幼若ホルモン様農薬のミジンコ類に対する影響調査（２）伊藤和男 、村岡美和 、清水謙一 、佐々木隆 、高橋基子 、永吉秀光*1*1*2*2*22*2

Kazuo ITOU, Miwa MURAOKA, Kenichi SHIMIZU, Takashi SASAKI, Motoko TAKAHASHI,Hidemitsu NAGAYOSHI（平成 19 年度実績）
要 約

前年度に引き続き、OECD テストガイドライン 211（TG211)の改訂案について、その試験法の問題点等検証を行った。幼若ホルモン様作用を示さない農薬数種を供試物質としてオオミジンコ繁殖試験を行った結果、一部に産仔数減少の症状は認められたものの濃度相関のあるものではなかった。さらに、同条件での産仔に雄は全く含まれなかった。また、
幼若ホルモン様農薬を作用させ、雄が発生するようになった個体から産仔を採取し、その産仔を農薬暴露のない環境で飼育した結果、次世代の累積産仔数は低下する傾向が認められたが、産仔に雄は含まれなかった。一方、ミナミヌマエビを供試した結果、産仔数については処理区において減少が認められたが雌雄比については違いが認められなかった。
はじめに
前年の通り、オオミジンコの繁殖性試験（TG211：Daphnia magna Reproduction Test）の改訂作業が進行中である。前年度調査の結果、幼若ホルモン様農薬を作用させると、累積産仔数および産仔の雌雄比が暴露濃度に応じて変動するが、その両作用の半数影響濃度は比較的近いものであることがわかっている。また、供試農薬の暴露を止めるとその影響が回復することが確認され、さらに、供試するオオミジンコの系統によってその感受性に違いがある可能性も示されている。このため、今年度は他の農薬の作用性と、幼若ホルモン様農薬の作用における回復性、そして他生物種における作用について調査を進めた。
調査研究方法１．雄化と他の毒性エンドポイントとの関係把握
幼若ホルモン様作用を示さないと思われる農薬として４種（ホスチアゼート、ベンチオ（独）農林水産消費安全技術センター農薬検査部検査技術研究課*2（独）農林水産消費安全技術センター農薬検査部有用生物安全検査課*1-1-カーブ、ペルメトリン、ＴＰＮ）を選定し、２１日間のオオミジンコ繁殖試験を実施した。
暴露濃度は、各供試農薬の急性遊泳阻害試験の半数影響濃度付近を最高濃度とし、その 1/10濃度および 1/100 濃度を設定した。
試験条件①暴露条件：試験液は通気を行わず、週２回全液を交換する半止水式で行った。試験区
は助剤対照区および薬剤処理区（３濃度）の計４区を設定し、各区は生後２４時間以内のオオミジンコ５匹を供試した。供試農薬は適当量をジメチルホルムアミドに溶解して調製し、最終濃度が以下の濃度となるよう、試験開始時および換水時に試験液に添加した。試験液に添加する薬液容量は 10µl/100 ml とした。
ホスチアゼート： 2，20，200 µg/L（ppb）、ベンチオカーブ： 10，100，1000 µg/L（ppb）
ペルメトリン： 0.025，0.25，2.5 µg/L（ppb)、ＴＰＮ： 1，10，100 µg/L（ppb)②環境条件：オオミジンコは各個体をそれぞれ 100 ml の人工調製水（Elendt-M4 培地をあらかじめ通気したもの）を入れたビーカーに収容した。ビーカーは２０℃のインキュベーターにセットして温度を一定に管理した。照明は１６時間明、８時間暗条件とした。給餌は１日１回、クロレラ懸濁液を 0.2 mg 炭素／匹となるよう与えた。
③観察および測定：試験は２１日間行った。毎日、供試した各ミジンコの生死、脱皮の有無、耐久卵の有無、産仔のある場合にはその生存産仔数、雌雄別の数、死虫数等観察した。なお、今回水中濃度の測定は行わず、結果は設定濃度に基づくものとした。
２．被験物質を除去した後の回復性に係る調査
幼若ホルモン様農薬（ピリプロキシフェン）200 ng/L をオオミジンコに暴露させて２１日間観察した。この観察中に、十分量の雄仔虫と雌仔虫が得られるタイミングで産仔をプールし、農薬暴露のない環境にて雌仔虫を引き続き２１日間飼育して各個体からの産仔数、産仔の雌雄比等を観察した。また、一部の雌仔虫には同条件で得られた雄仔虫も共存させ、交尾行動および耐久卵の発生等を観察した。
３．他生物種での雄化作用の解明
淡水エビであるミナミヌマエビを供試生物とし、幼若ホルモン様農薬（ピリプロキシフェン）に雌雄の親エビを抱卵時まで暴露させ、産仔数および雌雄を観察した。農薬暴露濃度は急性毒性半数致死量（LC50）の 1/20 濃度および 1/100 濃度とした。雌雄の判定は、孵化１～ 1.5 ヶ月後に、背面の卵巣の有無を観察することで行った。
試験条件①暴露条件：試験液は 1 時間あたり 6L が交換される流水式で行った。ピリプロキシフ
ェンは事前に試験を行った急性毒性試験結果に基づき、その LC50 値の 1/100 濃度および1/20 濃度である 2 および 10µg/L になるよう、試験系に連続的に滴下した。なお、試験液中のピリプロキシフェン濃度を測定した結果、設定濃度の 80%以上を維持していることを確認した。供試生物数は雌雄各１０匹／区とし、親エビの暴露期間はおよそ２０日間であるが、抱卵時期により適宜延長した。
②環境条件：試験液は脱塩素水道水を使用し、水温は 22 ℃とした。照明は１６時間明、８時間暗条件とした。
-2-

③観察条件：暴露後の親エビは各区５匹を個別の水槽に移し、孵化後成熟するまで飼育した。雌雄の判定は、孵化１～ 1.5 ヶ月後に、背面の卵巣の有無を観察することで行った。
結果及び考察ホスチアゼート、ベンチオカーブ、ペルメトリン、ＴＰＮを供試した結果、産仔数については対照区との有意差が認められる投与群があるものの、明確な濃度相関のある産仔数減少は認められなかった。また、同条件での産仔中に雄ミジンコは認められず、今回供試した農薬の化学物質としてのストレスは雌雄比変動には結びつかないことが示唆された。
（表１）
オオミジンコ幼体を供試生物とし、ピリプロキシフェン 200ppt を投与すると産仔数が有意な減少、雄発生率が 45%となった。これは前年度実施のリングテストの結果とほぼ等しかった。今回供試したオオミジンコは５日令を使用しており、通常１日令を使用する
TG211 と異なる試験であったが感受性に大きな違いはないものと思われた。（表２－１）
上記条件から発生した雌仔虫をピリプロキシフェンの含まれない培地中に移し、試験を継続した結果、ピリプロキシフェン暴露個体から発生した雌は、その産仔数に有意な減少が認められた。ただし、今回の雌仔虫は厳密には親の育包内で短期間ピリプロキシフェンの暴露があるため、この影響を排除するような更なる調査が必要と思われる。一方、同条
件での産仔中に雄は認められず、雌雄決定プロセスが次世代には引き継がれないことが示された。（表２－２）
さらに、第１世代で発生した雌雄仔虫を共存させた結果、共存群はその産仔数が減少する傾向が示されたが、これが雄の存在によるものか生育環境の違い（餌量等）に由来するものなのかはさらなる調査が必要である。ただしいずれの群からも交尾行動や耐久卵の発生は認められなかった。（表２－３）
ミナミヌマエビを供試した結果、暴露開始１日から１０日間で約半数の抱卵エビが得られ、２０日間では最大 70%（７匹）の抱卵であった。産仔数は、対照区、助剤対照区の平均３５匹に対して、2 µg/L は３１匹、10 µg/L は１７匹で暴露区の方が少ない結果となった。一方、雌雄を判別した結果、対照区及び助剤対照区は 59.7 及び 56.9%、2 µg/L 区は 61.8%、10 µg/L 区は 52.0%が雄で、ピリプロキシフェンの暴露の有無による雌雄の割合に違いは認められなかった。（表３）-3-表１：各種農薬を供試したオオミジンコ繁殖試験結果

表１－１
ﾍﾞﾝﾁｵｶｰﾌﾞ投与区
試験１ 対照区 2ppbﾎｽﾁｱｾﾞｰﾄ投与区
20ppb 200ppb 10ppb 100ppb 1000ppb
21日間
5553550
生存親数
累積産仔数 252 227 243 205 233 206－平均値
CV6%
6%
4%
7%
8%7%
－5%有意差 －有有有♂発生率 0%
0%
0%
0%0%
0%
－
表１－２
TPN投与区試験２ 対照区 0.025ppbﾍﾟﾙﾒﾄﾘﾝ投与区
0.25ppb 2.5ppb 1ppb 10ppb 100ppb
21日間
4510453
生存親数
累積産仔数 196 161 195
－
214
216
157
平均値
CV
27%
43%
－
－
31%
33%
51%
5%有意差 －
♂発生率 0%
0%
0%
－
0%
0%
0%

表２－１
第1世代
21日間
生存親数
累積産仔数
平均値
CV5%有意差
♂発生率
表２－２
第２世代
（薬剤なし）
21日間
生存親数
累積産仔数平均値
CV5%有意差♂発生率

表２：オオミジンコの２世代影響結果
対照区

ﾋﾟﾘﾌﾟﾛｷｼﾌｪﾝ
200ppｔ101019615215%

24%

－

有0%

45%

対照区
産仔♀

表２－３
ﾋﾟﾘﾌﾟﾛｷｼﾌｪﾝ♂＋♂＋産仔♀ 対照区産仔♀ ﾋﾟﾘﾌﾟﾛ産仔♀

910910279

206

212

166

13%

20%

20%

10%

－有－

有0%

0%

0%

0%

-4-

表３：ミナミヌマエビの繁殖試験結果
個体番号

群
対照区
助剤対照区
2μg/L区
10μg/L区

平均

1

2

3

4

5

雌雄数(匹)

35

30

2535

46

34.2

雄％

51.4

53.3

32.0

34.3

30.4

40.3

雌雄数(匹)

42

43

51

13

27

35.2

雄％

42.9

34.9

54.9

38.5

44.4

43.1

雌雄数(匹)

735

35

37

41

31.0

雄％

57.1

31.4

34.3

21.6

46.3

38.1

雌雄数(匹)※

30

18211320.5

雄％－

36.7

44.4

57.1

53.848.0※1匹の産仔を確認したが、その後死亡-5-