超高圧電子顕微鏡の医生物科学への応用

超高圧電子顕微鏡を用いた生物試料観察の基礎と応用
The Basis and Application for the Observation of Biological Materials
with High Voltage Electron Microscopy
小澤史ａ，ｂ

一

Hitoshi Ozawaａ

日本医科大学大学院医学研究科生体制御形態科学分野ｂ

要旨

大阪大学超高圧電子顕微鏡センター

超高圧電子顕微鏡を用いて生物試料の微細構造を立体的に観察する有用性を示す．構造が複雑な展開を示すもの，方向性が不鮮明な不整形の構造などの観察には大きな力を発揮することが考えられる．これまでの，よく用いられてきたステレオ観察に加え，近年ではトモグラフィー観察の技術も進み，微細構造の三次元化が容易に出来るようになりつつある．従って，超微細構造を局所的観察で考察することから，微細構造の全体像を捉えることが出来るようになりつつある．ユニークなアイデアの惹起によって，超高圧電子顕微鏡が生物試料観察に，さらに大きな手助けを示す可能性が示唆される．これまで我々が行ってきた，神経細胞，神経膠細胞の機能形態学的変化を，超高圧電子顕微鏡を用いて解析するデータも示しながら，実際の有用性について説明する．

キーワード：超高圧電子顕微鏡，三次元観察，トモグラフィー，神経細胞，神経膠細胞る 1 ～ 3）．超高圧電子顕微鏡を用いた，生物研究に関わる研究
1.

はじめに者の間では，その特徴や利点，可能性などについての情報を

電子線照射を用いる電子顕微鏡は，0.2 μm という光学顕共有し，また研究者間の情報交換も多少ながら行われるが，

微 鏡 の 分 解 能 の 限 界 値 を は る か に 超 え た nm（1 nm = 1/

実際に解剖学，病理学，神経科学などの専門分野の学会や研1,000 μm）から Å（1Å = 0.1 nm）という単位で，極めて微細究会で，それらが紹介されても，超高圧電子顕微鏡なるものな構造を観察できる高い解像度をもつ．この解像度を利用しがどういったものであるかの理解が浅く，一般に十分に知れて，電子顕微鏡は 1950 年代半ばから本格的に医学や生物の渡るまでには至っていないのが現状である．

場に導入され，その後半世紀で様々な細胞小器官，神経細胞

本稿においては，まず，超高圧電子顕微鏡の生物学的利用間の伝達の場であるシナプスの構造など，細胞，組織の微細の基礎と応用について解説し，通常の電子顕微鏡との比較を構造の発見とその機能の解析に多大なる貢献をしてきた．こ

論じつつ，具体的な応用例を提示し，今後の可能性についての間，電子顕微鏡自体の進化も目覚ましいものがあり，電子も触れ，本特集の「序」としたい．

線源，照射解析系，試料支持，操作，撮影，画像処理など，コンピュータ技術の進化とも相まって，着実な発展を積み重2.

ねてきている．西暦は 2000 年を越え，21 世紀に入り，電子

超高圧電子顕微鏡は，基本的構造は通常の透過型電子顕微

顕微鏡の貢献は生物学的意義と工学的意義の境を跨ぎ，両者鏡とほとんど同じである．通常の医学生物学に用いられる透の線引きを払拭しつつ，自然や生命を様々な角度から理解す

過型電子顕微鏡は加速電圧が 100 kV 前後であるのに対して，る新しい視点を見出しつつある．

超高圧電子顕微鏡は 1,000 kV ～ 3,000 kV に達する．この超超高圧電子顕微鏡の基本構造と特性

超 高 圧 電 子 顕 微 鏡（High voltage electron microscopy;

高圧の電子線を発する電子顕微鏡は，その外観も極めて巨大UHVEM）は，照射する電子線の加速電圧を高めた極めてユである（図 1）．その高さは電子銃の部分だけでもビルの 2ニークで特殊な電子顕微鏡である．もともとは非生物材料の階分を優に超え，照射系から撮影系まで全てを含めて納める構造観察，解析を目的として開発され実用化されたものであにはビル 3 ～ 4 階分の高さとなり，専用の建物が必要になる．

り，本格的な生物学的応用は，ここ 20 ～ 30 年の出来事であ

内部構造は，電子銃，照射（レンズ）系，試料室，結像系，観察室，カメラ室など，基本構造は通常の透過型電子顕微鏡ａ〒 113–8602 東京都文京区千駄木 1–1–5
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2008 年 9 月 25 日受付

特集

超高圧電子顕微鏡を用いた生物試料観察の基礎と応用とほとんど同じである．ただし，高電圧によって加速され放出された電子線が試料に照射されて，像が確実に結ばれるためには，精度の高い制御システムが必要になってくる．この241【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

図 1 各種透過型電子顕微鏡の大きさの比較図．右側の写真は大阪大学超高圧電子顕微鏡センターの 3000 kV 超高圧電子顕微鏡（図提供：大阪大学，日立ハイテクノロジーズ）ために，鏡筒内全体を 10−6 Pa 以下の高真空度を常に保つ必要が生じ，排気真空系，試料に一様に露光照射するための各種レンズ系，装置内での試料支持のための除振や試料ホルダーの開発が必要になる．

図 2 （A）通常の透過型電子顕微鏡観察用の超薄切片（厚さ（B）超高圧電子顕微鏡用に作成した厚切り80 nm）の模式図．
切片（厚さ 5 μm）の模式図．（A）と（B）は実際の厚みの違いと同じ状況を再現している．両者を比べたとき，厚切り切片において z 軸方向の情報が極めて広がることが理解できる．

一般に，加速電圧が 100 kV 以下の通常の透過型電子顕微鏡では，加速電圧が高まるにつれて蛍光板上の像は明るくなを持った切片の観察が可能となる．すなわち，通常の透過型り，数万倍の高倍率での解像度が特に向上する．しかし，そ電子顕微鏡に比べて，40 ～ 80 倍，z 軸方向の情報を加えての一方で像のコントラストは低下する．この特徴は，超高圧観察することが出来ることを意味する（図 2）．このことは電子顕微鏡においても同様であり，従ってその特徴を生かし超微細構造の三次元化の可能性を意味するものである．て生物学的応用が可能になる．そこで，超高圧電子顕微鏡に加速電圧が高まることは，電子線の試料透過能とそれによおける超高圧加速電子線の照射，超高圧電子顕微鏡特有の構る解像度の向上を生み出す．しかし，試料が薄ければ薄いほ造によって得られる顕微鏡像について触れることにする．

ど，切片の一断面を蛍光板上に結像するので，適切なコントラストが設定できるのであれば，細胞，組織の二次元的な微3.

超高圧電子顕微鏡による生物試料の観察

細構造を観察するには，むしろ通常の透過型電子顕微鏡で十電子顕微鏡の蛍光板に像をきちんと結像するためには，試分であり，また適している．これに対して，高電圧で加速さ料に含まれる細胞・組織の種類，染色などの条件の把握が必れた結果得られる電子顕微鏡像は，厚い試料を透過した結果要であるが，大きな要因の一つに観察試料の厚さがあげられの投影像であり，その厚みの中には薄い試料に比べて，多くる．通常の透過型電子顕微鏡（100 kV）では，例えばごく一の情報量が含まれることもある．具体的には厚みのある試料

般的に用いられるグルタールアルデヒド―オスミウム酸によの情報は二次元的情報（x-y 面の情報）から，厚みという zる二重固定後，（場合によりウランブロック染色を加え）エ軸方向の情報を加えることになり，このことは二次元的な微ポキシ樹脂に包埋し，切片を作成して，ウラン・鉛染色によっ細構造の情報が z 軸方向分の厚さ重なり，それが 1 つの圧縮てコントラストを付ける方法では，おおよそ 60 ～ 90 nm の像として投影され，結像されていることを意味する．そこで，厚さの超薄切片の観察が行われる．加速電圧が高まると，こ生物学的には超高圧電子顕微鏡の蛍光板に投影された三次元の試料の透過性も高まっていく．しかし，同じ電子顕微鏡で，情報（z 軸方向）を含む圧縮された二次元的投影像をいかに200 ～ 300 nm の切片を観察すると像自体は観察することがして三次元に戻し，三次元的微細構造を描出するかが重要な出来るが，きっちりとした焦点合わせが難しくなり，細部の応用ポイントとなってくる．

構造が不鮮明となる．このことは，100 kV の加速電圧でも，そのための手段として，現在，2 つの方法が用いられる．

電子線はこの厚さの試料を透過することは出来るが，適切な1 つは観察する試料を傾斜して撮影し，撮影した複数の傾斜解像度を得るには不十分であることを物語るものである．こ像から立体像を得る方法である．試料ホルダーを ± 8° に傾の切片を 200 kV の電子顕微鏡で観察すれば，解像度は格段斜し，それによって得た組写真をステレオ観察する．裸眼視に向上する．一方，1000 kV ～ 3000 kV の超高圧電子顕微鏡が難しい場合には特別のステレオスコープによって立体視すを用いて，この切片を観察すると，逆にコントラストが低下る．

し，あるいは何も識別出来ない可能性も出てくる．1000 kV

さらに 2 枚のステレオ像の原理を用いて，より詳細に発展以上の高い加速電圧が加わる場合には，実用的には 3 ～応用するのがトモグラフィー観察法である．試料ホルダーの5 μm の厚さの切片を電子線が透過し，顕微鏡像を結ぶ．従っ

傾斜角度を ± 60° に広げ，1° 毎に連続撮影を行う．これによって，通常の透過型電子顕微鏡の観察試料の 40 ～ 80 倍の厚みて得られた観察像をコンピュータソフト（cf. IMOD）によっ

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顕微鏡 Vol. 43, No. 4（2008）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

て処理することにより，三次元化して観察することが出来る．

副腎皮質ステロイドホルモンは，脳におけるストレス応答

細胞内微細構造や細胞の全体像などの観察に加え，免疫組系に重要な役割を果たしている．一連のストレス反応には，織化学法を用いた物質局在の解析について，特に微細構造上視床下部―下垂体―副腎皮質系がその中心的な役割を果たの局在解析には電子顕微鏡レベルの解析がもっとも詳細で確す．副腎皮質束状帯からコルチゾールが分泌されるが，これ実な情報が得られる．二次元的な微細構造の情報を連続的に

は下垂体からの ACTH の刺激を受け，さらに ACTH は視床重ね合わせて，三次元的情報を再構築することも可能である

下部室傍核の小細胞性領域に分布する CRH（corticotropinが，この場合には連続切片の観察という，極めてハードな課releasing hormone）産生によってその分泌が刺激される．コ

題をこなさなければならない．この点，はじめから厚みのあルチゾールはその化学的性状が脂溶性であることから，血液る切片を一度に観察することが出来る超高圧電子顕微鏡はよ

脳関門において排除されず脳内に直接入ることが出来，コルり簡便なものであり，勝手がよい．しかしながら「超高圧」

チゾールに対する受容体を有する神経細胞に直接作用する．

によって透過する電子線に反応する，言い換えればコントラ

コルチゾールに対する受容体はタンパクであり，通常細胞質ストを作り得る染色，マーキングが必要になる．これらの超に分散している．コルチゾールと特異的に結合することに高圧電子顕微鏡観察のための長所，短所を理解し，研究展開

よって，受容体は活性化され核内に移行し，DNA のホルモの戦略と組み合わせることにより，超高圧電子顕微鏡が微細

ン 応 答 配 列（Hormone response element; HRE） と 結 合 し，構造の三次元化という極めて魅力的な情報描出のツールにな

その結果転写が進み，特定の遺伝子が発現され，細胞機能のり得る．

発現，細胞構造の維持などに働くと考えられる．脳内には二種類の副腎皮質ステロイドホルモン受容体が存在する．一つ4.

超高圧電子顕微鏡による神経細胞，神経膠細胞の観察

はミネラルコルチコイド受容体（Type I）であり，コルチゾー

さて，実際の超高圧電子顕微鏡による観察例を示す．そのルやアルドステロンと高い親和性を有する．他はグルココル

代表的なものにゴルジ鍍銀染色による脳の神経細胞や神経膠チコイド受容体（Type II）であり，コルチゾールとの親和性細胞の観察がある．ゴルジ鍍銀染色自体は，19 世紀末にかは Type I に比して低い親和性を示す．血中のコルチゾールの有名な Camillo Golgi によって開発された染色法であり，値が低い状態ではミネラルコルチコイド受容体が優位に働く

極めて古典的な染色技法で，その原理については未だはっきが，コルチゾール値が高い場合，すなわち，ストレス環境下りしない点も多く，さらにその染色性は不安定なため，なかにおいては，よりグルココルチコイド受容体が重要な意味をなか難しい染色法である．しかし，適切に染色された標本でなすことになる．脳において，視床下部室傍核の CRH 産生は，ニューロンやグリアの構造が鮮やかに観察される．ゴルニューロンには豊富なグルココルチコイド受容体が発現してジ鍍銀染色では，細胞質内に沈着した銀の重金属が電子線のおり，コルチゾールの直接作用を受けることがわかる．この透過を遮り，この結果，非染色部位とのコントラストが極めほかに，脳の様々な領域，例えば海馬，扁桃体，大脳皮質とて良好となる．このことが，厚い切片において電子線の透過いった辺縁系，脳幹，小脳などでもこの受容体は豊富に発現性の高低差が大きい場合に生きてくる，超高圧電子顕微鏡観している．海馬は副腎皮質ステロイドホルモンの重要な標的察に適する染色法になり得るわけである．ゴルジ鍍銀染色を部位であり，電気生理学的にラットの海馬を刺激すると血中習得するためにはある程度の経験，コツが必要であるし，一のコルチコステロン量の変動が生じることが知られており，面においてその染色性に「偶然性」が伴うのも確かである．

また，グルココルチコイド受容体も豊富に発現しており，海しかし，偶然にしても，染色がうまくいった場合には，極め馬こそが副腎皮質ステロイドホルモンの調節中枢として捉えて大きな情報を与えることも事実である．

ることが出来る．従って，コルチゾール（ラットではコルチ

我々は副腎皮質や性腺から分泌されるステロイドホルモンコステロン）分泌機構は海馬―視床下部―下垂体―副腎皮質が脳の神経細胞の機能形態に与える影響について，様々な方の軸によって調整されるといえる．血中コルチゾールの変動法を用いて観察している

4 ～ 6）．副腎皮質ステロイドホルモン

は海馬の神経細胞に様々な機能形態変化を引き起こすことがであるグルココルチコイド，ミネラルコルチコイド，性ステ多数報告されている．また，長期間の副腎機能障害は記憶障ロイドホルモンである，エストロゲン，アンドロゲンなどの害を引き起こすことがある．実際にラットの副腎を摘出し，受容体は，脳のある種の神経細胞や神経膠細胞にも発現してコルチコステロン濃度が低下，或いは欠落した状況を作ると，おり，これらの細胞においては，循環するステロイドホルモ

錐体細胞の樹状突起の棘 spines の形状や密度が大きく変化

ンの状況に反応して，様々な機能，形態の変動を示す．すなする．樹状突起の棘の多くは，他のニューロンとのシナプス

わち，ステロイドホルモンはある種の神経細胞や神経膠細胞を形成しており，この変化は，神経情報伝達機能の変化を示の機能制御に重要な役割を果たしていることを意味する．こ唆するものである．ストレスは脳の反応であり，脳によってれらのステロイドホルモンとその受容体のうち，我々は特にその現象が構築される．従って，この脳における副腎皮質ス副腎皮質ステロイドホルモンとその受容体であるグルココル

テロイドホルモン受容体の発現機構や機能を解明することチコイド受容体に注目して，これらの脳への影響を検索しては，すなわちストレス現象の解明にも繋がる重要な課題といいる．

える．このストレス応答系は様々な内部環境や加齢などに特集

超高圧電子顕微鏡を用いた生物試料観察の基礎と応用

243【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

図 4 超高圧電子顕微鏡による，ゴルジ染色によって剖出したラット大脳皮質の神経細胞の樹状突起のステレオ像．（A）2 ヶ月齢の若いラット，（B）24 ヶ月齢の老齢ラット．左列の写真
は − 8° に傾斜して得られた像，右列の写真は + 8° に傾斜して得られた像．2 ヶ月齢の若いラットの神経細胞樹状突起ではよく発達した棘（spines）が高い密度で発達している様子が観察されるが，老齢ラットではこの棘の明らかな形状変化，密度変化が観察される．Bar = 2 μm

ダイナミックに観察するためには，超高圧電子顕微鏡によるトモグラフィー観察を行い（図 5），その画像をコンピュータ処理によって三次元立体化，あるいはムービーとしてその三次元変化を観察することも有用であり，実用化が進みつつ
図 3 超高圧電子顕微鏡による，ゴルジ染色によって剖出した
ラット海馬 CA1 領域の星状グリア細胞のステレオ観察像．（A）
コントロール（正常）群，（B）副腎摘出（ADX）後 4 週間群，（C）
副腎摘出 2 週間 + コルチコステロン補充 2 週間群．左列の写
真は − 8° に傾斜して得られた像，右列の写真は + 8° に傾斜して得られた像．ADX によってグリア細胞の突起が発達，細かく突起の枝が広がる様子が鮮明に観察され，コルチコステロンの補充によってコントロール状態に戻る様子が観察される．N：核，v：血管 Bar = 5 μm

ある 7）．
ゴルジ鍍銀染色法の他に，免疫組織化学による反応細胞の観察がある．ただし，通常の DAB 反応による反応細胞の観察は，よほどしっかりとした反応が出ていないと，コントラストを得る上で厳しいものがある．このような場合にはDAB 反応の際に，ニッケルアンモニウム，塩化コバルトを加え，増感発色させる工夫を加えると，コントラストを高めることが出来る．それでも足りない場合にはさらに，金粒子よって変化を示し，その際の神経細胞，神経膠細胞の形態変銀増感法を用いること工夫もある．これは，いわゆる二次抗化は超高圧電子顕微鏡で捉えると，実にダイナミックに，ま体反応を DAB/ コバルト・ニッケル増感に加え，nano-goldた詳細に観察することが出来る一例である．図 3，4 は，ス法を組み合わせることによって，さらに銀増感して用いるもトレス応答と密接な関連を持つ，海馬領域における星状グリのである．ただし，銀増感の条件設定は試料によって異なり，ア細胞，神経細胞の樹状突起とその棘（spiens）の様子につ事前の条件設定のチェックが重要になる．

いて，± 8° の傾斜をかけてステレオ観察したものである．
これらの細胞の機能形態変化を三次元的に捉えることは，極5.

おわりにめて重要な情報となり，神経解剖学，神経科学の見地からも顕微鏡観察の技術は，この 20 年間において飛躍的に発展意義深いものとなる．さらに，超高圧電子顕微鏡画像をよりし，特に共焦点レーザ顕微鏡の導入・発展は大きな成果を提244

顕微鏡 Vol. 43, No. 4（2008）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

図 5 超高圧電子顕微鏡によるトモグラフィー像．実際には − 60° ～ + 60° の間で 1° ずつ傾けて，合計 120 枚の像を得，これをもとに立体構築へ持って行く．この像は，海馬領域における神経細胞の樹状突起（dendrite）とその周囲にある血管（v）を取り囲む星状グリア細胞（Glia）のうち − 60，− 50，− 40，− 30，− 20，− 10，+ 10，+ 20，+ 30，+ 40，+ 50，+ 60 の傾斜で撮影されたものを並べた．Bar = 10 μm

供してきた．この間，いわゆる電子顕微鏡を用いる研究は，

謝これに取って代わられる時代もあったが，しかし，研究，学

辞

本研究は，自然科学研究機構生理学研究所超高圧電子顕微問が展開する中で，改めて電子顕微鏡の役割が見直されてい鏡共同利用実験，および文部科学省ナノテクノロジー総合支るのも事実である．「電子顕微鏡だけ」の研究の時代はすで援プロジェクトとして行われているものの一部である．関係に去ったが，「電子顕微鏡も」利用して多角的に研究する時各位に心からの謝意を表します．

代となっている．分子生物学が進み，培養系や本年のノーベ
ル 化 学 賞 受 賞 で 話 題 と な っ た GFP（green fluorescentprotein）を代表とする細胞標識技術が進む中，研究者の知恵，戦略次第によって，空間解像度に関して優れた力を有する超高圧電子顕微鏡がもたらす多様な研究，成果には多くの可能性が示唆されるようになっていると思う．是非，様々なアイデアを駆使して，この大きな可能性を有する顕微鏡を活かしてほしいと願う．

特集

超高圧電子顕微鏡を用いた生物試料観察の基礎と応用

文献1）Arii, K. and Hama, K.: J. Electron Microsc., 36，177–195（1987）
2）Hama, K. et al.: Microsc. Res. Tech., 29，357–367（1994）
3）Hama, K. et al.: J. Neurocytol., 33，277–285（2004）
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7）Nishida, T. et al.: Acta Histochem. Cytochem., 40，93–99（2007）245【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】