ユーザー発表

jPOSTデータベースの利用
ストレス耐性作物の作出を目指した
プロテオミクス解析
小松節子
福井工業大学

ダイズ

枝豆

納豆

Licensed under a Creative Commons表示4.0国際ライセンス(c)2019小松節子（福井工業大学）

豆腐

醤油

豆乳

初めに
（１）食糧問題・環境問題
地球温暖化
気温偏差年間平均(oC)

人口増加率

途上国で27億人増加

年間平均
回帰曲線

年度

地球温暖化による異常気象による農作物の生産条件の悪化

各国の食糧自給率（2017年度）（農林水産省・改変）

人口増加による食糧不足の懸念

食糧自給率の向上が重要

38

しかし（東北農政局）

（２）なぜダイズの湿害耐性研究か？
湿害を克服すれば。。。

ダイズ生産の85％を水田転換畑で栽培

ダイズ子実収量（トン/ﾍｸﾀｰﾙ）

ダイズの生産量が低い原因
300

ダイズの単収の安定向上

3

世界平均

250

湿害が生産性低下の原因
生育初期の梅雨による湿害が問題
出芽不良による欠株雑草との生育競合
土壌病原菌の感染

2.8トン／ﾍｸﾀｰﾙ

2002

1.7トン／ﾍｸﾀｰﾙ150100

日本

15000

122001345672016年度

栽培面積の拡大
１４．７万ヘクタール ＆ ９．３万ヘクタール
現在
転作作物を作付けしていない水田（農林水産省）

ダイズ自給率の向上

ダイズ耐湿性機構の解明
耐湿性ダイズ品種の開発

（３）プロテオミクス解析
gel free/label free proteomics (質量分析基盤無標識比較プロテオミクス解析)
ダイズ

Label-free

Gel-free

TCA/Acetone↓
Chloroform/Methanol↓
Trypsin/LysC digestion↓
LC-MS/MS analysis↓
Comparative analysis using
SIEVE softwarewith Mascot search engine

生物学的：３反復
技術的： ２反復装置:
Ultimate 3000 (Dionex) with
Nano HPLC C18 capillalycolumn(Nikkyo Technos)
LTQ-Orbitrap discovery(Thermo Scientific)
液クロ:Flow rate 200 nL/min
ACN gradient elution
10-30% for 100 min
30-50% for 10 min
80% for 10 min
質量分析計：
Data dependent Top10

１．ダイズプロテオームデータベース構築とデータ格納http://proteome.dc.affrc.go.jp/Soybean/

Sakata et al. J Proteome Res. 8, 3539-3548 (2009)
Ohyanagi et al. Front. Plant Sci. 3, 110 (2012)
Komatsu et al. J Proteomics 163:52-66 (2017)
ABC

Web presentation of SPD
After opening the SPD homepage, the left hand menu includes options for“Gel-based Proteomics” and “Gel-free Proteomics”. In “Gel-free Proteomics”A) images of soybean plantsB) a list of organs or organelles over a sequence of time pointsC) “Enter Search keyword” box allows the user to search for protein information“Download all data in spread sheet style” is used to download all data.
Komatsu et al. J Proteomics 163:52-66 (2017)

(1)

(2)

Result_cgi.txt(3)

How to use search result of SPD(1) Search data
(2) Save “Result” as a text file(3) Open the file “Result cgi,txt” with Microsoft Excel.

Komatsu et al. J Proteomics 163:52-66 (2017)

List of proteins

Example of a search for soybean protein information in SPD
The result file can be downloaded onto a personal computer, and dragged/dropped
the file into a spreadsheet. When one of the proteins is selected, information on its
chromosomal position from DAIZUbase (http://daizu.dna.affrc.go.jp/) is shown.
Komatsu et al. J Proteomics 163:52-66 (2017)

Application of SPD for functional categorizationof proteins in the soybean root identified in a time-dependent manner
Using these data, a set of 228 proteins significantly changed in abundance in theroot under flooding stress, compared with those of non-treated soybean, weredetected and analyzed using MapMan bin codes.
Komatsu et al. J Proteomics 163:52-66 (2017)

ControlFlooding
Ratio
0.1

1

10

Application of SPD for cluster analysis
of significantly changed proteins insoybean during exposure to flooding

Application of SPD for in silico proteinprotein interaction analysis of proteins
with significant changes in abundance
Komatsu et al. J Proteomics 163:52-66 (2017)

まとめ １
１．ダイズ遺伝子発現の包括的な研究の促進に資するため、機能解明研究に広く利用可能なダイズプロテオームデータベースを構築・公開。
（http://proteome.dc.affrc.go.jp/Soybean/）
２． データベースの特徴（１）「電気泳動を基盤にしたプロテオミクス」と「質量分析計を基盤にしたプロテオミクス」
解析技術を用いて得られたダイズタンパク質データ（２）経時的生育時期の各種器官と細胞小器官から得られたタンパク質データ、さらに、ストレス下のダイズで変動するタンパク質データを提供。
（３） DAIZUbase (http://daizu.dna.affrc.go.jp/)の染色体上の位置と連動。
（４）データのダウンロードが可能なため、使用者が加工し利用可能。
３．得られた質量分析生データ等は「jPOSTプロテオームデータベース」へ格納し、閲覧・使用が可能。

２．湿害耐性ダイズの作出を目指したプロテオミクス解析

ダイズの冠水ストレス応答機構
湿害
低酸素

アブシジン酸関連転写調節
カルシウム情報伝達系
活性酸素消去系
Starchグルコース分解シュークロース蓄積
翻訳後修飾

小胞体

糖鎖付加
リン酸化
ニトロシル化
ユビキチン化

解糖系
糖鎖付加
異常タンパク質

電子伝達系
クエン酸回路ミトコンドリア

ＧＡＢＡ蓄積Sucrose

無処理

嫌気代謝系
ユビキチン・プロテアソーム系タンパク質分解
Ub
Ub
Ub

Ub UbUb細胞壁弛緩

冠水処理

リグニン化抑制
生育遅延
病気

プロテオミクス解析で明らかになった生育初期のダイズの冠水ストレス応答機構
J Proteome Res, 2015, 14:3768-78 改定

これまでの研究
無処理
ダイズ

プロテオミクス解析

冠水ダイズ

器官特異的細胞小器官
翻訳後修飾

冠水応答機構本研究
ガンマ線照射ダイズ
ダイズ品種系統
冠水耐性試験（生存率）
冠水抵抗性インデックス

冠水耐性機構冠水耐性突然変異体
冠水耐性品種系統
形質転換ダイズ
植物ホルモン処理ダイズ

出芽期ダイズの湿害応答機構に関しては解明された。
しかし、湿害耐性機構に関しては未だ不明な点が多い。

J Proteome Res, 2015, 14:3768-3778

これまでの研究

本研究

ATP content (μ mol / DW g)

Fresh weight of plant (g)

10 mm

48(0)

51(0)

54(0)

60(0)

72(0)

51(3)

54(6)

60(12)

72(24)

0.93Control

0.89

Flood0.85

*0.81

0.77
0.73
2.5
21.5

**

10.5
48(0)

51546072(3)
(12)
(24)
(6)
h after sowing (h after flooding)

出芽期ダイズにおいて、生育初期の湿害応答機構に関しては解明された。
しかし、湿害直後の湿害応答機構に関しては未だ不明な点が多い。
J Proteome Res, 2009, 8:4766-4778
J Proteomics, 2014, 106:1-16

植物ホルモン処理ダイズ

冠水抵抗性突然変異ダイズ

567Flooding（days）
wild typeSurvival ratio (%)

120
100806040200A
B
C
7-day-flooding
gamma-ray irradiatedmutant120

Survival ratio (%)

410080604020(-)
07
Wild type07 days after flooding
Mutant A➢冠水抵抗性突然変異ダイズは、7日間の冠水後の水除去により生長を開始する。

aabbddcont flood

10GAc051050 μM
ABA➢アブシジン酸処理ダイズは、7日間の冠水後の水除去により生長を開始する。

冠水抵抗性ダイズ素材を用いて、湿害抵抗性機構を解明する
J Proteome Res, 2013, 12: 4769-4784
J Proteomics, 2013, 79: 231-250

栽培ダイズ

突然変異ダイズ
播種

２日間
冠水処理 アブシジン酸＋冠水処理 冠水処理
３時間

試料採取
プロテオミクス
Gel-free/label-freeproteomics

トランスクリプトミクス
RNA-sequenced
transcriptomics

冠水抵抗性突然変異ダイズ

メタボロミクス
Mass based
metabolomics

アブシジン酸処理ダイズ

冠水抵抗性突然変異ダイズとアブシジン酸処理ダイズの両冠水抵抗性素材において共通に変動する因子が、湿害耐性機構に関与する鍵となる。
J Proteomics 2017, 169:225-232

Proteomics
899

146

Mutant line/Wild type

238

ABA treated soybean/Wild typeprotein
RNAsignalingperoxidases
mitochondrial ETstressDNA
development
redox
hormone metabolism
othersnot assigned

8060 200Percentage of changed proteins
Mutant line (common: 146 proteins)

020 6080
Percentage of changed proteins
ABA treated soybean (common: 146 proteins)

Functional distribution of proteins identified in mutant line andABA-treated soybean at initial flooding stress.

The significantly changed flooding tolerance-related proteins weremainly involved in protein synthesis and RNA regulation.
J Proteome Res, 2016, 15:2008-2025

protein synthesis
Nascent polypeptide associatedcomplex

RNA regulation
Glycine rich RNA binding protein 3

Nascent polypeptide
associated complex
protects newly synthesized
proteins

Chaperone
functions in the correct
refolding of proteins.
Eukaryotic aspartyl protease

Chaperonin 20

Glycine-rich RNA-binding
proteinaffects catalase/peroxidase
activities under abioticstresses.

protein abundance ratio

RNA expression levelprotein abundance ratio

RNA expression level

Aspartyl proteaseimproves abiotic tolerance
by increasing activity ofantioxidases

mRNA expression of genes related to protein synthesis and RNA regulation
at initial flooding stress.
The mRNA expression level of genes related to refolding, assembly of newly synthesized
proteins, and activity of antioxidases was up-regulated in mutant and ABA treated soybean.
J Proteome Res, 2016, 15:2008-2025

Transcriptomics
31698

Mutant / wild type (729 genes)

105224

ABA treated / wild type (255 genes)

RNA
Protein metabolism
Signaling
DNACellStressTransport
Hormone metabolism
Amino acid metabolism
MiscellaneousNot assigned00

Number of genes
Mutant / wild type (common: 31 genes)

510

Number of genes
ABA treated / wild type (common: 31 genes)

Functional categorization of differentially expressed genes
in mutant line and ABA-treated soybean.
The significantly changed flooding tolerance-related genes were mainly involvedin protein synthesis and RNA regulation.

Plant Mol Biol, 2017, 93: 479-496

CYP77A7 (At3g10560)
977
1000

CYP77A5P (At5g04660)

CYP77A9 (At5g04630)
CYP77A6 (At3g10570)

991

CYP77A4 (At5g04660)

CYP 77A1 (Glyma17g01870)

1000

75.9%

Ratio of mRNA expression

0.1

CYP77B1 (At1g1160)
aaacytochrome P450 77A1-likeabbbbbbbbbcbaaca

Flooding
Flooding
Control

Flooding

Stress, temporal, and organ specific mRNA expression level of cytochrome P450 77A1
Cytochrome P45077A1 exhibited high correlation with flooding tolerance
in root tip of soybean at initial stage.
Plant Mol Biol, 2017, 93: 479-496

Metabolomics
207

16

Mutant / wild type (223 metabolites)

6

ABA treated / wild type (213 metabolites)

Carbohydrates
Organic acids
PeptidesLipidsPhytochemical compoundsNucleic acids
OthersNot assign6040200
Number of metabolites
Mutant / wild type (common: 207 metabolites)

0204060
Number of metabolites

ABA treated / wild type (common: 207 metabolites)

Functional categorization of metabolites in flooding-tolerant mutant and ABA-treatedsoybeans at initial flooding stress
Significantly changed metabolites were carbohydrates, organic acids, and peptides
between flooding-tolerant mutant and ABA-treated soybeans.

Plant Mol Biol, 2017, 94: 669-685

D-Fructose-6PSPS
Sucrose(extracellular)

Sucrose-6P
Sucrose-6PSucrose

D-Fructose

INVINV

UDPglucose

SuSy

D-Glucose-6P

HK
KHK
Cellobiose(extracellular) Cellobiose-6P

D-Fructose

UGP2

D-Glucose
a-DGlucose-1P

Cellulose
Cellobiose

Increase
Decrease
Inverted

PGM

GPI
D-Fructose-6PHK
D-Glucose-6P

D-Glucose

Sugar-metabolism pathway in flooding-tolerant mutant and ABA-treated soybeansat initial flooding stress.
Sucrose, glucose-6-phosphate, glucose, and fructose-6-phosphate were decreased,
while fructose and glucose-1-phosphate were increased in both flooding-tolerant materials
compared to flooded soybeans.
Plant Mol Biol, 2017, 94: 669-685

まとめ ２
オミクスデータの統合（一部）

1 cmSucrose
Sucrose synthase
UDP-glucose

51(0)

48(0)

Metabolites
Proteins
Transcripts
Increase
Decrease
Inverted

0.8

D-Glucose-6P
Glucose-6-phosphate isomerase 1
D-Fructose-6P

Fresh weight of plant(g)Phosphoglucomutase
D-Glucose51(3)F-Fru

0.9

D-Glucose-1P
Hexokinase 151(3)F

Hexokinase 1
Fructokinase 4

Fructose

Phosphofructokinase (Glyma17g01361.1)
Phosphofructokinase (Glyma04g09180.1)

abbc0.7
0.1
0D-Fructose-1,6P2
h after sowing (h after stress)

冠水耐性素材において共通に変動する因子
hexokinaseとphosphofructokinaseの制御下で糖代謝系が関与している。
統合オミクス解析で重要因子とされたfructoseの添加により、冠水下でダイズの生長を制御できる。

オミクスデータの格納サイトに関しては要検討事項である。
ダイズにおいては、未だ多くのmissing proteinsが存在する。
Plant Mol Biol, 2017, 94: 669-685
Int J Mol Sci. 2018;19(5)

今後
結果の一部

プロテオミクスおよびトランスクリプトミクス解析で同定されたタンパク質・遺伝子群をダイズ染色体へ貼付けることで、冠水耐性に関与する領域を絞込む。
→マーカー選抜育種

謝辞
国立研究開発法人 農業・食品産業技術総合研究機構（農研機構）
羽鹿 牧太
南條 洋平
杉本 和彦
Zhejiang University
宮尾 安藝雄TIAN Jingkui
筑波大学（連携大学院）
ZHU WeiYIN Xiaojian
元・三菱スペースソフトウエア（株）
WANG Xin
大柳 一
新潟大学（敬称略）
西村 実 （元・農研機構）
前橋工科大学坂田 克己 （元・農研機構）

本研究はJSPS科研費の助成を受けて実施された。
基盤研究B（平成19～22年度）（19380015）
挑戦的萌芽研究（平成23～24年度）（23658063）
基盤研究B（平成27～29年度）（25H04445）
挑戦的萌芽研究（平成28～29年度）（16K14842）