−技術資料−●葉酸測定試薬及びビタミン B12 測定試薬の開発
バイオサイエンス事業部

第一開発部

試薬グループ

東ソー・エイアイエイ株式会社

製造グループ

1．序論

三谷田中
北岡
堀田俊介
千代
憲二
秀樹

2．測定原理と材料

赤血球細胞の形成や核酸合成に関与する酵素の補酵

葉酸は血中で葉酸結合蛋白質と結合しているため、素として働く水溶性ビタミンとして葉酸及びビタミン前処理によって検体中の葉酸を遊離させ、測定に用いB12 が知られている。これら二つのビタミンは体内でる。ビタミン B12 も同様に前処理によって結合蛋白は合成されず、食事やサプリメントなど体外から摂取質から遊離させるが、さらにシアン化カリウムを添加する必要がある。臨床的には貧血マーカーとして主にし、検出可能な CN 型ビタミン B12（シアノコバラミン）欠乏症の診断に用いられている。に変換させ、測定に用いる。以上の理由から葉酸及び葉酸欠乏の主な疾患として、DNA 合成が阻害されることで正常に赤血球が造られなくなる巨赤芽球性貧1）

ビタミン B12 は検体前処理が必要となる。
今回開発した葉酸測定試薬及びビタミン B12 測定

血がある 。さらに葉酸は胎児の神経系発達にも重要

試薬は血清中の葉酸またはビタミン B12 濃度を測定であり、葉酸のサプリメント摂取で神経管閉鎖障害のする試薬であり、前処理工程を葉酸及びビタミン B12リスクが低減するため、妊娠計画初期からの摂取が厚の各々の専用前処理カップ（表１参照）中で、反応工2）

生労働省から推奨されている 。また、米国食品医薬程を各々の反応試薬カップ中で実施する。反応に必要品局（U.S. Food and Drug Administration : FDA）は製な物質は凍結乾燥し、試薬カップ内に密封されている造業者に対し、穀物製品について葉酸添加を要請する（ビタミン B12 前処理試薬− 2 については液状品での供など、葉酸欠乏回避のための施策が執られている 3）。

給となり、専用バイアルへ分注、装置へ架設して使用

ビタミン B12 欠乏の主な疾患は葉酸同様に巨赤芽する）。

球性貧血であり、疲労感や便秘、食欲不振、体重減少

反応試薬の試薬カップには 2 つのセル（セル（1）、が症状として現れる。さらに別の欠乏症状としてうつ、セル（2））がある。セル（1）には磁性微粒子に固定

4）

認知症、記憶力の低下などが報告されている 。こう化された葉酸結合蛋白質またはビタミン B12 結合能した中でビタミン B12 摂取推奨量が厚生労働省よりを有する内因子を含む凍結乾燥体が、セル（2）には定められているが、近年ではその推奨量では栄養状態

アルカリ性ホスファターゼ標識葉酸誘導体またはビタ保持には少ない可能性があると見解を示す論文も出て

ミン B12 誘導体を含む凍結乾燥体が封入されている。

5）

きており 、葉酸同様に適正な摂取が望まれている。

この試薬カップのセル（1）に分注水と前処理された

以上のように、葉酸及びビタミン B12 は健康維持検体を、セル（2）には分注水を加え、それぞれ凍結の指標および臨床上の有用性が今後さらに高まる可能乾燥試薬を溶解する。前処理された検体が注入された性がある物質である。

セル（1）においては凍結乾燥試薬が溶解すると同時

今 回、 我 々 は 全 自 動 化 学 発 光 酵 素 免 疫 測 定 装 置®に第一反応が開始する。一定時間、一定温度でインキュ（AIA − CL2400 又はそれと同等の性能を有する専用機ベートした後、セル（2）の内容物を一定量、セル（1）器）を用いて、簡便かつ迅速に葉酸及びビタミン B12に移すことにより第二反応が開始される。一定時間、を測定できる試薬の開発を行ったので、その基本性能一定温度でインキュベートした後、洗浄水で洗浄するについて報告する。なお、本技術は適切な診断及び治ことにより、未反応の各種酵素標識誘導体と検体成分療を提供する一助として医療に貢献することを目指しを除去する（B ／ F 分離）。B ／ F 分離後、磁性微粒子にたものである。

結合した酵素活性を測定するために化学発光基質として３−（５− tert −ブチル− 4,4 −ジメチル− 2,6,7 −トリオキ57TOSOH Research & Technology Review Vol.66（2022）

では、水酸化ナトリウムで各種結合蛋白質を変性させ、サビシクロ［3.2.0］ヘプト− 1 −イル）フェニルリン酸エ®

ステル ジナトリウム塩（D I F U R AT ）を添加し、酵検出対象である葉酸またはビタミン B12 を遊離させ素による分解で得られる発光強度を測定することによる。また、変性剤である水酸化ナトリウムと同時に還り、検体中の葉酸またはビタミン B12 濃度を測定する。

元剤を加え、悪性貧血患者が保持する非特異抗体（夾測定の際、検体のカップへの分注、検体の前処理、雑物）を不活化する必要がある。なお、ビタミン B12

一定時間下での測定対象物と結合蛋白質との反応、Bにおいてはさらにシアン化カリウムを添加し、血中の／ F 分離、基質分注、発光強度の測定は全自動化学発ビタミン B12 類似体を検出可能なシアノコバラミン

光酵素免疫測定装置により自動で行われ、各試薬ともに変換する。中和工程では水酸化ナトリウムによりアに測定開始から約 25 分後に結果が得られる（試薬のルカリ性になった検出環境を中性付近に戻す目的で緩主な仕様を表１、測定原理図を図１に示す）。

衝剤を添加し、前処理工程が完了する。
AIA − CL システムでは共通試薬を除き、試薬は凍結乾燥形態をとっている［図 3］。例として反応試薬を3．前処理試薬の開発挙げると、固相試薬と標識試薬が二穴の試薬カップに

検体前処理は結合蛋白質から葉酸またはビタミン凍結乾燥状態で封入されており、オールインワンカッB12 を遊離させる変性工程、そして検出環境を整えるプ方式を採用している。較正試薬や検体希釈試薬も同中和工程の 2 段構成となっている［図２］。変性工程様の試薬形態のため、いずれの試薬もトレイごと装置

表１
試薬名称
検出対象
前処理試薬形態
対象検体種
検体量
検量域
測定時間

試薬仕様

AIA－パック CL 葉酸
葉酸

AIA－パック CL ビタミン B12ビタミン B12
前処理試薬－1（凍結乾燥品）
前処理試薬カップ（凍結乾燥品）
前処理試薬－2（液状品）
血清
血清40［μL］
50［μL］
1.0－20［ng ／ mL］
90－2,000［pg ／ mL］
25［min］
25［min］

Pretreatment process

Dissolution with specimen and the Diluent(Pretreatment Reagent Cup)

Incubation(Pretreated reaction)

Addition of reconstituted reagent fromCell-ll(Neutralization reaction)

Reaction process

Dissolution with Pretreated specimen
and the Diluent

Incubation(1st reaction)

Incubation(2nd reaction)

Magnetic particle
immobilization binding protein

Enzyme-labeled derivative

図１58

Addition ofreconstituted
reagent from Cell-ll

測定原理図（葉酸測定の場合）

Washing

Addition of the SubstrateandMeasurement ofchemiluminescent intensity

Contamination

東ソー研究・技術報告第 66 巻（2022）① 変性剤、還元剤の添加

血中状態② 中和剤の添加

葉酸、B12 の遊離

葉酸、B12結合蛋白質

較正試薬

図３

夾雑物

前処理工程原理図

図２

反応試薬

中和

検体希釈試薬前処理試薬

各種試薬形態写真

へ架設するだけであり、ユーザビリティの高い仕様と活性検証結果を示す。検証はイールマン試薬を用いていえる。これらの試薬は凍結乾燥化しているため試薬実施した［図４］。還元剤によって生成されるチオー安定性に優れ、さらにモノテスト（すべての反応工程ル基が、イールマン試薬中のジスルフィド結合を切断が試薬カップ内で行われる）方式のためコンタミネーし生成する 2 −ニトロ− 5 −メルカプト安息香酸の吸光度

ションや汚染に強く、用手の調製が不要であること、を測定し評価した。0 日目の活性を 100％としたとこ

測定数の増減にフレキシブルに対応できるといった利ろ、水酸化ナトリウム共存化では 7 日後に残存活性が点があり、競合他社に対する強みとなっている。そこ27.2％まで低下した。

で今回の前処理試薬についても凍結乾燥形態をとれる

そこで試薬の凍結乾燥形態に着目し、変性剤と還元ように開発を進めた（ビタミン B12 については前処剤を 2 段分注することで還元剤の活性保持に成功し理試薬成分にシアン化カリウムが含まれるため、一部た 6）。すなわち、変性剤溶液と還元剤溶液は別個に調を液状品として開発した）。以降は葉酸前処理試薬の製し、初めに変性剤溶液を分注、凍結する。その後、開発工程について説明する。

還元剤溶液を分注し凍結することで還元剤の活性を保二穴の試薬カップに変性剤と還元剤、そして中和剤持でき、かつ 1 穴に変性剤と還元剤を共存させることを凍結乾燥状態で封入する必要があるため、原理上、ができた［図５］。

変性剤と還元剤は共通の穴に封入する必要が生じる。

既存の体外診断用前処理試薬には測定前に用手調製

しかしながら還元剤はアルカリ性条件下では活性が失が必要なものや、安定性の兼ね合いから試薬の開封後われる。水酸化ナトリウムの有無による還元剤の残存有効期間が 14 日間程度のものもある。一方で、今回

120

残存活性［％］

100806040NaOH 無200NaOH 有01234567

保存日数［day］

図４

水酸化ナトリウムの有無による還元剤の残存活性59

TOSOH Research & Technology Review Vol.66（2022）

中和剤
還元剤
一次凍結変性剤

二次凍結還元剤の分注

中和剤の分注／変性剤の分注

図５

変性剤及び還元剤の 2 段分注原理図開発した AIA − CL 前処理試薬はモノテスト仕様であCV）は葉酸：2.6 ～ 4.0％、ビタミン B12：1.3 ～ 2.4％

り、用手調製が不要のため調製ミスがなく、装置上でであった。各試料を試薬、装置を変えずに 1 日 4 回測すべての前処理工程が実施される。また、凍結乾燥形定し、それを 20 回繰り返して行った測定間再現性試

態のため試薬の安定性が高く、装置にセットしてから験の結果（検量線作成後 93 日間に渡って合計 80 回測の安定性（開封後安定性）は 180 日であり、未開封の定）、各試料の測定値の CV は葉酸：2.3 ～ 4.4％、ビ場合の有効期間は 25 ヶ月となっており、総じてユータミン B12：0.9 ～ 3.6％であった［表２］。

ザビリティの高い試薬開発ができたといえる。
［2］共存物質の影響
検体中に含まれる可能性のある各物質をプール血清4．基本性能評価へ添加し、測定値への影響を確認した［表３］。共存物質としてはヘモグロビン、遊離型ビリルビン、抱合［1］再現性
測定内再現性、測定間再現性試験を 3 種のプール型ビリルビン、脂質、ヒト血清アルブミン、アスコル血清を用いて行った。使用した 3 種（Low、Middle、ビン酸を各々表３に記載の濃度まで添加し測定した。

High）は 1 回の測定分を小分け分注し使用まで凍結保

その結果、未添加条件に対して測定値はいずれも±存した。5 重同時測定による測定内再現性試験の結果、10％以内であったため、これら物質は表３に記載の濃各試料の測定値の変動係数（coefficient of variation；度まで添加しても影響しないと判断した。

表２

測定内および測定間再現性

1）葉酸

Mean［ng ／ mL］
SDCV［％］

測定内再現性（n＝5）
Low
Mid.
High
3.9
9.0
15.5
0.1
0.4
0.4
2.7
4.02.6

測定間再現性（n＝80，93 日間）
Low
Mid.
High
3.9
9.3
15.5
0.2
0.3
0.4
4.4
3.02.3

測定内再現性（n＝5）
Low
Mid.
High
356
700
1,2578.5
11.8
16.1
2.4
1.71.3

測定間再現性（n＝80，93 日間）
Low
Mid.
High
3697131,27813.110.511.03.61.50.92）ビタミン B12

Mean［pg ／ mL］
SDCV［％］

表３共存物質の影響

ヘモグロビン［mg ／ dL］
遊離型ビリルビン ［mg ／ dL］
抱合型ビリルビン ［mg ／ dL］
脂質［mg ／ dL］
ヒト血清アルブミン ［g ／ dL］
アスコルビン酸［mg ／ dL］

60

葉酸441717830
2.520

ビタミン B12440
17191600
2.520東ソー研究・技術報告第 66 巻（2022）

た［図６］。その結果、葉酸の定量限界は CV10％にお［3］希釈性能試験
濃度の異なる 3 種の血清検体を用い、希釈性能試験

いて 2.24 ng ／ mL、CV20％において 1.09 ng ／ mL となっを行った［表４］。各々の検体を葉酸・ビタミン B12た。また、ビタミン B12 の定量限界は CV10％で 91.8

共通の検体希釈試薬（AIA − CL 用 検体希釈試薬 F）

pg ／ mL、CV20％で 45.6 pg ／ mL となった。

を用いて測定装置上で 10 倍まで自動希釈を実施した。
4 重測定した結果、いずれの血清検体においても理［5］相関性論濃度に対する回収率が± 15％以内に収まっており、良好な希釈性能を有することが示された。

大 阪 大 学 医 学 部 附 属 病 院 の 協 力 の も と、AIA −CL2400（y）を用いて、対照となる 2 種の既存体外診断用医薬品キット（x）との相関性を確認した 7）［図７］。
その結果、葉酸は対照キット− 1 において n ＝ 130、回［4］ブランク上限、検出限界、定量限界
0 濃度サンプル 4 種類を 5 日間 3 重測定し、総計 60

帰式 y ＝ 1.08x − 1.78、相関係数 r ＝ 0.930 であり、対照のデータからブランク上限（Limit of Blank）を算出

キット− 2 については n ＝ 130、回帰式 y ＝ 1.08x − 0.548、したところ、葉酸は 0.322 ng ／ mL、ビタミン B12 は相関係数 r ＝ 0.951 であった。ビタミン B12 について

36.2 pg ／ mL であった。また、5 濃度のプール血清を対照キット− 1 との相関性は n ＝ 121、回帰式 y ＝ 0.967x調製し、それらの検体について一日あたり 4 重測定を− 9.16、相関係数 r ＝ 0.966 であり、対照キット− 2 につ3 日間繰り返し、総計 60 のデータから検出限界（Limitいては n ＝ 116、回帰式 y ＝ 1.05x ＋ 36.0、相関係数 rof Detection） を 算 出 し た と こ ろ、 葉 酸 は 0.775 ng ／＝ 0.986 であった。

mL、ビタミン B12 は 47.8 pg ／ mL であった。さらに
10 濃度のプール血清を調製し、それらの検体につい［6］機種間差て一日あたり 8 重測定を 5 日間繰り返し、Precision

AIA − CL2400（x）と、中型機の AIA − CL1200（y）、おprofile にて定量限界（Limit of Quantitation）を算出しよび小型機である AIA − CL300（y）との機種間差を確認

希釈性能試験

表４1）葉酸
希釈率

理論濃度
測定濃度 回収率［ng ／ mL］ ［ng ／ mL］ ［％］
－
16.1
16.1
100
3.2
3.2
88
1.6
1.4－
510

血清－2－
51014.8
3.0
1.514.8
2.61.3血清－3－51014.4
2.9
1.4

14.4
3.2
1.350454035302520151050理論濃度
測定濃度 回収率［pg ／ mL］ ［pg ／ mL］ ［％］
－
1,709
1,709
11034237595171162

血清－1－
510－
8787

血清－2－
5101,637327
1641,637345145－
10589－
11090

血清－3－
5101,299260
1301,299225115－
8788

454035

CV10％＝2.24［ng ／ mL］
CV20％＝1.09［ng ／ mL］

CV［％］

CV［％］

血清－12）ビタミン B12
希釈率

y＝21.81x－0.969

CV10％＝91.8［pg ／ mL］
CV20％＝45.6［pg ／ mL］

3025201510y＝878.59x－0.99

5024680

葉酸［ng ／ mL］0100200300400500

ビタミン B12［pg ／ mL］

図6

定量限界

61

TOSOH Research & Technology Review Vol.66（2022）

25AIA－パック CL 葉酸［ng ／ mL］

AIA－パック CL 葉酸［ng ／ mL］

2520151050y ＝ 1.08x－1.78
r ＝ 0.930
n ＝ 130
051015202015105025

y ＝ 1.08x－0.548
r ＝ 0.951
n ＝ 1300

既存体外診断用医薬品－1［ng ／ mL］

1,000

y ＝ 0.967x－9.16
r ＝ 0.966
n ＝ 121
0500

1,000

1,500

2,000

既存体外診断用医薬品－1［pg ／ mL］

図７

AIA－パック CL ビタミン B12［pg ／ mL］

AIA－パック CL ビタミン B12［pg ／ mL］1,500010152025

既存体外診断用医薬品－2［ng ／ mL］

2,00050052,000

1,500

1,0005000y ＝ 1.05x＋36.0
r ＝ 0.986
n ＝ 116
0500

1,000

1,5002,000

既存体外診断用医薬品－2［pg ／ mL］

既存体外診断用医薬品キットとの相関性

した［図８］。その結果、葉酸は AIA − CL2400 と AIA理工程の自動化に成功した。用手調製が不要であるこ−CL1200 の機種間差は n ＝ 100、回帰式 y ＝ 0.984x−0.01、とや、試薬有効期間が 25 ヶ月と長期にわたって安定

相 関 係 数 r ＝ 0.977 で あ り、AIA − CL2400 と AIA −であることが大きな特長となっている（ビタミン B12CL300 では n ＝ 100、回帰式 y ＝ 0.998x ＋ 1.11、相関係

前処理試薬については凍結乾燥品と液状品の 2 種類で数 r ＝ 0.984 であった。ビタミン B12 は AIA − CL2400の供給となる）。と AIA − CL1200 の機種間差は n ＝ 100、回帰式 y ＝ 1.00x

また、試薬の基本性能として、測定内、測定間再− 6.85、 相 関 係 数 r ＝ 0.999 で あ り、AIA − CL2400 と現性は 5％以内と良好であり、検体中の共存物質の影

AIA − CL300 では n ＝ 99、回帰式 y ＝ 1.01x ＋ 16.8、相響を受けにくいことが確認された。葉酸及びビタミン関係数 r ＝ 0.996 であった。

B12 測定試薬に共通の検体希釈試薬（AIA − CL 用 検体希釈試薬 F）を用いて装置上での自動希釈性能を確5．総括認したところ、10 倍希釈まで良好な希釈性能を有することが確認された。既存の体外診断用医薬品 2 キッ今回、我々は葉酸測定試薬及びビタミン B12 測定トとの相関性も良好であった。さらに大型機である試薬を開発した。これらの試薬は測定機器として全自

AIA − CL2400 と中型機の AIA − CL1200、および小型機

動化学発光酵素免疫測定装置 AIA − CL シリーズを用の AIA − CL300 の同等性も確認できたことから、大病いて、迅速（約 25 分）かつ多検体の測定が可能である。

院から個人経営のクリニックまで幅広いユーザーの要

本試薬は葉酸及びビタミン B12 測定に必要な前処理望に答えることができる仕様となっている。

操作を凍結乾燥技術によりモノテスト仕様とし、前処62以上より、葉酸及びビタミン B12 測定試薬は前処

東ソー研究・技術報告第 66 巻（2022）

葉酸の機種間差
AIA－CL2400－AIA－CL1200

2520
AIA－CL 300［ng ／ mL］

AIA－CL 1200［ng ／ mL］

201510y ＝ 0.984x－0.01
r ＝ 0.977n ＝ 10050

葉酸の機種間差
AIA－CL2400－AIA－CL300

25051015201510y ＝ 0.998x＋1.11r ＝ 0.984
n ＝ 100

50250AIA－CL 2400［ng ／ mL］

AIA－CL 300［pg ／ mL］

AIA－CL 1200［pg ／ mL］

1,0000y ＝ 1.00x－6.85
r ＝ 0.999
n ＝ 100

0500

1,000152025

ビタミン B12 の機種間差
AIA－CL2400－AIA－CL300

2,000

1,500500

10AIA－CL 2400［ng ／ mL］

ビタミン B12 の機種間差
AIA－CL2400－AIA－CL1200

2,00051,500

1,500

1,000500

02,000y ＝ 1.01x＋16.8r ＝ 0.996
n ＝ 990AIA－CL 2400［pg ／ mL］500

1,000

1,500

2,000

AIA－CL 2400［pg ／ mL］

図８

機種間差

理試薬の用手調製が不要であり、かつ高い試薬安定性

３）U. S. Food and Drug Administration, Foodを有しているため、臨床検査現場の工数削減及び診断

Standards:Amendment of Standards of Identity For

補助の一助となることが期待される。

Enriched Grain Products to Require Addition ofFolic Acid ., 61（4），8781 − 8797（1996）

6．謝辞
本開発において、臨床評価、基礎評価ならびに多く

４）T. Bottiglieri, Nutrition Reviews , 54（12），382 − 390（1996）
５）渡邉文雄、ビタミン、91、595 − 602（2017）の助言を頂きました大阪大学医学部附属病院臨床検査

６）東ソー株式会社、特開 2019 − 78590、2019 − 5 − 23部・日高洋教授、同病院医療技術部検査部門・畑伸顕

７）家原暉恵、畑伸顕、日高洋ほか、医療検査と自動検査技師、家原暉恵検査技師に心より感謝を申し上げ

化、47（2）、168 − 177（2022）ます。

7．文献
１）日本ビタミン学会、水溶性ビタミン学、2、390（1980）
２）厚生労働省、日本人の食事摂取基準（2020 年版）
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