Niigata Dent. J. 33（2）：17−23,

2003

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−原著−
ヒト口腔由来と腸管由来のEnterococcus faecalis における遺伝学的検討中條和子１,２），中澤太１），星新潟大学大学院医歯学総合研究科

野悦郎１）

口腔生命科学専攻

口腔健康科学講座
口腔環境・感染防御学分野，2 ）う蝕学分野

1）

Phylogenetic Diversity of Enterococcus faecalis from
Human Oral Cavities and Intestinal Tracts
Nakajo Kazuko１,２），Nakazawa Futoshi１），Hoshino Etsuro１）
Division of Oral Ecology in Health and Infection1, Cariology2,
Department of Oral Health Science, Cource for Oral Life Science,
Niigata University Graduate School of Medical and Dental Sciences
平成15年11月14日受付

11月14日受理

Key words：Enterococcus faecalis,16S rDNA sequence similarity（16SリボゾームDNA塩基配列類似性）,
Phylogenetic diversity（遺伝学的多様性）, Human oral cavities and intestinal tracts (ヒト口腔由来株と腸管由来株）
Abstract：Enterococcus faecalis has been isolated frequently from human intestinal tracts. Also we have reported
previously that these bacterial species has been occurred as predominant alkali resistant bacteria in humaninfected root canals. The aim of this study is to evaluate phylogenetic diversity of 16S rRNA of the human oral E.
faecalis.
In the present study, we used 9 strains of E. faecalis, ATCC 19433T, 4 strains isolated from human infected root
canals and 4 strains isolated from human feces. From cells of these bacterial strains, genomic DNAs wereextracted by using InstaGene Matrix and used as templates for amplification of 16S rDNA with universal primer
sets in Polymerase Chain Reactions（PCR）. For cycle sequence method of 16S rDNA sequence analysis, aThermo Sequenase fluorescent labelled primer cycle sequencing kit was used with the 11 universal primer setslabeled with Cy-5, following the manufacture's protocol. Sequences of 16S rDNA were analyzed with a DNAsequencer. The segmented nucleotide sequences of 16S rDNA were connected using Seqman in LASERGENE
computer program. Sequence similarity was analyzed by a clustal W method, which is programmed by Megalignin the LASERGENE computer program.
16S rDNA sequences of the E. faecalis reference strain（ATCC 19433T）was highly similar（98.4〜100 %）tothose of the feces isolates and oral isolates, repectively. On the other hands, when the 16S rDNA sequences of oral
isolates were compared to those of isolates from feces, these similarities were ranged widely and low（93.1〜99.1%）. These results of the present study has suggested that some of human oral E. faecalis may adapt to oralconditions and change genetically.
抄録：Enterococcus faecalisはヒトの腸管細菌叢に広く生息している。我々はこれまで，本菌種が感染根管象牙質から検出されることや，強いアルカリ耐性を示すことを報告してきた。今回は，生息の場の違いによる遺伝学的変異を明らかにする目的で，感染根管及び腸管分離E. faecalisについて，その16S rRNA geneの塩基配列を明らかにし，相−17−184

新潟歯学会誌

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互に比較検討した。
E. faecalis の標準株ATCC 19433の他，感染根管象牙質，およびヒト糞便から得たE. faecalis分離株を用い，その培養菌体からInstaGene MatrixにてDNAを抽出した。そのDNAをtemplateとし，universal primersを用いてPCR法にて16S rDNAを増幅後，精製16S rDNA，Thermo Sequenase Labelled Primer Cycle Sequencing Kit with 7-deazadGTPと11種類のprimerにてPCRし，ALF expressを使ってその塩基配列を明らかにした。更にsequence解析プログ
ラムLASERGENEを用いて相互のsequence similarityを明らかにし，遺伝学的相互関係を検討した。
その結果，根管由来と腸管由来の菌株それぞれと，標準株との比較では著しく高い相同性（98.4〜100 ％）を示したのに対し，根管由来と腸管由来の菌株間の相同性は93.1〜99.1 ％であった。これらの結果から，根管由来と腸管由来のE. faecalisにおいては，生息の場の違いと共に菌株間にも遺伝学的差異が認められた。

一方，E. faecalisはヒトう蝕象牙質や歯内病巣部から諸言分離されることが知られている。現在，根管治療において最も効果が期待される薬剤のひとつとして，水酸化カヒトの生体には多種多様の細菌種が生息し，その生息ルシウム製剤が広く使用されてる。しかし，水酸化カル場所に応じた独自の細菌叢を形成している。即ち，細菌シウム製剤貼薬後の根管から，Enterococcus属細菌種がはそれぞれに最も適した環境を持つ場所に生息し，その高頻度に分離されることが報告されている ９, 10）。また，細菌叢は独特の細菌群によって構成され，それぞれに遺高濃度アルカリ性培地を用い，根尖性歯周炎，歯周歯内伝学的進化を展開していると考えられる。例えば，ヒト病変におけるアルカリ耐性細菌を検討した結果，E.

歯周病の原因菌の１つとされる黒色色素産生性グラム陰faecalisが高い頻度で検出され，アルカリ耐性細菌とし性桿菌Porphylomonas gingivalisは，その大部分が口腔てのE. faecalisの重要性が指摘されている11）。

領域に生息しており，非口腔領域から分離され生物学的本研究では，これらヒト口腔から分離されるE.に酷似している菌種Porphylomonas asaccharolyticusとfaecalisの由来を明らかにする目的で，ヒト口腔内から遺伝学的に異なっていることが明らかにされている １）。

分離したE. faecalisと，ヒト腸管由来と考えられる糞便

また，これまで同じLactobacillus属の細菌種として分類から分離したE. faecalisを用い，その16S rRNA geneのされていたLactobacillus uliとLactobacillus rimaeは，塩基配列を明らかにし，相互の遺伝学的類縁性を比較検16SリボソームRNA（16S rRNA）geneの塩基配列を明討した。

らかにした近年の研究によって，発生遺伝学的に材料および方法Lactobacillus属の基準菌種とは極めて異なっていることが明らかになり，ヒト口腔内に生息するLactobacillus
uliはOlsenella uliとして，また非口腔由来のLactobacillus

１：使用細菌株

rimaeはApotobium rimaeとして，新しく再分類されてEnterococcus faecalisの標準株であるATCC 19433株

いる2〜4）。同様なことはPropionibacterium acnesにも見らの他，表1で示したヒト口腔由来（感染根管から分離）れ，ヒト口腔内から分離されるP. acnes株は，ヒトの皮の４株と，ヒト腸管由来（糞便から分離）の４株を用い膚などに生息し，ニキビなどの炎症を起こすP. acnesのた。

分離株とは異なった生化学的性状を示すことが知られ，生息場所の異なるP. acnesは遺伝学的にも異なる可能性

２ ：細菌種の同定方法
１）一般性状検査：本研究で用いた分離株は，純培養が示唆されている 。
５）Enterococcus faecalisはヒトの腸管細菌叢に広く生息を確認した後，Virginia Polytechnic Instituteする通性嫌気性グラム陽性球菌である。長い間，本菌種

manual12）に準じて性状検査を行った。またはStreptococcus属の血清D群に属するStreptococcus

Pepton-yeast extract-glucose（PYG）brothに産faecalisとして分類されていた。しかし，細菌のDNAを生された最終産物をガスクロマトグラフィーを用用いた分類方法の導入によってDNA-DNA hybridization

いて分析を行い 1 3 , 1 4 ），更にグラム染色，6.5％によるDNA相同性においてStreptococcus属の他の菌種NaCl含有培地における生育の確認を行った。との間に著しい違いがあることが明らかになり，

２）Polymerase Chain Reactions（PCR）法：BHI血Enterococcus faecalisとして再分類された６，７）。また表液寒天平板に培養した菌株のコロニーをエッペン現形質においてもE. faecalisはStreptococcus属細菌種とドルフチューブに採取し，滅菌生理食塩水で遠心は異なり6.5 ％ NaCl存在下で生育することも報告され洗浄後，InstaGene Matrix（Bio-Rad, Hercules,ている 。

CA, USA）を加え，通法に従って加熱処理を加８）−18−