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カンジダ選択分離培地の簡易同定に関する比較検討○塚口池本扶美枝１），木下敏行１），九嶋愛１），谷川翔平１），藤村晴香１），清水馨１），林亮治１）１）滋賀医科大学医学部附属病院検査部〒520-2192

滋賀県大津市瀬田月輪町

滋賀医学検査2022 vol.12 №１
公益社団法人滋賀県臨床検査技師会裕司１），

第44回滋賀県医学検査学会特集号 投稿論文

技術論文

カンジダ選択分離培地の簡易同定に関する比較検討○塚口九嶋扶美枝１），木下愛１），谷川翔平１），藤村晴香１），清水馨１），林裕司１），池本敏行１），亮治１）

１）滋賀医科大学医学部附属病院検査部〒520-2192

滋賀県大津市瀬田月輪町

Key words
Candida，選択分離培地，発育支持能，鑑別性能【要約】

Candida属は宿主側の要因によって重篤な病態を呈するカンジダ感染症を起こすため，迅速かつ適切な抗真菌薬の投与が必要である。しかしCandida属は菌種により抗真菌薬の感受性が異なるため迅速かつ正確な菌種同定が重要となる。今回我々は迅速かつ正確な菌種同定が可能であるかを検証するため，5種類のカンジダ選択分離培地を用いて簡易同定に関する比較検討を行った。標準菌株３菌種を用いたMiles&Misra法による発育支持能試験ではすべての培地において同等の発育支持能を示した。臨床分離株 62株を用いた色調や形態による鑑別性能では同定一致率に大きな差は認めなかった。臨床上重要であるCandida albicansとnonalbicans Candida鑑別に関してもすべての培地において24時間培養での同定一致率が良好であり，迅速簡易同定が可能であることが示唆された。しかし，各培地に発育したコロニーの色調，発色に要する時間や形態など異なる特徴があり，各施設の運用方法に適した培地を選択する必要があると考える。

I はじめにもしくは低感受性を示すなど，菌種により抗真菌薬のカンジダ感染症はCandida属の特定の菌種によっ感 受 性 が 異 な る １）。Clinical Laboratory Standardsて原発性または続発性に引き起こされる。病原性

Institute（CLSI）２）のCandida属感受性検査の基準

Candida属菌種はヒトに親和性が強く，消化管，上は現在M27-S４であり，菌種ごとのMIC値およびカ気道，膣などの粘膜や，全身の皮膚の表面にしばしテゴリーが異なる。従って，カンジダ感染症に対しば常在菌として定着している。そのため，宿主側のて迅速かつ正確な菌種同定が重要となっている。近様々な要因（免疫力の低下，抗がん剤や免疫抑制剤

年，コロニーの色調などから迅速かつ簡易に同定可の投与による好中球減少期間の遷延，広域抗菌薬の能なカンジダ選択分離培地が各社から開発されてき長期使用による日和見感染，体内留置医療器具等のた。今回我々は，５種類のカンジダ選択分離培地を汎用）によって重篤な病態を呈し，死亡率が高いカ用い，発育支持能および鑑別性能について評価し，ンジダ血症や播種性カンジダ症を起こすことが知ら

迅速簡易同定に有用であるかを検討したので報告すれている。従って，迅速かつ適切な抗真菌薬の選択る。

が重要である。また，Candida albicansの標準治療薬 がamphotericinB（AMPH-B）とfluconazole（FLCZ）

II対象および方法である一方，
Candida glabrataやCandida kruseiでは

１．比較検討培地

FLCZに対して耐性もしくは低感受性であること，比較検討培地は，CHROMagar CandidaⅡ寒天培

Candida guilliermondiiで はAMPH-Bに対して耐性地（日本ベクトン・ディッキンソン，以下Candida2

滋賀医学検査Vol.12. No.1

第44回滋賀県医学検査学会特集号 投稿 論 文Ⅱ），XM-Candida寒天培地（日水製薬，以下XM），

Candida metapsilosis １株である。いずれも質量分Ⓡ

ポアメディア Vi Candida寒天培地（栄研化学，以析装置MALDI Biotyper（ブルカージャパン）を用下Vi），バイタルメディアカラーCandida寒天培地

い てmatrix-assisted laser desorption/ionization time

（ 極 東 製 薬 工 業， 以 下 カ ラ ーCa），CHROMagarof flight mass spectrometry（MALDI-TOF MS）

Candida（関東化学，以下CHROMagar）の５種類により同定を実施し，Score value 2.00以上の結果のカンジダ選択分離培地を用いた。

が 得 ら れ た 菌 株 を 用 い た（ ソ フ ト ウ ェ アversion

２．Miles&Misra法による発育支持能試験

MBT Compass 4.1，ライブラリー Ver.7.0.0.0 使用）。

標準菌株３菌種（C. albicans ATCC 90028，Candida

各菌株をMcFarland No. 1.0に調製後，各培地に画

tropicalis ATCC 750，Candida parapsilosis ATCC

線塗抹し，35℃好気培養を実施した。24時間後と4822019）を用いて比較検討培地の発育支持能試験を時間後に発育したコロニーの色調と形態を観察し，行った。菌液は，滅菌生理食塩水にてMcFarland

メーカー配布資料と見本培地（典型的な発色を示す３）に準拠して，10菌株を画線塗抹し培養した培地）を参照に簡易同定−1から10−7までの希釈系列を作成した。各希釈菌液を実施，MALDI-TOF MSとの同定一致率を求めた。

を20μLずつ検討培地に滴下し，35℃好気培養を実簡易同定は微生物検査に従事している検査技師３名施し，24時間後と48時間後に発育したコロニー数を（各技師をA，B，Cと表記）と微生物検査に未経験算定した。の検査技師１名（D）が行い評価した。

No. 0.5に調製後，Miles&Misra法

３．色調および形態による鑑別性能III

検討菌株は当院で分離した臨床分離株 62株を結果

１．Miles&Misra法による発育支持能試験用いた。内訳は，C.albicans 22株，C.glabrata 19株，C.tropicalis ８株，C.parapsilosis ６株，C.krusei ３

標準菌株３菌種を用いたMiles&Misra法による発株，Candida dubliniensis ２株，C.guilliermondii １株，

育支持能試験の結果を表１に示す。いずれの培地，

表１
菌種

時間

24ｈ
C. albicans（ATCC 90028）
48ｈ

24ｈ
C. tropicalis（ATCC 750）
48ｈ

24ｈ
C. parapsilosis（ATCC 22019）48ｈ

滋賀医学検査Vol.12. No.1

培地
CandidaⅡ
XM
Vi
カラーCa
CHROMagar
CandidaⅡ
XM
Vi
カラーCa
CHROMagar
CandidaⅡ
XM
Vi
カラーCa
CHROMagar
CandidaⅡ
XM
Vi
カラーCa
CHROMagar
CandidaⅡ
XM
Vi
カラーCa
CHROMagar
CandidaⅡ
XM
Vi
カラーCa
CHROMagar

Miles&Misra法による発育支持能試験
10-1>100>100>100>100>100>100>100>100>100>100>100>100>100>100>100>100>100>100>100>100>100>100>100>100>100>100>100>100>100>100

10-2
50〜10050〜10030〜49
50〜10050〜10050〜10050〜10050〜10050〜10050〜10050〜10050〜100
30〜49
30〜49
30〜49
50〜10050〜100
30〜49
30〜49
30〜49
50〜10050〜10030〜49
30〜49
50〜10050〜10050〜10030〜49
30〜49
50〜100

10-3
28
29
19
22
28
30
29
19
22
28
20
22
21
7
23
20
22
22
8
23
26
30〜49
1025
24
26
30〜4912
28
24

希釈倍率
10-4
51
1
4451
1
441
331113311453434544
310-5
00100001000010010100000100001010-6
000000000000000000000000000000

10-700000000000
0000
000
0
0
00
0
0
0
0
0
0
00

（CFU/20µL）
3

第44回滋賀県医学検査学会特集号 投稿論文

C. albicans

CandidaⅡC. glabrata

C. tropicalis

C. parapsilosis

C. krusei

24h48hXM

24h48hVi24h48hカラーCa

24h48hCHROMagar
CHROMagar

24h48h

図１

図１各培地における主要 5 菌種の発育コロニー
各培地における主要5菌種の発育コロニー

4

滋賀医学検査Vol.12. No.1

第44回滋賀県医学検査学会特集号 投稿 論 文

菌種も24時間培養と48時間培養ともに10−4まで発育培地を作成して鑑別を行い，その同定一致率と，資を認めた。コロニーの大きさにおいて菌種間差は認料により鑑別した同定一致率を比較し，その結果をめたが，培地間差は認められず，発育支持能に大き図２に示した。同定一致率は多くの培地において，な差は認められなかった。

資料参照により鑑別を行った結果より，見本培地を２．色調および形態による鑑別性能参照に鑑別を行った方が上昇した。特に，24時間培養各培地の発育コロニーを図１に示す。C. albicans，でのC.glabrataのすべての培地，C.albicansのカラー

C.tropicalisおよびC.kruseiでは，24時間培養においCaとCHROMagar，C.tropicalisのCandidaⅡ，Viおて，すべての培地でコロニーの特徴的な色調や形態よびXMで30%以上の上昇を認めた。

が認められた。XMとVi，カラーCa（C.tropicalisの配布資料と比較して見本培地の同定一致率の成績み）では特に強い発色を呈していた。C. glabrataでが優れていたため，見本培地を用いて鑑別を行ったは，24時間培養において，いずれの培地も発色の程同定一致率を，培地と菌種および技師ごとにまとめ度は弱かったが，48時間培養では特徴的な色調や形て表２に示した。C.kruseiの同定一致率は，すべて態が認められた。C.parapsilosisにおいては，24時の培地，技師において，24時間培養，48時間培養と間培養ではいずれの培地も１mm以下の微小コロもに100%であった。C.albicansにおいては24時間培ニーの発育であり，特にVi以外の培地では24時間培養で80%以上，48時間培養では90%以上，C.tropicalis

養と48時間培養ともに薄い色調であった。Viは検討においては24時間培養で75%以上，48時間培養ではした５菌種について，他の培地とは全く異なる色調85%以上であり，この３菌種については高い同定一で あ り， さ ら に 色 調 の 程 度 は 明 瞭 で あ っ た。

致 率 を 認 め た。C.glabrataは24時 間 培 養 で5.3%〜

CandidaⅡ，カラーCa，CHROMagarは48時間培養

94.7%，48時間培養で26.3%〜100%となり，培地間差，では色調の差が明瞭であった。

技師間差を認めた。C.parapsilosisにおいても24時間培養で０%〜66.7%，48時間培養で０%〜83.3%と各メーカーの配布資料は，実際に発育したコロ培地間差，技師間差を認めた。

ニーの特徴が異なる菌種や培地を認めたため，見本10010080806060404020200C.albicans

C.glabrata
24h 資料C.parapsilosis
24h 見本培地

C.tropicalis

48h 資料

0C.krusei

C.glabrata
24h 資料

10010080806060

4040200C.albicans

48h 見本培地

C.parapsilosis
24h 見本培地

C.tropicalis

C.krusei

48h 見本培地

20C.albicans

C.glabrata
24h 資料

C.parapsilosis
24h 見本培地

C.tropicalis

48h 資料

0C.krusei

C.albicans

C.glabrata
24h 資料

48h 見本培地

C.parapsilosis
24h 見本培地

100806040200

48h 資料

C.albicans

C.glabrata
24h 資料

C.parapsilosis
24h 見本培地

C.tropicalis

48h 資料

図２
滋賀医学検査Vol.12. No.1

C.krusei

48h 見本培地

資料と見本培地を用いた同定一致率の比較
548h 資料

C.tropicalis
48h 見本培地

C.krusei第44回滋賀県医学検査学会特集号 投稿論文

表２
菌種
C. albicans（n=22）
C. glabrata（n=19）
C. tropicalis（n=8）
C. parapsilosis（n=6）
C. krusei（n=3）

臨床分離株（５菌種）を用いた鑑別性能を指標とした同定一致率（%）

技師
A
B
C
D
A
B
C
D
A
B
C
D
A
B
C
D
A
B
C
D

Candida Ⅱ
24h
48h
90.9
95.5
90.9
95.5
90.9
100
90.9
100
63.2
100
89.5
100
57.9
94.7
84.2
100
100
100
100
100
100
100
100
100
083.3
083.3
50.0
50.0
66.7
83.3
100
100
100
100
100
100
100
100

24h
90.990.990.9
90.9
47.4
84.2
94.7
78.9
100
100
87.5
100
33.3
16.7
16.7
50.0
100
100
100
100

XM

48h
100
95.5
100
95.5
94.7
100
26.3
89.5
100
100
100
100
66.7
66.7
50.0
83.3
100
100
100
100

24h
90.9
90.9
90.9
90.9
68.4
57.9
57.9
73.7
87.5
75.0
87.5
87.5
33.3
16.7
50.0
50.0
100
100
100
100

培地
Vi

48h
95.5
95.5
95.5
95.5
78.9
94.7
73.7
94.7
100
100
100
87.5
33.3
50.0
33.3
83.3
100
100
100
100

カラー Ca
24h
48h
81.8
95.5
86.4
95.5
90.9
95.5
90.9
95.5
84.2
94.784.294.7
89.5
94.7
94.7
94.7
100
100
100
100
10087.5
10087.5
016.7
066.7
00
16.7
16.7
100
100
100
100
100
100
100
100

CHROMagar
24h48h
90.9
95.5
90.9
95.5
90.9
95.5
90.9
95.5
5.3
100
63.2
100
68.4
10063.2
100
100
100
100
100
100
87.5
87.5
87.5
33.3
83.3
050.0
16.7
33.3
33.3
83.3
100
100
100
100
100
100100100

主要５菌種以外の菌種では，C.guilliermondiiはの培地において24時間培養で特徴的なコロニーの色

技師４名ともに主要５菌種とは異なると判断できた

調および形態が認められた。特にXM，Viおよびカが， 菌 種 同 定 は 困 難 で あ っ た。C.dubliniensisはラーCa（C.tropicalisのみ）では発色を強く認めたが，C.albicansと，C.metapsilosisはC.parapsilosisと酷似

同定一致率において培地間差は見られず，すべてのしており鑑別は困難であった。

培地で良好な結果が得られた。よってこの３菌種についてはすべての培地において迅速簡易同定が可能

IV考察であると考えられる。C.glabrataとC.parapsilosisにおけるコロニーは24時間培養ではほとんどの培地に今回我々は５種類のカンジダ選択分離培地の簡易おいて発色が弱い。さらに，C.parapsilosisのコロ同定に関する比較検討を行った。
Miles&Misra法による発育支持能試験ではいずれニーの大きさは，いずれの培地においても微小での培地においても大きな差は認められず，検出能はあった。しかし，カラーCaのみC.glabrataの24時間同等であると考えられる。

培養の同定一致率が80%以上であった。これは，ココロニーの色調および形態による鑑別性能についロニーの色調（または発色）から判断したのではなては，メーカー配布資料と実際に発育したコロニー

く，コロニーの大きさによって判断したためである

において一部の培地および菌種で若干の色調およびと思われる。この２菌種について，コロニーの大き形態に差異を認めた。そのため，資料と見本培地をさのみで鑑別を行うことは誤同定の要因にもなるこ用いた同定一致率を比較すると，見本培地の方が多とが予想され，安易に簡易同定を行うことは避ける

くの培地および菌種において同定一致率の上昇が認

方 が 望 ま し い と 考 え る。 従 っ て，C.glabrataとめられた。従って，選択分離培地を導入する際にはC.parapsilosisにおいてはいずれの培地においてもメーカー配布資料だけではなく，見本培地を作成し，24時間培養での簡易同定は困難であると考えられ色調や形態を観察することが必要であると考えられる。C.glabrataの48時間培養では，XM以外では特る。

徴的な色調や形態を認め，高い同定一致率が得られまた，見本培地を参照に鑑別を行った結果は，た。XMについて，技師Cの24時間培養では94.7%鑑

C.albicans，C.tropicalis およびC.kruseiではすべて別できていたにも関わらず，48時間培養では26.3%
6滋賀医学検査Vol.12. No.1

第44回滋賀県医学検査学会特集号 投稿 論 文と大幅に低下した。これは48時間培養ではC.glabrata

C.parapsilosisと 酷 似 し て お り， す べ て の 培 地 でとC.parapsilosisのコロニーの大きさに差が生じなC.parapsilosisと鑑別されていた。C.parapsilosisは，かったために鑑別が困難であったと考えられる。し以前はグループⅠ，Ⅱ，Ⅲに分けられていたが，かし，XMにおけるC.glabrataの48時間培養での色2005年にグループⅠをC.parapsilosis，グループⅡ

調は中心部が淡い灰色であること，他の技師は80%をC.orthopsilosis，グループⅢをC.metapsilosisと分以上の同定一致率であったことを考えると，培地の類 さ れ た ４）。 も と は 複 合 群 で あ っ た こ と，特徴を把握することにより鑑別可能であると考えら

C.metapsilosisの病原性が低いこと，さらに抗真菌れる。従って，48時間培養においてはすべての培地薬に対して高い感受性を示すことから，この３菌種においてC. glabrataにおける簡易同定は可能であるの識別までは行う必要がないと考えられる。主要５と考えられる。C.parapsilosisは48時間培養でも０%菌種以外の稀な菌種や発育が典型的でないものに関〜83.3%と同定一致率に技師間差，培地間差を生じしては，従来同様に形態学的特徴の観察や同定キッた。C. parapsilosisは菌株によりコロニーの色調やト，MALDI-TOF MS等を用いることが必要である

形態が異なる。主な菌株ではコロニーはS型を呈すと考えられる。

るが，R型のコロニーも存在する。今回準備した菌

カンジダ感染症の原因菌としてC.albicansが多く株は，S型は４株，R型は２株であり，見本培地はSを 占 め， そ の 他 にnon-albicans Candida４ 菌 種型のコロニーのみであった。48時間培養では，S型（C.glabrata，C.tropicalis，C.parapsilosis，C.のコロニーではいずれの培地においても色調や形態krusei）の検出頻度が高い。治療薬は菌種ごとで異により鑑別が可能であったが，R型のコロニーの菌な り，C.albicansに 対 し て はAMPH-BとFLCZが 標株では鑑別困難となり，同定一致率の低下につな準治療薬となる。一方，non-albicans Candidaではがったと考えられる。R型のコロニーも，視認性のFLCZなどのアゾール系抗真菌薬に耐性，もしくは改善を図ることにより同定一致率の向上が認めら低感受性の菌種が多いため，臨床的有効性が高いとれ，簡易同定が可能になると考えられる。

言 わ れ て い るmicafunginが 第 一 選 択 薬 と な る ５）。

そ の 他 主 要 ５ 菌 種 以 外 の 菌 種 に つ い て，C.

従って，早期に治療薬を選択する上で迅速な菌種同dubliniensisは ど の 培 地 もC.albicansと 酷 似 し て お定が重要となる。すべての培地でC.albicansの24時り， 選 択 分 離 培 地 で の 鑑 別 は 困 難 で あ る。C.

間培養における同定一致率の結果に大きな差は認め

dubliniensisはC.albicansと形態学的特徴が類似してず，C.albicansとnon-albicans Candidaとの識別だけおり，42℃での発育性，キシロースとα−メチル−に限定すると迅速簡易同定は可能であると考えられD−グルコシドの利用能が異なる点で識別可能である。また，薬剤感受性検査においてサブロー寒天培る。しかし，選択分離培地上ではこれらの性状を確地に純培養した場合とMIC値に差を認めないと報告認することができないため，迅速にこの２菌種を識されている選択分離培地もあり ６），運用の方法に別 す る こ と は 困 難 で あ る。C.dubliniensisはよっては時間とコストの削減に貢献できると考えら

C.albicansの第一選択薬であるFLCZに対して高いれる。

感受性を示し，臨床的観点からはこの２菌種を迅速Ⅴ 結語に 識 別 す る 必 要 性 は 低 い と 考 え ら れ る。
C.guilliermondiiはすべての培地で主要５菌種とは５種類のカンジダ選択分離培地の簡易同定に関す異なると判断できたが，菌種推定には至らなかった。

る比較検討を行った。発育支持能については各培地

添付文書では，唯一鑑別可能な培地はXMのみであに大きな差は認められず，同等であると考えられる。

り，臨床材料からの検出の経験を積むことで鑑別のまた，24時間培養，48時間培養における鑑別性能に

向 上 が 期 待 で き る と 思 わ れ る。C.metapsilosisは関しても同定一致率に大きな差は認められなかっ滋賀医学検査Vol.12. No.1

7第44回滋賀県医学検査学会特集号 投稿論文

た。 臨 床 上 重 要 と な るC.albicansとnon-albicans

Fourth informational supplement M27-S４”.

Candidaとの鑑別に関しては，すべての培地におい

CLSI, Wayne, PA, USA, 2012.
３）坂崎利一， 吉崎悦郎，三木寛二：「培地の評価て24時間培養の同定一致率は良好な結果が得られ，法」，新細菌培地講座培地上第二版，182-192，迅速簡易同定が可能であることが示唆された。

近代出版，東京，1986.

それぞれの培地には，発育したコロニーの色調，発色に要する時間，形態など異なる特徴があり，各４）山口英世：「病原カンジダ菌種の多様化とその施設の運用方法に適した培地を選択する必要がある

医 真 菌 学 的 イ ン パ ク ト 」， モ ダ ン メ デ ィ ア，と考える。

2012; 58: 261-277.
５）深在性真菌症のガイドライン作成委員会：「深■文献

在性真菌症の疫学，診断法および治療戦略」，

１）山口英世：「日和見感染型深在性真菌症」，病原

深在性真菌症の診断・治療ガイドライン 2014，真菌と真菌症改訂４版，158-169，株式会社南101-114，深在性真菌症のガイドライン作成委

山堂，東京，2007.

員会（編），協和企画，東京，2014.

２）Clinical and Laboratory Standards Institute６）杉 山知代，他：「Candida属分離・鑑別用培地“Reference method for broth dilutionとしてのバイタルメディアカラーCandida寒天

antifungal susceptibility testing of yeasts:培地の有用性」，医学検査，2010; 59: 1050-1056.

8滋賀医学検査Vol.12. No.1