淀川水系に生息するレジオネラ属菌と宿主となる自由生活性アメーバに関する研究（地独）大阪健康安全基盤研究所
衛生化学部 生活環境課
琵琶湖・淀川水質保全機構
平成30年 水質保全研究助成 成果報告会

レジオネラとはレジオネラ症※の原因となる細菌※感染症法4類（全数把握）の呼吸器感染症

淀川水系に生息するレジオネラ属菌と宿主となる自由生活性アメーバに関する研究

届出件数

2200
2000
1800
1600
1400
1200
1000
800
600
400
2000

地⽅独⽴⾏政法⼈

大阪健康安全基盤研究所＊
衛生化学部 生活環境課

枝川

＊

亜希子

2,130

届出件数は増加傾向
1,592

LAMP法 喀痰検査
保険適用

1602

1733

1,248
1,124893
尿中抗原検査
保険適用

56

154

86

167 146 161

668

717 751818899519281旧）大阪府⽴公衆衛生研究所

国⽴感染症研究所

感染症発生動向調査

12

Osaka Institute of Public HealthOsaka Institute of Public Health

レジオネラの感染経路レジオネラ症の感染源●国内では、入浴施設などの浴槽水が多い●国外では、冷却塔水、給湯水、水道水など環境水中

水道水系でのレジオネラ汚染が問題になっている

レジオネラ 増殖エアロゾルを吸入

レジオネラ

水道水源をレジオネラが検出される河川に切りかえた年にレジオネラ症が増加
水道水源のレジオネラ汚染が周辺地域のレジオネラ症発生に関連している可能性が指摘

発症

アメーバ

レジオネラ 捕食⽶国フリント市での事例1)2)

新しい宿主
アメーバ

アメーバ

破壊

1) Stateof Michigan, FlintWater Advisory Task Force FINAL REPORT, 2016
2) Zahran S et al. Proc Natl Acad Sci USA. 20:115(8) E1730-E1739, 201834

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淀川水系に生息するレジオネラ属菌と宿主となる自由生活性アメーバに関する研究（地独）大阪健康安全基盤研究所
衛生化学部 生活環境課

日本国内の水道原水のレジオネラ

レジオネラ検出
培養法とリアルタイムqPCR法は、検出感度や検出対象が異なる

生息状況に関する知⾒は非常に少なく、分布実態は明らかになっていない

リアルタイムqPCR法

平成29年度に、淀川水系を対象としたレジオネラやその宿主となるアメーバの分布実態調査を開始

培養法
⼈工培地で検出することができる生菌

昨年度（H29年度）の調査結果
陽性試料数
レジオネラ 培養法
リアルタイムqPCR法

0 / 400100● VBNC(viable but non-culturable)
生きているが⼈工培地では検出できない生理状態の菌●培養不能菌種

陽性率 (%)

40 / 40●死菌

主に用いられている培養法だけでなく、複数の⼿法を合わせて⾏うことが重要
56

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今年度の研究

アメーバ共培養法とは？

昨年度（H29年度）、レジオネラと宿主アメーバの分布実態調査時に、並⾏してアメーバ共培養法を実施し試料を保存した今年度（H30年度）は、この保存試料について詳細に解析し、昨年度の結果との⽐較検討を⾏うことにより、淀川水系のレジオネラおよびアメーバの生息状況をさらに詳細に明らかにすることを目的とする

レジオネラをアメーバの中で増殖させてから検出する⽅法

Acanthamoeba castelanii （栄養体） *L. pneumophila が寄生した A. castelanii *本研究では、アメーバ共培養法とリアルタイムqPCR法を組み合わせた「アメーバ共培養ーqPCR法」により、レジオネラの検出を⾏った*第4版レジオネラ症防止指針 p.131

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調査概要

採水地点

●試料：淀川河川水 40試料
●検査項目：
・レジオネラの検出 アメーバ共培養－qPCR法1. 枚⽅大橋
（左岸）

3. 鳥飼大橋下流（右岸）

・レジオネラ菌種の同定

2. 鳥飼仁和寺大橋（右岸）

アメーバ共培養－qPCR法により、菌数が増加した試料

・アメーバ種の同定

大阪湾

H29年度に分離した Acanthamoeba spp.

4. 豊⾥大橋（左岸）

5. ⽑⾺上流（左岸）

H29年度：レジオネラ（培養法、リアルタイムqPCR法）、アメーバ、従属栄養細菌、ATP、濁度、⾊度、気温、水温、pH浄水場の取水口の位置などを考慮し、地点を選定
各5地点から平成29年5⽉〜12⽉に毎⽉1回採水
910

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⽅法－アメーバ共培養法◆ アメーバの調整（Acanthamoeba castelanii
AC
マイクロプレート

ATCC30234）
純培養のアメーバ（AC）
を入れる
30℃ 半日〜1日 静置
ACが底面に貼り付いた状態

ただちに次の操作を⾏う

リアルタイムqPCR法●DNAの抽出：QIAamp DNA Mini Kit（QIAGEN）◆ 試料とアメーバの共培養● Cycleave PCR Legionella (16S rRNA) Detection Kit

AC +河川水濃縮試料（Takara Bio Co.）

【反応条件】【反応液組成（1test）】
2×Cycleave Reaction Mixture 12.5 μL
95℃ 10sec
5 μL↓Primer / Probe Mix
2.5 μL95℃ 5sec
Sample DNA
5 μL↓25 μL
total
55℃ 10sec

30℃ 5-7日共培養
試料保存（-20℃）

40cycles↓72℃ 25sec

DNA抽出

測定：ABI PRISM 7900HT (Applied Biosystems)
データ解析：SDS v2.4.1 software (Applied Biosystems)

リアルタイムqPCR法

キットのプロトコール通りに⾏った1112Osaka Institute of Public HealthOsaka Institute of Public Health2-3淀川水系に生息するレジオネラ属菌と宿主となる自由生活性アメーバに関する研究（地独）大阪健康安全基盤研究所
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レジオネラ菌種の同定

アメーバ種の特定
形態学的同定により分離した Acanthamoeba spp. 2株について18S rRNAを標的としたPCR法によるAcanthamoeba 属の確認とシークエンス法によるアメーバ種の同定を⾏った

アメーバ共培養法により菌数が増殖した試料について、16S rRNA遺伝子を標的としたPCR法とそれに続くシーケンス法によりレジオネラ菌種の同定を⾏った

プラーク辺縁部の顕微鏡像得られた塩基配列は、BLAST によってデータベースに登録されている遺伝子配列との相同性検索を⾏った

上部がプラークの中心側。上半分はアメーバ栄養体で埋め尽くされている。下半分は、寒天表面に塗抹された大腸菌が確認でき、大腸菌を捕食しながら矢印の⽅向に増殖する

1314

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結果

アメーバ共培養法の有無によるqPCR法の結果
リアルタイムqPCR 法 (copy/test)

リアルタイムqPCR 法 (copy/test)
試料番号

試料番号
アメーバ共培養法●アメーバ共培養－qPCR法

1234567891011121314151617181920

河川水40試料のうち、40試料すべてが陽性検出したレジオネラ菌数は、1.2×102（試料No.24）〜2.3×105（No.7）copy/test
昨年度の調査では、培養法はすべて不検出、リアルタイムqPCR法はすべて陽性

5.3 ×104
3.1 ×104
4.0 ×104
2.0 ×104
2.1 ×104
1.7 ×104
1.4 ×104
1.3 ×104
2.0 ×104
2.3 ×104
2.8 ×104
3.1 ×104
2.1 ×104
2.8 ×104
3.2 ×104
2.0 ×103
9.2 ×1029.0 ×102
5.9 ×102
8.7 ×102

なし1)

アメーバ共培養法 なし1)

アメーバ共培養法 あり2)
6.6
1.0
7.1
3.7
5.2
5.2
2.3
1.2
8.3
1.1
5.8
7.7
5.4
6.1
4.5
2.3
1.2
1.0
2.3
1.3

4

21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40×10
4×10
4×10
4×10
4×10
4×10
5×10 *
5×10
4×10
4×10
4×10
4×10
4×10
4×10
3×10
3×10
4×10 *
3×10
2×10
3×10

1)

5.2
2.1
2.1
1.5
8.7
4.1
4.1
3.6
4.6
5.5
4.3
6.15.04.64.5
1.09.18.66.3
5.6

アメーバ共培養法 あり2)3×103×103×103×102×103×103×103×103×103×103×103×103×103×103×104×103×103×103×103×10リアルタイムqPCR法、2) アメーバ共培養－qPCR法

3.2
4.7
1.3
1.2
1.3
4.9
5.5
5.8
6.0
2.5
2.6
8.4
9.4
5.5
5.1
4.4
2.1
1.5
2.4
3.6

3×102×103×102×103×103×103×103×103×103×103×102×102×102×102×103×103×103×103×103×10

アメーバ共培養法を⾏うことにより、レジオネラ菌数が10倍以上増加した試料は、2試料あった

15

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Osaka Institute of Public Health2-4淀川水系に生息するレジオネラ属菌と宿主となる自由生活性アメーバに関する研究（地独）大阪健康安全基盤研究所
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レジオネラ菌種

アメーバ種

PCR法を⾏った結果、1試料（No.17）が陽性となり、シーケンス法により遺伝子配列の解析を⾏った

形態学的同定により分離したAcanthamoeba spp. 2 株
は、2 株ともPCR法陽性であった
シークエンス法による種の同定を⾏った結果、Legionella-like amoebal pathogen 2（LLAP-2）と97%一致

2 株ともAcanthamoeba lenticulataと98〜99%一致※LLAPとは⼈工培地では増殖しないがアメーバ内でのみ増殖生息することができるレジオネラ培養不能菌種※ A. lenticulata とは河川水などの環境中に生息するアメーバ種であるが、A.castellaniiなど淀川水系には培養法では検出できないが、アメーバ内で増殖することがきる培養不能レジオネラ菌種が生息していたと共にアカントアメーバ角膜炎の原因となるアメーバ種

1718

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まとめ謝辞● レジオネラをアメーバの中で増殖させてから検出するアメーバ共培養法を用いることにより、培養法で不検出の試料にレジオネラ培養不能菌種が存在することが明らかとなった

本研究は、公益財団法⼈ 琵琶湖・淀川水質保全機構「平成30年度 水質保全研究助成」により⾏った。
記して、感謝を申し上げます。

● 昨年度（H29 年度）に分離したAcanthamoeba spp.
について、種の同定を⾏った結果、ヒトに角膜ご清聴、ありがとうございました。

潰瘍炎を引き起こす原因となるA. lenticulataであった調査研究協⼒：大阪健康安全基盤研究所 生活環境課

1920

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