3−報文−

結核菌測定試薬の開発
益土伊徳近堀保石田屋澤永藤江川黒昇滋祐雅隆
敬佳夫一巧英一清彦

Development of a Test Reagent for Nucleic Acid Based Infectious
Disease. Detection of Mycobacterium Tuberculosis
Noriyoshi MASUDA
Shigeo TSUCHIYA
Yuichi ISAWA
Takumi TOKUNAGA
Masahide KONDO
Ryuichi HORIE
Kiyoshi YASUKAWA
Takahiko ISHIGURO

We have recently developed the TRC method that is based on a homogeneous detection system
involving an INAF (intercalation-activating fluorescence) DNA probe and an isothermal RNA amplification
through the TRC (transcription-reverse transcription concerted) reaction. In this paper, we report aneffective test reagent for nucleic acid based infectious disease, i.e., a specific reagent to detect

Mycobacterium tuberculosis. The target RNA of the reagent is mRNA of Pab DNA encoding the protein
antigen b specific to Mycobacterium tuberculosis. Time course measurement of the fluorescence intensity
at 520 nm of the reaction mixture was carried out using our trial product for real-time monitoring. Since
the intensity of fluorescence was proportional to the initial amount of Pab standard RNA (102-108copies/test), the amount of Pab mRNA was readily determinable from the detection time. Fluorescenceenhancement was specific to the nucleic acids extracted from the sputum of the patients infected withpulmonary tuberculosis, but not so to those from the ones infected with Mycobacterium avium complex(MAC). The BCG cells were cultured in the presence of anti-tuberculosis drugs and after 24 h thedecrease in amount of Pab mRNA was confirmed by the TRC method using this reagent. This results
demonstrate that the TRC method is useful for detecting the viable cells and can be applied to themonitoring of the patients infected with pulmonary tuberculosis and also to the drug susceptibility test ofMycobacterium tuberculosis.

（ 3 ）

4

TOSOH Research ＆ Technology Review Vol.46（2002）

1．緒

する試薬の開発を行った。さらに、これまでの結核菌

言群を検出する遺伝子増幅キットが成し得なかった迅速結核はこれまで減少傾向が続いてきたが、最近になって高齢者の罹患率が上がり、さらには結核感染を経験していない若年層で、集団感染を引き起こす例が増えている。1999年7月に厚生省が「結核非常事態宣言」を発表したことに象徴されるように、結核は深刻な問な増幅検出を実証すると共に、薬剤感受性試験への応用について検討した。

2．材料および方法〔1〕プライマー、プローブ
結核菌群特異的蛋白質protein antigen b（Pab）の題となっている。
結核菌の検査法としては、培養検査が基本であるが、mRNAを増幅の標的とした。

Pab

結核菌の発育は遅く、結果を得るのに4週間以上を必mRNAの増幅及び検出に使用したプライマー要とするケースもある。そこで結核菌群を検出する遺の配列とプローブの配列は以下の通りである。

伝子増幅キットが開発された。現在市販されているキ・プロモータープライマー（DNA）

ットは、PCR法で16S rRNAをコードするゲノムDNA

5 −AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAGGCAを増幅し、特異DNAプローブをハイブリダイズして検出するもの（アンプリコア

マイコバクテリウムツ

ATAGCTCTGGCAATTTCTT-3・アンチセンスプライマー（DNA）

ベルクローシス、ロシュ）や、同じく16S rRNAを
transcription mediated amplification（TMA）法によっ

5 −CTTTTGCCGGTTGTTGACGAT-3・切断プローブ（DNA）て増幅した後、増幅したRNAに相補的な標識DNAを

5 −TATTGCCTAGTTGGGCCTCGCCGA-3

ハイブリダイズさせて検出するもの（DNAプローブ

・発蛍光プローブ（INAFプロープ、DNA）「中外」-MTD、中外）、結核菌群特異的蛋白質である

5 −TCGTAGTTGA*TGATCGGGTA-3

protein antigen b（以下Pabとする）をコードする
Pab遺伝子をligase chain reaction（LCR法）で増幅し、上記のうち、プロモータープライマーの下線部はEIAによって検出するものなどが知られている（LCX

T7プロモーター配列であり、発蛍光プロープの*はイプローブシステムM．ツベルクローシス・ダイナジー

ンターカレーター性蛍光色素オキサゾールイエローン、ダイナボット）。これらのキットは培養法に比べ（YO）の修飾位置を示している。なお、切断プローブれば迅速ではあるが、増幅後の検出工程を必要とするの3 末端はアミノ基で、発蛍光プローブの3 末端はグため、所要時間は2時間〜2日程度である。さらに、生リコール酸で修飾し、それぞれからの伸長反応を防止

菌、死菌の区別がつかないために、培養検査の代替とした。これらのプライマーとプローブの配列は、特別しては使用されていない。また、結核菌の薬剤感受性な変性処理のない条件でもアニールできるよう、41℃の判定や、患者に対する治療効果を観察するには不適の反応液中で標的RNAが分子内結合フリーとなる領切であることが報告されている域に設定した。さらに、Pab RNAキャリブレーター。

1），2）

われわれは、核酸のホモジニアスな検出法として、として、鋳型DNAからのin vitro転写により、E．B．

標的核酸と相補結合を形成することによって顕著な蛍Hansen 10） らが同定した塩基番号111〜1436を含む光増感を与える発蛍光プロープ（INAFプローブ：1326merのRNAを調製した。

intercalation activatingProbe）を開〔2〕Pab領域の標準RNAの作製

fluorescence

発した 3）〜7）。さらにわれわれは、逆転写酵素およびソートン培地にて培養したBCG菌からISOPLANT

RNAポリメラーゼの協奏的作用によって、一定温度（ニッポンジーン）を用いて、ゲノムDNAを抽出した。

で標的RNAを極めて効率的に複製する転写・逆転写

このゲノムDNAをテンプレートとして、PCR法によ

協 奏 増 幅 法 （ T R C 反 応 ： t r a n s c r i p t i o n −r e v e r s e

り Pab 遺伝子（領域：111〜1436）を増幅させた。

8）transcription concerted reaction）を開発してきた 。

PCR増幅産物はフェノール／クロロフォルム抽出、エこの2つの技術を組み合わせることにより、一定温度タノール沈殿により精製した。このDNA 10μgを鋳型下にて増幅反応工程と検出工程を一段階で実施するとしてT7 RNAポリメラーゼにてin vitro転写を行っTRC蛍光リアルモニタリング法（TRC法）を構築したた。得られたRNAをDNase処理し、フェノール／クロ。

ロフォルム抽出、エタノール沈殿、Chromaspin−100

今回、このTRC法を用いて、結核菌群特異的蛋白質（CLONTECH）により精製した。

8），9）

Pab遺伝子に由来する、mRNAを特異的に増幅、検出

PCR用プライマー配列（ 4 ）東ソー研究・技術報告 第46巻（2002）

5〔5〕BCG菌株の薬剤感受性試験

・フォワードプライマー「日本結核病学会：新結核菌検査指針」（結核予防5 −AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGA会、2000）の薬剤感受性試験に準拠した方法を用いた。

GACGCCAAGCGCGGAAATTGAAG-3
下線部はT7プロモーター配列

ただし、試験用培地として小川培地のかわりにミドル・リバースプライマー

ブルック7H9液体培地（BBL）を用いた。培養したBCG菌由来株を吸光度（OD600）0.1となるよう7H9培

5 −AGCACCAAGACCAGCGCAAG-3

地で希釈し、さらに100倍希釈した。これに抗結核薬〔3〕TRC蛍光モニタリング

を 一 種 類 加 え た 。（ 抗 結 核 薬 の 培 養 液 中 の 濃 度 はTRC法による測定は41℃の一定温度下においてFig.

ethambutolが2.5μg／mL，isonicotinic acidが1μg／１に示した操作手順に従って実施した。まず、サンプ

mL，streptomycinが10μg／mL，rifampicinが40μg／ルに対してReagent mixを添加し、41℃に保温した後

mL，kanamycinが20μg／mLである）培養開始0，6，にEnzyme mixを添加して反応を開始し、直ちに密閉24，48，72，144時間後に培養液を1mLずつ分取し、栓を閉じてTRC蛍光モニターにセットした。TRC蛍光遠心して集菌した。続いて、4Mチオシアン酸グアニ

モニターの励起波長は470nm、蛍光検出波長は520nm

ジン溶液150μLに懸濁し、上記〔4〕の方法により核である。

酸を抽出し、TRC蛍光モニタリングを行った。

〔4〕臨床検体からの核酸抽出
結核菌の塗抹陽性、培養陽性喀痰15検体、3．結果および考察

Mycobacterium avium complex（MAC）の塗抹陽性、〔1〕TRC蛍光モニタリングによるPab m RNAの検出

培養陽性喀痰9検体および塗抹陰性、培養陰性の喀痰3

Fig.２はTRC蛍光モニターを使用し、Pab RNAキャ検体を用いた。

リブレーターをサンプルとして測定したTRC蛍光モニ喀痰をNALC処理（MycoPrep，BBL）した後に微タリングの結果である。横軸の時間原点はTRC増幅反細なガラスビーズ（150−212μm，SIGMA）を用い応の開始時間であり、Enzyme mixの添加時点に相当て激しく振とうし、溶菌処理を行った。続いて、する。また、縦軸の蛍光強度比は反応時間原点の蛍光「EXTRAGEN」（東ソー）を用いて核酸を抽出した。

強度（バックグラウンド蛍光）に対する各時間の蛍光強度の比を表している。

Reagent mix (20μL)
Tris-HCl(pH8.6)

90mM

KCl

180mM

MgCl2

29mM

Dithiothreitol

1.5mM

dNTPs

0.38mM

NTPs

3.0mM

ITP

5.4mM

Forward Primer

1.5μM

Reverse Primer

1.5μM

Scissor Probe

0.24μM

INAF Probe

45nM

DMSO

15％Sample (5μL)

TRC Monitor

Enzyme mix (5μL)
T7 RNA Polymerase
140U/assay
Reverse Transcriptase (AMV)
6.4U/assay
RNaseH

Fig.１

0.03U/assay

280mm(W)×500mm(D)×370mm(H)TRC protocol. Fluorescence intensity of the reaction mixture is measured using an instrument
named TRC monitor. The reagent and enzyme mixtures were added to a sample in this order.

（ 5 ）6TOSOH Research ＆ Technology Review Vol.46（2002）

2.8Starting standard
RNA copies/test

Fluorescence intensity ratio

2.4102.0101010101.6101032456781.2
Nega0.80Fig.２

510Reaction time〔min〕

1520

Profile of fluorescence enhancement of starting copies of Pab standard RNA. A broadline shows the cut-off value corresponding to a fluorescence intensity ratio of 1.2.

Fig.２に示すように、反応液中に標的RNAが存在し4ない場合、蛍光信号は一定値（バックグラウンド蛍光）

6Detection time〔min〕で推移した。これに対し、反応開始前のPab RNA量が10 2コピーの場合、約14分で蛍光強度比の立ち上がりが認められた。今回構築した検出系によって極めて短時間に高感度分析が可能であることが示された。また、蛍光信号の立ち上がり時間と標的RNAの初期コ
ピー数の間には相関が認められ、立ち上がり時間と初8101214

期コピー数から検量線を作成することにより定量的な16分析も可能と考えられた。Fig.３にPab m RNAキャリ

18ブレーターをサンプルとして測定した際に得られた蛍20光プロファイル（Fig.２）から、初期コピー数と蛍光0信号の立ち上がり時間の関係を示した。蛍光信号の立ち上がり時間は蛍光プロファイルにおいて蛍光強度比

246810Starting standard RNA copies/test(Log)
Fig.３がカットオフ値1.2に設定して算出した。Fig.３から分かるように定量分析の可能性を示された。

Calibration curve. Detection time, which corresponds
to a time reaching the cut-off value, is plottedagainst the logarithms of starting copies of PabRNA（102 −108copies）. Error bars mean ±SD.

〔2〕臨床材料からの検出
患者の喀痰から核酸を抽出し、本測定試薬を用いてTRCモニタリングを行った。Fig.４に示したように、増幅反応阻害物の持ち込みの可能性も考えられ、今後結核患者の喀痰はTRC蛍光モニタリングで14検体が陽の検討課題である。MAC陽性の9検体は、いずれも陰性、1検体のみ陰性であった。結核陽性サンプルの立性であり、本測定試薬は結核菌特異的であることが示

ち上がり時間のばらつきは喀疾中に含まれる結核菌数された。

を反映しているものと思われる。ただし、喀痰からの（ 6 ）東ソー研究・技術報告 第46巻（2002）

プル採取終了時の144時間まで低い値のまま推移した。

5Detected
14／15

なお、Streptomycin，Rifampicin，Kanamycinを添加

10Detection time〔min〕

7

したものについては6時間後に既にPab mRNAの発現量の低下が見られ、Ethambutol, Isonicotinic acidは1524時間後に低下が見られたが、これは抗結核薬の菌体20への作用機構の違いを示していると思われる。
Fig.６は抗結核薬未添加あるいはKanamycinを添加25して培養したBCG菌株からの核酸抽出物中の Pab
30DNAをPCR法で増幅し、電気泳動をしたときのパターンである。抗結核薬未添加及びKanamycin添加の
0／1

9／9

3／3

Pulmonarytuberculosis

Pulmonary
MACOthers

BCG菌からの核酸抽出物で同時にPabのDNAが増幅され、薬剤感受性を反映しないことが示された。
現在行われている薬剤感受性試験では、小川培地な

Fig.４ Detection of Pab mRNA in nucleic acids extracted
from the sputum of the patients infected withpulmonary tuberculosis, pulmonary Mycobacterium
avium complex（MAC）, and others.

どの固体培地を用いた培養法で3週間程度、ミドルブ
ルック7H9培地を用いた液体培養法（MGIT，BACTEC）などでも検体採取から判定まで2週間から3週間程度を要する。薬剤感受性試験はTRC蛍光モニタ〔3〕薬剤感受性試験への応用リング法の応用として期待されるが、各種薬剤耐性の今回、結核菌のモデルとしてBCG菌株を薬剤存在下で培養し、本測定試薬を用いたTRC蛍光モニタリングにより、BCG菌の Pab mRNAのコピー数を求め、結核菌を用いた検討が今後の課題である。

4．おわりに時間変化を示した（Fig.５）。グラフの縦軸は抗結核以上のように、結核菌群特異的蛋白質PabのmRNA薬未添加のPab mRNAコピー数を1として、各抗結核を特異的に増幅する試薬を開発した。本試薬は初期コ薬存在下で培養したBCG菌のPab mRNAコピー数のピー数102コピーのPab RNAを約14分で検出可能であ相対値を示した。いずれの抗結核薬を用いたときもった。また、蛍光強度の立ち上がり時間から未知試料

Pab mRNAのコピー数は24時間程度で激減し、サン中の Pab mRNAの初期コピー数を推算することがで

1.2

1.0Ethambutol

Control

Relative mRNA copies

0.8

Isonicotinic acid
0.6

0.4
Streptomycin

Kanamycin

Rifampicin

0.2

0.0024487296120144

Incubation time〔h〕

Fig.５

Pab mRNA from BCG cultured in the presence of drugs. The BCG cells were cultured in thepresence or absence of an anti-tuberculosis drug. The amount of Pab mRNA in 1 mL of theculture liquid is determined by the TRC method and shown as the relative values against thoseobtained in the absence of drugs.

（ 7 ）8TOSOH Research ＆ Technology Review Vol.46（2002）

None
036Kanamycin
924036924

Incubation time〔h〕（kbp）
1.88
1.49
0.93
0.42

Fig.６

Electrophoresis of PCR products. Pab DNA was amplified by PCR from the nucleic acids
extracted from BCG cells, cultured in the presence or absence of kanamycin(20μg/mL)
for a given hour, and then subjected to 1.5％ agarose gel treatment. The arrow indicatesthe amplified Pab DNA.

き、さらに実検体を用いた検討では、本測定試薬は結４）T．Ishiguro et al, Nucleic Acids Res,. 24, 4992

核菌特異的であることを示した。また、薬剤感受性試（1996）
５）石黒敬彦，Jpn. J. Electroph., 41，293（1997）

験への応用の可能性を示した。
今後、喀痰からの高効率な核酸抽出法の確立および

６）T．Ishiguro et al, Nucleic Acids Symposium

Series, 39，39（1998）

喀痰中の増幅反応阻害物の除去の検討を行い、本測定試薬を結核菌定量試薬として上市することを目指して

７）T．Ishiguro et al, Nucleic Acids Symposium

Series, 44，191（2000）

いく。
文８）田谷敏貴、斉藤寿一、林献俊典、石黒敏彦、東ソー研究報告、43、1（1999）

１）山根誠久，医学のあゆみ，198，195（2001）

９）林

２）臨床と微生物

10）Å. B. Andersen and E. B. Hansen，Inf. and増刊号，26，565（1999）

３）斉藤寿一，石黒敬彦，東ソー研究報告，41，13（1997）（ 8 ）俊典ら、 東ソー研究報告、45、3（2001）

Immun., 57，2481（1989）

東ソー研究・技術報告 第46巻（2002）

著者

氏名 益 田 昇 佳
Noriyoshi MASUDA著者

氏名 土 屋 滋 夫

著

9者

著

氏名 伊 澤 祐 一

Shigeo TSUCHIYA

Yuichi ISAWA

者

氏名 徳 永巧

Takumi TOKUNAGA

入社 平成11年４月１日

入社 平成８年４月１日

入社 昭和63年４月１日

入社 昭和62年４月１日

所属 科学計測事業部

所属 科学計測事業部

所属 科学計測事業部

所属 有限会社東ソー分析センター東京事業部

TRCプロジェクトチーム

TRCプロジェクトチーム

TRCプロジェクトチーム

解析・営業グループ

開発グループ開発グループ開発グループ

主任研究員

著

著

著

著

者

氏名 近 藤 雅 英
Masahide KONDO

者

氏名 堀 江 隆 一

者

氏名 保 川Ryuichi HORIE

清Kiyoshi YASUKAWA者

氏名 石 黒 敬 彦
Takahiko ISHIGURO

入社 昭和61年４月１日

入社 昭和61年４月１日

入社 昭和59年４月２日

入社 昭和58年４月１日

所属 科学計測事業部

所属 科学計測事業部

所属 科学計測事業部

所属 東京研究所

TRCプロジェクトチーム

TRCプロジェクトチーム

TRCプロジェクトチーム

企画管理グループ

開発グループ開発グループ開発グループ

主席研究員（ 9 ）