大気圧走査電子顕微鏡（ASEM）

巨核球による血小板産生と樹状細胞による細菌貪食の液中電顕観察
Observation of Megakaryocyte and Dendritic Cells in Liquid Using Atmospheric
Scanning Electron Microscope (ASEM)
佐藤主税ａ，渡邊要平ａ，丸山雄介ａ，佐藤真理ａ，山本雅之ｂ，辻典子ａ，本橋ほづみｃ

Chikara Sato, Yohei Watanabe, Yuusuke Maruyama, Mari Sato, Masayuki Yamamoto, Noriko M Tsuji and Hozumi Motohashiａ

産業技術総合研究所

バイオメディカル研究部門ｂ

東北大学大学院医学系研究科

ｃ

東北大学加齢医学研究所

要旨

医化学分野

加齢制御研究部門

遺伝子発現制御分野

血液中の細胞成分の一つである血小板は，骨髄において巨核球から生産される．巨核球は多核細胞であり，成熟に伴い胞体突起を伸長する．その突起がちぎれることにより血小板が形成される．一方，樹状細胞は抗原提示細胞として機能する自然免疫細胞である．細菌などを食作用により細胞内にとりこみ，抗原情報を T 細胞に提示すると共にサイトカインなどの様々な液性因子を産生して獲得免疫を誘導する．これら細胞の微小な内部器官とタンパク質複合体による機構には，未知の部分が多い．巨核球を，コーティングした SiN 薄膜上で初代培養し，前血小板中の接着因子 P-selectin を免疫ラベルした．大気圧走査電子顕微鏡（ASEM）で水中観察したところ，前血小板はラベルされた a 顆粒らしい構造を含み，周囲に微小管が張りめぐらされていた．また，細菌が樹状細胞に貪食され，細菌を取り込んだ食胞が F-actin に囲まれる様子を ASEM で観察した．

キーワード：免疫電子顕微鏡，巨核球，血小板，樹状細胞，微小管1.

様々な刺激下で培養して，細胞応答を観察できる．しかし，はじめに細胞の長い末端突起は基質上に薄く 2 次元的に広がるため，大気圧走査電子顕微鏡（ASEM: Atmospheric Scanning Elec­

通常の超薄切片による透過電顕法では，接着基質と水平に薄tron Microscope）は，走査電顕を倒立させることで，水中の切する必要があり容易ではない．ASEM デッシュを用いて，サンプルを電子線透過膜から 2–3 mm の深さで観察する

1,2）

．

SiN 膜近くでの分解能は 8 nm である 1）．ASEM では，サンプルはディッシュ上に置かれ，ディッシュ底の 100 nm（原子巨核球と樹状細胞を初代培養・実験し，化学固定後に水溶液中で ASEM 観察した．

400 個程度）厚の強靭な SiN 薄膜を透して反射電子により観2.

結果と考察察される．さらに，上に備えた光顕と相関観察（CLEM: Cor­

2.1

巨核球

relative Light and Electron Microscopy）できる．ASEM ディッ

巨核球は，前駆細胞から分化して成熟するにつれて，多核シュは，取り外し可能で CO2 培養器で培養でき，細胞に対化し細胞質が豊富な大型の細胞になる．やがて，胞体突起とするこれまでの生理的刺激法・蛍光ラベル法のほとんどを適よばれる突起を伸長して，そこから血小板が形成される．血用可能にした．SiN 膜は，ガラス板と同様に，タンパク質な小板は，止血機構だけでなく，動脈硬化・炎症・がん転移などで表面をコートできる．そのため，株細胞のみならず，培ど，様々な病態において重要な役割を果たしていることが近養が難しい組織からの初代培養を膜上で行うことが可能であ年報告されている．血液細胞の中でも，巨核球は生体内の存る 3 ～ 5）．それは，SiN 膜の製造過程で，膜表面が酸化され在数が非常に少ないために，解析が難しい細胞系列の一つでSiOx になっておりガラス様の性質を持つからと思われる．

ある．しかし，血小板の減少時に特異的に血小板増加作用をしかも，水中観察は観察までの処理の手間が少ない．光顕と示す因子としてトロンボポエチン（thrombopoietin: TPO）がほぼ同じである．

発見され試験管内での巨核球の分化誘導が可能となり，一方，巨核球と樹状細胞は，生理学的に重要で疾患治療の観点か発生工学の技術が進歩し様々な遺伝子改変マウスの作製が可らも高い注目を集める．初代培養が可能であることが知られ，能となったことにより，巨核球の分化成熟と血小板形成の分ａ〒 305–8566 茨城県つくば市東 1–1–1
E-mail: ti-sato@aist.go.jp
2014 年 2 月 10 日受付
14

子機構が徐々に明らかになってきた．これまでに我々は，転写因子 NF-E2 が巨核球の成熟と血小板産生，さらに血小板の反応性の獲得に重要であることを明らかにしてきた 6 ～ 10）．
顕微鏡 Vol. 49, No. 1（2014）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

図 1 巨核球による胞体突起形成の ASEM 観察．（A）Ti-Blue 染色後に水中で ASEM 観察．白枠を拡大撮影したのが（B）であり，その中のサブパネルは胞状突起の先端をさらに高倍撮影．4）より改変．

また，近年では，NF-E2 を線維芽細胞へ導入することにより，血小板を産生できることが報告されたり 11），ヒト ES 細胞やiPS 細胞から巨核球を分化させて血小板を産生できることが報告されている 12）．しかしながら，巨核球から血小板が放出される分子機構については，まだ多くの謎が残されている．
このプロセスは，巨核球の初代培養からの胞体突起形成として観察することが可能である．マウス骨髄から単離した巨核球をディッシュに蒔き，12 時間ほど培養すると，胞体突起形成が起こり始める．ASEM を用いて観察するために，ASEM ディッシュをフィブロネクチンでコートすることにより巨核球の接着性を増加させた．Ti-Blue を用いた染色では，ビーズ状のふくらみを有する胞体突起が観察された（図 1）．

図 2 胞体突起の P セレクチンを免疫ラベル．（A）膜透過後に，Pセレクチンを抗体ラベルし，蛍光と金（FluoroNanogold）標識 Fab’
で 2 次ラベル．金増感後に ASEM 撮影．（B）タンニン酸／酢酸ウラン／クエン酸鉛で追加染色．前小胞体の膜構造などが見える．矢印は P セレクチンを含む a 顆粒で，矢頭は密顆粒．4）より改変．

血小板の機能に極めて重要とされる P セレクチンは，血小板の a 顆粒の膜に存在しているとされている．P セレクチン

印は P セレクチンを含む a 顆粒で，矢頭は P セレクチンを含抗体により標識し，FluoroNanogold Fab’ で 2 次標識し金増感

まず密顆粒と思われる．さらに，P セレクチンと微小管とのしたところ 3,4），たしかに，血小板内の顆粒状の構造体を観関係を調べると，前血小板内部に微小管が張り巡らされてお察することができた（図 2）．金属溶液でカウンター染色すり，それに結合するように P セレクチンが存在すると思われることで周辺の構造や細胞境界を可視化することができ，矢る構造物（矢印）が確認できた（図 3）．一般に，ASEM dish図 3 巨核球の a-チューブリンと P セレクチンを免疫ラベル．
（A）位相差光顕．
（B–D）免疫ラベル後に ASEM 観察．それぞれ白枠を拡大撮影．
（B）胞体突起と連結部は微小管が豊富で（C）高倍像では一本一本の微小管が観察され（D）顆粒状の構造（矢印）も見える．4）より改変．

特集

巨核球による血小板産生と樹状細胞による細菌貪食の液中電顕観察

15【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

図 4 樹状細胞による食作用．（A）蛍光写真．（B–C）タンニン酸／酢酸ウラン／クエン酸鉛染色像．（D–E）燐タングステン酸染色像．白枠は右図でそれぞれ拡大撮影された．とりこまれた乳酸菌（矢印）は，細胞質と区分けされたエンドソーム（矢頭）と思われる器官に包まれ，さらにラベルされた F-actin（緑）・microtubule（赤）に取り囲まれる．青は DAPI による染色で，核が染まって見える．4）より改変．

上の細胞の水中での免疫ラベルは，光顕並にハイスループッくに分布しているように見える（図 4A）．細菌の輸送には，主トに行うことができる．今後，血小板形成に関わる分子が実に F-actin が使われるのであろうか．ここでは，細菌をとりこ際に血小板形成のどの局面で機能しているかを検証するため

んだ樹状細胞は細胞質が厚くなり，上方からの蛍光観察は各には，ASEM が有効な解析手段を提供するものと期待される．

層の蛍光が重なり合うため明解ではない．光顕側を Confocal

2.2

樹状細胞による食作用顕微鏡にする必要性が感じられる．ここでの染色はタンニン

樹状細胞は免疫系による防護の引き金をひく重要な自然免

酸，酢酸ウラン，クエン酸鉛染色であるが，燐タングステン疫細胞である．マクロファージや好中球と同様に，細菌など酸単独の染色に変えても綺麗に染まる（図 4D–E）．ここで，を食作用によって細胞内にとりこむ（ファゴサイトーシス）．

乳酸菌を囲むエンドソームと思われる小胞の内部は黒く（密とりこんだ抗原情報を T 細胞に提示するとともに，様々な度が低く），その周りの細胞質は白く（密度が高く）見える．

液性因子を産生して獲得免疫を誘導する 13）．無菌飼育動物では，自然免疫細胞と獲得免疫細胞の連携が十分に機能せず，3.

免疫系は未熟なままである．これは共生バクテリアが免疫系

ASEM dish での初代培養技術は，遺伝子改変動物から得らの成熟にとって重要であることを示唆している．腸管は多くれた細胞にも適用することができる 5）．これまでの巨核球研の腸内細菌と共生関係にあり，自然免疫刺激を受けている．

究におけるマウス遺伝子改変の蓄積を用いて，今後は分子・特に小腸には免疫誘導器官であるパイエル板と多くの免疫細複合体レベルでの血小板産生機構の解明が進むことが期待さ胞が存在し，主要な共生細菌として乳酸菌が常在している．

れる．また，蛍光と電子線による水中 CLEM は，多色によ

今後の展望

これまでに我々は，乳酸菌が骨髄由来樹状細胞を活性化する複数種分子のラベルを高分解能ラベルと比較することを可ることを報告してきた 14,15）．乳酸菌は，樹状細胞の活性化と能にした 3 ～ 5）．複合体形成など様々な研究に応用できる．樹

サイトカインやインターフェロンの分泌を促すことで，NK状細胞が乳酸菌を取り込んだ像は，肺胞上皮細胞がレジオネ細胞・T 細胞・B 細胞を活性化する 14,16,17）．樹状細胞などはラ菌を取り込んで肺炎が慢性化している様子とも似ている．

食作用の際，細胞骨格の動態をともなって細菌や抗原粒子をASEM の各種感染症・炎症性疾患研究への応用の可能性を示

とりこむ 18）．ここでは，骨髄細胞から分化誘導した樹状細胞唆すると思われる．に，乳酸菌 Lactcoccus lactis C60 の加熱死菌体を共培養してとりこませた 4）．固定後，細胞骨格を蛍光ラベルで特定した

謝辞（図 4A）．さらに，重金属で染色し，ASEM で相関観察をおこ

産総研の小椋俊彦博士に ASEM（ClairScope）開発におけなった．ASEM では，乳酸菌は膜区画に閉じ込められて観察る貢献に感謝します．本研究は，新学術領域「構造細胞生物される（図 4B–C）．おそらくエンドソームであろう．F-actin

学」，CREST，ヤクルト・バイオサイエンス研究財団の支援と a-Tubulin との位置関係は，F-actin がよりエンドソーム近を受けて行われました．

16

顕微鏡 Vol. 49, No. 1（2014）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

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巨核球による血小板産生と樹状細胞による細菌貪食の液中電顕観察

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