研究報告

秦野研究所年報
33, 9-15（2010）

マウス新生児期の化学物質曝露による生殖器系の発達および老化に及ぼす影響の研究
大向英夫1，太田亮2，豊泉友康2，宮原敬3，永田伴子4，丸茂秀樹5，小野宏6

Effects of neonatal chemical exposure on the developmentand aging of the reproductive system in mice
Hideo OHMUKAI1, Ryo OHTA2, Tomoyasu TOYOIZUMI2, Takashi MIYAHARA3,
Tomoko NAGATA4, Hideki MARUMO5, Hiroshi ONO6

In the previous study, one-lifespan test using rats revealed that neonatal chemical exposure
affected the development of female reproductive system and its aging. In order to confirm thereproducibility of the previous findings, another one-lifespan test was performed using mice and theaging process of reproductive function was observed. Neonates of C57BL/6J mouse were submitted
to forced oral administration of diethylstilbestrol (DES) at doses of 0 (vehicle), 0.005, 0.05, 0.5
and 5 µg/kg for 5 days after birth. Sexual maturation (vaginal opening of females and preputial
separation of males) and estrous cycles of females (at 8 to 54 weeks of age) were examined. The
observation of animals was terminated at 117 weeks of age and survival rate were determined.
Body weight of females was significantly higher in groups of 0.05 µg/kg or more as compared to thevehicle control group. Vaginal opening delayed significantly in the group received DES at 5 µg/kg
than the vehicle control group. Normal estrous cycles were observed only in few females of 5 µg/kg
DES group throughout the study, and in less than 20% of 0.5 µg/kg DES group females on 28 weeks
and after. The lower survival rate was observed in the 0.5 and 5 µg/kg group females.
These results demonstrated that early exposure of low doses of DES potentially cause delayed
sexual maturation, and compromised reproductive function such as estrous cyclicity in female mice.
It is confirmed that disturbance on aging of reproductive system by neonatal chemical exposure
occurs in female mice as well as female rats.

緒

言

非対応の実験結果にも科学的に確実なものがあ内分泌攪乱化学物質（環境ホルモン）に関するり，それらを無視する事は適切ではないという意

大きな問題点は，低用量域での変化を有害作用と見も出された 2）．Myers らは，適切な試験計画にするか否かである．米国食品医薬品局（FDA）は，適切な陽性対照群，さらには高感度な試験法を指ビスフェノール A に関する報告の中から GLP 基

標に，リスクアセスメントは行われるべきだと主準で実施された試験結果のみを信頼できる資料と張している．一方で，GLP 基準非対応の実験結して選別し、それらから，低用量域での影響はな

果は再現性に乏しく，実験方法も研究機関によっいものと判断した ．しかし，一方で GLP 基準て異なるなどの問題点が指摘されている 3）．この

1）

1 試験研究管理部基準毒性試験室
2 毒性部遺伝学研究室
3 毒性部毒性学第 1 研究室
4 毒性部長
5 毒性部病理学研究室
6 秦野研究所研究顧問

ようなことから，内分泌攪乱化学物質の確定試験には，科学的に適切で，再現性の高い評価項目（エンドポイント）が求められている．
われわれは，新生児期に投与したジエチルスチルベストロール（DES）が，Sprague-Dawley系ラット（SD ラット）の性周期の老化過程に影
9

秦野研究所年報 Vol. 33. 2010

響を与える所見をすでに示した 4）．本報告では，mm）に 5 ～ 6 匹ずつ収容した．児動物の体重を，DES を C57BL/6J 系 マ ウ ス（B6 マ ウ ス ） の 新

生後 1 ～ 5 日目までは毎日測定し，以降 10 週齢

生児期に投与し，児の発達，成熟および老化に至までは週 1 回，10 週齢以降は 2 週間に 1 回，26る段階において生殖器系への影響を検索する「マ週齢以降は 4 週間に 1 回 114 週齢まで測定した．

ウス一生涯試験」を試み，「ラット一生涯試験」

性成熟の指標として，雌は生後 21 日から腟開4）

口を，雄は生後 23 日から陰茎包皮分離を和田のの所見と比較検討した．

方法 7）に従い毎日観察した．さらに雌については，材料と方法各群約 24 匹ずつ 8 週齢から 54 週齢まで 2 週間

試験には，日本チャールス・リバーから入手しおきに毎日，腟垢を採取し，性周期を観察した．

た妊娠 14 日の B6 マウスを使用した．B6 マウス

腟垢像を発情前期，発情期，発情休止期に分類し，は，エストロゲンに対して高感受性の近交系であ渡辺らの方法 8）に従って性周期の型を分類した．

り 5），遺伝子改変動物の背景系統として多用され，各群 5 匹の雄は，15 週齢時にペントバルビター

秦野研究所においては子宮肥大試験の背景データ

ルナトリウム麻酔下で放血し，脳，下垂体，甲状腺，が豊富 な系統である．入手した妊娠雌マウスは，胸腺，肝臓，脾臓，腎臓，副腎，精巣，精巣上体，床敷としてペパークリーン（日本エスエルシー）

前立腺腹葉，前立腺背側葉，精嚢，凝固腺の重量を入れた TPX 樹脂製ケージ（143W × 293D ×を測定した．また，各群雌雄 6 匹ずつには，20148H mm）に 1 匹ずつ収容し，温度 21 ～ 25℃，週齢時に 1 × 108 個 / 匹となる濃度に調製した洗湿度 40 ～ 75％，照明 12 時間（7 時～ 19 時点灯）

浄ヒツジ赤血球溶液を尾静脈内投与し，投与後 5に調節された飼育室で，固型飼料（CE-2，日本ク日目に尾静脈より採血して，ヒツジ赤血球に対レア）と水道水を自由摂取させて飼育した．全てする IgM 抗体価を ELISA 法 9）により測定した．の実験操作は，「財団法人食品薬品安全センター秦これらの中間屠殺動物を除き、雌雄とも 117 週

野研究所 動物実験に関する指針」に基づいて実施

齢まで継続飼育し，生存日数を調べた．

6）

した（承認番号：1070476A および 2070014A）．

離乳前の児に関するデータは腹単位，離乳以降DES の投与経路として，前回実施したラットのデータは個体を標本単位として一元配置型の分一生涯試験と同様に，強制経口投与を選択した．

散分析を行い，群間に有意性が認められた場合は投与量は，子宮肥大試験で子宮重量増加が有意

Dunnett 法による多重比較検定を行った．有意水準となる最小有効用量である 5 µg/kg/day を最高用は 5% および 1% とした．得られた結果を，SD ラッ量とし，公比 10 で減じて 0.5, 0.05 および 0.005

トを用いた一生涯試験の結果 4）と比較検討した．

µg/kg/day の 4 用量を設定した．シグマ・アルドリッチ社（St. Louis, MO）から入手した DES を結果

20 mg 秤量し，1 mL のエタノールに溶解後，コー

体重推移： 雌雄とも，離乳前から 5 週齢までン油を加えて全量を 20 mL とした 1 mg/mL 液を，の体重に DES 投与の影響は認められなかった（結コーン油で段階希釈して投与液とした．

果は示さず）．しかし，その後の雌の体重は 0.05

新生児は，生後 1 日（分娩日を生後 0 日とした）µg/kg 以上の投与群で 6 週から 86 週において対に性別および外表奇形の有無を検査し，低体重や照群より有意な高値を示し，用量依存的な体重増

外表異常のない雌雄を試験に用いた．投与液量は加が認められた（図 1a）．雄の体重は 0.05 µg/kg

10 mL/kg 体重とし，マイクロシリンジおよび血投 与 群 で 42 週 か ら 46 週 に，5 µg/kg 投 与 群 で管内カテーテル（アーガイル ，PI カテーテルキッ58 週において対照群より有意な高値を示したが，ト，日本シャーウッド）を応用して作製した新生用量依存性はなかった（図 1b）．

®

児用胃管を用いて，生後 1 日から生後 5 日まで 1性 成 熟： 雌 の 腟 開 口 日（ 平 均 ± S.D.）は，5日 1 回投与した．投与した児動物は，生後 21 日µg/kg 投与群（36.0 ± 2.8）で対照群（32.3 ± 1.7）に離乳させ，離乳後は，ペパークリーンを入れより有意に遅延した（図 2a）．雄の陰茎包皮分離た TPX 樹 脂 製 ケ ー ジ（235H × 325D × 170H

時期に，DES 投与の影響は認められなかった（図10図1
研究報告

a. Femaleb. Male55
5040

Body weight (g)Body weight (g)45353025200 μg/kg (n=29)0.005 μg/kg (n=26)
0.05 μg/kg (n=26)
0.5 μg/kg (n=28)
5 μg/kg (n=27)

15

45
40
3530
25
0 μg/kg (n=27)0.005 μg/kg (n=26)
0.05 μg/kg (n=25)
0.5 μg/kg (n=26)
5 μg/kg (n=25)

20
15

100

10
6142230

384654627078

8694

61422

Weeks of age

図2

図130385470

78

8694

b. Male10080806060

400 μg/kg (n=29)0.005 μg/kg (n=26)
0.05 μg/kg (n=26)
0.5 μg/kg (n=28)% of animals

10020

400 μg/kg (n=27)0.005 μg/kg (n=26)
0.05 μg/kg (n=25)20

0.5 μg/kg (n=26)
5 μg/kg (n=26)

5 μg/kg (n=26)0024262830

32343638

4042

Age at vaginal opening (days after birth)

図262

新生児期に DES を投与した B6 マウスの体重推移

a. Female% of animals

46

Weeks of age

283032343638

Preputial separation (days after birth)

新生児期に DES を投与した B6 マウスの腟開口日と陰茎包皮分離日
図3% of females

1000 μg/kg (n=24)0.005 μg/kg (n=24)
0.05 μg/kg (n=24)
0.5 μg/kg (n=24)
5 μg/kg (n=25)500

図3Weeks of age
新生児期に DES を投与した雌の B6 マウスにみられた異常性周期の推移11秦野研究所年報
Vol. 33. 2010
図48-9 Weeks of age

20-21 Weeks of age

48-49 Weeks of age

36-37 Weeks of age

80

8080

0. 05 μg/ kg (n=24)

70

7070

70

5 μg/ kg (n=25)

60606060

50505050

404040403030303020202020

1010101000000 μg/ kg (n=24)

0. 5 μg/ kg (n=24)

4 d ay cycle
5 d ay cycle
4 / 5 d ay cycle
L o ng cycle
Un cycleA n estrus
Ext ended estrus
Ot h ers

Ot h ers

Ext ended estrus

Un cycleA n estrus

L o ng cycle

5 d ay cycle

4 d ay cycle

4 / 5 d ay cycle

100

Ot h ers

Ext ended estrus

Un cycleA n estrus

L o ng cycle

5 d ay cycle

4 / 5 d ay cycle

100

4 d ay cycle

4 d ay cycle

図4Ot h ers

80

Ext ended estrus

0. 005 μg/ kg (n=24)

Un cycle90

A n estrus

90

L o ng cycle

90

5 d ay cycle90

4 / 5 d ay cycle

100

Frequency (%)

100

新生児期に DES を投与した雌の B6 マウスにみられた性周期型の推移

Types of estrous cycle

図5(mg)(mg)

Seminal vesicle

350
300

40250
**

200150

**

30*

**

20

100

10500Coagulating gland

500(mg)10.005 0.05

0.550(mg)

Ventral prostate

2001515

10.005 0.05

0.55Dorsal lateral prostate

1010550010.005 0.05

0.55DES (μg/kg)

図50010.005 0.05

0.55DES (μg/kg)

新生児期に DES を投与した雄の B6 マウスの 15 週齢における副生殖器重量各群5例の平均±標準偏差を表す．
*，** は対照群と比較して有意差（5％および1％）があることを示す．

2b）．5 µg/kg 投与群の雌では，尿道開口部の過られなかった．0.5 µg/kg 投与群では，28 週齢時ま剰開裂が 26 例中 2 例に認められた．

でに 80％以上，36 週齢以降は全例が異常性周期と性周期： 異常な性周期を示した雌の割合を図なった．0.05 および 0.005 µg/kg 投与群は対照群と3 に示した．5 µg/kg 投与群では，観察を開始したほぼ同様に推移し，異常性周期を示す雌が 28 週齢

8 週齢から正常な性周期を示す雌はほとんど認めまでは 20％以下，52 週齢で約半数となった．性周1210）

図6
研究報告

Female (n=6)
655Log titer2Log titerMale (n=6)

6113**

0.5

532000.005

10.05

0.5050DES (μg/kg)

図6*440.005

10.05

DES (μg/kg)

新生児期に DES を投与した B6 マウスの IgM 抗体産生能
各群6例の平均±標準偏差を表す．
*，** は対照群と比較して有意差（5％および1％）があることを示す．

図7Survival rate (%)

100500 μg/kg (n=27)0.005 μg/kg (n=28)
0.05 μg/kg (n=26)
0.5 μg/kg (n=26)
5.0 μg/kg (n=25)

Male006181224

Survival rate (%)

100500 μg/kg (n=29)0.005 μg/kg (n=26)
0.05 μg/kg (n=26)
0.5 μg/kg (n=28)
5.0 μg/kg (n=27)

Female006181224

Months of age

図7

新生児期に DES を投与した B6 マウスの生存曲線

期を型別（図 4）に見ると，5 µg/kg 投与群で早期低下した．その他の器官重量に DES 投与の影響に認めれた性周期異常の型は連続発情であったのは認められなかった．

に対し，0.5 µg/kg 以下の投与群で加齢に伴って増加

免疫学的検査：20 週齢に測定したヒツジ赤血球した異常周期の型は不規則周期や無発情であった．

に対する IgM 抗体価を図 6 に示した．雌では対照

器官重量： 15 週齢に測定した雄の副生殖器重群と DES 投与群との間に有意差は認められなかっ量を図 5 に示した．精嚢重量が 5 µg/kg 投与群でたが，雄では用量依存的に低下する傾向があり，0.5対照群と比較して有意に低下したほか，凝固腺重µg/kg 以上の投与群で有意差が認められた．

量が 0.005，0.5 および 5 µg/kg 投与群で有意に生存曲線： 雌雄の生存曲線を図 7 に示した．
13

秦野研究所年報 Vol. 33. 2010

雄の生存日数に DES 投与の影響は認められなボリック作用が疑われる．本研究においては 0.05

かったが，雌の生存日数は，観察最終日の対照群µg/kg 以上の投与群で有意な体重増加が認められの生存率が 61.5％であったのに対して，0.5 およたことから，体重推移も内分泌攪乱化学物質を確

び 5 µg/kg 投与群では，それぞれ 25.9％および定する上で，重要な評価項目になると考えられた．
15 週齢目に測定した精嚢と凝固腺重量の低下に14.8％と，短縮する傾向が認められた．

関しては，同様の変化が SD ラット一生涯試験 4）
考察で認められていないことから，再現性に乏しい変B6 マウスを用いた一生涯試験においても，SDラットを用いた一生涯試験

4）と同様に，5 µg/kg

投与群で新生児期の androgenization によると化と考えられるが，マウスに特有の指標になる可能性もあることから，今後，追加の実験が必要と考えられた．

考えられる連続発情が観察されたほか，0.5 µg/SD ラットを用いた一生涯試験 4）の 5 µg/kg 投kg 投与群でも遅発性の性周期異常が認められた．

与群で確認された雌の生存日数の短縮が，B6 マ

B6 マウスで認められた遅発性の性周期異常の型ウスの雌においても観察された．したがって，新は，SD ラットで認められた異常の型と同じ不生児期の DES 曝露は，ラット・マウスを問わず，規則周期や無発情を示した．対照群にみられる加雌の生存日数を短縮させると考えられ，これらの齢性変化に似た性周期異常が，新生児期の DES変化は，生体に及ぼす有害作用と判断できる．

4）

曝露により誘発されることが，B6 マウスにおいても確認され，遅発性の性周期異常が内分泌攪乱

結化学物質を確定する上で，高感度で再現性の高い評価項目になると考えられた．

論
本研究ではエストロゲン活性を有する DES をマウスの新生児期に投与し，発達から老化に至る

一方，B6 マウスの腟開口時期は 5 µg/kg 投与段階において，生殖器系および免疫系を検索する群で遅延し，腟開口時期が 5 µg/kg 投与群で早期試験を実施した結果，雌における性成熟の遅延，化した SD ラットの結果とは一致しなかった．

遅発性の性周期異常および体重増加，生存日数のしたがって，新生児期の化学物質曝露の影響を，短縮，雄における抗体産生能の低下，副生殖器重視床下部・下垂体・性腺軸の発達を指標として評量の低下などが観察され，内分泌攪乱性を確定す価する際には，動物種によって結果が異なる可能る上で，これらの評価項目の有効性を示した．し性を考慮する必要がある．ただし，同群で認めらかし，マウス・ラット間で異なる結果も得られた

れた尿道口の過剰開裂

10）については，SD ラッ

ことから，一生涯試験を実施する際は，適切な陽トを用いた一生涯試験

4）でも認められているこ性対照群を置き，用いる動物種に適した検査項目

4）とから，再現性のある評価項目と考えられた．

を選択することが重要であることが示唆された．

新生児期の DES 投与による抗体産生能の低下が B6 マウスの雄で用量依存的に認められ，0.5µg/kg 以上の投与群で有意差が認められた．ラッ謝

辞本研究は，平成 20 年度厚生労働省厚生労働科においても雄で抗体産生能の低学研究費の補助事業（化学物質リスク研究事業，下が認められていることから（未発表），抗体産H19- 化学 - 一般 -003）により実施した．本研究

生能の検査は，内分泌攪乱化学物質を確定する上の試験計画は，国立医薬品食品衛生研究所安全性で，有用な評価項目の一つとして期待される．

生物試験研究センター毒性部菅野純部長の御指導ト一生涯試験

4）

その他，SD ラット一生涯試験では認めらによるものである．研究の実施にあたり，抗体価れなかった新生児期の DES 曝露による体重増加

測定では毒性学第 2 研究室，また病理解剖ではが，B6 マウスの雌で認められた．低用量ビスフェ病理学研究室，動物飼育管理では動物飼育管理室

ノール A の周産期投与の協力を得た．

11）

4）

でも SD ラットの雌で体重増加が報告されており，いずれも雄には認められていない変化であることから，遅発性のアナ
14

研究報告

文献

7） 和田和義: AGD測定および包皮分離観察ならびに

1) FDA: Draft assessment of bisphenol A for use
in food contact applications: DRAFT version
08/14/2008.
2) Myers JP, vom Saal FS, Akingbemi BT, et al.:Why public health agencies cannot depend on
good laboratory practices as a criterion for

それらの問題点．秦野研究所年報，2002; 25: 109114
8） 渡辺千朗，代田眞理子，長尾哲二：SD系雌ラットの性周期の加齢性変化に関する研究．秦野研究所
年報，1994; 17: 37-40
9） Temple L, Kawabata TT, Munson AE, et al.:selecting data: The case of bisphenol A. Environ.

Comparison of ELISA and plaque-forming cell

Health Perspect. 2009; 117: 309-315

assays for measuring the humoral immune

3) Tyl RW: Basic exploratory research versus
guideline-compliant studies used for hazard
evaluation and risk assessment: Bisphenol A as acase study. Environ. Health Perspect. 2009; 117:1644-16514) 太田亮，宮原敬，又吉健ら：内分泌系攪乱性確定試験としてのラット一生涯試験の試み，秦野研究所年報，2007; 30: 17-245) Spearow JL, Doemeny P, Sera R, et al.: Geneticvariation in susceptibility to endocrine
disruption by estrogen in mice. Science. 1999; 285:1259-12616) 太田亮，田面喜之，宮原敬ら：マウス子宮肥大

response to SRBC in rats and mice treated withbenzo[a]pyrene or cyclophosphamide. Fundam.
Appl. Toxicol. 1993; 21: 412-419
10） Sawaki M, Noda S, Muroi T, et al.: In utero
through lactational exposure to ethinyl estradiol
induces cleft phallus and delayed ovariandysfunction in the offspring. Toxicol. Sci. 2003;
75: 402-411
11） Rubin BS, Murray MK, Damassa DA, et al.:Perinatal exposure to low doses of bisphenol A
affects body weight, patters of estrus cyclicity,and plasma LH levels. Environ. Health Perspect.
2001; 109: 675-680

試験，秦野研究所年報，2004; 27: 28-35

15