学位研究紹介

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学 位 研 究 紹 介

FcγⅢb 多型に関連するヒト好中球プロテオミックプロファイリング
Proteomic profiling of humanneutrophils in relation to
immunoglobulin G Fc receptor IIIbpolymorphism
新潟大学大学院医歯学総合研究科歯周診断・再建学分野

横山智子

で好中球タンパク発現が異なることを仮説とし，プロテオーム解析を用いて網羅的に検証することを目的とした。

【材料および方法】
対象者の抽出のため，インフォームドコンセントが得られた健常者 40 名における FcγRIIa，IIIb 多型を PCR 法にて同定した。FcγRIIIb は IIa を介して好中球機能が発揮されるため，IIa-R/H131 に多型を統一し，その中から，FcγRIIIbNA1/NA1 ５名，-NA2/NA2 ５名を対象者とした。
各対象者

Division of Periodontology, Department of Oral Biologicalから，末梢血採取後，比重遠心法好中球を分離した。
FcγScience, Niigata University Graduate School of Medical andRIIIb の IgG1 作用による発現タンパクを観測するため，hu-Dental Sciences

Tomoko Yokoyama

man monoclonal IgG1 antibodies to P. gingivalis 381 recombinant 40kDa outer membrane protein (hMAb) を用いて刺激し，
FcγRIIIb 誘導性タンパク質を抽出，タンパク質【目抽出可溶化溶液にて溶解した。FcγRIIIb の多型間での発的】現の違いの検証のため，フローサイトメトリーにより，Fcγ
RIIIB 陽性率と平均蛍光強度を比較し，多型間での陽性率，好中球は，歯周病原細菌に対する宿主防御機構におい平均蛍光強度とも変化はないことを確認した。
抽出されたタて重要な役割を担っている。ヒト好中球上には，構成的ンパク質についてブラッドホード法にてタンパク質量を測に FcγRIIA と IIIB があり，IIA は細胞内に活性化シグ定し，各 100μg を pI レンジ 3-10 で等電点電気泳動し，次いナルを伝達する ITAM を持ち，IIIB は GPI アンカーでで SDS-PAGE を行い，10-225kDa までの分離を行った。
泳結合し，活性型サブユニットとは直接会合していない。

動像はシプロルビー染色を行い，泳動像をスキャニングし，しかし，FcγRIIIB は好中球上に最も発現が多く，好中ImageMaster2D プラチウムでそれぞれのスポットを検出し球の免疫複合体への結合は主に FcγRIIIB を介して行わた。検出された総計 757 個のスポットからのスポットボれ，その後 IIIB と IIA の協調作用により，効果的な貪食リューム値を Student's unpaired t-test で多型間の比較をがすすむと考えられている。FcγRIIIB は，好中球特異行い，p 値 0.05 未満で有意性の得られた５つのスポットを的な免疫グロブリン G（IgG）レセプターであるが，機同定スポットとして採択した。 採択した５スポットを切り能的に違いのある NA1-NA2 多型を有する。これまで，出し，トリプシン消化後，質量分析，タンパク質同定を行った。

NA1-NA2 遺伝子型と歯周炎には関連性があることが示【結唆されてきた。日本人歯周炎患者を対象に行った研究で果】

は，健常者に比べ侵襲性歯周炎で FcγRIIIb-NA2/NA2の割合が有意に高い結果となっている。NA1-NA2 多型

FcγRIIIb 誘導性タンパク質の２次元電気泳動により，はエクソン３内の５つの塩基置換によって，第一細胞外757 タン パク質 スポットが 得られ た（ 図１）。Student's

Ig 様ドメイン内の４つのアミノ酸が変化しており，また，unpaired t-test により，NA1-NA2 遺伝子型で５つのタンパ２か所のアミノ酸変化の結果，２つの N 結合糖鎖付加部位がつくられる。この違いにより IgG との結合親和性がNA1/NA1 で高いこと，そして貪食能・活性酸素能がNA1/NA1 で高いことが報告されているが，その間にある FcγRIIIB と IgG との相互作用によって生じる，細胞内タンパク質にどのような影響を与えるか，また，貪食能だけでなく他のリスクファクターになりうる要因についてはまだ検証されていない。そこで，本研究では，
FcγRIIIb-IgG の相互作用により，NA1-NA2 遺伝子型間－ 53 －

図１

代表的な２次元電気泳動像

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新潟歯学会誌
表１42（2）：2012

有意差のある５スポットの同定結果

Protein name

Mean spot volume
ratio（NA1/NA2）

Accession number（NCBInr）

MW（Da）

MOWSE
score

Matched peptide sequences

Spot no.1

Protein-arginin
deiminase type-4（PADI4）

0.6

gi ¦ 12230488

74.079182

TLPVVFDSPRVMGPDFGYVTRILFGDSCYPSNDSRGPQTGGISGLDSFGNLEVSPPVTVRSpot no.2

Annexin VI

0.7

gi ¦ 34533483

75.873153

ALIEILATR
LVFDEYLKFMTILCTRSEIDLLNIRRILISLATGHREEGGENLDQAR

Spot no.3

Cdc42hs-Gdp
complex1.4

gi ¦ 4389379

21.25878

YVECSALTQKWVPEITHHCPKQKPITPETAEKLAR

Spot no.4

Myosin light chain
12A

1.5

gi ¦ 5453740

19.794124

GNFNYIEFTRKGNFNYIEFTRFTDEEVDELYR
EAPIDKKGNFNYIEFTR

Spot no.5Coactosin- like11.3

gi ¦ 21624607

15.944194

KELEEDFIKDDGSAVWVTFKELEEDFIKSELKELEEDFIKSELKKFALITWIGENVSGLQRSKFALITWIGENVSGLQR

されている。PADI4 は細胞外カルシウムイオンの影響を受けるとの報告があり，FcγRIIIB はカルシウムイオンの放出トリガーとなることが報告されているため，このカルシウムイオンの制御差の多型間における違いが，PADI4 発現差につながるのではと推察する。今のところ，
PADI4 が直接歯周炎と関連するという証拠はない。仮説として，PADI4 発現が高かった NA2/NA2 ドナーの
図２

FcγR Ⅲ b-NA1NA1，-NA2NA2 好中球 PADI4 濃度

方がシトルリン化されたタンパク質が増え，その結果，補体の活性化や好中球の動員・活性化，炎症性サイトカ
イ ン の 産 生 な ど の 炎 症 反 応 が 増 加 し た と 考 え る。

ク質スポット発現レベルに有意差が認められた（p ＜ 0.05）。

annexin VI は，好中球のファゴゾーム成熟期に発現上NA1/NA1 好中球では２スポット（PADI4，annexin VI）昇し，好中球機能と関連することが示唆されている。今が 有 意に 発 現 低 下しており，３スポット（Cdc42hs-Gdp，回の結果から，ある測定時点での annexin VI タンパクcomplex，myosin light chain 12A，coactosin-like 1）が有意

質発現は NA1-NA2 多型間で異なることから，好中球のに高い発現を示した（表１）。
このうち PADI4 では，同様のタ機能差につながるのではないかと推測される。Cdc42hs-ンパク質発現傾向が，ELISA 測定により確認された（図２）。

【考Gdp Complex は貪食や活性酸素産生に重要なタンパク質であり，coactosin-like １はアクチン細胞骨格に関わり，察】これらのタンパク質発現が高いほど，好中球機能は亢進し，NA1/NA1 で好中球機能が亢進したと考えられる。

PAD はアルギニンのイミノ基を外す脱イミノ反応を以上の結果より，FcγRIIIb 遺伝子多型は好中球におすすめる酵素であり，タンパク質を構成するアルギニンけるタンパク質発現に影響を及ぼすことが示唆された。

残基の正電荷を消失させ，中性のシトルリンに変換する。

【文

そのため，ターゲットとなるタンパク質の高次構造や他

献】の分子との相互作用が変化し，細胞内の様々な機能に大きな影響を及ぼすと考えられている。PADI4 は５種類

Yokoyama T, Kobayashi T, Yamamoto K, Yamagata A,の PAD のアイソフォーム中で，骨髄・末梢血など免疫・Oofusa K, Yoshie H: Proteomic profiling of human

血液系臓器・細胞に発現することが知られており，核移

neutrophils in relation to immunoglobulin G Fc

行シグナルを持つこと，シトルリン化酵素であり，そのreceptor IIIb polymorphism．

過剰発現は慢性炎症性疾患の病因になりえることが報告

Journal of Periodontal Research,45(6):780-787, 2010.

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