研究報告
秦野研究所年報
35, 26-34（2012）

同一個体を用いたマウス皮膚コメット・小核組み合わせ試験の有用性
豊泉友康 1，川上久美子 1，中川ゆづき 2，野口 聡 3，臼見憲司 3，桑形麻樹子 3，須井 哉 1，太田 亮 4，山影康次 2
Usefulness of combined with skin comet assay andskin micronucleus test using same mouse
Tomoyasu TOYOIZUMI1, Kumiko KAWAKAMI1, Yuzuki NAKAGAWA2, Satoshi NOGUCHI3, Kenji USUMI3,Makiko KUWAGATA3, Hajime SUI1, Ryo OHTA4, Kohji YAMAKAGE2

The aim of the present study was to explore the usefulness of the new test method. Three carcinogens(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine: MNNG, 4-nitroquinoline 1-oxide: 4NQO, benzo[a]pyrene: B[a]P) were evaluated using the combined in vivo skin comet assay and in vivo skin micronucleus test. In
the 4NQO, significant increases in the percent of DNA (%DNA) in the tail and frequency of MN (%MN)
were observed in epidermal skin cells. In the MNNG, significant increases in the %DNA in the tail wereobserved, however there were no significant increases of %MN. In the B[a]P, significant increases in the%DNA in the tail and %MN were observed. This combined test can evaluate different genotoxicity insame the sampling time. And this test also would lead to reduce the number of animals required.

諸言する染色体異常試験と比較して，異常の判断およ遺伝毒性試験は，遺伝子への傷害を指標として，び試験法が容易などの利点を有する．

化学物質の発癌性の有無をスクリーニングする試In vivo 試験で汎用されている小核試験は，染色験法である．細菌，培養細胞および動物を用いた体異常の誘発を指標とするため，細胞増殖性の高遺伝毒性試験があり，in vivo 試験では，DNA 損い臓器を評価対象とし，限られた部位での遺伝毒傷を検出するアルカリコメットアッセイ（以下，性評価となる欠点を有する．しかし，上述の通り，コメットアッセイ），不定期 DNA 合成試験，染コメットアッセイは，対象臓器の細胞増殖性に依色体異常を検出する小核試験，遺伝子突然変異を存しない試験であるため，小核試験と組み合わせ検出するトランスジェニック動物を用いた遺伝子ることで，その欠点を補完できる可能性がある．

突然変異試験などがある．これらの試験の中

そこで，最近コメットアッセイおよび小核試験ので，コメットアッセイは，①少数の細胞で評価す組み合わせ試験が用いられるようになってきているため臓器の一部があれば解析が可能，②試験時

る 5,6）．この組み合わせ試験は，同一個体の異なる間が短時間のため迅速な結果の収集が可能，③対臓器での組み合わせがよく用いられるが，同一臓象臓器の細胞増殖性に依存せず，細胞単離が可能器でも試験が可能である．しかし，同一臓器の場であればすべての臓器を評価対象とすることが可

合は，上述の小核試験の特徴から必ずしも容易と能などの利点を有する．一方，小核試験は，染色ならない場合がある．皮膚に関しては，既に小核体異常に起因して生じる小核を数えることで染色試験の有用性が報告されており 7），コメットアッ体異常誘発性を調べる試験で，直接染色体を観察セイとの組み合わせが容易であると考えられた．

1 - 4）

1

代替法試験部遺伝学研究室

2

代替法試験部細胞毒性学研究室

3毒性部病理学研究室

4毒性部毒性学研究室

26

本研究では，遺伝毒性物質であり，かつ，皮膚で発癌性を示す物質でもある，4-nitroquinoline
1 -oxide（ 4 NQO）8 , 9），N-methyl-N’-nitro-N10,11）
nitrosoguanidine（MNNG）
お よ び benzo[a]研究報告12）pyrene（B[a]P）を用いて，同一個体の皮膚表皮細布部位を消毒用エタノール含浸綿で軽く拭いた胞を用いるコメットアッセイおよび小核試験の組後，投与範囲（約 3 × 4 cm）の皮膚を，カミソリみ合わせ試験の有用性を検討したので報告する．

刃を用いて摘出した．摘出した皮膚は氷冷したPBS（-）で洗い，脂肪等の余分な組織を除去した．

材料および方法

その際，一部（約 1 × 1 cm 以上）の皮膚は，病理1. 使用動物

組織標本用として，10 v/v% 中性ホルマリン溶液

日本エスエルシーから 6 週齢で購入した雄ヘで固定した．真皮側が濾紙に接するように貼りアレスマウス（Hos:HR-1，星野試験動物飼育所，付けた皮膚片付き濾紙をキムタオルで挟み，手茨城）を，入荷後 6 日間，検疫と馴化を兼ねて飼で軽く押して水分を除いた後，皮膚片を濾紙ご育し，その間の一般状態に異常の認められなかっとカミソリ刃で 1～3 mm 幅の短冊状に細切した．

た動物を試験に使用した．なお，実験では各群 3細切した皮膚片付き濾紙を 0. 02 w/v% EDTA 溶匹を使用した．全ての実験操作は，「財団法人食液に浸し，氷上で静置した．10 分後，皮膚片付品薬品安全センター秦野研究所 動物実験に関すき濾紙を 0 . 25 w/v% トリプシン溶液に浸し，冷る指針」に基づいて実施した．

蔵・遮光下で 1 晩静置した．静置後，皮膚片付

2. 投与検体の調製および投与

き濾紙を氷冷した PBS（-）に浸し，軽く洗った皮

4NQO，MNNG および B[a]P のそれぞれの濃度は，既報の論文

膚片から表皮を剥離し，ウシ血清（Invitrogen，を参考に設定した．4 NQOCarlsbad，CA）を 10 v/v% 含む約 10 mL の MEM（CAS 番号：56-57- 5，和光純薬工業），MNNG（以下 MEM）が入った 15 mL チューブに移した．

（CAS 番号：70- 25 -7，関東化学，東京）および

表 皮 を 集 め た 15 mL チ ュ ー ブ は， ロ ー タ リ ーB[a]P（CAS 番 号：025- 01113， 和 光 純 薬 工 業）

シェーカーを用いて約 4 ºC で 1 時間緩やかに攪拌はそれぞれ秤量後，アセトン（和光純薬工業）おした．攪拌後の MEM をポアサイズ 70 µm のセルよびオリブ油（小堺製薬，東京）を 4：1 で混合しストレーナーで濾過し，濾過した細胞浮遊液をコた媒体（AOO）を加えてボルテックスミキサーでメットアッセイおよび小核試験用として，それぞ攪拌溶解させた．4NQO は 0 .05，0.1 および 0 . 2

れ以下の手順でスライド標本を作製した．

w/v%，MNNG は 0. 01，0 .02，0. 05 お よ び 0 . 12）コメットアッセイ

w/v%，B[a]P は 0 .2，0. 5，1 および 2 w/v% とな（1）
スライド標本の作製るよう AOO で調製した．なお，これらはいずれ標本作製の前に，スライドグラスを1.0 w/v%電13 - 15）

気泳動用アガロース液（Type Iアガロース，Sigma-も用時調製した．
投与期間および投与回数について，西川らは，解剖の 72，48 および 24 時間前の計 3 回反復経皮Aldrich，St. Louis，MO）に浸し，自然乾燥させて，アガーコートスライドガラスを作製した．

塗布が皮膚小核試験の検出力を増加させるため最高用量群で最も小さい動物番号の細胞浮遊液に有用であることを報告している ．また，我々から採取した 10 µL を 10 µL の 20 µg/mL 臭化エは，解剖の 24 あるいは 3 時間前の単回経皮塗布

チジウム液と混合し，蛍光顕微鏡下で，血球計算が皮膚コメットアッセイで DNA 損傷を検出する盤を用いて細胞数を計測した．その値を基に細胞ために有用であることを確認している．そこ

浮遊液の希釈率を決定した．他の動物から単離しで，本試験では，これら 2 つの報告を組み合わせた細胞浮遊液についても，同じ希釈率を適用した．

た，解剖 72，48，24 および 3 時間前の反復経皮細胞浮遊液の一部を遠心（510 × g，5 分間，4 ºC）塗布を採用した．投与検体は，動物の背部皮膚（約し，上清を除いた後，氷冷したミンス緩衝液（203 × 4 cm）に塗布し，1 回塗布量は，1 個体につきmM EDTA 2 Na，10 v/v% DMSO in Hanks’

0 .2 mL/ 匹とした．

Balanced Salt Solution，pH 7. 5）を加え，1 .5 ×

3. 実験方法

106 細胞 /mL の細胞浮遊液を調製した．360 µL

1）皮膚片の摘出，皮膚表皮細胞の単離の 0 . 5 w/v% 低融点アガロース液（NuSieve GTG，7）

13）

最終塗布の約 3 時間後に動物を安楽死させ，塗Lonza，Basel, Swiss）に 40 µL の細胞浮遊液を加27

秦野研究所年報 Vol. 35. 2012

えて数秒間ボルテックスミキサーで混合した．ブ3）小核試験

ラインド番号を記したアガーコートスライドグラ（1）スライド標本の作製

スに 150 µL 滴下し，24 × 60 mm のカバーガラ

単離した細胞浮遊液を遠心し（310×g，5分間，ス（IWAKI，東京）をかけ，氷上に置いたステン

室温），上清を除去して細胞をほぐした後，冷却しレストレーの上に置き，固化させた．1 個体あた

た約10 mLのMEMを加えて再浮遊させた．再度遠り，2 枚のスライド標本を作製した．

心し，上清を除去して細胞をほぐした後，37ºCに保（2）細胞溶解および電気泳動

温した10 mLの75 mmol/L KClを少しずつ加えて軽標本のカバーガラスを除去し，予冷しておいた

く転倒混和した．37ºCのウォーターバス中に15分細胞溶解液（100 mmol/L EDTA 2 Na，2.5 mol/間静置し，低張処理した．その後，冷却した1.25

L NaCl，10 mmol/L tris，1 v/v% triton-X 100，mLのカルノア液（酢酸：メタノール＝1：3）を少し10 v/v% DMSO）に浸し，冷蔵で 4～6 時間静置しずつ加えて軽く転倒混和し，遠心した．上清を除去た．細胞溶解液から標本を取り出し，予冷してして細胞をほぐした後，冷却した10 mLのカルノア

おいた精製水でリンス後，電気泳動槽（BE- 540，液を加えて，軽く転倒混和した後，遠心する操作をバイオクラフト，東京）のゲルトレー上に標本2回繰り返した．上清を除去して細胞をほぐした後，をランダムに並べた．アルカリ電気泳動液（0. 3

冷却した10 mLの1 v/v%酢酸メタノール液（酢酸：mmol/L NaOH，1 mmol/L EDTA 2 Na）
を1 L注

メタノール=1：99）を加えて軽く転倒混和した．細ぎ，20 分間静置して，アンワインドした後，約胞浮遊液を遠心し，上清を除去して細胞をほぐした

26 V（約 0.7 V/cm）に設定し，4 ºC で 20 分間電気後，1 v/v%酢酸メタノール液を適量加えて細胞懸濁泳動した．電気泳動終了後，予冷しておいた精製液を得た．スライドグラスに細胞懸濁液を滴下して，水で標本をリンス後，中和液（0. 4 mol/L Tris）に1個体あたり2枚のスライド標本を作製した．

20 分間浸して中和した．中和後，標本をエタノー（2）
標本染色および観察

ルに 10 分間浸して脱水し，自然乾燥し，室温で標本観察の直前に，ゼーレンゼンの 1/ 15 mol/保管した．

L リン酸緩衝液に溶解した 40 µg/mL のアクリジ（3）標本染色および観察

ンオレンジをスライド標本に数滴滴下してカバー

標本観察の直前に，SYBR Gold染色液（Invitrogen，グラスをかけた．標本あたり 1 , 000 細胞（1 個体原液の10,000倍希釈）を標本に50 µL滴下し，カバー

あたり 2 枚の標本により 2 , 000 細胞）を蛍光顕微ガラスをかけて染色した．観察は，蛍光顕微鏡下で鏡下で 400 倍の倍率で観察し，そのうち，小核を200倍の倍率で行った．まず，標本あたり50細胞有する表皮細胞の数を記録した．

（1個体あたり2枚の標本により100細胞）について，4）
病理組織学および免疫組織化学検査

ヘッド部位が小さい細胞（ヘッジホッグ）の出現数をコメットアッセイのみが陽性の時には，常法に記録した．次に，標本あたり50細胞（1個体あたり従ってヘマトキシリン・エオジン（HE）染色標本2枚の標本により100細胞）について，デジタルカメを作製して病理組織学検査を実施した．また，陰ラ（A312f-VIS，Basler，東京）を用いて標本観察像

性対照群と MNNG の最高用量群（0. 1 w/v% 投与を取り込み，コメット分析ソフト（Comet assay IV，群）の各 3 例においては細胞分裂マーカーである

バ ー ジ ョ ン 番 号：4.11，Perspective Instruments，Ki 67 抗体による免疫組織化学観察を行い，表皮Bury St Edmunds，UK）を用いて解析を行った．前の分裂能を評価した．各標本 5 視野を無作為に選述したヘッジホッグは死細胞の可能性があるため，択して表皮細胞中の Ki 67 陽性細胞を数え，表皮画像解析の対象外とした．DNA損傷性の評価は，単位面積あたりの Ki 67 陽性細胞数を算出した．

%DNA in tail（Comet assay IVのパラメーターではTail intensity：Tail中のDNA蛍光強度/全体のDNAデータ解析

蛍光強度×100）を用いた．観察終了後，カバーガラ

1）
コメットアッセイ

スを除去し，標本をエタノールに10分間浸し，自然･ 多群間での比較の場合乾燥させた後，室温で保管した．

個体ごとの %DNA in tail およびヘッジホッグ

28

研究報告

表14 NQO のマウス皮膚コメット・小核組み合わせ試験結果
Skin comet assay% DNA in tailNo. ofanimalsGroupSkin micronucleus test

Frequency of hedgehogs

Observed Average (S.D.)
cells
of 100 cells

Observedcells% ofhedgehogs

Observedcells

No. ofMN cells

1100

14 . 9 ( 18 . 4 )10010200012100

16 . 8 ( 19 . 8 )10027200003100

16 . 3 ( 18 . 2 )1001620002Total−−−53−

3Average ± S.D.

300

16 . 0 ± 0 . 9300

17 . 7 ± 8 . 6

6000

0 . 05 ± 0 .05

1100

25 . 0 ( 18 . 1 )10016200022100

20 . 3 ( 17 . 5 )100152000

9Negativecontrol   AOO

4 NQO                     0.05 w/v%

3100

23 . 6 ( 21 . 6 )1001520005Total−−−466000

16Average ± S.D.

300

22 . 9 ± 2 . 3300

15 . 3 ± 0 . 6−

0 . 27 ± 0 . 18 ††1100

38 . 3 ( 21 . 4 )

100

25

2000

21210036 . 1 ( 21 . 9 )10016200018

3100

35 . 9 ( 24 . 3 )

100

20

2000

164 NQO                       0.1 w/v%

Total−−−616000

55

Average ± S.D.

300

36 . 8 ± 1. 5 **300

20 . 3 ± 4 . 5−0 . 92 ± 0 . 13 ††4 NQO                         0.2 w/v%110021 . 0 ( 23 . 1 )

100

65

2100

34 . 8 ( 26 . 3 )

76

82

3100

38 . 4 ( 23 . 8 )

80

63

Total

−−−

210

Average ± S.D.

300

31 . 4 ± 1 . 7 *256

70 . 0 ± 10 . 4 ##Toxicity

AOO, Acetone:olive oil (4:1); 4NQO,4-Nitroquinoline 1 -oxide*, **, Significantly higher than the negative control at 5 or 1 % level (Dunnett’s test, two-tailed).
##, Significantly higher than the negative control at 1 % level (Dunnett’s test, one-tailed).
††, Significantly different from the negative control at 5 or 1 % level (Kastenbaum and Bowman’s table).の平均値について，陰性対照群と各投与群（0. 053）
免疫組織化学検査～0.2 w/v% 4 NQO，0.01～0.1 w/v% MNNG お

個体ごとの Ki 67 陽性細胞数の平均値についよび 0.2～1 w/v% B[a]P 投与群）との間で，それて，陰性対照群と 0 . 1 w/v% MNNG 投与群の間ぞれ有意水準 5% で Dunnett 検定（両側検定，パで，有意水準 5 % で Student’s t 検定
（両側検定）

ラ メ ト リ ッ ク）お よ び Dunnett 検 定（ 片 側 検 定，を行った 17）．

パラメトリック）を行った 16）．
･ 2 群間での比較の場合

結果

個体ごとの %DNA in tail およびヘッジホッグ4 NQO（表 1）については，コメットアッセイの平均値について，陰性対照群と 2 w/v% B[a]の 結 果，0. 1 お よ び 0 . 2 w/v% 投 与 群 に お い て，P 投 与 群 と の 間 で， そ れ ぞ れ 有 意 水 準 5 % で%DNA in tail の有意な増加が認められた．また，Student's t 検定（両側検定）および Student’s t検

0 . 2 w/v% 投与群においては，ヘッジホッグの有定（片側検定）を行った意な増加が認められた．小核試験の結果，0 . 05．

17）2）小核試験

および 0 . 1 w/v% 投与群において，小核出現頻度

小 核 出 現 頻 度 に つ い て， 陰 性 対 照 群 と 各 投の有意な増加が認められた．0. 2 w/v% 投与群に与群との間で，有意水準 5% で条件付二項検定

おいては，強い細胞毒性により，既定の細胞数を（Kastenbaum and Bowman の表）を行った

観察することが不可能であった．

．

18）

29

秦野研究所年報 Vol. 35. 2012

表2

MNNG のマウス皮膚コメット・小核組み合わせ試験結果
Skin comet assayGroup

No. ofanimals

Skin micronucleus test

% DNA in tailFrequency of hedgehogs

Observed       Average (S.D.)                      cellsof 100 cells

Observed        % of                     cells
hedgehogs                          Observedcells

No. of
MN cells

1100  12 . 0 ( 21 . 0 )10010200012100  16 . 8 ( 24 . 0 )10011200003100  9 . 3 ( 15 . 1 )

100

92000

3Total300−300306000

4Average ± S.D.

−

12 . 7 ± 3 . 8−

10 . 0 ± 1 . 0−0 . 07 ± 0 . 08

Negativecontrol
AOO

MNNG
0.01 w/v%

1100   12 . 2 ( 17 . 1 )

100

28

2000

02100   12 . 1 ( 18 . 6 )10010200003100  9 . 3 ( 15 . 6 )1001120000Total

300

−300

49

6000

0Average ± S.D.

−

11 . 2 ± 1 . 7−  16 . 3 ± 10 . 1−0 . 00 ± 0 . 00

1100  21 . 8 ( 15 . 5 )10010200032100  17 . 5 ( 19 . 1 )10016200023100

8 . 8 ( 13 . 4 )10042000

2MNNG
0.02 w/v%

Total

−−300

30

6000

7Average ± S.D.

300

16 . 0 ± 6 . 6−

10 . 0 ± 6 . 0−

0 . 12 ± 0 . 03

1100   25 . 1 ( 18 . 7 )10010200062100   20 . 5 ( 16 . 8 )10012200013100   28 . 2 ( 15 . 8 )

100

92000

0Total300−300

316000

7Average ± S.D.

−

24 . 6 ± 3 . 9 *−10 . 3 ± 1 . 5−

0 . 12 ± 0 . 16

MNNG
0.05 w/v%

MNNG
0.1 w/v%

1100   39 . 4 ( 16 . 3 )10014200042100   48 . 0 ( 15 . 0 )10017200033100   45 . 7 ( 13 . 7 )

100

72000

4Total300−300

386000

11Average ± S.D.

−

44 . 3 ± 4 . 5 **−12 . 7 ± 5 . 1−

0 . 18 ± 0 . 03

AOO, Acetone: olive oil (4:1); MNNG, N-Methyl-N ’-nitro-N-nitrosoguanidine*, **, Significantly higher than the negative control at 5 or 1 % level (Dunnett’s test, two-tailed).

MNNG（表 2）については，コメットアッセイ

B[a]P（表 3）については，コメットアッセイのの結果，0 .05 および 0 .1 w/v% 投与群において，結果，いずれの投与群においても %DNA in tail%DNA in tail の有意な増加が認められた．また，の有意な増加は認められなかった．ヘッジホッグ

ヘッジホッグ分析および小核試験においては，い分析の結果，いずれの投与群においても有意な差ずれの投与群においても有意な差は認められなは認められなかった．小核試験の結果，0 .5，おかった．病理組織学検査の結果，0 .1 w/v% 投与

よび 1 w/v% 投与群において，小核出現頻度の有群において，軽度ではあったが限局性のびらん（図意な増加が認められた．コメットアッセイで 2 w/1，A，B）が観察された．免疫組織化学検査の結v% B[a]P 単回塗布 24 時間後，DNA 損傷性が検果，統計学的に有意な差は認められなかったが，出されていることから 13），同濃度を用いて追加細胞分裂マーカーである Ki67 陽性細胞の減少傾検討（表 4）を行った．その結果，%DNA in tail向（ 図 1，C，D）が観 察さ れ た（陰 性 対 照：18. 1および小核出現頻度の有意な増加が認められた．

± 2.1 細胞 /2,500 µm ，MNNG: 14. 1 ± 2 . 7 細ヘッジホッグについては，2 w/v% 投与群におい胞 /2 ,500 µm ）．て有意な差は認められなかった．

2230

研究報告

図 1 MNNG 塗布後の皮膚組織像
A：陰性対照物質の 4 回反復塗布後の HE 染色像，B：0 . 1 w/v% MNNG の4 回反復塗布後の HE 染色像，C：陰性対照物質の 4 回反復塗布後の Ki 67 染色像，D：0.1 w/v% MNNG の 4 回反復塗布後の Ki 67 染色像．

表3B[a]P のマウス皮膚コメット・小核組み合わせ試験結果
Skin comet assay

GroupNo. ofanimals
1

Negativecontrol   AOOB[a]P0.2 w/v%

B[a]P0.5 w/v%

B[a]P
1 w/v%% DNA in tailObserved Average (S.D.)
cells
of 100 cells
100  12 . 0 ( 21 . 0 )Skin micronucleus test

Frequency of hedgehogs
Observedcells% ofhedgehogs

100

10Observed     cellsNo. ofMN cells

2000

12100  16 . 8 ( 24 . 0 )10011200003100  9 . 3 ( 15 . 1 )

100

92000

3Total300-300

30

6000

4Average ± S.D.

-12 . 7 ± 3 . 8-

10 . 0 ± 1 . 0-0 . 07 ± 0.08

1100  10 . 8 ( 18 . 0 )

100

72000

22100  12 . 1 ( 19 . 4 )10010200033100  13 . 6 ( 18 . 4 )

100

92000

4Total300-300

2660009

Average ± S.D.

-12 . 2 ± 1 . 4-  8 . 7 ± 1 . 5-

0 . 15 ± 0.05

1100  8 . 4 ( 15 . 1 )100112000112100  18 . 3 ( 23 . 4 )

100

62000

53100

9 . 5 ( 12 . 9 )1001120005Total

300

-

300

28600021

Average ± S.D.

-12 . 1 ± 5 . 4-  9 . 3 ± 2 . 9-0 . 35 ± 0.17 ††1100

16 . 4 ( 23. 2 )10013200052100

16 . 4 ( 18. 6 )

100

92000

1631009 . 4 ( 17 . 1 )10013200013Total300-300

35

6000

34

Average ± S.D.

-

14 . 1 ± 4 . 1-

11 . 7 ± 2 . 3-0 . 57 ± 0.28 ††AOO, Acetone:olive oil (4:1); B[a]P, Benzo[a]pyrene††, Significantly different from the negative control at 1 % level (Kastenbaum and Bowman's table).
31