― 80 ―Massilia sp. BS-1が生産する青紫色素，秋青紫（Shu-Violet）
─新規ビオラセイン生産菌の分離と諸性質─
鈴木一也＊・上松仁

Bluish-purple Pigments, Shu-Violet, Produced by Massilia sp. BS-1
― Isolation and characterization of a novel bacterium producing violacein ―Kazuya SUZUKI ＊ and Hitosi AGEMATU（平成21年12月 3 日受理）
In the course of screening for pigments produced by microorganisms, we found a novelbacterium, BS-1 strain, producing a bluish-purple pigment named Shu-Violet（SV）. BS-1 strain
was isolated from the soil collected at a park in Akita city, Akita Prefecture, Japan, and wasfound to be a new species belonged to the genus Massilia based on its 16S ribosomal DNAsequences. The strain was named Massilia sp. BS-1. The strain was a motile aerobic
bacterium and also produced biofilm. SV was included in the biofilm. The chemical analysisof the pigment by UV-visible spectrum, mass spectroscopy and 1H-NMR spectroscopy showedthat the pigment was a mixture of violacein and deoxyviolacein. The 16S ribosomal DNA ofBS-1 strain displayed 93 % homology with that of its nearest violacein-producing neighbor,Janthinobacterium lividum. The antibacterial effect of SV was confirmed for two putrefactivebacteria, Bacillus subtilis and Escherichia coli. The minimum inhibitory concentration（MIC）
of SV for B. subtilis was 1.25mg/L. The high concentration of SV above 20mg/L caused lethal
effects on B. subtilis. However, SV could not inhibit the growth of E. coli even if more than
30mg/L.

1.

緒言

天然色素はその由来から植物界，動物界に存在するものと，微生物により作られるものとに分類される。例えば，植物界の色素としてインジゴ（藍）がある。インジゴは最も古い青紫色の天然染料で，少なくとも BC2000年のミイラを包んでいた麻布が藍で染められていたことが知られている。1800年代の終わり頃まで，インジゴはコマツナギ属（Indigofera）という植物から得られていたが，1887年にインジゴが 2 分子のインドールが重合した構造であることが分かると化学合成法で製造されるようになった。現
在でもジーパンなどのデニムの染料として使われている。動物界の色素としては昆虫に由来するカルミン酸（赤色）やケルメス酸（赤紫）などがある。一＊秋田高専専攻科学生

方，微生物は様々な色素を生産することが知られているが，染料として繊維に吸着する染着性を持つ色素は少ない。鮮やかな青紫の色素として唯一ビオラセイン（Violacein）が知られている（Fig. 1）。天然色素は合成色素に比べて，鮮やかさに欠け，また日光で色あせるなどの色の安定性が弱い欠点を持っているが，抗菌活性などの生理的活性を持つものもあり機能性色素として注目されている。
ビオラセインは，1882年にアマゾン川流域の土壌や水から採取された細菌 Chromobacterium violaceumが生産する青紫色素として報告された1）。その後の研究からこの青紫色素は 2 つの物質の混合物であることが分かり，主成分がビオラセイン，少量含まれる物質をデオキシビオラセインと名付けられて化学構造が決定された2）。ビオラセインの化学構造
は （3-［1,2-dihydro-5-（5-hydroxy-1H-indol-3-yl）-2-oxo-3H- pyrrol-3-ylidene］-1,3-dihydro-2H-indol-2平成22年２月

― 81 ―
Massilia sp. BS-1 が生産する青紫色素，秋青紫（Shu-Violet）

one）で表わされる。ビオラセインは青紫色の目立つ色素であることから，Chromobacterium fluviatile3），
Janthinobacterium lividum4），Alteromonas luteoviolacea5），
Pseudoalteromonas luteoviolacea6） などの他の微生物でも生産の報告がなされている。安定同位体を用いた生合成研究から，ビオラセインは 2 分子の L- トリ
プトファンが脱炭酸を伴う縮合反応により生成されることが分かった7）。また，ビオラセインは，抗菌活性8），抗腫瘍活性9），抗ウイルス活性10），抗酸化活性11），抗原生動物活性12）などの広範囲の生理活性を持つことが報告されている。

Fig 1.

Structures of violacein（R ＝ OH）anddeoxyviolacein（R ＝ H）.

著者らは微生物の有効利用を目的として機能性微生物の探索を行っている。その一つが微生物が生産する染料として利用可能な機能性色素の探索である。この探索の過程で秋田市内の公園の土壌から青紫色のコロニーを形成する新種の細菌 Massilia sp.
BS-1 株を発見した13）。この青紫色素を秋青紫（Shuviolet，以後 SV と略記）と名付けて構造決定したと
ころビオラセインとデオキシビオラセインであった。これまでに Massilia 属の菌によるビオラセイン生産の報告はない。
本報告では BS-1 株の発見と同定，青紫色素 SV の構造決定，SV 生産，抗菌活性について報告する。
2.

実験方法

2.1 培地組成及び培養条件
BS-1 株の培養は分離培地（酵母エキス0.1%，ポリペプトン0.1%，KH2PO4 0.1%，（pH 6.8））を用いた。なお，寒天平板分離培地は1.5%の寒天を加えた。
培養温度は25℃あるいは28℃で振とう培養した。
検定菌の Bacillus subtilis および Escherichia coli の培養は LB 培地（トリプトン 1 %，酵母エキス0.5%，NaCl 1%）を用いて30℃で振とう培養した。
2.2 土壌からの BS-1株の分離
秋田市内の公園から採取した耳かき一杯程の土壌
秋田高専研究紀要第45号

を 1 ml の滅菌した生理食塩水に懸濁し，ミキサーで良く撹拌した後に上清0.1ml を寒天平板分離培地（シクロヘキシミド50µg/ml 含有）に塗布した。
28℃で 2～3 日保温すると青紫色の固いコロニーが生育し BS-1 株と名付けた。
2.3 BS-1 株の同定
BS-1 株のゲノムの16SrDNA 領域を PCR 法により増幅し，得られた479bpをシークエンス後，National14）
Center for Biotechnology information（NCBI）のBLAST サーチでホモロジー検索を行った。系統樹
解析は MEGA 4を用いて行った15）。
2.4 BS-1 株の液体培養による SV の生産
分 離 培 地 2 ml を 入 れ た 遠 沈 管 に 寒 天 平 板 か ら
BS-1 株を接種し，28℃もしくは25℃で振とう培養（レシプロ）を行った。フラスコ培養は分離培地
50ml を入れた300ml 容のエルレンマイヤーフラスコに植菌して振とう培養（ロータリー）を行った。
ジャー培養は 3 L 容のジャーファーメンターを用い，培養温度：25℃，通気量：0.5vvm，撹拌速度：300rpm，培養液：2 L で培養を行った。
2.5 SV の定量
BS-1 株が生産した SV の簡便な定量はλmax である570nm の吸光度（A570）により行った。培養液 1mlを1.5ml 容 の エ ッ ペ ン チ ュ ー ブ に 取 り15,000rpm
で 5 分間遠心して透明な上清を除き，得られた凝集菌体にメタノール 1 ml 加えて攪拌して SV をメタノールに抽出した。SV は凝集体の中にあるのでメタノールに溶出しにくい時は超音波処理を行い，再び15,000rpm で 5 分遠心して沈殿から SV が完全に抽出していることを確認して上清のメタノール液を取り，570nm の吸光度を測定してε＝1.7×104 L
mol －1 cm －1より SV の濃度を求めた16）。なお，SVの相対量を比較する場合は A570を用いた。
2.6 SV の HPLC 分析
SV の HPLC 分析は以下の条件で行った。
Table 1.

Analytical HPLC conditions

Column : ZORBAX SB-Aq（ODS, 4.6 I.D. ×150 L mm）
Mobile Phase : 70% MeOH（v/v）
Flow Rate : 0.5 mL/min
Column Temp. : 40℃
Detection : 570 nm

― 82 ―
鈴木一也・上松

2.7 培養液からの SV の単離精製
3 L 容のジャーファーメンターで得られた培養液
2 L を菌体ごと等量の酢酸エチルで抽出して SV を酢酸エチル層に抽出した。酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後にエバポレーターで減圧下に酢酸エチルを留去して残渣を得た。残渣を70％メタノールに溶かして以下の条件の分取 HPLC によるピーク分取を行い，移動相を減圧下に除いて SV-1（デオキシビオラセイン）と SV-2（ビオラセイン）を得た。
Table 2.

Preparative HPLC conditions

Column : Inertsil ODS-3（20 I.D. ×250 L mm）
Mobile Phase : 70% MeOH（v/v）
Flow Rate : 5.0 mL/min
Column Temp. : room temp.
Injection Vol. : 5.0 mL
Detection : 570 nm

2.8 SV の構造決定
1H-NMR ス ペ ク ト ル は Bruker AVANCE-500（Bruker 社 製 ） を 用 い て 溶 媒 は 重 メ タ ノ ー ル（CD3OD）で測定した。分子量は Agilent 6320 Ion
Trap LC/MS システム（アジレント・テクノロジー（株）製）を用いた ESI-MS で測定した。

仁

Fig 2. Flocculation of Massilia sp. BS-1.

BS-1 株を同定するために16S rDNA 領域（479bp）の 塩 基 配 列 を 決 定 し た（Fig. 3）。16S rDNA の 部分塩基配列に基づく相同性解析の結果，既知菌種との相同性が低く，97.9％の最も高い相同性を示した Massilia brevitalea から Massilia 属の新種であると
判 断 し Massilia sp. BS-1と 名 付 け た。Massilia 属 は
Oxalobacteraceae 科に属するグラム陰性菌である。
これまでにビオラセインの生産は報告されてない。
特徴的な青紫色素であるビオラセインの生産菌として，Chromobacterium violaceum，Janthinobacteriumlividum，海洋細菌である Pseudoalteromonas 属が報告されている。これらの細菌を含めた系統樹解析を 行 っ た（Fig. 4）。 一 番 近 縁 の Janthinobacterium
lividum との16S rDNA の塩基配列の相同性は93％であった。この結果より，BS-1 株は既存のビオラセイン生産菌とは属が異なる Massilia 属の新種である。

2.9 SV の抗菌活性SV の発育阻止効果を検討するために，B. subtilisと E. coli を検定菌として LB 寒天平板培地での最小発育阻止濃度（MIC）を測定した。また，SV の致死効果を検討するために，検定菌を LB 培地で対数増殖期（培養 3 時間）まで振とう培養し，DMSO に溶かした様々な濃度の SV を添加して培養を続け，経時的に培養液を LB 寒天平板培地に塗布して生育コロニー数を数えた。
3.

実験結果および考察

3.1 SV 生産菌 BS-1 株の分離と同定
BS-1 株は寒天平板分離培地上で青紫色素を含むフィルム状の物質を生産して硬いコロニーを形成した。液体培養では BS-1 株は運動性を有する好気性桿菌で，凝集菌体になった（Fig. 2A）。顕微鏡で観察するとフィルム状の物質生産と菌が凝集しているのが分かる（Fig. 2B）。分離液体培地で静置培養をすると培養液の表面に菌膜を形成した。

Fig 3.

16S rDNA sequences of Massilia sp. BS-1.

3.2 BS-1 株の培養と SV の生産
BS-1 株のフラスコ培養の結果から，SV の生産には十分な溶存酸素が必要なこと，培養温度は25℃が最適なことが分かった。そこで，Jar 培養を行った。
培養経過を Fig. 5 に示す。培養開始16時間後の対数増殖期末期から急激に SV の生産が始まり，5 時
平成22年２月

― 83 ―
Massilia sp. BS-1 が生産する青紫色素，秋青紫（Shu-Violet）

Fig 4.

Phylogenetic relationships of Massilia sp. BS-1
to its relatives and violacein-producing bacteria
constructed by using 16S rDNA sequences.

間後にほぼ SV 生産が終了した。培養21時間で A570は0.848であり，これはビオラセイン濃度0.017g/Lに相当する。C. violaceum においてビオラセインはautoinducer（AI）を介して起きるクオラムセンシング（Quorum Sensing）と呼ばれる菌数依存的な生物活性制御システムにより生産される17）。おそら
く BS-1株においても常に少量の AI を培養液中に分泌していて，菌体濃度がある濃度以上になった時，AI 濃度が閾値に達し AI の自己誘導により AI 量が飛躍的に増大して，AI による SV の生合成遺伝子の誘導が起きると考えている。C. violaceum の AI はN-acylhomoserine lactone であるが18），BS-1株の AIについて現在，研究中である。
BS-1 株は多糖を生産して凝集菌体になる。SV は菌体外に分泌されるが水溶性が低い（0.019g/L）ためにほとんどが凝集菌体中に蓄積された。培養液を遠心分離するとほとんどの SV は沈殿した凝集菌体から回収された。酢酸エチルで抽出する場合は，菌体を分離することなく全培養液を抽出すると凝集菌体からも SV が完全に抽出され，水層側には白色の凝集菌体が残った。
3.3 SV の HPLC 分析
Massilia sp. BS-1 が生産した青紫色素 SV を凝集菌体からメタノールで抽出して ODS カラムを用いて Table 1 の条件で HPLC 分析した。Fig. 6 に示す
ように SV は 2 つの物質 SV-1（デオキシビオラセイン）と SV-2（ビオラセイン）の混合物であった。
SV 中の比率はおよそ 1：7 であった。
3.4 SV の構造決定
Massilia sp. BS-1 の培養液から酢酸エチル抽出，
分 取 HPLC に よ り SV-1と SV-2を そ れ ぞ れ0.7mg，1.3mg 精製し，化学構造の決定を可視吸収スペクト
秋田高専研究紀要第45号

Fig 5.

Time courses of cell growth（A 660）and SVproduction（A570）using Massilia sp. BS-1.
Symbols : ● , optical density of cells ; ○ ,optical density of SV ; ■ , pH.

Fig 6.

HPLC analysis of SV.
HPLC conditions : column : ODS（4.6 I.D. ×150 L mm）; mobile phase : 70% MeOH ; flowrate : 0.5 mL/min ; column temp. : 40℃ ; detection :570 nm

ル測定，ESI-MS 測定，1H-NMR スペクトル測定により行った。
Fig. 7 に SV-1と SV-2の 吸 収 ス ペ ク ト ル を 示 す。
λmax は そ れ ぞ れ560nm，575nm で あ っ た。SV-1の分子量は，ESI-MS 分析から m/z : 328.2（positive），326.0（negative）より327と考えた。同様に SV-2の分 子 量 を m/z : 344.2（positive），342.1（negative）
より343と考えた。
これらの情報から Chapman & Hall/CRC 社の化19）
合物辞典（DVD 版）
で UV ＝550～590nm，MS ＝327～328で検索したところ，ビオラセイン（MW :343.34，CAS : 548-54-9）とデオキシビオラセイン（MW : 327.34，CAS : 5839-61-2）がヒットした。
最終的な構造確認は 1H-NMR スペクトル測定で行った。重メタノールで測定したために，フェノー

― 84 ―
鈴木一也・上松ル性およびアミン性のHシグナルは観察できなかったが，DMSO-d6で測定したビオラセインの文献値20） と矛盾なく一致したことから，SV-1はデオキシビオラセイン，SV-2はビオラセインと同定した。測定したシグナルの帰属を Fig. 8 に示す。
3.5 SV の抗菌活性
ビオラセインの腐敗菌に対する抗菌活性は既に報告されている21）が SV の腐敗菌に対する抗菌活性の検討を行った。枯草菌 B. subtilis を検定菌として最小生育阻止濃度（MIC）を求めたところ1.25µg/mlであった。次に，増殖菌体への致死効果を見るために B. subtilis を LB 培地に植菌して30℃で 3 時間培養して対数増殖期に達したところで，最終濃度が 0，10，20，30µg/ml になるように SV を添加して，培養液を経時的に LB 平板培地に塗布して生菌数を数仁えた。Fig. 9 に示すように20µg/ml 以上の濃度で増殖菌体に対する致死効果を示した。同様の実験を大腸菌 E. coli K12株でも行ったが，MIC は検定した最大濃度30µg/ml でも菌が生育し，この濃度においても増殖菌体の致死効果は見られなかった。ビオラセインはグラム陽性菌に対して抗菌活性を示すが，グラム陰性菌の大腸菌や真菌には抗菌活性を示さない21）。SV の抗菌活性も同様の結果になった。

Fig 9.

Growth inhibitory and lethal effect of SV in thelogarithmic phase of B. subtilis.
Symbols : ● , 0µg/ml ; ○ , 10µg/ml ; ▲ , 20µg/ml ; △ , 30µg/ml.

4.
Fig 7.

Absorbance spectrum of SV-1 and SV-2.

Fig 8.

Assignment of 1H-NMR signals of SV-1（deoxyviolacein）and SV-2（violacein）.

結論

Massilia と言う属名はフランスのマルセイユで発見された菌であることに由来する。今までに 5 種が報告されている。BS-1 株が秋田市の公園の普通の土壌から分離されたこと，これほど鮮やかな青紫色に目立つ菌が今までに報告されていないことも意外である。現在，Massilia sp. BS-1 株の新種提案を計画している。
ビオラセインを生産する様々な菌が報告されている。その生合成遺伝子もクローニングされている。
おそらく，この生合成遺伝子は水平伝播により属間を超えて広がったものと考える。微生物の遺伝子レベルでの多様性は予想以上に活発なのかもしれない。
BS-1 株にとってビオラセインを生産することのメリットは，一つは抗菌活性である。少なくともグラム陽性菌は自分のテリトリーであるバイオフィル
ムから完全に阻害することができる。もう一つは光の遮蔽効果ではないかと考えている。
平成22年２月

― 85 ―
Massilia sp. BS-1 が生産する青紫色素，秋青紫（Shu-Violet）

ビオラセインで注目されているのは，QuorumSensing と呼ばれる一種の微生物同士のコミュニ
ケ ー シ ョ ン シ ス テ ム で あ る。BS-1 株 に お い て もQuorum Sensing に関わる AI について研究中である。
謝辞
SV-1と SV-2の構造決定には，メルシャン株式会
社生物資源研究所 一色邦夫博士のご協力を頂きました。ここに深く感謝します。
参考文献
1） Boisbaudran, L. D. : Matiere colorante se forma
nt dans la cole de farine. Compt. Rend., 94, 562（1882）
2） Laatsch, Hartmut, et al. : Spectroscopic
proper-tiesof violacein and related compounds : crystal structure of tetramethylviolacein.
Physical Organic Chemistry（1972-1999）, 13319（1984）3）M.O. Moss, C.Ryall, N.A. Logan : The classification and characterization of chromobacteriafrom a lowland river. J. Gen. Microbiol., 105, 1121（1978）
4） T. R. Oberhofer : Cultural and biochemical
char-acteristics of clinical isolates of unusual
colistin-resistant pseudomonads. J. Clin. Microbiol., 12, 156-160（1980）
5） S. A. McCarthy, T. Sakata, D. Kakimoto, R. M.
Johnson : Production and isolation of purple
p i g m e n t b y A I t e ro m o n a s l u t e o v i o l a c e a .
Bull. Jpn. Soc. Sci. Fish., 51, 479-484（1985）
6） L. H. Yang, H. Xiong, O. O. Lee, S. H. Qi, P. Y.
Qian : Effect of agitation on violacein productionin Pseudoalteromonas luteoviolacea isolated
from amarine sponge. Lett. Appl. Microbiol.,44, 625-630（2007）
7） A. Z. M. Ruhul Momen and Tsutomu Hoshino :Biosynthesis of Violacein : Intact Incorporatio
nof the Tryptophan Molecule on the Oxindole
Side, with Intramolecular Rearrangement ofthe Indole Ring on the 5-Hydroxyindole Side.
Biosci. Biotechnol. Biochem., 64, 539-549（2000）
8） N.Duran, S.Erazo, V.Campos : Bacterial chemistryII : antimicrobial photoproduct from pigmentof Chromobacterium violaceum. An. Acad. Bras.
秋田高専研究紀要第45号

Cienc., 55, 231-234（1983）
9） N. Duran, P. S. Melo, M. Haun : In vitro evalutionof violacein on AIDS-related lymphomaandhumantumor cell lines. Proceedings ofthe XXVAnnual Meetings of the Brazilian
Societyof Biochemistry and Molecular Biology,
Sociedade Brasileira de Bioquimica e Biologia
Molecular SBBq, Caxambu, MG, Brazil, p.150（1996）
10）D. Rettori, N.Duran : Production, extraction
and purification of violacein : an antibiotic
p i g m e n t p r o d u c e d b y C h ro m o b a c t e r i u mviolaceum. World J. Microb. Biotechnol., 14, 685688（1998）11）M. B. M. De Azevedo, et al. : Biological activities of violacein, a new antitumoral indole
derivative, in an inclusion complex with
β-cyclodextrin. J. Incl. Phenom. Macrocyclic
Chem., 37, 93-101（2000）.
12）L. L. Leon, C.C. Miranda, et al. : Antileishmanial activity of the violacein extracted from
Chromobacterium violaceum. J. Antimicrob.
Chemother., 48, 449-450（2001）
13）鈴木一也，津谷浩晃，上松仁：Massilia sp. BS-1が生産する青紫色素，第60回日本生物工学会大会講演要旨集，11p18，p209（2008）14）http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
15）http://www.megasoftware.net/
16）R. V. Antonio, et al. : Genetic analysis of violacein biosynthesis by Chromobacterium violaceum.
Genetics and Molecular Reserch, 3, 85-91（2004）
17）Paul Williams, et al : Look who's talking :communication and quorum sensing in thebacterial world, Phil. Trans. R. Soc. B., 362, 111
9-1134（2007）
18）Kay H. McClean, et al. : Quorum sensing andChromobacterium violaceum : exploitation of violacein production and inhibition for the detectionof N-acylhomoserine lactones. Microbiology,143, 3703-3711（1997）19）http://www.chemnetbase.co/20）Tsutomu Hoshino, et al. : Biosynthesis of Violacein : a Novel Rearrangement in Tryptophan
Metabolism with a 1, 2-Shift of the Indole
Ring. Agric. Biol. Chem., 51, 965-968（1987）21）Yoshitoshi Nakamura, et al. : Production of

― 86 ―
鈴木一也・上松Antibacterial Violet Pigment by Psychrotropic
Bacterium RT102 Strain. Biotechnology and仁

Bioprocess Engineering, 8, 37-40（2003）

平成22年２月