体内時計のかたち

中枢時計の時間を見る
Visualize Time in the Brain Clock瀬尾和志，岡村均

Kazuyuki Seo and Hitoshi Okamura
京都大学大学院薬学研究科医薬創成情報科学講座システムバイオロジー分野
要

旨

視交叉上核（SCN）は概日リズムの中枢であり，この神経核のニューロンは睡眠覚醒リズムを規定する．我々は，マウス Per1 遺伝
子のプロモーター下流にホタル発光遺伝子を結合した Per1-luc トランスジェニックマウスを作成し，これより作成した SCN スライスを高感度 CCD 顕微鏡にて連続観察できる系を開発し，SCN 細胞 1 つ 1 つの発光リズムを時空間解析することに成功した．この観察系を用いて，SCN で体内時計の朝に発現する抑制性 G タンパク質制御物質である RGS16 の機能を検索した結果，RGS16 欠損マウスでは，リズムの起点を形成する SCN の背内側部の先頭集団細胞の時間位相が遅れ，マウス個体の活動リズムも遅延することが明らかとなった．このようなリアルタイムイメージング技術は，SCN，ひいては神経ネットワークがいかにして個体の行動パターンを規定するのかという脳の仕組みを理解するうえで重要なツールとなるだろう．

キーワード：視交叉上核，時計遺伝子，RGS16，概日リズム，リアルタイムイメージングによるものであると考えられている．具体的には，ポジティ
1.

はじめにブ因子である BMAL1，CLOCK が，ネガティブ因子である

生物時計システムは，時計遺伝子の自律的で周期的な発現

Per，Cry 遺伝子のプロモーター部に結合し，転写を促し，変動が個体の活動レベルまで反映する極めてユニークな系で産生された PER，CRY 蛋白質がポジティブ因子による転写ある．時計遺伝子は全身の細胞概日リズムを産生しているが，を抑制する．このリズム発振の仕組みは，SCN でも末梢組それらのリズムを統括する中枢は視床下部の視交叉上核（su-織でも同じと考えられる．

prachiasmatic nucleus, SCN）と呼ばれる小神経核に存在している．SCN から発振される周期的なシグナルは，神経伝達3．中枢時計である視交叉上核やホルモンを介して全身に伝達され，睡眠覚醒やホルモン分概日リズムの中で最も代表的なものは睡眠覚醒リズムであ泌ばかりでなく，脂質代謝や細胞分裂などの多様な生理現象り，これは，SCN の約 1 万のニューロンがほぼ独占的にそが 24 時間リズムとして調律されるのである．本稿では，中の特質を決めている．では，SCN の時計と末梢の時計とで枢時計としての SCN の特性に着目し，SCN という組織の中は何が異なるのであろうか．それは培養した細胞を観察すれでリズムが形成されるしくみを最新の研究とともに紹介したばすぐにみえてくる．驚くべきことに，SCN は脳内から取い．

り出して生体外で培養しても 1 年以上にわたって正確な時を刻み続けることができるのである．ところが，末梢組織では，

2．全身にある細胞時計リズムが数日で消失する．これは，個々の細胞のリズムは同ほんの 10 年前には考えられなかったことであるが，現在期せず時間とともに乖離していくため，全体としてのリズム

では，全身のどの部位から取ってきた細胞（たとえば，ヒトは数周期で減衰してしまうと考えられる 3）．すなわち，SCN皮膚の分散培養）でさえ，サーカディアンリズム（概日リズにはリズムを生み出すだけではなく，そのリズムを維持するム）は認められている

1,2）．細胞がこのサーカディアンリズ仕組みが存在するといえる．

ムを生み出す仕組みは中枢，末梢を問わず，すべての細胞において時計遺伝子の転写，翻訳を介したフィードバック機構

4．中枢時計の時間を見る
著者らは SCN の細胞間のリズム位相がどのような機構で〒 606–8501 京都市左京区吉田下阿達町 46–29
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2012 年 4 月 11 日受付

特集

中枢時計の時間を見る

決定されているのかに非常に興味を持った．そのため，SCNのシングルセルレベルでの細胞の時間位相を観察できるシステムを開発した．まず，時間をどう可視化するかであるが，これには，日内の転写レベルが数倍から数十倍に変動するリ
71【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

ズム発振の中心遺伝子である Per1 に着目した．マウス Per1はなく，背内側部から始まり，腹外側部へと広がっていくよ

遺伝子のプロモーター下流にホタル発光遺伝子 luciferase をうな特異的な時空間パターンに従って同期しているのであつないで作製した人工レポーター遺伝子をマウスに導入してる．ところが，この特異的なリズムは Na+ チャネルブロッカー作りだした Per1-luc トランスジェニックマウスを作成し 4），であるテトロドトキシン（TTX）を添加し，SCN ニューロ

この SCN を用いることにした．続く課題は，どのようにしンの活動電位の発生と伝播を抑制すると，瞬く間に脱同調をて in vivo の SCN の機能を保ちながら，生体外に取り出せる起こし，細胞ごとのリズムが乱れてしまい，SCN 全体としかであるが，これには，以前ラット SCN で確立したスライてのリズムは減弱消失する 1）．しかし，TTX を除去すると細ス培養系を用いることにした 5）．すなわち，Per1-luc マウス胞が再び同期し，元の背内側部から順に広がるリズムを構築から作成した SCN スライス培養細胞に luciferase の基質であするのである．このことは，SCN 各細胞におけるリズム発る luciferin を添加すると，Per1 が発現する時刻に細胞が発光振が単一の細胞だけで決まるのではなく，他の細胞のリズムすることを利用したものである．このイメージングに極微弱が互いに影響を及ぼし合っていることを示している．

光用高感度 CCD 顕微鏡を用い，SCN 細胞 1 つ 1 つの発光リズムを時空間解析することに成功した 1）．すなわち，SCN の6．G タンパク質シグナリングがリズムを規定する部位特異性を保ちながら，生体外で時計遺伝子の転写変動をでは，この SCN の細胞集団に特有の組織レベルの特性にリアルタイムイメージングにより検証できる SCN スライスはどのようなメカニズムがはたらいているのであろうか．

培養系が完成したのである．

SCN には G タンパク質受容体が多いことが知られており，興味深いことに，Gi/o の特異的阻害剤である百日咳毒素を5．中枢時計の時計細胞は相互連絡しあって時を刻む

SCN に作用させると，TTX と同様に，リズムが減弱消失す

この Per1-luc トランスジェニックマウスの SCN スライスることが報告された 6）．そこで我々は，Gi/o タンパク質を介培養系を用いた解析の結果，各時計細胞のリズムピークがするシグナル伝達が SCN の細胞間同調にかかわるのではな

SCN の空間的位置により異なることが明らかになった（図 1）．

いかと考え，SCN の細胞間連絡の分子メカニズムに迫るべ

すなわち，SCN 内の Per1 の発現はどれも一様というわけで

く，SCN に特異的に発現する G タンパク質関連因子を網羅

図 1 左半分は，視交叉上核スライスカルチャーにおける Per1-luc 発光の概日変動を 1 時間毎の CCD カメラ像で示す．7 時間の点での像の拡大図を右に示す．この拡大図中の点線は正中線であり，矢印の方向は背側を示す．生体内での元の第 3 脳室（v），視交叉（oc）を示す．スケールバーは 100 μm を表す．
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顕微鏡 Vol. 47, No. 2（2012）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

的に探索した 7）．その過程で，SCN においては RGS16（regulator G-protein signaling 16）が非常に強く発現しており，さ8．おわりにらに，朝に発現がピークとなるような強いリズムがみられる

上述の結果は，これまで長い間謎に包まれていた SCN 細8）

ことを見出した ．RGS16 は生化学的には 3 量体 G タンパ

胞間コミュニケーションの分子機序に迫ろうとするものであ

ク質の Gαi に対して抑制的に働く GAP（GTP 加水分解活性る．これら一連の研究において，個々の SCN 細胞を時空間化タンパク質）として知られる分子である．興味深いことに，的に解析することができる SCN スライス培養系は非常に強RGS16 欠損マウスを作製し SCN を調べたところ，リズムの力なツールとなった．今後もこのようなリアルタイムイメー起点を形成する背内側部の先頭集団細胞の時間位相が遅れ，ジング技術は，SCN，ひいては脳の神経ネットワークがいかマウス個体の活動リズムも遅延することがわかった．にして個体の行動パターンを規定するのかという脳の仕組みを理解するうえで重要なツールとなるだろう．そして，さら7．視交叉上核の背内側にあるリズムリーダーなる研究の発展のためにより高性能な解析技術の登場が期待

RGS16 欠損マウスの背内側部で何が起こっているのであされる．

ろうか．正常マウスでは背内側部細胞に早朝 RGS16 が発現し，それに続いて細胞内 cAMP が上昇し，その下流に位置するシグナル伝達が活性化される．Per1 はそのプロモーター部位に活性のある CRE が存在し，転写の増大に伴う Per1 の発現がどこよりも早く惹起されるのである．一方，早朝以外の時間帯には RGS16 の発現が低下するので，Gαi の活性の抑制がなくなり細胞内に cAMP シグナルが流れなくなる．
つまり，RGS16 は SCN 背内側の細胞では，時間特異的に起こる cAMP シグナル伝達により，特有の早いリズムを生み出しているのである 8）．この SCN 背内側のリズムが，SCNの他の細胞に伝わり，SCN 全体としてのリズムを早くする．

特集

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文献1）Ymaguchi, S. et al.: Science, 302, 1408–1412 (2003)
2）Brown, S.A. et al.: PLoS Biol., 3, e338 (2005)
3）Nagoshi, E. et al.: Cell, 119, 693–705 (2004)
4）Yamaguchi, S. et al.: Curr Biol., 10, 873–876 (2000)
5）Tominaga, K. et al.: Neuroscience, 59, 1025–1042 (1994)
6）Aton, S.J. et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103, 19188–19193(2006)
7）Okamura, H.: Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol., 72, 551–556(2007)
8）Doi, M. et al.: Nat. Commun., 2, 327 (2011)73【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】