技術ノート

ウサギにおける脳内埋植試験法の検討
今野和則 1，磯江孝治 1，熊谷文明 1，太田秀春 1，斉藤義明 1，太田亮2

Examination of the brain implantation test in rabbits
Kazunori KONNO1, Koji ISOE1, Fumiaki KUMAGAI1, Hideharu OHTA1, Yoshiaki SAITO1, Ryo OHTA2

材料および方法緒言
医療機器のリスクマネジメントプロセスの一環

1．埋植試料として生物学的な安全性を評価するにあたり，医脳組織に対する病理学的な陽性反応を確認する

療機器の生物学的安全性評価で考慮すべき評価項ために，埋植試験の陽性対照材料として，一般的目のなかに埋植がある．埋植は医療機器の分類がに使用されているジエチルジチオカルバミン酸亜

表面接触医療機器，体内と体外とを連結する医療鉛（Zinc diethyldithiocarbamate）を 0.75％含有

機器およびインプラント医療機器のなかで主にさせたポリウレタンロッドを一般財団法人食品薬

人体への接触期間（累積）が短・中期的（24 時間を品安全センター秦野研究所より入手し，EOG 滅超え，30 日以内）から長期的（30 日を超える）なも菌処理して使用した．埋植試料のサイズは，幅 1のに対して評価が求められ，その評価法として× 1 mm，長さ 2 mm のロッド状とした．

in vivo 試験による埋植試験がある．埋植試験は2．動物

医療機器または原材料が，その適用部位の生体組動物は，雄の日本白色種（Kbs：JW）ウサギを織へ及ぼす局所的な影響を病理学的（肉眼的検査

5 匹 使 用 し た． 温 度 21～25℃， 湿 度 40～75％，および組織学的検査）に評価する試験であり，国換気設定約 15 回 / 時間，明暗サイクル 12 時間（点内のガイダンスである薬生機審発 0106 第 1 号 の灯時間 7～19 時）に設定された飼育室内で，金属ほか，ISO 10993 の Part 6 にも詳しい試験法が製金網床ケージに個別に収容し，飼料（LRC 4，掲載されている．動物への埋植は主に筋肉，骨，オリエンタル酵母）を制限給餌（約 130 g/ 日），水

皮下および脳の 4 つの部位から臨床に適用される道水（秦野市水道局給水）を自由摂取させて飼育部位に近い組織（組織・器官の起原，構成組織，した．

1）2）細胞種などを勘案）を選択し，ガイダンスで推奨

埋植期間は 1 週間と 4 週間の 2 期間を設定した．

されている各部位の試験法で評価するのが一般試験群は 1 週間埋植群および 4 週間埋植群の 2 群的である．そのなかでも 2016 年 12 月 1 日に ISO構成とし，1 週間埋植群に 2 匹，4 週間埋植群に 310993-6（Third edition）に追加された脳に対する匹の動物を割り振った．

局所的な影響を評価する脳内埋植試験法は，他の3．埋植方法

部位の埋植試験法よりも高度な埋植技術を要し，すべての実験操作は，｢一般財団法人食品薬品術後動物の一般状態（行動）に対しても大きく影響安全センター秦野研究所動物実験に関する指針｣することが予想される．また，検査方法も体系的に基づき，承認（動物実験承認番号：1170117A，ではなく複雑である．そこで，ウサギを用いた脳4170006A）を得て実施した．

内埋植による手術操作，術後の行動学的および神埋植部位は大脳皮質内とした．埋植部位数は経学的徴候，脳に対する病理学的な組織反応につ1 匹の大脳右半球に 2 か所とし，1 か所あたり 1いて検討した．

本の埋植試料を埋植した．埋植前の処置として，三種混合麻酔薬（塩酸メデトミジン，ミダゾラム

1214

安全性事業部
安全性事業部

一般試験検査 1Gおよび酒石酸ブトルファノールの混合液）を調製し，動物の臀部へ筋肉内注射（1.2 mL/kg）して，

技術ノート表1

写真 1 ウ サギの頭蓋骨における埋植部位（切削部位）の位置★：矢状縫合と冠状縫合との交点（Bregma）①：Bregma から右側の側頭葉側に向かって約 5 mm，後頭葉側に向かって約 7 mm の位置②：Bregma から右側の側頭葉側に向かって約 5 mm，後頭葉側に向かって約 14 mm の位置

一般機能検査（反射）
反射

方法

プライエル反応

突発的な音刺激に対する耳介反射の有無を観察する．

瞳孔反射

観察者の掌等で動物の頭部を覆い，約30 秒間暗順応させた後，光にさらして縮瞳反応の有無を観察する．

痛覚反射

ピンセットで指趾間の皮膚を挟んだ時の嫌悪反応の有無を観察する．

後肢引き込み反射

後肢を伸展させ，反射的に直ちに引き込み，正常位に復する反応の有無を観察する．

眼瞼反射

眼瞼に触れたときに瞬目反射の有無を観察する．

正向反射

動物を背臥位に置き，直ちに立ち直る反射の有無を観察する．

植試料が完全に大脳皮質内に埋没することを確認した．（8）切削した頭蓋骨を高密度ポリエチレ
ンシートで作製した円盤状の蓋で塞いだ．（9）切開した皮膚は縫合糸，手術用ワイヤーで縫合した．（10）術部をヨード系消毒剤およびアルコー
ル綿で消毒した．（11）動物を飼育ケージに戻し，麻酔の覚醒を確認した．手術翌日に鎮痛剤として塩酸ブプレノルフィンを 0.1 mL/ 匹の用量で動物の皮下へ 6 時間間隔で 2 回投与した．術後は毎日，
図1

切り出し部位および薄切面埋植部位（①および②）を含む厚さ約 4 mm に切り出した．

常同行動および異常行動を含む一般状態について注意深く観察し，週に 1 回の頻度で体重を測定した．
4．一般機能検査

全身麻酔を施した．麻酔後，術部を含めた動物の術後，週に 1 回の頻度で中枢神経系の障害を確頭部を剪毛し，以下の手順で埋植手術を行った．

認するために動物を検査台の上におき，プライエ（1）手術台にウサギを腹臥位に保定し，剪毛したル反応，瞳孔反射，痛覚反射，後肢引き込み反頭部をヨード系消毒剤およびアルコール綿で消射，眼瞼（瞬目）反射，正向反射をみる一般機能検毒した．（2）頭部の正中線に沿って皮膚を約 4 cm査
（表 1）を実施した．

切開した．切開した皮膚を鈍性剥離して頭蓋骨5．病理学的検査を露出させ，骨膜を剥離した．（3）Bregma から

埋植後 1 週間
（埋植第 8 日）および 4 週間
（埋植第右側の側頭葉側に向かって約 5 mm，後頭葉側に29 日）にそれぞれの動物をバルビツール酸系麻酔

向かって約 7 mm（1 か所目）および約 14 mm（2 か下で放血による安楽死処理を行い，脳を試料とと所目）の位置にフェルトペンでマーキングした（写真もに摘出した．摘出した脳は 4％パラホルムアル1）．（4）ハンドドリルを用いて，生理食塩液で洗デヒド固定液で 2 日間浸漬固定し，その後リン酸いながらマーキング部分に直径約 3 mm の穴をあ緩衝液で洗浄した．

けた．
（5）穿孔した穴から目視にて硬膜を確認し，5.1

肉眼的検査

ピンセットを用いて硬膜を除去した．（6）埋植試

試料の縦断面が出るように埋植部位を切り出料を挿入しやすいように 22 ゲージの注射針を用し（図 1），試料周囲組織および試料を実体顕微

いて，大脳皮質を約 5 mm の深さで穿刺した．（7）

鏡下で表 2 に示す項目を観点として肉眼的検査

ピンセットで埋植試料を穿刺した穴に挿入し，埋を実施した．
15

秦野研究所年報 Vol. 44. 2021
表2

埋植局所における肉眼的検査の観点（ISO 10993-6）
観察部位

肉眼的検査の観点
出血，被包形成，変色の有無

試料周囲組織所見が認められた時は，その程度，広がり，厚さなどの詳細
変色および変質の有無

埋植試料所見が認められた時は，色，ひび割れの有無，硬さなどの詳細埋植部位近傍のリンパ節（頚部）腫脹などの変化

その他に認められた異常所見のすべて
表3

埋植局所における組織学的検査の観点（ISO 10993-6）
観察部位

組織学的検査の観点

試料周囲組織埋植試料周囲のニューロンプロセスの破壊
埋植試料周囲のアストロサイトおよび結合組織の領域
大血管数の増加リンパ球浸潤
マイクログリアの活性化（特性評価）
被膜形成，巨細胞およびマクロファージの存在
鉱質化および石灰化の領域
上衣層における変化およびくも膜顆粒における上記の変化
埋植痕に隣接する部位（～3 mm，同側）
炎症細胞 / 浸潤物
出血
壊死
グリオーシス，灰白質
グリオーシス，白色その他

5.2

組織学的検査また，常同行動（過度のグルーミング，旋回行動）

切り出し後の試料を含めた埋植部位についや異常行動（自傷行動，後ろ向き歩行）などの行動て，組織染色標本（HE 染色，Nissl 染色，LFB-に対する異常も認められなかった．週に 1 回の頻HE 染色）および免疫組織化学染色標本（アスト度で体重測定を実施した結果，いずれの動物におロサイトマーカーの GFAP 染色およびミクロいても体重は順調に増加していた．

グリアマーカーの Iba1 染色）を作製し，光学顕2．一般機能検査

微鏡下で表 3 に示す項目を観点として組織学的プライエル反応，瞳孔反射，痛覚反射，後肢引検査を実施した．また，ISO 10993-6, Annex

き込み反射，眼瞼（瞬目）反射，正向反射を確認しE で推奨されている神経組織の半定量スコアリた結果，いずれの動物においても，中枢神経系の（表 4）を参考に，試料
ングシステムの評価方法異常を示す反射異常は認められなかった．

周囲組織に認められた細胞の種類および組織反3．病理学的検査

応を検索した．

埋植後 1 および 4 週間の剖検では，頭蓋骨切削部位を塞いだ高密度ポリエチレンシート製の蓋は結果頭蓋骨に留まっていたが，一部浮いているか所も1．一般状態および体重推移あった．摘出した脳組織は穿刺部に暗赤色の変色

埋植期間中の一般状態の観察では，いずれの動（出血痕）が認められた（写真 2）．

物においても，外観，姿勢，体位，歩行，発声，埋植後 1 および 4 週間の肉眼的検査では，試料痙攣などの一般状態に異常は認められなかった．

周囲組織に黒色（写真 3-A，3-B）または乳白色の16

技術ノート
表4

半定量スコアリングシステム ‐ 神経組織の反応 ‐（ISO 10993-6, Annex E）

細胞の種類 / 反応

評価点
0

多形核白血球

0

リンパ球

0

形質細胞

0

マクロファージ

0

多核巨細胞

0

変性 / 壊死

0

血管新生

0

1

2

まれ，1～5/phf *5～10/phf

まれ，1～2/phf

3～5/phf

わずか

軽度

34

中等度浸潤

集簇 / 凝集

中等度

重度

1～3 の未熟血管が限 線維芽細胞様構造で 線維芽細胞様構造で 線維芽細胞様構造で局性にみられるわず 支持された4～7の毛 支持された毛細血管 支持された毛細血管が広範囲に及ぶが広域にみられる
かな毛細血管の増殖 細血管が集簇する

線維化

0狭い領域

中等度の厚さの領域

厚い領域

広い領域

星状膠細胞

0狭い領域

中等度の厚さの領域

厚い領域

広い領域

脂肪浸潤

0狭い領域

中等度の厚さの領域

厚い領域

広い領域

その他の所見-: 変化なし，± : 軽微，+: 軽度，2+: 中等度，3+: 重度，
P: 順位尺度のない変化，NE: 検査なし，M: 消失，A: 自己融解*: phf = 強拡大（400 倍）で 1 視野あたり（写真 4-B）がみられ，泡沫状の空胞化（写真 4-E）
，フィブリン様物質の析出，鉱質沈着および血管新生（写真 4-D）も認められた．免疫組織化学染色にてミクログリアおよびアストロサイトの分布を確認した結果，いずれも組織傷害部の外側で増殖活性化を示す傾向があった（写真 5-A，5-B）．
考察
今回，ウサギの右脳半球に 2 か所の埋植部位を設け，病理学的検査における炎症反応および壊死性の変化を確認するために陽性対照材料を大脳皮
写真 2

剖検時のウサギの脳埋植部位（①および②）に穿刺痕がみられ，埋植試料の刺入部位（①）
は暗赤色に変色している．

質内に 1 および 4 週間埋植したが，埋植期間中，いずれの動物においても死亡例はみられず，術創部に出血および化膿など外科的手術による影響は認められなかった．また，術後の動物に行動学的変色（写真 3-C，3-D）が認められた．また，いずな異常など神経学的な兆候を示す所見も認められれの動物においても試料自体は脳組織内に存在なかったことから，手術操作および埋植部位の位し，試料の脱落や突出は認められなかった．なお，

置に問題はないと考えられる．ただし，本検討の埋植試料自体に変色・変質等の異常はなく，埋植一般機能検査は主に反射について検査を行った部位近傍のリンパ節に腫脹等の異常所見は認めらが，ISO 10993-6 でも推奨されている Functionalれなかった．

observation battery（FOB），Modiﬁed Irwin test

組織学的検査では，埋植後 1 週間
（埋植第 8 日）などを参考に検査することにより，より詳細に中および 4 週間（埋植第 29 日）の試料周囲組織に好枢神経系の障害を評価することが可能と考えら

中球，リンパ球およびマクロファージの浸潤がる．埋植部位については ISO 10993-6 において，みられ（写真 4-B）
，試料の界面に線維化による被脳実質表面の埋植について記載されていることか膜形成（写真 4-D）および神経膠細胞の消失が認めら，次の検討課題としたい．

られた．また，脳実質には出血および変性 / 壊死

病理学的検査においては，剖検時に切削部位の17

秦野研究所年報 Vol. 44. 2021

3-A

3-B

3-C

3-D

写真 3

切り出し後のウサギ脳組織（埋植後 1 週間）

3-A：埋植部位①の写真，埋植部位を示す（矢印）3-B：3-A の拡大像（点線の枠内）．埋植部位（矢印）に黒色の変色が認められる．
3-C：埋植部位②の写真，埋植部位を示す（矢印）3-D：3-C の拡大像（点線の枠内）．埋植部位（矢印）に乳白色の変色が認められる．

4-A

2.0 mm4-B

4-C

200 μm

4-D

200 μm

100 μm写真 4 埋 植後 4 週間の埋植局所の組織反応（HE 染色）4-E

18100 μm

4-A：埋植試料（＊）の存在部位
4-B：埋植試料（＊）周囲に白血球浸潤，変性 / 壊死，出血が認められる．
4-C：埋植試料（＊）周囲に多核巨細胞，マクロファージが認められる．
4-D：埋植試料（＊）の界面部に線維化（被膜）がみられ，実質には血管新生が認められる．
4-E：埋植試料周囲組織に泡沫状の空胞化が認められる．

技術ノート5-A

200 μm200 μm

写真 5

埋植後 4 週間の埋植局所の組織反応（免疫組織化学染色）

5-B

5-A：Anti-glial fibrillary acidic protein（GFAP）
antibody，点線の枠内に陽性反応を示す細胞（アストロサイト）が認められる．
5-B：Anti-iba-1（Iba1）antibody，点線の枠内に陽性反応を示す細胞（ミクログリア）が認められる．

蓋がわずかに浮いているか所があったことから蓋の壊死性の変化や既存細胞の分布についても確認をする際は医療用接着剤で確実に固定したほうがができた．なお，今回の検討では，摘出後の脳はよいと考えられた．ただし，医療用接着剤などの固定液に浸漬させる浸漬固定法を用いたが，作製高分子化学物質を使用する場合，埋植試料との反したいずれの組織標本においても評価が困難とな応に注意して埋植試料および試料周囲組織に対しるアーティファクトは認められなかった．
ただし，て影響がないことを事前に確認する必要があると免疫組織化学染色を実施する場合は，血管内に固考える．肉眼的検査においては，試料周囲組織に定液を注入する灌流固定法を用いることが望まし出血痕と思われる黒色の変色が認められたが，試いと考えられる．

料自体は頭頂葉の大脳皮質内に留まっており，留今回の検討では手術操作および埋植する位置に置する深さも問題なかった．組織学的検査におい問題ないことが明らかになり，短期間（1 および 4ては，試料界面部に線維性被膜の形成およびフィ週間）の埋植による脳組織に対する組織反応につブリン様物質の析出が観察されたが，HE 染色標いて背景データが収集できた．

本による観察では形態的に鑑別することが困難な部位もあったことから，膠原線維を選択的に染め文献るマッソントリクローム染色法を用いることによ

1） 医療機器の製造販売承認申請等に必要な生物学的安り，より詳細な評価が可能となる．表 4 に示した
ISO 10993-6 で推奨されている半定量スコアリン
グンシステム（神経組織の反応）
は，一般的に認められる炎症反応の例示であるが，その大部分の組織反応について確認ができ，さらに炎症反応以外

全性評価の基本的考え方についての改正について（令和 2 年 1 月 6 日，薬生機審発 0106 第 1 号）
2） Biological Evaluation of Medical Devices - Part
6: Tests for Local Effects after Implantation (ISO10993-6，December 1，2016)19