善に努力すに到り，住血吸虫症淫浸の地から河川改修の人海る。

土木工事で之を駆遂せし跡を見せらる。前演者2以上のように，住民を単に研究の対象としてみ人は熱帯現地で覚えし無力感を訴えられしが，両るのではなく，熱帯地に生活しているが我々と同氏よ，熱帯病対策は虫（病原）のみならず，環境

じ人間であるという考えにたって住民の検診をやと宿主を併せた多岐長期の大戦であり，兄らは虫らなければ，フィールドの調査活動は成功しないを追ふ一人の捨石に徹せられよ。思ふに中国は広であろう。

し。熱帯学者就中九州の諸士の研究進出活動が望
まれる。

3．中国

中村

正

（長崎大・医・衛生）

1980年8月下半2週間熱帯研片峰，内藤両教授

4．インドネシアでの経験

高岡 長雄に伴し中国行，14日15：30大村発，上海経由北京

今日「急を要する海外への医療対策」に，病気

空港20時着。初訪の中国，その予想した広大さもにもなれない在外邦人，企業と個人のリスクで自機上からでは感うすし。翌15日中国医学科学院に衛，望まれる政府の医療協力，外務省，厚生省も黄家馳院長訪問，中国の医学研究・教育の概要を対策の検討をし，発展途上国への医療技術援助を承る。医者は中国国務院教育部（文部省相当）と進めおるが，アフリカ，中近東では日本のライセ

衛生部の両部の管下にあり，全国に医学校116，

ンスで許可するところがあるが，正式に日本医師

年限は短きは5年，長きは8年と多岐にわたる由。

免許による診療許可はASEAN諸国では困難で医療も発展途上にある中国が高水準の医師養成とあります。

ともに末端に広くこれを布及さすべく，いわゆるインドネシアに対し，JICA，IMFJ，日本熱帯医「はだしの医者」を養成しつ、ある現状，察して余学協会等数十団体より幾多の協力なされおり，更りあり（因みに文革時代に3年制に抑えられしに日本在外企業協会（会長永田敬生立造船会長）由）。又医療と共に予防衛生活動に重点が置かれや在外邦人医療対策討論部会等設立され，今回鈴ある由，感染性諸疾患に長年悩み来たこの国とし

木総理ASEAN諸国歴訪に際し，各国に科学技術て当然な事とうなづかる。医学の研究所は諸領域

協定の調印をし，医療（イ国に対し），農業等の共併せ全国に20あり，医学科学院の管下にある由，同研究及び交流を約束されました。

15日午後より20日まで衛生研究所を初めに伝染病，

私は第二次大戦中，イ国に駐留したことあり，・

ウイルス，熱帯医学などの各研究所を歴訪，いづ昭和39年以降約16年に亘り歩を運び，現地各界

こにも「熱烈歓迎長崎大医学訪中団」の文字飾ら（スハルト大統領主治医Dr．Max，夫人実弟ハル

れしに此の国らしさを覚え乍ら，予防衛生重点主トモ少将等）の人々と交流を重ね，今回高野医師義を再痛感す。臨床医，予防医いづれも公務員で（九大昭13年卒）が保健省の許可を受け，労働許ありその処遇も又同じ由。見学の合間帝制時代の

可（労働者），移住許可（法務省，移民局）を正式

御陵の一っ定陵と万里の長城見学，この国5千年に認可を得て，合弁方式でDr．Bayuのクリニッの長史と力に打たる。21日抗洲に飛び，衛生実験

グで診療できることになりました。

院など訪れ，半日を西湖に遊び中国の古きロマン

今日米国を凌ぎ，常時数干人の日本人が滞在し，

257

400社に及ぷ合弁日系企事に数万人のイ国人従事

市の反華僑暴動や近年途上国でナショナリズム高し，国土は日本の5倍もあり，1億4千万の人口

まり，必要でも拒む傾向強く，折角取得したこのにイ国人医師は8千人弱であり，6百万のジャカ方式を，私のライフワークとして継続し，政府民ルタ市に日本大使館付の渡辺医務官一人であり，間の医療支流の絆として，生生発展を祈念して止他は推して知るべし。咋年12月中部ジャワ，ソロ

みません。

ワークショップll．
医学部学生の熱帯医学研究活動

動サークルがまとまれば，情報も豊富になり，活1．全国熱医研活動の動向と熊大熱医研
山下耕一（熊大熱医研）我々，熊大熱医研では，発会するに当り，熱帯

動も活発になると思われます。また，熱帯医学に従事される諸先生方にお願いしたいこととして，学生に対し熱帯の現状を知らせ，刺激して，関心

医学とは何なのか，何をしていけばよいのかが，を持つ学生を増やすべく，御尽力頂けたらと思い問題になりました。そこで我々は全国大学の熱医ます。

研活動の問題点，現状を知ることによって我々の方向性を見い出そうと思い，全国の大学にアンケートを出し，熱帯医学活動をしている20校の2．長崎大学熱医研国内活動の問題点について
大野 康治（長大医・MIII）

サークルのうち，14校から，回答を得ました。

国内活動の目的としては学生が共同生活をしてサークル名によると，熱帯医学，国際保健，無医あるひとつのことをやりとげる努力をすることに地区を対象としたものです。アンケートの結果とあると思います。活動テーマの選定については，

して，まず発会年度では，ここ10年内の発会が11

実際の現地活動も含めて教官の御指導が不可欠で校を占めております。もっと歴史のある研究会があります。資金については寄付金に頼るには批判あるはずですが，何らかの理由で中断しているとも多く，なるべく自己調達ができるように努力し思われます。次に，現在までの総会員数が，30人ています。実際の現地活動に関しての注意点は，をこえるのは，5校しかなく，卒後，熱帯医学関

現地の住民とのコンタクトを十分にとり細心の注係に従事されているOBは，14人しかいません。

意を払って活動すること，必要な動物捕獲に関しまた現役会員数をみると，10人前後の会が，多いては国の許可がいるものもあるので前もって準備ようです。発会の動機としては，熱帯への興味，

しておくことなどがあげられます。最後に，成果

視野の拡大が，多いですが，カンボジア難民問題のまとめについては，報告書はなるべく早くまとをきっかけとするものが数校にあります。OBとめること，現地住民への還元を決っして忘れてはの交流は，報告書，報告会が，多いようです。

いけないことなどが必要であります。

国際的視野を得ることや，フィールドワークでの体験を，熱帯医学活動の意義として挙げていますが，問題点としては，資金，会員の獲得に困難「長崎大学熱医研国外活動」

木村 和也（長大医・Mlll〉

があるようです。これは，大学学生・一般人の熱1980年夏期フィリピン研修を通して感じた，学

帯医学への関心が低いことにもよるでしょう。し生が海外研修を行う際の留意点について述べた。

かし，カンボジア難民問題を契機として，医学生

第1に，研修先を早期に決定することが重要でアジア交流会議が開催されたことから考えても全ある。それが決定されて初めて，予算がたち，資く無関心ではないと思われ，全国での熱帯医学活

金集め，勉強等の準備にとりかかるこ．とができる。

258

語学訓練その他も含めて，1，2ケ月ではとても準

バングラディシュ，インドで研修や，調査を行っ備できるものではなく，早期からの余裕のある準て来た。

備が必要である。今回の研修の成果として，①国

沖縄班は当初健康診断の後投薬治療を行ってい内では見ることのできない熱帯病患者に接するこ

たが，これは現地の医療システムの破壊になりかとができ新しく見聞を広めることができた。②多ねないことを悟り，健康診断にもとずいた住民のくの感染症の蔓延の実態を知り，自分たちなりに

健康台帳の作製，衛生教育，疫学調査にその主力

医学の概念を深めることができた。③語学力の重を置くようになった。

要性を痛感した。以上我々は，フィリピン研修を

沖縄の開発が進むにつれて八重山地区の医療状通じて貴重な体験を得ることができたが，諸先輩態も改善され，特に県の行う巡回検診が高い受診はじめ多くの方々の御援助があってはじめて実現率をあげる事で当会が八重山地区で果してきた役しているということを常に心に留めておかねばな

割もうすれてきたため今年より宮古郡多良間村にらない。

場所を変えて，健康診断と衛生教育を行って行く予定である。

3．九州大学熱帯医学研究会の活動について

田中

耕二（九大・医・学1）

一方海外班は，
ICDDR

昨年はバングラディシュのB．で下痢性疾患の基礎と臨床を研修し，当会は1965年に学生の発案によって『熱帯医学また九州大学の公衆衛生学教室に協力してインドの研究，海外への調査団派遺，各国との学術交流のマドラスで菜食主義者と消化器系のガンとの関等により医学の発展に寄与し人類への貢献を目係についての資料を集めました。

的』として発足した。活動は沖縄班と海外班にわ

これらの活動を行う中で当会は人材，資金，及かれており，沖縄班は石垣市伊原間地区，西表島

び経験の不足という問題をかかえており，今年か

西部地区，与那国町に検診団を派遣し，海外班は，らは海外班の派遣を見合わせ沖縄班のみを派遣す

フィリッピン，タイ，マレーシア，シンガポール，

る予定である。

ワークショップ1皿．
熱帯のトピック
きた貴重な材料であるとも考えられる。

1．世界のムカシウサギを追って鈴木博

我が国の奄美大島，徳之島にだけ生息するアマ（長大・熱研・ウイルス）日本のアマミノクロウサギPon∫01㎎麗sル1nθ35

ミノクロウサギについて，1971年以来，その生態，，内部・外部寄生虫の調査を続けているが，この中，メキシコのメキシコウサギRo規θro1α8μS4如払ア

特にこの宿主に特異的に寄生するクロウサギチマ

フリカのアカウサギPronoZ㎎硲堰ρεs∫risの3種は，今から3，000〜4，000万年前の始新，漸新世にダニ加θ

繁栄していたとされるムカシウサギ亜科（Palaeo−n卯h脚o傭θn

ロ108の存在が知られていた。

其の後の筆者の調査からダニ類の一群，蒜虫の1aginae）に属し，現存するウサギ科（Leporidae）

中にもクロウサギワルヒッツガムシ肱1ch如ρ8ルのうちで最も原始的な形態を遺すウサギ類である。

∫ロ1㎎∫，ナカヤマタマツッガムシCor躍5θ如πoんoアか

この亜科には他に10属が含まれるが何れも化石種

吻α∫の2種がクロウサギにのみ寄生している事実のみであり，前述の現存する3種が生きた化石とを明らかにした（1977）。

云われる所以でもある。従ってこれらのウサギ類

とりわけ，Co〜4∫sε紛属はメキシコを基産地とは生物進化に関する古い歴史の情報を提供する生する蒜虫であることを知り，ムカシウサギ亜科に

259

属するメキシコウサギ，更に，アフリカに分布す

関与を皮膚症状より推測し得る可能性が示唆されるアカウサギについて，その生態と，特異的に寄た。

生する内部・外部寄生虫を指標にして宿主及び寄生虫の類縁関係，宿主一寄生虫の適応，進化の過程を明らかにする目的で文部省海外学術調査を行った。

調査の結果の概要をスライドを中心に述べる。

3・東アフリカにおける肝疾患とカポジ肉腫の

疫学と病理
板倉 英世

（長崎大・熱研・病理）

熱帯地疾患の疫学と病理学的調査研究を行うにあたって，熱帯環境と疾患の病態の特異像との関2．オンコセルカ症の皮膚症状
野中

連性を追求するということも研究上の一つの観点

薫雄（国立長崎中央病院皮膚科）

オンコセルカ症の皮膚病変としてオンコセルカと考えられる。我々は熱帯にも温帯にも広く分布
している肝臓疾患と，熱帯を主とした比較的限局

腫瘤，オンコセルカ皮膚炎，皮膚療痒，下肢前脛した地域にみられるKaposi肉腫について病理形

部色素脱失，皮膚萎縮，リンパ節腫大，象皮病な態学的方法を中心とした疾患の本態を探っている。

どの報告が見られている。演者はグァテマラ共和

目下のところは，赤道東アフリカを主要な調査地

国のオンコセルカ流行地において住民検診を行う

域としているが今後は中央および西アフリカ，さ機会を得たので，グァテマラのオンコセルカ症にらに東南アジア方面の研究者と共同で調査を進めおける皮膚病変の観察を行い，アフリカ型におけていく計画を持っている。肝臓の病変は種々のウる皮膚病変との比較検討を行った。

イルス，原虫，寄生虫によって，また各種物質のオンコセルカ皮膚炎は慢性経過をとる汎発性の代謝異常によっても惹起される。我々は今までに皮膚炎として報告されているが，グァテマラにおケニア各地の住民のB型肝炎ウイルス関連抗原

いては本症罹患住民のL5彩にみられ，皮疹は色抗体の保有率やそのサブタイプなどを免疫血清学

素沈着，苔癬化が著明であった。オンコセルカ皮的に調べ，同時に病理組織学的に肝炎・肝硬変・膚炎の頻度は非常に低く，その発生機序はOn−
chocerca volvulus感染に加えて何らかの他の要肝癌などを調べて，住民の種族による感染率やサ因が想像された。また，これらの皮膚炎は成人型型肝炎ウイルスとの関連性などを病理学および疫

アトピー性皮膚炎に類似しており，両者に血清学両面から同じ地域において見出した。アフリカ

IgE値の上昇をみることからも両者の類似点を更

大陸中央部から南部にかけては住民の肝臓に鉄沈に検索する必要性を感じた。皮膚病変の病理組織着が見られることが以前から報告されている。我学的検索では皮膚真皮内にミクロフィラリアを検我は東アフリカにおいても鉄沈着症の多くの材料出するも，病変との関連は不明確であった。

を得て，鉄と肝臓病変との関連性を，径口的鉄摂色素脱失斑は一般に下腿前面にみられ，アフリ

ブタイプの特徴，さらに肝臓疾患とくに肝癌とB

取，輸血後鉄沈着，特発性鉄沈着などについて検

depig−

討出来る機会も持った。住血吸虫症も東アフリカ

mentationに一致する症例もみられた。しかし色に多いが，これは肝臓に肝線維症や肝硬変を惹き

素脱失斑のみならず療痕が多く，その鑑別が困難

起すので，肝臓における肝細胞の再生から癌化まな場合もみられた。その他，オンコセルカ症に高での病変と線維症との関連性を検討する場合に好頻度にみられる症状としてリンパ節腫大が著し適な材料である。各種原虫によっても肝臓病変がかったが，アフリカ型にみられるhanginggroin

生じるが，慢性化しても上記の各疾患ほどには強などは見られなかった。また，流行地住民の皮膚い形態学的変化を来さないことは興味があるとこにはブユ刺点（SimuliuX

point）が多数みらろである。Kaposi肉腫は赤道アフリカや地中海れ，殊に上半身におけるブユ刺点の陽性率はミク沿岸に多いといわれ，その原因は勿論，病理組織

ロフィラリア腸性率との相関性がみられ，感染の発生も不明の点が多い。東アフリカ各地においてカ型に報告されているいわゆるpretibial

bite

260

我々も調査を進めており，特定の地方・種族に多Mansonella

い傾向にあるようで，また病理組織発生について

諸島のみ，Onchocerca

興味ある知見を得つつある。

中南米の他，イエメンに浸淫している。

4．東南アジア・西アフリカを旅して（摯驚蘇椴纏．姦リ）
福島（鹿大・医・熱研）

わが国においては，糸状虫症，マラリア，住血吸虫症などは撲滅対策が成功しているが，熱帯にvolvulusは熱帯アフリカ，

15彩以上の濃厚浸淫地区は，Wuchereria ban−croftiでは54ケ国（アジア：8，南太平洋：21，ア
フリカ：20，アメリカ：5），Brugia
ケ国，Timor

英雄・鮫島洋子

ozzardiは中央アメリカ，西インド

malayiは8filariaはチモール島のみ，Loa

loa

は2ケ国，Dipetalonemaperstansは13ケ国，Dip−

etalonema

streptocercaは1ケ国，Mansonella

Ozzardiは7ケ国，Onchocercavolvulusは14ケ
国である。

おいては，依然として，マラリア，糸状虫症，癩

マラリアは残留噴霧により，1960年頃は抑圧可などは多い。又，肝炎も多く，海外へ行く日本人

能と考えられたが，その後，DDT使用中止，薬剤耐性原虫，媒介蚊の出現により，増加しつつにとっては，大きな問題となっているので，これ
ら疾病の現在の浸淫状態について述べる。

糸状虫症は対策が成功している地域は，日本，ある地域が多く，76年は72年の2．3倍の751万人が発病し，76年末，高度汚染が89国（居住者スリランカ，南太平洋の島々のみで，熱帯におい1，548，615，000人）あり，他の54国（499，355，000ては，依然として，本症の浸淫に悩まされている。

人）でも再蔓延の危険性がある。

糸状虫の種別に浸淫地区をみると，Wuchereria

次に吸血吸虫も濃業灌概開発に伴い蔓延していbancroftiは世界中，Brugiamalayiはアジア（南・る地域が，アフリカ，西アジア，ブラジルなどで東南・東）のみ，Timor

みられ，大きな社会問題となっている。

nlariaはアジア（チモー

ル島，フローレス島）のみ，Loaloaはアフリカ（熱帯雨林地帯）のみ，Dipetalonema

日本人におけるA型肝炎ウイルス抗体の保有

perstansは率の低下に伴い，熱帯に赴任，旅行する際は，若南米と中央アフリカの他，西南アジア，Dipeta−

い日本人は7グロブリンの投与をうけるべきであ

10nemastreptocercaは西・中央アフリカのみ，る。

JAPANESE JOURNALOF
TROPICAL MEDICINE AND HYGIENE
December, 1982

Vol. lO No. 3, 4

CONTENTS
Origma' I article
SAKURAI. H., SATO M., HIRosE, T., OMATA, Y., SArro, A. and SuzuKI, N.

Microbicidal Activity of Hydrolyzed Toxoplasma Immune Mouse Serum (HS‑LKS) in
183‑195

Heterologous Cell Cultures . . . . . . . . . .

lwAKI, M.
Ecological Study of Mansonia (Mn.) umformis Theobald and Mansonia (Co.) ochracea
Theobald (Diptera, Culicidae) in Kyoto City. Midoroga‑ike pond

197‑205

SUGIHARA, H., Krro, R., NIKAI. T. and SAKAI, E.
Enzymochemical Studies on Snake Venoms. XI. Purification and Properties of Arginine
Ester Hydrolase (ME‑4) in the Venom of Trimeresurus mucrosquamatus
207‑217

MlzuNo, F.. NOGAMI. S., MARUHASHI, M. and MATSUMURA. T.
Life Cycle of African Ticks, Ornithodoros moubata as a Vector of Filariae Dipetalonema
viteae at the Condition of Continuous Light and Continuous Darkness . . . . . . .

219‑227

HoRI, S., IHZUKA, H. and NAKAMURA, M.
Comparison of Physiological Responses to Heat Between Subtropical and Temperate
Natives229‑237HASHIGUCHI, Y., TADA, I., FLORES C, O. and TAKAOKA, H.
Diurnal Biting Activity of Four Zoophilic Species of Simulium in an Area Endemic for

Human Onchocerciasis in Guatemala. 239‑244

SHICHIJO, A., MIFUNE, K. and LIN, J. W.
Rapid titration of rabies virus infectivity by biotin‑avidin‑peroxidase technique and its
application to virus neutralization test .

Published byJAPANESE SOCIETY OF TROPICAL MEDIClNE
c/o Institute for Tropical Medicine, Nagasaki University

124 Sakamoto‑machi, Nagasaki, 852, Japan

.245‑251