トピックス

免疫毒性予測評価のための多色発光細胞株の樹立
およびその試験法
齋藤るみ子 1 , 2，木村裕 2，相場節也 2

Evaluation system of immunotoxicity using multi-color light emitting cells
Rumiko SAITO1, 2, Yutaka KIMURA2, Setsuya AIBA2

緒言

び製造等の規制に関する法律（略称 : 化審法）
」が，生体は経皮，経口，および経気道など様々な経

REACH 規制内容と同様な内容で平成 21 年 5 月

路で体外から侵入してくる多くの化学物質に常にに一部改正，平成 22 年および平成 23 年に施行さ曝されている．科学技術や産業の進歩により，新れている．このように，化学物質をより安全に，

規化学物質は，今後さらに増加し，様々な用途でそしてより有効に使用していくという潮流は国際使用されていくと考えられる．そのため，我々は的なものとなってきている．

これらのリスクを有害性と曝露量から評価する必要がある．

しかしながら，リスクを評価すべき化学物質は技術や産業の発展とともに，膨大な数に上っていまた近年，化学物質は様々な製品などを通じる．化学物質として知られているものは，1 , 000て 国 際 的 に 流 通 し て お り， 各 国 の 行 政 に よ っ

万以上もの種類があり，天然化学物質だけでなく，て，その使用に関する規制がなされている．近合成化学物質も多い．これら膨大な数の化学物質

年の国際的な規制の一つとして，欧州においてを一元的に評価，管理するというのは現時点にお平成 18 年 12 月採択，平成 19 年 6 月より施行さいて非常に困難なことから，迅速な評価のためのれた「化学物質の登録，評価，認可及び制限に行政制度および技術的システムを構築することが関する規則（REACH: Registration, Evaluation,

求められている．

Authorization and Restriction of Chemicals）」

このような化学物質の中には，免疫毒性を引きがある．REACH は既存，新規を問わず，化学物起こす要因の一つとなり得る物質がある．昭和大

質全般について新たな登録制度を設けた点で，従学名誉教授 吉田武美博士は，免疫毒性とは，皮来の規制枠組みとは異なる．また，政府が実施し膚，気道などから取り込まれた化学物質により免ていた化学物質のリスク評価を事業者へ義務付

疫系のホメオスタシスに異常が生じ，その結果人

け，リスク評価の観点から化学物質管理の推進や体に何らかの障害が生じることと定義している．

流通経路を通じた取り扱いに関する情報の伝達を

表 1 1）に免疫毒性の分類と代表的な免疫毒性物質

強化し，製品中の化学物質に対する対策を講じるを示した．

といった新しい考え方が盛り込まれている．このこれまでの免疫毒性評価は，Gell and Cooms

考え方はアメリカやカナダ，韓国などの諸外国にの分類 2）に基づく古典的免疫学を基盤とし，主とも拡がり，結果として各国の化学物質管理関連法

して実験動物，または実験動物から採材した培養規が改正された．我が国も例外ではなく，化学物

細胞を用いて行われてきた．そのため，結果の取質規制関連法の代表格である「化学物質の審査及得には多大な時間と費用を必要する．その上，膨大な数の化学物質を全て評価することは，これま1

代替法試験部細胞発がん研究室2東北大学大学院医学系研究科皮膚科学分野

での方法では不可能に近い．そのため，一部の医薬品や化粧品を除いて，ほとんどの化学物質は免35

秦野研究所年報 Vol. 35. 2012

表1

免疫毒性物質の分類と代表的な免疫毒性物質

免疫毒性の種類

化学物質・環境汚染物質

免疫抑制

ハロゲン化芳香族炭化水素類 :四塩化ダイオキシン（TCD），四塩化ジベンゾ -p- ジオキシン（TCDO），
ポリ臭化ビフェニル（PBB），ヘキサクロロベンゼン
芳香族炭化水素類 : ベンゼン
多環芳香族炭化水素族 : ベンゾピレン，ジメチルベンズアントラセン
アミン類 : ベンジン，N- ジメチルニトロサミン
重金属化合物 : 水銀，カドミウム，バナジウム，スズ，鉛
酸化性ガス : 二酸化窒素，オゾン

自己免疫
劇症肝炎
ルーブス型腎炎
強皮症様疾患

水銀，カドミウム
塩化ビニルモノマー，シリカ

アレルギー

ベリリウム
ホルムアルデヒド
プラスチックゴム原材料 : エチレンジアミン，
即時型過敏症（Ⅰ～Ⅲ型反応） 無水トリメリト酸，無水フタル酸，ジイソシネアート類
綿，木材，穀物，タンパク質製剤等粉塵

遅延型過敏症（Ⅳ型反応）ディーゼル排気微粒子
重金属 : 白金，ニッケル，クロム，コバルト，水銀
ジニトロクロロベンゼン，オキサゾロン，
パラフェニレンジアミン，ジブチルスクアラート（SADBE），
ジフェンシプロン（DPCP）

文献 1 より引用，一部改変

疫毒性を評価されることなく市場に流通していれらの細胞の中でも，免疫反応成立の根幹を担る．現在，化学物質によるアレルギー性接触皮膚う 3 種類の細胞に着目して免疫毒性予測試験法を炎，喘息，アレルギー性鼻炎，アトピー性皮膚炎開発した．それらは①外界と接し化学物質に直接の増加や膠原病様症状の誘発など，免疫毒性が原曝露される上皮細胞，②免疫の司令塔である樹状因と考えられる障害は後を絶たない．

細胞，③樹状細胞から刺激を受けて Th 1，Th2，

わ れ わ れ は，2006 ~2010 年 度 ま で 行 わ れ

Th 17 や制御性 T 細胞
（Treg）など異なる機能を担た（独）新 エ ネ ル ギ ー・ 産 業 技 術 総 合 開 発 機 構

う細胞に分化し，種々の免疫疾患のエフェクター（NEDO: New Energy and Industrial Technology

もしくは調節を行う T 細胞である（図 1）．

Development Organization）受託事業「高機能簡

化学物質が免疫毒性を発揮する分子レベルのメ

易型有害性評価手法の開発」において，これまで

カニズムは，大きく二つに分類される．一つは，主として行われてきた実験動物を用いた免疫毒性

主として医薬品等の限られた化学物質が免疫担当

評価手法に代わり，化学物質の免疫毒性発現機序

細胞の受容体や細胞内のシグナル伝達物質などにの分子レベルでの解析に基づく，培養細胞を用い特異的に作用し，その細胞の機能を変化させて免た高機能かつハイスループット型の新たな免疫毒

疫毒性を誘発する「特異的作用」
である．もう一つ性評価法の樹立を目標に研究を行ってきた．本稿は，化学物質が細胞を構成する DNA やタンパクではその一部を紹介したい．

質，膜脂質など生体構成分子を修飾することにより誘導される細胞ストレス反応を介して免疫関連

本研究で注目した免疫反応

細胞へ影響を及ぼし，免疫毒性を誘発する「非特免疫反応には，T 細胞，B 細胞，NK 細胞，樹異的作用」
である．前者による免疫毒性解析には，状細胞，マクロファージ，肥満細胞，上皮細胞な標的となっている分子それぞれに対応した評価系

ど種々の細胞が関与する．本研究においては，そが必要となるため，本研究においては後者の細胞36

トピックス

図1

細胞レベルでの化学物質による免疫毒性発症メカニズム

表2

免疫毒性評価遺伝子のまとめ

Cell

RefSeq

Gene…Symbol

Description

NM_ 000575

IL- 1αInterleukin 1 ,…alpha

NM_ 000576

IL- 1βInterleukin 1 ,…beta

NM_ 000584

IL- 8Interleukin…8

NM_ 005746

NAMPT…
（PBEF 1）Nicotinamide…phosphoribosyltransferase

NM_ 002133

HMOX 1…
（HO- 1） Heme…oxigenase…
（decycling）…1

NM_ 000576

IL- 1βInterleukin 1 ,…beta

NM_ 000600

IL- 6Interleukin…6…
（Interferon,…beta 2）

NM_ 000584

IL- 8…
（CXCL 8）Interleukin…8

NM_ 002133

HMOX 1…
（HO- 1） Heme…oxigenase…
（decycling）…1

NM_ 000594

TNF…
（TNF- α）

Tumor…necrosis…factor

NM_ 000619

MoDC

Keratinocyte

IFN-γ

Interferon,…gamma

NM_ 000586
T…cell（Down-regulate） NM_ 000589

IL- 2Interleukin…2

IL- 4

Interleukin…4

NM_ 000879

IL- 5Interleukin…5

ストレス反応を介して生じる免疫毒性を対象に評イで網羅的に解析した．得られた結果から，定量価系を構築することを試みた．

PCR やタンパク質アレイによる確認を行い，再現性が取れた標的遺伝子候補の中から，さらにバ

免疫毒性評価細胞の樹立と測定方法

イオインフォマティクスや文献情報等による検討

1）評価遺伝子候補の選択を行い，免疫毒性評価遺伝子を選定した．選定しはじめに，化学物質の刺激によって変動する遺た評価遺伝子を表 2 に示した．本研究で選定した伝子の候補の選定を行った．検討には，市販の正遺伝子は，複数の化学物質による刺激で共通の遺常ヒト表皮角化細胞（上皮細胞），もしくはヒト

伝子変動が誘導され，さらにはバイオインフォマ

末梢血から分離した細胞（樹状細胞および T 細胞）

ティクスに基づく検討により，免疫反応に重要なを使用し，代表的な免疫毒性物質である 2, 4 - ジ

役割を果たしていると考えられる．これらの結果

ニトロクロロベンゼン（DNCB），ニッケル化合は，免疫毒性を有する個々の化学物質が，免疫担物（NiCl 2，NiSO 4）など計 5 種類の物質で刺激し当細胞を化学物質固有の伝達経路で刺激し，全くた．刺激後，直ちに total RNA 等各種サンプルを

異なった免疫関連遺伝子の発現変動を誘導するの回収し，遺伝子発現の変動を DNA マイクロアレ

ではなく，異なった化学物質でもいくつかの共通37

秦野研究所年報 Vol. 35. 2012

した免疫関連遺伝子の発現を誘導することを示唆

SLG， オ レ ン ジ : SLO， 赤 : SLR）に， そ れ ぞ れしている．この結果は，膨大な数の化学物質に由hygromycin，neomycin（G418）および puromycin

来する免疫毒性を比較的限られた指標で評価できの各選択抗生剤に対する耐性遺伝子マーカーを含むる可能性を示している．

遺伝子配列カセットを導入した．この際，哺乳類由2）多色発光ルシフェラーゼアッセイ系の樹立

来細胞において安定発現させる目的で，SV40プロ

次に，選定した複数の評価遺伝子に対して，発モーターおよびHSVtK polyA配列を同時にベクター

現調整を解析できる免疫毒性評価細胞の作製をに挿入し，発光プローブ基本ベクターを構築した．

行った．実際には，免疫毒性評価遺伝子の転写領

さらに，挿入された薬剤耐性遺伝子のタンパク質へ域の下流に各色ルシフェラーゼ遺伝子を導入したの翻訳効率を高めるため，薬剤耐性遺伝子オープン

プラスミド（発光プローブ）を作製し，これらのプ

リーディングフレームの開始メチオニンの上流にコラスミドを上皮細胞，樹状細胞，T 細胞の長期培

ザック配列を導入した．

養細胞株である HaCaT（ヒト上皮角化細胞株 : 非

2 - 2）
プロモーター領域のクローニング

腫瘍形成性），U 937（ マクロファージ細胞株 : 性各遺伝子のプロモーター領域のクローニング

質が樹状細胞と類似しており，その代用としてを行うに当たり，各免疫毒性評価遺伝子の転写用いられることが多い），THP-1（ ヒト単球性白開始点を mRNA 転写開始点データベース DBTSS

血病細胞株 : 樹状細胞様の感作性応答を示す）や（http://dbtss.hgc.jp/）を用いて検索した．続いて，Jurkat（ヒト T 細胞性白血病細胞株）に導入する

ヒト由来ゲノム DNA から各免疫毒性評価遺伝子

ことにより安定細胞株を樹立した．

のプロモーター領域を PCR でクローニングし，本 研 究 で は， 培 養 細 胞 1 種 類 に つ き， 免 疫

目的領域を取得した．次いで，クローニングした

毒 性評価遺 伝子 1～2 種 類 と デー タ 標準 化 のた

各遺伝子のプロモーター領域を，先に構築した各め の 内 部 標 準 遺 伝 子 で あ る G3PDH も し く はベクターにライゲーションした．構築した各プラ

Thymidine kinase（TK）の各プロモーター領域を

スミドは，挿入部位の 5’および 3’領域のシーク持つプラスミドを導入してレポーターアッセイ系を

エンス解析を行い，目的配列の挿入を確認した．

構築した．今回，主として用いたMultiReporter2 - 3）遺伝子導入および多色発光安定細胞株の樹立

Assay System -Tripluc （東洋紡績，大阪）に構築した発光プラスミドをホスト細胞へ導入

含まれる緑色（最大発光波長λ max= 550 nm），

し，
安定細胞株を樹立した．本項では一例として，橙色（λ max= 580 nm），赤色（λ max= 630 nm）

Jurkat# 2 H4 について述べる．

®

の各色発光ルシフェラーゼは全て D- ルシフェリ

ヒト T 細胞由来の多色発光安定細胞株では，ンを基質とし，色分離測定によって一度の測定でホスト細胞としてヒト T 細胞株 Jurkat（ATCC，

最大 3 種類までのレポーター酵素の活性を測定す

Manassas，USA）を使用した．Jurkat 細胞へのることが可能である．樹状細胞と表皮細胞の遺伝子導入には，リポフェクション法を用いた．

いずれにおいても評価遺伝子である HMOX 1 がホスト細胞へは，最初に内部標準である G 3 PDH

入る組み合わせについては，転写領域をクローニ

プロモーター-SLR を導入した．導入後，一次選ングしてルシフェラーゼ遺伝子（luc 2）発現ベク

択として選択抗生剤存在のもと，1 週間培養を

ター pGL 4.17
（Promega，Madison，USA）に当行った．続く二次選択として，一次選択培養で該領域を挿入した．また，内部標準化遺伝子と生存した細胞を 96 ウェル細胞培養用プレートにして TK 遺伝子の転写調節領域をルシフェラーゼ

1 ウ ェ ル あ た り 1 cell も し く は 100 cells で 播 種（hRluc）発 現 ベ ク タ ーpGL 4. 82（Promega）に 挿し，選択抗生剤存在のもと，2 週間培養した．二入し，ホスト細胞に導入した．

次選択培養後，シグナル強度および陽性化学物質

2-1）発光プローブ基本ベクターの作製（PMA および ionomycin）処理によるシグナル誘

3 , 4）

免 疫 毒 性 評 価 細 胞 の 樹 立 に あ た り， 発 光 プ

導の 2 点から良好なラインの選択を行って 1 色安

ローブ遺伝子を評価対象となる培養細胞に安定

定細胞株を樹立した．その後，IFN-γプロモー

導入するため，3 色の発光プローブ遺伝子（緑 :ター-SLO，IL-2 プロモーター-SLG を同様の手

38

トピックス

表3樹立した発光安定細胞株

Host cell line

ColorsNormalizationgene

1 color

G 3 PDH-SLR
G 3 PDH-SLR

2 colorJurkat3 color1 color
U 937

THP- 1

図2

Establishedcell lines−−# 14 D 1

IL- 4 -SLG

−

#4A4

G 3 PDH-SLR

IFN-γ-SLO−# 2 B 12G 3 PDH-SLR

IL- 4 -SLG

IFN-γ-SLO# 10 C 6

G 3 PDH-SLR

IL- 2 -SLG

IFN-γ-SLO#2H4

G 3 PDH-SLR−−#UGA 122 color

G 3 PDH-SLR

IL- 1β -SLG−

# 6 c 123 color

G 3 PDH-SLR

IL- 1β -SLG

IL 8 -SLO# 6 c 121 color

TK-hRluc

−

−

#UR 2

2 color

TK-hRluc

HMOX 1 -luc 2−#UR 2 H 4117

1 color

G 3 PDH-SLR−−#TGC 17G 3 PDH-SLR

IL- 1β -SLG−

#TGC 17 bA 16 , 19

G 3 PDH-SLR

IL- 8 -SLO−

#THP-G 8

2 color

HaCaT

Target gene 2

Target gene 1

3 color

G 3 PDH-SLR

IL- 1β -SLG

IL 8 -SLO#THP-G 18

1 color

TK-hRluc−−−

2 color

TK-hRluc

HMOX 1 -luc 2−#HR 38 H 6

測定方法

順でホスト細胞に導入し，最終的に 3 色安定細胞

ンキュベートする．ただし，化学物質を添加し株 Jurkat#2H4 を樹立した．

て 1 時 間 後，Jurkat#2H 4 に つ い て は 抗 原 刺 激

このようにして樹立した各種安定細胞株は，両として PMA と ionomycin による活性化処理が，鎖解析によるシークエンス解析を行い，各プラスミ

U 937 # 6c12 については LPS による活性化処理

ドがゲノムDNAに挿入されていることを確認した．

が，それぞれ必要である．インキュベート終了後，

これまで樹立した細胞の一覧は表3の通りである．

Tripluc® Luciferase Assay Reagent（東洋紡績）な2-4）測定方法

ど，D- ルシフェリンを基質とする発光試薬をウェ実験の概略を図 2 に示した．試験前々日もしく

ルに添加し，Phelios（ アトー，東京）などのルミは前日に継代および培地交換した各種細胞を，1ノメーターを用いて発光量を測定する．このようウ ェ ル あ た り 1 × 10 ～1 × 10 cells/100 µL とに，本測定系は処理から測定まで半日程度で終了なるように，各種選択抗生剤，抗菌剤を除いたすることが可能なため，将来的にハイスループッ培地を使用して，96 ウェル黒色プレートに播種ト化が期待できる．また，本システムに使用した

する．次いで各種化学物質溶液を各ウェルに添

ベクターに含まれる各色ルシフェラーゼは，前述

加し，37℃，5% CO 2 の条件で 4～6 時間程度イの通りその発光色を問わず D- ルシフェリンを発

4

6

39

秦野研究所年報 Vol. 35. 2012

表4

IL- 8 Luc assay で定義したパラメーター

略語

パラメーター定義

SLO-LASLO ルシフェラーゼ活性

SLR-LASLR ルシフェラーゼ活性nSLO-LASLO-LA / SLR-LA（SLO-LA 値を SLR-LA 値で除した値 = 内標で補正した値）

I.I.-SLR-LA

化学物質処理有の SLR-LA / 化学物質処理無の SLR-LA（化学物質処理の有無による SLO-LA の変化）

FlnSLO-LA

化学物質添加時の SLO-LA / 無添加時の SLO-LA（化学物質処理の有無による nSLO-LA の変化）

I.I.

NAC 存在下の FInSLO-LA / NAC 非存在下の FInSLO-LA(Inhibitory Index) （NAC の有無による FInSLO-LA の変化）

光基質として利用するため，1 回の操作で複数の活性の測定が可能な THP-G8 安定細胞株を用い発光を測定できるが，光学フィルターを装着したて，感作性試験代替法の可能性を検討した．

ルミノメーターの使用が必要である．

解析方法は IL- 8 評価細胞の応答性の検討で確立した方法に従い，まず額田ら 13）の報告にある

多色発光安定細胞株を利用した

15 種類のハプテンと，7 種類の非感作性物質に関

免疫毒性評価システムの構築

して THP-1#THP-G8 の応答性を検討した．表 4

1）感作性試験代替法 ; THP-G 8 安定細胞株

5）

免疫毒性の 1 種である感作性を評価する感作性に，検討に際して設定したパラメーターの一覧を示した．

試験代替法は，接触皮膚炎感作相におけるハプテ

その結果，化学物質を添加して6時間後，代表的ンの免疫系に及ぼす作用メカニズムに基づいて開なハプテンの一種であるDNCBやニッケル化合物

発されている．感作相におけるハプテンは，その（NiSO4）においてSLO-LAの有意な上昇が認められ

親電子性物質としての特性から，①抗原提示細胞

た．また，定量PCRでの結果も同様であり，いず

表面の主要組織適合性（MHC）抗原上の自己ペプれの反応も濃度依存的であることが示された．

チドと反応し，T 細胞により認識される抗原決定またこれまでの研究により，われわれは感作性

基（エピトープ）を形成，②活性酸素の産生や，樹物質による樹状細胞の成熟化は，抗酸化剤の一種

状細胞表面のチオール基と反応し当該細胞を活性で あ る N-acetylcycteine（NAC）に よ っ て 抑 制 さ化，③樹状細胞や表皮細胞を刺激してアデノシン

れることを既に報告した 14 , 15）．一般的に樹状細三リン酸（ATP）などの免疫応答を誘導するシグ

胞に化学物質刺激を与えると，共刺激分子の発現

ナルを放出させることが知られている．

上昇やサイトカインの産生が誘導されるが，その現 在， 感 作 性 試 験 代 替 法 と し て，ECVAM

シ グ ナ ル と し て p38 mitogen-activated protein（European Centre for the Validation ofkinase（p38 MAPK）の活性化（リン酸化）が必要

Alternative Methods）に よ り direct peptideである．そこで，化学物質がヒト樹状細胞に対しreactivity assay（ DPRA） や human cell lineて p38 MAPK の上流シグナルとされる細胞内酸

activation test（ h-CLAT）

化ストレスを誘導するかについて，細胞内グルタ

6）

7 , 8）

お よ び myeloidのプチオン比（GSH: 還元型 / GSSG: 非還元型）
を測定

レバリデーションが行われているが，いずれも正することにより検討した．その結果，感作性物質

確性，簡便性，迅速性などの観点から問題点を残では GSH/GSSG 値は低下し，かつ p 38 MAPK のしているとされる．そのような中で，最近新リン酸化を確認できたが，非感作性物質では細胞

たにハプテンと非感作性物質とを区別する分子内グルタチオン比の変動，およびリン酸化についマーカーとして，IL- 8 が多くの研究者により注ては確認されず，その反応は長期継代培養細胞株

目されているである THP-1 においても同様に認められた．グU937 skin sensitization test
（MUSST）

9 , 10）40

11）．そこで，IL-8 プロモーター

10, 12 , 13）

トピックス

図3

IL- 8 Luc assay における感作性物質と非感作性物質の違い（文献 5 より引用、一部改変）

THP- 1 #THP-G8 に対し，各種化学物質刺激 30 分前に NAC を添加した（+）．続いて，感作性物質（DNCB，および非感作性物質（1-BB; 1-bromobutane）で 6 時間刺激し，ルシフェラーゼ活性を測定した．
NiSO 4）***（NAC 非存在下の 1 要因による one-way ANOVA）:p< 0 . 001###（NAC 非存在下，存在下の 2 要因による two-way ANOVA): p< 0 . 001

ルタチオンは NAC から合成され，NAC の添加に

Jukat# 2 H4 および U 937# 6c 12 を併用して，多より細胞内グルタチオンの比率を上げると，活性面的な免疫毒性評価の構築を試みた．

酸素の発生が抑制されることは既に知られてい2 - 1）IL-2/IFN-γレポーター細胞（Jurkat#2H4）とる．また，IL- 8 の産生には p 38 MAPK の関与

16）

IL- 1β/IL- 8レポーター細胞（U 937 # 6 c 12）が必要であるという報告もなされていることからに導入した免疫毒性評価遺伝子の特徴，THP- 1#THP-G8 においても，感作性物質おT 細胞での毒性評価遺伝子として選択した IL-2

よび非感作性物質刺激によるルシフェラーゼ活性および IFN-γは以下のような特徴を持つ．IL-2 はが，NAC の添加により変化するのではないかと

抗原やマイトジェン刺激された Th1 細胞や NK 細いう仮説を立てた．そこで，化学物質刺激 30 分胞等から産生される．T 細胞において IL-2 は抗原

前に NAC を加えたところ，SLO-LA の上昇は感受容体を介する主要シグナルに加え，CD28 等の作性物質で有意に抑制されるが，非感作性物質で副受容体からの副シグナルが入って初めて産生さは抑制されないことが判明した（図 3）．

れる機構を持ち，活性化 T 細胞増殖因子であると

17）

そこで，われわれは ECVAM が提案した感作性試験代替法正確性評価のための化学物質リスト

ともに NK 細胞の増殖・分化および活性化にも重18）

要な役割を果たす 19）．また，IFN-γは活性化シグにある 16 物質を本方法で検討したところ，10 種

ナル刺激を受けた NK 細胞や T 細胞から一過性にの感作性物質のうち 8 物質を，4 種の非感作性物

産生され，ほぼ全ての免疫応答や炎症応答に関与

質のうち 4 物質の感作性を正しく判定することがする多指向性のサイトカインであり，T 細胞や Bできた．本方法は，短時間で多検体を処理するこ細胞，NK 細胞など様々な細胞の活性化や増殖，とが可能であり，感作性試験代替法としての有分化に関与している 20）．このように IL-2 および用性が示唆されたことから，本方法を「IL- 8 Luc

IFN-γは，免疫系には必須のサイトカインである．

assay」と呼称し，現在 OECD テストガイドライ

また，樹状細胞での評価遺伝子として選択したン（TG）化を視野に入れ，複数機関によるバリデー

IL-1βは炎症性サイトカインの一つであり，単球ションを行っている．

やマクロファージから産生される 21）．そのシグ

2）多面的免疫毒性評価システム ;ナルを受けて IL-2，IL-3 や IL-6 などのサイトカ

Multi-ImmunoTox assay

インが産生され，B 細胞や T 細胞における炎症反複雑な免疫系におよぼす化学物質の毒性評価に応が誘導される．IL-8 も IL-1βの刺激を受けては，可能な限り多面的な解析が求められることか

各種細胞から産生されるケモカインの一つであら，われわれは先に樹立した免疫毒性評価細胞

り，炎症反応のメディエーターとして，免疫関連41

秦野研究所年報 Vol. 35. 2012

表5

多面的免疫毒性評価（Multi-ImmunoTox assay）で定義したパラメーター

略語

パラメーター定義

SLG（SLO）-LA

SLG（SLO）  ルシフェラーゼ活性

SLR-LASLR ルシフェラーゼ活性nSLG（nSLO）-LA

SLG（SLO）-LA / SLR-LA（SLG-LA（SLO-LA）値を SLR-LA 値で除した値 = 内標で補正した値）

FInSLG（FlnSLO）-LA活性化処理有の nSLG（nSLO）-LA / PMA/Ionomycin 処理無の nSLG（nSLO）-LA（活性化処理の有無による nSLG（nSLO）-LA の変化）

SLG（SLO）抑制率（%）（1 - 化学物質処理有の FlnSLG（SLO）-LA / 化学物質処理無の FlnSLG（SLO）-LA）× 100（化学物質処理の有無による FlnSLG（SLO）-LA の変化）

細胞に対する様々な活性が報告されている 22）．

中程度に分類された．この結果は，われわれがヒ

免疫学的にも非常に重要な役割を果たすこれら

ト末梢血から分離・精製したＴ細胞を用いて検討の標的遺伝子のプロモーター領域を組み込んだ

した結果と概ね一致していた 23）．一方で，免疫各色発光プラスミドを長期培養細胞株 Jutkat お

反応を Th 2 優位に導くことが知られている医薬

よ び U937 に 導 入 し， そ れ ぞ れ Jurkat#2 H 4 と品および環境化学物質では 23 , 24），比較的高い抑U937#6c12 の多色安定細胞株を得た．

制率が得られた．図 4 に示すように，作用機序が2-2）多面的免疫毒性評価

既知である免疫毒性物質のパターンと比較するこ評 価 に 先 立 ち，THP- 1#THP-G8 と 同 様 に パとにより，新規の化学物質の免疫毒性作用を推測

ラメーターの定義を設定した．Jurkat# 2H 4 でできる可能性が示唆された．加えて，われわれはは，PMA/ionomycin に よ る 活 性 化 処 理 前 後，

Jurkat# 2 H4 を使用し，ニッケルによる T 細胞かU937#6c12 で は LPS に よ る 活 性 化 処 理 前 後らのサイトカイン産生の抑制作用を新たに見出し

で，FInSLG-LA お よ び FInSLO-LA を 求 め， そた 25）．このように，これら評価細胞を使用する

れぞれに対して化学物質処理前後の抑制率（%）

ことにより，様々な免疫毒性作用を解析する手がを計算した．免疫抑制の程度を，抑制率を指標かりが得られることが示唆された．

と し て Null（N）; +5 < x ≤ 5，Weak（W）;5<x≤ 25，Moderate（W）; 25 < x ≤ 75，Strong（S）; x

まとめと今後の展望について< 75 と定義した．また，化学物質により免疫系

化学物質に対する免疫毒性の評価は，医薬品，が 賦 活 化 し た 場 合， つ ま り FInSLG-LA も し く

化粧品などの開発分野以外では，現在まであまり

は FInSLO-LA が 1. 05 より大きくなる場合には顧みられてこなかった．その免疫毒性評価方法のAugmentation（A）と定義した．定義したパラメー

多くは，動物実験に依存したもので，現時点では

ターを表 5 に示した．

数万とも言われる化学物質のハザードを免疫毒性

前 述 の 通 り 設 定 し た 評 価 基 準 に 基 づ き，の観点から適切かつ迅速に評価できるスクリーニ

Jurkat#2H 4 および U 937 #6 c12 を用いて 21 種

ング方法は存在しない．近年，化学物質の免疫毒類の化学物質を評価した（表 6）．その結果，本方性発生機序の分子レベルの知見に基づく，培養細法により医薬品や環境化学物質など，多くの化学胞を用いた高機能かつハイスループットな新規評

物質の免疫作用を評価することができた．加え価方法が注目されており，本安定細胞株はその方て，SLG-LA 抑制率ないし SLO-LA 抑制率により，法を提供できるものである．

免疫抑制の「質」まで評価できる可能性が示唆され本研究においては，化学物質が免疫系に有害作

た．実際，臨床治療に用いられている免疫抑制剤

用を及ぼした際の指標となり得る遺伝子をトキシについて，T 細胞から産生されるサイトカインのコゲノミクスの手法により抽出し，免疫毒性評価

抑制効果を比較したところ，Cyclosporin A の抑遺伝子として樹状細胞では IL-1α，IL-1β，IL- 8

制効果が強度に，抗炎症剤の Dexamethasone，など 5 遺伝子，表皮細胞では Heme oxigenase 1

抗がん剤の Mitomycin C および Methotrexate が（HMOX 1）な ど 5 遺 伝 子，T 細 胞 で は IL- 2 や42

トピックス

表6

多面的免疫毒性評価（Multi-ImmunoTox assay）による免疫毒性物質の評価
Jurkat# 2 H 4

分類

化学物質

IL- 2
抑制率

U 937 # 6 c 12

IFN-γ
免疫抑制
抑制率 （IL- 2 /IFN-γ）

IL- 1β
抑制率

27
28
14
22

15
22
+ 14
11

M/W
M/W
W/A
W/W

+ 10
3
34
+ 15

12
13
3
+9

A/W
N/W
M/M
A/A

Dexamethasone
Cyclosporin A
Mitomycin C
Vitamin D 3
Azathioprine
Cyclophosphamide
Methotrexate
Mizoribine

41
100
46
+1
22
15
47
8

11
65
0
8
17
5
34
13

M/W
S/M
M/N
N/W
W/W
W/N
M/M
W/W

23
+ 12
3
+ 78
5
+2
+5
+4

53
+ 28
+ 59
+ 243
+ 20
+ 20
+ 20
8

W/M
A/A
N/A
A/A
N/A
N/A
N/A
N/W

NiCl 2
環境化学物質 Formaldehyde
Diesel exhaust particles（DEP）

75
45
67

65
+1
18

S/M
M/N
M/M

26
+ 67
+ 59

+ 61
+ 154
19

M/A
A/A
A/W

94
92

49
10

S/M
S/W

40
4

28
+ 118

M/M
N/A

IL- 10
IL- 4
サイトカイン
IFN- γIP- 10

医薬品

IL- 8
免疫抑制
抑制率 （IL- 1β/IL-8）

金属

BaCl 2
MnCl 2
ZnCl 2
FeCl 2

82
92

34
51

S/M
S/M

13
3

+ 207
+ 35

W/A
N/A

その他

Trimellic anhydrate+ 82
Dinitrochlorobenzene（DNCB） + 100

+ 18
+ 39

A/A
A/A

+1
23

+ 10
13

N/A
W/W

免疫抑制: Null（N）
; +5 < x ≤ 5，Weak（W）; 5 < x≤ 25，Moderate（M）; 25< x ≤ 75，Strong（S）; x < 75，Augmentation（A）; + 5 <x

図4

Jurkat# 2 H 4 と U 937#6c12 を用いた多面的免疫毒性評価（Multi-ImmunoTox assay）

各遺伝子に示される矢印は発現の変動を示す．

43

秦野研究所年報 Vol. 35. 2012

IFN-γ など 4 遺伝子を同定した．それらのうち，に適した安定発現株を取得できる可能性がある．

HMOX 1，IFN-γ ，IL- 4，IL- 2，IL- 1β，IL- 8

この HAC ベクターを利用した多色発光安定細胞などについては，免疫毒性評価のための多色発株については，現在詳細な実験条件等について検光安定細胞株を樹立した．IL-8 レポーター細胞

討を行っている．

（THP- 1#THP-G 8）を用いた IL-8 Luc assay は感

このように，種々の免疫系の特徴を持つ複数の作性試験代替法としての有用性が明らかとなり，

安定細胞株を用いた化学物質の免疫毒性の検出系

今後多施設でのバリデーションを経て OECD TG

は，総合的なリスク評価において，非常に有用で化 を 目 指 す 予 定 で あ る． 一 方，IL- 2/IFN-γ レあることが示唆される．本研究は，化学物質のリポーター細胞（Jurkat# 2H4）および IL- 8/IL- 1β

スク評価のための新たな検出方法として寄与する

レ ポ ー タ ー 細 胞（U 937 # 6 c12）を 用 い る Multi-

ものであり，今後，免疫毒性分野における化学物

ImmunoTox assay は，免疫毒性を多面的に評価

質の新規毒性評価方法についての更なる研究の発できる可能性があり，実用化に向けて更なる検討

展が期待される．

を重ねていく予定である．以上の樹立細胞および免疫毒性評価系は国内・国際特許が既に認められ謝辞ている（発明名称 ; 多色発光を用いた免疫毒性評

本 研 究 は，2006 ~ 2010 年 度 NEDO 受 託 事 業価システム , 国内出願番号 ; 特願 2010- 151362 ,「高機能型有害性簡易手法の開発」（食品薬品安全国際出願番号 ; PCT/JP 2011/ 065090）．本稿でセンター秦野研究所 田中 憲穂 PL）の一部としては割愛したが，ストレスセンサーともいわれる行われました．ここに関係各位に対し，心より厚HMOX1 レポータ ー細 胞（#HR38H 6）を 用い たく御礼申し上げます．

HMOX1 assay は，活性酸素産生酸化還元バラン
ス，小胞体ストレスなど細胞にストレスを与える

文献

化学物質のスクリーニング系としての有用性があ1)

ると考えられる．

2)

本研究で用いた多色発光システムは，内部標準とは別に 2 つのレポーターまでが評価でき，2 種

Gell PGH, Coombs RRA eds: Clinical Aspects of
Immunology 1 st ed. Oxford. UK: Blackwell, 1963

3)

Nakajima Y, Kimura T, Sugata K, et al.: Multicolor
luciferase assay system: one-step monitoring of

類の標的遺伝子を全く同じタイミング，かつ厳密

multiple gene expressions with a single substrate.

に同条件で比較することができるものであり，多くの化学物質を迅速に，多方面から解析する点に大沢基保 : トキシコロジーフォーラム . 8: 684, 1986

Biotechniques. 2005; 38: 891-894
4)Noguchi T, Ikeda M, Ohmiya Y, et al.: Simultaneous

おいて大きな利点になると考えられる．ホスト細monitoring of independent gene expression patterns

胞や標的遺伝子の組み合わせによって，様々な免in two types of cocultured fibroblasts with different
color-emitting luciferases. BMC Biotechnol. 2008;

疫系の特徴を持ち合わせた複数パターンの安定細胞株の樹立が可能になり，特徴の異なる複数の安定細胞株を樹立することができた．また，本プロ

8: 40
5)

Takahashi T, Kimura Y, Saito R, et al.: An in
vitro test to screen skin sensitizers using a stable

ジェクトにおいては，鳥取大学の押村光雄教授やTHP- 1 -derived IL- 8 reporter cell line, THP-G 8 .

大林徹也准教授らが研究を進めてきたヒト人工染

Toxicol Sci. 2011 ; 124 : 359 -369

色体
（HAC: Human Artificial Chromosome）
ベク

6)

ターを用いての多色発光安定細胞株を樹立する系

screening contact allergens: a classification treeも既に成功している（データ未発表）．HAC ベク
ターは細胞中で単一コピーの自律的な染色体として機能するベクターであり，遺伝子の導入サイズに制限がない．加えてランダムインテグレーショ
ンによるホストゲノムの破壊がなく，本来の遺伝子発現が損なわれないという利点を有し，評価系
44

Gerberick GF, Vassallo JD, Foertsch LM, et al.:Quantification of chemical peptide reactivity formodel approach. Toxicol Sci. 2007; 97: 417-427

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トピックス

8)

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9)758- 764
17) Megherbi R, Kiorpelidou E, Foster B, et al.: Role

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10 ) Python F, Goebel C, Aeby P: Assessment of
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