技術ノート

成体マウス脳内への神経幹細胞の移植について
村松

大1，能智禄弥2，佐藤祐樹2，久恒辰博2

Transplantation of neural stem cells into adult mouse brain
Dai MURAMATSU1, Rokuya NOCHI2, Yuki SATO2, Tatsuhiro HISATSUNE2

緒言

造，判断といった高次機能を司る大脳皮質では，「成体哺乳類の中枢神経は一度損傷すれば，二通常，ニューロンの再生は見られないが，脳虚血度と再生させる事は出来ない．この絶対真理を変後に神経前駆細胞から，新たなニューロンが生みえることが可能であるとするなら，それは将来出されるという報告がなされている 7,8）．しかし，の科学である．」これは 19 世紀の偉大なる神経

この様な内在性神経幹細胞や神経前駆細胞による解剖学者 Santiago Ramon y Cajal の言葉である

ニューロンの再生は神経変性疾患に見られる大規1）．近年の脳科学研究はこれに応えるかの如く進模なニューロンの脱落を補うレベルでは無く，そ展目覚しく，中枢神経系の再生に関する報告も数の為，神経変性疾患に対しては移植による外部か多く見られる様になってきた．例えば，ヒトを含らのニューロンの補填が現実的な治療方法であるめた霊長類では，記憶を司る海馬という領域に神と考えられている．

経幹細胞が存在し，新たにニューロンを生み出す

これまで細胞移植に関しては，ドナー不足や免事が明らかになっている ．海馬に存在する神経疫拒絶，脳死患者や中絶胎児からの臓器移植に伴幹細胞は，その数が一生を通して保たれており，う倫理的問題など，様々な問題を抱えていた．し学習行動による刺激を受ける事で新たなニューロ

かし近年，人工多能性幹細胞（iPS 細胞）の登場ンを生み出すと考えられている．囓歯類では，や骨髄における間葉系幹細胞の研究から，これら海馬の他に側脳室下帯という領域に神経幹細胞の問題に対する解決の糸口が見出されたことによが存在し，新たなニューロンを生み出している．

り，移植研究はかつてない盛り上がりを見せて

生 み 出 さ れ た ニ ュ ー ロ ン は Rostral Migratory

いる 9）．既に，ラットパーキンソン病モデルやマStream（RMS）という経路を介して，嗅覚を司ウス脊椎損傷モデルにおいて，病変部位への iPSる嗅球に移動する ．これらの新生ニューロンは，細胞の移植により，有意な治療効果が示されてい脳梗塞など虚血症状をきたした脳内においては，

る 10,11）．また，脊椎損傷患者への胚性幹細胞（Ｅ嗅球ではなく線条体へ移動することが確認されてＳ細胞）の移植に関わる臨床試験が開始されるな

いる ．線条体は運動機能を司る領域であり，脳ど，移植による中枢神経系の再生医療は現実的な梗塞により障害を受けた線条体に，これらの新生ものとなりつつある．今後，パーキンソン病やアニューロンが移動することで，運動機能の回復にルツハイマー病，脳梗塞といった様々な疾患に対寄与しているものと考えられている．認知，創する移植研究が行われると考えられるが，これに

2）

3,4）

5）

6）

はまだ多くの問題が残されている．すなわち，幹1 代替試験法研究部細胞発がん研究室
2 東京大学大学院新領域創成科学研究科先端生命科学専攻細胞応答化学研究室

細胞移植による治療を行う場合，どの領域に，どのタイプのニューロンを移植すれば良いのか，移植されたニューロンはどのように既存の神経組織49

秦野研究所年報 Vol. 33. 2010とネットワークを構築するのかなど，解明すべき

mL になるように添加し，pH7.2 に調整した培地

問題は多い．また，移植に最適な細胞の分化段階を使用した．レトロウィルスベクターの感染おを把握することも重要である．細胞を未分化のよびニューロンへの分化誘導の際には，ウシ胎分化段階で移植した場合では，生着率は高いが児血清，塩基性繊維芽細胞成長因子の代わりにニューロンへの分化効率が低く，さらに増殖能がN2 サプリメント（Life Technologies）を加えた無高い為に細胞塊を形成してしまう可能性がある血清培地を使用した．なお，培養ディッシュは，．一方，ニューロンに分化した状態で移植した

15 µg/mL ポリ- L -オルニチン（Sigma-Aldrich,

12）．

St. Louis, MO）により 2 時間以上コーティング

この様な背景から，様々な神経疾患に対する治した後，リン酸緩衝生理食塩水（PBS）により療法の検討や移植細胞の品質管理の為に，移植細２回洗浄後，1 µg/mL フィブロネクチン（Life胞の性状を簡便に評価できる試験系が将来求めらTechnologies）により 2 時間以上コーティングしれると考えられる．そこで本稿では，細胞接着分たものを使用した．

子インテグリンα 5 を指標にした，細胞の移植に適レトロウィルスベクターの産生場合では，生着することなく死滅してしまう

13）

した時期の選定と，それに基づく成体マウス脳内へのニューロンの移植に関する技術を紹介する

神経幹細胞のニューロンへの分化誘導とラベル14）．

を行うため，レトロウィルスベクターによる遺伝

この方法は，神経幹細胞がニューロンへ分化する子導入を行った．実験には，ニューロン分化に際に，インテグリンα 5 の発現が減少する事を関わる転写因子である Neurogenin 1（Ngn 1）と指標とするものである

15）．神経幹細胞がニューEnhanced Green Fluorescent Protein（EGFP）

ロンへ分化する時期を把握するのに有効であり，を発現する pMY-Ngn1-IRES-EGFP レトロウィ

ニューロンへ分化する直前の神経幹細胞を移植す

ルスベクター，対照として EGFP のみを発現することにより，脳組織において速やかに分化するる pMY-IRES-EGFP レトロウィルスベクターをことが可能となった．この方法により，これまで用いた（タカラバイオ , 滋賀）．レトロウィルス

ニューロンの再生が難しいとされた成体大脳皮質ベクターの産生はφ 100 mm の培養皿に GP2-をはじめ，様々な領域で細胞移植によるニューロ

293 パッケージング細胞（タカラバイオ）を播種ンの再生が可能となった．また，移植されたニューし，細胞密度が 80% に達した時期に，Transfast

ロンは短期間で神経回路網を構築することから，

transfection reagent（Promega, Madison, WI）

移植後の脳組織での移植細胞の詳細な挙動についを用い，ベクタープラスミド（pMY-Ngn1-IRES-て簡便に解析できるのではないかと考えられる．

EGFP もしくは pMY-IRES-EGFP）と水疱性口内炎ウイルスのエンベロープ蛋白質を発現する

１.	インテグリンα5を指標にした細胞移植に適した時期の選定

pVSV-G プラスミド（タカラバイオ）を遺伝子導入した．32℃ , CO2 5.0% で 48 時間培養後，産材料と方法生されたレトロウィルスを含む培地を回収し，孔細胞径 0.45 µm のセルロース混合エステルタイプのp53 ノックアウトマウス胎生期 14 日の大脳基底核より樹立された神経幹細胞株

メンブレンフィルター（アドバンテック , 東京）を用いによりろ過し，6,000 g，4℃で 18 時間遠心した．て実験を行った．神経幹細胞の増殖用培地は，遠心後，沈殿したレトロウィルスを PBS で溶解

Dulbecco's modified Eagle medium/F12 nutrientし－ 80℃にて保存した．

mixture 1:1（Life Technologies, Carlsbad, CA）

遺伝子導入16）に 1.2 g/L 炭酸水素ナトリウム，100 U/mL ペニ

4 穴チャンバースライドに神経幹細胞を 1.5 ×シリン（萬有製薬，東京），100 µg/mL ストレプ

104 個 /mL と な る よ う に 播 種 し， 翌 日，pMY-トマイシン（明治製菓，東京），10% ウシ胎児血

Ngn1-IRES-EGFP お よ び pMY-IRES-EGFP レ清（Life Technologies）を加え，さらに塩基性繊トロウィルスベクターを添加した．

維芽細胞成長因子（Life Technologies）を 10 ng/50

技術ノートフローサイトメトリーによる胞の核染色を行った．その後，DABCO 入りの包インテグリンα5の発現解析埋剤（Life Technologies）を用いて包埋した．翌

レトロウィルスベクター添加後 1-4 日における神日，マニキュアで封入し，共焦点レーザー顕微鏡経幹細胞のインテグリンα5の発現解析を行った．

（Leica, Mannheim, Germany）により観察した．

2+

PBS で 2 回洗浄後，0.1% トリプシンを含む Ca ,20 視野のカウント結果から，細胞数を DAPI 数 /フリーの Hanks' Balanced Salt Solutions

mm2 として，MAP-2ab 陽性細胞の割合を MAP-2+Mg（HBSS，Life Technologies）により 37℃で 5 分

2ab 陽性細胞数 /DAPI 数として示した．

間の反応により細胞を剥離し，1,400 rpm で 5分間の遠心により細胞を回収した．0.1% ウシ胎結果

児 血 清（Bayer, Kankakee, IL） お よ び 0.1% ア

インテグリンα5はニューロンへ分化しようとジ化ナトリウム（和光純薬工業，大阪）を添加しする神経幹細胞において，その発現が減少するこた HBSS を 用 い て，2 × 10 個 /50 µL の 濃 度とが知られている 15）．そこで，ニューロンへのに細胞懸濁液を調製した．一次抗体反応として分化を促す転写因子 Ngn1 及び EGFP を共発現

HBSS により 1/25 に希釈したビオチン標識 - 抗インするベクターを遺伝子導入した群と，対照としてテグリンα5 抗体（Becton Dickinson, San Jose,EGFP のみを発現するベクターを導入した群にCA）を細胞懸濁液に加え 4℃で 20 分間静置しおいて，インテグリンα5の発現変化をフローサた．HBSS を加え遠心した後，一次抗体反応液イトメトリーにより解析した．その結果，Ngn1を含む上澄みを捨てた．この洗浄操作を 2 回行っ遺伝子が導入された群では，2 日にインテグリンた後，二次抗体反応として 1/50 希釈したストレα5の発現が低下した細胞が多く見られた（図 1）．

プトアビジン標識 - フィコエリスリン（Becton

一方，対照として EGFP 遺伝子のみを導入されDickinson）を細胞懸濁液に加え 4℃で 20 分間静た細胞群では，インテグリンα5の発現が低下し置 し た．HBSS で 1 回 洗 浄 し，0.5 µg/mL ヨ ウた細胞は見られなかった．ニューロンマーカー化プロピジウム（和光純薬工業）を含む HBSS

MAP-2ab に対する免疫抗体染色の結果からも，に 細 胞 を 懸 濁 し，FACS キ ャ リ バ ー（Becton

Ngn1 遺伝子が導入された群では 2 日から 3 日にDickinson）により解析を行った．

かけて，細胞増殖の停止，またニューロンへの分神経幹細胞の免疫抗体染色化が見られることが分かった（図 2）
．これらの

5

レトロウィルスベクター添加後 1-4 日の神経幹結果から，インテグリンα5の発現低下した細胞細胞について，ニューロンマーカーである MAP-が多数見られた Ngn1 遺伝子導入後 2 日の時期

2ab に対する免疫抗体染色を行った．4％パラホルがニューロンへ分化する直前の細胞が多い時期とムアルデヒド溶液を用いて細胞を 20 分間固定した考え，移植に用いるのに適した時期であると判断後，一次抗体の細胞抗原に対する特異性を賦活性した．

化するため，0.1%トリトン X-100（和光純薬工業）を含む PBS に 3% ヤギ血清（Life Technologies）

２. 成体脳内への神経細胞の移植を加えたブロッキング溶液を用いて，2 時間のブ材料と方法ロッキングを行った．その後，一次抗体反応とし動物てブロッキング溶液で希釈した 1/750 マウス IgG

4 週齢の ICR マウス 5 匹（三共ラボサービス ,抗 MAP-2ab 抗体（Abcam，Cambridge，UK）に東京）を細胞移植のレシピエントとして用いた．

より，4℃で一晩静置した．次に PBS による 5全ての実験はアメリカ国立衛生研究所と独立行分間の洗浄を 3 回繰り返した後，二次抗体反応

政法人医薬基盤研究所の The Guide for the Careとして，PBS により希釈した 1/200 ローダミン

and Use of Laboratory Animals を遵守し，併せ標識 - 抗マウス IgG 抗体（Life Technologies）にて東京大学新領域創成科学研究科の動物実験ガイより，室温で 2 時間静置した．PBS で 3 回洗浄

ドラインと独立行政法人医薬基盤研究所の The

後，1 µg/mL DAPI を 含 む PBS で 10 分 間， 細Animal Welfare and Animal Care Committee
51

秦野研究所年報 Vol. 33. 2010

図1

Ngn1導入によるニューロン分化の解析
Ngn1 遺伝子によるインテグリンα 5 発現の低下

Ngn1遺伝子導入後１－４日での免疫抗体MAP-2染色による解析
Ngn1遺伝子導入後1-4日における，インテグリンα5の発現をフローサイトメトーリーにより解析した．Ngn1遺伝子導入後2日より，インテグリンα5の発現低下した細胞が見られ始めたことから，この時期を神経幹細胞がニューロンへと分化している時期とし，移植に適すると判断した．
（a）

（c）

細胞数/ mmm2

MAP-2(+)細細胞数(%)

（b）

図2

Ngn1 遺伝子導入後 1-4 日における細胞の変化（a）Ngn1遺伝子を導入して4日のMAP-2a2bに対する免疫抗体により染色した像．スケールバー = 20 µm（b）Ngn1遺伝子導入後1-4日の細胞数．
（c）Ngn1遺伝子導入後1-4日のMAP-2ab陽性細胞の割合．に則して行った .

による麻酔下にて，マウス頭部を三次元固定器に細胞移植より固定し頭部の皮膚を開いた後，移植を行う領

レトロウィルスにより遺伝子導入された神経幹域上にある頭蓋骨を口径 0.8 mm のドリル歯を用細胞を 2 日間培養後，PBS で 2 回洗浄し，10%いて切除し，脳を露出させた．
側脳室下帯，線条体，ト リ プ シ ン を 含 む Ca , Mg

フ リ ー の HBSSおよび大脳皮質の領域に 1µL の細胞懸濁液，すにより 5 分間 , 37℃で反応させ細胞を遊離させなわち 10,000 個の細胞を移植した．細胞懸濁液

た．その後，細胞を 1,400 rpm で 5 分間遠心回の入ったガラスニードルを挿入し，50 nL を 15

収 し 10,000個/µL に な る 様 に HBSS で 懸 濁 し秒毎，すなわち 1 分間に 200 nL になる様に細胞た．移植に用いたガラスニードルは耐熱ガラス懸濁液を注入し，合計１µL の細胞懸濁液を注入管（ボロシリケイトガラス管 ）（World precisionした後，2 分間静置してから静かにニードルを抜

instruments, Sarasota, FL）をマイクロピペッいた．側脳室下帯や線条体に比べ大脳皮質は細胞

ト・ プ ラ ー（Sutter instrument, Novato, CA）

密度が高い為，注入した細胞懸濁液は組織内へ浸により口径 100 µm になる様に引張し作製した．

潤し難い．そこで，大脳皮質への移植に関しては，このガラスニードルをマイクロインジェクショ

大脳皮質前頭前野領域の 5 箇所に合計 1µL とな

ン 装 置（ ナ ノ ジ ェ ク ト 2; Drummond scientificるように移植した．切開部の皮膚を生理的食塩水company, Broomall, PA）に取り付け，細胞懸濁で洗浄し，縫合糸により縫合した．各マウスには液を脳内に注入した．移植方法は，ケタミン（20

移植手術前日に免疫抑制剤サイクロスポリン Amg/kg, i.m.）およびキシラジン（10 mg/kg, i.p.）（ノバルティスファーマ , 東京）を 10 mg/kg にな

2+

522+

技術ノート（a）

Ngn1

NeuN（b）

図 3 成体大脳皮質へ移植されたニューロン
（a）

（b）

 gn1遺伝子を導入した細胞を移植後，5日の成体大脳皮質NをNeuNに対する免疫抗体により染色した像．EGFPを発現した移植細胞がNeuNを発現していたことが確認された．スケールバー = 40 µm
移植されたニューロンの樹状突起にスパイン構造が確認された．スケールバー = 4 µm

るように腹腔内投与し，以後１日置きに投与した．

反応として 0.3% トリトン X-100 を含む TBS で脳切片の作成希釈した 1/1000 Alexa488 標識 - 抗ラット IgG 抗成体マウス脳内へ細胞を移植して 5 日後にエー

体 , 1/200 ローダミン標識 - 抗マウス IgG 抗体（Lifeテル麻酔下で 4％パラホルムアルデヒド溶液をTechnologies）により室温で 2 時間静置した．TBS

用いてマウスの灌流固定を行った．灌流固定後，で 3 回洗浄後，1µg/mL DAPI を含む TBS で 10 分脳を取り出し，４％パラホルムアルデヒド溶液

間，組織切片の核染色を行った．その後，DABCO

中に一晩固定し，翌日，スクロース置換を行っ入りの包埋剤を用いて包埋した後，マニキュアでた．置換後，凍結包埋剤（Electron microscopy

封入し，共焦点レーザー顕微鏡により観察した．

sciences, Hatfield, PA）により脳を凍結させ，クライオスタットを用いて前頭断面方向に 40 µmの厚さとなる様に脳切片を作製した．
組織の免疫抗体染色結果
Ngn1 遺伝子の導入によりインテグリンα5の発現低下が見られた細胞群を移植した場合，脳室移植後 5 日の脳組織切片について，成熟ニュー下帯，線条体，大脳皮質いずれの領域においても，ロンマーカーである NeuN タンパクに対する免放射状に樹状突起を伸ばした移植細胞を見ること

疫抗体染色を行った．脳組織切片をトリス緩衝生が出来た．成熟ニューロンマーカー NeuN に対理食塩水（TBS）で 10 分間洗浄後，0.3% トリト

する免疫抗体染色の結果から，これらの移植細胞

ン X-100 を含む TBS に 3% ヤギ血清を加えたブが NeuN を発現する成熟ニューロンへ分化したロッキング溶液を用いて，2 時間のブロッキングをことが確認された（図 3a）．また，他のニューロ行った．その後，一次抗体反応としてブロッキンンとシナプス結合をする際に見られる樹状突起ス

グ溶液で希釈した 1/1000 ラット IgG 抗 GFP 抗体

パインの構造が，ニューロンへ分化した移植細胞（Abcam），
1/1000 マウス IgG 抗 NeuN 抗体（Abcam）において確認された（図 3b）．これらの結果から，により，4℃で一晩静置した．次に，TBS によりインテグリンα5の発現低下した細胞は，移植後15 分間の洗浄を 3 回行った．洗浄後，二次抗体速やかにニューロンへ分化し，レシピエントの神53

秦野研究所年報 Vol. 33. 2010

経回路網へ組み込まれた事が示された．

文献

一方，対照としてインテグリンα5の発現低下

1） Ramon y Cajal, S.:"Degeneration and regenerationが見られなかった細胞群を移植した場合では，移of the nervous system". Oxford University Press,植された細胞は移植部位で未分化のまま細胞塊を形成していることが確認された．また，免疫抗体染色の結果から NeuN 陽性となる細胞は見られなかった．

Oxford 19282） Eriksson PS, Perfilieva E, Bjork-Eriksson
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考察in adult hippocampal progenitor cells. Neuron.

一 般 に， 脳 内 に 移 植 し た 神 経 幹 細 胞 が 成 熟ニューロンへ分化するには，2 週間ないし 1 か月以上の時間が必要とされている 17）．しかし，本実験では，ニューロンへの分化が最も抑制的な環境下であるとされる成体大脳皮質において，5 日という短期間で移植細胞のニューロンへの分化が確認された．さらに，大脳皮質のみならず，側脳室下帯や線条体への移植においても，移植細胞のニューロンへの分化を確認している．一方，脳組織への細胞移植の問題点として，移植後に細胞が異常増殖し細胞塊を形成してしまうという危険性が指摘されているが2005; 47: 803-815
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2003; 13: 127-132.

，対照群では脳内で異常

7） Koketsu D, Mikami A, Miyamoto Y, et al.:

増殖し細胞塊を形成しているものが見られた．こNonrenewwal of neurons in the cerebral

12）

れらの結果から，インテグリンα5の発現を指標とすることで，移植細胞は異常増殖をすることなく速やかにニューロンへ分化することが示された．その為，インテグリンα 5 の発現を指標とした細胞移植は，脳内の様々な領域への移植実験に対して，移植細胞のニューロンへの分化能や神経回路網の構築といった性状解析を簡便に行うことが出来る系として有用ではないかと考えられる．
謝辞
本研究を進めるにあたり，懇切なご指導および御助言を賜りました東京大学大学院新領域創成科学研究科先端生命科学専攻細胞応答化学分野の久恒辰博准教授に心より感謝するとともに深く御礼申し上げます．また，本研究を行うにあたり，レトロウィルスベクターを御供与頂いた奈良先端科
学技術大学院大学バイオサイエンス研究科細胞生物学専攻分子神経分化制御学の中島欽一教授に心より感謝致します．

neocortex of adult macaque monkeys. J Neurosci.
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13） Fricker-Gates RA, Shin JJ, Tai CC, et al.: Latestage immature neocortical neurons reconstructinterhemispheric connections and from synaptic

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cortex undergoing targeted neurodegeneration. J

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55