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飼料中のイミダクロプリドの液体クロマトグラフ質量分析計による定量法

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飼料中のイミダクロプリドの液体クロマトグラフ質量分析計による定量法
野崎 友春 *，山多 利秋 *Determination of Imidacloprid in Feed by LC-MSTomoharu NOZAKI* and Toshiaki YAMATA *( * Food and Agricultural Materials Inspection Center (I.A.A.), Fertilizer and Feed Inspection Department)
An analytical method for determination of imidacloprid in feed by using liquid
chromatograph-mass spectrometer (LC-MS) was developed.
Imidacloprid was extracted with acetonitrile-water and filtered.

The filtrate was purified

by salting-out, by C18 cartridge chromatography and by graphitized non-porous carbon column
chromatography.

Imidacloprid was determined by LC-MS.

A collaborative study with corn spiked with imidacloprid at 100 µg/kg and with alfalfa
spiked with imidacloprid at 5,000 µg/kg was conducted in 8 laboratories.

The meanquantitative value of corn was 83.0 µg/kg (83.0%), and the repeatability and reproducibility as therelative standard deviation (RSDr and RSDR) and HorRat were 3.0%, 15% and 0.66 respectively.
As for alfalfa, they were 4,220 µg/kg (84.3%), 3.5% ,12% and 0.96 respectively.
Key words: イミダクロプリド imidacroplid ; 残留農薬 pesticide residue ; 液体クロマトグ
ラフ質量分析計 liquid chromatograph-mass spectrometer (LC-MS) ; 穀類 grain ; 乾牧
草 grass hay ; 共同試験 collaborative study
1緒言

農林水産省では，食品の安全性を確保する観点から，飼料原料に用いられている農薬を中心に60 種類の農薬について，飼料安全法に基づいて残留基準値を設定し，平成 18 年 5 月 29 日付けで施行した．
しかしながら，イミダクロプリドについては，飼料中の分析法が確立されていないことから，今回，厚生労働省の食品中のイミダクロプリドの分析法 1)を基にして，飼料中のイミダクロプリドの分析法について検討を行ったのでその概要を報告する．
イミダクロプリドは，日本特殊農薬製造（株）（現バイエルクロップサイエンス）が開発した，クロロニコチニル系殺虫剤である．国内では稲，果樹，野菜等の広範囲の主要害虫対策として登録されている 2)．
国内での飼料中の基準は，乾牧草が 6 mg/kg，とうもろこしが 0.1 mg/kg，その他穀物が 0.05mg/kg である 3)．国内での食品中の暫定基準は 0.05~10 mg/kg である 1)．

*

独立行政法人農林水産消費安全技術センター肥飼料安全検査部

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飼料研究報告 Vol.32 (2007)

22.1

試

実験方法

料

市販のとうもろこし及び乾牧草（アルファルファ）をそれぞれ 1 mm の網ふるいを通過するまで粉砕し，供試試料とした．
2.21)

試薬

イミダクロプリド標準原液
イミダクロプリド標準品（関東化学製，純度 99.7%）25 mg を正確に量って 50 mL の褐色メスフラスコに入れ，メタノールを加えて溶かし，更に標線まで同溶媒を加えてイミダクロプリド標準原液を調製した（この液 1 mL は，イミダクロプリドとして 0.5 mg を含有する．）．
使用に際して，イミダクロプリド標準原液の一定量をメタノールで正確に希釈し，1 mL 中にイミダクロプリドとしてそれぞれ 0.002 µg，0.005 µg，0.01 µg，0.02 µg，0.05 µg，0.1 µg 及び 0.2 µg を含有するイミダクロプリド標準液を調製した．

2)

アセトニトリル，メタノールは残留農薬分析用試薬を用いた．
特記している以外の試薬については特級を用いた．

2.3

装置及び器具1)

液体クロマトグラフ質量分析計：島津製作所製

LCMS-2010EV

2)

振とう機：タイテック製

SR-2W

3)

エバポレーター：BÜCHI 製

R-2004)

C18 カートリッジ：Waters 製

Sep-Pak Plus C18 cartridge

5)

グラファイトカーボン－NH2 積層カートリッジ：

レシプロシェーカー

Supelco 製
2.41)

ENVI-Carb/LC-NH2 (500 mg/500 mg)

定量方法
抽出

試料 10.0 g を量って 200 mL の共栓三角フラスコに入れ，アセトニトリル－水（13+7）を乾
牧草は 100 mL，その他の試料は 50 mL 加え，30 分間振り混ぜて抽出した．乾牧草は 200 mLの全量フラスコをブフナー漏斗の下に置き，抽出液をろ紙（5 種 B）で吸引ろ過した後，容器及び残さをアセトニトリル 50 mL で洗浄し，吸引ろ過し更に全量フラスコの標線までアセトニトリルを加えた．200 mL に定容した抽出液の 10 mL を正確に取り，アセトニトリルで 100mL に定容し，液液分配に供する試料溶液とした．その他の試料は 100 mL の全量フラスコをブフナー漏斗の下に置き，抽出液をろ紙（5 種 B）で吸引ろ過した後，容器及び残さをアセトニトリル 25 mL で洗浄し，吸引ろ過し更に全量フラスコの標線までアセトニトリルを加えて液液分配に供する試料溶液とした．
2)

液液分配
試料溶液（乾牧草は 10 mL，その他の試料は 20 mL）を正確に取り，100 mL の分液漏斗に入れ，塩化ナトリウム 10 g を加え，0.5 mol/L リン酸緩衝液（pH 7.0）20 mL を加え，10 分間振り混ぜた後静置した．水層を捨て，アセトニトリル層をカートリッジカラムクロマトグラフ
ィーⅠに供する試料溶液とした．

3)

カートリッジカラムクロマトグラフィーⅠ
C18 カートリッジをアセトニトリル 10 mL であらかじめ洗浄した．100 mL の三角フラスコを C18 カートリッジの下に置き，試料溶液をカートリッジに入れ，液面が充てん剤の上面に達飼料中のイミダクロプリドの液体クロマトグラフ質量分析計による定量法

25するまで流下させ，イミダクロプリドを流出させた．アセトニトリル 2 mL を加え同様に流出させた．
三角フラスコに硫酸ナトリウム（無水）を適量加え脱水し，100 mL のなす形フラスコにろ紙（5 種 B）でろ過した．
ろ液を 40°C 以下の水浴上でほとんど乾固するまで減圧濃縮した後，窒素ガスを送って乾固した．
アセトニトリル－トルエン（3+1）2 mL を加えて残留物を溶かし，カートリッジカラムクロマトグラフィーⅡに供する試料溶液とした．
4)

カートリッジカラムクロマトグラフィーⅡ
グラファイトカーボン－NH2 積層カートリッジを注射筒に連結し，アセトニトリル－トルエン（3+1）10 mL であらかじめ洗浄した．50 mL のなす形フラスコをグラファイトカーボン－NH2 積層カートリッジの下に置き，試料溶液を注射筒に入れ，容器をアセトニトリル－トルエン（3+1）2 mL ずつで 2 回洗浄し，洗液を順次グラファイトカーボン－NH2 積層カートリッジに加え，液面が充てん剤の上面に達するまで流下させ，イミダクロプリドを流出させた．アセ
トニトリル－トルエン（3+1）16 mL を加えて同様に流出させた．
溶出液を 40°C 以下の水浴上でほとんど乾固するまで減圧濃縮した後，窒素ガスを送って乾固した．
メタノール 2 mL を正確に加えて残留物を溶かし，液体クロマトグラフ質量分析計による測定に供する試料溶液とした．

5)

液体クロマトグラフ質量分析計による測定
試料溶液及びイミダクロプリド標準液各 5 µL を液体クロマトグラフ質量分析計に注入し，選択イオン検出（SIM）クロマトグラムを得た．

6)

計算得られた SIM クロマトグラムからピーク高さを求めて検量線を作成し，試料中のイミダクロプリド量を算出した．
なお，定量法の概要を Scheme 1 に，液体クロマトグラフ質量分析計の測定条件を Table 1 に示した．

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飼料研究報告 Vol.32 (2007)

Sample 10.0 g
add acetonitrile-water (13:7) (grass hay; 100 mL, others; 50 mL)
shake for 30 minutes
filtrate with suction filter (No.5B)
wash with acetonitrile (grass hay; 50 mL, others; 25 mL)
grass hay; fill up to 200 mL with acetonitrile
others; fill up to 100 mL with acetonitrile
100 mL Separating funnel
grass hay; 10 mL of 1/10 diluted sample solution, others; 20 mL
add 10 g of NaCl
add 20 mL of 0.5 mol/L phosphate buffered saline (pH7.0)
shake for 10 minutes
Upper layer (acetonitrile layer)
Sep-Pak Plus C18 cartridge (prewash with 10 mL of acetonitrile)
apply sample solution
elute with 2 mL of acetonitrile
Elutedehydrate with Na2SO4 anhydride
filtrate with filter paper (No.5B)
evaporate to dryness under 40°C
dissolve in 2.0 mL of acetonitrile-toluene (3:1)
ENVI-Carb/NH2 cartridge (prewash with 10 mL of acetonitrile-toluene (3:1))
apply sample solution
add 4 mL of acetonitrile-toluene (3:1)
elute with 16 mL of acetonitrile-toluene (3:1)
evaporate to dryness under 40°C
dissolve in 2.0 mL of methanol
LC-MS
Scheme 1

Analytical procedure for imidacloprid in feeds by using LC-MS

Table 1
Operating conditions for LC-MS
ColumnAgilent ZORBAX XDB-C18 (2.1 mm i.d.×150 mm, 3.5 µm)
Mobile phase A: 5 mmol/L ammonium acetate solution,
B: 5 mmol/L ammonium acetate methanol solution
B(%) 15%(0 min)→40%(1 min)→40%(3.5 min)→50%(6 min)→55%(8 min)→95%(17.5 min)→95%(30 min)→15%(30.1 min)→47 min(15%)
Frow rate
0.2 mL/min
Column temp. 40°C
Ionization
Electrospray ionization(ESI) positive mode
Monitor ion m/z 256

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飼料中のイミダクロプリドの液体クロマトグラフ質量分析計による定量法

33.1

結果及び考察共同試験
本法の再現精度を調査するため，共通試料による共同試験を実施した．
穀類（とうもろこし）及び乾牧草（アルファルファ）を用い，株式会社島津総合分析試験セン

ター，社団法人日本科学飼料協会科学飼料研究センター，財団法人日本穀物検定協会中央研究所，財団法人日本食品分析センター多摩研究所，全国酪農業協同組合連合会分析センター，独立行政法人肥飼料検査所（現（独）農林水産消費安全技術センター）本部，同大阪事務所（現同神戸センター大阪事務所）及び同仙台事務所（現同仙台センター）の 8 試験室で共同試験を実施した．その結果は Table 2 のとおり，とうもろこし中のイミダクロプリドの平均回収率は83.0%，その室内繰返し精度及び室間再現精度は相対標準偏差（RSDr 及び RSDR）として 3.0%及び 15%であり，HorRat は 0.66 であった．また，アルファルファ中のイミダクロプリドの平均回収率は 84.3%，その室内繰返し精度及び室間再現精度は相対標準偏差（RSDr 及び RSDR）として3.5%及び 12%であり，HorRat は 0.96 であった．
なお，参考のため，各試験室で使用したガスクロマトグラフ質量分析計の機種等を Table 3 に示した．
Table 2

Quantitative value of imidacloprid from corn spiked at 100 µg/kg andalfalfa spiked at 5,000 µg/kg in the collaborative study(µg/kg)

Lab No.
12345678
Spiked levela)

Mean value
Recovery (%)
RSDr b)(%)c)
RSDR (%)
PRSDR d)(%)
HorRatCorn
89.4
101.2
84.1
89.5
71.2
71.8
68.0
92.6

Alfalfa
87.0
97.8
85.4
84.7
70.0
75.8
62.6
96.3

100.0
83.0
83.0
3.0
15220.66

4,330
5,020
4,080
4,400
3,560
3,500
1,280 e)
4,490
5,000
4,217
84.3
3.5
12
13
0.96

4,100
4,890
4,360
4,210
3,830
3,520
1,230 e)4,730a) Corn: n=16, Alfalfa: n=14 (without Lab No. 7)b) Relative standard deviation of repeatability within same laboratoryc) Relative standard deviation of reproducibility between laboratoriesd) Predicted Relative standard deviation of reproducibility between laboratories
calculated from the modified Horwitz equatione) Excluded by the single Grubbs test

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飼料研究報告 Vol.32 (2007)

Table 3Lab No.
12Instruments used in the collaborative study
LC/MS
ColumnAgilent ZORBAX XDB-C18
SHIMADZU LCMS-2010EV prominence（2.1 mm i.d.×150 mm, 3.5 µm）
LC:Agilent 1100 series
Kanto Chemical Mightysil RP-18GPMS:Agilent G1956B

3SHIMADZU LCMS-2010EV

4

LC:Waters alliance2695
MS:Waters Micromass Quattro micro

5Waters Quattro micro API MassAnalyzer

6SHIMADZU LCMS-2010EV

7SHIMADZU LCMS-2010EV

8SHIMADZU LCMS-2010EV

4（2.0 mm i.d.×150 mm）
SHIMAZDU VP-ODS（2.0 mm i.d.×150 mm, 5 µm）
GL Sciences Inertsil ODS-3（2.1 mm i.d.×150 mm, 5 µm）
Agilent ZORBAX XDB-C18（2.1 mm i.d.×150 mm, 3.5 µm）
Agilent ZORBAX XDB-C18（2.1 mm i.d.×150 mm, 3.5 µm）
Phenomenex Gemini 5u C18 110A（2.0 mm i.d.×150 mm, 5 µm）
Agilent ZORBAX XDB-C18（2.1 mm i.d.×150 mm, 3.5 µm）

まとめ

飼料中のイミダクロプリドの液体クロマトグラフ質量分析計による定量法について検討したところ，次の結果を得た．
とうもろこし及び乾牧草にイミダクロプリドとしてそれぞれ 100 µg/kg 及び 5,000 µg/kg 相当量を添加した試料を用いて，8 試験室で本法による共同試験を実施した．その結果，とうもろこしの平均回収率は 83.0%であり，その室内繰返し精度及び室間再現精度は相対標準偏差（RSDr 及びRSDR ）として 3.0%及び 15%であり，HorRat は 0.66 であった．また，乾牧草の平均回収率は84.3%であり，その室内繰返し精度及び室間再現精度は相対標準偏差（RSDr 及び RSDR ）として3.5%及び 12%であり，HorRat は 0.96 であった．
なお，本法は，平成 18 年 12 月 18 日付けで飼料分析基準に収載された 3)．
また，添加回収試験及び定量下限の検討については，財団法人日本食品分析センターで検討を行っている 5) ことからこちらを参照されたい（p.225）．
謝辞

共同試験にご協力をいただいた株式会社島津総合分析試験センター，社団法人日本科学飼料協会
科学飼料研究センター，財団法人日本穀物検定協会中央研究所，財団法人日本食品分析センター多摩研究所及び全国酪農業協同組合連合会分析センターの試験室の各位に感謝の意を表します。
文献1) 厚生労働省告示：“食品，添加物等の規格基準の一部を改正する件”，平成 17 年 11 月 29 日，
平成 17 年厚生労働省告示第 499 号 (2005).

飼料中のイミダクロプリドの液体クロマトグラフ質量分析計による定量法

292) 第 188 回食品安全委員会配付資料「資料２:農薬専門調査会における審議状況について(イミダクロプリド)」 (2007).
3) 農林水産省令：“飼料及び飼料添加物の成分規格等に関する省令”，昭和 51 年 7 月 24 日，農林省令第 35 号 (1976).
4) 農林水産省消費・安全局長通知：“飼料分析基準の一部改正について”，平成 18 年 12 月 18 日，
18 消安第 9921 号 (2006).
5) 飼料中の有害物質等残留基準を設定するための分析法開発及び家畜等への移行調査委託事業「飼料中の有害物質等の分析法の開発」，平成 19 年 3 月，財団法人日本食品分析センター(2007).