単一菌体の時間的・空間的連続観察から得られた新知見と将来展望

酵母サッカロミセスのストラクトーム解析
Structome Analysis of Saccharomyces cerevisiae
山

口

正

視

Masahi Yamaguchi
千葉大学・真菌医学研究センター
要旨1932 年に電子顕微鏡が発明されて以来，半世紀以上にわたって，細胞構造は，定性的，二次元的にのみ観察されており，定量的，三次元的解析はほとんどなされてこなかった．ストラクトームは，「電子顕微鏡レベルにおける細胞の定量的，三次元的全構造情報」と定義され，ゲノム，プロテオームと並ぶ，重要な概念である．本稿では，酵母サッカロミセス・セレビシエを急速凍結・凍結置
換法および連続超薄切片法を用いて，初めて，ストラクトーム解析を行った結果を解説し，その特徴を明らかにする．また，ストラクトーム解析を応用したことによって未知の微生物の発見に至った経緯を紹介する．さらに，近年盛んに行われている連続スラ
イス SEM 法との違いについて考察する．

キーワード：細胞構造，凍結置換法，連続超薄切片法，定量的，三次元再構築

1.

2.

はじめに

サッカロミセス・セレビシエのストラクトーム解析

ヒトの体を構成する細胞の数は約 60 兆個，ヒトの脳は約

解析には，YPD 液体培地（1％酵母エキス，2％ポリペプト

150 億個の細胞から構成されていることがわかっている．しン，2％グルコース）で培養した指数増殖期（OD660 が 1.0 くらかし，例えば，一個の酵母細胞に何個のリボソームがあるのい）の細胞を用いた．細胞を遠心で集め，サンドイッチ法にか，小胞体はどのくらいの体積を占めているのかはわかってより液体プロパンで急速凍結した後，2％四酸化オスミウム・

いないし，また，各オルガネラは細胞内に立体的にどのようアセトン液で –80°C で凍結置換固定を行った．エポキシ樹脂に局在しているのかなどもわかっているとは言いがたい．
「スに包埋し，トリミングして，連続超薄切片を作製した．切片

トラクトーム」とは，私が structure と -ome を組み合わせては，スリットグリッドに拾い，酢酸ウラニルとクエン酸鉛で作った造語であり，「電子顕微鏡レベルにおける細胞の定量染色した後，日本電子 JEM-1400 電子顕微鏡で撮影した 3）．

的，三次元的全構造情報」と定義される 1,2）．
1932 年に電子顕微鏡が発明されてからこれまで，半世紀今回の実験では，全部で 32 個の細胞の連続超薄切片を撮影したが，このうち，出芽していない単個菌（G1 期）を 3 個，

以上にわたって，細胞構造の研究は，ほとんど定性的，二次細胞分裂は終了したが母細胞からまだ分離していない娘細胞

元的解析によってなされてきた．これまでの解析によっても，（G1 初期）を 3 個選んで解析した．

光学顕微鏡では得られない新しい情報が得られ，数多くの発図 1 は，様ざまな細胞成分の拡大像を示す．原形質膜，液見がなされたが，細胞を定量的，三次元的に解析すれば，定胞膜などの生体膜は典型的な三層構造を呈し（図 1a，b，c，

性的，二次元的解析では得られない新しい情報が得られるこ

d，e，f，g，l，m，o），また，核の断面はほぼ円形であるのでとが期待される．

（図 1i），今回の試料は，自然なままの構造が，高解像で得られサッカロミセスは，真核生物の中で最初にゲノム解析がなていることが確認された．表 1 と表 2 は，オルガネラ，細胞された種で，世界中で細胞の研究材料として最も盛んに研究

成分の数と体積を解析したものである．表 3 は，細胞と細胞されているものの一つである．本稿では，ゲノム解析に用い成分の直径（短径）と長径を，表 4 は，オルガネラの膜の厚られた S288c 株を用いて，サッカロミセスのストラクトーム

さを計測したものである．図 2 に，細胞 1 から 6 の三次元再2）解析を行ったので報告する ．

構築像を示す．図 3 に，6 個の細胞のそれぞれのサイトゾル，
細胞壁，核，ミトコンドリア，液胞，その他の成分の割合を〒 206–8673 千葉市中央区亥鼻 1–8–1
TEL: 043–222–7171; FAX: 043–226–2486
E-mail: yama@faculty.chiba-u.jp
2015 年 3 月 16 日受付
98

示す．図 4 に，6 個すべての細胞の平均の細胞成分の割合を示す．以下に，細胞，オルガネラ，細胞成分ごとに，定量的，三次元的に解析（ストラクトーム解析）した結果を述べる．

顕微鏡 Vol. 50, No. 2（2015）【著作権者：公益社団法人 日本顕微鏡学会】

図 1 サッカロミセスのオルガネラ，細胞成分の拡大像．（a）細胞壁（CW）と原形質膜（PM）．o：外層．i：内層．ER：小胞体．（b）
陥入（Inv）．（c）ミトコンドリア（M）．OM：外膜．（d）オートファゴソーム（A）．（e）多胞体（MVB）．（f）ペルオキシソーム（P）．
C：結晶．（g）小胞体／ゴルジ体（ER/Golgi）．（h）ウイルス様粒子（VLP）．（i）核（N）．NE：核膜．NP：核孔．Nu：核小体．
（j）リボソーム（R）．（k）フィラソーム（F）．（l）小胞（Ves）．（m）紡錘極体（SPB）．Mt：微小管．（n）微小線維（Mf）．（o）
液胞（V）．VM：液胞膜．（i）と（o）以外はすべて同一倍率．スケールは 100 nm．（文献 2）より）

特集

酵母サッカロミセスのストラクトーム解析

99【著作権者：公益社団法人 日本顕微鏡学会】

表1

オルガネラ，細胞成分の細胞あたりの数

G1 期（3 細胞の平均±標準偏差）G1 初期（3 細胞の平均±標準偏差）

合計（6 細胞の平均±標準偏差）

核

1±0

1±0

1±0

核小体

1±0

1±0

1±0

紡錘極体

1±0

1±0

1±0

ミトコンドリア

2.3 ± 1.2

2.3 ± 1.5

2.3 ± 1.2

小胞体／ゴルジ体

21.7 ± 7.8

18.0 ± 5.3

19.8 ± 6.3

液胞

2.0 ± 1.7

1.7 ± 0.6

1.8 ± 1.7

オートファゴソーム

0.3 ± 0.6

1.7 ± 0.6

1.0 ± 0.9

多胞体

1.7 ± 2.9

0.0 ± 0.0

0.8 ± 2.0

リボソーム数

217000 ± 48000

175000 ± 62000

195000 ± 55000

リボソーム密度（/μm3）

19600 ± 600

19400 ± 1500

19500 ± 1000

小胞9.7 ± 6.4

5.3 ± 4.9

7.5 ± 5.6

フィラソーム29.3 ± 9.5

20.7 ± 2.3

25.0 ± 7.8

ウイルス様粒子82.7 ± 38.1

58.0 ± 15.1

70.3 ± 29.2

ペルオキシソーム

0.0 ± 0.0

0.0 ± 0.0

0.0 ± 0.0

陥入31.7 ± 12.6

22.7 ± 15.6

27.2 ± 13.6

オルガネラ／細胞成分

表2細胞，オルガネラの体積（単位は μm3，括弧内は細胞に対する割合）

G1 期（3 細胞の平均±標準偏差）G1 初期（3 細胞の平均±標準偏差）

合計（6 細胞の平均±標準偏差）

細胞17.1 ± 3.1（100 ± 0％）13.3 ± 4.3（100 ± 0％）15.2 ± 4.0

細胞壁

2.9 ± 0.6

（17 ± 2％）2.4 ± 0.6

（18 ± 3％）2.6 ± 0.6

（18 ± 3％）核

1.8 ± 0.4

（10.5 ± 1.0％）

1.3 ± 0.4

（9.7 ± 0.3％）

1.5 ± 0.4

（10.1 ± 0.8％）

核小体

0.40 ± 0.10

［22.1 ± 1.5％］*

0.22 ± 0.19

［15.7 ± 10.1％］*

0.31 ± 0.17

［18.9 ± 7.4％］*

細胞／オルガネラ（100 ± 0％）

ミトコンドリア0.28 ± 0.03

（1.7 ± 0.4％）

0.17 ± 0.04

（1.4 ± 0.6％）

0.23 ± 0.07

（1.6 ± 0.5％）

小胞体／ゴルジ体

0.12 ± 0.04

（0.7 ± 0.3％）

0.06 ± 0.02

（0.5 ± 0.1％）

0.09 ± 0.05

（0.6 ± 0.3％）

液胞

0.99 ± 0.28

（5.8 ± 1.0％）

0.36 ± 0.45

（2.2 ± 2.4％）

0.68 ± 0.49

（4.0 ± 2.5％）

オートファゴソーム

0.004 ± 0.007（0.03 ± 0.05％）

0.006 ± 0.008（0.04 ± 0.04％）

0.006 ± 0.008（0.03 ± 0.04％）

多胞体

0.008 ± 0.014（0.04 ± 0.06％）0±0（0 ± 0％）0.003 ± 0.008（0.02 ± 0.04％）

サイトゾル

11.0 ± 2.2（64.3 ± 0.6％）

9.0 ± 3.0

（68.0 ± 3.6％）

10.0 ± 2.6（66.2 ± 3.1％）* は核に対する割合

2.1

細胞

関与している 4）．核には，1 個の核小体があり（表 1），粒子G1 期の細胞は，球に近い楕円体で，短径は 3.24 ± 0.42 μm，状の電子密度の高い物質から構成されている（図 1i）．核小体

長径は 3.85 ± 0.48 μm であった（表 3）．体積は 15.2 ± 4.0 μm3

は，0.31 ± 0.17 μm3 の体積を持ち，核の体積の 18.9 ± 7.4％であった（表 2）．

を占める（表 2）．

2.2

細胞壁

2.4

ミトコンドリア

細胞壁は，120 ± 14 nm の厚さで，2 つの層から成る（図 1a）．

ミトコンドリアは，切片上では，卵形や細長い形態を示す

外層は，厚さが 34 ± 3 nm で，線維状の構造から成り（図 1a），が（図 1c），三次元再構築像では，ひも状でしばしば枝分か

マンナンタンパクで構成されている．内層は，厚さが 86 ±れがみられる（図 2）．ミトコンドリアは，直径が 232.9 ±14 nm で，電子密度が低く（図 1a），β グルカンとキチンで34.0 nm で（表 3），長さは，長いものでは 6.2 μm に達する構成されている．

（図 2c）．ミトコンドリアの体積は，0.23 ± 0.07 μm3 で，細2.3

核，核膜，核孔，および核小体胞の体積の 1.6 ± 0.5％を占める（表 2，
図 4）．細胞に 2.3 ± 1.2

核は，二重の核膜で包まれている（図 1i）．G1 期の核は球個のミトコンドリアが存在し（表 1），それぞれの細胞には，形で（図 1i），1.63 ± 0.20 μm の直径をもち（表 3），1.5 ± 0.4 μm3

1 個の巨大なミトコンドリアが存在する傾向がある（図 2）．

の体積を示し，細胞の体積の 10.1 ± 0.8％を占める（表 2，

今回の培養条件では，ミトコンドリアの外膜は，明瞭に観察

図 4）．核膜は，外膜と内膜とからなり，それぞれ 12.6 ± 1.5

されたが，クリステは観察されにくかった．外膜の厚さは，nm，13.3 ± 1.6 nm の厚さを持っている（表 4）．核孔の直径14.1 ± 2.0 nm であった（表 4）．

は，93.7 ± 11.8 nm で（表 3），核内と細胞質間の物質輸送に
100

顕微鏡 Vol. 50, No. 2（2015）【著作権者：公益社団法人 日本顕微鏡学会】

表 3 細胞，オルガネラ，細胞成分の直径（短径）と長径（平均 ±標準偏差）（文献 2）より）
細胞／オルガネラ／
細胞成分

直径（短径）

長径

測定数

細胞

3.24 ± 0.42 μm

3.85 ± 0.48 μm

36

核1.63 ± 0.20 μm

液胞0.87 ± 0.46 μm

核孔93.7 ± 11.8 nm

20

紡錘極体

117.2 ± 18.8 nm

8ミトコンドリア232.9 ± 34.0 nm

20

オートファゴソーム

263.0 ± 67.4 nm

316.0 ± 76.7 nm

25

多胞体

185.9 ± 38.9 nm

206.3 ± 43.3 nm

16多胞体中の微小胞

39.3 ± 4.5 nm

14

リボソーム

20.2 ± 1.2 nm

50

0.93 ± 0.49 μm

表4厚さ（nm）

測定数

原形質膜15.6 ± 2.1

20外葉

4.6 ± 1.0

20

36

中葉

47

3.8 ± 0.620内葉

7.3 ± 1.920

小胞70.2 ± 6.3 nm

20

フィラソーム175.2 ± 33.2 nm

33

ウイルス様粒子51.7 ± 6.2 nm

100

微小管

25.1 ± 0.5 nm

24

微小線維

   7.3 ± 0.8 nm

7

オルガネラ

19.4 ± 2.720外葉7.8 ± 2.2

20中葉

4.1 ± 0.820内葉7.6 ± 1.7

20

オートファゴソーム

16.8 ± 2.3

11

多胞体

16.9 ± 2.6

8

核膜外膜

12.6 ± 1.5

20

核膜内膜

13.3 ± 1.6

20小胞体／ゴルジ体

14.2 ± 1.8

20

ミトコンドリア外膜

14.1 ± 2.0

20

液胞

2.7
2.5

オルガネラの膜の厚さ（平均±標準偏差）（文献 2）より）リボソームとサイトゾル

リボソームは，直径 20.2 ± 1.2 nm の電子密度の高い粒子

小胞体とゴルジ体

サッカロミセス・セレビシエでは，ゴルジ体は，典型的なである（図 1j，表 3）．リボソームは，細胞質にランダムに存層状構造を示すことはほとんどなく，個々の薄い袋として存在しているが，しばしば，小胞体と核膜に付着しているのが（図 1a，1g 参照）．したがって，我々は，小胞在している 5）見られる．リボソームは細胞あたり，195,000 ± 55,000 個存在

体とゴルジ体を一つのオルガネラとして解析した．小胞体／し，1 μm3 あたりの密度は，19,500 ± 1,000 個であった（表 1）．

3ゴルジ体は，19.8 ± 6.3 個存在し（表 1），0.09 ± 0.05 μm の

サイトゾルの体積は，細胞の体積からすべてのオルガネラ

体積を持ち，細胞の体積の 0.6 ± 0.3％を占める（表 2）．そと細胞成分の体積を差し引いた値であり（即ち，表 2 の核の膜は，約 14.2 ± 1.8 nm の厚さを示す（表 4）．動物細胞の小体を除いた細胞壁から多胞体まで），細胞あたり 10.0 ± 2.6

小胞体は，しばしば細胞全体にネットワークを形成するが，μm3 の体積をもち，66.2 ± 3.1％を占める（表 2，図 4）．

サッカロミセスでは，小胞体／ゴルジ体は島状に散らばっていて，体積は 1％に満たない．
2.6

液胞，オートファゴソーム，および多胞体細胞には 1.8 ± 1.7 個の液胞が存在する（表 1）．形態はほぼ球形で（図 1o），（0.87 ± 0.46）μm ×（0.93 ± 0.49）μm の2.8

小胞とフィラソーム

小胞は，直径が 70.2 ± 6.3 nm で辺縁が明瞭な球形を呈し，しばしば細胞壁の近くに観察される（図 1l，表 3）．細胞あたり，7.5 ± 5.6 個存在し（表 1），グルカナーゼ活性を持っている．

大きさをもつ（表 3）．液胞の体積は，0.68 ± 0.49 μm3 で，フィラソームは，直径が，175.2 ± 33.2 nm の球状で，中心細胞の体積の 4.0 ± 2.5％を占める（表 2，図 4）．液胞の膜は，の小胞とこれを包む細いフィラメントからなっている（図 1k，三層構造を示し，19.4 ± 2.7 nm の厚さをもつ（表 4）．

表 3）8）．細胞に 25.0 ± 7.8 個のフィラソームが存在するがオートファゴソーム（図 1d）は，膜に包まれた構造体で，（表 1），しばしば細胞壁の近くに観察される．

（263.0 ± 67.4）nm ×（316.0 ± 76.7）nm の大きさの楕円体を2.9呈し（表 3），細胞に 1.0 ± 0.9 個存在する（表 1）．しばしば，

図 1m に G1 期の紡錘極体を示す．紡錘極体は，核膜内に消化の途中と思われるリボソーム粒子を含む（図 1d）．膜は，局在し，細胞質および核微小管を付着させた円盤型構造から三層構造を示し，厚さは，16.8 ± 2.3 nm（表 4）である．オー

成る 9）．円盤型構造の直径は，117.2 ± 18.8 nm であった（表 3）．

トファゴソームは，自食体の前駆体である 6）．

紡錘極体，微小管，および微小線維

微小管（図 1m）は，直径が 25.1 ± 0.5 nm である（表 3）．

多胞体は，微小胞（microvesicles）を含む球形の膜で包まれほとんどの微小管は，紡錘極体に付着しており，紡錘極体か（図 1e）．多胞体は，細胞に 0.8 ± 2.0 個たオルガネラである 7）

ら離れて存在する微小管は，ほとんどない．微小線維の直径存在し（表 1），大きさは（185.9 ± 38.9）nm ×（206.3 ± 43.3）

は，7.3 ± 0.8 nm であった（表 3）．

nm である（表 3）．多胞体の膜は，16.9 ± 2.6 nm の厚さで，2.10

三層構造を示す（図 1e）．多胞体は，酸性フォスファターゼ

ペルオキシソームは，膜に包まれた，電子密度の高い球形を含んでおり，ライソソームの一部であると考えられる．

（図 1f）．ペルオキシソームは，よりのオルガネラである 10）

ペルオキシソームとウイルス様粒子

電子密度の高い結晶構造を，内部にもつことがある（図 1f）．
特集

酵母サッカロミセスのストラクトーム解析

101【著作権者：公益社団法人 日本顕微鏡学会】

図 2 サッカロミセスの細胞 1 から 6 の三次元再構築像．赤：核．緑：ミトコンドリア．青：液胞．紫：小胞体／ゴルジ体．黄色い点：小胞．赤い点：
ウイルス様粒子．細胞 4 から 6 の＊は，母細胞のついている位置を示す．（文献 2）より）

図 3 細胞 1 から 6 のサイトゾル（C），細胞壁（CW），核（N），
ミトコンドリア（M），液胞（V），およびその他（O）の体積の割合．その他は，小胞体／ゴルジ体，オートファゴソーム，および多胞体を含む．サイトゾルは，リボソーム粒子，小胞，フィラソームおよびウイルス様粒子を含む．個体間の変異は小さい
ことに注意．（文献 2）より改変）
102

図 4 サッカロミセスのサイトゾル（C），細胞壁（CW），核（N），
ミトコンドリア（M），液胞（V），およびその他（O）の体積の G1 期の 6 個の細胞の平均の割合．サイトゾルは 66.2％，細胞壁は 17.7％，核は 10.1％，ミトコンドリアは 1.6％，液胞は4.0％を占める（表 2 参照）．
顕微鏡 Vol. 50, No. 2（2015）【著作権者：公益社団法人 日本顕微鏡学会】

今回の培養条件では，ペルオキシソームはほとんど存在せず，
細胞 1 から 6 には観察されなかった（表 1）．
ウイルス様粒子は，中空の球形の粒子で（図 1h），51.7 ±6.2 nm の直径をもっている（表 3）．一細胞に 70.3 ± 29.2 個存在する（表 1）．この粒子は，逆転写活性をもつことが知られている．
2.11

原形質膜と膜系

原 形 質 膜 は， 三 層 構 造 を 示 し， 厚 さ は 15.6 ± 2.1 nm で
（図 1a，表 4），赤血球の原形質膜よりかなり厚い．外葉と内葉は，電子密度が高く，中葉は，電子密度が低い．外葉．中葉，
内葉は，それぞれ約 4.6 ± 1.0，3.8 ± 0.6，7.3 ± 1.9 nm の厚さを示した（表 4）．原形質膜には，しばしば，陥入が見られ

図 5 エクソフィアラのサイトゾル（C），細胞壁（CW），核（N），
ミトコンドリア（M），液胞（V），およびその他（O）の体積の平均の割合．サイトゾルは 47.5％，ミトコンドリアは 9.9％を占める（文献 12）より改変）．

（図 1b），細胞あたり 27.2 ± 13.6 個の陥入が存在した（表 1）．
サッカロミセスの膜系は，その厚さから，二つの系に分けることができると思われる．一つは，16–19 nm の膜系でミトコンドリアの距離が近いのではないかと解釈される．同（表 4），原形質膜（図 1a），液胞（図 1o），オートファゴソー

様な解析結果は，マウスの系でも報告されていて興味深い 11）．

ム（図 1d），および多胞体の膜（図 1e）が含まれる．もう一つは，厚さが，13–14 nm の膜系で（表 4），核膜の外膜と5. オートファゴソーム，多胞体，およびペルオキシソー
ムの形成

内膜（図 1m），小胞体／ゴルジ体（図 1a，1g），およびミトコンドリアの外膜が含まれる（図 1c）．
2.12

解析した 6 個の細胞のうち，オートファゴソームは，2 つの細胞で，多胞体は 5 つの細胞で，ペルオキシソームは，ど個体間の変異図 3 に，サイトゾル，細胞壁，核，ミトコンドリア，おの細胞でも観察されなかった（表 1）．これらのオルガネラ

よび液胞の，個々の細胞における割合を示す．図に見られるを欠く細胞が存在するということは，これらのオルガネラはように個体間の変異は，以外に小さいことがわかった．

細胞の生存に必須なものではなく，必要な時に，新たに形成

3.

G1 期と G1 初期のストラクトームの比較

細胞の大きさ，細胞壁，核，核小体，ミトコンドリア，小されることを示唆している．
6.

他の酵母との比較

胞体／ゴルジ体，液胞，およびサイトゾルの体積は，G1 初

我々は，すでに，他の酵母エクソフィアラのストラクトー期の方が，G1 期と比較して小さい傾向にある（両者の違いは，

ムを報告しており（図 5）12 ～ 14），サッカロミセスとの比較がおそらく計測数が少ないために，本研究では有意ではなかっ可能である．サッカロミセスには，油滴，グリコーゲン顆粒，た，表 2）．これは，通常，娘細胞は母細胞に比べて小さい

および貯蔵物質が存在しないが，エクソフィアラには存在す

ため，当然のことであろう．この結果は，細胞周期によってる．一方，小胞，フィラソーム，ペルオキシソームおよびウ

ストラクトームが変化することを示唆しており，今後この方

イルス様粒子は，サッカロミセスには存在するが，エクソフィ

向での研究が待たれる．

アラには存在しない．ミトコンドリアは，サッカロミセスで4.

は少ないが，エクソフィアラには多い（2.3 ± 1.2 対 25.6 ±小胞体／ゴルジ体とミトコンドリアの距離の計測

14.8）．ミトコンドリアの体積は，サッカロミセスではエクソ細胞構造を三次元再構築したことによって，小胞体／ゴルフィアラに比べてかなり小さい（1.6 ± 0.5％対 9.9 ± 1.7％）．

ジ体とミトコンドリアの距離を立体的に計測することが可能

また，サイトゾルの体積は，サッカロミセスの方がエクソフィになった．両者の距離は，
G1 期の細胞 1 では 775 ± 634 nm で，

アラより，大きな割合を占める（66.2 ± 3.1％対 47.5 ± 3.5％）．

G1 初期の細胞 5 では 231 ± 253 nm であり，両者の違いは統両者のこれらの違いが何を意味するかについて議論するため計的に有意であった（表 5）．これは，G1 初期の細胞は，よりには，さらに多くの種のストラクトームの情報を得ることが多くのエネルギーを必要とするために，小胞体／ゴルジ体と必要と思われる．
7.

表 5 細胞 1 と細胞 5 における小胞体／ゴルジ体とミトコンドリアとの距離（平均±標準偏差，括弧内は測定数）
細胞 1（G1 期）
A

775 ± 634 nm
（28）

特集

細胞 5（G1 初期） A と B との差異（t 検定）
B

231 ± 253 nm（14）

P < 0.001（t = 4.35）

酵母サッカロミセスのストラクトーム解析

ストラクトーム解析の応用

微生物のストラクトーム解析によって，新しい発見がなされた例を，ここに述べる．
2010 年に，我々は，八丈島の南 100 km にある明神海丘で，深さ 1,200 m の海底から，原核生物と真核生物の中間的な細胞構造をもつ微生物を発見し，「准核生物」と命名した 15 ～ 18）．
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【著作権者：公益社団法人 日本顕微鏡学会】

論文を検索した．論文は 1 編見つかったものの 20），その論文には，体積以外の情報はなかった．大腸菌は，原核生物を代表する最も広く研究に使われている材料の一つであり，詳細な構造情報（即ち，ストラクトーム）があれば，必ず将来役に立つと考えた．しかし，急速凍結した試料を連続超薄切片法で解析しているグループは，世界で唯一，我々のグループだけであり，我々が，これをやらなければ，大腸菌のストラ
クトーム解析は永遠になされない恐れがあった．我々は，そこで，我々自身で大腸菌のストラクトームを実施する決心をし，現在解析を進めている．さらに，病原性の原核生物である結核菌については，最近ストラクトーム解析を終了し 21），
本特集で山田博之博士が解説している．
9.
図 6 准核生物パラカリオン・ミョウジネンシスの超薄切片像（a）と三次元再構築像（b）．CW：細胞壁，E：内部共生体（赤），PM：原形質膜，N：核様体（青），NM：核様体膜．（文献 15）
より改変）

おわりに

近年，連続スライス SEM を用いて，透過電子顕微鏡の連続超薄切片と同じような像を得る手法が開発されている 22）．
FIB/SEM トモグラフィー法は，SEM 連続スライス観察による生体組織の三次元再構築法の一つであり，その特徴は試料切削に収束イオンビーム（FIB）を用いる点にある 23）．Serial
block-face scanning electron microscopy（SBF-SEM）は，組み

まず，深海から採取した微生物は，通常の化学固定では細胞込み式ミクロトームによる表層切削と SEM による試料の断構造が保持されにくいことがわかり，船上で化学固定した試

面観察とを交互に反復することにより，数百 μm2 以上におよ料を研究室に持ち帰って，サンドイッチ法による急速凍結・

ぶ比較的広範囲の領域から，透過電子顕微鏡による連続超薄凍結置換固定を適用することによって，細胞構造を格段によ

切片観察に類似した画像を，迅速に取得する方法である 24）．

19）

．この新しい方法（化学固定／

連続切片 SEM 法は，超薄連続切片を硬い基盤に載せ，その凍結置換法と命名する）により作製した試料から，連続超薄切片像を走査電子顕微鏡で取得する技法である 25）．しかし，切片を作製し，電子顕微鏡で観察したところ，これまで報告

いずれの方法でも透過電子顕微鏡と比べて，分解能が低く，がなされていない細胞構造をもつ微生物を発見した（図 6）．

微小管や微小線維，リボソームの一つひとつを識別すること

67 枚の完全な連続超薄切片から，コンピュータを用いて三次は，今のところできない．また，試料を削りながら画像を得

元再構築をすると，図 6b のような細胞構造をもつ微生物でる手法では，一度撮影した部位を，後に再撮影することは不あることが明らかになった．この微生物は以下の特徴をもつ．

可能である．

く保持する方法を開発した

1）細胞は，通常の原核生物よりはるかに大きく，体積はそのため，深海微生物の試料のように，初めは低倍で連続大腸菌の 100 倍，酵母の 3 倍の大きさをもつ．2）真核をも超薄切片を撮影して，どんな微生物が存在するかを確認した

たず，かわりに存在する核様体は，大きく不定形で，原核生

後，興味ある微生物について，再度，高倍率で撮影すること

物型の DNA 線維からなり，核小体はない．3）核様体を包は不可能である．准核生物の核様体内に太さが，2–3 nm のむ核様体膜は一重膜からなり，完全には閉じていない．4）

DNA 様線維が，明瞭に観察されているが，このような観察は，細胞内に共生している内部共生体は，構造が細菌に似ている．

この手法ではできないのである．我々が用いている凍結置細胞壁はない．5）他のオルガネラとして，ミトコンドリア，

換／連続超薄切片法は，極めて解像力の高い，微生物のスト

葉緑体，ゴルジ体，ペルオキシソーム，中心小体，紡錘極体，ラクトーム解析に適した方法である．この手法は，決してむ

微小管はない．

ずかしい手法ではなく，便利な補助具と 26），多少の練習をす

即ち，細胞構造は，原核生物と真核生物との中間的な特徴

れば，誰でもができる方法である（そのための講習会も毎年をもつと言えよう．もし，深海微生物を，これまでのように，行っている．詳しくは，日本顕微鏡学会のホームページを参

定性的，二次元的な観察しか行っていなかったら，おそらく，

照のこと）．多くの方々が，ストラクトームに興味をもって准核生物は発見されていなかっただろうと思われる．定量的，いただき，いろいろな種のストラクトーム解析が進むことを三次元的解析を行ったからこそ，上記のような特徴を明らか願うものである．

にすることが可能になったと考える．
文

8.

原核生物のストラクトーム「准核生物」の論文を執筆する際，大腸菌の体積を計測した
104

献1）Yamaguchi, M.: Curr. Trends Microbiol., 2, 1–12 (2006)
2）Yamaguchi, M., Namiki, Y., Okada, H., Mori, Y., Furukawa, H.,
顕微鏡 Vol. 50, No. 2（2015）【著作権者：公益社団法人 日本顕微鏡学会】

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特集

酵母サッカロミセスのストラクトーム解析

14）山口正視，岡田 仁，並木侑一：顕微鏡，45，212–217（2010）15）Yamaguchi, M., Mori, Y., Kozuka, Y., Okada, H., Uematsu, K., Tame,
A., Furukawa, H., Maruyama, T., Worman, C.O. and Yokoyama, K.: J.
Electron Microsc., 61, 423–431 (2012)16）山口正視：顕微鏡，48，124–127（2013）17）Yamaguchi, M. and Worman, C.O.: Jpn. J. Protozool., 47, 29–48(2014)
18）Yamaguchi, M.: JSM Mycotoxins, in press (2015)19）Yamaguchi, M., Namiki, Y., Okada, H., Uematsu, K., Tame, A.,
Maruyama, T. and Kozuka, Y.: J. Electron Microsc., 60, 283–287(2011)20）Pilavtepe-Çelik, M., Balaban, M.O. and Yousef, A.E.: J. Food Sci.,
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22）村田和義：顕微鏡，49，160（2014）23）太田啓介，金澤知之進，中村桂一郎：顕微鏡，49，161–165（2014）24）大野伸彦，齊藤 成，齊藤百合花，大野伸一：顕微鏡，49，
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