体内時計のかたち

概日時計の細胞自律性
Cell-Autonomous Formation of Mammalian Circadian Clock八 木 田和弘

Kazuhiro Yagita
京都府立医科大学大学院医学研究科神経生理学
要旨

概日時計（体内時計）は，約 24 時間周期の生体リズムである概日リズム（サーカディアンリズム）を司る内因性の自律振動体であり，バクテリアから人に至るまで地球上のほとんどの生物に備わる普遍的な生命機能の一つである．加えて，環境周期に同調する性質を持ち，周期的に変動する環境条件に生体機能を適応させることができることから，概日時計の生理学的意義が多岐にわたることが近年の研究の進展から明らかになってきている．本稿では哺乳類概日時計について概説し，特に概日時計の細胞自律性について述べる．

キーワード：概日リズム，時計遺伝子，発生，細胞自律性性の概日リズムを刻むことが明らかとなった 7,8）．これらの1.

はじめに

約 24 時間周期の概日リズムは地球上のほとんどの生物に見られる普遍的な生命現象であり，内在性の測時機構である研究を通じて，哺乳類の概日時計は，ほとんどの組織において個々の細胞に備わっており，1 細胞レベルで振動を発することができることが証明された．

概日時計（体内時計）によって制御されている．概日時計は，一方で，SCN を破壊すると行動リズムは消失し，末梢臓多くの生理機能の時間的統合を担い，哺乳類の測時機構の基器においても臓器レベルでの時計遺伝子発現リズムも消失す

盤をなし，生体機能に周期性を与える内因性の自律振動体でる．この現象は一見，末梢組織にも概日時計振動体が備わっあり，環境周期に同調する性質を持つ．これにより，周期的ているという上の記述に矛盾しているように思われる．しかに変動する環境条件に生体機能を適応させることができる．

し，実は末梢臓器における個々の細胞の概日時計が脱同調し本稿では，線維芽細胞など末梢の細胞にも概日時計が備わっているために，リズムが消失しているように見えるだけで，ていること，概日時計は細胞分化と密接に関連して細胞自律

1 細胞レベルでは個々の細胞がリズムを刻み続けているので性に形成されること，などを中心に，概日時計の分子メカニある．

ズムから生理学的意義について，これまで記述してきたことを再度要約して述べる 1 ～ 4）．
2.

この知見は，哺乳類においては，SCN が全身の末梢組織の概日時計を同調させていることを示しており，それゆえSCN を中枢時計とし，それ以外の組織細胞の概日時計を末全身の細胞に存在する哺乳類概日時計

梢時計と総称することになった．つまり，オーケストラに例

哺乳類概日時計の中枢は，視床下部の視交叉上核（Supra-えると，SCN は指揮者であり，個々の楽器を奏でる末梢細chiasmatic nucleus: SCN）に存在している．SCN は，破壊によっ胞の時計を調律しているということになる．このように，哺て睡眠覚醒や活動といった行動リズムが完全に消失すること

乳類の概日リズムは中枢時計と末梢時計が階層的に協調してから，中枢時計と呼ばれる．長年，哺乳類では SCN のみが制御しているのである．

概日時計を発振することができる唯一無二の器官であると考えられてきた．しかし，時計遺伝子の発見以降の分子レベル

3.

哺乳類概日時計の発振機構での研究が進むにつれ，実際はほとんどの臓器や組織に概日

現在のところ，概日時計の振動は，時計遺伝子と呼ばれる時計振動体が備わっており，それぞれの組織において時刻を一連の遺伝子群の転写と翻訳を介したフィードバックループ刻んでいることが分かってきた 5,6）．生体から完全に切り離であると考えられている．哺乳類では，bHLH 型転写因子でされた状況にある rat-1 や NIH3T3 などの細胞株においても，ある CLOCK と BMAL1 がヘテロ二量体を形成し，Period（Per）

概日時計の基本的な振動メカニズムが保存されており，自律や Cryptochrome（Cry）などネガティブ因子と呼ばれる遺伝〒 602–8566 京都市上京区河原町通広小路上る梶井町 465
TEL: 075–251–5313
2012 年 2 月 28 日受付
80子のプロモーター領域にある E-box と呼ばれる CACGTG 配列に結合することで，Per や Cry などの遺伝子発現を正に調節する 9,10）．発現した PER タンパク質は Casein Kinase Iε,δ
顕微鏡 Vol. 47, No. 2（2012）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

などによってリン酸化された後に分解される 11）．さらに概日リズムが出現する．マウスやラットなどの実験動物でもPER タンパク質と CRY タンパク質は結合することで互いに同様に，出生直前までは遺伝子レベルでも視交叉上核などで安定化して核内に蓄積していき，ポジティブ因子 BMAL1-概日リズムが見られず，時計の振動体の形成が完了していな

CLOCK によって活性化された Per および Cry 遺伝子の発現いことを示している 15）．

を抑制する．BMAL1-CLOCK による転写活性が一日のうち約 24 時間の周期はどのように形成されていくのか，そので 大 き く 変 動 す る の に は 理 由 が あ る．BMAL1 お よ び

過程を詳細に解析することで，概日時計の特徴である非常にCLOCK タンパク質の C 末端部分には転写活性化に必須のド安定な周期を示す発振原理を真に理解する事ができる．そのメインがあるが，このドメインに重なるように抑制因子の理解があってはじめて，概日リズム異常との関連が示唆されCRY タンパク質が結合し，転写を抑制することで切れの良ている様々な疾患の克服に向けた治療・予防戦略を正しく構い転写の ON と OFF の制御が可能になるのである

12）

．これ

築できるのではないだろうか．このような考えのもと，筆者

らの時計遺伝子を欠失させたマウスでは，概日リズムに異常は，多能性幹細胞である embryonic stem cell（ES 細胞）やをきたすことから，これらの時計遺伝子が構成するフィード

induced pluripotent stem cell（iPS 細胞）の性質を利用した細バックループを特にコアループと呼ぶこともある．他の生物

胞レベルでの概日時計の発生メカニズムを明らかにする試み

でも，それぞれの時計遺伝子が構成するフィードバックルーを行った．

プが概日時計の基本骨格であると考えられている．

まず，時計遺伝子 Bmal1 および Dbp のプロモーターにホ

さらに，哺乳類では，コアループに加えて，副次的ループタルルシフェラーゼ遺伝子をつないだレポーターを作製し，が機能している．BMAL1/CLOCK によって転写が活性化さマウスの ES 細胞に導入して，概日時計振動の状態を検出でれる Rev-erb 遺伝子と Ror 遺伝子の翻訳産物 REV-ERB タン

きる発光 ES 細胞株を樹立した．上述のように，初期胚ではパク質と ROR タンパク質は二量体を形成して Bmal1 遺伝子概日時計の振動が見られないことは報告されているが，ESのプロモーター領域に結合し，Bmal1 遺伝子の転写を抑制す細胞は不死化した細胞株であり，まずこの ES 細胞自体に概る．また，別の副次的ループとして，同じように BMAL1/日時計の振動が見られるかどうかを検討した．樹立した発光CLOCK によって転写が活性化される Dbp 遺伝子の翻訳産物

ES 細胞を観察したところ，体細胞で見られるような時計遺DBP は Per1 や Per2 遺伝子のプロモーター領域に結合してこ

伝子の概日リズムは全く見られず，ES 細胞には概日時計はれらの遺伝子発現を正に制御する．これに対して E4BP4 はリズム発振装置として機能していないことが明らかとなっ

DBP タンパク質と同じ配列に結合し Per1 や Per2 遺伝子発現た 16）（図 1）．

を抑制する．これらの副次的ループを構成する遺伝子をノッ前にも述べた通り，ES 細胞からマウス個体になりうる．

クアウトしても概日リズムは消失することはなく，必須の機in vivo では，ES 細胞由来の細胞がマウス胎仔組織内におい構ではないと考えられるが，おそらく概日リズムの安定性にて分化していく過程で，概日時計が形成されていく．しかし，寄与していると考えられている．

母体内の胚を細胞レベルで長期間連続観察することは非常に一方で，近年，シアノバクテリアでは，時計タンパク質困難であり，また，母体内にあることで何らかの同調因子やKaiABC のみで 24 時間周期の自己リン酸化反応を生み出す細胞の周辺環境などが概日時計の成立に影響する可能性が除ことが示されている

13）．概日時計の様々な性質は全ての生物外しにくい，などの問題がある．これらの問題を回避するた間で共通の普遍的であることを考えると，哺乳類にもこのよめ，そして，そもそも受精卵が発生・分化の過程で，個々のうな安定した 24 時間を生み出す機構が備わっている可能性

細胞自律的に概日時計の振動体を成立させ得るものなのか，は高いと思われるが，現在のところ，哺乳類でシアノバクテという問を明らかにするため，筆者らは，ES 細胞の in vitro

リアの KaiABC に当たるような正確な 24 時間周期を発振すでの分化誘導培養による概日時計形成能をみることにした．

るタンパク質，あるいは化学振動子の存在は証明されていな

ES 細胞を in vitro で分化誘導するにあたり，筆者らはレチい．しかし，2010 年，イギリスのグループから，哺乳類のノイン酸を投与する方法を試みた．ES 細胞の分化誘導法は赤血球で peoxyredoxin（PRX）の酸化還元反応に約 1 日の周様々なものが報告されているが，今回の実験における目的で期性が見られ，転写のフィードバックループを介さない振動はできるだけ一斉に同じようなスピードで ES 細胞を分化さの存在が報告された 14）．ただ，この PRX の酸化還元リズムせる必要があると考えたためである．ES 細胞をレチノインは不安定であり，周期を決定している安定な化学振動子と考酸投与によって分化誘導したところ，分化誘導開始後数日間えるには合理性に欠ける部分もある．いずれにしても，いまは全く概日時計振動は見られなかった．一週間ほどたったとだ哺乳類の概日時計の発振原理は解明された訳ではなく，今ころでも，明瞭なリズムは見られなかったが，さらに分化誘後の更なる研究が待たれる．

導開始後二週間まで引き続き観察したところ，Bmal1 プロ4.

モーターおよび Dbp プロモーターで転写されるルシフェラー
体内時計の発生と細胞分化との関連

ゼの発光に，明瞭な概日振動が出現した．顕微鏡を用いた単哺乳類の概日リズムの発生は遅く，ヒトでは，生後すぐに一細胞レベルでの詳細な解析から，概日時計振動体は個々のは睡眠覚醒リズムが見られず，約 2 ヶ月後になってようやく細胞において細胞の分化に伴って徐々に形成されることが示特集

概日時計の細胞自律性

81【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

図 1 細胞分化・リプログラミングと哺乳類概日時計の発生
ES 細胞を in vitro で分化誘導すると概日時計の振動体が形成される．時計が形成された細胞をリプログラミングすると概日時計は再び消失する．概日時計の発生は，細胞分化と密接に関連した現象である．

唆された 16）．
レチノイン酸投与条件では約 2 週間で概日時計の形成が見られ，これが in vivo で見られる胚発生期の概日時計の発生ます重要度を増している．そこから得られた知見をもとにして，概日時計を意識した疾病の治療法や予防法を考えていくことで，より健康の増進に寄与できると考えられる．

時期とかなり近いものであった．しかし，我々自身の研究によって，常にどのような培養条件でも約 2 週間で概日時計が形成されるという訳ではなく，培養条件によって細胞の分化スピードが異なることに依存して概日時計の形成までに要する時間はまちまちであることが分かっている．
このように，細胞の分化と概日時計の形成に相関がある可能性が示唆されたが，これを確かめるために，分化して概日時計が備わっている細胞をリプログラミングすることで，iPS 細胞にしたとき，形成された概日時計はどのような影響を受けるのかを解析した．まず，ES 細胞から in vitro で神経幹細胞に分化誘導し，同様に概日時計の振動が生じることを確認した 16）．その上で，山中らの方法に従って，この神経幹細胞に Sox2, Klf4, Oct3/4, c-Myc を導入し，リプログラミングを行った 17）．ES 細胞のマーカーである Nanog を強く発現している iPS 細胞の概日リズムを測定してみると，再び ES細胞と同様に概日振動が消失していた．さらに，リズムが消失した iPS 細胞を再度レチノイン酸で分化誘導すると，また明瞭な概日時計の振動が現れた 5）．これらの結果から，概日時計振動体の形成が，細胞の分化というプロセスと密接に関連していることが明らかになった（図 1）．
5.

おわりにこのように，哺乳類概日時計は細胞機能から全身状態に至るまで様々なレベルで生体機能に関与している．概日時計が最も基本的な細胞機能であることを考えると当然とも言えるが，上述の様に，哺乳類概日時計の振動原理が全て理解できている訳ではない．普遍的な生命現象であり，なおかつ我々の健康にも密接に関連している概日時計の基礎的研究はます82

文献1）八木田和弘：細胞工学，29，366–377（2010）2）八木田和弘：太陽紫外線防御研究委員会（編），からだと光の辞典，朝倉書店，東京，293–297（2010）3）八木田和弘：細胞工学，30，1288–1292（2011）4）八木田和弘：京都府立医科大学雑誌，120，845–852（2011）5）Yamazaki, S. et al.: Science, 288, 682–685 (2000)
6）Yoo, S. et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101, 5539–5546 (2004)
7）Balsalobre, A., Damiola, F. and Schibler, U.: Cell, 93, 929–937 (1998)
8）Yagita, K., Tamanini, F., van der Horst, G. and Okamura, H.:Science, 292, 278–281 (2001)9）Reppert, S.M. and Weaver, D.R.: Nature, 418, 935–941 (2002)10）Lowrey, P.L. and Takahashi, J.S.: Annu. Rev. Gemonics Hum. Genet.,
5, 407–441 (2004)11）Lowrey, P.L., Shimomura, K., Antoch, M.P., Yamazaki, S.,
Zemenides, P.D., Ralph, M.R., Menaker, M. and Takahashi, J.S.:Science, 288, 483–492 (2000)
12）Kiyohara, Y.B., Tagao, S., Tamanini, F., Morita, A., Sugisawa, Y.,Yasuda, M., Yamanaka, I., Ueda, H.R., van der Horst, G.T.J., Kondo,T. and Yagita, K.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103, 10074–10079(2006)
13）Nakajima, M., Imai, K., Ito, H., Nishiwaki, T., Murayama, Y.,
Iwasaki, H. et al.: Science, 308, 414–415 (2005)14）O’Neill, J.S. and Reddy, A.B.: Nature, 469, 498–503 (2011)15）Sumova, A., Bendova, Z., Sladek, M., El-Hennamy, R., Laurinova, K.,
Jindrakova, Z. and Illnerova, H.: FEBS Lett., 580, 2836–2842 (2006)16）Yagita, K., Horie, K., Koinuma, S., Nakamura, W., Yamanaka, I.,Urasaki, A., Shigeyoshi, Y., Kawakami, K., Shimada, S., Takeda,
J. and Uchiyama, Y.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 107, 3846–3851(2010)
17）Takahashi, K. and Yamanaka, S.: Cell, 126, 663–676 (2006)

顕微鏡 Vol. 47, No. 2（2012）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】