技術ノート

有機溶媒抽出物を用いたマウス
Local Lymph Node Assay法の検討
高岡 裕1，藤田恵子1，関 剛幸1，田面喜之2，青木聡子1，森村智美1
Study of a murine local lymph node assay for organic solvent extracts
Yutaka TAKAOKA1, Keiko FUJITA1, Takayuki SEKI1, Yoshiyuki TAZURA2, Satoko AOKI1, Tomomi MORIMURA1

緒言

ISO10993-12 に従った方法で抽出物が感作性をマ ウ ス を 用 い る Local Lymph Node Assay

示さないほど微量である可能性がある 4）．そのた（LLNA）は，モルモットを用いる皮膚感作性試

め，より多くの物質を抽出でき，より高濃度の検験の代替法である．LLNA の被験物質として，体で LLNA が実施できる可能性の高い抽出法と正確な結果が得られないことがある金属化合物，して，医療機器審査 No.36 に従い，抽出溶媒を直ちに皮膚に吸収されない高分子化合物，偽陽性留去して得た抽出物を，投与溶媒に溶解または分を呈する可能性がある強刺激性物質，耳介への適散させる第 1 法を選択した．今回，被験物質と用が十分にできない物質，利用できるデータのしては，抽出物に感作性物質を含む複数物質が抽限られている混合物などは適さないとされてい出される可能性があるポリ塩化ビニル製チューブる ．しかし，動物福祉，定量性，試験期間短縮と，高分子化合物の合成原料で感作性物質であるによるコスト削減などの理由から，上記のようなイソシアネートが残留している可能性があるポリLLNA に適さないとされている物質についてもウレタン製チューブを用いた．

1）

LLNA の利用が進みつつある．LLNA に適さな上記の被験物質について抽出物を作製し，投与いとされている被験物質のうち，高分子化合物ま溶媒に溶解させて投与検体を調製した．これらのたは複数素材からなる医療機器は，LLNA を実検体を用いて LLNA を実施することにより，混施するために抽出操作を必要とすることが多い．

合物や高分子化合物の抽出物を用いた感作性の評

OECD Test Guideline 429 （OECD 429）
では，2）価が可能であるか否かを検討した．

LLNA で用いる被験物質の抽出方法は特に定められていない．今回の検討では，モルモットを用方法

いる皮膚感作性試験で行われている抽出方法を参1．LLNAにおける投与検体の調製考にした．すなわち，ISO10993-12 に従った生市販のポリ塩化ビニル製チューブ（PVC）お理食塩水と植物油の二媒体で抽出する方法と，「生よびポリウレタン製チューブ（PU）の抽出溶媒物学的安全性試験の基本的考え方に関する参考としてメタノール，アセトン，2 -プロパノール /資料について」 （医療機器審査 No.36）に従っシクロヘキサン混液（1:1）（混液）およびヘキサた有機溶媒で抽出する方法から選択することにしン（媒体はいずれも試薬特級，和光純薬工業，大た．このうち，高分子化合物を含む医療機器では，阪）の 4 種類を用いた．

3）

4）

抽出は，以下の手順で行った．被験物質質量の1 毒性学第 2 研究室
2 基準毒性試験室

10 倍相当量の溶媒を加え，25℃で 24 時間振とう抽出した．抽出後，27℃で減圧濃縮してすべての溶媒を留去した．留去後 12 時間以上デシケー
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秦野研究所年報 Vol. 33. 2010

ター（シリカゲル入り）中で乾燥し，抽出物質量PU/A は 50，15 および 5 w/v%）した．溶媒対照を秤量した．また，抽出物質量を被験物質質量で群には投与溶媒である AOO を，陽性対照群には除して抽出率を算出した．

0.1 w/v%2,4 -ジニトロクロロベンゼン（DNCB）

抽出物質量，抽出率，性状を表 1 に示す．両を用いた．

被験物質とも抽出率が最も高かった溶媒は，アセ2．動物トンであった．PVC の抽出物の性状は，アセト動物は OECD 429 に定められている CBA/J 系

ンで強い粘性をもつ液体，メタノール，混液およ雌マウス（CBA/JNCrlj，日本チャールス・リバー，びヘキサン抽出で液体であった．PU の抽出物の厚木）を 8 週齢で購入し，9 週齢から試験に用いた．

性状はいずれも固体であった．投与に用いる抽出使用動物数は 55 匹，群構成は PVC/C 投与群が 3物として PVC では抽出率が最も高いアセトン抽群（100，30 および 10 w/v%），PVC/A 投与群が出物（PVC/A）と抽出原体で投与可能な性状の3 群（50，15 および 5 w/v%），PU/A 投与群が 3混液抽出物（PVC/C）を，PU では最も抽出率が群（50，15 および 5 w/v%），溶媒対照群および高いアセトン抽出物（PU/A）を選択した．

陽性対照群の計 11 群（各群 5 匹）とした．なお，

PVC/A お よ び PU/A を 投 与 溶 媒 に 溶 か し て

すべての動物実験は，（財）食品薬品安全センター投与検体を調製した．投与溶媒には OECD 429

秦野研究所の動物実験に関する指針に準じて実施で推奨されているアセトン / オリブ油（4:1）液（動物実験承認番号：1090247A）された．

（AOO）を用いた．各抽出物の投与検体の最高濃3．LLNA試験

度は，PVC/C は抽出原体で投与可能なため 100

検体投与初日を処置第 1 日として，処置第 1 ～w/v% で，PVC/A および PU/A は抽出物の性状か3 日の間，1 日 1 回ピペットを用いて両耳介に投らそのまま投与できないため投与可能な最高濃度与検体を塗布投与（片耳あたり 25 µL）した．処である 50 w/v% とした．また，抽出物毎に最高置 第 6 日 に 3H-methyl thymidine（ パ ー キ ン エ

濃度以下公比約 3 で除して 3 濃度を設定（PVC/ルマージャパン，横浜）液を尾静脈内投与（20C は 100，30 および 10 w/v%，PVC/A ならびにµCi/250 µL/ 匹）した．投与 5 時間後に両耳介リ

表1

被験物質の抽出結果

塩化ビニル製チューブ
抽出溶媒

被験物質
採取質量（g）

抽出物
質量（g）

抽出率（%）a

抽出物の性状

メタノール

2.181

0.414

18.9

液体

アセトン

2.175

0.829

38.1

強い粘性の液体

混液b

2.194

0.785

35.7

液体

ヘキサン

2.115

0.742

35.0

液体

抽出率（%）a

抽出物の性状

ポリウレタン製チューブ
抽出溶媒

被験物質
採取質量（g）

抽出物
質量（g）

メタノール

1.915

0.011

0.5固体

アセトン

2.060

0.030

1.4

固体

混液b

2.141

0.010

0.4固体ヘキサン

2.063

0.002

0.0

固体a，抽出率＝抽出物質量（g）
被験物質採取質量（g）×100

b，2-プロパノール/シクロヘキサン混液（1：1）

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技術ノートンパ節を摘出し，リン酸緩衝塩類溶液（三菱化学示した．また，放射活性を統計解析したところ，

メディエンス，東京）2 mL で細胞浮遊液を調製

溶媒対照群と比較して 100 w/v% PVC/C，50 w/した．調製した測定試料の放射活性を，液体シン

v% PVC/A，50 w/v% PU/A および 15 w/v% PU/チレーションカウンター（Tri-Carb 2910TR，パーA で有意差が認められた．

キンエルマージャパン，横浜）にて測定した．測定した放射活性は，Dunnett 法による多重比較検定（有意水準 5%）を行った．

考察
PVC については，PVC/C の SI が 3 を上回り，感作性の指標として，群毎の放射活性の平均かつ用量相関関係も認められたため感作性を有す値を溶媒対照群の放射活性の平均値で除してると判定し，この抽出条件で感作性を評価できるStimulation Index（SI）を求めた．SI が 3 以上と判断した．なお，
PVC/A は SI が 3 を下回ったが，の場合を陽性とした．また，個体毎の反応から陽放射活性の統計解析で有意差が認められること，性を示した動物の割合（陽性率）を求めた．感作

最 高 濃 度（50 w/v% PVC/A） の SI が 2.69 と 3性の有無の判断は，OECD 429 を参考に，放射に近く，陽性率は 40% であることから感作性を活性の統計解析結果，SI および陽性率のデータ有する可能性があると判断した．一方，PU につを総合的に評価して行った．

いては，50 w/v% PU/A の SI が 2 を下回る値であることおよび陽性率が 0% であったことから，結果感作性を有さないと判断した．しかし，PU につSI，陽性率および統計解析結果を表 2 に示す．

いては 50 および 15 w/v% PU/A の放射活性で有100 w/v% PVC/C では SI が 3 を上回り，陽性率意差が認められたこと，および 15 w/v% PU/Aは 40% であった．また，SI は 3 を下回ったが，で陽性率が 20% あることから偽陰性を疑い，今30 w/v% PVC/C お よび 50 w/v% PVC/A で陽性回の実験と同様の方法で作製した PU/A を用い

率 は 40%，10 w/v% PVC/C，5 w/v% PVC/A お

Guinea Pig Maximization Test（GPMT，感作濃よび 15 w/v% PU/A で陽性率はそれぞれ 20% を

度 10 w/v%，惹起濃度 10，1 および 0.1 w/v％）

表2

LLNA の結果群

溶媒対照（AOO）
PVC/C

PVC/APU/A

動物数

放射活性 aSI

陽性率（%）

5174 ±-

07710 w/v%

5299 ± 135

1.722030 w/v%

5367 ± 175

2.1140100 w/v%

5644 ± 301 *3.70405 w/v%

5364 ± 195

2.092015 w/v%

5278 ±

43

1.60

050 w/v%

5468 ± 119 *2.69405 w/v%

5283 ±94

1.63015 w/v%

5411 ± 114 *2.362050 w/v%

5340 ± 106 *

1.95

052224 ± 974

13.23

100

陽性対照
（0.1 w/v% DNCB）

a，平均±標準偏差*，対照群と比較して有意差（5%）を示す。
AOO，アセトン/オリブ油（4:1）液PVC/C，ポリ塩化ビニル製チューブの2-プロパノール/シクロヘキサン混液（1:1）抽出物
PVC/A，ポリ塩化ビニル製チューブのアセトン抽出物
PU/A，ポリウレタン製チューブのアセトン抽出物
DNCB，2,4-ジニトロクロロベンゼン
47

秦野研究所年報 Vol. 33. 2010を追加実施した．

た，モルモットを用いる感作性試験では抽出率のそ の 結 果， 惹 起 濃 度 10 お よ び 1 w/v ％ で 感最も高い抽出溶媒が選択される．しかし，LLNA作性を示すことが確認された．よって，PU はにおいては，抽出物原体を投与する場合も想定しLLNA で感作性陰性，GPMT で感作性陽性となて十分な暴露量を得られる抽出溶媒を選択する必り，結果が異なった．この相違は GPMT の結果要があるため，抽出率に加えて抽出物の性状も考が陽性であることおよび LLNA の放射活性に有慮に入れる必要があると考える．

意差がみられていることから，LLNA におけるPU/A の結果が偽陰性であることに起因したと考文献えられた．以上の結果，PU は感作性を有する可

1） Recommended Performance Standards: Murine

能性があると考えられた．なお，PU/A の LLNA
結果は，感作に十分な量の感作性物質が得られなかったことが偽陰性を引き起こした原因の一つだと考えられた．これは，投与に供する抽出物の性状が抽出原体（100 w/v%）の投与に適さなかったため，投与可能な濃度まで最高濃度を下げたことが関係しているかもしれない．
今回の実験は，有機溶媒による抽出操作が被験物質における LLNA 実施の可能性を示したと考えられる．しかし，LLNA と GPMT で結果が異なることもあるため，LLNA で陰性と判断された場合においても統計解析結果や陽性反応率を考慮し，感作性が示唆される場合は GPMT を実施するなど，偽陰性を除く工夫が必要であろう．ま48

Local Lymph Node Assay. NIH PublicationNumber 09-7357.Research Triangle Park, NC:
National Institute of Environmental Health
Sciences. ICCVAM. 2009
2） OECD : Guideline for the Testing of Chemicals,
Guideline 429 : Skin Sensitisation : LocalLymph Node Assay, Organisation for Economic
Cooperation and Development, 2002
3） ISO 10993-12 Biological evaluation of medicaldevices Part 12: Sample preparation andreference materials, 2007.
4） 厚生労働省医薬局審査管理課:「生物学的安全性試
験の基本的考え方に関する参考資料について」,
2003