ChIP-IT ®Express
Magnetic Chromatin
Immunoprecipitation Kit&
Sonication Shearing Kit（F5 版本）货号：53008 & 53032

Active Motif 中国

地址：上海市闵行区浦江镇万康路 290 号
电话：(86)-21-20926090
邮箱：techchina@activemotif.com

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有。

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ChIP-IT Express +,- .............................................................................................................................. 3./01.............................................................................................................................................. 423456789:;< ............................................................................................................................ 6

ChIP-IT Express Kit=>?@53008A ................................................................................................... 6
ChIP-IT Express Shearing Kit=>?@53032A...................................................................................... 7
BCDEFG ...................................................................................................................................... 8
HIFG.............................................................................................................................................. 8
ChIP-IT Express JKLM ........................................................................................................................... 9
JK#$-NOP+QR ............................................................................................................................. 11ST

UVWX8YZ ....................................................................................................................... 11

JK#$-NOP[\]^ ......................................................................................................................... 13_T[\]^ .................................................................................................................................. 13`T

ab+cd .............................................................................................................................. 14

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NOP+dfghijk Proteinase K lm ............................................................................. 14

JK#$-PCR 7n ................................................................................................................................... 16oT

p- PCR ................................................................................................................................. 16

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JrXs PCR .......................................................................................................................... 19

tu ........................................................................................................................................................... 23

Section A UVWXv,wYZ;< ................................................................................................... 23
Section B xy;<,w .................................................................................................................... 24
Section C DNA cdvz{YZ|}8 DNA ~• ............................................................................. 25
Section D €•UV‚ƒs+NOPQR ........................................................................................... 26
Section E ab8a„;+…† .......................................................................................................... 28
Section F ‡ˆ‰Š ............................................................................................................................ 31
Section G‹Œ•01 ........................................................................................................................... 35

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!"
ChIP（Chromatin Immunoprecipitation）是研究蛋白与 DNA 互作的有力工具[1,2]。利用甲醛固定完
整的细胞，能够交联和保护蛋白与 DNA 的互作。随后将 DNA 剪切成小片段，可以用超声或者酶切
的方法将 DNA 剪切成大小相对一致的片段，通过抗体免疫感兴趣的蛋白与 DNA 互作复合体。紧接
着解交联，利用蛋白酶 K（Proteinase K）去除蛋白质，回收目标 DNA 片段。对回收的 DNA 进行分析便可知蛋白结合怎样的 DNA 序列（见第二页的图一）。

ChIP 在染色质生物学和转录调控领域是非常有用的一种实验方法，用于确认染色质蛋白，组蛋
白修饰，和转录因子的特异作用位点。而且，蛋白质与 DNA 相互作用是在内源性染色体环境中固定的，所以 ChIP 结果反映了染色体拓扑结构(Topology)的影响和细胞调节蛋白的作用[3,4,5]。

ChIP 技术的实验要求较高，需要高质量的抗体去识别固定后的目标蛋白，同时还需要高效的试剂（通常指 protein A or G beads）沉积抗体和染色质的复合物。除此之外，还需要特定化学试剂，抑制剂，和封闭液，从而减少非特异性富集以及蛋白的降解。

Active Motif’s ChIP-IT®Express Kits 提供完全的 ChIP 实验方案，更加便捷，准确的监测蛋白与
DNA 的互作。ChIP-IT®Express Kits 利用 protein G 耦合磁珠，充分简化了实验方法和提高了 ChIP 实
验的效率。相比于经典的 ChIP 实验方法，很多步骤在此试剂盒中被简化或完全舍弃（详见第三页），使得 ChIP-IT Express 成为一个快速，高效的 ChIP 实验方案。

ChIP-IT®Express Kits 所包含试剂可供 10 个样本染色质的准备，也有用于 2 次剪切优化，总共能
提供 25 次 ChIP 反应。如果您需要剪切更多的染色质，可单独加购 ChIP-IT Express Shearing Kit。另
外，若想了解更多实验文档或 ChIP-IT Express 系列相关产品的信息，请访问
www.activemotif.com/chipitdocs。

产品名称

规格

货号

ChIP-IT®Express

25 rxns

53008

ChIP-IT®Express Shearing Kit

10 rxns

53032

ChIP-IT®Protein G Magnetic Beads

25 rxns

53014

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1

#$%&

!" ChIP-IT Express #$%&'()!
在 ChIP-IT Express 实验过程中，用甲醛固定细胞中蛋白与 DNA 的复合物，被固定后的 DNA 经超声
剪切或者酶切消化成短片段。片段化后的染色质与一抗经孵育后，抗体结合目标蛋白与 DNA 的复合
物。再经 Protein G 磁珠的偶联。最后经清洗和解交联步骤，回收纯化后的 DNA 片段用于后续 ChIP
结果分析。

'()*
1.

Solomon, M.J. et al. (1988) Cell 53(6):937-47.

2.

Solomon, M.J. and Varshavsky A. (1985) PNAS USA 82(19):6470-4.

3.

Kuo, M.H. and Allis, C.D. (1999) Methods 19(3):425-33.

4.

Weinman, A.S. and Farnham, P.J. (2002) Methods 26:37-47.

5.

Caretti, G. et al. (2003) J Biological Chem. 278:30435-30440.

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2

ChIP-IT Express +,!"#$%&'()*# ChIP +,l

更短的实验步骤，和显著减少的操作时间。

l

同时进行多个样本的 ChIP 实验。

l

兼容多通道加样。

ChIP-IT Express 和 ChIP-IT Express Enzymatic 两款试剂盒全方位的简化了染色质免疫共沉淀步骤。试剂盒可用于染色质的制备，最佳染色质剪切条件的确定和 ChIP 实验。

ChIP-IT Express 试剂盒中包含的组分足够 10 个样本染色质的制备，适用于两次染色质剪切优化，且能够满足 25 个样本的 ChIP 实验。试剂盒中还包含了 Protein G 包被的磁珠供实验者使用，
Protein G 磁珠对 IgG 具有较高的亲和性，且具有较低的非特异性结合。相比于凝胶微珠，Protein G 只需很少的清洗步骤，而且不需要预处理染色质在 ChIP 实验前。除此之外，磁珠的使用不需要离心步
骤，只需用磁力架吸附，所需时间更短，操作更加简便，也使得操作更有利于在不扰动磁珠的情况下
吸出液体，清洗步骤也可以使用排枪提高实验效率。这样的实验方案显著的减少了操作时间，且保证
了样品间的统一性。在清洗步骤使用 1.7 ml 的硅化管能有效减少 Protein G 磁珠和 DNA 的损耗。

此试剂盒也对其他一些 ChIP 实验步骤进行了优化。专用的洗脱缓冲液（Elution Buffer）与解交联缓冲液（Reverse Cross-linking Buffer）相结合，可节省时间并消除操作过程中可能发生的 DNA 损失。

这些优化大大的减少了操作时间，使得 8，16，或 24 样本的 ChIP 实验可同时进行，这是传统
ChIP 实验不可能达到的。为了更高通量的 ChIP 实验，Active motif 还开发出 ChIP-IT Express HT（货号：53018），能够处理 96 个样本的 ChIP 试剂盒。

*+',- . ChIP-IT Express(/01)2 ChIP-IT Express Enzymatic34+15
ChIP-IT Express 试剂盒的试剂足够准备 10 个染色质超声样本，适用于两次优化剪切方法。使用
此方案，每份剪切染色质的制备都需要一个 15 cm 的细胞培养板，并且产生的染色质足以进行多达 6
个 ChIP-IT Express 反应（一个 ChIP 反应是指一样本的染色质样品与一种抗体的孵育）。但是，染色www.activemotif.com

3质制备方案可以按比例放大或缩小，具体取决于所使用的细胞数（具体操作见附录-Section D）。如
若需要超声制备更多的染色质样品，我司提供相应的配套试剂盒 ChIP-IT Express Shearing Kit（货号：53032）
ChIP-IT Express Enzymatic Kit 与 ChIP-IT Express Kit 类似，但它是使用拥有专利的剪切酶（Enzymatic Shearing Cocktail）和消化缓冲液（Digestion Buffer）替代超声的方式剪切染色质。因为酶切法过程仅于时间和温度有关，所以不会有超声过程的过热和乳化问题的出现。因此酶切法不仅更简单，而且还可以更轻松地优化剪切条件并在制备之间进行更可重复的剪切，从而改善了 ChIP 的结
果。

#$%&
请访问我们的网站以获取有关以下各项的完整信息，这些产品和其他相关产品的货号在本手册附
录部分中列出：
由于合适的对照能使 ChIP 的结果和故障排除更加容易分析，因此 Active Motif 提供了用于人类，
小鼠和大鼠样品的 ChIP-IT Control Kits。这些有用的试剂盒包含阳性和阴性对照抗体以及物种特异性的阳性对照 PCR 引物。用于验证 ChIP 级抗体时，此试剂盒是非常有用的。
经过验证的 ChIP Control qPCR primer sets 也可以单独用作阳性对照和阴性对照，用于许多常见
的 ChIP 靶点，以验证 ChIP 反应是否成功。使用我们的引物对将节省合成和测试您自己的基因/物种特异性对照引物所需的时间和精力。
Active motif 生产的 Ready-to-ChIP Chromatin 是从多种不同细胞系（HeLa，Hep G2，K-562 和
NIH/3T3）中提取的高质量染色质，且已用超声片段化，可直接用于 ChIP 反应。
对于需要制作比 ChIP-IT Express Kit 提供的试剂更多的剪切染色质样品的用户，可单独购买ChIP-IT Express Shearing Kits。
如果您使用的小鼠单克隆抗体的同种型不能与 Protein G 很好地结合，请考虑使用我们的小鼠 IgG
桥接抗体（Bridging Antibody for Mouse IgG）。它与 Protien G 磁珠和小鼠一抗都具有很强的亲和力。这样可以最大程度地捕获小鼠抗体-免疫复合物，从而改善使用小鼠一抗的 ChIP 和 IP 实验的结果。
最后，ChIP 的一个困难方面是找到能够与目标蛋白，结合并通过甲醛固定 DNA 的识别目标蛋白的抗体。在蛋白质印迹（Western Blot）或其他应用中表现良好的抗体在 ChIP 实验中可能无法很好地
发挥作用。因此，Active Motif 提供了数量不断增加的经过 ChIP 验证的抗体，这些抗体已被验证可在ChIP 中使用。请参阅本手册的附录- Section G，或访问 www.activemotif.com/chipabs 查看最新的 ChIP
级抗体列表。

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4Active Motif 的 ChIP-IT High Sensitivity Kit 非常适合在研究低丰度转录因子，与结合亲和力不佳的抗体一起使用或在细胞数量有限的情况下开展 ChIP 实验时使用。该实验方案提供更高的灵敏度
来克服这些障碍。ChIP-IT High Sensitivity Kit 与 ChIP-IT qPCR Anylysis Kit 兼容，可用于简化 qPCR
分析并实现多种样品类型和实验数据的标准化。
ChIP-IT Express HT 专为需要执行许多 ChIP 的用户而设计。通过为您提供基于磁珠的 ChIP-IT
Express Kit 方法改善为可实现 96 孔 ChIP 实验的试剂和方法，它可以实现真正的高通量 ChIP。
一个共同的实验目标是确定在单个染色质样品的同一基因座上存在两个表观遗传标记或染色质相关蛋白。这是通过连续的 ChIP 完成的，在该过程中，将样品用另一种抗体进行第二次 ChIP 处理。由于序列染色质免疫沉淀反应（Sequential ChIP）可能是一个复杂的过程，因此 Active Motif 提供 ReChIP-IT Kit，该试剂是针对 ChIP-IT-Express 开发的方法，简化了的序列染色质免疫沉淀反应（Sequential ChIP）技术。
对于希望将 ChIP 结合 NGS（ChIP-Seq）进行全基因组分析的研究人员，Active Motif 提供了ChIP-IT ChIP-Seq 分析试剂盒。该试剂盒包括经过验证的试剂，简化的实验方案和对照，以进行ChIP 富集，验证 ChIP 反应并准备用于 NGS 文库构建。
经典的 ChIP 实验是使用甲醛固定的组织或培养的细胞系进行的。为了利用可从临床样本中获得
有价值的回顾性数据，Active Motif 开发了 ChIP-IT FFPE Kit，可与福尔马林固定的石蜡包埋（FFPE）组织块和组织学切片一起使用。

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5./012345678
ChIP-IT Express Kit'()*53008+
请依据下表对试剂盒中各组分进行合理保存。Protein G 收货后不可再复冻（re-freeze）。
!"#$'()*/+,-%&

RNase A (10 μg/μl)

40 μl-20℃ 6 ./5 M NaCl

200 μl

-20℃ 6 ./100 mM PMSF

475 μl

-20℃ 6 ./Proteinase K (0.5 μg/μl)

250 μl

-20℃ 6 ./Protein K Stop Solution

150 μl

-20℃ 6 ./Protease inhibitor Cocktail (PIC)

2 × 100 μl-20℃ 6 ./1 × Lysis Buffer

16 ml-20℃ 6 ./10 × Glycine

33 ml-20℃ 6 ./10 × PBS

120 ml

-20℃ 6 ./Shearing Buffer

10 ml-20℃ 6 ./Elution Buffer AM2

1.6 ml

-20℃ 6 ./Reverse Cross-linking Buffer

1.6 ml

-20℃ 6 ./ChIP Buffer1

70 ml-20℃ 6 ./ChIP Buffer2

70 ml-20℃ 6 ./Protein G Magnetic Beads*

650 μl4℃ 6 ./

Siliconized 1.7 ml microcentrifuge tube

2501

Bar Magnet

1

01

Mini Glue Dots

1 sheet01*Protein G 磁珠不可反复冻融。当收到试剂盒后，请将磁珠 4℃保存。

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6

ChIP-IT Express Shearing Kit'()*53032+
此表为 ChIP-IT Express Shearing Kit 的组分列表，只包含剪切相关试剂。完整的 ChIP-IT Kit 的组分列
表见前页。请依据下表信息保存各试剂组分。

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www.activemotif.com%&'()*/+,-

RNase A (10 μg/μl)

40 μl-20℃ 6 ./5 M NaCl

200 μl

-20℃ 6 ./100 mM PMSF

475 μl

-20℃ 6 ./Proteinase K (0.5 μg/μl)

250 μl

-20℃ 6 ./Protein K Stop Solution

150 μl

-20℃ 6 ./Protease inhibitor Cocktail (PIC)

2 × 100μl-20℃ 6 ./1 × Lysis Buffer

16 ml-20℃ 6 ./10 × Glycine

33 ml-20℃ 6 ./10 × PBS

120 ml

-20℃ 6 ./Shearing Buffer

10 ml-20℃ 6 ./76789:;l靶标蛋白的 ChIP 级抗体l带有小间隙研杵的 Dounce 均质器（例如：货号 40401 和 40415 带有紧密配合的研磨杵）。强烈建议在超声剪切染色质的方法中使用 Dounce 均质器。Dounce 均质化极大地提高 ChIP 实验的成功
机会l

磁力架。可使用配套的磁力条（详见附录—Section E）或者购买商业化磁力架（例如：Promega
MagneSphere® 12 孔磁力架）

l37% 甲醛溶液（福尔马林）含 10-15%的甲醇以防止多聚反应，不建议使用多聚甲醛l

相差显微镜或组织培养显微镜，和血球计数板l

50%甘油（去离子水配制）

l

酚/氯仿（1∶1）TE 饱和 pH=8.0（DNA 纯化，分子生物学级）l

3 M 乙酸钠 pH=5.2（在通过分光光度法或凝胶电泳检查浓度之前，纯化的 input DNA 或者纯化剪切后的 DNA 检测）l

100%乙醇

l

70%乙醇

l

DNase-free H2O（纯化 input DNA）

l培养板的旋转台

l

置于 4℃的旋转摇床（例如 Barnstead/Thermolyne 公司的 Labquake，带有 1.7 ml 微型离心管的管座）

l

离心机（台式 4℃离心机）和离心管l

DNA 定量分光光度计l

移液器和枪头（建议使用带滤芯的枪头）l

超声打断仪（例如：Active Motif 的带 1/8 探头和 EpiShearTM Cooled Sonication Platform（货号：53080）的 EpiShearTM Sonicator（货号：53051））。

l

凝胶电泳成像仪l细胞培养基（无血清培养板）

l

细胞刮刀（橡皮淀帚）<,:;l八连管（例如：Thermo Fisher 货号：AB-0451）l

1.7 ml 硅化管（例如：Active Motif 货号：53036）l

Chromatin IP DNA Purification 试剂盒（例如：Active motif 货号：58002）

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8

ChIP-IT Express 9:;<=#$>?@ABCDEF#$GHI

JKLMlUVŽ•8NOP+QR

当计划一个实验时，请计算您将需要准备的染色质数量，并确定您计划对每个准备的染色质进
行的 ChIP 的数量。一定要在计算时将对照 ChIP 实验也包含进去。此外，请注意，如果您希望分
析特定化合物或培养条件对转录因子/DNA 相互作用的影响，您应该从对照（未处理）细胞制备染色质作为参考样品。
lProtein G 23456
提供的磁珠一旦完全再悬浮形成匀浆，就可以使用了。不需要预封闭磁珠和预清洗样本。为了
最好的实验结果，轻柔的混匀试管。磁珠沉降速度较快，在使用前可用移液枪吹打重悬。Protein G请勿反复冻融，直接放于 4℃保存。ChIP-IT 的 Protein G 磁珠可单独购买（货号：53014）。

l

789 ChIP :;<ChIP 抗体必须能够识别与 DNA 结合和/或与其他蛋白质复合的固定的天然蛋白质。许多抗体在其他实验中有较好的效果，但不一定适用于 ChIP 实验。因此，使用未经验证的 ChIP 抗体必须使用对照抗体（例如 Active Motif 的 RNA pol II 抗体，货号：39097）和阴性对照抗体 IgG（小鼠IgG 对应小鼠单克隆，兔 IgG 对应兔的多克隆）验证染色质制备和 ChIP 方法。为方便起见，Active
Motif 提供用于人类、小鼠和大鼠样本的 ChIP-IT Control Kit，这些试剂盒包含阳性和阴性对照抗体、合适的阳性 PCR 引物、PCR 缓冲液和上样染料。
（详见附录）。

l=>?

使用试剂盒中提供的 1.7 ml 硅化管，或八连管进行 ChIP 实验（制备染色质和分离 input
DNA 若使用此管，会使得 ChIP 实验试管用量受限，请勿在染色质制备和 input DNA 分离
步骤使用此管）。
l5@)
提供的的磁力条可用于 1.7 ml 硅化管或八连管（见附录-Section E）。或使用商业侧拉式磁力架（例如：Promega MagneSphere ® 12 位磁力架-1.7 ml 离心管型）。

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9l

ABCDEF
室温下完全融解 PMSF 和 Proteinase K Stop Solution，大概需要 30 分钟。在使用前轻柔涡旋震荡并瞬时离心。

l

GHIJK<L
Chromatin shearing(sonication) buffer 通常含有去垢剂（如：0.1% SDS 和 0.5%脱氧胆酸钠）。若您计划的超声使用的染色质体积超过了 60 μl，请使用表一（第 13 页）中的 200 μl 体系。
100 μl 超声体系中切勿使用超过 60 μl 的染色质。
l;<49&
最佳结果通常用 1-3 μg 抗体。然而，这将根据抗体的亲和力和染色质的质量而变化，您可能
需要使用更多的特定抗体。

lMBNO
福尔马林和 PMSF 是剧毒化学品。使用时请佩戴合适的安全装备（例如：安全眼镜，手套，实验服）。同时，福尔马林具有吸入毒性，请在通风橱中使用。如果染色质是从生物危害性或传染性物质中提取的，则应在生物安全罩中进行染色质超声处理。

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109:#$-=>?+@A,- ./01234
此方案适用于 15 cm 培养皿（约 1.5×107 个细胞）的固定及染色质的酶切片段化（附录-Section
D 包含其他量级细胞的实验方案）。请在使用本方案前需要确定您所用细胞的超声打断条件。若未确定，请不要直接使用本方案。请依据附录中的 Section A-C 确定您所用细胞样本的超声打断条件，需要使用三个平板的细胞，所产出的染色质足够用于超声条件的摸索。根据确定后的超声打断条件，使用本方案（见下文）。

PQRSTUChIP 实验往往要求染色质被剪切到 200-1500 bp 大小。总的来说，通过使用小的超声体积和使用V-底管进行超声剪切比平底管的超声效率更高。若超声过程中产生样品乳化并有气泡产生，这会使得
超声剪切无效化，可以通过降低超声功率，缓慢梯度上调超声功率，从而避免乳化和气泡的产生。若不经意间产生了乳化和气泡，停止超声，在 4℃ 8,000 rpm 下离心 4 min 以去除残留的空气。为阻止
样品过热使 DNA 变性，超声过程尽可能的使样本一直保持在冰上，并间断超声（如：超声 20 s,冰/水
上放置 30 s，再超声 20 s，等），若可能，全程冰上操作。
注：下文实验方法中部分缓冲液需要加入 PMSF 和蛋白酶抑制剂（Protease inhibitors, PIC）。融化这些缓冲液在实验开始之前（例如提前 30 min 室温融化），在实验使用前加入 PMSF 和蛋白酶抑制剂。
1.

在一个 15 cm 培养皿中培养 70-80%的细胞。可以对细胞中感兴趣的通路进行刺激。

2.

当细胞准备好收获时，新鲜制备以下溶液。下面的体积适用于一个 15 cm 培养皿：a.

固定液：取 0.54 ml 37% 甲醛溶液与 20 ml 基础细胞培养基混匀，室温放置。

b.

1×PBS 溶液：取 2.33 ml 10×PBS 溶液与 21 ml dH2O 混合均匀，冰上放置。

c.

甘氨酸终止液：1 ml 10×甘氨酸溶液（10×Glycine Buffer），1 ml 10×PBS 和 8 ml dH2O 混合

均匀，室温放置。
d.
3.

细胞刮除液：0.6 ml 10×PBS 与 5.4 ml dH2O 混匀，冰上放置。

将培养基从细胞中倒出，在每个平板上加入 20 ml 固定液。室温下，在摇床上孵育 10 min。
注：在标准方案中，染色质在剪切前固定 10 min。虽然这是标准的固定条件，但一些抗体/染色质组合可能在较短的固定时间内工作得更好。
4.

将固定液小心倾倒掉，并在每个平板上加入 10 ml 预冷的 1× PBS 清洗。摇晃盘子 5 s，然后倒
出 PBS。

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11

5.

在每个平板中加入 10 ml 甘氨酸终止液以终止固定反应，覆盖整个平板，室温摇晃反应 5 min。

6.

将终止液倒掉后，加入 10 ml 预冷的 1×PBS，水平晃动平板 5 s，倒掉 PBS 溶液。

7.

细胞刮除液使用前加入 30 μl 100 mM PMSF。每个平板加入 5 ml 预冷的细胞刮除液，用细胞刮刀刮取细胞。以一定角度握住培养板，向下刮取细胞，将其收集在培养板的底部边缘。用 1 ml 移液管将细胞转移到冰上的 15 ml 锥形管中。

8.

第 7 步刮取的细胞 4℃ 2,500 rpm（720 RCF）离心 10 min。

9.

去除上清，完成后可继续后续步骤，也可冻存细胞聚团物。若是冻存处理，加入 1 μl 100mM PMSF
和 1 μl PIC 后 -80℃保存。

VWXYZGHI[\

下面的章节描述了用超声法分离和制备染色质。

1.

冰上解冻冻存的固定后细胞聚团，同时用 1 ml 预冷的 Lysis Buffer（含 5 μl PIC + 5 μl PMSF），轻
柔吹打并短暂涡旋以重悬细胞。冰上孵育 30 min。

2.

将细胞转移到一个预冷的 dounce 均质器中。在冰上搅拌 10 下，以利于细胞核释放。
细胞裂解状态检测：为确保细胞完全裂解，取 10 μl 在相差显微镜下用血球计数板观察，以确认细胞核已被释放。在裂解步骤前后观察细胞状态通常是有帮助的，因为这样更容易识别细胞核和整个
细胞。完整的细胞应该有一个黑暗的中央区域（细胞核），周围有一个密度较低的细胞质晕。在裂
解后的细胞中，细胞核将呈现圆点状，周围环绕着不对称的碎片。如果细胞没有溶解，则在冰上再用 dounce 研磨杵研磨 10 下，或直到细胞充分裂解。
3.

转移匀浆至 1.7 ml 离心管中，4℃ 5,000 rpm（2,400 RCF）离心 10 min。

4.

小心移除上清。加入 350 μl Shearing Buffer（需加入 1.75 μl PIC 和 1.75 μl PMSF），冰上放置，有时需要利用 dounce 均质器轻柔的搅动使其重悬。
。

5.

超声 DNA 依据实验前经过优化确定的针对实验细胞系的超声条件（附录-Sections A-C）。

6.

4℃ 15,000 rpm（18,000 RCF）离心 10 min 超声后的样品。小心转移上清至新的 1.7 ml 离心管中，此溶液包含了剪切后的染色质。剪切后的染色质可立即使用，也可-80℃保存。在冻存前，取出 50
μl 用于评估剪切效率和 DNA 浓度。剩余的染色质（约 350 μl）足够 6 个 ChIP 反应的开展，为了减少融冻次数，在冻存前请分装。
注：根据附录—Section C 部分的 DNA 清洗方案处理上述 50 μl 染色质样本，以检查 DNA 浓度并

确认染色质已被剪切。您需要 DNA 的浓度用于后续 ChIP 实验。

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129:#$-=>?BCDE
5- 67891.

冰上溶解染色质。取 10 μl 转移至新管中，标记为“input DNA”
，input DNA 将被用于 D 中的第6 步作为对照用于 PCR 分析。若在 6 小时内就需要使用此样本，可放置于 4℃，否则存放于-20℃保存。

2.

依据下表（表一），在 1.7 ml 硅化管（或者 PCR 管中）中配制 ChIP 反应体系。务必依据剪切后
的 DNA 浓度计算 ChIP 反应体系。在使用磁珠前，需充分涡旋震荡（或颠倒）混匀磁珠。抗体需
最后加入反应体系。
表一

1 次 ChIP 反应

1 次 ChIP 反应

（所用染色质体积小于 60 μl）（所用染色质体积大于 60 μl）

25 μl

25 μl

ChIP buffer 1

10 μl

20 μl

片段化的染色质

20-60 μl61-150 μl

1 μl

2 μl

dH2O

补齐至 100 μl

补齐至 200 μl

Antibody

1-3 μg1-3 μg100 μl200 μl试剂名称

Protein G
Magnetic Beads（7-25 μg）*

Protease Inhibitor
Cocktail (PIC)（最后加入）
总体积*注：根据应用的不同，ChIP 反应所用染色质的范围可在 1-50 μg。一个重要的影响因素是染色质的体积，
特别是用超声法制备染色质，
超声过程中使用的试剂可能会降低抗体的结合效率。
若 ChIP
体系中染色质使用量＞60 μl，则需按照上表右侧的 200 μl 体系进行反应。可见附录中关于 ChIP
实验染色质的用量使用讨论，和定量 DNA 的方法。
3.

闭合管盖，在 4℃旋转摇床上孵育 4 h，在某些情况下，如果过夜孵育，灵敏度可能会提高。

4.

轻柔的瞬时离心收集管盖上的液体。

5.

将离心管转移至磁力架上，使磁珠汇聚在管壁处。

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13

6.

待磁珠吸附完全后，小心吸除上清。

:- ;<=>?
注：切勿使磁珠“过干燥”。从移除缓冲液到添加下一次清洗液或洗脱缓冲液之间的间隔不超过 1 分

钟。关于洗珠方法的建议，详见附录—Section E。
1.7 ml 离心管的清洗方案：
1.

加入 800 μl ChIP Buffer1，清洗一次。

2.

加入 800 μl ChIP Buffer2，清洗两次。

3.

最后一次洗涤后，在不干扰珠子的情况下，尽可能多地去除上清液。可使用 200 μl 的移液器用于
移除上清液体。

8 连管的清洗方案：
1.

加入 200 μl ChIP Buffer1，清洗三次。

2.

加入 200 μl ChIP Buffer2，清洗两次。最后一次洗涤后，在不干扰珠子的情况下，尽可能多地去
除上清液。

@- ABC=?DEFGHI Proteinase K JK
1.

用 50 μl Elution Buffer AM2 重悬清洗过的磁珠。

2.

旋转摇床上室温孵育 15 min。

3.

瞬时离心收集管盖上的液体。

4.

加入 50 μl 解交联缓冲液（Reverse Cross-linking Buffer）并用移液器上下吹打混匀。将离心管置于
磁力架上使磁珠聚集在离心管的一侧。

5.

转移上清至新管，此溶液包含染色质。

6.

现在需要使用前面准备的“input DNA”，取 10 μl 分装的 input DNA（源自 B 中第 1 步）并在冰
上融化，若需要，加入 88 μl ChIP Buffer2 和 2 μl 5 M NaCl 与 input DNA 混合均匀（只针对 inputDNA），最后总体积是 100 μl。

7.

在温度循环仪上，95℃同时孵育 ChIP 和 input DNA 样品 15 min。
注：如果您使用的是更大、更厚壁的微型离心管，请执行以下操作：65℃孵育 2.5 小时。更多的蛋白质样品可能需要更长的解交联时间。在此节点样品可储存在-20℃。
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14

8.

将管转至室温，如果瓶盖内部聚集了液体，则瞬时离心，然后添加 2 μl Proteinase K。

9.

关闭管盖，混匀液体并在 37℃下反应 1 h。在此期间，可将 Proteinase K Stop Solution 放置室温融化 30 min 至 1 h。

10. 反应 1 h 过后，将离心管转移至室温，加入 2 μl Proteinase K Stop Solution。瞬时离心收集管盖上
的液体。此时 DNA 可立即用于后续 PCR 分析，或-20℃保存。

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9:#$-PCR 3F
L- MN PCR
下文的实验方案是 ChIP 收集的 DNA 的 PCR 分析指南。为了获得不同 ChIP 反应中收集的 DNA
量的可靠比较，终点 PCR（End Point PCR）必须在线性扩增阶段停止。由于样本和 PCR 引物集合之间的扩增窗口不同，必须根据经验确定正确的 PCR 周期数。实时 PCR 分析简化了这些考虑，因为可以确定每个样本的 Ct 值，代表线性扩增开始的循环数。由于这些优点，我们建议您尽可能使用实时
PCR。
四个 DNA 模板需要经 PCR 分析：阳性抗体和阴性抗体 ChIP 实验的 DNA（例如 Active Motif 的ChIP-IT Control Kits 中的 RNA pol II 阳性对照抗体和 IgG 阴性对照抗体），Input DNA 和实验组 ChIP
的 DNA。只用超纯水作模板的对照，以确保 PCR 试剂不受污染。

引物的设计
使用 silico PCR 程序（例如：UCSC 基因组浏览器 http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr）设计和分
析潜在的引物对，以确保所选择的引物将从被扩增的物种的基因组 DNA 中产生单个扩增子。理想情况下，扩增子长度应为 150-400 bp 用于标准 PCR。PCR 设计软件的使用有助于选择好的引物对。
注：PCR 非常灵敏，应采取一切预防措施防止污染。应戴手套并使用带滤芯的移液管。

PCR 程序的设置
在下面的例子中，PCR 反应是使用 2 种不同的 PCR 体系建立的，其中包含阳性和阴性对照 PCR
引物集合。如果您使用的是来自 Active Motif ChIP-IT Control 试剂盒的中的阳性对照抗体，则可能只有阳性对照 PCR 引物可使用，因为我们选择阳性对照抗体是因为它们与基因组中的许多区域结合，这使得为我们的阳性对照抗体设计“阴性对照”引物不切实际。对于用其他抗体进行的 ChIP 分析，根据抗体的不同，可能包括适用于该抗体的阳性和阴性 PCR 引物集合。
1.

PCR 循环程序，94℃预变性 3 min，然后 30-36 个循环如下步骤 [94℃ 20 s，59℃ 30 s，72℃ 30s]，最后 10℃保持。每个 PCR 反应的总体积是 25 μl。最好从 36 个循环开始，可能需要根据实际情况优化循环数。

2.

重要：依据 1∶10 稀释 input DNA，取 20 μl input DNA 与 180 μl dH2O 混匀。

3.

使用下表对 PCR 管进行标记，并添加 PCR 模板和仅水的对照，使试管保持在冰上。然后添加步骤 4 中要用的 PCR 扩增反应混合物：

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PCR 模板

PCR 反应物

（每个 5 μl）

（每个 20 μl）

1

ChIP DNA — 阳性对照抗体

阳性引物 PCR 反应

2ChIP DNA — 阴性对照抗体 IgG

阳性引物 PCR 反应

3Input DNA （稀释比 1∶10）

阳性引物 PCR 反应

4ChIP DNA — 靶标抗体

阳性引物 PCR 反应5

H2O（不含有 DNA）

阳性引物 PCR 反应

6ChIP DNA — 阳性对照抗体

阴性引物 PCR 反应

7

ChIP DNA — 阴性对照抗体（IgG）

阴性引物 PCR 反应

8Input DNA （稀释比 1∶10）

阴性引物 PCR 反应

9ChIP DNA — 靶标抗体

阴性引物 PCR 反应10

H2O（不含有 DNA）

阴性引物 PCR 反应

反应编号

4.

依据下表，冰上配制阳性和阴性对照 PCR 扩增反应混合物。先加入 dH2O 最后加入 Taq 聚合酶。
混合均匀后冰上放置。这可确保反应混合物在循环开始前处于非活性状态。正如上文中所提及的，Active Motif 的 ChIP-IT Control 试剂盒质包含阳性对照 PCR 引物以及阳性抗体和阴性抗体 IgG（引物是以混合物的形式提供的，其中包含了正向和反向引物，所以每个反应只需 4 μl）。然而，对于您的靶标抗体我们建议设计对应的阳性和阴性引物集合，并在实验前测试其引物可用性。

阳性引物 PCR 反应体系

试剂名称

1 个反应

5 个反应

DEPC H2O

12.3 μl61.5 μl阳性正向引物（5 pmol/μl）

2.0 μl10 μl

阳性反向引物（5 pmol/μl）

2.0 μl10 μl

dNTP mixture（5 mM each dNTP）

1.0 μl

5.0 μl10 × PCR Buffer

2.5 μl12.5 μlTaq（5 U/μl）

0.2 μl

1.0 μl总体积（不包含 DNA 模板）

20 μl

100 μlwww.activemotif.com

17阴性引物 PCR 反应体系：

5.

试剂名称

1 个反应

5 个反应

DEPC H2O

12.3 μl61.5 μl阴性正向引物（5 pmol/μl）

2.0 μl10 μl

阴性反向引物（5 pmol/μl）

2.0 μl10 μl

dNTP mixture（5 mM each dNTP）

1.0 μl

5.0 μl10 × PCR Buffer

2.5 μl12.5 μlTaq（5 U/μl）

0.2 μl

1.0 μl总体积（不包含 DNA 模板）

20 μl

100 μl

将第 4 步配好的 20 μl PCR 反应混合物中加入第 3 步 5 μl PCR DNA 模板，总体积 25 μl，冰上吹打混匀。小心盖好 PCR 管盖并确保每管的反应物都在管底。

6.

将 PCR 管转移至按第 1 步设好程序的 PCR 仪中。待反应完成后，转移样品至冰上。

7.

此时可将样本立即用于后续分析，也可-20℃冻存。

PCR 产物分析
1.

取～8 μl PCR 产物用于 3% 琼脂糖凝胶检测。剩余产物保存以备不时之需。

2.

用人 GAPDH 阳性对照引物扩增产物 166 bp；小鼠 EF1a 引物扩增的引物为 233 bp，而大鼠肌动
蛋白引物产生 223 bp 的 PCR 产物。使用 50 或 100 bp 的 DNA ladder 作为迁移标准。凝胶电泳直到 PCR 产物与引物和引物二聚体分离良好。染色凝胶并分析。

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!N OP ChIP-IT Express Q 100,000 RSTUVWXYZ[\] PCR
HeLa 细胞用 1%甲醛固定 10min，超声剪切（5 次脉冲）制备染色质。使用阴性对照 IgG 和 RNA pol
II 抗体对从 100,000 和 750,000 个细胞分离的染色质进行 ChIP 检测。用 GAPDH 阳性对照引物对 ChIP
反应分离的 DNA 进行 36 个 PCR 循环的分析(这些抗体和引物来源于 ChIP-IT Control Kit-Human，小鼠和大鼠也有对应试剂盒，详见参见相关产品）。10 μl PCR 产物用于 1%琼脂糖凝胶检测，并在溴化
乙锭染色后通过紫外线照射进行观察。用 GAPDH 引物对 RNA pol II 抗体分离的 DNA 进行 PCR，比用阴性对照 IgG 分离的 DNA 进行的类似反应产生更多的产物。这些结果表明，用 RNA pol II 抗体构
建的 ChIP 能显著富集 GAPDH 启动子 DNA，而用阴性 IgG 构建的 ChIP 不能富集 GAPDH 启动子
DNA。

O- PQ1R PCR
在免疫沉淀染色质的最终洗脱、解交联和 Proteinase K 消化之后，在某些下游应用之前，样品应
经过 DNA 清理步骤。对于实时 PCR，我们建议在扩增前使用 Active Motif 的 Chromatin IP DNA 纯化
试剂盒（货号：58002）。这些柱子的产量为 50 μl，每次 PCR 会用到 2 μl，足够 25 个 PCR 反应的DNA。我们建议您使用市售 SYBR Green PCR 试剂盒和实时定量检测 PCR 仪。
A．引物的设计
l

用 silico PCR 程序（例如：UCSC 基因组浏览器 http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr）设计和分
析潜在的引物对。终点 PCR 设计的引物可能并不适用于实时定量 PCR。

l应避免使用会产生二聚体的引物，因为它们将被 SYBR Green 结合，这将影响准确定量。你可
以 测 试 你 的 引 物 的 自 我 互 补 性 和 二 级 结 构 在

http://frodo.wi.mit.edu/cgi-

bin/primer3/primer3_www.cgi。
l理想情况下，扩增子长度应为 50-150 bp，用于实时 PCR。

l应避免 3’ 末端的 G/C 延伸。

l

正向和反向引物之间的 Tm 值差异不应超过 3°C。

B．建立标准曲线确定富集倍数
注：这一步不是必需的，但许多下游计算将依赖于标准曲线。

1.

为了测试引物的效率，请使用引物组对已知 DNA 量的 input DNA 进行 qPCR，生成标准曲线，
一式三份。运行 10 倍稀释的三到五个样品，例如：0.005 ng、0.05 ng、0.5 ng、5 ng 和 50 ng。

2.

运行 ChIP 和 IgG 组样品以及 input DNA 标准的稀释队列。每个引物组都有不同的扩增曲线，因此可以绘制 Ct 值以创建线性回归图。这可能不是必需的，因为大多数实时热循环仪会自动创建标准曲线。

3.

Ct = Threshold Cycle (信号超过背景阈值水平的循环数)

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19

4.

Plot Ct vs DNA quantity (log scale) 生成的标准曲线图（图三）。

使用标准曲线斜率计算倍数富集的两种方法。对于大多数情况，第一种方法已足够，但也提供了可选
的第二种方法。
Method 1:
1.

第一种方法需要（a）求解 ChIP 和 IgG 样本的 DNA 量，然后（b）计算 ChIP 样本相对于 IgG 样本
的富集倍数：
X = DNA 量
Y = CtM = 标准曲线的斜率
B = 当 X = 1 时对应的 Ct 值，（例如图三所示：Ct = 27.46）
ChIP Ct = 22.77 循环（来自图三）
IgG Ct = 30.22 循环（来自图三）（a）Y = M (log X) + B 或者
log(X) = (Y-B) ÷ M（b）富集倍数 = ChIP DNA 的量 ÷ IgG DNA 的量
利用图三中的数据，计算过程如下：使用已知的斜率、y 截距、ChIP Ct 和 IgG Ct 的值求解 X：（a）log（X）= （Y-B）÷ M
如：log（DNA 总量） = （Ct – y-int）÷ 斜率
ChIP 样本： log (X) = (22.77 - 27.463) ÷ -3.508 即 X = 21.767 ng
IgG 样本： log (X) = (30.22 - 27.463) ÷ -3.508 即 X = 0.1637 ng（b）

用计算出的 DNA 量计算富集倍数：
21.767 ng ÷ 0.1637 ng = 133 倍

Method 2U2.

第二种方法将富集度计算为 ChIP 样品的扩增效率与 IgG 的扩增效率之比。
引物的效率可依据标准曲线斜率和下列公式计算得出：% 效率 = [10(-1/

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斜率)– 1] × 100%20

如图三所示，斜率 = -3.508% 效率 = [10(-1/斜率) – 1] × 100% = [10(-1/-3.508) – 1] × 100%
% 效率 = [1.928 - 1] × 100% = 0.928 × 100%
% 效率 = 92.8%
最理想的效率应该在 100 ± 10% （范围：90-110%，当斜率 = -3.32 时，效率 = 100%）。在这个
案例中，引物的效率在理想效率范围内。所以，此引物的扩增效率可以用来计算 ChIP 和 IgG 样
本的扩增效率。
AE = 扩增效率（是引物效率的一个系数） = 10(-1/斜率)
Fd = 稀释系数（例如：1）（a）%ChIP = AE(input Ct – ChIP Ct) × （Fd）
（100）

（b）

%IgG = AE(input Ct – IgG Ct) × （Fd）
（100）

（c）

富集倍数 = %ChIP ÷ %IgG

运用图三中的数据，计算如下：
斜率 = -3.508
AE = 10(-1/斜率) = 10(-1/-3.508) = 1.928
Input Ct = 21.36 循环 （选取最接近 ChIP 样品的 input DNA 值，即图三上 input DNA = 50ng）
ChIP Ct = 22.77 循环（图三）IgG Ct = 30.22 循环（图三）（a）%ChIP = （1.928(21.36 – 22.77)）(1) (100)%ChIP = （1.928(-1.41)）(1) (100)%ChIP = 39.62%（b）%IgG = （1.928(21.36 – 30.22)）(1) (100)%IgG = （1.928(-8.86)）(1) (100)%IgG = 0.3%（c）

最终富集倍数的计算如下：39.62% ÷ 0.3% =132 倍

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!^ _ 10 `abcd' input DNA efgh
用 GADPH 引物将 5 份 10 倍稀释的 input DNA，ChIP 和 IgG 样品一起进行 qPCR 扩增，每个样品共扩增 3 份。绘制每个 input DNA 量的 Ct 值，并用于产生标准曲线。其斜率和 y 截距值与样品的 Ct 值
一起计算富集度。

!i jP GAPDH klm DNA no RNA pol II pqrstpq IgG ' ChIP uvw
HeLa 细胞用 1%甲醛固定 10min，超声剪切（5 次脉冲）制备染色质。ChIP 是用从 750,000 个细胞分
离的染色质使用 ChIP-IT Express 试剂盒，使用阴性对照 IgG 和阳性对照 RNA pol II 抗体（货号：39097）。用 GAPDH 基因特异性引物对从每个 ChIP 反应中纯化的 DNA 进行实时 PCR(这些抗体和引
物集可在 ChIP IT Control Kit–Human（货号：53010）中同时获得。这些结果表明，用 RNA pol II 抗体构建的 ChIP 能显著富集 GAPDH 启动子 DNA，而用阴性 IgG 构建的 ChIP 不能富集 GAPDH 启动
子 DNA。

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GH!"#$%&'()*
染色质剪切条件可能因细胞类型而显著不同，有时还取决于细胞培养和细胞刺激条件。然而，在为给定的细胞类型优化剪切后，这些条件通常保持恒定在该细胞类型。因此，当您第一次从细胞系中提取染色质时，我们建议使用以下方案来确定最佳剪切条件。然后您可以使用优化的条件从这个细胞
类型和刺激条件下制备染色质。这可能需要使用三个平板培养的细胞用于优化 ChIP 实验超声条件，
经过优化后，正式实验只需单个平板的细胞就足以完成 ChIP 实验。

Section A +,-./)*$%&'
在以下的方案中，染色质的制备使用了 3 个 15 cm 的细胞培养板（大约 4.5×107 cells），并是用
三种不同的剪切条件。总的来说，至少有一种条件产生的染色质可用于 ChIP 实验。只需要 50 μl 用作
染色质剪切分析，更多的（每种超声条件通常~300 μl）染色质约可用于 6 次 ChIP 实验，这个染色质
溶液中需含有 Protease inhibitor cocktail（PIC）和 PMSF。然而，在优化过程中使用 PIC 和 PMSF 将减
少剪切和 ChIP 反应的数量，使您一旦您建立了最佳剪切条件并准备好进行正式实验时试剂可能出现不够的情况。
注意：如果您想在 ChIP 实验中使用未使用过的染色质，在开始此方案前解冻 PIC 和 PMSF，并

在使用前立即添加到缓冲液中。在剪切分析时冻存未使用的染色质。如果执行优化只是为了识别剪切
参数，请不要将 PIC 和 PMSF 添加到缓冲液。这将节省这些试剂，使得后需可用于 10 个样本的染色
质制备供 25 次 ChIP 反应。
1.

在一个 15 cm 培养皿中培养 70-80%的细胞。若适用，三个培养板用相同的处理方式刺激感兴趣的通路，将三个平板的细胞合并为一个样本。

2.

3.

当细胞准备好收获时，依据下文新鲜配制固定液，冷的 1×PBS，甘氨酸终止液，和细胞刮除液：a.

固定液：取 1.62 ml 37% 甲醛溶液与 60 ml 基础细胞培养基混匀，室温放置。

b.

1×PBS 溶液：取 7 ml 10×PBS 溶液与 63 ml dH2O 混合均匀，冰上放置。

c.

甘氨酸终止液：3 ml 10×甘氨酸溶液，3 ml 10×PBS 和 24 ml dH2O 混合均匀，室温放置。

d.

细胞刮除液：1.8 ml 10×PBS 与 16.2 ml dH2O 混匀，冰上放置。

将培养基从细胞中倒出，在每个平板上加入 20 ml 固定液。室温下在摇床上孵育 10 min。
注：在标准方案中，染色质在剪切前固定 10 min。虽然这些标准的固定条件，但一些抗体/染色质组合可能在较短的固定时间内工作得更好。
4.

将固定液倒掉，并在每个平板上加入 10 ml 预冷的 1× PBS 清洗。摇晃盘子 5 s，然后倒出 PBS。

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5.

在每个平板中加入 10 ml 甘氨酸终止液以终止固定反应，覆盖整个平板，室温摇晃反应 5 min。

6.

将终止液倒掉后，加入 10 ml 预冷的 1×PBS，水平晃动平板 5 s，倒掉 PBS 溶液。

7.

细胞刮除液使用前加入 90 μl 100 mM PMSF。每个平板加入 5 ml 预冷的细胞刮除液，用细胞刮刀刮取细胞。以一定角度握住培养板，向下刮取细胞，将其收集在培养板的底部边缘。用 1 ml 移液
管将细胞转移到冰上的 15 ml 锥形管中。用同样的操作刮取另外两个平板，收集三个平板的细胞在
同一个锥形管中。

8.

第 7 步刮取的细胞 4℃ 2,500 rpm（720 RCF）离心 10 min。

9.

去除上清，完成后可继续后续步骤，也可冻存细胞聚团物。若是冻存处理，加入 1 μl PMSF 和 1μl
PIC 后 -80℃保存。

Section B 01&')*在开始前请阅读第 11 页的剪切小要点。在下面的方法中，染色质在 5，10，和 20 脉冲（pulses）
下进行超声剪切。总的来说，至少会有一种方法产生的染色质适用于后续 ChIP 实验。因为只有少部
分的剪切后染色质用于检测分析剪切效果，剩余的染色质便可用于正式的 ChIP 实验，前提是在下文
中的超声过程中使用的缓冲液已加入 PIC 和 PMSF，且前期细胞已被固定。
我们的超声条件优化方法是基于配有 1/8’’ 探头的 Active Motif’s EpiShearTM Probe Sonicator 而产
生的，同时还配有稳定探头高度和保持样品温度的 EpiShearTM Cooled Sonication Platform（货号：53080）。超声是在 25%的功率，体积约为 300 μl 的情况下进行的。
1.

若需要，冰上加入 3 ml 预冷的 Lysis Buffer（使用前加入 15 μl PIC + 15 μl PMSF）融解细胞聚团物，冰上孵育 30 min。

2.

转移细胞至冷的 Dounce 均质器。冰上研磨 10 次已便细胞核的释放。
细胞裂解状态检测：为确保细胞完全裂解，取 10 μl 在相差显微镜下用血球计数板观察，以确认细胞核已被释放。在裂解步骤前后观察细胞状态通常是有帮助的，因为这样更容易识别细胞
核和整个细胞。完整的细胞应该有一个黑暗的中央区域（细胞核），周围有一个密度较低的细胞质晕。在裂解后的细胞中，细胞核将呈现圆点状，周围环绕着不对称的碎片。如果细胞没有溶解，则在冰上再用 dounce 研磨杵研磨 10 下，或直到细胞充分裂解。
3.

转移细胞至 1.7 ml 离心管中，4℃ 5,000 rpm（2,400 RCF）离心 10 min 以聚集裂解后的细胞核。

4.

小心移除上清，加入 1.0 ml Shearing Buffer（使用前加入 5 μl PIC 和 5 μl PMSF），重悬后的样
本分装至 3 个 1.7 ml 离心管中，冰上放置。分装的样本每管大约 300 μl。

5.

设置超声频率为 25%，三管样品分别按下列三种不同条件超声冰上超声：a.

5 pulses 20 s，每次脉冲间间歇 30 s。

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6.

b.

10 pulses 20 s, 每次脉冲间间歇 30 s。

c.

20 pulses 20s, 每次脉冲间间歇 30 s。

超声结束后，4℃ 15,000 rpm（18,000 RCF）下离心 10 min，转移上清至新的 1.7 ml 离心管并每管分装出 50 μl 用于后续染色质剪切效率的评估。无论是分装的还是未分装的染色质均可-80℃保存。或者分装的 50 μl 染色质直接用于 Section C 进行解交联并纯化用于后续凝胶分析
和分光光度计检测。

Section C DNA 23/45$%678 DNA 9:
1. 若需要，融解分装的 50 μl 剪切后的染色质样本。
2. 每管加入 150 μl dH2O 后加入 10 μl 5 M NaCl。
3. 在 65℃水浴锅或者热循环仪上孵育样本 4 h 或过夜解交联。使用水浴锅时请防止样品管管盖因加热而弹开。
4. 每管样品加入 1 μl RNase A 并 37℃孵育 15 min。
5. 每管加入 10 μl Proteinase K 并 42℃孵育 1.5 h。
注：如果您打算用分光光度计来测定 DNA 的浓度，必须先把 DNA 清理干净。不建议柱纯化，因为高蛋白含量可能会堵塞柱。因此，DNA 应该用苯酚/氯仿提取和沉淀，步骤如下：a. 每个样品加入 200 μl 苯酚/氯仿（1∶1） TE 饱和，pH = 8。涡旋震荡混匀后用台式离心机最高速离心 5 min。
b. 转移水相至新管，加入 20 μl 3 M 醋酸钠（pH = 5.2）和 500 μl 100% 乙醇。涡旋混匀后，-80℃
放置最少 1 h，或者-20℃过夜放置。
c. 利用台式离心机最大转速 4℃下离心 10 min。
d. 小心移除上清，切勿触碰底部沉淀。
e. 加入 500 μl 70% 预冷乙醇（不可扰动沉淀），最大转速离心 4℃离心 5 min。
f. 小心移除上清，切勿扰动底部沉淀，空干。
g. 空干后，加入 30 μl dH2O 重悬沉淀，并用分光光度计检测 260 nm 下吸光度，确定 DNA 浓度（1.0 A260 单位 = 50 μg/ml）。
小份 DNA 的浓度可以用来反算被剪切染色质样品的浓度。可选，但建议：如果您对多个染色
质样本（如未处理和处理的样本）进行 ChIP 检测，请计算初始 DNA 浓度，以便所有 ChIP 反应的初始 DNA 量相等（建议使用 7-25 μg）。这确保了每个 IP 使用等量的染色质，使得处理组之间的相对差异具有可比性。

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25

6. 我们建议在凝胶上加载两个不同量的剪切后样品，以确保其中一个在可接受的范围内。添加 4 μl 6
× Loading Buffer 与 16 μl 样品混合。然后再 1% TAE 琼脂糖凝胶中每个样品分别上样 5 μl 和 10μl。100 V 电泳 45 min 至 1 h，直到上样染料移动至胶的下 3/4 位时停止电泳。
7. 最佳的超声结果应如图五的第 2 和第 3 泳道所示，片段大小在 200-1500 bp 左右。
8. 如果在优化实验中使用 PIC 和 PMSF，则剩余的~150 μl 在上述步骤 B5 中冷冻的合适大小的染色质，可用于 ChIP 反应。

!x /0yz{|}~3ChIP-IT Express5
HeLa 细胞用 1%甲醛固定 10 min，然后用 ChIP-IT Express试剂盒制备染色质。使用带有 1/8’’ 探头的 Active MotifTM
EpiShear 探头超声仪，用 5、10 和 20 pulses 以 25%的振幅
剪切三个样品，每个样品约 300 μl。每个脉冲包括 20 s 的
超声波处理，然后在冰上间歇 30 s，以防止热量积聚。剪切
和未剪切的染色质样品进行解交联，用蛋白酶 K 处理，苯酚/氯仿提取并沉淀，如方案所述。样品通过 1%琼脂糖凝胶电泳分离。最佳剪切染色质将产生 200-1,500 bp 的条带。
泳道 1：100 至 1,000 bp 的 Ladder
泳道 2：Hela DNA 经 5 pulses 剪切（最佳结果）
泳道 3：Hela DNA 经 10 pulses 剪切（最佳结果）
泳道 4：Hela DNA 经 20 pulses 剪切*注：在此实验中，5 和 10 pulses 的结果是均可用于后续 ChIP 实验。

Section D ;<+,=>?(!"#@A
我们的标准染色质制备方案使用细胞生长在一个 15 cm 的组织培养板（约 1.5 × 107 cells），并
产生足够的材料来完成多达 6 个 ChIP 反应。根据您的实验，您可能希望使用不同体积的细胞。下面
的信息和表格旨在帮助我们调整方案以使用不同的细胞数量。
l

不建议使用小于 500 μl 或 2 ml 以上裂解缓冲液，用于细胞裂解和 Dounce 均质化步骤。

l如果您打算比较不同样本的 ChIP 结果，请保证样本间处理的一致性。例如，将诱导细胞和未诱导细胞生长在相同大小的培养板中，并达到相同的密度，然后使用相同的体积和剪切条件。这
将有助于确保染色质制剂在细胞数量（基因组等量）、DNA 剪切效率等方面是等效的。量化制

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26

备的染色质中的 DNA 的总量（通过遵循上述 DNA 清洗协议），然后在每个 ChIP 分析中使用等
量的染色质。
l每个人类二倍体细胞含有 6.6 pg 的 DNA。如果已知起始材料中的细胞数，这可以用来估计染色
质制备中的 DNA。我们估计染色质剪切的 DNA 回收率约为 60-70%，这取决于细胞/组织类型。

l

当使用 3 mm（或者更小）的探头进行超声时，请再 1.5 或者 1.7 ml EP 管中操作，样品体积约
300 – 400 μl。预期会有 50 μl 的损失量（由于样本雾化）。更小的体积（50-100 μl）需要用 1 mm
探头使超声更有效。

l进行超声剪切染色质需要使剪切后的染色质浓度在 ChIP 实验可用范围内。ChIP 反应需要用小体积反应（最适体积是 100 μl，最多不超过 200 μl）。因为 200 μl 的 ChIP 反应需要 25 μl 磁珠，
20 μl ChIP Buffer 1，几微升抗体和 PIC，染色质最大的使用体积~150 μl。染色质制备过程中去垢剂的使用会对 ChIP 实验造成负面影响，限制染色质的使用量。保证每一个 200 μl ChIP 反应
的染色质使用体积不超过 100 μl。
1 个孔（24 孔板）

10 cm 培养皿15 cm 培养皿3×15 cm 培养皿

细胞数量130,000

0.66 × 107

1.5×107

4.5 × 107

（组织重量）(-)(-)(～75 mg)(～225 mg)

固定液

2 ml

10 ml

20 ml

60 ml (20 ml/plate）

甘氨酸终止液

1 ml

5 ml

10 ml

30 ml (10 ml/plate)

1 ×PBS

2 × 1 ml2 × 5 ml2 × 10 ml

2 × 30 ml (2 × 10 ml/plate)

细胞刮除液 + PMSF

500 μl +1 ml +

5 ml +

15 ml + 90 μl PMSF

2.5 μl PMSF

5 μl PMSF

30 μl PMSF

(5 ml + 30 μl/plate)
三个平板合并

Lysis Buffer + PIC +200 μl + 1 μl PIC +500 μl +2.5 μl PIC +1 ml + 5 μl PIC + 5 μl

3 ml + 15 μl PIC + 15 μl

PMSF

1 μl PMSF

2.5 μl PMSF

PMSF

PMSF

Shearing Buffer +50-100 μl + 0.25-0.5

300 μl + 1.5 μl PIC +350 μl + 1.75 μl PIC +1000 μl + 5 μl PIC + 5 μl

PIC + PMSF

μl PIC + 0.25-0.5 μl

1.5 μl PMSF

1.75 μl PMSF

PMSF

PMSF

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27Section E BC8BD&(EFl磁铁应存放在提供的管中。

l

在金属物体或表面附近工作时要小心。一块磁铁会以惊人的速度跳到附近的金属表面上很远的距离。这会破坏磁铁。

l

使用提供的微型胶点将条形磁铁连接到空的枪头盒上，以构建一个临时的磁性支架，用于 PCR 管
或微量离心管。

l

如果磁铁附着在平坦的金属表面上，则应将其从表面边缘滑出，将其移除。如果你试图将磁铁的一端从金属上拉开或撬开，磁铁可能会断开。
注：钕棒磁铁是非常强大的，如果处理不当，很容易被破坏。

制作一个适用于八连管的磁力架
注：建议 8 连管选用适配标准 96 孔 PCR 仪的耗材（例如：Thermo Fisher AB-0451）

1.

将一条 PCR 管放在一个空的针头盒（200 μl 的枪头盒）并将磁铁直接靠在管子上。磁铁将被定位，
胶点是用来粘贴到盒子上。

2.

从两个胶点的一侧取下覆盖的胶带，将胶点贴在条形磁铁上（胶点的未覆盖面放在朝上）
，如下所
示。

3.

从胶点的外露侧撕下覆盖胶带。将磁铁固定到枪头盒上，使其紧靠 PCR 管。磁性支架现在可以使
用了。
注：在首次使用 PCR 管之前，请熟悉使用磁性支架。在 8 连管中的一个管中加 5 μl 磁珠和 100 μl

ChIP Buffer1。使用组装的磁铁支架，熟悉磁珠和磁铁的使用。如果管直接与磁铁相邻，则很难重新悬浮磁珠，因此最好将管从磁铁上移开，以便进行重悬步骤。

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28

•€•‚ƒ„…
a. 将管子靠着磁铁放在支架上，让珠子固定在管子的侧面，如下所示。

b. 用 200 μl 移液枪或 200 μl 的排枪移除上清。

c. 将 8 连管移动到与磁铁不相邻的一排。
d. 加入洗涤缓冲液，用移液枪上下吹打，使珠子完全重新悬浮。重新悬浮完成后，确保尽量少的磁珠
被吸走。
e. 重复步骤 a-d 直到所需的清洗步骤完成。

†‡ˆ'‰Š…
当使用 8 连管时，可能需要对管进行离心，以收集瓶盖内部的液体和珠子。这是可以很容易做到，使用离心机装有的平板离心适配器。在适配器中放置一个标准的 96 孔板，以便将管固定到位。
确保平衡转子（即在转子相对的 96 孔板适配器中放置一个适当质量的 96 孔板）。短暂离心，使转子达到 1000 × g 的速度，然后让转子停止。

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29

制作一个适用于 1.7 ml 离心管的磁力架1.

从两个胶点的一侧取下覆盖胶带。

2.

将两个 1.7 ml 离心管放置在一个空的枪盒中（1000 μl 的枪盒）把磁铁直接放在管子上。使磁铁被
定位，用胶点将磁条粘贴到盒子上。

3.

如上文所示，将胶点贴在条形磁铁上（胶点的未覆盖面朝上）。

4.

从胶点的外露侧撕下覆盖胶带。将磁铁固定在枪盒上，使其紧靠管子。磁性支架现在可以使用了。
注：1.7 ml 微型离心管在这种组装管架中的固定比在典型的商用磁力支架中的固定更不牢固。请严

格按照以下清洗方案。一次操作一个管子，将管子放在标准管架上，不要把管子直接放在磁铁旁边。

‹ˆ•€•‚ƒ„3Œ•"Ž••‘"ˆ5…
1.

将试管放入标准的 1.7 ml 微型离心试管架中，并打开盖子。

2.

将打开的管放入组装好的磁性支架中。如下图所示，将管底部靠在磁铁上，然后缓慢地放入孔中，
珠子将更快地形成聚集。这会使珠子在管子的侧面上形成小球。

3.

使珠子完全成团，并用 1000 μl 移液枪去除上清。您可以将管留在机架中，也可以在去除缓冲液后将其拔出。珠子将留在管的一侧，即使不在磁铁旁边。

4.

将试管放回标准离心管架上，加 800 μl 清洗缓冲液，并通过上下吹打将珠子完全重新悬浮。

5.

重复步骤 2-4，直到完成所需的清洗步骤。最后一次清洗完成后，清除清洗缓冲液应该用 200 μl 的移液枪。

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30Section F GHIJ
故障/问题

建议

哪些步骤节点可以中以下步骤节点可停止，样本可在一定温度下保存一段时间：途停止？

1. 固定完成并离心后，-80℃保存
2. 染色质剪切后，-80℃保存
3. 解交联后，-20℃保存
4. DNA 清洗后，-20℃保存经过超声剪切和离心

根据不同细胞类型，脂质或者糖分层会在离心后出现。例如，肝组织会有后，染色质中可见粘

糖层和乳状层出现，脂肪组织可能会出现脂质层。在移除上清的过程中要稠或浑浊的分层。

避免这些层。然而如果上清全部都是浑浊的，那么它不应该影响 IP 反应。

超声后染色质产量低细胞核没有释放出来。即使使用超声方法制备染色质，也非常建议使用Dounce 均质器。使用带有小间隙杵的 Dounce 均质器（参见第 8 页可选材
料中的参考）。在显微镜下监测细胞裂解情况。一般来说，被裂解的细胞越多，被剪切的染色质产量就越高。
减少固定时间。过固定的细胞常常会增加细胞裂解和剪切难度。长时间的交联固定，会使细胞形成巨大的接团，不能被有效剪切。减少甲醛固定时间至 5 min。若不经意间染色质样本发生乳化，立即停止超声，并在 4℃
8,000 rpm 离心 4 min 去除空穴。
制备固定液时使用新鲜的福尔马林溶液。
缓冲液未按样本大小成比例缩放。使用 Section-D 部分中的表格放大或缩
小染色质的制备。

凝胶分析发现剪切效

样品卡在孔中，能从胶带上发现拖带或者污迹和条纹。剪断的染色质需要率不高。

解交联，去除蛋白质（蛋白酶 K）和 RNA（核糖核酸酶），然后用苯酚/氯仿纯化 DNA。遵循 SectionC 部分的 DNA 清理方案。不建议使用 DNA
纯化柱，因为高蛋白含量可能会堵塞柱。
对于含有大量染色质的样品，可能需要较长时间（65℃孵育 4 小时或过夜）解交联。

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31

故障/问题

建议

凝胶分析发现剪切效率不在纯化过程中丢失了 DNA。苯酚应该用 pH 值为 8 的 TE 溶液的饱和高。

溶液。较低的 pH 值溶液会降解 DNA。由于样品蛋白质含量高，不建议柱纯化，这可能会堵塞柱。
高分子量产品。通过再超声，减小超声片段大小。

预设 ChIP 实验体积超过说不建议更改 ChIP 反应体积。最好设置几个小的 ChIP 反应（200 μl）

明书规定。

并在最后汇集样本，而不是一次性用大体积的染色质。不要进行单一
的放大反应，因为捕获效率会降低。

靶标抗体富集效果差染色质太少。通常，我们建议使用 7-10 μg 染色质的一个“常规”ChIP（高度丰富，DNA 相关的目标，如组蛋白）。对于中等丰度的转录因子，建议使用 7-25 μg 染色质，对于非常低丰度的转录因子，每个
ChIP 反应最多使用 50 μg。对于小规模 ChIP 实验，染色质数量据报道
低至 1 μg，但这在很大程度上取决于转录因子的丰度和抗体的亲和
力，可能需要进行相应的调整。一定要测定剪切的染色质样品的浓度，以确保每个样品使用足够的染色质，并且每个 ChIP 使用相同质
量的染色质。
抗体不是经验证的 ChIP 级的抗体。抗体不能有效识别固定的蛋白质，这可能是因为表位被固定所破坏，也可能是因为表位被更大复合
体中的其他蛋白质所掩盖。为了帮助 ChIP 验证抗体，使用阳性对照抗体（例如来自同一物种的 RNA Pol II 和阴性 IgG）以及已被证明在所使用的 PCR 类型中起作用的引物是非常关键的。
低亲和性。将 ChIP 孵育时间增长，4℃过夜旋转孵育。
抗体对 Protein G 的亲和力较弱。单个单克隆对 Protein G 具有可变的结合亲和力，这种亲和力依赖于 pH 值，每种免疫球蛋白的最适 pH值可能都不同，对于抗体亲和力低到中等的单克隆，通过使用我们的桥接抗体（货号：53017）可以显著提高 Protein G 的捕获效率，这种
抗体是一种兔抗鼠抗体，能识别小鼠免疫球蛋白的所有亚类。如果您
的小鼠 IgG 对 Protein A 和 G 的亲和力较弱/中等，则桥接抗体将增
加珠子捕获抗体的能力，而不会显著增加背景。
PCR 有问题。用于实时 PCR 的 DNA 必须在扩增前进行纯化。
引物问题，确认引物的物种特异性。你可能需要重新设计您的引物。
在终点 PCR 中起作用的引物并不总是在实时 PCR 中起作用。

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32

故障/问题

建议

PCR 产物大小正确，但条上样更多 PCR 产物，或使用较小的胶孔进行琼脂糖凝胶。值得注意的带很浅

是，由于 PCR 反应在对数扩增阶段停止，PCR 产物的产率可能低于
典型的 PCR 扩增，后者是为了获得最大的产物产率。您还可以执行更多 PCR 循环。
注：在正确大小的 PCR 产物下面可能看到引物二聚体带。

Input DNA 样本没有 PCR
条带（但 ChIP 样本有正确
的 PCR 产物）。

在 PCR 前对 input DNA 进行 1:10 稀释，如说明书所示
Proteinase K 可能没有被完全抑制。将 Proteinase K Stop Solution 加热
至室温 30 min，然后短暂涡旋震荡，然后添加推荐的 2 μl 并按推荐条件孵育。
在 PCR 前用 DNA 纯化柱纯化 input DNA 将有效地解决上述任一问
题。

ChIP 后的样本无 PCR 产物增加 ChIP 反应中染色质的使用量，或抗体的使用量，或者两者都增（但 input DNA 样本有正加。

确的 PCR 产物）实时 PCR 没有产物

使用不同的抗体。
在实时 PCR 前 DNA 需要经过纯化。我们建议扩增前使用 Active
Motif’s Chromatin IP DNA Purification Kit（货号：58002）进行纯化。
其单柱产量为 50 μl，每次 PCR 都使用 2 μl，为 25 个 PCR 反应提供足够的 DNA。

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33

故障/问题

建议

高背景值

染色质剪切的还不够。剪切应该产生足够小的 DNA 片段，以排除从
相邻的染色体序列引入的背景。但同时也需要有足够大的片段，以保证扩增子的完整。我们推荐 200-1500 bp 的片段。如果 DNA 片段太
大，背景会增加。考虑增加脉冲。检查凝胶上的碎片大小，以评估剪
切效率。
抗体问题。ChIP 反应中染色质含量抗体过多。过量的抗体会导致更多的非特异性结合，这将致使背景增加。
太多的模板 DNA。减少 PCR 反应中 DNA 的含量。
增加洗涤次数。在大多数情况下，本手册中的清洗方案是合适的。但是，如果背景很高，可以通过以下几种方式提高清洗的严格性：
1.在清洗步骤中添加 ChIP Buffer1 或 ChIP Buffer2 后，在移除缓冲液之前，轻轻地将样品搅拌几分钟。
2.进行额外清洗。ChIP Buffer 1 的供量足够每个样本多清洗两次，ChIP Buffer 2 足够额外清洗一次。
3.使用高盐缓冲液（20 mM Tris-Cl，1 mM EDTA，0.1%SDS，
1%Triton X-100，500 mM NaCl，pH 7.4）增加两次清洗过程（未提供）。这个额外的清洗过程应在使用 ChIP Buffer 1 进行清洗之后进
行。然后，按照方案中的概述继续进行 ChIP Buffer 2 清洗。
封闭磁珠。提供的磁珠可直接用于大多数 ChIP。然而，对于对非特异性结合高度敏感的应用（例如克隆 ChIP DNA 或在其他应用时需要额
外封闭的抗体时），可以向 ChIP 反应中添加封闭试剂。
封闭试剂：2.5 μg/μl BSA（例如 Sigma 货号：4503），1.25 μg/μltRNA（例如 Sigma 货号：R3629）或 2.5 μg/μl 鲑鱼精子 DNA（例如Sigma 货号：A-7888）（这里显示的是终浓度）可以直接添加到
ChIP 反应中。这些使用量是最适使用量，可以根据需要增加。

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34Section GKLMNOKChIP-IT®试剂盒

规格

货号

®

ChIP-IT Express

25 次

53008

ChIP-IT® Express Enzymatic

25 次

53009

ChIP-IT Express Shearing kit

10 次

53032

ChIP-IT® Express Enzymatic Shearing kit

10 次

53035

ChIP-IT® High Sensitivity

16 次

53040

ChIP-IT qPCR Analysis kit

10 次

53029

ChIP-IT® ChIP-Seq

10 个文库

53041

ChIP-IT FFPE

16 次

53045

ChIP-IT® FFPE Chromatin Preparation kit

5次

53030

ChIP-IT® Express HT

96 次

53018

Re-ChIP-IT

25 次

53016

RNA ChIP-IT®

25 次

53024

Chromatin IP DNA Purification kit

50 次

58002

EpiShear™超声打断仪探头

110 V

53051

EpiShear™冷却超声打断仪, 1.5 ml

1 台仪器

53080

ChIP-IT Protein G Magnetic Beads

25 次

53014

Protein G Agarose Columns

30 次

53039

Siliconized Tubes, 1.7 ml

25 个离心管53036

ChIP-IT Control qPCR Kit – Human

5次

53026

ChIP-IT® Control qPCR Kit – Mouse

5次

53027

ChIP-IT Control qPCR Kit – Rat

5次

53028

ChIP-IT® Control Kit – Human

5次

53010

ChIP-IT® Control Kit – Mouse

5次

53011

ChIP-IT Control Kit – Rat

5次

53012

Ready-to-ChIP Hela Chromatin

10 次

53015

Ready-to-ChIP Hep G2 Chromatin

10 次

53019

Ready-to-ChIP K562 Chromatin

10 次

53020

Ready-to-ChIP NIH/3T3 Chromatin

10 次

53021

鼠 IgG 桥接抗体500 μg

53017

Dounce 均质器

1 ml

40401

Dounce 均质器

15 ml

40415

®

®

®

®

®

®

®

®

ChIP 验证抗体要获取最新的 ChIP 验证抗体列表，请访问 www.activemotif.com/chipabs 网站。
www.activemotif.com

35

全基因组扩增

规格货号

GenoMatrix™ Whole Genome Amplification 试剂盒

1 个试剂盒

58001

Co-Immunoprecipitation规格货号

Nuclear Complex Co-IP 试剂盒

50 次

54001

Universal Magnetic Co-IP 试剂盒

25 次

54002

Modified Histones Assay规格货号

MODified™ Histone Peptide Array

1 个芯片

13001

Histones Modification FP Binding Assay规格货号

HiLite™ Histone H3 Methyl-Lys9/Lys27 FP Binding Assay

1 个试剂盒

57001

Histone ELISAs规格货号Histone H3 monomethyl Lys4 ELISA

1 x 96 次

53101

Histone H3 dimethyl Lys4 ELISA

1 x 96 次

53112

Histone H3 trimethyl Lys4 ELISA

1 x 96 次

53113

Histone H3 acetyl Lys9 ELISA

1 x 96 次

53114

Histone H3 dimethyl Lys9 ELISA

1 x 96 次

53108

Histone H3 trimethyl Lys9 ELISA

1 x 96 次

53109

Histone H3 monomethyl Lys27 ELISA

1 x 96 次

53104

Histone H3 trimethyl Lys27 ELISA

1 x 96 次

53106

Histone H3 phospho Ser10 ELISA

1 x 96 次

53111

Histone H3 phospho Ser28 ELISA

1 x 96 次

53100

Histone H3 acetyl Lys14 ELISA

1 x 96 次

53115

Histone Purification & Chromatin Assembly规格货号Histone Purification kit

10 次

40025

Histone Purification Mini kit

10 次

40026

Chromatin Assembly kit

10 次

53500

HeLa Core Histones

36 μg

53501

重组甲基化，乙酰化，磷酸化组蛋白
要获取最新的重组组蛋白列表，请访问 www.activemotif.com/recombhis 网站。

www.activemotif.com

36