技術ノート

OECD テストガイドラインに準拠した習熟度評価用物質の…
in chemico/in vitro 皮膚感作性試験（OECD TG 442 C，OECD TG 442D）の結果
奥富弘子，稗田紀絵，福永裕基，磯江孝治，小林美和子，渡辺美香
諸言Test Method 試験を実施した．

欧州連合（EU）では，EU 化粧品指令 76 / 768 /1．ペプチド結合性試験（DPRA）EEC により 2013 年 3 月 11 日から動物実験を用

本試験は，OECD TG 442CおよびEURL ECVAM

いて開発された化粧品の販売が全面禁止となって

DB-ALM，Protocol n˚154: Direct Peptide Reactivity

いる．こうした海外の動きもあり，刺激性試験や

Assay（DPRA）
for Skin Sensitisation Testing8）に 準

感作性試験の代替法をはじめとする様々な代替法

拠して実施した．
1.1の開発が進められてきた．

試験の原理

皮膚感作性物質の検出に関しては様々な試験法

DPRA は，システインまたはリジンを含む 7が開発されているが，皮膚感作成立における一連個のアミノ酸から成る 2 種類の合成ペプチドをの 過 程 が AOP（Adverse Outcome Pathway: 有

それぞれ被験物質と反応させ，未反応の合成ペ

害性発現経路）としてまとめられ，4 つの主要なプチド量を高速液体クロマトグラフ（HPLC，測1）

事象が上げられている ．その後，最初の事象で定波長 220 nm）
で分離定量し，その減少率を求ある化学物質とタンパク質との結合能を評価するめることによって被験物質の皮膚感作性を予測試験法としてペプチド結合性試験（Direct Peptide

する試験法である．被験物質の反応性は 4 段階

Reactivity Assay：DPRA，OECD TG 442 C ），（High，Moderate，Low，Minimal）に分類される．

第 2 の事象であるケラチノサイトの活性化を評

1.2

価 す る 試 験 法 と し て ARE-Nrf2 Luciferase Test

1.2.1

2）

材料および方法
試薬および試液

Method（OECD TG 442D ），第3の事象である

試薬は，日本薬局方，HPLC 用および特級グ

樹状細胞の活性化を評価する試験法として human

レードを用いた．なお，システイン含有ペプチ

Cell Line Activation Test（h-CLAT，OECD TG

ドは，容易に酸化されるため，試験に使用する

442E ）が OECD テストガイドラインとして採択

アセトニトリル，緩衝液，希釈溶媒は使用前にされた．第 4 の事象である T 細胞の活性化およびアルゴンガスで置換した．

抗原特異的 T 細胞の増殖を評価する試験は動物を

1.2.2

3）

4）

習熟度評価用物質溶液の調製用いる代替法としてこれまで行われてきた LLNA

OECD TG 442C, ANNEX 2 に記載されてい試験（OECD TG 429 , OECD TG 442A , OECDる習熟度評価用の 10 物質（表 1）を用いた．そTG 442B ）である．しかし，in vivo 皮膚感作性

れらは，in vivo における予測（LLNA 結果）にを単独の動物を用いない試験法のみで評価するこ

おいて感作物質とされる 6 物質および非感作物とは困難であることから，複数の試験法を組み合質とされる 4 物質である．10 物質すべてアセ

わせて評価を行う必要がある．

トニトリルに溶解するため，アセトニトリル

5）

6）

7）

我々はすでに h-CLAT の受託試験を実施していに溶解して習熟度評価用物質溶液（90 . 3～105

るが，実施経験のない DPRA および ARE-Nrf 2

mmol/L）
を用時調製した．なお，このアセトニ

Luciferase Test Method の受託試験を開始する

トリルが，合成ペプチドの安定性に影響しないにあたり，OECD ガイドラインに従い，受託機ことを確認した．

関としての習熟度を示すために，習熟度評価用物

1.2.3

質 を 用 い て DPRA お よ び ARE-Nrf 2 Luciferase

陽性対照原液の調製

陽性対照として，trans- シンナムアルデヒド
15

秦野研究所年報 Vol. 40. 2017

表1

OECD TG 442 C ANNEX 2 に記載されているペプチド結合性試験の習熟度評価用物質
習熟度評価用物質

1 2 , 4 - ジニトロクロロベンゼン

CAS No.

分子量

純度
（%）

97 - 00 - 7

202 . 55

99 . 8メーカー

In vivo における
予測

DPRA による予測

Sigma-Aldrich

感作物質

陽性

（St. Louis, MO） （非常に強い [extreme]）
2 オキサゾロン

15646 - 46 - 5

217 . 2298 . 4

和光純薬工業

感作物質（大阪）（非常に強い [extreme]）

陽性

3 ホルムアルデヒド

50 - 00 - 030 . 0336 . 8

和光純薬工業

感作物質

陽性

（大阪）

（強い [strong]）

4 ベンジリデンアセトン

122 - 57 - 6

146 . 1998 . 6

和光純薬工業

感作物質（大阪）（中程度 [moderate]）

5 ファルネソール

19317 - 11 - 4

220 . 36

96 . 0Frinton Laboratories

感作物質（Hainesport, NJ）（弱い [weak]）

6 2 , 3 - ブタンジオン

431 - 03 - 8

86 . 09

98 . 9Sigma-Aldrich

感作物質（St. Louis, MO）（弱い [weak]）

7 1 - ブタノール

71 - 36 - 3

74 . 12100 . 0

和光純薬工業

非感作物質

陰性

8 6 - メチルクマリン

92 - 48 - 8

160 . 1799 . 9Sigma-Aldrich

非感作物質

陰性

非感作物質

陰性

非感作物質

陰性

陽性
陽性
陽性

（大阪）
（St. Louis, MO）
9 乳酸

50 - 21 - 5

90 . 08

88 . 7

Sigma-Aldrich（St. Louis, MO）

10 4 - メトキシアセトフェノン

100 - 06 - 1

150 . 17100 . 0Sigma-Aldrich（St. Louis, MO）

16[CAS 番号 14371-10-9，分子量 132.16，純度

プチド原液を希釈溶媒で希釈し，6 濃度（0. 534，

99.1 ％（GC），Sigma-Aldrich（St. Louis, MO）]

0. 267，0 . 133，0 .0667，0 . 0334 および 0 . 0167

を使用し，アセトニトリルに溶解して，陽性対

mmol/L，STD 1～STD 6）の検量線用標準液を

照原液（100～104 mmol/L）を用時調製した．

調製した．希釈溶媒は，システイン含有ペプ

1.2.4

チドではリン酸緩衝液（pH7 . 5）/ アセトニトリ

合成ペプチド原液の調製

合成ペプチドは，アルギニン（R），フェニ

ル（8: 2 v/v）
，リジン含有ペプチドでは酢酸ア

ルアラニン（F），4 個のアラニン（A）とシステ

ンモニウム緩衝液（pH10 . 2）
/ アセトニトリル

イン（C）またはリジン（K）からなる．システイ（8 : 2 v/v）
を用いた．

ン 含 有 ペ プ チ ド [Ac-RFAACAA-COOH， 純

1.2.6

共溶出対照溶液，基準対照溶液，

度 92 .75％，スクラム（墨田区）] およびリジン

陽性対照溶液，試料溶液の調製

含 有 ペ プ チ ド [Ac-RFAAKAA-COOH， 純 度

HPLC オートインジェクタ用バイアルを使用

98.58％，スクラム（墨田区）] はいずれも吸湿

し，共溶出対照溶液，基準対照溶液 A～C，陽しやすいため，開封時限りの使用とした．シス性対照溶液および試料溶液を調製した（表 2）．

テイン含有ペプチドは pH7 .5 のリン酸緩衝液

共溶出対照溶液は，習熟度評価用物質と未反応に溶解し，リジン含有ペプチドは pH10. 2 の酢ペプチドの保持時間が同じになる共溶出によって酸アンモニウム緩衝液に溶解して，それぞれ測定に影響しないことを確認するために用いた．

0.667 mmol/L の合成ペプチド原液を習熟度評

調製は，該当する習熟度評価用物質の測定と同日

価用物質との反応の度に調製した．

に行った．基準対照溶液AはHPLCシステム適合

1.2.5

検量線用ペプチド標準液の調製性確認，基準対照溶液Bは分析時間中の合成ペプ

システインおよびリジン含有ペプチドの双方

チドの安定性確認のために用いた．また，基準対について，標準検量線を作成するため，合成ペ照溶液Cは，習熟度評価用物質の溶解に用いた溶技術ノート表2各対照溶液および試料溶液の調製方法＊
システイン含有ペプチド用溶液

溶液の種類

混合溶液

リジン含有ペプチド用溶液
混合量
（µL）

アセトニトリル
共溶出対照溶液（習熟度評価用物質 習熟度評価用物質溶液（約 100 mmol/L）
ごと n= 1 で調製） りん酸緩衝液（pH 7 . 5）750

アセトニトリル

250

混合溶液

混合量
（µL）

200

酢酸アンモニウム緩衝液（pH 10 . 2）

750

50

習熟度評価用物質溶液（約 100 mmol/L）

250

リジン含有ペプチド原液（0 . 667 mmol/L）

750

アセトニトリル

250

基準対照溶液 A（n= 3 で調製）

システイン含有ペプチド原液（0 . 667 mmol/L） 750

基準対照溶液 B（n= 6 で調製）

リジン含有ペプチド原液（0 . 667 mmol/L）

750

システイン含有ペプチド原液（0 . 667 mmol/L） 750

アセトニトリル

250

アセトニトリル

200

リジン含有ペプチド原液（0 . 667 mmol/L）

750

習熟度評価用物質を溶解した媒体（アセトニトリル）

50

習熟度評価用物質を溶解した媒体（アセトニトリル） 250

基準対照溶液 C（n= 3 で調製）
陽性対照溶液（n= 3 で調製）

アセトニトリル

250

システイン含有ペプチド原液（0 . 667 mmol/L） 750
アセトニトリル

200

リジン含有ペプチド原液（0 . 667 mmol/L）

750

陽性対照原液（約 100 mmol/L）

50

陽性対照原液（約 100 mmol/L）

250

リジン含有ペプチド原液（0 . 667 mmol/L）

750

習熟度評価用物質溶液（約 100 mmol/L）

250

システイン含有ペプチド原液（0 . 667 mmol/L） 750
アセトニトリル

200
試料溶液（習熟度評価用物質 習熟度評価用物質溶液（約 100 mmol/L）
50
ごと n= 3 で調製） システイン含有ペプチド原液（0 . 667 mmol/L） 750＊

記載順に添加した．

媒がペプチド減少率に影響を与えないことを確認求め，検量線用ペプチド標準液の結果から最小するために用いた．

二乗法により検量線を作成した．また，試料溶

1.2.7

液および陽性対照溶液の未反応ペプチド減少率

試験方法

システイン含有ペプチドおよびリジン含有ペは，［（1- 試料溶液または陽性対照溶液におけプチドの試験は，それぞれ別の日に実施した．

る未反応ペプチドのピーク面積 / 基準対照溶液

両ペプチドの試験ともに 1 日に 2～4 の習熟度

C におけるペプチドのピーク面積の平均値）×

評価用物質を試験に用いた．

100］から算出した．

検量線用ペプチド標準液，共溶出対照溶液，

なお，本試験の実施に先立ち，測定日，分析

基準対照溶液A～C，陽性対照溶液および試料溶

カラムおよび測定者を変動要因とした 3 回の室液を25±2.5℃でインキュベートした．HPLC

内再現性を確認し，未反応ペプチド濃度測定法

分析前に沈殿や相分離が観察された場合，必要の妥当性を確認した．

に応じてバイアルを低速（100～400 xg）
で遠心分

1.2.8

離した．

試験成立条件システイン含有ペプチドの測定を 3 回実施しまず，表 3 の装置および HPLC 条件で，検量たが，3 回ともに試験成立の許容基準（表 4）を線作成，HPLC のシステム適合性確認および共すべて満たした．リジン含有ペプチドの測定に溶出の確認を 24 時間のインキュベーション終

ついても 3 回実施したが，1 回については陽性了前に完了した．次に基準対照溶液 B，C，陽対照溶液のペプチド減少率が許容基準を満たさ

性対照溶液および試料溶液について，試料溶液

なかったことから，そのデータを不採用とし，の 1 回目の測定がインキュベーション開始から

4 回目の測定を行い，許容基準を満たすことを24 ± 2 時間となるように測定を開始した．こ確認した．

れらの一連の HPLC 分析は，30 時間未満で終

1.3

了した．

1）
システイン含有ペプチドの試験

各溶液の未反応合成ペプチドのピーク面積を結果および考察

習熟度評価用 10 物質すべてにおいて，シス
17

秦野研究所年報 Vol. 40. 2017表3

装置および HPLC 条件装置（島津製作所製造）
ポンプ（2 台）LC- 10 AD VP

オートインジェクタ
カラムオーブン
検出器（UV-VIS）
システムコントローラ
デガッサ
データ処理装置

SIL- 10 AD VP
CTO- 10 A
SPD- 10 A VP
SCL- 10 A VP
DGU- 14 A
C-R 7 A plus

HPLC 条件
分析カラム
ガードカラムカラム設定温度
試料設定温度
測定波長
試料注入量
分析時間
移動相
溶出条件

カラムの平衡化

表4

Zorbax SB-C 18（内径 2.1 mm，長さ 100 mm，粒子径 3.5 µm，アジレント・テクノロジー）
Security Guard Cartridge Holder Kit（P/N KJ 0 - 4282，phenomenex）
Security Guard Cartridge C 18
（4 . 0 mm × 2 . 0 mm，P/N AJ 0 - 4286，phenomenex）
30 ℃
室温（設定なし）
220 nm
5 µL
20 分間
移動相 A：0 . 1 %（v/v）
トリフルオロ酢酸水溶液
移動相 B：0 . 085 %（v/v）
トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液時間（分）流速（mL/ 分）
移動相 A
（%）
移動相 B
（%）
0
0 . 3590
10
10
0 . 3575
25
11
0 . 351090
13
0 . 351090
13 . 5
0 . 35901020終了
測定前に 1 時間以上，移動相 A 50 %/ 移動相 B 50 %，30 °C でカラムを平衡化した．
測定開始前に，上記の溶出条件で 2 回繰り返し送液し，カラムの最適化を行った．

ペプチド結合性試験における試験成立条件および習熟度評価用物質の測定成立条件

試験成立条件検量線の直線性

確認項目
決定係数
（r 2）

許容基準
0 . 990 より大きい
0 . 50 ± 0 . 05 mmol/L
15 . 0 % 未満

HPLC システムの適合性 基準対照溶液 A のペプチド濃度の平均値
経時的な基準対照溶液の 基準対照溶液 B および基準対照溶液 C の
安定性ペプチドのピーク面積の変動係数（CV）
陽性対照溶液のペプチド 平均値
システイン含有ペプチド 60 . 8～100.0% ＊減少率
リジン含有ペプチド40 . 2～69.4% ＊習熟度評価用物質の 試料溶液のペプチド測定成立条件減少率

最大標準偏差（SD）

システイン含有ペプチド 14 . 9 % 未満
リジン含有ペプチド11 . 6 % 未満

最大標準偏差（SD）

システイン含有ペプチド 14 . 9 % 未満
リジン含有ペプチド11 . 6 % 未満

習熟度評価用物質の基準対照溶液 C のペプチド濃度の平均値
溶解に用いる溶媒の影響＊

0 . 50 ± 0 . 05 mmol/L

EURL ECVAM DB-ALM Protocol No. 154 に基づく．

テイン含有ペプチド減少率はガイドラインで規

反応ペプチドのピーク面積値から共溶出対照溶液

定されている基準範囲内の値を示した（表 5）．

で得られたオキサゾロンまたはベンジリデンアセ

なお，オキサゾロンおよびベンジリデンアセト

トンのピーク面積値を差し引き，それぞれの試料

ンの2物質については，これら2物質由来のピー

18

溶液の未反応ペプチド量を算出した．

クと試料溶液由来の未反応ペプチドのピークが完

ファルネソールは試料溶液調製直後に相分離

全に重なったことから，試料溶液から得られた未した．24 時間のインキュベーション後には相分

技術ノート

表5

システイン含有ペプチドによる習熟度評価用物質のペプチド結合性試験結果

習熟度評価用物質

沈殿・相分離の有無
ペプチド
遠心の
との
添加
HPLC
有無＊1
共溶出
直後
分析前

2,4- ジニトロクロロベンゼン

無

沈殿

無

無

オキサゾロン

無

沈殿

無

共溶出

ペプチド減少率
（%）
採用値＊4

平均値
（SD）

基準範囲 判定
（平均値）

100
100
99 . 85
71 . 07 ＊2

100
100
99 . 85100（0 . 1 %）90～100適合

73 . 61 ＊2

73 . 61適合

69 . 72
57 . 72
62 . 84
54 . 44

71 . 5（2 . 0 %）

60～80

＊2

58 . 3（4 . 2 %）

30～60

適合

93 . 6（1 . 1 %）80～100適合

28 . 3（2 . 9 %）

15～55

適合

71 . 9（2 . 8 %）60～100適合

0.0（0 . 0 %）

0～7

適合

1.2
（2 . 1 %）

0～7

適合

1.4
（1 . 2 %）

0～7

適合

5.3
（4 . 6 %）

0～7

適合

実測値

69 . 72
ホルムアルデヒド

無

沈殿

無

無

ベンジリデンアセトン

無

沈殿

無

共溶出

57 . 72
62 . 84
54 . 44
92 . 35 ＊2

相分離

沈殿

無

無

94 . 40＊2

94 . 1031 . 38 ＊3
25 . 60 ＊3

31 . 38＊3

28 . 0368 . 76
72 . 80
74 . 05
0 . 000 . 000 . 003 . 680 . 000 . 002 . 320 . 001 . 750 . 008 . 157 . 6628 . 032,3- ブタンジオン

無

沈殿

無

無

1- ブタノール

無

沈殿

無

無

6- メチルクマリン

無

沈殿

無

無

乳酸

無

沈殿

無

無

4- メトキシアセトフェノン

無

沈殿

無

無

92 . 35

94 . 40 ＊2
94 . 10ファルネソール

71 . 0768 . 76
72 . 80
74 . 05−9 . 33−0 . 67−2 . 37
3 . 68−8 . 33−0 . 65
2 . 32−3 . 72
1 . 75−1 . 57
8 . 157 . 6625 . 60＊1

HPLC 分析前に発生する少量の白色沈殿は，遠心により沈降しないことが検討でわかっていたため，本試験での遠心は実施しなかった．
	試料溶液から得られた未反応ペプチドのピーク面積値から，共溶出対照溶液で得られた習熟度評価用物質由来のピーク面積値を差し引いて算出した．
＊3
再試験データ．
＊4
負のペプチド減少率は，「0.00」とした．
＊2

離は認められなかったが，この試料溶液のシスは，相分離により，化学物質とペプチドの反応

テイン含有ペプチドの減少率の平均値（10.7％）

が不完全となり，ペプチド減少率が過小評価さは基準（15～55％）を満たさなかった．この原因

れ，偽陰性の判定やより低い反応性に分類されとして，相分離により，液相中でのファルネソー

る可能性がある．今後，相分離が起きた場合にルとペプチドの反応が不十分であったと考えら

は，試料溶液の状態をよく観察し，混和条件にれた．そこで，再実験では試験試料調製直後に注意する必要がある．

アルゴンガスを十分に充填し，最初の実験より

ファルネソールを除く試料溶液では，24 時

も長い時間穏やかに撹拌して試料溶液とした．

間のインキュベート後にごく少量の白色沈殿がその結果，相分離は初回よりも不明瞭で，シス発生した．この沈殿は，合成ペプチドを含まな

テイン含有ペプチド減少率の平均値は 28.3％とい共溶出対照溶液では発生しなかったことかなり，基準を満した．

ら，システインが酸化し二量体化したものであ

このように，疎水性の高い化学物質の場合にると考えられる．未反応合成ペプチドで作成し19

秦野研究所年報 Vol. 40. 2017

表6

リジン含有ペプチドによる習熟度評価用物質のペプチド結合性試験結果

習熟度評価用物質

沈殿・相分離の有無
ペプチド
遠心の
との
添加
HPLC
有無
共溶出
直後
分析前

2,4- ジニトロクロロベンゼン

相分離

相分離

有

無

オキサゾロン

沈殿

沈殿

有

共溶出

ペプチド減少率
（%）
実測値

採用値＊3

平均値
（SD）

平均値
基準範囲

判定

13 . 94
29 . 61
29 . 64−＊1

13 . 94
29 . 61
29 . 64

24 . 4（9 . 1 %）

15～45

適合

−＊1

−

−

10～55

判定
不能

5.8
（5 . 6 %）

0～24

適合

−

0～7

判定
不能

6.3
（3 . 7 %）

0～25

適合

25 . 6（2 . 2 %）

10～45

適合

1.6
（2 . 1 %）0～5 . 5適合

2.8
（4 . 4 %）0～5 . 5適合

0.9
（1 . 5 %）0～5 . 5適合

5.5
（3 . 7 %）0～5 . 5適合−
ホルムアルデヒド

無

無

無

無

ベンジリデンアセトン

無

無

無

共溶出

ファルネソール

相分離

無

有

共溶出

＊1

無

無

無

無

1- ブタノール

無

無

無

無

6- メチルクマリン

無

無

無

無

乳酸

無

無

無

無

4- メトキシアセトフェノン

無

無

無

無

−
11 . 200 . 006 . 1311 . 20−1 . 426 . 13
−＊1

−

−＊1

−

−＊1

−

4 . 70 ＊2
3 . 66 ＊2

4 . 70＊2

10 . 60
27 . 59
23 . 27
25 . 970 . 000 . 903 . 930 . 550 . 007 . 910 . 002 . 620 . 009 . 823 . 453 . 21

10 . 60
2,3- ブタンジオン−

27 . 59
23 . 27
25 . 97−1 . 71
0 . 903 . 930 . 55−0 . 63
7 . 91−2 . 30
2 . 62−7 . 53
9 . 823 . 453 . 213 . 66＊1

夾雑物を伴う共溶出のため算出不可．
	試料溶液から得られた未反応ペプチドのピーク面積値から，共溶出対照溶液で得られた習熟度評価用物質由来のピーク面積値を差し引いて算出した．
＊3
負のペプチド減少率は，「0.00」とした．
＊2

た検量線の直線性は良好であり，バラツキも少基準を満たさなかったオキサゾロンおよびベ

ないことから，この白色沈殿の発生による結果

ンジリデンアセトンの2物質は，約6～11分の範への影響は低いと考えられた．

囲にシステイン含有ペプチドでは認められなかっ

2）リジン含有ペプチドの試験

た複数の夾雑物のピークが認められる共溶出とな

習熟度評価用物質 10 物質のうち，8 物質のリジン含有ペプチド減少率はガイドラインで規

20

り，ペプチド減少率の測定が不能であった．
3）DPRA予測モデルによる皮膚感作性の予測結果

定されている基準範囲内の値であった（表 6）．

2 種類の合成ペプチドを用いた試験結果から，

なお，ファルネソールについては，未反応ペプ

ガイドラインの DPRA 予測モデルに従って 10

チドのピークとファルネソール由来のピークが完

種類の習熟度評価用物質の皮膚感作性を予測し全に重なったことから，試料溶液から得られたペ

た（表 7）．その結果，ガイドラインに記載されプチドのピーク面積値から共溶出対照溶液で得らている予測性と完全に一致し，6 物質は陽性，4れたファルネソールのピーク面積値を差し引き，物質は陰性と判定された．なお，オキサゾロン

試料溶液の未反応ペプチド量を算出した．

とベンジリデンアセトンについては，システイ

技術ノート表7

習熟度評価用物質の反応性の分類と感作性の予測結果

習熟度評価用物質
2,4- ジニトロクロロベンゼン
オキサゾロン
ホルムアルデヒド
ベンジリデンアセトン
ファルネソール
2,3- ブタンジオン
1- ブタノール
6- メチルクマリン
乳酸
4- メトキシアセトフェノン＊1ペプチド減少率の平均値（%）
システイン含有 リジン含有
ペプチド
ペプチド
100
24 . 471 . 5−58 . 3
5.8
93 . 6−28 . 3
6.3
71 . 925 . 6
0
1.6
1.2
2.8
1.4
0.9
5.3
5.5

2 種類の
ペプチド減少率の平均値（%）

反応性の分類＊ 1

感作性の予測結果

62 . 2−32 . 1−17 . 348 . 8
0.8
2
1.2
5.4

High reactivity
Moderate reactivity
Moderate reactivity
Moderate reactivity
Low reactivity
High reactivity
No or minimal reactivity
No or minimal reactivity
No or minimal reactivity
No or minimal reactivity

陽性
陽性
陽性
陽性
陽性
陽性
陰性
陰性
陰性
陰性

	OECD TG 442C, Table 1: Cysteine 1:10/lysine 1:50 prediction model による分類．ただし，オキサゾロンおよびベンジリデンアセトンは，
Table 2: Cysteine 1:10 prediction model を用いた．

現するベクターを導入した細胞を用いるレポー

ン含有ペプチドの結果のみで予測した．
習熟度評価用の 10 物質のうち，ファルネソー

ターアッセイ系で，UN GHS に従った皮膚感

ル，オキサゾロンおよびベンジリデンアセトン

作性物質と非感作性物質の識別に利用するためについては，共溶出対照溶液のピークと試料溶の in vitro 試験法である．このガイドラインで液の未反応ペプチドのピークが完全に重なった使用する KeratinoSensTM 細胞は，ヒトケラチ

ことから，共溶出対照溶液の値を差し引くことノサイト由来の HaCaT 細胞にヒト AKR 1 C 2によってペプチド減少率を求めた．ガイドライ

遺 伝 子 の ARE 制 御 下 の ル シ フ ェ ラ ー ゼ 遺 伝

ンでは，このような共溶出は HPLC の設定条子を導入した細胞で，この細胞におけるルシ

件をわずかに調整することで解決できる可能性

フェラーゼの発現は，感作性物質による転写があると記載されている．今後更に，ピーク分

因 子 Nrf2（nuclear factor-erythroid 2 -related

離が可能な HPLC 条件を検討したい．

factor 2）遺伝子の活性化を反映し，かつ Nrf 2

今回我々は DPRA を実施し，習熟度評価用物

依存的であることが実証されている．したがっ質 10 物質のうち少なくとも 8 物質がガイドライて，この細胞を被験物質で処理し，ルシフェラーンに記載された基準を満たし，DPRA 予測モデ

ゼ遺伝子の発現誘導をその発光量で調べること

ルによるこれら 10 物質の皮膚感作性の予測結果

により，被験物質の皮膚感作性を予測すること

は，ガイドラインに記載されている DPRA 予測が可能となる．

結果と完全に一致することを確認した．これら

2.2の結果から，ガイドラインで要求されている試2.2.1

験施設でのペプチド結合性試験（DPRA）の技術的習熟度に問題はないことが示された．

材料および方法
使用細胞

KeratinoSensTM（ 入 手 日：2016年6月17日，
継代数：6）
は，Givaudan Schweiz AG（Dubendorf，

2．ARE-Nrf2 Luciferase Test Method

Switzerland）より購入した．牛胎児血清（FBS，

本試験は，OECD TG 442DおよびEURL ECVAM

非働化済み，終濃度：9.1％）および抗生物質に準拠（Geneticin：G418，終濃度：500 µg/mL）
を含む

TM9）

DB-ALM, Protocol n˚ 155: KeratinoSens
して実施した．
2.1

試験の原理

ARE-Nrf2 Luciferase Test Method は， 感ダルベッコ改変イーグル培地（以下，DMEM培地）
を用いて37℃，5% CO2 の条件下で培養した．
試験用に凍結保存した細胞を解凍後は2～4日ご

作性物質によって発現誘導されることが知らとに継代し，25代以内の継代数で使用した．

れている遺伝子の ARE（Antioxidant response

2.2.2

element）制御下でルシフェラーゼ遺伝子が発

習熟度評価用物質および陽性対照物質

OECD TG 442 D ANNEX 3 に記載されてい21

秦野研究所年報 Vol. 40. 2017

表8

OECD TG 442 D ANNEX 2 に記載されている ARE-Nrf2 luciferase test method の習熟度評価用物質
習熟度評価用物質

CAS No.

1 イソプロパノール

67 - 63 - 0

2 サリチル酸

69 - 72 - 7

3 乳酸

50 - 21 - 5

4 グリセロール

56 - 81 - 5

5 シンナミルアルコール104 - 54 - 1

6 ジメタクリル酸エチレングリコール

97 - 90 - 5

7 2 - メルカプトベンゾチアゾール

149 - 30 - 48 メチルジブロモ グルタロニトリル

35691 - 65 - 7

9 4（メチルアミノ）
フェノール硫酸塩

55 - 55 - 0

10 2 , 4 - ジニトロクロロベンゼン

97 - 00 - 7

＊

メーカー

KeratinoSensTM
による予測＊

和光純薬工業
非感作物質（大阪）
和光純薬工業
非感作物質（大阪）
Sigma-Aldrich
非感作物質（St. Louis，MO）
和光純薬工業
非感作物質（大阪）
Sigma-Aldrich
感作物質（St. Louis，MO）（弱い [weak]）Sigma-Aldrich
感作物質（St. Louis，MO）（弱い [weak]）Sigma-Aldrich
感作物質（St. Louis，MO）（中程度 [moderate]）
Sigma-Aldrich
感作物質（St. Louis，MO）（強い [strong]）
和光純薬工業
感作物質（大阪）（強い [strong]）
Sigma-Aldrich
感作物質（St. Louis，MO） （非常に強い [extreme]）

陰性
陰性
陰性
陰性
陽性
陽性
陽性
陽性
陽性
陽性

OECD TG 442 D ANNEX 2 を参照した．

る 10 物質を用いた（表 8）．それらは，in vivo

液および陰性対照物質をさらに 1% FBS 含有における予測（LLNA 結果）において非感作物質

DMEM 培地で 25 倍希釈してそれぞれの処理用とされる 4 物質および感作物質とされる 6 物質

培地を調製し，処理に用いた．

である．

2.2.4

細胞播種および処理

陽性対照物質として trans- シンナムアルデ

試験には 96 ウェルプレートを用い，1 プレー

ヒド [CAS 番号 14371- 10 - 9，分子量 132. 16，

ト内に，陰性対照物質は 6 ウェル，習熟度評価

純 度 99.1％（GC），Sigma-Aldrich（St. Louis,

用物質（最大 7 物質同時実施可能）および陽性対MO），以下，シンナムアルデヒド ] を用いた．

照物質については各濃度 1 ウェルを配置し，ル2.2.3

シフェラーゼ活性測定用として 3 枚の白色 96

試験液の調製習熟度評価用物質はすべて第一選択溶媒であるジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解しウェルプレートを，細胞生存率測定用として 1枚の透明 96 ウェルプレートを用いた．

たことから，それらを DMSO に溶解して 200

KeratinoSensTM 細胞を各プレートに播種（1mmol/L の原液を調製した．原液を溶媒で希釈

× 10 4 細胞 / ウェル）した．24 時間培養後，96

して 12 濃度（0. 098～200 mmol/L，公比 2）のウェルプレートの培地を 1% FBS 含有 DMEM

習熟度評価用物質試験液を調製した．

培地 150 µL と交換した．さらに，習熟度評価

陽 性 対 照 物 質 に つ い て は，DMSO に 溶 解用物質処理用培地，陽性対照物質処理用培地おして調製した 200 mmol/L の溶液を，さらによび陰性対照物質処理用培地を合計 4 枚の 96

DMSO で希釈して 6. 4 mmol/L の陽性対照物質

ウェルプレートに 50 µL/ ウェルずつ添加した．

原液を調製した．それを公比 2 で希釈して 5 濃

プレートシールを貼り，37℃，5 % CO 2 インキュ度
（0 .4～6 .4 mmol/L）の陽性対照物質試験液をベーター内で 48 時間培養した．

調製した．

22

In vivo による予測＊

培養終了後，ルシフェラーゼ活性測定用のプ

陰性対照物質としてDMSOをそのまま使用した．

レートについては，測定が重ならないように，習熟度評価用物質試験液，陽性対照物質試験

3 枚の白色プレートの開始時間をずらして以下

技術ノートの操作を行った．
各ウェルの培地を除き，リン酸緩衝液で洗浄，
細 胞 溶 解 緩 衝 液（Promega，Madison，WI）
を 20 µL/ ウ ェ ル 添 加 し て 室 温 で 20 分 静 置 しよび IC 30 とした．
2.2.7

試験成立条件

次に示す①～③の条件を満たした場合，試験成立とした．

た．各ウェルにルシフェラーゼ基質（Promega，① 各実験の陽性対照物質のルシフェラーゼ

Madison，WI）を 50 µL 分 注 後，1 秒 静 置 し，活性の誘導倍率が少なくとも 1 濃度で 1 .5

2 秒間の発光量積算となるよう設定したルミノ倍超となり，統計学的に有意であること．

メーター（フェリオス，AB- 2350，アトー）で② 各実験の陽性対照物質の EC 1.5 値が背景発光量を測定した．

値の 2 倍の標準偏差内であること（本試験

細胞生存率測定用のプレートについては，培ではバリデーション済みのデータセット

地を除き，3（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）に基づいた値として 7～30 µmol/L を用い-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド
（MTT）

た）
．さらに，陽性対照物質 64 µmol/L のを595 µg/mLの 濃 度 と な る よ う に1% FBS含濃度における誘導倍率の平均値が 2～8 の有DMEM培地に溶解したMTT培地を添加後，間であること．

37℃，5% CO 2 インキュベーター内で4時間培養③ 各実験の陰性対照（DMSO）における発光

した．培養終了後MTT培地を除き，10%ドデシ

値（6 ウェル / プレート× 3 プレート，合計

ル硫酸ナトリウム溶液をウェルあたり200 µL添

18 ウェル）の変動係数が 20% 未満である

加し，37℃，5% CO2 インキュベーター内で一晩こと．

以上静置し細胞を溶解した．測定前にプレート

2.2.8

判定

を10分間撹拌し，595 nmの吸光度をマイクロ

最低 2 回の実験において，次に示す①～④のプレートリーダー（モデル 680 マイクロプレート

条件をすべて満たした場合を陽性とし，それ以リーダー，BIO RAD）
で測定した．

外の場合は陰性とした．

以上の実験を 1 回（rep1）とし，別の日に 2 回① Imax が 1 . 5 倍超であり，陰性対照に対し統（rep2）ないし 3 回（rep3）の実験を実施し，それらの結果を 1 試験の結果として判定に用いた．
2.2.5

計学的に有意であること．
② EC 1 . 5 の判定濃度において，細胞生存率が誘導倍率および EC 1 . 5 の算出

70 % を超えていること．

実験毎に，各濃度におけるルシフェラーゼ活③ EC 1 . 5 が 1000 µmol/L 未満であること．

性の誘導倍率（習熟度評価用物質または陽性対④ ルシフェラーゼの誘導に濃度依存的な反照物質の発光値 / 陰性対照物質の発光値の平均値）を算出した．さらに，各物質の最大誘導倍率（Imax）を各実験の最大誘導倍率の平均値から算出した．
次に，ガイドラインに記載されている計算式を用いてルシフェラーゼ活性の誘導倍率が1.5倍となる濃度（EC1.5）を実験毎に算出し，その値から求めた幾何平均値（GeoMean）
をその物質のEC1.5

応が認められること．
2.3

結果および考察

習熟度評価用 10 物質の ARE-Nrf2 Luciferase
Test を実施するために 8 回の実験を行ったが，そのすべての実験が試験成立条件を満たしていることを確認した（表 9）．
習熟度評価用物質の試験結果を表 10 および
表 11 に示した．

とした．

KeratinoSensTM における予測が陰性である 42.2.6

物質については，すべて陰性であり，EC 1.5 お

細胞生存率の算出

MTT 法による吸光度の結果から，陰性対照
物質に対する処理物質の細胞生存率が 50% 減

よび IC 50 についてもすべて基準範囲内の値を示した．

および 30% 減となる濃度（IC 50 および IC 30）を

KeratinoSensTM における予測が陽性である

実験毎に算出した．各実験から算出した IC 50

6 物質は，すべて陽性であった．そのうち 4 物

および IC 30 の幾何平均値をその物質の IC 50 お質については，EC 1 . 5 および IC 50 の基準を満た23

秦野研究所年報 Vol. 40. 2017

表9

ARE-Nrf 2 luciferase test における試験成立条件とその判定結果
陽性対照物質試験回数 実験回数
4
Run 1
Run 2
Run 3
Run 4

各濃度（µmol/L）
における誘導倍率
8
16
32
1 . 31
1 . 72 ＊2 . 23 ＊5 . 30 ＊64

陰性対照の変動係数＊1EC 1 . 5（µmol/L） （％）

判定＊2

rep 1

1 . 16

11 . 7

6.2

成立

rep 2

1 . 101 . 201 . 56 ＊1 . 74 ＊2 . 80 ＊14 . 8

11 . 7成立

rep 1

1 . 281 . 37

1 . 87 ＊7 . 21 ＊10 . 1

9.9

成立

rep 2

1 . 11

1 . 101 . 472 . 52 ＊1 . 79 ＊5 . 41 ＊6 . 25 ＊17 . 417 . 5

8.3
11 . 2

成立
成立

rep 1
rep 2

0 . 971 . 12＊

1 . 161 . 15

1 . 42
1 . 52 ＊2 . 302 . 15 ＊3 . 74 ＊15 . 5

7.7

成立

＊

＊

5 . 76 ＊12 . 011 . 3成立

2 . 01 ＊3 . 99 ＊14 . 4

11 . 3成立

rep 1

1 . 381 . 36

1 . 64rep 2

1 . 271 . 24

1 . 57 ＊2 . 21＊1

陰性対照（DMSO）の発光値（合計 18 ウェル）から変動係数を算出した．
＊2
次の判定基準①～③の条件をすべて満たした場合「成立」とした．
①陽性対照物質の EC 1 . 5 が 7～30 µmol/L の間であること．
②陽性対照物質 64 µmol/L の濃度において，その誘導倍率の平均値が 2～8 の間であること．
③陰性対照（DMSO）の発光値の変動係数が 20% 未満であること．
＊：誘導倍率が 1.5 倍を超え，t 検定で有意であった（p< 0 . 05）．

表 10

習熟度評価用物質の ARE-Nrf 2 luciferase test の結果（最大誘導倍率および EC 1 . 5）
最大誘導倍率（Imax）
rep 1
rep 2 Average

rep 1

EC 1 . 5（µmol/L）
rep 2
GeoMean 基準範囲＊1

総合判定

1 イソプロパノール
2 サリチル酸
3 乳酸
4 グリセロール
5 シンナミルアルコール
6 ジメタクリル酸エチレングリコール
7 2 - メルカプトベンゾチアゾール
8 メチルジブロモ グルタロニトリル
9 4（メチルアミノ）
フェノール硫酸塩

1 . 01
1 . 16
1 . 041 . 255 . 54 *31 . 03 *5 . 57 *2 . 67 *6 . 81 *1 . 161 . 131 . 11
1 . 092 . 48 *42 . 47 *7 . 41 *2 . 66 *7 . 09 *1 . 091 . 15
1 . 071 . 174 . 0136 . 75
6 . 492 . 67
6 . 95> 2000> 2000> 2000> 2000176 . 863 . 773 . 1
11 . 71.3> 2000> 2000> 2000> 2000210 . 961 . 9101 . 310 . 5
0 . 7 ＊2

10 2 , 4 - ジニトロクロロベンゼン

7 . 80 *11 . 83 *9 . 82

3.7

3.9

習熟度評価用物質> 2000> 2000> 2000> 2000193 . 162 . 886 . 1
11 . 1> 1000> 1000> 1000> 100025 - 175
5 - 125
25 - 250
< 20

陰性
陰性
陰性
陰性
陽性
陽性
陽性
陽性

1.0
3.8

< 12 . 5< 12 . 5

陽性
陽性

＊1

OECD TG 442D ANNEX 2 を参照した．
最低濃度（0.98 µmol/L）において誘導倍率が 1.5 を超えたことから，用量反応曲線より算出した．
＊：Imax が 1.5 倍を超え，t 検定で有意であった（p<0.05）．
＊2

表 11

習熟度評価用物質の ARE-Nrf 2 luciferase test の結果（IC 50 および IC 30）
習熟度評価用物質

1 イソプロパノール
2 サリチル酸
3 乳酸
4 グリセロール
5 シンナミルアルコール
6 ジメタクリル酸エチレングリコール
7 2 - メルカプトベンゾチアゾール
8 メチルジブロモ グルタロニトリル
9 4（メチルアミノ）
フェノール硫酸塩
10 2 , 4 - ジニトロクロロベンゼン＊124OECD TG 442D ANNEX 2 を参照した．

rep 1

IC 50（µmol/L）
rep 2 GeoMean 基準範囲＊1> 2000> 2000> 2000> 2000> 2000697 . 4> 200030 . 5
12 . 911 . 0> 2000> 2000> 2000> 2000> 2000974 . 3> 200038 . 313 . 5
13 . 4> 2000> 2000> 2000> 2000> 2000824 . 3> 200034 . 213 . 212 . 1> 1000> 1000> 1000> 1000> 1000> 500> 500
20 - 100
20 - 200
5 - 20IC 30（µmol/L）
rep 1> 2000> 2000> 2000> 20001706
524 . 41504
26 . 011 . 59.1

rep 2> 2000> 2000> 2000> 2000> 2000875 . 01819
29 . 311 . 5
12 . 3

GeoMean> 2000> 2000> 2000> 2000> 1706677 . 4165
27 . 6
11 . 5
10 . 6

技術ノート

したが，シンナミルアルコールの EC 1 . 5 は基ともに，少なくとも 8 物質がそれぞれのガイドラ

準範囲上限である 175 µmol/L を超え（176 . 8，

インに記載されている基準を満たす必要があると210.9 µmol/L），4（メチルアミノ）
フェノール

されている．今回我々は，ガイドラインに従って硫酸塩の IC 50 は基準範囲下限である 20 µmol/L

DPRA および ARE-Nrf 2 Luciferase Test のそれを下回った（12 . 9，13 . 5 µmol/L）．

ぞれの習熟度評価用 10 物質の試験を実施した結シンナミルアルコールについては購入元を，4（メ果，両試験ともに 10 物質の感作性を正しく予測

チルアミノ）
フェノール硫酸塩については溶媒を変し，8 物質についてガイドラインの基準を満たす

えて試験を実施したが，それらの結果に大きな差はことを示した．これらの結果から，秦野研究所が見られず，基準を満たすことはできなかった．

OECD ガイドラインに従った DPRA および ARE-

本法のバリデーション試験では，5施設でそれ

Nrf 2 Luciferase Test の試験施設として，技術的ぞれ3回試験を実施した結果が報告されている

習熟度に問題のないことを示すことができた．

．シンナミルアルコールの場合，個々の実

10,11）

験 の EC 1.5 は 59.5～190.9 µmol/L の 範 囲 で あ

文献り，少なくとも今回の 1 実験の値はバリデーショ

1) OECD: The Adverse Outcome Pathway for Skin

ン試験の範囲内であった．また，4（メチルアミ

Sensitisation Initiated by Covalent Binding to

ノ）フェノール硫酸塩の個々の実験の IC 50 は 9.8～172.1 µmol/L の範囲であり，我々の実験で得られた IC 50（12.9～19.5 µmol/L）はバリデー
ション試験で得られた範囲内であった．
以 上 の よ う に， シ ン ナ ミ ル ア ル コ ー ル のEC 1 . 5 の 1 データのみがバリデーション試験の報告データをわずかに超える値となったが，基準の範囲外となったそれ以外のデータはバリデーション試験の範囲内のデータであり，許容可能であると考えられる．
今回我々は ARE-Nrf 2 Luciferase Test を実
施 し， 習 熟 度 評 価 用 物 質 10 物 質 の う ち 少 な
くとも 8 物質がガイドラインに記載された基準を満たし，10 物質の皮膚感作性の予測結果
は，ガイドラインに記載されている ARE-Nrf 2
Luciferase Test の予測結果と完全に一致することを確認した．これらの結果から，ガイドラ
インで要求されている試験施設での ARE-Nrf 2
Luciferase Test の技術的習熟度に問題はない
ことが示された．
結論
In chemico/in vitro 皮膚感作性試験の試験法ガ

Proteins; Part 1 : Scientific Evidence, 2012 ,2) O E C D : O E C D G u i d e l i n e f o r t h e T e s t i n gof Chemicals No. 4 4 2 C, In Chemico Skin
Sensitisation: Direct Peptide Reactivity Assay(DPRA), 2 0 1 5 , http://www.oecd-ilibrary.org/
environment/test-no- 4 4 2 c-in-chemico-skinsensitisation_9789264229709 -en
3) OECD: OECD Guideline for the Testing ofChemicals No. 442 D, In Vitro Skin Sensitisation:
ARE-Nrf 2 Luciferase Test Method, 2015 , http://
www.oecd-ilibrary.org/environment/test-no-442din-vitro-skin-sensitisation_9789264229822 -en
4) OECD: OECD Guideline for the Testing ofChemicals No. 442E, In Vitro Skin Sensitisation:
human Cell Line Activation Test (h-CLAT),
2016, http://www.oecd-ilibrary.org/environment/
test-no-442e-in-vitro-skinsensitisation_9789264264359-en
5) OECD: OECD Guideline for the Testing ofChemicals No. 429 , Skin Sensitisation: Local
Lymph Node Assay, 2 0 1 0 ,6) OECD: OECD Guideline for the Testing ofChemicals No. 442 A, Skin Sensitisation: Local
Lymph Node Assay: DA, 2010 ,7) OECD: OECD Guideline for the Testing ofChemicals No. 442 B, Skin Sensitisation: Local

イドラインである OECD TG 442 C および OECD
TG 442D ではともに，試験施設がこの試験を開始する前にこれらの試験法に関する技術的な習熟度を示すために，習熟度評価用の 10 物質の試験を実施し，10 物質の感作性を正しく予測すると25

秦野研究所年報 Vol. 40. 2017

Lymph Node Assay: BrdU-ELISA, 2010 , http://10)EURL ECVAM: EURL ECVAM Recommendationwww.oecd-ilibrary.org/environment/test-no-442b-on the KeratinoSens ™ assay for skinskin-sensitization_9789264090996-en8) E U R L E C V A M : E U R L E C V A M D a t a b a s eservice on Alternative Methods to animal
experimentation（EURL ECVAM DB-ALM），…

KeratinoSens.
11)Natsch A, Bauch C, Foertsch L, Gerberick F,

Protocol n˚ 154 : Direct Peptide Reactivity Assay

Normann K, Hilberer A, Inglis H, Landsiedel R,（DPRA）for Skin Sensitisation Testing. https://

Onken S, Reuter H, Schepky A, Emter R: The

ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/methods-and-intra- and inter-laboratory reproducibility andprotocols/protocols/protocol/direct-peptide-

predictivity of the KeratinoSens assay to predict

reactivity-assay-(dpra)-for-skin-sensitisation-skin sensitizers in vitro: results of a ring-study intesting/key/p_1542

ﬁve laboratories. Toxicol. In Vitro 2011 , 25,9) E U R L E C V A M : E U R L E C V A M D a t a b a s eservice on Alternative Methods to animal
experimentation (EURL ECVAM DB-ALM),
Protocol n˚ 155 : KeratinoSensTM,

26

sensitisation testing, 2 . Relevant validation
study reports, Attachments: INVITTOX Protocol

733 -744.