77●全自動シスタチンC測定試薬の開発
バイオサイエンス事業部 開発部 AIA試薬開発G

三澤遠田新谷井上

孝一
容子
晃司
益男

性腫瘍および自己免疫疾患の場合に高くなることがあ

1．はじめにる。これらの問題に対しシスタチンCは血清または血シスタチンCは、分子量13kDaの塩基性低分子蛋白

漿を用いて測定することができる上に、前述のようなでシスタチンスーパーファミリーに属し、全身の有核腎前性の影響が小さいことなどから、GFRの指標とし細胞からシステインプロテアーゼインヒビターとしてて簡便に測定できる内因性腎機能マーカーとして腎機産生され、生体内での酵素活性による細胞および組織能の評価に有用とされている8）〜13）。の障害を抑制している。遺伝子はハウスキーピングタ

今回、従来の腎機能検査マーカーに比べより早期にイプであり、炎症などによる細胞内外の環境変化に対腎機能障害を反映するマーカーとして注目されているする影響を受けることなく一定の割合で産生・分泌さシスタチンCについて、新規にシスタチンC測定試薬

1）れている 。細胞外に分泌されたシスタチンCは、他のAIA試薬化を進め、全自動エンザイムイムノアッセの血清蛋白と複合体を形成することなく腎糸球体からイ装置AIAシリーズを用いた短時間、高感度な測定試

濾過され、近位尿細管で再吸収・分解される

2）〜3）薬の開発を行ったので報告する。

。そのため糸球体濾過量（glomerular filtration rate：GFR）の悪化とシスタチンC濃度は相関するとされ 4）〜5）、

2．測定原理と材料

GFRの低下により血中のシスタチンC濃度が上昇すると報告されている6）。

シスタチンC測定試薬は抗原抗体反応を利用し、そ現在、臨床的に用いられているGFR測定法は、内因の反応に関与する物質が凍結乾燥体として試薬カップ性物質であるクレアチニンを用いた24時間クレアチニに封入されている。

ンクリアランスの測定がある。また、GFRを推定する

本試薬の測定原理は1ステップサンドイッチ蛍光酵ための腎機能マーカーとして血清クレアチニン値やβ素免疫測定（FEIA）法であり、試薬カップに含まれ7）2−マイクログロブリン値等が用いられてる 。クレるモノクローナル抗体は各々シスタチンC上の異なる

アチニンクリアランスの測定は、畜尿の煩雑さや時間部位（エピトープ）を特異的に認識し結合することにの制約があり患者への負担が大きいという問題点があより免疫複合体（磁性単体結合抗体−抗原（シスタチる。血清クレアチニン値は筋肉量や食事の影響を受け、ンC）−酵素標識抗体）を形成する（図１）。測定は、性差・年齢により変化することなど実際のGFRより過試薬カップに抗原を含む検体を分注することにより、大に算出されることが指摘されている。また、β2−凍結乾燥体は溶解し抗原抗体反応が開始する。37℃、

マイクログロブリン値は腎機能の低下に関わらず、悪10分間の反応後、未反応の抗原および酵素標識抗体をFree

抗体固定化磁性ビーズ

E

E
E

E
E
E

E
E

E

E

E

Bound

検体分注

検体（抗原）

B／F分離（抗原抗体反応）

図１

酵素標識抗体

E

基質分注
（洗浄）

酵素基質（4MUP）（蛍光測定）

シスタチンC測定の免疫複合体模式図（ 77 ）

酵素反応生成物（4MU）

78

TOSOH Research ＆ Technology Review Vol.52（2008）

B／F分離により洗浄除去し、酵素基質である4−メチルウンベリフェリルりん酸（4MUP）を分注後、経時的3．AIA試薬の開発に蛍光強度を測定し単位時間あたりの4−メチルウンベ

シスタチンCの測定試薬として短時間、高感度な測リフェロン（4MU）の生成量を測定する。基質の蛍定試薬の開発をするためにシスタチンCへの親和性の光強度は固定化された酵素量に依存し、さらにシスタ高いマウスモノクローナル抗体を選定した。固定化抗チンC抗原量に比例する。したがって、あらかじめ既体については固定化量等の条件を最適化し、酵素標識知濃度のシスタチンCを含む標準品を用いその蛍光強抗体については酵素を結合させる架橋試薬の使用量等度とシスタチンC濃度による標準曲線を作成し、シスを最適化し十分な感度を得られるようにした。

タチンC濃度未知の患者検体の蛍光強度に相当するシ

免疫反応液組成について、検体中に含まれる可能性スタチンC濃度を標準曲線より算出することによりシのある異好性抗体（Heterophilic Antibodies）との非スタチンCの定量が可能である。測定の際、検体のカ特異的反応を抑えるためにブロッキング剤を添加し、ップへの分注、一定時間下での抗原抗体反応、B／F分

また、安定性を向上すべく各種蛋白質を最適化した。

離、基質分注、蛍光強度の測定は全自動エンザイムイ

標準品について、シスタチンCは等電点が9.3の塩基ムノアッセイ装置により自動で行われ、各試薬ともに性蛋白質であり、容器等に吸着しやすい性質を持ち合測定開始から約18分後に結果が得られる。（試薬の主わせていることから、抗原の吸着を防ぐために各種蛋な仕様を表１に、全自動エンザイムイムノアッセイ装白質等を最適化した。他社キットでは凍結乾燥形態で置AIA−1800を使用したときに得られる検量線の例をある標準品を、本シスタチンC測定試薬では液状形態

図２に示す。
）とすることができた。
その結果、他社キットと同様の再現性を確保し、高感度な測定試薬を開発することができたので、評価結果を以下に報告する。

Rate［nmol／（L・s）］

600

4．基本性能評価

500（1）感400度

シスタチンC濃度0濃度の標準品および低濃度患者

300

血清をシスタチンC濃度0濃度の標準品を用い8段階に200希釈した試料を10重測定し、得られた蛍光量より最小100

検出限界を求めた結果、0濃度試料の平均値＋2倍標準00.00.3

偏差（SD）と希釈試料の平均値−2倍SDと重ならな

シスタチン C 濃度［mg ／ L］

い点を最小検出限界値としたときの濃度は0.003 mg／0.10.2Lであった。また、変動係数（coefficient of variation
図２

シスタチン C 測定試薬の検量線例

表１：CV）が10％以内の理論値を実効感度として算出しシスタチンC測定試薬の主な仕様

測定項目
測定原理

血中シスタチンC
1ステップサンドイッチ蛍光酵素免疫測定法（抗シスタチンCマウスモノクローナル抗体）
測定装置
全自動エンザイムイムノアッセイ装置（AIA−1200シリーズおよびAIA−600は除く）
免疫反応温度・時間 37℃・10分
酵素反応温度・時間 37℃・5分
測定対象検体血清または血漿（ヘパリン，EDTA）
測定範囲
0.01〜8.00 mg／L
検体量／分注水量
10μL（希釈済）／140μL
検体希釈倍率
25培希釈
標準品形状
液状品
濃度単位mg／L（ 78 ）

東ソー研究・技術報告 第52巻（2008）

79

たときの濃度は0.004 mg／Lとなり、良好な結果が得ール血清およびプール血漿（ヘパリン）へ添加し、測られた（図３）。

定値への影響を確認した。共存物質としてはヘモグロ（2）再現性ビン、遊離型ビリルビン、抱合型ビリルビン、脂質、測定内再現性、測定間再現性試験を濃度の異なる3

ヒト血清アルブミン、アスコルビン酸を、抗凝固剤と種のプール血清およびプール血漿（ヘパリン）を用いしてはクエン酸、ヘパリン、EDTAを各々表３に記載て行った。使用した3種（Low、Middle、High）は1の濃度まで添加し測定した結果、未添加に対して測定回の測定分を小分け分注し使用まで凍結保存した。5値はいずれも±10％以内であり、これら物質による影重同時測定による測定内再現性試験の結果、各試料の響は添加量上限まで認められないと判断した。

測定値のCVは1.49〜2.86 ％であった。1日2回各2重測（5）健常者の濃度分布定し、試薬、装置を変えずに20回繰り返して行った測

健常者192例（男性：157例，女性：35例）について、定間再現性試験の結果（検量線作成後91日間）、各試血清中のシスタチンC濃度を測定した結果のヒストグ料の測定値のCVは1.37〜3.41 ％であった（表２）。

ラムを図５に示す。ノンパラメトリック法による95（3）希釈直線性％基準範囲を求めた結果、0.56〜0.97 mg／Lであった。

希釈直線性試験を濃度の異なる3種の血清検体およまた、男女別の比較においては、男性：0.61〜0.97

びヘパリン血漿検体を用い4重測定にて行った。各々mg／L、女性：0.49〜0.88 mg／Lであり、女性の方が若の検体を専用希釈液で5段階の希釈系列を作製し測定干低値傾向を示した。

した結果、血清検体、ヘパリン血漿検体ともに原点に（6）他社キットとの相関性収束する良好な希釈直線性性能を有していることが認

血清検体を使用し本シスタチンC測定試薬（y）とめられた（図４）。

他社A法（x）および他社B法（x）で測定し、測定値（4）共存物質および抗凝固剤の影響の比較を行った結果（図６）、他社A法に対して相関検体中に含まれる可能性のある各物質を高濃度でプ係数（r）0.997、回帰係数0.979、y切片0.087、他社B（a）最小検出限界（b）実効感度20

濃度CV［％］

Rate［nmol／（L・s）］

3.02.01.0151050.0 0.003mg／L00.01

00.02

0.03

0.04

0.004mg／L
0.00

シスタチンC濃度［mg／L］

図３0.010.020.03

シスタチンC濃度［mg／L］

感度：（a）最小検出限界、（b）実効感度表２

測定内および測定間再現性

シスタチンC濃度［mg／L］
Pooled heparinized plasma
Pooled serum
MiddleHighLow
MiddleHighLow
測定内再現性（n＝5）
mean
SD
CV［％］

0.71
0.01
1.51

2.23
0.05
2.09

4.78
0.14
2.86

0.69
0.02
2.25

2.22
0.04
1.79

4.85
0.07
1.49

測定間再現性（n＝20）
mean
SD
CV［％］

0.70
0.02
2.59

2.15
0.03
1.37

4.69
0.16
3.41

0.69
0.02
2.30

2.08
0.04
1.834.690.16
3.40（ 79 ）0.04

80TOSOH Research ＆ Technology Review Vol.52（2008）（a）血清検体（b）ヘパリン血漿検体
7

血清−A y＝5.80x−0.02，r＝1.00
血清−B y＝4.23x＋0.03，r＝1.00
血清−C y＝2.78x＋0.03，r＝1.00

6

シスタチンC濃度［mg／L］

シスタチンC濃度［mg／L］

7

5
4
3
2

血漿−A y＝6.27x＋0.03，r＝1.00
血漿−B y＝4.87x＋0.06，r＝1.00
血漿−C y＝2.66x＋0.03，r＝1.00

654
32
1

100
0.0

0.3

0.5

0.8

1.0

0.0

0.30.5

希釈率

図４

表３0.8

1.0

希釈率

希釈直線性：（a）血清検体、（b）ヘパリン血漿検体

る時間の短縮、被検体回収量などの点から血清より優共存物質および抗凝固剤影響れている。そこで、血漿検体（ヘパリン血漿、
プール血清
471
ヘモグロビン［mg／dL］
19
遊離型ビリルビン ［mg／dL］
18
抱合型ビリルビン ［mg／dL］［mg／dL］
1,666
脂質50
ヒト血清アルブミン ［mg／mL］
20
アスコルビン酸 ［mg／dL］［mg／dL］
クエン酸
20
ヘパリン
［U／mL］
100
EDTA［mg／mL］
10

プール血漿
471
1918
1,666
502020100
10EDTA・2Na）へ対応可能であるか検討した。同時に同一人物から採取した血清とヘパリン処理採血から得られた血漿との相関性試験を行った結果（血清（x）、ヘパリン血漿（y））、106例での相関係数（r）0.999、回帰係数0.980、y切片0.018、また、同様に採取した血清とEDTA・2Na処理採血から得られた血漿との相関性試験を行った結果（血清（x）、EDTA・2Na血漿（y））
、99例での相関係数（r）0.999、回帰係数1.010、y切片−0.004といずれの結果も良好な相関性が認められた法に対して相関係数（r）0.997、回帰係数0.980、y切（図７）。したがって、本シスタチンC測定試薬は血清、片−0.004と良好な相関性が認められた。

血漿のマトリックスの違いによる測定値の差は認めら（7）血清検体と血漿検体の相関性試験れずいずれの検体種にも同等な測定値を与える試薬であることが明らかとなった。

血漿は血液凝固を伴わないためサンプル調製に要す

15％

10％
頻度

5％

0％

0.1

0.2

0.3

0.4

0.50.60.7

0.80.9シスタチンC濃度［mg／L］

図５

健常者の濃度分布（ 80 ）

11.11.21.3

東ソー研究・技術報告 第52巻（2008）88
y＝0.979x＋0.087
r＝0.997n＝129

6

y＝0.980x−0.004
r＝0.997n＝77

7
シスタチンC測定試薬［mg／L］

7シスタチンC測定試薬［mg／L］

815432654321100012345678012

他社A法［mg／L］

図６85678678

シスタチンC測定試薬と他社キットとの相関性

8

y＝1.010x−0.004
r＝0.999n＝99

7
EDTA・2Na血漿［mg／L］

ヘパリン血漿［mg／L］

4

他社B法［mg／L］

y＝0.980x＋0.018
r＝0.999n＝10673654326543211000123456780123

血清［mg／L］

45

血清［mg／L］

図７

血清検体と血漿検体の相関性

65．臨床上の有用性確認（1）腎機能検査項目との相関性

y＝1.281x＋0.057
r＝0.851n＝100

従来、腎機能障害の指標に用いられている血清クレアチニン（x）と本シスタチンC測定試薬（ｙ）との相関性について、100例の血清検体を使用し検討した結果（図８）、血清クレアチニンに対して相関係数（r）
0.851、回帰係数1.281、y切片0.057となり、両測定間で正の相関性が認められた。
（2）24時間クレアチニンクリアランスとの関係

血清シスタチンC濃度［mg／L］

54321

血清シスタチンC値および血清クレアチニン値の24時間クレアチニンクリアランス（数値低下は腎機能低00123下を意味する）との関係を検討した結果（図９）、24
血清クレアチニン濃度［mg／dL］

時間クレアチニンクリアランスに対する相関係数（r）
は血清クレアチニンの−0.806に対し血清シスタチン（ 81 ）図８

血清クレアチニンと血清シスタチンCの相関性

482TOSOH Research ＆ Technology Review Vol.52（2008）

665y＝−0.818Ln（x）＋4.721
r＝−0.823
n＝1004

血清クレアチニン［mg／dL］

血清シスタチンC［mg／L］

532

y＝−0.532Ln（x）＋3.174
r＝−0.806
n＝100

4

32

1

100020406080

100 120 140 160 180 200 220

0

24時間クレアチニンクリアランス［mL／min／1.73m2］

図９20406080

100 120 140 160 180 200 220

24時間クレアチニンクリアランス［mL／min／1.73m2］

24時間クレアチニンクリアランスに対するシスタチンCとクレアチニンの散布図

Cは−0.823となり、血清シスタチンCの方が若干強い
100

負の相関が認められた。血清シスタチンC値および血清クレアチニン値の基準値上限をそれぞれ1 mg／Lお80

よび1 mg／dLとした時、それぞれの回帰曲線が基準値上限を通過する点は、血清クレアチニン値の約60
感度［％］mL／min／1.73m2に対し血清シスタチンC値は約90 mL／min／1.73m 2と高い糸球体濾過値に相当する点で高値化していることが明らかであり、血清シスタチンCの6040

血清シスタチンC
血清クレアチニン方が腎機能の低下をより強く反映していることが認め20られた。
（3）ROC解析による比較

0

血清シスタチンCと血清クレアチニンについて、0GFRの測定法である24時間クレアチニンクリアランス

2040

60

80

100

1−特異度［％］で91 mL／min未満（表４に示すように日本腎臓学会
ガイドラインでは、91 mL／min未満から、腎機能障

図10 血清シスタチンCと血清クレアチニンのROC曲線害を示す。）を腎機能低下群としたときのROC解析の結果を図 10に示す。それぞれのArea

Under theCurve （AUC）は血清シスタチンCが0.84、血清クレアチニンよりもGFR 91 mL／min未満を察知する感アチニンが0.79となり、血清シスタチンCの方が良好度・特異度がともに優れていることを意味する。

な結果を示した。これは血清シスタチンCが血清クレ6．ま と め
表４腎機能ステージ

今回開発したシスタチンC測定試薬について、基本
腎機能
日本腎臓学会ガイドライン
GFR：mL／min
尿毒症群
10以下
腎不全（腎臓の働きなし）
11〜30
腎機能重度障害群
31〜50
腎機能中度障害群
51〜70
腎機能軽度障害群
71〜90
腎機能正常群
91以上＊GFR：腎糸球体濾過能性能および臨床的有用性を確認した。
基本性能において、測定内、測定間再現性は4％以内と良好であり、検体の希釈直線性も良好であった。
検体中の共存物質や抗凝固剤の影響がないこと、血清、血漿（ヘパリン，EDTA・2Na）両検体を同等に測定可能なことが確認された。他社キットとの相関性試験においても他社2法と良好な相関性を示した。
（ 82 ）

東ソー研究・技術報告 第52巻（2008）

臨床上の有用性については、従来、腎機能障害の指標に用いられている血清クレアチニンと相関性が良好であり、また、24時間クレアチニンクリアランスとの文（1990）
２）Simonsen, O., et al, Scand. J. Clin. Lab. Invest., 45,められた。従来、GFRを推測するための血清クレアチ
ニン値はGFRが正常の1／2程度（50 mL／min）に低下

献１）Abrahamson, M., et al, Biochem. J., 1, 287−294

関係において、血清シスタチンCは血清クレアチニンに比べ腎機能障害軽度の段階から高値化することが認

83

97−101（1985）
３）Randers, E., et al, Clin. Lab. Med., 37, 389−395（1999）

しないと上昇しない、いわゆるCreatinine blind rangeが存在するが、本シスタチンC測定試薬ではより早期４）Grubb, A., Clin. Nephrol., 38, 20−27（1992）に上昇することが認められた。このことから今後、血５）Coll, E., et al, Am. J. Kidney. Dis., 36, 29−34

清クレアチニンに代わりシスタチンCがGFRの指標になることが期待された。さらにROC解析の結果から（2000）
６）Newman, DJ., Ann. Clin. Biochem., 39, 89−104

GFR（糸球体濾過値）が91 mL／min 前後の軽症腎機能障害において血清クレアチニンより診断感度・診断（2002）
７）Filler, G., et al, Clin. Chem., 43, 1077−1088

特異度ともに高いことが確認された。

（1997）

以上から、本シスタチンC測定試薬は、早期腎機能

８）Grubb, A., et al, Acta Med Scand, 128, 499−503

障害のマーカーとしてスクリーニング、モニタリング目的の検査の両方に有用であることが示された。クレ（1985）
９）Frans J. Hoke, et al, Nephrol Dial Transplant, 18,

アチニンクリアランスのような煩雑さがなく、全自動

2024−2031（2003）

で測定できることから外来での腎機能検査など利便性

10）Pucci, L., et al, Clin. Chem., 53, 480−488（2007）

を生かした運用も期待される。また最近シスタチンC11）佐藤弘恵、他、モダンメディア、52、184−192の新たな可能性として、心血管系疾患の発症に関係す（2006）

る予後因子となることが報告されており、心血管系疾12）堀田修、他、日腎会誌、41、797−803（1999）

患のリスクファクターとしても有用性が期待される。

13）平田明彦、他、日本臨床、60、515−519（2002）
14）金子拓志、他、医学検査、56、955−963（2007）

7．謝辞

本開発において臨床的有用性の確認に対してご協力していただいた各先生方に厚く御礼申し上げます。
旭川医科大学臨床検査医学講座 ： 伊藤喜久 教授

旭川医科大学病院臨床検査・輸血部生化学検査室： 新関紀康先生（ 83 ）