肝臓から腸をつくる！
〜脱分化型肝細胞の腸上皮細胞への運命転換〜
九州大学 生体防御医学研究所 器官発生再生学分野◯三浦 静、堀澤健一、唐澤皐月、鈴木淳史
要旨

肝細胞は培養下で脱分化し、脱分化型肝細胞として増殖し維持できることが知られている。一方、脱分化した肝細胞の細胞動態、脱分化状態の誘導と維持のメカニズム、脱分化細胞の分化能については未解明な点が残されている。そこで当研究室では、肝細胞から脱分化型肝細胞（dedifferentiated hepatocyte: dediHep）を作製する方法を独自に確立し、これらについて検証を行った。その結果、dediHepは上皮細胞と間葉系細胞の両方の特徴を有するハイブリッドな状態を呈していることが明らかになった。つづいて、肝細胞への再分化能を調べた結果、凝集塊を形成すると機能的な細胞へ分化誘導可能であり、高チロシン血症モデルマウスに移植すると、成熟した肝細胞として生着した。次に、dediHepが上皮細胞と間葉系細胞のハイブリッドという特殊な状態を有していることから、他の内胚葉系の細胞へも分化可能なのではないかと考え、検証を行なった。その結果、90%以上の細胞が腸上皮細胞マーカーのCdx2を発現していた。そこで、腸幹・前駆細胞の培養系でdediHepを培養した。その結果、球状のオルガノイドを形成し、このオルガノイドを大腸炎モデルマウスに移植すると大腸組織を再構築できた。さらに、dediHepにCdx2を強制発現すると、成体の腸幹細胞と同様に陰窩-絨毛構造を有するオルガノイドを形成した。以上のことから、肝細胞由来の細胞が腸の細胞へと運命転換できることが明らかになった。肝細胞が脱分化過程でハイブリッドな表現型を獲得することは、肝細胞が前駆細胞へ脱分化する際の重要なイベントであり、肝細胞が高い可塑性を発揮するための鍵になっていると考えられる。

② 肝細胞の脱分化過程の解析① 目的

Hepatocyte
単離+Tamoxifen

肝細胞 (Hepatocyte)を単層培養すると機能が低下することや、前駆細胞様の細胞へ脱分化することが知られている。

一方、脱分化した肝細胞の細胞動態、脱分化細胞の分化能については未解明な点が多い。
脱分化型肝細胞(dedifferentiated hepatocyte:dediHep)

4d解析
1w

2w

P4YFP

Hepatocyte

3h

Cyp7a1
Cyp8b1
Cyp3a11
Cyp1a2
Mup5
Cldn3
Ocln
Cdh1
Mki67
Krt19
Prom1
Vim
Lamb1
S100a7adediHep

0 hrPhase[当研究室で確立した方法]

Alb -CreERT2; R26RYFP/YFP

網羅的遺伝子発現解析

単層培養

3 hr Day1 Day2

③ dediHepは、 ④ dediHepは機能的な肝細胞へ再分化できる上皮細胞と間葉 in vitro （3D培養） Aggregate
Phase
HE(凝集塊）系細胞の両方のdediHep
性質を有する

網羅的遺伝子発現解析

Epithelial cellProliferation

Cholangiocyte
Mesenchymalcell

dediHepHepatocyte-2 -1 0 12

肝細胞は、肝機能マーカーの発現が低下し、増殖マーカーや胆管マーカー、間葉系細胞マーカーの発現が経時的に上昇した。一方、上皮細胞マーカーの発現は維持された。

肝細胞特異的にYFPを発現する (Alb -CreERT2; R26RYFP/YFP) マウスの肝臓から肝細胞を単離し、dediHepへの脱分化過程を詳細に解析した。肝細胞は4日目には広がった紡錘形となり、その後増殖しながら上皮細胞の形態になった。

本研究では、肝細胞の脱分化過程とdediHepの分化能を詳細に解析した。

Day4 Day7 Day14

Hepaticenzyme

in vivo
dediHep
aggregate

移植3ヶ月

解析

Fah -/- マウス

Alb/CK19/DAPI
Alb: 肝細胞
CK19: 胆管細胞
DAPI: 核染色E-cad

Alb E-cad/Alb/DAPI

E-cad

Fah+ cells(%)

Hepatocyte

Ki67 E-cad/Ki67/DAPI

Fah
dediHep aggregate Hepatocyte

N.S.

E-cad/Vim/DAPI

E-cad

Vim E-cad/Vim/DAPI

E-cad: 上皮細胞
Vim: 間葉系細胞
DAPI: 核染色dediHepは肝細胞や胆管細胞の性質を有していた。また、上皮細胞と間葉系細胞の両方の性質を有するハイブリッドな状態を呈した。

dediHepを非吸着培養ディッシュに播種して3D培養すると、凝集塊を形成した。
免疫染色の結果、凝集塊 (dediHep aggregate)は、Albumin (Alb)とE-cadを発現している一方で、Vimentinや増殖マーカー（Ki67）の発現は低下した。また、dediHepとdediHep aggregateの遺伝子発現解析の結果、aggregateでは増殖関連遺伝子の発現が低下し、肝機能関連遺伝子の発現が上昇することが示された。

⑤ dediHepは腸上皮細胞マーカーのCdx2を発現している
Cdx2

YFP

DAPI

Cdx2/YFP/DAPI⑥ dediHepはSOを形成する
3D培養

dediHep

Spherical organoid
腸前駆細胞用培地
(SO)

マトリゲル
11dP1

P6

マウス胎仔腸前駆細胞(FIPC)

cdx2 /E-cad/DAPI

大腸炎モデル移植
マウス
2 ~ 4 週間
+ DSS 0 2 5 (日)

3ヶ月
解析

GFP

cdx2+ cells
in E-cad+ cells (%)

in YFP+ cells (%)⑦ dediHepは障害を受けた大腸組織を再構築できる
dediHep-SO

矢印：GFP陽性の
dediHep-SOが生着した
組織
Villin GFP DAPI Muc2 GFP DAPI Cdx2 GFP DAPIIn situ

Cdx2+ cellsdediHep aggregateとHepatocyteを高チロシン血症モデルマウス（Fah-/-マウス)に移植した。抗Fah抗体 で 免 疫 染 色 す る と 、 dediHep aggregate とHepatocyteの生着効率はほとんど同じであることがわかった。

93%
E-cad Cdx2

E-cad Villin
DAPI

E-cad Sox9
DAPI

E-cad Ki67
DAPI

dediHep
Klf5 GFP DAPI EphB2 GFP DAPI Sox9 GFP DAPI

免疫染色の結果、dediHepは約60%の細胞がCdx2陽性であった。また、In situ hybridizationの結果、93%の細胞がCdx2を発現していた。このことから、dediHep
はほとんどの細胞が腸上皮細胞マーカーのCdx2を発現していることが示された。

⑧ まとめ
肝臓肝細胞へ再分化

E-cad: 上皮細胞 Villin: 腸の分化細胞 Sox9：腸前駆細胞 Ki67: 増殖している細胞
Cdx2: 腸上皮細胞

dediHepを腸前駆細胞の培養系で培養すると、生体マウス胎仔腸前駆細胞と同様にSOを形成した。dediHep由来のSOは、腸上皮細胞マーカーや腸前駆細胞マーカー、増殖細胞マーカーを発現していた。

移植
肝臓dediHep

肝細胞単層培養

3D培養
上皮細胞と間葉系細胞の特徴を有する
腸へ分化
Miura et al., Nature Communications, 2024.

大腸・肝細胞を単層培養すると脱分化過程で間葉系細胞の特徴を獲得し、上皮細胞と間葉系細胞の両方の特徴を有するdediHepへ脱分化する。
・dediHepは凝集塊形成により肝細胞へ再分化可能であり、生体内で肝臓組織を構築できる。
・dediHepは培養環境を変えることで腸上皮細胞へと分化し、大腸組織を再構築できる。
肝細胞のもつ可塑性を初めて明らかにした。
本研究は、腸上皮化生などの関連疾患の研究や治療に役立つと考えられる。

Villin、Muc2: 腸の分化細胞
Cdx2、Klf5:腸上皮細胞
EphB2、Sox9: 腸幹・前駆細胞

dediHep-SOを大腸炎モデルマウスに移植すると、生着して大腸の分化細胞や幹細胞へと分化し、大腸上皮組織を構築できた

謝辞
器官発生再生学分野の皆様