97●親水性化合物分離用NH2カラムの特性とその応用
バイオサイエンス事業部 セパレーションメディア製造部 セパレーションセンター

山崎
河合坂田森山浩行
康俊
道子
弘之の問題点を解決するため、TSKgel NH2−100 3μmは、1．はじめに

図１の表面構造模式図に示すように、スペーサーを介高速液体クロマトグラフィーにおいて最も多く使わしアミノエチル基を導入し、かつ充てん剤表面に残存れている逆相（RPC）モードは、親水性の高い化合物する未反応のシラノール基のエンドキャップを実施すが保持しにくいため、代謝物、糖ペプチドや核酸などることにより、従来のアミノカラムに比べ大幅に耐久の親水性の高い低分子化合物の測定に不向きである。

性を向上した。分離特性では、図２に示すように、グ一方、充てん剤表面に高極性官能基を導入し、有機溶ルコース等のアルデヒド基を持つ糖類もアノマー分離媒組成の高い溶離液で分離を行う親水性相互作用クロすることなく測定できる。また、表面の高極性官能基

マトグラフィー（HILIC）は、親水性の高い化合物の（アミノエチル基）との親水性相互作用とアミノ基に保持が強く、LC／MS分析での検出感度の向上が期待よるアニオン交換性を有したマルチモードのHILICカできることから、高性能なHILICカラムが望まれていラムとして、親水性の高い低分子化合物を分離するこる。とが可能である。

今回、充てん剤表面の高極性を維持したまま、残存するシラノール基のエンドキャップを施すことによ

2.2

保 持 力

り、極性の高い化合物に対して強い保持を与え、耐久

TSKgel NH2−100 3μmは、充てん剤表面に極性の高性にも優れたシリカ系アミノカラムTSKgel NH2−100

い官能基を有していることから、溶離液の極性を変化3μmを開発した。

（有機溶媒濃度の変更）することにより、HILICモー

本報告では、シリカ系アミノカラムであるTSKgel

ド、及びRPCモードで分離することができる。疎水度NH2−100 3μmの特性と応用例について紹介する。
R：SpacerNH2

2．TSKgel NH2−100の基本特性

CH2CH22.1

充てん剤の特徴

RH3C

表１にカラムの仕様を示す。TSKgel NH2−100 3μm

SiH3C Oは、細孔径10nm、表面積450m 2／gのシリカゲル表面CH3SiO O O

H3CCH3SiH3C O

Silica gelにアミノアルキル基を導入したアミノカラムである。
従来のシリカ系アミノカラムは、化学的安定性に乏しく、耐久性に問題があることが知られている。これら
表１

図１

TSKgel NH2−100 3μmの表面構造模式図

TSKgel NH2−100 3μmカラムの仕様

シリカゲル
基材
3μm
平均粒子径10nm
細孔径（シリカゲル）
450m2／g
比表面積（シリカゲル）
アミノアルキル基
表面官能基
トリメチルシリル基
エンドキャップ
カラムサイズ（分析） 2.0mmI.D.×5cm, 15cm 4.6mmI.D.×5cm, 15cm
3.2mml.D.×1.5cm
カラムサイズ（ガード） 2.0mmI.D.×1cm（ 97 ）

98TOSOH Research ＆ Technology Review Vol.52（2008）

表面の高極性官能基との親水性相互作用（HILICモー

2002［mV］持がより増大している。一方、アセトニトリル濃度が4150100ド）により、極性の高い化合物（logPが小さい）の保3150％以下の場合、充てん剤表面の疎水性部位との疎水性相互作用（RPCモード）により、疎水性の高い化合B）3250物（logPが大きい）の保持が大きくなる。
溶離液のアセトニトリル濃度と糖類、ポリオール類

4A）の溶出時間の関係を図４に示す。溶離液中のアセトニトリル濃度が高くなるにしたがい、糖類、ポリオール

0051015類の保持力が大きくなる。また、図５に示すように

20TSKgel NH2−100 3μmは、シリカゲル表面にカルバモ

Retention time［min］イル基を導入した既存の糖分析用カラムTSKgelConditionsAmide−80 3μmに比べ、イノシトールに対し強い保持

Column; A）TSKgel NH2−100 3μm（4.6mmI.D.×15cm）B）TSKgel Amide−80 3μm（4.6mmI.D.×15cm）
Eluent; H2O／AcCN＝25／75
Flow rate ; 1.0mL／min
Temp.
; 40℃
Inj. vol.
; 10μL
Detect.
; RI
Sample ; 1.Fructose, 2.Glucose, 3.Sucrose, 4.Maltose

力を示し、糖類を溶解し易いより水の多い溶離液系で測定することが可能であることを示唆している。
2.3

理論段高さ（HETP）の線速度依存性

ウラシルを用いてTSKgel NH2−100 3μmとTSKgel
図２

Amide−80 3μmのHETPの線速度依存性について確認

TSKgel Amide−80との保持力の比較した。図６に示すように、TSKgel NH2−100 3μmは、（logP）の異なる3種類の化合物、ウラシル（logP＝−粒子径3μmの充てん剤を用いていることから、高い0.87）、カフェイン（logP＝0.16）および、ベンゼン

線速度においてもHETPの上昇が小さく、高いカラム（logP＝1.99）を用い、溶離液中のアセトニトリル濃効率を維持していることがわかる。また、TSKgel度の溶出時間への影響の確認を行った。図３に示すよAmide−80 3μmのように充てん剤表面にカルバモイル

うに、溶離液中のアセトニトリル濃度が50％以上では、基を多重層で導入した充てん剤に比べ、広い線速度範30Uracil（logP＝−0.87）
Caffeine（logP＝0.16）

Retention time［min］

Retention time［min］

6

Ethylene glycol
Glycerin
Erythritol
XylitolMannitolInositol

25Benzene（logP＝1.99）
422015105

RPC mode0HILIC mode

5000204060801007080

Conditions

AcCN concentration［Vol％］

Column ; TSKgel NH2−100 3μm（4.6mmI.D.×15cm）
Eluent; H2O／AcCN＝25／75
Flow rate ; 1.0mL／min
Temp.
; 40℃
Inj. vol.
; 10μL
Detect.
; RI
Sample ; 1.Ethylene glycol, 2.Glycerin, 3.Erythritol
4.Xylitol, 5.Mannitol, 6.Inositol

Conditions
Column ; TSKgel NH2−100 3μm（4.6mmI.D.×15cm）
Eluent; 0.1％HCO2H in H2O／AcCN＝90／10〜5／95
Flow rate ; 1.0mL／min
Temp.
; 40℃
Inj. vol.
; 10μL
Detect.
; UV（254nm）
Sample ; 1.Uracil, 2.Caffeine, 3.Benzene

図４
図３60

AcCN concentration［Vol％］

アセトニトリル濃度の溶出時間への影響（ 98 ）

アセトニトリル濃度の溶出時間への影響（糖類，ポリオール類）

東ソー研究・技術報告 第52巻（2008）

2.41599

RPCカラム（ODS−100V）との溶出挙動の比較

TSKgel NH2−100 3μm

HILICモードは、表面の高極性官能基（アミノアルTSKgel Amide−80 3μmキル基）との親水性相互作用により、有機溶媒濃度の高い溶離液で極性化合物を保持する。一方、RPCカラムは、疎水性の固定相を有し、有機溶媒濃度の低い溶k'10離液で疎水性化合物を保持するため、HILICカラムとは異なる溶出挙動を示す。図７に核酸塩基を用いた

5

TSKgel NH2−100 3μmとTSKgel ODS−100V 3μmとの分離の比較を示す。RPCカラムであるTSKgel ODS−
100V 3μmで極性の高い（logPの小さい）核酸塩基か050607080

ら順に溶出しているのに対し、TSKgel NH2−100 3μm

AcCN concentration［Vol％］

では、一部核酸塩基で溶出順序の逆転が認められるが、Conditions

極性の低い（logPの大きい）核酸塩基から溶出していColumn; TSKgel NH2−100 3μm（4.6mmI.D.×15cm）
TSKgel Amide−80 3μm（4.6mmI.D.×15cm）
Eluent; H2O／AcCN＝20／80〜45／55
Flow rate ; 1.0mL／min
Temp.
; 40℃
Inj. vol.
; 10μL
Detect.
; RI
Sample; Inositol

図５る。また、図８に葉酸代謝拮抗剤のメトトレキサート（MTX）と投与されたMTXが細胞内で代謝されて末端のグルタミン酸が連鎖的に付加されたメトトレキサー
ト−ポリグルタミン酸（MTXPG）の分離の比較を示す。TSKgel ODS−100V 3μmでは、グルタミン酸付加が大きいMTXPGほど早く溶出しているのに対して、

TSKgel Amide−80との保持力の比較

TSKgel NH2−100 3μmでは、グルタミン酸付加が大き囲（4〜12 cm／min）で高いカラム効率が得られておいMTXPGほど強い保持を示し、TSKgel ODS−100V 3り、TSKgel NH2−100 3μmは、より高速で、かつ高分μmに比べ、良好な分離が得られている。逆相モード離な測定が可能である。

で分離困難な親水性試料の分析に有効である。

303.

25

1.

2.
4.

TSKgel Amide−80 3μm
20［mV］HETP［μm］

1. Thymine（logP＝−0.32）
2. Uracil（logP＝−0.87）
3. Adenine（logP＝−0.73）
4. Cytosine（logP＝−1.47）

600

TSKgel NH2−100 3μm15400B）
1. 2.

200103.
4.

5A）
00005101524681012Retention time［min］

Linear velocity［cm／min］
Conditions
Conditions

Column; A）TSKgel NH2−100 3μm（4.6mmI.D.×15cm）B）TSKgel ODS−100V 3μm（4.6mmI.D.×15cm）
Eluent; A）20mmol／L HCO2NH4／AcCN＝10／90B）20mmol／L HCO2NH4／AcCN＝90／10
Flow rate ; 1.0mL／min
Temp.
; 40℃
Inj. vol.
; 10μL
Detect.
; UV（254nm）
Sample; 1.Thymine, 2.Uracil, 3.Adenine, 4.Cytosine

Column; TSKgel NH2−100 3μm（4.6mmI.D.×15cm）
TSKgel Amide−80 3μm（4.6mmI.D.×15cm）
Eluent; H2O／AcCN＝10／90
Flow rate ; 0.1〜2.4mL／min
Temp.
; 40℃
Inj. vol.
; 10μL
Detect.
; UV（254nm）
Sample; Uracil

図６

図７

理論段高さ（HETP）の線速度依存性（ 99 ）核酸塩基によるODS−100Vとの分離の比較

100

TOSOH Research ＆ Technology Review Vol.52（2008）

2.

1000

1.

E）

6.
［mV］

B）
600
1.

2.

2.

800D）

C）

400

400
3. 4.

2005.

A）

B）
6.

7.

A）
0002468100125

Retention time［min］
Conditions

ConditionsColumn

Column1520; A）TSKgel NH2−100 3μm（4.6mmI.D.×15cm）B）TSKgel Amide−80 3μm（4.6mmI.D.×15cm）
C）Brand A（NH2 type）（4.6 mmI.D.×15 cm）
D）Brand B（Polyamine type）（4.6 mmI.D.×25 cm）
E）Brand C（Polymer NH2）（4.6 mmI.D.×25 cm）
F）Brand D（NH2 type）（4.6 mmI.D.×15 cm）
Eluent; A）H2O／AcCN＝25 ／75
Flow rate ; 1.0 mL／min
Temp.
; 40℃
Inj. vol.
; 10μL
Detect.
; RI
Sample ; 1.Ethylene glycol, 2.Glycerin, 3.Erythritol
4.Xylitol, 5.Mannitol, 6.Inositol

図９図８10Retention time［min］; A）TSKgel NH2−100 3μm（2.0mmI.D.×15cm）B）TSKgel ODS−100V 3μm（2.0mmI.D.×15cm）
Eluent; A）A : H2O／AcCN（10／90）＋0.1％ TFA
B : H2O＋0.1％ TFAB）A : H2O／AcCN（90／10）＋0.1％ TFA
B : AcCN＋0.1％ TFA
Flow rate ; 0.2 mL／min
Gradient ; 0min（B 0％）→15min（B 40％）→17min（B 0％）Temp.
; 40℃
Inj. vol.
; 10μL
Detect.
; UV（313nm）
Sample; 1.MTX（25μg／mL）,2.MTXPG2（25μg／mL）
3.MTXPG3（25μg／mL）,4.MTXPG4（25μg／mL）
5.MTXPG5（25μg／mL）,6.MTXPG6（25μg／mL）
7.MTXPG7（25μg／mL）

2.56F）

3.
4.
5.

800

［mV］

21 34 51200

糖類、ポリオール類の分離比較

ODS−100VとのMTXPG分離比較

11200

他社HILICカラムとの比較

234

糖類、ポリオール類を用いて他社糖分離用カラムとE）の分離の比較を行った。図９に示すように、TSKgel
800

した。その他の糖類においても同様に、強い保持力を与えている。また、他社カラムでは、カラムへの吸着によるピーク面積の低下が認められたが、TSKgel

D）

［mV］

NH2−100 3μmは、他社カラムに比べ強い保持力を示C）
400B）

NH2−100 3μmでは、他社カラムに比べ、カラムへの吸着が少なく、良好なピーク面積が得られた。

A）

核酸塩基を用いてアミノカラムを含む、他社HILICカラムとの分離の比較を行った。図10に示すように、

0051015Retention time［min］

他社HILICカラムに比べ、保持が強く、TSKgelAmide−80 3μ mと 同 等 の 保 持 力 を 示 し た 。 ま た 、TSKgel NH2−100 3μmは、他社HILICカラムと官能基が異なることから、核酸塩基との相互作用の違いによる分離選択性の差異が認められた。
2.6

耐 久 性

従来のシリカ系アミノカラムは、充てん剤表面に未Conditions
Column; A）TSKgel NH2−100 3μm（4.6mmI.D.×15cm）B）TSKgel Amide−80 3μm（4.6mmI.D.×15cm）
C）Brand A（NH2 type）（4.6 mmI.D.×15 cm）
D）Brand E（Silica type）（4.6 mmI.D.×15 cm）
E）Brand F（Zwitter ion type）（4.6 mmI.D.×15 cm）
Eluent; A）20mmol／L HCO2NH4／AcCN＝10／90
Flow rate ; 1.0 mL／min
Temp.
; 40℃
Inj. vol.
; 10μL
Detect.
; UV（254nm）
Sample
; 1.Thymine, 2.Uracil, 3.Adenine, 4.Cytosine

反応の残存シラノール基が存在し高い表面極性のため、シロキサン結合の加水分解によるアミノアルキル（ 100 ）図10 核酸塩基による他社HILICカラムとの分離比較

東ソー研究・技術報告 第52巻（2008）

101

Ratio of retention time change［％］基の脱離に起因する保持力の低下など、耐久性に問題がある。TSKgel NH2−100 3μmは、充てん剤表面に残存する未反応のシラノール基をトリメチルシリル基（TMS基）によりエンドキャップすることで、表面の疎水性を高め、シロキサン結合の加水分解を抑制する
ことにより耐久性の向上を図っている。図11に示す
ように、既存のシリカ系アミノカラムであるTSKgelNH2−60に比べ、高い耐久性を示している。

100604020

TSKgel NH2−100 3μm
TSKgel NH2−6003．応用分析例
3.1800100200

ピリジルアミノ化糖（PA化糖）の分析

糖タンパク質の糖鎖解析では、酵素や化学反応によConditions

り、試料から切り出した糖鎖をピリジリアミノ化

Columnれ、解析が行われている。11種類の市販PA化糖を用
いてTSKgel NH2−100 3μm、TSKgel Amide−80 3μm、及びTSKgel ODS−100V 3μmでの分離の比較を行った。TSKgel NH2−100 3μmとTSKgel ODS−100V 3μm

図111.／4.

11.

［mV］

9.
5.
10.

3. 2.8.

6.
7.

B）
6.

1.

50

3. 8.
4.
7. 5.

2.

9.

10.

203011.

A）
00500600

シリカ系アミノカラム（NH2−60）との耐久性比較のクロマトグラムの比較（図12）では、HILICモード

100400; A）TSKgel NH2−100 3μm（4.6mmI.D.×15cm）B）TSKgel NH2−60（4.6mmI.D.×25cm）
Eluent; H2O／AcCN＝25／75
Flow rate ; 1.0mL／min
Temp.
; 40℃
Inj. vol.
; 10μL
Detect.
; RI
Sample ; Inositol（PA化）した後、ODSカラムやHILICカラムで分析さ150300

Purge time［hr］

1040

Retention time［min］
Conditions
Column; A）TSKgel NH2−100 3μm（4.6mmI.D.×15cm）B）TSKgel ODS−100V 3μm（4.6mmI.D.×15cm）
Eluent; A）A : 200mmol／L Triethylamine Acetate（pH 6.5）／AcCN＝30／70
B : 500mmol／L Triethylamine Acetate（pH 6.5）／AcCN＝60／40B）A : 50mmol／L HCO2NH4／AcCN＝98／2
B : 50mmol／L HCO2NH4／AcCN＝90／10
Flow rate ; 1.0 mL／min
Gradient ; 0min（B 0％）→30min（B 100％）→45min（B 100％）→46min（B 0％）
Temp.
; 40℃
Inj. vol. ; 10μL
Detect. ; Fs（Ex. 315nm, Em. 380nm）
Sample ; 1. PA−Sugar Chain 001, 2. PA−Sugar Chain 002,
3. PA−Sugar Chain 004, 4. PA−Sugar Chain 005,
5. PA−Sugar Chain 006, 6. PA−Sugar Chain 009,
7. PA−Sugar Chain 010, 8. PA−Sugar Chain 011,
9. PA−Sugar Chain 022, 10. PA−Sugar Chain 024,
11. PA−Sugar Chain 025

図12 ODS−100VとのPA化糖（11種類）の分離比較（ 101 ）102

TOSOH Research ＆ Technology Review Vol.52（2008）

150

6.
1.／11.
3. 8.
7. 4. 5.
9. 10.
2.

100
［mV］

B）
6.

1.

50

3. 8.
4.
7. 5.

2.

9.

10.

2030

11.

A）
001040Retention time［min］
Conditions
Column ; A）TSKgel NH2−100 3μm（4.6mmI.D.×15cm）B）TSKgel Amide−80 3μm（4.6mmI.D.×15cm）
Eluent ; A）A : 200mmol／L Triethylamine Acetate（pH 6.5）／AcCN＝30／70
B : 500mmol／L Triethylamine Acetate（pH 6.5）／AcCN＝60／40
B）A : 200mmol／L Triethylamine Acetate（pH 6.5）／AcCN＝26／74
B : 200mmol／L Triethylamine Acetate（pH 6.5）／AcCN＝50／50
Flow rate ; 1.0 mL／min
Gradient ; 0min（B 0％）→30min（B 100％）→45min（B 100％）→46min（B 0％）
Temp.
; 40℃
Inj. vol. ; 10μL
Detect. ; Fs（Ex. 315nm, Em. 380nm）
Sample ; 1. PA−Sugar Chain 001, 2. PA−Sugar Chain 002,
3. PA−Sugar Chain 004, 4. PA−Sugar Chain 005,
5. PA−Sugar Chain 006, 6. PA−Sugar Chain 009,
7. PA−Sugar Chain 010, 8. PA−Sugar Chain 011,
9. PA−Sugar Chain 022, 10. PA−Sugar Chain 024,
11. PA−Sugar Chain 025

図13 Amide−80とのPA化糖（11種類）の分離比較で溶出するTSKgel NH 2−100 3μmにおいて、一部の今回、われわれが開発したアミノアルキル基を導入PA化糖で溶出順序の逆転が認められるが、ODSではしたHILICカラムは、耐久性を大幅に向上し、糖類に溶出の遅いPA化糖ほど早く溶出している。また、

おいてカラムへの吸着が小さく、かつアノマー分離が図13に示すようにHILICカラムであるTSKgel Amide−見られないシリカ系アミノカラムである。また、親水80 3μmでは、11種類のPA化糖を有機溶媒のみのグラ性相互作用とアニオン交換性のマルチモードを有するジエントで溶出しているのに対し、TSKgel NH2−100

HILICカラムであり、他のHILICカラムに比べ、極性3μmでは、酸性糖がアミノ基とのイオン的相互作用の高い化合物に対して強い保持を与えることから、極を示すため、有機溶媒および塩濃度の同時グラジエン性の高い代謝物などへの適用が期待される。

トにより、11種類のPA化糖を完全に分離しており、既存のHILICカラムであるAmide−80と異なった分離選択性を示した。

4．おわりに従来のシリカ系アミノタイプのHILICカラムは、水系溶離液において化学的安定性に乏しく、耐久性に問題を有していた。また、アミドタイプのカラムは、アルデヒド基を持つ糖類においてアノマー分離するため、使用上の制限を有していた。

（ 102 ）