6.3.3 低線量率γ線連続照射マウスにおける悪性リンパ腫等病変発生の早期化の確認 -血清中のタンパク質を指標とした解析Latency Period of Malignant Lesions in Mice Exposed to Continuous Low dose-rate
Gamma-rays -Analysis of Serum Proteins杉原 崇, 田中 聡, 田中 イグナシャ, 田中 公夫
生物影響研究部

Takashi SUGIHARA, Satoshi TANAKA, Ignacia TANAKA, Kimio TANAKA
Department of Radiobiology
Abstract
Our previous study has revealed that exposure of mice to continuous low dose-rate gamma-rays(LDR: 21 mGy/22 h/day) shortens the life span by approximately 120 days due to premature death fromvarious neoplasms including malignant lymphomas. We have been performing gene expression analyses
using microarray to search for bio-active molecules that are serologically detectable in LDR-irradiated miceor in mice that develop neoplasms after LDR-irradiation. Results of the microarray analyses, which werefocused on liver adenoma, suggest that alpha-1B-glycoprotein (A1BG) may be a good marker of LDR
radiation-induced liver tumors. The concentration of A1BG in sera of mice with liver adenomas afterirradiation was lower compared to mice not exposed to radiation. Therefore, we conclude that A1BG isusable as a serological marker to analyze radiation-induced liver tumor development in LDR-irradiatedmice.
1. 目的明らかにし、さらに、その変化を引き起こす原因と平成 7 年度から 15 年度にかけて行った寿命試験になる物質の一つを同定した。
平成 23 年度の調査では、

おいて、低線量率（20 mGy/22 時間/日）放射線を 400

悪性リンパ腫に着目し、病理診断で悪性リンパ腫と日間連続照射することで腫瘍死による寿命短縮が認同定されたマウスの血清を CBA 法で解析し、悪性められることが示された。本課題では寿命短縮の原リンパ腫発生あるいは低線量率放射線照射が原因で因及び死亡前の影響を明らかにするために、低線量血清中への放出量が変化する生理活性物質を予測し率（20 mGy/22 時間/日）放射線照射開始から 100 日た。また、その血清中の量的変化を ELISA 法によっごとにマウスを経時的に解剖し、病理学的解析結果て解析した。本年度は、昨年度に引き続き、低線量を基に悪性リンパ腫や肝腫瘍等に関与する血清中因率γ線連続照射によってリンパ腫を発症したマウス子の解析を行った。
平成 22 年度にガンマ線を連続照で血清中の量が減少することが CBA 法で予測され射したマウスの血清を検定用の培養細胞に添加し、たコルチゾールについて、ELISA 法により再度解析

マイクロアレイ法を用いて、血清中の生理活性物質した結果を報告する。また、肝腫瘍に着目し、肝腫による培養細胞への活性を解析する新規の方法

瘍に関わる血清中因子のスクリーニングを行い、低（Cell-based-assay ：CBA 法）を開発した。この方

線量率放射線と肝腫瘍及び肝臓疾患との関わりを明法を用いて、放射線の連続照射によって生体内に生らかにすることを目指した。

じた生理活性物質の量的な変化を検出できることを2. 方法B6C3F1 メスマウスに低線量率（20 mGy/22 時間/137を示した。これらの結果は、照射群のマウス血清中
AFP タンパク質を測定することで肝細胞腺腫を持つ日） Cs-ガンマ線を 400 日間連続照射した（集積線マウスを診断できる可能性があることを示す。一方、量は 8 Gy）。照射開始後、非照射 SPF 条件下で 100，AFP タンパク質以外にもマイクロアレイ解析の結果、

200，300、400、500、600、700 日間飼育したマウス

肝細胞腺腫を持つマウスで有意な A1BG（アルファから心採血し、採取した血液から血清を分離後、１-B グリコプロテイン）遺伝子発現量低下が見られELISA 法によって解析した。今年度、新たに肝腫瘍た。A1BG は血清中に分泌されているタンパク質とに関わる遺伝子 A1BG（アルファ１-B グリコプロテしてよく知られていることから、マウス数を増やしイン）を同定したため、血清中の A1BG タンパク質

リアルタイム PCR 法にて詳細に解析した。その結果、量を ELISA 法により測定した。また、ビジコムジャ

マイクロアレイ法と同様に、リアルタイム PCR 法にパンより購入した倫理審査済みのヒト血清（60 歳以よってもマウス由来の肝細胞腺腫において有意に低下の正常女性及び 60 歳以下の肝臓癌女性の血清）をい遺伝子発現結果が得られた。次に、この A1BG タ用いて、ELISA 法により A1BG 量を測定した。さらンパク質を照射によって発生した肝腫瘍のマーカーに、昨年度に報告した NR3C1（コルチコイドリセプとして使用できるかを ELISA 法によって検討した。

ター）のリガンドであるコルチゾールの血清中濃度解析の結果、血液中の A1BG は低線量率照射/肝腫瘍を明らかにするために、経時的解剖実験第 2 群のマ群で有意に減少していた（Fig. 1）。また、低線量率ウスすべての血清を ELISA 法により解析した。肝腫照射/非肝腫瘍群においても有意に A1BG 量は減少

瘍マーカー探索のため、低線量率（20 mGy/22 時間/しており、この結果から肝腫瘍発生前から A1BG 量日）ガンマ線により照射開始から 500-700 日間たっの減少が肝腫瘍発生に何らかの形で関与している可たマウス個体（計 20 匹）から採取した血清を CBA能性が考えられた。また、ヒトの肝臓癌患者の血清法で解析した。病理診断により、肝腫瘍と同定され中の A1BG 量を測定したところ、正常対照群と比較たマウスと正常マウスの血清それぞれ 30l を 2 mlして、有意な減少が見られた。以上の結果から、マの無血清培地中に加えて、37℃、5％CO2 の条件下で、ウスの血液中の A1BG を測定することにより、低線初代肝細胞を一日間培養した。培養後細胞にトリゾ量率放射線誘発肝臓腫瘍を予測・確認できる可能性ール液を加え、RNA を抽出し、マイクロアレイがあると考えている。

（Agilent 社）及びリアルタイム PCR により遺伝子発現解析を行い、上流因子の予測を行った。

低線量率ガンマ線照射によって正常マウスの肝臓に誘発される遺伝子発現変化を検出したところ、高線量率放射線応答の際に、アポトーシスや細胞周期3. 成果の概要

抑制に働く重要な転写因子 p53 による発現制御を受昨年度からの予備実験で肝細胞腺腫（アデノーマ）ける Phlda3 の発現上昇が確認できた。Phlda3 は細胞で発現変化の大きい遺伝子を抽出し解析したところ、の代謝制御を行う Akt1 活性の抑制に関与することAFP（アルファフェトプロテイン）が低線量率γ線が知られているため、低線量率照射によって引き起照射マウス由来の肝細胞腺腫において正常組織部位こされる p53 の活性化が Phlda3 の発現上昇を引き起より 288 倍高い発現を示す遺伝子としてマイクロア

こし、解糖系やインシュリン代謝などの代謝機構にレイ法によって検出された。リアルタイム PCR 法に影響を及ぼしている可能性が考えられる。
そのため、てマウス数を増やし詳細に解析したところ、同様に今後は、低線量率照射がこの経路の起点にあたるマウス由来の肝細胞腺腫において高い遺伝子発現がp53 の活性化を引き起こしているかを確認する必要示された。また、遺伝子発現と同様に血清中 AFP タがあると考えている。

ンパク質が増加すると考え、ELISA 法で実験検討を初代肝細胞を用いた CBA 法により肝腫瘍に関わ行い、血清中 AFP タンパク質が有意に増加することるマウス血清中の生理活性物質を探索したが、腫瘍化の原因となる生理活性物質は予測できなかった。の解剖時期において照射群マウスで有意に減少して一方、肝腫瘍ではなく照射によって変化すると考えいることを確認した。また、悪性リンパ腫を持つマられる血清中生理活性物質として、インヒビンや成ウスの解析数を昨年度より増やして実験を行ったと長ホルモン量の変化が予測された。今後、低線量率

ころ、昨年度の報告結果と同様に、照射条件下で悪照射による、これらの血清中生理活性物質量変化に性リンパ腫を発生したマウスのコルチゾール量が、関して解析を行っていきたい。

非照射の悪性リンパ腫を持つマウスよりも減少して一方、悪性リンパ腫を発生したマウスの血清解析いることが明らかになった。グルココルチコイド系を CBA 法により行ったところ、照射群中の悪性リステロイドはリンパ球の走化性を抑え炎症を強力にンパ腫を持つマウスの血清中には、NR3C1 等の核内抑制するなど、広く生体環境の恒常作用を有する。

受容体の転写因子の活性化制御に関与する生理活性

グルココルチコイドは悪性リンパ腫の治療薬として物質の存在が予測された。そこで、昨年度はグルコ知られている。また、古くからマウスリンパ腫のアコルチコイド受容体である NR3C1 に着目し解析をポトーシスをコルチゾールが誘導することが報告さ行った。グルココルチコイドは、副腎皮質ホルモンれている。これらの知見と、ここで観察された照射の一つであり、副腎皮質の束状層で産生される。3群におけるコルチゾール量減少および照射群中でリ種類あるグルココルチコイドの中でコルチゾールのンパ腫を発生した個体におけるコルチゾール量のさ生体内量が最も多く、グルココルチコイドの 95％はらなる減少結果から、照射によるコルチゾールの減コルチゾールであると言われている。今年度は、マ少が悪性リンパ腫発生に何らかの影響を及ぼしていウス数を増やして解析を行うため、経時的解剖実験る可能性が考えられる。

第 2 群で使用した全マウスの血清中コルチコイド量

Quantity of A1BG protein (g/ml)を測定した。解析の結果、コルチゾール量はすべてFig. 1

Quantitative analysis of A1BG protein in mice sera.
SKC: Non-irradiated mice, SKR: LDR (20 mGy/22h/day)-irradiated miceC