ポリエーテル系抗生物質の定量に用いる塩基性アルミナの検討

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技術レポート1

ポリエーテル系抗生物質の定量に用いる塩基性アルミナの検討
千原 哲夫 *1，橋本 仁康 *2，進藤 富枝 *3
1

飼料分析基準1)

緒言に収載されたポリエーテル系抗生物質の微生物学的定量法 2)~7)で用いるカラムク

ロマトグラフ用塩基性アルミナは，サリノマイシンナトリウム（SL）及びモネンシンナトリウム（MN）では Alcoa 製の Activated Aluminas F-20 又はこれと同等のもの，ナラシン（NR）では Alcoa
Indstrial Chemicals 製の Activated Aluminas CG-20 又はこれと同等のもの（粒径はいずれも 74~177 µm（200~80 メッシュ））を用いることが注記されている．なお，Activated Aluminas CG-20 は ActivatedAluminas F-20 を精製し たものであり，Activated Aluminas CG-20 が流通してからは，ActivatedAluminas F-20 の入手が困難になったことから，Activated Aluminas CG-20 を Activated Aluminas F-20の同等品として扱ってきた．
平成 18 年 7 月時点での調査では，上記の 2 種類の塩基性アルミナは，一般に流通しておらず，また Alcoa Indstrial Chemicals は塩基性アルミナの製造を停止し，Almatis AC，更に Engelhard がその製造を引き継いだとの情報が得られた．
各試験室内の Activated Aluminas CG-20 の在庫が尽きた場合に，微生物学的定量法によるポリエーテル系抗生物質の定量に支障を来すことが考えられるために，今回，現在流通しているカラムクロマトグラフ用塩基性アルミナを調査，検討し，これらの代替となる同等品としての知見を得たので，その概要を報告する．
22.1

試実験方法

料

抗菌性物質を含まない市販の中すう育成用配合飼料及び肉用牛肥育用配合飼料をそれぞれ 1mm の網ふるいを通過するまで粉砕し，供試試料とした．
各配合飼料の配合割合は，表 1 のとおりである．
なお，サリノマイシンナトリウム及びナラシンでは中すう育成用配合飼料，モネンシンナトリ
ウムでは肉用牛肥育用配合飼料を用いた．

*1

独立行政法人肥飼料検査所本部，現*2（独）肥飼料検査所本部，現*3（独）農林水産消費安全技術センター肥飼料安全検査部（独）農林水産消費安全技術センター名古屋センター（独）農林水産消費安全技術センター神戸センター大阪事務所

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飼料研究報告 Vol.32 (2007)

表1
飼料の種類
中すう育成用配合飼料の配合割合

原材料の区分

割合（%）

原材料名類

69

とうもろこし植物性油かす類

13

大豆油かす

そ う こ う 類

7

米ぬか

動物質性飼料5

魚粉

そ6

アルファルファ，りん酸カルシウム，穀の他

炭酸カルシウム，食塩，飼料添加物
肉用牛肥育用2.21)

試類

59

とうもろこし，大麦，マイロ

そ う こ う 類

35

ふすま，コーングルテンフィード

植物性油かす類

5

大豆油かすそ1

炭酸カルシウム，食塩，飼料添加物

穀の他

薬

サリノマイシンナトリウム標準液
常用標準サリノマイシン適量を減圧下（0.67 kPa 以下），60°C で 3 時間乾燥した後，20 mg(力価)相当量を正確に量って 100 mL の全量フラスコに入れ，メタノールを加えて溶かし，更に標線まで同溶媒を加えてサリノマイシンナトリウム標準原液を調製した（この液 1 mL は，サリノマイシンナトリウムとして 0.2 mg(力価)を含有する．）．
使用に際して，標準原液の一定量をメタノール－水（9+1）で正確に希釈し，1 mL 中に 10 µg(力価)を含有するサリノマイシンナトリウム標準液を調製した．

2)

ナラシン標準液
常用標準ナラシン 20 mg(力価)相当量を正確に量って 100 mL の全量フラスコに入れ，メタノールを加えて溶かし，更に標線まで同溶媒を加えてナラシン標準原液を調製した（この液 1 mL
は，ナラシンとして 0.2 mg(力価)を含有する．）．
使用に際して，標準原液の一定量をメタノール－水（9+1）で正確に希釈し，1 mL 中に 8 µg(力価)を含有するナラシン標準液を調製した．

3)

モネンシンナトリウム標準液
常用標準モネンシン 20 mg(力価)相当量を正確に量って 100 mL の全量フラスコに入れ，メタノールを加えて溶かし，更に標線まで同溶媒を加えてモネンシンナトリウム標準原液を調製した（この液 1 mL は，モネンシンナトリウムとして 0.2 mg(力価)を含有する．）．
使用に際して，標準原液の一定量をメタノール－水（9+1）で正確に希釈し，1 mL 中に 6 µg(力価)を含有するモネンシンナトリウム標準液を調製した．

4)

カラムクロマトグラフ用塩基性アルミナ比較試験を行った塩基性アルミナは，表 2 のとおりである．

ポリエーテル系抗生物質の定量に用いる塩基性アルミナの検討

83

表2

塩基性アルミナの種類
製品名粒度製造番号
製造（販売）業者
ActivatedAluminas
CG-20
80-200meshA1-192
Alcoa
Indstrial Chemicals①80-200 mesh P567098
GFS Chemicals② Alumina Activated #670 Alcoa #CG20
80-200 mesh P672606
GFS Chemicals③ Alumina Activated #670 Alcoa #CG20
80-200 mesh 803-04
Engelhard④ Chromatographic alumina CG-20⑤ Aluminium Oxide 90 Active Basic Art.1076 70-230 mesh TA1237076 Merck⑥ Aluminium Oxide 90 Active Basic Art.1076 70-230 mesh TA1306676 Merck⑦ Aluminium Oxide 90 Active Basic Art.1076 70-230 mesh TA1326276 Merck
80-200 mesh 112K0955 Sigma-Aldrich⑧ Aluminum oxide Type F-20
Alumina,Activated,
BasicBrockmann
I
40-200 mesh L137915
GFS Chemicals⑨2.31)

装置及び器具液体クロマトグラフ
溶 離 液 用 ポ ン プ：島津製作所製 LC-9AD
オ ー ト サ ン プ ラ ー：日本分光製 AS-950
紫外可視吸光光度検出器：島津製作所製 SPD-10AV
反 応 液 用 ポ ン プ：島津製作所製 LC-9AD
反2)
2.41)

槽：島津製作所製 CRB-6A

応

カラム

恒温

槽：島津製作所製 CTO-6A

データ処

理機：島津製作所製 C-R6A

マグネチックスターラー：柴田科学製 MU-4
定量方法
抽出

試料（サリノマイシンナトリウム及びナラシンでは中すう育成用配合飼料，モネンシンナト
リウムでは肉用牛肥育用配合飼料）10.0 g を量って 200 mL の共栓三角フラスコに入れ，標準液100 mL を加え，マグネチックスターラーで 20 分間かき混ぜた後，ろ紙（5 種 A）でろ過し，カラムクロマトグラフィーに供する試料溶液とした．
2)

カラムクロマトグラフィー
カラムクロマトグラフ用塩基性アルミナ 12 g をカラム管（内径 14 mm）に乾式で充てんし，クリーンアップ用カラムを調製した．試料溶液をカラムに入れ，流出液 5 mL 毎の画分を採取し，液体クロマトグラフィーに供する試料溶液とした．

3)

液体クロマトグラフィー
試料溶液及び標準液 20 µL を液体クロマトグラフに注入し，クロマトグラムを得た．
測定条件
検出器：紫外可視吸光光度検出器（測定波長：520 nm）

カラ

ム：Shim-pack VP-ODS（内径 4.6 mm，長さ 150 mm，粒径 5 µm）

溶

離液：メタノール-水-酢酸（94+6+0.1）

反応

液：硫酸 10 mL をメタノール 475 mL にかき混ぜながら徐々に加えた後，バニリン 15 g を加えて溶かす（用時調製）．

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飼料研究報告 Vol.32 (2007)

流速：溶離液 0.6 mL/min，反応液 0.6 mL/min

カラム槽温度：40°C
反 応 槽 温 度：95°C4)計算得られたクロマトグラムからピーク面積を求め，各標準液におけるピーク面積に対する各試料液におけるピーク面積の比を求め，各抗生物質の回収率として算出した．
33.11)

結果及び考察液体クロマトグラフィーによる回収率の確認
サリノマイシンナトリウムについて
中すう育成用配合飼料にサリノマイシンナトリウム標準液（10 µg(力価)/mL）を添加した試料液を表 3 の①から⑨の各カラムクロマトグラフ用塩基性アルミナに入れ，各流出画分を採取し，サリノマイシンナトリウムの回収率を求めたところ，表 3，図 1 の結果となった．
通常使用してきた①のカラムクロマトグラフ用塩基性アルミナと同等の挙動を示すものとしては⑤及び⑧があり，0~5 mL の画分で吸着が認められたが，10 mL 以降の画分でほぼ同等の挙動を示すものとして⑥，⑦及び⑨があった．また複数のロットが入手可能であった②及び③並びに⑤，⑥及び⑦ではロット差が認められた．

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ポリエーテル系抗生物質の定量に用いる塩基性アルミナの検討

表3サリノマイシンナトリウム中すう育成用配合飼料：10 µg(力価)/mL
回収率：%
製品名

製造番号

流出画分（mL）~5~10~15~20~25~30① Activated Aluminas CG-20

A1-1929797

9710010196② Alumina Activated #670 Alcoa #CG20803-04

53

104

105

108

107

102

③ Alumina Activated #670 Alcoa #CG20P567098

25109110110

110

108

④ Chromatographic alumina CG-20P672606

695107108108105⑤ Aluminium Oxide 90 Active Basic Art.1076 L137915919610010110197⑥ Aluminium Oxide 90 Active Basic Art.1076 TA1237076

7698102103

100101⑦ Aluminium Oxide 90 Active Basic Art.1076 TA1306676

719798102107106⑧ Aluminum oxide Type F-20TA1326276

104

100

101100103103⑨ Alumina, Activated, Basic Brockmann I112K0955

77

92

96

96

100

104

図1120

サリノマイシンナトリウム回収率(%)

100
80
60
402000.02)

5.0

10.0

15.0
20.0画分(mL)

25.0

30.0

①②
③④
⑤⑥⑦⑧⑨

ナラシン
中すう育成用配合飼料にナラシン標準液（8 µg(力価)/mL）を添加した試料液を表 3 の①から⑨の各カラムクロマトグラフ用塩基性アルミナに入れ，各流出画分を採取し，ナラシンの回収率を求めたところ，表 4，図 2 の結果となった．
通常使用してきた①のカラムクロマトグラフ用塩基性アルミナと同等の挙動を示すものとしては⑤及び⑧があり，0~5 mL の画分で吸着が認められたが，10 mL 以降の画分でほぼ同等の挙動を示すものとして⑥，⑦及び⑨があった．また複数のロットが入手可能であった②及び③並
びに⑤，⑥及び⑦ではロット差が認められた．

86

飼料研究報告 Vol.32 (2007)

表4ナラシン

中すう育成用配合飼料：8 µg(力価)/mL
回収率：%
製品名流出画分（mL）

製造番号~5~10~15~20~25~30① Activated Aluminas CG-20A1-192

101101

99101

101101② Alumina Activated #670 Alcoa #CG20803-04

63104

104106

107

108③ Alumina Activated #670 Alcoa #CG20P56709828106107109

108105④ Chromatographic alumina CG-20

P672606

2193112110

109110⑤ Aluminium Oxide 90 Active Basic Art.1076 L137915

97

100

97

105105103⑥ Aluminium Oxide 90 Active Basic Art.1076 TA1237076

8395

97101

101

102

⑦ Aluminium Oxide 90 Active Basic Art.1076 TA1306676

77

96

98

98

102

105

⑧ Aluminum oxide Type F-20TA1326276

106100

104

104

103

103

⑨ Alumina, Activated, Basic Brockmann I112K0955

88

97

100

100103

103

図2120

ナラシン
①
②
③
④
⑤
⑥
⑦⑧
⑨

回収率(%)

100
80
60
40
2000.03)

5.0

10.0

15.0
画分(mL)

20.025.030.0

モネンシンナトリウム
肉用牛肥育用配合飼料にモネンシンナトリウム標準液（6 µg(力価)/mL）を添加した試料液を
表３の①から⑨の各カラムクロマトグラフ用塩基性アルミナに入れ，各流出画分を採取し，モネンシンナトリウムの回収率を求めたところ，表 5，図 3 の結果となった．
通常使用してきた①のカラムクロマトグラフ用塩基性アルミナと同等の挙動を示すものとしては⑤，⑥，⑧及び⑨があり，0~5 mL の画分で吸着が認められたが，10 mL 以降の画分でほぼ同等の挙動を示すものとして⑦があった．また複数のロットが入手可能であった②及び③並びに⑤，⑥及び⑦ではロット差が認められた．

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ポリエーテル系抗生物質の定量に用いる塩基性アルミナの検討

表5モネンシンナトリウム

肉用牛肥育用配合飼料：6 µg(力価)/mL
回収率：%
製品名

製造番号

流出画分（mL）~5~10~15~20~25~30① Activated Aluminas CG-20A1-192

109102

103

102

103

103

② Alumina Activated #670 Alcoa #CG20803-04

85110108107108

106③ Alumina Activated #670 Alcoa #CG20P567098

381120128

131

128

④ Chromatographic alumina CG-20

P672606

02987

117

130

136

⑤ Aluminium Oxide 90 Active Basic Art.1076 L137915

105

101

103

102

103

102

⑥ Aluminium Oxide 90 Active Basic Art.1076 TA1237076

102

104

105

106

105

103

⑦ Aluminium Oxide 90 Active Basic Art.1076 TA1306676

96107

105

103

105

103

⑧ Aluminum oxide Type F-20TA1326276

110101101101101

102⑨ Alumina, Activated, Basic Brockmann I112K0955

100102101102102103

図3140

モネンシンナトリウム回収率(%)

1201008060
40
2000.0

3.2

5.0

10.0

15.0
20.0
画分(mL)

25.0

30.0①②③④⑤⑥⑦⑧⑨

Activated Aluminas CG-20 の同等品について
3.1 の 1)~3)の試験結果から，また図 4~6 のとおり，3 種類のポリエーテル系抗生物質の定量で用 い る カ ラ ム ク ロ マ ト グ ラ フ 用 塩 基 性 ア ル ミ ナ ① Activated Aluminas CG-20 （ Alcoa IndstrialChemicals 製）の同等品として，⑥Aluminium Oxide 90 Active Basic Art. 1076（Merck 製）及び⑧Aluminum oxide Type F-20（Sigma-Aldrich 製）が比較的良好と判断できた．
しかし，⑥Aluminium Oxide 90 Active Basic Art. 1076 は，粒度が 70-230 mesh と①ActivatedAluminas CG-20 の 80-200 mesh と異なり，また多数のロットが流通しており，ロット差も認められたことから，同等品として扱うには問題があると判断した．また，⑧Aluminum oxide Type F-20
は，粒度が 80-200 mesh と①Activated Aluminas CG-20 と同じであったことから，今後はこれを同等品として扱って問題ないと判断した．

88

飼料研究報告 Vol.32 (2007)

図4

回収率（%)

105

サリノマイシンナトリウム

100

①⑧⑥95
900.0

5.0

10.0

図5110
回収率(%)

15.0
20.0画分（mL）

25.0

30.0

ナラシン

105

①⑧⑥100950.05.010.0

図6112

15.0
20.0画分（mL）

25.0

30.0

モネンシンナトリウム回収率(%)

110108①⑧⑥106104102
1000.03.31)

5.0

10.0

15.0
画分(mL)

20.0

25.0

30.0

微生物学的定量法による回収率の確認
サリノマイシンナトリウムサリノマイシンが 50 mg(力価)/トン添加された市販の中すう育成用配合飼料及び幼中すう育成用配合飼料について，①Activated Aluminas CG-20 及び⑧Aluminum oxide Type F-20 を用いて微生物学的定量法（飼料分析基準 10.12.1 の(2)）により定量し，得られた表示量に対する回収率を比較した．
その結果，表 6 のとおり，回収率に顕著な差は認められなかった．

2)

ナラシン
ナラシンが 80 mg(力価)/トン添加された市販の 2 種類のブロイラー肥育前期用配合飼料について，①Activated Aluminas CG-20 及び⑧Aluminum oxide Type F-20 を用いて微生物学的定量法

89

ポリエーテル系抗生物質の定量に用いる塩基性アルミナの検討（飼料分析基準 10.31.1 の(2)）により定量し，得られた表示量に対する回収率を比較した．
その結果，表 6 のとおり，回収率に顕著な差は認められなかった．
3)

モネンシンナトリウムモネンシンナトリウムが 30 mg(力価)/トン添加された市販の 2 種類の肉用牛肥育用配合飼料について，①Activated Aluminas CG-20 及び⑧Aluminum oxide Type F-20 を用いて微生物学的定量法（飼料分析基準 10.25.1 の(3)）により定量し，得られた表示量に対する回収率を比較した．
その結果，表 6 のとおり，回収率に顕著な差は認められなかった．
表6

微生物学的定量法による回収率

回収率：%
抗生物質名

①Activated⑧Aluminum
Aluminas CG-20 oxide Type F-20

飼料の種類

サリノマイシン 中すう育成用
ナトリウム
幼中すう育成用
ナラシン
ブロイラー肥育前期用
ブロイラー肥育前期用
モネンシンナト 肉用牛肥育用リウム
肉用牛肥育用4（n =2）11710010311211210312196103111113107

まとめ

ポリエーテル系抗生物質の微生物学的定量法で用いるカラムクロマトグラフ用塩基性アルミナの同等品について検討したところ，飼料分析基準に規定された Activated Aluminas F-20（Alcoa 製）及び Activated Aluminas CG-20（ Alcoa Indstrial Chemicals 製）の同等品として，Aluminum oxide Type F-20（Sigma-Aldrich 製）が適当と考えられた．
文献1) 農林水産省生産局長通知：“飼料分析基準の制定について”，平成 7 年 11 月 15 日，7 畜 B 第 1660号 (1995).
2) 小山敬之：飼料研究報告，6，163 (1980).
3) 安倍豊子，河野敏威：飼料研究報告，6，122 (1980).
4) 草間豊子：飼料研究報告，11，124 (1986).
5) 安倍豊子，河野敏威：飼料研究報告，6，114 (1980).
6) 草間豊子：飼料研究報告，11，107 (1986).
7) 千原哲夫：飼料研究報告，27，80 (2002).