47●イムノアフィニティークロマトグラフィーに関する研究（吸着体の調製法とその応用）
南陽研究所 機能高分子グループ 中村 孝司
加藤 芳男
長谷川 正積される抗体の配向性が良くないためである。今回、1．はじめに我々はこの問題を解決すべくTSKgel Tresyl-5PWを用

近年、バイオテクノロジー技術の進歩により、種々

い抗体固定化条件を詳細に検討し、抗原吸着効率の高のバイオ医薬品が上市され、臨床試験に供されている。

い免疫吸着体の調製方法を確立した。本稿では、そのこれらのバイオ医薬品は、酵素、タンパク質、ペプチ抗体の固定化方法および免疫吸着体を用いたイムノアド等の生体高分子がほとんどで、生理活性、薬理作用フィニティークロマトグラフィーの応用について紹介を失わないように温和な条件下での精製が要求され、する。

かつ原料中の目的物質濃度は低い場合が多い。またバ
イオ医薬品は生命に直接かかわってくるため高い精製2．実

験

度も要求される。このような生体高分子を高純度に精［1］抗体の固定化製する手段としてカラムクロマトグラフィーが利用さ（1）抗体（アフィニティー精製）の固定化

1)

れている 。生体高分子のカラムクロマトグラフィー

0.5〜5.0mgの抗ヒトアルブミン抗体（ヤギ、アフィは原理によって大別すると（１）ゲルろ過クロマトグ

ニティー精製、Biosys社製）を0.25gのTSKgel Tresyl-ラフィー（２）イオン交換クロマトグラフィー（３）5PW（東ソー製）に2mlの1M リン酸カリウム緩衝液

疎水性クロマトグラフィー（４）アフィニティークロ（pH6.5〜8.5）中、4℃で振盪させ固定化した。

マトグラフィーの四つに分類される。ゲルろ過、イオ（2）抗体（IgG画分）の固定化

ン交換および疎水性クロマトグラフィーは分離の原理

抗ヒトアルブミン、抗ヒトトランスフェリン、抗ヒが物質のもつ物理的、化学的特性の差に基づいている

トIgG、抗ヒトIgM、抗ヒトオロソムコイド、抗ヒトため、分離の際の特異性は一般に低く、目的物質の純プラスミノーゲン抗体（ウサギ、IgG画分、Dako社製）

度を上げるためには、数種類のクロマトグラフィーを各1mlを0.25gのTSKgel Trsyl-5PWに2mlの1.5M リン酸組み合わせることにより達成可能ではあるが、収率がカリウム緩衝液（pH7.5）中、25℃で振盪させ固定化減少し長時間を要する。これらに対してアフィニティした。

ークロマトグラフィーは、二種の生物学的に活性な物（3）抗体固定化量の測定

質間に作用する特異的かつ可逆的な相互作用を利用し抗体の固定化量は、固定化反応前後のゲルスラリーているため、精製度はしばしば数千倍にも達し、活性上清のタンパク質量をTSKgel G3000SW XL（7.8mmな物質の回収率も非常に高く、目的物質と特異的に結I.D. × 30cm、東ソー製）で測定することにより計算合するリガンドが入手可能であれば短時間で高純度のした。

目的物質が得られることになる。
アフィニティークロマトグラフィーの中でも、抗体［2］抗原結合量の測定を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィー

各種抗体を固定化した充填剤を0.1Mリン酸ナトリ

は、分離プロセスに免疫反応の選択性と特異性を利用ウム緩衝液（pH7.4）でスラリー濃度10％に調製した。

しているため、タンパク質の精製手段として非常に有調製したスラリーをカラム（6mmI.D. × 1cm）に加効であり、この方法により多くのタンパク質が精製さえ、アスピレーターで吸引しながら充填した。充填しれている。しかしながら、活性化型担体に抗体を固定たカラムをHPLC装置に装着し、0.1Mリン酸緩衝液化し、免疫吸着体を調製する時、抗原に対する吸着量（pH7.4）を流速0.5ml/min、25℃で平衡化した。平衡が少ないといった問題がおこる2)。この問題は固定化

化 後 、 抗 原 各 5.0mgを 0.5mlの 0.1M リ ン 酸 緩 衝 液（ 47 ）48

TOSOH Research ＆ Technology Review Vol.48（2004）（pH7.4）に溶解し、流速0.5ml/minでカラムに注入し［2］アフィニティー精製抗体の固定化た。吸着されない過剰の抗原を完全に洗浄した後、充抗体の固定化量と抗原の吸着量の関係を調べるた

填剤に吸着した抗原は0.1Mクエン酸−HCl溶液

め、アフィニティ精製抗体、Tresyl-5PWを用い固定（pH1.6）で溶出した。カラム溶出液を5ml採取し、こ化条件を検討した。本研究では抗体として抗ヒトアルの溶出液をUV280nmの吸光度を測定することにより、ブミン抗体（ヤギ、アフィニティ精製品）を用いた。

タンパク質濃度を測定し、抗原吸着量を計算した。ア
ルブミン、トランスフェリン、IgG、IgMの濃度は（1）固定化緩衝液のpHの影響
固定化緩衝液のpHの影響について検討した結果をE1％(280nm)をそれぞれ5.8、11.4、14.7、13.3とし計Fig. 2 に示した。ヒトアルブミンの結合量は、ヒトア算した。

ルブミンのE1％(280nm)を5.8として測定した。また、［3］タンパク質の分離

固定化された抗体の効率は、抗体を二価とし、抗アル免疫吸着体による抗原の分離は6mmI.D. × 1cmまブミン抗体、ヒトアルブミンの分子量をそれぞれ15、たは6mmI.D. × 4cmのカラムを用い、25℃で実施し6.7万として計算した。抗体の固定化反応は、固定化た。測定装置はポンプ（東ソー製 CCPM）、検出器反応時に使用する緩衝液のpHが高いほど進行しやす（東ソー製 UV8020、検出波長：280nm）により構成

く、pH 7以上で96％以上の固定化収率が得られた。

した。

抗原であるヒトアルブミンに対する吸着量もpHの上昇と伴に増加し、pH 7.5で最高となった。固定化され［4］Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis（SDS-PAGE）

た抗体の効率はpH 7〜8で70％以上の値が得られており、抗体が有効に固定化されていることが判明した。

免疫吸着体で分離精製されたタンパク質の純度は抗体はFig. 3に示したような構造をしており、Fab部

SDS-PAGEで実施した。SDS-PAGEは4-20％のポリア分に抗原結合部位がある。このため、有効な免疫吸着3)クリルアミドゲル（アトー製）を用いLaemmli法 に体を作成するためには抗体のFc部分で充填剤に固定従い実施した。電気泳動は定電流（22mA）、30分泳動化する必要がある。また、抗体のFab部分の外側は親し、電気泳動後のゲルの染色はクーマシーブリリアン

水性であるのに対し、Fc部分は疎水性であると考えトブルー（ナカライ製）で実施した。

られている5)。本検討では、固定化用の緩衝液として
1Mリン酸緩衝液を使用したが、この緩衝液中ではタ3．結果と考察

ンパク質がTresyl-5PWに疎水的に吸着し固定化され［1］TSKgel Trersyl-5PWについてるため、非常に効率よく固定化されることを我々は既TSKgel Tresyl-5PW（以下Tresyl-5PW）は、粒子径に報告している6）。この高濃度のリン酸緩衝液中で抗10μm、細孔径約1000ÅのTSKgel G5000PW4)に2,2,2トリフルオロエタンスルホニルクロライド（トレシルシル基が約20μmol/ml gel導入されている。Tresyl5PWはリガンド中のアミノあるいはチオール基とFig.
1のように反応し、リガンドを化学的に固定化できる。

〈Activation reaction〉
CH2OH ＋ CF3−CH2−SO2Cl

CH2OSO2−CH2−CF341007525025006

TSKgel G5000PW

Antigen Binding Capacity［mg/ml gel］

Antigen Binding Efficiency［％］
Antibody Coupling Yield［％］

クロライド）を反応させ活性化された充填剤で、トレ789

pH of Coupling Buffer〈Immobilization reaction〉
H2N−ligand

CH2−NH−ligand

Fig.２

CH2OSO2−CH2−CF3＋TSKgel Tresyl-5PW

Fig.１

HS−ligand

CH2−S−ligand

Activation and immobilization reactions（ 48 ）

Effect of pH of coupling buffer on (●) antibody
coupling yield, (○) antigen binding efficiency and(■) antigen binding capacity
Affinity-purified anti-human albumin antibody(2.5mg) was reacted with 0.25 g of Tresyl-5PW
in 2 ml of 1 M potassium phosphate buffer ofpH 6.5-8.5 at 4℃ for 16h.

東ソー研究・技術報告 第48巻（2004）

49

ンパク質量が多いため25℃で固定化反応を実施した。
Fig. 5にIgG画分固定化時の緩衝液のpHの影響を
FabFc

Fig. 6に固定化反応の経時変化を示した。アフィニテ
ィー精製品と同様、pH 7.5〜8付近でヒトアルブミンに対する吸着量が最大となった。固定化反応の経時変化では、固定化時間と伴に抗体の固定化量は増加した。

Antigen binding sites

ヒトアルブミンの吸着量は、8時間で最高値が得られた。
（2）各種抗ヒトタンパク質抗体の固定化
Fig.３

Structure of IgG

抗ヒトアルブミン抗体で得られた最適条件を用いて、各種抗ヒトタンパク質抗体の固定化を実施した。

体を固定化すると、まず抗体のFc部分が疎水的に吸着した後、固定化されるため効率の良い免疫吸着体がミンに対する結合量も増加したが、固定化された抗体の効率は、抗体量の少ない時、最高値が得られ、抗体量の増加と伴に減少した。これは抗体分子が大きいため、固定化される抗体量が多くなると立体障害がおこるためと推定している。

1004502

Antigen Binding Capacity［mg/ml gel］

Fig. 4に抗体量の影響について検討した結果を示す。固定化に使用する抗体量が増加するとヒトアルブ

Antibody Coupling Yield［％］作成されたものと推測している。

006［3］IgG画分の固定化

789pH of Coupling Buffer（1）抗ヒトアルブミン抗体の固定化
アフィニティー精製抗体は免疫吸着体の調製に有効

Fig.５であるが、種類が限られている。このため比較的に入手しやすいIgG 画分の固定化に関しても検討した。ア100450225025000240060

Amount of antibody (mg)

Antigen Binding Capacity［mg/ml gel］

75

Antibody Coupling Yield［％］

4100

Antigen Binding Capacity［mg/ml gel］

Antigen Binding Efficiency［％］
Antibody Coupling Yield［％］

フィニティー精製品の場合と異なり、IgG画分は総タEffect of pH of coupling buffer on (●) antibodycoupling yield and (○) antigen binding capacity
IgG fraction of anti-human albumin antibody(10.7mg) was reacted with 0.25 g of Tresyl-5PW
in 2 ml of 1 M potassium phosphate buffer of
pH 6.5-8.5 at 25℃ for 16h.

510152025Reaction Time (h)Fig.４

Effect of amount of reacted antibody on (●)
antibody coupling yield, (○) antigen binding
efficiency and (■) antigen binding capacity
Affinity-purified anti-human albumin antibody(0.5-5mg) was reacted with 0.25g of Tresyl-5PW
in 2 ml of 1 M potassium phosphate buffer(pH7.5) at 4℃ for 16h.

Fig.６

（ 49 ）

Effect of reaction time on (●) antibody coupling
yield and (○) antigen binding capacity
IgG fraction of anti-human albumin antibody(10.7mg) was reacted with 0.25 g of Tresyl-5PW
in 2 ml of 1 M potassium phosphate buffer(pH 7.5) at 25℃.

50

TOSOH Research ＆ Technology Review Vol.48（2004）

結果をTable 1に示した。検討した全ての抗体で、固増加させ精製した。SDS-PAGEより高純度のプラスミ

定化収率は80％以上であり、抗原の結合量は2〜3ノーゲンが精製されたことがわかる。またpH1.6で溶mg/ml gelであった。IgMのように非常に大きな分子出したにもかかわらず、80％以上の活性回収率が得らでも同様の抗原結合量が得られたが、Tresyl-5PWのれた。
血友病は、特異的な凝固因子濃度が低いことが原因細孔径が大きいためと考えている。の先天性出血性疾患である。最もよく知られているの［3］応 用 例が、第VIII因子欠乏症であり、X染色体遺伝である7)。

（1）タンパク質の精製

このため血液製剤メーカーは血漿より第VIII因子を精Table 1で作成した各種抗ヒトタンパク質抗体を固製し、医薬品として販売している。血液凝固因子の血定化した充填剤を用い、ヒト血漿からタンパク質の精中含有量は非常に少ないため、従来のイオン交換クロ製を実施した。結果をFig. 7-9に示した。Fig. 7, 8よマトグラフィーをベースとした精製法では、精製ステり、高純度のアルブミンやトランスフェリンが短時間ップも多く、長時間を要していた。この問題を解決すで精製できることがわかる。Fig. 9ではプラスミノーるため、最近では精製工程にイムノアフィニティーク

ゲンの精製を検討した。プラスミノーゲンの血中含有

ロマトグラフィーが導入されている8)。

量は非常に少ない(〜0.2mg/ml)ため、試料注入量をTable１ Results of coupling of various antibodies to Tresyl-5PWAntibody

Amount of antibody Coupling yield

Antigen binding

reccted［mg］［％］

capacity［mg/ml gel］

Anti-human albumin antibody

9.089

2.8

Anti-human transferrin antibody

7.589

2.0

Anti-human IgG antibody

5.596

2.5

Anti-human IgM antibody

5.090

2.5

Anti-human α1-acidglycoprotein antil

1283−

Anti-human plasminogenantibody

5.590−

Anti-human serum protein antibodies (5-12 mg) were reacted with 0.25 of Tresyl-5PW in 1 M
potassium phosphate buffer (pH 7.5) at 25℃ for 8 h. Antigen binding capacity was notdetermined for anti-human α1-acidglycoprotein antibody and anti-human plasminogen antibody.

1200

1 2 3 4 5220 KDa
800

116

A280

66
4230

400

170024

6

Retention time［min］

Fig.７

Purification of albumin by high-permance affinity chromatography
Human serum (6μl) was applied to a column (6 mm I.D. × 1 cm) of Tresyl-5PW coupledwith anti-human albumin antibody at a flow-rate of 1 ml/min at 25℃. The pH of eluent
was changed stepwise from 7.0 to 1.6 at 3 min after the sample injection. Bound andunbound peaks were collected and subjected to SDS-PAGE. The results of SDS-PAGE areincluded; lanes 1 and 5, lane 2, lane 3 and lane 4 represents patterns of molecular weightmarkers, haman serum, unbound fraction and bound fraction, respectively.

（ 50 ）

東ソー研究・技術報告 第48巻（2004）

51

1 2 3 4 51200
220 KDa
116
800

66A2804230
4001700246Retentin time［min］

Fig.８

Purification of transferrin by high-permance affinity chromatographyExperimental procedure as for albumin in Fig. 7 , except that 80μl of human serum wasapplied to a column of Tresyl-5PW coupled with anti-human transferrin antibody. The
results of SDS-PAGE are included; lanes 1 and 5, lane 2, lane 3 and lane 4 represents
patterns of molecular weight markers, haman serum, unbound fraction and bound fraction,
respectively.

1 2 3 4 51200
220 KDa
116
800

66A2804230400

17002468

Retention time［min］

Fig.９

Purification of plasminogen by high-performance affinity chromatography
Experimental procedure as for albumin in Fig. 7 , except that 500μl of human serum wasapplied to a column of Tresyl-5PW coupled with anti-human plasminogen antibody andthe pH of the eluent was changed at 5 min after the sample injection. The results of
SDS-PAGE are included; lanes 1 and 5, lane 2, lane 3 and lane 4 represents patterns ofmolecular weight markers, haman serum, unbound fraction and bound fraction, respectively.

（2）臨床分析（3）プロテオーム解析の前処理

ヒト血清タンパク質の臨床分析についてもイムノア

さて、ヒトの全遺伝子情報であるDNAの30億塩基フィニティークロマトグラフィーが応用できる。Fig.

対を調べるヒトゲノム計画は、ほぼ終了し、次のステ10では血清中のIgGの分析を実施した。試料は4分間ップとして、これらゲノム情報を基にしてその最終発隔で注入し、300回繰り返し測定した。IgG量はpH1.6現産物である全タンパク質を網羅的に解析し、高度にで溶出したピーク高さより測定した。ピーク高さと注複雑な生体システムの総合的理解を目指す研究（プロ入したIgG量との間には、160μgまで直線性が確認さテオーム）が世界各国で熾烈な競争となっている。プれた。本法による血清中のIgG定量を臨床検査で使用

ロテオーム解析の流れは、二次元電気泳動でタンパクされるSRID (Single Radial Immuno Diffusion) 法と比質を分離し、分離されたタンパク質をそれぞれ質量分較した。その結果をFig. 11に示すが、本法はSRID法

析によりペプチドマップを作製したり、アミノ酸配列と良好な相関性が認められた。

を決定する。これらのデータをもとにゲノム解析で得（ 51 ）

52

TOSOH Research ＆ Technology Review Vol.48（2004）

A28040020000123Retention time［min］

IgG Content by SRID［μg/μl］

Fig.10 Analysis of IgG in human aerum by high-performance affinity chromatography
A 1μl of human serum diluted 10-fold with 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0) was applied
to a column (6 mm I.D. × 1 cm) of Tyesyl-5PW coupled with anti-human IgG antibody at aflow-rate of 1 ml/min at 25℃. Bound IgG was eluted by pulse injection of 1 ml of 0.1 M
citric acid (pH 1.6) at 1 min after the sample injection.

パク質が検出できる、②試料負荷量の増加が可能とな40り、低発現量のタンパク質の検出が改善される、ということになる。このアルブミンとIgGの除去にアフィ30ニティークロマトグラフィーが利用されている。ヒト
20

アルブミンと親和性のあるリガンドといえば、Cibacron Blueという色素または抗ヒトアルブミン抗10体が考えられる。両者の性能を比較するため、色素を0固定化した充填剤と本検討で得られた抗体を固定化し010203040た充填剤でヒト血清を分離した。色素が固定化されたIgG Content by HPLC［μg/μl］

充填剤はアガロースを基材としたBlue-Sepharose 6FF

Fig.11 Relationship between IgG contents in human serum
determined by single radial immunodiffusion (SRID)
and by high-performance affinity chromatography(HPAC) Three human serum standards (1 μl) ofdifferent IgG contents were analyzed in the same
way as in Fig. 10.

（アマシャム製）とToyopearl AF-Blue（東ソー製）を使用し、抗体は表1に示した充填剤を使用した。Fig．
12にSDS-PAGEの結果を示した。第4、6および8レー
ンはそれぞれBlue-Sepharose、Toyopearl AF-Blueおよび抗ヒトアルブミン抗体固定化5PWに吸着したヒトられたデータベースを検索し、タンパク質と遺伝子のアルブミン画分であるが、色素を固定化した充填剤は関係を明らかにする。プロテオーム解析の成否は、いヒトアルブミン以外の成分まで吸着しており、やはりかに多くのタンパク質をハイスループットで分離精製

特異性は抗体の方が優れていた。したがって、ヒト血できるかにかかっている。

清中のアルブミン除去では、抗体固定化充填剤を使用

ヒト血清のプロテオーム解析では、まず二次元電気した方が好ましいと言える。

泳動により血清中のタンパク質が分離されるが、大量表1に示した抗アルブミン、抗IgG抗体固定化充填に存在するタンパク質の影響で、低発現量のタンパク剤を4:1の割合で混合した後、カラムに充填し、ヒト質解析が困難となる。アルブミンとIgGだけでも血清血清を分離したクロマトグラムをFig.13に示した。非中に存在する総タンパク質量の約70％を占める。これ

吸着画分と吸着画分のSDS-PAGEをFig. 13の第9、10らのタンパク質をあらかじめ除去すれば、SDS-PAGE

レーンに示したが、Tresyl-5PWは粒子径が10μmと小または二次元電気泳動において、①アルブミンやIgGさいため、非吸着画分があまり希釈されずに溶出されに近似した分子量または等電点を有する他の重要タンる。このため、その後のSDS-PAGEで負荷量を多くす（ 52 ）

東ソー研究・技術報告 第48巻（2004）

1 23456 78

9 10 11 1253

Lanes 1, 12 : Markers
Lanes 2, 11 : human serum

200

Lane 3 : Blue-Sepharose flow-through

116

Lane 4 : Blue-Sepharose bound66

Lane 5 : Toyopearl AF-Blue flow-through42

Lane 6 : Toyopearl AF-Blue bound30

Lane 7 : Anti-Albumin flow-through17

Lane 8 : Anti-Albumin boundLane 9 : Anti-Alb ＋ IgG flow-through［KDa］

Lane 10 : Anti-Alb ＋ IgG boundFig.12 SDS-PAGE analysis

300
Elution buffer

250
A280

200
150
100
500051015［min］

Fig.13 Removal of albumin and IgG by high-performance affinity chromatography
Human serum (20μl) was applied to a column (6 mm I.D.×1 cm) of Tresyl-5PW coupledwith anti-human albumin and anti-human IgG antibody at a flow-rate of 0.5 ml/min at25℃. The pH of eluent was changed stepwise from 7.4 to 1.6 at 8 min after the sample
injection. Unbound and bound peaks were collected and subjected to SDS-PAGE.

ることが可能となり、タンパク質の検出がさらに改善できる。

参考文献
１）バイオセパレーションプロセス便覧（1996）.

[4] おわりに２）R. R. Walters, Anal. Chem., 57, 1099（1985）.

以上のようにTSKgel Tresyl-5PWはイムノアフィニ

３）U. K. Laemmli, Nature, 227, 680（1970）.

ティークロマトグラフィー用の充填剤として有効であ４）T. Hashimoto, H. Sasaki, M. Aiura, Y. Kato, J.

った。抗体は温和な条件下で容易に固定化でき、抗体

Polym. Sci., Polym. Phys. Ed., 16, 1789（1978）.の固定化収率も高く、最適条件下で抗体を固定化する

５）S. J. Van Oss, C. F. Gillman, A. W. Newman,と、70〜80％の抗原結合効率を示した。Tresyl-5PW

Phagocytic Engulfmen and Adhesiveness asを用いたイムノアフィニティークロマトグラフィーに

Cellular Surface Phenomena,（1975）.

より、短時間で高純度のタンパク質が得られ、臨床分

６）K. Nakamura,

T. Hashimoto,Y. Kato,K.

析にも応用可能である。また、本検討で使用した1M

Shimura, K. Kasai, J. Chromatogr., 513, 367

リン酸緩衝液は抗体の固定化だけでなく、他のタンパ（1990）

ク質の固定化にも使用可能である。

７）L. W. Hoyer, New Engl. J. Med., 330, 38（1994）.
８）T. Burnouf, H. Goubran, M. Radosevich, J.

Chromatogr. B, 715, 65（1998）.

（ 53 ）