環境研究総合推進費 戦略的研究開発（SII-7）
新たな海洋保護区（沖合海底⾃然環境保全地域）管理のための深海を対象とした⽣物多様性モニタリング技術開発

沖合海底⾃然環境保全地域（海洋保護区）を対象とした
深海⽣態系のモニタリング⽅法（海底設置型フリーフォール式ランダーおよび画像を⽤いて）マニュアル

2023 年 3 ⽉

海洋研究開発機構
千葉県⽴中央博物館
東京⼤学
国⽴環境研究所
美ら島財団
神⼾⼤学
京都⼤学
熊本⼤学

⽬次
1. 本マニュアル作成者（藤倉克則）--- 1
2. 背景と⽬的（藤倉克則）--- 2
3. 深海⽣態系モニタリング⽅法の概要（藤倉克則）--- 5
4. 海底設置型 フリーフォールランダーシステム（古島靖夫・藤原義弘）--- 6
4.1.フリーフォールランダーシステム全体構成と観測概要（古島靖夫）--- 6
4.1.1. 全体構成--- 6
4.1.2. ランダー観測の概要--- 8
4.2.ランダー搭載機器（古島靖夫・藤原義弘）--- 8
4.2.1. ⾳響切離し装置（古島靖夫）--- 8
4.2.1.1. ⾳響切離し装置概要--- 8
4.2.1.2. 切離し装置 使⽤⽅法--- 9
4.2.2. 環境 DNA ⽤海⽔現場⼤量ろ過器 MASS Pump（藤原義弘）--- 10
4.2.2.1. MASS Pump 概要--- 10
4.2.2.2. MASS Pump の準備--- 11
4.2.2.2.1. バッテリーの充電--- 11
4.2.2.2.2. 配管洗浄の準備--- 11
4.2.2.2.3. 配管の洗浄--- 12
4.2.2.2.4. フィルターの取り付け--- 12
4.2.2.2.5. 採⽔タイマーのセット--- 12
4.2.2.3. MASS Pump の投⼊--- 13
4.2.2.4. フィルタの回収--- 13
4.2.2.5. データの回収--- 13
4.2.3. ニスキン採⽔器（古島靖夫）--- 14
4.2.3.1. ニスキン採⽔ 概要--- 14
4.2.3.2. ニスキン採⽔ 使⽤⽅法--- 15
4.2.4. メイオベントス⽤堆積物採泥器（古島靖夫）--- 15
4.2.4.1. 採泥器概要--- 15
4.2.4.2. 採泥器使⽤⽅法--- 16
4.2.5. ⼩型深海カメラシステム（古島靖夫）--- 17
4.2.5.1. ⼩型深海カメラシステム概要--- 17
4.2.5.2. ⼩型深海カメラシステム使⽤⽅法--- 17
4.2.6. RINKO Profiler（古島靖夫）--- 25
4.2.6.1. RINKO Profiler 概要--- 25
4.2.6.2. RINKO Profiler 使⽤⽅法--- 25
4.2.7. Aquadopp-DW（超⾳波流向流速計）（古島靖夫）--- 28
4.2.7.1. Aquadopp-DW 概要--- 28
4.2.7.2. Aquadopp-DW 使⽤⽅法--- 28
4.2.8. その他搭載機器（古島靖夫）--- 32
4.2.8.1. フラッシャー--- 32
4.2.8.2. イリジウム衛星ビーコン（iBCN）--- 33
4.2.8.3. ROV ホーマー--- 33

4.2.8.4. 浮⼒材--- 35
4.2.8.5. 錘--- 35
4.3. ランダー観測（古島靖夫）--- 36
4.3.1. 事前準備--- 36
4.3.1.1. 装置類の重量計測とバランス調整--- 36
4.3.1.2. 浮⼒調整--- 37
4.3.1.3. 浮⼒計算--- 37
4.3.2. 設置⽅法--- 41
4.3.2.1. 船上での作業--- 40
4.3.2.2. 設置時間の設定--- 40
4.3.3. 回収⽅法--- 40
4.3.3.1. 回収時の船上作業--- 40
4.3.3.2. 回収後の整備（陸上）--- 42
5. ⼤型の⿂類・無脊椎動物の分析（⼭北剛久・吉⽥尊雄・宮 正樹・源 利⽂）--- 43
5.1. 無⼈探査機 ROV などによる画像の取得と分析（⼭北剛久）--- 43
5.1.1. 調査範囲・航⾛条件の選定--- 43
5.1.2. 撮影条件と撮影⽅法の選定--- 44
5.1.3. 解析⼿法・モデルの選定--- 47
5.1.3.1. 解析の時間スケールの選定--- 47
5.1.3.2. 解析で利⽤するモデルの選定--- 48
5.1.4. 深層学習⽤データの作成--- 48
5.1.5. 分類群の同定--- 55
5.1.6. 個体数の計数--- 56
5.1.7. 被度の計測--- 57
5.1.8. 調査⾯積の算定--- 58
5.2. 環境 DNA ⽤ニスキン採⽔器による採⽔および前処理（吉⽥尊雄）--- 59
5.2.1. ろ過作業に必要な実験器具と試薬・消耗品（例）--- 59
5.2.2. チューブ類のハイター処理と UV 処理--- 61
5.2.3. ニスキンボトルから海⽔を滅菌バックに移す作業--- 61
5.2.4. ろ過作業--- 63
5.2.5. RNAlater 注⼊作業--- 64
5.2.6. チューブ洗いとハイター処理--- 64
5.3. ⿂類の環境 DNA メタバーコディング法（DNA 抽出から種決定まで）（宮 正樹・佐⼟哲也）--64
5.3.1. RNAlater を⽤いたサンプルの保存法--- 65
5.3.2. カートリッジ式フィルターからの DNA 抽出--- 65
5.3.2.1. 実験の準備--- 65
5.3.2.2. RNAlater の吸引--- 65
5.3.2.3. DNA の抽出--- 66
5.3.2.4. DNeasy Blood and Tissue kit を⽤いた DNA の精製--- 66
5.3.3. MiFish メタバーコーディング--- 67
5.3.3.1. ライブラリーの調整① 1st PCR--- 67
5.3.3.1.1. 1st PCR--- 68
5.3.3.1.2. 1st PCR 産物の精製と濃縮--- 69
5.3.3.1.3. 精製・濃縮済み 1st PCR 産物の定量と希釈--- 69

5.3.3.2. ライブラリーの調整② 2nd PCR--- 70
5.3.3.2.1. 2nd PCR--- 71
5.3.3.2.2. 2nd PCR 産物の切り出し--- 73
5.3.3.2.3. 切り出した 2nd PCR 産物の定量--- 73
5.3.3.2.4. インデクス関連情報--- 74
5.3.3.3. MiSeq を⽤いた超並列シークエンス--- 75
5.3.3.3.1. MiSeq のメンテナンス--- 75
5.3.3.3.2. シークエンスの下準備--- 76
5.3.3.3.3. ライブラリー濃度の最終調整--- 76
5.3.3.3.4. シークエンス開始前後の操作--- 77
5.3.4. データ解析（usearch）--- 78
5.3.4.1. 得られたリードのアセンブル--- 78
5.3.4.2. プライマー配列の除去--- 78
5.3.4.3. クオリティフィルタリング--- 78
5.3.4.4. 合同配列をまとめる--- 78
5.3.4.5. denoise して ASVs の作成--- 78
5.3.4.6. リファレンス DB に参照した種の割り当て--- 78
5.4. 無脊椎動物の環境 DNA メタバーコディング法（DNA 抽出から種決定まで）（源 利⽂・邬 倩倩）--- 79
5.4.1. サンプルの保存法（RNAlater 法と ATL 法）--- 79
5.4.2. 実験室への輸送--- 79
5.4.3. ステリベクスからの DNA 抽出 --- 79
5.4.3.1. 実験の準備--- 79
5.4.3.2. DNeasy Blood & Tissue kit を⽤いた DNA の抽出 （RNAlater 法と ATL 法）--- 79
5.4.4. 無脊椎動物の環境 DNA メタバーコーディング--- 81
5.4.4.1. ライブラリー調整①:1st PCR--- 81
5.4.4.1.1. 1st PCR--- 81
5.4.4.1.2. 1st PCR 産物のビーズ精製 （サイズセレクション）--- 83
5.4.4.1.3. 精製済みの 1st PCR 産物の濃度測定と希釈--- 84
5.4.4.2. ライブラリーの調整②:2nd PCR--- 84
5.4.4.2.1. 2nd PCR--- 84
5.4.4.2.2. E-Gel Power Snap Electrophoresis Device （G8100, Invitrogen）を⽤いた 2nd
PCR 産物の精製 （サイズセレクション）--- 84
5.4.4.2.3. 切り出した 2nd PCR 産物の質の確認と濃度測定--- 85
5.4.5. MiSeq または iSeq100 を⽤いた超並列シークエンス--- 85
5.4.5.1. 下準備 （キットの解凍）--- 85
5.4.5.2. ライブラリー濃度の最終調整及び濃縮--- 85
5.4.5.3. シークエンス開始前後の操作--- 85
5.4.6. データ解析（usearch）--- 86
5.4.6.1. 得られたリードのアッセンブル（ペアエンドの場合）--- 86
5.4.6.2. プライマー配列の除去--- 86
5.4.6.3. クオリティフィルタリング--- 86
5.4.6.4. 合同配列をまとめる--- 86
5.4.6.5. denoise して ASVs の作成--- 86
5.4.6.6. リファレンス DB に参照した種の割り当て--- 86
5.4.6.7. 得られたリードのアッセンブル（⽚側の場合）--- 87

6. メイオベントスの分析（河地正伸・越川 海・北橋 倫・⼩島茂明・新⾥宙也）--- 88
6.1. フローカムによる画像解析（河地正伸・越川 海・北橋 倫）--- 88
6.1.1. 画像解析によるメイオベントスの分類・計数の概要--- 88
6.1.2. 深海底からの堆積物試料の採取--- 88
6.1.3. コアの処理：深度層別分割とホルマリン固定--- 89
6.1.4. サンプル・デバイダによる泥の分割--- 89
6.1.5. ローズベンガルによるメイオベントスの⽣体染⾊--- 90
6.1.6. Ludox を⽤いた密度差分離--- 90
6.1.7. セルストレーナーによるメイオベントスの分画--- 92
6.1.8. 実体顕微鏡によるメイオベントス（≧200 µm 画分）の同定・計数--- 92
6.1.9. FlowCAM によるメイオベントス（＜200 µm 画分）の撮影（⼯程 F）--- 93
6.1.10. FlowCAM 本体の電源投⼊とソフトウェアの起動（フローチャート 1〜2）--- 94
6.1.11. 洗浄液、廃液回収容器の確認（フローチャート 3）--- 94
6.1.12. 対物レンズ、フローセル、ポンプシリンジの取り付け（フローチャート 4）--- 94
6.1.13. トランスファーバイアルの取り付け（フローチャート 5）--- 95
6.1.14. FlowCAM 測定条件の設定（コンテキストファイルの設定と読込）（フローチャート 6）-- 96
6.1.15. フローラインへの呼び⽔導⼊とサンプルセット（フローチャート 7〜9）--- 98
6.1.16. サンプル測定（フローチャート 10〜13）--- 99
6.1.17. 測定終了後（フローチャート 14〜16）--- 100
6.1.18. FlowCAM 画像の深層学習による分類予測モデルの構築--- 100
6.1.19. 機械学習・⼿作業による教師画像データの整理（フローチャート 3〜4）--- 101
6.1.20. FlowCAM コラージュ形式画像からの粒⼦画像の抽出と深層学習のための画像前処理（フローチャート 5〜6）--- 102
6.1.21. 深層学習モデルの構築（フローチャート 7〜10）--- 103
6.1.22. FlowCAM と分類予測モデルを⽤いた⾃動分類と計数--- 105
6.1.23. ⼯程 G：同定・計数データの結合--- 106
6.2. メタゲノムによる分析（⼩島茂明・新⾥宙也）--- 106
6.2.1. 前処理--- 106
6.2.2. DNA 抽出及びシーケンスライブラリ調製--- 108
6.2.3. メタゲノムアセンブリおよび後⽣動物由来ミトコンドリア DNA 配列の抽出--- 109
6.2.4. メタゲノムデータの処理--- 117
7. 原核⽣物の分析（メタゲノム）（濱崎恒⼆・砂村倫成・⾼⾒英⼈・吉武和敏）--- 120
7.1. 堆積物試料採取と船上での前処理（濱崎恒⼆・砂村倫成）--- 120
7.1.1. 堆積物コアサンプリング概要--- 120
7.1.2. センサー測定：堆積物の pH と ORP の測定--- 121
7.1.3. 先端カットシリンジでの堆積物採取--- 121
7.1.4. 全微⽣物計数⽤サンプル--- 122
7.1.5. DNA（16S rRNA 遺伝⼦）アンプリコン解析⽤サンプル--- 122
7.1.6. ショットガンメタゲノム解析⽤サンプル--- 122
7.1.7. 間隙⽔サンプル--- 122
7.2. 16SrRNA 遺伝⼦アンプリコン解析による多様性と群集構造の把握（砂村倫成）--- 123
7.2.1. 解析の⽬的と概要--- 123
7.2.2. DNA 抽出--- 123

7.2.3. PCR 増幅と MiSeq ライブラリの作成--- 124
7.2.4. QIIME2 を⽤いた配列処理--- 126
7.2.5. R を⽤いた多様性解析--- 127
7.3. ショットガンメタゲノム解析による原核⽣物叢と機能ポテンシャルの把握（⾼⾒英⼈）--- 128
7.3.1. 解析の⽬的と概要--- 128
7.3.2. DNA 抽出--- 129
7.3.3. 配列⽣データのアミノ酸配列への変換--- 131
7.3.4. アミノ酸配列の Genomaple TM への供試--- 131
7.3.5. Ribosomal protein に基づく菌叢解析--- 132
7.3.6. 機能ポテンシャル解析--- 132
7.3.6.1. 機能ポテンシャルのグラフ化--- 132
7.3.6.2. 機能アバンダンスのクラスタリングとヒートマップ化--- 133
7.3.6.3. 統計解析--- 134
7.4. ショットガンメタゲノム解析による個別原核⽣物種の存在量の把握（吉武和敏）--- 140
7.4.1. 解析の⽬的と概要--- 140
7.4.2. 動作環境--- 141
7.4.3. ツールのインストール⼿順--- 141
7.4.4. 解析の実⾏--- 143
7.4.5. 結果の説明--- 144
7.5. 原核⽣物数の把握--- 147
7.5.1. 準備する器具、試薬--- 147
7.5.2. 計数⼿順--- 147
8. おわりに（藤倉克則）--- 148

1. 本マニュアル作成者（藤倉克則）
全体監修・編集・執筆
藤倉 克則：海洋研究開発機構 地球環境部⾨ 海洋⽣物環境影響研究センター センター⻑
fujikura(a)jamstec.go.jp
監修・執筆
濱崎 恒⼆：東京⼤学 ⼤気海洋研究所 海洋⽣態系動態部⾨ 教授 hamasaki(a)g.ecc.u-tokyo.ac.jp
宮 正樹：千葉県⽴中央博物館 資料管理研究科 主任上席研究員 miya(a)chiba-muse.or.jp
執筆邬 倩倩：神⼾⼤学⼤学院⼈間発達環境学研究科 学術研究員 wuqq1124(a)gmail.com
河地 正伸：国⽴環境研究所 ⽣物多様性領域 ⽣物多様性資源保全研究推進室 室⻑
kawachi.masanobu(a)nies.go.jp
越川 海：国⽴環境研究所 地域環境保全領域 海域環境研究室 室⻑ koshikaw(a)nies.go.jp
北橋 倫：株式会社 KANSO テクノス 東京⽀店 技術グループ kitahashi_tomo(a)kanso.co.jp
⼩島 茂明：東京⼤学 ⼤気海洋研究所 海洋⽣態系動態部⾨ 教授 kojima-aori(a)g.ecc.u-tokyo.ac.jp
佐⼟ 哲也：千葉県⽴中央博物館 資料管理研究科 zacco_evolans(a)yahoo.co.jp
新⾥ 宙也：東京⼤学⼤学院理学系研究科 ⽣物科学専攻 准教授 c.shinzato(a)aori.u-tokyo.ac.jp
砂村 倫成：東京⼤学⼤学院理学系研究科 地球惑星科学専攻 助教 sunamura(a)eps.s.u-tokyo.ac.jp
⾼⾒ 英⼈：東京⼤学 ⼤気海洋研究所 海洋⽣態系動態部⾨ 特任研究員 takamih(a)g.ecc.u-tokyo.ac.jp
藤原 義弘：海洋研究開発機構 地球環境部⾨ 海洋⽣物環境影響研究センター 上席研究員
fujiwara(a)jamstec.go.jp
古島 靖夫：海洋研究開発機構 地球環境部⾨ 海洋⽣物環境影響研究センター 准研究主任
furus(a)jamstec.go.jp
源 利⽂：神⼾⼤学⼤学院⼈間発達環境学研究科 教授 minamoto(a)people.kobe-u.ac.jp
⼭北 剛久：海洋研究開発機構 地球環境部⾨ 海洋⽣物環境影響研究センター 副主任研究員
yamakitat(a)jamstec.go.jp
吉⽥ 尊雄：海洋研究開発機構 地球環境部⾨ 海洋⽣物環境影響研究センター 主任研究員
tyoshida(a)jamstec.go.jp
吉武 和敏：東京⼤学⼤学院農学⽣命科学研究科 助教 akyoshita(a)g.ecc.u-tokyo.ac.jp
電⼦メールアドレスの(a)は@となる。

1

2. 背景と⽬的（藤倉克則）
四⽅を海に囲まれた⽇本は、国⼟⾯積の約 12 倍に相当する世界有数の広⼤な管轄海域を有する。そこには多様な環境や⽣態系が形成されており、既知のバクテリアから哺乳類まで合わせると世界の全海洋
⽣物種数の約 14%にあたる計 3 万種以上が分布する等、⽣物多様性が極めて⾼い海域となっている。
⽣物多様性条約の愛知⽬標や持続可能な開発⽬標（SDGs）の⽬標 14 では、2020 年までに沿岸域及び海域の 10%を保全する旨の⽬標が掲げられているが、我が国における海洋保護区を含め保全海域は、管轄権内の海域のうち沿岸域（内⽔及び領海かつ⽔深 200 m 以浅の場所）を中⼼に 8.3 %にとどまっていた。また、沖合域（内⽔及び領海のうち沿岸域を除いた場所のほか、排他的経済⽔域（EEZ）及び延⻑⼤陸棚）に関して、海洋⽣物多様性保全戦略において記載はあるものの、具体的な施策は⼀部を除き講じられておらず、沖合域の海洋保護区の設定も⼗分とは⾔えなかった。
環境省では、沖合域の海洋保護区設定を含め各種施策の推進の基礎資料とすることを⽬的として、我が国が環境を保全し得る領海及び EEZ の⽣物多様性の中で重要度が⾼い海域を抽出し、2016 年に「⽣物多様性の観点から重要度の⾼い海域」（以下、重要海域）として公表した（図 2.1）。なお、この時に⽤いた抽出の基準は、「⽣態学的・⽣物学的に重要な海域（EBSA）」選定のための基準も参照しつつ、⽣態学的及び⽣物学的観点から、1．唯⼀性⼜は希少性、2．種の⽣活史における重要性、3．絶滅
危惧種⼜は減少しつつある種の⽣育・⽣息地、4．脆弱性、感受性⼜は低回復性、5．⽣物学的⽣産性、
6．⽣物学的多様性、7．⾃然性、8．典型性・代表性の 8 項⽬であった。
さらに環境省では、沖合域における海洋保護区の設定について中央環境審議会の答申を踏まえて改正法案を国会に提出し、改正⾃然環境保全法が 2019 年 4 ⽉に成⽴した。なお、同審議会の答申において、優先的・先⾏的に保全を図る海域としては、我が国の EEZ 内で最も深い海溝や最も⾼密度に海⼭が存在する重要海域を含み、脆弱な⽣態系タイプが多様に存在していること等を勘案すれば、⼩笠原⽅⾯の沖合域が有望な選択肢と考えられるとされた。
2020 年 12 ⽉ 3 ⽇、⾃然環境保全法に基づき、初めての沖合海底⾃然環境保全地域が４地域指定された。この中には⽇本の EEZ（排他的経済⽔域）内で最も深い海溝や、海⼭が⾼密度に存在する海域である、①⽇本海溝の最南部及び伊⾖・⼩笠原海溝周辺の海域、②中マリアナ海嶺と⻄マリアナ海嶺を含む
海域、③⻄七島海嶺を含む海域、及び④マリアナ海溝北部の海域が含まれている（図 2.2）。この指定により、⽇本の海洋保護区の割合は沿岸域を含め管轄権内⽔域の 13.3％となり、⽇本としては「2020 年までに各国の管轄権内⽔域の 10％を海洋保護区等として保全する」とした愛知⽬標や SDGs の⽬標 14が達成された。
沖合海底⾃然環境保全地域（海洋保護区）では、底曳き網などによる漁業や海底資源採取といった⼈間活動や地震や海底⽕⼭噴⽕といった⾃然変動などにより、⽣物多様性の変化、地形や底質の改変、海底下からの化学物質噴出などが想定され⽣態系の変動が起こり得る。また、中央環境審議会の答申においても、保護区の⾒直しを⾏うことも想定されている。このため、設定した海洋保護区での⽣物多様性の変動がどの程度あるのか、開発等により⾃然環境が劣化してしまっていないか、海洋保護区として保全効果が発揮できているか等を評価するべく、沖合海底⾃然環境保全地域（海洋保護区）において継続
的に深海⽣態系をモニタリングする必要がある。しかし、深海の海洋保護区では、沿岸域・表層に⽐べて調査観測が難しく、⼤がかりな調査機器と予算が必要で、⼤型調査船、無⼈探査機、有⼈潜⽔調査船、⼤型ウインチなどが必要であり、また深海調査の機会も限られる。このような⼤がかりな調査機器と⾼額な予算は、深海底における海洋保護区の継続的な⽣態系モニタリングを実施するにあたり⼤きな制約となる。
最近では、画像解析・環境 DNA・メタゲノム解析・⼩型環境計測センサーといった技術が開発され、⽣物多様性や環境データ収集ができるようになり、これらの技術を⽤いることで⽣物個体の採取に偏重せず、かつ⼤型観測機器への依存を可能な限り軽減しながら深海⽣態系をモニタリングできる可能性が出てきた。また、上述の重要海域の中から沖合海底⾃然環境保全地域（海洋保護区）が指定されたが、指定にあたっては、それぞれの海域に「指定書及び保全計画書」が⽰されており（https://www.env.go.jp/press/108741.html）、そこに記述されている⽣物の出現や環境の変動をモニ
2

タリングすることが肝要となる。
以上の背景を踏まえ、2020-2022 年度に環境研究総合推進費戦略的研究開発課題のもとに「新たな海洋保護区（沖合海底⾃然環境保全地域）管理のための深海を対象とした⽣物多様性モニタリング技術開発（SⅡ-7）」というプロジェクトを進め、最新の技術及びデータ解析⼿法を⽤いながら低コストで実施できる簡便な深海⽣態系のモニタリング法の構築に取り組んだ（表 2.1）。

図 2.1. 沖合海底域における「⽣物多様性の観点から重要度の⾼い海域（重要海域）」
https://www.env.go.jp/nature/biodic/kaiyo-hozen/kaiiki/kaitei/index.html。

図 2.2. 沖合海底⾃然環境保全地域。⽇本海溝の最南部及び伊⾖・⼩笠原海溝周辺の海域、中マリアナ海嶺と
⻄マリアナ海嶺を含む海域、⻄七島海嶺を含む海域、マリアナ海溝北部
https://www.env.go.jp/council/12nature/y120-41b/2-2mat.pdf。
表 2.1. 環境研究総合推進費戦略的研究開発課題：新たな海洋保護区（沖合海底⾃然環境保全地域）管理のための深海を対象とした⽣物多様性モニタリング技術開発（SⅡ-7）の課題構成と実施体制

3

全体課題名：新たな海洋保護区（沖合海底⾃然環境保全地域）管理のための深海を対象とした⽣物多様性
モニタリング技術開発（SⅡ-7）
全体課題リーダー 藤倉克則（海洋研究開発機構）
テーマ 1：深海⽣物相の画像解析によるモニタリング法及びサンプリング法の開発
テーマ 1 リーダー 藤倉克則（海洋研究開発機構）
サブテーマ 1：深海⽣物相の画像解析をはじめとする深海⽣態系の多⾓的モニタリング法の提案
サブテーマ 1 リーダー 藤倉克則
（海洋研究開発機構）

藤原義弘・⼩栗⼀将・古島靖夫・⼭北剛久・吉⽥尊雄（海洋研究開発機構）

サブテーマ 2：深海堆積物中⽣物相の画像解析によるモニタリング法の開発
サブテーマ 2 リーダー 河地正伸
（国⽴環境研究所）

越川 海・⼤⽥修平（国⽴環境研究所）、北橋 倫（KANSO テクノス）

テーマ 2：深海⼤型⽣物相の環境 DNA によるモニタリング法の開発
テーマ 2 リーダー 宮 正樹（千葉県⽴中央博物館）
サブテーマ 1：脊椎動物における調査⽅法の開発と実践、ならびに基盤データの整備
サブテーマ 1 リーダー 宮 正樹
（千葉県⽴中央博物館）

⾺渕浩司（国⽴環境研究所）・岡 慎⼀郎（沖縄美ら島財団）

サブテーマ 2：無脊椎動物における調査⽅法の開発と実践、ならびに基盤データの整備
サブテーマ 2 リーダー 源 利⽂
（神⼾⼤学）

駒井智幸（千葉県⽴中央博物館）・中野智之（京都⼤学）

テーマ 3：深海微⼩⽣物相のメタゲノム解析によるモニタリング法の開発
テーマ 3 リーダー 濱崎恒⼆（東京⼤学）
サブテーマ 1：深海原核⽣物のメタゲノム解析によるモニタリング法の開発
サブテーマ 1 リーダー 濱崎恒⼆
（東京⼤学）

砂村倫成・吉武和敏（東京⼤学）

サブテーマ２：深海⼩型底⽣⽣物のメタゲノム解析によるモニタリング法の開発
サブテーマ 1 リーダー ⼩島茂明
（東京⼤学）

新⾥宙也・峰岸有紀（東京⼤学）、嶋永元裕（熊本⼤学）

本マニュアルは、SⅡ-7 参画者以外でも SⅡ-7 で構築した⼿法により、深海⽣態系のモニタリングが実施できるようにすることを⽬的に作成した。また、このマニュアルは、重要海域の指標や沖合海底⾃然環境保全地域（海洋保護区）の「指定書及び保全計画書」に則った評価ができ、海洋保護区の実効的管理の第⼀歩として今後の継続的なモニタリングに向けた⼟台となることを⽬標に整備した。なお、
SⅡ-7 においてモデル海域としたのは、沖合海底⾃然環境保全地域のうち⻄七島海嶺を含む海域の⽔深2000 m 以浅である。よって、本マニュアルも⽔深 2000 m 以浅における深海⽣態系のモニタリング法について記述したものになる。

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3. 深海⽣態系モニタリング⽅法の概要（藤倉克則）
本マニュアルは、原則として⼤型無⼈探査機 ROV、有⼈潜⽔調査船、⼤型ウインチなどを⽤いずに、
重要海域の指標（EBSA）や沖合海底⾃然環境保全地域（海洋保護区）の「指定書及び保全計画書」に則った評価を⾏うための科学的情報を取得する⼿法を⽰す。
取得するデータは、① 原核⽣物の機能と分類群の多様性② メイオベントスの分類群の多様性③ ⼤型無脊椎動物（ベントス）の分類群の多様性④ ⿂類の分類群の多様性⑤ ⽔温、塩分、流向流速、濁度、⽔深、溶存酸素濃度 DOとなる。データを得る⼿法としては、① は堆積物や海⽔のメタゲノム解析② は堆積物のメタゲノム解析および画像解析③と④ は海⽔の環境 DNA 解析⑤ は観測装置による観測となる。これらのデータを得るためのサンプリングや観測は、フリーフォールランダーシステム（以下、ランダーと記す）を基本とする。
① のメタゲノム解析⽤海⽔はランダーのニスキン採⽔器や海⽔をろ過するランダーの MASS Pump、①と② のメタゲノム解析⽤および②の画像解析⽤堆積物はランダーの採泥器、③と④ の環境 DNA サンプルはランダーの MASS Pump、⑤ はランダーの RINKO Profiler と流向流速計、によるサンプリングと観測を⾏う。
なお、③および④についてより広範囲で精度の⾼いデータを取得するためには、⼩型無⼈探査機 ROVによる映像を⽤いた解析も有効であるため、⼩型無⼈探査機 ROV が使える状況にある場合を想定して、本マニュアルには「5.1. 無⼈探査機 ROV による画像の取得と分析」も加味した。これについては
ランダーのカメラで撮影した映像にも適⽤できる。
ランダーは、⽬標サイトの船上よりフリーフォールで設置し、⼀定時間後、切り離し信号により錘を落下させて浮上、回収する。⼩型無⼈探査機 ROV のオペレーションについては各機関に独⾃のノウハ
ウがあるため、ここでは割愛する。

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4. 海底設置型 フリーフォールランダーシステム（古島靖夫・藤原義弘）
4.1. フリーフォールランダーシステム全体構成と観測概要（古島靖夫）
4.1.1. 全体構成
海底環境を総合的にかつ簡便・安価に調べることができるフリーフォールランダーシステム（以下、ランダーと記す）開発した（図 4.1.1.1.）。
ランダーは、⾼さ約 2.35 m、⼀辺が約 1.50 m の三⾓柱（図 4.1.1.2.）をしており、フレームの材質
は、海⽔の防触に強いチタン製とした。本体の空中重量は装置類と錘を全て取付けた状態おおよそで452 kg あり、⽔中重量（沈む⽅向への⼒）は約 22 kg である。また、ランダーのフレームには、海底での観測終了後に⾃⼰浮上させるための浮⼒材（17 インチのガラス球 6 個と球ブイ 3 個）が取り付けられている。これらの浮⼒材により、回収時（錘を切離した後）には約 60 ㎏の浮⼒（錘を切離した後の上向きの⼒）を確保した
ランダーには、CTD、流速計、採⽔器、採泥器、ビデオカメラ等の環境計測機器類が搭載されている（表 4.1.1.）。本ランダーは、これらの重量バランスが⼤きく変わることがなければ、表 4.1.1.1.に⽰した環境計測機器以外の装置や代替え装置を取付けることは可能である。ただし、構成を変えた場合は、陸上での重量計測やバランス調整等を再度実施する必要があるだろう。また、岸壁などで実際に切離しと浮上試験を⾏うことで観測の確実性は増す。
ランダーに搭載した環境計測機器類の詳細は、「4.2 ランダー搭載機器類」以降に⽰した。

図 4.1.1.1. フリーフォールランダーシステムの外観。

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図 4.1.1.2. フリーフォールランダーシステムの⼤きさ。（a）側⾯図、（b）上⾯図。
表 4.1.1.1 ランダーシステムに搭載されている環境計測・サンプリング機器類
個数
仕様(メーカー・型番等)
観測項⽬/⽤途
⾳響切離し装置
1
海洋電⼦社製 モータ駆動式
ランダー設置⽤に取付けた錘を切離す。同時
切離しトランスポンダーに切離しが確実に⾏われたかを検知し応答信(TMR-6005B)
号を発信する。
フラッシャー
1
海洋電⼦社製 ストロボフラ
夜間･荒天時等の回収時に、ストロボ発光によッシャー(10L-CD)
り浮上位置の発⾒を容易にする。
イリジウム
1
NOVATECH イリジウムビー 浮上時のランダーの位置情報を知らせる。
ビーコン
コン MMI -513 -12000(iBCN)ROV ホーマー
1
Sonardyne Type 7835 ROV- ROV ⽤⾳響ガイダンスシステム。海底に設置
Homer 4000m
された観測装置に装備し、回収時に的確な⽅向と距離を知らせる。
超⾳波流速計1
NORTEK Aquadopp-DW
海底近傍における単層の流向・流速を計測。
(ADP-DW)
ニスキン採⽔器
3
GENERAL OCEANICS, INC
ランダー着底後(Galvanic Times Releases が20L
溶解しトリガーがかかる 6〜８時間後)の現場の海⽔を採集。
MASS Pump
2
環境 DNA を測るために⼤量の現場海⽔をフィ
ルターでろ過。
RINKO Profiler
1
JFE Advantech RINKOCTD 測定装置。同時に濁度と DO を測定。
(CTD)
Profiler(ASTD-2XTU)
装置名

⼩型深海カメラ
システム
柱状採泥器

1

⼩栗⼀将(JAMSTEC)製作

1 分間の海底映像を約 200 フレーム取得。

3

離合社 G.S 型表層採泥器(アシュラ)

錘1㈱瀧澤鋳機製作所 ランダー⽤(TK−25C−Φ300-165)

ランダー着底時に⾃重で管状の採泥器を海底堆積中に差し込み採泥を⾏う。上下の蓋のト
リガーは 6〜８時間後に作動(Galvanic Times
Releases の溶解時間)。
ランダーを海底に沈めるための錘。重量は約
93 ㎏。

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4.1.2.ランダー観測の概要
ランダー観測の概要（⼿順）はおおよそ次の通りである（図 4.1.2.1.）。
①陸上での調整：空中・⽔中重量計測、バランス調整、環境計測機器および装置類の取付けと取外し、切り離し装置の作動確認など②船上での準備：環境計測機器類の設定と取付け、錘の取付け、⾳響切離し装置（以下、トランスポンダー）の作動確認、設置場所のおおよその位置決め（海底地形図を基に平坦な場所を検索、ROV による事前調査）③ランダーの設置：ランダーを船上からフリーフォールで投⼊する。ランダーは約 0.7 m/sec の速さで降下する。降下から着底までは、船上から送受波器（以下、トランスデューサー）を介してトランスポ
ンダーの情報を取得し着底を確認する。また、船舶の送受波器でランダーが追尾できた場合は、位置情報を取得する。追尾できない場合は、舷側よりトランスデューサーを垂下し 3 点補正を⾏い設置位置の情報を取得する。
④ランダーの回収：舷側よりトランスデューサーを垂下しランダーに切離しコマンドを送信し錘を切離す。ランダーまでの距離を数分に 1 回程度計測し、ランダーが浮上を開始していることを確認する。
⑤船上へ回収・データ収録：海⾯にランダーが浮上したら、船上に揚収してもらう。ただし、採泥器を取付けてある場合は、各脚部に取付けた採泥管を取外してから、ランダー⽤台座に載せる。各環境計測
機器類のデータ収録を⾏う。

図 4.1.2.1. フリーフォールランダーシステムの観測概要。

ランダーによる観測⼿順はシンプルではあるが、特に陸上での重量やバランス調整、機器類の調整は⾮常に重要である。また、ランダーを設置する位置については、過去に調査した地点であれば、海底地形の情報や海底映像等を事前に⼊⼿し設置地点を選定しておくことが重要であるだろう。また、初めて設置する調査地点の場合は、ROV による海底調査が可能な場合は、事前に⽬視観測により設置位置を決めるのがよいだろう。ROV 調査ができない場合は、投⼊前に海底地形調査を実施し、得られた地形図を基に平坦な場所を探し設置するのがよいだろう。
4.2.ランダー搭載機器（古島靖夫・藤原義弘）
4.2.1.⾳響切離し装置（古島靖夫）
4.2.1.1. ⾳響切離し装置概要
⾳響切離し装置（トランスポンダー：図 4.2.1.1a）は、ランダーを海底に設置する際に必要な錘を本体に取付け、そして観測終了後は、錘をランダーから切離して浮上させる⾮常に重要な役割を持つ装置である。また、ランダー投⼊から着底までは、船上から送受波器（トランスデューサー：図 4.2.1.1c）を介してトランスポンダーへ⾳響信号を送ることで、トランスポンダーまでの概ねの距離が分かる。距8離は船上制御装置に表⽰される（図 4.2.1.1b）これにより、ランダーの着底が確認できる。⼀⽅、ランダー回収時には、船上のトランスデューサーから切離しコマンド（切離しの⾳響信号）をトランスポン
ダーへ送ることにより取付けた錘が切離される。錘が切離されたランダーは、本体に取付けた浮⼒材（ガラス球ブイや球ブイ）の浮⼒で海⾯まで浮上する。

図 4.2.1.1. ⾳響切離し装置概要。（a）⾳響切離し装置（トランスポンダー）、（b） 船上制御装置、（c） 送受波器（トランスデューサー）。

4.2.1.2. 切離し装置 使⽤⽅法
本ランダーでは、海洋電⼦社製のモーター駆動式切離しトランスポンダー（TMR-6005B）を使⽤した。トランスポンダーは、ランダー中央上部に配置されている（図 4.2.1.2a）。トランスポンダーから
錘（図 4.2.1.2b）までは、⻑さ 1m のスリングベルトとシャックルを⽤いて繋ぎ、錘はランダーの脚部より上になる、すなわち、海底設置時にランダーにぶら下がった状態になるように調整して取付ける。
その際、軽量ハンドリフター（図 4.2.1.2 c）を使うと錘の取付けが容易になる。錘から延ばしたスリン
グベルトの先端部をトランスポンダーのフックにかけ、マグネットスイッチ部に磁⽯をあててフックを閉じる。マグネットスイッチ部に磁⽯を当てるとトランスポンダーのモーターが作動しフックが閉じて固定される。錘の重量は約 93 ㎏で円柱型をしている。なお、トランスポンダーから錘までの⻑さ調整
は航海前に実施しておくと良い。⻑さの調整は、シャックルの数を減らす、スリングベルト（特に新品の場合）に錘を付けてクレーン等で吊上げて事前に延ばしておくなどの策を講じておくと良いだろう。
また、トランスポンダーのバッテリーは、海底設置調査を実施する毎に新品と交換することを薦める。なぜなら、切離し装置が作動しなければランダーは浮上できないから、確実に錘を切離すためには
トランスポンダーが確実に作動し錘を切離す必要があるからである。

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図 4.2.1.2 ⾳響切離し装置と錘の取付け。

4.2.2. 環境 DNA ⽤海⽔現場⼤量ろ過器 MASS Pump（藤原義弘）
4.2.2.1. MASS Pump 概要
海⽔を⼤量にろ過し、環境 DNA 試料を集めるためのポンプである。ポンプユニット、コントロールユ
ニット、フィルターユニットより構成、最⼤ 8 本のステリベックスフィルターを⽤いてろ過することが可能である（図 4.2.2.1.）。
主な仕様
サイズ

ポンプユニット：φ95x200 mm、コントロールユニット：φ140x380 mm、フィルター
ユニット：φ120x36 mm

重量（空中）

ポンプユニット：2.0 kg、コントロールユニット：5.7 kg、フィルターユニット：0.2 kg

耐圧3000 m

電源

BlueRobotics 製リチウムイオン電池、14.8 V

フィルター

ステリベックスフィルター（φ0.45 µm）×8（最⼤）10図 4.2.2.1. ベイトカメラに取り付けた MASS Pump。

4.2.2.2. MASS Pump の準備
4.2.2.2.1. バッテリーの充電① 充電器の取扱説明書に従い、BlueRobotics 製リチウムイオン電池（14.8 V）をフル充電。
4.2.2.2.2. 配管洗浄の準備
図 4.2.2.2.2. を参照。
① ポンプユニットとコントロールユニットを⽔中ケーブルで接続。
② コントロールユニット内電源端⼦と AC100 V ⽤ケーブルを接続。
③ ポンプユニット吸⽔⼝に採⽔チューブを接続（チューブ：Masterflex L/S16）。
④ フィルターユニットとポンプユニットを排⽔チューブで接続（チューブ：Masterflex L/S16）。
⑤ フィルターユニットのルアーロックに排⽔⽤耐油チューブを接続。
⑥ 使⽤しないルアーロックにコンビキャップ装着。

図 4.2.2.2.2. コントロールユニットとポンプユニット。

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4.2.2.2.3. 配管の洗浄① 洗浄液（ハイター、6 倍希釈、3 リットルサンプル瓶使⽤）の準備（約 1 リットル）。
② 採⽔チューブ、排⽔⽤耐油チューブを洗浄液⼊のサンプル瓶に投⼊。
③ AC100 V 電源オン→10 分間還流→AC100 V 電源オフ。
④ 精製⽔タンク（例えば精製⽔を⼊れたステリテナー）と採⽔チューブを接続。
⑤ 廃液⼊れに排⽔⽤耐油チューブをセット。
⑥ AC100 V 電源オン→精製⽔ 3 リットルを⽤いて配管内のハイターを洗浄→AC100V 電源オフ。
4.2.2.2.4. フィルターの取り付け
図 4.2.2.2.4. を参照。
① ステリベックス⽤ラベルの準備、貼り付け。
② 排⽔⽤耐油チューブを取り外し。
③ ステリベックスフィルター（Φ0.45 µm）を取り付け。
④ AC100 V オン→配管内、フィルター内に精製⽔を充填→→AC100 V オフ。
⑤ ステリベックスフィルターにコンビキャップを取り付け。
⑥ 採⽔チューブを精製⽔タンクから取り外し、採⽔チューブにコンビキャップを取り付け。
⑦ AC100 V ⽤ケーブルの取り外し。

図 4.2.2.2.4 ステリベックスフィルターを取り付けたフィルターユニット。採⽔直後の様⼦につき、コンビキャップを取り付けていない状態。

4.2.2.2.5. 採⽔タイマーのセット① Micro SD カードにプログラムの書き込み。
a. ファイル「schedule.txt」に b.のように記述。
b. 02012100/20230201210000/20230202030000/F
データ書き出しファイル名/ろ過開始⽇時/ろ過終了⽇時/使⽤チャンネル（通常 F で可）② ファイル「schedule.txt」のコピーを PC 等に保管。
③ 充電済みバッテリーとコントローラを接続（図 4.2.2.2.5.）。
④ GPS 時刻同期（空の⾒える場所に持ち出し数分待機）。
⑤ 時刻、バッテリー残量、流量計カウンター値の確認（図 4.2.2.2.5.）。
⑥ コントローラと耐圧容器内ケーブルとを接続。
⑦ 耐圧容器の O リンググリスアップ確認。

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⑧ 耐圧容器の蓋閉め。

図 4.2.2.2.5. コントローラとリチウムイオン電池。

4.2.2.3. MASS Pump の投⼊① 配管系の精製⽔の充填状況の確認。
② 投⼊直前にステリベックスフィルタ、採⽔チューブに取り付けたコンビキャップの取り外し。
4.2.2.4.フィルタの回収① 保存⽤ユニパックにラベル記⼊。
② クリーンベンチの準備。
③ RNA Later をクリーンベンチ内で分注（ステリベックス 1 本約 2 mL 必要）。
④ 使い捨てミニピペット、コンビキャップ、シリンジ、保存⽤ユニパックをクリーンベンチ内に準備。
⑤ 排⽔⽤耐油チューブの取り外し。
⑥ フィルターユニットからステリベックスフィルターを回収。
⑦ ステリベックスフィルターをクリーンベンチ内に移動。
⑧ ステリベックスフィルター内の海⽔をシリンジで排出。
⑨ ステリベックスフィルター出⼝側にコンビキャップの取り付け。
⑩ ステリベックスフィルター⼊⼝側から RNA Later 2 mL を注⼊。
⑪ ステリベックスフィルター⼊⼝側にコンビキャップの取り付け。
⑫ 保存⽤ユニパックに挿⼊。
⑬ 冷蔵庫に⼀晩保管。
⑭ 冷凍庫に移動。
4.2.2.5. データの回収①耐圧容器・蓋の開放（コネクタのない側）。
②コントローラと耐圧容器のコネクタの接続解除。
③コントローラに表⽰されている数値（流量計カウンター、電池電圧）の読み取り（念の為）。
④コントローラからリチウムイオン電池の取り外し。
⑤コントローラから Micro SD カードの取り出し。
⑥Micro SD カードからデータのコピー、グラフ化して状態を確認。

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データファイル：********.tsv（4.2.2.2.5 で設定したファイル名．例えば 02012100.tsv）。
デバッグファイル：debug.log（問題が発⽣したときに状態を確認できるファイル）。
4.2.3.ニスキン採⽔器（古島靖夫）
4.2.3.1. ニスキン採⽔ 概要
ニスキン採⽔器（図 4.2.3.1a）は、ランダーを設置した海底近傍の採⽔を⾏うために 12 L ボトルを 3
本ランダーの中央部に取付けた。本ランダーにおける採⽔は、操作および作業を簡便化するため、採⽔トリガーに「Galvanic Timed Releases」（以下、ガルバニックリリーサー）を⽤いた（図 4.2.3.1b）。
これにより、ランダーを投⼊してから⼀定時間が経過した後に採⽔が⾏われる。ガルバニックリリーサーは、電⾷（ガルバニック腐⾷）を利⽤した安価な治具の⼀種で図 4.2.3.1b のような形状をしている。
⼀定時間経過すると、ガルバニックリリーサー中央の⾦属部が溶解し 2 分割する。この機能を採⽔器のトリガーに応⽤した。ガルバニックリリーサーは、表 4.2.3.1.に⽰す通り、海⽔温に応じて 6 時間から
100 ⽇程度までの溶解時間を持つ種類がある。本ランダーでは、AA2 タイプのものを取付け、投⼊後 6時間から 8 時間後の現場海⽔を採集するようにした。
なお、「Galvanic Timed Releases」の詳細は、International Fishing Devices Inc.のホームページ（https://www.underseareleases.com/）を参照されたい。ガルバニックリリーサーは、「4.2.4 メイオベ
ントス⽤堆積物採泥器」のトリガーとしても利⽤している。

図 4.2.3.1. ランダーに取付けた 3 本のニスキン採⽔器と Galvanic Timed Releases。（a） ニスキン
採⽔器、（b）Galvanic Timed Releases （ガルバニックリリーサー）。
表 4.2.3.1 ガルバニックリリーサーの種類※縦軸は溶解時間、横軸は⽔温を⽰し、⾚字のアルファベットは型番をそれぞれ⽰す。

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4.2.3.2. ニスキン採⽔ 使⽤⽅法
図 4.2.3.2.のように、ニスキン採⽔器の上蓋と下蓋を開き、上下の蓋に取付けられているナイロンテ
グスをガルバニックリリーサーにインシュロック等を⽤いて固定する。その際、採⽔器の蓋が閉まらな
い程度にナイロンテグスの⻑さ（張⼒）を調整する。採⽔器上部にある空気⼝が閉まっていることを確認する。併せて、排⽔⼝のコックが閉じていることも確認する。
ガルバニックリリーサーによるトリガーの設定は、投⼊⽇に⾏う。また、ここでは 3 本の採⽔器に同タ
イプのガルバニックリリーサー（AA2：6〜8 時間で溶解）を取付けたが、時間をずらして採⽔したい場
合は、種類の異なるガルバニックリリーサーを取付ければ可能である。ただし、採⽔時間の精度は半⽇から 1 ⽇程度である。

図 4.2.3.2. ニスキン採⽔器による採⽔概要。

4.2.4.メイオベントス⽤堆積物採泥器
4.2.4.1. 採泥器概要
ランダーの 3 本の脚部に、G.S.表層型採泥器（アシュラ）に⽤いられている採泥器（マルチプルコア
ラーでも使⽤）を個々に取付け、ランダーが着底すると同時に⾃重で 3 本の堆積物コアがサンプリングできるようにする（図 4.2.4.1.）。採泥器の蓋を閉めるトリガーは、採⽔器と同様にガルバニックリリ
ーサーを⽤いる。
ランダーが着底した海底の底質の条件が良ければ、柱状コア 3 本の採集が可能である。

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図 4.2.4.1. メイオベントス⽤堆積物採泥器概要。

4.2.4.2. 採泥器使⽤⽅法
採泥器のセットアップは、ランダー専⽤台⾞に載せた状態でセットアップを⾏う。⾼さが⾜りない場
合は、クレーンでランダーを吊り上げてコアをセットする。
採泥器の蓋のセットアップ（図 4.2.4.2）は、上蓋と下蓋と個々に⾏う。下蓋は、蓋に付いている細ワイ
ヤーとガルバニックリリーサーの⼀端をインシュロックで固定する。ランダー本体の⽀柱からテグスを輪にして延ばし、その輪とガルバニックリリーサーのもう⼀端とをインシュロックで固定し、インシュ
ロックを締めながら蓋が開いた状態で⽌まるように調整する。上蓋は、蓋に付いている治具の⽳にイン
シュロックを通し、ガルバニックリリーサーの⼀端と結ぶ。もう⼀端は、下蓋と同様にランダー本体の⽀柱からテグスを輪にして延ばし、ガルバニックリリーサーとインシュロックで蓋が開いた状態で⽌まるように固定する。
ランダーの採泥機能の模式図を図 4.2.4.3.に⽰した。ランダーが着底すると同時に、⾃重で海底⾯にコアが挿⼊される。着底してから 6〜8 時間後にガルバニックリリーサーが溶解し上蓋が閉まる。その時点で下蓋は海底⾯に⽌まった状態となる。ランダーの回収時にランダーの浮上と同時に下蓋が閉じて採泥を完了する。

図 4.2.4.2. ガルバニックリリーサーの取付け概要。

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図 4.2.4.3. ランダーによる採泥機能の概要。

4.2.5. ⼩型深海カメラシステム（古島靖夫）
4.2.5.1. ⼩型深海カメラシステム概要
⼩型深海カメラシステムは、海底観察⽤のビデオカメラとライト（LED 光源）から構成される
5000m 級深海ミニカメラで（図 4.2.5.1.）、海洋研究開発機構の⼩栗⼀将により製作・開発された。
カメラ撮影可能時間は、起動後約 3.5 時間である。カメラは、SONY Actioncam HDR-AZ1×1 台（本体バッテリー無）に 64 GB microSD を搭載している。本カメラシステムでは、タイマー起動の他に設定した時刻・時間間隔でのプログラム撮影が可能である。バッテリーは 18650B リチウムイオンバッテ
リー（3400 mAh）を 5 本使⽤する。バッテリー5 本の内 1 本はカメラ・制御⽤で残りの４本は LED 光
源⽤に⽤いる。

図 4.2.5.1. ⼩型深海カメラシステムの概要。

4.2.5.2. ⼩型深海カメラシステム使⽤⽅法①カメラの開放蓋のネジを外し、蓋を垂直にゆっくりと引き抜く（図 4.2.5.2.）。もし内側のケーブルとコネクターが繋がっている場合は引っ張らないように注意する。ケーブルが張る前に中のカメラユニットも引き出す（ケーブルを引っ張るとコネクターが損傷するので⼗分に注意する）。カメラユニット側のケーブルを外す。

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図 4.2.5.2. カメラの開放。

②蓋と耐圧容器の接合⾯の清掃
蓋と耐圧容器の接触⾯をベンコットとイソプロピルアルコールを使って拭く（図 4.2.5.3.）。ホコリや傷が無いかを慎重に確認する。O リングも汚れているようならば外して、イソプロピルアルコールで拭き、シリコングリースを軽く塗布する。O リングの溝は綿棒を使って清掃する。カメラのレンズやアクリル窓が汚れている場合は付属のメガネ拭きで綺麗にする。O リングに傷を発⾒した場合は交換する。

図 4.2.5.3. 蓋と耐圧容器の接合⾯の清掃。

③電池の組込み
基板の電源スイッチが OFF になっていることを確認して、充電した 18650B リチウムイオンバッテ
リーを指定された向きに 5 本装填する（図 4.2.5.4.）。制御⽤には制御⽤の電池を使⽤すること。極性の向きを絶対に間違えないように注意。間違えた状態で電源を ON にすると電池と基板が壊れるため慎重に⾏う（＋極の⾚テープ確認）。

18図 4.2.5.4. 電池の組込み。

④電池固定
ドレッジなど衝撃が加わる環境で使⽤時には電池をビニールテープ等で固定する（図 4.2.5.5.）。
（スイッチ類に接触しないように注意）

図 4.2.5.5. 電池固定。

⑤光源給電⽤ケーブルの接続
カメラと蓋の間のケーブルを接続し、蓋上の 2 本の防⽔コネクターにそれぞれトリガーと光源給電⽤のケーブルを繋ぐ（図 4.2.5.6.）。光源も接続する。コネクターのピンにはグリス（信越シリコーン
Hivac-G）を塗っておくこと。これをしないとケーブル伝いに漏⽔することがある。

図 4.2.5.6. 光源給電⽤ケーブルの接続。

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⑥カメラの電源投⼊
・基板上のダイヤルスイッチを任意のタイマー時間に精密ドライバーでセットする（図 4.2.5.7.）。
・次に電源スイッチを ON にする→光源が⼀瞬点灯する（しなければこれまでの過程を再確認）。

図 4.2.5.7. カメラの電源投⼊。

⑦カメラの組み⽴て電池や蓋との隙間にシリカゲルを１〜２個⼊れながら、耐圧容器内にカメラユニットを戻す（図4.2.5.8.）。耐圧容器と蓋の接合⾯に埃などが付着していないことを⼗分に確認し、USB ケーブルが蓋の間に挟まれないように注意しながら蓋を閉じる。またショート防⽌のために、USB コネクターにはプ
ラスチック製のキャップを必ず被せておくこと。
この際に邪魔ならば⼀旦光源ケーブルは外してもよい。ただし、トリガープラグを抜くと起動してしまうので注意する。
蓋は、両⼿で均等に⼒をかけて閉じる。蓋のネジを対⾯位置から均等に締めていく（六⾓レンチを使って軽く締める程度でよい）。

図 4.2.5.8. カメラの組み⽴て

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⑧カメラの据え付け・投⼊
カメラをランダーに据え付け、投⼊開始直前にトリガープラグを抜いて、必ず 2 端⼦型の防⽔コネク
ターを代わりに挿す（図 4.2.5.9.）。トリガーを抜くと LED 光源が⼀瞬点灯し、タイマーが起動する（タイマーダイアルを０で設定した場合は連続点灯して撮影開始する）。

図 4.2.5.9. カメラの据え付け・投⼊。

⑨タイマーモードによる時系列撮影
トリガープラグを挿さずに電源をいれると、タイマーによる連続時系列撮影ができる（図4.2.5.10）。
・トリガープラグコネクターに防⽔コネクターを挿しておくか、トリガープラグを抜いておく。
・基板の Micro USB ポートに Micro USB ケーブルを接続し、⽚側を PC に接続しておく（図4.2.5.10.）。
・ターミナルソフト（TeraTerm）を⽴ち上げ、シリアル通信を確⽴しておく。
・カメラ基板の電源を⼊れる。
・FTDI ドライバのインストールが必要なため、以下のサイトから取得する。
http://www.ftdichip.com/Drivers/VCP.htm

図 4.2.5.10. タイマーモードによる時系列撮影設定。

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➉ターミナルソフト（Tera Term）の設定
USB シリアルケーブルを PC に接続した後、シリアルポートと端末を（図 4.2.5.11.）のように設定する。ポート番号は、⾃動的に割り当てられる。改⾏コードは CR とし、ローカルエコーにチェックを⼊れる。

図 4.2.5.11. Tera Term の設定。

⑪タイマーモードによる時系列撮影
ターミナルソフトを⽴ち上げ（図 4.2.5.12.）、以下の項⽬を⼊⼒する。
（1） 撮影開始の年、⽉、⽇を⼊⼒。
（2） 撮影開始の曜⽇を⼊⼒。
（3） 撮影開始の時刻を⼊⼒（分まで）。
（4） 録画時間を⼊⼒（単位は分）。
（5） 録画間隔を⼊⼒（単位は分）。⼀回しか撮らない場合は、255 にすればよい。
（6） 収録回数（7） 現在時刻の⼊⼒（年⼆桁、⽉、⽇）（8） 現在の曜⽇を⼊⼒。
（9） 現在の時間を⼊⼒（時間、分、秒）（10） ⼀通り⼊⼒が済むと、ライト電池の電圧チェックが⾏われる。13 V より⾼ければ合格。低ければ撮影に移⾏しない。この場合、電池を交換してやりなおすこと。
（11）カメラが OFF であることを確認する。（12） すべて OK なら「Y」を⼊⼒。設定はすべて終了。

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図 4.2.5.12. 設定画⾯。

⑫カメラの回収
カメラが船上に回収されたら、清⽔で洗浄しはじめに防⽔コネクターを外し、トリガープラグを挿す（カメラがまだ作動してる場合は光源が消えて撮影停⽌になる） （図 4.2.5.13.）。次に、光源とのケーブルを外して両端に防⽔コネクターを挿す。耐圧容器は、圧縮空気で⽔気を⾶ばし、ウェスで⽔気を拭き取る。
もし、耐圧容器内に浸⽔が認められた場合、使⽤しているリチウムイオン電池は浸⽔すると発⽕や有毒ガス発⽣の恐れがあるため注意する。

図 4.2.5.13. カメラの開封。

ラボにカメラを持ち込んで蓋のネジを外す。海⽔がネジ⽳から出る場合はウェスや綿棒で拭く。組⽴時と同様に蓋内側のケーブルやコネクターを損傷しないように、ゆっくりと垂直に蓋を開ける。⽔がカメラユニットに付かないように注意する。ある程度蓋を開けたら、内側のカメラユニットも併せて引き抜く。
蓋が陰圧で開けにくい場合は、隙間に厚紙などを挟みながら少しずつ開けていく。マイナスドライバ
ーなどを差し込むと接触⾯に傷つくので絶対にしない。
蓋のネジ⽳に海⽔が溜り易い構造になっており、腐⾷の原因となるので耐圧容器をウェスなどの上で
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逆さまにして排⽔させる。それでも抜けない場合は綿棒やキムワイプ等を使って拭き取る。また、耐圧窓と⾦属蓋の部分も⽔分が抜けにくいのでエアダスター等で⽔気を⾶ばす。
⑬データ収録カメラ背⾯のパネルに⾚ LED が点灯していないことを確認し、コントロール基板の電源スイッチを
OFF にする（図 4.2.5.14.）。⾚ LED が点灯している場合は撮影が継続しているので、REC ボタンを押して撮影停⽌し、カメラ PWR スイッチを OFF、続けて基板電源を OFF にする（このようにしないと映像ファイルが壊れる）。

図 4.2.5.14. カメラの作動停⽌。

撮影データは付属 USB ケーブルをカメラ・PC に接続し、コントロール基板の電源を ON にし、カメラ PWR スイッチを ON にする（図 4.2.5.15.）。PC 上でカメラ内の microSD カードがドライブとして認識される。microSD カードは、カードが認識されなくなるので決して抜かないこと。

図 4.2.5.15. 映像データの収録。

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4.2.6. RINKO Profiler（古島靖夫）
4.2.6.1. RINKO Profiler 概要
⽔温、塩分、濁度、溶存酸素（DO）等の環境計測を⾏うために、JFE アドバンテック社製の RINKO
Profiler（耐圧 2000 m 仕様：ASTD-2XTU を使⽤、現在は 3000 ｍ仕様：ASTD-3XTU）を搭載した（図 4.2.6.1.）。この RINKO Profiler には、CTD（⽔温、塩分、⽔深）センサーと併せて DO と濁度センサーが装備されている。本体の空中重量は約 3.8 kg で⽔中重量は約 2.3 kg と⾮常に軽量でかつ⼩型である。電源は、充電式リチウムイオン電池が採⽤されているため、観測時のバッテリー交換の作業が発⽣しない。測定⽅法は、⼀定時間毎にデータを記録する連続 （Continuous） モードと、間⽋的にデータを記録するバースト （Burst） モードの 2 種類が選択できる。測定インターバルは 0.1〜600 秒の間で設定が可能である。

図 4.2.6.1. RINKO Profiler。

4.2.6.2. RINKO Profiler 使⽤⽅法
RINKO Profiler の使⽤⽅法について、簡潔に記すと概ね次の４項の通りとなる。
①RINKO Profiler の充電②専⽤ソフトを⽤いた計測設定③計測を開始④計測を終了しデータ収録
図 4.2.6.2.に RINKO Profiler（ASTD-2XTU）とインターフェイス（ASTD-IF）、ノートパソコンとの接続の概略図を⽰した。

図 4.2.6.2. RINKO Profiler の接続の概略図。

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①充電
本体とインターフェイスを図 4.2.6.2.のように通信・充電ケーブルと接続する。本体の電源を OFF にした状態で ASTD-IF の CHARGE ボタンを押す。インターフェイスの CHARGE ボタンの下側のランプが⾚⾊に点灯すると同時に、ASTD-2XTU（本体）上部のパイロットランプが⾚⾊に点灯し、充電が開始される。充電が終わるとパイロットランプが消灯する。充電時間は、測器内の充電池の消耗の割合に依存するが、最⼤で 8 時間以上かかる場合もある。充電は、観測毎に必ず実施し、観測時は常にフル充電の状態で投⼊する。
②専⽤ソフトを⽤いた計測設定
RINKO Profiler には、データ収録のための専⽤ソフトウェア―（MW-RINKO-Profiler）が付属している。ここではデータの計測⽅法について簡単に⽰す。詳細は付属のマニュアルに委ねる。
RINKO Profiler の測定⽅法は、先に記した通り⼀定時間毎にデータを記録する連続（Continuous）
モードと、間⽋的にデータを記録するバースト （Burst） モードの 2 種類が選択できる。連続モードでは、プリヒート時間※1（5 秒）後から、⼀定の時間（インターバル時間※2）間隔（例えば、1 秒毎）で計測（記録）していくモードで、電⼒消費が早いため短期設置の場合に有効である（図 4.2.6.3a）。⼀⽅、バーストモードは 5 分毎、10 分毎…と⾔うように、設定した時間間隔（バースト時間※3）で計測するモードである（図 4.2.6.3b）。バーストモードの場合、計測エラーを除くために観測時間がきたら⼀定の時間間隔で複数回サンプリングを⾏い、それを平均化した値をその時の観測値とする。例えば、「10 分バーストでサンプル個数を 1 秒 30 個」と設定すると、観測時間が来ると 1 秒間隔で連続して 30個のデータを取得し、それを平均化した値をその時の観測値とする。バーストモードは、⻑期的にランダーを設置する際に有効な計測⽅法である。計測モードの設定は、ランダーの観測期間を鑑みて決めると良い。

図 4.2.6.3. RINKO Profiler による観測モードの概要。

※1 プリヒート時間（5 秒）：測器が観測準備に⼊ってから、センサーの出⼒が安定するまでに必要な時間。観測開始時刻になってから 1 データ⽬を記録するまでに、プリヒート時間分の待機時間が発⽣する。
※2 インターバル時間：0.1〜600 秒の間で設定できる。ただし、1 秒未満は 0.1 秒単位、1 秒以上は 1
秒単位の設定となる。
※3 バースト時間：1〜1440 分の間で 1 分単位で設定できる。
※4：サンプル個数：1〜18000 個の間で、1 個単位で設定できる。
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③計測を開始
本体とインターフェイスとパソコンを接続し、本体の電源を ON にする（図 4.2.6.4）。本体の電源をON にすると上部のパイロットランプが⾚⾊に点灯する。専⽤ソフトウェア―（MW-RINKO-Profiler）
を起動し、設定画⾯から、観測開始時刻、観測モード、装置の時計合わせ等の設定を⾏い（図4.2.6.5）、観測設定ウィンドウの “観測スタート“ボタンを押すと測器に観測設定が書込まれ観測設定ロ
グ情報ウィンドウが表⽰される。観測設定に問題がないことを確認してから 画⾯を閉じる。本体の電源
は ON のまま、測器から通信・充電ケーブルを取外す。通信・充電ケーブルを取外すとパイロットランプが消灯し観測待機の状態になる。観測開始時刻前になると、再びパイロットランプが点灯し、計測が終了すると消灯する。なお、本体の電源は回転式になっているため、ランダーに取付ける際には電源をOFF にしないように気を付ける。

図 4.2.6.4. RINKO-Profiler 上部の概略図。

図 4.2.6.5. MW-RINKO-Profiler の画⾯構成。

④計測を終了しデータ収録
本体の電源を OFF にして観測を終了させる。
本体と通信可能状態にし、MW-RINKO-Profiler を起動する。ソフトウェア上の“データ転送”（ソフト上のファイルフレーム）から、測器内の raw ファイルを読込む。転送ウィンドウに測器内に記録されている raw ファイルのリストが表⽰されるので、観測したデータを選択し“データ読込”からパソコンへ
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raw ファイルを抜きだす。
raw ファイルは、MW-RINKO-Profiler を介して csv ファイルに変換可能である。
4.2.7. Aquadopp-DW（超⾳波流向流速計）（古島靖夫）
4.2.7.1. Aquadopp-DW 概要
Aquadopp-DW（以下、ADP-DW）は、シングルポイント（単層計測）の超⾳波流向流速計（図4.2.7.1.）である。3 つの⾳響変換器を持ち、低反射率で良好な流速測定を可能とするアルゴリズムにより、⾼精度なデータを取得することができる。本装置では、⼀定⽔深における流向流速計の時系列変動を捉えることができる。また、本装置には、温度、コンパス、傾斜、圧⼒の各センサーも搭載されている。装置の空中重量は 3.6 kg で、⽔中重量が 1.2 kg とこのクラスの流向流速計ではコンパクトな設計になってる。さらに、専⽤のアルカリまたはリチウム内蔵バッテリーパックを 2 個装着することにより、⻑期間の設置観測も可能である。流向流速の計測地点は、専⽤ソフトウェアを介して測器から 5 m 離れた距離まで設定可能である。

図 4.2.7.1. Aquadopp-DW の外観。

4.2.7.2. Aquadopp-DW 使⽤⽅法
ADP-DW の使⽤⽅法を簡便に記す。詳細については付属のマニュアルに委ねる。
①ADP-DW のバッテリーを装着し本体と結線する
ADP-DW の圧⼒ケース下部にある４つのチタンネジとワッシャを付属の 6 ⾓レンチで外しエンドキ
ャップを開ける（図 4.2.7.2.）。耐圧容器内にある 2 ピンの電源コネクターケーブルにバッテリーを結合する（図 4.2.7.2.）。バッテリーは、必ず新品の物を使い、装着前にテスターでバッテリーに記載されている電圧を満たしているか確認する。電源コネクターケーブルにテンションがかからない様にバッ
テリーを挿⼊する。電源コネクターケーブルは円形の耐圧容器と四⾓形のバッテリーの間にできる隙間を通すと挿⼊しやすい。エンドキャップと本体とを繋いでいるメインコネクターを外すと作業はし易い
が、最後にコネクターを結合させることを忘れないようにする必要がある。
バッテリーの装着（交換）と同時にエンドキャップの O リングへのグリスアップ（必要に応じて交換）を必ず⾏う。
バッテリー交換後、エンドキャプを閉じる。その際、容器内の湿気予防として、⼩型（⼩袋⼊り）のシリカゲルがあれば容器内に⼊れておく。また、エンドキャップを閉じる際に、窒素ガスなどを充填しながら閉じると湿気防⽌になる HFC-134a のエアダスターでもよい。

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図 4.2.7.2. Aquadopp-DW のバッテリー装着。

②専⽤ソフトを⽤いて計測設定と計測の開始
新品バッテリーを装着した ADP-DW と PC を図 4.2.7.3.のように結合する。その際、ADP-DW とPC を繋ぐケーブルに AC アダプターとの接続コネクター部があるが、観測設定の際は、絶対に AC ア
ダプターとの接続はしない。なぜなら、本来装置が作動しない状の場合でも AC アダプターと接続されていると観測設定ができてしまうからである。例えば、バッテリーケーブルが繋がっていなかったり、
古いバッテリーを繋いでしまっていたりなど。この点は、まず、⼗分に注意されたい。

図 4.2.7.3. Aquadopp-DW の観測設定時の接続図。

観測設定は、専⽤ソフト（Aquadopp DW）で⾏う（図 4.2.7.4.）。専⽤ソフト（Aquadopp DW）を起動すると図 4.2.7.4 が表⽰されるので、①ボタン（Deployment Planning）を押して観測設定画⾯を開く。

図 4.2.7.4. Aquadopp DW のスタート画⾯。図中の①〜⑤は主に使うボタン。

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図 4.2.7.5. Aquadopp DW の観測設定画⾯。

観測設定の画⾯は、Standard と Inductive Modem の２画⾯がある（図 4.2.7.5.）。Standard 画⾯で計測
インターバルを秒単位で⼊⼒する。例えば、10 分インターバルに設定する場合は“600”と⼊⼒する。また、10 分インターバルに設定する際に、測定開始時刻から何秒間の値を平均化するのかを Averageinterval に⼊⼒する。例えば、ここに“60”と⼊⼒すると、計測開始時刻から 1 分間（60 秒間、60 回）⾳
波を発しその平均から流速値が決まる。次に、バッテリーの種類（Battery pack）と観測希望⽇数（Assumed duration）を⼊⼒するとバッテリーの消費量やメモリー使⽤量が確認できるので、観測期間に余裕をもった⽇数で設定する。Coordinate system は“ENU”を選択すると東⻄、南北、鉛直の各成分で流れが計測される。Blanking dist. は、ADP-DW から計測層までの距離を表す。設定が完了したら“OK” ボタンを押し、図 4.2.7.4.の画⾯に戻る。
次に、②のボタンを押すと観測開始時刻を⼊⼒する画⾯（図 4.2.7.6.）が出てくるので観測開始時刻を⼊⼒する。画⾯中央の Name に⼊⼒した名前は、ログファイルおよび設定ファイルとして保存される。
コメント欄は、覚え書きの⼊⼒が可能である。“OK”ボタンを押すと時刻合わせの画⾯が出てくるのでそのまま“OK”を押す。なお、重要なのは、この時刻はパソコンの時刻と測器の時刻を合わせる。それゆえ、観測設定を⾏う前に時報や船舶等で得られる正確な時刻とパソコンに時計を合わせておく必要がある。
最後に、設定内容が表⽰され、ADP-DW とケーブルを外すように指⽰が出るのでそれに従う。そして最後に、ADP-DW のコネクター部分にダミーのプラグを差し込み設定が完了する。

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図 4.2.7.6. Aquadopp DW の観測開始時刻設定画⾯。

③計測の終了とデータ収録回収した ADP-DW を真⽔で洗浄した後、⽔分を良く拭き取り図 4.2.7.7.のように PC と結合する。コ
ネクター部分の⽔分は、エアダスターやキムワイプなどを⽤いて良く拭き取る。ADP-DW と PC を繋ぐケーブルに AC アダプターとの接続コネクター部があるので、AC アダプターと電源も接続する。観
測終了時は ADP-DW のバッテリーが消耗しており、データ収録時に停⽌してしまう可能性があるた
め、AC 電源は必ず繋ぐ。③のボタンを押すと、観測をストップして良いかの画⾯が出てくるので“OK”を押し観測を停⽌する。

図 4.2.7.7. Aquadopp DW の観測終了時およびデータ収録時の接続図。

④データ収録図 4.2.7.7.の接続をしたまま、図 4.2.7.4.の④のボタン（Recorder data retrieval）を押すと ADP-DW
内部に保存されているデータが表⽰されるので、今回取得したデータを選択し“retrieval”を押してファイルを保存する。保存する場所は⾃由に設定ができる。保存先フォルダーに“ファイル名.aqd”というRAW データが保存される。
⑤データ変換31

④で保存したデータをテキスト変換するために、図 4.2.7.4.の⑤のボタン（Data Conversion）を押す。図 4.2.7.8.の上段画⾯が表⽰されたら、図中①の“Add file…”ボタンを押し保存した拡張⼦が aqd のファイルを選択する。変換データ保存先フォルダー（図 4.2.7.8 の②）を決め、中央の⽮印ボタン（③）を押すと図 4.2.7.8.の下段画⾯が表⽰される。必要なデータの範囲等を指定したら“OK”ボタンを押す。保存先フォルダーに、拡張⼦が“ssl”、“hdr”、”dat”というファイルが作られる。それぞれのファ
イルはテキストエディタや Excel 等のソフトウェア―で読み込むことができる。

図 4.2.7.8. Aquadopp DW の Data Conversion の画⾯。

4.2.8. その他搭載機器（古島靖夫）
4.2.8.1. フラッシャー
夜間や荒天時のランダー回収時において、浮上位置の確認や発⾒を補助するため、ランダー上部にス
トロボ発光をするストロボフラッシャー（海洋電⼦社製：10L-CD、図 4.2.8.1.）を取付けた。
本装置はチタン製で、軽量かつ防蝕性にも優れ、12,000ｍ迄の深度で使⽤が可能である。直径 4.7 ㎝で全⻑は 50 ㎝の円柱形（空中重量：約 1.3 kg）をしており、電源は単 2 アルカリ電池 4 本で約 50 時間作
動する。また、フラッシャー強度は 4.6 km〜7.3 km（2.5〜4.0 海⾥）程度である。

図 4.2.8.1. ランダー上部に取付けたフラッシャー。

32

4.2.8.2. イリジウム衛星ビーコン （iBCN）
本ランダーには、予測不能な事態（例えば、底質の状況により切離しコマンドを送信したにも関わらず本体が浮上せず、予定していた時刻よりかなり遅れて浮上した場合等）に対応するため、海面におけるランダーの位置情報の追跡が可能な次世代型の NOVATECH イリジウム衛星ビーコン（MetOcean
Telematics 社製 MMI -513 -12000、以下、イリジウムビーコン）を装備した（図 4.2.8.2.）。イリジウムビーコンは、イリジウム®衛星テレメトリシステムの双方向通信機能によりリアルタイムで GPS による位
置情報を入手することができる。イリジウムビーコンはリチウム電池（CR123A） 9 個を使用し、動作寿命は 約 4 ヶ月（60 分毎に送信の場合）である。大きさは、直径 29 mm、長さ 390 mm の円柱形で、空中重量は 0.81 ㎏で水中重量は 0.50 ㎏と軽量かつ小型の装置である。バッテリー装着後、イリジウムビーコン上部の磁気バンド（図 4.2.8.2.）を外すことで通信が始まる。なお、イリジウムによる通信を開始するためには、キュービック・アイあるいは KDDI を介した通信サービスを利用する必要がある。詳細は、キュービック・アイホームページ（http://www.cubic-i.co.jp/iridium/）を参照されたい。

図 4.2.8.2. ランダー上部に取付けたイリジウムビーコン。

4.2.8.3. ROV ホーマー
ランダーの回収時において、切離し装置が作動せず浮上させることができない等の不測の事態が発⽣した場合、ランダーは無⼈探査機（ROV）による回収を想定している。ROV ホーマー（図 4.2.8.3.1）
は、海底に設置されたランダーに装備することで、回収時に的確な位置（⽅向と距離）を知らせる簡単
で低価格な ROV ⽤⾳響ガイダンスシステムである。本ランダーでは、上部に Sonardyne 社製 ROV ホーマー（Type 7835 ROV-Homer 4,000m）を取付ける。
ROV ホーマーは、専⽤のバッテリーパックを挿⼊することで作動を開始する。アルカリバッテリーパ
ックであれば約 2 年間、ロングライフリチウムバッテリーであれば約 4.5 年間作動させることが可能である（年数は最⼤リスニング時間で、応答頻度により変わる）。各 ROV ホーマーには ID 番号が割り当てられおり、ROV 潜航調査前に船上で作動確認をした後にランダーに取付ける。⼤きさは、直径63.5 mm、⻑さ 393.9 mm の円柱形で、空中重量は 1.9 ㎏で⽔中重量は 1.2 ㎏の⼩型の装置である。
ROV ホーマーのバッテリー交換の⽅法を図 4.2.8.3.2.に⽰す。

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図 4.2.8.3.1. ランダー上部に取付けた ROV ホーマー。

ROV ホーマーのバッテリーの交換⽅法① エンドキャップの取り外し
a）2.5 mm 六⾓レンチで３箇所のネジを外す。
b）図 4.2.8.3.2 のようにエンドキャップを外側にずらす。密閉されているためかなり硬いが。ねじるよ
うに外すと⽐較的楽に外れる。ドライバー等を⽤いてこねて開けることは絶対にしない。
c）エンドキャップに着いている⾚い”圧⼒抜き栓“を内部から押し出しておく。
② バッテリーの装填a）基盤に接続されているコネクターを外し、古いバッテリーを引き出す。
b）新しいバッテリーパックの有効期限を確認して”FIT WITH THIS SIDE TOWARDS THE PCB”と記されている側を内部基盤に沿わして新しいバッテリーパックを挿⼊する。
c）バッテリーのコネクターを PCB の”BATTERY”（左側）と記されたコネクターに接続する。
d）ハウジングとエンドキャップのネジ⽳が合う位置にエンドキャップを戻す。
e）3 個の 2.5 mm 六⾓ネジを締める。（このネジはハウジング側のみネジ⼭が切られていますので
f） “圧⼒抜き栓”を押し込む。
※Sonardyne https://www.sonardyne.com/products/deep-water-beacon/※⽇本の代理店 株式会社ソリューションシステムズ
https://www.solution-systems.com/pro10/rovhomer/

図 4.2.8.3.2. ROV ホーマーのバッテリー交換。

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4.2.8.4. 浮⼒材
ランダーには、⾃⼰浮上させるための浮⼒材として、Bnethos 社製の 17 インチガラス球ブイ（204017V/H）3 個、NAUTILUS Marine Service GmbH 製の 17 インチガラス球ブイ（VITROVEX NMS-FS6700-17） 3 個、Plastech Industrial 社製の球ブイ（10AS-30）3 個をそれぞれ取りつけてある（図4.2.8.4.）。17 インチのガラス球ブイの浮⼒は 1 個当たり前者が約 25.4 kg で後者が約 26 kg、球ブイは1 個当たり約 5 ㎏である。これらの浮⼒材により、ランダーは切り離し装置で錘を切離した後に浮上する。なお、Bnethos 社のガラス球ブイについては、Bnethos 社がガラスブイの製造・販売を数年前に⽌めてしまったため現在では新規⼊⼿ができない。

図 4.2.8.4. ランダーに取付けたガラス球ブイと球ブイ。⻩⾊：Bnethos 社製（⽶国）のガラス球ブイ、橙
⾊：NAUTILUS M.S.社製（ドイツ）のガラス球ブイと Plastech Industrial（台湾）社製の球ブイ。

4.2.8.5. 錘
ランダー下部に取付ける錘（図 4.2.8.5.）は、瀧澤鋳機製作所製の直径 300 mm、⾼さ 165 mm の円柱形をしている。錘は、鉄製で重さは約 92 kg である。錘の⼤きさのうち特に⾼さについては、ランダーが着底した際に錘が海底に当たらないように調整されている。ランダーの錘を重くしたい場合は、円柱形の錘の横⽅向に重さを増やす。

図 4.2.8.5. ランダーに取付けた錘。

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4.3. ランダー観測（古島靖夫）
4.3.1. 事前準備
4.3.1.1. 装置類の重量計測とバランス調整
現在、現場調査で使⽤しているランダー（図 4.1.1.1.）の総重量は、錘を取付けた状態おおよそで452.0 kg ある。また、4.3.1.3.にも記すがランダーの浮⼒は約 429.8 kg と推算されている。したがって、現在のランダーは、海中では約 22.2 kg で沈む⽅向（海底⽅向）へ⼒がかかる。また、錘の⽔中重量は 80.9 kg と推算できるため、錘を切離し後のランダーの上向きの浮⼒は約 58.7 kg となる。ただし、この浮⼒には、採泥器１本あたりの引抜き⼒（2.6〜5.9 kg）を含めなければいけないことに注意する必要がある。
基本的には、上記の重量バランスが保持できれば、装置類の付け替えなどは⾃由に可能である。その際、取付けたい装置の空中重量と⽔中重量の確認は必ず⾏い、記載が無い場合は、⾃⾝で⼤型⽔槽等を利⽤して計測する。
以下にランダー観測を⾏うための事前準備の例として、海洋研究開発機構で実施した屋内試験の⽅法を記す。
ランダーの重量計測は、海洋研究開発機構では⼯学実験場にある天井クレーンと⼤型⽔槽（超⾳波⽔槽）で⾏った（図 4.3.1.1.）。この時に計測をする項⽬は以下の通りである。
・ランダー⽤の錘のみの空中重量と⽔中重量の計測・装置類を取付けたときのランダー空中重量の計測（錘はなし）
・装置類と錘を取付けたときの空中重量と⽔中重量の計測※⽔中重量を計測する際に、ランダーが⼤型⽔槽内で沈むことを⽬視により確認すること。
・バランス調整

図 4.3.1.1. ランダーの重量計測模式図（左）と現場写真（右）。

ランダーのバランス調整は、錘を付けずにクレーンで⼤型⽔槽にランダーを垂下し、まずランダーが浮くことを確認する。次に、クレーンに張⼒が無くなった状態でランダーの傾き具合を⽬視により観察する。上部からランダーを沈める⽅向に⼒を加え、⽔⾯での動きを確認し極端な傾きが⽣じていないか記録する。ランダーが傾く場合は、機器類の配置場所を再検討し、再度バランス調整を⾏う。

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図 4.3.1.2. ランダーのバランス調整試験。

4.3.1.2. 浮⼒調整本ランダーは、表 4.1.1.1.に記載された機器類を搭載し、設置・回収ができるように浮⼒調整がされている。もし、構成された機器類を変更する場合、可能な限り現状の浮⼒が維持されるように機器類の追加あるいは削減を⾏うようにされたい。また、構成を変えた場合は、4.3.1.1.で⽰した屋内試験、後述
する岸壁試験を必ず実施すると同時に浮⼒計算を⾏い観測に備える。
本ランダーの天頂部には、あと 1 個のガラス球ブイを装備するスペースがある。浮⼒を増やしたい場
合は、ガラス球を増やすか本体に別の浮⼒材（球ブイやシンタクチックフォーム等）を加えることができる。浮⼒との関係で錘を重くする必要がある場合は、図 4.2.8.5.で⽰した円柱形の錘の⾼さは維持をして、径を変える等を講じて重くするのが良いと考えられる。なぜなら、海底におもりが着底しランダーが浮いた状態になるとランダー全体が傾き錘との切離しに⽀障が⽣じるからである。
浮⼒調整は、ランダー全体の重量とそこから推算される浮⼒との差などを綿密に試算しておく必要がある。
（錘付きランダー総重量 kg）−（錘付きランダーの⽔中重量㎏）＞0 （kg） …①①式が成り⽴てばランダーは沈むが、この値が軽すぎると沈降速度が遅くなり、海流の影響で設置⽬
標地点と⼤きく異なる地点に着底してしまう可能性がある。現在のランダーの下向きの重さは約 22 kg
あり、沈降速度はおおよそ 0.6 m/sec で、投⼊地点のほぼ直下に設置ができている。また、②式が成り
⽴てば、ランダーには浮く⽅向に⼒がかかる。
①−（錘の⽔中重量 ㎏）＜0 （㎏） …②
現在のランダーでは、沈む⼒が約 22 kg で錘の⽔中重量が約 8１kg だから約−59 kg の⼒が浮く⽅向働くように調整されている。次の節では、ランダーの屋内試験と岸壁試験から浮⼒を計算する⽅法を⽰す。
4.3.1.3. 浮⼒計算
ランダーの浮⼒計算を⾏う場合、事前に屋内での重量計測（屋内試験）や岸壁での作動試験（岸壁試験）を実施する必要がある。
ランダーの屋内試験の概要については、4.3.1.1.に⽰した通りである。ここでは、ランダーの岸壁試験の概要と屋内試験で得られた結果を合わせた浮⼒計算の⽅法を⽰す。ランダーの岸壁試験では、浮⼒計算に必要な重量計測のみならず、取付けられた採⽔器や採泥器が確実に作動し⾃⼰浮上できるのかも併せて試験を⾏う。なお、岸壁試験では、25 トンクレーン⾞を 1 ⽇⼿配（経費は 8 万円程度）する必要

37

があることを参考に記しておく。
2022 年に実施した岸壁試験（図 4.3.1.3.）の主な内容を以下に記す。
【試験 1】錘の巻上げ試験：クレーンの巻上げ速度（スロー、デッドスロー）の違いによる重さの振れ幅の確認。
この試験は、初めに実施しておくことを薦める。クレーン⾞は巻上スピードが⾃由に調整できる。しかし、巻上速度が速すぎると吊り上げ開始時の重さが⼤きくなる。それゆえ、スロー巻上、デッドスロ
ー巻上で吊上げ開始の重量の違いを計測しその重さ（テンション）がより⼩さい巻上げ⽅を選択するのがよい。
【試験 2】錘付き採泥器無しでフリーフォール後に重量計測：採泥器が無い場合のランダーの吊り上げ
重量の計測（2〜3 回⾏う）。15 分程度海底に設置。
この試験は、ランダーに取付けた採泥器の引抜き⼒を推定するために必要である。
【試験 3】錘付き採泥器ありでフリーフォール後に重量計測：採泥を⾏った場合のランダーの吊り上げ
重量の計測（2 回⾏う）。60 分程度海底に設置。
この試験は、ランダーに取付けた採泥器の引抜き⼒の推定と採泥器の作動確認のために必要である。
なお、この試験ではおおよそ 60 分で溶解するガルバニックリリーサーを事前に製作しておく必要がある。実際に使⽤するガルバニックリリーサーを現場海⽔に数時間浸して溶かしておく。浸す時間は、実験を⾏う時期の気温や⽔温に反映されるので注意しながら製作する。
【試験 4】ランダーの作動試験：全ての装置類と錘を取付け、実際に切離し信号を送り、⾃⼰浮上するか確認。
この試験は、実際に現場で調査が可能であるかの試験となる。この試験の際にも、試験 3 で⽤いるガルバニックリリーサーを使⽤する。
【試験 5】 錘の埋没時からの巻上げ重量の計測：錘が海底に沈んだ場合、底質によって錘を引き上げるのにどの程度の抵抗がかかるのかを計測。
この試験は、必須ではないが、試験 2 および 3 で得られた重量計測結果に内在しうる錘の埋没重量を知るうえで必要となる。この計測は、切離した錘の回収時に 2〜3 回⾏う。
<<計測結果の例>>■ランダーの体積を求める：
超⾳波⽔槽（真⽔）中における錘あり⽔中重量 32.7 kg（平均）を⽤いて逆算する。
（錘有ランダーの空中重量−錘有ランダーの⽔中重量）÷ 1（真⽔密度 kg/L）＝ ランダー体積 L（452.0 kg −32.7 kg）÷ 1（真⽔密度 kg/L）＝419.3 L■海⽔中の浮⼒を求める：ここで海⽔の密度を 1.025 kg/L とする。
419.3 L ＊1.025 kg/L＝429.8kg■ランダーの錘有りの海⽔中の正味浮⼒＝⽔中重量を求める：
452.0 kg ‒ 429.8 kg = 22.2 kg （沈む⽅向↓）■海⽔中（密度 1.025 kg/L）の錘なし時のランダーの正味浮⼒を求める：
ランダーの⽔中重量から錘の⽔中重量の差を求めればよいので以下のように計算できる。
錘の海⽔中の重量 kg＝錘の空中重量 kg−{（錘の空中重量 kg−⽔中重量 kg）×1.025 kg/L}
93.3 kg−{（93.3 kg−81.2 kg）×1.025 kg/L}= 80.90 kg
ランダーの正味の浮⼒＝22.2 kg− 80.90 kg=−58.7 kg （浮く⽅向↑）
試験 5 の結果を⽤いた場合ランダーの正味の浮⼒＝22.2 kg− 83.0 kg=−60.8 kg （浮く⽅向↑）38図 4.3.1.3. ランダーのバランス調整試験。

■採泥器の引抜き⼒の試算：
採泥器の引抜き試験では、採泥器がある場合と無い場合での引上げ時の重量が、先に求めたランダーの正味の浮⼒（58.7 kg〜60.8 kg）よりも⼩さければ、ランダーには上向きの⼒がかかることになり浮上する。ただし、底質の違い（砂や泥など）によってその⼒は⼤きく変わる可能性があるので、余裕のある重量に調整する必要がある。以下、2023 年の結果を基に計算⽅法⽰す。
試験 2（採泥器無し）：計測値−ランダーの錘有りの海⽔中の正味浮⼒
1 回⽬：引抜き⼒ ⇒ 69.8 kg− 22.2 kg = 47.6 kg
2 回⽬：引抜き⼒ ⇒ 70.0 kg− 22.2 kg = 47.8 kg
試験 3（採泥器有り） ：計測値−ランダーの錘有りの海⽔中の正味浮⼒
1 回⽬：引抜き⼒ ⇒ 87.4 kg− 22.2 kg = 65.2 kg （ND）
2 回⽬：引抜き⼒ ⇒ 77.6 kg− 22.2 kg = 54.4 kg
なお、試験 2 と 3 の計測はクレーン吊り上げ時のロードセルの表⽰で最も⼤きな値を計測値とした。
なお、重量計測時は、ロードセルの表⽰板を動画で保存しておく。
（補⾜）2023 年の採泥器の引抜き⼒の試算は、図 4.3.1.4.のように岸壁付近の海底に錘が埋没してた可能性があり、計測された重量が過⼤評価されていることが⽰唆された。
錘が図 4.3.1.4.の設置状況①のような場合、吊り上げにかかる重量には錘が海底に埋没しそれを引き抜く重さはかからない。これが設置時の理想型である。しかしながら、岸壁試験 2 と 3 の回収時の錘には、錘の半分あるいはそれ以上が埋没していたような形跡が⾒られた。⼩型 ROV でも確認ができた。
埋没した錘を引き上げる⼒が線形に変化すると仮定すると、試験 2、3 の引抜き重量は過⼤評価をしている可能性がある。そこで、試験 5 として錘のみの埋没重量の計測を⾏った。ランダーの脚部の引抜き重量を求めることはできないが、仮に、錘を引き抜く⼒が海底に埋没した錘を引き抜く⼒の５割程度かかるとすると、約 35.7 kg［{（56.5+62.1）/2}×0.5）になる。この値を、試験 3 の結果（引抜き⼒の平均）から差し引ひくと採泥器有りの引抜き⼒は{（65.2+54.4）/2 ‒ 35.7}＝24.1 kg となり、結果とし
39

て、ランダーの正味の浮⼒（58.7 kg）は、採泥込みの引抜き⼒に対して 2.4 倍程度の余⼒（上向きの⼒）があると試算できた。深度が⼤きくなれば、密度は増に向くので正味浮⼒は⼤きくなるので、問題なくランダーで採泥が可能であると結論付けられた。

図 4.3.1.4. ランダー錘の埋没状況の概要図。

4.3.2. 設置⽅法
4.3.2.1. 船上での作業
ランダーに搭載する機器類は、投⼊⽇の前⽇までには取付けを完了しておく。また、各機器類のバッ
テリーのチェックは必ず⾏う。バッテリーが交換式の装置は新品のバッテリーを装着し、充電式の装置
はフル充電しておく。また、作動チェックができる装置は、ランダーが投⼊される前に船上で確認できるように計測時間を設定し、作動確認後に都乳するようにする。機器を取付ける際に、装置の蓋がきちんと閉められているかチェックする。機器の設定の際には、O リングの損傷の確認やグリスアップも忘れずに⾏う。また、各種計測器の時計は、船の時間（時計）に併せておくと良い。
採泥器、採⽔器の採集トリガーとして使⽤するガルバニックリリーサーにつては、投⼊⽇に取付けるのが良い。また、ガルバニックリリーサーのタイプについては、採⽔、採泥を利⽤する研究者と協議の上で決めると良いだろう。
ランダーの錘は、最後に取付ける。軽量ハンドリフターに錘を載せ、ランダー下部でリフターを上昇させると錘は取付けやすい。
運⽤上の安全⾯から、ランダーを投⼊する直前に船上でトランスポンダーの作動確認およびトランスポ
ンダーの状況確認（スリープ状態かウェイクアップ状態か）を必ず実施し、確認後に投⼊するようにする。なぜなら、ウェイクアップコマンドが通らない限り、投⼊後の測距コールも届かなくなる危険性があるためである。
投⼊後、ランダーに付いているトランスポンダーの信号が追尾できるか事前に船側の電⼦部と確認しておく。追尾できない場合は、舷側よりトランスデューサーを垂下し船上ユニットで投⼊後のランダーを追尾する必要があるので準備をしておく。
舷側からトランスデューサーでランダーまでの距離を計測する場合、ウェイクアップコマンドを送信
後、船上ユニットの CALL ボタンを押して距離を計測する。投⼊時のトランスポンダーの応答⾳は 1 回返してくる（フックが閉の時）。なお、回収時の距離計測時のトランスポンダーの応答⾳は 2 回返してくる（フックが開の時）。なお、トランスポンダーはスリープ状態からウェイクコマンドを受けた時か
ら 1 時間はウェイクの状態になる。したがって、ウェイクアップコマンドを送信してから 1 時間以上か
けてランダーが下降している場合は、⼀度、スリープ状態になってしまうので、再度ウェイクアップコ
マンドを送信する必要がある。
4.3.2.2. 設置時間の設定
ランダーの設置時間に特に決まりはない。調査計画、航海⽇程に準じて設置して構わない。ただし、ランダーの設置位置（緯度、経度情報）については、船側と良く協議をして決める。3 点補正が必要な場合は、それぞれの点でトランスデューサーを使ったランダーまでの距離の計測とその時の位置情報の計測が必要となる。機器調整が完了したら、ランダーは船上から⾃由落下させて海底に設置する。
4.3.3. 回収⽅法
4.3.3.1. 回収時の船上作業

40

船上にてトランスデューサーと船上ユニット（図 4.2.1.1b、c）を準備する。ランダーの錘の切離しの許可が船側から下りたら、舷側よりトランスデューサーを垂下し、船上ユニットから切離しの信号を送る（図 4.3.2.1.）。まず、船上ユニットの UNIT CODE 等を図 4.3.3.1.1.のように設定し電源を⼊れる。
次に、船上ユニット左側下部の「OP1 WAKE」ボタンを押しランダーのトランスポンダーを起動する。
その後、「CALL」ボタンを押しランダーまでの距離を何度か確認する。距離は、ボタン上部の画⾯に「L＝****m」と表⽰される。応答⾳は 1 回返ってくる。ランダーの設置⽔深とほぼ同程度の距離であった場合、船橋に切離しコマンドを送信する旨の連絡をした後、切離しのコマンドをランダーへ送る。切離しコマンドは、船上ユニットの左側下部にある「CALL」と「REREASE」のボタンを少し⻑めに押す。切離しが完了するとランダーのトランスポンダーから 16 回応答（信号）⾳が返ってくる。その時
点で、切離しが完了した旨を船橋に伝える。切離し後、「CALL」ボタンを押し、浮上していることを確認し、ランダーまでの距離を伝える。ランダーは概ね 1.0 m/s の浮上速度で上昇する。⽔深と浮上速度からおおよその浮上時間も併せて船橋に伝える。⽔深 2200 m の地点にランダーを設置・回収した場
合の⾒積時間の概要図を図 4.3.3.1.2.に⽰した。なお、船側の電⼦室でトランスポンダーの信号が追える
場合は依頼する。なお、ランダーの海⾯への浮上確認は⽬視で⾏う。

図 4.3.3.1.1. 切り離し装置船上ユニットの概要。

図 4.3.3.1.2. ランダー設置・回収時の⾒積時間の概要図。

海⾯に浮上したランダーの回収は、2 通りの⽅法がある。１つ⽬は、浮上したランダーに船を近づけ41て舷側からランダーに回収⽤フックを取付け、船のクレーンで回収する⽅法である（図 4.3.3.1.3.）。もう⼀⽅は、浮上したランダーに作業艇を使って近づき回収⽤フックを取付けた後、船のクレーンで回収する⽅法である（図 4.3.3.1.4.）。いずれの⽅法を使うかは、利⽤する船側とよく打合せを⾏い、回収時に必要なロープのランダーへの取付け等の指⽰を事前に受けて準備をしておくのが良いだろう。

図 4.3.3.1.3. 作業艇を使ったランダーの回収作業の概要。

図 4.3.3.1.4. ランダーの回収作業の概要。

船上に回収されるランダーの脚に採泥器が取付けられている場合は、ランダーをオンデッキする（船上に準備した台⾞に載せる）前に、クレーンで吊上げた状態で採泥管を取り外すと作業がし易い。特に、ランダー台⾞の１辺に着座する脚部の採泥管は、ランダーを吊り上げた状態でないと回収できないことに注意する。
4.3.3.2. 回収後の整備（陸上）ランダーを船上に回収したら、船上の真⽔で全体を洗う。エアーブロワガンなどを使って⽔気を⾶ばす。船上での塩抜きは難しいので、取り外しが可能な計測機器類をまず取外し、塩抜きをした後にデータ収録等を⾏う。
航海終了後、陸上に上げたランダーは、⾼圧洗浄機等を使って良く洗浄する。特に、ガラス球の 内部
およびフレームのパイプ内部の塩分はよく洗浄しておく。⼤型の⽔槽などがある場合は、クレーン等を利⽤して真⽔の⼊った⽔槽に浸けて塩抜きをするのも有効である。また、各装置を取付けてある治具類も⼀旦ばらして、錆び落としやグリスアップをしておくと良いだろう。

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5. ⼤型の⿂類・無脊椎動物の分析（⼭北剛久・吉⽥尊雄・宮 正樹・源 利⽂）
5.1. 無⼈探査機 ROV などによる画像の取得と分析（⼭北剛久）
5.1.1. 調査範囲・航⾛条件の選定
環境変化の影響や時間変動をモニタリングするにあたり、基本的には調査対象範囲の環境の傾度全体をランダムに複数の独⽴した繰り返しをもって、サンプリングすることが求められる。環境傾度については、⽔深や海流、地形などが考えられる。海⼭のふもとから⼭頂までの⽔深、海流などの条件がことなるであろう各⽅位、⽕⼭のカルデラの内外などの異なる環境の場所については⽐較できることが理想である。例えば、Rowden et al. 2017（図 5.1.1.1.）では⼀つの海域において、6 つの海⼭それぞれについて平均 19 以上のトランセクトを調査し、これらの海⼭での⽣物の在不在の予測モデルの作成を可能にしている。これらと同等の⽐較を実施するには、例えば深海曳航式カメラ Deep-tow やカメラ付きト
ロールや AUV などを⽤いて、広範囲のトランセクトを⼀度に調査できるシステムの活⽤が求められる。特に AUV では広範囲の画像を安定した⾼度で得ることができ（図 5.1.1.2.）、今後複数を同時運⽤し、効果的な広域調査ができることが期待される。

図 5.1.1.1. ⽣物分布モデル作成のために実施した 6 つの海⼭における多数のトランセクト調査の例。＜
Rowden 他 2017. Frontiers in Marine Science 4:335. doi: 10.3389/fmars.2017.00335.より引⽤＞。

図 5.1.1.2. AUV により海⼭調査の例、3.5 時間 2.5 km に及ぶ⼭麓から⼭頂付近までの範囲のトランセク

43

トの調査を実現した。

ROV による調査の場合は航⾏する範囲が限定されることから、⽬的や調査対象を限定する必要がある。そのため、海⼭の特定の⽔深範囲、例えば麓部分と頂上部分、あるいは頂上の異なる海⼭同⼠を⽐較するために特定の同じ⽔深に限って調査範囲を設定することが考えられる。
調査範囲やトランセクトの距離は、調査範囲の環境がなるべく⼊るようにするほかに、多様性などの評価のためにはその範囲の種数が飽和するまでの距離や環境を含む必要がある。沖合海底⾃然環境保全地域である⻄七島海嶺のケースでは、おおむね 10 数分連続的に同じ環境の範囲が続いている場所が多い。そのため、これらの各範囲の映像を連続的にあるいは切り出して使⽤する。
上記に挙げたようなトランセクトによる観測ではなく、ベイトカメラなどの設置型のカメラ、採泥器、CTD などにカメラをつけて海底をスナップショットで観測する際には、同じ調査地点での繰り返
しを得ることが難しい場合が多い。その場合には逆に１つの観測点はなるべく周辺環境が均質な代表点とする。細かい環境変化は無視し、代表点のみで議論されること少なくないが、統計的な解析を前提とすると望ましくなく、多数出現している種に限った調査や、種の発⾒のみの検討になりがちである。そのため、時間変動の⽐較であるのであれば、統計的な⽐較を可能にするために可能であれば同⼀地点の同⼀環境で複数の繰り返しをもって観測できることが望ましい。
こうした観測地点の選定は複数の教科書が存在するため参照されたい（例えば「⽣態学のための標本抽出法 Manly ら編」、「保全⽣態学の技法 宮下ら編」、「Spatial Analysis: A Guide for Ecologists
Fortin and Dale」、「Experiments in Ecology Underwood」など）。
5.1.2. 撮影条件と撮影方法の選定
撮影にあたって、基本的には決まった画⾓と同じ位置から撮影することで、のちに画⾓と⾼さとから向きの情報から⾯積の算出や補正が可能になる。そのため、基本的にはカメラのズームを使わずに、全体の景観が撮影できるようにする（図 5.1.1.2.）。また、あらかじめカメラの⽔中画⾓のほかに、撮影時のカメラ中⼼の⾼度、傾きの情報を記録しておく必要がある。特に中型以上 ROV などを⽤いる際には、センサーの位置によってカメラ中⼼とそのほかの情報との位置がずれるので、センサーからカメラ中⼼までの位置を計測して算出する必要がある点に注意が必要である。これらを⽤いた画像の撮影⾯積の算出⽅法は別途 5.1.8 に記載する。

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図 5.1.1.2. 撮影画像の例（上から 2 枚ずつ、GR、KM-ROV、GOPRO HERO3、SONY RX0）。

撮影にあたり、ライティングも重要な要素である。特に深海では⾊が⽩い海綿や珊瑚などはハレーシ
ョンによって細部が⾒えなくなってしまう恐れがある⼀⽅で、⿊⾊の⿂類などは適切に光を当てないと構造がわからない。また、⼀般にライティングが明るいほうが遠⽅を⾒ることができる。また、光によって集まる⽣物や逃避する⽣物が存在する。
これらを考慮した上で、全体を ROV で最⼤の明るさではなく、中程度の明るさで複数の⽅向から照らすことが望ましい。また、下向きのカメラの場合は LED 左右 2 灯でも⾼度によっては不⼗分な場合があり、フラッシュなどをカメラと同期させることができればその⽅が望ましい。
画像からの同定や深層学習の活⽤を前提とした場合、解像度やゆがみなどについても考慮したい。解
像度は基本的には⾼ければ⾼いほうが良いが、深層学習を実施する上では、モデルで⽤いる解像度と画像の細かなピクセルのノイズなどのバランスを考慮する必要があり、解像度を荒くすることやぼかしなどの前処理を⾏う場合もある。
市販のカメラを使⽤する際には、出⼒される解像度が⼀定より⼤きい場合には、像撮するセンサーのサイズが⼤きいほうがより明瞭に画像が記録される。また、CMOS を⽤いたカメラで動画を撮影する場
合にローリング歪みが⽣じることがある。多くが電⼦シャッターを搭載する CCD センサーを利⽤するか、電⼦シャッターが扱える CMOS センサーを⽤いるか、近年の読み出し速度が⾼速な CMOS を採⽤45したカメラを利⽤することで解決できる。
なお、事例として AUV YOZAN で使⽤しているカメラは APS-C／DX サイズ（23.6mm×15.6mm
CMOS）約 2424 万画素のセンサーを持ち、F2.8 と⽐較的レンズが明るい RICHO GR シリーズである。また、ROV で使⽤されているカメラは、JAMSTEC かいめいに搭載される KM-ROV のメインカメ
ラ Mini Zeus の場合 1/3 型（CMOS）約 200 万画素、サブカメラの Aurora Plus の場合 1/3 型 CCD の
約 48 万画素である。GoPro HERO3+（1/2.3 型(6.2×4.7mm)、1200 万画素）などオプションのカメラを設置することもある。（参考：https://www.jamstec.go.jp/mare3/j/boarding/guide_ship/doc/kmrov.pdf、https://www.first-action-camera.com/?topic_id=1）。その他に、ベイトカメラでは 1 型（13.2×8.8mm）センサーを搭載し約 1530 万画素の SONY CYBERSHOT RX0(DSC-RX0)を⽤いている。耐圧容器に⼊れやすい形状の市販カメラとしてはその他に、中型のセンサーを⽤いた Panasonic 、
LUMIX DC-BGH1（フォーサーズ 4/3 型(17.2×13mm)LiveMOS 静⽌画 1028 万画素、動画 4K）、
LUMIX DC-BS1H （フルサイズ 35.6mm×23.8mm CMOS 有効画素 2420 万画素、動画 6k）なども挙げられる。補助レンズを含め、画⾓、撮影対象、ライティングが異なるため定量的な⽐較は⾏えていな
いが、この中では RICHO GR および、SONY CYBERSHOT RX0 が、静⽌画にした際にも解像度が⾼く⽐較的よい画像が得られている（表 5.1.2.1）。
表 5.1.2.1 主要な２つのカメラの仕様
RICOH GR III 主な仕様
レンズ構成

4 群 6 枚(⾮球⾯レンズ 2 枚)

焦点距離・F 値

18.3mm (35 ミリ判換算で約 28mm 相当)、F2.8〜F16

撮像素⼦

原⾊フィルター/CMOS、23.5mm×15.6mm（ APS-C サイズ）

有効画素数

約 2424 万画素

感度(標準出⼒感度）

ISO100-102400、オート(上下限/低速限界値可)、マニュアル

⼿ぶれ補正

撮像素⼦シフト⽅式 (Shake Reduction)(3 軸補正)

ローパスセレクター

SR ユニットを⽤いたモアレ低減機能 (オフ、弱、強)ダストリムーバル

超⾳波振動による撮像素⼦クリーニング機能(DR II)

記録形式：静⽌画

形式：RAW (DNG) 14bit、JPEG (Exif2.3)、DCF2.0 準拠
⾊空間：sRGB、AdobeRGB
サイズ：【3:2】L(24M:6000x4000)、M(15M:4800x3200)、S(7M:3360x2240)、
XS(2M:1920x1280)、【1:1】L(16M:4000x4000)、M(10M:3200x3200)、S(5M:2240x2240)、
XS(1.6M:1280x1280)

記録形式：動画

ファイル形式：MPEG4 AVC/H.264 (MOV)
記録サイズ：Full HD (1920x1080、60p/30p/24p)、⾳声: 内蔵ステレオマイク
記録時間: 最⼤ 4GB または最⻑約 25 分、温度上昇時⾃動終了

RX0(DSC-RX0)仕様表

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センサータイプ

1.0 型(13.2x8.8mm) Exmor RS CMOS センサー、アスペクト⽐ 3：2

総画素数

約 2100 万画素

有効画素数

約 1530 万画素

レンズタイプZEISS テッサー T*レンズ(レンズ構成：6 群 6 枚(⾮球⾯レンズ 6 枚))

F 値(開放)

F4.0

虹彩絞り

-

焦点距離

f=7.7mm

画⾓(35mm 判相当)

84 ﾟ (24mm *2)(静⽌画)

撮影距離

約 50cm-∞(レンズ先端から)

ズーム：静⽌画時

15M サイズ 約 2 倍 / 7.7M 約 2.8 倍 / 3.8M 約 4 倍 / VGA 約 13 倍

ズーム：動画時

約 1.5 倍（4K）[4K HDMI 出⼒時]約 2 倍（HD）

デジタルズーム ：静⽌画
時

15M サイズ 約 4 倍 / 7.7M サイズ 約 5.6 倍 / 3.8M サイズ 約 8 倍 / VGA サイズ 約 13
倍

デジタルズーム ：動画時

約4倍

5.1.3. 解析⼿法・モデルの選定
5.1.3.1. 解析の時間スケールの選定
撮影された画像からの⽣物の抽出⽅法であるが、対象範囲について、連続的に⽣物を抽出する⽅法、範囲もしくは時間を区切って層別に抽出する⽅法がある。また、抽出の時間間隔についても、⼀定間隔で抽出する⽅法、ランダムに抽出する⽅法がある（図 5.1.3.1.1.）。特に連続的に抽出する場合には重複
カウントに配慮しないとならないため注意が必要である。なお、⼀定間隔の抽出は例えば 10 秒おきの抽出には ffmpeg を⽤いて以下のような⽅法を⽤いることができる「ffmpeg -i input.mp4 -vf
fps=fps=0.1 output%05d.jpg」。
AUV の連続画像については、連続的に抽出して後で重複を補正する⽅法、ROV の画像については地
形的な特徴のある範囲で区切り、区切った範囲の中から全体が⾒える画像についてランダムに抽出する⽅法を⽤いることとしている。

図 5.1.3.1.1. 映像データの解析における、記録期間の違いを図化したもの。対象には移動する⿂、⼤きな
地形や⽣物、特定の個体などが挙げられる。

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5.1.3.2. 解析で利⽤するモデルの選定
深層学習を含む画像解析のモデルには多数のタイプがあるが、主なものに以下のタイプがあげられる。画像分類のモデル、物体検出のモデル、画像を塗分けるモデル、画像を⽣成するモデルである。
「画像分類」のモデルは画像中に 1 つの物体が⼀⾯に移っている画像から特徴を抽出して分類するものである。有名なものとして深層学習が世に広まるきっかけとなった ILSVRC2012 の優勝モデルである
AlexNet、最近のものであれば、EfficientNetV2、Normalizer-Free Networks などがあげられる。この⼿法はそのまま移動窓による検出をかけることで、物体検出に使われることもあるが、基本的には判別を⽬的としたモデルであるため、今回は使⽤しなかった。なお、Alexnet などで⽤いられている畳み込み
ニューラルネットワーク (CNN)は、深層学習の基本となるもので、畳み込み層とプーリング層を何層にもわたって多数組み合わせることで、画像の特徴を効率的に抽出することができる。
「物体検出」のモデルとは、画像内にある物体を検出し、その物体を囲む四⾓形（バウンディングボックス）やそのほかの形状を⽣成するタスクである。Fast R-CNN、SSD をはじめ多数の取り組みがあるが、他の多くの物体検出アルゴリズムと⽐較して⾼速でそこそこの精度が得られる Yolo を試⾏した
例を紹介する。この⽅法は画像全体を分割してそのグリッドに対象物が含まれているかどうかを判定する。そのため、対象物の候補を探して個別に分析していく R-CNN の派⽣物とくらべて、⾼速に実⾏できることや、何もない背景から対象物を認識してしまう誤検出も格段に少なくなる。⼀⽅で、物体が多数写っている場合や、⼩さい物体が多い場合は、R-CNN や SSD の派⽣物と⽐べて調整が必要である。
画像を塗分けるモデルとは、「画像セグメンテーション」とも呼ばれ、画像内にある複数の物体や場所を個別に抽出することができる。Mask-RNN、U-Net などがあげられ、リモートセンシングなどでも活⽤されている。最近は、Efficient U-Nets などが使われ始めている。密度の⾼いサンゴや海綿などの特に被度で評価するべき⽣物の分類に適切であると考えられることから、今回試⾏対象としている。
「画像⽣成」するモデルとは、⼊⼒として与えられたデータから、類似した特徴量をもつ新しい画像を⽣成するモデルである。画像⽣成モデルは、⼿書きの絵から写真のような画像にするなどかなり⾼い
⾃由度をもった画像⽣成をするだけでなく、衛星画像から地図にするような画像のスタイル変換や画像の情報抽出に利⽤されることもある。例えば画像上連続しない⼀連の養殖いかだなどを、線として⽣成するなどができる（Yamakita 2019 IEEE-IGARSS.）⼀⽅で、⾃由度が⾼いために教師データに依存した偏りが強まる傾向がある。そのためセグメンテーションと同様の検討が実施できるが、今回検討の対象とはしていない。
5.1.4. 深層学習⽤データの作成
深層学習⽤のラベルデータの作成には、いくつかの⽅法がある。ここでは、YOLO ⽤のデータの作成⽅法として CVAT、セグメンテーション⽤のデータセットの作成⽅法としてペイントソフト（Paint.NET）を活⽤⽅法を概説する。
「YOLO ⽤のデータの作成⽅法」
YOLO ⽤のデータの作成⽅法としては、代表的なもので LabelMe、VoTT、CVAT などのソフトがある。そのうち導⼊が少し複雑ではあるものの特に「CVAT (Computer Vision Annotation Tool)」の完成度が⾼いため、主にこれを利⽤する。ここでは CVAT の使⽤について簡単に概説する。詳細は本体のマニュアルを参照されたい。
① CVAT のインストール：
CVAT のインストール⽅法として、Docker イメージや Python パッケージとして提供されている。
Windows の場合、公式サイトの記述に従い、あらかじめ WSL2 の導⼊、Docker for Windows の導⼊、Git の Windows への導⼊、GoogleChrome の導⼊を⾏った後に、GitBash の上からインストールコマン
ドを打ってインストールする（参考：https://qiita.com/taku824/items/7e55e66edac0c8e2eed0）② CVAT の起動：
⼀度インストールが完了してからは、cvat ディレクトリに移動して（cd cvat）Docker 上のサーバー

48

を起動（docker-compose up -d）することで CVAT を起動することができる。起動した状態で、Google
Chrome を開いて”localhost:8080″にアクセスすることで、CVAT にログインでき、Web ブラウザ上でアノテーションを⾏うことができるようになる。
③ アノテーションの実施：概要としては、アノテーションを⾏う画像や動画を⽤意して、画像や動画を表⽰させ、物体や場所を囲むバウンディングボックスを作成。その後、各バウンディングボックスに対応するラベルを付与する（図 5.1.4.1.）。CVAT ではジョブとタスクという階層がある点に注意が必要である。
はじめに、CVAT にログインした初回には、CVAT にログインすると、表⽰されるダッシュボード画
⾯画⾯で、新しいアノテーションジョブを作成しする。ジョブが作成されたら、アノテーション対象となる画像や動画をアップロードする。
次に、アップロードした画像を指定してタスクを作成する。タスクには、アノテーションする画像や動画、およびアノテーションの種類（バウンディングボックス、ポリゴン、キーポイントなど）を指定する。タスクが作成されると、アノテーションを実施することができるようになる。
アノテーションの画⾯でアノテーションを実施するには、画像内に対象物を囲むバウンディングボッ
クスを描画したり、ポリゴンを描画したりするなどの操作を⾏なう。バウンディングボックスやポリゴンを描画した後、各図形に対してラベルを付与する。ラベルは、タスクを作成する際にも定義できるが、あらかじめ設定されたものだけではなく途中で新しく追加することもできる。アノテーションの結
果はこまめに保存するようにしておく。

図 5.1.4.1. CVAT によるアノテーション作業の例。

④アノテーション結果のエクスポート：
アノテーションが完了したら、アノテーション結果をエクスポートして、ラベル付きデータとして保存しする。CVAT では、様々な形式でのエクスポートがサポートされている（図 5.1.4.2.）。データの形式によっては複数のファイルが⽣成されるので、それらは、zip 形式で圧縮されて出⼒される。なお別に作成したアノテーションデータも ZIP に圧縮をすることでアップロードすることが可能である。

49

図 5.1.4.2. CVAT による出⼒形式の例 （参考：https://dev.classmethod.jp/articles/import_annotation_into_cvat/）。

「セグメンテーション⽤のデータセットの作成⽅法」
セグメンテーション⽤のデータセットの作成⽅法としては、CVAT も使うことはできるが、⾊域に基づく抽出やペンタブレットによる抽出が容易に実現できるペイントソフトを活⽤する。Windows では
Paint.NET と PSD 形式保存⽤のプラグインを、Mac および Linux ではその派⽣ソフトである Pinta を⽤い、Pinta の出⼒形式である ORA 形式が読める別のペイントソフト GIMP を⽤いて PSD 形式に変換する。ここでは、Windows 上での Paint.NET での作業⽅法について説明する。なお、GIMP でも同様の作業は可能であり、ラベルの作成については以下などが参考になる（https://farml1.com/segmentation_2/）。
① インストール：まず、Paint.NET のオフィシャルサイトもしくは窓の杜から最新版の Winodows ス
トア版ではないほうのインストーラをダウンロードする（https://www.getpaint.net/download.html
https://forest.watch.impress.co.jp/library/software/paintdotnet/）。ダウンロードが完了したら、イン
ストーラを実⾏する。インストールウィザードが起動し、インストール先やアイコンの設置場所などを指定する画⾯が表⽰されるので、指⽰に従い、インストールを完了する。Paint.NET は、Windows のス
タートメニューから起動できるようになる。
② PSD 形式のファイルの読み書きを可能にするために、以下の PSD Plugin を導⼊する。
（https://www.psdplugin.com/）ダウンロードした ZIP ファイルを解凍して、PhotoShop.dll をプラグインのフォルダへとコピー＆ペーストする。プラグインのフォルダは特に変更せずにインストールした
場合には「C:\Program Files Paint.net Paint.NET FileTypes」である。Winodows ストア版や⾃分でインストール先を変更した場合には別途確認が必要である。なお、この PSD Plugin よりも GIMP のほうがより正確に PSD ファイルを操作できるので、特に⾼度な機能を⽤いた PSD ファイルへの利⽤には注意が必要である。
③ 画像の編集の開始：Paint.NET を起動する。
起動すると、開かれるウインドウに。メニューを含むメインウインドウのほかに、① ツール（作業⽅法を選択する）② レイヤー （レイヤーを表⽰、選択、作成する）。③ ⾊ 選択⾊がわかる。④履歴などがある。消えてしまった場合はメインウィンドウの右上のアイコンから再度表⽰できる。

50

（
）
まず画像を開く。
「ファイル-開く」からまたはドラックアンドドロップで画像を開く。
④ ラベルの作成：

元の画像は不意に加⼯されないように、また元のものをいつでも表⽰できるように、レイヤーウインド
ウ下のレイヤーの複製から背景の画像を複製しておく。
次に、⾊を塗る準備をする。
レイヤーパネルの下から新しいレイヤーを追加して、ラベルのカテゴリーごとのレイヤーを作成する。

ここで試しに、⼀旦保存をする。初回の保存時にはメニューの「ファイルー名前を付けて保存」から「psd」形式で保存する。以降は適宜「ファイル-保存」から上書きで保存する。

51

トレース⽅法の設定について、ペンやペイントブラシ、⾊域選択（魔法の杖）などが使⽤できる。その際、必ずアンチエイリアスを切って、「ピクセル選択範囲」もしくは「アンチエイリアスの無効」とすることで、グラデーションや中間⾊が不意に紛れ込まないようにする。
「ペイントブラシ」を使⽤する際には「ブラシ幅」を適宜調整いただき、「硬度」は 100%で、メニューの「アンチエイリアスの無効」を選択する。

「魔法の杖」の場合には、適⽤範囲を「連続します」、サンプリング⽅法を（表⽰している）「イメージ」に、選択の縁の処理を「ピクセル単位」に設定する。塗りたい⾊とレイヤーを選択しておく。

万が⼀、グラデーションがまぎれた場合には⾊域指定などで、範囲を選択したのちに新しいレイヤーで抽出範囲を塗りつぶすことで、グラデーションを回避できる。
ラベルが完成したら PSD 形式で保存する。
⑤ラベルの抽出のための PSD ファイル編集ツールのインストール：
各レイヤーの情報をラベルとして抽出するには Photoshop PSD ファイルを開くための Python パッケージである「PSD-Tools」を利⽤する。Windows 上でインストールするには、以下の⼿順を参考にする。（参考：https://qiita.com/rhene/items/ff11c7850a9a7617c50f）
まず WSL 上などに、Python をインストールする。PSD-Tools は、Python 3.6 以降のバージョンで動作する。
pip を使⽤して、PSD-Tools をインストールする。ターミナルまたはコマンドプロンプトを開き、次のコマンドを⼊⼒する。
sudo apt-get update
sudo apt-get install python-pip
pip install
pip install psd-tools
sudo apt install python-tk -ysudo -H pip install matplotlib
sudo -H pip install numpy
PSD ファイルからラベル⼀覧の作成：
python 実⾏ファイルとして、以下を
test_ext_psd_layer_1.py として保存する。
import sys
52

from sys import argv
from psd_tools import PSDImage
if __name__ == '__main__':input_file = sys.argv[1]file_path = input_file
psd = PSDImage.open(file_path)
psd.compose().save('example.png')
print(file_path)for layer in psd:
print(layer)
python test_ext_psd_layer_1.py test.psdとするとコマンド上で
test_ext_psd_layer_1.py:8: DeprecationWarning: 'compose' is deprecatedpsd.compose().save('example.png')
test.psd
PixelLayer(u'\u80cc\u666f' size=80x60)
PixelLayer(u'test1' size=54x49)
PixelLayer(u'test2\u3042\u3042\u3042' size=48x39)などのようにレイヤ名が表⽰され、psd のコンポジット画像が出⼒される。
⽇本語の⽂字コードにするには、
layer_name = layer.name.encode('cp932').decode('cp932')
print(layer_name)
サイズだけ書き出すには
print(layer.size)などのように for の中を書き換える。
また、テキストに書き出すには、以下のようにする。（>>で追記される）
python test_ext_psd_layer_1.py test.psd >> test.txt⑥PSD ファイルからラベルごとの画像の作成：
PSD ファイルからのラベルの作成については、PSD-TOOLS によってまずラベルごとの画像を作成
し、そこから、U-NET ⽤のラベルもしくは MaskRNN ⽤のラベルを作成する。U-NET については、トレーニング⽤フォルダの下に image, label の２つのディレクトリを作成し、それぞれに元の画像とイン
デックスカラー化したラベルを⼊れる。
これらの⼀連の作業は以下のプログラムで「psd_to_masks」という PSD のレイヤーをマスクとして抽出するコマンド、「masks_to_annots」という抽出されたレイヤーを YOLO,MaskRNN、U-NET の学
習⽤のラベルデータの形式に変換するプログラムを作成してある。以下から申請することで利⽤可能である「https://drive.google.com/drive/folders/19jf8eux41SZETsvYajQHcMyn66N3bxzn?usp=sharing」。なお、プログラムは Ubuntu 上でコンパイルされているため Linux ⽤となっている。
データの準備の注意点：
上記で基本的な準備は完了するが。何点か注意点がある。まず、学習にあたり画像を適切なサイズに53リサイズする必要がある。適切な画像のサイズは、ニューラルネットワークの構造や処理能⼒によって異なる。特に画像のサイズが⼤きすぎると、学習や推論が遅くなる可能性がある。
作業の準備にあたっては、画像をトレーニングデータセット、バリデーションデータセット、テスト
データセットに分割する。トレーニングデータセットは、モデルを学習するために使⽤される。バリデーションデータセットは、モデルの訓練中に汎化性能の評価に利⽤される。テストデータはモデルの作
成後のモデルの性能テストに使⽤される。バリデーションデータセットに 10-20%、テストデータセッ
トに 10-20%を分割する場合が⼀般的ですが、データのサイズや課題による。
例えば、Yolo の場合では⼀般的には以下のようなフォルダ構成でデータセットを配置する。
└─dataset_ROV20220707├─train│ ├─images│ │20220707_090159_001.jpg│ │...
│ └─labels│
20220707_090159_001.txt│...
└─valid├─images│
20220707_125801_003.jpg│...
└─labels
20220707_125801_003.txt...
深層学習の実⾏：
データセットが適切なフォーマットとフォルダ配置で準備されていれば、いよいよモデルの学習と検出を試すことができる。
各モデルの train.py を実⾏する。
それぞれのモデルの train.py は主に以下のような変数が設定できる。
yolov5weights: 初期重みのパス
cfg: model.yaml のパス
data: dataset.yaml のパス
epochs: 学習エポック数
batch_size: 学習に使⽤するバッチサイズ
img_size: 学習時に使⽤する画像サイズ
resume: 直近のトレーニングから再開する
nosave: 最終チェックポイントのみ保存
cache: 画像をメモリにキャッシュし、⾼速な学習を実現する。
name: 学習させるモデルの名前
detectron2 による MaskRNN
output: 訓練出⼒フォルダ
model_name: モデルの名前
weights: 学習に⽤いるベースウェイト54

(modelzoo のベースウェイト、もしくは過去に学習させたウェイト)
dataset: インスタンス分割のデータセットパス
annotations: インスタンスセグメンテーションアノテーションのパス
iterations: 学習の反復回数
batch_size: 学習に使⽤するバッチサイズ
learning_rate: 学習時に使⽤する学習レート
image_size: 学習時に使⽤する画像サイズ
workers: データローダワーカーの数
resume: 与えられた重みから学習を再開するかどうか
u-net
source: u-net の⼊⼒画像へのパス
masks: u-net の⼊⼒マスクへのパス
output: 訓練出⼒フォルダ
epochs: トレーニングのエポック数
image_size: 学習時に使⽤する画像サイズ
batch_size: 学習に使⽤したバッチサイズ
validation: 検証に使⽤したデータの割合
out_thresh: 学習時に使⽤する予測閾値
iterations: 学習の反復回数
n_channels: ⼊⼒画像に含まれるチャンネル数n_classes: 学習セットに含まれるクラス数 + 1 (背景)scale: ⼊⼒画像のサイズダウン係数（＊代わりに image_size を使うことが推奨されている）．
model: 学習に使⽤する u-net の基本モデル
load: 与えられたモデルから学習を再開するかどうか
モデルが作成できたら各モデルの detect.py を実⾏して、画像を指定することで画像からの検出を⾏なう。
5.1.5. 分類群の同定
映像からの⽣物種の同定にはそもそも⼤きな課題があり、⽣物の分類学的な分類キーを⼀般的な解像度と拡⼤率の映像で⼗分に押さえることは困難である。実際の分類は科やそれ以上のレベルになることが多くなる。そのうえで、過去の調査を含めて ROV やドレッジなどによるサンプリング、あるいはROV などによる拡⼤映像から得られている情報から、類似している種が出現していない場合は、その種であると推定し、類似する種がいる場合にはそれらをひとまとめにした分類カテゴリーとして特定することになる。
⼀⽅で⾊や形状、表⾯の模様など、分類キーとして⼗分に検討されていない情報であっても、同⼀地域内で、種間で⾒られている特徴を画像解析で新たに判別基準として分類可能な場合がある。画像からの⾃動での分類については、こうした部分で判別している要素が⼤きいため、⼀般的な分類カテゴリー
で必ずしも分類できない点に注意が必要である。例えば、科などの⼤きなレベルでの分離の他に、形態種や携帯に基づく機能群としての概念を適⽤する必要がある。モデル⾃体も類似したカテゴリーを分割するほど精度が下がってしまうため、必要ならばラベルのカテゴリーを減らして合わせてしまうことが求められる。
後⽇こうした課題が発⽣することを⾒越して、ROV などのリアルタイムで操作可能な調査の場合には代表的な⽣物のサンプルを採集しておくこと、分類キーとなる部分がわかるように拡⼤した画像を残しておくことなどが必要である。

55

近年の深層学習のモデルでは教師なしによる分類も盛んに⽤いられるようになっており、将来的にはそのような⼿法による分類と画像からの分類⽅法と、形態からの分類とを⽐較することが期待される。
5.1.6. 個体数の計数
個体数を計数するにあたり、深層学習の結果を⽬視による⽅法と⽐較して評価する。その⽅法にはいくつかある。代表的なものには以下のものがある。混同⾏列(Confusion Matrix)、平均精度(mean
Average Precision, mAP)、損失関数の値(loss)などである。loss は学習中に表⽰される。物体検出のタ
スクにおいては、混同⾏列(Confusion Matrix)や平均精度(mean Average Precision, mAP)が⽤いられる。これらを⽤いて⽬視カウント結果と⽐較することになる。
混同⾏列は、実際のラベルと予測されたラベルの組み合わせを⾏列で表現してクラス分類の⼀致性を評価する。この⾏列から、適合率(precision)、再現率(recall)、F1 スコア(F1-score)、正解率(accuracy)などの指標を計算することができる。例えば、⼆値分類の場合は以下のような⾏列となる。
予測
positive negative
実際 positive TP
FN
結果 negative FP
TN
ここから、正解率（（Accuracy = (TP + TN) / (TP + TN + FP + FN)）などを計算する。
平均精度は、物体検出器が正しく検出した物体の領域と、実際の物体の領域との IoU(Intersection
over Union)を計算し、閾値を変化させながら精度を求める。物体検出において、予測されたバウンディ
ングボックスと実際のバウンディングボックスの重なり具合を表す指標であり、以下の式で計算される。
IoU = (予測領域と実際の領域の交わりの⾯積) / (予測領域と実際の領域の和集合の⾯積)
平均精度は、IoU が⼀定以上の閾値を満たす予測領域を正解とみなし、その精度を求める。複数のクラスに対して mAP を計算する場合、各クラスの AP(Average Precision)を求め、それらの平均値を取ったものが mAP となる。
現実的には、混同⾏列の作成には、個々の検出したものの 1 個体 1 個体と、⽬視で計数した個体とが、対応している必要がある。つまり、画像上である個体が⽬視、モデルのそれぞれで検出されているのかを⽐較するのである。そのためラベリングを⾏った画像でテスト⽤に分けたものを⽤いて⾏いる。
Yolo では、デフォルトの設定では混同⾏列と mAP はテストデータに対して⾃動で計算されるが⾃動では表⽰されない。明⽰的に実⾏・表⽰するには「--task test オプション」「--verbose オプション」を実⾏時に記載して、テスト時に混同⾏列や mAP を計算・表⽰するように Yolo に指⽰する。計算の際の閾値は以下のオプションで設定することができる「--conf-thres（confidence の閾値）、--iou-thres（IoU の閾値）、--augment（データ拡張を有効化）」。
また、画像 1 枚 1 枚の中での個体の検出に対する評価だけではなく、検出結果全体を⽬視調査と⽐較することもできる。特に個体数を計測するモデルについては、YOLO の結果であれば csv ファイルで出⼒されたラベルからラベルごとの⽣物数を数え上げることができる（図 5.1.6.1.-5.1.6.1.3）。画像ごとに⽬視で計数した結果と、モデルで計数した結果を⽐較することで、モデルの実⾏後の精度の評価が可能である。その場合は相関などを使⽤しますが、⼀般に検出数が多い場合にエラーが多くなることが多い点に注意が必要である。また、⽬視による評価が 100%正しいわけでは無い点にも注意が必要である。数えにくいものに関しては深層学習のほうが優れた検出をする場合があり、特に⽬視抽出を⼗分ト
レーニングできていない観測者が⾏う際には、⽐較の際の事後のチェックが有効である場合がある。

56

図 5.1.6.1.

深層学習のモデルの実⾏例。

図 5.1.6.2. ⽬視判読結果と深層学習のモデルの結果との⽐較による正答率。

図 5.1.6.3. ⽬視判読結果と深層学習のモデルとの計時的な⽐較例。

5.1.7. 被度の計測
被度を検討したモデルの場合の評価⽅法には mAP に近いものが複数存在する。また、ランダムな点をとってそこで混同⾏列を作成して評価することもできる。mAP に近い⽅法としては、予測された⾯と正解の⾯の IoU を計算し評価する⽅法がある（閾値を任意に変化させないことが多い）。さらにMean Intersection over Union (mIoU)として、 すべてのクラスにおける IoU の平均値を求める。また、
IoU と同様の⽅法で抽出した重なり合いから、類似度指標の１つである Dice Similarity Coefficient を計算する⽅法もある（https://jp.mathworks.com/help/images/ref/dice.html）。いずれの場合にも深層学習のモデルの出⼒として出せれる json の扱いや、⾯的な塗りつぶしデータの⽐較に定まったソフトやコ
マンドはあまりない。COCO API で実現できる（https://github.com/cocodataset/cocoapi）が、その他

57

の使い勝⼿の良いツールは無いため、GIS ソフトを⽤いるなどの⽅法も取られる。こうした指標の計算のための処理にまだ課題がある（https://pyimagesearch.com/2022/05/02/mean-average-precisionmap-using-the-coco-evaluator/）。
5.1.8. 調査⾯積の算定
⾯積当たりの個体数や被度の算出のために、調査範囲を推定することが求められる。平均的な調査撮
影幅と側線の距離から⼤まかな⾯積を推定している場合もあるが、より正確にはカメラの画⾓と向きの情報に基づき撮影⾯積を算出することができる。
まず、カメラの画⾓についての情報を⽔中、できれば調査地と同程度の⽔温・濃度の海⽔中で計測することが望ましい。あらかじめカメラの画⾓が定まっているものであれば、⽔中では焦点距離で約 1.33
倍相当の画⾓になり、ピントの合焦位置が 1/4 程度の距離になるとされている。ただし、これは概算値であり実測と差が⽣じる。画⾓が不明な場合には、できるだけ実際の撮影に近い距離でメジャーを設置するなどして計測することが必要である。他に、実際の⾵景上の既知のサイズから推定する⽅法、Metashape など SfM-MVS（Sarface flow Motion - Malti View Stereo)によって推定された値、別途平⾏
レーザーなどを活⽤する⽅法もある。
また、ROV などで⼤きな機器の場合には、機体の傾きなどの⾓度の原点（DVL などの測定点）とカ
メラ原点が異なるために、この分のオフセットを換算することも必要である。例として、JAMSTEC のROV「ハイパードルフィン」における計算を、以下に⽰す（図 5.1.8.1.）。ROV の傾きや位置を⽰す
DVL は後ろについており、底から前に設置されたカメラ中⼼までの傾きを考慮することで、DVL の情報から撮影した⾓度などの情報が抽出できる。これらとカメラとの位置関係から撮影範囲を特定する。

図 5.1.8.1. 撮影⾯積の推定⽅法検討のための⽔中画⾓と距離計算の例（ハイパードルフィンの背景図はNakajima et al. 2014 JAMSTEC-R による）。左：横から⾒た図、右：斜め上から⾒た図、下：真上から⾒た場合の図。

まず、カメラ先端とカメラ中⼼とが異なるため、カメラ中⼼までを⻑さ推定しておいて、a と c の真の58

値 a'、c'を推定する必要がある。
a'=a+SIN(RADIANS(-カメラ傾き))*先端からレンズ中⼼までの距離c'==c-(COS(RADIANS(-カメラ傾き))*先端からレンズ中⼼までの距離)
次に、カメラの⾼さは探査機⾼度 d、探査機前傾⾓ η の際には、以下になる。
CamH=a'/COS(RADIANS(η))+d-SIN(RADIANS(η))*(c'+TAN(RADIANS(η))*a')
カメラの対地の傾きを θcam を探査機前傾⾓(Pitch)とカメラ⾃体の傾き(Tilt)からもとめ画像中⼼までの距離 α0、β0 を算出する。
α0＝CamH/SIN(RADIANS(θcam))； β0=CamH/TAN(RADIANS(θcam))
カメラの横⽅向の画⾓ W の時、撮影画像の中⼼の横幅 2γ0 を以下のように求めることができる。
2γ0=2*(TAN(RADIANS(Ｗ/2))*α0)
同様の⽅法で、画像の下端と上端の横幅は、θcam の部分にカメラの縦⽅向の画⾓の半分 H/2 を加算もしくは引くことで、計算できる。また、β についても θcam を同様に計算し、カメラ上端と下端の距離を求めることが可能である。その結果撮影範囲は台形の⾯積として計算ができる。
しかし、実際には上端については背景が地平線よりも上であると無限遠になってしまうので、対地⾓度に応じて適当な上端を設定する必要がある。
以上の⽅法で、⾯積当たりの⽣物の数などの分布データを映像から作成可能になる。
5.2. 環境 DNA ⽤ニスキン採⽔器による採⽔および前処理（吉⽥尊雄）
深海の海⽔は、⽣物密度が低く、そこから得られる環境 DNA は浅海域とは異なり、⾮常に少ない場合が多い。深海の海⽔から環境 DNA を得るためには、⼤量の海⽔をろ過することで解析に必要な量の環境 DNA を得ることができる。このマニュアルでは、⿂類を想定した環境 DNA 解析のための海⽔ろ過⽅法を記載する。CTD、無⼈探査船、有⼈探査線、ランダーなどに搭載したニスキンボトルで採⽔した海⽔を 0.45 µm のステリベックスフィルター1 本にろ過する⽅法を記載するが、フィルターのつまり具合や得られる DNA 量など状況に応じて、ろ過量やろ過経を決めると良い。⼤量の海⽔をろ過する必要があるために、ろ過⽤のポンプは、送液量が⾼いものを利⽤すると効率的にろ過することができる。
また、CTD のニスキンから海⽔を移す場所、ろ過する場所、海⽔をいれたバックを保管する場所などが必要。特にろ過する場所は、コンタミしないように他とはドアなどで隔離された場所で⾏うのがよい。
5.2.1. ろ過作業に必要な実験器具と試薬・消耗品（例）○ニスキンボトルからの海⽔回収関連
ニスキン-異経ジョイント接続⽤チューブ内径 7×外径 10 mm（アズワン、 品番：9-869-16）
チューブ異経ジョイント（アズワン、品番：5-4042-31）
コック-異径ジョイント接続⽤チューブ内径 9×外径 12 mm（アズワン、 品番：9-869-20）
10 L 滅菌バック（アズワン、 品番：3-8676-03）
コック（アズワン、 品番：64-8883-14）
折りたたみ式コンテナ（アズワン、 品番：78-0186-69）
チューブ⽤の栓（UV 滅菌済みビニール袋⼜はチューブ外径に合わせて３D プリンターなどで栓を⾃作）
海⽔計量⽤吊りばかり（アズワン、 品番：62-9045-61）
海⽔計量⽤かご（アズワン、 品番：65-5552-48）○ろ過フィルター関連
ルアーロック付き 0.45 µｍステリベックスフィルター（メルクミリポア、型番：SVHML10RC）
ステリベックス両端⽤キャップ（アズワン、品番：7-3496-01）
RNAlater500 mL（サーモフィッシャー、品番：AM7021）
RNAlater ⼩分け⽤チューブ（アズワン、品番：61-9715-35）
RNAlater 注⼊⽤ディスポスポイト（個包装）（ビーエム機器、品番：231-1S）

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○ろ過⽤ペリスタポンプ関連
ペリスタポンプ マスタフレックス L/S エコノミータイプ（ヤマト科学、品番：07555-00）
ペリスタポンプヘッド 07519-06 型（ヤマト科学、品番：07519-06）
ペリスタポンプカートリッジ 07519-70 型（ヤマト科学、品番：07519-70）
ペリスタポンプ⽤チューブ L/S17（ヤマト科学、品番：96400-17）
ステリベクス接続⽤ルアーVRM606（アズワン、品番：5-1043-12）
タイトン○現場作業⽤関連
携帯式クリーンベンチ（アズワン、 品番：3-4050-11）
ディスポーザル⽩⾐
サージカルマスク
ゴム⼿袋
記録簿
医療施設⽤泡洗浄ハイター1000（アズワン、 品番：8-3813-01）
病院⽤ハイター（アズワン、 品番：8-9759-03）
厚⼿の紙タオル○ろ過作業スペース⽤
組み⽴て式棚（例えば、ルミナスのスチールラックなど）○チューブ類の組み⽴て・ニスキン⽤チューブ①コック-異経ジョイント接続⽤チューブを⻑さ 5-6 cm に切って、チューブ異経ジョイントとコックの間につなげる（図 5.2.1.1.）。
②ニスキン-異径ジョイント接続⽤チューブを 100-115 cm に切って、切ったチューブの⽚⽅を①でつなげたチューブ異経ジョイントにつなげる（図 5.2.1.1.）。もう⼀⽅は、ニスキンボトルの⼝に接続しやすくするために、斜めに切り落とす（図 5.2.1.1.）。
③ニスキン⽤チューブは、先端の栓はチューブにはめず、コックも開いた状態にして、ハイター処理を⾏う。（チューブ内部にハイターが⼊るようにするため）・ペリスタポンプ⽤チューブ①ペリスタポンプ⽤チューブを⻑さ 100-120 cm に切る。
②チューブの⽚⽅には、ステリベックスを接続できるように、ステリベクス接続⽤ルアーVRM606 をチ
ューブにつなげる。VRM606 とチューブをつなげた部分をタイトンで固定する（図 5.2.1.2）。この部
分は、ろ過中に圧⼒がかかるためにタイトンをよく締め上げておく。

60

図 5.2.1.1. ニスキン⽤チューブの構成。

図 5.2.1.2. ペリスタポンプ⽤チューブの構成。

5.2.2. チューブ類のハイター処理と UV 処理
組み⽴てたチューブ類は予めハイター処理と UV 処理を⾏う。
① ハイター原液を 6 倍希釈した溶液（約 1％次亜塩素酸濃度）を⽤意し、その溶液に、チューブ外側もチューブ内もハイター溶液にふれるように、チューブの内に空気が⼊らないように（チューブ内を溶液で満たす）いれる。⻘コンなどに、希釈ハイター溶液を 20 L ほど作り、その中にチューブを⼊れると良い。数時間〜⼀晩つけておく。
② チューブ中のハイター液を除きながら取り出し、ステンレス製のバットなどに移す。
③ 5 L ビーカーなどにミリ Q ⽔を⼊れ、取り出したチューブを 5 L ビーカー内のミリ Q にチューブ全
体が浸るまで⼊れる。チューブ外側のハイターをよくもみ洗い流し、バットなどにチューブを移す。その際に、チューブ内部の⽔はビーカーへ出し切ること。ビーカーのミリ Q はチューブ 10〜15 本ごと適宜取りかえ、排液はタンクなどに保管して排液として捨てる）。
④ ミリ Q 装置に直付けしたチューブを介して、バットに⼊れたチューブに直付けして、ミリ Q を流し、チューブ内部をミリ Q で洗浄する。
⑤ 乾燥後、UV 滅菌器にチューブを⼊れて、UV 滅菌する。
⑥ その後、チューブは 1 本ずつ UV 滅菌したビニール袋に⼊れて保管する。
5.2.3. ニスキンボトルから海⽔を滅菌バックに移す作業① 採⽔の前⽇などに、予め、折りたたみ式コンテナに滅菌バック（バックにマジックでニスキンボト
ルの番号など ID を記しておくこと）を 2 つずつ、ニスキン⽤チューブを繋げた状態で準備しておく

61

（図 5.2.1.1.、図 5.2.2.1.）。コックは開けた状態にしておく。ニスキンボトルとの接続部のチューブの先端は、チューブセット⼊れていた UV 滅菌済みビニール袋の中に⼊れて、先端部分を保護しておく。
または、⾃作した栓（ハイター処理済み）をはめておく。
② 採⽔終了後、ニスキンボトルが船上に上がってきたら、まずはニスキンボトルの上部の空気弁ネジを回して開いて下部の蓋からの漏れがないか確認する（図 5.2.2.2.）。次に、上部の空気弁ネジを閉じ、下の取⽔⼝を押して開き、上部の蓋からの漏れが無いか確認する（図 5.2.2.2.）。その後、取⽔⼝を引いて閉じておく。漏れがあった場合には、ニスキンのボトル番号を記録しておく。
③ 先端の保護したビニール袋⼜は栓を外しニスキン⽤チューブをニスキンの取⽔⼝につなげて、取⽔⼝を押して開く、上部の空気弁ネジをが開きになっているのを確認して滅菌バックへの採⽔を開始する。ニスキンボトルから海⽔がバックに流れていることを⽬視し、チューブ接続部分などから漏れがな
いかどうか確認する。滅菌バックが満杯になったら上部の空気弁ネジを閉め、コックも閉める。CTDのニスキンボトル 36 本で、この作業が全体で約 20 分くらい。
④ 最初にろ過するバックは、海⽔計量⽤のかごに⼊れてバックの重さを測定して記録し、ろ過する場
所（棚を組んでバックを置くとよい）に移動させ、ろ過を開始する（次項）。直ちにろ過しないバックの海⽔は、チューブの先に、キャップをつけたまま折りたたみ式コンテナに⼊れた状態で冷蔵室や冷蔵庫などで冷蔵保存が望ましい。
ニスキンボトル 36 本分を処理するのには、この作業には 4-5 ⼈必要。採⽔作業は全員で始めて、その後重さを測るのに 2 ⼈。運ぶ⼈、ろ過作業を始める⼈などに分担を決めると良い。また、海⽔を移した
バックは重いので、取り扱いに注意が必要。バックを海⽔を移す場所からろ過する場所や保管する場所に運ぶときは、重いのでカートなどがあると良い。

図 5.2.2.1. 折りたたみ式コンテナに⼊れたニスキン⽤チューブを繋げた滅菌バック。

図 5.2.2.2. ニスキンボトルから海⽔を滅菌バックに移す作業のセットアップ。

62

5.2.4. ろ過作業（図 5.2.4.1.、図 5.2.4.2.）① ろ過を始める前に、ステリベックスに ID を書いておく。
② 滅菌バックに繋げた、ニスキンにつなげていたニスキン-異経ジョイント接続⽤チューブをチューブ
異経ジョイント部分から外し、そこにペリスタポンプ⽤チューブをつなげる。
③ ペリスタポンプ⽤チューブをカセットにセット（左から右へ、径は 17 に合わせて締めネジは 4 くらい）する。ペリスタポンプからステリベックス部分のチューブをなるべく⻑めにセットする。
④ ポンプの右回りスイッチを⼊れる（ダイヤルは 3〜6 付近、状況に応じて調節）。
⑤ 少し海⽔を出した後で、⼀度ポンプを⽌めてステリベックスをステリベクス接続⽤ルアーVRM606
部分に接続し、最後ポンプのスイッチを⼊れ、ろ過開始する。
⑥ カセット部分からペリスタポンプ⽤チューブがよじれたり、チューブが切れて海⽔が漏れていないことを確認する。
⑦ カセット部分のペリスタポンプ⽤チューブがヘタってきたら、ペリスタポンプを⼀時的に⽌めて、カセットを外して、カセット部分のチューブを上流へ移動させて、再度ポンプにセットする。（そのまま使⽤するとチューブが切れるので、早めにチューブに負荷がからないポンプの上流の圧がかからない部分へ移動することで、チューブが切れずに使える）。
⑧ バックの海⽔を全部ろ過したところで、ペリスタポンプ⽤チューブをチューブ異経ジョイント部分
からチューブを外し、続けてろ過するバックに接続して、ろ過を続ける。（チューブを外す前に、空になったバックを別の場所に移動させ、空いた場所に続けてろ過するバックを設置して、チューブ交換をするとよい）。
⑨ 空になったバックにたニスキン-異経ジョイント接続⽤チューブを再度つなげて、重さを計量する。
⑩ 設定した海⽔量をろ過したステリベックスは、次項で説明する RNAlater をステリベックスに添加する。
⑪ 記録⽤紙に、ろ過開始時間、終了時間、バックのろ過開始前重量、終了後の重量などを記録しておく。
⑫ ⽤いているペリスタポンプ 1 台で 4 つろ過することができる。

図 5.2.4.1. ろ過作業の作業１。

63

図 5.2.4.2. ろ過作業の作業 2。

5.2.5. RNAlater 注⼊作業
① ろ過を終えたステリベックスは、携帯式クリーンベンチにて以下の処理をする。
② RNAlater を 20 mL チューブに必要量分注。（その⽇使⽤する分を新しいチューブに分注し、RNAlater が残っても再利⽤はしない）。
③ ステリベックス内に海⽔が残っている場合には、シリンジで海⽔を押しだす。
④ ステリベックスルアーのついている⽅（ろ過出⼝）にステリベックス両端⽤キャップを付けて、ディスポスポイトで RNAlater を反対の⽳（ろ過⼊り⼝）から１mL ⼊れる。（突き刺しすぎない）2 回⽬
は新しいスポイトに変えてさらにもう 1 mL ⼊れる。合計 2 mL でちょうどフィルターが全てかぶるく
らい。RNAlater を⼊れ終わったらステリベックス両端⽤キャップを付けて、ユニパック袋に⼊れる（図 5.2.5.1.）。
⑤ 冷蔵庫で１晩保存し、次の⽇に-20 ℃⼜は−80 ℃に移動し保管する。

図 5.2.5.1. RNAlater を添加したステリベックス。

5.2.6.チューブ洗いとハイター処理① ろ過後に、真⽔ですすいだ後に、ペリスタポンプ⽤チューブを外し、そこに、ニスキン-異経ジョイ
ント接続⽤チューブをつなぎ、コックを開いておく。
② すすいだチューブ類をハイター処理する（チューブ類のハイター処理と UV 処理参照）。
5.3. ⿂類の環境 DNA メタバーコディング法（DNA 抽出から種決定まで）（宮 正樹・佐⼟ 哲也）
⿂類における環境 DNA の保存法は、環境 DNA の分解を防ぐ RNAlater を添加する⽅法で解析可能な
DNA 収量が得られているため、ここでは環境 DNA 学会作成の環境 DNA 調査・実験マニュアル Ver.
2.2（2020 年 4⽉3⽇発⾏）（https://ednasociety.org/wpcontent/uploads/2022/06/eDNA_manual_ver2_2.pdf）を元に適宜、改変し解説する。

64

5.3.1. RNAlater を⽤いたサンプルの保存法
ろ過が終了したステリベクスから内部に残った⽔を取り除き、排出孔を 3φ 点眼キャップ（コクゴ社）などで封じた後、⼩型スポイトを使って注⼊孔から RNAlater を 1.7 mL 注⼊する。注⼊後はテルフュージョン三⽅活栓キャップ（XX-WS01K；テルモ社）などで注⼊孔を封じ、液が満遍なく浸透するよ
うに軽くステリベクスを転倒させる。保存液を添加したステリベクス本体に油性ペンで必要事項を記し、チャック付きポリ袋（ユニパック B-2 等）に⼊れる。さらに、そのポリ袋にも必要事項を記しておくと、本体の記⼊事項が消えてしまった場合のバックアップとなる。
5.3.2. カートリッジ式フィルターからの DNA 抽出
DNA 抽出に必要な実験器具と試薬・消耗品（例）・ 乾熱滅菌器（56℃に設定）
・ ミニローテーター（ACR-100、アズワン）と付属の 10 mL/15 mL チューブホルダー
・ QIAVac Connecting System（QIAvac 24 Plus マニホールドと QIAGEN Vacuum Pump、キアゲン社）1
・ 卓上超遠⼼機（PZ5557-A000、クボタ社）
・ 微量⾼速冷却遠⼼機（MX-307、TOMY 社）
・ 微量⾼速冷却遠⼼機⽤ローターラック（AR015-24、TOMY 社）
・ 卓上⼩型遠⼼機（マイクロシックス MS-1、アズワン）
・ ボルテックス・ミキサー（VORTEX-GENIE 2 Mixer、エムエス機器株式会社）と 3 インチプラット
ホーム
・ ルアーフィッティング（VPRM406 オスルアーロック 4mmID ⽤、株式会社アイシス）
・ 50 mL コニカルチューブ
・ DNeasy Blood and Tissue kit（キアゲン社）2・ エタノール（分⼦⽣物学⽤）
・ 2.0 mL チューブ （DNA 低吸着；ザルスタット社）
・ 1.5 mL チューブ（DNA 低吸着；ザルスタット社）
・ PBS （-）（マグネシウムとカルシウムを含まないリン酸緩衝⽣理⾷塩⽔、細胞科学研究所）
・ ゴム⼿袋（パウダーフリー）・ マイクロピペット P-5000、P-1000、P-200、P-100（ピペットマン、ギルソン社）
・ フィルターチップ（マイクロピペットの容量に合わせて各種）
・ 標準型ピンセット 1 本（IPT-12、アズワン）
・ 1.5 mL/2 mL ⽤チューブラック
1
QIAVac を使うかわりに、50 mL コニカルチューブと 2.0 mL チューブを組み合わせ、卓上超遠⼼機でRNAlater を抜き取ってもよい（Miya et al. 2016 が参考になる）。
2
本プロトコルでは、DNeasy キットに付属のバッファーATL は使⽤しない。
5.3.2.1. 実験の準備
実験中は必ずゴム⼿袋を着⽤する（これ以降の作業中に⼿袋の汚染が⽣じた場合は速やかに交換する）。
① 乾熱滅菌器を 56℃に設定する（温まるのに時間がかかるので事前に準備しておく）。
② RNAlater が充填されたろ過済みのステリベクスを準備する（凍結している RNAlater は常温で⽐較的すぐに解凍できる。
5.3.2.2. RNAlater の吸引① QIAvac 24 Plus マニホールドにルアーフィッティングを取りつける。
② ステリベクスの排出孔を封じていたキャップを取り外し、ルアーフィッティングを介して QIAvac
24 Plus マニホールドとステリベクスを接続する。
③ QIAvac のポンプのスイッチを⼊れ、注⼊孔側から排出孔側に向かって RNAlater がなくなるまで吸65引する（ステリベクス内に構造上の問題で若⼲の RNAlater が残るが、これ以降 DNA 抽出で問題はない）。
④ RNAlater を吸引したステリベクスをマニホールドから外し、再度、先のキャップで排出孔に封をする。
5.3.2.3. DNA の抽出① DNeasy Blood and Tissue kit（以下 DNeasy）と PBS （-）を使って抽出液（プレミックス）の準備をする。キット付属のスピンカラム（以下カラム）の内容量が約 700 µL であるため 1 本のステリベク
スあたり 22.8 µL の Proteinase-K（600mAU/mL）、228 µL の AL、250 µL の PBS（-）の割合でプレミックスを調整して約 500 µL の抽出液を作る。これを必要な本数と、DNA 抽出中のコンタミネーショ
ンを検知するための「抽出ブランク」⽤の 1 本を合わせた量を⽤意する。
② ステリベクスの注⼊孔を開封し、マイクロピペット（P-1000）と 1,000 µL ⽤のフィルターチップを⽤いて上記のプレミックスを充填する。充填後、同じキャップで再度封をする。この時、強く締め過ぎ
ると次にキャップを外す際に内側の突起がねじ切れ、ステリベクス内に残ることがあるので注意すること。
③ ミニローテーターの 10 mL/15 mL チューブホルダーにステリベクスを差し込み、ステリベクスが地⾯と平⾏になるようにチューブホルダーをローテーター本体に取り付ける。
④ ステリベクスを取り付けたローテーターを乾熱滅菌器内に置き、10 rpm で回転させ 56 ℃で 1 時間加温する（注意:ミニローテーターの耐久温度は 60 ℃）。
⑤ ステリベクスを加温中に DNA 回収⽤の 2.0 mL チューブ（DNA 低吸着）と 50 mL コニカルチュー
ブを⽤意し、2.0 mL チューブを 50 mL コニカルチューブに⼊れる（2.0 mL のチューブにはキャップに番号など必要事項を記⼊してコニカルチューブの奥まで押し込まない）。
⑥ ステリベクスの加温が終了後、ステリベクス内の空気が膨張しているためすぐに開封すると細かい液が外へ⾶散するため、常温で 10 分ほどローテーターを回した状態で放置する。
⑦ ローテーターを停⽌させ、ステリベクスが室温と同じ程度になったことを確認し、注⼊孔側のキャップを内部の液が漏れないように注意深く取り外す。
⑧ ステリベクスの注⼊孔をコニカルチューブ内に⼊れた 2.0 mL チューブ内に挿⼊し、そのまま 50 mL
コニカルチューブの底まで押し込む。その後しっかりとコニカルチューブのキャップを閉める。
⑨ ステリベクスを⼊れたコニカルチューブを 6,000 G で 1 分間遠⼼し、DNA 抽出液を⑤の 2.0 mL チ
ューブに回収する。
⑩ 遠⼼後、50 mL コニカルチューブを遠⼼機から取り出し、ピンセットを使ってステリベクス、2.0mL チューブの順に取り出す（2.0 mL チューブはキャップが開いた状態なので注意深く扱う）。
⑪ 2.0 mL チューブのキャップをしっかりと閉じ、使⽤済みステリベクスは廃棄する。
5.3.2.4. DNeasy Blood and Tissue kit を⽤いた DNA の精製① ステリベクスの本数に抽出ブランク 1 本を加えた本数の DNeasy 付属のカラムを⽤意する。
② 抽出 DNA が⼊った 2.0 mL チューブに 200 µL の 96〜100 %エタノールを⼊れ、ピペットでよく混和する。
③ マイクロピペット（P1000）の吸引量を 700 µL にセットし、カラムに抽出 DNA を⼊れる（カラムの内容量が約 700 µL で内部を⼗分に満たす量になる）。もし RNAlater を含んだ抽出液の量がカラムに⼊り切らない場合は、軽くカラムを遠⼼して溶液をカラムの下にあるコレクションチューブに少し落とし、残った抽出液をカラムに注ぐ。抽出ブランクも同様に 5.3.2.3 ①で⽤意した混合溶液 500 µL に 200µL の 96〜100 %エタノールを加えてピペットで混和したものを⽤いる。
④ 溶液が⼊ったカラムを 6,000 G で 1 分間遠⼼する。
⑤ 遠⼼を終了後、カラムのコレクションチューブを外し、新しい 2 mL コレクションチューブにカラムに載せ替える。使⽤済みのコレクションチューブは廃棄する。
⑥ カラムに 500 µL の Buffer AW1 を⼊れ、6,000 G で 1 分間遠⼼する。
⑦ 遠⼼を終了後、カラムを新しい 2 mL コレクションチューブに載せ替える。使⽤済みのコレクション
66

チューブは廃棄する。
⑧ カラムに 500 µL の Buffer AW2 を⼊れ、20,000 G で 3 分間遠⼼する。
⑨ 新しい DNA 低吸着の 1.5 mL チューブを⽤意し、キャップにサンプル ID などの必要事項を記⼊する。
⑩ 遠⼼を終了後、カラムを⑨で⽤意した 1.5 mL チューブに載せ替える。 使⽤済みのコレクションチュ
ーブは廃棄する。
⑪ 200 µL の溶出 Buffer AE（溶出バッファー）をカラムのメンブレン上に注ぎ、室温で 1 分間インキ
ュベートした後に 6,000 G で 1 分間遠⼼する。
⑫ 遠⼼を終了後、カラムを取り外してチューブのキャップをしっかりと閉じる。使⽤済みカラムを廃棄する。
⑬ この状態で‒20 ℃で安定的に保存可能である。
5.3.3. MiFish メタバーコーディング
5.3.3.1. ライブラリーの調整① 1st PCR
MiFish メタバーコーディングでは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を⽤いてターゲットとなる環境
DNA を分析可能な量に増幅すると同時に、PCR 産物の両端に各種のアダプターを付加することによって次世代シークエンサーで分析可能な分⼦に加⼯する（ライブラリーの調整）。⼀⽅、PCR は⼤量のDNA 断⽚を合成するため、実験の汚染源となりやすい。したがって、PCR の準備（試薬の調合等）を⾏う実験室（プレ PCR ルーム）と、PCR を⾏うまたは PCR 産物そのものを扱う実験室（ポスト PCRルーム）は空間的に隔離すべきである。また、PCR 産物を扱った当⽇には DNA 抽出やその他の実験を⾏わないなど、コンタミのリスクを減らす⼯夫も必要となる。さらには、MiFish メタバーコーディング
では⼆段階 PCR を⾏うため、最初の PCR（1st PCR）産物を希釈して⼆回⽬の PCR（2nd PCR）のテンプレートにする操作が必要となる。そのため、後者の実験室（ポスト PCR ルーム）には、この操作の際に⽣じるコンタミを防ぐためのクリーンベンチや、クリーンなオープンスペースをつくるテーブル
コーチ（KOACH T 500、KOKEN）等を設置する必要がある。また、あらかじめマイクロピペット、
チップ、チューブ、チューブラック、ミリ Q ⽔は殺菌灯式電気消毒器（NB-5、⽇鈑⼯業株式会社など）を使って除染を⾏い、実験机も泡ハイター等を使⽤して除染すべきである。
1st PCR に必要な実験器具と試薬・消耗品（例）・ サーマルサイクラー（GeneAmp PCR System 9700、Applied Biosystems など）
・ 殺菌灯式電気消毒器（NB-5、⽇鈑⼯業株式会社など）
・ Super Fi II Master Mix（Platinum SuperFi II PCR Master Mix、Invitrogen 社）
・ MiFish プライマー原液（TE バッファーで 100 µM に希釈済みのものを注⽂すると便利）
板鰓類⽤（サメ・エイ類に最適化したプライマー）
MiFish-E-F-v2（5 ́‒3 ́; 61 mer）:
ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNRGTTGGTAAATCTCGTGCCAGC
MiFish-E-R-v2（5 ́‒3 ́; 68 mer）:
GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNGCATAGTGGGGTATCTAATCCTAG TTTG
硬⾻⿂類⽤（硬⾻⿂類全般に適⽤可能なユニバーサルプライマー）
MiFish-U-F（5 ́‒3 ́; 60 mer）:
ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNGTCGGTAAAACTCGTGCCAGC
MiFish-U-R（5 ́‒3 ́; 67 mer）:
GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNCATAGTGGGGTATCTAATCCC
AGT TTG・ ミリ Q ⽔（または分⼦⽣物学実験⽤のハイグレードな滅菌⽔）・ TE バッファー（分⼦⽣物学実験⽤のハイグレードなもの）

67

・ 8 連チューブ
・ 1.5 mL チューブ（DNA 低吸着）・ マイクロピペット P-1000、P-200、P-100、P-20、P-2（ピペットマン、ギルソン社など）
・ フィルターチップ（マイクロピペットの容量に合わせて各種）
・ 電動マイクロピペット 0.5〜10 µL、5〜100 µL（Xplorer Plus、エッペンドルフ社など）
・ 1.5 mL/2.0 mL チューブ⽤チューブラック
・ 8 連チューブ⽤チューブラック
・ ゴム⼿袋（パウダーフリー）
注意：実験室共⽤でミリ Q ⽔を使っているとコンタミの原因となりやすい。ミリ Q ⽔を使う場合は殺菌灯で実験のたびに除染するか、そうでない場合は分⼦⽣物学実験⽤の滅菌⽔を購⼊した⽅がよい。
1st PCR 産物の精製と濃縮に必要な実験器具と試薬・消耗品（例）・ 微量⾼速冷却遠⼼機（MX-307、TOMY など）
・ ボルテックス・ミキサー（VORTEX-GENIE 2、エムエス機器など）
・ 8 連チューブ⽤卓上遠⼼機（マイクロ PCR スピナー MS-PCR、アズワンなど）
・ 1.5 mL/2.0 mL ⽤卓上遠⼼機（マイクロシックス MS-1、アズワンなど）
・ GeneRead Size Selection Kit（180514、キアゲン）
・ 2.0 mL コレクションチューブ（19201、キアゲン;キットの不⾜分を補うために別途購⼊）
・ 1.5 mL チューブ（DNA 低吸着）・ 80 %エタノール（適量）・ マイクロピペット P-1000、P-200、P-100、P-20、P-2（ピペットマン、ギルソン社など）
・ フィルターチップ（マイクロピペットの容量に合わせて各種）
・ ゴム⼿袋（パウダーフリー）
精製・濃縮した 1st PCR 産物の定量に必要な実験器具と試薬・消耗品（例）・ TapeStation 4150（アジレント・テクノロジー）
・ High Sensitivity D1000 Screen Tape（5067-5584、アジレント・テクノロジー）
・ High Sensitivity D1000 Reagents（5067-5585、アジレント・テクノロジー）
・ TapeStation ⽤ローディングチップ（5067-5598、アジレント・テクノロジー）
・ 卓上撹拌器（ボルテックス MS3 ベーシック、イカジャパン）
・ 8 連チューブ⽤卓上遠⼼機（マイクロ PCR スピナー MS-PCR、アズワンなど）
・ 1.5 mL/2.0 mL ⽤卓上遠⼼機（マイクロシックス MS-1、アズワンなど）
・ 電動マイクロピペット 0.5〜10 µL（Xplorer plus、エッペンドルフ）・ マイクロピペット P-2（ピペットマン、ギルソンなど）
・ フィルターチップ 10 µL
・ 8 連チューブ・ 8 連チューブラック
・ ゴム⼿袋（パウダーフリー）・ ミリ Q ⽔（超純⽔）5.3.3.1.1. 1st PCR① 実験を始める前にサーマルサイクラーの電源を⼊れる。
② プライマーの希釈：市販の TE バッファーを⽤いて、プライマーの原液（100 µM）を 20 倍に希釈する。希釈済みプライマーを MiFish-E-v2-F/R : MiFish-U-F/R=1 : 1 の⽐率で混合してプライマーミックスを作る。
③ 試薬の組成：全容量 12 µL（DNA 量 2 µL を含む）で PCR を⾏う場合に、チューブ 1 本あたりのプレミックスの組成は以下のようになる。（注意:試薬は必要量の 1.1〜1.2 倍程度の量を調合しないと、
電動ピペットで分注する際に不⾜することがある）。

68SuperFi II PCR Master Mix

6.0 µL

プライマーミックス

2.8 µL

ミリ Q ⽔1.2 µL④ PCR の繰り返し数：PCR での取りこぼし（PCR dropouts）を最⼩限に抑えるために、同⼀のサン
プル（環境 DNA）に対して 8 連チューブ 1 本を使った繰り返し数 8 回の PCR を⾏う。なお、1st PCRを実施する際に⽣じるコンタミネーションをモニターするために、1st PCR に必ず 1 本以上のブランクを⼊れること（繰り返し数は 1 回 抽出 DNA の代わりにミリ Q ⽔をテンプレートとして⼊れる）。ろ過ブランクと抽出ブランクも同時に実験する場合でも、1stPCR の段階で必ず PCR ブランクを含める。
⑤ 上記試薬を必要量の 1.1 倍程度調合してプレミックスを作成し、これを電動ピペットで 8 連チュー
ブに 10 µL ずつ分注する。その後、個々のチューブに抽出済みの環境 DNA を 2 µL ずつ電動ピペットで分注する。PCR の繰り返し数が 8 回の場合抽出 DNA を 2 µL×8=16 µL 使うことになる。
⑥ サーマルサイクラーの設定は以下のようになる:
最初に 95 ℃の DNA 変性を 3 分間挿⼊
98 ℃の DNA 変性を 20 秒
65℃のアニーリングを 15 秒 38 サイクル
72 ℃の伸⻑反応を 15 秒
最後に 72 ℃の伸⻑反応を 5 分間挿⼊
5.3.3.1.2. 1st PCR 産物の精製と濃縮
本項ではスピンカラム（GeneRead Size Selection Kit；以下「カラム」と記す）を⽤いた精製・濃縮法について記す。環境 DNA メタバーコーディングでは、事前に濃度が不明な微量の DNA を分析可能な量まで増幅させるため、それ以降の実験を阻害するプライマーダイマーやアダプターダイマーが残りやすく、これらを取り除くことが良質のライブラリーを作成するための必須条件となる。
① 8 本の繰り返しした 1st PCR 産物を 1 本の 1.5 mL チューブにまとめる。8 連チューブ 1 本あたりの反応系が 12.0 µL なので、すべて合わせると 96.0 µL になる。ブランクについては 1 繰り返しのため
12.0 µL のまま。
② 各 1.5 mL チューブに 4 倍量の SB1 溶液（384 µL;ブランクの SB1 溶液量は 48 µL）を⼊れ、よく撹拌してから軽く遠⼼する。室温で 1 分間静置。
③ GeneRead Size Selection Kit に付属する専⽤のカラム（コレクションチューブ付き）を必要分⽤意し、キャップに必要事項を記⼊する。
④ コレクションチューブにセットされたカラムに SB1 を混合した PCR 産物を⼊れ、20,000 G で 1 分
間遠⼼する。
⑤ 遠⼼後、コレクションチューブを外し、別途購⼊の新しいコレクションチューブ（19201；キアゲン社）にカラムを載せ替える。使⽤済みのコレクションチューブは廃棄する。
⑥ カラムに 700 µL の 80 %エタノールを添加し、20,000 G で 1 分間遠⼼する。終了後、カラムを新しいコレクションチューブに載せ替える。使⽤済みのコレクションチューブは廃棄する。この操作（80 %エタノールによる精製）を 2 回繰り返す。
⑦ DNA 低吸着の 1.5 mL チューブを⽤意し、必要事項をキャップに記⼊する。キャップを開けたままその上にカラムを装着する。
⑧ 1stPCR で⽤いる SuperFi II PCR Master Mix の酵素はダイマーがあまり発⽣しないので、キットに付属する TE は使わず、EB バッファー17 µL をカラムのメンブレンの中⼼に注意深くピペットで注ぎ⼊れ、室温で 1 分間静置。
⑨ 1 分間静置したカラムを 20,000 G で 1 分間遠⼼。終了後、カラムを取り外してチューブのキャップをしっかりと閉じる。カラムは廃棄する。この状態で‒20 ℃で安定的に保存が可能。
5.3.3.1.3. 精製・濃縮済み 1st PCR 産物の定量と希釈
69

精製によってプライマーダイマー等が除かれているかを確認すると同時に PCR 産物の量を測定する。
ここでは、アジレント社の TapeStation 4150 を⽤いたプロトコールを記す。ちなみに、TapeStation 以
外にも同社の BioAnalyzer、あるいは他社の同等の機器でも同様の分析が可能である。⽤いるキットはHigh Sensitivity D1000 ScreenTape System になる。ScreenTape には予めゲルが充填されており、DNA
ラダーはエレクトリックラダーが使⽤できるため、⼀度に最⼤ 16 本の 1st PCR 産物を定量できる。
① 30 分前に試薬を室温に戻しておく。
② TapeStation 4150 付属のコンピューターを起動する。起動完了後に TapeStation 4150 の本体の電源を⼊れる。
③ TapeStation とコンピューターの接続が確認できたら、TapeStation 4150 コントローラーを起動し、ScreenTape とチップのカートリッジをセットする。
④ 8 連チューブを⽤意し、サンプル数を合計した本数の High Sensitivity D1000 Sample Buffer 2 µL を分注する。
⑤ 分注した 2 µL のバッファーに精製濃縮済み 1stPCR 産物を 2 µL ずつ⼊れキャップをする。軽く遠⼼
後、ボルテックスを使⽤し 2,000 rpm で 1 分間撹拌する。攪拌後に再度軽く遠⼼し、溶液をチューブの底に集める。
⑥ 遠⼼後、溶液が⾶び散らないように注意深くキャップを開け、TapeStation 4150 にセットする。
⑦ TapeStation 4150 コントローラーの指⽰に従って泳動を開始すると、20 分ほどでターゲットのバンド（約 310 bp）がフェログラムと共に表⽰される。
⑧ ターゲットバンドの濃度を読み取り、その濃度にしたがってミリ Q ⽔で 0.1 ng/µL に希釈する。ブランクについては、ポジティブサンプルの平均希釈率を便宜的に⽤いて希釈する。但し所定の濃度に達しないときは、0.05 ng/µL に希釈して 5.3.3.2.1 2nd PCR 項にある 2nd PCR のサイクル数を増やすなど⼯夫する。
⑨ 希釈後の 1stPCR 産物と、残った希釈前の 1stPCR 産物は‒20 ℃で保存する。
5.3.3.2 ライブラリーの調整② 2nd PCR
2nd PCR に必要な実験器具と試薬・消耗品（例）・ サーマルサイクラー（GeneAmp PCR System 9700、Applied Biosystems など）
・ 殺菌灯式電気消毒器（NB-5、⽇鈑⼯業株式会社など）
・ 定量済み 1st PCR 産物（0.1 ng/µL）・ KAPA HiFi HS ReadyMix（KK2602、KAPA Biosystems 社）
・ インデクス付きプライマー原液（TE バッファーで 100 µM に希釈されたものを注⽂すると便利）
フォワードプライマーの⼀例（⻘の部分が 8 塩基からなるインデクス配列）
2nd PCR F D501 （5 ́‒3 ́; 70 mer）
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTATAGCCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTT
CCGATCT
リバースプライマーの⼀例（⾚の部分が 8 塩基からなるインデクス配列）
2nd PCR R D701 （5 ́‒3 ́; 66 mer）
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGAGTAATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCG
ATCT・ミリ Q ⽔（または分⼦⽣物学実験⽤のハイグレードな滅菌⽔）・ TE バッファー（分⼦⽣物学実験⽤のハイグレードなもの）
・ 8 連チューブ・ 1.5 mL チューブ（DNA 低吸着）・ マイクロピペット P-1000、P-200、P-100、P-20、P-2（ピペットマン、ギルソン社など）
・ フィルターチップ（マイクロピペットの容量に合わせて各種）
・ 電動マイクロピペット 0.5〜10 µL、5〜100 µL（Xplorer Plus、エッペンドルフ社）
・ 1.5 mL/2.0 mL チューブ⽤チューブラック70

・ 8 連チューブ⽤チューブラック
・ 実験⽤ゴム⼿袋（パウダーフリー）
2ndPCR 産物の切り出しに必要な実験器具と試薬・消耗品（例）・ E-Gel iBase Power System（G6400、Invitrogen）
・ E-Gel Safe Imager E-Gel Real-Time Transilluminator（G6500、Invitrogen）
・ E-gel SizeSelect II 2%（G661012、Invitrogen）
・ 分⼦サイズマーカー:50bp DNA Ladder（10416014、Invitrogen）
・ 2nd PCR 産物（1 本あるいはライブラリーごとに複数本のチューブにまとめたもの）
・ ミリ Q ⽔・ 1.5 mL チューブ（DNA 低吸着）・ マイクロピペット P-100（ピペットマン、ギルソン社など）
・ フィルターチップ 100 µL
・ 1.5 mL/2.0 mL チューブ⽤チューブラック
・ ゴム⼿袋（パウダーフリー）
切り出した 2nd PCR 産物の定量に必要な実験器具と試薬・消耗品（例）・ Qubit Fluorometer（Life Technologies）
・ Qubit dsDNA HS Assay（Q32851[100 サンプル⽤]もしくは Q32854[500 サンプル⽤]、Life
Technologies）
・ Qubit 測定⽤ 500 µL 専⽤チューブ（Q32856、Life Technologies）
・ 500 µL チューブ⽤チューブラック
・ 卓上⼩型遠⼼機（マイクロシックス MS-1、アズワン社など）
・ マイクロピペット P-1000、P-200、P-100、P-20、P-2（ピペットマン、ギルソン社など）
・ フィルターチップ（マイクロピペットの容量に合わせて各種）・ E-Gel で回収した 2nd PCR 産物
・ ゴム⼿袋（パウダーフリー）
5.3.3.2.1. 2nd PCR① 実験を始める前にサーマルサイクラーの電源を⼊れる。
② インデクスプライマーの希釈:市販の TE バッファーを⽤いて、プライマーの原液を 5 µM に希釈する。
③ 試薬の組成:全容量 15 µL（DNA 量 1.86 µL を含む）で PCR を⾏う場合に、チューブ 1 本当たりの組成は以下のようになる。（注意:試薬は必要量の 1.2 倍などに調合しないと、電動ピペットは余分に溶液を吸い上げるため分注する際に不⾜する）。
KAPA HiFi HS ReadyMix

7.5 µL

プライマー

各 0.88 µL

ミリ Q ⽔3.88 µL

定量済み 1st PCR 産物

1.86 µL

注意：2nd PCR では、フォワードプライマーとリバースプライマーに含まれるインデクス配列の組み合
わせをサンプルごとに変える。こうすることによって、シークエンス後に異なるサンプルの識別が可能になる。インデクス配列の組み合わせ⽅にはいろいろな⽅法があるが、ここでは 8 連チューブをチュー
ブラックに並べたときの「⾏」と「列」でインデクス配列を変える⽅法を採⽤する。8 連チューブの場
合、⾏数は 8 に固定されている⼀⽅で、列数は使⽤する 8 連チューブの本数で調整できる。以下に、8種のフォワードプライマー（インデクス配列は D501〜508）と 4 種のリバースプライマー（インデクス
配列は A701〜 704）を⽤いることで、32 ライブラリー（=サンプル）の並列シークエンスを可能にする 組み合わせを⽰す。また、冒頭に記したように、ラン間のキャリーオーバー（MiSeq 内部の流路に残71存する前回ランのライブラリー）の影響を最⼩限にするために、1 回使ったインデクス配列の組み合わせはその後の数回（2〜3 回）のランに使うべきではない。
D501/A701

D501/A702

D501/A703

D501/A704

D502/A701

D502/A702

D502/A703

D502/A704

D503/A701

D503/A702

D503/A703

D503/A704

D504/A701

D504/A702

D504/A703

D504/A704

D505/A701

D505/A702

D505/A703

D505/A704

D506/A701

D506/A702

D506/A703

D506/A704

D507/A701

D507/A702

D507/A703

D507/A704

D508/A701

D508/A702

D508/A703

D508/A704

上記のような組み合わせの場合、⾏⽅向（横⽅向）には標記のフォワードプライマー（D501〜508）を含むチューブ 4 本分のプレミックスを 8 種類、列⽅向（縦⽅向）には標記のリバースプライマー（A701〜704）を含むチューブ 8 本分のプレミックスを 4 種類作成すればよい。このように（プライマーのみ
を 1 本 1 本分注するのではなく）プライマーを含むプレミックスを作成することで、PCR 反応の総量が⼩さくても（ここでは 15 µL）正確な反応溶液の調整が可能になる。
④ 全体に必要なプレミックス（KAPA HiFi HS ReadyMix+ミリ Q ⽔のみのプレミックス）を必要量の1.2 倍作成する（ただしサンプル数が少ない場合は電動ピペットが余分に吸うため⾜りなくなる場合があるため、その際は必要量の 1.3 倍など変更する必要がある）。上記の 32 ライブラリーの場合であれ
ば、KAPA HiFi HS ReadyMix; 7.5 µL×32×1.2=288 µL にミリ Q ⽔；3.88 µL×32×1.2=149 µL を加える（総量 437µL）。
⑤ フォワードプライマー8 種+リバースプライマー4 種に⽤いる計 12 本の 1.5 mL チューブを⽤意してキャップに必要事項を記⼊する。
⑥ 上記のフォワードプライマー8 種のチューブに必要なプレミックス（7.5 µL+3.88 µL）
×4×1.12/2=25.5 µL を 8 本のチューブに分注する（1.12 倍量）。
⑦ 上記のリバースプライマー4 種のチューブに必要なプレミックス（7.5 µL+3.88 µL）
×8×1.12/2=51 µL を 4 本のチューブに分注する（1.12 倍量）。
⑧ ⑥の各チューブに必要な 8 種のフォワードプライマーを 0.88 µL×4×1.12=3.94 µL ずつ分注する。
⑨ ⑦の各チューブに必要な 4 種のリバースプライマーを 0.88 µL×8×1.12=7.88 µL ずつ分注する。
⑩ 各フォワードプライマーを含むプレミックスを横⽅向に 6.57 µL ずつ分注する（電動ピペットの機種によっては⼩数点第⼆位まで設定できない場合があるので、その時は 6.5 µL とする）。
⑪ 各リバースプライマーを含むプレミックスを縦⽅向に 6.57 µL ずつ分注する（電動ピペットの機種
によっては⼩数点第⼆位まで設定できない場合があるので、その時は 6.5 µL とする）。
⑫ 分注が終了した 8 連チューブのキャップを軽く閉じ、卓上⼩型遠⼼機で遠⼼して溶液をチューブの底に振り落とす。
⑬ 8 連チューブをチューブラックごと PCR 室のクリーンベンチ（あるいはそれに相当する空間）に持って⾏く。
⑭ 8 連チューブのキャップをプレミックスが⾶散しないように注意深く開け、希釈済み 1st PCR 産物
を所定のチューブに 1.86 µL ずつ⼊れる。
⑮ 8 連チューブのキャップをしっかりと閉じ、卓上⼩型遠⼼機で溶液をチューブの底に落とす。
⑯ 2nd PCR では、アニーリングと伸⻑反応を合わせたシャトル PCR を⾏う。サーマル サイクラーを
以下のように設定する。
最初に 95 °C の DNA 変性を 3 分間挿⼊72

98 °C の DNA 変性を 20 秒
72°C のアニーリング+伸⻑反応を 15 秒
最後に 72 °C の伸⻑反応を 5 分間挿⼊
⑰ 8 連チューブをサーマルサイクラーにセットし 2nd PCR を開始する。
⑱ 2nd PCR が終了すると、サンプルごとに固有のインデクスが付加されているのでチューブにまとめることができる。複数にまとめると（たとえば 1 回の調査でとられた 10 サンプルごとなど）以降のライブラリー調整での濃度のばらつきが軽減される。1st PCR 後に希釈を⾏っている場合、特に濃度調整などは不要である。
5.3.3.2.2. 2nd PCR 産物の切り出し
2nd PCR 産物には、MiSeq を⽤いた超並列シークエンスに必要なフローセル結合配列（計 53 bp）とインデクス配列（計 16 bp）が 1st PCR 産物（約 300 bp）の両端に付加されている。1st PCR 産物には、ターゲットとなる⿂類由来の産物に加えて 70 bp ほど⼤きな⾮特異的産物（微⽣物の 16S rRNA 由来の産物と推定されている）が含まれることが多い。本項では、⿂類由来の 2nd PCR 産物（約 370bp）のみを E-Gel を⽤いたゲル泳動で切り出す⽅法（実際にはピペットで吸い出す⽅法）を記す。
① 分⼦サイズマーカー（50bpDNALadder）原液 80 µL にミリ Q ⽔ 920 µL を加えて希釈する。
② E-Gel iBase Power System（以下 iBase）を E-Gel Safe Imager E-Gel Real-Time Transilluminator（以下 Safe Imager）の上にのせ、両者を付属のケーブルで接続してスイッチを ON にする。
③ E-gel SizeSelect II 2 %（プラスチックケースに封⼊されたゲルで以下「ゲル」と呼ぶ）が⼊ったパッケージを開封し、ゲルのウェルにセットされてあるコーム 2 枚を注意深く取り外す。
④ ゲルの右側を iBase の左側から挿⼊する。ゲルが正しく差し込まれると iBase のライトが点灯する。
⑤ 全てのウェルにマイクロピペットを使って 50 µL のミリ Q ⽔を注ぐ。
⑥ 2ndPCR 産物と付属の Loading Buffer を混合し、上段の各ウェルに 20〜25 µL ローディングする。
DNA マーカーをサンプルと別のウェルに 20〜25 µL ローディングする。
⑦ iBase に観察⽤プレートユニット（オレンジ⾊のフィルター付きユニット）をセットし、モードボ
タンを何回か押して Run SizeSelect 2 %（No. 9）モードにセットする。泳動時間はとりあえず 15 分にセットする。
⑧ 慣れないうちは、LED 照射ボタンを泳動中に押して産物の状態をチェックするとよい。 本マニュ
アルで指定した分⼦サイズマーカーは 350 bp が他のサイズより明るく光るので、約 370 bp のターゲッ
トバンドの良い⽬安となる。
⑨ 15 分が経過するとチャイムが鳴って泳動が⼀時停⽌する。LED 照射ボタンを押してターゲットバ
ンドの位置を確認する。回収ウェルの直上に切り込まれたサイズマーカー（基準線）に達していなければ、さらに泳動を数分間追加する。
⑩ 回収ウェルにバンド全体が⼊ったところで泳動を停⽌する。ターゲットバンドは基本的に同じサイズなので横並びになるが、ゲルの状態や産物によってはサンプル間で多少ターゲットバンドの位置が上下にずれることがあるため、ターゲットバンドが最初に中段のウェルに⼊ったものから順に吸い取る。
⑪ ピペットを⽤いて回収ウェルからターゲットバンドを吸い出し、ライブラリーごとに 1.5 mL チューブにまとめる。回収する際に、ウェルの底にピペット先端が触れるとチップの先端をゲルが塞いでし
まい、チューブに回収した溶液を注ぐ際に溶液が勢いよく⾶び出してしまうことがあるので、底のゲルにチップ先端をあまり突き刺さないように注意する。
注意:多くの場合、⼀回の回収で⼗分量の 2nd PCR 産物を吸い出せるが、定量後に 4 nM に調整するには濃度が不⾜することがある。そのような場合は、回収ウェルにミリ Q ⽔を満たして泳動を再開し、⼀旦バンドを回収ウェルの下流側に出し、泳動モードを Reverse E-Gel にして回収ウェルに戻して再び吸い出すという操作を繰り返すことも可能。この場合、カラムをつかって産物を濃縮すると⼗分な濃度の2nd PCR 産物が得られる。
5.3.3.2.3. 切り出した 2nd PCR 産物の定量
73本項では、E-Gel を⽤いて切り出したライブラリーの濃度測定法について記す。
① Qubit dsDNA HS Assay キットを冷蔵庫から取り出す。蛍光⾊素の Qubit Reagent は冷蔵で凝固しているため 30 分以上かけて室温に戻す。
② Qubit の濃度測定に必要なチューブの本数は校正⽤スタンダード#1 と#2 にライブラリーの数を加えたものになる。
③ キットが室温に戻ったら、Qubit Reagent を 1 µL に Qubit Buffer 199 µL 加えた 計 200 µL のプレミックスを必要本数分調整する。例えば濃度を測定するライブラリーが 1 本の場合、校正⽤スタンダード
2 本を含めて計 3 本が必要になるので、Qubit Reagent を 3 µL に Qubit Buffer を 597 µL 加えたプレミ
ックスとなる。
④ Qubit 測定⽤ 500 µL 専⽤チューブを 2 本取り出し、校正⽤スタンダード#1 と#2 ⽤にプレミックス
を 190 µL ずつ分注する。その後、キットに付属するスタンダード#1 と#2 をそれぞれのチューブに 10µL ずつ⼊れ、チューブのキャップを閉めてボルテックスで 2〜3 秒撹拌し軽く遠⼼する。
⑤ 濃度を測定するライブラリーの数だけ 500 µL チューブを⽤意し、それぞれにプレミックスを 198µL ずつ分注する。その後、ライブラリーを 2 µL ⼊れ、チューブのキャップを閉めてボルテックスで 2〜3 秒撹拌し軽く遠⼼する。2 分間室温で静置する。
注意；最低でも 2 分間室温で静置しないと測定値が安定しない。
⑥ Qubit Fluorometer を起動する。画⾯から DNA を選択し、次いで dsDNA High Sensitivity を選択する。校正⽤スタンダードを⽤いた校正をするかどうか聞いてくるので、④で⽤意したスタンダード#1 と#2 を Qubit の指⽰に従って順番に測定する。
⑦ 次にライブラリーの濃度測定を⾏う。チューブをセットし、Calculate Stock Conc をタッチし、使⽤するサンプルの量を 2 µL に設定して濃度を測定する。同じサンプルの濃度測定を、計測値が安定する
まで複数回⾏うとよい。
⑧ Qubit ではテンプレートを 100 倍希釈した計測値（ng/mL）が表⽰される。この値が 10.0ng/mL 未満の場合には、複数ウェルから同⼀ライブラリーを回収し、それを 5.2.3.3.1.2 項の GeneRead Size
Selection Kit などを⽤いて濃縮するなど⼯夫が必要になる。
5.3.3.2.4. インデクス関連情報
メタバーコーディングで広く使われているイルミナ社のインデクス配列（8 塩基）である（A501〜
508/A701〜712/D501〜508/D701〜712）。カスタムプライ マーを注⽂する際には、i5 の配列をフォ
ワードプライマーに、i7 の配列をリバースプライ マーに、それぞれそのまま挿⼊する。以下の表では 8塩基の配列が記載されている。MiSeq のランで⽤いるサンプルシートに記⼊する際には、i7 の配列は逆相補鎖に変換して記⼊しないとならないので、以下の表でも逆相補鎖に変換して記載している。
iSeq100 など、機種によっては記⼊の仕⽅が異なるので注意が必要である。なお、これ以外のインデク
スを使⽤したい場合は、Hamady et al. （2008） にリストアップされているインデックス配列から適当なものをピックアップすれば良い。⼿持ちのインデクス配列を増やすと、同時に分析できるライブラリ
ーの数が増えると共に、ランごとにインデクスを変えることにより、ラン間のクロスコンタミ（MiSeq
内部の流路に残存する前回ランのライブラリーに由来するコンタミ）を避けることもできる。また、異なる研究室間で相乗りシークエンスを⾏えるようになるため、研究経費の節約にもつながる。
Hamady, M., Walker, J. J., Harris, J. K., Gold, N. J., and Knight, R. （2008） Error- correcting barcoded primers forpyrosequencing
hundreds of samples in multiplex. Nature Methods 5: 235–237.
Name

i5 basesName

i7 basesName

i5 basesName

i7 bases

A501

TGAACCTT

A701

ATCACGACD501

TATAGCCTD701

ATTACTCG

A502

TGCTAAGT

A702

ACAGTGGTD502

ATAGAGGC

D702

TCCGGAGA

A503

TGTTCTCT

A703

CAGATCCA

D503

CCTATCCT

D703

CGCTCATTA504

TAAGACACA704

ACAAACGG

D504

GGCTCTGA

D704

GAGATTCC

74

A505

CTAATCGA

A705

ACCCAGCA

D505

AGGCGAAG

D705

ATTCAGAA

A506

CTAGAACA

A706

AACCCCTC

D506

TAATCTTA

D706

GAATTCGT

A507

TAAGTTCC

A707

CCCAACCT

D507

CAGGACGT

D707

CTGAAGCT

A508

TAGACCTA

A708

CACCACAC

D508

GTACTGAC

D708

TAATGCGC

A709

GAAACCCA

D709

CGGCTATG

A710

TGTGACCA

D710

TCCGCGAA

A711

AGGGTCAA

D711

TCTCGCGC

A712

AGGAGTGG

D712

AGCGATAG

5.3.3.3. MiSeq を⽤いた超並列シークエンス
本項では、イルミナ社の MiSeq（MiSeq Control Software ver. 4.0.0.1769）を⽤いた超並列シークエンス法について記す。MiSeq の使⽤ガイドは下記の URL で公開されている。
https://support.illumina.com/content/dam/illuminasupport/documents/documentation/system_documentation/translations/miseq-system-guide-15027617jpn.pdf
また MiSeq Control ソフトウェア v4.0 使い⽅の動画が下記の URL で公開されている。
https://www.youtube.com/watch?v=424dO-13K3g
本⼿法によるシークエンスを成功に導く最も重要な点は、アダプターダイマーや⾮特異的産物を含まな
い、MiFish アンプリコンのみからなる良質のライブラリーを調整することである。このような良質のライブラリーを得ると同時に、ライブラリーごとにほぼ均等なリード数を得るため、本プロトコールでは
1st PCR 産物に対して精製・定量を⾏い、1st PCR 産物を⼀定濃度（0.1 ng/µL）に調整したテンプレー
トを⽤いて 2nd PCR を⾏うプロトコールを採⽤した。また、ランを失敗しないためにも MiSeq のメン
テナンスが⾮常に重要になるので、最初にメンテナンスに関連する情報を列記した。なお、MiSeq の他にイルミナ社の iSeq100 でもほぼ同様の解析が可能であることが確認されている。
MiSeq Reagent Kit には、冷凍保存品として HT1 チューブと試薬カートリッジが、冷蔵保存品として
PR2 ボトルとフローセルの 4 点が 含まれる。PR2 ボトルとフローセルは凍結すると劣化するので、それぞれの保管は厳密に⾏う。
5.3.3.3.1. MiSeq のメンテナンス
MiSeq 内部には、シークエンス反応が⾏われるフローセルにライブラリーや試薬を送るチューブが縦横に張り巡らされている。これらチューブの流路を、前回ランの影響が残らないようにきれいに保つことがランを成功に導く⼤きな要因の⼀つになる。
MiSeq では次の 3 通りの洗浄を⾏う。① メンテナンスウォッシュ：2 回のウォッシュ液交換を伴う
3×20 分のウォッシュで⽉に 1 回必ず⾏う（前回のランから 1 ヶ⽉以上経過すると、MiSeq 側から強制的にメンテナンスウォッシュを⾏うように要求される）。② スタンバイウォッシュ：1 回のウォッシュ
液交換を伴う 2×50 分のウォッシュで、1 週間以上 MiSeq をアイドリング状態にすると MiSeq 側から
このウォッシュを⾏うように要求される。このウォッシュの後はポストランウォッシュをしないとアイ
ドリング状態から使⽤できない。③ ポストランウォッシュ：ウォッシュ液交換のない 1×20 分のウォッシュでラン終了後に⾏う。なお、ポストランウォッシュには、イルミナが提供するアダプターを⽤いた
次亜塩素酸ウォッシュというプロトコールがあるので、通常はこちらを⽤いて前回ランの持ち越しライ
ブラリーを流路から取り除くようにする。ラン終了後、ポストランウォッシュを⾏いスイッチオフにした場合、以下のような流れで⼀連のウォッシュを⾏い、次のランに進むことになる。なお、前回ウォッ
シュを⾏なった⽇付はウォッシュのトップ画⾯に⽇付が表⽰されるので、それを参考にする。

75

1．MiSeq 本体のスイッチオン（MiSeq コントロールソフトウェア（MCS）が起動）↓
2．Home 画⾯のウォッシュをクリックしメンテナンスウォッシュ（前回のランから 1 ヶ⽉以上経過した場合）↓
3．次亜塩素酸を⽤いたポストランウォッシュ（前回ランのライブラリーを除去）↓
4．MiSeq のラン開始↓
5．通常のポストランウォッシュ（次亜塩素酸を⽤いない）↓
6．MiSeq 本体のスイッチオフ
5.3.3.3.2. シークエンスの下準備
本項では、シークエンスを実際に開始する遅くとも 1 時間前までに終えるべき操作について記す。他の実験（とくに PCR）とは異なりこの段階でのコンタミの恐れは低いが、実験中は必ずゴム⼿袋を着⽤して事前にピペットやチューブ類は殺菌灯式電気消毒器で 20 分程度照射し除染しておく。
① 冷凍品の解凍:バットを⽤意し、冷凍保存してある試薬カートリッジと HT1 バッファーのチューブを⼊れ、カートリッジの側⾯にある最⼤⽔量線まで脱イオン⽔を静かに注ぐ。そのまま約 1 時間脱イオ
ン⽔に漬けたまま静置し、キット内部の試薬を⼗分に解凍する。冷蔵庫内で試薬を解凍させる場合は 24
時間程度だとホール番号 12 番や 16 番などの溶液が溶けていない場合があるので、必ず確認する。凍ったままで使⽤するとシッパートラブルの原因になる。
② 0.2N NaOH 溶液の準備:0.2N NaOH 溶液は、ライブラリーの DNA を⼀本鎖に変性させるために⽤いる。毎ランごとに 2N NaOH 溶液（ストック可）からミリ Q ⽔を⽤いて希釈し、新鮮な 0.2N NaOH
溶液を調整することが重要。使⽤する量は微量なので、1.5 mL チューブに 1 mL 調整すれば、希釈時の誤差も⼩さく⼗分量が得られる。調整した 0.2N NaOH 溶液は使⽤するまで冷蔵庫に保存する。
③ サンプルシートの作成：MiSeq 本体に搭載されているソフトウェア Local Run Manager（以下LRM）を起動し、画⾯の指⽰に従ってサンプルシートを作成する。作成した CSV 形式のサンプルシー
トをエクスポートして⽤意しておけばエクセル等のスプレッドシートで内容を編集することで次回以降のランでサンプルシートの作成が容易になる。作成したサンプルシートは、MiSeq 本体の Sample Sheetから読み込ませて使⽤する。
5.3.3.3.3. ライブラリー濃度の最終調整① 4 nM への調整:Qubit で定量した濃度に基づきライブラリーを 4 nM に調整する。モル数の計算に⽤いるのはライブラリー⻑（平均 372 bp）と 1 塩基あたりの分⼦量（660 g/mol）になるが、複数の単位（micro/nano/pico）にまたがって濃度を計算しなくてはならないので、予めスプレッドシートにモ
ル数換算式を⼊れておくと良い。また、サンプル数が異なる複数のライブラリーを⼀度にシークエンス
する場合は、サンプル数（ブランクを除いたもの）から混合⽐を算出し、それぞれの混合量を決定する。2nd PCR 産物をサイズセレクションしたライブラリは平均 372 bp のライブラリー⻑となる。その溶液の重量濃度が a ng/µL の時、モル濃度は a×106/372×660 の計算式で求めることができる。
② DNA の変性:新しい 1.5 mL チューブに、4nM に調整したライブラリーを 5 µL と 0.2N NaOH を 5µL ⼊れてピペットで混合する。その後、数秒間ボルテックスし、軽く遠⼼ して溶液をチューブの底に集め、室温で 5 分間静置してライブラリー中の DNA を変性する。この時点での濃度は 2 nM。
③ 20 pM への調整:変性した DNA に HT1 バッファーを 990 µL 加え、20 pM に調整する（100 倍希
釈）。
④ 最終濃度（10 pM）への調整:MiFish アンプリコンの場合、最終濃度を 10 pM に調整すると 800〜
1,000K/mm2 のクラスター密度が得られ、メーカーのスペックにほぼ⼀致するリード数が得られる。最終濃度を 10pM にするには、ライブラリーを 300 µL に HT1 バッファーを 300 µL 加えればよい。ライ76ブラリーが低品質の場合（本来の⻑さ である 370 bp 付近よりも短い DNA が混ざっている場合）、最終濃度を 10 pM に調整するとオーバークラスターとなりランを失敗するので注意すること。
⑤ PhiX のスパイクイン：フローセル上に形成されるクラスターのシグナル分離をよくするため、塩基バランスが良い PhiX をスパイクインとして 10〜25 %⼊れる。イルミナ社から販売されている PhiX
control v3 は 10 nM に調整済みのバクテリオファー ジに由来する既知配列に基づくライブラリーである。これをサンプル DNA と同様に 0.2N NaOH で変性し、HT1 バッファーで 20 pM に調整する。その後、上記の 600 µL のライブラリーから 60 µL を抜き取り、20 pM に調整した PhiX を 30 µL、HT1
バッファーを 30 µL 加える。
以上の操作で、10pM に調整されたライブラリー600 µL ができた。後は、調整済みライブラリーを試薬
カートリッジに注⼊し、ランを開始するにあたっての最終操作を⾏えばよい。
5.3.3.3.4. シークエンス開始前後の操作
本項では、シークエンス開始前後に必要な操作について記す。既にライブラリーは 10 pM に調整されており、機器を正しく設定すればシークエンスできる段階になっている。
① 試薬カートリッジ内の試薬が完全に解凍されたことを確認し、キムタオルでカートリッジ外側についた⽔滴を⼗分に拭き取る。試薬カートリッジを 10 回程度転倒撹拌し、カートリッジ内の試薬を混和する。試薬内の気泡を取り除くため、キムタオルを敷いた実験台の上にカートリッジを何回か軽く叩きつける。
② 1,000 µL のピペットチップをつかってライブラリー注⼊ポート（ホール番号 17 番。オレンジ⾊が⽬印）のホイルに孔を開る。
③ 1,200 µL または 1,000 µL のピペットチップをつかって 10 pM に調整されたライブラリー600 µL を
試薬カートリッジの注⼊ポートに⼊れる。気泡が⼊らないようにピペット操作には注意すること。
④ MiSeq コントロールソフトウェア（MCS）を起動し Sequence ボタンを押してランのセットアップに進み、Sample Sheet からサンプルシートを読み込ませる。
⑤ MiSeq をインターネットに接続していると、サンプルシートを読み込ませた後、Next ボタンを押すと BaseSpace（イルミナ社が提供するクラウド環境）を使⽤するかどうかの画⾯が表⽰される。
BaseSpace の利⽤にあたっては、事前に Myillumina へのユーザー登録が必要となる。
⑥ BaseSpace を使⽤する場合には、Use BaseSpace for storage and analysis のボックスにチェックを⼊れ、表⽰欄に Myillumina アカウント登録時に使⽤した情報を⼊⼒する。BaseSpace を使⽤しない場合はこのボックスを空欄にしておけばよい。選択が終わったら、Next ボタンを押すとフローセルのセッティ
ング画⾯に切り替わる。
⑦ 冷蔵保存されていたフローセルをプラスチック製ピンセットで容器から取り出す。フローセルは容器内でバッファーに浸かった状態で保存されており、MiSeq にセットする前にそのバッファーを完全に洗い流す必要がある。この洗浄が⼗分でないと、残存したバッファーがシークエンス中にフローセル上に析出し、データが読み取れなくなる恐れがある。洗浄にあたってはゴム⼿袋を着⽤し、MiSeq にセットする前にフローセルのガラス部分とプラスチック部分をミリ Q ⽔でよくリンスする。とくに、フローセルのプラスチックケース内にバッファーが残りやすいので、その部分はよくリンスすると共にケース内の⽔分を（注意深く）軽く振り出す。この際、ガスケット（試薬やサンプルへの流路の⼊り⼝）部分に強く⽔流が当たらないように注意する。
⑧ レンズクリーニングティッシューに 99.5%エタノールを少量滴下し、フローセルのガラス部分についた⽔分を軽く拭き取る。ガラス部分に汚れや染みがないか⽬で確認し、きれいになるまでレンズクリーニングティシュで軽く磨く。フローセルのプラスチック部分にある 2 ⽳のガスケットポートには触れないように注意すること。
⑨ MiSeq のフローセルコンパートメントのドアを開け、更にフローセルラッチを開けて使⽤済みのフ
ローセルを取り出す。この時、中のフローセルが⾶び出さないように、ラッチの上⾯に⼿を当てた状態でラッチを開ける銀⾊のボタンを押し、急なラッチの跳ね上がりを防ぐとよい。フローセルラッチの台
座に埃や析出したバッファーがある場合には、フローセルを磨いたレンズティッシューで拭き取る。
77

⑩ フローセルを台座の所定の位置に載せ、カチッと⾳がするまでラッチを押し下げ固定する。
⑪ MiSeq コントロールソフトウェア（MCS）の画⾯左下をチェックし、フローセルに記された ID（RFID）の読み取りがうまくいっていることを確認する。RFID が読まれていたら、フローセルコンパートメントのドアを閉め、Next ボタンを押す。
⑫ 冷蔵保存の PR2 ボトル（シークエンスバッファー）を取り出し、軽く混和してからスクリューキャ
ップを開ける。
⑬ MiSeq の試薬コンパートメントのドアを開け、シッパーハンドルを引き上げる。右側の部分に冷蔵保存の PR2 ボトルをセットし、廃液ボトルを空にする。セットが完了したらシッパーハンドルを必ず引き下げること。
注意：シッパーハンドルを引き下げていない場合は引き下げるよう警告が表⽰される。
⑭ MCS の画⾯左下をチェックして、RP2 のボトルに記された ID（RFID）が読み込まれていることを確認する。
⑮ 試薬チラーのドアを開け、ウォッシュカートリッジに挿⼊されているシッパーが完全に引き上げられるまで待つ。シッパーが上がる前にウォッシュカートリッジを引き出そうとすると、シッパーが折れてしまうので注意すること。
⑯ ライブラリーが充填された試薬カートリッジを試薬チラーに挿⼊する。最後まで押し込まないと試薬チラーのドアが閉まらないので注意すること。
⑰ 試薬チラーのドアを閉める。MCS の画⾯左下をチェックして、試薬カートリッジに記された ID（RFID）の読み取りがうまくいっているかどうか確認して Next を押す。
⑱ プレランチェックの画⾯に移⾏する。チェック項⽬が表⽰され、全ての項⽬にチェックが⼊るとStart Run ボタンがアクティブになる。ランを開始してよければボタンを押す。
⑲ Start Run ボタンを押してからしばらくの間はシークエンスの初期トラブルが発⽣しやすい。試薬がフローセルに流れ込むまではランの再開が可能な場合があるので、5 分間ほどは MiSeq ランの進⾏を機器の前で⾒守るとよい。
参考⽂献）Miya, M., Sato, Y., Fukunaga, T., Sado, T., Poulsen, J. Y., Sato, K., Minamoto, T., Yamamoto,S., Yamanaka, H., Araki, H., Kondoh, M., Iwasaki, W. 2015. MiFish, a set of universal PCR primers formetabarcoding environmental DNA from fishes: detection of more than 230 subtropical marine species.
Royal Society Open Science, 2 （7）: 150088. doi: 10.1098/rsos.150088
5.3.4. データ解析（usearch）
5.3.4.1. 得られたリードのアセンブル
ペアエンドリード（R1:forward read、R2：reverse read）を USEARCH の「fastq_mergepairs」コマン
ドを⽤いてマージする。この際、テールトリミング後のリードが短すぎてアッセンブルできないものと、マージした部分（約 65 bp）に 5 塩基以上の変異のあるペアリードは破棄される。
5.3.4.2. プライマー配列の除去「fastx_truncate」コマンドを⽤いて、マージされたリードからプライマー配列を除去する。
5.3.4.3. クオリティフィルタリング
「fastq_filter」コマンドによりリードの品質フィルタリングを⾏う。ここでは、プライマー配列を除去したリードのうち、予想エラー率が 1%を超える低品質リードと 140 bp 未満の短いリードを除去する。
5.3.4.4. 合同配列をまとめる「fastx_uniques」コマンドで完全に⼀致する配列をまとめる。
5.3.4.5. denoise して ASVs の作成「unoise3」コマンドを⽤いて配列に含まれるノイズを除去し、Amplicon Sequence Variant（ASV）を⽣成した後、キメラ配列、エラー配列、4 リード未満の ASV を破棄する。
5.3.4.6. リファレンス DB に参照した種の割り当て「usearch_global」コマンドを使⽤して、各 ASV の分類学的割当を⾏う。

78

5.4. 無脊椎動物の環境 DNA メタバーコディング法（DNA 抽出から種決定まで）(源 利⽂,邬 倩倩）
環境 DNA の保存法としては、これまで環境 DNA の分解を防ぐ RNAlater を添加する⽅法が⼀般的であった。しかし、RNAlater で保存されたサンプルは、抽出にあたり遠⼼による前処理が必要である
ことなどから、DNA の収量に影響を与える可能性がある。本マニュアルでは、RNAlater 添加法に加え、より収量が⾼まる可能性のある、Buffer ATL（Qiagen 社：以下 ATL）によって保存する⼿法を記載する。深海を含む環境 DNA 濃度が特に薄いと予測される環境下では、ATL による保存法が推奨される。
5.4.1. サンプルの保存法（RNAlater 法と ATL 法）① RNAlater 法： サンプルを RNAlater で保存する場合、⼩型スポイトを使って注⼊孔から RNAlater を
1-2 mL 注⼊する。ステリベクスの注⼊孔と本体の間に段差があるため、⼩型スポイトの先端がそれに引っかかると RNAlater がうまく⼊らない。段差を避けるように奥まで⼩型スポイト先端を⼊れるとスムースに RNAlater を注⼊できる。
ATL 法： サンプルを ATL で保存する場合、⼩型スポイトを使って注⼊孔から ATL を 1 mL 注⼊する。周囲温が低いときには ATL に沈殿が⽣じる場合がある、そのような場合は ATL 加温して、沈殿を解消してから⽤いる。
② ステリベクス注⼊孔の密閉：保存液をステリベクスに充填したら、注⼊孔をルアーフィッティングか
パラフィルムを使って密閉する。
③ 保存液添加済みステリベクスの保管：ユニパック E-4 に必要事項を記⼊し、保存液が添加されたステリベクスをユニパックに⼊れる。
5.4.2. 実験室への輸送① ステリベクスが⼊ったユニパックをジップロックに⼊れ、保冷剤が⼊ったクーラーボックスに⼊れて冷暗条件で保管し、持ち帰る。
② ラボに持ち帰ったステリベクスは-20 ℃以下で保存する。
5.4.3. ステリベクスからの DNA 抽出
5.4.3.1. 実験の準備① 恒温槽（インキュベーター）を 56 ℃に設定する。
② ろ過済みのステリベクスを準備する。
5.4.3.2. DNeasy Blood & Tissue kit を⽤いた DNA の抽出 （RNAlater 法と ATL 法）
RNAlater 法① ステリベクスの排出孔のキャップやパラフィルムなどを外す。50 mL のコニカルチューブを⽤意し、サリベットで固定されたステリベクス（図 5.4.3.2.1.）を 50 mL コニカルチューブに⼊れる。
② 5000 G で 2 min 遠⼼しステリベクス内の RNAlater を排出する。遠⼼終了後、サリベットの下部に溜まった RNAlater を廃棄する。
③ 処理完了後、キャップやパラフィルムなどでステリベクスの排出孔を再びふさぐ。
④ DNeasy Blood & Tissue Kit と PBS（-）を使って抽出液（プレミックス）の準備をする。1 本のステ
リベクスあたり 100 µL の Proteinase-K（600 mAU/mL）、910 µL の Buffer AL、990 µL の PBS（-）の割合でプレミックス（合計 2000 µL）を調整する。これには、DNA 抽出中のコンタミネーションを検知するための「抽出ブランク」⽤の 1 本分も含める。

79

図 5.4.3.2.1. 固定方法。

⑤ ステリベクスの注⼊孔を開封し、上記のプレミックスを充填する（注意：注⼊孔とカートリッジの接合部に段差があるため、チップ先端の挿⼊具合によって液があふれ出ることがある）。
⑥ ルアーフィッティングやパラフィルムなどを使ってステリベクスの注⼊孔を密閉する。
⑦ 恒温槽で 56 ℃、30 分間保温処理する。その間、5 分に 1 度程度ステリベクスを回転させ、ステリベ
クス内の液がフィルター全⾯に⾏き渡るようにする。もしくはミニローテーターを恒温槽内に置き、10rpm 程度で回転させ 56 ℃で 20 分間加温する。
⑧ ステリベクスを保温中に DNA 回収⽤のサリベットの下部と 50 mL コニカルチューブを⽤意し、サリベットの下部にサンプル番号など必要事項を記⼊する。
⑨ ステリベクスの保温が終了後、注⼊孔側のパラフィルムやルアーフィッティングなどを内部の液が漏れないように注意深く取り外す。
⑩ ステリベクスの注⼊孔とサリベットの下部をテープで固定した後、50 mL コニカルチューブに⼊れる。
⑪ ステリベクスを⼊れたコニカルチューブを 6,000 G で１分間遠⼼し、サリベットの下部に溜まった抽出液約 1000 µL から DNA を抽出する。
⑫ ステリベクスの本数に抽出ブランク 1 本を加えた本数の DNeasy Blood & Tissue Kit 付属のスピンカ
ラムを⽤意する。
⑬ サリベットの下部に 1000 µL のエタノールを添加し、マイクロピペットでよく混和する。
⑭ マイクロピペットの吸引量を 700 µL にセットし、液をカラムへ移し、6,000 G で 1 分間遠⼼する。
⑮ カラムの下の 2 mL チューブに溜まった濾液を捨て、サリベット下部に残ったサンプル液を再びカラムに移し、遠⼼する（14-15 の操作を液がなくなるまで繰り返す）。
⑯ カラムを新しい 2 mL チューブに載せ替える。
⑰ カラムに 500 µL の Buffer AW1 を⼊れ、6,000 G で 1 分間遠⼼する。遠⼼した後にカラムを新しい 2mL チューブに載せ替える。
⑱ カラムに 500 µL の Buffer AW2 を⼊れ、14000 G で 2 分間遠⼼する（注意:遠⼼機から取り外す時や移動させるときなどは揺らして Buffer をカラムに付着させないようにする）。
⑲ カラムをエッペンチューブに載せ替える（この容器のままで⻑期保存するため、正式なサンプル名を記⼊しておく）。
⑳ 75 µL Buffer AE を添加し、室温で 1 分間インキュベートした後に 6,000 G で 1 分間遠⼼する。
㉑ 75 µL Buffer AE を添加し、室温で 1 分間インキュベートした後に 6,000 G で 1 分間遠⼼分離後、カラムを取り外しチューブの蓋をしっかり閉める。
（注意:回収 DNA 濃度が特に希薄であることが予想される場合には、溶出バッファー量を減じることも可能である。その際は溶出バッファー量を記録しておくこと。）㉒ この状態で-20℃で安定的に保存可能である。
80

ATL 法
① DNeasy Blood & Tissue Kit と PBS （-） を使って抽出液（プレミックス）の準備をする。1 本のステリベクスあたり 50 µL の Proteinase-K （600 mAU/mL）、455 µL の Buffer AL、495 µL の PBS（-）の割合でプレミックス （ステリベクスの中にはすでに 1000 µL の ATL が⼊っているので、合計2000 µL となる）を調整する。これには、DNA 抽出中のコンタミネーションを検知するための「抽出ブランク」⽤の 1 本分も含める。
② ステリベクスの注⼊孔を開封し、マイクロピペットと 1000 µL ⽤のフィルターチップを⽤いて上記のプレミックスを充填する（注意:注⼊孔とカートリッジの接合部に段差があるため、チップ先端の挿⼊具合によって液が溢れ出ることがある）。
③ ルアーフィッティングかパラフィルムを使ってステリベクスの注⼊孔を密閉する。以降の作業は、RNALater 法と同様（RNAlater 法の 7 以降を参照）。
5.4.4. 無脊椎動物の環境 DNA メタバーコーディング
5.4.4.1. ライブラリー調整①:1st PCR
5.4.4.1.1. 1st PCR
事前準備
コンタミ回避のため、実験室で使⽤する試薬類は使い捨てにし、その都度必要量を分注する。（TE、精製⽔、85%エタノール、SPRIselect Reagent Kit（Beckman Coulter, Brea, California, USA））
TE buffer （pH 8.0）：30 µL*サンプル数＋１
85 %エタノール：180 µL* （サンプル数＋１）
SPRI select：48 µL* （サンプル数＋１）*4（1st PCR が 4 繰り返しの場合）
SPRI の操作に使⽤する 0.2 mL のチューブ（マグネットプレートのサイズに依存する）
試薬の配合と PCR 条件
酵素

試薬の配合（1Tube あたり）

KOD Plus Neo

KAPA

PCR 条件

KOD Plus Neo：0.27 µL
KOD buffer：1.25 µL
dNTPs：1.25 µL
MgSO4：0.75 µL
分類群プライマー_F（10 µM）:0.75 µL
分類群プライマー_R（10 µM）:0.75 µL
ミリ Q ⽔：5 µL
DNA：2 µL

94 ℃/2 min→（98 ℃/10 s→プライマーごとのアニーリング温度/30 s→68 ℃/60 s）×40 サイクル
→68 ℃/5 min→4℃∞

KAPA HiFi HS ReadyMix：6 µL
分類群プライマー_F（10 µM）:0.36 µL
分類群プライマー_R（10 µM）:0.36 µL
ミリ Q ⽔：4.28 µL
DNA：1 µL

95 ℃/3min→（98 ℃/20 s→プライマーごとのア
ニーリング温度/15 s→72 ℃/15 s）×40 サイク
ル→68 ℃/5min→4℃∞※電気泳動で 1st PCR 産物の増幅を確認する
各分類群のプライマー情報及び PCR 増幅に使⽤したアニーリング温度と酵素：
分類群

配列情報（5 ́‒3 ́）

F:ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTT
CCGATCTNNNNNNGGCTRGAATGAAWGGTTTGACG

81

アニーリング温度

酵素

増幅⻑

頭⾜綱

⼗腕形⽬（イカ類）

R:GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNCGCTGTTATCC
CTATGGTARCT

62 ℃

KOD
Plue
NEO

約 350 bp

KOD
Plue
NEO

約 310 bp

KOD
Plue
NEO

約 290 bp

KOD
Plue

約 220-300
bp

F:ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTT
CCGATCTNNNNNNGRCTAGAATGAATGGTTTGACG
タコ⽬
R:GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNCGCTGTTAYCC
CTATGGTAACT
鉢⾍綱

根⼝クラゲ⽬
旗⼝クラゲ⽬
冠クラゲ⽬
⼗⽂字クラゲ⽬

F:ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTT
CCGATCTNNNNNNGAAAAGACCCTATYGAGCTTTAC
62 ℃
R:GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNCCTGTTATCCCTAYGGTAACTT

ウミトサカ⽬
アオサンゴ⽬
ウミエラ⽬

F:ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTT
CCGATCTNNNNNNCCTYTGAATARGAAACGAAGGCG
R:GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNGCTGTTATCCC
TRCGGTAGCT

イソギンチャク⽬
ツノサンゴ⽬

F:ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTT
CCGATCTNNNNNNCGAAAAGWCCCC
ATTGAGCTTTA
R:GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNCCTTAAGCTCACCTTCGTTACC

花⾍綱
イシサンゴ⽬

60 ℃

F:ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTT
CCGATCTNNNNNNAAGWCCCCATGR
ARCTTTACTG
R:GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNTCCCCAGRGTA
ACTTTTATYTGY

スナギンチャク⽬

F:ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTT
CCGATCTNNNNNNAAAAGACCCCRTT
GAGCTTTA
R:GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNCCTTAAGCRCACCTTCGTTAC

ヒトデ綱
ウニ綱

F:ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTT
CCGATCTNNNNNNGACGAGAAGACCCTRTCGAG

82

62 ℃

ナマコ綱

棘⽪動
物⾨

R:GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNATCCAACATCGAGGTCGCAA
F:ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTT
CCGATCTNNNNNNGGACGAGAAGACCCYRTWGAG

NEO

56 ℃

クモヒトデ綱R:GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNCAACATCGAGG
TCGCAAACF:ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTT
CCGATCTNNNNNNTTGGGGCAACCDC
GAAG
ウミユリ綱

60 ℃
R:GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNCAACATCGAGG
TCGCAAAC

軟甲綱

⼗脚⽬
端脚⽬
等脚⽬

F:ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTT
CCGATCTNNNNNNGGACGATAAGACC
CTATAAA

約 290 bp

KOD
Plue
NEO

約 270 bp

⼗脚⽬:
約 160 bp
60 ℃、 62 ℃

R:GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNACGCTGTTATCCCTAAAGT

KOD
Plue
NEO

KAPA
HiFi HS
Ready
Mix
端脚⽬、等
脚⽬:約 140bp※増幅長が 300 bp より長い場合、iSeq 100 ではペアエンド解析ができない。必要に応じて、MiSeq での解析が必要である。MiSeq を用いた超並列シークエンスの手法については、5.3.7 MiSeq を用いた超並列シークエ
ンスの項を参照のこと。

5.4.4.1.2. 1st PCR 産物のビーズ精製 （サイズセレクション）① 1st PCR 産物の繰り返しを 1 サンプルにつき、1 チューブにまとめる。
② PCR 産物と等量の SPRI を添加する。
③ ピペッティング（またはボルテックス）で混ぜ、1 分間静置する。
④ マグネットプレートにチューブを置き、溶液が完全に透明になるまで待つ。
⑤ 溶液（SPRI ビーズ以外）をピペット吸って廃棄する（注意：SPRI ビーズに触れないようにする。また、作業はマグネットプレート上で⾏う）。
⑥ 180 µL の 85 %エタノールを添加、30 秒ほど待って上澄みを廃棄する（作業はマグネットプレート
上で⾏う）。
⑦ マグネットプレートから外して 30 µL の TE を添加する（注意：深海の環境 DNA サンプルは特に濃度が薄いと考えられるため、1st PCR 後の泳動の際のバンドの明るさで添加する TE の量を調整す
る）。
⑧ ピペッテイングして 1 分間静置する。

83

⑨ 再びプレートの上に乗せて上澄みが完全に透明になるまで静置。
⑩ DNA 溶液を回収し保存容器へ（注意：作業はマグネットプレート上で⾏う。溶液を回収する時 SPRI
ビーズに触れないようにする）。
5.4.4.1.3. 精製済みの 1st PCR 産物の濃度測定と希釈① SPRI でサイズセレクションしたサンプルを Qubit 3.0 で濃度を測定する。
② Qubit 3.0 の使い⽅は Qubit のプロトコルを参照のこと。
③ サンプルそれぞれ（各種ブランクを除く）について 0.1 ng/µL になるような希釈倍率を計算する。
④ 各種ブランクはサンプルの平均的な倍率で希釈する。
⑤ 希釈したサンプルを 2nd PCR の鋳型 DNA として⽤いる。
5.4.4.2. ライブラリーの調整②:2nd PCR
5.4.4.2.1. 2nd PCR※インデクス関連情報（イルミナ社のインデクス配列 8 塩基、もしくは Hamady et al., （2008）にリス
トアップされたインデクス配列も使⽤可能）。
Hamady, M., Walker, J. J., Harris, J. K., Gold, N. J., and Knight, R. （2008） Errorcorrecting barcodedprimers forpyrosequencing hundreds of samples in multiplex. Nature Methods 5: 235-237.
イルミナ社公認のインデクス配列に関する情報は、以下のサイトからを⼊⼿することができる。
https://support.illumina.com/content/dam/illuminasupport/documents/documentation/chemistry_documentation/experiment- design/illumina-adaptersequences-1000000002694-06.pdf
2nd PCR ではインデクス付きのプライマーを使う。
フォワードプライマーの⼀例（XXXXXXXX はインデクス配列を⽰す）
5ʼAATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACXXXXXXXXACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3
リバースプライマーの⼀例（XXXXXXXX はインデクス配列を⽰す）
5ʼCAAGCAGAAGACGGCATACGAGAXXXXXXXXGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT3ʼ
2nd PCR ではコンタミを防ぐため、第１PCR 産物の添加以前の PCR 溶液は PCR 前の作業を⾏う部屋で調整する。
試薬の配合（1Tube あたり）
KAPA HiFi HS ReadyMix：6 µL
インデクス付きプライマー_F（1.8μM）：2 µL
インデクス付きプライマー_R（1.8μM）：2 µL
ミリ Q ⽔：1 µL
DNA（PCR 以降の作業を⾏う部屋で添加する）：1 µL
PCR 条件: 95℃/3min→（98 ℃/20 s→72 ℃/20 s）×12 サイクル→72 ℃/5 min→4 ℃∞
2nd PCR が完了したら産物を等量ずつ吸い上げてチューブに混合する。
補⾜： 2nd PCR では、フォワードプライマーとリバースプライマーに含まれるインデクス配列の組
み合わせをサンプルごとに変える。こうすることによって、シークエンス後に異なるサンプルの識別が可能になる。
5.4.4.2.2. E-Gel Power Snap Electrophoresis Device （G8100、 Invitrogen）を⽤いた 2nd PCR 産物の精製 （サイズセレクション）① 事前にマーカー（50bp）を解凍し、回収⽤の純⽔を⽤意する。
② サンプルと E-Gel の 10*buffer を混合する（サンプル：buffer＝22.5：2.5 µL）。
③ ゲル板上段のウェルに DNA サンプルを⼊れる（25 µL；使わないウェルにも⽔を添加する）。
④ 下段の回収ウェルに⽔を 30 µL ⼊れる。
⑤ 上段の真ん中のマーカーウェルにはマーカーと⽔それぞれ 5 µL を添加し、ウェル内でピペッテイン
84

グする。
⑥ 9: size select を選択し、泳動時間は⼀旦 20 分にセットする（泳動時間を追加することが可能）。
⑦ E-Gel ⽤のサイズマーカーは 350 bp が他のサイズより明るく光る。それぞれの分類群のターゲット
バンドは、350 bp より上に出現するはずである。
⑧ ターゲットバンドを回収する直前に泳動を⼀時停⽌し、回収ウェルの⽔を吸い出し、新しい純⽔と交換する。
⑨ 泳動を再開する。回収ウェルにターゲットバンド全体が⼊ったところで泳動を停⽌する。
⑩ ピペットを⽤いて回収ウェルからターゲットバンドを吸い出し、ライブラリーごとにチューブにまとめる。回収する際に、ウェルの底にピペット先端で⽳を開けないように注意する。
5.4.4.2.3. 切り出した 2nd PCR 産物の質の確認と濃度測定① バイオアナライザーやテープステーションなどを⽤いてターゲット DNA を回収できているかを確認する。
＊プロトコルはそれぞれの機器の取扱説明書を参照のこと。
② ターゲットのピークが確認したら、さらに Qubit で濃度を測定する。
5.4.5. MiSeq または iSeq100 を⽤いた超並列シークエンス（ここでは iSeq100 の場合を記載）＊MiSeq を⽤いた超並列シークエンスは 5.3.7 を参照のこと。
5.4.5.1. 下準備 （キットの解凍）① 冷凍庫からカートリッジを取り出す。
② 箱からカートリッジを取り出す（注意：ホイルの袋を開けない！）。
③ 次の⽅法の 1 つに従って、袋⼊りカートリッジを融解する。融解後の再凍結は不可。
⽅法

融解時間

安定限界

⼿順

20 ℃〜25 ℃、ウォーターバス

6 時間

最⼤ 18 時間

ラベルを上に向け、完全に沈む。重りを乗せて浮き上がらないようにする。

15 ℃〜19 ℃、ウォーターバス

8 時間

最⼤ 18 時間

ラベルを上に向け、完全に沈む。重りを乗せて浮き上がらないようにする。

2 ℃〜8 ℃、冷蔵

36 時間

最⼤ 72 時間

ラベルを上に向ける。

5.4.5.2. ライブラリー濃度の最終調整及び濃縮① 切り出した 2nd PCR 産物の濃度を調整する（計算）。
式：濃度（nM）=（Qubit で測定した濃度 ng/µL）*1,000,000/（ターゲットバンドの⻑さ＊660）② iSeq シーケンシングのために純⽔で 4 nM に調整する。（シーケンスランの直前であれば 1 nM でもよい）③ 1 nM より薄い場合は Qiagen の GeneRead Size Selection Kit で濃縮する。
＊プロトコルは GeneRead Size Selection Kit の取扱説明書を参照のこと。
5.4.5.3. シークエンス開始前後の操作① ライブラリーを Resuspension Buffer（RSB）で 1 nM に希釈する。
② 1 nM のライブラリーをローディング濃度（50 pM）に希釈する（5 µL の 1 nM のライブラリーを 95µL の RSB で希釈する）。
③ -25 ℃〜-15 ℃の冷凍庫から PhiX 原液（10 nM）を室温で融解する。1.5 mL チューブに下記の量を加えて 20 µL の 1nM の PhiX を調整する。
10 nM PhiX（2 µL）
RSB（18 µL）

85

④ 希釈した PhiX を軽くボルテックスして、280 G で 1 分間遠⼼する。
※1 nM に希釈した PhiX は-25 ℃〜-15 ℃で最⻑ 1 ヶ⽉保管できる。
⑤ 1 nM の PhiX をローディング濃度（50 pM）に希釈する（5 µL の 1 nM の PhiX を 95 µL の RSB で希釈する）。
⑥ 軽くボルテックスして、280 G で 1 分間遠⼼する。
⑦ ローディング試薬に含まれる PhiX の割合が 20 %になるように、80 µL のライブラリと 20 µL のPhiX を混合する。
⑧ 軽くボルテックスして、280 G で 1 分間遠⼼する。
⑨ ライブラリーと PhiX の混合液を氷上に静置する。
⑩ カートリッジを袋から取り出し、袋を処分する。カートリッジ上部のアクセスウィンドウに触れないように注意する。
⑪ カートリッジを 5 回転倒し、試薬を混合する。
⑫ ラベルが上に向いた状態で、机または他の堅い表⾯でカートリッジを 5 回軽く叩き、泡を除く。
⑬ 新しいピペットチップを使って、ライブラリーリザーバーに⽳を開ける。
⑭ ピペットチップを捨てる。
⑮ ライブラリーと PhiX の混合したライブラリーをピペットで 20 µL を吸って、リザーバーの底部に加える。このとき⽳を開けたリザーバーの蓋には触れない。
⑯ 2 ℃〜8 ℃の保管庫から新しいフローセルを取り出す。
⑰ 未開封のフローセルパッケージを 10〜15 分間放置し、結露を防ぐ。
⑱ 切れ込みから⽩いホイルフローセルパッケージを破って開く。開封後 24 時間以内に使⽤する。
⑲ フローセルをパッケージから引き出す。
注意：フローセルを扱う時はプラスチック部分だけに触れる。電気的インターフェース、CMOS センサ
ー、ガラス及びガラス両端のガスケットに触れない。
⑳ ラベルが上を向いた状態でフローセルにグリップポイントを持つ。
㉑ カートリッジの前⾯のスロットにフローセルを挿⼊する。
カチッという⾳によりフローセルが固定されたことがわかる。適切にロードされると、グリップがカー
トリッジから突き出し、ガラスがアクセスウィンドウから⾒えるようになる。
㉒ シーケンスランは、Local Run Manager モードを使⽤する。
詳しいプロトコルは iSeq 100 の取り扱い説明書を参照のこと。
5.4.6. データ解析（usearch）
5.4.6.1. 得られたリードのアッセンブル（ペアエンドの場合）
ペアエンドリード（R1:forward read、R2：reverse read）を USEARCH の「fastq_mergepairs」コマン
ドを⽤いてマージする。この際、テールトリミング後のリードが短すぎてアッセンブルできないものと、マージした部分（約 65 bp）に 5 塩基以上の変異のあるペアリードは破棄される。
5.4.6.2. プライマー配列の除去「fastx_truncate」コマンドを⽤いて、マージされたリードからプライマー配列を除去する。
5.4.6.3. クオリティフィルタリング「fastq_filter」コマンドによりリードの品質フィルタリングを⾏う。ここでは、プライマー配列を除去したリードのうち、予想エラー率が 1%を超える低品質リードと 140 bp 未満の短いリードを除去する。
5.4.6.4. 合同配列をまとめる「fastx_uniques」コマンドで完全に⼀致する配列をまとめる。
5.4.6.5. denoise して ASVs の作成「unoise3」コマンドを⽤いて配列に含まれるノイズを除去し、Amplicon Sequence Variant（ASV）を⽣成した後、キメラ配列、エラー配列、4 リード未満の ASV を破棄する。
5.4.6.6. リファレンス DB に参照した種の割り当て86「usearch_global」コマンドを使⽤して、各 ASV の分類学的割当を⾏う。
5.4.6.7. 得られたリードのアッセンブル（⽚側の場合）
プライマー配列の除去「fastx_truncate」コマンドを⽤いて、⽚側リードからプライマー配列を除去する。
クオリティフィルタリング「fastq_filter」コマンドによりリードの品質フィルタリングを⾏う。ここでは、プライマー配列を除去したリードのうち、予想エラー率が 1 %を超える低品質リードと 100 bp 未満の短いリードを除去する。
合同配列をまとめるから種の割り当てまでの作業は上記と同様。

87

6. メイオベントスの分析（河地正伸・越川 海・北橋 倫・⼩島茂明・新⾥宙也）
6.1.フローカムによる画像解析（河地正伸・越川 海・北橋 倫）
6.1.1. 画像解析によるメイオベントスの分類・計数の概要
海底堆積物中のメイオベントスの分類・計数の作業フローの概要を図 6.1.1.1 に⽰す。堆積物の採取や保存処理は、⼀般的な海洋調査法に準じた⽅法を⽤いることができる（⼯程 A および B）。

図 6.1.1.1. 画像解析によるメイオベントスの分類・計数の作業フロー（⼯程 A〜G）。

次いで、堆積物からメイオベントスを分離し、顕微鏡や FlowCAM で観察可能なサンプルを調製する（⼯程 C および D）。堆積物中の砂泥、デブリ、メイオベントスの分離には、ステンレス篩いによるサイズ分画（主に泥分の分離）と、Ludox 等の⾼⽐重シリカゾル溶液への再懸濁による密度差分離（⽣物・⾮⽣物の分離）を併⽤した⽅法が普及している。しかし、ステンレス篩い上に捕集されたメイオベ
ントスを安定して⾼い効率で回収するには、熟練した技術が求められる。本マニュアルでは、ステンレス篩いの代わりに⼩型ナイロン製篩い（セルストレーナー）を⽤いることで、従来法よりも扱いやす
く、且つ安定した回収率が得られる⽅法について述べる。従来法に⽐べて 1 回の操作で処理できる堆積
物量は少ないが、個体数の多い⼩型メイオベントスの分析には⼗分なサンプルを得ることができる。
メイオベントスは 1000 µm の篩いを通過する底⽣動物と定義され、堆積物やデブリから完全に分離されたメイオベントスの実体顕微鏡や倒⽴顕微鏡による判別は⽐較的容易である。しかし、200〜300 µmの篩いを通過する画分のサンプルは、密度差分離を施した後であっても、分析対象の⼩型メイオベント
スよりも多くの砂泥やデブリが混在してしまう。このため、従来法である顕微鏡観察では、砂泥、デブリ、メイオベントスの判別に⻑い作業時間が必要となり、サンプル分析のスループットを⼤きく低下させる。本マニュアルで述べるイメージングフローサイトメトリ（FlowCAM）と深層学習による画像解析技術を組み合わせた⽅法は、この課題の解決を⽬的とし、⼯程 D によって分画された孔径 200 µm の篩いを通過する画分のサンプルに適⽤される（⼯程 F）。なお、密度差分離処理後に孔径 200 µm の篩いに捕捉されるサンプル粒⼦に砂などの⼤量の⾮⽣物粒⼦が混在することは少なく、実体顕微鏡下での同定・計数、写真撮影（⼯程 E）が効率的である。実体顕微鏡による≧200 µm 画分の観察（⼯程 E）とイメージングフローサイトメトリによる＜200 µm 画分の分析データ（⼯程 F）と組み合わせて、メイオ
ベントスの計数データを得るアプローチが実⽤的である。以下、1.2 節〜において⼯程 A〜F の詳細⼿順を⽰す。
6.1.2. 深海底からの堆積物試料の採取
現場海域における深海底からの採泥⽅法は、「4.2.4 メイオベントス⽤堆積物採泥器」のマルチプルコ

88

アラーによる採泥を参照。マルチプルコアラーによる採泥に加えて、ROV 等に装備したプッシュコア
ラーを⽤いて採泥を⾏うこともある（図 6.1.2.1）。

図 6.1.2.1. フリーフォールランダー外観（左）、採泥ユニット（採泥管内径 82 mm）（中）、有⼈潜⽔調査船「しんかい 6500」アームによるプッシュコアラーを⽤いた採泥（右）。
ランダー下部の 3 つの「⾜」にマルチプルコアラーの採泥ユニット（採泥管内径 82 mm）が取り付けられている。上下の蓋はガルバニックリングで固定されており、ランダーが着底して、採泥管が堆積物に貫⼊した後、電蝕によりリングが切れて上下の蓋が閉まる機構となっている。

6.1.3. コアの処理：深度層別分割とホルマリン固定
船上に揚がってきた採泥器から採泥管を回収して、速やかに実験室に運び込み、以下の⼿順でコアの深度層別分割（スライシング）及び各層のホルマリン固定を⾏う。処理作業までに時間が掛かる場合には、バケツ内に氷を⼊れて、その中で保管する（図 6.1.3.1）。
① 実験室内にて、採泥管を押し出し器に取り付け、1 cm 刻みでコアを押し出しながら、⾦属ヘラを使って各層（0-1, 1-2, 2-3, 3-4, 4-5 cm の 5 層）をボトルに⼊れる。
② ろ過海⽔ 100mL ほどを使い、⾦属ヘラについた堆積物を洗い流してボトルに⼊れる。
③ 中和ホルマリンを 5 mL 添加する（最終濃度約 5%）。
④ 実験室内または冷暗所で保管する。

図 6.1.3.1. 採取直後の採泥管（左）、押し出し器に取り付けられた採泥管（中）、深度別分割作業の y 様⼦（右）。

6.1.4. サンプル・デバイダによる泥の分割
内径 82 mm の採泥管の場合、1 cm 層の堆積物の容積は約 52.8 mL である。Ludox を⽤いた密度差分
離とそれに続く⼩型ナイロン製篩い（セルストレーナー）を⽤いた分画には、50 mL 容量の遠⼼管を⽤89

いて⾏う。この⽅法で、処理可能な堆積物量は 1 本あたり 10〜15 mL となる。従って、サンプル・デ
バイダを⽤いて、以下の⼿順で 1 層の堆積物（全量 52.8 mL）を 4 分割する作業を⾏う。

図 6.1.4.1. A. 保管容器から堆積物試料をサンプル・デバイダに移す作業。B. 横から⾒たサンプル・デバイダ。
C. 分割した試料を受け容器に移す作業。D. 受け容器から、遠⼼管(E)に移す作業。いずれの作業でも容器やサ
ンプル・デバイダ内に残った泥をろ過海⽔で洗浄しながら注意深く移す。

① ボトル内の堆積物試料を懸濁させてサンプル・デバイダに⼊れる。ボトル内に残存する堆積物にはろ
過海⽔を加え、再懸濁して、サンプル・デバイダに⼊れる（図 6.1.4.1. A, B）。
② サンプル・デバイダで堆積物試料を 2 分割して、各々2 本のボトルに⼊れる。サンプル・デバイダに残った堆積物にろ過海⽔を加え、再懸濁して、別容器に回収する（図 6.1.4.1. C）。
③ 2 分割した堆積物試料をサンプル・デバイダで更に 2 分割して、50 mL 遠⼼管に回収する（図6.1.4.1. D）。以上により１層を 4 本の 50 mL 遠⼼管に分割する。
6.1.5. ローズベンガルによるメイオベントスの⽣体染⾊
ローズベンガル溶液：原液として 5g/L 溶液を作成しておく。最終濃度 50 mg/L となるようにホルマ
リン固定試料に加える (Kitahashi et al. 2014)。なおローズベンガルは酸性側で不安定となり、染⾊されにくくなることや沈殿を⽣じることがあるため、固定試料に添加する前に、固定試料の pH を弱アルカリに調整しておくと良い。例えば、固定試料に標準緩衝液 (pH9)を 0.1%程度添加してから、ローズベ
ンガル染⾊液を添加する（図 6.1.5.1）。

図 6.1.5.1.ローズベンガルを添加した試料（左）。⾚く染⾊されたメイオベントスの実体顕微鏡像（右）。有孔⾍など、染まりにくいメイオベントスも存在する。

6.1.6. Ludox を⽤いた密度差分離
堆積物中の鉱物の⽐重は 2.5~2.8 g/mL、メイオベントスの⽐重はおおよそ 1.13 g/mL である。Ludoxの⽐重は 1.3〜1.4 であり、メイオベントスを分離する際に、DW と混合して⽐重を 1.13〜1.14 g cm-3

90

に調整した溶液を使う。あるいは間隙⽔による希釈を⾒越して、⽐重 1.18 g cm-3 に調整する場合(Somerfield and Warwick, 2013)や原液のまま使⽤することもある。堆積物試料に対して、適切な⽐重のLudox を添加して、よく撹拌した後に、遠⼼することでメイオベントスを分離できる。Ludox にはTM、AS、AM、HS 等の規格があり、SiO2 濃度、pH、密度、価格等が異なる（表 6.1.6.1）。
表 6.1.6.1. 市販されている Ludox の規格と特徴。価格は 2022 年 12 ⽉時点のものである
Ludox TM-40

Ludox AS-40

Ludox AM

Ludox HS-40

SiO2 濃度

40%

40%

30%

40%

pH

9.0

9.1

9.6-9.39.8

密度1.3 (25°C)

1.295 (25°C)

1.21 (25°C)

1.3 (25°C)

価格（4L）

22,000 円

16,800 円

15,500 円

15,700 円

Medium particle size

Low sodium

Small, high pH

Ludox は海⽔中の Ca や Mg と反応してゲル化するので、Ludox を堆積物試料に添加、混合する際には、予め海⽔を除去しておく必要がある。Ludox によるメイオベントスの回収⼯程は、⼀度だけだと全てのメイオベントスを回収できていない可能性があるため、回収⼯程を 2 回以上繰り返すのが望ましい。あと遠⼼機はスイングロータ式を使⽤する。
① 10〜15 mL の堆積物試料の⼊った 50 mL の遠⼼管を 900 G で 5 分間遠⼼する（図 6.1.6.1. A）。
② 上澄み（海⽔）を除去して（図 6.1.6.1. D）、DW を約 30 mL 添加する（図 6.1.6.1. B）。
③ ボルテックスで約 30 秒強く混合した後に、2〜5 分間振盪する（図 6.1.6.1.C）。
④ 900 G で 5 分間遠⼼する。
⑤ 上澄み（DW）を除去して、Ludox を約 30 mL 添加する（図 6.1.6.1. E）。
⑥ ボルテックスで約 30 秒強く混合した後に、2〜5 分間振盪する（図 6.1.6.1. F）。
⑦ 900 G で 10 分間遠⼼する。
⑧ 上澄み（Ludox、メイオベントスの懸濁液）を別の遠⼼管（#1）に移して、堆積物試料の⼊った遠⼼管に、再度 Ludox を約 30 mL 添加する（2 度⽬の回収⼯程）。
⑨ ⑥〜⑧の⼯程を繰り返す。
⑩ 上澄み（Ludox、メイオベントスの懸濁液）を別の遠⼼管（#2）に移す。

図 6.1.6.1. A. スイングロータ式の遠⼼機を使⽤する。B, D. 上澄み（海⽔）を除去した後、DW を添加。C, F. ボルテックスで強く撹拌した後、振盪する。E. DW を除去した後、Ludox を添加する。

91

6.1.7. セルストレーナーによるメイオベントスの分画
Ludox に懸濁しているメイオベントスの分画にはセルストレーナーを⽤いて⾏う。セルストレーナー（Cell Strainer, pluriSelect, funakoshi から販売）は、メッシュを含めて⼀体成型となっているフィルタ
ーで、細胞や組織を精製、分離、洗浄するために使われている。メッシュサイズは、1, 5, 10, 15, 20, 30,
40, 50, 60, 70, 85, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 750, 1000 µm 孔径の 19 種類があり、そのうちの 40 µmと 200 µm 孔径のセルストレーナーを使⽤する。50 mL の遠⼼管に装着して作業を⾏う。別売品だが、ろ過の際に、流速調節が可能となるコネクターリング、そして最⼤ 24 mL の試料処理が可能となるファンネルも併⽤している。コネクターリングに、三⽅活栓（流路切り替え⽤）とシリンジを装着すること
で、溶液の保持、ろ過、回収作業が容易に⾏えるようになる。シリンジで圧を加えることで、セルスト
レーナー上の懸濁液を保持できる。液が無くなったら、再度 DW を添加して、スポイトでメイオベント
スを懸濁して回収する。メイオベントスを対象とする場合、通常、200 µm 及び 40 µm 孔径のセルスト
レーナーをセットしているが、より⼤きな夾雑物を取り除くために、400 µm セルストレーナーを 200µm の上にセットすることもある。分画が終了後は、セルストレーナー、ファンネル、コネクターリン
グを洗浄して、繰り返し使⽤する。
① 200 µm 及び 40 µm 孔径のセルストレーナーをセットする（図 6.1.7.1. A, B）。
② #1 の遠⼼管の Ludox-メイオベントス懸濁液をろ過する（図 6.1.7.1. C）。
③ 速やかに DW でファンネルの Ludox を洗い流して、ろ過する（Ludox の除去、シリンジで吸引）。
④ 200 µm 孔径セルストレーナー上のメイオベントスを DW で懸濁して、スポイト等で回収する。DWで懸濁する際に、シリンジで圧を加えると良い（図 6.1.7.1. E, G）。
⑤ 40 µm 孔径セルストレーナー上のメイオベントスも同様に回収する（図 6.1.7.1. F）。
⑥ #2 の遠⼼管についても同様に、メイオベントス懸濁液をろ過、DW で Ludox を洗浄して、200 µm
及び 40 µm 孔径のセルストレーナー上のメイオベントスを各々回収する。
⑦ 200 µm 以上の画分のメイオベントスは実体顕微鏡を⽤いて、同定・計数を⾏い、200〜40 µm 画分のメイオベントスは FlowCAM を⽤いて、同定・計数する。
⑧ 分画直後に同定・計数を⾏わない場合は、各分画試料に、ホルマリンを 5%、pH9 標準緩衝液を0.1%程度、そしてローズベンガル染⾊液を 0.005%程度添加して、冷暗所で保管する。
⑨ ⼀時的な保管容器として、観察が容易な 12 ⽳のマルチウエルプレートを使⽤（図 6.1.7.1. H）。

図 6.1.7.1. A, B. 上⽅から、ファンネル、200 µm、40 µm 孔径のセルストレーナー、コネクターリング、50 mL 遠⼼管。コネクターリングとシリンジは三⽅活栓とシリコンチューブを介して繋がっている。C. Ludox-メイオベントス
懸濁液をファンネルに注いで、ろ過する作業。シリンジでマイルドに吸引して、ろ過を⾏い、ファンネルを DW で洗い流して、Ludox を除去する。D, E, F. ファンネルを外し、シリンジで圧を加えながら DW をスポイトで添加して、メッシュ上のメイオベントスを別のスポイトで懸濁しながら回収する。G. メッシュ上のメイオベントス。H. ⼀
時的な保管容器として、使⽤している 12 ⽳マルチウェルプレート。

6.1.8. 実体顕微鏡によるメイオベントス（≧200 µm 画分）の同定・計数① 200 µm 以上の画分をシャーレあるいは 12 ⽳のマルチウエルプレートに分取する。観察しやすいように、保存溶液あるいは DW を適量加える。

92

② 実体顕微鏡で観察、分類群ごとに計数する。必要に応じて、⼀定倍率で各個体の写真撮影を⾏って、記録に残す（図 6.1.8.1）。
③ より⾼倍率の観察を⾏う必要がある場合には、倒⽴顕微鏡を⽤いて、観察、写真撮影を⾏うと良い。

図 6.1.8.1. 200 µm 以上の画分で確認できたメイオベントス。スケールは 2 mm。

6.1.9. FlowCAM によるメイオベントス（＜200 µm 画分）の撮影（⼯程 F）
Yokogawa Fluid Imaging Technologies 社（https://www.fluidimaging.com/）の FlowCAM 8400 を⽤いたメイオベントスの撮影⼿順をフローチャートに⽰す（図 6.1.9.1 ）。

図 6.1.9.1. 画像解析によるメイオベントスの分類・計数の作業フロー。

93

6.1.10. FlowCAM 本体の電源投⼊とソフトウェアの起動（フローチャート 1〜2）
本体のメインスイッチ（筐体背⾯）を ON にし、本体正⾯の内蔵コンピュータの起動ボタンを押す。
Windows の起動後、専⽤ソフトウェア（VisualSpreadsheet ver.4）を⽴ち上げる（図 6.1.10.1）。起動時に装着済みまたは装着予定の対物レンズの種類（後述）を選択する。
なお VisualSpreadsheet の最新版 ver. 5 ではデータ保存形式が変更され、測定後の画像抽出⽅法が異なるが、本マニュアルは ver. 4 の利⽤を前提として作成する。

図 6.1.10.1. FlowCAM8400 の外観。本体は左側の⽩筐体。パソコンが内蔵されており、Windows 上で動作する専⽤ソフトウェア VisualSpreadsheet を⽤いて操作およびデータ解析を⾏う。メインスイッチは筐体背⾯、内蔵パソコンは本体上⾯のスイッチにより起動される。

6.1.11. 洗浄液、廃液回収容器の確認（フローチャート 3）
本体正⾯には、跳ね上げ式および跳ね下げ式のカバーが備わり、このうち、跳ね下げ式カバーの内側に 3 種のポリ瓶が並んでいる（図 6.1.11.1）。
測定前に、左側のポリ瓶には流路洗浄⽤の界⾯活性剤（メーカー推奨は Citrajet 1%溶液）、右側のポリ瓶には流路の洗浄、濯ぎのための純⽔を満たしておく。中央のポリ瓶は測定後のサンプル溶液や洗浄
⽔の廃⽔回収容器であり、空もしくは余裕があることを測定前に確認する。
なお、メイオベントスの測定では、1 測定あたりの廃液量は 10〜50 mL（洗浄⽔含む）である。本体
内蔵の廃液回収ポリ瓶の容量は 250 mL であるため、頻繁な廃液容器の保守が必要となる。国⽴環境研究所の FlowCAM は、廃⽔チューブを筐体の外に延⻑し、筐体外の 1 L 容器（図 6.1.10.1 の FlowCAM
筐体とモニターの間の⻘キャップ容器）に廃液を回収できるよう変更されている。

図 6.1.11.1. 本体正⾯跳ね下げ式カバーの内側の流路洗浄液容器（洗剤および純⽔）、廃液回収容器。

6.1.12. 対物レンズ、フローセル、ポンプシリンジの取り付け（フローチャート 4）
測定粒⼦の粒径範囲に適した対物レンズ、フローセル、シリンジを選択し取り付ける、もしくは取付済みであることを確認する（図 6.1.12.1）。孔径 200 µm の篩いを通過したメイオベントス粒⼦の測定

94

には、倍率 4 倍の対物レンズと奥⾏ 300 µm のフローセル、サンプル輸液のためのポンプシリンジは 5
mL の選択が最適である。また、定量的な粒⼦計数では、全視野の撮影が可能な FOV（Field of View）
タイプのフローセルを選択することが望ましい。FOV 以外のフローセルを⽤いる場合、各種分析条件に対する計数効率の詳細検討が必要となる。
篩いの粒径画分とフローセルの奥⾏（フローセルの最⼩内径に相当）には⼗分なクリアランスを設定することが重要である。クリアランスが不⼗分な場合、測定途中でのフローセル閉塞による中断、サン
プル⽋測を招く。
篩いの公称孔径は、メッシュ開⼝部の辺の⻑さであり、対⾓線の⻑さではない。仮にメッシュ開⼝部が正⽅形であるとき、開⼝部の最⼤⻑は開⼝部の辺の⻑さの√2 倍であり、篩いの公称粒径の√2 倍の幅を有する粒⼦が通過するケースが出てくる。また、堆積物中の粒⼦には、縦横⽐が 2 倍以上の粒⼦（例えば線⾍）も多い。ある公称孔径の篩いを通過した粒⼦についてその最⼤⻑を顕微鏡下で計測すると、公称孔径の数倍以上に達していることもある。⾼縦横⽐の粒⼦のうち、とくに線⾍などの⽣物粒⼦
は、篩い分画の際には⻑く伸び容易にメッシュを通過しても、FlowCAM 測定の際には流路内で絡まり、他の微粒粒⼦を巻き込みながら⼤きな塊となって、フローセルを閉塞させることがある。測定中のフローセルの閉塞を防ぐため、奥⾏の深いフローセルを選定する⽅法も考えられ、奥⾏ 600 µm のフロ
ーセルの取り付けも可能である。しかし、奥⾏の深いフローセルに⼩粒⼦を流すと、焦点が合っていな
い画像が多くなり、画像解析による粒⼦分類を困難にする。本マニュアルで推奨する篩いの孔径（200µm）とフローセルのサイズ（奥⾏ 300 µm）の組み合わせは、これらのトレードオフを検討した結果、導かれたものである。

図 6.1.12.1. 対物レンズ（左上）、フローセル（上中央）、ポンプシリンジ（下中央）。フローセルを挟んで対物レンズの反対側にフラッシュ光源が備わる。測定時はフローセルおよび対物レンズ部はカバーで覆われる。

6.1.13. トランスファーバイアルの取り付け（フローチャート 5）
FlowCAM のサンプルポートに、メイオベントスサンプル測定⽤に考案されたトランスファーバイアル
キットを取り付ける（図 6.1.13.1 右）。トランスファーバイアルキットは、直径 30 mm のガラスバイ
アル、磁気スターラーと撹拌⼦、⼩径テフロンチューブ（OD 2 mm × ID 1 mm など）、⼿動三⽅弁 2個、洗浄⽔⽤バレル、NPT1/8 × 2mm チューブ⽤オスコネクター、3D プリンターで作成した取り付け
ステー等から構成される（図 6.1.13.1）。本キットは FlowCAM に供給されるサンプル溶液中の粒⼦濃度を安定させ、流路の閉塞防⽌や質の⾼い画像の取得に効果がある。国⽴環境研究所が考案作成したもので市販はされていないが、⼀般的な部材の組み合わせにより実装可能である。

95

図 6.1.13.1. FlowCAM 標準サプルポート（写真左）と標準サンプルポートにトランスファーバイアルキットを取り付けた状態（写真右）。トランスファーバイアルキットの磁気スターラーとバイアルを⽔平に対して傾けて据
え付けることにより、平底バイアル内のサンプルのほぼ全量を FlowCAM に導⼊可能である。流路の途中に三⽅バルブで接続されたシリンジバレルは、流路の洗浄やサンプル導⼊時の「呼び⽔（純⽔）」⽤容器である。

＜トランスファーバイアル作成・導⼊の背景＞
FlowCAM へのサンプル導⼊は、通常、1）市販ピペットチップ（1 mL〜10 mL まで取り付け可能）にサンプル溶液を分取、2）筐体上⾯の円錐状開⼝部（サンプルポート）にピペットチップを挿⼊（Fig.
6 左）、3）FlowCAM のシリンジポンプによりチップ内の溶液を⼀定速度で吸引（300 µm フローセルの場合は 0.9 mL min-1）により⾏われる。また、サンプルポート上部にはテーパーめねじ（NPT 1/8）が彫られており、ピペットチップの代わりに、チューブコネクター等を介して⼤容量のバレルやボトルに採取したサンプルも導⼊可能である。
しかし、メイオベントスのサンプルは、密度差分離を⾏った後でも、多量の砂泥、デブリと混ざった状態であるため、個体数（濃度）の評価に⼗分なメイオベントス画像の取得では、メイオベントス数の数⼗倍〜数百倍の粒⼦の撮影が必要である。また、粒⼦撮影では、フローセル内で複数の粒⼦が重なり合わない濃度に調整されている必要があり、多くの場合、セルストレーナで濃縮されたサンプル粒⼦
は、FlowCAM 測定前に純⽔により希釈・分散される。このため、メイオベントス測定における 1 サン
プルあたりのボリュームは 10 mL を超えることが多い。
FlowCAM のサンプル吸引速度は 0.9 mL min-1 と低速である。このため、10 mL を超えるサンプル全量を容量の⼤きなピペットチップ、バレル、ボトルにサンプル溶液を静置保持すると、測定中にピペッ
トチップやボトル内で粒⼦の沈降あるいは上昇が起こる。この傾向は、⼤きな粒⼦や分散媒と異なる⽐重を有する粒⼦が多いメイオベントスサンプルにおいて顕著で、ピペットチップやバレル内の粒⼦分布の不均⼀化を招く。サンプルによっては多くの粒⼦が分散媒の特定部分に集まり、粒⼦が⾼濃度に集まった部分がフローセル（あるいは流路が狭⼩化するフローセルの⼊⼝部分）を通過する際に流路を閉塞させ、サンプルの⽋測を引き起こす。
トランスファーバイアルの利⽤により、こうしたトラブルの発⽣頻度を低下させることができる。測定中に⼩容量のピペットチップに良く分散させたサンプル溶液を少しずつ追加する⽅法や、測定を複数回に分けて少量ずつ⾏う⽅法も可能であるが、トランスファーバイアルの利⽤に⽐べて、作業効率が⼤幅に低下する。
6.1.14. FlowCAM 測定条件の設定（コンテキストファイルの設定と読込）（フローチャート 6）
ハードウェアのセットアップが完了した後、VisualSpreadsheet の Context メニューより、Capture、Flow Cell、Fluidics、Filter タブの条件を⼊⼒する。これらの条件の幾つかは、機器、サンプル状態、撮影⽬的に応じて試⾏錯誤と調整が必要だが、参考として、国⽴環境研究所における設定値を図 6.1.14.1〜4 に⽰す。

96

図 6.1.14.1. Context/Capture の設定例。

図 6.1.14.2. Context/Flow Cell の設定例。

Capture タブ（図 6.1.14.1）の Distance to Nearest Neighbor (µm)は、フローセルの視野上に複数のオブジェクトが検出されたとき、別々の粒⼦として扱うか、同じ粒⼦を構成するオブジェクトかを定義する条件である。過⼩な値を設定すると、明暗差のある 1 つ粒⼦が複数の粒⼦として認識され、過⼤な値を設定すると、複数の別々の粒⼦が 1 つの⼤きな粒⼦として認識される。Particles Defined By は粒⼦検出の条件で、バックグラウンドとオブジェクトの輝度の差により定義する。メイオベントスサンプルの粒⼦は、光源光が透過するタイプ（⾼輝度で撮影される）と透過しないタイプ（低輝度で撮影される）の両⽅が含まれるため、Both Dark and Light Pixels を選択の上、Segmentation Threshold に明暗両⽅の閾値（輝度差）を設定する。
Flow Cell タブ（図 6.1.14.2）には、取り付けたフローセルのタイプと⼨法を⼊⼒する。

図 6.1.14.3. Context/Fluidics の設定例。

図 6.1.14.4. Context/Filter の設定例。

Fluidics タブ（図 6.1.14.3）において、1 回に測定するサンプル量、サンプル流速、撮影速度等を設定する。トランスファーバイアルを⽤いた測定では、Sample volume には、バイアルに導⼊するサンプル
⽤よりも少し⼤きな値を設定しておく。なお、FlowCAM の測定はユーザーが選択したトリガー条件によって設定される。例えば、1）Sample volume に設定されたサンプルがフローセルを通過したとき、
2）フローセルの直前に設けられたセンサーにより流路に空気が検出されたとき（＝すべてのサンプルが吸引されたとき）、3）ユーザーが強制終了ボタンを押したときなどである。Sample volume は、測定終了のトリガー条件の 1 つとなる。Flow rate（サンプル流速）は、フローセルのサイズに応じてメー97

カー推奨値を設定すると良い。メーカー推奨値を超える流量を設定すると、フローセル内でキャビテー
ションが発⽣し、⽬的粒⼦の撮影を妨害する。AutoImage Rate は撮影フレームレートである。フローセル撮影⾯の⾯積と容積、サンプル流速および撮影フレームレートの組み合わせに基づき、EstimatedEfficiency and Run Time ペインにサンプルの撮影効率が表⽰される。撮影効率が 100%を超えた設定では同⼀粒⼦が重複撮影されるため、粒⼦濃度を定量する⽬的では、100%未満になるようにフレームレ
ートを調整する。なお、フローセル内壁⾯近くの流速は壁⾯抵抗によって平均流速未満となるため、100%近くのフレームレートで撮影を⾏うと、フローセル内壁近くを通過した粒⼦画像は重複して撮影されることがある。このため、70%以下の撮影効率になるようにフレームレートを制限すべきである。
Priming ペインにおいて、サンプルポートからフローセルへのサンプル充填⽅法を選択する。ピペット
チップによる標準的なサンプル導⼊では machine prime（センサーによる⾃動充填）を⽤いることができるが、トランスファーバイアルによるサンプル導⼊では、manual prime with non-sample を選択の上、シリンジポンプの⼿動操作による流路への呼び⽔導⼊とサンプル⽔への置換が必要である（後述）。
Filter タブ（図 6.1.14.4）では、撮影計測する粒⼦サイズの選択や幾何学形状や光学特性で選択する
ためのフィルター（別途定義が必要）を設定できる。メイオベントスサンプルの場合は、最⼩径を 50µm、最⼤径を 1000 µm 等に設定する。多様な形状の粒⼦の網羅的な撮影では、幾何学形状フィルターの設定が必要なケースは少ない。
6.1.15. フローラインへの呼び⽔導⼊とサンプルセット（フローチャート 7〜9）
サンプル溶液をトランスファーバイアルに分取する前に、トランスファーバイアルからフローセルまでの流路を純⽔で満たす操作を⾏う。トランスファーバイアルによるサンプル導⼊系は、標準サンプル
ポートによる導⼊系に⽐べて、流路ボリュームや圧⼒損失が⼤きいため、流路全体が空気で満たされた状態からポンプシリンジで吸引減圧してもトランスファーバイアル内の溶液が輸送されない場合がある。このため、先ず、標準サンプルポートの直上の⼿動三⽅弁に接続したシリンジバレルに純⽔を注⼊し、シリンジバレルからフローセルまでの流路を純⽔で満たす。次いで、トランスファーバイアルに純⽔を注ぎ、⼿動三⽅弁を切り替えて、トランスファーバイアルからフローセルまでの流路を純⽔（呼び⽔）で満たす操作を⾏う。⼀連の作業におけるポンプシリンジ制御は VisualSpreadsheet の Prime
System ウィンドウで⾏う（図 6.1.15.1）。流路上に空気が残留しないように純⽔を満たすことが重要である。

図 6.1.15.1. Prime System ウィンドウ。

流路全体が純⽔で満たされた後、トランスファーバイアル内に残っている余分な純⽔を捨てる。次に、メイオベントスサンプル溶液をトランスファーバイアルに⼊れ、スターラーによる撹拌を開始する。トランスファーバイアルとサンプルポートを接続している⼩径テフロンチューブは、トランスファ
98

ーバイアル側の先端を含めて純⽔で満たされた状態に保たれるよう注意する。Prime System の操作により、⼩径テフロンチューブの先端からフローセルまでのボリュームに相当する純⽔を吸引する。以上により、フローセル直前までの流路が純⽔からサンプル溶液に置換される。Prime System の Evacuate
Syringe によりシリンジポンプバレルをボリュームゼロの位置に戻し、測定準備が完了する。
6.1.16. サンプル測定（フローチャート 10〜13）
サンプル粒⼦の撮影および計測は、AutoImage モードで⾏う。メインウィンドウから「AutoImage」
を開始する（図 6.1.16.1）と、測定終了トリガーウィンドウ（図 6.1.16.2）が表⽰される。ここでは、Stope when user terminates experiment or fluid aspirated を選択する。Notes ペインにサンプルメタ情報（サンプル ID、採取地点、堆積物量など）を記⼊することもできる。測定終了トリガーを決定すると、PC 上のデータファイル名の⼊⼒画⾯に遷移する。ファイル名⼊⼒後、測定が開始される。サンプ
ル ID などをファイル名とすることができるが、測定履歴を管理しやすくするためには、測定開始時刻に基づくファイル名の⾃動⼊⼒（“ユリウス⽇-時刻”フォーマット）を利⽤すると良い。測定失敗や予定外の繰り返し測定を余儀なくされることを前提に、ファイル名とサンプル ID や分析条件を含むサンプ
ルメタ情報との紐付けには、Excel テーブル等を利⽤した⽅がデータを管理しやすい。

図 6.1.16.1. VisualSpreadsheet メインウィンドウ（測定終了時の画⾯）。測定は画⾯左上の AutoImage より開始。右上のグラフはフローセル横断⽅向位置に対する粒⼦計数頻度（⻘棒）と相対積算値（緑）。粒⼦がランダムにフローセルを通過していたことを⽰している。

図 6.1.16.2. 測定終了トリガー選択ウィンドウ。

単位堆積物あたりのメイオベントス濃度の評価を⾏う場合には、トランスファーバイアルに分取したサンプル液量（mL）およびそのサンプル液量の作成に⽤いた堆積物量（mL または g）に基づき単位堆99

積物あたりのサンプル液量を計算し、サンプル ID 等を記録する Excel テーブルに追記する。
測定開始後は、撮影された粒⼦画像（コラージュ形式、リアルタイムビューウィンドウ）とともに、粒⼦の⾯積、球相当径、縦横⽐、⾊情報などの計測データのうちユーザーが選択した幾何学・光学的データの集計グラフ（メインウィンドウ）がリアルタイム表⽰される。また、単位時間あたりの粒⼦のフ
ローセル通過数の時系列変化を表⽰できる（図 6.1.16.1）。測定中は、これらの情報のうち、とくにフローセル横断⽅向と縦断⽅向の通過位置に対する粒⼦計数頻度グラフ、ならびに単位時間あたりの粒⼦のフローセル通過数の時系列変動グラフを表⽰させ、粒⼦数の定量測定を損なう流路の⼀部閉塞やフローセル撮影⾯の（しばしば粘着性の）汚れ、不均⼀な粒⼦のフローセル通過が起こっていないことを監視することが望ましい。また、フローセル撮影⾯における複数の粒⼦のオーバーラップ（重なり）や近接（Distance to Nearest Neighbor（図 6.1.14.1）の設定値より近い位置に存在）すると、複数粒⼦が 1つの粒⼦として判定され、正常な粒⼦画像が取得できなくなる。このトラブルを防ぐには、1 撮影フレームあたりに存在する粒⼦数を 1 前後に調整することが好ましい。測定開始後、直ちにメインウィンド
ウ下部に表⽰される“PPI”（Particle Per Image、1 撮影フレームあたりの平均粒⼦数）を確認し、PPIが⼤きすぎるときは、⼀旦測定を中断しサンプル希釈後に再分析を⾏うか、測定を継続しながらトラン
スファーバイアル中のサンプルの希釈を⾏う（図 6.1.16.1）。ただし、途中で希釈操作を⾏うときは、希釈液量を Excel テーブルに追記する。
トランスファーバイアルのサンプルが全量吸引されると、測定が終了する。1 サンプルあたりの測定
時間は、流量（mL min-1） × サンプル量（mL）である。ただし、トランスファーバイアルのサンプ
ル残量を FlowCAM に直接通知する⼿段はなく、フローセル上部の流路への空気層が出現したとき、全量が吸引されたことを検出できるのみであるため、測定中は、トランスファーバイアル内の⼩径チュー
ブ先端が常にサンプル溶液に浸かるように留意することが重要である。なお、⼩径チューブの先端をサンプル溶液から浮かせることで、測定を中断、分割できる。1 サンプルの測定を中断操作等によって複数回に分割しても、測定済みのサンプル量情報は各々保存されるため、後解析において分割データを結合可能である。
6.1.17. 測定終了後（フローチャート 14〜16）
測定後は流路の洗浄を⾏う。洗瓶の純⽔などでトランスファーバイアルを濯ぎ、純⽔を満たした状態
で定位置に戻し、FlowCAM のシリンジポンプの Flush 機能を⽤いて、5〜10 mL の純⽔で流路を洗浄する。次いでトランスファーバイアルキットの流路側⽅から空気を導⼊できるように三⽅弁を切り替え、
FlowCAM の Cleaning および Rinse 機能を⽤いて、標準サンプルポートより下流の流路の界⾯活性剤を⽤いた洗浄と純⽔による濯ぎを⾏う。Cleaning、Rinse 機能では、界⾯活性剤や純⽔の供給時に適度な間隔での空気分節が設けられ、その気液界⾯の移動がフローセルや流路壁⾯に残留した微粒⼦を掻き取る効果を⽣み、連続的な洗浄液の注⽔よりも有効な洗浄効果が得られる。なお、天然サンプルには粘着性の物質が含まれ、次の測定における粒⼦の流路内固着等の原因となるので、1 測定終了毎に界⾯活性剤を⽤いた洗浄を⾏うことを推奨する。
次のサンプルがある場合は、フローチャート 7 に戻り、測定を継続する。全てのサンプルの測定が終了したときは、Flush 機能等により流路の残液を排出し、保存データ⼀式をオフライン解析⽤の PC に
コピー転送する。その後、Windows をシャットダウンし、FlowCAM のメイン電源を OFF にする。なお、Flush による流路の全排出ではフローセル内の⽔分を完全に除去することはできないため、⻑期間
FlowCAM を動作させない場合には、カビの発⽣を防ぐため、フローセルを取り外しデシケーター内で保管することを推奨する。
6.1.18. FlowCAM 画像の深層学習による分類予測モデルの構築
深層学習に基づく画像分類は、近年、様々なフレームワークが開発、公開されているが、本マニュア
ルでは python および GPU 対応の tensorflow/keras 環境をインストールした Windows PC 上で動作す
る、Chollet （2016）の 131 のマルチレイヤーニューラルネットワーク（MNN）で構成される

100

Xception モデルをベースモデルとする⽅法を採⽤した。Xception モデルでは、画像内の⼀般的なオブジ
ェクトの検出や特徴量を抽出するための学習済みの汎⽤パラメータが公開されており、特定⽤途の分類
タスクを最⼩限の追加学習（転移学習）で実現できる。
メイオベントス分類予測モデルの構築では、分類ごとのメイオベントス画像を FlowCAM データより作成し、それを教師画像として転移学習を⾏う。分類性能の評価とモデルのチューニングを繰り返し、最終的な分類予測モデルを構築、未分類の画像にモデルを適⽤する。本節では、FlowCAM データを⽤いた教師画像データセットの作成から分類予測モデルの構築までの基本的な流れについて解説する（図6.1.18.1）。

図 6.1.18.1. 教師画像データセットの作成〜分類予測モデルの構築の流れ。

6.1.19. 機械学習・⼿作業による教師画像データの整理（フローチャート 3〜4）
転移学習⽤の教師画像は、分類ごとに数百〜数千枚以上の画像を準備することが望ましい。このため
FlowCAM で撮影された各サンプルの粒⼦画像を分類ごとに整理した上で、複数のサンプルに含まれる
各分類の画像を統合する作業を⾏う。個々のサンプルからの特定分類群の画像の抽出および複数サンプルから取得した画像データの統合には、VisualSpreadsheet の Classification 機能および Library 機能を活⽤すると効率的である（図 6.1.19.1）。

101

図 6.1.19.1. 教師画像の整備の流れ（VisualSpreadsheet を⽤いた作業）。

各サンプルからの特定分類群の画像の抽出では、VisualSpreadsheet から各サンプルのデータ（拡張⼦lst のリストファイルで保存されている）を開く。Open View ウィンドウを開くと、撮影された粒⼦が撮影順にタイル状に表⽰される。Open View ウィンドウを開いたまま、File メニューから “OpenClassification window”を選択し、Classify ウィンドウを開く。Classes タブから New Class を選択し、当該サンプルに含まれる分類群の分類クラスを作成する（例えば、Copepoda、Namatoda、etc.）。Open
View ウィンドウに戻り、画像粒⼦の⾯積、縦横⽐、最⼤⻑、光学強度などの特徴量によるソート機能
や特徴量の組み合わせによる類似画像選択機能（VisualSpreadsheet に実装された機械学習機能）を⽤いて、特定の分類群に属する粒⼦を選択し、右クリックコマンドで Classify ウィンドウの分類群に画像を移動する。これを繰り返して、Classify ウィンドウ上で複数の分類群に画像を整理する。
Classify ウィンドウにおける当該サンプルの分類が完了した後、複数サンプルの画像を統合するために、File メニューから “Open Library Window”を選択して Library ウィンドウを開き、各分類群のLibrary ファイルを新規作成、あるいは他のサンプルの分類作業時に作成した既存の Library ファイルを開く。Classify ウィンドウ上で当該サンプルの画像データを Library ファイル上にコピー転送する。
Classify ウィンドウでは、1 つの測定ファイル内の粒⼦についてのみ分類操作が可能だが、Library フ
ァイルは複数の測定ファイルの画像情報を横断的に集約することができる。複数の測定データについて分類作業を繰り返し、1 分類あたり数百枚以上の画像を収集した Library ファイルを作成する。
分類ごとの Library は、粒⼦画像をコラージュ形式で整理した tif 形式の画像ファイル、幾何学、光学計
測値、粒⼦ ID、当該粒⼦の tif 画像上の保存位置（xy 座標）などの情報が保存された
VisualSpreadsheet 専⽤フォーマットの flb ファイルと edg ファイルから構成され、flb ファイルの情報
は csv 形式でも出⼒される。
6.1.20. FlowCAM コラージュ形式画像からの粒⼦画像の抽出と深層学習のための画像前処理（フローチャート 5〜6）
Xception モデルへの粒⼦画像の⼊⼒には 1 画像 1 ファイル形式を⽤いる。VisualSpreadsheet からは
分類ごとの複数粒⼦のコラージュ画像が出⼒されるので、コラージュ画像から粒⼦ごとの画像抽出を⾏102

う。また、Xception モデルが受け⼊れ可能な画像サイズ（縦横 244 ピクセルの正⽅形）、フォーマット
（png 形式）に変換する。変換後の画像ファイルは、分類ごとの名前を付したフォルダに分けて保存する。
VisualSpreadsheet コラージュ画像と同時に出⼒される csv ファイルには、各粒⼦が保存されている tif
ファイル名、tif ファイル上の各粒⼦画像の原点、縦横のピクセル⻑が記録されており、python のOpenCV ライブラリなどを⽤いて各粒⼦の画像データを抽出し 1 画像 1 ファイルに変換する。変換した各画像のファイル名には VisualSpreadsheet が各粒⼦に付与した 128 ビットのユニーク ID を⽤いる。これにより、異なる粒⼦画像に重複したファイル名が⽣じるリスクが回避される。また、このユニーク
ID は FlowCAM による粒⼦の撮影時に付与されるため、異なるサンプル由来の粒⼦画像を 1 つのLibrary に統合した後でも、各粒⼦の元サンプルを追跡することが可能である。
なお、FlowCAM の各画像の縦横⽐は、その粒⼦形状に応じて異なる。深層学習を⽤いた画像分類タ
スクでは、⼊⼒される被写体の縦横⽐の変化による分類予測性能の低下は⼩さいことが確認されているが、⼊⼒画像や推定結果の⽬視確認や分類変更の際には、可能な限りオリジナルの縦横⽐の画像である
ことが好ましい。このため、国⽴環境研究所のスクリプトでは、画像の⻑辺のエッジピクセルを平均化しながら短辺⽅向に膨張させ、被写体の縦横⽐を維持したまま、画像の縦横⽐を１：１に統⼀する前処理を⾏っている（図 6.1.20.1）。被写体の⼀部が撮影視野から外れた画像も混在する。このような画像は、分類モデルの学習におけるノイズとなると考えられたため、画像エッジのピクセル強度の分布に基づくアルゴリズムにより教師画像から除外する処理を加えている。

図 6.1.20.1. Copepoda と Namatoda 画像の正⽅形加⼯処理。

6.1.21. 深層学習モデルの構築（フローチャート 7〜10）
python スクリプトにより、分類予測モデルの作成を⾏う。
最初に分類ごとのフォルダに整理した画像ファイルリストをデータフレーム化し、モデル訓練⽤フォ
ルダ（60%）、モデル訓練中の検証⽤画像フォルダ（20%）、モデル構築後の予測性能評価・テスト⽤
画像フォルダ（20%）に無作為分割する（層化無作為抽出）（フローチャート 7）。
次いで Xception ベースモデルに⼊⼒層及び上位（出⼒側）の隠れ層（5 層）を追加し、Keras
ImageDataGenerator を⽤いて各画像の分類クラス（分類フォルダ名を使⽤）とともに訓練⽤画像および検証⽤画像を Xception モデルに読み込ませる（フローチャート 8）。学習の初期段階では、ベースモ
デルの重みパラメータは不変とし、新規追加層のパラメータのみを変化させた転移学習を⾏う。新規追加層の学習が安定化したタイミングで、ベースモデルの幾つかの上位層の重みパラメータを不変から可変に変更し、モデル全体のファインチューニングを⾏う。パラメータ最適化アルゴリズムとして Adam
（適応運動量推計法、Kingma and Ba 2014）等を⽤い、学習の進捗に応じた学習率（重みパラメータを⼀度に調整可能な割合）の⾃動調整を⾏う。また、画像上の被写体位置等による過学習を低減させるた
め、訓練画像のモデル⼊⼒に際しては、毎回、画像反転や回転等のデータ拡張処理を⾏う。初期の転移
学習は 10〜20 エポック、ファインチューニングは 20〜50 エポックの学習を⾏う。ここで、エポックは学習単位を指し、全ての訓練画像について⼀通り学習に利⽤された段階を１エポックという。エポック
が進むにつれて Xception モデルの重みパラメータがメイオベントス画像に最適化される。エポックごとに訓練画像および検証画像の分類正解率（accuracy）を出⼒する。学習期間の前半に急激な向上が起
こり、次第に⼀定値（80%〜）に近づく。分類対象や分類数に⼤きく依存するが、正解率の上昇が停⽌

103

したエポックで学習を停⽌し、モデルを⼀時保存する。ただし、訓練画像の正解率が検証画像の正解率を⼤きく超えて収束する場合は、重みパラメータが訓練画像の分類に最適化しすぎた状態（過学習）である。学習率、最適化アルゴリズムやそのパラメータの変更、モデル構造の改良（上位の隠れ層の変更）等により改善する場合もあるが、多くの場合、訓練データ不⾜やデータの質の偏りに依存するため、サンプルの追加分析による教師画像の拡充等を検討すべきである。
続いて、テスト⽤画像（モデル構築に使⽤されていない独⽴した分類情報付き画像セット）を⽤いて、⼀時保存したモデルの分類予測性能の評価を⾏う（フローチャート 9）。⼀時保存したモデルに画像ファイルリストを引数として predict メソッドを実⾏すると、予測結果の配列が返される。画像ファイルリストの事前分類情報と照合することで、予測性能の評価を⾏う。具体的には、事前の分類情報と予測結果を混同⾏列で表し（図 6.1.21.1）、precision、recall、F1-score 値などの評価指標を計算する（表 6.1.21.1）。precision は、任意の分類に属すると予測された画像の分類正解率であり、混同⾏列の任意の縦列の画像数の和に対する正解画像の割合に相当する。recall は任意の分類に属することが予め定義されている画像が予測においても正しく予測される再現率であり、混同⾏列の任意の横１列の画像数の和に対する予測正解画像の割合に相当する。F1-score は、precision と recall の調和平均である。こ
れらの評価指標に基づく予測性能が⽬標性能に達していると判断されるならば、そのモデルおよび重みパラメータをメイオベントス分類予測モデルとして保存し、未分類画像の分類に適⽤する。

図 6.1.21.1. メイオファウナ画像分類モデルを⽤いたテスト画像（727 枚）の分類予測結果を混同⾏列で⽰した例。各セルの数値およびカラーは対応する画像枚数を表す。Python 環境における混同⾏列の作成は、scikitlearn のモデル評価ライブラリ（sklearn.metrics）の confusion_matrix モジュールが使いやすい。本図は scikitlearn で計算した混同⾏列を可視化ライブラリ Seaborn の heatmap メソッドを⽤いて作図されている。
表 6.1.21.1. メイオベントス分類モデルの性能評価指標のとりまとめの例
Category

precision

recall

f1-score

Copepoda

0.91

0.94

0.92

Nematoda

0.91

0.88

0.89

Desmoscolecidae

0.81

0.83

0.82

Epsilonematidae

0.59

0.76

0.67

Nauplii

0.9

0.95

0.92

Polychaeta

0.41

0.78

0.54

104

Others benthos

0.61

0.71

0.66

Debris

0.69

0.49

0.57
0.82

accuracymacro avg

0.73

0.79

0.75

weighted avg

0.82

0.82

0.81

6.1.22. FlowCAM と分類予測モデルを⽤いた⾃動分類と計数
分類予測モデルの構築後、以下の手順に沿って、FlowCAM 画像データの自動分類による分類ごとの計
数結果のレポート出力を行うことができる（図 6.1.22.1）。

図 6.1.22.1. 分類予測モデルを⽤いた⾃動分類と計数の流れ。

FlowCAM によるサンプル測定後、各サンプルのデータフォルダに保存されている tif ファイル、csv
ファイル、txt ファイルを画像抽出処理⽤の python スクリプトおよび分類予測モデルが動作する PC に
コピー転送する（フローチャート 1）。Tif ファイルは、コラージュ形式で粒⼦画像が撮影順に並んでいる。Csv ファイルは、各粒⼦の幾何学・光学計測データ、tif ファイル上の当該画像位置、粒⼦の 128 ビ
105

ットユニーク ID などの情報が記録されている。Txt ファイルには、撮影サンプル量などの粒⼦カウン
トを濃度に変換するための情報が記録されている。必要に応じて、FlowCAM 測定時に作成した Excel
形式等のサンプルリスト（ファイル名とサンプルメタ情報の紐付け、単位堆積物あたりのサンプル液量などのレコード）を準備する（フローチャート 2）。
各サンプルの FlowCAM コラージュ画像、csv ファイルを先に作成した python スクリプトを⽤いて、個々の粒⼦の 1 画像 1 ファイル化、画像の正⽅形化処理、サイズの統⼀を⾏う。ただし、ここで抽出される粒⼦は未分類なので全ての画像ファイルは任意の同⼀フォルダに出⼒する（フローチャート 3〜
4）。
次いで、画像分類を⾏うフォルダ内の画像ファイルリストをデータフレーム形式で⽣成し、保存済みの分類予測モデルに⼊⼒する。サンプル中の全粒⼦の分類結果が出⼒される（フローチャート 5）。
Python の Pandas あるいは Scikit-learn ライブラリ等の集計機能を⽤いて、画像ファイルの分類集計表を作成し、csv や Excel 形式で保存する（フローチャート 6）。
分類集計表の出⼒とともに、モデルにより分類された画像ファイルを分類ごとのフォルダにコピーする。汎⽤画像閲覧ソフトウェア等を⽤いて、分類結果の事後確認を⾏う（フローチャート 7〜8）。分類
結果が良好であれば、集計表の分類ごとの個体数、単位堆積物あたりのサンプル量、FlowCAM の有効
撮影サンプル量に基づき、単位堆積物あたりの分類別個体数を計算し、レポートを出⼒する（フローチャート 10〜11）。
6.1.23. ⼯程 G：同定・計数データの結合
実体顕微鏡による 200 µm 以上画分（図 6.1.1.1）および FlowCAM による 200 µm 未満画分のメイオ
ベントス同定・計数データの結合を⾏い、各サンプルのメイオベントス各分類群の個体数を得る。

6.2. メタゲノムによる分析（⼩島茂明・新⾥宙也）
6.2.1. 前処理① コアサンプラー（プッシュコア、マルチプルコアラーなど）を⽤いて採集した海底堆積物を深度層（例えば海底表⾯〜海底下 1 cm 層、同 1〜2 cm 層、2〜3 cm、3〜4 cm、4~5 cm）にスライスし、それぞれ⼗分量（少なくとも体積で堆積物の 10 倍量）の 100 %エチルアルコール（分⼦⽣物学⽤ 500 mL
4980 円）中に懸濁して、冷凍庫（-25〜30 ℃）内で保管する（図 6.2.1.1.）。

図 6.2.1.1. 船上での海底堆積物処理。

② 各サンプルを超純⽔でステンレス篩シリーズ（例えば東京スクリーン社 試験ふるい ⽬合い 1 mm、500 µm、250 µm、125 µm、63 µm、38 µm）を⽤いて、超純⽔中で篩いながら順次、サイズ分画する。分画しない場合は、1 mm 篩を通過し、38 µm の篩上に残るサンプルを以下の解析に⽤いる（図6.2.1.2.）。
106

図 6.2.1.2. 堆積物サンプルのサイズ分画。

③ 篩上の⽔を切って、500 µm 以下の各篩上に残ったサンプルを乾熱滅菌（除 DNA）した薬さじを⽤いて 50 mL ファルコンチューブ等に移す。洗瓶を使って LUDOX（W. R. Grace & Co.-conn. 18 L、76900 円）で篩に残ったサンプルもファルコンチューブ等に移す。ファルコンチューブに LUDOX を加えて総量が 35〜45 mL にする。終了後、洗瓶に残った LUDOX を容器に戻し、洗瓶を超純⽔で洗う。
また、LUDOX はゴム⼿袋をして取り扱う（図 6.2.1.3.）。

図 6.2.1.3. サイズ分画したサンプルの回収。

④ 卓上遠⼼機を⽤いて、800 G で 10 分間遠⼼する。サンプルを取り出したのと同じ⽬合いの篩に上澄みを流し込む。ファルコンチューブに LUDOX を加えて総量を 35〜45 mL にし、緩やかに攪拌して沈殿物を再懸濁する（図 6.2.1.4.）。

図 6.2.1.4. 遠⼼処理したサンプルの回収。

107

⑤ ④の操作を３回繰り返し、篩上に集めたサンプルを超純⽔中で篩って、ファルコンチューブ等に超純⽔で流し込む。この間、篩のスクリーン部分を超純⽔に浸けておくなどしてサンプルが乾燥しない様に注意する。
⑥ 各⽣物サンプルをプランクトンサンプルデバイダ（⼤⽇貿易株式会社）などを⽤いて２つに分わけ、⽚⽅を形態分類またはフローカムによる画像解析（6.1 参照）による⾼次分類群の個体数計数に⽤いる（図 6.2.1.5.）。なお、10 %ルゴール液で固定し、先にフローカムによる画像解析をおこなったサンプ
ルを回収し、メタゲノム解析に⽤いることも可能である。

図 6.2.1.5. プランクトンデバイダによるサンプルの分取。

⑦ 残りのもう⼀⽅のサンプルを次世代シーケンエンスに⽤いる。この際、当該観測点のサンプル数は、
コアサンプル数 × 深度層数 × サイズ分画数になる。サンプリング時のシップタイムや解析予算、マンパワーなどの制約があるが、後でデータを統合することは容易なので、できるだけサンプル数を多くする⽅がよい。解析結果を安定させるのに⼗分なサンプル数は、海域や⽔深などで変化するため、⼀律には決められず、個別に検討する必要がある
が、多くの場合シップタイムで決まってしまうことが多い。なお、⼀つのサンプルを深度層やサイズ分
画により複数に分けても後述する様にタグを付けて⼀緒に解析できるため、次世代シークエンスに掛かる費⽤はそれほど変わらない。
6.2.2. DNA 抽出及びシーケンスライブラリ調製
注意事項：使⽤するチップは全てフィルター付き、チューブは PCR クリーングレード、⽔はDNase/RNase-Free のものを使⽤する。例えば BMBio 社のフィルターチップ（1000 µL ⽤ （品番：WF-1000RS） 1 セット（96 本×8）13,700 円、200 µL ⽤ （品番：WF-200RS） 1 セット（96 本×10）13,700 円、20 µL ⽤ （品番：WF-20RS） 1 セット（96 本×10）13,700 円、10 µL ⽤ （品番：WF-10RS） 1 セット（96 本×10）13,700 円）や、Eppendorf 社の Safe-Lock Tube（1.5 mL （品番：0030120086） 1000 本 7,700 円、2.0 mL （品番：0030120094） 1000 本 10,500 円）、Thermo Fisher
Scientific 社の Distilled water（品番：10977015、500 mL 4,800 円）など。
① Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kits （品番：69504、50 サンプル⽤ 29,000 円）を⽤いて、付属プロ
トコルの“動物組織からのトータル DNA 精製”に従って DNA を抽出する。サンプル量に依存するが、DNA 濃度は 10ng/µL 程度と薄いため、溶出する液量は通常よりも少ない 30 µL 程度にし、DNA を濃縮させる。DNA 濃度が濃ければ、溶出量を増やす。
② KAPA HyperPlus Kit （品番：KK8510、8 サンプル⽤ 46,000 円、品番：KK8512、24 サンプル⽤
110,000 円）と KAPA Unique Dual-Indexed Adapter Kit （品番：KK8727、96 インデックス 423,000円）を⽤いて、付属プロトコルに従って、シーケンスライブラリを調製する（磁気ビーズ AMPure XP（品番：A63880） 5 mL 48,000 円、DNA 精製⽤マグネットスタンド（品番：FG-SSMAG2） 36,000
円、PCR チューブ別売）。正規の半分量を使⽤することで、試薬の使⽤量を節約することも可能である。

108

③ Agilent D1000 ScreenTape （品番：5067-5582、112 サンプル分 31,000 円） と Agilent D1000 試薬
キット （品番：5067-5583、112 サンプル分 12,000 円）を⽤いて、付属プロトコルに従ってライブラリの断⽚⻑を定量する。
④ KAPA Library Quantification Kit （品番：KK4824、500 回⽤ 75,000 円）を⽤いて、付属プロトコルに従って定量 PCR を⾏い、ライブラリの DNA 濃度を定量する（MicroAmp 384 ⽳プレート（品番：4309849）50 枚 69,100 円別売）。シーケンス外注時には、DNA 濃度が 5 nM かつ液量は 20 µL 以上など、⼀定の条件を要求されることが多い。サンプルの DNA 濃度が薄い場合は、ステップ２のライブラ
リ増幅ステップからやり直すことができる。
⑤ 異なるインデックス配列を付加したサンプルを等量ずつ混合し、マルチプレックスライブラリを作成する。例えばサンプル A が 20 nM、サンプル B が 10 nM、サンプル C が 15 nM であった場合、サンプ
ル A を 5 µL、サンプル B を 10 µL、サンプル C を 6.67 µL ずつ混ぜることで、DNA 量はほぼ等量になる。
⑥ マルチプレックスライブラリの DNA シーケンスを⾏う。外注する場合、⽇本ジェネティクス社を介した Novogene 社での例では、（ライブラリ QC 費⽤ （品番：NV-LIBQC、1 ライブラリ 3,000 円） +レーンシーケンス（Illumina HiSeq PE150（品番：MG-HILN-PE150）、データ量：110 Gb 180,000円） + HDD 納品（品番：MG-HDD）28,000 円）程度の費⽤がかかる。サンプルの状態に依存するが、データ量は 1 サンプルあたり 10〜20 Gb あると、⼗分量の Contigs（6.2.3 に後述）を構築することができる。レーンシーケンスを依頼した場合、HDD 納品を希望することで、最低保証の 110 Gb 以上のデータ量が納品される場合が多い。サンプル数が少なく、必要とするデータ量が 110 Gb より少ない場合は、シーケンスするデータ量が指定できるギガ読み（品番：NV-PE150、1Gb あたり 3000 円）などがお得である。
6.2.3. メタゲノムアセンブリおよび後⽣動物由来ミトコンドリア DNA 配列の抽出＊注意事項：シーケンス⽣データは、必ず外付け HDD 等にバックアップし、解析を始める。
実⾏するコマンドは枠で囲った部分で、⾒やすくするために改⾏を⼊れている場合があるが、実際にタイプする際は⼀⾏で⼊⼒する。“\”はバックスラッシュを意味する（MS word によって⾃動変換されてしまう）。解析の際、コマンド実⾏前後に、ファイルの中⾝を確認することを推奨する。例えば、 lesstest.txt とタイプすると、test.txt というファイルの中⾝を⾒ることができる。
*解析ソフトウェアのインストール：ソフトウェアのインストールは、パッケージ管理ツール
Miniconda（https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html）を使うことで、個々のソフトウェアのイ
ンストールの煩雑さや、ソフトウェアをインストールできないなどのトラブルを回避できる。公式サイト（https://conda.io/projects/conda/en/latest/user-guide/install/index.html）に従って、プラットホーム（Windows, Mac, or Linux）に適した Miniconda インストーラーをダウンロードし、インストールする。Linux ⽤のインストーラーを選択・ダウンロードした場合、以下をタイプすることでインストール
できる。（$は⾒やすくするために挿⼊している。タイプする必要ない）。
$ bash Miniconda3-latest-Linux-x86_64.sh① シーケンスデータの前処理①-1．Cutadapt（https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/）を⽤いて⾏う。Miniconda を介してインストールする。
$ conda install -c bioconda cutadapt①-2．以下をタイプして、画⾯に以下の様なバージョンや著作権に関する情報が出⼒されたら、適切に
インストールされていることを意味する。
$ cutadapt -h109

①-3．低クオリティとシーケンスアダプター由来の配列の除去：シーケンスクオリティが低い（Quality score < 20） 塩基やシーケンスアダプターに由来する配列を、解読された DNA 配列の 3ʼ末端から削除し、それらの削除に伴って短くなったリードを除去する。例えば Quality score=10、20、30
は、それぞれシーケンスクオリティが 90 %、99 %、99.9 %であることを意味する。-a はフォワードリ
ード（Read 1）のアダプター配列、-A はリバースリード（Read 2）のアダプター配列を意味する。アダ
プター配列は、使⽤したライブラリ調整キットやインデックスキットに依存するので、事前に HP 等で配列を確認する。今回は、KAPA Unique Dual-Indexed Adapter Kit で⽤いられたアダプター配列を⼊⼒している。--minimum-length は最短リード⻑。--cores は使⽤する CPU の数（コンピュータの性能によって変更可能）。--output はフォワードリード（Read 1）の処理後のアウトプットファイル名。-paired-output はリバースリード（Read 2）の処理後のアウトプットファイル名。最後は対象とするサン
プルのデータを、フォワードリード（Read 1）、リバースリード（Read 2）の順で⼊⼒する。以下、全て⼀⾏で改⾏なし⼊⼒する。
$ cutadapt-a AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCA-A AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT--minimum-length 150--cores 2--output sample.R1.trimmed.fq--paired-output sample.R2.trimmed.fq
sample.R1.fq sample.R2.fq
以降は、処理後のリード、sample.R1.trimmed.fq（フォワードリード、Read 1）とsample.R2.trimmed.fq（リバースリード、Read 2）を解析に⽤いる。
② シーケンスデータのアセンブリ②-1．Megahit（https://github.com/voutcn/megahit）を⽤いて⾏う。Miniconda を介してインストー
ルする。
$ conda install -c bioconda megahit②-2．以下をタイプして、バージョン情報などが出⼒されれば、問題なくインストールされている。
$ megahit -h②-3．アッセンブリの実⾏。-1 はフォワードリード（Read 1）の前処理したシーケンスデータ、-2 はリ
バースリード（Read 2）の前処理したシーケンスデータ。--num-cpu-threads は使⽤する CPU の数（コ110

ンピュータの性能によって変更可能）。--memory は許容するメモリサイズ（megahit の場合、280 G あ
れば⼤抵は⼗分である。メモリ不⾜で解析が途中で⽌まる場合は、320G 程度を試してみる）。--mincontig-len は最短コンティグ⻑（bp）。値を⼩さくするとコンティグが多く構築されるが、必要メモリ
サイズなども増加する。--out-dir はアウトプットディレクトリの名前。以下、全て⼀⾏で改⾏なし⼊⼒する。
$ megahit-1 sample.R1.trimmed.fq-2 sample.R2.trimmed.fq--num-cpu-threads 2--memory 280000000000--min-contig-len 500--out-dir out_dir_sample_megahit
解析がタイムアウトして中断した場合は、以下のコマンドをタイプすることで、中断した時点から再解析が可能である。
$ megahit-o out_dir_sample_megahit--continue
最終的にアッセンブルされた Contigs（CONTIGuous sequence の略で、アッセンブリによって復元された DNA 配列を意味する）は、FASTA 形式のファイルとして out_dir_sample_megahit というディレ
クトリ（フォルダ）内に final.contigs.fa というファイル名で保存される。
③ アッセンブルされた Contigs からミトコンドリア様配列の抽出③-1．MitoFinder（https://github.com/RemiAllio/MitoFinder）を⽤いて⾏う。Miniconda を介してインストールする。
$ conda install -c bioconda mitofinder③-2．MitoFinder を実⾏するには、ミトコンドリア DNA のデータベースが必要になる。これまでに報告されている配列を、公共データベースからダウンロードする。下記は、NCBI の RefSeq に登録されている全ミトコンドリア配列をダウンロードする場合の例。MitoFinder の HP
（https://github.com/RemiAllio/MitoFinder#how-to-get-reference-mitochondrial-genomes-from-ncbi）に詳細が記載されている。
③-2-1．NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）にアクセスする。
③-2-2．検索対象を“Nucleotide”にし、“mitochondrion genomes”を検索する③-2-3．左側の検索条件を“RefSeq”、“12000bp to 20000bp”に設定する。
111

③-2-4. 右上の Send to:をクリックしてファイルを GenBank 形式でダウンロードする。

③-2-5．ダウンロードしたファイルを、解析しているプラットホームに移動する。
③-3．MitoFinder の実⾏。--seqid は任意の ID。--assembly は megahit でアッセンブルした Contigs（out_dir_sample_megahit 内の final.contigs.fa（②-3.参照））を指定する。--refseq は③-2.でダウンロードしたデータベース（GenBank 形式）。--organism は遺伝暗号（1 はスタンダードな遺伝暗号）。-ignore は⾮スタンダードなミトコンドリア遺伝⼦を無視するオプション。--processors は使⽤する CPUの数（コンピュータの性能によって変更可能）。--out-gb は GenBank 形式のアウトプットファイルを⽣成しないオプション。以下、全て⼀⾏で改⾏なし⼊⼒する。
$ mitofinder--seqid MF_sample--assembly out_dir_sample_megahit/final.contigs.fa--refseq 20201230_animal-mt_refseq.gb--organism 1--ignore--processors 2 --out-gb
Megahit でアッセンブルした Contigs ファイルのうち、ミトコンドリア由来と推定された Contigs が、MF_sample というディレクトリ（フォルダ）内に、Contigs ごとに出⼒される。
③-4．以下をタイプして、結果が出⼒されたディレクトリ（フォルダ）に⼊る。
112

$ cd MF_sample③-5．ミトコンドリア様と推定された Contigs を、⼀つのファイル（cat.fasta）にまとめて保存する。
下記⼆⾏を、⼀⾏ずつ実⾏する。各コマンドの説明を#から始まる⾏で説明する（#の⾏は⼊⼒する必要ない）。
$ cat MF*_contig_*fasta > cat.fasta# （MF _contig_ fasta が含まれるファイル＝ミトコンドリア様と推定された Contigs であり、これらを1 つの FASTA 形式のファイル（cat.fasta）にまとめて保存する）$ cd ../# （元のディレクトリ（フォルダ）に戻る）④．抽出したミトコンドリア様 Contigs の、由来⽣物の種推定④-1．Assignment-taxonomy-with-Blast（https://github.com/Joseph7e/Assign- Taxonomy-withBLAST）を⽤いて⾏う。まず B L A S T をインストールする。
$ conda install -c bioconda blast④-2．Assignment-taxonomy-with-Blast をダウンロードする。
$ git clone https://github.com/Joseph7e/Assign-Taxonomy-with-BLAST.git④-3．Assignment-taxonomy-with-Blast を実⾏するには、既存のデータベースが必要になる。NCBI がまとめる最も⼤きい区分の核酸データベース（nt）を使⽤する（約 250 Gb）。以下の 10 個のコマンドを、⼀⾏ずつ実⾏することで、ダウンロード及び、セッティングが完了する。各コマンドの説明を#から始まる⾏で説明する。公式 HP （https://github.com/Joseph7e/Assign-Taxonomy-withBLAST#prepare-sequence-database-and-taxonomic-lookup）に詳細が記載されている。
$ mkdir ncbi_nt_database && cd ncbi_nt_database# （ncbi_nt_database というディレクトリ（フォルダ）を作成し、中に⼊る）$ wget 'ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/nt*.gz'# （圧縮された nt データベースをダウンロード）$ tar -xvf nt*# （圧縮された nt データベースを展開）$ cd ../# （ひとつ前のディレクトリ（フォルダ）に戻る）$ mkdir ncbi_taxonomy/ && cd ncbi_taxonomy/# （ncbi_taxonomy というディレクトリ（フォルダ）を作成し、中に⼊る）$ wget ftp://ftp.ncbi.nih.gov/pub/taxonomy/new_taxdump/new_taxdump.tar.gz# （nt データベースの種名等の情報が保存されている圧縮ファイルをダウンロード）$ tar xvzf *.tar.gz# （圧縮されたファイルを展開）$ python3 ../Assign-Taxonomy-with-BLAST/genbank_nodes_and_names_to_taxonomy.py names.dmp
nodes.dmp# （圧縮したファイルから TSV 形式に変換したファイル（expanded_ncbi_taxonomy.tsv）を作成）
113

$ mv expanded_ncbi_taxonomy.tsv ncbi_taxonomy_20210624_expanded.tsv# （TSV 形式に変換したファイル（expanded_ncbi_taxonomy.tsv）を、nt データベースをダウンロード
した⽇付等を加えた名称（ncbi_taxonomy_20210624_expanded.tsv）に変更）$ cd ../# （元のディレクトリ（フォルダ）に戻る）④-4．これ以降の解析の都合上、ミトコンドリア様 Contigs の配列名をシンプルにする。例えば、元のファイル（cat.fasta）の配列名は「k141_841332 flag=1 multi=7.0000 len=2858」の様に配列⻑などの情報も含む。各 Contigs は配列の先頭部分「k141_841332」のみで識別可能なため、配列名を簡略化した
FASTA 形式のファイル（temp.fa）を⼀時的に作成する。
$ cat cat.fasta | perl -ne 'if($_=~/^>/){@a=split(/\s/,$_); print "$a[0] \n"}else{print}' > temp.fa④-5．Assignment-taxonomy-with-Blast の実⾏。--blast_threads は使⽤する CPU の数（コンピュータの性能によって変更可能）。--output_dir は結果が出⼒されるディレクトリ名（任意の名前に変更可能）。--ncbi_nt は使うデータベースの名前。--blast_database はダウンロードしたデータベースの場所を参照。--blast_evalue は相同性検索の際の域値。--hits_to_consider、--percent_sway、-cutoff_species、--cutoff_family、--cutoff_phylum については⽣物群同定に必要なパラメータ。詳細については公式 HP を参照。最後に④-4.で配列名を簡略化したミトコンドリア様 Contigs（temp.fa）とデー
タベースの種名情報等を⼊⼒。以下、全て⼀⾏で改⾏なしで⼊⼒する。
$ python3 /Assign-Taxonomy-with-BLAST/taxonomy_assignment_BLAST.py--blast_threads 2--output_dir out-default_1e5_sample_Assign-Taxonomy-with-BLAST--ncbi_nt--blast_database /ncbi_nt_database/nt--blast_evalue 1e-5--hits_to_consider 3--percent_sway 0.5--cutoff_species 97--cutoff_family 90--cutoff_phylum 80
temp.fa ncbi_taxonomy_20210624_expanded.tsv
out-default_1e5_sample_Assign-Taxonomy-with-BLAST というディレクトリ（フォルダ）内のtaxonomy_assignment_per_sequence.tsv というファイルに、各 Contigs の推定される分類群情報が出⼒される。
⑤．後⽣動物（Metazoa）由来のミトコンドリア様 Contigs の抽出⑤-1．後⽣動物（Metazoa）由来と推定されたミトコンドリア様 Contigs の ID 及び推定される分類群情報を抽出する。下記⼆⾏を、⼀⾏ずつ実⾏する。各コマンドの説明を#から始まる⾏で説明する（#の⾏は⼊⼒する必要ない）。
$ cd out-default_1e5_sample_Assign-Taxonomy-with-BLAST# （Assign-Taxonomy-with-BLAST 実⾏の際に指定したアウトプットディレクトリ outdefault_1e5_sample_Assign-Taxonomy-with-BLAST に⼊る）
$ grep Metazoa taxonomy_assignment_per_sequence.tsv | perl -pe 's/ /\t/g' > temp.txt# （出⼒結果 taxonomy_assignment_per_sequence.tsv 内の、“Metazoa”が含まれる⾏を抽出し、タブで区切り、temp.txt というファイルに保存する）
114

⼆⾏⽬まで実⾏すると、後⽣動物由来と推定されたミトコンドリア様 Contigs の ID と推定される分類
群情報が以下の様な形式で temp.txt に保存される。

⑤-2．後⽣動物由来と推定されたミトコンドリア様 Contigs のリストを作成する。
taxonomy_assignment_per_sequence.tsv 内の、“Metazoa”が含まれる⾏が後⽣動物由来と推定される
Contigs であり、各 Contigs の配列名が含まれる⼀列⽬を抜き出し、metazoan.contigs.lst に保存する。
$ grep Metazoa taxonomy_assignment_per_sequence.tsv | awk '{print$1}' > metazoan.contigs.lst⑤-3．塩基配列の操作ツール Seqkit（https://bioinf.shenwei.me/seqkit/）をインストールし、⑤-2.で作成したリストに含まれる Contigs の塩基配列を抽出する。各コマンドの説明を#から始まる⾏で説明する（#の⾏は⼊⼒する必要ない）。
$ conda install -c bioconda seqkit# （seqkit のインストール）$ seqkit grep -f metazoan.contigs.lst ../cat.fasta > cat.metazoa.contigs.fasta# （ミトコンドリア様と推定された contigs をまとめた FASTA 形式のファイル（cat.fasta）から、後⽣動物由来と推定された contigs を抽出し、cat.metazoa.contigs.fasta に保存する）⑤-4．後⽣動物由来と推定されたミトコンドリア様 Contigs へ、前処理済みのシーケンスデータ（①-3.
参照）をマッピングすることで、個々の後⽣動物由来と推定されたミトコンドリア様 Contigs を形成しているリード数を算出し、各 Contigs に由来する DNA の存在量を推定する。
⑤-4-1．マッピングソフトウェア Bowtie2、その後の解析に便利な Samtools をインストールする。下記
⼆⾏を、⼀⾏ずつ実⾏する。各コマンドの説明を#から始まる⾏で説明する（#の⾏は⼊⼒する必要ない）。
$ conda install -c bioconda bowtie2# （bowtei2 のインストール）$ conda install -c bioconda samtools# （samtools のインストール）⑤-4-2．マッピングする配列（後⽣動物由来と推定されたミトコンドリア様 Contigs ：cat.metazoa.contigs.fasta）に INDEX（索引）を作成する。
$ bowtie2-build -f cat.metazoa.contigs.fasta contig.ref⑤-4-3．上記の配列に、前処理後のシーケンスデータ（①-3. 参照）をマッピングする。-1 はフォワー
ドリード（Read 1）、-2 はリバースリード（Read 2）。-p は使⽤する CPU の数（コンピュータの性能によって変更可能）。-S はアウトプットの名前。以下、全て⼀⾏で改⾏なし⼊⼒する。
$ bowtie2 -x contig.ref-1 sample.R1.trimmed.fq-2 sample.R2.trimmed.fq-p 2-S sample.sam⑤-4-4．アウトプットファイルのデータサイズの軽量化を⾏う。その後の解析のため、マッピング結果をまとめたひとつのファイルから、マッピング結果を Contigs ごとにまとめたファイルへ分割する。下
記三⾏を、⼀⾏ずつ実⾏する。各コマンドの説明を#から始まる⾏で説明する（#の⾏は⼊⼒する必要ない）。
115

$ samtools sort -O bam -o sample.sort.bam sample.sam# （マッピングの出⼒ファイル（sample.sam）を圧縮して、sample.sort.bam として保存する）$ samtools index sample.sort.bam# （圧縮したファイルに索引をつける）$ for i in `cat metazoan.contigs.lst`
dosamtools view -b sample.sort.bam ${i} > ${i}.bamdone# （圧縮したファイルを Contigs ごとに分割する⑤-5．上記（⑤-4.）で Contigs ごとに分割したファイルに含まれる情報から、マッピングしたリードをフォワードリード（Read 1）、リバースリード（Read 2）に分けて抽出する。以下、全て⼀⾏で⼊⼒する。
$ for i in `cat metazoan.contigs.lst`
dosamtools fasta -1 ${i}.1.fa -2 ${i}.2.fa ${i}.bam
done⑤-6．上記（⑤-5.）で抽出したリード数を集計する。以下、全て⼀⾏で⼊⼒すると、各 Contigs にマッピングされたリード数の情報が num-reads-mapped-to-contig.txt というファイルに保存される。リード
1 とリード 2 は同じ DNA 断⽚に由来するため、リード 1 のみをカウントしている。
$ for i in `ls | grep 1.fa`doseqkit stat ${i}done | grep FASTA | awk '{print$1"\t"$4}' > num-reads-mapped-to-contig.txt⑤-7．マッピングしたリードが COI 領域を含むか調べる。
⑤-7-1．動物の COI 領域のデータベースの準備。Heller et al. （2018） （DOI:
https://doi.org/10.1038/sdata.2018.156）が後⽣動物（Metazoa）の COI 領域をまとめた fasta 形式のデータベース（約 799 Mb）を報告している（データベースへのリンク：
https://figshare.com/articles/dataset/COARBitrator_COI_nucleotide_records_fasta_format/5733891?backTo=/collections/COARBitrator_1_1_Collection/3971493、ファイル名：Coarbitrator_COI_nuc.fa）。下記⼆⾏を、⼀⾏ずつ実⾏する。各コマンドの説明を#から始まる⾏で説明する（#の⾏は⼊⼒する必要ない）。
$ wget https://figshare.com/ndownloader/files/10090176# （リンク先からデータベースのダウンロード）$ mv 10090176 Heller2018_metazoa-COI.fa# （10090176 というファイル名でダウンロードされるため、Heller2018_metazoa-COI.fa というファイル名に変更する）⑤-7-2．ダウンロードしたデータベースへの索引付け。
$ makeblastdb -dbtype nucl -in Heller2018_metazoa-COI.fa⑤-7-3．BLAST を⽤いて、マッピングしたリードが、既報の後⽣動物の COI 配列と相同性を持つか調べる。-query は検索したいファイル。この場合は、“1.fa”がファイル名に含まれるファイル全てが対象となり、1 つずつ代⼊される。-db は相同性検索の対象となるデータベース（⑤-7-1.でダウンロードした FASTA 形式のファイル）。-evalue は検索域値。-num_threads は使⽤する CPU の数。num_alignments はデータベースの配列と相同性が⾒つかった際に表⽰する最⼤配列数（今回の場合は116

特に指定しなくても良い）。-outfmt はアウトプットするフォーマット。検索結果は blastout というファイル名で保存される（例えば、k141_205875.1.fa.blastout 等）。以下、全て⼀⾏で⼊⼒する。
$ for i in `ls | grep 1.fa`doblastn-query ${i}-db Heller2018_metazoa-COI.fa-evalue 1e-1-num_threads 2-num_alignments 5-outfmt 6 > ${i}.blastoutdone⑤-7-4．後⽣動物の COI 配列と相同性を⽰したリードを集計する。以下、全て⼀⾏で⼊⼒すると、各Contigs にマッピングされたリードのうち、既報の後⽣動物の COI 領域に対して相同性を⽰したリード数の情報を num-reads-matched-to-coi.txt というファイルに保存する。
$ for i in `ls | grep blastout`
doecho ${i} | perl -pe 's/\n/\t/g';awk '{print$1}' ${i} | sort | uniq | wc
done | awk '{print$1"\t"$2}' > num-reads-matched-to-coi.txt
作成したファイルをエクセル等で開き、エクセル形式などで別名保存すると、以下の様なファイルを作成することができる。

6.2.4. メタゲノムデータの処理① 対象とする分類群およびその上位の分類群、外群（例えばソコミジンコ⽬を対象とする場合、上位分類群として甲殻亜⾨、外群として他の節⾜動物や他の脱⽪動物（例えば線形動物）といった様に）についてメタゲノム解析で選択した遺伝⼦マーカーについて Web 上のデータベース（DDBJ;
https://www.ddbj.nig.ac.jp/index-e.html、International Barcode of Life; https://ibol.org/about/dnabarcoding/など）から塩基配列を収集し分⼦系統解析⽤データファイルを作成する。データファイルの編集には MEGA（https://www.megasoftware.net から最新版が無料でダウンロードできる）などのプロ

117

グラムパッケージが利⽤できる。塩基配列間に挿⼊・⽋失がある場合には MEGA に搭載されている
ClustalW などの機能などを使って整列（アライメント）させる必要があるが、コンピュータによるアラ
イメントは完全ではないため、経験豊富な者の確認が必要である。COI や Cytb などのミトコンドリア
DNA のタンパク質遺伝⼦には挿⼊・⽋失が少なく、有ってもアミノ酸配列が参考になるためアライメ
ントが容易である。
② メタゲノム解析で①の上位分類群に分類された各配列から遺伝⼦マーカー部分をコピーして、データ
ファイルに加える。該当部分が分からない場合、ミトコンドリア DNA 上のマーカーなら MITOS Web
Server（http://mitos.bioinf.uni-leipzig.de/index.py）に配列をアップロードして、遺伝⼦マーカー配列を含む遺伝⼦領域の位置や⽅向を確認できる。核 DNA 上の遺伝⼦マーカーについては、データベース
で Homology search をおこなって、位置や⽅向を確認する。完成したデータファイルを MEGA のExport 機能を使って FASTA format に変換する。
③ コンピュータプログラム IQ-TREE（www.iqtree.org から最新版が無料でダウンロードできる）を⽤いて最尤法で分⼦系統樹を構築する（図 6.2.4.1.）。MEGA でも近隣結合法や最⼤節約法などで分⼦系統樹を構築できるが、より信頼性の⾼い最尤法を使うのが望ましい。
④ 分⼦系統樹上で対象分類群の中に⼊るメタゲノムデータ由来の配列数（使⽤した遺伝領域を含むもの）をサンプルに含まれている対象分類群の種数の推定値とする（表 6.2.4.1）。また、各配列（種）を構成するリードの数を配列⻑で割った値の⽐を個体数⽐とする。この際、サンプルの前処理でサイズ分画をおこなっている場合には、「250 µm サンプルの１リードを 500 µm サンプルの８リードに換算する」といった様に重み付けして、個体数⽐を算出する。形態分類またはフローカムによる画像解析により得られた対象分類群の個体数を種の個体数⽐に基づいて配分し、各配列（種）の個体数を推定する。
解析例

図 6.2.4.1. メタゲノム解析で得られた塩基配列の分⼦系統解析結果の例。
表 6.2.4.1. メタゲノムデータから推定された種組成の例

118

119

7. 原核⽣物の分析（濱崎恒⼆・砂村倫成・⾼⾒英⼈・吉武和敏）
7.1. 堆積物試料採取と船上での前処理（濱崎恒⼆・砂村倫成）
7.1.1. 堆積物コアサンプリング概要
ランダーシステムで採取したコアサンプル（図 7.1.1.1.）、ROV で採取したプッシュコアサンプル（図 7.1.1.2.）、マルチプルコアラーで採取したコアサンプル（ランダーシステムのコアサンプルと同じサイズ）の処理について記載する。
準備するもの・2.5 mL 先端カットシリンジ
・薬さじ
・ハイター
・50 mL チューブ
・1.5 mL マイクロチューブ
・15 mL チューブ
・4% PFA in 3xPBS
・pH、 Eh センサー・ライゾン式間隙⽔抽出キット（⼟壌溶液採取器（ファイバー式）、 5 cm、 ⼤起理化⼯業）
堆積物コア試料の分割① スライス 8 層：1、 2、 3、 4、 5、 7-9、 10-12、 15-17 cm。
② 堆積物コア２本の場合は 1 本をメタゲノム解析⽤とする。
③ 堆積物コアの外周部から 2 cm 程度は、器具からのコンタミや、上下層からの混⼊が⽣じやすいので、なるべく内側から採取するのが望ましい。コアの本数が限られている場合は、アンプリコン解析と微⽣物細胞観察⽤試料はコアの中⼼部から採取する。センサーは外周から 2 cm 程度の近接した箇所に差す。

図 7.1.1.1.ランダーシステム（左）と採取したコアサンプル（右）。

120図 7.1.1.2. KM-ROV（左）と採取したプッシュコアサンプル（右）。

図 7.1.1.3. コアサンプルの処理。

7.1.2. センサー測定：堆積物の pH と ORP の測定 （図 7.1.1.3.）① あらかじめ pH、ORP の校正を実施する。ORP 校正は必要に応じて⾏う。側⾯のキャップを開けるのを忘れずに。ORP センサーは極端な還元条件（マイナス）にならなければ校正は必要ない。
② 堆積物コアの外周から 2cm 程度の箇所にセンサー部を挿す。センサー部が堆積物コアに⼗分浸っていることを確認し、数値が安定したら記録する。可能であれば電圧値も記録しておくと良い。
7.1.3. 先端カットシリンジでの堆積物採取（図 7.1.1.3.）① 先端をカットした 2.5 mL シリンジを 1 cm 程度堆積物に挿し、コア中央部の数カ所から少なくとも 2
mL 以上になるように挿す場所を変えて繰り返しシリンジ内に堆積物を採取する。堆積物の状態に応じて、シリンジの先端切除⽅法を変える。堆積物の含⽔量が多いなどサラサラの場合は、注射器の突起部分のみを切除したシリンジを⽤いると良い。
② シリンジのピストンをゆっくり引きながら堆積物に挿すと堆積物が採取しやすく、空気も⼊りにくい。空気が⼊ってしまった場合は、堆積物にシリンジ先端を押し付けながら、シリンジのピストンをゆっくり押し出すと堆積物を密に詰めやすい。
③ シリンジに 2 mL 以上の堆積物を詰め、シリンジのピストンゴム部の⽬盛を 2 mL に合わせて堆積物を押し出し、余分な堆積物を清浄なプラスチック容器でシリンジのカット部に合わせて平になるよう切121

除④ ⽬盛 1 mL まで押し出した堆積物をチューブに採取すると定量的に採取できる。
⑤ 1 mL を 4%PFA 溶液 3 mL の⼊った 15 mL チューブに⼊れる（→7.1.4.全微⽣物計数⽤サンプル）。
⑥ さらに、1 mL を押し出し、エッペンチュープに取る（→7.1.5.DNA アンプリコン解析⽤サンプル）。
⑦ コア 1 本の場合は、センサーが触れた部分を除いた該当深度の堆積物を、薬さじもしくは堆積物層状分割に⽤いるへらを⽤いて、50 mL チューブに 10 g 以上分取する（→5.メタゲノム解析⽤サンプル）。
⑧ コアに残った堆積物を 50 mL チューブに採取（→6.間隙⽔サンプル）。
7.1.4. 全微⽣物計数⽤サンプル① 15 mL チューブに、あらかじめ 3 mL の細胞固定液（4％パラフォルムアルデヒド液）を加えておく。
② 4％パラフォルムアルデヒド液：湯浴した 3xPBS（Phosphate Buffered Saline：塩化ナトリウム 24g、塩化カリウム 0.6 g、リン酸⼀⽔素ナトリウム 4.32 g、リン酸⼆⽔素カリウム 0.72g を超純⽔ 1L に溶解し、pH を 7.4 に調整）中でパラフォルムアルデヒドを溶解する。
③ 上記の先端カットシリンジで採取した堆積物から 1 mL を加え、上下反転して混合する。
④ 混合後、速やかにデジタルピペットを⽤いて、懸濁液 1 mL をマイクロチューブもしくはクライオバ
イアルに分取する。
⑤ デジタルピペットでの分取にあたっては、チップの先端をあらかじめ 5mm 程度切除しておくと堆積物粒⼦がチップ先端に詰まりにくくなる。
⑥ 試料は、4 ℃にて 4-12 時間保管後、-80 ℃にて冷凍で実験室に持ち帰る。
⑦ 元の懸濁液も冷凍で持ち帰る。
7.1.5. DNA（16S rRNA 遺伝⼦）アンプリコン解析⽤サンプル①上記の全微⽣物数測定に⽤いた先端カットシリンジ内に残っている堆積物 1 mL 程度を滅菌ずみ 1.5
もしくは 2 mL のマイクロチューブに分取し、-80 ℃にて冷凍保存する。
7.1.6. ショットガンメタゲノム解析⽤サンプル（図 7.1.1.3.）① コア 1 本の場合は、センサーが触れた部分を除いた該当深度の堆積物を、薬さじもしくは堆積物層状分割に⽤いるへらを⽤いて、50 mL チューブに 10 g 以上分取する。
② コア 2 本の場合は、1 本を専⽤にヘラでスライスして、50 mL チューブに 10 g 以上分取する。
③ -80 ℃にて冷凍保存する。
7.1.7. 間隙⽔サンプル（図 7.1.7.1.）① コアに残った堆積物を 50 mL チューブに採取。
② 50 mL チューブに⼊った堆積物を振って、空隙ができないようにチューブの底に集める。
③ ⽳の空いた 50 mL チューブ⽤の蓋にライゾンのフィルター部を通し、ライゾンフィルター、コネク
ター、注射器（10 or 20 mL）を繋げ、ライゾンフィルター部がチューブ内の堆積物からはみ出していないことを確認。
④ 注射器のピストンを引っ張り、付属の⽊⽚で板を挟んで固定し陰圧を保ちつつ、間隙⽔が貯まるのを待つ（>10 mL が⽬標）。
⑥ 得られた間隙⽔は、孔径 0.45 もしくは 0.22 µm のシリンジフィルターを⽤いて、ろ過し、濾液を 30mL 容のナルゲン低密度ポリエチレン瓶に保存する。常温で可。
⑦ 堆積物中の微⽣物活性により⾮平衡状態になりやすい（平衡状態を仮定できれば pH と ORP から推定できる）、栄養塩や微量⾦属の測定⽤。

122

図 7.1.7.1. ライゾンフィルターによる間隙⽔採取。

7.2. 16SrRNA 遺伝⼦アンプリコン解析による多様性と群集構造の把握（砂村倫成）
7.2.1. 解析の⽬的と概要
堆積物サンプルに含まれる原核⽣物の多様性と群集構造を把握することを⽬的としている。後述する
ショットガンメタゲノム解析に⽐べて、低コストで原核⽣物群集の多様性や構造を網羅的に把握することができる。サンプルから DNA を抽出し、原核⽣物の種判別に汎⽤される 16SrRNA 遺伝⼦を PCR 増
幅する。得られた配列のバリエーションと各バリアントの相対出現頻度から、各サンプルに含まれる原核⽣物種数とその相対出現頻度を推定し、そこから多様性指数を算出する。配列のバリエーションは、統計モデルを⽤いて PCR エラーやシーケンスエラーを排除して１塩基違いを識別する Amplicon
Sequence Variant（ASV）法を⽤いて推定する。また、種名と rRNA 遺伝⼦配列が紐付けされた SILVA
データベース（https://www.arb-silva.de/）を参照することにより、分類群を推定する。結果の解釈に当たっては、rRNA 遺伝⼦コピー数が分類群によって異なるため、配列バリアントの出現頻度がそのま
ま種の出現頻度を⽰すものではない点に留意する必要がある。
7.2.2. DNA 抽出
⼟壌や堆積物からの DNA 抽出では、シリカメンブレンカラムを⽤いた市販の DNA 抽出キットによる抽出法が広く⽤いられている。⼟壌や堆積物からの DNA 抽出キットは数種類市販されているが、最も⽤いられてきた MOBio 社の Power soil DNA キットは、Qiagen、 Thermo への買収を経て、⼟壌に特化した Power soil pro DNA キットに受け継がれたが、ビーズやバッファー類の変化に伴い外洋堆積物
での DNA 収量が減少した。DNA 収量、PCR 増幅の成功率、得られる群集組成の多様性指数を他の数種の市販 DNA 抽出キット（MOBio Power soil DNA、 Nucleospin soil、 Thermo Powersoil pro、 ニッ
ポンジーン ISOIL、 ニッポンジーン ISOSPIN soil DNA）について検討した。これらの結果に加えて、今後の継続的なモニタリングを考慮すると、国産であり容易に⼊⼿できることや買収などによる販売停⽌の可能性を鑑みて、本マニュアルでは IsoSpinsoil DNA キット（ニッポンジーン）の使⽤を推奨する。
必要な試薬と物品
・ISOSPIN Soil DNA、 ニッポンジーン、 50 サンプル⽤・薬さじ・ガスバーナー123

・電⼦天秤
・ビーズ破砕機。BMS シェイクマン 6 や ASONE BHA-6 などが⽐較的安価に⼊⼿できる。
・1 mL デジタルピペット、フィルター付きチップ
・100 µL デジタルピペット、フィルター付きチップ
・1.5 mL、 2 mL マイクロチューブ（RNase, DNase free, Eppendorf DNA low bind tube 推奨）
抽出の⼿順はニッポンジーンから提供されているマニュアル（https://www.nippongene.com/siyaku/product/extraction/isospin-soil-dna/image/protocol-isospinsoil-dna.gif）に従うが、下記に⼿順と概要を⽰す。
① Beads tube に堆積物試料を加え、堆積物重量が約 0.5 g となるように電⼦天秤で計り取る。堆積物の量が多すぎると抽出効率が悪化するので、0.4-0.6 g を⽬安に分取するとよい。
② Beads Tube に、Lysis SolutionBB 600 µL、 LysisSolutionA 100 µL、 Lysis Solution20S 10 µL、
RNase 10 µL を加え、ビーズと試料が混ざるように緩やかに上下反転してかき混ぜる。
③ ビーズ破砕機を⽤いて、4200-6800 rpm にて 3 分間振盪する。
④ 上清 400 µL を 1.5 mL チューブに取り分け、50 µL の SE Buffer を加えたのち、チューブミキサーで混合。
⑤ 20,000 G にて 5 分間遠⼼。
⑥ 上清 400 µL を新しい 2 mL チューブにとりわけ、30 µL の SB Buffer と 350 µL のエタノールを加えたのち、緩やかに混合。
⑦ Spin Column にチューブ内の混合液を全量加える。
⑧ 13,000 G にて 30 秒間遠⼼。
⑨ 下部のチューブ内に溜まった濾液を捨てる。
⑩ Spin Column に SB Buffer を 600 µL 加える。
⑪ 13,000 G にて 1 分間遠⼼。
⑫ 下部のチューブ内に溜まった濾液を捨てる。
⑬ 10-12 をもう⼀度繰り返す。
⑭ Spin Column に SW Buffer を 600 µL 加える。
⑮ 13,000 G にて 1 分間遠⼼。
⑯ 下部のチューブ内に溜まった濾液を捨てる。
⑰ 13,000 G にて 1 分間遠⼼。
⑱ Spin Column を新しい 1.5 mL チューブに乗せ、Spin Column に Buffer TE を 50 µL 加える。
⑲ 13,000 G にて 1 分間遠⼼。
⑳ Spin Column を捨てる。
㉑ 1.5 mL チューブ内の DNA 溶液の DNA 濃度を Qubit を⽤いて決定する。
㉒ チューブ内の DNA 溶液を DNA 濃度に応じて PCR チューブに分注しておく。PCR までの時間が 2
⽇以内であれば、冷蔵、3 ⽇以上保存する場合は、-30 もしくは-80 °C にて保存する。
㉓ 抽出 DNA を含む 1.5 mL チューブは-80 °C にて保存。
7.2.3. PCR 増幅と MiSeq ライブラリの作成
必要な試薬と物品
・1st PCR ⽤ PCR 酵素（共雑物に強く、DNA 増幅精度の⾼い酵素を推奨：Takara LAtaq、 Gflex、ExPremier など）
・ライブラリ作成⽤ PCR 酵素（⾊素⼊りの ready mix 酵素を使うと実験時間が短縮できる）
・電気泳動装置、試薬⼀式
・1st PCR ⽤プライマー（Nextera や Truseq など illumina 社シーケンサーのライブラリ作成に⽤いる配列を参考に、3ʼ末端に対象分⼦⽤のプライマー配列を付与する。本マニュアルでは Nunoura et al. 2012による Univ530F-Univ907R プライマー配列を⽤いる）

124

・Univ530F: GTGCCAGCAGCCGCGG, GTGBCAGCCGCCGCGG, YTGCCAGCCGCCGCGG,
GTGCCAGCAGCWGCGG, GTGCCAGCAGTCGCGG,
GTGCCAGAAGMMTCGG,GTGGCAGTCGCCACGG について、混合⽐率 30/24/6/1/1/1/3 で混合したものを使⽤。
・Univ907R: CCGYCAATTCMTTTRAGTTT, CCGYCTATTCCTTTGAGTTT,CCGYCAATTTCTTTRAGTTT, CCGYCAATTCCCTTRAGTTT, CCGYCAATTCCTTMAAGTTT,
CCGCCAATTCCTTTGAATTT について、混合⽐率 20/1/1/1/1/1 で混合したものを使⽤。
・2nd PCR ⽤プライマー
・100 µL、 10 µL デジタルピペット、フィルター付きチップ
・96well PCR プレート、プレートシール
・DNA 定量装置（Qubit など）
・DNA 精製⽤磁気ビーズ Ampure （Beckman）
・エタノール、超純⽔
実験⽅法

図 7.2.3.1. ライブラリ作成の流れ。

重要：以下の①-⑥の過程では、サンプル同⼠が混ざらないよう細⼼の注意を払うこと。
① DNA 抽出試料をシーケンスプライマー付きプライマー（530F-907R） にて増幅 （primer 濃度が酵
素付属のマニュアル濃度より濃いと、ダイマーができやすい）。
② PCR プログラム：96℃ 1 min 、 30x（ 96℃ 25 sec 、 52℃ 45 sec 、 72℃ 1 min ） 、 72℃ 7 min 、
4℃ ∞。
③ 電気泳動にて増幅産物の塩基⻑とおおよその濃度を確認（本プライマーを⽤いると、原核⽣物は400bps 前後、真核⽣物は 700bps 程度の増幅産物が得られる）。
④ Exonuclease 8 µL、 Shrimp Alkarin Phosphatase 8 µL に 1 x TE 溶液 104 µL を加えた ExoSAP 溶液を作成し、プライマー除去（ExoSAP 溶液 1.2 µL を 20 µL 産物に加え、37 ℃ 40 min.反応後、80℃
30min.にて反応させる。
⑤PCR template を超純⽔で 1/100 に希釈し（⽤いる PCR 酵素によっては、さらに希釈が必要な場合がある）、2 µL を 96 well PCR プレートに分注する⑥ 1st PCR 産物に index 配列とシーケンスアダプター配列を付与するため、index 配列と illumina シー
ケンサー⽤のアダプター配列を含むプライマーを⽤いて、PCR を実施（96 ℃ 5 min、 [96 ℃ 30 s、
65 ℃ 45 s、 72 ℃ 1 min] x 20 72 ℃ 5 min）。
125

⑦ 電気泳動と産物の濃度チェック：泳動後の写真を⽤いて、各試料の濃度を測定する。
⑧ PCR 産物の 1 index あたり 50 ng となるように 20-50 サンプル程度を⼀つの 1.5 mL マイクロチュー
ブに混合。
⑨ ⽬的のバンド（約 400、 700 bps）以外のバンドが多数⾒られる場合は、混合した PCR 産物のアガロ
ースゲル電気泳動、⽬的バンドの切り出し、アガロースゲルからの DNA 精製により、⽬的のバンドを抽出する。
⑩ ⽬的バンド以外のバンドが少ない場合は、プライマーダイマーなどの短い PCR 産物を除くため、
AMpure を⽤いて DNA を精製する。
⑪ Qubit にて精製済み PCR 産物を定量し、各 index が等量となるように、精製済み PCR 産物を混合（最終濃度：混合済みのもので 20 ng/µL 以上、1 µg 以上）。必要に応じてエタ沈にて濃縮する。
⑫ 以上のように調整したライブラリを illumina Miseq を⽤いて配列を決定する。配列決定は illumina
300 paired end にて、phiX を 50 %加えて実施する。⼀試料あたりの read 数は 10 万以上となることが望ましい。
7.2.4. QIIME2 を⽤いた配列処理
MiSeq により、PCR 産物の両端から 300 bps ずつ読んだシーケンスが得られる。本マニュアルで⽤いているプライマーからは原核⽣物は、index やプライマー配列も含め、約 430 bps の PCR 産物が得られるので、オーバーラップ部を結合することができる。各 read を結合後、DNA 配列の品質評価を⾏い、各配列をほぼ微⽣物種に相当する ASV としてグループ化したのち、ARB-SILVA-v132 データベースに基づき分類し、試料ごとの ASV テーブル及び分類テーブルを作成する。上記の配列解析は、QIIME2による dada2 アルゴリズム（Callahan et al. 2016）を⽤いて実施する。
本マニュアルで⽤いたプライマーセットを⽤いると、真核⽣物の SSU rRNA 遺伝⼦も⼀部増幅可能である。真核⽣物では対象領域の配列⻑として約 700 bps 程度の産物が得られる。両端結合せずに、⽚側
read の配列のみを⽤いた解析により真核⽣物を含めた全⽣物の群集解析を実施することができる。
QIIME-dada2 は、⼀般的なパソコン（RAM16 GB 程度）で解析が可能であるが、真核⽣物を対象とする場合は、RAM32 GB 程度あることが望ましい。
Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Rosen, M. J., Han, A. W., Johnson, A. J. A., & Holmes, S. P. （2016）.
DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature methods, 13（7）, 581583. https://www.nature.com/articles/nmeth.3869

qiime tools import --type SampleData[PairedEndSequencesWithQuality] \--input-path sample_manifest.txt --output-path pairend.qza \--input-format PairedEndFastqManifestPhred33V2
qiime demux summarize \--i-data pairend.qza \--o-visualization demux.qzv
qiime dada2 denoise-paired \--i-demultiplexed-seqs pairend.qza \--p-trim-left-f 16 \--p-trim-left-r 20 \--p-trunc-len-f 280 \--p-trunc-len-r 200 \--p-n-threads 20 \--o-table table.qza \126

--o-representative-sequences rep-seqs.qza \--o-denoising-stats denoising-stats.qza
qiime metadata tabulate \--m-input-file denoising-stats.qza \--o-visualization denoising-stats.qzv
qiime feature-classifier classify-consensus-vsearch \--i-query rep-seqs.qza \--i-reference-reads silva132_99_v345.qza \--i-reference-taxonomy majority_taxonomy_7_levels.qza \--o-classification taxonomy.qza \--p-threads 20
qiime feature-classifier classify-sklearn \--i-classifier classifier.qza \--i-reads rep-seqs.qza \--o-classification taxonomy2.qza \--p-n-jobs 20
qiime alignment mafft --i-sequences rep-seqs.qza --o-alignment aligned-repseqs.qza --p-n-threads 20
qiime alignment mask --i-alignment aligned-repseqs.qza --o-masked-alignment masked-alignedrepseqs.qza
qiime phylogeny fasttree --i-alignment masked-aligned-repseqs.qza --o-tree unrooted-tree.qza --p-nthreads 20
qiime phylogeny midpoint-root --i-tree unrooted-tree.qza --o-rooted-tree rooted-tree.qza
7.2.5. R を⽤いた多様性解析
QIIME2 にて解析したデータは、エクセルなどで読み込めるファイル形式になっていない。そのため、QIIME2 上で解析するか、R での解析が⼀般的である。本マニュアルでは、R でのプラグイン
phyloseq と qiime2R を⽤いた多様性解析のコードを⽰した。
library(vegan)library(psych)
library(qiime2R)
library(phyloseq)
library(ggplot2)
library(grid)library(gridExtra)
library(venn)
library(gplots)
library(ggtree)library(dplyr)library(tidyverse, warn.conflicts=F, quietly=T)
data.phy<-qza_to_phyloseq("./prok/table.qza", "./prok/rooted-tree.qza",
127

"./prok/taxonomy2.qza", ./prok/manufest.txt)#多様性評価div <- otu_table(data.phy)
divt <- t(div)out<-rarecurve(divt, step = 100, sample = 0, label = FALSE, col=c("black", "darkred", "forestgreen","orange", "blue", "yellow", "hotpink"))
divt10000<-rrarefy(divt, 10000) #10000reads ずつ subsampling
divalpha<-estimateR(divt10000) #Chao1 と ACEdiversity の値を計算
divalpha<-rbind(divalpha, t(diversity(divt10000, index="simpson"))) #Simpson 多様度指数の計算
rownames(divalpha)[nrow(divalpha)] <- "Simpson" #最終⾏の名称を simpson にする
divalpha<-rbind(divalpha, t(colSums(otu_table(phyl.Sampl.ori)))) #総リード数
rownames(divalpha)[nrow(divalpha)] <- "totalreads" #最終⾏の名称を totalreads にする
knitr::kable(t(divalpha), caption="Table . Alpha diversity index for 10000 Miseq reads")
plot_richness(phyl.Sampl, measures="Chao1")
plot_richness(phyl.Sampl, measures= "Shannon")## ドメインの棒グラフ：プロットと凡例を分けて表⽰
p <- plot_bar(data.phy, fill="Kingdom") + theme(legend.position="bottom", legend.key.size=grid::unit(0.5, "lines"), legend.text = element_text(size = 7)) + geom_bar(aes(x = Samplename,color=Kingdom, fill=Kingdom), stat="identity", position="stack")
p$data$Sample <- factor(p$data$Sample, levels = sample_data(data.phy)$Samplename)legend <- cowplot::get_legend(p)p <- plot_bar(data.phy, fill="Kingdom") + theme(legend.position="none", legend.key.size=grid::unit(0.5, "lines"), legend.text = element_text(size = 7)) + geom_bar(aes(x = Samplename,color=Kingdom, fill=Kingdom), stat="identity", position="stack")
p$data$Sample <- factor(p$data$Sample, levels = sample_data(data.phy)$Samplename)pgrid.newpage()grid.draw(legend)
7.3. ショットガンメタゲノム解析による原核⽣物叢と機能ポテンシャルの把握（⾼⾒英⼈）
7.3.1. 解析の⽬的と概要
海洋保護区の海底海⼭のモニタリングに当たり、底泥サンプルのメタゲノム配列サンプルから、ベースラインとなる各海⼭の菌叢組成、機能的特徴を把握する。また、各海⼭における菌叢組成、機能的差
異を明確化し、⻑期的モニタリングにおいて各海⼭の特徴が維持されているか、どのような変化が⽣じているかの指標となる解析データの取得を⽬的とする。機能的特徴付けには、Genomaple システムを⽤いて世界的に頻繁に⽤いられている代謝データベースである KEGG で定義されている、代謝パスウェイ
モジュール（解糖系、TCA サイクル、炭素・窒素固定など）や各種トランスポータモジュールの充⾜率と各モジュールのアバンダンスを算出し指標として⽤いる。菌叢組成は、コピー数や PCR バイアスの影
響がないリボソームタンパク質遺伝⼦群を指標として⽤いる。以下に全体の解析の流れを⽰す（図7.3.1.1., 図 7.3.1.2.）。

128

図 7.3.1.1. ショットガンメタゲノム解析による菌叢と機能ポテンシャルの⽐較の流れ。

図 7.3.1.2. JAMSTEC から提供されている Genomaple 。

7.3.2. DNA 抽出① 凍結コアサンプルを 37 ℃で完全に融解し、サンプルが均⼀になるように混ぜ合わせた後、5g を秤量し、Nippon Gene 社の⼟壌 DNA 抽出キット（ISOIL for beads beating for Large ver.2: Code No. 31206791）にあるビーズ⼊りチューブに⼊れる。
② これに 1/5 に MilliQ ⽔で薄めた Lysis buffer BB を 9 mL チューブに加え、Vortex でよく混合する。
このチューブを Bio Medical Science 社製の Shake Master にセットし、1,100 rpm で 2 分間ビーズ破砕を⾏う。
③ ビーズ破砕終了後のチューブに 200 mg/mL の lysozyme 溶液を 0.5 mL （100 mg）加えチューブを上下してよくかき混ぜた後、50 ℃でゆっくり振とうしながら 30 分インキュベートする。
④ 次に、20 mg/mL の Proteinase K 溶液を 0.5 mL （10 mg）と 0.6 mL の lysis buffer 20S を加え、50℃で 30 分インキュベートする。
⑤ 酵素処理が終了したチューブを 8,000 rpm （6,200 x G）、 4℃で 30 分間遠⼼し、上澄みを回収す129

る。上澄み液は 9 mL ほど回収できる。30 分でも上澄みに濁りがある時は、濁った上澄みを回収してから再度 10 分遠⼼すると透明な上澄みが得られる。上澄み液は 9~10 mL 弱回収できる。
⑥ 上澄み液 9 mL に対し、6.0 mL の purification solution （精製液）と 9 mL の chloroform を加えてチューブを上下してよく混ぜ、8,000 rpm、 4℃で 15 分間遠⼼後中間層を取らないように慎重に上澄み液を回収する。遠⼼前は⽔層が茶⾊いが、遠⼼後は chloroform 層が茶⾊くなる（上澄み液と精製液の⽐は3:2）。
⑦ 上澄み液は 15 mL ほど回収できるので。これと等量の 15 mL precipitation solution （沈殿液）を加えチューブを上下してよく混ぜた後、8,000 rpm、 4 ℃で 1 時間遠⼼する。
⑧ 上澄みを捨て、5 mL の wash solution （洗浄液）を加え、管壁をリンスした後 8000 rpm、 4 ℃で 10
分間遠⼼する。
⑨ 上澄みを捨て、5 mL の 70 ％-ethanol （-20℃）と 10 µL の ethachinmate を加え、チューブを回しながら沈殿を形成させる。
⑩ 沈殿が⾒えたら 8,000 rpm、 4 ℃で 10 分間遠⼼し、ピペットマンで上澄みを注意深く捨てチューブの上部をキムワイプで封をして輪ゴムで⽌め、rotor を外した SpeedVac （遠⼼吸引乾燥機）に⼊れ、庫内を 60 °C に設定して 5 分間吸引して乾燥する。
⑪ 乾燥後、tube に 0.5 mL の TE を加えて沈殿を溶解させ、2 mL 容 tube に移す。
⑫ TE に溶解した DNA 溶液 0.5 mL に対し ethanol （-20 ℃）を 1.5 mL と 2 µL の ethachinmate を加え、蓋をしてからチューブを上下に振って沈殿を形成させる。DNA 量がある程度有れば、この時点でもやもやとした沈殿が⾒えるが、⾒えない場合でも遠⼼後に沈殿が確認できる場合が多いので、15,000rpm （22,000 G）、 4℃で 10 分間遠⼼を⾏う。
⑬ 上澄みを捨て、チューブを SpeedVac のローターにセットし、庫内を 60 °C に設定して 5 分間吸引して乾燥する。50 µL の TE を加えてチップの先で沈殿を崩してから 37 ℃で 10 分間インキュベートする。
⑭ 沈殿に着⾊がなければ、Qubit （サーモフィッシャー社） の High sensitive （HS） DNA detection
kit を使って DNA の定量を⾏う。DNA 溶液は、まず 10 倍希釈したものを 2 µL ⽤いて⾏う。
NanoDrop （サーモフィッシャー社）などの分光器で DNA 量を測定する場合は、夾雑物の影響を受けやすいので、Qubit を強く推奨する。
⑮ DNA 量が⼗分ある場合は、50 ng の DNA を 1％-agarose （TAE）で電気泳動し、λHindIII digestの分⼦量マーカーの 20 kb 付近に太いバンドが⾒られるかどうかを確認する。
⑯ 太いバンドが⾒られた場合は、抽出 DNA の quality を確認するため、16S rDNA が PCR 増幅されたかどうかを先と同様に電気泳動で確認する。
PCR の条件は以下の通り（図 7.3.2.1.）。
Reaction volume: 20 µL
Template DNA: 1 µ1
Ex-Taq polymerase: 1 µL
5 µm primer: 1 µL each （2 µL）
Buffer: 2 µL
dNTP mix: 1.6 µL
H2O: 12.4 µL

図 7.3.2.1. PCR 増幅の条件。

130

⑰ DNA 溶液に着⾊ （薄い⻩⾊）があり、PCR がかからない場合は、 Zymo Research 社の One stepPCR Inhibitor Removal kit （Cat. No. D6030） を⽤い、製品付随の protocol に従い精製した後に、再度PCR による 16S rDNA の増幅を確認する。
・Zymo-Spin III-HRC カラムを Collection tube にセットする。
・カラムの蓋を開け 600 µL の Pre-Solution を⼊れ、8,000 G で 3 分間遠⼼する。
・カラムを新しい 1.5 mL のチューブにセットし、50-200 µL の DNA 溶液を加え、16,000 G で 3 分間遠⼼する。カラムを外し回収された DNA 溶液の濃度を先と同様に Qubit で測定し、回収率を計算する。
⑱ 回収した DNA を⽤いて再度同様の条件にて PCR を⾏い、先と同様に電気泳動で確認する。
7.3.3. 配列⽣データのアミノ酸配列への変換
Illumina 社の NOVA SEQ6000 や MGI 社の DNBSEQ G-400 などの NGS で解析した 200-bp ペアエンドの fastq ファイル R1、 R2 を JAMSTEC のウェブサイトから提供されている MAPLE submission datamaker （MSDM）を⽤いて、ペアエンドアセンブルからアミノ酸の multi-FASTA ファイルの作成までを⾏う （提供アドレス: https://maple.jamstec.go.jp/maple/maple-2.3.1/）。ペアエンドアセンブルに⽤いる配列⻑は、配列⻑が変わると相同な遺伝⼦グループ（オーソログ）の割り振り結果が変わるので、200-bp に固定する。MSDM は提供されたマニュアルにしたがってインストールし、コア数 4 以上、メ
モリー16 GB 以上、ストレージ 500 GB 以上のスペックのパソコンであれば、使⽤可能である。しかし、複数サンプルを短時間でペアエンドアセンブルを⾏う場合は、さらにハイスペックの専⽤マシンが望ましい。最終的に出⼒するアミノ酸配列は任意に指定できるが、今回の解析では 100 万本のアミノ酸配列からなる multi-FASTA ファイルを作成する。

7.3.4. アミノ酸配列の Genomaple TM への供試
各海⼭のメタゲノム配列から作成されたアミノ酸の multi-FASTA を GenomapleTM に供試する（https://maple.jamstec.go.jp/maple/maple-2.3.1/）。Genomaple の詳細な使い⽅は、ホームページ上のHelp を参照するか、複数の⽇本語の成書があるのでそれを参照する 1,2）。データをサブミットする際のデータベースは全⽣物種 （all organisms）を選択し、ホモロジーサーチのエンジンは GHOSTX、検索法
は single-directional best hit （SBH）をそれぞれ選択する。100 万本の計算時間は、データ配列によって異なるが、5 時間程度で終了する。100 万本のアミノ酸配列を供試した祭の rarefaction curve が⾃動で作成されるので、KEGG module にアサインされたオーソログ遺伝⼦ （KO）の種数と、種数がプラトーに達しているかを確認する。図 7.3.4.1.にはその⼀例を⽰したが、全ての海⼭のサンプルで同様の結果が得られ、供試したアミノ酸配列が⼗分量であることを確認する。
1）
⽇本ゲノム微⽣物学会ニュースレター（https://www.sgmj.org/pdf/newsletter/sgmj_no15.pdf）
2）
実験医学別冊 「今すぐ始める！ メタゲノム解析 実験プロトコール」p.215-225. 2016 年⽺⼟社

131

図 7.3.4.1. 供試配列がアサインされた KO の rarefaction curve。

7.3.5. Ribosomal protein に基づく菌叢解析
Genomaple で充⾜率が計算されるモジュールの中にリボソームモジュールがある。KEGG オリジナルのモジュールは、バクテリア（M00178）、 アーキア（M00179）、 真核⽣物（M00177）があるが、Genomaple にはこれに加え、これらモジュールを統合した仮想的全⽣物種リボソームモジュール（M91000）がある。このモジュールにアサインされた配列の⽣物種情報を⽤いることで、メタゲノム
中の真核⽣物、アーキア、バクテリアの組成の算出が可能である。リボソームタンパク質は、基本的にシングルコピーで、バクテリアは 52 遺伝⼦、アーキア 58 遺伝⼦、真核⽣物 77 遺伝⼦で、16S rRNA
遺伝⼦と異なり種によるコピー数に違いはない。したがって、メタゲノム中にリボソームタンパクとア
サインされた配列を⽣物種ごとに集計することで、菌叢組成の算出が可能である。ただし、バクテリ
ア、アーキア、真核⽣物 1 細胞あたりのリボソームタンパクの数が異なるので、アーキア、真核⽣物を含めた⽣物種組成を算出する場合は、アーキア及び真核⽣物の総数にそれぞれ 52/58、52/77 を乗じた
値にバクテリアの総数を加えたものを全リボソームタンパク数としてそれぞれの組成を計算する。⼀般に菌叢組成は Phylum レベルの組成で⽰される場合が多いので、 Genomaple では、 KEGG で定義された第⼆階層分類 （ITR: phylum, class）による組成を算出する。現在の Genomaple には全ゲノム配列が決定された 3949 ⽣物種（原核⽣物: 3480 種、真核⽣物: 469 種）が登録されているので、これらの⽣物
種情報に基づく種レベルの菌叢組成解析も可能である。グラフ化による菌叢組成は第⼆階層分類を⽤
い、統計解析には種レベルの菌叢組成を⽤いる。
7.3.6. 機能ポテンシャル解析
7.3.6.1. 機能ポテンシャルのグラフ化
Genomaple は、813 種類の機能モジュールに対する充⾜率 （MCR）、充⾜した⽣物種数（第⼆階層分類）、また、充⾜されないモジュールが機能する確率を⽰唆する Q 値、充⾜されたモジュールのアバン
ダンスを⾃動的に計算する。各サンプルの計算が終了した後、各海⼭間で⽐較解析を⾏うため、各海⼭のジョブを選択したのち、comparison 機能を使って、⽐較解析を⾏う。⽐較解析の結果は、Genomaple の結果画⾯に⽰されるが、全ての情報をエクセル形式にまとめたファイル（All module
types in one file [EXCEL]）をダウンロードすることができる。また、この結果は、
https://maple.jamstec.go.jp/maple/maple-2.3.1 から提供されている MAPLE Graph Maker を⽤いて簡単にグラフ化することができる。この際、MCR （ITR）、MCR （Q-value）、number of ITR、
module abundance （ITR）を選択して、棒グラフを表⽰する。このグラフは、pdf フォーマットでダウンロードできるので、必要に応じて Adobe Illustrator などを⽤いて整形することができる （図7.3.6.1.）。これにより、サンプル間の各モジュールの充⾜率やアバンダンスなどの違いを容易に可視化することができる。

132

図 7.3.6.1. 機能モジュールの MCR と abundance のサンプル間⽐較。

7.3.6.2. 機能アバンダンスのクラスタリングとヒートマップ化
7.3.6.1.でダウンロードした All module types in one file をエクセルで開き、各海⼭サンプルの module
abundance （ITR_sum）の列を抜き出し、⼀つのファイルにまとめる。モジュール数は 813 種あるが、この中から全ての海⼭サンプルに於いてアバンダンスが 0 （MCR が 100 未満でアバンダンスが計算されていないも）のモジュールを除く。各モジュールのアバンダンスの合計値を算出し、全海⼭サンプルのモジュール合計値に占める各海⼭の割合（%）を全てのモジュールに於いて計算する。
⾏には海⼭サンプル名、列にはモジュール番号とモジュールごとのアバンダンス値が⼊⼒されたタブ区
切りのテクストデータを作成し、これをクラスタリング解析に⽤いるデータファイルとする。クラスタ
リング解析を⾏うデータを、あらかじめ energy metabolism、 carbohydrate metabolism、 transportsystem、 two-component system など、機能カテゴリー別に分けて作成しておくと、機能カテゴリーごとのアバンダンスの特徴をまとめることができる。
クラスタリングには、フリーソフトの Cluster 3.0 を⽤いるが、本ソフトは、
http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm からダウンロードする。
ダウンロードした Cluster 3.0 を起動し、ファイルから先ほど作成したテキストファイルを読み込み、プ
ログラム中の Hierarchical ボタンをクリックする。 Genes、 Arrays とも cluster をチェクし、clustering
method は、complete linkage を選択する。複数のファイルが形成されるが、そのうち拡張⼦が cdt ファ
イルを⽤いて結果の可視化を⾏う。
結果の可視化、heat map 化は、フリーソフトの Java Tree View を⽤いて⾏うが、ソフトはhttps://sourceforge.net/projects/jtreeview/からダウンロードする。Java Tree View を起動し、ファイル
から先ほど作成された cdt ファイルを読み込むとヒートマップが描画される。
描画されたヒートマップは、フォントや⾊調を⾃由に変えられるので、setting から項⽬を選択し、⾒やすい⾊調や本当に帰る。ヒートマップは、ポストスクリプト（ps）の形式でダウンロードできるので、export から post script を選択してダウンロードする。ダウンロードしたファイルは Adobe Illustrator な
どで整形することができる （図 7.3.6.2.）。ヒートマップによる可視化は、ribosomal protein に基づく菌叢解析のデータでも同様に⾏うことができる。これにより、菌叢組成と機能アバンダンスによる各海⼭の特徴の違いをハイライトすることができる。

133

図 7.3.6.2. エネルギー代謝に関する各海⼭のモジュールアバンダンスのヒートマップ。

7.3.6.3. 統計解析
各サンプル間の類似性や違いを可視化し、どのような機能や⽣物種がその違いに寄与しているかを調べるため、 R 統計パッケージに含まれる機能のうち、クラスタリングと主成分分析（PCA）のプログラムを⽤いて、統計解析を⾏う。まず、ウエブサイトから R と R Studio をインストールする。プラット
フォームが Mac の場合は、https://cran.r-project.org/bin/macosx/から OS に適合した R-4.2.1 ファイルを https://cran.r-project.org/bin/macosx/からをダウンロードする。統計解析には、各サンプルの種レ
ベルでの菌叢組成、全てのサンプルで充⾜されたモジュールのアバンダンスのうち、最も低いアバンダ
ンスを 1 とした場合の各サンプルのアバンダンス⽐、半数以上のサンプルで充⾜されたモジュールのアバンダンスの総和を分⺟とし各サンプルのアバンダンスを百分率で⽰した 3 種類のデータセットを⽤いた。
クラスタリングは、complete linkage 法を⽤いて⾏う。同じデータセットを⽤いて PCA も⾏い、PC1
及び PC2 の分散に寄与する⽣物やモジュールを factor loadings の⾼い値から 10 種程度選択しグラフ化する（図 7.3.6.3.1, 図7.3.6.3.2.）。
モジュールの場合は、そのモジュールに寄与する⽣物種情報を Genomaple からエクセル形式のファイルでダウンロードできるので、必要な場合は、モジュールのアバンダンスに寄与する⽣物種の割合を集計し、円グラフ化する。

134

図 7.3.6.3.1 . PCA による解析結果。

図 7.3.6.3.2. PC1 の分散に寄与するモジュールとその機能。

統計解析に⽤いたスクリプト（クラスタリング)install.packages("ape")
install.packages("tidyverse")
library(ape)library(tidyverse)
135In_file <-read.csv("/Users/takamihideto/Desktop/Nikko_abundance%_dataset1.csv",
header = T, fileEncoding = "UTF-8-BOM")
ID <- In_file$module#GRP <- In_file$Habitat
Cluster_in <- In_file[, 2:ncol(In_file)]
rownames(Cluster_in) <- ID
DIS <- dist(Cluster_in, method = "euclidean")
TAV <- hclust(DIS, method = "average")
TWD <- hclust(DIS, method = "ward.D")
TCP <- hclust(DIS, method = "complete")
TSG <- hclust(DIS, method = "single")
PAV <- as.phylo(TAV)PWD <- as.phylo(TWD)
PCP <- as.phylo(TCP)PSG <- as.phylo(TSG)################################
pdf("/Users/takamihideto/Desktop/SNikko_abundance1_Culster.pdf", width = 15, height = 15)
plot(PAV, edge.width = 5, type = "unrooted", main="Average", cex = 1.5)
plot(PWD, edge.width = 5, type = "unrooted", main="Ward", cex= 1.5)
plot(PCP, edge.width = 5, type = "unrooted", main="Complete", cex= 1.5)
plot(PSG, edge.width = 5, type = "unrooted", main="Single", cex= 1.5)
par(mfrow=c(2,2), mar=rep(0,4))
dev.off()（主成分分析)#####グラフ描写パッケージのインストール#####
Install.packages(“ggplot2”)
library(ggplot2)#####csv 形式のデータセットのインポート#####
In_file <- read.table("ファイル名.csv", sep = ",", header = T, fileEncoding = "UTF-8-BOM")#####module を識別する変数を指定#####
ID <- In_file$ID (A 列の 1 番⽬にある⽂字を⼊れる)#GRP <- In_file$module (今回は使わないので#を先頭に⼊れている)#####主成分分析に⽤いる変数を指定#####136

PCA_in <- In_file[, 2:ncol(In_file)]#####主成分分析の演算・結果の格納#####
PCA <- prcomp(PCA_in) #主成分分析
SUM <- summary(PCA) #主成分分析の結果の Summary
IMP <- SUM$importance #主成分得点
ROT <- PCA$rotation #因⼦負荷量
PSD <- IMP[1,]#各主成分の標準偏差PRO <- IMP[2,]#各主成分の寄与率
PSC <- PCA$x[,1:2] #第⼀、第⼆主成分得点の取得#####作図に必要なデータセットの作成#####FIG <- as.data.frame (cbind(ID, GRP1, PSC))
FIG$PC1 <- as.numeric (FIG$PC1)
FIG$PC2 <- as.numeric (FIG$PC2)#####主成分分析の結果を csv 形式ファイルで作成#####
write.csv (IMP, file = "Summary.csv") ファイル名とパスは、計算に使うファイルを⼀度ターミナルにドラッグしwrite.csv (ROT, file = "Sul_Rotation.csv") その情報を copy & paste する
write.csv (FIG, file = "Score.csv")#####第⼀、第⼆主成分得点の散布図を pdf 形式ファイルで作成#####
pdf ("PCA_figure.pdf", width=12, height=10) #pdf ファイルの作成
ggplot() +#図の作成
geom_point (data= FIG, aes(x=PC1, y=PC2, colour=GRP1), size=2) + (plot のサイズは 2 ぐらいが適当)
scale_colour_manual(values=c("Animal"="red", "Lake"="green", "Marine/saline"="blue", "Soil"="pink","Terrestrial"="yellow")) +theme_bw() +theme(panel.border = element_rect(size = 1.8, colour = "black"),
panel.grid.major = element_blank(),
panel.grid.minor = element_blank(),
panel.background = element_blank(),
legend.position = "right",
legend.background = element_rect(fill = "white", colour = "black"),
legend.title = element_text(size = 20, face = "bold"),
legend.text = element_text(size = 20, face = "bold"),
axis.text=element_text(size = 20, face = "bold"),
axis.title=element_text(size = 25, face = "bold")) +geom_text(data= FIG, aes(x=PC1, y=PC2-1, label=ID), size=4, colour="black") +labs(colour="Habitat")dev.off()#描写の終了137

スクリプトの説明(クラスター解析に使⽤した R スクリプト)#####樹形図データ処理・表形式データ処理のパッケージのインストール#####
install.packages("ape")
install.packages("tidyverse")
library(ape)library(tidyverse)#####csv 形式のデータセットのインポート#####
In_file <-read.csv(“ファイル名.csv”, header = T, fileEncoding = "UTF-8-BOM")#####細菌ゲノムを識別する変数を指定#####
ID <- In_file$Strain
GRP <- In_file$Habitat#####クラスター解析に使⽤する変数を指定#####
Cluster_in <- In_file[, 2:ncol(In_file)]#####クラスター解析データセットに、ID を結合#####
rownames(Cluster_in) <- ID#####クラスター解析#####DIS <- dist(Cluster_in, method = "euclidean") #ユークリッド距離の算出
TAV <- hclust(DIS, method = "average") #群平均法
TWD <- hclust(DIS, method = "ward.D") #ウォード法
TCP <- hclust(DIS, method = "complete") #最遠隣法
TSG <- hclust(DIS, method = "single")#最近隣法#####樹形図作成⽤のデータ形式に変換#####
PAV <- as.phylo(TAV)PWD <- as.phylo(TWD)
PCP <- as.phylo(TCP)PSG <- as.phylo(TSG)#####樹形図の枝の⾊を指定#####
Col_AV <- GRP[PAV$edge[,2]]ECol_AV <- ifelse(is.na(Col_AV), "gray", Col_AV)
ECol_AV <-ECol_AV %>%str_replace_all(c("Animal"="red", "Lake"="green", "Marine/saline"="blue", "Soil"="pink","Terrestrial"="yellow"))
Col_WD <- GRP[PWD$edge[,2]]ECol_WD <- ifelse(is.na(Col_WD), "gray", Col_WD)
ECol_WD <-ECol_WD %>%str_replace_all(c("Animal"="red", "Lake"="green", "Marine/saline"="blue", "Soil"="pink",
138

"Terrestrial"="yellow"))
Col_CP <- GRP[PCP$edge[,2]]ECol_CP <- ifelse(is.na(Col_CP), "gray", Col_CP)
ECol_CP <-ECol_CP %>%str_replace_all(c("Animal"="red", "Lake"="green", "Marine/saline"="blue", "Soil"="pink","Terrestrial"="yellow"))
Col_SG <- GRP[PSG$edge[,2]]ECol_SG <- ifelse(is.na(Col_SG), "gray", Col_SG)
ECol_SG <-ECol_SG %>%str_replace_all(c("Animal"="red", "Lake"="green", "Marine/saline"="blue", "Soil"="pink","Terrestrial"="yellow"))#####樹形図を pdf 形式ファイルで作成#####
pdf("C:\\Users\\shu-ji\\Desktop\\R file\\Nomura\\Sul_Culster.pdf", width = 15, height = 15)
plot(PAV, edge.color = ECol_AV, edge.width = 5, type = "unrooted", main="Average", cex = 1.5) # 群平均法
plot(PWD, edge.color = ECol_WD, edge.width = 5, type = "unrooted", main="Ward", cex= 1.5) #ウォード
法
plot(PCP, edge.color = ECol_CP, edge.width = 5, type = "unrooted", main="Complete", cex= 1.5) #最遠隣法
plot(PSG, edge.color = ECol_SG, edge.width = 5, type = "unrooted", main="Single", cex= 1.5) #最近隣法
par(mfrow=c(2,2), mar=rep(0,4))
dev.off()#描写を終了(主成分分析に⽤いた R スクリプト)#####グラフ描写パッケージのインストール#####
Install.packages(“ggplot2”)
library(ggplot2)#####csv 形式のデータセットのインポート#####
In_file <- read.table("ファイル名.csv", sep = ",", header = T, fileEncoding = "UTF-8-BOM")#####module を識別する変数を指定#####
ID <- In_file$module
GRP <- In_file$module#####主成分分析に⽤いる変数を指定#####
PCA_in <- In_file[, 2:ncol(In_file)]#####主成分分析の演算・結果の格納#####
PCA <- prcomp(PCA_in) #主成分分析
139

SUM <- summary(PCA) #主成分分析の結果の Summary
IMP <- SUM$importance #主成分得点
ROT <- PCA$rotation #因⼦負荷量
PSD <- IMP[1,]#各主成分の標準偏差PRO <- IMP[2,]#各主成分の寄与率
PSC <- PCA$x[,1:2] #第⼀、第⼆主成分得点の取得#####作図に必要なデータセットの作成#####FIG <- as.data.frame (cbind(ID, GRP1, PSC))
FIG$PC1 <- as.numeric (FIG$PC1)
FIG$PC2 <- as.numeric (FIG$PC2)#####主成分分析の結果を csv 形式ファイルで作成#####
write.csv (IMP, file = "Summary.csv")
write.csv (ROT, file = "Sul_Rotation.csv")
write.csv (FIG, file = "Score.csv")#####第⼀、第⼆主成分得点の散布図を pdf 形式ファイルで作成#####
pdf ("PCA_figure.pdf", width=12, height=10) #pdf ファイルの作成
ggplot() +#図の作成
geom_point (data= FIG, aes(x=PC1, y=PC2, colour=GRP1), size=5) +scale_colour_manual(values=c("Animal"="red", "Lake"="green", "Marine/saline"="blue", "Soil"="pink","Terrestrial"="yellow")) +theme_bw() +theme(panel.border = element_rect(size = 1.8, colour = "black"),
panel.grid.major = element_blank(),
panel.grid.minor = element_blank(),
panel.background = element_blank(),
legend.position = "right",
legend.background = element_rect(fill = "white", colour = "black"),
legend.title = element_text(size = 20, face = "bold"),
legend.text = element_text(size = 20, face = "bold"),
axis.text=element_text(size = 20, face = "bold"),
axis.title=element_text(size = 25, face = "bold")) +geom_text(data= FIG, aes(x=PC1, y=PC2-1, label=ID), size=4, colour="black") +labs(colour="Habitat")dev.off()#描写の終了7.4. ショットガンメタゲノム解析による個別原核⽣物種の存在量の把握（吉武和敏）
7.4.1. 解析の⽬的と概要
堆積物サンプルのショットガンメタゲノムデータから、既知の原核⽣物種の存在量を把握することを⽬的とする。アンプリコン解析では難しい同種で別株の原核⽣物の存在量を区別して⾒ることができる。特定の原核⽣物種あるいは株の機能的特徴を把握すると共に、その存在量のサイト間⽐較や時間変140

化を⾒ることができる。ここでは、⽇光海⼭と正保海⼭の周辺堆積物サンプルのショットガンメタゲノ
ムデータから metagenome assembled genome（MAG）として構築された 89 株の原核⽣物について、新たに得られたショットガンメタゲノムデータからそれらの存在量を算出する⽅法を⽰す。DNA 配列
データは、7.3.で⽤いたものと同じデータを使う。
7.4.2. 動作環境
Windows 10 以降、もしくは Docker と Python3 が動作する Linux サーバが必要
スペックとしては、最低でも下記のスペックが必要
・メモリー：16 GB 以上
・HDD/SSD：100 GB 以上の空き容量
・インターネット接続
・（Windows の場合）仮想化⽀援機能（Intel VT や AMD-V）が BIOS で有効になっている必要がある。WSL2 を実⾏するために必要。市販の PC の半分くらいでデフォルトでは無効に設定されている。
7.4.3. ツールのインストール⼿順
ここでは Windows 上で使⽤する⼿順を説明する。
① 画⾯下の Windows ロゴを右クリックして、Windows PowerShell （管理者）を起動する。
② Windows Subsystem for Linux （WSL）をインストールするために、wsl --install と⼊⼒して実⾏する。
③ Windows を再起動する。
④ 再起動後に下記のような画⾯が表⽰されるので、WSL で新しく作るアカウントのユーザ名とパスワ
ードを⼊⼒する。パスワードは表⽰されなくても⼊⼒されているので、⼊⼒したら Enter を押す。

⑤https://github.com/c2997108/OpenPortablePipeline/releases/download/v1.1.0/PortablePipelinewin-v1.1.0.zip
から Portable Pipeline をダウンロードして、解凍しておく。

141

⑥ 解凍したフォルダの中にある「PortablePipeline(.bat)」をダブルクリックして起動する。すると、「Windows によって PC が保護されました」と出るので、「詳細情報」をクリックして、⑦「実⾏」をクリックする。

⑧ ユーザアカウント制御画⾯が表⽰されるので、「はい（許可する）」をクリックする。
142

⑨ Portable Pipeline が起動したら、「Settings」タブを開いて、「Preset:」を WSL にチェックを⼊れ、先ほど作成した WSL のユーザ名とパスワードを⼊⼒する。

7.4.4. 解析の実⾏① Portable Pipeline を起動したら「Analysis Scripts」タブを開き、「metagenome~mapping-to-MAG」を選択し、「input1」をクリックし、参照ゲノムファイルをすべて選択してから、「開く」をクリックする。ここでは例として 2021 年に海洋保護区の日光海山、正保海山の深海堆積物から得られた
Metagenome-Assembled Genome (MAG)と、海外の深海土壌データ（https://trace.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/index.html?view=study&acc=ERP125879）から得られた MAGを⾜し合わせたものを参照ゲノムとして使⽤した。デモデータは下記からダウンロード可能である。
https://github.com/c2997108/OpenPortablePipeline/releases/download/v1.1.0/MAG_sample.zip②「input2」を開き、シーケンスデータを選択して、「開く」をクリックして⼊⼒ファイルを指定する。CPU 数は PC のスペックに合わせて設定してから「Run」を押す。（メモリー設定はグリッドエン
143

ジン（SGE）モードで使⽤するので、ここで指定しても使⽤しない）
例として 2021 年に海洋保護区の⽇光海⼭、正保海⼭の深海堆積物から得られたシーケンスデータと、海外の深海⼟壌データから得られたシーケンスデータをそれぞれ 100 万リードずつ使⽤した。サンプル
データは下記の URL からダウンロード可能である。
https://github.com/c2997108/OpenPortablePipeline/releases/download/v1.1.0/fastq_sample.zip③ 実⾏すると、「Job List」にジョブが追加され、途中経過がログで表⽰される。⿊いターミナル画⾯が表⽰されるが、それは開いたままにしておく。ジョブが完了すると「finished」のステータスになる。

7.4.5. 結果の説明① ジョブが完了したら、「Job List」の右側にあるフォルダーアイコンをクリックすると、結果ファイルの⼀覧が表⽰される。その中の「output(.png)」をダブルクリックして開く。

144

② 結果ファイルを開くと、下記のようなヒートマップが出⼒されている。縦に参照配列として⼊⼒したバクテリアゲノムが、横にシーケンスデータがサンプルごとに表⽰されている。図の左上にインジケー
ターが表⽰されているが、この数字は各バクテリアゲノムにマッピングされたリードの平均カバレッジ
情報を常⽤対数で変換した値である。

145

③ 海洋保護区の⽇光海⼭、正保海⼭の 2021 年の深海堆積物では、bin.4 の MAG がどちらの海⼭でも共通して多く、海外の深海堆積物にはほぼ存在しないことが⽰されている。こうした bin.4 のゲノムを持
つようなバクテリアが今後も⽇光海⼭、正保海⼭に⽣息しているかを調べることで海洋保護区の多様性が維持されているか調査可能である。
146

7.5. 原核⽣物数の把握（砂村倫成）
7.5.1. 準備する器具、試薬
試料取得時（7.1.4 節参照）
・4％パラフォルムアルデヒド液 [湯浴した 3xPBS（Phosphate Buffered Saline：塩化ナトリウム 24 g、塩化カリウム 0.6 g、リン酸⼀⽔素ナトリウム 4.32 g、リン酸⼆⽔素カリウム 0.72 g を超純⽔ 1 L に溶
解し、pH を 7.4 に調整）中でパラフォルムアルデヒドを溶解する｡]
・先端をカットした 2.5 mL シリンジ
観察時・0.01 M ピロリン酸ナトリウム溶液（0.2 µm フィルターでろ過したもの）
・ろ過器
・ポリカーボネートブラックフィルター（孔径 0.2 µm、 Advantec）
・SYBR Green I
・退⾊防⽌剤（Prolong Diamond、 Molecular Probes）
・落射型蛍光顕微鏡（x100 もしくは x40 対物レンズ）
7.5.2. 計数⼿順
① 堆積物試料 1 mL に対し、4%パラフォルムアルデヒド溶液 3 mL を加え、4℃にて⼀晩固定する。固定作業を⾏うことによって、微⽣物の増殖を防ぐとともに、微⽣物核酸染⾊試薬の膜透過性を⾼めることができる。観察までの処理が 3 ⽇以内にできない場合は-80℃で冷凍保存。
② 0.01M ピロリン酸ナトリウム溶液で適宜希釈し、超⾳波洗浄機中で 30 秒間の超⾳波処理を⾏い、コ
ア試料から微⽣物細胞を分離。
③ 固定・希釈したサンプル 1 mL に対し、SYBR Green I（Molecular Probes ; x10000 濃度）を 10 µL 加
え、室温で 10 分間染⾊。
④ 染⾊した試料を速やかに孔径 0.2 µm のポリカーボネート製ブラックフィルターに吸引ろ過する．ろ過には直径 15-25 mm のファンネルを⽤い、吸引圧を 2.5 kPa 以下で⾏うことで細胞の破損を最⼩限に抑える。
⑤ ろ過後 0.2%の低融点アガロース溶液に浸し、乾燥することで、試料中の微⽣物細胞の移動を防ぐ。
⑥ 成した試料をスライドガラス上にのせ、退⾊防⽌剤を加えたのち、カバーガラスをのせ、顕微鏡観察に供する．微⽣物の観察は、形態判別の⾯からも、対物 100 倍のレンズを使⽤することが好ましいが、対物 40 倍以上のレンズであれば、観察が可能である。
⑦ SYBR Green I で染⾊された微⽣物細胞は蛍光顕微鏡下で⻘⾊の励起光により、緑⾊の蛍光を発する。緑⾊の蛍光を発している輪郭のはっきりした微⽣物細胞様の粒⼦を微⽣物とみなして計数。
⑧ 微⽣物細胞の密度を以下の式にて算出（⼀視野中の微⽣物細胞数）÷（⼀視野の⾯積）×（ろ過⾯積）÷（試料のろ過量と希釈率）。

147

8.おわりに（藤倉克則）
本マニュアルは、SⅡ-7 参画者以外でも SⅡ-7 で構築した⼿法により、海洋保護区などにおいて深海⽣態系のモニタリングが実施できるように作成した。とはいいつつも、マニュアルには書ききれない細かなノウハウやコツというものがあることは否めない。また、専⾨的知識や経験がないと理解しにくい部分もあるかと思う。
実際に本マニュアルを⽤いて深海⽣態系のモニタリングを実施する場合、当初は本マニュアルの作成
者らとの協同が必要かもしれない。そのような場合は遠慮なく、それぞれの担当者に声をかけていただ
きたい。
最後に、本マニュアルが、深海域の海洋保護区管理のみならず、科学的知⾒の充実に貢献できれば幸いである。
謝辞：本マニュアルのベースとなるプロジェクト環境研究総合推進費戦略的研究開発課題（SⅡ-7）「新たな海洋保護区（沖合海底⾃然環境保全地域）管理のための深海を対象とした⽣物多様性モニタリ
ング技術開発」環境推進費体系的番号 SⅡ-7JPMEERF20S20700 の実施にあたっては、以下の⽅々をはじめたくさんの⽅々からご助⾔やご協⼒をいただいた。⼼より感謝する。
・環境省⾃然環境局⾃然環境計画課 守 容平 ⽒、⽊村 ⿇⾥⼦ ⽒、⼤澤 隆⽂ ⽒、⼭根 篤⼤ ⽒
・環境再⽣保全機構 ⼤河内 勇 ⽒、藤井 亮介 ⽒
・アドバイザリーボード委員 ⼩池 勲夫 東京⼤学 名誉教授、中⽥ 薫 ⽔産研究・教育機構 理事、藤⽥敏彦 国⽴科学博物館動物研究部 部⻑、⼭中 寿朗 東京海洋⼤学 教授
・海洋研究開発機構 ⽩⼭ 義久 博⼠、伊藤 誠 ⽒、府川 典⼦ ⽒

148