理研ＮＭＲ施設利用報告書（トライアルユース）
13-500-039

平成 26 年 7 月 25 日

利用機関名

クロレラ工業株式会社

実施部署名

生産本部 技術特販部

実施責任者管理職名・岩坂昌樹

氏名
実施部署所在地

福岡県筑後市久富 1343

実施部署連絡先利用課題名

安定同位体標識法によるウイルス蛋白質の解析

利用目的・内容天然変性の傾向を持つと推測された HIV-1 の殻蛋白質であるマトリックス蛋白質とカプシド蛋白質の変異体を安定同位体標識して作成し、動的揺らぎ構造へのアミノ酸変異による影響を、高磁場 NMRを用いることによって解析していく。新しい野生株も樹立する。

利用実施時期及び期間

平成 25 年 11

月 1 日～平成 26 年 4 月 30 日

当初計画どおり（変更理由）

利用施設

ＮＭＲ

利用装置①

装置

・( ○ )600MHz、(（該当

利用期間 1：平成部分に利用装置②○）・()700MHz、(26 年

26 年1)900MHz2 月 26 日～平成 26 年 3 月)600MHz、( ○ )700MHz、(利用期間 1：平成)800MHz､(2月)800MHz､(3日)900MHz

10 日～平成 26 年 2 月17 日

利用期間 2：平成26 年

3 月 10 日～平成 26 年 3 月

17 日

利用期間 3：平成26 年

3 月 31 日～平成 26 年 4 月7日

利用期間 4：平成

26 年

4月

21 日～平成 26 年 4 月 28 日

利用装置③・()600MHz、()700MHz、( ○ )800MHz､()900MHz

利用期間 1：平成26 年

2 月 17 日～平成 26 年 2 月24 日

利用期間 2：平成26 年

3 月 17 日～平成 26 年 3 月

31 日

利用期間 3：平成26 年

4月

21 日

8 日～平成 26 年 4 月

利用装置④・()600MHz、( )700MHz、()800MHz､(○)900MHz

利用期間 1：平成 26 年 2 月 10 日 ～ 平成 26 年 2 月 17 日
利用期間 3：平成 26 年 3 月 3 日 ～ 平成 26 年 3 月 17 日
利用期間 4：平成 26 年 3 月 17 日 ～ 平成 26 年 3 月 24 日
利用期間 5：平成 26 年 3 月 27 日 ～ 平成 26 年 3 月 31 日
利用期間 6：平成 26 年 3 月 31 日 ～ 平成 26 年 4 月 7 日
立体構
造解析
パイプライン・発現確認 ：利用回数・フォールド判定 ：1回

利用回数・大量調製 ：利用回数13 回

・構造決定 ：

利用回数回

利用満足度

(◯)大いに満足、(（複数選択不可）()大いに不満

29回)ほぼ満足、()やや不満、

成果の概要 実施内容

※実際に行った作業の概要について記載してください。
ワクチンの作製に関わる HIV-1 マトリックス蛋白質とカプシド蛋
白質の変異体の作成をおこなった。マトリックス蛋白質の変異体の作成はやや困難であり、E12A は発現したものの、L85A の発現量は低かった。H89A はほとんど発現しなかった。一方、カプシド蛋白質に関しては、M68T と P90T の発現はうまくいったが、G60W と I115Tの発現量は少なく、測定を断念することとなった。実際に発現された変異体は、解析可能な NMR スペクトルを与えた。
N タグや C タグの付残ったものを、カプシド蛋白質としてこれまで使用してきたが、今回の変異体を作り始める前に、N 端に GSSGSSGという最小のリンカー配列だけを残したものを新しくコントロールとして樹立し、NMR スペクトルを測定した。シグナル帰属も新しい野生株で新たに確立した。シグナル帰属に基づいて解析すると、新しい野生株は予想どおり、45 ループ領域において柔軟な構造を持っていたが、それ以外の領域では、N 端以外は折りたたまれた構造を保持していた。その N 端領域の柔軟性は、Pro1 と Asp51 間のソルトブリッジが、GSSGSSG が存在するだけで作られないことによると判断した。カプシド蛋白質は、N 端や C 端にやや長いタグを残すだ
けでも、不安定な構造をとることがわかってきた。

本課題に※本課題実施の結果得られた成果および当初目標に対する達成より得ら度などについて記載してください。

れた成NMR の測定としては、マトリックス蛋白質の E12A と L85A のシグ

果、当初ナル帰属用の 3D と、揺らぎ構造を明らかにする緩和実験の測定を目標と結行うことができた。またカプシド蛋白質では、今回は新しい野生株

果との比を確立することができ、さらに M68T と P90T のシグナル帰属用の 3D

較と緩和実験を測定することができた。変異体のシグナルは、今回デザインされたすべての変異体において、有意なシグナルのシフト変化が野生株と比較して観測されているので、何らかの構造変化を伴っていると考えられた。
当初の予定では、変異体のシグナル帰属が現時点で終わっている予定であったが、カプシド蛋白質の新しいコントロール実験のために新しい野生株を樹立したことなどにより、時間を要した。しかしながら、実験計画は順調に進行しているといえる。これから多くの解析に移るが、計算が多く時間を要す。マトリックス蛋白質変異体
は、やや不安定であり調整が難しいが、一度調整完了すると NMR シ
グナルはきれいに分離して観測されるので、よい結果が得られると期待できた。E12A 変異体から、きれいなシグナルが得られた。

3今後の展※本課題の結果を踏まえた今後の展開方針および目的達成に向開、課題

けた今後の課題などについて記載してください。
天然変性蛋白質を対象として用いて、今回は比較的に構造を持つ
marginally な安定性をもつ蛋白質の揺らぎ構造解析を行ってきた。
一方今後は、構造がほとんど壊れており、残存構造として、かすかな構造のみをしめす天然変性蛋白質の NMR による構造解析を目指す。このように多角的な観点から、天然変性を解析していく。残存
構造の検知に鋭敏な化学シフト変化を観測し、これまでわからなかった構造を、側鎖の観点から幅広く明らかにしていくことを目標とする。同時にこれまで中心だった主鎖のラベルから、側鎖の安定同位体ラベルへと発展できるようにしていく。さらに安定同位体標識において、これから新しい市場を開拓していく。
天然変性蛋白質を marginally な安定性をもつ揺らぎ構造解析から、変性状態中に存在する残存構造の解析へと幅広く行うことにより、天然変性度の異なる段階別アプローチを行っていく。このアプローチによって、蛋白質の構造の進化との関わりも考えていく。今後は NMR の揺らぎ情報に基づいて、新たな変異体の作成も試みてみたい。どのデザインを行っても、不安定化し実際に変異体を得ることが難しいことが多かったので、その点を改良していきたい。

社会・経済への波及効
果の見通し

本研究では、HIV-1 を覆う殻の蛋白質の研究により、治療効果の高いワクチン開発を目指すとともに、安定同位体標識 NMR の広い生化学者への普及を目指していく。天然変性蛋白質は、とてもよい研究のターゲットとなることに疑いの余地はない。

成果公開延期の希望の （有無）あり： （◯ ）なし「あり」の場合理由：

理研 NMR 施設利用にお ※本施設を利用して良かった点、改善してほしい点、提案事項なける感想

ど、施設利用の感想を記載してください。
蛋白質の作成やマシンタイムに関して、さまざまなこちらの要望に応じてくださるので、大変に助かりました。NMR の基礎的な情報もわかりやすく教えてくださるので、理解が深まりました。これからの研究の発展に明るい見通しを与えてくれました。

4

利用周辺環境に関する 特になし
希望

今後の利用形態の予定(◯)再度本事業への申請を考えている。
()成果の非公開を前提とした「外部利用」（有料）を考えている。
()その他理研との共同研究等を考えている。

具体的に：

(
今後期待するその他の （サービス)未定）NMR 装置利用の教育（これまで NMR を使用した経験の無い方に対する教育も含む）（）NMR 装置利用の技術的なサポート

（）その他

具体的に

文部科学省の共用ナビ（http://kyoyonavi.mext.go.jp/）（研究施設共用総合ナ （○）見た ：（）見ていないビゲーションサイト） 感想等：
に対する感想・改善についてその他（上記の項目以外でご意見等お願いします。）

本報告書については、印刷または必要な編集・加工を行った上で公開します。また、別途開催予定の成果報告会・シンポジウムや委託事業報告書作成時において、本報告書の内容についての資料作成または発表をお願いする場合があります。

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