11

高効率細胞融合技術の開発
二丸山森
松

見山中本丸

達高廣麻帆
篤史
慶 太 郎

Development of Highly Efficient Technique for Cell Fusion
Using Dielectrophoretic Force in Micropores

Toru FUTAMI
Takahiro MARUYAMA
Maho YAMANAKA
Atsushi MORIMOTO
Keitaro MATSUMARU

We have developed a novel, highly efficient technique for cell fusion. This technique comprises (1) formationof micropores on the insulating membrane, located in the lower electrode of the planar electrodes for the cellfusion chamber, and maneuvering and fixating object cells onto those micropores by dielectrophoretic forcegenerated by the electric field constriction at the said micropores, and (2) the cell−to−cell fusion process of
spleen cell and myeloma cell carried out on the micropore thus formed. This technique has provided an
extremely high cell fusion frequency (1.4×10 −2), and has been shown to be applicable to the antibody
development processes.

1．緒られた融合細胞（ハイブリドーマ）の選別（スクリー言ニング）」の３工程からからなり、工程③で得た高機

近年、モノクローナル抗体は、成人病や感染症等の能抗体を産生するハイブリドーマからモノクローナル臨床診断薬や、副作用の少ない癌の治療薬として注目抗体が大量に生産される。ここで一般に、抗体産生細されている抗体医薬等に利用される様になり、その応胞には免疫したマウスの脾臓細胞が用いられ、骨髄腫

１）用範囲が急速に拡大している 。従って、診断薬や医細胞にはマウスミエローマ細胞（SP2／0）が用いられ薬品の性能を左右する高機能抗体（高親和性、高特異る事が多い。

性を有するモノクローナル抗体）の取得効率の向上が求められている。

しかしながら、抗体取得工程の課題の一つとして、工程②の細胞融合において融合効率が極めて低いた

一般に、モノクローナル抗体を取得する主な工程は、

め ２）（従来の細胞融合法であるPEG法 ３）や電気融合

Fig.１に示すように、①「動物への免疫」、②「免疫法 ４） による、マウス細胞を用いた融合効率：約1×した動物から摘出した抗体産生細胞とミエローマ細胞

10−6〜1×10−4）、融合細胞の取得が難しいという課題（骨髄腫細胞）との細胞融合」、③「細胞融合により得があり、モノクローナル抗体の開発効率を低下させる（ 11 ）12

TOSOH Research ＆ Technology Review Vol.53（2009）

Electrode

Step 1
Immunization

AC VoltageCell

Spleen cells
Step 2Cell Fusion

MediumHybridomas

Fig.１

Dielectrophoretic
Force

Insulator
Electrode

Myeloma cells（cell culture）

Micropore

Fig.２

Step 3
Screening

ElectricFluxes

Field Constriction

Principle of dielectrophoresis

Monoclonal Antibody

Development process of monoclonal antibody

上部平板電極に対向する下部電極に形成した絶縁膜上の微細孔に、一様でない不均一な電界（電気力線）が一因となっていた。これは、従来の細胞融合法である与えられると、細胞は電界の集中する方向（電気力線PEG法や電気融合法では、２種の細胞をランダムな混が密な方向）、すなわち微細孔の方向へと引き寄せら合状態で融合するため、目的とする２細胞が融合するれる。これが誘電泳動である13）。一般に誘電泳動力は、事は極めて偶発的であり、同種の細胞や３個以上の細粒子の体積、粒子と媒体の誘電率の差、不均一な電界胞が融合したり、全く融合しない細胞が多数を占めるの大きさの２乗に比例する。例えば、直径5〜10μm場合が多いためである。

程度の細胞に対し、電界として周波数100kHz〜3MHz、融合効率を高めるため、目的とする２細胞を融合す

1×105〜5×105V／mの交流電界を与えると、誘電泳動る方法が近年いくつか報告されている。例えば、細胞力が作用して細胞が電界の集中する方向に引き寄せらが２個程度入る数百μm四方の大きさのマイクロチャれる。

ンバーの底にあけた微小な穴から吸引により２細胞を５）本融合法の原理は、この誘電泳動の原理を利用して、固定し融合する方法 （ここでは、マイクロチャンバ上部平板電極に対向する下部電極に形成した絶縁膜上ー法と称する）、レーザー光を細胞に照射し光トラッの微細孔に交流電界を集中させる事で細胞を引き寄ピングを利用して細胞を１つずつ搬送し融合する方せ、目的とする２細胞を接触させて融合する事を特徴６）

法 （ここでは、光トラッピング法と称する）、電極としている。

間に設置された絶縁膜上の微細孔での電界集中によりなお、細胞に誘電泳動力を作用させる場合の媒体の生じる誘電泳動力を利用し絶縁膜の両側から２細胞を電気伝導度は、媒体に過剰に電流が流れないよう10〜微細孔に引き寄せて融合する方法７）〜12）（ここでは、100μS／cm程度が好ましい。

電界集中法と称する）等がある。

また、細胞が収縮したり膨張して破裂しないよう細我々は、上記電界集中法に関して東京大学大学院工胞の浸透圧を保つ必要がある事から、200mM〜学系研究科・鷲津正夫教授に技術指導をいただき、こ500mMの糖（マンニトールやシュクロース等）を加の技術を工業用に応用展開し、実用的な細胞数（100えた溶媒が一般に用いられる。

万個〜1億個）を対象に、目的とする２細胞を融合する高効率細胞融合技術の開発に取り組んだ。その結果、従来の細胞融合法に比べ飛躍的に高い融合効率

3．細胞融合チャンバーの作製法（1.9×10−3〜1.4×10−2）を得る事ができた。

本融合法に用いる細胞融合チャンバーの作製には、

本報告では、誘電泳動の原理、高効率細胞融合技術

近年注目が高まっている、いわゆるμTAS（Microと融合プロセス、融合効率の検証、細胞の大量処理にTotal Analysis System）や、Lab−on−a−chipなどと呼ば向けた対応に関して報告する。

れているミクロンサイズの微小流路や微細孔を有したデバイスを作製する微細加工技術（フォトリソグラフ
ィー技術）を利用している。

2．誘電泳動の原理

電極部材として片面にITOを成膜（膜厚150nm、抵Fig.２に誘電泳動の原理を示した。交流電界中に置抗率10Ω／sq）したガラス基板（70mm×38mm×厚さかれた媒体中の細胞等の誘電体粒子には分極が生じ、1mm）上に、ネガ型のフォトレジスト（SU−８）をス正負の電荷が誘導される。ここでFig.２に示すように、ピンコートにより塗布（膜厚5μm）する。次に、微（ 12 ）

東ソー研究・技術報告 第53巻（2009）

細孔（直径8μm、孔間隔20μm）に対応するパター13の微細孔を有する絶縁膜が形成されている。

ンを形成したガラス製フォトマスクを介してフォトレ

細胞操作・固定技術や融合効率を検討するために、ジストを紫外線露光し、続いて現像、ベークを行い、本細胞融合チャンバーに市販の交流電源（エヌエフ回所定の微細孔に相当する凹部をレジストに形成する。

路設計ブロック製、WF1966）と市販の細胞融合電源

ここで露光条件として、微細孔の底部に電極部材であ（ネッパジーン製、LF101）を電極間に接続し実験装るITOが露出する様に露光時間、現像時間を調整する。

置を組み上げた。交流電源と細胞融合電源は、細胞融

なお、ネガ型のフォトレジストとして用いたSU−８は、合チャンバーとの接続をスイッチにより切り換えられ紫外線露光された部分が硬化しエポキシ系樹脂となるようにした。

り、微細孔を有する絶縁膜となる。
このようにして作製した電極基板を下側にし、細胞融合領域を確保する厚さ1.5mmのシリコンゴム製の支持体を介し、さらにその上に電極基板（ITOを成膜し4．高効率細胞融合技術［1］目的とする２細胞の融合技術た同ガラス基板）を配する事で細胞融合チャンバーをFig.４に、微細孔に２種の細胞を固定した後に直流製作した。なお、シリコンゴムの厚みが1.5mmである

パルス電圧を印加して細胞融合するときの概念図と、事から、本細胞融合チャンバーの電極間は1.5mmとなその時の微細孔近傍の電界分布を示した。なお、微細る。

孔近傍の電界分布は、市販の電界解析ソフト（Field製作した細胞融合チャンバーをFig.３に示した。本Precision社製、TriComp）により計算した。

細胞融合チャンバーは、ITOを成膜したガラス基板上本融合法では、上部平板電極に対向する下部電極にのほぼ中央の30mm×30mmのエリアに、孔径8.5μm、形成した絶縁膜上の微細孔の中に平均直径の小さい細孔間隔20μm、孔数225万個（縦1500個×横1500個）

胞を固定し、その上に平均直径の大きい細胞を接触させて２細胞を融合することを特徴としている。一般に、電気融合では電界により細胞膜を一時的に破壊した

Glass Substrate

ITO Electrode後、膜破壊された部分で２細胞が結合し、細胞膜が再Spacer（Silicone Rubber）生される事で細胞融合する。細胞膜を破壊するのに必Micropores

要な電界は、細胞直径に反比例するといわれており14）、Diameter : 8.5μm
Interval : 20μm
Depth : 5μm
Number : 2.25million
Area : 30×30mm2

平均直径の小さい細胞の膜破壊に必要な電界は、平均直径の大きい細胞の膜破壊に必要な電界よりも大きくする必要がある。本融合法が対象としているマウス脾

70mm

臓細胞の平均直径は約6μm、マウスミエローマ細胞の平均直径は約11μmである事から、マウス脾臓細胞

ITO Electrode
Glass substrateの細胞膜を破壊するには、マウスミエローマ細胞より38mm
Fusion Chamber（small scale）

ここで、Fig.４の右側に微細孔近傍の電界分布を示

Structure of fusion chamber having
2.25million micropores

した。微細孔近傍の電界分布は、印加する電圧と電極

ElectrodePulsed
DC Voltage

ElectricFluxes
MyelomaMedium

Spleen Cell

Position［μm］

Fig.３

も約1.8倍大きい電界をかける必要がある。

Field Distribution（calculation）
2010Insulator
Electrode

00.5

1.0
E2micropore

Fig.４

field constriction

Field［arbitrary unit］

Principle of highly efficient technique for cell fusion（ 13 ）

E1

14TOSOH Research ＆ Technology Review Vol.53（2009）

間距離、媒体、絶縁膜の材質が一定の場合、微細孔形

STEP1：Spleen cells settle down
onto micropores状（孔径、孔間隔、孔深さ）に依存するが、その電界の大きさは、微細孔内で最も大きく、微細孔から離れSpleen Cell

るに従って小さくなる。従って、平均直径の小さい細AC
Voltage胞であるマウス脾臓細胞を微細孔の中に固定し、その上に平均直径の大きい細胞であるマウスミエローマ細胞を固定した場合、マウス脾臓細胞の中心にマウス脾

STEP2：Myeloma cells settle down
onto micropores

臓細胞を膜破壊する電界（E1）が、マウスミエローマ細胞の中心にマウスミエローマ細胞を膜破壊する電Myeloma Cell界（E2）がかかる電界分布を目安に微細孔径、微細AC
Voltage

孔間隔、微細孔深さを概略設計した。更に、これらの設計値を少しずつ変更しながら細胞融合を繰り返し行い、可能な限り高い融合効率が得られる事を指標に、

STEP3：Cell Fusion

設計値を最適化した。その結果、300nMのマンニトー
ル水溶液の溶媒中で、電極間距離1.5mm、直流パルス
電圧100Vを印加した場合の微細孔形状として、微細Pulsed
DC Voltage

孔径8.5μm、微細孔間隔20μm、微細孔深さ5μmに決定した。
なおこの場合、微細孔の中のマウス脾臓細胞と接触STEP4：Cultivation

したマウスミエローマ細胞の上に、更に別の細胞が接HAT Medium

触したとしても、その細胞近傍の電界は小さく細胞膜

Hybridomaを破壊するには不十分であるため細胞融合は生じにくく、従って、本融合法では３個以上の細胞が融合する

Fig.５

Fusion process

確率は低いと考えられる。
このように微細孔形状を最適化し、マウス脾臓細胞、マウスミエローマ細胞の順に逐次細胞を導入し微細孔Immunogenic Protein）を免疫したマウスの脾臓細胞に固定する事で、目的とする２細胞を融合する事が可を用い、マウスミエローマ細胞（SP2／0）と細胞融合能になった。

させた。得られたハイブリドーマは、ハイブリドーマを選択培養するHAT培地で１週間培養し、生き残っ［2］融合プロセス

たハイブリドーマのコロニー数をカウントした。なおFig.５に、本融合プロセスの概念図を示した。

融合効率は、ハイブリドーマのコロニー数を細胞融合

なお本融合法では、ほぼ１つの微細孔に１つの脾臓チャンバーに入れたマウス脾臓細胞数で除算して求め細胞を固定する事が好ましい。この条件として、融合た。

容器に導入する脾臓細胞数が微細孔数とほぼ同じかそ

融合効率を検証する際、細胞を固定する交流電圧にれ以下になるように脾臓細胞の濃度を調整しておく必は10Vpp、3MHzの交流電圧を、融合電圧には100V、要がある。一方、ミエローマ細胞は、微細孔に入った30μsの直流パルス電圧を、前述した細胞融合チャン脾臓細胞との接触確率を高めるために、脾臓細胞数とバーの電極間（1.5mm）に印加した。また、細胞融合等しいかそれ以上（例えば、微細孔数の１〜８倍程度）

チャンバーの微細孔の形状は、前述した孔径、孔間隔、になるようにミエローマ細胞の濃度を調整しておく必孔深さとした。

要がある。

また溶媒として、300mMのマンニトール水溶液に、1mg／mLのBSA（ウシ血清アルブミン）と、それぞれ0.1mMのCaCl2及びMgCl2を添加した融合液を用いた。

5．融合効率の検証

前述した様に、糖の種類と濃度は、細胞の浸透圧を保前述した実験装置を用いて、本融合法による融合効ち細胞の形状を維持に影響する。また融合液の添加物と し て 、 B S A や C a イ オ ン （ C a C l 2 ）、 M g イ オ ン率を検証した。
抗体産生細胞には、抗原としてBCP（Blue Carrier（MgCl 2）を適量添加により融合効率が向上するとい（ 14 ）

東ソー研究・技術報告 第53巻（2009）

われている15）。一般に、BSAには細胞膜保護作用があるといわれ、また、Caイオンは細胞膜の修復を促進する作用があり、MgイオンはCaイオンによる細胞膜

156．細胞の大量処理に向けた対応［1］細胞融合装置の構成の修復を高める作用があるといわれている。これらの一般に、マウス１匹から約１億個の脾臓細胞が摘出

融合液組成の条件も可能な限り高い融合効率が得られされるため、１億個の細胞を１度に細胞融合処理できる事を指標に最適化した。

る事が望ましい。

上記融合条件での融合効率の結果をTable.１に示し

本融合法では、処理できる細胞数は微細孔の数と等た。特にNo.1〜No.4は、同じマウスを用いて、従来しい。また、最適化した微細孔形状（孔径、孔間隔、法であるPEG法（No.1,2）と本融合法（No.3,4）を同孔深さ）のまま、細胞処理量を増やす必要がある事か時に行い、融合効率を比較した結果である。なお、ら、細胞融合チャンバーの面積を大きくした大型融合

No.1〜No.4の融合効率は、Fig.６にも示した。

チャンバーを作製した。

ここでPEG法での融合条件として、分子量1500のFig.７に大量処理に対応した細胞融合装置の概観をPEGが50％含有した無血清培地（ERDF）に、マウス示した。細胞融合装置は、本融合法専用の細胞融合用

脾臓細胞とマウスミエローマ細胞（SP2／0）を８：１電源と大型融合チャンバーから構成される。
大型融合チャンバーのサイズは、微細加工時や細胞で混合し融合した。
この結果から、本融合法は、脾臓細胞の処理量は融合時のハンドリングの容易性から、125mm×PEG法より少ないが、PEG法よりも２桁程度高い融合125mm×厚さ１mmサイズのガラス基板を用いた。ガ効率を得た。またマウスは異なるものの 、最大でラス基板のほぼ中央の100mm×100mmのエリアに前−21.4×10 の極めて高い融合効率を得、本融合法が従述した形状の微細孔を2,500万個（縦5,000個×横5,000来法に比べて飛躍的に高い融合効率を得られる事がわ個）形成した。従って、本大型融合チャンバー４枚でかる。

約１億個の細胞を細胞融合できる。なお、１枚の大型融合チャンバーの融合領域は、融合液中の細胞を均一

Fusion power Supply

Fusion Frequency

10−210−310−4

125mm

Area1
Area1
Area1
Area1125mm10−51234

No.
Fusion Chamber（large scale）

Fig.６

Fusion frequencies of PEG fusion（No.1, 2）andhighly efficient cell fusion（No.3, 4）

Table.１
No.
12345678

Spleen Cells
6.5×106
6.5×106
9.9×105
9.9×105
9.9×105
9.9×105
9.9×105
9.9×105

Fig.７

Cell fusion system

Fusion frequencies of PEG fusion（No.1, 2）and highly efficient cell fusion（No.3−8）

Myeloma Cells
8.1×105
8.1×105
3.9×106
3.9×106
7.6×106
7.6×106
3.0×106
3.0×106

Hybrid. Colonies
176
170
2200
1900
7400
840013500
12900

Fusion Frequency
2.7×10−5
2.6×10−5
2.2×10−3
1.9×10−3
7.5×10−3
8.5×10−3
1.4×10−2
1.3×10−2

Fusion Frequency＝Hybrid. Colonies／Spleen Cells（ 15 ）

Note（date）
mouseA、PEG fusion（ 06／11／01）
mouseA、PEG fusion（ 06／11／01）
mouseA、highly efficient cell fusion（ 06／11／01）
mouseA、highly efficient cell fusion（ 06／11／01）
mouseB、highly efficient cell fusion（ 07／06／21）
mouseB、highly efficient cell fusion（ 07／06／21）
mouseC、highly efficient cell fusion（ 07／08／08）
mouseC、highly efficient cell fusion（ 07／08／08）

16

TOSOH Research ＆ Technology Review Vol.53（2009）に充填し易くするため長方形形状に４分割（Area1〜Area4）した。

7．ま と めまた、電解質である融合液（溶媒）の量の増加に伴以上の様に、上部平板電極に対向する下部電極に形う融合チャンバーの電気抵抗の変動に対応できるよ

成した絶縁膜上の微細孔の中に、平均直径の小さい細う、印加電圧をフィードバックし交流電圧を安定して胞を固定し、その上に平均直径の大きい細胞を接触さ出力できる機能を付加した専用の細胞融合用電源を製せて２細胞を融合する高効率細胞融合技術を開発し作した。

た。
また、本技術を用いた融合法に最適な融合条件を検［2］細胞融合装置を用いた融合効率の検証討し、従来の細胞融合法に比べ飛躍的に高い融合効率本細胞融合装置を用いて細胞融合した時の融合効率（最大で1.4×10−2）を得た。

をTable.２とFig.８に示した。抗体産生細胞には、更に、専用の細胞融合用電源の製作と細胞融合チャBCP免疫したマウスの脾臓細胞（約2,300万個）を用ンバーの大型化により、マウス１匹から摘出される脾い、マウスミエローマ細胞（SP2／0）と融合した。

臓細胞（１億個）の融合処理を１時間以内に実施でき融合効率は、1枚の大型融合チャンバーを４分割した融合領域毎（Area1〜Area4）に示してある。融合
領域毎の融合効率はほぼ同等であり、平均で6.1×10る見込みを得た。現在、具体的な開発ターゲットを設定し、本融合法による抗体開発を予定している。

−3

最後に、本研究開発にあたり、基本技術である電界集中法７）〜12）に関して技術的なご指導をいただいた、の飛躍的に高い融合効率を得た。
なお、大型融合チャンバー１枚の細胞融合処理に要する時間は14分程度であった。本結果から、大型融合東京大学大学院工学系研究科・鷲津正夫教授に深く感謝を申し上げる。

チャンバーにおいても飛躍的に高い融合効率を得られ、実用的な細胞数である約１億個の脾臓細胞を対象にした細胞融合を１時間以内で実施できる見込みを得た。

参考文献１）㈱富士経済、2005バイオビジネス市場、178（2005）
２）V. Krenn et al., Hum. Antibod. Hybridomas，6（2），47（1995）

8Fusion Frequency［×10−3］３）De St. Groth S.F., Scheidegger D.，J. Immunol.

Methods，35，1（1980）6４）U. Zimmermann，G. Pilwat，H. Pohl， J. Biol.

Phys.，10，43（1982）4５）K. Sato，Y. Kawamura et al.，Sensors andActuators，A21−A23，948（1987）

2６）特開平3−297385
７）S. Masuda，M. Washizu et al.，IEEE Trans. on IA，012325（4），732（1989）

4８）特公平7−4218

AreaFig.８９）O. Kurosawa，M. Washizu，et al.，Fusion frequencies of highly efficient cell fusion
with large scale fusion chamber

Table.２

Area
12
34

microTAS2006，458（2006）

Fusion frequencies of highly efficient cell fusion with large scale fusion chamber

Spleen Cells
5.7×106
5.7×106
5.7×106
5.7×106
Total : 2.3×107

Myeloma Cells
1.1×107
1.1×107
1.1×107
1.1×107

Hybrid. colonies
32500
32100
36300
39500

Date： 07／06／08
Fusion Frequency
5.7×10−3
5.6×10−3
6.4×10−3
6.9×10−3

Total : 140400

Average : 6.1×10−3（ 16 ）

東ソー研究・技術報告 第53巻（2009）1710）K. Tsuda，M. Washizu，et al.，microTAS2007，1375（2007）11）Y. Kimura，M. Washizu，et al.，microTAS2008，
540（2008）
12）M. Gel，M. Washizu，et al.，microTAS2008，
1968（2008）13）H. A. Pohl，Dielectrophoresis，6（1978）
14）U. Zimmermann，G. Pilwat，F. Riemann，Biophysical Journal，14，881（1974）
15）K. Ohnishi，J. Chiba，Y. Goto，T. Tokunaga，J.

Immunol. Methods，100，181（1987）

著者

氏名 二 見達Toru FUTAMI

氏名 丸 山 高 廣

氏名 山 中 麻 帆

Takahiro MARUYAMA

Maho YAMANAKA

氏名 森 本 篤 史
Atsushi MORIMOTO

所属 東京研究センター

所属 東京研究センター

所属 東京研究センター所属 東京研究センター

東京研究所

東京研究所

東京研究所

東京研究所

新材料無機分野

新材料無機分野

新材料無機分野

新材料無機分野

主席研究員

主任研究員

副主任研究員

副主任研究員

氏名 松 丸 慶太郎
Keitaro MATSUMARU
所属 東京研究センター
東京研究所
新材料無機分野
副主任研究員（ 17 ）